(57)【要約】  本発明は、αＶβ３インテグリンシステインループドメインアゴニストおよびアンタゴニスト（ペプチドアゴニストおよびアンタゴニストならびにその類似体を含む）を提供し、また当該アゴニストおよびアンタゴニストを用いる方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＧＦ−１作用の阻害が必要な被検対象において、ＩＧＦ−１作用を阻害するのに有効な量で前記被検対象にαＶβ３インテグリンシステインループドメインのアンタゴニストを投与することを含む、前記被検対象におけるＩＧＦ−１作用を阻害する方法。
【請求項２】
前記被検対象が腫瘍を患い、そして前記腫瘍を治療するのに有効な量で前記アンタゴニストを投与する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記腫瘍が、乳がん腫瘍、結腸がん腫瘍、肺がん腫瘍および前立腺がん腫瘍からなる群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記腫瘍または腫瘍に供給する血管がαＶβ３受容体を発現する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記被検対象がアテローム性動脈硬化症を患い、そして前記アテローム性動脈硬化症を治療するのに有効な量で前記アンタゴニストを投与する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アテローム性動脈硬化症が、冠動脈、頸動脈または大腿アテローム性動脈硬化症である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記アテローム性動脈硬化症が、αＶβ３受容体を発現するアテローム性動脈硬化性病変細胞を特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記被検対象が骨粗鬆症を患い、そして前記骨粗鬆症を治療するのに有効な量で前記アンタゴニストを投与する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記被検対象が病的血管新生、網膜症または腎症を患い、そして前記病的血管新生、網膜症または腎症を治療するのに有効な量で前記アンタゴニストを投与する請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記病的血管新生が腫瘍の脈管形成を含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
腫瘍の治療を必要とする被検対象に、治療有効量の抗腫瘍性化合物または放射線治療を与えることにより前記被検対象における腫瘍を治療する方法における、ＩＧＦ−Ｉ作用を阻害するのに有効な量でαＶβ３インテグリンシステインループドメインのアンタゴニストを前記被検対象に投与することを含む改善。
【請求項１２】
前記腫瘍が、乳がん腫瘍、結腸がん腫瘍、肺がん腫瘍および前立腺がん腫瘍からなる群から選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記腫瘍がαＶβ３受容体を発現する請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＩＧＦ−１作用の増強が必要な被検対象に、ＩＧＦ−１作用を増強するのに有効な量でαＶβ３インテグリンシステインループドメインのアゴニストを投与することを含む、前記被検対象におけるＩＧＦ−１を増強する方法。
【請求項１５】
前記被検対象が発育不良を患い、そして前記被検対象の成長を増強するのに有効な量で前記アゴニストを投与する請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記被検対象が、幼児、若年または青年被検対象である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記被検対象が網膜脈管形成欠損を患い、そして前記網膜脈管形成欠損を治療するのに有効な量で前記アゴニストを投与する請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記被検対象が幼児被検対象である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記被検対象が虚血性傷害を患い、そして前記虚血性傷害を治療するのに有効な量で前記アゴニストを投与する請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記虚血性傷害が跛行を伴う末梢血管疾患を含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記被検対象がニューロン萎縮または神経成長の不全を患い、そして前記ニューロン萎縮を治療するかまたは神経成長を促すのに有効な量で前記アゴニストを投与する請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記被検対象が股関節骨折を患い、そして前記股関節骨折を治療するのに有効な量で前記アゴニストを投与する請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記被検対象が、成人または老年被検対象である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記被検対象が糖尿病性虚血性潰瘍を患い、そして前記糖尿病性虚血性潰瘍を治療するのに有効な量で前記アゴニストを投与する請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
前記アンタゴニストが、（ａ）ヒトβ３インテグリンのアミノ酸１７７から１８４のシステインループドメインに特異的に結合し、（ｂ）ヒトβ３インテグリンのＲＧＤ結合部位に特異的に結合せず、（ｃ）ブタβ３インテグリンのアミノ酸１７７から１８４のシステインループドメインに特異的に結合する抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記アンタゴニストが式ＩＩ：
【化１】
2007536265.tif 000012
（式中、
Ａ11はＲ、ＫおよびＨからなる群から選択される塩基性アミノ酸であり、
Ａ12はＲ、ＫおよびＨからなる群から選択される塩基性アミノ酸であり、
Ａ13は任意のアミノ酸であり、
Ａ14は任意のアミノ酸であり、
Ａ15はＦ、Ｙ、ＷおよびＨからなる群から選択される芳香族アミノ酸であり、
Ａ16はＲ、ＫおよびＨからなる群から選択される塩基性アミノ酸であり、
Ａ17はＲ、ＫおよびＨからなる群から選択される塩基性アミノ酸であり、
Ａ18はＩ、ＬおよびＶからなる群から選択される疎水性アミノ酸またはＭ、Ｆ、Ｗ、ＣおよびＡからなる群から選択される中性アミノ酸であり、
Ｘ’は０〜５個のアミノ酸の鎖であり、そのＮ末端のアミノ酸が場合によってはＲ11およびＲ12に結合しており、
Ｙ’は０〜４個のアミノ酸の鎖であり、そのＣＡＮのＣ末端のアミノ酸がホスホセリンでよいか、または任意選択によりＲ13およびＲ14に結合しており、
Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14は存在するかまたは存在せず、各々別個にＨ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ６−Ｃ１８アリール、Ｃ１−Ｃ１２アシル、Ｃ７−Ｃ１８アラルキルおよびＣ７−Ｃ１８アルカリールからなる群から選択される）
の化合物またはその薬学的に許容される塩である請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記アゴニストが式Ｉ：
【化２】
2007536265.tif 000013
（式中、
Ａ1はＲ、ＫおよびＨからなる群から選択される塩基性アミノ酸またはリン酸化セリンであり、
Ａ2はＲ、ＫおよびＨからなる群から選択される塩基性アミノ酸であり、
Ａ3は任意のアミノ酸であり、
Ａ4は任意のアミノ酸であり、
Ａ5はＦ、Ｙ、ＷおよびＨからなる群から選択される芳香族アミノ酸であり、
Ａ6はＲ、ＫおよびＨからなる群から選択される塩基性アミノ酸であり、
Ａ7はＲ、ＫおよびＨからなる群から選択される塩基性アミノ酸であり、
Ａ8はＲ、ＫおよびＨからなる群から選択される塩基性アミノ酸またはリン酸化セリンであり、
Ｘは、０〜５個のアミノ酸の鎖であり、そのＮ末端のアミノ酸が任意選択によりＲ1およびＲ2に結合しており、
Ｙは０〜４個のアミノ酸の鎖であり、そのＣ末端のアミノ酸が任意選択によりＲ3およびＲ4に結合しており、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は存在するかまたは存在せず、各々別個にＨ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ６−Ｃ１８アリール、Ｃ１−Ｃ１２アシル、Ｃ７−Ｃ１８アラルキルおよびＣ７−Ｃ１８アルカリールからなる群から選択される）
の化合物またはその薬学的に許容される塩である請求項１４に記載の方法。
【請求項２８】
前記被検対象が、治療有効量で投与された前記αＶβ３インテグリンシステインループドメインのアンタゴニストによる治療を必要とする糖尿病性網膜症または腎症を患う請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記アンタゴニストが式ＩＩ：
【化３】
2007536265.tif 000014
（式中、
Ａ11はＲ、ＫおよびＨからなる群から選択される塩基性アミノ酸であり、
Ａ12はＲ、ＫおよびＨからなる群から選択される塩基性アミノ酸であり、
Ａ13は任意のアミノ酸であり、
Ａ14は任意のアミノ酸であり、
Ａ15はＦ、Ｙ、ＷおよびＨからなる群から選択される芳香族アミノ酸であり、
Ａ16はＲ、ＫおよびＨからなる群から選択される塩基性アミノ酸であり、
Ａ17はＲ、ＫおよびＨからなる群から選択される塩基性アミノ酸であり、
Ａ18はＩ、ＬおよびＶからなる群から選択される疎水性アミノ酸またはＭ、Ｆ、Ｗ、ＣおよびＡからなる群から選択される中性アミノ酸であり、
Ｘ’は０〜５個のアミノ酸の鎖であり、そのＮ末端のアミノ酸が任意選択によりＲ11およびＲ12に結合しており、
Ｙ’は０〜４個のアミノ酸の鎖であり、そのＣ末端のアミノ酸がホスホセリンでよいかまたは任意選択によりＲ13およびＲ14に結合しており、
Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14は存在するかまたは存在せず、各々別個にＨ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ６−Ｃ１８アリール、Ｃ１−Ｃ１２アシル、Ｃ７−Ｃ１８アラルキルおよびＣ７−Ｃ１８アルカリールからなる群から選択される）
の化合物またはその薬学的に許容される塩である請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記アンタゴニストが、（ａ）ヒトβ３インテグリンのアミノ酸１７７から１８４のシステインループドメインに特異的に結合し、（ｂ）ヒトβ３インテグリンのＲＧＤ結合部位に特異的に結合せず、（ｃ）ブタβ３インテグリンのアミノ酸１７７から１８４のシステインループドメインに特異的に結合する抗体である請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
式Ｉ：
【化４】
2007536265.tif 000015
（式中、
Ａ1はＲ、ＫおよびＨからなる群から選択される塩基性アミノ酸またはリン酸化セリンであり、
Ａ2はＲ、ＫおよびＨからなる群から選択される塩基性アミノ酸であり、
Ａ3は任意のアミノ酸であり、
Ａ4は任意のアミノ酸であり、
Ａ5はＦ、Ｙ、ＷおよびＨからなる群から選択される芳香族アミノ酸であり、
Ａ6はＲ、ＫおよびＨからなる群から選択される塩基性アミノ酸であり、
Ａ7はＲ、ＫおよびＨからなる群から選択される塩基性アミノ酸であり、
Ａ8はＲ、ＫおよびＨからなる群から選択される塩基性アミノ酸またはリン酸化セリンであり、
Ｘは、０〜５個のアミノ酸の鎖であり、そのＮ末端のアミノ酸が任意選択によりＲ1およびＲ2に結合しており、
Ｙは０〜４個のアミノ酸の鎖であり、そのＣ末端のアミノ酸が任意選択によりＲ3およびＲ4に結合しており、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は存在するかまたは不在であり、そして各々別個にＨ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ６−Ｃ１８アリール、Ｃ１−Ｃ１２アシル、Ｃ７−Ｃ１８アラルキルおよびＣ７−Ｃ１８アルカリールからなる群から選択される）
の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３２】
薬学的に許容される担体中に請求項３１の化合物を含む医薬製剤。
【請求項３３】
式ＩＩ：
【化５】
2007536265.tif 000016
（式中、
Ａ11はＲ、ＫおよびＨからなる群から選択される塩基性アミノ酸であり；
Ａ12はＲ、ＫおよびＨからなる群から選択される塩基性アミノ酸であり；
Ａ13は任意のアミノ酸であり；
Ａ14は任意のアミノ酸であり；
Ａ15はＦ、Ｙ、ＷおよびＨからなる群から選択される芳香族アミノ酸であり；
Ａ16はＲ、ＫおよびＨからなる群から選択される塩基性アミノ酸であり；
Ａ17はＲ、ＫおよびＨからなる群から選択される塩基性アミノ酸であり；
Ａ18はＩ、ＬおよびＶからなる群から選択される疎水性アミノ酸またはＭ、Ｆ、Ｗ、ＣおよびＡからなる群から選択される中性アミノ酸であり；
Ｘ’は０〜５個のアミノ酸の鎖であり、そのＮ末端のアミノ酸が任意選択によりＲ11およびＲ12に結合しており；
Ｙ’は０〜４個のアミノ酸の鎖であり、そのＣ末端のアミノ酸がホスホセリンでよいかまたは任意選択によりＲ13およびＲ14に結合しており；
Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14は存在するかまたは存在せず、各々別個にＨ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ６−Ｃ１８アリール、Ｃ１−Ｃ１２アシル、Ｃ７−Ｃ１８アラルキルおよびＣ７−Ｃ１８アルカリールからなる群から選択される）
の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３４】
薬学的に許容される担体中に請求項３３の化合物を含む医薬製剤。
【請求項３５】
それに結合した請求項３３の化合物を有するインプラント。
【請求項３６】
前記インプラントがステントまたは眼科用インプラントである請求項３５に記載のインプラント。
【請求項３７】
（ａ）ヒトβ３インテグリンのアミノ酸１７７から１８４のシステインループドメインに特異的に結合し、（ｂ）ヒトβ３インテグリンのＲＧＤ結合部位に特異的に結合せず、（ｃ）ブタβ３インテグリンのアミノ酸１７７から１８４のシステインループドメインに特異的に結合する抗体。
【請求項３８】
検出可能な基に結合した請求項３７に記載の抗体。
【請求項３９】
治療的な基に結合した請求項３７に記載の抗体。
【請求項４０】
薬学的に許容される担体中に請求項３７に記載の抗体を含む医薬製剤。
【請求項４１】
それに結合した請求項３７に記載の抗体を有するインプラント。
【請求項４２】
前記インプラントがステントまたは眼科用インプラントである請求項４１に記載のインプラント。
【請求項４３】
（ａ）β３インテグリンを含む系に被験化合物を接触させるステップと、
（ｂ）前記被験化合物がβ３インテグリンのアミノ酸１７７から１８４のシステインループに結合するかどうかを決定するステップと、
（ｃ）前記化合物が前記システインループドメインと結合する場合、被験化合物をＩＧＦ−１による細胞活性化の調整において活性であると同定するステップと
を含むＩＧＦ−Ｉによる細胞活性化を調整する活性に関して化合物をスクリーニングする方法。
【請求項４４】
前記系がαＶβ３インテグリンを含む請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記接触ステップをインビトロで実施する請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記被験化合物が前記システインループドメインに特異的に結合する抗体の結合を阻害するかどうかを決定することによって、前記決定ステップを実施する請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記β３インテグリンが哺乳動物β３インテグリンである請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記β３インテグリンがヒトおよびブタβ３インテグリンからなる群から選択される哺乳動物β３インテグリンである請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
（ａ）β３インテグリンのアミノ酸１７７から１８４を含むペプチドであるシステインループドメインに被験化合物を接触させるステップと、
（ｂ）前記被験化合物が前記システインループドメインに結合するかどうかを決定するステップと、
（ｃ）前記被験化合物が前記システインループドメインと結合する場合、前記化合物をＩＧＦ−１による細胞活性化の活性化において活性であると同定するステップと
を含むＩＧＦ−１による細胞活性化を調整する活性に関して化合物をスクリーニングする方法。
【請求項５０】
前記システインループドメインが固体支持体に固定されている請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記接触ステップをインビトロで実施する請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記被験化合物が前記システインループドメインに特異的に結合する抗体の結合を阻害するかどうかを決定することによって、前記決定ステップを実施する請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記β３インテグリンが哺乳動物β３インテグリンである請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記β３インテグリンがヒトおよびブタβ３インテグリンからなる群から選択される哺乳動物β３インテグリンである請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
固体支持体に結合された、β３インテグリンのアミノ酸１７７から１８４を含むペプチドを含む固定化システインループドメイン。
【請求項５６】
前記β３インテグリンがヒトまたはブタβ３インテグリンである請求項５５に記載の固定化システインループドメイン。
【請求項５７】
前記固体支持体がポリマー支持体である請求項５５に記載の固定化システインループドメイン。
【請求項５８】
前記ペプチドが１５個以下のアミノ酸からなる請求項５５に記載の固定化システインループドメイン。
【請求項５９】
（ａ）コンピューター上でαＶβ３インテグリンのシステインループドメインに関する少なくとも３０の座標を提供するステップと、
（ｂ）コンピューター読取可能な形式で前記コンピューターに候補化合物の構造を提供するステップと、
（ｃ）前記候補化合物が前記システインループドメインの結合空洞と適合するかまたはドッキングするかどうかを決定するステップであって、前記結合空洞と適合するかまたはドッキングする候補化合物はＩＧＦ−１の活性を調整する可能性があることを決定するステップと
を含むＩＧＦ−Ｉの活性を調整する化合物を同定するためのコンピューターベースの方法。
【請求項６０】
前記候補化合物が化合物ライブラリーのメンバーである請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
請求項５９に記載の方法を含むコンピューター読取可能媒体。
【請求項６２】
（ａ）αＶβ３インテグリンの細胞外マトリックスタンパク質結合部位のコンピューター読取可能モデルを作成するステップと、
（ｂ）前記結合部位に適合する構造および電荷分布を有し、前記結合部位と相互作用してアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を調整する官能基を有する化合物を、前記モデルによりコンピューター上で設計するステップと
を含むＩＧＦ−Ｉの活性を調整する化合物を理論的に設計するためのコンピューターベースの方法。
【請求項６３】
請求項６２に記載の方法を含むコンピューター読取可能媒体。
【請求項６４】
前記アンタゴニストが、（ａ）ヒトβ３インテグリンのアミノ酸１７７から１８４のシステインループドメインに特異的に結合し、（ｂ）ヒトβ３インテグリンのＲＧＤ結合部位に特異的に結合せず、（ｃ）ブタβ３インテグリンのアミノ酸１７７から１８４のシステインループドメインに特異的に結合する抗体である請求項１１に記載の方法。
【請求項６５】
前記アンタゴニストが式ＩＩ：
【化６】
2007536265.tif 000017
（式中、
Ａ11はＲ、ＫおよびＨからなる群から選択される塩基性アミノ酸であり、
Ａ12はＲ、ＫおよびＨからなる群から選択される塩基性アミノ酸であり、
Ａ13は任意のアミノ酸であり、
Ａ14は任意のアミノ酸であり、
Ａ15はＦ、Ｙ、ＷおよびＨからなる群から選択される芳香族アミノ酸であり、
Ａ16はＲ、ＫおよびＨからなる群から選択される塩基性アミノ酸であり、
Ａ17はＲ、ＫおよびＨからなる群から選択される塩基性アミノ酸であり、
Ａ18はＩ、ＬおよびＶからなる群から選択される疎水性アミノ酸またはＭ、Ｆ、Ｗ、ＣおよびＡからなる群から選択される中性アミノ酸であり、
Ｘ’は０〜５個のアミノ酸の鎖であり、そのＮ末端のアミノ酸が任意選択によりＲ11およびＲ12に結合しており、
Ｙ’は０〜４個のアミノ酸の鎖であり、そのＣ末端のアミノ酸がホスホセリンでよいかまたは任意選択によりＲ13およびＲ14に結合しており、
Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14は存在するかまたは不在であり、そして各々別個にＨ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ６−Ｃ１８アリール、Ｃ１−Ｃ１２アシル、Ｃ７−Ｃ１８アラルキルおよびＣ７−Ｃ１８アルカリールからなる群から選択される）
の化合物またはその薬学的に許容される塩である請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は国立衛生研究所の認可番号ＡＧ−０２３３１の下で政府の支援を受けて為されたものである。政府は本発明に対して特定の権利を有する。
【０００２】
関連出願
本出願は２００５年２月２８日出願の米国仮特許出願番号第６０／６５７，１５１号および２００４年５月７日出願の米国仮特許出願番号第６０／５６９，１４７号の利益を主張し、その双方の開示は、参照することによりその全体を本明細書に組み込まれる。
【０００３】
発明の分野
本発明は、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）の作用を阻害または増強するための方法について記載する。
【背景技術】
【０００４】
ＩＧＦ−Ｉは全ての型の細胞の増殖を刺激する小型のポリペプチドホルモンである。ＩＧＦ−Ｉは広い作用域を有し、そして均衡の取れた組織成長を刺激するので、いくつかの重要なヒトがんの進行に、そしてアテローム性動脈硬化症にも関わっている。ＩＧＦ−Ｉは、主にこれらの組織に含まれる足場依存性細胞に作用する。これらの細胞は、また細胞外マトリックス分子への付着に寄与するインテグリン受容体と称される受容体のクラスを有する。細胞が正常に分裂するために、細胞外刺激に応答して細胞は、そのインテグリン受容体が細胞外マトリックス分子に結合することを察知しなければならない。したがってインテグリン受容体のリガンド占有の操作により、細胞分裂および移動のような疾患の進行に重要である過程を変化させることができる。
【０００５】
我々の研究では、ＩＧＦ−Ｉが内皮および平滑筋細胞分裂を刺激することを決定した。さらに、これらの細胞が分裂するためにαＶβ３インテグリン受容体を利用して、これらが細胞外マトリックスに十分に付着していることを細胞核に伝達するということを決定した。ある特異的なインテグリン（αＶβ３インテグリン）の豊富さは、ヒト組織で比較的限局的であり、そして増殖中の細胞および特に平滑筋および内皮細胞のような血管の維持に関与する細胞において主に発現される。我々の研究ではこのインテグリン受容体の、オステオポンチン、ビトロネクチンおよびトロンボスポンジンのようなその天然のリガンドによる占有が、これらの細胞がＤＮＡ合成の増加および細胞移動を伴うＩＧＦ−Ｉに対する応答に必要であることを示した。このインテグリンのディスインテグリンアンタゴニストでのリガンド占有の遮断が、細胞増殖および移動の阻害を招く。我々の研究では、αＶβ３とＩＧＦ−Ｉ受容体との間のこの協力的相互作用は、２つの特異的なシグナル伝達分子の転位置を調節することにより介されることを示した。これらの分子は、１）ＳＨＰ−２と称されるタンパク質チロシンホスファターゼおよび２）Ｓｈｃと称されるシグナル伝達タンパク質である。正常な状況下では、ＳＨＰ−２は、細胞の細胞骨格およびサイトゾル区画に局在する。αＶβ３のリガンド占有の後、β３インテグリンの細胞質ドメインはチロシンリン酸化を受ける。ＳＨＰ−２は、β３のリン酸化チロシン残基に結合するタンパク質への結合により細胞膜に移される。この移動は、ＳＨＰ−２が膜に局在し、そこでＳｈｃのようなその他の重要なシグナル伝達分子を補充するために必要である。ＳＨＰ−２がＳｈｃと同時局在し、及び／またはＩＧＦ−Ｉシグナル伝達経路内でシグナル伝達分子を脱リン酸化することは、その活性化、および続くＩＧＦ−Ｉ受容体から核へのシグナルの伝達に必要である。ＩＧＦ−Ｉ活性化に必要である２つの主要な細胞内シグナル伝達経路（例えばＰＩ−３キナーゼおよびＭＡＰキナーゼ経路）の活性化を、ＳＨＰ−２またはＳｈｃのいずれかの膜への移動を阻害することにより阻害することができる。ＳＨＰ−２およびＳｈｃの局在の部位は、ＳＨＰＳ−１と称される膜タンパク質である。ＳＨＰＳ−１はＩＧＦ−Ｉに応答してリン酸化される。このリン酸化は、ＳＨＰ−２およびＳｈｃ移動に必要である。ＳｈｃはＳＨＰＳ−１への移動の後にリン酸化される。αＶβ３リガンド占有の遮断は、ＳＨＰ−２およびＳｈｃの双方の移動を遮断し、したがってＩＧＦ−Ｉ刺激された細胞増殖を阻害する。
【０００６】
αＶβ３インテグリンのリガンド占有を阻害するための方法は、以前に記載されているが、それらは全てＥＣＭリガンド内のアルギニン、グリシン、アスパラギニン（ＲＧＤ）配列に結合するαＶβ３ヘテロ二量体上の特異的結合部位への結合を阻害する科学技術を利用する。αＶβ３アンタゴニストのこの部位への結合は、薬物毒性および副作用を伴う。したがって、ＲＧＤ配列に結合するαＶβ３結合部位を利用しないが、ＩＧＦ−１作用を阻害または活性化する新しい方式が必要とされている。
【発明の開示】
【０００７】
我々の発明では、いくつかの細胞外マトリックスタンパク質に結合するαＶβ３の第２結合部位が存在することを決定した。さらに重要なことに、このドメインのリガンド占有の増強が、ＩＧＦ−Ｉシグナル伝達を増加させ、そしてこの特異的ドメインのリガンド占有の阻害がＩＧＦ−Ｉ作用を阻害することを決定した。重要なことにこの第２結合部位のリガンド占有は、ＲＧＤ結合部位に結合するペプチドにより刺激される特異的生化学的事象を刺激しない。
【０００８】
本発明の第１の態様は、αＶβ３細胞外マトリックスタンパク質結合部位（またはβ３サブユニットのアミノ酸１７７−１８４に含まれるシステインループドメイン）アンタゴニスト（例えばシステインループドメインに結合するペプチドアンタゴニストもしくはその類似体または抗体）である。
【０００９】
前記の特定の実施形態は、αＶβ３インテグリン細胞外マトリックスタンパク質結合部位（またはシステインループドメイン）に特異的に結合する（例えばヒトβ３インテグリンのアミノ酸１７７から１８４のシステインループドメインに特異的に結合する；任意選択により、しかし好ましくは、ヒトβ３インテグリンのＲＧＤ結合部位に特異的に結合しない；そして任意選択により、しかし好ましくはブタβ３インテグリンのアミノ酸１７７から１８４のシステインループドメインに特異的に結合する）抗体である。
【００１０】
本発明の第２の態様は、αＶβ３インテグリン細胞外マトリックスタンパク質結合部位（またはシステインループドメイン）アゴニスト（例えばペプチドアゴニストまたはその類似体）である。
【００１１】
本発明の別の態様は、本明細書に記載する活性薬剤を薬学的に許容される担体中に含む医薬である。
【００１２】
本発明の別の態様は、ＩＧＦ−１作用の阻害を必要とする被検対象において、ＩＧＦ−１作用を阻害するのに有効な量でαＶβ３インテグリン細胞外マトリックスタンパク質結合部位（またはシステインループドメイン）アンタゴニストを該被検対象に投与することを含む、該被検対象においてＩＧＦ−１作用を阻害する方法である。例えば、被検対象は腫瘍（例えば乳がん腫瘍、結腸がん腫瘍、肺がん腫瘍、および前立腺がん腫瘍）を患っていてよく、そしてアンタゴニストは腫瘍を治療するのに有効な量で投与される。ある実施形態では、腫瘍または腫瘍に供給する血管はαＶβ３受容体を発現する。
【００１３】
もう１つの実施例では、被検対象はアテローム性動脈硬化症（例えば冠動脈アテローム性動脈硬化症）を患い、そしてアンタゴニストはアテローム性動脈硬化症を治療するのに有効な量で投与される。ある実施形態ではアテローム性動脈硬化症は、αＶβ３受容体を発現するアテローム性動脈硬化病変細胞を特徴とする。もう１つの実施例では、被検対象は骨粗鬆症を患い、そしてアンタゴニストは骨粗鬆症を治療するのに有効な量で投与される。
【００１４】
もう１つの実施例では、被検対象は病的血管新生（例えば免疫組織化学的に検出可能なレベルのインテグリンαＶβ３を発現する腫瘍および免疫組織化学的に検出可能なレベルのインテグリンαＶβ３を発現しない腫瘍を含む腫瘍の脈管形成）を患い、そしてアンタゴニストは病的血管新生を治療するのに有効な量で投与される。
【００１５】
もう１つの実施例では、被検対象は糖尿病（例えばＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症）を患い、そしてアンタゴニストはこれらの糖尿病の合併症を治療するのに有効な量で投与される。
【００１６】
本発明の態様は、腫瘍の治療を必要とする被検対象に治療上有効量の抗腫瘍性化合物または放射線治療を投与することにより被検対象における腫瘍を治療する方法における、被検対象においてＩＧＦ−Ｉ作用を阻害するのに有効な量でαＶβ３インテグリンシステインループドメインアンタゴニストを被検対象に投与することを含む改善である（例えば、それにより被検対象に対する抗腫瘍性化合物または放射線治療の活性を増強し、被検対象における骨減少を阻害するか、または双方）。被検対象は乳がん腫瘍、結腸がん腫瘍、肺がん腫瘍、および前立腺がん腫瘍のような腫瘍を患っていてよい。ある実施形態では腫瘍はαＶβ３受容体を発現する。
【００１７】
本発明のさらに別の態様は、ＩＧＦ−１作用の増強を必要とする被検対象において、ＩＧＦ−１作用を増強するのに有効な量でαＶβ３インテグリンシステインループドメインアゴニストを被検対象に投与することを含む該被検対象におけるＩＧＦ−１作用を増強する方法である。例えば、被検対象（例えば幼児、若年または青年被検対象）は、発育不良を患っていてよく、そしてアゴニストは被検対象の成長を増強するのに有効な量で投与される。もう１つの実施例では、被検対象（例えば幼児被検対象）は、網膜脈管形成不全を患い、そしてアゴニストは網膜脈管形成不全を治療するのに有効な量で投与される。もう１つの実施例では、被検対象は虚血性傷害（例えば跛行を伴う末梢血管疾患、心筋梗塞等）を患い、そしてアゴニストは虚血性潰瘍を治療するのに有効な量で投与される。もう１つの実施形態では、被検対象はニューロン萎縮または神経成長の不全を患い、そしてアゴニストは、ニューロン萎縮を治療するかまたは神経成長を促進するのに有効な量で投与される。もう１つの実施形態では、被検対象（例えば成人または老年被検対象）は、股関節部骨折を患い、そしてアゴニストは股関節部骨折を治療するのに有効な量で投与される。もう１つの実施形態では、被検対象は糖尿病性虚血性潰瘍を患い、そしてアゴニストは糖尿病性虚血性潰瘍を治療するのに有効な量で投与される。
【００１８】
本発明の別の態様は本明細書に前記したような治療の方法を実施するための医薬品の製造のための本明細書に記載する活性薬剤の使用である。
【００１９】
本発明の別の態様は、（ａ）コンピューターでαＶβ３インテグリンのシステインループドメイン（アミノ酸１７７〜１８４）に関する複数の複数の座標（例えば少なくとも２０、３０または４０の座標）を提供するステップと、（ｂ）コンピューター読取可能な形式でコンピューターに候補化合物の構造を提供するステップと、（ｃ）候補化合物がシステインループドメインの結合空洞と適合するかまたはドッキングするかどうかを決定するステップであって、結合空洞と適合するかまたはドッキングする候補化合物はＩＧＦ−１の活性を調整する可能性があることが決定されているステップとを含むＩＧＦ−Ｉの活性を調整する化合物を同定するためのコンピューターベースの方法である。
【００２０】
本発明の別の態様は、（ａ）αＶβ３インテグリンの細胞外マトリックスタンパク質結合部位のコンピューター読取可能モデルを作成するステップと、次に（ｂ）そのモデルを含むコンピューターで結合部位に適合する構造および電荷分布を有する化合物であって、結合部位と相互作用してアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を調整する官能基を有する化合物を設計するステップとを含む、ＩＧＦ−Ｉの活性を調整する化合物を理論的に設計するためのコンピューターベースの方法である。
【００２１】
１つの実施形態では、本発明は、（ａ）好ましくはインビトロで被験化合物をβ３インテグリンを含む系と接触させるステップと、次に（ｂ）被験化合物がβ３インテグリンのアミノ酸１７７から１８４のシステインループに結合するかどうかを決定するステップと、次に（ｃ）化合物がシステインループドメインと結合する場合、被験化合物をＩＧＦ−１による細胞活性化の調整において活性であると同定するステップとを含む、ＩＧＦ−１による細胞活性化を調整する活性に関して化合物をスクリーニングする方法を提供する。ある実施形態では、被験系は複合体としてαＶβ３インテグリンを含む。被験化合物が本明細書に記載される、システインループドメインに特異的に結合する抗体、アゴニストまたはアンタゴニストの結合を阻害するかどうかを決定することのような任意の適当な手段により決定ステップを実施できる。インテグリンは、好ましくはヒトまたはブタβ３インテグリンのような哺乳動物β３インテグリンである。
【００２２】
本発明のもう１つの実施形態は、（ａ）好ましくはインビトロでβ３インテグリンのアミノ酸１７７から１８４を含むペプチドであるシステインループドメインと被験化合物を接触させるステップと、次に（ｂ）被験化合物がシステインループドメインに結合するかどうかを決定するステップと、（ｃ）化合物がシステインループドメインと結合する場合、被験化合物をＩＧＦ−１による細胞活性化の活性化において活性であると同定するステップとを含むＩＧＦ−１による細胞活性化を調整する活性に関して化合物をスクリーニングする方法を提供する。ペプチドは多くて８、１０、１５または２０個のアミノ酸からなり、そして配列にβ３インテグリンのアミノ酸１７７〜１８４を含む。ある実施形態ではシステインループドメインは溶液中にあり；ある実施形態ではシステインループドメインは固体支持体上で（例えばアフィニティカラムとして）固定されている。被験化合物が本明細書に記載する、システインループドメインに特異的に結合する抗体、アゴニストまたはアンタゴニストの結合を阻害するかどうかを決定することにより決定ステップを実施することができる。この場合もやはり、インテグリンは、ヒトまたはブタβ３インテグリンのような哺乳動物β３インテグリンであるのが好ましい。ある実施形態では、ペプチドはβ３インテグリンのアミノ酸１７７から１８４を含む。
【００２３】
以下の非限定的な実施例においてさらに詳細に本発明を説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明を以下でさらに詳細に説明する。この記載は本発明を実行できる様々な方式の全ての、または本発明に加えることができる特徴の全ての詳細なカタログを意図するものではない。例えば１つの実施形態に関して説明された特徴を別の実施形態に組み入れることができ、そして特定の実施形態に関して説明された特徴をその実施形態から削除することができる。加えて、多くの変法および本明細書において示唆された種々の実施形態への追加は、本発明から逸脱しない本開示に鑑みて当業者には明白である。したがって、以下の明細書は、本発明のある特定の実施形態を説明することを意図し、そしてその全ての置換、組み合わせおよび変法を余すところなく明示することを意図するものではない。
【００２５】
概して、本発明は、薬物毒性に至り得る特異的細胞内シグナル伝達事象の活性化に至らない、代替的結合部位を介してαＶβ３インテグリンのリガンド占有を特異的に阻害するための科学技術を包含する。ビトロネクチンのこの代替的αＶβ３結合部位への結合を阻害するアンタゴニストの投与は、ＩＧＦ−Ｉ刺激されたＰＩ−３キナーゼ、ＭＡＰキナーゼ、ＤＮＡ合成および細胞移動の活性化を遮断することが示されている。これらの事象は、全てＩＧＦ−Ｉがアテローム性動脈硬化病変内の平滑筋細胞成長を刺激するのに重要である。同様に腸平滑筋細胞がこのインテグリンを発現するので、この細胞型におけるＩＧＦ−Ｉ作用の阻害は炎症性腸疾患の治療に有用であろう。この科学技術は内皮細胞の表面で発現されるαＶβ３のこの部位へのリガンド結合を阻害するのに有用であり、したがってリガンド結合を阻害するアンタゴニストはＩＧＦ−Ｉシグナル伝達を阻害する可能性があり、そしてしたがって糖尿病性網膜症の、および腫瘍形成に随伴される血管新生に有効な治療であろうということも示されている。本発明は、結合を阻害し、そしてαＶβ３インテグリンのこの結合部位に結合するＥＣＭリガンドの結合に関する競合的アンタゴニストとして機能し得る化合物の開発を伴う。
【００２６】
本発明は、この分野の進歩を妨げている薬物開発における主要な２つの問題に対処するのを助ける。第１の問題はＩＧＦ−Ｉ受容体に関係する。ＩＧＦ−Ｉ受容体へのリガンド結合を阻害するモノクローナル抗体は開発されているが、受容体の結合部位の分子半径は大きく、したがって結合を十分に阻害するのに必要である分子の大きさのために、ＩＧＦ−Ｉ受容体へのリガンド結合の阻害は薬物開発における困難な問題である。対照的に本発明は、αＶβ３インテグリン上の非常に小さな結合部位への結合を阻害する。インテグリン自体の実際の結合部位は８個のアミノ酸に包含され、そして結合阻害に有効である最小ペプチドは８個のアミノ酸であり、したがって結合部位の分子半径はＩＧＦ−Ｉ受容体へのリガンド結合部位よりも実質的に小さく、そして分子量の小さなアンタゴニストを開発することができるというのは大きさの点である。ＩＧＦ−Ｉ受容体の拮抗に伴う第２の問題はそれが全ての細胞に偏在的に存在するということである。したがって、ＩＧＦ−Ｉ受容体活性を阻害するために計画が立てられ、そしてこれはアポトーシスを刺激する治療（例えばがん化学療法または抗血管新生薬）との組み合わせで用いられたとしたら、正常細胞におけるＩＧＦ−Ｉ作用の阻害はまた胃腸管上皮、骨髄前駆細胞およびニューロンのような正常な細胞型の大規模なアポトーシスが伴い得る。したがって、併用薬剤の毒性は非常に増幅される。同様にＩＧＦ−Ｉ受容体アンタゴニストの投与は併用薬剤がない場合でもタンパク質合成の阻害に至り、そして恐らく正常細胞型でアポトーシスに至る可能性がある。対照的にこの薬物はαＶβ３インテグリンを選択的に標的とする。ＩＧＦ−Ｉ受容体と協力してシグナル伝達するαＶβ３インテグリンは血管内皮および平滑筋細胞に存在し、そして通常増殖細胞においてのみ高濃度で発現されるので、これらの細胞型を特異的に標的とするので開発中の化合物はかなり選択的である。十分なαＶβ３インテグリンを発現しない胃腸管上皮および骨髄前駆細胞のような細胞型は毒性を免れる可能性がある。したがって、本発明はＩＧＦ−Ｉ作用を阻害する低分子量阻害剤を開発することができる問題を解決する。第２に任意の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体アンタゴニストに明白である一般毒性の主要な問題に対処する。第３にインスリン受容体チロシンキナーゼの阻害および糖尿病の進行に至るＩＧＦ−Ｉ受容体チロシンキナーゼを阻害する問題に対処する。
【００２７】
ＩＧＦ−Ｉ作用の増強によりいくつかの疾患状態に有益な効果が提供される。筋萎縮性側索硬化症のような特定の神経系疾患は部分的にＩＧＦ−Ｉに応答することが示されている。同様に、ニューロンにおけるグルコース毒性がＩＧＦ−Ｉにより阻害され、そしてαＶβ３がニューロン再生のために栄養補給するグリア細胞において時に発現されるので、αＶβ３のリガンド占有を増強する薬剤で糖尿病性ニューロパシーのような疾患を治療することができる。ＩＧＦ−Ｉと共に与えられる小型分子アゴニストが血管移植片内の創傷治癒または内皮細胞成長を刺激することもまた可能である。
【００２８】
Ａ．定義
本発明により治療され得る被検対象は、医学的目的のためのヒト被検対象および獣医学ならびに薬物スクリーニングおよび開発目的のための動物被検対象の双方を含む。その他の適当な動物被検対象は一般的に霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、げっ歯類（例えばラットおよびマウス）等のような哺乳動物被検対象である。ヒト被検対象が最も好ましい。ヒト被検対象は胎児、新生児、幼児、若年および成人被検対象を含む。
【００２９】
本明細書で用いるアミノ酸はα炭素上に遊離カルボキシル基および遊離非置換アミノ基を有する化合物を意味し、これはペプチド結合により連結され本明細書に記載するペプチド活性薬剤を形成することができる。アミノ酸は標準または非標準、天然または合成でよく、限定するものではないが、
Ａｓｐ＝Ｄ＝アスパラギン酸
Ａｌａ＝Ａ＝アラニン
Ａｒｇ＝Ｒ＝アルギニン
Ａｓｎ＝Ｎ＝アスパラギン
Ｃｙｓ＝Ｃ＝システイン
Ｇｌｙ＝Ｇ＝グリシン
Ｇｌｕ＝Ｅ＝グルタミン酸
Ｇｌｎ＝Ｑ＝グルタミン
Ｈｉｓ＝Ｈ＝ヒスチジン
Ｉｌｅ＝Ｉ＝イソロイシン
Ｌｅｕ＝Ｌ＝ロイシン
Ｌｙｓ＝Ｋ＝リジン
Ｍｅｔ＝Ｍ＝メチオニン
Ｐｈｅ＝Ｆ＝フェニルアラニン
Ｐｒｏ＝Ｐ＝プロリン
Ｓｅｒ＝Ｓ＝セリン
Ｔｈｒ＝Ｔ＝トレオニン
Ｔｒｐ＝Ｗ＝トリプトファン
Ｔｙｒ＝Ｙ＝チロシン
Ｖａｌ＝Ｖ＝バリン
Ｏｒｎ＝オルニチン
Ｎａｌ＝２−ナフチルアラニン
Ｎｖａ＝ノルバリン
Ｎｌｅ＝ノルロイシン
Ｔｈｉ＝２−チエニルアラニン
Ｐｃｐ＝４−クロロフェニルアラニン
Ｂｔｈ＝３−ベンゾチエニルアラニン
Ｂｉｐ＝４，４’−ビフェニルアラニン
Ｔｉｃ＝テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸
Ａｉｂ＝アミノイソ酪酸
Ａｎｂ＝αアミノノルマル酪酸
Ｄｉｐ＝２，２−ジフェニルアラニン
Ｔｈｚ＝４−チアゾリルアラニン
を含む実施例（および略語）がある。
【００３０】
本明細書で記載する全ペプチド配列はＮ末端アミノ酸が左にあり、そしてＣ末端アミノ酸が右にある通常の慣例に従って記載される。２個のアミノ酸残基間の短い棒線（または棒線なし）はペプチド結合を示す。
【００３１】
「塩基性アミノ酸」とはｐＨ６．０で正に荷電する任意のアミノ酸を指し、限定するものではないがＲ、ＫおよびＨを含む。
【００３２】
「芳香族アミノ酸」とはα炭素に結合する側鎖に芳香族基を有する任意のアミノ酸を指し、限定するものではないがＦ、Ｙ、ＷおよびＨを含む。
【００３３】
「疎水性アミノ酸」とはα炭素に結合する疎水性側鎖を有する任意のアミノ酸を指し、限定するものではないがＩ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＷおよびＣを含み、最も好ましくはＩ、ＬおよびＶである。
【００３４】
「中性アミノ酸」とはＭ、Ｆ、Ｗ、ＣおよびＡのような荷電していないアミノ酸を指す。
【００３５】
本明細書で用いる「αＶβ３インテグリンシステインループドメイン」とはαＶβ３インテグリン受容体（特に哺乳動物受容体、例えば治療される被検対象において内因的に見出されるもの）の以前は受容体活性化を招く領域として同定されていなかった特異的領域を指し、そして具体的にはＲＧＤ結合ドメインを除外する。この領域で結合するアゴニストには一般に称されるヘパリン結合ドメインである配列の領域を含有するものが含まれる。一般的に、αＶβ３のシステインループドメインまたは領域はβ３サブユニット内のアミノ酸位置１７７から１８３の間で生じる。例えばＢ．Ｖｏｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｅｘｅｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ  ｖ  ｂｅｔａ  ５  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｂａｓｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＩＶ  Ｔａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２１：４６１−８（１９９３）参照。
【００３６】
本明細書で用いる「ＩＧＦ−Ｉ」とはインスリン様成長因子Ｉを意味する。
【００３７】
本明細書で用いる「治療する」とは、被検対象の症状（例えば１つ以上の病徴）の改善、疾患の発展の遅延、病徴の発症の遅延または病徴の発展の緩徐化等を含む、疾患を患うかまたは疾患を進行させる危険性のある被検対象に利益を付与する任意の型の治療または防御を指す。このように「治療」なる用語はまた病徴の発症を防御するための被検対象の予防的治療を含む。本明細書で用いる「治療」および「防御」とは、疾患を患う患者に患者の症状（例えば１つ以上の病徴）における改善、疾患の発展の遅延等を含む利益を付与する任意の型の治療に対して病徴の治癒または完全な廃絶を含意することを意図する必要はない。
【００３８】
本明細書で用いる「治療有効量」、「治療するのに有効な量」等は、がん、腫瘍、アテローム性動脈硬化症、網膜症、糖尿病性ニューロパシーまたはＩＧＦ−Ｉが細胞成長異常を誘起しているその他の望ましくない医学的症状に苦しむ患者に望ましい効果を生み出すのに十分な本発明のアンタゴニストの量を意味する。これには患者の症状（例えば１つ以上の病徴）における改善、疾患の発展の遅延等が含まれる
【００３９】
本明細書で用いる「薬学的に許容される」とは、疾患の重篤度および治療の必要性に鑑みて過度に有害な副作用がなく、化合物または組成物が本明細書に記載する治療を達成するために被検対象に投与するのに適当であることを意味する。
【００４０】
本明細書で用いる「抗体」または「（複数の）抗体」とは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含む全ての型の免疫グロブリンを指す。「免疫グロブリン」なる用語はＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4等のようなこれらの免疫グロブリンのサブタイプを含む。これらの免疫グロブリンのうちＩｇＭおよびＩｇＧが好ましく、そしてＩｇＧが特に好ましい。抗体は、（例えば）マウス、ラット、ウサギ、ウマまたはヒトを含む任意の種の起源でよいか、またはキメラもしくはヒト化抗体でよい。本明細書で用いる「抗体」なる用語は標的抗原に対する結合能力を保持している抗体フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2およびＦｖフラグメント、並びにＩｇＧ以外の抗体から得られる対応するフラグメントを含む。そのようなフラグメントはまた公知の技術により生成される。ある実施形態では公知の技術に従って検出可能な基または治療的な基に抗体を結合またはコンジュゲートさせることができる。
【００４１】
「治療的な基」とは、放射性核種、化学療法剤および細胞毒性薬剤を含む任意の治療的な基を意味するが、これに限定されない
【００４２】
本明細書で記載する「放射性核種」は放射線の治療的用量を腫瘍またはがん細胞に分配するのに適当な任意の放射性核種でよく、227Ａｃ、211Ａｔ、131Ｂａ、77Ｂｒ、109Ｃｄ、51Ｃｒ、67Ｃｕ、165Ｄｙ、155Ｅｕ、153Ｇｄ、198Ａｕ、166Ｈｏ、113mＩｎ、115mＩｎ、123Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、189Ｉｒ、191Ｉｒ、192Ｉｒ、194Ｉｒ、52Ｆｅ、55Ｆｅ、59Ｆｅ、177Ｌｕ、109Ｐｄ、32Ｐ、226Ｒａ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、153Ｓｍ、46Ｓｃ、47Ｓｃ、72Ｓｅ、75Ｓｅ、105Ａｇ、89Ｓｒ、35Ｓ、177Ｔａ、117ｍＳｎ、121Ｓｎ、166Ｙｂ、169Ｙｂ、90Ｙ、212Ｂｉ、119Ｓｂ、197Ｈｇ、97Ｒｕ、100Ｐｄ、101mＲｈおよび212Ｐｂを含むが、これらに限定されない。
【００４３】
本明細書で用いる「化学療法剤」には、メソトレキセート、ダウノマイシン、マイトマイシン、シスプラチン、ビンクリスチン、エピルビシン、フルオロウラシル、ベラパミル、シクロホスファミド、サイトシン、アラビノシド、アミノプテリン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、デモコルシン、エトポシド、ミトラマイシン、クロラムブシル、メルファラン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、タモキシフェン、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、カンプトテシン、アクチノマイシンＤ、およびシタラビンが含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
本明細書で用いる「細胞毒性薬剤」には、リシン（またはさらに具体的にはリシンＡ鎖）、アクラシノマイシン、ジフテリア毒素、モネンジン、ベルカリンＡ、アブリン、ビンカアルカロイド、トリコテセンスおよびシュードモナスエキソトキシンＡが含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
本明細書で用いる「検出可能な基」には、公知の技術に従って用いられるような放射性核種（例えば35Ｓ、125Ｉ、131Ｉ等）、酵素標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ等）、蛍光標識（例えばフルオレセイン、緑色蛍光タンパク質等）等のような任意の適切な検出可能な基が含まれる。
【００４６】
本明細書で用いる「モジュレーター」とは指示された結合部位に結合する（例えばβ３のシステインループに特異的に結合する）化合物を指し、そしてアゴニストまたはアンタゴニストであるか、または近接する部位に結合し、そしてそれによりβ３ドメインのシステインループでの結合に影響する（例えばアロステリック阻害剤）化合物を指す。
【００４７】
出願人は、具体的には、本明細書に引用した全ての米国特許参照はその全てを参照により本明細書に組み込まれることを意図する。
【００４８】
Ｂ．アゴニストおよびアンタゴニスト
本発明の実施にあたり活性薬剤として用いることができるアゴニストおよびアンタゴニストは、さらに以下で記載するような種々の異なる構造の形態でよい。一般的にアゴニストは、以前は受容体活性化を招く領域として同定されていなかったαＶβ３インテグリン受容体の特異的領域に結合する。この領域に結合することが決定されている全てのアゴニストは一般にヘパリン結合ドメインと称される配列の領域を含有する。このヘパリン結合ドメインは、今ではαＶβ３のこの領域に結合することが解っている５個のリガンドに存在する。これらがαＶβ３の特異的領域に結合するという文書は、以下の実施例１で論じられているように２つの型の実験により提供されている。
【００４９】
アゴニストの好ましい基の本質的なリガンド構造は、一般に８個のアミノ酸に含まれる。結合することが示されている５個のリガンドは結合組織成長因子、ヘパリン結合上皮細胞成長因子、ビトロネクチン、オステオポンチンおよびインスリン様結合タンパク質−５（ＩＧＦＢＰ−５）（配列番号１）である。これらのリガンドの各々は以下の配列を有している：ＢＢＸＸＡＢＢＢ（配列番号２）（Ｂ＝塩基性、Ａ＝芳香族性、Ｘ＝任意）。これらのペプチドの変異誘発を用いて、下線を付した、活性に絶対的に必要である残基を決定するための複数の実験を実施した。これらの３個の塩基性残基の代わりにアラニンで置換することにより、αＶβ３のこの領域に関するこれらの合成ペプチドの結合親和性が結果的に７０〜９０％の間に低下する。この構造を有する合成ペプチド（すなわちビトロネクチンの領域が以下の配列367ＫＫＱＲＦＲＨＲ374（配列番号３）を含有する）はβ３リン酸化の十分な刺激、下流シグナル伝達分子へのＳＨＰ−２移動、およびＩＧＦ−Ｉに応答したＩＧＦ−Ｉ受容体の活性化の増強を招くということも決定されている。この構造を有する合成ペプチドは十分な生物学的活性を有し、そしてＤＮＡ合成、細胞移動およびタンパク質合成に及ぼすＩＧＦ−Ｉの影響を増強することも示されている。ビトロネクチンの３７４位置での単一のアルギニンのアラニンへの変異誘発は、結合の７０％低下のみならず、上記の３つのパラメーターにより評価されるような生物学的活性における対応する低下をも招く。同様に最初の２個の塩基性残基のアラニン変異は生物学的活性の損失も招く。
【００５０】
アンタゴニストに関しては、最初の２個の残基を無傷で残し、すなわち双方とも塩基性にしておいた後、３７４位置の疎水性残基または３７４位置のリン酸化セリンを付加することは競合性アンタゴニストを招く：すなわちこれらのペプチドはαＶβ３に結合する能力を幾分保持するが、β３リン酸化および／またはＳＨＰ−２移動を活性化せず、そしてＩＧＦ−Ｉ刺激の受容体リン酸化または細胞分裂を増強しないことが決定されている。このβ３ドメインに結合することが解っているその他のリガンドからの配列を用いてアンタゴニストを調製することもできる。例えばＩＧＦＢＰ−５（配列番号１）のヘパリン結合ドメインを用いて、そしてリジン２０８がアラニンに置換されている場合、このペプチドはβ３に結合するが、ＩＧＦ−Ｉ作用を阻害する。これらのデータを以下の実施例２でさらに詳細に論じる。
【００５１】
アゴニストおよびアンタゴニスト活性薬剤のさらに特定の実施例を以下で示す。
【００５２】
アゴニスト。本発明を実施するのに用いることができるアゴニストには、式Ｉ：
【化１】
2007536265.tif 000002
（配列番号４）
（式中、
Ａ1は塩基性アミノ酸またはリン酸化セリンであり；
Ａ2は塩基性アミノ酸であり；
Ａ3は任意のアミノ酸であり；
Ａ4は任意のアミノ酸であり；
Ａ5は芳香族アミノ酸であり；
Ａ6は塩基性アミノ酸であり；
Ａ7は塩基性アミノ酸であり；
Ａ8は塩基性アミノ酸またはリン酸化セリンであり；
Ｘは０〜５個のアミノ酸（任意）の鎖であり、それに含まれるそのＮ末端のアミノ酸は任意選択によりＲ1およびＲ2に結合しており；
Ｙは０〜４個のアミノ酸の鎖であり、それに含まれるそのＣ末端のアミノ酸は任意選択によりＲ3およびＲ4に結合しており；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は存在するかまたは存在せず、そして各々別個にＨ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル（例えばメチル）、Ｃ６−Ｃ１８アリール（例えばフェニル、ナフタレンアセチル）、Ｃ１−Ｃ１２アシル（例えばホルミル、アセチルおよびミリストイル）、Ｃ７−Ｃ１８アラルキル（例えばベンジル）およびＣ７−Ｃ１８アルカリール（例えばｐ−メチルフェニル）からなる群から選択される）
の化合物またはその薬学的に許容される塩が含まれるが、これに限定されない
【００５３】
アンタゴニスト。本発明を実施するのに用いることができるアンタゴニストには、式ＩＩ：
【化２】
2007536265.tif 000003
（配列番号５）
（式中、
Ａ11は塩基性アミノ酸であり；
Ａ12は塩基性アミノ酸であり；
Ａ13は任意のアミノ酸であり；
Ａ14は任意のアミノ酸であり；
Ａ15は芳香族アミノ酸であり；
Ａ16は塩基性アミノ酸であり；
Ａ17は塩基性アミノ酸であり；
Ａ18は非荷電すなわち中性アミノ酸または疎水性アミノ酸であり；
Ｘ’は０〜５個のアミノ酸（任意）の鎖であり、それに含まれるそのＮ末端のアミノ酸は任意選択によりＲ11およびＲ12に結合しており；
Ｙ’は０〜４個のアミノ酸の鎖であり、それに含まれるそのＣ末端のアミノ酸はホスホセリンでよいかまたは任意選択によりＲ13およびＲ14に結合しており；
Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14は存在するかまたは不在であり、そして各々別個にＨ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル（例えばメチル）、Ｃ６−Ｃ１８アリール（例えばフェニル、ナフタレンアセチル）、Ｃ１−Ｃ１２アシル（例えばホルミル、アセチルおよびミリストイル）、Ｃ７−Ｃ１８アラルキル（例えばベンジル）およびＣ７−Ｃ１８アルカリール（例えばｐ−メチルフェニル）からなる群から選択される）
の化合物またはその薬学的に許容される塩が含まれるが、これに限定されない。
【００５４】
本明細書の式ＩおよびＩＩではＸ、Ｙ、Ｚ、Ａ1、Ａ2、Ａ12等の記号はアミノ酸残基、すなわちＮ末端にある場合、＝ＮＨ−ＣＨ（Ｒ）−ＣＯ−、またはＣ末端にある場合、−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ）−ＣＯ−Ｎ＝、またはＮもしくはＣ末端にない場合、−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ）−ＣＯ−を表し、ここでＲはアミノ酸またはその残基の側鎖（または識別基）を示す。またアミノ酸残基が任意選択により活性である場合、Ｄ型が明示されていなければ意図されるのはＬ型立体配置である。
【００５５】
前記の式Ｉおよび式ＩＩの化合物のような本発明のペプチドアゴニストまたはアンタゴニストは好ましくは８個のアミノ酸から１１、１４または２０個のアミノ酸の長さであり、そして６００、８００または９００から約１２００または２０００までの分子量を有し得る。
【００５６】
ペプチドの作成。本発明のペプチドを当分野で公知の技術に従って作成することができる。化学合成の認められている技術を用いて、Ｎ末端またはさらに典型的にはＣ末端のいずれかから、単一のアミノ酸または２つ以上アミノ酸残基を含有する予め形成されたペプチドのいずれかを用いてペプチドを構築することができる。ペプチドを合成するための特定の技術には、（ａ）各アミノ酸または予め形成されたペプチドの添加の前にサイズが徐々に増えていくペプチドが単離される古典的な方法、および（ｂ）ペプチドがメリーフィールド樹脂のような樹脂に付着して構築される固相ペプチド合成が含まれる。これらの合成手順では、アミノ酸の基は一般的にｔ−ブトキシカルボニルのような標準的な保護基を用いて保護された形態である。必要により、一度合成が完了するとこれらの保護基を切断する。ペプチドの合成の間または後にその他の修飾を導入することができる。本発明のペプチドをまた当分野で公知の組換えＤＮＡ手順により生成することもできる。
【００５７】
擬ペプチド結合。さらに別の態様では、本発明はその中のアミノ酸残基間に少なくとも１つの擬ペプチド結合を有する式Ｉまたは式ＩＩの類似体を特徴とする。「擬ペプチド結合」とは２個の残基間の結合に参加する炭素原子がカルボニル炭素からメチレン炭素、すなわちＣＨ2−ＮＨに還元されていること；またはあまり好ましくはないが、ＣＯ−ＮＨがＣＨ2−Ｓ、ＣＨ2−ＣＨ2、ＣＨ2−ＯもしくはＣＨ2−ＣＯのいずれかで置き換えられていることを意味する。好ましくは擬ペプチド結合は１個以上のアミノ酸残基間に在る。加えてそのような擬ペプチド結合類似体を用いて前記のような二量体類似体を形成することができる。擬ペプチド結合の化学についての詳細な議論はＣｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４４：８３５−８４１（１９８８）で示されている。
【００５８】
類似体。活性薬剤は本明細書で記載する式Ｉおよび式ＩＩの化合物の類似体を含む。「類似体」は構造において第１の化合物に類似する化学的化合物であり、そして第１の化合物と類似するかまたは逆のいずれかの生理学的作用を有している。特に本発明に関して、類似体は対応するタンパク質またはペプチドのアミノ酸配列を有していないが、本明細書に記載する活性化合物に実質的に類似の様式でアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができるこれらの化合物である。そのような類似体はペプチドまたは非ペプチド類似体であってよい。
【００５９】
受容体（具体的にはαＶβ３システインループドメイン）と相互作用するタンパク質またはペプチド分子では、タンパク質またはペプチドおよび受容体との間の相互作用は一般的に適当な三次元分子の表面に接触可能な部位で生じる。適切なコンフォメーションで重要な結合部位残基を整列させることにより、本明細書に記載するペプチドの本質的な表面特徴を疑似するペプチド類似体を公知の技術に従って作成および合成することができる。ペプチド三次元構造およびそれに対する類似体を決定するための方法は公知であり、そしてしばしば「ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｓｉｇｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」と称される。例えばＧｅｙｓｅｎに対する米国特許第４，８３３，０９２号；Ｎｅｓｔｏｒに対する米国特許第４，８５９，７６５号；Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏに対する米国特許第４，８５３，８７１号；Ｂｌａｌｏｃｋに対する米国特許第４，８６３，８５７号参照（出願者は具体的に本明細書に引用した全ての米国特許参照の開示がその全てを参照により本明細書に組み込まれることを意図する）。Ｗａｌｄｒｏｐ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７，２８０２９（１９９０）；Ｒｏｓｓｍａｎｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３３３、３９２（１９８８）；Ｗｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３３，４２６（１９８８）；Ｊａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０，１９３７（１９９３）（テトラペプチドリガンドの構造および機能に基づいてベンゾジアゼピンペプチド疑似化合物の開発）もまた参照。
【００６０】
本発明のアゴニストまたはアンタゴニストの非ペプチド疑似物質は、また本発明の態様である。コンピューターグラフィックモデリングを用いるような公知の技術に従って非タンパク質疑似物質を作成して、本明細書に記載する活性薬剤に類似した様式で結合を作動または拮抗することができる非ペプチド有機分子を設計することができる。例えばＫｎｉｇｈｔ，ＢＩＯ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８，１０５（１９９０）；Ｉｔｚｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３，４１８（１９９３）（インフルエンザウイルス酵素のペプチド疑似阻害剤、シアリダーゼ）参照。Ｉｔｚｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３，４１８（１９９３）はＸ線結晶学研究のデータを用いてシアリダーゼ受容体タンパク質の結晶構造をモデル化し、そしてモデルの活性部位に付着する阻害剤を開発し；モデリングのための核磁気共鳴（ＮＭＲ）データの使用もまた当分野で公知であり、そして本発明を実施するのにそのような技術を利用することができる。またＨＩＶプロテアーゼ阻害剤として機能する生物的に利用できる非ペプチド環状尿素の理論的設計に関するＬａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３，３８０（１９９４）をも参照。Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，は非ペプチド阻害剤を設計するためにＨＩＶプロテアーゼ阻害剤複合体のＸ線結晶構造研究の情報を使用した。
【００６１】
親水性基。本発明の活性薬剤は、公知の技術に従ってその分配を促進するかまたは安定性を改善するためにそこに結合した、特にそこに共有結合した親水性基を含み得る（例えばペプチドのＮ末端に）。適当な親水性基は典型的には、直鎖および分岐鎖ポリオールを含むポリオールまたはポリアルキレンオキシド基であり、特に、限定するものではないがポリ（プロピレングリコール）、ポリエチレン−ポリプロピレングリコールまたはポリ（エチレングリコール）を含む実施例がある。親水性基は２０，０００から４０，０００または６０，０００の数平均分子量を有し得る。適当な親水性基およびその結合の様式は公知であり、そして例えば米国特許第４，１７９，３３７号；第５，６８１，８１１号、第６，５２４，５７０号、第６，６５６，９０６号、第６，７１６，８１１号および第６，７２０，３０６号に記載されている。例えばペプチドアゴニストまたはアンタゴニストを単一分子量４０，０００のポリエチレングリコール部分を用いてペグ化する、すなわちペプチドに付着させることができる。
【００６２】
医薬用塩。上記の本明細書に開示する活性化合物をその薬学的に許容される塩の形態で調製および投与することができる。薬学的に許容される塩は親化合物の望ましい生物学的活性を保持する塩であり、そして過剰な毒性学的影響を付与しない。そのような塩の実施例は（ａ）無機酸例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸等で形成された酸付加塩；および例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸等のような有機酸で形成された塩；（ｂ）塩素、臭素およびヨウ素のような陰イオン性元素から形成された塩、ならびに（ｃ）アンモニウム塩のような塩基から誘導された塩、ナトリウムおよびカリウムの塩のようなアルカリ金属塩、カルシウムおよびマグネシウムの塩のようなアルカリ土類金属塩、およびジシクロヘキシルアミンおよびＮ−メチル−Ｄ−グルカミンのような有機塩基との塩である。
【００６３】
Ｃ．処方および投与
以下に記載する使用方法における投与のために、一般的に活性薬剤を投与の前に無毒の薬学的に許容される担体物質（例えば通常の食塩水またはリン酸塩緩衝食塩水）と混合し、そして任意の医学的に認められた手順、例えば静脈内または動脈内注射によるような非経口投与（例えば注射）を用いて投与する。
【００６４】
前記した活性薬剤を公知の技術に従って薬学的に許容される担体で投与用に処方することができる。例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（９ｔｈ  Ｅｄ．１９９５）参照。本発明による医薬処方の製造において、典型的には活性化合物（その生理学的に許容される塩を含む）をとりわけ許容される担体と混合する。もちろん担体は処方中の任意のその他の成分と適合するという意味で許容されなければならず、そして患者に有害であってはならない。担体は液体でよく、そして好ましくは、活性化合物の重量で０．０１または０．５％から９５％または９９％を含有し得る単位用量処方として化合物と処方する。
【００６５】
非経口投与に適当な本発明の処方は活性化合物の無菌水性および非水性注射用溶液を含み、その調製物は好ましくは意図される受体の血液と等張である。これらの調製物は抗酸化剤、バッファー、静菌剤および処方を意図される受体の血液と等張にする溶質を含有し得る。
【００６６】
活性薬剤を任意の医学的に適切な手段、例えば通常の静脈内または動脈内投与により投与することができる。アテローム性動脈硬化血管への直接投与が望ましい場合もある。
【００６７】
活性薬剤を滅菌した無菌容器中に凍結乾燥形態で提供することができるか、または滅菌パイロジェン不含水もしくは滅菌パイロジェン不含生理食塩水溶液のような薬学的に許容される担体と組み合わせて医薬処方で提供することができる。
【００６８】
以下に記載する使用方法のための活性薬剤の用量は、とりわけ被検対象の症状、治療されるがんの特定の種類または型、投与経路、用いる治療薬の特性、および特定の治療薬に対する腫瘍の感受性に依存する。例えば用量は典型的には被検対象の体重ｋｇあたり約１から１０μｇである。罹患した集団内のいくらかの個体でいくらかの有利な効果を招くのに有効である限り、抗体の具体的な用量は重大ではない。一般的に用量は被検対象の体重ｋｇあたり約０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２０もしくは５０μｇほどの低量、またはさらに低量、および被検対象の体重ｋｇあたり約５、１０、２０、５０、７５もしくは１００μｇほどの高量またはなおさらに高量でよい。
【００６９】
Ｄ．使用方法：アゴニスト
本発明のアゴニスト活性薬剤を種々の異なる疾患に利用することができる。１つの好ましい標的疾患状態は正常量の成長ホルモンを分泌する小人症の子供である。彼らは診断試験時には成長ホルモン欠乏であることを判明できないが身長の低い子供である。彼らが相対的に成長ホルモンおよびＩＧＦ−Ｉの作用に抵抗することを示すかなりの証拠がある。したがってＩＧＦ−Ｉ作用を増強する因子はこれらの子供の成長を増強し、そしてそのＩＧＦ−Ｉ分泌は損なわれていないので、成長を最適化するためにその他の治療を必要としないはずである。
【００７０】
もう１つの適用は網膜脈管形成欠損を患う被検対象用である。早産児は重篤な栄養失調であり、そして特に網膜の後部で十分なＩＧＦ−Ｉを合成しない。これは網膜の脈管形成の遅延および奇形を招き、これは失明または極度な視力低下を招き得る。ＩＧＦ−Ｉ作用を必要とする臨界期が２６週〜２９週の間にある。ＩＧＦ−Ｉ作用欠損の原因ははっきりとは確立されていないが、網膜血管内皮細胞でのＩＧＦ−Ｉ作用を増強する因子は、これらの細胞がαＶβ３受容体を有しているので治療上の利点を提供するはずである。
【００７１】
もう１つの適用は、虚血性傷害後の側副血管の発達を促すためである。跛行を伴う末梢血管疾患および心筋梗塞の双方は、治癒期間中の側副血管の発達が伴う。側副を形成する能力はこれらの虚血性侵襲から回復する能力を大きく決定する。側副化を増強するために血管内皮成長因子のようないくつかの因子が示されているが、患者において臨床的に有効であると判明しているものはない。この化合物の使用の可能性は側副血管の発達の過程の間の平滑筋および内皮細胞を刺激するためである。
【００７２】
もう１つの適用は神経萎縮および神経成長の不全の治療または阻害を伴う。これは具体的には変性認知症および糖尿病性ニューロパシーに適用される。
【００７３】
さらにもう１つの適用は高齢者の股関節骨折を治療するためである。高濃度のＩＧＦ−Ｉの注入により、高齢者の股関節骨折の治癒が加速することが示されている。この薬剤の利用性により、十分なＩＧＦ−Ｉの存在下で骨芽細胞活性を増強する可能性があるペプチドで骨折部位にそれを直接注射することが可能になる。ＩＧＦ−Ｉを伴ってまたは伴わずにアゴニストを投与して股関節骨折の治癒を改善することができる。
【００７４】
もう１つの適用は糖尿病性虚血性潰瘍を治療するためである。糖尿病動物モデルでは、その結合タンパク質の１つと共にＩＧＦ−Ｉを創傷に添加することが創傷治癒の改善を招くことが示されている。糖尿病ではＩＧＦ−Ｉ濃度が低いので、創傷にＩＧＦ−Ｉと共にこのアゴニストを添加すると結果的に糖尿病性潰瘍の存在下での創傷治癒をより良好にする可能性がある。糖尿病性ニューロパシーでは、ニューロンが急速にアポトーシスを被り、そして十分なＩＧＦ−Ｉが存在しなければ、軸索伸長が乏しいことが示されている。αＶβ３受容体はニューロンを支援するグリア細胞に存在するので、このアゴニストがニューロン伸長および軸索突起の発達および糖尿病性ニューロパシーにおける連結を増強し得ることが可能である。ＡＬＳおよび種々の認知症のような神経変成性疾患では、ＩＧＦ−Ｉがニューロンアポトーシスを阻害することが示されており、したがってこの薬剤での治療はこれらの神経変成性症状を防御するのにいくらか有用であり得る。
【００７５】
Ｅ．使用方法：アンタゴニスト
ＩＧＦ−Ｉ作用の拮抗が損傷形成および初期アテローム性動脈硬化性病変の発達を遮断することが示されている。αＶβ３のこの結合部位を遮断するアンタゴニストの投与はビトロネクチン、オステオポンチンおよびフィブリノーゲンのようなアテローム性動脈硬化性病変に豊富であるマトリックスタンパク質の効果を拮抗する。ヘパリン結合上皮細胞成長因子および結合組織成長因子がアテローム性動脈硬化性病変発達において活性である程度までアンタゴニストはまたその効果を阻害するように作用する。
【００７６】
アンタゴニストのもう１つの用途は炎症性大腸疾患を治療することである。腸平滑筋細胞はαＶβ３受容体を発現し、そしてこれらの疾患におけるその増殖は腸狭窄に至る。したがってアンタゴニストでのその成長の阻害はこの合併症の防御に至り得る。
【００７７】
本発明のアンタゴニストのもう１つの用途は骨粗鬆症の治療においてである。骨芽細胞はαＶβ３を発現しないが、骨再吸収を刺激する破骨細胞で発現される。したがって、アンタゴニストの使用による破骨細胞におけるリガンド占有の刺激の阻害は、骨形成の増強を招くはずである。オステオポンチンのようないくつかのタンパク質は骨細胞外マトリックスにおいて豊富であり、そしてこのメカニズムにより破骨細胞を刺激することができ、したがってその作用の拮抗によりＩＧＦ−Ｉ骨再吸収を増加させないで骨形成を増加させることが可能になり得る。
【００７８】
アンタゴニストのもう１つの用途は血管新生異常の状態を治療することである。血管新生は腫瘍発達において重要であるが、糖尿病性網膜症のような別の病態生理学的過程においても同様に重要である。内皮細胞は豊富なαＶβ３受容体を発現するので、血管内皮細胞成長因子のような内皮細胞成長因子またはこのヘパリン結合ドメインを介するαＶβ３へのヘパリン結合上皮細胞成長因子の結合を阻害するアンタゴニストは血管新生の阻害に至ると予測され、したがってこのアンタゴニストはこれらの臨床症状において有用な薬物である。
【００７９】
アンタゴニストのもう１つの用途はがんまたは腫瘍、特にαＶβ３受容体を有するもの（例えばウィルムス腫瘍、腎芽細胞種、神経芽細胞種）を治療することである。αＶβ３は全ての腫瘍細胞において豊富な受容体ではないが、αＶβ３を発現するいくつかの腫瘍細胞型が記載されている。今日までの研究法は一般的にαＶβ３を刺激するリガンドにおけるＲＧＤ配列を標的としており、そしてこのドメインに結合しているアンタゴニストを用いてαＶβ３作用を阻害する。αＶβ３のシステインループを拮抗する我々の研究法はＲＧＤ結合部位とは対照的にこの受容体を標的とする独特な研究法を提供し、そしてしたがってこれらの腫瘍の発達を阻害する大きな効果を有し得る。
【００８０】
がんまたは腫瘍の治療において、本発明の活性薬剤を任意選択により、本明細書に記載する障害または症状の治療に有用な化学療法性もしくは抗腫瘍性化合物または放射線治療のようなその他の異なる細胞毒性薬剤（例えば化学療法性または抗腫瘍性化合物）と組み合わせて投与することができる。その他の化合物を同時に投与することができる。本明細書で用いる「同時に」なる言語は、組み合わせ効果を生み出すのに十分に近い時間を意味する（すなわち同時には一斉にでよいか、または互いに前もしくは後で生じる２回以上の投与でよい）。本明細書で用いる「放射線治療」なる語句は限定するものではないが、ビームのような外的に適用される供給源から、または小型の放射活性供給源の移植によるかのいずれかから分配されるＸ線またはγ線を含む。本明細書に記載する活性薬剤と同時に投与することができるその他の適当な化学療法剤の実施例には、限定するものではないがアルカリ化剤（限定するものではないがナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソウレアおよびトリアゼンを含む）；ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド（サイトキサンＲＴＭ）、イフォスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジンおよびテモゾロミド；代謝拮抗剤（限定するものではないが葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類似体、プリン類似体、およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤を含む）；メソトレキセート、５−フルオロウラシル、フロキシウリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、ペントスタチンおよびゲムシタビン；天然生成物およびその誘導体（例えばビンカアルカロイド、抗腫瘍性抗生物質、酵素、リンホカインおよびエピポドフィロトキシン）；ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、Ａｒａ−Ｃ、パクリタキセル（パクリタキセルはＴａｘｏｌ（登録商標）として市販により入手可能である）、ミトラマイシン、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン−Ｃ、Ｌ−アルパラギナーゼ、インターフェロン（特にＩＦＮ−ａ）、エトポシドおよびテニポシドが挙げられ；その他の抗増殖性細胞毒性薬剤はナベルベン、ＣＰＴ−１１、アナストラゾール、レトラゾール、カペシタビン、レロキサフィン、シクロホスファミド、イフォサミド、およびドロロキサフィンである。さらなる抗増殖性細胞毒性薬剤には、限定するものではないがメルファラン、ヘキサメチルメラミン、チオテパ、シタラビン、イダトレキセート、トリメトレキセート、ダカルバジン、Ｌ−アスパラギナーゼ、カンプトテシン、トポテカン、ビカルタミド、フルタミド、ロイプロリド、ピリドベンゾインドール誘導体、インターフェロンおよびインターロイキンが含まれる。好ましいクラスの抗増殖性細胞毒性薬剤はＥＧＦＲ阻害剤、Ｈｅｒ−２阻害剤、ＣＤＫ阻害剤およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）である。（例えば米国特許第６，５３７，９８���号；米国特許第６４２０３７７号参照）。そのような化合物を現在その投与のために公知である技術に従って与えることができる。
【００８１】
Ｆ．抗体
抗体およびその生成は公知である。例えば米国特許第６，８４９，７１９号参照；また米国特許第６，８３８，２８２号；第６，８３５，８１７号；第６，８２４，９８９号参照。
【００８２】
本発明の抗体は、すなわち共有結合が抗体のその結合部位への特異的結合を妨げないように、任意の型の分子を抗体に共有結合させることにより、修飾された抗体を含む。例えば本発明の抗体を例えばグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化によるか、またはその他の保護／遮断基、タンパク質溶解性切断、細胞性リガンドもしくはその他のタンパク質への連結等で修飾することができる。限定するものではないが特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等を含む公知の技術により、多くの化学的修飾のいずれかを実施することができる。加えて、抗体は１つ以上の非古典的アミノ酸を含有し得る。
【００８３】
当分野で公知の任意の適当な方法により本発明のポリクローナル抗体を作成することができる。例えば抗原に特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の生成を誘起するために適当な抗原を、限定するものではないがウサギ、マウス、ラット等を含む種々の宿主動物に投与することができる。種々のアジュバントを用いて宿主の種に依存して免疫学的応答を高めることができ、そして限定するものではないがフロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのような無機ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールおよびＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルバムのような有用な可能性のあるヒトアジュバントが含まれる。
【００８４】
ハイブリドーマ、組換えおよびファージディスプレイ技術、またはその組み合わせの使用を含む広範な種類の技術を用いてモノクローナル抗体を調製することができる。例えばＨａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮＹ．，１９８１）で教示されるものを含むハイブリドーマ技術を用いて例えばモノクローナル抗体を生成することができる。本明細書で用いる「モノクローナル抗体」なる用語はハイブリドーマ技術により生成された抗体に限定されるものではない。「モノクローナル抗体」なる用語は任意の真核細胞性、原核細胞性またはファージクローンを含む単一のクローンから誘導される抗体を指すが、モノクローナル抗体が生成される方法を指すものではない。
【００８５】
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を生成およびスクリーニングするための方法は日常的であり、そして公知である。簡単には、マウスを抗原またはそのような抗原を発現する細胞により免疫する。一度免疫応答が検出される、例えば抗原に特異的な抗体がマウス血清中で検出されると、マウス脾臓を回収し、そして脾細胞を単離する。次いで公知の技術により脾細胞を任意の適当な骨髄腫細胞、例えばＡＴＣＣから入手可能な細胞系ＳＰ２０の細胞に融合させる。ハイブリドーマを選択し、そして限界希釈によりクローン化する。次いで当分野で公知の方法によりハイブリドーマクローンを本発明のポリペプチドに結合することができる抗体を分泌する細胞に関してアッセイする。陽性ハイブリドーマクローンでマウスを免疫することにより、一般的に高レベルの抗体を含有する腹水を作成することができる。
【００８６】
したがって、本発明は本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することを含む方法により生成されたモノクローナル抗体および抗体を作成する方法であって、好ましくは本発明の抗原で免疫したマウスから単離した脾細胞を骨髄腫細胞と融合させ、そして次に融合の結果得られたハイブリドーマを、本発明のポリペプチドに結合することができる抗体を分泌するハイブリドーマクローンに関してスクリーニングすることによりハイブリドーマを作成する方法を提供する。
【００８７】
公知の技術により特異的エピトープを認識する抗体フラグメントを作成することができる。例えばパパイン（Ｆａｂフラグメントを生成するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを生成するため）のような酵素を用いて免疫グロブリン分子のタンパク質溶解性切断により本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成することができる。Ｆ（ａｂ’）2フラグメントは可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨＩドメインを含有する。
【００８８】
例えば、当分野で公知の種々のファージディスプレイ方法を用いて抗体を作成することもできる。ファージディスプレイ方法では、機能的抗体ドメインはそれらをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面上に提示される。特にそのようなファージを利用して、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えばヒトまたはネズミ）から発現される抗原結合ドメインを提示させることができる。例えば標識抗原または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉させた抗原を用いて、目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージを抗原で選択または同定することができる。これらの方法で用いるファージは典型的には、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換えにより融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む線状ファージである。本発明の抗体を作るために用いることができるファージディスプレイ方法の実施例には、限定するものではないが米国特許第５，６９８，４２６号；第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；第５，５８０，７１７号；第５，４２７，９０８号；第５，７５０，７５３号；第５，８２１，０４７号；第５，５７１，６９８号；第５，４２７，９０８号；第５，５１６，６３７号；第５，７８０，２２５号；第５，６５８，７２７号；第５，７３３，７４３号および第５，９６９，１０８号に開示されるものが挙げられる。
【００８９】
前記の参照文献で記載されるように、ファージ選択の後、ファージの抗体コード領域を単離し、そしてヒト抗体を含む全抗体または任意のその他の望ましい抗原結合フラグメントを作成し、そして以下に詳細に記載するような哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む任意の所望の宿主において発現させることができる。例えば当分野で公知の方法を用いて、組換えによりＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成するための技術を用いることもできる。
【００９０】
１本鎖Ｆｖｓおよび抗体を生成するために用いることができる技術の実施例には米国特許第４９４６７７８号および第５２５８４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；ならびにＳｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載されるものが挙げられる。
【００９１】
ヒトにおける抗体のインビボ使用およびインビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ、ヒト化またはヒト抗体を用いるのが好ましいかもしれない。キメラ抗体は、ネズミモノクローナル抗体から誘導される可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体のような抗体の異なる部分が異なる動物種から誘導される分子である。キメラ抗体を生成するための方法は当分野で公知である。例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２（１９８９）；米国特許第５，８０７，７１５号；第４，８１６，５６７号；および第４，８１６，３９７号（これらはその全てを参照により本明細書に組み込まれる）参照。ヒト化抗体は、非ヒトの種からの１つ以上の相補的決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する、所望の抗原に結合する非ヒトの種の抗体からの抗体分子である。しばしばヒトフレームワーク領域のフレームワーク残基をＣＤＲドナー抗体からの対応する残基で置換して、抗原結合を変化、好ましくは改善する。当分野で周知方法により、例えばＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用をモデリングして抗原結合および配列比較に重要なフレームワーク残基を同定して特定の位置で異常なフレームワーク残基を同定することによりこれらのフレームワーク置換を同定する。（例えばＱｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）（これらはその全てを参照により本明細書に組み込まれる）参照。）例えばＣＤＲ移植（例えば米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；および第５，５８５，０８９号参照）、化粧張り（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）または回復（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（例えば欧州特許第５９２，１０６号；欧州特許第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３（１９９４）参照）およびチェーンシャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む当分野で公知の種々の技術を用いて抗体をヒト化することができる。
【００９２】
完全ヒト抗体がヒト患者の治療的治療、診断および／または検出に望ましい。ヒト免疫グロブリン配列から誘導される抗体ライブラリーを用いる前記したファージディスプレイ方法を含む当分野で公知の種々の方法によりヒト抗体を作ることができる。例えば米国特許第４，４４４，８８７号および第４，７１６，１１１号参照。
【００９３】
機能的内因性免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いてヒト抗体を生成することもできる。例えばヒト重および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を無作為にまたは相同的組換えによりマウス胚幹細胞に導入することができる。これに代えて、ヒト重および軽鎖遺伝子に加えてヒト可変領域、定常領域および多様性領域をマウス胚幹細胞に導入することができる。ヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と別個にまたは同時に相同的組換えによりマウス重および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を非機能性にすることができる。特にＪＨ領域のホモ接合型欠失は内因性抗体生成を防御する。修飾された胚幹細胞を広げ、そして胚盤胞へのマイクロインジェクションによりキメラマウスを生成する。次いでキメラマウスを繁殖させてヒト抗体を発現するホモ接合型の子孫を生み出す。通常の様式でトランスジェニックマウスを選択された抗原、例えば本発明のポリペプチド全体または一部で免疫する。従来のハイブリドーマ技術を用いて抗原に対して指向するモノクローナル抗体を免疫したトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスに抱かれるヒト免疫グロブリン導入遺伝子はＢ細胞分化の間に再編され、そして続いてクラススイッチングおよび体細胞変異を被る。したがって、そのような技術を用いて治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を生成することが可能である。ヒト抗体を生成するためのこの技術の概説に関しては、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５））参照。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのこの技術およびそのような抗体を生成するためのプロトコールの詳細な議論に関しては例えば米国特許第５，４１３，９２３号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，５６９，８２５号；第５，６６１，０１６号；第５，５４５，８０６号；第５，８１４，３１８号；および第５，９３９，５９８号参照。
【００９４】
「ガイド付き選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と称される技術を用いて選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体を作成することができる。この研究法では選択された非ヒトのモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を用いて同一エピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を手引きする（Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３（１９８８））。
【００９５】
さらに今度は当業者に周知の技術を用いて本発明のポリペプチドに対する抗体を利用して本発明のポリペプチドを「擬似する（ｍｉｍｉｃ）」抗イディオタイプ抗体を作成することができる。（例えばＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７（５）：４３７−４４４；（１９８９）およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）参照）。例えば結合し、そしてポリペプチド多量体化および／または本発明のポリペプチドのリガンドへの結合を競合的に阻害する抗体を用いて、ポリペプチド多量体化および／または結合ドメインを「擬似し」、結果的にポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合しそして中和する抗イディオタイプ抗体を作成することができる。そのような中和抗イディオタイプまたはそのような抗イディオタイプのＦａｂフラグメントを治療計画で用いてポリペプチドリガンドを中和することができる。例えばそのような抗イディオタイプ抗体を用いて本発明のポリペプチドに結合し、および／またはそのリガンド／受容体に結合し、そしてそれによりその生物学的活性を遮断することができる。
【００９６】
本発明はさらに前記したような本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。当分野で公知の任意の方法によりポリヌクレオチドを得ることができ、そしてポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。例えば抗体のヌクレオチド配列が公知である場合、抗体をコードするポリヌクレオチドを化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから組み立てることができ（例えばＫｕｔｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２（１９９４）に記載されるように）、これは簡単には抗体をコードする配列の一部を含有する重複オリゴヌクレオチドを合成し、これらのオリゴヌクレオチドをアニーリングおよびライゲートし、そして次にライゲートされたオリゴヌクレオチドをＰＣＲにより増幅することを伴う。これに代えて、抗体をコードするポリヌクレオチドを適当な供給源からの核酸から作成することができる。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンを入手できないが、抗体分子の配列は公知である場合、配列の３’および５’末端にハイブリダイズすることができる合成プライマーを用いるＰＣＲ増幅により、または例えば抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定するための、特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いてクローニングすることにより、適当な供給源（例えば抗体ｃＤＮＡライブラリーもしくはそこから作成されるｃＤＮＡライブラリー、またはそこから単離される核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ、本発明の抗体を発現するために選択されたハイブリドーマ細胞のような抗体を発現する任意の組織もしくは細胞）から免疫グロブリンをコードする核酸を得ることができる。次いで当分野で周知の任意の方法を用いてＰＣＲにより作成された増幅された核酸を複製可能なクローニングベクターにクローン化することができる。
【００９７】
Ｇ．インプラント
本明細書に記載した方法を実施するために、または狭窄および再狭窄のような移植片に随伴される問題を打破するために公知の技術に従って、本発明の活性化合物、特に前記したような抗体またはペプチドのようなアンタゴニストをインプラントまたは移植可能な医学的装置に結合またはコンジュゲートさせることができる。例えば米国特許第６，７８６，９２２号；第６，７４６，６８６号；第６，７１８，２０８号；第６，６１７，１４２号；第６，３５２，８３２号；第６，２３８，８７２号参照。限定するものではないがステント（例えば血管ステント）、電極、カテーテル、リード、移植可能なペースメーカーまたは心臓除細動器筺体、関節、スクリュー、ロッド、眼科用インプラント（限定するものではないが眼内レンズインプラント、緑内障インプラントまたは排液用インプラント、および涙点インプラントまたはプラグを含む）等を含む任意のインプラントをそのように利用することができる。インプラントは限定するものではないが有機ポリマー（安定または不活性ポリマーおよび生分解性ポリマーを含む）、ステンレススチールおよびチタンのような金属、シリコンのような無機材料ならびにその複合材料を含む任意の適当な材料のものでよい。
【００９８】
Ｈ．スクリーニングアッセイ
Ｌ．Ｔｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，の「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｘｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  Ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ，ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」と題されたＰＣＴ出願ＷＯ２００４／０６３７１５に記載されるような公知の技術に従って方法、保存媒体、データ構造等を、そのような方法により同定された化合物およびそれの使用方法と一緒に、使用することができる。
【００９９】
有利なことに、そのシステインループドメインを含むβ３インテグリンの結晶構造は公知であるが、本明細書に記載される目的に関しては知られていない。
【０１００】
Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４：５６５（２００５）はビトロネクチンの三次元構造を決定するために小角光散乱を、および初期の文献ではＮＭＲを利用している。それらのモデルでは、ヘパリン結合ドメインは暴露された表面であり、そしてＲＧＤ結合ドメインおよびプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤１結合ドメインとは明確に区別される。ヘパリン結合ドメインは不可解ではないが、重合ビトロネクチンは、このドメインがさらに良好に暴露されるために、より貪欲にヘパリンに結合する可能性があると解説されている。ビトロネクチンの多量体形態はアテローム性動脈硬化症のような疾患状態で、および細胞外マトリックスに随伴されるビトロネクチンで生じるので、これは病態生理学的意義を有し得る。同様に、ＲＧＤリガンドと複合化している、および複合化していないαＶβ３二量体の細胞外部部の結晶構造が報告されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：３３９（２００１）およびＳｃｉｅｎｃｅ  ２９６：１５１（２００２））。これらの２つの文献は以後システインループと称されるシステイン１７７とシステイン１８４の残基の間のシステインループ構造の分子座標を報告している。この構造がマッピングされ、そして三次元構造が最初の原稿の図６で説明されている。文献ではこの結合部位がＲＧＤ配列結合部位と区別されることが明白に説明されている。それはリガンド特異性領域として記載されているが、この出版物ではその機能的特性のさらなる記載は為されていない。結晶構造からその表面が暴露されていることは明白である。同様にタンパク質の能動的確認の結果、この結合ドメインはさらに表面暴露されている。分子座標が記載され、そしてＧＩ拡張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）番号は２３２００４３４０  ２０６６４２７９および１６９７５２５４である。同様に結晶構造の拡張番号はＩＬ５ＧＡＺ−Ａ５およびＢ０、Ｂ６、７、８、９、１０ならびにＣ０である。
【０１０１】
αＶβ３インテグリンの下線を付したおよびＲＧＤリガンド構造に関するタンパク質データバンク（ＰＤＢ）アクセッション番号は１ＪＶ２および１Ｌ５Ｇであり、その開示はその教示に関してその全てを参照により本明細書に組み込まれる。以下に示す表１および２は各々β３インテグリンの下線を付したおよびＲＧＤリガンド構造のシステイン１７７とシステイン１８４の間のアミノ酸残基に関する分子座標を提供する。
【０１０２】
【表１Ａ】
2007536265.tif 000004
【表１Ｂ】
2007536265.tif 000005
【０１０３】
【表２Ａ】
2007536265.tif 000006
【表２Ｂ】
2007536265.tif 000007
一般的に当業者に公知の任意の方法を用いてＸ線回折データを処理することができる。加えて本発明によるβ３インテグリンの原子構造を決定するために、多重同形置換（ＭＩＲ）分析、モデル構築および精密化を実施することができる。ＭＩＲ分析に関して、結晶を重原子に浸してＭＩＲ分析に必要な重原子誘導体を生成する。本明細書で用いる重原子誘導体または誘導化とはタンパク質またはタンパク質複合体結晶の化学的に修飾された形態を生成する方法を指し、ここで該タンパク質は結晶内の重原子に特異的に結合している。実際には、結晶を重金属原子もしくは塩、または有機金属化合物、例えば塩化鉛、シアン化金、チメロサール、酢酸鉛、酢酸ウラニル、塩化水銀、塩化金等を含有する溶液に浸し、これは結晶を介して拡散し、そしてタンパク質に特異的に結合する。結合した（複数の）重金属原子または塩の（複数の）位置を、浸した結晶のＸ線回折分析により決定することができる。この情報を用いてＭＩＲ相情報を作成し、これを用いてβ３インテグリンの結晶化システインループドメインの三次元構造を構築する。その後、プログラムＯ（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ａ４７：１１０−１１９（１９９１））を用いて三次元構造の最初のモデルを構築することができる。構造の解釈および構築はプログラムＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５４：９０５−９２１（１９９８））の使用によりさらに促進され得る。
【０１０４】
分子置換の方法は広く、本発明のβ３インテグリンのシステインループ構造の結晶の三次元構造の予備モデルの作成を伴う方法に言及する。未知の結晶の観察された回折パターンを最もよく説明するために、研究中のβ３インテグリンのシステインループドメイン（または対応する酵素／基質複合体または酵素／阻害剤複合体）から得られるＸ線回折パターンにより定義されるように、その構造座標が単位格子内で公知である分子の方向付けおよび位置決めにより分子置換を達成する。次いでこのモデルから相を計算することができ、そして観察された振幅と組み合わせて概算の構造のフーリエ合成を得ることができる。今度はこれをいずれかのいくつかの形態の精密化に供して最終的な正確な構造を提供することができる。当業者に公知の技術を用いて分子置換方法を適用することができる。
【０１０５】
β３のシステインループドメインの該構造に随伴される三次元構造および特異的原子座標は、単独でまたは基質もしくはヘパリンのような特異的結合リガンドとの複合体で、その他のβ３リガンドのヘパリン結合ドメインの結晶化形態の構造を解明するのに有用である。そのようなタンパク質はβ３インテグリンのシステインループドメインの構造の少なくとも５０％以上のアミノ酸に関してＣα原子の位置でせいぜい２．０Å、１．５Å、１．０Åまたは０．５Åの二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）を含む。そのようなＲＭＳＤはアミノ酸配列同一性に基づいて予測され得る。ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：８２３−８２６（１９８６）。
【０１０６】
先行のセクションおよび以下の実施例で示すように得られた三次元構造を用いてβ３インテグリン、およびしたがってＩＧＦ−Ｉ活性のモジュレーターを設計することができる。これらの構造を用いてシステインループドメインの１つ以上の結合部位と望ましい相互作用を形成することができる分子に関して設計またはスクリーニングすることができる。
【０１０７】
本明細書で記載するβ３インテグリンのシステインループドメインのモデル（およびその活性部位、結合部位または空洞を含むサブ領域）を用いてβ３インテグリンに関するモジュレーターを直接的かいずれかで開発することができる。そのようなモジュレーターの、β３インテグリンのシステインループドメインの活性を調整する能力を、さらにコンピューター分析によるか、ならびに／またはインビトロおよび／もしくはインビボ試験により確認することができる。
【０１０８】
システインループドメインのモデルは元来のβ３インテグリンタンパク質のシステインループドメインよりも小さい、大きいまたは同じ大きさである仮想または現実のタンパク質構造に含まれ得る。活性部位モデルを取り囲むタンパク質環境はβ３インテグリンの元来のシステインループドメインと相同であるかもしくは同一でよいか、または部分的もしくは完全に非相同でよい。
【０１０９】
したがって、本発明は（ｉ）β３インテグリン（例えばヒトまたはブタβ３インテグリン）のシステインループドメインの領域（すなわち活性部位、反応部位、または結合部位）を含む分子のコンピューター読取可能モデルを生成するステップ；および（ｉｉ）システインループドメインの領域と適合する構造および電荷分布を有する（すなわちその中に収容されることが可能である）被験化合物を設計するためのモデルを用いるステップを含むβ３インテグリンのモジュレーターを理論的に設計するための方法であって、被験化合物は活性部位と相互作用して活性を調整することができる官能基を含むことができる方法を提供する。結晶構造が試験されるシステインループドメインに利用できない場合、当業者に公知のホモロジーモデリング方法を用いてモデルを生成することができ、次いでこれを用いて前記したような被験化合物を設計することができる。
【０１１０】
β３インテグリンまたはβ３インテグリン関連酵素のシステインループドメイン（またはその領域／部分）の原子の原子座標を、ＧＲＡＭ、ＤＯＣＫ、ＨＯＯＫまたはＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｄｕｎｂｒａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｌｄｉｎｇ  ＆  Ｄｅｓｉｇｎ  ２：２７−４２（１９９７））のようなドッキングプログラム用いるコンピューターモデリングと併せて用いて潜在的モジュレーターを同定することができる。この手順は潜在的モジュレーターの形状および化学構造がどのくらい良好に活性部位と相補するかを確認するための、または潜在的モジュレーターを活性部位における物質もしくは公知の阻害剤分子の結合と比較するための、潜在的モジュレーターのシステインループドメインのモデル（システインループドメインの領域、例えば活性部位または結合部位のモデルを含む）に対するコンピューターフィッティングを含み得る。
【０１１１】
コンピュータープログラムを用いて反応部位モデルおよび潜在的モジュレーター化合物との間の想定される相互作用に随伴される誘引、反発および／または立体障害を推測することができる。一般的に、モジュレーター活性に随伴される相互作用の特性には、限定するものではないが、密なかみ合い、低い立体障害、正の誘因力および特異性が挙げられる。
【０１１２】
また「手作業による」薬物設計としてのような当分野で公知の技術でβ３インテグリンのシステインループドメインの反応部位の三次元構造を肉眼で検査することにより本発明のモジュレーター化合物を設計することもできる。手作業による薬物設計は肉眼検査を用い、そして当分野で公知のグラフィックビジュアル化プログラムを用いて分析することができる。
【０１１３】
理論的に設計したモジュレーターの代替または付属として、β３インテグリンのシステインループドメインの目的の部位／領域（すなわち例えば結合部位、活性部位、または反応部位）と相互作用および／または結合する化合物の小型分子ライブラリー、ペプチドライブラリーまたはファージライブラリーの無作為スクリーニングを用いて有用な化合物を同定することができる。そのようなスクリーニングは仮想でよく；β３インテグリンのシステインループドメインの活性部位、結合部位または反応部位の仮想モデルと結合またはそうでなければ相互作用することができる化学物質または化合物に関して小型分子データベースをコンピューターによりスクリーニングすることができる。これに代えて、システインループドメインまたはその部分の実際の分子モデルに対してスクリーニングすることができる。さらにβ３のシステインループドメインの目的の部位に結合する抗体を作成することができる。システインループドメインに結合することができる候補（または「被験」）化合物を同定した後、次いで化合物を試験してそれらがシステインループドメイン活性を調整することができるかどうかを決定することができる（以下を参照）。
【０１１４】
１つの実施形態では、システインループドメインを含有するβ３インテグリン、核酸ならびにシステインループドメインを含有および／または発現する細胞をスクリーニングアッセイで用いる。最初にシステインループドメインまたはその部分に結合することができる候補化合物を見出すようにスクリーニングを設計することができ、そして次に候補化合物のシステインループドメインまたはβ３インテグリン活性を調整する能力を評価するアッセイにおいてこれらの化合物を用いることができる。したがって、当業者には理解されるように、結合アッセイおよび活性アッセイを含む、行うことができる多くの異なるアッセイがある。１つの態様では、候補化合物を最初に試験してそれらがヘパリン結合ドメインの特定の結合部位に結合することができるかどうかを決定する。
【０１１５】
したがって、１つの実施形態では、本方法はシステインループドメインまたはその部分および候補化合物を合わせること、ならびに候補化合物のシステインループドメインまたはその部分への結合を決定することを含む。本明細書の方法のある実施形態では、システインループドメイン（またはその部分）または候補薬剤は単離された試料受容部を有する不溶性支持体（例えばマイクロタイタープレート、アレイ等）に非拡散的に結合している。不溶性支持体は組成物が結合できる任意の組成物から作られていてよく、容易に可溶性材料から分離され、そしてそうでなければスクリーニングの方法全体と適合する。そのような支持体の表面は任意の従来の形状の固体または多孔性でよい。適当な不溶性支持体の実施例には、マイクロタイタープレート、アレイ、膜およびビーズが挙げられる。これらは典型的にはガラス、プラスチック（例えばポリスチレン）、多糖類、ナイロンまたはニトロセルロース、Ｔｅｆｌｏｎ（商標）等から作られる。マイクロタイタープレートおよびアレイは、少量の試薬および試料を用いて多くのアッセイを同時に実施することができる、すなわちハイスループットスクリーニングが可能であるので特に都合良い。システインループドメインの結合の後、過剰の非結合性材料を洗浄により除去する。次いでウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインまたはその他の無害なタンパク質もしくはその他の部分で試料受容部を遮断することができる。
【０１１６】
候補化合物をアッセイに加える。候補化合物には限定するものではないが、特異的抗体、化学ライブラリーからの化合物、ペプチド類似体等が含まれる。特に興味深いのは、ヒト細胞に関して低毒性である化合物に関するスクリーニングアッセイである。インビトロ標識タンパク質−タンパク質結合アッセイ、タンパク質結合に関するイムノアッセイ、タンパク質−タンパク質またはタンパク質−化学的化合物結合を決定するためのＮＭＲアッセイ等を含む広範な種類のアッセイをこの目的で用いることができる。候補化合物は殺虫剤、除草剤または殺菌剤をも含み得る。
【０１１７】
本明細書で用いる「候補化合物」なる用語はヘパリン結合ドメインまたはβ３インテグリン活性を直接的または間接的に調整する能力を有する任意の分子、例えばタンパク質、オリゴペプチド、小型有機分子、多糖類、ポリヌクレオチド等を記載する。一般的に複数のアッセイ混合物を異なる化合物濃度で並行して作動させて種々の濃度に対する異なる応答を得る。典型的にはこれらの濃度の１つは陰性対照として、すなわちゼロ濃度でまたは検出レベル以下で提供される。
【０１１８】
候補化合物は多くの化学的クラスを包含し得るが、典型的にはそれらは有機分子であり、そして１つの実施形態ではそれらは１００ダルトンを超えるおよび約２，５００ダルトン未満の分子量を有する小型の有機化合物である。候補化合物はタンパク質との構造相互作用、例えば水素結合に必要な官能基を含むことができ、そして典型的には少なくとも１つのアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの官能化学基を含む。候補化合物は１つ以上の前記の官能基で置換された環状炭素もしくはヘテロ環状構造および／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含むことができる。候補薬剤はまたペプチド、単糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体またはその組み合わせを含む生体分子の中からも見出される。
【０１１９】
候補化合物を合成または天然化合物のライブラリーを含む広範な種類の供給源から入手することができる。例えば、広範な種類の有機化合物および生体分子の無作為のおよび指定された合成のために、コンビナトリアル化学合成および無作為化されたペプチドまたはオリゴヌクレオチドの発現を含む多くの手段を利用することができる。これに代えて、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが利用可能であるかまたは容易に生成される。加えて、天然または合成により生成されたライブラリーおよび化合物は従来の化学的、物理的および生化学的手段により容易に修飾される。公知の薬理学的薬剤を、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化のような指定されたまたは無作為の化学修飾に供して構造類似体を生成することができる。１つの実施形態では、ライブラリーは任意の位置で配列選択性または定常性を有さないで十分に無作為化される。別に、ライブラリーを偏向させる。すなわち配列内のいくつかの位置を定常にしておくか、または限られた数の可能性から選択するかのいずれかである。
【０１２０】
候補化合物のシステインループドメインへの結合の決定は多くの方式で行われ得る。１つの実施形態では、候補化合物を標識し、そして結合を直接決定する。例えばシステインループドメインの全てまたは一部を固体支持体に付着させ、標識した候補化合物（例えば蛍光標識または放射活性標識）を加え、過剰の試薬を洗浄して除き、そして標識が固体支持体上に存在するかどうかを決定することにより行うことができる。当分野で公知の種々の遮断および洗浄ステップを利用することができる。
【０１２１】
本明細書において「標識された」とは検出可能なシグナルを提供する標識、例えば放射性同位元素、蛍光、酵素、抗体、磁性粒子のような粒子、化学発光物質または特異的結合分子等で化合物を直接的または間接的のいずれかで化合物が標識されることを意味する。特異的結合分子にはビオチンおよびストレプトアビジン、ジゴキシンおよび抗ジゴキシン等のような対が含まれる。特異的結合メンバーに関しては、前記で概要を示したような公知の手順に従って検出を提供する分子で相補メンバーを通常的に標識する。標識は直接的または間接的に検出可能なシグナルを提供することができる。
【０１２２】
１つの実施形態では、競合結合アッセイの使用により候補化合物の結合を決定する。この実施形態では、競合物質は抗体、ペプチド、リガンド等のようなシステインループドメインに結合することが解っている結合部分である。特定の状況下では結合部分が生物活性薬剤を置換するので、候補化合物と公知の結合部分との間でどちらかをとるような競合結合があり得る。
【０１２３】
１つの実施形態では、候補化合物を標識する。候補化合物もしくは競合物質のいずれかまたは双方を、存在する場合、最初に結合を可能にするのに十分な時間システインループドメインに加える。最適な結合を促す任意の温度で、典型的には４〜４０℃の間でインキュベーションを実施することができる。インキュベーション時間は最適結合に関して選択するが、迅速なハイスループットスクリーニングを促すために最適化することもできる。典型的には０．１時間〜１時間の間が十分である。一般的に過剰の試薬を除去または洗浄して除く。次いで第２成分を加え、そして標識成分の存在または不在を追跡して結合を示す。
【０１２４】
１つの実施形態では、競合物質を最初に加え、続いて候補化合物を加える。競合物質の置換は、候補化合物がシステインループドメインに結合し、そしてしたがってシステインループドメインに結合でき、そしてその活性を調整できる可能性があるということの指標である。この実施形態ではいずれかの成分を標識することができる。したがって例えば競合物質が標識されている場合、洗浄溶液中の標識の存在は候補化合物による競合物質の置換を示している。これに代えて、候補化合物が標識されている場合、支持体上の標識の存在は候補化合物の置換を示している。
【０１２５】
１つの実施形態では、組換えバクテリオファージライブラリーをスクリーニングすることによりシステインループドメインの潜在的リガンドを得ることができる（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：３８６−３９０（１９９０）；Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，８７：６３７８−６３８２（１９９０）；Ｄｅｖｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：４０４−４０６（１９９０））。具体的には、低融点ＬＢ寒天中でファージライブラリーを低希釈で許容大腸菌と混合することができ、これを次いでＬＢ寒天プレートの上部に注ぐ。プレートを３７℃で一定時間インキュベートした後、大腸菌の菌叢中に小型の透明なプラークが形成され、これは活性ファージ成長および大腸菌の溶解を示す。乾燥フィルターを寒天プレートに載せることによりこれらのファージの典型的なものをナイロンフィルターに吸収されることができる。フィルターを配向に関して印付けし、取り外し、そして洗浄溶液中に置いて任意の残留する吸収部位を遮断することができる。次いで例えば放射活性ヘパリン結合ドメイン（またはその部分）を含有する溶液中にフィルターを置くことができる。指示されたインキュベーション時間の後、フィルターを完全に洗浄し、そしてオートラジオグラフィー用に現像することができる。次いで放射活性ヘパリン結合ドメインまたはその部分に結合するファージを含有するプラークを同定することができる。これらのファージをさらにクローン化し、そして次に以前のようにシステインループドメインに結合するその能力に関して再試験することができる。一度ファージが精製されると、ファージに含まれる結合配列を標準的なＤＮＡシークエンシング技術により決定することができる。一度ＤＮＡ配列が解ると、これらの配列を示す合成ペプチドを作成することができ、そして本明細書で論じるようにさらに結合研究を実施することができる。
【０１２６】
別の実施形態では、システインループドメインに関する潜在的リガンドを、ＮＭＲによる候補化合物のスクリーニング（例えば米国特許出願第ＵＳ２００３／０１４８２９７Ａ１号またはＰｅｌｌｅｃｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，１：２１１−２１９（２００２）参照）により入手することができる。記載されるように、システインループドメインまたはその部分を全ての型の固体支持体に固定することができる。結合が共有結合である必要はない。ＮＭＲ測定環境内で標的が固定され続けていることだけが必要とされる。さらに、固定化は固体支持体に直接的である必要はなく；またそれは適当な結合部分もしくは分子を介して、または空間を介して間接的に生じ得る。非常に適当な支持体は、例えばビーズ形態または多孔性マトリックス形態のポリスチレン、セファロースおよびアガロース樹脂ならびにゲルのようなクロマトグラフィーで用いられる固体ポリマーである。加えて、適切に化学的修飾されたシリコンを基盤とする材料もまた非常に適当な支持体である。
【０１２７】
任意の可溶性分子をシステインループドメインに結合する候補である化合物として用いることができる。該可溶性分子が水溶性である必要はない。該化合物をもシステインループドメイン分子をも変質しない任意の液体溶媒をＮＭＲ測定において用いることができる。システインループドメイン標的分子を固体樹脂のような適当な支持体に固定し、そしてさらにスクリーニングの期間中適当なＮＭＲプローブ、例えばフローインジェクションＮＭＲプローブ中に置く。次いでスクリーニングする化合物、例えばライブラリーからの化合物の各々の試料をそれをポンピングすることにより固体支持体に通して、沿ってまたは介して固定化標的に適用する。アッセイする試料はシステインループドメイン標的分子への結合が疑われる単一の成分を含有し得るか、または化合物ライブラリーまたはその他の型のコレクションもしくは混合物の複数の成分を含有し得る。望ましいレベルの濃度のアッセイする化合物が標的の入ったプローブまたは容器に到達したときに流れを止めることができる。
【０１２８】
ＮＭＲスペクトルの獲得のために、原理的には、溶解した分子の試料からの共鳴を検出し、そして好ましくはパルス磁場勾配によるように、残留する溶媒シグナルを抑制することができる任意のＮＭＲパルス系列を用いて結合を検出することができる。しかしながら実際には、対照固体支持体の存在下でアッセイ中の各化合物から誘導される共鳴を検出および定量するのに十分な解像度および感度で一次元1Ｈ−ＮＭＲスペクトルが獲得される。加えて、固定されたシステインループドメイン標的分子を含有する固体支持体の存在下でスクリーニングされる化合物の同一溶液に関して同一のＮＭＲプロトコールを用いて記録される第２のスペクトルが獲得される。場合によっては、極度に弱い標的結合を検出するために、固定されたシステインループドメイン標的分子を含有する固体支持体の存在下で第３のスペクトルを獲得することができる。拡散またはＴ２フィルターを用いながらこのスペクトルを記録することができる。
【０１２９】
ＮＭＲスペクトルを獲得した後、標的固定化固体支持体を含有するＮＭＲプローブから小型の化合物または（複数の）化合物の試料を洗い流す。続いて、次の試料をストップ−フロー様式でプローブに適用することができる。全スクリーニング過程にわたって、固体支持体に固定した標的の単一の試料がＮＭＲプローブに残留する。洗浄して除去することができない堅固に結合した化合物により万一標的が変性、化学的分解、または飽和されるようになった場合はただ標的固定化固体支持体を変える必要がある。標的分子が特定の段階で遮断されるような方式で、特定の化合物が結合しないように保護するために、標的分子への結合機会の利用性を検査するための制御を実施する。
【０１３０】
好ましくは２つのＮＭＲデータセットの一方から他方を減じることによりＮＭＲスペクトルを比較し、それにより異なるスペクトルを創出する。一般的に標的分子は本質的に固体相にあるので、標的分子に結合する化合物からの共鳴は結合状態の間検出不能で広がる。したがって、結合は標的分子に結合する化合物の溶液形態から独占的に誘導されるピークの高さの低下により鋭敏におよび確実に検出可能である。この効果は差スペクトルにおいて最も容易に認められる。標的リガンド相互作用の親和性を定量するために用いることができる代替の研究法は対照および実験スペクトルにおいて（例えば積分により）ピーク面積を決定し、そしてこれらの面積の値を比較することである。バッチ様式でＮＭＲスクリーニング方法を実施することが可能であるが、フローインジェクションセットアップでは、標的の１つの試料を用いて全ライブラリーをスクリーニングすることができる。
【０１３１】
生物学的または生化学的スクリーニングアッセイ。さらに本発明のバイオアッセイまたは化学的アッセイにおいて化合物をＩＧＦ−１による細胞活性化を調整する活性に関してスクリーニングすることができる。前記した方法によりＩＧＦ−１活性のモジュレーターまたは潜在的モジュレーターとして同定された化合物を、公知の技術に従って、および／または以下でさらに論じるようにインビボまたはインビトロアッセイでアゴニストまたはアンタゴニストとしての特異活性に関してさらにスクリーニングすることができる。
【０１３２】
アッセイ方法論
αＶβ３のエンハンサーまたは阻害剤の生化学的および生物学的活性を評価するための方法。ＩＧＦ−Ｉ作用の修飾。競合結合アッセイに加えてαＶβ３のシステインループ結合部位に結合する化合物がＩＧＦ−Ｉシグナル伝達および作用に影響するかどうかを決定するために、この部位がリガンドにより活性化されたときに刺激される生化学的および生物学的作用およびどのようにこれがＩＧＦ−Ｉに対する細胞応答を変化させるかを評価するアッセイの利用が必要とされている。阻害剤は明らかに、ＩＧＦ−Ｉがこれらの細胞過程を刺激する能力を阻害し、一方刺激剤はそのようにする能力を促進する。これらのアッセイには、限定するものではないが以下のものが含まれる：β３サブユニットリン酸化、ＳＨＰＳ−１に対するβ３結合、および複合体としてのインテグリン結合タンパク質（ＩＡＰ）、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１との会合、ＳＨＰＳ−１リン酸化およびＳＨＰＳ−１へのＳｈｃ補充、Ｓｈｃリン酸化、ＤＮＡ合成および細胞複製の刺激または細胞移動。システインループドメインを介してβ３に結合するリガンドはしばしばコンフォメーション変化およびβ３リン酸化の双方を誘起する。同様にβ３リン酸化の刺激は二次的にβ３のコンフォメーション変化を誘起し得る。β３に結合する化合物を培養中の平滑筋および内皮細胞に適用することによりβ３リン酸化を測定する。第１化合物を０．１から１μｇ／ｍｌの様々な濃度を用いて１０ｃｍ皿中の集密状態の平滑筋または内皮細胞単層に加える。一定時間（２〜４時間）の細胞への暴露の後、ＲＩＰＡバッファー（１、２）９００μｌ中で細胞を溶解する。ライセートを、重合を測定するためにβ３に関する免疫ブロッティングにより直接的に分析するか、または抗β３抗体で免疫沈殿し、そして次にホスホチロシンに関して免疫ブロッティングする。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により細胞ライセート３０μｌに含まれるタンパク質の分離の後、免疫ブロッティングを分析する。免疫沈殿のために、一次β３抗体を１：３００希釈でライセート９００μｌに加え、そして一晩インキュベートする。免疫複合体をプロテインＡセファロースで沈殿させ、そしてラエムリ試料バッファーで溶出する（Ｍａｉｌｅ  ＬＡおよびＣｌｅｍｍｏｎｓ  ＤＲ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４３：４２５９−４２６４（２００２）；Ｍａｉｌｅ  ＬＡ，Ｃｌａｒｋｅ  ＪＢ，Ｃｌｅｍｍｏｎｓ  ＤＲ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７７：８９５５−８９６０（２００２））。次いでリン酸化されたβ３の量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、続いてモノクローナル抗ホスホチロシン抗体（ＰＹ９９）での免疫ブロッティングにより決定する（Ｌｉｎｇ  Ｙ，Ｍａｉｌｅ  ＬＡ，Ｃｌｅｍｍｏｎｓ  ＤＲ，Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１７：１８２４−１８３３（２００３））。
【０１３３】
ＳＨＰＳ−１とＩＡＰとの間の複合体形成を決定するための方法論は以前に公開されている（Ｍａｉｌｅ  ＬＡ，Ｃｌａｒｋｅ  ＪＢ，Ｃｌｅｍｍｏｎｓ  ＤＲ，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ，１４：３５１９−２８（２００３））。簡単にはシステインループドメインを介してβ３を活性化する被験薬剤に細胞を暴露し、そして次にそれをＩＧＦ−Ｉに暴露する。ＩＧＦ−Ｉ暴露の後、β３が活性化リガンドによりリガンド占有される場合、ＩＡＰおよびＳＨＰＳ−１は高分子量複合体で会合する。重要なことに、これがシステインループドメインに結合する抗体またはその他の阻害剤により完全に阻害される場合、これらは会合しない。この複合体を検出するために、細胞ライセートを以前に記載されたように調製し、そしてポリクローナル抗血清の１：３３０希釈を用いてＳＨＰＳ−１に関して免疫沈殿する。免疫沈殿したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そしてＩＡＰを検出する精製されたモノクローナル抗体（Ｂ６Ｈ１２）を用いて免疫ブロッティングする（前出）。
【０１３４】
ＳＨＰＳ−１リン酸化。ＳＨＰＳ−１リン酸化を決定するために、β３リガンド（アゴニストまたはアンタゴニストのいずれか）を３０分〜２時間の間の時間、３７℃で培養物に加える。次いでＩＧＦ−Ｉを加え、そして特定の時点で細胞ライセートを調製する。基準に加えて、ＩＧＦ−Ｉへの暴露の後３、５、１０および２０分ライセートを調製する。以前に記載されたようにライセートを調製し、そして抗ＳＨＰＳ−１ポリクローナル抗血清の１：３３０希釈を用いてＳＨＰＳ−１に関して免疫沈殿する。次いでプロテインＡセファロースでペレット化した免疫沈殿をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、続いてリン酸化チロシン残基を検出するＰＹ９９モノクローナル抗体を用いるホスホチロシンに関する免疫ブロッティングにより分析する（Ｍａｉｌｅ  ＬＡおよびＣｌｅｍｍｏｎｓ  ＤＲ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４３：４２５９−４２６４（２００２）；Ｍａｉｌｅ  ＬＡ，Ｃｌａｒｋｅ  ＪＢ，Ｃｌｅｍｍｏｎｓ  ＤＲ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７７：８９５５−８９６０（２００２）；Ｍａｉｌｅ  ＬＡおよびＣｌｅｍｍｏｎｓ  ＤＲ，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ，９３：９２５−９３１（２００３））。予測される応答は、ＩＧＦ−ＩがＳＨＰＳ−１リン酸化を刺激すること、およびアゴニストがＳＨＰＳ−１リン酸化の強度を増加させるかまたはその期間を延長するかのいずれかであることである。対照的にアンタゴニストは強度を低下させ、そしてその期間を短縮する。
【０１３５】
Ｓｈｃリン酸化。ＳｈｃのＳＨＰＳ−１への結合および補充は、特に糖尿病の平滑筋細胞および内皮細胞におけるＩＧＦ−Ｉシグナル伝達に必要であるＳｈｃリン酸化に重要である。Ｓｈｃリン酸化を測定するために、細胞培養物を以前に記載されたようなアゴニストまたはアンタゴニストに暴露し、そして次に細胞培養物を次いでＩＧＦ−Ｉに１０、２０または３０分間暴露する。以前に記載されたように各時点で細胞ライセートを調製し、そして１：１０００希釈の抗Ｓｈｃポリクローナル抗血清を用いて免疫沈殿する。免疫沈殿をプロテインＡセファロースで取り除き、そして次にタンパク質をラエムリ試料バッファーで溶出し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、続いて抗ホスホチロシン抗体ＰＹ９９を用いる免疫ブロッティングにより分析する。予測される応答は、ＩＧＦ−ＩがＳｈｃリン酸化を刺激することである。これは特にβ３アゴニストに暴露された培養物において後期の時点で有意に延長され、そして増強される。対照的にアンタゴニストはＳｈｃリン酸化を阻害する。
【０１３６】
ＳｈｃのＳＨＰＳ−１への補充。培養物をアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかに以前に列挙した時間暴露する。次いで培養物を洗浄し、そして５、１０、２０または３０分の時間ＩＧＦ−Ｉを加える。細胞ライセートを以前に記載されたように調製し（Ｍａｉｌｅ  ＬＡおよびＣｌｅｍｍｏｎｓ  ＤＲ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４３：４２５９−４２６４（２００２））、そして１：３３０希釈を用いる抗ＳＨＰＳ−１抗血清を用いて免疫沈殿する。プロテインＡセファロースで免疫複合体を取り除いた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、続いて１：２０００希釈の抗Ｓｈｃ抗血清を用いてＳｈｃに関する免疫ブロッティングにより免疫沈殿を分析する。予測される応答は、ＩＧＦ−Ｉが、Ｓｈｃがリン酸化を被るのに必要とされるＳＨＰＳ−１へのＳｈｃ補充を刺激するということである。しかしながら、アンタゴニストを用いる場合、次いでＳＨＰＳ−１はリン酸化されず、そしてＳｈｃはＳＨＰＳ−１に結合せず、したがって補充は検出されないかまたは大いに減少する。
【０１３７】
ＭＡＰキナーゼの活性化。ＭＡＰキナーゼの活性化は、ＩＧＦ−Ｉによる平滑筋細胞および内皮細胞における細胞分裂および細胞移動の刺激に重要である。以前に示されているようにＳｈｃリン酸化および膜への補充はＭＡＰキナーゼ活性化に必要とされる。ＭＡＰキナーゼ活性化が損なわれているかどうかを決定するために、細胞を以前に記載された時間アゴニストまたはアンタゴニストに暴露し、次いで以前に記載されたように細胞ライセートを調製する（Ｍａｉｌｅ  ＬＡおよびＣｌｅｍｍｏｎｓ  ＤＲ，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ，９３：９２５−９３１（２００３））。細胞ライセート３０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより直接的に分析し、ＥＲＫ１／２のリン酸化形態（ＭＡＰキナーゼ活性化の指標）に関して免疫ブロッティングする（Ｌｉｎｇ  Ｙ，Ｍａｉｌｅ  ＬＡ，Ｃｌｅｍｍｏｎｓ  ＤＲ，Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１７：１８２４−１８３３（２００３））。ＭＡＰキナーゼ活性化の経時的強度はβ３アゴニストにより延長され、そしてβ３アゴニストにより阻害されることは理解されよう。
【０１３８】
細胞複製。平滑筋および／または内皮細胞を相対的に低い密度の１０4／ｃｍ2で、低血清（０．２％）含有培地中でプレートする。プレートした２４時間後、０．２％乏血小板血漿含有培地中で細胞を静止させる。２４時間後、培養物を０〜１００ｎｇ／ｍｌの間の漸増濃度のＩＧＦ−Ｉおよびβ３アゴニストまたはアンタゴニストに暴露する。４８時間後、細胞培養物をトリパンブルーで染色し、そして手作業の計数により細胞数を決定する。β３がアゴニストにより占有されている場合、次いでこの期間中に細胞数の少なくとも２倍の増加がある。一方アンタゴニストを加える場合、しばしば２０％未満の細胞数の増加がある。
【０１３９】
細胞移動。集密状態の静止期の平滑筋または内皮細胞培養物をＭａｉｌｅ  ＬＡ，Ｉｍａｉ  Ｙ，Ｃｌａｒｋｅ  ＪＢ，Ｃｌｅｍｍｏｎｓ  ＤＲ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７７：１８００−１８０５（２００２）に記載されるようにカミソリの刃で傷つける。直線的な端が得られ、そしてプレートに溝がないことを決定するために傷を調べる。次いで正確に傷つけられた少なくとも５つの部分をカラーマーカーで同定する。５０または１００ｎｇ／ｍｌのいずれかの濃度でＩＧＦ−Ｉを加え、そして種々の濃度のアゴニストまたはアンタゴニストを少なくとも２検体ずつで培養物に加える。７２時間後、メチレンブルーで染色した後、傷の端から少なくとも５０ミクロン移動した細胞の数を決定し、そして計数する。通常ＩＧＦ−Ｉは顕微鏡視野あたり２０個〜５０個の間の細胞を刺激してこの距離を移動させる。アンタゴニストの存在下、一般的に顕微鏡視野あたり移動する細胞は５個よりも少ないが、アゴニストはＩＧＦ−Ｉに対する応答を２倍ほどまで増加させ得る。
【０１４０】
以下の非限定的な実施例で本発明をさらに詳細に説明する。
【０１４１】
実施例１
ＤＮＡ合成
細胞を９６ウェル組織培養プレート中２．５×１０4／ｃｍ2の密度でプレートし、そして培地交換せずに５日間成長させる。それを血清不含ＤＭＥＭで１回すすぎ、そしてＤＭＥＭ＋０．２％乏血小板血漿（ＰＰＰ）と共に２４時間インキュベートすることにより血清を欠乏させる。次いで細胞をＩＧＦ−Ｉ＋任意の治療に暴露し、そして３７℃で２４時間インキュベートし、そしてＩｍａｉ  ＹおよびＣｌｅｍｍｏｎｓ  ＤＲ．Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−Ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−Ｉ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４０，４２２８−４２３５（１９９９）に記載されるようにＤＮＡに組み込まれた［3Ｈ］チミジンの量を決定した。
【０１４２】
実施例２
ペプチド合成
レイニンマルチプルペプチド合成装置でＦＭＯＣ化学を用いてペプチドを合成する。ＦＭＯＣアミノ酸の活性化およびアシル化は塩基（Ｎメチルモルホリン）の存在下でＨＡＴＵを利用する。アシル化の完了時にＦＭＯＣ保護基をジメチルホルムアミド中２０％ピペリジンで除去する。合成後、ペプチドを樹脂から除去し、そして適切な有機スカベンジャーを含有する９５％トリフルオロ酢酸で治療することにより脱保護する。
切断、脱保護したペプチドを冷エタノール中で沈殿させ、希ＴＦＡ／アセトニトリル混合物中に再懸濁し、そして高速液体クロマトグラフィーにより逆相樹脂で漸増的アセトニトリル濃度勾配を用いて精製する。
ペプチド生成物の品質管理を分析用ＨＰＬＣにより、およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析により評価する。精製されたペプチドを凍結乾燥し、そして−２０℃で保存する。
【０１４３】
実施例３
アゴニストの同定
前記で示したようにアゴニストは、以前は受容体活性化を招く領域とは同定されていなかったαＶβ３インテグリン受容体の特異的領域に結合する。この領域に結合すると決定されている全てのアゴニストは通例ヘパリン結合ドメインと称される配列の領域を含有する。このヘパリン結合ドメインは今ではαＶβ３のこの領域に結合することが見出されている５つのリガンドに存在する。それがαＶβ３の特異的領域に結合するという文書は２つの型の実験により提供されている。最初に我々はαＶβ３のこの領域、すなわち１７７および１８３位置のアミノ酸の間に位置するβ３サブユニットの領域と反応することが解っているポリクローナル抗体を有している。このポリクローナル抗体をいずれかの公知のアゴニストと共にインキュベートする場合、それは結合する能力を完全に阻害する。
【０１４４】
β１インテグリンの同一の領域をβ３内の８個のアミノ酸領域に関する変異誘発により置換したより明確な実験を行った。次いでβ３を構成的に発現しないＣＨＯ細胞中に変異タンパク質を発現させた。次いでこれらのリガンドを用いて結合アッセイを行った。この変異が結合の完全な喪失およびβ３を活性化の不能を招いたことが示された。これらのアゴニストの、β３のこの領域への結合により刺激されることが示されているβ３リン酸化により活性化を測定した。これらのデータにより、これがこれらのリガンドに結合するβ３の領域であることが示される。
【０１４５】
実施例４
アンタゴニストの同定
以下の構造：ＫＫＱＲＦＲＨＬ（配列番号６）を有する合成ペプチドがこれらの生物学的アッセイの各々において阻害活性を有することが見出された。ＩＧＦ−ＩによるＩＧＦ−Ｉ受容体の活性化をおよそ６０％まで阻害することができた。さらに分析により、この配列を含有する環化ペプチドはさらに強力な阻害剤であることが示されている。２０８位置のアルギニンの代わりに疎水性残基での置換は活性の最大の喪失を招く。
【０１４６】
実施例５
さらなるアゴニスト
本発明を実施するために用いることができるさらなるペプチドアゴニストを以下の表１に示す。そのようなペプチドアゴニストは前記の実施例１に記載したように合成する。
【０１４７】
【表３Ａ】
2007536265.tif 000008
【表３Ｂ】
2007536265.tif 000009
【０１４８】
実施例６
さらなるアンタゴニスト
本発明を実施するために用いることができるさらなるペプチドアンタゴニストを以下の表２に示す。そのようなペプチドアゴニストは前記の実施例２に記載したように合成する。
【０１４９】
【表４Ａ】
2007536265.tif 000010
【表４Ｂ】
2007536265.tif 000011
【０１５０】
実施例７
免疫のためのペプチド調製
抗体を調製するために、ビトロネクチンおよびその他のリガンドのヘパリン結合ドメインに結合するβ３サブユニットの配列である合成ペプチドを調製した。ＦＭＯＣ化学を用いてレイニンマルチプルペプチド合成装置を用いてペプチドを合成した。ＦＭＣＯアミノ酸の活性化およびアシル化は塩基（ｎ−メチルモルホリン）の存在下でＨＴＡＵを利用する。アシル化の完了時にＦＭＯＣ保護基をジメチルホルムアミド中２０％ピペリジンで除去する。合成後、ペプチドを樹脂から除去し、そして適切な有機スカベンジャーを含有する９５％トリフルオロ酢酸での治療により脱保護する。次いで切断し、そして脱保護したペプチドを冷エタノール中で沈殿させ、そして希ＴＦＡ／アセトニトリルに再懸濁し、そして高速液体クロマトグラフィーにより逆相樹脂で漸増的アセトニトリル勾配を用いて精製する。ペプチド生成物の品質を分析用ＨＰＬＣにより、およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析により評価する。次いで精製されたペプチドを凍結乾燥し、そして−２０℃で保存する。データベース中の公知の質量との比較により、溶出したペプチドの質量を正確なアミノ酸を含有するとして確認する。
【０１５１】
β３システインループペプチド（ＣＹＤＭＫＴＴＣ）（配列番号８３）のイムジェクトマレイミド活性化マリカルチャーキーホールリンペットヘモシアニン（ピアース、ロックフォールド、イリノイ州）へのコンジュゲート。０．７ｍｇ、１．２ｍｇおよび２．１ｍｇの量のペプチドを重量測定し、そして各々を別個に溶解した後、０．９Ｍ塩化ナトリウムを含有する０．０３Ｍ  ＮａＨ2  ＰＯ4（ｐＨ７．２）５００ｍｃｌ中のＫＬＨに加えた。マレイミド活性化ＫＬＨ  ２ｍｇを蒸留水５００ｍｃｌに溶解した。次いで溶解したペプチド０．７ｍｇをＫＬＨ溶液に加え、そして室温で２０分間インキュベートした。バッファーに溶解し、そして同一のＫＬＨ溶液に加えたペプチド０．７ｍｇを含有するさらなる試験管を再度室温で２５分間インキュベートした。ペプチド１．２ｍｇおよび２．１ｍｇを逐次的にＫＬＨ溶液に加え、そして各添加の後１時間間隔で室温でさらにインキュベートした。ペプチドコンジュゲート体を除去し、そして０．０８３Ｍ  Ｈ2ＰＯ4ナトリウム（ｐＨ７．２）、０．９Ｍ  ＮａＣｌ  ２ｌに対して１回交換で２４時間透析した。ペプチド／ＫＬＨコンジュゲート体全部で４．７ｍｇを５つのアリコートに等分し、凍結乾燥し、そして後の使用のために−２０℃で凍結した。
【０１５２】
実施例８
ウサギ免疫
２〜３月齢の雌ニュージーランド白ウサギを免疫に使用した。コンジュゲート体１．３４ｍｇを含有する凍結乾燥した５つのアリコートのうちの１つを蒸留水４５０ｍｃｌに溶解した。完全フロイントアジュバント４５０ｍｃｌを加え、そして混合物をホモジナイズした。注射あたり４０〜５０μｌの間の混合物を含有する１０回分の皮内注射を利用し、そしてウサギの背部に注射した。４週〜５週の間の間隔の後、動物を出血させ、そして全血９〜１１ｍｌを取り出した。次いで動物は不完全フロイントアジュバント４５０μｌを含有する蒸留水４５０ｍｃｌに溶解したコンジュゲート体１．３ｍｇを含有するブースター注射を受けた。この混合物を皮下の１つの部位に注射した。次いで毎月ウサギを中央耳動脈から出血させ、各出血で９〜１２ｍｌを収集した。免疫を４回繰り返し、そして４〜５週間隔で出血させた。
【０１５３】
実施例９
抗体精製
シグマから購入したプロテインＧアフィニティカラムで抗体を精製した。粗製ウサギ血清１０〜１５ｍｌを同量の２５ｍＭ  Ｈ2ＰＯ4ナトリウム（ｐＨ７．２）で希釈し、そして同一バッファーで予め平衡にしたプロテインＧアフィニティカラムに４℃で１６時間、多回通過させた。次いでカラムを２５ｍＭリン酸ナトリウム（７．２）１０カラム容量（１００ｍｌ全部）で溶出させ、そして０．１ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．７）でＩｇＧを溶出した。抗体を含有するクロマトグラフィー分画を１．０Ｍトリス（ｐＨ９からｐＨ７．２）で中和し、そして５０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）に対して透析した。透析後プロテインＧ精製した抗体を−２０℃で保存した。
【０１５４】
実施例１０
アフィニティカラムの調製および抗体精製
全血清から抗体を精製するために、免疫原の正確なアミノ酸配列を含有するペプチドアフィニティカラムを調製した。スルフォリンクカップリングゲル（ピアースケミカル社）を用いてシステインループペプチド（ＣＹＤＭＫＴＴＣ）（配列番号８３）をアガロースに結合させた。カップリングゲル５ｍｌを５０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）、５ｍＭ  ＥＴＤＡナトリウムを含有するバッファーで平衡にした。合成ペプチド０．７ｍｇをカップリングバッファー１ｍｌに溶解し、そしてゲル５ｍｌに加え、そして混合しながら室温で３０分間インキュベートした。カップリングゲルの入った同一の試験管に逐次的に加えたペプチドの０．８および２ｍｇアリコートで手順を繰り返し、そして３０分間インキュベートした。最後のステップの間、カップリングバッファー中ペプチド３．２ｍｇを加え、そして全混合物をさらに３時間再インキュベートした。最後の３時間のインキュベーションの後、材料を１０００×ｇで回転させ、そして上澄を除去した。前記のバッファー中５０Ｍシステイン５ｍｌをカップリングゲルに加え、そして穏やかに攪拌しながら室温で１時間インキュベーションを続けて未反応部位を遮断した。使用時までゲルを蒸留水中０．２５％アジ化ナトリウム中に保存した。抗体を精製するために、最初にアフィニティカラムを５０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．２）で平衡にした。プロテインＧアフィニティカラムから溶出され、そして予め透析されている抗体プールを３６時間カラムに循環させた。１０カラム容量（１００ｍｌ）の負荷バッファーでカラムを洗浄し、そして０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．７）で溶出させた。次いで抗体を１Ｍトリス（ｐＨ９）で中和し、そして使用時まで−２０℃で保存した。最終タンパク質濃度は１８０ｍｃｇ／ｍｌであった。
【０１５５】
実施例１１
モノクローナル抗体の生成およびスクリーニング
免疫。パイロジェン不含スイスウェブスターマウスを免疫に利用する。前記したコンジュゲートペプチドを乳化マウスＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＤＴＭエマルジョン）アジュバントと混合し、そして乳化した抗原３００ｍｃｇを腹腔内注射する。３週間隔で２回注射を繰り返す。これらの３週間隔で尾静脈から血液５０〜１００ｍｃｌを抜くことにより抗体力価を決定する。固定化β３抗原に関するマウス血清の反応性を試験することにより力価を決定する。マウスでは６週後に十分な抗体が得られ、マウスを屠殺し、そしてハイブリドーマ形成のために骨髄腫細胞と融合させるために脾臓およびリンパ節を取り出す。
【０１５６】
ハイブリドーマ形成。脾臓回収のために２匹のマウスを選択する。これらのマウスを抗原３００ｍｃｇで３回ブーストし、次いで４日後に屠殺する。血液および脾臓を収集する。脾臓細胞を回収し、そして５０％  ＰＥＧ溶液を用いて６３−ＡＧＡ．６５（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８０）細胞と融合させる。次いでこれらの融合細胞をＨＡＴ選択培地中ウェルあたり１×１０5セルで９６ウェルプレートにプレートする。１２〜１４日後、融合プレートまたはクローンをＨＴ培地中で育てる。このとき培地を収集して以下に記載するようにＥＬＩＺＡアッセイによりスクリーニングして望ましいハイブリドーマ細胞を同定する。
【０１５７】
ＥＬＩＳＡ材料。以下の材料でＥＬＩＳＡを実施する。
９６ウェルイムロンＩＶプレート（フィッシャーカタログ番号１４−２４５−１５３）
１×コーティングバッファー（０．０５Ｍ炭酸塩／重炭酸塩バッファー（ｐＨ９．６）シグマカタログ番号Ｃ３０４１）
ＰＢＳ中２％ＢＳＡ（遮断バッファー）
ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ（ＥＬＩＳＡバッファー）
０．０５％トゥイーンＰＢＳ（洗浄バッファー）
ＤＥＡ展開剤
【０１５８】
ＤＥＡ展開剤（５００ｍｌ用）：を８５％ジエタノールアミン（フィッシャーカタログ番号Ｄ４５）４．８ｍｌ；１Ｍ  ＭｇＣｌ2  ０．２５ｍｌ；およびｐＮＰＰ錠剤（シグマカタログ番号Ｎ２７６５）から生成する。展開剤を調製するために、ＤＥＡを滅菌水４００ｍｌに溶解し、そしてＨＣｌおよびＮａＯＨでｐＨ１０に調整する。ＭｇＣｌ2を加える。容量を５００ｍｌにする。４℃で保存する。ホイルで包んで光から保護する。使用の直前にｐＮＰＰ錠剤１個をバッファー２０ｍｌに加える。
【０１５９】
二次抗体はヤギ抗マウスＩｇＧアルカリ性ホスファターゼコンジュゲート体（ジャクソンイムノリサーチカタログ番号１１５−０５５−１６４）である。
ペプチドはＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ。
【０１６０】
ＥＬＩＳＡ方法。以下のように、前記したように調製した材料を用いて前記したように生成したモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡスクリーニングを実施して本発明のモノクローナル抗体を単離および提供する。
１．コーティングバッファー中５μｇ／ｍｌの濃度のペプチド５０μｌ／ウェルで４℃で一晩プレートをコートする。
２．０．０５％トゥイーンでプレートを洗浄する。
３．遮断バッファー２００μｌ／ウェルで４℃で一晩プレートを遮断する。
４．ステップ２を繰り返す。
５．一次抗体（被験抗体）を４０μｌ／ウェル（上澄）または５０μｌ／ウェル（血清希釈）で加え、そして室温で１時間インキュベートする。
６．ＰＢＳ中０．０５％トゥイーンでプレートを洗浄する。
７．１：２０００希釈の二次抗体５０μｌ／ウェルを加え、そして室温で１時間インキュベートする。
８．ＰＢＳ中０．０５％トゥイーンでプレートを洗浄する。
９．ＤＥＡ展開剤５０μｌ／ウェルを加え、そしてインキュベートさせる。
１０．４０５ｎＭで分光光度計を読む。
【０１６１】
前記は本発明の説明であり、本発明を限定することを意図するものではない。本発明は請求の範囲により定義され、請求の範囲の均等物は本発明に含まれるものとする。
【国際調査報告】
2007536265.tif 000018
2007536265.tif 000019
2007536265.tif 000020
2007536265.tif 000021