(57)【要約】【課題】ジカフェオイルキナ酸やトリカフェオイルキナ酸を、簡便に単離精製することを可能にする技術を提供する。【解決手段】ジカフェオイルキナ酸及びトリカフェオイルキナ酸からなる群から選ばれたカフェオイルキナ酸類化合物の少なくとも１種と、動物性タンパク質とを、水性媒体中で混合し、前記カフェオイルキナ酸類化合物と前記動物性タンパク質とにより前記水性媒体に不溶性の複合体を形成させる工程を含む、カフェオイルキナ酸類化合物含有複合体の製造方法である。上記製造方法においては、前記カフェオイルキナ酸類化合物がサツマイモ茎葉由来であることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジカフェオイルキナ酸及びトリカフェオイルキナ酸からなる群から選ばれたカフェオイルキナ酸類化合物の少なくとも１種と、動物性タンパク質とを、水性媒体中で混合し、前記カフェオイルキナ酸類化合物と前記動物性タンパク質とにより前記水性媒体に不溶性の複合体を形成させる工程を含む、カフェオイルキナ酸類化合物含有複合体の製造方法。
【請求項２】
前記カフェオイルキナ酸類化合物がサツマイモ由来である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記動物性タンパク質が水溶性タンパク質である、請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
前記動物性タンパク質がゼラチン、水溶性コラーゲン、水溶性エラスチン、水溶性ケラチン、及びコラーゲンペプチドからなる群から選ばれた１種又は２種以上である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記動物性タンパク質が豚由来ゼラチン及び魚由来ゼラチンからなる群から選ばれた１種又は２種以上である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかの製造方法で得られたカフェオイルキナ酸類化合物含有複合体を、含水有機溶媒で処理する工程を含む、カフェオイルキナ酸類化合物の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかの製造方法で得られたカフェオイルキナ酸類化合物含有複合体を、タンパク質分解酵素で処理する工程を含む、カフェオイルキナ酸類化合物の製造方法。
【請求項８】
ジカフェオイルキナ酸及びトリカフェオイルキナ酸からなる群から選ばれたカフェオイルキナ酸類化合物の少なくとも１種とゼラチンとで形成されたカフェオイルキナ酸類化合物含有複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はカフェオイルキナ酸類化合物に関し、より詳細には、カフェオイルキナ酸類化合物とタンパク質とによる複合体の形成に関する。
【背景技術】
【０００２】
カフェオイルキナ酸類化合物は、サツマイモ、プロポリス（蜂ヤニ）、コーヒー豆などに含まれる、生理的機能性を有するポリフェノール系物質である。とりわけ、サツマイモの茎葉に多く含まれるジカフェオイルキナ酸やトリカフェオイルキナ酸には、アルツハイマー型認知症予防効果（特許文献１）、ＡＴＰ産生促進効果（特許文献２）、神経新生促進効果（特許文献３）、血圧降下作用（非特許文献１）、ヒトがん細胞増殖抑制効果（非特許文献２）、抗糖尿病作用（非特許文献２）等が見出され、注目されている。
【０００３】
一方、ポリフェノール系物質とタンパク質とによる複合体の形成に関し、例えば、特許文献４には、茶ポリフェノールをタンパク質との複合体とすることにより、茶ポリフェノールを安定した状態で使用可能で、特有の渋味も減じるので、医薬品、食品等の分野での利用が期待される、と記載されている。
【０００４】
また、例えば、特許文献５には、茶葉の水抽出物と大豆タンパク抽出物を混合し、酸性に調整する手順により、茶葉抽出物から高価なカラムゲルを用いることなく、茶葉抽出物からカテキン類を分離し、ポリフェノール−蛋白複合体を調製することができ、生成された複合体は、茶カテキンと大豆蛋白を原料としており、食品として安全性と機能性に優れた素材である、と記載されている。
【０００５】
また、例えば、特許文献６には、ポリフェノールとタンパク質との水不溶性複合体からなるポリフェノール含有タンパク質の製造方法について記載され、その製造方法によれば、ランピング（ダマ形成）等による不均一な複合体形成が防止され、ポリフェノールとタンパク質の均一な複合体を得ることができ、当該製造方法によって得られるポリフェノール含有タンパク質は、苦味・渋味が大きく低減される、と記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００７／０９１６１３号
【特許文献２】特許第５４０３５８２号公報
【特許文献３】特開２０１７−１４５２１５号公報
【特許文献４】特開平０２−２０２９００号公報
【特許文献５】特開２００２−６８９９１号公報
【特許文献６】特開２０１２−５１８４０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】石黒 浩二、吉元 誠、鍔田 仁人、高垣 欣也、「サツマイモ茎葉の血圧降下作用」、日本食品科学工学会誌、第54巻 (2007) 1号 p. 45-49
【非特許文献２】吉元 誠、「サツマイモ茎葉に含まれるポリフェノール類の薬理作用」、食品工業、第48巻 (2005) 6号 p. 69-75
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、天然物を由来にした基原からジカフェオイルキナ酸やトリカフェオイルキナ酸を単離精製する技術に関しては、例えば、熱水や含水エタノールで抽出後に合成吸着剤を用いてカラム精製を行う方法が知られているが、そのような方法では、工業的に大量生産するのに製造コストがかかり高価なものになってしまうという問題があった。また、上記特許文献４〜６に記載の技術は、カフェオイルキナ酸類化合物について着眼したものではなかった。
【０００９】
よって、本発明の目的は、ジカフェオイルキナ酸やトリカフェオイルキナ酸を、より簡便に単離精製することを可能にする技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ジカフェオイルキナ酸やトリカフェオイルキナ酸が、特定のタンパク質に対して複合体を形成することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、第１の観点では、ジカフェオイルキナ酸及びトリカフェオイルキナ酸からなる群から選ばれたカフェオイルキナ酸類化合物の少なくとも１種と、動物性タンパク質とを、水性媒体中で混合し、前記カフェオイルキナ酸類化合物と前記動物性タンパク質とにより前記水性媒体に不溶性の複合体を形成させる工程を含む、カフェオイルキナ酸類化合物含有複合体の製造方法を提供するものである。
【００１２】
上記構成からなる本発明によれば、ジカフェオイルキナ酸やトリカフェオイルキナ酸が、特定のタンパク質に対して複合体を形成し、水性媒体中で不溶物として析出するので、他の夾雑物が含まれる、例えば植物の一次的な抽出物等からであっても、ジカフェオイルキナ酸やトリカフェオイルキナ酸等のカフェオイルキナ酸類化合物を、簡便に単離精製することができる。
【００１３】
上記製造方法においては、前記カフェオイルキナ酸類化合物がサツマイモ由来であることが好ましい。
【００１４】
また、上記製造方法においては、前記動物性タンパク質が水溶性タンパク質であることが好ましい。
【００１５】
また、上記製造方法においては、前記動物性タンパク質がゼラチン、水溶性コラーゲン、水溶性エラスチン、水溶性ケラチン、及びコラーゲンペプチドからなる群から選ばれた１種又は２種以上であることが好ましい。
【００１６】
また、上記製造方法においては、前記動物性タンパク質が豚由来ゼラチン及び魚由来ゼラチンからなる群から選ばれた１種又は２種以上であることが好ましく、特に豚由来ゼラチンが好ましい。
【００１７】
一方、本発明は、第２の観点では、上記の製造方法で得られたカフェオイルキナ酸類化合物含有複合体を、含水有機溶媒で処理する工程を含む、カフェオイルキナ酸類化合物の製造方法を提供するものである。
【００１８】
上記構成からなる本発明によれば、上記の製造方法で得られたカフェオイルキナ酸類化合物含有複合体を、含水有機溶媒で処理することにより、その溶媒中には、ジカフェオイルキナ酸やトリカフェオイルキナ酸等のカフェオイルキナ酸類化合物が溶出し、一方、複合体を形成させたタンパク質はほとんど溶出しないか、溶出しても一部であるので、更にそのカフェオイルキナ酸類化合物の精製度を高めることができる。
【００１９】
また、本発明は、第３の観点では、上記の製造方法で得られたカフェオイルキナ酸類化合物含有複合体を、タンパク質分解酵素で処理する工程を含む、カフェオイルキナ酸類化合物の製造方法を提供するものである。
【００２０】
上記構成からなる本発明によれば、上記の製造方法で得られたカフェオイルキナ酸類化合物含有複合体を、タンパク質分解酵素で処理することにより、その処理後には、複合体を形成させたタンパク質がほとんど分解しているか、少なくとも一部は分解するので、ひいては上記複合物が分解するので、これにより、ジカフェオイルキナ酸やトリカフェオイルキナ酸等のカフェオイルキナ酸類化合物を再度溶液中に溶出させることができる。そして、所望により、更にその精製度を高めることができる。
【００２１】
更に、本発明は、第４の観点では、ジカフェオイルキナ酸及びトリカフェオイルキナ酸からなる群から選ばれたカフェオイルキナ酸類化合物の少なくとも１種とゼラチンとで形成されたカフェオイルキナ酸類化合物含有複合体を提供するものである。
【００２２】
上記構成からなる本発明によれば、例えばヒトが経口的に摂取しても安全であり、食品をはじめ、医薬品、化粧品、動物飼料等の様々な分野に応用可能な有用素材を提供することができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、ジカフェオイルキナ酸やトリカフェオイルキナ酸を、非常に簡便に単離精製することを可能にする技術が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１には、溶液ＡをＨＰＬＣに供したときの測定チャートと、サンプル１５において複合体形成後に固液分離して得られた液部溶液をＨＰＬＣに供したときの測定チャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
一般に、カフェ酸のカルボキシル基がキナ酸のヒドロキシ基とエステル結合してなる化合物は、カフェオイルキナ酸類化合物として知られている。本発明は、そのうち、１分子のキナ酸に対して２分子のカフェ酸が結合してなるジカフェオイルキナ酸や、１分子のキナ酸に対して３分子のカフェ酸が結合してなるトリカフェオイルキナ酸に、特に適用されるものである。
【００２６】
具体的には、天然物を由来として、これを基原としたジカフェオイルキナ酸としては、例えば、下記化学式（１）で表わされる３,４−ジ−O−カフェオイルキナ酸や、下記化学式（２）で表わされる３,５−ジ−O−カフェオイルキナ酸や、下記化学式（３）で表わされる４,５−ジ−O−カフェオイルキナ酸がある。
【００２７】
【化１】
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【００２８】
【化２】
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【００２９】
【化３】
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【００３０】
また、同様に、天然物を由来として、これを基原としたトリカフェオイルキナ酸としては、下記化学式（４）で表わされる３,４,５−トリ−O−カフェオイルキナ酸がある。
【００３１】
【化４】
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【００３２】
ただし、本発明が適用されるカフェオイルキナ酸類化合物としては、具体的に上記に記載した化合物に限られるものではなく、上述したとおり、１分子のキナ酸に対して２分子のカフェ酸が結合してなる化合物や、１分子のキナ酸に対して３分子のカフェ酸が結合してなる化合物であればよい。また、上記カフェオイルキナ酸類化合物として、単一種類の化合物に対して適用されてもよく、複数種類の化合物の混合物に対して適用されてもよい。更に、本発明が適用される上記カフェオイルキナ酸類化合物としては、化学的合成品であってもよく、天然物由来のものであってもよい。上記カフェオイルキナ酸類化合物を含む天然物としては、例えば、サツマイモ、ヨモギ、ゴボウ、コーヒー、セイタカアワダチソウ等が挙げられる。
【００３３】
本発明の好ましい態様においては、上記カフェオイルキナ酸類化合物がサツマイモ由来である。特に好ましくはサツマイモ茎葉由来である。一般に、サツマイモ茎葉から水、含水有機溶媒（好ましい有機溶媒はエタノール、メタノール、イソプロパノール）等によって抽出した一次的な抽出物中には、ポリフェノール系物質としてカフェオイルキナ酸類化合物（クロロゲン酸（５−カフェオイルキナ酸）を含むモノカフェオイルキナ酸、ジカフェオイルキナ酸、及びトリカフェオイルキナ酸を含む）が含まれており、なかでも、上述した、３,４−ジ−O−カフェオイルキナ酸や、３,５−ジ−O−カフェオイルキナ酸や、４,５−ジ−O−カフェオイルキナ酸の含有量が豊富である。また、それらジカフェオイルキナ酸よりは低含有量ながら、上述した、３,４,５−トリ−O−カフェオイルキナ酸も含んでいる。
【００３４】
本発明の好ましい態様において用いられる上記サツマイモの品種は特に限定されないが、例えば、コガネセンガン、ムラサキマサリ、すいおう、ジョイホワイト、シロユタカ、サツマスターチ、アヤムラサキ、高系１４号等であり、好ましくはコガネセンガン、ムラサキマサリ、すいおうである。
【００３５】
本発明は、このような植物の一次的な抽出物等に適用する場合であっても、その多種・多様な夾雑物が含まれる抽出物中から、上記カフェオイルキナ酸類化合物を、簡便に単離精製することができる。なお、植物抽出物中には、往々にして、多糖成分が多く含まれていることがあるので、そのような場合には、まず、その多糖類をエタノール、メタノール、イソプロパノール等によるアルコール処理により沈殿させたうえ、固液分離により除いておくことが、より好ましい（多糖除去処理を含むことがより好ましい）。これによれば、多種・多様な夾雑物が含まれる植物の一次的な抽出物等からの、上記カフェオイルキナ酸類化合物の精製効率を、より高めることができる。
【００３６】
一方、本発明に用いられるタンパク質としては、水性媒体中でジカフェオイルキナ酸及びトリカフェオイルキナ酸からなる群から選ばれたカフェオイルキナ酸類化合物の少なくとも１種と混合したとき、その水性媒体に不溶性の、そのカフェオイルキナ酸類化合物との複合体を形成できるものであればよいが、複合体形成の場である水性媒体中において分子レベルでよく分散させようとすることを考慮すると、少なくとも室温の水中で凝集が起こらない程度に水溶性を有するものであることが好ましい。また、複合体を形成したときには、その水性媒体に対して不溶性にさせることを考慮すると、動植物等の天然物を由来にしてその基原から一旦は水に難溶性の形態で得られ、それを加熱・加圧処理や酸・アルカリ処理や酵素処理等の各種処理や、それらの処理の任意の組み合わせ等の処理により、水溶性を向上させてなるタンパク質であることがより好ましい。より具体的には、後述の実施例によれば、ゼラチン、水溶性コラーゲン、水溶性エラスチン、水溶性ケラチン、コラーゲンペプチド等、動物性タンパク質由来の水溶性タンパク質が例示される。上記タンパク質としては、単一種類のタンパク質を用いてもよく、複数種類のタンパク質を併用してもよい。
【００３７】
本発明においては、上記タンパク質がゼラチンであることが好ましい。一般に、ゼラチンは、動物のコラーゲン質に由来して、酸処理、熱処理、アルカリ処理、加圧処理等の化学的及び／又は物理的手段によって水に可溶な形態に抽出したものであり、その由来によっては、性質を大きく異にする。例えば、豚、牛、魚等に由来するゼラチンが汎用されているが、本発明においては、豚、魚由来ゼラチンが好ましく、このうち特に豚由来ゼラチンを用いることがより好ましい。後述の実施例で示されるように、豚由来ゼラチンによれば、上記カフェオイルキナ酸類化合物との複合体を形成したうえ水性媒体中で不溶物として析出させる能力が高い。また、ゼラチンの品質規格の１つとしてゼリー強度が知られるが、本発明において上記タンパク質がゼラチンである場合、そのゼリー強度が８０〜３３０（ｇ）であることが好ましく、２３０〜３３０（ｇ）であることが特に好ましい。このようなゼリー強度の範囲の品質のゼラチンを用いれば、有効に上記カフェオイルキナ酸類化合物との複合体を形成させることができる。なお、後述の実施例で示されるように、ゼリー強度が高いほうが、上記カフェオイルキナ酸類化合物と複合体を形成したうえ水性媒体中で不溶物として析出させる能力が、より高い傾向がある。
【００３８】
上記ゼリー強度とは、標準測定法として日本工業規格JIS K 6503:2001「にかわ及びゼラチン」があり、その標準測定法によれば、ゼラチンを水に溶解して濃度６．６７ｗ／ｖ％に調整し、その後１０℃で１７時間冷却して調製したゼリーの表面を、２分の１インチ（１２．７ｍｍ）径のプランジャーで４ｍｍ押し下げるのに必要な荷重を意味するものとされており、本明細書においても同様の意義であり、また、同様にして測定することができる。
【００３９】
本発明においては、上記カフェオイルキナ酸類化合物と上記タンパク質とを、水性媒体中で混合し、その水性媒体に不溶性の複合体を形成させる。これにより、上記カフェオイルキナ酸類化合物が、その水性媒体中に析出する不溶物に取り込まれる一方、他の夾雑物は溶液中に残るので、これにより、上記カフェオイルキナ酸類化合物を簡便に単離精製することができる。そして、上記複合体の形成の後には、適宜適当な固液分離手段により、その複合体を回収することができる。固液分離手段としては、遠心分離装置、フィルターろ過等が挙げられる。また、それに加えて、又は、それに代えて、適宜適当な乾燥手段により、水分の除去を行ったり、その水性媒体や夾雑成分の溜去を行ったりしてもよい。乾燥手段としては、噴霧乾燥、真空乾燥、凍結乾燥等が挙げられる。
【００４０】
上記水性媒体としては、複合体形成の場を提供することができればよく、特に制限はないが、水を主成分とするものであることが好ましく、より具体的には、上記複合体を形成させる際の系全体中には、水が５０質量％以上含まれていることが好ましく、８０質量％以上含まれていることがより好ましい。ただし、上記カフェオイルキナ酸類化合物を簡便に単離精製するという、本発明の作用効果に実質的に悪影響を与えない成分であれば、任意に他の成分を含み得る。
【００４１】
上記水性媒体中で混合する態様としては、上記カフェオイルキナ酸類化合物と上記タンパク質との接触を促すようにすればよく、特に制限はないが、典型的には、例えば、系全体中に、上記カフェオイルキナ酸類化合物（複数種類の場合にはその合計質量換算にして）が０．１〜３０質量％含まれていることが好ましく、１〜２０質量％含まれていることがより好ましい。また、上記タンパク質（複数種類の場合にはその合計質量換算にして）が０．１〜３０質量％含まれていることが好ましく、１〜２０質量％含まれていることがより好ましい。また、上記カフェオイルキナ酸類化合物（複数種類の場合にはその合計質量換算にして）と、上記タンパク質（複数種類の場合にはその合計質量換算にして）との質量比が１０：１〜１：１０であることが好ましく、５：１〜１：５であることがより好ましい。特に、上記タンパク質としてゼラチン、より好ましく豚由来ゼラチンを用いたときは、混合の際の系全体中に、そのゼラチンが１〜２０質量％含まれていることが好ましく、２〜１０質量％含まれていることがより好ましい。また、上記カフェオイルキナ酸類化合物（複数種類の場合にはその合計質量換算にして）と、そのゼラチンとの質量比が７：１〜１：７であることが好ましく、４：１〜１：４であることがより好ましい。上記カフェオイルキナ酸類化合物や上記タンパク質の存在量が低すぎる場合には、複合体の形成功率や不溶物の析出効率が下がる場合がある。上記カフェオイルキナ酸類化合物や上記タンパク質の存在量が高すぎる場合には、上記水性媒体中でその存在量の高い化合物自身が凝集を起こす等により、相手化合物との接触がうまく促されない場合がある。そして、１０〜３０℃で、０．５〜７２時間保持する等により、複合体の形成を十分なさしめることが好ましい。混合の際には、所望に応じて、適宜適当な撹拌手段によりその系をなす溶液を撹拌するようにしてもよい。
【００４２】
なお、上記水性媒体中で混合する際、ｐＨのコントロールは特に必要的ではないが、それを行った方が複合体形成に有利であればｐＨコントロールを行ってもよい。
【００４３】
以上のようにして得られた複合体は、ジカフェオイルキナ酸及びトリカフェオイルキナ酸からなる群から選ばれたカフェオイルキナ酸類化合物の少なくとも１種とタンパク質とで形成された、上記カフェオイルキナ酸類化合物を含有する複合体となっている。この場合、上述したように、所望に応じて、適宜適当な固液分離手段により複合体を水性媒体から回収したり、適宜適当な乾燥手段により乾燥させたりしてもよく、その組成物としての形態に特に制限はないが、典型的には、例えば、上記カフェオイルキナ酸類化合物（複数種類の場合にはその合計質量換算にして）が固形分中１〜９０質量％含まれていることが好ましく、１０〜５０質量％含まれていることがより好ましい。また、上記タンパク質（複数種類の場合にはその合計質量換算にして）が固形分中１０〜９９質量％含まれていることが好ましく、５０〜９０質量％含まれていることがより好ましい。また、上記カフェオイルキナ酸類化合物（複数種類の場合にはその合計質量換算にして）と、上記タンパク質（複数種類の場合にはその合計質量換算にして）との質量比が１０：１〜１：１０であることが好ましく、７：１〜１：７であることがより好ましい。特に、上記タンパク質としてゼラチン、より好ましく豚由来ゼラチンを用いたときは、そのゼラチンが固形分中５〜７０質量％含まれていることが好ましく、１０〜６０質量％含まれていることがより好ましい。また、上記カフェオイルキナ酸類化合物（複数種類の場合にはその合計質量換算にして）と、そのゼラチンとの質量比が１０：１〜１：１０であることが好ましく、６：１〜６：１であることがより好ましい。
【００４４】
本発明の好ましい態様においては、上記のようにして得られた複合体を含水有機溶媒で処理するようにしてもよい。これにより、その溶媒中には、上記カフェオイルキナ酸類化合物が溶出する一方、複合体を形成させたタンパク質はほとんど溶出しないか、溶出しても一部であるので、更にそのカフェオイルキナ酸類化合物の精製度を高めることができる。用いる含水有機溶媒としては、エタノール、メタノール、イソプロパノール、アセトン等からなるものを適宜選択して用いればよいが、溶出効率を考慮すると、特に含水エタノール又は含水アセトンを用いることが好ましい。また、その含水率としては、５〜７０ｖ／ｖ％であることが好ましく、２０〜５０ｖ／ｖ％であることがより好ましい。含水有機溶媒は、複数種類の有機溶媒をその溶出処理の際に一緒に併用して含水溶媒の形態にして用いてもよく、複数種類の含水有機溶媒で段階的に溶出の処理を行って、得られた溶出物を後で合わせるようにしていてもよい。
【００４５】
上記含水有機溶媒で溶出させる態様としては、上記複合体と上記含水有機溶媒との接触を促すようにすればよく、特に制限はないが、典型的には、例えば、上記複合体の１質量部に対して、上記含水有機溶媒を５〜７０質量部用いて溶出させることが好ましく、１０〜５０質量部用いて溶出させることがより好ましい。また、２０〜５０℃で、０．５〜２４時間保持する等により、複合体からの溶出を十分なさしめることが好ましい。また、所望に応じて、適宜適当な撹拌手段により、その溶出系をなす溶液を撹拌するようにしてもよい。また、溶出の処理は、超音波処理を施しながら行ってもよい。これによれば、溶出効率をより高めることができる。
【００４６】
上記のようにして得られた含水有機溶媒による溶出物は、適宜適当な固液分離手段により、その液部を回収することができる。これにより、液部に溶出しないタンパク質を除去することができる。固液分離手段としては、遠心分離、遠心ろ過、フィルターろ過等が挙げられる。また、それに加えて、又は、それに代えて、適宜適当な乾燥手段により、水分の除去を行ったり、その水性媒体や夾雑成分の溜去を行ったりしてもよい。乾燥手段としては、噴霧乾燥、真空乾燥、凍結乾燥等が挙げられる。
【００４７】
本発明の好ましい態様においては、上記のようにして得られた複合体をタンパク質分解酵素で処理するようにしてもよい。これにより、その処理後には、複合体を形成させたタンパク質がほとんど分解しているか、少なくとも一部は分解するので、ひいては上記複合物が分解するので、上記カフェオイルキナ酸類化合物を再度溶液中に溶出させることができる。用いる酵素としては、プロティナーゼもしくはペプチターゼの中から適宜選択して用いればよいが、本発明に用いられる、上記タンパク質に対する分解効率を考慮すると、アスパラギン酸プロテアーゼ（例えばマイタケプロテアーゼ）もしくはシステインプロテアーゼ（例えばパパイン）等を用いることが好ましい。
タンパク質分解酵素による処理条件は、適宜、用いる酵素に至適な条件が知られているので、その条件に準じて設定すればよい。
【００４８】
上記のようにして得られた酵素による処理物は、適宜適当な分離手段により、その酵素分解物を除去して、上記カフェオイルキナ酸類化合物を回収することができる。例えば、酵素分解物はアミノ酸類であるので、それらの分離手段として好ましい方法としては、イオン（カチオン）交換樹脂を用いる方法が挙げられる。イオン（カチオン）交換樹脂を充填したカラムを通すことにより、処理物中のアミノ酸は吸着除去されるので溶出液を減圧濃縮等すれば、更に精製度の高められた上記カフェオイルキナ酸類化合物が得られる。
【００４９】
本発明により提供される、上記カフェオイルキナ酸類化合物含有複合体や上記カフェオイルキナ酸類化合物は、食品をはじめ、医薬品、化粧品、動物飼料等の様々な分野に応用可能な有用素材等として有用である。特に、例えば、上述したようにカフェオイルキナ酸類化合物には種々の機能性が知られていうるので、そのような機能性を有するサプリメント等として有用である。更には、食品添加物、もしくは育毛用化粧品（特開２０１５−０３６３７０号公報参照）等として有用である。
【００５０】
以上説明したように、本発明によれば、出発物に含まれているジカフェオイルキナ酸及びトリカフェオイルキナ酸からなる群から選ばれたカフェオイルキナ酸類化合物の少なくとも１種を、水性媒体中で、特定のタンパク質との複合体を形成させて、その水性媒体に対して不溶性とすることにより、出発物に含まれている他の夾雑成分から、非常に簡便に単離精製する技術を提供することができ、また、それによって、有用素材を工業的スケールでより安価に生産する技術を提供することができる。なお、「単離精製」とは、本明細書おいては、出発物に含まれている上記カフェオイルキナ酸類化合物以外の他の夾雑成分の少なくとも一部が除かれることを意味するものである。より具体的は、出発物に含まれている上記カフェオイルキナ酸類化合物以外の他の夾雑成分のうち、その出発物に含まれていた固形分あたりの含有濃度（質量％）に換算して、その含有濃度から５０質量％以上の量で減じていることを意味するものであり、より典型的には５０〜９８質量％の量で減じていることを意味するものであり、更により典型的には８０〜９８質量％の量で減じていることを意味するものである。
【実施例】
【００５１】
以下、試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら試験例の形態に限定されるものではない。
【００５２】
まず、下記に示す溶液Ａ〜溶液Ｃを調製した。
【００５３】
（溶液Ａ）ジカフェオイルキナ酸を含有する水溶液
市販のサツマイモ茎葉由来エキス（商品名「ポリフェミン」、晨星興産株式会社製）を使用した。このサツマイモ茎葉由来エキスは、約２質量％のカフェオイルキナ酸類化合物を含有する液体状組成物であって、含有するカフェオイルキナ酸類化合物のうちジカフェオイルキナ酸が主成分であり、若干のクロロゲン酸（５−カフェオイルキナ酸）とトリカフェオイルキナ酸を含む（以下では、単に「サツマイモ茎葉由来エキス」という。）
上記サツマイモ茎葉由来エキスの主成分であるジカフェオイルキナ酸の純度を高めるために、カラム精製を行った。具体的には、上記サツマイモ茎葉由来エキスを吸着樹脂である合成吸着剤（ＭＣＩ ｇｅｌ ＣＨＰ２０Ｐ（三菱化学株式会社製））が充填された吸着カラムに吸着させた。次に、用いた吸着樹脂容量の３倍容量程度の水で、吸着カラムを洗浄することにより、吸着樹脂に吸着しなかった非吸着夾雑物を除去した。更に、用いた吸着樹脂容量の２倍容量の含水エタノール（２０ｖ／ｖ％エタノール含有）で溶出することにより、クロロゲン酸を主成分とする夾雑物を除去した。最後に、用いた吸着樹脂容量の２倍容量の含水エタノール（４０ｖ／ｖ％エタノール含有）で溶出し、ジカフェオイルキナ酸の溶出画分を集めた。
【００５４】
得られたジカフェオイルキナ酸の溶出画分を、エバポレーターで濃縮し乾固させたところ、ジカフェオイルキナ酸を含有する固形物を得ることができた。収率として、サツマイモ茎葉由来エキスを１ｋｇ用いたとき、得られた固形物は１４gであった。標品を用いて固形物中の含有率をＨＰＬＣ分析したところ、本固形物は３種類のジカフェオイルキナ酸異性体、すなわち、３,４−ジ−O−カフェオイルキナ酸、３,５−ジ−O−カフェオイルキナ酸、及び４,５−ジ−O−カフェオイルキナ酸の混合物であり、３種合わせて９０質量％以上の純度であった。なお、クロロゲン酸とトリカフェオイルキナ酸はほとんど検出されなかった。この固形物を脱気した蒸留水に溶解し、ジカフェオイルキナ酸の５質量％水溶液とした。
【００５５】
（溶液Ｂ）トリカフェオイルキナ酸を含有する水溶液
上記サツマイモ茎葉由来エキスに含まれるトリカフェオイルキナ酸の量は極めて微量である。そのため、再表２０１４／１６８１３９記載の方法でトリカフェオイルキナ酸を合成し、その５質量％水溶液を調製した。
【００５６】
（溶液Ｃ）多糖類除去エキス溶液
上記サツマイモ茎葉由来エキスは、上述したようにカフェオイルキナ酸類化合物を約２質量％含有する液体状組成物であるが、カフェオイルキナ酸類化合物以外にも多種多様な夾雑物を含む組成物であり、特に水溶性多糖類を多く含む。そこで、多糖類の含有量を減らすための処理を行った。具体的には、上記サツマイモ茎葉由来エキス１００ｇに対してエタノール２００ｍＬを添加し、約１時間撹拌した。その後室温で一晩放置し、析出した水不溶性多糖類を吸引ろ過した。ろ過する際、ろ紙の上にろ過助材として市販のセルロース粉体を使用した。ろ液を減圧濃縮したところ約９ｇの固形物が得られた。それを水に溶解し２５ｇの溶液とすることにより、ジカフェオイルキナ酸の含有濃度として、約５質量％に調整することができた。
【００５７】
（試験例１）各種水溶性高分子化合物によるジカフェオイルキナ酸との複合体の形成試験
タンニンのようなポリフェノール（主にピロガロール基を分子内有するポリフェノール）と水中で複合体を形成して沈殿することが知られている水溶性高分子化合物を１４種類選択し、それらを蒸留水に溶解し５質量％水溶液を調製した。
【００５８】
表１には、使用した１４種類の水溶性高分子化合物の由来を示す。なお、サンプル３、４、７に用いた高分子化合物は、参考にした文献に基づき調製した後に凍結乾燥して粉末としてから使用した。それら以外のサンプルに用いた高分子化合物はすべて粉末として入手した。使用した高分子化合物によってはその５質量％水溶液に若干の濁りが生ずることがあったが、その場合は遠心分離機を用いて濁り成分を沈殿させ、その上澄み液を用いた。
【００５９】
これらの５質量％水溶液１０ｍＬと、溶液Ａ（ジカフェオイルキナ酸を５質量％含有する水溶液）２ｍＬとを混合し、沈殿の有無を観測した。なお、いずれの場合にも混合液のｐＨ調整は行わなかった。
【００６０】
【表１】
2019199453.tif 000006
【００６１】
その結果、表１に示すように、ジカフェロイルキナ酸を含有する溶液Ａは、タンニンに比べて複合体を形成しにくく、濁り生成以上の変化を示したのは動物性タンパク質の由来の水溶性高分子であるゼラチン、水溶性コラーゲン、水溶性エラスチン、コラーゲンペプチド（いずれも豚由来）、水溶性ケラチン（羽毛由来）および加水分解ケラチン（羊毛由来）を用いたサンプル１〜６であった。それらの中で複合体を形成して明確に沈殿を生じたのはゼラチンを用いたサンプル１のみであった。
【００６２】
（試験例２）各種原料由来ゼラチンによるジカフェオイルキナ酸との複合体の形成試験
試験例１において、ゼラチンがジカフェオイルキナ酸との複合体を形成しやすいことが判明したので、原料の異なるゼラチンの種類によって複合体形成がどのように異なるかを試験した。用いたゼラチンは表２に示した。実験条件はを用いて、試験例１と同様に、５質量％に調製したゼラチン水溶液１０ｍＬと、溶液Ａ（ジカフェオイルキナ酸を５質量％含有する水溶液）の２ｍＬを混合して観測した。
【００６３】
【表２】
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【００６４】
その結果、表２に示すように、ゼラチンでもその原料が重要であり、豚（豚皮）原料を用いたサンプル１５では沈殿生成、魚原料のゼラチンを用いたサンプル１６では二層分離（上層が複合体）して明確な複合体生成を示したが、牛（牛骨）原料ゼラチンのサンプル１７は二層分離せず複合体生成を確認できなかった。
【００６５】
（試験例３）残存ジカフェオイルキナ酸の定量及びゼラチンのゼリー強度の影響
試験例２で調製したサンプル１５と１６について、複合体形成試験後に、更に１２時間放置し、その後、遠心分離にかけて固液分離し、得られた液部溶液についてＨＰＬＣ分析を行った。そして、複合体形成前の溶液Ａ２ｍＬ中に含まれたジカフェオイルキナ酸の質量に対する残存率（元の質量に対する百分率）を求めた。また、ゼリー強度の異なるゼラチンを用いた場合についても、試験例２と同じ条件で複合体形成後に、同様に残存率を求めた。
【００６６】
【表３】
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【００６７】
その結果、表３に示すように、複合体形成後に固液分離して得られた液部溶液中に残存するジカフェオイルキナ酸は、サンプル１５の場合は４．６％の残存率であり、サンプル１６の場合は３６％の残存率であった。これは、試験例２で示されたように豚原料ゼラチンが魚原料ゼラチンに比べてジカフェオイルキナ酸と複合体を形成しやすいことと、よく相関していた。
【００６８】
また、表３に示す結果からは、同じ基原に由来するゼラチンにおいては、ゼリー強度が高いほうが、より複合体形成に有利であることが明らかとなった。ゼリー強度の影響は、魚原料ゼラチンの場合に、より大きかった。更に、同程度のゼリー強度であっても、豚原料ゼラチンが魚原料ゼラチンに比べてジカフェオイルキナ酸との複合体形成に有利であることが明らかとなった（サンプル１８に対するサンプル１６の比較及びサンプル１９に対するサンプル２０の比較）。
【００６９】
なお、図１には、溶液ＡをＨＰＬＣに供したときの測定チャートと、サンプル１５において複合体形成後に固液分離して得られた液部溶液をＨＰＬＣに供したときの測定チャートを示す。
【００７０】
（試験例４）ゼラチンによるトリカフェオイルキナ酸との複合体の形成試験
試験例３のサンプル１９で使用した豚原料ゼラチン（ゼリー強度：２３５〜２６５ｇ、商品名「ＡＰＨ−２５０」新田ゼラチン株式会社製）を使用し、その５質量％水溶液１０ｍＬと、溶液Ｂ（トリカフェオイルキナ酸を５質量％含有する水溶液）２ｍＬとを混合して、沈殿の有無を観測した。
【００７１】
その結果、試験例１ではサンプル１により、また、試験例２ではサンプル１５により、それぞれジカフェオイルキナ酸について観察されたのと同様、トリカフェオイルキナ酸についても豚原料ゼラチンとの混合により、明確な沈殿を生成した。これを遠心分離にかけて固液分離し、得られた液部溶液をＨＰＬＣ分析で定量したところ、複合体形成前の溶液Ｂ２ｍＬ中に含まれたトリカフェオイルキナ酸の質量に対する残存率（元の質量に対する百分率）は２．０％であった。よって、トリカフェイロキナ酸は、ジカフェオイルキナ酸と同様に、ゼラチンとの混合により容易に複合体を形成することが明らかとなった。
【００７２】
（試験例５）サツマイモ茎葉由来エキスを使用した複合体の形成試験
試験例３のサンプル１９で使用した豚原料ゼラチン（ゼリー強度：２３５〜２６５ｇ、商品名「ＡＰＨ−２５０」新田ゼラチン株式会社製）を使用し、その５質量％水溶液１０ｍＬと、溶液Ｃ（サツマイモ茎葉由来エキスに多糖類除去処理を施したうえ、ジカフェオイルキナ酸の含有濃度が、約５質量％に調整された水溶液）２ｍＬとを混合したとこころ沈殿を生成した。これを遠心分離にかけて固液分離し、得られた液部溶液をＨＰＬＣ分析で定量したところ、複合体形成前の溶液Ｃ２ｍＬ中に含まれたジカフェオイルキナ酸の質量に対する残存率（元の質量に対する百分率）は３８％であった。よって、サツマイモ茎葉由来エキスから多糖類を除去しただけの組成物中には、すなわちそのような祖エキス中には、複合体形成を阻害する成分が含まれている可能性が考えられた。
【００７３】
そこで、上記豚原料ゼラチン（ゼリー強度：２３５〜２６５ｇ、商品名「ＡＰＨ−２５０」新田ゼラチン株式会社製）の５質量％水溶液を２０ｍＬに増量し、１０ｍＬずつ分割して添加する試験（１時間間隔）を行ったところ、ジカフェオイルキナ酸の残存率は５％に減じた。よって、サツマイモ茎葉由来エキスから多糖類を除去しただけの組成物中から、すなわちそのような祖エキス中から、９５％のジカフェオイルキナ酸をゼラチン複合体として取り込めることが明らかとなった。一方、溶液Ｃには少量のクロロゲン酸（５-カフェオイルキナ酸）が含まれるが、上記固液分離後の液部溶液をＨＰＬＣ分析にかけた結果によれば、全く複合体には取り込まれずにその液部溶液中に残存していた。
【００７４】
以上の結果によれば、このような複合体形成による方法が、ジカフェオイルキナ酸やトリカフェオイルキナ酸について、簡便に単離精製する方法になり得ることが示された。
【００７５】
なお、多糖類を除去しない（アルコール処理をしない）サツマイモ茎葉由来エキスの場合、同じ条件で複合体の形成試験を行ったところ、ジカフェオイルキナ酸の残存率は２０％であった。よって、ややゼラチン複合体への取り込み量は減じたものの、多糖類等のより多様な成分を含む粗エキス中からであっても、ジカフェオイルキナ酸やトリカフェオイルキナ酸について、簡便に単離精製する方法になり得ることが示された。
【００７６】
（試験例６）ゼラチンによるクロロゲン酸との複合体の形成試験
クロロゲン酸（５-カフェオイルキナ酸）を試薬として入手し、クロロゲン酸の５質量％水溶液を調製した。その２ｍＬと、試験例４や試験例５で調製した上記豚原料ゼラチン（ゼリー強度：２３５〜２６５ｇ、商品名「ＡＰＨ−２５０」新田ゼラチン株式会社製）の５質量％水溶液の１０ｍＬとを撹拌混合し、２４時間放置したが沈殿は生じなかった。１週間放置後も濁りさえ生じることはなかった。このことからクロロゲン酸はゼラチンとは複合体を形成しないものと考えられた。
【００７７】
（試験例７）ジカフェオイルキナ酸／ゼラチン複合体の調製
試験例４〜６で調製した上記豚原料ゼラチン（ゼリー強度：２３５〜２６５ｇ、商品名「ＡＰＨ−２５０」新田ゼラチン株式会社製）の５質量％水溶液４００ｇ（ゼラチン含量２０ｇ）と、溶液Ａ（ジカフェオイルキナ酸を５質量％含有する水溶液）の８０ｇ（ジカフェオイルキナ酸含量４ｇ）を混合して得られた沈殿物を遠心分離した。得られた沈殿物を水洗ろ過した後に凍結乾燥することにより２３．２ｇの固形物が得られた。上記固液分離した液部溶液のＨＰＬＣ分析から、固形物に含有するジカフェオイルキナ酸の量は３．６ｇと推定できた。
【００７８】
（試験例８）複合体から含水有機溶媒を用いたジカフェオイルキナ酸の回収
試験例７で得られた複合体の各５ｇを、含水エタノール（５０ｖ／ｖ％エタノール含有）の２５ｍＬ又は含水アセトン（５０ｖ／ｖ％アセトン含有）の２５ｍＬにそれぞれ加え、超音波洗浄機でおよそ３０分間超音波を照射して、その後室温で２４時間放置した。その後、それらの溶液に５℃に冷却したエタノール５０ｍＬに注ぎ、３０分ほど撹拌したのち遠心分離にかけて沈殿物を除いた。これを濃縮乾固した固形物をＨＰＬＣ分析にかけてジカフェオイルキナ酸の量を定量したところ、純度９０質量％以上のジカフェオイルキナ酸がそれぞれ０．６５ｇ、０．７０ｇ得られた。回収率は、用いた複合体５ｇ中に含まれていたジカフェオイルキナ酸の量に対する百分率として、それぞれ８４％と９０％であり、含水アセトンを用いたほうが、含水エタノールを用いるよりも、若干回収率に優れていた。
【００７９】
以上の結果から、上記ゼラチンとの複合体を含水有機溶媒で処理する工程を経ることにより、純度の高いジカフェオイルキナ酸が調製可能であることが明らかかとなった。
【００８０】
（試験例９）複合体の酵素分解によるジカフェオイルキナ酸の再生
試験例７で得られた複合体５ｇに水５０ｍＬを加え、それにプロテナーゼＫ（和光純薬製）２ｍｇを添加して、３６℃の恒温容器中に約２日間放置した。得られた溶液をＨＰＬＣ分析にかけてジカフェオイルキナ酸の量を定量したところ、用いた複合体５ｇ中に含まれていたジカフェオイルキナ酸の量に対する百分率として、９８％のジカフェオイルキナ酸が溶液中に溶出していることが明らかとなった。
【００８１】
以上の結果から、上記ゼラチンとの複合体をタンパク質分解酵素で処理する工程を経ることにより、純度の高いジカフェオイルキナ酸が調製可能であることが明らかかとなった。
【図１】
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