(57)【要約】【課題】試料注入量を微量化する。【解決手段】基板の一方の板材には分離流路が一本の溝として形成され、他方の板材には流路の両端に対応する位置に小リザーバとなる貫通穴が形成されて、電気泳動部材が構成されている。両板材は、流路が内側になり流路の両端が前記リザーバとつながるように張り合わされて、一体の基板となっている。板材上には、前記リザーバの位置にそれぞれ前記リザーバよりも大きな径をもつ大リザーバが接合されている。【選択図】図１
2007506092.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、
前記基板内部に少なくとも１つ設けられ、それぞれが１本の流路からなり、両端間に電圧が印加されることによりその流路に沿って試料が電気泳動分離する分離流路と、
前記分離流路の両端部に配置され前記分離流路と通じる液溜め用第１リザーバと、
前記分離流路の両端のうち、少なくとも試料注入側の端部においてその端部側の前記第１リザーバの内側に設けられた試料注入用の少なくとも１個の第２リザーバと、を備えた電気泳動部材。
【請求項２】
前記第２リザーバは第１リザーバより径の小さい窪みとして形成されている請求項１に記載の電気泳動部材。
【請求項３】
前記少なくとも１個の第２リザーバの内壁が親水性、前記第１リザーバの１個は少なくとも底面が疎水性となっている請求項２に記載の電気泳動部材。
【請求項４】
前記第１リザーバの１個は、その底面のうち、前記分離流路とつながる部分の周辺部が親水性、その外側が疎水性となるように表面処理がなされていることにより、その１個の第１リザーバの底面上に前記第２リザーバが形成されている請求項１に記載の電気泳動部材。
【請求項５】
前記第１リザーバ及び第２リザーバ内には一体化された電極が設けられている請求項１から４のいずれかに記載の電気泳動部材。
【請求項６】
前記分離流路は複数個設けられ、前記第１リザーバの少なくとも１個はそれらの複数の分離流路で共通になっている請求項１に記載の電気泳動部材。
【請求項７】
請求項１に記載の電気泳動部材と、
前記分離流路の両端間に泳動電圧を印加する電源装置と、
微量試料を前記試料注入用第２リザーバに分注するための試料分注プローブと、
前記分離流路の試料注入側とは反対側の端部に配置され、前記分離流路に沿って泳動してきた試料成分を検出する検出装置とを備えた電気泳動装置。
【請求項８】
前記試料分注プローブは先端に毛細管現象と表面張力の少なくとも一方を利用して微量の試料を採取して分注する手段を備えている請求項７に記載の電気泳動装置。
【請求項９】
前記手段は窪み又は溝のいずれかである請求項８に記載の電気泳動装置。
【請求項１０】
請求項１に記載の電気泳動部材を用い、以下のステップを含む電気泳動分離方法。
前記電気泳動部材の少なくとも１つの分離流路に泳動媒体を充填するステップ、
試料注入側の１つの第１リザーバから少なくとも１つの第２リザーバに試料を注入し、他方の第１リザーバに泳動バッファを満たし、電気泳動的に試料を流路内に導入するステップ、
試料導入後、前記試料注入用第２リザーバ内の試料をそのままにして試料注入側の第１リザーバに泳動バッファを満たすステップ、及び
前記分離流路の両端間に泳動電圧を印加して泳動分離を行なうステップ。
【請求項１１】
先端に毛細管現象と表面張力の少なくとも一方を利用して微量の試料を採取して分注する手段を備えた試料分注プローブ。
【請求項１２】
前記手段は窪み又は溝のいずれかである請求項１１に記載の試料分注プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生化学、分子生物学、臨床などの分野において、例えばＤＮＡシーケンシングなど、極微量のタンパク質や核酸、薬物などを高速かつ高分解能に分析する電気泳動分離に用いる電気泳動部材、それを用いた電気泳動装置及び方法、並びに試料分注プローブに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
極微量のタンパク質や核酸などを分析する場合には、従来から電気泳動装置が用いられている。その代表的なものとしてキャピラリー電気泳動装置があるが、キャピラリー電気泳動装置の取扱いが煩雑であるという欠点を補って分析の高速化、装置の小型化を目的として基板内部に流路をもつ電気泳動部材、いわゆるマイクロ流体デバイスが提案されている。そのマイクロ流体デバイスの例を図１２に示す。
【０００３】
図１２に示されるように、マイクロ流体デバイス１は、一対の板材を張り合わせた基板の接合面に、マイクロマシニング技術により互いに交差する試料導入用のローディング流路３と泳動分離用の分離流路５とを形成し、一方の板材にはその流路３，５の端に対応する位置に貫通穴をアノードリザーバ７ａ、カソードリザーバ７ｃ、サンプルリザーバ７ｓ、ウエイストリザーバ７ｗとして設けたものである。このようなマイクロ流体デバイスは、２本の溝（channel）が交差して形成されていることから、クロスチャネル・マイクロチップ（Cross-channel Micro-chip）とも呼ばれる。
【０００４】
このマイクロ流体デバイス１を用いて電気泳動を行なう場合には、分析に先立って、例えばシリンジを使った圧送により、いずれかのリザーバ、例えばアノードリザーバ７ａから流路３，５内及びリザーバ７ａ，７ｃ，７ｓ，７ｗ内に泳動媒体を充填する。
【０００５】
これまでのマイクロ流体デバイスを用いた電気泳動法は、図１２のようにクロスインジェクターデザインの流路を基本としている（特許文献１〜４参照。）。クロスインジェクション法では、次の手順で試料を導入している。
１）サンプルリザーバ７ｓの泳動媒体を除去し、そこに試料を注入する。
２）ローディング流路３に試料を均一にかつクロス部９で試料が分離流路５側に広がらないように、試料を電気泳動的に導入する。このとき、ピンチングなど電圧を複数箇所に印加しながら導入するか、あるいはＤＮＡシーケンシングなどの１塩基分離以上の高分離を達成するための粘調ゲルの場合はピンチングの操作は必要なく、ローディング流路に電圧を印加するだけでよい。
３）電圧印加を分離流路５側に切り替え、かつローディング流路３にもクロス部９から逆方向に試料が移動するよう電圧を印加して、クロス部９の試料のみを分離流路５に導入して電気泳動分離を行なう。
【０００６】
電気泳動装置その他の分析装置への試料注入は、ノズルに試料を吸引した後、分析装置の所定の位置にそのノズルから試料を吐出することにより行なっている。
【特許文献１】特開２００２−１３１２７９号公報
【特許文献２】特開２００２−１３１２８０号公報
【特許文献３】特開２００２−３１０９９０号公報
【特許文献４】特開２００３−１６６９７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
クロスインジェクション法では分離流路５に導入される試料はサンプルリザーバ７ｓに注入される試料のごく一部である。したがって、サンプルリザーバ７ｓに注入する試料量は比較的多く、通常は５〜２０μＬ（マイクロリットル）を注入している。ＤＮＡシーケンシングなどの生体試料は微量しか得られないこともある。クロスインジェクション法では必要な試料量を微量化、例えば数１０ｎＬ〜数μＬというような微量の注入試料量を実現することは困難である。
【０００８】
また、ノズルに試料を吸引した後、そのノズルから試料を吐出する試料注入方法では、極微量の試料を注入することは困難である。
本発明の目的は、上述の問題点に鑑み、微量な試料を扱うことのできる電気泳動部材、それを用いた電気泳動装置及び方法、並びに試料分注プローブを提供することである。
本発明の他の目的及び利点は後に続く発明の詳細な説明により明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明の第１の局面によれば、微量の試料を分析できるように試料の利用効率を高めるように構成された電気泳動部材が構成される。そのための本発明の電気泳動部材は、基板内部に少なくとも１つ設けられ、それぞれが１本の流路からなり、両端間に電圧が印加されることによりその流路に沿って試料が電気泳動分離する分離流路と、分離流路の両端部に配置され分離流路と通じる液溜め用第１リザーバと、分離流路の両端のうち、試料注入側の端部においてその端部側の第１リザーバの内側に設けられた試料注入用の第２リザーバとを備えている。
【００１０】
第２リザーバは第１リザーバより径の小さい窪みとして形成することができる。その場合、第２リザーバの内壁が親水性、第１リザーバの少なくとも底面が疎水性となっていることが好ましい。
【００１１】
また、第２リザーバは第１リザーバの底面上に形成してもよい。すなわち、第１リザーバの底面のうち、分離流路とつながる部分の周辺部が親水性、その外側が疎水性となるように表面処理がなされていることにより、第１リザーバの底面上に第２リザーバが形成されているようにすることができる。
第１リザーバ及び第２リザーバ内には予め一体化された電極を設けておくことができる。
この電気泳動部材は、１つの基板に１つの分離流路を備えたものであってもよく、共通の基板に複数の分離流路が形成されたものであってもよい。
【００１２】
本発明の第２の局面によれば、本発明の電気泳動装置は、電気泳動部材として本発明のものを使用し、分離流路の両端間に泳動電圧を印加する電源装置と、微量試料を試料注入用第２リザーバに分注するための試料分注プローブと、分離流路の試料注入側とは反対側の端部に配置され、分離流路に沿って泳動してきた試料成分を検出する検出装置とを備えたものである。
【００１３】
本発明の第３の局面によれば、試料分注プローブが微量の試料を注入できるようにした。その試料分注プローブは、先端に窪み又は溝をもち、毛細管現象と表面張力の一方又は両方を利用して微量の試料を採取して分注するものである。
【００１４】
その試料分注プローブは、本発明の電気泳動装置だけでなく、従来のクロスインジェクション方式による電気泳動装置を初め、他の分析装置においても微量の試料注入を行なう際には利用することができるものである。
【００１５】
本発明の第４の局面によれば、電気泳動方法において、本発明の電気泳動部材を用い、以下のステップを行なうことにより電気泳動分離を行なう。
前記分離流路に泳動媒体を充填するステップ、
試料注入側の第１リザーバから試料注入用第２リザーバに試料を注入し、他方の第１リザーバに泳動バッファを満たし、電気泳動的に試料を流路内に導入するステップ、
試料導入後、試料注入用第２リザーバ内の試料をそのままにして試料注入側の第１リザーバに泳動バッファを満たすステップ、及び
分離流路の両端間に泳動電圧を印加して泳動分離を行なうステップ。
この場合、試料注入用第２リザーバに試料を注入するステップで注入された試料が試料注入用第２リザーバ内に残存していても、残存試料を除去したり洗浄したりすることはしない。そして、泳動バッファを注入して試料を希釈し、そのまま泳動分離を行なう。本発明では、サンプルが注入された後、試料が除去や洗浄されなくても、泳動パターンに影響はない。したがって、電気泳動部材の操作が容易である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の第１の局面によれば、電気泳動部材は分離流路と交差するローディング流路を備えていない。試料は試料注入用第２リザーバに注入され、分離流路に直接導入される。ローディング流路に試料を導入することがないので、分析に必要な試料量を微量化することができる。
【００１７】
また、クロスインジェクション法による試料導入では、試料ローディング流路中でも試料が泳動分離する。ローディングバッファの組成によってはローディング流路中でスタッキング（濃縮）現象を生じ、ローディング流路中に不均一な試料分布が生じてしまう。分離流路に導入される試料はローディング流路に導入された試料の一部である。したがって、分離流路５に導入された試料が元の試料の組成を忠実に反映しない虞がある。
それに対し、本発明の電気泳動部材によれば、ローディング流路を備えた従来のクロスインジェクション法と比べると、ローディング流路におけるスタッキングは生じず、試料濃度分布は均一になり、試料は濃度分布を維持して分離流路に導入される。
【００１８】
本発明では、第２リザーバは第１リザーバより径の小さい窪みとして形成することができる。第２リザーバの内壁が親水性、第１リザーバの少なくとも底面が疎水性となっていることが好ましい。したがって、試料を選択的に第２リザーバ内に凝集させることができ、注入された試料を有効に分離流路に導入することができるようになる。
【００１９】
第１リザーバの底面のうち分離流路とつながる部分の周辺部が親水性、その外側が疎水性となるように表面処理がなされている。この構成により、第１リザーバの底面上に第２リザーバを形成するのが容易になる。
両第１リザーバ内に予め一体化された電極を設けておけば、試料量が微量でも試料を確実に電極と接触させることができるようになる。
【００２０】
本発明の第３の局面によれば、試料分注プローブは、毛細管現象と表面張力の一方又は両方を利用して微量の試料を採取して分注することができるので、ノズルに試料を吸入し吐出する従来の方法と比べると微量の試料を注入するのが容易になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下に、図面を参照して本発明の実施例を説明する。
図１（Ａ），（Ｂ）は本発明の第１の実施例による電気泳動部材を表わす。
基板は一対の板材１０ａ，１０ｂが接合されたものである。一方の板材１０ａには分離流路１２が一本の溝として形成されている。流路１２の幅は１００ｎｍ〜１０００μｍ、好ましくは５０〜９０μｍであり、深さは１００ｎｍ〜１０００μｍ、好ましくは２０〜４０μｍである。他方の板材１０ｂには流路１２の両端に対応する位置に第２リザーバとなる貫通穴１４ａと１４ｂがそれぞれ形成されている。第２リザーバは直径が１０μｍ〜３ｍｍ、好ましくは５０μｍ〜２ｍｍであり、数１０ｎＬ〜数μＬの試料を注入するのに適した大きさをもっている。両板材１０ａと１０ｂは、流路１２が内側になり流路１２の両端が第２リザーバ１４ａ，１４ｂとつながるように張り合わされて、一体の基板となっている。
【００２２】
板材１０ｂ上には、第２リザーバ１４ａ，１４ｂの位置にそれぞれ第１リザーバ１６ａと１６ｂが接合されている。第１リザーバは第２リザーバ１４ａ，１４ｂよりも大きな径をもつ円筒状の部材であり、板材１０ｂ上に接合されている。第２リザーバ１４ａ，１４ｂがそれぞれ第１リザーバ１６ａ，１６ｂの穴の中心部に位置するように第１リザーバ１６ａ，１６ｂが位置決めされている。
【００２３】
図２（Ａ），（Ｂ）は本発明の第２の実施例による電気泳動部材を表わす。
この実施例では、他方の板材１０ｂに流路１２ａ、１２ｂが貫通穴として形成され、それぞれが分離流路１２の両端とつながっている。第１リザーバ１６ａ，１６ｂはそれぞれ底のある円筒状部材により構成され、それぞれの底面中央部に第２リザーバ１４ａ、１４ｂとして第１リザーバ１６ａ，１６ｂの径より小さい径の貫通穴が形成されている。第２リザーバ１４ａ、１４ｂがそれぞれ流路１２ａ、１２ｂとつながるように第１リザーバ１６ａ，１６ｂが板材１０ｂ上に取りつけられている。
【００２４】
図１（Ａ），（Ｂ）、図２（Ａ），（Ｂ）の実施例において、少なくとも試料注入側の第２リザーバ１４ａ（ここでは“ａ”がついている方を試料注入側とする。）の内壁が親水性、第１リザーバ１６ａの底面又は底面から内壁面にかけて疎水性となっていることが好ましい。
【００２５】
図３は本発明の第３の実施例による電気泳動部材の試料注入側を拡大して示したものであり、第２リザーバ１４ａは第１リザーバ１６ａの底面上に形成されている。すなわち、第１リザーバ１６ａの底面のうち、分離流路１２とつながる部分１２ａの周辺部（１４ａとして示されている領域）が親水性、その外側が疎水性となるように表面処理がなされている。これにより、注入された試料は親水性処理が施された部分に保持されることなり、その親水性領域が第２リザーバ１４ａとなる。その親水性領域１４ａの大きさは、保持される試料量が数１０ｎＬ〜数μＬとなるのに適した大きさをもっている。
【００２６】
そのような親水性と疎水性の表面処理としては、種々の方法を挙げることができる。例えば、基板としてガラス板を使用した場合には、酸で処理することにより親水性を持たせることができ、フッ素樹脂などの樹脂コーティング、シランカップリング剤処理などにより疎水性を持たせることができる。また、基板板材１０ｂとして親水性の材質、第１リザーバ１６ａとして疎水性の材質を使用することによっても親水性と疎水性の性質をもたせることができる。
【００２７】
図４は本発明の第４の実施例による電気泳動部材を表わす。図１（Ａ）〜３の実施例では、電極は第１リザーバ１６ａ、１６ｂとは別体として用意され、第１リザーバ１６ａ、１６ｂに収容された泳動バッファにそれぞれ電極が浸される。図４の実施例では電極２０ａ、２０ｂは第１リザーバ１６ａ，１６ｂから第２リザーバ１４ａ，１４ｂに延びるように予めこの電気泳動部材と一体に形成されている。
【００２８】
電極２０ａ、２０ｂは白金からなる金属層又は金属線からなるものである。電極２０ａ、２０ｂを金属層により形成するには、金属層を堆積法やスパッタリング法により形成した後、リゾグラフィーとエッチングによりパターン化する。この場合、図４のように第１リザーバ１６ａ、１６ｂの内壁面が開口部に向かって広がるように傾斜しているのが好ましく、それにより金属層の形成が容易になる。電極２０ａ、２０ｂの他の形態としては、金属線を樹脂により埋設して固着することにより第１リザーバ１６ａ，１６ｂと一体化したものを挙げることができる。電極２０ａ、２０ｂは第２リザーバ１４ａ，１４ｂにおいて試料又は泳動バッファと接触するように露出し、かつ第１リザーバ１６ａ，１６ｂの外部で電源装置のリード線に接続されるように露出して形成されている。
【００２９】
図５（Ａ）から（Ｃ）は本発明のさらに他の実施例による電気泳動部材を表わす。
図１（Ａ）から図４の実施例では基板に一本の分離流路１２が形成されている。図５（Ａ）から（Ｃ）の実施例では複数の分離流路１２が共通の基板に形成されている。図５（Ａ）から（Ｃ）では複数の分離流路１２が互いに交差しないように配列されている。分離流路１２のそれぞれの一端に第２リザーバ１４ａが設けられて試料が注入されるようになっており、それぞれの他端は共通の第１リザーバ１６ｂに接続されている。一端側の第１リザーバ１６ａは全ての第２リザーバ１４ａが配置されている領域を覆って共通の１つの大きいリザーバとなっている。その斜視図を表わす図５（Ｃ）に示されるように、全ての第２リザーバ１４ａは共通の第１リザーバ１６ａ内に設けられ、第１リザーバ１６ａとつながっている。他端側の共通の第１リザーバ１６ｂも全ての分離流路１２の他端側の開口が配置されている領域を覆って共通の１つの大きいリザーバとなっており、全ての分離流路１２の他端側の開口が第１リザーバ１６ｂとつながっている。
【００３０】
電極は第１リザーバ１６ａ，１６ｂにそれぞれ予め設けておいてもよく、電極を別途挿入するようにしてもよい。また、試料注入側では第２リザーバ１４ａごとに電極を設けておいてもよく、別途挿入するようにしてもよい。
【００３１】
基板を構成する板材１０ａ，１０ｂの材質としては、石英ガラス、ホウ珪酸系ガラス、樹脂などを用いることができる。泳動分離された成分を光学的に検出する場合には透明材質を選択する。光以外の検出手段を使用する場合は、板材１０ａ，１０ｂの材質は透明なものに限定されるものではない。
【００３２】
分離流路１２はリソグラフィーとエッチング（ウエットエッチング及びドライエッチング）により形成することができる。また第２リザーバ１４ａ，１４ｂ又は流路１２ａ，１２ｂとなる穴はサンドブラストやレーザドリルなどの方法により形成することができる。
【００３３】
図６は図１（Ａ）〜３の電気泳動部材を用いた電気泳動装置を概略的に示したものである。
電気泳動部材３０が温調プレート３２上に配置されている。電気泳動部材３０の基板も温調プレート３２も共に透明な材質で形成されており、温調プレート３２は加熱装置と温度制御装置を備えて一定温度に保たれている。
【００３４】
３４はゲル充填機構であり、電気泳動部材３０に泳動ゲルを充填するためのものである。ゲル充填機構３４はゲルを吐出するノズル３６と、ゲルの吸入と吐出を行なうシリンジ３８とを備えている。ノズル３６は平面内のＸ、Ｙ方向と垂直方向のＺ方向に移動できるように支持され、第１リザーバ１６ａ又は１６ｂから第１リザーバ及び流路に泳動ゲルを充填する。
【００３５】
カソード側で第１リザーバ１６ａの底部の第２リザーバに試料を注入するために分注機構４０が配置されている。分注機構４０は平面内のＸ、Ｙ方向と垂直方向のＺ方向に移動することができる。分注機構４０のノズル４２は試料を収納しているサンプルプレートとしてのマイクロタイタープレート４４の任意のウエルの位置と、第１リザーバ１６ａ内の第２リザーバの位置との間を移動して、プレート４４上のウエル内の試料を第２リザーバに注入できるようになっている。４６は分注ノズル４２を洗浄するためのポートである。洗浄液４８がポンプ５０で供給され、ドレインへ排出されており、ノズル４２をその洗浄ポート４６に漬すことによって洗浄することができる。
【００３６】
第２リザーバから分離流路への試料導入と、導入された試料の電気泳動分離のための電圧印加のために、高電圧電源装置５２が設けられている。電源装置５２には電極５４ａ、５４ｂが接続されている。電極５４ａは第１リザーバ１６ａ内の泳動バッファ又は第２リザーバ内の試料に挿入され、電極５４ｂは第１リザーバ１６ｂ内の泳動バッファに挿入されて電圧が印加される。
【００３７】
電気泳動媒体３０の分離流路１２で試料注入用第２リザーバと反対側の端部側の位置で、泳動分離されてきた試料成分を検出するために多色蛍光検出系５６が温調プレート３２の下方に配置されている。検出系５６からは例えばアルゴンレーザなどの光源からの励起光が分離流路１２に照射され、その励起光により励起されて発生した蛍光が光学系５６により検出される。サンプルとして例えばＤＮＡサンプルが分析されるときは、末端塩基別に４種類の蛍光色素で標識されたＤＮＡ断片が泳動分離され、それぞれの蛍光色素を検出するために４種類の蛍光波長で検出が行なわれる。
【００３８】
５８はこの電気泳動装置の制御と検出系５６が受光した蛍光信号に基づいてデータ処理を行なうための制御・データ処理装置としてのパーソナルコンピュータ（ＰＣ）である。パーソナルコンピュータ５８により電気泳動媒体３０への泳動ゲル充填、試料注入、電圧印加などの各部の操作が制御され、光学系５６による蛍光検出信号の取得、その取得した蛍光信号に基づく泳動パターンの作成、及び塩基配列決定がなされる。
【００３９】
泳動分離された成分の検出は蛍光光度法により行なっているが、他の検出方法として吸光光度法、電気化学的方法又は電気伝導度法などの手段により行なうこともできる。
【００４０】
試料分注機構４０の分注ノズル４２は微量の試料を分注できるように、その先端が図７（Ａ）又は（Ｂ）のように形成されている。
図７（Ａ）のノズルは、その先端に窪み６０を有する。その窪み６０の直径は１０μｍ〜５ｍｍ、好ましくは２ｍｍ、深さは５μｍ〜１ｍｍ、好ましくは２００μｍであり、数１０ｎＬ〜数μＬの試料が表面張力によってその窪み６０に保持され、第１リザーバ１６ａ内の第２リザーバに搬送されて分注される。
【００４１】
図７（Ｂ）のノズルは、その先端部に空洞６２が形成されている。その空洞６２は先端に通じる溝６４によって先端に開口されている。溝６４と空洞６２は、溝６４から空洞６２にかけて数１０ｎＬ〜数μＬの試料が収容されるような大きさをもっている。試料は毛細管現象によって溝６４から空洞６２にかけて収容され、第１リザーバ内１６ａの第２リザーバに搬送されて分注される。
【００４２】
図８（Ａ）及び（Ｂ）は試料分注機構４０のノズルを搬送機構とともに概略的に示したものである。
図８（Ａ）に示されるノズルは、先端に分注ノズルチップ６６を備えており、そのチップ６６内に試料を毛細管現象により吸入し、第１リザーバ内１６ａの第２リザーバへ搬送して分注する。
図８（Ｂ）に示されるノズルは、図７（Ｂ）のノズル６８を先端に備えており、微量分注用のプローブとして用いられる。
【００４３】
次に本発明の実施例の泳動分離を従来のクロスインジェクション法を用いた電気泳動と比較して説明する。
調整例１：ＤＮＡサンプル、泳動ゲル、バッファ
以下に説明する実施例１，２及び比較例１において、ＤＮＡサンプル、泳動ゲル、バッファとして次のものを使用した。
鋳型サンプル：ｐＵＣ１８プラスミドＤＮＡ
サンガー試薬：BigDie  （登録商標） Ver.3.1（Applied Biosystems 社の製品）
精製：エタノール沈殿法
試料ローディングバッフア：Milli-Ｑ水又は５０〜８０％ホルムアミド
泳動ゲル：２％リニアポリアクリルアミドゲル（×１ＴＴＥ），７Ｍ尿素
泳動バッフア：×１  Tris−ＴＡＰＳ−ＥＤＴＡ（ＴＴＥ）
【００４４】
実施例１：一つの基板に一本の分離流路が形成された泳動部材を用いた本発明に基づく電気泳動
図１に示す一つの基板に１本の分離流路が形成された泳動部材を用いた。電気泳動の手順は以下のとおりである。
１）分離流路のアノード側から泳動ゲルをシリンジで加圧充填する。
２）それぞれの第１リザーバに泳動バッファを満たし、電極を浸漬して高電圧を印加（１２５Ｖ／ｃｍ、５分）して、ゲル中の夾雑イオンを除去するためのプレランを行なう。
３）カソード側の第１リザーバの泳動バッファを吸引後、第２リザーバにＤＮＡサンプルを３μＬ注入する。
４）電極をそれぞれの第１リザーバに浸漬して、試料導入のために電圧を印加する（５０Ｖ／ｃｍ、４０秒）
５）試料導入後、電圧印加を一旦切り、泳動バッファをカソード側の第１リザーバに満たす。このとき、第２リザーバに試料が残っていても泳動バッファにより希釈される。
６）泳動分離のために、高電圧を印加する。このときの印加電圧は、７０〜３００Ｖ／ｃｍが適当であり、一例として１２５Ｖ／ｃｍとした。
７）検出部で光学的又は電気化学的に、泳動分離されたＤＮＡサンプルの断片を時系列に検出してデータ処理を行ない、泳動分離波形を取得する。
【００４５】
比較例：従来のクロスインジェクション法を用いた電気泳動
図１２に示す泳動部材を用いた。電気泳動の手順は以下のとおりである。
１）分離流路のアノード側から泳動ゲルをクロス部からの３方分岐流路に均等にかつ均一になるようシリンジで加圧充填する。
２）それぞれのウエルに泳動バッファを満たし、電極を浸潰して高電圧を印加して、プレラン及びプレローディングを行なう。印加電圧及び時間は、ともに１２５Ｖ／ｃｍ、５分とした。
３）サンプルウェルの泳動バッファを吸引後、ＤＮＡサンプルを８μＬ注入した。
４）電極をサンプルリザーバとサンプルウエストリザーバに浸潰して、ローディング流路間に電圧を印加する。このときの印加電圧と時間は１２５Ｖ／ｃｍ、１０分とした。
５）拭料導入後、電圧印加を一旦切り、アノードとカソード間に高電圧を印加する。このときの印加電圧は７０〜３００Ｖ／ｃｍが適当であり、ここではＩ２５Ｖ／ｃｍとした。
６）上の５）項と同時に２００秒間、サンプルリザーバとサンプルウエストリザーバにプルバック用電圧を印加する。このときの印加電圧は１０〜１００Ｖ／ｃｍが適当であり、ここでは６０Ｖ／ｃｍとした。その２００秒間の電圧印加後、電圧印加を止める。
７）検出部で光学的又は電気化学的に、泳動分離されたＤＮＡサンプルの断片を時系列に検出してデータ処理を行ない、泳動分離波形を取得した。
【００４６】
このようにして取得した泳動パターンの一例を図９（Ａ）と９（Ｂ）に示す。図９（Ａ）は実施例１の結果、図９（Ｂ）は比較例の結果である。これらの泳動パターンは検出部で泳動分離されたＤＮＡサンプルに励起光を照射し、その蛍光を検出したものであり、横軸は励起光で走査したときの走査番号を表し、時間に対応している。縦軸は蛍光強度である。
図９（Ａ）と９（Ｂ）を比較すると、本発明の実施例の方が泳動分離された各ピークの蛍光検出の信号強度が大きく、かつ良好な分離状態を示している。
【００４７】
図１０は実施例１と比較例とで泳動パターンの分離能を比較した結果である。菱形のデータは実施例、三角形のデータは比較例を示しており、横軸は塩基対（ｂｐ）、縦軸は分離能である。分離能は０．５以上であれば２つのピークが分離されており、０．５未満であれば２つのピークが重なって１つのピークになっていることを示している。分離能に関しては、実施例と比較例はほとんど同じパターンを示しており、ほとんど違いのないことがわかる。また、残った試料を洗浄するステップを設けなくても、残った試料の影響はない。
図１１は信号強度をピーク高さで比較したものである。図９（Ａ）と（Ｂ）からも明らかなように、実施例による結果の方か信号強度を大きくとることができることを示している。
【００４８】
実施例２：共通の部材に複数の泳動路が形成された泳動部材を用いた本発明に基づく電気泳動
共通の部材に３８４本の泳動流路が形成された図５に示す泳動部材を用いた。電気泳動の手順は、実施例１と同様である。
【００４９】
図１３（Ａ）から１３（Ｈ）に、図５に示される３８４本の分離流路のうち、左から数えて１２９から１３５番目の分離流路の泳動パターンを示す。図１３（Ａ）から１３（Ｈ）に示されるように、いずれの泳動流路においても、ベースラインの安定した良好な分離状態を示している。また、泳動流路間での泳動分離の状態も再現性がよい。各流路の巨大ピーク（分離がなくなり、すべてのサンプル断片が一つのピークとなって現れる部位）が、隣り合う流路に出ていることにより、分離流路間でのサンプルのクロストークが生じていないことがわかる。すなわち、泳動部材が複数の泳動流路を備えていて、それらがサンプル注入側で第１リザーバを共通にしているとしても、第２リザーバに注入されたサンプルは泳動バッファで希釈されるので、各分離流路での泳動パターンに影響はない。
図１４に、３８４本の分離流路のうち代表的な流路の一つ（左から数えて１２９番目）の分離度を示す。図１０に示す実施例１における分離度と比べてわかるとおり、図１３（Ａ）から１３（Ｈ）に示される分離流路について良好な分離状態が得られた。
【００５０】
本発明の電気泳動部材、それを用いた電気泳動装置及び方法、並びに試料分注プローブは、生化学、分子生物学、臨床などの分野において、極微量のタンパク質や核酸、薬物などを高速かつ高分解能に電気泳動分離するのに利用することができる。
特願２００３−３３０６１４号（平成１５年９月２２日出願）の開示を本出願に取り込む。
本発明を特定の実施例を参照して説明しているが、その説明は例示であり、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】電気泳動部材の一実施例を示す図であり、（Ａ）は平面図、（Ｂ）はそのＸ−Ｘ線位置での断面図である。
【図２】電気泳動部材の他の実施例を示す図であり、（Ａ）は平面図、（Ｂ）はそのＹ−Ｙ線位置での断面図である。
【図３】電気泳動部材のさらに他の実施例における試料注入側を拡大して示す断面図である。
【図４】電気泳動部材のさらに他の実施例を示す断面図である。
【図５】電気泳動部材のさらに他の実施例を示す図であり、（Ａ）は流路と第１リザーバの平面図、（Ｂ）は試料注入側の第２リザーバ部分を示す一部拡大図、（Ｃ）は試料注入側の概略斜視図である。
【図６】電気泳動装置の一実施例を示す概略斜視図である。
【図７】（Ａ），（Ｂ）はそれぞれ試料分注機構の分注ノズルの一例を示す断面図である。
【図８】（Ａ），（Ｂ）はそれぞれ試料分注機構の分注ノズルの一例を搬送機構とともに概略的に示す断面図である。
【図９】（Ａ）は実施例１における泳動パターンを示す図、（Ｂ）比較例における泳動パターンを示す図である。
【図１０】実施例１と比較例とで泳動パターンの分離能を比較した結果を示すグラフである。
【図１１】実施例１と比較例とで泳動パターンのピーク高さを比較した結果を示すグラフである。
【図１２】従来の電気泳動部材を示す平面図である。
【図１３】実施例２における泳動パターンを示すグラフであり、（Ａ）は、左から数えて１２９番目の泳動路、（Ｂ）は同じく１３０番目の泳動路、（Ｃ）は同じく１３１番目の泳動路、（Ｄ）は同じく１３２番目の泳動路、（Ｅ）は同じく１３３番目の泳動路、（Ｆ）は同じく１３４番目の泳動路、（Ｇ）は同じく１３５番目の泳動路、（Ｈ）は同じく１３６番目の泳動路の泳動パターンを示す。
【図１４】実施例２において左から数えて１２９番目の泳動路での分離能を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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