(57)【要約】【課題】組織培養が困難な植物種および品種を含む様々な種類の植物に適用できる、簡便かつ迅速な形質転換技術を提供すること。【解決手段】種子胚の茎頂にアグロバクテリウムを接種し、該種子胚を生長させることを特徴とする、形質変換植物体の生産方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
種子胚の茎頂部にアグロバクテリウムを接種し、該種子胚を生長させることを特徴とする、形質転換植物体の生産方法。
【請求項２】
茎頂部に傷を付け、該創傷部位にアグロバクテリウムを接種する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
種子胚の茎頂部にアグロバクテリウムを接種することを特徴とする、植物のインプランタ形質転換方法。
【請求項４】
茎頂部に傷を付け、該創傷部位にアグロバクテリウムを接種する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
植物が双子葉植物である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インプランタ（in planta）形質転換方法を用いるアグロバクテリウムによる遺伝子改変植物の生産方法、およびアグロバクテリウムによる植物のインプランタ形質転換方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまで植物に広く利用されてきた従来のアグロバクテリウムを用いた遺伝子導入法は、アグロバクテリウムの感染後に植物体の再生技術が必須であり、再生技術が確立されていない植物では、アグロバクテリウムによる遺伝子導入法は利用できなかった。ジーンガン法やウィスカー法による直接遺伝子導入法も同様に、組織培養による再生技術が必要であり、新しい産業の素材となるような新品種育成には大きな足かせとなっていた。このため、植物体再生が容易かつ植物体組織に直接的に核酸を導入し、特別な植物体再生技術を用いずに植物体へと発生する組織に直接遺伝子導入する方法が必要であった。
【０００３】
組織培養を用いずに形質転換植物を得る方法として、ケナフの腋芽に傷を付けてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を接種することによるインプランタ形質転換方法（特許文献１）、イネ種子の胚の出芽部に傷を付けてアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種することによるインプランタ形質転換方法（特許文献２）、ソルガム（Sorghum bicolor (L.) Moench）の芽生えの茎頂分裂組織にアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種することによるインプランタ形質転換方法（非特許文献１）が知られている。
【０００４】
しかしながら、様々な種類の植物に適用できる、さらなるインプランタ形質転換方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４１７００７８号
【特許文献２】特許第４７５４９６８号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Journal of Genetics, Vol.94, No.3, September 2015, pp. 425-434
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、組織培養が困難な植物種および品種を含む様々な種類の植物に適用できる、簡便かつ迅速な形質転換技術の確立を目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究した。その結果、驚くべきことに、植物の種子胚の茎頂から直接、植物個体を発生させる手法と、アグロバクテリウム法を組み合わせることによって、組織培養を経ずに形質転換体が得られることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、
［１］種子胚の茎頂部にアグロバクテリウムを接種し、該種子胚を生長させることを特徴とする、形質転換植物体の生産方法、
［２］茎頂部に傷を付け、該創傷部位にアグロバクテリウムを接種する、［１］記載の方法、
［３］種子胚の茎頂部にアグロバクテリウムを接種することを特徴とする、植物のインプランタ形質転換方法、
［４］茎頂部に傷を付け、該創傷部位にアグロバクテリウムを接種する、［３］記載の方法、および
［５］植物が双子葉植物である、［１］〜［４］のいずれか１つに記載の方法
を提供する。以後、まとめて「本発明の方法」と称する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法によれば、アグロバクテリウムにより遺伝子導入した茎頂部位から直接、遺伝子改変植物個体を得ることができる。本発明の方法は、組織培養が不要なので、組織培養による組織片からの植物体再生技術が確立されていない植物種および品種、ならびに組織培養による植物体再生ができない植物種および品種にも適用することができる。さらに、本発明の方法では、種子胚の茎頂に遺伝子導入し、該部位から直接、植物個体を再生させるため、従来の組織培養法では有り得ない非無菌的生育環境下での形質転換植物体の取得が可能であり、また、従来法と比べて短期間で形質転換植物体を得ることができる。したがって、本発明は、より簡便でかつ効率的な植物のインプランタ形質転換方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、茎頂インプランタ法に使用する植物体の調製を示す。
【図２】図２は、ｐＣＡ２３＿ＧＦＢＳＤ２の構造を示す。
【図３】図３は、インプランタ形質転換後、２週間経過のＧＦＰ遺伝子発現が観察された植物体の茎頂部分を示す写真である。上段は可視光下の実体顕微鏡観察の結果を示し、下段は蛍光下の実体顕微鏡観察の結果を示す。
【図４】図４は、インプランタ形質転換後、４〜６週間経過の再生植物体の様子を示す写真である。
【図５】図５は、インプランタ形質転換後、４〜６週間経過の形質転換植物体の再生を示す写真である。Ａは可視光下の実体顕微鏡観察の結果を示し、Ｂは、Ａの茎葉部を拡大したものを示す。Ｂの左は可視光下の実体顕微鏡観察の結果を示し、Ｂの右は蛍光下の実体顕微鏡観察の結果を示す。
【図６】図６は、インプランタ形質転換後、６〜８週間経過の形質転換植物体の再生を示す。左は可視光下の実体顕微鏡観察の結果を示し、右は蛍光下の実体顕微鏡観察の結果を示す。
【図７】図７は、インプランタ形質転換により得られた再生植物体のＴ−ＤＮＡ挿入を確認するための電気泳動結果を示す。
【図８】図８は、ゲノム編集ベクターｐＧＥｇＰ２３７＿ＩＡＡ９の構造（図８ａ）およびトマトＩＡＡ９遺伝子の標的配列（図８ｂ）を示す。図８ａにおいて、ＧＦＢＳＤ２は、２ｘカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ遺伝子プロモーター（配列番号６）およびオメガ翻訳エンハンサー（配列番号２）を含む配列（Ｐｒｏ  ２ｘ３５Ｓ）およびシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２ｋＤａ遺伝子ターミネーター（Ｔｅｒ  １８．２）（配列番号８）の制御下で発現するＧＦＢＳＤ２遺伝子およびブラストサイジン耐性遺伝子の融合遺伝子ＧＦＢＳＤ２発現カセット（配列番号７）を示す。Ｕ６は、シロイヌナズナＵ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子プロモーターを示す（配列番号１１）。ｇＲＮＡは、標的認識配列を含むガイドＲＮＡを示す（配列番号１２）。Ｃａｓ９は、３ｘ核移行シグナルを含むＣａｓ９を示す（配列番号１４）。ＮＰＴＩＩは、２ｘカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ遺伝子プロモーターおよびカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ遺伝子ターミネーターの制御下で発現するカナマイシン耐性遺伝子ＮＰＴＩＩ（配列番号３）発現カセットを示す。図８ｂにおいて、小文字はＳｐ（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９のＰＡＭ配列を示す。
【図９】図９は、インプランタ形質転換法によりｐＧＥｇＰ２３７  ＩＡＡ９導入再生植物体における変異解析を示す。図９ａは、インプランタ形質転換法実施後、１３日目（左）および３０日目（右）のｐＧＥｇＰ２３７  ＩＡＡ９導入トマト植物体の様子を示す。上段は可視光下の実体顕微鏡観察の結果を示し、下段は蛍光下の実体顕微鏡観察の結果を示す。図９ｂは、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法による変異解析を示す。白抜き三角印は野生型由来のＡｃｃＩ切断断片を示し、黒三角印は変異導入の結果ＡｃｃＩ切断を受けない変異導入断片あるいは、変異導入の結果、野生型由来とは異なる電気泳動度となった切断断片を示す。
【図１０】図１０は、トマトＩＡＡ９遺伝子上に導入された変異配列解析結果を示す。下線は標的配列を示し、枠内はＳｐＣａｓ９のＰＡＭ配列を示す。ハイフン（−）は塩基欠失を示す。図の右側に、塩基の挿入数を＋で、欠失数を−で示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の方法は、種子植物に適用でき、双子葉植物および単子葉植物を含む被子植物ならびに裸子植物のいずれにも適用できる。したがって、本発明の対象植物の例としては、双子葉植物、例えば、限定するものではないが、トマト、タバコ、ダイズ、ワタ、サトウダイコン、アズキ、ソバ、キュウリ、メロン、ナタネ、ダイコン、レタス、アルファルファ、エンドウ、サツマイモ、ジャガイモ等；単子葉植物、例えば、限定するものではないが、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、シバ、ソルガム、サトウキビ、バナナ、パイナップル等；および裸子植物、例えば、限定するものではないが、マツ、スギ、イチョウ、ソテツ等が挙げられる。好ましくは、双子葉植物が使用される。
【００１３】
本発明の方法において使用されるアグロバクテリウムは、植物に感染できる菌種および菌株であれば特に限定されない。例えば、限定するものではないが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、アグロバクテリウム・ビチス（Agrobacterium vitis）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）、およびそれらの各種菌株が挙げられる。
【００１４】
アグロバクテリウムは、植物に感染すると、自身が有するＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミド内のＴ−ＤＮＡ領域を植物染色体中に組み込む能力を有する。アグロバクテリウム法は、アグロバクテリウムのこの能力を利用した形質転換法である。したがって、本発明の方法で使用されるアグロバクテリウムは、植物に導入したい外来遺伝子がＴ−ＤＮＡ領域中に組み込まれたＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミド、あるいは植物に導入したい外来遺伝子が組み込まれたＴ−ＤＮＡ領域を有するバイナリーベクターを含んでいてもよい。かかるアグロバクテリウムは、当該分野で既知の方法によって調製することができる。例えば、ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドへの外来遺伝子の組み込みのための種々の中間ベクターが知られている。また、当該分野において、多くのバイナリーベクターが開発されており、本発明においては、これらの既知のベクターを用いることができる。アグロバクテリウムへの上記ベクターの導入は、既知の方法、例えば、熱ショック法、エレクトロポレーション法、トリペアレンタルメイティング法等によって行えばよい。
【００１５】
外来遺伝子は、特に限定されず、いずれのタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子であってもよい。また、Ｔ−ＤＮＡ領域には、植物に導入したい目的の外来遺伝子に加えて、形質転換体を選抜するためのマーカー遺伝子を挿入してもよい。該マーカー遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子等が挙げられるが、これに限定されること無く、遺伝子導入を判別することの可能なマーカー遺伝子を利用することができる。
【００１６】
本発明において、「種子胚」とは、対象植物の種子中に存在する胚、すなわち、種皮に包まれた状態の胚をいう。種子は、未熟または完熟のいずれであってもよく、また、発芽前または発芽中のいずれであってもよい。ここで、「発芽中」とは、発芽は開始しているが、胚の茎頂部はまだ種皮に包まれている状態から幼植物体が種皮を破って完全に出現するまでの過程をいい、本発明では発芽中のどの段階の種子胚を用いてもよい。本発明の方法においては、好ましくは、発芽前の種子の種子胚を使用する。したがって、本発明では、事前に種子を発芽誘導処理に付す必要はない。
【００１７】
本発明では、アグロバクテリウムを接種するために、種子胚は種子から取り出される。種子胚を種子から取り出す方法は、限定されず、当業者により適宜選択される。例えば、種皮の外側にメスで切り込みをいれ、切込み口からピンセットを用いて種皮を剥がすことによって、種子胚を取り出してもよい。好ましくは、次いで、取り出した種子胚の子葉部を切除することにより、種子胚の茎頂部を突出させる。
【００１８】
本発明では、アグロバクテリウムを接種する前に種子胚の茎頂部に傷をつけ、該創傷部位にアグロバクテリウムを接種してもよい。好ましくは、種子胚の茎頂部の成長点に傷をつける。傷の形状は特に限定されないが、例えば、穿孔、切り込み等が挙げられる。好ましくは、メス、カミソリ、カッターナイフ、先端が鋭利な針状の器具等を用いて、１以上の切り込みを入れる。
【００１９】
種子胚の茎頂部へのアグロバクテリウムの接種方法は、接種によりアグロバクテリウムが茎頂部を介して植物に感染できればよく、特に限定されない。例えば、アグロバクテリウムの懸濁液に種子胚の茎頂部を浸す方法、アグロバクテリウムの懸濁液を浸した綿棒を用いて種子胚の茎頂部に塗布する方法、注射器等を用いてアグロバクテリウムの懸濁液を種子胚の茎頂部に注入する方法、またはアグロバクテリウムの懸濁液を種子胚の茎頂部に噴霧する方法等が挙げられる。アグロバクテリウムの懸濁液に種子胚の茎頂部を浸す場合、さらに、浸した状態にて減圧処理を行うことにより、アグロバクテリウムの感染効率を向上させることができる。アグロバクテリウムの懸濁液は、アグロバクテリウムを液体培地中に懸濁して調製される。懸濁液中の菌体濃度は、接種方法に応じて、感染に適当な濃度を適宜選択すればよい。液体培地としては、既知の液体培地を用いればよく、接種方法にもよるが、例えば、ＭＳ液体培地、Ｂ５液体培地、ＡＢ液体培地、ＬＢ液体培地あるいは、１％−１０％スクロース溶液等が使用される。
【００２０】
アグロバクテリウムを種子胚に接種後、各対象植物に適した条件下で該種子胚を生長させる。例えば、アグロバクテリウムを接種した種子胚を寒天培地上に置き、２０〜３０℃で培養する。アグロバクテリウム接種後の種子胚の培養には、組織培養のように特別の組織培養用培地を必要とせず、例えば、ＭＳ培地、Ｂ５培地、ハイポネックス培地等の植物培養に適した既知の培地を用いればよい。生長した植物体は、適宜移植しながら、所望の生育ステージまで生長させる。本発明の方法では、組織培養を経ないで種子胚の茎頂部から直接、植物体を再生させるため、組織培養を用いる従来の形質転換方法と比べて短期間で植物成体が得られる。例えば、トマトの場合、組織培養を用いる従来の形質転換方法では植物成体を得るのに約６ヶ月かかるところ、本発明の方法では約３〜４ヶ月で植物成体が得られる。さらに期間短縮のために、植物の生長を促す植物ホルモンを短期間、例えば２〜３０日間、アグロバクテリウム接種部位に対して投与してもよい。該植物ホルモンとしては、限定するものではないが、例えば、ゼアチン、カイネチン、ベンジルアデニン、チジアズロン、インドール酢酸、ナフタレン酢酸および２，４−ジクロロフェノキシ酢酸等が挙げられる。
【００２１】
アグロバクテリウムを接種した種子胚の培養後、形質転換体の選抜は、常法により行えばよい。例えば、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等によって、得られた植物体のゲノム中にアグロバクテリウム由来のＴ−ＤＮＡ領域が組み込まれたかどうかを確認することができる。あるいは、抗生物質耐性遺伝子や蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子等のマーカー遺伝子をＴ−ＤＮＡ領域中に組み込んだＴｉまたはＲｉプラスミドを含むアグロバクテリウム、あるいは該マーカー遺伝子を組み込んだＴ−ＤＮＡ領域を有するバイナリーベクターを含むアグロバクテリウムを用いることにより、抗生物質耐性または蛍光タンパク質発現を指標として、形質転換体を容易に選抜することができる。例えば、効果的な形質転換体の選抜のために、アグロバクテリウムを介して植物体内に導入したマーカー遺伝子に対応する抗生物質を短期間、例えば２〜３０日間、該植物体のアグロバクテリウム接種部位に投与して、生存している植物体を形質転換体として選抜する方法が挙げられる。
【００２２】
したがって、本発明はさらに、種子胚から子葉部を切除して茎頂部を突出させる工程、該茎頂部にアグロバクテリウムを接種する工程を含む、植物のインプランタ形質転換方法、および、さらに該種子胚を生長させる工程を含む、遺伝子改変植物の生産方法を提供する。またさらに、本発明は、種子胚から子葉部を切除して茎頂部を突出させる工程、該茎頂部に傷をつける工程、該茎頂部にアグロバクテリウムを接種する工程を含む、植物のインプランタ形質転換方法、および、さらに該種子胚を生長させる工程を含む、遺伝子改変植物の生産方法を提供する。またさらに、本発明は、種子胚から子葉部を切除して茎頂部を突出させる工程、該茎頂部にアグロバクテリウムを接種する工程、該種子胚を生長させて、該茎頂部より発生した形質転換植物体を得る工程を含む、遺伝子改変植物の生産方法を提供する。本発明の方法は、例えば、植物のゲノム編集にも用いることができる。
【００２３】
以下、実施例によって本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
実施例１．トマト形質転換体の作製
（１）トマト植物体の調製
トマト植物体の生育条件は、照度３０，０００ｌｕｘ、温度２０〜２５℃、および光周期：１６時間明期／８時間暗期で行った。トマト（Solanum lycopersicum cv. Ailsa Craig）の種子を次亜塩素酸で表面殺菌し、滅菌水に１０数時間浸した後、ナイフ及びピンセットを用いて種皮を取り除いた。種子から取り出した種子胚の子葉をメスあるいはカミソリで取り除き、これをインプランタ形質転換の供試材料として使用した。（図１）
【００２５】
（２）アグロバクテリウム・ツメファシエンスの調製
本実施例では、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ２２６０株を用いた。バイナリープラスミドベクターｐＣＡ２３＿ＧＦＢＳＤ２（図２）を用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンスを形質転換した。ｐＣＡ２３＿ＧＦＢＳＤ２のＴ−ＤＮＡは、イネ翻訳伸長因子遺伝子プロモーター（Ｐｒｏ  ｏｅｆ１）（配列番号１）およびイネ熱ショックタンパク質１６．９ｋＤａ遺伝子ターミネーター（Ｔｅｒ  １６．９Ｂ）（配列番号４）の制御下で発現するカナマイシン耐性遺伝子ＮＰＴＩＩ発現カセット（配列番号３）と、２ｘカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ遺伝子プロモーター（配列番号６）およびオメガ翻訳エンハンサーを含む配列（配列番号２）（Ｐｒｏ  ２ｘ３５Ｓ）およびシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２ｋＤａ遺伝子ターミネーター（Ｔｅｒ  １８．２）（配列番号８）＋カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ遺伝子ターミネーター（Ｔｅｒ  ３５Ｓ）（配列番号５）の制御下で発現するＧＦＰ遺伝子およびブラストサイジン耐性遺伝子の融合遺伝子ＧＦＢＳＤ２発現カセット（配列番号７）を含む。ｐＣＡ２３＿ＧＦＢＳＤ２のＴ−ＤＮＡが植物ゲノムに組み込まれることで、カナマイシンによる薬剤選抜とＧＦＰによる可視選抜が可能になる。ｐＣＡ２３＿ＧＦＢＳＤ２を保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンスを、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で２８℃、２４〜４８時間培養し、選抜し、これをインプランタ形質転換に用いた。インプランタ法に用いるアグロバクテリウム・ツメファシエンスは、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で２８℃、１８時間培養した後、培養液を集菌し、５０μＭアセトシリンゴン、０．０５％シルエットＬ−７７（バイオメディカル社製）、３％スクロースを含むＭＳ液体培地に懸濁し、最終菌体濃度を０．０１ＯＤ（６００ｎｍ）とした。
【００２６】
（３）アグロバクテリウム・ツメファシエンスによるトマト植物のインプランタ形質転換
上記（１）で調製したトマト種子胚から子葉を取り除いた植物体の茎頂部の頂端部分に、メスを用いて切り込み傷を加えた。ついで、傷をつけた植物体を、上記（２）で調製した０．０１ＯＤ（６００ｎｍ）アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌液に浸漬し、減圧処理（−０．０２５ＭＰａ，１０分間）行なう事によって、傷をつけた茎頂部へのアグロバクテリウム・ツメファシエンス接種を行った。感染終了後、植物体から余分なアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌液を拭い去り、３％スクロースを含むＭＳ寒天培地に移植し、２３℃、暗所にて５日間培養の共存培養を行った。
【００２７】
共存培養５日後に、１２．５ｍｇ／Ｌメロペナム（和光純薬製）を含む滅菌水を用いて、植物体を数回洗浄し、植物体から余分の水分を拭い去った後に、３％スクロースを含むＭＳ寒天培地に再び移植した。移植後、植物体の茎頂部分に１．５ｍｇ／Ｌゼアチンおよび１００ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む水溶液を塗布した。塗布は２〜３日おきに５回程度行った。ゼアチンおよびカナマイシン溶液を塗布した後に導入遺伝子であるＧＦＰの発現が観察された茎頂部を図３に示す。茎頂部分においてＧＦＰ発現が観察された植物体は、インプランタ形質転換処理個体のうち、約８０％であった。
【００２８】
インプランタ形質転換の２〜３週間経過後、植物体を３％スクロース入りＭＳ寒天培地を含むマジェンタボックスへ移植し、植物体再生を促し、茎頂部分より再生する茎葉のＧＦＰ発現を観察しながら、形質転換植物体の可視選抜を行った。インプランタ形質転換後、４〜６週間経過の再生植物体の様子を図４に示す。図４に示す生育ステージの植物体のうち茎葉部全体においてＧＦＰ遺伝子発現が観察された植物体を図５および図６に示す。図６から明らかなように、茎葉だけでなく、花芽および果実においてもＧＦＰ発現が観察された。インプランタ形質転換処理個体のうち、約１０％において、図５および図６に示すような植物体組織全体において遺伝子導入が生じた植物個体が得られた。
【００２９】
（４）ＰＣＲ法による導入遺伝子の確認
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）  Ｐｌａｎｔ  ＩＩキット（タカラバイオ社製）を用いて、メーカーの提供するプロトコールに従って、上記（３）のインプランタ形質転換法により得られた植物体の葉からゲノムＤＮＡを調製した。
【００３０】
ｐＣＡ２３＿ＧＦＢＳＤ２のＴ−ＤＮＡ上に配置される２ｘカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ遺伝子プロモーターの下流に位置するオメガ翻訳エンハンサー配列（配列番号２）近辺に、ｏｍｅｇａ＿Ｆ１：５’−ＧＴＡＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣ−３’（配列番号９）を設計し、またＧＦＢＳＤ２遺伝子の翻訳開始コドンから１００ｂ下流に位置する領域に、ＧＦＰ＿Ｒ１００：５’−ＣＧＣＣＧＧＡＣＡＣＧＣＴＧＡＡＣＴＴＧＴ−３’（配列番号１０）を設計し、ＰＣＲによるＧＦＢＳＤ２遺伝子断片増幅を行うプライマーを合成した。
【００３１】
ＰＣＲ反応は、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社製）を用い、メーカー推奨の反応プロトコールに従って行った。得られたＰＣＲ断片は１．５％アガロースゲル電気泳動により分離し、遺伝子導入の有無を確認した。上記の設計したＰＣＲプライマーにより１７１ｂｐのＰＣＲ断片が増幅されるが、図７に示すとおり、ＧＦＰ発現の観察された再生植物体の全てから予想通りの１７１ｂｐ断片の増幅が得られた（Ｌｉｎｅ＃１〜６）。
【００３２】
さらに、同様の方法で、難組織培養性を示すトマトであるリオ・グランデ品種をインプランタ形質転換に供した。その結果、形質転換植物が得られたことを確認した。
【実施例２】
【００３３】
実施例２．インプランタ形質転換法によるゲノム編集トマト植物体の作製
インプランタ形質転換法の実施例の一形態として、ゲノム編集ベクターを使って、インプランタ形質転換法によりトマト形質転換植物体を作製し、ゲノム編集による標的遺伝子への変異導入が行えることを実証した。
【００３４】
（１）ゲノム編集ベクターの構造
ゲノム編集としてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用い、図８ａに示すゲノム編集ベクターを構築した。標的配列および該配列に導入する変異として、Ａｕｘ／ＩＡＡ転写因子  ＩＡＡ９遺伝子を選び、図８ｂに示す標的配列５’−ＧＡＧＣＴＣＡＧＧＣＴＣＧＧＴＣＴＡＣＣｔｇｇ−３’（小文字は、ＳｐＣａｓ９のＰＡＭ配列を示す）を設計した（配列番号１３）。標的配列を人工化学合成し、図８ａに示すガイドＲＮＡとし、バイナリーベクターｐＧＥｇＰ２３７＿ＩＡＡ９を完成させた。
【００３５】
（２）インプランタ形質転換法によるゲノム編集トマト植物体の作製
構築したバイナリーベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ２２６０株に導入し、実施例１に記載したインプランタ形質転換法により、トマトの種子胚の茎頂部に遺伝子導入を行い、再生形質転換植物体を作出した。得られたトマト形質転換体を図９ａに示す。
【００３６】
ｐＧＥｇＰ２３７＿ＩＡＡ９を導入した植物体のうち、ＧＦＰ蛍光が観察された植物体の本葉からゲノムＤＮＡを調製した。ゲノムＤＮＡの調製は、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）  Ｐｌａｎｔ  ＩＩキット（タカラバイオ社製）を用いて、メーカーの提供するプロトコールに従って行った。ＩＡＡ９の標的配列中には制限酵素ＡｃｃＩの認識配列が存在し、ゲノム編集の結果、変異が導入されればＡｃｃＩ認識部位が消失するか、あるいはＡｃｃＩ切断断片長が変化する。これを利用しＡｃｃＩを用いたＰＣＲ−制限酵素長多型（ＲＦＬＰ）解析により、ＩＡＡ９の標的配列に生じた変異解析を行った。調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＩＡＡ９遺伝子の標的配列近傍を、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社製）を用いて増幅した。ＰＣＲ断片をＡｃｃＩにより制限酵素切断を行ったところ、ｐＧＥｇＰ２３７＿ＩＡＡ９を導入した形質転換植物体由来ＰＣＲ断片中には、ＩＡＡ９標的配列に変異導入が起きた結果、ＡｃｃＩにより切断を受けない配列、あるいは切断断片長が変化する配列が含まれていることがわかった（図９ｂ）。変異導入が確認された植物体については、さらにシーケンス解析により変異配列を解析したところ、ＩＡＡ９の標的配列上のＰＡＭ配列の直後に塩基挿入型、塩基欠失型、あるいは塩基挿入と塩基欠失の組み合わせを含む変異が導入されていることが明らかとなった（図１０）。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明によって、簡便かつ効率的な植物のインプランタ形質転換法が提供される。したがって、本発明により、経済上および農業上付加価値を有する形質転換植物体が簡便かつ効率的に得られる。
【配列表フリーテキスト】
【００３８】
SEQ ID NO:1 ; Rice translation elongation factor gene promoter (Pro osef1)
SEQ ID NO:2 ; Tobacco mosaic virus omega translation enhancer sequence
SEQ ID NO:3 ; NPTII gene sequence
SEQ ID NO:4 ; Rice heat shock protein 16.9 kDa gene terminator (Ter 16.9B)
SEQ ID NO:5 ; Cauliflower mosaic virus 35S gene terminator (Ter 35S)
SEQ ID NO:6 ; 2X Cauliflower mosaic virus 35S gene promoter 
SEQ ID NO:7 ; Fusion gene sequence of GFP gene and blasticidin resistant gene (GFBSD2)
SEQ ID NO:8 ; Arabidopsis heat shock protein 18.2 kDa gene terminator (Ter 18.2)
SEQ ID NO:9 ; PCR primer omega_F1
SEQ ID NO:10 ; PCR primer GFP_R100
SEQ ID NO:11 ; Arabidopsis U6 snRNA gene promoter
SEQ ID NO:12 ; gRNA sequence
SEQ ID NO:13 ; Target sequence on tomato IAA9 gene
SEQ ID NO:14 ; Streptococcus pyrogenes Cas9 nucleotide sequence (comprising Nuclear localizing signal)
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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