(57)【要約】  細胞培養に有用な表面は、ＣＡＲ物質が結合している支持体と、該ＣＡＲ物質に結合しているコラーゲンＶＩまたは生物学的に活性なその断片もしくは変異体と、任意選択で、エラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシン、ラミニン、エンタクチン、アグリカン、デコリン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、およびコラーゲンＩＶなどの他のＥＣＭタンパク質（またはそれらの断片もしくは変異体）の１つまたは複数とを含む。ポリ−Ｄ−リジンまたはポリ−Ｄ−オルニチンなどのポリカチオン性ポリマーの１つまたは複数も、任意選択で該表面に存在する。この表面は、細胞培養において、（ａ）肝細胞（例えばＨｅｐＧ２腫瘍細胞および新たに発見されたラット肝臓上皮幹細胞系）、（ｂ）マウス細胞系ＭＣ３Ｔ３細胞系などの骨芽細胞、ならびに、（ｃ）初代骨髄細胞など、多数の異なった細胞型における細胞の付着、生存、および／または増殖を促進するのに使用される。該表面および追加の試薬を含むキットも開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）細胞接着抵抗性（ＣＡＲ）物質が結合している支持体、および、
ｂ）該ＣＡＲ物質に結合しているコラーゲンＶＩまたは生物学的に活性なその断片もしくは変異体；ならびに、任意選択で、
（ｉ）１つもしくは複数の異なった細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質または該ＥＣＭタンパク質の生物学的に活性な断片もしくは変異体、および／または、
（ｉｉ）１つもしくは複数のポリカチオン性ポリマーまたは該ポリカチオン性ポリマーの生物学的に活性な断片もしくは変異体
を含むことを特徴とする表面。
【請求項２】
（ｉ）前記任意選択のＥＣＭタンパク質は、１つもしくは複数のエラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシン、ラミニン、エンタクチン、アグリカン、デコリン、およびコラーゲンからなる群から選択され、
（ｉｉ）前記任意選択のポリカチオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン、およびポリ−Ｄ−オルニチンからなる群から選択される
ことを特徴とする請求項１に記載の表面。
【請求項３】
ａ）ＣＡＲ物質が結合している支持体と、
ｂ）該ＣＡＲ物質に結合しているコラーゲンＶＩまたは生物学的に活性なその断片もしくは変異体、および、１つもしくは複数の異なったＥＣＭタンパク質または該ＥＣＭタンパク質の生物学的に活性な断片もしくは変異体と
を含むことを特徴とする表面。
【請求項４】
前記ＥＣＭタンパク質は、１つもしくは複数のエラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシン、ラミニン、エンタクチン、アグリカン、デコリン、およびコラーゲンからなる群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の表面。
【請求項５】
前記ＣＡＲ物質は、ヒアルロン酸（ＨＡ）もしくはその誘導体、アルギン酸（ＡＡ）もしくはその誘導体、ポリ−ＨＥＭＡ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリムもしくはその誘導体、ポリプロピルアクリルアミド、ポリイソプロピルアクリルアミド、またはこれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする請求項１または３に記載の表面。
【請求項６】
コラーゲンＶＩおよび／または１つもしくは複数の前記ＥＣＭタンパク質は、共有結合によって前記ＣＡＲ物質に結合していることを特徴とする請求項１または３に記載の表面。
【請求項７】
前記ＣＡＲ物質は、ＨＡであることを特徴とする請求項６に記載の表面。
【請求項８】
１つもしくは複数の前記コラーゲンＶＩもしくは前記ＥＣＭタンパク質は、非共有結合によって前記ＣＡＲ物質に結合していることを特徴とする請求項１または３に記載の表面。
【請求項９】
前記ＣＡＲ物質は、ＨＡであることを特徴とする請求項８に記載の表面。
【請求項１０】
前記支持体は、天然または合成の有機重合体または無機複合体であることを特徴とする請求項１または３に記載の表面。
【請求項１１】
前記支持体は、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリラクチド、セルロース、ガラス、またはセラミックからなる群から選択されることを特徴とする請求項１０に記載の表面。
【請求項１２】
前記支持体は、ポリスチレンであることを特徴とする請求項１１に記載の表面。
【請求項１３】
（ａ）ヒアルロン酸が結合しているポリスチレン支持体と、
（ｂ）該ヒアルロン酸に共有結合によって結合しているコラーゲンＶＩまたは生物学的に活性なその断片もしくは変異体と
を含むことを特徴とする表面。
【請求項１４】
請求項１に記載の表面を含むことを特徴とする物品。
【請求項１５】
スライド、マルチウェルプレート、培養皿、培養フラスコ、または培養ビンであることを特徴とする請求項１４に記載の物品。
【請求項１６】
医療用具；３Ｄインプラント、組織、および／または器官を生成するための足場もしくは鋳型；気泡；またはファイバーメッシュの一部であることを特徴とする請求項１４に記載の物品。
【請求項１７】
請求項１に記載の表面を作製する方法であって、
（ａ）ＣＡＲ物質を前記支持体に結合させるステップと、
（ｂ）該ＣＡＲ物質に、コラーゲンＶＩまたは生物学的に活性なその断片もしくは変異体；ならびに、任意選択で、
（ｉ）１つもしくは複数の異なったＥＣＭタンパク質、または該ＥＣＭタンパク質の生物学的に活性な断片もしくは変異体、および／または、
（ｉｉ）１つもしくは複数のポリカチオン性ポリマー、または生物学的に活性なその断片もしくは変異体
を結合させるステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
前記ＣＡＲ物質は、
ａ）前記支持体を酸化プラズマで処理し、前記処理された支持体に前記ＣＡＲ物質を結合させること、または、
ｂ）前記支持体を酸化プラズマで処理し、前記処理された支持体を、アミノ基を備えたポリカチオン性ポリマーに曝露して中間層を形成し、前記ＣＡＲ物質を該中間層に結合させること
によって前記支持体に結合されることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリカチオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
培養中の細胞の付着、生存、および／または増殖を促進する方法であって、
（ａ）ＣＡＲ物質が結合している支持体、および、
（ｂ）該ＣＡＲ物質に結合している、コラーゲンＶＩ、または生物学的に活性なその断片もしくは変異体；ならびに、任意選択で、
（ｉ）１つもしくは複数の異なったＥＣＭタンパク質、または該ＥＣＭタンパク質の生物学的に活性な断片もしくは変異体、および／または、
（ｉｉ）１つまたは複数のポリカチオン性ポリマー
を含む表面に、該細胞の付着、生存、増殖に効果的な条件下で、培養培地中の細胞を接触させるステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
（ｉ）前記任意選択のＥＣＭタンパク質は、１つもしくは複数のエラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシン、ラミニン、エンタクチン、アグリカン、デコリン、およびコラーゲンからなる群から選択され、
（ｉｉ）前記任意選択のポリカチオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン、およびポリ−Ｄ−オルニチンからなる群から選択される
ことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
培養中の細胞の付着、生存、および／または増殖を促進する方法であって、
（ａ）ＣＡＲ物質が結合している支持体と、
（ｂ）該ＣＡＲ物質に結合しているコラーゲンＶＩまたは生物学的に活性なその断片もしくは変異体、および、１つもしくは複数の異なったＥＣＭタンパク質または該ＥＣＭタンパク質の生物学的に活性な断片もしくは変異体と
を含む表面に、該細胞の付着、生存、および／または増殖に効果的な条件下で、培養培地中の該細胞を接触させるステップを含み、該ＥＣＭタンパク質は、エラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシン、ラミニン、エンタクチン、アグリカン、デコリン、およびコラーゲンからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項２３】
前記コラーゲンＶＩ、１つもしくは複数のＥＣＭタンパク質、またはポリカチオン性ポリマーは、共有結合によって前記ＣＡＲ物質に結合されていることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記コラーゲンＶＩ、１つもしくは複数のＥＣＭタンパク質、またはポリカチオン性ポリマーは、非共有結合によって前記ＣＡＲ物質に結合されていることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＣＡＲ物質は、ＨＡであることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞は、哺乳類細胞であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記哺乳類細胞は、ヒト細胞であることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記哺乳類細胞は、齧歯類細胞であることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記哺乳類細胞は、骨細胞または肝細胞であることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記肝細胞は、初代肝細胞、樹立肝細胞系から得られた細胞、肝腫瘍細胞系から得られた細胞、または上皮幹細胞であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記哺乳類細胞は、ＨｅｐＧ２肝腫瘍細胞系のヒト肝細胞であることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
初代肝細胞または初代骨髄細胞の生存を促進する方法であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
樹立肝細胞系または肝腫瘍細胞系から得られた細胞の増殖を促進する方法であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
上皮幹細胞の増殖を促進する方法であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項３５】
前記培養培地は、無血清であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項３６】
前記培養培地は、血清を補充されていることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項３７】
前記培養培地は、ＢＤ培地＃１であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項３８】
培養中の細胞の増殖を刺激または阻害する因子を含有する試験試料を同定する方法であって、
（ａ）無血清培地中でインキュベートされた培養細胞に、該試験試料を添加するステップであって、該細胞は、請求項１の表面と接触しているステップと、
（ｂ）（ａ）における細胞増殖を測定するステップと、
（ｃ）（ａ）における細胞増殖を、試験試料が添加されていない対照培養における、類似の細胞の増殖と比較するステップと
を含み、
（ｉ）（ａ）における細胞増殖が、対照培養と比較して増大している場合は、該試験試料中に細胞増殖を刺激する因子が存在していることを示し、
（ｉｉ）（ａ）における細胞増殖が、対照培養と比較して低減している場合は、該試料中に細胞増殖を抑制する因子が存在していることを示す
ことを特徴とする方法。
【請求項３９】
細胞の特性または挙動に対する、物質の影響を測定する方法であって、
（ａ）無血清培地中でインキュベートされた培養細胞に、該物質を添加するステップであって、該細胞は、請求項１の表面と接触しているステップと、
（ｂ）（ａ）における細胞増殖を測定するステップと、
（ｃ）（ａ）における細胞増殖を、該物質が添加されていない対照培養における、類似の細胞の増殖と比較するステップと
を含み、
（ｉ）（ａ）における細胞増殖が、対照培養と比較して増大している場合は、該物質が細胞増殖を刺激することを示し、
（ｉｉ）（ａ）における細胞増殖が、対照培養と比較して低減している場合は、該物質が細胞増殖を抑制することを示す
ことを特徴とする方法。
【請求項４０】
前記物質は、薬物であることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記物質は、小分子であることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
細胞の付着、生存、および／または増殖を促進するのに有用なキットであって、請求項１に記載の表面と、該細胞を培養して細胞の付着、生存、および／または増殖を可能にするのに適した１つまたは複数の構成要素または試薬とを含むことを特徴とするキット。
【請求項４３】
培養中の細胞の増殖を正または負に変調する因子を同定するキットであって、請求項１に記載の表面と、（ａ）細胞の成長および（ｂ）細胞増殖の測定に適した１つまたは複数の構成要素または試薬とを含むことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養するのに有用な表面と、それらの表面を使用する方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
通常、細胞を培養するには、血清を補充した培養培地中に細胞を分散させ、次に、この培養培地を、組織培養グレードのポリスチレン（ＰＳ）など、合成細胞培養基質でできた容器中に分配する。これらの条件下で、ＰＳ表面への非特異的タンパク質吸着が迅速に起こり、ほとんど未変性の状態から強く変性された状態までにわたる所定範囲の多様な立体配座状態にある多数の異なった血清タンパク質からなるタンパク質層を生成する。静置培養では、細胞は、それに続いて表面に定着し、この十分に組織化されていない界面を、それらの表面にある細胞インテグリン、プロテオグリカン、およびセレクチンを介して「応答指令信号」を送り始める。この無作為に吸着されたタンパク質層との相互作用は、細胞の付着（または接着）、拡散、増殖、移動、および分化を含めた様々な過程に影響を与える恣意的な生物反応を導く。対照的にｉｎ  ｖｉｖｏでは、特異的でかつ組織化されたリガンド受容体相互作用を介して、正常な生物反応が起こり、これが次に、高度に組織化されたシグナル伝達過程の引き金となる。
【０００３】
したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養中における所望の細胞生物活性をより効率的に支持するために、生物学的事象のｉｎ  ｖｉｖｏでの特異性を模擬する、高度に画定された細胞培養表面が必要とされている。
【０００４】
従来、細胞培養に用いられている血清は、血清ロットによって異なったタンパク質からなる未確定の混合物を含んでおり、望ましくない複雑な状態をさらに作り出すことがある。例えば、ヒトにおける細胞療法など、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用するために細胞を調製する場合、培養中で血清を予め使用することによって、その細胞調製物中に、（１）生物学的有害物質と、（２）受容者において好ましくない免疫応答を誘導しうる動物性製品とを導入することがある。
【０００５】
したがって、培養中に血清が提供するのと同じ恩恵を与える、無血清で、かつ化学的に特定されている培養培地を用いた細胞培養方法が必要とされている。
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願第１０／２５９７９７号明細書、Andrea Liebmann-VinsonおよびR.Clark、２００２年９月３０日出願
【特許文献２】米国特許出願第１０／２６０７３７号明細書、Mohammad A. HeidaranおよびMary K. Meyer、「Method and Apparatuses for the Integrated Discovery of Cell Culture Environments」、２００３年９月３０日出願
【特許文献３】米国特許出願第１０／２５９８１５号明細書、John J. Hemperly、「Proliferation and Differentiation of Stem Cell from Bone Marrow and Other Cells Using Extracellular Matrix and other Molecules」、２００２年９月３０日出願
【特許文献４】整理番号７７６７−１８４０４５、２００３年８月１５日出願
【特許文献５】米国特許出願第１０／２５９８１６号明細書
【非特許文献１】Chen et al. (2000), Advanced Materials 12:455-457
【非特許文献２】Liver Growth and Repair edited by A.J. Strain and A.M. Diehl, pp 68-71, Chapman and Hall, 1998
【非特許文献３】Grisham, J.W., Thal, S.B. And Nagel, A. (1975). Cellular derivation of continuously cultured epithelial cells from normal rat liver, in Gene Expression and Carcinogeneisis in Cultured Liver (Eds. L.E. Gerschenson and B.B.Thompson, Academic Press , New York, pp. 1-23.)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、高度に画定されている細胞培養表面を提供することによって、上述の必要を満たすことを意図したものであり、この細胞培養表面は、とりわけ、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質であるコラーゲンＶＩを含む。これらの新規の表面がもつ利点の一つは、それらが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける血清濃度の低下または血清の完全な回避を可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、細胞接着抵抗性（ＣＡＲ）物質が結合している支持体、および、該ＣＡＲ物質に結合しているコラーゲンＶＩまたは生物学的に活性なその断片もしくは変異体と、任意選択で、（１）他の１つもしくは複数のＥＣＭタンパク質または生物学的に活性なその断片もしくは変異体、および／または、（２）１つもしくは複数のポリカチオン性ポリマーとを含む表面（細胞培養表面など）に関する。「生物学的に活性」とは、細胞の付着、生存、および／または増殖の促進において、その断片または変異体が、完全長の野生型タンパク質と本質的に同じ活性を有することを意味する。「増殖」とは、細胞数の増加を意味する。
【０００９】
本発明者らは、驚くべきことに、本発明の表面が、様々な細胞型の付着、生存、および／または増殖を、従来の条件を用いた標準的な培養表面（例えば、市販されている血清含有培地または無血清培地を用いた従来の組織培養ＰＳ上でのインキュベーション）と同様に、そしてしばしばより良好に促進することを見出した。これらの改善された効果は、化学的に特定されている無血清培地を用いて実現することが好ましい。
【００１０】
本発明の表面が、広いスペクトルの細胞型におけるそのような付着、生存、および／または増殖を支持するという発見も驚くべきものである。これらには、ＨｅｐＧ２（ヒト肝細胞癌細胞系）などの肝臓腫瘍細胞、およびラットの肝臓由来上皮幹細胞を含めた、肝臓内に見出される細胞型または肝臓に由来する細胞型を含む。他の細胞には、樹立マウス細胞系ＭＣ３Ｔ３の骨芽細胞およびラット初代骨髄細胞など、骨由来の細胞が含まれる。
【００１１】
本発明の利点には、
１）培養基質上に層形成する非特異的（無作為かつ恣意的）に付着した血清タンパク質のかわりに、細胞培養基質に結合したＥＣＭタンパク質による、細胞付着過程の制御を可能にし、マトリゲル（商標）など、他の未特定または未精製の動物性製品を使用する必要性を除去する、特定された哺乳類細胞培養条件の使用と；
２）従来の血清補充培地中に存在する他の生物学的因子との、複数のＥＣＭタンパク質の混成生物作用を除去する、特定の細胞過程を特定のＥＣＭ、例えばコラーゲンＶＩに起因するものとする能力と；
３）ＥＣＭを基質に制限して、液相（培養培地）中への脱離を防止し、また、受動的なコーティング上にある可溶化されたＥＣＭ物質が懸濁細胞表面の付着部位を封鎖するのを防止することによって、細胞付着も増強する、単独で、あるいは他のＥＣＭ物質と共に該表面に付着している共有結合コラーゲンＶＩ（受動的に吸着されたのではない）の使用と；
４）生物学的有害物質、すなわち免疫原性または別様に有害である産物を、除去または有意に低減する、血清が有意に低減または除去されていることによってより迅速に規制認可を獲得する能力とが含まれる。
【００１２】
本発明の一態様は、（ａ）細胞接着抵抗性（resistant）（または抵抗性（resistive））（ＣＡＲ）物質が結合している支持体と、（ｂ）該ＣＡＲ物質に結合しているコラーゲンＶＩまたは生物学的に活性なその断片もしくは変異体、および、任意選択で、１つもしくは複数の他のＥＣＭタンパク質または生物学的に活性なその断片もしくは変異体とを含むことを特徴とする表面である。他のＥＣＭは、エラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシン、ラミニン、エンタクチン、アグリカン、デコリン、または、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、もしくはコラーゲンＩＶなどの他のコラーゲンでよい。任意選択で、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−オルニチン（ＰＤＯ）、またはポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＯ）などの１つまたは複数のポリカチオン性ポリマーも、ＣＡＲ物質に結合させることができる。
【００１３】
本発明の別の態様は、（ａ）ＣＡＲ物質が結合している支持体と、（ｂ）該ＣＡＲ物質に結合しているコラーゲンＶＩまたは生物学的に活性なその断片もしくは変異体、および、１つもしくは複数の他のＥＣＭタンパク質または生物学的に活性なその断片もしくは変異体とを含むことを特徴とする表面である。他のＥＣＭタンパク質は、例えば、エラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシン、ラミニン、エンタクチン、アグリカン、デコリン、または、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、および／またはコラーゲンＩＶなどのコラーゲンでよい。
【００１４】
本明細書で使用する場合、「ＣＡＲ物質」という用語は、表面に存在する際に、支持体への細胞、または細胞表面タンパク質もしくはポリペプチドの非特異的結合（接着）を防止、抑制、または減弱させる物質を指す。ＣＡＲ物質は哺乳類細胞に対して抵抗性であり、好ましくは微生物にも抵抗性である。ＣＡＲ物質は、時には、「非汚損性基質」、「不活性コーティング」、「低親和性試薬」、または「非接着性コーティング」とも呼ばれる。ＣＡＲ物質の例には、ヒアルロン酸（ＨＡ）もしくはその誘導体、アルギン酸（ＡＡ）もしくはその誘導体、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ポリ−ＨＥＭＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリムもしくはその誘導体、ポリプロピルアクリルアミド、ポリイソプロピルアクリルアミド、またはこれらの化合物の組合せが含まれる。ＣＡＲ物質はＨＡであることが好ましい。
【００１５】
一部の実施形態では、１つまたは複数のプロテオグリカン、ビグリカン、グリコサミノグリカン、またはマトリゲル（商標）を、ＣＡＲ物質に結合できる。
【００１６】
ＣＡＲ物質に結合しているタンパク質または他の物質、例えば、コラーゲンＶＩ、別のＥＣＭタンパク質、またはポリカチオン性ポリマーは、共有結合によって結合していても、非共有結合によって結合していてもよいが、好ましくは共有結合している。
【００１７】
支持体は、天然または合成の有機重合体または無機複合体でよい。適当な支持体には、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリラクチド、セルロース、ガラス、またはセラミックが含まれる。支持体はＰＳであることが好ましい。
【００１８】
本発明は、上述の通り、本発明の表面を含む製品も対象とする。好ましい物品の例は、細胞培養器、スライド、マルチウェルプレート、培養皿、培養フラスコ、および培養ビンなどである。別法として、該物品は、医療用具；３Ｄインプラント、組織、および／または臓器を生成するための足場もしくは鋳型；気泡；またはファイバーメッシュの一部でもよい。
【００１９】
本発明の別の態様は、本発明の上記表面を作製する方法であって、（ａ）ＣＡＲ物質を支持体に結合させるステップと、（ｂ）該ＣＡＲ物質に、コラーゲンＶＩまたは生物学的に活性なその断片もしくは変異体、ならびに、任意選択で、１つもしくは複数の他のＥＣＭタンパク質（または該ＥＣＭタンパク質の生物学的に活性な断片もしくは変異体）、および／または１つもしくは複数のポリカチオン性ポリマーを結合させるステップとを含む方法である。本明細書に開示されたいずれのＥＣＭタンパク質もしくはポリカチオン性ポリマー、または他のものも使用できる。
【００２０】
一実施形態では、支持体へのＣＡＲ物質の結合は、該支持体を酸化プラズマで処理し、処理された支持体に該ＣＡＲ物質を結合させることによって行う。別の実施形態では、支持体へのＣＡＲ物質の結合は該支持体を酸化プラズマで処理し、処理された支持体を、アミノ基を備えたポリカチオン性ポリマーに曝露して中間層を形成し、該ＣＡＲ物質を中間層に結合させることによって行う。ポリカチオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）であることが好ましい。
【００２１】
本発明の別の態様は、培養中の細胞の付着、生存、および／または増殖を促進する方法である。この方法は、培養培地中の細胞を、該細胞の付着、生存、および／または増殖に効果的な条件下で、本発明の表面に接触させるステップを含む。表面の例は、（ａ）ＣＡＲ物質が結合している支持体、および、（ｂ）該ＣＡＲ物質に結合しているコラーゲンＶＩまたは生物学的に活性なその断片もしくは変異体、ならびに、任意選択で、他の１つもしくは複数のＥＣＭタンパク質（または生物学的に活性なその断片もしくは変異体）を含むものである。この方法における好ましいＥＣＭタンパク質の例には、エラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシン、ラミニン、エンタクチン、アグリカン、デコリン、および、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、またはコラーゲンＩＶなどの他のコラーゲンが含まれる。エラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、およびコラーゲンＩＶが最も好ましい。任意選択で、１つまたは複数のポリカチオン性ポリマー（例えば、ＰＥＩ、ＰＤＬ、ＰＬＬ、ＰＬＯ、またはＰＤＯ）も、ＣＡＲ物質に結合される。
【００２２】
上記方法の一実施形態では、該表面は、（ａ）ＣＡＲ物質が結合している支持体、および、（ｂ）該ＣＡＲ物質に結合しているコラーゲンＶＩまたは生物学的に活性なその断片もしくは変異体を含み、さらに、上記のＥＣＭタンパク質のうち１つまたは複数（または生物学的に活性なその断片もしくは変異体）も含む。
【００２３】
上記方法におけるコラーゲンＶＩおよび／または他のＥＣＭタンパク質もしくはポリカチオン性ポリマーは、ＣＡＲ物質に、共有結合によって結合しても、非共有結合によって結合してもよいが、それらは、共有結合によって結合しているのが好ましい。支持体物質およびＣＡＲ物質は、上述したいずれのものでもよい。好ましい支持体はＰＳであり、好ましいＣＡＲ物質はヒアルロン酸（ＨＡ）である。
【００２４】
この方法の好ましい実施形態では、細胞は哺乳類細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。好ましい細胞は、肝細胞（肝腫瘍由来の細胞、樹立肝細胞、または、Ｈｅｐ２Ｇ細胞などの肝臓腫瘍細胞系を含める）である。骨細胞（例えばＭＣ３Ｔ３細胞系などの骨芽細胞）および骨髄細胞も含まれる。細胞は、肝臓上皮幹細胞などの上皮幹細胞でもよい。ラット肝臓上皮細胞を本明細書で記述する。
【００２５】
この方法の実施形態では、培養培地は、血清が補充されているものでもよいが、好ましくは無血清である。化学的に特定されている適当な血清遊離培地−ＢＤ培地＃１−を、本明細書で記述する。
【００２６】
この方法は、創薬の際に、例えば、潜在的薬物標的を同定するために、細胞の特性に対する物質の効果を測定するために、あるいは、候補物質が細胞に対して毒性であるかどうか決定するためなどに使用することもできる。本発明の別の態様は、培養中の細胞の増殖を刺激または抑制する、試験試料中の因子を同定する方法であって、（ａ）無血清培地中の細胞を、本発明の表面、および、該因子を含んでいると思われる試験試料と接触させるステップと、（ｂ）これらの細胞の増殖を、試験試料無しの同様の対照細胞の増殖と比較して測定するステップとを含む方法である。該試験試料の存在下で増殖が増大している場合は、該細胞の細胞増殖を刺激する因子が存在していることを示し、試験試料の存在下で増殖が低減している場合は、該細胞の細胞増殖を抑制する因子が存在していることを示す。結果の尺度が、細胞付着または細胞生存であり、適切かつ既知の方法を用いて、これらのクラスの反応をそれぞれ測定する類似の方法を用いることもできる。
【００２７】
細胞の付着、生存、および／または増殖を促進するのに有用なキットであって、本発明の表面と、細胞を培養して細胞の付着、生存、および／または増殖を可能にするのに適した１つまたは複数の構成要素または試薬とを含むキットも提供する。培養中の細胞の付着、生存、および／または増殖（あるいは任意の他の細胞挙動）を変調する因子を同定するのに有用な別のキット実施形態であって、本発明の表面、ならびに、（ａ）該細胞の付着、成長、または生存の促進と、（ｂ）細胞の付着、生存、および／または増殖の測定とに適した１つまたは複数の構成要素または試薬を含むことを特徴とするキット実施形態も、本発明で提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明の表面は、固体、好ましくは重合体の支持体を含み、それにＣＡＲ物質が結合する。支持体は、様々な形態のいかなるものをとることもできる。それは、細胞培養器（スライド、マルチウェルプレート、培養皿など）に使用されるものなど、適当ならばいかなる形のものでもよく、２次元でも、３次元でもよい。それは、天然高分子、合成重合体、および無機複合体を含めた、様々な材質のいかなるものでもよい。天然高分子には、例えば、コラーゲンおよびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ベースの物質が含まれる。合成重合体には、例えば、ポリ乳酸（ＰＬＡ）などのポリ（ａ−ヒドロキシ酸）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）およびその共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ（オルトエステル）、ポリウレタン、ならびに、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ポリ−ＨＥＭＡ）またはポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド共重合体などのヒドロゲルが含まれる。天然由来ポリマー材料および合成ポリマー材料を含有するハイブリッド材も使用できる。そのような物質の非限定的な例が開示されている（非特許文献１）。無機複合体には、例えば、リン酸カルシウムセラミック、バイオガラス、および生理活性ガラス−セラミックが含まれ、詳細には、カルシウムヒドロキシアパタイトとシリコン安定化リン酸三カルシウムとを化合させた複合物が挙げられる。好ましい支持体には、ＰＳ、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリトリフルオロエチレンもしくはポリテトラフルオロエチレン、ポリヘキサフルオロプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリラクチド、セルロース、ガラス、またはセラミックがある。好ましい実施形態では、支持体は、ＰＳ組織培養皿またはマルチウェルプレートなどの組織培養器の一部である。
【００２９】
多数のＣＡＲ物質が当業者に知られており、適当ないかなるＣＡＲ物質を支持体に結合させてもよい。典型的なＣＡＲ物質には、ヒアルロン酸（ＨＡ）もしくはその誘導体、アルギン酸（ＡＡ）もしくはその誘導体、ポリ−ＨＥＭＡ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリムもしくはその誘導体、ポリプロピルアクリルアミド、ポリイソプロピルアクリルアミド、またはこれらの物質の組合せが含まれる。好ましい実施形態では、ＣＡＲ物質は、ＨＡである。
【００３０】
ＣＡＲ物質は、共有結合によって支持体に結合させるのが好ましい。様々なタイプの共有結合を形成させることができ、それらのうち一部が、例えば、同一出願人による同時係属中の特許文献１；特許文献２；特許文献３；および特許文献４（これらは参照により本明細書に援用する）により詳細に議論されている。これらの出願はまた、ＣＡＲ物質およびＥＣＭタンパク質が結合している支持体をすくむ表面を作成および使用する他の態様を開示している。
【００３１】
一実施形態では、コラーゲンＶＩ（または生物学的に活性なその断片もしくは変異体）、ならびに、任意選択で、１つもしくは複数の別のＥＣＭタンパク質（または生物学的に活性なその断片もしくは変異体）、および／または、１つもしくは複数のポリカチオン性ポリマーがＣＡＲ物質に結合している。好ましい実施形態では、コラーゲンＶＩ（または生物学的に活性なその断片もしくは変異体）、および１つもしくは複数の他のＥＣＭタンパク質（または生物学的に活性なその断片もしくは変異体）がＣＡＲ物質に結合している。
【００３２】
コラーゲンＶＩ、または、任意選択で、追加のＥＣＭタンパクは、天然存在のポリペプチド（タンパク質）、組換え体ポリペプチド、または合成もしくは準合成ポリペプチドの形態、あるいはこれらの任意の組合せをとりうる。本明細書において、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、互換性をもって使用される。
【００３３】
ＥＣＭタンパク質などのポリペプチドをクローニング、発現、および精製する方法は従来通りであり、合成もしくは準合成のポリペプチドを生成する方法も同様である。ＥＣＭタンパク質は、商業的供給源から購入することもできる。
【００３４】
コラーゲンＶＩの生物学的に活性な断片もしくは変異体、または、任意選択で、１つもしくは複数の他のＥＣＭタンパク質を、コラーゲンＶＩと共にＣＡＲ表面に結合させることができる。本明細書で使用する場合、「生物学的に活性なその断片もしくは変異体」は、野生型ポリペプチドの少なくとも１つの生物機能または活性を実質的に保有するポリペプチドを含む。例えば、コラーゲンＶＩ（または他のＥＣＭタンパク質もしくはポリカチオン性ポリマー）の生物学的に活性な断片もしくは変異体は、本発明の方法で使用される際に細胞の付着、生存、および／または増殖を促進する能力を保持しながら、ＣＡＲ物質に結合できるものである。
【００３５】
生物学的に活性な断片は、それらに必要な活性と適合性を有するいかなる大きさのものでもよく、その範囲は、Ｎ末端もしくはＣ末端から１もしくは２アミノ酸のみ短縮されたポリペプチドから、約３〜２０アミノ酸を有するペプチドにまで及ぶ。所与の断片が所望の生物活性を保有するかどうかは、当業者ならば、本明細書に記載の方法、または当技術分野で周知の方法を用いて容易に決定することができる。生物学的に活性な断片の例は、ＥＣＭタンパク質の細胞外ドメインであり、それは、該タンパク質の細胞に結合する能力を保持する。
【００３６】
生物学的に活性な変異体は、様々な形態をとることができる。例えば、１つまたは複数のアミノ酸残基を、保存されているアミノ酸または保存されていないアミノ酸残基（好ましくは保存されているアミノ酸残基）で置換することができる。変異体は、野生型ポリペプチドと、例えば、１つまたは複数の付加、置換、欠失、挿入、逆位、融合、切り詰め、またはこれらのうち、任意のものの組合せによって、アミノ酸配列が相違しうるものである。他の活性な変異体の多くは、当業者には明らかであろうが、それらには、別の化合物に連結されているポリペプチド、または別の、可能な場合には異種のペプチド配列に融合しているポリペプチドが含まれる。
【００３７】
本発明で使用するＣＡＲ表面に結合させるのに好ましいＥＣＭタンパク質には、エラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシン、ラミニン、エンタクチン、アグリカン、デコリン、および、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、またはコラーゲンＩＶなどのコラーゲンが含まれる。本明細書における実施例は、コラーゲンＶＩと、任意選択で、他のＥＣＭタンパク質またはポリカチオン性ポリマーとの様々な組合せの、本発明の方法での使用を例示する。ＣＡＲ物質に結合できる他の化合物には、プロテオグリカン、ビグリカン、グリコサミノグリカン、および／またはマトリゲル（商標）が含まれる。
【００３８】
コラーゲンＶＩおよび／または他のＥＣＭタンパク質またはポリカチオン性ポリマーは、共有結合または非共有結合（例えば、静電力、イオンもしくは水素結合、親水性もしくは疎水性相互作用、およびファンデルワールス力などによって受動的に吸着される）によってＣＡＲ物質に結合させることができる。好ましい実施形態では、この結合は共有結合である。ＣＡＲ表面への、分子のそのような共有結合が記載されている（同時係属中の特許文献１、特許文献２、および特許文献３）。
【００３９】
表面を作製する方法であって、ＣＡＲ物質を支持体に結合し、ＥＣＭタンパク質、ポリカチオン性ポリマー、または同様のものをＣＡＲ物質に結合する方法が詳細に記載されている（同時係属中の特許文献１、特許文献２、および特許文献３）。簡潔には、支持体にＣＡＲ物質を結合させる１つの方法は、酸化プラズマで支持体を処理し、処理された支持体にＣＡＲ物質を結合させることを含む。支持体にＣＡＲ物質を結合させる別の方法は、酸化プラズマで支持体を処理し；処理された支持体を、アミノ基を備えたポリカチオン性ポリマー（ＰＥＩ、ＰＬＬ、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）、ポリ‐Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）、ポリ−Ｄ−オルニチン（ＰＤＯ）、ポリビニルアミン（ＰＶＡ）、またはポリアリルアミン（ＰＡＡ）、好ましくはＰＥＩまたはＰＬＬ）に曝露して中間層を形成し、ＣＡＲ物質を中間層に結合させることを含む。ＥＣＭまたはポリカチオン性ポリアミノ酸をＣＡＲ物質に結合させる方法は従来通りである。これらには、例えば、過ヨウ素酸ナトリウム酸化および還元的アミノ化が含まれる。
【００４０】
様々な物品が本発明の表面を含みうる。適当な物品は、当業者には明らかであろう。そのような物品には、スライド（例えば、組織スライド、顕微鏡用スライドなど）、プレート（例えば、マイクロプレートを含めた、培養プレートまたはマルチウェルプレート）、フラスコ（例えば、静置フラスコもしくはスピナーフラスコ）、ボトル（例えばローラーボトル）、バイオリアクター、または同様のものなどの細胞培養器が含まれる。他の適当な物品は、体外装置、人工関節、および肝臓補助装置などの医療用具である。他のものは、チューブ、縫糸、膜、フィルム、マイクロ粒子（好ましくはプラスチック製）、および２次元または３次元のインプラント、組織、および／または器官を生成するための足場または他の鋳型である。一実施形態では、そのような足場または鋳型に、細胞を播種し、その後、哺乳動物体内の適当な位置に移植する。別の実施形態では、足場を対象に移植し、それに細胞が移植部位で付着するようにする。足場または鋳型などの物品は、いかなる適当な物質でもよく、例えば、ガラス、プラスチック、気泡、またはファイバーメッシュでよい。
【００４１】
本発明は、培養細胞の付着、生存、および／または増殖を促進する方法に関し、この方法は、培養培地中の細胞を、本発明の表面に接触させるステップを含む。細胞の「付着」は、細胞が表面に結合し、それによって、細胞が通常の洗浄または取り扱い操作で溶出されないようになることを意味する。細胞、特に初代細胞の「生存」は、持続的な生存を意味する。「増殖」は、細胞数の増大を意味する。
【００４２】
細胞は、任意の適当な方法で、該表面に「接触させる」か、あるいは接触状態にすることができる。例えば、該表面を含む培養器中に、培養培地中の細胞を注ぎ入れたり、ピペットで入れたり、分注したりすることができ、あるいは、該表面を含む医療用具または足場を、細胞が懸濁されている培養培地中に浸すこともできる。
【００４３】
本明細書に記載する発明性のある表面のいずれもが、この方法に適している。一実施形態では、該表面は、ＨＡに結合したコラーゲンＶＩと、任意選択で、１つもしくは複数の他のＥＣＭタンパク質、および／またはポリカチオン性ポリマーとを含む。別の実施形態では、少なくとも１つの追加のＥＣＭタンパク質が含まれる。好ましい実施形態では、支持体はＰＳであり、ＣＡＲ物質はＨＡであり、これに、エラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、およびコラーゲンＩＶなどの、他のＥＣＭタンパク質のうち１つまたは複数を結合させることができる。下記の実施例は、この方法における、コラーゲンＶＩ、および他のＥＣＭタンパク質またはポリカチオン性ポリマーの典型的な組合せのいくつかの使用について記述する。当然ながら、他の組合せも使用することができる。
【００４４】
本発明の方法によって、様々な細胞型を培養することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養できる細胞ならば、植物、酵母、または哺乳類細胞を含めた、いかなる細胞も使用できる。本発明の方法に特に良く適しているのは、哺乳類細胞である。ヒト細胞が最も好ましい。例えば、本明細書における実施例は、肝臓由来の細胞（ＨｅｐＧ２細胞）、ヒト肝細胞癌細胞系（ＡＴＣＣ  ＨＢ−８０６５）、および骨由来のＭＣ３Ｔ３骨芽細胞の培養を例示する。初代ラット骨髄細胞についても例示する。肝臓または他の組織に由来する上皮幹細胞、および他の初代ヒト細胞（例えば、自家細胞、または、対象への移植が意図されている、供与者由来の細胞、好ましくは肝細胞）など他の細胞型も、本発明の方法によって培養することができる。表１は、様々な細胞型の付着、生存、および増殖を支持する、本発明の表面の能力を例示するものである。
【００４５】
【表１】
2007504823.tif 000002
【００４６】
実施例３および４は、本発明者らによって得られ、特徴付けられたラット肝臓上皮幹細胞系を用いた研究を含む。この細胞系は、非特許文献２に記載されているものに類似している。非特許文献３も参照。
【００４７】
さまざまな培養培地のいかなるものも、この方法における発明性のある表面と併せて用いることができる。ＤＭＥＭ、Ｆ１２、αＭＥＭ、Ｈｅｐａｔｏｓｔｉｍ（商標）、ＲＰＭＩ、またはこれらの組合せなどの市販されている培地を、血清の存在下または非存在下で使用することができる。適当な血清には、子ウシ血清、牛胎児血清、ウマ血清、または同様のものが含まれる。化学的に特定されている合成の無血清培地を使用することが好ましい。化学的に特定されている様々な適当な培地は、当業者には明らかなものであろう。実施例では、そのような培地の１つであるＢＤ培地１を用いる。ＢＤ培地１の組成を、表２に要約する。
【００４８】
【表２】
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【００４９】
【表３】
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【００５０】
上記方法では、細胞の付着、生存、および／または増殖に効果的な条件下で、本発明の表面に細胞を接触させる。「効果的な」条件とは、測定可能な量の細胞の付着、生存、および／または増殖をもたらす条件を意味する。効果的な条件は、当業者ならば、従来の方法を用いて、容易に決定および／または最適化することができる。変動させるべき因子には、例えば、播種密度、容器、培養培地、温度、Ｏ２／ＣＯ２濃度、および同様のものが含まれる。効果的な条件のうち一部の典型的なものを、実施例で記述する。
【００５１】
本発明の別の態様は、培養細胞の増殖を変調する（例えば、刺激する、阻害する、増強するなど）物質（因子）を含有する試験試料を同定する方法であって、（ａ）血清を含まない培養培地中で、細胞を、本発明の表面に、該因子を含んでいると思われる試験試料に接触させるステップと、（ｂ）該細胞の増殖を、試験試料が存在しない培養の中にある類似細胞の増殖と比較して測定するステップとを含み、（ｉ）試験試料の存在下において細胞の増殖が増大した場合は、増殖を刺激する因子が試験試料中に存在していることを示し、かつ、（ｉｉ）試験試料の存在下において細胞の増殖が低減した場合は、増殖を抑制する因子が試験試料中に存在していることを示すことを特徴とする方法である。この比較は、実験試料と平行して育成された、試験試料が添加されていない細胞に対して行うことができ、あるいは、参照データベースと比較することもできる。試験試料は、その作用が未知である純粋化合物でも、その成分および作用が未知である組成物でもよい。
【００５２】
当業者ならば、この方法で試験することのできる物質の様々なタイプを認識するであろう。例えば、この方法は、注目している細胞活性（例えば、細胞間シグナル伝達カスケード、代謝経路など）に作用する推定上の薬物（例えば、タンパク質、ペプチド、小分子、あるいはアンチセンス分子、リボザイム、もしくはＲＮＡｉ、または同様のものなどの核酸）を試験するのに用いることができる。この方法は、薬物スクリーニング、創薬、および潜在的薬物標的の同定に加えて、薬物候補が細胞に対して毒性であって、測定可能な有害効果をもっているかどうか、調節されていない増殖を誘導する（発癌性形質転換）かどうかなどを決定するのに用いることができる。
【００５３】
別の実施形態では、試験される物質は、注目しているマーカーを誘導、促進、または維持できる推定上の因子であるか、あるいは、所望の細胞機能の維持に重要な推定上の因子である。肝細胞において試験できるそのようなマーカー／機能の典型的なものには、（１）重要な肝細胞機能である、チトクロームＰ４５０ファミリー（ＣＹＰ）の薬物／毒素代謝酵素の誘導；あるいは、（２）肝細胞の初代培養中では通常欠失しているが、ＨｅｐＧ２細胞では維持されている機能である、アルブミンの生産が含まれる。
【００５４】
試験することのできる物質のタイプには、アンジオポエチン２、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、エリスロポイエチン、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＨＧＦ、インスリン、ノギン、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ、幹細胞因子、ＧＤＦ６、ＣＳＦ、ＦＨ３／Ｆ２、ＴＧＦβ、または同様のものなどの増殖因子がある。別法では、従来のコンビナトリアル化学、またはペプチドライブラリーによって生成された小分子を試験することもできる（例えば同時係属中の特許文献２および特許文献５を参照のこと）。他のタイプの物質は、当業者には明らかであろう。
【００５５】
本発明の方法のいずれをも、高スループット操作法に適合させることができる。１つまたは複数の過程を自動装置によって行うこともできる。
【００５６】
本発明の別の態様は、細胞の付着、生存、および／または増殖を促進するのに有用なキットであって、本発明の表面と、細胞を培養するのに適した１つまたは複数の構成要素または試薬（例えば、細胞増殖の促進などをする、培養器、適当な培養培地、および／または因子）を含むことを特徴とするキットである。
【００５７】
培養細胞の増殖を変調する因子を同定するのに有用な本発明の別のキットは、本発明の表面と、細胞培養（増殖を導く）および培養中の細胞増殖の測定に適した１つまたは複数の構成要素とを含む。これらの構成要素には、培養器、適当な培養培地、細胞増殖を促進する因子、および／または、本明細書に記載のものなどの細胞増殖を測定するのに使用できる１つまたは複数の試薬が含まれる。
【００５８】
そのようなキットは多くの用途を有し、それらは当業者には明らかであろう。例えば、それらは、初代細胞、幹細胞、および細胞療法などの方法で使用する細胞のような注目している細胞を増殖するため、推定上の治療薬のような物質の特徴付けをするため、注目している細胞機能で役割を有する薬剤を同定するため、などに用いることができる。そのようなキットは、例えばハイスループットの薬物研究において、商業的に有用なものであるかもしれない。
【００５９】
上記において、そして下記の実施例において、すべての温度は、未修正の摂氏温度で記載されており、別段に示されない限り、すべての部分および割合は重量によるものである。
【００６０】
これまで本発明の説明を全般的に行ったが、下記の実施例を参照することにより、本発明はより容易に理解されよう。これらの実施例は、特記されない限り、本発明を限定するものではなく、実例として提供する。
【実施例１】
【００６１】
無血清培地中でのＨｅｐ  Ｇ２ヒト肝細胞癌細胞の付着および増殖
ＨｅｐＧ２ヒト肝細胞癌細胞は、化学的に特定されている無血清培地であるＢＤ培地＃１において、コラーゲンＶＩが、単独で、あるいは共有結合によって付着している他の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質と共に、共有結合によって付着しているヒアルロン酸（ＨＡ）を含む表面で成長させた（ＢＤ培地＃１の成分は表２に要約した）。試験されたＥＣＭの組合せは、コラーゲンＶＩのみ、あるいは、コラーゲンＶＩと、エラスチン、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、またはビトロネクチンとの組合せである。対照試料では、ＢＤ培地＃１中で、標準的な組織培養用に処理されたポリスチレン上に細胞を播種した。
【００６２】
細胞は、１０４細胞／ウェルの初期密度で９６ウェルマイクロプレートのウェル中に播種し、炭酸ガス恒温器中、３７℃で、インキュベートし、図中に示す時点で、ヨウ化プロピジウムを用いて染色した。ＢＭＧ  Ｐｏｌａｒｓｔａｒ（商標）蛍光光度計を用い、励起５４４ｎｍで、発光６１５ｎｍの蛍光を測定した。図１に示すように、コラーゲンＶＩでコートされた表面の細胞数は、１日目と１８日目との間で増加した。組織培養ポリスチレン上、またはいかなる細胞外マトリックスタンパク質も存在しない細胞接着抵抗性の表面に播種した細胞は増殖しなかった。これは、コラーゲンＶＩ単独、あるいは他の細胞外マトリックスと組み合わせたコラーゲンＶＩの存在が、無血清環境で増殖を支持することを示す。
【実施例２】
【００６３】
市販培地に対する、無血清培地でのＨｅｐ  Ｇ２ヒト肝細胞癌細胞の増殖の比較
ＨｅｐＧ２ヒト肝細胞癌細胞は、ＨＡ表面に共有結合した唯一のＥＣＭがコラーゲンＶＩであったことを除いては、実施例１における記載の通りに成長させた。ＢＤ培地＃１中でこのコラーゲンＶＩ表面にある細胞の増殖を、標準的な組織培養条件下における、血清存在下または血清非存在下での増殖と比較した。５日間培養した後の細胞数を、図２に図示する。
【００６４】
細胞は、ヨウ化プロピジウムで染色した。蛍光顕微鏡像は、ＨＴ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓの子会社、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ所在）製、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ−１）で、励起５３５ｎｍ、発光７００ｎｍで取得した。細胞数は、これらの蛍光顕微鏡像からＵＩＣ  Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ（商標）分析ソフトウェアを用いて測定した。図２は、コラーゲンＶＩを無血清ＢＤ培地＃１と併用した場合、血清存在下における標準的な組織培養条件（組織培養ＰＳ表面、ＤＭＥＭ）と同程度に、ＨｅｐＧ２細胞の増殖が促進され、血清非存在下における標準的な培養条件よりはるかに優れていたことを示す。
【実施例３】
【００６５】
無血清培地におけるラット上皮幹細胞の付着および増殖
ラット上皮幹細胞（継代数６）を、ＢＤ培地＃１中において、コラーゲンＶＩが単独で、あるいは、エラスチン、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ビトロネクチン、またはコラーゲンＩＩＩと共に、共有結合によって付着しているヒアルロン酸（ＨＡ）を含む表面で成長させた。対照試料は、（１）市販培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２の１：１混合）を用いて、組織培養ＰＳプレート上に細胞を播種することを含む「標準的な組織培養条件」下で、あるいは、（２）ＢＤ培地＃１中に細胞外マトリックスタンパク質が存在しない状態における、ヒアルロン酸（ＨＡ）表面で培養した。細胞は、ヨウ化プロピジウムで染色し、実施例２における記載の通りに分析した。経時的な増殖をアッセイした。
【００６６】
図３に示すように、コラーゲンＶＩ表面の細胞数は、８日目と１９日目との間に増加した。ＢＤ培地＃１中における、コラーゲンＶＩを含む表面での増殖は、血清を含まない市販培地中での増殖より優れていた。ＨＡ対照で増殖がなかったことは、ラット上皮幹細胞の効率的な付着および増殖が、コラーゲンＶＩ単独または他の細胞外マトリックスタンパク質との組合せによって可能となったことを実証する。
【実施例４】
【００６７】
市販培地に対する、無血清培地でのラット上皮幹細胞の増殖の比較
ラット上皮幹細胞（継代数９）は、ＨＡ表面に共有結合した唯一のＥＣＭがコラーゲンＶＩであったことを除いては、実施例３における記載の通りに成長させた。ＢＤ培地＃１中でコラーゲンＶＩ表面にある細胞の増殖を、標準的な組織培養条件における、血清存在下または血清非存在下での増殖と比較した。細胞は、ヨウ化プロピジウムで染色し、実施例２における記載の通りに分析した。図４に示すように、コラーゲンＶＩを無血清ＢＤ培地＃１と併用した場合、血清存在下における標準的な組織培養条件（組織培養ＰＳ表面、ＤＭＥＭ）と同程度に、ラット上皮幹細胞の増殖が促進され、血清非存在下で標準的な培養条件を用いた場合の増殖より優れていた。
【実施例５】
【００６８】
ＭＣ３Ｔ３骨芽細胞の増殖および付着
ＭＣ３Ｔ３骨芽細胞は、１０％血清を含む市販のαＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中において、コラーゲンＶＩが単独で、あるいは、エラスチン、フィブロネクチン、コラーゲンＩＩＩ、ビトロネクチン、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）、ポリ−Ｄ−オルニチン（ＰＤＯ）、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＩ、またはラミニンと共に、共有結合によって付着したヒアルロン酸（ＨＡ）を含む表面で成長させた。共有結合によって連結した細胞外マトリックスタンパク質上での増殖を、１２、７２、および１２０時間に、標準的な組織培養条件下での増殖と比較した。これを図５に示す。細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、ウェルの蛍光を、ＢＭＧ  Ｐｏｌａｒｓｔａｒ蛍光計を用いて、励起５４４、発光６１４で測定した（ゲイン＝４０）。図は、単独で、あるいは共有結合によって付着した他のＥＣＭタンパク質と共に共有結合によって連結したコラーゲンＶＩが、骨細胞由来ＭＣ３Ｔ３細胞の効率的な細胞接着および増殖に重要であることを示す。
【実施例６】
【００６９】
無血清培地中での初代ラット骨髄細胞の増殖および付着
ラット骨髄細胞を単離し、組織培養フラスコ中にプレーティングし、１０％牛胎児血清および１％  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐで補充されたＤＭＥＭを二回与えた。細胞を２回継代し、ＢＤ培地＃１中に再懸濁し、その後、２０００細胞／ウェルで、コラーゲンＶＩが、単独で、あるいは他の共有結合したＥＣＭタンパク質−エラスチン、コラーゲンＩＩＩ、またはビトロネクチンのいずれか−と共に、共有結合によって連結しているＨＡ表面に播種した（２回のコラーゲンＶＩ＋エラスチン実験では、異なった密度で細胞を播種した）。１日目および６日目にタイムポイントをとり、生存細胞の存在を示すために、カルセインａｍ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（商標）で染色した。蛍光顕微鏡像を取得し、実施例５における記載の通りに分析した。図６に示すように、単独で、あるいは共有結合によって付着した他のＥＣＭタンパク質と共に共有結合によって連結したコラーゲンＶＩは、ラット骨髄細胞の効率的な細胞接着および増殖に重要であった。
【００７０】
当業者ならば、以上の記述から本発明の本質的特質を容易に確かめることができ、さらに、その趣旨および範囲から逸脱せずに、本発明の改変および修正を行って、それを様々な使用および条件に適合させることができる。
【００７１】
さらに工夫を加えることなく、当業者ならば、以上の記述を用いて、本発明を最大限に利用できると考えられる。したがって、前述した特定の好ましい実施形態は、例示としてのみ解釈されるべきであり、本開示におけるその他の部分をいかようにも限定するものではない。
【００７２】
本明細書に引用したすべての出願、特許、および出版物における開示全体を、これによって参照により本明細書に援用する。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】Ｈｅｐ  Ｇ２細胞を用いた増殖および付着試験を示す図である。
【図２】Ｈｅｐ  Ｇ２細胞の増殖試験を示す図である。
【図３】ラット上皮幹細胞を用いた増殖および付着試験を示す図である。
【図４】ラット上皮幹細胞の増殖試験を示す図である。
【図５】ＭＣ３Ｔ３骨芽細胞を用いた増殖および付着試験を示す図である。
【図６】ラット骨髄細胞を用いた増殖および付着試験を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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2007504823.tif 000012
2007504823.tif 000013