(57)【要約】【課題】新たな抗がん剤感受性判定マーカーの提供。【解決手段】ＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる１以上の分子からなる抗がん剤感受性判定マーカー。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＡＬＤＯからなる抗がん剤感受性判定マーカー。
【請求項２】
抗がん剤が、白金錯体系抗がん剤である請求項１記載の抗がん剤感受性判定マーカー。
【請求項３】
抗がん剤が、オキサリプラチン又はその塩から選ばれるものである請求項１又は２記載の抗がん剤感受性判定マーカー。
【請求項４】
さらに、Ｃ１ＱＢＰからなる請求項１〜３のいずれかに記載の抗がん剤感受性判定マーカー。
【請求項５】
さらに、ＣＲＢＰ１からなる請求項１〜４のいずれかに記載の抗がん剤感受性判定マーカー。
【請求項６】
がん患者由来の生体試料中のＴＡＬＤＯの量を測定する工程を含む抗がん剤の感受性判定方法。
【請求項７】
さらに、前記測定結果を対照レベルと比較することにより、当該がん患者の抗がん剤に対する感受性を判定する工程を含む請求項６記載の判定方法。
【請求項８】
生体試料が、抗がん剤を投与されたがん患者由来の生体試料である請求項６又は７記載の判定方法。
【請求項９】
抗がん剤が、白金錯体系抗がん剤である請求項６〜８のいずれかに記載の判定方法。
【請求項１０】
抗がん剤が、オキサリプラチン又はその塩から選ばれるものである請求項６〜９のいずれかに記載の判定方法。
【請求項１１】
さらに、Ｃ１ＱＢＰの量を測定する工程を含む請求項６〜１０のいずれかに記載の判定方法。
【請求項１２】
さらに、ＣＲＢＰ１の量を測定する工程を含む請求項６〜１１のいずれかに記載の判定方法。
【請求項１３】
がん患者由来の生体試料中のＴＡＬＤＯの量を測定するためのプロトコールを含むことを特徴とする請求項６〜１２のいずれかに記載の判定方法を実施するためのキット。
【請求項１４】
抗がん剤の存在下、がん細胞株又は担癌動物由来の生体試料中のＴＡＬＤＯの発現変動を指標とする抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニング方法。
【請求項１５】
抗がん剤が、白金錯体系抗がん剤である請求項１４記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
抗がん剤が、オキサリプラチン又はその塩から選ばれるものである請求項１４又は１５記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
さらに、抗がん剤の存在下、がん細胞株又は担癌動物由来の生体試料中のＣ１ＱＢＰの発現変動を指標とする請求項１４〜１６のいずれかに記載の抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニング方法。
【請求項１８】
さらに、抗がん剤の存在下、がん細胞株又は担癌動物由来の生体試料中のＣＲＢＰ１の発現変動を指標とする請求項１４〜１７のいずれかに記載の抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニング方法。
【請求項１９】
請求項１４〜１８のいずれかに記載の方法により得られた抗がん剤感受性亢進剤。
【請求項２０】
請求項１９記載の感受性亢進剤と、感受性亢進の対象となる抗がん剤とを組み合わせてなるがん治療用組成物。
【請求項２１】
抗がん剤が、白金錯体系抗がん剤である請求項２０記載のがん治療組成物。
【請求項２２】
抗がん剤が、オキサリプラチン又はその塩である請求項２０又は２１記載のがん治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象となる患者のがんが、使用しようとする抗がん剤に治療反応性を有するか否かを判定するために用いる抗がん剤感受性判定マーカー及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗がん剤には、アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗剤、抗がん性抗生物質、抗がん性植物アルカロイド等の種類がある。そしてこれらの抗がん剤には、がんの種類によって効果を示す場合と効果を示さない場合がある。しかし、有効であると認められている種類のがんであっても、個々の患者によって効果を示す場合と効果を示さない場合があることが知られている。このような個々の患者のがんに対して抗がん剤が効果を示すか否かを抗がん剤感受性という。
【０００３】
オキサリプラチン（ＳＰ−４−２）−［（１Ｒ，２Ｒ）−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１，２−ｄｉａｍｉｎｅ−κＮ，κＮ'］［ｅｔｈａｎｅｄｉｏａｔｏ（２−）−κＯ1，κＯ2］ｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＵＰＡＣ）は第三世代白金錯体系抗悪性腫瘍薬である。作用機序は先行薬剤であるシスプラチン（ＣＤＤＰ）やカルボプラチン（ＣＢＤＣＡ）と同様、ＤＮＡ塩基との架橋形成によるＤＮＡ合成阻害、蛋白合成阻害と考えられているが、ＣＤＤＰやＣＢＤＣＡが無効な大腸癌に対してもオキサリプラチン（Ｌ−ＯＨＰ）は抗腫瘍効果を示し、従来の白金錯体系抗悪性腫瘍薬とは異なる抗腫瘍スペクトルを示す。アメリカでは２００４年１月にフルオロウラシル（５−ＦＵ）／レボホリナート（ＬＶ）との併用で転移性結腸・直腸癌のファーストライン治療として承認されており、日本においても２００５年４月、「治癒切除不能な進行・再発の結腸・直腸癌」に対するレボホリナート及びフルオロウラシルの静脈内持続投与法との併用（ＦＯＬＦＯＸ４法）にて薬価収載された。進行再発大腸癌の治療は、１９９０年代前半まで行われていた５−ＦＵ／ＬＶ療法での生存率は１０〜１２ヶ月であったのに対し、オキサリプラチンを加えたＦＯＬＦＯＸ療法での生存期間は１９．５ヶ月とほぼ２倍にまで到達している。さらに２００９年８月には、同じくレボホリナート及びフルオロウラシルの静脈内持続投与法との併用による「結腸癌における術後補助化学療法」が効能・効果として追加され、大腸癌患者での使用拡大と有益性が期待できる薬剤である。
【０００４】
しかし、それでもなお進行再発大腸癌に対するＦＯＬＦＯＸ療法の奏効率は５０％程度であり、換言すれば治療を受けた患者の半数は効果が得られていないことを意味する。また、オキサリプラチンの使用により好中球減少症のほか高頻度の末梢神経障害を呈し、これは致死的副作用ではないものの治療継続を困難にする因子ともなっている。したがって、治療開始前に効果の期待できる患者（レスポンダー）と、効果の期待できない患者（ノンレスポンダー）を予測し、治療反応性を早期に診断できるバイオマーカーにより、有効性と安全性の高い化学療法が実現する。
【０００５】
さらに、一般にがん化学療法の治療スケジュールは長期に渡るため、治療継続中における抗がん剤に対する感受性の経時的モニターは治療継続の是非の判定を可能とし、患者負担や副作用軽減につながるのみならず医療経済の観点からも有用であると考えられる。個々の患者における治療反応性を予測、そして早期に診断して適切な薬剤や治療レジメンを選択する「個別化治療」実現のためには、オキサリプラチン等の抗がん剤の効果予測もしくは治療応答性の早期診断を可能とするバイオマーカーの確立は急務である。
【０００６】
かかる観点から本発明者らは、複数のヒトがん細胞株を培養し、これらのがん細胞株の薬剤感受性を測定し、これら薬剤感受性の異なる細胞株に薬剤を曝露し、薬剤曝露後の細胞内タンパク質の経時的発現変化を、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）を用いて網羅的に解析し、薬剤感受性と比較解析することにより、抗がん剤感受性判定マーカーの探索を行い、いくつかのマーカーを報告した（特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００９／０９６１９６号
【特許文献２】国際公開第２０１１／０５２７４８号
【特許文献３】国際公開第２０１１／０５２７４９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、先に報告したマーカーは、いまだ抗がん剤の感受性判定マーカーとして実用化されておらず、さらに新たなマーカーの開発が望まれている。
従って、本発明の課題は、さらに新たな抗がん剤感受性判定マーカーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで本発明者は、まず、がん細胞株を抗がん剤（オキサリプラチン：Ｌ−ＯＨＰ）に対する感受性の程度によって高感受性、中感受性及び低感受性の３種に分類し、高感受性細胞株と低感受性細胞株において発現しているタンパク質の発現量に差のあるタンパク質を二次元ディファレンシャル電気泳動（２Ｄ−ＤＩＧＥ）で検討した。その結果、高感受性細胞株と低感受性細胞株において、細胞内発現レベルの異なるスポットを見出し、そのスポットをＬＣ−ＭＳ／ＭＳで解析し、データベース検索することで、１０種のタンパク質を同定した。次に、高感受性、中感受性及び低感受性の３種の細胞株でのこれらのタンパク質の発現量と抗がん剤に対するＩＣ50値との相関を確認したところ、Ｐｒｏｈｉｂｉｔｉｎ（ＰＨＢ）、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ａ５（ＡＮＸＡ５）、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ａ１（ＡＮＸＡ１）、Ｔｒａｎｓａｌｄｏｌａｓｅ（ＴＡＬＤＯ）、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  １Ｑ  ｓｕｂｃｏｍｐｏｎｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃ１ＱＢＰ）、及びＩｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＩＰＹＲ）の６タンパク質で高い相関が確認されることを見出した。
また、高感受性細胞株と低感受性細胞株において発現しているタンパク質の発現量に差のあるタンパク質を表面エンハンス型レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）で検討した。なお、発現量に差のあるタンパク質を広く探索するために、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにおいては、陽イオン用、陰イオン用両方のチップを使用し、マトリックスとして高分子用のＳＰＡ（ＥＡＭ：５０％ＡＣＮ／０．５％ＴＦＡ溶液によるｓｉｎａｐｉｎｉｃ  ａｃｉｄの飽和溶液）と低分子用のＣＨＣＡ（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）を用いて検討した。また、細胞内タンパク質抽出工程では、細胞への刺激および細胞内タンパク質の活性化を避けるためにラバーポリスマンで剥がさずそのまま細胞溶解液を用い細胞内タンパク質を抽出した。その結果、高感受性細胞株と低感受性細胞株において、細胞内発現量に違いのあったタンパク質について推定される分子量及び等電点の情報を得た。これらのタンパク質をデータベース検索することで、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ５Ａ（ＣＯＸ５Ａ）を同定した。また、高感受性細胞株および低感受性細胞株の細胞抽出液の二次元電気泳動を行い、推定される分子量及び等電点の範囲にあり、かつ発現量に差のあるスポットを見出し、そのスポットをＬＣ−ＭＳ／ＭＳで解析し、データベースで検索することで、Ｒｅｔｉｎｏｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＣＲＢＰ１）を同定した。
かかる知見に基づき、さらに検討した結果、がん患者由来の生体試料中の当該タンパク質の濃度を測定すれば、当該がん患者のがんが、抗がん剤に対する感受性を有するか否かを判定できること、また、これら物質の発現変動を指標とすれば抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニングが可能になること、さらに当該抗がん剤感受性亢進剤と感受性亢進の対象となる抗がん剤を併用すれば、当該抗がん剤の治療効果が飛躍的に向上することを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔１６〕の発明を提供するものである。
〔１〕ＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる１以上の分子からなる抗がん剤感受性判定マーカー。
〔２〕抗がん剤が、白金錯体系抗がん剤である〔１〕記載の抗がん剤感受性判定マーカー。
〔３〕抗がん剤が、オキサリプラチン又はその塩から選ばれるものである〔１〕又は〔２〕記載の抗がん剤感受性判定マーカー。
〔４〕がん患者由来の生体試料中のＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる１以上の分子の量を測定する工程を含む抗がん剤の感受性判定方法。
〔５〕さらに、前記測定結果を対照レベルと比較することにより、当該がん患者の抗がん剤に対する感受性を判定する工程を含む〔４〕記載の判定方法。
〔６〕生体試料が、抗がん剤を投与されたがん患者由来の生体試料である〔４〕又は〔５〕記載の判定方法。
〔７〕抗がん剤が、白金錯体系抗がん剤である〔４〕〜〔６〕のいずれかに記載の判定方法。
〔８〕抗がん剤が、オキサリプラチン又はその塩から選ばれるものである〔４〕〜〔７〕のいずれかに記載の判定方法。
〔９〕がん患者由来の生体試料中のＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる１以上の分子の量を測定するためのプロトコールを含むことを特徴とする〔４〕〜〔８〕のいずれかに記載の判定方法を実施するためのキット。
〔１０〕抗がん剤の存在下、がん細胞株又は担癌動物由来の生体試料中のＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる１以上の分子の発現変動を指標とする抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニング方法。
〔１１〕抗がん剤が、白金錯体系抗がん剤である〔１０〕記載のスクリーニング方法。
〔１２〕抗がん剤が、オキサリプラチン又はその塩から選ばれるものである〔１０〕又は〔１１〕記載のスクリーニング方法。
〔１３〕〔１０〕〜〔１２〕のいずれかに記載の方法により得られた抗がん剤感受性亢進剤。
〔１４〕〔１３〕記載の感受性亢進剤と、感受性亢進の対象となる抗がん剤とを組み合わせてなるがん治療用組成物。
〔１５〕抗がん剤が、白金錯体系抗がん剤である〔１４〕記載のがん治療組成物。
〔１６〕抗がん剤が、オキサリプラチン又はその塩である〔１４〕又は〔１５〕記載のがん治療用組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の抗がん剤感受性判定マーカーを用いれば、個々の患者の抗がん剤感受性を治療開始前もしくは治療開始後早期に適確に判定できる結果、治療効果の高い抗がん剤の選択が可能となる。さらに効果が得られない抗がん剤の使用を回避できるため不必要な副作用を回避できる。また、抗がん剤を用いた治療スケジュールは長期に及ぶため、治療継続中においても治療サイクルごとに抗がん剤感受性を判定することにより、そのがんに対する抗がん剤の感受性の経時的評価が可能となり、治療を継続すべきか否かの判定ができる。その結果、治療効果の得られない抗がん剤の継続投与に伴うがんの進行、副作用の増大を防止でき、患者の負担軽減、医療費の削減にもつながる。
さらに、また、このマーカーを用いれば、抗がん剤感受性を亢進させる薬剤がスクリーニングでき、その対象となった抗がん剤と抗がん剤感受性亢進剤とを併用すれば、がん治療効果が飛躍的に向上する。本発明の抗がん剤感受性判定マーカーの測定試薬は、抗がん剤感受性判定試薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】２Ｄ−ＤＩＧＥの結果を示す。図中の枠は、選び出した１６スポットを示す。
【図２】ＰＨＢの発現量とがん細胞に対するオキサリプラチン感受性（ＩＣ50値）の関係を示す。ＩＣ50値は、左から、ＳＷ４８０、Ｌｓ１７４Ｔ、Ｌｏｖｏ、ＳＷ６２０、ＨＣＴ１１６、ＨＣＴ１５、ＨＴ２９、ＤＬＤ−１、ＷｉＤｒの結果をプロットしている。
【図３】Ｃ１ＱＢＰの発現量とがん細胞に対するオキサリプラチン感受性（ＩＣ50値）の関係を示す。ＩＣ50値は、左から、ＳＷ４８０、Ｌｓ１７４Ｔ、Ｌｏｖｏ、ＳＷ６２０、ＨＣＴ１１６、ＨＣＴ１５、ＨＴ２９、ＤＬＤ−１、ＷｉＤｒの結果をプロットしている。
【図４】ＡＮＸＡ５の発現量とがん細胞に対するオキサリプラチン感受性（ＩＣ50値）の関係を示す。ＩＣ50値は、左から、ＳＷ４８０、Ｌｓ１７４Ｔ、Ｌｏｖｏ、ＳＷ６２０、ＨＣＴ１１６、ＨＣＴ１５、ＨＴ２９、ＤＬＤ−１、ＷｉＤｒの結果をプロットしている。
【図５】ＡＮＸＡ１の発現量とがん細胞に対するオキサリプラチン感受性（ＩＣ50値）の関係を示す。ＩＣ50値は、左から、ＳＷ４８０、Ｌｓ１７４Ｔ、Ｌｏｖｏ、ＳＷ６２０、ＨＣＴ１５、ＨＴ２９、ＤＬＤ−１、ＷｉＤｒの結果をプロットしている。
【図６】ＴＡＬＤＯの発現量とがん細胞に対するオキサリプラチン感受性（ＩＣ50値）の関係を示す。ＩＣ50値は、左から、ＳＷ４８０、Ｌｓ１７４Ｔ、Ｌｏｖｏ、ＳＷ６２０、ＨＣＴ１１６、ＨＣＴ１５、ＨＴ２９、ＤＬＤ−１、ＷｉＤｒの結果をプロットしている。
【図７】ＩＰＹＲの発現量とがん細胞に対するオキサリプラチン感受性（ＩＣ50値）の関係を示す。ＩＣ50値は、左から、ＳＷ４８０、Ｌｓ１７４Ｔ、Ｌｏｖｏ、ＳＷ６２０、ＨＣＴ１１６、ＨＣＴ１５、ＨＴ２９、ＤＬＤ−１、ＷｉＤｒの結果をプロットしている。
【図８】候補タンパク質ＡのＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ結果を示す。
【図９】候補タンパク質Ａの等電点の予測を示す。
【図１０】候補タンパク質ＢのＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ結果を示す。
【図１１】候補タンパク質Ｂの等電点の予測を示す。
【図１２】ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで推定された分子量と等電点を同定するために行ったＬ−ＯＨＰ高感受性株と低感受性株に対する二次元電気泳動の結果を示す。
【図１３】ｍ／ｚ  １５，８５０（ＣＲＢＰ１）のウエスタンブロットとＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの各種ピーク強度解析結果の比較を示す。
【図１４】ｍ／ｚ  １２，５０６（ＣＯＸ５Ａ）のウエスタンブロットとＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの各種ピーク強度解析結果の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明における抗がん剤感受性判定マーカーは、ＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａの８種のタンパク質である。これらタンパク質は、後記実施例に示すように、抗がん剤に高感受性の細胞株と低感受性の細胞株において発現しているタンパク質の発現量の差を２Ｄ−ＤＩＧＥ又はＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いて検討した結果、ＰＨＢ、Ｃ１ＱＢＰ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａの４タンパク質では、高感受性株で発現量が増大していることが判明した。また、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ及びＩＰＹＲの４タンパク質では、低感受性株で発現量が増大していることが判明した。従って、これら８タンパク質は、抗がん剤感受性判定マーカー、特にオキサリプラチンの抗がん剤感受性判定マーカーとして有用である。
【００１４】
ＰＨＢは、がん抑制遺伝子であること（特開平５-２７１２９４号公報）、前立腺がんマーカーとして使用できること（特開２０１２-１９６２１１号公報）は知られているが、抗がん剤の感受性判定マーカーとして使用できること、抗がん剤感受性の高いがん細胞でＰＨＢの濃度が上昇することは全く知られていない。
ＡＮＸＡ５およびＡＮＸＡ１は、泌尿生殖管、腸管のがんの診断等に使用され得る（特表２００８-５４５６３４号公報）が、抗がん剤感受性判定マーカーとして使用できること、抗がん剤感受性の低いがん細胞でＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１の濃度が上昇することは全く知られていない。
ＴＡＬＤＯは、がんマーカーについての報告はなく、抗がん剤感受性判定マーカーとして使用できること、抗がん剤感受性の低いがん細胞でＴＡＬＤＯの濃度が上昇することは全く知られていない。
Ｃ１ＱＢＰは、腎細胞がんの診断マーカーとして使用できること（特表２００６−５１４５５４号公報）は知られているが、抗がん剤感受性判定マーカーとして使用できること、抗がん剤感受性の高いがん細胞でＣ１ＱＢＰの濃度が上昇することは全く知られていない。
ＩＰＹＲは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで結腸直腸がんを診断する方法に使用できること（特表２００８-５０２８８９号公報）は知られているが、抗がん剤感受性判定マーカーとして使用できること、抗がん剤感受性の低いがん細胞でＩＰＹＲの濃度が上昇することは全く知られていない。
ＣＲＢＰ１は、乳がんや大腸がんにおいてレチノールによる細胞増殖抑制作用を助長すること（Ｋａｌｅａｇａｓｉｏｇｌｕ  Ｆ，ｅｔ．ａｌ．，Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ（１９９３）４３（４）：４８７−９０）は知られているが、抗がん剤感受性判定マーカーとして使用できること、抗がん剤感受性の高いがん細胞でＣＲＢＰ１の濃度が上昇することは全く知られていない。
ＣＯＸ５Ａは、マウス大腸がんモデルにおいて、癌細胞でその発現が正常細胞に比べて低いこと（Ｙａｓｕｉ  Ｙ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ  Ｃａｒｃｉｎｏｇ（２００９）８：１０）は知られている。また、前記特許文献３の段落（００６８）にて、ＣＯＸ５Ａは、タンパク質Ｇの候補の一つとして挙がっている。しかし、特許文献３においてタンパク質Ｇは、抗がん剤低感受性細胞株で高感受性株に比べてその濃度が上昇しており、本願とは逆の結果を示しているので、特許文献３のタンパク質ＧはＣＯＸ５Ａでないと考えられる。このため、ＣＯＸ５Ａが、抗がん剤感受性判定マーカーとして使用できること、抗がん剤感受性の高いがん細胞でＣＯＸ５Ａの濃度が上昇することは全く知られていないと言える。
【００１５】
本発明の抗がん剤感受性判定マーカーの対象となる抗がん剤としては特に限定されないが、例えばオキサリプラチン、シクロフォスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イフォスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ニムスチン（ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ラニムスチン（ｒａｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、テガフール／ウラシル（ｔｅｇａｆｕｌ・ｕｒａｃｉｌ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、テガフール／ギメラシル／オテラシル（ｔｅｇａｆｕｌ・ｇｉｍｅｒａｃｉｌ・ｏｔｅｒａｃｉｌ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン（６−ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、フルダラビン（ｆｕｌｕｄａｒａｂｉｎ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎｅ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、アムルビシン（ａｍｕｒｕｂｉｃｉｎ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｅ）、ペプレオマイシン（ｐｅｐｌｅｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ）、アクラルビシン（ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ）、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン活性代謝物（ＳＮ−３８）、ノギテカン（ｎｏｇｉｔｅｃａｎ、ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、トレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ）、メドロキシプロゲステロン（ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、アナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）、エキセメスタン（ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ）、レトロゾール（ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、��ムツズマブ・オゾガマイシン（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ  ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、トレチノイン（ｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）、三酸化ヒ素（ａｒｓｅｎｉｃ  ｔｒｉｏｘｉｄｅ）、又はそれらの塩、又はそれらの活性代謝物等が挙げられる。このうち白金錯体系抗がん剤が好ましく、特にオキサリプラチン又はその塩が好ましい。
【００１６】
本発明の抗がん剤感受性判定マーカーを用いて抗がん剤感受性を判定するには、がん患者由来の生体試料（検体）中のＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる１以上の分子の量を測定すること、詳細にはさらに当該測定結果を対照レベル（標準濃度、抗がん剤投与前の本発明の抗がん剤感受性判定マーカーの濃度等）と比較すること、により行うことができる。
ここで、がん患者としては、がんを有する被験者又はがんを有していた被験者が包含される。生体試料としては、例えば血液、血清、血漿、がん組織生検検体、がん摘出手術標本、便、尿、腹水、胸水、脳脊髄液、喀痰等が挙げられるが、血清が特に好ましい。
【００１７】
また、本発明の対象となるがんとしては、咽頭がんを代表とする口唇、口腔及び咽頭がん、食道がん、胃がん、膵がん、結腸・直腸がんなどを代表とする消化器がん、肺がんを代表とする呼吸器及び胸腔内臓器がん、骨及び関節軟骨がん、皮膚の悪性黒色腫、有棘細胞がん及びその他の皮膚のがん、中皮腫を代表とする中皮及び軟部組織がん、乳房がん、子宮がん、卵巣がんを代表とする女性性器がん、前立腺がんを代表とする男性性器がん、膀胱がんを代表とする尿路がん、脳腫瘍を代表とする眼、脳及び中枢神経系がん、甲状腺及びその他の内分泌腺がん、非ホジキンリンパ腫やリンパ性白血病を代表とするリンパ組織、造血組織及び関連組織がん、及びこれらを原発巣とする転移組織のがん等が挙げられるが、特に胃がん、膵がん及び大腸がん（結腸・直腸がん）に対して好適に利用でき、特に大腸がんに好適に利用できる。
【００１８】
検体中のＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる分子の測定手段は、例えば電気泳動法（２Ｄ−ＤＩＧＥなど）、質量分析法（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳなど）、免疫学的測定法（イムノブロッティング、ＥＬＩＳＡなど）等により測定可能である。
【００１９】
ここで２Ｄ−ＤＩＧＥ及びＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる測定は後記実施例に記載の方法によって行うことができる。また、ＬＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳなどの質量分析法による測定は、ＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる分子を、常法に従って定量分析することによって測定することができる。また、免疫学的測定法においては、ＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる分子に対する抗体を用いる測定法が好ましい。用いるＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる分子に対する抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。より具体的には、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウエスタンブロット、免疫染色、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくはウエスタンブロット又はエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのはウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着定量法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）（例えば、ｓａｎｄｗｉｃｈＥＬＩＳＡ）である。
【００２０】
ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ及びＩＰＹＲは、対象とする抗がん剤がオキサリプラチン又はその塩である場合、抗がん剤に対する感受性を判定するには、抗がん剤投与前又は投与後早期の段階において、がん患者由来の生体試料中のＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ及び／又はＩＰＹＲの量、例えば濃度を測定すればよい。濃度が所定の標準濃度より低いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性であると判定できるため、これら抗がん剤感受性判定マーカーは、治療効果を期待出来る患者に対して積極的に治療を継続するためのマーカーとして使用できる。一方、濃度が所定の標準濃度より高いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性ではないと判定できる。対象とする抗がん剤に対して感受性を有さない場合は、その薬効を期待することができず、このような薬効の期待できない抗がん剤の投与が行われたり、続けられた場合、がんの進行、副作用の増大が危惧される。このように、本発明における抗がん剤感受性判定マーカーは、治療効果を期待出来る患者に対して積極的に治療を継続するためのマーカーとして使用できるのに加え、薬効の期待できない抗がん剤の継続投与に伴うがんの進行や副作用の増大を回避するためのマーカーとしても使用できる。
【００２１】
ＰＨＢ、Ｃ１ＱＢＰ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａは、対象とする抗がん剤がオキサリプラチン又はその塩である場合、抗がん剤に対する感受性を判定するには、抗がん剤投与前又は投与後早期の段階において、がん患者由来の生体試料中のＰＨＢ、Ｃ１ＱＢＰ、ＣＲＢＰ１及び／又はＣＯＸ５Ａの量、例えば濃度を測定すればよい。濃度が所定の標準濃度より高いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性であると判定できるため、これら抗がん剤感受性判定マーカーは、治療効果を期待出来る患者に対して積極的に治療を継続するためのマーカーとして使用できる。一方、濃度が所定の標準濃度より低いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性ではないと判定できる。対象とする抗がん剤に対して感受性を有さない場合は、その薬効を期待することができず、このような薬効の期待できない抗がん剤の投与が行われたり、続けられた場合、がんの進行、副作用の増大が危惧される。このように、本発明における抗がん剤感受性判定マーカーは、治療効果を期待出来る患者に対して積極的に治療を継続するためのマーカーとして使用できるのに加え、薬効の期待できない抗がん剤の継続投与に伴うがんの進行や副作用の増大を回避するためのマーカーとしても使用できる。
【００２２】
本発明の抗がん剤感受性の判定方法を実施するには、検体中のＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる１以上の分子を測定するためのプロトコールを含むキットを用いるのが好ましい。当該キットには、ＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる１以上の分子の測定試薬、及びプロトコール（測定試薬の使用方法、及び抗がん剤感受性の有無を判定するための基準等）が含まれる。当該基準には、ＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる１以上の分子の標準濃度、高いと判断される濃度、低いと判断される濃度、測定結果に影響を与える要因とその影響の程度等が含まれ、これらの濃度は対象とする抗がん剤ごとに設定することが可能である。当該基準を用いて、前記のように判定することができる。
【００２３】
また、抗がん剤の存在下、がん細胞株又は担癌動物由来の生体試料中のＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる１以上の分子の発現変動を指標とすることにより抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニングが可能となる。
すなわち、がん細胞株又は担癌動物に抗がん剤及び試験物質を添加又は投与し、がん細胞株又は担癌動物由来の生体試料中のＰＨＢ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ、Ｃ１ＱＢＰ、ＩＰＹＲ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａから選ばれる１以上の分子の発現量を遺伝子レベル又はタンパク質レベルで測定する工程、及び当該発現量の変動に基づいて、前記がん細胞株又は担癌動物の前記抗がん剤に対する感受性を亢進する試験物質を選択する工程を行うことにより、前記抗がん剤に対する感受性亢進剤をスクリーニングすることができる。
【００２４】
例えば、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ及びＩＰＹＲについて、対象とする抗がん剤がオキサリプラチン又はその塩である場合、これらのタンパク質の発現変動、具体的には発現抑制を指標とすれば、抗がん剤感受性亢進剤がスクリーニングできる。すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏにおいてこれらのタンパク質の発現を抑制する物質は、抗がん剤感受性を亢進する。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、各種がん細胞株において抗がん剤の存在下でこれらのタンパク質の濃度を低下させる物質は、当該がん細胞株の当該抗がん剤感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。またｉｎ  ｖｉｖｏでは、担癌動物における抗がん剤投与前後において、これらのタンパク質の濃度を低下させる物質は、当該担癌動物の当該抗がん剤感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。
【００２５】
また、例えば、ＰＨＢ、Ｃ１ＱＢＰ、ＣＲＢＰ１及びＣＯＸ５Ａについて、対象とする抗がん剤がオキサリプラチン又はその塩である場合、これらのタンパク質の発現変動、具体的には発現上昇を指標とすれば、抗がん剤感受性亢進剤がスクリーニングできる。すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏにおいてこれらのタンパク質の発現を上昇させる物質は、抗がん剤感受性を亢進する。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、各種がん細胞株において抗がん剤の存在下でこれらのタンパク質の濃度を上昇させる物質は、当該がん細胞株の当該抗がん剤感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。またｉｎ  ｖｉｖｏでは、担癌動物における抗がん剤投与前後において、これらのタンパク質の濃度を上昇させる物質は、当該担癌動物の当該抗がん剤感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。
【００２６】
かくして得られた抗がん剤感受性亢進剤と感受性亢進の対象となる抗がん剤とを併用すれば、当該抗がん剤の治療効果が飛躍的に向上する。抗がん剤感受性亢進剤と感受性亢進の対象となる抗がん剤とを組み合せた形態としては、それらの成分の両方を含む一の組成物であってもよく、それぞれ別個の製剤の組み合せであってもよい。また、それらの成分はそれぞれ別の投与経路であってもよい。
ここで用いられる対象となる抗がん剤としては、前記と同様であり、オキサリプラチン、シクロフォスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イフォスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ニムスチン（ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ラニムスチン（ｒａｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、テガフール／ウラシル（ｔｅｇａｆｕｌ・ｕｒａｃｉｌ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、テガフール／ギメラシル／オテラシル（ｔｅｇａｆｕｌ・ｇｉｍｅｒａｃｉｌ・ｏｔｅｒａｃｉｌ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン（６−ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、フルダラビン（ｆｕｌｕｄａｒａｂｉｎ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎｅ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、アムルビシン（ａｍｕｒｕｂｉｃｉｎ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｅ）、ペプレオマイシン（ｐｅｐｌｅｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ）、アクラルビシン（ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ）、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン活性代謝物（ＳＮ−３８）、ノギテカン（ｎｏｇｉｔｅｃａｎ、ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、トレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ）、メドロキシプロゲステロン（ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、アナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）、エキセメスタン（ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ）、レトロゾール（ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、ゲムツズマブ・オゾガマイシ��（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ  ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、トレチノイン（ｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）、三酸化ヒ素（ａｒｓｅｎｉｃ  ｔｒｉｏｘｉｄｅ）、又はそれらの塩、又はそれらの活性代謝物等が挙げられる。このうち白金錯体系抗がん剤が好ましく、特にオキサリプラチン又はその塩が好ましい。
【実施例】
【００２７】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
【００２８】
試験例１
ヒト大腸癌細胞株のオキサリプラチン感受性の測定
（１）方法
（ａ）使用細胞
ヒト大腸癌細胞株９種類（ＳＷ４８０、Ｌｓ１７４Ｔ、Ｌｏｖｏ、ＳＷ６２０、ＨＣＴ１１６、ＨＣＴ１５、ＨＴ２９、ＤＬＤ−１及びＷｉＤｒ）は、以下（表１）より入手した。
培養は、φ１００ｍｍ／Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｄｉｓｈ（ＩＷＡＫＩ）、培地（Ｄ−ＭＥＭ、２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１０％  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）、３７℃、５％ＣＯ2の条件下にて行った。
【００２９】
【表１】
2019194597.tif 000002
【００３０】
（ｂ）薬剤
オキサリプラチン（Ｌ−ＯＨＰ）原末は、和光純薬工業および株式会社ヤクルト本社より入手した。
【００３１】
（ｃ）ヒト大腸癌細胞株のオキサリプラチン感受性の測定方法
前記９種類のヒト大腸癌細胞株を、９６ｗｅｌｌプレートに１５００個／ｗｅｌｌ播種し、２４時間後にオキサリプラチンを添加した。薬剤曝露４８時間後の細胞生存率をＭＴＳ  ａｓｓａｙ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６TM  ＡＱｕｅｏｕｓＯｎｅＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ）にて評価し、吸光度からＩＣ50値を求めた。薬剤曝露条件はＣｏｎｔｒｏｌ（０μＭ）、０．００１μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭ、１０００μＭの１１条件を用いた。感受性の評価は、１回の試験においてそれぞれの細胞株、薬剤曝露時間、薬剤曝露条件について３サンプルずつ測定し、異なる継代数の細胞にて３回実施した。解析は、ＭＴＳ  ａｓｓａｙの結果から算出した生存率をもとに行った。
【００３２】
（２）結果
ＩＣ50値は、表２に示す値となった。表２より、ＳＷ４８０、Ｌｓ１７４Ｔ及びＬｏｖｏをオキサリプラチン高感受性株、ＳＷ６２０、ＨＣＴ１１６及びＨＣＴ１５をオキサリプラチン中感受性株、ＨＴ２９、ＤＬＤ−１及びＷｉＤｒをオキサリプラチン低感受性株と分類した。
【００３３】
【表２】
2019194597.tif 000003
【００３４】
実施例１
２Ｄ−ＤＩＧＥによるオキサリプラチン感受性予測バイオマーカーの探索
（１）使用細胞
試験例１にてオキサリプラチン高感受性株として分類したＳＷ４８０、Ｌｓ１７４Ｔ及びＬｏｖｏ、並びにオキサリプラチン低感受性株として分類したＨＴ２９、ＤＬＤ-１及びＷｉＤｒを使用した。
【００３５】
（２）細胞内タンパク質抽出方法
ｄｉｓｈより培地を除き氷冷ＰＢＳで３回洗浄後、細胞への刺激および細胞内タンパク質の活性化を避けるために、直接細胞溶解液（２Ｍ  ｔｈｉｏｕｒｅａ，  ７Ｍ  Ｕｒｅａ，  ４％  ＣＨＡＰＳ，  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９）を加え細胞を溶解し、１．５ｍＬマイクロチューブに移した。氷冷下で超音波破砕処理を行った後、４℃にて１３，０００×ｒｐｍ、１０分間遠心して上清を回収した。２Ｄ  Ｑｕａｎｔ  ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、タンパク質定量を行い、細胞溶解液で５ｍｇ／ｍＬに調製した後、分注して分析するまで−８０℃にて保存した。
【００３６】
（３）ＣｙＤｙｅTM  ＤＩＧＥ  Ｆｌｏｕｒ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｄｙｅｓによるタンパク質の標識
ＣｙＤｙｅ  ＤＩＧＥ  ｆｌｕｏｒｓ，ｍｉｎｉｍａｌ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して細胞内タンパク質を標識した。それぞれの細胞溶解液５０μｇに対し４００ｐｍｏｌの試薬（Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５）で標識し、十分に混和した。遠心機で軽く遠心し、４℃暗所で３０分間静置した。１０ｍＭリジンを添加し反応を停止した。溶液を混和し、軽く遠心して４℃暗所で１０分間静置した。使用まで−８０℃にて保存した。
【００３７】
（４）等電点電気泳動（一次元目）
各ゲルにアプライしたサンプルを表３に示す。
内部標準は全ての細胞溶解液を等量ずつ混和したものを使用した。
それぞれのゲル用に、（３）で標識したタンパク質サンプルを５０μｇ（１２μＬ）ずつ１．５ｍＬマイクロチューブに入れ、混和した。３６μＬの２ｘサンプルバッファー（２Ｍ  ｔｈｉｏｕｒｅａ、７Ｍ  ｕｒｅａ、４％  ＣＨＡＰＳ、２％ＰｈａｒｍａｌｙｔｅｐＨ３−１０、２％  Ｄｅｓｔｒｅａｋ  Ｒｅａｇｅｎｔ）を混和したタンパク質サンプルに添加し、氷上で１０分間静置した。各サンプル１５０μｇ溶液を膨潤液（２Ｍ  ｔｈｉｏｕｒｅａ、７Ｍ  ｕｒｅａ、４％  ＣＨＡＰＳ、２％ＰｈａｒｍａｌｙｔｅｐＨ３−１０、１％  Ｄｅｓｔｒｅａｋ  Ｒｅａｇｅｎｔ）で４５０μＬに調整し、４℃にて１３，０００×ｒｐｍ、１０分間遠心した。各ストリップホルダーにサンプルの上清を４５０μＬ加え、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｌｉｎｅ  ＤｒｙＳｔｒｉｐ  ｐＨ３−１０ＮＬ，２４ｃｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をストリップホルダーに設置した後、Ｅｔｔａｎ  ＩＰＧｐｈｏｒ２を使用して、等電点電気泳動を行った。等電点電気泳動の条件を表４に示す。
【００３８】
【表３】
2019194597.tif 000004
【００３９】
【表４】
2019194597.tif 000005
【００４０】
（５）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（二次元目）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に２４ｃｍの１５％アクリルアミドゲルを作成した。一次元目泳動済みのＩｍｍｕｎｏｂｉｌｉｎｅ  ＤｒｙＳｔｒｉｐを１０ｃｍ  ｄｉｓｈに入れ、平衡化バッファーＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．８、６Ｍ  Ｕｒｅａ、３０％グリセロール、１％ＳＤＳ、０．２５％ＤＴＴ、ＢＰＢ）で満たし１５分間振盪しながら平衡化させた。平衡化バッファーＢ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．８、６Ｍ  Ｕｒｅａ、３０％グリセロール、１％ＳＤＳ、４．５％ヨードアセトアミド、ＢＰＢ）に変え１５分間振盪しながら平衡化させた。平衡化したＩｍｍｕｎｏｂｉｌｉｎｅ  ＤｒｙＳｔｒｉｐをＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲルに設置し、泳動層（Ｔｒｉｓ/Ｔｒｉｃｉｎ/ＳＤＳ  ｂｕｆｆｅｒ）にて７ｍＡで泳動した。
Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で撮影し、ＤｅＣｙｄｅｒ  ２Ｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｅｒ６．５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で解析し、Ｐ＜０．００１で、かつ、発現量の差が１．３倍以上のスポットを解析した。
【００４１】
（６）スポットの回収
標識していない内部標準１５０μｇを（４）、（５）同様に二次元電気泳動した。
次に（５）で得られたスポットを回収するために、ゲルをＰｌｕｓＯｎｅTM  Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ，Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で銀染色した。
まず、ゲルにＦｉｘｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３０％  Ｅｔｈａｎｏｌ、１０％  Ｇｌａｃｉａｌ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）を２５０ｍＬ添加し、６０分間静置した。この作業を２回繰り返し、ゲルを固定した。固定したゲルに、Ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３０％  Ｅｔｈａｎｏｌ、４％  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｔｈｉｏｓｕｌｐｈａｔｅ（５％  ｗ/ｖ）、６．８％  Ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）を２５０ｍＬ添加して１２０分間静置することでゲルを増感させ、Ｍｉｌｌｉ−ＱTM水により、８分間洗浄し、当該洗浄を５回繰り返した。洗浄したゲルに、Ｓｉｌｖｅｒ  ｓｏｌｕｔｏｎ  （１０％  Ｓｉｌｖｅｒ  ｎｉｔｒａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２．５％  ｗ/ｖ））を２５０ｍＬ添加して６０分間銀反応させ、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水にて１分間洗浄し、当該洗浄を４回繰り返した。洗浄後のゲルにＤｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｓｏｌｕｉｏｎ（２．５％Ｓｏｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ、０．０８％  ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（３７％  ｗ/ｖ））を２５０ｍＬ添加して、２〜５分間現像し、Ｓｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１．４６％  ＥＤＴＡ−Ｎａ２・２Ｈ2Ｏ）を２５０ｍＬ添加して、４５分間静置し、反応を止めた。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で３０分間洗浄し、当該洗浄を２回繰り返した後、解析する目的のスポットをスポットペッカー（Ｇｅｎｅ  Ｗｏｒｌｄ）で採取し、１．５ｍＬマイクロチューブに４スポットずつ移した。
【００４２】
（７）スポットの解析
（６）までの操作で回収された１６スポット（図１の枠）について、公知の方法に従ってタンパク質のゲル内トリプシン消化を行った後、ＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ（液体クロマトグラフ質量分析計、Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を用いて分析（ＭＳ／ＭＳ測定）を行い、得られた結果についてＭＡＳＣＯＴデータベース検索を行った。
【００４３】
データベース検索の結果、Ｐｒｏｈｉｂｉｔｉｎ（ＰＨＢ）、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ａ５（ＡＮＸＡ５）、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ａ１（ＡＮＸＡ１）、Ｔｒａｎｓａｌｄｏｌａｓｅ（ＴＡＬＤＯ）、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  １Ｑ  ｓｕｂｃｏｍｐｏｎｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃ１ＱＢＰ）、及びＩｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＩＰＹＲ）の６種類が同定された。
【００４４】
実施例２
６タンパク質の大腸癌細胞株中での発現量とＩＣ50値との相関
実施例１にて同定された６タンパク質について、試験例１にて使用した９種類の大腸癌細胞株中での発現量と試験例１で算出したＩＣ50値との相関を確認した。
【００４５】
（１）方法
（ａ）使用細胞
試験例１記載の９種類の大腸癌細胞株を使用した。
（ｂ）細胞内タンパク質の抽出
ｄｉｓｈより培地を除き氷冷ＰＢＳで３回洗浄後、細胞への刺激および細胞内タンパク質の活性化を避けるために、直接細胞溶解液（９Ｍ  Ｕｒｅａ，  ２％  ＣＨＡＰＳ，  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９）を加え細胞を溶解し、１．５ｍＬマイクロチューブに移した。氷冷下で超音波破砕処理を行った後、４℃にて１３，０００×ｒｐｍ、１０分間遠心して上清を回収した。ＢＣＡ  ＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、タンパク質定量を行い、細胞溶解液で５ｍｇ／ｍＬに調製した後、分注して分析するまで−８０℃にて保存した。
【００４６】
（ｃ）Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ
１０％アクリルアミドゲルに試験例１記載の９種類の大腸癌細胞株をそれぞれ１０μＬ/Ｌａｎｅ（５０μｇ/Ｌａｎｅ）添加し、泳動層（Ｔｒｉｓ/Ｇｌｙｃｉｎ/ＳＤＳ  ｂｕｆｆｅｒ）にて、１枚２０ｍＭでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。セミドライ式ブロッター（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用い１枚当たり７２ｍＡ、３０分間にて、ＰＶＤＦ膜（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にｔｒａｎｓｆｅｒを行い、５％  ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ／ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ  ｗｉｔｈ  Ｔｗｅｅｎ２０）を用い室温で一時間ｂｌｏｋｋｉｎｇし、表５に示した一次抗体を添加し、４℃、ｏｖｅｒ  ｎｉｇｈｔで反応させた。
【００４７】
【表５】
2019194597.tif 000006
【００４８】
ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、表６に示す二次抗体を添加し、室温で一時間振盪させた。ＴＢＳ−Ｔで洗浄後、ＥＬＣ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を反応させ、ＬＡＳ４０００  ｍｉｎｉ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で撮影し解析した。
【００４９】
【表６】
2019194597.tif 000007
【００５０】
（２）結果
ＰＨＢ及びＣ１ＱＢＰは、オキサリプラチン高感受性株でその発現量が多く、低感受性株で発現量が少なく、高い正の相関を示した（図２、図３）。
ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ１、ＴＡＬＤＯ及びＩＰＹＲは、オキサリプラチン高感受性株でその発現量が少なく、低感受性株で発現量が多く、高い負の相関を示した（図４〜図７）。
【００５１】
実施例３
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いたオキサリプラチン感受性予測バイオマーカーの探索
（１）方法
（ａ）使用細胞
試験例１にてオキサリプラチン高感受性株として分類したＳＷ４８０、Ｌｓ１７４Ｔ及びＬｏｖｏ、並びにオキサリプラチン低感受性株として分類したＨＴ２９、ＤＬＤ-１及びＷｉＤｒを使用した。
【００５２】
（ｂ）細胞内タンパク質の抽出
実施例２の（１）方法（ｂ）細胞内タンパク質の抽出、と同様の方法で行った。
【００５３】
（ｃ）タンパク質発現解析のためのサンプル調製及びプロテインチップの作製、細胞内タンパク質の発現解析
細胞溶解バッファーをｐＨ４の希釈／洗浄バッファー（５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）（以下、ｐＨ４バッファー）にて０．５ｍｇ／ｍＬに調製したサンプル１００μＬを、ｐＨ４バッファーにて前処理した陽イオン交換チップアレイ（ＣＭ１０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のスポットにａｐｐｌｙし、３０分インキュベートして反応させた後、ｐＨ４バッファーにて３回洗浄、ｍｉｌｌｉＱ水にて２回リンスした。風乾後、ｅｎｅｒｇｙ ａｂｓｏｒｂｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（高分子側の確認用としてＳＰＡ（ＥＡＭ：５０％ ＡＣＮ／０．５％ ＴＦＡ溶液によるｓｉｎａｐｉｎｉｃ ａｃｉｄの飽和溶液）を、低分子側の確認用としてＣＨＣＡ（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）を使用）１．０μＬを、０．５μＬずつ２回に分けて各スポットにａｐｐｌｙし、スポット表面が乾いた後、プロテインチップアレイの分析を行った。
また、前記同様に、ｐＨ８の希釈／洗浄バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ）（以下、ｐＨ８バッファー）にて０．５ｍｇ／ｍＬに調製したサンプル１００μＬを、ｐＨ８バッファーにて前処理した陰イオン交換チップアレイ（Ｑ１０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のスポットにａｐｐｌｙし、１時間インキュベートして反応させた後、ｐＨ８バッファーにて３回洗浄、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水にて２回リンスした。風乾後、ｅｎｅｒｇｙ ａｂｓｏｒｂｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＥＡＭ及びＣＨＣＡを使用）１．０μＬを、０．５μＬずつ２回に分けて各スポットにａｐｐｌｙし、スポット表面が乾いた後、プロテインチップアレイの分析を行った。
タンパク質発現解析は、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）にて行った。分析機器としては、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐT M Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｄｅｌ ＰＣＳ４０００ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた。
マトリックスとしてＳＰＡを使用した場合、Ｍａｓｓ Ｒａｎｇｅ １０，０００〜５０，０００ Ｄａｌｔｏｎｓ、Ｆｏｃｕｓ Ｍａｓｓ １８，０００ Ｄａｌｔｏｎ,Ｅｎｅｒｇｙ４，０００ ｎＪ、１サンプルあたり合計２６５ｓｈｏｔｓ の条件にて分析を行った。
マトリックスとしてＣＨＣＡを使用した場合、Ｍａｓｓ Ｒａｎｇｅ ２，０００〜２０，０００ Ｄａｌｔｏｎｓ、Ｆｏｃｕｓ Ｍａｓｓ ７，７００ Ｄａｌｔｏｎ、Ｅｎｅｒｇｙ １，５００ ｎＪ、１サンプルあたり合計２６５ｓｈｏｔｓ の条件にて分析を行った。
ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ ｒａｔｉｏ（Ｓ／Ｎ比）５以上のピークの抽出とタンパク質発現比較解析は、ＣｉｐｈｅｒｇｅｎＥｘｐｒｅｓｓ T M Ｄａｔａ Ｍａｎａｇｅｒ ３．０ を用いて行った。
【００５４】
（ｄ）候補ピークの選択
オキサリプラチン高感受性株と低感受性株のタンパク質ピークを比較した際に、ｐ＜０．００１で発現量に違いのあったピークを最終的に２種類抽出した（候補タンパク質Ａ及びＢ）。また、ｐＨの変動による発現量の変動から候補タンパク質Ａ及びＢの等電点を推定した。
【００５５】
（２）結果
チップとしてＣＭ１０を使用した際に見出された候補タンパク質Ａは、図８に示すように、オキサリプラチン高感受性株で低感受性株に比べ発現量が増加していた。候補タンパク質Ａは、オキサリプラチン高感受性株と低感受性株のタンパク質ピークを比較した際のｐ値は、ｐ＝７．９×１０-6であり、ｍ／ｚ  １５８４７Ｄａ、等電点（ＰＩ）４．５〜５．５（図９）であった。
また、チップとしてＱ１０を使用した際に見出された候補タンパク質Ｂは、図１０に示すように、オキサリプラチン高感受性株で低感受性株に比べ発現量が増加していた。候補タンパク質Ｂは、オキサリプラチン高感受性株と低感受性株のタンパク質ピークを比較した際のｐ値は、ｐ＝１．０×１０-4であり、ｍ／ｚ  １２５０６Ｄａ、等電点（ＰＩ）４．０〜５．０（図１１）であった。
【００５６】
前記で得られた候補タンパク質Ｂについて、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ解析で得られた分子量と等電点から、データベース（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ；スイス生物情報科学機構）を使用してタンパク質Ｂを推測した結果、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｖａ（ＣＯＸ５Ａ）（分子量１２，５０１、等電点４．８８）が候補タンパク質Ｂと推定された。
【００５７】
実施例４
候補タンパク質Ａの二次元電気泳動による解析
候補タンパク質Ａの同定を目的として、さらに二次元電気泳動による解析を行った。
オキサリプラチン高感受性株であるＳＷ４８０及び低感受性株であるＷｉＤｒを用いて、実施例２の（１）方法（ｂ）細胞内タンパク質の抽出と同様の方法で細胞内タンパク質を抽出し、５ｍｇ／ｍＬに調整した後、分析するまで−８０℃にて保存した。
細胞溶解液５０μｇを膨潤液（２Ｍ  ｔｈｉｏｕｒｅａ、７Ｍ  ｕｒｅａ、４％  ＣＨＡＰＳ、２％ＰｈａｒｍａｌｙｔｅｐＨ３−１０、１％  Ｄｅｓｔｒｅａｋ  Ｒｅａｇｅｎｔ）で１２５μＬに調整した。調整したサンプル溶液を４℃にて１３，０００×ｒｐｍ、１０分間遠心し、上清をＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  ＤｒｙＳｔｒｉｐ  ｇｅｌ（ｐＨ３〜１０  ｎｏｎ―ｌｉｎｅａｒ、１３ｃｍ、ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス）に添加し、ゲルの膨潤を行った後、等電点電気泳動を行った。電気泳動の条件を表７に示す。
【００５８】
【表７】
2019194597.tif 000008
【００５９】
等電点電気泳動終了後、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  ＤｒｙＳｔｒｉｐ  ｇｅｌを１０ｍＬチューブに入れ、平衡化バッファーＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．８、６Ｍ  Ｕｒｅａ、３０％グリセロール、１％ＳＤＳ、０．２５％ＤＴＴ、ＢＰＢ）で満たし１５分間振盪しながら平衡化させた。平衡化バッファーＢ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．８、６Ｍ  Ｕｒｅａ、３０％グリセロール、１％ＳＤＳ、４．５％ヨードアセトアミド、ＢＰＢ）に変え１５分間振盪しながら平衡化させた。平衡化の終了したＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ ＤｒｙＳｔｒｉｐ ｇｅｌを２０ｍＡの定電流にて電気泳動を行った。ゲルは１０〜２０％、１６×１６ｃｍポリアクリルアミドグラジェントゲル（バイオクラフト）を用いた。
次に得られたスポットを回収するために、ゲルをＰｌｕｓＯｎｅ  ＳｉｌｖｅｒＳｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ，Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で銀染色した。銀染色によるスポットの回収は、実施例１（６）スポットの回収、と同様の方法で行った。
実施例３で得られた候補タンパク質Ａに関する情報（分子量及び等電点）に基づき、二次元電気泳動にて展開したゲル上の分子量１０，０００〜３０，０００Ｄａ及び、およそｐＨ４．５〜６．５の範囲に分離されたスポット（図１２の枠内）を対象とし、これらの中からＳＷ４８０とＷｉＤｒを比較した際に発現量に差のある８スポットを選択し、これらのスポットを回収した。
【００６０】
回収したスポットについて、公知の方法に従ってタンパク質のゲル内トリプシン消化を行った後、ＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ（液体クロマトグラフ質量分析計、Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を用いて分析（ＭＳ／ＭＳ測定）を行い、得られた結果についてＭＡＳＣＯＴデータベース検索を行った。
【００６１】
データベース検索の結果、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｔｉｎｏｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＣＲＢＰ１）（分子量１５，８５０、等電点４．９９）が同定された。これは、分子量、等電点ともにほぼ一致することから、候補タンパク質Ａと推定された。
【００６２】
実施例５
Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔによるタンパク質発現の確認
（１）ＣＲＢＰ１の確認
実施例２の（１）方法（ｂ）細胞内タンパク質の抽出と同様の方法で、オキサリプラチン高感受性株と低感受性株の細胞内タンパク質を抽出後、１５％ポリアクリルアミドゲルに１レーンあたりタンパク量５０μｇをａｐｐｌｙし、２０ｍＡ定電流にてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動後、ドライブロッティングシステム（ｉＢｌｏｔＴＭ 、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＶＤＦ膜にタンパク質をブロットし、ブロッキングを行った後、抗ＣＲＢＰ１モノクローナル抗体（ｓｃ−５３９８９、ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ）（×１／２００）を、内在性タンパク質については抗ＧＡＰＤＨモノクローナル抗体（ａｎｔｉ−ＧＡＰＤＨ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｍｂｉｏｎ）（×１／１００００）を用いて一次抗体反応を行った。アルカリホスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（×１／２００００）と二次抗体反応をさせた後、反応基質としてＣＤＰ−ＳｔａｒT M ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅを添加して発光させ、ルミノ・イメージアナライザー（ＬＡＳ−４０００ｍｉｎｉ、富士フィルム）により検出した。ブロッキング試薬、二次抗体および反応基質はＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚｅT M 、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。
【００６３】
オキサリプラチン高感受性株におけるＣＲＢＰ１の発現は、抗ＣＲＢＰ１抗体を用いたウエスタンブロット法によって確認された（図１３）。
【００６４】
（２）ＣＯＸ５Ａの確認
一次抗体として、抗ＣＯＸ５Ａモノクローナル抗体（ｓｃ−３７６９０７、ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ）（×１／２００添加）を使用した以外は、前記（１）ＣＲＢＰ１の確認と同様の方法で行った。その結果、オキサリプラチン高感受性株におけるＣＯＸ５Ａの発現は、抗ＣＯＸ５Ａ抗体を用いたウエスタンブロット法によって確認された（図１４）。
【００６５】
実施例６
ｓｉＲＮＡの導入によるヒト大腸癌細胞株のオキサリプラチン感受性の変化
（１）方法
（ａ）使用細胞
試験例１記載の９種類の大腸癌細胞株のオキサリプラチン高感受性株としてＬｓ１７４Ｔを、中感受性株としてＨＣＴ１１６を、低感受性株としてＨＴ２９及びＤＬＤ−１を使用した。
【００６６】
（ｂ）薬剤
試験例１記載のオキサリプラチン原末を使用した。
【００６７】
（ｃ）ヒト大腸癌細胞株へのｓｉＲＮＡの導入
前記ヒト大腸癌細胞株を、６ｗｅｌｌのプレートに１×１０5個／ｗｅｌｌ播種し、２４時間後に無血清のＤＭＥＭ培地（Wako, 044-29765）に交換した。１ｗｅｌｌあたり、１５０ｐｍｏｌの表８に示した各ｓｉＲＮＡを２５０μＬ Ｏｐｔｉ ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ，Ｎｏ．３１９９８５）に溶解した溶液、及び４．５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ＲＮＡｉＭＡＸ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｎｏ．１３７７８−１５０）と２５０μＬ Ｏｐｔｉ ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ，Ｎｏ．３１９９８５）を混合した溶液を混合し、１０〜２０分間インキュベートした。インキュベート後、ヒト大腸癌細胞株を培養した６ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌに５００μＬずつ添加し、添加して４〜６時間後に各ｗｅｌｌを、血清を添加したＤＭＥＭ培地（Wako, 044-29765）に交換した。ｓｉＲＮＡ添加後２４時間後に細胞を回収した。
また、使用したヒト大腸癌細胞株と導入したｓｉＲＮＡの組み合わせを表９に示した。なお、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡは、life technologies社のNo. 4390843を使用した。
【００６８】
【表８】
2019194597.tif 000009
【００６９】
【表９】
2019194597.tif 000010
【００７０】
（ｄ）ｓｉＲＮＡを導入したヒト大腸癌細胞株のオキサリプラチン感受性の測定方法
試験例１（１）（ｃ）記載の方法で、ｓｉＲＮＡを導入したヒト大腸癌細胞株のオキサリプラチン感受性の測定（ＩＣ50値の測定）を行った。
【００７１】
（２）結果
（ａ）ＰＨＢ  ｓｉＲＮＡ
結果を表１０に示す。ｓｉＲＮＡ導入により、ＰＨＢをノックアウトしたＬｓ１７４Ｔ、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９、ＤＬＤ−１の各ヒト大腸癌細胞株は、それぞれのＣｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡと比較して、ＩＣ50値が上昇し、オキサリプラチンに対する感受性が低下した。この結果は、ＰＨＢがオキサリプラチン高感受性株で発現量が多く、低感受性株で発現量が少ないことを示した実施例２の結果とも一致した。
【００７２】
【表１０】
2019194597.tif 000011
【００７３】
（ｂ）ＡＮＸＡ５  ｓｉＲＮＡ
結果を表１１に示す。ｓｉＲＮＡ導入によりＡＮＸＡ５をノックアウトしたＨＣＴ１１６、ＨＴ２９の各ヒト大腸癌細胞株は、それぞれのＣｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡと比較して、ＩＣ50値が低下し、オキサリプラチンに対する感受性が亢進した。この結果は、ＡＮＸＡ５がオキサリプラチン高感受性株で発現量が少なく、低感受性株で発現量が多いことを示した実施例２の結果とも一致した。
【００７４】
【表１１】
2019194597.tif 000012
【００７５】
（ｃ）ＴＡＬＤＯ  ｓｉＲＮＡ
結果を表１２に示す。ｓｉＲＮＡ導入によりＴＡＬＤＯをノックアウトしたＬｓ１７４Ｔ、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９の各ヒト大腸癌細胞株は、それぞれのＣｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡと比較して、ＩＣ50値が低下し、オキサリプラチンに対する感受性が亢進した。この結果は、ＴＡＬＤＯがオキサリプラチン高感受性株で発現量が少なく、低感受性株で発現量が多いことを示した実施例２の結果とも一致した。
【００７６】
【表１２】
2019194597.tif 000013
【００７７】
（ｄ）Ｃ１ＱＢＰ  ｓｉＲＮＡ
結果を表１３に示す。ｓｉＲＮＡ導入によりＣ１ＱＢＰをノックアウトしたＨＣＴ１１６は、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡと比較して、ＩＣ50値が上昇し、オキサリプラチンに対する感受性が低下した。この結果は、Ｃ１ＱＢＰがオキサリプラチン高感受性株で発現量が多く、低感受性株で発現量が少ないことを示した実施例２の結果とも一致した。
【００７８】
【表１３】
2019194597.tif 000014
【００７９】
（ｅ）ＩＰＹＲ  ｓｉＲＮＡ
結果を表１４に示す。ｓｉＲＮＡ導入によりＩＰＹＲをノックアウトしたＬｓ１７４Ｔは、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡと比較して、ＩＣ50値が低下し、オキサリプラチンに対する感受性が亢進した。この結果は、ＩＰＹＲがオキサリプラチン高感受性株で発現量が少なく、低感受性株で発現量が多いことを示した実施例２の結果とも一致した。
【００８０】
【表１４】
2019194597.tif 000015
【図１】
2019194597.tif 000016
【図２】
2019194597.tif 000017
【図３】
2019194597.tif 000018
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2019194597.tif 000027
【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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