(57)【要約】  核酸を合成するための方法であって、ｃＤＮＡの合成に具体的な用途を有する方法。該方法によって、ｃＤＮＡ合成後、該ｃＤＮＡの濃縮または精製をする必要なしに、該ｃＤＮＡをマイクロアレイに適用することが可能になる。
2007506439.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡの初期試料を得る工程、
該ＲＮＡ試料を逆転写して、ｃＤＮＡの試料を合成する工程、および
該ｃＤＮＡ試料をマイクロアレイに適用する工程
を含む方法であって、
ｃＤＮＡ合成後、かつｃＤＮＡ試料をマイクロアレイに適用する前にｃＤＮＡ試料を濃縮せずに該ｃＤＮＡ試料をマイクロアレイに適用する方法。
【請求項２】
ｃＤＮＡ試料合成後、かつｃＤＮＡ試料をマイクロアレイに適用する前にｃＤＮＡ試料を精製せずに該ｃＤＮＡ試料をマイクロアレイに適用する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＲＮＡの初期試料が全ＲＮＡを含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ＲＮＡの初期試料がメッセンジャーＲＮＡを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ＲＮＡの初期試料が、約０．１から１マイクログラムの全ＲＮＡを含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ＲＮＡの初期試料が、約１から１０００ナノグラムのｍＲＮＡを含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ｃＤＮＡ試料中のｃＤＮＡにデンドリマーをハイブリダイズさせる工程をさらに含む、請求項１〜６いずれか記載の方法。
【請求項８】
ｃＤＮＡ試料中のｃＤＮＡにデンドリマーをハイブリダイズさせる工程をさらに含む、請求項１〜６いずれか記載の方法であって、該デンドリマーが、検出可能なシグナルを発生するように標識されている方法。
【請求項９】
ｃＤＮＡ試料中のｃＤＮＡにデンドリマーをハイブリダイズさせる工程をさらに含む、請求項１〜６いずれか記載の方法であって、該デンドリマーが、検出可能なシグナルを発生するように標識されており、該デンドリマーが各デンドリマー分子上において５００よりも多い蛍光色素で標識されている方法。
【請求項１０】
ＲＮＡの初期試料を得る工程、
該ＲＮＡ試料を逆転写して、ｃＤＮＡの試料を合成する工程、
該ｃＤＮＡ試料をマイクロアレイに適用する工程であって、該マイクロアレイが、それに固定された核酸試料を有する工程、
該ｃＤＮＡ試料中のｃＤＮＡを、マイクロアレイ上の核酸試料にハイブリダイズさせる工程、および、
デンドリマーを、該ｃＤＮＡ試料中のｃＤＮＡにハイブリダイズさせる工程
を含む方法であって、
ｃＤＮＡ合成後、かつｃＤＮＡ試料をマイクロアレイに適用する前にｃＤＮＡ試料を濃縮せずに該ｃＤＮＡ試料をマイクロアレイに適用する方法。
【請求項１１】
ｃＤＮＡ試料合成後、かつｃＤＮＡ試料をマイクロアレイに適用する前にｃＤＮＡ試料を精製せずに該ｃＤＮＡ試料をマイクロアレイに適用する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ＲＮＡの初期試料が全ＲＮＡを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
ＲＮＡの初期試料がメッセンジャーＲＮＡを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
ＲＮＡの初期試料が、約０．１から１マイクログラムの全ＲＮＡを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
ＲＮＡの初期試料が、約１から１０００ナノグラムのｍＲＮＡを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
ｃＤＮＡ試料中のｃＤＮＡにデンドリマーをハイブリダイズさせる工程をさらに含む、請求項１０〜１５いずれか記載の方法であって、該デンドリマーが、検出可能なシグナルを発生するように標識されている方法。
【請求項１７】
ｃＤＮＡ試料中のｃＤＮＡにデンドリマーをハイブリダイズさせる工程をさらに含む、請求項１０〜１５いずれか記載の方法であって、該デンドリマーが、検出可能なシグナルを発生するように標識されており、該デンドリマーが各デンドリマー分子上において５００よりも多い蛍光色素で標識されている方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００３年９月２６日に出願された米国仮出願第６０／５０６，２４７号の優先権を主張するものである。
【０００２】
また、本出願は、２００１年１月１３日に出願された米国仮出願第６０／２６１，２３１号の優先権を主張する、２００２年１月１４日に出願された米国非仮出願第１０／０５０，０８８号（放棄された）の継続出願である、２００４年４月１６日に出願された米国非仮出願第１０／８２５，７７６号（係属中）の一部継続出願でもある。
【０００３】
また、本出願は、２００１年８月３１日に出願された米国仮出願第６０／３１６，１１６号の優先権を主張する、２００２年９月３日に出願された米国非仮出願第１０／２３４，０６９号（係属中）の一部継続出願でもある。
【０００４】
また、本出願は、２００２年３月２５日に出願された米国仮出願第６０／３６７，４３８号の優先権を主張する、２００３年３月２５日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／０９２３２号（係属中）（「’２３２号出願」）の一部継続出願でもある。
【０００５】
これらの出願すべてについて優先権が主張されており、これらはすべて、その全体が参照して本明細書に組み込まれる。
【０００６】
発明の技術分野
本発明は、核酸合成の改良法に関する。
【背景技術】
【０００７】
発明の背景
核酸合成法は、現代の分子生物学の基礎の一つであり、非常に多様な実験技術および診断技術に利用されている。現在知られている核酸のさまざまな形態のうち、ｃＤＮＡすなわち「相補的ＤＮＡ」は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはその他のタイプのＲＮＡ分子の鋳型から作り出されるＤＮＡのコピーである。
【０００８】
元となるｍＲＮＡからのｃＤＮＡ分子の合成は、逆転写酵素（ＲＴ）として知られる酵素、すなわちＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼを用いて遂行される。逆転写酵素は、当初レトロウイルスに関連して発見され、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）またはモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）などのウイルスから、または、クローニングされた該遺伝子を含む細胞から精製して得ることができる。
【０００９】
任意の細胞ソースから単離したｍＲＮＡを用いて、該細胞ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ分子からなるライブラリーを作製することができる。そして、このｃＤＮＡライブラリーは、様々な実験目的に用いることができる。例えば、特定の組織型から作成されたｃＤＮＡライブラリーは、遺伝子発現解析に用いて、すなわち、初期試料内での核酸の発現に関する情報の提供することができる。遺伝子発現解析は、例えば、遺伝子の新規発現の同定、特定の表現型に対する遺伝子発現の相関関係、疾患素因のスクリーニング、および、毒性試験や新たな薬剤化合物のスクリーニングなどにおいて特定の作用因子の細胞遺伝子発現に対する効果の同定などの多様な応用的用途に役立ちうる。
【００１０】
解析を行うために、全（またはメッセンジャー）ＲＮＡを所望の細胞試料から抽出する
。逆転写により、該ＲＮＡから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のコピーを生じさせる。このｃＤＮＡコピーを、蛍光マーカーなどのマーカーまたはラベルで標識し、短い断片に分解する。
【００１１】
本発明者の先行特許出願において論じたように、任意の試料中におけるｃＤＮＡ配列の解析は、ＤＮＡマイクロアレイなど核酸解析のための高速技術（例えば、２００１年８月３１日に出願された米国仮出願第６０／３１６，１１６号の優先権を主張する２００２年９月３日に出願された米国非仮出願第１０／２３４，０６９号、および２００２年９月３日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／０２７７９９号、国際公開第ＷＯ０３／０２０９０２  Ａ２号「核酸の非特異的ハイブリダイゼーションを阻止する方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）」を参照。これらすべては参照されて、本明細書に組み込まれる）を用いて行う場合に特に効果的である。マイクロアレイはすべて同様の原理で機能する。すなわち、スライドガラスまたはシリコンチップまたはナイロン膜など、実質的に平坦な基板を、直径約２０から１００ミクロンの微細なスポットで格子状にコーティングする。各スポット（すなわちフィーチャ）は、ＤＮＡまたはヌクレオチドの短い配列のコピーを何百万も含み、コンピューターが、各配列の基板上での位置を追跡し続けるため、使用者が、何千もの小規模な試験管様反応を同時に行うことを可能にする。
【００１２】
該ｃＤＮＡコピーを標識した後、標識された断片をマイクロアレイ上に洗い流して一晩放置し、標識された該断片が該マイクロアレイに付着しているＤＮＡにハイブリダイズできるようにする。ハイブリダイゼーションさせてから、蛍光ｃＤＮＡと対合した、マイクロアレイ上のフィーチャは、顕微鏡で観察可能か、またはコンピューターにより検出可能な蛍光シグナルを放出する。このようにして、マイクロアレイ上のどの配列が試験試料のｃＤＮＡと一致するかを知ることができる。時にはミスマッチが生じても、各スポットすなわちフィーチャに何百万ものプローブを用いることによって、相補的ｃＤＮＡが存在する場合にのみ、確実に蛍光が検出されるようにする。蛍光シグナルが強いほど（すなわち、スポットが明るいほど）、一致するｃＤＮＡが細胞中に多く存在した。
【００１３】
しかし、残念なことに、当業において公知の従来の方法では、逆転写によりｃＤＮＡを調製した後、該ｃＤＮＡの濃縮を行わなければ、該ｃＤＮＡを、マイクロアレイに適用されるハイブリダイゼーション用混合液中で使用することができない。また、該ｃＤＮＡが染料を用いてラベリングされている場合などには、しばしば精製も行わなければならない。これらの濃縮および／または精製工程は、試験解析に対する余計な時間および費用を加えることになる。
【００１４】
例えば、核酸を濃縮する一つの典型的な方法はエタノール沈殿法である。ｃＤＮＡ濃縮を可能にするエタノール沈殿法の具体的なプロトコールは以下の通りである。
【００１５】
合成されたｃＤＮＡのエタノール沈殿法
１．  １×ＴＥバッファーで、合成されたｃＤＮＡの容量を１３０μＬに調整する。
２．  合成ｃＤＮＡ混合物に３μｌの直鎖状アクリルアミド（５．０ｍｇ／ｍＬ）を添加する。
３．  ６μｌの５Ｍ  ＮａＣｌまたは２５０μｌの３Ｍ酢酸アンモニウムを添加して混合する。
４．  ＮａＣｌを用いる場合、１００％のエタノールを５４０μｌ、または３Ｍ酢酸アンモニウムを用いる場合、１００％のエタノールを８７５μｌ加える。適度なボルテックス処理により混合する。
５．  −２０℃で３０分間培養する。
６．  試料を１０，０００ｇより大にて１５分間遠心分離する。
７．  慎重に上清を吸引して、ｃＤＮＡペレットが失われないようにする。デカントするとペレットが滑り落ちて失われる可能性があるため、デカントしないようにする。
８．  ｃＤＮＡペレットに７０％のエタノールを３００μｌ添加する。チューブの側面を軽くたたいてゆっくりと混合する。混ぜ過ぎはｃＤＮＡペレットを壊すことになるため、混ぜ過ぎないようにする。
９．  １０，０００ｇより大にて５分間遠心分離して、上清を除去する。デカントしないこと。
１０．  ６５℃で１０〜３０分間加熱して、ｃＤＮＡペレットを完全に乾燥させる。ｃＤＮＡペレットが完全に乾燥していないと、再懸濁することが困難となり、不完全な再懸濁によりマイクロアレイ上に斑点だらけのバックグラウンドおよび／またははっきりしない結果を生じる可能性がある。
１１．  ｃＤＮＡのアレイへのハイブリダイゼーションに進む。
【００１６】
エタノール沈殿法は、従来から一般に認められている核酸濃縮法であるが、残念ながら、ペレット化したｃＤＮＡが部分的または完全に失われるか、または沈殿したｃＤＮＡの再可溶化が不完全であるために、一定しない結果をもたらす可能性がある。例えば、上記のように、少量のＲＮＡの逆転写により、非常に少量であって、処理の過程で、またはピペットチップの内側に付着することによって容易に消失してしまうｃＤＮＡペレットが産生されるため、慎重にエタノール沈殿処理を行わないと問題が生じる可能性がある。
【００１７】
ｃＤＮＡペレットを濃縮する別法は、登録商標Ｍｉｃｒｏｃｏｎ微量濃縮装置を用いる濃縮法である。登録商標Ｍｉｃｒｏｃｏｎ濃縮法のサンプルプロトコールは、以下の通りである。
【００１８】
ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社の登録商標ＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−３０遠心濾過装置を用いたｃＤＮＡの濃縮
ｃＤＮＡ試料は、ミリポア社の登録商標ＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−３０遠心濾過装置（３０，０００分子量カットオフ、ミリポア社カタログ番号４２４０９）を用いて濃縮することができる。以下のプロトコールは、アレイにハイブリダイゼーションさせるため、ｃＤＮＡ合成反応液の容量を１３０μｌから３〜１０μｌに減らすために提供される方法の一例である。（注意：以下のサンプルプロトコールは製造業者から提供されたプロトコールに類似しているが、３ＤＮＡアレイ３５０キットで使用するために若干の変更を含んでいる。さらに、登録商標ＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−３０を使用する者は、自身の遠心分離の設定を評価して、最終容量を３〜１０μｌとするために最適な時間および速度の設定を決定すべきである。）
１．  登録商標ＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−３０の試料用容器を１．５ｍｌの回収用チューブに入れる。
２．  １００μｌのＴＥ、ｐＨ８．０を登録商標ＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−３０の試料用容器に加えて、この容器の膜を予備洗浄する。
３．  １０〜１４，０００ｇが可能な固定角ローター卓上遠心分離機の中に、チューブ／試料用容器を組み立てたものを入れる。
４．  １０〜１４，０００ｇで３分間回転させる。
５．  ｃＤＮＡ反応液の１３０μｌをすべて、登録商標ＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−３０の試料用容器に加える。ピペットの先端で膜に触れてはならない。
６．  １０〜１４，０００ｇが可能な固定角ローター卓上遠心分離機の中に、チューブ／試料用容器を組み立てたものを入れる。
７．  １０〜１４，０００ｇで８〜１０分間遠心する。
８．  チューブ／試料用容器を組み立てたものを取り出す。試料用容器中の液体をこぼさないよう慎重に試料用容器から回収用チューブを分離する。
９．  膜に触れることなく、試料用容器膜に１×ＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０／１ｍＭ  ＥＤＴＡ）５μｌを添加する。濃縮装置の側面を軽くたたいて、濃縮物と１×ＴＥバッファーとの混合を促進する。
１０．  新たな回収用チューブ上に試料用容器を上下逆にして慎重に載せる。同じ遠心分離機中最高速度で２分間遠心する。
１１．  回収用チューブから試料用容器を切り離して、容器を廃棄する。チューブの底に集まった容量（総容量３〜１０μｌ）を記録する。ｃＤＮＡ試料は、後に使用するために、回収用チューブの中で保存することができる。
１２．  ｃＤＮＡのアレイへのハイブリダイゼーションに進む。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
上記の例から分かるように、ｃＤＮＡをマイクロアレイに適用する前に従来用いられてきた試料濃縮プロトコールは、ｃＤＮＡ合成後に時間のかかる余計な一連の工程を必要とする。場合によっては、これらの追加的工程は、効率、およびアッセイにおいて得られる結果を低下させる可能性がある。
【００２０】
したがって、本発明の目的は、上述した合成後の試料濃縮を不要にするｃＤＮＡを合成するための改良された方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
発明の概要
本発明の目的は、核酸を合成するための改良された方法を提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、ｃＤＮＡを合成するための改良された方法を提供することである。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、ｃＤＮＡを合成した後、該ｃＤＮＡの濃縮を不要にする方法を提供することである。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、ｃＤＮＡを合成した後、ｃＤＮＡ試料から望ましくない分子を取り除く精製工程を不要にする方法を提供することである。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、非常に少量の試料材料を用いて、ｃＤＮＡを合成するための方法を提供することである。
【００２６】
本発明のさらなる目的は、高い感度を提供するｃＤＮＡを合成するための方法を提供することである。
【００２７】
本発明のさらなる目的は、マイクロアレイで使用するためのｃＤＮＡを合成するための改良された方法を提供することである。
【００２８】
本発明のさらなる目的は、ｃＤＮＡを合成するための方法であって、ｃＤＮＡの合成後に該ｃＤＮＡの濃縮を必要とせずに、マイクロアレイにｃＤＮＡを適用することを可能にする方法を提供することである。
【００２９】
本発明のさらなる目的は、ｃＤＮＡを合成するための方法であって、ｃＤＮＡの合成後に該ｃＤＮＡ試料から望ましくない分子の除去を必要とせずに、マイクロアレイにｃＤＮＡを適用することを可能にする方法を提供することである。
【００３０】
本発明のさらなる目的は、簡単に自動化可能な仕方でマイクロアレイに適用するためのｃＤＮＡを合成するための方法を提供することである。
【００３１】
上記の目的に加えて、本発明に従って、改良された核酸合成法を開示する。本方法は、核酸合成後の試料濃縮プロトコールをなくすことにより、非常に少量の試料材料から、当業における従来の方法が提供するよりも感度の高い結果を提供する。
【００３２】
好適な実施形態において、本発明は、対象となる試料源のｍＲＮＡなど、ＲＮＡの初期試料からｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）を合成するために用いられる。さらに好適な実施形態において、本方法は、マイクロアレイへの適用を目的とする核酸のために用いられ、アレイに固定された既知の分子に対する合成核酸のハイブリダイゼーションを用いてこれらの核酸をアッセイするために用いられる。さらに好適な実施形態において、該アッセイは樹枝状核酸試薬を用いて行う。さらに好ましくは、キャプチャー配列を用いて、合成核酸および／またはアレイ上の核酸を標識する。
【００３３】
本発明のさらなる実施形態において、本明細書において開示された方法を実行するためのキットを提供することができる。さらに、本処理法は、別の用途のために別タイプの試料調製物に使用することもできる。
【発明の効果】
【００３４】
合成後の試料濃縮プロトコールを不要にしたことは、特に、このようなプロトコールが試料の過度な消失の原因となりうるため、本発明の方法の重要な利点である。本方法は、全ＲＮＡまたは同等の核酸試料１マイクログラム（１０００ナノグラム）未満からの少量の調製物にとって特に有用である。
【００３５】
本発明のさらに重要な利点は、ｃＤＮＡの完全な合成を行うのに必要な操作の時間および数を減らすことができることである。この利点は、研究室、診断用キット、医療現場におけるニーズなど、多様な状況および用途に特に重要である。
【００３６】
しかし、本発明のさらに重要な利点は、同じ投入材料での最終ｃＤＮＡ収量がより一貫して提供されるため、結果のより優れた再現性をもたらすことである。
【００３７】
本発明のさらなる目的および利点は、本明細書記載の詳細な開示内容とともに明らかになるはずである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本発明および好適な実施形態の詳細な説明
本発明をさらに説明するにあたり、本発明は、本明細書に記載された発明の特定の実施形態に限定されず、その特定の実施形態を変更することが可能であり、それらも、本発明の範囲または添付の請求の範囲に依然として含まれるものと理解されるべきである。
【００３９】
また、用いられる用語は、特定の実施形態を説明するためのものであり、限定的であることを意図するものでもないと理解されるべきである。
【００４０】
本発明は、一般的に、合成後の試料濃縮を不要にする核酸合成の方法に関する。従来の研究室の技術、装置および試薬を用いて、核酸配列の試料を調製し、本発明の方法を実施する、費用効率がよく有効な方法であるため、それらは、研究および臨床での使用、ならびに自動化に特に適している。
【００４１】
本発明は、マイクロアレイ上でのアッセイに関連して行なわれるｃＤＮＡ合成などの核
酸合成に特に適している。このような方法においては、実質的に平面である基板の表面（「マイクロアレイ」）に固定されているか、安定的に結合しているＤＮＡまたは遺伝子プローブのアレイを、相補的プローブ／標的複合体のハイブリダイゼーションパターンを生成するのに十分なハイブリダイゼーション条件下で、標的核酸試料と接触させる。使用することができる多様なマイクロアレイが当技術分野において知られている。次に、ハイブリダイズした核酸試料は、標識されたプローブの標的となり、ハイブリダイズして、特定のハイブリダイゼーションパターンに対応する検出可能なシグナルを発生させる。標的核酸にハイブリダイズした各標識プローブはすべて、既知の強度をもつ同一のシグナルを生成することができる。したがって、マイクロアレイ中の各陽性シグナルは、標的核酸試料の遺伝子プロフィールに関する定量的情報を得るために「計測」することができる。
【００４２】
標的核酸と配列特異的にハイブリダイズできるマイクロアレイのＤＮＡまたは遺伝子プローブは、ポリヌクレオチド、またはそれのハイブリダイズする類似体（ａｎａｌｏｇｕｅｓ）または模倣体（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）であり得、たとえばホスホロチオエート、メチルイミノ、メチルホスホン酸、ホスホルアミデート、グアニジンなど、ホスホジエステル結合が置換結合基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｇｒｏｕｐ）で置換されている核酸、リボースサブユニットが置換されている核酸、例えばヘキソースリン酸ジエステル、ペプチド核酸などであるが、これらに限定されるものではない。プローブの長さは、通常１０〜１０００ヌクレオチドの範囲であるが、本発明はそのような長さのプローブに限定されるものではない。本発明のいくつかの実施形態においては、例えば、プローブは１５〜１５０ヌクレオチド、より一般的には、１５〜１００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであろう。別の実施形態において、プローブはより長く、通常１５０〜１０００ヌクレオチドの長さになるが、ここで、該ポリペプチドプローブは一本鎖または二本鎖であってもよく、通常は一本鎖であり、ｃＤＮＡから増幅されたＰＣＲ断片でもよい。基板の表面上のＤＮＡまたは遺伝子プローブは、好ましくは、解析中の生理学的由来源の既知の遺伝子に対応し、また、マイクロアレイ上の既知の位置に配置されるため、陽性のハイブリダイゼーションが生じると、標的核酸試料の由来源である生理学的由来源における特定遺伝子の発現と相互に関連付けることができる。下記で説明されているとおり、標的核酸試料を生成する方法のため、遺伝子プローブのマイクロアレイは、通常、それらが対応する遺伝子の非鋳型鎖と相補的な配列を有する。
【００４３】
遺伝子プローブが安定的に結合する基板は、プラスチック、セラミック、金属、ゲル、膜、ガラスなど、多様な材料から製造することができる。マイクロアレイは、遺伝子プローブを予備形成してから、支持体の表面に安定して結合させるか、遺伝子プローブを支持体上で直接成長させるなど、簡便かつ通常の方法に従って作成することができる。数多くの異なったマイクロアレイの構成および作成法が当業者に知られており、その一つがＳｃｉｅｎｃｅ、２８３，８３，１９９９に記載されているため、その内容は参照されて本明細書に組み込まれる。
【００４４】
本発明の方法に従って、安定して固定されているプローブ核酸配列を有する所望のマイクロアレイが提供される。さらに、研究対象である標的分子を有する試料が提供される。該標的分子は検出のために標識されるが、本明細書において用いる「標識」という用語は、直接的に、またはシグナル発生システムの１個以上の付加的メンバーとの相互作用を介して、検出可能なシグナルを提供することができる作用因子を意味する。標識は、好ましくは可変シグナルを提供せず、代わりに所定の時間にわたり一定かつ再現可能なシグナルを提供するものである。標的分子は、標的をアレイに適用する前か後に標識することができるが、通常は、適用する前に標識するのが好ましい。好ましくは、例えばジェニコン社（Ｇｅｎｉｃｏｎ．  Ｉｎｃ．）／インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の標識のように、例えば、ナノゴールド標識を用いる相対光散乱検出法（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）のような、デンドリマーまたは別の比
較的高感度のシグナルを発生させる方法など、非常に感度のよいシグナルを発生させる方法を用いる。
【００４５】
本発明に関連しては、樹枝状核酸分子が、検出能力に関して特に好適である（ただし、適切な感度を有するいかなるタイプの標識分子も、本明細書に開示した発明とともに利用することができる）。樹枝状核酸分子すなわちデンドリマーは複雑な、高度に枝分かれした分子であり、相互に結合した天然または合成された二本鎖ＤＮＡの複数の単量体サブユニットからなる。デンドリマーは、Ｎｉｌｓｅｎら、樹枝状核酸分子構造（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）、  Ｊ．  Ｔｈｅｏｒ．  Ｂｉｏｌ．，１８７，２７３−２８４（１９９７）、Ｓｔｅａｒｓら、デンドリマー技術を利用した高密度マイクロアレイの新規な高感度検出システム（Ａ  Ｎｏｖｅｌ，  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ３：  ９３−９９  （２０００）；および米国特許第５，１７５，２７０号、第５，４８４，９０４号、第５，４８７，９７３号、第６，０７２，０４３号、第６，１１０，６８７号および第６，１１７，６３１号など、さまざまな米国特許において、非常に詳しく説明されている。また、これらはすべて、その全文が参照されて本明細書に組み込まれる。同様に、デンドリマーおよびマイクロアレイ上におけるその使用に関するさまざまな発明については、２００３年３月２５日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／０９２３２号、２００２年３月２５日に出願された米国仮出願第６０／３６７，４３８号、２００４年４月１６日に出願された米国非仮出願第１０／８２５，７７６号、２００２年１月１４日に出願された米国非仮出願第１０／０５０，０８８号、２００１年１月１３日に出願された米国仮出願第６０／２６１，２３１号、２００３年１２月８日に出願された米国非仮出願第１０／７３０，８２３号、２００３年３月２０日に出願された米国非仮出願第１０／３９３，５１９号、２００１年９月２０日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／２９５８９号、２００１年９月２０日に出願された米国仮出願第６０／２３４，０６０号、２００１年７月１９日に出願された米国非仮出願第０９／９０８，９５０号、２０００年７月１９日に出願された米国仮出願第６０／２１９，３９７号、２０００年３月８日に出願された米国仮出願第６０／１８７，６８１号、２００１年３月８日に出願された米国非仮出願第０９／８０２，１６２号、および２０００年３月８日に出願された米国仮出願第６０／１８７，６８１号、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００３／００９２３２号、およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２５８６５号に記載されており、これらすべて、その全文が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００４６】
デンドリマーは、表面上にあって、２個の主要な官能基を結合するために使用される２つのタイプの一本鎖のハイブリダイゼーション用「アーム」を含む。１個のデンドリマー分子は、表面上にそれぞれのタイプのアームを１００本以上持つことができる。一方のタイプのアームは、特異的な標的分子を付着させて、標的特異性を確立するために用いられ、もう一つのタイプは、標識またはマーカーを付着させるために用いられる。デンドリマーの標的および標識の特異性を決定する分子は、オリゴヌクレオチドとして、またはオリゴヌクレオチド結合体として付着する。単純なＤＮＡ標識、ハイブリダイゼーションおよび連結反応を用いて、デンドリマー分子が、高度に標識された標的特異的プローブとして作用するように設定することができる。
【００４７】
調製した混合物を適切なバッファーの存在下で配合して、一方のタイプの「アーム」に結合した蛍光標識を有するデンドリマー、およびもう一方のタイプの「アーム」に結合したオリゴヌクレオチドであって、ＲＴプライマーに結合したｃＤＮＡ断片のキャプチャー配列に相補的なオリゴヌクレオチドを有するデンドリマーを含むデンドリマーのハイブリダイゼーション用混合物を得る。アレイの表面上にスポッティングした核酸に対するｃＤ
ＮＡまたはデンドリマーの非特異的相互作用をブロックするように設計されたオリゴヌクレオチドを、この時点で加えることもでき、多数の同一核酸塩基を含む遮断オリゴヌクレオチドを、ＲＮＡ試料に由来するｃＤＮＡおよびマイクロアレイの表面上の核酸プローブに見られる同一の相補的塩基の長い鎖を遮断することができる。
【００４８】
蛍光標識デンドリマーを調製するために、登録商標Ｃｙ３  ＲＴプライマーおよび登録商標Ｃｙ５  ＲＴプライマーの上にあるキャプチャー配列と相補的な配列を別々に、既述の方法により調製した精製ずみの樹枝状コア物質に連結させる（前掲Ｎｉｌｓｏｎら、および前掲米国特許第‘２７０号、第‘９０４号、および第‘９７３号参照）。次に、５’側に登録商標Ｃｙ３または登録商標Ｃｙ５を有する４層デンドリマーの外側アームに相補的な、３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを合成する（オレゴン州ウィルソンビル（Ｗｉｌｓｏｎｖｉｌｌｅ，  ＯＲ）にあるオリゴスエトセ社（Ｏｌｉｇｏｓ  ｅｔｃ．，  Ｉｎｃ．））。次いで、登録商標Ｃｙ３および登録商標Ｃｙ５のオリゴヌクレオチドを、それぞれに対応するデンドリマーの外側表面にハイブリダイズさせて共有結合により架橋する。次いで、過剰な捕獲用標識オリゴヌクレオチドおよび蛍光標識オリゴヌクレオチドを、サイズ排除クロマトグラフィーおよび密度勾配超遠心分離法などの技術によって除去する。
【００４９】
紫外線／可視光分光器で２６０ｎｍにおける精製物質の光学密度を測定して、デンドリマーの濃度を決定する。蛍光光度計（ＦｌｕｏｒｏＭａｘ、ＳＰＥＸインダストリーズ社（ＳＰＥＸ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ））を用いて、最適なシグナル／ノイズの波長における蛍光を測定する。Ｃｙ３は５４２ｎｍで励起可能であるため、５７０ｎｍで発光を測定する。Ｃｙ５は６４１ｎｍで励起可能であるため、６７６ｎｍで発光を測定する。
【００５０】
本発明の好適な実施形態において、ジェニスフィア社の３ＤＮＡ  Ａｒｒａｙ  ９００標識キットで使用可能なデンドリマーのように、各分子上に約８５０の蛍光色素を有するデンドリマーを用いる。あるいは、約３００の色素を有する従前のデンドリマー、または５００よりも多い蛍光色素を有するデンドリマーを用いることもできる。
【００５１】
このようなデンドリマープローブを用いると、デンドリマーの優れたシグナル増幅能力によって、感度の増加が著しく大きくなる。感度の増加により、アッセイに必要とされるＲＮＡの量が減少し、より少量の初期試料の使用で済む。特に、本発明は、０．２５〜１マイクログラムの全ＲＮＡ、またはわずか１００ナノグラム（０．１マイクログラム）の全ＲＮＡを用いるか、または１〜１０００ナノグラムのポリＡ  ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を用いて容易に実施することができる。したがって、好ましくは、約８５０以上の蛍光色素を有するデンドリマーを用いて、これら改善された結果が得られる。（例えば、改良デンドリマー、または他の改良された標識分子またはシグナル分子を用いて）本技術分野において検出感度が向上すると、本発明を用いて、より少量のＲＮＡ試料をアッセイできるようになる。
【００５２】
アッセイ法自体に関しては、好ましくは、連続的ハイブリダイゼーション工程（「２段階法」）を用いる手法であって、逆転写されたｃＤＮＡを、アレイにハイブリダイズするのに十分な時間アレイに適用して、該ｃＤＮＡ分子を標的である固定プローブにハイブリダイズさせた後、未結合のｃＤＮＡおよび過剰なＲＴプライマーをアレイから除去する洗浄処理を行う手法が用いられる。ｃＤＮＡは、好ましくは、下記に開示したように、検出可能なシグナルを生成することができる標識を有する樹枝状核酸に結合するため、自身に取り込まれたキャプチャー配列を有する。次いで、蛍光標識されたデンドリマー分子（またはｃＤＮＡに取り込まれたキャプチャー配列と結合可能な別の分子）は、洗浄したアレイに適用され、この第二のハイブリダイゼーションの過程で、ｃＤＮＡに付随するキャプチャー配列にハイブリダイズする。二次的な洗浄処理の過程で過剰なデンドリマーを洗い
流し、アレイをスキャニングして、標識分子によって生成されたシグナルを検出する。
【００５３】
所望ならば、さらに好適な実施形態において、温度サイクリングを用いて、標的核酸とマイクロアレイの間におけるハイブリダイゼーション、およびキャプチャー試薬とマイクロアレイの間におけるハイブリダイゼーションを選択的に制御することができる（好ましくは、それぞれ、ｃＤＮＡ−マイクロアレイ間のハイブリダイゼーションおよびｃＤＮＡ−デンドリマー間のハイブリダイゼーション）。このようなサイクリングを用いることによって、まず、ｃＤＮＡがマイクロアレイのみにハイブリダイズし、次にｃＤＮＡがデンドリマーに対してハイブリダイズするように、ハイブリダイゼーションを慎重に制御することが可能になる。本処理を用いて、２つの成分、すなわちプローブに対する標的核酸、および標的核酸に対するキャプチャー試薬のそれぞれのハイブリダイゼーション反応速度を向上させることができる。このような温度サイクリングの使用に関するさらなる詳細が、２００１年１月１４日に出願された米国非仮出願第１０／０５０，０８８号、２００１年１月１３日に出願された米国仮出願第６０／２６１，２３１号、および、本発明者らおよびニュージャージー州モントベール（Ｍｏｎｔｖａｌｅ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）にあるジェニスフィア社（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ  Ｉｎｃ．）により公表されたプロトコールに記載されており、これらすべてが、その全文が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００５４】
本発明の好適な実施形態において、合成される核酸は、通常、天然の由来源から得られたＲＮＡから逆転写されたＤＮＡであり、ここで、該ＲＮＡは、全ＲＮＡ、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ、増幅されたＲＮＡなどからなるグループから選択することができる。初期ＲＮＡ由来源は、さまざまな異なった試料中に存在しうるが、ここで、該試料は、一般的には、生理学的由来源から得られる。生理学的由来源は、さまざまな由来源から得ることができるが、対象となる生理学的源には、酵母またはバクテリアのような単細胞生物、および植物や動物などの多細胞生物、特に哺乳動物に由来する由来源などがあり、ここで、多細胞生物由来の該生理学的由来源は、多細胞生物の特定の器官または組織から得ることができ、またはそれらに由来する単離した細胞から得ることができる。解析すべき試料ＲＮＡを、それが由来する生理学的由来源から得る際、該生理学的由来源に数多くの処理工程を施すことができるが、ここで、そのような既知の処理工程には、組織のホモジネーション、細胞の単離および細胞質抽出、核酸抽出、ポリＡテール付与などがありうる。細胞、組織、器官または全生物体からＲＮＡを単離する方法は、当業者に周知であり、例えば、コールドスプリングハーバー研究所出版、１９８９年（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）のＭａｎｉａｔｉｓら、分子クローニング：実験マニュアル、第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．，  ２ｎｄ  ｅｄ．）、およびジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．）、１９９８年のＡｕｓｕｂｅｌら、分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）に記載されており、これらはともにその全文が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００５５】
試料ｍＲＮＡは、好ましくは、ハイブリダイズしたプライマーを酵素的に伸長させるのに充分な条件下で、オリゴ（ｄＴ）プライマーまたはＲＴプライマーを該ｍＲＮＡにハイブリダイズさせることにより、ｃＤＮＡの形になった標的核酸に逆転写する。プライマーは、ｍＲＮＡテールに効率的にハイブリダイズするのに充分な長さであるが、ここで、この領域は、典型的には１０〜２５ヌクレオチド、通常は１０〜２０ヌクレオチド、より通常には１２〜１８ヌクレオチドの長さである。
【００５６】
応用場面では、一般的に、配列特異的プライマーを用いる必要があることを考えれば、本発明において使用されるような標準的プライマーは、さらに、「キャプチャー配列」のヌクレオチド部分を含む。本明細書中で言及されている好適なキャプチャー配列は、例え
ば、２００２年９月３日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／０２７７９９号において開示されているような、登録商標Ｃｙ３  ＲＴプライマーキャプチャー配列（オレゴン州ウィルソンビルにあるオリゴスエトセ社）または登録商標Ｃｙ５  ＲＴプライマーキャプチャー配列（オレゴン州ウィルソンビルにあるオリゴスエトセ社）であり、この文献はその全文が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００５７】
カスタムプライマーでは、当該カスタム製造されたオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端にキャプチャー配列を結合すべきである。このようにすれば、カスタムプライマーは標準的なＲＴプライマーの代わりになる。本発明は標準的なＲＴプライマー用に考案されているため、カスタムプライマーで代用する場合には、いくつか変更が必要になるかもしれない。このような変更は当業者に周知であり、使用するＲＮＡ試料の量および種類に基づいて、プライマーの量および配合を調節することなどがありえよう。上記したように、プライマーは、特異的なヌクレオチド配列からなるキャプチャー配列を有する。キャプチャー配列は、さらに少なくとも１つの標識を有するデンドリマープローブのアームに結合しているオリゴヌクレオチドに相補的である。このような相補的ヌクレオチドは、外部の販売業者から入手でき、また、標識部分としても入手することも可能である。当技術分野において周知のとおり、標識は、デンドリマープローブのアームに結合した１個以上のオリゴヌクレオチドに、直接または結合基を介して結合させることが可能である。好適な実施形態において、デンドリマープローブは、登録商標Ｃｙ３または登録商標Ｃｙ５で標識されたオリゴヌクレオチドをデンドリマーのアームにハイブリダイズおよびクロスリンクさせることにより標識される。登録商標Ｃｙ３または登録商標Ｃｙ５で標識されたオリゴヌクレオチドは、それぞれ登録商標Ｃｙ３または登録商標Ｃｙ５のＲＴプライマーキャプチャー配列に相補的である。
【００５８】
標的核酸試料を作成する際に、逆転写酵素、および第１鎖ｃＤＮＡ合成を誘発するのに十分な条件下でプライマー伸長させるのに必要な他の試薬が存在する中で、プライマーをＲＮＡに接触させる。通常はＤＮＡポリメラーゼであるが、逆転写酵素活性を有するさまざまな酵素を、第１鎖ｃＤＮＡ合成工程に用いることができる。適切なＤＮＡポリメラーゼの例は、好熱細菌および古細菌、レトロウイルス、酵母、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｓ）、ショウジョウバエ、霊長類および齧歯類からなる群から選択される生物に由来するＤＮＡポリメラーゼなどである。逆転写酵素活性を有する適切なＤＮＡポリメラーゼは、市販されているか、または、当業者に公知の方法によって、該ポリメラーゼをコードするクローン化遺伝子を高レベルで発現する細胞から得られる生物から単離することができるが、ここで、ポリメラーゼを得る具体的な方法は、主に、利便性、費用、入手可能性などの要素に基づいて選択される。試薬を混合する順序は、所望のように変更可能である。
【００５９】
本発明の一つの好適な実施形態において、ｃＤＮＡ合成プロトコールは、全ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、ＲＴプライマーおよびＲＮアーゼを含まない水と混合してＲＮＡ−ＲＴプライマー混合液を得ることを含む。下記のとおり、本発明に従って、非常に少量の初期ＲＮＡを用いることができる。
【００６０】
次に、ＲＮＡ−ＲＴプライマー混合液を混合して微量遠心分離して、微量遠心分離用チューブの底に内容物を集める。そして、ＲＮＡ−ＲＴプライマー混合液を１０分間適当な温度（例えば８０℃）で加熱してから、直ちに氷上に移す。氷上に置いた別の微量遠心分離用チューブの中で、ＲＴバッファー、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、ＲＮアーゼインヒビター、ｄＮＴＰ混合液、および逆転写酵素を、ＲＮアーゼを含まない水と混合する（反応用主混合液）。この混合物をゆっくりと混合し（ボルテックス処理はしない）、短時間微量遠心して内容物を微量遠心分離用チューブの底に集めて、反応混合液を回収する。次に、ＲＮＡ−ＲＴプライマー混合液を反応用主混合液と混合し、第１鎖ｃＤＮＡプライ
マー伸長産物を形成するのに十分な時間、適当な温度（例えば約４２℃）でインキュベートするが、これは通常約２時間を要する。この反応を１．０ＭのＮａＯＨ／１００ｍＭのＥＤＴＡで停止させてから、適当な温度（例えば６５℃）でインキュベートして、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを変性し、ＲＮＡを分解させる。次に、２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）で中和する。
【００６１】
これが完了したところで、ｃＤＮＡを、合成後にｃＤＮＡを濃縮することなく、直接アレイに適用して、それにハイブリダイズさせる。（一つの付加的実施形態において、合成後にｃＤＮＡの精製も行わない。）そうではなく、上記で得られた混合液を直接該マイクロアレイに加えて、２回目のハイブリダイゼーション温度で、ｃＤＮＡが該マイクロアレイに結合するのに十分な時間インキュベートする。適当なハイブリダイゼーション条件は当業者に周知であり、前掲のＭａｎｉａｔｉｓらに概説されているが、ここで、条件は、所望のハイブリダイゼーション特異性を得るよう調節することができる。所望であれば、２００２年９月３日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／０２７７９９号および国際公開第ＷＯ  ０３／０２０９０２  Ａ２号で検討されているように、遮断用のＬＮＡオリゴヌクレオチドを用いて、ｃＤＮＡとアレイの間の非特異性結合を減少させることもできる。そして、これらは参照されて本明細書に組み込まれる。次に、アレイを洗浄して、アレイ上のバックグラウンド（例えば、ｃＤＮＡ分子に取り込まれない遊離のＲＴプライマーが原因で生じる）を低下させる。
【００６２】
そして、標識をｃＤＮＡのキャプチャー配列にハイブリダイズさせるため、標識分子（好ましくは、所望の標識を有するデンドリマー）をアレイに適用して、検出可能なシグナルを提供させる。ハイブリダイゼーション工程の後、ハイブリダイズしていない複合体をマイクロアレイから除去する洗浄工程を用い、それによって、マイクロアレイに結合しているハイブリダイズしたｃＤＮＡ−デンドリマープローブの可視的な不連続パターンが残る。これらの用途に対するさまざまな洗浄用溶液およびプロトコールが当業者に公知であり、利用可能である。利用される具体的な洗浄条件は、用いられるシグナル発生システムの具体的な性質に応じて必然的に決まり、用いる具体的なシグナル発生システムに通じている当業者には既知である。
【００６３】
その結果得られた標識ｃＤＮＡ断片のハイブリダイゼーション・パターンをさまざまな方法で可視化または検出することができ、具体的な検出方法は、ｃＤＮＡの具体的な標識に基づいて選択される。ここで、代表的な検出手段は、シンチレーション計測、オートラジオグラフィー、蛍光測定、熱量測定、発光測定などである。
【００６４】
上記したような、ハイブリダイゼーション工程およびいずれかの洗浄工程、および／またはその後の処理に続いて、得られたハイブリダイゼーション・パターンを検出する。ハイブリダイゼーション・パターンを検出して可視化する際には、標識の強度またはシグナル値を検出するだけでなく定量化も行うが、これはハイブリダイゼーションの各スポットからのシグナルを測定するという意味である。
【００６５】
検出または可視化の後、ハイブリダイゼーション・パターンを用いて、初期ＲＮＡ試料についての定量的および定性的な情報を決定することができる。例えば、マイクロアレイに接触してハイブリダイゼーション・パターンを生成した標識付標的核酸試料の遺伝子の特徴に関する情報を得ることができる。このデータから、生理学的由来源である組織または細胞中で発現される遺伝子の種類、および各遺伝子の発現レベルなど、標的核酸試料が由来した生理学的由来源に関する情報を、特に定量的な表現で得ることができる。２つ以上の生理学的由来源からの標的核酸を比較するのに本発明の方法を用いる場合、ハイブリダイゼーション・パターンを比較して、パターンの違いを同定することができる。異なるプローブのそれぞれが既知の遺伝子に対応するマイクロアレイを用いる場合、不一致があ
れば、比較されている生理学的由来源における特定の遺伝子の発現の違いに関連付けることができる。したがって、例えば、本発明の方法は、遺伝子発現の差異をアッセイするという用途があり、例えば腫瘍性組織と正常組織のような疾患組織と正常組織や、異なった組織または下位組織（ｓｕｂｔｉｓｓｕｅ）のタイプなどの発現差異を解析するのに本発明の方法を用いることができる。
【００６６】
上記処理操作のその他の変形の多くを、本発明と一貫性を有する形で用いることができる。例えば、ハイブリダイゼーションの前にｃＤＮＡに転換されている試料から抽出したＲＮＡを用いる代わりに、本発明は直接、ＲＮＡ試料に用いることができる。そのような実施形態の一つにおいて、酵素的手段を介するなどして、ＲＮＡをスプライシングする既知の方法を用いて、適当なキャプチャー配列をＲＮＡにライゲーションすることができる。または、ＲＮＡがキャプチャー配列として有用な特異的オリゴヌクレオチドを含んでいれば、相補的なオリゴヌクレオチドをデンドリマーに結合させて、該ＲＮＡ分子を標識することができる。逆転写を必要とせずにＲＮＡを直接用いる方法に関するさらなる詳細が、２００１年７月１９日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／２２８１８号に記載されており、これは、参照されて本明細書に組み込まれる。
【００６７】
本発明は、従来の方法よりも少量の初期ＲＮＡ試料を用いることを可能にしたため、非常に少量の初期出発材料を用いる、改良されたｃＤＮＡ合成法および測定法に特に適している。例えば、３ＤＮＡデンドリマー技術（または、例えばジェニコン社／インビトロジェン社などのナノゴールド標識を用いる相対光散乱検出法のような、その他非常に感度の高いシグナル生成技術）組み合わせると、このｃＤＮＡ法は、ＲＮＡ標的の増幅を全く必要とせずに、全ＲＮＡ試料を２５０ナノグラム以下にまで減らして使用できるため、特に有益である。本発明は、０．２５〜１マイクログラムの試料、または、所望であれば１００ナノグラム（０．１マイクログラム）の初期全ＲＮＡ試料、または１から１０００ナノグラムのポリＡ  ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とともに容易に用いることができる。これは、同じ感度レベルを得るのに、２０〜５０マイクログラムの全ＲＮＡ、または１〜２．５マイクログラムのポリＡ  ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を必要とする直接取り込み法よりも、約２桁単位で優れている。
【００６８】
従って、本方法は、他の方法を用いれば合成後の濃縮工程または精製工程で失われるような非常に少量の開始試料の使用を可能にする。当技術分野において（例えば、改良デンドリマー、または付加的に蛍光色素を有するデンドリマー、またはその他のシグナル生成法を用いて）検出感度が向上すると、より少量のＲＮＡ試料を本発明でも用いることができるようになる。そのような試料も、同様にｃＤＮＡ合成後濃縮を行うことなく、マイクロアレイに適用することができる。
【００６９】
本発明は、反応をスケールアップすることもできるが、依然として、最終ｃＤＮＡ合成精製物の濃縮を不要にすることができる。本発明の更なる利益は、本発明を用いれば回避されることではあるが、多量のｃＤＮＡが存在することが直接的または間接的な原因で起こるマイクロアレイ上の非特異的なバックグラウンドを減少させることである。同様に、本方法は、データ品質（特に、遺伝子発現試験における差異の範囲）の向上をもたらすが、これは、アレイ上におけるハイブリダイゼーションアッセイ法では、非常に少量のｃＤＮＡしか用いないことの結果である可能性が高い。これは、従来の方法とは対照的に、本発明では、合成後ｃＤＮＡの濃縮を行わないという事実によるものである。従来の方法では、一般的に、非３ＤＮＡ法で必要とされるよりも多量の試料が必要であり、マイクロアレイ上でのハイブリダイゼーションには小量の試料が必要であるため、ほとんどのタイプのアレイでｃＤＮＡを用いるためには、該ｃＤＮＡを濃縮することが必要である。
【００７０】
同様に、本明細書で提供されるさらなる改善点は、直接的に色素を取り込むｃＤＮＡ合
成法では、ｃＤＮＡに取り込まれなかった過剰な色素と酵素を除去するために通常行われるｃＤＮＡ合成産物の精製を必要としないことである。
【００７１】
さらに、本発明は、これに関連して通常用いられ、現在のところ自動的にまたはロボットによって行うことが困難な濃縮工程および精製工程とは対照的に、容易に自動化が可能であるという、さらなる利益を提供する。
【００７２】
本発明のさらなる利点、特徴および態様は、以下の実施例に関連して明らかになる。
実施例１：
全ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成
１．マイクロチューブの中で以下のものを混合する：
１〜５μｌの全ＲＮＡ（０．２５〜１．０μｇの哺乳動物全ＲＮＡまたは０．５〜２．５μｇの植物全ＲＮＡ）
１μｌのＲＴプライマー（５ｐｍｏｌｅ／μｌ）。
【００７３】
最終容量が６μｌになるよう、ヌクレアーゼを含まない水を加える。
これがＲＮＡ−ＲＴプライマー混合液である。
【００７４】
注意：５ｐｍｏｌｅ／μｌのＲＴプライマーを使用すると、一部のタイプのアレイ（すなわち、ポリ−Ｌ−リジンでコーティングしたスライド）において非特異的なバックグラウンドシグナルを生じる可能性がある。この種のバックグラウンドは、ＲＴプライマーを、ＲＮＡ試料に加える前に、ヌクレアーゼを含まない水で最大２．５倍まで希釈することによって低減させることができる（注意：プライマーを２ｐｍｏｌｅ／μｌよりも低くなると、ｃＤＮＡ合成の効率が悪くなるので、これよりも低く希釈しないようにすること。）
２．混合して、短時間微量遠心して内容物をチューブの底に集める。
３．５分間８０℃まで加熱して、直ちに氷上に移して２〜３分間置く。
４．キットの一部として提供される場合には、逆転写酵素、および該酵素の反応用バッファーは、そのキット中に含ませるか、または、別個に購入させることができる。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号１８０６４−０１４−１０，０００ユニット＠２００Ｕ／μｌ）を使用することを推奨する。
【００７５】
反応用の主混合溶液を、同時に開始するｃＤＮＡ合成の数に応じて、最終容量に調合しなければならない。各ｃＤＮＡ合成には、４．５μｌの反応用主混合溶液が必要である。ピペッティングの誤差を低減するために、反応用主混合溶液は９μＬ（２回分のｃＤＮＡ合成に十分な量）以上なければならない。
【００７６】
氷上にて、下記の表に従って別々のマイクロチューブで混合する。
【００７７】
【表１】
2007506439.tif 000003
【００７８】
これが反応用主混合溶液である（この反応用主混合溶液は使用時まで氷上で保持するべきである）。
５．穏やかに混合し（ボルテックスはしない）、短時間微量遠心して反応混合液の内容物をチューブの底に集める。
６．工程１のＲＮＡ−ＲＴプライマー混合液６μｌに、工程５の反応溶液を４．５μｌ加える（最終容量１０．５μｌになる）。
７．ゆっくりと混合し（ボルテックスはしない）、４２℃で２時間インキュベートする。８．１．０μｌの１．０Ｍ  ＮａＯＨ／１００ｍＭ  ＥＤＴＡを加えて反応を停止させる。
９．６５℃で１０分間インキュベートして、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを変性させ、ＲＮＡを分解させる。
１０．反応液を１．２μｌの２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で中和させる。ここで、ｃＤＮＡ合成用調製液は、合成後の濃縮を必要とすることなく実験（マイクロアレイ、ブロット、ＦＩＳＨなど）に使用できる状態になる。所望であれば、このｃＤＮＡ調製液は、合成後何らかの精製をして用いることも可能である。
【００７９】
実施例２：
合成後に試料濃縮せずにマイクロアレイで使用するためのｃＤＮＡ合成法
以下の方法は、マイクロアレイで使用するためのｃＤＮＡを合成するための方法の一例であって、本発明によると、この合成法では、合成後の試料濃縮をする必要がなくなる。本明細書に開示されている好適な実施形態において、本方法は、Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ社の試薬用に、特に、極めて少量のＲＮＡを用いたときにマイクロアレイ上で高い感度を提供できるように設計されているＧｅｎｉｓｐｈｅｒｅ（登録商標）３ＤＮＡアレイ９００キット（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ  Ｉｎｃ．  ｏｆ  Ｍｏｎｔｖａｌｅ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ  ａｎｄ  Ｈａｔｆｉｅｌｄ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａから入手可能）で使用するよう設計されている。（アレイ９００キットと共に提供されるキットの使用説明書はすべて、本明細書中に参考として組み込まれる。）あるいは、本方法は、下記に開示する少量合成法を用いて、別のキットまたはシステムで使用することも可能である。
【００８０】
好適な方法において、合成後の試料濃縮をなくしたため、濃縮処理過程で試料の減損を回避できる、本発明の修正ｃＤＮＡ合成プロトコールを使用することによって、よりよい感度が得られる。また、約８５０の蛍光色素を含むデンドリマーの形状で、より効率的なハイブリダイゼーション反応速度が得られるよう改造されている登録商標Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ  ３ＤＮＡキャプチャー試薬を使用することによって、また、より優れたハイブリダイズ効率を得るために設計されているＧｅｎｉｓｐｈｅｒｅ（登録商標）２倍増強ｃＤ
ＮＡハイブリダイゼーション用バッファー（２Ｘ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃＤＮＡ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ）を使用することによって、感度をさらに向上させることもできる。
【００８１】
Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ（登録商標）３ＤＮＡアレイ９００キットは、使い方が簡単で、オリゴヌクレオチドまたはＰＣＲ産物（ｃＤＮＡ）をプリントしたアレイ用に設計されている。まず、デオキシヌクレオチド三リン酸混合液および特定のＲＴ  ｄＴプライマーを用いて、全ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ＲＮＡのいずれかを逆転写する。そして、このｃＤＮＡと蛍光性３ＤＮＡ試薬とを連続してマイクロアレイにハイブリダイズさせる。蛍光性３ＤＮＡ試薬は、ＲＴプライマーの５’末端上の配列に相補的な「キャプチャー配列」を含んでいるため、ｃＤＮＡにハイブリダイズする。
【００８２】
３ＤＮＡアレイ９００標識システムは、２つの理由で、直接的または間接的な色素取り込みよりも予測可能で一貫性のあるシグナルを提供する。第一は、蛍光色素が３ＤＮＡ試薬の一部であるため、ｃＤＮＡ調製の過程でそれを取り込む必要がないということである。これにより、蛍光色素とヌクレオチドの結合体を逆転写物に取り込むことが原因で生じる、ｃＤＮＡのアレイへの不効率なハイブリダイゼーションを回避できる。第二に、各３ＤＮＡ分子が平均約８５０の蛍光色素を含み、各結合ｃＤＮＡを１個の３ＤＮＡ分子で検出できるため、各メッセージから生じるシグナルは、転写産物の塩基組成および長さとほとんど無関係となる。これに対して、色素の取り込みによって標識された各メッセージから生じるシグナルは、メッセージの塩基組成および長さによって変動する。
【００８３】
全ＲＮＡ試料を用いる場合、本キットによって作出されるアレイのパターンは、直接的または間接的な色素取り込みによる標識法によって作出されるパターンとは若干異なる可能性があることに留意すべきである。その理由は、逆転写酵素は、ＲＮＡだけでなくゲノムＤＮＡも（プライマーを必要とすることなしに）標識することが知られているからである。したがって、色素取り込み標識法は標識されたゲノムＤＮＡをも産生することがある。標識されたゲノムＤＮＡはマイクロアレイに結合すると、存在しない遺伝子に対する偽陽性の結果、および／またはＲＮＡの逆転写によって産生されたｃＤＮＡも同時に結合したアレイ要素について、不適切かつ誤解を招くような蛍光量をもたらす。これに対して、３ＤＮＡ逆転写法は、いかなる蛍光もゲノムＤＮＡに取り込むことができない非標識ヌクレオチドを利用するため、ゲノムＤＮＡからのシグナルが関与する可能性がなくなる。このように３ＤＮＡ標識は色素取り込み標識法とは異なるため、作出されるアレイパターンは、どの標識法を用いるかによって変動しうる。しかしながら、さまざまな発現実験において、ゲノムＤＮＡが試料から除かれているならば、２つのＲＮＡ試料間で発現パターンは、標識方法に関わりなく同じはずである。
【００８４】
キットの内容
（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ（登録商標）アレイ９００キットの一定の構成成分、特にバイアル１、２および１１は、他のマイクロアレイ標識キットと適合性がなくてもよい。）
バイアル１  Ｃｙ３／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６（赤色キャップ）またはＣｙ５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（青色キャップ）の３ＤＮＡアレイ９００キャプチャー試薬。（１分子当り約８５０の蛍光色素で標識された、本明細書に記載のデンドリマープローブ試薬。Ｃｙ３（またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６）で標識されたデンドリマーは、キャプチャー配列に結合したデンドリマーに相補的な５’末端配列を含むプライマーを用いて合成されたｃＤＮＡだけに、デンドリマーを標的できるようにする同一のユニークなキャプチャー配列を含む。Ｃｙ５（またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７）で標識されたデンドリマーは、異なったキャプチャー配列を含み、Ｃｙ３およびＣｙ５で標識されたデンドリマーがｃＤＮＡに示差的に結合できるようになっている。）
バイアル２  Ｃｙ３／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６（赤色キャップ）またはＣｙ５
／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（青色キャップ）に対して１．０ｐｍｏｌｅ／μｌのＲＴプライマー。（３’末端ｄＴ（１７）および５’末端の３１量体のキャプチャー配列を含むＲＴプライマー（４８量体））。
【００８５】
バイアル３  デオキシヌクレオチド三リン酸混合液（水の中でそれぞれ１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）。
【００８６】
バイアル４  Ｓｕｐｅｒａｓｅ−Ｉｎ（商標）ＲＮアーゼインヒビター（Ａｍｂｉｏｎ社）。
【００８７】
バイアル５  ２倍増強ｃＤＮＡハイブリダイゼーション用バッファー（ニュージャージー州モントベールおよびペンシルバニア州ハットフィールドにあるＧｅｎｉｓｐｈｅｒｅ
Ｉｎｃ．から入手可能）。
【００８８】
バイアル６  ２×ＳＤＳを主成分とするハイブリダイズ用バッファー（０．５０Ｍ  ＮａＰＯ４；  １％  ＳＤＳ；  ２ｍＭ  ＥＤＴＡ：  ２×ＳＳＣ；  ４×デンハルト溶液）
バイアル７  ２×ホルムアミドを主成分とするハイブリダイゼーション用バッファー（５０％ホルムアミド；８×ＳＳＣ；１％  ＳＤＳ；  ４×デンハルト溶液）
バイアル８  退色防止用試薬（０．１Ｍ  ＤＴＴ）
バイアル９  ＬＮＡ  ＴＭ  ｄＴブロッカー（ＰＣＲ産物（ｃＤＮＡ）のマイクロアレイ用）（３６個のうち１３個のヌクレオチドがＬＮＡ（ロックされた核酸、Ｅｘｉｑｏｎ
ＡＧ社）残基であるヌクレオチドを含むｄＴブロッカー。例えば、２００１年８月３１日に出願された米国仮出願第６０／３１６，１１６号の優先権を主張する、２００２年９月３日に出願された米国非仮出願第１０／２３４，０６９号、および「核酸の非特異的ハイブリダイゼーションを阻止する方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）」、２００２年９月３日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／０２７７９９号、国際公開第ＷＯ０３／０２０９０２  Ａ２号を参照。これらすべては参照されて本明細書に組み込まれる）。
【００８９】
バイアル１０  ヌクレアーゼを含まない水（Ａｍｂｉｏｎ社から入手可能）
バイアル１１  Ｃｙ３／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６（赤色キャップ）またはＣｙ５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（青色キャップ）に対して５．０ｐｍｏｌｅ／μｌのＲＴプライマー
（３’末端ｄＴ（１７）、および５’末端３１量体のキャプチャー配列を含むＲＴプライマー（４８量体））。
【００９０】
バイアル１〜１１は、−２０℃で暗所に保存しなければならない。バイアル１は、短期間（約１週間）４℃で保存することもできる。
【００９１】
その他必要な材料
本方法を利用するのに必要な更なる材料には、以下のものが含まれる。
・マイクロアレイ：オリゴヌクレオチドまたはＰＣＲ／ｃＤＮＡ産物のいずれかから調製した市販または自前のもの。
・Ｃｙ３／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６蛍光色および／またはＣｙ５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７蛍光色素を読み取るように装備されたマイクロアレイ読み取り装置。・全ＲＮＡ試料（１００ｎｇ／μｌ以上）またはポリ（Ａ）＋ＲＮＡ試料（５０ｎｇ／μｌ以上）
・逆転写酵素
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社カタログ番号１８０６４−０１４−１０，０００ユニット、＠２００Ｕ／μｌ）
Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ  ＲＴ酵素（ジェニスフィア社カタログ番号ＲＴ３００３２０）
または、その他同等の逆転写酵素（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社など）。
・Ｃｏｔ−１  ＤＮＡ（選択的、種特異的、インビトロジェン社から入手可能）。
・試薬級脱イオン水（推奨：ＶＷＲカタログ番号ＲＣ９１５０−５）
注意：インターネット・リスト・サーブ（Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  Ｌｉｓｔ  Ｓｅｒｖｅ）に記載されているように、登録商標ＭｉｌｌｉＱ水は、Ｃｙ５を損なうことが分かっている（ｈｔｔｐ：／／ｇｒｏｕｐｓ．ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ／ｇｒｏｕｐ／ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ／ｍｅｓｓａｇｅｓ／２８６７）。
・１．０Ｍ  ＮａＯＨ、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｃＤＮＡ合成停止用溶液）
・２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５
・１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０／１ｍＭ  ＥＤＴＡ（１×ＴＥバッファー）・ガラス製のカバースリップ（フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）社またはＶＷＲ社によって配布されているコーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）ブランドのもの）またはＬｉｆｅｒＳｌｉｐｓＯ（Ｅｒｉｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
・２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳバッファー
・２×ＳＳＣバッファー
・０．２×ＳＳＣバッファー
・ガラス製のコプリンジャー（または同等物）
・０．５Ｍ  ＮａＯＨ／５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（任意：添付資料ＡまたはＢとともに使用するため）
・１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５（任意：添付資料ＡまたはＢとともに使用するため）
・登録商標Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−３０遠心分離用濾過装置（３０，０００分子量カットオフ、ミリポア社カタログ番号４２４０９）（任意：添付資料Ｃとともに使用するため−−ミリポアマイクロコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｃｒｏｃｏｎ）処理）
・イソプロパノール（任意：添付資料Ｄとともに使用するため）
・０．２％ＳＤＳバッファー（任意：添付資料Ｄとともに使用するため）
・９５％エタノール（任意：添付資料Ｄとともに使用するため）
・ダイセイバー（ＤｙｅＳａｖｅｒ）（ジェニスフィア社カタログ番号Ｑ１００２００）（任意：蛍光シグナルを保存し、光退色を防止するため）
ＲＮＡ調製：
高品質のＲＮＡを調製および使用することが、マイクロアレイ実験の成功を左右する。
【００９２】
分解されたＲＮＡを使用すると、ｄＴプライマーを用いたＲＴ反応は、全長ｃＤＮＡとは対照的な短鎖のポリｄＴテールを生成するだけで、その後アレイハイブリダイゼーションを行っても、特異的なシグナルは、ほとんど或いは全く発生しない。分解されたＲＮＡ試料を使用しなければならない場合には、試料をジェニスフィア社の３ＤＮＡアレイ３５０ＲＰ（バージョン２）キットを用いて標識すれば良好な結果が得られる可能性がある。
【００９３】
ＲＮアーゼインヒビター（Ｓｕｐｅｒａｓｅ−Ｉｎ、バイアル４）を使用することが強く推奨される。ＲＮアーゼインヒビターは、ＲＮアーゼが混入していると考えられる保存ＲＮＡ試料に添加すべきである。また、逆転写酵素反応に際して、ｃＤＮＡ合成の過程でＲＮＡが分解されるのを防ぐためにもインヒビターを添加すべきである。ＲＮアーゼによるＲＮＡ分解に関するより多くの情報については、以下の参考文献を参照されたい（それらはすべて、参照されて本明細書に組み込まれる）。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．Ｆ．，  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．  「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）
（第２版）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．，  Ｂｒｅｎｔ，  Ｒ．，  Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，  Ｒ．Ｅ．，  Ｍｏｏｒｅ，  Ｄ．Ｄ．，  Ｓｅｉｄｍａｎ，  Ｊ．Ｇ．，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｊ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｈｌ，  Ｋ．  「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９９８。
【００９４】
３ＤＮＡアレイ９００標識システムはゲノムＤＮＡを標識しない。したがって、ゲノムＤＮＡの混入を除去することは必須ではない。しかし、ゲノムＤＮＡを分解し去っておけば、存在するＲＮＡの量と質をより正確に測定することが可能になる。また、ゲノムＤＮＡを試料中に残したままにしておくと、ＲＴ酵素の一部に結合して、酵素を逆転写に使用できなくなる可能性がある。混入しているゲノムＤＮＡを分解するには、ＲＮアーゼを含まないＤＮアーゼが推奨される。
【００９５】
ＤＮアーゼを使用する場合には、ｃＤＮＡ合成処理に進む前にこのＤＮアーゼを完全に失活させておくことが重要である。ＤＮアーゼを失活させる方法には、フェノール−クロロホルム抽出法、およびキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社の登録商標ＲＮｅａｓｙキットを使用することなどがある。高温によるＤＮアーゼの失活では、酵素を完全に失活させることができない。
【００９６】
高品質のＲＮＡは以下の特徴を有する。
１．ＯＤ  ２６０／２８０の比率が１．９から２．１である。
２．アガロースゲル上で、植物および哺乳動物の全ＲＮＡは、２本のはっきりした明るいバンドとして現れる。哺乳動物のＲＮＡでは、バンドは約４．５ｋｂと約１．９ｋｂのところにあって、それぞれ２８Ｓおよび１８Ｓのリボゾームサブユニットを表す。
（このように高品質のＲＮＡを産生するためのＲＮＡ精製法について当該分野で公知の任意の適当なプロトコールを利用することができ、例えば、登録商標Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅのものなどがある。）
マイクロアレイの選択と調製：
ジェノミック・ソリューション社、アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）社、およびタカラ（Ｔａｋａｒａ）社によって製造されたスポット前のｃＤＮＡアレイは、使用前に特別な処理を必要としない。ＭＷＧバイオテック（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）社によって製造されたスポット前のオリゴアレイでは、最適な結果を得るために、添付資料Ｅに記載されている予備洗浄を必要とする。その他購入したアレイでは、製造業者が記載している通りにマイクロアレイを調製または前処理する。「自前」で作成したアレイについては、添付資料Ｄのプロトコールの一つを、アレイを前処理するために利用することが推奨される。これらのプロトコールは、無水コハク酸処理を必要とせず、多くのタイプのアレイ上で、より強いシグナルとより低いバックグラウンドが得られている（このプロトコールは、アジレント社のアレイとは適合しないことに留意されたい。）
ジェニスフィア社は、ＰＣＲ産物（ｃＤＮＡ）のスポッティングには、一定のアミノ−シランでコートされたスライド、具体的には、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  ＤＮＡ−Ｒｅａｄｙ
Ｔｙｐｅ  ＩＩ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＧＡＰＳ  ＩＩおよびＵｌｔｒａＧＡＰＳ、ならびにＴｅｌｅｃｈｅｍ  ＳｕｐｅｒＡｍｉｎｅのスライドの使用を推奨している。これらのスライドを３ＤＮＡアレイ９００キットと共に用いると、良好なＤＮＡ結合が得られることが実証されている。
【００９７】
ポリ−Ｌ−リジン、アルデヒドまたはアミノ−シラン（例えばＣｏｒｎｉｎｇ  ＧＡＰＳ）表面上で調整されたアレイは、ハイブリダイゼーション後に見られるバックグラウンドを低減するために予備洗浄工程または予備ハイブリダイゼーション工程のいずれかを行う必要があろう。マイクロアレイ上のバックグラウンドを低減するのに役立つ処理につい
ては、添付資料ＥまたはＦをそれぞれ参照のこと。
【００９８】
アレイが古くなるにつれて、特異的シグナルが低下し、バックグラウンドのノイズの量が多くなることがある。場合によっては、アレイが古くなるにつれて、スポッティングされたプローブが、「緑色」（Ｃｙ３）チャンネルでのバックグラウンドを示すようになる。これは、市販および「自前」を問わず、すべての基板表面上のアレイで生じている。市販および「自前」のアレイとも、スポッティング（またはアレイを受領した）直後と、その後も定期的に品質管理試験を行って、アレイとその他の材料が古くなったときに特徴的な非特異的バックグラウンドノイズを確認すべきである。また、スポッティング後のアレイ処理に使用する溶液はすべて試験して、一貫性があること、および非特異的なアレイバックグラウンドに最小限の寄与しかしていないことを確認すべきである。
【００９９】
ハイブリダイゼーション条件：
マイクロアレイは多様であるため、それぞれのアレイタイプについて、最適なバッファー選択を含めた最適なハイブリダイゼーション条件を決定することが重要である。例えば、Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ  Ａｒｒａｙ  ９００キットは、以下のハイブリダイゼーション用バッファーを含む。
【０１００】
１．  ２倍増強ｃＤＮＡハイブリダイゼーション用バッファー（バイアル５）−さらなる感度が望ましい場合にｃＤＮＡのハイブリダイゼーション工程にだけ用いられる。このバッファーは、比較的高温（６５℃まで）に耐えるアレイに使用することができる。
【０１０１】
２．  ２×ＳＤＳを主成分とするハイブリダイズ用バッファー（バイアル６）−ｃＤＮＡおよび３ＤＮＡの両ハイブリダイゼーション工程用であり、このバッファーは、比較的高温（６５℃まで）に耐えるアレイに使用することができる。
【０１０２】
３．  ２×ホルムアミドを主成分とするハイブリダイゼーション用バッファー（バイアル７）−ｃＤＮＡおよび３ＤＮＡの両ハイブリダイゼーション工程用であり、このバッファーは、高ストリンジェンシー用の処方であるため、比較的低温で使用するように設計されている。
【０１０３】
ハイブリダイゼーション用バッファーを試験して、どれが、利用中のアレイの種類に最も適しているかを決定することが推奨されている。２倍増強ｃＤＮＡハイブリダイゼーション用バッファー（バイアル５）は粘性であるため、ピペッティングすると容量が失われることから、カバースリップの下に比較的大量のハイブリダイゼーション容量が必要となることに留意されたい。さらに、この製品マニュアルに含まれているハイブリダイゼーション温度範囲は、手引きとして記載されている。ジェニスフィア社は、マイクロアレイの各ロットについて、最適なハイブリダイゼーション温度を実験的に決定することを推奨している。例えば、アレイのポリ−Ｌ−リジン表面には、バイアル５および６のバッファーを使用するのに必要とされるハイブリダイゼーション温度では剥がれ落ちてしまうものがあるかもしれない。この問題を経験したことがある場合には、バイアル７を指示に従って使用する。
【０１０４】
ほとんどのＰＣＲ産物は、ポリ（ｄＡ／ｄＴ）配列を含むため、ｃＤＮＡアレイ上ではＬＮＡ  ｄＴブロッカー（バイアル９）を使用することが推奨されている。ＬＮＡ  ｄＴブロッカーは、ジェニスフィア社によって設計された高効率のポリＴによる遮断試薬である（特許係属中、２００２年９月３日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／０２７７９９号、国際公開第ＷＯ０３／０２０９０２  Ａ２号を参照のこと。この文献は、全文が参照して本明細書に組み込まれる）。これは、ポリｄＡ配列だけを含むコントロールスポットを含む、アレイのフィーチャ中に存在するポリＡ配列をすべて完全に遮断するよう
に設計されている。この新規の遮断試薬は、ロックされた核酸（ＬＮＡ）のヌクレオチド（特許付与された商標Ｅｘｉｑｏｎ技術）を、ポリｄＴの合成鎖の中の重要な位置に含んでいる。これらの修飾ヌクレオチドが存在すると、核酸の相補鎖間におけるハイブリダイゼーションを安定化し、それによって、ポリｄＴ試薬の遮断能力が向上する。ＬＮＡ化学に関する更なる情報については、下記の参考文献３を参照されたい。遮断されたアレイに関する平均アレイシグナル強度は、遮断されていないアレイに較べると低いかもしれないが、相補的なアレイ要素に結合した逆転写ｃＤＮＡから生じる特異的シグナルに有害な影響を与えることはないはずである。各ハイブリダイゼーションに対して２μｌという容量のＬＮＡ  ｄＴブロッカー（バイアル９）が推奨されているが、アレイによっては、増量したＬＮＡ  ｄＴブロッカー（３〜４μｌ）を使用すれば、より良好な効率が得られるかもしれない。
【０１０５】
さらに、必要に応じて競合核酸（例えば、インビトロジェン社の種特異的Ｃｏｔ−１  ＤＮＡ）を加える。投入された全ＲＮＡの質量の１０分の１の競合核酸を使用する（すなわち、全ＲＮＡ１ｍｇに対して１００ｎｇのＣｏｔ−１  ＤＮＡを使用する）。競合物質が多すぎると、ハイブリダイゼーション中に過剰な競合物質が、有限なｃＤＮＡと非特異的に相互作用するため、シグナルが低下する可能性がある。ハイブリダイゼーション混合液に添加する前に、Ｃｏｔ−１  ＤＮＡおよびその他の競合核酸を（９５〜１００℃で５〜１０分間）変性することが推奨されている。
【０１０６】
使用手順
全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成するのに必要な工程を以下に要約する。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを使用している場合には、添付資料Ｂに記載されているｃＤＮＡに関する手順に従う。マイクロアレイおよびＲＮＡ調製物の量が変動するため、所定の実験に必要とされるＲＮＡの正確な量は、一般的には、動物の全ＲＮＡで０．２５〜１．０μｇ、植物の全ＲＮＡで０．５〜２．５μｇの範囲である。最初に使用する場合には、動物の全ＲＮＡでは１μｇ、植物の全ＲＮＡでは２μｇを出発点としてｃＤＮＡ合成することが推奨されている。ＲＮＡ試料およびアレイの品質によっては、最適な結果を得るために、これよりも多いか少ない量のＲＮＡが必要とされるかもしれない。
【０１０７】
大規模なｃＤＮＡ合成には、より大量のＲＮＡ（＞２μｇ）を使用することができる。添付資料Ａに、２〜５０μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する簡単な方法が詳しく記載されている。あるいは、第１１頁に概説されている方法をスケールアップして、より大量の全ＲＮＡに適合させることもできる。しかし、大量の反応容量ができるため、目的のｃＤＮＡ試料を濃縮する必要が出てくる（添付資料Ｃ参照）。また、その他のジェニスフィア社のキットによる手順を用いて調製したｃＤＮＡも、アレイ９００キットとともに使用することができる。以下のジェニスフィア社のキットには、アレイ９００  ３ＤＮＡキャプチャー試薬（バイアル１）に適合するｃＤＮＡを生成するｃＤＮＡ合成のための成分が含まれている。
【０１０８】
アレイ３５０（カタログ番号：Ｗ３００１００、Ｗ３００１１０、Ｗ３００１３０、Ｗ３００１４０、Ｗ３００１８０およびＷ３００１８４）
アレイ３５０ＨＳ（カタログ番号：Ｈ３００１００、Ｈ３００１１０、Ｈ３００１３０、Ｈ３００１４０、Ｈ３００１８０およびＨ３００１８４）
アレイ５０（バージョン２）（カタログ番号：Ｂ１００１２１、Ｂ１００１２２、Ｂ１００１７１、Ｂ１００１７２、Ｂ１００１８７およびＢ１００１８９）
全ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成：
合成後濃縮をしない少量合成法
注意事項：本処理法は、極めて少量の試料および試薬のピペッティング操作を必要とする。０．５μｌから１０μｌのピペッティングを正確に行えるよう設計されたピペッター
の使用が推奨される。
１．０．５ｍＬの「こびり付かない」マイクロチューブの中で、ＲＮＡ−ＲＴプライマー混合液を調製する。
【０１０９】
全ＲＮＡ  １〜５μｌ（０．２５〜１．０μｇの哺乳類全ＲＮＡまたは０．５〜２．５μｇの植物全ＲＮＡ）
ＲＴプライマー  １μｌ（バイアル２、１ｐｍｏｌｅ／μｌ）
ヌクレアーゼを含まない水（バイアル１０）を最終容量が６μｌになるよう加える。
２．ＲＮＡ−ＲＴプライマー混合液を混合し短時間微量遠心分離して、チューブの底に内容物を集める。
３．５分間８０℃まで加熱してから、すぐに氷上に移して２〜３分間置く。短時間遠心分離してチューブの底に内容物を集めてから氷上に戻す。
４．反応用主混合溶液を、氷上に置いたマイクロチューブ内で調製する（下記の表参照）。反応用主混合溶液は、同時に開始するｃＤＮＡの合成数に応じて、最終容量になるよう調合しなければならない。各ｃＤＮＡ合成には、４．５μｌの反応用主混合溶液が必要である。ピペッティングの誤差を低減するために、反応用主混合溶液は９μＬ以上なければならない。
【０１１０】
【表２】
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【０１１１】
穏やかに混合し（ボルテックスはしない）、短時間微量遠心して反応用主混合液の内容物をチューブの底に集める。使用する時まで氷上に置いておく。
５．工程４の反応用主混合溶液４．５μｌを、工程３のＲＮＡ−ＲＴプライマー混合溶液６μｌに加える（最終容量１０．５μｌ）。
６．穏やかに混合し（ボルテックスはしない）、４２℃で２時間インキュベートする。
７．１．０μｌの１．０Ｍ  ＮａＯＨ／１００ｍＭ  ＥＤＴＡを加えて反応を停止させる。
８．６５℃で１０分間インキュベートしてＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを変性させ、ＲＮＡを分解させる。
９．１．２μｌの２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で反応液を中和する。
１０．下記の「ｃＤＮＡおよび３ＤＮＡのマイクロアレイへの連続的ハイブリダイゼーション」に進む。
【０１１２】
ｃＤＮＡおよび３ＤＮＡのマイクロアレイへの連続的ハイブリダイゼーション
（注意：以下のプロトコールは、アジレント社のアレイには適合しない。）
ｃＤＮＡのハイブリダイゼーション
１．２×ハイブリダイゼーション用バッファー（バイアル５、バイアル６、またはバイアル７）を、少なくとも１０分間または完全に再懸濁されるまで６５〜７０℃に加熱することにより、融解して再懸濁する。ボルテックスして、確実に成分を均等に再懸濁する。必要ならば、材料がすべて再懸濁されるまで加熱とボルテックスを繰り返す。１分間、微量遠心分離する。
２．各アレイについて、２４×５０のガラス製カバースリップで使用するために以下のｃＤＮＡハイブリダイゼーション用混合液を調製する。
【０１１３】
ｃＤＮＡ合成用１番  １２．７μｌ
ｃＤＮＡ合成用２番、または一つのチャンネル実験用にヌクレアーゼを含まない水（バイアル１０）  １２．７μｌ
２×ハイブリダイゼーション用バッファー（バイアル５、バイアル６、またはバイアル７）（最終ｃＤＮＡハイブリダイゼーション用混合溶液の５０％）  ２７．４μｌ
ＬＮＡ  ｄＴブロッカー（バイアル９）（オリゴアレイには必要ないかもしれない）  ２μｌ
全容量  ５４．８μｌ
任意：所望であれば１．０μｌのＣ０Ｔ−１  ＤＮＡを加えることも可能である（使用前に９５〜１００℃で１０分間変性させる必要がある。）
＊あるいは、より小さなカバースリップとハイブリダイゼーション容量が望ましい場合には、単に、一つのアレイ上で使用されるよりも多い量のｃＤＮＡを調製して、より少ない、アレイ当りのｃＤＮＡ容量をロードする。例えば、ｃＤＮＡ合成において１０００ｎｇの全ＲＮＡで出発し、最終的なｃＤＮＡ逆転写反応物の容量の半分を使用することによって、チャンネル当り５００ｎｇの全ＲＮＡ由来のｃＤＮＡを含む３０μｌのハイブリダイゼーション容量にすることができる。最終的なハイブリダイゼーション混合液は以下のものを含むであろう。
【０１１４】
ｃＤＮＡ合成用１番  ６．５μｌ
ｃＤＮＡ合成用２番  ６．５μｌ
２×ハイブリダイゼーション用バッファー  １５μｌ
ＬＮＡブロッカー  ２．０μｌ
全容量  ３０．０μｌ
より大きなカバースリップまたはリフタースリップ（ＬｉｆｔｅｒＳｌｉｐ）が必要ならば、等容量の２×ハイブリダイゼーション用バッファー（バイアル５、６または７）およびヌクレアーゼを含まない水（バイアル１０）を加えてｃＤＮＡハイブリダイゼーション用混合液の容量を増やすことができる。
注意：２倍増強ｃＤＮＡハイブリダイゼーション用バッファー（バイアル５）は粘性であるため、ピペッティングすると容量が失われることから、比較的大量のハイブリダイゼーション容量が必要となる。これに対処するには、等容量のヌクレアーゼを含まない水（バイアル１０）および２×増強ｃＤＮＡハイブリダイゼーション用バッファー（バイアル５）を加えてｃＤＮＡハイブリダイゼーション用混合液の全容量を増やす。
（注意：本製品は、ハイブリダイゼーション・ステーションで使用できるかについては確認されていない。）
３．すべての成分を加えた後、ｃＤＮＡハイブリダイゼーション用混合液を穏やかにボルテックスしてから短時間微量遠心分離する。このｃＤＮＡハイブリダイゼーション用混合液を、まず７５〜８０℃で１０分間、次に、アレイにロードするまでハイブリダイゼーション温度でインキュベートする（推奨ハイブリダイゼーション温度については、工程５の下にある表を参照）。マイクロアレイをハイブリダイゼーション温度になるよう予熱する
。
４．ｃＤＮＡハイブリダイゼーション用混合液を穏やかにボルテックスしてから短時間微量遠心分離する。沈殿物がチューブの底に残るよう注意して、予熱しておいたマイクロアレイにｃＤＮＡハイブリダイゼーション用混合液を加える。
５．適当なガラス製カバースリップをアレイに載せる。このアレイを、暗所の加湿チャンバーの中、適当なハイブリダイゼーション温度で一晩インキュベートする。
【０１１５】
【表３】
2007506439.tif 000005
【０１１６】
このプロトコールにおける推奨ハイブリダイゼーション温度は、出発点として示したものであり、手引きとして利用すべきである。アレイ上にスポッティングされた核酸の性質ならびにスライド表面の化学的性質によって決まるストリンジェンシー要件に適合するよう温度を調整する必要があるかもしれない。特に、ハイブリダイゼーション温度を５℃上げると、非特異的シグナルを除去することができる。
【０１１７】
ｃＤＮＡハイブリダイゼーション後の洗浄：
１．２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳの洗浄用バッファーを予熱する。
【０１１８】
ＰＣＲ産物（ｃＤＮＡ）アレイは５５〜６５℃
オリゴヌクレオチドをスポッティングしたアレイは４２℃
２．予熱しておいた２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中でアレイを２〜５分間またはカバースリップが浮き上がるまで洗浄してカバースリップを取り除く＊。２倍増強ｃＤＮＡハイブリダイゼーション用バッファー（バイアル５）が用いられている場合には、カバースリップを取り除くのにさらに時間がかかるかもしれない。
３．予熱しておいた２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中で１０〜１５分間洗浄する。
４．室温の２×ＳＳＣ中で１０〜１５分間洗浄する。
５．室温の０．２×ＳＳＣ中で１０〜１５分間洗浄する。
６．アレイを乾いた５０ｍＬの遠心分離用チューブに移し、標識がすべてチューブの中で下向きになるようスライドを配向する。チューブの蓋をせずに、直ちに８００〜１０００ＲＰＭで２分間遠心してスライドを乾燥する（この工程では、少しの遅れでも、高いバックグラウンドを生じる結果となる）。アレイの表面に接触しないこと。
７．最適なアレイ効率を達成するには、洗浄条件をさらに最適化することが必要となるかもしれない。アレイ上のバックグラウンドを減少させる必要がある場合には、一部または全部の洗浄時間を１５〜２０分間に増加させることが推奨される。洗浄中に振とうすることも、アレイの表面への非特異的な結合によるバックグラウンドを低下させるのに役立つかもしれない。
＊注：カバースリップを取り外すのが困難な場合、それは、乾燥してしまったためかもしれない。将来の実験でこの問題を再発させないよう、ヌクレアーゼを含まない水（バイアル１０）と２×ハイブリダイゼーション用バッファー（バイアル５、６または７）を等容量加えて、ｃＤＮＡハイブリダイゼーション用混合液の総容量を増加させる。さらに、ハ
イブリダイゼーション用チャンバーが適切に加湿され密閉されていることを確認する。
【０１１９】
３ＤＮＡハイブリダイゼーション
１．３ＤＮＡアレイ９００キャプチャー試薬（バイアル１）を調製する。凍結処理の結果生じうる凝集物を破壊する必要がある。
【０１２０】
ａ．３ＤＮＡアレイ９００キャプチャー試薬（バイアル１）を、暗所で室温にて２０分間融解する。
【０１２１】
ｂ．ボルテックスを最大値に設定して３秒間撹拌し、短時間微量遠心する。
ｃ．５０〜５５℃で１０分間インキュベートする。
【０１２２】
ｄ．ボルテックスを最大値に設定して３〜５秒間撹拌する。
ｅ．チューブを短時間微量遠心して、内容物を底に集める。
【０１２３】
使用前にサンプルを凝集物についてチェックし、必要があれば、ボルテックスによる混合処理を繰り返す。凝集物は、溶液面より下のチューブの側面に小さな気泡または薄片として出現する。必要があれば、工程ａ〜ｅを繰り返す。
【０１２４】
２．２×ハイブリダイゼーション用バッファー（バイアル６またはバイアル７）を、少なくとも１０分間または完全に再懸濁されるまで、７０℃に加熱して融解・再懸濁する。ボルテックスして、確実に成分を均等に再懸濁する。必要ならば、材料がすべて再懸濁されるまで加熱とボルテックス処理を繰り返す。１分間微量遠心する。
【０１２５】
使用上の注意：２×増強ｃＤＮＡハイブリダイゼーション用バッファー（バイアル５）を３ＤＮＡハイブリダイゼーション工程では使用しないこと。
【０１２６】
３．退色防止用試薬（バイアル８）は、蛍光色素がハイブリダイゼーション後に退色するのを抑制する。１μｌの退色防止用試薬を１００μｌの２×ハイブリダイゼーション用バッファー（バイアル６またはバイアル７）に加えて保存溶液を調製する。未使用のハイブリダイゼーション用バッファーは−２０℃に保存し、２週間以内に使用すること。しかし、アレイが、アルデヒドで被覆されたスライドにプリントされている場合には、背景がぼやけることになるため、この退色防止用試薬をしないこと。退色防止用試薬は、使用後に再凍結する。
【０１２７】
４．各アレイについて、２４×５０のガラス製カバースリップで使用するために以下の３ＤＮＡハイブリダイゼーション用混合液を調製する＊。
【０１２８】
Ｃｙ３／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６  ３ＤＮＡアレイ９００キャプチャー試薬（バイアル１）  ２．５μｌ
Ｃｙ５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  ３ＤＮＡアレイ９００キャプチャー試薬（バイアル１）  ２．５μｌ
２×ハイブリダイゼーション用バッファー（バイアル６または７）（３ＤＮＡハイブリダイゼーション用混合溶液の５０％）  ２７．５μｌ
ヌクレアーゼを含まない水（バイアル１０）  ２２．５μｌ
全容量  ５５．０μｌ
任意：所望であれば１．０μｌのＣｏｔ−１  ＤＮＡを加えることも可能である（使用前に９５〜１００℃で１０分間変性させる必要がある。）
注：単一チャンネルの発現解析には、２番目の３ＤＮＡアレイ９００キャプチャー試薬の代わりに２．５μｌのヌクレアーゼを含まない水（バイアル１０）を使用する。
【０１２９】
＊あるいは、より小さなカバースリップとハイブリダイゼーション容量が望ましい場合には、２×ハイブリダイゼーション用バッファー（バイアル６または７）およびヌクレアーゼを含まない水（バイアル１０）の容量を、所望のカバースリップに適した容量に調整する。例えば、容量３０μｌの最終３ＤＮＡハイブリダイゼーション用混合液は以下のものを含む。
【０１３０】
Ｃｙ３／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６  ３ＤＮＡアレイ９００キャプチャー試薬（バイアル１）  ２．５μｌ
Ｃｙ５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  ３ＤＮＡアレイ９００キャプチャー試薬（バイアル１）  ２．５μｌ
２×ハイブリダイゼーション用バッファー（バイアル６または７）（３ＤＮＡハイブリダイゼーション用混合溶液の５０％）  １５．０μｌ
ヌクレアーゼを含まない水（バイアル１０）  １０．０μｌ
全容量  ３０．０μｌ
５．３ＤＮＡハイブリダイゼーション用混合溶液を穏やかにボルテックスしてから短時間微量遠心する。この３ＤＮＡハイブリダイゼーション用混合液を、まず７５〜８０℃で１０分間、次に、アレイにロードするまでハイブリダイゼーション温度でインキュベートする（推奨ハイブリダイゼーション温度については、工程７の下にある表を参照）。
【０１３１】
６．３ＤＮＡハイブリダイゼーション用混合液を穏やかにボルテックスしてから短時間微量遠心する。沈殿物がチューブの底に残るよう注意して、予熱しておいたマイクロアレイに３ＤＮＡハイブリダイゼーション用混合液を加える。（マイクロアレイをハイブリダイゼーション温度に予熱すると、バックグラウンドを減少させることができる。）
７．２４×５０のガラス製カバースリップをアレイに載せる。より大きなカバースリップまたはリフタースリップ（ＬｉｆｔｅｒＳｌｉｐ）が必要ならば、等容量の２×ハイブリダイゼーション用バッファー（バイアル６または７）およびヌクレアーゼを含まない水（バイアル１０）を加えて３ＤＮＡハイブリダイゼーション用混合液の容量を増やすことができる。このアレイを、暗所の加湿チャンバーに入れて、適当なハイブリダイゼーション温度で４〜５時間インキュベートする。
【０１３２】
【表４】
2007506439.tif 000006
【０１３３】
３ＤＮＡハイブリダイゼーション後の洗浄
ハイブリダイゼーション後、スライドを数回洗浄して未結合の３ＤＮＡ分子を取り除く。蛍光色素の光退色および退色を防止するために、これらの洗浄は暗所で行う。ハイブリダイゼーション後のＣｙ５の退色を抑制するためには、最初２回の洗浄用バッファーに最終濃度０．５〜１ｍＭでＤＴＴを含ませることも有益であろう。古いか低品質のＤＴＴは、Ｃｙ３チャンネルにおいて「もや」のように見えるバックグラウンドを増加させる原因となりうるため、確実に新鮮なＤＴＴを用いて作業すること。マイクロアレイ実験を行う際にＣｙ５の分解を抑制するための推奨事項については、添付資料Ｇを参照されたい。
【０１３４】
使用上の注意：洗浄用バッファーを調製する際には、Ｃｙ５／Ａｌｅｘａ  ６４７を損なう原因となりうる水の使用を避けること。インターネット・リスト・サーブ（Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  Ｌｉｓｔ  Ｓｅｒｖｅ）に記載されているように、登録商標ＭｉｌｌｉＱ水は、Ｃｙ５を損なうことが分かっている（ｈｔｔｐ：／／ｇｒｏｕｐｓ．ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ／ｇｒｏｕｐ／ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ／ｍｅｓｓａｇｅｓ／２８６７）。また、ＤＥＰＣ処理した溶液は、ＤＥＰＣがすべて完全に取り除かれていることを確認しなければならない（ＤＥＰＣは強力な酸化剤である）。あるいは、非ＤＥＰＣ処理したヌクレアーゼを含まない溶液の使用が推奨される。アンビオン社から市販されている溶液（水、バッファーなど）が、Ｃｙ５で標識されたマイクロアレイで良好に働くことが分かっている。アンビオン水以外には、ＶＷＲ社（カタログ番号ＲＣ９１５０５）のＤＩ水も推奨できる。アンビオン社およびＶＷＲ社の水は、マイクロアレイに使用できることが確認されており、Ｃｙ５を酸化する成分を含んでいない。
【０１３５】
１．２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳの洗浄用バッファーを以下のように予熱する。
１．ＰＣＲ産物（ｃＤＮＡ）アレイおよび５０ヌクレオチド長よりも長いオリゴヌクレオチドアレイは６５℃、
２．５０ヌクレオチド長よりも短いオリゴヌクレオチドアレイは４２℃
８．予熱しておいた２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中でアレイを２〜５分間またはカバースリップが浮き上がるまで洗浄してカバースリップを取り除く＊。
【０１３６】
９．予熱しておいた２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中で１０〜１５分間洗浄する。
１０．室温の２×ＳＳＣ中で１０〜１５分間洗浄する。
【０１３７】
１１．室温の０．２×ＳＳＣ中で１０〜１５分間洗浄する。
１２．アレイを乾いた５０ｍＬの遠心分離用チューブに移し、標識がすべてチューブの中で下向きになるようスライドを配向する。チューブの蓋をせずに、直ちに８００〜１０００  ＲＰＭで２分間遠心してスライドを乾燥する（この工程では、少しの遅れでも、高いバックグラウンドを生じる結果となる）。アレイの表面に接触しないこと。
【０１３８】
最適なアレイ効率を達成するには、洗浄条件をさらに最適化することが必要となるかもしれない。アレイ上のバックグラウンドを減少させる必要がある場合には、一部または全部の洗浄時間を１５〜２０分間に増加させる。洗浄中に振とうすることも、アレイの表面への非特異的な結合によるバックグラウンドを低下させるのに役立つかもしれない。
【０１３９】
「シグナル検出」に進むか、まず、ＤｙｅＳａｖｅｒコーティング（ジェニスフィア社カタログ番号Ｑ１００２００）を塗布して蛍光シグナルを保存する。
＊注：カバースリップを取り外すのが困難な場合、それは、乾燥してしまったためかもしれない。将来の実験でこの問題を再発させないよう、ヌクレアーゼを含まない水（バイアル１０）と２×ハイブリダイゼーション用バッファー（バイアル６または７）を等容量加えて、３ＤＮＡハイブリダイゼーション用混合液の総容量を増加させる。さらに、ハイブリダイゼーション用チャンバーが適切に加湿され密閉されていることを確認する。
【０１４０】
シグナル検出
重要事項：アレイはスキャニングするまで暗所で保存すること。３ＤＮＡ試薬の蛍光、特にＣｙ５およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７は、定常光下でも酸化によって急速に減衰する可能性がある。マイクロアレイ実験を行う際にＣｙ５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ
６４７の分解を抑制するための推奨事項については、添付資料Ｆを参照されたい。
【０１４１】
スキャナーの製造業者の説明に従ってマイクロアレイをスキャンする。色素は、スキャ
ナーの光源に曝露すると光退色する可能性があるため、過剰な多重走査は避ける。
【０１４２】
パッカード（Ｐａｃｋａｒｄ）社のスキャナーを使用する場合には、推奨されるのは、レーザーを８０％の出力に設定して開始して、「オートバランス」機能または下記の表を利用して、適正なチャンネルバランスを取るためにスキャニングの初期パラメータを設定する。さまざまなフルオロフォア・チャンネルのバランスを取るために、スキャナーのレーザー出力と光電子増倍管（ＰＭＴ）の電圧を調整する必要があろう。ＰＭＴ設定が高すぎると、観察されるバックグラウンドが許容できないほどになるかもしれない。このような場合には、ＰＭＴの設定を低くして、レーザー出力を高めてシグナル対ノイズの比率を最適化すべきである。しかし、１回のスキャンの後で、蛍光色素、特にＣｙ５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７の光退色を防ぐためには、レーザーの設定を高くしすぎてはならない（＞９０〜９５％）。
注意：レーザーまたはＰＭＴを相殺して画像のバランスを取ると、各チャンネルにおいてデータが非直線的に分布する結果となる可能性がある。そのような場合には、統計学的な標準化が必要となろう。さらなる指示については、機器の使用説明書を参照されたい。
【０１４３】
【表５】
2007506439.tif 000007
【０１４４】
Ａｘｏｎ  ４０００シリーズのスキャナーを使用する場合には、推奨ＰＭＴ設定値は以下のとおりである。
【０１４５】
【表６】
2007506439.tif 000008
【０１４６】
以下の参考文献は、本明細書において検討されている技術としての更なる背景の記載があり、全文が参照されて本明細書に組み込まれる。
１．Ｎｉｌｓｅｎ，  Ｔ．Ｗ．，  Ｇｒａｙｚｅｌ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｐｒｅｎｓｋｙ，  Ｗ．  「樹枝状核酸分子構造（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）」．  Ｊ．  Ｔｈｅｏｒ．  Ｂｉｏｌ．  （１９９７）  １８７：
２７３−２８４．
２．Ｓｔｅａｒｓ，  Ｒ．Ｌ．，  Ｇｅｔｔｓ，  Ｒ．Ｃ．，  Ｇｕｌｌａｎｓ，  Ｓ．Ｒ．  「デンドリマー技術を利用した高密度マイクロアレイの新規な高感度検出システム（Ａ  ｎｏｖｅｌ，  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ
ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｕｓｉｎｇ  ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」．  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３：  ９３−９
９，  ９００．
３．Ｓｉｎｇｈ，  Ｓ．Ｋ．，  Ｎｉｅｌｓｅｎ，  Ｐ．，  Ｋｏｈｓｋｉｎ．  Ａ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｗｅｎｇｅｌ，  Ｊ．  ＬＮＡ  （Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）：  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．  Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ．，４５５−４５６，  １９９８．
注意：Ｃｙは、アマーシャム・バイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｉｃｅｎｃｅ）の商標であり、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒは、モレキュラー・プローブズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の商標であり、ＲＮｅａｓｙおよびＱｉａｇｅｎは、キアゲン社の商標であり、Ｓｕｐｅｒａｓｅ−Ｉｎは、アンビオン社の商標登録された製品であり、ＥｘｉｑｏｎおよびＬＮＡは、エキシコン社（Ｅｘｉｑｏｎ  Ａ／Ｓ）の商標であり、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭｉｌｌｉＱおよびＭｉｃｒｏｃｏｎは、ミリポア社の商標であり、ＬｉｆｔｅｒＳｌｉｐは、エリーサイエンティフィック（Ｅｒｉｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．）の商標であり、また、３ＤＮＡ、Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ，  Ａｒｒａｙ  ３５０ＲＰ、Ａｒｒａｙ  ３５０、Ａｒｒａｙ  ５０、Ａｒｒａｙ  ９００およびＤｙｅＳａｖｅｒは、ニュージャージー州モントベール（Ｍｏｎｔｖａｌｅ，  Ｎｅｗ
Ｊｅｒｓｅｙ）にあるデータスコープ社（Ｄａｔａｓｃｏｐｅ  Ｃｏｒｐ．）の商標である。
【０１４７】
添付資料Ａ
スケールアップｃＤＮＡ調製法
２〜５０μｇの全ＲＮＡからスケールアップ逆転写反応を行って、反復実験、ｃＤＮＡの定量、またはその他の平行分析を行うための余分のｃＤＮＡを提供することができる。
【０１４８】
ｃＤＮＡ合成：
１．０．５または１．５  ｍＬのＲＮアーゼを含まない微量遠心分離用チューブの中で、ＲＮＡ−ＲＴプライマー混合液を調製する。
【０１４９】
１〜１０μｌの全ＲＮＡ（２〜５０μｇの哺乳動物全ＲＮＡまたは２５〜１２５μｇの植物全ＲＮＡ）
１μｌのＲＴプライマー（バイアル１１、５ｐｍｏｌｅ／μｌ）。
【０１５０】
最終容量が１１μｌになるよう、ＲＮアーゼを含まない水を加える。
２．ＲＮＡ−ＲＴプライマー混合液を混合して、短時間微量遠心して内容物をチューブの底に集める。
【０１５１】
３．１０分間８０℃まで加熱して、直ちに氷上に移して２〜３分間置く。
４．別のマイクロチューブの中で以下のものを混合する（氷上で）。
【０１５２】
４μｌの５×ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ第１鎖用バッファーまたは同等の反応用バッファー（酵素とともに供給されたもの）
２μｌの０．１  Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）（酵素と一緒に供給されたもの）
１μｌのＳｕｐｅｒａｓｅ−Ｉｎ（バイアル４）
１μｌのｄＮＴＰ混合液（バイアル３）
１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ酵素、２００ユニット
これが反応用溶液である。最終容量は９μｌになるはずである。ゆっくりと混合し（ボルテックスはしない）、短時間微量遠心して内容物をチューブの底に集める。使用時まで氷上に置く。
【０１５３】
５．工程３のＲＮＡ−ＲＴプライマー混合液１１μｌに、工程４の反応用溶液９μｌを
加える（最終容量２０μｌ）。
【０１５４】
６．ゆっくりと混合し（ボルテックスはしない）、４２℃で２時間インキュベートする。
【０１５５】
７．３．５μｌの０．５  Ｍ  ＮａＯＨ／５０  ｍＭ  ＥＤＴＡを加えて反応を停止させる。
【０１５６】
８．６５℃で１０分間インキュベートして、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを変性させ、ＲＮＡを分解する。
【０１５７】
９．５μｌの１  Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．５で反応液を中和する。得られた溶液が目的のｃＤＮＡである。
【０１５８】
１０．所望のハイブリダイゼーション容量に適した濃度になるようｃＤＮＡを希釈する。
【０１５９】
「ｃＤＮＡおよび３ＤＮＡのマイクロアレイへの連続的ハイブリダイゼーション」に進む。
【０１６０】
添付資料Ｂ
ポリ（Ａ）＋ＲＮＡからのｃＤＮＡ調製
以下の処理手順は、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡからｃＤＮＡを合成するために必要な工程をまとめたものである。マイクロアレイおよびＲＮＡ調製は品質がさまざまであるため、所定の実験に必要とされるＲＮＡの正確な量は、１２．５〜５０  ｎｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡの範囲であろう。初めての利用者には、５０  ｎｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡが、ｃＤＮＡ合成の出発点として推奨されている。
【０１６１】
ｃＤＮＡ合成：
１．１．５  ｍＬのＲＮアーゼを含まない微量遠心分離用チューブの中で、以下のものを混合する。
【０１６２】
１〜１０μｌのポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（２５〜１００  ｎｇ）
１μｌのＲＴプライマー（バイアル１１、５ｐｍｏｌｅ／μｌ）。
【０１６３】
最終容量が１１μｌになるよう、ＲＮアーゼを含まない水を加える。
これがＲＮＡ−ＲＴプライマー混合液である。
【０１６４】
２．混合して、短時間微量遠心して内容物をチューブの底に集める。
３．１０分間８０℃まで加熱して、直ちに氷上に移して２〜３分間置く。
【０１６５】
４．別のマイクロチューブの中で以下のものを混合する（氷上で）。
４μｌの５×ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ第１鎖用バッファーまたは同等の反応用バッファー（酵素とともに供給されたもの）
２μｌの０．１  Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）（酵素と一緒に供給されたもの）
１μｌのＳｕｐｅｒａｓｅ−Ｉｎ（バイアル４）
１μｌのｄＮＴＰ混合液（バイアル３）
１μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ酵素、２００ユニット
これが反応用溶液である。最終容量は９μｌになるはずである。ゆっくりと混合し（ボルテックスは使用しない）、短時間微量遠心して内容物をチューブの底に集める。使用時
まで氷上に置く。
【０１６６】
５．工程４の反応混合液９μｌに、工程３のＲＮＡ−ＲＴプライマー混合液１１μｌを加える（最終容量２０μｌ）。
【０１６７】
６．ゆっくりと混合し（ボルテックスはしない）、４２℃で２時間インキュベートする。
【０１６８】
７．３．５μｌの０．５  Ｍ  ＮａＯＨ／５０  ｍＭ  ＥＤＴＡを加えて反応を停止させる。
【０１６９】
８．６５℃で１０分間インキュベートして、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを変性し、ＲＮＡを分解する。
【０１７０】
９．５μｌの１  Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．５で反応液を中和する。得られた溶液が目的のｃＤＮＡである。
【０１７１】
１０．所望のハイブリダイゼーション容量に適した濃度になるようｃＤＮＡを希釈する。
【０１７２】
「ｃＤＮＡおよび３ＤＮＡのマイクロアレイへの連続的ハイブリダイゼーション」に進む。
【０１７３】
添付資料Ｃ
ｃＤＮＡの濃縮
ミリポア社のＭｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−３０遠心分離濾過装置（分子量３０，０００のカットオフ、ミリポア社カタログ番号４２４０９）を用いてｃＤＮＡ試料を濃縮することができる。これらの装置は、ｃＤＮＡ合成反応液の容量を、約８〜１０分間で３〜１０μｌに減少させることができる。以下の処理手順は、製造業者の指示に３ＤＮＡアレイ９００キットに合わせて軽微な修正を加えたものを繰り返したものである。
使用上の注意：ミリポアＭｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−３０遠心分離濾過装置の使用は、少量（＜１．０μｇ）のｃＤＮＡ試料の重大な損失をもたらす可能性がある。
重要事項：Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−３０の使用者は、自身の遠心分離の設定を評価して、最終容量を３〜１０μｌとするために最適な時間および速度の設定を決定しなけらばならない。
【０１７４】
１．Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−３０の試料用容器を１．５ｍＬの回収用チューブに入れる。
【０１７５】
２．１００μｌの１×ＴＥバッファーをＭｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−３０の試料用容器に加えて、この容器の膜を予備洗浄する。
【０１７６】
３．チューブ／試料用容器を組み立てたものを１０〜１４，０００ｇが可能な固定角ローター卓上遠心分離機の中に入れる。
【０１７７】
４．１０〜１４，０００ｇで３分間回転させる。
５．ｃＤＮＡ反応液の容量を、１×ＴＥバッファーで１００μｌにする。ｃＤＮＡ反応液をすべて、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−３０の試料用容器に加える。ピペットの先端で膜に触れてはならない。
【０１７８】
６．１０〜１４，０００ｇが可能な固定角ローター卓上遠心分離機の中に、チューブ／試料用容器を組み立てたものを入れる。
【０１７９】
７．１０〜１４，０００ｇで８〜１０分間遠心する。
８．チューブ／試料用容器を組み立てたものを取り出す。試料用容器中の液体をこぼさないよう慎重に試料用容器から回収用チューブを分離する。
【０１８０】
９．膜に触れることなく、試料用容器膜に５μｌの１×ＴＥバッファーを加える。濃縮装置の側面を軽くたたいて、濃縮物と１×ＴＥバッファーの混合を促進する。
【０１８１】
１０．新たな回収用チューブ上に試料用容器を上下逆にして慎重に載せる。同じ遠心分離機中最高速度で２分間遠心する。
【０１８２】
１１．回収用チューブから試料用容器を分離し、容器を廃棄する。チューブの底に集まった容量（総容量３〜１０μｌ）を書き留める。ｃＤＮＡ試料は、後に使用するために、回収用チューブの中で保存することができる。
【０１８３】
１２．水を加えて所望のｃＤＮＡ容量にする。
「ｃＤＮＡおよび３ＤＮＡのマイクロアレイへの連続的ハイブリダイゼーション」に進む。
【０１８４】
添付資料Ｄ
アレイ処理手順（無水コハク酸なし）
選択肢１（推奨）（クロスリンク、イソプロパノール洗浄およびボイル）
１．ホットプレートに載せた４リットルのビーカーの中で２リットルの試薬級の脱イオン蒸留水（利用可能な最高品質の水）を９５℃〜１００℃に予備加熱（ボイリング）する。２．２５０ｍＬのイソプロパノールをガラス製の長方形の染色皿に移して、小さな撹拌バーを皿の中に入れる。この皿を磁気撹拌プレートに載せて、バーをゆっくりと安定した速度で撹拌させる。
３．未処理のアレイを回収する。慎重に、一枚のスライドを角でつまみ上げ、沸騰している（工程１の）水の湯気に５秒間かざす。アレイが上向きになっていることを確認する。スライドを空中で３秒間振ってから、アレイ面を上にして無繊維性実験用布巾の上に置く。８枚のスライドが水和して乾燥するまで繰り返す。
４．８枚のスライドを、アレイ面を上にして５０〜２２０ｍＪに設定されたクロスリンカーに移す。
５．クロスリンクした後、８枚のアレイを、溝があるガラス／金属製のＷｈｅａｔｏｎ染色スライドホルダーの中に移す（スライドを両末端にある溝に入れてはならない）。スライドを入れたホルダーを（工程２の）イソプロパノールの中に入れ、撹拌しながら１５分間インキュベートする。
６．スライドホルダーを（工程１の）沸騰している湯の中に移し、８〜１０分間インキュベートする。スライドが水面下にあることを確認する。
７．沸騰している湯の中からスライドホルダーを取り出して、実験用の布巾の上に置いて、余分な水分を除く。これで、アレイは、ハイブリダイゼーションできるばかりになった。
選択肢２（クロスリンク、ＳＤＳ洗浄、ボイル、および冷エタノールリンス）
１．試薬級の脱イオン蒸留水（最高品質の水）の中で２リットルの０．２％ＳＤＳ溶液を調製する。例えば、４０  ｍＬの１０％ＳＤＳと１９６０ｍＬの水を、２リットルのオートクレーブ済みガラス瓶の中で混合する。この溶液を濾過して、沈殿したＳＤＳをすべて除去する。この０．２％ＳＤＳ溶液を２５０  ｍＬ、長方形のガラス製染色皿に移して、皿の中に小さな撹拌バーを入れる。この皿を磁気撹拌プレートに載せて、バーにゆっくり
と安定した速度で撹拌させる。
２．ホットプレートに載せた４リットルのビーカーの中で２リットルの試薬級の脱イオン蒸留水（利用可能な最高品質の水）を９５℃〜１００℃に予備加熱（ボイリング）する。３．２リットルの試薬級の脱イオン蒸留水を、４リットルのビーカーに移し、室温に置く。
４．２５０ｍＬのエタノールを長方形のガラス製染色皿に移す。この皿を氷バケツの中に入れて、氷冷したエタノール浴槽をセットする。
５．未処理のアレイを回収する。慎重に、一枚のスライドを角でつまみ上げ、沸騰している（工程２の）水の湯気に５秒間かざす。アレイが上向きになっていることを確認する。スライドを空中で３秒間振ってから、アレイ面を上にして無繊維性実験用布巾の上に置く。８枚のスライドが水和して乾燥するまで繰り返す。
６．８枚のスライドを、アレイ面を上にして５０〜２２０  ｍＪに設定されたクロスリンカーに移す。
７．クロスリンクした後、８枚のアレイを、溝があるガラス／金属製のＷｈｅａｔｏｎ染色スライドホルダーの中に移す（スライドを両末端にある溝に入れてはならない）。スライドを入れたホルダーを（工程１の）０．２％ＳＤＳの中に入れ、撹拌しながら１０分間インキュベートする。
８．スライドホルダーを取り出して、実験用の布巾の上に置いて、余分な水分を除く。そして、ホルダーを２リットルの（工程３の）室温水に５回浸す。
９．スライドホルダーを（工程２の）沸騰している湯の中に移し、８〜１０分間インキュベートする。スライドが水面下にあることを確認する。
１０．沸騰している湯の中からスライドホルダーを取り出して、実験用の布巾の上に置いて、余分な水分を除く。このスライドホルダーを（工程４の）氷冷エタノールの中に移し、５分間インキュベートする。スライドがエタノール面下にあることを確認する。
１１．スライドホルダーを取り出して、実験用の布巾の上に置いて、余分な水分を除く。各スライドを５０  ｍＬの遠心分離用チューブの中に移す。１０００  ｒｐｍで３分間遠心分離してスライドを乾燥させる。これで、アレイは、ハイブリダイゼーションできるばかりになった。
【０１８５】
添付資料Ｅ
バックグラウンドを低減させるためのアレイの予備洗浄処理
１．以下の条件でマイクロアレイを洗浄する。
【０１８６】
ａ．２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳによって５５℃で２０分間
ｂ．０．２×ＳＳＣによって室温で５分間
ｃ．脱イオン蒸留水によって室温で３分間
２．アレイを、乾燥した５０  ｍＬ遠心分離用チューブに直ちに移す。これを速やかに行って、スライド上にむらのあるバックグラウンドが生じないようにする。標識がチューブの中で下に降りるようにスライドを置く。チューブの蓋をせずに、８００〜１０００  ＲＰＭで２分間遠心してスライドを乾燥させる。アレイの表面に接触しないこと。マイクロアレイのアレイを皿またはコプリン・ジャー（Ｃｏｐｌｉｎ  ｊａｒ）の中に、室温で５分間、０．２×ＳＳＣとともに移す。
【０１８７】
ここで、アレイは、ｃＤＮＡと予備ハイブリダイゼーションまたはハイブリダイゼーションを行える状態になった。
【０１８８】
添付資料Ｆ
バックグラウンドを低下させるためのアレイの予備ハイブリダイゼーション：
アレイ表面への非特異的結合は、多くのタイプのアレイに共通する問題である。以下に述べる予備ハイブリダイゼーション用プロトコールは、一部のタイプの非特異的結合を抑
制し、ハイブリダイゼーション後に見られるバックグラウンドを低下させるために推奨されている。
１．マイクロアレイを５０℃に１０分間予熱する。
２．２×ハイブリダイゼーション用バッファー（バイアル７）を、少なくとも１０分間または完全に再懸濁されるまで７０℃に加熱することにより、融解・再懸濁する。ボルテックスして、確実に成分を均等に再懸濁する。必要ならば、材料がすべて再懸濁されるまで加熱とボルテックス処理を繰り返す。１分間微量遠心する。
３．以下の予備ハイブリダイゼーション用混合液を調製する。
【０１８９】
２５μｌの２×ホルムアミドベース・ハイブリダイゼーション用バッファー（バイアル７）
１μｌのヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡ
２４μｌのヌクレアーゼを含まない水
４．予備ハイブリダイゼーション用混合液を１０分間８０℃に加熱する
５．予備ハイブリダイゼーション用混合液を、予熱しておいたマイクロアレイに適用して、２４×６０  ｍｍのカバースリップをかぶせる。
６．５０℃で１〜２時間インキュベートする。
７．以下の条件でアレイを洗浄する。
【０１９０】
ａ．２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳによって６０〜６５℃で１５分間
ｂ．２×ＳＳＣによって室温で１０分間
ｃ．０．２×ＳＳＣによって室温で１０分間
８．アレイを、乾燥した５０  ｍＬ遠心分離用チューブに直ちに移す。これを速やかに行って、スライド上にむらのあるバックグラウンドが生じないようにする。標識がチューブの中で下に降りるようにスライドを置く。チューブの蓋をせずに、８００〜１０００  ＲＰＭで２分間遠心してスライドを乾燥させる。アレイの表面に接触しないこと。
【０１９１】
アレイは、ｃＤＮＡとハイブリダイゼーションが行える状態になった。
添付資料Ｇ
マイクロアレイ実験を行う際に、Ｃｙ５またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７が分解されるのを抑制するための推奨事項
Ｃｙ５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７色素の性能は、特に夏期に一般的になるさまざまな要素によって影響を受ける。Ｃｙ５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７色素溶液とハイブリダイズしたアレイを光と酸化環境に曝露すると、利用した標識システムが何であるかに関わらず、Ｃｙ５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７色素の急速な退色が起こる可能性がある。これらの環境にアレイを曝露することを制限または制御すると、Ｃｙ５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７の退色が顕著に抑制されることが明らかになっている。
【０１９２】
以下は、マイクロアレイ実験を行うときに、Ｃｙ５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７が分解されるのを抑制するための推奨事項である。
１．常に、Ｃｙ５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７を含む溶液およびアレイが光、特に日光に当たらないようにする。Ｃｙ５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７は、普通の蛍光灯などの光に当たると光退色する。
２．ハイブリダイズして乾燥したアレイは、特に暑い夏の日には、空気に触れないよう保護する。夏季の空気汚染から生じる大気のオゾンレベルが、Ｃｙ５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７の酸化的分解を引き起こすかもしれない。小さな容器（５０  ｍＬチューブ）の中で不活性大気（窒素）の中に置かれた、Ｃｙ５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７を含むアレイは、Ｃｙ５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７の退色を顕著に遅らせることができる。また、研究者には、少量のＤＴＴまたはβメルカプトエタノール（ＢＭＥ）をチューブの底に添加して、還元的微小環境をさらに促進する者もいる（アレイがこれらの
化学薬品と接触しないことを確認する）。
３．Ｃｙ５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７キャプチャー試薬を含むハイブリダイゼーション用溶液中で退色防止用試薬（３ＤＮＡキットで提供されている）を使用すること。退色防止用試薬は、酸化過程を遅延させる抗酸化特性を有する。
４．洗浄用バッファーを調製するときには、Ｃｙ５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７を損なう原因となる水を使用しないようにする。インターネット・リスト・サーブ（Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  Ｌｉｓｔ  Ｓｅｒｖｅ）に記載されているように、登録商標ＭｉｌｌｉＱ水は、Ｃｙ５を損なうことが分かっている（ｈｔｔｐ：／／ｇｒｏｕｐｓ．ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ／ｇｒｏｕｐ／ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ／ｍｅｓｓａｇｅｓ／２８６７）。また、ＤＥＰＣ処理した溶液は、ＤＥＰＣがすべて完全に取り除かれていることを確認しなければならない（ＤＥＰＣは強力な酸化剤である）。あるいは、非ＤＥＰＣ処理したヌクレアーゼを含まない溶液の使用が推奨される。アンビオン社から市販されている溶液（水、バッファーなど）が、Ｃｙ５で標識されたマイクロアレイで良好に働くことが分かっている。アンビオン水以外には、ＶＷＲ社（カタログ番号ＲＣ９１５０５）のＤＩ水も推奨できる。アンビオン社およびＶＷＲ社の水は、マイクロアレイに使用できることが確認されており、Ｃｙ５を酸化する成分を含んでいない。
５．少量のジチオスレイトール（ＤＴＴ）を、すなわち最終濃度０．１ｍＭになるようハイブリダイゼーション後洗浄溶液に加える。この強力な還元剤はアレイ上のＣｙ５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７を洗浄用バッファー中の酸化剤による攻撃から保護する。
６．常に、必ず、目的の３ＤＮＡ  Ｃｙ３／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６とＣｙ５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７のキャプチャー試薬（バイアル１）を混合して、保存中に生じる凝集物を破壊する。
【０１９３】
ａ．３ＤＮＡキャプチャー試薬（バイアル１）を、暗黒下室温で２０分間融解する。
ｂ．ボルテックスを最大値に設定して３秒間撹拌し、短時間微量遠心する（１秒間）。
【０１９４】
ｃ．５０〜５５℃で１０分間インキュベートする。
ｄ．ボルテックスを最大値に設定して３〜５秒間撹拌する。
【０１９５】
ｅ．チューブを短時間微量遠心して、内容物を底に集める。
必ず使用前に凝集物をチェックし、必要があれば、ボルテックスによる混合処理を繰り返す。凝集物は、面液面より下のチューブの側面に小さな気泡または薄片として出現する。必要であれば、工程ａ〜ｅを繰り返す。
７．上記の推奨事項が、Ｃｙ５分解という問題を解消できない場合、可能性の高い原因は、大気汚染物質への曝露である。この問題に取り組むために、ジェニスフィア社は、最終洗浄と遠心の後にアレイに塗布されるＤｙｅＳａｖｅｒという試薬（ジェニスフィア社カタログ番号Ｑ１００２００）を開発した。ＤｙｅＳａｖｅｒは使いやすく、ほとんどのアレイ表面化学法に適合し、最大３週間、Ｃｙ５を大気による酸化から保護する。また、ＤｙｅＳａｖｅｒは、光退色によるＣｙ５の損傷も抑制することが示されている。
【０１９６】
具体的な実施形態に関して本発明を説明してきたが、当業者にとっては、さらなる実施形態、改変および変更が明らかであるか、それが示唆されているため、この記載は、制限的なものではないと解すべきである。本出願は、そのような実施形態、改変、および変更を包含するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１９７】
【図１】本発明に従った好適な方法の概略図である。
【図１】
2007506439.tif 000009
【国際調査報告】
2007506439.tif 000010