(57)【要約】培養下にある骨髄に由来する早期付着細胞に対して血管新生促進性導入遺伝子をトランスフェクトすることにより、障害のある骨髄細胞が患者における虚血部位に導入された場合に血管新生を促進する能力を増強するための方法を提供する。血管新生促進性の導入遺伝子またはタンパク質を患者に対して送達するために、自己骨髄由来のこのような早期付着細胞、または、細胞（これは自己細胞からのものである必要はない）を培養下で増殖させた際のこれらの細胞に由来する培地を利用するための方法も提供される。トランスフェクトされた早期付着細胞、または細胞を培養下で増殖させた際のこれらの細胞に由来する培地は、側副血管の形成を増強する目的で、心臓などの虚血組織に対して導入される。細胞または培地を血流（虚血組織への供給路である動脈、または任意のその他の動脈もしくは静脈）内に注入することもできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
障害のある骨髄細胞が側副血管の発達を促進する能力を、それを必要とする患者において増強するための方法であって、以下の段階を含む方法：
障害のある骨髄細胞を、適切な培養条件下、適切な培地中にて、骨髄細胞による早期付着細胞の生成を促進するのに十分な期間増殖させる段階、
早期付着細胞の少なくとも一部に対して、血管新生サイトカイン、増殖因子および哺乳動物血管新生促進因子より選択される1つまたは複数の作用因子をコードするポリヌクレオチドを含むベクターをトランスフェクトする段階、ならびに
トランスフェクトされた早期付着細胞を、1つまたは複数の作用因子が生成されるように培養する段階、
それにより、障害のある骨髄細胞および/または培養下で増殖させた際のこれらの細胞に由来する培地を送達された患者における側副血管の発達を促進する、その細胞および/または培地の能力を、非トランスフェクト細胞または培養下で増殖させた非トランスフェクト細胞から得られる培地の能力と比較して増強する段階。
【請求項２】
骨髄細胞がドナーの加齢によって障害されている、請求項1記載の方法。
【請求項３】
骨髄細胞が、若齢健常個体でみられる天然に起こる血管新生プロセスを障害させる疾患を有するドナーによって障害されている、請求項1記載の方法。
【請求項４】
疾患が高コレステロール血症である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
ドナーが患者である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
細胞を培養下で約12時間〜約12日間増殖させる、請求項1記載の方法。
【請求項７】
期間が約12時間〜約3日間である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
ドナーから骨髄を入手する段階、および骨髄細胞を得るために骨髄を濾過する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
濾過によって約300μ〜約200μよりも大きい粒子が除去される、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
1つまたは複数の作用因子が、低酸素誘導性因子1（HIF-1）、内皮PASドメインタンパク質1（EPAS1）、単球走化性タンパク質1（MCP-1）、顆粒球-単球コロニー刺激因子（GM-CSF）、PR39、線維芽細胞増殖因子（FGF）、および一酸化窒素シンターゼ（NOS）より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
ベクターがプラスミドベクターおよびアデノウイルスベクターより選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
作用因子がPR39、FGF、およびNOSより選択される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
トランスフェクトされた早期付着細胞を刺激する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
細胞が骨髄由来ストロマ細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
培地が、骨髄由来ストロマ細胞の培養によって得られる、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
側副血管の形成を、それを必要とする患者において増強するための方法であって、以下の段階を含む方法：
患者から自己骨髄を入手する段階、
自己骨髄を、適切な培養条件下、容器内にて、骨髄による早期付着細胞の生成を促進するのに十分な期間増殖させる段階、
早期付着細胞の少なくとも一部に対して、線維芽細胞増殖因子（FGF）、NOSおよびPR39より選択される1つまたは複数の作用因子をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを、その1つまたは複数の作用因子の発現を引き起こすためにトランスフェクトする段階、ならびに
トランスフェクトされた早期付着細胞の有効量および/または培養下で増殖した際のトランスフェクトされた細胞に由来する培地の有効量を、患者における所望の部位に直接投与する段階、
それにより、患者におけるその部位での側副血管形成を増強する段階。
【請求項１８】
側副血管の形成を、それを必要とする対象において増強するための方法であって、以下の段階を含む方法：
骨髄を、適切な培養条件下、骨髄による早期付着細胞の生成を促進するのに十分な期間増殖させる段階、
早期付着細胞の少なくとも一部に対して、血管新生サイトカイン、増殖因子および哺乳動物血管新生促進因子より選択される1つまたは複数の作用因子をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを、早期付着細胞による発現のためにトランスフェクトする段階、ならびに
トランスフェクトされた早期付着細胞を、培地中にて、細胞による1つまたは複数の作用因子の発現を行わせるのに適した期間培養し、それによって馴化培地を生成する段階、ならびに
トランスフェクトされた早期付着細胞および/または馴化培地の有効量を患者における所望の部位に直接投与する段階、
それにより、患者におけるその部位での側副血管形成を増強する段階。
【請求項１９】
早期付着細胞が骨髄由来ストロマ細胞であり、かつ細胞が患者における虚血部位に直接投与される、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
早期付着細胞が骨髄由来ストロマ細胞であり、かつ馴化培地が患者における虚血部位に直接投与される、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
細胞および/または馴化培地が、部位への投与のために血流内に注入される、請求項18記載の方法。
【請求項２２】
細胞および/または馴化培地が、部位への供給路である動脈内に注入される、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
期間が約3時間〜約12日間である、請求項18記載の方法。
【請求項２４】
期間が約3時間〜約3日間である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
早期付着細胞を得るために、骨髄を培養する前に骨髄を濾過する段階をさらに含む、請求項18記載の方法。
【請求項２６】
骨髄が自己骨髄である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
作用因子が、哺乳動物血管新生を促進する転写因子である、請求項18記載の方法。
【請求項２８】
ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項18記載の方法。
【請求項２９】
作用因子が線維芽細胞増殖因子（FGF）、NOS、およびPR39より選択される、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
作用因子がFGF-1、FGF-2、FGF-4、およびFGF-5より選択される、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
作用因子が誘導型NOSおよび内皮型NOSより選択される、請求項29記載の方法。
【請求項３２】
作用因子がPR39である、請求項29記載の方法。
【請求項３３】
トランスフェクトされた細胞が、心臓または脚の筋肉内に、そこにおける血管新生を促進するために直接注入される、請求項18記載の方法。
【請求項３４】
心臓または脚の筋肉における側副血管形成を増強する、請求項18記載の方法。
【請求項３５】
新たに移植された心筋細胞の発達を促進する、請求項18記載の方法。
【請求項３６】
心臓の電気経路疾患を有する患者の心臓の電気伝導性を促進する、請求項18記載の方法。
【請求項３７】
心筋機能疾患を有する患者における心筋機能を増強する、請求項18記載の方法。
【請求項３８】
患者の心臓における心機能疾患の原因となる左心室または右心室の状態を治療する、請求項18記載の方法。
【請求項３９】
骨髄由来の早期付着細胞を含む治療用組成物であって、早期付着胞は、血管新生サイトカイン、増殖因子、および血管新生促進因子より選択される1つまたは複数の作用因子をコードするポリヌクレオチドを含むベクターによりトランスフェクトされている、治療用組成物。
【請求項４０】
1つまたは複数の作用因子の発現を行わせるのに十分な時間、培養下で細胞を増殖させた馴化培地をさらに含む、請求項39記載の治療用組成物。
【請求項４１】
ポリヌクレオチドが、そのポリヌクレオチドに機能的に付随した転写調節領域をさらに含む、請求項39記載の組成物。
【請求項４２】
トランスフェクトされた細胞が低酸素状態に対する曝露によって刺激される、請求項39記載の組成物。
【請求項４３】
ヘパリンまたは別の抗凝固薬をさらに含む、請求項39記載の組成物。
【請求項４４】
ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項39記載の組成物。
【請求項４５】
早期付着細胞が骨髄由来のストロマ細胞である、請求項39記載の組成物。
【請求項４６】
虚血組織を有する患者への注入が意図された組成物であって、早期付着細胞はその患者から入手した骨髄に由来する、請求項39記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本出願は、自己骨髄および骨髄細胞を注入するための方法に向けられたものである。より具体的には、本発明は、側副血管の形成（血管新生）および組織灌流を増強するための、自己骨髄およびトランスフェクトされた骨髄細胞、ならびに/または培養下で増殖させた際のこれらの細胞に由来する培地（これは自己細胞から得られる必要はない）の心筋内注入に向けられたものである。
【０００２】
関連出願
本出願は、2003年7月10日に提出された米国特許出願第10/618,183号（これは、1999年6月9日に提出された米国仮特許出願第60/138,379号および1999年3月30日に提出された第60/126,800号に優先権を依拠している2000年3月30日に提出された国際出願第PCT/US00/08353号の国内段階であった2001年6月14日に提出された米国特許出願第09/868,411号の一部継続出願である2002年6月6日に提出された米国特許出願第10/160,514号の一部継続出願である）に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
心筋の側副血管の機能を増強するために組換え遺伝子または増殖因子を用いることは、心血管疾患の治療への新たなアプローチとなる可能性がある。Kornowski, R., et al.,「Delivery strategies for therapeutic myocardial angiogenesis」, Circulation 2000；101：454-458。この概念は心筋虚血の動物モデルで実証されており、さらに臨床試験が進行中である。Unger, E.F., et al.,「Basic fibroblast growth factor enhances myocardial collateral flow in a canine model」, Am J Physiol 1994；266：H1588-1595；Banai, S. et al.,「Angiogenic-induced enhancement of collateral blood flow to ischemic myocardium by vascular endothelial growth factor in dogs」, Circulation 1994；83-2189；Lazarous, D.F., et al.,「Effect of chronic systemic administration of basic fibroblast growth factor on collateral development in the canine heart」, Circulation 1995；91：145-153；Lazarous, D.F., et al.,「Comparative effects of basic development and the arterial response to injury」, Circulation 1996；94：1074-1082；Giordano, F.J., et al.,「Intracoronary gene transfer of fibroblast growth factor-5 increases blood flow and contractile function in an ischemic region of the heart」, Nature Med 1996；2：534-9。Guzman, R.J., et al.,「Efficient gene transfer into myocardium by direct injection of adenovirus vectors」, Circ Res 1993；73：1202-7；Mack, C.A., et al.,「Biologic bypass with the use of adenovirus-mediated gene transfer of the complementary deoxyribonucleic acid for VEGF-121, improves myocardial perfusion and function in the ischemic porcine heart」, J Thorac Cardiovasc Surg 1998；115：168-77。
【０００４】
血管新生因子の直接的な術中心筋内注入が側副路の機能に及ぼす効果が、心筋虚血の動物モデルで研究されている。血管新生ペプチドをコードする導入遺伝子を含むアデノウイルスベクターの開胸式経心外膜投与は、側副路機能の増強を引き起こした（Mack et al., 前記）。患者の開心術中に血管新生ペプチドまたはプラスミドベクターの直接的な心筋内注入を行っても血管新生が起こることが報告された。Schumacher, B., et al.,「Induction of neoangiogenesis in ischemic myocardium by human growth factors. First clinical results of a new treatment of coronary heart disease」, Circulation 1998；97：645-650；Losordo, D.W., et al.,「Gene therapy for myocardial angiogenesis：initial clinical results with direct myocardial injection of phVEGF165 as sole therapy for myocardial ischemia」, Circulation 1998；98：2800。本発明者らは、本特許を心筋内注入に限定することは望んでいない。――本発明者らはこの段落を割愛すべきであろうか？
【０００５】
冠動脈疾患の患者を治療するための新たな様式として治療的血管新生は有望ではあるものの、どの特定の戦略が臨床的に関連する治療的血管新生応答を最適に促進するかに関しては未だに大きな隔たりがある。さらに、多数の血管新生増殖因子のうちどの1つ（または複数）が有益な血管新生応答に関連しうるか明確ではない。加えて、最適な血管新生応答を促進することを目的として、種々の組織送達用プラットフォーム、例えば、タンパク質、アデノウイルスまたは「裸の（naked）」DNAを用いることも、未解決の課題として残されている。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、最適な側副路発達には、数百種ではないにせよ数十種の遺伝子の差次的発現を伴う、多数の複雑なプロセスが必要であるという前提に基づく。この概念に基づけば、側副血管の最適な発達および組織灌流を、コードされる産物が血管新生に関係することが知られている単一の遺伝子の投与によって達成することはできず、さらに、血管新生プロセスの複雑性のため、複数の血管新生関連遺伝子の組み合わせの投与によっても達成することができないことになる。本発明は、血管新生に関与する増殖因子およびサイトカインを、時間および濃度に依存した、協調的で、かつ適切な順序で分泌するという骨髄細胞の能力に依拠する。
【０００７】
最近試験されているほとんどの治療アプローチは、単一の血管新生増殖因子（例えば、VEGF、FGF、アンジオポエチン1）を虚血組織に送達することに焦点を当てている。これは、多様なベクターを用いた最終産物（例えば、タンパク質）の送達、または遺伝子導入のいずれかによって実現しうる。しかし、新たな血管形成の開始および維持のためには、複数の増殖因子系の間の複雑な相互作用がおそらく必要であろうと考えられている。より具体的には、新たな血管の形成および機能の開始および維持のために、協調し、かつ時宜を得た様式で相互作用する種々の血管新生サイトカインにより、特定の局所的な血管新生環境が誘導されることが重要であると考えられている。
【０００８】
したがって、1つの態様において、本発明は、障害のある骨髄細胞が側副血管の発達を促進する能力を、それを必要とする患者において増強するための方法を提供する。障害のある骨髄細胞を患者から入手し、適切な培養条件下、適切な培地中にて、骨髄細胞による早期付着細胞（early attaching cell）の生成を促進するのに十分な期間増殖させる。早期付着細胞の少なくとも一部に対して、血管新生サイトカイン、増殖因子、および哺乳動物血管新生促進因子より選択される1つまたは複数の作用因子をコードするポリヌクレオチドを含むベクターをトランスフェクトし、かつトランスフェクトされた骨髄細胞を、1つまたは複数の作用因子の生成を行わせるのに十分な期間さらに培養する。この方法により、培養骨髄細胞および/または培養下で増殖させた際のこれらの細胞に由来する培地を、送達された患者における側副血管の発達を促進する、その細胞および/または培地の能力は、非トランスフェクト細胞、または培養下で増殖させた非トランスフェクト細胞から得られる培地の能力と比較して増強される。
【０００９】
別の態様において、本発明は、以下の段階により、側副血管の形成を、それを必要とする患者において増強するための方法を提供する：骨髄を適切な培養条件下、骨髄による早期付着細胞の生成を促進するのに十分な期間増殖させる段階、早期付着細胞の少なくとも一部に対して、血管新生サイトカイン、増殖因子、および哺乳動物血管新生促進因子より選択される1つまたは複数の作用因子をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを、早期付着細胞による発現のためにトランスフェクトする段階、ならびに、トランスフェクトされた早期付着細胞を、培養液中にて、細胞による1つまたは複数の作用因子の発現を行わせるのに適した期間培養し、それによって馴化培地を作製する段階。続いて、トランスフェクトされた早期付着細胞の有効量および/または馴化培地の有効量を患者における所望の部位に直接投与し、それによって患者におけるその部位での側副血管形成を増強させる。
【００１０】
さらに別の態様において、本発明は、骨髄に由来し、血管新生サイトカイン、増殖因子、および血管新生促進因子より選択される1つまたは複数の作用因子をコードするポリヌクレオチドを含むベクターによりトランスフェクトされている早期付着細胞を含む、治療用組成物を提供する。治療用組成物はさらに、トランスフェクトされた細胞を、トランスジェニック作用因子の1つまたは複数、およびその種の細胞が培養下で通常生成する他の作用因子の発現を行わせるのに十分な期間、培養下で増殖させた馴化培地を含みうる。
【００１１】
発明の詳細な説明
骨髄（BM）は、血管新生プロセスの制御に関与する広範囲のサイトカイン（例えば、増殖因子）および細胞の天然源である。このため、自己（A）BMまたはそれに由来する骨髄細胞、または細胞を培養下で増殖させた際のこれらの細胞に由来する培地を、これらの細胞が多くの血管新生因子を時宜を得た様式で分泌するという自然能力を利用することによって送達することは、虚血心筋における治療的な側副路の発達を達成するための最適な介入を提供すると考えられる。
【００１２】
本発明のさまざまな態様によれば、自己骨髄、またはそれに由来する細胞、または細胞を培養下で増殖させた際のこれらの細胞に由来する培地を、「単独」の治療薬として注入するか、または血管新生増殖因子の骨髄生成を増強しうる、およぶ/または内皮細胞の増殖、遊走、および血管形成を促進しうる任意の薬理学的薬剤、タンパク質または遺伝子または任意の他の化合物または介入と組み合わせて注入する。「組み合わせ」血管新生作用因子は、患者もしくは標的組織に直接投与することもでき、または骨髄もしくは骨髄細胞を患者に注入する前にエクスビボで骨髄とともにインキュベートすることもできる。本明細書で用いる場合、「骨髄細胞」という用語は、吸引した骨髄を細胞増殖条件下で培養することによって生成される任意の細胞を意味する。
【００１３】
これらの「組み合わせ」血管新生作用因子の非制限的な例には、顆粒球-単球コロニー刺激因子（GM-CSF）、単球走化性タンパク質1（MCP-1）、および低酸素誘導性因子1（HIF-1）がある。
【００１４】
骨髄はまた、血管新生および炎症プロセスの制御に関与する広範囲のサイトカイン、増殖因子、および血管新生促進因子の天然源でもある。発現される血管新生サイトカイン、増殖因子、および血管新生促進因子には、初期および後期の造血の維持に関与することが公知のメディエーター（IL-1αおよびIL-1β、IL-6、IL-7、IL-8、IL-11およびIL-13；コロニー刺激因子、トロンボポエチン、エリスロポエチン、幹細胞因子、fit 3リガンド、肝細胞増殖因子、腫瘍壊死因子α、白血病抑制因子、形質転換増殖因子β1およびβ3；およびマクロファージ炎症タンパク質1 α）、血管新生因子（線維芽細胞増殖因子1および2、血管内皮増殖因子）、ならびに、通常の標的（および源）が結合組織形成細胞（血小板由来増殖因子A、上皮増殖因子、形質転換増殖因子αおよびβ2、オンコスタチンMおよびインスリン様増殖因子1）、または神経細胞（神経成長因子）であるようなメディエーターが含まれる。Sensebe, L., et al., Stem Cells 1997；15：133-43。さらに、VEGFポリペプチドが血小板および巨核球に存在し、かつ活性化血小板からβ-トロンボグロブリンの放出とともに放出されることが示されている。Wartiovaara, U., et al., Thromb Haemost 1998；80：171-5；Mohle, R., Proc Natl Acad Sci USA 1997；94：663-8。
【００１５】
また、血管新生は、骨髄の機能を支援し、かつ循環に入って創傷治癒および/または虚血の部位へと標的化され、最終的に新たな血管の形成に寄与する、幹細胞および前駆細胞を含む造血細胞の発達を支援するために必要であるという概念を支持する指標もある。成人骨髄から単離された、未分化間葉前駆細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体は、発達中の微小血管系の細胞表面マーカーを認識することが示されており、かつ論拠からはこの種の細胞が胚の血管新生において役割を果たす可能性が示唆される。Fleming, J.E., Jr., Dev Dyn 1998；212：119-32。
【００１６】
骨髄血管新生は、骨髄が悪性細胞によって活性化される病的状態（例えば多発性骨髄腫）では亢進する可能性があり、この状態では、骨髄血管新生はヒト多発性骨髄腫細胞の発達と同時に増進することが示されている。Ribatti, D., et al., Br J Cancer 1999；79：451-5。さらに、血管内皮増殖因子（VEGF）は、パラクリンまたはオートクライン機構のいずれかを通じて、多発性骨髄腫などの造血系新生物の成長に役割を果たすことが示されている。Bellamy, W.T., Cancer Res 1999；59：728-33；Fiedler, W., Blood 1997；89：1870-5）。自己骨髄は、それに特有の生得的な体液性および細胞性の特性を有しており、さまざまな血管新生化合物の潜在的な源になると考えられている。驚いたことに、「混合された」血管新生サイトカインのこの天然源は、治療的な血管新生および/または筋形成を生成する有力な相互作用性増殖因子の混合物として利用することができる；細胞自体を用いることにより、これらの天然の血管新生作用因子のより持続的な源が提供されうる。
【００１７】
さらに、現在では驚いたことに、このような骨髄細胞を培養した培地も、治療的な血管新生および/または筋形成をもたらすこのような相互作用性増殖因子タンパク質の混合物を含むことが発見されている。さらに、非自己骨髄細胞を、骨髄細胞による相互作用性増殖因子タンパク質の生成を行わせるのに適した期間培養し、かつ「馴化」培地を虚血組織の領域に送達して、治療的な血管新生および/または筋形成をもたらすことによって治療効果を生成することもできる。実際に、トランスフェクトされた早期付着骨髄細胞、このような骨髄細胞および培養下でトランスフェクトされた骨髄細胞を増殖させることによって得られる馴化培地、または馴化培地のみを、虚血を伴う組織中に注入した場合、または虚血組織への供給路である動脈もしくは他の任意の動脈もしくは静脈など、血流への注入によって送達した場合に、その結果生じる血管新生がトランスフェクトされた骨髄幹細胞のみの注入によって達成される血管新生よりも大きいことは「予想外の結果」である。
【００１８】
虚血に応答した血管新生の開始にあずかる可能性が最も高い血管新生促進因子の1つはHIF-1であり、これは低酸素への応答に関与するいくつかの遺伝子のプロモーターと結合して賦活化する有力な転写因子である。HIF-1の誘導および活性化は組織pO2によって厳密に制御されている；HIF-1の発現はpO2の低下に伴って指数関数的に増加し、それにより、pO2の低下が、低酸素環境に対する適応応答としての役目を果たす遺伝子産物の発現上昇を引き起こすという正のフィードバックループが提供される。HIF-1の活性化は、例えば、エリスロポエチン、解糖に関与する遺伝子の誘導、およびVEGFの発現を導く。これはおそらく、低pO2レベルに対する適応応答にあずかる他の多くの遺伝子の発現をも調節する。HIF-1が低酸素に対する応答に関与するタンパク質のレベルを調節する機構は、低pO2に応答する遺伝子の転写調節による。このため、このような遺伝子は、HIF-1結合部位を含むプロモーターまたはエンハンサー領域の内部に、低酸素応答エレメント（HRE）と称される短いDNA配列を有する。HIF-1は塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックスモチーフを有するヘテロ二量体であり、サブユニットHIF-1αおよびHIF-1βからなる。そのレベルはpO2によって転写時および転写後の双方において調節される――HIF-1の誘導は低酸素によって増大し、かつその半減期はpO2レベルの上昇に伴って著しく縮小する。
【００１９】
HIF-1の発現（HeLa細胞における評価）がpO2と指数関数的および逆比例的に関係する一方で、曲線の変曲点が酸素飽和度5％にあり、最大活性が0.5％、かつ最大活性の1/2が1.5〜2.0％にあることは重要である。これらは比較的低レベルの低酸素状態であり、かつこのようなレベルが、軽度の心筋虚血または下肢虚血の存在下―すなわち、組織壊死（それぞれ心筋梗塞および下腿潰瘍）の非存在下で存在するレベル―で生じているか否か明確でない。このため、骨髄細胞が血管新生因子を分泌し、それによって側副路の発達を増強する能力を有する可能性がある。しかし、このような活性は、何らかの補足的な刺激が存在しなければ、治療を受ける特定の組織環境において顕在化しない可能性がある。したがって、本発明の好ましい局面は、必要に応じて、骨髄または移植骨髄細胞をHIF-1とともに投与することである。HIF-1は移植骨髄中に存在する多くの低酸素誘導性血管新生遺伝子の最適な発現を提供することが期待される。HIF-1はタンパク質として、または遺伝子として注入できる。後者の様式の場合であれば、それは、機能的に関連したタンパク質レベルが存在するよう導くプラスミドベクターもしくはウイルスベクターの様式または任意の他の様式のいずれでも注入することができる。
【００２０】
HIF-1は、低酸素誘導性遺伝子の転写活性化に決定的な役割を果たす転写因子である。これはHIF-1αサブユニットおよびHIF-1βサブユニットから構成されるヘテロ二量体として機能する。HIF-1活性はHIF-1αサブユニットの安定性によって制御される。それゆえに、HIF-1αは正常酸素条件下ではユビキチン化され、このことはHIF-1αをプロテアソーム分解へと標的化する。低酸素状態はユビキチン化の低下を導き、かつこれによってタンパク質安定性を高める。このことはヘテロ二量体形成を増強し、かつこれによってHIF-1活性を高める。HIF-1の機能活性が酸素レベルと厳密かつ逆比例的に結びついているという事実は、酸素の分子センサーとしての、さらにそのことによる細胞の低酸素に対する適応応答の調節における、HIF-1の決定的な役割を示している。HIF-1の転写活性は、記したように低酸素条件下のみで形成される形態であるヘテロ二量体が、VEGF、VEGFR1、VEGFR2、Ang-2、Tie-1、および一酸化窒素シンターゼを含む、細胞の低酸素に対する応答に関与する多くの遺伝子のプロモーターに存在する特異的なDNA低酸素応答認識エレメント（HRE）と結合する能力に由来することが発見されている。したがって、HIF-1は、虚血に対する組織応答の協調において中心的な役割を果たす。
【００２１】
低酸素状態の非存在下におけるHIF-1αの不安定性のために、正常酸素条件下でもHIF-1αに恒常的な活性を確保させることを目的として、以下の実施例8に記載したように、HIF-1α由来のDNA結合ドメインおよび二量体化ドメイン、ならびに単純ヘルペスウイルスVP16タンパク質由来のトランス活性化ドメインからなるHIF-1α遺伝子のキメラ構築物が構築されている。このVP16ドメインはHIF-1αのユビキチン化部位を無効化し、これによってプロテアソームを介したこのタンパク質の分解を消失させる。したがって、この結果得られる安定したレベルのHIF-1αは、HIF-1が標的化する遺伝子の恒常的なトランス活性化を導く。
【００２２】
しかし、HIF-1は骨髄による血管新生物質の生成を増強しうる介入の一例として用いられることが強調される。本発明はまた、HIF-1活性を増強すること（すなわち、その半減期を延長すること）により、またはHIF-1に類似した効果をもたらすことにより、骨髄を刺激して血管新生因子の発現を増大させる、他の血管新生作用因子の使用にも及ぶ。類似のアプローチは、自己骨髄を内皮PASドメインタンパク質1（EPAS1）に対して曝露させることに関する。EPAS1はHIF-1と高度の構造的および機能的な相同性を有し、HIF-2としても公知である。
【００２３】
本発明による別の態様においては、HIF-1によりVEGFプロモーター活性を増強するために、骨髄細胞をエクスビボの培養下で、低酸素状態、または例えば、超音波、RFまたは電磁エネルギーのような他の形態のエネルギーに曝露させることができる。この介入はVEGFおよび他の遺伝子の発現を増大させる。この効果により、これは骨髄が血管新生を刺激する能力を増進しうる。したがって、本態様において、本発明は、HIF-1（またはHIF-1の作用を増進する産物、もしくは骨髄に対してHIF-1と類似した作用をもたらす産物）によって、吸引した自己骨髄をエクスビボ刺激、または骨髄の低酸素環境への直接曝露を行い、その後に、活性化された骨髄細胞、または細胞を培養下で増殖させた際のこれらの細胞に由来する培地を、心臓および/または末梢性の虚血組織における側副路依存的な灌流を増大させる目的で、虚血性の心筋または末梢器官（例えば、虚血肢）に対して送達することを含む。
【００２４】
最新のデータは、側副路機能を増強するために単球由来のサイトカインが重要であることを示している。単球はインビボで側副路が成長する間活性化され、単球走化性タンパク質1（MCP-1）はインビトロでの剪断ストレスによって上方制御される。単球は、側副血管成長（動脈新生）および毛細血管出芽（血管新生）の間、血管壁に付着することが示されている。MCP-1もまた、ウサギ慢性後肢虚血モデルにおける大腿動脈閉塞後の側副路の成長を増強することが示されている（Ito et al., Circ Res 1997；80：829-3）。単球の活性化は、側副路の成長および毛細血管の出芽に重要な役割を果たすように思われる。LPSによる単球の動員の増大は、実験的動脈閉塞の7日後における毛細血管密度の増大ならびに側副路および末梢の伝導性の増強に関連する（Arms M. et al., J Clin Invest 1998；101：40-50）。
【００２５】
本発明のさらなる局面は、吸引した自己骨髄をMCP-1によってエクスビボ刺激し、その後に、活性化された骨髄細胞、または細胞を培養下で増殖させた際のこれらの細胞に由来する培地を、心臓および/または末梢性の虚血組織における側副路依存的な灌流および筋機能を増強させる目的で、虚血性の心筋または末梢器官（例えば、虚血肢）に対して直接送達することに関する。骨髄の刺激は、骨髄をタンパク質の形態にあるMCP-1に対して直接曝露させることによって行うこともでき、または骨髄細胞に対してMCP-1遺伝子を保有するベクターをトランスフェクトすることもできる。例えば、骨髄または骨髄に由来する早期付着細胞に対して、MCP-1導入遺伝子を保有するプラスミドベクターまたはアデノウイルスベクターをトランスフェクトすることができる。
【００２６】
顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）および顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）は単球成熟のための刺激性サイトカインであり、かつこれらは多能性造血性増殖因子であって、癌患者において免疫抑制療法または化学療法に反応して通常起こる白血球数の減少（すなわち、白血球減少症または顆粒球減少症または単球減少症）といったさまざまな血液学的病態に対する臨床行為に利用されている。GM-CSFはまた、赤芽球バースト形成単位、好酸球コロニー形成単位（CSF）、および多能性（CSF）からの、さらには顆粒球-マクロファージCSFおよび顆粒球CFUからの、インビトロでのコロニー形成を誘導する多系列性増殖因子としても記載されている（Bot F.J., Exp Hemato 1989, 17：292-5）。GM-CSFに対するエクスビボ曝露はCD-34+前駆細胞の急速な増殖を誘導することが示されている（Egeland T. et al., Blood 1991；78：3192-g）。これらの細胞は血管内皮細胞へと分化する能力を有しており、かつ天然では生後の血管新生に関与している可能性がある。さらに、GM-CSFはマクロファージ/単球の増殖、分化、運動性および生存（アポトーシスの割合の低下）に対する多数の刺激作用を有する。骨髄由来内皮前駆細胞および単球に対する公知の複合的作用に合致して、虚血性心血管器官における新たな血管形成および分化を誘導することを意図した自己骨髄注入に対する補助療法としてGM-CSFを用いることは、本発明の別の局面である。さらに、GM-CSFは、骨髄の作用を増進することにより、または、インビボもしくはインビトロのいずれかで投与されて、HIF-1、EPAS1、低酸素状態もしくはMCP-1などの作用因子によっても刺激されている骨髄をさらに刺激することにより、骨髄によって引き起こされる治療的な心筋血管新生をさらに増強する可能性がある。
【００２７】
しかし、虚血領域への血液の送達を増強する目的で、側副血管の発達が望まれる領域内に注入された骨髄細胞は、ある種の「リスクを負った」条件が優勢である場合には、最適な血管新生効果をもたらさない可能性がある。例えば、高コレステロール血症の存在下では血管新生が障害されることを論証する証拠があり、かつこれは加齢によっても損なわれる。さらに、天然に起こる血管新生プロセスが、若齢健常個体でみられるものと比較して障害されている数多くの遺伝病および他の疾患がある。骨髄細胞の機能は、加齢に伴う高コレステロール血症の存在下においても、さらには、天然に起こる血管新生プロセスを、若齢健常個体でみられるものと比較して障害するような遺伝疾患および他の疾患によっても損なわれるということも現在発見されている。
【００２８】
高コレステロール血症は、低密度リポタンパク質コレステロールレベルの出生時に始まる顕著な上昇を引き起こす優性遺伝性の遺伝的素因であり、かつ若齢での心筋梗塞を引き起こす。「加齢」とは、この用語が本明細書で用いられる場合、必ずしも年齢で計測される必要はなく、血管系を健康状態に保つ身体能力の衰退の見地から計測される。しかし、身体が血管の健康を保つ能力は、時間とともに（すなわち、年齢とともに）やはり衰退する傾向がある。
【００２９】
実験的な証拠から、進行した動脈硬化に罹患した患者の最大のコホートである高齢者では、血管系の側副路の発達が障害されていることが示唆されている。骨髄前駆細胞（BMPC）の機能およびHIF-1活性はいずれも加齢に伴って低下する。したがって、側副路の発達を障害する加齢関連因子はすべて、高齢患者から回収されて患者の虚血組織へと送達される骨髄由来ストロマ細胞（MSC）などの骨髄由来細胞にも影響を及ぼすと考えられる。その結果として、高齢患者は、障害のあるHIFに関する機序に一部起因する、側副路形成の障害を有し、かつ発達中の側副路を高濃度のHIF-1誘導型サイトカインに曝露させることにより側副路形成が増進されると考えられる。
【００３０】
別の局面において、本発明は、これらおよび他の「危険因子」の交絡的な影響を認識しており、かつ、このような障害のある骨髄細胞が側副血管の発達を助長する能力を増強するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞へ形質導入することにより、このような機能的に損なわれた骨髄細胞の血管新生能力を増強するようにデザインされた方法を、本出願を通じて記載している。別の遺伝子がいくつか存在し、重要なこととして、害された骨髄細胞の側副血管形成を増強する能力は、そのタンパク質産物によって増強される。例えば、別の態様において、本発明は、1つまたは多種の一酸化窒素シンターゼ（NOS）をコードする遺伝子による骨髄細胞の形質転換のための方法を提供する。「NOS遺伝子」とは、この用語を本明細書において用いる場合、誘導型NOS（iNOS）および内皮型NOS（eNOS）を含むNOSの公知である任意のアイソフォーム、さらには、いずれもより有力な血管新生作用をもたらす、発現の規模が改変されるように変異したNOS遺伝子、または改変されたタンパク質をコードするNOS遺伝子を意味する。
【００３１】
NOSをコードするポリヌクレオチドによる細胞の形質導入のための原理は、同定されているより有力な血管新生作用因子の一つであるVEGFが、NOSシグナル伝達経路を介して働くという事実に基づく。例えば、NOS遺伝子がノックアウトされたマウスでは、VEGFは血管新生を誘導できないことが示されている。さらに、NOSタンパク質の産物である一酸化窒素（NO）は、血管新生を誘導し、さらに多くが血管新生に関与する多数の異なる遺伝子の発現を誘導するという複合的な作用を有する。したがって、骨髄細胞にNOSをトランスフェクトすることにより、多数の血管新生サイトカインおよび増殖因子を分泌し、さらに多数の血管新生関連遺伝子の発現をも賦活化するという骨髄細胞の内在的能力を増進する。本発明はまた、NOSがトランスフェクトされたこのような骨髄細胞、特にABM細胞、または細胞を培養下で増殖させた際のこれらの細胞に由来する培地も提供する。
【００３２】
側副血管の発達を増強する骨髄細胞の能力を増進する能力を有するものとして本発明が記載する別の遺伝子ファミリーは、線維芽細胞増殖因子（FGF）ファミリーである。この遺伝子ファミリーは、14種を上回る密接に関連した遺伝子を含み、これにはFGF 1、FGF 2、FGF 4およびFGF 5が非制限的に含まれる。FGFファミリー遺伝子の1つによる骨髄細胞の形質導入を行う原理は、FGFが、血管新生の有力な刺激物質であることが公知である上、タンパク質産物の多くが同じく血管新生を誘導しうる多数の遺伝子の発現をも賦活化しうることにある。
【００３３】
したがって、さらに別の態様において、本発明は、例えば高コレステロール血症および加齢を含むがこれらに限定されない多様な危険因子のために血管新生を増強する能力が障害されている可能性のある骨髄細胞のような骨髄細胞において、側副血管の発達を増大させる能力を増強するために、FGFファミリーのペプチドの1つをコードするポリヌクレオチドがトランスフェクトされた骨髄細胞を用いるための方法を提供する。本発明はまた、このようなFGFトランスフェクト骨髄細胞、特にABM細胞、または細胞を培養下で増殖させた際のこれらの細胞に由来する培地も提供する。
【００３４】
単球/マクロファージによって発現される別の遺伝子であるPR39は、側副路形成を改善する骨髄細胞の血管新生能力を増強しうるものとして本発明が記載する別の遺伝子である。このタンパク質をコードする遺伝子による骨髄細胞の形質導入を行う原理は、PR39がHIF-1αのプロテアソーム分解を阻害し、その結果インビトロで血管構造の形成を促進し、かつマウスにおいて心筋血管系を増大させるという事実に由来する。HIF-1αの定常レベルを増大させることにより、HIF-1関連遺伝子の発現を誘導する転写因子であるヘテロ二量体HIF-1α/HIF-1βが形成される。これらの遺伝子のうち多くのタンパク質産物は、血管新生の発達を促進する。この戦略、すなわちHIF-1αの定常レベルを増大させることの原理は、以上に詳述されている。さらに別の態様において、本発明はまた、このようなPR39トランスフェクト骨髄細胞、特にABM細胞、または細胞を培養下で増殖させた際のこれらの細胞に由来する培地も提供する。
【００３５】
例えば、血管新生サイトカイン、増殖因子、または哺乳動物血管新生促進因子の導入遺伝子、例えばHIF-1もしくはEPAS1導入遺伝子、またはPR39、もしくはNOSもしくはFGFファミリーのメンバーをコードする導入遺伝子を保有するプラスミドベクターまたはアデノウイルスベクターを、本明細書に記載したようにトランスフェクトされた細胞を治療部位に注入した場合、または細胞を培養下で増殖させた際のこれらの細胞に由来する培地を治療部位に注入した場合の、細胞および/または対象における導入遺伝子の発現を目的として、対象から収集したABM細胞に対して、エクスビボでトランスフェクトすることができる。
【００３６】
しかし、新鮮な骨髄または溶液中にある骨髄細胞に対して、本明細書に記載の治療用サイトカイン、増殖因子、および血管新生促進因子をコードするベクターをトランスフェクトすることは困難な可能性がある。この困難さを克服することを目的として、骨髄由来の早期付着細胞を容器に付着させ、かつ早期付着細胞をトランスフェクション用に選択するのに十分な期間、骨髄細胞を容器内で増殖させた場合には、導入遺伝子を保有するベクターによりエクスビボ（例えば、培養下）で骨髄細胞がトランスフェクトされうる際の効率が大きく高まることが発見されている。「早期付着細胞」とは、この用語を本明細書で用いる場合には、骨髄を含む培地からの、または容器内に播かれた骨髄細胞からの細胞であって、適切な培養条件下で約8時間（例えば、一晩）から約24時間増殖させた後に洗い流されない細胞を意味する。早期付着細胞のほとんどは単球、内皮前駆細胞またはその他の造血系列細胞である。播種は細胞を数時間にわたり培養した後に行われ、かつ播種された細胞は約12時間後〜3日後に導入遺伝子の産物を生成しはじめる。早期付着細胞を、1つまたは複数の血管新生サイトカイン、増殖因子、および/または哺乳動物細胞における血管新生を促進する因子をコードするベクターとともに、当技術分野で公知である任意の方法により、例えば、播種後約2時間〜約3日間にわたるインビトロ接触により、播種することができる。用いるベクターは、当技術分野で公知である任意のものから選択することができ、かつこれには本明細書に記載したものが含まれるがそれらに限定されない。ベクター（例えば、ウイルスまたはプラスミド）は一般に、播種から約2時間後〜約3日後、患者への投与用に細胞が調製される前に洗い流される。
【００３７】
任意には、約300μ〜約200μよりも大きい粒子を除去するために、培養下におく前にABMを濾過することもできる。骨髄細胞はまた、早期付着細胞の生成を導く容器内での増殖のために、濾過されたABMから分離することもできる。適切な培養条件は当技術分野で周知であり、かつこれには本明細書の実施例の項に記載されたものが含まれるが、それらに限定されない。
【００３８】
本発明の方法に係る、骨髄早期付着細胞にトランスフェクトするのに適した導入遺伝子には、HIF-1、EPAS1（HIF-2としても公知）、MCP-1、CM-CSF、NOS、FGFなどの血管新生促進因子をコードするものが含まれるがそれらに限定されない。本明細書に記載したように調製した骨髄由来のトランスフェクトされた早期付着細胞の有効量を、患者における所望の部位に対して、患者のその部位での側副血管形成を増強するために直接投与する（すなわち、注入する）ことができる。血管新生促進因子がトランスフェクトされた細胞の投与のために特に有効な部位には、心臓および/または末梢性虚血組織における側副路依存的灌流を増強するための、心筋または下腿などにおける骨格筋が含まれる。細胞またはこのような細胞に由来する培地はまた、血液により所望の部位へと送達されるように、血管系に注入することもできる。
【００３９】
骨髄細胞のトランスフェクション効率の増強を図るための本発明の方法の非制限的な実例として、上記のように調製した骨髄早期付着細胞にトランスフェクトするために、アデノウイルスベクター中のX-gal導入遺伝子を利用した研究が実施されている。これらの研究では、トランスフェクション後適切な期間をおいた時点でのX-galによるトランスフェクト細胞の染色により、非付着性骨髄細胞または新鮮な骨髄と比較して骨髄早期付着細胞のトランスフェクションに対する感受性が実質的に増大することが示されている。
【００４０】
治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドには、コードされる産物を細胞膜を越えて「輸送」することができるシグナル配列が「機能的に付け加え」られていても、または「機能的に付随し」ていてもよい。多様なこの種のシグナル配列が公知であり、かつ当業者によって過度の実験を行わずに使用されうる。
【００４１】
このような目的が企図される遺伝子導入ベクター（「発現ベクター」とも称する）は、核酸を、その発現および/または複製のために宿主細胞中に輸送するために用いられる組換え核酸分子である。発現ベクターは環状または直鎖状のいずれでもよく、かつ内部にさまざまな核酸構築物を組み入れることが可能である。発現ベクターは典型的には、適切な宿主細胞中に導入された場合に挿入された核酸の発現を引き起こすプラスミドの形態をとる。
【００４２】
遺伝子治療に用いるのに適したウイルスベクターが、個別の宿主系、特に哺乳動物系における使用を目的として開発されており、これには例えば、レトロウイルスベクター、その他のレンチウイルスベクター、例えばヒト免疫不全ウイルス（HIV）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターなどに基づくものが含まれる（Miller and Rosman, BioTechniques 7：980-990, 1992；Anderson et al., Nature 392：25-30 Suppl., 1998；Verma and Somia, Nature 389：239-242, 1997；Wilson, New Engl. J. Med. 334：1185-1187 (1996)を参照のこと。これらはそれぞれ参照として本明細書に組み入れられる）。好ましい遺伝子導入ベクターは、進行性冠動脈閉塞症に罹患している対象における側副動脈の発達を生じさせるcDNAを保有する複製能欠損アデノウイルスである（Barr et al.,「PCGT Catheter Based Gene Transfer Into the Heart Using Replication-Deficient Recombinant Adenoviruses」, Journal of Cellular Biochemistry, Supplement 17D, p.195, Abstract P101（Mar. 1993）；Barr et al.,「Efficient catheter-mediated gene transfer into the heart using replication-defective adenovirus」, Gene Therapy, vol. 1：51-58 (1994)）。一般に、関心対象の遺伝子は、心筋細胞（および骨格筋細胞）を含む心臓（または骨格筋）に輸送され、コードされるタンパク質の恒常的な産生を導く。
【００４３】
複数のさまざまな遺伝子導入アプローチが実施可能であり、これにはヘルパー非依存的な複製能欠損ヒトアデノウイルス5系が含まれる。ヒトアデノウイルス5をベースとする組換えアデノウイルスベクター（Virology 163：614-6l7, 1988）は、アデノウイルスゲノムのうち必須な初期遺伝子を欠いており（通常はE1A/E1B）、このため、欠けている遺伝子産物をトランス性に与える許容性細胞系の中で増殖させなければ、複製することはできない。欠けているアデノウイルスゲノム配列の代わりに関心対象の導入遺伝子をクローニングし、複製能欠損アデノウイルスに感染させた組織/細胞中で発現させることができる。アデノウイルスを利用した遺伝子導入は宿主ゲノム中への導入遺伝子の組込みはもたらさず（アデノウイルスを介したトランスフェクションのうち導入遺伝子の宿主DNA中への組み入れが起こるのは0.1％）、このため安定ではないが、アデノウイルスベクターは高い力価で増殖させることができ、非複製性細胞にもトランスフェクトすることができる。
【００４４】
宿主生物、細胞または細胞系に導入される外因性核酸の量は、治療しようとする個体の必要性に応じて当業者による変更が可能である。例えば、遺伝子導入を実現するためにウイルスベクターを用いる場合には、トランスフェクトしようとする細胞に導入する核酸の量を、ウイルスベクターのプラーク形成単位（PFU）の量を変更することによって変更することができる。
【００４５】
本発明によるさらに別の態様においては、側副血管の形成を、それを必要とする対象において増強するための方法であって、患者からABMを入手すること；ABMを容器内で適切な培養条件下、骨髄による早期付着細胞（この早期付着細胞は容器に付着する）の生成を促進するのに十分な期間増殖させることによる方法が提供される。早期付着細胞に対して、血管新生サイトカイン、増殖因子および哺乳動物血管新生促進因子などより選択される1つまたは複数の作用因子をコードするポリヌクレオチドを含む、本明細書に記載のベクターを、培養下で上記の通りに（すなわち、インビトロで）トランスフェクトし、続いて、処理された（すなわち、トランスフェクトされた）早期付着細胞（および/またはトランスフェクション後にそれらを培養した培地）を、発現される作用因子をその部位に送達する目的で、患者における所望の部位に直接投与する。例えば、1つの態様においては、血管新生促進因子を、トランスフェクト細胞が注入された対象において一過性に発現させ、それによって治療用の血管新生促進因子またはそれらの組み合わせを虚血部位に送達し、患者における投与部位での側副血管形成の増強を導くことができる。
【００４６】
「骨髄由来ストロマ細胞」という語句は、本明細書で用いる場合、骨髄の試料から入手しうるCD34-/CD45-早期付着細胞のことを意味する。
【００４７】
本明細書で用いる場合、「転写調節領域」という用語は、mRNA転写の開始を制御する核酸または遺伝子構築物の一部分のことを指す。本明細書において使用を想定している調節領域は、非哺乳動物性トランス活性化因子がない場合、一般的には、少なくとも1つの最小プロモーターがリガンド/受容体ペプチド複合体に応答する調節エレメントと組み合わされたものを含む。最小プロモーターは、調節エレメントを組み合わせられると、リガンド/機能性二量体複合体に応答してmRNA転写を開始するように働く。しかし、転写は、必要な誘導物質（それに対するリガンド）が存在しなければ起こらない。しかしながら、本明細書で記載しているように、本発明のキメラタンパク質ヘテロ二量体のいくつかは、DNA結合ドメインに対するリガンドが存在しなくてもmRNAを活性化または抑制する。
【００４８】
本明細書で用いる場合、「機能的に付随している」という用語は、DNAと調節性およびエフェクター性のヌクレオチド配列、例えばプロモーター、エンハンサー、転写および翻訳開始部位ならびにその他のシグナル配列などとの機能的関係のことを指す。例えば、DNAとプロモーターとの機能的な結び付きとは、そのDNAを特異的に認識し、結合して転写するRNAポリメラーゼが、プロモーターからのこのようなDNAの転写を開始するような、DNAとプロモーターとの物理的および機能的な関係のことを指す。
【００４９】
好ましくは、転写調節領域はさらに、遍在性転写因子に対する結合部位を含む。このような結合部位は、プロモーターと調節性エレメントとの間に位置することが好ましい。本明細書における使用に適した偏在性転写因子は当技術分野で周知であり、これには例えばSp1が含まれる。
【００５０】
真核生物発現ベクターの例には、pSV-2 gptシステムなどの真核生物用構築物（Mulligan et al., (1979) Nature, 277：108-114）；PBLUESKRIPT（登録商標）ベクター（Stratagene, La Jolla, CA）、Genetics Instituteにより記載されている発現クローニングベクター（Science, (1985) 228：810-815）などが含まれる。これらのプラスミドベクターはそれぞれ、関心対象のタンパク質の発現を促進することができる。
【００５１】
1つの特定的な態様において、本明細書において使用が想定される遺伝子導入ベクターは、裸のプラスミド、ウイルスベクター（アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルスをベースとするベクターなど）、遺伝子治療用の合成ベクターなどである（例えば、Suhr et al., Arch. of Neurol. 50：1252-1268, 1993を参照）。例えば、本明細書に用いられる遺伝子導入ベクターは、レトロウイルスベクターであってよい。本明細書において使用が想定されるレトロウイルスベクターは、外因性核酸を2つのレトロウイルスLTR間に存在するように含む発現構築物を有する遺伝子導入プラスミドである。レトロウイルスベクターは通常、レトロウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターをテンプレートとして用いて転写されるRNAが、適切なパッケージング細胞系中にウイルスビリオンとしてパッケージングされることを可能にする適切なパッケージングシグナルを含む（例えば、米国特許第4,650,764号を参照されたい）。
【００５２】
本明細書における使用のために適したレトロウイルスベクターは、例えば、米国特許第5,399,346号および第5,252,479号；ならびにWIPO公報WO 92/07573号、WO 90/06997号、WO 89/05345号、WO 92/05266号およびWO 92/14829号に記載されており、これらのそれぞれはその全体が参照として本明細書に組み入れられる。これらの文書は、このようなレトロウイルスベクターを用いて核酸をヒト細胞に効率的に導入するための方法の記載を行っている。他のレトロウイルスベクターには、例えば、マウス乳腺腫瘍ウイルスベクター（例えば、Shackleford et al., (1988) FNAS, USA, 85：9655-9659）、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Naldini et al. (1996) Science 272：165-320）などが含まれる。
【００５３】
複製性ウイルスを本質的には含まないレトロウイルスベクター粒子を生成するヘルパー細胞を得るためのさまざまな手順も当技術分野では知られている。例えば、複製性ウイルスを含むウイルスベクターが生成される可能性を最小限に抑えながらウイルスベクターおよびヘルパー細胞を作製するための手順を開示している、米国特許第4,650,764号；Miller, Human Gene Therapy：1：5-14, 1990；Markowitz, et al., Journal of Virology, 61(4)：1120-1124, 1988；Watanabe, et al., Molecular and Cellular Biology, 3(12)：2241-2249, 1983；Danos, et al., PNAS, 85：6460-6464, 1988；およびBosselman, et al., Molecular and Cellular Biology, 7(5)：1797-1806, 1987を参照されたい。
【００５４】
血管新生増殖因子などの治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドのプレパッケージングのために適した組換えレトロウイルスは、レトロウイルスビリオンを作製するための周知の方法を用いて作製される。例えば、米国特許第4,650,764号；Miller、前記 1990；Markowitz, et al., 前記 1988；Watanabe, et al., 前記 1983；Danos, et al., PNAS, 85：6460-6464, 1988；およびBosselman, et al., Molecular and Cellular Biology, 7(5)：1797-1806, 1987を参照されたい。
【００５５】
以下の実施例では、本発明のいくつかの面に関するいくつかの検討について述べている。これらの実施例は非制限的である。
【００５６】
実施例
実施例1
内皮細胞の増殖に対する骨髄培養培地の効果
入手した吸引ブタ自己骨髄細胞が、有力な血管新生因子であるVEGFおよび重要な血管新生補助因子として最近同定されたMCP-1を分泌するか否かを明らかにするための試験を行った。骨髄をインビトロで4週間培養した。培養ブタ大動脈内皮細胞（PAEC）に馴化培地を添加し、4日後に増殖を評価した。馴化培地中のVEGFおよびMCP-1のレベルをELISAを用いてアッセイした。4週間の培養期間中、BM細胞はVEGFおよびMCP-1を分泌し、このためこれらの濃度は時間依存的な様式で上昇した。結果として得られた馴化培地は、用量依存的な様式で、PAECの増殖を増強した。これらの結果は、BM細胞がVEGFおよびMCP-1といった有力な血管新生サイトカインを分泌しうること、ならびに血管内皮細胞の増殖を誘導しうることを示している。
【００５７】
ブタ骨髄の培養
骨髄（BM）細胞を、慢性心筋虚血のブタから、保存料を含まないヘパリン（20単位/ml BM細胞）中に無菌条件下で収集し、300μおよび200μのステンレス鋼製メッシュフィルターを用いて逐次的に濾過した。続いてBM細胞をFicoll-Hypaque勾配遠心処理によって単離し、T-25培養フラスコ内で長期培養液（LTCM）（Stem Cell Tech, Vancouver, British Columbia, Canada）中にて5％ CO2下、330℃で培養した。各培養物におけるBMCの播種密度は7×106個/mlとした。毎週、培地の半分を取り出して新たなLTCMと入れ換えた。取り出した培地を濾過し（0.2μフィルター）、その後の固相酵素免疫アッセイ（ELISA）および細胞増殖アッセイのために-200℃で保存した。
【００５８】
ブタ大動脈内皮細胞の単離および培養
新鮮なブタ大動脈内皮細胞（PAEC）を従来の方法を用いて単離した。37℃、5％二酸化炭素下にある、2％ FBS、ヒドロコルチゾン、ヒトFGF、VEGF、ヒトEGF、IGF、ヘパリンおよび抗生物質を含む内皮細胞増殖培地（EGM-2培地、Clonetics, San Diego, CA）。細胞が約7日の時点で集密化したところで、それらを2.5％トリプシンによって分割し、その後は10％ FBSを含む培地199中で培養した。それらの実体は、典型的な内皮細胞形態および第VIII因子に対する免疫組織化学染色によって確認した。3〜10回継代したものを増殖試験のために用いた。
【００５９】
大動脈内皮細胞に対する馴化培地の効果
細胞増殖アッセイ：PAEC（3〜10回継代）をトリプシン処理によって培養フラスコから取り出した。剥離した細胞を96ウェル培養プレートに移し、5,000細胞/ウェルの播種密度でプレーティングした。細胞を2〜3日培養し、その後に増殖およびDNA合成の実験に用いた。BM細胞培養物による馴化培地を4週時点で収集し、7個の培養フラスコからの培地をプールしてバイオアッセイに用いた。プールした馴化培地のアリコート（10μL、30μL、100μLまたは200μL）またはLTCM（200μL、対照として）を96ウェルプレート中の集密化PAECに添加した（3つずつ用意）。馴化培地または対照培地との4日間の培養後に、PAECをトリプシン処理し、細胞計数器（Coulter Counter Beckman Corporation, Miami FL）。
【００６０】
PAECのDNA合成に対する馴化培地の効果
プール試料からの馴化培地のアリコート（10μL、30μL、100μLまたは200μL）または対照培地（LTCM、200μL）を、96ウェルプレート中のPAEC（上と同じ播種密度）に対して添加した（3つずつ用意）。2日後に、1μCiのトリチウム標識チミジンを各ウェルに添加した。48時間後に、PAEC中のDNAを細胞収集装置（Mach III M Tomtec, Hamden, CT）を用いて収集し、放射能を液体シンチレーションカウンター（Multi-detector Liquid Scintillation Luminescence Counter EG&G Wallac, Turku, Finland）により計数した。
【００６１】
ELISA VEGFによる馴化培地中のVEGFおよびMCP-1の測定
馴化培地中のVEGF濃度はサンドイッチ式ELISAキット（Chemicon International Inc., Temecula, CA）を用いて測定した。手短に述べると、抗ヒトVEGF抗体でプレコーティングしたプレートを用いて、馴化培地中のVEGFまたは既知濃度の組換えVEGFと結合させた。この複合体を、捕捉されたVEGFと結合するビオチン化抗VEGF抗体により検出した。続いてビオチン化VEGF抗体をストレプトアビジン-アルカリホスファターゼおよび発色性溶液により検出した。この抗ヒトVEGF抗体はブタVEGFと交差反応する。
【００６２】
ELISAによる馴化培地中のMCP-1の測定
馴化培地中のMCP-1濃度はサンドイッチ式酵素イムノアッセイキット（R&D Systems, Minneapolis, MN）を用いてアッセイした：抗ヒトMCP-1抗体でプレコーティングしたプレートを用いて、馴化培地中のMCP-1または既知濃度の組換えタンパク質と結合させた。この複合体を、捕捉されたMCP-1と結合するビオチン化抗MCP-1抗体により検出した。続いてビオチン化MCP-1抗体をストレプトアビジン-アルカリホスファターゼおよび発色性溶液により検出した。この抗ヒトMCP-1抗体はブタMCP-1と交差反応する。
【００６３】
結果
4週時点で収集したBM馴化培地は、用量依存的な様式で、PAECの増殖を亢進させた（図1）。これは、細胞数を直接算定することによって、およびトリチウム標識チミジンの取り込みを測定することによって示された（どちらの測定に関してもp＜0.001）。この用量依存的応答は下行脚を示した；すなわち、増殖は200μL馴化培地の場合には30μLおよび100μLに比して低下した（どちらの比較ともP＝0.003）。同様の用量依存的な結果がトリチウム標識チミジン取り込み試験でも観察された（200μLとの比較で、30μLおよび100μLでそれぞれP＝0.03）。
【００６４】
新たに吸引したBM細胞のうち、第VIII因子に対して陽染されたものは限られた数（5±4％）であった。これらの結果は図2に示されている。これは4週間培養したBM細胞の付着層での57±14％とは対照的であった（そのうち60±23％が内皮様細胞であり、40±28％は巨核球の外観を呈した）。
【００６５】
4週間の期間にわたり、BM馴化培地中のVEGFおよびMCP-1の濃度は徐々に上昇し、第1週のレベルに対してそれぞれ10倍および3倍となった（どちらの比較ともP＜0.001）（図3）。これに対して、BMに対して曝露されていない対照培養液におけるVEGFおよびMCP-1のレベルは、図4に示されているように、それぞれ0および11±2 pg/mlであった。
【００６６】
実施例2
培養ブタ骨髄細胞によるVEGF分泌に対する低酸素の効果
低酸素状態は培養骨髄内皮細胞によるVEGFの発現を著しく低下させることが示されており、これらの結果は、低酸素に対するエクスビボ曝露が、低酸素誘導性血管新生因子の発現を増加させることにより、虚血筋組織に注入される骨髄細胞およびその馴化培地の側副路増強効果をさらに強めうることを示している。ブタ骨髄を採取し、300μおよび200μのステンレス鋼製メッシュフィルターを用いて逐次的に濾過した。続いてBMCをFicoll-Hypaque勾配遠心処理によって分離し、T-75培養フラスコ内で33℃、5％CO2下で培養した。細胞が約7日の時点で集密化したところで、それらをトリプシン処理によって1：3に分割した。4週間の培養後に、BMCを低酸素条件（1％酸素を含むチャンバーに入れる）に24〜120時間曝露させるか、または正常条件下に保った。この結果得られた馴化培地を収集し、VEGF、MCP-1をELISAにより分析した。
【００６７】
低酸素に対する曝露は、VEGF分泌を著しく増加させた：24時間の時点で、VEGF濃度は正常酸素下での106±13pg/mlから、低酸素条件下では1,600±196pg/mlに上昇した（p＝0.0002）；120時間後の時点では、これは4,163±62から6,028±167pg/mlに上昇した（p＜0.001）。新たに単離したBMCに対して別個に試験を行ったところ、同じ傾向がみられた。また、低酸素状態はBMCの増殖速度も低下させた。MCP-1発現は低酸素状態によって増加しなかったが、これはそのプロモーターがHIF結合部位を持たないことが知られているため、予想外の所見ではなかった。
【００６８】
実施例3
内皮細胞の管形成に対する骨髄培養液の効果
ブタ内皮細胞および血管平滑筋細胞の共培養の手法を用いて、骨髄細胞の馴化培地がインビトロで構造上の血管の形成を誘導することが示された。血管形成に対するこのような効果は、骨髄馴化培地に対する曝露がなければ観察されなかった。これらの結果は、骨髄細胞およびその分泌因子が血管新生誘発（pro-angiogenic）効果を発揮することを示唆する。
【００６９】
実施例4
慢性心筋虚血モデルにおける側副灌流および局所機能に対する自己骨髄の経心内膜的送達の効果
左回旋冠動脈の周囲にアメロイド閉塞具（ameroid constrictor）を埋込むことにより、ブタ14匹において慢性心筋虚血を作成した。埋込みの4週後に、ブタ7匹に対して、経心内膜的注入カテーテルを用いて、新たに吸引したABMを虚血域へ経心内膜的に注入し（動物1匹当たり2.4ml、12箇所に注入）、7匹の対照動物に対してはヘパリン添加食塩水を注入した。ベースラインおよび4週後の時点で、被験動物に対して、局所収縮性（心筋肥厚の割合（％））を評価するための安静時およびペーシング時の心エコー検査、ならびに安静時およびアデノシン持続注入時の側副路依存的灌流を評価するためのミクロスフェア試験を行った。ABMの注入から4週後の側副血流（虚血域/正常域×100の比で表される）は、ABM投与ブタでは改善したが、対照では改善しなかった（ABM：安静時には95±13に対して81±11、P＝0.017；アデノシン注入時には85±19に対して72±10、P＝0.046；対照：安静時には86±14に対して86±14、P＝NS；アデノシン注入時には73±17に対して72±14、P＝0.63）。同様に、収縮性もABM投与ブタでは増大したが、対照では増大しなかった（ABM：安静時には83±21に対して60±32、P＝0.04；ペーシング時には91±44に対して35±43、P＝0.056；対照：安静時には69±48に対して64±46、P＝0.74；ペーシング時には65±56に対して37±56、P＝0.23）。
【００７０】
これらの結果は、カテーテルを利用したABMの経心内膜的注入が虚血心筋における側副灌流および心筋機能を増強しうることを示しており、これらの所見は、このアプローチが最適な治療的血管新生を実現するための新規な治療戦略となりうることを示唆している。
【００７１】
特定の病原体を持たない体重約70kgの家畜ブタ14匹に麻酔を施し、挿管した上で、処置期間を通じて2L/分のO2補給および1〜2％イソフルレン吸入を行った。動脈へのアクセスは右大腿動脈を単離し、8フレンチ・シースを挿入することで確保した。左回旋動脈を左側開胸術によって単離し、金属で包み込んだアメロイド閉塞具をこの動脈のごく近位部に埋込んだ。アメロイド閉塞具の埋込みから4週後に、すべてのブタに対して（1）アメロイド閉塞の確認および側副血流の評価のための選択的な左および右冠動脈の血管撮影法；（2）経胸的心エコー検査、ならびに（3）局所心筋血流の評価を行った。
【００７２】
骨髄の吸引および調製ならびに心筋内注入
ベースラインの評価を完了した直後に、全動物に対して、左大腿骨幹から標準的な手法を用いてBM吸引を行った。BMは2つの部位から（1部位当たり3ml）、保存料を含まないヘパリン化ガラス製シリンジ（ヘパリン20単位/新鮮BM 1ml）を用いて吸引した。吸引した骨髄を直ちに、300μおよび200μのステンレス鋼フィルターを逐次的に用いてマクロフィルター処理した。続いて、虚血心筋領域およびその境界領域に向けて、経心内膜的注入カテーテルを用いて、心筋内の12箇所に骨髄を注入した（1つの注入部位当たり0.2ml、合計2.4ml）。
【００７３】
心エコー検査
被験動物における乳頭筋中位レベルでの短軸断面および長軸断面の経胸的心エコー画像をベースラインおよびペーシング時、ならびにベースラインおよびABM埋込みから4週後の追跡評価時に記録した。短縮率の測定値は、壁肥厚の割合（％）（収縮終期の厚み−拡張終期の厚み/拡張終期の厚み）×100を測定することによって得た。これらの測定を虚血領域（外側域）および遠隔領域（前方中隔域）で行った。その後に、一時的ペースメーカー電極を右大腿静脈シースから挿入し、右心房内に留置した。被験動物に対して180/分のペーシングを2分間行い、同時に心エコー画像を記録した。
【００７４】
局所心筋血流
局所心筋血流の測定は、安静時および冠動脈の血管最大拡張時に多数の蛍光色ミクロスフェア（Interactive Medical Technologies, West Los Angeles, CA）を用いることによって行い、基準試料法（Heymann MA, et al., Prog Cardiovasc Dis 1977；20：55-79）によって定量した。蛍光ミクロスフェア（0.8ml、ミクロスフェア5×106個/ml、直径15μmが0.01％ Tween 80を含む食塩水懸濁液中にある）を、6Fジャドキンス・レフト3.5診断用カテーテルを介して左心房内に注入した。冠動脈の最大拡張は、アデノシンを140μg/kg/分（Fujisawa USA, Deerfield, IL）という定速で左大腿静脈内に6分間にわたって持続注入することによって誘導した。持続注入の最後の2分間に、ミクロスフェア注入および血液基準試料の採取を、安静時試験と同じ様式で行った。
【００７５】
灌流評価の完了後に、過大用量のペントバルビタールナトリウムおよびKCLを用いて被験動物を屠殺した。心臓を採取してリンゲル乳酸液を流して洗浄し、10〜15分間の灌流固定を行った後に、10％緩衝ホルムアルデヒドによる浸漬固定を3日間行った。固定を終えた後に、心臓を短軸に沿って切断し、7mm厚スライスとした。中心側の2枚のスライスをそれぞれ分割して、さらに小さな8つの楔状片とし、それをさらに切断して心内膜側および心外膜側のサブセグメントとした。8つの外側虚血域および8つの正常中隔域のサブセグメントでの測定値を、心内膜側および心外膜側の局所心筋血流の評価に用いた。側副血流の相対値も虚血域/非虚血域（IZ/NIZ）血流の比として計算した。
【００７６】
組織病理学
注入カテーテルを用いたBM吸引物の注入が機械的な細胞損傷を伴うか否かを評価するために、新たに濾過したABM吸引物をインビボ試験の場合と同程度の注入圧を用いて針を通して注入する前および後に、標準的なBM塗沫標本を調製した。形態学的評価は、試験プロトコールを知らされていない無関係な熟練技術者によって行われた。
【００７７】
組織病理学的評価を、試料として採取した心臓組織に対して行った。パイロット試験では、蛍光標識された領域を同定するために、7mm圧の短軸スライスをUV光の下で検査した。同定された各領域を切断して、隣接した3つの全層ブロック（中央、右および左）とし、これらを10％緩衝ホルムアルデヒド中で浸漬固定した。引き続いて、これらの各ブロックを3つのレベルに切断し、そのうち2つをヘマトキシリンおよびエオジン（H&E）で、1つをPASで染色した。加えて、1つの新たな蛍光標識組織ブロックを各被験動物の虚血領域から入手してOCTコンパウンド（Sakura Finetek USA Inc., Torrance, CA）中に包埋した上で、液体窒素中で凍結させた。これらの急速凍結心筋組織の凍結切片を風乾させ、アセトンで固定した。免疫ペルオキシダーゼ染色を、自動Dako immunno Stainer（Dako, Carpenteria, CA）を用いて行った。内在性ペルオキシダーゼおよび非特異的取り込みは、0.3％水素ペルオキシダーゼおよび10％オボアルブミンでブロックした。CD-34に対するモノクローナルマウス抗体（Becton Dickinson, San Jose, CA）を一次抗体として用いた。リンク用抗体はビオチン化ヤギ抗マウスIgG抗体とし、三次抗体は西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させたストレプトアビジンとした。ジアミノベンジジン（DAB）を色素原として用い、切片を1％メチルグリーンで対比染色した。脱水および洗浄の後に、スライドをマウントし、Nikon Labphot顕微鏡を用いて検査した。
【００７８】
有効性試験では、虚血領域および非虚血領域からの1.5平方センチメートルの全層切片をパラフィン切片として調製した。試料のそれぞれをH&E、マッソン三色染料および第VIII因子関連抗原により染色した。免疫ペルオキシダーゼ染色を行ったスライドを、内皮細胞集団の密度および血管形成に関して調べた。後者は内腔の存在によって前者と識別した。血管形成は、虚血心筋および非虚血心筋の内側2分の1から作成した第VIII因子染色スライドの5つの顕微鏡写真試料を用いて評価した。内皮細胞の密度は同じ顕微鏡写真のデジタル画像を用いて評価した。内皮集団の密度はSigma-Scan Pro形態計測ソフトウエアにより、強度閾値法を用いて決定した。各試料および各標本に関する内皮総面積を、相対的内皮面積の百分率（内皮面積/被験心筋面積）とともに求めた。内皮総面積は、被験心筋の非梗塞（生存）領域の相対百分率としても算出した。三色染料で染色した切片はデジタル化し、青色の染色性コラーゲンによって占められる面積、ならびに心外膜（これは通常、コラーゲンを含む）によって占有される面積を除外した総切片面積を、Sigma-Scan Proを用いて測定した。続いて梗塞面積を青色の染色によって占められる面積として算出した。
【００７９】
手順データ
ABMまたはプラセボの心筋内注入はいずれも、平均血圧、心拍数および不整脈誘導に関する急性変化を伴わなかった。血行動態パラメーターはすべて二群間で同等であった。ペアワイズ比較からは、対照群で初期平均動脈血圧が追跡時の方が高かったこと（P＝0.03）を除き、指標に関する各群内部での追跡手順との比較で同等の血行動態パラメーターが示され、ペーシング時およびアデノシン持続注入時には差がみられなかった。
【００８０】
心筋機能
局所心筋機能評価に関して以下の表Iに示している。虚血域に対する非虚血域（IZ/NIZ）の比×100として表した、安静時およびペーシング時の、介入前の壁肥厚相対値は、群間で同程度であった（それぞれP＝0.86および0.96）。ABMの心筋内注入から4週後の時点では、局所壁肥厚の改善が安静時およびペーシング時にみられ、これは側副路依存的な虚血側壁の壁肥厚が〜50％増大したことに起因した。対照動物では有意差は認められなかったが、追跡時点でのペーシング時には虚血領域において壁肥厚が改善する傾向は認められた。
【００８１】
（表Ｉ）虚血壁の局所収縮性
2007527395.tif 000002
ABMは自己骨髄を表す。
【００８２】
心筋灌流データ
局所心筋灌流評価に関して以下の表IIに示している。安静時およびアデノシン持続注入時の、介入前の貫壁性心筋灌流、IZ/NIZに関して、投与群と対照群との間に差はみられなかった（それぞれP＝0.42および0.96）。ABM注入から4週後には、安静時およびペーシング時の相対的な局所貫壁性心筋灌流が有意に改善した。これは、安静時（57％の改善、P＝0.08）およびアデノシン持続注入時（37％、P＝0.09）ともに虚血域における心筋灌流の絶対値が改善したことに起因したが、安静時（35％の増加、P＝0.18）およびアデノシン持続注入時（25％の増加、P＝0.26）のいずれにおいても非虚血域への血流の絶対値に関して有意な変化は認められなかった。虚血域でみられた局所心筋血流の増加は、安静時には心内膜側（73％）および心外膜側（62％）の局所的改善の両者からなり、アデノシン持続注入時には改善の程度が幾分低下した（いずれの区域とも40％）。4週時点で、対照群においては、虚血域および非虚血域における貫壁性、心内膜側または心外膜側の灌流に関して、介入前の値と比較して差がみられなかった。
【００８３】
（表ＩＩ）局所心筋灌流
2007527395.tif 000003
ABMは自己骨髄を表す。
【００８４】
組織病理学および血管形成評価
濾過した吸引物を注入カテーテルに通す前および後のBM塗抹標本の評価により、正常な構造が認められ、大凝集アルブミンは存在せず、細胞断片や細胞形態の変形はみられないことが判明した。注入第1日時点での組織病理学的評価では、フィブリン、および散在性の細胞浸潤を伴う炎症域を特徴とする急性病変が示された。この浸潤物は、BM浸潤物と形態的に識別できない単核細胞を特徴とした。細胞密度は3日および7日の時点が最大で、その後は時間経過とともに低下した。3週時点では、0.5ml注入部位において0.2mlのものと比較してより高度の線維化が認められた。BM由来前駆細胞を同定することを意図したCD-34免疫染色を、最大の細胞浸潤物が認められた切片で行った。全体的には、細胞浸潤物の4〜6％がCD-34に対する陽性免疫反応性を示した。
【００８５】
検査した虚血心筋の全体のうち10％未満を占める小さな壊死壊死領域が、両群ともに虚血境界部の特徴としてみられた。非虚血性領域では正常な心筋構造が示された。この二群における組織形態計測的な特徴の変化を比較した。血管によって占められる総面積、直径50μmを上回る血管数のいずれにも差はみられなかった。しかし、第VIII因子に対して陽染される総面積（内皮細胞、内腔の有無は問わない）を虚血区域と非虚血区域との間で比較したところ、二群間に差が示された。ABM群では、虚血性側副路依存的区域における内皮細胞総面積が、非虚血性区域で観察されたものよりも100％大きく（面積11.6±5.0％に対して5.7±2.3％、P＝0.016）、一方、対照群では有意差はみられなかった（面積12.3±5.5％に対して8.2±3.1％、P＝0.11）。しかし、血管により占められる面積％および50μを上回る血管の数を含む、血管形成のその他のパラメーターは、両群ともに虚血区域と非虚血区域との間で同程度であった。
【００８６】
実施例5
心筋虚血の動物モデルにおける、GM-CSFの前投与によりインビボ刺激した自己骨髄の効果
左回旋冠動脈の周りにアメロイド閉塞具を埋込むことにより、ブタ16匹において慢性心筋虚血を作成した。アメロイド埋込みから4週が経過する3日前に、8匹の被験動物に対して、GM-CSFの皮下注射を連続3日間（用量1日10μg）行った後に（4日目かつアメロイド埋込みからちょうど4週後に）、新たに吸引したABMの虚血域への経心内膜的注入を経心内膜的注入カテーテルを用いて行い（1匹当たり2.4ml、12箇所）、GM-CSF刺激を受けていない8匹の対照動物にはヘパリン添加食塩水を注入した。ベースラインおよび4週後の時点で、被験動物に対して、局所伸張性（心筋肥厚の％）を評価するための安静時およびペーシング時の心エコー検査、ならびに安静時およびアデノシン持続注入時の側副路依存的灌流を評価するためのミクロスフェア試験を行った。ABMの注入から4週後の側副血流（虚血域/正常域×100という比として表される）は、ABM投与ブタでは改善したが、対照では改善しなかった（ABM：安静時には85±11に対して72±16、P＝0.026；アデノシン注入時には83±18に対して64±19 、P＝0.06；対照：安静時には93±10に対して89±9、P＝0.31；アデノシン注入時には73±17に対して75±8、P＝0.74）。同様に、収縮性もABM投与ブタでは増大したが、対照では増大しなかった（ABM：安静時には93±33に対して63±27、P＝0.009；ペーシング時には84±36に対して51±20、P＝0.014、対照：安静時には72±45に対して66±43、P＝0.65；ペーシング時には70±36に対して43±55、P＝0.18）。
【００８７】
これらの結果は、GM-CSFを3日間全身投与することによって前刺激したABMのカテーテル経心内膜的注入が、虚血心筋における側副灌流および心筋機能を増強しうることを示しており、これらの所見は、このアプローチが最適な治療的血管新生を実現するための新規な治療戦略となりうることを示唆している。
【００８８】
実施例6
ヒト患者の治療
心臓の処置を開始する約60分前に、保存料を含まないヘパリン化ガラス製シリンジ（ヘパリン20単位/新鮮BM 1ml）を用いて、骨髄（〜5ml）を腸骨稜から吸引する。吸引した骨髄を直ちに、300μおよび200μのステンレス鋼フィルターを逐次的に用いてマクロフィルター処理する。処置は熟練した血液学者が無菌条件下で行うことが考えられる。骨髄調製物の組織形態が正常なことを確かめるために骨髄塗抹標本を評価する。
【００８９】
作用因子を心筋に送達するためのいくつかの手順のうち任意のものを用いうる。これらには、外科的アプローチ（例えば、経胸的切開、または針もしくは他の任意の送達デバイスの経胸的挿入、または胸腔鏡など、ただしこれらには限定されない）により、またはいくつかの経皮的手順の任意のものによって実施しうると考えられる、直接的な経心外膜的送達が含まれる。以下は経皮的送達の一例である。以下の例は、送達の選択肢を、その例に記載された特定的なカテーテル利用プラットフォームシステムに限定することを意味するものではないこと、すなわち任意のカテーテル利用プラットフォームシステムを用いうることが強調されるべきである。
【００９０】
経皮的冠動脈形成術のための標準的な手順を用いて、少なくともSFの誘導シースを、右または左の大腿動脈に挿入する。動脈シースの挿入後にヘパリンを投与し、手順のうちLVマッピングおよびABM移植の部分を通じて、ACTを200〜250秒間保つために必要に応じて補充する。ACTは処置の間は30分を超えない間隔で確かめ、さらに処置の終了時にも必要条件に適合することを確認する。
【００９１】
NOGA-STAR（商標）および注入カテーテルのガイド支援のために左心室撮影法を標準的なRAOおよび/またはLAO撮像として行い、NOGA-STAR（商標）カテーテルを用いてLV電気機械的マップを入手する。8FのINJECTION-STARカテーテルを大腿シースから逆向させて大動脈弁に対して留置する。先端を十分に弯曲させた後に、丸みのついた遠位先端を大動脈弁を通して静かに突出させ、LV腔内に達したところで適切なように真っ直ぐに伸ばす。
【００９２】
カテーテル（電磁チップセンサーを内蔵する）を治療区域の一つに向ける（例えば、前方、側方、下後方またはその他）。NOGA（商標）システムの安全面での特徴により、針の挿入および注入は安定性シグナルが3未満のLS値を示した場合にのみ可能となる。新たに吸引したABM 0.2ccの単回注入により、経心内膜アプローチを介して、各注入部位の間隔が5mm未満ではない最大で2つの治療区域の範囲に送達がなされると考えられる。注入部位の密度は、個々の対象のLV心筋内解剖構造、およびカテーテルのずれや心室期外収縮（PVC）を伴わずに心内膜表面に安定した留置が得られることに依存すると考えられる。
【００９３】
虚血心筋内に移植されて、有害作用を伴わずに側副血流の改善をもたらす新たな吸引ABMは、いくつかの理由から臨床的意義があると考えられる。以上に考察した方法は、有効かつおそらく安全と思われる様式で局所的な血管新生応答を誘導するという骨髄に天然に備わった能力を利用している。このような血管新生戦略はおそらく、現在検討されている他の多くのものよりもコストがかからないと思われる。これはまた、ウイルスベクターを用いる種々の遺伝子利用アプローチに可能性は低いとはいえ確実に付随する、毒性にかかわる問題も防止すると考えられる。
【００９４】
本発明は、ABMが、虚血性の心臓または末梢肢といった別の組織に移行した際に新たな血管の成長および修復機能を促進するために必要な、細胞性（その一例は内皮前駆細胞であると考えられるが、骨髄中の多くの他の細胞も血管新生作用に重要な寄与を果たす可能性があるため、本発明はこの種の細胞には限定されない）および分泌性（血管新生増殖因子など）の成分の最適な源である可能性があるという概念に基づく。患者の自らの骨髄を、動脈閉塞に起因する血流灌流障害を有する、例えば心筋および/または虚血肢などの虚血組織における治療的な血管新生および/または筋形成を誘導するための鍵となる治療的な供給源として用いることができる。血管の成長を促進するために、患者の自らの骨髄を吸引し（すなわち、ABM供与）、本明細書に記載したように処理して、虚血組織および/または隣接した非虚血組織、例えば心筋および/または虚血肢に対して直接注入する。
【００９５】
ABMおよび/または骨髄の産物を、カテーテルを利用した経心内膜的な注入アプローチまたは外科的な（開胸術または胸腔鏡による）経心外膜的胸腔切開アプローチにより、心筋、例えば心筋に注入する。これら2つの送達戦略は、標的器官の組織、例えば心筋および/または虚血肢における血管新生骨髄成分の取り込みおよび組み込みを促進することにより、同じ治療目標を達成するために用いうる。
【００９６】
本発明によれば、ABM、骨髄細胞、または血管新生促進因子がトランスフェクトされた骨髄細胞の有効量が治療のために投与される。熟練した従事者には理解されるであろうが、投与される量は、意図する治療、治療しようとする状態の重症度、治療しようとする領域のサイズおよび程度などを含む、多くの要因に依存すると考えられる。本発明による治療に関連した、代表的なプロトコールは、約12回〜約25回の注入のそれぞれにおいて、約0.2〜約0.5mlの量のABMを、合計約2.4〜約6mlのABMとして投与することであると考えられる。投与する各用量は、容積比にして約1〜約2％のヘパリン、またはクマジンなどの別の抗凝血薬を含むことが好ましいと考えられる。ABMを培養もしくは刺激する場合、および/または他の医薬品などと併用投与する場合には、存在するABMの量は、各投与においてほぼ同一であること、および/または投与されるABMの合計が上記のものとほぼ同一であるべきである。各治療において投与されるABMの総細胞数は約107〜5×108個のオーダーであると考えられている。
【００９７】
本発明の別の態様において、血管新生遺伝子の発現の最適化は、種々の血管新生刺激物質とABMとの同時投与によって強化されうる。したがって、本発明によれば、ABM移植物は、「単独の」治療薬として、または血管新生増殖因子の骨髄産生を増強させる、ならびに/もしくは内皮細胞の増殖、遊走および血管形成を促進させる可能性のある任意の薬理作用薬、タンパク質もしくは遺伝子または任意の他の化合物もしくは介入と組み合わせて、注入される。「組み合わせられた」血管新生作用因子は、患者もしくは標的組織に直接投与することもでき、または骨髄もしくは骨髄細胞を患者に注入する前にエクスビボで骨髄とともにインキュベートすることもできる。これらの「組み合わせられた」血管新生作用因子の例には（これらの作用因子には限定されないが）、顆粒球-単球コロニー刺激因子（GM-CSF）、単球走化性タンパク質1（MCP1）、EPAS1または低酸素誘導性因子1（HIF-1）がある。骨髄の刺激は、骨髄をタンパク質の形態にある因子に対して直接曝露させることによってもよく、または関連遺伝子を保有するベクターを骨髄細胞にトランスフェクトすることもできる。例えば、骨髄に対して、HIF-1またはEPAS1導入遺伝子を保有するプラスミドベクターまたはアデノウイルスベクターをトランスフェクトすることができる。血管新生因子の骨産生を増強する可能性のある介入の一例は、骨髄細胞の低酸素状態に対するエクスビボ曝露である。この介入は、骨髄を用いて単独で行うこともでき、または以上に概説した因子の任意のものと組み合わせて用いることもできる。これらの最適化戦略は、血管内皮増殖因子（VEGF）発現および/または血管新生活性を有する他のサイトカインの産生を、心臓または任意の末梢虚血組織への骨髄の直接注入の前に増加させるようにデザインされる。広義において、本発明は、ABMと、骨髄の刺激および/または骨髄もしくはそのストロマ微小環境による任意の血管新生増殖因子の産生のエクスビボもしくはインビボ刺激を引き起こす、任意の作用因子との心筋内注入を含む。
【００９８】
上記の治療手段の患者への送達は、臨床状況に応じて異なると考えられる。例えば、治療抵抗性の冠動脈疾患または虚血性末梢血管障害を有する患者は、骨髄吸引手順に引き続いて、治療的な血管新生および/または筋形成を目的として、虚血組織またはその境界区域および/もしくは正常組織に向けて、罹患組織への側副路または細胞の供給のための源としての役割を果たす可能性のあるABMの心筋または脚への移植を行う候補であると考えられる。例えば、治療抵抗性の冠動脈疾患または虚血性末梢血管障害を有する患者は、骨髄吸引手順に引き続いて、治療的な血管新生および/または筋形成を目的として、虚血組織またはその境界区域および/もしくは正常組織に向けて、罹患組織への側副路または細胞の供給のための源としての役割を果たす可能性のあるABMの心筋または脚への移植を行う候補であると考えられる。この手順は、骨髄吸引手順、骨髄の収集および処理を用い、その後に、ABMまたはその成分（患者の自らの骨髄から単離される増殖因子および/または細胞成分）の（その送達形態のエクスビボ刺激を行って、または行わずに）、虚血性または非虚血性の心筋および/または末梢虚血組織（肢虚血部）への注入を用いることを含む。骨髄は標準的な抗凝固性/抗凝集性溶液（クエン酸ナトリウムおよびEDTAを含む）中に保ち、使用時まで無菌培地中で4℃に維持する。
【００９９】
その使用に際して、残存する凝血塊または大凝集物を標的組織に注入することを避けるために骨髄を濾過する。
【０１００】
骨髄は、その送達形態のいずれかに刺激物質を伴うか伴わないかにかかわらず、または骨髄の血管新生作用を増強するようにデザインされた導入遺伝子を保有するベクターによりトランスフェクトされたか否かにかかわらず、心筋内に、すなわち治療的な心筋血管新生または治療的な筋形成において、カテーテルを利用した任意の経心内膜的注入デバイスを用いて、または外科的（開胸式）経心外膜的胸腔切開アプローチ、もしくは経心外膜的送達を可能にする任意の他のアプローチにより、注入される。肢虚血の治療の場合には、骨髄またはその成分の直接注入により（その送達形態のいずれかにおけるエクスビボまたはインビボ刺激を伴って、または伴わずに）、骨髄が肢の筋肉に導入される。
【０１０１】
1つの治療部位当たりの注入容積は、おそらく、1つの治療部位当たり0.1〜5.0ccの範囲であると考えられ、これは具体的な骨髄産物および虚血状態の重症度ならびに注入部位に依存する。総注入回数はおそらく、1回の治療セッションにつき1〜50個の注入部位と考えられる。
【０１０２】
実施例7
ブタ骨髄の培養
ブタから骨髄細胞（BMC）を、保存料を含まないヘパリン（20単位/ml BM細胞）中に無菌条件下で収集し、300μおよび200μのステンレス鋼製メッシュフィルターを用いて逐次的に濾過する。続いて、BMCをFicoll-Hypaque勾配遠心処理によって単離し、T-75フラスコに播種し、T-75培養フラスコ内で長期培養液（LTCM）（Stem Cell Tech, Vancouver, British Columbia, Canada）中にて5％CO2下、33℃で培養する。続いて培地を交換し、非付着細胞を洗い流す。付着細胞（すなわち、「早期付着細胞」）の大部分は単球、内皮前駆細胞またはその他の造血系列細胞である。早期付着細胞中の単球の中には骨髄由来ストロマ細胞がある。lac-Z染色試験によって、これらの細胞はアデノウイルスに対して許容性であることがマーカータンパク質の発現から示されている。
【０１０３】
各培養皿におけるBMCの播種密度は7×106/mlとする。約7日の時点で細胞が集密化したところで、それらを0.25％トリプシンにより3分の1に分割する。3〜8回継代したものをこの試験に用いる。
【０１０４】
アデノウイルスのトランスフェクション
BMCをまず、ペトリ皿に付着する早期付着細胞の内層の産生が行われるように、6cmペトリ皿で3〜14日間培養する。非付着細胞は初回播種の翌日に洗い流す。続いて、早期付着細胞に対して、1つまたは複数のサイトカイン、増殖因子または他の哺乳動物血管新生促進因子（転写因子HIF-1またはHIF-2など、ただしこれには限定されない）をコードするベクターを接種する。この接種は、播種の3〜28日後、例えば3〜12日後または3〜8日後に行うことができる。接種の約2時間〜3日後に、トランスフェクトされた細胞からウイルスを洗い流す。続いて、トランスフェクトされた細胞を患者の標的組織、例えば心臓または脚に注入する。
【０１０５】
実施例8
MSCにはインビトロで生物活性のある側副路増強因子を分泌する能力がある
MSCのHIF-1形質導入によって細胞の血管新生能が高まるという仮説の可能性に関する最初の検証として、マウスMSCを培養し、馴化培地をサイトカイン産生に関して連続的に分析した（図5）。単核骨髄細胞をマウスの大腿骨および脛骨から採取し、Ficoll密度勾配を用いて単核画分を分離した。細胞を10日間培養し、異種混成的な培養細胞から二重磁気ビーズ法を用いてCD34-/CD45-細胞を単離した。この単離手順は、細胞マーカーCD34およびCD45を発現しない細胞を、これらのマーカーに対する市販の抗体で標識した磁気ビーズを用いることによって陰性選択し、MSCを異種混成的な培養細胞から精製することを含む。FITC標識抗CD34抗体（Pharmingen, San Diego, CA）で標識し、続いて抗FITCおよび抗CD45磁気ビーズ（Miltenyi Biotech, Sunnyvale, CA）との同時インキュベーションを行うことにより、CD34-/CD45-画分を単離した。細胞を磁気カラムに通し、二重陰性画分を回収した。次に、ビーズ陰性集団およびビーズ陽性集団を別々に培養した。ビーズ陰性集団は、MSCの典型的な線維芽細胞性形態を示したが、一方、ビーズ陽性集団は主として、リンパ性造血細胞に合致する小型の球状細胞からなるように思われた（図5Aおよび5B）。FACS分析を行ったところ、これらの細胞は、リンパ性造血細胞に典型的な表面マーカーCD31、CD34、CD45およびCD117は発現しないが、骨髄由来ストロマ細胞に典型的なCD44（95±0.6％）、CD90（99.1±0.1％）およびCD105（89±2.1％）を高レベルで発現することが示された。
【０１０６】
（これらのCD34-/CD45-細胞を、本明細書では「骨髄由来ストロマ細胞」または「MSC」とも呼んでいる）。単離したMSCを再プレーティングし、馴化培地をその後24時間にわたり収集した。
【０１０７】
以上のようにして調製した馴化培地を、血管新生サイトカインの存在に関してELISAにより分析した。サイトカインレベルは、細胞培養物の総タンパク質量に対して補正した。データは少なくとも3つの異なる細胞集団を反映しており、各集団は2匹のマウスからプールした細胞を含む。これらの結果（図5）は、MSCが、VEGF、MCP-1およびbFGF（アンジオポエチン1およびPIDGFも同じ（提示はしていない））のような既知の側副路増強因子を発現することを示している。これとは対照的に、CD34+細胞（前駆内皮細胞）はこれらの因子を発現しない。
【０１０８】
培養MSCの培地中に分泌されたサイトカインの機能的な能力に関しても、それらが内皮細胞の増殖を引き起こす能力を検討することによって調べた。以上のようにして調製したMSC馴化培地を収集したところ、これは実際に培養ヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖を増強することが見いだされた。MAECまたはSMC（1×104個/ウェル）を、0.1％ウシ胎仔血清を含むMEMとともに24ウェルプレートにプレーティングし、24時間おいた。続いて培地を種々の希釈度のMSCCMまたはDM-10のみの対照ウェルと交換した。培養を72時間続け、その後に細胞を回収し、Coulter計数器により算定した。データは、対照と比較した場合の増殖の平均変化率として報告されている。
【０１０９】
MSCはマウス虚血後肢における側副血流を増大させる
12週齢の雄性Balb/Cマウスに対して、当技術分野で知られた方法を用いて右遠位大腿動脈結紮を行った。24時間後にマウスを3群に無作為に割り付けた。すなわち、1つの群には、虚血後肢の内転筋に、同系マウスから上記の通りに調製した1×106個のMSCを投与し、1つの群には同系マウスから単離した1×106個の成熟内皮細胞を投与し、もう1つの群には非馴化培地を注入した。以後の28日間にわたり、レーザードプラ灌流画像法（LDPI）を利用して虚血後肢血流回復のを追跡した（図6）。
【０１１０】
図6に示したこれらの検討の結果は、虚血後肢の内転筋へのMSCの注入が側副血流を有意に増大させ、これは成熟内皮細胞を注入することによっては得られない効果であったことを示している。
【０１１１】
MSCの形質導入後の細胞生存および遺伝子産物発現の確認
MSCが遺伝的改変のための適切な標的となるか否かを明らかにするための最初の段階として、アデノウイルスベクターを用いたエクスビボ形質導入後のインサイチューでのMSCの生存性を検討した。この目的で、一方は緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードする遺伝子を含むアデノウイルスを用い、もう一方はβ-ガラクトシダーゼをコードする遺伝子を含むものを用いる、2つの別々の実験を行った。以上のように調製したMSCに対してエクスビボで形質導入を行った。予備試験からは、MSCの90％超が、レポーター導入遺伝子を含むアデノウイルスにより首尾良く形質導入され、MOIが150であったことが明らかになった（非提示データ）。タンパク質発現を追跡するために、細胞をMOl 150のAd.GFPまたはAd.β-ガラクトシダーゼとともに2時間インキュベートし、3回すすぎ洗いして回収した上で、直ちに内転筋に注入した（手術の24時間後）。注入したGFP+/MSCの運命を追跡するために、内転筋および腓腹筋の多数の切片をNikon倒立蛍光顕微鏡を用いて検査した。β-gal+/MSCの運命を追跡する目的には、切片を市販X-galキット（Invitrogen）で現像し、24時間前に大腿動脈結紮を受けたマウスの内転筋に直ちに注入した。マウスを第3日、第7日および第14日の時点で屠殺した。続いて、当技術分野で公知の適切なプロトコールに応じて、内転筋切片を蛍光顕微鏡で観察するか、X-galで染色した。
【０１１２】
第3日の時点では、関心対象の遺伝子を発現することが認められた細胞はわずかであった。しかし、第7日までに（これは第14日まで保たれた）、関心対象の遺伝子を発現する多くの細胞が内転筋組織の全体に分布するようになったことが判明した。
【０１１３】
以上より、この実験から、細胞の生存性および転写/翻訳機構の保存が確かめられただけではなく、MSCを関心対象の遺伝子を特定の組織、例えば筋組織に導入するためのベクターとして用いうることも示された。
【０１１４】
MSCに対するインビトロでのHIF-1α/VP16トランスフェクションは低酸素状態によって誘導されるものを上回る、側副路増強関連因子の増加をもたらす
上記のようにマウスMSCを単離してプレーティングした。MSCの3つの群を比較した。第1群――正常酸素条件下で培養したMSC；第2群――1％ O2中で培養したMSC；第3群――上記の通りに調製したHIF-1α/VP16をコードするアデノウイルスをトランスフェクトしたMSC。MSCを感染多重度200のウイルスとともに2時間インキュベートし、その後に遺伝子発現のための期間が得られるように48時間培養した。
【０１１５】
続いて培養馴化培地を24時間にわたり3つの細胞群のすべてから収集した。市販のELISAキットを用いて、培地を血管新生サイトカインVEGFおよびβ-FGFの存在に関して分析した。サイトカインレベルは細胞培養物の総タンパク質に対して補正した。図7に示したこれらの結果は、HIF-1α/VP16トランスフェクションが、MSCによるVEGFおよびβ-FGFの双方の発現および分泌を、低酸素状態によって得られるよりも大幅に高いレベルに高めることを示している。
【０１１６】
これらの培養細胞を含んでいた培地（MSC馴化培地またはMSCCM）を、細胞増殖に対するMSCCMの効果を評価するために、内皮細胞（EC）および平滑筋細胞（SMC）の培養物に対しても添加した。マウス大動脈内皮細胞（MAEC）を以下の通りに単離した。無菌条件下で、マウス胸部大動脈を摘出し（n＝10）、外膜を除去して、切断して1〜2mmの環とした。続いてこれらの環を0.25％トリプシンとともに37℃で20分間インキュベートし、その後に洗浄して浮遊細胞を回収した。これらを、10％FBSを加えた最小必須培地中で培養した。細胞は一様に第VIII因子に対して陽性であった。以前に記載されたプロトコールの変法を用いて平滑筋細胞（SMC）を単離した8。手短に述べると、MAECを以上のように収集した後に、コラゲナーゼを含むハンクス平衡塩類溶液（1mg/ml）を添加し、37℃で最長3時間にわたり、15〜30分毎に静かに攪拌しながらインキュベートした。浮遊細胞を再び回収し、洗浄した上で、10％FBSを加えた培地199中に再懸濁させた。細胞は一様に平滑筋アクチンに対して染色された。両方の細胞を3〜8回継代したものを本試験には用いた。
【０１１７】
正常酸素または低酸素条件下にあるMSCから調製したMSCCMと比較して、HIF-1α/VP16を形質導入したMSCからのMSCCMは、EC増殖（対照培地中での増殖と比較してそれぞれ290％、31％、79％、p＜0.001）およびSMC増殖（それぞれ220％、26％、58％、p＜0.01）を増加させた。
【０１１８】
MSCへのHIF-1α/VP16トランスフェクションは側副血流の増加をもたらす
次に、後肢虚血のマウスモデルにおける側副血流に対する、MSCへのHIF-1α/VP16形質導入の効果を調べた。被験動物の1つの群（以上と同じく）には1×105個の非形質導入MSCを投与し、1つの群にはHIF-1α/VP16形質導入細胞を投与し、第3の群には培地を投与した。虚血肢における血流は上記の通りにモニターした。21日間にわたって収集したこれらの結果（図8）から、形質導入MSCを投与されたマウスは、非形質導入MSCを投与されたマウスで観察されたものを一貫して上回る、大きな側副血流の回復を示したことが示された。
【０１１９】
以上をまとめると、この実験は、アデノウイルスベクター中のHIF-1α/VP16によるトランスフェクションが、MSCのインビトロ血管新生効果を有意かつ顕著に増強することを示している。さらに重要なことに、インビボ試験により、この戦略がMSCのみの注入によって得られるものを上回る側副路改善効果の増大をもたらすことが示されている。これらの試験は、MSCへのHIF-1α（FGFファミリーのタンパク質などの他の血管新生関連サイトカインおよびNOSをコードする遺伝子でもおそらくそうと考えられる）の形質導入により、虚血組織における側副血流を増加させるための細胞利用戦略の側副路増強効果が最適化されると考えられることを示している。
【０１２０】
本発明を、その精神またはその本質的な属性から逸脱することなく他の具体的な形態として具現化することもできる。すなわち、本発明の以上の説明は、その例示的な態様を開示しているに過ぎず、他の変形物も本発明の範囲に含まれると考えられる。したがって、本発明は、本明細書に詳細に述べてきた特定の態様には限定されない。その代わりに、参照は、本発明の範囲および内容を示すものとしての、添付した特許請求の範囲に対してなされるべきである。
【０１２１】
以上の具体的な態様は、本発明の実施を例示したものである。しかし、当業者に公知である、または本明細書に開示したその他の方策を、本発明の精神または添付した特許請求の範囲を逸脱することなく用いることもできることが理解される必要がある。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】PAECの増殖と馴化培地の量との関係についてのグラフである。
【図２】内皮細胞の増殖と馴化培地の量との関係についてのグラフである。
【図３】4週間の期間にわたる馴化培地中のVEGF濃度に関するグラフである。
【図４】4週間の期間にわたる馴化培地中のMCP-1濃度に関するグラフである。
【図５】マウスのCD34+細胞および骨髄由来ストロマ細胞によるVEGF、MCP-1およびbFGFのインビトロ産生を示したグラフである。
【図６】骨髄由来ストロマ細胞マウスを虚血後肢の内転筋に注射した場合の側副血流の発達に対する効果を、レーザー/ドプラ灌流イメージングにより評価して示したグラフである。血流は、虚血肢における血流と正常後肢における血流との比として表している。MSC＝骨髄由来ストロマ細胞；培地＝非馴化培地；MAEC＝マウス大動脈内皮細胞。
【図７】HIF-1α-VP16をコードするアデノウイルスをトランスフェクトしたマウス骨髄由来ストロマ細胞（MSC）からの、インビトロでのVEGFおよびbFGFの放出に対する効果を示したグラフである（MSC＝MSCのみ；低酸素＝低酸素条件のみ；HIP＝融合タンパク質HIF-1α-VP16をコードするDNAがトランスフェクトされたMSC。データは少なくとも3つの異なるMSC集団の分析を表している。
【図８】1×105個のHIF-1α/VP16を形質導入したMSCを虚血後肢に注入されたマウスにおけるインビボ血流回復の改善を1×105個の非形質導入MSCと比較して示したグラフである （ANOVAによる傾向の比較、p＝0.05）。細胞は第1日に注入した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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