(57)【要約】【課題】ＤＮＡやヒストンの特定の領域に特定のエピジェネティック修飾を導入する技術を開発すること。【解決手段】特定のＤＮＡ配列を認識するピロール−イミダゾールポリアミドと、ブロモドメイン阻害剤とを含む複合体を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定のＤＮＡ配列を認識するピロール−イミダゾールポリアミドと、ブロモドメイン阻害剤とを含む複合体。
【請求項２】
ブロモドメイン阻害剤がヒストンアセチル基転移酵素、ヒストンメチル基転移酵素、ＡＴＰ依存性クロマチンリモデリング複合タンパク質、およびＢＥＴタンパク質からなる群から選択されるタンパク質が含有するブロモドメインと相互作用する化合物である、請求項１記載の複合体。
【請求項３】
ブロモドメイン阻害剤が、ヒストンアセチル基転移酵素と相互作用する化合物である、請求項２記載の複合体。
【請求項４】
ブロモドメイン阻害剤が、５−イソキサゾリル−ベンゾイミダゾール化合物である、請求項１〜３のいずれか１項記載の複合体。
【請求項５】
５−イソキサゾリル−ベンゾイミダゾール化合物が、下記式：
【化１】
2019199471.tif 000015
［式中、
Ｒは、ＮＨ２またはＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨであり、
Ｒ’は、Ｈ、ＣＨ３、Ｆ、Ｃｌ、またはＮＯ２であり、
Ｒ’’は、下記式：
【化２】
2019199471.tif 000016
で表される基であり、
Ｒ’’’は、ＨまたはＣＨ３であり、
Ｒ’’’’は、ＨまたはＣＨ３であり、
Ｘは、ＣＨまたはＮであり、
Ｙは、ＣＨまたはＯであり、
Ｚは、ＣＨまたはＯである］
で表される化合物である、請求項４記載の複合体。
【請求項６】
式Ｉ：
【化３】
2019199471.tif 000017
または式ＩＩ：
【化４】
2019199471.tif 000018
で示される、請求項３記載の複合体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の複合体を含む、生化学的活性制御用組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項記載の複合体を含む、ヒストン修飾制御用組成物。
【請求項９】
請求項３〜６のいずれか１項記載の複合体をヌクレオソームを含む試料に接触させる工程を含む、ＤＮＡ配列選択的にヌクレオソームをアセチル化する方法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項記載の複合体を含む、ブロモドメイン含有タンパク質動員組成物。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項記載の複合体を試料に接触させる工程を含む、ＤＮＡ配列選択的にブロモドメイン含有タンパク質を動員する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、特定のＤＮＡ配列を認識するピロール−イミダゾールポリアミドおよびブロモドメイン阻害剤を含む複合体（コンジュゲート）、ならびに該複合体を含む生化学的活性制御用組成物、該複合体を含むヒストン修飾制御用組成物、特にヒストンアセチル化誘導組成物、該複合体を含むブロモドメイン含有タンパク質動員（リクルート）組成物、該複合体を用いるヌクレオソームアセチル化方法、および該複合体を用いるブロモドメイン含有タンパク質動員方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞のゲノムＤＮＡは、ヌクレオソームを最小単位とするクロマチンとして核内に収納されている。ヌクレオソームはＤＮＡとヒストンによって構成されており、該ヌクレオソーム構造の反復によってクロマチンが形成されている。クロマチン構造や遺伝子発現は、ヒストンやＤＮＡのエピジェネティック修飾に調節されていると考えられる。
【０００３】
ヒストンにおける主要な翻訳後修飾（posttranslational modification（ＰＴＭ））の１つとして、リジン残基のアセチル化があり、転写活性化に強く相関する。ヒストンリジン残基のアセチル基修飾は、ヒストンアセチル基転移酵素（histone acetyltransferase（ＨＡＴ））により導入され、ヒストン脱アセチル化酵素（histone deacetylase（ＨＤＡＣ））によって消去される。アセチル化ヒストンは、一般的にユークロマチンや活性化遺伝子の領域に見られ、２つのメカニズムを介して機能することが知られている。１つは、ヒストンタンパク質の正電荷を減少させて、ヒストンとＤＮＡ間の相互作用を弱化し、次いでクロマチン構造を開けることである。もう１つは、アセチル化リジン残基に選択的に結合するブロモドメインを含有するタンパク質によって仲介されるメカニズムである。ヒストンアセチル化の遺伝子座特異的（すなわち、ＤＮＡ配列特異的）調節は生物学的プロセスにおいて必須であるが、現在、目的の領域でのヒストンアセチル化を調節する技術は非常に限られている。
【０００４】
一方、Ｎ−メチルピロールとＮ−メチルイミダゾールからなるピロール−イミダゾールポリアミド（以下、「ＰＩポリアミド」または「ＰＩＰ」ともいう）は、合成オリゴマーであり、ヘアピン連結によって対面するピロール（Ｐ）およびイミダゾール（Ｉ）対により、ＤＮＡの副溝に塩基配列選択的に結合可能な化合物である。ＰＩポリアミドは、Ｐ／Ｉ対がＣ・Ｇ塩基対を、Ｐ／Ｐ対がＡ・ＴまたはＴ・Ａ塩基対を、Ｉ／Ｐ対がＧ・Ｃ塩基対を認識し、これにより任意の二重鎖ＤＮＡ配列に特異的に結合することができる。したがって、様々な順序のＰ／Ｉ対を設計することにより、所望のゲノム上の標的部位へのＰＩポリアミドのインビボデリバリーが可能になることから、核内のＤＮＡを標的としてさまざまな応用がされてきた。
【０００５】
近年の研究では、強力なＨＤＡＣ阻害剤であるスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）とコンジュゲートしたＰＩポリアミドが合成された（非特許文献１、非特許文献２）。また、ＨＡＴを活性化する化合物であるＮ−（４−クロロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−２−エトキシベンズアミド（ＣＴＢ）とコンジュゲートしたＰＩポリアミドが合成された（特許文献１）。該ＳＡＨＡ−ＰＩポリアミドコンジュゲートおよびＣＴＢ−ＰＩポリアミドコンジュゲートは、標的遺伝子の発現を特異的にアップレギュレートすることが示された。しかしながら、遺伝子活性化のレベルはいまだ一定ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２０１６／１２９６８０
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Pandian, G. N. et al., Sci Rep 4, 3843, doi:10.1038/srep03843 (2014)
【非特許文献２】Saha, A. et al., Bioorg Med Chem 21, 4201-4209, doi:10.1016/j.bmc.2013.05.002 (2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本開示は、ＤＮＡの特定の領域または特定のヌクレオソームに特定のエピジェネティック修飾を導入する技術を開発することを目的の一つとした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ブロモドメイン（以下、「ＢＤ」ともいう）を有するＨＡＴは、ＢＤを介してアセチル化されたリジンへ結合し、ＨＡＴドメインで近傍のリジンをアセチル化することにより、アセチル基修飾が伝播すると考えられる。発明者らは、この天然のアセチル化伝播システムに注目し、鋭意研究の結果、ブロモドメインへ結合するブロモドメイン阻害剤と配列特異的にＤＮＡへ結合するＰＩポリアミドを用いて、ＤＮＡ配列特異的にブロモドメイン含有タンパク質をリクルート（動員）することにより、該タンパク質による修飾をＤＮＡ上の特定の領域にもたらす技術の開発に成功した。すなわち、発明者らは、ブロモドメイン阻害剤（以下、「Ｂｉ」ともいう）およびＰＩポリアミドの二分子を結合させることによりＢｉ―ＰＩポリアミドコンジュゲート（以下、「Ｂｉ−ＰＩＰ」ともいう）を合成し、一連の新規技術を完成させた。
【００１０】
すなわち、以下の態様が提供される。
［１］特定のＤＮＡ配列を認識するピロール−イミダゾールポリアミドと、ブロモドメイン阻害剤とを含む複合体、
［２］ブロモドメイン阻害剤がヒストンアセチル基転移酵素、ヒストンメチル基転移酵素、ＡＴＰ依存性クロマチンリモデリング複合タンパク質、およびＢＥＴタンパク質からなる群から選択されるタンパク質が含有するブロモドメインと相互作用する化合物である、［１］記載の複合体、
［３］ブロモドメイン阻害剤が、ヒストンアセチル基転移酵素と相互作用する化合物である、［２］記載の複合体、
［４］ブロモドメイン阻害剤が、５−イソキサゾリル−ベンゾイミダゾール化合物である、［１］〜［３］のいずれか１項記載の複合体、
［５］５−イソキサゾリル−ベンゾイミダゾール化合物が、下記式：
【００１１】
【化１】
2019199471.tif 000002
［式中、
Ｒは、ＮＨ２またはＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨであり、
Ｒ’は、Ｈ、ＣＨ３、Ｆ、Ｃｌ、またはＮＯ２であり、
Ｒ’’は、下記式：
【００１２】
【化２】
2019199471.tif 000003
で表される基であり、
Ｒ’’’は、ＨまたはＣＨ３であり、
Ｒ’’’’は、ＨまたはＣＨ３であり、
Ｘは、ＣＨまたはＮであり、
Ｙは、ＣＨまたはＯであり、
Ｚは、ＣＨまたはＯである］
で表される化合物である、［４］記載の複合体、
［６］式Ｉ：
【００１３】
【化３】
2019199471.tif 000004
または式ＩＩ：
【００１４】
【化４】
2019199471.tif 000005
で示される、［３］記載の複合体、
［７］［１］〜［６］のいずれか１項に記載の複合体を含む、生化学的活性制御用組成物、
［８］［１］〜［６］のいずれか１項記載の複合体を含む、ヒストン修飾制御用組成物、［９］［３］〜［６］のいずれか１項記載の複合体をヌクレオソームを含む試料に接触させる工程を含む、ＤＮＡ配列選択的にヌクレオソームをアセチル化する方法、
［１０］［１］〜［６］のいずれか１項記載の複合体を含む、ブロモドメイン含有タンパク質動員組成物、および
［１１］［１］〜［６］のいずれか１項記載の複合体を試料に接触させる工程を含む、ＤＮＡ配列選択的にブロモドメイン含有タンパク質を動員する方法。
【発明の効果】
【００１５】
本開示によれば、一例として、所望の標的ＤＮＡ配列を認識するＰＩポリアミドと、所望のＢＤ含有タンパク質のＢＤに対する阻害剤との複合体Ｂｉ−ＰＩＰを用いることにより、該標的ＤＮＡ配列を含む特定のヌクレオソームに所望の修飾をもたらすことができる。本開示の一態様において、Ｂｉ−ＰＩＰは、ヌクレオソーム上の標的ＤＮＡ配列へ選択的に結合し、Ｂｉを通じて所望のＢＤ含有タンパク質（例えばＨＡＴ）を標的配列付近にリクルートし、それにより、当該配列付近に所望の修飾（例えばリジン基のアセチル化）をもたらす。例えば、本明細書に開示されるＢｉ−ＰＩＰによる標的ヌクレオソームの修飾技術は、ヌクレオソーム単位でのエピジェネティック修飾クロストークのメカニズム解明や、エピゲノム編集・内在性遺伝子の発現制御などへの応用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、実施例で使用したＢｉ−ＰＩＰ、Ｂｉ、およびＰＩＰの構造を表す。図中、Ｍｅはメチル基を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、実施例で使用したＤＮＡ鋳型を図示したものである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、実施例で行ったＨＡＴ反応−インビトロＣｈＩＰ−ｑＰＣＲの概略図である。
【図３】図３は、Ｂｉ−ＰＩＰによる、標的ヌクレオソームのアセチル化誘導の結果を示すグラフである。左から、陽性対照、ビヒクル群におけるＰ３００を０、１、３、１０、３０、１００ｎＭ添加した結果、Ｂｉ−ＰＩＰ１群におけるＰ３００を０、１、３、１０、３０、１００ｎＭ添加した結果を示す。
【図４】図４は、Ｂｉ−ＰＩＰ１、ＰＩＰ１モノマー、Ｂｉモノマー、ＢｉおよびＰＩＰ１の混合物による標的ヌクレオソームのアセチル化誘導の結果を示す。
【図５】図５は、Ｂｉ−ＰＩＰ１およびＢｉ−ＰＩＰ２による標的ヌクレオソームのアセチル化誘導の結果を示す。
【図６】図６は、Ｂｉ−ＰＩＰによる、核抽出物中における標的ヌクレオソームのアセチル化誘導の結果を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、培養細胞におけるＢｉ−ＰＩＰによる選択的遺伝子活性化を示す。Ｂｉ−ＰＩＰ１対ビヒクル（左）およびＢｉ−ＰＩＰ２対ビヒクル(右)のトランスクリプトーム比較のボルケーノプロットである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、培養細胞におけるＢｉ−ＰＩＰによる選択的遺伝子活性化を示す。Ｂｉ−ＰＩＰ１またはＢｉ−ＰＩＰ２の存在下における、培養細胞中におけるＮＴＳおよびＩＥＲ５Ｌの発現をＲＴ−ｑＰＣＲによって定量した結果である。エラーバーは、２つの培養ウェルから得られたデータの標準偏差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
１．ＰＩポリアミド
ＰＩポリアミドは、一般に、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐ）とＮ−メチルイミダゾール単位（Ｉ）と、γ−アミノ酪酸部分とを含むポリアミドであり、ＰとＩとγ−アミノ酪酸部分とは互いにアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）で連結される（Trauger et al, Nature, 382, 559-61(1996); White et al, Chem.Biol., 4,569-78(1997);およびDervan, Bioorg. Med. Chem., 9, 2215-35(2001)）。ＰＩポリアミドは、γ−アミノ酪酸部分がリンカー（以下、「γ−リンカー」という）となって全体が折りたたまれてＵ字型のコンフォメーション（ヘアピン型）をとる。Ｕ字型のコンフォメーションにおいては、γ−リンカーを挟んでＰとＩとを含む２本の鎖が並列に並ぶ。この２本の鎖の向かい合うＰおよび／またはＩからなる対（以下、「ピロール−イミダゾール対」ともいう）が特定の組み合わせ（Ｐ／Ｉ対、Ｉ／Ｐ対、またはＰ／Ｐ対）のときに、ＰＩポリアミドは、ＤＮＡ中の特定の塩基対に高い親和性で結合する。例えば、Ｐ／Ｉ対はＣ・Ｇ塩基対に結合することができ、Ｉ／Ｐ対はＧ・Ｃ塩基対に結合することができる。また、Ｐ／Ｐ対はＡ・Ｔ塩基対およびＴ・Ａ塩基対の両方に結合することができる。また、ＰＩポリアミドには、ＰおよびＩの他に、３−ヒドロキシピロール（Ｈｐ）またはβアラニンが含まれていてもよく、ＰをＨｐまたはβアラニンに置き換えることができる。Ｈｐ／Ｐ対は、Ｔ・Ａ塩基対に結合することができる（White at al., Nature, 391, 468-71 (1998)）。βアラニン／βアラニン対は、Ｔ・Ａ塩基対もしくはＡ・Ｔ塩基対に結合することができる。βアラニン／Ｉ対はＣ・Ｇ塩基対に、Ｉ／βアラニン対はＧ・Ｃ塩基対に結合することができる。βアラニン／Ｐ対およびＰ／βアラニン対は、Ｔ・Ａ塩基対もしくはＡ・Ｔ塩基対に結合することができる。また、γ−リンカー部分や、ＰＩポリアミドのＮ末端に付加したβアラニン部分も、Ｔ・Ａ塩基対もしくはＡ・Ｔ塩基対に結合することができる。Ｐ、Ｉ、Ｈｐ、および／またはβアラニンによって形成される対の構成、順序、および組み合わせ等を適宜変更することにより、標的のＤＮＡ配列を認識し、結合するＰＩポリアミドを設計することができる。
【００１８】
本開示において、ＰＩポリアミドを構成するＰおよびＩの１位の窒素上のメチル基は、水素またはメチル基以外のアルキル基で置き換わっていてもよい。メチル基以外のアルキル基の例としては、炭素数２〜１０個の直鎖、分枝鎖または環状の飽和または不飽和アルキル基、好ましくは、炭素数２〜５個の直鎖、分枝鎖直鎖、分枝鎖または環状の飽和または不飽和アルキル基が挙げられ、例えば、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル等が挙げられる。また、メチル基を含め、アルキル基は置換されていてもよく、例えば、アルキル基中のメチレンは、酸素等で置換されていてもよい。さらに、本開示において、ＰＩポリアミドを構成するＰの３位はヒドロキシ基で置換されていてもよい。本明細書で用いる場合、「Ｐ」または「ピロール単位」および「Ｉ」または「イミダゾール単位」なる語は、上記したようなＮ置換またはＮ非置換ピロール単位、３−ヒドロキシピロール単位、およびＮ置換またはＮ非置換イミダゾール単位を包含する。
【００１９】
本開示において、ＰＩポリアミドを構成するγ−リンカーは、α位またはβ位に側鎖を有していてもよい。例えば、α位またはβ位がアミノ基で置換されたγ−リンカー、すなわち、Ｎ−α−Ｎ−γ−ジアミノ酪酸残基またはＮ−β−Ｎ−γ−ジアミノ酪酸残基からなるリンカーであってもよく、さらに該アミノ基が蛍光基やビオチン等の分子で修飾されていてもよい。
【００２０】
本開示において、ＰＩポリアミドのＮ末端およびＣ末端には、種々の官能基または分子が付加されていてもよい。ＰＩポリアミドのＮ末端およびＣ末端に付加する官能基または分子は、当業者が適宜決定することができる。例えば、アミド結合を介して様々な官能基を付加することができる。該官能基の例としては、限定するものではないが、β−アラニン残基、γ−アミノ酪酸残基などのカルボキシル基、アセチル基、アミノ基等が挙げられる。例えば、限定するものではないが、Ｎ末端にはアセチル基が付加されていてもよい。例えば、限定するものではないが、Ｃ末端にはジメチルアミノプロピルアミノ基が付加されていてもよい。また、ＰＩポリアミドのＮ末端およびＣ末端は、蛍光基やビオチン、イソフタル酸等の分子で修飾されていてもよい。本願明細書において、蛍光基としては、限定するものではないが、例えば、フルオレセイン、ローダミン系色素、シアニン系色素、ＡＴＴＯ系色素、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ系色素、ＢＯＤＩＰＹが挙げられる。フルオレセインには、フルオレセイン誘導体（例えば、フルオレセインイソチオシアネート等）も含まれる。
【００２１】
また、本開示において、ＰＩポリアミドは、ＤＮＡに対する結合能力を維持または向上するように修飾されたＰＩポリアミド修飾物であってもよい。該ＰＩポリアミド修飾物としては、例えば、ＰＩポリアミドのγ−リンカーのα位またはβ位にアミノ基を付加した修飾物、すなわち、Ｎ−α−Ｎ−γ−ジアミノ酪酸残基またはＮ−β−Ｎ−γ−ジアミノ酪酸残基からなるγ−リンカーを有する修飾物、該修飾物の上記アミノ基を蛍光基やビオチン等の分子で修飾した修飾物、ＰＩポリアミドのＮ末端を蛍光基やビオチン等の分子で修飾した修飾物、およびＰＩポリアミドのＣ末端をイソフタル酸等の分子で修飾した修飾物等が挙げられる。
【００２２】
本開示において使用されるＰＩポリアミドは、特定のＤＮＡ配列、すなわち、所望のいずれかのＤＮＡ配列を認識するように設計される。所望のＤＮＡ配列は、例えば、修飾または発現制御したい遺伝子の配列またはその関連配列の一部から選択すればよい。発現制御には、発現の活性化および抑制が包含される。
【００２３】
本開示において使用されるＰＩポリアミドを構成する、Ｐ、Ｉ、Ｈｐ、および／またはβアラニンによって形成されるピロール−イミダゾール対の数は、２個以上であれば特に限定されないが、例えば３〜１２個、好ましくは４〜１０個、より好ましくは４〜８個が挙げられる。対の個数が５個以上のＤＮＡ配列認識部分を有するＰＩポリアミドを設計する場合は、好ましくはβアラニンを含むように設計される。なお、本明細書において用いる場合、「ピロール−イミダゾール対」なる語は、Ｐ、Ｉ、Ｈｐ、およびβアラニンのいずれの組み合わせからなる対も包含する。
【００２４】
ＰＩポリアミドの設計方法および製造方法は公知である（例えば、特許第３０４５７０６号、特開２００１−１３６９７４号、ＷＯ０３／０００６８３号、特開２０１３−２３４１３５号、特開２０１４−１７３０３２号参照）。例えば、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）を用いた固相合成法（Ｆｍｏｃ固相合成法）による自動合成法によって簡便に製造することができる。また、液相合成法によって製造することもできる。
【００２５】
２．ＰＩポリアミドコンジュゲート
本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」（複合体）は、安定したより大きな構築物を形成するのに十分な結合（例えば、共有結合）を介して連結されて、当該構築物を形成している２つまたはそれより多くの分子を指す。本開示において、一実施形態において、ＰＩポリアミドは、そのＮ末端、Ｃ末端、および／またはγリンカー部位に、ＢＤ阻害剤が結合されてＢｉ―ＰＩポリアミドコンジュゲート（Ｂｉ−ＰＩＰ）を形成している。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「ブロモドメイン（ＢＤ）」は、一般的には、アセチル化リジン残基を選択的に認識し、結合するタンパク質ドメインであり、ＨＡＴをはじめ様々なタンパク質中に存在することが知られている。例えば、ブロモドメインは、ヒストン上のアセチル化リジン残基を認識する。
【００２７】
本明細書において使用される場合、「ＢＤ阻害剤」との用語は、ブロモドメインと特異的に相互作用する化合物であり、近年、様々な化合物が同定され、また、その同定手法も開発されている。例えば、一実施形態において、ＢＤ阻害剤は、ＢＤのポケットに特異的に結合して、アセチル化リジン残基との結合を妨害する化合物である。本明細書において用いる場合、ＢＤ阻害剤は、例えば、ＢＤに特異的に結合する化合物であればよく、阻害作用をもたらす化合物に限定されず、阻害作用以外の相互作用をもたらす化合物であってもよい。
【００２８】
本開示の態様において、ＰＩポリアミドコンジュゲートに含まれるＢＤ阻害剤は、特に限定されないが、好ましくは、所望の生化学的活性を有するＢＤ含有タンパク質のＢＤに特異的に結合する化合物から選択される。このようなＢＤ阻害剤は、既知の手法によって同定することもできる。該ＢＤ含有タンパク質としては、限定するものではないが、各種酵素や転写活性化因子等が挙げられ、より具体的には、例えば、ＨＡＴ、ヒストンメチル基転移酵素、ＡＴＰ依存性クロマチンリモデリング複合タンパク質、ＢＥＴ（bromodomain and extra-terminal）タンパク質（例えば、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＤＴ等）等が挙げられる。さらに、ＨＡＴドメインおよびＢＤの両方を有するＨＡＴとしては、Ｐ３００／ＣＢＰファミリー、例えば、Ｐ３００（ＫＡＴ３Ｂ）およびＣＢＰ（ＫＡＴ３Ａ）等、ＧＮＡＴファミリー、例えば、ＧＣＮ５（ＫＡＴ２Ａ）およびＰＣＡＦ（ＫＡＴ２Ｂ）等、ＴＡＦ１（ＫＡＴ４）等が挙げられる。
【００２９】
ＢＤ阻害剤の具体例としては、限定するものではないが、５−イソキサゾリル−ベンゾイミダゾール化合物、ＪＱ１およびその類似化合物、Ｉ−ＢＥＴ７６２、ＯＴＸ０１５等が挙げられる。本開示の態様においては、既知のＢＤ阻害剤を使用してもよく、または既知の手法によって同定されたＢＤ阻害剤を使用してもよい。
【００３０】
ＢＤ阻害剤としての５−イソキサゾリル−ベンゾイミダゾール化合物の例としては、限定するものではないが、下記式：
【００３１】
【化５】
2019199471.tif 000006
［式中、
Ｒは、ＮＨ２またはＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨであり、
Ｒ’は、Ｈ、ＣＨ３、Ｆ、Ｃｌ、またはＮＯ２であり、
Ｒ’’は、下記式：
【００３２】
【化６】
2019199471.tif 000007
で表される基であり、
Ｒ’’’は、ＨまたはＣＨ３であり、
Ｒ’’’’は、ＨまたはＣＨ３であり、
Ｘは、ＣＨまたはＮであり、
Ｙは、ＣＨまたはＯであり、
Ｚは、ＣＨまたはＯである］
で表される化合物が挙げられる。
【００３３】
ＢＤ阻害剤としての５−イソキサゾリル−ベンゾイミダゾール化合物のさらに具体的な例としては、限定するものではないが、下記式：
【００３４】
【化７】
2019199471.tif 000008
［式中、Ｒは、ＮＨ２またはＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨである］
で表される化合物が挙げられる。
【００３５】
ＢＤ阻害剤とＰＩポリアミドとのコンジュゲーション（結合）は、常法により行うことができる（例えば、J. Am. Chem. SOC. 1995, 117, 2479-2490参照）。ＢＤ阻害剤は、ＰＩポリアミドのＮ末端、Ｃ末端、および／またはγリンカー部位に、直接結合してもよいし、あるいはリンカーを介して結合してもよい。Ｎ末端、Ｃ末端、およびγリンカー部位から選ばれる２以上の位置に、ＢＤ阻害剤が結合する場合、各ＢＤ阻害剤は互いに同一であってもよく、または異なっていてもよい。
【００３６】
上記ＰＩポリアミドコンジュゲートにおけるＢＤ阻害剤とＰＩポリアミドとの間のリンカーとしては、ＢＤ阻害剤の作用を妨げず、かつＰＩポリアミドのＤＮＡ配列認識を妨げないものであれば特に限定されないが、例えば、アミド結合、ホスホジスルフィド結合、エステル結合、配位結合、またはエーテル結合等そのもの、あるいはこれらの結合の１種類以上を形成する官能基を含む分子を例示することができる。「これらの結合の１種類以上を形成する官能基を含む分子」は、ＰＩポリアミドおよび／またはＢＤ阻害剤の末端部分と共に、アミド結合、ホスホジスルフィド結合、エステル結合、配位結合、およびエーテル結合等からなる群から選択される１種類以上の結合を形成する官能基を含む分子である。「これらの結合の１種類以上を形成する官能基を含む分子」はまた、アミド結合、ホスホジスルフィド結合、エステル結合、配位結合、およびエーテル結合等からなる群から選択される１種類以上の結合を１個以上含む分子であってもよい。好ましいリンカーとしては、アミド結合、またはアミド結合を形成する官能基を含む分子が挙げられる。上記リンカーは当業者により適宜決定することができる。
【００３７】
本開示の一態様において、ＰＩポリアミドコンジュゲートは、薬理学的に許容し得る塩の形態であってもよい。例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩もしくは臭化水素酸塩等の無機酸塩、または酢酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩もしくはトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。
【００３８】
本開示の一態様において、ＰＩポリアミドコンジュゲートは、ＰＩポリアミド、ＢＤ阻害剤、および／またはＰＩポリアミドとＢＤ阻害剤とを連結するリンカー部分の１つ以上の部分または分子が、エナンチオマーもしくはジアステレオマーの形態またはこれらの混合物で存在していてもよい。上記ＰＩポリアミドコンジュゲートは、立体異性体の混合物またはそれぞれ純粋なもしくは実質的に純粋な異性体を包含する。上記複合体がジアステレオマーまたはエナンチオマーの形態で得られる場合、これらを当該技術で周知の慣用方法、例えば、クロマトグラフィーまたは分別結晶法等で分離することができる。
【００３９】
また、上記ＰＩポリアミドコンジュゲートは、ＰＩポリアミド、ＢＤ阻害剤、および／またはＰＩポリアミドとＢＤ阻害剤とを連結するリンカー部分の１つ以上の部分または分子上で、同位元素（例えば、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ等）等で標識されていてもよく、または重水素変換体であってもよい。
【００４０】
３．ブロモドメイン含有タンパク質のリクルート(動員)
上記のとおり、本開示の一態様において、ＰＩポリアミドコンジュゲートは、特定のＤＮＡ配列を認識するＰＩポリアミドおよび特定のＢＤ含有タンパク質を標的とするＢＤ阻害剤を含むため、該ＰＩポリアミドのＤＮＡ認識能によりＤＮＡ上の特定の配列に結合すると同時に、該ＢＤ阻害剤を介して、該ＢＤ阻害剤の標的となるＢＤ含有タンパク質を動員することができる。したがって、上記のＰＩポリアミドコンジュゲートを用いることにより、ゲノムＤＮＡ上の所望の特定の領域または該領域を含む特定のヌクレオソームに、所望の生化学的活性を有するＢＤ含有タンパク質を動員することができ、延いては、上記の特定の領域またはヌクレオソームに、該ＢＤ含有タンパク質による所望の生化学的活性をもたらすことができる。上記生化学的活性には、限定するものではないが、翻訳後修飾、例えば、ヒストンの修飾、例えば、ヒストンのアセチル化やメチル化等も含まれる。したがって、本開示によれば、ＤＮＡ上の特定の領域または特定のヌクレオソームにＢＤ含有タンパク質を動員する組成物、すなわち、ＤＮＡ配列選択的にＢＤ含有タンパク質を動員する組成物（以下、「ブロモドメイン含有タンパク質動員組成物」ともいう）が提供される。さらに、本開示によれば、ＤＮＡ上の特定の領域または特定のヌクレオソームにＢＤ含有タンパク質を動員する方法、すなわち、ＤＮＡ配列選択的にＢＤ含有タンパク質を動員する方法（以下、「ブロモドメイン含有タンパク質動員方法」ともいう）が提供される。さらには、本開示によれば、ＤＮＡ上の特定の領域または特定のヌクレオソームにおいて生化学的活性を制御する組成物（以下、「生化学的活性制御用組成物」ともいう）、およびＤＮＡ上の特定の領域または特定のヌクレオソームにおいて、ヒストン修飾を制御する組成物（以下、「ヒストン修飾制御用組成物」ともいう）が提供される。ここで、「制御」には、活性化および抑制のいずれもが包含され、上記ＰＩポリアミドコンジュゲートのターゲットとなるＢＤ含有タンパク質の種類によって、所望の制御をもたらす組成物を製造することができる。
【００４１】
本開示の一態様において、ブロモドメイン含有タンパク質動員組成物、生化学的活性制御用組成物、およびヒストン修飾制御用組成物（以下、「ブロモドメイン含有タンパク質動員組成物等」ともいう）は、本明細書に開示されるＰＩポリアミドコンジュゲートを含有する組成物である。該組成物は、上記ＰＩポリアミドコンジュゲートそのものであってもよく、または使用目的に応じて、上記ＰＩポリアミドコンジュゲートの他に担体や添加物を含んでいてもよい。該担体および添加物としては、好ましくは医薬上許容される担体および添加物であり、限定するものではないが、例えば、水、酢酸、有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、界面活性剤等が挙げられる。また、上記ブロモドメイン含有タンパク質動員組成物等は、使用目的に応じて、常法にしたがい製剤化することもできる。該組成物の剤形は、経口投与および非経口投与用のいずれの剤形であってもよく、例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤、噴霧剤、塗布剤、点眼剤、外用剤、注射剤等が挙げられる。
【００４２】
本開示の一態様において、ブロモドメイン含有タンパク質動員方法は、本明細書に開示されるＰＩポリアミドコンジュゲートまたは本明細書に開示されるブロモドメイン含有タンパク質動員組成物を試料と接触させることを特徴とする。該方法は、インビトロ、インビボ、およびエクスビボのいずれの方法も包含する。該試料は、ＤＮＡ、例えばゲノムＤＮＡ、またはヌクレオソームを含むものであり、生体、および生体外試料が包含される。生体としては、二本鎖ＤＮＡを生体制御に利用するあらゆる生物、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）が挙げられる。生体外試料は、生体から単離されたいずれかの試料であり、例えば、限定するものではないが、血液、体液、各種細胞等が挙げられる。試料として細胞を用いる場合は、例えば、通常の培養培地中に上記ＰＩポリアミドコンジュゲートまたはブロモドメイン含有タンパク質動員組成物を添加して培養すればよい。ＰＩポリアミドコンジュゲートまたはブロモドメイン含有タンパク質動員組成物の添加量および培養条件は、当業者により適宜決定することができる。
【００４３】
４．ヒストンアセチル化の誘導および促進
本開示の一態様において、ＰＩポリアミドコンジュゲートがＨＡＴのＢＤに対する阻害剤を含む場合、該ＰＩポリアミドコンジュゲートは、特定のヌクレオソームにヒストンアセチル化を誘導し、かつ、促進することができる。すなわち、該ＰＩポリアミドコンジュゲートは、ＰＩポリアミドのＤＮＡ認識能によりＤＮＡ上の特定の配列に結合すると同時に、ＢＤ阻害剤を介して、該ＢＤ阻害剤の標的となるＨＡＴを、該特定配列を含むヌクレオソームに誘導し、該特定配列の近辺のヒストン上のリジン基をアセチル化することができる。本開示において、上記ＰＩポリアミドコンジュゲートにより一旦ヒストンアセチル化が誘導されると、ＨＡＴに含まれるＢＤがアセチル化リジンに結合してその近辺のリジン基をアセチル化するというＨＡＴを介したアセチル基修飾伝播により、ヒストンアセチル化が促進される。このように、上記のＨＡＴに対するＢＤ阻害剤を含むＰＩポリアミドコンジュゲートは、ＢＤによって仲介されるヒストンアセチル化の天然の伝播システムを標的アセチル化の調節に利用することにより、ヌクレオソームのアセチル化を促進する。したがって、本開示によれば、ＤＮＡ配列選択的にヌクレオソームのヒストンアセチル化を誘導し且つ促進する組成物、およびＤＮＡ配列選択的にヌクレオソームをアセチル化する方法が提供される。
【００４４】
本開示の態様において、ヒストンアセチル化誘導組成物は、本明細書に開示されるＰＩポリアミドコンジュゲートを含有する組成物である。該組成物は、さらに、ヒストンアセチル化を促進する。該組成物は、上記ＰＩポリアミドコンジュゲートそのものであってもよく、または使用目的に応じて、上記ＰＩポリアミドコンジュゲートの他に担体や添加物を含んでいてもよい。該担体および添加物としては、ブロモドメイン含有タンパク質動員組成物等について上記したのと同様の例が挙げられる。また、上記ヒストンアセチル化誘導組成物は、使用目的に応じて、常法にしたがい製剤化することもできる。該組成物の剤形としては、ブロモドメイン含有タンパク質動員組成物等について上記したのと同様の例が挙げられる。
【００４５】
本開示において、ヌクレオソームアセチル化方法は、本明細書に開示されるＰＩポリアミドコンジュゲートまたは本明細書に開示されるヒストンアセチル化誘導組成物を、ヌクレオソームを含む試料と接触させることを特徴とする。該方法は、インビトロ、インビボ、およびエクスビボのいずれの方法も包含する。該試料としては、ブロモドメイン含有タンパク質動員方法について上記したのと同様の例が挙げられる。上記ＰＩポリアミドコンジュゲートは特定の配列を認識するＰＩポリアミドを含むので、本開示におけるヌクレオソームアセチル化方法は、配列選択的にヌクレオソームのヒストンをアセチル化する。
【００４６】
実際に、Ｂｉ−ＰＩＰ存在下でヌクレオソームの混合物にＨＡＴ（Ｐ３００）を作用させると、標的ＤＮＡ配列を含むヌクレオソームに選択的にアセチル化がもたらされ、配列選択的なアセチル化が促進することが示された（実施例２）。また、培養細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）を用いて、塩基配列特異的なアセチル化が選択的に遺伝子発現を亢進していることを実証した（実施例４）。本開示において、ＰＩポリアミドの認識配列を変えることにより、所望の特定の遺伝子群を活性化することができる。
【００４７】
以下、実施例を用いて、本明細書に開示される新規技術をさらに説明するが、これらの実施例は例示的なものであり、これらの実施例を当該新規技術の外延を限定するものと解釈してはならない。
【実施例】
【００４８】
実施例１：Ｂｉ−ＰＩＰの設計および合成
（１）ＢＤ阻害剤の設計および合成
標的となるＢＤ含有タンパク質として、コアアクチベーターＰ３００／ＣＢＰファミリータンパク質を選択した。Ｐ３００／ＣＢＰは、真核細胞における転写活性化において中心的な役割を果たすヒストンアセチル基転移酵素であり、Ｐ３００／ＣＢＰは、ＨＡＴドメインおよびＢＤの両方を有する。ＢＤ阻害剤として、以前に報告された５−イソキサゾイル−ベンズイミダゾールを有するＰ３００／ＣＢＰ選択的ＢＤ阻害剤（ＣＢＰ３０）のうち、ＣＢＰのＢＤに対して中程度の結合アフィニティーを示すＣＢＰ３０誘導体の１つを用いた（Hay et al., J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 9308-9319）。該ＢＤ阻害剤の合成は以前の報告（前掲の文献）にしたがった。次いで、常法にしたがい、第一アミンを有するＢＤ阻害剤ユニットを設計し、合成した。
【００４９】
【化８】
2019199471.tif 000009
【００５０】
メチル３−（４−（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）エトキシ）フェニル）プロパノエート（１１）
メチル３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパノエート（９）およびｔｅｒｔ−ブチル（２−ヒドロキシエチル）カルバマート（１０）を既知の方法にしたがって合成した。メチル３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパノエート（５５０ｍｇ、３．１ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル（２−ヒドロキシエチル）カルバマート（４８６ｍｇ，３．０ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３）（１．０１ｇ、３．９ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（３ｍＬ）中に溶解し、４℃に冷却した。ＴＨＦ（３ｍＬ）中のジエチルアゾジカルボキシレート（ＤＥＡＤ）（６９０ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ）を滴下した。該反応混合物を次いで、室温に温め、一晩攪拌した。該混合物を次いで、濃縮し、（酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）中に溶解した。有機層を水、水性水酸化ナトリウム（ＮａＯＨａｑ）およびブラインで洗浄した。該溶液をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。粗化合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝４：１）で精製して、５１０ｍｇの無色油を得た（１．６ｍｍｏｌ、５３％）。
1H NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 7.11 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.81 (d, J = 8.9, 2H), 4.98 (s, br, 1H), 3.99 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.66 (s, 3H), 3.52 (d, J = 5.5 Hz, 2H), 2.89 (t, J = 7.9 Hz, 2H), 2.59 (t, J = 7.9, 2H), 1.45 (s, 9H)
【００５１】
メチル３−（４−（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）エトキシ）フェニル）プロピオン酸（１２）
１１（５１０ｍｇ，１．６ｍｍｏｌ）および水酸化カリウム（５２５ｍｇ，９．３６ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）および水（５ｍＬ）の混合物中に溶解した。該混合物を７０℃で３０分間攪拌し、次いで室温に冷却した。該混合物をＡｃＯＨで中和し、ＥｔＯＡｃで２階抽出し、ブラインで洗浄した。該混合物を次いで、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、濃縮して、１３６ｍｇの白色固体を得た（０．４４ｍｍｏｌ，２７％）。
1H NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 7.12 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 6.82 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 4.99 (s, br, 1H), 3.99 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 3.52 (m, 2H), 2.90 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.65 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.45 (s, 9H)
【００５２】
ｔｅｒｔ−ブチル（２−（４−（２−（５−（３，５−ジメチルイソキサゾール−４−イル）−１−（２−モルホリノエチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）エチル）フェノキシ）エチル）カルバマート（１３）
３−（４−（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）エトキシ）フェニル）プロパン酸（８）を既知の方法にしたがって合成した。８（９４ｍｇ，０．３０ｍｍｏｌ）、１２（９３ｍｇ，０．３０ｍｍｏｌ）、プロピルホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）（１９３ｍｇ，０．６１ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（６３μＬ，０．３６ｍｍｏｌ）をＥｔＯＡｃ（４ｍＬ）中に溶解した。該混合物を電子レンジで加熱した（１５０℃，１０分）。該反応物を０．１Ｍ  ＮａＯＨａｑで塩基性にし、ＥｔＯＡｃと水の間に分相した。有機相を回収し、ブラインで洗浄した。該混合物をＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過した。粗化合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝９：１）で精製して、１３２ｍｇのベージュ色のガムを得た（０．２２ｍｍｏｌ，７３％）。
1H NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 7.63 (s, 1H), 7.35 (d, J = 8.3, 1H), 7.15 (d, J = 8.9, 2H), 7.12 (d, J = 7.9, 1H), 6.84 (d, J = 8.9, 2H), 4.98 (s, br, 1H), 4.12 (m , 2H), 4.00 (t, J = 5.2 , 2H), 3.67 (t, J = 4.5, 4H), 3.53 (d, J = 4.8, 2H), 3.23 (m, 2H), 3.17 (m, 2H), 2.61 (t, J = 7.2, 2H), 2.46 (t, 4H), 2.43 (s, 3H), 2.30 (s, 3H), 1.45 (s, 9H)
【００５３】
２−（４−（２−（５−（３，５−ジメチルイソキサゾール−４−イル）−１−（２−モルホリノエチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）エチル）フェノキシ）エタン−１−アミン（Ｂｉユニット、１４）
１３（３０ｍｇ，５１μｍｏｌ）を、１．２５ｍｍｏｌのＨＣｌを含有するＭｅＯＨ（５ｍＬ）およびＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）の混合物中に溶解した。該混合物を３時間還流した。該反応物を冷却し、濃縮し、ＥｔＯＡｃおよびＣＨ２Ｃｌ２中に溶解した。該混合物を飽和ＮａＨＣＯ３ａｑで中和した。有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過した。該混合物を次いで、濃縮して、２５．６ｍｇのベージュ色のガムを得た。該混合物を更に精製するとなく、ＰＩポリアミドコンジュゲートの合成に用いた。
【００５４】
（２）ＰＩポリアミドの設計および合成
５’−ＷＷＣＷＧＷＣＷ−３’および５’−ＷＧＣＣＧＣＣＷ−３’（ここに、ＷはＡまたはＴ）を標的配列とする２つのＰＩポリアミドを設計し（それぞれ、「ＰＩＰ１」および「ＰＩＰ２」と称する）、既知の方法にしたがって合成した。簡単に言うと、ＰＳＳＭ−８ペプチド合成器（島津製作所）により、Ｐｙ−オキシム樹脂上で固相合成を行った。次いで、化合物をＮ，Ｎ−ジメチルプロパンジアミンを用いて切り出した（４５℃、３時間）。粗化合物を、ＹＭＣ  Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８カラム（１５０×２０ｍｍ，ＹＭＣ）を用いるＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＰＵ−２０８９プラスシリーズシステム（Jasco）上で逆相ＨＰＬＣにより精製した。溶離剤として水中０．１％ＴＦＡおよびアセトニトリルを用い、流速１０ｍｌ／分で、２５４ｎｍで検出した。
【００５５】
（３）ＰＩポリアミドコンジュゲートの合成
【００５６】
【化９】
2019199471.tif 000010
【００５７】
Ｎ末端にカルボン酸を有するＰＩポリアミドと、上記ＢＤ阻害剤ユニットとのカップリングにより、それぞれ５’−ＷＷＣＷＧＷＣＷ−３’および５’−ＷＧＣＣＧＣＣＷ−３’（ここに、ＷはＡまたはＴ）を標的とする２つのコンジュゲート（それぞれ、「Ｂｉ−ＰＩＰ１」および「Ｂｉ−ＰＩＰ２」と称する）を既知の方法にしたがって合成した。簡単に言うと、Ｂｉユニット（１当量）および上記で合成したＰＩＰ（１当量）および１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリ（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）（２当量）を１５０μＬのジメチルホルムアミド中で混合した。次に、ＤＩＥＡ（５当量）を加え、反応物を室温で１．５時間振盪した。粗Ｂｉ−ＰＩＰを、ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩカラム（１５０×１０ｍｍ，Nacalai Tesque）を用いるＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＰＵ−２０８９プラスシリーズシステム（Jasco）上における逆相ＨＰＬＣで精製した。水中０．１％ＴＦＡおよびアセトニトリルを溶離剤として用い、流速３ｍｌ／分で、２５４ｎｍで検出した。精製したＢｉ−ＰＩＰを分析ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで特徴付けた。
Ｂｉ−ＰＩＰ１
分析HPLC tR = 17.6 min; MALDI-TOF MS m/z C118H152N35O24+ [M + H]+の計算値2443.17、測定値2443.51
Ｂｉ−ＰＩＰ２
分析HPLC tR = 17.8 min; MALDI-TOF MS m/z C115H149N38O24+ [M + H]+ の計算値2446.16、測定値2446.46
【００５８】
実施例２：Ｂｉ−ＰＩＰによる標的ＤＮＡ配列を有するヌクレオソーム上でのヒストンアセチル化の促進
（１）Ｂｉ−ＰＩＰによるヌクレオソーム上での配列選択的ヒストンアセチル化
Ｂｉ−ＰＩＰによる配列選択的ヒストンアセチル化を試験するために、ＨＡＴ反応、次いで以前に報告された再構成したヌクレオソームを用いる免疫沈降（ＣｈＩＰ）（Nguyen et al, Nat. Methods 2014, 11, 834-40）、および定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を組み合わせることによる生化学的アッセイ（ＨＡＴ反応−インビトロＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ）を確立した（図２Ａ〜Ｃ）。
【００５９】
ヒストン発現および精製
ヒトヒストンタンパク質（Ｈ２Ａ  ｔｙｐｅ１−Ｂ／Ｅ、Ｈ２Ｂ  ｔｙｐｅ１−Ｋ、Ｈ３．１およびＨ４）を、Ｔ７プロモーター駆動発現ベクターｐＥＴ２２ｂを用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に発現させた。尿素バッファー（６Ｍ尿素，２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）および１ｍＭ２−メルカプトエタノール）中の粗ヒストンを、ＡＫＴＡ  ｐｕｒｅ  ２５タンパク質製製システム（GE Healthcare）上のＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰカラム（GE Healthcare）を用いる陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。０．２−０．７Ｍ  ＮａＣｌを含有する尿素バッファーを溶出に用いた。標的ヒストンモノマーを含有するフラクションを回収し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４（Merck），ＭＷＣＯ  １０ｋＤａ遠心フィルターユニットを用いて濃縮した。バッファーをアンフォールディングバッファー（６Ｍ塩化グアニジウム，２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）および５ｍＭ２−メルカプトエタノール）に交換した。
【００６０】
ヒストンオクタマーの精製
上記で得たアンフォールディングバッファー中の各ヒストンモノマー２０μＭを含有する１０ｍｌのＨ２Ａ−Ｈ２Ｂ−Ｈ３−Ｈ４オクタマー再構成溶液を７０００  ＭＷＣＯ  ＳｎａｋｅＳｋｉｎ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｔｕｂｉｎｇ（Thermo Fisher Scientific）にパックし、５００ｍｌのプレ−リフォールディングバッファー（６Ｍ尿素、２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）およびリフォールディングバッファー（６Ｍ尿素無しのプレ−リフォールディングバッファー）に対して各々、２時間および１２時間４℃で透析した。遠心分離（１５０００ｒｐｍ，１０分，４℃）によって不純物を除去後、ＡＫＴＡ  ｐｕｒｅ  ２５タンパク質精製システム上のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ２００（GE Healthcare）およびリフォールディングバッファーを用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって、ヒストンオクタマーを精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってフラクションを分析し、ヒストンオクタマーを含有するフラクションを回収し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４を用いて濃縮した。
【００６１】
ヌクレオソームの再構成
ヒストンオクタマーならびにＷｉｄｏｍ６０１ヌクレオソームポジショニング配列および５つのＰＩポリアミド結合配列（Ｂｉ−ＰＩＰ１について、５’−ＡＡＣＡＧＴＣＡ−３’、およびＢｉ−ＰＩＰ２について５’−ＡＧＣＣＧＣＣＡ−３’）を有するＤＮＡ鋳型から、塩透析法（salt-dialysis method）を用いてモノヌクレオソームを再構成した（図２Ａ）。ゲル電気泳動により、ＤＮＡ鋳型の大部分が首尾良くヌクレオソーム上に形成されたことを確認した。こうして得られた２つのヌクレオソームをそれぞれ、「Ｎｕｃ１」（Ｂｉ−ＰＩＰ１に対する結合配列を５つ有するもの）、および「Ｎｕｃ２」（Ｂｉ−ＰＩＰ２に対する結合配列を５つ有するもの）と称する。
【００６２】
簡単に言うと、鋳型ＤＮＡ（４００ｎＭ）およびヒストンオクタマー（４４０ｎＭ）の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨバッファー（ｐＨ７．５）中混合物を、透析カップ（ＭＷＣＯ  ８０００， Bio.tech）を用いて、高塩バッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．５；２Ｍ  ＮａＣｌ）を用いて２時間透析し、次いで低塩バッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．５；０Ｍ  ＮａＣｌ）中で、４℃で一晩透析した。透析後、２６０ｎｍ波長でＤＮＡの吸光度を測定することによって、ヌクレオソームの濃度を決定した。再構成されたヌクレオソームは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（６％ＤＮＡ遅延ゲル，Thermo Fisher Scientific）によって分析した。使用した鋳型ＤＮＡの配列を下記に示す。
【００６３】
Ｎｕｃ１の鋳型ＤＮＡ（下線部は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを示す。Ｂｉ−ＰＩＰ結合配列を四角で囲む。太文字は、Ｗｉｄｏｍ６０１ヌクレオソームポジショニング配列を示す。）
【００６４】
【化１０】
2019199471.tif 000011
【００６５】
Ｎｕｃ２の鋳型ＤＮＡ（下線部は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを示す。Ｂｉ−ＰＩＰ結合配列を四角で囲む。太文字は、Ｗｉｄｏｍ６０１ヌクレオソームポジショニング配列を示す。）
【００６６】
【化１１】
2019199471.tif 000012
【００６７】
ヒストンアセチル化反応
ＨＡＴ反応は既知の方法に基づいて行った。簡単に言うと、１５μＬのＨＡＴバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０％グリセロール，１ｍＭ  ＤＴＴ，ｐＨ８．０）中の再構成したヌクレオソームＮｕｃ１およびＮｕｃ２の混合物（各１０ｎＭ）を、種々の濃度（０、１、３、１０、３０、１００ｎＭ）の組み換えヒトＰ３００（アミノ酸９６５−１８１０）（BPS Bioscience, catalog number: 50071）と共に、１０μＭのアセチル−ＣｏＡ（Wako）の存在下、１００ｎＭのＢｉ−ＰＩＰ１の存在下または不在下（Ｂｉ−ＰＩＰ１の代わりに、ＤＭＳＯ（vehicle）を添加した）で、３０℃で１時間インキュベートした。
【００６８】
インビトロクロマチン免疫沈降ないし定量的ポリメラーゼ連鎖反応（in vitro ChIP-1PCR）
ＨＡＴ反応液（１５μＬ）に、１／５００容量のパン−アセチル化Ｈ３（Ｋ９、Ｋ１４、Ｋ１８、Ｋ２３、Ｋ２７でアセチル化）に対する抗体（抗−アセチル化Ｈ３、Abcam社製, ab47915）を含有する８５μＬのＡＢバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、室温で１時間インキュベートした。次いで、１００μＬのＡＢバッファー中の４０μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ（Thermo Fisher Scientific）を混合物に加え、さらに室温で１時間インキュベートした。２００μＬのＡＢバッファーでビーズを３回洗浄し、１００μＬの溶離バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１Ｍ  ＮａＣｌ）を加えた。沈澱したＤＮＡを９０℃で５分間振盪することによって溶離させた。ＤＮＡ溶液を希釈し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０（Roche Diagnostics GmbH）上でのＳＹＢＲ  ＦＡＳＴ  ｑＰＣＲ  Ｋｉｔ（Kapa Bioscience）を用いるｑＰＣＲによって、免疫沈降した各ヌクレオソームの量を測定した（図２Ｂ）。Ｃｐ値は、２ｎｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｍａｘｉｍｕｍ法によって決定し、相対的ＲＮＡ量をΔΔＣｐ法によって計算した。ｑＰＣＲには、上記ＤＮＡ鋳型に特異的なプライマー対（表１）を用いた。陽性対照として、合成アセチル化ヒストンＨ３（Ｋ４ａｃ、Ｋ９ａｃ、Ｋ１４ａｃ、Ｋ１８ａｃ、Ｋ２３ａｃ）を有するヌクレオソームを用いて同様に実験した。
【００６９】
【表１】
2019199471.tif 000013
【００７０】
結果を図３に示す。１００ｎＭ Ｂｉ−ＰＩＰ１の添加は、その標的Ｎｕｃ１において強力なアセチル化を誘導した。一方、Ｎｕｃ２ではアセチル化は誘導されなかった。アセチル化レベルの増加は、Ｐ３００の濃度に依存した。
【００７１】
（２）ＢｉモノマーおよびＰＩＰモノマーとの比較
次に、ＢｉおよびＰＩＰドメインの重要性を明らかにするために、各モノマー分子を上記（１）に記載のアッセイにおいて試験した（図１参照）。上記（１）に記載の方法にしたがい、Ｎｕｃ１およびＮｕｃ２の混合物を１０ｎＭの組み換えヒトＰ３００（アミノ酸９６５−１８１０）と共に、１００ｎＭのＢｉ−ＰＩＰ１、１００ｎＭのＰＩＰ１モノマー単独、１００ｎＭのＢｉモノマー単独、または１００ｎＭのＰＩＰ１モノマーおよび１００ｎＭのＢｉモノマーの混合物の存在下でインキュベートし、ＣｈＩＰ、次いでｑＰＣＲを行った。陰性対照として、上記Ｂｉ−ＰＩＰ、ＰＩＰモノマーまたはＢｉモノマーあるいはその混合物の代わりに、ＤＭＳＯ（vehicle）を添加して同様の実験を行った。
【００７２】
結果を図４に示す。ＰＩＰ１モノマー単独、Ｂｉモノマー単独およびその混合物はいずれも、アセチル化を促進しなかった。この結果は、明らかに、ＰＩＰドメインのその標的ＤＮＡ配列への配列選択的結合およびＢＤ−Ｂｉ相互作用によって媒介されるＰ３００のリクルートによって、Ｂｉ−ＰＩＰによるＮｕｃ１選択的アセチル化が達成されたことを示す。
【００７３】
（３）Ｂｉ−ＰＩＰのプログラム可能性の確認
Ｂｉ−ＰＩＰのプログラム可能性を試験するために、Ｎｕｃ２を標的とするように設計されたＢｉ−ＰＩＰ２を用いて上記（１）と同様に試験した（図１参照）。上記（１）に記載の方法にしたがい、Ｎｕｃ１およびＮｕｃ２の混合物を１０ｎＭの組み換えヒトＰ３００（アミノ酸９６５−１８１０）と共に、１００ｎＭのＢｉ−ＰＩＰ１または１００ｎＭのＢｉ−ＰＩＰ２の存在下でインキュベートし、ＣｈＩＰ、次いでｑＰＣＲを行った。
【００７４】
結果を図５に示す。Ｂｉ−ＰＩＰ２は、Ｎｕｃ２の選択的アセチル化を引き起こした。したがって、Ｂｉ−ＰＩＰの標的配列がプログラム可能であることが示された。
【００７５】
（４）マススペクトロメトリー分析
Ｂｉ−ＰＩＰでのヒストンアセチル化を直接マススペクトロメトリー分析で確認した。Ｎｕｃ１（５００ｎＭ）、Ｂｉ−ＰＩＰ１（０または２．５μＭ）、組み換えヒトＰ３００（５０ｎＭ）およびＡｃ−ＣｏＡ（１０μＭ）を用いるＨＡＴ反応後、ヒストンを非修飾リジンのプロピオニル化、トリプシン消化、および末端アミンのプロピオニル化によって処理した。得られたペプチドを液体クロマトグラフィー−タンデムマススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって分析した。その結果、上記の抗体によるアッセイ結果と同様に、Ｈ３（例えば、Ｈ３Ｋ１４ａｃ、Ｈ３Ｋ１８ａｃ、Ｈ３Ｋ２３ａｃ、Ｈ３Ｋ２７ａｃ、およびＨ３Ｋ３６ａｃ）のＮ末端領域にアセチルリジンを含有するペプチドについて、シグナル強度の増加が観察された。また、アセチル化は、Ｈ４Ｋ５ａｃ、Ｈ４Ｋ８ａｃ、およびＨ４Ｋ１２ａｃを含む、ヒストンＨ４のＮ末端領域において促進されることも見出された。
【００７６】
実施例３：Ｂｉ−ＰＩＰによる生存細胞における選択的遺伝子活性化
Ｂｉ−ＰＩＰが細胞性環境において機能するか否かを評価した。最初の実験として、ＨＡＴ供給源として組み換えＰ３００の代わりにＨｅＬａ核抽出物を用いて、実施例２−（１）に記載の方法にしたがって、ＨＡＴ反応−インビトロＣｈＩＰ−ｑＰＣＲアッセイを行った。ＨｅＬａ核抽出物は、Ｐ３００／ＣＢＰだけでなく他の細胞性ＨＡＴおよびＨＤＡＣも含有するので、組み換えＰ３００のみを用いて観察された場合よりも、細胞様環境を提供した。簡単に言うと、Ｎｕｃ１およびＮｕｃ２の混合物に、反応液中２％ｖ／ｖになるようにＨｅＬａ核抽出物（０．３μＬ／反応）を添加し、１００ｎＭのＢｉ−ＰＩＰ１の存在下または不在下でインキュベートし、ＣｈＩＰ、次いでｑＰＣＲを行った。対照として、ＨｅＬａ核抽出物およびＢｉ−ＰＩＰ１の両方を用いずにインキュベートし、同様に実験した。
【００７７】
結果を図６に示す。図６は、［核抽出物（＋）／Ｂｉ−ＰＩＰ（−）］試料の値に対して標準化したＮｕｃ１およびＮｕｃ２の相対量を示す。Ｂｉ−ＰＩＰ１を用いないアセチル化の基底レベルは増加したものの、Ｂｉ−ＰＩＰ１は、Ｎｕｃ２ではなく、Ｎｕｃ１のアセチル化のみを増強した。このことは、Ｂｉ−ＰＩＰを生存細胞に適用できることを示唆する。
【００７８】
実施例４：Ｂｉ−ＰＩＰ処理細胞におけるトランスクリプトーム解析
遺伝子発現を活性化する転写コアクチベーターとしてのＰ３００／ＣＢＰの基本的役割を考慮して、Ｂｉ−ＰＩＰで処理された細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）から抽出した全ＲＮＡのトランスクリプトーム解析を行った。＞２または＜−２倍変化および＜０．０５Ｐ値の基準を差別的発現された転写物の検出に適用した。
【００７９】
細胞処理およびＲＮＡ抽出
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＡＴＣＣから購入し、１０％（ｖ／ｖ）胎子ウシ血清（FBS, Sigma Aldrich）を補足したＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２下で維持した。Ｂｉ−ＰＩＰでの処理のために、細胞を２４ウェルプレート（２×１０５細胞／ウェル）に播種した。１日後、１μＭの各Ｂｉ−ＰＩＰおよび４μＭのＥｎｄｏ−Ｐｏｒｔｅｒ（１０％ポリエチレングリコール形態， Gene Tools）を加えた。０．１％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）をビヒクルとして用いた。Ｂｉ−ＰＩＰ処理の１５時間後、ＦａｓｔＧｅｎｅ（登録商標）ＲＮＡ  Ｂａｓｉｃ  Ｋｉｔ（Nippon Genetics）を用いて、製造者の指示書にしたがい、ＲＮＡを抽出した。
【００８０】
マイクロアレイ
ＲＮＡのクオリティーは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００  Ｐｉｃｏ  Ｋｉｔ（Agilent Technologies）を用いてＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Agilent Technologies）でチェックした。全ＲＮＡは、ｂｙ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＷＴ  ＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Affymetrix）で処理し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，  Ｗａｓｈ，  ａｎｄ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（Affymetrix）を用いてＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  ２．１  ＳＴ  Ａｒｒａｙ  Ｓｔｒｉｐ（Affymetrix）にハイブリダイズした。ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，  Ｗａｓｈ，  ａｎｄ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（Affymetrix）を用いて、フルーディックスおよびスキャンをＧｅｎｅＡｔｌａｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Affymetrix）で行った。データの標準化、サマライズおよび比較を、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｎｓｏｌｅ  ｖ４（Affymetrix）を用いて行った。
【００８１】
その結果、Ｂｉモノマーは、遺伝子発現において最小限の変化のみを示した（２つのアップレギュレート転写物および４つのダウンレギュレート転写物）。ＰＩＰ１モノマーおよびＰＩＰ２モノマーは、全体的な遺伝子発現において中程度の変化をもたらした（ＰＩＰ１により３２個のアップレギュレートおよび３１個のダウンレギュレート転写物、ＰＩＰ２により１４３個のアップレギュレートおよび６３個ダウンレギュレート転写物）。一方、Ｂｉ−ＰＩＰ１およびＢｉ−ＰＩＰ２コンジュゲートは、主に抑制よりも活性化について、より大きなトランスクリプトソーム変化を与えた（Ｂｉ−ＰＩＰ１により４７３個のアップレギュレートおよび２５８個のダウンレギュレート転写物、Ｂｉ−ＰＩＰ２により４４６個のアップレギュレートおよび１３７個のダウンレギュレート転写物）。したがって、Ｂｉ−ＰＩＰが、クロマチン上へＰ３００／ＣＢＰをリクルートし、ヒストンアセチル化により、遺伝子発現の活性化をもたらすことが示された。
【００８２】
次いで、ＤＮＡ配列選択性の相違が遺伝子発現において異なる変化をもたらすか否かを評価した。トランスクリプトーム解析の結果に、２４７個の転写物がＢｉ−ＰＩＰ１およびＢｉ−ＰＩＰ２の両方によって共通してアップレギュレートされた。これは、Ｂｉ−ＰＩＰ１およびＢｉ−ＰＩＰ２の結合部位がゲノム全体において排他的に分布しておらず、故に、いくつかの遺伝子はＢｉ−ＰＩＰ１およびＢｉ−ＰＩＰ２の両方によって活性化されることができるためであると考えるのが妥当である。しかしながら、＞１．５または＜−１．５倍変化の基準を適用することによって、差別的に発現された転写物が同定された（図７Ａ）。これらの独特に活性化された転写物のうち、Ｂｉ−ＰＩＰ１およびＢｉ−ＰＩＰ２によって最もアップレギュレートされたタンパク質コード遺伝子は、それぞれ、ＮＴＳ（ニューロテンシン）およびＩＥＲ５Ｌ（immediate early response 5-like）であった。
【００８３】
ＲＴ−ｑＰＣＲ
上記２つの転写物の発現量をＲＴ−ｑＰＣＲを用いて測定した。全ＲＮＡをＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  Ｒｅｍｏｖｅｒ（Toyobo）で逆転写した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０（Roche Diagnostics GmbH）において、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ  ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（Toyobo）を用いてｑＰＣＲを行った。Ｃｐ値は、２ｎｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｍａｘｉｍｕｍ法によって決定し、相対的ＲＮＡ量をΔΔＣｐ法によって計算した。使用したプライマーの配列を表２に示す。
【００８４】
【表２】
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【００８５】
結果を図７Ｂに示す。さらに、各遺伝子座におけるＢｉ−ＰＩＰ１およびＢｉ−ＰＩＰ２の結合配列の位置を調べたところ、興味深いことに、ＮＴＳ遺伝子座のゲノム配列は、Ｂｉ−ＰＩＰ２ではなく、Ｂｉ−ＰＩＰ１の結合部位を含有し、ＩＥＲ５Ｌ遺伝子座は、Ｂｉ−ＰＩＰ１ではなく、Ｂｉ−ＰＩＰ２の結合部位を有することが分かった。このような別個の転写活性化および別個の結合部位の分布から、ＮＴＳおよびＩＥＲ５Ｌはそれぞれ、Ｂｉ−ＰＩＰ１およびＢｉ−ＰＩＰ２の推定標的遺伝子であると結論付けられた。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本明細書に開示されるＢｉ−ＰＩＰによる標的ヌクレオソームの修飾技術は、ヌクレオソーム単位でのエピジェネティック修飾クロストークのメカニズム解明や、エピゲノム編集・内在性遺伝子の発現活性化などへの応用が期待される。
【配列表フリーテキスト】
【００８７】
SEQ ID NO:1: Sequence of template DNA for Nuc1
SEQ ID NO:2: Sequence of template DNA for Nuc2
SEQ ID NO:3: Forward primer for Nuc1
SEQ ID NO:4: Forward primer for Nuc2
SEQ ID NO:5: Reverse primer for Nuc1 & Nuc2
SEQ ID NO:6: Forward primer for GAPDH
SEQ ID NO:7: Reverse primer for GAPDH
SEQ ID NO:8: Forward primer for NTS
SEQ ID NO:9: Reverse primer for NTS
SEQ ID NO:10: Forward primer for IER5L
SEQ ID NO:11: Reverse primer for IER5L
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
2019199471.tif 000026
【図７Ｂ】
2019199471.tif 000027
【配列表】
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