(57)【要約】  本明細書中に記載の方法は、治療上有効性又は毒性作用を見積もるための被験体に対する化合物の評価を可能にする。解析の標的は、疾患病因に関与すると考えられる基礎となる生化学プロセス又はプロセス群（すなわち代謝プロセス）である。1以上の生化学プロセス内での分子流束量がバイオマーカーとなり、定量化されて対照被験体（すなわち、化合物に曝露されていない被験体）からの分子流束量（すなわちバイオマーカー）と比較される。対照被験体でのバイオマーカーと比較しての被験体でのバイオマーカーにおけるいかなる変化も、投与薬物の治療上有効性又は毒性作用を評価するため、及び所望であれば該化合物を更に開発するために必要な情報を与える。本発明の一態様では、安定同位体標識基質分子を被験体に投与し、該標識が1以上の対象となる代謝経路を通る分子流束量を明らかにする様式で標的分子に取り込まれる。この方法によって、被験体と対照被験体との比較によりバイオマーカーに対する化学物質又は化学物質群の効果が明らかになる。つまり、このことは、化合物の潜在的な治療上の用途又は毒性の特定を可能にする。化合物の新規な治療的若しくは毒性の組み合わせを特定し且つ確認するための戦略として、本発明の方法を用いて、対象となる代謝経路に対する相補的、相乗的、又は拮抗的作用について化合物の組み合わせを網羅的に評価することもできる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患若しくは化合物活性についての信頼性のあるバイオマーカーとしての、決定経路を通る分子流束量に対する1種以上の化合物の作用を評価する方法であって、
a)  生体系を1種以上の化合物に曝露するステップと、
b)  同位体標識基質が1以上の対象となる代謝経路に到達し、これにより該生体系中の1以上の対象となる該代謝経路内の少なくとも1つの対象となる標的分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと、
c)  該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの対象となる同位体標識された標的分子を含むものであるステップと、
d)  少なくとも1種の対象となる該標的分子の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと、
e)  少なくとも1種の対象となる該標的分子の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、1以上の対象となる該代謝経路での分子流束量を算出するステップと、
f)  ステップa)に定めるように1種以上の該化合物に曝露されていない少なくとも1つの生体系において、ステップb)からe)に従い1以上の対象となる該代謝経路での分子流束量を測定するステップ、及び
g)  1種以上の化合物を投与した生体系における1以上の対象となる代謝経路での分子流束量と、1種以上の化合物を投与していない生体系における1以上の対象となる代謝経路での分子流束量とを比較することにより、該分子流束量に対する1種以上の該化合物の作用を評価するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２】
1以上の対象となる代謝経路での分子流束量が、1以上の疾患の基礎となる分子的病因又は原因に関連するものである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
1以上の対象となる代謝経路での分子流束量が、１以上の疾患に関する発生、進行、重症度、病理、侵襲性、進行度、活動性、後遺症、致死率、罹病率、疾患サブクラス又はその他の基礎となる病因的若しくは病理学的特徴の原因となるものである、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
対象となる代謝経路での分子流束量が、１以上の疾患に関する予後、生存率、罹病率、致死率、ステージ、治療応答、総体的症状、後遺症又はその他の臨床的因子の原因となるものである、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
1以上の対象となる代謝経路での分子流束量を同時に測定する、請求項2に記載の方法。
【請求項６】
対象となる代謝経路からの分子流束量の同時測定を、安定同位体標識技術を用いて行う、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
用いる同位体標識が安定（すなわち、非放射性）同位体である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
安定同位体標識で用いる安定同位体が、安定同位体標識水である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
安定同位体標識水が2H2Oである、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
対象となる代謝経路からの分子流束量の同時測定を、放射性同位体標識技術を用いて行う、請求項5に記載の方法。
【請求項１１】
1種以上の化合物が認可薬物である、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
認可薬物が、米国連邦政府食品医薬品局認可薬物である、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
認可薬物を任意に選択する、請求項11又は12に記載の方法。
【請求項１４】
認可薬物を、1以上の疾患の分子的病因において仮定される役割に関する特定の生化学的原理若しくは仮説に基づいて選択する、請求項11又は12に記載の方法。
【請求項１５】
1種以上の化合物が新規化学物質である、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
1種以上の化合物が生物学的因子である、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
生体系において疾患に関連する可能性がある1以上の代謝経路における分子流束量に対する前記作用を評価するために、1以上の疾患動物モデルを用いる、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
1以上の疾患動物モデルが、アルツハイマー病、心不全、腎疾患、糖尿病性腎症、骨粗鬆症、肝線維症、肝硬変、肝細胞壊死、肺線維症、強皮症、腎線維症、多発性硬化症、動脈硬化、変形性関節炎、関節リウマチ、乾癬、皮膚の紫外線老化、皮膚発疹、乳癌、前立腺癌、結腸癌、膵臓癌、肺癌、後天性免疫不全症候群、免疫欠如、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、糖尿病、糖尿病性合併症、インスリン耐性、肥満、リポジストロフィ、筋肉疲労、虚弱、体調不良、血管新生、高脂血症、不妊、ウイルス感染又は細菌感染、自己免疫障害、及び免疫発赤より選択される、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
1以上の対象となる代謝経路を、１種以上の化合物の特定の用量又は一定範囲の用量に対する応答において測定する、請求項1に記載の方法。
【請求項２０】
1以上の対象となる代謝経路が、肝細胞増殖及び破壊、全肝細胞増殖及び破壊、腎細管細胞ターンオーバー、リンパ球ターンオーバー、精母細胞ターンオーバー、筋肉及び心臓でのタンパク質合成及び分解、肝コラーゲン合成及び分解、脳又は末梢神経でのミエリン合成及び分解、乳房上皮細胞増殖、結腸上皮細胞増殖、前立腺上皮細胞増殖、卵巣上皮細胞増殖、子宮内膜細胞増殖、気管支上皮細胞増殖、膵上皮細胞増殖、皮膚でのケラチン合成、ケラチン生成細胞増殖、免疫グロブリン合成、ミトコンドリアDNA合成及び分解、ミトコンドリアリン脂質合成及び分解、ミトコンドリアタンパク質合成及び分解、脂肪合成及び分解、並びに脂肪細胞合成及び分解より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項２１】
認可薬物を、複数の生化学プロセスに対する作用について同時にスクリーニングする、請求項12に記載の方法。
【請求項２２】
認可薬物が、スタチン、グリタゾン、COX-2インヒビター、NSAID、β-ブロッカー、カルシウムチャネルブロッカー、ACEインヒビター、抗生物質、抗ウイルス剤、脂質低下剤、降圧剤、抗炎症剤、抗うつ剤、抗不安薬、抗精神病薬、鎮静剤、鎮痛剤、抗ヒスタミン剤、経口血糖降下剤、鎮痙薬、抗新生物薬、癌化学療法剤、性ステロイド、下垂体ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、食欲抑制剤、甲状腺ホルモン様薬剤、抗けいれん剤、交感神経刺激薬、サルファ剤、ビグアニド、及び他のクラスの薬剤より選択される、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
生体系が、原核細胞、真核細胞、細胞株、細胞培養、単離組織調製物、ウサギ、イヌ、マウス、ラット、ギニアピッグ、ブタ、非ヒト霊長類、及びヒトより選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項２４】
生体系がヒトである、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
同位体標識基質が、2H2O、2H-グルコース、2H-標識アミノ酸、2H-標識有機分子、13C-標識有機分子、13CO2、15N-標識有機分子、3H2O、3H-標識グルコース、3H-標識アミノ酸、3H-標識有機分子、14C-標識有機分子、及び14CO2より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項２６】
同位体標識基質が2H2Oである、請求項1に記載の方法。
【請求項２７】
該生体系において生物学的活性についての潜在能力を有することが確立されているか仮定されている用量範囲に従って、1種以上の化合物を投与する、請求項1に記載の方法。
【請求項２８】
1以上のサンプルを、生体系への同位体標識基質の投与又は接触後であり、且つ1種以上の化合物に生体系を曝露した後である既知の時点又は間隔において採取する、請求項1に記載の方法。
【請求項２９】
2種以上の化合物の組み合わせを該生体系に曝露する、請求項1に記載の方法。
【請求項３０】
1以上の代謝経路を通る分子流束量に対する化合物の組み合わせの相乗的、相補的、又は拮抗的作用を、化合物の組み合わせに曝露した生体系での分子流束量と、単一の化合物のみに曝露したか又は試験対象の化合物のいずれにも曝露していない生体系での分子流束量との比較により決定する、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
化合物の組み合わせを任意に選択する、請求項29に記載の方法。
【請求項３２】
化学物質の組み合わせを、1以上の疾患の分子的病因における1種以上の該化学物質の仮定される役割に関する特定の生化学的原理又は仮説に基づいて選択する、請求項29に記載の方法。
【請求項３３】
請求項1の方法により特定される薬物に対する権利。
【請求項３４】
毒性についての信頼性のあるバイオマーカーとしての、決定経路を通る分子流束量に対する1種以上の化合物の作用を評価する方法であって、
a)  生体系を1種以上の化合物に曝露するステップと、
b)  同位体標識基質が1以上の対象となる代謝経路に到達し、これにより該生体系中の1以上の対象となる該代謝経路内の少なくとも1つの対象となる標的分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するが、ここで1以上の対象となる該代謝経路は1以上の毒性作用と関連しているステップと、
c)  該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、1つ以上の対象となる同位体標識された標的分子を含むものであるステップと、
d)  対象となる該標的分子若しくは分子群の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと、
e)  対象となる該分子若しくは分子群での同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、1以上の対象となる該代謝経路での分子流束量を算出するステップと、
f)  1種以上の該化合物を投与していない1以上の生体系において、ステップb)からe)に従い1以上の対象となる該代謝経路での分子流束量を測定するステップ、及び
g)  1種以上の化合物を投与した生体系における1以上の対象となる代謝経路での分子流束量と、1種以上の化合物を投与していない1以上の生体系における1以上の該代謝経路での分子流束量とを比較し、それにより該分子流束量に対する1種以上の該化合物の作用を評価するステップ
を含む、上記方法。
【請求項３５】
毒性作用が、少なくとも1種の標的器官毒性を含む、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
標的器官毒性が、肝細胞増殖及び破壊、全肝細胞増殖及び破壊、腎細管細胞ターンオーバー、リンパ球ターンオーバー、精母細胞ターンオーバー、筋肉及び心臓でのタンパク質合成及び分解、肝コラーゲン合成及び分解、脳又は末梢神経でのミエリン合成及び分解、乳房上皮細胞増殖、結腸上皮細胞増殖、前立腺上皮細胞増殖、卵巣上皮細胞増殖、子宮内膜細胞増殖、気管支上皮細胞増殖、膵上皮細胞増殖、皮膚でのケラチン合成、ケラチン生成細胞増殖、免疫グロブリン合成、ミトコンドリアDNA合成及び分解、ミトコンドリアリン脂質合成及び分解、ミトコンドリアタンパク質合成及び分解、脂肪合成及び分解、並びに脂肪細胞合成及び分解より選択される、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
標的器官毒性に関連する1以上の対象となる代謝経路を、1種以上の化学物質の特定の用量又は一定範囲の用量に対する応答において測定する、請求項34に記載の方法。
【請求項３８】
生体系が、原核細胞、真核細胞、細胞株、細胞培養、単離組織調製物、ウサギ、イヌ、マウス、ラット、ギニアピッグ、ブタ、及び非ヒト霊長類より選択される、請求項34に記載の方法。
【請求項３９】
同位体標識基質が、2H2O、2H-グルコース、2H-標識アミノ酸、2H-標識有機分子、13C-標識有機分子、13CO2、15N-標識有機分子、3H2O、3H-標識グルコース、3H-標識アミノ酸、3H-標識有機分子、14C-標識有機分子、及び14CO2より選択される、請求項34に記載の方法。
【請求項４０】
同位体標識基質が2H2Oである、請求項34に記載の方法。
【請求項４１】
該生体系において生物学的活性についての潜在能力を有することが確立されているか仮定されている用量範囲に従って、化合物を投与する、請求項34に記載の方法。
【請求項４２】
1以上のサンプルを、生体系への同位体標識基質の投与又は接触後であり、且つ1種以上の化合物に生体系を曝露した後である既知の時点又は間隔において採取する、請求項34に記載の方法。
【請求項４３】
生体系を2種以上の化合物の組み合わせに曝露する、請求項34に記載の方法。
【請求項４４】
1以上の対象となる代謝経路を通る分子流束量に対する化合物の組み合わせの相乗的、相補的、又は拮抗的作用を、化合物の組み合わせに曝露した生体系での分子流束量と、単一の化合物のみに曝露したか又は1種以上の試験対象の化合物のいずれにも曝露していない生体系での分子流束量との比較により決定する、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
請求項1又は34に記載の方法により取得したデータを含んでなる、情報格納デバイス。
【請求項４６】
印刷したリポートである、請求項45に記載のデバイス。
【請求項４７】
前記リポートが印刷されている媒体が、紙、プラスチック、及びマイクロフィッシュより選択される、請求項46に記載の印刷したリポート。
【請求項４８】
コンピュータディスクである、請求項45に記載のデバイス。
【請求項４９】
前記ディスクが、コンパクトディスク、デジタルビデオディスク、光ディスク、及び磁気ディスクより選択される、請求項48に記載のディスク。
【請求項５０】
コンピュータである、請求項45に記載のデバイス。
【請求項５１】
請求項1又は34に記載の方法により生成される、同位体擾乱分子。
【請求項５２】
タンパク質、脂質、核酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、ポルフィリン、及び炭水化物分子より選択される、請求項51に記載の同位体擾乱分子。
【請求項５３】
ミエリンである、請求項51に記載の同位体擾乱分子。
【請求項５４】
アミロイドβである、請求項51に記載の同位体擾乱分子。
【請求項５５】
デオキシリボ核酸である、請求項51に記載の同位体擾乱分子。
【請求項５６】
リボ核酸である、請求項51に記載の同位体擾乱分子。
【請求項５７】
コラーゲンである、請求項51に記載の同位体擾乱分子。
【請求項５８】
トリグリセリドである、請求項51に記載の同位体擾乱分子。
【請求項５９】
被験体における疾患に関連する可能性がある1以上の代謝経路での分子流束量に対する作用について、1種以上の化合物のスクリーニングを行うためのキットであって、
a)  1種以上の同位体標識前駆体、及び
b)  キットの使用説明書
を含んでなる、上記キット。
【請求項６０】
前駆体分子の投与のための手段を更に含んでなる、請求項59に記載のキット。
【請求項６１】
被験体からのサンプルの採取のための器具を更に含んでなる、請求項59に記載のキット。
【請求項６２】
被験体における1以上の毒性作用に関連する可能性がある1以上の代謝経路での分子流束量に対する作用について、1種以上の化合物のスクリーニングを行うためのキットであって、
a)  1種以上の同位体標識前駆体、及び
b)  キットの使用説明書
を含んでなる、上記キット。
【請求項６３】
前駆体分子の投与のための手段を更に含んでなる、請求項62に記載のキット。
【請求項６４】
被験体からのサンプルの採取のための器具を更に含んでなる、請求項62に記載のキット。
【請求項６５】
請求項1に記載の方法によって少なくとも部分的に特定される1種以上の化合物の製造を更に含んでなる、請求項1に記載の方法。
【請求項６６】
請求項1に記載の方法によって少なくとも部分的に特定される1種以上の化合物を開発するステップを更に含んでなる、請求項1に記載の方法。
【請求項６７】
前記方法により得られるデータを1種以上の化合物の開発のステップにおいて用いる、請求項66に記載の方法。
【請求項６８】
以下のステップ：
a)  対象となるバイオマーカーとしての決定経路を通る分子流束量を1種以上の同位体を用いて測定するステップと、
b)  ステップa)の結果を、対象となる化合物の存在下での対象となるバイオマーカーの決定経路を通る分子流束量と比較するステップと、
c)  対象となる化合物が対象となる分子流束量を変化させる場合に、該化合物を開発するステップ
を含む方法。
【請求項６９】
治療薬又は診断薬を商業的に販売するステップを更に含む、請求項68に記載の方法。
【請求項７０】
治療薬又は診断薬を譲渡するステップを更に含む、請求項68に記載の方法。
【請求項７１】
医学的疾患若しくは状態をモニタリング又は診断するための方法であって、
a)  同位体標識基質が1以上の対象となる代謝経路に到達し、これにより生体系中の1以上の対象となる該代謝経路内の少なくとも1つの対象となる標的分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと、
b)  該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの対象となる同位体標識された標的分子を含有するステップと、
c)  少なくとも1種の対象となる標的分子の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップ、及び
d)  少なくとも1種の対象となる標的分子の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、1以上の対象となる該代謝経路での分子流束量を算出し、それにより医学的疾患若しくは状態をモニタリング又は診断するステップ
を含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、米国仮出願第60/546,580号（2004年2月20日出願）及び米国仮出願第60/581,028号（2004年6月17日出願）についての優先権を主張し、これらの出願は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本発明は、種々の疾患及び障害の基礎となる生化学プロセスにおける変化を測定するための方法に関する。より具体的には、本発明は、診断、予後診断、及び治療目的のために、これらの生化学プロセスの分子流束量を測定することに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
生物学及び医学の分野では、大部分の疾患の徴候及び症状（臨床表現型）は基礎となる生化学的及び分子的プロセスの二次的な結果であり、言い換えればこれらのプロセスが疾患の原因となる必須の推進力であり、また病因的要素であるということが一般的に認められている。生化学的な表現で言えば、大部分の疾患の基礎となるプロセスは、複雑な生化学経路を通る分子流束（molecular flux）として最もよく説明することができる。これらの基礎となる生化学プロセス（すなわち、非常に複雑な、適応的代謝経路又はネットワークを通る分子の流れ）は、発症前の段階から、臨床的に明らかな段階若しくは病的な段階にわたる疾患又は障害の発症及び/又は進行の原因であり、従って、現代の臨床治療（例えば、薬物療法、食餌療法、行動療法又は遺伝療法）の真の標的である。
【０００４】
疾患を進行させる上でのこれらのプロセスの支配的な重要性にもかかわらず、現行の薬物研究及び臨床診断は、in vivoでの主要な生化学プロセスにおける変化を測定するための、信頼性のある、再現性の高いハイスループットな測定手段を欠いている。現代の生化学のレパートリーにおけるこのギャップについての主な説明は方法論的なものであり、つまり、複雑な経路及びネットワークを通る分子流束は大部分の疾患の基礎であるが、分子流束量（molecular flux rate）を測定するための効果的な手段がない、というものである。この状況は、生体生物内の動的プロセス（流量、反応速度）の測定は、静的な分子パラメータ（例えば、分子の濃度、構造、又は組成）の測定とは異なる手段及びモデルを要する、という事実を反映している。従って、対象となる生物学的システムを構成する物理的なもの又は構成要素（遺伝子、タンパク質等）それ自体ではなく、生化学プロセスの進行速度を、対象として、又は薬物の作用若しくは疾患活動性の標的若しくはバイオマーカーとして標的としようとする考えは、新規なばかりでなく、以前には実行のための技術的手段のないものであった。
【０００５】
本明細書中には、薬物の創薬、開発及び認可（DDA）、臨床診断及び予後診断、並びに毒物学のためのバイオマーカーとして、生体系における代謝経路及びネットワークを通る分子流束量に対する化合物、化合物の組み合わせ、又は化合物の混合物（すなわち、化学物質（新規又は従前の）、薬物（例えば認可薬物又は既知薬物）、薬物リード、若しくは薬物候補、毒性物質、生物学的因子）の効果を試験するための方法を開示する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の概要
本発明は、疾患若しくは障害の病因又は進行に関与するか、関与すると考えられている生化学プロセスを解析することを目的とする。生化学プロセス（すなわち、標的となる代謝経路又はネットワークを通る分子の流れ）が解析（本明細書中で開示されている通り）の中心であり、なぜなら、疾患若しくは障害の治療又は診断的モニタリングのための重要若しくは真の標的は、基礎となる生化学プロセスでの変化（すなわち、分子流束量）であり得るためである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、薬剤（例えば、薬物、薬物候補、又は薬物リード）をはじめとする1種以上の化合物に曝露された細胞、組織、若しくは生物から測定される、対象となる1以上の代謝経路内での分子流束量と、非曝露細胞、組織、若しくは生物から測定される、対象となる1以上の代謝経路からの分子流束量との比較を可能にする。非曝露細胞、組織、若しくは生物とは、対象となる疾患又は状態を有するが、1種以上の薬剤（すなわち、化合物）にまだ曝露されていない細胞、組織、若しくは生物であるか、あるいは、非曝露細胞、組織、若しくは生物とは、対象となる疾患又は状態を有していない細胞、組織、若しくは生物であり得る。曝露分子流束量と非曝露分子流束量との差を明らかにし、次にこの情報を、薬剤をはじめとする1種以上の化合物（又はその組み合わせ若しくは混合物）が、曝露細胞、組織、若しくは生物において1以上の対象となる代謝経路での変化を引き起こすか否かを決定するために用いる。薬剤をはじめとする1種以上の化合物を哺乳動物に投与し、分子流束量を算出し、そして同種の非曝露哺乳動物から算出した分子流束量に対して評価することができる。あるいはまた、同一哺乳動物からの分子流束量を、薬剤をはじめとする1種以上の化合物への曝露に先立って算出し、次に1種以上の化合物への曝露後に同一哺乳動物において分子流束量を算出し、そして比較してもよい。哺乳動物はヒトであってよい。
【０００８】
別の実施形態では、疾患の分子的病因に関与する1以上の代謝経路において分子流束量を測定する。また別の実施形態では、1以上の代謝経路とは疾患の原因であるか、又は疾患の発症、進行、活動性、病理的帰結、症状、又は重症度の一因である。
【０００９】
別の実施形態では、毒性を評価するために、1種以上の化合物への曝露前後に、生体生物から対象となる1以上の代謝経路での分子流束量を測定する。かかる化合物は化学物質又は薬剤であり得る。一変法では、1種以上の化合物は工業的又は産業的化学薬品であり得る。別の変法では、1種以上の化合物は化粧品であり得る。また別の変法では、1種以上の化合物は食品添加物であり得る。そしてまた別の変法では、1種以上の化合物は環境汚染物質であり得る。対象となる毒性は、標的器官毒性（end-organ toxicity）又はいずれかの他の毒性評価項目であり得る。
【００１０】
あるいはまた、毒性を評価するために、1種以上の化合物又は化学物質の曝露を一方の生体生物に対するものとし、そして1以上の代謝経路からの分子流束量を、同一種の他方の曝露されていない生体生物と比較することができる。対象となる毒性は、標的器官毒性又はいずれかの他の毒性評価項目であり得る。
【００１１】
別の実施形態では、2以上の代謝経路の分子流束量を同時に測定する。また別の実施形態では、安定同位体標識技術を用いて分子流束量を測定する。同位体標識は、生体分子中に存在する元素の特定の重同位体、例えば2H、13C、15N、18O、33S、34Sを包含することができ、又は生体分子内に存在する元素の他の同位体、例えば3H、14C、32P、33P、35S、125I、131Iを含有してもよい。同位体標識前駆体としては、限定するものではないが、2H2O、15NH3、13CO2、H13CO3、2H-標識アミノ酸、13C-標識アミノ酸、15N-標識アミノ酸、18O-標識アミノ酸、34S-又は33S-標識アミノ酸、3H2O、3H-標識アミノ酸、及び14C-標識アミノ酸が挙げられる。安定同位体基質は、2H2O、2H-グルコース、2H-標識アミノ酸、13C-標識アミノ酸、2H-標識有機分子、13C-標識有機分子、及び15N-標識有機分子標識水より選択することができる。安定同位体基質は標識水でもよい。標識水とは2H2Oであり得る。
【００１２】
安定同位体標識基質は、対象となる1以上の代謝経路を構成する1以上の分子に取り込まれる。この様式では、ある特定の時間間隔にわたって、例えば質量分析を用いて標的分子中の同位体含量及び/又はパターン、あるいは同位体含量及び/若しくはパターンの変化の速度を測定し、それにより、当該技術分野で公知の解析方法及び計算方法を用いて対象となる1以上の代謝経路内の分子流束量の決定を可能にすることによって、分子流束量を決定することができる。
【００１３】
あるいはまた、放射線標識基質が本出願での使用のために意図され、この場合該放射線標識基質が対象となる1以上の代謝経路を構成する1以上の分子に取り込まれる。この様式では、シンチレーション計測のような当該技術分野で公知の技術を用いて、対象となる1以上の代謝経路内の対象となる1以上の標的分子の放射及び/又は放射活性を測定することにより、分子流束量を測定することができる。次に、当該技術分野で公知の方法を用いて、1以上の対象となる代謝経路内での分子流束量を算出する。
【００１４】
本発明は更に、1種以上の同位体擾乱分子（isotopically-perturbed molecule）を目的とする。同位体擾乱分子には、1種以上の安定同位体を含めることができる。同位体擾乱分子とは本明細書中に記載の標識方法の産物である。同位体擾乱分子は当該技術分野で公知のサンプリング技術により回収し、そして本明細書中に記載のもののような適当な分析手段を用いて分析する。
【００１５】
また別の実施形態では、同位体擾乱分子を1種以上の放射活性同位体で標識する。
【００１６】
また別の実施形態では、同位体標識前駆体と、それらの使用説明書を包含する1種以上のキットを提供する。該キットは安定同位体標識前駆体若しくは放射性標識同位体前駆体、又はその両者を包含することができる。安定同位体標識前駆体及び放射性標識同位体前駆体を1つのキット中に提供するか、又は2つ以上のキット中に別々にして提供してもよい。該キットは更に、同位体標識前駆体を投与するための1以上の手段を包含することができる。該キットはまた、被験体からサンプルを採取するための1以上の手段を包含することもできる。
【００１７】
また別の実施形態では、本発明の方法により生成したデータを含んでなる1以上の情報格納デバイスを提供する。該データは解析されていてもよいし、部分的に解析されるか、又は解析されていなくてもよい。該データは、紙、プラスチック、磁気的、光学的、その他の格納及び表示のための媒体に焼き付けることができる。
【００１８】
本出願は更に、本発明の方法により特定され、少なくとも部分的に特性決定される1種以上の化合物を目的とする。
【００１９】
本出願は更に、疾患についての信頼性のあるバイオマーカーとしての、決定経路（critical pathway）を通る分子流束量に対する1種以上の化合物の作用を評価する方法を目的とし、ここで該方法は、以下のステップ：a)生体系を1種以上の化合物に曝露するステップと；b)同位体標識基質が1以上の対象となる代謝経路に到達し、これにより該生体系中の1以上の対象となる該代謝経路内の少なくとも1つの対象となる標的分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；c)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの対象となる同位体標識された標的分子を含有するステップと；d)少なくとも1種の対象となる該標的分子の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；e)少なくとも1種の対象となる該標的分子の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、1以上の対象となる該代謝経路での分子流束量を算出するステップと；f)ステップa)に定めるように1種以上の該化合物に曝露されていない少なくとも1つの生体系において、ステップb)からe)に従い1以上の対象となる該代謝経路での分子流束量を測定するステップ；及びg)1種以上の化合物を投与した生体系における1以上の対象となる代謝経路での分子流束量と、1種以上の化合物を投与していない生体系における1以上の対象となる代謝経路での分子流束量とを比較することにより、該分子流束量に対する1種以上の該化合物の作用を評価するステップを含む。信頼性のあるバイオマーカーとは、疾患又は障害の進行に関与する標的代謝経路を通る分子の流れである。
【００２０】
対象となる1以上の代謝経路中の分子流束量は、1以上の疾患の基礎となる分子的病因、又は原因であり得る。更に、対象となる1以上の代謝経路での分子流束量は、1以上の疾患の発生、進行、重症度、病理、侵襲性、進行度、活動性、後遺症、致死率、罹病率、疾患サブクラス又はその他の基礎となる病因的若しくは病理学的特徴の原因となるものである場合もある。更に、対象となる代謝経路での分子流束量は、1以上の疾患の予後、生存率、罹病率、致死率、ステージ、治療応答、総体的症状、後遺症又はその他の臨床的因子の原因となるものである場合もある。
【００２１】
本発明の方法の一形式では、対象となる2以上の代謝経路の分子流束量を同時に測定する。本発明の別の形式では、1以上のサンプルを、生体系への同位体標識基質の投与若しくは接触後であり、且つ1種以上の化合物に生体系を曝露した後である既知の時点又は間隔において採取する。
【００２２】
対象となる代謝経路からの分子流束量の同時測定は、安定同位体標識技術を用いて行うことができる。用いる同位体標識は、安定（すなわち、非放射性）同位体であり得る。安定同位体標識は、同位体標識水、例えば2H2Oであり得る。
【００２３】
一形式では、対象となる代謝経路からの分子流束量の同時測定は、放射性同位体標識技術を用いて行うことができる。
【００２４】
別の形式では、1種以上の化合物は、認可薬物、例えば米国連邦政府食品医薬品局認可薬物であるか、又は米国以外の同様の機関により認可された薬物である。一形式では、認可薬物を任意に選択する。別の形式では、認可薬物を、1以上の疾患の分子的病因において仮定される役割に関する特定の生化学的原理若しくは仮説に基づいて選択することができる。別の形式では、1種以上の化合物は化学物質（新規又は従前の）又は生物学的因子である。認可薬物は、スタチン、グリタゾン、COX-2インヒビター、NSAID、β-ブロッカー、カルシウムチャネルブロッカー、ACEインヒビター、抗生物質、抗ウイルス剤、脂質低下剤、降圧剤、抗炎症剤、抗うつ剤、抗不安薬、抗精神病薬、鎮静剤、鎮痛剤、抗ヒスタミン剤、経口血糖降下剤、鎮痙薬、抗新生物薬、癌化学療法剤、性ステロイド、下垂体ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、食欲抑制剤、甲状腺ホルモン様薬剤、抗けいれん剤、交感神経刺激薬、サルファ剤、ビグアニド、及び他のクラスの薬剤より選択することができる。
【００２５】
本発明の一形式では、生体系において疾患に関連する可能性がある1以上の代謝経路での分子流束量に対する作用を評価するために、1以上の疾患動物モデルを用いる。1以上の該疾患動物モデルは、アルツハイマー病、心不全、腎疾患、糖尿病性腎症、骨粗鬆症、肝線維症、肝硬変、肝細胞壊死、肺線維症、強皮症、腎線維症、多発性硬化症、動脈硬化、変形性関節炎、関節リウマチ、乾癬、皮膚の紫外線老化、皮膚発疹、乳癌、前立腺癌、結腸癌、膵臓癌、肺癌、後天性免疫不全症候群、免疫欠如、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、糖尿病、糖尿病性合併症、インスリン耐性、肥満、リポジストロフィ、筋肉疲労、虚弱、体調不良、血管新生、高脂血症、不妊、ウイルス感染又は細菌感染、自己免疫障害、及び免疫発赤より選択することができる。
【００２６】
本発明の一形式では、1以上の対象となる代謝経路を、1種以上の化合物の特定の用量又は一定範囲の用量に対する応答において測定する。
【００２７】
1以上の対象となる代謝経路は、肝細胞増殖及び破壊、全肝細胞増殖及び破壊、腎細管細胞ターンオーバー、リンパ球ターンオーバー、精母細胞ターンオーバー、筋肉及び心臓でのタンパク質合成及び分解、肝コラーゲン合成及び分解、脳又は末梢神経でのミエリン合成及び分解、乳房上皮細胞増殖、結腸上皮細胞増殖、前立腺上皮細胞増殖、卵巣上皮細胞増殖、子宮内膜細胞増殖、気管支上皮細胞増殖、膵上皮細胞増殖、皮膚でのケラチン合成、ケラチン生成細胞増殖、免疫グロブリン合成、ミトコンドリアDNA合成及び分解、ミトコンドリアリン脂質合成及び分解、ミトコンドリアタンパク質合成及び分解、脂肪合成及び分解、並びに脂肪細胞合成及び分解より選択することができる。
【００２８】
本発明のまた別の形式では、認可薬物を複数の生化学プロセスに対する作用について同時にスクリーニングする。
【００２９】
一形式では、生体系を、原核細胞、真核細胞、細胞株、細胞培養、単離組織調製物、ウサギ、イヌ、マウス、ラット、ギニアピッグ、ブタ、非ヒト霊長類、及びヒトより選択する。
【００３０】
別の形式では、同位体標識基質を、2H2O、2H-グルコース、2H-標識アミノ酸、2H-標識有機分子、13C-標識有機分子、13CO2、15N-標識有機分子、3H2O、3H-標識グルコース、3H-標識アミノ酸、3H-標識有機分子、14C-標識有機分子、及び14CO2より選択する。
【００３１】
1種以上の化合物は、生体系において生物学的活性についての潜在能力を有することが確立されているか仮定されている用量範囲に従って投与することができる。
【００３２】
本発明の別の形式では、2種以上の化合物の組み合わせを生体系に曝露する。この形式では、1以上の代謝経路を通る分子流束量に対する化合物の組み合わせの相乗的、相補的、又は拮抗的作用を、化合物の組み合わせに曝露した生体系での分子流束量と、単一の化合物のみに曝露したか又は試験対象の化合物のいずれにも曝露していない生体系での分子流束量との比較により決定する。一形式では、化合物の組み合わせを任意に選択する。化合物の組み合わせは、1以上の疾患の分子的病因における1種以上の該化合物の仮定される役割に関する特定の生化学的原理又は仮説に基づいて選択してもよい。
【００３３】
本発明は更に、毒性についての信頼性のあるバイオマーカーとしての、決定経路を通る分子流束量に対する作用を評価する方法であって、以下のステップ：a)生体系を1種以上の化合物に曝露するステップと；b)同位体標識基質が1以上の対象となる代謝経路に到達し、これにより該生体系中の1以上の対象となる該代謝経路内の少なくとも1つの対象となる標的分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するが、ここで1以上の対象となる該代謝経路は1以上の毒性作用と関連しているステップと；c)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、1つ以上の対象となる同位体標識された標的分子を含有するステップと；d)対象となる該標的分子若しくは分子群の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；e)対象となる該分子若しくは分子群での同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、1以上の対象となる該代謝経路での分子流束量を算出するステップと；f)1種以上の該化合物を投与していない1以上の生体系において、ステップb)からe)に従い1以上の対象となる該代謝経路での分子流束量を測定するステップ；及びg)1種以上の化合物を投与した生体系における1以上の対象となる代謝経路での分子流束量と、1種以上の化合物を投与していない1以上の生体系における1以上の該代謝経路での分子流束量とを比較するステップを含む方法を目的とする。
【００３４】
1以上の毒性作用は、少なくとも1種の標的器官毒性（end-organ toxicity）を包含することができる。標的器官毒性は、肝細胞増殖及び破壊、全肝細胞増殖及び破壊、腎細管細胞ターンオーバー、リンパ球ターンオーバー、精母細胞ターンオーバー、筋肉及び心臓でのタンパク質合成及び分解、肝コラーゲン合成及び分解、脳又は末梢神経でのミエリン合成及び分解、乳房上皮細胞増殖、結腸上皮細胞増殖、前立腺上皮細胞増殖、卵巣上皮細胞増殖、子宮内膜細胞増殖、気管支上皮細胞増殖、膵上皮細胞増殖、皮膚でのケラチン合成、ケラチン生成細胞増殖、免疫グロブリン合成、ミトコンドリアDNA合成及び分解、ミトコンドリアリン脂質合成及び分解、ミトコンドリアタンパク質合成及び分解、脂肪合成及び分解、並びに脂肪細胞合成及び分解より選択することができる。
【００３５】
標的細胞毒性に関連する1以上の代謝経路は、1種以上の対象となる化合物の特定の用量又は一定範囲の用量に対する応答において測定することができる。
【００３６】
生体系は、原核細胞、真核細胞、細胞株、細胞培養、単離組織調製物、ウサギ、イヌ、マウス、ラット、ギニアピッグ、ブタ、及び非ヒト霊長類より選択することができる。かかる毒性作用は単離ヒト細胞又は組織調製物で分析することができるが、in vivoのヒトでは行わない。生体系を2種以上の化合物の組み合わせに曝露してもよい。1以上の対象となる代謝経路を通る分子流束量に対する化合物の組み合わせの相乗的、相補的、又は拮抗的作用は、化合物の組み合わせに曝露した生体系での分子流束量と、単一の化合物のみに曝露したか又は1種以上の試験対象の化合物のいずれにも曝露していない生体系での分子流束量との比較により決定することができる。
【００３７】
本発明の方法を用いて生成した情報を、情報格納デバイスに格納することができる。デバイスは印刷したリポートであり得る。リポートを印刷する媒体は、紙、プラスチック、及びマイクロフィッシュより選択することができる。デバイスはコンピュータディスクであってもよい。該ディスクは、コンパクトディスク、デジタルビデオディスク、光ディスク、及び磁気ディスクより選択することができる。デバイスはコンピュータでもよい。
【００３８】
本出願は更に、本発明の方法により生成される同位体擾乱分子を目的とする。該分子は、タンパク質、脂質、核酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、ポルフィリン、及び炭水化物分子より選択することができる。一形式では、同位体擾乱分子はミエリン、アミロイド-β、デオキシリボ核酸、リボ核酸、コラーゲン又はトリグリセリドである。
【００３９】
本出願は更に、被験体における疾患に関連する可能性がある1以上の代謝経路での分子流束量に対する作用について、1種以上の化合物のスクリーニングを行うためのキットであって、a)1種以上の同位体標識前駆体、及びb)キットの使用説明書を含んでなるキットを目的とする。該キットは、前駆体分子の投与のための手段又は被験体からのサンプルの採取のための器具を更に含むことができる。
【００４０】
本出願は更に、被験体における1以上の毒性作用に関連する可能性がある1以上の代謝経路での分子流束量に対する作用について、1種以上の化合物のスクリーニングを行うためのキットであって、a)1種以上の同位体標識前駆体、及びb)キットの使用説明書を含んでなるキットを目的とする。該キットは、前駆体分子の投与のための手段又は被験体からのサンプルの採取のための器具を更に含むことができる。
【００４１】
本出願の方法は、本発明の方法により少なくとも部分的に特定される1種以上の化合物を製造するステップを更に包含することができる。本発明の方法は、本発明の方法により少なくとも部分的に特定される1種以上の化合物を開発するステップを更に包含することができる。
【００４２】
本出願は更に、以下のステップ：対象となる信頼性のあるバイオマーカーについての分子流束量を、同位体を用いて測定するステップと；ステップa)の結果を、対象となる化合物の存在下での対象となる信頼性のあるバイオマーカーの分子流束量と比較するステップと；対象となる化合物が対象となる分子流束量を変化させる場合に、該化合物を更に開発するステップを含む方法を目的とする。
【００４３】
本出願は更に、臨床的若しくは医学的疾患又は状態をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が1以上の対象となる代謝経路に到達し、これにより生体系中の1以上の対象となる該代謝経路内の少なくとも1つの対象となる標的分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの対象となる同位体標識された標的分子を含有するステップと；c)少なくとも1種の対象となる標的分子の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)少なくとも1種の対象となる標的分子の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、1以上の対象となる該代謝経路/バイオマーカーでの分子流束量を算出し、それにより臨床的若しくは医学的疾患又は状態をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００４４】
表1では、信頼性のあるバイオマーカー、関連する臨床的若しくは医学的疾患又は状態、及び本出願の方法を用いて検出されるべき対象となる分子の具体例を示す。表1を考慮して、本出願は更に、臨床的若しくは医学的疾患又は状態をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が1以上の対象となる代謝経路に到達し、これにより生体系中の1以上の対象となる該代謝経路内の少なくとも1つの対象となる標的分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの対象となる同位体標識された標的分子を含有するステップと；c)少なくとも1種の対象となる標的分子の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)少なくとも1種の対象となる標的分子の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、1以上の対象となる該代謝経路/バイオマーカーでの分子流束量を算出し、それにより臨床的若しくは医学的疾患又は状態をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。別の形式では、臨床的若しくは医学的疾患又は状態に対する化合物の効果の予測因子として、バイオマーカーに対する1種以上の化合物の作用を評価するために、生体系における1以上の対象となる代謝経路の分子流束量の測定の前又は後に、1種以上の化合物を生体系に投与する。
【００４５】
表1に示したように、本発明の方法を用いて種々の臨床的若しくは医学的疾患又は状態を診断又はモニタリングすることができる。後記でより詳細に説明した臨床的若しくは医学的疾患又は状態のそれぞれを、1種以上の化合物の投与の前後に本発明の方法を用いてモニタリングし、それにより可能性のある治療、診断薬又は原因物質の作用を評価することができる。
【００４６】
例えば、肥満、脂肪萎縮（lipoatrophy）、脂肪分布、若しくは肥厚化-肥大は、脂肪トリグリセリド動態を測定又は検出することによりモニタリングあるいは診断することができる。この方法では、対象となる標的分子はトリグリセリドグリセロール又は1種以上の脂肪酸である。そうすると、本出願は更に、生体系において肥満、脂肪萎縮、脂肪分布若しくは肥厚化-肥大をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が脂肪トリグリセリド代謝経路に到達し、これにより生体系中の脂肪トリグリセリド代謝経路内の少なくとも1つのトリグリセリドグリセロール又は脂肪酸に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識されたトリグリセリドグリセロール又は脂肪酸を含有するステップと；c)トリグリセリドグリセロール又は脂肪酸の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)トリグリセリドグリセロール又は脂肪酸の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、脂肪トリグリセリド代謝経路での分子流束量を算出し、それにより肥満、脂肪萎縮、脂肪分布及び/若しくは肥厚化-肥大をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００４７】
肥厚化-肥大は、脂肪細胞動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は脂肪細胞から単離されたDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において肥厚化-肥大をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が脂肪代謝経路に到達し、これにより生体系中の脂肪代謝経路内の少なくとも1つの脂肪細胞から単離されたDNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された脂肪細胞から単離されたDNA分子を含有するステップと；c)脂肪細胞から単離されたDNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)脂肪細胞から単離されたDNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、脂肪代謝経路での分子流束量を算出し、それにより肥厚化-肥大をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００４８】
不健康（unfitness）、心血管疾患リスク、自己中毒性薬物、体調不良若しくは虚弱は、筋ミトコンドリアDNA又はリン脂質動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は筋ミトコンドリア由来DNA又は筋ミトコンドリア由来リン脂質である。この形式では、本出願は更に、生体系において不健康、心血管疾患リスク、自己中毒性薬物、体調不良若しくは虚弱をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が筋ミトコンドリアDNA又はリン脂質代謝経路に到達し、これにより生体系中の筋ミトコンドリアDNA又はリン脂質代謝経路内の少なくとも1つの筋ミトコンドリア由来DNA分子又は筋ミトコンドリア由来リン脂質に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された筋ミトコンドリア由来DNA分子又は筋ミトコンドリア由来リン脂質を含有するステップと；c)筋ミトコンドリア由来DNA又は筋ミトコンドリア由来リン脂質の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)筋ミトコンドリア由来DNA又は筋ミトコンドリア由来リン脂質の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、筋ミトコンドリアDNA又はリン脂質代謝経路での分子流束量を算出し、それにより不健康、心血管疾患リスク、自己中毒性薬物、体調不良若しくは虚弱をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００４９】
虚弱、消耗又は栄養障害（dystrophy）は、筋タンパク質動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は筋由来タンパク質である。この形式では、本出願は更に、生体系において虚弱、消耗若しくは栄養障害をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が筋タンパク質代謝経路に到達し、これにより生体系中の筋タンパク質代謝経路内の少なくとも1つの筋由来タンパク質に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された筋由来タンパク質を含有するステップと；c)筋由来タンパク質の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)筋由来タンパク質の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、筋タンパク質代謝経路での分子流束量を算出し、それにより虚弱、消耗若しくは栄養障害をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００５０】
アテローム硬化又は真性糖尿病リスクは、脂肪分解の動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子はトリグリセリドグリセロール又は1種以上の脂肪酸である。この形式では、本出願は更に、生体系においてアテローム硬化をモニタリング又は診断するか、あるいは真性糖尿病リスクを評価するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が脂肪分解経路に到達し、これにより生体系中の脂肪分解経路内の少なくとも1つのトリグリセリドグリセロール又は脂肪酸に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識されたトリグリセリドグリセロール又は脂肪酸を含有するステップと；c)トリグリセリドグリセロール又は脂肪酸の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)トリグリセリドグリセロール又は脂肪酸の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、脂肪分解経路での分子流束量を算出し、それによりアテローム硬化をモニタリング又は診断するか、あるいは真性糖尿病リスクを評価するステップを含む方法を目的とする。
【００５１】
炭水化物過剰摂取、同化ブロック、脂肪酸化障害又はエネルギーバランス障害は、脂肪又は肝臓でのde novo脂質合成の動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は1種以上の脂肪酸である。この形式では、本出願は更に、生体系において炭水化物過剰摂取、同化ブロック、脂肪酸化障害若しくはエネルギーバランス障害をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が脂肪代謝経路又は肝臓でのde novo脂質合成経路に到達し、これにより生体系中の脂肪代謝経路又は肝臓でのde novo脂質合成経路内の少なくとも1つ以上の脂肪酸に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された脂肪酸を含有するステップと；c)脂肪酸の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)脂肪酸の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、脂肪代謝経路又は肝臓でのde novo脂質合成経路での分子流束量を算出し、それにより炭水化物過剰摂取、同化ブロック、脂肪酸化障害若しくはエネルギーバランス障害をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００５２】
インスリン耐性、グルコース耐性障害又は真性糖尿病リスクは、解糖系の動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は水である。この形式では、本出願は更に、生体系においてインスリン耐性、グルコース耐性障害若しくは真性糖尿病リスクをモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が解糖系に到達し、これにより生体系中の解糖経路内の少なくとも1つの水分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された水分子を含有するステップと；c)水の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)水の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、解糖経路での分子流束量を算出し、それによりインスリン耐性、グルコース耐性障害若しくは真性糖尿病リスクをモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００５３】
肥満リスク、代謝低下若しくは代謝亢進、又は化合物若しくは治療薬に対する応答は、代謝的H2O若しくはCO2産生の動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は水又はCO2である。この形式では、本出願は更に、生体系において肥満リスク、代謝低下若しくは亢進、又は化合物若しくは治療薬に対する応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が代謝的H2O又はCO2産生経路に到達し、これにより生体系中の代謝的H2O又はCO2産生経路内の少なくとも1つの水分子又はCO2分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された水分子を含有するステップと；c)水の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)水の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、代謝的H2O又はCO2産生経路での分子流束量を算出し、それにより肥満リスク、代謝低下若しくは代謝亢進、又は化合物若しくは治療薬に対する応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００５４】
肥満リスク又はインスリン耐性は、脂肪酸酸化の動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は水である。この形式では、本出願は更に、生体系において肥満リスク若しくはインスリン耐性をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が脂肪酸酸化経路に到達し、これにより生体系中の脂肪酸酸化経路内の少なくとも1つの水分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された水分子を含有するステップと；c)水の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)水の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、脂肪酸酸化経路での分子流束量を算出し、それにより肥満リスク若しくはインスリン耐性をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００５５】
肝インスリン耐性、代謝低下若しくは代謝亢進又はその治療は、肝グルコース産生の動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子はグルコースである。この形式では、本出願は更に、生体系において肝インスリン耐性又は代謝低下若しくは亢進をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が肝グルコース産生経路に到達し、これにより生体系中の肝グルコース産生経路内の少なくとも1つのグルコース分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識されたグルコース分子を含有するステップと；c)グルコースの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)グルコースの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、肝グルコース産生経路での分子流束量を算出し、それにより肝インスリン耐性、代謝低下若しくは代謝亢進又はその治療をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００５６】
肝脂肪変性（腫瘍及び肝硬変を含む）又はその治療は、肝トリグリセリド合成の動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子はトリグリセリドグリセロール又は1種以上の脂肪酸である。この形式では、本出願は更に、生体系において肝脂肪変性をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が肝トリグリセリド合成経路に到達し、これにより生体系中の肝トリグリセリド合成経路内の少なくとも1つのトリグリセリドグリセロール又は脂肪酸に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識されたトリグリセリドグリセロール又は脂肪酸を含有するステップと；c)トリグリセリドグリセロール又は脂肪酸の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)トリグリセリドグリセロール又は脂肪酸の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、肝トリグリセリド合成経路での分子流束量を算出し、それにより肝脂肪変性をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００５７】
膵臓負荷（pancreatic burden）、膵予備力（pancreatic reserve）若しくは真性糖尿病リスク又はその治療は、β細胞DNA動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は膵β細胞由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において膵臓負荷、膵予備力若しくは真性糖尿病リスクをモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質がβ細胞DNAに到達し、これにより生体系中のβ細胞DNA内の少なくとも1つの膵β細胞由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された膵β細胞由来DNA分子を含有するステップと；c)膵β細胞由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)膵β細胞由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、β細胞DNAでの分子流束量を算出し、それにより膵臓負荷、膵予備力若しくは真性糖尿病リスク又はその治療をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００５８】
膵臓負荷若しくは膵予備力又はその治療は、インスリン動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子はインスリンである。この形式では、本出願は更に、生体系において膵臓負荷/膵予備力をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質がインスリン代謝経路に到達し、これにより生体系中のインスリン代謝経路内の少なくとも1つのインスリン分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識されたインスリン分子を含有するステップと；c)インスリンの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)インスリンの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、インスリン代謝経路での分子流束量を算出し、それにより膵臓負荷及び/若しくは膵予備力をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００５９】
真性糖尿病性合併症又はその治療は、糖化最終産物動態若しくは糖化最終産物グリコシル化動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は糖化最終産物である。この形式では、本出願は更に、生体系において真性糖尿病性合併症をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が糖化最終産物経路/糖化最終産物グリコシル化経路に到達し、これにより生体系中の糖化最終産物経路又は糖化最終産物グリコシル化経路内の少なくとも1つの糖化最終産物に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された糖化最終産物を含有するステップと；c)糖化最終産物の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)糖化最終産物の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、糖化最終産物経路又は糖化最終産物グリコシル化経路での分子流束量を算出し、それにより真性糖尿病性合併症若しくはその治療をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００６０】
カロリー制限/長命養生法（longevity regimen）は、ケラチン生成細胞又は乳房上皮細胞動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子はケラチン生成細胞又は乳房上皮細胞由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系においてカロリー制限/長命養生法をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質がケラチン生成細胞又は乳房上皮細胞産出経路に到達し、これにより生体系中のケラチン生成細胞又は乳房上皮細胞産出経路内の少なくとも1つのケラチン生成細胞又は乳房上皮細胞由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識されたケラチン生成細胞又は乳房上皮細胞由来DNA分子を含有するステップと；c)ケラチン生成細胞又は乳房上皮細胞由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)ケラチン生成細胞又は乳房上皮細胞由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、ケラチン生成細胞又は乳房上皮細胞産出経路での分子流束量を算出し、それによりカロリー制限/長命養生法をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００６１】
高リポタンパク質血症又はその治療は、肝胆汁酸動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は1種以上の肝胆汁酸である。この形式では、本出願は更に、生体系において高リポタンパク質血症をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が肝胆汁酸合成経路に到達し、これにより生体系中の肝胆汁酸合成経路内の少なくとも1つの肝胆汁酸に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された肝胆汁酸を含有するステップと；c)肝胆汁酸の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)肝胆汁酸の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、肝胆汁酸合成経路での分子流束量を算出し、それにより高リポタンパク質血症若しくはその治療をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００６２】
高リポタンパク質血症若しくは肝硬変/脂肪変性リスク又はその治療は、エタノールからアセテート及びトリグリセリドへの変換の動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は1種以上の脂肪酸又はアセテートである。この形式では、本出願は更に、生体系において高リポタンパク質血症若しくは肝硬変/脂肪変性リスクをモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質がエタノールからアセテート及びトリグリセリドへの変換経路に到達し、これにより生体系中のエタノールからアセテート及びトリグリセリドへの変換経路内の少なくとも1つの脂肪酸又はアセテートに到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された脂肪酸又はアセテートを含有するステップと；c)脂肪酸又はアセテートの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)脂肪酸又はアセテートの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、エタノールからアセテート及びトリグリセリドへの変換経路での分子流束量を算出し、それにより高リポタンパク質血症若しくは肝硬変/脂肪変性リスク又はその治療をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００６３】
冠動脈疾患リスク又は冠動脈疾患の治療は、アポリポタンパク質B動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子はアポリポタンパク質Bである。この形式では、本出願は更に、生体系において冠動脈疾患リスクをモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質がアポリポタンパク質B代謝経路に到達し、これにより生体系中のアポリポタンパク質B代謝経路内の少なくとも1つのアポリポタンパク質B分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識されたアポリポタンパク質B分子を含有するステップと；c)アポリポタンパク質Bの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)アポリポタンパク質Bの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、アポリポタンパク質B代謝経路での分子流束量を算出し、それにより冠動脈疾患リスク又は冠動脈疾患の治療をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００６４】
冠動脈疾患リスク、膵炎若しくは高リポタンパク質血症又はその治療は、超低密度リポタンパク質（VLDL）-トリグリセリド動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子はアポリポタンパク質B及びトリグリセリドグリセロールである。この形式では、本出願は更に、生体系において冠動脈疾患リスク、膵炎若しくは高リポタンパク質血症をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質がVLDL/トリグリセリド代謝経路に到達し、これにより生体系中のVLDL/トリグリセリド代謝経路内の少なくとも1つのアポリポタンパク質B又はトリグリセリドグリセロール分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識されたアポリポタンパク質B又はトリグリセリドグリセロール分子を含有するステップと；c)アポリポタンパク質B及びトリグリセリドグリセロールの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)アポリポタンパク質B及びトリグリセリドグリセロールの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、VLDL/トリグリセリド代謝経路での分子流束量を算出し、それにより冠動脈疾患リスク、膵炎若しくは高リポタンパク質血症又はその治療をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００６５】
スタチン応答又は冠動脈疾患リスクは、コレステロール動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は血清又は血液由来のコレステロールである。この形式では、本出願は更に、生体系においてスタチン応答又は冠動脈疾患リスクをモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質がコレステロール合成経路に到達し、これにより生体系中のコレステロール合成経路内の少なくとも1つの血清又は血液由来コレステロール分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、スタチンの存在下又は非存在下に同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された血清又は血液由来コレステロール分子を含有するステップと；c)血清又は血液由来コレステロールの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)血清又は血液由来コレステロールの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、コレステロール合成経路での分子流束量を算出し、それによりスタチン応答又は冠動脈疾患リスクをモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００６６】
アテローム硬化リスク又はアテローム硬化の治療は、血管平滑筋細胞動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は血管平滑筋細胞由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系においてアテローム硬化リスクをモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が血管平滑筋細胞産出経路に到達し、これにより生体系中の血管平滑筋細胞産出経路内の少なくとも1つの血管平滑筋細胞由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された血管平滑筋細胞由来DNA分子を含有するステップと；c)血管平滑筋細胞由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)血管平滑筋細胞由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、血管平滑筋細胞産出経路での分子流束量を算出し、それによりアテローム硬化リスク又はアテローム硬化の治療をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００６７】
冠動脈疾患リスク又はその治療は、コレステロール輸送動態（コレステロール逆輸送）を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は胆汁酸及びコレステロールである。この形式では、本出願は更に、生体系において冠動脈疾患リスクをモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質がコレステロール逆輸送経路に到達し、これにより生体系中のコレステロール逆輸送経路内の少なくとも1つの胆汁酸及びコレステロール分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された胆汁酸及びコレステロール分子を含有するステップと；c)胆汁酸及びコレステロールの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)胆汁酸及びコレステロールの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、コレステロール逆輸送経路での分子流束量を算出し、それにより冠動脈疾患リスクをモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００６８】
心筋症又はその治療は、心筋タンパク質動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は心筋由来のタンパク質である。この形式では、本出願は更に、生体系において心筋症をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が心筋タンパク質合成経路に到達し、これにより生体系中の心筋タンパク質合成経路内の少なくとも1つの心筋由来タンパク質に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された心筋由来タンパク質を含有するステップと；c)心筋由来タンパク質の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)心筋由来タンパク質の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、心筋タンパク質合成経路での分子流束量を算出し、それにより心筋症若しくはその治療をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００６９】
心臓の健康状態（cardiac fitness）若しくはうっ血性心不全又はその治療は、心臓コラーゲン動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は心臓組織由来のコラーゲンである。この形式では、本出願は更に、生体系において心臓の健康状態若しくはうっ血性心不全をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が心臓コラーゲン合成経路に到達し、これにより生体系中の心臓コラーゲン合成経路内の少なくとも1つの心臓組織由来コラーゲン分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された心臓組織由来コラーゲン分子を含有するステップと；c)心臓組織由来コラーゲンの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)心臓組織由来コラーゲンの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、心臓コラーゲン合成経路での分子流束量を算出し、それにより心臓の健康状態若しくはうっ血性心不全又はその治療をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００７０】
脈管炎若しくはその治療は、血管平滑筋細胞又は内皮細胞動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は血管平滑筋細胞又は内皮細胞由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において脈管炎をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が血管平滑筋細胞又は内皮細胞産出経路に到達し、これにより生体系中の血管平滑筋細胞又は内皮細胞産出経路内の少なくとも1つの血管平滑筋細胞又は内皮細胞由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された血管平滑筋細胞又は内皮細胞由来DNA分子を含有するステップと；c)血管平滑筋細胞又は内皮細胞由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)血管平滑筋細胞又は内皮細胞由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、血管平滑筋細胞又は内皮細胞産出経路での分子流束量を算出し、それにより脈管炎若しくはその治療をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００７１】
乾癬、皮膚過剰増殖若しくは異所的形成（ectopy）又は1種以上の化合物を用いたその治療の応答は、ケラチン生成細胞動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子はケラチン生成細胞由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において乾癬、皮膚過剰増殖若しくは異所的形成をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質がケラチン生成細胞産出経路に到達し、これにより生体系中のケラチン生成細胞産出経路内の少なくとも1つのケラチン生成細胞由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識されたケラチン生成細胞由来DNA分子を含有するステップと；c)ケラチン生成細胞由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)ケラチン生成細胞由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、ケラチン生成細胞産出経路での分子流束量を算出し、それにより乾癬、皮膚過剰増殖若しくは異所的形成又は1種以上の化合物を用いたその治療の応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００７２】
乾癬又は皮膚バリアは、皮膚ケラチン動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は皮膚ケラチンである。この形式では、本出願は更に、生体系において乾癬若しくは皮膚バリアをモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が皮膚ケラチン合成経路に到達し、これにより生体系中の皮膚ケラチン合成経路内の少なくとも1つの皮膚ケラチン分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された皮膚ケラチン分子を含有するステップと；c)皮膚ケラチンの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)皮膚ケラチンの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、皮膚ケラチン合成経路での分子流束量を算出し、それにより乾癬若しくは皮膚バリアをモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００７３】
皮膚のしわ、皮膚筋炎（dermatomyolitis）若しくは強皮症又は1種以上の化合物を用いたその治療に対する応答は、皮膚コラーゲン動態及びエラスチン動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は皮膚（表皮又は真皮）由来のコラーゲンである。この形式では、本出願は更に、生体系において皮膚のしわ、皮膚筋炎若しくは強皮症をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が皮膚コラーゲン及びエラスチン合成経路に到達し、これにより生体系中の皮膚コラーゲン及びエラスチン合成経路内の少なくとも1つの皮膚由来コラーゲン分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された皮膚由来コラーゲン分子を含有するステップと；c)皮膚由来コラーゲンの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)皮膚由来コラーゲンの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、皮膚コラーゲン及びエラスチン合成経路での分子流束量を算出し、それにより皮膚のしわ、皮膚筋炎若しくは強皮症又は1種以上の化合物を用いたその治療に対する応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００７４】
創傷治癒、補助化合物（adjunctive compound）又は1種以上の化合物でのその治療に対する治療応答は、創傷コラーゲン動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は皮膚その他の創傷組織由来のコラーゲンである。この形式では、本出願は更に、生体系において創傷治癒、補助化合物若しくは治療応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が創傷コラーゲン産生経路に到達し、これにより生体系中の創傷コラーゲン産生経路内の少なくとも1つの皮膚その他の創傷組織由来コラーゲン分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された皮膚その他の創傷組織由来コラーゲン分子を含有するステップと；c)皮膚その他の創傷組織由来コラーゲンの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)皮膚その他の創傷組織由来コラーゲンの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、創傷コラーゲン産生経路での分子流束量を算出し、それにより創傷治癒、補助化合物若しくはその治療に対する治療応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００７５】
変形性関節炎、関節リウマチ、関節保護/破壊（joint protection/destruction）若しくは食餌（diet）又は1種以上の化合物を用いたその治療に対する応答は、滑膜腔ヒアルロン酸又はコンドロイチンスルフェート動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は関節液又は軟骨由来のヒアルロン酸及び関節液又は軟骨由来のコンドロイチンスルフェートである。この形式では、本出願は更に、生体系において変形性関節炎、関節リウマチ、関節保護/破壊若しくは食餌をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が滑膜腔ヒアルロン酸又はコンドロイチンスルフェート経路に到達し、これにより生体系中の滑膜腔ヒアルロン酸又はコンドロイチンスルフェート経路内の少なくとも1つの関節液又は軟骨由来ヒアルロン酸及び関節液又は軟骨由来コンドロイチンスルフェート分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された関節液又は軟骨由来ヒアルロン酸及び関節液又は軟骨由来コンドロイチンスルフェート分子を含有するステップと；c)関節液又は軟骨由来ヒアルロン酸及び関節液又は軟骨由来コンドロイチンスルフェートの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)関節液又は軟骨由来ヒアルロン酸及び関節液又は軟骨由来コンドロイチンスルフェートの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、滑膜腔ヒアルロン酸又はコンドロイチンスルフェート経路での分子流束量を算出し、それにより変形性関節炎、関節リウマチ、関節保護/破壊若しくは食餌をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００７６】
骨粗鬆症、ページェット病若しくは骨折治癒又は1種以上の化合物を用いたその治療に対する応答は、骨コラーゲン動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は骨由来のコラーゲンである。この形式では、本出願は更に、生体系において骨粗鬆症、ページェット病若しくは骨折治癒をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が骨コラーゲン合成経路に到達し、これにより生体系中の骨コラーゲン合成経路内の少なくとも1つの骨由来コラーゲン分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された骨由来コラーゲン分子を含有するステップと；c)骨由来コラーゲンの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)骨由来コラーゲンの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、骨コラーゲン合成経路での分子流束量を算出し、それにより骨粗鬆症、ページェット病若しくは骨折治癒又は1種以上の化合物を用いたその治療に対する応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００７７】
変形性関節炎、関節リウマチ、関節保護又は1種以上の化合物を用いたその治療に対する応答は、関節コラーゲン動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は関節液又は軟骨由来のコラーゲンである。この形式では、本出願は更に、生体系において変形性関節炎、関節リウマチ、関節保護若しくは治療に対する応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が関節コラーゲン合成経路に到達し、これにより生体系中の関節コラーゲン合成経路内の少なくとも1つの関節液又は軟骨由来コラーゲン分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された関節液又は軟骨由来コラーゲン分子を含有するステップと；c)関節液又は軟骨由来コラーゲンの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)関節液又は軟骨由来コラーゲンの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、関節コラーゲン合成経路での分子流束量を算出し、それにより変形性関節炎、関節リウマチ、関節保護若しくは1種以上の化合物を用いたその治療に対する応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００７８】
関節リウマチ若しくは関節破壊又は1種以上の化合物を用いたその治療に対する応答は、関節液白血球/T細胞動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は関節液中若しくは関節に付随する白血球又はT細胞由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において関節リウマチ若しくは関節破壊をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が関節液白血球/T細胞産出経路に到達し、これにより生体系中の関節液白血球/T細胞産出経路内の少なくとも1つの関節液中若しくは関節に付随する白血球又はT細胞由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された関節液中若しくは関節に付随する白血球又はT細胞由来DNA分子を含有するステップと；c)関節液中若しくは関節に付随する白血球又はT細胞由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)関節液中若しくは関節に付随する白血球又はT細胞由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、関節液白血球/T細胞産出経路での分子流束量を算出し、それにより関節リウマチ若しくは関節破壊又はその治療に対する応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００７９】
癌に対するリスク又はその治療に対する治療応答は、乳房上皮細胞動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は乳房上皮細胞由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において癌に対するリスク又は化合物若しくは治療応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が乳房上皮細胞産出経路に到達し、これにより生体系中の乳房上皮細胞産出経路内の少なくとも1つの乳房上皮細胞由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された乳房上皮細胞由来DNA分子を含有するステップと；c)乳房上皮細胞由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)乳房上皮細胞由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、乳房上皮細胞産出経路での分子流束量を算出し、それにより癌に対するリスク若しくはその治療をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００８０】
癌に対するリスク又はその治療は、結腸上皮細胞動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は結腸上皮細胞由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において癌に対するリスク又は化合物若しくは治療応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が結腸上皮細胞産出経路に到達し、これにより生体系中の結腸上皮細胞産出経路内の少なくとも1つの結腸上皮細胞由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された結腸上皮細胞由来DNA分子を含有するステップと；c)結腸上皮細胞由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)結腸上皮細胞由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、結腸上皮細胞産出経路での分子流束量を算出し、それにより癌に対するリスク又は化合物若しくは治療応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００８１】
癌に対するリスク又はその治療は、気管支細胞又は組織動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は気管支組織由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において癌に対するリスク又は化合物若しくは治療応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が気管支細胞又は組織産出経路に到達し、これにより生体系中の気管支細胞又は組織産出経路内の少なくとも1つの気管支組織由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された気管支組織由来DNA分子を含有するステップと；c)気管支組織由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)気管支組織由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、気管支細胞又は組織産出経路での分子流束量を算出し、それにより癌に対するリスク若しくはその治療をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００８２】
癌に対するリスク、良性前立腺過形成又はその治療は、前立腺上皮細胞動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は前立腺上皮細胞由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において癌に対するリスク、良性前立腺過形成又は化合物若しくは治療応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が前立腺上皮細胞産出経路に到達し、これにより生体系中の前立腺上皮細胞産出経路内の少なくとも1つの前立腺上皮細胞由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された前立腺上皮細胞由来DNA分子を含有するステップと；c)前立腺上皮細胞由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)前立腺上皮細胞由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、前立腺上皮細胞産出経路での分子流束量を算出し、それにより癌に対するリスク、良性前立腺過形成若しくはその治療をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００８３】
癌に対するリスク又はその治療は、前立腺、膀胱、胃、脳、卵巣又は頸部の腫瘍動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は腫瘍が発生しうる細胞（例えば上皮細胞）若しくは前癌細胞、又は増殖挙動が癌のリスクの増大に関連する細胞由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において癌に対するリスク又は化合物若しくは治療応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が前立腺、膀胱、胃、脳、卵巣又は頸部癌の腫瘍形成経路に到達し、これにより生体系中の前立腺、膀胱、胃、脳、卵巣又は頸部の腫瘍形成により発生しうる腫瘍からの細胞由来の少なくとも1つのDNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された腫瘍が発生しうる細胞由来DNA分子を含有するステップと；c)腫瘍が発生しうる細胞由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)腫瘍が発生しうる細胞由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、前立腺、膀胱、胃、脳、卵巣又は頸部癌の腫瘍形成での分子流束量を算出し、それにより癌に対するリスク若しくはその治療をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００８４】
腫瘍成長、進行度、予後、侵襲性、又はその治療は、充実性腫瘍（乳癌、結腸癌、肺癌、及びリンパ腫を含む）の動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は充実性腫瘍細胞由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において腫瘍成長、進行度、予後、侵襲性、若しくは治療応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が充実性腫瘍形成経路に到達し、これにより生体系中の充実性腫瘍形成経路内の少なくとも1つの充実性腫瘍細胞由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された充実性腫瘍細胞由来DNA分子を含有するステップと；c)充実性腫瘍細胞由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)充実性腫瘍細胞由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、充実性腫瘍形成経路での分子流束量を算出し、それにより腫瘍成長、進行度、予後、侵襲性、若しくはその治療をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００８５】
腫瘍成長、予後、又はその治療は、液性腫瘍の動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は液性腫瘍細胞由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において腫瘍成長、予後、又は化合物若しくは治療応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が液性腫瘍形成経路に到達し、これにより生体系中の液性腫瘍形成経路内の少なくとも1つの液性腫瘍細胞由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された液性腫瘍細胞由来DNA分子を含有するステップと；c)液性腫瘍細胞由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)液性腫瘍細胞由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、液性腫瘍形成経路での分子流束量を算出し、それにより腫瘍成長、予後、若しくはその治療をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００８６】
多発性骨髄腫活動性、予後、成長、組織量又はその治療は、免疫グロブリン、アルブミン、骨髄腫タンパク質動態又は骨髄腫細胞動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は血清若しくは骨髄由来の骨髄腫タンパク質、免疫グロブリン又はアルブミン、あるいは骨髄腫細胞由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において多発性骨髄腫活動性、予後、成長、組織量若しくはその治療に対する治療応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が免疫グロブリン、アルブミン、骨髄腫タンパク質又は骨髄腫細胞産出経路に到達し、これにより生体系中の免疫グロブリン、アルブミン、骨髄腫タンパク質又は骨髄腫細胞産出経路内の少なくとも1つの血清若しくは骨髄由来骨髄腫タンパク質、免疫グロブリン又はアルブミン、あるいは骨髄腫細胞由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された血清若しくは骨髄由来骨髄腫タンパク質、免疫グロブリン又はアルブミン、あるいは骨髄腫細胞由来DNA分子を含有するステップと；c)血清若しくは骨髄由来骨髄腫タンパク質、免疫グロブリン又はアルブミン、あるいは骨髄腫細胞由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)血清若しくは骨髄由来骨髄腫タンパク質、免疫グロブリン又はアルブミン、あるいは骨髄腫細胞由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、免疫グロブリン、アルブミン、骨髄腫タンパク質又は骨髄腫細胞産出経路での分子流束量を算出し、それにより多発性骨髄腫活動性、予後、成長、組織量若しくはその治療をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００８７】
血管新生又はその治療は、腫瘍血管内皮細胞（tumor endothelial cell）動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は腫瘍血管内皮細胞由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において血管新生又は化合物若しくは治療応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が腫瘍血管内皮細胞産出経路に到達し、これにより生体系中の腫瘍血管内皮細胞産出経路内の少なくとも1つの腫瘍血管内皮細胞由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された腫瘍血管内皮細胞由来DNA分子を含有するステップと；c)腫瘍血管内皮細胞由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)腫瘍血管内皮細胞由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、腫瘍血管内皮細胞産出経路での分子流束量を算出し、それにより血管新生若しくはその治療をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００８８】
血管新生又はその治療は、リボヌクレオチドレダクターゼ基質及び代謝物の動態（流量/回収量）を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子はデオキシアデノシン及びデオキシチミジンである。この形式では、本出願は更に、生体系において化合物若しくは治療応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質がリボヌクレオチドレダクターゼ基質の代謝系に到達し、これにより生体系中のリボヌクレオチドレダクターゼ基質の代謝系内の少なくとも1つのデオキシアデノシン及びデオキシチミジン分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識されたデオキシアデノシン及びデオキシチミジン分子を含有するステップと；c)デオキシアデノシン及びデオキシチミジンの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)デオキシアデノシン及びデオキシチミジンの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、リボヌクレオチドレダクターゼ基質の代謝系での分子流束量を算出し、それにより血管新生若しくはその治療に対する治療応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００８９】
癌リスク又はその治療に対する治療応答は、上皮幹細胞動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は上皮幹細胞由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において癌リスク又は化合物若しくは治療応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が上皮幹細胞産出経路に到達し、これにより生体系中の上皮幹細胞産出経路内の少なくとも1つの上皮幹細胞由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された上皮幹細胞由来DNA分子を含有するステップと；c)上皮幹細胞由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)上皮幹細胞由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、上皮幹細胞産出経路での分子流束量を算出し、それにより癌リスク若しくはその治療に対する治療応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００９０】
腫瘍進行度、予後、治療標的、又はその治療に対する治療応答は、腫瘍細胞RNA動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は腫瘍細胞由来のRNA（全体又は転写産物特異的）である。この形式では、本出願は更に、生体系において腫瘍進行度、予後、治療標的、又は化合物若しくは治療応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が腫瘍細胞転写に到達し、これにより生体系中の腫瘍細胞転写内の少なくとも1つの腫瘍細胞由来RNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された腫瘍細胞由来RNA分子を含有するステップと；c)腫瘍細胞由来RNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)腫瘍細胞由来RNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、腫瘍細胞転写での分子流束量を算出し、それにより腫瘍進行度、予後、治療標的、又はその治療に対する化合物若しくは治療応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００９１】
移植物の増殖及び成長は、T細胞その他の血液細胞動態（骨髄移植後）を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は移植細胞又は移植細胞から成熟した細胞由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において移植物の増殖及び成長をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質がT細胞その他の血液細胞産出経路に到達し、これにより生体系中のT細胞その他の血液細胞産出経路内の少なくとも1つの移植細胞又は移植細胞から成熟した細胞由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された移植細胞又は移植細胞から成熟した細胞由来DNA分子を含有するステップと；c)移植細胞又は移植細胞から成熟した細胞由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)移植細胞又は移植細胞から成熟した細胞由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、T細胞その他の血液細胞産出経路での分子流束量を算出し、それにより移植物の増殖及び成長をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００９２】
外科手術の妥当性は、腫瘍の切除縁での細胞動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は腫瘍の切除縁由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において外科手術の妥当性をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が腫瘍の切除縁で細胞を形成するための経路に到達し、これにより生体系中の腫瘍の切除縁で細胞を形成するための経路内の少なくとも1つの腫瘍の切除縁由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された腫瘍の切除縁由来DNA分子を含有するステップと；c)腫瘍の切除縁由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)腫瘍の切除縁由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、腫瘍の切除縁で細胞を形成するための経路での分子流束量を算出し、それにより外科手術の妥当性をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００９３】
進行度、侵襲性、又は移植片対宿主病治療応答は、被移植組織動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は被移植組織由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において進行度、侵襲性、若しくは移植片対宿主病治療応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が被移植組織の取り込み経路に到達し、これにより生体系中の被移植組織の取り込み経路内の少なくとも1つの被移植組織由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された被移植組織由来DNA分子を含有するステップと；c)被移植組織由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)被移植組織由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、被移植組織の取り込み経路での分子流束量を算出し、それにより進行度、侵襲性、若しくは移植片対宿主病治療応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００９４】
遺伝子サイレンシングによる癌の診断、癌進行のモニタリング及び癌の治療は、メチルシトシンの動態（メチルデオキシシトシンメチル化/メチル化低下）を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は対象となる細胞由来のDNAからのメチルデオキシシトシンである。この形式では、本出願は更に、生体系において遺伝子サイレンシング、予後又は化合物若しくは治療応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質がメチルデオキシシトシンメチル化経路に到達し、これにより生体系中のメチルデオキシシトシンメチル化経路内の少なくとも1つの対象となる細胞由来DNAからのメチルデオキシシトシン分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された対象となる細胞由来DNAからのメチルデオキシシトシン分子を含有するステップと；c)対象となる細胞由来DNAからのメチルデオキシシトシンの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)対象となる細胞由来DNAからのメチルデオキシシトシンの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、メチルデオキシシトシンメチル化経路での分子流束量を算出し、それにより癌若しくは癌進行又は遺伝子サイレンシングによる癌治療をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００９５】
アルツハイマー病リスク又はその治療に対する応答は、脳アミロイドβ又はアミロイド前駆体タンパク質動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子はアミロイドβペプチド若しくはアミロイド前駆体タンパク質又はそのいずれかの部分断片である。この形式では、本出願は更に、生体系においてアルツハイマー病リスク若しくは治療に対する応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が脳アミロイドβ又はアミロイド前駆体タンパク質合成経路に到達し、これにより生体系中の脳アミロイドβ又はアミロイド前駆体タンパク質合成経路内の少なくとも1つのアミロイドβペプチド若しくはアミロイド前駆体タンパク質又はそのいずれかの部分断片に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識されたアミロイドβペプチド若しくはアミロイド前駆体タンパク質又はそのいずれかの部分断片を含有するステップと；c)アミロイドβペプチド若しくはアミロイド前駆体タンパク質又はそのいずれかの部分断片の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)アミロイドβペプチド若しくはアミロイド前駆体タンパク質又はそのいずれかの部分断片の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、脳アミロイドβ又はアミロイド前駆体タンパク質合成経路での分子流束量を算出し、それによりアルツハイマー病リスク若しくはその治療に対する応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００９６】
多発性硬化症（MS）活動性、MSの治療に対する応答、脊髄及び脳損傷回復又はその治療に対する治療応答は、脳又は末梢神経系ミエリン動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は脳、末梢神経系又は血液由来のガラクトセレブロシドである。この形式では、本出願は更に、生体系において多発性硬化症（MS）活動性、MSの治療に対する応答、脊髄及び脳損傷回復及び/又は化合物若しくは治療応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が脳又は末梢神経系ミエリン生成経路に到達し、これにより生体系中の脳又は末梢神経系ミエリン生成経路内の少なくとも1つのガラクトセレブロシド分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識されたガラクトセレブロシド分子を含有するステップと；c)ガラクトセレブロシドの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)ガラクトセレブロシドの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、脳又は末梢神経系ミエリン生成経路での分子流束量を算出し、それにより多発性硬化症（MS）活動性、MSの治療に対する応答、脊髄及び脳損傷回復若しくはその治療に対する治療応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００９７】
神経細胞新生、X線治療毒性、発達、ストレス若しくは抑うつ又はその治療に対する治療応答は、神経細胞動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は神経細胞由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において神経細胞新生、X線治療毒性、発達、ストレス若しくは抑うつをモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が神経細胞新生経路に到達し、これにより生体系中の神経細胞新生経路内の少なくとも1つの神経細胞由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された神経細胞由来DNA分子を含有するステップと；c)神経細胞由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)神経細胞由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、神経細胞新生経路での分子流束量を算出し、それにより神経細胞新生、X線治療毒性、発達、ストレス若しくは抑うつ又はその治療に対する治療応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００９８】
精神障害又はその治療は、神経伝達物質動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は脳由来の神経伝達物質、又は他の組織中に見出される循環中若しくは分解した神経伝達物質である。この形式では、本出願は更に、生体系において精神障害をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が神経伝達物質合成経路に到達し、これにより生体系中の神経伝達物質合成経路内の少なくとも1つの神経伝達物質に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された神経伝達物質を含有するステップと；c)神経伝達物質の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)神経伝達物質の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、神経伝達物質合成経路での分子流束量を算出し、それにより精神障害若しくはその治療をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【００９９】
神経細胞新生、抑うつ又はその治療に対する治療応答は、神経前駆細胞動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は神経前駆細胞由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において神経細胞新生、抑うつ又は化合物若しくは治療応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が神経前駆細胞産出経路に到達し、これにより生体系中の神経前駆細胞産出経路内の少なくとも1つの神経前駆細胞由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された神経前駆細胞由来DNA分子を含有するステップと；c)神経前駆細胞由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)神経前駆細胞由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、神経前駆細胞産出経路での分子流束量を算出し、それにより神経細胞新生、抑うつ若しくはその治療に対する治療応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【０１００】
神経炎症、多発性硬化症、アルツハイマー病、卒中、自閉症、抑うつ、慢性疼痛、筋萎縮性側索硬化症、脳アミロイドアンギオパチー、興奮毒性損傷又はその治療に対する治療応答は、マイクログリア細胞動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子はマイクログリア由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において神経炎症、多発性硬化症、アルツハイマー病、卒中、自閉症、抑うつ、慢性疼痛、筋萎縮性側索硬化症、脳アミロイドアンギオパチー、興奮毒性損傷若しくは治療応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質がマイクログリア細胞産出経路に到達し、これにより生体系中のマイクログリア細胞産出経路内の少なくとも1つのマイクログリア由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識されたマイクログリア由来DNA分子を含有するステップと；c)マイクログリア由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)マイクログリア由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、マイクログリア細胞産出経路での分子流束量を算出し、それにより神経炎症、多発性硬化症、アルツハイマー病、卒中、自閉症、抑うつ、慢性疼痛、筋萎縮性側索硬化症、脳アミロイドアンギオパチー、興奮毒性損傷若しくはその治療に対する治療応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【０１０１】
アルツハイマー病、興奮毒性損傷、神経細胞新生、神経変性疾患又はその治療に対する治療応答は、脳微小管動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は中枢若しくは末梢神経系由来の微小管又は微小管サブフラクション（例えばタウ結合型、二量体型、ポリマー型）である。この形式では、本出願は更に、生体系においてアルツハイマー病、興奮毒性損傷、神経細胞新生、神経変性疾患若しくは治療応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が脳微小管産生経路に到達し、これにより生体系中の脳微小管産生経路内の少なくとも1つの中枢若しくは末梢神経系由来の微小管又は微小管サブフラクションに到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された中枢若しくは末梢神経系由来の微小管又は微小管サブフラクションを含有するステップと；c)中枢若しくは末梢神経系由来の微小管又は微小管サブフラクションの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)中枢若しくは末梢神経系由来の微小管又は微小管サブフラクションの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、脳微小管産生経路での分子流束量を算出し、それによりアルツハイマー病、興奮毒性損傷、神経細胞新生、神経変性疾患若しくはその治療に対する治療応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【０１０２】
肝細胞壊死、毒物曝露、肝炎又はその治療に対する応答は、肝細胞動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は肝細胞由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において肝細胞壊死、毒物曝露、肝炎若しくは治療に対する応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が肝細胞産出経路に到達し、これにより生体系中の肝細胞産出経路内の少なくとも1つの肝細胞由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された肝細胞由来DNA分子を含有するステップと；c)肝細胞由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)肝細胞由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、肝細胞産出経路での分子流束量を算出し、それにより肝細胞壊死、毒物曝露、肝炎若しくはその治療に対する応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【０１０３】
肝線維症、肝硬変リスク、予後、疾患活動性又はその治療に対する応答は、肝コラーゲン動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は肝臓由来のコラーゲンである。この形式では、本出願は更に、生体系において肝線維症、肝硬変リスク、予後、疾患活動性若しくは治療に対する応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が肝コラーゲン産生経路に到達し、これにより生体系中の肝コラーゲン産生経路内の少なくとも1つの肝臓由来コラーゲン分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された肝臓由来コラーゲン分子を含有するステップと；c)肝臓由来コラーゲンの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)肝臓由来コラーゲンの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、肝コラーゲン産生経路での分子流束量を算出し、それにより肝線維症、肝硬変リスク、予後、疾患活動性若しくはその治療に対する応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【０１０４】
肝毒素、ミトコンドリア毒素への曝露による影響、回復又は治療に対する応答は、肝ミトコンドリア動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は肝ミトコンドリア由来のDNA又はリン脂質である。この形式では、本出願は更に、生体系において肝毒素、ミトコンドリア毒素への曝露による影響、回復若しくは治療に対する応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が肝ミトコンドリア産出経路に到達し、これにより生体系中の肝ミトコンドリア産出経路内の少なくとも1つの肝ミトコンドリア由来DNA分子又はリン脂質に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された肝ミトコンドリア由来DNA分子又はリン脂質を含有するステップと；c)肝ミトコンドリア由来DNA又はリン脂質の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)肝ミトコンドリア由来DNA又はリン脂質の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、肝ミトコンドリア産出経路での分子流束量を算出し、それにより肝毒素、ミトコンドリア毒素への曝露による影響、回復若しくは治療に対する応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【０１０５】
腎毒素への曝露による影響、回復又は治療に対する応答は、腎上皮細胞動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は腎上皮細胞由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において腎毒素への曝露による影響、回復若しくは治療に対する応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が腎上皮細胞産出経路に到達し、これにより生体系中の腎上皮細胞産出経路内の少なくとも1つの腎上皮細胞由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された腎上皮細胞由来DNA分子を含有するステップと；c)腎上皮細胞由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)腎上皮細胞由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、腎上皮細胞産出経路での分子流束量を算出し、それにより腎毒素への曝露による影響、回復若しくは治療に対する応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【０１０６】
真性糖尿病性腎症リスク及び活動性又は治療に対する応答は、腎コラーゲン動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は腎臓由来のコラーゲンである。この形式では、本出願は更に、生体系において真性糖尿病性腎症リスク及び活動性若しくは治療に対する応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が腎コラーゲン産生経路に到達し、これにより生体系中の腎コラーゲン産生経路内の少なくとも1つの腎臓由来コラーゲン分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された腎臓由来コラーゲン分子を含有するステップと；c)腎臓由来コラーゲンの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)腎臓由来コラーゲンの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、腎コラーゲン産生経路での分子流束量を算出し、それにより真性糖尿病性腎症リスク及び活動性若しくは治療に対する応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【０１０７】
肺線維症疾患活動性、治療に対する応答；黒色肺、過敏性肺炎、アスベスト症、珪肺若しくは慢性閉塞性肺疾患又はその治療に対する応答は、肺コラーゲン動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は肺コラーゲンである。この形式では、本出願は更に、生体系において肺線維症疾患活動性、治療に対する応答；黒色肺、過敏性肺炎、アスベスト症、珪肺若しくは慢性閉塞性肺疾患をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が肺コラーゲン産生経路に到達し、これにより生体系中の肺コラーゲン産生経路内の少なくとも1つの肺コラーゲン分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された肺コラーゲン分子を含有するステップと；c)肺コラーゲンの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)肺コラーゲンの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、肺コラーゲン産生経路での分子流束量を算出し、それにより肺線維症疾患活動性、黒色肺、過敏性肺炎、アスベスト症、珪肺若しくは慢性閉塞性肺疾患又はその治療に対する応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【０１０８】
肺気腫予後又はその治療に対する治療応答は、肺エラスチン動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は肺エラスチンである。この形式では、本出願は更に、生体系において肺気腫予後若しくは治療応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が肺エラスチン産生経路に到達し、これにより生体系中の肺エラスチン産生経路内の少なくとも1つの肺エラスチン分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された肺エラスチン分子を含有するステップと；c)肺エラスチンの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)肺エラスチンの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、肺エラスチン産生経路での分子流束量を算出し、それにより肺気腫予後若しくはその治療に対する治療応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【０１０９】
炎症性腸疾患活動性、予後又はその治療に対する治療応答は、結腸細胞（colonocyte）DNA動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は糞便、結腸生検その他の結腸組織サンプルより単離された結腸細胞由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において炎症性腸疾患活動性、予後若しくは治療応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が結腸細胞DNA複製経路に到達し、これにより生体系中の結腸細胞DNA複製経路内の少なくとも1つの結腸細胞由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された結腸細胞由来DNA分子を含有するステップと；c)結腸細胞由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)結腸細胞由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、結腸細胞DNA複製経路での分子流束量を算出し、それにより炎症性腸疾患活動性、予後若しくはその治療に対する治療応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【０１１０】
ピロリ菌（H. pylori）活動性若しくはその治療に対する治療応答、癌リスク又は胃癌は、胃上皮DNA動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は胃上皮細胞由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系においてピロリ菌活動性若しくは治療応答、癌リスク又は胃癌をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が胃上皮DNA複製経路に到達し、これにより生体系中の胃上皮DNA複製経路内の少なくとも1つの胃上皮細胞由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された胃上皮細胞由来DNA分子を含有するステップと；c)胃上皮細胞由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)胃上皮細胞由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、胃上皮DNA複製経路での分子流束量を算出し、それによりピロリ菌活動性若しくはその治療に対する治療応答、癌リスク又は胃癌をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【０１１１】
細胞性免疫、免疫賦活、AIDS又はその治療に対する治療応答は、T細胞動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子はT細胞由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において細胞性免疫、免疫賦活、AIDS若しくは治療応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質がT細胞産出経路に到達し、これにより生体系中のT細胞産出経路内の少なくとも1つのT細胞由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識されたT細胞由来DNA分子を含有するステップと；c)T細胞由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)T細胞由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、T細胞産出経路での分子流束量を算出し、それにより細胞性免疫、免疫賦活、AIDS若しくはその治療に対する治療応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【０１１２】
ワクチン接種応答は、抗原特異的T細胞動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は抗原特異性に基づいて単離されたT細胞由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系においてワクチン接種応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が抗原特異的T細胞産出経路に到達し、これにより生体系中の抗原特異的T細胞産出経路内の少なくとも1つの抗原特異性に基づいて単離されたT細胞由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された抗原特異性に基づいて単離されたT細胞由来DNA分子を含有するステップと；c)抗原特異性に基づいて単離されたT細胞由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)抗原特異性に基づいて単離されたT細胞由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、抗原特異的T細胞産出経路での分子流束量を算出し、それによりワクチン接種応答をモニタリングするステップを含む方法を目的とする。
【０１１３】
胸腺細胞増殖（thymopoiesis）、胸腺機能不全又はその治療に対する治療応答は、ナイーブT細胞（naive T-cell）動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子はナイーブT細胞由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において胸腺細胞増殖、胸腺機能不全若しくは治療応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質がナイーブT細胞産出経路に到達し、これにより生体系中のナイーブT細胞産出経路内の少なくとも1つのナイーブT細胞由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識されたナイーブT細胞由来DNA分子を含有するステップと；c)ナイーブT細胞由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)ナイーブT細胞由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、ナイーブT細胞産出経路での分子流束量を算出し、それにより胸腺細胞増殖、胸腺機能不全若しくはその治療に対する治療応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【０１１４】
B細胞/形質細胞活動性又はその治療に対する治療応答若しくはワクチン応答は、特異的抗体動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は選択した抗原に対して特異的な抗体である。この形式では、本出願は更に、生体系においてB細胞/形質細胞活動性、化合物若しくは治療応答又はワクチン応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が特異的抗体産生経路に到達し、これにより生体系中の特異的抗体産生経路内の少なくとも1つの選択した抗原に対して特異的な抗体に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された選択した抗原に対して特異的な抗体を含有するステップと；c)選択した抗原に対して特異的な抗体の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)選択した抗原に対して特異的な抗体の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、特異的抗体産生経路での分子流束量を算出し、それによりB細胞/形質細胞活動性、又は治療応答若しくはワクチン応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【０１１５】
免疫賦活又は疾患活動性は、血清急性期反応物質動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は急性期タンパク質である。この形式では、本出願は更に、生体系において免疫賦活若しくは疾患活動性をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が血清急性期反応物質産生経路に到達し、これにより生体系中の血清急性期反応物質産生経路内の少なくとも1つの急性期タンパク質に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された急性期タンパク質を含有するステップと；c)急性期タンパク質の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)急性期タンパク質の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、血清急性期反応物質産生経路での分子流束量を算出し、それにより免疫賦活若しくは疾患活動性をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【０１１６】
体液性免疫は、形質細胞動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は形質細胞由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において体液性免疫をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が形質細胞産出経路に到達し、これにより生体系中の形質細胞産出経路内の少なくとも1つの形質細胞由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された形質細胞由来DNA分子を含有するステップと；c)形質細胞由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)形質細胞由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、形質細胞産出経路での分子流束量を算出し、それにより体液性免疫をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【０１１７】
宿主防御活性又は治療応答（例えばIL-2）は、ナチュラルキラー細胞動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子はナチュラルキラー細胞由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において宿主防御活性若しくは治療応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質がナチュラルキラー細胞産出経路に到達し、これにより生体系中のナチュラルキラー細胞産出経路内の少なくとも1つのナチュラルキラー細胞由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識されたナチュラルキラー細胞由来DNA分子を含有するステップと；c)ナチュラルキラー細胞由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)ナチュラルキラー細胞由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、ナチュラルキラー細胞産出経路での分子流束量を算出し、それにより宿主防御活性若しくは治療応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【０１１８】
外来性化合物若しくは治療剤に対する内因性応答又は宿主防御は、サイトカイン動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は分泌型又は組織結合型サイトカインである。この形式では、本出願は更に、生体系において外来性化合物若しくは治療剤に対する内因性応答又は宿主防御をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質がサイトカイン産生経路に到達し、これにより生体系中のサイトカイン産生経路内の少なくとも1つの分泌型又は組織結合型サイトカインに到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された分泌型又は組織結合型サイトカインを含有するステップと；c)分泌型又は組織結合型サイトカインの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)分泌型又は組織結合型サイトカインの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、サイトカイン産生経路での分子流束量を算出し、それにより外来性化合物若しくは治療剤に対する内因性応答又は宿主防御をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【０１１９】
ウイルス複製、疾患活動性、又は治療応答若しくは抗ウイルス薬に対する感受性は、ウイルスDNA/RNA動態（例えばHIV、B型肝炎ウイルス）を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は対象となるウイルス由来のDNA又はRNAである。この形式では、本出願は更に、生体系においてウイルス複製、疾患活動性、化合物若しくは治療応答又は抗ウイルス薬に対する感受性をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質がウイルスDNA/RNA合成経路に到達し、これにより生体系中のウイルスDNA/RNA合成経路内の少なくとも1つの対象となるウイルス由来DNA又はRNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された対象となるウイルス由来DNA又はRNA分子を含有するステップと；c)対象となるウイルス由来DNA又はRNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)対象となるウイルス由来DNA又はRNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、ウイルスDNA/RNA合成経路での分子流束量を算出し、それによりウイルス複製、疾患活動性をモニタリング又は診断するか、あるいは治療応答若しくは抗ウイルス薬に対する感受性をモニタリングするステップを含む方法を目的とする。
【０１２０】
ウイルス複製、疾患活動性、又は治療応答若しくは抗ウイルス薬に対する感受性は、ウイルスタンパク質動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は対象となるウイルス由来のタンパク質である。この形式では、本出願は更に、生体系においてウイルス複製、疾患活動性、化合物若しくは治療応答又は抗ウイルス薬に対する感受性をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質がウイルスタンパク質合成経路に到達し、これにより生体系中のウイルスタンパク質合成経路内の少なくとも1つの対象となるウイルス由来タンパク質に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された対象となるウイルス由来タンパク質を含有するステップと；c)対象となるウイルス由来タンパク質の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)対象となるウイルス由来タンパク質の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、ウイルスタンパク質合成経路での分子流束量を算出し、それによりウイルス複製、疾患活動性をモニタリング又は診断するか、あるいは治療応答若しくは抗ウイルス薬に対する感受性をモニタリングするステップを含む方法を目的とする。
【０１２１】
細菌細胞分裂、疾患活動性又は抗生物質に対する応答は、細菌動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は対象となる細菌由来のDNAその他の分子（例えばタンパク質、炭水化物、脂質）である。この形式では、本出願は更に、生体系において細菌細胞分裂、疾患活動性若しくは抗生物質に対する応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が細菌複製経路に到達し、これにより生体系中の細菌複製経路内の少なくとも1つの対象となる細菌由来DNAその他の分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された対象となる細菌由来のDNAその他の分子を含有するステップと；c)対象となる細菌由来のDNAその他の分子の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)対象となる細菌由来のDNAその他の分子の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、細菌複製経路での分子流束量を算出し、それにより細菌細胞分裂、疾患活動性若しくは抗生物質に対する応答をモニタリングするステップを含む方法を目的とする。
【０１２２】
寄生虫分裂及び成長又は治療応答（例えば、マラリア、住血吸虫）は、寄生虫動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は対象となる寄生虫由来のDNAその他の分子（例えばタンパク質、炭水化物、脂質）である。この形式では、本出願は更に、生体系において寄生虫分裂及び成長若しくは治療応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が寄生虫複製経路に到達し、これにより生体系中の寄生虫複製経路内の少なくとも1つの対象となる寄生虫由来DNAその他の分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された対象となる寄生虫由来のDNAその他の分子を含有するステップと；c)対象となる寄生虫由来のDNAその他の分子の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)対象となる寄生虫由来のDNAその他の分子の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、寄生虫複製経路での分子流束量を算出し、それにより寄生虫分裂及び成長若しくは治療応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【０１２３】
感染症活動性又はその治療に対する治療応答は、腸内細菌動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は腸内細菌由来のDNAその他の分子（例えばタンパク質、炭水化物、脂質）である。この形式では、本出願は更に、生体系において感染症活動性若しくは治療応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が腸内細菌複製経路に到達し、これにより生体系中の腸内細菌複製経路内の少なくとも1つの腸内細菌由来DNAその他の分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された腸内細菌由来DNAその他の分子を含有するステップと；c)腸内細菌由来DNAその他の分子の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)腸内細菌由来のDNAその他の分子の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、腸内細菌複製経路での分子流束量を算出し、それにより感染症活動性若しくはその治療に対する治療応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【０１２４】
膿瘍、蓄膿又はその治療に対する治療応答は、閉鎖空間内での細菌動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は組織若しくは膿瘍又は体液サンプル由来の細菌DNAその他の分子（例えばタンパク質、炭水化物、脂質）である。この形式では、本出願は更に、生体系において膿瘍、蓄膿若しくは治療応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が細菌複製経路に到達し、これにより生体系中の細菌複製経路内の少なくとも1つの組織若しくは膿瘍又は体液サンプル由来細菌DNAその他の分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された組織若しくは膿瘍又は体液サンプル由来細菌DNAその他の分子を含有するステップと；c)組織若しくは膿瘍又は体液サンプル由来細菌DNAその他の分子の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)組織若しくは膿瘍又は体液サンプル由来細菌DNAその他の分子の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、細菌複製経路での分子流束量を算出し、それにより膿瘍、蓄膿若しくはその治療に対する治療応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【０１２５】
心内膜炎又はその治療に対する治療応答は、血管内細菌動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は血管内細菌由来のDNAその他の分子（例えばタンパク質、炭水化物、脂質）である。この形式では、本出願は更に、生体系において心内膜炎若しくはその治療に対する治療応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が血管内細菌複製経路に到達し、これにより生体系中の血管内細菌複製経路内の少なくとも1つの血管内細菌由来DNAその他の分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された血管内細菌由来DNAその他の分子を含有するステップと；c)血管内細菌由来DNAその他の分子の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)血管内細菌由来DNAその他の分子の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、血管内細菌複製経路での分子流束量を算出し、それにより心内膜炎若しくはその治療に対する治療応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【０１２６】
幹細胞応答（移植、化合物又は治療剤）又は血球減少状態は、骨髄前駆細胞/骨髄細胞動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は骨髄前駆細胞/骨髄細胞由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において幹細胞応答若しくは血球減少状態をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が骨髄前駆細胞/骨髄細胞産出経路に到達し、これにより生体系中の骨髄前駆細胞/骨髄細胞産出経路内の少なくとも1つの骨髄前駆細胞/骨髄細胞由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された骨髄前駆細胞/骨髄細胞由来DNA分子を含有するステップと；c)骨髄前駆細胞/骨髄細胞由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)骨髄前駆細胞/骨髄細胞由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、骨髄前駆細胞/骨髄細胞産出経路での分子流束量を算出し、それにより幹細胞応答若しくは血球減少状態をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【０１２７】
溶血、貧血応答（網状赤血球増加）、異常血色素症又はその治療は、赤血球中のヘモグロビン動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子はヘモグロビンである。この形式では、本出願は更に、生体系において溶血、貧血応答（網状赤血球増加）若しくは異常血色素症をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質がヘモグロビン合成経路に到達し、これにより生体系中のヘモグロビン合成経路内の少なくとも1つのヘモグロビン分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識されたヘモグロビン分子を含有するステップと；c)ヘモグロビンの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)ヘモグロビンの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、ヘモグロビン合成経路での分子流束量を算出し、それにより溶血、貧血応答（網状赤血球増加）、異常血色素症若しくはその治療をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【０１２８】
血小板減少症、血小板増加症又はその治療は、血小板リン脂質動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は1種以上の血小板若しくは血小板前駆体由来のリン脂質又はDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において血小板減少症若しくは血小板増加症をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が血小板リン脂質合成経路に到達し、これにより生体系中の血小板リン脂質合成経路内の少なくとも1つの同位体標識された血小板若しくは血小板前駆体由来リン脂質又はDNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された血小板若しくは血小板前駆体由来リン脂質又はDNA分子を含有するステップと；c)血小板若しくは血小板前駆体由来リン脂質又はDNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)血小板若しくは血小板前駆体由来リン脂質又はDNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、血小板リン脂質合成経路での分子流束量を算出し、それにより血小板減少症、血小板増加症若しくはその治療をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【０１２９】
貧血、溶血又はその治療に対する治療応答は、赤血球膜動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は赤血球由来のリン脂質である。この形式では、本出願は更に、生体系において貧血、溶血若しくはその治療に対する治療応答をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が赤血球膜産生経路に到達し、これにより生体系中の赤血球膜産生経路内の少なくとも1つの同位体標識された赤血球由来リン脂質に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された赤血球由来リン脂質分子を含有するステップと；c)赤血球由来リン脂質の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)赤血球由来リン脂質の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、赤血球膜産生経路での分子流束量を算出し、それにより貧血、溶血若しくはその治療に対する治療応答をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【０１３０】
精子形成、男性不妊症、又はその治療に対する治療応答若しくは内分泌撹乱物質は、精母細胞動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は精母細胞由来のDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において精子形成、男性不妊症、化合物若しくはその治療に対する治療応答又は内分泌撹乱物質をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が精子形成経路に到達し、これにより生体系中の精子形成経路内の少なくとも1つの精母細胞由来DNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された精母細胞由来DNA分子を含有するステップと；c)精母細胞由来DNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)精母細胞由来DNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、精子形成経路での分子流束量を算出し、それにより精子形成、男性不妊症、又はその治療に対する治療応答若しくは内分泌撹乱物質をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【０１３１】
発生生物学又はその障害は、胎児性タンパク質及び脂質のタイミングの動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は胎児性タンパク質、脂質又はDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において発生生物学若しくはその障害をモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質が胎児性タンパク質及び脂質産生経路に到達し、これにより生体系中の胎児性タンパク質及び脂質産生経路内の少なくとも1つの胎児性タンパク質、脂質又はDNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識された胎児性タンパク質、脂質又はDNA分子を含有するステップと；c)胎児性タンパク質、脂質又はDNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)胎児性タンパク質、脂質又はDNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、胎児性タンパク質及び脂質産生経路での分子流束量を算出し、それにより発生生物学若しくはその障害をモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【０１３２】
遺伝的不安定性又は癌リスクは、ゲノムDNA動態を測定若しくは検出することにより、モニタリング又は診断することができる。この方法では、対象となる標的分子は（適当ならば、リスクのある組織由来の）ゲノムDNAである。この形式では、本出願は更に、生体系において遺伝的不安定性若しくは癌リスクをモニタリング又は診断するための方法であって、以下のステップ：a)同位体標識基質がゲノムDNA複製経路に到達し、これにより生体系中のゲノムDNA複製経路内の少なくとも1つのゲノムDNA分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの同位体標識されたゲノムDNA分子を含有するステップと；c)ゲノムDNAの同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)ゲノムDNAの同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、ゲノムDNA複製経路での分子流束量を算出し、それにより遺伝的不安定性若しくは癌リスクをモニタリング又は診断するステップを含む方法を目的とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１３３】
図面の簡単な説明
図1は、作業を継続するか又は中止するかを決定するための方法としてバイオマーカーに対する効果（すなわち、本発明の方法により収集したデータ）を用いた薬物の創薬、開発及び認可（DDA）を示す模式図である。  
図2は、例示的な代謝経路（de novo及びサルベージ（回収）両方のDNA合成）及び種々の構成要素の模式図である。安定又は放射性同位体標識の位置を示してある。G6P＝グルコース-6-リン酸、R5P＝リボース-5-リン酸、PRPP＝5-ホスホリボシル-α-ピロリン酸、NDP＝ヌクレオチド二リン酸、dNTP＝デオキシヌクレオチド三リン酸、RR＝リボヌクレオチドレダクターゼ、dN＝デオキシヌクレオチド、3H-dT＝トリチウム化デオキシチミジン、BrdU＝5-ブロモ-2-デオキシウリジン、GNG＝糖新生、DNNS＝de novoヌクレオチド合成、DNPS＝de novo前駆体合成。  
図3は、DNA中に取り込まれる標識（すなわち、2H2O由来の2H）を示す。  
図4は、標識アミノ酸によるコラーゲンへの標識取り込みを示す。  
図5は、コラーゲンの合成及び分解経路を示す。  
図6は、創薬プロセスでの本発明の使用を例示する。  
図7は、オス129SvEvマウスでの海馬神経前駆細胞増殖に対する長期的イミプラミン処理の効果を示す。長期的イミプラミン処理は、オス129SvEvマウスにおいて前駆細胞増殖を増大させる。マウスを、飲料水中のイミプラミンを用いて3週間処理し（20mg/kg/日）、処理の最後の3日間に10％2H2Oを用いて標識した。データは平均±SDを表している（1群あたり、n＝4）。  
図8は、オス129SvEvマウスでの海馬神経前駆細胞増殖に対する長期的フルオキセチン処理の効果を示す。フルオキセチンは前駆細胞増殖を増大させる。マウスを、飲料水中のフルオキセチンを用いて2週間処理し（10mg/kg/日）、処理の最後の1週間に10％2H2Oを用いて標識した。データは平均±SDを表している（1群あたり、n＝5）。*p<0.05（ビヒクル群との有意差あり）
図9は、Wisterラットでの、50％膵切除術後の島（β細胞）増殖の増大を示す。  
図10は、SW1753細胞に対する2種類の脱メチル化薬（アザシチジン及びデシタビン）の効果を示す。細胞は20mM 2H3-メチルメチオニンを添加したDMEM培地中（10％FBS）で一晩培養した。次に、3種類の異なる濃度（125nM、250nM、及び500nM）のアザシチジン及びデシタビンを添加し、陰性対照としてはメチルデオキシシチジン（125nM及び500nM）を用いた。250nMでのメチル化の阻害において、デシタビン（70％減少）はアザシチジン（10％未満）と比較して良好な有効性を示した。
【０１３４】
図11は、精液分析において正常な11人の被験者についての精母細胞標識曲線を示す。50mlの70％2H2Oを用いて、男性被験者を1日2回、3週間標識した。精液サンプルは、2H2O開始から90日間にわたって、2週間に1回採取した。精母細胞DNAの含有率（enrichment）をGC/MSを用いて測定し、完全にターンオーバーする細胞（単球）のものと比較することにより存在する新規な細胞の割合を算出した。  
図12は、細菌性毒素リポ多糖（LPS）に対する応答での大脳皮質組織のターンオーバーを示す。高用量のLPSは皮質組織ターンオーバーに影響を及ぼし、このことは毒素の攻撃に対する脳の応答を表している。  
図13は、四塩化炭素処理の7日間にわたる肝細胞増殖のin vivoでの用量反応を示す。Swiss Websterマウスに、2H2Oと同時に、7日間にわたってCCl4の腹腔内注射を行った。  
図14は、神経炎症性毒素リポ多糖（LPS）に対するマイクログリア応答を示す。LPSは示した2種類の用量（1及び4mg/kg体重）で1日おきにマウス腹腔内に投与する。2H2Oを同時に投与した。一部の動物を示した各時点で回収し、マイクログリアを単離して重水素取り込みについて分析した。いずれの用量に対しても、増殖応答の増大は測定したいずれの時点においても対照と比較して有意であり（p<0.05, ANOVA/Tukey）、14日目以降は用量依存性が観察される（p<0.05, ANOVA/Tukey）。エラーバーは標準偏差を示す。  
図15は、マイクログリア増殖に対する2種類の抗炎症性化学療法剤（デキサメタゾン及びミノサイクリン）の効果を示す。マウスに、2H2Oと、神経炎症を誘発するための腹腔内リポ多糖（LPS）又はビヒクル（対照）のいずれかを与えた。LPSを与えたマウスは、ビヒクルか、デキサメタゾン又はミノサイクリンのいずれかを用いて処理した。次にマイクログリアを単離し、本明細書中に記載の通りに重水素取り込みについて分析した。結果は、マイクログリア増殖アッセイにより、有効な抗神経炎症治療剤のin vivoでの活性を検出することが可能であることを示している。LPS処理群は対照群と比較して増殖の増大を示すが（p<0.01, ANOVA/Tukey）、デキサメタゾン及びミノサイクリン処理群はビヒクル処理群と比較して増殖の抑制を示している（p<0.001, ANOVA/Tukey）。  
図16は、正常及びfsnマウスでのケラチン動態を示す。fsnマウスは、乾癬様表現型を有する突然変異体マウスである。ケラチンへの重水素取り込みにより測定すると、ケラチンターンオーバーはfsnマウスにおいて劇的に増大している。fsnマウスは4日目に最大標識に達するのに対して、対照動物では15日目である。  
図17は、正常及びfsnマウスでのケラチン生成細胞動態を示す。fsnマウスは、乾癬様表現型を有する突然変異体マウスである。ケラチン生成細胞DNAへの重水素取り込みにより測定すると、ケラチン生成細胞ターンオーバーはfsnマウスにおいて増大している。fsnマウスは4日目に最大標識に達するのに対して、対照動物では30日目である。  
図18は、抗血管新生薬（アバスチン）又はビヒクル（生理食塩液）を用いて処理したマウスでの異種移植腫瘍由来の内皮細胞の増殖を示す。内皮細胞増殖は、該薬物を用いて処理した動物において抑制されている。  
図19は、四塩化炭素（CCl4）誘導肝線維症に対する治療剤の効果を示す。インターフェロン-γ（a）及びロシグリタゾン（b）のいずれも、CCl4を用いて処理したマウスでのコラーゲン合成速度を低減した。  
図20は、5日間の化学療法剤処理におけるin vivoでの腫瘍細胞増殖を示す。メスbalb/Cマウスに、マトリゲル中の約106個のEMT7マウス乳癌細胞を皮下的に埋め込み、約1500mm3に行き渡らせた。マウスを腹腔内ボーラス注射により2H2Oを用いて標識し、続いて研究の期間、飲料水中の8％2H2Oにより標識した。マウスには、125mg/kg Gem又は500mg/kg HUのいずれかを用いた同時処理を施した。Gemは1日おき、HUは毎日投与した。5日間の最後に腫瘍を取り出し、ホモジナイズして下記の実施例2のようにしてDNAを単離した。両方の化学療法剤が腫瘍細胞及び骨髄増殖を抑制した。
【０１３５】
図21は、マウスにおける脂質分解（a）及び脂肪組織TG合成（b）を示す。脂質分解及び脂肪組織TG合成は、正常マウス、未処理ob/obマウス、対照マウスの半分の餌を与えたob/obマウス、及びレプチン処理ob/obマウスにおいて測定した。レプチン処理マウスは、研究の間にわたってTG合成での有意な減少を示した。略語：TG＝トリグリセリド；g＝グラム
図22は、ヒドロキシ尿素（OHU）を用いた処理に対する別個の骨髄細胞亜群の応答を示す。全骨髄（TBM）を分析するか、又は細胞をリンパ球系、骨髄球系、その他の細胞に分けて別々に分析した。3つのケースで（**で示す）、OHUが骨髄増殖を抑制した。  
図23は、OHU媒介骨髄抑制後のインターロイキン-1（IL-1）を用いた処理に対する別個の骨髄細胞亜群の応答を示す。TBMは全骨髄であり、又は細胞をリンパ球系、骨髄球系、その他の細胞に分けて別々に分析した。3つのケースで（**で示す）、IL-1は骨髄細胞増殖を刺激することが可能である。リンパ球系細胞については統計学的に有意でない。  
図24は、重水素化グルコース投与後の重水素水産生を測定することにより決定した場合の解糖系処理（glycolytic disposal）速度を示す。重水素化グルコース投与後60分及び90分で血液を採取し、分析した。SD対照とは正常動物を表し、ZDF動物は前糖尿病のモデルであって解糖処理の低減を示している。処理後には、ZDF動物は健康な対照動物と同様の解糖処理速度を有している。このデータは、疾患動物モデルでの公知のインスリン感作薬（ロシグリタゾン）の明らかな効果を示している。  
図25は、健常ボランティア又は骨髄腫患者での血清タンパク質合成速度（総タンパク質濃度及び各タンパク質についての重水素富化速度を用いて算出した）を示す。骨髄腫患者では、評価した血清タンパク質の合成速度はすべて抑制されており、特にMタンパク質（悪性細胞により産生される）についてあてはまる。記載したタイプの動態解析は合成におけるこのような変化に対して非常に敏感である。  
図26は、ガラクトセレブロシド（GalCer）への重水素取り込みを測定することにより決定した場合のミエリンの合成割合（fractional synthesis）を示す。6週間又は9週間、記載したように動物を処理し、処理の最後の3週間、重水素水を用いて標識した。対照動物（黒ダイヤ）は3週間での12％の新規（GalCer）合成速度を示している。脱髄化毒素であるクプリゾン（cuprizone）を用いて処理した動物は、合成速度割合における減少を示し、5％新規産物へと低下している（黒四角）。クプリゾンで6週間処理し、次にクプリゾン処理を中止した時点から3週間、重水素水を与えた動物は、合成割合の劇的な増大を示し（白三角）、髄鞘再形成が起こっているようである。  
図27は、正常及び抗うつ剤（イミプラミン）処理成獣マウスでの成熟神経細胞の増殖を示す。フローサイトメトリーを用いて神経細胞を単離し、下記の実施例2に記載のようにして分析した。公知の抗うつ剤であるイミプラミンは、成熟神経細胞形成速度を増大させた。  
図28は、前糖尿病のラットモデル（Zucker fat）、糖尿病のラットモデル（Zucker-diabetes）及び対照動物（SD-対照）における膵島/β細胞増殖を示す。糖尿病ラットは、糖尿病動物から予測されるように、膵島/β細胞増殖の障害を有している。前糖尿病動物は膵島/β細胞増殖の増大を示し、膵臓がインスリン感受性の低下に応答しているようである。  
図29は、解糖処理試験により測定した場合の正常ラットに対する高脂肪食の影響を示す。投与したグルコース負荷（％負荷）に由来する測定可能なものの全割合としての産生された重水素水を、正常及び高脂肪食（3週間）ラットについて示してある。データは重水素化グルコース投与の60分及び90分後に収集した。  
図30は、様々な状態にあるヒト患者における全身解糖処理を示す。痩せ＝痩せた正常被験者、体重過多＝体重過多被験者、肥満＝肥満被験者、DM2＝II型糖尿病、HIV+＝HIV陽性患者。結果は脂肪を除いた体重kgあたりに産生された2H2Oのモル数として表している。測定は15グラムのグルコース負荷の投与4時間後に行った。
【０１３６】
発明の詳細な説明
I.  導入
生化学的な表現では、大部分の疾患の基礎となるプロセスは、複雑な生化学経路又はネットワークを通る分子流束として最もよく記述することができる。生化学経路とは、典型的にはタンパク質により触媒され、in vivoでは高度に複雑化したネットワークとして起こる連続した一連の生化学的、物理学的又は空間的変換を含む。経路を通る分子の流れを触媒するタンパク質は遺伝子によってコードされている。従って、現在行われている薬物の創薬、開発及び認可（DDA）は、大部分が、主要なものとして疾患に関連すると考えられている経路の必須成分を構成する個々のタンパク質又は遺伝子を特定し、モジュレートするための戦略によりなる。現代の薬物研究手段としては、遺伝子発現プロファイリング、プロテオミクス、酵素活性のハイスループットスクリーニング、及び特定のタンパク質標的に対するスクリーニングのためのコンビナトリアル化学ライブラリーが挙げられる。これらの遺伝子及びタンパク質は、現在の薬物研究では潜在的な治療上の標的と呼ばれ、ある標的に対して活性を有する可能性がある化合物は薬物リード又は薬物候補と呼ばれる。
【０１３７】
治療的介入のための真の機能的な標的は、個々のタンパク質又は遺伝子ではなく、全体としての生化学経路又はネットワーク中の完全に組み立てられた経路を通る分子流束量である。最終的な解析では、疾患又は、実際にはいずれかの生命体としての表現型という機能的帰着を見るものは、いずれの個々の触媒性タンパク質又はコード化遺伝子の活性でもなく、生体系中のある経路を通る分子の流れである。更に、酵素的触媒作用又は複雑な経路の制御が論じられているとしても、全ての生化学系における主要な調節されたパラメータは、分子流束である（Kacser, H. & Burns, J. A. (1973). The control of flux. In Rate Control of Biological Processes. Symposium of the Society for Experimental Biology Vol 27 (D. D. Davies編), pp. 65-104. Cambridge University Press, Cambridgeを参照されたい）。従って、完全に組み立てられた生体系におけるin vivoでの生化学経路又はネットワークを通る分子流束量の測定のための動的バイオマーカーは、DDA及び臨床診断において用いられる現行で利用可能な非動的測定手段とは異なる。
【０１３８】
製薬上の研究開発、臨床医学、及び公衆衛生学での広範な適用を有する化合物作用の新規で測定可能な標的又はバイオマーカーが本明細書中に開示されている。DDAの場合、現在DDA及び臨床診断のために教示されている、薬物作用の標的としての、タンパク質、遺伝子、代謝物その他の生物系の構成要素の濃度、構造、状態、活性又は組成を測定するのではなく、本出願人は、生体系への同位体標識（例えば安定同位体標識）の導入により測定される、in vivoでの標的となる決定的な代謝経路を通る分子流束量が、有益で、薬物作用のより高いレベルの標的であり、且つDDA及び臨床医学において有力な用途を有する疾患活動性の機能的尺度であることを見出した。
【０１３９】
本明細書中に記載した方法は、以下のステップを含む：対象となる疾患又は状態における薬物の作用に対する潜在的な決定的標的である生化学経路流量を特定するステップ；対象となる代謝経路中の標的分子（その反応速度（合成、分解、供給、除去、又はターンオーバー）は、対象となる決定的な代謝経路を通る分子流束量を表すために用いることができる）を特定するステップ；天然には存在しない標的分子の同位体擾乱集団のin vivoでの形成をもたらすように設計されている同位体標識（例えば非放射性（安定）同位体標識）を、対象となる生体系に導入するステップ；対象となる標的分子を単離し、例えば質量分析を用いてその同位体含量及び/又はパターン、あるいは同位体含量及び/若しくはパターンの変化の速度を測定するステップ；擾乱された同位体含量及び/又はパターン、あるいは同位体含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、対象となる標的分子の反応速度を決定し、それにより対象となる標的代謝経路を通る分子流束量を算出するステップ；ある化合物（例えば化学物質（新規な又は従来の）、薬物候補、薬物リード、認可薬物、生物学的因子）、又はその組み合わせ若しくは混合物の、対象となる疾患を示す又は示さないモデル系又はヒトでの対象となる代謝経路を通る分子流束量に対する効果を試験し、決定するステップ。この様式では、経路の流量測定を対象となる疾患での化合物作用のバイオマーカーとして用いることができ、また対象となる生体系中の標的となる代謝経路を通る分子流束量に対する化合物又はその組み合わせの活性を、化合物若しくはその組み合わせの潜在的な治療的作用又は毒性作用を特定するために使用することができる。
【０１４０】
対象となる特定の疾患に対する化合物作用の標的としての、経路を通る分子流束量（本明細書中で開示されている安定同位体標識/同位体測定方法により測定される）の使用の正当性を確認するための手法も開示されている。細胞からヒト被験者、及び前臨床研究からフェーズIV臨床試験及びそれに続く日常的な医学的ケアまでの、DDAの一連の段階の全てのレベルでの、本明細書中に開示した同一又は近縁安定同位体標識手法の適用の可能性もまた開示されている。本明細書中に開示されている適用は、DDA及び医学的ケアのために現在利用可能な非動的生化学測定手段に照らして多数の利点を提供する。
【０１４１】
別の実施形態では、本出願は以下のステップを含む：対象となる公衆衛生上の疾患又は状態でのある化合物の作用に対する潜在的に決定的な標的である生化学経路の流量を特定するステップ；代謝経路中の標的分子（その反応速度（合成、分解、供給、除去、又はターンオーバー）は、代謝経路を通る分子流束量を表すために用いることができる）を特定するステップ；天然には存在しない標的分子の同位体擾乱集団のin vivoでの形成をもたらすように設計されている同位体標識（例えば非放射性（安定）同位体標識）を、対象となる生体系に導入するステップ；対象となる標的分子を単離し、例えば質量分析を用いてその同位体含量及び/又はパターン、あるいは同位体含量及び/若しくはパターンの変化の速度を測定するステップ；擾乱された同位体含量及び/又はパターン、あるいは同位体含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、対象となる標的分子の反応速度を決定し、それにより標的代謝経路を通る分子流束量を算出するステップ；ある化合物（例えば化学物質（新規又は従前の）、工業化学薬品、食品添加物、環境汚染物質、化粧品、生物学的因子）、又はその組み合わせ若しくは混合物の、培養細胞系及び動物等のモデル系での代謝経路を通る分子流束量に対する効果を試験し、決定するステップ。この様式では、経路の流量の測定を対象となる公衆衛生病での化学的又は生物学的作用のバイオマーカーとして用いることができ、また工業化学薬品、食品添加物、化粧品、環境汚染物質、若しくは生物学的因子、又はその組み合わせの、対象となる生体系中の標的となる代謝経路を通る分子流束量に対する活性を、工業化学薬品、化粧品、食品添加物、環境汚染物質、生物学的因子、又はその組み合わせの潜在的な毒性作用を特定するために使用することができる。
【０１４２】
化合物（例えば化学物質（新規又は従前の）、薬物候補、薬物リード、認可薬物、生物学的因子）、又はその組み合わせ若しくは混合物の、生体系中の代謝経路を通る分子流束量に対する効果を、DDA及び臨床診断のためのバイオマーカーとして試験するための方法が、本明細書中に開示されている。化合物（例えば化学物質（新規又は従前の）、工業化学薬品、食品添加物、化粧品、及び環境汚染物質）の、生体系中の代謝経路を通る分子流束量に対する効果を、化学的に誘導されるか若しくは生物学的に誘導される疾患又は外傷（すなわち、産業若しくは工業毒物学的、食品毒物学的、皮膚毒物学的、及び環境毒物学的適用）のバイオマーカーとして試験する方法もまた開示される。
【０１４３】
II.  一般的技術
本発明の実施は、別に示さない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技術を用い、それらは当該技術分野の技能の範囲内であろう。そのような技術は、例えば以下の文献中に完全に説明されている：Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版 (Sambrookら, 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, 編, 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, 編, 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, 編, 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture ( J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press;  Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, 編, 1993-8) J. Wiley and Sons;  Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, 編); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, 編, 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubelら, 編, 1987); PCR:  The Polymerase Chain Reaction, (Mullisら, 編, 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coliganら, 編, 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); 及びMass isotopomer distribution analysis at eight years: theoretical, analytic and experimental considerations by Hellerstein and Neese (Am J Physiol 276 (Endocrinol Metab. 39) E1146-E1162, 1999)。更に、市販のアッセイキット及び試薬を利用する手法は、特に断らない限り製造業者が定めたプロトコールに従って用いるであろう。
【０１４４】
III.  定義
別に定義しない限り、本明細書中で用いる全ての技術的表現、表記法、その他の科学的専門用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解される意味を有するものと意図される。一部のケースでは、通常理解される意味を有する表現を、明確にするために、及び/又は容易に参照できるように、本明細書中で定義し、本明細書中のかかる定義の内容は、必ずしも当該技術分野で一般的に理解されるものと比した本質的な差異を表すものと解釈されるべきではない。本明細書中に記載したか参照した技術及び手法は、一般によく理解され、例えば以下の文献のような当業者によって従来の方法論を用いて通常利用されるものである：Mass isotopomer distribution analysis at eight years: theoretical, analytic and experimental considerations by Hellerstein and Neese (Am J Physiol 276 (Endocrinol Metab. 39) E1146-E1162, 1999)。適当な場合には、市販のキット及び試薬の使用を含む手法は、特に断らない限り製造業者が定めたプロトコール及び/又はパラメータに従って一般的に行う。
【０１４５】
「分子流束量」とは、細胞、組織若しくは生物内における分子の動的な流れ、合成及び/又は分解速度を指す。「分子流束量」とはまた、分子のプールへの分子の供給又はそこからの除去を指し、これにより分子の当該プールに入るか又はそこから出る流れと同義である。
【０１４６】
「代謝経路」とは、その最終的な結果が分子若しくは分子群の化学的、空間的又は物理的変換である、生体系中の任意の連続した一連の2以上の生化学的ステップ（すなわち、生化学プロセス）を指す。代謝経路は、該経路を構成する生化学的ステップを経由する分子の方向及び流れにより規定される。代謝経路内の分子は、例えば、限定するものではないが、脂質、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、核酸、ポリヌクレオチド、ポルフィリン、グリコサミノグリカン、糖脂質、中間代謝物、無機鉱物、イオン等をはじめとする、いずれの生化学的クラスのものでもあり得る。
【０１４７】
「代謝経路を通る流束量」とは、所定の代謝経路を通る分子変換の速度を指す。経路を通る流束量の単位は、時間あたりの化学量（例えばモル/分、グラム/時間）である。経路を通る流束量は、最適には明確に規定された生化学的開始点から明確に規定された生化学的終点まで（対象となる所定の代謝経路中の全ての段階を含む）の変換速度を指す。
【０１４８】
「同位体」とは、同数の陽子を有し、これにより同じ元素であるが異なる数の中性子を有する原子（例えば1Hと2H又はD）を指す。
【０１４９】
「アイソトポログ」（isotopologue）とは、同一の元素組成及び化学組成を有するが、同位体含量が異なる同位体類似体又は同位体分子種を指す（上記の例で言えばCH3NH2とCH3NHD）。アイソトポログ同士はそれらの同位体組成により規定され、従って各アイソトポログは固有の精密質量（exact mass）を有するが、固有の構造は有しない。アイソトポログは多くの場合同位体異性体（アイソトポマー（isotopomer））のファミリーにより構成され、同位体異性体同士はその分子上の同位体の位置が異なっている（例えば、CH3NHDとCH2DNH2は同じアイソトポログであるが異なるアイソトポマーである）。
【０１５０】
「同位体標識水」とは、水素又は酸素のいずれかの1個以上の特定の重同位体を用いて標識された水を含む。同位体標識水の具体例としては、2H2O、3H2O、及びH218Oが挙げられる。
【０１５１】
「化学物質」には、潜在的治療薬（薬物又は薬物候補若しくは薬物リード）の発掘若しくは毒物作用（工業化学薬品、殺虫剤、除草剤、食品添加物、化粧品等）の発見の目的で、生物学的又は生化学的活性についてスクリーニングするために生体系に投与する、新規又は既知のいずれかの任意の化学薬品が含まれる。
【０１５２】
「薬物リード」又は「薬物候補」は、本明細書中では、潜在的治療薬（薬物）として評価されている化学物質又は生物学的分子と定義する。「薬剤」又は「作用物質」は、本明細書中では交換可能に用いられ、潜在的治療薬として投与、認可されるか若しくは試験下にあるか、又は既知の治療薬であるいずれかの組成物（化学物質又は生物学的因子等）を表現する。
【０１５３】
「既知薬物」若しくは「既知薬剤」又は「認可薬物」とは、米国又は他の地域においてヒト若しくは動物での薬物としての治療的使用について認可されている化合物（すなわち化学物質又は生物学的因子）を指す。本発明との関係では、「認可薬物」との用語は、本明細書中に開示した方法を用いて試験される適応症とは異なる適応症について認可されている薬物を意味する。例として乾癬とフルオキセチンを用いると、本発明の方法は、抑うつの治療についてFDA（及び他の地域）により認可された薬物であるフルオキセチンを、乾癬のバイオマーカー（例えばケラチン生成細胞増殖又はケラチン合成）に対する効果について試験することを可能にする。フルオキセチンを用いて乾癬を治療することは、FDA又は他の地域により認可されていない適応症である。この様式では、認可薬物（この例ではフルオキセチン）について新規の用途（この例では抗乾癬効果）を見出すことができる。
【０１５４】
「生物学的因子」とは、生物学若しくは生理学活性（例えば、予防的、治療的及び/又は毒性作用）を有する、生存生物により作り出される化合物又は化合物群を指す。生物学的因子の例としては、限定するものではないが、ワクチン、ポリクローナル若しくはモノクローナル抗体、組換えタンパク質、単離タンパク質、可溶性受容体、遺伝子治療産物、環境毒素等が挙げられる。本明細書中で用いる場合には、「生物製剤」（biologics）との用語は、「生物学的因子」と同義に用いられる。
【０１５５】
「化合物」とは、本出願との関係では、任意の新規化学物質、化学物質、薬物リード、薬物候補、薬物、薬剤、作用物質、既知薬物、既知薬剤、認可薬物、生物的若しくは生物学的因子、食品添加物、工業化学薬品、環境汚染物質等を意味する。該用語は、全ての化学的又は生物学的分子を包含するものと意図される。
【０１５６】
「食品添加物」としては、限定するものではないが、感覚刺激物質（すなわち、風味、感触、香り、及び色をもたらす物質）、保存料（ニトロサミン、ニトロサミド、N-ニトロソ物質等）、凝固剤（congealant）、乳濁化剤、分散化剤、燻蒸剤、湿潤剤、酸化還元剤、充填剤、金属イオン封鎖剤、溶媒、界面活性剤、表面処理剤、佐剤、殺虫剤、塩素化有機化合物、食用動物により消化されるか、食用植物により吸収される任意の化学薬品、及び包装材料から食物又は飲料に浸み出す（か又はそれ以外の方法でたどり着く）任意の化学薬品が挙げられる。該用語は、製造及び包装プロセス中の一部の段階で食品若しくは飲料製品に添加されるか、あるいは食用動物による消化若しくは食用植物による吸収により、又は微生物副産物（内毒素及び外毒素等）を介して（ボツリヌス毒素又はアフラトキシンのような前形成毒素）、又は調理プロセスを介して（例えば2-アミノ-3-メチルイミダゾ[4,5-f]キノロンのような複素環アミン等）、又は製造、包装、保管、及び取り扱いの間に包装材料から浸み出すかどうかして、食物にたどり着く化学薬品を包含するものと意図される。
【０１５７】
「工業化学薬品」としては、限定するものではないが、揮発性有機化合物、半揮発性有機化合物、洗浄剤、溶媒、シンナー、希釈剤（mixer）、金属化合物、金属、有機金属、半金属（metalloid）、置換及び非置換脂肪族並びに非環式炭化水素（ヘキサン等）、置換及び非置換芳香族炭化水素（ベンゼン及びスチレン等）、ハロゲン化炭化水素（塩化ビニル等）、アミノ誘導体及びニトロ誘導体（ニトロベンゼン等）、グリコール及び誘導体（プロピレングリコール等）、ケトン（シクロヘキサノン等）、アルデヒド（フルフラール等）、アミド及び無水物（アクリルアミド等）、フェノール、シアン化物及びニトリル、イソシアネート、並びに殺虫剤、除草剤、殺鼠剤、及び殺菌剤が挙げられる。
【０１５８】
「環境汚染物質」には、自然界では見出されない任意の化学薬品又は自然界に見出されるが自然界で見出される（少なくとも自然界中のアクセス可能な生活環境に見出される）ものを超えるレベルまで人工的に濃縮した化合物が含まれる。従って、例えば、環境汚染物質としては、公園、学校、又は遊び場等の非産業的・非工業的環境中にさえも見出される産業的又は工業的化学薬品として特定される非天然化学薬品のいずれをも含むことができる。あるいはまた、環境汚染物質は、鉛のように天然に存在する化学薬品であるが、バックグラウンドレベルを上回るレベルにあるもの（例えば、自動車中の加鉛ガソリンの燃焼に由来する排気が堆積した高速道路沿いの土壌中に見出される鉛）を包含し得る。環境汚染物質は、工場煙突又は地表面若しくは地下水への工業廃液等の点状発生源に由来するものでもよいし、あるいは高速道路を移動中の車からの排気、一般道を移動中のバスからのディーゼル排気（及びそれが含有する全て）、又は農地に由来して空気により運ばれる塵から土壌に堆積した殺虫剤などの非点状発生源からのものでもよい。本明細書中で用いる場合には、「環境汚染因子」は「環境汚染物質」と同義に用いられる。
【０１５９】
「生体系」（living system）としては、限定するものではないが、細胞、細胞株、疾患動物モデル、ギニアピッグ、ウサギ、イヌ、ネコ、他のペット動物、マウス、ラット、非ヒト霊長類、及びヒトが挙げられる。
【０１６０】
「生物学的サンプル」は、細胞、組織、又は生物から取得されるいかなるサンプルをも包含する。この定義は、侵襲的手段（例えば外科手術、直視下生検（open biopsy）、内視鏡生検、及び無視できないリスクを伴う他の手法）による、又は最小限侵襲的若しくは非侵襲的なアプローチ（例えば尿回収、採血、注射針吸引、及び最小限のリスク、不快又は労力を伴う他の手法）によるサンプル採取を介して生物から取得可能な、生物起源の血液その他の液体サンプルを包含する。該定義はまた、その入手後にいずれかの手法（試薬を用いた処理、可溶化、又はタンパク質若しくは有機代謝物等の特定の成分の富化等）により操作されたサンプルも含む。「生物学的サンプル」との用語はまた、血清、血漿、他の生物学的液体、又は組織サンプル等の臨床サンプルをも包含し、また、培養細胞、細胞上清及び細胞溶解物も含む。
【０１６１】
「生物学的液体」（biological fluid）とは、限定するものでないが、尿、血液、間質液、浮腫液、唾液、涙液、炎症性滲出液、関節液、膿瘍、蓄膿その他の感染体液、脳脊髄液、汗、肺分泌物（喀痰）、精液、糞便、胆汁、腸分泌物その他の生物学的液体を指す。
【０１６２】
「精密質量」（exact mass）とは、ある分子の化学式中の全ての同位体の精密質量の合計により算出される質量（例えば、CH3NHDについて32.04847）を指す。
【０１６３】
「整数質量」（nominal mass）とは、ある分子の精密質量を概数化することにより得られる整数の質量を指す。
【０１６４】
「質量アイソトポマー」とは、同位体組成ではなく整数質量に基づいてグループ化した同位体異性体のファミリーを指す。質量アイソトポマーは、アイソトポログとは異なり、異なる同位体組成の分子を含む場合がある（例えば、CH3NHD、13CH3NH2、CH315NH2は同じ質量アイソトポマーの一部であるが、異なるアイソトポログである）。実用上の意味では、質量アイソトポマーは質量分析計で区別されないアイソトポログのファミリーである。四重極質量分析計については、このことは典型的には質量アイソトポマーは整数質量を同じくするアイソトポログのファミリーであるということを意味する。例えば、アイソトポログであるCH3NH2とCH3NHDは整数質量では異なり、別個の質量アイソトポマーであるとして区別されるが、アイソトポログであるCH3NHD、CH2DNH2、13CH3NH2、及びCH315NH2は全て同じ整数質量であり、従って同じ質量アイソトポマーである。従って、各質量アイソトポマーは典型的には2以上のアイソトポログからなり、2以上の精密質量を有する。全ての個別のアイソトポログは四重極質量分析計を用いては区別されず、より高い質量分解能をもたらす質量分析計を用いてさえも区別され得ないため、質量分析データからの計算はアイソトポログではなく質量アイソトポマーの含有量について行わなければならないことから、アイソトポログと質量アイソトポマーとの区別は実用上有用である。最も質量の小さい質量アイソトポマーはM0と表され、大部分の有機分子について、これは12C、1H、16O、14N等の全てを含む種類である。他の質量アイソトポマーは、それらの質量差により、M0とは区別される（M1、M2等）。所定の質量アイソトポマーについては、分子内の同位体の位置及び配置は特定されず、また変化しうる（すなわち、「位置アイソトポマー」は区別されない）。
【０１６５】
「質量アイソトポマーエンベロープ」とは、モニターされる各分子又はイオン断片に関連するファミリーを構成している質量アイソトポマーの組を意味する。
【０１６６】
「質量アイソトポマーパターン」とは、ある分子の質量アイソトポマーの含有量のヒストグラムを指す。古典的には、該パターンは各含有量の全てを最も多い質量アイソトポマーに対して標準化した場合（最も多いアイソトポマーを100％とする）の相対含有量％として表されている。しかしながら、確率分析（質量アイソトポマー分布解析（MIDA）等）をはじめとする適用についての好ましい形式は、それぞれの種類が総量に対して寄与する部分を用いる、割合量又は含有量割合である。「同位体パターン」との用語は、「質量アイソトポマーパターン」との用語と同義に用いることができる。
【０１６７】
「モノアイソトピック質量」とは、1H、12C、14N、16O、32S等の全てを含有する分子種の精密質量である。C、H、N、O、P、S、F、Cl、Br、及びIからなるアイソトポログについては、最も小さい質量を有するアイソトポログの同位体組成は、固有且つ明白であり、なぜならこれらの元素の最も多い同位体もまた質量が最も小さいものであるからである。モノアイソトピック質量はm0と略され、他の質量アイソトポマーの質量はm0とのそれらの質量差から特定される（m1、m2等）。
【０１６８】
「誘導体化する」、「誘導体化すること」、「誘導体化」、「加水分解及び誘導体化」は、本発明との関係では、GC/MS分析のためのサンプルを調製するプロセスを意味する。この調製は単離生体分子、細胞、複合サンプルその他のサンプル又は分子について行うことができ、具体的なプロセスは分析対象の経路によって決まる。かかる調製は、それぞれが多くのステップを有する複数の手順を含み、通常は「誘導体化」手順で終わる。従って、サンプル調製の長いプロセスが時にはこれらの用語、すなわち最終手順で呼ばれる。文脈によっては、この用語がこの最終手順のみを指すこともある。
【０１６９】
「同位体擾乱」（isotopically perturbed）とは、天然にはあまり多くない同位体が過剰に（富化されて）存在するか又は不足して（枯渇して）存在するかどうかしている、自然界で最も一般的に見出される分布とは異なる同位体分布を有する元素又は分子の明白な取り込みによりもたらされる元素又は分子の状態を指す。
【０１７０】
「対象となる分子」とは、限定するものではないが、生体系中の代謝経路内に存在する、アミノ酸、炭水化物、脂肪酸、ペプチド、糖、脂質、核酸、ポリヌクレオチド、グリコサミノグリカン、ポリペプチド、又はタンパク質をはじめとするいずれかの分子（ポリマー及び/又はモノマー）をも意味する。本発明との関係では、「対象となる分子」は疾患の「バイオマーカー」である場合があり、曝露されていないか又は健康な被験体（すなわち、対照被験体）の流量と比較したその流量が、対象となる被験体での、臨床では気がつきにくいか又は検出しづらい病態生理学的発症を表すことができ、これは対象となる被験体での将来の疾患若しくは傷害を予測するものであり得る。この様式では、対象となる被験体での1種以上の対象となるバイオマーカーの流量と対照被験体での1種以上の対象となるバイオマーカーの流量との比較には、対象となる疾患を有する対象となる被験体の診断、又は対象となる被験体が該疾患に罹患するリスクの評価若しくは定量における用途があるであろう。更に、そのような情報には、対象となる疾患を有する対象となる被験体の確定診断若しくは予後診断、対象となる被験体での対象となる疾患の進行のモニタリング、又は対象となる疾患を有する対象となる被験体での治療計画の治療的有効性の評価における用途があるであろう。
【０１７１】
「対象となる被験体」とは、対象となる疾患を有するか、又は対象となる疾患に罹患する一定レベルのリスクを有するヒト若しくは動物を意味する。
【０１７２】
「対照被験体」とは、対象となる疾患を有しないか、又は対象となる疾患に罹患する一定レベルのリスクを有しないヒト若しくは動物を意味する。
【０１７３】
「モノマー」とは、ポリマーの合成の間に結合する化学的単位であって、ポリマー中に2回以上存在するものを指す。
【０１７４】
「ポリマー」とは、モノマーの2以上の繰り返しにより合成されるか、それを含有する分子を指す。「バイオポリマー」とは、生体系によって、若しくは生体系中で合成されるか、又は他の何らかの様式で生体系と関連するポリマーである。
【０１７５】
「タンパク質」とは、アミノ酸のポリマーを指す。本明細書中で用いる場合には、「タンパク質」は長いアミノ酸ポリマーを指し、同様にペプチドのような短いポリマーを指すことがある。
【０１７６】
「アミノ酸」とは、アミノ基（すなわちNH2）を有する両性有機酸を意味する。該用語は、20種類の一般（当該技術分野では、「標準」又は時には「天然に存在する」とも称される）アミノ酸、及び稀少（当該技術分野では、「非標準」とも称される）アミノ酸を包含する。20種類の一般アミノ酸の例としては、アルファ-アミノ酸（又はα-アミノ酸）が挙げられ、これはα位にアミノ基を有し、一般的には式RCH-(NH2)-COOHを有する。α-アミノ酸はタンパク質のモノマー性の構成要素であり、タンパク質から加水分解を経て取得することができる。非標準アミノ酸の例としては、限定するものではないが、γ-アミノ酪酸、ドーパミン、ヒスタミン、チロキシン、シトルリン、オルニチン、ホモシステイン、及びS-アデノシルメチオニンが挙げられる。
【０１７７】
「脂質」とは、水に不溶であり、非極性（又は有機）溶媒（アルコール、エーテル、クロロホルム、ベンゼン等）により抽出可能なことを特徴とする脂肪及び脂肪様物質の混成グループのいずれかを指す。その全てが主要な構成成分として脂肪族炭化水素を含有する。脂質は身体内に蓄積され易く、燃料源として働き、細胞構造の重要な成分であり、且つ他の生物学的機能を担う。脂質には、限定するものではないが、脂肪酸、中性脂肪（例えばトリアシルグリセロール）、ワックス及びステロイド（例えばコレステロール）が含まれる。複合脂質は、糖脂質、リポタンパク質及びリン脂質を含む。
【０１７８】
「脂肪酸」とは、長鎖炭化水素側基を有するカルボン酸である。それらは、メチル基の、アルコール、アルデヒド、そして酸への酸化の平衡により炭化水素から誘導される有機一塩基酸からなる。脂肪酸は飽和型でも不飽和型でもあり得る。
【０１７９】
「DNA」とは、二本鎖若しくは一本鎖形態の、弛緩型又はスーパーコイル型の、デオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、又はシトシン）のポリマー型を意味する。この用語は、分子の一次及び二次構造のみを指し、いずれの三次元構造に限定するものでもない。例えば、この用語は、とりわけ直線状DNA分子（例えば制限断片）、ウイルス、プラスミド、及び染色体中に見出される一本鎖及び二本鎖DNAを包含する。該用語は4種類の塩基であるアデニン、グアニン、チミン、又はシトシンを含有する分子、及び当該技術分野で公知の塩基アナログを含有する分子を取り込んでなる。
【０１８０】
「核酸」配列とは、DNA又はRNA配列を指す。該用語はDNA及びRNAの公知の塩基アナログのいずれかを含有する配列を取り込んでなり、そのようなアナログとしては例えば、限定するものではないが、4-アセチルシトシン、8-ヒドロキシ-N6-メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボキシメチル-アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルアデニン、1-メチルシュードウラシル、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルケオシン（queosine）、5-メトキシカルボニルメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、オキシブトキシシン（oxybutoxosine）、シュードウラシル、ケオシン（queosine）、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、N-ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、シュードウラシル、ケオシン（queosine）、2-チオシトシン、及び2,6-ジアミノプリンがある。
【０１８１】
「炭水化物」とは、少なくとも3個の炭素原子を有する直鎖ポリヒドロキシルアルコールのアルデヒド又はケトン誘導体を意味する。該ポリヒドロキシルアルコールは原則的に（とはいえ排他的ではなく）、五価及び六価アルコール種のものである。炭水化物（carbohydrate）は、水素と酸素が、通常は一般式Cn(H2O)nを有して水を形成する割合となっているために、そのように名付けられている。最も重要な炭水化物は、デンプン、糖、セルロース及びガムである。それらは単糖類、二糖類、三糖類、多糖類及び異糖類に分類されている。最も小さいものはグルコースのような単糖類であり、一方、デンプン、セルロース又はグリコーゲンは大きく、長さに制限がない。
【０１８２】
「糖」とは、多価アルコールのアルデヒド又はケトン誘導体である、甘味のある結晶性の単純炭化水素についての一般名である。糖は主にスクロースのような二糖類及びフルクトース又はグルコースのような単糖類である。この用語は、単糖類、二糖類、三糖類、異糖類、又は多糖類（これは単糖残基からなる）を包含する。単糖類はグルコース（D-グルコース及びL-グルコースのいずれも）、マンノース、フルクトース、ガラクトース及び糖誘導体を含み、糖誘導体としては、限定するものではないが、N-アセチルムラミン酸、N-アセチルノイラミン酸その他のシアル酸、N-アセチルマンノサミン、グルクロン酸、グルコサミン等が挙げられる。多糖類には、スクロース、マルトース及びラクトース等の二糖類、並びにデンプン、グリコーゲン、セルロース、キチン等のより長い鎖の糖分子が含まれる。「オリゴ糖」との用語は、数個の共有結合した単糖モノマーからなる分子を意味する。
【０１８３】
「グリコサミノグリカン」とは、アミノ基糖（そのうちの少なくとも1つは負に荷電した側基（カルボキシレート又はスルフェート）を有する）を含有する二糖類の繰り返し単位により作られる非分岐長鎖のネットワークからなるポリマーを意味する。グリコサミノグリカンの例としては、限定するものではないが、ヒアルロネート（D-グルクロン酸-N-アセチル-D-グルコサミン：MW最大1000万）、コンドロイチンスルフェート（D-グルクロン酸-N-アセチル-D-ガラクトサミン-4又は6-スルフェート）、デルマタンスルフェート（D-グルクロン酸又はL-イズロン酸-N-アセチル-D-ガラクトサミン）、ケラタンスルフェート（D-ガラクトース-N-アセチル-D-グルコサミンスルフェート）、及びヘパランスルフェート（D-グルクロン酸又はL-イズロン酸-N-アセチル-D-グルコサミン）が挙げられる。「ムコ多糖」はグリコサミノグリカンと同義の用語である。
【０１８４】
「糖タンパク質」とは、1つ以上の炭水化物分子と共有結合しているタンパク質又はポリペプチドを意味する。糖タンパク質には、プロテオグリカン及び、大部分ではないにしても多数の、外側膜を介して細胞外腔に突出した重要な膜内タンパク質、並びに大部分ではないにしても多数の分泌型タンパク質が含まれる。
【０１８５】
「プロテオグリカン」とは、タンパク質とグリコサミノグリカンからなる巨大分子の多様なグループのうちのいずれかを意味する。「ムコタンパク質」はプロテオグリカンと同義の用語である。
【０１８６】
「同位体標識基質」には、生体系中で対象となる分子に取り込まれることが可能な、同位体標識したいずれの前駆体分子も含まれる。同位体標識基質の例としては、限定するものではないが、2H2O、3H2O、2H-グルコース、2H-標識アミノ酸、2H-標識有機分子、13C-標識有機分子、14C-標識有機分子、13CO2、14CO2、15N-標識有機分子及び15NH3が挙げられる。
【０１８７】
「標識糖」とは、1つ以上の2H同位体等の安定同位体標識を取り込んだ糖を指す。
【０１８８】
「標識脂肪酸」とは、1つ以上の2H同位体等の安定同位体標識を取り込んだ脂肪酸を指す。
【０１８９】
「重水素化水」とは、1つ以上の2H同位体等の安定同位体標識を取り込んだ水を指す。
【０１９０】
「標識グルコース」とは、1つ以上の2H同位体を用いて標識したグルコースを指す。標識グルコース又は2H-標識グルコースの具体例としては、[6,6-2H2]グルコース、[1-2H1]グルコース、及び[1,2,3,4,5,6-2H7]グルコースが挙げられる。
【０１９１】
生体系を化学物質若しくは物質等の化合物に「曝露すること」とは、限定するものではないが、動物その他の高等生物での、局所投与、経口摂取、吸入、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、及び動脈内注射によるものであり得る。
【０１９２】
「治療的作用」とは、発症、進行、重症度、病理、侵襲性、進行度、活動性、後遺症、死亡率、罹病率、疾患サブクラスその他の、1種以上の疾患の基礎となる病因的又は病理学的特徴についての発生様式の一因となるか、又はそれに寄与すると考えられる生化学的又は分子的プロセス（すなわち、代謝経路又はネットワークを通る分子の流れ）に対する効果を意味するが、ここで該効果は健康に対して有益であるか、又は何らかの様式で望ましい結果（例えば、望ましい臨床転帰）に寄与するものである。
【０１９３】
「作用」とは、薬物の投与等の介入の特異的且つ直接的結果を意味する。
【０１９４】
「効果」とは、化合物を用いた介入のいずれかの結果（二次的又は関連の薄いものを含む）のみならず、自然発生的な結果（例えば天然で発現するか阻害された場合に遺伝子が発揮する効果）を意味する。
【０１９５】
「毒性作用」とは、ある化合物又はその組み合わせ若しくは混合物に曝露された生体系による不都合な応答を意味する。毒性作用は、例えば標的器官毒性（end-organ toxicity）を含むことができる。
【０１９６】
「個体」とは、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトである。
【０１９７】
「哺乳動物」とは、哺乳綱のいずれかのメンバーを意味し、限定するものではないが、ヒト及び非ヒト霊長類（チンパンジーその他の類人猿（ape）及びサル（monkey）種等）；家畜（ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマ等）；ペット哺乳類（イヌ及びネコ等）；実験動物（マウス、ラット及びギニアピッグ等のげっ歯類を含む）等が挙げられる。該用語は、特定の月齢又は性別を意味するものではない。従って、メス又はオスのいずれかを問わず、成体及び新生被験体、及び胎児を包含するものと意図される。
【０１９８】
「少なくとも部分的に特定された」とは、薬物創薬及び開発との関係では、1以上の本発明の方法を用いて特定された薬剤（すなわち「化合物」）についての、少なくとも1種の臨床的な意義のある薬理学的特性を意味する。この特性は、望ましいものであって、例えば、疾患プロセスの原因となる代謝経路を通る分子流束量を増大又は減少させるもの、疾患に関連がある代謝経路の活性を変化させるシグナル伝達経路又は細胞表面受容体を変化させるもの、酵素の活性化を阻害するもの等であり得る。あるいはまた、薬剤の薬理学的特性は、望ましくないものであって、例えば、1以上の毒性作用をもたらすものであり得る。当業者に周知の薬剤の望ましい特性及び望ましくない特性には極めて多くのものがあり、その各々が開発対象の特定の薬剤及び標的疾患との関係で考慮されるであろう。例えば、薬剤開発経路での特定の重大な段階（milestone）の決定点を支持するのに十分なだけのいくつかの特性（望ましいもの若しくは望ましくないもの又はその両方）が特定されている場合には、薬剤は少なくとも部分的によりは特定されていると言える。そのような重大な段階としては、限定するものではないが、in vitroからin vivoへの移行についての前臨床的決定、IND申請前のgo/no go決定、フェーズIからフェーズIIへの移行、フェーズIIからフェーズIIIへの移行、NDA申請、及び販売についてのFDA認可が挙げられる。従って、「少なくとも部分的に」特定されたことには、創薬/薬物開発プロセスでの薬剤の評価に有用な1以上の薬理学的特性の特定が含まれる。薬理学者又は医師その他の専門家は、治療指数を確定するために、薬剤について特定された望ましいか望ましくない特性の全部又は一部分を評価することができる。これは当該技術分野で周知の手法を用いて達成することができる。
【０１９９】
「薬剤を製造すること」には、本発明との関係では、薬剤製品を生産するために利用する当業者に周知のいかなる方法も含まれる。製造プロセスには、限定するものではないが、医薬的化学薬品合成（すなわち、合成有機化学）、コンビナトリアル・ケミストリー、バイオテクノロジー法（ハイブリドーマモノクローナル抗体産生、組換えDNA技術）その他の当業者に周知の技術が含まれる。かかる製品は、複合製品の一部分であるか単体の製品であるかを問わず、治療用途のために販売される最終的な薬剤であるか、治療用途のために販売される複合製品の構成品であるか、又は最終的な薬剤製品の開発において使用するいずれかの中間製品であり得る。「薬剤を製造すること」は「化合物を製造すること」と同義である。
【０２００】
「信頼性のある（authentic）バイオマーカー」とは、ある化合物の真の若しくは所望の機構上の標的か、又は発症、進行、重症度、病理、侵襲性、進行度、活動性、後遺症、死亡率、罹病率、疾患サブクラスその他の、1種以上の疾患の基礎となる病因的若しくは病理学的特徴についての発生様式の一因となるか、それに寄与すると考えられる機構上の事象を代表する生物由来若しくは生物での物理学的、生化学的、又は生理学的尺度を意味する。バイオマーカーは、治療的介入の成果をモニタリングするための標的（すなわち、薬剤の機能上又は構造上の標的）であり得る。本明細書中で定義する「信頼性のあるバイオマーカー」及び「バイオマーカー」は、本明細書中では交換可能に用いられ、疾患若しくは障害の病因又は進行に関与するか、又は関与すると考えられる生化学プロセスを指す。生化学プロセス（すなわち、標的となる代謝経路又はネットワークを通る分子の流れ）が解析（本明細書中に開示されている通りの）の焦点であり、なぜなら、疾患若しくは障害の治療又は診断的モニタリングについての注目に値するか信頼できる標的であり得るのが、生化学プロセス（すなわち、分子流束量）の基礎となる変化だからである。
【０２０１】
「代理バイオマーカー」（surrogate biomarker）とは、死亡率、休職期間、罹病率等の「ハードの」臨床転帰とは独立に、多くの場合、政府系機関（例えばFDA）又は医学的な専門家の意見により、それ自体十分な治療上の標的であると認められる、生物由来か又は生物上での物理的、生化学的、又は生理学的尺度を意味する。米国には比較的少数の代理バイオマーカーしかなく、それらとしては血圧及び血糖レベルが挙げられる。そのような代理バイオマーカーは本出願の対象ではない。
【０２０２】
「評価する」又は「評価」若しくは「評価すること」とは、本発明との関係では、通常は実験結果と確立された標準及び/又は条件との比較により、評価・研究を通じて、化学物質、生物学的因子、化学物質の組み合わせ、若しくは生物学的因子の組み合わせの、活性、毒性、相対的効能、潜在的な治療上の価値及び/若しくは有効性、重要性、又は価値を決定するプロセスを意味する。該用語は、化学物質又は生物学的因子（又は化学物質の組み合わせ若しくは生物学的因子の組み合わせ）について薬物開発プロセスにおいて更に先に進めることの「go/no go」決定を行うために、意思決定者に対して十分な情報を提供するコンセプトを包含する。「go/no go」決定は、薬物開発プロセス中のいずれの時点又は重要段階においても行うことができ、そのような時点又は段階には、限定するものではないが、前臨床開発での任意の段階、前臨床から治験薬（IND）への段階、フェーズIからフェーズIIへの段階、フェーズIIからフェーズIIの更に進んだフェーズ（例えばフェーズIIb）、フェーズIIからフェーズIIIへの段階、フェーズIIIから新薬申請（NDA）若しくは生物製剤認可申請（BLA）への段階、又は更に先の段階（例えばフェーズIVその他のNDA後又はBLA後段階）が含まれる。該用語はまた、あるクラスの化合物（化学薬品、生物製剤）の中で「最善の種類」（best-in-breed又はbest-of-breed）を選択するために十分な情報を提供するというコンセプトも包含する。
【０２０３】
「特性決定する」、「特性決定すること」、又は「特性決定」とは、本発明との関係では、化学物質若しくは化学物質の組み合わせの性質又は質を説明するための努力を意味する。本明細書中で用いる場合には、該用語は「評価する」と殆ど等価であるが、「評価する」のうちのより精密な部分を欠き、ここで、ある薬物を「評価する」ことには、当該薬物又は化学物質の薬物開発プロセスでの進行について、（治療的価値の評定に基づいて）「go/no go」決定を行う能力が含まれる。
【０２０４】
「肝線維症」とは、肝細胞又は肝機能を損ない、従って総体的な肝臓機能を損なう任意の肝臓の線維化状態を意味する。該線維症は必ずしもその起源を肝組織に有していなくてよく、例えば肝細静脈の周囲に起こって肝細胞への血流の乱れを引き起こすものであってもよい。肝線維症は一般的に、「線維症」と呼ばれ、本明細書中で用いる場合には、「線維症」、「肝臓線維症」、及び「肝線維症」は等価の用語である。
【０２０５】
「状態」又は「医学的状態」とは、全身又は身体の部分のうち1つについての身体状態を意味する。該用語は、多くの場合、以前の身体若しくは精神状態からの変化、又は医学識者によっては疾患若しくは障害であると認められない異常を示すために用いられる。「状態」又は「医学的状態」の例としては、肥満又は妊娠が挙げられる。
【０２０６】
IV.  本発明の方法
A.  本発明の方法の概要
本発明は、生体系内の1以上の対象となる代謝経路における1種以上の分子の分子流束量の変化を測定するための方法を目的とする。対象となる代謝経路は、公知であるか、又は疾患若しくは障害の駆動要因として、又は必須メカニズムとして重要であると推測されるかのいずれかのものである。対象となる代謝経路における変化（すなわち分子流束量、反応速度）は、例えば化学物質、既知薬物、薬物候補、薬物リード（又はその組み合わせ）、あるいは工業化学薬品（殺虫剤、除草剤、プラスチック等）又は化粧品若しくは食品添加物をはじめとする1種以上の化合物により引き起こすことができる。
【０２０７】
少なくとも1種の同位体標識基質分子を、1以上の標的となる代謝経路内の1種以上の対象となる分子にin vivoで（又は生体系が培養細胞である場合には細胞内で）取り込まれるのに十分な時間にわたって、細胞、組織又は生物に投与する。一実施形態では、同位体標識基質分子は、安定同位体（すなわち非放射性同位体）を用いて標識する。別の実施形態では、同位体標識基質分子は、放射性同位体を用いて標識する。また別の実施形態では、1種以上の同位体標識基質分子を標識するのに安定同位体と放射性同位体の両方を用いる。
【０２０８】
対象となる標的分子は、細胞、組織、又は生物から生化学的単離手法によって取得し、質量分析その他の当該技術分野で公知の方法により特定する。安定同位体標識を用いる方法については、それぞれの特定される対象となる分子に対応する質量アイソトポマー性エンベロープ内のイオンの相対量及び絶対量（すなわち、分子の同位体含量及び/又はパターンあるいは分子の同位体含量及び/若しくはパターンの変化の速度）を定量する。一実施形態では、それぞれの特定される対象となる分子に対応する質量アイソトポマー性エンベロープ内のイオンの相対量及び絶対量を、質量分析を用いて定量する。次に、標的となる代謝経路を通る流量を、当該技術分野で公知であり、下記で論じる式を用いて算出する。標的となる代謝経路を通る流量は、1種以上の化合物、1種以上の化学物質（すなわち、薬物、薬物候補、工業化学薬品、食品添加物、環境汚染物質等）若しくは化学物質の組み合わせ（すなわち、薬物、薬物候補その他の化学薬品の組み合わせ）への曝露の有無において比較し、あるいは1種以上の化合物若しくは1種以上の化学物質への異なるレベルの曝露に対する応答において、又は化合物若しくは1種以上の化学物質の組み合わせへの異なるレベルの曝露に対する応答において比較する。
【０２０９】
この様式では、標的となる基礎の生化学的（代謝）経路における変化を測定及び定量し、そして疾患診断；疾患予後診断；投与した化合物、薬物、薬物候補若しくは薬物リードの治療上有効性；又は化合物、化学物質（薬物候補、薬物リード、既知薬物、工業化学薬品、殺虫剤、除草剤、化粧品、食品添加物等）の毒性作用に関連づける。
【０２１０】
B.  同位体標識前駆体の投与
本発明の方法の第1のステップとして、同位体標識前駆体を投与する。
【０２１１】
1.  同位体標識前駆体分子の投与
1種以上の同位体標識基質を投与する方法は、該同位体標識基質の吸収特性及び各化合物が標的とされる具体的な生合成プールに応じて変わり得る。前駆体はin vivo分析のために、生物、植物及びヒトをはじめとする動物に直接的に投与することができる。更に、前駆体は生存細胞にin vitroで投与することができる。生存細胞の具体的なタイプとしては、肝細胞、脂肪細胞、筋細胞、線維芽細胞、マイクログリア、神経細胞、神経前駆細胞、精子細胞、膵β細胞、腸上皮細胞、乳房上皮細胞、前立腺上皮細胞、内皮細胞、白血球、リンパ球、赤血球、微生物細胞、及びin vitroで生存し機能的に保つことができる任意の他の細胞タイプが挙げられる。
【０２１２】
一般的には、適切な投与方法は少なくとも一時的に、生合成プール及び/又はかかるプールに供給を行う格納内に前駆体の定常状態レベルをもたらすものである。ヒトをはじめとする生物にかかる前駆体を投与するために、通常は血管内又は経口の投与経路を用いる。遅延放出前駆体組成物と適宜組み合わせて用いる場合には、他の投与経路（例えば皮下又は筋内投与）も適切である。注射のための組成物は一般的に無菌製薬用賦形剤中に調製する。
【０２１３】
a.  標識前駆体分子
(1)  同位体標識
分子流束量の測定における第1のステップは、細胞、組織、又は生物に同位体標識前駆体分子を投与することを含む。同位体標識前駆体分子は、安定同位体又は放射性同位体を含有することができる。本発明の方法に従って用いることができる同位体標識としては、限定するものではないが、2H、13C、15N、18O、3H、14C、35S、32P、33P、125I、131I、その他の、有機系に存在する元素の同位体が挙げられる。これらの同位体及び他のものは、本発明での使用が意図される全てのクラスの化学薬品（すなわち前駆体分子）にとって好適である。そのような前駆体分子としては、限定するものではないが、タンパク質前駆体、脂質前駆体、炭水化物前駆体、核酸前駆体、ポルフィリン前駆体、グリコサミノグリカン前駆体、及びプロテオグリカン前駆体が挙げられる（それぞれの具体例については、下記を参照されたい）。
【０２１４】
一実施形態では、同位体標識は2Hである。
【０２１５】
(2)  前駆体分子（同位体標識基質）
前駆体分子は生体系中においてin vivoでの（又は培養細胞においてin vitroでの）代謝経路の通過により対象となる分子に取り込まれる、同位体標識を有するいずれの分子でもよい。典型的に用いられる前駆体分子としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：H2O；CO2；NH3；アセチルCoA（コレステロール、脂肪酸を形成するため）；リボ核酸（RNAを形成するため）；デオキシリボ核酸（DNAを形成するため）；グルコース（グリコーゲンを形成するため）；アミノ酸（ペプチド/タンパク質を形成するため）；ホスホエノール-ピルベート（グルコース/UDP-グルコースを形成するため）；及びグリシン/スクシネート（ポルフィリン誘導体を形成するため）。同位体標識は、同位体標識前駆体分子を形成させるために本明細書中に開示した全ての前駆体分子を修飾するのに用いることができる。
【０２１６】
代謝経路内の1種以上の対象となる分子に前駆体分子の全体が取り込まれ得る。あるいはまた、1種以上の対象となる分子に前駆体分子の一部分が取り込まれてもよい。
【０２１７】
i.  タンパク質前駆体
タンパク質前駆体分子は、当該技術分野で公知のいずれのタンパク質前駆体分子でもよい。これらの前駆体分子とは、アミノ酸、CO2、NH3、グルコース、ラクテート、H2O、アセテート、及び脂肪酸であり得る。
【０２１８】
同位体標識としては生体分子中に存在する元素の特定の重同位体（例えば、2H、13C、15N、18O、33S、34S）が含まれ、又は生体分子中に存在する元素の他の同位体（例えば、3H、14C、35S、32P、33P、125I、又は131I）も含まれ得る。
【０２１９】
タンパク質の前駆体分子としては、1種以上のアミノ酸も挙げられる。前駆体はいずれのアミノ酸でもよい。前駆体は1ヵ所又は複数ヵ所重水素化されたアミノ酸であり得る。前駆体分子は、13C-リジン、15N-ヒスチジン、13C-セリン、13C-グリシン、2H-ロイシン、15N-グリシン、13C-ロイシン、2H5-ヒスチジン、及びいずれかの重水素化アミノ酸のうち1種以上であり得る。例として、同位体標識タンパク質前駆体としては、限定するものではないが、2H2O、15NH3、13CO2、H13CO3、2H-標識アミノ酸、13C-標識アミノ酸、15N-標識アミノ酸、18O-標識アミノ酸、33S-又は34S-標識アミノ酸、3H2O、3H-標識アミノ酸、及び14C-標識アミノ酸が挙げられる。標識アミノ酸は、例えば非標識アミノ酸で希釈しないで、又は希釈して投与することができる。全ての同位体標識前駆体を、例えばCambridge Isotope Labs（Andover, MA）より購入することができる。
【０２２０】
タンパク質前駆体分子には、翻訳後又は翻訳前に修飾されたアミノ酸も含まれ得る。これらの前駆体としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：メチル化の前駆体（グリシン、セリン、H2O等）；ヒドロキシ化の前駆体（H2O又はO2等）；リン酸化の前駆体（ホスフェート、H2O又はO2等）；プレニル化の前駆体（脂質、アセテート、H2O、エタノール、ケトン体、グルコース、又はフルクトース等）；カルボキシル化の前駆体（CO2、O2、H2O、又はグルコース等）；アセチル化の前駆体（アセテート、エタノール、グルコース、フルクトース、ラクテート、アラニン、H2O、CO2、又はO2等）；及び当該技術分野で公知の他の翻訳前又は後修飾。
【０２２１】
遊離アミノ酸中に存在する標識の程度は、実験的に測定するか、又はアミノ酸中の標識部位の数に基づいて推定することができる。例えば、標識として水素同位体を用いる場合には、体内水中の2H2Oへの曝露の際に遊離アミノ酸（より具体的にはtRNA-アミノ酸）のC-H結合中に存在する標識を明らかにすることができる。各非必須アミノ酸中のC-H結合の総数は公知である（例えばアラニン中には4ヵ所、グリシン中には2ヵ所等）。
【０２２２】
タンパク質の前駆体分子は水でもよい。タンパク質のO-H結合及びN-H結合は水溶液中では不安定であるので、C-H結合中の水素原子は2H2Oからのタンパク質合成の測定にとって有用なアミノ酸中の水素原子である。すなわち、2H2OからO-H結合又はN-H結合への2H-標識の交換は、上記のような遊離アミノ酸からのタンパク質の合成がなくても生じる。C-H結合は、特異的な酵素触媒中間代謝反応の間、H2Oから遊離アミノ酸への取り込みを行う。従って、2H2O投与後のタンパク質結合アミノ酸のC-H結合中の2H-標識の存在とは、2H2O曝露の間、遊離型であったアミノ酸からタンパク質が組み立てられることを意味し、すなわち、該タンパク質は新規に合成されたものであることを意味する。分析的には、用いるアミノ酸誘導体は全てのC-H結合を有していなければならないが、潜在的に汚染性であるN-H結合及びO-H結合は全て取り除かれなければならない。
【０２２３】
体内水由来の水素原子は、遊離アミノ酸から取り込むことができる。標識水由来の2H又は3Hは中間代謝系の反応を介して細胞中の遊離アミノ酸に入り込むことが可能であるが、ペプチド結合中に存在するか又はトランスファーRNAに結合しているアミノ酸には2H又は3Hが入り込むことができない。遊離の必須アミノ酸は、迅速で可逆的なアミノ基転移反応を介して、単一の水素原子を体内水からα-炭素C-H結合へと取り込む。遊離の非必須アミノ酸は代謝により交換可能なC-H結合をより多く含有し、これにより当然に、新規に合成されたタンパク質中では、2H2O由来のより高い同位体含有率（isotopic enrichment）の値を示すことが予測される。
【０２２４】
当業者であれば、体内水由来の標識水素原子を、他の生化学経路を介して他のアミノ酸に組み込むことができることを認識するであろう。例えば、水由来の水素原子はクエン酸回路中で前駆体であるα-ケトグルタレートの合成を通じてグルタメートに取り込むことができることは、当該技術分野で公知である。そして、グルタメートは、グルタミン、プロリン、及びアルギニンの生化学的前駆体であることが知られている。別の例では、体内水由来の水素原子は、翻訳後に修飾されるアミノ酸に取り込むことができ、そのような修飾としては例えば、3-メチルヒスチジン中のメチル基、ヒドロキシプロリン又はヒドロキシリジン中のヒドロキシル基等がある。他のアミノ酸合成経路が当業者に公知である。
【０２２５】
酸素原子（H218O）もまた、酵素触媒反応を介してアミノ酸に取り込むことができる。例えば、酵素触媒反応の際に、アミノ酸のカルボン酸部分への酸素交換が起こる場合がある。アミノ酸への標識酸素の取り込みは、当業者に公知である。酸素原子は酵素触媒反応を介して18O2からアミノ酸へと取り込むこともできる（ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジンその他の翻訳後修飾アミノ酸を含む）。
【０２２６】
標識水からの水素及び酸素標識は、翻訳後修飾を介してアミノ酸に取り込むこともできる。一実施形態では、翻訳後修飾は、翻訳後修飾に先立って、生合成経路を通じて標識水素又は酸素を既に含有していてもよい。別の実施形態では、翻訳後修飾は、翻訳後修飾ステップ（例えば、メチル化、ヒドロキシ化、リン酸化、プレニル化、硫酸化、カルボキシル化、アセチル化その他の公知の翻訳後修飾）の前又は後に、体内水由来の遊離交換標識水素に関連する代謝誘導体から、標識水素、酸素、炭素、又は窒素を取り込んでもよい。
【０２２７】
被験体への投与に好適なタンパク質前駆体としては、限定するものではないが、タンパク質中に見出される標準アミノ酸に加えて、H2O、CO2、NH3、又はHCO3が挙げられる。
【０２２８】
標識タンパク質前駆体を投与する個体は哺乳動物とすることができる。一変法では、個体は、限定するものではないが、げっ歯類、霊長類、ハムスター、ギニアピッグ、イヌ、又はブタをはじめとする実験動物であってよい。薬物、薬物候補、薬物リード、又はそれらの組み合わせの投与を含む変法では、個体は一般に認められた疾患動物モデルをはじめとする実験動物又はヒト等の哺乳動物であり得る。食品添加物、工業若しくは産業的化学薬品、環境汚染物質、又は化粧品の投与を含む変法では、個体は、限定するものではないが、げっ歯類、霊長類、ハムスター、ギニアピッグ、イヌ、又はブタ等のいずれかの実験動物であり得る。
【０２２９】
ii.  有機代謝物の前駆体
有機代謝物の前駆体は、有機代謝物経路に到達することが可能ないずれの前駆体分子でもよい。有機代謝物又は有機代謝物前駆体としては、限定するものではないが、H2O、CO2、NH3、HCO3、アミノ酸、単糖類、炭水化物、脂質、脂肪酸、核酸、解糖中間体、酢酸、及びトリカルボン酸回路中間体が挙げられる。
【０２３０】
同位体標識有機代謝物前駆体としては、限定するものではないが、2H2O、15NH3、13CO2、H13CO3、2H-標識アミノ酸、13C-標識アミノ酸、15N-標識アミノ酸、18O-標識アミノ酸、33S-又は34S-標識アミノ酸、3H2O、3H-標識アミノ酸、14C-標識アミノ酸、14CO2、及びH14CO2が挙げられる。
【０２３１】
有機代謝物前駆体を直接的に投与することもできる。有機代謝物前駆体の質量同位体標識に有用であり得る質量同位体としては、限定するものではないが、2H、3H、13C、14C、15N、18O、33S、34S、35S、32P、125I、131I、その他の有機系中に存在する元素の同位体が挙げられる。同位体標識の代謝的損失を避けるために、同位体標識原子が被験体中で比較的不安定でないか、又は少なくとも予測可能な様式で振舞うことが、多くの場合望ましい。生合成プールへの同位体標識前駆体の投与により、同位体標識前駆体は該プール中で形成される有機代謝物へと直接的に取り込まれるものとなることが可能である。
【０２３２】
標識有機代謝物前駆体を投与する個体は哺乳動物であり得る。一変法では、個体は、限定するものではないが、げっ歯類、霊長類、ハムスター、ギニアピッグ、イヌ又はブタをはじめとする実験動物であってよい。薬物、薬物候補、薬物リード、又はそれらの組み合わせの投与を含む変法では、個体は一般に認められた疾患動物モデルをはじめとする実験動物又はヒト等の哺乳動物であり得る。食品添加物、工業若しくは産業的化学薬品、環境汚染物質、又は化粧品の投与を含む変法では、個体は、限定するものではないが、げっ歯類、霊長類、ハムスター、ギニアピッグ、イヌ、又はブタ等のいずれかの実験動物であり得る。
【０２３３】
iii.  核酸の前駆体
核酸（すなわちRNA、DNA）の前駆体は、RNA及び/又はDNA合成経路への取り込みに好適ないずれかの化合物である。DNAのデオキシリボース環の標識に有用な基質の例としては、限定するものではないが、[6,6-2H2]グルコース、[U-13C6]グルコース及び[2-13C1]グリセロールが挙げられる（米国特許第6,461,806号を参照のこと、これは参照により本明細書中に組み込まれる）。デオキシリボースの標識は、種々の希釈源を避けるので、DNA中の情報を有する窒素塩基の標識よりも優れている。安定同位体標識は、質量分析技術により容易に検出することができる。
【０２３４】
一実施形態では、グルコース、グルコース-6-リン酸の前駆体又はリボース-5-リン酸の前駆体由来のDNAのデオキシリボース環を標識するために、安定同位体標識を用いる。出発材料としてグルコースを用いる実施形態では、好適な標識としては、限定するものではないが、重水素標識グルコース（[6,6-2H2]グルコース、[1-2H1]グルコース、[3-2H1]グルコース、[2H7]グルコース等）；13C-1標識グルコース（[1-13C1]グルコース、[U-13C6]グルコース等）；及び18O-標識グルコース（[1-18O2]グルコース等）が挙げられる。
【０２３５】
グルコース-6-リン酸前駆体又はリボース-5-リン酸前駆体が望ましい実施形態では、糖新生前駆体又はグルコース-6-リン酸若しくはリボース-5-リン酸へと変換可能な代謝物を用いることができる。糖新生前駆体としては、限定するものではないが、13C-標識グリセロール（[2-13C1]グリセロール等）、13C-標識アミノ酸、重水素化水（2H2O）及び13C-標識ラクテート、アラニン、ピルベート、プロピオネートその他の糖新生の非アミノ酸前駆体が挙げられる。グルコース-6-リン酸又はリボース-5-リン酸へと変換可能な代謝物としては、限定するものではないが、標識（2H又は13C）ヘキソース（[1-2H1]ガラクトース、[U-13C]フルクトース等）；標識（2H又は13C）ペントース（[1-13C1]リボース、[1-2H1]キシリトール等）、標識（2H又は13C）ペントースリン酸経路代謝物（[1-2H1]セデュヘプタロース（seduheptalose）等）、及び標識（2H又は13C）アミノ糖（[U-13C]グルコサミン、[1-2H1] N-アセチル-グルコサミン等）が挙げられる。
【０２３６】
本発明は、de novoヌクレオチド合成経路を介してDNAのプリン又はピリミジン塩基を標識する安定同位体標識も包含する。内因性プリン合成のための種々の構成成分を、プリンを標識するために用いることができ、そのようなものとしては、限定するものではないが、15N-標識アミノ酸（[15N]グリシン、[15N]グルタミン、[15N]アスパルテート等）、13C-標識前駆体（[1-13C1]グリコン（glycone）、[3-13C1]アセテート、[13C]HCO3、[13C]メチオニン等）、及びH-標識前駆体（2H2O等）が挙げられる。内因性ピリミジン合成のための種々の構成成分を、ピリミジンを標識するために用いることができ、そのようなものとしては、限定するものではないが、15N-標識アミノ酸（[15N]グルタミン等）、13C-標識前駆体（[13C]HCO3、[U-13C4]アスパルテート等）、及び2H-標識前駆体（2H2O等）が挙げられる。
【０２３７】
上記のリストに加えて、DNAの内因性標識をもたらすいずれかの経路の基質又は前駆体である他の安定同位体標識もまた本発明の範囲に包含されることは、当業者には理解される。本発明の使用に好適な標識は、概ね市販されており、又は当該技術分野で周知の方法により合成することができる。
【０２３８】
標識核酸前駆体を投与する個体は哺乳動物であり得る。一変法では、個体は、限定するものではないが、げっ歯類、霊長類、ハムスター、ギニアピッグ、イヌ、又はブタをはじめとする実験動物であってよい。薬物、薬物候補、薬物リード、生物製剤、又はそれらの組み合わせの投与を含む変法では、個体は一般に認められた疾患動物モデルをはじめとする実験動物又はヒト等の哺乳動物であり得る。食品添加物、工業若しくは産業的化学薬品、環境汚染物質、又は化粧品の投与を含む変法では、個体は、限定するものではないが、げっ歯類、霊長類、ハムスター、ギニアピッグ、イヌ、又はブタ等のいずれかの実験動物であり得る。
【０２３９】
iv.  前駆体分子としての水
水は、タンパク質及び多数の有機代謝物の前駆体である。従って、標識水は本明細書中で教示する方法において前駆体として働く。
【０２４０】
H2O利用可能性は細胞内での生合成反応について制限されることはないであろうが（なぜなら、細胞の含有物のうちの70％近く、又は>35モル濃度を占めるからである）、H2O由来の水素及び酸素原子は生合成経路に関与する多くの反応に、化学量論的に寄与する（例えば、R-CO-CH2-COOH + NADPH + H2O→R-CH2CH2COOH（脂肪酸合成））。
【０２４１】
結果として、H-又はO-同位体標識水の形でもたらされる同位体標識は、合成経路の一部として生物学的分子に取り込まれる。水素取り込みは2種類のやり方で起こり得る。すなわち、分子内の不安定な位置へ（すなわち、迅速に交換可能で、酵素触媒反応を必要としない）、又は安定な位置へ（すなわち、迅速に交換可能ではなく、酵素触媒を要する）取り込まれる。酸素取り込みは安定部位で起こる。
【０２４２】
細胞水から生物学的分子中のC-H結合への水素取り込みステップの一部は、一連の生合成反応中のよく知られた酵素触媒ステップにおいてのみ起こり、成熟した最終産物分子中に存在するようになれば、不安定（組織中の溶媒水で交換可能）ではない。例えば、グルコースのC-H結合は溶液中で交換可能ではない。一方で、以下のC-H位のそれぞれは、特定の酵素反応の逆反応において体内水と交換する：C-1及びC-6（クレブス回路中のオキサロ酢酸/コハク酸シーケンス及びラクテート/ピルベート反応において）；C-2（グルコース-6-リン酸/フルクトース-6-リン酸反応において）；C-3及びC-4（グリセルアルデヒド-3-リン酸/ジヒドロキシアセトン-リン酸反応において）；C-5（3-ホスホグリセレート/グリセルアルデヒド-3-リン酸及びグルコース-6-リン酸/フルクトース-6-リン酸反応において）。
【０２４３】
分子の特定の不安定でない位置に共有結合的に取り込まれた、水に由来する標識水素又は酸素原子は、それにより、該分子の「生合成履歴」を明らかにする。すなわち、標識取り込みは、細胞水の中に同位体標識水が存在している間に該分子が合成されたことを意味する。
【０２４４】
これらの生物学的分子中の不安定な水素（非共有的に結合しているか又は交換可能な共有結合中に存在する）は分子の生合成履歴を明らかにしない。しかしながら、不安定な水素原子は非標識水（H2O）とのインキュベーションによって（すなわち、2H又は3Hがそもそも取り込まれたのと同じ非酵素的交換反応の逆反応により）容易に取り除くことができる：
【数１】
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結果として、生合成履歴を反映しないが、非合成交換反応により取り込まれた潜在的に汚染性の水素標識は、天然の構成のH2Oとのインキュベーションにより、実際には容易に取り除くことができる。
【０２４５】
生物学的分子への標識水素原子の取り込みを定量的に測定するために、分析的方法を用いることができる（例えば、3Hについては液体シンチレーション計測；2H及び18Oについては質量分析又はNMR分光法）。同位体標識水取り込みの理論に関する更なる考察については、例えばJungas RL.  Biochemistry. 1968 7:3708-17（参照により本明細書中に組み込まれる）を参照されたい。
【０２４６】
標識水は容易に購入することができる。例えば、2H2OはCambridge Isotope Labs（Andover, MA）より購入することができ、また3H2Oは例えばNew England Nuclear, Incから購入することができる。一般的には、2H2Oは非放射性であるため、放射性の3H2Oよりも毒性についての危惧が少ない。2H2Oは、例えば体内水全体のうちのある割合（例えば、消費される体内水全体の1％）として投与することができる（例えば、1日に消費する3リットルの水に対して、30マイクロリットルの2H2Oを消費する）。3H2Oを用いる場合には、無毒な量（当業者により容易に決定される）を投与する。
【０２４７】
2H2Oについての比較的高い体内水中含有率（例えば体内水全体の1〜10％が標識されている）は本発明の技術を用いて比較的安価に達成することができる。この水中含有率は比較的一定且つ安定であり、これらのレベルがいかなる毒性の徴候も伴わずにヒト及び実験動物体内で数週間から数ヶ月維持される。多数のヒト被験者（>100人）でのこの知見は、高用量の2H2Oでの前庭毒性に関する従前の危惧とは相容れない。本出願人は、体内水中含有率の急速な変化を防いでいる限り（例えば少量の分割用量での最初の投与により）、2H2Oの高い体内水中含有率は毒性を伴わずに維持し得ることを見出した。例えば、市販の2H2Oの低価格は、比較的安価での1〜5％の範囲の含有率の長期的維持を可能にする（例えば、計算により、2％の2H2O含有率（従って、アラニン前駆体プール中7〜8％の含有率）での2ヶ月にわたる標識は、10％の遊離ロイシン含有率での2H-ロイシンの12時間の標識（従って、その期間についてのロイシン前駆体プール中の7〜8％の含有率）よりも低コストであることが分かる）。
【０２４８】
18O同位体は無毒であり、結果として顕著な健康上のリスクを示さないので、H218Oの投与についても比較的高く、比較的一定な体内水中含有率を維持することができる。
【０２４９】
同位体標識水は、継続的な同位体標識水投与、不連続な同位体標識水投与によって、又は同位体標識水投与の単回若しくは複数回投与後に投与することができる。継続的な同位体標識水投与では、個体体内で長期にわたって比較的一定な水中含有率を維持するのに十分な期間、個体に対して同位体標識水を投与する。継続的な方法では、最適には標識水を、定常濃度を達成するのに十分長い期間にわたって投与する（例えばヒトでは3〜8週間、げっ歯類では1〜2週間）。
【０２５０】
不連続な同位体標識水投与では、同位体標識水の量を測定し、次に1回以上投与し、そして同位体標識水への曝露を中止して、体内水プールからの同位体標識水の排出が起こるようにする。続いて脱標識の経時変化をモニタリングする。最適には生物学的分子中で検出可能なレベルに達するのに十分な長さの時間にわたって水を投与する。
【０２５１】
同位体標識水は、当該技術分野で公知の種々の方法により個体又は組織に投与することができる。例えば、同位体標識水を経口的に、非経口的に、皮下的に、血管内に（例えば静脈内、動脈内）、又は腹腔内に投与することができる。2H2O及びH218Oについて、Isotec, Inc.（Miamisburg OH）及びCambridge Isotopes, Inc.（Andover, MA）をはじめとするいくつかの購入元が利用可能である。投与する同位体標識水の同位体含量は、約0.001％から約20％の範囲とすることができ、且つ生物学的分子の同位体含量を測定するために用いる装置の分析上の感度によって決まる。一実施形態では、飲料水中において4％の2H2Oを経口投与する。別の実施形態では、50mlの2H2Oをヒトに経口投与する。
【０２５２】
標識水を投与する個体は哺乳動物であり得る。一変法では、個体は、限定するものではないが、げっ歯類、霊長類、ハムスター、ギニアピッグ、イヌ、又はブタをはじめとする実験動物であってよい。薬物、薬物候補、薬物リード、又はそれらの組み合わせの投与を含む変法では、個体は一般に認められた疾患動物モデルをはじめとする実験動物又はヒト等の哺乳動物であり得る。食品添加物、工業若しくは産業的化学薬品、環境汚染物質、又は化粧品の投与を含む変法では、個体は、限定するものではないが、げっ歯類、霊長類、ハムスター、ギニアピッグ、イヌ、又はブタ等のいずれかの実験動物であり得る。
【０２５３】
v.  炭水化物の前駆体
炭水化物を含んでなる組成物としては、単糖類、多糖類、又は単糖類若しくは多糖類と結合した他の化合物が挙げられる。
【０２５４】
同位体標識は、炭水化物又は炭水化物誘導体に取り込まれ得る。これらのものとしては、当該技術分野で公知の生化学経路による、単糖類（限定するものではないが、グルコース及びガラクトースを含む）、アミノ糖（N-アセチル-ガラクトサミン等）、多糖類（グリコーゲン等）、糖タンパク質（シアル酸等）、糖脂質（ガラクトセレブロシド等）、グリコサミノグリカン（ヒアルロン酸、コンドロイチンスルフェート、及びヘパランスルフェート等）への取り込みが挙げられる。
【０２５５】
2H-標識糖は、単糖類として、又は単糖類残基を含んでなるポリマーとして個体に投与することができる。標識単糖類は、容易に購入することができる（例えば、Cambridge Isotopes, Massachusetts）。
【０２５６】
2H-標識糖を含んでなる化合物については、比較的少量が投与に必要とされる。量はミリグラムのオーダーであって、101mg、102mg、103mg、104mg、105mg、又は106mgとすることができる。2H-標識糖含有率は、いかなる毒性の徴候も伴わずに、ヒト及び動物体内で数週間又は数ヶ月、維持することができる。市販の標識単糖類の比較的低い価格、及び投与する必要がある量の少なさにより、安価に含有率を維持することが可能である。
【０２５７】
一実施形態では、標識糖はグルコースである。グルコースは、解糖系及びクエン酸回路により代謝される。解糖系により、大部分のH原子がグルコースのC-H結合から放出され、クエン酸回路による酸化が、全てのH原子が放出されてH2Oになることを保証する。グルコースによる3H-又は2H-標識の減少は、グルコースについての細胞内代謝経路である解糖系を評価するために用いられてきた。一部の研究者は静脈内投与した3H-グルコースから3H2Oへの3Hの放出を、解糖系の指標として用いてきた。2H-グルコースから2H2Oへの放出は以前には用いられてきておらず、それは、検出可能な2H2Oレベルを達成するためには、標識グルコースでの2H投与に対して体内水プールは大きすぎる、との予測のためである。別の変法では、標識グルコースは、[6,6-2H2]グルコース、[1-2H1]グルコース、及び[1,2,3,4,5,6-2H7]グルコースとすることができる。
【０２５８】
別の実施形態では、標識糖はフルクトース又はガラクトースを含んでなる。フルクトースはフルクトース-1-リン酸経路を介して、及び補助的にヘキソキナーゼによるフルクトース-6-リン酸へのリン酸化を通じて解糖系に入る。ガラクトースはガラクトース-グルコース変換経路を介して解糖系に入る。
【０２５９】
いずれの他の糖も、本発明での使用が予想される。意図される単糖類としては、限定するものではないが、トリオース、ペントース、ヘキソース、及び他のより高次な単糖類が挙げられる。単糖類として更に、限定するものではないが、アルドース及びケトースが挙げられる。
【０２６０】
別の実施形態では、多糖類を含んでなるポリマーを投与することができる。また別の実施形態では、標識多糖類を投与することができる。また別の実施形態では、標識糖モノマーを、スクロース（グルコースα-(1,2)-フルクトース）、ラクトース（ガラクトースβ-(1,4)-グルコース）、マルトース（グルコースα-(1,4)-グルコース）、デンプン（グルコースポリマー）、その他のポリマーの構成成分として投与することができる。
【０２６１】
一実施形態では、標識糖を経口的に、強制経口投与により、腹腔内に、血管内に（例えば静脈内、動脈内）、皮下的に、その他の身体的経路により投与することができる。特に、糖を、場合によっては食品又は飲料の一部として、個体に対して経口的に投与することができる。
【０２６２】
標識炭水化物前駆体を投与する個体は哺乳動物であり得る。一変法では、個体は、限定するものではないが、げっ歯類、霊長類、ハムスター、ギニアピッグ、イヌ、又はブタをはじめとする実験動物であってよい。薬物、薬物候補、薬物リード、又はそれらの組み合わせの投与を含む変法では、個体は一般に認められた疾患動物モデルをはじめとする実験動物又はヒト等の哺乳動物であり得る。食品添加物、工業若しくは産業的化学薬品、環境汚染物質、又は化粧品の投与を含む変法では、個体は、限定するものではないが、げっ歯類、霊長類、ハムスター、ギニアピッグ、イヌ、又はブタ等のいずれかの実験動物であり得る。
【０２６３】
vi.  脂質その他の脂肪の前駆体
2H-標識脂肪酸を含んでなる化合物の代謝の測定も、本発明により意図される。同位体標識水由来の同位体標識は、当該技術分野で公知の生化学経路により、脂肪酸、アシルグリセロール（限定するものではないが、トリアシルグリセリド、リン脂質、及びカルジオリピンを含む）のグリセロール部分、コレステロール及びその誘導体（限定するものではないが、コレステロールエステル、胆汁酸、ステロイドホルモンを含む）にも取り込むことができる。
【０２６４】
糖脂質及びセレブロシドのような複合脂質もまた、同位体標識水から標識することができる。同位体標識水はセレブロシド（限定するものではないが、N-アセチルガラクトサミン、N-アセチルグルコサミンスルフェート、グルクロン酸、及びグルクロン酸スルフェートを含む）の糖部分の前駆体である。
【０２６５】
2H-標識脂肪酸は、脂肪又は標識脂肪酸を含有する他の化合物として個体に投与することができる。2H-標識脂肪酸は容易に購入することができる。比較的少量の標識脂肪酸が、投与に必要とされる。量はミリグラムのオーダーであって、101mg、102mg、103mg、104mg、105mg、又は106mgとすることができる。脂肪酸（特に2Hを有するもの）含有率は、いかなる毒性の徴候も伴わずに、ヒト及び動物体内で数週間又は数ヶ月、維持することができる。市販の標識脂肪酸の比較的低い価格、及び投与に必要とされる量の少なさから、安価に含有率を維持することができる。
【０２６６】
標識水（特に2H2O）への標識脂肪酸（特に2H-標識脂肪酸）からの放出は、脂肪の酸化を正確に反映する。中程度の量の標識脂肪酸の投与は、水への標識水素又は酸素の放出を測定するのに十分である。特に、中程度の量の2H-脂肪酸の投与は、重水素化水への2Hの放出を測定するのに十分である。
【０２６７】
別の変法では、標識脂肪酸を経口的に、強制経口投与により、腹腔内に、血管内に（例えば静脈内、動脈内）、皮下的に、その他の身体的経路により投与することができる。特に、標識脂肪酸を、場合によっては食品又は飲料の一部として、個体に対して経口的に投与することができる。
【０２６８】
標識脂質前駆体を投与する個体は哺乳動物であり得る。一変法では、個体は、限定するものではないが、げっ歯類、霊長類、ハムスター、ギニアピッグ、イヌ、又はブタをはじめとする実験動物であってよい。薬物、薬物候補、薬物リード、又はそれらの組み合わせの投与を含む変法では、個体は一般に認められた疾患動物モデルをはじめとする実験動物又はヒト等の哺乳動物であり得る。食品添加物、工業若しくは産業的化学薬品、環境汚染物質、又は化粧品の投与を含む変法では、個体は、限定するものではないが、げっ歯類、霊長類、ハムスター、ギニアピッグ、イヌ、又はブタ等のいずれかの実験動物であり得る。
【０２６９】
C.  1種以上の対象となる標的分子の取得
本発明の方法の実施において、一態様では、対象となる標的分子を、当該技術分野で公知の方法に従って、細胞、組織、又は生物から取得する。方法はその対象となる分子に特異的なものである。対象となる分子を生物学的サンプルから単離してもよい。
【０２７０】
複数の対象となる分子を、細胞、組織、又は生物から取得してもよい。1種以上の生物学的サンプルは、例えば、採血、蓄尿、生検その他の当該技術分野で公知の方法により取得することができる。1種以上の生物学的サンプルは、1種以上の生物学的液体であってよい。対象となる分子は、特定の器官又は組織（筋、肝臓、副腎組織、前立腺組織、子宮内膜組織、血液、皮膚、及び乳房組織等）からも採取することができる。対象となる分子は、特定の細胞のグループ（腫瘍細胞又は線維芽細胞等）から取得してもよい。対象となる分子を、当該技術分野で公知の標準的な生化学的方法を用いて生物学的サンプルから取得し、場合によっては部分的に精製するか又は単離してもよい。
【０２７１】
生物学的サンプル採取の頻度は、種々の要因に依存して決めることができる。そのような要因としては、限定するものではないが、対象となる分子の性質、サンプル採取の容易さ及び安全性、対象となる分子の合成及び分解/除去速度、並びに化合物（化学物質、生物学的因子、認可薬物、薬物候補、薬物リード等）の半減期が挙げられる。
【０２７２】
対象となる分子を、通常用いられる精製法により部分的に精製し、又は場合によっては単離してもよく、そのような精製法としては、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、中圧液体クロマトグラフィー（fast performance liquid chromatography）（FPLC）、化学的抽出、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、及び/又は当業者に公知の他の分離方法が挙げられる。
【０２７３】
別の実施形態では、対象となる分子を加水分解又はそれ以外の様式で分解して、より小さな分子を形成させることができる。加水分解方法には当該技術分野で公知のいずれの方法も含まれ、限定するものではないが、化学的加水分解（酸加水分解等）及び生化学的加水分解（ペプチダーゼ分解等）が挙げられる。加水分解又は分解は、対象となる分子の精製及び/若しくは単離の前又は後のいずれかに行うことができる。対象となる分子を、通常用いられる精製法により部分的に精製し、又は場合によっては単離してもよく、そのような精製法としては、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、中圧液体クロマトグラフィー（fast performance liquid chromatography）（FPLC）、ガスクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、及び/又は当業者に公知の他の化学的及び/若しくは生物学的化合物の分離方法が挙げられる。
【０２７４】
D.  分析
作用物質の生物学的作用を特定するために用いられる現在利用可能な方法（静的方法）は、細胞内の分子の組成、構造、又は濃度のみを測定するものであり、それを1つの時間点で行う。例えば、RNA及びタンパク質発現「チップ」を種々の病状にある細胞又は生物において1つの時間点で複数の生物学的分子について測定するのに用いることができるが、これらの技術ではタンパク質又は転写産物の分子流束量を測定することはできない。本発明の方法は、多数のタンパク質又は転写産物の分子流束量、及び多数の有機代謝物の分子流束量、並びに種々の病状及び1種以上の薬物、薬物候補、薬物リード、若しくはそれらの組み合わせへの曝露に対する応答、又は1種以上の工業化学薬品、食品添加物、化粧品、若しくは環境汚染物質への曝露に対する応答におけるその変化の測定を可能にする。
【０２７５】
1.  質量分析
同位体含有率バイオマーカーは、質量分析等の様々な方法によって測定することができ、そのような方法としては、限定するものではないが、ガスクロマトグラフィー質量分析（GC-MS）、同位体比質量分析、GC同位体比燃焼MS、GC-同位体比ピロール分解（pyrrolysis）MS、液体クロマトグラフィーMS、エレクトロスプレーイオン化MS、マトリックス支援レーザー脱離-飛行時間MS、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴MS、及びサイクロイドMSが挙げられる。
【０２７６】
質量分析計は、分子を高速で移動する気体イオンに変換し、そしてそれらをその質量/電荷比に基づいて分離する。従って、イオン若しくはイオン断片の同位体又はアイソトポログの分布を、多数のタンパク質又は有機代謝物中の同位体含有率を測定するために用いることができる。
【０２７７】
一般的には、質量分析計にはイオン化手段と質量分析器とが含まれる。多くの異なるタイプの質量分析器が当該技術分野で公知である。これらのものとしては、限定するものではないが、磁場型分析器、エレクトロスプレーイオン化、四重極、イオン捕捉、飛行時間質量分析器、及びフーリエ変換分析器が挙げられる。
【０２７８】
質量分析計は複数の異なるイオン化方法を含むこともできる。これらのものとしては、限定するものではないが、気相イオン化源（電子衝突、化学的イオン化、及び電界イオン化等）、並びに脱離源（電界脱離、高速原子衝突、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化、及び表面増強レーザー脱離/イオン化等）が挙げられる。
【０２７９】
更に、2種以上の質量分析器を組み合わせて（MS/MS）、まず前駆体イオンを分離し、次いで気相断片イオンを分離及び測定することができる。これらの装置は、タンパク質の第1の一連のイオン性断片を作り出し、次に第1のイオンの二次的断片を作り出す。結果として得られる重複した配列により、重複した「パズルのピース」をつなぎ合わせることによって、数分間での単回の質量分析（及びコンピュータ解析時間）に基づくタンパク質の完全なシーケンシングが可能となる。
【０２８０】
種々のイオン化方法もまた当該技術分野で公知である。1つの重要な進歩は、タンパク質及びポリヌクレオチド等の大きな非揮発性高分子のイオン化のための技術の開発であった。このタイプの技術には、エレクトロスプレーイオン化（ESI）及びマトリックス支援レーザー脱離（MALDI）が含められる。これらは、MSを、液体クロマトグラフィーやキャピラリーゾーン電気泳動等の強力なサンプル分離導入技術との組み合わせに適用することを可能にした。
【０２８１】
更に、質量分析計はガスクロマトグラフィー（GC）や高速液体クロマトグラフィー（HPLC）等の分離手段と組み合わせることができる。ガスクロマトグラフィー質量分析（GC/MS）では、ガスクロマトグラフからのキャピラリーカラムを、場合によってはジェット分離器を用いて直接的に質量分析計につなげる。そのような応用では、ガスクロマトグラフィー（GC）カラムはサンプルガス混合物からサンプル成分を分離し、そして分離した成分は質量分析計においてイオン化され、化学的に分析される。
【０２８２】
有機分子の質量アイソトポマー含有量を測定するためにGC/MS（又は、低分子量無機ガスではなく生体分子のイオンを分析する他の質量分析手段）を用いる場合には、同位体標識水からの水素標識同位体取り込みは、in vivoで同位体分析水から有機分子へと取り込まれる水素原子の数に応じて、3〜7倍増幅される。
【０２８３】
一般的には、対象となる分子についてのベースラインの質量アイソトポマー出現頻度分布を決定するために、同位体標識前駆体の注入の前にかかるサンプルを取得する。そのような測定は、対象となる分子の質量アイソトポマーの天然に存在する出現頻度を、細胞、組織又は生物内で確定する1つの手段である。細胞、組織又は生物が類似の環境履歴を有する被験体の集団の一部分である場合には、集団アイソトポマー出現頻度分布をそのようなバックグラウンド測定のために用いることができる。更に、そのようなベースラインのアイソトポマー出現頻度分布は、同位体の公知の平均天然含有量を用いて推定することができる。例えば、自然界では、有機炭素中に存在する13Cの天然含有量は1.11％である。そのようなアイソトポマー出現頻度分布を決定する方法については下記で論じる。典型的には、対象となる分子のサンプルを、被験体への同位体標識前駆体の投与に先立って、及びそれに続いて取得し、そして下記のようにアイソトポマー出現頻度を分析する。
【０２８４】
a.  質量アイソトポマー含有量の相対的及び絶対的測定
測定した質量スペクトルのピーク高、あるいはピーク下面積は親（質量同位体なし）アイソトポマーに対する比として表すことができる。本発明の目的では、そのようなデータの記述において、サンプル中のアイソトポマー含有量についての相対値及び絶対値を与えるいずれの計算方法でも用いることができることは、価値がある。
【０２８５】
2.  対象となる分子の標識：非標識比率の算出
続いて、対象となる標識及び非標識分子の比率を算出する。実施者はまず、分子の単離したアイソトポマー種について測定された過剰モル率を決定する。実施者は次に、測定された過剰率の内部パターンを理論的パターンと比較する。かかる理論的パターンは、米国特許第5,338,686号、同第5,910,403号、及び同第6,010,846号（参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）に記載のような二項分布又は多項分布関数を用いて計算することができる。該計算には、質量アイソトポマー分布解析（MIDA）が含まれる。質量アイソトポマー分布解析（MIDA）組み合わせアルゴリズムの変形については、当業者に公知の多数の種々の情報源において考察されている。該方法は、Neese (1999)並びにChinkesら (1996)、及びKelleher and Masterson (1992)、及び米国特許出願第10/279,399号（これらの全ては、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）によりさらに考察されている。
【０２８６】
上記で参照した引用文献に加えて、該方法を実行する計算ソフトウェアが、Marc Hellerstein教授（University of California, Berkeley）により公衆に利用可能とされている。
【０２８７】
過剰モル率と理論的パターンとの比較は、対象となる分子について所定の関数を用いて作成した表又は図表を用いて行うことができる。これらの比較から、p値のような値が決定され、この値は前駆体サブユニットプール中のあるサブユニットの質量同位体含有率の確率を表す。この含有率を、次にAX*値のような値を決定するのに用い、この値は各質量アイソトポマーについて新規に合成されたタンパク質の含有率を表し、全種類のアイソトポマーが新規に合成されたとした場合に存在するものと期待されるアイソトポマー過剰率を明らかにする。
【０２８８】
続いて含有量割合を算出する。個々の同位体（元素について）又は質量アイソトポマー（分子について）の含有量割合とは、その同位体又は質量アイソトポマーが占める総含有量のうちの割合である。これは相対含有量とは区別され、相対含有量においては、最も含有量の多い種を100の値とし、全ての他の種を100に対して標準化して、相対含有量パーセントとして表す。質量アイソトポマーMXについては、
【数２】
2007527996.tif 000003
（式中、0〜nは、含有量が認められる最小質量（M0）質量アイソトポマーと比較した整数質量の範囲である。）
【数３】
2007527996.tif 000004
（式中、下付き記号eは富化されていること（enriched）を指し、bはベースライン又は天然含有量を指す。）
【０２８９】
前駆体投与の間に実際に新規に合成されたポリマーの割合を決定するために、測定された過剰モル率（EMX）を算出した含有率値AX*と比較するが、ここでAX*は各質量アイソトポマーについて新規に合成された生体ポリマーの含有率を表し、それにより全種類のアイソトポマーが新規に合成されたとした場合に存在するものと期待されるアイソトポマー過剰率を明らかにする。
【０２９０】
3.  分子流束量の算出
合成速度を決定する方法は、分子前駆体プール中に存在する質量同位体標識サブユニットの割合を算出すること、及びこの割合を用いて少なくとも1種の質量同位体標識サブユニットを含有する対象となる分子の期待出現頻度を算出することを含む。次に、この期待出現頻度を、対象となる該分子の実際の、実験的に測定されたアイソトポマー出現頻度と比較する。これらの値により、選択された取り込み時間中に添加した同位体標識前駆体から合成された対象となる分子の割合を決定することができる。それにより、かかる時間中の合成速度もまた決定される。
【０２９１】
次に前駆体-産物関数を適用することができる。継続的標識法では、同位体含有率を漸近の（すなわち、最大限あり得る）含有率と比較し、反応速度パラメータ（例えば合成速度）を前駆体-産物方程式から算出する。合成速度割合（ks）は継続的標識、以下の前駆体-産物式を適用することにより決定することができる：
ks = [-In(1-f)]/t
（式中、f = 合成割合 = 産物含有率/漸近前駆体/含有率、
且つ、t = 研究対象の系中での接触の標識投与時間）
【０２９２】
非継続的標識法については、同位体含有率における減少速度を算出し、対象となる分子の反応速度パラメータを指数的減衰方程式から算出する。本方法の実施では、生体ポリマーを、好ましくは複数ヵ所質量同位体標識された前駆体を含有して、質量アイソトポマーについて富化する。対象となる分子のこれら高質量な質量アイソトポマー（例えば3又は4ヵ所同位体標識された前駆体を含有する分子）は、天然の質量同位体により標識された前駆体での比較的少ない含有量のために、外因性前駆体の非存在下では無視できる量しか形成されないが、分子前駆体取り込み時間中には顕著な量で形成される。連続した時間点において細胞、組織、又は生物から取得した対象となる分子を質量分析により分析して、高質量質量アイソトポマーの相対的出現頻度を決定する。高質量質量アイソトポマーは殆ど第1の時間点の前にしか合成されないため、2つの時間点の間のその減衰は、対象となる分子の減衰速度の直接的尺度を与える。
【０２９３】
好ましくは第1の時間点は、投与方法に左右されるが、質量同位体標識サブユニットの割合が前駆体投与後のその最高レベルから十分減衰しているように、前駆体投与終了の少なくとも2〜3時間後とする。一実施形態では、次の時間点は典型的には第1の時間点の1〜4時間後であるが、このタイミングは生体ポリマープールの置換速度に左右される。
【０２９４】
対象となる分子の減衰速度は、対象となる分子の三同位体についての減衰曲線から決定する。この場合、減衰曲線を数ヵ所の時間点より規定するときには、減衰動態は該曲線を指数的減衰曲線に対してフィッティングし、それにより減衰定数を求めることにより決定することができる。
【０２９５】
分解速度定数（kd）は、指数的その他の動的減衰曲線に基づいて算出することができる：
kd = [-In f]/t
【０２９６】
記載の通り、サブユニットプール組成、並びに質量同位体標識が可能な2以上の別個のサブユニットにより形成される実質的にいずれもの生体ポリマーについての合成及び減衰速度を決定するのに、本方法を用いることができる。他の周知の計算法及び実験的標識/脱標識アプローチを、分子流束量及び対象となる代謝経路を通る流量の算出に用いることができる（例えば、Wolfe, R. R.  Radioactive and Stable Isotope Tracers in Biomedicine: Principles and Practice of Kinetic Analysis.  John Wiley & Sons; (March 1992)を参照のこと）。
【０２９７】
E.  本発明の方法の用途
開示した発明は、対象となる疾患の駆動因子、若しくは病因メカニズムであると考えられる代謝経路又はネットワーク内の分子流束の測定を可能にする。代謝経路又はネットワークを通る分子流束が根本的に生体系の生理学的及び病態生理学的プロセスを代表するものであるので、それ自体、解析のためのバイオマーカーである。本発明の方法を用いることにより、1以上の標的代謝経路若しくはネットワーク内の1種以上の対象となる分子についての分子流束量を定量し、且つその情報を臨床診断、予後診断、又は薬物若しくは薬物治療の組み合わせの治療的活性についてのバイオマーカーとして用いることが可能である。該方法は、化合物の特性決定若しくは評価（又は特性決定及び評価の両方）を可能にし、且つ当業者が治療的有効性及び/又は毒性作用を評価できるようにする。
【０２９８】
本明細書中に開示した方法は、ある化合物又は化合物の組み合わせに生体系を曝露した後に、バイオマーカーに対する効果を観察できるようにする。従って、作成及び解析したデータは、DDA意思決定プロセスを容易にするので、DDAプロセスにおいて有用である。すなわち、ある化合物若しくは化合物の組み合わせに対して更なる開発を継続するか（例えばバイオマーカーデータが有望であるように思われる場合）、又は該作業を中止するか（例えばバイオマーカーデータが好ましくないと思われる場合）の決定において、意思決定者に対して有用な情報を与える（このプロセスについての図式的な表示については図1を参照のこと）。
【０２９９】
更に、該方法は当業者があるクラスの化合物の中で「最善の種類」と特定し、選択し及び/又は特性決定するのを可能にする。一旦、特定、選択及び/又は特性決定されれば、当業者は本発明の方法により作成した情報に基づいて、「最善の種類」を更に評価するか、又は該化合物を別の者（製薬企業又はバイオテクノロジー企業）に対してライセンスするかを決定することができる。
【０３００】
別の実施形態では、本発明の方法は、工業化学薬品、食品添加物、化粧品、及び環境汚染物質への曝露による毒性作用の特性決定若しくは評価（又は特性決定及び評価の両方）を可能にする。本発明の方法を用いて、工業的、食品、化粧品、及び環境毒性物質を更なる公衆衛生上の目標のために特定及び検索するプログラムを確立することができる。
【０３０１】
一実施形態では、1以上の測定対象の代謝経路中の分子流束量は、1種以上の疾患の基礎となる分子的病因又は原因に対応するものであり得る。別の実施形態では、1以上の対象となる代謝経路中の分子流束量が、対象疾患の発生、進行、重症度、病理、侵襲性、進行度、活動性、後遺症、致死率、罹病率、疾患サブクラス又はその他の基礎となる病因的若しくは病理学的特徴の原因となるものであり得る。
【０３０２】
また別の実施形態では、1以上の対象となる代謝経路中の分子流束量が、対象疾患の予後、生存率、罹病率、致死率、ステージ、治療応答、総体的症状、後遺症又はその他の臨床的因子の原因となるものであり得る。代謝経路中の2以上の分子流束量を別々又は同時に測定してもよい。
【０３０３】
かかる代謝経路としては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：肝細胞増殖及び破壊（又は増殖の阻害）、全肝細胞増殖及び破壊（又は増殖の阻害）、腎細管細胞ターンオーバー、リンパ球ターンオーバー、精母細胞ターンオーバー、筋及び心臓でのタンパク質の合成及び分解、肝コラーゲンの合成及び分解、脳又は末梢神経でのミエリンの合成及び分解、神経細胞増殖及び破壊（又は増殖の阻害）、神経前駆細胞増殖及び破壊（又は増殖の阻害）、乳房上皮細胞増殖及び破壊（又は増殖の阻害）、結腸上皮細胞増殖及び破壊（又は増殖の阻害）、前立腺上皮細胞増殖及び破壊（又は増殖の阻害）、卵巣上皮細胞増殖及び破壊（又は増殖の阻害）、子宮内膜細胞増殖及び破壊（又は増殖の阻害）、内皮細胞増殖及び破壊（又は増殖の阻害）、気管支上皮細胞増殖及び破壊（又は増殖の阻害）、膵上皮細胞増殖及び破壊（又は増殖の阻害）、膵β細胞増殖、膵ランゲルハンス島増殖及び破壊（又は増殖の阻害）、マイクログリア増殖及び破壊（又は阻害）、皮膚でのケラチン合成、ケラチン生成細胞増殖及び破壊（又は増殖の阻害）、Mタンパク質の合成及び分解をはじめとする免疫グロブリンの合成及び分解、ミトコンドリアDNAの合成及び分解、ミトコンドリアリン脂質の合成及び分解、DNAメチル化及び脱メチル化、ミトコンドリアタンパク質の合成及び分解、脂肪の合成及び分解、並びに脂肪細胞の合成及び分解。
【０３０４】
公知の疾患動物モデルを本発明の一部として用いることができる。かかる疾患動物モデルとしては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：アルツハイマー病、心不全、腎疾患、糖尿病性腎症、骨粗鬆症、肝線維症、肝硬変、肝細胞壊死、肺線維症、強皮症、腎線維症、多発性硬化症、動脈硬化（又はアテローム硬化）、変形性関節炎、関節リウマチ、乾癬、皮膚の紫外線老化、皮膚発疹、乳癌、前立腺癌、結腸癌、膵臓癌、肺癌、後天性免疫不全症候群、免疫欠如、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、糖尿病、糖尿病性合併症、インスリン耐性、肥満、リポジストロフィ、メタボリック症候群（又はX症候群）、筋肉疲労、虚弱、体調不良、血管新生、高脂血症、不妊、ウイルス感染又は細菌感染、自己免疫障害、及び免疫発赤。
【０３０５】
化合物間のこれらの相互作用は、疾患に関連する経路中のある時間において1種類の分子標的及びステップについて調べる現行の若しくは従来のアッセイの使用によっては検出又は定量され得ない。化学物質、生物製剤、化学物質の組み合わせ、若しくは生物製剤の組み合わせをはじめとする化合物を、経路を通る分子流への効果について網羅的に評価するための方法は、以前には利用可能になっていなかった。本明細書中に開示した発明は、薬剤の有効な治療上の組み合わせを特定、開発及び認可するプロセスを容易にするであろう。
【０３０６】
別の実施形態では、本発明の方法は、工業的若しくは産業的化学薬品、食品添加物、化粧品、又は環境汚染物質/汚染因子の毒性作用の検出において有用である。かかる毒性作用には、標的器官毒性が含まれる。標的器官毒性としては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：肝細胞増殖及び破壊（又は増殖の阻害）、全肝細胞増殖及び破壊（又は増殖の阻害）、腎細管細胞ターンオーバー、リンパ球ターンオーバー、精母細胞ターンオーバー、筋及び心臓でのタンパク質の合成及び分解、肝コラーゲンの合成及び分解、脳又は末梢神経でのミエリンの合成及び分解、神経細胞増殖及び破壊（又は増殖の阻害）、神経前駆細胞増殖及び破壊（又は増殖の阻害）、乳房上皮細胞増殖及び破壊（又は増殖の阻害）、結腸上皮細胞増殖及び破壊（又は増殖の阻害）、前立腺上皮細胞増殖及び破壊（又は増殖の阻害）、卵巣上皮細胞増殖及び破壊（又は増殖の阻害）、子宮内膜細胞増殖及び破壊（又は増殖の阻害）、内皮細胞増殖及び破壊（又は増殖の阻害）、気管支上皮細胞増殖及び破壊（又は増殖の阻害）、膵上皮細胞増殖及び破壊（又は増殖の阻害）、膵β細胞増殖、膵ランゲルハンス島増殖及び破壊（又は増殖の阻害）、マイクログリア増殖及び破壊（又は阻害）、皮膚でのケラチン合成、ケラチン生成細胞増殖及び破壊（又は増殖の阻害）、Mタンパク質の合成及び分解をはじめとする免疫グロブリンの合成及び分解、ミトコンドリアDNAの合成及び分解、ミトコンドリアリン脂質の合成及び分解、DNAメチル化及び脱メチル化、ミトコンドリアタンパク質の合成及び分解、脂肪の合成及び分解、並びに脂肪細胞の合成及び分解。
【０３０７】
図6では、本明細書中の発明の、創薬プロセスでの用途が表されている。ステップ601では、多数の薬物候補又はその他の化合物を選択する。ステップ603では、バイオマーカーの流量を、好ましくは本明細書中で述べた方法に従って、細胞内で調べる。別の実施形態では、例えば標的発見のプロセスで本発明を用いる場合には、ステップ603を最初に行う。ステップ605では、該当する流量を特定する。例えば、ある特定の表現型状態でのある特定のバイオマーカーの流量を低減することが望ましい場合には、該流量を低減する化合物が一般的にはより有用であるとみなされるであろうし、逆に、該流量を増大する化合物は一般的にあまり望ましくないとみなされるであろう。標的発見プロセスでは、別の表現型に比べて流量を増大又は低減している特定の表現型（例えば病的と病的でない）が治療上若しくは診断上の良い標的であるか、又は治療上若しくは診断上の良い標的である経路内にあるとみなされる場合がある。ステップ607では、対象となる化合物、対象となる標的又は診断薬を選択し、更に使用し、更に開発する。標的の場合には、かかる標的は、例えば周知の小分子スクリーニングプロセス等（例えば新規の化学物質についてのハイスループットスクリーニング）の対象であり得る。あるいはまた、生物学的因子、若しくは認可薬物その他の化合物（又は化合物の組み合わせ及び/若しくは混合物）を用いてもよい。ステップ609では、化合物若しくは診断薬を譲渡又は販売する。図6のプロセス中の1以上のステップは、多くの場合最適な成果のために何度も繰り返されるであろうことが当然に理解される。
【０３０８】
表1には、バイオマーカーの具体例、関連する臨床的若しくは医学的疾患又は状態、及び本出願の方法を用いた検出の対象となる分子を示す。表1を考慮に入れて、本出願は更に、臨床的若しくは医学的疾患又は状態をモニタリング又は診断する方法を目的とし、該方法は以下のステップ：a)同位体標識基質が1以上の対象となる代謝経路に到達し、これにより生体系中の1以上の対象となる該代謝経路内の少なくとも1つの対象となる標的分子に到達してそれを標識するのに十分な時間にわたって、同位体標識基質を生体系に投与するステップと；b)該生体系より1以上のサンプルを取得するが、ここで1以上の該サンプルは、少なくとも1つの対象となる同位体標識された標的分子を含有するステップと；c)少なくとも1種の対象となる標的分子の同位体標識についての含量、取り込み速度及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンにおける変化の速度を測定するステップと；d)少なくとも1種の対象となる標的分子の同位体標識についての含量及び/又はパターン、あるいは含量及び/若しくはパターンの変化の速度に基づいて、1以上の対象となる該代謝経路/バイオマーカーでの分子流束量を算出し、それにより臨床的若しくは医学的疾患又は状態をモニタリング又は診断するステップを含む。別の形式では、臨床的若しくは医学的疾患又は状態に対する化合物の効果の予測因子として、バイオマーカーに対する1種以上の化合物の効果を評価するために、生体系における1以上の対象となる代謝経路の分子流束量の測定の前後で、生体系に対して1種以上の化合物を投与する。
【０３０９】
表1.  動的バイオマーカー及び適用
【表１】
2007527996.tif 000005
【０３１０】
2007527996.tif 000006
【０３１１】
2007527996.tif 000007
【０３１２】
2007527996.tif 000008
【０３１３】
2007527996.tif 000009
【０３１４】
2007527996.tif 000010
【０３１５】
2007527996.tif 000011
【０３１６】
2007527996.tif 000012
【０３１７】
F.  同位体擾乱分子
別の変法では、同位体擾乱分子（標識脂肪酸、脂質、炭水化物、タンパク質、核酸等）又はその断片若しくは分解産物を生成する方法を提供する。これら同位体擾乱分子又はその断片若しくは分解産物は、対象となる代謝経路内の分子の流れの測定において有用な情報を有する。生物の細胞及び/又は組織から単離した場合、1種以上の同位体擾乱分子又はその断片若しくは分解産物を、上記の通りに情報を抽出するために分析する。
【０３１８】
G.  キット
本発明はまた、in vivoにおいて分子流束量を測定及び比較するためのキットも提供する。キットには同位体標識前駆体分子を含めることができ、また更に、タンパク質を分離、精製、若しくは単離するために当該技術分野で公知の化合物、及び/又は組織サンプルを取得するために必要な化学薬品、組み合わせ解析のための自動計算ソフトウェア、並びにキットの使用のための説明書を含めることができる。
【０３１９】
場合によっては、水の投与のための手段（例えば軽量カップ、注射針、シリンジ、ピペット、IV管等）のような他のキットの内容物をキット中に提供してもよい。同様に、場合によっては、細胞、組織、又は生物からサンプルを取得するための器具（試料カップ、注射針、シリンジ、及び組織サンプリング装置）を提供してもよい。
【０３２０】
H.  情報格納デバイス
本発明はまた、本発明の方法から収集したデータを含んでなる、紙製リポート又はデータ格納デバイス等の情報格納デバイスも提供する。情報格納デバイスとしては、限定するものではないが、紙若しくは同様の有体媒体上に書き出されたリポート、プラスチック透明シート若しくはマイクロフィッシュ上に書き出されたリポート、及び光学若しくは磁気媒体（コンパクトディスク、デジタルビデオディスク、光ディスク、磁気ディスク等）上に格納されたデータ、又は一時的若しくは恒久的に情報を格納しているコンピュータが挙げられる。データは少なくとも部分的にコンピュータ内に含ませることができ、且つ電子メールメッセージの形態であるか又は別個の電子ファイルとして電子メールメッセージに添付してあってもよい。情報格納デバイス内のデータは、「生データ」であるか（すなわち、収集されたが解析されていない）、部分的に解析されているか、又は完全に解析されたものであり得る。データ解析はコンピュータその他の自動化デバイスによるか、又は手動で行うことができる。情報格納デバイスは、更なる解析若しくは表示、又はその両者のために、別個のデータ格納システム（コンピュータ、ハンドヘルド・コンピュータ等）へのデータのダウンロードに用いてもよい。あるいはまた、情報格納デバイス内のデータを、更なる解析若しくは表示、又はその両者のために、紙、プラスチック透明シートその他の有体媒体に印刷してもよい。
【０３２１】
I.  実施例
以下の非限定的な実施例により、本明細書中に開示した発明を更に説明する。
【実施例１】
【０３２２】
肥満関連疾患又は状態のバイオマーカーとしての、ラットでのトリグリセリド合成（脂質生成）及び分解（脂質分解）：
トリグリセリド合成は、脂肪形成（脂質生成（lipogenesis））に対する必須の生化学プロセス（すなわち代謝経路）であり、従って肥満関連疾患又は状態（肥満それ自体が1つの状態であり、本明細書中で対象となる主要な（しかし唯一ではない）状態である）に対するバイオマーカーである。ある化合物又は化合物の組み合わせ若しくは化合物の混合物（例えば、新規化学物質（NCE）等の化学物質、若しくはNCEの組み合わせ等の化学物質の組み合わせ、薬物候補、若しくは薬物候補の組み合わせ、薬物リード、若しくは薬物リードの組み合わせ、又はthe Physician’s Desk Reference (PDR)若しくはMerck Indexに列挙されているもの等の認可薬物、若しくは認可薬物の組み合わせ、又は生物学的因子、若しくは生物学的因子の組み合わせ（あるいは、NCE、薬物候補、薬物リード、認可薬物、及び/又は生物学的因子の混合物のいずれかの組み合わせ））が脂質生成を阻害できるかどうかを決定することは、ある化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物が肥満関連疾患又は状態その他の代謝的障害を治療する潜在能力を有するかどうかの決定において重要である。
【０３２３】
ある化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物が脂質生成を阻害するかどうか（従って、上記のように、肥満関連疾患又は状態その他の代謝的障害の治療のための特異的な薬物候補であるかどうか）を評価するために、Sprague-Dawleyラット（200〜300g、Simonsen Labs, Gilroy, CA）を化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物に曝露するか、あるいは曝露しないままにする（すなわち、対照）。ラットに、化合物又は化合物の組み合わせ若しくは化合物の混合物、あるいはビヒクルを、適当な投与経路より投与する。1種類の化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物を投与することができる。
【０３２４】
初期用量である99.8％の2H2Oを、約2.5％体内水含有率を達成するように（体重のうち60％が水であると見積もる）腹腔内注射により投与し、続いて最大12週まで、飲料水中に8％の2H2Oを投与する。
【０３２５】
脂肪組織サンプルを、二重ガラス組織グラインダー（例えば、Kontes組織グラインダー、Kimble Kontes, Vineland, NJ）に1mlのメタノール：クロロホルム（2：1）と一緒に入れ、均一になるまですり潰した後、遠心してタンパク質を除去する。溶液を各2mlのクロロホルムと水で抽出する。水相を捨て、脂質画分を3NメタノールHCL（Sigma-Aldrich）と共に55℃にて60分間インキュベートすることにより、エステル交換する。脂肪酸メチルエステルをFolch法（水相に5％NaClでなく純水を用いるとの改変を伴う）によりグリセロールから分離する。グリセロールを含有する水相を次に凍結乾燥し、他文献に記載のように無水酢酸：ピリジン（2：1）とインキュベートすることによりグリセロールトリアセテートに変換する（Hellerstein, M. K., R. A. Neese, and J. M. Schwarz.  Am J Physiol 265:E814-20, 1993、参照により本明細書中に組み入れる）。一部のサンプルを抽出し、他文献に記載のように薄層クロマトグラフィー（TLC）により他のアシルグリセリドからTGを分離し（Jung, H. R., S. M. Turner, R. A. Neese, S. G. Young, and M. K. Hellerstein. Biochem J 343 Pt 2:473-8, 1999、参照により本明細書中に組み入れる）、そして上記のように分析する。
【０３２６】
グリセロールトリアセテートを上記のようにGC/MSにより同位体含有率について分析する。
【０３２７】
新規に合成されているTGの割合（f）を上記のように算出する。
【０３２８】
2H2O標識の間のTG-グリセロールについての理論上のプラトー又は漸近値（A1∞）は、2種類の方法で決定する：グリセロール中の組み合わせ標識パターンについての質量アイソトポマー分布解析（MIDA）によるもの（A1∞mida）、及び「完全に置換された」TG格納（depot）について到達したプラトーの含有率の測定によるもの（A1∞plateau）である（以下を参照されたい）。次に標準前駆体-産物方程式を適用する：
f = 1-e-ks*t
ks = -In(1-f)/t
（式中、ksは置換割合又は合成速度定数を表し、tは標識時間である。）
【０３２９】
脂肪TGの絶対的合成速度は、測定した合成割合（ks）を、標識期間をTGのプールの大きさに掛けたものと乗ずることにより算出する。この計算のために、TG含量は非肥満若齢げっ歯類において体重の10％であると見積もる。脂肪組織TGの絶対的合成速度は、以下のように算出することができる：
絶対的合成（mg/d） = ks(d-1)×TG含量（mg）
【０３３０】
統計解析にはANOVAを用い、有意差水準p<0.05として各群を比較した。標識取り込みデータの曲線フィッティングはDelta Graph（Delta Point, Inc.）を用いて行った。
【０３３１】
次にTG合成速度を曝露動物と非曝露動物間で比較し、化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物が脂質生成を阻害するかどうか決定するが、このことは、かかる肥満関連疾患及び状態の治療について開発並びに評価するための化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物を選択するための基盤を与える。
【０３３２】
上記のプロトコールを用いて、化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物が脂質分解を刺激するかどうか評価することもできる。脂質分解の刺激もまた、肥満関連疾患及び状態その他の代謝的障害の治療において重要であり、従って化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物が脂質分解を刺激するかどうかは、その化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物が肥満関連疾患又は状態を治療する潜在能力を有するかどうかを決定する上で重要である。
【０３３３】
個体の脂肪格納における正味の脂質分解（TG分解）速度は、TG合成の絶対速度とTG蓄積の正味速度との差から算出するが、後者は脂肪体（fad pad）又は全身中の一定時間にわたる重量の変化から決定する：
正味の脂質分解（mg/d） = 絶対的TG合成 - 正味TG蓄積
= ([ks(d-1)×TG含量(mg)] - [(TG含量の変化)/時間(d)]
【０３３４】
次に曝露動物を非曝露動物と比較し、化合物又は化合物の組み合わせ若しくは化合物の混合物が脂質分解活性を有しているかを決定するが、このことは、肥満関連疾患及び状態のような徴候の治療について開発並びに評価し、且つ有効性、用量等を求めるために化合物を選択及び/又は特性決定するための基盤を与える。
【０３３５】
図21に示したように、脂肪中脂質分解及びトリグリセリド合成は肥満マウスでは上昇しており、レプチン投与で抑制することができる。
【実施例２】
【０３３６】
細胞増殖のバイオマーカーとしてのラットでのDNA合成：
DNA合成は細胞増殖に対する必須の生化学プロセス（すなわち代謝経路）であり、従って細胞増殖に対するバイオマーカーである。一部の場合には細胞増殖を刺激することが望ましいことがあるが（創傷治癒等）、別の場合には細胞増殖を阻害することが望ましい（癌等）。
【０３３７】
上記実施例1に記載のように、ラットに2H2Oを投与する。DNAは図2及び3に示すように2Hにより標識する。
【０３３８】
上記実施例1に記載のように、ラットに化合物又は化合物の組み合わせ若しくは化合物の混合物、あるいはビヒクル（対照）を投与する。
【０３３９】
次にQiagenキット（Qiagen, Valencia, CA）を製造業者のプロトコールに従って用いて、対象となる組織又は細胞からDNAを単離する。単離したDNA（水に溶解）をpH9〜10に調整し、酵素的に加水分解する；デオキシリボースがプリンデオキシヌクレオチド（dA/dG）から選択的に放出され、ペンタンテトラアセテート誘導体へと変換される。あるいはまた、酸性条件下での過剰量のペンタフルオロベンジルヒドロキシルアミンとの反応及び引き続く無水酢酸でのアセチル化により、ペンタフルオロベンジル誘導体を調製する。いずれのタイプの誘導体も、引き続いて有機溶媒により抽出し、硫酸ナトリウムにより脱水し、そして上記のようにGC/MSにより分析する。
【０３４０】
次に同位体含有率を分析し、上記のように分子流束量を算出する。続いてDNA合成を、上記及び米国特許第5,910,403号に記載の通りに決定する。曝露動物を非曝露動物と比較して、その化合物又は化合物の組み合わせ若しくは化合物の混合物がDNA合成に対して（すなわち、DNA合成の刺激又は阻害に対して）効果を有しているかどうか決定する。化合物又は化合物の組み合わせ若しくは化合物の混合物がDNA合成を阻害する場合、このことは、細胞増殖の低減により恩恵を受ける徴候（増殖悪性細胞及び増殖内皮細胞をはじめとする癌等）について開発及び評価し、且つ有効性、投与量等を求めるために化合物を選択及び/又は特性決定するための基盤を与える。化合物又は化合物の組み合わせ若しくは化合物の混合物がDNA合成を刺激する場合、このことは、細胞増殖の増大により恩恵を受ける徴候（創傷治癒等）の治療について開発及び評価し、且つ有効性、投与量等を求めるために化合物を選択及び/又は特性決定するための基盤を与える。
【０３４１】
図20に示したように、細胞増殖は抗増殖薬（この場合ゲムシタビン及びヒドロキシ尿素）により低減させることができる。
【実施例３】
【０３４２】
神経細胞新生のバイオマーカーとしてのラット海馬神経前駆細胞でのDNA合成：
化合物又は化合物の組み合わせ若しくは化合物の混合物を、それらが神経細胞新生に対して効果を有しているかを決定するためにラットで試験した。神経細胞新生可能性を有する化合物（すなわち、神経細胞新生を刺激するか、且つ/又は神経前駆細胞死を阻害する（アポトーシスの阻害及び/又は壊死の阻害を含む）化合物）は、脊髄損傷、パーキンソン病、ハンチントン病その他の神経変性疾患の治療での用途を見出し得る。神経細胞新生及び/又は神経前駆細胞死の阻害を検出することにより、本方法は上述の障害を治療するための薬剤を開発及び評価する化合物の選択及び/又は特性決定を可能にする。
【０３４３】
ラットを曝露群と対照群とに分け、上記の実施例1のように標識水を投与する。化合物又は化合物の組み合わせ若しくは化合物の混合物、あるいはビヒクル（対照ラットの場合）への、強制経口投与、クモ膜下腔投与、又は頭蓋内投与による曝露後に（投与経路は、当該技術分野で周知の通りの、化合物又は化合物の組み合わせ若しくは化合物の混合物の化学的性質によって決まる）、ラットをCO2窒息により安楽死させ、全脳を取り出す。
【０３４４】
神経細胞新生の解析のために組織を単離する目的で、脳を体軸方向に二分割し、各海馬葉を、海馬白板に沿った生来の分割線を用いて上にかぶさる大脳白質から分離する。海馬采及び鉤状回の白質は除去する。
【０３４５】
組織を細かく切り刻み、HibernateA中に溶解したパパイン（2.5 U/ml；Worthington, Freehold, NJ）、DNase（250 U/ml, Worthington）、及び中性プロテアーゼ（1U/mlディスパーゼ；Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）の溶液中で45分間消化する。
【０３４６】
次に消化済み組織全体をHibernateA中に懸濁し、わずかに加熱溶解させシリコナイズしたパスツールピペットを用いてばらし、等量のPercoll溶液とよく混合する。Percoll溶液は9割のPercoll（Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）を1割の10×PBS（Irvine Scientific, Santa Ana, CA）と混合して作製する。
【０３４７】
続いて細胞懸濁液を20,000×g、18℃にて30分間の遠心により分画する。細胞画分を回収し、HibernateA中で3回以上リンスすることによりPercollを洗い流す。
【０３４８】
DNA合成は実施例2のようにして測定する。DNAは図2及び3に示すように2Hにより標識する。
【０３４９】
続いて曝露動物を非曝露動物と比較して化合物又は化合物の組み合わせ若しくは化合物の混合物が海馬神経前駆細胞でのDNA合成を増大させるかどうかを決定するが、このことは、神経変性疾患の治療について開発及び評価し、且つ有効性、投与量等を求めるために化合物を選択及び/又は特性決定するための基盤を与える。
【実施例４】
【０３５０】
神経細胞新生のバイオマーカーとしてのマウス海馬神経前駆細胞でのDNA合成：
成獣オスマウス神経前駆細胞増殖アッセイを、上記の実施例3に記載の通りに行った。マウスは、ビヒクル、フルオキセチン（10mg/kg/日）、又はイミプラミン（20mg/kg/日）のいずれかを用いて長期にわたり処理した。薬物処理の開始から2週間後に、マウスを10％2H2Oで標識した。標識の3〜7日後にマウスを屠殺し、海馬前駆細胞を単離し、そしてDNA単離及びGC/MS分析を上記の実施例2に記載のようにして行った。
【０３５１】
抗うつ剤であるイミプラミン及びフルオキセチンでの長期処理は、海馬においてマウス海馬神経前駆細胞の増殖での顕著な増大をもたらす（図7及び8を参照のこと）。応答の程度は、抗うつ剤処理後のBrdU標識により細胞増殖の増大を示した以前の研究と一致する。
【実施例５】
【０３５２】
アルツハイマー病のバイマーカーとしてのマウスでのAβ、APP、sAPP及びCTFの流量の測定：
アルツハイマー病（AD）は加齢に伴い自然発生する進行性の神経変性障害である。ADの原因となる複数の因子が存在するが、最も重要な構成要素の1つはAβペプチドであり、これは患者脳内で不溶性沈着物を形成し、種々の神経変性イベントを引き起こす。Aβペプチドはβ-アミロイド前駆体タンパク質（APP）に由来し、これがある一群のプロテアーゼにより切断されてAβが形成される。APPのプロセシングの乱れにより、CNSからのAβのクリアランス速度の変化が生じるため、これがADの原因となっていることが提案されている。Aβの生成を低減するためにAPPのプロセシングを変化させることを目指した治療的介入は、ADを予防又は治療するための合理的で広く実行される戦略をもたらす。APP及び/又はAβのプロセシングを変化させる薬物はAD薬の「次世代」を担うと考えられている。
【０３５３】
他の薬物（臨床試験中の一部のものを含む）はAβ生成及び沈着の下流にあるイベントを治療するか又は遅らせることに焦点を置いている。そのような下流のプロセスとしては、神経炎症、記憶障害、神経細胞死、及び神経細胞新生障害が挙げられる。
【０３５４】
上述の通り、Aβ、APP、分泌型アミロイド前駆体タンパク質（sAPP）、及びAPPのC末端断片（CTF）はADの病因において重要である。化合物、化合物の組み合わせ、又は化合物の混合物がAβ又はAPP若しくはsAPP又はCTF（あるいはこれらのタンパク質のうち2以上）の合成を阻害しうるかどうか測定することにより、ADを治療するための新規な手段が見出される可能性がある。
【０３５５】
前臨床AD薬開発に対する現行の基準は、APPトランスジェニックマウスモデルである。これらのマウスにおいて、脳内の総Aβ沈着を組織学的に計測する。この「プラーク量」（plaque load）測定における減少は、薬物効果の指標となる。しかしながら、トランスジェニックマウスでのプラーク形成には数ヶ月から数年を要する上に、このマウスは高価である。APP/Aβ経路での治療的介入の作用を試験するために正常マウスにおいて用いることができるAPP及び/又はAβ動態の迅速で定量的な前臨床アッセイは、前臨床的AD研究を大幅に加速するであろう。Aβ又はこの経路で生成される他のペプチドの、尿、血漿又は脳脊髄液からの単離は、ADリスク及び治療に対する応答のバイオマーカーとして、ヒトに適用されるべきこの動的アプローチを可能にし得る。
【０３５６】
Aβ生成経路を通るAPPの流束は、前臨床薬評価のための有効性の迅速且つ敏感なマーカーであろう。APP生成をダウンレギュレートするか、Aβ生成性プロテアーゼであるβ-セクレターゼによるAPPのプロセシングをブロックする薬物を、特定し、活性について比較し、そしてAPP動態について最適化することができる。このアプローチの利点は、これらの測定が若齢の野生型動物において、ADのトランスジェニックモデル同様に行うことができる点である。このアプローチの更なる利点は、これが、トランスジェニック動物でプラークの形成を待つよりも非常に速い（数週間から数ヶ月と、数ヶ月から数年）と予想されることである。
【０３５７】
上記の実施例1でラットについて記載した手順を用いて、マウスを2H2Oで標識する。強制経口投与、クモ膜下腔投与、又は頭蓋内投与により、化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物をマウスに与える。尿を収集してAβタンパク質を単離する。尿中総タンパク質を濃縮し、イムノアフィニティー精製に適したバッファーに交換する。イムノアフィニティー精製後、サイズ排除クロマトグラフィー及び/又は逆相クロマトグラフィーを用いてAβを更に精製することができる。精製ペプチドが所望のものであることは、ELISA、ウエスタンブロット、及びLC-MS（ESI）により確認することができる。
【０３５８】
あるいはまた、マウスを屠殺して脳組織を摘出し、APP及びCTFを得る。分泌型APPはマウス脳脊髄液（CSF）又は脳から抽出する。タンパク質を中性バッファー中に抽出し、不溶物を取り除いて、タンパク質を沈殿させる。得られた物質をイオン交換バッファーに交換し、イオン交換クロマトグラフィーと、続くサイズ排除クロマトグラフィー及び/又は逆相クロマトグラフィーにより精製する。精製タンパク質が所望のものであることは、ELISA及びウエスタンブロットにより確認する。
【０３５９】
精製タンパク質を、6N HClを用いて110℃にて16時間処理して加水分解させる。加水分解物を乾燥させ、PFBBr（Pierce）を100℃にて1時間添加することによりN,O-ペンタフルオロベンジル誘導体を生成する。誘導体化した加水分解物を酢酸エチルで抽出し、NaSO4を用いて脱水し、DB225 GCカラムで分析する（開始温度100℃、10℃/分で220℃まで上昇）。アラニンはm/z 448,449の選択イオンモニタリングにより分析し、グリシン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、及びチロシンをはじめとする他のアミノ酸も分析することができる。
【０３６０】
Aβ、APP、及びCTFの含有率を上記のように測定する。Aβ、APP、及びCTFの分子流束量を上記のように算出する。次に曝露動物を非曝露動物と比較して、化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物がAβ、APP、sAPP、及びCTF合成を阻害するか、且つ/又はそれらの分解を刺激するかどうかを決定するが、このことは、ADの治療について開発及び評価し、且つ有効性、投与量等を求めるために化合物を選択及び/又は特性決定するための基盤を与える。
【実施例６】
【０３６１】
インスリン耐性、II型糖尿病、メタボリック症候群、及び心血管疾患についてのバイオマーカーとしての正常ラットでのグルコースの解糖系処理：
グルコース負荷についての解糖系処理（glycolytic disposal）は、血中グルコースの取り込み、リン酸化、及び解糖系代謝をはじめとするいくつかのインスリン感受性の代謝ステップを反映するものである。従って、全身解糖速度は、インスリン耐性、メタボリック症候群、心血管疾患、及びII型糖尿病に対するバイオマーカーである（Reaven GM.  Banting Lecture 1988.  Role of insulin resistance in human disease.  Diabetes 37(12):1595-607, 1988を参照のこと）。インスリン感受性に対する効果について、化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物に対する応答におけるin vivoでの解糖系処理を測定するのに、上記の実施例1におけるのと同様にラットを用いた。インスリン耐性（インスリン感受性の欠如）は欧米社会では多数の疾患の基礎となるので（Reaven）、解糖系処理の測定はインスリン耐性、メタボリック症候群、心血管疾患、及びII型糖尿病に対する治療薬の開発及び評価のための化合物の特定並びに特性決定において用途がある。
【０３６２】
より具体的には、該方法は新規に合成されたグリコーゲンを測定するために用いることができる。新規に合成されたグリコーゲンの合成は、当初投与したグルコースの総量から解糖を差し引くことにより間接的に測定することができ、なぜなら、グルコースの全消失量は、解糖量総量＋新規合成グリコーゲン総量に等しいからである。以下の方程式を用いて、新規に合成されたグリコーゲンを算出することができる：
総グルコース利用 - 解糖 = 新規に合成されたグリコーゲン
【０３６３】
2H-グルコース標識プロトコールは、99.9％の[6,6-2H2]グルコースの腹腔内（ip）注射又は経口投与からなる。ラットを標識するために、2mg/g体重の標識グルコースを与える。いくつかの時間点で体内水を血清として収集する。化合物又は化合物の組み合わせ若しくは化合物の混合物を強制経口投与等の適当な投与経路で投与する。
【０３６４】
解糖は、投与した[6,6-2H2]グルコース（グルコース分子と水分子中の重水素のモル量の違いを考慮に入れるために標準化した）のうちの割合として、体内水中の重水素を測定することにより測定する。重水素水は上記のように測定する。曝露ラットからの解糖と非曝露ラットからの解糖とを比較して、化合物又は化合物の組み合わせ若しくは化合物の混合物が解糖を増大させかどうかを決定するが、このことは、インスリン耐性、II型糖尿病、及び/若しくはその他の代謝的障害の治療について開発及び評価し、且つ有効性、投与量等を求めるために化合物を選択及び特性決定するための基盤をもたらす。
【０３６５】
図24に示したように、公知のインスリン感作薬であるロシグリタゾンは、インスリン耐性及び前糖尿病の動物モデルであるZucker-Diabetes-Fat（ZDF）ラットのインスリン感受性を改善することができる。
【０３６６】
図29では、投与した重水素化グルコースの総量のうちの割合として測定したグルコース利用の減少を示す。見て取れるように、3週間、高脂肪食を摂ったラットは、正常食を摂った対照ラットと比較して、グルコースを代謝する能力に欠陥があった（結果はp<0.05で統計学的に有意である）。
【０３６７】
図30では、痩せ、過体重、肥満、II型糖尿病、及びHIV感染個体に分類された多数のヒト被験者でのグルコース利用を示す。全ての群が、痩せの群に対して低下したグルコース利用を示したが、これは、過体重、肥満、及びHIV＋個体はインスリン耐性である場合がより多いことを示す確立されたデータと一致する。予想通り、II型糖尿病被験者はインスリン耐性であることが示された。
【実施例７】
【０３６８】
脱髄性疾患での再ミエリン化のバイオマーカーとしての脳ガラクトセレブロシドターンオーバー：
脳ガラクトセレブロシドターンオーバーは、多発性硬化症（MS）等の脱髄性疾患の基礎となる生化学プロセス（代謝経路）である脱髄に対する基本的なバイオマーカーである。上記の実施例1におけるのと同様に重水素水をラットに与える。強制経口投与、クモ膜下腔投与、又は頭蓋内投与により、化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物をラットに与える。化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物が再ミエリン化を刺激するか、且つ/又は脱髄を阻害することが見出されれば、このことは、MSその他の脱髄性疾患の治療について開発及び評価するために化合物を選択及び特性決定するための基盤となる。
【０３６９】
1組の2ml微小遠沈管を計量する。ラット又はマウスの死体から脳を集め、計量する。脳を氷冷したガラス板に載せ、BHTの結晶10個を加える。剃刀を用いて1分間、脳を切り刻む。スパチュラを用いて切り刻んだ脳を微小遠沈管に戻す。スパチュラで脳をよく細かくする。細かくした脳のうち80〜120mgを、PTFEスクリューキャップ付きの13×100mmガラス管に入れ、組織が試験管の底にあるようにする。脳の残りは微小遠沈管中で-20℃にて保存する。BHTを加えたクロロホルム-メタノール2：1（v/v）2mlをガラス管に添加し、試験管をボルテックスして、組織が全て溶媒中に浸かるようにする。室温にて少なくとも5分間置く。試験管を室温、2000 RCFにて10分間遠心する。上清（脂質抽出物）をスクリューキャップ付き2mlバイアルに移し、固形残渣は捨てる。
【０３７０】
TLCを行う。20mlピペットを用いて、Whatman LK6DFシリカゲル60 TLCプレートの1、10、19番のレーンに20mlの全セレブロシド標準をスポットする。各サンプルについて、40μlの脂質抽出物を各レーンにスポットする。TLCプレートを、69.2％クロロホルム、26.6％メタノール、4.2％水からなる現像溶媒を用いて現像する。TLCプレートの現像後、15分間待ってプレートを乾燥させる。ヨウ素蒸気のために特別に用いるタンクに20個のヨウ素結晶を入れる。タンクを80℃に設定したヒートブロック上に置く。乾燥したTLCプレートをヨウ素タンクに入れ、二重結合を有する脂質のスポットを可視化する。全セレブロシド標準のスポットを、サンプルのものと合わせる。シリカゲルを秤に載せた紙の上に集め、12×75mm使い捨てガラス管に移す。2mlの65％ジクロロメタン/25％メタノール/10％水酸化アンモニウム溶液を加えてボルテックスにかける。シリカが沈殿するまで置く。溶媒を13×100mmスクリューキャップ付き試験管に注ぎ入れ、乾かす。次にサンプルを、BHTを加えたクロロホルム-メタノール2：1 1mlに再懸濁し、1mlの3NメタノールHClを試験管に加えて試験管のキャップをしっかりと閉める。試験管を80℃のヒートブロック上に1時間置く。続いて試験管をヒートブロックから降ろし、室温まで冷ます。H2O 1.5mlとヘキサン3mlを試験管に加え、ボルテックスする。1.8〜2mlの下層（メチルグルコース及びメチルガラクトース）をGCバイアルに移す。GCバイアルをスピードバック（speedvac）中で乾燥させる。乾燥後、100μlの新たに調製した無水酢酸-ピリジン2：1（v/v）をGCバイアル中に加え、バイアルに覆いをかけて室温で1時間置く。次にバイアルを乾燥するまでN2に当てる。100μlの酢酸エチルを加える。サンプルをGC/MSにかけ、ガラクトセレブロシド含有率を測定する。ガラクトセレブロシドの分子流束量を、化合物又は化合物の組み合わせ若しくは化合物の混合物に曝露したラット及び非曝露（ビヒクル対照）ラットから、上記のように測定する。対照動物でのガラクトセレブロシド含有率よりも大きなガラクトセレブロシド含有率は、ガラクトセレブロシド合成の増大及び再ミエリン化の可能性を表す（このことは、上記の通り、MSその他の脱髄性疾患の治療について開発及び評価し、且つ有効性、投与量等を求めるために化合物を選択及び/又は特性決定するための基盤を与える。）。
【０３７１】
対照よりも小さな含有率は、低下したミエリン合成を表す（神経毒性、具体的にはミエリン鞘に対する毒性を暗示する；これは、新規な工業溶媒等の神経毒性化学薬品の特定において用途があるであろう。）。
【０３７２】
図26に示したように、公知の脱髄性毒薬であるクプリゾン（cuprizone）が、脳内のガラクトセレブロシド（GalCer）の合成を抑制することが見て取れる。クプリゾンの除去後、GalCerの合成割合は、再ミエリン化期の間、通常の速度を上回って増大した。
【実施例８】
【０３７３】
変形性関節炎のバイオマーカーとしてのラットでのコラーゲンターンオーバー：
関節面からの軟骨の減少は、進行型変形性関節炎（OA）の主な特徴である。無視できない数の事実が、この減少が少なくとも部分的にはコラーゲンの分解速度の増大によるものであるとの仮説を支持している。従って、コラーゲンターンオーバー（コラーゲンの成分分解産物（原則的にはヒドロキシプロリン及びテロペプチド）への分解）はOA及び軟骨破壊を含む他の関節疾患の基礎となる生化学プロセス（代謝経路）における基本的なバイオマーカーである（コラーゲン標識の図解については図4を参照のこと；その生合成及び分解経路については図5を参照のこと）。
【０３７４】
正常メスラット（13週齢、Sprague Dawley）を以下のプロトコールにより2H2Oで標識する：0時点で無菌100％2H2O、0.9％NaClの腹腔内注射を行う（30ml/kg）。飲料水を8％2H2Oを含有する水溶液に交換し、屠殺まで維持する。
【０３７５】
適当な投与経路より化合物又は化合物の組み合わせ若しくは化合物の混合物をラットに投与する。化合物又は化合物の組み合わせ若しくは化合物の混合物がコラーゲン分解を阻害することが明らかになった場合は（例えば、ペプチド、遊離ヒドロキシプロリン及び/又はテロペプチドをはじめとするコラーゲンの分解産物の含有率の減少により）、このことは、OA及び軟骨破壊を含む他の関節疾患の治療について開発及び評価し、且つ有効性、投与量等を求めるために化合物を選択及び/又は特性決定するための基盤となる。
【０３７６】
ラット（1時点あたり5匹）を2H2O標識の2、4、8及び12日後に回収する。後肢膝関節表面（MTP、LTP、MFC、LFC）及び大腿骨頭から関節軟骨を回収し、予め計量しておいたRNaseフリーの試験管に移し、急速冷凍し（snap frozen）、分析まで-70℃で保存する。
【０３７７】
まず0.1M NaOH中で組織をホモジナイズすることによりコラーゲンを単離する。以下のようにして、10mgばかりの新鮮又は凍結全肝ホモジネートからコラーゲンを精製する：Polytronホモジナイザーを用いて、0.5mlの100mM NaOH中でホモジナイズすることにより軟組織からコラーゲンを単離する。これらの条件下では、大部分の他のタンパク質は容易に溶解するものの、コラーゲンは不溶性のままである。7,000×g、4℃にて10分間の遠心後、上清を捨てる。ペレットを2mlのH2Oで軽く洗浄し、3分間ボイルした後、還元性Laemmliサンプルバッファー（Bio-Rad, Hercules, CA）中に可溶化させる。溶解物をSDS-PAGEによりサイズ分画する。標準的な技術を用いて、タンパク質を次にPVDFにトランスファーし、そしてクーマシー・ブルーでメンブレンを染色した後、コラーゲンのαモノマー型に対応するコラーゲンバンドを、得られたメンブレンから切り出す。
【０３７８】
コラーゲンの分解産物（遊離ヒドロキシプロリン、コラーゲン由来ペプチド、テロペプチド等）を、まず逆相固相抽出により濃縮する。次に、サイズ排除、アニオン交換、及び逆相分離を含む一連のクロマトグラフィーステップを行う。単離プロトコールの間、特異的な分解産物の存在を、市販の免疫学的試薬であるCartilaps（Nordic Bioscience, Herlew, Denmark）、並びにエレクトロスプレーイオン化質量分析（ES/MS）の両者によりモニタリングする。ES/MSに関しては、選択イオンモニタリングは、最も頻繁に存在するCTxIIの変異型（分子量1592.64を有するものを用いた）の質量に基づくものとした。関節軟骨中で測定されたコラーゲンターンオーバーを、各採取部位間で、及び関節液から単離したCTxIIペプチドと比較する。
【０３７９】
コラーゲンの分解産物（遊離ヒドロキシプロリン、コラーゲン由来ペプチド、テロペプチド等）を、6N HClで110℃にて16時間処理することで加水分解させる。加水分解物を乾燥させ、PFBBr（Pierce）を100℃にて1時間添加することによりN,O-ペンタフルオロベンジル誘導体を生成する。ヒドロキシプロリンのヒドロキシル基を、メチルイミダゾール/MTBSTFAを用いて更に誘導体化する。ヒドロキシプロリンを、m/z 424,425の選択イオンモニタリングにてDB225 GCカラムで分析する（開始温度100℃、10℃/分で220℃まで上昇）。
【０３８０】
合成速度は上記の通りに測定及び算出する。
【実施例９】
【０３８１】
無症候性肝毒性又は疾患についてのバイオマーカーとしての肝細胞ターンオーバー：
肝細胞ターンオーバーは、肝傷害及び肝疾患についてのバイオマーカーである。実際、肝細胞増殖（環境汚染因子若しくは治療的化合物又は肝炎ウイルス等の他の因子への曝露に対する応答における）は、傷害又は疾患の臨床的徴候よりもかなり早く始まる。化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物に対する曝露（例えば、毒性化学薬品（新規工業的化学薬品、環境汚染物質、又は四塩化炭素等の公知の肝毒性物質等）若しくは環境毒素（毒性作用を誘発する生物学的因子等）への曝露、又は化学物質（新規又は従前の）、若しくは薬物候補、若しくは薬物リード、若しくは認可薬物、若しくは生物学的因子への曝露）に対する応答における、in vivoでの肝細胞増殖の測定は、従って、臨床的傷害又は疾患が発生する前に肝臓の変化を検出するための感度の高い方法である。DNA複製中のdNTPのデオキシリボース（dR）部分は、安定同位体標識グルコース又は2H2Oを用いて、de novoヌクレオチド合成経路を介して内因性に標識することができる（図1）。この実施例では、上記の実施例1に記載の手順を用いて2H2Oでラットを標識する。上記の実施例1と同様に、対照群と曝露群を用いる。
【０３８２】
マウスにCCl4を1週間に2回、最大4週間まで腹腔内的に与え、その間、2H2Oの腹腔内ボーラス注射に続いて、継続的に経口により2H2Oを与える。血球の混入を最小限にするために、肝臓をin situで生理食塩液を用いて灌流する。肝臓をホモジナイズし、上記の実施例1に記載の通りにゲノムDNAを単離及び加水分解した後、5mgのアリコートからのDNAをガスクロマトグラフィー/質量分析により2H取り込みについて分析する。CCl4の最終投与の4日後に肝臓を回収する。続いて細胞増殖速度を、測定した体内水含有率又は完全に置き換えられる参照細胞タイプと比較して、標的細胞のDNA中の含有率から算出することができる。
【０３８３】
生検又は肝臓ホモジネートのいずれかによる肝臓サンプルからDNAを抽出する。肝細胞増殖は、2mg（400,000細胞）程度のサンプルで測定することができる。単離肝細胞ではなく全肝臓を用いることで効率的なスケールアップが可能になり、サンプル処理を超ハイスループットの96ウェル自動化システムに適合させることができる。全肝細胞増殖は、単離肝細胞及び、確認のための非実質細胞について測定された増殖と比較する。全肝細胞増殖は単離肝細胞増殖よりも用いるのにはシンプルな方法であり、従って、全肝細胞増殖の測定が単離肝細胞増殖に近似していれば、全肝細胞増殖の利用は無症候性肝毒性の検出において単離肝細胞増殖の利用よりも好ましい。
【０３８４】
図13には、7日間の処理における肝細胞増殖に対するCCl4の効果が示されている。Swiss Websterマウスに対して、2H2Oと同時にCCl4の腹腔内注射を7日間にわたって行った。全肝細胞ターンオーバー（すなわち、肝細胞増殖の増大）はCCl4の用量の増大に伴って明らかとなり、これは毒素傷害に対する肝臓の応答を反映している。
【実施例１０】
【０３８５】
肝線維症のバイオマーカーとしてのコラーゲン合成：
線維症（細胞外マトリックス（ECM）成分の過生成）は、脈管系、心臓、肺、肝臓、及び腎臓、並びに皮膚の多くの疾患の特徴である（コラーゲン標識の図解については図4を参照のこと；その生合成及び分解経路については図5を参照のこと）。線維症は一般的に、アルコール等の毒性物質によるか、同様に機械的ストレス及び酸化ストレスによる組織傷害に対する応答として生じる。組織線維症の最も特筆すべき特徴は、コラーゲン生合成の慢性的増強と、分解の減少である；最終的にはこの組み合わせにより臓器の機能が低下し、臓器機能不全につながる。
【０３８６】
従前より、組織線維症の予測診断は薬物毒性及び疾患治療の評価について重要である。しかしながら、既存の線維症のバイオマーカーは、多くの場合費用がかかり且つ反応性が低い。これらのものとしては、コラーゲンプールサイズの増大の測定についての指標アッセイ及び組織生検試料内のECM成分の組織化学染色が挙げられる。コラーゲン合成での変化の測定は、プールサイズ測定又は定性的組織病理学スコアよりも感度が高く、且つ定量的である。
【０３８７】
肝線維症（過剰な細胞外マトリックス（コラーゲン）の集積）は、慢性的肝傷害又は肝疾患の、よく発生する結果である。慢性的な、加療していない線維症は肝硬変へと進行し、肝硬変は不可逆的である。しばしば慢性アルコール摂取に伴うが、線維症は他の薬物毒性（フェノフィブレート、グリセオフルビン、又はメトトレキセート等の化学治療剤による副作用を含む）、及び環境化学薬品（例えば、新規工業化学薬品又は四塩化炭素等の公知の工業化学薬品）への曝露によって生じることがある。実際、軽度の持続的肝ダメージを引き起こすいずれの薬物も線維症を生じうるが、これは実際の臨床では広範な使用から何年も経つまで明らかにならない場合がある。
【０３８８】
本実施例では、上記の実施例1に記載の手順を用いて2H2Oでラットを標識する。上記の実施例1に記載されているのと同様に、対照群及び曝露群を用いる。曝露ラットにはジエチルニトロソアミン（diethylnitroseamine）の単回投与を行う（200mg/kg）。ジエチルニトロソアミンは強力な肝毒素、発癌物質且つ突然変異原であり、単回投与により線維症を誘発することが示されている。ラットに最大2週間、2H2Oを継続的に与え、続いて動物を処理から7及び14日後に屠殺する。
【０３８９】
以下のようにして、10mgばかりの新鮮又は凍結全肝ホモジネートからコラーゲンを精製する：Polytronホモジナイザーを用いて、0.5mlの100mM NaOH中でホモジナイズすることにより軟組織からコラーゲンを単離する。これらの条件下では、大部分の他のタンパク質は容易に溶解するものの、コラーゲンは不溶性のままである。7,000×g、4℃にて10分間の遠心後、上清を捨てる。ペレットを2mlのH2Oで軽く洗浄し、3分間ボイルした後、還元性Laemmliサンプルバッファー（Bio-Rad, Hercules, CA）中に可溶化させる。溶解物をSDS-PAGEによりサイズ分画する。標準的な技術を用いて、タンパク質を次にPVDFにトランスファーし、そしてクーマシー・ブルーでメンブレンを染色した後、コラーゲンのαモノマー型に対応するコラーゲンバンドを、得られたメンブレンから切り出す。
【０３９０】
コラーゲン分解産物は上記の実施例8に記載のようにして誘導体化及び分析する。
【０３９１】
ヒドロキシプロリンを対象となる分子とし、OH-プロリンとして測定するが、該分子は基本的にコラーゲンに固有のものである。この事実から、全肝タンパク質加水分解物を誘導体化し、ヒドロキシプロリンの2H含有率をGC/MSにより測定することができる。正常及びジエチルニトロソアミン処理動物でのコラーゲン合成割合は、全肝タンパク質由来のヒドロキシプロリンへの2H取り込みから算出する。この様式では、コラーゲン合成を最小量のサンプル調製物で測定することができ、このことはそれ自身をハイスループット分析とする。従って、どのような物質（又は物質の組み合わせ）でも、スクリーニングし、曝露に応答してコラーゲン合成が起こったかどうかを決定することができる。コラーゲン合成が観察された場合、該生物は肝線維症に対するリスクが増大している。従って該方法は、肝臓でのコラーゲン合成を誘導するかどうか、従って、曝露した生物を肝線維症及び肝硬変に対するリスクが高まった状態に置く肝毒性作用を有するかどうか決定するための、化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物のスクリーニングを可能にする。
【０３９２】
逆に言うと、化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物がコラーゲン合成を阻害若しくは低減するか、且つ/又はコラーゲン分解を増大させることが見出されれば、このことは、肝線維症の治療について開発及び評価し、且つ有効性、投与量等を求めるために化合物を選択及び/又は特性決定するための基盤を与える。
【０３９３】
図19に示したように、公知の線維化誘発薬であるCCl4はマウス肝臓でのコラーゲン合成を増大させ、この効果は2種類の抗線維化薬、(a)インターフェロン-γ及び(b)ロシグリタゾンにより抑制された。
【実施例１１】
【０３９４】
肺線維症のバイオマーカーとしてのコラーゲン合成：
線維症（細胞外マトリックス（ECM）成分の過生成）は、脈管系、心臓、肺、肝臓、及び腎臓、並びに皮膚の多くの疾患の特徴である（コラーゲン標識の図解については図4を参照のこと；その生合成及び分解経路については図5を参照のこと）。線維症は一般的に、アルコール等の毒性物質によるか、同様に機械的ストレス及び酸化ストレスによる組織傷害に対する応答として生じる。組織線維症の最も特筆すべき特徴は、コラーゲン生合成の慢性的増強と、分解の減少である；最終的にはこの組み合わせにより臓器の機能が低下し、臓器機能不全につながる。
【０３９５】
従前より、組織線維症の予測診断は薬物毒性及び疾患治療の評価のために重要である。しかしながら、既存の線維症のバイオマーカーは、多くの場合費用がかかり且つ反応性が低い。これらのものとしては、コラーゲンプールサイズの増大の測定についての指標アッセイ及び組織生検試料内のECM成分の組織化学染色が挙げられる。コラーゲン合成での変化の測定は、プールサイズ測定又は定性的組織病理学スコアよりも感度が高く、且つ定量的である。
【０３９６】
肺線維症は、広範なスペクトルの飛散化学汚染物質及び微粒子への曝露により、サルコイドーシスにより、及びカルムスチン等のある種の製剤への曝露により生じ得る。病因が明らかでない特発性肺線維症も存在する。
【０３９７】
正常オスラット（6〜9週齢、Sprague Dawley）を、以下のプロトコールにより2H2Oで標識する：0時点で無菌100％2H2O、0.9％NaClの腹腔内注射を行う（30ml/kg）。飲料水を8％2H2Oを含有する水溶液に交換し、屠殺まで維持する。
【０３９８】
腹腔内注射等の適当な投与経路により、化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物をラットに投与する。化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物がコラーゲン合成を阻害若しくは低減するか、且つ/又はコラーゲン分解を増大させることが見出されれば、このことは、肺線維症の治療について開発及び評価し、且つ有効性、投与量等を求めるために化合物を選択及び/又は特性決定するための基盤を与える。
【０３９９】
逆に言うと、化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物がコラーゲン合成を増大させ、且つ/又はコラーゲン分解を低減することが見出されれば、このことは、新規化学物質、薬物候補、薬物リード、認可薬物、生物学的因子、環境化学薬品、新規リード化合物等についての潜在的な、これまで公にされていない毒性を報告することの基盤を与える。
【０４００】
ラット（1時点あたり5匹）を2H2O標識の2、7、14、21及び28日後に安楽死させる。限定するものではないが、皮膚、肺、肝臓、心臓、及び腎臓をはじめとする組織を取り出し、分析まで-20℃で保存する。
【０４０１】
最初に組織を0.1M NaOH中でホモジナイズすることによりコラーゲンを優先的に沈殿させる。ホモジネートを7,000×gで遠心し、得られたペレットをドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動によりサイズ分画する。タンパク質をPVDF固体支持体にトランスファーする。該ブロットからコラーゲンを切り出し、110℃で16時間加水分解させる。アミノ酸を誘導体化し、対照群との比較において、処理群での2H含有量を測定し、時間の関数として解析する。
【０４０２】
コラーゲン分解産物は上記の実施例8に記載の通りに誘導体化及び分析する。
【実施例１２】
【０４０３】
心筋線維症のバイオマーカーとしてのコラーゲン合成：
線維症（細胞外マトリックス（ECM）成分の過生成）は、脈管系、心臓、肺、肝臓、及び腎臓、並びに皮膚の多くの疾患の特徴である（コラーゲン標識の図解については図4を参照のこと；その生合成及び分解経路については図5を参照のこと）。線維症は一般的に、アルコール等の毒性物質によるか、同様に機械的ストレス及び酸化ストレスによる組織傷害に対する応答として生じる。組織線維症の最も特筆すべき特徴は、コラーゲン生合成の慢性的増強と、分解の減少である；最終的にはこの組み合わせにより臓器の機能が低下し、臓器機能不全につながる。
【０４０４】
従前より、組織線維症の予測診断は薬物毒性及び疾患治療の評価のために重要である。しかしながら、既存の線維症のバイオマーカーは、多くの場合費用がかかり且つ反応性が低い。これらのものとしては、コラーゲンプールサイズの増大の測定についての指標アッセイ及び組織生検試料内のECM成分の組織化学染色が挙げられる。コラーゲン合成での変化の測定は、プールサイズ測定又は定性的組織病理学スコアよりも感度が高く、且つ定量的である。
【０４０５】
心筋線維症は心臓疾患の主要な特徴である。最も多い原因は冠動脈硬化である。他の原因としては、以下が挙げられる：1, 高血圧による心肥大を原因とする相対的冠不全；2, 治癒したリウマチ性心筋炎；3, 治癒した感染性、免疫性、毒性、又は特発性心筋炎；4, 強皮症。
【０４０６】
正常オスラット（6〜9週齢、Sprague Dawley）を、以下のプロトコールにより2H2Oで標識する：0時点で無菌100％2H2O、0.9％NaClの腹腔内注射を行う（30ml/kg）。飲料水を8％2H2Oを含有する水溶液に交換し、屠殺まで維持する。
【０４０７】
腹腔内注射等の適当な投与経路により、化合物、化合物の組み合わせ、又は化合物の混合物をラットに投与する。化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物が心筋組織でのコラーゲン合成を低減するか、且つ/又はコラーゲン分解を増大させることが見出されれば、このことは、心筋線維症の治療について開発及び評価し、且つ有効性、投与量等を求めるために化合物を選択及び/又は特性決定するための基盤を与える。
【０４０８】
対照的に、化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物がコラーゲン合成を増大させ、且つ/又はコラーゲン分解を低減することが見出されれば、このことは、それらの化合物、化合物の組み合わせ、又は化合物の混合物についての潜在的な、これまで公にされていない心筋毒性を報告することの基盤を与える。
【０４０９】
ラット（1時点あたり5匹）を2H2O標識の2、7、14、21及び28日後に安楽死させる。限定するものではないが、皮膚、肺、肝臓、心臓、及び腎臓をはじめとする組織を取り出し、分析まで-20℃で保存する。
【０４１０】
最初に組織を0.1M NaOH中でホモジナイズすることによりコラーゲンが優先的を沈殿させる。ホモジネートを7,000×gで遠心し、得られたペレットをドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動によりサイズ分画する。タンパク質をPVDF固体支持体にトランスファーする。該ブロットからコラーゲンを切り出し、110℃で16時間加水分解させる。アミノ酸を誘導体化し、対照群との比較において、処理群での2H含有量を測定し、時間の関数として解析する。
【０４１１】
コラーゲン分解産物は上記の実施例8に記載の通りに誘導体化及び分析する。
【実施例１３】
【０４１２】
皮膚線維症のバイオマーカーとしてのコラーゲン合成：
線維症（細胞外マトリックス（ECM）成分の過生成）は、脈管系、心臓、肺、肝臓、腎臓、及び皮膚の多くの疾患の特徴である（コラーゲン標識の図解については図4を参照のこと；その生合成及び分解経路については図5を参照のこと）。線維症は一般的に、アルコール等の毒性物質によるか、同様に機械的ストレス及び酸化ストレスによる組織傷害に対する応答として生じる。組織線維症の最も特筆すべき特徴は、コラーゲン生合成の慢性的増強と、分解の減少である；最終的にはこの組み合わせにより臓器の機能が低下し、臓器機能不全につながる。
【０４１３】
従前より、組織線維症の予測診断は薬物毒性及び疾患治療の評価のために重要である。しかしながら、既存の線維症のバイオマーカーは、多くの場合費用がかかり且つ反応性が低い。これらのものとしては、コラーゲンプールサイズの増大の測定についての指標アッセイ及び組織生検試料内のECM成分の組織化学染色が挙げられる。コラーゲン合成での変化の測定は、プールサイズ測定又は定性的組織病理学スコアよりも感度が高く、且つ定量的である。
【０４１４】
皮膚線維症は、強皮症、強皮症障害、移植片対宿主病、重症痊瘡その他の障害の病理の一部として生じる。ハロフジノンその他の抗線維化薬が研究され、かかる治療に処方されているが、この分野はそのような疾患の早期検出のためのより良い試験及び疾患動物モデルの出現により急速に加速するであろう。
【０４１５】
正常オスラット（6〜9週齢、Sprague Dawley）を、以下のプロトコールにより2H2Oで標識する：0時点で無菌100％2H2O、0.9％NaClの腹腔内注射を行う（30ml/kg）。飲料水を8％2H2Oを含有する水溶液に交換し、屠殺まで維持する。
【０４１６】
腹腔内注射等の適当な投与経路により、化合物、化合物の組み合わせ、又は化合物の混合物をラットに投与する。化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物がコラーゲン合成を低減するか、且つ/又はコラーゲン分解を増大させることが見出されれば、このことは、皮膚線維症の治療について開発及び評価し、且つ有効性、投与量等を求めるために化合物を選択及び/又は特性決定するための基盤を与える。
【０４１７】
逆に言うと、化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物がコラーゲン合成を増大させ、且つ/又はコラーゲン分解を低減することが見出されれば、このことは、それらの化合物、化合物の組み合わせ、又は化合物の混合物についての潜在的な、これまで公にされていない毒性を報告することの基盤を与える。
【０４１８】
ラット（1時点あたり5匹）を2H2O標識の2、7、14、21及び28日後に安楽死させる。限定するものではないが、皮膚、肺、肝臓、心臓、及び腎臓をはじめとする組織を取り出し、分析まで-20℃で保存する。
【０４１９】
最初に組織を0.1M NaOH中でホモジナイズすることによりコラーゲンを優先的に沈殿させる。ホモジネートを7,000×gで遠心し、得られたペレットをドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動によりサイズ分画する。タンパク質をPVDF固体支持体にトランスファーする。該ブロットからコラーゲンを切り出し、110℃で16時間加水分解させる。アミノ酸を誘導体化し、対照群との比較において、処理群での2H含有量を測定し、時間の関数として解析する。
【０４２０】
コラーゲン分解産物は上記の実施例8に記載の通りに誘導体化及び分析する。
【実施例１４】
【０４２１】
腎線維症のバイオマーカーとしてのコラーゲン合成：
線維症（細胞外マトリックス（ECM）成分の過生成）は、脈管系、心臓、肺、肝臓、及び腎臓の多くの疾患の特徴である（コラーゲン標識の図解については図4を参照のこと；その生合成及び分解経路については図5を参照のこと）。線維症は一般的に、アルコール等の毒性物質によるか、同様に機械的ストレス及び酸化ストレスによる組織傷害に対する応答として生じる。組織線維症の最も特筆すべき特徴は、コラーゲン生合成の慢性的増強と、分解の減少である；最終的にはこの組み合わせにより臓器の機能が低下し、臓器機能不全につながる。
【０４２２】
従前より、組織線維症の予測診断は薬物毒性及び疾患治療の評価のために重要である。しかしながら、既存の線維症のバイオマーカーは多くの場合費用がかかり且つ反応性が低い。これらのものとしては、コラーゲンプールサイズの増大の測定についての指標アッセイ及び組織生検試料内のECM成分の組織化学染色が挙げられる。コラーゲン合成での変化の測定は、プールサイズ測定又は定性的組織病理学スコアよりも感度が高く、且つ定量的である。
【０４２３】
腎臓では、線維症は、健常組織から線維化組織への長期の漸次的置換を特徴とする。典型的な創傷治癒応答とは異なり、毒性傷害又は同様の損傷形成イベントを受けたときに、腎臓は、最初のイベントから長期にわたってコラーゲンをはじめとする細胞外マトリックスタンパク質を産生し続ける。腎線維症の治療のための抗線維化薬は、熱心な研究の対象である。
【０４２４】
正常オスラット（6〜9週齢、Sprague Dawley）を、以下のプロトコールにより2H2Oで標識する：0時点で無菌100％2H2O、0.9％NaClの腹腔内注射を行う（30ml/kg）。飲料水を8％2H2Oを含有する水溶液に交換し、屠殺まで維持する。
【０４２５】
腹腔内注射等の適当な投与経路により、化合物、化合物の組み合わせ、又は化合物の混合物をラットに投与する。化合物、化合物の組み合わせ、又は化合物の混合物がコラーゲン合成を低減するか、且つ/又はコラーゲン分解を増大させることが見出されれば、このことは、腎線維症の治療について開発及び評価し、且つ有効性、投与量等を求めるために化合物を選択及び/又は特性決定するための基盤を与える。
【０４２６】
逆に言うと、化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物がコラーゲン合成を増大させ、且つ/又はコラーゲン分解を低減することが見出されれば、このことは、化合物、化合物の組み合わせ、又は化合物の混合物についての潜在的な、これまで公にされていない毒性を報告することの基盤を与える。
【０４２７】
ラット（1時点あたり5匹）を2H2O標識の2、7、14、21及び28日後に安楽死させる。限定するものではないが、皮膚、肺、肝臓、心臓、及び腎臓をはじめとする組織を取り出し、分析まで-20℃で保存する。
【０４２８】
最初に組織を0.1M NaOH中でホモジナイズすることによりコラーゲンを優先的に沈殿させる。ホモジネートを7,000×gで遠心し、得られたペレットをドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動によりサイズ分画する。タンパク質をPVDF固体支持体にトランスファーする。該ブロットからコラーゲンを切り出し、110℃で16時間加水分解させる。アミノ酸を誘導体化し、対照群との比較において、処理群での2H含有量を測定し、時間の関数として解析する。
【０４２９】
コラーゲン分解産物は上記の実施例8に記載の通りに誘導体化及び分析する。
【実施例１５】
【０４３０】
神経毒性及び神経変性のバイオマーカーとしての神経細胞新生：
屠殺したばかりの2H2O標識マウスからの解剖により、大脳皮質組織を単離する。大脳皮質総DNAを、市販のキットを用いて約25mgの組織から単離し（Qiagen, Valencia, CA）、上記の実施例2に記載のようにGC/MSのために加水分解及び誘導体化する。重水素取り込みをGC/MSを用いて測定し、大脳皮質での細胞増殖速度を測定するのに用いる。これらの速度は、（脳の発達の一部としての、損傷に対する応答としての、又は投与した薬剤に対する応答としての）種々のプロセス（最も特筆すべきはグリア産出である）を反映することができる。これらの速度はまた、神経炎症（これはマイクログリア細胞増殖を刺激することがある）を反映する場合もある。神経毒性（神経変性及び引き続くグリア産出又は神経炎症を引き起こし得る）もまた、上記の方法により検出可能な大脳皮質に対する効果を有する場合がある。神経細胞新生（大脳皮質ではより緩慢に起こる）もまた同じ方法で検出可能であろう。これらの速度はまた、大脳皮質へのマクロファージ等の他の細胞タイプの浸潤も反映する場合がある。この技術は、解剖により単離可能な脳のいずれの下位構造での細胞増殖を調べるためにも適合させることができ、その組織についての同種の情報をもたらすであろう。従って、化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物を、抗炎症、マイクログリア細胞増殖、神経細胞新生、及び/又はグリア産出活性について試験することができる。かかる活性を有する化合物、化合物の組み合わせ、又は化合物の混合物は、脳損傷及び/又は脳疾患の治療のために開発及び評価するための候補である。
【０４３１】
逆に言うと、化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物を神経毒性についてスクリーニングすることができる。図12では、1種類のそのような毒素であるリポ多糖（LPS）を示し、この場合、高用量での投与がLPSの神経毒性作用に応答した皮質細胞ターンオーバーの増大を引き起こした。
【実施例１６】
【０４３２】
糖尿病についてのバイオマーカーとしての膵β細胞ターンオーバー：
ランゲルハンス島にある機能的に正常な膵β細胞数は、真性糖尿病の発症、経過、及び転帰に対して決定的に重要である。一般的に言うと、β細胞総量はこれらの細胞の新生と脱落のバランスを反映する。ほぼ全ての型の真性糖尿病は、糖尿病で生じるβ細胞の脱落又は機能不全を補償するのに必要なβ細胞複製の程度の不十分性により特徴付けられる。実際、膵臓中のβ細胞量の減少は、1型糖尿病の発症での重要な臨床徴候であり、インスリン耐性と合併した膵島体積の減少は、2型糖尿病の発症に必要である。1型糖尿病は、β細胞の自己免疫的破壊の結果、発症し；2型糖尿病は、早期のインスリン耐性発症及びβ細胞が高インスリン血症を埋め合わせることができないことを特徴とする。生物学的に活性なインスリンの不十分な産生は、大部分の型の糖尿病に共通する特徴であり、インスリン欠乏の程度が該疾患の重症度及び治療法の選択の両者を決定する。従って、膵島増殖が膵β細胞再生の代わりでとなるので、膵島増殖を測定する方法の開発は絶対的に必要である。特にβ細胞再生を調べるために、ラットの50％膵部分切除を行って、前糖尿病状態を模倣することができる（総説として、Risbud M.V and Bhonde R.R. Diabetes Res Clin Pract. 2002 Dec;58(3):155-65; Kulkarni R.N. Int J Biochem Cell Biol. 2004 Mar;36(3):365-71を参照のこと）。
【０４３３】
膵切除（50％）オスWistarラット、及び体重と週齢を合わせた対照を市販元から得る（Charles River, Wilmington, MA）。ラットには、自由摂取で水と餌を与える。動物は、12時間明暗サイクルで温度制御された部屋で飼育する。ラットを、研究条件により定めた薬物又はビヒクルで処理する。
【０４３４】
ラットをCO2ガスで屠殺し、膵管を特定して管内コラゲナーゼ注入のためにカニューレを挿入する。30mlのV型コラゲナーゼ溶液（20mg/30ml；Sigma Chemical Co. St Louis, MO）（Hanks平衡塩溶液（HBSS）バッファーで希釈）をカニューレ挿入後に膵管に注入する。膵臓を膨張させ、注意深く取り出して5ml冷却コラゲナーゼを入れた25mlフラスコに移す。膵臓を37℃の恒温槽内で15分間消化する。消化の最後に、膵消化物を新たなHBSSで洗浄する。膵島をFicoll勾配により精製する。膵臓当たり約200〜250個の完全な膵島を得る。
【０４３５】
膵島からDNAを単離し、実施例2に記載のように同位体含有率を測定する。
【０４３６】
これにより、化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物を膵島増殖を刺激するか又は膵島分解を阻害する能力について試験することができる。ランゲルハンス島は膵β細胞増殖についての代用マーカーになる。かかる活性を有する化合物は、糖尿病治療のための薬剤としての開発及び評価のための候補である。
【０４３７】
本明細書に記載の方法を用いて得たデータを図9に示す。対照動物及び膵切除動物に2H2Oを14日間投与し、膵島（β細胞）増殖を測定した。膵切除動物は、14日間の2H2Oの後に増大した増殖を示した（19.31％±4.0、n=3に対して11.23％±3.0、n=3；t-テストによりP<0.05）。
【０４３８】
図28では、前糖尿病のラットモデル（Zucker fat）、糖尿病のラットモデル（Zucker-diabetes）、及び対照動物（SD対照）での膵島細胞増殖を示す。糖尿病ラットでは、糖尿病動物から予測されるように、島細胞増殖が低下している。前糖尿病動物は、膵臓がインスリン感受性の低下に対応して、島細胞の増殖の増大を示している。
【実施例１７】
【０４３９】
血管新生のバイオマーカーとしての内皮細胞増殖：
血管新生とは、既存の血管からの新たな血管の形成を指す。内皮細胞増殖は、この複雑な生物学的プロセスの必須の構成要素のうちの1つである。過剰な血管新生は、癌、失明（網膜症）、乾癬その他の状態の病因に関与するが、不十分な血管新生は脳血管疾患、潰瘍、強皮症及び不妊の原因となり得る。
【０４４０】
微小血管密度は、血管新生研究で広く用いられ、微小血管密度と癌の再発との間に正の相関が報告されている。しかしながら、他の報告は、微小血管密度が血管新生又は治療有効性の良い指標ではないと指摘している。むしろ、それは維持されている腫瘍細胞の固有の代謝要求を反映する。現在、血管新生について他の信頼できる尺度は存在しない。
【０４４１】
新規な信頼性のある血管新生の測定を本明細書中に開示する。組織中での血管新生速度を、内皮細胞増殖速度により測定する。内皮細胞増殖は、上記で詳細に述べた重水（2H2O）標識技術を用いて定量化する。
【０４４２】
血管新生動態は、肝臓及び腫瘍異種移植片において測定する。 Balb/c Nu-/Nu-マウスにヒト乳房腫瘍細胞を移植する。2H2Oでの標識後、個々の動物を屠殺し、腫瘍組織と肝臓組織の両方を同じ動物から回収する。次に組織をコラゲナーゼ（1mg/ml）で消化して単一細胞懸濁物とする。内皮細胞をPercoll勾配遠心により濃縮し、続いてFACSにかける（イソレクチン（isolection）及びCD31陽性細胞をソーティングする）。次に、腫瘍内皮細胞、及び肝内皮細胞の増殖速度を、上記の実施例2に記載のように、単離内皮細胞由来のDNAを単離し、プロセシングし、誘導体化し、そして分析することにより測定する。
【０４４３】
これにより、化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物を内皮細胞増殖増殖を刺激するか又は阻害する能力について試験することができる。従って、内皮細胞は血管新生についてのバイオマーカーになり得る。かかる活性を有する化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物は、癌、乾癬その他の障害、及び創傷治癒等の状態の治療についての開発及び評価のための候補である。
【０４４４】
例として、公知の抗血管新生薬であるアバスチン（Genentech, CA）を本方法で試験した。2週間の薬物処理により、処理動物中の腫瘍内皮細胞は非処理群と比較して顕著に低い増殖速度を示した（図18）。
【実施例１８】
【０４４５】
骨髄抑制のバイオマーカーとしての骨髄細胞ターンオーバー：
骨髄球系細胞（感染に対する宿主防御に重要）は、末梢血中で最も急速にターンオーバーする細胞である。従って、正常骨髄球系細胞数の維持は進行中の骨髄前駆体の増殖を必要とする。このことが、好中球減少症/骨髄抑制が癌の化学療法で用いる抗増殖薬（骨髄球系前駆細胞の増殖を妨害する）の一般的な用量規定毒性である理由である。組換えコロニー刺激因子を用いた予防は好中球減少症を緩和又は予防するが、代わりとなる、より安価な治療が求められている。
【０４４６】
好中球減少症は通常、完全血算により検出及び定量化されている。しかしながら、骨髄球系細胞前駆体の増殖とその子孫の血中への出現との時間差により、血中好中球数の実質的な低下は治療の開始から数日（げっ歯類）又は数週間（ヒト）後まで起こらない。このことは言い換えれば、前臨床毒性スクリーニングでの遅延を意味する。ヒトでは、好中球減少症が発症したときには、重症好中球減少症の進行、従って致死的な感染症を防ぐのに遅すぎる場合がある。造血のin vitroでの代替物に依る代わりのマーカーは前臨床試験については開発中であるが、それをヒトでの使用に置き換えるのは困難である。
【０４４７】
重水（2H2O）投与後に新規に合成された細胞DNAへの2Hの取り込みは、細胞ターンオーバーの敏感で定量的な指標を与える。動物では、抗増殖薬投与後の骨髄毒性は、短期間の2H2O標識後の全骨髄DNAへの2H取り込みの減少により検出することができる。より具体的には、精製骨髄中骨髄球系細胞のDNAへの2H取り込みの減少が骨髄抑制についての迅速な表示をもたらす。ヒトでは、血中単球及び顆粒球DNAへの2H標識の取り込みの減少は、細胞数の減少が明らかになる前の、骨髄抑制の早期警鐘となり得る。
【０４４８】
マウスを化合物で処理し（上記の実施例1で述べた通り）、2H2Oで24時間から5日間標識する（体内水中5％2Hに至る腹腔内ボーラス注射、続いて飲料水中8％の2H2Oにより体内水含有率を維持する）。ヒトには、1〜2.5％体内水含有率に至る2H2Oを1日2回、経口的に与える。全骨髄から、FACS若しくは免疫磁気ビーズを用いて単離した骨髄中骨髄球系細胞から、血中単球若しくは顆粒球から、又はこれらの細胞のいずれかの表現型サブセットからDNAを単離する。上記の実施例2で述べたように、DNAを酵素的に加水分解し、プリンデオキシリボヌクレオシドからデオキシリボースを選択的に放出させ、ガスクロマトグラフィー/質量分析のために誘導体化する。同じ動物を、他の細胞又はタンパク質への2H取り込みについて調べることができる。ヒトの研究については、より短い期間の、低用量2H2O標識プロトコールを、低レベルの2H標識を検出するための高感度同位体比質量分析と組み合わせて用いる。
【０４４９】
これにより、化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物を、骨髄細胞増殖を刺激する能力について試験することができる。骨髄細胞は骨髄球系列の前駆細胞であり、骨髄抑制のバイオマーカーとなる。かかる活性を有する化合物、化合物の組み合わせ、又は化合物の混合物は、例えば癌に対する化学療法及び放射線治療に起因する骨髄抑制の治療のために開発及び評価するための候補である。
【０４５０】
図22は、Swiss Websterマウス（示されているもの以外は1群当たりn=4）に500mg/kgのヒドロキシ尿素（「OHU」）又は等量のビヒクル（「対照」）を腹腔内的に単回投与し、続く24時間、飲料水中8％の2H2Oで標識した実験について表すデータを示している。屠殺時に大腿骨及び脛骨の全骨髄（TBM）から単一細胞懸濁液を調製した。リンパ球系細胞（B220、CD3、DX5、及び/又はNK1.1を発現）、骨髄球系細胞（CD11b及びGr-1を発現）、及び他の細胞（上記の抗原を欠く）を、蛍光色素標識抗体カクテル、抗蛍光色素コンジュゲート磁気ビーズとのインキュベーション、及びMACSカラムの通過により成功裏に単離した。各画分から取得したDNAを加水分解し、プリンdRをPFTA誘導体に変換し、そしてM1質量アイソトポマーへの2H取り込みを定量化した。完全なターンオーバーを予測し、0.15付近のEM1値を得た。p値は細胞タイプ間及び処理間の比較についての2-way ANOVAにより決定した。図22に示されているように、ヒドロキシ尿素は全骨髄、リンパ球系細胞、及びその他の骨髄細胞の増殖に対して統計学的に有意な抑制効果を有する。
【０４５１】
図23は、Swiss Websterマウス（1群当たりn=4）を、500mg/kg/dのヒドロキシ尿素の3日間の腹腔内投与により骨髄抑制し、4日目は休息させた実験について表すデータを示している。5日目に、マウスにビヒクル（「対照」）又は200ngのインターロイキン-1（IL-1）の腹腔内注射を2回（7〜12時間離して）行い、最初のサイトカイン注射のときから24時間標識した。DNAターンオーバー割合（プリンdRのPFTA誘導体でのEM1により測定）を、全骨髄細胞について、又はリンパ球系、骨髄球系、若しくは非リンパ球系/非骨髄球系（「その他」）の骨髄細胞サブセットにおいて測定した。IL-1は、ヒドロキシ尿素による抑制後に、全骨髄、骨髄球系、及びその他の骨髄の増殖に対して統計学的に有意な刺激効果を有する。
【実施例１９】
【０４５２】
多発性骨髄腫のバイオマーカーとしてのMタンパク質ターンオーバー：
多発性骨髄腫は、骨髄及びリンパ系器官での単クローン性増殖形質細胞の蓄積に起因する血液の悪性腫瘍である。これは、小さな割合の選ばれた患者での骨髄移植による以外は不治である。Mタンパク質（骨髄腫細胞により分泌されるモノクローナル抗体）の過剰産生が血清中で検出可能であり、その断片が尿中に出現する場合もある。骨髄中での悪性細胞の蓄積による（造血との競合：貧血、免疫不全）、Mタンパク質による（免疫複合体病）、及び他の分泌産物による（骨浸食、高カルシウム血症）、致死的な合併症が引き起こされる。抗増殖薬を用いた、及びより最近では抗血管新生薬を用いた化学療法は疾患の進行を延ばすか遅くすることができる。忠実な動物モデルがないことから、ヒトでの有効性研究が特に重要である。
【０４５３】
疾患の進行及び治療応答をモニタリングするために、Mタンパク質レベルを日常的に追跡する。しかしながら、Mタンパク質の過剰産生は、同じアイソタイプの正常ポリクローナルIgと比較してクリアランスを加速させるため、Mタンパク質レベルでは骨髄中の腫瘍組織量が実際より小さく見積もられる。Mタンパク質レベルは多くの場合、化学療法に対する応答での変化が緩慢である；従って、治療の有効性が明らかになるまで、又は有効でない場合に潜在的に毒性のある治療をやめるまでに、数ヶ月のサイクルの化学療法を行わなければならない。
【０４５４】
悪性形質細胞は骨髄でサンプル採取することができる；増殖の指標である悪性細胞による細胞周期マーカーの発現は予後診断に有用であるが、その臨床上の有用性には議論が残っている。骨髄腫細胞の遺伝学的マーカーは、後遺症の検出を可能にし、予後診断を助けるが、腫瘍組織量及び治療に対する応答の評価にはあまり有用でない。
【０４５５】
絶対的Mタンパク質合成の測定は、Mタンパク質レベルと比較して、腫瘍組織量の追跡での精密度の改善及び治療に対する応答の早期の検出を約束する。Mタンパク質合成割合は、2H2Oでのin vivo標識後の新規合成Mタンパク質への2H標識取り込みとして測定する。ターンオーバー速度割合は上記のように1次指数的動態を用いて算出する。絶対的ターンオーバー速度は、上記のように、Mタンパク質レベル及び合成速度割合の産物として算出する。
【０４５６】
経口的に2H2Oを投与された多発性骨髄腫患者から、少量（<5ml）の血清サンプルを得る。対象となるタンパク質を、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィーを用いる簡素化された手順で単離する。上記の実施例5に記載のように、タンパク質を加水分解し、得られたアミノ酸をGC/MS分析のために誘導体化する。新規タンパク質合成の指標として、アラニンへの標識取り込みを追跡する。
【０４５７】
これにより、化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物をMタンパク質合成を阻害する能力について試験することができる。Mタンパク質は多発性骨髄腫のバイオマーカーであり、従ってかかる活性を有する化合物は多発性骨髄腫の治療薬としての開発及び評価のための候補である。
【０４５８】
図25に示されているように、多発性骨髄腫患者では血清タンパク質合成が変化している。更に、多発性骨髄腫患者では、Mタンパク質合成はアルブミンをはじめとする他の血清タンパク質よりも顕著に多いことが示されている。
【実施例２０】
【０４５９】
遺伝子発現のバイオマーカーとしてのDNAメチル化：
DNAのプロモーター領域のメチル化亢進は、多くのヒトの癌でのよくあるエピジェネティックなイベントであり、腫瘍抑制因子遺伝子不活化及び癌の発病についての考えられる経路である。この反応を触媒する酵素はメチルトランスフェラーゼの1つのファミリーに属し、これは補因子であるS-アデノシル-l-メチオニン（SAM）からシトシンへとメチル基を転移し、DNA中に5’-メチルシトシンを形成する。
【０４６０】
DNAメチル化のモニタリングは、非常に感心を持たれてきた。当該技術分野で公知の多数のDNAメチル化法があり、それらのうち大部分は交差反応性（非特異的）、反応の不完全性、試薬の不安定性、長い解析時間、試薬の毒性、再現性の低さ、及び、測定可能なパラメータが形成速度ではなくメチルシトシンの含量だけであること等の制約を受ける。このようにメチル化速度の直接的な測定が不可能であることは、周知の方法（例えば細胞分裂の繰り返しによって、メチルシトシン含量がかなり希釈された後でしかメチル化の変化を検出することができない）の全てについての原理的な制約である。
【０４６１】
一般的に、DNAメチル化は遺伝子発現をブロックし、他方、脱メチル化が遺伝子活性化をもたらし得る。組織中でのDNAメチル化の新規な増大又は低減は、投与したメチオニンからの2H3-メチル基の標識取り込み又はメチレンフォレート（これは次にホモシステインに取り込まれ、メチオニンシンターゼによってメチオニンを形成する）のde novo合成されたメチレン基への2H2O侵入の量及び速度により測定する。新規に取り込まれた標識は、実施例2に記載のようなDNA抽出及び加水分解後のGC-MSにより検出する。簡潔には、100μlの95％ギ酸をGCバイアル中の乾燥DNAサンプルに添加した。バイアルにキャップをし、140℃で15分間インキュベートした。
【０４６２】
サンプルを乾燥させ、100μlのアセトニトリルと、5μlの臭化ペンンタフルオロベンジルと共に1〜2mgの炭酸ナトリウムを加えた。混合物を70℃で15分間インキュベートした。0.5mlの水で反応を止めた。次に溶液を0.5mlの酢酸エチルで2回抽出した。抽出物を乾燥させ、50μlのMBTFAと共に50μlのピリジンを加えた。得られた溶液を60℃で15分間インキュベートした。得られた溶液に2mlの水を加え、次にこれをジクロロメタンで2回抽出した（2×0.8ml）。続いて有機抽出物を更なる処理を加えずにGCMSで分析した。
【０４６３】
メチル化によりサイレンシングされた腫瘍抑制因子遺伝子の発現は、潜在的な薬物で腫瘍細胞を処理することにより活性化することができる。例として、20μMの2H3-メチルメチオニンを添加したDMEM培地（10％FBS）中でSW 1753細胞を一晩培養した。続いて3種類の異なる濃度（125nM、250nM、及び500nM）の2種類の公知の脱メチル化剤（アザシチジン及びデシタビン）を加え、陰性対照としてはメチルデオキシシチジンを用いた。
【０４６４】
本発明の方法は、DNAメチル化及び脱メチル化を測定するための迅速で信頼性の高い試験を提供し、それにより、より新しく有効な薬物の開発を促進する。これにより、例えば、化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物を、DNAの脱メチル化を刺激し、これにより腫瘍抑制因子遺伝子の発現を活性化する能力について試験することができ、そのようなものは様々な癌の治療での用途を見出し得る。
【０４６５】
図10に示されているように、24時間の標識時間中の新規なメチルシトシン画分は、2種類の公知の抗メチル化薬であるアゾシタジン（azocitadine）及びデシタビンにより抑制される。
【実施例２１】
【０４６６】
抗うつ活性及び他の精神障害又は認知障害のバイオマーカー並びに神経学的疾患若しくは状態からの治癒又は回復でのバイオマーカーとしての神経細胞新生：
成体神経細胞新生とは、成体生物の脳での新規な神経細胞の形成を指す。神経細胞新生は、成体哺乳動物脳では明確に区別された領域で、特にげっ歯類、霊長類、及びヒトの海馬で起こることが知られている。成体の海馬神経細胞は、増殖性の神経前駆細胞から形成され、これら新規な神経細胞は機能的連結を形成する。
【０４６７】
現在、脳での細胞増殖の最も広く用いられるマーカーは免疫組織学的解析での5-ブロモ-2’-デオキシウリジン（BrdU）を介したものである。神経細胞新生は、BrdU投与2〜4週間後のBrdUと神経細胞マーカーとの免疫組織学的共標識により評価する。神経細胞新生の評価のためのBrdU標識は非常に労力がかかり、これは脳からのBrdUのクリアランス前の短い時間（2時間）の間に「S」期にある細胞のみしか標識せず、再現性及び正確性が比較的低い。また、真の神経細胞新生を評価するためのBrdU投与から1ヶ月後の免疫標識は、標識の更なる希釈をもたらす。更に、高用量のBrdUが必要であるため、毒性の可能性がある。
【０４６８】
脳での細胞増殖は、上記のように重水（2H2O）からの新規なDNAの合成及び、従って新規な細胞から測定する。神経細胞新生の測定は、標識成体脳組織からの神経細胞の単離を含む。
【０４６９】
げっ歯類を飲料水中8％の2H2Oで標識する。動物を屠殺し、脳を取り出して海馬を切り出す。海馬DNA合成により、海馬での細胞増殖速度が明らかになる。異なる期間の標識投与を用いて、神経細胞での比較的緩慢な標識取り込み速度と比較して、比較的速く増殖する細胞（前駆細胞集団等）の動態を区別することができる。神経細胞新生を直接的に評価するために、2H2O標識ラットを屠殺し、脳を取り出し、海馬を切り出して0.5mmのスライスにし、パパイン及びトリプシンで消化/分散する。単離細胞を神経細胞マーカーで染色し、フローサイトメトリーによりソーティングする。上記の通りにDNAを単離し、標識を測定する。
【０４７０】
海馬神経細胞新生は、抗うつ剤の作用に関与し、またそれに必要であることが示されている。他の考えられる適用としては、アルツハイマー病、卒中、外傷性脳損傷のために開発中の薬物、並びに学習及び記憶のための薬剤の神経細胞新生効果の評価が挙げられる。これにより、例えば、化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物を、神経細胞新生（上記の実施例3で述べた神経前駆細胞増殖とは異なる神経細胞増殖）を刺激する能力について試験し、これにより更なる開発及び評価のために、抑うつ、AD、外傷性脳損傷、神経炎症によるダメージ、卒中、記憶、及び学習の治療のための化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物を特定することができる。
【０４７１】
図27に示されているように、公知の抗うつ剤（イミプラミン）はマウスにおいて成熟神経細胞の形成（すなわち神経細胞新生）の増大をもたらした。
【実施例２２】
【０４７２】
男性不妊のバイオマーカーとしての精母細胞ターンオーバー：
出産年齢にあるカップルのうち15％が不妊症に見舞われている。それらの苦しんでいる人々の中で、男性側の問題が40％のケースで明らかになっている。顕著な割合の男性側の不妊は、説明されていない精子形成不全に起因する。
【０４７３】
現在、組織学的精液分析が、精液の質の評価に用いられる標準である。この分析は複数の尺度を含む：射精量、精子数、精子運動性、前進性、精液pH、及び形態についてである。しかしながら、精液の質についてのこれら静的なマーカーによっては、精子形成の基礎となる動的なプロセスについてはあまり得るものがなく、また異常な精子産出/成熟を引き起こし得る欠陥及び結果として起こる男性不妊については殆ど洞察が得られない。
【０４７４】
実際に、ヒト精子形成における有糸分裂及び減数分裂活性の動態についての現在の理解というのは非常に限られている。精子形成について明らかにしている直近のデータは、様々な年齢の健常男性から得た、精巣の組織学的特徴に関する比較的シンプルな顕微鏡解析である。精子形成の動態の測定に対する上記及び他のアプローチは、本来的な毒性によるばかりではなく、それらが労力を要する、困難且つ費用のかかるものであるために制約を受ける。
【０４７５】
この分野では、in vivoでの精子産出の非侵襲的な指標がなかった。本発明の方法は、そのような指標を提供する。
【０４７６】
精子形成を測定するための本発明の方法は、動物の飲料水によるか、又はヒト被験者に毎日数口を与えることにより2H2O（重水）を投与するものであり、ヒト又は動物に適用可能である。
【０４７７】
2H2O由来の重水素（2H）は、精原細胞分裂の間に合成される複製中DNAのデオキシリボース（dR）部分に共有結合により取り込まれる。dNTPのデオキシリボースdR部分は、de novoヌクレオチド合成経路を介して内因性に標識される。プリン（デオキシアデノシン及びデオキシグアノシン）のdR部分中の重水素の同位体含有率を測定することにより、精子産出速度を測定することができる。
【０４７８】
被験体を重水素水で標識した後、精液又は精巣生検組織を得る。Percoll勾配遠心により精液から精子を単離する。精巣組織からは酵素消化及び半数性細胞のFACSソーティングにより精子を単離する。上記の実施例2に記載のように、DNAを抽出し、加水分解して、プリンデオキシリボース部分をガスクロマトグラフィー/質量分析（GC/MS）のために誘導体化する。精母細胞のDNA2H含有率を、完全にターンオーバーする組織（動物研究については骨髄、ヒト研究については血中顆粒球又は血中単球等）の2H含有率と比較して、精子増殖速度を算出する（図11を参照のこと）。射精物中の標識精子の出現についての時間差と、組織又は射精細胞中の標識取り込みの動態の両者を決定することにより、精子形成の生物学及び男性不妊の病因についての複数の洞察が得られる。
【０４７９】
精子形成の測定を可能にする本発明の方法は、男性不妊の臨床診断及び種々の方法での薬物開発に適用することができる。精巣生検サンプルでの精子形成の測定に適用する場合、ある男性が精子形成阻害又は不全による無精子症であるかどうか決定するために用いることができる。精原細胞分裂速度の増大のための化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物の効果を測定するために用いることもできる。更に、化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物が成熟サイクル及び精巣上体への放出を変化させ、且つ/又は精巣の通過時間に影響を与えるかどうか決定するために用いることができる。
【実施例２３】
【０４８０】
神経炎症のバイオマーカーとしてのマイクログリア増殖：
神経炎症は、多数の神経変性疾患の特徴であり、且つ卒中又は外傷性脳損傷（TBI）によるCNSダメージの構成要素である。マイクログリアは脳の免疫系細胞であり、これらが神経炎症を媒介し、また神経防護及び神経変性の両者において働く。マイクログリアは神経細胞と複雑なシグナル連関を有しており、広範な炎症性因子又は神経栄養因子を分泌することができ、並びに食細胞及び抗原提示細胞として機能する。これらはアルツハイマー病（AD）での神経変性に直接的に関連づけられており、また卒中又はTBI後のダメージ及び回復において働く。マイクログリアはまた、パーキンソン病（PD）及び多発性硬化症（MS）でも軽い役割を有する。
【０４８１】
脳損傷又は疾患のより重症なケースでは、血液脳関門が破れ、血液中の免疫系細胞（MSでのT細胞等）もCNSに侵入し、神経炎症において働く。
【０４８２】
マイクログリアの活性をモジュレートする能力は、神経変性障害若しくはCNS損傷の治療又は管理に対する価値のある手段であろう。循環中の免疫系細胞によるCNSの浸潤を防ぐか又は変化させることは、同様に価値のある手段であろう。
【０４８３】
神経炎症及び神経防護は現在、様々な前臨床モデルを用いて研究されている。これらのモデルとしては、毒物又は炎症性物質の投与、CNSを維持する動脈の慎重な閉鎖、CNSの直接的な外傷性損傷等が挙げられる。モデルの範囲は広いが、それらのほぼ全てが神経炎症応答を評価するための脳組織の徹底的な組織学的スコアリングに頼るものである。免疫組織化学による活性型マイクログリアと反応性アストロサイトの観測及び計数は、神経炎症評価の現行の標準である。
【０４８４】
本発明の方法は、上記のようにDNAのリボース部分への2H2Oからの重水素の取り込みをモニタリングすることにより、細胞の小集団の増殖速度を測定することを更に可能にする。マイクログリア（多くの場合活性化に際して増殖する）を、動物脳組織から単離し、その増殖速度を測定することができる。更に、迅速に増殖する循環中の免疫系細胞は予め標識して、その脳への浸潤を損傷後に測定することができる。
【０４８５】
本発明の方法を用いて、当業者は、考えられる化合物の、マイクログリアの増殖性応答又は血液中の免疫系細胞の侵入を低減する能力を評価することができる。最初のケースでは、マイクログリアの増殖速度を測定し、次のケースではCNSでの強く標識された細胞の出現を測定する。この技術の幅が、慢性的神経変性障害又は急性CNS損傷を治療するために用いることができる化合物の研究を可能にする。
【０４８６】
グリア線維状酸性タンパク質合成及びミトコンドリア増殖速度もまた、神経炎症の2つの別の構成要素であるアストロサイト活性化及び酸化ダメージのバイオマーカーとして用いることができる。
【０４８７】
マウスを適当な時間、2H2Oで標識する。マウスを麻酔し、10mlの氷冷PBSで灌流する（経心臓灌流）。すぐに脳を取り出し、冷却PBS中で氷上に置く。次に脳を細かく刻み、0.05％DNAse、0.25％トリプシン、0.8％グルコース、及び0.16％EDTAを添加した30mlのPBSの入ったバッフル付きフラスコ中で、37℃にて25分間振盪する。続いて、各フラスコを30mlの氷冷培地（10％FBS添加1：1 DMEM：HAM’s F10）で中和し、氷上に置く。全ての組織断片が分散するまで、組織を10mlピペットで繰り返しばらす。得られたものを100マイクロメーターフィルターに通し、培地中で洗浄し、非細胞残渣を取り除くために不連続Percoll勾配に供する。
【０４８８】
得られた細胞をマクロファージ特異的マーカーであるF4/80及びCD11bで染色し、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定し、そしてFACSにより単離する。あるいは、細胞を、FACS若しくはMACSによってマイクログリア又はマイクログリアサブセットをソーティングするのに用いることができる他の細胞表面マーカー又は細胞内マーカーで染色することができる。細胞を4％PFAで固定するのではなく、すぐにソーティングすることもできる。上記の実施例2に記載の通りに、ソーティングした細胞からDNAを抽出し、加水分解し、誘導体化し、そしてGC/MSにより分析する。このデータから、同位体含有率及び細胞増殖若しくは移動速度を決定する。この技術を、循環系から脳に侵入した浸潤白血球を単離するために用いることもできる。図14に示されているように、LPS誘導性神経炎症は、統計学的に有意且つ用量依存的なマイクログリア増殖の増大をもたらした。図15に示されているように、マイクログリア増殖に対するLPS誘導性の効果は、公知の抗炎症剤又は抗マイクログリア薬（デキサメタゾン及びミノサイクリン）により抑制される。
【０４８９】
本発明の方法は、マイクログリア増殖を阻害する能力を評価し、それにより神経炎症のための治療の更なる開発及び評価のために特定するための化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物の投与を可能にする。
【実施例２４】
【０４９０】
乾癬その他の皮膚疾患及び状態のバイオマーカーとしてのケラチンターンオーバー：
ケラチンは、共通の構造を有する50以上の構造タンパク質からなるファミリーである。数種類のケラチンが皮膚で発現し、表皮の主要なタンパク質構成要素を形成する。表皮の基底細胞は娘細胞を生み出し、これが皮膚表面に向かって移動して成熟し、少なくともケラチンK1及びK10並びに脂質を含有するようになる。これらの細胞は、最終的には死滅して、多数が積層した防御性の外皮表面、つまり角質層を形成する。健康なヒト皮膚では、新規なケラチン合成からそれが皮膚表面より剥がれ落ちるまでに、平均で約4週間かかる。
【０４９１】
乾癬は重要な皮膚疾患であり、米国では人口の約3％が罹患し、そのうち約3分の1は中程度から重症であると診断される。遺伝及び環境の両者が、乾癬につながる自己免疫性応答の原因となる。乾癬は、表皮の過剰増殖により特徴付けられる；つまり、表皮ケラチン及びケラチン生成細胞の移行期間は数週間ではなく数日である。
【０４９２】
現在の乾癬に対する臨床的及び検査室的評価には、乾癬領域重傷度指数（PASI）、医師による包括的評価（PGA）及び写真撮影をはじめとする身体的検査指標の組み合わせが含まれる。PASIでは、紅斑、硬化、落屑、及び4ヵ所の解剖学的部位での罹患した身体表面領域の割合についてのスコアを組み合わせる。PGAは医師による乾癬の全体的な評価であり、ベースラインでの評価と比較して、プラークの質及び程度を考慮に入れる。
【０４９３】
ケラチンは、皮膚ターンオーバーについての利用しやすいマーカーである。ケラチンターンオーバーは2種類の方法によりモニタリングすることができる。1つ目では、全表皮を簡単なタンパク質分解処理を用いて皮膚サンプルから単離し；2つ目では、特別に接着性に設計されたテープ状のストリップ（CuDerm, Dallas TX）を皮膚表面に被せ、最も外側の非生存組織を1回に1層回収する。標識ケラチンは重水素水の投与に際して全表皮中にすぐに現れ始めるが、テープ状ストリップによりモニタリングされる正常ヒト皮膚表面に何らかの標識が現れるまでには、約2週間半かかる。正常皮膚で表皮の下層の生存部分に到達するには、少なくとも30本の連続的なテープの適用が必要である。
【０４９４】
ケラチンは非常に不溶性なので、皮膚の他のタンパク質からケラチン画分を単離するのは容易である。同様の手順が全表皮とテープ状ストリップの両方でうまく機能する。皮膚回収用ストリップを用いてサンプルを採取する。まず、ストリップを、界面活性剤であるTriton X-100を含有する高塩バッファー中で洗浄する。これによりケラチン以外の全ての表皮タンパク質が除去される。次にケラチンを、ドデシル硫酸ナトリウムの溶液中でボイルすることにより可溶化する。毛髪もケラチン（多少異なる構造を有する）よりなるが、毛髪のケラチンはこの方法により可溶化されず、サンプルを汚染することはない。この単純な抽出により、ほぼ純粋な皮膚ケラチンが生成される。続いてケラチンターンオーバーを、上記の実施例4に記載のように質量分析を用いて測定する。
【０４９５】
ケラチン生成細胞増殖もまた単独で、又はケラチンターンオーバーと組み合わせて、乾癬及びしわ（紫外線老化）等の他の皮膚状態のためのバイオマーカーとして用いることができる。動物又はヒト被験体に2H2Oを摂取させ（上記の通り）、該動物（皮膚がカサカサの（flaky）マウス等）又はヒトからケラチン生成細胞を単離する。ケラチン生成細胞は、皮膚サンプルから毛髪を除去し、洗浄し、そしてディスパーゼII（表皮（主にケラチン生成細胞）を真皮（より複雑な組織）から分離するタンパク質分解酵素）の溶液中でインキュベートすることにより単離する。続いて、上記の実施例2に記載の方法及び技術を用いて、単離サンプルにおいてDNA合成を測定する。
【０４９６】
正常及びカサカサの皮膚（「fsn」）のマウスでのケラチンターンオーバーを図16に示し、正常及びfsnマウスから、本明細書中に記載の方法を用いて測定したケラチン生成細胞増殖を図17に示してある。これらの結果は、fsn乾癬マウスモデルでのケラチン合成及びケラチン生成細胞増殖の増大を表している。
【０４９７】
本発明の方法は、ケラチン生成細胞増殖若しくはケラチン合成を阻害する能力を評価し、それにより乾癬その他の皮膚疾患及び状態に対する治療の更なる開発並びに評価のために特定するための化合物、又は化合物の組み合わせ、若しくは化合物の混合物の投与を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【０４９８】
【図１】作業を継続するか又は中止するかを決定するための方法としてバイオマーカーに対する効果（すなわち、本発明の方法により収集したデータ）を用いた薬物の創薬、開発及び認可（DDA）を示す模式図である。
【図２】例示的な代謝経路（de novo及びサルベージ（回収）両方のDNA合成）及び種々の構成要素の模式図である。
【図３】DNA中に取り込まれる標識（すなわち、2H2O由来の2H）を示す模式図である。
【図４】標識アミノ酸によるコラーゲンへの標識取り込みを示す模式図である。
【図５】コラーゲンの合成及び分解経路を示す模式図である。
【図６】創薬プロセスでの本発明の使用を例示する模式図である。
【図７】オス129SvEvマウスでの海馬神経前駆細胞増殖に対する長期的イミプラミン処理の効果を示すグラフである。
【図８】オス129SvEvマウスでの海馬神経前駆細胞増殖に対する長期的フルオキセチン処理の効果を示すグラフである。
【図９】Wisterラットでの、50％膵切除術後の島（β細胞）増殖の増大を示すグラフである。
【図１０】SW1753細胞に対する2種類の脱メチル化薬（アザシチジン及びデシタビン）の効果を示すグラフである。
【図１１】精液分析において正常な11人の被験者についての精母細胞標識曲線を示すグラフである。
【図１２】細菌性毒素リポ多糖（LPS）に対する応答での大脳皮質組織のターンオーバーを示すグラフである。
【図１３】四塩化炭素処理の7日間にわたる肝細胞増殖のin vivoでの用量反応を示すグラフである。
【図１４】神経炎症性毒素リポ多糖（LPS）に対するマイクログリア応答を示すグラフである。
【図１５】マイクログリア増殖に対する2種類の抗炎症性化学療法剤（デキサメタゾン及びミノサイクリン）の効果を示すグラフである。
【図１６】正常及びfsnマウスでのケラチン動態を示すグラフである。
【図１７】正常及びfsnマウスでのケラチン生成細胞動態を示すグラフである。
【図１８】抗血管新生薬（アバスチン）又はビヒクル（生理食塩液）を用いて処理したマウスでの異種移植腫瘍由来の内皮細胞の増殖を示すグラフである。
【図１９】四塩化炭素（CCl4）誘導肝線維症に対する治療剤の効果を示す。
【図２０】5日間の化学療法剤処理におけるin vivoでの腫瘍細胞増殖を示すグラフである。
【図２１】マウスにおける脂質分解（a）及び脂肪組織TG合成（b）を示すグラフである。
【図２２】ヒドロキシ尿素（OHU）を用いた処理に対する別個の骨髄細胞亜群の応答を示すグラフである。
【図２３】OHU媒介骨髄抑制後のインターロイキン-1（IL-1）を用いた処理に対する別個の骨髄細胞亜群の応答を示すグラフである。
【図２４】重水素化グルコース投与後の重水素水産生を測定することにより決定した場合の解糖系処理（glycolytic disposal）速度を示すグラフである。
【図２５】健常ボランティア又は骨髄腫患者での血清タンパク質合成速度を示すグラフである。
【図２６】ガラクトセレブロシド（GalCer）への重水素取り込みを測定することにより決定した場合のミエリンの合成割合を示すグラフである。
【図２７】正常及び抗うつ剤（イミプラミン）処理成獣マウスでの成熟神経細胞の増殖を示すグラフである。
【図２８】前糖尿病のラットモデル（Zucker fat）、糖尿病のラットモデル（Zucker-diabetes）及び対照動物（SD-対照）における膵島/β細胞増殖を示す。
【図２９】解糖処理試験により測定した場合の正常ラットに対する高脂肪食の影響を示すグラフである。
【図３０】様々な状態にあるヒト患者における全身解糖処理を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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