(57)【要約】      （修正有）【課題】辺縁系脳炎、ＰＮＳ、脳脊髄炎、白質脳症、網膜炎または視神経萎縮を診断する方法を提供すること。【解決手段】哺乳類２型ボルナウイルス、より好ましくはＶＳＢＶ−１、及び、哺乳類１型ボルナウイルス、より好ましくはＢｏＤＶ−１を含む群からの、試料中のボルナウイルスの検出方法であり、ＢｏＤＶ−１−Ｎ、ＢｏＤＶ−１−Ｐ、ＶＳＢＶ−Ｎ及びＶＳＢＶ−Ｐを含む群から選択される少なくとも１つのポリペプチドに対する抗体を捕捉するための担体、ならびに捕捉した抗体を検出するための手段および試料の存在を検出するための対照を含むキット；ならびに担体またはキットあるいはボルナウイルスの検出に適したプライマーあるいは脳炎を検出するため、移植後合併症を予測するため、脳炎の療法もしくは移植後合併症をモニタリングするため、または自己免疫性脳炎と、感染によって引き起こされる脳炎とを区別するためのプローブの使用に関する。【選択図】図１
2019120689.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
辺縁系脳炎、ＰＮＳ、脳脊髄炎、白質脳症、網膜炎または視神経萎縮を診断する方法であって、試料、好ましくはヒト試料中の、好ましくは哺乳類２型ボルナウイルス、さらにより好ましくはＶＳＢＶ−１、および、哺乳類１型ボルナウイルス、さらにより好ましくはＢｏＤＶ−１を含む群からのボルナウイルスを検出するステップを含む方法。
【請求項２】
神経移植後合併症を予測する、または臓器ドナーもしくはドナー臓器をスクリーニングする方法であって、試料、好ましくはヒト試料中のボルナウイルスを検出するステップを含む方法。
【請求項３】
自己免疫性脳炎と、感染によって引き起こされる脳炎とを区別するための方法であって、試料、好ましくはヒト試料中のボルナウイルスを検出するステップを含む方法。
【請求項４】
前記検出は、好ましくは前記ボルナウイルスのＮ、ＰおよびＸタンパク質を含む群からの、前記試料中のボルナウイルス特異的ポリペプチドに対する抗体を検出することによって達成される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記試料は、ＢｏＤＶ−１−Ｎ、ＢｏＤＶ−１−Ｐ、ＢｏＤＶ−１−Ｘ、ＶＳＢＶ−Ｎ、ＶＳＢＶ−ＰおよびＶＳＢＶ−Ｘを含む群から選択される少なくとも１つのポリペプチドに対する抗体を捕捉するための手段を含む担体と接触される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
捕捉された抗体は、酵素活性、蛍光または化学発光によって検出される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記担体が、膜ベースのイムノブロット、好ましくはウェスタンブロットまたはラインブロット、１つまたは複数のビーズ、免疫蛍光のために配置されたバイオチップ、およびＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを含む群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＢｏＤＶ−１−Ｎ、ＢｏＤＶ−１−Ｐ、ＢｏＤＶ−１−Ｘ、ＶＳＢＶ−Ｎ、ＶＳＢＶ−ＰおよびＶＳＢＶ−Ｘを含む群から選択される少なくとも１つのポリペプチドに対する抗体を捕捉するための手段を含む担体。
【請求項９】
前記担体が、単純ヘルペスＨＳＶ−１、単純ヘルペスＨＳＶ−２、ヒトヘルペスウイルスＨＨＶ−６、ヒトヘルペスウイルスＨＨＶ−７、狂犬病ウイルス、ＬＣＭＶ、西ナイルウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ウスツウイルス、トスカーナウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン−バールウイルス、サイトメガロウイルス、ウマ脳炎ウイルス、チクングンヤウイルス、ラクロスウイルス、リフトバレー熱ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、ヘンドラウイルス、ニパウイルス、エンテロウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、ポワッサンウイルス、マレー渓谷脳炎ウイルスおよび日本脳炎ウイルスを含む群からの少なくとも１つのウイルスに対する抗体を捕捉するための手段をさらに含む、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法または担体。
【請求項１０】
前記担体が、ＮＭＤＡＲ、ＡＭＰＡＲ、ＧＡＤ６５、アンフィファイシン、ＧＡＢＡ（Ａ）、ＧＡＢＡ（Ｂ）、ＤＰＰＸ、ＬｇＩ１、ＣＡＳＰＲ２、ＩＧＬＯＮ５、ＳＮＡＲＥ、ＮＢＣ１、フロチリンおよびＩＴＰＲを含む群からの神経学的抗原に対する、好ましくはＮＭＤＡＲに対する抗体を捕捉するための手段をさらに含む、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法または担体。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか１項に記載の担体、およびさらに、捕捉された抗体を検出するための手段または試料、好ましくは血清またはＣＳＦ試料の存在を検出するための対照を含むキット。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか１項に記載の担体またはキット、あるいはボルナウイルスの検出に適したプライマー、あるいは脳炎、ＰＮＳ、脳脊髄炎、白質脳症、網膜炎もしくは視神経萎縮を診断するため、移植後合併症を予測するため、脳炎もしくは移植後合併症の療法をモニタリングするため、または自己免疫性脳炎と、感染によって引き起こされる脳炎とを区別するためのまさにそのようなプローブの使用。
【請求項１３】
請求項８〜１１のいずれか１項に記載の担体もしくはキット、または自己免疫性脳炎と、感染によって引き起こされる脳炎、好ましくは辺縁系脳炎とを区別するための、ＮＭＤＡＲに対する抗体を捕捉するための手段を含む担体の使用。
【請求項１４】
脳炎の診断、好ましくは辺縁系脳炎の鑑別診断のための診断薬またはキットの調製のための、ＢｏＤＶ−１−Ｎ、ＢｏＤＶ−１−Ｐ、ＶＳＢＶ−Ｎ、ＶＳＢＶ−Ｐ、ＮＭＤＡＲ、ＡＭＰＡＲ、ＧＡＤ６５、アンフィファイシン、ＧＡＢＡ（Ａ）、ＧＡＢＡ（Ｂ）、ＤＰＰＸ、ＬｇＩ１、ＣＡＳＰＲ２、ＩＧＬＯＮ５、ＳＮＡＲＥ、ＮＢＣ１、フロチリンおよびＩＴＰＲまたはそれらのバリアントを含む群からの抗原性ポリペプチドの使用。
【請求項１５】
移植後合併症または脳炎、好ましくは辺縁系脳炎、ＰＮＳ、脳脊髄炎、白質脳症、網膜炎または視神経萎縮の予防または治療のためのボルナウイルスに対して効果的な薬剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、辺縁系脳炎、腫瘍随伴症候群（ＰＮＳ）、脳脊髄炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｙｍｙｅｌｉｔｉｓ）、白質脳症、網膜炎または視神経萎縮を診断する方法であって、好ましくは哺乳類２型ボルナウイルス、さらにより好ましくはＶＳＢＶ−１、および哺乳類１型ボルナウイルス、さらにより好ましくはＢｏＤＶ−１を含む群からの、試料中のボルナウイルスを検出するステップを含む方法；ＢｏＤＶ−１−Ｎ、ＢｏＤＶ−１−Ｐ、ＶＳＢＶ−ＮおよびＶＳＢＶ−Ｐを含む群から選択される少なくとも１つのポリペプチドに対する抗体を捕捉するための手段を含む担体；本発明による担体、ならびにさらに、捕捉した抗体を検出するための手段および試料の存在を検出するための対照を含むキット；ならびに担体またはキットあるいはボルナウイルスの検出に適したプライマーあるいは脳炎を検出するため、移植後合併症を予測するため、脳炎の療法もしくは移植後合併症をモニタリングするため、または自己免疫性脳炎と、感染によって引き起こされる脳炎とを区別するためのまさにそのようなプローブの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳炎は、感染、腫瘍随伴疾患または自己免疫疾患によって引き起こされる脳の炎症である。患者は、発熱、頭痛、麻痺、視覚障害、痙攣、意識消失、ならびに知覚および見当識障害などの多数の非特異的症状に悩まされる。
【０００３】
時宜にかなった同定により、多くの脳炎に効果的であるが、疾患の原因に依存してかなり異なる治療アプローチが存在する。細菌によって引き起こされる脳炎は抗生物質により治療でき、ウイルス性脳炎は、アシクロビルなどの抗ウイルス剤の静脈内投与により治療できるが、自己免疫によって引き起こされる脳炎の場合に示されているものは免疫抑制剤の投与である。
【０００４】
多くの場合、脳炎は軽度の兆候の場合では全く気付かれない。疾患の治療は早いほどよく、したがって、症状が非特異的で場合によっては軽度であったとしても、早期に確実な方法で診断を行うことができることは特に重要である。不正確に治療されるか、または治療されないと、麻痺、発話障害および精神障害などの永続的な損傷を伴う重篤な疾患を引き起こす可能性がある。細菌性脳炎の場合、死亡率は最大で５０％であり、単純ヘルペスによって引き起こされる脳炎の場合、実に７０％である。
【０００５】
近年、ウイルスまたは自己免疫によって引き起こされる脳炎、例えば、ＮＭＤＡＲ（欧州特許第２０５７４６６Ｂ１）、ＧＡＢＡ（Ａ）（欧州特許第２８６３２３１Ａ１）、ＧＡＢＡ（Ｂ）（欧州特許第２４８３４１７Ｂ１）、ＤＰＰＸ（米国特許第９７１９９９３ＢＢ）、ＬｇＩ１（米国特許第９２５０２５０ＢＢ）、ＩＧＬＯＮ５（欧州特許第２９０５６２２Ａ１）、ＳＮＡＲＥ（欧州特許第１７００１２０５）、ＮＢＣ１（欧州特許第３０２６４３４Ａ１）、フロチリン（欧州特許第３１０１４２４Ａ１）およびＩＴＰＲ（欧州特許第３０１８４７８Ａ１）に対する自己抗体によって引き起こされる脳炎の多様な兆候が発見されている。
【０００６】
それにもかかわらず、脳炎に特有な症状を有する疾患に罹患しているが、正確に診断され得ない多数の患者が依然として存在している（Ｂｌｏｃｈ  ａｎｄ  Ｇｌａｓｅｒ  （２００７）  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  （４）：３１５−２２）。これは特に辺縁系脳炎を有する患者の群に関係しており、例外なく自己免疫によって引き起こされると文献に記載されている（Ｍｅｌｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｌｉｍｂｉｃ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｃｉｒｃｕｉｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｙｇｄａｌａ．Ｆｒｏｎｔ．Ｎｅｕｒｏｌ．３；６：１７１）。
【０００７】
特に脆弱な群は臓器移植を受ける患者である。いずれにせよ前記患者の弱体化した状態とは別に、長年にわたる薬剤、移植後の高用量の免疫抑制剤の投与は、日和見感染症などの非常に多様な疾患の突然発生を促進する。固形臓器を移植するときの特に重大な問題は神経学的合併症であり、いずれにしても受容者の１０％〜５９％に影響を及ぼす（Ｓｅｎｚｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｆｔｅｒ  ｓｏｌｉｄ  ｏｒｇａｎ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｔｒａｎｓｐｌ．Ｉｎｔ．（３）：２６９−７８，１０−５９％）。
【０００８】
多くの場合、これらの神経学的合併症が何によって引き起こされるのかは不明である。可能性としては、神経学的感染症の症状だけでなく、投与された免疫抑制剤の神経毒性も含まれる。例えば、コルチコステロイドの投与はミオパチーのリスクの増加をもたらす。肝不全もまた、神経学的症状の形態で現れ得る（Ｓｈａｌｉｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ａｃｕｔｅ  Ｌｉｖｅｒ  Ｆａｉｌｕｒｅ．  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（５）：Ｓ１０４−Ｓ１１５）。
【０００９】
哺乳動物におけるボルナウイルス感染は１００年以上前に既に記載されていた。ウマの場合、哺乳動物ボルナウイルスＢｏＤＶ−１は脳炎を引き起こすことが知られている。この症例において発症するものは中枢神経系の持続性疾患であり、その結果として、非化膿性髄膜脳炎（脳および脳膜の炎症）が発症する。病気の動物は、行動上の問題によって識別される運動障害を発症し、多くの場合、感染の結果として死亡する。
【００１０】
Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ａ  ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ  ｓｑｕｉｒｒｅｌ  ｂｏｒｎａｖｉｒｕｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｆａｔａｌ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１５；３７３，ｐａｇｅｓ  １５４−１６２は、カワリリス（ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ  ｓｑｕｉｒｒｅｌ）に影響を及ぼすボルナウイルス（「ＶＳＢＶ−１」、すなわち、カワリリスボルナウイルス−１）による、既存の状態（高血圧、糖尿病および／または肥満）を有する複数の高齢の男性患者の末期ウイルス感染を記載している。全ての患者は血栓症に罹患し、肺塞栓症を引き起こした。患者は脳炎に罹患したが、その脳炎は辺縁系脳炎ではなく、辺縁系が分布していない大脳皮質領域において浮腫病変を伴う症候群であった。完全ＢｏＤＶ−１ウイルスに感染したネコ細胞株に基づく間接蛍光抗体試験（ＩＩＦＴ）が、ボルナウイルスに対する抗体を検出するために使用された。
【００１１】
２０００年代初頭、ある研究グループが、精神障害と、ウマに影響を及ぼす種のボルナウイルスによる感染との間の推定される関連性について報告した。これらの結果は、独立した専門家によって再現され得ず、したがって専門分野においては認められていない。それどころか、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｋｏｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅは、「現在の見解によれば、Ｂｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）に記載されている試験は、意味のある診断には不適切であると見なさなければならない。」という結論に達している（２０１７年１２月１４日に検索した、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｋｉ．ｄｅ／ＤＥ／Ｃｏｎｔｅｎｔ／Ｆｏｒｓｃｈ／Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｓｃｈｗｅｒｐｕｎｋｔｅ／ＮｅｕｅＲｉｓｉｋｅｎ／ＮｅｕａｒｔｉｇｅＥｒｒｅｇｅｒ／Ｅｉｎｓｔｅｌｌｕｎｇ＿Ｐｒｏｊｅｋｔ＿Ｂｏｒｎａｖｉｒｕｓ．ｈｔｍｌ）。ヒトにおけるＢｏＤＶ−１によって引き起こされる脳炎は、これまで、先行技術には記載されていない。
【００１２】
プレス声明において、Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ  Ｌｏｆｆｌｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅは、ＶＳＢＶ−１を検出するための試験の開発について報告している（２０１７年１２月１４日に検索した、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｉｒ−ｓｉｎｄ−ｔｉｅｒａｒｚｔ．ｄｅ／２０１５／０７／ｂｅｓｔａｅｔｉｇｔ−ｂｕｎｔｈｏｅｒｎｃｈｅｎ−ｕｅｂｅｒｔｒａｇｅｎ−ｂｏｒｎａｖｉｒｅｎ／）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】欧州特許第２０５７４６６Ｂ１
【特許文献２】欧州特許第２８６３２３１Ａ１
【特許文献３】欧州特許第２４８３４１７Ｂ１
【特許文献４】米国特許第９７１９９９３ＢＢ
【特許文献５】米国特許第９２５０２５０ＢＢ
【特許文献６】欧州特許第２９０５６２２Ａ１
【特許文献７】欧州特許第１７００１２０５
【特許文献８】欧州特許第３０２６４３４Ａ１
【特許文献９】欧州特許第３１０１４２４Ａ１
【特許文献１０】欧州特許第３０１８４７８Ａ１
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｂｌｏｃｈ  ａｎｄ  Ｇｌａｓｅｒ  （２００７）  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  （４）：３１５−２２
【非特許文献２】Ｍｅｌｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｌｉｍｂｉｃ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｃｉｒｃｕｉｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｙｇｄａｌａ．Ｆｒｏｎｔ．Ｎｅｕｒｏｌ．３；６：１７１
【非特許文献３】Ｓｅｎｚｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｆｔｅｒ  ｓｏｌｉｄ  ｏｒｇａｎ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｔｒａｎｓｐｌ．Ｉｎｔ．（３）：２６９−７８，１０−５９％
【非特許文献４】Ｓｈａｌｉｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ａｃｕｔｅ  Ｌｉｖｅｒ  Ｆａｉｌｕｒｅ．  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（５）：Ｓ１０４−Ｓ１１５
【非特許文献５】Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ａ  ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ  ｓｑｕｉｒｒｅｌ  ｂｏｒｎａｖｉｒｕｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｆａｔａｌ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１５；３７３，ｐａｇｅｓ  １５４−１６２
【非特許文献６】ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｋｉ．ｄｅ／ＤＥ／Ｃｏｎｔｅｎｔ／Ｆｏｒｓｃｈ／Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｓｃｈｗｅｒｐｕｎｋｔｅ／ＮｅｕｅＲｉｓｉｋｅｎ／ＮｅｕａｒｔｉｇｅＥｒｒｅｇｅｒ／Ｅｉｎｓｔｅｌｌｕｎｇ＿Ｐｒｏｊｅｋｔ＿Ｂｏｒｎａｖｉｒｕｓ．ｈｔｍｌ
【非特許文献７】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｉｒ−ｓｉｎｄ−ｔｉｅｒａｒｚｔ．ｄｅ／２０１５／０７／ｂｅｓｔａｅｔｉｇｔ−ｂｕｎｔｈｏｅｒｎｃｈｅｎ−ｕｅｂｅｒｔｒａｇｅｎ−ｂｏｒｎａｖｉｒｅｎ／
【発明の概要】
【００１５】
これを背景として、本発明の目的は、好ましくは、先行技術に記載されているシステムと比較して、特に、特異性および／または感受性に関して改善された診断確実性により、ウイルス感染、より特にはボルナウイルス感染を診断するための改善された検出システムを提供することである。
【００１６】
さらに、本発明の目的は、特に、自己免疫性脳炎と、感染によって引き起こされる脳炎、特にウイルス感染によって引き起こされる脳炎、さらにより好ましくは辺縁系脳炎とを区別することを可能にする、辺縁系脳炎に焦点を当てた、脳炎の診断、より特には鑑別診断のための検出システムを提供することである。
【００１７】
さらに、本発明の目的は、移植後合併症、特に神経症状を伴う合併症を診断、治療および予防することを可能にする検出システムを提供することである。
【００１８】
本発明の目的は、添付の独立請求項および従属請求項の主題によって達成される。
【００１９】
第１の態様では、本発明の目的は、辺縁系脳炎、ＰＮＳ、脳脊髄炎、白質脳症、網膜炎または視神経萎縮を診断する方法であって、試料、好ましくはヒト試料中の、好ましくは哺乳類２型ボルナウイルス、さらにより好ましくはＶＳＢＶ−１、および哺乳類１型ボルナウイルス、さらにより好ましくはＢｏＤＶ−１を含む群からのボルナウイルスを検出するステップを含む方法によって達成される。
【００２０】
第２の態様では、本発明の目的は、神経移植後合併症を予測する方法または臓器ドナーもしくはドナー臓器をスクリーニングする方法であって、試料、好ましくはヒト試料中のボルナウイルスを検出するステップを含む方法によって達成される。
【００２１】
第３の態様では、本発明の目的は、自己免疫性脳炎と、感染によって引き起こされる脳炎とを区別するための方法であって、試料、好ましくはヒト試料中のボルナウイルスを検出するステップを含む方法によって達成される。
【００２２】
好ましい実施形態では、検出は、好ましくはボルナウイルスのＮ、ＰおよびＸタンパク質を含む群からの、試料中のボルナウイルス特異的ポリペプチドに対する抗体を検出することによって達成される。
【００２３】
さらなる好ましい実施形態では、試料は、ＢｏＤＶ−１−Ｎ、ＢｏＤＶ−１−Ｐ、ＢｏＤＶ−１−Ｘ、ＶＳＢＶ−Ｎ、ＶＳＢＶ−ＰおよびＶＳＢＶ−Ｘを含む群から選択される少なくとも１つのポリペプチドに対する抗体を捕捉するための手段を含む担体と接触される。
【００２４】
さらに好ましい実施形態では、捕捉された抗体は、酵素活性、蛍光または化学発光によって検出される。
【００２５】
さらなる好ましい実施形態では、担体は、膜ベースのイムノブロット、好ましくはウェスタンブロットまたはラインブロット、１つまたは複数のビーズ、免疫蛍光のために配置されたバイオチップ、およびＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを含む群から選択される。
【００２６】
第４の態様では、本発明の目的は、ＢｏＤＶ−１−Ｎ、ＢｏＤＶ−１−Ｐ、ＢｏＤＶ−１−Ｘ、ＶＳＢＶ−Ｎ、ＶＳＢＶ−ＰおよびＶＳＢＶ−Ｘを含む群から選択される少なくとも１つのポリペプチドに対する抗体を捕捉するための手段を含む担体によって達成される。
【００２７】
好ましい実施形態では、担体は、単純ヘルペスＨＳＶ−１、単純ヘルペスＨＳＶ−２、ヒトヘルペスウイルスＨＨＶ−６、ヒトヘルペスウイルスＨＨＶ−７、狂犬病ウイルス、ＬＣＭＶ、西ナイルウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ウスツウイルス、トスカーナウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン−バールウイルス、サイトメガロウイルス、ウマ脳炎ウイルス、チクングンヤウイルス、ラクロスウイルス、リフトバレー熱ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、ヘンドラウイルス、ニパウイルス、エンテロウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、ポワッサンウイルス、マレー渓谷脳炎ウイルスおよび日本脳炎ウイルスを含む群からの少なくとも１つのウイルスに対する抗体を捕捉するための手段をさらに含む。
【００２８】
好ましい実施形態では、担体は、ＮＭＤＡＲ、ＡＭＰＡＲ、ＧＡＤ６５、アンフィファイシン、ＧＡＢＡ（Ａ）、ＧＡＢＡ（Ｂ）、ＤＰＰＸ、ＬｇＩ１、ＣＡＳＰＲ２、ＩＧＬＯＮ５、ＳＮＡＲＥ、ＮＢＣ１、フロチリンおよびＩＴＰＲを含む群からの神経学的抗原に対する抗体を捕捉するための手段をさらに含む。
【００２９】
第５の態様では、本発明の目的は、本発明による担体、およびさらに、捕捉された抗体を検出するための手段または試料の存在を検出するための対照を含むキットによって達成される。
【００３０】
第６の態様では、本発明の目的は、本発明による担体またはキット、あるいはボルナウイルスの検出に適したプライマー、あるいは脳炎、ＰＮＳ、脳脊髄炎、白質脳症、網膜炎もしくは視神経萎縮を診断するため、移植後合併症を予測するため、脳炎もしくは移植後合併症の療法をモニタリングするため、または自己免疫性脳炎と、感染によって引き起こされる脳炎とを区別するためのボルナウイルスに対する抗体を検出するためのまさにそのようなプローブまたは手段の使用によって達成される。
【００３１】
第７の態様では、本発明の目的は、本発明による担体もしくはキットまたは自己免疫性脳炎と、感染によって引き起こされる脳炎、好ましくは辺縁系脳炎とを区別するための、ＮＭＤＡＲに対する抗体を捕捉するための手段を含む担体の使用によって達成される。
【００３２】
第８の態様では、本発明の目的は、脳炎の診断、好ましくは辺縁系脳炎の鑑別診断のための診断薬またはキットの調製のための、ＢｏＤＶ−１−Ｎ、ＢｏＤＶ−１−Ｐ、ＶＳＢＶ−Ｎ、ＶＳＢＶ−Ｐ、ＮＭＤＡＲ、ＡＭＰＡＲ、ＧＡＤ６５、アンフィファイシン、ＧＡＢＡ（Ａ）、ＧＡＢＡ（Ｂ）、ＤＰＰＸ、ＬｇＩ１、ＣＡＳＰＲ２、ＩＧＬＯＮ５、ＳＮＡＲＥ、ＮＢＣ１、フロチリンおよびＩＴＰＲまたはそれらのバリアントを含む群からの抗原性ポリペプチドの使用によって達成される。
【００３３】
第９の態様では、本発明の目的は、移植後合併症または脳炎、好ましくは辺縁系脳炎の予防または治療のためのボルナウイルスに対して効果的な薬剤の使用によって達成される。
【００３４】
本発明は、患者、特にヒト患者におけるボルナウイルスによる感染が、関連試料がボルナウイルスの種に対する抗体だけでなく、ＢｏＤＶ−１およびＶＳＢＶに対する抗体についても試験される場合、特に確実に診断され得るという本発明者らの驚くべき発見に基づく。
【００３５】
さらに、本発明は、辺縁系脳炎が自己免疫疾患の形態で発症するだけでなく、ウイルス感染、特にボルナウイルスによる感染の結果として発症する可能性があり、それがボルナウイルスに対する抗体の検出によって診断され得るという本発明者らの驚くべき発見に基づく。
【００３６】
さらに、本発明は、神経学的症状および疾患、それぞれ脳脊髄炎、白質脳症、網膜炎または視神経萎縮を含む移植後合併症が、ボルナウイルス、特にＢｏＤＶ−１の伝染によって引き起こされる可能性があり、ボルナウイルスに対する抗体の検出を介して診断および適切に治療され得るという本発明者らの驚くべき発見に基づく。さらに、ボルナウイルスに対する抗体をその試料中で検出することによって、臓器ドナーおよびドナー臓器の品質を検査することが可能である。同様に、臓器受容者の予防的抗ウイルス治療または免疫化が適応されるかどうかを明らかにすることが可能である。
【００３７】
好ましい実施形態では、本明細書に使用される場合、「辺縁系脳炎」という用語は、ＭＲＩ検査が、辺縁系に属する脳領域における異常なシグナル強度、特に内側側頭（ｔｅｍｐｏｒｏ−ｍｅｄｉａｌ）シグナルの上昇であって、より特には数日以内に正常化しないものを示す、中枢神経系の神経疾患を意味すると理解される。さらにより好ましくは、短期記憶障害、側頭葉発作および情動障害からなる群からの３つの症状のうちの少なくとも１つが発症する。特徴的なＭＲＩ記録は、文献、例えば、Ｓｉｍｏｎ／Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ／Ａｍｉｎｏｆｆ，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００９，ｐａｇｅ  ６６（図１〜２３）に開示されている。
【００３８】
好ましい実施形態では、本明細書に使用される場合、「診断する」という用語は、対象が疾患に罹患しているか、または一般の人よりも高い確率で疾患に罹患しているか、または過去に罹患していたか、または将来罹患するかどうかについて、およびさらに疾患が進行中であるかどうか、もしくは疾患が将来どのように発症するかについて、またはある特定の治療が有効であるかどうかを評価するために、評価を支援するか、または最初に評価を可能にする情報が得られている処置を意味すると理解される。例えば、ドナーまたはドナー臓器からの試料中のボルナウイルスの検出は、ボルナウイルスによって引き起こされる移植後合併症の確率が増加することを示す。さらに、このような検出は、患者が、例えばリバビリンによる抗ウイルス治療から利益を受けることができるが、自己抗体の形成を阻止または低減させることを目的とする、免疫抑制処置から利益を受けることができないことを示す。言い換えれば、「診断する」という用語は、診断を行うことだけでなく、疾患の進行または疾患の場合の療法の成功の予測およびモニタリングも包含する。
【００３９】
好ましくは、診断は、抗体が存在するかどうかを単に検出し、抗体の検出可能な濃度が試料中に存在するかどうかを決定できれば十分である。好ましい実施形態では、診断される患者における抗体の相対濃度が平均的な健康なヒトよりも高いかどうかが決定される。濃度が平均的な健康なヒト由来の試料におけるよりも１．１倍、より好ましくは１．２倍、１．５倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、１００００倍または１０００００倍高いかどうかが決定され得る。
【００４０】
ボルナウイルス、好ましくはＶＳＢＶ−１またはＢｏＤＶ−１を含む群からのボルナウイルスに対する抗体が検出され得る場合、このことは、患者がボルナウイルスに感染している可能性が高いことを示すか、または、脳炎、好ましくは辺縁系脳炎が、自己免疫疾患によってではなく、ウイルス感染によって引き起こされることを示す。さらに、脳炎に罹患している患者におけるこのような抗体の検出は、前記患者がＰＮＳ、したがってＰＮＳ関連がん、例えば小細胞肺がんに罹患していないことを示す。
【００４１】
ボルナウイルスに対する抗体の検出、およびそれから推測されるボルナウイルスによる感染は、抗ウイルス薬またはそれぞれの治療作用による治療的または予防的処置の根拠となる。例えば、リバビリンがボルナウイルスに対して有効であることを示すことが可能である。他方で、免疫抑制剤の投与は、重大な副作用と関連するだけでなく、ウイルスおよび日和見感染に対する患者の免疫系を弱めるので、完全に失敗するであろう。ボルナウイルスに対する抗体の不在および／または好ましくはＮＭＤＡＲに対する自己抗体の存在は、例えば、リツキシマブ、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、シクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル、静注用免疫グロブリン、タクロリムス、シクロスポリン、メトトレキサートおよびアザチオプリンを含む群からの免疫抑制剤による治療的または予防的処置の根拠となる。
【００４２】
好ましい実施形態では、診断される患者が、ボルナウイルスに対する、１つまたは複数の、好ましくは２つ以上または３つ以上の異なる抗体を有するかどうかが識別され、抗体は、任意選択で、ＢｏＤＶ−１−Ｎ、ＢｏＤＶ−１−Ｐ、ＢｏＤＶ−１−Ｘ、ＶＳＢＶ−Ｎ、ＶＳＢＶ−ＰおよびＶＳＢＶ−Ｘ、より好ましくはＢｏＤＶ−１−Ｎ、ＢｏＤＶ−１−Ｐ、ＶＳＢＶ−ＮおよびＶＳＢＶ−Ｐに対する抗体の群から選択される。より特には、前記群からの抗原に対する抗体の検出は、患者が初期または潜伏感染に罹患していることを示し得、一方、前記群からの１つより多い抗原、好ましくは２つ、３つまたは４つの抗原に対する抗体の検出は臨床的に明らかな感染を示す。
【００４３】
当業者は、このような検出が一般にそれ自体では総合診断を可能にせず、さらなる態様、例えば、試料、病歴、臨床症状、既往歴またはイメージング法、例えばＭＲＩからの結果において決定されるさらなるパラメータを考慮しなければならないことを理解する。当業者は、本発明による方法の価値は間接診断または鑑別診断を実施することが可能であることであり得、ここで、ある疾患を除外することは、患者が同様の症状を有する別の疾患に罹患していることを示すことをさらに理解する。好ましい実施形態では、ボルナウイルスに対する抗体の検出は、患者が自己免疫疾患ではない辺縁系脳炎に罹患していることを示し得る。さらに、そのような検出は、患者が腫瘍随伴症候群および／またはがん、好ましくは小細胞肺がんに罹患していないことを示し得る。反対に、ＮＭＤＡ受容体に対する自己抗体の検出は、患者がウイルスによって引き起こされる脳炎、特に辺縁系脳炎に罹患していないことを示し得る。
【００４４】
好ましい実施形態では、当業者は、優先日における関連する教科書、例えば、Ｓｉｍｏｎ／Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ／Ａｍｉｎｏｆｆ，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００９から明らかなように、本明細書に言及されている臨床症状を重視する。
【００４５】
ボルナウイルスは、好ましくは哺乳動物に影響を及ぼすボルナウイルスである。さらにより好ましくは、ボルナウイルスはヒトに影響を及ぼすボルナウイルスである。特に好ましい実施形態では、ボルナウイルスは、哺乳類２型ボルナウイルス、さらにより好ましくはＶＳＢＶ−１、および哺乳類１型ボルナウイルス、さらにより好ましくはＢｏＤＶ−１を含む群から選択される。
【００４６】
好ましい実施形態では、本明細書に使用される場合、「哺乳類１型ボルナウイルス」は、ＡＪ３１１５２４＿ＢｏＤＶ−２＿１９９８、ＡＪ３１１５２２＿ＢｏＤＶ−１＿１９８０、ＢＤＵ０４６０８＿ＢｏＤＶ−１＿１９２９、ＡＪ３１１５２３＿ＢｏＤＶ−１＿１９９４、ＡＢ２４６６７０＿ＢｏＤＶ−１＿２００４、およびＡＢ２５８３８９＿ＢｏＤＶ−１＿１９９７を包含する。原稿が提出された、Ｔａｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１８）Ｆａｔａｌ  ｌｉｍｂｉｃ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｉｎ  ａ  ｚｏｏ  ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅｔａｋｅｒ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ  ｓｑｕｉｒｒｅｌ  ｂｏｒｎａｖｉｒｕｓ：  Ｚｏｏｎｏｔｉｃ  ｂｏｒｎａｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ  ｒｉｓｋを参照のこと。
【００４７】
好ましい実施形態では、本明細書に使用される場合、「哺乳類２型ボルナウイルス」は、ＬＴ５９４３８７＿ＢＨ１２２／１５−２＿Ｃ．ｐｒｅｖｏｓｔｉｉ＿２０１５、ＫＹ４８８７２４＿ＢＨ２２／１６−３６＿Ｃ．ｐｒｅｖｏｓｔｉｉ＿２０１６、ＫＹ４８８７２３＿ＢＨ２２／１６−３７＿Ｃ．ｐｒｅｖｏｓｔｉｉ＿２０１６、ＫＹ４８８７２７＿ＢＨ２２／１６−１６＿Ｔ．ｓｗｉｎｈｏｅｉ＿２０１６、ＬＴ５９４３８９＿ＢＨ４９／１５−１＿Ｃ．ｐｒｅｖｏｓｔｉｉ＿２０１５、ＫＹ４８８７２６＿ＢＨ２２／１６−３４＿Ｃ．ｐｒｅｖｏｓｔｉｉ＿２０１６、ＬＴ５９４３８８＿ＢＨ１３３／１５＿Ｃ．ｐｒｅｖｏｓｔｉｉ＿２０１５、ＫＹ４８８７２２＿ＢＨ２２／１６−３８＿Ｃ．ｐｒｅｖｏｓｔｉｉ＿２０１６、ＫＹ４８８７２５＿ＢＨ２２／１６−３５＿Ｃ．ｆｉｎｌａｙｓｏｎｉｉ＿２０１６、ＬＴ５９４３８３＿ＢＨ３／１６−２＿Ｃ．ｐｒｅｖｏｓｔｉｉ＿２０１６、ＬＴ５９４３８１＿ＢＨ１２２／１５−１＿Ｃ．ｐｒｅｖｏｓｔｉｉ＿２０１５、ＬＴ５９４３８２＿ＢＨ４８／１５−１＿Ｓ．ｖａｒｉｅｇａｔｏｉｄｅｓ＿２０１５、ＬＮ７１３６８１＿Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ＿２０１５、ＬＮ７１３６８０＿Ｓ．ｖａｒｉｅｇａｔｏｉｄｅｓ＿２０１５、ＬＴ５９４３８６＿ＢＨ３／１６−１＿Ｃ．ｐｒｅｖｏｓｔｉｉ＿２０１６、ＬＴ５９４３８４＿ＢＨ４９／１５−６＿Ｓ．ｖａｒｉｅｇａｔｏｉｄｅｓ＿２０１５、ＬＴ５９４３８５＿ＢＨ４９／１５−１１＿Ｓ．ｖａｒｉｅｇａｔｏｉｄｅｓ＿２０１５、ＬＴ５９４３９１＿ＢＨ４８／１５−２＿Ｓ．ｖａｒｉｅｇａｔｏｉｄｅｓ＿２０１５、ＬＴ５９４３９０＿ＢＨ７５／１５＿Ｓ．ｖａｒｉｅｇａｔｏｉｄｅｓ＿２０１５、ＫＹ４８８７２８＿ＢＨ２１／１６＿Ｃ．ｐｒｅｖｏｓｔｉｉ＿２０１６、ＭＦ５９７７６２＿ＢＨ５５／１６＿Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ＿２０１６およびＫＹ４８８７２９＿ＢＨ１２／１６＿Ｃ．ｐｒｅｖｏｓｔｉｉ＿２０１６を包含する。原稿が提出された、Ｔａｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１８）Ｆａｔａｌ  ｌｉｍｂｉｃ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｉｎ  ａ  ｚｏｏ  ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅｔａｋｅｒ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ  ｓｑｕｉｒｒｅｌ  ｂｏｒｎａｖｉｒｕｓ：  Ｚｏｏｎｏｔｉｃ  ｂｏｒｎａｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ  ｒｉｓｋを参照のこと。
【００４８】
全てのボルナウイルスは、原稿が提出された、Ｔａｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１８）Ｆａｔａｌ  ｌｉｍｂｉｃ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｉｎ  ａ  ｚｏｏ  ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅｔａｋｅｒ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ  ｓｑｕｉｒｒｅｌ  ｂｏｒｎａｖｉｒｕｓ：  Ｚｏｏｎｏｔｉｃ  ｂｏｒｎａｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ  ｒｉｓｋによって公開されているデータと組み合わせて、Ｓｈａｈｈｏｓｓｅｉｎｉ  Ｎ，  Ｌｕｈｋｅｎ  Ｒ，  Ｊｏｓｔ  Ｈ，  Ｊａｎｓｅｎ  Ｓ，  Ｂｏｒｓｔｌｅｒ  Ｊ，  Ｒｉｅｇｅｒ  Ｔ，  Ｋｒｕｇｅｒ  Ａ，  Ｙａｄｏｕｌｅｔｏｎ  Ａ，  ｄｅ  Ｍｅｎｄｏｎｃａ  Ｃａｍｐｏｓ  Ｒ，  Ｃｉｒｎｅ−Ｓａｎｔｏｓ  ＣＣ，  Ｆｅｒｒｅｉｒａ  ＤＦ，  Ｇａｒｍｓ  Ｒ，  Ｂｅｃｋｅｒ  Ｎ，  Ｔａｎｎｉｃｈ  Ｅ，  Ｃａｄａｒ  Ｄ，  Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｃｈａｎａｓｉｔ  Ｊ．（２０１７）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｇｅｎｅｔ  Ｅｖｏｌ．；５５：２６０−２６８に記載されている方法論を使用して全ゲノムシークエンシングによって同定された。
【００４９】
試験される試料は、抗体が検出される場合、患者由来の抗体の代表的なセットを含有する試料である。好ましくは、それは、血清、血漿、唾液およびＣＳＦを含む群から選択される。
【００５０】
特に好ましい実施形態では、ウイルスはまた、ボルナウイルス特異的プライマーおよびプローブを使用する分子遺伝学的手段、好ましくはＰＣＲにより、さらにより好ましくは逆転写ＰＣＲによって同定され、検出される。プライマーおよび／またはプローブはＢｏＤＶ−１および／またはＶＳＢＶ−１に特異的であり得る。ＶＳＢＶ−１を検出するための例示的なプライマー、プローブおよび対応するプロトコールは、Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ａ  ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ  ｓｑｕｉｒｒｅｌ  ｂｏｒｎａｖｉｒｕｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｆａｔａｌ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１５；３７３，ｐａｇｅｓ  １５４−１６２に記載されている。全ての既知の哺乳動物ボルナウイルスおよび鳥類に影響を及ぼすボルナウイルスの大部分を検出するための広範囲の試験のための適切な試薬および方法、ならびにＢｏＤＶ−１を検出するための試薬および方法は、Ｂｏｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ；１３：１５１に記載されている。
【００５１】
要するに、ボルナウイルスは、市販のキット［ＭａｇＭＡＸ（商標）  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  ＵＳＡ）］を使用して試料からウイルス核酸を最初に抽出することによって、分子遺伝学的手段によりヒト試料中で検出され得る。その後、ウイルスゲノムは、シークエンシング［Ｓｃｈｌｏｔｔａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８］、および得られた配列と文献からの既知の配列、例えば［Ｓｃｈｌｏｔｔａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８；ＧｅｎＢａｎｋ：ＶＳＢＶ−１についてＬＮ７１３６８１；ＢｏＤＶ−１についてＫＵ７４８７８７、ＡＪ３１１５２１、ＡＹ３７４５２１、ＡＹ３７４５１９；ＢｏＤＶ−２についてＡＪ３１１５２４］との比較によって、決定され得る。
【００５２】
あるいは、ボルナウイルスはＲＴ−ＰＣＲによって検出され得る。この目的のために、ウイルスＲＮＡは、Ｖｉｒａｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）などの適切なキットを使用して抽出され得る。ボルナウイルスの検出は、Ｂｏｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）に記載されている、プライマー：「フォワードプライマーＢｏｒｎａ−２０４８−Ｆ」：５’−ＣＧＣ  ＧＡＣ  ＣＭＴ  ＣＧＡ  ＧＹＣ  ＴＲＧ  Ｔ−３’および「リバースプライマーＢｏｒｎａ−２１１８−Ｒ」：５’−ＧＡＣ  ＡＲＣ  ＴＧＹ  ＴＣＣ  ＣＴＴ  ＣＣＫ  ＧＴ−３’を使用した、Ｐ遺伝子の６１ｂｐ断片およびＸ遺伝子の末端の増幅によって達成され得る。検出はアガロースゲル電気泳動によって達成される。ＢＯＤＶ−１の定量的検出は、以下のプライマーおよびプローブ：ＢｏＤＶ１−１２８８−Ｆ  ＴＡＧＴＹＡＧＧＡＧＧＣＴＣＡＡＴＧＧＣＡ、ＢｏＤＶ−１４４９−Ｒ  ＧＴＣＣＹＴＣＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＣ、ＢｏＤＶ１−１３４６−プローブ  ＦＡＭ−ＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＣＣＡＧＡＣＡＣＴＡＣＧＡＣＧ−ＢＨＱ１（Ｓｃｈｌｏｔｔａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）を使用した、ＸおよびＰ遺伝子の１６１ｂｐ断片の増幅によって達成され得る。ＢＯＤＶ−１の定量的検出は、以下のプライマーおよびプローブ：ＢｏＤＶ１−２２６２−Ｆ  ＣＡＡＴＹＡＡＴＧＣＡＧＣＹＴＴＣＡＡＴＧＴＣＴＴ、ＢｏＤＶ１−２３３６−Ｒ  ＧＡＡＴＧＴＣＹＧＧＧＣＣＧＡＧＡＧ、ＢｏＤＶ−２３１６−プローブ  ＦＡＭ−ＣＣＡＲＣＡＣＣＡＡＴＧＴＴＣＣＧＡＡＧＣＣＧ−ＢＨＱ１（Ｓｃｈｌｏｔｔａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）を使用した、ＭおよびＧ遺伝子の７４ｂｐ断片の増幅によって達成され得る。
【００５３】
ウイルスはまた、組織切片の検査による免疫組織化学的手段によって検出され得る。これは、血液試料がないときにドナー臓器を検査する場合の選択肢である。
【００５４】
好ましい実施形態では、本明細書に使用される場合、「移植後合併症」という用語は、身体部分、好ましくは組織または固形臓器、さらにより好ましくは、肝臓、腎臓、肺、腸、膵臓および心臓を含む群から選択される固形臓器の移植後の合併症を意味することが理解される。特に好ましい実施形態では、合併症は、神経学的症状の発症を包含し、脳炎、好ましくは辺縁系脳炎を包含し得る。さらに特に好ましい実施形態では、感染は、「移植後合併症」の場合に発症する。好ましい実施形態では、神経学的症状は、四肢麻痺、神経障害、意識混濁、構音障害、運動緩慢、振戦、不安定歩行、認知能力および記憶の障害ならびに神経炎を含む群から選択される。特に好ましい実施形態では、移植後合併症は、視覚機能の障害、好ましくは神経学的眼科症状および／または疾患、特に好ましくは視神経萎縮を包含する。
【００５５】
時間の観点から、「移植後合併症」は、好ましくは、受容者に対する外科処置の後、好ましくは１カ月まで、処置後の最初の６カ月または６カ月より後に発症する合併症である。
【００５６】
臓器ドナーまたはドナー臓器のスクリーニングのために、移植が実施される前に、適切な試料がドナーまたはそれらの臓器から採取され得る。ドナーの場合、血液、唾液またはＣＳＦ試料が好ましい。臓器の場合、試験されるものは、血液または組織残留物、それぞれ試料である。組織は、肝臓、腎臓、肺、腸、膵臓、心臓および脳を含む群から選択される臓器に由来し得る。
【００５７】
好ましい実施形態では、本明細書に使用される場合、「自己免疫性脳炎」は、１つまたは複数の自己抗体の発生に関連する脳炎を意味することが理解される。自己抗体は、好ましくは神経自己抗原に対する自己抗体であり、好ましくは、ＮＭＤＡＲ（欧州特許第２０５７４６６Ｂ１）、ＧＡＢＡ（Ａ）（欧州特許第２８６３２３１Ａ１）、ＧＡＢＡ（Ｂ）（欧州特許第２４８３４１７Ｂ１）、ＤＰＰＸ（米国特許第９７１９９９３ＢＢ）、ＬｇＩ１またはＣＡＳＰＲ２（米国特許第９２５０２５０ＢＢ）、ＩＧＬＯＮ５（欧州特許第２９０５６２２Ａ１）、ＳＮＡＲＥ（欧州特許第１７００１２０５）、ＮＢＣ１（欧州特許第３０２６４３４Ａ１）、フロチリン（欧州特許第３１０１４２４Ａ１）、ＤＡＧＬＡ（欧州特許第１８１９６８６７）、ＳＮＡＲＥ（欧州特許第１７００１２０５）およびＩＴＰＲ（欧州特許第３０１８４７８Ａ１）を含む群から選択される。自己抗原の適切な配列は括弧内に示された特許明細書に開示されている。
【００５８】
好ましい実施形態では、ボルナウイルスは試料中で検出される。このことは、ウイルスもしくはそれに由来する分子またはウイルスもしくはそれに由来する分子に対する患者抗体が試料中で検出されることを意味する。
【００５９】
ボルナウイルスによる感染によって引き起こされる脳炎ではなく、自己免疫により引き起こされる脳炎、より特にはＮＭＤＡ受容体脳炎は、高い頻度で腫瘍の発症と関連する。好ましい実施形態では、本明細書に使用される場合、「ＰＮＳ」（神経学的腫瘍随伴症候群）という用語は、腫瘍の存在によって、例えば、エピトープを形成するか、またはホルモンなどの物質を放出するか、またはそれらを増加した量で放出する腫瘍（その腫瘍が由来する細胞は同等の状況下で放出しないか、またはそのような量で放出しない）によって、間接的に引き起こされる全身性疾患を意味することが理解される。直接的または間接的な結果は、神経系の構造または部分に対して優先的に指向され、いずれの場合にも神経学的症状の発症に直接的または間接的に関連し、それらを優先的に引き起こす自己抗体の形成であり得る。ＮＭＤＡ受容体脳炎は、卵巣の奇形腫の発症と関連し得ることが知られている。腫瘍は、自己免疫によって引き起こされる脳炎の場合、検出できないことがある。
【００６０】
本発明による検出は、ボルナウイルスに特異的なポリペプチドまたはボルナウイルスに対する抗体、好ましくはボルナウイルスに対する抗体の検出によって達成され得る。抗体は、好ましくはＢｏＤＶ−１−Ｎ、ＢｏＤＶ−１−Ｐ、ＢｏＤＶ−１−Ｘ、ＶＳＢＶ−Ｎ、ＶＳＢＶ−ＰおよびＶＳＢＶ−Ｘ、好ましくはＢｏＤＶ−１−Ｎ、ＢｏＤＶ−１−Ｐ、ＶＳＢＶ−ＮおよびＶＳＢＶ−Ｐを含む群からのウイルスポリペプチドに対する抗体である。特に好ましい実施形態では、患者が、ＢｏＤＶ−１−Ｎ、ＢｏＤＶ−１−Ｐ、ＢｏＤＶ−１−Ｘ、ＶＳＢＶ−Ｎ、ＶＳＢＶ−ＰおよびＶＳＢＶ−Ｘを含む群からのウイルスポリペプチドに対する１つ、２つ、３つ、４つまたは１つより多い、２つより多い、３つより多い、４つより多い、５つより多いもしくは６つより多い抗体を有するかどうかを検出する。
【００６１】
好ましい実施形態では、担体は、捕捉手段として、ボルナウイルスの約４０ｋＤａの核タンパク質を含む。好ましい実施形態では、担体は、捕捉手段として、ボルナウイルスの約２３ｋＤａのリンタンパク質を含む。好ましい実施形態では、担体は、捕捉手段として、ＢｏＤＶ−１−Ｎ、ＢｏＤＶ−１−Ｐ、ＢｏＤＶ−１−Ｘ、ＶＳＢＶ−Ｎ、ＶＳＢＶ−ＰおよびＶＳＢＶ−Ｘ、好ましくはＢｏＤＶ−１−Ｎ、ＢｏＤＶ−１−Ｐ、ＶＳＢＶ−ＮおよびＶＳＢＶ−Ｐ、またはそれらのバリアントを含む群からの１つまたは複数の、２つより多い、３つより多い、４つより多い、５つより多いもしくは６つより多いポリペプチドを含む。好ましい実施形態では、担体は、ＢｏＤＶ−１−ＮおよびＢｏＤＶ−１−Ｐまたはそのバリアントを含む。好ましい実施形態では、担体は、ＶＳＢＶ−ＮおよびＶＳＢＶ−Ｐまたはそれらのバリアントを含む。好ましい実施形態では、担体は、ＢｏＤＶ−１−ＰおよびＶＳＢＶ−Ｐまたはそれらのバリアントを含む。好ましい実施形態では、担体は、ＶＳＢＶ−ＮおよびＢｏＤＶ−１−Ｎまたはそれらのバリアントを含む。
【００６２】
好ましい実施形態では、「ＢｏＤＶ−１−Ｎ」、「ＢｏＤＶ−１−Ｐ」、「ＶＳＢＶ−Ｎ」および「ＶＳＢＶ−Ｐ」は、本特許出願の優先日において、それぞれ、Ｕｎｉｐｒｏｔ  ｅｎｔｒｉｅｓ  Ｐ０Ｃ７９６（ＢｏＤＶ−１−Ｎ）、Ｐ０Ｃ７９８（ＢｏＤＶ−１−Ｐ）、Ａ０Ａ０Ｈ５ＢＷＤ６（ＶＳＢＶ−Ｎ）およびＡ０Ａ０Ｈ５ＢＷＫ０（ＶＳＢＶ−Ｐ）に記載されている配列を意味すると理解される。ＶＳＢＶ−Ｘは、好ましくは配列ＡＲＴ６７０５９．１を有し、ＢｏＤＶ−１−Ｘは、好ましくは配列ＡＩＫ２７０１１．１を有する。全ての項目について、優先日に利用可能であったデータベースのバージョンおよび当該日に検索可能であったデータの状態が関連する。好ましい実施形態では、ボルナウイルスのＮ、ＰまたはＸタンパク質は、配列Ｐ０Ｃ７９６、Ｐ０Ｃ７９８またはＡＩＫ２７０１１．１に対して少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有するタンパク質、特に好ましくはそれらのバリアントを意味すると理解される。
【００６３】
好ましい実施形態では、本発明に従って使用される担体は、１つまたは複数の抗体を捕捉するための手段を含む、医療機器、好ましくは診断機器である。本明細書に使用される場合、「抗体を捕捉するための手段」という用語は、別の抗体（特に、相同ポリペプチドに結合し偽陽性結果を優先的に誘発し得る別の抗体の形態である別の抗体）よりも強い結合を生じるような、検出しようとしている抗体と特異的に結合する薬剤を意味すると理解される。
【００６４】
特に、神経学的症状を有する患者において、患者が自己免疫によって引き起こされる脳炎または感染によって引き起こされる脳炎、好ましくは辺縁系脳炎に罹患しているかどうかを区別することを目的とし得る鑑別診断に関しては、一方ではＮＭＤＡＲに対する抗体を、また感染において類似または混同しやすい症状を引き起こすＢｏＤＶ−１−Ｎ、ＢｏＤＶ−１−Ｐ、ＶＳＢＶ−Ｎ、ＶＳＢＶ−Ｐまたはそれらに由来する他のウイルスもしくは抗原に対する抗体を、同時に捕捉および／または検出することが有利である。この目的に適した担体は、ＮＭＤＡＲおよび／またはＢｏＤＶ−１−Ｎ、ＢｏＤＶ−１−Ｐ、ＶＳＢＶ−Ｎ、ＶＳＢＶ−Ｐを含む群からの少なくとも１つの抗原に加えて、別のウイルスの少なくとも１つの抗原、好ましくは他のウイルスのいくつかの抗原を含み得る。さらなる自己抗体を検出することができる他の抗原も有用である。この場合、抗原による陽性結果は１つの試験手順内で達成され得、排除に基づく診断による作業をする必要がない可能性が高い。
【００６５】
特に好ましい実施形態では、本明細書に使用される場合、「特異的に結合する」という用語は、抗体の場合、１×１０−５Ｍ、より好ましくは１×１０−７Ｍ、より好ましくは１×１０−８Ｍ、より好ましくは１×１０−９Ｍ、より好ましくは１×１０−１０Ｍ、より好ましくは１×１０−１１Ｍ、より好ましくは１×１０−１２Ｍである解離定数、またはより強い結合反応によって特徴付けられる結合反応において、対応する抗原に対して結合することを意味する。好ましくは、解離定数は、この文脈において、２５℃にてＢｉａｃｏｒｅ機器を使用し、ｐＨ７のＰＢＳ緩衝液中で表面プラズモン共鳴によって測定され、製造業者によって供給されるソフトウェアを使用して計算される。
【００６６】
特に好ましい実施形態では、抗体を捕捉するための手段は、検出しようとしている抗体またはそのバリアントによって認識されるエピトープを有するポリぺプチドである。あるいは、検出しようとしている抗体に対して適切な結合能力を有するようなポリペプチド、例えば、ペプトイド、ベータ−ペプチドおよび非天然アミノ酸を含有するペプチドのペプチド模倣物を使用することも可能である。当業者は、このような分子およびそれらの設計に精通している（Ｐｅｌａｙ  Ｇｉｍｅｎｏ  Ｍ，  Ｇｌａｓ  Ａ，  Ｋｏｃｈ  Ｏ，  Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ  ＴＮ（２０１５）．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：  Ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ”．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．５４（３１）：８８９６−８９２７）。捕捉手段としての例示的なポリペプチドは、ヒトＮＭＤＡ受容体のＮＲ１サブユニット、その二量体またはＮＭＤＡ受容体に対する抗体の捕捉のためのＮＲ２Ａ（欧州特許第２０５７４６６号からの配列番号３）もしくはＮＲ２Ｂ（欧州特許第２０５７４６６号からの配列番号１）もしくはＮＲ２Ｃ（欧州特許第２０５７４６６Ｂ１号からの配列番号５）などのＮＭＤＡ受容体の他のサブユニットを有するその複合体に対する抗体の捕捉のための配列番号７、ヒトＧＡＢＡ（Ａ）受容体に対する抗体の捕捉のための欧州特許第２８６３２３１Ａ１号からの配列番号１および／または配列番号２、ヒトＧＡＢＡ（Ｂ）受容体に対する抗体の捕捉のための欧州特許第２４８３４１７Ｂ１号からの配列番号１、配列番号２または配列番号３、ＤＰＰＸに対する抗体の捕捉のための国際公開第２０１４／０４１０３５Ａ１号からの配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４、ＬｇＩ１またはＣＡＳＰＲ２（米国特許第９２５０２５０ＢＢ号）に対する抗体の捕捉のための米国特許第９２５０２５０ＢＢ号からの配列番号２、ＩＧＬＯＮ５に対する抗体の捕捉のための欧州特許第２９０５６２２Ａ１号からの配列番号１、ＮＳＦに対する抗体の捕捉のための欧州特許第１７００１２０５号からの配列番号１、ＳＴＸ１Ｖに対する抗体の捕捉のための欧州特許第１７００１２０５号からの配列番号３、ＶＡＭＰ２に対する抗体の捕捉のための欧州特許第１７００１２０５号からの配列番号６、ＮＢＣ１に対する抗体の捕捉のためのＵｎｉｐｒｏｔからの配列Ｑ９Ｙ６Ｒ１（欧州特許第３０２６４３４Ａ１号を参照のこと）、フロチリンに対する抗体の捕捉のためのＯ７５９５５（フロチリン１、Ｕｎｉｐｒｏｔ）および／またはＱ１４２５４（フロチリン２、Ｕｎｉｐｒｏｔ）（欧州特許第３１０１４２４Ａ１号を参照のこと）ならびにＩＴＰＲに対する抗体の捕捉のためのＱ１４６４３（Ｕｎｉｐｒｏｔ）（欧州特許第３０１８４７８Ａ１号を参照のこと）ならびに各場合、それらのバリアントを包含する。捕捉手段は、ウイルス自体、好ましくは、ウイルスに感染している、細胞、より好ましくは哺乳動物細胞の形態であってもよい。細胞は、好ましくは単離および／または精製される。
【００６７】
本発明に従う教示は、場合により暗に、今後まとめて「完全長ポリペプチド」と称される配列番号、またはデータベースコードもしくは他の何らかの手段の形態で、本明細書に指定される特定のポリペプチドの野生型配列または参照配列を使用することによって実施することができるだけではなく、前記配列のバリアントを使用することによっても実施することができる。
【００６８】
特に好ましい実施形態では、本明細書に使用される場合、「バリアント」という用語は、この文脈において、Ｃ末端および／またはＮ末端において１つまたは複数のアミノ酸によって完全長ポリペプチドに対して切断されている完全長ポリペプチドの少なくとも１つの断片を意味する。このような断片は、完全長ポリペプチドの配列由来の５、６、７、８、１０、１２、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００または６００個の連続するアミノ酸、好ましくは１０個またはそれ以上の長さを含有してもよい。
【００６９】
さらなる好ましい実施形態では、本明細書に使用される場合、「バリアント」という用語は、断片だけではなく、選好度が増加していく順で、完全長ポリペプチドまたはその断片に対して少なくとも４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有し、生物活性、例えば、完全長ポリペプチド抗原に特異的な抗体に結合する抗原の能力に必須の任意のアミノ酸の欠失または非保存的置換がない、アミノ酸配列を有するポリペプチドも包含する。先行技術は、例えば、Ａｒｔｈｕｒ  Ｌｅｓｋ（２００８），Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００８，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎにおいてアミノ酸配列の配列同一性を確立するための方法を開示している。好ましい実施形態では、この目的のために標準的な設定を使用するＣｌｕｓｔａｌＷソフトウェア（Ｌａｒｋｉｎ，  Ｍ．  Ａ．，  Ｂｌａｃｋｓｈｉｅｌｄｓ，  Ｇ．，  Ｂｒｏｗｎ，  Ｎ．  Ｐ．，  Ｃｈｅｎｎａ，  Ｒ．，  ＭｃＧｅｔｔｉｇａｎ，  Ｐ．  Ａ．，  ＭｃＷｉｌｌｉａｍ，  Ｈ．，  Ｖａｌｅｎｔｉｎ，  Ｆ．，  Ｗａｌｌａｃｅ，  Ｉ．  Ｍ．，  Ｗｉｌｍ，  Ａ．，  Ｌｏｐｅｚ，  Ｒ．，  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｊ．  Ｄ．，  Ｇｉｂｓｏｎ，  Ｔ．  Ｊ．，  Ｈｉｇｇｉｎｓ，  Ｄ．  Ｇ．（２００７）．Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ  ａｎｄ  Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２３，２９４７−２９４８）が使用される。
【００７０】
さらに、本発明に従って使用されるポリペプチドまたはそのバリアントは、化学修飾、例えば、同位体標識、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、脱カルボキシル化、シトルリン化、メチル化、ヒドロキシル化などの共有結合修飾を有してもよい。
【００７１】
バリアントはまた、他の既知のポリペプチドまたはそのバリアントとの融合タンパク質、好ましくは精製タグ、さらにより好ましくはＨｉｓタグ、チオレドキシン、マルトース結合タンパク質、ストレプトアビジン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼまたはそれらのバリアントを含む群からの精製タグとの融合タンパク質であってもよく、好ましくは、完全長ポリペプチドに対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有する活性部分またはドメインであってもよいか、またはそれらを含んでもよい。好ましい実施形態では、「活性部分またはドメイン」という用語は、完全長ポリペプチドの断片またはバリアントを意味すると理解され、両方の場合、それらは、完全長ポリペプチドの生物活性の少なくともいくらかを保持する。
【００７２】
完全長ポリペプチドのバリアントは生物活性を有することが必須である。好ましい実施形態では、生物活性は、完全長ポリペプチドに特異的に結合する抗体を捕捉する抗原の能力である。したがって、ＢｏＤＶ−１−Ｎ、ＢｏＤＶ−１−Ｐ、ＢｏＤＶ−１−Ｘ、ＶＳＢＶ−Ｎ、ＶＳＢＶ−ＰおよびＶＳＢＶ−Ｘのバリアントは、それぞれ、ＢｏＤＶ−１−Ｎ、ＢｏＤＶ−１−Ｐ、ＢｏＤＶ−１−Ｘ、ＶＳＢＶ−Ｎ、ＶＳＢＶ−ＰおよびＶＳＢＶ−Ｘに対する抗体を捕捉する能力を有する。好ましくは、抗体は、特定の疾患に罹患している患者の血液中に特異的に存在するものである。例えば、ボルナウイルスに対する抗体を捕捉するための抗原のバリアントは、ボルナウイルスの前記抗原に対する患者由来の抗体に特異的に結合する能力を有する。これが当てはまるかどうかは、実施例１に記載されるイムノブロットを使用して決定され得る。
【００７３】
本発明によるバリアントは、例えば、配列番号１（ＶＳＢＶ−Ｎのバリアント）、配列番号３（ＶＳＢＶ−Ｐ）、配列番号４（ＢｏＤＶ−１−Ｎ）および配列番号５（ＢｏＤＶ−１−Ｐ）を包含する。
【００７４】
好ましい実施形態では、捕捉手段は、特に好ましくは組換え体である単離されたおよび／または精製されたポリペプチドである。「単離された」ポリペプチドは、この文脈において、ポリペプチドがその天然環境から除去されたことを意味すると理解され得る。「精製された」ポリペプチドは、好ましい実施形態では、好ましくは、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを含む群から選択されるクロマトグラフ法を使用して、その天然環境における濃度および／または純度に対して濃縮されたポリペプチドを意味すると理解される。特に好ましい実施形態では、ポリペプチドは、それが少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９または９９．５％の純度を有する場合、精製されており、これは、視覚的に、または好ましくはクマシー染色後のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のバンドの強度の測定によって評価され得る。
【００７５】
ポリペプチドは、組織または細胞、好ましくは組換え組織または組換え細胞の形態で提供され得る。細胞は、好ましくは真核細胞、より好ましくは昆虫、植物または哺乳動物細胞、さらにより好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞である。
【００７６】
ポリペプチドは、折り畳まれた形態または折り畳まれていない形態で提供され得る。好ましくは、折り畳みは、測定を可能にし、タンパク質がその三次元折り畳みをとることができる緩衝液中、例えばｐＨ７の１０ｍＭリン酸ナトリウム中でのＣＤ分光分析によって測定される（例えば、Ｂａｎａｓｚａｋ  Ｌ．  Ｊ．（２００８），Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃｓ  ＰｒｅｓｓまたはＴｅｎｇ  Ｑ．（２０１３），Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒを参照のこと）。好ましくは、タンパク質は、検出しようとしている抗体によって認識される折り畳みをとる。
【００７７】
捕捉手段は、好ましくは担体上に、さらにより好ましくは共有結合または非共有結合を介して固定化される。
【００７８】
好ましい実施形態では、抗体は、捕捉後、免疫拡散、免疫電気泳動、光散乱、凝集、放射能、酵素活性、（電気）化学発光および免疫蛍光を含む群からの方法によって検出される。放射能、酵素活性、（電気）化学発光および免疫蛍光による検出の場合、検出可能な標識が使用され得る。それは、好ましくは検出しようとしている抗体に結合する二次抗体に付着される。検出方法は、例えば、Ｚａｎｅ，  Ｈ．  Ｄ．（２００１），Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  −  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｗ．  Ｂ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，特に１４章に記載されている。
【００７９】
好ましい実施形態では、検出しようとしている抗体は、免疫グロブリンクラスＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンクラスＭ（ＩｇＭ）および免疫グロブリンクラスＡ（ＩｇＡ）、好ましくはＧまたはＭ、さらにより好ましくはＧを含む群からの抗体である。さらなる好ましい実施形態では、免疫グロブリンクラスＧ、免疫グロブリンクラスＭおよび免疫グロブリンクラスＡを含む群からの抗体の２つ以上のクラス、好ましくはＧおよびＭが検出される。
【００８０】
検出しようとしている抗体は定量され得る。好ましい実施形態では、検出しようとしている抗体は、１日を超えて検出され、そして好ましくは定量される。さらにより好ましくは、抗体はクラスＧ（ＩｇＧ）のうちの１つである。このようにして、力価の経過を追跡することが可能である。この場合、経時的に上昇するＩｇＧ力価により、ボルナウイルスによる活動性感染の同定、およびボルナウイルスによる活動性感染と、受動免疫または接触、それぞれさらに過去からの病原体による感染との区別が可能になる。
【００８１】
好ましい実施形態では、担体は、膜ベースのイムノブロット、好ましくはウェスタンブロット、ラテラルフローアッセイまたはラインブロット、１つまたは複数のビーズ、免疫蛍光のために配置されたバイオチップ、およびＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを含む群から選択される。
【００８２】
本発明は、本発明による担体、ならびにさらに任意選択で指示書および／または好ましくは洗浄溶液、捕捉された抗体を検出するための手段を含む溶液および陽性対照を含む溶液を含む群からの緩衝液および試薬を含むキットを提供する。溶液の代わりに、特定の試薬もまた、乾燥形態で、例えば粉末として、好ましくは必要に応じて溶解され得る溶液と共に提供されてもよい。陽性対照として、抗体が結合する抗原に特異的に結合する、検出しようとしている抗体またはそのバリアントを使用することができる。好ましくは、担体は、試料、好ましくは血清試料の存在を検出するための対照を含む。例えば、全ての血清試料中に存在するタンパク質が血清試料の存在を確認するために検出され得る。捕捉された抗体を検出するために使用される手段は、好ましくは検出可能な標識を有する二次抗体である。
【００８３】
本特許出願において、新規ポリペプチドおよび／または核酸が列挙される。それらは以下の配列を有する：
配列番号１（ＶＳＢＶ−Ｎ（４０ｋＤａ、Ｈｉｓタグ））
MNITMPPKRRLLEDPDVMDDQEPEPTSPPMPKLPGKFLQYTVGGSDPHPGIGEEKDIKHNAVALLDSSRRDMFHPVTPSLVFLCLLIPGLHAAFLHGGVPKESYLSTPISRGEQTFVKVSRFYGERTASRELTELEISSIFNHCCSLLIGVVIGSSAKIRAGAEQIKKRFKTLMASLNRPSHGETATLLQMFNPHEAIDWINGQPWVGSLVLSLLTTDFESPGKEFMDQIKLVASYAQMTTYTTIKEYLAECMDATLTIPAVAHEIREFLEISAKLKNEHAELFPFLGAIRHPDAIKLAPRSFPNLASAAFYWSKKENPTMAGYRASTIQPGATVKETQLARYRRREVSRGEDGAELSGEISDIMKMIGVTGLVLEHHHHHH
配列番号２（ＶＳＢＶ−Ｎペプチド（３０ｋＤａ、Ｈｉｓ−ＧＳＴタグ））
MSHHHHHHHHMSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKLEVLFQGPAMFVKVSRFYGERTASR
配列番号３（ＶＳＢＶ−Ｐ（２３ｋＤａ、Ｈｉｓタグ））
MASRPSSLVESLEDEESLQTPRRVRSRSPRPKRIPQDALTQPVDRLLKNIKKNPSMISDPEQRTGREQLSNDELIKQLVTELAENSMIEAEGLRGALDDISSKVDSGLESISSLQVETLQTVQKTDYADSIKTLGENIKVLDRSMKTMMETMRLMMEKIDLLYASTAIGQSNTPMLPSHPAQPRLYPTLPSAPTADEWDILPLEHHHHHH
配列番号４（ＢｏＤＶ−１−Ｎ（４０ｋＤａ、Ｈｉｓタグ））
MNITMPPKRRLVDDADAMEDQDLYEPPASLPKLPGKFLQYTVGGSDPHPGIGHEKDIRQNAVALLDQSRRDMFHTVTPSLVFLCLLIPGLHAAFVHGGVPRESYLSTPVTRGEQTVVKTAKFYGEKTTQRDLTELEISSIFSHCCSLLIGVVIGSSSKIKAGAEQIKKRFKTMMAALNRPSHGETATLLQMFNPHEAIDWINGQPWVGSFVLSLLTTDFESPGKEFMDQIKLVASYAQMTTYTTIKEYLAECMDATLTIPVVAYEIRDFLEVSAKLKEEHADLFPFLGAIRHPDAIKLAPRSFPNLASAAFYWSKKENPTMAGYRASTIQPGASVKETQLARYRRREISRGEDGAELSGEVSAIMKMIGVTGLNLEHHHHHH
配列番号５（ＢｏＤＶ−１−Ｐ（２３ｋＤａ、Ｈｉｓタグ））
MATRPSSLVDSLEDEEDPQTLRRERSGSPRPRKIPRNALTQPVDQLLKDLRKNPSMISDPDQRTGREQLSNDELIKKLVTELAENSMIEAEEVRGTLGDISARIEAGFESLSALQVETIQTAQRCDHSDSIRILGENIKILDRSMKTMMETMKLMMEKVDLLYASTAVGTSAPMLPSHPAPPRIYPQLPSAPTADEWDIIPLEHHHHHH
配列番号６（ＶＳＢＶ−Ｎペプチド、Ａ０Ａ０Ｈ５ＢＷＤ６のアミノ酸１１６〜１３０）
FVKVS RFYGERTASR
配列番号７（ＮＭＤＡＲ受容体のＮＲ１サブユニット）
MSTMHLLTFALLFSCSFARAACDPKIVNIGAVLSTRKHEQMFREAVNQANKRHGSWKIQLNATSVTHKPNAIQMALSVCEDLISSQVYAILVSHPPTPNDHFTPTPVSYTAGFYRIPVLGLTTRMSIYSDKSIHLSFLRTVPPYSHQSSVWFEMMRVYNWNHIILLVSDDHEGRAAQKRLETLLEERESKAEKVLQFDPGTKNVTALLMEARELEARVIILSASEDDAATVYRAAAMLNMTGSGYVWLVGEREISGNALRYAPDGIIGLQLINGKNESAHISDAVGVVAQAVHELLEKENITDPPRGCVGNTNIWKTGPLFKRVLMSSKYADGVTGRVEFNEDGDRKFANYSIMNLQNRKLVQVGIYNGTHVIPNDRKIIWPGGETEKPRGYQMSTRLKIVTIHQEPFVYVKPTMSDGTCKEEFTVNGDPVKKVICTGPNDTSPGSPRHTVPQCCYGFCIDLLIKLARTMNFTYEVHLVADGKFGTQERVNNSNKKEWNGMMGELLSGQADMIVAPLTINNERAQYIEFSKPFKYQGLTILVKKEIPRSTLDSFMQPFQSTLWLLVGLSVHVVAVMLYLLDRFSPFGRFKVNSEEEEEDALTLSSAMWFSWGVLLNSGIGEGAPRSFSARILGMVWAGFAMIIVASYTANLAAFLVLDRPEERITGINDPRLRNPSDKFIYATVKQSSVDIYFRRQVELSTMYRHMEKHNYESAAEAIQAVRDNKLHAFIWDSAVLEFEASQKCDLVTTGELFFRSGFGIGMRKDSPWKQNVSLSILKSHENGFMEDLDKTWVRYQECDSRSNAPATLTFENMAGVFMLVAGGIVAGIFLIFIEIAYKRHKDARRKQMQLAFAAVNVWRKNLQDRKSGRAEPDPKKKATFRAITSTLASSFKRRRSSKDTSTGGGRGALQNQKDTVLPRRAIEREEGQLQLCSRHRES
【００８４】
本発明は、図面を参照して以下の例示的な実施形態によって説明される。記載される実施形態は、あらゆる点において、単に例示であり、限定的であると理解されるべきではなく、述べられた特徴の様々な組み合わせが本発明の範囲に包含される。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】実施例１において調製し、使用したボルナウイルス抗原を用いたラインブロットストリップの構造を示す図である。
【図２】実施例１に従ったインキュベーション後の、実施例１において調製したボルナウイルス抗原を用いたラインブロットストリップを示す図である。
【図３】実施例１において調製したラインブロットストリップを使用した辺縁系脳炎を有する患者由来の試料の試験結果を示す図である。
【図４】実施例１において調製したさらなるラインブロットストリップを使用した辺縁系脳炎を有する患者由来の試料の試験結果を示す図である。
【図５】２つの異なる倍率（左側２００倍、右側４００倍）における免疫蛍光による移植患者由来の試料の試験結果（実施例２を参照のこと）を示す図である。
【図６】実施例１に従って調製したボルナウイルス抗原を用いたラインブロットストリップを使用した移植患者由来の試料の試験を示す図である。実施例２を参照のこと。
【実施例】
【００８６】
［実施例１］
＜カワリリスボルナウイルスＩ（ＶＳＢＶ１）および哺乳類Ｉ型ボルナウイルス（ＢｏＤＶ−１）に対する膜ベースの抗体検出＞
（１．１．ＥＵＲＯＬＩＮＥ抗ボルナウイルスプロファイルの調製）
ニトロセルロース膜上の抗原のコーティング：
ＶＳＢＶ−Ｎタンパク質（配列番号１）、ＶＳＢＶ−Ｎペプチド（配列番号２）、ＢｏＤＶ−１−Ｎタンパク質（配列番号４）、ＢｏＤＶ−１−Ｐタンパク質（配列番号５）およびＶＳＢＶ−Ｐタンパク質（配列番号３）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における組換え手段によってＨｉｓタグと融合し、標準的なプロトコールを使用したアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製したタンパク質を凍結状態（−７０℃）で保存し、コーティングプロセスの前に解凍した。
【００８７】
ＥＵＲＯＬＩＮＥ抗ボルナウイルスプロファイルａの調製のために、抗原を各場合において２つの希釈物中でコーティングした（各抗原について可変である９μｇ／ｍｌ〜５９μｇ／ｍｌの濃度を有する）。
【００８８】
続く第２のＥＵＲＯＬＩＮＥ抗ボルナウイルスプロファイルｂにおいて、ＢｏＤＶ−１抗原の濃度は各場合において５０％減少した。希釈した抗原を、接触チップディスペンサーを使用して機器によってコーティングした（Ｒａｐｈａｅｌ  Ｗｏｎｇ，  Ｈａｒｌｅｙ  Ｔｓｅ：Ｌａｔｅｒａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；２００８，ｐａｇｅ  １３７を参照のこと）。図１は、ＥＵＲＯＬＩＮＥの構造を示し、ここで、１はより高い抗原濃度を示し、２はより低い抗原濃度を示す。
【００８９】
その後、コーティングした膜をブロックし、すすぎ、乾燥し、さらなる使用のために−２０℃で保存した。
【００９０】
担体フィルム上のコーティングの付着：
ＥＵＲＯＬＩＮＥ抗ボルナウイルスプロファイルを作製するために、各抗原の系統をプラスチックフィルム上に固定した。この後、個々の試験ストリップに分割した。
【００９１】
（１．２  ＥＵＲＯＬＩＮＥを使用した免疫学的検定の性能）
血清試料のインキュベーション：
１．前処理：
試験すべき患者試料の数に従って、インキュベーション槽を、各場合において、使用できる状態に希釈された１．５ｍｌの汎用緩衝液（ＺＤ１１００−１０５０、ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ  ＡＧ）で満たした。必要量の試験ストリップを、ピンセットを使用してパッケージから取り出し、各場合において、緩衝液で満たしたインキュベーション槽に直接入れ、１５分間室温にてロッカーシェーカー（ｒｏｃｋｅｒ  ｓｈａｋｅｒ）上でインキュベートした。その後、液体を槽から完全に除去した。
【００９２】
２．試料インキュベーション：
汎用緩衝液中で１：５１に希釈した１．５ｍｌの患者試料を、試験ストリップで満たした各インキュベーション槽に満たし、３０分間室温（＋２３℃）にてロッカーシェーカー上でインキュベートした。
【００９３】
３．洗浄：
液体を各槽から完全に除去し、洗浄を、各場合において、使用できる状態の希釈した１．５ｍｌの汎用緩衝液を用いて３×５分間ロッカーシェーカー上で実施した。
【００９４】
４．コンジュゲートインキュベーション：
各場合において１．５ｍｌの使用できる状態の希釈した酵素コンジュゲート（アルカリホスファターゼで標識した抗ヒトＩｇＧ；ＡＥ１４２−１０３０、ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ  ＡＧ）をインキュベーション槽にピペットで入れ、３０分間室温（＋２３℃）にてロッカーシェーカー上でインキュベートした。
【００９５】
５．洗浄：
液体を槽から完全に除去した。ステップ３を再び実施した。
【００９６】
６．基質インキュベーション：
各場合において１．５ｍｌの基質溶液（ＺＷ  １０２０−０１３０、ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ  ＡＧ）をインキュベーション槽にピペットで入れた。この後、室温（＋２３℃）にてロッカーシェーカー上で１０分インキュベーションを行った。
【００９７】
７．停止：
各槽からの液体を完全に除去し、各試験ストリップを蒸留水または脱イオン水で３×１分の間、すすいだ。
【００９８】
８．評価：
試験ストリップを風乾し、評価した。
【００９９】
液体試料のインキュベーション：
１．前処理：
試験すべき患者試料の数に従って、インキュベーション槽を、各場合において、１．５ｍｌの汎用緩衝液で満たした。必要量の試験ストリップを、ピンセットを使用してパッケージから取り出し、各場合において、緩衝液で満たしたインキュベーション槽に直接入れた。インキュベーションを、１５分間室温（＋２３℃）にてロッカーシェーカー上で実施した。その後、液体を槽から完全に除去した。
【０１００】
２．試料インキュベーション：
１．０ｍｌの希釈した患者試料（液体希釈係数１：４、汎用緩衝液中で希釈した）を、試験ストリップで満たした各インキュベーション槽に満たした。この後、室温（＋２３℃）にてロッカーシェーカー上で３時間インキュベーションを行った。
【０１０１】
３．洗浄：
液体を各槽から完全に除去し、洗浄を、各場合において、使用できる状態の希釈した１．５ｍｌの洗浄緩衝液を用いて、３×５分の間、ロッカーシェーカー上で実施した。
【０１０２】
４．コンジュゲートインキュベーション：
各場合において１．５ｍｌの使用できる状態の希釈した酵素コンジュゲート（アルカリホスファターゼで標識した抗ヒトＩｇＧ）をインキュベーション槽にピペットで入れた。インキュベーションを、１時間室温（＋２３℃）にてロッカーシェーカー上で実施した。
【０１０３】
５．洗浄：
液体を槽から完全に除去し、洗浄を上記のように実施した。
【０１０４】
６．基質インキュベーション：
各場合において１．５ｍｌの基質溶液をインキュベーション槽にピペットで入れた。インキュベーションを、２０分間室温（＋２３℃）にてロッカーシェーカー上で実施した。
【０１０５】
７．停止：
液体を各槽から完全に除去し、各試験ストリップを蒸留水または脱イオン水で３×１分の間、すすいだ。
【０１０６】
８．評価：
試験ストリップを風乾し、評価した。
【０１０７】
図２はインキュベーション後の例示的なストリップを示す。
【０１０８】
評価：
ＥＵＲＯＬＩＮＥＳｃａｎソフトウェア（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ  Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ  Ｌａｂｏｒｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ  ＡＧ、Ｌｕｂｅｃｋ）を使用して測定した強度を、下記の基準を考慮して、経験のあるスタッフのメンバーによって評価した。陽性結果に関して、各場合において特異的抗原コーティング（２つのコーティングした希釈物のうち濃度が低い方）を、カットオフより多く反応させなければならなかった。
【０１０９】
ＥＵＲＯＬＩＮＥ抗ボルナウイルスプロファイルａに関して、カットオフは以下のように規定した。数字はＥＵＲＯＬＩＮＥ−Ｓｃａｎにおいて測定したバンド強度に対応する。
ＢｏＤＶ−１抗原：０〜２３＝陰性；２４〜３０＝ボーダーライン；＞３０＝陽性
ＶＳＢＶ抗原：０〜１３＝陰性；１４〜２０＝ボーダーライン；＞２０＝陽性
ＥＵＲＯＬＩＮＥ抗ボルナウイルスプロファイルｂに関して、以下のカットオフを定義した。
全ての抗原：０〜１３＝陰性；１４〜２０＝ボーダーライン；＞２０＝陽性
【０１１０】
（１．３．  種々の試料群を使用した結果）
ＮＭＤＡ−Ｒ−ＩＦＴにより事前に特徴付けした患者血清：
辺縁系脳炎の症状に罹患している患者由来の非特定化血清試料を試験した。
【０１１１】
全体として、インキュベーションを、ＥＵＲＯＬＩＮＥ抗ボルナウイルスプロファイルａに対する第１の実験においてｎ＝６０の試料から実施し、ＥＵＲＯＬＩＮＥ抗ボルナウイルスプロファイルｂに対する第２の研究においてさらなるｎ＝４９の試料から実施し、それらはこれらの要件を満たす。試料を、免疫蛍光によってＮＭＤＡ受容体に対する自己抗体の存在について調べた（製品ＦＡ  １１２ｄ−１００３−５１、ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ  Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ  Ｌａｂｏｒｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ  ＡＧ）。その後、それらを、１．１で調製したＥＵＲＯＬＩＮＥ抗ボルナウイルスプロファイル上で試験した。
【０１１２】
免疫蛍光検査の場合、全部でｎ＝１０９の試料からのｎ＝７の試料が、抗ＮＭＤＡ−Ｒ−ＩＦＴにおいて陽性に反応した。したがって、これらの患者については、脳炎はＮＭＤＡ受容体に対する自己抗体に起因し得る。ｎ＝７のＮＭＤＡ−Ｒ−ＩＦＴ陽性血清はいずれも、ＥＵＲＯＬＩＮＥ抗ボルナウイルスプロファイル上で、陽性に反応しなかった。
【０１１３】
残りのｎ＝１０２の患者については、その試料は抗ＮＭＤＡ−Ｒ−ＩＦＴにおいて陰性に反応し、疾患の原因は未解決のままである。この群では、とりわけ、ボルナウイルス感染が、可能性のある原因として予想され得る。
【０１１４】
これらのｎ＝１０２の試料から、全部でｎ＝１４の試料が少なくとも１つのボルナウイルス抗原と陽性に反応した（これらのうち、第１の実験ではｎ＝７、第２の実験ではｎ＝７）。これは、ボルナウイルス感染によって引き起こされ得る脳炎の１３．７３％に相当する。
【０１１５】
多発性硬化症を有する患者由来の血清：
散在性脳脊髄炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔａ）の場合、正確な原因も依然として不明である。しかしながら、この脳炎は辺縁系脳炎とは異なるＣＮＳの領域に影響を及ぼし、対照群として役立つ。試験は、ＥＵＲＯＬＩＮＥ抗ボルナウイルスプロファイルｂ上で、ｎ＝３６の試料に対して行われ、そのうちのｎ＝１の血清はＥＵＲＯＬＩＮＥ抗ボルナウイルスプロファイルと陽性に反応した。
【０１１６】
陽性対照：
陽性対照として、以下の試料をＥＵＲＯＬＩＮＥ抗ボルナウイルスプロファイルａ上で使用した。
ｎ＝１の抗ＶＳＢＶ陽性液体
ｎ＝１の精神病患者由来の血清
ｎ＝２の血清学的に事前に特徴付けしたＢｏＤＶ−１陽性血清
以下の陽性対照を、ＥＵＲＯＬＩＮＥ抗ボルナウイルスプロファイルｂについてインキュベートした。
ｎ＝４のポリクローナルウサギ血清（ＶＳＢＶ−Ｎに対するもの、ＶＳＢＶ−Ｐに対するもの、ＢｏＤＶ−１−Ｎに対するもの、ＢｏＤＶ−１−Ｐに対するもの、実施例の項の１．１節に記載される配列を有するＶＳＢＶ−Ｎタンパク質、ＶＳＢＶ−Ｎペプチド、ＢｏＤＶ−１−Ｎタンパク質、ＢｏＤＶ−１−Ｐタンパク質およびＶＳＢＶ−Ｐタンパク質を使用した標準的なプロトコールに従ってウサギの免疫化によって調製した）
これらの全部でｎ＝８の血清のうち全てがＥＵＲＯＬＩＮＥ抗ボルナウイルスプロファイル上の少なくとも１つの抗原と陽性に反応し、ポリクローナル抗体は、各場合において、対応するコーティングされた抗原を認識した。
【０１１７】
陰性対照：
辺縁系脳炎が疑われる患者に由来しない液体試料を使用した。液体試料のいずれもＥＵＲＯＬＩＮＥ抗ボルナウイルスプロファイルと陽性に反応せず、これらのインキュベーション条件下での試験ストリップの特異性を示した。
【０１１８】
ＥＵＲＯＬＩＮＥ抗ボルナウイルスプロファイルａによる結果を図３に示し、ＥＵＲＯＬＩＮＥ抗ボルナウイルスプロファイルｂによる結果を図４に示す。それらは、ＮＭＤＡＲ受容体脳炎および関連するＰＮＳまたは関連するがん型に罹患している患者がＢｏＤＶ−１またはＶＳＢＶ−１に対する抗体を有していないことを示す。
【０１１９】
［実施例２］
＜移植後合併症を有する患者由来の試料中のボルナウイルスに対する抗体の検出＞
患者：
患者１は臨床的に正常なドナーから臓器提供を受けた。移植後、受容者は脳炎に至る神経学的合併症を発症した。
【０１２０】
陰性対照として、健康な血液ドナー由来の２６４個の血液試料を試験した。
【０１２１】
抗体検出：
患者由来の血清試料を、ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ  Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ  Ｌａｂｏｒｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ  ＡＧ（注文番号ＦＩ  ２９３ａ−１００５Ｇ）からの抗チクングニアウイルスＩＩＦＴを使用して検査し、相違としては、使用した抗原は上述の試験において使用したもの（ＣＨＩＫＶにより感染したＶｅｒｏ細胞）ではなく、Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ａ  ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ  ｓｑｕｉｒｒｅｌ  ｂｏｒｎａｖｉｒｕｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｆａｔａｌ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１５；３７３，ｐａｇｅｓ  １５４−１６２および関連する補足用の付録（１９ページ）に記載されているＢｏＤＶ−１により感染した細胞株ＣＲＦＫ２２７であった。製造業者からの指示書のプロトコールに従った。
【０１２２】
移植後７２日目から定期的に採取した試料を、ＢｏＤＶ−１−Ｐ、ＢｏＤＶ−１−Ｎ、ＶＳＢＶ−ＰおよびＶＳＢＶ−Ｎに対する抗体の存在について試験した。これは、実施例１に記載されるブロットを使用し、前記実施例と同様の検出を実施することを含んだ。
【０１２３】
結果：
患者１からの連続した試料のいくつかを、間接免疫蛍光試験を使用して検査した。全ての試料は陽性反応を示し、すなわち、ボルナウイルスに感染した細胞における特異的蛍光パターンを同定することができた。これは図５に例として示される。感染細胞の細胞核では、個々の顆粒からウイルス抗原を含有する複数の顆粒まで蛍光が存在する。これにより、患者試料中のボルナウイルス特異的抗体の存在が確認される。
【０１２４】
ラインブロットにおける血液試料の試験により、移植後７２日目に依然として検出可能な抗体が存在しないことが示された（図６）。８４日目から、ＢｏＤＶ−１−Ｐに対する抗体を検出することができ、３８２日目から、ＶＳＢＶ−Ｎに対する抗体を検出することもできた。血液ドナーの９８．５％がＩＩＦＴによると陰性であった。
【０１２５】
＜結論＞
したがって、臓器ドナーは臨床的に明らかな感染を発症せずに、ＢｏＤＶ−１に潜伏感染したと結論付けることができる。移植は、おそらく免疫抑制治療のために、臓器受容者において感染の突然発生を引き起こした。
【０１２６】
［実施例３］
＜ＶＳＢＶ−１による感染に起因する辺縁系脳炎＞
（方法）
事例研究：
２０１３年７月、Ｓｃｈｌｅｓｗｉｇ−Ｈｏｌｓｔｅｉｎ出身の４５歳の動物飼育者が、発熱、発声困難、咳嗽、咽頭炎、目眩および眼の下の感覚異常を発症した。これらの症状の後に、運動失調、昏睡および下垂体機能不全が続いた。患者は以前に知られていた状態はなかった。ＣＳＦの分析により、リンパ球増加が示された。末梢血における炎症パラメータは上昇し、相対的な好中球増加およびリンパ球減少を伴った。頭部の最初のＭＲＩ検査は正常な結果を示した。３週間後の追跡ＭＲＩ検査により、基底核および上部脊髄において、両側辺縁系分布（内側側頭葉、前帯状束、島、海馬、視床下部、脳室周囲蓋）で病変が示された。形態学的に、辺縁系脳炎は１週間以内に進行すると診断された。中枢神経系の感染および自己免疫疾患に関する広範な臨床試験により、正常な結果が示された。内在する新生物は発見されなかった。反復された脳波図により、全般的に緩徐な活動および非痙攣性てんかん発作が示された。顕微鏡検査、培養またはＰＣＲにより、向神経性細菌、真菌、寄生虫またはウイルスは全く示されなかった。免疫組織化学により、クロイツフェルト−ヤコブ病を除外することができた。両側性肺炎のため、患者は人工呼吸を必要とし、広範な抗感染療法（アシクロビルを含む）、抗痙攣剤および疾患の後期においてステロイドにより治療された。症状の発症後３カ月以内に、患者はその時点では未確定であった病因の骨髄脳炎により最終的に死亡した。
【０１２７】
ＰＣＲ：
保存され、凍結されたＣＳＦおよびホルマリン固定され、パラフィン包埋された脳組織、心筋、肺組織、腎組織、肝組織、脾臓組織、膵臓組織、骨髄および腸組織を分析のために準備した。ＶＳＢＶ−１特異的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）に記載されているように実施した。
【０１２８】
免疫組織化学：
ＶＳＢＶ−１ならびにＢｏＤＶ−１のＮタンパク質およびＰタンパク質に対するポリクローナル抗血清を、それぞれの組換え抗原により免疫化したウサギから得、それらをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（Ｄａｖｉｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）によって精製した。ウサギ抗血清および免疫前血清の反応性を、免疫蛍光抗体試験（ＩＦＡＴ）によって、および実施例１に記載されるボルナウイルスイムノブロットを用いて試験した。１０個の無関係なヒト脳組織試料を陰性対照として使用した。プロテイナーゼＫによる前処理および内因性ペルオキシダーゼの遮断の後、患者からのＦＦＰＥ切片を抗血清（ＰＢＳ中に１：１０００〜１：５０００、室温にて一晩）とインキュベートした。その後、それらを、ヤギ抗ウサギビオチン化ポリマー抗体、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体、および３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）基質（ＤＣＳ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）とインキュベートした。
【０１２９】
血清学的試験：
血清およびＣＳＦ中のボルナウイルス特異的ＩｇＧ抗体の検出のために、ＢｏＤＶ−１に安定に感染させた細胞株を標準的な間接免疫蛍光試験（ＩＦＡＴ）（Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）のために使用し、さらにＥＬＩＳＡおよびイムノブロットを開発した。
【０１３０】
ＶＳＢＶ−１  ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡに関して、ＶＳＢＶ−１のＮおよびＰタンパク質の配列をクローニングし、大腸菌株ＢＬ２１  ＧＯＬＤ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ−Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）内でマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）との融合タンパク質の形態で発現させた。タンパク質を精製し、アミロースアフィニティークロマトグラフィーによって溶出した。Ｎ末端ＭＢＰタグを３Ｃプロテアーゼによって４℃にて一晩切断した。プロテアーゼの除去後、タンパク質試料をゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｕｎｉｃｈ、ドイツ）によってさらに精製した。マイクロタイタープレート（Ｐｏｌｙｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）を、２μｇ／ｍｌのＶＳＢＶ−１のＮまたはＰタンパク質を用いて４℃にて一晩コーティングした。６％ＢＳＡを用いて遮断した後、１％ＢＳＡ希釈溶液中で希釈したヒト血清を添加した。３７℃での２時間のインキュベーション後、１００μｌの抗ヒトＩｇＧ（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ、１：６０００希釈）を添加し、プレートを３７℃にて１時間インキュベートした。室温での３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンとの５分のインキュベーション後、反応を停止した。最後に、光学密度（ＯＤ）を４５０ｎｍにて測定した（基準：６２０ｎｍ）。各血清試料についての最終ＯＤ値を、ＶＳＢＶ−１のＮまたはＰタンパク質を含有するウェルとＭＢＰを含有するウェルとの間の差として測定した。１：４００の血清希釈についての最終ＯＤ値を、平均ＯＤが、平均ＯＤプラス２００人の健康な血液ドナーからの対照試料で得られた標準偏差の３倍を超えた場合に陽性と見なした。
【０１３１】
ボルナウイルスＩｇＧイムノブロットのために、実施例１において調製したストリップを使用した。それらを室温にて血清（３０分、１：５１）またはＣＳＦ（３時間、１：４）とインキュベートし、続いて、アルカリホスファターゼコンジュゲート（３０分または１時間、各場合において１：１０）および基質としてのニトロブルーテトラゾリウムクロリド（１０または２０分）とインキュベートした。検出抗体の強度を、ＥｕｒｏＬｉｎｅＳｃａｎソフトウェア（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ  ＡＧ、Ｌｕｂｅｃｋ、ドイツ）を使用して自動的に評価した。検証のために、１５０人の健康な血液ドナーからの試料を試験した。
【０１３２】
（結果）
脳炎患者由来の試料を用いた血清学
ボルナウイルス特異的ＩｇＧ抗体を、免疫蛍光（ＩｇＧエンドポイント力価１：２５６０）およびＥＬＩＳＡによって核パターンの形態で患者のＣＳＦ中に高濃度で検出した。強力なＩｇＧ反応性が、ＶＳＢＶ−１のＮポリペプチドに対するイムノブロットにおいて示され、ＶＳＢＶ−１−ＰおよびＢｏＤＶ−１−Ｐ抗原に対しては、より少ない程度で示された（表１）。
【０１３３】
【表１】
2019120689.tif 000003
【０１３４】
動物飼育者の血清学的試験
全部で１４人の動物飼育者からの血清を、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光およびイムノブロットにより試験した。６人の動物飼育者が定期的にカワリリスと接触し、５人の動物飼育者が不定期に接触していた。残りの人々は稀にしか接触しなかった。イムノブロットから判断すると、１４人のうちの６人の血清はＶＳＢＶ−１−Ｎと陽性にまたはわずかに陽性に反応し、４人はＢｏＤＶ−１−Ｎと反応したが、対応するＰ抗原とはいずれも反応しなかった。免疫蛍光試験により、２つの症例で低力価が示されたが、ＥＬＩＳＡの結果は陰性であった。血清学的反応性は、リスとの報告された接触強度と相関しなかった。イムノブロットによれば、血液ドナーの１３．５％、４．５％、１．５％および６％が、それぞれＶＳＢＶ−１−Ｎ、ＢｏＤＶ−１−Ｎ、ＶＳＢＶ−１−ＰおよびＢｏＤＶ−１−Ｐ抗原と陽性にまたはわずかに陽性に反応した。血液ドナーの１人は１つより多いボルナウイルス抗原と反応した。
【図１】
2019120689.tif 000004
【図２】
2019120689.tif 000005
【図３】
2019120689.tif 000006
【図４】
2019120689.tif 000007
【図５】
2019120689.tif 000008
【図６】
2019120689.tif 000009
【配列表】
2019120689000001.app
【外国語明細書】
2019120689000001.pdf