(57)【要約】脂質代謝を調節する作用を有するが、ＩＧＦ−１にそれほど影響がない治療上の有効量のペプチドを哺乳類に投与することを特徴とする、哺乳類における骨障害を予防または治療する方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質代謝を調節する作用を有するが、ＩＧＦ−１にそれほど影響がない治療上の有効量のペプチドを哺乳類に投与することを特徴とする哺乳類において骨障害を予防または治療する方法。
【請求項２】
該ペプチドがヒト成長ホルモン配列の１７７−１９１番目のアミノ酸残基またはその機能的なアナログまたはバリアントである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該ペプチドが脂質合成活性を減少することができ；および／または脂肪分解を刺激することができる請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該ペプチドが少なくとも哺乳類の成長ホルモンのジスルフィド結合したループを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
該ペプチドが配列：
【化１】
2007536282.tif 000007
から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
該ペプチドがヒト成長ホルモンの１８２−１８９番目のアミノ酸（ｈＧＨ１８２−１８９）を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項６】
該ペプチドがヒト成長ホルモンの１７７−１９１番目のアミノ酸（ｈＧＨ１７７−１９１）を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項７】
該ペプチドがＴｙｒ−ｈＧＨの１７７−１９１番目であって、該配列が、Tyr Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Pheを有する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項８】
該ペプチドが融合パートナーと共役する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
該ペプチドが医薬組成物として投与される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
該医薬組成物が医薬的に許容される担体を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該医薬組成物がさらに骨障害に対して活性なさらなる薬剤を含む、請求項９または請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該さらなる活性な薬剤が、１またはそれ以上のカルシウム、骨塩、γ−リノレン酸、ビタミンＤ、ビタミンＫ、エストロゲン、エストロゲン様化合物、ビホスフェートおよびイソフラボンから選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該組成物がエネルギー源をさらに含む、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
該ペプチドが経口、舌下、口腔、鼻腔内、吸入によって、経皮、局所、または非経口的に投与され、皮下、静脈内、筋肉内、髄腔内、頭蓋内、注射または注入技術によって投与される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
該ペプチドが遺伝子組み換え食物の形態において経口投与される、請求項１〜１３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１６】
該骨障害が骨代謝変化によって特徴付けられる、請求項１〜１５に記載のいずれかの方法。
【請求項１７】
該骨障害が閉経後骨粗鬆症、骨減少症、パジェット病、癌患者における溶骨性転移、肝臓疾患における骨形成異常、および腎不全または血液透析、骨折、骨の手術、老化、妊娠、および栄養失調によって引き起こされる骨代謝変化を含む、骨粗鬆症から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
該哺乳類がまた、成長ホルモン欠乏でもある、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
該哺乳類がヒトである、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
哺乳類における、骨障害の治療または予防における使用のための医薬品製造におけるＣ末端成長ホルモンフラグメントの使用。
【請求項２１】
該医薬品がまた、骨障害に対して活性なさらなる薬剤もさらに含む、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
該さらなる活性化剤が１またはそれ以上のカルシウム、骨塩、γ−リノレン酸、ビタミンＤ、ビタミンＫ、エストロゲン、エストロゲン様化合物、ビホスフェートおよびイソフラボンから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
該組成物がエネルギー源をさらに含む、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨障害の予防または治療のための方法、およびかかる方法において使用するための化合物に関する。特に本発明は、閉経後骨粗鬆症、骨減少症、パジェット病、癌患者における溶骨性転移、肝臓病における骨形成異常、および腎不全または血液透析、骨折、骨の手術、老化、妊娠、および栄養失調によって引き起こされる骨代謝変化を含む、骨粗鬆症を包含する骨代謝変化によって特徴付けられる骨障害を予防または治療するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
いずれの特許または特許出願、本明細書に引用されるすべての引例は、本発明を十分理解することができるように引例によって本明細書に引用される。言うまでもなく、かかる引例は、これらの文書のいずれも、オーストラリアまたは他のいずれの国においても、当該技術分野で通常周知なことの部分を形成すると承認されているように読まれるべきではない。該引例の議論には、それらの著者が主張していることが述べられており、本出願人は該引用文献の正確性および妥当性を調べる権利を保有している。
【０００３】
骨は、常に再生される生体組織である。結晶性無機物で覆われた細胞および分化したコラーゲン繊維を含む。一緒に、該無機物、細胞、および繊維は、有機マトリックスまたは「類骨」を形成する。
【０００４】
骨は、骨芽細胞による骨形成および破骨細胞による骨吸収を常に行っている。血液カルシウムレベルが低下するなら、骨吸収は、体の至る所でカルシウム所要量を満たすために増加する。
【０００５】
骨代謝変化は、骨形成および骨吸収との間の不均衡によって特徴付けられうる。それは、数種類の障害に関して生じうる。具体例には、骨粗鬆症、骨減少症、パジェット病、癌患者における溶骨性転移、肝臓病における骨形成異常、および腎不全または血液透析、骨折、骨の手術、老化、妊娠、および栄養失調によって引き起こされる骨代謝変化がある。
【０００６】
骨量の減少は、老化と共に加速される。高齢者における主な骨疾患は、骨粗鬆症である。この疾病は、骨脆弱性および骨折のより大きなリスクの増加に導く、広範囲の骨量の減少によって特徴付けられる。それは、かなりの痛み、身体障害、外観および自立性の喪失を引き起こし、医療サービスへのコストおよび負担となる。国際的に、骨粗鬆症の結果として、毎年１５０万人以上の骨折が起こる。
【０００７】
存在が認められる骨粗鬆症には２つのタイプがある。第一には、典型的に５０〜７５歳で起こり、男性に比べて女性（閉経後骨粗鬆症）が６倍多く襲われる。第二のタイプは、老人性骨粗鬆症と呼ばれ、７５歳以上の男性および女性の両方が襲われ、通常の骨量減少より大きいものを含まない。両方のタイプの骨粗鬆症に関する危険因子は、高カフェイン摂取、アルコール消費、低体重および低カルシウム摂取である。
【０００８】
閉経後骨粗鬆症の最も顕著で十分立証された原因は、エストロゲンの欠損である。閉経後、卵巣は、このホルモンを産生するのを停止し、骨塩量の減少に直接関連する。骨粗鬆症を含む閉経後症状の公知の治療は、ホルモン補充療法（ＨＲＴ）であり、このエストロゲン補充は、骨粗鬆症の進行を効果的に防ぐ。しかしながら、ＨＲＴの使用は、例えば乳房組織成長刺激のような深刻な副作用を有し得て、閉経後骨粗鬆症のための別の治療が必要である。
【０００９】
他のタイプの骨障害の主な原因は、まだ確定しておらず、かかる障害のための治療が必要である。
【００１０】
骨障害の予防または治療のための方法およびかかる方法において使用するための組成物を提供することが本発明の好ましい態様の目的である。
【００１１】
（概要）
第一の態様において、本発明によれば、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）にそれほどの効果を有さず、脂質代謝を調節する作用を有する治療上の有効量のペプチドを哺乳類に投与することを特徴とする、哺乳類における骨障害を予防または治療する方法を提供する。
【００１２】
モナッシュ大学による豪州特許第６９３４７８号において、肥満の制御のためのヒト成長ホルモンのカルボキシル末端の配列に由来するペプチドの使用、または他の哺乳類の成長ホルモンに由来する対応する領域を記載した。成長ホルモンのこの領域は、脂質代謝を調節する能力を有する。特に、ヒト成長ホルモン配列の１７７〜１９１番目のアミノ酸残基（以下で、ｈＧＨ１７７−１９１と称する）に対応する合成ペプチドは、肥満のモデル系である、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ（Ｏｂ／Ｏｂ）マウスにおいて、体重増加および脂肪組織量を減少することが見出された。続く出願、メタボリック・ファーマシューティカルズ社によるＰＣＴ／ＡＵ９８／００７２４は、この活性を共有するｈＧＨ１７７−１９１ペプチドのアナログを開示する。ＡＵ６９３４７８およびＰＣＴ／ＡＵ９８／００７２４の全体の開示は、この引例によって本明細書に引用される。
【００１３】
本出願、ＰＣＴ／ＡＵ００／０１３６２（ＷＯ０１／３３９７７）は、かかるペプチドの驚くべき経口活性を開示する。
【００１４】
ＡＯＤ９６０４（Ｔｙｒ−ｈｇＨ１７７−１９１）の研究は、閉経後骨粗鬆症のための老齢ラットモデルの骨格で現在実施されている。我々の以前の出願に記載されたヒト成長ホルモンのＣ末端フラグメントに対応するペプチドが、通常の全長の成長ホルモンの標準的な成長効果を全く示さず、ＩＧＦ−１（ヒト成長ホルモンの成長効果に介在する）に影響しないので、骨代謝における効果は全く見出されないと思われていた。驚くべきことに、我々は二つの研究において、ＡＯＤ９６０４が骨成長に効果を有することを見出し、実際に、骨量の減少を防ぐ効果がエストロゲンよりも良いことを見出した。
【００１５】
それ故本発明者は、ヒト成長ホルモン（ＡＯＤ９６０４）のＣ末端フラグメントに対応するペプチドが骨代謝に効果があることを認識した。従って本発明者は、脂質代謝を調節する作用を有することを以前に示したヒト成長ホルモンのすべてのＣ末端フラグメントが、骨代謝において、ＡＯＤ９６０４と同様の効果を有することを提案する。従って、発明者は、以前にＩＧＦ−１に影響を与えることなく脂質代謝を調節する作用を有することを示したペプチドのすべてが骨障害を治療または予防するために使用され得ることを提案する。
【００１６】
第二の態様によれば、本発明は、骨障害の治療または予防における使用のための医薬品製造において、ＩＧＦ−１にそれほど影響することなく、脂質代謝を調節する作用を有するペプチドの使用を提供する。
【００１７】
第三の態様において、本発明は、骨障害の予防または治療に使用するための医薬製剤を提供し、製剤には、ＩＧＦ−１にそれほど影響しない脂質代謝を調節する作用を有するペプチドおよび医薬的に許容される担体が含まれる。
【００１８】
第三の態様に従う製剤は、骨障害を治療または予防するための１またはそれ以上の薬剤をさらに含んでもよい。
【００１９】
第一の態様の方法または第二の態様の医薬品によって治療されうる骨障害には、骨代謝変化によって特徴付けられるそれらの障害が含まれる。
【００２０】
該骨障害は、とりわけ閉経後骨粗鬆症、骨減少症、パジェット病、癌患者における溶骨性転移、肝臓病における骨形成異常、および腎不全または血液透析、骨折、骨の手術、老化、妊娠、および栄養失調によって引き起こされる骨代謝異常を含む、骨粗鬆症であり得る。
【００２１】
本発明は、閉経後骨粗鬆症の治療または予防にとりわけ適しうる。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
ＩＧＦ−１にそれほど影響しない脂質代謝を調節する作用を有するペプチドは、とりわけ成長ホルモンのＣ末端アミノ酸配列に一致する。かかるペプチドは、「Ｃ末端成長ホルモンフラグメント」と命名する。本明細書の目的で、用語「Ｃ末端成長ホルモンフラグメント」とは、脂質合成活性を減少および／または脂肪分解を刺激することができる哺乳類の成長ホルモンのアミノ酸配列のカルボキシ末端領域由来のペプチドフラグメントを意味すると理解される。
【００２３】
本明細書で用いられる「ペプチド」とは、長さにおいて２〜５０個のアミノ酸残基、好ましくは長さにおいて２〜２０個、より好ましくは約１５個のアミノ酸残基のアミノ酸のいずれかの鎖を意味する。従って、本明細書で用いられる用語「ペプチド」はまた、ポリペプチドも含み、それと同じ意味でも使用され得る。但し、本発明に従って使用するためのいずれのペプチドも、他の種由来のヒト成長ホルモンまたはそのアナログの全長配列を有しない。全長の成長ホルモンは、脂質代謝を調節するばかりでなく、またＩＧＦ−１も調節できる。従って、全長の成長ホルモンは、本発明に従って使用するためのペプチドに含まれない。
【００２４】
好ましくは、本発明に従って使用されるペプチドは、脂肪分解における鍵酵素であるホルモン感受性リパーゼの活性を刺激し、脂質合成における鍵酵素であるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼを阻害する作用を有する。
【００２５】
好ましくは、本発明に従って用いられるペプチドは、哺乳類の成長ホルモンの少なくともジスルフィド結合したループを含む。
【００２６】
用語「成長ホルモンフラグメント」はまた、哺乳類の成長ホルモンの未変性のカルボキシル末端配列の機能的なアナログであるペプチドも含み、その中でアナログペプチドがＩＧＦ−１にそれほど影響しない脂質代謝を調節することができる。かかるアナログは、天然源に由来するか、組み換えＤＮＡ技術によって生じるか、または通常のペプチド合成法を用いて合成されうる。かかるペプチド合成法は、コンビナトリアル方法を含むことが理解される。好ましくは、かかるアナログには、ペプチドに環状配置を与えるジスルフィド結合が含まれる。特に、ＡＵ６９３４７８およびＰＣＴ／ＡＵ９８／００７２４に開示された活性なペプチドのすべては、例えば、
【化１】
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［式中、
用いられたアミノ酸残基の略語は、標準的なペプチド命名法に従う：
Gly＝グリシン；Ile＝イソロイシン；
Glu＝グルタミン酸；Phe＝フェニルアラニン；
Cys＝システイン；Arg＝アルギニン；Gln＝グルタミン；
Leu＝ロイシン；Ser＝セリン；Val＝バリン；
Lys＝リジン；Ala＝アラニン；
Asp＝アスパラギン酸；His＝ヒスチジン；
Orn＝オルニチン；Tyr＝チロシン；
Pen＝ペニシラミン（ｐ，ｐ’−ジメチルシステイン）］
も本発明の範囲内であることが理解される。
【００２７】
グリシンを除いたすべてのアミノ酸は、絶対配置がＤと指示しない限り、絶対配置がＬである。上記のペプチドはすべては、必要に応じて、Ｃｙｓ（１８２）およびＣｙｓ（１８９）、またはＰｅｎ（１８２）およびＰｅｎ（１８９）の間に環状ジスルフィド結合を有する。
【００２８】
好ましくは、該ペプチドは、１８２〜１８９番目のアミノ酸（ｈＧＨ１８２−１８９）、より好ましくはヒト成長ホルモンの１７７〜１９１番目のアミノ酸（ｈＧＨ１７７−１９１）を含む。さらにより好ましくは、該ペプチドはヒト成長ホルモンアナログであるＡＯＤ９６０４（Ｔｙｒ−ｈＧＨ１７７−１９１）である。しかしながら、これらに限らないが、ウシ、ヒツジ、ブタおよびウマのような家畜、ネコおよびイヌのようなペット、およびネコ科、イヌ科、およびヒト以外の霊長類を含む動物園の動物を含む、他の哺乳類種の成長ホルモンのアミノ酸配列にも対応したペプチドに適応可能である。ＰＣＴ／ＡＵ９８／００７２４および本明細書の引用される引例で述べられるように、生物種間の成長ホルモンのこの領域の配列には強い保存(conservation)がある。
【００２９】
該ペプチドはまた、より容易な生合成および／または輸送することができる融合パートナーと共役してもよい。それは通常の医薬組成物に導入されるか、またはＷＯ０１／３３９９７に開示されたような遺伝子組み換え食物中に存在してもよい。
【００３０】
該ペプチドは、投与のための医薬的に許容される担体と一緒の医薬組成物でも投与され得る。
【００３１】
該ペプチドは、いずれの適当な経路によっても投与され、当業者は、治療される症状のための最適経路および投与量を容易に決定することができる。該ペプチドは、通常の無毒の医薬的に許容される担体、補助剤、およびベヒクルを含む単位投与製剤において、経口、舌下、口腔、鼻腔内、吸入によって、経皮、局所、または非経口で投与され得る。本明細書で用いられる用語「非経口」とは、皮下、静脈内、筋肉内、髄腔内、頭蓋内、注射または注入技術を含む。
【００３２】
投与量は、担当の医師または獣医の判断であり、治療される症状の性質および状態、治療される患者の年齢および健康状態、投与経路、および投与されてきた以前の治療に依存する。投与間隔は、１週間に１回、１日１回、または連続放出でありうる。
【００３３】
好ましくは、対象の哺乳類は、閉経後骨粗鬆症、骨減少症、パジェット病、癌患者における溶骨性転移、肝臓病における骨形成異常、および腎不全または血液透析、骨折、骨の手術、老化、妊娠、および栄養失調によって引き起こされる骨代謝変化を含む、骨粗鬆症のような骨代謝変化によって特徴付けられる骨障害を患っている。該哺乳類はまた、成長ホルモン欠乏であってもよい。
【００３４】
該哺乳類はヒト、もしくは家畜またはペットであってもよい。本発明がヒトの医療において使用されることを特に意図しながら、イヌおよびネコのようなペット、およびウマ、ウシおよびヒツジのような家畜、またはヒト以外の霊長類、ネコ科、イヌ科、ウシ科、および有蹄動物のような動物園の動物の治療を含む、獣医学的治療にも適用可能である。
【００３５】
好ましくは、該哺乳類がヒトである。ヒトは、子供または大人であってもよい。
【００３６】
医薬組成物の調製のための方法および医薬担体は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, Williams and Williams, Pennsylvania, USA (2000)のようなテキストで述べられるように当該技術分野で周知である。
【００３７】
本明細書で用いられる「医薬的に許容される担体」とは、成長ホルモンフラグメントおよび／または患者に対して医薬的に活性な薬剤を輸送するための医薬的に許容される溶媒、懸濁剤、賦形剤またはベヒクルである。該担体または希釈剤、および他の賦形剤は、投与経路に依存し、また当業者は、各特定の場合のための最適な製剤を容易に決定することができる。
【００３８】
本明細書に記載されたペプチドのアナログは、本発明の範囲内に含まれるが、但し、それらは機能的に活性である。本明細書で用いられる用語「機能的に活性な」および「機能的な活性」とは、アナログがＩＧＦ−１にそれほど影響せず脂質代謝を調節することができる（またはする作用を有する）ことを意味するアナログに関する。
【００３９】
骨障害を予防または治療する本発明に従って使用されるペプチドまたはアナログの能力は、実施例において記載されるような骨芽細胞形成活性によって証明されうる。
【００４０】
本明細書で用いられるアナログには、提供されたアミノ酸配列のペプチドのアミノ酸配列のバリアントが含まれる。配列バリアントには、上述の成長ホルモンフラグメントのアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の欠失、挿入または置換体が含まれる。欠失、挿入、および置換体のいずれの組合せも成長ホルモンフラグメントのアミノ酸配列バリアントに達するように調製され得るが、但し、該バリアントは、本明細書に記載される所望の機能的な特徴；すなわち、ＩＧＦ−１にそれほど影響しない脂質代謝を調節する作用を有する。
【００４１】
とりわけ、バリアントが機能的に活性であるかどうかを決定するための試験は、該バリアントが最初に胎児のラット骨芽細胞におけるチミジン導入を刺激して、統計的に有意なレベルに達するかどうかである（さらなる詳細のための実施例１を参照されたい）。
【００４２】
かかる置換が、機能的な活性において変化をもたらさないなら、その時は表１の例示の置換で記載されるか、またはアミノ酸分類に関して下記でさらに述べられているような、より実質的な変化が導入され得、生じたバリアント成長ホルモンフラグメントが機能的な活性について分析される。
【００４３】
当業者は、通常の周知の方法によって、ペプチドが脂質代謝を調節する作用を有しているが、ＩＧＦ−１にそれほど影響しないかどうかを決定することができるだろう。
【００４４】
本明細書で用いられる用語「それほど影響しない」とは、ＩＧＦ−１における影響は統計的に有意差がないこと、およびペプチドの何らかの影響がアッセイにおいて記録されても、それは無視できるとみなすことができることを意味する。
【００４５】
当業者は、ペプチドが脂質代謝を調節することができるかどうかを決定する一つの方法は、実施例Ａに記載される脂肪分解アッセイを行うことによる。手短にラットを処置し、屠殺し、脂肪組織を、処置およびコントロールラットから得て、バイアルに入れ、テルブタリンを加える。該バイアルを３７℃で１時間インキュベートし、炭素で気化し、例えばシグマＧＰＯ−３３７のようなアッセイキットを用いる標準的なグリセロールアッセイにおいてアッセイする。
【００４６】
実施例Ｂに記載される脂質合成アッセイは、ペプチドが脂質代謝を調節することができるかどうかを当業者が決定しうる他の方法である。
【００４７】
ペプチドがＩＧＦ−１にかなりの影響を有するかどうかを決定するために、当業者は、血液サンプル（例えば、マウス由来）において、ＩＧＦ−１アッセイを実施してもよい。適切なアッセイキットは、Ｒ＆Ｄシステムズ社（カタログ番号ＤＹ７９１）から入手可能である。これは、捕獲抗体としてハムスター抗マウスＩＧＦ−１および検出抗体としてヤギ抗マウスＩＧＦ−１を用いる、サンドウィッチＥＬＩＳＡ法である。該試験の全詳細は、実施例Ｃで提供される。
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【００４８】
本明細書で用いられる用語「治療上の有効量」および「治療量」とは同義であり、所望の治療応答を得るために有効な本発明のペプチド量を意味する。
【００４９】
特定の治療上の有効量は、治療される特定の症状、治療される哺乳類のタイプ、健康状態および哺乳類の病歴、治療の持続時間、併用療法の性質（もし必要なら）、および用いられた特定の製剤ならびにペプチドの構造のような要因で明らかに変更するだろう。
【００５０】
一般的に、用語「治療（処置）する」、「治療（処置）」などは、所望の薬理学的および／または生理的効果を得るために患者、組織または細胞に作用することを意味するように本明細書では用いる。その効果は、骨量の減少を完全または部分的に防ぐことで予防しうることおよび／または骨形成および／または骨芽細胞沈着を増加させることで治療しうることである。
【００５１】
本明細書で用いられる「治療（処置）すること」とは、哺乳類、とりわけヒトにおける疾病の治療または予防方法のいずれも含み、そして疾病にかかりやすいが、それを有するとしてまだ診断されていない患者に起こる疾病を防ぐこと；疾病を阻害すること、すなわち、その進行を止めること；または疾病の影響を軽減または改善すること、すなわち、疾病の作用の緩和を引き起こすことを含む。
【００５２】
本発明の第三の態様として、骨障害を改善するために有用な種々の医薬組成物を含む。本発明の一態様に従う医薬組成物は、成長ホルモンのフラグメントのＣ末端に対応するペプチド、そのアナログ、バリアントまたは塩、および１またはそれ以上の骨障害に対して活性な薬剤を共に、担体、賦形剤および添加剤または補助剤を用いて患者に投与するのに適した形態に調製される。
【００５３】
骨障害に対する追加の活性な薬剤には、カルシウム、マグネシウムおよびホウ素のような骨塩、γ−リノレン酸、ビタミンＤおよびビタミンＫのようなビタミン類、エストロゲンもしくはエストロゲン補充療法で使用される１またはそれ以上のエストロゲン様化合物、ビホスホネートおよびイソフラボンが含まれる。
【００５４】
カルシウムは、骨において、カルシウム沈着を増加するために加えられてもよい。カルシウム源は、カルシウムを含むいずれの無機または有機化合物も適している。具体例は、無機カルシウム塩、例えば塩化カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、酸化カルシウム、水酸化カルシウムまたは炭酸カルシウムなどである。有機カルシウム化合物の具体例は、粉乳またはカゼイン酸カルシウム、クエン酸カルシウム、リンゴ酸カルシウム、クエン酸リンゴ酸カルシウムまたは乳酸カルシウムである。カルシウム量は、１日投与量あたり、好ましくは２００〜１５００ｍｇである。
【００５５】
骨塩は、骨強度を増加させるために加えられてもよい。好ましくは、製剤には、１日投与量あたり１００ｍｇ〜５００ｍｇのマグネシウムおよび２ｍｇ〜６ｍｇのホウ素が含まれる。
【００５６】
γ−リノレン酸は、カルシウム代謝を調節するために使用され得て、好ましくは１日投与量あたり２５ｍｇ〜１００ｍｇの量がよい。
【００５７】
ビタミンは、最適な骨代謝のための共同因子として加えられてもよい。好ましくは、１日のビタミンＫ投与量は、２５ｐｇ〜５ｍｇのビタミンＫが必要である。ビタミンＤは、消化管からカルシウムの取り込みを増加するために使用される。好ましくは、１日投与量あたり２００ＩＵ〜８００ＩＵが製剤中に存在する。
【００５８】
エストロゲンまたはエストロゲン補充療法に使用される１またはそれ以上のエストロゲン様化合物はまた、製剤中にも含まれうる。エストロゲン様化合物の具体例には、ゲニステイン、リグナンまたはクメラン（coumerans）のような植物性エストロゲン、または１７ｐ−エストラジオール、エステル化されたエストロゲン、硫酸エストロン、共役されたウマ・エストロゲン、およびエチニルエストラジオールのような医薬製剤がある。植物性エストロゲンについて、これらの化合物の量は、１日投与量あたり５〜１００ｍｇである。医薬製剤に関して、活性な量は、製品の説明書によって定義される。
【００５９】
１またはそれ以上のビホスホネートは、破骨細胞の骨吸収を阻害するために使用され得る。これらの化合物の具体例には、アレンドロン酸塩およびリセドロン酸塩がある。好ましくは、これらの化合物の量は、１日投与量あたり５ｍｇ〜５０ｍｇである。
【００６０】
イソフラボンは、大豆またはブラック・コホッシュから得られる（単離される）か、または合成イソフラボンである。イソフラボンは、１日投与量あたり１０〜７５ｍｇの量において加えられうる。
【００６１】
本発明の第三の態様に従う製剤には、脂肪および炭水化物のような他のエネルギー源、蛋白質、ビタミン類、ミネラル、繊維、香料、保存料、着色料、甘味料等がさらに含まれる。
【００６２】
いずれの医薬的に活性な薬剤の化学的に互換性のある組合せも、本発明の範囲内であるが、但し、該組合せは、本発明の成長ホルモンのフラグメントの活性を排除しない。
【００６３】
該医薬組成物は、好ましくは調製され、単位投与量で投与される。固体の投与単位には、錠剤、カプセル剤および坐剤が含まれる。患者の治療に関して、化合物の活性、投与様式、障害の性質および重症度、患者の年齢および体重に依存して、異なった１日投与量が使用されうる。しかしながら特定の環境下で、より多いか、または少ない１日投与量が適当であり得る。１日投与量の投与は、個別投与単位でなければいくつかのより少ない投与単位の形態における単独投与で、およびまた特定の間隔で、さらに分割した投与量の複数回投与の両方で実施されうる。
【００６４】
該医薬組成物は、治療的に有効な投与量において、局所的または全身的に投与されてもよい。もちろんこの使用に関する有効量は、患者の疾病の重症度および体重ならびに全般的な状態に依存する。典型的に、インビトロで用いられる投与量は、医薬組成物のインシチュ投与に有用な量において、有用な指針を提供し、動物モデルは、細胞毒性の副作用の治療のために有効な投与量を決定するために使用され得る。
【００６５】
治療上用いられる成長ホルモンフラグメントの有効量は、例えば治療目的、投与経路、および患者の症状に依存するだろう。従って、療法士が投与量を判定すること、および最適な治療効果を得るために必要である投与経路を修正することが必要であるだろう。典型的な１日投与量は、送達様式によって決まり、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、またはそれ以上の範囲である。
【００６６】
成長ホルモンフラグメントの投与量レベルは、通常体重ｋｇあたり約０．５ｍｇ〜約２０ｍｇのオーダーであり、好適には体重ｋｇあたり１日約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ（１日あたり患者の約０．５ｇ〜約３ｇ）の投与量範囲である。単独投与を生じるための担体材料と組み合わせてもよい活性成分の量は、治療される宿主および特定の投与様式によって変更する。例えば、ヒトに経口投与するための製剤は、適当で都合のよい担体材料の量と共に約５ｍｇ〜１ｇの活性化合物を含み、全組成物の約５〜９５％を変更してもよい。投与単位形態は、一般的に約５ｍｇ〜５００ｍｇの活性成分を含む。
【００６７】
しかしながら、いずれの特定の患者についての特定の投与量レベルが、用いられる特定の化合物の活性、年齢、体重、全体的な健康、性別、食事、投与時間、投与経路、排出速度、薬物の組合せおよび治療を受ける特定の疾病の重症度を含む多様な要因によることは理解されるだろう。
【００６８】
本明細書の目的について、用語「からなる、含む(comprising)」とは、「必ずしもこれらに限らずに含む」を意味し、用語「からなる、含む(comprise)」は、対応する意味を有することが明らかに理解されるだろう。
【００６９】
本発明は、明確性および理解の目的のために少し詳しく記載してきたが、本明細書に記載された態様および方法に対して種々の修飾および変更は、本明細書に開示される発明概念の範囲から逸脱することなくなされ得ることは、当業者に自明である。
【００７０】
本発明は、下記の非限定的な具体例に対してのみ参考の方法によって記載される。
【００７１】
実施例
ラット処置プロトコル
ラット：１６匹のオスのウィスターラット
細身のウィスターラットに高脂肪食を２９日間与える。ラットは、毎週体重を量る（薬物投与０日を含む）。ラットは、薬物または生理食塩水の投与の間、高脂肪食を続ける。
【００７２】
８匹のオスのウィスター（細身）ラット（成熟年齢）を、有効な投与経路によって投与される薬物（生理食塩水中）で処置する。８匹のオスのウィスター（細身）ラット（成熟年齢）はまた、生理食塩水（等量）でも毎日２９日間処置する。
【００７３】
０日の体重を測定し、次いで毎週測定する。動物は、同じ時間（午前８：３０〜９：３０）で毎日投与しなければならない。
【００７４】
２８日目に、すべてのラットから血液サンプルを取り、適切に保存する。
【００７５】
投与後２９日目に、屠殺する前に動物を餓死させず、食物および水を自由に摂らせる。
【００７６】
最終投与後、ラットを２時間（食物および水を自由に摂りながら）放置する。この期間、緩衝液および薬物ストック（シグマから入手したテルブタリン−ＨＣｌ）を作り、解剖装置および作業場を作る。
【００７７】
各バイアル（ラットあたりそれぞれ６倍希釈）に、１．８ｍＬのＫＲＢ（付属書３参照）緩衝液（２％ＢＳＡおよび１ｍＭグルコースを含む）を加え、組織解剖までに蓋をして放置する。テルブタリンの保存溶液は、１０倍に濃縮し、続いて組織をバイアルに加え、インキュベーションのすぐ前に、２００μＬをすべてのバイアルに加える。これにより、が０μｍｏｌ／Ｌ、０．１μｍｏｌ／Ｌおよび０．５μｍｏｌ／Ｌのテルブタリンの最終濃度が得られる。インキュベーション前まで、テルブタリンは冷蔵庫で蓋をして放置する（光に敏感である！！）。
【００７８】
ラットは、最終投与後２時間ですぐに断頭により殺す。すぐに精巣脂肪組織を除き、生理食塩水（室温）で全体的にすすぐ。
【００７９】
実施例Ａ−脂質代謝を調節するペプチドの作用についての脂肪分解試験
１個の脂肪パッドを１８個の等しい一片に切り裂き（テルブタリン処置につき８個の複製物）、各片をすぐに１．８ｍＬのＫＲＢ緩衝液に入れる。重量を記録し、すべての片を最初に切断することによりインキュベーション時間のばらつきを最小限にし、次いでそれらをバイアルに入れる。
【００８０】
２００μＬのテルブタリン溶液を、組織を含む各バイアルに加え、インキュベーターにすぐに入れる。
【００８１】
３７℃で６０分間、カルボゲン（carbogen）気体下でインキュベートする。
【００８２】
インキュベーションに続いて、１００μＬのインキュベーション溶液を除去し、エッペンドルフに入れる。これの１０μＬを取り、標準的なグリセロール・アッセイキット（シグマGPO-337）を使用する。残った９０μＬの混合物を−８０℃で冷凍する。
【００８３】
実施例Ｂ−脂質代謝を調節するペプチドの作用についての脂質合成試験
各ラットから第二の脂肪パッドを取る。組織を同重量（２００ｍｇ）の片に切断する。各ラットについて６片の組織を集める。
【００８４】
組織の各片を２ｍｌのＫＲＢ緩衝液／２％ＢＳＡを含む１０ｍｌのコニカルフラスコに入れて、［12Ｃ］−グルコースを［14Ｃ］−グルコース（０．０５μＣｉ／μｍｏｌの最終特異活性）およびヒト・インスリン（１００μＵ／ｍｌ）と合わせる。１００ｒｐｍで定速振とうしながら３７℃の水浴中、６０分間インキュベートし、９５％Ｏ2／５％ＣＯ2ガスを満たす。
【００８５】
組織を除去し、０．９％ＮａＣｌで３回リンスし、拭き取って、５ｍｌのクロロホルム：メタノール（２：１ ｖ／ｖ）溶液を含むスクリューキャップのガラス管（またはファルコン）に入れ、４℃で終夜冷蔵する。
【００８６】
該組織を除去し、（溶液を保存し、）１０ｍｌの遠心分離管に、２ｍｌのクロロホルム：メタノール（２：１ ｖ／ｖ）溶液と一緒に入れて、ボルテックスし、３０分間冷蔵した。この工程からの抽出溶液を工程４からの抽出液と共にプールする。該組織をガラス棒で圧縮し、いずれの残った脂質を抽出する。
【００８７】
次に該組織を２ｍｌのメタノール：０．１％ＭｇＣｌ2（１：１ ｖ／ｖ）溶液と４℃で１５分間混合する。
【００８８】
工程５および６からの抽出物をプールし、１０℃で６０００ｘｇにて１０分間遠心分離する。
【００８９】
上層を除去し、廃棄する。５ｍｌの下層溶液を計数バイアルに移し、温風気流下で終夜蒸発するために放置した。
【００９０】
乾燥した物質を１ｍｌのクロロホルムで再懸濁し、それに１０ｍｌのシンチラント（scintillant）を加える。
【００９１】
放射能を６０秒間測定し、ｄｐｍ／ｍｇ組織として表す。
【００９２】
実施例Ｃ−ＩＧＦ−１の効果に関する試験
カタログ番号ＤＹ７９１であるＲ＆Ｄリサーチシステムズ社によって提供されるDuoSetＥＬＩＳＡ開発キットは、ＩＧＦ−１における影響に関するアッセイに使用され得る。各キットは、細胞培養液上清および血清において、ＩＧＦ−１を測定するためのサンドウィッチＥＬＩＳＡの発育のために必要な基礎成分を含む。ＩＧＦ−１キットＤＹ７９１の使用説明書は、付属書１で再現される。
【００９３】
実施例１
物質
使用したペプチド：ＡＯＤ９６０４、９５％純度
供給元：メタボリック・ファーマシューティカル社
保存：−２０℃
溶解性：１ｍｇ／ｍｌの生理食塩水中で溶解する；しかしながら、これは、曇った溶液を生じ、遠心分離し、上清を除去し、蛋白質についてアッセイした。溶液は、依然＞１ｍｇ／ｍｌを含んでおり、したがって、推定された沈殿物は蛋白質ではなかった。
【００９４】
方法
初代骨芽細胞増殖アッセイ
下記で詳しく述べるように、初代ラット胎児骨芽細胞培養系において、ＡＯＤ９６０４ペプチドをアッセイした。
【００９５】
初代ラット骨芽細胞は、２１日胎児ラット頭頂骨の連続的なコラゲナーゼ消化から生じる。消化物３−４をプールし、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でＴ−７５フラスコにて増殖する。細胞を増殖させて集密し、次いでトリプシン処理し、５％ＦＢＳを含む最小必須培地（ＭＥＭ）で２４ウェルプレートに播種し、２４時間インキュベートした。次いで細胞は、ＭＥＭ／０．１％ＢＳＡ中で２４時間、血清不足にされる。培地を置換し、増殖基質を加え、細胞をさらに２４時間インキュベートする。3Ｈ−チミジンを、このインキュベーション期間の終了前４時間に加えた。細胞を洗浄し、１０％ＴＣＡをウェルに加え、プレートを４℃で終夜放置する。次いで、プレートをチミジン導入のために処理する。
【００９６】
結果
ＡＯＤは、初代骨芽細胞において、タンパク同化作用を有する。
ＡＯＤは、初代ラット胎児骨芽細胞において、１０-10Ｍおよび１０-9Ｍの濃度でチミジン導入をかなり活性化した（図１ａ）。有意差は、スチューデントのｔ検定を用いて評価した。
【００９７】
結論
ＡＯＤは、初代骨芽細胞培養液中で、かなり細胞分裂性であった。それ故、それは骨タンパク同化のプロファイルを有し、骨領域において治療化合物としての可能性を有しうる。
【００９８】
実施例２
この研究は、閉経後骨粗鬆症についての高齢ラットモデルにおける骨格上のＡＯＤ９６０４の効果を観察する。ＡＯＤは、ラットにおいて卵巣摘出の結果として起こる骨変化を防がないと考えられた。
【００９９】
物質および方法
（ａ）動物の世話および保管
本研究には、ハーラン（Harlan）（ハーランファーム、インディアナ州）から得られた全部で９６匹の高齢メスSprague-Dawleyラット（Rattus Norvegicus）、およそ９ヶ月齢が含まれる。該ラットを無秩序に８群に分けた。１２週の研究期間、それらはトロント大学で比較医学部門の動物施設にて飼育された。該ラットは、飼育のためのコーンミールを敷いて、プラスチック製の管を持つ透明なプラスチック製の檻に２匹一組で保管した。水道水および研究の食物は、適宜すべてのラットが得ることができた。部屋は、２０．５℃の定温および６０％の湿度に関して毎日モニターした。
【０１００】
（ｂ）薬物の製造および投与
ＧＨおよびＡＯＤ処置群におけるラットは、１２週間、１週あたり５日注射した。すべての処置は、皮下注射によって与えられた。ＧＨ処置群は、組み換えヒトＧＨ（ｒｈＧＨ）（BresaGen、アデレード、オーストラリア）で処置した。それは製造元の説明書に従い再構成し、毎日アリコートに分けて、−７０℃で４週間まで冷凍した。ＡＯＤ処置群をＡＯＤ９４０６（フォーマテック社、アンドーバー、マサチューセッツ州、米国）で処置し、４℃で凍結乾燥して保存した。該ペプチドを製薬企業プロトコルに従って調製した。これは毎日完了し、調製の４時間以内に使用した。該薬物濃度は、実験を通じて一定の投与量を確実にするために、ラットの重量を用いて４、８および１０週後に再計算した。
【０１０１】
実験デザイン
９６匹の高齢Sprague-Dawleyラットを、８群のうちの１つに無作為に割り当てた。最初の２群は、偽手術した。群１は、偽コントロールとして保持し、群２は、２．５ｍｇ／ｋｇ／日の組み換えヒトＧＨ（ｒｈＧＨ）（BresaGen）で処置した。残りの６群は、ハーラン（Harlan）から調達し、卵巣摘出した（ＯＶＸ）。この手術は、処置の開始前、およそ８日実施した。群３は、ＯＶＸモデルに対するコントロールとして残した。群４は、２．５ｍｇ／ｋｇ／日のｒｈＧＨの処置を与えた。群５は、低用量のＡＯＤペプチド（ＬＡＯＤ）、０．７５ｍｇ／ｋｇ／日で処置し、群６は、高用量のＡＯＤペプチド（ＨＡＯＤ）、２．０ｍｇ／ｋｇ／日で処置した。最後の２つのＯＶＸ群は、首の後ろに皮下移植している１７Ｂ−エストロゲンペレット（０．０１ｍｇ／日、１７Ｂ−エストラジオール、アメリカのイノベイティブ・リサーチ、サラソタ、フロリダ州、アメリカ合衆国）の持続放出を受けた。群７は、エストロゲンコントロールとして残し、群８には、ＡＯＤペプチド（（ＨＡＯＤ）２．０ｍｇ／ｋｇ／日、フォーマテック社）の高用量の処置を与えた。群のまとめおよび処置は以下に与える。
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【０１０２】
処置の開始前に、ラットを秤量し、１ｍＬの血液サンプルを採取した。血液サンプルを４、８および１２週後に再び採取した。該血液サンプルを１００ｘｇで１０分間、血清分離管で遠心分離した。該血清を取り除き、さらなる分析のために４個のアリコートに分けた。該アリコートを−２０℃で保存した。すべてのラットを屠殺前１３および３日に、３０ｍｇ／ｍＬのオキシテトラサイクリン(Tetraject LP, Bimeda−ＭＴＣファーマシューティカル、ケンブリッジ、ＯＮ、カナダ）を腹腔内注入した。必要ないずれの希釈液も滅菌生理食塩水を用いて行った。
【０１０３】
１２週間の処置期間の最後に、ラットを麻酔し、重量を測定した。麻酔をしたままで、ラットを放血によって屠殺した。大腿、頸骨および脊椎を摘出し、前もってラベルした管に入れた。骨をすぐにドライアイス上に置いた後、−７０℃で保存した。図２は、実験計画の概要およびスケジュールを示す。
【０１０４】
二重エネルギーＸ線吸光光度分析法（ＤＥＸＡ）
二重エネルギーＸ線吸光光度分析法（ＤＥＸＡ）は、骨塩量（ＢＭＣ）測定し、骨塩密度（ＢＭＤ）を計算するために用いられる。ＤＥＸＡは、特に小動物の測定のために、設計されているＰＩＸＩｍｕｓ密度計（Lunar GE社、マディソン、ウィスコンシン州、アメリカ合衆国）を用いて実施する。測定は、サンプルを高低両方のエネルギーＸ線の円錐形の光線に曝すことによって得られる。低エネルギー光線は、骨だけでなく柔組織を通過し、高エネルギー光線は、すべての物質を通過する。骨密度は、高低エネルギー光線から骨によって吸収されるエネルギーに基づいて計算される。該機械を、ＰＩＸＩｍｕｓの走査領域の後ろから１センチメートルに置かれたアルミニウム／ルーサイト・ファントムを用いて、各使用の前に校正する。
【０１０５】
摘出し、洗浄した大腿および腰部脊椎４および５を走査した。サンプルを骨上の柔組織の厚さと同等であるとシミュレーションするために、ポリスチレン製の専用プレートに別々に置き、半冷凍した。すべてのサンプルを各測定のために同方向に置いた。腰椎Ｌ４およびＬ５のＢＭＤを全体の分析のために一緒に加えた。
【０１０６】
製造業者によって供給されたソフトを、ＢＭＣおよび領域からＢＭＤを計算するために用いた［ＢＭＤ（ｇ／ｃｍ2）＝ＢＭＣ（ｇ）／領域（ｃｍ2）］。領域は、関心領域（ＲＯＩ）と称されるサンプル周辺の箱の大きさで分類することによって手動で決めた。
【０１０７】
統計分析
すべてのデータは、平均、＋／−平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表示される。統計分析は、統計ソフト、ＳＰＳＳ（バージョン１０．０）を用いて実施した。
【０１０８】
２群を含む比較は、独立ｔ検定によって分析された。多角的な比較のために、分散の等価性のルービン（Levene）検定を等分散検定として実施した。該データが等分散を有するなら、多重比較を、２つ１組のフィッシャーのプロテクテッド最小有意差（Protected Least Significant Difference）（ＬＳＤ）のポストホック(pasthoc)検定を用いて、一元配置のＡＮＯＶＡ分析によって分析した。有意差は、ｐ＜０．０５で決定し、傾向は、ｐ＜０．１で決定した。
【０１０９】
二重エネルギーＸ線吸光光度分析法（ＤＥＸＡ）
ＤＥＸＡは、骨塩密度（ＢＭＤ）を計算するために用いられる。腰椎のＢＭＤは、骨梁質量における変化を決定するために主に用いられ、一方、摘出した大腿は、皮質骨質量における変化を決定するために主に用いられる。
【０１１０】
卵巣摘出の効果
骨塩密度における卵巣摘出の効果は、閉経後骨粗鬆症のためのエストロゲン欠損モデルを確かめるために試験した。ｔ検定分析は、図４ａで示されるコントロールの偽(Sham)群（ｐ＝０．０２）のＢＭＤと比較してＯＶＸ群における腰椎のＢＭＤにおいて、有意な減少があったことを明らかにした。この効果はまた、図４ｂに示される大腿においても起こり、そこではまた偽群（ｐ＝０．０４６）と比較してＯＶＸ群のＢＭＤにおいて、有意な減少があった。このことにより、ＯＶＸモデルが本研究において機能的であることを確かめる。
【０１１１】
ＡＯＤ処置の効果
ＡＯＤに応答するＢＭＤ変化は、腰椎および大腿では異なる。腰椎において、ＡＮＯＶＡ分析は、ＡＯＤの高用量（ｐ＝０．０５）および低用量（ｐ＝０．０７６）の両方ともが、図５ａで示されるようにＯＶＸコントロールと比較して有意にＢＭＤを増加したことを示した。該ＢＭＤは、偽コントロールレベルのそれに戻った。
【０１１２】
大腿骨のＢＭＤは、ＡＯＤ（ｐ＝０．１０７）の低用量で増加する傾向にあったが、この効果は、図５ｂで示されるように高用量のＡＯＤでは見られなかった。高用量のＡＯＤは、ＢＭＤにおいていずれの増加も生じず、ＯＶＸコントロール群に対して同様のＢＭＤを有した。高用量のＡＯＤ群のＢＭＤは、低用量のＡＯＤ群（ｐ＝０．０１３）より有意に低かった。
【０１１３】
全体として、ＡＯＤの処置した腰椎および大腿におけるＢＭＤにおいて増加したが、腰椎において、より有意差のある増加があった。
【０１１４】
実施例３
機械的な試験方法
３個の試験は、皮質および骨梁の両方の力学的性質を決定するために行った。三点曲げおよびねじれ試験は、皮質骨の機械的および物質的性質を試験するために行った。椎骨の圧縮は、骨梁の機械的および物質的性質を研究するために行った。
【０１１５】
統計分析
すべてのデータは、平均、＋／−平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表示される。統計分析は、統計ソフト、ＳＰＳＳ（バージョン１１．０）を用いて実施した。２群を含む比較は、独立スチューデントｔ検定によって分析された。多重比較は、２つ１組のフィッシャーのプロテクテッド最小有意差（ＬＳＤ）のポストホック(posthoc)検定での対比較を用いるワンウェイＡＮＯＶＡ分析によって分析された。有意差は、ｐ＜０．０５で決定し、傾向は、ｐ＜０．１で決定した。
【０１１６】
三点曲げ
右大腿を三点曲げ試験のために用いた。試験される骨は、試験前２日間、−７０℃〜−２０℃の冷凍庫に移した。試験前夜、サンプルを−２０ＥＣ冷凍庫から出し、生理食塩水溶液を染みこませたガーゼで別々に包んだ。次いで、サンプルが完全に溶解するのを確実にするために、これらのサンプルを終夜でおよそ４℃に置いた。試験前、ジグでサンプルの置き場所を決定するために骨を測定した。最初に、骨長をデジタル測径器で測定した。大腿の遠位末端から全長の２５％の骨上に印を付けた。第一の点から第二の印は、決まったゲージの長さである１５．６ｍｍの点に付けて、最後に印をゲージの長さの中点に付けた。
【０１１７】
試験は、１０００ニュートン・ロードセルを用いて、機械的な試験機（Instron 4465, インストロン・カナダ社、トロント、オンタリオ州、カナダ）で行った。三点曲げジグを取り付けた後、該ロードセルを校正し、バランスを取った。インストロンのクロスヘッドに付着した２個の支持体およびくぼみを持つ基盤からなるステンレス製のジグを、試験用に使用した。すべてのサンプルを、それらの最も安定な位置で支えに自然と静止させて、上方に面する前側面で同方向に置いた。ゲージの長さの印は、ジグの２個の支えで整列させて、くぼみは、ゲージの長さの中点で整列させた。該骨をおよそ１．０Ｎで前負荷させた。試験は、破断するまで１ｍｍ／分の速度で実施した。時間に対する負荷データは、LabViewデータ取得ソフト（ナショナル・インストゥルメント社；オースチン、テキサス州）によってインストロンから入手した。デジタル画像は、切断点で大腿の断面を撮った（ニコン8500、ニコン・カナダ）。画像解析ソフト（ImageJ 1.28u, 国立衛生研究所）は、骨の寸法を決定するため、および慣性モーメントを計算するために用いられた。内側−外側（Ｍ／Ｌ）の直径および前部／後部（Ａ／Ｐ）の方向、ならびに厚さを測定した。
【０１１８】
時間データは、表計算ソフト（エクセル2000、マイクロソフト）を用いて負荷−変形曲線を構築するために変形データに変換された。この曲線から、最終負荷、破断変形点、破断までのエネルギー（曲線下面積）および剛性（線形領域の傾き）を含む、規格化されていない力学的性質を決定した。
【０１１９】
直径および慣性モーメントは、負荷・変形曲線を応力・ひずみ曲線に変換するために用いられた。規格化された力学的性質は、最終応力、破断ひずみ、破断弾性率までの規格化されたエネルギーが含まれる応力・ひずみ曲線を取得した。
【０１２０】
椎骨圧縮
５番目の腰椎（Ｌ５）を圧縮試験のために用いた。該椎骨は、試験用の椎体のみ残し、すべて切り取った。試験される骨は、−７０℃の冷凍庫から出し、試験前少なくとも１日、−２０℃の冷凍庫に置いた。サンプルは、骨が完全に溶解するのを確実にするために試験前の少なくとも２時間、−２０℃の冷凍庫から出した。該椎骨は、解凍する間、生理食塩水溶液を染みこませたガーゼで別々に包んだ。
【０１２１】
デジタル画像を取得し、画像解析ソフト（ImageJ 1.28u, NIH）を用いて、椎体の高さおよび断面領域を決定した。圧縮試験は、１０００Ｎロードセルを用いて、機械的な試験機（Instron 4465, インストロン・カナダ）で行った。該椎体を尾側または平面な下端を持つジグの浅いウェル内に置いた。サンプルを３個のネジで留めて、次いでＰＭＭＡで囲んだ。該椎骨は、ＰＭＭＡを少なくとも１０分間固定しながら、生理食塩水を染みこませたガーゼで包んだ。少量のＰＭＭＡは、椎骨の負荷表面を平らにするために用いられた。サンプルは、およそ１．０Ｎで前負荷し、ＰＭＭＡを固定するために、およそ３分間置いた。該サンプルを前負荷しながら、圧盤間の距離を、デジタル測径器を用いて測定した。次いでゲージの長さは、ジグの高さを圧盤間の距離で差し引くことにより決定した。該骨は、破断するまで１．０ｍｍ／分で負荷した。椎骨の圧縮に対する破断は、有効な明らかな落下として、またはあまり定義されない例であるが、有効な１０％の落下として定義された。
【０１２２】
時間に対する負荷データは、LabViewデータ取得ソフトによるインストロンから取得した。デジタル画像は、画像解析ソフト（ImageJ, NIH）を用いて、高さおよび断面領域を決定するために取得した。
【０１２３】
時間は、負荷−変形曲線を構築するために変形データに変換された。この曲線から最終負荷、破断変形点、破断までのエネルギー（曲線下面積）および剛性（直線領域の傾き）を含む、規格化されていない力学的性質を決定した。断面領域をデジタル画像から取得し、ゲージの長さは、負荷・変形曲線を応力・ひずみ曲線に変換するために用いられた。規格化された性質は、応力・ひずみ曲線から取得され、最終応力、破断ひずみ、破断までの規格化されたエネルギー（曲線下面積）および弾性率（傾き）が含まれた。
【０１２４】
大腿骨頸部骨折
右の近位大腿は、大腿骨頸部骨折試験のために用いられた。試験前、近位大腿のＸ線を取得し、大腿骨頭がフィルムに対して平らであることを確認した。試験される骨は、−２０℃の冷凍庫から出し、生理食塩水溶液で染みこませたガーゼで別々に包んだ。次いで、該サンプルが完全に溶解するのを確実にするために、これらのサンプルを室温、およそ２１℃で２時間置いた。いずれの大腿骨頸部の周辺結合組織も試験前に除去した。
【０１２５】
試験は、インストロン４４６４で行った。サンプルは、４個の平坦なネジ口のネジを用いてジグで留めた。該サンプルは、長軸がジグのウェルに対して垂直であり、およそ１１ｍｍのゲージの長さ（骨の末端からジグのウェルの先端まで）を有するように視覚的に整列させた。次いで、ジグのウェルをＰＭＭＡで満たし、１０分間固定させた。該サンプルは、固定しながら生理食塩水を染みこませたガーゼで包んだ。試験前、デジタル測径器を、内側／外側方向および前部／後部方向において、正確なゲージの長さおよび大腿骨頸部の直径を測定するために使用した。サンプルを固定し、測定するとすぐに、インストロン機で負荷され、大腿骨頸部は、底板にドリルで穴を開けた穴の縁で整列させた。およそ１．０Ｎの前負荷を適用した。試験は、破断するまで２．５ｍｍ／分で行った。
【０１２６】
時間は、負荷−変形曲線を構築するために変形データに変換された。この曲線から規格化されていない力学的性質を決定し、この性質には最終負荷、破断変形点、破断までのエネルギー（曲線下面積）および剛性（直線領域の傾き）が含まれた。これらの力学的性質は、大腿骨頸部の複雑な形状およびサンプルに適用した異なった負荷の組合せ（圧縮力、剪断力および曲げ力）のためにいずれの規格化もすることなく直接比較した。
【０１２７】
機械的試験の結果
規格化されていない力学的性質は、三点曲げ、ねじれおよび椎骨圧縮試験で得られた負荷変位曲線から取得した。このデータは、幾何学的パラメーターを用いて規格化された。規格化されたパラメーターは、有意差のために比較された。問題が骨を試験している間に起こったら、これらの試験を分析から除外した。ＨＡＯＤ群由来の１サンプルは、右大腿に異常なカルスを有し、試験されなかった。統計検定で発見された範囲外のデータは、以下の分析から除外された。
【０１２８】
三点曲げ
三点曲げ試験は、大腿で実施し、皮質骨の力学的性質を表す。最終応力、破断ひずみ、破断までのエネルギーおよび弾性率のためのグラフで示す群のデータは、図６および７で見ることができる。
【０１２９】
ＡＯＤ処置の効果
低用量（ＬＡＯＤ）および高用量（ＨＡＯＤ）がＯＶＸコントロール群（ｐ＝０．０６２、ｐ＝０．０７６）と比較してより高い最終応力を有することを示す傾向に思われたが、ＬＡＯＤおよびＨＡＯＤ群の両方共にＡＯＤ処置は、最終応力において、有意な差を示さなかった。ＨＡＯＤ群およびＯＶＸは、同様のひずみおよび弾性率を有したが、ＬＡＯＤ群は、より高い弾性率（ｐ＝０．０１４）およびより低い破断ひずみ（ｐ＝０．００５）を有した。図６および図７を参照されたい。
【０１３０】
まとめ
ＯＶＸモデルは、偽群と比較して、皮質骨の強度および剛性における減少によって機能的であることが示された。低用量および高用量のＡＯＤの薬物処置において、異なった効果が見られた。両方の用量は、ＯＶＸと比較して強度が増加したが、低用量の方がより有効であり、剛性も増加した。
【０１３１】
椎骨圧縮
椎骨圧縮試験は、５番目の腰椎体で実施し、骨梁の力学的性質を表す。椎体にあまりに近接しすぎて切り取られた処理を行ったいくつかの椎骨は、少し皮質殻を損なっていたので分析から除外した。
【０１３２】
ＡＯＤ処置の効果
ＬＡＯＤ群は、ＯＶＸコントロール（ｐ＝０．０５）より高い弾性率を有した。図８を参照されたい。
【０１３３】
まとめ
低用量のＡＯＤ処置は、弾性率の増加によって表されるＯＶＸと比較して、増加した剛性傾向を示した。エストロゲン処置は、応力および弾性率の値がより高かったが、ＯＶＸによって引き起こされる強度および剛性の減少を防がなかった。全体として、皮質骨と比較して骨梁におけるＡＯＤの効果はより小さい。これは、ＡＯＤが原型のＧＨである骨格において同様の効果を有することを示す。ＧＨは、骨膜表面で皮質骨形成を上昇することが知られる。
【０１３４】
大腿骨頸部骨折
ＡＯＤの効果
ＡＯＤは、大腿骨頸部変形および剛性に影響を与えた。ＯＶＸラットは、低用量ＡＯＤおよび高用量ＡＯＤ群（０．０１７、０．００９）の両方より有意に大きい変形を有した。ＡＯＤ群の両方共にＯＶＸ（ｐ＝０．０９２，ｐ＝０．０２３）より大きな剛性を有したが、ＨＡＯＤ群と僅かな有意差しかなかった。ＯＶＸ群は、より高い柔軟性（ｐ＝０．０１３，ｐ＝０．００８）のために破断まで有意により大きなエネルギーを有した。ＯＶＸラットに起こる骨質の減少が予防され得ることを示したＡＯＤで処置した群において、剛性の増加があった。図９および図１０を参照されたい。
【０１３５】
まとめ
卵巣摘出は、大腿骨頸部の強度および剛性の低下を引き起こした。これは、大腿骨頸部における、主に骨梁の損失のためである。これはまた、ＯＶＸモデルが機能的であることを再確認する。低用量および高用量のＡＯＤ処置は、ＯＶＸと比較して増加した剛性傾向を示したが、強度に差はなかった。これは、無機物またはコラーゲンにおける変化のような物質変化のためである。
【０１３６】
議論
ＡＯＤが卵巣摘出から生じる骨格変化を防がなかったので、骨代謝に影響しなかったという仮説を我々は立てた。本研究の結果は、我々の仮説が誤りであること、およびＡＯＤが骨格に影響することを示唆する。この事は、卵巣摘出で生じる多くの骨格変化を防ぐことによる本研究を通じて見られた。ＡＯＤ９６０４ペプチドは、脂肪分解を刺激するドメインのみを含むが、骨代謝を刺激しないと考えられた。原型のＧＨは、体内で異なったいくつかの標的細胞を有するので、ＡＯＤが骨細胞と相互作用するらしいと我々は信じる。
【０１３７】
ＡＯＤは、骨梁および皮質骨の両方共に影響したが、主に皮質骨に影響を与えた。ＡＯＤが原型のＧＨ分子としての骨格において、同様の効果を有すると考えられる。ＡＯＤはまた、皮質ＢＭＤの減少を予防し、機械的な試験は、低用量のＡＯＤが皮質骨の低下を防ぐことを示した。骨梁におけるＡＯＤの効果はほとんどなかった。
【０１３８】
付属書１
マウスのＩＧＦ−Ｉ
カタログ番号：ＤＹ７９１
このＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ発育キットは、細胞培養上清および血清における天然および組み換えマウスのインスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）を測定するために、サンドウィッチＥＬＩＳＡの発育に必要である主要成分を含む1。各キットは、およそ１５個の９６ウェルプレート上でＥＬＩＳＡを実施するために十分な物質を含むが、但し、下記の条件の条件を満たす2：
・該アッセイは、一般的なＥＬＩＳＡプロトコルにまとめられるように実施される。
・推奨されるマイクロプレート、緩衝剤、希釈剤、基質および溶液が使用される。
この能書は、本製品を使用する前にその全体を読まなければならない。
【０１３９】
提供物質
すべての試薬は使用前に室温にする。
捕獲抗体（パート841413、１バイアル）
１．０ｍＬのＰＢＳで再構成する際、７２０μｇ／ｍＬのハムスター抗マウスＩＧＦ−Ｉ。再構成後、２〜８℃で６０日間まで保存するか、または等分し、６ヶ月間まで手動解凍冷凍庫で−２０℃〜−７０℃にて保存する3。担体蛋白質を含まずにＰＢＳ4中４．０μｇ／ｍＬの作業濃度まで希釈する。
【０１４０】
検出抗体（パート841414、１バイアル）
１．０ｍＬの試薬希釈液（必要な溶液の部を参照）で再構成する際、３６μｇ／ｍＬのビオチン化したヤギ抗マウスＩＧＦ−Ｉ。再構成後、２〜８℃で６０日間まで保存するか、または等分し、６ヶ月間まで手動解凍冷凍庫で−２０℃〜−７０℃にて保存する3。試薬希釈液中、２００ｎｇ／ｍＬの作業濃度まで希釈する4。
【０１４１】
標準品（パート841415、１バイアル）
０．５ｍＬの試薬希釈液（必要な溶液の部を参照）で再構成する際、１００ｎｇ／ｍＬの組み換えマウスＩＧＦ−Ｉ。標準品は、希釈液を調製する前に、穏やかに攪拌しながら最小１５分間静置させる。再構成した標準品を６０日間まで２〜８℃で保存するか、または等分し、−７０℃で６ヶ月間まで保存する3。試薬希釈液中、２倍連続希釈液を用いる７点の標準曲線、および高い標準品の２０００ｐｇ／ｍＬは、再構成される。
【０１４２】
ストレプトアビジン−ＨＲＰ（パート890803、１バイアル）
セイヨウワサビ・パーオキシダーゼに共役する１．０ｍＬのストレプトアビジン。最初の使用後、６ヶ月間まで２〜８℃で保存する3。凍結させない。試薬希釈液（必要な溶液の部を参照）を用いて、バイアルのラベルで特定された作業濃度まで希釈する4。
【０１４３】
必要な溶液
ＰＢＳ
１３７ｍＭ ＮａＣｌ，２．７ｍＭ ＫＣｌ，８．１ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4，１．５ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4，ｐＨ７．２−７．４，０．２μｍで濾過した。
洗浄緩衝液
０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０のＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２−７．４（Ｒ＆Ｄシステムズ カタログ番号ＷＡ１２６）。
遮断緩衝液
０．０５％ＮａＮ3を含む、５％Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液
試薬希釈液1
５％Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２−７．４、０．２μｍで濾過した。
基質溶液
呈色試験液Ａ（Ｈ2Ｏ2）および呈色試験液Ｂ（テトラメチルベンジジン）の１：１混合液（Ｒ＆Ｄシステムズ カタログ番号ＤＹ９９９）
停止溶液
２Ｎ Ｈ2ＳＯ4（Ｒ＆Ｄシステムズ カタログ番号ＤＹ９９４）。
【０１４４】
一般的なＥＬＩＳＡプロトコル
プレート調製
１．担体蛋白質を含まないＰＢＳ中で作業濃度まで捕獲抗体を希釈する。すぐに、９６ウェル・マイクロプレート5を、希釈した捕獲抗体のウェルあたり１００μＬでコーティングする。該プレートを密封し、室温で終夜インキュベートする。
２．各ウェルを吸引し、洗浄緩衝液で洗浄し、該方法を２回繰り返し、合計３回洗浄する。噴射瓶、マニフォールド分配器またはオートウォッシャーを用いて、各ウェルを洗浄緩衝液（４００μＬ）で満たすことによって洗浄する。各工程で液体の完全な除去は、好結果のために必須である。最後の洗浄後、プレートを吸引または反転することによって、残った洗浄緩衝液のいずれも除去し、きれいな紙タオルでそれを拭き取る。
３．３００μＬの遮断緩衝液を各ウェルに加えることによってプレートを遮断する。最低１時間室温でインキュベートする。
４．工程２のとおり、吸引／洗浄を繰り返す。プレートは、サンプル添加の準備が整う。
【０１４５】
アッセイ手順
１．１００μＬのサンプルまたは標準品の試薬希釈液、または適当な希釈液をウェル毎に加える。粘着性ストリップで覆い、室温で２時間インキュベートする。
２．プレート調製の工程２のとおり吸引／洗浄を繰り返す。
３．試薬希釈液中で希釈した１００μＬの検出抗体を各ウェルに加える。新しい粘着性ストリップで覆い、室温で２時間インキュベートする。
４．プレート調製の工程２のとおり、吸引／洗浄を繰り返す。
５．１００μＬのストレプトアビジン−ＨＲＰの作業希釈液を各ウェルに加える。該プレートを覆い、室温で２０分間インキュベートする。該プレートを直接光に置くことを避ける。
６．工程２のとおり、吸引／洗浄を繰り返す。
７．１００μＬの基質溶液を各ウェルに加える。室温で２０分間インキュベートする。該プレートを直接光に置くことを避ける。
８．５０μＬの停止溶液を各ウェルに加える。該プレートを穏やかに軽くたたいて、完全な混合を確実にする。
９．マイクロプレートリーダーセットを用いて、４５０ｎｍに対する各ウェルの光学密度をすぐに決定する。波長補正ができるなら、５４０ｎｍまたは５７０ｎｍにセットする。波長補正ができないなら、４５０ｎｍでの読み取り値から５４０ｎｍまたは５７０ｎｍでの読み取り値を差し引く。この差し引きは、プレートにおける光学的な不完全さを修正する。補正せず直接４５０ｎｍで行った読み取り値は、正確な値より高くなったり、低くなったりする。
【０１４６】
技術的な手引きおよび制限
このＤｕｏＳｅｔは、ラベル上の期限日を超えて使用するべきではない。
再構成用および標準品の希釈用に選択される希釈液は、測定されるサンプルの環境を反映することが重要である。このプロトコルで提案される希釈液は、ほとんど細胞培養液上清のサンプルに適するべきである。使用前に、特定のサンプルのタイプ用の希釈液を確かめる。
使用する酵素および基質のタイプおよび捕獲／検出抗体の濃度は、異なった感受性および動的範囲を持つ免疫アッセイを作るために変更可能である。免疫アッセイ開発の基礎的な理解は、免疫アッセイにおける、これらの試薬の好結果の使用に要求される。
完全な一貫性のある洗浄技術は、適切なアッセイ性能のために必須である。洗浄緩衝液は、効果的に分配し、吸引またはデカントによってウェルから完全に除去するべきである。プレートを反転することによって残った洗浄緩衝液のいずれも除去し、それをきれいな紙タオルで拭き取る。
各工程用に未使用の貯蔵試薬およびピペットチップを使用する。
すべての標準品およびサンプルは、二回アッセイすることを薦める。
試薬および緩衝液の微生物混入を避ける。これは、アッセイの感受性を妨害し得る。大量の蛋白質を含む緩衝液は、滅菌条件で調製し、２〜８℃で保存するか、または毎日新たに調製する。
【０１４７】
安全上のご注意
このキットで使用するために提案される停止溶液は、酸溶液である。この物質を使用する場合、目、手、顔、および衣類の保護具を着用する。
【０１４８】
結果の計算
各標準品、コントロール、およびサンプルについて２回の読み取り値を平均し、平均ゼロ標準光学密度を差し引く。
４個のパラメーター・ロジスティック(４−ＰＬ）適合曲線を得ることができるコンピューターソフトを用いて、データを還元することによって標準曲線を作成する。別法として、ｘ軸の濃度に対するｙ軸上の各標準品に対する平均吸収をプロットすることによって標準曲線を作って、グラフ上の点を通る最適合曲線を描く。データは、Ｏ．Ｄ．のｌｏｇに対するＩＧＦ−Ｉ濃度のｌｏｇをプロットすることによって直線化され得て、最適曲線は、回帰分析によって決定されうる。この手順は、適切ではあるが精度が劣るデータの適合を与える。サンプルが希釈されているなら、標準曲線から読み取った濃度は、希釈因子によって多様である。
【０１４９】
典型的なデータ
この標準曲線は、実験目的のためのみである。
標準曲線は、アッセイされたサンプルの各セットのために作られるべきである。
以下のグラフは、このマウスＩＧＦ−ＩのＤｕｏＳｅｔを用いた場合に得られる典型的なデータを表す。該標準曲線は、コンピューターから得られた４−ＰＬ適合曲線を用いて計算された。
【表１】
2007536282.tif 000006
【０１５０】
特異性
５０ｎｇ／ｍＬの組み換えマウスのＩＧＦ−ＩＩを含むサンプルをアッセイし、交差反応性または干渉を全く示さなかった。
２５ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトＩＧＦ−Ｉを含むサンプルは、６３ｐｇ／ｍＬとして読み取る（０．２％交差反応性）。
【０１５１】
校正
このＤｕｏＳｅｔは、Ｒ＆Ｄシステムズで生産され、高度に精製した大腸菌で発現した組み換えマウスのＩＧＦ−Ｉに対して校正される。
【０１５２】
1血清サンプルをアッセイするために、それぞれの研究室は、その独自の血清希釈液を開発およびバリデートするべきである。血清希釈液は、検出抗体またはストレプトアビジン−ＨＲＰを希釈するために使用してはいけない。
2個別の結果は、技術、プラスチック器および水源の違いのために変更しうる。
3但しこれは、キットの期限日以内である。
4最初の再構成後、すべての成分を最低１５分間穏やかに攪拌しながら置いておく。作業希釈液は、調製し、すぐに使用するべきである。
5コスターＥＩＡプレート（カタログ番号2592）が推奨される。
Ｒ＆Ｄシステムズ社、６１４ マッキンリー・プレイス ＮＥ、ミネアポリス、ミネソタ州 55413 アメリカ合衆国
1-800-343-7475
Tel: (612) 379-2956
Fax: (612) 656-4400
Ｒ＆Ｄシステムズ社・ヨーロッパ １９ バートンレーンアビントン・サイエンスパークアビントン, ＯＸ１４ ３ＮＢ 英国
Tel: +44 (0)1235 529449
Fax: +44 (0) 1235 533420
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】図１は、骨芽細胞増殖アッセイにおいて、初代骨芽細胞培養液中のチミジン導入の量に対するＡＯＤ９６０４の濃度の棒グラフ。
【図２】図２は、実施例２のための実験計画の概要およびスケジュール。
【図３】図３は、実施例２に従う１２週の処置後のすべての処置群の骨塩密度（ＢＭＤ） ａ）腰椎（Ｌ４＋Ｌ５）、ｂ）大腿。
【図４】図４は、卵巣摘出モデルを試験する、ａ）腰椎（Ｌ４＋Ｌ５）およびｂ）大腿の骨塩密度（**ｐ＜０．０５で評価した有意差、***ｐ＜０．１で評価した傾向）。
【図５】図５は、ＯＶＸコントロールを薬物処置群と比較する、ａ）腰椎（Ｌ４＋Ｌ５）（ＬＡＯＤに対するＯＶＸ、０．０７５，０．０５、およびｂ）大腿（０．１，０．０１）のＢＭＤ（*ｐ＜０．０１で評価した有意差、**ｐ＜０．０５で評価した有意差、***ｐ＜０．１で評価した傾向）。
【図６】図６は、すべての処置群のＡ）最終応力、Ｂ）破断ひずみを比較する右大腿についての三点曲げの結果（*は、ｐ＜０．０１での有意差を示し、**は、ｐ＜０．０５での有意差を示す）。
【図７】図７は、すべての処置群のＡ）破断までの規格化したエネルギー、Ｂ）弾性率を比較する右大腿についての三点曲げの結果（*は、ｐ＜０．０１での有意差を示し、**は、ｐ＜０．０５での有意差を示す）。
【図８】図８は、すべての処置群のＡ）破断までの規格化したエネルギー、Ｂ）弾性率を比較するＬ５の椎骨圧縮（**は、ｐ＜０．０５での有意差を示す）。
【図９】図９は、大腿骨頸部の力学的性質：Ａ）最終応力（Ｎ）、Ｂ）破断変形（ｍｍ）。*は、ｐ＜０．０１での有意差を表し、**は、ｐ＜０．０５での有意差を表し、***は、ｐ＜０．１の傾向を表す。
【図１０】図１０は、大腿骨頸部の力学的性質：Ａ）破断までのエネルギー（ｍＪ）、Ｂ）剛性（ＭＰａ）、*は、ｐ＜０．０１での有意差を表し、**は、ｐ＜０．０５での有意差を表し、***は、ｐ＜０．１の傾向を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2007536282.tif 000016
【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年12月27日(2006.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2007536282.tif 000029
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