(57)【要約】  本発明は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）突然変異体をコードする核酸配列、その変異酵素自体およびこれらの酵素を用いて、改変されたアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）をコードする遺伝子を発現する特定のホスト中での分枝アミノ酸の発酵的製造方法に関する。
2007506407.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１または配列番号３による核酸配列；
ｂ）それぞれＡｓｐおよびＰｈｅをコードする塩基トリプレット２１位および２２位を含有する核酸配列；
ｃ）ストリンジェントな条件下でａ）またはｂ）の核酸配列とハイブリダイズする核酸配列；
ｄ）ａ）またはｂ）の核酸配列と少なくとも７０％のホモロジーを有する核酸配列；
ｅ）ａ）またはｂ）によりコードされるポリペプチドとアミノ酸レベルにおいて少なくとも８０％のホモロジーを有するポリペプチドをコードする核酸配列；
ｆ）ａ）またはｂ）によりコードされるポリペプチドと比較して、改善された活性および／または選択性および／または安定性を有するポリペプチドをコードする核酸、この場合、この核酸は、
ｉ）ａ）またはｂ）の核酸を突然変異させ、
ｉｉ）ｉ）で得られた核酸配列を、適したベクターとライゲートし、その後に適した発現系中に形質転換させ、かつ、
ｉｉｉ）改善された活性および／または選択性および／または安定性を有する特定のポリペプチドを発現および検出させることにより製造されるものであって、
ｇ）ポリヌクレオチド配列ａ）〜ｆ）の少なくとも１５個の連続する塩基を含有するポリヌクレオチド
から成る群から選択された、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）活性を有するポリペプチドをコードする、単離された核酸配列。
【請求項２】
ａ）請求項１に記載の核酸配列によりコードされたポリペプチド；
ｂ）配列番号２または配列番号４による配列を有するポリペプチド；
ｃ）配列番号２または配列番号４を有するポリペプチドと少なくとも８４％のホモロジーを有し、配列番号２または配列番号４を有するポリペプチドと比較して、ポリペプチドの活性および／または選択性および／または安定性が本質的に減少していない、ポリペプチドから成る群から選択されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載の一つまたはそれ以上の核酸配列を含有するプラスミド、ベクター、微生物。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸配列をＰＣＲ法により製造するためのプライマーまたは請求項１に記載の核酸配列を検出するためのハイブリダーゼーションプローブ。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸配列から出発する、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）活性を有する改善されたｒｅｃ−ポリペプチドを製造するための方法において、
ａ）核酸配列を突然変異させ、
ｂ）ａ）により得ることが可能な核酸配列を、適したベクター中でクローニングし、かつこれらを適した発現系中にトランスファーし、かつ、
ｃ）改善された活性および／または選択性および／または安定性を有する形成されたポリペプチドを検出し、かつ単離する、
ことを特徴とする、請求項１に記載の核酸配列から出発する、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）活性を有する改善されたｒｅｃ−ポリペプチドを製造するための方法。
【請求項６】
請求項５により得ることが可能なｒｅｃ−ポリペプチドまたはこれをコードする核酸配列。
【請求項７】
エナンチオ濃縮された分枝アミノ酸を製造するための、請求項２から６までのいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項８】
アミノ酸生成微生物を製造するための、請求項１から６までのいずれか１項に記載の核酸配列の使用。
【請求項９】
請求項２のポリペプチドを使用する、分枝アミノ酸を製造するための方法。
【請求項１０】
ベクターｐＥＣＫＡまたはｐＥＣＫＡ／ｉｌｖＢＮＣ。
【請求項１１】
微生物：ＤＳＭ１５６５２、ＤＳＭ１５６５１、ＤＳＭ１５６５０。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の核酸およびその核酸によりコードされるポリペプチドならびにその適用に関する。本発明のポリペプチドは、分枝アミノ酸の発酵的製造の改善に役立つものである。特に本発明は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）変異体をコードする核酸配列、その変異酵素自体およびその酵素を用いての、改質化されたアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）をコードする遺伝子を発現する特定のホスト中での分枝アミノ酸の発酵的製造方法を提供する。
【０００２】
アミノ酸が、コリネ型細菌、特にCorynebacterium glutamicum菌株の発酵によって製造できることは知られている。その重要性により、常に製造方法を改善するための努力がなされている。方法の改善は発酵技術についての尺度、たとえば撹拌および酸素供給、あるいは栄養媒地の組成、たとえば発酵中の糖濃度に関するものであるか、あるいは、たとえばイオン交換クロメトグラフィーによる生成物の後処理、あるいは微生物自体の固有の性能特性に関するものである。
【０００３】
これらの微生物の性能特性は、突然変異、選択および変異選択の方法を用いて改善される。この方法において、菌株は、代謝拮抗物質、たとえば、イソロイシン類似物質イソロイシンヒドロキシメート（Kisumi M, Komatsubara S, Sugiura, M, Chibata I (1972) Journal of Bacteriology 110: 761-763）、バリン類似物質２−チアゾールアラニン（Tsuchida T, Yoshinanga F, Kubota K, Momose H (1975) Agricultural and Biological Chemistry, Japan 39: 1319-1322）またはロイシン類似物質α−アミノブチレート（Ambe-Ono Y, Sato K, Totsuka K, Yoshihara Y, Nakamori S (1996) Bioscience Biotechnology Biochemistry 60: 1386-1387）に対して耐性の菌株が得られるか、あるいは、調節的顕著な代謝物質に関して栄養要求性であり、かつ、たとえば分枝アミノ酸を製造する菌株が得られる（Tsuchida T, Yoshinaga F, Kubota K, Momose H, Okumura S (1975) Agricultural and Biological Chemistry; Nakayama K, Kitada S, Kinoshita S (1961) Journal of General and Applied Microbiology, Japan 7; 52-69; Nakayama K, Kitada S, Sato Z, Kinoshita (191) Journal of General and Applied Microbiology, Japan 7: 41-51）。
【０００４】
数年に亘って、組換えＤＮＡ技術はさらに分枝アミノ酸のための独立した生合成遺伝子を複製し、かつ、その製造における作用を研究することによって、分枝アミノ酸を製造するコリネバクテリウムの菌株を改良するために使用されている。これに関する文献としては、特にKinoshita（“Glutamic Acid Bacteria”,in: Biology of Industrial Microorganisms, Demain and Solomon (eds.), Benjamin Cummings, London, UK, 1985, 115-142）、Hilliger（Biotec 2, 40-44 (1991), Eggeling (Amino Acids 6: 261-272 (1994)）、JettenおよびSinskey（Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995)）、Sahmら（Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)）およびEggelingら（Journal of Biotechnology 56: 168-180 (1997)）が挙げられる。
【０００５】
特に分枝アミノ酸であるＬ−イソロイシン、Ｌ−バリンおよびＬ−ロイシンは、ヒト薬学分野および動物栄養学分野において使用されている。細菌中の全部で３種のアミノ酸の合成に関して鍵となる酵素は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）である。これは、３種のアミノ酸の前駆体を生じる２種の反応を触媒するものである。
【０００６】
バリンおよびロイシンの生合成経路において、ＡＨＡＳのための基質はピルベートである。ＡＨＡＳは、ピルベートおよびピルベート第２分子とのその縮合物の脱カルボキシル化を触媒し、アセトラクテートを製造する。イソロイシン経路において、ＡＨＡＳはピルベートおよび２−ケトブチレートの反応を触媒し、アセトヒドロキシブチレートを製造する。Escherichia coli 菌株においては３種ほどのＡＨＡＳイソ酵素が存在する。イソ酵素の活性は、アミノ酸の組合せによって阻害され、これによればバリンによる阻害が最も強いものとなる（De Felice, M. Levinthal, M., Iaccarino, M., Guardiola, J., 1979. Growth inhibition as a consequence of antagonism between related amino acids: effect of valine in Escherichia coli K12. Microbiol Rev 43, 4258）。遺伝子ｉｌｖＢＮによってコードされるＡＨＡＳ  Ｉは、バリンおよびイソロイシンによって阻害され、ｉｌｖＧＭによってコードされるＡＨＡＳ  ＩＩはバリン耐性であり、かつ、ｉｌｖＩＨによってコードされるＡＨＡＳ  ＩＩＩは、バリンおよびイソロイシンによって阻害される。すべての場合において、酵素は２個のサブユニットから構成される。ＡＨＡＳ  ＩおよびＡＨＡＳ  ＩＩＩ中で、遺伝子ｉｌｖＮおよびｉｌｖＨによってコードされる小さい調節サブユニットは、それぞれ阻害に関与する。
【０００７】
Ｅ．ｃｏｌｉとは対照的に、ｉｌｖＢＮは、C. glutamicum（Keilhauer, C., Eggeling, L., Sahm, H., 1993. Isoleucine syntehsis in Corynebacterium glutamicum: molecular analysis of the ilvB-ilvN-ilvC オペロン.J.Bacteriol. 175, 5595-5603）中でＡＨＡＳのみをコードする。C. glutamicumの酵素の活性は、バリン、ロイシンおよびイソロイシンによって阻害される（Eggeling, I., Cordes, C., Eggeling, L., Sahm, H., 1987. Regulation of acetohydroxy acid synthetase in corynebacterium glutamicum during fermentation of alfaketobutyrate to L-isoleucine. Appl Microbiol Biotechnol 25, 346-351）。遺伝子クラスタｉｌｖＢＮＣの発現はさらに、これらの３種のアミノ酸によって、転写減衰により調整される（Morbach, S., Junger, C., Sahm, Corynebacterium glutamicum: evidence of leader peptide formation without the presence of ribosome binding site. J Biosci Bioeng 90, 501-507）。
【０００８】
Corynebacterium glutamicumにおいて、ＡＨＡＳ活性を脱調節する変異体については、今日まで分子レベルでは報告されていない。
【０００９】
本発明の対象は、改変されたアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）を提供することである。特に本発明によるＡＨＡＳは、製造されたアミノ酸による阻害を減ずる傾向にあるものであってもよい。
【００１０】
本発明の課題は、請求の範囲により充足される。請求項１は、所望の特徴を有するポリペプチドをコードする特定の核酸に関する。請求項２は、ポリペプチド自体に関する。請求項３および４は、本発明の核酸を含有するか、あるいは、ＰＣＲによって本発明による核酸を製造するための特異的プライマーまたはプローブを開示するものである。さらに請求項５には、本発明のさらに改善されたポリペプチドを製造するための方法を示し、その一方で請求項６では、このようにして製造されたポリペプチドおよび核酸をそれぞれ保護するものである。請求項７および８は特定の使用に関し、かつ請求項９はアミノ酸の製造方法に関するものである。同様に請求項１０および１１は、特定のベクターおよび微生物を提供する。
【００１１】
ａ）配列番号１または配列番号３による核酸配列；
ｂ）それぞれＡｓｐおよびＰｈｅをコードする塩基トリプレット２１位および２２位を含有する核酸配列；
ｃ）ａ）またはｂ）の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列；
ｄ）ａ）またはｂ）の配列と少なくとも７０％のホモロジーを有する核酸配列；
ｅ）ａ）またはｂ）によりコードされたポリペプチドと、アミノ酸レベルで、少なくとも８０％のホモロジーを有するポリペプチドをコードする核酸、
ｆ）ａ）またはｂ）によりコードされたポリペプチドと比較して、改善された活性および／または選択性および／または安定性を有するポリペプチドをコードするための核酸、この場合、これは、
ｉ）ａ）またはｂ）の核酸を変異させ、
ｉｉ）ｉ）により得られる核酸配列を、適したベクター中にライゲートし、その後に適した発現系で形質転換をおこない、かつ、
ｉｉｉ）改善された活性および／または選択性および／または安定性を有する特定のポリペプチドの発現および検出をおこなうことにより得られるものであって；
ｇ）ａ）〜ｆ）の核酸配列の少なくとも１５個の連続する塩基を含有する核酸配列：
から成る群から選択された、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列を提供することによって、前記の技術水準から公知の障害を、驚くべきことに優れた様式で克服する。本発明の核酸は、野生型酵素に対して、アミノ酸フィードバック阻害を減少させたポリペチドをコードするものである。
【００１２】
突然変異法を用いての、本発明による核酸またはこれによりコードされるポリペプチドを改善するための方法は、当業者にとって十分に知られている。突然変異の適した方法は、当業者に対してこの目的のために利用可能な方法のすべてであるといえる。特に、これらは飽和変異（saturation mutagenesis）、ランダム突然変異、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  組換法および部位指定変異を含む（Eigen, M. and Gardiner, W., Evolutionary molecular engineering based on RNA replication, pure Appl. Chem. 1984, 56, 967-978; Chen, K. and Arnold, F., Enzyme enginnering for non-aqueous solvents: random mutagenesis to enhance activity of subtilisin E in polar organic media. Bio/Technology 1991, 9, 1073-1077; Hortwitz, M. and Loeb, L., Promoters Selected From Random DNA-Sequences, Proc Natl Acad Sci USA 83, 1986, 7405-7409; Dube, D. and L. Loeb, Mutants Generated By The Insertion Of Random Oligonuckeotides Into The Active-Site Of The Beta-Lactamase Gene, Biochemistry 1989, 28, 5703-5707; Stemmer, P.C,, Rapid evolution of protein in vitro by DNA shuffling, Nature 1994, 370, 389-391 and Stemmer, P.C., DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution. Proc Natl acd Sci USA 91, 1994, 10747-10751）。
【００１３】
得られた新規核酸配列は、ホスト微生物中で、以下に示す常用の方法を用いてクローニングし、かつこの方法で発現したポリペプチドを検出し、その後に適したスクリーニング方法を用いて単離した。検出の目的のために、このポリペプチドで形成された分子に関して考えられうるすべての検出反応は、原則として適している。特に、形成された化合物（たとえばアセトラクテート）または消費された化合物による光度測定試験、ＨＰＬＣまたはＧＣ法を、ここで、形成されたアミノ酸を検出するために使用することができる。さらに、遺伝子工学技術、検出のためのゲル電気泳動法または抗体を用いる検出方法によって改質化された新規ポリペプチドを検出することはさらに適している。
【００１４】
前記に示したように、さらに本発明は、本発明による一本鎖核酸配列またはこれらと相補的な一本鎖核酸配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列に関する。「ストリンジェントな条件下で」の表現は、ここではＳａｍｂｒｏｏｋら（Sambrook, J.; Fritsch, E. F. and Manistis, T. (1989), Molecular cloning; a laboratory manual, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）で記載された同様の方法であると理解される。本発明によるストリンジェントなハイブリダイゼーションとは、好ましくは、１×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）および０．１％ＳＳＤ（ドデシル硫酸ナトリウム）を用いて、５０℃で、好ましくは５５℃で、より好ましくは６２℃で、さらに好ましくは６８℃で１時間に亘ってインキュベーションした後に、かつより好ましくは０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで、５０℃で、好ましくは５５℃で、より好ましくは６２℃で、かつ最も好ましくは６８℃で１時間に亘ってインキュベーションした後に、ポジティブなハイブリダイゼーションシグナルが依然として観察されることを意味する。
【００１５】
本発明の第２の対象は、
ａ）請求項１による核酸配列によってコードされたポリペプチド；
ｂ）配列番号２または配列番号４による配列を有するポリペプチド；
ｃ）配列番号２または配列番号４を含むポリペプチドと、少なくとも８４％のホモロジーを有し、その際、配列番号２または配列番号４を含むポリペプチドと比較して、活性および／または選択性および／または安定性が、本質的に減少することのないポリペプチド；から成る群から選択されたポリペプチドであり、この場合、これらは、分枝アミノ酸、特にバリン、ロイシンおよびイソロイシンの発酵による製造において、生体経路において改質化されたＡＨＡＳ−酵素として役立ちうるものである。前記のようにこれらの酵素は、より少ないフィードバック阻害を有するため、不都合な阻害作用を有することなく、発酵ブロス中で高濃度のアミノ酸を生成することが可能である。
【００１６】
本発明の第３の対象は、１個またはそれ以上の本発明による核酸配列を含むプラスミド、ベクター、微生物に関する。適したプラスミドまたはベクターは、原則としてこの目的のために当業者に公知の使用可能なすべての態様である。これらの型のプラスミドおよびベクターは、たとえばＳｔｕｄｉｅｒら（Studier, W. F.; Rosenberg A.H.; Dunn J.J.; Dubendroff J. W.;, Use of the T7 RNA polymmerase to direct expression of cloned genes, Mothds Enzymol. 1990, 185, 61-89）またはＮｏｖｅｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＣｌｏｎｔｅｃｈまたはＧｉｂｃｏ  ＢＲＬによって発行された企業パンフレットで見いだすことができる。他の好ましいプラスミドおよびベクターは、Glover,D.M.(1985), DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R. L. and Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V., Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 1990, 185, 3-7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2ｎｄ ed., Cold Spring Harbor laboratory Press, New York．で見いだされる。本発明による核酸を含有する遺伝子コンストラクトを、ホスト微生物中で極めて好ましい方法でクローニングすることができるプラスミドは、図１および図２のものである。
【００１７】
同様に、さらに本発明は、１個またはそれ以上の本発明による核酸配列を含有する微生物を提供する。
【００１８】
本発明による核酸配列がクローニングされたプラスミドを含む微生物を、多重的に使用し、かつ組換え酵素の十分な量を得ることが可能である。この目的のために使用される方法は当業者に公知である（Sambrook, J.; Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。微生物は、原則として、この目的のために適した当業者に公知のすべての微生物であってもよく、たとえば、酵母、たとえばHansenula polymorpha、Pichia sp.、 Saccharomyces cerevisiae、原核生物、E.coli、Bacillus subtilisまたは真核生物、たとえば、ほ乳類細胞、昆虫細胞が、この目的のために好ましくは使用される。Ｅ．Ｃｏｌｉの菌株は、好ましくはこの目的のために使用される。以下は特に好ましい：Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＸＬ１  Ｂｌｕｅ、ＮＭ５２２、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９、ＪＭ１０５、ＲＲ１、ＤＨ５α、ＴＯＰ１０−またはＨＢ１０１。本発明による核酸を含有する遺伝子コンストラクトを有するプラスミドは、好ましくは前記に示したホスト微生物中でクローニングされる。
【００１９】
本発明により提供される好ましい微生物は、グルコース、スクロース、ラクトース、マンノース、フラクトース、マルトース、糖蜜、デンプン、セルロースから、あるいはグリセロールおよびエタノールから、分枝アミノ酸を製造することができる。微生物は、典型的にはコリネ型細菌、特にCorynebacterium属のものである。Corynebacterium属の範囲内で、Corynebacterium Glutamicumが特に挙げられてもよく、この場合、これらはエナンチオ濃縮アミノ酸、特にＬ−アミノ酸を製造するその能力に関して専門家の間ではよく知られている。
【００２０】
Corynebacterium属、特にCorynebacterium glutamicum種の特に適した菌株は、特に野生型菌株
【００２１】
【化１】
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および分枝アミノ酸製造突然変異体またはこれから製造された菌株であり、たとえばイソロイシン生成菌株
【００２２】
【化２】
2007506407.tif 000004
たとえば、ロイシン生成菌株
【００２３】
【化３】
2007506407.tif 000005
たとえば、バリン生成菌株
【００２４】
【化４】
2007506407.tif 000006
である。
【００２５】
本発明による核酸配列は、適したホスト中で過剰発現されてもよい。過剰発現は、相当する遺伝子のコピー数の増加によってか、あるいは、構造遺伝子の上流に位置するプロモーターおよび調節領域またはリボソーム結合部位を変異させることによって達成することができる。構造遺伝子より上流に導入された発現カセットも同様に作用する。付加的に、分枝アミノ酸の発酵製造中に誘導可能なプロモーターによって、発現を増加させることも可能である。さらに発現は、ｍＲＮＡの寿命を延長させるための尺度によって改善される。さらに酵素活性は、酵素タンパク質の変性を防止することによって増幅させる。遺伝子または遺伝子コンストラクトは、プラスミド中で可変のコピー数で存在していてもよいか、あるいは、染色体中にインテグレートされ、かつ増幅されてもよい。二者択一的に、考えられうる遺伝子の過剰発現はさらに、栄養培地の組成および培養条件を改質化することによって達成されうる。これに関してはさらにＵＳ０９／４７１８０３またはその同等物ＤＥ１９９５１７０８に記載されている。
【００２６】
ＰＣＲを用いての製造のためのプライマーであるか、あるいは、本発明の核酸配列を検出するためのハイブリダイゼーションプローブについては以下に記載する。本発明による核酸配列は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびＤＮＡのためのハイブリダイゼーションプローブとして、ＡＨＡＳタンパク質をコードする完全長ｃＤＮＡを単離し、かつその配列が、本発明の配列と高いレベルでの同一性を示すｃＤＮＡまたは遺伝子を単離するのに適している。
【００２７】
さらに本発明による核酸配列は、プライマーとして適しており、この場合、このプライマーにより、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のすべての型を用いて、ＡＨＡＳタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡを製造することができる。相当するアミノ酸配列をコードするセンスまたはアンチセンスプライマーまたは相補的ＤＮＡ配列が含まれる。適したプライマーは、原則として当業者に公知の方法で得ることができる。本発明によるプライマーのデザインは、公知のＤＮＡ配列との比較によってか、あるいは、微生物の好ましいコドンを考慮して検出されたアミノ酸配列を翻訳することによって実施される（たとえば、Streptomyces: Wright F. and Bibb M. J. (1992), Codon usage in the G+C-rich Streptomyces genome, Gene 113, 55-65）。いわゆるスーパーファミリーからのタンパク質のアミノ酸配列中の一般的な特徴は、さらにこれに関して使用される（Firestine, S. M.; Nixon, A. E.; Benkovic, S. J. (1996), Threading your way to protein function, Chem. Biol. 3, 779-783）。これに関する他の記載は、Gait, M. J. IRL Press Ltd., Oxford; Innis, M. A.; Gelfound, D. H.; Sninsky, J.J. and White, T. J. (1990), PCR Protocols: A guide to methods and applications, Academic Press Inc., San Diego.で見いだすことができる。以下のプライマーは特に好ましい：
【００２８】
【化５】
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プローブまたはプライマーとして作用するこのような核酸配列は、少なくとも３０、好ましくは少なくとも２０、特に好ましくは少なくとも１５の連続する核酸を、通常は本発明の核酸配列中に有する。少なくとも４０または５０塩基対の長さの核酸配列もまた適している。
【００２９】
本発明の他の実施態様は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）活性を有する改善されたｒｅｃ−ポリペプチドを、本発明による核酸配列から出発して製造するための方法に関し、この場合、この方法は、
ａ）核酸配列を突然変異させ、
ｂ）ａ）から得られた核酸配列を、適したベクター中でクローニングし、かつこれらを適した発現系にトランスファーし、かつ、
ｃ）改善された活性および／または選択性および／または安定性を有するポリペプチドを形成し、検出し、かつ単離することを特徴とする。
【００３０】
さらに本発明は、ｒｅｃ−ポリペプチドまたはこれをコードする核酸配列を提供し、この場合、これらは、前記に示す方法によって得ることができるものである。改善されたｒｅｃ−ポリペプチドおよびそのホスト中での発現を製造するのに必要とされる核酸配列の製造は、以前および本明細書中で示す。
【００３１】
本発明によるポリペプチドおよび改善されたｒｅｃ−ポリペプチドは、好ましくは、エナンチオ濃縮分枝アミノ酸、より好ましくはバリン、ロイシンおよびイソロイシンを製造するために使用される。さらに核酸配列および改善された核酸配列は、好ましくは、分枝アミノ酸生成微生物を製造するために使用されてもよい。
【００３２】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドを用いての分枝アミノ酸の製造方法に関する。
【００３３】
ベクターｐＥＣＫＡ（図１）またはｐＥＣＫＡ／ｉｌｖＢＮＣ（図２）は、本発明による包含されるものである。さらに改質化された微生物、たとえばＤＳＭ１５６５２、ＤＳＭ１５５６１またはＤＳＭ１５６５０も本発明中に包含される。これらは、ブタペスト条約（2003 June 04）にしたがって、Deutsche Sammlng fuer Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweigに寄託されているものである。
【００３４】
ｉｌｖＢＮＣオペロンを含有するｉｌｖＮ遺伝子中の突然変異体のクローニングのために、シャトルベクターＥ．Ｃｏｌｉ−Corynebacterium glutamicumが構築される。最初に制限酵素ＢｇｌＩＩのための再構築部位をベクターｐＫ１９から除去する。その後に、Brevibacterium lactofermentuｍからのプラスミドｐＢＬ１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＨｉｎｄＩＩフラグメント（２．７ｋｂ）を、ｐＫ１９のＮｈｅＩ部位にクローニングした。得られたプラスミドベクターｐＥＣＫＡ（５．４ｋｂ）をＥ．ＣｏｌｉおよびCorynebacterium glutamicum中で複製し、７個の特有のクローニング部位、カナマイシン耐性マーカーおよびβ−ガラクトシダーゼのα−相補性がＥ．Ｃｏｌｉ中のクローニングのために得られた。ｉｌｖＢＮＣオペロンを有する染色体フラグメントＳｓｐＩ／ＥｃｏＲＩ（５．７ｋｂ）（ＳｓｐＩ＋ＢａｍＨＩ末端を有する）を、ＨｉｎｄＩＩ＋ＢａｍＨＩ−消化ベクター中でクローニングし、ｐＥＣＫＡｉｌｖＢＮＣ（１１．１ｋｂ）を製造した。
【００３５】
ｉｌｖＢＮＣオペロン（７７０ｂｐ）の天然ＳｃａＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントを、部位指定突然変異によって構築された３〜５塩基の交替物（alteration）を含有する同様のフラグメントを用いて交換した。部位指定突然変異のための標的は、Ｎ末端近くのｉｌｖＮによってコードされる調節サブユニットの保存領域である。突然変異は、Ｅ．ＣｏｌｉおよびStreptomyces cinnamonensis AHAS突然変異体の配列にしたがって、ＰＣＲによってデザインされる。突然変異はシークエンシングにより検出される。
【００３６】
プラスミドＤＮＡは、Ｅ．Ｃｏｌｉから単離され、かつ、菌株Corynebacterium glutamicum  ＡＴＣＣ１３０３２△ｉｌｖＮを、プラスミドｐＥＣＫＡｉｌｖＢＮＣ（ＷＴ）、ｐＥＣＫＡｉｌｖＢＮＣ（Ｍ８）およびｐＥＣＫＡｉｌｖＢＮＣ（Ｍ１３）用いて形質転換した。分枝アミノ酸によるＡＨＡＳ阻害の減少が証明された。
【００３７】
「単離された」とは、その天然の環境から分離されることを意味する。場合によって濃縮された（エナンチオ濃縮、エナンチオマー濃縮）化合物は、本発明の範囲内において、他の対掌体と混合された１個の光学的対掌体が＞５０モル％存在することを意味するものである。
【００３８】
意図する発現核酸配列は、すべての型の一本鎖または二本鎖ＤＮＡさらにはＲＮＡまたはこれらの混合物を含む。
【００３９】
活性および／または選択性および／または安定性の改善は、本発明によれば、ポリペプチドがより高い活性および／またはより高い選択性および使用した反応条件下でのより高い安定性を意味する。その一方で、個々の適用のための酵素の活性および安定性は、本来は可能な限り高くあるべきであり、選択性関しては、改善は、物質選択性が減少するかまたは酵素のエナンチオ選択性が増加する場合に関する。発現に関しては、本質的には減少しないが、これに関連して使用する場合には、同様の定義を必要な変更を加えて適用する。
【００４０】
請求されたタンパク質配列および核酸配列は、さらに本発明によれば、これらの配列の一つに対して９１％を上廻る、好ましくは９２％、９３％または９４％を上廻る、より好ましくは９５％または９６％を上廻る、かつ特に好ましくは９７％、９８％または９９％を上廻るホロモジーを有し、このような配列の作用様式または目的が保持される。ここで使用する表現「ホモロジー（または同一性）」は、方程式Ｈ（％）＝［１−Ｖ／Ｘ］×１００により定義され、その際、Ｈはホモロジーを意味し、Ｘは、比較可能な配列中の核酸塩基／アミノ酸の全数を意味し、かつＶは比較可能な配列に対して考慮されるべき配列中の種々の核酸塩基／アミノ酸の数である。それぞれの場合において、ポリペプチドをコードする核酸配列の用語は、すべての、遺伝子コードの縮重により生じる場合のあるすべての配列を含む。
【００４１】
前記に引用された刊行物は、本明細書中の開示の範囲内に含まれるものとする。
【００４２】
実施例
１．プラスミドベクターｐＥＣＫＡの構築
ｉｌｖＮ遺伝子における変異を含むC.glutamicumｉｌｖＢＮＣオペロンのクローニングおよびその過剰発現のために、Ｅ．ＣｏｌｉおよびCorynebacterium glutamicum中で複製されたシャトルベクターを構築した。最初に、制限酵素ＢｇｌＩＩに対する組換え部位を、ベクターｐＫ１９（Pridmore, R. D., 1987. New and versatile cloning vectors with kanamycin-resistance marker. Gene 56, 309-312）から除去した。プラスミドｐＫ１９をＢｇｌＩＩで消化し、クレノー酵素により平滑末端とし、かつ再度ライゲーションをおこなった。ライゲーションの後に、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞を、ライゲーション混合物で形質転換し、かつ、得られたプラスミドｐＫ１９Ｂを含有する形質転換体を、カナマイシン（２０ｍｇ／ｌ）を含有するアガープレート上で選択した。ｐＫ１９Ｂ中のＢｇｌＩＩ部位の除去を、単離されたプラスミドのＢｇｌＩＩでの処理によって確認した（この除去によって、ｉｌｖＮ遺伝子を有するフラグメントの新規に構築されたベクターｐＥＣＫＡへの後のサブクローニングを可能にする）。その後に、Brevibacterium lactofermentumからのプラスミドｐＢＬ１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＨｉｎｄＩＩフラグメント（２．７ｋｂ）であって、クレノー酵素により平滑末端化したものを、ｐｋ１９Ｂの平滑末端ＮｈｅＩ部位にクローニングした。得られたプラスミドベクターｐＥＣＫＡ（５．４ｋｂ）を、Ｅ．ＣｏｌｉおよびCorynebacterium glutamicum中で複製し、７個の固有のクローニング部位（HindII, SalI, BamHI, SmaI, AvaI, KpnI, SacI）、カナマイシン耐性マーカーおよびβ−ガラクトシダーゼのα−相補性がＥ．Ｃｏｌｉ中でのクローニングのために提供された。その制限酵素マップおよび遺伝子マップについては図１に示す。
【００４３】
２．ｉｌｖＢＮＣオペロンのベクターｐＥＣＫＡ中へのクローニング
ｉｌｖＢＮＣオペロンを有するCorynebacterium glutamicum染色体の５．７−ｋｂフラグメントを、プラスミドｐＫＫ５（Keilhauer, C., Eggeling, L., Sahm, H., 1993. Isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicum: molecular analysis of the ilvB-ilvN-ilvC operon. J.Bacteril. 175, 5595-5603）を、制限酵素ＳｓｐＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化することによって得られた。フラグメントをＨｉｎｄＩＩ＋ＢａｍＨＩ−消化ベクターｐＥＣＫＡを用いてライゲーションし、かつライゲーション混合物をＥ．ＣｏｌｉＤＨ５αの形質転換のために使用した。形質転換体はカナマイシン（３０ｍｇ／ｌ）を含有するアガープレート上で選択した。得られたプラスミドｐＥＣＫＡｉｌｖＢＮＣ（１１．１ｋｂ）の構造を、制限酵素分析により確認した。プラスミドｐＥＣＫＡｉｌｖＢＮＣの制限酵素マップおよび遺伝子マップについては図２に示す。
【００４４】
３．ｉｌｖＮ遺伝子突然変異のためのオリゴヌクレオチドプライマーのデザイン
C. glutamicumｉｌｖＮ遺伝子（GenBank受託番号L09232）によってコードされるＡＨＡＳの調節サブユニットの公知アミノ酸配列は、Streptomyces cinnamonensis（GenBank受託番号AF175526）およびE. coli（GenBank受託番号AE016769、完全なゲノムのセクション１５）からのＡＨＡＳの調節サブユニットの公知アミノ酸配列でアライメントした。E.coliおよびStreptomyces cinnamonensisのバリンに対する耐性を有する種々の突然変異が記載されている（Vyazmensky, M., Sella, C., Barak, Z., Chipman, D.M., 1996. Isolation and characterization of subunits of acetohydroxy acid synthase isozyme III and reconstitution of the holoenzyme. Biochemistry 35, 10339-10346: Kopecky, J., Janata, J., Pospisil, S., Felsberg, J., Spizek, J., 1999. Mutations in two distinct regions of acetolactate synthase regulatory subunit from Streptomyces cinnamonensis result in the lack of sensitivity to end- product inhibition. Biochem Biophys Res Commun 266, 162-166）。この表現系を示すいくつかの菌株において、２０位（E.Coli中の番号付け）で、グリシンをアスパルテートにするアミノ酸の変異は、E.coliおよびS.cinnamonensisの双方において、タンパク質のＮ−末端近くでの部分的保存領域で見出された：
【００４５】
【化６】
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【００４６】
C. GlutamicumのｉｌｖＮ遺伝子の部位指定変異のための、変性されたオリゴヌクレオチドプライマーＩＬＶＮＭ１（配列番号７）をデザインした。このプライマーは、アミノ酸グリシン、イソロイシンおよびイソロイシンに相当するヌクレオチドトリプレットの位置で、C. glutamicum AHAS 調節サブユニット中の２０〜２２位で、ｉｌｖＮ遺伝子中に変異を導入することができる：
【００４７】
【化７】
2007506407.tif 000009
【００４８】
野生型の配列と比較して改変されたヌクレオチドは太字で示す。トリプレット２０および２２の範囲で（ＧまたはＡおよびＡまたはＴ、それぞれ）２個の改変部位を有する。
【００４９】
４．ｉｌｖＮ遺伝子の部位指定突然変異
C. GlutamicumのｉｌｖＢＮＣオペロンの天然ＳｃａＩ／ＢｇＩＩフラグメント（７７０ｂｐ）の部位指定変異は、ＰＣＲ反応および４個のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて実施した（Ito, W., Ishiguro, H., Kurosawa, Y., 1991. A general methods for introducing a series of mutations into cloned DNA using the polymerase chain reaction. Gene 102, 67-70）。
【００５０】
【化８】
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【００５１】
第１プライマー：プライマーＭＩＬＶＮＨおよびＭＩＳＢＧＬを用いて、改変された天然ＢｇｌＩＩ部位を有するフラグメントＡ（７８６ｂｐ）を増幅させた。プライマーＩＬＶＭ１およびＭＩＬＶＮＤを用いて、ｉｌｖＮ遺伝子の範囲内の突然変異を有するフラグメントＢ（４９１ｂｐ）を増幅させた。テンプレートとして、プラスミドｐＥＣＫＡｉｌｖＢＮＣを使用した。得られたＤＮＡフラグメントをアガロースゲル中で分離し、処理し、かつ沈殿によって精製させた。
【００５２】
第２プライマー：プライマーＭＩＬＶＮＨ−ＭＩＬＶＮＤおよびテンプレートフラグメントＡ＋Ｂ（モル比１：１で混合したもの）を用いて、ＢｇｌＩＩ部位での突然変異を有するフラグメントＣ（８０３ｂｐ）およびｉｌｖＮ遺伝子中での突然変異を有するフラグメントＤ（８０３ｂｐ）を増幅させた。この混合物をＳｃａＩおよびＢｇｌＩＩによって消化し、かつ得られたフラグメントをアガロースゲルから単離した。プラスミドｐＥＣＫＡｉｌｖＢＮＣは、７６６ｂｐおよび１０３３４ｂｐのフラグメントを生じる同様の酵素により消化し、かつ後者のフラグメントについてはさらにゲルから単離した。この単離されたフラグメントを混合し、かつライゲートした。Ｅ．ＣｏｌｉＤＨ５αの細胞を、ライゲーション混合物により形質転換し、かつ形質転換体を、カナマイシン（３０ｍｇ／ｌ）を含むプレート上で選択した。この方法で、プラスミドｐＥＣＫＡｉｌｖＢＮＣ中の天然のＳｃａＩ／ＢｃｌＩＩ染色体フラグメント（７６６ｂｐ）を、同様のフラグメントについて交換し、その際、ｉｌｖＮは３〜５個の改変されたヌクレオチドを含有していてもよいものである。
【００５３】
５．ｉｌｖＮの突然変異のシークエンシング
得られたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αクローンからプラスミドＤＮＡを単離し、かつプライマーＳＩＬＶＮＨおよびオートマチックシークエンサーＶｉｓｔｒａ（Amersham）を用いてシークエンシングをおこなった。
【００５４】
【化９】
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【００５５】
トリプレット２０〜２２の範囲内で２種の異なる配列を有するクローンを単離した：
【００５６】
【表１】
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突然変異体Ｍ８およびＭ１３の完全ｉｌｖＮ配列を、それぞれ配列番号３および配列番号１で示す。
【００５７】
６．C. Glutamicumの形質転換
プラスミドをＥ．Ｃｏｌｉから単離し、かつ菌株C. GlutamicumＡＴＣＣ１３０３２△ｉｌｖＮをプラスミドｐＥＣＫＡｉｌｖＢＮＣ（ＷＴ）、ｐＥＣＫＡｉｌｖＢＮＣ（Ｍ８）およびｐＥＣＫＡｉｌｖＢＮＣ（Ｍ１３）を用いて、エレクトロポレーション法で形質転換をおこなった（Liebl, W., Bayerl, A., Schein, B., Stillner, U., Schleifer, K.H., 1989. High efficiency electroporation of intact Corynebacterium glutamicum cells. FEMS Microbiol. Lett. 53, 299-303）。形質転換体は、プレート上でカナマイシン（３０ｍｇ／ｌ）を用いて選択した。
【００５８】
７．ＡＨＡＳ活性およびバリン、ロイシンおよびイソロイシンによるその阻害の測定
プラスミドｐＥＣＫＡｉｌｖＢＮＣ（ＷＴ）、ｐＥＣＫＡｉｌｖＢＮＣ（Ｍ８）およびｐＥＣＫＡｉｌｖＢＮＣ（Ｍ１３）を有する菌株C. Glutamicum ＡＴＣＣ１３０３２△ｉｌｖＮを、ＡＨＡＳの活性を測定するために使用した。細胞を、無機媒体ＣＧＸＩＩ中で一晩に亘って培養し、遠心分離によりハーベストし、かつ超音波により粉砕させた。遠心分離（１６０００ｘｇ、３０分）後に、ＡＨＡＳ活性を細胞不含のエクストラクト中で測定した。分光測定法酵素アッセイにより、間接的に反応生成物アセトラクテートを検出した（Singh, B. K., Stidham, M. A., Shaner, D. L., 1988. Assay of acetohydroxyacid synthase. Anal Biochem 171, 173-179）。このアッセイは、最終生成物アセトラクテートのアセトインへの変換およびクレアリンおよびナフトールの複合体形成を介してのアセトインの検出を含む。
【００５９】
酵素活性測定の結果は第１表に示す。バリン、ロイシンおよびイソロイシンによる酵素阻害を試験するために、３種のアミノ酸（１０ｍM）を別個に反応混合物中に添加した。結果を、第２表および第３表にそれぞれ示した。
【００６０】
【表２】
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【００６１】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明によるベクターｐＥＣＫＡを示す図
【図２】本発明によるベクターｐＥＣＫＡ／ｉｌｖＢＮＣを示す図
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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