(57)【要約】増殖性疾患を治療することができるアデノウイルスベクターと遺伝子p53との一種の組換え体遺伝子医薬は、アデノウイルスベクターとヒト腫瘍抑制遺伝子p53発現キットから構築された混合配列である。本発明において、我々は、原核細胞（大腸菌）内でアデノウイルスベクターとヒト遺伝子p53との相同組換え体を作製し、アデノウイルスベクターとヒト遺伝子p53発現キットとの組換え体遺伝子医薬を得た。ヒトp53遺伝子発現キットは、プロモーター-p53cDNA-ポリアデノシンヌクレオチドからなる特徴的な配列である。前記医薬は、ケロイドのような増殖性疾患を治療するための臨床遺伝子治療学的生成物を調製するために使用され得る。
2007504274.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
増殖性疾患を治療するためのアデノウイルスベクターとp53遺伝子との組換え体遺伝子医薬であって、前記組換え体遺伝子医薬が、アデノウイルスベクターとヒト腫瘍抑制p53遺伝子発現カセットによって構築され、その組換え体配列が：
アデノウイルス5の右端                                                      --
ATGTTTACCGCCACACTCGCAGGGTCTGCACCTGGTGCGGGTCTCATCGTACCTCAGCACCTTCCAGATC70TCTGACATGCGATGTCGACTCGACTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTATCTGAGGGGACTAGGGTGTGTTTAGGCGAAAAGCGGGGCTTCGGTTGTACGCGGTTAGGAGTCCCCTCAGGATATAGTAGTTTCGCTTTTGCATAGGGAGGGGGAAATGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGCCATTTGACCATTCACCACATTGGTGTGCACCTCCAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCCG523CTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGGTAGCTGCTGGGCTCCGGGGACACTTTGCGTTCGGGCTGGGAGCGTCTTTCCACGACGGTGACACGCTTCCCTGGATTGGCAGCCAGACTGCTTTCCGGGTCACTGCC655ATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCCTAGCGTCGAGCCCCCTCTGAGTCAGGAAACATTTTCAGACCTATGGAAACTACTTCCTGAAAACAACGTTCTGTCCCCCTTGCCGTCCCAAGCAATGGATGATTTGATGCTGTCCCCGGACGATATTGAACAATGGTTCACTGAAGACCCAGGTCCAGATGAAGCTCCCAGAATGCCAGAGGCTGCTCCCCCCGTGGCCCCTGCACCAGCAGCTCCTACACCGGCGGCCCCTGCACCAGCCCCCTCCTGGCCCCTGTCATCTTCTGTCCCTTCCCAGAAAACCTACCAGGGCAGCTACGGTTTCCGTCTGGGCTTCTTGCATTCTGGGACAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTACTCCCCTGCCCTCAACAAGATGTTTTGCCAACTGGCCAAGACCTGCCCTGTGCAGCTGTGGGTTGATTCCACACCCCCGCCCGGCACCCGCGTCCGCGCCATGGCCATCTACAAGCAGTCACAGCACATGACGGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATTTGCGTGTGGAGTATTTGGATGACAGAAACACTTTTCGACATAGTGTGGTGGTGCCCTATGAGCCGCCTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCACTACAACTACATGTGTAACAGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCATCACACTGGAAGACTCCAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGTGCCTGTCCTGGGAGAGACCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAGAAAGGGGAGCCTCACCACGAGCTGCCCCCAGGGAGCACTAAGCGAGCACTGCCCAACAACACCAGCTCCTCTCCCCAGCCAAAGAAGAAACCACTGGATGGAGAATATTTCACCCTTCAGATCCGTGGGCGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCGAGAGCTGAATGAGGCCTTGGAACTCAAGGATGCCCAGGCTGGGAAGGAGCCAGGGGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAAAAGGGTCAGTCTACCTCCCGCCATAAAAAACTCATGTTCAAGACAGAAGGGCCTGACTCAGACTGA1837CATTCTCCACTTCTTGTTCCCCACTGACAGCCTCCCACCCCCATCTCTCCCTCCCCTGCCATTTTGGGTTTTGGGTCTTTGAACCCTTGCTTGCAATAGGTGTGCGTCAGAAGCACCCAGGACTTCCATTTGCTTTGTCCCGGGGCTCCACTGAACAAGTTGGCCTGCACTGGTGTTTTGTTGTGGGGAGGAGGATGGGGAGTAGGACATACCAGCTTAGATTTTAAGGTTTTTACTGTGAGGGATGTTTGGGAGATGTAAGAAATGTTCTTGCAGTTAAGGGTTAGTTTACAATCAGCCACATTCTAGGTAGGGGCCACTTCACCGTACTAACCAGGGAAGCTGTCCCTCACTGTTGAATTTTCTCTAACTTCAAGGCCCATATCTGTGAAATGCTGGATTTGCCCTACCTCGGAATGCTGGCATTTGCACCTACCTCACAGAGTGCATTGTGAGGGTT2297AATGAAATAATGTACATCTGGCCTTGAAACCACCTTTTATTACATGGGGTCTAGCGGGATCCACTAGTAACGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCTCGAGCATGCATCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGAGGGGGATCCCCACGCTAGAGCT2733GACTATAATAATAAAACGCCAACTTTGACCCGGAACGCGGAAAACACCTGAGAAAAACACCTGGGCGAGTCTCCACGTAAACGGTCAAAGTCCCCGCGGCCCTAGACAAATATTA2848- アデノウイルス5の左端
上記配列中：
１）アデノウイルス５の右端およびアデノウイルス５の左端は、アデノウイルス５の全配列中に記載されている(Genbank No: NC_001406)
２）1-70：アデノウイルスの右アーム(70番目の塩基はアデノウイルス遺伝子配列の3328に位置する)
３）71-523：ラウス肉腫ウイルス（RSV）LTR（プロモーター）
４）524-655：5'末端非翻訳領域
５）656-1837：p53遺伝子コーディング配列
６）1838-2733：3'末端非翻訳領域（2298で開始するポリアデノシン尾部）
2734-2848：アデノウイルスの左アーム（2734の塩基はアデノウイルス５遺伝子配列の452に位置する）。
である組換え体遺伝子医薬。
【請求項２】
前記組換え体の遺伝子発現カセットが、プロモーター-p53cDNA-ポリアデノシンで構成された特異的な配列である請求項１に記載の組換え体遺伝子医薬。
【請求項３】
前記遺伝子発現カセットの上流が、任意の真核細胞プロモーター、原核細胞プロモーターまたはウイルスプロモーターであり、かつその下流が、任意の真核生物遺伝子のポリアデノシン残基（ポリＡ尾部）である請求項２に記載の組換え体遺伝子医薬。
【請求項４】
前記組換え体遺伝子医薬が、
１）組換え体pGT-2を、アデノウイルスとプラスミドpGT-1（アデノウイルスの両末端にある２つの逆方向末端反復を含む）との大腸菌内での相同組換えによって得る工程と、
２）組換え体pGT-3を、pGT-2と人工的配列「アデノウイルスの右アーム／プロモーター-p53cDNA-ポリA／アデノウイルスの左アーム」との大腸菌内での相同組換えによって得る工程と、
３）組換え体p53アデノウイルスを、エンドヌクレアーゼPacIを使用して原核生物の配列を切り捨てることによって得る工程と
を含む相同組換えによって原核細胞内で得られる請求項１に記載の組換え体遺伝子医薬。
【請求項５】
前記組換え体遺伝子医薬が、相同組換えによって任意の原核細胞内で得られる請求項4に記載の組換え体遺伝子医薬。
【請求項６】
注射液を生成するために使用される請求項１に記載の組換え体遺伝子医薬。
【請求項７】
注射するために使用される請求項６に記載の組換え体遺伝子医薬。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学技術、特に、増殖性疾患の治療のためのヒト腫瘍抑制遺伝子p53とアデノウイルスベクターとの組換え配列で作られた遺伝子組換え体医薬に関する。
【発明の背景】
【０００２】
増殖性疾患は、細胞過形成および／または代謝産物の異常発現によって特徴づけられる遺伝子疾患である。これは、全てのヒト組織および器官（例えば皮膚、髄および乳腺）で機能障害を引き起こす恐れがある良性の過形成である。瘢痕は、ヒト創傷回復プロセスの必然的な結果である。あらゆる種類の創傷回復は瘢痕を生じ得る。瘢痕には、正常瘢痕と病理学的瘢痕とを含む2種類の瘢痕が存在する。病理学的瘢痕には、腫瘍性増殖と機能障害の両方を引き起こす、肥厚性瘢痕とケロイドが含まれる。これは、医学における4つの最も難しい問題のうちの1つである。ケロイドは、皮膚過形成疾患である。これは、皮膚傷害において通常起こる自発的または非自発的に誘導された異常なコラーゲンの蓄積によって引き起こされる過剰な過形成である。その臨床的症状には、過剰な成長、傷害部の当初境界の超過、隣接組織の浸潤、非退縮、および手術後の再発が含まれる。p53遺伝子の変異がケロイド形成を引き起こすことが多くの実験によって証明されてきた。しかしながら、今日においてもケロイドのための効率的かつ特異的な治療は未だ存在しない。これはまた、整形外科手術における最も重要な問題の1つでもある。
【０００３】
遺伝子治療で使用されるベクターは、単独では治癒的潜在能力をもたない。一方、疾患を治療するのに使用され得る遺伝子は、標的細胞内に直接的に入ってその後に発現することが非常に難しいので、潜在的な治療能力を有するにとどまる。潜在的な治療学的遺伝子が効果を奏するためには、最初に、ベクターをその遺伝子で組換え、その後、トランスフェクションによってその遺伝子を標的細胞内に運ぶべきであり、最終的にはその遺伝子は細胞に入って発現することができる。従って、遺伝子治療の鍵は、治療学的遺伝子と遺伝子ベクターで組換えＤＮＡを構築することである。
【０００４】
標的遺伝子発現カセットをそのベクターで組み換える一般的な方法は、真核細胞において相同組換えを行うことであり、これは非常に複雑でかつ時間のかかる方法である。しかしながら、相同組換えのために原核細胞を使用して組み換えベクターを構築すれば、上記問題を解決することができる。
【０００５】
遺伝子治療の欠点は、特異的、標的および効率的遺伝子ベクターの欠如にある。現在、ベクターには、ウイルスベクターと非ウイルスベクターを含む、遺伝子治療研究において使用される2種類のベクターが存在する。一般的なウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターが含まれる。アデノウイルスベクターは、最も一般的である。その利点は、高いトランスフェクション効率、その相対的な安全性および取扱いの容易さ、大きな遺伝子断片を運ぶ能力および高力価のウイルス粒子を調製する能力、生成に対する適応性、および分裂期だけでなく非分裂期においても細胞に感染する能力を含む。しかしながら、その不利な点は、標的特異的な感染の欠如および免疫原性の生成を含む。従って、遺伝子治療のためにアデノウイルスベクターを改善する必要がある。研究は、遺伝子がE1またはE3欠如領域に運ばれる場合、アデノウイルスベクターによって運ばれた遺伝子がより長期間にわたって発現し、かつベクターの抗原性が低下し得ることを示す。レトロウイルスベクターは、外来遺伝子を運んで標的細胞ゲノム内に組み込むことができるので、安定的かつ継続的な遺伝子発現を実現することができる。しかしながら、レトロウイルスは、以下の不利な点：インビトロでの低い再生力価、低いトランスフェクション効率、分裂期のみの細胞の感染、および潜在的に発癌活性をもたらす染色体でのランダムな組み換えを有する。遺伝子形質転換において使用される他のウイルスまたは非ウイルスベクターは全て、異なる利点および不利な点を有する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的は、潜在的に治療学的な遺伝子をそのベクターで組換えること、すなわち、過形成の治療のためにアデノウイルスベクターとp53遺伝子の組換えＤＮＡを提供する。その後、この組換え生成物は、過形成細胞が正常なP53タンパク質を発現するように誘導する。このようにして、異常細胞の過形成は効率的に抑制され得、ケロイドのような過形成疾患を治療するために使用することができる。
【０００７】
本発明の目的はまた、この組換え体を生成するための方法、およびこの組み換え体を実際に入れることができる組み換え体の製剤を提供することである。
【０００８】
本発明は、アデノウイルスベクターとp53遺伝子の組換えＤＮＡを提供する。この組換え体は、アデノウイルスベクターとヒト腫瘍抑制遺伝子発現カセットを結合させることによって構築され、以下の配列をもつ：
アデノウイルスの右端                                                        --
ATGTTTACCGCCACACTCGCAGGGTCTGCACCTGGTGCGGGTCTCATCGTACCTCAGCACCTTCCAGATC70TCTGACATGCGATGTCGACTCGACTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTATCTGAGGGGACTAGGGTGTGTTTAGGCGAAAAGCGGGGCTTCGGTTGTACGCGGTTAGGAGTCCCCTCAGGATATAGTAGTTTCGCTTTTGCATAGGGAGGGGGAAATGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGCCATTTGACCATTCACCACATTGGTGTGCACCTCCAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCCG523CTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGGTAGCTGCTGGGCTCCGGGGACACTTTGCGTTCGGGCTGGGAGCGTCTTTCCACGACGGTGACACGCTTCCCTGGATTGGCAGCCAGACTGCTTTCCGGGTCACTGCC655ATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCCTAGCGTCGAGCCCCCTCTGAGTCAGGAAACATTTTCAGACCTATGGAAACTACTTCCTGAAAACAACGTTCTGTCCCCCTTGCCGTCCCAAGCAATGGATGATTTGATGCTGTCCCCGGACGATATTGAACAATGGTTCACTGAAGACCCAGGTCCAGATGAAGCTCCCAGAATGCCAGAGGCTGCTCCCCCCGTGGCCCCTGCACCAGCAGCTCCTACACCGGCGGCCCCTGCACCAGCCCCCTCCTGGCCCCTGTCATCTTCTGTCCCTTCCCAGAAAACCTACCAGGGCAGCTACGGTTTCCGTCTGGGCTTCTTGCATTCTGGGACAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTACTCCCCTGCCCTCAACAAGATGTTTTGCCAACTGGCCAAGACCTGCCCTGTGCAGCTGTGGGTTGATTCCACACCCCCGCCCGGCACCCGCGTCCGCGCCATGGCCATCTACAAGCAGTCACAGCACATGACGGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATTTGCGTGTGGAGTATTTGGATGACAGAAACACTTTTCGACATAGTGTGGTGGTGCCCTATGAGCCGCCTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCACTACAACTACATGTGTAACAGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCATCACACTGGAAGACTCCAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGTGCCTGTCCTGGGAGAGACCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAGAAAGGGGAGCCTCACCACGAGCTGCCCCCAGGGAGCACTAAGCGAGCACTGCCCAACAACACCAGCTCCTCTCCCCAGCCAAAGAAGAAACCACTGGATGGAGAATATTTCACCCTTCAGATCCGTGGGCGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCGAGAGCTGAATGAGGCCTTGGAACTCAAGGATGCCCAGGCTGGGAAGGAGCCAGGGGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAAAAGGGTCAGTCTACCTCCCGCCATAAAAAACTCATGTTCAAGACAGAAGGGCCTGACTCAGACTGA1837CATTCTCCACTTCTTGTTCCCCACTGACAGCCTCCCACCCCCATCTCTCCCTCCCCTGCCATTTTGGGTTTTGGGTCTTTGAACCCTTGCTTGCAATAGGTGTGCGTCAGAAGCACCCAGGACTTCCATTTGCTTTGTCCCGGGGCTCCACTGAACAAGTTGGCCTGCACTGGTGTTTTGTTGTGGGGAGGAGGATGGGGAGTAGGACATACCAGCTTAGATTTTAAGGTTTTTACTGTGAGGGATGTTTGGGAGATGTAAGAAATGTTCTTGCAGTTAAGGGTTAGTTTACAATCAGCCACATTCTAGGTAGGGGCCACTTCACCGTACTAACCAGGGAAGCTGTCCCTCACTGTTGAATTTTCTCTAACTTCAAGGCCCATATCTGTGAAATGCTGGATTTGCCCTACCTCGGAATGCTGGCATTTGCACCTACCTCACAGAGTGCATTGTGAGGGTT2297AATGAAATAATGTACATCTGGCCTTGAAACCACCTTTTATTACATGGGGTCTAGCGGGATCCACTAGTAACGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCTCGAGCATGCATCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGAGGGGGATCCCCACGCTAGAGCT2733GACTATAATAATAAAACGCCAACTTTGACCCGGAACGCGGAAAACACCTGAGAAAAACACCTGGGCGAGTCTCCACGTAAACGGTCAAAGTCCCCGCGGCCCTAGACAAATATTA 2848- アデノウイルス5の左端
上記配列中：
１．アデノウイルス５の右端およびアデノウイルス５の左端は、アデノウイルス５遺伝子の完全配列中に記載されている(Genbank No: NC_001406)
２．1-70：アデノウイルスの右アーム(70番目の塩基はアデノウイルス５遺伝子配列の3328に位置する)
３．71-523：ラウス肉腫ウイルス（RSV）LTR（プロモーター）
４．524-655：5'末端非翻訳領域
５．656-1837：p53遺伝子コーディング配列
６．1838-2733：3'末端非翻訳領域（2298で開始するポリアデノシン尾部）
2734-2848：アデノウイルスの左アーム（2734の塩基はアデノウイルス５遺伝子配列の452に位置する）。
【０００９】
この組換え体の発現カセットは、プロモーター-p53cDNA-ポリアデノシンで構成された特異的な配列である。その上流の配列は、任意の真核生物の細胞プロモーター、原核細胞のプロモーターまたはウイルスプロモーターを含む。その下流の配列は、真核細胞の任意のポリアデノシン（ポリA）を含む。
【００１０】
本発明の組換えＤＮＡを以下に記載したように得た。組換えウイルスベクターを相同組換えによって原核細胞内で得た。第一に、組換え生成物pGT-2を、アデノウイルスとプラズマpGT-1（両末端にアデノウイルスの逆方向反復配列を含む）との大腸菌内での相同組換えによって構築した。第二に、組換え生成物pGT-3を、pGT-2と人工的配列「アデノウイルスの右アーム／プロモーター-p53cDNA-ポリアデノシン／アデノウイルスの左アーム」との大腸菌内での相同組換えによって構築した。最後に、エンドヌクレアーゼPacIを使用して原核生物のプラスミド配列を切り捨てることによって組換え体p53アデノウイルスを得た。
【００１１】
実際に、相同組換えによって任意の原核細胞からこの組換え体を得ることができる。
【００１２】
上述の方法によれば、アデノウイルスの両側にある長い末端反復（LTR）をPCRによって増幅し、PacI制限酵素部位をそれぞれに導入した。両LTR断片を、pUC18ベクターにクローン化し、pGT-1組換え配列を生成した。そして、構築されたpGT-1ベクターおよびアデノウイルス５遺伝子配列を、大腸菌(BJ5183, SiBiono Companyによって保存, 保存番号: P-e012)にコトランスフェクトした。次に、アデノウイルス５遺伝子配列を、pGT-1で相同的に組換えた。その後、ポジィティブなウイルスクローンを増幅、PCRによってスクリーニングし、制限酵素を使用して試験を行った。最後に、アデノウイルス５全遺伝子配列を含む組換え体ベクターpGT-2を得た。
【００１３】
5'ATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCおよび5'ATATCTGCAGAATTCCAGCACをプライマーとして使用し、ヒト腫瘍抑制p53遺伝子をPCRによって増幅した。p53遺伝子の全配列（5'および3’非翻訳配列を含む）をベクターpUC19にクローン化し、DNAシークエンシングによって試験した。次に、RSV(ラウス肉腫ウイルス)LTR配列およびBGHのPA配列およびアデノウイルスのE1配列をPCRによって増幅した。上記各配列の片側にリンカー配列を付着させ、DNAシークエンシングによって確認した。次のPCR反応において、LTRおよびPA配列をp53の5'および3'末端にそれぞれ付着させた。アデノウイルスE1領域およびその上流配列をp53の外側に結合させ、p53遺伝子発現カセットを構築した(図１を参照)。
【００１４】
組換え体ベクターpGT-2およびp53遺伝子発現カセットを、相同組換えが起こる大腸菌BJ5183にコトランスフェクトした。次に、ポジィティブなクローンを増幅、PCRによってスクリーニングし、制限酵素反応を介して試験した。得られた組換え体ベクターはpGT-3であり、大部分のアデノウイルス５配列を含む（そのE1領域およびその上流配列の一部がp53発現カセットによって置換された）。組換え体ベクターpGT-3をPacIによって直線化し、pUC18起源の配列を切り捨てた。その後、293細胞（SiBiono Corpによって保存, 保存番号: E-393）にトランスフェクトするためにpGT-3を使用した。組換え体を細胞内にパックし、アデノウイルスシス活性配列およびLTRプロモーターを含むヒト腫瘍抑制遺伝子p53を生成した。得られた組換え体p53アデノウイルスは、高いトランスフェクション効率を示し、操作が簡単であり、かつ単一プロモーターによって制御されている。
【００１５】
この組換え体p53アデノウイルスは、以下の特徴を有している：
該アデノウイルスは、アデノウイルスベクターおよびp53遺伝子人工発現カセットで構築され、
【００１６】
１．構造：該アデノウイルスは、他の化学合成医薬、薬草、および遺伝的に加工された医薬とは異なる組換え体生アデノウイルスである。該アデノウイルスは、高い生物学的活性を有し、インビボで直接発現することができ、医療用途において非常に効果的である。アデノウイルスは、大きな遺伝子断片を運ぶことができ、かつ高いトランスフェクション効率を示す。アデノウイルスは、高力価のウイルス粒子として調製することができ、非常に広い宿主範囲をもち、十分に安全であることが解っている。その抗原性は、特に再構築後に大きく低下する。標的遺伝子はインビボで容易に安定化されて発現される。p53人工遺伝子発現カセットでは、p53遺伝子の発現が、アデノウイルスベクターの単一プロモーターによって直接的に制御され、かつポリアデノシン尾部シグナルが付加されているので、無傷の発現カセットが構築される。
【００１７】
２．応用：この組換え体医薬は、多くの悪性腫瘍を治療するために使用され得るだけでなく、多くの過形成疾患を治療するために使用され得る。これは、異常な過形成細胞が正常なp53タンパク質を発現するように誘導することができるので、細胞複製を効率的に抑制し、かつケロイドを含む過形成疾患を治癒する。
【００１８】
本発明の組換え体医薬を、第一に、特異的に遺伝的に加工された細胞にトランスフェクトした。その後、細胞を増殖、濃縮し、これを医薬用途に使用され得る組換え体p53アデノウイルス抗-過形成注射液に精製した。
【００１９】
本発明に使用される293細胞(ATCC CRL-1573、第32世代、ATCCから入手、June 13th, 1997)は、アデノウイルス５(Ad5)DNAによって形質転換され、かつAd5の5'末端からゲノムの11％(E1aを含む)を含んだヒト胎児腎上皮細胞からスクリーニングされた。この細胞は、アデノウイルスによる感染に対して高い許容性を示し、アデノウイルスの増殖に対しても許容性を示した。
【００２０】
本発明の主要な貢献は、多くの異常な過形成細胞の増殖を抑制することができるヒト腫瘍抑制遺伝子p53を利用することにある。抑制遺伝子をE1-アデノウイルスにクローン化し、局所的に体内に注入した。アデノウイルスは、p53遺伝子が過形成組織に入るのを助ける。発現したp53タンパク質は、異常な過形成細胞の増殖を阻害するかまたはさらに異常な細胞を殺すことができた。本発明はまた、この組換え型p53アデノウイルス生成物を調製するための方法を提供し、インビトロでのP53タンパク質の不安定性（半減期＝20分）によって引き起こされる問題を解決した。
【００２１】
組換え型p53アデノウイルスはヒト腫瘍抑制遺伝子p53を運び、かつこれを直接的に異常な過形成細胞内で発現させるので、p53タンパク質の不安定性のために、遺伝的に加工された組換え生成物をインビトロで作ることができないという問題を解決した。過形成疾患の治療のためにアデノウイルスを使用し、P53タンパク質をインビボで継続的かつ非常に効率的に発現させることができた。さらに、リン酸化、折り畳み、および重合を含むインビボでのタンパク質分子の修飾は、真核生物細胞内の修飾と等しい。本発明の組換え体p53アデノウイルスは、真核細胞内でのp53遺伝子の発現を導入するために使用され得、前記遺伝子を過形成組織に直接的に導入してタンパク質を発現させ、ヒト腫瘍抑制因子P53タンパク質を生成する源として患者に効果的に使用することができる。この方法は外来p53遺伝子をヒトの体にうまく導入し、該遺伝子が過形成組織内で強発現することを可能にした。これは、過形成疾患の遺伝子治療を可能にした。
【実施形態の詳細な説明】
【００２２】
以下の実施形態を本発明のためにさらに記載する。本発明の実施は、これらの実施形態に限定されない。
【００２３】
実験１：
図１および２に記載された組換え体p53アデノウイルスの構築および試験     
１．２つのプライマーは、p53cDNAの開示された全配列に基づいて考案された：
２つのプライマーは、5'ATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCおよび5'ATATCTGCA GAATTCCAGCACであった。リンカー配列を両末端に付着させた。ヒトp53遺伝子を、ヒーラ細胞cDNAを鋳型として使用してPCR増幅させた。実験条件は以下の通りである：
第１サイクルでは、94℃で4分間にわたってDNAを変性させ、58℃で1分間にわたってアニーリングし、その後に72℃で2分間にわたって伸長させた。残りのサイクルの各々では、94℃で1分間にわたってDNAを変性させ、58℃で1分間にわたってアニーリングし、72℃で2分間にわたって伸長させた。合計30サイクルを行った。その結果、大量のp53遺伝子断片を得た。p53遺伝子を、アガロースゲル電気泳動を使用して試験した。p53遺伝子の全配列をゲルから回収、精製し、制限酵素によって切断し、同じ酵素によって切断されたpUC19ベクターに挿入した。その後、前記断片の配列を決定した。試験対象の翻訳領域の塩基配列と予測されるアミノ酸配列は、GenBank Acc XM_058834の配列と同一である。最後に、前記断片を制限酵素によって開裂して再回収した。
【００２４】
２．LTRおよびPA配列をPCR増幅した。これらのプライマーはそれぞれ：
5'TCTGACATGCGATGTCGACTCG，
5'CGGCAGTGACCCGGAAAGCAG；
5'TCACAGAGTGCATTGTGAGGG，
5'GCTCTAGCGTGGGGATCCC.
リンカー配列を5'プライマーおよび3'プライマーに付着させた。LTRおよびPAを、上記に記載した同じアニーリング条件下でPCR増幅させた。増幅された断片を精製し、配列決定によって試験を行った。
【００２５】
３．アデノウイルスE1配列を、上記に記載した同じPCR条件下で別々にPCR増幅させた。BamHIおよびEcoRIの制限酵素部位を両末端のプライマーにそれぞれ連結させた。前記断片を増幅後に試験した。
【００２６】
４．工程１からの断片と工程２からの断片を、PCR反応によってそれぞれ連結させた。実験条件は上述した通りである。PCR複製産物LTR-p53-PAを得た。得られた配列をシークエンシングによって試験した。
【００２７】
５．工程３からの断片と工程４からのLTR-p53-PAを、T4 DNAリガーゼによって連結した。得られた配列がp53遺伝子カセットである。
【００２８】
６．アデノウイルスの両末端からの逆方向末端反復(IRT)配列を、上述したのと同じ実験条件下でPCR増幅した。シークエンシングによって試験した後、得られた断片をpUC18ベクターにクローン化した。これによって組換え体ベクターpGT-1を得た。
【００２９】
７．組換え体ベクターpGT-1および野生型アデノウイルス５(ATCC-VR-5、アデノウイルス75、力価：10(6.75) TCID(50)/ml)DNAを、大腸菌BJ5183にコトランスフェクトした。1分間にわたって4℃に維持した後、トランスフェクションを行う細菌を、50秒間にわたって42℃で熱ショックを与え、1分間にわたって4℃にインキュベートし、その後、1ml LB培地と混合し、1時間にわたってインキュベートした。加工された細菌を、アンピシリンを含む寒天培地上に播種し、24時間にわたってインキュベートした。１つの細胞群を、無菌のつま楊枝でつつき、これをLB培地の入ったボトルに入れ、24時間にわたって培養した。プラスミドを通常の方法によって抽出し、PacIによってスクリーニングした。ポジィティブクローンはpGT-2(Ad5の全配列を含む)である。
【００３０】
８．組換え体ベクターpGT-2およびp53遺伝子カセットを、大腸菌BJ5183にコトランスフェクトした。培養条件、スクリーニングおよびキャラクタリゼーションの方法は上述した通りである。ポジィティブクローンは、アデノウイルス全遺伝子配列および挿入されたp53発現カセットを含むpGT-3である。クローンをPacIによって直線化した後にpUC18起源のベクター配列を切り捨てた。
【００３１】
９．ポジィティブな直線状のプラスミドをCsClによって精製し、CaCl2方法を使用して293細胞にトランスフェクトした。細胞を7日後に収集した。細胞を15分間にわたって1000rpmで遠心分離した。上清を捨てた。細胞を37℃〜80℃で3回溶解させた。30分間にわたって4000rpmで再び遠心分離を行った。沈殿物を捨てた。上清を細胞に再び感染させ、ウイルスを増幅し、上述に記載されたのと同じ方法で溶解した。得られた上清を、16時間にわたって4℃、60000rpm、CsClで密度勾配遠心分離した。組換え体アデノウイルスのバンドをNo.7針によって抽出した。DNA断片をN1Hバッファーに加え、Spectra MW6000透析バック中に4時間にわたって4℃で透析した。DNA溶液を0.25μmフィルターを通過させることによって滅菌した。その後、DNA溶液をパックして-80℃で貯蔵した。得られた生成物の一部を、プラーク検定およびウイルス力価試験に使用した。
【００３２】
１０．組換え体アデノウイルスの構造安定性試験。ウイルスのゲノムDNAを複製の数世代後に得た。5'CCACGACGGTGACACGCTTCおよび5'CAAGCAAGGGT TCAAAGACであるp53の両末端からのプライマーを使用してDNA断片をPCR増幅した。アガロースゲル電気泳動の結果を図3に示した。組換え体アデノウイルスの両側のアデノウイルスのアームを、プライマー：5'TTT CTC AGG TGT TTT CCG Cおよび5'CAT CGT ACC TCA GCA CCT TCとして考案した。PCRの結果を図４に示した。上記結果は、組換え体p53アデノウイルスの構造が、複製の多くの世代後に安定したことを示した。
【００３３】
１１．Hep-2およびH1299細胞中でのp53遺伝子発現試験。組換え体アデノウイルスをトランスフェクトした36時間後、Hep-2およびH1299細胞を一般的な方法によって溶解させた。p53タンパク質特異的抗体を使用したウェスタンブロットの結果を図５に示した。
【００３４】
実験２：
線維芽細胞に対する組換え体アデノウイルスの殺傷効果：
インビトロでの瘢痕線維芽細胞の培養（図6を参照）：瘢痕皮膚を外科から入手し、0.5〜1cm3の大きさの小さな断片に各々無菌状態で切断した。次に、皮膚断片を直ちに1000U/mlアンピシリンおよびストレプトマイシンを含む培養液に入れた。組織をPBS（アンピシリンおよびストレプトマイシンを含む）で２回洗浄し、脂肪および結合組織を除去した。その後、油成分が無くなりクリアになるまでD-Hank溶液で再度数回にわたって組織を洗浄した。次に、皮膚断片を、各断片1mm3の大きさになるまで再度切断した。数滴の血清を組織上に添加し、断片を培養容器の壁に広げた。次に、組織表面の容器側が上向きになるまで容器を回転させ、10%FBSを含むDMEM培養液を加えた（注：組織と溶液が分かれた）。組織表面の容器側を上向きにした状態で37℃および5%CO2のオーブン中に容器を静置した。6〜8時間後、容器をゆっくりと回転させた。その後、ボトルを3〜4日間にわたって静置した。その後、溶液を3〜4日毎に交換した。新しい細胞が10日で組織片の周りに増殖し、細胞塊が生じた。細胞は、約１月で単層の細胞群を形成して容器全面を覆った。
【００３５】
S-P染色および真空方法を使用した細胞タイプの特徴描写
サンプル調製：細胞をトリプシンを使用して消化し、10000細胞/ml濃度の細胞懸濁液を調製した。18×18mmのカバーガラスを、55mmサイズの培養皿に入れた。2滴の細胞懸濁液を各カバーガラス上に滴下した。そして、カバーガラスをCO2を含むオーブン中に6〜8時間にわたって静置し、その後、PBSで3回にわたって十分に洗浄した。次に、カバーガラスを純粋なアセトン中に入れ、室温で15分間にわたって固定し、PBSで3回洗浄した。
【００３６】
真空中でS-Pを使用する免疫化学的細胞染色（図７を参照）：カバーガラスを、スライドの上部に細胞表面側が上向きになるように静置した。50μlのマウス抗ヒトを、各スライド上に滴下した。同じ量のPBSを、ネガティブコントロールグループに加えた。スライドを、66.7kPaの真空オーブン中に10分間にわたって入れ、再びPBSで3回洗浄した。各スライドに50μlのストレプトマイシンビオチンタンパク質−ペルオキシダーゼ溶液を添加し、10分間にわたって真空オーブン中に静置し、PBSで3回洗浄し、1分間にわたってヘマトキシリンで再染色し、数秒間にわたって1％アルコールを適用し、アルコールで脱水し、ジメチルベンゼンを適用し、ゴムで封止し、最後に顕微鏡下で観察した。
【００３７】
顕微鏡における細胞変化の観察（図8を参照）： 5×105数の瘢痕線維芽細胞を、25cm2容器中にインキュベートし、24時間にわたって培養した。その後、培養液を交換し、細胞を200MOIの組換え体アデノウイルスに感染させた。細胞の形状変化を、24時間、48時間および72時間後に顕微鏡下で観察した。
【００３８】
電子顕微鏡における細胞構造の変化（図9を参照）： 5×105数の瘢痕線維芽細胞を、25cm2容器中にインキュベートし、24時間にわたって培養した。その後、培養液を交換し、細胞を200MOIの組換え体アデノウイルスに48時間にわたって感染させた。細胞をトリプシンによって消化し、細胞懸濁液をアガロース管に収集した。次に、前記管を2000r/minで15分間にわたって遠心分離し、細胞凝集塊を形成させた。その後、2%のグルタルアルデヒドおよび1%の四酸化オスミウムで細胞を固定した。その後、寒天中に包まれた細胞凝集塊を脱水、透過させ、エポキシ樹脂で包み、薄くスライスして染色し、透過型電子顕微鏡下で観察して写真を撮った。
【００３９】
実験3：
瘢痕遺伝子治療の臨床調査における、この組換え体アデノウイルスのケロイドに対する治療結果。
【００４０】
図10Aおよび10Bに示したように、女性のケロイド罹患患者は、瘢痕を座瘡後の彼女の左胸部から切除した。しかしながら、腫瘍性瘢痕は手術後に再発した。局所的再発は3年で発生した。ステロイドおよび他の一般的治療は効果を示さなかった。彼女の胸部上の瘢痕の体積は、2×1×1cm3である（図10Aを参照）。瘢痕の大きさは、4週間にわたる遺伝子治療後に著しく減少した。明らかな副作用は自己制限的発熱を除いて表われなかった。ケロイドのための組換え体アデノウイルスの治療は、臨床実験によって安全であることが証明された。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１Ａ】図１Ａは、組換え体医薬の構築の模式的なプロセスの一部である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、組換え体医薬の構築の模式的なプロセスの一部である。
【図２】図２は、組換え体医薬の生産のための実験的なプロトコルの流れ図である。
【図３】図３は、プライマーとして5'CCACGACGGTGACACGCTTCおよび5'CAAGCAAGGGTTCAAAGAC、鋳型としてp53cDNAを使用して、PCRによって組換え体p53アデノウイルスを増幅して作られた数世代の継代後の組換え体遺伝子のアガロースゲル電気泳動の安定性試験のダイアグラムである。
【図４】図４は、293細胞を組換え体遺伝子によって感染後36時間で得られたウイルスDNAのPCR増幅物のアガロースゲル電気泳動の結果分析のダイアグラムである。(SiBiono Corpによって保存、保存番号：No-1、以下同じ）。
【図５】図５は、Hep-2およびH1299細胞を組換え型アデノウイルスによって感染後36時間のウェスタンブロット分析の結果である。
【図６】図６は、インビトロで初期培養されたヒト肥厚性瘢痕の線維芽細胞である。
【図７】図７は、SP染色および真空を使用した線維芽細胞の特徴描写である。
【図８】図８は、インビトロでの瘢痕線維芽細胞に対する組換え体遺伝子の殺傷効果の顕微鏡写真である。
【図９】図９は、インビトロでの瘢痕線維芽細胞に対する組換え体遺伝子の殺傷効果の電子顕微鏡写真である。
【図１０】図１０は、治療前後のケロイド罹患患者に対する組換え体遺伝子の効果の写真を含む。
【図１Ａ】
2007504274.tif 000003
【図１Ｂ】
2007504274.tif 000004
【図２】
2007504274.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2007504274.tif 000011
【図９】
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【図１０】
2007504274.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月19日(2004.11.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
増殖性疾患を治療するための医薬を調製するためのアデノウイルスベクターとヒト腫瘍抑制p53遺伝子発現カセットとの組換え体の適用。
【請求項２】
前記組換え体のアデノウイルスベクターとヒト腫瘍抑制p53遺伝子発現カセットが、プロモーター-p53cDNA-ポリアデノシンで構成された特異的な配列である請求項１に記載の適用。
【請求項３】
前記遺伝子発現カセットの上流が、任意の真核細胞プロモーター、原核細胞プロモーターまたはウイルスプロモーターであり、かつその下流が、任意の真核生物遺伝子のポリアデノシン残基（ポリＡ尾部）である請求項２に記載の適用。
【請求項４】
前記組換え体遺伝子医薬が、
１）組換え体pGT-2を、アデノウイルスとプラスミドpGT-1（アデノウイルスの両末端にある２つの逆方向末端反復を含む）との原核細胞内での相同組換えによって得る工程と、
２）組換え体pGT-3を、pGT-2と人工的配列「アデノウイルスの右アーム／プロモーター-p53cDNA-ポリA／アデノウイルスの左アーム」との原核細胞内での相同組換えによって得る工程と、
３）組換え体p53アデノウイルスを、エンドヌクレアーゼPacIを使用して原核生物の配列を切り捨てることによって得る工程と
を含む相同組換えによって原核細胞内で得られる請求項１に記載の適用。
【請求項５】
前記原核細胞が、大腸菌である請求項４に記載の適用。
【請求項６】
前記増殖性疾患が、任意の種類の瘢痕である請求項１に記載の適用。
【請求項７】
前記瘢痕が、病理学的瘢痕である請求項６に記載の適用。
【請求項８】
前記病理学的瘢痕が、ケロイドである請求項７に記載の適用。
【請求項９】
前記組換え体が、注射液を生成するために使用される請求項１に記載の適用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学技術、特に、増殖性疾患の治療のためのヒト腫瘍抑制遺伝子p53とアデノウイルスベクターとの組換え配列で作られた遺伝子組換え体医薬に関する。
【発明の背景】
【０００２】
増殖性疾患は、細胞過形成および／または代謝産物の異常発現によって特徴づけられる遺伝子疾患である。これは、全てのヒト組織および器官（例えば皮膚、髄および乳腺）で機能障害を引き起こす恐れがある良性の過形成である。瘢痕は、ヒト創傷回復プロセスの必然的な結果である。あらゆる種類の創傷回復は瘢痕を生じ得る。瘢痕には、正常瘢痕と病理学的瘢痕とを含む2種類の瘢痕が存在する。病理学的瘢痕には、腫瘍性増殖と機能障害の両方を引き起こす、肥厚性瘢痕とケロイドが含まれる。これは、医学における4つの最も難しい問題のうちの1つである。ケロイドは、皮膚過形成疾患である。これは、皮膚傷害において通常起こる自発的または非自発的に誘導された異常なコラーゲンの蓄積によって引き起こされる過剰な過形成である。その臨床的症状には、過剰な成長、傷害部の当初境界の超過、隣接組織の浸潤、非退縮、および手術後の再発が含まれる。p53遺伝子の変異がケロイド形成を引き起こすことが多くの実験によって証明されてきた。しかしながら、今日においてもケロイドのための効率的かつ特異的な治療は未だ存在しない。これはまた、整形外科手術における最も重要な問題の1つでもある。
【０００３】
増殖性疾患のための共通の医薬は、（１）コルチコステロイドである。これは、小さな病的瘢痕に効果があるが、局所的皮膚萎縮、色素減少または脱色、末梢血管拡張、さらには皮膚の壊死およびエルコーシス(elkosis)を誘発するおそれがある。これは、一般的な反応、例えば、高血圧症、骨粗鬆症、消化器穿孔、奇形癌腫、さらにはクッシング反応を強く引き起こすであろう。（２）トレチノインである。これは、瘢痕を治療するためにはほとんど使用されない。（３）トラニラストである。これは、６ヶ月以上の投与を必要とする。外科的治療、レーザー治療、放射線治療および圧迫方法はまた、増殖性疾患を治療するために使用され得る。
【０００４】
病的瘢痕の関連遺伝子の研究の発展において、線維芽細胞の増殖−アポトーシスおよびコラーゲンの代謝の幾つかの制御遺伝子がクローン化されかつ記述されてきた。それゆえ、増殖性疾患のための遺伝子治療が登場している。
【０００５】
本出願は、特異的な遺伝的に加工された株化細胞の中で増幅および増殖することができ、また、真核生物細胞の中で腫瘍抑制タンパク質を発現することができる組換え体を開示する。組換え体のベクターは、DNAウイルスまたはRNAウイルスでもよい。好ましいベクターはアデノウイルスベクターであり、アデノウイルスベクター配列を含む結合ベクターである。最も好ましいベクターは、アデノウイルスベクターである。
【０００６】
ヒト腫瘍抑制遺伝子は、任意の腫瘍抑制遺伝子であってもよいが、最も好ましいものはp53である。
【０００７】
アデノウイルスベクターとp53遺伝子とを結合した組換え体は、以下の配列を有する組換え体p53アデノウイスルとして定義される：
アデノウイルスの右端                                                        --
ATGTTTACCGCCACACTCGCAGGGTCTGCACCTGGTGCGGGTCTCATCGTACCTCAGCACCTTCCAGATC70TCTGACATGCGATGTCGACTCGACTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTATCTGAGGGGACTAGGGTGTGTTTAGGCGAAAAGCGGGGCTTCGGTTGTACGCGGTTAGGAGTCCCCTCAGGATATAGTAGTTTCGCTTTTGCATAGGGAGGGGGAAATGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGCCATTTGACCATTCACCACATTGGTGTGCACCTCCAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCCG523CTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGGTAGCTGCTGGGCTCCGGGGACACTTTGCGTTCGGGCTGGGAGCGTCTTTCCACGACGGTGACACGCTTCCCTGGATTGGCAGCCAGACTGCTTTCCGGGTCACTGCC655ATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCCTAGCGTCGAGCCCCCTCTGAGTCAGGAAACATTTTCAGACCTATGGAAACTACTTCCTGAAAACAACGTTCTGTCCCCCTTGCCGTCCCAAGCAATGGATGATTTGATGCTGTCCCCGGACGATATTGAACAATGGTTCACTGAAGACCCAGGTCCAGATGAAGCTCCCAGAATGCCAGAGGCTGCTCCCCCCGTGGCCCCTGCACCAGCAGCTCCTACACCGGCGGCCCCTGCACCAGCCCCCTCCTGGCCCCTGTCATCTTCTGTCCCTTCCCAGAAAACCTACCAGGGCAGCTACGGTTTCCGTCTGGGCTTCTTGCATTCTGGGACAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTACTCCCCTGCCCTCAACAAGATGTTTTGCCAACTGGCCAAGACCTGCCCTGTGCAGCTGTGGGTTGATTCCACACCCCCGCCCGGCACCCGCGTCCGCGCCATGGCCATCTACAAGCAGTCACAGCACATGACGGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATTTGCGTGTGGAGTATTTGGATGACAGAAACACTTTTCGACATAGTGTGGTGGTGCCCTATGAGCCGCCTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCACTACAACTACATGTGTAACAGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCATCACACTGGAAGACTCCAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGTGCCTGTCCTGGGAGAGACCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAGAAAGGGGAGCCTCACCACGAGCTGCCCCCAGGGAGCACTAAGCGAGCACTGCCCAACAACACCAGCTCCTCTCCCCAGCCAAAGAAGAAACCACTGGATGGAGAATATTTCACCCTTCAGATCCGTGGGCGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCGAGAGCTGAATGAGGCCTTGGAACTCAAGGATGCCCAGGCTGGGAAGGAGCCAGGGGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAAAAGGGTCAGTCTACCTCCCGCCATAAAAAACTCATGTTCAAGACAGAAGGGCCTGACTCAGACTGA1837CATTCTCCACTTCTTGTTCCCCACTGACAGCCTCCCACCCCCATCTCTCCCTCCCCTGCCATTTTGGGTTTTGGGTCTTTGAACCCTTGCTTGCAATAGGTGTGCGTCAGAAGCACCCAGGACTTCCATTTGCTTTGTCCCGGGGCTCCACTGAACAAGTTGGCCTGCACTGGTGTTTTGTTGTGGGGAGGAGGATGGGGAGTAGGACATACCAGCTTAGATTTTAAGGTTTTTACTGTGAGGGATGTTTGGGAGATGTAAGAAATGTTCTTGCAGTTAAGGGTTAGTTTACAATCAGCCACATTCTAGGTAGGGGCCACTTCACCGTACTAACCAGGGAAGCTGTCCCTCACTGTTGAATTTTCTCTAACTTCAAGGCCCATATCTGTGAAATGCTGGATTTGCCCTACCTCGGAATGCTGGCATTTGCACCTACCTCACAGAGTGCATTGTGAGGGTT2297AATGAAATAATGTACATCTGGCCTTGAAACCACCTTTTATTACATGGGGTCTAGCGGGATCCACTAGTAACGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCTCGAGCATGCATCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGAGGGGGATCCCCACGCTAGAGCT2733GACTATAATAATAAAACGCCAACTTTGACCCGGAACGCGGAAAACACCTGAGAAAAACACCTGGGCGAGTCTCCACGTAAACGGTCAAAGTCCCCGCGGCCCTAGACAAATATTA 2848- アデノウイルス5の左端
上記配列中：
１．アデノウイルス５の右端およびアデノウイルス５の左端は、アデノウイルス５遺伝子の完全配列中に記載されている(Genbank No: NC_001406)
２．1-70：アデノウイルスの右アーム(70番目の塩基はアデノウイルス５遺伝子配列の3328に位置する)
３．71-523：ラウス肉腫ウイルス（RSV）LTR（プロモーター）
４．524-655：5'末端非翻訳領域
５．656-1837：p53遺伝子コーディング配列
６．1838-2733：3'末端非翻訳領域（2298で開始するポリアデノシン尾部）
７．2734-2848：アデノウイルスの左アーム（2734の塩基はアデノウイルス５遺伝子配列の452に位置する）。
【０００８】
この組換え体の発現カセットは、プロモーター-p53cDNA-ポリアデノシンで構成された特異的な配列である。その上流の配列は、任意の真核生物の細胞プロモーター、原核細胞のプロモーターまたはウイルスプロモーターを含む。その下流の配列は、真核細胞の任意のポリアデノシン（ポリA）を含む。
【０００９】
本発明の組換えＤＮＡを以下に記載したように得た。組換えウイルスベクターを相同組換えによって原核細胞内で得た。第一に、組換え生成物pGT-2を、アデノウイルスとプラズマpGT-1（両末端にアデノウイルスの逆方向反復配列を含む）との大腸菌内での相同組換えによって構築した。第二に、組換え生成物pGT-3を、pGT-2と人工的配列「アデノウイルスの右アーム／プロモーター-p53cDNA-ポリアデノシン／アデノウイルスの左アーム」との大腸菌内での相同組換えによって構築した。最後に、エンドヌクレアーゼPacIを使用して原核生物のプラスミド配列を切り捨てることによって組換え体p53アデノウイルスを得た。
【００１０】
上述の方法によれば、アデノウイルスの両側にある長い末端反復（LTR）をPCRによって増幅し、PacI制限酵素部位をそれぞれに導入した。両LTR断片を、pUC18ベクターにクローン化し、pGT-1組換え配列を生成した。そして、構築されたpGT-1ベクターおよびアデノウイルス５遺伝子配列を、大腸菌(BJ5183, SiBiono Companyによって保存, 保存番号: P-e012)にコトランスフェクトした。次に、アデノウイルス５遺伝子配列を、pGT-1で相同的に組換えた。その後、ポジィティブなウイルスクローンを増幅、PCRによってスクリーニングし、制限酵素を使用して試験を行った。最後に、アデノウイルス５全遺伝子配列を含む組換え体ベクターpGT-2を得た。
【００１１】
5'ATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCおよび5'ATATCTGCAGAATTCCAGCACをプライマーとして使用し、ヒト腫瘍抑制p53遺伝子をPCRによって増幅した。p53遺伝子の全配列（5'および3’非翻訳配列を含む）をベクターpUC19にクローン化し、DNAシークエンシングによって試験した。次に、RSV(ラウス肉腫ウイルス)LTR配列およびBGHのPA配列およびアデノウイルスのE1配列をPCRによって増幅した。上記各配列の片側にリンカー配列を付着させ、DNAシークエンシングによって確認した。次のPCR反応において、LTRおよびPA配列をp53の5'および3'末端にそれぞれ付着させた。アデノウイルスE1領域およびその上流配列をp53の外側に結合させ、p53遺伝子発現カセットを構築した(図１を参照)。
【００１２】
組換え体ベクターpGT-2およびp53遺伝子発現カセットを、相同組換えが起こる大腸菌BJ5183にコトランスフェクトした。次に、ポジィティブなクローンを増幅、PCRによってスクリーニングし、制限酵素反応を介して試験した。得られた組換え体ベクターはpGT-3であり、大部分のアデノウイルス５配列を含む（そのE1領域およびその上流配列の一部がp53発現カセットによって置換された）。組換え体ベクターpGT-3をPacIによって直線化し、pUC18起源の配列を切り捨てた。その後、293細胞（SiBiono Corpによって保存, 保存番号: E-393）にトランスフェクトするためにpGT-3を使用した。組換え体を細胞内にパックし、アデノウイルスシス活性配列およびLTRプロモーターを含むヒト腫瘍抑制遺伝子p53を生成した。得られた組換え体p53アデノウイルスは、高いトランスフェクション効率を示し、操作が簡単であり、かつ単一プロモーターによって制御されている。
【００１３】
この組換え体p53アデノウイルスは、以下の特徴を有している：
該アデノウイルスは、アデノウイルスベクターおよびp53遺伝子人工発現カセットで構築され、
【００１４】
１．構造：該アデノウイルスは、他の化学合成医薬、薬草、および遺伝的に加工された医薬とは異なる組換え体生アデノウイルスである。該アデノウイルスは、高い生物学的活性を有し、インビボで直接発現することができ、医療用途において非常に効果的である。アデノウイルスは、大きな遺伝子断片を運ぶことができ、かつ高いトランスフェクション効率を示す。アデノウイルスは、高力価のウイルス粒子として調製することができ、非常に広い宿主範囲をもち、十分に安全であることが解っている。その抗原性は、特に再構築後に大きく低下する。標的遺伝子はインビボで容易に安定化されて発現される。p53人工遺伝子発現カセットでは、p53遺伝子の発現が、アデノウイルスベクターの単一プロモーターによって直接的に制御され、かつポリアデノシン尾部シグナルが付加されているので、無傷の発現カセットが構築される。
【００１５】
２．応用：この組換え体p53アデノウイルスは、広範な抗腫瘍医薬であった。それは、多くの悪性腫瘍を治療するために使用され得る。第二相臨床試験では、頭や首の扁平上皮癌および肺癌、その他の癌において著しい治療効果があることが示された。組換え体p53アデノウイルスは、癌の再発を防ぐのに特に効果的であった。第一相臨床試験および３年後の外科観察は、この組換え体p53アデノウイスルが癌ワクチンとして喉頭癌患者の術後再発を防ぐことを示した。
【００１６】
本発明の組換え体p53アデノウイスルは、実験における多くの悪性腫瘍の治療のための医薬に調製され得る。そして、腫瘍形成および腫瘍の術後再発の防止のための医薬に調製され得る。
【００１７】
また、本出願が見出した組換え体p53アデノウイルスは、異常な過形成細胞が正常なp53タンパク質を発現するように誘導することができるので、細胞複製を効率的に抑制し、かつケロイドを含む過形成疾患を治癒する。
【発明の概要】
【００１８】
本発明の目的は、潜在的に治療学的遺伝子をそれらのベクターで組換えることによって、過形成の治療のためにアデノウイルスベクターとp53遺伝子の組換え体DNAを提供することである。その後、この組換え体生成物は、過形成細胞に導入され、正常なp53タンパク質を発現する。この方法において、異常な細胞の増殖が効果的に抑制され得、ケロイドといった過形成疾患を治療するのに使用され得る。
【００１９】
本発明の組換え体医薬を、第一に、特異的に遺伝的に加工された細胞にトランスフェクトした。その後、細胞を増殖、濃縮し、これを医薬用途に使用され得る組換え体p53アデノウイルス抗-過形成注射液に精製した。
【００２０】
本発明に使用される293細胞(ATCC CRL-1573、第32世代、ATCCから入手、June 13th, 1997)は、アデノウイルス５(Ad5)DNAによって形質転換され、かつAd5の5'末端からゲノムの11％(E1aを含む)を含んだヒト胎児腎上皮細胞からスクリーニングされた。この細胞は、アデノウイルスによる感染に対して高い許容性を示し、アデノウイルスの増殖に対しても許容性を示した。
【００２１】
本発明の主要な貢献は、多くの異常な過形成細胞の増殖を抑制することができるヒト腫瘍抑制遺伝子p53を利用することにある。抑制遺伝子をE1-アデノウイルスにクローン化し、局所的に体内に注入した。アデノウイルスは、p53遺伝子が過形成組織に入るのを助ける。発現したp53タンパク質は、異常な過形成細胞の増殖を阻害するかまたはさらに異常な細胞を殺すことができた。本発明はまた、この組換え型p53アデノウイルス生成物を調製するための方法を提供し、インビトロでのP53タンパク質の不安定性（半減期＝20分）によって引き起こされる問題を解決した。
【００２２】
組換え型p53アデノウイルスはヒト腫瘍抑制遺伝子p53を運び、かつこれを直接的に異常な過形成細胞内で発現させるので、p53タンパク質の不安定性のために、遺伝的に加工された組換え生成物をインビトロで作ることができないという問題を解決した。過形成疾患の治療のためにアデノウイルスを使用し、P53タンパク質をインビボで継続的かつ非常に効率的に発現させることができた。さらに、リン酸化、折り畳み、および重合を含むインビボでのタンパク質分子の修飾は、真核生物細胞内の修飾と等しい。本発明の組換え体p53アデノウイルスは、真核細胞内でのp53遺伝子の発現を導入するために使用され得、前記遺伝子を過形成組織に直接的に導入してタンパク質を発現させ、ヒト腫瘍抑制因子P53タンパク質を生成する源として患者に効果的に使用することができる。この方法は外来p53遺伝子をヒトの体にうまく導入し、該遺伝子が過形成組織内で強発現することを可能にした。これは、過形成疾患の遺伝子治療を可能にした。
【実施形態の詳細な説明】
【００２３】
以下の実施形態を本発明のためにさらに記載する。本発明の実施は、これらの実施形態に限定されない。
【００２４】
実験１：
図１および２に記載された組換え体p53アデノウイルスの構築および試験     
１．２つのプライマーは、p53cDNAの開示された全配列に基づいて考案された：
２つのプライマーは、5'ATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCおよび5'ATATCTGCA GAATTCCAGCACであった。リンカー配列を両末端に付着させた。ヒトp53遺伝子を、ヒーラ細胞cDNAを鋳型として使用してPCR増幅させた。実験条件は以下の通りである：
第１サイクルでは、94℃で4分間にわたってDNAを変性させ、58℃で1分間にわたってアニーリングし、その後に72℃で2分間にわたって伸長させた。残りのサイクルの各々では、94℃で1分間にわたってDNAを変性させ、58℃で1分間にわたってアニーリングし、72℃で2分間にわたって伸長させた。合計30サイクルを行った。その結果、大量のp53遺伝子断片を得た。p53遺伝子を、アガロースゲル電気泳動を使用して試験した。p53遺伝子の全配列をゲルから回収、精製し、制限酵素によって切断し、同じ酵素によって切断されたpUC19ベクターに挿入した。その後、前記断片の配列を決定した。試験対象の翻訳領域の塩基配列と予測されるアミノ酸配列は、GenBank Acc XM_058834の配列と同一である。最後に、前記断片を制限酵素によって開裂して再回収した。
【００２５】
２．LTRおよびPA配列をPCR増幅した。これらのプライマーはそれぞれ：
5'TCTGACATGCGATGTCGACTCG，
5'CGGCAGTGACCCGGAAAGCAG；
5'TCACAGAGTGCATTGTGAGGG，
5'GCTCTAGCGTGGGGATCCC.
リンカー配列を5'プライマーおよび3'プライマーに付着させた。
LTRおよびPAを、上記に記載した同じアニーリング条件下でPCR増幅させた。増幅された断片を精製し、配列決定によって試験を行った。
【００２６】
３．アデノウイルスE1配列を、上記に記載した同じPCR条件下で別々にPCR増幅させた。BamHIおよびEcoRIの制限酵素部位を両末端のプライマーにそれぞれ連結させた。前記断片を増幅後に試験した。
【００２７】
４．工程１からの断片と工程２からの断片を、PCR反応によってそれぞれ連結させた。実験条件は上述した通りである。PCR複製産物LTR-p53-PAを得た。得られた配列をシークエンシングによって試験した。
【００２８】
５．工程３からの断片と工程４からのLTR-p53-PAを、T4 DNAリガーゼによって連結した。得られた配列がp53遺伝子カセットである。
【００２９】
６．アデノウイルスの両末端からの逆方向末端反復(IRT)配列を、上述したのと同じ実験条件下でPCR増幅した。シークエンシングによって試験した後、得られた断片をpUC18ベクターにクローン化した。これによって組換え体ベクターpGT-1を得た。
【００３０】
７．組換え体ベクターpGT-1および野生型アデノウイルス５(ATCC-VR-5、アデノウイルス75、力価：10(6.75) TCID(50)/ml)DNAを、大腸菌BJ5183にコトランスフェクトした。1分間にわたって4℃に維持した後、トランスフェクションを行う細菌を、50秒間にわたって42℃で熱ショックを与え、1分間にわたって4℃にインキュベートし、その後、1ml LB培地と混合し、1時間にわたってインキュベートした。加工された細菌を、アンピシリンを含む寒天培地上に播種し、24時間にわたってインキュベートした。１つの細胞群を、無菌のつま楊枝でつつき、これをLB培地の入ったボトルに入れ、24時間にわたって培養した。プラスミドを通常の方法によって抽出し、PacIによってスクリーニングした。ポジィティブクローンはpGT-2(Ad5の全配列を含む)である。
【００３１】
８．組換え体ベクターpGT-2およびp53遺伝子カセットを、大腸菌BJ5183にコトランスフェクトした。培養条件、スクリーニングおよびキャラクタリゼーションの方法は上述した通りである。ポジィティブクローンは、アデノウイルス全遺伝子配列および挿入されたp53発現カセットを含むpGT-3である。クローンをPacIによって直線化した後にpUC18起源のベクター配列を切り捨てた。
【００３２】
９．ポジィティブな直線状のプラスミドをCsClによって精製し、CaCl2方法を使用して293細胞にトランスフェクトした。細胞を7日後に収集した。細胞を15分間にわたって1000rpmで遠心分離した。上清を捨てた。細胞を37℃〜80℃で3回溶解させた。30分間にわたって4000rpmで再び遠心分離を行った。沈殿物を捨てた。上清を細胞に再び感染させ、ウイルスを増幅し、上述に記載されたのと同じ方法で溶解した。得られた上清を、16時間にわたって4℃、60000rpm、CsClで密度勾配遠心分離した。組換え体アデノウイルスのバンドをNo.7針によって抽出した。DNA断片をN1Hバッファーに加え、Spectra MW6000透析バック中に4時間にわたって4℃で透析した。DNA溶液を0.25μmフィルターを通過させることによって滅菌した。その後、DNA溶液をパックして-80℃で貯蔵した。得られた生成物の一部を、プラーク検定およびウイルス力価試験に使用した。
【００３３】
１０．組換え体アデノウイルスの構造安定性試験。ウイルスのゲノムDNAを複製の数世代後に得た。5'CCACGACGGTGACACGCTTCおよび5'CAAGCAAGGGT TCAAAGACであるp53の両末端からのプライマーを使用してDNA断片をPCR増幅した。アガロースゲル電気泳動の結果を図3に示した。組換え体アデノウイルスの両側のアデノウイルスのアームを、プライマー：5'TTT CTC AGG TGT TTT CCG Cおよび5'CAT CGT ACC TCA GCA CCT TCとして考案した。PCRの結果を図４に示した。上記結果は、組換え体p53アデノウイルスの構造が、複製の多くの世代後に安定したことを示した。
【００３４】
１１．Hep-2およびH1299細胞中でのp53遺伝子発現試験。組換え体アデノウイルスをトランスフェクトした36時間後、Hep-2およびH1299細胞を一般的な方法によって溶解させた。p53タンパク質特異的抗体を使用したウェスタンブロットの結果を図５に示した。
【００３５】
実験２：
線維芽細胞に対する組換え体アデノウイルスの殺傷効果：
インビトロでの瘢痕線維芽細胞の培養（図6を参照）：瘢痕皮膚を外科から入手し、0.5〜1cm3の大きさの小さな断片に各々無菌状態で切断した。次に、皮膚断片を直ちに1000U/mlアンピシリンおよびストレプトマイシンを含む培養液に入れた。組織をPBS（アンピシリンおよびストレプトマイシンを含む）で２回洗浄し、脂肪および結合組織を除去した。その後、油成分が無くなりクリアになるまでD-Hank溶液で再度数回にわたって組織を洗浄した。次に、皮膚断片を、各断片1mm3の大きさになるまで再度切断した。数滴の血清を組織上に添加し、断片を培養容器の壁に広げた。次に、組織表面の容器側が上向きになるまで容器を回転させ、10%FBSを含むDMEM培養液を加えた（注：組織と溶液が分かれた）。組織表面の容器側を上向きにした状態で37℃および5%CO2のオーブン中に容器を静置した。6〜8時間後、容器をゆっくりと回転させた。その後、ボトルを3〜4日間にわたって静置した。その後、溶液を3〜4日毎に交換した。新しい細胞が10日で組織片の周りに増殖し、細胞塊が生じた。細胞は、約１月で単層の細胞群を形成して容器全面を覆った。
【００３６】
S-P染色および真空方法を使用した細胞タイプの特徴描写
サンプル調製：細胞をトリプシンを使用して消化し、10000細胞/ml濃度の細胞懸濁液を調製した。18×18mmのカバーガラスを、55mmサイズの培養皿に入れた。2滴の細胞懸濁液を各カバーガラス上に滴下した。そして、カバーガラスをCO2を含むオーブン中に6〜8時間にわたって静置し、その後、PBSで3回にわたって十分に洗浄した。次に、カバーガラスを純粋なアセトン中に入れ、室温で15分間にわたって固定し、PBSで3回洗浄した。
【００３７】
真空中でS-Pを使用する免疫化学的細胞染色（図７を参照）：カバーガラスを、スライドの上部に細胞表面側が上向きになるように静置した。50μlのマウス抗ヒトを、各スライド上に滴下した。同じ量のPBSを、ネガティブコントロールグループに加えた。スライドを、66.7kPaの真空オーブン中に10分間にわたって入れ、再びPBSで3回洗浄した。各スライドに50μlのストレプトマイシンビオチンタンパク質−ペルオキシダーゼ溶液を添加し、10分間にわたって真空オーブン中に静置し、PBSで3回洗浄し、1分間にわたってヘマトキシリンで再染色し、数秒間にわたって1％アルコールを適用し、アルコールで脱水し、ジメチルベンゼンを適用し、ゴムで封止し、最後に顕微鏡下で観察した。
【００３８】
顕微鏡における細胞変化の観察（図8を参照）： 5×105数の瘢痕線維芽細胞を、25cm2容器中にインキュベートし、24時間にわたって培養した。その後、培養液を交換し、細胞を200MOIの組換え体アデノウイルスに感染させた。細胞の形状変化を、24時間、48時間および72時間後に顕微鏡下で観察した。
【００３９】
電子顕微鏡における細胞構造の変化（図9を参照）： 5×105数の瘢痕線維芽細胞を、25cm2容器中にインキュベートし、24時間にわたって培養した。その後、培養液を交換し、細胞を200MOIの組換え体アデノウイルスに48時間にわたって感染させた。細胞をトリプシンによって消化し、細胞懸濁液をアガロース管に収集した。次に、前記管を2000r/minで15分間にわたって遠心分離し、細胞凝集塊を形成させた。その後、2%のグルタルアルデヒドおよび1%の四酸化オスミウムで細胞を固定した。その後、寒天中に包まれた細胞凝集塊を脱水、透過させ、エポキシ樹脂で包み、薄くスライスして染色し、透過型電子顕微鏡下で観察して写真を撮った。
【００４０】
実験3：
瘢痕遺伝子治療の臨床調査における、この組換え体アデノウイルスのケロイドに対する治療結果。
図10Aおよび10Bに示したように、女性のケロイド罹患患者は、瘢痕を座瘡後の彼女の左胸部から切除した。しかしながら、腫瘍性瘢痕は手術後に再発した。局所的再発は3年で発生した。ステロイドおよび他の一般的治療は効果を示さなかった。彼女の胸部上の瘢痕の体積は、2×1×1cm3である（図10Aを参照）。瘢痕の大きさは、4週間にわたる遺伝子治療後に著しく減少した。明らかな副作用は自己制限的発熱を除いて表われなかった。ケロイドのための組換え体アデノウイルスの治療は、臨床実験によって安全であることが証明された。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１Ａ】図１Ａは、組換え体医薬の構築の模式的なプロセスの一部である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、組換え体医薬の構築の模式的なプロセスの一部である。
【図２】図２は、組換え体医薬の生産のための実験的なプロトコルの流れ図である。
【図３】図３は、プライマーとして5'CCACGACGGTGACACGCTTCおよび5'CAAGCAAGGGTTCAAAGAC、鋳型としてp53cDNAを使用して、PCRによって組換え体p53アデノウイルスを増幅して作られた数世代の継代後の組換え体遺伝子のアガロースゲル電気泳動の安定性試験のダイアグラムである。組換え体p53アデノウイルスのPCR増幅は、1400bp DNA断片を得る。1. DNAマーカー  2,3,4. p53 cDNAのPCR結果。
【図４】図４は、293細胞を組換え体遺伝子によって感染後36時間で得られたウイルスDNAのPCR増幅物のアガロースゲル電気泳動の結果分析のダイアグラムである。(SiBiono Corpによって保存、保存番号：No-1、以下同じ）。DNA断片は2750bpである。1. DNAマーカー  2. 組換え体p53アデノウイルスのPCR結果。
【図５】図５は、Hep-2およびH1299細胞を組換え型アデノウイルスによって感染後36時間のウェスタンブロット分析の結果である。Hep-2細胞およびH1299細胞内の組換え体p53アデノウイルスによって行われたp53の発現。1. タンパク質マーカー；  2-3. それぞれ、ネガティブコントロール： SBN-1によって感染していないHep-2細胞およびH1299細胞；  4-5. それぞれ、SBN-1によって感染したHep-2細胞およびH1299細胞。
【図６】図６は、インビトロで初期培養されたヒト肥厚性瘢痕の線維芽細胞である。連続的な線維芽細胞は整然としており、結節性またはらせん形態を示す。線維芽細胞は、紡錘形状か不規則形状であり、細胞の境界は光学顕微鏡下で明瞭である。
【図７】図７は、SP染色および真空を使用した線維芽細胞の特徴描写である。S-P染色および真空を使用したｃ細胞の透明質は褐色であり、核は青色である。全ての連続的な細胞は線維芽細胞であり、これらは位置細胞であるのでIII型プロトコラーゲンを生成することができる。
【図８】図８は、インビトロでの瘢痕線維芽細胞に対する組換え体遺伝子の殺傷効果の顕微鏡写真である。Ｂ,Ｃ,Ｄは、組換え体アデノウイルスに感染した瘢痕線維芽細胞の立体配置の変化を、24時間、48時間、および72時間後にカウントした。細胞の体積が増加し、紡錘体から多角形に変化し、透明質がまた増加し、核分裂が減少し、解離および崩壊した。しかしながら、対照細胞の立体配置は著しくは変化しなかった。
【図９】図９は、インビトロでの瘢痕線維芽細胞に対する組換え体遺伝子の殺傷効果の電子顕微鏡写真である。透過電子顕微鏡下での観察（図９Ａ，Ｂ，Ｃ）は、泡立ち、アポトーシス体の出現、および組換え体医薬(ＭＯＩ＝２００)を含む細胞内におけるアポトーシス体のキャスティングの過程を示す。図９Ｄは、コンドリオソームの明らかな増加が認められるアポトーシスの他の状況を表わす。
【図１０】図１０は、治療前後のケロイド罹患患者に対する組換え体遺伝子の効果の写真を含む。４週にわたる遺伝子治療後に瘢痕の大きさが著しく減少した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ａ】
2007504274.tif 000014
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2007504274.tif 000022
【図９】
2007504274.tif 000023
【図１０】
2007504274.tif 000024
【国際調査報告】
2007504274.tif 000025
2007504274.tif 000026
2007504274.tif 000027
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