(57)【要約】本発明は、アプタマープローブ、ナノ粒子・アプタマーコンジュゲートプローブ、アプタマー・アレイ、標的分析物のアプタマープローブとの結合を検出することからなる試料中の標的分析物を検出する方法、検出方法、およびキットを提供する。
2007536528.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する少なくとも１つの標的分析物を検出する方法であって、
ａ）特異的標的分析物の第１の結合部位に結合することのできる少なくとも１種類の捕捉プローブが結合している基材を提供する工程と、
ｂ）該標的分析物の第２の結合部位に結合することのできる検出アプタマーを含んでなる少なくとも１種類のナノ粒子プローブを提供する工程と、
ｃ）該捕捉プローブが該標的分析物の第１の結合部位に結合し、かつ該ナノ粒子プローブが該標的分析物の第２の結合部位に結合して複合体を形成するのに有効な条件下で、該基材と該ナノ粒子プローブとに該試料を接触させる工程と、
ｄ）該試料中の特異的標的分析物の存在の有無を示す、該複合体の存在の有無を検出する工程と
から成る方法。
【請求項２】
前記捕捉プローブは抗体または捕捉アプタマーを含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記結合部位は特異的捕捉プローブが結合する抗原決定基である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
２種類以上のナノ粒子プローブであって、各ナノ粒子プローブに、同じ標的分析物上の異なる抗原決定基、または異なる標的分析物、あるいはその両方に結合することのできる検出アプタマーが結合していることを特徴とするナノ粒子プローブが提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
試料中に存在する標的分析物がナノ粒子プローブ上の検出アプタマーに結合するように、試料を最初にナノ粒子プローブに接触させ、次いで、該標的分析物が基材上の捕捉プローブに結合するように、前記ナノ粒子プローブに結合した標的分析物を基材に接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
試料中に存在する標的分析物が捕捉プローブに結合するように、試料を最初に基材に接触させ、次いで、該標的分析物がナノ粒子プローブ上の検出アプタマーに結合するように、前記捕捉アプタマーに結合した標的分析物をナノ粒子プローブに接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
試料、ナノ粒子プローブ、および基材上の捕捉プローブを同時に接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
捕捉された標的とナノ粒子プローブとの複合体を、光学的、電気的、音響学的、光音響学的、重力学的、電気化学的、電気光学的、質量分光学的、酵素的、化学的、生化学的または物理的な手段によって検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ナノ粒子は貴金属から作製される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ナノ粒子は金または銀から作製される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ナノ粒子は金から作製される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記基材は磁性ビーズである請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記基材は平坦な表面を有する請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記基材はガラス、石英、セラミックまたはプラスチックから作製される請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出工程は前記基材を銀染色剤に接触させる工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記検出工程は前記ナノ粒子によって散乱された光を検出する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出工程は光学スキャナを用いて観察する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記スキャナはグレイスケール測定値を算出することのできるソフトウェアを装備したコンピュータに連結され、検出された分析物の量を定量するためにグレイスケール測定値が算出される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記基材は位置指定可能である請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
各々異なる標的分析物を認識することのできる複数の捕捉プローブが、アレイ状のスポットとして基材に結合される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
捕捉プローブの各スポットが２つの電極の間に配置され、前記ナノ粒子が導電体である材料から作製され、工程（ｄ）が導電率の変化を検出する工程を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記電極は金から作製され、前記ナノ粒子は金から作製される請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記基材を銀染色剤に接触させて導電率の変化を発生させる請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する少なくとも１種類の標的分析物を検出する方法であって、
ａ）検出アプタマーを含んでなる少なくとも１種類のナノ粒子プローブであって、各種類のプローブ上の検出アプタマーが、特定の種類の標的分析物の第１の結合部位に結合することのできる構造を有することを特徴とするナノ粒子プローブを提供する工程と、
ｃ）検出アプタマーが標的分析物に結合するのに有効な条件下で、試料をナノ粒子プローブに接触させる工程と、
ｄ）該検出アプタマーが該標的分析物に結合するかどうかを検出する工程と
から成る方法。
【請求項２５】
試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する標的分析物を検出する方法であって、
ａ）標的分析物の２つ以上の結合部位に結合することのできるアプタマーが結合している、ある種類のナノ粒子を提供する工程と、
ｂ）標的分析物とナノ粒子に結合しているアプタマーとの間の結合を可能にするのに有効な条件下で、試料と、アプタマーが結合しているナノ粒子とを接触させる工程と、
ｃ）標的分析物がナノ粒子に結合しているアプタマーと結合することによってもたらされる検出可能な変化を観察する工程と
から成る方法。
【請求項２６】
試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する標的分析物を検出する方法であって、
ａ）アプタマーが結合している少なくとも２種類のナノ粒子であって、各種類のアプタマーが標的分析物の異なる結合部位に結合することができることを特徴とするナノ粒子を提供する工程と、
ｂ）標的分析物とナノ粒子に結合しているアプタマーとの間の結合を可能にするのに有効な条件下で、試料と、アプタマーが結合している少なくとも２種類のナノ粒子とを接触させる工程と、
ｃ）ナノ粒子に結合しているアプタマーが標的分析物と結合することによってもたらされる検出可能な変化を観察する工程と
から成る方法。
【請求項２７】
試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する標的分析物を検出する方法であって、
ａ）標的分析物のある結合部位に結合することのできるアプタマーが結合している少なくとも１種類のナノ粒子と、標的分析物の異なる結合部位に結合することのできる抗体が結合している少なくとも１種類のナノ粒子とを提供する工程と、
ｂ）試料と、アプタマーが結合している少なくとも１種類のナノ粒子と、抗体が結合している少なくとも１種類のナノ粒子とを、標的分析物とナノ粒子に結合しているアプタマーおよび抗体との間の結合を可能にするのに有効な条件下で接触させる工程と、
ｃ）ナノ粒子に結合しているアプタマーおよびナノ粒子に結合している抗体が標的分析物と結合することによってもたらされる検出可能な変化を観察する工程と
からなる方法。
【請求項２８】
検出工程は、光学的、電気的、音響学的、光音響学的、重力学的、電気化学的、電気光学的、質量分光学的、酵素的、化学的、生化学的または物理的な手段によってなされる、請求項２４、２５、２６、または２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ナノ粒子は貴金属から作製される請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ナノ粒子は金または銀から作製される請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ナノ粒子は金から作製される請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
検出工程は、前記ナノ粒子によって散乱された光を検出する工程を含む、請求項２４、２５、２６、または２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
オリゴヌクレオチド・テールを有するアプタマーと、
該オリゴヌクレオチド・テールの配列の少なくとも一部分と相補的な配列を有し、任意選択の標識を有する第２のオリゴヌクレオチドと
から成るアプタマープローブ。
【請求項３４】
前記任意選択の標識は、光学的、電気的、音響学的、光音響学的、重力学的、電気化学的、電気光学的、質量分光学的、酵素的、化学的、生化学的または物理的な手段による検出を可能にする検出標識である、請求項３３に記載のアプタマープローブ。
【請求項３５】
前記任意選択の標識は、蛍光性、発光性、リン光性、または放射性の検出標識である、請求項３３に記載のアプタマープローブ。
【請求項３６】
前記任意選択の標識は、量子ドット、ナノ粒子、デンドリマー、分子集合体またはビーズである、請求項３３に記載のアプタマープローブ。
【請求項３７】
前記任意選択の標識は既知配列を有する第３のオリゴヌクレオチドである、請求項３３
に記載のアプタマープローブ。
【請求項３８】
前記第３のオリゴヌクレオチドは、物理的、化学的または生化学的な手段により増幅されるように設計されている、請求項３３に記載のアプタマープローブ。
【請求項３９】
前記第３のオリゴヌクレオチドの増幅はハイブリダイゼーション・カスケードまたは酵素的手段によって行われる、請求項３８に記載のアプタマープローブ。
【請求項４０】
前記任意選択の標識はナノ粒子である請求項３３に記載のアプタマープローブ。
【請求項４１】
前記任意選択の標識はナノ粒子・オリゴヌクレオチドコンジュゲートである請求項３３に記載のアプタマープローブ。
【請求項４２】
前記コンジュゲートは１種類以上のＤＮＡバーコードが結合しているナノ粒子を含む請求項３３に記載のアプタマープローブ。
【請求項４３】
前記第２のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド・テールに結合している第１の部分およびナノ粒子コンジュゲートに結合しているオリゴヌクレオチドに結合している第２の部分の、少なくとも２つの部分の配列を有する、請求項４２に記載のアプタマープローブ。
【請求項４４】
前記第２のオリゴヌクレオチドは、複数のＤＮＡバーコードがさらに結合しているナノ粒子で標識されている、請求項３３に記載のアプタマープローブ。
【請求項４５】
前記ＤＮＡバーコードは前記ナノ粒子に直接的または間接的に結合している請求項４４に記載のアプタマープローブ。
【請求項４６】
前記ＤＮＡバーコードが検出標識をさらに含む請求項４４に記載のアプタマープローブ。
【請求項４７】
前記検出標識は、光学的、電気的、音響学的、光音響学的、重力学的、電気化学的、電気光学的、質量分光学的、酵素的、化学的、生化学的または物理的な手段による検出を可能にする請求項４４に記載のアプタマープローブ。
【請求項４８】
ａ）ナノ粒子と、
ｂ）該ナノ粒子上に約１．０×１０１０〜約５．０×１０１２個／ｃｍ２の表面密度で存在する少なくとも１種類のアプタマーと
を含んでなるナノ粒子・アプタマーコンジュゲートプローブ。
【請求項４９】
少なくとも２種類のアプタマーを含む請求項４８に記載のプローブ。
【請求項５０】
前記アプタマーが約８．０×１０１１〜６．４×１０１２の範囲の表面密度でナノ粒子上に存在する請求項４８に記載のプローブ。
【請求項５１】
前記ナノ粒子は前記アプタマーに加えてさらにオリゴヌクレオチドが結合している、請求項３３または４４に記載のプローブ。
【請求項５２】
前記オリゴヌクレオチドはポリアデノシンオリゴヌクレオチドである請求項５１に記載のプローブ。
【請求項５３】
前記ポリアデノシンオリゴヌクレオチドはＡ１０またはＡ２０である請求項５２に記載のプローブ。
【請求項５４】
前記アプタマーはホスホロチオエート部分またはホスホロジチオエート部分を含む請求項３３または４４に記載のプローブ。
【請求項５５】
前記ナノ粒子は金属ナノ粒子または半導体ナノ粒子である請求項５１に記載のプローブ。
【請求項５６】
前記ナノ粒子は貴金属から作製される請求項５５に記載のプローブ。
【請求項５７】
前記ナノ粒子は金から作製される請求項５６に記載のプローブ。
【請求項５８】
１つ以上の標的分析物を検出するための基材であって、
ａ）基材と、
ｂ）該基材に結合している少なくとも１種類の捕捉アプタマーであって、各種類の捕捉アプタマーが特異的標的分析物に結合し、アレイ状の別個のスポットとして配置されることを特徴とする捕捉アプタマーと、
ｃ）該別個のスポットの間に配置された電極と
から成る基材。
【請求項５９】
試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する少なくとも１つの標的分析物を検出する方法であって、
ａ）特異的標的分析物の第１の結合部位に結合することのできる少なくとも１種類の捕捉プローブが結合している基材を提供する工程と、
ｂ）請求項３３に記載の少なくとも１種類の検出アプタマープローブであって、該検出アプタマーが前記標的分析物の第２の結合部位に結合することができることを特徴とする検出アプタマープローブを提供する工程と、
ｃ）該捕捉プローブが該標的分析物の第１の結合部位に結合し、かつ該アプタマープローブが該標的分析物の第２の結合部位に結合して複合体を形成するのに有効な条件下で、試料を該基材および該プローブに接触させる工程と、
ｄ）検出可能な変化を観察する工程と
から成る方法。
【請求項６０】
前記捕捉プローブは抗体または捕捉アプタマーを含んでなる請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記結合部位は特異的捕捉プローブが結合する抗原決定基である請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
２種類以上のアプタマープローブであって、各種類のプローブに、同じ標的分析物上の異なる抗原決定基、または異なる標的分析物、あるいはその両方に結合することのできる検出アプタマーが結合していることを特徴とするアプタマープローブが提供される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
試料中に存在する標的分析物がプローブ上の検出アプタマーに結合するように、試料を最初にアプタマープローブに接触させ、次いで、標的分析物が基材上の捕捉プローブに結合するように、前記アプタマープローブに結合している標的分析物を基材に接触させる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
試料中に存在する標的分析物が捕捉プローブに結合するように、試料を最初に基材に接
触させ、次いで、標的分析物がアプタマープローブ上の検出アプタマーに結合するように、前記捕捉アプタマーに結合している標的分析物をアプタマープローブに接触させる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
前記試料、前記アプタマープローブ、および前記基材上の前記捕捉プローブを同時に接触させる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６６】
捕捉された標的とアプタマープローブとの複合体を、光学的、電気的、音響学的、光音響学的、重力学的、電気化学的、電気光学的、質量分光学的、酵素的、化学的、生化学的または物理的な手段によって検出する請求項５９に記載の方法。
【請求項６７】
前記基材は磁性ビーズである請求項５９に記載の方法。
【請求項６８】
前記基材は平坦な表面を有する請求項５９に記載の方法。
【請求項６９】
前記基材はガラス、石英、セラミックまたはプラスチックから作製される請求項５９に記載の方法。
【請求項７０】
前記検出工程は前記基材を銀染色剤に接触させる工程を含む請求項５９に記載の方法。
【請求項７１】
前記基材は位置指定可能である請求項５９に記載の方法。
【請求項７２】
各々異なる標的分析物を認識することのできる複数の捕捉プローブが、アレイ状のスポットとして基材に結合されている、請求項５９に記載の方法。
【請求項７３】
捕捉プローブの各スポットが２つの電極の間に配置され、前記アプタマープローブ上の任意選択の標識は導電体である材料から作製されたナノ粒子であり、かつ工程（ｄ）は導電率の変化を検出する工程を含む請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記電極は金から作製され、前記ナノ粒子は金から作製される請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記基材を銀染色剤に接触させて導電率の変化を発生させる請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する少なくとも１種類の標的分析物を検出する方法であって、
ａ）請求項３３に記載の少なくとも１種類の検出アプタマープローブであって、各種類のプローブ上の検出アプタマーが特定の種類の標的分析物の第１の結合部位に結合することのできる構造を有することを特徴とする検出アプタマープローブを提供する工程と、
ｃ）該検出アプタマーが該標的分析物に結合するのに有効な条件下で、試料をアプタマープローブに接触させる工程と、
ｄ）検出アプタマーが標的分析物に結合するかどうかを検出する工程と
から成る方法。
【請求項７７】
試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する標的分析物を検出する方法であって、
ａ）請求項３３に記載のある種類の検出アプタマープローブであって、アプタマーが標的分析物の２つ以上の結合部位に結合することができることを特徴とする検出アプタマープローブを提供する工程と、
ｂ）試料と、アプタマーが結合している該アプタマープローブとを、該標的分析物と該アプタマーとの間の結合を可能にするのに有効な条件下で接触させる工程と、
ｃ）該標的分析物が該アプタマーに結合することによってもたらされる検出可能な変化を観察する工程と
から成る方法。
【請求項７８】
試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する標的分析物を検出する方法であって、
ａ）請求項３３に記載の少なくとも２種類のアプタマープローブであって、各種類のアプタマーが標的分析物の異なる結合部位に結合することができることを特徴とするアプタマープローブを提供する工程と、
ｂ）試料と、少なくとも２種類のアプタマープローブとを、該標的分析物と該ナノ粒子に結合している該アプタマーとの間の結合を可能にするのに有効な条件下で接触させる工程と、
ｃ）該アプタマーが該標的分析物と結合することによってもたらされる検出可能な変化を観察する工程と
から成る方法。
【請求項７９】
請求項３３または４８に記載のアプタマー検出プローブと任意選択の基材とを含む、試料中の１つ以上の分析物を検出するためのキット。
【請求項８０】
前記基材は特異的標的分析物用の少なくとも１つの捕捉プローブでアレイ化されている、請求項７９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、アプタマープローブ、ナノ粒子・アプタマーコンジュゲートプローブ、アプタマー・アレイ、標的分析物のアプタマープローブとの結合を検出することからなる試料中の標的分析物の検出方法、検出方法、およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
（相互参照）
本願は２００４年１１月２２日出願の米国特許出願第１０／９９５０５１号の一部継続出願であり、２００４年５月３日出願の米国仮特許出願第６０／５６７８７４号の利益を主張する。米国特許出願第１０／９９５０５１号および米国仮特許出願第６０／５６７８７４号の全体を本明細書に援用する。
【０００３】
（発明の背景）
抗体マイクロアレイによるタンパク質分析物の検出は、プロテオミクスならびに診断の強力なツールとして登場した（非特許文献１〜３）。抗体アレイを標識するための多種多様な検出法が開発されており、限定するものではないが、蛍光（非特許文献１、非特許文献４）、化学発光（非特許文献２）、共鳴光散乱（非特許文献３）、およびＳＥＲＳ（非特許文献５）が挙げられる。また、ローリングサークル型増幅（ＲＣＡ）法などのシグナル増幅戦略を使用して、蛍光を用いる方法の検出感度が増大されてきた（非特許文献６および７）。これらの方法はタンパク質分析物の高感度検出（＜１０ｐｇ／ｍＬ）を提供してきたが、そのような標識方法の使用は、交差反応を生じ易い抗体の性能による制限を受けてきた（非特許文献３）。また、高度に精製された抗体試薬を再現性よく調製するのは困難であると同時に時間を要する（非特許文献８）。したがって当該分野では、対象のタンパク質分析物に対する高い感度および特異性を提供するだけでなく製造および使用の際の再現性も提供するプローブ・システムが必要とされている。
【０００４】
ＲＮＡおよびＤＮＡアプタマーは種々の用途においてモノクローナル抗体の代わりになり得る（非特許文献８および９）。アプタマーとは、非核酸分子または核酸分子に対して古典的なワトソン・クリック型塩基対形成以外の相互作用を介した特異的結合親和性を有する核酸分子である。例えば、アプタマーについては特許文献１〜５に記載されている。
【０００５】
アプタマーは、特異的アプタマーの選択工程が比較的速く、安価に合成できることから、モノクローナル抗体の有用な代替物となっている。これらの核酸は、合成が容易で、簡単に操作することができ、また長期間保存することができる。これらの利点から、核酸は、対応するタンパク質である抗体よりも魅力的なバイオテクノロジーのツールとなっている。さらに、これらの核酸プローブを放射性同位体、ビオチン、または蛍光のタグで標識することも可能であり、種々の条件下で標的を検出するために使用することができる。非核酸の標的を認識する一層多くのＤＮＡおよびＲＮＡアプタマーがＳＥＬＥＸ法によって開発されており、特性解析されている（非特許文献１０および１１）。
【特許文献１】米国特許第５４７５０９６号
【特許文献２】米国特許第５２７０１６３号
【特許文献３】米国特許第５５８９３３２号
【特許文献４】米国特許第５５８９３３２号
【特許文献５】米国特許第５７４１６７９号
【非特許文献１】マクビース，ジー．（Ｍａｃｂｅａｔｈ，Ｇ．）；シュライバー，エス．エル．（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓ．Ｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００年）、第２８９巻、ｐ．１７６０〜１７６３
【非特許文献２】ムーディー，エム．ディー．（Ｍｏｏｄｙ，Ｍ．Ｄ．）；ファン・アルスデル，エス．ダブリュ．（ＶａｎＡｒｓｄｅｌｌ，Ｓ．Ｗ．）；マーフィー，ケイ．ピー．（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｋ．Ｐ．）；オレンコル，エス．エフ．（Ｏｒｅｎｃｏｌｅ，Ｓ．Ｆ．）；バーンズ，シー．（Ｂｕｒｎｓ，Ｃ．）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２００１年）、第３１巻、ｐ．１８６〜１９４
【非特許文献３】ニールセン，ユー．ビー（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｕ．Ｂ．）；ゲイエルスタンガー，ビー．エイチ．（Ｇｅｉｅｒｓｔａｎｇｅｒ，Ｂ．Ｈ．）、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．（２００４年）、第２９０巻、ｐ．１０７〜１２０
【非特許文献４】リ，ワイ．エル．（Ｌｉ，Ｙ．Ｌ．）；ライヘルト，ダブリュ．エム．、Ｌａｎｇｍｕｉｒ（２００３年）、第１９巻、ｐ．１５５７〜１５６６
【非特許文献５】グルビシャ，ディー．エス．（Ｇｒｕｂｉｓｈａ，Ｄ．Ｓ．）；ライペルト，アール．ジェイ．（Ｌｉｐｅｒｔ，Ｒ．Ｊ．）；パーク，エイチ．ワイ．（Ｐａｒｋ．Ｈ．−Ｙ．）；ドリスケル，ジェイ．（Ｄｒｉｓｋｅｌｌ，Ｊ．）；ポーター，エム．ディー．（Ｐｏｒｔｅｒ，Ｍ．Ｄ．）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（２００３年）、第７５巻、ｐ．５９３６〜５９４３
【非特許文献６】シュバイツァー，ビー．（Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ，Ｂ．）；ロバーツ，エス．（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．）；グリムウェイド，ビー．（Ｇｒｉｍｗａｄｅ，Ｂ．）；シャオ，ダブリュ．（Ｓｈａｏ，Ｗ．）；ワン，エム．（Ｗａｎｇ，Ｍ．）；フウ，キュー．（Ｆｕ，Ｑ．）；シュウ，キュー．（Ｓｈｕ，Ｑ．）；ラロシェ，アイ．（Ｌａｒｏｃｈｅ，Ｉ．）；チョウ，ズィー．（Ｚｈｏｕ，Ｚ．）；チェルネフ，ヴィー．ティー．（Ｔｃｈｅｒｎｅｖ，Ｖ．Ｔ．）；クリスチャンセン，ジェイ．（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，Ｊ．）；ヴェレカ，エム．（Ｖｅｌｌｅｃａ，Ｍ．）；キングスモア，エス．エフ．（Ｋｉｎｇｓｍｏｒｅ，Ｓ．Ｆ．）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２年）、第２０巻、ｐ．３５９〜３６５
【非特許文献７】ウィルトシャー，エス．（Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，Ｓ．）；ランベルト，ジェイ．（Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｊ．）；オマリー，エス．（Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ，Ｓ．）；クカンスキス，ケイ．（Ｋｕｋａｎｓｋｉｓ，Ｋ．）；チュー，ズィー．（Ｚｈｕ，Ｚ．）；キングスモア，エス．エフ．（Ｋｉｎｇｓｍｏｒｅ，Ｓ．Ｆ．）；リザルディ，ピー．エム．（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．）；ウァルド，ディー．シー．（Ｗａｒｄ，Ｄ．Ｃ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（２０００年），第９７巻、ｐ．１０１１３〜１０１１９
【非特許文献８】ジェイセナ，エス．ディー．（Ｊａｙａｓｅｎａ，Ｓ．Ｄ．）、「Ａｐｔａｍｅｒｓ：ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｈａｔ  ｒｉｖａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ」、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９９９年）、第４５巻第９号、ｐ．１６２８〜１６５０
【非特許文献９】モリスら（Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）、「Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｒｏｍ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔａｒｇｅｔｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，第９５巻第６号、ｐ．２９０２‐７、１９９８年
【非特許文献１０】ゴールドら（Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．），「Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ」、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第６４巻、ｐ．７６３〜７９７、１９９５年
【非特許文献１１】ベイチャーとエリントン（Ｂａｃｈｅｒ  ＆  Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ）、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  Ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，第３巻第６号、ｐ．２６５〜２７３、１９９８年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、アプタマープローブ、ナノ粒子・アプタマーコンジュゲートプローブ、アプタマー・アレイ、標的分析物のアプタマープローブとの結合を検出することからなる試料中の標的分析物の検出方法、検出方法、およびキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要約）
本発明は、非核酸分子および核酸分子などの分析物を検出する方法を提供する。１実施形態では、該方法は、アプタマーが結合しているナノ粒子（ナノ粒子・アプタマーコンジュゲート）に分析物を接触させる工程を含み、該アプタマーは特異的標的分析物に結合することのできる構造を有する。この接触工程は、ナノ粒子上のアプタマーと分析物との結合を可能にするのに有効な条件下で行われる。ナノ粒子上のアプタマーを分析物に結合させると、検出可能な変化が生じる。
【０００８】
１実施形態では、試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する少なくとも１つの標的分析物を検出する方法が提供され、該方法は、ａ）特異的標的分析物の第１の結合部位に結合することのできる少なくとも１種類の捕捉プローブが結合している基材を提供する工程と；ｂ）該標的分析物の第２の結合部位に結合することのできる検出アプタマーを含んでなる少なくとも１種類のナノ粒子プローブを提供する工程と；ｃ）該捕捉プローブが該標的分析物の第１の結合部位に結合し、かつ該ナノ粒子プローブが該標的分析物の第２の結合部位に結合して複合体を形成するのに有効な条件下で、該基材および該ナノ粒子プローブに該試料を接触させる工程と；ｄ）該試料中の特異的標的分析物の存在の有無を示す、該複合体の存在の有無を検出する工程とを含む。
【０００９】
１態様では、試料中に存在する標的分析物が検出プローブ上の検出アプタマーと結合するように、試料を検出プローブに接触させ、次に、標的分析物が基材上の捕捉アプタマーと結合するように、検出プローブに結合した標的分析物を基材に接触させることができる。別例として、試料中に存在する標的分析物が捕捉アプタマーと結合するように、試料を基材に接触させ、次に、標的分析物が検出プローブ上の検出アプタマーと結合するように、捕捉アプタマーに結合した標的分析物を検出プローブに接触させることができる。別の実施形態では、試料を検出プローブおよび基材に同時に接触させることができる。
【００１０】
別の実施形態では、捕捉プローブは抗体または捕捉アプタマーを含んでなる。標的分析物上の結合部位は、特異的捕捉プローブが結合する抗原決定基である。
別の実施形態では、２種類以上のナノ粒子プローブが提供され、各種類のナノ粒子プローブには、同じ標的分析物上の異なる抗原決定基に、または異なる標的分析物に、あるいはその両者に結合することのできる検出アプタマーが結合している。
【００１１】
本発明の別の実施形態では、試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する標的分析物を検出する方法が提供され、該方法は、（ａ）標的分析物の２つ以上の結合部位に結合することのできるアプタマーが結合している種類のナノ粒子を提供する工程と；（ｂ）試料と、アプタマーが結合しているナノ粒子とを、標的分析物とナノ粒子に結合しているアプタマーとの間の結合を可能にするのに有効な条件下で接触させる工程と；（ｃ）標的分析物がナノ粒子に結合しているアプタマーと結合することによってもたらされる検出可能な変化を観察する工程とを含む。
【００１２】
本発明のさらに別の実施形態では、試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する標的分析物を検出する方法が提供され、該方法は、（ａ）アプタマーが結合している少なくとも２種類のナノ粒子であって、各種類のアプタマーが標的分析物の異なる結合部位に結合することができることを特徴とするナノ粒子を提供する工程と；（ｂ）試料と、アプタマ
ーが結合している少なくとも２種類のナノ粒子とを、標的分析物とナノ粒子に結合しているアプタマーとの間の結合を可能にするのに有効な条件下で接触させる工程と；（ｃ）ナノ粒子に結合しているアプタマーが標的分析物と結合することによってもたらされる検出可能な変化を観察する工程とを含む。
【００１３】
本発明のさらに別の実施形態では、試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する標的分析物を検出する方法が提供され、該方法は、（ａ）標的分析物のある結合部位に結合することのできるアプタマーが結合している少なくとも１種類のナノ粒子と、標的分析物の異なる結合部位に結合することのできる抗体が結合している少なくとも１種類のナノ粒子とを提供する工程と；（ｂ）試料と、アプタマーが結合している少なくとも１種類のナノ粒子と、抗体が結合している少なくとも１種類のナノ粒子とを、標的分析物とナノ粒子に結合しているアプタマーおよび抗体との間の結合を可能にするのに有効な条件下で接触させる工程と；（ｃ）ナノ粒子に結合しているアプタマーおよびナノ粒子に結合している抗体が標的分析物と結合することによってもたらされる検出可能な変化を観察する工程とを含む。
【００１４】
捕捉された標的とナノ粒子プローブとの複合体は、任意の適切な手段、例えば光学的、電気的、音響学的、光音響学的、重力学的、電気化学的、電気光学的、質量分光学的、酵素的、化学的、生化学的または物理的な手段によって検出される。１態様では、適切な検出方法は、銀染色法を用いてナノ粒子の存在を増強すること、ナノ粒子によって散乱される光を検出すること；または光学スキャナを用いた視覚による観察を含む。
【００１５】
ナノ粒子は任意の適切な材料から作製される。１態様では、ナノ粒子は金または銀などの貴金属から作製される。
磁性ビーズまたは表面が平坦な基材などの任意の基材を用いてよい。基材はガラス、石英、セラミックまたはプラスチックなどの任意の適切な材料から作製されてよい。本実施形態の１態様では、基材は位置指定可能であり、各々異なる標的分析物を認識することのできる複数の捕捉プローブがアレイ状のスポットとして基材に結合される。本実施形態の別の態様では、捕捉プローブの各スポットが２つの電極の間に配置され、ナノ粒子が導電体である材料から作製され、工程（ｄ）が導電率の変化を検出する工程を含んでもよい。電極およびナノ粒子は金などの任意の導電性材料から構成されてよい。必要に応じて、基材を銀染色剤と接触させて導電率の変化を発生させてもよい。
【００１６】
本発明の別の実施形態では、アプタマープローブが提供される。該アプタマープローブは、オリゴヌクレオチド・テールを有するアプタマーと；該オリゴヌクレオチド・テールの配列の少なくとも１部分と相補的な配列を有する、任意選択の標識を有する第２のリンカーオリゴヌクレオチドとを含む。
【００１７】
１態様では、任意選択の標識は、光学的、電気的、音響学的、光音響学的、重力学的、電気化学的、電気光学的、質量分光学的、酵素的、化学的、生化学的または物理的な手段によって検出が可能な検出標識である。代表例には、蛍光性、発光性、リン光性、または放射性の検出標識、量子ドット、ナノ粒子、デンドリマー、分子集合体またはビーズ、ナノ粒子、および既知配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。該オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションのカスケードまたは酵素的手段などの物理的、化学的または生化学的手段によって増幅されるように設計される。
【００１８】
別の態様では、任意選択の標識は粒子とオリゴヌクレオチドとのコンジュゲート（粒子・オリゴヌクレオチドコンジュゲート）である。該粒子コンジュゲート標識は、ナノ粒子に直接的または間接的に結合している１種類以上のＤＮＡバーコードを有する粒子を含む。これらの「ＤＮＡバーコード」は、標的分析物の代理として働きシグナル増幅のための
手段を提供するオリゴヌクレオチドである。該ＤＮＡバーコードは任意選択で検出標識、例えば、フルオロフォアで標識されてもよい。該検出標識は、光学的、電気的、音響学的、光音響学的、重力学的、電気化学的、電気光学的、質量分光学的、酵素的、化学的、生化学的または物理的な手段による検出を可能にする。
【００１９】
分離されたバーコードは、任意の適切な検出プローブを用いたサンドイッチ・アッセイにおいて、アレイ化した基材などの任意の適切な手段によって検出可能である。粒子は、ナノ粒子およびマイクロ粒子などの任意の適切な大きさであってよく、ポリマー（例えば、ポリスチレン）、金属（例えば、金または銀）、セラミック類、半導体材料などの任意の適切な材料から作製されてよい。任意選択の標識が粒子・オリゴヌクレオチドコンジュゲートである場合、本発明のアプタマープローブは、本明細書にその全体を援用する２００４年６月２５日出願の米国特許第１０／８７７７５０号明細書に記載のものなどのバイオバーコード検出アッセイに特に有用である。
【００２０】
別の態様では、第２のオリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの部分、すなわちオリゴヌクレオチド・テールに結合している第１の部分、およびナノ粒子コンジュゲートに結合しているオリゴヌクレオチドに結合している第２の部分を有する配列を有する。
【００２１】
本発明の別の実施形態では、ナノ粒子・アプタマーコンジュゲートプローブが提供される。該アプタマープローブは、（ａ）ナノ粒子；および（ｂ）該ナノ粒子上に、約１．０×１０１０〜約１．０×１０１３個／ｃｍ２、好適には、約８．０×１０１１〜６．４×１０１２の範囲の表面密度で存在する少なくとも１種類のアプタマーを含んでなる。１態様では、該ナノ粒子は金属性または半導体性のナノ粒子である。別の態様では、該ナノ粒子は金などの貴金属から作製される。
【００２２】
１態様では、該コンジュゲートプローブは少なくとも２種類のアプタマーを含む。
別の態様では、該コンジュゲートプローブには、アプタマーに加えてさらに希釈オリゴヌクレオチドが結合している。該希釈オリゴヌクレオチドには、ポリＡ１０［配列番号６］またはポリＡ２０［配列番号７］などの任意の適切な長さのポリアデノシンオリゴヌクレオチドがある。
【００２３】
さらに別の実施形態では、本発明のアプタマーは、ホスホロチオエート部分またはホスホロジチオエート部分を含んだチオアプタマーであり得る。
別の実施形態では、基材に結合したアプタマーが２つの電極の間に配置され、該ナノ粒子が導電体である材料から作製され、本発明の方法の工程（ｄ）が導電率の変化を検出する工程を含んでもよい。さらに別の実施形態では、各々異なる標的分析物を認識し得る複数のアプタマーがアレイ状のスポットとして基材に結合され、アプタマーのスポットの各々が２つの電極の間に配置され、ナノ粒子が導電体である材料から作製され、本発明の方法の工程（ｄ）は導電率の変化を検出する工程を含む。該電極は、例えば金から作製することができ、ナノ粒子は金から作製される。あるいは、基材を銀染色剤に接触させて導電率の変化を発生させることもできる。
【００２４】
本発明の別の実施形態では、１つまたは複数の標的分析物を検出するための基材が提供される。該基材は、基材と、該基材に結合している少なくとも１種類の捕捉アプタマーであって各種類が特異的標的分析物に結合しアレイ状の個別スポットとして配置された捕捉アプタマーと、（ｃ）該個別スポット間に配置された任意選択の電極とを含む。
【００２５】
本発明の別の実施形態では、試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する少なくとも１つの標的分析物を検出する方法が提供され、該方法は、（ａ）特異的標的分析物の第１の結合部位に結合することのできる少なくとも１種類の捕捉プローブが結合している基材
を提供する工程と；（ｂ）標的分析物の第２の結合部位に結合することのできる少なくとも１種類の検出アプタマープローブを提供する工程と；（ｃ）該捕捉プローブが該標的分析物の第１の結合部位に結合し、かつ該アプタマープローブが該標的分析物の第２の結合部位に結合して複合体を形成するのに有効な条件下で、試料を基材およびプローブに接触させる工程と；（ｄ）検出可能な変化を観察する工程とを含む。捕捉された標的とアプタマープローブとの複合体は、光学的、電気的、音響学的、光音響学的、重力学的、電気化学的、電気光学的、質量分光学的、酵素的、化学的、生化学的または物理的な手段によって検出される。
【００２６】
１態様では、捕捉プローブは抗体または捕捉アプタマーを含んでなる。結合部位は特異的捕捉プローブが結合する抗原決定基である。
別の態様では、２種類以上のアプタマープローブが提供され、各種類のプローブには、同じ標的分析物上の異なる抗原決定基に、または異なる標的分析物に、あるいはその両方に結合することのできる検出アプタマーが結合している。
【００２７】
別の態様では、試料中に存在する標的分析物がプローブ上のアプタマーに結合するように試料を最初にアプタマープローブに接触させ、次いで、標的分析物が基材上の捕捉プローブに結合するように、アプタマープローブに結合した標的分析物を基材に接触させる。
【００２８】
別の態様では、試料中に存在する標的分析物が捕捉プローブに結合するように試料を最初に基材に接触させ、次いで、標的分析物がアプタマープローブ上の検出アプタマーに結合するように、捕捉アプタマーに結合した標的分析物をアプタマープローブに接触させる。
【００２９】
別の態様では、試料と、アプタマープローブと、基材上の捕捉プローブとを同時に接触させる。
任意の適切な基材を用いてよく、そのような基材は位置指定可能であってもよい。代表的な基材を上に記載した。各々異なる標的分析物を認識し得る複数の捕捉プローブをアレイ状のスポットとして基材に結合させることができる。必要に応じて、捕捉プローブの各スポットが２つの電極の間に配置され、アプタマープローブ上の任意選択の標識が導電体である材料から作製されたナノ粒子であり、導電率の変化が検出されてもよい。電極は金から作製することができ、該ナノ粒子は金から作製することができる。
【００３０】
本発明の別の実施形態では、試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する少なくとも１種類の標的分析物を検出する方法が提供され、該方法は、（ａ）少なくとも１種類の検出アプタマープローブであって、各種類のプローブ上の検出アプタマーが特定の種類の標的分析物の第１の結合部位に結合することのできる構造を有することを特徴とする検出アプタマープローブを提供する工程と；（ｃ）該検出アプタマーが標的分析物に結合するのに有効な条件下で、該試料を該アプタマープローブに接触させる工程と；（ｄ）該検出アプタマーが該標的分析物に結合したかどうかを検出する工程とを含む。
【００３１】
本発明のさらに別の実施形態では、試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する標的分析物を検出する方法が提供され、該方法は、（ａ）請求項３３に記載のある種類の検出アプタマープローブであって、アプタマーが標的分析物の２つ以上の結合部位に結合することができることを特徴とする検出アプタマープローブを提供する工程と；（ｂ）該試料と、アプタマーが結合しているアプタマープローブとを、該標的分析物と該アプタマーとの間の結合を可能にするのに有効な条件下で接触させる工程と；（ｃ）該標的分析物がアプタマーに結合することによってもたらされる検出可能な変化を観察する工程とを含む。
【００３２】
本発明のさらに別の実施形態では、試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する標的
分析物を検出する方法が提供され、該方法は、（ａ）請求項３３に記載の少なくとも２種類のアプタマープローブであって、各種類のアプタマーが標的分析物の異なる結合部位に結合することができることを特徴とするアプタマープローブを提供する工程と；（ｂ）該試料と、該少なくとも２種類のアプタマープローブとを、該標的分析物と該ナノ粒子に結合しているアプタマーとの間の結合を可能にするのに有効な条件下で接触させる工程と；（ｃ）該アプタマーが該標的分析物に結合することによってもたらされる検出可能な変化を観察する工程とを含む。
【００３３】
本発明のさらに別の実施形態では、アプタマー検出プローブおよび任意選択の基材を含む、試料中の１つまたは複数の分析物を検出するためのキットが提供される。該基材は特異的標的分析物に対する少なくとも１つの捕捉プローブでアレイ化されていてもよい。
【００３４】
本発明の好適な具体的実施形態は、特定の好適な実施形態についての以下のより詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
（好適な実施形態についての詳細な説明）
文脈上必要な場合以外は、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語はその単数形を含むものとする。
【００３６】
本開示に従って使用される場合、以下の用語は特に指定のない限り、以下の意味を有するものと理解されたい。
本明細書で用いられる場合「核酸配列」、「核酸分子」または「核酸」は、本明細書に定める１つまたは複数のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指す。
【００３７】
本明細書中で参照される場合「ポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも１０塩基長の一本鎖または二本鎖の核酸ポリマーを意味する。ある実施形態では、該ポリヌクレオチドを含んでなるヌクレオチドは、リボヌクレオチドでもデオキシリボヌクレオチドでもよく、あるいはいずれかの種類のヌクレオチドが修飾された形態でもよい。前記修飾には、ブロモウリジンなどの塩基修飾、アラビノシドおよび２’，３’−ジデオキシリボースなどのリボース修飾、ならびにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデートおよびホスホロアミデートなどのヌクレオチド間結合修飾がある。「ポリヌクレオチド」という用語は具体的には一本鎖または二本鎖の形態のＤＮＡを含む。
【００３８】
本明細書中で参照される「オリゴヌクレオチド」という用語には、天然および／または非天然のオリゴヌクレオチド結合により互いに結合された、天然ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドが挙げられる。オリゴヌクレオチドは、一般に一本鎖であり２００塩基長以下のものからなるポリヌクレオチドのサブセットである。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは１０〜６０塩基長である。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９塩基長または２０〜４０塩基長である。オリゴヌクレオチドは、例えば遺伝子突然変異体の構築に使用するために一本鎖または二本鎖であってよい。本発明のオリゴヌクレオチドはタンパク質をコードしている遺伝子に関してセンスオリゴヌクレオチドであってもよいしアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００３９】
「天然ヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。「修飾ヌクレオチド」という用語は、修飾または置換された糖基等を有するヌクレオチドである。「オリゴヌクレオチド結合」という用語は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロ
チオエート、ホスホロアニラデート、ホスホロアミデートなどのオリゴヌクレオチド結合などを含む。例えば、ラプランシェら（ＬａＰｌａｎｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８６年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第１４巻、ｐ．９０８１；ステックら（Ｓｔｅｃ
ｅｔ  ａｌ．）、１９８４年、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第１０６巻、ｐ．６０７７；スタインら（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８８年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第１６巻、ｐ．３２０９；ゾンら（Ｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９１年、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、第６巻、ｐ．５３９；ゾンら（Ｚｏｎ
ｅｔ  ａｌ．）、１９９１年、「ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ」、ｐｐ．８７〜１０８、（エフ．エクスタイン（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）編、英国オックスフォードのオックスフォード大学出版（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）；ステックら（Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第５１５１５１０号明細書；ウフルマンとペイマン（Ｕｈｌｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ）、１９９０年、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、第９０巻、ｐ．５４３を参照されたい。これらの文献の開示を目的に応じて本明細書に援用する。オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドまたはそのハイブリダイゼーションの検出を可能にするための検出可能な標識を含み得る。
【００４０】
本発明の方法において用いられる「位置指定可能な基材」とは、アプタマーまたは分析物を結合させることのできる任意の表面であり得る。そのような表面には、限定するものではないが、ガラス、金属、プラスチック、またはアプタマーもしくは分析物を結合するように設計された官能基で被覆された材料が挙げられる。この被覆は単分子層よりも厚いものでよく、実際、被覆はアプタマーまたは分析物が内部へと拡散してその内表面に結合することのできる多孔性３次元構造を生成するのに十分な厚さの多孔性材料を含み得る。
【００４１】
「捕捉プローブ」とはアプタマーまたは抗体を指す。当技術分野で知られた方法を利用して、タンパク質、ポリペプチド、フラグメント、バリアント、および誘導体などの標的分析物を用いて抗体を調製することができる。したがって、標的分析物に結合する抗体および抗体フラグメントを、アプタマーの検出プローブを使用する場合には基材上の捕捉プローブとして、アプタマーを基材上の捕捉プローブとして使用する場合は検出プローブとして、あるいはアプタマーの検出プローブと組み合わせて検出プローブとして、サンドイッチ・アッセイにおいて使用することができる。抗体は、ポリクローナル抗体、単一特異性ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全なヒト抗体、単鎖抗体および／または二重特異性抗体であってよい。
【００４２】
標的分析物に対するポリクローナル抗体は一般に、ＪＮＫを活性化するホスファターゼポリペプチドおよびアジュバントを複数回皮下注射または腹腔内注射することによって、動物（例えば、ウサギまたはマウス）内で生成される。標的分析物のタンパク質、ポリペプチド、あるいはそのバリアント、フラグメントまたは誘導体を、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、血清、アルブミン、ウシのチログロブリン、または大豆トリプシンインヒビターなどの、免疫される生物種において免疫原性である担体タンパク質に結合させることは有用であり得る。また、ミョウバンなどの凝集剤を用いて免疫応答を増強する。免疫化の後、該動物を放血させ、その血清を抗標的分析物抗体力価アッセイに供する。
【００４３】
標的分析物に対するモノクローナル抗体は、培養下の連続継代細胞株によって抗体分子を生産する任意の方法を用いて生産される。モノクローナル抗体を調製するのに適した方法の例には、ケーラーら（Ｋｏｈｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻、ｐ．４９５〜９７（１９７５年）のハイブリドーマ法およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（コズボル（Ｋｏｚｂｏｒ）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１３３巻、ｐ．３００１（１９８４年）；ブロデュールら（Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．）、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎｓ」、ｐ．５１〜６３（マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ）、１９８７年））がある。
【００４４】
アプタマー含有プローブを、標的分析物の検出および定量のために、競合結合アッセイ、直接的または間接的サンドイッチ・アッセイ、および免疫沈降アッセイ（ソラ（Ｓｏｌａ）、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、ｐ．１４７〜１５８（シーアールシープレス（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年）などの任意の周知のアッセイ法に用いてもよい。
【００４５】
競合結合アッセイは、限られた量の抗標的抗体との結合について、標識された標準物（例えば、既知の標的ポリペプチドまたはその免疫学的に反応性の部分）が試験試料の分析物（標的ポリペプチド）と競合する能力に依存する。試験試料中の標的分析物の量は、抗体と結合する標準物の量に反比例する。結合する標準物の量の決定を容易にするために、一般に抗体を競合の前または後で不溶化して、該抗体に結合した標準物および分析物が結合していない標準物および分析物からうまく分離できるようにする。
【００４６】
サンドイッチ・アッセイでは一般に２つの抗体が使用され、各抗体は検出および／または定量されるタンパク質の異なる免疫原性部分または抗原決定基と結合することができる。サンドイッチ・アッセイでは、試験試料分析物は典型的には固体支持体上に固定化された第１の抗体と結合し、その後第２の抗体が該分析物に結合し、これによって不溶性の３部複合体が形成される。例えば、米国特許第４３７６１１０号明細書を参照されたい。第２の抗体はそれ自身が検出可能な部分で標識されていてもよいし（直接的サンドイッチ・アッセイ）、検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定されてもよい（間接的サンドイッチ・アッセイ）。例えば、サンドイッチ・アッセイの１種がＥＬＩＳＡ法であり、この場合検出可能な部分は酵素である。本発明を実施する際には、第１の抗体、第２の抗体またはその両者のいずれかがアプタマーで置換される。
【００４７】
本明細書中で使用される場合「捕捉アプタマー」という用語は、基材に結合されており、標的分析物を探し出す（すなわち、試料中で結合する）ことによって標的の非核酸分析物を該捕捉アプタマーとの結合を介して基材に結合させるアプタマーを指す。
【００４８】
「アプタマー」という用語は、核酸を分子の混合物に添加したときに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの選択または当技術分野で周知の他のタイプのアプタマー選択法（例えば、フロー・サイトメトリーを用いたビーズ系の選択法または高密度アプタマー・アレイ法）によって選び出される核酸（典型的にはＤＮＡ、ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチド）を指す。アプタマーを結合するリガンドには、限定するものではないが、小分子、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ホルモン類、糖、代謝副産物、補因子、薬物および毒素が挙げられる。本発明のアプタマーはある特定の分析物に特異的であることが好ましい。アプタマーは診断用途、標的バリデーション用途および治療用途を有し得る。この結合の特異性はアプタマーのそのリガンドに対する解離定数Ｋｄで定義される。アプタマーは、抗体と同様のＫｄ範囲（ｐＭ〜ｎＭ）の高い親和性、および抗体と同様または抗体より優れた特異性を有し得る（ツエルクとゴールド（Ｔｕｅｒｋ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ）、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４９巻、ｐ．５０５；エリントンとショスタク（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ
Ｓｚｏｓｔａｋ）、１９９０年、Ｎａｔｕｒｅ、第３４６巻、ｐ．８１８）。アプタマーは典型的には１０〜３００ヌクレオチド長である。ＲＮＡおよびＤＮＡアプタマーは、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ
Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ；試験管内人工進化法）などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択実験から得ることができる。アプタマーの使用および技術の例は、ＰｈｏｔｏＳＥＬＥＸ（商標）およびＲｉｂｏｒｅｐｏｒｔｅｒｓ（商標）である。アプタマー、その使用および製造法については、例えば、米国特許第５８４０８６７号明細書、米国
特許第６００１６４８号明細書、米国特許第６２２５０５８号明細書、米国特許第６２０７３８８号明細書および米国特許出願公開第２００２０００１８１０号に記載されており、本明細書にそれらの開示全体を援用する。
【００４９】
特異的標的分析物に結合するように構成されたアプタマーは、例えば、最初にオリゴヌクレオチドのヘテロ集団を合成し、次いでその集団内で特定の標的分析物にしっかりと結合するオリゴヌクレオチドを選択することによって選択することができる。特定の標的分子に結合するアプタマーが同定されれば、生物学および他の分野で知られた種々の技術を用いて、例えば、クローニングおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅の後で転写することによって、該アプタマーを複製することができる。
【００５０】
オリゴヌクレオチドのヘテロ集団の合成およびその集団内でのアプタマーの選択は、試験管内進化法すなわちＳＥＬＥＸとして知られている手順を用いて達成することができる。ＳＥＬＥＸ法については、例えば、ゴールドら（Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．）の米国特許第５２７０１６３号明細書および同第５５６７５８８号明細書；フィッツウォーターら（Ｆｉｔｚｗａｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、「Ａ  ＳＥＬＥＸ  Ｐｒｉｍｅｒ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第２６７巻、ｐ．２７５〜３０１（１９９６年）；およびエリントンとショスタック（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ）、「Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｈａｔ
Ｂｉｎｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｇａｎｄｓ」、Ｎａｔｕｒｅ、第３４６巻、ｐ．８１８〜８２２に記載されている。例えば、ＤＮＡオリゴマーのヘテロ集団を合成して、アプタマーのｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択のための候補となるオリゴマーを提供することができる。この最初のＤＮＡオリゴマー集団は、１５〜１００ヌクレオチド長の無作為配列に１０〜５０ヌクレオチド長の一定の５’および３’配列が隣接しているもののセットである。この一定領域は、ＰＣＲプライマーがハイブリダイゼーションする部位を提供し、また１実施例では、ＲＮＡポリメラーゼによる転写を開始してＲＮＡオリゴマーの集団を生成するための部位を提供する。この一定領域は、選択されたアプタマーをクローニングするための制限酵素認識部位も含む。一定領域の多数の実例をアプタマーの進化において用いることができる。例えば、コンラッドら（Ｃｏｎｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．）、「Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｐｔａｍｅｒｓ  Ｔｈａｔ  Ｂｉｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第２６７巻、ｐ．３３６〜３８３（１９９６年）；シエシオルカら（Ｃｉｅｓｉｏｌｋａ
ｅｔ  ａｌ．）、「Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ−Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Ｒｉｂｏｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｏｌｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第２６７巻、ｐ．３１５〜３３５（１９９６）；およびフィッツウォーターら（Ｆｉｔｚｗａｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、「Ａ  ＳＥＬＥＸ  Ｐｒｉｍｅｒ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第２６７巻、ｐ．２７５〜３０１（１９９６年）を参照されたい。
【００５１】
アプタマーは５〜１００サイクルの手順で選択される。各サイクルにおいて、オリゴマーは、標的分子に結合され、オリゴマーが結合している標的を単離することによって精製され、標的から分離され、２０〜３０世代のＰＣＲ増幅によって複製される。
【００５２】
限定するものではないが、２’−フルオロ−リボヌクレオチド・オリゴマー、ＮＨ２−置換およびＯＣＨ３−置換リボース・アプタマー、およびデオキシリボース・アプタマーなどの種々のオリゴマーをアプタマーの選択に使用することができる。ＲＮＡ集団およびＤＮＡ集団から同等に、任意の種類の標的分子に結合するように構成されたアプタマーを得ることが可能である。いずれの集団内でも、選択されるアプタマーは１０９〜１０１３の頻度で発生し（ゴールドら（Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．）、「Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ
Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ」、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉ
ｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６４巻、ｐ．７６３〜７９７（１９９５年）を参照されたい）、相応の抗原に対する抗体の親和性と同程度に強力な、標的に対するｎＭの結合親和性を有する場合が最も多い。グリフィンら（Ｇｒｉｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ＥＭＢＯ  Ｊ．、第１３巻、ｐ．３２４５〜３２６０（１９９４年）を参照されたい。
【００５３】
２’−フルオロ−リボヌクレオチド・オリゴマーを使用することにより、非置換のリボオリゴヌクレオチドまたはデオキシリボオリゴヌクレオチドを用いて得られるよりも結合親和性が１０〜１００倍増大する可能性がある（パグラティスら（Ｐａｇｒａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）、「Ｐｏｔｅｎｔ  ２‘−ａｍｉｎｏ  ａｎｄ  ２’ｆｌｕｏｒｏ  ２’ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＲＮＡ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１５巻、ｐ．６８〜７３を参照されたい）。このような修飾塩基はさらなる結合相互作用を提供し、アプタマーの二次構造の安定性を増大させる。これらの修飾はまた、アプタマーをヌクレアーゼに対して抵抗性とするが、このことは本システムを現実に応用するのに重要な利点である。リンら（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）、「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２２巻、ｐ．５２２９〜５２３４（１９９４年）；およびパグラティスら（Ｐａｇｒａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）、「Ｐｏｔｅｎｔ  ２’−ａｍｉｎｏ  ａｎｄ  ２‘ｆｌｕｏｒｏ  ２’ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＲＮＡ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１５巻、ｐ．６８〜７３を参照されたい。
【００５４】
アプタマーは、基材に該アプタマーを付着または結合させるのを可能にするであろう適切な修飾を含んでよい。限定するものではないが、適切な修飾には、チオール、アミン、カルボン酸、マレイミド、およびジエンなどの官能基が挙げられる。ハプテン相互作用などの他の方法を用いてもよい。ハプテン相互作用の例には、限定するものではないが、ストレプトアビジン−ビオチン、ｘ−ビオチン−ビオチン、ｘ−フルオレセイン／フルオレセインおよび当技術分野で知られている他のハプテン対がある。化学合成および固体支持体上での化学合成など、任意の適切な手段によってアプタマーを調製することができる。
【００５５】
１実施形態では、該アプタマーはオリゴヌクレオチド・テールを含み得る。「オリゴヌクレオチド・テール」という用語は、アプタマーの合成オリゴヌクレオチド延長部を指す。この延長部はアプタマーの合成中に作出されてもよいし、化学的手段または酵素的手段などの任意の適切な手段を用いてアプタマーの３’または５’末端に付加されてもよい。重要なのは、アプタマー配列が選択された後にこの延長部が付加されることである。したがって、延長部はアプタマーの結合活性を決定する配列の一部を提供するものではない。この延長部は一般に一本鎖であり、長さは約１０〜６０塩基である。ある実施形態では、該オリゴヌクレオチドは１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０〜４０塩基長である。該オリゴヌクレオチド・テールは、アプタマーがその標的に結合する能力に干渉しない任意の適切な長さおよび配列でよい。オリゴヌクレオチド・テールは所定の配列を有するので、該オリゴヌクレオチド・テールの少なくとも一部分と相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチド、例えば、フルオロフォアで標識したオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることによって、任意の所望の標識を有するようにアプタマーを修飾することが可能である。
【００５６】
本発明の別の実施形態では、アプタマープローブが提供される。該アプタマープローブは、オリゴヌクレオチド・テールを有するアプタマーと；該オリゴヌクレオチド・テールの少なくとも一部分と相補的な配列を有し、任意選択の標識を有する第２のリンカーオリ
ゴヌクレオチドとを含む。該オリゴヌクレオチド・テールは、有利なことに、多重化、例えば、蛍光体、デンドリマー、放射性標識、酵素等の様々な検出部分で標識した様々なオリゴヌクレオチド・プローブを結合させることを可能にする。オリゴヌクレオチド・テールを有するアプタマープローブは、直接的または間接的サンドイッチ・アッセイなどの、標的分析物を検出する種々のアッセイにおいて広く有用である。図１６は代表的なサンドイッチ・アッセイを示しており、同アッセイは、捕捉用基材、例えば、捕捉抗体プローブを有する磁性ビーズ（ＭＢ）と、検出部分で標識されたリンカーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド・テールを備えた検出アプタマーを有する検出プローブと、捕捉プローブと検出アプタマーとの間に挟まれた標的分析物を要している。図１６（ｂ）は図１６（ａ）と同じであるが、リンカーオリゴヌクレオチドを単一のＤＮＡバイオバーコードとして使用したものを示している。該ＤＮＡバイオバーコードは、任意選択で増幅（例えば、ＰＣＲ増幅）して、サンドイッチ・アッセイなどの任意の適切な手段によって検出することができる。好ましくは、該ＤＮＡバイオバーコードは、アレイ化された基材および銀増幅を用いて高感度のナノ粒子系検出システムを利用して検出される（図１７）。米国特許第６７５００１６号明細書および２００４年６月２５日出願の米国特許出願第１０／８７７７５０号明細書を参照されたい。これらの特許文献の全体を本明細書に援用する。別例として、該ＤＮＡバイオバーコードを蛍光体などの任意の適切な検出標識で標識することができる。標識されたＤＮＡバイオバーコードは溶液系の蛍光定量法などの任意の適切な手段によって検出することができる。
【００５７】
１態様では、該任意選択の標識は、光学的、電気的、音響学的、光音響学的、重力学的、電気化学的、電気光学的、質量分光学的、酵素的、化学的、生化学的または物理的な手段による検出を可能とする検出標識である。代表例には蛍光性、発光性、リン光性、または放射性の検出標識、量子ドット、ナノ粒子、デンドリマー、分子集合体またはビーズ、ナノ粒子、および既知配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。該オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション・カスケードまたは酵素的手段などの物理的、化学的または生化学的手段によって増幅されるように設計される。別の態様では、該任意選択の標識は粒子・オリゴヌクレオチドコンジュゲートである。この粒子コンジュゲート標識は、１または複数の種類のＤＮＡバーコードをナノ粒子に直接的または間接的に結合している粒子を含む。これらの「ＤＮＡバーコード」は、標的分析物の代理として働きシグナル増幅のための手段を提供するオリゴヌクレオチドである。分離されたバーコードは任意の適切な検出プローブを用いたサンドイッチ・アッセイにおいてアレイ化基材などの任意の適切な手段によって検出することができる。該粒子はナノ粒子およびマイクロ・サイズの粒子、例えば、１μｍなど、任意の適切な大きさであってよく、ポリマー（例えば、ポリスチレン）、金属（例えば、金または銀）、セラミック、半導体材料などの任意の適切な材料から作成されてよい。
【００５８】
任意選択の標識が粒子・オリゴヌクレオチドコンジュゲートである場合、本発明のアプタマープローブは、本明細書にその全体を援用する２００４年６月２５日出願の米国特許出願第１０／８７７７５０号明細書に記載されたものなどのバイオバーコード検出アッセイにおいて特に有用である。タンパク質検出の場合、タンパク質認識事象に関連するシグナルを増幅することを可能にする、ＰＣＲに匹敵する方法は非常に少ない。最も将来性のあるものは、タンパク質検出のための、イムノＰＣＲ法（ティー．サノ、シー．エル．スミス、シー．アール．カンター（Ｔ．Ｓａｎｏ、Ｃ．Ｌ．Ｓｍｉｔｈ、Ｃ．Ｒ．Ｃａｎｔｏｒ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５８巻、ｐ．１２０（１９９２年））およびバイオバーコード増幅法（ナム，ジェイ．エム．、サクストン，シー．エス．、マーキン，シー．エイ．（Ｎａｍ，Ｊ．Ｍ．，Ｔｈａｘｔｏｎ，Ｃ．Ｓ，Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）（２００３年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、第３０１巻、ｐ．１８８４〜１８８６；およびナム，ジェイ．エム．、ストエバ，エス．アイ．、マーキン，シー．エイ．（Ｎａｍ，Ｊ．Ｍ．Ｓｔｏｅｖａ、Ｓ．Ｉ．、Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）（２００４年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、
第１２６巻、ｐ．５９３２〜５９３３）である。このバイオバーコード増幅法は、これまで研究されてきたこの系のためのイムノＰＣＲ法よりも感度が高く、酵素増幅に頼らず、あまり複雑ではないという利点を有する。バイオバーコード・アッセイの説明については、本明細書にその全体を援用する２００４年６月２５日出願の米国特許出願第１０／８７７７５０号を参照されたい。該バイオバーコード増幅アッセイでは一般に２種類の粒子、すなわち、対象の標的に対して親和性を有する基で官能化された磁性マイクロ粒子（ＭＭＰ）と、その同じ標的に対して親和性を有する第２の基とともに該対象の標的に関するレポーター基として働き得るオリゴヌクレオチド（バーコードＤＮＡ）で官能化されたナノ粒子とを要する。標的がタンパク質である場合、該磁性粒子上の認識物質は典型的にはモノクローナル抗体であるが、アプタマーであってもよく、金ナノ粒子上の認識物質はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であるが、磁性粒子上の抗体のとは異なる抗原決定基を認識するアプタマーであることが好ましい。バイオバーコード・アッセイでは、ＭＭＰプローブが対象のタンパク質標的の入った溶液に添加される。ＭＭＰプローブに標的と反応する機会を与えた後、バーコードＤＮＡを有するナノ粒子プローブを加えて、捕捉された標的を有するＭＭＰプローブとともにサンドイッチ構造を形成する。適切な分離方法、例えば、磁界を用いてそのようなサンドイッチ複合体を試験溶液から分離することが可能であり、その上清は廃棄する。バーコードＤＮＡを脱ハイブリダイズしてから金ナノ粒子プローブを用いてマイクロアレイ検出すると、そのバーコード配列を同定し、試験溶液中のタンパク質標的の量を定量することが可能となる。別例として、ナノ粒子に結合しているＤＮＡバーコードを任意の適切な標識（蛍光体など）でさらに修飾し、蛍光検出法などの別の適切な手段によって検出することもできる。図１８は、ＤＮＡバーコードを有するナノ粒子・オリゴヌクレオチドコンジュゲートで標識したアプタマープローブを用いた、アプタマーを介在させたバイオバーコード・アッセイを示している。分離されたＤＮＡバイオコードは、一部には該バイオコードが標識されているか否かに応じて、任意の適切な手段によって検出することができる。
【００５９】
「分析物」という用語は、本発明の方法によって検出またはアッセイしようとする物質を指す。典型的な分析物には、限定するものではないが、タンパク質、ペプチド、核酸セグメント、分子、細胞、微生物、ならびにこれらのフラグメントおよび産物、あるいは付着部位、結合メンバーまたはレセプター（抗体など）を作製することができる任意の物質を含み得る。分析物は、捕捉プローブおよび検出プローブ（例えば、抗体またはアプタマーあるいはその両方）の標的となりうる少なくとも１つの結合部位、好適には少なくとも２つの結合部位（例えば、抗原決定基）を有する。
【００６０】
本発明の「検出プローブ」は１つまたは複数の検出アプタマーまたは抗体を結合させることのできる任意の担体であってよく、該１つまたは複数の検出アプタマーは、特異的標的分析物を結合する構造を含む。担体自身が標識として作用してもよいし、検出可能な標識を含んでも該標識で修飾されてもよいし、あるいは検出アプタマーがそのような標識を担持してもよい。本発明の方法に適した担体には、限定するものではないが、ナノ粒子，量子ドット、デンドリマー、半導体、ビーズ、アップコンバートまたはダウンコンバートするリン光体、巨大タンパク質、脂質、炭水化物、または十分な大きさの任意の適切な無機分子または有機分子、またはこれらを組み合わせたものが挙げられる。
【００６１】
１実施形態では、担体はナノ粒子である。本発明の実施に有用なナノ粒子には、金属（例えば、金、銀、銅および白金）、半導体（例えば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、およびＺｎＳで被覆されたＣｄＳまたはＣｄＳｅ）および磁性（例えば、強磁性）コロイド材料が挙げられる。本発明の実施に有用な他のナノ粒子には、ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＴｉＯ２、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓおよびＧａＡｓが含まれる。ナノ粒子のサイズは、好適には約５ｎｍ〜約１５０ｎｍ（平均直径）、より好適には約５〜約５０ｎｍ、最も
好適には約１０〜約３０ｎｍである。ナノ粒子はロッドであってもよい。本発明に有用な他の粒子にはシリカおよびポリマー（例えば、ラテックス）のナノ粒子がある。
【００６２】
金属、半導体および磁性ナノ粒子を製造する方法は当分野では周知である。例えば、シュミット，ジー．（Ｓｃｈｍｉｄ，Ｇ．）編、「Ｃｌｕｓｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ」（ワインハイム所在のＶＣＨ、１９９４年）；ハヤット，エム．エイ．（Ｈａｙａｔ，Ｍ．Ａ．）編、「Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｇｏｌｄ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（サンディエゴ所在のアカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９１年）；マサール，アール．（Ｍａｓｓａｒｔ，Ｒ．）、ＩＥＥＥ  Ｔａｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  Ｏｎ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、第１７巻、ｐ．１２４７（１９８１年）；アフマディー，ティー．エス．ら（Ａｈｍａｄｉ，Ｔ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７２巻、ｐ．１９２４（１９９６年）；ヘングライン，エイ．ら（Ｈｅｎｇｌｅｉｎ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、第９９巻、ｐ．１４１２９（１９９５年）；カーチス  エイ，シー．ら（Ｃｕｒｔｉｓ，Ａ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、第２７巻、ｐ．１５３０（１９８８年）を参照されたい。蛍光体またはリン光体を含浸させたシリカ・ナノ粒子を作成する方法も当該分野では周知である（タンら（Ｔａｎ  ａｎｄ  ｃｏｗｏｒｋｅｒｓ）、ＰＮＡＳ、２００４年、第１０１巻、ｐ．１５０２７〜１５０３２を参照されたい）。
【００６３】
ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＴｉＯ２、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓおよびＧａＡｓナノ粒子を製造する方法も当該分野で知られている。例えば、ウェラー（Ｗｅｌｌｅｒ）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、第３２巻、ｐ．４１（１９９３年）；ヘングライン（Ｈｅｎｇｌｅｉｎ）、Ｔｏｐ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．、第１４３巻、ｐ．１１３（１９８８年）；ヘングライン（Ｈｅｎｇｌｅｉｎ）、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、第８９巻、ｐ．１８６１（１９８９年）；ブルス（Ｂｒｕｓ）、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ａ．、第５３巻、ｐ．４６５（１９９１年）；バーンスマン（Ｂａｈｎｃｍａｎｎ）、「Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｏｒａｇｅ  ｏｆ  Ｓｏｌａｒ  Ｅｎｅｒｇｙ」（ペリゼッティ（Ｐｅｌｉｚｅｔｔｉ）およびスキアヴェロ（Ｓｃｈｉａｖｅｌｌｏ）編、１９９１年）内、ｐ．２５１；ワンとヘロン（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｈｅｒｒｏｎ）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、第９５巻、ｐ．５２５（１９９１年）；オルシャフスキーら（Ｏｌｓｈａｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第１１２巻、ｐ．９４３８（１９９０年）；ウシダら（Ｕｓｈｉｄａ
ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、第９５巻、ｐ．５３８２（１９９２年）を参照されたい。
【００６４】
適切なナノ粒子は、例えば、テッド・ペラ・インコーポレイテッド（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．）（金）、アマシャム・コーポレイション（Ａｍｅｒｓｈａｍ）（金）およびナノプローブス・インコーポレイテッド（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）（金）、およびクオンタム・ドット・インコーポレイテッド（Ｑｕａｎｔｏｍ  Ｄｏｔ，Ｉｎｃ．）（ＣｄＳｅ／ＺｎＳなどのコア・シェル半導体粒子）から市販されている。
【００６５】
別の実施形態では、ナノ粒子には、アプタマーに加えて、ゼロ個、１個、または複数個の希釈オリゴヌクレオチドが結合していてもよい。例えば、以下の実施例において説明するように、ナノ粒子を３：１比のアプタマーおよびオリゴヌクレオチドとともにインキュベートすることができる。１実施形態では、オリゴヌクレオチドはポリアデノシンオリゴヌクレオチドであり、例えば、１０個のアデノシンで構成されるオリゴヌクレオチドＡ１０である。別の実施形態では、該オリゴヌクレオチドは２０個のアデノシンで構成される。アプタマーに加えて希釈オリゴヌクレオチドを使用することにより、コンジュゲートが
所望のレベルの結合相互作用を示すように調整する手段が提供される。この希釈オリゴヌクレオチドおよびアプタマーは、コンジュゲートを調製するためにナノ粒子と接触させる溶液中における比とほぼ同じ比でナノ粒子に結合することがわかっている。したがって、コンジュゲートが所望の数の結合事象に関与するように、ナノ粒子に結合する希釈オリゴヌクレオチドとアプタマーとの比を制御することができる。希釈オリゴヌクレオチドは、アプタマーがナノ粒子に結合される能力または標的分析物と結合する能力に干渉しない、任意の配列を有してよい。例えば、希釈オリゴヌクレオチドは、アプタマーまたは核酸標的分析物の配列に相補的な配列を有するべきではない。希釈オリゴヌクレオチドはまた、アプタマーが個々の標的と結合する能力に干渉することなく、アプタマーがその標的に結合しうるように、アプタマーの長さよりも短いことが好ましい。
【００６６】
本明細書中で用いられる場合「検出アプタマー」または「検出用アプタマー」とは、標的分析物を探し出す（すなわち、試料中で結合する）のに用いることのできる構造を含むものとして本明細書中で定義されるアプタマーである。
【００６７】
本明細書中で用いられる場合、「標識」または「検出標識」とは、光学的、電気的、電気光学的、磁気的、重力学的、音響学的、酵素的、あるいは他の物理的または化学的な手段によって検出することのできる検出可能なマーカーを指す。「標識‐（された）」という用語は、そのような検出可能なマーカーの組み込み（例えば放射標識ヌクレオチドの組み込みによるもの）または検出可能なマーカーのアプタマーへの結合を指す。
【００６８】
別の実施形態では、検出オリゴヌクレオチドを検出可能なように標識することができる。ポリヌクレオチドを標識する種々の方法が当分野では知られており、本明細書に開示した方法において有利なように使用してよい。ある特定の実施形態では、本発明の検出可能な標識は、蛍光性、発光性、ラマン活性、リン光性、放射活性であるか、または光を散乱させるのに有効であってもよいし、固有の質量を有していてもよいし、あるいはその他の標識は何らかの他の容易かつ特異的に検出可能な物理的および化学的特性を有しており、前記検出可能な特性を増強するために、該標識を凝集させてもよいし、または同じ標識が１個以上、デンドリマー、分子集合体、量子ドット、またはビーズなどの担体に結合していてもよい。標識は例えば、光学的、電気的、音響学的、光音響学的、重力学的、電気化学的、酵素学的、化学的、ラマン、または質量分光学的手段による検出を可能にする。
【００６９】
本明細書中で使用される場合「試料」とは、核酸を含み、本発明の方法において用いることのできる任意の量の物質を指す。例えば、試料は生体試料でもよいし、またはヒト、動物、植物、菌類、酵母、細菌、ウイルス、組織培養物またはウイルス培養物、または上記の組み合わせから抽出されてもよい。試料は、固体組織（例えば、骨髄、リンパ節、脳、皮膚）、体液（例えば、血清、血液、尿、痰、精液またはリンパ液）、骨格組織、または個々の細胞を含んでもよいし、これらから抽出されてもよい。あるいは、試料は精製または部分的に精製された核酸分子と、例えば、本発明の方法を上手く実行するのに適した条件を作り出すのに用いられる緩衝液および／または試薬とを含み得る。
【００７０】
１実施形態では、本発明の検出プローブは少なくとも１種類の検出アプタマーが結合しているナノ粒子プローブであり得る。２種類以上のアプタマーを、２つ以上の標的分析物が関わる多重アッセイに使用してもよい。任意の適切な表面密度の検出アプタマーを使用してよいが、アプタマーが約８．９×１０１１〜約６．４×１０１２個／ｃｍ２の表面密度が有用であることがわかっている。必要に応じて、検出アプタマーが結合しているナノ粒子プローブが、ポリアデノシンＡ１０またはＡ２０のオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドをさらに含んでもよい。ホスホロチオエート官能部分またはホスホロジチオエート官能部分を有するチオアプタマーが好ましい。金属ナノ粒子または半導体ナノ粒子などの任意の適切なナノ粒子標識を用いてよい。特に好適な貴金属、例えば、金のナノ粒
子を用いてよい。
【００７１】
ナノ粒子は、その大きさに起因する独特な物理的および化学的特性のために、強い関心の対象となっている。これらの特性を背景として、ナノ粒子は、従来の検出方法よりも感度が高く、より特異的で、費用効率の高い、新しい種類の生物学的センサを開発するための有望な道を提供する。ナノ粒子を合成する方法およびナノ粒子について得られた特性を研究するための方法論が、過去１０年にわたって広く開発されてきた（クラブンデ（Ｋｌａｂｕｎｄｅ）編、「Ｎａｎｏｓｃａｌｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、ワイリーインターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、２００１年）。しかしながら、生物学的検出におけるナノ粒子の使用は、ナノ粒子と対象の生体分子という２つの異質な材料が本質的に不適合であるために、対象の生体分子でナノ粒子を官能化するための堅牢な方法が無いことにより制限されてきた。修飾オリゴヌクレオチドでナノ粒子を官能化する非常に有効な方法が開発されている。本明細書にその全体を援用する米国特許第６３６１９４４号明細書および同第６４１７３４０号明細書（譲受人：ナノスフェアー  インコーポレイテッド）を参照されたい。この方法によって、オリゴヌクレオチドで高度に官能化されたナノ粒子が得られ、この粒子は驚くほどの粒子安定性およびハイブリダイゼーション特性を有する。得られたＤＮＡ修飾粒子は、電解質濃度の高い溶液中での安定性、遠心分離および冷凍に対する安定性、および加熱と冷却とが繰り返されるときの熱安定性によって証明されるように、非常に堅牢であることも証明されている。この装荷方法は制御可能かつ適合可能でもある。このような方法を、ナノ粒子・アプタマーコンジュゲートを作製するために用いることもできる。
【００７２】
様々な大きさおよび組成のナノ粒子が官能化されており、認識オリゴヌクレオチド配列のナノ粒子上への装荷は上記装荷方法により制御することができる。非限定的であるが、ナノ粒子の適切な例には、米国特許第６５０６５６４号明細書；国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／１６３８２号；２００３年５月７日出願の米国特許出願第１０／４３１３４１号明細書；および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／１４１００号に記載されたものがある。これらの文献の全体を本明細書に援用する。
【００７３】
アプタマーおよび任意選択の希釈オリゴヌクレオチドが結合しているナノ粒子は、本明細書にその全体を援用する米国特許第６５０６５６４号に記載のようなナノ粒子・オリゴヌクレオチドコンジュゲートを調製するための塩エイジング法（ｓａｌｔ  ａｇｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）によって調製されることが好ましい。ナノ粒子に結合し得る官能基からなる部分が共有結合しているアプタマーおよびオリゴヌクレオチドが使用される。前記部分および官能基は、オリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合（すなわち、化学吸着または共有結合により結合）させるための米国特許第６５０６５６４号および同第６７６７７０２号（本明細書にそれら全体を援用する）に記載のものである。例えば、アルカンチオールまたはアルカンジスルフィドが５’または３’末端に共有結合しているオリゴヌクレオチドを用いて、オリゴヌクレオチドを金ナノ粒子などの種々のナノ粒子に結合させることができる。ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートの官能性部分が５’または３’末端に結合しているチオアプタマーを用いて、アプタマーを金ナノ粒子などの種々のナノ粒子に結合させることができる。また、金ナノ粒子表面に対して高い親和性を有するポリＡテールなどのオリゴヌクレオチド・テールを介してオリゴヌクレオチドを結合させることができる（タルロフら（Ｔａｒｌｏｖ  ａｎｄ  ｃｏｗｏｒｋｅｒｓ）、ＪＡＣＳ、２００４年を参照されたい）。あるいは、ストレプトアビジンまたはｘ−ビオチンで修飾したナノ粒子をビオチン化アプタマーに接触させてアプタマー・ナノ粒子コンジュゲートを形成することができる。
【００７４】
アプタマーおよび任意選択の希釈オリゴヌクレオチドを、該アプタマーおよびオリゴヌクレオチドの少なくとも一部が官能基によりナノ粒子に結合するのに十分な時間、水中で
ナノ粒子に接触させる。このような時間は実験的に決定することができる。例えば、約１２〜２４時間で良好な結果が得られることがわかっている。アプタマーおよびオリゴヌクレオチドを結合するための他の適切な条件も実験的に決定することができる。例えば、約１０〜２０ｎＭのナノ粒子濃度で室温にてインキュベートすれば良好な結果が得られる。
【００７５】
次に、少なくとも１種類の塩を水に加えて塩溶液を形成する。塩は任意の水溶性の塩であってよい。例えば、塩は塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、これらの塩の２種以上の組み合わせ、またはこれらの塩のうちの１つをリン酸緩衝剤に含めたものであってよい。塩は濃溶液として添加されることが好ましいが、固体として加えることも可能である。塩は水に対し全量を一時に加えることもできるし、時間をかけて徐々に加えることもできる。「時間をかけて徐々に」とは、塩を少なくとも二分して時間間隔を置いて断続的に加えることを意味する。適当な時間間隔は実験的に決定することができる。
【００７６】
該塩溶液のイオン強度は、オリゴヌクレオチド相互の静電反発力、ならびに負に荷電したオリゴヌクレオチドの正に荷電したナノ粒子への静電引力または負に荷電したオリゴヌクレオチドの負に荷電したナノ粒子への静電反発力のいずれかを、少なくとも部分的に克服するのに十分でなければならない。時間をかけて徐々に塩を加えることにより徐々に静電引力および静電反発力を低減させると、ナノ粒子上においてオリゴヌクレオチドが最も高い表面密度となることがわかった。適切なイオン強度は、各々の塩または塩の組み合わせについて実験的に決定することができる。塩化ナトリウムの最終濃度をリン酸緩衝液中で約０．１Ｍ〜約１．０Ｍとし、好適には時間をかけて徐々に塩化ナトリウム濃度を増加させると、良好な結果が得られることがわかった。
【００７７】
塩を加えた後、アプタマー、オリゴヌクレオチドおよびナノ粒子を、さらなるオリゴヌクレオチドがナノ粒子に結合するのに十分な時間さらに塩溶液中でインキュベートして、アプタマーおよびオリゴヌクレオチドが結合している安定なナノ粒子コンジュゲートを作製する。以下に詳細に記載するように、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの表面密度が増加するとコンジュゲートが安定することが分かった。このインキュベーションの時間は実験的に決定することが可能である。合計で約２４〜４８時間、好適には４０時間のインキュベーションが、良好な結果を生むことが分かった（これはインキュベーションの合計時間である；上記のようにこの合計時間内で塩濃度を徐々に増加させることができる）。塩溶液中におけるこの第２のインキュベーション期間を本明細書では「エイジング」工程と呼ぶ。この「エイジング」工程の他の適切な条件も実験的に決定することができる。例えば、室温およびｐＨ７．０でインキュベートすると良好な結果が得られる
「エイジング」工程の使用によって生産されたアプタマー・ナノ粒子コンジュゲートは、「エイジング」工程を用いずに生産したものよりも大幅に安定性が高いことがわかった。上記のように、この安定性の増大は、「エイジング」工程により達成されるナノ粒子表面上のオリゴヌクレオチド密度の増大による。「エイジング」工程によって達成される表面密度は、ナノ粒子のサイズおよび種類、ならびにアプタマー／オリゴヌクレオチドの長さ、配列および濃度に依存する。ナノ粒子を安定するために適した表面密度、およびナノ粒子とアプタマー／オリゴヌクレオチドの所望の組み合わせについて該表面密度を得るのに必要な条件は、実験的に決定することが可能である。
【００７８】
ＤＮＡで修飾されたナノ粒子、特にアプタマーで修飾された金ナノ粒子プローブを調製するための上記の装荷方法により、オリゴヌクレオチド標的および非核酸標的のための比色検出スキームが開発されている。例えば、本明細書にその全体を援用する米国特許第６５０６５６４号には、ＤＮＡで修飾されたナノ粒子を用いた比色検出スキームが記載されている。この方法は２つの金ナノ粒子プローブと、対象の標的、例えばＤＮＡの２つの別個の領域とのハイブリダイゼーションに基づくものである。各プローブは同じ配列を有す
る複数のオリゴヌクレオチドで官能化されているので、十分な標的が存在する場合、標的と結合させると標的／金ナノ粒子プローブ凝集体が形成されることになる。このＤＮＡ標的の認識の結果、粒子の粒子間距離が減少することによって色が変化する。この色の変化を、ＵＶ／ｖｉｓ分光光度計を用いて光学的に測定してもよいし、肉眼で視覚的に観察してもよい。さらに、該溶液を膜上で濃縮すると、この色が増強される。したがって、単純な色の変化により特異的ＤＮＡ配列の有無が証明される。このアッセイを用いて、モデルＤＮＡ標的およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅された核酸配列についてフェムトモル量およびｎＭの濃度が検出されている。
【００７９】
ＤＮＡ修飾ナノ粒子コンジュゲート、特にアプタマーで修飾された金ナノ粒子プローブの開発により、オリゴヌクレオチド標的および非核酸標的のための散乱光を測定する比色法ももたらされた。本明細書にその全体を援用する２００４年１１月２２日出願の米国特許第１０／９９５０５１号を参照されたい。この散乱を用いる比色検出法は、低い標的濃度でのプローブと標的との結合を可能にする中性またはアニオン性多糖類を用いた改善ハイブリダイゼーション法と組み合わせると、核酸検出においてこれまで報告されている吸光度を用いるスポット試験よりも感度が高い（＞４桁）。さらに、本発明の方法は、複合体形成していない粒子が著しく過剰に存在する（このことは低い標的濃度のもとでのハイブリダイゼーションを促進する）中での２以上の粒子を含んだプローブ−標的複合体の検出を可能にする。また、硫酸デキストランを介したプローブと標的との複合体形成を本明細書に記載のエバネセントによる散乱と併せることにより、または抗原抗体間相互作用と併せることにより、細菌の全ＤＮＡ中の核酸配列についての簡単で均一なハイブリダイゼーションおよび比色検出のプロトコルが可能となる。
【００８０】
本明細書に記載のように、ナノ粒子プローブ、特にアプタマーを含んだ金ナノ粒子プローブは、驚くほどまた予想以上に分析物の検出に適している。マイクロアレイ系のアッセイにおける銀を用いるシグナル増幅法は、超高感度の増強をさらに提供し得る。銀染色法は銀の還元を触媒する任意の種類のナノ粒子と共に用いることができる。好ましいのは貴金属（例えば、金および銀）から作製されたナノ粒子である。バッセルら（Ｂａｓｓｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、第１２６巻、ｐ．８６３〜８７６（１９９４年）；ブラウン−ホウランドら（Ｂｒａｕｎ−Ｈｏｗｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第１３巻、ｐ．９２８〜９３１（１９９２年）を参照されたい。銀染色を用いて、上記のものなどの基材上で実行される任意のアッセイにおいて検出可能な変化を生成または増強することができる。特に、銀染色は一種類のナノ粒子を用いたアッセイの感度を非常に大きく増大させるので、ナノ粒子の層、凝集体プローブおよびコア・プローブを使用しなくて済む場合が多いことがわかっている。
【００８１】
例えば、光学スキャナまたはフラットベッド・スキャナを用いて本発明の方法においてナノ粒子を検出することができる。該スキャナを、グレイスケール測定値を算出することのできるソフトウェアを装備したコンピュータに連結することができ、このグレイスケール測定値を計算して検出された分析物の量が定量される。
【００８２】
適切なスキャナには、反射モードで動作可能な、文書を走査してコンピュータに送るのに用いられるもの（例えば、フラットベッド・スキャナ）、この機能を実行することができるか同じタイプの光学系を利用する他のデバイス、任意の種類のグレイスケールを感知する計測デバイス、および本発明の基材を走査するように改変された標準的なスキャナが挙げられる。
【００８３】
該ソフトウェアは色のついたスポットの色数を提供することも可能であり、また走査の画像（例えば、プリントアウト）を生成することもできるが、これを検証して核酸の存在、核酸の量またはこの両方を定量的に決定することが可能である。また、陽性結果を表す
色から陰性結果を表す色を差し引くことによってアッセイの感度を増大させうることがわかっている。
【００８４】
コンピュータは容易に入手可能な市販の標準的なパーソナル・コンピュータでよい。したがって、標準的ソフトウェアを搭載した標準的コンピュータに連結された標準的なスキャナを使用することにより、基材上でアッセイが実行される際に核酸を検出および定量する便利で簡単で安価な手段を提供することができる。走査結果をコンピュータに格納して、その結果の記録を維持してさらに参照および使用することができる。当然ながら、必要に応じてより最新式の機器およびソフトウェアを用いてよい。
【００８５】
暗視野顕微鏡検査、エバネセント導波路、またはガラス基材の平面的照明などの種々の方法によって照明した後に、例えば共鳴光散乱を用いて、本発明においてナノ粒子を検出することができる。直径＞４０ｎｍの金属粒子は、表面プラスモン共鳴周波数において特定の色を散乱し（イグエラビデ，ジェイ．（Ｙｇｕｅｒａｂｉｄｅ，Ｊ．）；イグエラビデ，イー．イー．（Ｙｇｕｅｒａｂｉｄｅ，Ｅ．Ｅ．）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、（１９９８年）、第２６２巻、ｐ．１５７〜１７６）、粒子の大きさ、形状および化学組成を制御することによって基材上の多色標識化に用いることができる（タトン，ティー．エイ．（Ｔａｔｏｎ，Ｔ．Ａ．）；ルー，ジー．（Ｌｕ，Ｇ．）；マーキン，シー．エイ．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００１年）、第１２３巻、ｐ．５１６４〜５１６５；ジン，アール．シー．（Ｊｉｎ，Ｒ．Ｃ．）；カオ，ワイ．ダブリュ．（Ｃａｏ，Ｙ．Ｗ．）；マーキン，シー．エイ．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）；ケリー，ケイ．エル．（Ｋｅｌｌｙ，Ｋ．Ｌ．）；シャッツ，ジー．シー．（Ｓｃｈａｔｚ，Ｇ．Ｃ．）；ツウェン，ジェイ．ジー．（Ｚｈｅｎｇ，Ｊ．Ｇ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１年）、第２９４巻、ｐ．１９０１〜１９０３）。別の実施形態では、例えば、ナノ粒子の凝集を用いて均質溶液中で（グラハムら（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  ｃｏｗｏｒｋｅｒｓ）、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．、２０００年、第１１２巻、ｐ．１１０３）、または固相アッセイで基材上で（ポーターら（Ｐｏｒｔｅｒ  ａｎｄ  ｃｏｗｏｒｋｅｒｓ）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９９年、第７１巻、ｐ．４９０３〜４９０８）表面増感ラマン分光法（ＳＥＲＳ）を用いることによって、あるいは銀による現像に続いてＳＥＲＳを用いることによって（マーキンら（Ｍｉｒｋｉｎ  ａｎｄ  ｃｏｗｏｒｋｅｒｓ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２年、第２９７巻、ｐ．１５３６〜１５４０）、本発明においてナノ粒子を検出することができる。
【００８６】
別の実施形態では、本発明のナノ粒子は光熱イメージング（ボイヤーら（Ｂｏｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２年、第２９７巻、ｐ．１１６０〜１１６３）によって検出される。別の実施形態では、本発明のナノ粒子は回折を用いる感知技術によって検出される（ベイリーら（Ｂａｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００３年、第１２５巻、ｐ．１３５４１）。別の実施形態では、本発明のナノ粒子はハイパー・レイリー散乱法によって検出される（キムら（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．、２００２年、第３５２巻、ｐ．４２１）。
【００８７】
別の実施形態では、基材に結合させるアプタマーが２つの電極の間に配置され、ナノ粒子が導電体である材料から作製され、かつ本発明の方法の工程（ｄ）が導電率の変化を検出する工程を含んでいてもよい。さらに別の実施形態では、各々異なる標的分析物を認識し得る複数のアプタマーがアレイ状のスポットとして基材に結合され、アプタマーのスポット各々が２つの電極の間に配置され、ナノ粒子が導電体である材料から作製され、本発明の方法の工程（ｄ）が導電率の変化を検出する工程を含む。電極は、例えば金から作製可能であり、ナノ粒子は金から作製される。あるいは、基材を銀染色剤に接触させて導電率の変化を発生させることができる。
【００８８】
１実施形態では、結合条件はアプタマーの標的分析物への特異的かつ選択的結合に有効である。典型的な一本鎖または二本鎖の核酸アプタマーは、標的分析物との特異的結合相互作用を可能にする二次構造を有する。したがって、特異的標的分析物へのアプタマーの特異的かつ選択的結合に用いられる条件は、アプタマーが特異的な立体構造に折り畳まれることを必要とする。例えば、提示する実施例に使用したＩｇＥアプタマーは、適切なｐＨおよび塩（例えば、ＭｇＣｌ２）の条件下で、ＩｇＥ標的の結合を容易にするステムループ構造に折り畳まる。したがって、アプタマーの構造およびこの構造を生成する条件は、適切なアッセイ条件を選択するための重要なファクターである。
【００８９】
ある特定の実施形態では、本発明は、非核酸分子および核酸分子などの分析物を検出する方法を提供する。１実施形態では、該方法は、特異的標的分析物に結合することができる構造を有するアプタマーが結合しているナノ粒子（ナノ粒子・アプタマーコンジュゲート）に分析物を接触させる工程を含む。
【００９０】
１実施形態では、試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する少なくとも１つの標的分析物を検出する方法が提供される。該方法は、特異的標的分析物の第１の結合部位に結合することのできる少なくとも１種類の捕捉プローブが結合している基材を提供する工程と、標的分析物の第２の結合部位に結合することのできる検出アプタマーを含んでなる少なくとも１種類のナノ粒子プローブを提供する工程とを含む。該方法は、捕捉プローブが標的分析物の第１の結合部位に結合し、かつナノ粒子プローブが該標的分析物の第２の結合部位に結合して複合体を形成するのに有効な条件下で、試料を基材およびナノ粒子プローブに接触させる工程を含む。最後に、複合体の存在の有無を検出することができるが、ここで複合体の存在の有無は特異的標的分析物の存在の有無の指標である。
【００９１】
別の実施形態では、試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する少なくとも１種類の標的分析物を検出する方法が提供される。該方法は、検出アプタマーを含んでなる少なくとも１種類のプローブを提供する工程を含み、各種類のプローブ上の検出アプタマーは特定の種類の標的分析物の第１の結合部位に結合することのできる構造を有する。該検出アプタマーを標的分析物に結合させるのに有効な条件下で、試料をナノ粒子プローブに接触させる。最後に、検出アプタマーが標的分析物に結合するか否かが測定される。
【００９２】
本発明のさらに別の実施形態では、試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する標的分析物を検出する方法が提供される。該方法は、標的分析物の２つ以上の結合部位に結合することのできるアプタマーが結合している種類のナノ粒子を提供する工程を含む。標的分析物とナノ粒子に結合したアプタマーとの間の結合を可能にするのに有効な条件下で、試料とアプタマーが結合しているナノ粒子とを接触させる。標的分析物がナノ粒子に結合したアプタマーに結合することによってもたらされる検出可能な変化を観察する。
【００９３】
本発明のまたさらに別の実施形態では、試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する標的分析物を検出する方法が提供される。該方法は、アプタマーが結合している少なくとも２種類のナノ粒子を提供する工程を含み、各種類のアプタマーは標的分析物の異なる結合部位と結合することができる。試料およびアプタマーが結合している少なくとも２種類のナノ粒子を、標的分析物とナノ粒子に結合したアプタマーとの間の結合を可能にするのに有効な条件下で接触させる。この後、ナノ粒子に結合したアプタマーが標的分析物と結合することによってもたらされる検出可能な変化を観察する。特異的に結合する分析物を検出する方法は、金属ナノ粒子で標識されたプローブの複合体、例えば、金ナノ粒子プローブ複合体が分析物を介して形成され、その結果色または散乱光の強度が変化することに基づくものであり、この変化は、少量の試料を導波路上に置き、視覚的にまたは光センサを用いて散乱される光を検出することによって測定することが可能である。核酸検出に応用されるこの検出方法の例については、以下の実施例６で考察する。本明細書にその全体
を援用する同時係属の２００４年１１月２２日出願の米国特許出願第１０／９９５０５１号も参照されたい。ナノ粒子プローブ複合体は特異的標的分析物に結合した２以上のプローブを含む。
【００９４】
本発明のさらに別の実施形態では、試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する標的分析物を検出する方法が提供される。該方法は、標的分析物のある結合部位に結合することができるアプタマーが結合している少なくとも１種類のナノ粒子と、標的分析物の別の結合部位に結合することのできる抗体が結合している少なくとも１種類のナノ粒子とを提供する工程を含む。標的分析物と、ナノ粒子に結合しているアプタマーおよび抗体との間の結合を可能にするのに有効な条件下で、試料、アプタマーを有するナノ粒子、および抗体が結合しているナノ粒子を接触させる。この後、ナノ粒子に結合したアプタマーおよびナノ粒子に結合した抗体が標的分析物と結合することによりもたらされる検出可能な変化を観察する。
【００９５】
本発明の別の実施形態では、１つまたは複数の標的分析物を検出するための基材が提供される。該基材は、少なくとも１種類の捕捉アプタマーが結合している基材を含み、各種類のアプタマーは特異的標的分析物に結合し、アレイ状の別個のスポットとして配置され；（ｃ）該別個のスポットの間に任意選択で電極が配置されている。
【００９６】
本発明の別の実施形態では、試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する少なくとも１つの標的分析物を検出する方法が提供され、該方法は、（ａ）特異的標的分析物の第１の結合部位に結合することのできる少なくとも１種類の捕捉プローブが結合している基材を提供する工程と；（ｂ）該標的分析物の第２の結合部位に結合することのできる少なくとも１種類の検出アプタマープローブを提供する工程と；（ｃ）捕捉プローブが標的分析物の第１の結合部位に結合し、かつアプタマープローブが標的分析物の第２の結合部位に結合して複合体を形成するのに有効な条件下で、試料を基材およびプローブに接触させる工程と；（ｄ）検出可能な変化を観察する工程とを含む。光学的、電気的、音響学的、光音響学的、重力学的、電気化学的、電気光学的、質量分光学的、酵素的、化学的、生化学的または物理的な手段によって、捕捉された標的とアプタマープローブとの複合体を検出する。
【００９７】
１態様では、捕捉プローブは抗体または捕捉アプタマーを含む。結合部位は、特異的捕捉プローブが結合する抗原決定基である。
別の態様では、２種類以上のナノ粒子プローブが提供され、各種類のプローブには、同じ標的分析物上の異なる抗原決定基に、または異なる標的分析物に、あるいはその両者に結合することのできる検出アプタマーが結合している。
【００９８】
別の態様では、試料中に存在する標的分析物がプローブ上の検出アプタマーに結合するように、試料を最初にアプタマープローブに接触させ、次いで、標的分析物が基材上の捕捉プローブに結合するように、アプタマープローブに結合した標的分析物を基材に接触させる。
【００９９】
別の態様では、試料中に存在する標的分析物が捕捉プローブに結合するように、試料を最初に基材に接触させ、次いで、標的分析物がアプタマープローブ上の検出アプタマーに結合するように、捕捉アプタマーに結合した標的分析物をアプタマープローブに接触させる。
【０１００】
別の態様では、試料、アプタマープローブおよび基材上の捕捉プローブを同時に接触させる。
任意の適切な基材を用いてよく、そのような基材は位置指定可能であり得る。代表的な
基材は上記に記載した。各々異なる標的分析物を認識し得る複数の捕捉プローブを、アレイ状のスポットとして基材に結合させることができる。必要に応じて、捕捉プローブの各スポットを２つの電極の間に配置し、アプタマープローブ上の任意選択の標識を導電体の材料から作製されたナノ粒子とし、かつ導電率の変化を検出することもできる。該電極は金から作製され、該ナノ粒子は金から作製される。
【０１０１】
本発明の別の実施形態では、試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する少なくとも１種類の標的分析物を検出する方法が提供され、該方法は、（ａ）少なくとも１種類の検出アプタマープローブであって、各種類のプローブ上の検出アプタマーが特定の種類の標的分析物の第１の結合部位に結合することのできる構造を有することを特徴とする検出アプタマープローブを提供する工程と；（ｃ）該検出アプタマーを標的分析物に結合させるのに有効な条件下で、試料をアプタマープローブに接触させる工程と；（ｄ）検出アプタマーが標的分析物に結合したかどうかを検出する工程とを含む。
本発明のさらに別の実施形態では、試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する標的分析物を検出する方法が提供され、該方法は、（ａ）標的分析物の２つ以上の結合部位に結合することのできる、請求項３３に記載のある種類の検出アプタマープローブを提供する工程と；（ｂ）該試料と、アプタマーが結合しているアプタマープローブとを、該標的分析物と該アプタマーとの間の結合を可能にするのに有効な条件下で接触させる工程と；（ｃ）該標的分析物がアプタマーに結合することによってもたらされる検出可能な変化を観察する工程とを含む。
【０１０２】
本発明のさらに別の実施形態では、試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する標的分析物を検出する方法が提供され、該方法は、（ａ）請求項３３に記載の少なくとも２種類のアプタマープローブであって、各種類のアプタマーが標的分析物の異なる結合部位に結合することのできるアプタマープローブを提供する工程と；（ｂ）該試料と、該少なくとも２種類のアプタマープローブとを、該標的分析物と該ナノ粒子に結合しているアプタマーとの間の結合を可能にするのに有効な条件下で接触させる工程と；（ｃ）該アプタマーが該標的分析物に結合することによってもたらされる検出可能な変化を観察する工程とを含む。
【０１０３】
本発明のさらに別の実施形態では、アプタマー検出プローブおよび任意選択の基材を備えた、試料中の１つまたは複数の分析物を検出するためのキットが提供される。該基材は特異的標的分析物に対する少なくとも１つの捕捉プローブでアレイ化されていてもよい。
【０１０４】
［実施例］
以下の例示的実施例によって、本発明をさらに実証する。該実施例は例証として示すものであり、本発明をどのようにも限定することを意図したものではない。これらの実施例では、すべての割合（％）は固体の場合には重量％、液体の場合には容量％であり、特に記載のない限り、温度はすべて摂氏で記載されている。
【０１０５】
以下の代表的な実施例は、ＤＮＡアプタマーで修飾された金ナノ粒子に基づいてタンパク質分析物を検出する本発明の方法の効果および有用性を実証するものである。これまでの研究から、チオール結合を介してＤＮＡを金ナノ粒子にコンジュゲートすることが可能であることが実証されている（マーキン，シー．エイ．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）；レットシンガー，アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）；ムシック，アール．シー．（Ｍｕｃｉｃ，Ｒ．Ｃ．）；ストルホフ，ジェイ．ジェイ．（Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．）、Ｎａｔｕｒｅ（１９９６年）、第３８２巻、ｐ．６０７〜６０９）。得られたＤＮＡ修飾金粒子を用いて、ＤＮＡ標的その他の分析物が様々な形式で検出されており（例えば、ストルホフ，ジェイ．ジェイ．（Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．）；マーキン，シー．エイ．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．（１９９９年）、第９９
巻、ｐ．１８４９〜１８６２；ニーマイヤー，シー．エム．（Ｎｉｅｍｅｙｅｒ，Ｃ．Ｍ．）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．（２００１年）、第４０巻、ｐ．４１２８〜４１５８；リウ，ジェイ（Ｌｉｕ，Ｊ．）；ルー，ワイ．（Ｌｕ，Ｙ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００３年）、第１２５巻、ｐ．６６４２〜６６４３を参照されたい）、該形式は例えば、銀増幅と併用して高い検出感度が達成されるＤＮＡマイクロアレイ（タトン，ティー．エイ．（Ｔａｔｏｎ，Ｔ．Ａ．）；マーキン，シー．エイ．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）；レットシンガー，アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００年）、第２８９巻、ｐ．１７５７〜１７６０；ストルホフ，ジェイ．ジェイ．（Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．）；マルラ，エス．エム．（Ｍａｒｌａ，Ｓ．Ｍ．）；バオ，ピー．（Ｂａｏ，Ｐ．）；ハゲノー，エス．（Ｈａｇｅｎｏｗ，Ｓ．）；メータ，エイチ．（Ｍｅｈｔａ，Ｈ．）；ルーカス，エイ．（Ｌｕｃａｓ，Ａ．）；ガリメラ，ブイ．（Ｇａｒｉｍｅｌｌａ，Ｖ．）；パント，ティー．（Ｐａｔｎｏ，Ｔ．）；バッキンガム，ダブリュ．（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ，Ｗ．）；コーク，ダブリュ．（Ｃｏｒｋ，Ｗ．）；ミューラー，ユー．（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｕ．）、Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．（２００４年）、第１９巻、ｐ．８７５〜８８３）が含まれる。本技術のさらなる重要な特徴には、温度上昇および塩濃度上昇のいずれにも耐えるＤＮＡ修飾金ナノ粒子の著しい安定性および堅牢性（マーキン，シー．エイ．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）；レットシンガー，アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）；ムシック，アール．シー．（Ｍｕｃｉｃ，Ｒ．Ｃ）；ストルホフ，ジェイ．ジェイ．（Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．）、Ｎａｔｕｒｅ（１９９６年）、第３８２巻、ｐ．６０７〜６０９；ストルホフ，ジェイ．ジェイ．（Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．）；エルガニアン．アール．（Ｅｌｇｈａｎｉａｎ，Ｒ．）；マーキン，シー．エイ．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）；レットシンガー，アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）、Ｌａｎｇｍｕｉｒ（２００２年）、第１８巻、ｐ．６６６６〜６６７０）、ならびにＤＮＡ配列を認識する著しい特異性（ストルホフ，ジェイ．ジェイ．（Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．）；エルガニアン．アール．（Ｅｌｇｈａｎｉａｎ，Ｒ．）；ムシック，アール．シー（Ｍｕｃｉｃ，Ｒ．Ｃ）；マーキン，シー．エイ．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）；レットシンガー，アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９８年）、第１２０巻、ｐ．１９５９〜１９６４；タトン，ティー．エイ．（Ｔａｔｏｎ，Ｔ．Ａ．）；ムシック，アール．シー．（Ｍｕｃｉｃ，Ｒ．Ｃ．）；マーキン，シー．エイ．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）；レットシンガー，アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２０００年）、第１２２巻、ｐ．６３０５〜６３０６）がある。これまでの研究から、抗体またはハプテンをＤＮＡ依存性の固定化または受動的吸着により金ナノ粒子に結合させて、タンパク質検出に使用することが可能であることがわかっているが（ニールセン，ユー．ビー．（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｕ．Ｂ．）；ガイエルスタンガー，ビー．エイチ．（Ｇｅｉｅｒｓｔａｎｇｅｒ，Ｂ．Ｈ．）、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．（２００４年）、第２９０巻、ｐ．１０７〜１２０；ニーマイヤー，シー．エム．（Ｎｉｅｍｅｙｅｒ，Ｃ．Ｍ．）；セイヤン，ビー．（Ｃｅｙｈａｎ，Ｂ．）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．（２００１年）、第４０巻、ｐ．３５８５〜３６８８；ナム，ジェイ．エム．（Ｎａｍ，Ｊ．Ｍ．）；パーク，エス．ジェイ．（Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｊ．）；マーキン，シー．エイ．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００２年）、第１２４巻、ｐ．３８２０〜３８２１）、これらの戦略は依然として上記制限を受け易い。ＤＮＡ修飾金粒子をタンパク質分析物の検出に直接使用することは大きな進歩となろう。本実施例もまた、診断および治療の両方の用途のための種々のタンパク質分析物に対して開発された核酸系アプタマー（ジャヤセーナ，エス．ディー．（Ｊａｙａｓｅｎａ，Ｓ．Ｄ．）、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９９９年）、第４５巻、ｐ．１６２８〜１６５０；ブロディー，イー．（Ｂｒｏｄｙ，Ｅ．）；ゴールド，エル（Ｇｏｌｄ，Ｌ．）、Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０００年）、第７４巻、ｐ．５〜１３；ポティーライロ，アール．エイ．（Ｐｏｔｙｒａｉｌｏ，Ｒ．Ａ．）；コンラッド，アール．シー．（Ｃｏｎｒａｄ，
Ｒ．Ｃ．）；エリントン，エイ．ディー．（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｄ．）；ヒフティア，ジー．エム．（Ｈｉｆｔｊｅａ．Ｇ．Ｍ．）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、（１９９８年）、第７０巻、ｐ．３４１９〜３４２５）を、金ナノ粒子にコンジュゲートすることが可能であることを実証する。また、本実施例は、得られたアプタマー被覆金プローブ（ＡＧＰ）が、抗体で標識された金プローブよりも高い特異性および感度で抗体標識を検出し得ることを実証する。
【実施例１】
【０１０６】
オリゴヌクレオチドアプタマーで誘導体化した金ナノ粒子の調製およびヒトＩｇＥの検出のための方法（方法１）
この実施例では、代表的な金ナノ粒子・アプタマーオリゴヌクレオチドコンジュゲートの検出プローブを、ＩｇＥタンパク質の検出に使用するために調製した。タセットら（Ｔａｓｓｅｔ  ａｎｄ  ｃｏｗｏｒｋｅｒｓ）は、高い親和性と高い特異性を持ってヒトＩｇＥに結合するアプタマーオリゴヌクレオチド配列を最初に報告した。（ウィーガンドら（Ｗｉｅｇａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９６年、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１５７巻、ｐ．２２１〜２３０）。続いて、ＩｇＥ結合親和性を増大させるために、伸びたステムループ構造を有するアプタマー配列が設計された（リスら（Ｌｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．）、２００２年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、第７４巻、ｐ。４４８８〜４４９５頁）。このアプタマー配列および報告された研究から推定される二次構造を図１にまとめた。本明細書にその全体を援用した、１９９７年７月２１日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１２７８３号；２０００年６月２６日出願のＰＣＴ／ＵＳ００／１７５０７号；２００１年１月１２日出願のＰＣＴ／ＵＳ０１／０１１９０号に記載された手順を用いて、図１に示したアプタマー配列を検出プローブとして用いるために金ナノ粒子にコンジュゲートした。
【０１０７】
（ａ）直径１５ｎｍの金ナノ粒子の調製
フレンス（Ｆｒｅｎｓ）、１９７３年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｈｙｓ．Ｓｃｉ．、第２４１巻、ｐ．２０〜２２およびグラバー（Ｇｒａｂａｒ）、１９９５年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、第６７巻、ｐ．７３５に記載されているように、ＨＡｕＣｌ４をクエン酸で還元することによって金コロイド（直径約１５ｎｍ）を調製した。簡単に述べると、すべてのガラス器具を王水（ＨＣｌを３部とＨＮＯ３を１部）で洗浄し、Ｎａｎｏｐｕｒｅ（登録商標）水で濯ぎ、使用前にオーブン乾燥した。．ＨＡｕＣｌ４およびクエン酸ナトリウムはアルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）から購入した。ＨＡｕＣｌ４水溶液（１ｍＭ、５００ｍＬ）を攪拌しながら還流した。次いで、３８．８ｍＭのクエン酸ナトリウム（５０ｍＬ）を迅速に添加した。溶液の色が淡黄色から赤紫色に変化し、還流を１５分間継続した。室温まで冷却後、この赤色の溶液をマイクロン・セパレーション・インコーポレイテッド（Ｍｉｃｒｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）の０．２μｍの酢酸セルロースフィルタで濾過した。ヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）の８４５２Ａ型ダイオード・アレイ分光光度計を用いたＵＶ−ｖｉｓ分光法および日立（Ｈｉｔａｃｈｉ）８１００透過型電子顕微鏡を用いた透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によって、金コロイドの特徴を解析した。
【０１０８】
（ｂ）ステロイドジスルフィド修飾オリゴヌクレオチド（ＳＤＯ）の合成
アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のＥｘｐｅｄｉｔｅ８９０９型ＤＮＡ合成装置を利用して、ホスホロアミダイト法を用いたシングルカラムモードで、ＩｇＥ、ＡＰＣ遺伝子ＤＮＡ配列、またはＭｅｃＡ遺伝子ＤＮＡ配列に特異的なアプタマー配列、あるいはＡ１０に相当するオリゴヌクレオチドを１マイクロモルスケールで合成した。エックスタイン，エフ．（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．）編、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ」、（アイアールエルプレス（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）、オックスフォ
ード、１９９１年）。合成試薬はすべてグレン・リサーチ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）またはアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から購入した。平均カップリング効率は９８〜９９．８％で変化し、ステロイドジスルフィド・ホスホロアミダイトがカップリングされるように、最後のジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基をオリゴヌクレオチドから除去した。
【０１０９】
５’末端ステロイド−環状ジスルフィドオリゴヌクレオチド誘導体（開示全体を本明細書に援用する、レットシンガーら（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ．ａｌ．）、２０００年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、第１１巻、ｐ．２８９〜２９１および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０１１９０号（ナノスフェアー  インコーポレイテッド）を参照されたい）を作製するために、アプライド・バイオシステムズのＥｘｐｅｄｉｔｅ８９０９型自動合成装置で環状ジチアン結合エピアンドロステロンホスホロアミダイト（この試薬は、１，２−ジチアン−４，５−ジオール、エピアンドロステロンおよびｐ−トルエンスルホン酸（ＰＴＳＡ）を用いてトルエン存在下で調製した）を用いて、最終的なカップリング反応を実行した。このホスホロアミダイト試薬は次のように調製可能である。すなわち、エピアンドロステロン（０．５ｇ）、トランス１，２−ジチアン−４，５−ジオール（０．２８ｇ）およびｐ−トルエンスルホン酸（１５ｍｇ）のトルエン（３０ｍＬ）溶液を脱水条件下で７時間還流させた（ディーンスターク（Ｄｅａｎ  Ｓｔａｒｋ）装置）。次いで、トルエンを減圧下で除去し、残渣を酢酸エチルに入れた。この溶液を５％ＮａＨＣＯ３で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、シロップ状の残渣になるまで濃縮し、これをペンタン／エーテル中に放置するとステロイド−ジチオケタール化合物が白色固体（４００ｍｇ）として得られた。Ｒｆ値（ＴＬＣ、シリカプレート、溶離剤としてエーテル）は０．５であるが、比較のため、同条件下で得られたエピアンドロステロンおよび１，２−ジチアン−４，５−ジオールのＲｆ値はそれぞれ０．４および０．３である。この化合物をカラムクロマトグラフィで精製した。続いて、ペンタン／エーテルから再結晶化させて白色粉末を得た（融点１１０〜１１２℃；１Ｈ  ＮＭＲ，δ３．６（１Ｈ、Ｃ３ＯＨ），３．５４〜３．３９（２Ｈ、ジチアン環のｍ  ２ＯＣＨ）、３．２〜３．０（４Ｈ、ｍ  ２ＣＨ２Ｓ），２．１〜０．７（２９Ｈ、ｍ  ステロイドＨ）；質量スペクトル（ＥＳ＋）Ｃ２３Ｈ３６Ｏ３Ｓ２（Ｍ＋Ｈ）に対する計算値４２５．２１７９、実測値４２５．２１５１．分析（Ｃ２３Ｈ３７Ｏ３Ｓ２）Ｓに対する計算値１５．１２；実測値１５．２６）。ステロイド−ジスルフィドケタールホスホロアミダイト誘導体を調製するために、ステロイド−ジチオケタール（１００ｍｇ）をＴＨＦ（３ｍＬ）に溶解し、ドライアイス・アルコール槽で冷却した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８０μＬ）およびβ−シアノエチルクロロジイソプロピルホスホロアミダイト（８０μＬ）を連続的に添加し、次いで、この混合物を室温まで暖め、２時間攪拌し、酢酸エチル（１００ｍＬ）と混合し、５％ＮａＨＣＯ３水溶液および水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で脱水し、濃縮乾固させた。この残渣を無水アセトニトリルに入れ、減圧乾燥させた（収量１００ｍｇ；３１Ｐ  ＮＭＲ１４６．０２）。エピアンドロステロン−ジスルフィド結合オリゴヌクレオチドを、最後のＤＭＴを除去せずに、アプライド・バイオシステムズのＥｘｐｅｄｉｔｅ８９０９遺伝子合成装置で合成した。終了後、アンモニア水条件下でエピアンドロステロン−ジスルフィド結合オ���ゴヌクレオチドを支持体から脱保護し、イオン交換クロマトグラフィを用いてＨＰＬＣで精製した。
【０１１０】
ＳｏｕｒｃｅＱ樹脂を充填した３７５ｍｍ×１６ｍｍカラムおよび６５℃に設定しカラム・ヒータを装備したアマシャム・バイオサイエンシズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のＡＫＴＡ  Ｂａｓｉｃ  ＨＰＬＣシステムを用いて、イオン交換ＨＰＬＣを実行した。２０ｍＭ酢酸ナトリウム／１０％ＣＨ３ＣＮ／２０ｍＭ  ＮａＣｌ４の緩衝液および２０ｍＭ酢酸ナトリウム／１０％ＣＨ３ＣＮ／６００ｍＭ  ＮａＣｌ４の勾配を用いた。流速は５ｍｌ／分、２６０ｎｍでＵＶ検出した。目的のピークを回収した後、過剰な塩を除去するために、該溶液をメンブレンに通した。次いで、この溶液をほぼ乾固
するまで蒸発させ、２５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）中で再構成した。オリゴヌクレオチドの量を２６０ｎｍの吸光度で決定し、最終純度をイオン交換クロマトグラフィで評価した。
【０１１１】
（ｃ）直径１５ｎｍの金粒子への一本鎖アプタマーオリゴヌクレオチドの結合
クエン酸還元法を用いて約１３．７５ｎＭの金ナノ粒子（直径約１５ｎｍ）の溶液を調製した。この金ナノ粒子プローブは、これまでに開発された手法の変法を用いて直径約１５ｎｍの金粒子（約１３．７５ｎＭ）にステロイドジスルフィド修飾オリゴヌクレオチドを装荷することによって調製した。例えば、本明細書にその全体を援用した米国特許第６７６７７０２号明細書を参照されたい。このアプタマーオリゴヌクレオチドコンジュゲートについては、３ｎｍｏｌのアプタマーオリゴヌクレオチドおよび１ｎｍｏｌのＡ１０を１３．７ｎＭの金ナノ粒子１ｍＬ当たりに加え、室温で１５時間インキュベートした。この溶液を、１ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭリン酸（ｐＨ７）、１％アジドを用いて０．１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸（ｐＨ７）、０．０１％アジドまで上げ、１２時間インキュベートした。次いでこの溶液を、５ＭのＮａＣｌ緩衝液を用いて０．３ＭのＮａＣｌまで上げ、さらに１２時間インキュベートした。次いでこの溶液を、同じ緩衝液を用いて０．８ＭのＮａＣｌまで上げさらに２４時間インキュベートした。ベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）のＭｉｃｒｏｆｕｇｅ（登録商標）１８を用いて１３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、該アプタマー・金ナノ粒子コンジュゲートを単離した。遠心分離後、上清を除去し、エッペンドルフチューブの底に残った暗赤色のゼラチン状の残渣を水中に再分散させた。この工程を２回繰り返して結合していないオリゴヌクレオチドをすべて確実に除去するようにした。推定される吸光係数ε５２０＝２．４×１０８Ｍ−１ｃｍ−１を用いて、５２０ｎｍにおけるＵＶ‐可視吸光度に基づいて最終的なナノ粒子濃度を１０ｎＭに調整した。
【０１１２】
ヒトＩｇＥに特異的な以下のアプタマーオリゴヌクレオチドコンジュゲート：
ＩｇＥプローブ：金−Ｓ’−５’［ｇｃｇｃｇｇｇｇｃａｃｇｔｔｔａｔｃｃｇｔｃｃｃｔｃｃｔａｇｔｇｇｃｇｔｇｃｃｃｃｇｃｇｃ−３’］ｎ（配列番号１）
をこの方法で調製した。
【０１１３】
同じ条件および手順に基づいて、希釈用Ａ１０を用いずに以下のオリゴヌクレオチド・金ナノ粒子コンジュゲートを調製した（４ｎｍｏｌのオリゴヌクレオチドを使用）。
ＭＥＣＡ  ２Ｑ：金−Ｓ’−５’−［ａ１５−ｐｅｇ−ａｔｇｇｃａｔｇａｇｔａａｃｇａａｔａ］ｎ（配列番号２）
ＣＲＣ  ４Ｄ：金−Ｓ’−５’−［ａ２０−ｇｃａｇａａｔａａａａｇ］ｎ（配列番号３）
Ｓ’はエピアンドロステロンジスルフィド基を介して作製された連結ユニットを示し、ｎはいくつかのオリゴヌクレオチドが各々の金ナノ粒子に結合していることを示す。
【０１１４】
（ｄ）金ナノ粒子・抗体コンジュゲートの調製
アフィニティー精製された抗ＩｇＥポリクローナル抗体はケミコン・インターナショナル（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）から購入した。該抗体を、ブリティッシュ・バイオセル・インターナショナル（Ｂｒｉｔｉｓｈ  ＢｉｏＣｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；ＢＢＩ）によって以前報告された手順を用いて、径１５ｎｍの金ナノ粒子にコンジュゲートさせた。簡単に述べると、炭酸ナトリウム緩衝液を用いて直径１５ｎｍの金粒子をｐＨ９〜１０に調整した。５μｇ／ｍＬの抗体をこの金ナノ粒子に加え、室温で１．０時間インキュベートした。次いで、ＢＳＡを該溶液に添加し粒子を安定させた。この抗体・金ナノ粒子コンジュゲートを、ベックマン・コールターのＭｉｃｒｏｆｕｇｅ１８を用いて１３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって単離した。遠心分離後、上清を除去し、エッペンドルフチューブの底に残った暗赤色のゼラチン状の
残渣を緩衝液（０．２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．５）、０．１％ＢＳＡおよび０．０１％アジド）中に再分散させた。この工程を繰り返して、結合していない抗体をすべて確実に除去するようにした。推定される吸光係数ε５２０＝２．４×１０８Ｍ−１ｃｍ−１を用いて、５２０ｎｍにおけるＵＶ‐可視吸光度に基づいて最終的なナノ粒子濃度を１０ｎＭに調整した。
【０１１５】
（ｅ）タンパク質マイクロアレイの調製
精製ヒトＩｇＥはケミコン・インターナショナルから購入し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびＩｇＧはシグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）から購入した。これらのタンパク質を、ＧＭＳ４１７型アレイヤー（アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社）を用いてＣｏｄｅｌｉｎｋ（登録商標）スライド（アマシャム・インコーポレイテッド（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ．））上にアレイ化した。前記ヒトＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＢＳＡのアレイ化は、１５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）中の２ｍｇ／ｍＬの濃度として実施した。該スライドを湿潤チャンバ内で一晩インキュベートし、次に０．０５％Ｔｗｅｅｎを含んだＴＢＳ−Ｔ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭトリスベース緩衝液（ｐＨ８）で洗浄した。タンパク質はすべて３連としてアレイ化した。アレイ化スポットの位置は、各スライド上で複数のハイブリダイゼーション試験を行えるように設計し、シリコンガスケット（グレース・バイオラブス（Ｇｒａｃｅ  Ｂｉｏｌａｂｓ））を用いてスライドを別個の試験ウェルに間仕切りすることによって達成した。
【０１１６】
（ｆ）ＩｇＥの特異的検出
実験：
ＩｇＥ特異的なアプタマーオリゴヌクレオチド・金ナノ粒子コンジュゲートの検出プローブ（配列番号１）または陰性対照として用いた他のオリゴヌクレオチド・金ナノ粒子コンジュゲートの検出プローブ（配列番号２および３）の結合について、ＩｇＥが固定化され、かつＩｇＧおよびＢＳＡの陰性対照スポットを備えたマイクロアレイ化ガラススライドを用いて試験した（図２）。各５０μＬの結合反応物には、１×リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７）、１．０ｍＭのＭｇＣｌ２から成る結合緩衝液中に約２ｎＭの検出プローブを含めた。アプタマーで被覆された金プローブ溶液をエッペンドルフチューブ内で９５℃に３分間加熱し、室温まで５分間冷却し、氷上に２分間置き、次いでタンパク質アレイ上にピペットで移し、室温（約２４℃）で１時間インキュベートした。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、最初は１×リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７）、１．０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．００１％Ｔｗｅｅｎ２０にガラススライドを１分間浸漬し、次いでスライドを水中に（約２秒間）入れて、ガラススライドの表面から過剰な塩類を除いた。これまでに報告されている銀増幅法（タトンら（Ｔａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８９巻、ｐ．１７５７〜１７６０）を用いてスライドを銀増強溶液で染色し、回転式乾燥器で乾燥させ、ＡｒｒａｙＷｏｒｘ（登録商標）バイオチップリーダー（モデル番号ＡＷＥ、米国ワシントン州イサクア所在のアプライド・プレシジョン・インコーポレイテッド（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｃ．））で画像化した（図３および４）。ＡｒｒａｙＷｏｒｘソフトウェアを用いてアレイ上の各スポットからの散乱シグナルを定量した。陽性対照の結合反応として、抗ＩｇＥ抗体・金ナノ粒子コンジュゲートの検出プローブを試験した。結合反応に用いたプロトコルおよび緩衝液は、アプタマーで被覆された金プローブについて上述したものと同じであるが、最初の加熱工程は省いている。
【０１１７】
結果：
ガラス表面に固定化したＩｇＥとの結合反応において、ＩｇＥ特異的アプタマーで被覆した金プローブ（ＡＧＰ）の結合を、抗ＩｇＥ抗体で被覆した金プローブ（Ａｂ−ＧＰ）と比較した（「実験」参照）。ガラススライドを銀増幅後に画像化し、正味のシグナルをアレイ上で定量した（図３）。ＡＧＰ（配列番号１）は、ガラススライド上に固定化した陽性（ＩｇＥ）スポットおよび陰性対照（ＩｇＧ、ＢＳＡ）スポットからの正味のシグナ
ル強度に基づくと、アレイ上のＩｇＥに対して特異的結合を示した。同様のプローブ濃度でＡｂ−ＧＰを用いて実施された陽性対照反応においても、ＩｇＥへの特異的結合が観察された。このＩｇＥ特異的なＡＧＰを、銀増幅アッセイを用いて他のＤＮＡ修飾金ナノ粒子（配列番号２および３）とも比較した（図４）。ＤＮＡ修飾金ナノ粒子はＩｇＥまたは陰性対照に結合しなかったが、ＡＧＰはＩｇＥに特異的に結合した。これらの実験は、アプタマーが金ナノ粒子表面上で、タンパク質の特異的検出を可能にする機能を有していることを明らかに示している。この系は、銀増幅のほかにタンパク質標的を２種類のアプタマー被覆金プローブによって「サンドイッチ」することによる比色法を用いたサンドイッチ形式のアッセイにおけるタンパク質の検出に拡張することが可能である。
【実施例２】
【０１１８】
オリゴヌクレオチドアプタマーで誘導体化した金ナノ粒子の調製およびヒトＩｇＥの検出のための方法（方法番号２）
試作研究のさらなる証明として、この実施例は、ヒトＩｇＥに対して高い結合親和性を有する良く研究されたＤＮＡアプタマー配列（ヴィーガンド，ティー．ダブリュ．（Ｗｉｅｇａｎｄ，Ｔ．Ｗ．）；ウィリアムズ，ピー．ビー．（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．Ｂ．）；ドレスキン，エス．シー．（Ｄｒｅｓｋｉｎ，Ｓ．Ｃ．）；ジョウビン，エム．エイチ．（Ｊｏｕｖｉｎ，Ｍ．Ｈ．）；キネット，ジェイ．ピー．（Ｋｉｎｅｔ，Ｊ．Ｐ．）；タセット，ディー．（Ｔａｓｓｅｔ，Ｄ．）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９６年）、第１５７巻、ｐ．２２１〜２３０；リス，エム．（Ｌｉｓｓ，Ｍ．）；ピーターソン，ビー．（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｂ．）；ウォルフ，エイチ．（Ｗｏｌｆ，Ｈ．）；プロハスカ，イー．（Ｐｒｏｈａｓｋａ，Ｅ．）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、（２００２年）、第７４巻、ｐ．４４８８〜４４９５）：
（５’ｃｇｃｇｇｇｇｃａｃｇｔｔｔａｔｃｃｇｔｃｃｃｔｃｃｔａｇｔｇｇｃｇｔｇｃｃｃｃｇｃｇｃ３’）［配列番号４］
について評価する。
【０１１９】
この抗ＩｇＥアプタマーは、ＩｇＥ標的のＦｃ領域に結合するステムループ構造を形成し、Ｋｄの測定値は８．４ｎＭである（リス，エム．（Ｌｉｓｓ，Ｍ．）；ピーターソン，ビー．（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｂ．）；ウォルフ，エイチ．（Ｗｏｌｆ，Ｈ．）；プロハスカ，イー．（Ｐｒｏｈａｓｋａ，Ｅ．）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、（２００２年）、第７４巻、ｐ．４４８８〜４４９５を参照されたい）。この抗ＩｇＥアプタマーを、上記の塩エイジング法を用いて、チオール修飾を介して直径１５ｎｍの金粒子にコンジュゲートさせた（ストルホフ，ジェイ．ジェイ．（Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．）；マルラ，エス．エム．（Ｍａｒｌａ，Ｓ．Ｍ．）；バオ，ピー．（Ｂａｏ，Ｐ．）；ハゲノー，エス．（Ｈａｇｅｎｏｗ，Ｓ．）；メータ，エイチ．（Ｍｅｈｔａ，Ｈ．）；ルーカス，エイ．（Ｌｕｃａｓ，Ａ．）；ガリメラ，ブイ．（Ｇａｒｉｍｅｌｌａ，Ｖ．）；パント，ティー．（Ｐａｔｎｏ，Ｔ．）；バッキンガム，ダブリュ．（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ，Ｗ．）；コーク，ダブリュ．（Ｃｏｒｋ，Ｗ．）；ミューラー，ユー．（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｕ．）、Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．（２００４年）、第１９巻、ｐ．８７５〜８８３）。比較のために陰性対照ＤＮＡ配列を直径１５ｎｍの金粒子にコンジュゲートさせた：
対照１：５’ａａａａａａａａａａａａａａａａｔｇｇｃａｔｇａｇｔａａｃｇａａｔａ３’［配列番号５］。
【０１２０】
接触型プリントロボットＧＭＳ４１７アレイヤー（アフィメトリクス）を用いて、標的タンパク質（ヒトＩｇＥ抗体）および対照タンパク質（ヒトＩｇＧ抗体）を、アミン反応基を含んだガラススライド上に共有結合により固定化することによって、試験用アレイを作製した。これまでに記載された銀増幅および画像化手順を用いて抗ＩｇＥ  ＡＧＰの結合試験を該試験アレイ上で行った（図５Ａ）。典型的な実験では、抗ＩｇＥ  ＡＧＰ（２
ｎＭ、５０μＬ）を、ＩｇＥで被覆したガラススライド上で、１×ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、１ｍＭのＭｇＣｌ２中で約２４℃にて１時間インキュベートした。０．００１％Ｔｗｅｅｎ２０を含んだ同様の緩衝液でガラススライドを洗浄後、該ガラススライドを銀増強液で５分間染色した（タトン，ティー．エイ．（Ｔａｔｏｎ，Ｔ．Ａ．）；マーキン，シー．エイ．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）；レットシンガー，アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００年）、第２８９巻、ｐ．１７５７〜１７６０；ストルホフ，ジェイ．ジェイ．（Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．）；マルラ，エス．エム．（Ｍａｒｌａ，Ｓ．Ｍ．）；バオ，ピー．（Ｂａｏ，Ｐ．）；ハゲノー，エス．（Ｈａｇｅｎｏｗ，Ｓ．）；メータ，エイチ．（Ｍｅｈｔａ，Ｈ．）；ルーカス，エイ．（Ｌｕｃａｓ，Ａ．）；ガリメラ，ブイ．（Ｇａｒｉｍｅｌｌａ，Ｖ．）；パント，ティー．（Ｐａｔｎｏ，Ｔ．）；バッキンガム，ダブリュ．（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ，Ｗ．）；コーク，ダブリュ．（Ｃｏｒｋ，Ｗ．）；ミューラー，ユー．（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｕ．）、Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．（２００４年）、第１９巻、ｐ．８７５〜８８３）。この手順を、陰性対照のＤＮＡで修飾された金粒子を用いて別個のアレイ上で繰り返した。ガラススライド上に捕捉された金粒子の銀増幅によって散乱された光を、白色光でガラススライドを照射してＣＣＤカメラで画像を記録する市販のスキャナを用いて、分析した（ストルホフ，ジェイ．ジェイ．（Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．）；マルラ，エス．エム．（Ｍａｒｌａ，Ｓ．Ｍ．）；バオ，ピー．（Ｂａｏ，Ｐ．）；ハゲノー，エス．（Ｈａｇｅｎｏｗ，Ｓ．）；メータ，エイチ．（Ｍｅｈｔａ，Ｈ．）；ルーカス，エイ．（Ｌｕｃａｓ，Ａ．）；ガリメラ，ブイ．（Ｇａｒｉｍｅｌｌａ，Ｖ．）；パント，ティー．（Ｐａｔｎｏ，Ｔ．）；バッキンガム，ダブリュ．（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ，Ｗ．）；コーク，ダブリュ．（Ｃｏｒｋ，Ｗ．）；ミューラー，ユー．（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｕ．）、Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．（２００４年）、第１９巻、ｐ．８７５〜８８３）。この画像およびそれに対応するデータ分析から、抗ＩｇＥ  ＡＧＰはアレイ上に固定化されたＩｇＥ抗体に特異的に結合するが、陰性対照のＤＮＡ修飾金プローブはＩｇＥ抗体の試験部位においてシグナルをほとんど示さない／まったく示さないことを実証している（図５Ｂ）。これらのデータは、抗ＩｇＥアプタマー配列が金粒子表面に結合した後も機能を有し、該アプタマーは固定化されたＩｇＥ標的に特異的に結合することを実証している。また、これらのデータは、ＤＮＡ修飾金粒子はスライド上に固定化された抗体に対する非特異的結合が低いという予備的証拠を提供している。このことはＤＮＡマイクロアレイに関するこれまでの試験（タトン，ティー．エイ．（Ｔａｔｏｎ，Ｔ．Ａ．）；マーキン，シー．エイ．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）；レットシンガー，アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００年）、第２８９巻、ｐ．１７５７〜１７６０）と一致する。
【０１２１】
アフィニティー精製されたヤギ抗ヒトＩｇＥポリクローナル抗体および精製ヒトＩｇＥは、ケミコン・インターナショナル（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）から購入した。ヒトＩｇＧはシグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）から購入した。ＣｏｄｅＬｉｎｋ（登録商標）ガラススライドはアマシャム・インコーポレイテッド（Ａｍｅｒｓｈａｍ）から購入した。直径６０ｎｍの金粒子はブリティッシュ・バイオセル・インターナショナル（Ｂｒｉｔｉｓｈ  ＢｉｏＣｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；ＢＢＩ）から購入した。ＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏ、クエン酸三ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ２０、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および銀増強溶液ＡおよびＢはシグマ・アルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐａｎｙ）から購入した。
【０１２２】
（ａ）直径１５ｎｍの金粒子の調製
フレンス（Ｆｒｅｎｓ）、１９７３年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｈｙｓ．Ｓｃｉ．、第２４１巻、ｐ．２０〜２２およびグラバー（Ｇｒａｂａｒ）、１９９５年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、第６７巻、ｐ．７３５に記載されているように、ＨＡｕＣｌ４をクエン酸で還元する
ことによって金コロイド（直径約１５ｎｍ）を調製した。簡単に述べると、すべてのガラス器具を王水（ＨＣｌを３部とＨＮＯ３を１部）で洗浄し、Ｎａｎｏｐｕｒｅ（登録商標）水で濯ぎ、使用前にオーブン乾燥した。ＨＡｕＣｌ４およびクエン酸ナトリウムはアルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）から購入した。ＨＡｕＣｌ４水溶液（１ｍＭ、５００ｍＬ）を攪拌しながら還流し、次いで、３８．８ｍＭクエン酸ナトリウム（５０ｍＬ）を迅速に添加した。溶液の色が淡黄色から赤紫色に変化し、還流を１５分間継続した。室温まで冷却後、この赤色の溶液をマイクロン・セパレーション・インコーポレイテッド（Ｍｉｃｒｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）の０．２μｍの酢酸セルロースフィルタで濾過した。ヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）の８４５２Ａ型ダイオード・アレイ分光光度計を用いたＵＶ−ｖｉｓ分光法によって、金コロイドの特徴を解析した。
【０１２３】
（ｂ）ＤＮＡ修飾金ナノ粒子の調製
調製されたままの状態のナノ粒子を、これまでに記載されている塩エイジング法（ストルホフ，ジェイ．ジェイ．（Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．）；マルラ，エス．エム．（Ｍａｒｌａ，Ｓ．Ｍ．）；バオ，ピー．（Ｂａｏ，Ｐ．）；ハゲノー，エス．（Ｈａｇｅｎｏｗ，Ｓ．）；メータ，エイチ．（Ｍｅｈｔａ，Ｈ．）；ルーカス，エイ．（Ｌｕｃａｓ，Ａ．）；ガリメラ，ブイ．（Ｇａｒｉｍｅｌｌａ，Ｖ．）；パント，ティー．（Ｐａｔｎｏ，Ｔ．）；バッキンガム，ダブリュ．（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ，Ｗ．）；コーク，ダブリュ．（Ｃｏｒｋ，Ｗ．）；ミューラー，ユー．（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｕ．）、Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．（２００４年）、第１９巻、ｐ．８７５〜８８３、およびこの文献中に記載の参照文献）を用いて、チオール官能化オリゴヌクレオチドで誘導体化した。簡単に述べると、ＩｇＥアプタマー（最終濃度３μＭ）およびＡ２０希釈配列（最終濃度１μＭ）を、調製されたままの状態の金ナノ粒子とともに最初に１６時間超インキュベートし、次いでリン酸緩衝生理食塩水を、最終濃度が０．８ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸（ｐＨ７）になるまで連続して添加した。１０時間より長く放置した後、プローブを遠心分離によって単離し、等量の水で洗浄し、０．１ＭのＰＢＳ、０．０１％アジドに再分散させて粒子濃度１０ｎＭとした。プローブはすべて４℃で保管した。
【０１２４】
同様の手順に以下の変更を加えて、直径６０ｎｍの金ナノ粒子コンジュゲートを調製した。まず、０．９μＭのアプタマーオリゴヌクレオチドおよび１．８μＭのＡ２０希釈配列を、ＢＢＩから得た粒子に添加した。次に、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）界面活性剤を添加して最終濃度０．０１％とし、次いでＮａＣｌを連続添加して最終濃度０．８Ｍ  ＮａＣｌとした（ストルホフ，ジェイ．ジェイ．（Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．）；ルーカス，エイ．ディー．（Ｌｕｃａｓ，Ａ．Ｄ．）；ビスワナダム，ジー．（Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｍ，Ｇ．）；バオ，ワイ．ピー．（Ｂａｏ，Ｙ．Ｐ．）；ミューラー，ユー．（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｕ．）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００４年）、第２２巻、ｐ．８８３〜８８７、およびこの文献中の参照文献）。このアプタマー修飾粒子を遠心分離（２３００ｒｃｆで３０分間）によって単離し、等量の水中で洗浄し、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１ＭのＮａＣｌ、０．０１％アジド中で再分散させる。
【０１２５】
（ｃ）抗体修飾金ナノ粒子の調製
金コロイドの購入に伴って添付されたブリティッシュ・バイオセル・インターナショナル（ＢＢＩ）による既述の手順を用いて、直径６０ｎｍの金ナノ粒子にポリクローナル抗体をコンジュゲートさせた。簡単に述べると、炭酸ナトリウムを用いて直径６０ｎｍの金ナノ粒子をｐＨ９〜１０に調整した（０．１Ｍの炭酸ナトリウム約２５μＬを入手した状態のままのコロイド１ｍＬに添加）。金ナノ粒子１ｍＬ当たり３μｇの抗体を加え、室温で１．０時間インキュベートした。次いで、ＢＳＡを最終濃度１％になるまで添加して粒子を安定させた。この抗体・金ナノ粒子コンジュゲートを、ベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）のＭｉｃｒｏｆｕｇｅ（登録商標）１８を用いて２１０
０ｒｃｆで２５分間の遠心分離により単離した。遠心分離後、この上清を取り除き、エッペンドルフチューブの底に残る暗赤色のゼラチン状の残渣を緩衝液（２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）、０．５％ＢＳＡおよび０．０１％アジド）に再分散させた。吸光係数ε５２０＝２．８×１０１０Ｍ−１ｃｍ−１を用いて、５２０ｎｍのＵＶ‐可視吸光度に基づき最終的なナノ粒子濃度を算出した。
【０１２６】
（ｄ）抗体が固定化されたアレイの調製
直径５００μｍのピンを装備したアフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）ＧＭＳ４１７型ピンアンドリング方式マイクロアレイヤーを用いて、ヒトＩｇＥ抗体、抗ＩｇＥ抗体およびＩｇＧ抗体をＣｏｄｅｌｉｎｋ（登録商標）スライド（アマシャム・インコーポレイテッド）上にアレイ化した。典型的には、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、６０ｍＭトレハロース中で抗体を最終濃度５００μｇ／ｍＬとして緩衝化した。プリントした後、スライドを湿潤チャンバ内で一晩インキュベートし、続いてＴＢＳ−Ｔ緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含んだ１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  トリスベース緩衝液（ｐＨ８））で洗浄した。抗体は３連としてアレイ化し、アレイ化スポットの複製１０個を各スライド上に作製した。該アレイを、シリコンガスケット（グレース・バイオラブス）を用いて別個の試験ウェルに間仕切りした。
【０１２７】
（ｅ）アッセイおよび画像化
シリコンガスケットを用いて、容量４０〜５０μＬでアッセイを行った。アッセイ終了後、ガスケットを取り外し、スライドを遠心分離にかけて過剰な液体を除去する。銀で現像するために、銀増強溶液ＡおよびＢを１：１で混合し、各スライド上に置き、５分間インキュベートした。続いて、スライドを水で洗浄し、金属ハロゲン化物アーク灯を用いた白色光でスライドを照射して照射されたスライドからの散乱光を顕微鏡対物レンズ経由で冷却されたＣＣＤカメラ上に集める市販の画像分析システムを用いて画像化した（ストルホフ，ジェイ．ジェイ．（Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．）；マルラ，エス．エム．（Ｍａｒｌａ，Ｓ．Ｍ．）；バオ，ピー．（Ｂａｏ，Ｐ）；ハゲノー，エス．（Ｈａｇｅｎｏｗ，Ｓ．）；メータ，エイチ．（Ｍｅｈｔａ，Ｈ．）；ルーカス，エイ．（Ｌｕｃａｓ，Ａ．）；ガリメラ，ブイ．（Ｇａｒｉｍｅｌｌａ，Ｖ．）；パント，ティー．（Ｐａｔｎｏ，Ｔ．）；バッキンガム，ダブリュ．（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ，Ｗ．）；コーク，ダブリュ．（Ｃｏｒｋ，Ｗ．）；ミューラー，ユー．（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｕ．）、Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．（２００４年）、第１９巻、ｐ．８７５〜８８３、およびこの文献中の参照文献）。
【実施例３】
【０１２８】
ナノ粒子・アプタマーコンジュゲートおよびナノ粒子・抗体コンジュゲートの比較
この実施例では、サンドイッチ・アッセイ形式においてＩｇＥ標的に結合する検出標識として、抗ＩｇＥ  ＡＧＰと比較するために、抗ＩｇＥ抗体金ナノ粒子コンジュゲートを調製した（図５）。これらの試験のために、ヒトＩｇＥに対して作製されたヤギ・ポリクローナル抗体を、十分に確立された手法を用いて直径６０ｎｍの金粒子に受動吸着させ、抗ＩｇＥアプタマーを直径６０ｎｍの金粒子にコンジュゲートさせた（上記実施例２を参照）。種々の大きさのＡＧＰを作成し、検出標識として使用可能であることを実証するために、直径６０ｎｍの金粒子を選択した。直径＞４０ｎｍの金属粒子は表面プラスモン共鳴周波数で特定の色の光を散乱し（イグエラビデ，ジェイ．（Ｙｇｕｅｒａｂｉｄｅ，Ｊ．）；イグエラビデ，イー．イー．（Ｙｇｕｅｒａｂｉｄｅ，Ｅ．Ｅ．）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、（１９９８年）、第２６２巻、１５７〜１７６）、また、粒子の大きさ、形状および化学組成を制御することによってアレイ上で多色標識に用いることが可能であるほか（タトン，ティー．エイ．（Ｔａｔｏｎ，Ｔ．Ａ．）；ルー，ジー．（Ｌｕ，Ｇ．）；マーキン，シー．エイ．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００１年）、第１２３巻、ｐ．５１６４〜５１６５；ジン，アール．シー．（Ｊｉ
ｎ，Ｒ．Ｃ．）；カオ，ワイ．ダブリュ．（Ｃａｏ，Ｙ．Ｗ．）；マーキン，シー．エイ．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）；ケリー，ケイ．エル．（Ｋｅｌｌｙ，Ｋ．Ｌ．）；シャッツ，ジー．シー．（Ｓｃｈａｔｚ，Ｇ．Ｃ．）；ツウェン，ジェイ．ジー．（Ｚｈｅｎｇ，Ｊ．Ｇ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１年）、第２９４巻、ｐ．１９０１〜１９０３）、均質な検出アッセイにも使用することができる（ストルホフ，ジェイ．ジェイ．（Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．）；ルーカス，エイ．ディー．（Ｌｕｃａｓ，Ａ．Ｄ．）；ビスワナダム，ジー．（Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｍ，Ｇ．）；バオ，ピー．（Ｂａｏ，Ｐ）；ミューラー，ユー．（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｕ．）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００４年）、第２２巻、ｐ．８８３〜８８７）。抗ＩｇＥポリクローナル抗体およびヒトＩｇＧ抗体（標的には特異的でない）を先に記載したようなガラススライド上に固定化することによって、試験アレイを作製した。
【０１２９】
このアッセイの第１の工程では、異なる濃度のヒトＩｇＥ標的（１ｎｇ／ｍＬ−１μｇ／ｍＬ）または標的を含まず１μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧを含む対照を、別個の試験アレイ上で１×ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０中で約２４℃にて７分間インキュベートした。この標的溶液をアレイから除去した後、該スライドを、２％硫酸デキストランを含む同じ緩衝液中で、抗ＩｇＥ抗体で被覆した金プローブ（４００ｐＭ）または抗ＩｇＥ  ＡＧＰ（４００ｐＭ）と３分間反応させ、次いで緩衝液で洗浄し、上記のように画像化した。抗体およびアプタマーで被覆した金プローブの間の最も顕著な差はその結合特異性である。アプタマープローブで標識したアレイと比較すると、抗体プローブで標識したアレイは標的を含まない対照ウェルにおいて実質的に高いバックグラウンド・シグナルを示した（図７）。このことは、該抗体プローブが、ヤギ抗ＩｇＥポリクローナル抗体およびガラススライドに結合させた対照のヒトＩｇＧ抗体の両方に対して非特異的に結合したことによるものである。結果として、標的を含まない対照よりも標準偏差の３倍を超えて大きい正味シグナルに基づき、アプタマープローブを用いて１ｎｇ／ｍＬのヒトＩｇＥ標的が検出可能であった一方、抗体プローブを用いると、この基準値を超えて検出可能であるのは１０ｎｇ／ｍＬに過ぎなかった。この抗体プローブの非特異的結合は、硫酸デキストランを除去するか、プローブ濃度を下げることによって緩和されるが、これらの変更はアッセイ中の検出限界を改善するものではない。
【０１３０】
結論として、実施例１〜３は、ＤＮＡ系アプタマーを種々の大きさ（直径１５〜６０ｎｍ）の金粒子にコンジュゲートし、タンパク質標的に対する検出標識として使用することが可能であることを実証している。抗体アレイ上で実施されたサンドイッチ・アッセイでは、抗体で被覆した金プローブに比してＡＧＰは検出限界を約１桁向上させた。これはアレイに結合している抗体との非特異的結合／交差反応がより低いことによるものである。さらに、ＤＮＡ修飾金粒子に関するこれまでの試験で記録されているように、これらのプローブは長期間の保存ならびに熱および生理食塩水に対して安定している。本明細書で考察した新規な標識技術は、イムノアッセイまたは抗体アレイに用いられる他のナノ粒子を用いる検出方法（グルビシャ，ディー．エス．（Ｇｒｕｂｉｓｈａ，Ｄ．Ｓ．）；ライペルト，アール．ジェイ．（Ｌｉｐｅｒｔ，Ｒ．Ｊ．）；パーク，エイチ．ワイ．（Ｐａｒｋ．Ｈ．Ｙ．）；ドリスケル，ジェイ．（Ｄｒｉｓｋｅｌｌ，Ｊ．）；ポーター，エム．ディー．（Ｐｏｒｔｅｒ，Ｍ．Ｄ．）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（２００３年）、第７５巻、ｐ．５９３６〜５９４３；（ストルホフ，ジェイ．ジェイ．（Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．）；ルーカス，エイ．ディー．（Ｌｕｃａｓ，Ａ．Ｄ．）；ビスワナダム，ジー．（Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｍ，Ｇ．）；バオ，ワイ．ピー．（Ｂａｏ，Ｙ．Ｐ．）；ミューラー，ユー．（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｕ．）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００４年）、第２２巻、ｐ．８８３〜８８７；カオ，ワイ．ダブリュ．シー．（Ｃａｏ，Ｙ．Ｗ．Ｃ．）；ジン，アール．シー．（Ｊｉｎ，Ｒ．Ｃ．）；マーキン，シー．エイ．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２年、第２９７巻、ｐ．１５３６〜１５４０）ならびにアプタマーを設計することができる他の目的分子（ジャヤセーナ，エス．ディー．
（Ｊａｙａｓｅｎａ，Ｓ．Ｄ．）、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９９９年）、第４５巻、ｐ．１６２８〜１６５０）に応用することができる
【実施例４】
【０１３１】
ナノ粒子・アプタマープローブの表面密度の評価
この実施例では、種々の表面密度のアプタマーで標識されたナノ粒子を調製し、評価した。これらの標識ナノ粒子は実施例１に記載の手順に従って調製した。希釈用Ａ２０の比を変えてＩｇＥアプタマーで被覆した直径６０ｎｍの金粒子上で利用可能なアプタマー（Ａ１０アプタマー１またはＴ１０アプタマー１のプローブ配列）の数を、これまでに報告されている蛍光ベースのアッセイ（デマースら（Ｄｅｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２０００年）を用いて測定した（図８）。第１の実験で試験した金粒子に、ＩｇＥアプタマー：希釈用Ａ２０の比を１００：０、２：１、１：２、１：８、または０：１００（Ａ２０（対照））を、あるいはＴ１０アプタマーを装荷した。上記プローブ配列を以下の表１に示す。
【０１３２】
【表１】
2007536528.tif 000003
アプタマーで被覆された金プローブ各々についての利用可能なアプタマーの数を２つの別個のプローブ調製物について測定した。金粒子１個当たりの利用可能なアプタマーの数は、粒子に装荷されたアプタマー：Ａ２０の比に依存する（表２）。
【０１３３】
【表２】
2007536528.tif 000004
様々な数の利用可能なアプタマーおよびリンカー配列（Ａ２０またはＴ２０）を備えたアプタマー被覆金プローブをＩｇＥ標的への結合について試験して、最適なアプタマー装荷量を決定した。ＩｇＥ標的を捕捉するために、官能化したガラススライド上に抗ＩｇＥ
抗体をプリントした。抗ＩｇＥ抗体および対照のＩｇＧ抗体の連続希釈液（１０００、５００および２５０μｇ／ｍＬ）を官能化したガラススライド上に３連でアレイ化した。次いで、ＩｇＥ標的（１μｇ／ｍＬ）を個々の試験アレイ上で３０分間インキュベートした。このＩｇＥ標的をアレイから取り出し、アプタマー被覆金プローブ（図２を参照）を最適な結合緩衝液中で個々のアレイ上で１５分間インキュベートした。該試験スライド上に配置された抗ＩｇＥスポットおよびＩｇＧスポット各々からの散乱強度の合計を測定し、特異的に結合したＡＧＰの量を決定した（図９）。比較のために、陰性対照としてＡ２０で被覆した金プローブと共に抗ＩｇＥポリクローナル抗体プローブも別個の反応において試験した。アプタマー被覆金プローブならびに抗ＩｇＥ抗体被覆金プローブはそれぞれ、抗ＩｇＥスポットおよび対照ＩｇＧスポットからの散乱強度の合計についての比較に基づくと、ＩｇＥ標的に特異的に結合する。ＩｇＥ標的を含まない対照の反応は最小の散乱を示し、ＡＧＰの結合がＩｇＥ特異的であることを表している。定量的には、該予備データから、アプタマーで被覆された金プローブは、これらの結合条件下では、利用可能なアプタマーの数に関係無く抗ＩｇＥ抗体プローブよりもＩｇＥ標的への結合性が高いことが示唆される。
【０１３４】
各々のアプタマー被覆金プローブの結合動態を、試験アレイ上で所定のプローブ濃度にて固定化ＩｇＥとともに所定の時間（３〜１５分間）インキュベートすることによって試験した。２５０、５００または１０００μｇ／ｍＬでプリントされた抗ＩｇＥ抗体の試験部位（ＩｇＧ試験部位は陰性対照として機能する）に結合したＩｇＥ標的からの金プローブの散乱シグナルを、各プローブ反応について定量した。プローブのインキュベーション時間が最短の３分間のとき、アプタマーが最少（１：８、１０１アプタマー／粒子）のプローブは他の３つのプローブよりも非常に弱いシグナルを示した（図１０）。最高の平均シグナルは、アプタマーが４２０個（２：１）または２２８個（１：２）装荷されたＡＧＰから得られ、５１４個のアプタマー（ＦＬ）を装荷したＡＧＰからの平均シグナルとほぼ等しかった。プローブのインキュベーション時間７分では同様の傾向が観察されたが、１５分では、１：８のプローブはシグナル強度の点で他のＡＧＰとほぼ等しかった。これらのデータは、２２８個を超えるアプタマーを有するアプタマー被覆金プローブは、粒子当たり１０１個未満のアプタマーを有するプローブよりも著しく速い結合動態を示すことを示唆している。また、２２８個を超えるアプタマーを有するプローブはこれらの条件下で同様の結合動態を示すことが示唆され、このことから、粒子あたりのアプタマー数が最少限に達してしまえば、ある範囲のアプタマー表面被覆率が２段階アッセイに好適でありうることが示唆される。
【実施例５】
【０１３５】
アプタマーで被覆した金プローブのアレイの調製
この実施例では、アプタマーで被覆した金プローブのアレイの調製について説明する。アプタマーで被覆した金プローブを、導波路基材の表面に共有結合しているアミン修飾Ｔ２０オリゴヌクレオチド（配列番号１０）にハイブリダイゼーションすることにより、導波路基材に固定化した（図１１）。典型的には、アミン修飾Ｔ２０オリゴヌクレオチドを１×ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に最終濃度５００μＭに再懸濁させ、直径５００μｍのピンを装備したアフィメトリクスのＧＭＳ４１７型ピンアンドリング方式マイクロアレイヤーを用いてＣｏｄｅｌｉｎｋスライド（アマシャム・インコーポレイテッド）またはＳｕｐｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ（登録商標）スライド（テレケム・インターナショナル（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））上にアレイ化した。このスライドを湿潤チャンバ内で一晩インキュベートし、次に１×ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液で洗浄した。典型的には、オリゴヌクレオチドを３連として２列にアレイ化し、アレイ化したスポットの１０個の複製を各スライド上に作製した。シリコンガスケット（グレース・バイオラブス）を用いてこのアレイを別個の試験ウェルに間仕切りした。次いで、アプタマー修飾金プローブ（配列Ａ１０アプタマーと希釈用Ｔ２０、配列番号１０
）を種々の濃度で加えて室温で１５分間の第２工程とし（１×ＰＢＳ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）、「アプタマーで被覆した金プローブのアレイ」を形成した。各プローブアレイを白色光で照射し、カラーＣＣＤカメラを用いて画像化して散乱色を記録した。図１２に示すように、ＡＧＰはアルデヒド基材上の相補的なＴ２０スポットに固定化され、該プローブはプローブ濃度に応じて主に緑〜緑黄色の光を散乱する。このことは、表面に結合したＡＧＰの密度を、付加する金プローブの量によって制御することができることを示している。
【実施例６】
【０１３６】
抗ＩｇＥアプタマーで被覆した金プローブのアレイにおけるヒトＩｇＥの検出
この実施例では、実施例５で調製した抗ＩｇＥアプタマーで被覆した金プローブのアレイ上で、ヒトＩｇＥ標的の検出を試験した。図１３を参照されたい。これらの試験のために、抗ＩｇＥアプタマーで被覆した金プローブ（７５ｐＭ）を上記のようなＴ２０アレイ上に固定化した。アッセイ工程はすべて４０μＬの反応容量中で、室温で行った。第１の工程では、様々な濃度のヒトＩｇＥ（２μｇ／ｍＬ−１ｎｇ／ｍＬ）または陰性対照としてヒトＩｇＧ（２μｇ／ｍＬ）を、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１×ＰＢＳ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０に含めて、別個の試験アレイ上で３０分間インキュベートした。第２の工程では、抗ＩｇＥ抗体で被覆した金プローブ（上記のように調製）を、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１×ＰＢＳ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、２％硫酸デキストランを含んだ緩衝液中でプローブ濃度４５０ｐＭとしてアレイ上で１０分間インキュベートした。白色光で照射後、カラーＣＣＤカメラを用いて各プローブアレイからの散乱色を記録した（図１４）。緑色からオレンジ色までの散乱色の変化が、＞５０ｎｇ／ｍＬのＩｇＥ標的（２．５ｎｇの総ＩｇＥ）を含む試料について観察された。＜１０ｎｇ／ｍＬのＩｇＥ標的または２μｇ／ｍＬのＩｇＧ標的を含む試料は散乱色が緑のままであった。この散乱色は肉眼で視覚的に検出することも可能であることに留意されたい。
【０１３７】
別の分析方法では、スライドを５％ホルムアミド、１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄してからＶｅｒｉｇｅｎｅ（商標）ＩＤ検出システムを用いて画像化した（図１５）。この洗浄工程は対照のヒトＩｇＧ試料からの緑色の散乱量を低減させると同時に、ヒトＩｇＥ標的試料について観察される散乱色の赤色への移行を増大させた。このことから、アプタマーで被覆された金プローブは洗浄工程において脱ハイブリダイゼーションによってアレイから取り除くことができる一方、ヒトＩｇＥ標的および抗ＩｇＥ抗体で被覆された金プローブから形成されたＡＧＰプローブ複合体はスライドに結合したままであることが示された。したがって、結合していないプローブに起因するバックグラウンド・シグナル（緑色の散乱）を単純な洗浄工程によって選択的に取り除くことができる。この効果は、水でスライドを洗浄した後に最初に観察され、その後の異なる濃度のホルムアミドおよびＴｗｅｅｎを用いた実験では、５％ホルムアミド、１％Ｔｗｅｅｎ２０で金プローブ複合体からのシグナルを保持しつつバックグラウンドが最も良く除去されることが実証されたことに留意されたい。ヒトＩｇＥの１０ｎｇ／ｍＬ試料からの正味のシグナル強度は、陰性対照のヒトＩｇＧ試料の正味のシグナル強度に対して、標準偏差の３倍を超えて大きかった。これは、色の変化を視覚的に分析する（約５０ｎｇの検出限界）よりも検出限界が少なくとも５倍改善したことを表しており、洗浄工程と併せてＶｅｒｉｇｅｎｅ（商標）ＩＤ検出システムを用いてＡＧＰアレイを画像化することが可能であることを実証している。
【実施例７】
【０１３８】
ポリＡテールを備えたアプタマー：基材へのハイブリダイゼーションおよび検出における使用
標準的なホスホロアミダイト法によって、Ａ２０テールを備えた抗ＩｇＥアプタマー［配列番号１０］を合成した。アミンで修飾されたＴ２０およびＡ２０オリゴヌクレオチドをホスホロアミダイト法によって合成し、最終濃度約０．１〜１ｍＭで１０ｍＭのリン酸
（ｐＨ８）に再分散させた。直径５００μｍのピンを装備したピンアンドリング方式のマイクロアレイヤーを用いて、オリゴヌクレオチドの結合についての製造業者の推奨事項に従ってアミン修飾オリゴヌクレオチドをＣｏｄｅｌｉｎｋ（登録商標）基材に結合させた。
５’ａａａ  ａａａ  ａａａ  ａ  ａａａ  ａａａ  ａａａ  ａｇｃｇ  ｃｇｇ  ｇｇｃ
ａｃｇ  ｔｔｔ  ａｔｃ  ｃｇｔ  ｃｃｃ  ｔｃｃ  ｔａｇ  ｔｇｇ  ｃｇｔ  ｇｃｃ
ｃｃｇ  ｃｇｃ  ３’［配列番号１０］
このＡ２０テールを備えた抗ＩｇＥアプタマー（配列番号１０）を、基材に結合しているＴ２０オリゴヌクレオチドに、１×ＰＢＳ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液（インキュベーション緩衝液と呼ぶ）中で、１０ｎＭの濃度で室温にて１５分間ハイブリダイズさせた。このスライドを約１００ｍＬのインキュベーション緩衝液で洗浄した。次いで、インキュベーション緩衝液中のヒトＩｇＥ標的または陰性対照のヒトＩｇＧ（５０ｐｇ／ｍＬ−５００ｎｇ／ｍＬ）を基材に７分間添加した。続いて、この標的溶液をスライドから除去し、２％硫酸デキストランの入ったインキュベーション緩衝液中の４００ｐＭのヤギｘ−ＩｇＥポリクローナル抗体で被覆した直径６０ｎｍの金プローブを各アレイに加え、３分間インキュベートした。このスライドを約１００ｍＬのインキュベーション緩衝液で洗浄し、ＡｒｒａｙＷｏｒｘ画像分析装置で画像化した。図１９を参照すると、アレイ上のＴ２０にハイブリダイズしたＡ２０テールを備えたｘＩｇＥアプタマーを用いた、ＩｇＥの検出が示されている。
【０１３９】
上記開示は本発明のある特定の実施形態を強調するものであり、該実施形態と同等のあらゆる改変実施形態または代替実施形態が、添付の特許請求の範囲に記載されるように本発明の精神および範囲内にあることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】試験に使用するアプタマーの配列を示す図。これまでの検討から推定される二次構造およびＫｄ測定値を示す。
【図２】アプタマーで被覆した金プローブの実現可能性を実証するために用いられたアッセイの概略図。
【図３】抗体で被覆した金プローブ（抗ＩｇＥ）およびアプタマーで被覆した金プローブの、ガラススライド上に固定化したＩｇＥへの結合の比較を示す図。別個の反応ウェルにおいてプローブをスライドに曝露した後、銀で増幅した。  Ａ）Ａｒｒａｙｗｏｒｘ画像分析装置で捕捉した銀現像後のガラススライドの画像。  Ｂ）各スポットセットの３スポットについて平均した正味のシグナル強度。エラー・バーは標準偏差（×１）を表す。
【図４】ＩｇＥを含むタンパク質アレイ上でインキュベートしたアプタマー被覆金プローブの、検出特異性を示す画像。検出手順を図２に示した。  Ａ）ＩｇＥ特異的アプタマーで被覆した金プローブとともにインキュベートしたタンパク質アレイ。  Ｂ）ＡＰＣ遺伝子配列を含んだＤＮＡで修飾された粒子とともにインキュベートしたタンパク質アレイ。  Ｃ）ｍｅｃＡ遺伝子配列を含んだＤＮＡで修飾された粒子とともにインキュベートしたタンパク質アレイ。
【図５】Ａ）アプタマーで被覆した金プローブの抗体アレイへの結合を示す略図。シグナルを増強するために、アプタマー被覆金粒子上には銀が付着している。  Ｂ）抗ヒトＩｇＥアプタマーで被覆した金プローブ（ＡＧＰ）または対照のＤＮＡ修飾金プローブの、アレイ上に固定化したヒトＩｇＥ抗体およびＩｇＧ抗体への結合を示す略図。固定化された抗体からの正味のシグナル強度を各プローブについてプロットしている。エラー・バーは３つの複製スポットからの標準偏差を表す。挿入図は銀現像後のアプタマープローブで標識されたアレイの画像を示している。
【図６】アプタマーおよび抗体で修飾した直径６０ｎｍの金粒子の、ヒトＩｇＥ標的の検出標識としての比較を示す略図。この比較は、ＩｇＥ標的を捕捉するためにガラススライド上に固定化した抗ヒトＩｇＥ抗体を用いるサンドイッチ・アッセイ形式で実施された。陰性対照としてヒトＩｇＧ抗体をガラススライド上に固定化した。
【図７】抗ＩｇＥアプタマーまたは抗ＩｇＥ抗体で被覆した金プローブを用いた、ヒトＩｇＥの検出の比較を示す略図。アレイ上の抗ＩｇＥ捕捉抗体の部位からの正味のシグナル強度（ＩｇＥ標的のウェル−標的を含まない対照ウェルのシグナル）を、各プローブに対するＩｇＥ標的濃度の関数としてプロットしている。エラー・バーはアレイ上の３つの複製スポットからの標準偏差を表す。各プローブについての基準値ラインは、標的を含まない対照ウェルから上方へ３×標準偏差のラインである。挿入図は、１μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（ＩｇＥ標的を含まない）とともにインキュベートしてから抗体プローブまたはアプタマープローブで標識した後の、アレイ上のヤギ抗ＩｇＥ（上列）およびヒトＩｇＧ（下列）の試験部位を示す画像である。
【図８】金ナノ粒子表面の機能的アプタマーの密度を、フルオロフォアで標識したオリゴヌクレオチド（ＦＬＯ）のハイブリダイゼーションにより定量するスキームを示す図。このスキームはデマースら（Ｄｅｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０００年からの出典である。金ナノ粒子に結合しているアプタマーにＦＬＯをハイブリダイズさせる。次いで、過剰なＦＬＯを遠心分離によって除去する。次いで、ナノ粒子にハイブリダイズしたＦＬＯが遊離させ、蛍光プレートリーダーを用いて蛍光を定量する。
【図９】記載の捕捉配列（真中の列、ｘ軸）についてのアレイ上のスポット強度を示すプロット図。アレイをヒトＩｇＥ標的とともにインキュベートし、次いで、種々のアプタマー密度を用いてアプタマーで被覆した金プローブとともにインキュベートする。アレイを標識するのに用いたアプタマー被覆金プローブの種類を、Ａ１０アプタマー１：Ａ２０の比に基づいてｘ軸の一番下の列に示した。対照のＡ２０プローブおよび抗（ｘ）ＩｇＥプローブも陰性および陽性対照プローブとして試験したことに留意されたい。真中の列はスライド上の捕捉抗体（ＩｇＧまたはｘ−ＩｇＥ）を示しており、スポットの外側バックグラウンド（ガラス）についても測定したことに留意されたい。一番上の列はスライド上にアレイ化された捕捉抗体の濃度を示す。合計散乱強度の中央値（ｙ軸）は、試験した捕捉抗体濃度およびプローブの各々について測定した。アレイ上の複数のスポットを各プローブについて分析した。
【図１０】記載の捕捉配列（真中の列、ｘ軸）についてのアレイ上のスポット強度を示すプロット図。アレイをヒトＩｇＥ標的とともにインキュベートし、次いで、種々のアプタマー密度を用いてアプタマーで被覆した金プローブとともにインキュベートする。アレイを標識するのに用いたアプタマー被覆金プローブの種類を、ｘ軸の一番下の列に示した。様々なアプタマー密度の直径６０ｎｍの金プローブを、アレイ上で３分間インキュベートした。散乱強度が、アレイのスポット（２５０、５００または１０００μｇ／ｍＬのＩｇＥ標的またはＩｇＧ対照）および標識に使用したアプタマー被覆金プローブ（１：２、１：８、２：１、またはＦＬ）の関数としてプロットされている。
【図１１】ガラス表面上の、アプタマーで被覆した金プローブのアレイの調製について示す略図。工程１：ＤＮＡをガラス表面上に固定化する。この実施例ではＴ２０オリゴヌクレオチドを用いている。工程２：Ａ１０−抗ＩｇＥアプタマーで被覆した金プローブをＤＮＡアレイにハイブリダイズさせる。
【図１２】様々な濃度のＡ１０アプタマー被覆金粒子で調製した金プローブアレイのカラー画像。このプローブアレイは、Ａ１０アプタマーで被覆された金粒子（直径５０ｎｍ）をＴ２０ＤＮＡアレイにハイブリダイズさせることによって調製した。ガラススライドを白色光で平面的に照射することで、エバネセントの光散乱が金プローブから発生する。カラーＣＣＤカメラを装備したツァイス（Ｚｅｉｓｓ）のＡｘｉｏｐｌａｎ（商品名）顕微鏡を用いてカラー画像を記録した。プローブ濃度および曝露時間を画像の下に示す。散乱色は視覚的に肉眼で検出可能でもあることに留意されたい。散乱色は次のように略記する：ｙｇ＝黄色〜緑色、およびｇ＝緑色。
【図１３】抗ＩｇＥアプタマーで被覆した金プローブを用いた比色散乱法によるヒトＩｇＥ検出を示す略図。ヒトＩｇＥ標的をプローブアレイ上でインキュベートし、次いで、ヒトＩｇＥに結合する検出プローブ（抗ＩｇＥポリクローナル抗体で被覆した５０ｎｍの金プローブ）をインキュベートする。検出のために、光で基材を照射して金プローブから光散乱を生じさせ、これを光センサで測定する。
【図１４】抗ＩｇＥアプタマーで被覆した金プローブのアレイ上で実行したヒトＩｇＥアッセイのカラー画像。このプローブアレイを様々な濃度のヒトＩｇＥ標的または陰性対照ヒトＩｇＧ試料とともにインキュベートし（標的濃度を画像の下に示す）、次いで、検出プローブ（抗ＩｇＥポリクローナル抗体で被覆した５０ｎｍの金プローブ）をインキュベートした。ガラススライドを白色光で平面的に照射することで、エバネセントの光散乱が金プローブから発生する。カラーＣＣＤカメラを装備したツァイスのＡｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡を用いてカラー画像を記録した。観察された散乱色は画像の上に記載されている。
【図１５Ａ】Ｖｅｒｉｇｅｎｅ  ＩＤ検出システムを用いて記録した抗ＩｇＥアプタマー被覆金プローブアレイでのヒトＩｇＥのアッセイの画像。Ｖｅｒｉｇｅｎｅ  ＩＤ検出システムは赤色発光ダイオードを用いてスライドを照射し、単色光センサを用いてスライドの画像を捕捉する。スライドを洗浄して標的を伴わない金プローブを除いた後で画像を得た。ヒトＩｇＥ標的の濃度を各画像の下に示す。
【図１５Ｂ】プローブアレイ上の抗ＩｇＥアプタマー被覆金プローブからのシグナルの定量。Ｖｅｒｉｇｅｎｅ  ＩＤを用いて記録した画像をアクソン（Ａｘｏｎ）のＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）ソフトウェアを用いて分析した。金プローブのアレイスポットからバックグラウンド・シグナルを差し引くことによって正味のシグナル強度を算出した。各アレイ上の正味のシグナル強度の平均および６個のスポットからの標準偏差を示す。
【図１６】（Ａ）検出部分で標識されたリンカーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド・テールを有するアプタマープローブの、捕捉基材（例えば、磁性ビーズＭＢ）および標的分析物を用いるサンドイッチ式アッセイにおける適用を示す図。このアプタマープローブの設計は、多重サンドイッチ・アッセイを可能にする。  （Ｂ）このアプタマーのオリゴヌクレオチド・テールが、リンカーオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡバーコードの少なくとも一部分にハイブリダイズされる。直接的な検出のためにＤＮＡバイオバーコードが任意選択で検出可能な標識（例えば、フルオロフォア）で標識されてもよいし、アレイプレート上に捕捉されて検出プローブで検出されてもよい。
【図１７】サンドイッチされたハイブリダイゼーション複合体を単離し、該複合体を変性して遊離させた後で、アレイプレート上にＤＮＡバイオバーコードを捕捉することを示す図。捕捉されたＤＮＡバイオバーコードは、ナノ粒子検出などの任意の適切な手段で検出することができる。
【図１８】粒子（例えば、ナノ粒子）を介し、バーコードを介したシグナル増幅を用いる、アプタマーを介したバイオバーコード型アッセイ検出を示す図。遊離させたバイオバーコードを、該バーコードが標識されているかどうかに応じて、任意の適切な手段で検出することができる。未標識のバーコードは、ナノ粒子で標識した検出プローブとその後の銀増幅によって検出することができる。
【図１９】スライド表面のＴ２０にハイブリダイズしたＡ２０テールを備えたＩｇＥアプタマーを用いたＩｇＥの検出結果を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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