(57)【要約】  ヘルパー遺伝子の同時発現を利用してGタンパク質共役受容体の機能アッセイを可能にするまたは改善する方法を開示する。場合により、rap1Bタンパク質の調節ドメインをras癌遺伝子のエフェクタードメインに連結しているキメラを、細胞増殖に関する既存の機能アッセイと併用する。さらにまた、他の遺伝子の過剰発現により、ras／rapキメラの有効化特性をさらに増強することもできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘルパー遺伝子の同時発現を使って遺伝子機能のアッセイを可能にするまたは改善する方法。
【請求項２】
遺伝子産物に結合してそれらの機能を正または負に調整する化学化合物を同定することを目的とする、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
未知の機能または未知の機能遂行能力を持つ遺伝子の機能を検出／確証することを目的とする、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
未知の機能または未知の機能遂行能力を持つ遺伝子のシグナル伝達特性を同定し、それによってそれらの遺伝子に関する創薬スクリーニングアッセイを最適化することを目的とする、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
アッセイされる遺伝子が受容体である、請求項1〜3に記載の方法。
【請求項６】
アッセイされる遺伝子がGタンパク質共役受容体である、請求項1〜3に記載の方法。
【請求項７】
遺伝子機能のアッセイが遺伝子発現の変化を測定する、請求項1〜3に記載の方法。
【請求項８】
遺伝子機能のアッセイが第二メッセンジャーレベルの変化を測定する、請求項1〜3に記載の方法。
【請求項９】
遺伝子機能のアッセイが細胞の成長、形態、分化、または生存の変化を測定する、請求項1〜3に記載の方法。
【請求項１０】
当該受容体が通常は生成しない、受容体活性化に対する応答を、ヘルパー遺伝子が可能にする、請求項1〜3に記載の方法。
【請求項１１】
当該受容体が通常生成する応答を、ヘルパー遺伝子が増幅する、請求項1〜3に記載の方法。
【請求項１２】
当該受容体が通常は生成しない応答であるが、他のヘルパー遺伝子が可能にする応答を、ヘルパー遺伝子が増幅する、請求項1〜3に記載の方法。
【請求項１３】
一次機能応答の検出を妨害する受容体応答をヘルパー遺伝子が遮断する、請求項1〜3に記載の方法。
【請求項１４】
一次機能応答を保存または強化しつつ妨害シグナル入力または妨害シグナル出力を遮断する突然変異をヘルパー遺伝子が含有する、請求項1〜3に記載の方法。
【請求項１５】
ヘルパー遺伝子が、シグナル伝達系路をリダイレクトする2以上の遺伝子間のキメラであって、調節入力またはシグナル入力を受け取るドメインをエフェクター出力またはシグナル出力を与えるドメインに連結している、請求項1〜3に記載の方法。
【請求項１６】
キメラヘルパーが異なるGタンパク質に由来するドメインから構成される、請求項1〜3に記載の方法。
【請求項１７】
キメラヘルパーが、rasスーパーファミリーの異なるGタンパク質に由来するドメインから構成される、請求項1〜3に記載の方法。
【請求項１８】
キメラヘルパーが、rapサブファミリーおよびrasサブファミリーの異なるGタンパク質に由来するドメインから構成される、請求項1〜3に記載の方法。
【請求項１９】
ヘルパー遺伝子が、機能アッセイに用いられる宿主細胞内で通常は発現されない天然遺伝子である、請求項1〜3に記載の方法。
【請求項２０】
ヘルパー遺伝子が、機能アッセイに用いられる宿主細胞内で通常発現される、過剰発現された天然遺伝子である、請求項1〜3に記載の方法。
【請求項２１】
ヘルパー遺伝子が、機能アッセイに用いられる宿主細胞内で通常は発現されない天然遺伝子の切断型である、請求項1〜3に記載の方法。
【請求項２２】
ヘルパー遺伝子が、機能アッセイに用いられる宿主細胞内で通常発現される天然遺伝子の切断型である、請求項1〜3に記載の方法。
【請求項２３】
ヘルパー遺伝子が、キメラを含むキメラが由来するどちらかの遺伝子内に天然には存在しない突然変異をさらに含むキメラである、請求項1〜3に記載の方法。
【請求項２４】
ヘルパー遺伝子が、機能アッセイに用いられる宿主細胞内で通常は発現されない天然遺伝子であって、それらの遺伝子内に天然には存在しない突然変異をさらに含有する、請求項1〜3に記載の方法。
【請求項２５】
ヘルパー遺伝子が、機能アッセイに用いられる宿主細胞内で通常発現される天然遺伝子であって、それらの遺伝子内に天然には存在しない突然変異をさらに含有する、請求項1〜3に記載の方法。
【請求項２６】
ヘルパー遺伝子が、同時発現させた場合に受容体に対する機能応答の検出を可能にするまたは改善する、2以上の遺伝子、キメラ、突然変異遺伝子、または切断型遺伝子の混合物である、請求項1〜3に記載の方法。
【請求項２７】
ヘルパー遺伝子が、機能アッセイの対象である受容体がより良くシグナルすることを助ける他の天然受容体である、請求項1〜3に記載の方法。
【請求項２８】
ヘルパー遺伝子が、機能アッセイの対象である受容体の発現および形成を助ける他の天然受容体である、請求項1〜3に記載の方法。
【請求項２９】
ヘルパー遺伝子が、機能アッセイの対象である受容体がリガンドに対してより高感度に応答することを助ける他の天然受容体である、請求項1〜3に記載の方法。
【請求項３０】
ヘルパー遺伝子が、機能アッセイの対象である受容体がより良くシグナルすることを助ける他の非天然受容体もしくは突然変異受容体または受容体の断片である、請求項1〜3に記載の方法。
【請求項３１】
ヘルパー遺伝子が、機能アッセイの対象である受容体の発現および形成を助ける他の非天然受容体もしくは突然変異受容体または受容体の断片である、請求項1〜3に記載の方法。
【請求項３２】
ヘルパー遺伝子が、機能アッセイの対象である受容体がリガンドに対してより高感度に応答することを助ける他の非天然受容体もしくは突然変異受容体または受容体の断片である、請求項1〜3に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Gタンパク質共役受容体を活性化または阻害する能力について候補分子をスクリーニングするためのGタンパク質共役受容体高スループット機能アッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
Gタンパク質共役受容体（GPCR）ファミリーはヒトゲノムの1％以上を占める最大の既知遺伝子ファミリーである（1）。Gタンパク質共役受容体は医薬産業が治療化合物の開発に最もよく利用している遺伝子ファミリーである。多くのGPCRは分子多様性および不連続な組織局在を持つので、好ましい副作用プロファイルを持つ選択的で有効な化合物を開発できる見込みがある。GPCRの約50％は「オーファン」受容体であるとみなされているので、大きな創薬の可能性がまだ活用されずに残っていることは明らかである。
【０００３】
新規リード化合物を同定するためによく使用される戦略は多様な化合物ライブラリーの高スループットスクリーニングである。使用されるアッセイは、所定の分子標的への化合物の結合を測定することに基づくか、化合物／受容体相互作用に起因する機能出力を測定することに基づいている。競合結合アッセイの主な制約は、オーファン受容体のスクリーニングにはそれらを使用することができない点にある。結合アッセイとは対照的に、機能アッセイは、その機能出力を検出できると仮定すれば、オーファン受容体のスクリーニングに適している。また、機能アッセイではリガンドの固有活性を決定することもできる（2）。したがって、GPCRファミリーに対して広い適用可能性を持つ高スループット機能アッセイを開発することには、強い動機が存在する。
【０００４】
GPCRが惹起する応答は不均一であるため、広い適用可能性を持つ機能アッセイの開発には多くの問題がある。GPCRに関する大半の機能アッセイでは、第二メッセンジャーレベルを直接的に、またはレポーターコンストラクトを使って測定する。GPCR機能を評価するためによく測定される第二メッセンジャーの例として、イノシトールリン酸、カルシウム、およびサイクリックAMPが挙げられる（3〜8）。通例、これらの第二メッセンジャーを測定するためのアッセイプロトコールは、応答を定量するために、高価な試薬類、放射標識化合物、および／または数多くの面倒なステップを必要とする。もう一つの欠点は、測定されるこれらの応答が不均一であるため、大半の機能アッセイは、その範囲がGPCRのわずかなサブセットに限定されると共に、オーファン受容体について信頼できるスクリーニングを行なうには、シグナル伝達特性を事前に知っておく必要があるということである。
【０００５】
GPCRは、PTX非感受性Gタンパク質を介してサイクリックAMP産生を刺激する受容体（Gs共役型）、PTX感受性Gタンパク質を介してサイクリックAMP産生を阻害する受容体（Gi共役型）、およびPTX非感受性Gタンパク質を介してホスファチジルイノシトール産生を刺激する受容体（Gq共役型）に、大別することができる。例えば、カルシウムフラックスを測定するアッセイは、GqファミリーGタンパク質と共役する受容体ではよく機能するが、GiファミリーGタンパク質と共役する受容体ではあまり機能せず、GsファミリーGタンパク質と共役する受容体では全く機能しない。同様に、サイクリックAMP測定はGs共役受容体およびGi共役受容体では機能するが、Gq共役受容体では機能しない。
【０００６】
Gs共役受容体に関する機能アッセイでは、cAMP産生量を直接定量するか（6）、サイクリックAMP応答（CRE）配列プロモーターによるレポーター遺伝子の転写調節を定量するか（7）、カエル黒色素胞における色素変化を定量する（8）。カルシウムフラックスの測定とは異なり、サイクリックAMPアッセイはHTSを効果的に行なうのに必要なスループットを欠くので、Gs共役受容体に適合する高スループット機能アッセイが必要とされている。
【０００７】
GPCRの不均一な機能応答を均一な出力に変換するために、研究者らは、Gi共役受容体をGq調節性応答に結びつけるキメラGアルファサブユニット（9〜12）、およびGPCRをカルシウムフラックスに結びつける（受容体共役に関して）プロミスキュアス（promiscuous）なGアルファサブユニット（13，14）を使用してきた。しかし、GsおよびG12／13 Gタンパク質がGiに対してGqよりも遠い関係にあることが、おそらくその理由であると思われるが（15，16）、これらのGアルファサブユニットクラス間のキメラGタンパク質は、Gq／Giキメラほどにはうまく機能しない（10）。また、Gi連結型受容体でさえ様々なGq／Giファミリーキメラコンストラクトに対して異なる選択性を示すので（11，12，17）、この戦略の信頼性は受容体間で有意に変動しうる。同様に、いわゆる全適合性（universally compatible）Gα15およびGα16サブユニットも、一般有効化戦略として役立つほど十分な普遍性で全てのGPCRと共役するわけではない（18，19）。したがって、GPCR用の高スループット機能アッセイであって、より一層普遍的に適合し、特にGs連結型受容体に適するものは、今なお必要とされている。
【０００８】
GPCRシグナリングを一般的な測定可能出力に結びつけるもう一つの戦略は、ヘテロ三量体Gタンパク質より下流に位置する遺伝子を利用することである。GPCRはヘテロ三量体Gタンパク質を活性化するだけでなくras関連GTPアーゼも活性化し、そしてそれが、成長、分化、形態、および遺伝子発現に対する多様な一連の細胞作用を媒介する（20）。シグナル伝達カスケードにおいて、ras関連GTPアーゼは、ヘテロ三量体Gタンパク質に対して下流に位置する。GPCRの活性化をras関連GTPアーゼの活性化に結びつける最終ステップは、既知の例ではどの場合でも、グアニンヌクレオチド交換因子（GEF）の活性化である。GEF類は、GTPアーゼの活性化につながるGTPとGDPとの交換を触媒し、ras関連GTPアーゼの異なるサブファミリーに対して基質特異性を示す（21，22）。
【０００９】
Gq、Gs、およびGi連結型GPCRはras関連GTPアーゼrapを活性化することが知られている（23〜27）（ただし異なるシグナル伝達系路による）。さらに、第二メッセンジャーであるカルシウム、ジアシルグリセロール、およびサイクリックAMPは、rap GTPアーゼに選択的なGEF類を直接活性化することも知られている（27〜29）。そこで、GPCRを一般的な測定可能出力に結びつけるために、rap GTPアーゼを使用した。
【発明の開示】
【００１０】
本発明の一態様は、ヘルパー遺伝子の同時発現を使って遺伝子機能のアッセイを可能にするまたは改善する方法である。ある実施形態では、本発明は、遺伝子産物に結合してそれらの機能を正または負に調整する化学化合物を同定する目的で行なわれる。もう一つの実施形態では、本方法は、未知の機能または未知の機能遂行能力を持つ遺伝子の機能を検出／確証する目的で行なわれる。さらにもう一つの実施形態では、本方法は、未知の機能または未知の機能遂行能力を持つ遺伝子のシグナル伝達特性を同定することによって、それらの遺伝子に関する創薬スクリーニングアッセイを最適化する目的で行なわれる。
【００１１】
一部の実施形態では、アッセイ対象遺伝子が受容体である。一部の実施形態では、アッセイ対象遺伝子がGタンパク質共役受容体である。一部の実施形態では、遺伝子機能のアッセイが遺伝子発現の変化を測定する。一部の実施形態では、遺伝子機能のアッセイが第二メッセンジャーレベルの変化を測定する。一部の実施形態では、遺伝子機能のアッセイが細胞の成長、形態、分化、または生存の変化を測定する。
【００１２】
一部の実施形態では、当該受容体が通常は生成しない、受容体活性化に対する応答を、ヘルパー遺伝子が可能にする。一部の実施形態では、当該受容体が通常生成する応答を、ヘルパー遺伝子が増幅する。一部の実施形態では、当該受容体が通常は生成しない応答であるが、他のヘルパー遺伝子が可能にする応答を、ヘルパー遺伝子が増幅する。一部の実施形態では、一次機能応答の検出を妨害する受容体応答を、ヘルパー遺伝子が遮断する。一部の実施形態では、一次機能応答を保存または強化しつつ妨害シグナル入力または妨害シグナル出力を遮断する突然変異をヘルパー遺伝子が含有する。一部の実施形態では、ヘルパー遺伝子が、シグナル伝達系路をリダイレクトする2以上の遺伝子間のキメラであって、調節入力またはシグナル入力を受け取るドメインをエフェクター出力またはシグナル出力を与えるドメインに連結している。一部の実施形態では、キメラヘルパーが、異なるGタンパク質に由来するドメインから構成される。一部の実施形態では、キメラヘルパーが、rasスーパーファミリーの異なるGタンパク質に由来するドメインから構成される。一部の実施形態では、キメラヘルパーがrapサブファミリーおよびrasサブファミリーの異なるGタンパク質に由来するドメインから構成される。一部の実施形態では、ヘルパー遺伝子が、機能アッセイに用いられる宿主細胞内で通常は発現されない天然遺伝子である。一部の実施形態では、ヘルパー遺伝子が、機能アッセイに用いられる宿主細胞内で通常発現される、過剰発現された天然遺伝子である。一部の実施形態では、ヘルパー遺伝子が、機能アッセイに用いられる宿主細胞内で通常は発現されない天然遺伝子の切断型である。一部の実施形態では、ヘルパー遺伝子が、機能アッセイに用いられる宿主細胞内で通常発現される天然遺伝子の切断型である。一部の実施形態では、ヘルパー遺伝子が、キメラを含むキメラが由来するどちらかの遺伝子内に天然には存在しない突然変異をさらに含むキメラである。一部の実施形態では、ヘルパー遺伝子が、機能アッセイに用いられる宿主細胞内で通常は発現されない天然遺伝子であって、それらの遺伝子内に天然には存在しない突然変異をさらに含有する遺伝子である。一部の実施形態では、ヘルパー遺伝子が、機能アッセイに用いられる宿主細胞内で通常発現される天然遺伝子であって、それらの遺伝子内に天然には存在しない突然変異をさらに含有する遺伝子である。一部の実施形態では、ヘルパー遺伝子が、同時発現させた場合に受容体に対する機能応答の検出を可能にするまたは改善する、2以上の遺伝子、キメラ、突然変異遺伝子、または切断型遺伝子の混合物である。一部の実施形態では、ヘルパー遺伝子が、機能アッセイの対象である受容体がより良くシグナルすることを助ける他の天然受容体である。一部の実施形態では、ヘルパー遺伝子が、機能アッセイの対象である受容体の発現および形成を助ける他の天然受容体である。一部の実施形態では、ヘルパー遺伝子が、機能アッセイの対象である受容体がリガンドに対してより高感度に応答することを助ける他の天然受容体である。一部の実施形態では、ヘルパー遺伝子が、機能アッセイの対象である受容体がより良くシグナルすることを助ける他の非天然受容���もしくは突然変異受容体または受容体の断片である。一部の実施形態では、ヘルパー遺伝子が、機能アッセイの対象である受容体の発現および形成を助ける他の非天然受容体もしくは突然変異受容体または受容体の断片である。一部の実施形態では、ヘルパー遺伝子が、機能アッセイの対象である受容体がリガンドに対してより高感度に応答することを助ける他の非天然受容体もしくは突然変異受容体または受容体の断片である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
Gタンパク質共役受容体（GPCR）スーパーファミリーは、創薬に最もよく利用されている遺伝子ファミリーである。この点と、GPCRファミリーの50％以上が「オーファン受容体」に分類されている点とを考えると、このファミリーに対して広い適用可能性を持つ高スループット機能アッセイを開発する必要がある。GPCRに対する機能応答は不均一であるため、大半のGPCR機能アッセイは、GPCRのわずかなサブセットにしか、うまく機能しない。本発明者らは、rap1Bタンパク質の調節ドメインをras癌遺伝子のエフェクター領域に連結しているキメラを、細胞増殖に関する既存の機能アッセイと併せて使用することにより、Gs共役GPCRおよびGi共役GPCRに対する強い応答を容易に測定することができるということを、ここに報告する。さらに本発明者らは、他の遺伝子の過剰発現によってras／rapキメラの有効化（enabling）特性をさらに増強することができるということも示す。この有効化遺伝子および増幅遺伝子のカクテルを「ヘルパー遺伝子」と総称する。また、「ヘルパー遺伝子」の存在は、これらの同じアッセイフォーマットにおいて、Gq共役GPCRおよびG12／13共役GPCRに対する機能応答を有意に変化させない。したがって、このヘルパー遺伝子有効化戦略を既存の機能アッセイと併せて使用することにより、万能に近いGPCR機能アッセイが得られる。創薬ならびにオーファン受容体の機能特性の有効化および予測に関して、本発明の有用性を実証する。
【００１４】
以下に開示する発明は、特定のGタンパク質共役受容体に対する活性について候補化合物をスクリーニングするための機能アッセイに関する。好ましい実施形態では、関心対象である特定のGタンパク質共役受容体（GPCR）を発現させる標的細胞が調製される。GPCRは、rap／rasキメラコンストラクトまたは他の「ヘルパー遺伝子」を使って測定可能出力に機能的に結びつけられる。
【００１５】
便利な測定可能出力の一つは細胞増殖である。このアプローチの有用性を実証するために、本発明者らは、この有効化技術を検出するための便利な手段として、高スループット細胞系機能アッセイ（R-SAT（商標）、Receptor Selection and Amplification Technology）を利用した。R-SAT（商標）は、簡単なアッセイであるため、高スループット用途に適している（30）。R-SATにおいて細胞増殖を誘導する遺伝子の能力は、フォーカス形成アッセイにおいてNIH-3T3細胞を形質転換させるそれらの能力と、強い相関関係にある。したがって、GαqおよびGα12／13と共役するGPCR、ならびにrasなどの多くの癌原遺伝子がR-SAT（商標）において強い応答を誘発するのに対して、NIH-3T3細胞を形質転換しないヘテロ三量体Gタンパク質のGαiおよびGαsファミリーと共役するGPCRは、R-SAT（商標）でも応答を誘発しない（10，31，32，Bursteinの未公表の観察結果）。rasのエフェクター機能とrapの調節ドメインとを含有するrap GTPアーゼとras GTPアーゼの間のキメラを使用することにより、本発明者らは、Gi共役受容体およびGs共役受容体に由来するシグナルを、GqおよびG12／13連結型GPCRと同様に細胞増殖を刺激するようにリダイレクトできること、ならびにこの方法で決定される薬理学的応答が、第二メッセンジャーアッセイで得られる結果の予測に大いに役立つことを発見した。また本発明者らは、リダイレクトされたこれらのシグナルを、他の「ヘルパー」遺伝子の過剰発現によってさらに増幅できることも実証する。さらに本発明者らは、Gq経路またはG12／13経路と共役したGPCRに対する機能応答が、ras／rapまたはヘルパー遺伝子の同時発現によって有意に変化せず、したがってほとんどのGPCRを単一のアッセイフォーマットでアッセイできることを示す。最後に、オーファンGPCRの機能的特徴づけに関するras／rapの有用性を示す。
【００１６】
GPCRを一般的な測定可能出力に結びつけるために、本発明者らはrap GTPアーゼを利用しようとした。なぜなら、Gq、GsおよびGi連結型GPCRはいずれもrapを活性化することが知られているからである（23〜29）。便利な測定可能出力の一つは細胞増殖である。rasのエフェクター機能とrapの調節ドメインとを含有するrap GTPアーゼとras GTPアーゼの間のキメラを使用することにより、本発明者らは、Gi共役受容体およびGs共役受容体に由来するシグナルを、GqおよびG12／13連結型GPCRと同様に細胞増殖を刺激するようにリダイレクトできること、ならびにこの方法で決定される薬理学的応答が、第二メッセンジャーアッセイで得られる結果の予測に大いに役立つことを発見した。さらに、Gq経路またはG12／13経路と共役したGPCRに対する機能応答は、上述したヘルパー遺伝子の同時発現によって有意に変化しない。ヘルパー遺伝子を使って構成したアッセイは、高スループット機能アッセイを可能にする属性を全て保っている。
【００１７】
構成的応答を測定することにより、一群のオーファンGPCRの機能特性およびシグナリング特性を決定し、オーファンGPCRに対する機能応答の有効化および特徴づけに関するヘルパー遺伝子戦略の有用性を実証した。上述のように、大半のGPCRは単一のアッセイフォーマットを使ってアッセイすることができるので、Gαs、Gαi、およびGαq共役受容体の機能解析、ならびにオーファンGPCRの不偏的スクリーニングが可能になる。GPCRシグナリングの均一検出を要約した略図を図9に示す。
【００１８】
我々のアプローチの有用性を実証するために、本発明者らは、「Methods of identifying inverse agonists of the serotonin 2A receptor（セロトニン2A受容体のインバースアゴニストを同定する方法）」と題する米国特許第6,358,698号、「Identification of ligands by selective amplification of cells transfected with receptors（受容体をトランスフェクトされた細胞の選択的増幅によるリガンドの増幅）」と題する米国特許第5,955,281号、および「Identification of ligands by selective amplification of cells transfected with receptors（受容体をトランスフェクトされた細胞の選択的増幅によるリガンドの増幅）」と題する米国特許第5,912,132号（これらの特許はいずれも参照によりその全文が本明細書に組み入れられる）に記載の高スループット細胞系機能アッセイ（R-SAT（商標）、Receptor Selection and Amplification Technology）を利用した。
【００１９】
R-SAT（商標）は、簡単なアッセイであるため、高スループット用途に適している（30）。R-SAT（商標）は、癌遺伝子および多くの受容体がNIH-3T3細胞の増殖または形質転換応答を誘導するという観察結果に基づいている。したがって、NIH-3T3細胞を形質転換する遺伝子の能力と、R-SAT（商標）における応答を誘発する遺伝子の能力とは、強い相関関係にある。GαqまたはG12／13と共役したGPCR（これらはNIH-3T3細胞においてフォーカス形成を誘導する；46，47参照）、ならびに多くの成長因子受容体および非受容体癌原遺伝子、例えばGタンパク質およびMAPキナーゼなどが、R-SAT（商標）において強い応答を誘導するのに対して（10，32）、ヘテロ三量体Gタンパク質のGαiおよびGαsファミリーと共役したGPCRはNIH-3T3細胞を形質転換せず、単独ではR-SAT（商標）における応答も誘導しない。サイクリックAMPはNIH3T3細胞（50）を含む多くの細胞タイプで成長阻害シグナルを媒介することが知られているので（48，49）、サイクリックAMPの産生を促進するGPCRがR-SATにおける応答をほとんどまたは全く誘導しないことは、驚くに当たらない。これらの制約は、上に概説した戦略を使って克服された。したがってこの研究は、R-SAT（商標）技術が、細胞増殖を刺激する遺伝子に限定されないことを実証している。
【００２０】
GPCRに対する強い薬理学的応答の均一検出を可能にするために、ヘテロ三量体Gタンパク質の下流で作動する遺伝子が利用されている。R-SAT（商標）および他の機能アッセイにおけるシグナリング出力は、キメラヘテロ三量体Gアルファサブユニット（9〜12）の使用により、またはプロミスキュアスなGアルファサブユニット（Gα15およびGα16）（14）の使用により、共通する最終経路にリダイレクトすることができるが、これらのアプローチにはいくつかの欠点がある。Gタンパク質化学量論が変化し、それゆえに受容体の薬理作用が変化する、人工的コンストラクトとの受容体の共役が測定される、そしてキメラGアルファサブニットとプロミスキュアスなG-アルファサブユニットはどちらも、一般有効化戦略として役立つほど十分な普遍性で全てのGPCRと共役するわけではない（11，12，17〜19）。Gアルファサブユニットの下流で作動する遺伝子を使って、GPCRからのシグナリング出力を、一般的な測定可能出力に結びつけることにより、内在性ヘテロ三量体GアルファサブユニットとのGPCR共役が測定され、アッセイの信頼性および一般性ならびに検出される薬理作用の忠実性が有意に改善される。実際、ファミリーA、ファミリーB、およびファミリーC受容体を含む多種多様なGPCR、ならびにモノアミン作動性リガンド、脂質リガンド、およびペプチドリガンドを結合する受容体の機能的共役が示され、第二メッセンジャーアッセイと比較すると、効力の強い相関関係が観察される。
【００２１】
ヘテロ三量体Gタンパク質の下流にあってGPCRを細胞内シグナル伝達に結びつける多くの遺伝子ファミリーのうち、本発明者らは低分子量ras関連GTPアーゼおよびアデニリルシクラーゼ遺伝子ファミリーを利用した。ras関連GTPアーゼは、細胞成長および代謝に対するGPCRの作用を媒介する上で重要な役割を果たし、ヘテロ三量体Gタンパク質の活性化を遺伝子発現の変化に結びつけることが知られている。rapタンパク質は、GPCRを含む多種多様な細胞表面受容体に応答し、したがって多種多様な入力を均一な出力に統合することが潜在的にできると考えられるので、特に関心を持った。低分子量GTPアーゼのスーパーファミリー内では、ras GTPアーゼが増殖シグナルを伝達するのに対して、近縁関係にあるrap GTPアーゼはras機能を拮抗すると考えられている（51，52）。NIH3T3細胞においてrapは抗癌遺伝子として機能して、強力な癌遺伝子rasの作用を拮抗すると考えられている。したがってこれは、Gs連結型受容体およびGi連結型受容体が、細胞形質転換アッセイでほとんどまたは全く応答を媒介しない理由の考えうる説明になる。本発明者らは、rasのエフェクタードメイン（アミノ末端）をrapの調節ドメイン（カルボキシル末端）に連結することにより、Gi共役受容体およびGs共役受容体によって媒介されるシグナルを増殖出力に変換することができるかもしれないと考えた。本発明者らは、Gi共役受容体およびGs共役受容体がNIH3T3細胞を形質転換できるようにするには、rapが媒介するシグナルをras出力に変換すれば十分であることを実証し、そうすることによってこの仮説を確証した。原則として、ras／rap系キメラは、他の遺伝子ファミリーの有効化にも役立つだろう。rapは、チロシンキナーゼ連結受容体（53，54）、サイトカイン受容体（55）、抗原受容体（56，57）およびインテグリン（58）を含む様々な他のタイプの細胞表面受容体に応答することが知られているので、上に概説した戦略は、これらの遺伝子ファミリーでもうまく機能すると期待できるだろう。実際、本発明者らは、ras／rapAAが核受容体に対する応答も増強することを観察している（未公表の観察結果）。また、本発明者らはras／rap系キメラの有用性を実証するためにR-SATを使用したが、このようなキメラは、GPCRや、rapを活性化する他の遺伝子ファミリーを、ras活性化シグナル伝達カスケードに応答するレポーターコンストラクトの活性化に結びつけるためにも使用することができるだろう。
【００２２】
不均一な入力を均一な出力にリダイレクトすることの他に、本発明者らは、機能アッセイの信号対雑音比を向上させるために、シグナル出力を増大することにも関心があった。アデニリルシクラーゼ遺伝子ファミリーに関心を持った。なぜなら、GPCRが媒介するシグナルの増幅において律速となるのは、ヘテロ三量体Gタンパク質ではなくこれらのタンパク質であると考えられるからである（59）。II型アデニリルシクラーゼには特に関心を持った。なぜなら、これはGq-、Gi-およびGs-由来シグナルに応答することができ（39）、本発明者らはACIIが他のシクラーゼサブタイプと比較して極めて強い固有活性を持つことを観察しているからである（Burstein，未公表の観察結果）。実際、ras／rapキメラとは異なり、ACII自体がGPCRに対する有意な応答を可能にすることはないが、ACIIの過剰発現によってras／rap依存的応答が増強されることを、本発明者らは観察した。したがって、機能応答の有効化におけるアデニリルシクラーゼの役割は、むしろ増幅因子としての役割であって、シグナルをリダイレクトし有効化因子（enabler）として機能するras／rapキメラの役割とは、質的に異なる。アデニリルシクラーゼだけでなく、本発明者らは、他の遺伝子が同様の増幅機能を果たしうることを見いだした。例えば、Gq共役受容体は、細胞増殖を刺激するために、ras関連GTPアーゼracを必要とする（32）。本発明者らは、racの過剰発現もR-SATにおいてGs-およびGi-連結型GPCRに対するras／rap依存的応答を増強し、ras／rapAAおよび他の遺伝子と一緒に、強い機能応答を可能にするためのヘルパー遺伝子カクテルの一部として使用できることを見いだした（図5参照）。
【００２３】
結論として、本発明者らは、単量体GTPアーゼrasおよびrapに基づくキメラを単独で、または他の遺伝子と組合せて使用することにより、多種多様なGPCRに対する強い薬理学的応答を均一な単一の構成で測定することが可能になるということを実証した。R-SAT機能プラットフォームの場合、上述のフォーマットは、GPCRスーパーファミリー用の高スループット用途によく適しており、オーファンGPCRの研究には理想的に適している。本明細書に記載する原理に基づいて、今までの理解よりはるかに広範囲にわたる一連の遺伝子ファミリーに向けたR-SATを設計することが可能なはずである。好ましい実施形態ではR-SAT技術を利用するが、本願発明の実施には、R-SAT以外の他のアッセイフォーマットも使用することができる。
【００２４】
実験方法
細胞培養．NIH3T3細胞を、4500mg／lグルコース、4nM L-グルタミン、50U／mlペニシリンG、50U／mlストレプトマイシン（A.B.I.）および10％仔ウシ血清（Sigma）を添加したダルベッコ変法イーグル培地で、湿潤雰囲気（5％CO2）中、37℃でインキュベートした。百日咳毒素はCalbiochemから入手した。
【００２５】
コンストラクト．以下の実施例で使用した受容体は全て、ポリメラーゼ連鎖反応により、pfu Turboおよび以下のプライマー対を使ってクローニングした。rap1Bのアミノ酸61〜184をコードするPst1-KpnI PCR断片を、rasのアミノ酸1〜60をコードするXhoI-PstI PCR断片（33）と共に、KpnI-XhoI消化pBluescriptにライゲートした。次に、その結果得られたras-rap1B断片をKpnI-NotIで切り出し、pCI（Promega）にサブクローニングし、MluI-NotIでpCIから切り出し、pSI（Promega）にサブクローニングした。Quickchange突然変異誘発キット（Stratagene）を使ってアミノ酸Ser179およびSer180をアラニンに突然変異させることにより、これらの研究に用いるコンストラクトを作製した。クローンは全て配列を検証した。アデニリルシクラーゼII型については既に記述されている（34，P.Ram博士のご厚意により寄贈）。
【００２６】
機能アッセイ．Receptor Selection and Amplification Technology（R-SAT（商標））アッセイを以下のように行なった。トランスフェクションの前日に、15cmプレート1枚につき培地20ml中の細胞2×106個、6穴プレート1枚につき培地2ml中の細胞2×105個、または96穴プレートの1ウェルにつき培地0.1ml中の細胞7.5×103個を使って、細胞をプレーティングした。Superfect（Qiagen）を製造者の使用説明書に従って使用し、96穴プレートの1ウェルにつき1〜20ng／ウェルの受容体DNA、20ng／ウェルのras／rapキメラ、2ng／ウェルのアデニリルシクラーゼII型、および30ng／ウェルのpSI-β-ガラクトシダーゼ（Promega，ウィスコンシン州マディソン）を使って（大きい培養皿についてはそれぞれを比例的に増減する）、細胞を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの1日後に培地を交換し、子ウシ血清の代わりに2％cyto-SF3合成サプリメント（Kemp Laboratories）を添加したDMEM中で、細胞をリガンドと混合して、最終体積を200μl／ウェルとした。15cmプレートについては、細胞をトリプシン処理して、96穴プレートのウェルに分注するか（100μl／ウェル）、将来使用するために小分けして凍結し、その後、上述のようにリガンドと混合する。15cm2プレート1枚で2枚の96穴または384穴プレートに十分な細胞が得られる。5日間培養した後、基本的に記述されているとおりに、β-ガラクトシダーゼレベルを測定した（35）。培地をウェルから吸引し、細胞をリン酸緩衝食塩水（PBS）pH＝7.4ですすいだ。3.5mM o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシドおよび0.5％ノニデットP-40（どちらもSigma，ミズーリ州セントルイス）を含む200μlのPBSを各ウェルに加え、その96穴プレートを室温でインキュベートした。3時間後に、プレートを、プレートリーダー（Bio-Tek EL 310またはMolecular Devices）により、420nmで読み取った。R-SATアッセイで得た用量応答データを次式に当てはめた：
R＝D＋（A-D）／（1＋（x／c））
式中、A＝最小応答、D＝最大応答、c＝EC50（R＝応答、x＝リガンド濃度）。サイクリックAMPアッセイは、Biotrakアッセイキット（Amersham）を使用し、製造者の使用説明書に従って行なった。
【００２７】
PIターンオーバーアッセイ：ホスファチジルイノシトール加水分解アッセイはtsA細胞（形質転換HEK293細胞株）で行なった。簡単に述べると、トランスフェクションの前日に、96穴プレートの1ウェルにつき培地0.1ml中の細胞1.2×105個を使って、tsA細胞をプレーティングした。96穴プレートの1ウェルにつき30ngの受容体を使って、細胞を上述のように一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、2μCi／mlのミオ-［2-3H］イノシトール（21Ci／mmol，Perkin-Elmer Life Sciences，マサチューセッツ州ボストン）を含有する培養培地（0.1ml／ウェル）中で、細胞を18時間標識した。培地を除去し、1mM CaCl2、1mM MgCl2、20mM LiClおよび0.1％BSAを含有するハンクス平衡塩類溶液に置き換えた。次に細胞をリガンドと共に37℃で45分間インキュベートした。150μl／ウェルの氷冷20mMギ酸を使って反応を停止した。総［3H］イノシトールリン酸の分離は、AG1-X8樹脂（200〜400メッシュ、ギ酸イオン型，Bio-Rad，カリフォルニア州ハーキュリーズ）の50％懸濁液200μlを充填した1mlミニカラムでのイオン交換クロマトグラフィーによって行なった。総［3H］-イノシトールリン酸をLS6500多目的シンチレーション計数器（Beckman Coulter，カリフォルニア州フラートン）で計数した。
【００２８】
細胞内サイクリックAMPアッセイ：トランスフェクションの前日に、96穴プレートの1ウェルにつき培地0.1ml中の1×105個を使って、HEK293をプレーティングした。96穴プレートの1ウェルにつき20ngの受容体を使って、細胞を上述のように一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの18〜20時間後に、培地を除去し、200μl／ウェルの2.0％cyto-sf3／0.5％胎仔血清／1％PSG／DMEMと共に細胞を終夜インキュベートした。トランスフェクションの約40〜44時間後に、培地を0.45mM IBMXを含有する無血清DMEM／0.1％BSA（0.1ml／ウェル）に30分間置き換えた後、リガンドをさらに15分間加えた。緩衝液を200μl／ウェルの希釈溶解試薬B（Amersham）と交換してプレートを10分間振とうすることによって、反応を停止した。アッセイプレートを-80℃で保存するか、cAMP酵素イムノアッセイ（EIA）アッセイキット（Amersham Pharmacia Biotech UK，イングランド・バッキンガムシャー）を使って、製造者の使用説明書に従って直ちに加工した。
【実施例１】
【００２９】
この実施例では、それぞれrap配列に融合したras配列から構成されるレポーターキメラおよび突然変異キメラの構築および作用を説明し、確証する。
【００３０】
rap GTPアーゼはGq、GsおよびGi連結型GPCRからのシグナリング入力を統合し（23〜29）、ras GTPアーゼはほとんどの細胞タイプで細胞成長を刺激するので、原理上、rap入力に応答するがras出力を媒介するras／rapキメラは、Gq、GsおよびGi由来のシグナルを細胞増殖に結びつけるだろう。この案を図1に示す。rasとrapの間の一定のキメラがNIH3T3細胞を形質転換する能力を保っていることは以前に示されたが（33）、その研究では、GTPアーゼ欠損（脱調節）突然変異体しか使用されなかったので、エフェクター機能が明確にされただけで、これらのキメラの調節機能はいずれも明確にされなかった。これらの初期の知見と合致して、本発明者らは、rasのGTPアーゼ欠陥突然変異体型（ウイルスras由来，v-と表示する）の発現、またはrasとrap1Aとのキメラの発現が細胞増殖を強く刺激するのに対して、野生型はそうでないことを見いだした（図2A）。非GTPアーゼ欠陥ras／rapキメラが細胞増殖を刺激できるかどうかを決定するために、本発明者らは、c-rasのアミノ酸1〜60を、rap1Bの、またはPKAによるリン酸化のコンセンサス部位（Ser179およびSer180，36参照）をアラニンに突然変異させた突然変異型のrap1B（図1参照）の、アミノ酸61〜184と共に含有する一連のキメラを構築し、これらのキメラを、rapを活性化することが知られている交換因子と同時発現させた。rap選択的交換因子であるEPACおよびC3Gはどちらも、ras／rapキメラと同時発現させると、R-SATにおいて強い応答を誘導した（図2B，2C）。単独で発現させたras／rapキメラに対して有意な応答は観察されず、単独で発現させたいずれかの交換因子に対しては、わずかな応答しか観察されなかった。また、第二メッセンジャーであるサイクリックAMPによって活性化されるEPACは（28，29）、8-Br cAMPによってさらに刺激されて、ras／rap依存的応答を誘導した（図2D参照）。これは、調節制御がras／rap活性化から少なくとも2段階上流で保存されていることを示している。したがってこれらのras／rapキメラは調節された方法で細胞増殖を刺激する。
【００３１】
これらの相互作用の特異性を評価するために、ras選択的交換因子SOS2（37）および上記rap選択的交換因子の成長促進作用を、ras／rapAAまたはrasを使って試験した。図2Eに示すように、EPACおよびC3Gは、ras／rapAAと同時発現させた場合にのみ、有意な応答を誘導したのに対して、SOS2はrasと同時発現させた場合にのみ、有意な応答を誘導した。したがって、GEF特異性の配列決定因子は、スイッチII領域から始まるrasおよびrapのC末端部分内に含まれる。これらの結果は、rasおよびrapのグアニンヌクレオチド交換因子認識にとってスイッチII領域が最も重要であることを示す最近の研究と合致している（38）。これらの結果は全体として、ras／rapキメラがrapシグナル伝達系路から特異的シグナリング入力を受取り、rasと同様の効力で細胞を形質転換するシグナリング出力を伝達できることを示している。
【実施例２】
【００３２】
この実施例では、ヘルパー遺伝子を使ってシグナリング経路を非増殖シグナルから増殖シグナルへとリダイレクトすることの有用性を実証する。
【００３３】
多くのGPCRがrapを活性化できることから、本発明者らは、非形質転換GPCRがras／rapキメラによる細胞増殖を刺激できるかどうかを調べた。図3Aおよび3Bに示すように、サイクリックAMPの産生を刺激するGs共役D1ドーパミン作動性受容体、および百日咳毒素感受性Gタンパク質を選択的に共役するGi共役5HT1Eセロトニン作動性受容体は、R-SATにおいて単独では応答を生じることができなかった。しかし、同じ受容体をras／rap1Bまたはras／rapAAと同時発現させると、強いアゴニスト依存的応答がR-SATで観察された。一貫して、本発明者らは、ras／rapAAコンストラクトに対する応答の方が高いことを観察した。これは、PKAによるリン酸化が不必要であることを示している。リガンド結合研究では、ras／rapの発現が、D1（2.6pmol／mg単独対ras／rapの存在下で2.4pmol／mg）の発現にも、5HT1E（1.4pmol／ml単独対ras／rapの存在下で1.3pmol／mg）の発現にも有意な影響を及ぼさないことが示された。したがって、D1および5HT1Eが媒介する増殖応答はおそらくはras／rapの活性化によるものであり、受容体のアップレギュレーションによるものではなかった。
【実施例３】
【００３４】
この実施例では、有効化された受容体の一部がGiを利用することを実証する。
【００３５】
D1および5HT1Eに対する応答を媒介する際のGiファミリーGタンパク質の役割を評価するために、細胞増殖を百日咳毒素の存在下で調べた。図4Aに示すように、百日咳毒素は5HT1Eに対するras／rap依存的応答を完全に遮断したことから、これらの応答はGiファミリーGタンパク質によって伝達されることが確認された。これに対し、D1に対するras／rap依存的応答は百日咳毒素では遮断されず、わずかに増加したことから、D1は百日咳非感受性Gタンパク質によって刺激応答を媒介することが確認された。他のGi連結型受容体でも同様の結果が得られた（図4B）。
【実施例４】
【００３６】
この実施例では、特定ヘルパーコンストラクトの使用およびヘルパー遺伝子の混合物の使用を実証する。
【００３７】
次に、本発明者らは、他のシグナル伝達成分がras／rap依存的活性を増強しうるかどうかを決定したいと考えた。II型アデニリルシクラーゼ（AC2）は、GαSによっても、Gαiが放出するベータ-ガンマサブユニットによっても活性化することができるので（39）、GsおよびGiが調節するras／rap依存的活性を潜在的に増強する可能性がある。図5Aに示すように、D1に対する応答はII型アデニリルシクラーゼの添加によって有意に増加した。同様にACIIは、D2などのGi連結型受容体に対する応答も増強した（図5B）。しかし、ACIIはras／rap依存的応答を増強したものの、ras／rapAAとは異なり、ACIIそれ自体がGi-またはGs-連結型受容体を有意に有効化することはなかった（図5C〜5E）。そこで、これ以降の研究にはras／rapAAとACIIの両方をトランスフェクションに含めたので、以後、これらをまとめて「ヘルパー遺伝子」と呼ぶことにする。
【００３８】
ACIIだけでなく、他の遺伝子のras／rapAAとの同時トランスフェクションも、受容体刺激に対するras／rap依存的応答を増強することを観察した。BarkCTは、ベータ-アドレナリン受容体キナーゼまたはGRK2のカルボキシ末端断片であり、Gベータ-ガンマサブユニットに強く結合するので、ベータ-ガンマ依存的シグナル伝達経路を阻害する（60参照）。本発明者らは、BarkCTが、ベータ-ガンマサブユニットのもう一つの既知スカベンジャーであるトランスデューシンと同様に、ベータ-ガンマによって刺激される細胞増殖を阻害することを確認することができた（図5F）。しかし、BarkCTをras／rapAAと同時発現させると、D1およびMC4に対するアゴニスト依存的応答が増強され（図5Gおよび5H）、BarkCTだけをD1と同時発現させてもそのような増強は起こらなかった。
【００３９】
racは、NIH3T3細胞においてGPCRが媒介する細胞増殖の刺激に必要なras関連GTPアーゼである（32）。図5Hに示すように、BarkCTおよびras／rapAAと共にracを過剰発現させると、MC4に対するアゴニスト依存的応答が有意に増幅されることから、内在的に発現される遺伝子の過剰発現は、この機能アッセイの信号対雑音比を改善することが実証された。この結果は、アッセイ性能を改善するために「ヘルパー遺伝子」の混合物を同時発現させることの有用性も実証している。
【実施例５】
【００４０】
この実施例では、GsおよびGi連結型GPCRに関するアッセイを可能にする本明細書記載の方法の普遍的有用性を実証する。
【００４１】
これらの発見を他のGPCRに一般化するために、サイクリックAMPの産生を強く刺激することが知られている一群の受容体を、R-SATにおける機能応答を生じさせる能力について、ヘルパー遺伝子の存在下または非存在下で試験した。図6Aに示すように、Gαsと共役する一群のGPCR（ベータ2アドレナリン作動性、5HT7セロトニン作動性、CRF1、MC4メラノコルチン、およびIPプロスタノイド）は、ヘルパー遺伝子の非存在下では応答をほとんどまたは全く誘導しなかったが、ヘルパー遺伝子の存在下では強い応答を誘導した。同様に、PTX感受性Gαi Gタンパク質と共役することが知られている受容体群（アルファ2Cアドレナリン作動性、D2ドーパミン作動性、H3ヒスタミン作動性、およびSST5ソマトスタチン、図6B参照）も、同時トランスフェクトされるヘルパー遺伝子の存在下または非存在下に、R-SATで機能応答を生じさせる能力について調べた。Gαs共役受容体の場合と同様に、これらのGαi共役受容体の全てがヘルパー遺伝子の存在下では強い応答を生成したが、ヘルパー遺伝子の非存在下では強い応答を生成しなかった。非トランスフェクト細胞またはヘルパー遺伝子だけをトランスフェクトした細胞では、試験したどのリガンドに対しても、有意な応答はなかった。
【実施例６】
【００４２】
この実施例では、本明細書に記載するGPCR機能のアッセイが、ヘルパーを必要としない受容体に対する応答の測定を妨げないことを実証する。
【００４３】
GsおよびGi連結型受容体だけでなく、GqおよびG12／13連結型受容体も、同じアッセイフォーマットを使ってアッセイできることが望ましいだろう。試験対象であるGPCRの共役選択性がわからない場合、すなわちオーファン受容体の場合は特にそうである。GqおよびG12／13連結型受容体に対する応答は、補助タンパク質の異種発現を必要とせずに測定することができるので、本発明者らは、ras／rapAAおよびACIIの同時発現が、GqおよびG12／13タンパク質と共役することが知られている受容体、例えばm1、m5、アルファ1b、H1、CCKaおよびPAR2などに対する薬理学的応答を有意に変化させるかどうかを調べた。図6Cに示すように、ヘルパー遺伝子の同時発現は、これらの受容体に対する薬理学的応答を有意に変化させなかった。したがって上述のヘルパー遺伝子を使用することにより、ほとんどのGPCRに適合する単一のアッセイフォーマット（オーファンGPCRの機能評価にとりわけ望ましい性質）を、設計することができる。
【実施例７】
【００４４】
この実施例では、結果を他の機能アッセイで得られるデータと比較する。
【００４５】
次に本発明者らは、R-SATを使って決定される観察された薬理学的応答を、第二メッセンジャーアッセイから得られるデータと比較した。図10に示すように、Gαsと共役することが知られている受容体によるサイクリックAMP産生に関するEC50は、R-SATで得られるEC50とよく一致した。サイクリックAMPアッセイと比較してR-SATでは試験した受容体の大半について効力のわずかな増加が観察されたことから、R-SATはサイクリックAMP測定よりもわずかに高感度であることが示された。同様に、評価したGαi共役受容体の場合、シクラーゼ阻害アッセイから得られるEC50とR-SATで得られるEC50の間に良好な相関関係があった。最後に、ホスファチジルイノシトール加水分解アッセイにおいて、Gq共役受容体およびG12／13共役受容体におけるリガンド効力は、ヘルパー遺伝子が存在しても存在しなくても、R-SATとほぼ同じだった。したがって、ヘルパー遺伝子が有効化した応答に関して観察される薬理作用は、一般に用いられる第二メッセンジャーアッセイについて観察される薬理作用の予測に役立つ。
【実施例８】
【００４６】
この実施例では、ヘルパー遺伝子を必要とするまたはヘルパー遺伝子を必要としない多数の受容体について、本願発明の普遍的有用性を実証する。
【００４７】
均一なフォーマットでの機能応答の検出を可能にするためのヘルパー遺伝子の普遍的有用性を評価するために、Gs、Gi、GqおよびG12／13連結型GPCRを包含する数多くの一連のGPCRを、R-SATで、いずれも上述のヘルパー遺伝子アッセイフォーマットを使って試験した。これらの受容体は、小さな分子、脂質、ペプチド、イオンを天然リガンドのために利用し、それらをファミリーA、BおよびC型GPCRと分類する。本発明者は、上述のアッセイフォーマットを使用することにより、試験した受容体の90％が、少なくとも3倍の信号対雑音比を持つ強力な機能応答を媒介できることを観察した（表1参照）。
【表１】
2007536904.tif 000002
【実施例９】
【００４８】
この実施例では、未知の機能を持つ遺伝子の機能を評価するための、本願に開示する方法の使用を実証する。
【００４９】
オーファンGPCRを機能的に評価するには、利用できるリガンドが存在しないことから、構成的応答を測定する必要がある。以前、本発明者らは、Gqのアルファサブユニットを同時発現させることによって、Gq連結型GPCRの構成的活性を誘導できることを示した（40，41）。本明細書に記載するヘルパー遺伝子を使用すれば、Gq連結型オーファンと同様にGs連結型オーファンおよびGi連結型オーファンの構成的応答も検出することができるに違いないと、本発明者らは推論した。GPR3、GPR6、およびGPR12は、Gsと共役する類縁性の高いオーファンGPCRである（42〜44）。Drr5、MrgD、およびMrgX4は、mas様GPCRとして知られる、類縁性の高いもう一つのオーファンファミリーである（45）。今までのところ、mas様GPCRの機能特性についてはほとんどわかっていない。これらのオーファンGPCRの機能的特徴づけに関するヘルパー遺伝子の有用性を評価するために、本発明者らは、トランスフェクトするプラスミドの用量を増やしつつ、単独で、またはras／rapAAおよびACIIもしくはGαqの存在下で、各オーファンを発現させた。
【００５０】
図7Aに示すように、上記3つのmas様オーファンは、ヘルパー遺伝子と同時発現させるかどうかにかかわらず、用量依存的な構成的活性を示したが、Gαqと同時発現させた場合は特に強かったことから、これらは主としてGαqと共役することが示唆された。この観察結果をホスファチジルイノシトール（PI）加水分解アッセイを使って確認した。この場合、各受容体はPIターンオーバーを構成的に刺激した。GPR3、6および12の場合、強い構成的活性はヘルパー遺伝子の存在下でしか観察されなかった。これは、これらの受容体がおそらくはGαiまたはGαs共役型であることを示している（図7B）。サイクリックAMP蓄積の直接測定によって、GPR3およびGPR12はGαsと強く共役することが確認されたのに対して、GPR6は弱く共役するに過ぎなかった。百日咳毒素の存在下では、GPR6に対するヘルパー遺伝子依存的応答が有意に弱まったのに対して、GPR3およびGPR12に対する応答はほとんど影響を受けなかった。これは、GPR6がGαi型Gタンパク質と共役することを示している（図7C）。サイクリックAMPアッセイでGPR3およびGPR12をmas様GPCRと直接比較することにより、R-SATデータに基づくシグナリング特異性の予測が確認された（図7D）。このように、オーファンGPCRの機能的特徴づけは、本明細書に概説する戦略を使って実行できる。
【実施例１０】
【００５１】
この実施例では、特定の受容体に対する活性を持つ候補分子についてのスクリーニングに、本願に開示する方法をどのようにして使用することができるかを示す。
【００５２】
創薬に関するこれらの方法の有用性を実証するために、細胞にベータ2受容体、5HT7受容体、およびセクレチン受容体、ならびにras／rapAA、ACII、BarkCT、rac、およびベータ-ガラクトシダーゼの混合物をトランスフェクトし、これらの受容体でのアゴニスト活性に関して210,000化合物のライブラリーをスクリーニングするために使用した。これらの方法を使って、本発明者らは、ベータ2受容体においてアゴニストである8化合物を同定することに成功した。2つのヒット化合物を含む代表的なプレートを図8に示す。ヒット化合物の一つを他の受容体サブタイプに対してプロファイリングした例も示す。この化合物は強力なベータ1アゴニストでもあったが、ベータ3、D1、D2またはD3受容体サブタイプにおける活性は持っていなかった。いずれの場合も、これらの化合物の活性は、受容体と上述したヘルパー遺伝子の両方を発現させる細胞でのみ明白であり、受容体のみ、ヘルパーのみ、または他の受容体サブタイプおよびヘルパーを発現させる細胞では、活性は見られなかった。これらの結果は、創薬に関するこの「ヘルパー遺伝子」戦略の有用性を実証している。
「参考文献」
【００５３】
以下に言及する参考文献はいずれも参照によりその全文が本明細書に組み入れられる。
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【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】rap入力をras出力に結びつけるras／rapキメラの構成。
【０１１５】
【図２Ａ】ras／rapキメラの調節特性およびシグナリング特性の特徴づけ。A）R-SATで測定したras、rap、およびras／rapの増殖応答。野生型またはGTPアーゼ欠損性（V12）突然変異型のras、rap1A、またはras／rap1A（24）、それぞれ4ng／ウェルを、トランスフェクトし、「方法」で説明するように、増殖応答について解析した。
【図２Ｂ】BおよびC）Rap選択的交換因子はras／rapキメラ依存的に細胞増殖を活性化する。B）EPACとras／rapキメラとの相乗作用。1ウェルあたり2ngのrap選択的交換因子EPACを、1ウェルあたり20ngのrap1B、ras／rap1A、ras／rap1B、ras／rapAA、または対照ベクターと同時発現させ、上述のように増殖応答について解析した。
【図２Ｃ】C）C3Gとras／rapキメラとの相乗作用。1ウェルあたり20ngのrap選択的交換因子C3G（68）を、1ウェルあたり20ngのrap1B、ras／rap1A、ras／rap1B、ras／rapAA、または対照ベクターと同時発現させ、上述のように増殖応答について解析した。
【図２Ｄ】D）表示した用量（1ウェルあたりのng数）のEPACを、250μM 8-Br cAMPの存在下または非存在下で、1ウェルあたり20ngのras／rapAAと同時発現させ、上述のように増殖応答について解析した。
【図２Ｅ】E）rap交換因子はrasよりもras／rapキメラに選択的である。1ウェルあたり10ngの対照ベクター、rasまたはras／rapAAをEPAC（1ウェルあたり2ng）、C3G（1ウェルあたり10ng）、またはSos2（1ウェルあたり10ng）と同時発現させ、増殖応答について解析した。
【０１１６】
【図３】Gs共役GPCRおよびGi共役GPCRはras／rap依存的に細胞増殖を活性化した。A）D1ドーパミン受容体（96ウェルあたり4ng）を1ウェルあたり20ngの対照ベクター、ras／rap1B、またはras／rapAAと同時発現させ、表示した濃度のSKF81297の存在下で、上述のように増殖応答について解析した。B）5HT1Eセロトニン受容体（1ウェルあたり20ng）を1ウェルあたり20ngの対照ベクター、ras／rap1B、またはras／rapAAと同時発現させ、表示した濃度のBRL54443の存在下で、増殖応答について解析した。
【０１１７】
【図４Ａ】Gs共役GPCRおよびGi共役GPCRに対するras／rap依存的増殖応答の百日咳毒素感受性。A）D1（1ウェルあたり4ng）およびras／rapAA（1ウェルあたり20ng）を同時発現させ、表示した濃度のSKF81297の存在下に、100μg／ml百日咳毒素の存在下または非存在下で、増殖応答について解析した。
【図４Ｂ】B）5HT1E（1ウェルあたり20ng）およびras／rapAA（1ウェルあたり20ng）を同時発現させ、表示した濃度のBRL54443の存在下に、100μg／ml百日咳毒素の存在下または非存在下で、増殖応答について解析した。
【図４Ｃ】C）D2（4ng／ウェル）、アルファ2C（20ng／ウェル）、およびSST5（4ng／ウェル）を、ras／rapAA（20ng／ウェル）と共にそれぞれ発現させ、表示した濃度のリガンドと共に、100ng／ml百日咳毒素（PTX）を加えてまたは百日咳毒素を加えずにインキュベートし、上述のように増殖応答について解析した。対照は単独で発現させた受容体を表す。
【０１１８】
【図５Ａ】ras／rapの有効化作用を増幅するために、他の遺伝子を同時トランスフェクトすることができる。A）D1およびD2（それぞれ4ng／ウェル）を、ras／rapAA（20ng／ウェル）と共に、そしてアデニリルシクラーゼII型（2ng／ウェル）と共に、またはアデニリルシクラーゼII型を伴わずに、トランスフェクトし、表示した濃度のリガンドと共にインキュベートし、上述のように増殖応答について解析した。
【図５Ｂ】B）D1およびD2（それぞれ4ng／ウェル）を、ras／rapAA（20ng／ウェル）と共に、そしてアデニリルシクラーゼII型（2ng／ウェル）と共に、またはアデニリルシクラーゼII型を伴わずに、トランスフェクトし、表示した濃度のリガンドと共にインキュベートし、上述のように増殖応答について解析した。
【図５Ｃ】C）D2（4ng／ウェル）およびアルファ2C（20ng／ウェル）をそれぞれ単独で発現させるか、アデニルシクラーゼII型（2ng／ウェル）、ras／rapAA（20ng／ウェル）、またはその両方と共に発現させ、上述のように増殖応答について解析した。
【図５Ｄ】D）D2（4ng／ウェル）およびアルファ2C（20ng／ウェル）をそれぞれ単独で発現させるか、アデニルシクラーゼII型（2ng／ウェル）、ras／rapAA（20ng／ウェル）、またはその両方と共に発現させ、上述のように増殖応答について解析した。
【図５Ｅ】E）MC4（20ng／ウェル）を単独で発現させるか、アデニリルシクラーゼII型（2ng／ウェル）、ras／rapAA（20ng／ウェル）、またはその両方と共に発現させ、上述のように増殖応答について解析した。
【図５Ｆ】F）ベータ1サブユニットおよびガンマ2サブユニット（それぞれ1ウェルあたり2ng）を単独で発現させるか、対照ベクター、BarkCT、またはトランスデューシンのアルファサブユニットと共に発現させた。各トランスフェクションにおけるプールサイズを釣り合わせるために対照ベクターを加えた。
【図５Ｇ】G）D1（4ng／ウェル）を単独で発現させるか、BarkCT（4ng／ウェル）、ras／rapAA（20ng／ウェル）、またはその両方と共に発現させ、上述のように増殖応答について解析した。
【図５Ｈ】H）MC4（20ng／ウェル）を単独で発現させるか、ras／rapAA（20ng／ウェル）と共に発現させるか、BarkCT（4ng／ウェル）およびras／rapAA（20ng／ウェル）と共に発現させるか、BarkCT（4ng／ウェル）、ras／rapAA（20ng／ウェル）、およびrac（4ng／ウェル）と共に発現させ、上述のように増殖応答について解析した。
【０１１９】
【図６Ａ】GPCRはヘルパー遺伝子の存在下で増殖応答を刺激する。A）表示したGs共役受容体およびベータ-ガラクトシダーゼを、ras／rap（20ng／ウェル）およびAC2（2ng／ウェル）と共に、またはそれらを伴わずに、NIH3T3細胞に一過性にトランスフェクトし、上記「材料および方法」で述べるように、表示した濃度のリガンドの存在下で増殖応答についてアッセイした。
【図６Ｂ】B）表示したGi共役受容体およびベータ-ガラクトシダーゼを、ras／rap（20ng／ウェル）およびAC2（2ng／ウェル）と共に、またはそれらを伴わずに、NIH3T3細胞に一過性にトランスフェクトし、上記「材料および方法」で述べるように、表示した濃度のリガンドの存在下で増殖応答についてアッセイした。
【図６Ｃ】C）表示したGq-またはG12／13-共役受容体およびベータガラクトシダーゼを、ras／rap（20ng／ウェル）およびAC2（2ng／ウェル）と共に、またはそれらを伴わずに、NIH3T3細胞に一過性にトランスフェクトし、上記「方法」で述べるように、表示した濃度のリガンドの存在下で増殖応答についてアッセイした。
【０１２０】
【図７Ａ】ヘルパー遺伝子を使ったオーファンGPCRの機能の確証および特徴づけ。A）表示した受容体を、2つの用量で、単独で発現させるか、ras／rapAA（20ng／ウェル）およびACII（2ng／ウェル）、またはGαq（4ng／ウェル）と共に発現させ、上述のように細胞増殖の構成的刺激について解析した。対照は、受容体がベクターで置換されている同じヘルパー遺伝子のトランスフェクションを表す。トランスフェクションされるDNAの総量がいずれの場合も同じになるように、トランスフェクションは全て、ベクターを使って釣り合わせた。「方法」で述べるように、20ng／ウェルの各受容体をトランスフェクトしたtsa細胞を使って、PI加水分解アッセイを行なった。
【図７Ｂ】B）表示した受容体を、2つの用量で、単独で発現させるか、ras／rapAA（20ng／ウェル）およびACII（2ng／ウェル）、またはGαq（4ng／ウェル）と共に発現させ、上述のように細胞増殖の構成的刺激について解析した。対照は、受容体がベクターで置換されている同じヘルパー遺伝子のトランスフェクションを表す。トランスフェクションされるDNAの総量がいずれの場合も同じになるように、トランスフェクションは全て、ベクターを使って釣り合わせた。「方法」で述べるように、20ng／ウェルの各受容体をトランスフェクトしたHEK293細胞を使って、サイクリックAMP蓄積アッセイを行なった。
【図７Ｃ】C）表示した受容体をras／rapAA（20ng／ウェル）およびACII（2ng／ウェル）と共に発現させ、百日咳毒素（PTX，100ng／ml）の存在下または非存在下でインキュベートし、上述のように細胞増殖の構成的刺激について解析した。対照は、受容体がベクターで置換されている同じヘルパー遺伝子のトランスフェクションを表す。
【図７Ｄ】D）表示した受容体を、「実験方法」で述べるように、サイクリックAMP産生の刺激について試験した。
【０１２１】
【図８】HTSスクリーニングの結果。ベータ2受容体、5HT7受容体、およびセクレチン受容体、ならびにras／rapAA、ACII、BarkCT、rac、およびベータ-ガラクトシダーゼの混合物を、NIH3T3細胞に、一過性にトランスフェクトし、それを使って、210,000化合物のライブラリーを、これらの受容体におけるアゴニスト活性についてスクリーニングした。ヒット化合物および陽性対照を示す。ヒット化合物は個々の受容体に対して再検査した。図示するように、さらなる薬理学的特徴づけのために、選択性を示すヒット化合物を選択した。
【０１２２】
【図９】ras／rapキメラを用いるGPCRシグナリング経路の概略図。
【０１２３】
【図１０】細胞増殖アッセイ（R-SAT（商標）、参照によりその全文が本明細書に組み入れられる米国特許第5,707,798号参照）と、サイクリックAMP産生およびホスファチジルイノシトール（PI）加水分解に関する第二メッセンジャーアッセイとの比較。表示した受容体を、細胞増殖アッセイまたは表示した第二メッセンジャーアッセイにおける機能応答について試験した。各アッセイで得られるpEC50値およびこれらの値の比を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年3月1日(2006.3.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある物質があるGタンパク質共役タンパク質（GPCR）のリガンドであるかどうかを決定する方法であって、
（a）リガンドに応答してGPCRカスケードによって細胞増殖を増加または減少させるGPCRをコードする第1核酸、細胞増殖の程度を示すマーカーをコードする第2組換え核酸、およびRasエフェクタードメインをコードする第3組換え核酸を含む細胞を含む細胞培養物を用意すること、
（b）前記細胞培養物を試験化合物と接触させること、および
（c）細胞増殖のレベルを決定すること
を含む方法。
【請求項２】
前記第3組換え核酸が前記Rasエフェクタードメインに作動可能に連結されたRap入力ドメインをさらに含む、請求項1の方法。
【請求項３】
Rap入力ドメインが少なくとも1つのミスセンス突然変異を含む、請求項1の方法。
【請求項４】
前記Rapタンパク質中の前記少なくとも1つのミスセンス突然変異が前記Rap入力ドメインのリン酸化を妨げる、請求項3の方法。
【請求項５】
RasエフェクタードメインがGTPアーゼ欠損性でない、請求項1の方法。
【請求項６】
前記細胞集団が、ヘルパータンパク質を作動可能にコードする第4組換え核酸コンストラクトをさらに含む、請求項1、2、または3のいずれかの方法。
【請求項７】
前記ヘルパータンパク質がGタンパク質共役受容体シグナル伝達カスケードにおいてRap入力ドメインの上流で機能する、請求項6の方法。
【請求項８】
前記ヘルパータンパク質がGタンパク質共役受容体シグナル伝達カスケードにおいてRap入力ドメインの下流で機能する、請求項7の方法。
【請求項９】
前記ヘルパータンパク質が、第1組換え核酸上にコードされている組換えGタンパク質共役受容体以外のGタンパク質共役受容体によるシグナル伝達を減少させる、請求項7の方法。
【請求項１０】
前記ヘルパータンパク質がRasエフェクタードメインによる増殖を増幅する、請求項7の方法。
【請求項１１】
前記ヘルパータンパク質がGβγスカベンジャーである、請求項10の方法。
【請求項１２】
前記Gβγスカベンジャーがトランスデューシンである、請求項11の方法。
【請求項１３】
前記GβγスカベンジャーがBarkCTである、請求項11の方法。
【請求項１４】
前記ヘルパータンパク質が、前記第1組換え核酸によってコードされるGタンパク質共役受容体以外のGタンパク質共役受容体の断片である、請求項9の方法。
【請求項１５】
Rap入力ドメインの上流で機能する前記タンパク質がGαタンパク質である、請求項7の方法。
【請求項１６】
前記Gαタンパク質が、Gαs、Gαq、GαiおよびGα12／13からなる群より選択される、請求項15の方法。
【請求項１７】
前記ヘルパータンパク質がグアニンヌクレオチド交換因子（GEF）である、請求項7の方法。
【請求項１８】
前記ヘルパータンパク質がEPACである、請求項17の方法。
【請求項１９】
前記ヘルパータンパク質がC3Gである、請求項17の方法。
【請求項２０】
前記ヘルパータンパク質がシクラーゼである、請求項7の方法。
【請求項２１】
前記シクラーゼがアデニリルシクラーゼである、請求項20の方法。
【請求項２２】
前記ヘルパータンパク質がアデニリルシクラーゼII（ACII）である、請求項21の方法。
【請求項２３】
前記ヘルパータンパク質がGTPアーゼである、請求項7の方法。
【請求項２４】
前記GTPアーゼがRacである、請求項23の方法。
【請求項２５】
前記Gタンパク質共役受容体がGs連結型Gタンパク質共役受容体である、請求項1の方法。
【請求項２６】
前記Gタンパク質共役受容体がGi連結型Gタンパク質共役受容体である、請求項1の方法。
【請求項２７】
前記Gタンパク質共役受容体がGq連結型Gタンパク質共役受容体である、請求項1の方法。
【請求項２８】
前記Gタンパク質共役受容体がG12／G13連結型タンパク質共役受容体である、請求項1の方法。
【請求項２９】
前記細胞増殖のレベルを決定する前記ステップが、前記細胞培養物にβ-ガラクトシダーゼをコードする第4核酸をトランスフェクトし、前記細胞培養物のβ-ガラクトシダーゼ活性の量を測定することを含む、請求項1の方法。
【請求項３０】
細胞増殖のレベルを決定するステップが、R-SAT（商標）アッセイを実行することを含む、請求項1の方法。
【請求項３１】
Rap配列が突然変異を含有しない、請求項1の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成19年11月2日(2007.11.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある物質があるGタンパク質共役受容体（GPCR）のリガンドであるかどうかを決定する方法であって、
（a）リガンドに応答してGPCRカスケードによって細胞増殖を増加または減少させるGPCRをコードする第1核酸、細胞増殖の程度を示すマーカーをコードする第2組換え核酸、およびRasエフェクタードメインをコードする第3組換え核酸を含む細胞を含む細胞培養物を用意する工程であって、該第3組換え核酸が前記Rasエフェクタードメインに作動可能に連結されたRap入力ドメインをさらに含む工程、（b）前記細胞培養物を試験化合物と接触させる工程、および
（c）細胞増殖のレベルを決定する工程
を含む方法。
【請求項２】
Rap配列が突然変異を含有しない、請求項1の方法。
【請求項３】
Rap入力ドメインが少なくとも1つのミスセンス突然変異を含む、請求項1の方法。
【請求項４】
前記Rapタンパク質中の前記少なくとも1つのミスセンス突然変異が前記Rap入力ドメインのリン酸化を妨げる、請求項3の方法。
【請求項５】
RasエフェクタードメインがGTPアーゼ欠損性でない、請求項1の方法。
【請求項６】
前記細胞集団が、ヘルパータンパク質を作動可能にコードする第4組換え核酸コンストラクトをさらに含む、請求項1の方法。
【請求項７】
前記ヘルパータンパク質がGタンパク質共役受容体シグナル伝達カスケードにおいてRap入力ドメインの上流で機能する、請求項6の方法。
【請求項８】
前記ヘルパータンパク質がGタンパク質共役受容体シグナル伝達カスケードにおいてRap入力ドメインの下流で機能する、請求項6の方法。
【請求項９】
前記ヘルパータンパク質が、第1組換え核酸上にコードされている組換えGタンパク質共役受容体以外のGタンパク質共役受容体によるシグナル伝達を減少させる、請求項6の方法。
【請求項１０】
前記ヘルパータンパク質がRasエフェクタードメインによる増殖を増幅する、請求項6の方法。
【請求項１１】
前記ヘルパータンパク質がGβγスカベンジャーである、請求項10の方法。
【請求項１２】
前記Gβγスカベンジャーがトランスデューシンである、請求項11の方法。
【請求項１３】
前記GβγスカベンジャーがBarkCTである、請求項11の方法。
【請求項１４】
前記ヘルパータンパク質が、前記第1組換え核酸によってコードされるGタンパク質共役受容体以外のGタンパク質共役受容体の断片である、請求項9の方法。
【請求項１５】
Rap入力ドメインの上流で機能する前記タンパク質がGαタンパク質である、請求項7の方法。
【請求項１６】
前記Gαタンパク質が、Gαs、Gαq、GαiおよびGα12／13からなる群より選択される、請求項15の方法。
【請求項１７】
前記ヘルパータンパク質がグアニンヌクレオチド交換因子（GEF）である、請求項7の方法。
【請求項１８】
前記ヘルパータンパク質がEPACである、請求項17の方法。
【請求項１９】
前記ヘルパータンパク質がC3Gである、請求項17の方法。
【請求項２０】
前記ヘルパータンパク質がシクラーゼである、請求項7の方法。
【請求項２１】
前記シクラーゼがアデニリルシクラーゼである、請求項20の方法。
【請求項２２】
前記ヘルパータンパク質がアデニリルシクラーゼII（ACII）である、請求項21の方法。
【請求項２３】
前記ヘルパータンパク質がGTPアーゼである、請求項7の方法。
【請求項２４】
前記GTPアーゼがRacである、請求項23の方法。
【請求項２５】
前記Gタンパク質共役受容体がGs連結型Gタンパク質共役受容体である、請求項1の方法。
【請求項２６】
前記Gタンパク質共役受容体がGi連結型Gタンパク質共役受容体である、請求項1の方法。
【請求項２７】
前記Gタンパク質共役受容体がGq連結型Gタンパク質共役受容体である、請求項1の方法。
【請求項２８】
前記Gタンパク質共役受容体がG12／G13連結型タンパク質共役受容体である、請求項1の方法。
【請求項２９】
前記細胞増殖のレベルを決定する前記ステップが、前記細胞培養物にβ-ガラクトシダーゼをコードする第4核酸をトランスフェクトし、前記細胞培養物のβ-ガラクトシダーゼ活性の量を測定することを含む、請求項1の方法。
【請求項３０】
細胞増殖のレベルを決定するステップが、R-SAT（商標）アッセイを実行することを含む、請求項1の方法。
【国際調査報告】
2007536904.tif 000031
2007536904.tif 000032
2007536904.tif 000033
2007536904.tif 000034