(57)【要約】【課題】  出血を治療するための方法および医薬組成物が提供される。【解決手段】  医薬組成物には、被験者の出血を低減または阻害する有効量の抗線溶組成物が含まれる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とする被験者のプラスミン活性を阻害する方法であって、プラスミンプロテアーゼドメイン特異的なモノクローナル抗体またはその機能性断片を含む有効量のプラスミン阻害組成物を前記被験者に投与することを含む方法。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体またはその機能性断片は線維素溶解を阻害する、請求項１の方法。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体またはその機能性断片は第Ｖ因子蛋白質のプラスミン切断を阻害する、請求項１の方法。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体またはその機能性断片は、エプシロンアミノカプロン酸よりも強力に、トリペプチドパラニトロアニリド基質のプラスミン切断を阻害する、請求項１の方法。
【請求項５】
前記被験者はヒトである、請求項１の方法。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体またはその機能性断片はプラスミン活性の非競合的阻害因子である、請求項１の方法。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体またはその機能性断片は、プラスミンへの前記モノクローナル抗体の結合を媒介するためにプラスミンのループ４および５を必要とする、請求項１の方法。
【請求項８】
前記モノクローナル抗体またはその機能性断片は、プラスミンへの前記モノクローナル抗体の結合を媒介するためにプラスミンのループ７を必要とする、請求項１の方法。
【請求項９】
前記モノクローナル抗体またはその機能性断片は、非プラスミン・セリンプロテアーゼ・トリプシン、トロンビン、活性化プロテインＣ、カリクレイン、好中球エラスターゼ、またはそれらの組み合わせとは特異的に結合しない、請求項１の方法。
【請求項１０】
前記モノクローナル抗体またはその機能性断片は、配列番号１５および１６と少なくとも８０％同一の可変領域アミノ酸配列を含む、請求項１の方法。
【請求項１１】
前記モノクローナル抗体またはその機能性断片は、配列番号９〜１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のＣＤＲアミノ酸配列を含む、請求項１の方法。
【請求項１２】
治療を必要とする被験者の出血を治療する方法であって、プラスミンプロテアーゼドメイン特異的なモノクローナル抗体またはその機能性断片と製薬上許容される賦形剤とを含む医薬組成物の有効量を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項１３】
前記モノクローナル抗体またはその機能性断片は線維素溶解を阻害する、請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記モノクローナル抗体またはその機能性断片は第Ｖ因子蛋白質のプラスミン切断を阻害する、請求項１２の方法。
【請求項１５】
前記モノクローナル抗体またはその機能性断片は、エプシロンアミノカプロン酸よりも強力に、トリペプチドパラニトロアニリド基質のプラスミン切断を阻害する、請求項１２の方法。
【請求項１６】
前記被験者はヒトである、請求項１２の方法。
【請求項１７】
前記モノクローナル抗体またはその機能性断片はプラスミン活性の非競合的阻害因子である、請求項１２の方法。
【請求項１８】
前記モノクローナル抗体またはその機能性断片は、プラスミンプロテアーゼドメインにおいてループ４および５に特異的に結合する、請求項１２の方法。
【請求項１９】
前記モノクローナル抗体またはその機能性断片は、プラスミンへの前記モノクローナル抗体の結合を媒介するためにプラスミンのループ７を必要とする、請求項１２の方法。
【請求項２０】
前記モノクローナル抗体またはその機能性断片は、非プラスミン・セリンプロテアーゼ・トリプシン、トロンビン、活性化プロテインＣ、カリクレイン、好中球エラスターゼ、またはそれらの組み合わせとは特異的に結合しない、請求項１２の方法。
【請求項２１】
前記モノクローナル抗体またはその機能性断片は、配列番号１５および１６と少なくとも８０％同一の可変領域アミノ酸配列を含む、請求項１２の方法。
【請求項２２】
前記モノクローナル抗体またはその機能性断片は、配列番号９〜１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のＣＤＲアミノ酸配列を含む、請求項１２の方法。
【請求項２３】
前記モノクローナル抗体またはその機能性断片は、表１Ａおよび１Ｂ、表２Ａおよび２Ｂ、および図６Ａ〜６Ｄに提示されるものから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１２の方法。
【請求項２４】
出血を治療するための医薬組成物であって、プラスミン特異的なモノクローナル抗体またはその機能性断片と製薬上許容されるキャリアとを含む治療有効量の抗線溶組成物を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に援用される、２０１７年９月２１日出願の米国仮特許出願第６２／５６１，３３２号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、反応抑制的抗体による特異的プラスミン不活性化に関する。
【０００３】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に援用される配列表を含む。上記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１８年９月１３日に作成され、２７８４９−００２３＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは２７，１４１バイトである。
【背景技術】
【０００４】
出血は、外科手術、怪我、または凝固因子欠乏症の重大または致命的な合併症である。プラスミン介在線維素溶解または血餅溶解を阻害する抗線維素溶解剤は、重大な出血による血液損失、緊急再手術、病的状態、および死を減少させることができる１−１１。プラスミン活性は、プラスミン生成、プラスミン基質相互作用、および特定の阻害因子により調整される。プラスミン生成は、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）および尿中型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）が触媒する。プラスミン活性は、プラスミンクリングル介在によるフィブリン上のリシン残渣との結合相互作用、並びに活性化因子ＸＩＩＩおよびトロンビン活性化線溶阻害因子により誘発されるフィブリンへの変化によって支配される。プラスミン活性は、阻害因子、特に速効性セルピン、α２抗プラスミン因子、および（阻害因子としての効力は相対的に弱いが）α２マクログロブリンによっても厳重に制御されている１２−１５。野放し状態のプラスミンは血栓を溶解（線維素溶解）し、凝固因子（フィブリノーゲン、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子）を劣化させ、凝固を妨げることにより、出血のリスクを高める。加えて、野放し状態のプラスミンは好中球およびマクロファージを活性化し、化学走性および酸化ストレスを高めたり、炎症誘発性サイトカインおよびマトリックスメタロプロテナーゼの放出を促進したりする１６。
【０００５】
小分子プラスミン阻害因子は５０年以上前に最初に使用されたが、それ以来、出血および合併症を減少させる効果が証明されている。現在のプラスミン阻害因子は、酵素活性部位を阻害する、あるいはプラスミンと基質との間の相互作用に干渉する小分子である。現在の試薬としては、リシン類似体と活性部位阻害因子の２種類が存在する。
【０００６】
リシン類似体、エプシロンアミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）、およびトラネキサム酸はリシン残渣を模倣することにより、プラスミンクリングルのリシン結合部位と相互作用して、プラスミンとフィブリンとの間の相互作用を妨害する。リシン類似体は、その分子サイズおよび作用機構の故に、効力が低く特異性も適度であり、肝臓病の際に蓄積し、脳血液関門および胎盤を通過する２、１０−１２。リシン類似体は、プラスミノーゲンおよびｔＰＡがフィブリンに結合するのを阻害し、それによりプラスミノーゲン活性化および線維素溶解を妨げる。リシン類似体は、同じ機構を通して、α２抗プラスミンとクリングルとの間の相互作用を阻害することにより２０、並びに溶液中のｔＰＡまたはｕＰＡによりプラスミノーゲン活性を高めることにより２１、２２、実際にはプラスミン活性を増大させる場合もある。更に、リシン類似体は、プラスミノーゲン／プラスミンと細胞受容体との間の相互作用に干渉し、プラスミノーゲンと組織因子との間の相互作用を阻害する２３。リシン類似体と他のクリングル含有蛋白質（ｔＰＡ２４、（プロ）トロンビン２５、肝細胞成長因子、ｕＰＡ、リポ蛋白（ａ）のアポ蛋白（ａ）２５）との間の相互作用の影響は余りよく分かっていない。リシン類似体は胎盤および脳血液関門を通過し、心臓外科手術患者の発作を引き起こし２６〜３０、くも膜下出血患者における脳梗塞の可能性を増大させる。トラネキサム酸は無変化状態で尿を通して排泄される（９５％）ので、肝臓疾患の患者における毒性リスクは有意である３１。
【０００７】
ウシの膵臓のトリプシン阻害因子（ＢＰＴＩ、アプロチニン）はプラスミンの活性部位阻害因子である。ＢＰＴＩは、プラスミン／α２抗プラスミン複合体の形成によって測定した場合３３、心臓外科手術における出血の停止２９、３２およびプラスミン活性発生防止の点でリシン類似体よりも効力が高い。しかし、その名前が示す通り、ＢＰＴＩは、トリプシン、トロンビン、活性化プロテインＣ（天然の抗凝固剤）、（キニン系を活性化する）カリクレイン、好中球エラスターゼ、および他の蛋白質分解酵素を含む種々の他のセリンプロテアーゼの非特異的阻害因子でもある７２。ＢＰＴＩは、斯かる作用を通して、幅広い抗凝固効果、抗線溶効果、抗炎症効果、および他の効果を有する７３。ＢＰＴＩも腎不全の際に蓄積し、脳血液関門を通過する１７。ＢＰＴＩは心臓外科手術での出血停止の点でリシン類似体よりも効果的ではあるが、死亡率増大に伴う安全性の懸念により米国ではもはや入手不可能である。ＢＰＴＩは、３０日全死因死亡率の有意な増大と関連している３２。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
線維素溶解は、心臓外科手術、整形外科手術、肝移植、血管外科手術、胸部外科手術、婦人科外科手術、末期腎疾患、周産期出血、消化器官出血、神経外科手術、外傷、外傷性脳損傷、脳内出血、およびくも膜下出血５〜１１、３４〜６３を経験する何百万人もの患者の出血に影響を及ぼすことが、臨床試験により示されている。線維素溶解の阻害は、外科手術、外傷、または血液凝固因子欠乏症に関連した出血を有意に減少するであろう。現在の線溶阻害因子は小分子（エプシロンアミノカプロン酸、ＥＡＣＡ、およびトラネキサム酸）または活性部位阻害因子であるが、これらの阻害因子の使用は、作用の非特異的メカニズム、オフターゲット効果、低い効力、および特定の出血での効力不足のため、限定的である。特に、部分的にはオフターゲット効果の所為で現在の治療法では効果がなく有害な場合すらある、生命を脅かす重大な出血（脳出血など）の患者において、より特異的で効力の高い線溶阻害因子の必要性が求められている。プラスミンの活性部位を取り巻いている表面ループは、ユニークで、プラスミンと基質および他の分子との間の相互作用において非常に特異的な仲介を行っていることが知られている１８。プラスミンの酵素活性部位と他のトリプシン様セリンプロテアーゼとの間の相同性が有意に高いので、極めて特異的なプラスミンの触媒阻害因子を作製するのは困難な課題である。斯かる困難な課題を表す例として、最も効力が高く特異的なプラスミン阻害因子であるα２抗プラスミンでさえ、トリプシンを急速に阻害したり、他のセリンプロテアーゼと相互作用を行ったりする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示は、プラスミンプロテアーゼドメインのユニークなループ構造に向けられた抗体および他の結合分子を提供するものであるが、斯かる抗体は、インビトロによるプラスミン介在線維素溶解およびインビボによる外科手術出血において、非常に特異的な阻害因子として機能する。
【００１０】
実施形態において、本発明は、治療を必要とする被験者のプラスミン活性を阻害する方法を提供し、該方法には、プラスミンプロテアーゼドメイン特異的なモノクローナル抗体またはその機能性断片を含む有効量のプラスミン阻害組成物を該被験者に投与することも含まれる。
【００１１】
実施形態において、本発明は、治療を必要とする被験者のプラスミン介在線維素溶解を阻害する方法を提供し、該方法には、プラスミンプロテアーゼドメイン特異的なモノクローナル抗体またはその機能性断片を含む有効量のプラスミン阻害組成物を該被験者に投与することも含まれる。
【００１２】
実施形態において、本発明は、治療を必要とする被験者の出血を治療する方法を提供し、該方法には、プラスミンプロテアーゼドメイン特異的なモノクローナル抗体またはその機能性断片を含む有効量の医薬組成物および製薬上許容される賦形剤を該患者に投与することも含まれる。
【００１３】
本発明では、実施形態において、モノクローナル抗体またはその機能性断片が線維素溶解を阻害する。本発明では、実施形態において、モノクローナル抗体またはその機能性断片がプラスミンによる第Ｖ因子蛋白質の切断を阻害する。本発明では、実施形態において、モノクローナル抗体またはその機能性断片が、エプシロンアミノカプロン酸よりも強力に、プラスミンによるトリペプチドプラニトロアニリド基質の切断を阻害する。
【００１４】
本発明では、実施形態において、被験者は人である。
【００１５】
本発明では、実施形態において、モノクローナル抗体またはその機能性断片はプラスミン活性の非競合的阻害因子である。
【００１６】
本発明では、実施形態において、モノクローナル抗体またはその機能性断片は、モノクローナル抗体によるプラスミンへの結合を介在するのにプラスミンのループ４および５を必要とする。本発明では、実施形態において、モノクローナル抗体またはその機能性断片は、モノクローナル抗体によるプラスミンへの結合を介在するのにプラスミンのループ７を必要とする。
【００１７】
本発明では、実施形態において、モノクローナル抗体またはその機能性断片は、非プラスミン・セリンプロテアーゼ・トリプシン、トロンビン、活性化プロテインＣ、カリクレイン、好中球エラスターゼ、またはそれらの組み合わせとは特異的に結合しない。
【００１８】
本発明では、実施形態において、モノクローナル抗体またはその機能性断片は、配列番号１５および１６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、および１００％同一の軽鎖および重鎖可変領域アミノ酸配列を有する。
【００１９】
本発明では、実施形態において、モノクローナル抗体またはその機能性断片は、配列番号９〜１４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、および１００％同一のＣＤＲアミノ酸配列を有する。
【００２０】
実施形態において、本発明は、プラスミン活性を阻害する方法または治療を必要とする被験者の出血を治療する方法を提供するものであり、その場合、モノクローナル抗体またはその機能性断片は、表１Ａおよび１Ｂ、表２Ａおよび２Ｂ、および図６Ａ〜６Ｄ記載のアミノ酸配列から選択された配列を有している。
【００２１】
本発明は、プラスミン活性を阻害する、または出血を治療する医薬組成物を提供するものであるが、該医薬組成物は、プラスミン特異的なモノクローナル抗体またはその機能性断片および製薬上許容されるキャリアを含む治療学的有効量の抗線溶組成物を有する。本発明は、本明細書記載の特徴を有する部分的に分離された抗体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｄは、ヒトプラスミン用のＰｉの結合特異性および結合活性を示す。図１Ａは、免疫ブロット法によりＰｉが特異的に還元型ヒトプラスミンのプロテアーゼドメインに結合していることを示している。標準的分子の相対移動度（ｋＤａ）が示してある。
【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｄは、ヒトプラスミン用のＰｉの結合特異性および結合活性を示す。図１Ｂはマイクロプラスミノーゲンのリボン図であり、ｉＣＮ３Ｄ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｉｃｎ３ｄ／ｉｃｎ３ｄ．ｈｔｍｌ）で可視化させたプラスミンプロテアーゼドメインのループ（ＰＤＢエントリー１ＱＲＺ）を示してある。
【図１Ｃ】図１Ａ〜Ｄは、ヒトプラスミン用のＰｉの結合特異性および結合活性を示す。図１Ｃは種々のプラスミンプロテアーゼループ変異株へのＰｉの結合を示す。マイクロタイタープレートのウェルは、未変性（野生型、ＷＴ）または種々のマイクロプラスミン変異株（５ｕｇ／ｍＬ）でコーティングしてある。ブロッキング後、Ｐｉ、ウサギのポリクローン性抗プラスミン（プラスミンＡｂ）、または非反応性マウス（抗ジゴキシン、対照）抗体（１ｕｇ／ｍＬ）をウェルに添加した。結合した抗体（Ｐｉ、対照）は、二次抗マウスペロキシダーゼ（１：１０，０００）により検出し、プラスミン抗体は抗ウサギペロキシダーゼ抗体（１：５，０００）、次にＴＭＢ基質によって検出し、Ａ４０５でモニターした。
【図１Ｄ】図１Ａ〜Ｄは、ヒトプラスミン用のＰｉの結合特異性および結合活性を示す。図１Ｄは、ヒトプラスミノーゲンへのＰｉの相対結合および親和性を示している。マイクロタイタープレートのウェルはヒトプラスミノーゲン（２ｕｇ／ｍＬ）でコーティングした。ブロッキングおよび洗浄の後、種々の濃度の精製Ｐｉ（図示）を１時間添加した。洗浄後、結合した抗体量を二次抗マウス抗体、次にＴＭＢ基質で検出し、Ａ４０５ｎｍでモニターした。データは三重観測の平均＋／−標準誤差を示しており、実験は少なくとも２度行った。データはグラフパッドプリズムで分析した（ｒ＝０．９５）。
【図２】図２Ａ−図２Ｄ。図２Ａ〜Ｄは、Ｐｉ、ＥＡＣＡ、およびα２ＡＰによるプラスミン活性の相対阻害を示す。図２Ａは、ヒトプラスミン（２．８ｎＭ）がＳ２２５１基質およびＰｉ（１ｘ１０−９〜３．３ｘ１０−８Ｍ）またはＥＡＣＡ（３．９ｘ１０−３〜０．２５ｘ１０−１Ｍ）と混合されたこと、あるいは阻害因子を含まないことを示しており、基質切断速度はＡ４０５ｎｍで２０分間モニターした。プラスミンの残存活性率は、阻害因子の対数濃度の関数として示してある。図２Ｂは、ヒトプラスミンによる基質切断速度へのＰｉの影響を示している。基質Ｓ２２５１（０．１〜４ｍＭ）の存在下、ヒトプラスミン（１００ｎＭ、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）をＰｉ（５０ｎＭ）と一緒に（またはそれなしで）混合した。基質切断の初速度（６分）をＡ４０５でモニターした。データをプロットし、グラフパッドプリズムプログラムによるミカエリスメンテン速度式を用いて分析した。平均（重複観測）が示してあり、４つの異なる実験を表している。図２Ｃは、α２ＡＰおよびＰｉによるヒトプラスミンの相対阻害を示している。ヒトプラスミン（２００ｎＭ）をα２ＡＰ（１２．５〜２００ｎＭ）、またはＰｉ（１５．６２５〜５００ｎＭ）と混合し（または阻害因子を用いないで）、Ｓ２２５１の切断をＡ４０５でモニターした。重複観測の平均を示してある。図２Ｄは、ＰｉのＦａｂ型およびキメラＦａｂ型がプラスミンの酵素活性を効果的に阻害していることを示している。プラスミン（２５ｎＭ）は、ｐＨ７．４のＴＢＳ緩衝液中で種々の濃度（０〜２００ｎＭ）のマウスＦａｂまたはキメラＦａｂ（ｃＦａｂ）と混合した。プラスミン活性は、Ａ４０５におけるパラニトロアニリド産物の経時的放出により測定した。
【図３】図３Ａ−図３Ｄ。図３Ａ〜Ｄは、Ｐｉの結合および阻害特異性を示している。図３Ａは種々のセリンプロテアーゼへのＰｉの結合を示してある。ヒト（ｈ）プラスミノーゲン（Ｐｇ）、マウス（ｍ）Ｐｇ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、トリプシン（ｔｒｙｐｓ．）、キモトリプシン（ｃｈｙｍ．）、またはウシの血清アルブミンへのＰｉまたは対照モノクローナル抗体（抗ジゴキシン、Ｃｔｌ）の結合を、以下の方法に記載されるように、ＥＬＩＳＡによりマイクロタイタープレートで評価した。ウロキナーゼ添加後における、プラスミン活性へのＰｉの影響（またはＰｉなしの影響）を種々の動物血漿で示した。ヒト（Ｈｕ）、イヌ、モルモット（ＧＰ）、ウシ（Ｂｏｖ）、ネコ（Ｃａｔ）、アレチネズミ（Ｇｅｒ）、ハムスター（Ｈａｍ）、ブタ、ウサギ（Ｒａｂ）、およびラット血漿におけるプラスミン活性を、以下の方法に記載されるように、Ｓ２２５１基質の切断により、ウロキナーゼ（ＵＫ）の添加後評価した。ヒト、ヒヒ、またはアフリカミドリザルで形成された血餅への種々の濃度のＰｉ（０〜２０００ｎＭ）の影響を示す。血餅溶解は、以下の方法に記載されるように、マイクロタイタープレートで測定した。図３Ｄは、プラスミンプロテアーゼドメインの異なるエピトープに結合する、２つの異なる反応抑制的抗体ＰｉＭＡｂ３８およびＰｉＭＡｂ３４０による相対的血餅溶解を示す。
【図４】図４Ａ−図４Ｄ。図４Ａ〜Ｄは、Ｐｉ、ＥＡＣＡ、およびα２ＡＰにミンと比べ最切断およびヒト血餅線維素溶解（溶解）の相対的阻害を示す。図４Ａはプラスミン介在第Ｖ因子切断へのＥＡＣＡおよびＰｉの影響を示す。ヒト第Ｖ因子（２ｕｇ）を室温で１時間、ＥＡＣＡ（１ｍＭ）、対照のモノクローナル抗体（ＣＴＬ、抗ジゴキシン、５ｕｇ）、またはＰｉ（５ｕｇ）と混合し、その後７．５％のゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。分子量標準の相対移動度を示す（ｋＤａ）。塗りつぶされた矢印は未切断の第Ｖ因子を示しており、白抜きの矢印は切断した第Ｖ因子を示している。図４Ｂは、ヒト線維素溶解へのＥＡＣＡおよびＰｉによる用量依存的な相対的影響を示している。ヒト血漿は、微量な１２５Ｉフィブリノーゲンの存在下、ＣａＣｌ２（１０ｍＭ）およびトロンビン（１Ｕ／ｍＬ）により、３７℃において１時間で凝固した。１ｍＬのＴＢＳ（ｐＨ７．４）中で洗浄後、種々の量のＰｉ（６２．５〜１０００ｎＭ）、ＥＡＣＡ（０．１２５〜２ｍＭ）の存在下（または阻害因子なしで）、ｔＰＡ（５ｎＭ）を添加した。２．５時間後、上澄みに溶解した１２５Ｉフィブリンの量を測定することにより、線維素溶解の量を決定した。重複観測の平均が示してある。図４Ｂはα２ＡＰ対Ｐｉを示してある。血餅は、上記のように、ヒトプラスミノーゲン（２ｕＭ）およびα２ＡＰ（１ｕＭ）またはＰｉ（１ｕＭ）、および種々の量のｔＰＡ（０〜１０ｎＭ）の存在下に形成された。マイクロタイタプレートウェル内で、２時間かけ、Ａ４０５ｎｍで、血餅溶解をモニターした（２回の試験）。線維素溶解は、以下の方法に記載されるように、Ａ４０５における相対的減少により決定した３５。図４Ｄは、ヒトの血餅溶解への異なるＰｉ分子形態による相対的影響を示している。ヒト血漿の血餅を種々の濃度のＰｉＩｇＧ、ＰｉＦａｂ、およびキメラＰｉＦａｂ（２５〜４００ｎＭ）と混合し、プラスミンをウロキナーゼで活性化した。線維素溶解の量を以下の方法に記載するように決定した。
【図５】図５Ａ−図５Ｂ。図５Ａ〜Ｂは、Ｐｉがインビボで線維素溶解を抑制することを示している。図５Ａは、尻尾からの出血の期間を示している。図５Ｂは、出血による血液損失を示している。麻酔下にあるマウスを、径静脈的に、無作為的および盲検により、生理食塩水（対照）、Ｐｉ（１００ナノモル／ｋｇ）、またはＥＡＣＡ（５１０マイクロモル／ｋｇ）で処理した。ヒトプラスミノーゲン（１００ナノモル／ｋｇ）およびプラスミノーゲン活性化因子（８０，０００ＩＵ／ｋｇ）を６０分かけて投与した。尻尾からの出血は注入４０分後に開始した。尻尾を３７℃の生理食塩水３ｍＬで５分間予め温め、以下に記載するように出血をモニターした３６、３７。Ｎ＝５〜６、平均＋／−標準誤差を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ｎｓは非有意を意味する。クラスカル・ウォリス一元配置分散分析（修正型Ｄｕｎｎ法）。
【図６−１】図６Ａ〜Ｄは、Ｐｉ軽鎖（図６Ａ、配列番号１５）および重鎖（図６Ｂ、配列番号１６）の可変配列のＣｌｏｔｈｉａ一連番号付けを示す。軽鎖のＣＤＲループ（図６Ｃ、配列番号１５および配列番号９〜１１）（青および緑の２つのシェードのグレースケール）および重鎖のループ（図６Ｄ、配列番号１６および配列番号１２〜１４）（赤、橙色、および紫のグレースケール）が示してある。ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ  Ｐｒｏｇｒａｍバージョン４．９．２（２０１６−０９−２６）  Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ  Ｆ．，  Ｋａａｓ  Ｑ．ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ  Ｍ．−Ｐ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３８，  Ｄ３０１−３０７（２０１０）により作製。ＰＭＩＤ：１９９００９６７。
【図６−２】図６Ａ〜Ｄは、Ｐｉ軽鎖（図６Ａ、配列番号１５）および重鎖（図６Ｂ、配列番号１６）の可変配列のＣｌｏｔｈｉａ一連番号付けを示す。軽鎖のＣＤＲループ（図６Ｃ、配列番号１５および配列番号９〜１１）（青および緑の２つのシェードのグレースケール）および重鎖のループ（図６Ｄ、配列番号１６および配列番号１２〜１４）（赤、橙色、および紫のグレースケール）が示してある。ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ  Ｐｒｏｇｒａｍバージョン４．９．２（２０１６−０９−２６）  Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ  Ｆ．，  Ｋａａｓ  Ｑ．ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ  Ｍ．−Ｐ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３８，  Ｄ３０１−３０７（２０１０）により作製。ＰＭＩＤ：１９９００９６７。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本開示は、プラスミンのユニークなループ構造に向けられた抗体および他の結合分子を提供するものであるが、斯かる抗体および他の結合分子は、インビトロによるプラスミン介在線維素溶解およびインビボによる外科手術出血において、非常に特異的な阻害因子として機能する。
【００２４】
実施形態において、本発明は、治療を必要とする被験者のプラスミン活性を阻害する方法を提供し、該方法には、プラスミンプロテアーゼドメイン特異的なモノクローナル抗体またはその機能性断片を含む有効量のプラスミン阻害組成物を該被験者に投与することも含まれる。
【００２５】
実施形態において、本発明は、治療を必要とする被験者の出血を治療する方法を提供し、該方法には、プラスミンプロテアーゼドメイン特異的なモノクローナル抗体またはその機能性断片を含む有効量の医薬組成物および製薬上許容される賦形剤を該患者に投与することも含まれる。
【００２６】
本発明では、実施形態において、モノクローナル抗体またはその機能性断片が線維素溶解を阻害する。本発明では、実施形態において、モノクローナル抗体またはその機能性断片がプラスミンによる第Ｖ因子蛋白質の切断を阻害する。本発明では、実施形態において、モノクローナル抗体またはその機能性断片が、エプシロンアミノカプロン酸よりも強力に、プラスミンによるトリペプチドプラニトロアニリド基質の切断を阻害する。
【００２７】
本発明では、実施形態において、被験者は人である。本発明では、実施形態において、モノクローナル抗体またはその機能性断片はプラスミン活性の非競合的阻害因子である。
【００２８】
本発明では、実施形態において、モノクローナル抗体またはその機能性断片は、モノクローナル抗体によるプラスミンへの結合を介在するのにプラスミンのループ４および５を必要とする。本発明では、実施形態において、モノクローナル抗体またはその機能性断片は、モノクローナル抗体によるプラスミンへの結合を介在するのにプラスミンのループ７を必要とする。
【００２９】
本発明では、実施形態において、モノクローナル抗体またはその機能性断片は、非プラスミン・セリンプロテアーゼ・トリプシン、トロンビン、活性化プロテインＣ、カリクレイン、好中球エラスターゼ、またはそれらの組み合わせとは特異的に結合しない。
【００３０】
本発明では、実施形態において、モノクローナル抗体またはその機能性断片は、配列番号１５および１６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、および１００％同一の軽鎖および重鎖可変領域アミノ酸配列を有する。
【００３１】
本発明では、実施形態において、モノクローナル抗体またはその機能性断片は、配列番号９〜１４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、および１００％同一のＣＤＲアミノ酸配列を有する。
【００３２】
実施形態において、本発明は、プラスミン活性を阻害する方法または治療を必要とする被験者の出血を治療する方法を提供するものであり、その場合、モノクローナル抗体またはその機能性断片は、表１Ａおよび１Ｂ、表２Ａおよび２Ｂ、および図６Ａ〜６Ｄ記載のアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、および１００％同一のアミノ酸配列を有している。
【００３３】
本発明は、プラスミン活性を阻害する、または出血を治療する医薬組成物を提供するものであるが、該医薬組成物は、プラスミン特異的なモノクローナル抗体またはその機能性断片および製薬上許容されるキャリアを含む治療学的有効量の抗線溶組成物を有する。本発明は、本明細書記載の特徴を有する少なくとも部分的に分離されたモノクローナル抗体またはその機能性断片を提供する。
【００３４】
本発明またはその好ましい実施形態（複数も可）の要素を導入するにあたり、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「前記」は、１つ以上の要素が存在することを意味している。「有する」、「含む」、および「持つ」と言う用語は包含的であり、記載された要素以外の追加の要素が存在し得ることを意味する。
【００３５】
本明細書記載の発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「から成る」および／または「実質的にから成る」を含むことは理解されている。
【００３６】
本開示全体において、本発明の種々の態様が範囲形式で記載されている。範囲形式の記載は便利さおよび簡潔さ目的のためだけであり、本発明の範囲に弾力性のない制限を付すものとして解釈されるべきでないことは理解されるべきである。従って、範囲の記載は、あらゆる可能な部分範囲並びに斯かる範囲内の個々の数値を特に開示しているものと解釈されるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの部分範囲並びに斯かる範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５、および６が特に開示されているものと解釈されるべきである。これは範囲の大きさに関係なく適用される。
【００３７】
本明細書に記載される場合、「約」と言う用語の意味は当業者に理解されるであろうし、使用される文脈次第で、ある程度変化するものでもある。当業者には明白でない用語の使用があった場合、使用される文脈次第ではあるが、「約」と言う用語は、特定の用語の＋／−１０％を意味する。
【００３８】
本明細書に記載される場合、「抗体」と言う用語は、任意のアイソタイプの無処理イムノグロブリン（Ｉｇ）分子、または標的抗原に特異的に結合する無処理の抗体と競合可能な免疫学的に活性な断片を意味する。いくつかの例において、抗体は無処理の抗体（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖｓ））の免疫学的断片である。抗体には、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクロナール抗体、二重特異性抗体、低分子抗体、ドメイン抗体、合成抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合、およびそれらの断片が含まれる。一般的に、無処理の抗体は少なくとも２つの完全長重鎖および２つの完全長軽鎖を有するが、いくつかの例では、鎖の数が少ない場合もある（例えばラクダ類に天然に生じる抗体のように重鎖しか持たない場合など）。抗体は単一の供給源から誘導されてもよいし、「キメラ」であってもよい（すなわち、抗体の異なる部分が２つの異なる抗体から得られてもよい）。通常、抗体の基本構造単位は四量体を含む。一般的に、斯かる四量体は、各々、２つの同一のポリペプチド鎖の対から成り、各対は１つの完全長の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１つの完全長の「重」鎖（５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、通常、抗原認識を行う約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸から成る可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端は、通常、エフェクター機能を行い得る定常領域を規定する。ヒトの軽鎖は、通常、カッパおよびラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、通常、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、およびエプシロンとして分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを規定する。ＩｇＧおよびＩｇＭなどの特定のクラスはサブクラスも有している（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４など）。
【００３９】
本明細書に記載される場合、「モノクローナル抗体」または「ＭＡｂ」と言う用語は、同一の免疫細胞から作られ、全てがユニークな親細胞のクローンである抗体の集団を意味する。
【００４０】
本明細書に記載される場合、「抗原結合領域」と言う用語は、抗体分子の中で、抗原と相互作用を行い、該抗原への特異性および親和性を抗体分子に与えるアミノ酸残渣を含む部分である。抗原結合領域は、通常、１つ以上の「相補性決定領域」（ＣＤＲ）を含む。「ＣＤＲ」は抗原結合特異性および親和性に寄与するアミノ酸配列である。特定の抗原結合領域は１つ以上の「枠組み構造」領域も含む。「枠組み構造」領域は、ＣＤＲの適切な配座の維持を助けることにより、抗原結合領域と抗原との間の結合を促進する。枠組み構造領域は、構造的に、抗体内でＣＤＲ間に位置している。
【００４１】
本明細書に記載される場合、「エピトープ」と言う用語は、抗原を標的とする抗体が結合する抗原領域を意味しており、通常、抗体に直接接触する特定のアミノ酸を含んでいる。一般的に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、蛋白質および／または高分子の複合混合物中にある標的抗原のエピトープを優先的に認識する。
【００４２】
本明細書に記載される場合、「免疫学的結合」と言う用語は、抗体分子と該抗体が特異性を有する抗原との間に生じる非共有結合的な相互作用を意味する。免疫学的結合における相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）と言う用語で表現し得る。この場合、小さいＫｄは大きい親和性を意味する。選択された抗体の免疫学的結合特性は、当業界で周知の方法を用いて定量できる。斯かる方法の１つは、抗原結合部位／抗原複合体の形成および解離速度の測定を必要とするが、その場合、斯かる速度は、両方向に平等に影響を及ぼし得る複合パートナーの濃度、相互作用の親和性、および幾何学的パラメータに依存する。従って、「結合速度定数」（Ｋｏｎ）および「解離速度定数」（Ｋｏｆｆ）は、濃度および会合／解離の実際の速度を計算することにより決定できる。Ｋｏｎ／Ｋｏｆｆの比率は、親和性に関連しない全パラメータの解除を可能とし、解離定数Ｋｄに等しい。本開示の抗体は、解離定数（Ｋｄ）が１μＭ未満の場合に標的抗原に特異的に結合すると言われる。本開示の抗体は、Ｋｄが５ｎＭ未満の場合に「高親和性」で特異的に抗原に結合し、Ｋｄが０．５ｎＭ未満の場合に「超高親和性」で特異的に抗原に結合する。
【００４３】
抗体のアミノ酸配列の変形も本開示に含まれることが意図されており、アミノ酸配列の変形は、配列同一性の少なくとも７５％、更に好ましくは、少なくとも８０％、９０％、９５％、最も好ましくは９９％を維持する。それらの間の特定の割合、例えば、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％も含まれる。特に、アミノ酸の保存的変異も意図されている。保存的変異とは、側鎖に関連したアミノ酸ファミリー内で生じる変異である。遺伝子コード型アミノ酸は、一般的に四つのファミリー、すなわち（１）酸性アミノ酸はアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、（２）塩基性アミノ酸はリシン、アルギニン、ヒスチジン、（３）非極性アミノ酸はアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、および（４）非荷電極性アミノ酸はグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンに分けられる。親水性アミノ酸には、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸塩、グルタミン、グルタミン酸塩、ヒスチジン、リシン、セリン、およびトレオニンが含まれる。疎水性アミノ酸には、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンが含まれる。アミノ酸の他のファミリーには、（ｉ）脂肪族ヒドロキシファミリーであるセリンおよびトレオニン、（ｉｉ）アミド含有ファミリーであるアスパラギンおよびグルタミン、（ｉｉｉ）脂肪族ファミリーであるアラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、および（ｉｖ）芳香族ファミリーであるフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが含まれる。例えば、特に置換が枠組み構造部位内のアミノ酸に関係しない場合は、イソロイシンによるロイシンの孤立置換、グルタミン酸塩によるアスパラギン酸塩の孤立置換、セリンによるトレオニンの孤立置換、または構造的に関連したアミノ酸によるアミノ酸の類似置換は、結果的に得られる分子の結合特性には主要な影響を及ぼさないことが当然予想される。アミノ酸の変化が結果的に機能性抗体となるか否かは、抗体誘導体の比活性を調べることにより容易に決定できる。抗体の断片または類似体も当業者により容易に調製可能である。断片または類似体の好ましいアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能性ドメインの境界近くで生じる。
【００４４】
好ましいアミノ酸置換は、（１）蛋白質分解への感受性を減少させる置換、（２）酸化への感受性を減少させる置換、（３）蛋白質複合体を形成するため、結合親和性を変化させる置換、（４）結合親和性を変化させる置換、および（４）斯かる抗体の他の物理化学的特性または機能的特性を付与する、または変化させる置換である。抗体は天然に生じるペプチド配列以外の配列を有する種々のムテインも含み得る。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（好ましくは保存的アミノ酸置換）が天然に生じる配列（好ましくはドメイン（複数も可）の外のポリペプチド部分）内で起き、分子間接触を形成してもよい。保存的アミノ酸置換は親配列の構造的特性を実質的に変化させるべきではない（例えば、置換アミノ酸は、親配列で生じるヘリックスを破壊する傾向を有すべきではない、あるいは親配列を特徴付ける他のタイプの二次的構造を破壊する傾向を有すべきではない）。
【００４５】
本明細書に記載される場合、「実質的に純粋」と言う用語は、対象種が有力種である（すなわちモルベースで、組成物中の他の個々の種よりも豊富である）ことを意味し、実質的に精製された画分は、対象種が（モルベースで）全巨大分子種の少なくとも約５０％を含む組成物であるのが好ましい。一般的に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全巨大分子種の約８０％超、更に好ましくは約８５％、９０％、９５％、および９９％超を含む。対象種が本質的に均一な状態に精製されており（汚染種が従来の検出方法では組成物中に検出できない）、従って、組成物は実質的に単一の巨大分子種で構成されているのが最も好ましい。
【００４６】
本明細書に記載される場合、「患者」および「被験者」と言う用語は同義的に使用されており、ヒトおよび獣医学的対象を含む。
【００４７】
本明細書に記載される場合、「標的抗原」と言う用語は、抗体が選択的に結合可能な分子または分子の一部を意味する。特定の実施形態において、標的は１つ以上のエピトープを有し得る。この場合、分子は外来物である必要はない、あるいは免疫反応を誘発できるか否かは要求されない。
【００４８】
本明細書に記載される場合、「医薬組成物」（または薬剤あるいは医薬品）と言う用語は、患者に適切に投与された場合に望ましい治療効果をもたらし得る化合物、組成物、薬剤、または医薬品を意味する。必ずしも２つ以上のタイプの成分を必要とするものではない。
【００４９】
本明細書に記載される場合、「製薬上許容されるキャリア」と言う用語は、活性剤と一緒に投与される賦形剤、希釈剤、保存剤、溶解剤、乳化剤、助剤、および／またはビヒクルを意味する。斯かるキャリアは、水やオイルなどの無菌液であり、それにはピーナッツ油、大豆油、鉱物油、胡麻油など、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの石油源、動物源、植物源、または合成供給源の無菌液も含まれる。ベンジルアルコールやメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミンテトラ酢酸などのキレート剤、および塩化ナトリウムやデキストロースなどの等張化剤もキャリアであってよい。キャリアと組み合わせて組成物を製造する方法は当業者には周知である。いくつかの実施形態において、「製薬上許容されるキャリア」と言う用語には、医薬品投与に適した任意かつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、等張化剤、および吸収遅延剤が含まれる。製薬学的に活性な物質用の斯かる媒体および薬剤の使用は当業界では周知である。
【００５０】
本明細書に記載される場合、「治療学的有効量」と言う用語は、治療上の応答を患者から引き出し得る抗体の量を意味する。斯かる治療学的有効量は当業者により容易に決定される。
【００５１】
本明細書に記載される場合、「モジュレータ」と言う用語は、分子の活性または機能を変化させる組成物を意味する。例えば、モジュレータは、該モジュレータ不在の場合に観察される活性または機能の大きさと比較して、分子の特定の活性または機能の大きさを増大または減少できる。特定の実施形態において、モジュレータは分子の少なくとも１つの活性または機能の大きさを減少させる阻害因子である。分子の特定の例示的活性および機能には、限定されないが、結合親和性、酵素活性、およびシグナル伝達が含まれる。
【００５２】
本明細書に記載される場合、「治療する」および「治療」と言う用語は、被験者が疾病または他のリスク要因を進展させる危険性を減少させるための治療処置、予防処置、およびアプリケーションを含む。処置は疾病の完全な治癒を要求するものではなく、症状または重要なリスク要因を減少させる実施形態を包含する。
【００５３】
本明細書に記載される場合、「予防する」と言う用語は、事象が起きる可能性の１００％の排除を要求するものではない。むしろ、当該組成物または方法の存在下に事象が起きる可能性が減少することを意味する。
【実施例】
【００５４】
いくつかの例示的実施形態において、プラスミンプロテアーゼドメインの溶媒曝露表面ループのユニークな配列に向けられたモノクローナル抗体を生成した。このプラスミン阻害因子（Ｐｉ）は、小分子基質のプラスミン切断を無効化する点でＥＡＣＡよりも効力が対数で最高７まで高く、線維素溶解を消滅させる点では約５０００倍高かった。最も効力の高いプラスミンの共有結合阻害因子であるα２抗プラスミンと比べると、Ｐｉは、小分子基質のプラスミン触媒を阻害する点で同様に効果的であり、線維素溶解を阻害する点では更に効力が高い。このＰｉは他の阻害因子と比較して非常に特異的であり、結合にはヒトプラスミンのループ４および５を必要としヒト血漿中でプラスミン活性を無効化するが、他の９つの種の血漿では斯かる現象は生じなかった。酵素分析はＰｉが非競合的阻害因子として機能することを示している。ＰｉのＦａｂまたはキメラＦａｂ断片も、プラスミン触媒作用および線維素溶解の点で同等に効果的であった。外科手術の線溶出血において、Ｐｉは、インビボで、ＥＡＣＡの臨床投与量よりも効果的に出血を減少させた。プロテアーゼドメインのユニークなループ配列に向けられた例示的モノクローナル抗体Ｐｉは、特異性および親和性に高く非競合的なプラスミン阻害因子であり、実験的な外科手術出血をインビボで有意に減少させることをデータが示している。斯かるＰｉの改善された特異性および効力により、生命を脅かす重大な出血に対し、より効果的なアプローチが導かれるであろう。超強力で特異的なモノクローナル抗体Ｐｉは脳血液関門または胎盤を有意には通過しないし、腎臓から分泌されることもない。斯かる特性の故に、斯かるＰｉは、線維素溶解に関連した重大な出血に対する現在の治療の限界を乗り越える助けとなり得る。
【００５５】
方法
（モノクローナル抗体作製）
アプロチニンアガロースに結合したヒトプラスミンプロテアーゼドメインにおいて８か月間に４度免疫化したマウスの細胞を用いて、以下に記載するように体細胞融合によりモノクローナル抗体を作製した１９。直接結合試験を行い、ヒトプラスミノーゲンプロテアーゼドメインに結合する抗体の最大抗体価を有するマウスを特定した。ウロキナーゼで予め活性化した（１００Ｕ、３０分）ヒトプラスミノーゲンプロテアーゼドメイン（５０ｕｇ）により、腹膜内でマウスを過免疫処置した。麻酔後、以下に記載するように、ポリエチレングリコールを用いて、免疫脾臓細胞をＳＰ２／０細胞と融合させた１９。ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン選択培地において、５％の二酸化炭素雰囲気中、３７℃で、融合細胞を培養した。マイクロタイタープレートを１時間ヤギ抗マウスＦａｂ抗体（５ｕｇ／ｍＬ、２５ｕＬ）でコーティングし、ラジオイムノアッセイによりクローンを選択した。ウェルは１％ウシ血清アルブミンでブロックした。ハイブリドーマ上澄み液を添加し、プレートを室温（ＲＴ）で１時間培養した。洗浄後、ウェルを１２５Ｉ−ヒトプラスミン（５０，０００ｃｍｐ／２５ｕＬ）で１時間培養した。洗浄後、結合した１２５Ｉ−ヒトプラスミンをガンマシンチグラフィーで検出した。希釈を制限することによりポジティブなハイブリドーマをサブクローニングし、それを液体窒素中に保存した。
【００５６】
（モノクローナル抗体精製）
ハイブリドーマ上澄み液を流速１ｍＬ／分で抗マウスＩｇＧアガロースカラム（Ｉｍｍｕｎｅｃｈｅｍ社、カナダ）に注いだ。カラムはｐＨ７．４のＰＢＳで洗浄した。抗体を０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．９）で溶出し、その後４℃のＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で一晩透析した。抗体は、アミコンウルトラ−１５遠心濾過フィルター（ミリポア、ビレリカ、マサチューセッツ州）を用い、該製造元の指示に従って濃縮した。蛋白質濃度はＢＣＡ法により決定した。
【００５７】
（遺伝子組み換え蛋白質）
以下に記載するように（９）、プラスミンプロテアーゼドメインを遺伝子組み換えにより大腸菌中で発現させた。多重複プライマーを用いたＰＣＲクローニングにより、ハイブリドーマ細胞からＰｉのｃＤＮＡ配列を単離した。Ｐｉのヒト化キメラバージョンを一過性細胞トランスフェクションによりＨＥＫ２９３細胞中で発現させた。９６時間後、懸濁培養液を集めた。精製されたキメラＰｉをＨｉＴｒａｐ  ｒＰｒｏｔｅｉｎＧ  ＦＦで精製し、０．２ｕｍフィルターを通過させた。該フィルターは、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社（メンフィス、テネシー州）が提供したものである。
【００５８】
（飽和結合解析）
２ｕｇ／ｍＬのプラスミンまたはプラスミノーゲンでコーティングした９６ウェルプレート中、室温で１時間、ＥＬＩＳＡにより飽和結合解析を行った。ウェルはＰＢＳ−Ｔ（１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で６度洗浄した。非特異的な蛋白質結合部位は、室温で１時間、１％ＢＳＡを用いてブロックした。上記のようにプレートを洗浄後、室温で、１時間かけ、種々の濃度の抗体（０．００２〜１００ｕｇ／ｍＬ）を添加した（２回の試験）。プレートを洗浄し、西洋ワサビ（ＨＲＰ）複合ヤギ抗マウス二次抗体（１：８０００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ダラス、テキサス州）をプレートに添加した。室温で１時間培養後プレートを洗浄し、ＴＭＢを添加した。次に、３７０ｎｍで吸光度を読んだ。
【００５９】
（Ｐｉ結合の特異性）
ヒトプラスミノーゲン、マウスプラスミノーゲン、ｔＰＡ，トリプシンまたはキモトリプシン（１０ｕｇ／ｍＬ）でコーティングし１％ＢＳＡでブロックした９６ウェルプレート中、ＥＬＩＳＡを用いて、Ｐｉによる異なるセリンプロテアーゼへの結合を評価した。培養および洗浄後、Ｐｉまたは対照のモノクローナル抗体上澄み液（抗ジゴキシン）を１時間かけてウェルに添加した（３回の試験）。次に、ＨＲＰ複合ヤギ抗マウス抗体（１：５０００、Ｓｃ−２００５、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を添加した。１時間培養後プレートを洗浄した。ウェルにＴＢＳを添加し、３７０ｎｍで吸光度を記録した。
【００６０】
（プラスミン阻害分析）
ヒトプラスミン（２．８ｎＭ）をＳ２２５１基質およびＰｉ（１ｘ１０−９〜３．３ｘ１０−８Ｍ）またはＥＡＣＡ（３．９ｘ１０−３〜０．２５ｘ１０−１Ｍ）と混合し（または阻害因子なしで）、Ａ４０５ｎｍで２０分間、パラニトロアニリド産物の放出により基質切断速度をモニターした。プラスミンの残存活性率を阻害因子の対数濃度の関数として決定した。
【００６１】
ヒトプラスミンによる基質切断速度へのＰｉの影響を調べた。基質Ｓ２２５１（０．１〜４ｍＭ）の存在下、ヒトプラスミン（１００ｎＭ、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）をＰｉ（５０ｎＭ）と混合した（または混合しなかった）。基質切断の初速度をＡ４０５でモニターした（６分）。データをプロットし、グラフパッドプリズムプログラムによるミカエリスメンテン速度式を用いて分析した。
【００６２】
α２ＡＰおよびＰｉによるヒトプラスミン阻害を比較した。ヒトプラスミン（２００ｎＭ）をα２ＡＰ（１２．５〜２００ｎＭ）またはＰｉ（１５．６２５〜５００ｎＭ）と混合し（または阻害因子なしで）、Ｓ２２５１の切断をＡ４０５でモニターした（２回試験）。
【００６３】
マウスまたはキメラＦａｂによるプラスミン活性への影響を調べた。プラスミン（２５ｎＭ）をＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で種々の濃度のマウスＦａｂまたはキメラＦａｂ（ｃＦａｂ）およびＳ２２５１（０．５ｍＭ）と混合した。プラスミン活性は、Ａ４０５におけるパラニトロアニリド産物の経時的放出により測定した。
【００６４】
（プラスミン阻害の特異性）
プラスミノーゲン活性因子ウロキナーゼの添加後、異なる動物プラスミンへのＰｉの影響を調べた。Ｐｉ（１ｕＭ、１０ｕＬ）または緩衝液、Ｓ２２５１（１０ｕＬ、０．５ｍＭ最終）、ウロキナーゼ（１００または２００Ｕ）（全量１００ｕＬ）の存在下、種々の動物血漿（５ｕＬ）をマイクロタイタープレート内でＰＢＳと混合した。プレートは３７℃で培養し、プラスミン生成速度を４０５ｎｍにおける基質切断により１時間モニターした。
【００６５】
（第Ｖ因子切断）
ＥＡＣＡ（１ｍＭ）、Ｐｉ（５ｕｇ）または対照モノクローナル抗体（ジゴキシン、５ｕｇ）の存在下、ヒト第Ｖ因子（２ｕｇ、ＩＨＦＶ、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を室温（ＲＴ）で１時間プラスミン（０．０５ｕｇ）と混合した。次に、還元条件下、７．５％のゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。クマシーブルー染料で染色することにより、蛋白質バンドを検出した。
【００６６】
（インビトロにおける線維素溶解解析）
微量の１２５Ｉフィブリノーゲンの存在下、３７℃で１時間、ＣａＣｌ２（１０ｍＭ）およびトロンビン（１Ｕ／ｍＬ）で凝固させたヒト血漿において、線維素溶解へのＥＡＣＡまたはＰｉの影響を調べた（２回試験）。１ｍＬのＴＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄後、種々の量のＰｉ（６２．５〜１０００ｎＭ）、ＥＡＣＡ（０．１２５〜２ｍＭ）の存在下（または阻害因子なしで）、ｔＰＡ（５ｎＭ）を添加した。２．５時間後、上澄み液に溶解した１２５Ｉフィブリンの量を測定することにより、線維素溶解の量を測定した。
【００６７】
ヒトプラスミノーゲン（２ｕＭ）およびα２ＡＰ（１ｕＭ）またはＰｉ（１ｕＭ）、および種々の量のｔＰＡ（０〜１０ｎＭ）の存在下に、上述のように形成された血餅中で、α２ＡＰおよびＰｉによる線維素溶解への影響を調べた。マイクロタイタープレートのウェル中で、２時間にわたり、Ａ４０５ｎｍにおいて、血餅溶解をモニターした（２回試験）。以下に記載されるように（２６）、Ａ４０５における相対的減少により線維素溶解の量を測定した。
【００６８】
マイクロタイタープレートアッセイにおいて、霊長類の血餅溶解を阻害するＰｉの能力を調べた。種々の濃度のＰｉ（０〜２０００ｎＭ）、ＣａＣｌ２（２ｍＭ）、トロンビン（０．１２５Ｕ／ｍＬ）、およびヒトフィブリノーゲン（２ｍｇ／ｍＬ）、並びにウロキナーゼ（１０Ｕ）存在下に、ヒト、ヒヒ、またはアフリカミドリザルの血漿（５ｕＬ）を９６ウェルプレートに添加した。ウェルは３７℃で培養し、血餅溶解を動力学的に１２０分間記録し、完全な血餅溶解に要する時間を記録した。
【００６９】
ＰｉＩｇＧ、Ｆａｂ、またはキメラＦａｂの影響も、血餅溶解アッセイにおいてマイクロタイタ―プレート中で比較した。ヒト血漿（５ｕＬ）をＰｉ（ＩｇＧまたはＦａｂ、０〜４００ｎＭ）、フィブリノーゲン（２ｍｇ／ｍＬ）、ＣａＣｌ２（２ｍＭ）、トロンビン（０．１２５Ｕ／ｍＬ）、およびウロキナーゼ（１０Ｕ）（全量８０ｕＬ）と混合した。３７℃における血餅溶解を４０５ｎｍでモニターした。３０分における血餅溶解率を、  ベースライン＝１００％ｘ（ピーク吸光度−３０分吸光度）／（ピーク吸光度−ベースライン吸光度）に基づき、ピーク濁度における変化率として測定した。
【００７０】
Ｐｉ、ＭＡｂ３４０、および対照ＭＡｂ（抗ジゴキシン）の相対的効果を、血餅溶解アッセイにおいてマイクロタイタープレート中で比較した。ヒト血漿（５０ｕＬ）をＭＡｂ（２０ｕｇ）と混合し（２回試験）、次に遺伝子組み換え（ｒ）−ｔＰＡ（２ｎｍ）と一緒にまたはそれなしで、ＣａＣｌ２およびトロンビンで凝固した。３７℃における血餅溶解を４０５ｎｍで１２０分間モニターした。１２０分観測期間中に血餅を完全に溶解するのに必要な時間を記録した。ｒ−ｔＰＡおよびＭＡｂ３４０またはＰｉと一緒に培養した血餅は有意には溶解しなかった。＊＊＊ｐ＜０．００１：対照ＭＡｂを有するサンプルまたはＭＡｂを有さないサンプルにおける血餅溶解時間。
【００７１】
（インビトロにおける線溶出血解析）
麻酔下にあるマウスを無作為的および盲検により、生理食塩水（対照）、Ｐｉ（１００ナノモル／ｋｇ）、またはＥＡＣＡ（５１０マイクロモル／ｋｇ）で処理した。ヒトプラスミノーゲン（１００ナノモル／ｋｇ）およびプラスミノーゲン活性化因子（８０，０００ＩＵ／ｋｇ）を６０分かけて投与した。尻尾からの出血は注入４０分後に開始した。以下に記載するように、尻尾を３７℃の生理食塩水３ｍＬで５分間予め温めた（２７、２８）。
【００７２】
（統計的分析）
データは平均＋／−標準誤差で示してある。飽和結合および速度対基質曲線は、グラフパッドプリズムによる１サイト結合双曲線モデルおよびミカエリスメンテン速度モデルを用いて非線形回帰により分析した。インビトロの出血データは、修正型Ｄｕｎｎ法を用いたノンパラメトリックなクラスカル・ウォリス一元配置分散分析により分析した。ｐ＜０．０５は有意と考えた。
【００７３】
結果
（特定のプロテアーゼドメインループに向けられたモノクローナル抗体プラスミン阻害因子（Ｐｉ））
イムノブロット法により示されるように（図１Ａ）、プラスミン（マイクロプラスミン）のプロテアーゼドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体プラスミン阻害因子（Ｐｉ）を生成した。プロテアーゼのコア構造はセリンプロテアーゼ間で高度に保存されているが、プラスミンの外部ループ構造（図１Ｂ）は、他の酵素とは有意に異なっており、プラスミンと、基質モディファイア（ストレプトキナーゼなど）、基質、および阻害因子との間の特異的な相互作用を介在することが証明されている（図１Ｂ）（９）。プラスミンのループ構造を変化させた種々のプラスミン変異株を用いた結合試験により、Ｐｉは、天然のループ４および５は必要とするが天然のループ３、６、または７の配列を必要としないプロテアーゼドメインのエピトープ（図１Ｂ）に結合することが示された（図１Ｃ）。このＰｉは高結合活性でプラスミノーゲンに結合しており（Ｋｄ３．４＋／−０．８ｎＭ、図１Ｄ）、プラスミノーゲンの通常の生理学的濃度で結合が十分であることをそれは示している。
【００７４】
（Ｐｉは小分子基質におけるプラスミン触媒機能の強力な非競合的阻害因子である）
Ｐｉは、ＥＡＣＡよりも対数で約７倍の効力でプラスミン介在による小分子トリペプチドパラニトロアニリド基質（Ｓ２２５１）の切断を効果的に無効化した。ＰｉはプラスミンによるＳ２２５１切断のＶｍａｘ（最大速度）を減少させ、主にプラスミン活性の非競合的阻害因子として機能することを示した。Ｐｉは、最も強力なプラスミンの共有結合阻害因子であるα２抗プラスミンと比較すると、プラスミンによるＳ２２５１切断を阻害する点では同様の効力を有している（図３Ｃ）。ＭＡｂのＦｃ領域がＰｉの阻害機能の立体障害となっているか否か、あるいは阻害機能に影響を及ぼしているか否かを決定するため、Ｆｃドメインを欠如したＰｉのＦａｂ断片の影響を調べた。多重複プライマーを用いたＰＣＲクローニングにより、ＰｉのｃＤＮＡ配列を得た（表１）。マウスＦａｂも遺伝子組み換えによるＰｉのキメラＦａｂも、トリペプチド基質を用いたプラスミン活性を強力に阻害し（図２Ｄ）、大きいＩｇＧ分子による立体効果はプラスミン活性の阻害には有意には寄与しないことが示された。
【００７５】
（Ｐｉの相対的特異性）
Ｐｉの特異性を決定するため、他のセリンプロテアーゼへの結合を調べた。対照（抗ジゴキシン）モノクローナル抗体との比較により、Ｐｉはマウスプラスミノーゲン、ヒトｔＰＡ、トリプシン、キモトリプシン、またはウシ血清アルブミン（対照）との特異的結合を有しないことが示された（図３Ａ）。Ｐｉによるプラスミンへの影響をいくつかの異なる動物の血漿で調べた。Ｐｉはウロキナーゼにより生成されたヒト血漿のプラスミンを抑制したが、イヌ、モルモット、ウシ、ネコ、アレチネズミ、ハムスター、ブタ、ウサギ、またはラットの血漿ではプラスミン活性を阻害しなかった（図３Ｂ）。非ヒトの霊長類のプラスミンはヒトのプラスミンと比べ最も高い相同性を有している。Ｐｉは、プラスミン誘発によるヒト血餅の線溶時間を著しく長引かせたし、ヒヒおよびアフリカミドリザルに関しても用量依存的抑制を示した（図３Ｃ）。斯かるデータは、Ｐｉがヒトおよび非ヒト霊長類のプラスミンを特異的に阻害し、非霊長類のプラスミンには影響を及ぼさない、あるいは他のセリンプロテアーゼには結合しないことを示している。図３Ｄは、プラスミンプロテアーゼドメインの異なるエピトープに結合する２つの異なる反応抑制的抗体であるＰｉＭＡｂ３８とＰｉＭａｂ３４０による相対的な血餅溶解を示している。
【００７６】
（プラスミンプロテアーゼドメインに向けられた他のＰｉの作製）
斯かる方法の一般化可能性を調べるため、プラスミンプロテアーゼドメインに特異的に生成された他のモノクローナル抗体を試験した。Ｐｉとは異なるエピトープ（すなわちループ７を必要とする）に結合するＭＡｂ３４０も、ｒ−ｔＰＡにより開始されたヒト血餅溶解を阻害するが、一方、対照（抗ジゴキシン）のＭＡｂは斯かる阻害を行わなかった（図３Ｄ）。
【００７７】
（第Ｖ因子切断および線維素溶解の相対的阻害）
インビボでは、プラスミンによる第Ｖ因子切断は、無規制の血液プラスミンレベルにおける顕著な特徴である。インビトロでは、プラスミンは、対照（抗ジゴキシン抗体）の存在下、第Ｖ因子を容易に切断して低分子量のバンドを形成する（図４Ａ）。ＥＡＣＡの治療処置レベル（１ｍＭ）は第Ｖ因子の切断を僅かに弱める（図４Ａ）。しかし、Ｐｉの存在下では、第Ｖ因子切断は用量依存的に弱められた（図４Ａ）。更にＰｉは、プラスミン介在によるヒトフィブリン血餅の線溶を有意に抑制した（図４Ｂ）。ＥＡＣＡも線維素溶解を減少させるが、Ｐｉよりも効力が相対的に約５，０００倍小さい（図４Ｂ）。同じ用量のα２抗プラスミンと比較すると、Ｐｉは、ｔＰＡの用量を増やすことにより誘発したプラスミン介在によるヒトフィブリン血餅溶解の抑制の点で、２〜３倍強力であった（図４Ｃ）。Ｐｉの全ＩｇＧ、Ｆａｂ、およびキメラＦａｂフォームが同様の用量依存的な効力で血餅溶解を効果的に阻害したが、これはＩｇＧ分子関連の線維素溶解には立体効果が存在しないことを示している。  
【００７８】
外科手術時の動脈／静脈出血に関する無作為的盲検において、線溶出血抑制用のＰｉの潜在的有用性をインビボで調べた。Ｐｉはヒトに特異的に結合し阻害するがマウスのプラスミンに対してはそういう作用がないので、ヒトのプラスミノーゲンおよびヒトのｔＰＡを投与したヒト化モデルを開発した（２７、２８）。ＥＡＣＡの臨床投与量（５１０マイクロモル／ｋｇ）は、生理食塩水（対照）と比較し、出血時間も出血損失も減少させなかった（図５Ａ、Ｂ）。Ｐｉ（１００ナノモル／ｋｇ）は、対照と比べて（図５Ｂ、８５％超、ｐ＜０．０５）またはＥＡＣＡ処置マウスと比べて（図５Ｂ、ｐ＜０．０５）出血時間（８０％超、ｐ＜０．０１、図５Ａ）も血液損失も顕著に抑制した。
【００７９】
現在の線溶出血治療用プラスミン抑制因子の治療的価値は、特異性の欠如、低い効力、およびオフターゲット効果による毒性の所為で限定的である。斯かる効力および特異性の課題に対処するため、プラスミンプロテアーゼドメインの表面曝露ループにおけるユニークな配列（これは基質モディファイア、阻害因子、および基質との相互作用を介在することが証明されている）に対し、例示的なモノクローナル抗体Ｐｉを作製した１８。斯かるＰｉは、ヒトプラスミンのプロテアーゼドメインへの結合面で、リシン類似体およびα２抗プラスミンに比べ、他のセリンプロテアーゼに対しては示さない高い特異性および親和性を示した。Ｐｉは、プラスミン介在による小分子基質（Ｓ２２５１）の蛋白質分解に対し、強力な非競合的阻害因子として機能する。線維素溶解試験において、小分子基質切断の阻害に関してはＥＡＣＡよりも対数で約７以上効力が高く、フィブリン切断阻害に関しては約５０００倍強力である。既知のプラスミン阻害因子の中で最も強力な阻害因子であるα２抗プラスミンと比較すると、Ｐｉは、小分子量基質のプラスミン切断を阻害する点で同様に効果的であり、線溶活性阻害の点では更に強力であるように見える。Ｐｉは霊長類においてプラスミン介在線維素溶解を強力に無効化したが、他の動物のプラスミンにおいては斯かる作用は見られなかった。実験的な外科手術の出血モデルにおけるインビボでの線溶出血停止の点で、Ｐｉは臨床投与量のＥＡＣＡよりも効果的であった。
【００８０】
（Ｐｉの推定アミノ酸配列）
クローン化したハイブリドーマ細胞からＰｉのｃＤＮＡを得た。ｃＤＮＡをテンプレートとする変性マウスＩｇＧプライマー対を用いて、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）の遺伝子を増幅した。
【００８１】
【表１】
2019055949.tif 000002
【００８２】
【表２】
2019055949.tif 000003
【表３】
2019055949.tif 000004
【００８３】
【表４】
2019055949.tif 000005
【００８４】
【表５】
2019055949.tif 000006
【００８５】
図６Ａ〜６ＤはＰｉ軽鎖（図６Ａ）および重鎖（図６Ｂ）の可変配列に関するＣｌｏｔｈｉａ一連番号付けである。ＣＤＲループおよび配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）は、軽鎖に関して図６Ｃに示してある（青および緑の２つのシェードのグレースケール）。ＣＤＲ１  ＱＤＩＮＫＹ（配列番号９）、ＣＤＲ２  ＹＴＳ（配列番号１０）、ＣＤＲ３  ＬＱＹＤＮＬＹＴ（配列番号１１）。ＣＤＲループおよび配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）は、重鎖に関して図６Ｄに示してある（赤、橙色、および紫のグレースケール）。ＣＤＲ１  ＧＦＤＦＳＲＹＷ（配列番号１２）、ＣＤＲ２  ＩＮＰＤＳＳＴＩ（配列番号１３）、ＣＤＲ３  ＡＳＹＣＧＹＳＹＤＡＬＤＣ（配列番号１４）。ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ  Ｐｒｏｇｒａｍバージョン４．９．２（２０１６−０９−２６）  Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ  Ｆ．，  Ｋａａｓ  Ｑ．ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ  Ｍ．−Ｐ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３８，  Ｄ３０１−３０７（２０１０）により作製。ＰＭＩＤ：１９９００９６７。軽鎖可変領域（配列番号１５）。重鎖可変領域（配列番号１６）。
【００８６】
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２３．   Ａｌｂｒｅｃｈｔ  Ｓ，  Ｍａｇｄｏｌｅｎ  Ｖ，  Ｈｅｒｚｏｇ  Ｕ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｏｌｕｂｌｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｃｔｏｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｌｙｓｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ｋｒｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ．  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ２００２；８８：１０５４−１０５９  ＰＭＩＤ  １２５２９７５９．
２４．   ｖａｎ  Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ  ＡＪ，  Ｖｅｅｒｍａｎ  Ｈ，  Ｐａｎｎｅｋｏｅｋ  Ｈ．  Ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｋｒｉｎｇｌｅ−２  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｆｉｂｒｉｎ．  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｒｉｎｇｌｅ−２  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｆｉｂｒｉｎ  ｂｙ  ｅｐｓｉｌｏｎ−ａｍｉｎｏ  ｃａｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １９８６；２６１：１４２１４−１４２１８  ＰＭＩＤ  ３０２１７３２．
２５．   Ｈｏｏｖｅｒ−Ｐｌｏｗ  ＪＬ，  Ｍｉｌｅｓ  ＬＡ，  Ｆｌｅｓｓ  ＧＭ，  Ｓｃａｎｕ  ＡＭ，  Ｐｌｏｗ  ＥＦ．  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｙｓｉｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）  ａｎｄ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  １９９３；３２：１３６８１−１３６８７  ＰＭＩＤ  ８２５７７０２．
２６．   Ｍａｎｊｉ  ＲＡ，  Ｇｒｏｃｏｔｔ  ＨＰ，  Ｌｅａｋｅ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｅｉｚｕｒｅｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｃａｒｄｉａｃ  ｓｕｒｇｅｒｙ：  ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｔｒａｎｅｘａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ．  Ｃａｎ  Ｊ  Ａｎａｅｓｔｈ．  ２０１２；５９：６−１３  ＰＭＩＤ  ２２０６５３３３．
２７．        Ａｂｏｕ−Ｄｉｗａｎ  Ｃ，  Ｓｎｉｅｃｉｎｓｋｉ  ＲＭ，  Ｓｚｌａｍ  Ｆ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｓｍａ  ａｎｄ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｔｒａｎｅｘａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｂｙｐａｓｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ２０１１；８７９：５５３−５５６  ＰＭＩＤ  ２１３００５７７．
２８．   ＭｃＣｏｒｍａｃｋ  ＰＬ．  Ｔｒａｎｅｘａｍｉｃ  ａｃｉｄ：  ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ．  Ｄｒｕｇｓ．  ２０１２；７２：５８５−６１７  ＰＭＩＤ  ２２３９７３２９．
２９．   Ｂｅｒｍａｎ  Ｍ，  Ｃａｒｄｏｎｅ  Ｄ，  Ｓｈａｒｐｌｅｓ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｅｘａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｅｎｄａｒｔｅｒｅｃｔｏｍｙ  ｓｕｒｇｅｒｙ  ｗｉｔｈ  ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｉａ：  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ２００  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．  ２０１０；９０：１４３２−１４３６  ＰＭＩＤ  ２０９７１２３４．
３０．        Ｆｕｒｔｍｕｌｌｅｒ  Ｒ，  Ｓｃｈｌａｇ  ＭＧ，  Ｂｅｒｇｅｒ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒａｎｅｘａｍｉｃ  ａｃｉｄ，  ａ  ｗｉｄｅｌｙ  ｕｓｅｄ  ａｎｔｉｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ  ａｇｅｎｔ，  ｃａｕｓｅｓ  ｃｏｎｖｕｌｓｉｏｎｓ  ｂｙ  ａ  ｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ（Ａ）  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ．  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．  ２００２；３０１：１６８−１７３  ＰＭＩＤ  １１９０７１７１．
３１．   Ｎｇ  Ｗ，  Ｊｅｒａｔｈ  Ａ，  Ｗａｓｏｗｉｃｚ  Ｍ．  Ｔｒａｎｅｘａｍｉｃ  ａｃｉｄ：  ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗ．  Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｏｌ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｔｈｅｒ．  ２０１５；４７：３３９−３５０  ＰＭＩＤ  ２５７９７５０５．
３２．   Ｆｅｒｇｕｓｓｏｎ  ＤＡ，  Ｈｅｂｅｒｔ  ＰＣ，  Ｍａｚｅｒ  ＣＤ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ  ａｎｄ  ｌｙｓｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎ  ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ  ｃａｒｄｉａｃ  ｓｕｒｇｅｒｙ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２００８；３５８：２３１９−２３３１  ＰＭＩＤ  １８４８０１９６．
３３．   Ｋｕｉｔｕｎｅｎ  Ａ，  Ｈｉｉｐｐａｌａ  Ｓ，  Ｖａｈｔｅｒａ  Ｅ，  Ｒａｓｉ  Ｖ，  Ｓａｌｍｅｎｐｅｒａ  Ｍ．  Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｅｘａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｎ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｆｔｅｒ  ｃａｒｄｉａｃ  ｓｕｒｇｅｒｙ．  Ａｃｔａ  Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｏｌ  Ｓｃａｎｄ．  ２００５；４９：１２７２−１２７９  ＰＭＩＤ  １６１４６４６３．
３４．        Ｈｅｎｒｙ  ＤＡ．  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｕｐｐｅｒ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ．  Ｌａｎｃｅｔ．  １９９３；３４１：５２７−５２８  ＰＭＩＤ  ８０９４７７７．
３５．   Ｂｅｅｂｅ  ＤＰ，  Ａｒｏｎｓｏｎ  ＤＬ．  Ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ  ａｓｓａｙ  ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅｓ．  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ．  １９８７；４７：１２３−１２８  ＰＭＩＤ  ３１１６７０９．
３６．   Ｔｈｏｍａｓ  ＳＧ，  Ｃａｌａｍｉｎｕｓ  ＳＤ，  Ａｕｇｅｒ  ＪＭ，  Ｗａｔｓｏｎ  ＳＰ，  Ｍａｃｈｅｓｋｙ  ＬＭ．  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＨＳ１  ｉｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ．  ＢＭＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００７；８：４６  ＰＭＩＤ  １７９９６０７６．
３７．  Ｌｉｕ  Ｙ，  Ｊｅｎｎｉｎｇｓ  ＮＬ，  Ｄａｒｔ  ＡＭ，  Ｄｕ  ＸＪ．  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｉｎｇ  ａ  ｓｉｍｐｌｅｒ，  ｍｏｒｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｔａｉｌ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  ２０１２；２：３０−３６  ＰＭＩＤ  ２４５２０５３１．
【図１Ａ】
2019055949.tif 000007
【図１Ｂ】
2019055949.tif 000008
【図１Ｃ】
2019055949.tif 000009
【図１Ｄ】
2019055949.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2019055949.tif 000014
【図６−１】
2019055949.tif 000015
【図６−２】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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