(57)【要約】本発明は、（例えば、ＩｇＥ媒介性過敏症）によって媒介される病状および疾患の処置のための１つ以上のＲＮＡｉ因子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはＲＮＡｉベクター）を含有する組成物ならびにこの目的に有効なＲＮＡｉ因子を同定するための系を提供する。組成物は、アレルギー性鼻炎および／または喘息の処置に適切である。さらに、本発明は、ＲＮＡｉ因子／送達因子組成物および使用方法を提供する。本発明の特定の実施形態では、ＲＮＡｉ因子を含有する組成物は呼吸経路によって送達される。
2007527240.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＥ媒介性疾患または病状の発症、病原性、または症状に関係するタンパク質をコードする標的転写物を標的化する、ＲＮＡｉ因子。
【請求項２】
前記疾患が、アレルギー性鼻炎または喘息である、請求項１に記載のＲＮＡｉ因子。
【請求項３】
前記転写物が、ＦＣεＲ  α鎖、ＦＣεＲ  β鎖、ｃ−Ｋｉｔ、Ｌｙｎ、Ｓｙｋ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、４−１ＢＢリガンド、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＣＤ８３、ＳＬＡＭ、共通γ鎖およびＣＯＸ−２からなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項１に記載のＲＮＡｉ因子。
【請求項４】
前記ＲＮＡｉ因子がＲＮＡｉベクターである、請求項３に記載のＲＮＡｉ因子。
【請求項５】
前記ＲＮＡｉ因子がｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである、請求項３に記載のＲＮＡｉ因子。
【請求項６】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、少なくとも１５ヌクレオチド長の二重鎖部分を含む、請求項５に記載のＲＮＡｉ因子。
【請求項７】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、約１９ヌクレオチド長の二重鎖部分を含む、請求項５に記載のＲＮＡｉ因子。
【請求項８】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、配列が少なくとも１５個の連続するヌクレオチドにわたって表１〜２６に列挙した配列と実質的に相補的である部分を含むアンチセンス鎖を含む、請求項５に記載のＲＮＡｉ因子。
【請求項９】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、配列が少なくとも１５個の連続するヌクレオチドにわたって表１〜２６に列挙した配列と１００％相補的である部分を含むアンチセンス鎖を含む、請求項５に記載のＲＮＡｉ因子。
【請求項１０】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、配列が少なくとも１５個の連続するヌクレオチドにわたって配列番号１〜３１５のいずれかに列挙した配列と実質的に同一である部分を含むセンス鎖を含む、請求項５に記載のＲＮＡｉ因子。
【請求項１１】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、配列が少なくとも１５個の連続するヌクレオチドにわたって配列番号１〜３１５のいずれかに列挙した配列と１００％同一である部分を含むセンス鎖を含む、請求項５に記載のＲＮＡｉ因子。
【請求項１２】
エアゾール送達のために処方された、請求項１に記載のＲＮＡｉ因子を含有する、組成物。
【請求項１３】
乾燥粉末として処方された、請求項１に記載のＲＮＡｉ因子を含有する、組成物。
【請求項１４】
ＩｇＥ媒介性疾患または病状を処置または予防する方法であって、該方法は、
（ａ）ＩｇＥ媒介性病状の危険性があるか罹患している被験体を準備する工程；および
（ｂ）請求項１に記載のＲＮＡｉ因子を該被験体に投与する工程；
を包含する、方法。
【請求項１５】
前記ＩｇＥ媒介性病状が、アレルギー性鼻炎または喘息である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記転写物が、ＦＣεＲ  α鎖、ＦＣεＲ  β鎖、ｃ−Ｋｉｔ、Ｌｙｎ、Ｓｙｋ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、４−１ＢＢリガンド、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＣＤ８３、ＳＬＡＭ、共通γ鎖およびＣＯＸ−２からなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物が、吸入送達によって被験体の呼吸器系に直接投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
薬学的に受容可能なキャリアをさらに含有する、請求項１に記載のＲＮＡｉ因子を含有する、組成物。
【請求項１９】
送達因子をさらに含有する、請求項１に記載のＲＮＡｉ因子を含有する、組成物。
【請求項２０】
敗血症、ショック、または熱傷関連損傷の処置方法であって、（ｉ）敗血症、ショックまたは熱傷関連損傷の処置を必要とする被験体を準備する工程、および（ｉｉ）該被験体にＴｏｌｌ様レセプターを標的化するＲＮＡｉ因子を含有する組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２１】
標的転写物を標的化するｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ、またはハイブリダイズするか自己ハイブリダイズして標的転写物を標的化するｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡを形成する１つ以上のＲＮＡ分子の転写のためのテンプレートを含む核酸を含有する組成物であって、該標的転写物が、ＦＣεＲ  α鎖、ＦＣεＲ  β鎖、ｃ−Ｋｉｔ、Ｌｙｎ、Ｓｙｋ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、４−１ＢＢリガンド、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＣＤ８３、ＳＬＡＭ、共通γ鎖およびＣＯＸ−２からなる群より選択されるタンパク質をコードする、組成物。
【請求項２２】
前記タンパク質が、ＦＣεＲＩα鎖である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記タンパク質が、ＦＣεＲＩβ鎖である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記タンパク質が、ｃ−Ｋｉｔである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記タンパク質が、Ｌｙｎである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記タンパク質が、Ｓｙｋである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記タンパク質が、ＩＣＯＳである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２８】
前記タンパク質が、ＯＸ４０Ｌである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２９】
前記タンパク質が、ＣＤ４０である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３０】
前記タンパク質が、ＣＤ８０である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３１】
前記タンパク質が、ＣＤ８６である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３２】
前記タンパク質が、ＲｅｌＡである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記タンパク質が、ＲｅｌＢである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記タンパク質が、４−１ＢＢリガンドである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３５】
前記タンパク質が、ＴＬＲ１である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３６】
前記タンパク質が、ＴＬＲ２である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３７】
前記タンパク質が、ＴＬＲ３である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３８】
前記タンパク質が、ＴＬＲ４である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３９】
前記タンパク質が、ＴＬＲ５である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項４０】
前記タンパク質が、ＴＬＲ６である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項４１】
前記タンパク質が、ＴＬＲ７である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項４２】
前記タンパク質が、ＴＬＲ８である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記タンパク質が、ＴＬＲ９である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項４４】
前記タンパク質が、ＣＤ８３である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項４５】
前記タンパク質が、ＳＬＡＭである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項４６】
前記タンパク質が、共通γ鎖である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項４７】
前記タンパク質が、ＣＯＸ−２である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項４８】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、少なくとも１５ヌクレオチド長の二重鎖部分を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項４９】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、約１９ヌクレオチド長の二重鎖部分を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項５０】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、少なくとも１５ヌクレオチド長の二重鎖部分および少なくとも１つの一本鎖３’突出を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項５１】
前記ｓｈＲＮＡが、二重鎖構造を形成し得る自己相補領域を有する１つのＲＮＡ鎖を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項５２】
前記ｓｉＲＮＡが、二重鎖構造を形成し得る２つの相補性ＲＮＡ鎖を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記二重鎖構造が、少なくとも１５ヌクレオチド長である、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５４】
前記二重鎖構造が、少なくとも１５ヌクレオチド長である、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５５】
前記二重鎖構造が、約１９ヌクレオチド長である、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５６】
前記二重鎖構造が、約１９ヌクレオチド長である、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５７】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが前記標的転写物の領域に完全に相補的である部分を含み、該部分が少なくとも１５ヌクレオチド長である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項５８】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが多くとも１つのヌクレオチド以外は前記標的転写物の部分に完全に相補的である部分を含み、該部分が少なくとも１５ヌクレオチド長である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項５９】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが多くとも２つのヌクレオチド以外は前記標的転写物の部分に完全に相補的である部分を含み、該部分が少なくとも１５ヌクレオチド長である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項６０】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、センス鎖配列が配列番号１〜３１５に示す配列のいずれかに記載の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドからなるコア二重鎖領域を有するか、該コア二重鎖領域のセンス鎖配列が、配列番号１〜３１５に示す配列のいずれかに記載の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドからなり、但し、該１５個の連続ヌクレオチドのうちの１つまたは２つのヌクレオチドのいずれかが該配列とは異なり得る、請求項２１に記載の組成物。
【請求項６１】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、センス鎖配列が配列番号１〜３１５に示す配列のいずれかに記載の少なくとも１７個の連続ヌクレオチドからなるコア二重鎖領域を有するか、該コア二重鎖領域のセンス鎖配列が、配列番号１〜３１５に示す配列のいずれかに記載の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドからなる、請求項２１に記載の組成物。
【請求項６２】
少なくとも１つの修飾を含むという点でｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡとは異なる、請求項２１に記載のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのアナログ。
【請求項６３】
前記修飾が、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの安定性の増加、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの吸収の増強、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの細胞侵入の増強、またはこれらの任意の組み合わせを生じる、請求項６２に記載のアナログ。
【請求項６４】
前記修飾が、塩基、糖、またはヌクレオシド間結合を修飾する、請求項６２に記載のアナログ。
【請求項６５】
前記修飾がヌクレオチド２’修飾ではない、請求項６２に記載のアナログ。
【請求項６６】
前記修飾がヌクレオチド２’修飾である、請求項６２に記載のアナログ。
【請求項６７】
前記アナログが、少なくとも１つのリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドに置換されているという点でｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡとは異なる、請求項２１に記載のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのアナログ。
【請求項６８】
請求項２１に記載の組成物を含む、細胞。
【請求項６９】
前記細胞が、ハイブリダイズするか自己ハイブリダイズしてｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを形成する１つ以上のＲＮＡの転写のためのテンプレートを含む核酸を含む、請求項６８に記載の細胞。
【請求項７０】
請求項２１に記載の組成物を含む、トランスジェニック動物。
【請求項７１】
前記トランスジェニック動物が、ハイブリダイズするか自己ハイブリダイズしてｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを形成する１つ以上のＲＮＡの転写のためのテンプレートを含む核酸を含む、請求項７０に記載のトランスジェニック動物。
【請求項７２】
薬学的組成物であって：
請求項２１に記載の組成物；および
薬学的に受容可能なキャリア；
を含有する、薬学的組成物。
【請求項７３】
前記組成物がエアゾールとして処方される、請求項７２に記載の薬学的組成物。
【請求項７４】
前記組成物が鼻内噴霧剤として処方される、請求項７２に記載の薬学的組成物。
【請求項７５】
前記組成物が、同一転写物を標的化する複数の異なるｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含有する、請求項７２に記載の薬学的組成物。
【請求項７６】
前記組成物が、異なる転写物を標的化する複数のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む、請求項７２に記載の薬学的組成物。
【請求項７７】
前記組成物が、アレルギー性鼻炎または喘息の処置のための食品医薬品局承認薬をさらに含む、請求項７２に記載の薬学的組成物。
【請求項７８】
ＩｇＥ媒介性過敏症によって特徴づけられる疾患または病状を処置または予防する方法であって、
ＩｇＥ媒介性過敏症によって特徴づけられる疾患または病状の危険性があるか罹患している被験体を準備する工程；および
請求項７２に記載の組成物を該被験体に投与する工程；
を包含する、方法。
【請求項７９】
前記疾患または病状がアレルギー性鼻炎である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記疾患または病状が喘息である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記組成物がエアゾールとして投与される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
前記組成物が鼻内噴霧剤として投与される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８３】
敗血症、ショック、または熱傷関連損傷の処置方法であって、（ｉ）敗血症、ショック、または熱傷関連損傷の処置を必要とする被験体を準備する工程；および（ｉｉ）該被験体にＴｏｌｌ様レセプターを標的化するＲＮＡｉ因子を含有する組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項８４】
前記Ｔｏｌｌ様レセプターがＴＬＲ４である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記熱傷関連損傷が心筋損傷である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記組成物が、ハイブリダイズするか自己ハイブリダイズして、ＦＣεＲＩα鎖、ＦＣεＲＩβ鎖、ｃ−Ｋｉｔ、Ｌｙｎ、Ｓｙｋ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、４−１ＢＢリガンド、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＣＤ８３、ＳＬＡＭ、共通γ鎖およびＣＯＸ−２からなる群より選択されるタンパク質をコードする転写物を標的化するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを形成する１つ以上のＲＮＡの転写物のためのテンプレートを含む核酸を含有する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項８７】
前記核酸が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターを含む、請求項８６に記載の組成物。
【請求項８８】
前記プロモーターがＵ６プロモーターまたはＨ１プロモーターである、請求項８６に記載の組成物。
【請求項８９】
前記核酸が、ＲＮＡヘアピンの転写のためのテンプレートとして機能する配列を含み、該配列が、転写開始部位およびその後のポリＡカセットと極めて近接して並列し、それにより、転写されたヘアピン中の突出が最も小さくなるか全くなくなる、請求項８６に記載の組成物。
【請求項９０】
請求項８６に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項９１】
前記ベクターが、遺伝子治療への適用に適切なベクターである、請求項９０に記載のベクター。
【請求項９２】
前記ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターからなる群より選択される、請求項９１に記載のベクター。
【請求項９３】
請求項９０に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項９４】
ＩｇＥ媒介性過敏症によって特徴づけられる疾患または病状を処置または予防する方法であって、該方法は、
ＩｇＥ媒介性過敏症によって特徴づけられる疾患または病状の危険性があるか罹患している被験体を準備する工程；および
請求項８６に記載の組成物を該被験体に投与する工程；
を包含する、方法。
【請求項９５】
前記疾患または病状がアレルギー性鼻炎または喘息である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記組成物がエアゾールとして投与される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９７】
前記組成物が鼻内噴霧剤として投与される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９８】
カチオン性ポリマーをさらに含有する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項９９】
前記カチオン性ポリマーが、イミダゾール基修飾ＰＬＬ、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドンおよびキトサンからなる群より選択される、請求項９８に記載の組成物。
【請求項１００】
前記カチオン性ポリマーが、ポリ（β−アミノエステル）ポリマーからなる群より選択される、請求項９８に記載の組成物。
【請求項１０１】
アルギニンリッチペプチドまたはヒスチジンリッチペプチドをさらに含有する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項１０２】
前記アルギニンリッチペプチドが、少なくとも５つのアルギニン残基を含むポリアルギニンである、請求項１０１に記載の組成物。
【請求項１０３】
肺への導入に適切な界面活性剤をさらに含有する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項１０４】
前記転写物を発現する細胞または生物に請求項２１に記載の組成物を投与する工程を包含する標的転写物の発現を阻害する方法であって、前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが標的転写物を標的化する、方法。
【請求項１０５】
ＩｇＥ媒介性過敏症によって特徴づけられる疾患または病状を処置または予防する方法であって、該方法は、
ＩｇＥ媒介性疾患または病状の危険性があるか罹患している被験体を準備する工程；および
標的転写物を標的化するｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ、またはハイブリダイズするか自己ハイブリダイズして標的転写物を標的化するｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡを形成する１つ以上のＲＮＡ分子の転写のためのテンプレートを含む核酸を該被験体に投与する工程であって、該標的転写物の直接的または間接的な阻害により、ＩｇＥの産生もしくは分泌の阻害、ＩｇＥ分泌Ｂ細胞の増殖もしくは生存の減少、またはこれらの任意の組み合わせが生じる、工程；
を包含する、方法。
【請求項１０６】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、ＦＣεＲＩα鎖、ＦＣεＲＩβ鎖、ｃ−Ｋｉｔ、Ｌｙｎ、Ｓｙｋ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、４−１ＢＢリガンド、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＣＤ８３、ＳＬＡＭ、共通γ鎖およびＣＯＸ−２からなる群より選択されるタンパク質をコードする転写物を標的化する、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
不適切もしくは過剰な肥満細胞活性またはＩｇＥ媒介性過敏症によって特徴づけられる疾患もしくは病状を処置または予防する方法であって、該方法は、
不適切もしくは過剰な肥満細胞活性によって特徴づけられる疾患もしくは病状の危険性があるか罹患している被験体を準備する工程；および
標的転写物を標的化するｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡまたはハイブリダイズするか自己ハイブリダイズして標的転写物を標的化するｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡを形成する１つ以上のＲＮＡ分子の転写のためのテンプレートを含む核酸を該被験体に投与する工程であって、該標的転写物の阻害により、肥満細胞の活性または肥満細胞の生存が減少する、工程
を包含する、方法。
【請求項１０８】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、ＦＣεＲＩα鎖、ＦＣεＲＩβ鎖、ｃ−Ｋｉｔ、ＬｙｎおよびＳｙｋからなる群より選択されるタンパク質をコードする転写物を標的化する、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
不適切もしくは過剰なＴｈ２ヘルパー細胞応答またはＩｇＥ媒介性過敏症によって特徴づけられる疾患もしくは病状を処置または予防する方法であって、該方法は、
不適切もしくは過剰なＴｈ２ヘルパー細胞応答によって特徴づけられる疾患もしくは病状の危険性があるか罹患している被験体を準備する工程；および
標的転写物を標的化するｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡまたはハイブリダイズするか自己ハイブリダイズして標的転写物を標的化するｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡを形成する１つ以上のＲＮＡ分子の転写のためのテンプレートを含む核酸を該被験体に投与する工程であって、該標的転写物の阻害により、Ｔｈ２細胞応答が減少するか排除される、工程；
を包含する、方法。
【請求項１１０】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、ＦＣεＲＩα鎖、ＦＣεＲＩβ鎖、ｃ−Ｋｉｔ、Ｌｙｎ、Ｓｙｋ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、４−１ＢＢリガンド、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＣＤ８３、ＳＬＡＭ、共通γ鎖およびＣＯＸ−２からなる群より選択されるタンパク質をコードする転写物を標的化する、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
ＲＮＡｉ因子がＩｇＥ媒介性過敏症または不適切もしくは過剰な肥満細胞活性によって特徴づけられる病状の処置に適切な配列を含むと同定する方法であって、該方法は、
（ｉ）適切な刺激への曝露の前、同時、または後に候補ＲＮＡｉ因子を肥満細胞に送達する工程；
（ｉｉ）メディエーターの産生または分泌を評価する工程；
（ｉｉｉ）該ＲＮＡｉ因子の存在下で産生または分泌されたメディエーターの量と該ＲＮＡｉ因子の非存在下で産生または分泌された量とを比較する工程；および
（ｉｖ）該ＲＮＡｉ因子の存在下で産生または分泌されたメディエーターの量が該ＲＮＡｉ因子の非存在下で産生または分泌されたメディエーターの量よりも少ない場合、該ＲＮＡｉ因子が適切な配列を含むと同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１１２】
ＲＮＡｉ因子がＩｇＥ媒介性過敏症または不適切もしくは過剰なＴｈ２ヘルパー細胞活性によって特徴づけられる病状の処置に適切な配列を含むと同定する方法であって、該方法は、
（ｉ）候補ＲＮＡｉ因子をＴ細胞およびＡＰＣを含む培養物に送達する工程；
（ｉｉ）Ｔ細胞の増殖を評価し、および／またはＴｈ２細胞に特徴的なサイトカインの産生もしくは分泌を評価する工程；
（ｉｉｉ）該ＲＮＡｉ因子の存在下での該Ｔ細胞増殖の程度または該サイトカインの産生もしくは分泌の程度とｓｉＲＮＡの非存在下での該Ｔ細胞増殖の程度または該サイトカインの産生もしくは分泌の程度とを比較する工程；
（ｉｖ）該ＲＮＡｉ因子の存在下での該Ｔ細胞増殖の程度または該サイトカインの産生もしくは分泌の程度が、ＲＮＡｉ因子の非存在下での該Ｔ細胞増殖の程度または該サイトカインの産生もしくは分泌の程度よりも小さい場合、該ＲＮＡｉ因子が適切な配列を含むと同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１１３】
ＲＮＡｉ因子がＩｇＥ媒介性過敏症によって特徴づけられる病状の処置に適切な配列を含むと同定する方法であって、該方法は、
（ｉ）候補ＲＮＡｉ因子を、Ｂ細胞を含む培養物に送達する工程；
（ｉｉ）ＩｇＥの産生または分泌を評価する工程；
（ｉｉｉ）ｓｉＲＮＡの存在下で産生または分泌されたＩｇＥの量と該ＲＮＡｉ因子の非存在下で産生または分泌された量とを比較する工程；および
（ｉｖ）該ＲＮＡｉ因子の存在下で産生または分泌されたＩｇＥの量が該ＲＮＡｉ因子の非存在下で産生または分泌されたＩｇＥの量よりも少ない場合、該ＲＮＡｉ因子が適切な配列を含むと同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１１４】
前記ＩｇＥが抗原特異的である、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
ＲＮＡｉ因子がＩｇＥ媒介性過敏症によって特徴づけられる病状の処置に適切な配列を含むと同定する方法であって、該方法は、
（ｉ）候補ＲＮＡｉ因子を被験体に送達する工程；
（ｉｉ）血清ＩｇＥレベル、Ｔ細胞の増殖、Ｔｈ２細胞に特徴的なサイトカインの産生、気道炎症、気道反応性、気道壁再構築および肺機能からなる群より選択されるＩｇＥ媒介性過敏症の指標についての値を得る工程；
（ｉｉｉ）該ＲＮＡｉ因子の存在下で得られた値と該ＲＮＡｉ因子の非存在下で得られた値とを比較する工程；ならびに
（ｉｖ）ｓｉＲＮＡの存在下で得られた値が該ＲＮＡｉ因子の非存在下で得られた値よりも低い場合、該ＲＮＡｉ因子が適切な配列を含むと同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１１６】
前記血清ＩｇＥが抗原特異的であり、前記Ｔ細胞が抗原特異的である、請求項１１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は、２００４年３月１日に出願された米国仮特許出願第６０／５４９，０７０号の優先権の利益を主張し、これは、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（政府の支援）
合衆国政府は、本発明の開発に使用した助成金を提供した。特に、本発明の開発は、国立衛生研究所助成金番号５−ＲＯ１−ＡＩ４４４７７、５−ＲＯ１−ＡＩ４４４７８、５−ＲＯＩ−ＣＡ６０６８６、１−ＲＯ１−ＡＩ５０６３１およびＲＯ１−ＡＩ４０１４６の支援を受けた。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
アレルギー性鼻炎および喘息などのアレルギー性疾患は、少なくとも一部が他の点では一般的に無害な異物（アレルゲン）に対する過敏反応に起因すると広く考えられている。アレルギー性鼻炎および喘息は、アレルギー反応が起こる主な位置が異なる：アレルギー性鼻炎は鼻粘膜であり、喘息は下気道である。米国の人口の約１０％が、アレルギー性鼻炎に罹患している。他のいずれの医学的問題よりも多数の患者がアレルギー性疾患の診察を受けている。アレルギーはまた、仕事および学習の時間を奪う最大の原因であり、私生活にならびに医療制度および経済に直接および間接的に与える負担は甚大である。先進国において、５〜１０人に１人は喘息を罹患していると見積もられており、発生率は過去２０年間で劇的に増加している（非特許文献１）。
【０００４】
アレルギー性鼻炎および喘息は両方とも、肥満細胞および好塩基球からの薬理学的に活性なメディエーターの放出を含む。メディエーターにより、平滑筋が収縮し、血管透過性および血管拡張が増加し、鼻水および流涙などの代表的なアレルギー症状を生じる。これらのメディエーターはまた、気道過敏症、粘液分泌、および気道閉塞などの喘息症状の発症に直接または間接的に関与する。喘息は、代表的には、急性炎症および慢性炎症の両方によって特徴付けられ、急性炎症は主に偶発性気管支収縮の原因であり、慢性炎症および気道壁再構築は、慢性喘息で頻発する気道過反応性および固定性気道閉塞に寄与することが示唆されている（非特許文献２）。
【非特許文献１】Ｕｍｅｔｓｕ，Ｄ．ら、「Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、２００２年、第３巻、第８号、ｐ．７１５−７２０
【非特許文献２】Ｂｏｕｓｑｕｅｔ，Ｊ．ら、「Ａｍ．Ｊ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．」、２０００年、第１６１巻、ｐ．１７２０−１７４５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
多数の薬物（例えば、抗ヒスタミン薬、コルチコステロイドおよびうっ血除去薬）は、アレルギー性鼻炎の症状の一過性の緩和に利用可能である。アレルゲン免疫療法は、特に小児に治癒的であり得るが、処置をうける患者の約半分で有効でなく、代表的には、首尾の良い完治には何度も注射する必要がある。喘息は、種々の薬剤（気管支拡張薬およびコルチコステロイドが挙げられる）を使用して処置され得る。しかし、これらの治療薬はいずれも十分に効果的ではなく、その多くが望ましくない副作用を有する。したがって、アレルギー性鼻炎および喘息のための有効な治療および予防に対する必要性が依然として当該分野に存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、ＩｇＥおよび／またはＩｇＥを産生する細胞が主な役割を果たす種々の疾患および病状の処置のための新規の治療薬を提供する。特に、本発明は、ＩｇＥ媒介性過敏症（Ｉ型過敏症ともいう）に関連する疾患または病状（例えば、アレルギー性鼻炎および喘息）ならびにその徴候の改善（例えば、症状の緩和）のための新規の治療薬を提供する。この治療薬は、ＲＮＡｉ（標的ＲＮＡに相補的な部分を含む二本鎖ＲＮＡにより、細胞中に存在する場合に標的ＲＮＡを阻害する現象）に基づく。ＲＮＡｉの機構は、一般的に、標的ＲＮＡの切断またはその翻訳の阻害を含む。本発明のＲＮＡｉ因子は、細胞転写物の発現を阻害し、それにより、ＩｇＥ媒介性疾患に直接または間接的に寄与するタンパク質の合成を防止する。ＲＮＡｉを使用した標的遺伝子発現の阻害は、基本的に新規の治療アプローチを示す。
【０００７】
本発明者らは、免疫系細胞で発現される多数の遺伝子のうちでＩｇＥ媒介性疾患の病原性に関与する可能性が高いと同定した阻害のための標的遺伝子の特定の組を選択した。本発明の１つの局面は、好ましくはＲＮＡ転写レベルでのこの組における１つ以上の遺伝子の発現を阻害することが顕著に有利であるという認識である。本発明者らはまた、好ましい標的遺伝子の配列に基づいて新規のＲＮＡｉ因子を設計した。さらに、本発明者らは、ＲＮＡｉ因子が、呼吸器系に直接送達されるか、静脈に送達された場合に被験体の呼吸器系での遺伝子発現を有効に阻害し得ることを発見した。本発明者らは、特定の送達薬は、薬剤を呼吸器系に直接か静脈内に送達させるために使用した場合に動物モデルにおいてＲＮＡｉ因子の有効性を顕著且つ予想外に増強することをさらに発見した。
【０００８】
本発明は、喘息および／またはアレルギー性鼻炎の発症、病原性および／または症状に関与する分子をコードする種々の転写物のいずれかを標的化するＲＮＡｉ因子を提供する。種々の実施形態において、本発明は、肥満細胞もしくは好塩基球の活性および／またはＢ細胞によるＩｇＥの産生に直接的または間接的に関与する１つ以上の標的転写物を標的化する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および／または短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含有する組成物を提供する。本発明の特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、約１９ヌクレオチド長であるが、１７ヌクレオチド長と２９ヌクレオチド長との間の範囲である相補領域を有し、必要に応じて１つまたは２つの一本鎖突出さらに含む２つのＲＮＡ鎖を含む。本発明の特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡは、自己相補領域を有する１つのＲＮＡ分子を含む。１つのＲＮＡ鎖は、ステムおよびループ、および必要に応じて、ＲＮＡの５’末端および／または３’末端に１つ以上の非対合部分を含むヘアピン構造を形成する。このようなＲＮＡ種は、自己ハイブリダイズすると言われる。
【０００９】
さらに、本発明は、細胞内でのその存在によって１つ以上のＲＮＡが転写され、自己ハイブリダイズするか相互にハイブリダイズしてｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを形成し、肥満細胞もしくは好塩基球の活性および／またはＢ細胞によるＩｇＥの産生に関与する少なくとも１つの標的転写物の発現を阻害するベクターを提供する。
【００１０】
本発明は、組成物（例えば、本発明のＲＮＡｉ因子（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはベクター）を含有する薬学的組成物）ならびにこのような組成物の送達方法をさらに提供する。例えば、本発明は、構築物が細胞中に導入された場合に、肥満細胞もしくは好塩基球の活性および／またはＢ細胞によるＩｇＥの産生に直接的または間接的に関与する、標的転写物を宿主細胞内に標的化するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが産生されるように細胞中で活性な発現シグナル（例えば、プロモーターまたはプロモーター／エンハンサー）に作動可能に連結された核酸を含むベクターを提供する。一般に、ベクターは、細胞内でのその存在によって１つ以上のリボ核酸（ＲＮＡ）が転写され、自己ハイブリダイズするか相互にハイブリダイズして短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）または短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を形成し、それらが肥満細胞もしくは好塩基球の活性および／またはＢ細胞によるＩｇＥの産生に直接的または間接的に関与する少なくとも１つの標的転写物の細胞内における発現を阻害する、ＤＮＡプラスミドもしくはＲＮＡプラスミドまたはウイルスベクター（例えば、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスなど）であり得る。本発明の特定の実施形態では、ベクターは、転写によって相補領域を含むＲＮＡが合成され、そのＲＮＡがハイブリダイズして標的転写物を標的化するｓｈＲＮＡを形成するようプロモーターに作動可能に連結された核酸セグメントを含む。本発明の特定の実施形態では、ベクターは、反対方向の２つのプロモーターに隣接した核酸セグメントを含み、プロモーターからの転写によって２つの相補的なＲＮＡが合成され、これらが相互にハイブリダイズして標的転写物を標的化するｓｉＲＮＡを形成するようにプロモーターが核酸セグメントに作動可能に連結された核酸セグメントを含む。本発明は、さらに、ベクターを含む組成物を提供する。
【００１１】
本発明の任意の組成物は、本明細書中に記載のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはベクターに加えて、送達薬と呼ばれるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはベクターの送達および／または取り込みを容易にする１つ以上の物質を含有し得る。これらの物質としては、カチオン性ポリマー、ペプチド分子トランスポーター（アルギニンリッチペプトイドまたはアルギニンリッチペプチドおよびヒスチジンリッチペプチドが挙げられる）、カチオン性脂質および中性脂質、リポソーム、特定の非カチオン性ポリマー、炭水化物および界面活性物質が挙げられる。適切な送達薬は、同時係属中の米国特許出願１０／６７４，１５９号（ＵＳ２００４２４２５１８として公開）および１０／６７４，０８７号（ＵＳ２００５００８６１７として公開）、およびＷＯ２００４０２８４７１およびＷＯ２００４０２９２１３として公開されたＰＣＴ出願（本明細書中に参考として援用される）に記載されている。組成物は、種々の経路（静脈内、吸入、鼻腔内、エアゾールとして、腹腔内、筋肉内、皮内、経口などが挙げられる）によって投与され得る。呼吸器系（例えば、鼻腔内、吸入など）を標的化する送達方法は、特に目的のものである。
【００１２】
本発明は、さらに、ＩｇＥ媒介性過敏症（例えば、アレルギー性鼻炎および喘息）に関連する疾患または病状の処置方法もしくは予防方法、または症状の緩和方法であって、抗原などの誘発刺激物への曝露前、曝露中、または曝露後の適切な時間枠内に１つ以上の本発明のＲＮＡｉ因子を含有する組成物をこれらの病状の危険性があるか罹患している被験体に投与することによる、方法を提供する。ｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡは、化学合成され得るか、インビトロ転写を使用して産生され得るか、細胞内に産生され得る。組成物は、種々の経路（静脈内、吸入、鼻腔内、エアゾールとして、腹腔内、筋肉内、皮内、経口などが挙げられる）によって投与され得る。本発明の特定の好ましい実施形態では、組成物は、１種以上のｓｉＲＮＡを含有する。
【００１３】
本発明はまた、一般に、アレルギー性鼻炎および／または喘息ならびにＩｇＥ媒介性障害の処置または予防に有用な配列を有するＲＮＡｉ因子の同定のための系を提供する。説明するために、本発明の組成物をアレルギー性鼻炎および／または喘息の処置に使用することを本明細書中で想定する。しかし、その使用は、これらの病状に制限されないことに留意すべきである。本発明の組成物は、ＩｇＥが関与する任意の種々の病状（食品アレルギー、虫刺されまたは食品アレルギーに対するアナフィラキシー反応、寄生虫感染などが挙げられる）の処置および／または予防に使用され得る。さらに、これらは、例えば、遺伝子自体の研究、候補医薬品の試験などの研究目的のために標的遺伝子の発現を阻害することが望ましい種々の他の目的のために使用され得る。
【００１４】
本発明は、さらに、アレルギー性鼻炎、喘息および他のＩｇＥ媒介性病状の病態生理学ならびにこれらの病状における異なる細胞型および分子の役割の分析および特徴付けならびに種々の生物学的プロセス（肥満細胞、好塩基球、樹状細胞、Ｔ細胞、およびＢ細胞が挙げられる）の研究のための系および試薬を提供する。
【００１５】
本出願は、種々の特許、特許出願、学術論文および他の出版物（その全体が本明細書中で参考として援用される）を言及する。さらに、以下の標準的な参考文献が本明細書中で参考として援用される：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ａｎｄ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，２００２年７月版；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｒｕｓｓｅｌｌ，ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，２００１；Ｇｏｌｄｓｂｙ，Ｒ．Ａら、Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第４版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００；Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第１０版，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，２００１およびＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，第５６版，ＩＳＢＮ：１５６３６３４１１２  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，２００２。
【００１６】
他で定義しない限り、本明細書中で使用した全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。範囲が与えられた場合、終点はその範囲に含まれる。本発明の種々の実施形態がマーカッシュ群の言語またはその代替形態で記載されている場合、本明細書中に明確に引用されていない場合でさえも、マーカッシュ群およびリストの全サブセットおよび各メンバーも暗黙の内に示されていると理解されるべきである。本明細書中に記載のものと類似するか等価な方法および材料を本発明の実施または試験で使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。矛盾する場合、本明細書（定義が含まれる）が支配する。さらに、材料、方法、および実施例は、例示のみを目的とし、本発明を制限することを意図しない。
【００１７】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００１８】
（定義）
本明細書中で使用される場合、数に関する用語「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」とは、他で記載するか、文脈から明確でない限り、一般的にその数値のいずれかの方向（より多いかより少ない）で５％の範囲内に含まれる数値を含むと見なす。
【００１９】
用語「相補的」とは、特定の塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、または核酸の間の正確な対合能力をいうために当該分野で受け入れられている意味に従って本明細書中で使用される。例えば、アデニン（Ａ）とウリジン（Ｕ）とは相補的であり、アデニン（Ａ）とチミジン（Ｔ）とは相補的であり、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）とは相補的である。第１の核酸配列の一定の位置でのヌクレオチドが第２の核酸配列中の反対に位置するヌクレオチドに相補的である場合、ヌクレオチドは相補塩基対を形成し、核酸はその位置で相補的である。当業者は、核酸が逆平行の方向で整列している（すなわち、一方の核酸が５’→３’方向であり、他方が３’→５’方向である）ことを認識している。
【００２０】
２つの核酸またはその一部の相補性の程度を、２つの核酸またはその一部を相補性が最大になるように逆平行の方向でアラインメントした場合に、評価枠にわたる総ヌクレオチド数に対する比率として相補塩基対を形成する両鎖中の総ヌクレオチド数を決定することによって評価し得る。例えば、ＡＡＡＡＡＡＡＡおよびＴＴＴＧＴＴＡＴは、塩基対中の全部で１６個のうちの１２個のヌクレオチドが相補的であるため、７５％相補的である。評価枠にわたり少なくとも７０％相補的である核酸を、この枠にわたって実質的に相補的であると見なす。詳細には、評価枠が１５〜１６ヌクレオチド長である場合、実質的に相補的な核酸は、枠内に０〜３個のミスマッチを有しても良く、枠が１７ヌクレオチド長の場合、実質的に相補的な核酸は枠内に０〜４個のミスマッチを有しても良く、枠が１８ヌクレオチド長の場合、実質的に相補的な核酸は枠内に０〜５個のミスマッチを有しても良く、枠が１９ヌクレオチド長の場合、実質的に相補的な核酸は枠内に０〜６個のミスマッチを有しても良い。許容されるミスマッチの数は、枠内に存在するそれぞれのさらなるヌクレオチドにつき１ヌクレオチド増加する。特定の実施形態では、ミスマッチは連続した位置には存在しない。特定の実施形態では、枠は、２ヌクレオチド長よりも長いミスマッチのストレッチを含まない。好ましい実施形態では、１５〜１９ヌクレオチドの評価枠は０〜１個（好ましくは０個）のミスマッチを含み、２０〜２９ヌクレオチドの評価枠には０〜２個（好ましくは０〜１個、より好ましくは０個）のミスマッチを含む。
【００２１】
本明細書中で使用される、「遺伝子」とは、当該分野で理解されている意味を有する。一般に、遺伝子は、コード配列（オープンリーディングフレーム）に加えて、遺伝子調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）および／またはイントロン配列を含むと見なされる。「遺伝子」の定義は、タンパク質をコードしないが、むしろ構造ＲＮＡ分子または機能的ＲＮＡ分子をコードする核酸に対する言及を包含することがさらに認識される。明確にするために、本出願で使用される場合、用語「遺伝子」とは、一般に、タンパク質をコードする核酸の一部をいい、この用語は、必要に応じて、調節配列を包含し得ることに留意すべきである。この定義は、非タンパク質をコードする発現単位への用語「遺伝子」の適用を排除すること意図するのではなく、むしろ、ほとんどの場合、本明細書中で使用されるこの用語はタンパク質をコードする核酸をいうことを意図する。
【００２２】
「遺伝子産物」または「発現産物」とは、一般に、遺伝子から転写されたＲＮＡまたは遺伝子から転写されたＲＮＡによってコードされるポリペプチドである。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、用語「ハイブリダイズする」とは、２つの相補核酸配列の間の相互作用をいう。語句「高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」とは、当該分野で認識されている高ストリンジェンシー条件下で維持される十分に安定な相互作用を説明する。ハイブリダイゼーション反応実施のための手引きは、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．、６．３．１−６．３．６，１９８９およびより最近の改訂版（その全てが参考として援用される）に見出すことができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＲｕｓｓｅｌおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、２００１も参照のこと。水性の方法および非水性の方法が参考として記載され、いずれかが使用され得る。代表的には、約５０〜１００ヌクレオチド長にわたる核酸配列に関しては、以下の種々のストリンジェンシーレベルが定義されている：低ストリンジェンシー（例えば、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、その後の少なくとも５０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの２回の洗浄）（中−低ストリンジェンシー条件については、洗浄温度を５５℃に上昇させることができる）；中程度のストリンジェンシー（例えば、約４５℃での６×ＳＳＣ、その後の６０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの１回以上の洗浄）；高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション（例えば、約４５℃での６×ＳＳＣ、その後の６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの１回以上の洗浄）；および非常に高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件（例えば、６５℃での０．５Ｍリン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、その後の６５℃での０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳでの１回以上の洗浄）など。高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションは、非常に高い相補性を有する配列間のみで起こる。当業者は、異なるストリンジェンシー度に対するパラメーターは、一般に、ハイブリダイズする配列の長さ、ＲＮＡまたはＤＮＡを含むか否かなどの種々の要因に基づいて異なることを認識している。例えば、高、中、または低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションの適温は、一般に、オリゴヌクレオチドなどのより短い配列でより長い配列よりも低い。
【００２４】
「同一性」とは、２つ以上の核酸配列が同一である範囲をいう。評価枠にわたる２つの核酸間の同一性の程度を、平行方向で核酸を整列させること、評価枠内の各鎖中の同一ヌクレオチドが占める位置の比率を決定すること、いずれかの鎖中のギャップの導入を可能にすることによって計算することができる。代表的には、同一性の程度を、少なくとも１５ヌクレオチド長（例えば、１９ヌクレオチド長）の評価枠にわたって決定する。
【００２５】
転写物の発現を参照して、またはポリペプチドもしくは細胞の機能活性に関して本明細書中で使用される場合、「不適切な、または過剰な」とは、（ｉ）代表的な環境条件下で野生型細胞または健常な被験体で通常おこるよりも高いレベルでおこるか（代表的には、疾患の症状または徴候などの検出可能な結果に寄与するかまたはそれを引き起こすレベル）、および／または（ｉｉ）代表的な環境条件下で野生型細胞または健常な被験体で通常おこるものとは異なる一過性のまたは空間的なパターンで起こる（代表的には、疾患の症状または徴候などの検出可能な結果に寄与するかそれを引き起こす様式）発現または活性をいう。不適切または過剰な発現または活性としては、通常はこのような発現または活性を示さない細胞型における発現または活性が挙げられる。細胞または被験体が転写物の不適切もしくは過剰な発現またはポリペプチドもしくは機能活性の不適切もしくは過剰な活性を示すか否かを、例えば、この発現または活性と正常な（例えば、野生型）被験体が有する発現または活性、ヒストリカルコントロール、この被験体の以前の値などとの比較によって決定することができる。しかし、本発明の特定の実施形態では、発現または活性は、正常と見なされる範囲内に含まれる場合でさえも、被験体において不適切または過剰と見なされる。
【００２６】
転写物またはポリペプチドの過剰または不適切な発現「に関連する」、「によって特徴づけられる」、または「を特徴とする」とは、一般に、疾患または病状の存在下で、転写物またはポリペプチドの過剰または不適切な発現が頻繁に（例えば、症例の大部分）、代表的に、または一貫して起こることを意味する。過剰または不適切な発現が疾患または病状の存在下で常に起こる必要はなく、実際、過剰または不適切な発現は小集団（例えば、疾患または病状を罹患した被験体の５％未満）でのみ起こり得る。一般に、転写物またはポリペプチドの過剰または不適切な発現は、疾患もしくは病状またはその症状に直接的または間接的に起因するか寄与する。発現または活性が過剰または不適切であるか否かは状況に依存し得ることに留意すべきである。例えば、リガンドのレセプターの発現は、リガンドの非存在下では有効でなくてもよいが、リガンドの存在下では、疾患または症状が生じる場合、このような発現は過剰または不適切と見なされ得る。治療の文脈では、句「に関連する」、「によって特徴づけられる」、または「を特徴とする」とは一般に、処置すべき病状または疾患の少なくとも１つの症状が転写物またはコードされるポリペプチドに起因するか、それによって悪化するか、または寄与し、その結果、転写物またはポリペプチドの発現の減少が、疾患または病状の１つ以上の特徴または症状を緩和、減少または予防することを意味する。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「単離された」とは、１）通常は天然で会合している少なくともいくつかの成分から分離されているか、２）手作業を含むプロセスによって調製されているか精製されているか、そして／または３）天然に存在しないことを意味する。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「作動可能に連結された」とは、１つの核酸配列の発現が、他の核酸配列によって制御されているか、調節されているか、調整されているなどの２つの核酸配列の間の関係をいう。例えば、核酸配列の転写は、作動可能に連結されたプロモーター配列によって指向され、核酸の翻訳後プロセシングは、作動可能に連結されたプロセシング配列によって指向され、核酸配列の翻訳は、作動可能に連結された翻訳調節配列によって指向され、核酸またはポリペプチドの輸送または局在化は作動可能に連結された輸送配列または局在化配列によって指向され、ポリペプチドの翻訳後プロセシングは、作動可能に連結されたプロセシング配列によって指向される。好ましくは、第２の核酸配列に作動可能に連結された核酸配列は、このような配列に直接的または間接的に共有結合されるが、任意の有効な三次元結合が許容可能である。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「精製された」とは、多くの他の化合物または物質からの分離されたことを意味する。化合物または物質は、部分的に精製されているか、実質的に精製されているか、純粋であってもよく、実質的に全ての他の化合物または物質から取り出されている場合、純粋である（すなわち、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％を超えて純粋である）。
【００３０】
用語「調節配列」とは、作動可能に連結された配列の発現（特に、転写であるが、いくつかの場合、スプライシングまたは他のプロセシングなどの他の事象）を指向、増強、または阻害する核酸配列領域を記載するために本明細書中で使用される。この用語は、プロモーター、エンハンサーなどの発現シグナルおよび他の転写調節エレメントを含む。本発明のいくつかの実施形態では、調節配列は、ヌクレオチド配列の構成的発現を指向し得、他の実施形態では、調節配列は、組織特異的発現および／または誘導性発現を指向し得る。例えば、哺乳動物細胞中で使用に適した組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、リンパ特異的プロモーター（例えば、Ｃａｌａｍｅら、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５、１９８８を参照のこと）（例えば、Ｔ細胞レセプターサブユニット遺伝子のプロモーター（例えば、Ｗｉｎｏｔｏら、ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９，１９８９を参照のこと）および免疫グロブリン遺伝子（例えば、Ｂａｎｅｒｊｉら、Ｃｅｌｌ  ３３：７２９、１９８３；Ｑｕｅｅｎら、Ｃｅｌｌ  ３３：７４１、１９８３を参照のこと）など）およびニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３、１９８９）が挙げられる。発生調節プロモーターも含まれ、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４、１９９０）およびα−フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７、１９８９）が挙げられる。本発明のいくつかの実施形態では、調節配列は、鼻道、気道、および／または肺内の上皮細胞で活性なプロモーターおよび／またはエンハンサーを含み得る。例えば、界面活性タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターを使用し得る。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、用語「ＲＮＡｉ因子」とは、細胞内に存在することによりＲＮＡｉを生じ、それにより、ＲＮＡｉ因子が標的化される転写物の発現が減少するＲＮＡ分子およびベクター（人為的に修飾されていない天然に存在する分子以外）を包含する。この用語には、詳細には、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびＲＮＡｉベクターが含まれる。この用語を、米国特許出願番号６０／５４９，０７０号で使用されている、用語「ＲＮＡｉ誘導物質」の同義語として使用する。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「ＲＮＡｉベクター」とは、細胞内でのその存在によって１つ以上のＲＮＡの転写を生じ、自己ハイブリダイズするか相互にハイブリダイズしてｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを形成するベクターである。本発明の種々の実施形態では、この用語は、細胞内でのその存在によって１つ以上のＲＮＡが産生され、自己ハイブリダイズするか相互にハイブリダイズしてｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを形成するプラスミド（例えば、ＤＮＡベクター（その配列がウイルス由来の配列エレメントを含み得る））、またはウイルス（人為的に修飾されていない天然に存在するウイルスまたはプラスミド以外）を包含する。一般に、ベクターは、ベクターが細胞内に存在する場合にハイブリダイズするか自己ハイブリダイズしてｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを形成する１つ以上のＲＮＡ分子が転写されるように発現シグナルに作動可能に連結された核酸を含む。したがって、ベクターは、ＲＮＡまたはその前駆体の細胞内合成のためのテンプレートを含む。ＲＮＡｉを媒介するために、（例えば、ウイルスエンベロープの細胞膜との融合後の）細胞中のウイルスゲノムの存在は、細胞内のウイルスの存在を構成するのに十分と見なされる。さらに、ＲＮＡｉを媒介するために、ベクターは、細胞内に導入されるか、細胞に侵入するか、先祖細胞から受け継がれた場合、その後に細胞内または先祖細胞内で修飾またはプロセシングされるか否かに無関係に、細胞内に存在すると見なされる。ＲＮＡｉベクターは、細胞内のベクターの存在によって、相互にハイブリダイズするか自己ハイブリダイズして転写物を標的化するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを形成する１つ以上のＲＮＡ産生する場合（すなわち、細胞内のベクターの存在により、転写物を標的化する１つ以上のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを産生する場合）、転写物を標的化すると見なされる。ＲＮＡｉベクターを使用して、標的化される転写物を発現する細胞中でＲＮＡｉを媒介し、そして／または転写物を発現するか発現しない細胞中でｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を産生することができる。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを、これらを産生する細胞から精製し、本明細書中に記載の任意の目的のために使用することができる。用語「ＲＮＡｉベクター」を、米国特許出願番号６０／５４９，０７０号で使用されている、用語「ＲＮＡｉ誘導ベクター」の同義語として使用する。
【００３３】
「短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」は、約１５〜２９塩基対長のＲＮＡ二重鎖部分および必要に応じてさらに１つまたは２つの一本鎖突出（例えば、一方または両方の鎖上の３’突出）を含む。例えば、二重鎖部分は、１７〜１９ヌクレオチド長であり得るか、１５と２９との間の任意の他の部分的範囲または特定の値であり得る（例えば、１９、２１〜２３、１９〜２３、２４〜２７、２７〜２９）。以下により詳細に示すように、ｓｉＲＮＡを、一緒にハイブリダイズする２つのＲＮＡ分子から形成することができるか、自己ハイブリダイズ部分を含む１つのＲＮＡ分子から生成することができる。本発明の特定の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡ分子の遊離５’末端はリン酸基を有し、そして／または遊離３’末端は水酸基を有する一方で、他の実施形態によれば、遊離５’末端はリン酸基を欠き、そして／または遊離３’末端は水酸基を欠く。一般に、ｓｉＲＮＡ分子の遊離５’末端はリン酸基を有し、遊離３’末端は水酸基を有することが好ましい。ｓｉＲＮＡの二重鎖部分は、１つ以上の非対合ヌクレオチドからなる１つ以上のバルジ（ｂｕｌｇｅ）を含み得るが、代表的には含まない。バルジは、例えば、以下であり得る：（ｉ）ミスマッチ（２つの鎖が評価枠内で相補性を最大にするために相互にアラインメントされる場合、またはアラインメントした鎖中の相互の反対側の２つのヌクレオチドが非相補的である場合に起こる）、（ｉｉ）２つの鎖を評価枠内で相補性を最大にするためにアラインメントした場合に、一方の鎖が他方の鎖に関して「余剰な」ヌクレオチドを含む領域、または（ｉｉｉ）上記の組み合わせ。
【００３４】
ｓｉＲＮＡの一方の鎖（「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」ということができる）は、標的転写物とハイブリダイズする部分を含む。本発明の特定の好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、標的転写物領域と正確に相補的であり（１００％相補性）、これは、ｓｉＲＮＡが、１つのミスマッチまたはバルジを伴わずに標的転写物とハイブリダイズすることを意味する。本発明の他の実施形態では、ｓｉＲＮＡと標的転写物の標的化された部分との間に１つ以上のミスマッチが存在し得る。１００％相補性が達成されない本発明の特定の実施形態では、一般に、任意のミスマッチまたはバルジがｓｉＲＮＡ末端またはその付近に位置することが好ましい。
【００３５】
用語「短いヘアピンＲＮＡ」は、ＲＮＡｉを媒介するのに十分に長い二本鎖（二重鎖）構造を形成するためにハイブリダイズするかハイブリダイズすることができる少なくとも２つの相補部分およびループを形成する代表的には約１ヌクレオチド長と１０ヌクレオチド長との間の少なくとも１つの一本鎖部分を含むＲＮＡ分子をいう。二本鎖領域は、１７〜１９ヌクレオチド長であり得るか、１５と２９との間の任意の他の部分的範囲または特定の値であり得る（例えば、１９、２１〜２３、１９〜２３、２４〜２７、２７〜２９）。二重鎖部分は、１つ以上の非対合ヌクレオチドからなる１つ以上のバルジを含み得るが、その必要はない。以下により詳細に示すように、ｓｈＲＮＡは、保存された細胞ＲＮＡｉ機構によってｓｉＲＮＡにプロセシングされると考えられる。したがって、ｓｈＲＮＡはｓｉＲＮＡの前駆体であり、一般に、標的転写物の発現を同様に阻害し得る。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「被験体」とは、ＩｇＥが少なくとも部分的に原因因子または要因である疾患または病状の疑いがあるか罹患している任意の個体をいう。この用語は、動物（例えば、家畜（ニワトリ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコなど）、野性動物、非ヒト霊長類、およびヒト）を含む。
【００３７】
ＲＮＡｉ因子は、１）ＲＮＡｉ因子の存在下での標的転写物の安定性が、非存在下と比較して減少する場合、そして／または２）ＲＮＡｉ因子の配列が、少なくとも約１５、より好ましくは少なくとも約１７、さらにより好ましくは少なくとも約１８または１９から約２１〜２３ヌクレオチドのストレッチの標的転写物と少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の正確な配列相補性示す場合、そして／または３）薬剤の一部（例えば、ｓｉＲＮＡの１つの鎖またはｓｈＲＮＡの自己相補部分の１つ）がインビトロで小さな（５０ヌクレオチド未満の）ＲＮＡ分子のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントな条件下および／または哺乳動物細胞の細胞質または核内で代表的に見出される条件下で標的転写物とハイブリダイズする場合に、本明細書中に記載の目的のための標的転写物を標的化すると見なされる。その細胞内での存在によって転写物を標的化するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが産生されるＲＮＡｉベクターも、標的転写物に標的化されると見なす。転写物の標的化効果が転写物の合成のためのテンプレートを含む遺伝子の発現を減少または阻害することであるため、転写物に標的化するＲＮＡｉ因子もその遺伝子を標的化すると見なす。したがって、本明細書中で使用されるように、転写物を標的化するＲＮＡｉ因子は、転写物の合成のためのテンプレートを提供する遺伝子を標的化すると理解される。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、「処置」とは、一般に、以下の１つ以上を包含し得る：このような用語を適用する疾患、障害、もしくは病状またはこのような疾患、障害、もしくは病状の１つ以上の症状または徴候の逆転、緩和、進行の阻害、可能性の防止もしくは減少。「予防」は、疾患、障害、病状、またはこれらの症状もしくは徴候またはこれらの重症度を悪化させないか、生じさせないことをいう。
【００３９】
一般に、用語「ベクター」は、細胞内への第２の核酸分子の侵入（例えば、導入、輸送など）を媒介することができる核酸分子をいう。導入された核酸は、一般に、ベクター核酸分子に連結（例えば、挿入）される。ベクターは、自律複製を指向する配列を含み得るか、宿主細胞ＤＮＡに組み込まれるのに十分な配列を含み得る。有用なベクターとしては、例えば、プラスミドベクター（代表的には、ＤＮＡ分子であるが、ＲＮＡプラスミドも公知である）、コスミドベクター、およびウイルスベクターが挙げられる。当該分野で周知であるように、用語「ウイルスベクター」は、代表的には核酸分子導入または組み込みを容易にするウイルス由来の核酸エレメントを含む核酸分子（例えば、プラスミド）（例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが挙げられる）または核酸導入を媒介するウイルスまたはウイルス粒子（例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスが挙げられる）のいずれかをいう。当業者に明らかなように、ウイルスベクターには、核酸に加えて、種々のウイルス成分が含まれ得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
（本発明の特定の好ましい実施形態の詳細な説明）
（Ｉ．概説）
本発明は、ＩｇＥ媒介性疾患または病状に関与するか、ＩｇＥの分泌および／またはＩｇＥに対する応答に関与する細胞の生存、増殖および／または少なくとも１つの生物学的活性に重要な発現産物をコードする１つ以上の遺伝子から転写された転写物を標的化するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉベクターなどのＲＮＡｉ因子を含有する組成物を提供する。任意のこれらの転写物は、本発明のＲＮＡｉ媒介性阻害の適切な標的である。生物学的活性は、任意の細胞活性（生存、増殖、合成、分泌、脱顆粒（例えば、炎症メディエーターの）、移動、細胞−細胞相互作用などが挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。
【００４１】
肥満細胞のＩｇＥ媒介性脱顆粒は、アレルギー性鼻炎および喘息の両方で役割を果たす。アレルゲンへの曝露によってＢ細胞が活性化され、それにより、ＩｇＥ分泌形質細胞が形成される。分泌されたＩｇＥ分子は、血液中の好塩基球上および肥満細胞上のＩｇＥ特異的Ｆｃレセプターに結合する。アレルゲンへのその後の曝露に対する応答中に、肥満細胞関連ＩｇＥ分子はアレルゲンに結合し、それにより、結合したＩｇＥとＩｇＥ分子が結合したレセプターとが架橋し、肥満細胞の脱顆粒が誘発される。脱顆粒は、アレルギー症状の根底にある平滑筋および血管の変化の主な原因であるヒスタミンなどのメディエーターの放出を含む。その後のメディエーターの脱顆粒および放出を伴う肥満細胞へのＩｇＥの結合も多くの喘息症状の原因である。ＩｇＥ媒介性アレルギーおよび喘息の病原性の考察については、Ｇｏｌｄｓｂｙ，Ｒ．、Ｋｕｂｙｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第４版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、２０００；Ｕｍｅｔｓｕ，Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３（８）：７１５−７２０，２００２を参照のこと。
【００４２】
本発明の特定の実施形態に従って、ＲＮＡｉ因子を使用して、肥満細胞の少なくとも１つの生物学的活性を阻害するか、その数を減少させるか、これらを排除するか（例えば、気道中で）、そして／またはＢ細胞によるＩｇＥの産生を阻害する。生物学的活性は、生存、増殖、合成、分泌、移動、細胞−細胞相互作用などのいずれかの細胞の活性であり得るが、これらに限定されない。特定の好ましい実施形態では、生物学的活性の阻害により、肥満細胞が「不活化」され、その結果、肥満細胞は病原性効果（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）を発揮しない。本発明は、多数の異なるタンパク質をコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子およびＩｇＥ媒介性疾患（アレルギーおよび喘息が挙げられる）の処置におけるＲＮＡｉ因子の使用方法を提供する。本発明の特定の好ましい実施形態を、以下に詳述する。本明細書中で考察されているＩｇＥ媒介性病状を、「ＩｇＥ媒介性過敏症」または「過敏反応」ということができるが、被験体のＩｇＥに対する応答は、高める必要がないことに留意すべきである。一般に、この用語は、アレルゲンに対する任意の望ましくないかまたは不適切な炎症反応をいうことができる。
【００４３】
一般に、「Ｘ転写物」と記載される転写物（例えば、「ＣＤ４０転写物」）は、「Ｘ遺伝子」（例えば、ＣＤ４０遺伝子）（すなわち、ＣＤ４０タンパク質をコードするｍＲＮＡが適切な細胞型で転写される遺伝子）から転写された転写物を意味する。転写物を特定のタンパク質を「コードする」ということができるが、ＲＮＡｉ因子によって標的化される転写物領域は完全に転写物のコード部分からなる必要も、その一部からなる必要もないことに留意すべきである。標的化される領域は、例えば、本発明の種々の実施形態における５’または３’非翻訳領域またはイントロンであり得る。
【００４４】
（ＩＩ．ＲＮＡｉおよびＲＮＡｉ因子の設計）
どのような遺伝子標的が選択されても、本発明のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ因子の設計は、好ましくは特定の指針に従う。一般に、阻害されることが望ましい転写物に特異的な配列を標的化することが望ましい。また、多くの場合、本発明の細胞または被験体に送達される因子は、活性な抑制因子になる前に１つ以上のプロセシング工程を受け得る（さらなる考察については以下を参照のこと）。このような場合、当業者は、そのプロセシングに必要であり得る配列を含むように関連因子を設計することが好ましいと認識する。
【００４５】
ＷＯ０１／７５１６４号に記載のように、小さな阻害ＲＮＡは、ショウジョウバエにおけるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）現象の研究で最初に発見された。特に、ショウジョウバエにおいて、長い二本鎖ＲＮＡがＤＩＣＥＲと呼ばれるＲＮアーゼＩＩＩ様酵素（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３、２００１）によって２つの２１ヌクレオチド（ｎｔ）鎖（それぞれ５’リン酸基および３’水酸基を有し、２つのｎｔ−３’突出に隣接する１９ｎｔ二重鎖領域が存在するように他の鎖と正確に相補的な１９ｎｔの領域を含む）から構成される小さなｄｓＲＮＡにプロセシングされることが見出された。図１は、ショウジョウバエで見出されたｓｉＲＮＡの略図を示す。構造は、センス鎖３１０およびアンチセンス鎖３１５を含む１９ヌクレオチドの二本鎖（ＤＳ）部分３００を含む。各鎖は、２ｎｔの３’突出３２０を有する。
【００４６】
これらの小さなｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、ｄｓＲＮＡ鎖の１つと相補的な領域を含む任意の遺伝子の発現をサイレントにするように作用し、これはおそらく、ヘリカーゼ活性がｓｉＲＮＡ中の１９ｂｐの二重鎖をほぐしてｓｉＲＮＡの１つの鎖と標的転写物との間で別の二重鎖が形成されるためである。次いで、この新規の二重鎖は、エンドヌクレアーゼ複合体（ＲＩＳＣ）を標的ＲＮＡに導き、１つの位置で切断して（「スライス」）、非保護ＲＮＡ末端が得られる。これは、ただちに細胞機構によって分解される（図２）。下記のように、短いＲＮＡ種（ミクロＲＮＡ）によって媒介されるさらなるサイレンシング機構も公知である（例えば、Ｒｕｖｋｕｎ，Ｇ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９４、７９７−７９９、２００１；Ｚｅｎｇ，Ｙ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ、９、１−２０、２００２を参照のこと）。機構の考察および機構を示す図は、本発明の作用機構に対していかなる制限も示唆しないことを意図する。ＲＮＡｉのさらなる考察は、Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ，Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４：４５７−４６７に見出される。
【００４７】
ＤＩＣＥＲ酵素のホモログがＥ．ｃｏｌｉからヒトまでの範囲の多様な種に存在するという発見（Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５；４８５，２００１；Ｚａｍｏｒｅ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．８：７４６，２００１）により、ＲＮＡｉ様機構が種々の異なる細胞型（哺乳動物細胞、さらにヒト細胞を含む）で遺伝子発現をサイレンシングすることができるという可能性が高まった。しかし、不運なことに、長いｄｓＲＮＡ（例えば、約３０ヌクレオチドより長い二本鎖領域を有するｄｓＲＮＡ）は、哺乳動物細胞においてインターフェロン応答を活性化することが公知である。したがって、特異的遺伝子サイレンシングよりもむしろ、長いｄｓＲＮＡの哺乳動物細胞への導入により、翻訳のインターフェロン媒介性非特異的抑制が生じると予想され、おそらく細胞が死滅する。したがって、長いｄｓＲＮＡは、哺乳動物細胞中での特定の遺伝子の発現の特異的阻害に有用であると考えられる。
【００４８】
しかし、ｓｉＲＮＡは、哺乳動物細胞に導入された場合、標的遺伝子の発現を有効に減少させることができることが見出された。同時係属中の特許出願である米国特許出願番号１０／６７４，１５９号および同１０／６７４，０８７号に記載のように、本発明者らは、種々の転写物（ＣＤ８αなどの内因性転写物およびウイルス転写物の両方が含まれる）を標的化するｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡにより、哺乳動物細胞中の標的転写物レベルが大きく減少したことを示した。本発明者らはまた、種々のＲＮＡｉ因子が哺乳動物細胞、組織培養、ニワトリ胚、およびインタクトな動物（マウス）におけるインフルエンザウイルス転写物の発現を阻害することができることも示した。したがって、ＲＮＡｉ因子での処置は、標的転写物の発現の減少または阻害のための有効な戦略である。特に、本発明者らは、標的転写物の発現が、ＲＮＡｉ因子送達のための種々の送達因子および方法を使用してインタクトな生きた動物の呼吸経路（例えば、肺）中で阻害され得、それにより、喘息などの呼吸経路に影響を与える疾患および病状を処置するためのＲＮＡｉ使用の実行可能性を確立し得ることを実証した。流体力学的トランスフェクションを使用せずに標的転写物の有効な阻害が達成されたことに留意すべきである。
【００４９】
本発明での使用に好ましいｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、１５〜２９の間のヌクレオチド長（例えば、約１９ヌクレオチド長）の塩基対合領域（二重鎖部分または二重鎖領域という）を含み、必要に応じて、遊離末端またはループ状の末端を有し得る。例えば、図３は、本発明で利用され得る種々の構造を示す。図３Ａは、上記のショウジョウバエ系で活性であることが見出された構造を示し、また哺乳動物細胞で活性な種も示す。本発明は、ＩｇＥ媒介疾患および病状（アレルギー性鼻炎および喘息が挙げられるが、これらに限定されない）を処置または予防するための哺乳動物細胞への図３Ａに示す構造を有するｓｉＲＮＡの投与を包含する。しかし、投与された因子がこの構造を有する必要はない。例えば、投与した組成物は、投与した因子がインターフェロン応答の誘導などの負の事象を生じない限り、インビボで図３Ａの構造にプロセシングされ得る任意の構造を含み得る。（ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの合成、プロセシング、または活性に関して本明細書中で使用される場合、用語「インビボ」は、一般に、無細胞系とは対照的に細胞内で起こる事象をいうことに留意すること。一般に、細胞は、組織培養中で維持され得るか、インタクトな生物の一部であり得る）。本発明はまた、本明細書中で考察されるように、このような因子の投与によって標的転写物レベルが十分に減少する限り、図３Ａに示す構造に正確にプロセシングされない因子の投与を包含し得る。図３Ｂおよび図３Ｃは、本発明でＲＮＡｉ因子として使用するための２つの別の構造を示す。
【００５０】
図３Ｂおよび３Ｃは、ＲＮＡ干渉を媒介するために使用され得るさらなる構造を示す。これらのヘアピン（ステム−ループ）構造を細胞内でプロセシングして、図３Ａなどに記載のｓｉＲＮＡ構造を得ることができる。図３Ｂは、相互にハイブリダイズしてステム４００、ループ４１０、および突出３２０として示す二重鎖領域を形成する２つの相補部分を含むＲＮＡ分子を含む因子（ｓｈＲＮＡ）を示す。好ましくは、ステムは１５〜２９ヌクレオチド長の間（例えば、約１９ｎｔ長）であり、ループは１〜２０ｎｔ長、より好ましくは約４〜１０ｎｔ長、最も好ましくは約６〜８ｎｔ長であり、そして／または突出は約１〜２０ｎｔ長、より好ましくは約２〜１５ｎｔ長である。本発明の特定の実施形態では、ステムは最小で１９ヌクレオチド長であり、約２９ヌクレオチド長までであり得る。当業者は、４ヌクレオチドまたはそれ以上のループはより短いループよりも立体障害を受ける可能性が低く、従って、好ましいと認識する。いくつかの実施形態では、突出は、５’リン酸または３’水酸基を含む。以下に考察するように、図３Ｂに示す構造を有する因子を、インビボまたはインビトロ転写によって容易に生成し得、いくつかの好ましい実施形態では、多くの場合突出が複数のＵ残基（例えば、１と５との間のＵ残基）を含むように、転写物テールが突出に含められる。ループは、阻害されることが望ましい標的転写物に相補的な部分（すなわち、ｓｈＲＮＡのアンチセンス部分）の５’または３’末端のいずれかに位置づけられ得る。
【００５１】
図３Ｃは、約１９ｂｐ長のステム４００を形成するのに十分な相補性要素を含む環状のＲＮＡを含む因子を示す。このような因子は、本明細書中に記載の種々の他のＲＮＡｉ因子と比較して改良された安定性を示し得る。
【００５２】
ｓｉＲＮＡの記載では、ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖をいうことが多くの場合好都合である。以下でさらに考察するように、一般に、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の二重鎖部分の配列は標的転写物の標的化された部分と実質的に同一である一方で、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖はこの領域中の標的転写物と実質的に相補的である。ｓｈＲＮＡは自己ハイブリダイズする１つのＲＮＡ分子を含むが、得られた二重鎖構造はセンス鎖およびアンチセンス鎖または部分を含むと見なされ得ることが認識される。したがって、アンチセンス鎖またはアンチセンス部分が二重鎖を形成するか形成し得る分子のセグメントであり、かつ標的転写物の標的化された部分と実質的に相補的であり、センス鎖またはセンス部分が二重鎖を形成するか形成し得る分子のセグメントであり、かつ標的転写物の標的化された部分と配列が実質的に同一である場合、ｓｈＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖またはセンス部分およびアンチセンス部分ということが本明細書中では好都合である。
【００５３】
説明のために、以下の考察は、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡよりもむしろｓｉＲＮＡをいうことができる。しかし、当業者に明らかなように、ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖に関する教示は、一般に、対応するｓｈＲＮＡのステム部分のセンス部分およびアンチセンス部分に適用可能である。したがって、一般に、以下の検討を、本発明のｓｈＲＮＡの設計、選択、および送達にも適用する。
【００５４】
図３に示す任意の構造または本明細書中に記載の任意の他の有効な構造を有する因子は、完全に天然のＲＮＡヌクレオチドから構成され得るか、その代わりに１つ以上のヌクレオチドアナログを含み得ることが当業者に認識される。広範な種々のこのようなアナログが当該分野で公知であり、ホスホロチオエートが治療用核酸の研究で最も一般的に使用されている（ホスホロチオエートを利用した場合に関与する検討のいくつかの考察については、例えば、Ａｇａｒｗａｌ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４８９：５３、１９９９を参照のこと）。特に、本発明の特定の実施形態では、例えば、エキソヌクレアーゼによる消化を減少させるために１つ以上の遊離鎖末端にヌクレオチドアナログを含ませることによってｓｉＲＮＡ構造を安定化することが望ましい。１つ以上の遊離末端にデオキシヌクレオチド（例えば、デオキシチミジンなどのピリジン）を含ませることにより、この目的を果たし得る。あるいは、またはさらに、特に、ｓｉＲＮＡの１つの鎖（またはｓｈＲＮＡのステム部分の１つの鎖）と標的転写物との相互作用によって形成される任意のハイブリッドと比較して、ステムの安定性を増加または減少させるために１つ以上のヌクレオチドアナログを含ませることが望ましい。
【００５５】
本発明の特定の実施形態に従って、種々のヌクレオチド修飾が、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかで選択的に使用される。例えば、アンチセンス鎖で非修飾リボヌクレオチドを利用する一方で、センス鎖中のいくつかまたは全ての位置で修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾もしくは非修飾デオキシリボヌクレオチドを使用することが好ましい。本発明の特定の実施形態に従って、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖および／またはセンス鎖の二重鎖部分で非修飾リボヌクレオチドのみを使用する一方で、アンチセンス鎖および／またはセンス鎖の突出は修飾リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含み得る。特に、本発明の特定の実施形態に従って、同時係属中の米国特許出願番号１０／６７４，１５９号に記載のように、センス鎖は、センス鎖と相補的な転写物のサイレンシングを減少または消失させる一方で、アンチセンス鎖と相補的な転写物のサイレンシングを防止する修飾を含む。
【００５６】
多数のヌクレオチドアナログおよびヌクレオチド修飾物が当該分野で公知であり、ハイブリダイセーションおよびヌクレアーゼ耐性などの特性に対するその効果を調査した。例えば、塩基、糖、およびヌクレオシド間結合に対する種々の修飾を、選択された位置でオリゴヌクレオチドに導入し、得られた効果を非修飾オリゴヌクレオチドと比較した。多数の修飾が、相補核酸とハイブリダイズする能力、安定性などのオリゴヌクレオチドの１つ以上の局面を変化させることが示された。例えば、有用な２’修飾としては、ハロ基、アルコキシ基およびアリルオキシ基が挙げられる。米国特許第６，４０３，７７９号；同第６，３９９，７５４号；同第６，２２５，４６０号；同第６，１２７，５３３号；同第６，０３１，０８６号；同第６，００５，０８７号；同第５，９７７，０８９号およびその参考文献は、本発明の実施に有用であり得る広範な種々のヌクレオチドアナログおよび修飾物を開示している。Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．（編）「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（第１版）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ；ＩＳＢＮ：０８２４７０５６６１；第１版（２００１）およびその参考文献も参照のこと。当業者が認識するように、アナログおよび修飾物は、例えば、ウイルス遺伝子の発現を有効に減少させるアナログおよび修飾物を選択するための本明細書中に記載のアッセイまたは他の適切なアッセイを使用して試験され得る。
【００５７】
本発明の特定の実施形態では、アナログまたは修飾物は、例えば、ｓｉＲＮＡの吸収性を増加させ（例えば、粘液層を通過する吸収性の増加、吸収の増加など）、血流中または細胞内での安定性を増加させ、細胞膜を通過する能力を増加させる。当業者に明らかなように、アナログまたは修飾物は、Ｔｍを変化させることができ、それにより、ｓｉＲＮＡ配列と標的との間のミスマッチの耐性が増加し得る一方で、依然として有効に抑制し得る。
【００５８】
本発明に従って使用される有効なｓｉＲＮＡ薬はヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログではない１つ以上の部分を含み得ることが当業者にさらに認識される。
【００５９】
一般に、本発明のｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、好ましくは、インビボでこの鎖と標的転写物との間に正確なハイブリッドを形成し得るように、標的転写物部分（標的部分）と実質的に相補的な鎖（「ガイド」鎖または「アンチセンス」鎖）を含む領域（「阻害領域」または「二重鎖領域」）を含む。本発明の特定の好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのアンチセンス鎖は、標的転写物と完全に（１００％）相補的であり、他の実施形態では、１つ以上の非相補残基が、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡアンチセンス鎖および標的転写物によって形成された二重鎖内に位置する。この二重鎖の中心部分のミスマッチを回避することが好ましい（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２０：６８７７、２００１（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。一般に、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は標的転写物の標的化された部分と実質的に相補的である一方で、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのセンス鎖の配列はアンチセンス鎖と実質的に相補的である。したがって、代表的には、センス鎖は、標的転写物の標的化された部分と実質的に同一の部分を含む。しかし、当業者は、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのアンチセンス鎖と標的部分との間に形成された二重鎖によって示された相補性パーセントは、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間に形成された二重鎖（阻害領域）によって示された相補性パーセントと同一である必要はないことを認識する。
【００６０】
本発明の特定の好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのアンチセンス鎖は、標的転写物中のエクソン配列を含む標的部分とハイブリダイズする。イントロン配列とのハイブリダイズは排除されないが、一般に、哺乳動物細胞中で好ましくないようである。本発明の特定の好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのアンチセンス鎖は、エクソン配列と排他的にハイブリダイズする。本発明のいくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのアンチセンス鎖は、１つのエクソン中にのみ配列を含む標的部分とハイブリダイズし、他の実施形態では、標的部分は、一次転写物のスプライシングまたは他の修飾によって作製される。転写物のサイレンシングおよび分解を生じるｓｉＲＮＡ鎖またはｓｈＲＮＡ鎖とのハイブリダイゼーションに利用可能な任意の標的領域は、本発明に従って利用され得る。それにもかかわらず、当業者は、いくつかの例では、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのハイブリダイゼーション標的として標的遺伝子転写物の特定の領域を選択することが望ましいことを認識する。例えば、分解されることが望ましくない他の転写物を共有し得る標的遺伝子転写物の分泌を回避することが望ましい場合もある。コード領域および転写物の５’末端よりもむしろ３’末端に近い領域が本発明の特定の実施形態では好ましい。
【００６１】
ｓｉＲＮＡ配列およびｓｈＲＮＡ配列は、種々のアプローチにしたがって選択され得る。上記のように、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、好ましくは、アンチセンス鎖と標的転写物との間にインビボでハイブリッドを形成し得るような標的転写物の一部（「標的部分」）と実質的に相補的であるか、好ましくは完全に相補的なアンチセンス鎖、およびアンチセンス鎖と実質的または完全に相補的な部分を含むセンス鎖を含む領域（「二重鎖領域」）を含む。「コア領域」とも呼ばれる二重鎖領域は３’突出を含まないが、突出はまた、存在する場合、標的転写物またはその相補物と相補的であり得ると理解される（例えば、アンチセンスｓｉＲＮＡ（またはｓｈＲＮＡ）鎖の３’突出は標的転写物と相補的であってもよく、センスｓｉＲＮＡ（またはｓｈＲＮＡ）鎖の３’突出は標的転写物中の対応するヌクレオチド（すなわち、標的部位のすぐ３’側のヌクレオチド）と同一であり得る）。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのアンチセンス鎖が標的部分と完全に相補的であり、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡのアンチセンス鎖が二重鎖領域の形成に関与する部分内で相互に完全に相補的であることが一般に好ましいが、完全な相補性より低い相補性が許容可能であり、本発明の特定の実施形態では望ましい。標的転写物と１００％未満相補的なアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、ＲＮＡｉを媒介し得る。さらに、コア領域内で相互に完全にではなくても相補的なアンチセンス鎖およびセンス鎖を含むｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡもＲＮＡｉを媒介し得る。
【００６２】
本明細書中で説明するために、ｓｉＲＮＡコア領域またはｓｈＲＮＡコア領域の長さは、１９ヌクレオチドであると推測され、１９ヌクレオチド配列をＮ１９という。しかし、コア領域は、１５ヌクレオチド長〜２９ヌクレオチド長の範囲であり得る。代表的には、２つの各鎖の長さは、約２１ヌクレオチドと約２５ヌクレオチドとの間であるが、他の長さも許容可能である。代表的には、突出は、存在する場合、２ヌクレオチド長であるが、１ヌクレオチド長または２ヌクレオチド長より長くてもよい。さらに、標的転写物と相補的なアンチセンス鎖部分が標的転写物と完全に相補的であるようにｓｉＲＮＡ  Ｎ１９阻害領域を選択されると推測されるが、上記のように、１つ以上のミスマッチが許容され得る。
【００６３】
一般に、転写阻害経路（転写物切断経路）を介して標的転写物の発現を減少させる最大の能力を有するｓｉＲＮＡが望ましい場合、二重鎖領域中のミスマッチを回避することが望ましい。しかし、下記のように、標的転写物の発現を減少させる最大能力より小さい能力を示すｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを選択することが望ましいか、転写抑制に関与する別の経路を介して作用するｓｉＲＮＡを使用することが望ましい。このような状況では、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの二重鎖部分に１つ以上のミスマッチを組み込むことが望ましい。本発明の特定の実施形態では、好ましくは、阻害領域中の４残基未満または約１５％未満の残基がミスマッチである。本発明の特定の実施形態では、好ましくは、阻害領域内のアンチセンス鎖部分中の４残基未満または約１５％未満の残基がミスマッチである。
【００６４】
いくつかの場合、全アンチセンス鎖（存在する場合、３’突出を含む）が標的転写物と完全に相補的であるように、ｓｉＲＮＡ配列またはｓｈＲＮＡ配列が選択される。突出がＵＵ、ＴＴまたはｄＴｄＴである場合、これは、標的化された転写物の１９ｂｐ標的領域の前にＡＡが存在する（すなわち、標的領域のすぐ５’側の２つのヌクレオチドはＡＡである）ことを必要とする。同様に、全センス鎖（３’突出を含む）が標的転写物と完全に同一であるように、ｓｉＲＮＡ配列またはｓｈＲＮＡ配列が選択され得る。突出がＵＵ、ＴＴ、またはｄＴｄＴである場合、これは、標的化された転写物の１９ｂｐの標的領域のあとにＵＵが存在する（すなわち、標的転写物の標的領域のすぐ３’側の２つのヌクレオチドがＵＵである）ことを必要とする。しかし、突出が標的転写物と相補的または同一である必要はない。任意の所望の配列（例えば、ＵＵ）は、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのアンチセンスおよび／またはセンス１９ｂｐコア領域の３’末端に簡単に付加されて３’突出を生成し得る。一般に、１つ以上のピリミジン（通常、Ｕ、Ｔ、またはｄＴ）を含む突出が利用される。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを化学合成する場合、ＵよりもむしろＴを使用することがより好都合であり得るが、ＴよりもむしろｄＴの使用により、安定性が増加し得る。上記のように、突出の存在は任意であるが、存在する場合、標的配列自体のいかなる関係も有する必要はない。
【００６５】
例えば、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、（ｉ）５’末端で２つのＡＡ残基および３’末端で２つのＵＵ残基に隣接した１９ｎｔ領域（標的部分）からなる標的転写物中の２３ｎｔ領域を同定し、その後、（ｉｉ）２３ｎｔ領域のうちの１〜２１のヌクレオチドと完全に相補的なアンチセンス鎖および２３ｎｔ領域のｎｔ３〜２３と完全に同一のセンス鎖を有するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを選択することによって選択され得る。標的転写物がｍＲＮＡである場合、ｃＤＮＡのセンス鎖はｃＤＮＡがＵよりもむしろＴを含むこと以外はｍＲＮＡと同一であるので、ｓｉＲＮＡ配列およびｓｈＲＮＡ配列は、ｍＲＮＡ配列自体よりもむしろ対応するｃＤＮＡ配列を参照して選択され得ることが認識される。
【００６６】
全てのｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡが、任意の特定の標的遺伝子の発現の減少または阻害に等しく有効であるわけではなく（例えば、Ｈｏｌｅｎ，Ｔ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３０（８）：１７５７−１７６６、異なるｓｉＲＮＡの多様な効果についての報告を参照のこと）、種々の検討材料を使用して、選択されたｓｉＲＮＡが有効であり得る可能性を高め得る。例えば、イントロンよりもむしろエクソン内の標的部分を選択することが好ましい場合もある。一般に、標的転写物の３’末端付近の標的部分は、標的転写物の５’末端付近または中央の部分を標的することが好ましい場合もある。ｓｉＲＮＡは、一般に、ＲＮＡｉ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＆  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ  ８００２６（ＲＮＡ試薬の供給業者）から入手可能、またはＤｈａｒｍａｃｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃  ００３−Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  Ｂ、「ｓｉＲＮＡ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡｉ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」に記載の原理にしたがって設計され得る。ＲＮＡｉ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＆  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅは、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの設計パラメーター、合成などに関連する情報を豊富に含み、本明細書中で参考として援用される。
【００６７】
一般に、３０％と６０％との間のＧＣ含量を有するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを選択し、３つ以上の同一のヌクレオチドの文字列（例えば、ＧＧＧ、ＣＣＣなど）を回避することが好ましい。他の転写物の阻害を回避しながら標的転写物の特異的阻害を達成するために、可能な範囲でｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが送達される細胞または生物中に存在する他の配列に対して固有であるか有意な相同性を欠く配列を選択することが望ましい。提案されたｓｉＲＮＡ配列またはｓｈＲＮＡ配列のいずれかの鎖と相同な任意の配列を同定するための公的に利用可能なデータベース（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ、ｄｒａｆｔ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅなど）の検索および１つ以上の実質的に同一の配列が見出されるｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの使用の回避によってこのことが達成され得る。対応するマウス遺伝子およびヒト遺伝子中の同一または高度に保存された（例えば、１９ヌクレオチドあたり３つ、より好ましくは２つ、さらにより好ましくは１つのヌクレオチドが異なり、最も好ましくは完全に同一である）転写物部分を標的化するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを選択することが好ましい。これにより、マウス細胞株およびマウス疾患モデル中のＲＮＡｉ因子を試験することができ、マウスにおける標的遺伝子の阻害に有効であると同定された配列もヒトにおける対応標的遺伝子の阻害に有効である可能性が増加する。
【００６８】
表１〜２６は、ＦＣεＲα鎖、ＦＣεＲβ鎖、ｃ−Ｋｉｔ、Ｌｙｎ、Ｓｙｋ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、４−１ＢＢリガンド、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＣＤ８３、ＳＬＡＭ、共通γ鎖およびＣＯＸ−２をそれぞれコードする転写物の好ましい標的部分の配列を列挙する。
【００６９】
本発明の特定の実施形態に従って、表に列挙された任意の配列に基づいてｓｉＲＮＡを設計するために、配列のヌクレオチド１〜１９は、ｓｉＲＮＡセンス鎖のコア（二重鎖）領域の配列（すなわち、二重鎖形成に関与する部分）として選択される。この配列に相補的な配列が、アンチセンス鎖のために選択すされる。２ｎｔの３’突出が、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方に付加される。本発明の特定の実施形態では、上記のように、突出はｄＴｄＴであるが、他の突出を使用され得る。本発明の特定の実施形態では、センス鎖の３’突出は、センス鎖がｃＤＮＡ配列（必要に応じて、ＴがＵに置換される）の２１ｎｔ部分と同一であるように、表に列挙した１９ヌクレオチド配列のすぐ３’側の遺伝子中の２つのヌクレオチドからなる。本発明の特定の実施形態では、アンチセンス鎖の３’突出は、アンチセンス鎖がｃＤＮＡ配列の２１ｎｔ部分と相補的であるように、１９ヌクレオチドセンス鎖のすぐ５’側の２つのヌクレオチドに相補的な遺伝子中の２つのヌクレオチドからなる。各配列のヌクレオチド１〜２１に相補的な配列が、対応するアンチセンス鎖として選択される。例えば、ｃＤＮＡ配列ＦＣεＲα−２６８（ＴＴＧＧＴＣＡＴＴＧＴＧＡＧＴＧＣＣＡ＝配列番号３１６）に基づいてｓｉＲＮＡを設計するために、配列５’−ＵＵＧＧＵＣＡＵＵＧＵＧＡＧＵＧＣＣＡ−３’（配列番号１）が、センス鎖のコア領域として選択され、相補配列５’−ＵＧＧＣＡＣＵＣＡＣＡＡＵＧＡＣＣＡＡ−３’（配列番号３１７）がアンチセンス鎖のコア領域として選択される。ｄＴｄＴからなる２ｎｔの３’突出が各鎖に付加されて、配列５’−ＵＵＧＧＵＣＡＵＵＧＵＧＡＧＵＧＣＣＡｄＴｄＴ−３’（配列番号３１８）（センス鎖）および５’−ＵＧＧＣＡＣＵＣＡＣＡＡＵＧＡＣＣＡＡｄＴｄＴ−３’（配列番号３１９）（アンチセンス鎖）を生じる。
【００７０】
センス鎖とアンチセンス鎖とのハイブリダイゼーションにより、１９塩基対のコア二重鎖領域を有するｓｉＲＮＡを生じ、各鎖は２ヌクレオチドの３’ＯＨ突出を有する。センスおよびアンチセンスのｓｉＲＮＡ配列は、表に列挙した各鎖から同様に得ることができる。１９ｎｔのコア領域を使用して、センス鎖およびアンチセンス鎖のいずれかまたは両方に異なる３’突出を有する種々のｓｉＲＮＡ分子が設計され得ることが認識される。一般に、本発明は、センス鎖が高度に保存されたコア領域を含み、３’突出が変化し得るｓｉＲＮＡを包含する。センス鎖中の３’突出は、ｃＤＮＡ配列中のコア領域のすぐ３’側に存在するヌクレオチドと対応する必要はない。アンチセンス鎖中の３’突出は、ｃＤＮＡ配列中のコア領域のすぐ５’側に存在するヌクレオチドと相補的である必要はない。
【００７１】
上記の説明に従って、表中に示す配列が使用されて、各鎖に同一の３’突出を有する１９ｎｔ二重鎖コア領域からなる構造を有さない種々のｓｉＲＮＡを設計し得る。例えば、突出配列は変化し得、突出の一方または両方の存在は、遺伝子発現の有効なｓｉＲＮＡ媒介阻害に不可欠ではない。さらに、ｓｉＲＮＡの二重鎖部分の好ましい長さは１９ヌクレオチドであり得るが、より長いかより短い二重鎖部分が有効であり得る。したがって、表中に示す配列にしたがって設計したｓｉＲＮＡは、センス鎖中に列挙したヌクレオチドのサブセットのみを含み得る。
【００７２】
したがって、本発明は、表中に列挙した配列中の１９ヌクレオチドの全部または一部を含む配列を有するセンス鎖を有するｓｉＲＮＡを提供する。一般に、表中に示す配列にしたがって設計したｓｉＲＮＡのセンス鎖の配列は、列挙した配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７個の連続したヌクレオチド、さらにより好ましくは１９個の連続したヌクレオチドを含む。一般に、表中に示す配列にしたがって設計したｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の配列は、列挙した配列の一部と完全に相補的である少なくとも１５個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７個の連続したヌクレオチド、さらにより好ましくは１９個の連続したヌクレオチドを含む。
【００７３】
本発明の特定の実施形態では、表中に示す配列にしたがって設計したｓｉＲＮＡのセンス鎖の配列は、列挙した配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７個の連続したヌクレオチド、さらにより好ましくは１９個の連続したヌクレオチドを含み、これらは、１つのヌクレオチドが列挙した配列とは異なる。本発明の特定の実施形態では、表中に示す配列にしたがって設計したｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の配列は、１つのヌクレオチドが異なり得ること以外は、列挙した配列の一部と完全に相補的である少なくとも１５個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７個の連続したヌクレオチド、さらにより好ましくは１９個の連続したヌクレオチドを含む。
【００７４】
本発明の特定の実施形態では、表中に示す配列にしたがって設計したｓｉＲＮＡのセンス鎖の配列は、列挙した配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７個の連続したヌクレオチド、さらにより好ましくは１９個の連続したヌクレオチドを含み、これらは、２つまでのヌクレオチドが列挙した配列とは異なる。本発明の特定の実施形態では、表中に示す配列にしたがって設計したｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の配列は、２つのヌクレオチドが異なり得ること以外は、列挙した配列の一部と完全に相補的である少なくとも１５個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７個の連続したヌクレオチド、さらにより好ましくは１９個の連続したヌクレオチドを含む。
【００７５】
本発明の特定の実施形態では、表中に示す配列にしたがって設計したｓｉＲＮＡのセンス鎖の配列は、列挙した配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７個の連続したヌクレオチド、さらにより好ましくは１９個の連続したヌクレオチドを含み、これらは、３つまでのヌクレオチドが列挙した配列とは異なる。本発明の特定の実施形態では、表中に示す配列にしたがって設計したｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の配列は、３つのヌクレオチドが異なり得ること以外は、列挙した配列の一部と完全に相補的である少なくとも１５個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７個の連続したヌクレオチド、さらにより好ましくは１９個の連続したヌクレオチドを含む。これらの実施形態のいずれかでは、相違は、元の配列と１つのヌクレオチド、または、本発明の特定の実施形態では、１つを超えるヌクレオチドの挿入、欠失、または置換であり得る。本発明は、ｓｉＲＮＡについて上記のセンス鎖およびアンチセンス鎖を有するｓｈＲＮＡを提供する。上記の相違を有するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのアンチセンス鎖配列およびセンス鎖配列は、それぞれ列挙した配列と実質的に相補的であるか実質的に同一であると見なす。
【００７６】
当業者は、ｓｉＲＮＡが上記原理にしたがった融点（Ｔｍ）範囲および解離温度（Ｔｄ）範囲を示し得ると認識する。Ｔｍを、５０％の核酸およびその完全な相補物が溶液中で二重鎖である温度と定義し、Ｔｄを特定の塩濃度での温度と定義し、５０％のオリゴヌクレオチドおよびその完全なフィルター結合相補物が二重鎖である総鎖濃度は、１つの分子がフィルター上に固定される状態に関する。許容可能なＴｍの代表例を、本明細書中の実施例に開示するｓｉＲＮＡ配列に基づいて、実験的または適切な経験もしくは理論に基づく式を使用した当該分野で周知の方法を使用して決定することができる。
【００７７】
実際のＴｍの１つの一般的な決定方法は、ＵＶ分光光度計で温度自動調整セルを使用することである。温度を吸光度に対してプロットすると、２つのプラトーを有するＳ字曲線が認められる。プラトーの間を読み取った吸光度が、Ｔｍに相当する。Ｔｄの最も簡潔な式は、以下のウォレス（Ｗａｌｌａｃｅ）の法則である：Ｔｄ＝２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ）（Ｗａｌｌａｃｅ，Ｒ．Ｂ．；Ｓｈａｆｆｅｒ，Ｊ．；Ｍｕｒｐｈｙ，Ｒ．Ｆ．；Ｂｏｎｎｅｒ，Ｊ．；Ｈｉｒｏｓｅ，Ｔ．；Ｉｔａｋｕｒａ，Ｋ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．６，３５４３（１９７９）。固定化標的鎖の性質は、標的とプローブの両方が溶液中で遊離している場合、値に対して認められたＴｍの正味の現象を提供する。減少の大きさは、約７〜８℃である。１価のカチオン濃度に適切な値の範囲内でｐＨ５〜９の５０ヌクレオチドより長い配列に有効なＤＮＡについての別の有用な式は、以下である：Ｔｍ＝８１．５＋１６．６  ｌｏｇ  Ｍ＋４１（ＸＧ＋ＸＣ）−５００／Ｌ−０．６２Ｆ、ここで、Ｍは１価カチオンのモル濃度であり、ＸＧおよびＸＣは配列中のＧおよびＣのモル分率であり、Ｌは二重鎖中で最も短い鎖の長さであり、Ｆはホルムアミドのモル濃度である（Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ；Ｉｓｒａｅｌ，Ｍ．Ｆ．；Ｌａｗ，Ｍ−Ｆ．；Ｍａｒｔｉｎ，Ｍ．Ａ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４，４８７６）。ＲＮＡについての類似の式は以下である：Ｔｍ＝７９．８＋１８．５  ｌｏｇ  Ｍ＋５８．４（ＸＧ＋ＸＣ）＋１１．８（ＸＧ＋ＸＣ）２−８２０／Ｌ−０．３５Ｆ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドについては、Ｔｍ＝７９．８＋１８．５  ｌｏｇ  Ｍ＋５８．４（ＸＧ＋ＸＣ）＋１１．８（ＸＧ＋ＸＣ）２−８２０／Ｌ−０．５０Ｆである。これらの式は、固定化標的ハイブリッドから導かれる。いくつかの研究により、接相互作用についての熱力学的基準を使用してＴｍの正確な式が導かれている。ＤＮＡおよびＲＮＡについての式は以下である：Ｔｍ＝（１０００ΔＨ）／Ａ＋ΔＳ＋Ｒｌｎ（Ｃｔ／４）−２７３．１５＋１６．６  ｌｎ［Ｎａ＋］、ここで、ΔＨ（Ｋｃａｌ／ｍｏｌ）はハイブリッドの最近接エンタルピーの変化の和であり、Ａ（ｅｕ）は、ヘリックス開始の補正を含む定数であり、ΔＳ（ｅｕ）は最近接エントロピーの変化の和であり、Ｒは気体定数（１．９８７ｃａｌ  ｄｅｇ−ｌｍｏｌ−１）であり、Ｃｔは鎖の総モル濃度である。鎖が自己相補性を示す場合、Ｃｔ／４はＣｔに置換される。熱力学的パラメーターの値は、文献から利用可能である。ＤＮＡについては、Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３，３７４６−３７５０，１９８６を参照のこと。ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖については、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４（３５）：１１２１１−６、１９９５を参照のこと。ＲＮＡについては、Ｆｒｅｉｅｒ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３、９３７３−９３７７、１９８６、Ｒｙｃｈｌｉｋ，Ｗ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（２１）、６４０９−６４１２、１９９０を参照のこと。Ｔｍを計算するための種々のコンピュータプログラムは広範に利用可能である。例えば、ＵＲＬがｗｗ���．ｂａｓｉｃ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／ｂｉｏｔｏｏｌｓ／ｏｌｉｇｏｃａｌｃ．ｈｔｍｌのウェブサイトを参照のこと。本発明の特定の実施形態に従って、好ましいｓｉＲＮＡは、Ｓｅｍｉｚａｒｏｖ，Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１００（１１）、ｐｐ．６３４７−６３５２に記載の設計基準にしたがって選択される。
【００７８】
本発明のいくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのアンチセンス鎖は、１つ以上の３’ＵＴＲ配列を含むか、完全に３’ＵＴＲ内に存在する標的部位とハイブリダイズする。本発明のこのような実施形態は、ｓｉＲＮＡ／テンプレート二重鎖中に多数のミスマッチを許容し得、特に、二重鎖の中央領域内にミスマッチを許容し得る。実際、いくつかのミスマッチは、３’ＵＴＲ中でのｓｉＲＮＡ／テンプレート二重鎖形成が伝統的なＲＮＡ阻害に関連するが、それとは異なる機構によってテンプレート転写物によってコードされるタンパク質の発現を阻害し得るので、望ましい。特に、テンプレート転写物の３’ＵＴＲに結合するｓｉＲＮＡがその安定性の減少よりもむしろ転写物の翻訳を減少させることができることを示唆する証拠が存在する。例えば、標的転写物とハイブリダイズした場合、このようなｓｉＲＮＡは、頻繁に、ミスマッチ領域によって分離された完全に相補的な２つのストレッチを含む。種々の構造が可能である。例えば、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ、および／またはｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡのアンチセンス鎖と標的転写物とによって形成される二重鎖は、完全ではない相補性の１つ以上の領域（例えば、ミスマッチヌクレオチド、バルジなど）を含み得る。代表的には、完全に相補的なストレッチは、少なくとも５ヌクレオチド長（例えば、６、７またはそれ以上のヌクレオチド長）である一方で、ミスマッチ領域は、例えば、１、２、３または４ヌクレオチド長であり得る。
【００７９】
標的転写物に対して完全ではない相補性を示すアンチセンス鎖を含む短い二本鎖ＲＮＡは、標的転写物の切断に加えて、または切断の代わりに、または切断の前に起こる翻訳抑制によって遺伝子発現をサイレンシングすることができる。例えば、図４に示すように、上記で考察したショウジョウバエ系および種々の生物でもｓｉＲＮＡを生成するＤＩＣＥＲ酵素は、小さな一時的ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ＲＮＡ）（ｓｔＲＮＡ）基質を、標的転写物の３’ＵＴＲ内に結合した場合、転写物の翻訳を遮断する阻害剤にプロセシングすることもできることが公知である（図４を参照のこと；Ｇｒｉｓｈｏｋ，Ａ．ら、Ｃｅｌｌ  １０６、２３−２４、２００１；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ，Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３、８３４−８３８、２００１；Ｋｅｔｔｉｎｇ，Ｒ．ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１５、２６５４−２６５９）。一般にミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる類似の約２２ヌクレオチドのＲＮＡが多数の生物（哺乳動物が含まれる）で同定されており、この転写後遺伝子スプライシング機構が広範囲に及び得ることが示唆される（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９４、８５３−８５８、２００１；Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ，Ａ．、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１８（４）、１７１−１７３、２００２および上記の２つの論文中の参考文献）。ミクロＲＮＡは、約４〜１５ｎｔのループおよび代表的にはステム中に１つ以上のミスマッチ領域またはバルジ領域を含む約７０ｎｔの前駆体ヘアピンＲＮＡとして転写される。このような前駆体からプロセシングされたミクロＲＮＡは、哺乳動物細胞中に標的部位を含む標的転写物の翻訳を遮断することが示されているが（Ｚｅｎｇ，Ｙ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ、９、１−２０、２００２）、これらはまた、その標的を認識してＲＮＡ切断を指向することもできる（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ，Ｇ．およびＺａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９７：２０５６−２０６０、２００２；Ｚｅｎｇ，Ｙ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ９：１３２７−１３３３、２００２）。Ａｍｂｒｏｓ，Ｖ．らは、ミクロＲＮＡアノテーションおよび内因性ｓｉＲＮＡとｍｉＲＮＡとの区別のための均一系を提案している（Ａｍｂｒｏｓ，Ｖ．ら、ＲＮＡ、：２７７−２７９、２００３）。Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．、Ｃｅｌｌ、１１６（２）：２８１−９７、２００４も参照のこと。
【００８０】
ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの前駆体を模倣するために設計されたヘアピン構造は、標的転写物の発現を減少または阻害し得る分子に細胞内でプロセシングされる（ＭｃＭａｎｕｓ，Ｍ．Ｔ．ら、ＲＮＡ、８：８４２−８５０、２００２）。１００％相補的な二重鎖構造を形成する２つのＲＮＡ鎖からなる古典的ｓｉＲＮＡに基づいたこれらのヘアピン構造を、クラスＩヘアピンまたはクラスＩＩヘアピンに分類した。クラスＩヘアピンは、アンチセンスｓｉＲＮＡ鎖（すなわち、インヒビターが望ましい標的転写物に相補的な鎖）の５’末端または３’末端にループが組み込まれているが、その他の点では古典的ｓｉＲＮＡと同一であった。クラスＩＩヘアピンは、ステム中の１つ以上のヌクレオチドミスマッチに加えて、二重鎖のアンチセンス鎖の３’末端または５’末端のいずれかに１９ｎｔ二重鎖およびループを含むという点でｍｉＲＮＡ前駆体と類似していた。これらの分子を、サイレンシングを媒介することができる小さなＲＮＡ二重鎖構造に細胞内でプロセシングした。これらは、天然に存在するｍｉＲＮＡの場合と考えられるので、翻訳抑制よりもむしろ標的ｍＲＮＡの分解によってその効果を発揮するようであった。完全に相補的な二重鎖構造を有するが、そのアンチセンス鎖が標的と完全ではない相補性の二重鎖（すなわち、バルジを含む二重鎖）を形成するｓｉＲＮＡは、翻訳の阻害によって遺伝子発現をサイレンシングするようであった（Ｄｏｅｎｃｈ，Ｊ．ら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．、１７：４３８−４４２、２００３）。
【００８１】
したがって、二重鎖構造を含むＲＮＡ分子（その一部が標的転写物と実質的または完全に相補的である）が少なくとも２つの異なる機構によってサイレンシングを媒介することが明白である。本発明の目的のために、任意のこのようなＲＮＡ（その一部が、分解の誘発、翻訳の阻害、または他の手段によって標的転写物に結合してその発現を減少させる）は、ＲＮＡｉ因子と見なされ、本発明の実施で有用である。本明細書中に記載の任意の組成物または方法は、一定のＲＮＡ構造に特異的に制限され得る。
【００８２】
当業者は、本発明のＲＮＡｉ因子が、任意の利用可能な技術（化学合成、インビボまたはインビトロでの酵素切断もしくは化学的切断、またはインビボまたはインビトロでのテンプレート転写が含まれるが、これらに限定されない）にしたがって調製され得ることができることを容易に認識する。上記のように、本発明のＲＮＡｉ因子は、自己相補部分を含む１つのＲＮＡ鎖（ｓｈＲＮＡ）または相互にハイブリダイズした２つ（またはそれ以上）の鎖（ｓｉＲＮＡ）として送達され得る。例えば、２つの異なる２１ｎｔのＲＮＡ鎖（それぞれ他方に相補的な１９ｎｔ領域を含む）が生成され、各鎖が一緒にハイブリダイズして図３Ａなどに示す構造を作製し得る。
【００８３】
あるいは、各鎖は、インビトロまたはインビボのいずれかでのプロモーターからの転写によって生成され得る。例えば、２つの別個の転写可能領域（それぞれ、他方に相補的な１９ｎｔ領域を含む２１ｎｔ転写物を生成する）を含む構築物が提供され得る。あるいは、図５に示すように２つの異なる転写物（それぞれ他方と少なくとも部分的に相補的である）が生成されるように配置された、反対のプロモーターＰ１およびＰ２ならびにターミネーターｔ１およびｔ２を含む１つの構築物が使用され得る。
【００８４】
別の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ因子（例えば、ｓｈＲＮＡ）が、例えば、自己相補領域を含む１つの転写単位の転写によって１つの転写物として生成される。図６は、本発明の１つのこのような実施形態を示す。上記のように、第１の相補領域および第２の相補領域を含み、必要に応じてループ領域を含むテンプレートが使用される。このようなテンプレートは、プロモーター（必要に応じて他の調節エレメンント）を適切に選択してインビトロまたはインビボ転写のために使用され得る。本発明は、１つ以上のｓｉＲＮＡ鎖またはｓｈＲＮＡ鎖の転写のためのテンプレートとして機能し得る遺伝子構築物を含む。
【００８５】
種々の利用可能な系（Ｔ７、ＳＰ６、およびＴ３プロモーター／ポリメラーゼ系（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓなどから市販されている系）が挙げられる）を使用してインビトロ転写が行われ得る。当業者に認識されるように、Ｔ７またはＴ３プロモーターの使用は、代表的には、５’末端に２つのＧ残基を有するｓｉＲＮＡ配列を必要とする一方で、ＳＰ６プロモーターの使用は、代表的には、５’末端にＧＡ配列を有するｓｉＲＮＡ配列を必要とする。ベクター（Ｔ７、ＳＰ６、またはＴ３プロモーターを含む）は当該分野で周知であり、ｓｉＲＮＡの転写を指向するように容易に修飾され得る。ｓｉＲＮＡがインビトロで合成される場合、被験体へのトランスフェクションまたは送達前にハイブリダイズさせることが可能である。本発明のｓｉＲＮＡ組成物は完全に二本鎖（ハイブリダイズした）分子からなる必要はないと理解すべきである。例えば、ｓｉＲＮＡ組成物は、少量の一本鎖ＲＮＡを含み得る。これは、例えば、センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖との比の不均一、自己相補ＲＮＡ部分の合成前の転写の終結などに起因して、ハイブリダイズした分子とハイブリダイズしていない分子との間の均衡の結果として起こり得る。一般に、好ましい組成物は、少なくとも約８０％の二本鎖ＲＮＡ、少なくとも約９０％の二本鎖ＲＮＡ、少なくとも約９５％の二本鎖ＲＮＡ、さらに少なくとも約９９〜１００％の二本鎖ＲＮＡを含む。しかし、ｓｉＲＮＡ組成物は、十分に有効な二本鎖ＲＮＡを含む場合、８０％未満のハイブリダイズしたＲＮＡを含み得る。
【００８６】
当業者は、本発明のｓｉＲＮＡ因子がインビボで生成される場合、一般に、１つ以上の転写単位の転写を介して産生されることが好ましいと認識する。一次転写物を、必要に応じて、（例えば、１つ以上の細胞酵素によって）プロセシングして、遺伝子阻害を達成する最終的な因子を生成し得る。適切なプロモーターおよび／または調節エレメントが、哺乳動物細胞中の関連する転写単位の発現を可能にするために容易に選択され得ることがさらに認識される。本発明のいくつかの実施形態では、調節可能なプロモーターを使用することが望ましい場合もあり、他の実施形態では、構成的発現が望ましい場合もある。
【００８７】
本発明の特定の好ましい実施形態では、１つ以上のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの転写単位のインビボ発現を指向するために使用されるプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩＩ）のプロモーターである。Ｐｏｌ  ＩＩＩは、４〜５個のＴ残基のストレッチ内で終結する小さな転写物の合成を指向する。Ｕ６プロモーターまたはＨ１プロモーターなどの特定のＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターは、転写領域内にｃｉｓ活性化調節エレメント（最初に転写されたヌクレオチド以外）を必要とせず、それにより、所望のｓｉＲＮＡ配列が容易に選択可能であるため、本発明の特定の実施形態で好ましい。天然に存在するＵ６プロモーターの場合、最初に転写されたヌクレオチドはグアノシンであり、天然に存在するＨ１プロモーター場合、最初に転写されたヌクレオチドはアデニンである（例えば、Ｙｕ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９９（９）、６０４７−６０５２（２００２）；Ｓｕｉ，Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９９（８）、５５１５−５５２０（２００２）；Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．ら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．、１６、９４８−９５８（２００２）；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９６，５５０−５５３（２００２）；Ｍｉｙａｇａｓｈｉ，Ｍ．およびＴａｉｒａ，Ｋ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２０、４９７−５００（２００２）；Ｐａｕｌ，Ｃ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２０、５０５−５０８（２００２）；Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２０、４４６−４４８（２００２）を参照のこと）。したがって、本発明の特定の実施形態では、例えば、転写がＵ６プロモーターによって駆動される場合、好ましいｓｈＲＮＡ配列の５’ヌクレオチドはＧである。本発明の特定の他の実施形態では、例えば、転写物がＨ１プロモーターによって駆動される場合、５’ヌクレオチドはＡであり得る。
【００８８】
本発明の特定の実施形態に従って、例えばＸｉａ，Ｈ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０、ｐｐ．１００６−１０１０、２００２に記載されるＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）のプロモーターがまた使用され得る。これに記載されるように、ヘアピン配列が転写開始部位およびその後のポリＡカセットと極めて近接して並列し、それにより、転写されたヘアピン中の突出が最小になるか全くなくなる構築物が使用され得る。本発明の特定の実施形態では、上記要件を満たす場合、組織特異的、細胞特異的、または誘導性Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターが使用され得る。例えば、肥満細胞特異的プロモーター、Ｔ細胞特異的プロモーター、またはＢ細胞特異的プロモーターを使用することが望ましい場合もある。本明細書中に記載の特定の標的遺伝子は、このようなプロモーターを含み、その他は当該分野で公知である。
【００８９】
図７および図８などに示す構築物のインビボ発現は、ベクターへの構築物の導入および例えば被験体中の哺乳動物細胞へのベクターの導入によって達成され得ることが望ましいことが認識される。任意の種々のベクターが、特定の実施形態によって選択され得、呼吸経路中の１つ以上の細胞に構築物を送達し得るベクターを選択することが望ましい場合もある。ウイルスベクターまたは非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）のいずれかが使用され得る。本発明は、ｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡの転写単位を含むベクターならびにこのようなベクターを含むか、１つ以上のｓｉＲＮＡ鎖またはｓｈＲＮＡ鎖の転写のテンプレートとして機能し得る発現可能な転写単位を含むように操作された細胞を含む。本発明の特定の好ましい実施形態では、本発明のベクターは、哺乳動物細胞へのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの発現構築物の送達に適切なプラスミドまたは遺伝子治療ベクターである。このようなベクターは、喘息症状またはアレルギー症状の悪化を引き起こす疑いのある刺激物の曝露前または曝露後に被験体に投与され、これらの病状を予防または処置し得る。以下にさらに記載のように、本発明のＲＮＡｉベクターは、任意の種々の送達因子を含む組成物中で送達され得る。
【００９０】
したがって、本発明は、細胞内でのその存在によって１つ以上のＲＮＡが転写され、自己ハイブリダイズするか相互にハイブリダイズしてｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを形成し、細胞中で上記のタンパク質のうちの１つのタンパク質をコードする少なくとも１つの転写物の発現を阻害する種々のウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを提供する。本発明の特定の実施形態では、２つの個別の相補ｓｉＲＮＡ鎖が、２つのプロモーター（それぞれ１つのｓｉＲＮＡ鎖の転写を指向する（すなわち、転写が起こるようにｓｉＲＮＡのテンプレートに作動可能に連結する））を含む１つのベクターを使用して転写される。２つのプロモーターは同一方向にあってもよく、この場合、それぞれｓｉＲＮＡ鎖の１つのテンプレートに作動可能に連結される。あるいは、プロモーターは、プロモーター由来の転写によって２つの相補ＲＮＡ鎖が合成されるように１つのテンプレートに反対方向に隣接し得る。
【００９１】
本発明の他の実施形態では、２つの相補領域を含む１つのＲＮＡ分子（例えば、ｓｈＲＮＡ）の転写を駆動するプロモーターを含むベクターが使用される。本発明の特定の実施形態では、複数のプロモーター（それぞれ２つの相補領域を含む１つのＲＮＡ分子の転写を駆動する）を含むベクターが使用される。あるいは、１つのプロモーターまたは複数のプロモーターのいずれかから複数の異なるｓｈＲＮＡが転写され得る。種々の配置が可能である。例えば、１つのプロモーターは、複数の自己相補領域（それぞれ、ハイブリダイズして複数のステム−ループ構造を生成し得る）を含む１つのＲＮＡ転写物の合成を指向し得る。これらの構造は、例えば、ＤＩＣＥＲによってインビボで切断されて、複数の異なるｓｈＲＮＡを生成し得る。このような転写物は、好ましくは、転写物の３’末端に終結シグナルを含むが、各ｓｈＲＮＡ単位の間には含まないと認識される。複数のｓｉＲＮＡを生成し得る１つのＲＮＡは、インビボで産生される必要はないが、その代わりに、化学合成され得るか、インビトロ転写を使用して産生され得、外因的に提供し得ることも認識される。
【００９２】
本発明の別の実施形態では、ベクターは複数のプロモーターを含み、それらは、それぞれハイブリダイズしてｓｈＲＮＡを形成する自己相補ＲＮＡ分子の合成を指向する。複数のｓｈＲＮＡは全て同一の転写物を標的化し得るか、異なる転写物を標的化し得る。転写物の任意の組み合わせが標的化され得る。例えば、図７Ｂを参照のこと。一般に、本発明の特定の実施形態に従って、細胞中に発現されるｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡは、１５〜２９ヌクレオチド長（例えば、約１９ヌクレオチド長）の塩基対合（二重鎖）領域を含む。
【００９３】
当業者は、本発明のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのインビボ発現が、長期間（例えば、数日より長く、好ましくは少なくとも数週間〜数ヵ月、より好ましくは少なくとも１年またはそれ以上、おそらく、一生）にわたってｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを産生する細胞を産生することを可能にすることをさらに認識する。
【００９４】
ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを細胞内発現させるために組成物中で使用される好ましいウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターが挙げられる。例えば、頂上面（ａｐｉｃａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ）からインタクトな気道上皮を有効に形質導入するフィロウイルスエンベロープタンパク質シュードタイプＨＩＶベクターに基づくベクターを記載しているＫｏｂｉｎｇｅｒ，Ｇ．Ｐ．ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９（３）：２２５−３０、２００１を参照のこと。ＦＵＧＷレンチウイルスベクターを記載しているＬｏｉｓ，Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９５：８６８−８７２、２００２年２月１日；Ｓｏｍｉａ，Ｎ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（９）：４４２０−４４２４、２０００；Ｍｉｙｏｓｈｉ，Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：６８２−６８６，１９９９；および米国特許第６，０１３，５１６号も参照のこと。
【００９５】
本発明の特定の実施形態では、ベクターは、細胞内でのその存在によって、自己ハイブリダイズするか相互にハイブリダイズして細胞中の少なくとも１つの転写物の発現を阻害するｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを形成する１つ以上のＲＮＡが転写されるレンチウイルスベクターである。それを説明するために、ベクターはレンチウイルスベクターであると予想される。適切なレンチウイルスベクターは、例えば、Ｒｕｂｉｎｓｏｎ，Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，第３３巻、ｐｐ．４０１−４０６，２００３に記載されている。しかし、他のレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターも使用され得ることが理解されるべきである。本発明の種々の実施形態に従って、レンチウイルスベクターは、レンチウイルス導入プラスミドまたはレンチウイルス粒子（例えば、細胞を感染させ得るレンチウイルス）のいずれかであり得る。本発明の特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、転写によって相補領域を含むＲＮＡが合成され、その相補領域がハイブリダイズして標的転写物を標的化するｓｈＲＮＡを形成するように、プロモーターに作動可能に連結された核酸セグメントを含む。本発明の特定の実施形態に従って、ｓｈＲＮＡは、約１９ヌクレオチド長の塩基対合領域を含む。本発明の特定の実施形態に従って、ＲＮＡは、自己ハイブリダイズして、ループまたは一本鎖領域によって分離された複数の塩基対合領域が得られるように、２個を超える相補領域を含み得る。塩基対合領域は同一または異なる配列を有し得るので、１つの転写物の同一もしくは異なる領域または異なる転写物を標的化し得る。
【００９６】
本発明の特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、２つのプロモーターが反対方向で隣接する核酸セグメントを含み、そのプロモーターは、核酸セグメントに作動可能に連結され、従ってプロモーターからの転写は、相互にハイブリダイズして標的転写物を標的化するｓｉＲＮＡを形成する２つの相補ＲＮＡの合成を生じる。本発明の特定の実施形態に従って、ｓｉＲＮＡは、約１９ヌクレオチド長の塩基対合領域を含む。本発明の特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、少なくとも２つのプロモーターおよび少なくとも２つの核酸セグメントを含み、各プロモーターは、核酸セグメントに作動可能に連結され、従ってプロモーターからの転写は、相互にハイブリダイズして標的転写物を標的化するｓｉＲＮＡを形成する２つの相補ＲＮＡの合成を生じる。
【００９７】
上記のように、レンチウイルスベクターは、レンチウイルス導入プラスミドまたは感染性レンチウイルス粒子（例えば、レンチウイルスまたはシュードタイプレンチウイルス）であり得る。例えば、レンチウイルス導入プラスミド、レンチウイルス粒子、およびレンチウイルス発現系のさらなる考察については、米国特許第６，０１３，５１６号および参考文献１１３〜１１７を参照のこと。当該分野で周知のように、レンチウイルスは、ＲＮＡゲノムを有する。したがって、レンチウイルスベクターがレンチウイルス粒子（例えば、感染性レンチウイルス）である場合、ウイルスゲノムは、逆転写および第２の鎖合成を受けてＲＮＡ転写のためのテンプレートを含むＤＮＡを産生する。さらに、本明細書中でプロモーター、調節要素などの要素に対する参照がなされる場合、これらの要素の配列は本発明のレンチウイルス粒子中でＲＮＡ形態で存在し、本発明のレンチウイルス導入プラスミド中でＤＮＡ形態で存在すると理解されるべきである。さらに、ＲＮＡ合成のためのテンプレートがレンチウイルス粒子中に存在するＲＮＡ「によって提供される」場合、ＲＮＡが逆転写および第２の鎖合成を受けてＲＮＡ合成（転写）のためのテンプレートとして機能することができるＤＮＡを産生しなければはならないと理解すべきである。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの合成のためのテンプレートを提供するベクターは、このような合成が起こる細胞に導入された場合にｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを提供すると見なされる。
【００９８】
本発明のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、任意の利用可能な方法によって細胞に導入され得る。例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはこれらをコードするベクターは、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術によって細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、種々の当該分野で認識されている細胞への外来核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の導入技術（リン酸カルシウム共沈、塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクチンなどが挙げられる）をいうことを意図する。注入またはエレクトロポレーションも使用され得る。下記のように、本発明の１つの局面は、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの合成のためのテンプレートを含むｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびベクター（ＤＮＡベクターまたはウイルスベクターのどちらか）を細胞に導入するための種々の送達因子（カチオン性ポリマー、種々のペプチド分子トランスポーター（アルギニンリッチペプチド、ヒスチジンリッチペプチド、ならびにカチオン性脂質および中性脂質が挙げられる）、種々の非カチオン性ポリマー、リポソーム、炭水化物、および界面活性物質が挙げられるが、これらに限定されない）の使用を包含する。本発明はまた、以下にさらに記載されるように、例えば、送達因子への送達増強部分の付加などによる任意の種々の方法で修飾された送達薬の使用を包含する。
【００９９】
本発明は、本発明のＲＮＡｉ因子を含むように操作された任意の細胞を包含する。好ましくは、細胞は、哺乳動物細胞、特に、ヒトである。本発明のいくつかの実施形態では、細胞は、非ヒト生物内の非ヒト細胞である。例えば、本発明は、本発明のＲＮＡｉ因子を含むか発現するように操作されたトランスジェニック非ヒト動物を包含する。このような動物は、本発明のＲＮＡｉ因子の機能および／もしくは活性ならびに／またはＩｇＥ産生、ＩｇＥ媒介性過敏症、肥満細胞もしくは好塩基球の分解などに関与する機構の研究に有用である。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」は、動物の１つ以上の細胞が導入遺伝子を含む非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはラットまたはマウスなどのげっ歯類である。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリおよび両生類などが挙げられる。導入遺伝子は、外因性ＤＮＡまたは再構成（例えば、好ましくは、トランスジェニック動物の細胞のゲノムに組み込まれているかそこで生じる内因性染色体ＤＮＡの欠失）である。導入遺伝子は、トランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織中でのＲＮＡｉ因子の発現のためのテンプレートとして機能するか、この発現を指向し得る。本発明の特定の実施形態に従って、トランスジェニック動物は、アレルギー性鼻炎および喘息などのＩｇＥ媒介性疾患および病状の潜在的な治療薬の試験のための動物モデル（例えば、げっ歯類、ヒツジ、または非ヒト霊長類）として多様に使用される。
【０１００】
（ＩＩＩ．肥満細胞を阻害または不活化するためのＲＮＡｉ因子および使用方法）
（（Ａ）ＦｃεＲＩサブユニットをコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子）
肥満細胞は、高親和性ＩｇＥレセプターＦｃεＲＩを介してＩｇＥに結合する。（例えば、肥満細胞、ＩｇＥ媒介性肥満細胞脱顆粒の分子的機構、およびＩｇＥ媒介性病状における肥満細胞の役割の考察については、Ｇｏｌｄｓｂｙ，Ｒ．ら、Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、２０００およびその参考文献を参照のこと）。ＦｃεＲＩは、α鎖、β鎖、およびγ鎖からなる。γ鎖はＴ細胞および他の細胞型によって発現されるが、α鎖およびβ鎖は、主に、マウスおよびヒトの両方において肥満細胞および好塩基球によって発現される。
【０１０１】
本発明の１つの実施形態に従って、ＦｃεＲＩ発現は、ＦｃεＲ１のα鎖またはβ鎖をコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはＲＮＡｉベクター）の送達によって阻害される。このレセプターなしでは細胞はＩｇＥに結合することができず、それにより、アレルゲンによって活性化することができないので、このような阻害は肥満細胞を有効に安全にする（ｄｉｓａｒｍ）。本発明の特定の実施形態では、ＦｃεＲＩのα鎖およびβ鎖をコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子は、個別に、または組み合わせて送達される。本発明は、ＦｃεＲＩのα鎖またはβ鎖をコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびＲＮＡｉベクター（例えば、プラスミド、ウイルスベクター、遺伝子治療ベクター））ならびに１つ以上の本発明のＲＮＡｉ因子を含有する組成物（例えば、薬学的組成物）を提供する。
【０１０２】
本発明は、細胞または生物にＦｃεＲＩのα鎖をコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子を投与する工程を包含する、ＦｃεＲＩのα鎖の発現を阻害する方法を提供する。特に、本発明は、（ｉ）細胞もしくは生物にＦｃεＲＩのα鎖をコードする転写物を標的化するｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡを投与する工程、または（ｉｉ）細胞もしくは生物に、ハイブリダイズするか自己ハイブリダイズしてＦｃεＲＩのα鎖をコードする転写物を標的化するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを形成する１つ以上のＲＮＡ分子の転写のためのテンプレートを含む核酸を投与する工程を包含するＦｃεＲＩのα鎖の発現を阻害する方法を提供する。
【０１０３】
本発明は、さらに、細胞または生物にＦｃεＲＩのβ鎖をコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子を投与する工程を包含する、ＦｃεＲＩのβ鎖の発現を阻害する方法を提供する。特に、本発明は、（ｉ）細胞もしくは生物にＦｃεＲＩのβ鎖をコードする転写物を標的化するｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡを投与する工程、または（ｉｉ）細胞もしくは生物に、ハイブリダイズするか自己ハイブリダイズしてＦｃεＲＩのβ鎖をコードする転写物を標的化するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを形成する１つ以上のＲＮＡ分子の転写のためのテンプレートを含む核酸を投与する工程を包含するＦｃεＲＩのβ鎖の発現を阻害する方法を提供する。この方法は、ＩｇＥ媒介性過敏症によって特徴づけられる疾患または病状の予防および処置に有用である。
【０１０４】
ＦｃεＲＩのα鎖およびβ鎖をコードする転写物のいくつかの適切な標的部分の配列を、表１（α鎖）および表２（β鎖）に列挙する。特定の好ましい本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、表１または表２に列挙した配列を有する部分を含む。特定の好ましいｓｉＲＮＡは、表１または表２に列挙した標的部分に１００％相補的である部分を含むアンチセンス鎖を含む。その配列が表１または表２に列挙した配列と１００％相補的である部分を含む第１の部分およびその配列が配列のステム形成相補物（ループを形成する非関連配列によって第１の部分から分離された）を含む第２の部分を有するｓｈＲＮＡは、本明細書中に記載のように容易に設計され得る。
【０１０５】
（（Ｂ）ｃ−Ｋｉｔをコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子）
肥満細胞の発生および生存は、細胞表面レセプターｃ−Ｋｉｔの発現を必要とする（ｃ−Ｋｉｔおよび造血系におけるその役割の考察については、例えば、Ａｓｈｍａｎ，Ｌ．Ｋ．、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９９年１０月；３１（１０）：１０３７−５１を参照のこと）。本発明の１つの実施形態に従って、ｃ−Ｋｉｔ発現は、ｃ−Ｋｉｔをコードする転写物を標的化するｓｉＲＮＡの送達によって阻害される。本発明は、ｃ−Ｋｉｔをコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびＲＮＡｉベクター（例えば、プラスミド、ウイルスベクター、遺伝子治療ベクター））ならびに１つ以上の本発明のＲＮＡｉ因子を含有する組成物（例えば、薬学的組成物）を提供する。
【０１０６】
本発明は、さらに、細胞または生物にｃ−Ｋｉｔをコードする転写物を標的化するＲＮＡｉを投与する工程を包含する、ｃ−Ｋｉｔの発現を阻害する方法を提供する。特に、本発明は、細胞または生物にｃ−Ｋｉｔをコードする転写物を標的化するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを投与する工程、または（ｉｉ）細胞または生物に、ハイブリダイズするか自己ハイブリダイズしてｃ−Ｋｉｔをコードする転写物を標的化するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを形成する１つ以上のＲＮＡ分子の転写のためのテンプレートを含む核酸を投与する工程による、ｃ−Ｋｉｔの発現を阻害する方法を提供する。この方法は、ＩｇＥ媒介性過敏症によって特徴づけられる疾患または病状の予防および処置に有用である。
【０１０７】
ｃ−Ｋｉｔをコードする転写物のいくつかの適切な標的部分の配列を、表３に列挙する。特定の好ましい本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、表３に列挙した配列を有する部分を含む。特定の好ましいｓｉＲＮＡは、表３に列挙した標的部分に１００％相補的である部分を含むアンチセンス鎖を含む。その配列が表３に列挙した配列と１００％相補的である部分を含む第１の部分およびその配列が配列のステム形成相補物（ループを形成する非関連配列によって第１の部分から分離された）を含む第２の部分を有するｓｈＲＮＡが、本明細書中に記載のように容易に設計され得る。
【０１０８】
（（Ｃ）ＬｙｎまたはＳｙｋをコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子）
上記のように、肥満細胞上のＦｃεＲＩの架橋は、細胞内シグナル伝達経路を活性化し、最終的に脱顆粒を生じる。２つの重要なシグナル伝達分子は、プロテインチロシンキナーゼＬｙｎおよびＳｙｋである。研究により、ＬｙｎおよびＳｙｋを欠損するマウスが肥満細胞機能を欠損することが示されている（例えば、Ｃｏｓｔｅｌｌｏ，Ｐら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１３（１２）：２５９５、１９９６；Ｚｈａｎｇ，Ｓ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２２（２３）：８１４４−８１５４、２００２を参照のこと）。本発明者らは、ＲＮＡｉを使用した転写レベルまたは翻訳レベルでのＬｙｎまたはＳｙｋの発現の阻害は、肥満細胞機能を調節し、それにより、疾患における肥満細胞の役割を軽減する強力な方法であることを認識している。本発明の１つの実施形態に従って、Ｌｙｎおよび／またはＳｙｋの発現は、これらのタンパク質をコードする転写物を標的化する１つ以上のＲＮＡｉ因子の送達によって阻害される。
【０１０９】
本発明は、ＬｙｎまたはＳｙｋの転写物を標的化するＲＮＡｉ因子（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはＲＮＡｉベクターなど）、各センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖（ｓｉＲＮＡ）または１つの自己相補ｓｉＲＮＡ鎖（ｓｈＲＮＡ）のいずれかとしての本発明のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを産生するための本発明のＲＮＡｉ因子およびベクター（プラスミド、ウイルスベクター、遺伝子治療ベクターが挙げられる）を含有する組成物（例えば、薬学的組成物）を提供する。
【０１１０】
本発明は、さらに、細胞または生物にＬｙｎをコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子を投与する工程を包含する、Ｌｙｎの発現を阻害する方法を提供する。特に、本発明は、細胞または生物にＬｙｎをコードする転写物を標的化するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを投与する工程、または（ｉｉ）細胞または生物に、ハイブリダイズするか自己ハイブリダイズしてＬｙｎをコードする転写物を標的化するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを形成する１つ以上のＲＮＡ分子の転写のためのテンプレートを含む核酸を投与する工程を包含する、Ｌｙｎの発現を阻害する方法を提供する。この方法は、ＩｇＥ媒介性過敏症によって特徴づけられる疾患または病状の予防および処置に有用である。
【０１１１】
Ｌｙｎをコードする転写物のいくつかの適切な標的部分の配列を、表４に列挙する。特定の好ましい本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、表４に列挙した配列を有する部分を含む。特定の好ましいｓｉＲＮＡは、表４に列挙した標的部分に１００％相補的である部分を含むアンチセンス鎖を含む。その配列が表４に列挙した配列と１００％相補的である部分を含む第１の部分およびその配列が配列のステム形成相補物（ループを形成する非関連配列によって第１の部分から分離された）を含む第２の部分を有するｓｈＲＮＡは、本明細書中に記載のように容易に設計され得る。
【０１１２】
本発明は、さらに、細胞または生物にＳｙｋをコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子を投与する工程を包含する、Ｓｙｋの発現を阻害する方法を提供する。特に、本発明は、（ｉ）細胞または生物にＳｙｋをコードする転写物を標的化するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを投与する工程、または（ｉｉ）細胞または生物に、ハイブリダイズするか自己ハイブリダイズしてＳｙｋをコードする転写物を標的化するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを形成する１つ以上のＲＮＡ分子の転写のためのテンプレートを含む核酸を投与する工程を包含する、Ｓｙｋの発現を阻害する方法を提供する。この方法は、ＩｇＥ媒介性過敏症によって特徴づけられる疾患または病状の予防および処置に有用である。
【０１１３】
Ｓｙｋをコードする転写物のいくつかの適切な標的部分の配列を、表５に列挙する。特定の好ましい本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、表５に列挙した配列を有する部分を含む。特定の好ましいｓｉＲＮＡは、表５に列挙した標的部分に１００％相補的である部分を含むアンチセンス鎖を含む。その配列が表５に列挙した配列と１００％相補的である部分を含む第１の部分およびその配列が配列のステム形成相補物（ループを形成する非関連配列によって第１の部分から分離された）を含む第２の部分を有するｓｈＲＮＡは、本明細書中に記載のように容易に設計され得る。
【０１１４】
（ＩＶ．ＩｇＥ産生を阻害するためのＲＮＡｉ因子およびその使用方法）
上記のように、血清ＩｇＥは、肥満細胞媒介性アレルギー性鼻炎および喘息において主な役割を果たす。ＩｇＥ分泌を生じるＢ細胞抗体応答には一般的には、Ｔ細胞の補助が必要である。Ｔ細胞活性化は、代表的には、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、およびＢ細胞が含まれる）によるＴ細胞へのアレルゲンの提示を含む。未熟な樹状細胞は、通常、体内の種々の部位（例えば、皮膚および粘膜）における上皮の下部に存在する。これらの細胞がアレルゲンに遭遇すると、アレルゲンを取り込み、流入領域リンパ節に移動し、ここで、プロセシングされたアレルゲン由来のペプチドフラグメントがＴ細胞に提示される。樹状細胞上のＩＣＯＳ（「誘導性同時刺激物質」の略語である）と呼ばれる同時刺激分子は、Ｔ細胞の誘導で重要な役割を果たし、それにより、Ｂ細胞にＩｇＥを産生するように促し得る（例えば、Ｔａｆｕｒｉ，Ａら、Ｎａｔｕｒｅ、４０９：１０５−９、２００１；Ｇｏｎｚａｌｏ，Ｊ．Ａ．ら、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２（７）：５９７−６０４，２００１を参照のこと）。したがって、ＩＣＯＳ発現の非存在下では、アレルゲン刺激は、Ｂ細胞によるＩｇＥの分泌を生じない。本発明の１つの実施形態に従って、ＩＣＯＳ発現は、ＩＣＯＳをコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはＲＮＡｉベクターなど）の送達によって阻害される。
【０１１５】
したがって、本発明は、ＩＣＯＳ転写物を標的化するＲＮＡｉ因子、各センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖（ｓｉＲＮＡ）または１つの自己相補ＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）のいずれかとしてのｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡを産生するための本発明のＲＮＡｉ因子およびベクター（例えば、プラスミド、ウイルスベクター、遺伝子治療ベクター）を含有する組成物（例えば、薬学的組成物）を提供する。本発明は、細胞または生物にＩＣＯＳをコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子を投与する工程を包含する、ＩＣＯＳの発現を阻害する方法を提供する。特に、本発明は、（ｉ）細胞または生物にＩＣＯＳをコードする転写物を標的化するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ因子を投与する工程、または（ｉｉ）細胞または生物に、ハイブリダイズするか自己ハイブリダイズしてＩＣＯＳをコードする転写物を標的化するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを形成する１つ以上のＲＮＡ分子の転写のためのテンプレートを含む核酸を含むＲＮＡｉベクターを投与する工程を包含する、ＩＣＯＳの発現を阻害する方法を提供する。この方法は、ＩｇＥ媒介性過敏症によって特徴づけられる疾患または病状の予防および処置に有用である。
【０１１６】
ＩＣＯＳをコードする転写物のいくつかの適切な標的部分の配列を、表６に列挙する。特定の好ましい本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、表６に列挙した配列を有する部分を含む。特定の好ましいｓｉＲＮＡは、表６に列挙した標的部分に１００％相補的である部分を含むアンチセンス鎖を含む。その配列が表６に列挙した配列と１００％相補的である部分を含む第１の部分およびその配列が配列のステム形成相補物（ループを形成する非関連配列によって第１の部分から分離された）を含む第２の部分を有するｓｈＲＮＡは、本明細書中に記載のように容易に設計され得る。
【０１１７】
（Ｖ．樹状細胞およびマクロファージにおける遺伝子のＲＮＡｉ阻害）
ＩｇＥの分泌を生じるＢ細胞抗体応答は、一般に、代表的には、２型Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ２）由来のＴ細胞の補助を必要とする。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、アレルゲン特異的記憶Ｔｈ２細胞がそれ自体の活性化後のＢ細胞抗体応答の刺激に関与する可能性が高い。Ｔｈ２細胞の活性化は、代表的には、ＡＰＣによるこれらの細胞へのアレルゲンの提示を必要とする。これらのうち、樹状細胞が特に重要である。ＤＣが抗原に遭遇すると、ＤＣはこれらを取り込み、流入領域リンパ節に移動し、ここで、アレルゲン由来のペプチドフラグメントをＴ細胞に提示する。種々の遺伝子の活性化状態および発現に依存して、樹状細胞は、（ペプチド−ＭＨＣ複合体として）ＤＣ提示アレルゲンを認識するＴ細胞を活性化または不活化し得る。ＤＣおよびその機能の概説については、Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ．およびＳｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．、Ｎａｔｕｒｅ、３９２：２４５−２５２、１９９８を参照のこと。
【０１１８】
本発明は、ＲＮＡｉを使用したＴ細胞と抗原提示細胞（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）との間の相互作用の変化が、アレルギー性鼻炎および喘息に関与するＴ細胞を不活化し、そして／または完全もしくは部分的に排除し、それにより治療効果を達成するためのアプローチを提供するという認識を包含する。本発明は、ＡＰＣによる抗原提示およびＴ細胞活性化で役割を果たす種々のタンパク質をコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびＲＮＡｉベクター）を提供する。これらのタンパク質およびＲＮＡｉ因子を、以下にさらに詳述する。
【０１１９】
（（Ａ）ＦＣεＲＩのα鎖をコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子）
上記のように、α鎖、β鎖、およびγ鎖からなるＦＣεＲＩは、ＩｇＥの高親和性レセプターである。肥満細胞に加えて、アトピー性鼻炎および喘息を罹患する患者由来のＤＣはまたは、これらの病状を罹患していない個体の代表的な状況と対照的に、レセプターを発現する。（例えば、Ｎｏｖａｋ，Ｎ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１１１（７）：１０４７、２００３およびその参考文献を参照のこと）。ＤＣによって発現したＦｃεＲＩレセプターは、β鎖を欠く三量体形態である。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、ＤＣ上のＦｃεＲＩは、有効な取り込み、プロセシング、およびＴ細胞への提示のための抗原集中分子（ａｎｔｉｇｅｎ−ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）として機能し得る。α鎖がＩｇＥに結合するので、本発明に従って、α鎖をコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子を使用して、ＤＣおよび／またはマクロファージによるＦｃεＲＩ発現を阻害する。ＦｃεＲＩをコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子は、上記で考察している。
【０１２０】
（（Ｂ）ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）をコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子）
ＯＸ４０およびＯＸ４０Ｌは、Ｔ細胞同時刺激（すなわち、他の細胞によるＴ細胞の刺激）に重要なレセプター−リガンド対である（Ｇｒａｍａｇｌｉａ，Ｉ．ら、Ｊ  ｌｍｍｕｎｏｌ．、１６１（１２）：６５１０−７、１９９８）。ＯＸ４０は活性化Ｔ細胞で発現するのに対して、ＯＸ４０ＬはＤＣ、Ｂ細胞、小グリア細胞、および内皮細胞で発現する。アレルギー性喘息のマウスモデルでは、ＯＸ４０Ｌは、アレルギー性炎症におけるＴｈ２応答に強く関与していた（Ｈｏｓｈｉｎｏ，Ａ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３３（４）：８６１−９、２００３）。本発明に従って、ＯＸ４０Ｌをコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子を使用して、ＤＣおよび／またはマクロファージによるＯＸ４０Ｌ発現を阻害し、それにより、これらのＡＰＣに対するＴｈ２細胞応答を干渉する。本発明に従って、ＯＸ４０Ｌの合成阻害に起因するＴｈ２応答の減少によってＩｇＥの産生が減少し、それにより、肥満細胞の脱顆粒が減少して治療効果が得られる。
【０１２１】
本発明は、ＯＸ４０Ｌをコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびＲＮＡｉベクター）、各センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖（ｓｉＲＮＡ）または１つの自己相補ＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）のいずれかとしてのＲＮＡｉ因子を産生するための本発明のＲＮＡｉ因子およびベクター（プラスミドおよび遺伝子治療ベクターが挙げられる）を含有する組成物（例えば、薬学的組成物）を提供する。本発明は、ＯＸ４０Ｌをコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子を投与する工程を包含する、ＯＸ４０Ｌの発現を阻害する方法を提供する。特に、本発明は、（ｉ）細胞または生物にＯＸ４０Ｌをコードする転写物を標的化するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ因子を投与する工程、または（ｉｉ）細胞または生物に、ハイブリダイズするか自己ハイブリダイズしてＯＸ４０Ｌをコードする転写物を標的化するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを形成する１つ以上のＲＮＡ分子の転写のためのテンプレートを含む核酸を含むＲＮＡｉベクターを投与する工程を包含する、ＯＸ４０Ｌの発現を阻害する方法を提供する。この方法は、ＩｇＥ媒介性過敏症によって特徴づけられる疾患または病状の予防および処置に有用である。
【０１２２】
ＯＸ４０Ｌをコードする転写物のいくつかの適切な標的部分の配列を、表７に列挙する。特定の好ましい本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、表７に列挙した配列を有する部分を含む。特定の好ましいｓｉＲＮＡは、表７に列挙した標的部分に１００％相補的である部分を含むアンチセンス鎖を含む。その配列が表７に列挙した配列と１００％相補的である部分を含む第１の部分およびその配列が配列のステム形成相補物（ループを形成する非関連配列によって第１の部分から分離された）を含む第２の部分を有するｓｈＲＮＡは、本明細書中に記載のように容易に設計され得る。
【０１２３】
（（Ｃ）ＣＤ４０を標的化するＲＮＡｉ因子）
ＣＤ４０発現は、ＡＰＣの活性化時に誘導される。活性化されたＴ細胞でのＣＤ４０とＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）との相互作用は、Ｔ細胞応答において非常に重要な役割を果たす（ＣＤ４０ならびにその免疫および寛容の役割に関する概説については、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２００３年７月；１０（４）：２７２−８、２００３を参照のこと）。ＡＰＣによるＣＤ４０発現の欠如は、寛容の誘導に十分である（例えば、通常または以前の応答に対する被験体の抗原に対する応答の欠如または有意な減少）。本発明に従って、ＣＤ４０転写物を標的化する１つ以上のＲＮＡｉ因子を使用して、ＤＣおよび／またはマクロファージによるＣＤ４０発現を阻害し、それにより、これらのＡＰＣに対するＴｈ２細胞応答を妨害する。Ｔｈ２応答の減少により、ＩｇＥの産生が減少し、それにより、肥満細胞の脱顆粒が減少して治療効果が得られる。
【０１２４】
本発明は、ＣＤ４０をコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびＲＮＡｉベクターが挙げられる）、各センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖としてｓｉＲＮＡを産生するか、１つの自己相補ＲＮＡ分子としてｓｈＲＮＡを産生するための本発明のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびベクター（プラスミド、ウイルスベクター、遺伝子治療ベクターが挙げられる）を含有する薬学的組成物を提供する。本発明は、細胞または生物にＣＤ４０をコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子を投与する工程を包含する、ＣＤ４０の発現を阻害する方法を提供する。特に、本発明は、（ｉ）細胞または生物にＣＤ４０をコードする転写物を標的化するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを投与する工程、または（ｉｉ）細胞または生物に、ハイブリダイズするか自己ハイブリダイズしてＣＤ４０転写物を標的化するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを形成する１つ以上のＲＮＡ分子の転写のためのテンプレートを含む核酸を投与する工程を包含する、ＣＤ４０の発現を阻害する方法を提供する。この方法は、ＩｇＥ媒介性過敏症によって特徴づけられる疾患または病状の予防および処置に有用である。
【０１２５】
ＣＤ４０をコードする遺伝子のいくつかの適切な標的部分の配列を、表８に列挙する。特定の好ましい本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、表８に列挙した配列を有する部分を含む。特定の好ましいｓｉＲＮＡは、表８に列挙した標的部分に１００％相補的である部分を含むアンチセンス鎖を含む。その配列が表８に列挙した配列と１００％相補的である部分を含む第１の部分およびその配列が配列のステム形成相補物（ループを形成する非関連配列によって第１の部分から分離された）を含む第２の部分を有するｓｈＲＮＡは、本明細書中に記載のように容易に設計され得る。
【０１２６】
（（Ｄ）ＣＤ８０およびＣＤ８６を標的化するＲＮＡｉ因子）
ＣＤ８０およびＣＤ８６は、Ｔ細胞活性化において非常に重要な役割を果たす同時刺激分子である。これらは、Ｔ細胞上で発現するＣＤ２８およびＣＴＬＡ４と相互作用する。本発明に従って、ＣＤ８０またはＣＤ８６をコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子を使用して、ＤＣおよび／またはマクロファージによるＣＤ８０および／またはＣＤ８６の発現を阻害し、それにより、これらのＡＰＣに対するＴｈ２細胞応答を妨害する。Ｔｈ２応答の減少により、ＩｇＥの産生が減少し、それにより、肥満細胞の脱顆粒が減少して治療効果が得られる。
【０１２７】
本発明は、ＣＤ８０またはＣＤ８６をコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびＲＮＡｉベクター）、各センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖（ｓｉＲＮＡ）または１つの自己相補ＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）のいずれかとしてのＲＮＡｉ因子を産生するための本発明のＲＮＡｉ因子およびベクター（プラスミド、ウイルスベクター、遺伝子治療ベクターが挙げられる）を含有する組成物（例えば、薬学的組成物）を提供する。本発明は、細胞または生物にＣＤ８０を標的化するＲＮＡｉ因子を投与する工程を包含する、ＣＤ８０の発現を阻害する方法をさらに提供する。特に、本発明は、（ｉ）細胞または生物にＣＤ８０をコードする転写物を標的化するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを投与する工程、または（ｉｉ）細胞または生物に、ハイブリダイズするか自己ハイブリダイズしてＣＤ８０をコードする転写物を標的化するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを形成する１つ以上のＲＮＡ分子の転写のためのテンプレートを含む核酸を投与する工程を包含する、ＣＤ８０の発現を阻害する方法を提供する。この方法は、ＩｇＥ媒介性過敏症によって特徴づけられる疾患または病状の予防および処置に有用である。本発明は、細胞または生物に、ＣＤ８６を標的化するＲＮＡｉ因子を投与する工程を包含する、ＣＤ８６の発現を阻害する方法をさらに提供する。特に、本発明は、（ｉ）細胞または生物にＣＤ８６をコードする転写物を標的化するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを投与する工程、または（ｉｉ）細胞または生物に、ハイブリダイズするか自己ハイブリダイズしてＣＤ８６をコードする転写物を標的化するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを形成する１つ以上のＲＮＡ分子の転写のためのテンプレートを含む核酸を投与する工程を包含する、ＣＤ８６の発現を阻害する方法を提供する。この方法は、ＩｇＥ媒介性過敏症によって特徴づけられる疾患または病状の予防および処置に有用である。本発明の特定の実施形態に従って、ＣＤ８０およびＣＤ８６を標的化するＲＮＡｉ因子は、個別または組み合わせて投与される。
【０１２８】
ＣＤ８０またはＣＤ８６をコードする転写物のいくつかの適切な標的部分の配列を、表９および表１０に列挙する。特定の好ましい本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、表９および表１０に列挙した配列を有する部分を含む。特定の好ましいｓｉＲＮＡは、表９または表１０に列挙した標的部分に１００％相補的である部分を含むアンチセンス鎖を含む。その配列が表９または表１０に列挙した配列と１００％相補的である部分を含む第１の部分およびその配列が配列のステム形成相補物（ループを形成する非関連配列によって第１の部分から分離された）を含む第２の部分を有するｓｈＲＮＡは、本明細書中に記載のように容易に設計され得る。
【０１２９】
（（Ｅ）Ｒｅｌファミリーメンバーを標的化するＲＮＡｉ因子）
転写因子のＮＦ−κＢファミリーは、活性化ＤＣおよびマクロファージ中で誘導される（Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ，Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２（２４）：１０９４４、１９９５））。ＮＦ−κＢは、５つのファミリーのメンバー：ｐ５０、ｐ５２、ＲｅｌＡ（ｐ６５）、ｃ−ＲｅｌおよびＲｅｌＢからなる。ＲｅｌＢ／ｐ５０ヘテロ二量体は、ＡＰＣ機能の増加およびＣＤ４０のアップレギュレーションに関連する。ＤＣにおけるＲｅｌＢの欠損により、自己免疫応答が抑制され得る。（Ｖａｌｅｒｏ，Ｒ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６９（１）：１８５−９２、２００２）。本発明に従って、ＲｅｌＢをコードする転写物を標的化するｓｉＲＮＡを使用して、ＤＣおよび／またはマクロファージによるＲｅｌＢ発現を阻害し、それにより、これらのＡＰＣに対するＴｈ２細胞応答を妨害する。Ｔｈ２応答の減少により、ＩｇＥの産生が減少し、それにより、肥満細胞の脱顆粒が減少して治療効果が得られる。
【０１３０】
本発明は、ＲｅｌＡまたはＲｅｌＢをコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびＲＮＡｉベクターが挙げられる）、各センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖（ｓｉＲＮＡ）または１つの自己相補ＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）としてこれらを産生するための本発明のＲＮＡｉ因子およびベクター（プラスミド、ウイルスベクター、遺伝子治療ベクターが挙げられる）を含有する組成物（例えば、薬学的組成物）を提供する。本発明は、さらに、（ｉ）細胞または生物にＲｅｌＡまたはＲｅｌＢをコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）を投与する工程、または（ｉｉ）細胞または生物に、ハイブリダイズするか自己ハイブリダイズしてＲｅｌＡまたはＲｅｌＢをコードする転写物を標的化するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを形成する１つ以上のＲＮＡ分子の転写のためのテンプレートを含む核酸を投与する工程を包含する、ＲｅｌＢの発現を阻害する方法を提供する。この方法は、ＩｇＥ媒介性過敏症によって特徴づけられる疾患または病状の予防および処置に有用である。
【０１３１】
ＲｅｌＡまたはＲｅｌＢをコードする遺伝子のいくつかの適切な標的部分の配列を、表１１および表１２に列挙する。特定の好ましい本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、表１１または表１２に列挙した配列を有する部分を含む。特定の好ましいｓｉＲＮＡは、表１１または表１２に列挙した標的部分に１００％相補的である部分を含むアンチセンス鎖を含む。その配列が表１１または表１２に列挙した配列と１００％相補的である部分を含む第１の部分およびその配列が配列のステム形成相補物（ループを形成する非関連配列によって第１の部分から分離された）を含む第２の部分を有するｓｈＲＮＡは、本明細書中に記載のように容易に設計され得る。
【０１３２】
（（Ｆ）４−１  ＢＢリガンドを標的化するＲＮＡｉ因子）
４−１  ＢＢと４−１  ＢＢリガンドとは、Ｔ細胞同時刺激のための別のレセプター−リガンド対である。４−１  ＢＢは、活性化Ｔ細胞中で発現されるのに対して、４−１  ＢＢリガンドは病原体と遭遇した場合にＤＣ中で発現される。（４−１  ＢＢおよび他の同時刺激分子の役割の概説については、Ｃｒｏｆｔ，Ｍ．、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．、２００３年６月−８月；１４（３−４）：２６５−７３、２００３およびその参考文献を参照のこと。またＫｗｏｎ，Ｂ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３（８）：３７８−８０、２００２を参照のこと）。本発明に従って、４−１  ＢＢリガンドをコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子を使用して、ＤＣおよび／またはマクロファージによる４−１  ＢＢリガンド発現を阻害し、それにより、これらのＡＰＣに対するＴｈ２細胞応答を妨害する。Ｔｈ２応答の減少により、ＩｇＥの産生が減少し、それにより、肥満細胞の脱顆粒が減少して治療効果が得られる。
【０１３３】
本発明は、４−１  ＢＢリガンドをコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびＲＮＡｉベクターなど）、各センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖（ｓｉＲＮＡ）または１つの自己相補ＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）としてこれらを産生するための本発明のＲＮＡｉ因子およびベクター（プラスミド、ウイルスベクター、遺伝子治療ベクターが挙げられる）を含有する組成物（例えば、薬学的組成物）を提供する。本発明は、さらに、（ｉ）細胞または生物に４−１  ＢＢリガンドをコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）を投与する工程、または（ｉｉ）細胞または生物に、ハイブリダイズするか自己ハイブリダイズして４−１  ＢＢリガンドをコードする転写物を標的化するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを形成する１つ以上のＲＮＡ分子の転写のためのテンプレートを含む核酸を投与する工程を包含する、４−１  ＢＢリガンドの発現を阻害する方法を提供する。この方法は、ＩｇＥ媒介性過敏症によって特徴づけられる疾患または病状の予防および処置に有用である。
【０１３４】
４−１  ＢＢリガンドをコードする遺伝子のいくつかの適切な標的部分の配列を、表１３に列挙する。特定の好ましい本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、表１３に列挙した配列を有する部分を含む。特定の好ましいｓｉＲＮＡは、表１３に列挙した標的部分に１００％相補的である部分を含むアンチセンス鎖を含む。その配列が表１３に列挙した配列と１００％相補的である部分を含む第１の部分およびその配列が配列のステム形成相補物（ループを形成する非関連配列によって第１の部分から分離された）を含む第２の部分を有するｓｈＲＮＡは、本明細書中に記載のように容易に設計され得る。
【０１３５】
（（Ｇ）Ｔｏｌｌ様レセプターを標的化するＲＮＡｉ因子）
Ｔｏｌｌ様レセプターは、免疫応答の開始で役割を果たすパターン認識レセプターである。概説については、Ｄａｂｂａｇｈ  ＫおよびＬｅｗｉｓ  ＤＢ．、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ、１６（３）：１９９−２０４、２００３、ならびにＬｉｅｎ，Ｅ．、Ａｎｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８８（６）：５４３−７、２００２、およびその参考文献を参照のこと。本発明に従って、Ｔｏｌｌ様レセプターをコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子を使用して、ＤＣおよび／またはマクロファージによるこれらのレセプター発現を阻害し、それにより、これらのＡＰＣに対するＴｈ２細胞応答を妨害する。Ｔｈ２応答の減少により、ＩｇＥの産生が減少し、それにより、肥満細胞の脱顆粒が減少して治療効果が得られる。
【０１３６】
本発明は、Ｔｏｌｌ様レセプターをコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子（ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡなど）、本発明のＲＮＡｉ因子を含む組成物（例えば、薬学的組成物）、ならびに個々のセンスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖（ｓｉＲＮＡ）または１つの自己相補性ＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）のいずれかとして生じるベクター（プラスミド、ウイルスベクター、遺伝子治療ベクターが含まれる）を提供する。本発明は、さらに、（ｉ）細胞または生物にＴｏｌｌ様レセプターをコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）を投与する工程、あるいは（ｉｉ）細胞または生物に、ハイブリダイズするか自己ハイブリダイズしてＴｏｌｌ様レセプター転写物を標的化するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを形成する、１つまたは複数のＲＮＡ分子の転写のためのテンプレートを含む核酸を投与する工程を含む、Ｔｏｌｌ様レセプターの発現を阻害する方法を提供する。この方法は、ＩｇＥ媒介性過敏症によって特徴づけられる疾患または病状の予防および処置に有用である。
【０１３７】
ＦｃεＲＩのα鎖およびβ鎖をコードする遺伝子のいくつかの適切な標的部分の配列を、表１４〜２２に列挙する。特定の好ましい本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、表１４〜２２に列挙した配列を有する部分を含む。特定の好ましいｓｉＲＮＡは、表１４〜２２に列挙した標的部分に１００％相補的である部分を含むアンチセンス鎖を含む。その配列が表１４〜２２に列挙した配列と１００％相補的である部分を含む第１の部分およびその配列が配列のステム形成相補体（ループを形成する非関連配列によって第１の部分から分離される）を含む第２の部分を有するｓｈＲＮＡを、本明細書中の他の箇所に記載のように容易に設計することができる。
【０１３８】
本発明はまた、Ｔｏｌｌ様レセプターの活性化を含む経路の活性が起こる種々の他の病状の処置のための本発明のＲＮＡｉ因子の使用を含む。このような病状には、敗血症、ショック、および熱傷関連損傷が含まれる。Ｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）（哺乳動物内毒素レセプターの重要なエレメンント）の変異体形態を発現するかＴｏｌｌ様レセプター４を発現しないマウスは、熱傷後心筋収縮不全に耐性であることが示されている（Ｔｈｏｍａｓ  ＪＡら，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８３（４）：Ｈ１６４５−５５，２００２）。敗血症性ショックにおけるＴｏｌｌ様レセプターの役割を考察する概説については、Ｃｒｉｓｔｏｆａｒｏ  ＰおよびＯｐａｌ  ＳＭ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ，７（５）：６０３−１２，２００３およびその参考文献を参照のこと。本発明は、（ｉ）敗血症、ショック、または熱傷関連損傷の処置を必要とする被験体を提供する工程と、（ｉｉ）上記被験体にＴｏｌｌ様レセプターを標的化するＲＮＡｉ因子を含む組成物を投与する工程とを含む、敗血症、ショック、または熱傷関連損傷の処置方法を提供する。本発明の特定の実施形態では、Ｔｏｌｌ様レセプターはＴＬＲ４である。本発明の特定の実施形態では、熱傷関連損傷は、心筋損傷（例えば、虚血／再灌流傷害、心筋細胞アポトーシスなど）である。本発明のＲＮＡｉ因子を、本明細書中に記載の任意の方法および／またはカテーテル（例えば、心臓への直接送達用）を使用して送達することができる。
【０１３９】
（（Ｈ）ＣＤ８３を標的化するＲＮＡｉ因子）
ＣＤ８３は、ＤＣ成熟時にＣＤ８０およびＣＤ８６などの同時刺激分子を強力に上方制御する。ＣＤ８０およびその機能の概説については、Ｌｅｃｈｍａｎｎ  Ｍ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３（６）：２７３−５，２００２を参照のこと。ＤＣ媒介性Ｔ細胞増殖は、可溶性ＣＤ８３によって完全に阻害される（Ｌｅｃｈｍａｎｎ  Ｍ．ら，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．，１９４（１２）：１８１３−２１，２００１）。本発明によれば、ＣＤ８３をコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子は、ＤＣによるＣＤ８３発現を阻害し、それにより、これらのＡＰＣに対するＴｈ２細胞応答を妨害するために使用される。Ｔｈ２応答の減少により、ＩｇＥの産生が減少し、それにより、肥満細胞の脱顆粒が減少して治療効果が得られる。
【０１４０】
本発明は、ＣＤ８３をコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびＲＮＡｉベクターなど）、本発明のＲＮＡｉ因子を含む組成物（例えば、薬学的組成物）、ならびに個々のセンスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖（ｓｉＲＮＡ）または１つの自己相補性ＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）のいずれかとして生じるベクター（プラスミド、ウイルスベクター、遺伝子治療ベクターが含まれる）を提供する。本発明は、さらに、（ｉ）細胞または生物にＣＤ８３をコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子（ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなど）を投与する工程、または（ｉｉ）細胞または生物に、ハイブリダイズするか自己ハイブリダイズしてＣＤ８３をコードする転写物に標的化されるｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを形成する、１つまたは複数のＲＮＡ分子の転写のためのテンプレートを含む核酸を投与する工程を含む、ＣＤ８３の発現を阻害する方法を提供する。本発明の特定の実施形態では、ＣＤ８３をコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子を、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６をコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子と共に送達する。
【０１４１】
ＣＤ８３をコードする転写物のいくつかの適切な標的部分の配列を、表２３に列挙する。特定の好ましい本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、表２３に列挙した配列を有する部分を含む。特定の好ましいｓｉＲＮＡは、表２３に列挙した標的部分に１００％相補的である部分を含むアンチセンス鎖を含む。その配列が表２３に列挙した配列と１００％相補的である部分を含む第１の部分およびその配列が配列のステム形成相補体（ループを形成する非関連配列によって第１の部分から分離される）を含む第２の部分を有するｓｈＲＮＡを、本明細書中に記載のように容易に設計することができる。
【０１４２】
（（Ｉ）ＳＬＡＭに標的化されるＲＮＡｉ因子）
シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）は、活性化ＤＣ上に発現し、Ｔ細胞による炎症性サイトカインの産生を直接増大させる。ＳＬＡＭおよび免疫系でのその役割についての概説は、Ｖｅｉｌｌｅｔｔｅ  Ａ．およびＬａｔｏｕｒ  Ｓ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５（３）：２７７−８５，２００３を参照のこと。本発明により、ＳＬＡＭをコードする転写物転写物を標的化するｓｉＲＮＡを使用して、ＤＣおよび／またはマクロファージによるＳＬＡＭ発現を阻害し、それにより、これらのＡＰＣに対するＴｈ２細胞応答を妨害する。Ｔｈ２応答の減少により、ＩｇＥの産生が減少し、それにより、肥満細胞の脱顆粒が減少して治療効果が得られる。
【０１４３】
本発明は、ＳＬＡＭをコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびＲＮＡｉベクターが含まれる）、本発明のＲＮＡｉ因子を含む組成物（例えば、薬学的組成物）、ならびに個々のセンスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖（ｓｉＲＮＡ）または１つの自己相補性ＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）のいずれかとして生じるベクター（プラスミド、ウイルスベクター、遺伝子治療ベクターが含まれる）を提供する。本発明は、さらに、（ｉ）細胞または生物にＳＬＡＭをコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子（ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなど）を投与する工程、または（ｉｉ）細胞または生物に、ハイブリダイズするか自己ハイブリダイズしてＳＬＡＭをコードする転写物を標的化するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを形成する１つまたは複数のＲＮＡ分子の転写のためのテンプレートを含む核酸を投与する工程を含む、ＳＬＡＭの発現を阻害する方法を提供する。
【０１４４】
ＳＬＡＭをコードする転写物のいくつかの適切な標的部分の配列を、表２４に列挙する。特定の好ましい本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、表２４に列挙した配列を有する部分を含む。特定の好ましいｓｉＲＮＡは、表２４に列挙した標的部分に１００％相補的である部分を含むアンチセンス鎖を含む。その配列が表２４に列挙した配列と１００％相補的である部分を含む第１の部分およびその配列が配列のステム形成相補体（ループを形成する非関連配列によって第１の部分から分離される）を含む第２の部分を有するｓｈＲＮＡを、本明細書中の他の箇所に記載のように容易に設計することができる。
【０１４５】
（（Ｊ）共通γ鎖を標的化するＲＮＡｉ因子）
ＤＣの活性化により、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−７Ｒ、およびＩＬ−１５Ｒが誘導される。これらのレセプターの発現は、ＤＣの生存および機能に重要であり得る。これらのレセプターは全て共通γ鎖を含む。本発明によれば、共通γ鎖（γｃ）を標的化するｓｉＲＮＡの送達によってこれらのレセプターの発現が同時に阻害され、それにより、ＤＣの生存および機能を妨害する。Ｔｈ２応答の減少により、ＩｇＥの産生が減少し、それにより、肥満細胞の脱顆粒が減少して治療効果が得られる。
【０１４６】
本発明は、共通γ鎖をコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびＲＮＡｉベクターが含まれる）、本発明のＲＮＡｉ因子を含む組成物（例えば、薬学的組成物）、ならびに個々のセンスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖（ｓｉＲＮＡ）または１つの自己相補性ＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）のいずれかとして生じるベクター（プラスミド、ウイルスベクター、遺伝子治療ベクターが含まれる）を提供する。本発明は、さらに、（ｉ）細胞または生物に共通γ鎖をコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子（ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなど）を投与する工程、または（ｉｉ）細胞または生物に、ハイブリダイズするか自己ハイブリダイズして共通γ鎖をコードする転写物を標的化するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを形成する１つまたは複数のＲＮＡ分子の転写のためのテンプレートを含む核酸を投与する工程を含む、共通γ鎖の発現を阻害する方法を提供する。
【０１４７】
共通γ鎖をコードする遺伝子のいくつかの適切な標的部分の配列を、表２５に列挙する。特定の好ましい本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、表２５に列挙した配列を有する部分を含む。特定の好ましいｓｉＲＮＡは、表２５に列挙した標的部分に１００％相補的である部分を含むアンチセンス鎖を含む。その配列が表２５に列挙した配列と１００％相補的である部分を含む第１の部分およびその配列が配列のステム形成相補体（ループを形成する非関連配列によって第１の部分から分離される）を含む第２の部分を有するｓｈＲＮＡを、本明細書中の他の箇所に記載のように容易に設計することができる。
【０１４８】
（（Ｋ）シクロオキシゲナーゼ２を標的化するＲＮＡｉ因子）
プロスタグランジンＨシンターゼ（ＰＧＨＳ）としても公知のシクロオキシゲナーゼ−２は、アラキドン酸からプロスタノイドへの変換のための律速酵素である。ＣＯＸ−２の誘導体および調節は、多数の炎症性障害の病態生理学的プロセスにおける重要な要素であり、喘息の病因において重要な役割を果たし得る。ＣＯＸ−２欠損マウスは、アレルギー性肺応答の減少を示すと考えられる。ＣＯＸ−２は、活性化ＤＣにおいて誘導される。本発明により、ＣＯＸ−２をコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子を使用して、ＤＣおよび／またはマクロファージによるＣＯＸ−２発現を阻害し、それにより、これらのＡＰＣに対するＴｈ２細胞応答を妨害する。Ｔｈ２応答の減少により、ＩｇＥの産生が減少し、それにより、肥満細胞の脱顆粒が減少して治療効果が得られる。
【０１４９】
本発明は、ＣＯＸ−２をコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびＲＮＡｉベクターが含まれる）、本発明のＲＮＡｉ因子を含む組成物（例えば、薬学的組成物）、ならびに個々のセンスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖（ｓｉＲＮＡ）または１つの自己相補性ＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）のいずれかとして生じるベクター（プラスミド、ウイルスベクター、遺伝子治療ベクターが含まれる）を提供する。本発明は、さらに、（ｉ）細胞または生物にＣＯＸ−２をコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子（ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなど）を投与する工程、または（ｉｉ）細胞または生物に、ハイブリダイズするか自己ハイブリダイズしてＣＯＸ−２転写物を標的化するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを形成する１つまたは複数のＲＮＡ分子の転写のためのテンプレートを含む核酸を投与する工程を含む、共通γ鎖の発現を阻害する方法を提供する。
【０１５０】
ＣＯＸ−２をコードする転写物のいくつかの適切な標的部分の配列を、表２６に列挙する。特定の好ましい本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、表２６に列挙した配列を有する部分を含む。特定の好ましいｓｉＲＮＡは、表２６に列挙した標的部分に１００％相補的である部分を含むアンチセンス鎖を含む。その配列が表２６に列挙した配列と１００％相補的である部分を含む第１の部分およびその配列が配列のステム形成相補体（ループを形成する非関連配列によって第１の部分から分離される）を含む第２の部分を有するｓｈＲＮＡを、本明細書中に記載のように容易に設計することができる。
【０１５１】
（ＶＩ．配列）
表１〜２６は、それぞれ、ＦＣεＲα鎖、ＦＣεＲβ鎖、ｃ−Ｋｉｔ、Ｌｙｎ、Ｓｙｋ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、４−１ＢＢリガンド、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＣＤ８３、ＳＬＡＭ、共通γ鎖、およびＣＯＸ−２をコードする転写物の好ましい標的部分の配列を列挙する。好ましいｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、表１〜２６に列挙した配列と実質的または１００％相補的である部分を含むアンチセンス鎖を含む。特定の好ましいｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡのセンス鎖の配列は、表１〜２６に列挙した配列と同一である部分を含む。センス鎖配列を、ゲノム中に存在する配列に照らして５’→３’方向に列挙する（ゲノム配列は、ＵよりもむしろＴを含む）。
【０１５２】
各表は、ヒト遺伝子発現の阻害に適切な配列および対応するマウス遺伝子発現の阻害に適切な配列を含む。多くの場合、配列は、同一であるか非常に類似している。配列名の前に置かれた文字「Ｈ」は、配列がヒト遺伝子を標的化することを示す一方で、他の配列はマウス配列を標的化する。例えば、ＦＣεＲα−２６８は、ＦＣεＲαをコードするマウスｍＲＮＡ中の２６８位から２８６位までの範囲（２６８位および２８６位の両方を含む）の配列を示す。ＨＦＣεＲα−３３８は、ヒト遺伝子中の３３８位から３５６位までの範囲（ヌクレオチド３３８および３５６の両方を含む）の配列を示す。表は、ヒトおよびマウスｍＲＮＡのＧｅｎｂａｎｋ登録番号を含む。
【０１５３】
【表１】
2007527240.tif 000003
【０１５４】
【表２】
2007527240.tif 000004
【０１５５】
【表３−１】
2007527240.tif 000005
【０１５６】
【表３−２】
2007527240.tif 000006
【０１５７】
【表４】
2007527240.tif 000007
【０１５８】
【表５】
2007527240.tif 000008
【０１５９】
【表６】
2007527240.tif 000009
【０１６０】
【表７】
2007527240.tif 000010
【０１６１】
【表８】
2007527240.tif 000011
【０１６２】
【表９】
2007527240.tif 000012
【０１６３】
【表１０】
2007527240.tif 000013
【０１６４】
【表１１】
2007527240.tif 000014
【０１６５】
【表１２】
2007527240.tif 000015
【０１６６】
【表１３】
2007527240.tif 000016
【０１６７】
【表１４】
2007527240.tif 000017
【０１６８】
【表１５】
2007527240.tif 000018
【０１６９】
【表１６】
2007527240.tif 000019
【０１７０】
【表１７】
2007527240.tif 000020
【０１７１】
【表１８】
2007527240.tif 000021
【０１７２】
【表１９】
2007527240.tif 000022
【０１７３】
【表２０】
2007527240.tif 000023
【０１７４】
【表２１】
2007527240.tif 000024
【０１７５】
【表２２】
2007527240.tif 000025
【０１７６】
【表２３】
2007527240.tif 000026
【０１７７】
【表２４】
2007527240.tif 000027
【０１７８】
【表２５】
2007527240.tif 000028
【０１７９】
【表２６−１】
2007527240.tif 000029
【０１８０】
【表２６−２】
2007527240.tif 000030
（ＶＩＩ．ＩｇＥ媒介性過敏症を軽減または排除するＲＮＡｉ因子の同定、試験、および選択方法）
本明細書中に記載の技術および試薬を、他の遺伝子または遺伝子領域を標的化するさらなる新規のＲＮＡｉ因子の設計に容易に適用することができる。本明細書中で考察するように、これらの因子を、ＩｇＥ媒介性応答、疾患、および病状の阻害におけるその活性について試験することができる。本発明の種々の実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ因子を、最初に候補ＲＮＡｉ因子を細胞に導入すること（例えば、細胞へのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの内因性合成を指示するベクターまたは構築物の外因性投与または導入による）によって試験する。次いで、候補ＲＮＡｉ因子が標的転写物レベルを減少させる能力を、例えば、ノーザンブロット、ヌクレアーゼ保護アッセイ、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＴ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ分析などを使用した標的転写物量の測定によって評価する。候補ＲＮＡｉ因子が標的転写物によってコードされるポリペプチドの産生を（転写レベルまたは翻訳後レベルのいずれかで）阻害する能力を、種々の抗体ベースのアプローチ（ウェスタンブロット、免疫アッセイ、フローサイトメトリー、タンパク質マイクロアレイなどが含まれるが、これらに限定されない）を使用して測定することができる。一般に、標的転写物量または標的転写物によってコードされるポリペプチド量のいずれかを測定する任意の方法を使用することができる。一般に、特定の好ましいインヒビターにより、標的転写物レベルが、インヒビターの非存在下（例えば、インヒビターを欠く類似のコントロール細胞において）で存在するレベルの少なくとも１／２、好ましくは少なくとも１／４、より好ましくは少なくとも１／８、少なくとも１／１６、少なくとも１／６４またはさらに小さい程度に減少する。
【０１８１】
本発明は、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ因子を同定し、その効率を試験する種々のさらなる方法を提供する。例えば、本発明のＲＮＡｉ因子を、細胞応答（ＩｇＥなどの種々の刺激に対する肥満細胞の脱顆粒、ＤＣ、マクロファージ、Ｂ細胞、または小グリア細胞などによる刺激に対するＴｈ２細胞応答（例えば、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３などのサイトカインの増殖、放出））に対するインビトロでのその効果を評価するために試験することができる。このようなアッセイを行う方法は、当該分野で周知である。一般に、上記試験のいずれかのために、本発明のＲＮＡｉ因子が送達された細胞（試験細胞）を、本発明の組成物を受けていない類似または匹敵する細胞（コントロール細胞）と比較することができる。したがって、本発明は、ＲＮＡｉ因子がＩｇＥ媒介性過敏症または過剰もしくは不適切な肥満細胞活性によって特徴づけられる病状の処置に適切な配列を含むと同定する方法を提供し、この方法は、以下：（ｉ）適切な刺激への曝露の前、同時、または後に候補ＲＮＡｉ因子を肥満細胞に送達する工程と、（ｉｉ）メディエーターの産生または分泌を評価する工程と、（ｉｉｉ）上記ＲＮＡｉ因子の存在下で産生または分泌されたメディエーターの量と上記ＲＮＡｉ因子の非存在下で産生または分泌された量とを比較する工程と、（ｉｖ）上記ＲＮＡｉ因子の存在下で産生または分泌されたメディエーターの量が上記ＲＮＡｉ因子の非存在下で産生または分泌されたメディエーターの量よりも少ない場合、上記ＲＮＡｉ因子が適切な配列を含むと同定する工程とを含む。本発明の種々の実施形態では、ＲＮＡｉ因子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはＲＮＡｉベクターであり得る。実施例２を参照のこと（これは、候補ｓｉＲＮＡが肥満細胞の脱顆粒を阻害する能力の試験を記載する）。
【０１８２】
本発明のＲＮＡｉ因子を、被験体（例えば、げっ歯類、非ヒト霊長類、またはヒト）に投与し、肥満細胞、Ｔｈ２細胞、ＤＣ、Ｂ細胞などの細胞を被験体から回収することができる。本発明のＲＮＡｉ因子が標的転写物および／またはそのコードタンパク質の発現を阻害する能力を、上記のように測定する。上記のように、一定のＲＮＡｉ因子は、肥満細胞の生存および／または増殖に寄与し、および／または必要であるタンパク質をコードする転写物（例えば、ｃ−Ｋｉｔ）を標的化する。本発明のＲＮＡｉ因子の投与後の肥満細胞数の減少がその効率の指標である場合、本発明のＲＮＡｉ因子の肥満細胞数に対する効果を測定することもできる。
【０１８３】
本発明は、さらに、ＲＮＡｉ因子がＩｇＥ媒介性過敏症または不適切もしくは過剰なＴｈ２ヘルパー細胞活性によって特徴づけられる病状の処置に適切な配列を含むと同定する方法を提供し、この方法は、（ｉ）候補ＲＮＡｉ因子をＴ細胞およびＡＰＣを含む培養物に送達する工程と、（ｉｉ）Ｔ細胞の増殖を評価する工程、および／またはＴｈ２細胞に特徴的なサイトカインの産生もしくは分泌を評価する工程と、（ｉｉｉ）上記ＲＮＡｉ因子の存在下での上記Ｔ細胞の増殖または上記サイトカインの産生もしくは分泌の程度とＲＮＡｉ因子の非存在下での上記Ｔ細胞の増殖または上記サイトカインの産生もしくは分泌の程度とを比較する工程と、（ｉｖ）上記ＲＮＡｉ因子の存在下での上記Ｔ細胞の増殖または上記サイトカインの産生もしくは分泌の程度がＲＮＡｉ因子の非存在下でのＴ細胞の増殖または上記サイトカインの産生もしくは分泌の程度よりも小さい場合、上記ＲＮＡｉ因子が適切な配列を含むと同定する工程とを含む。（試験は、ＲＮＡｉ因子が存在しないコントロールを含み得るが、阻害の非存在下で産生または分泌されるメディエーター量または阻害の非存在下でのＴ細胞増殖量もしくはサイトカイン産生もしくは放出量に関する以前の情報を使用することもできる。）これらのアッセイを使用して、任意の転写物を標的化するＲＮＡｉ因子を試験することができるが、本明細書中に記載の転写物を標的化する因子に制限されない。
【０１８４】
特定の本発明のＲＮＡｉ因子は、ＩｇＥ産生に寄与するか必要であるタンパク質をコードする転写物を標的化する。細胞培養物中のＢ細胞によるＩｇＥ産生または被験体におけるＩｇＥレベルに対する本発明のＲＮＡｉ因子の効果を測定することができる。本発明のＲＮＡｉ因子の投与後のＩｇＥレベルの減少、またはＲＮＡｉ因子の非存在下で期待されるＩｇＥ応答に対するＲＮＡｉ因子の存在下での抗原投与後のＩｇＥ応答の減少は、ＲＮＡｉ因子の有効性についての１つの指標である。本発明は、ＲＮＡｉ因子がＩｇＥ媒介性過敏症によって特徴づけられる病状の処置に適切な配列を含むと同定する方法を提供し、この方法は、（ｉ）候補ＲＮＡｉ因子を、Ｂ細胞を含む培養物に送達する工程と、（ｉｉ）ＩｇＥの産生または分泌を評価する工程と、（ｉｉｉ）上記ＲＮＡｉ因子の存在下で産生または分泌されたＩｇＥの量と上記ＲＮＡｉ因子の非存在下で産生または分泌された量とを比較する工程と、（ｉｖ）上記ＲＮＡｉ因子の存在下で産生または分泌されたＩｇＥの量が上記ＲＮＡｉ因子の非存在下で産生または分泌されたＩｇＥの量よりも少ない場合、上記ＲＮＡｉ因子が適切な配列を含むと同定する工程とを含む。本発明は、さらに、ＲＮＡｉ因子がＩｇＥ媒介性過敏症によって特徴づけられる病状の処置に適切な配列を含むと同定する別の方法を提供し、この方法は、（ｉ）候補ＲＮＡｉ因子を被験体に送達する工程と、（ｉｉ）血清ＩｇＥレベル、Ｔ細胞の増殖、Ｔｈ２細胞に特徴的なサイトカインの産生、気道炎症、気道反応性、気道壁再構築、および肺機能からなる群から選択されるＩｇＥ媒介性過敏症の指標についての値を得る工程と、（ｉｉｉ）上記ＲＮＡｉ因子の存在下で得られた値と上記ＲＮＡｉ因子の非存在下で得られた値とを比較する工程と、（ｉｖ）ＲＮＡｉ因子の存在下で得られた値が上記ＲＮＡｉ因子の非存在下で得られた値よりも低い場合、上記ＲＮＡｉ因子が適切な配列を含むと同定する工程とを含む。
【０１８５】
その二重鎖部分が特定の配列を含んでＲＮＡｉを引き起こす、ＲＮＡｉ因子の有効性が、１つのＲＮＡｉ因子の型（例えば、ＲＮＡｉベクター）によって確立される場合、一般に、その配列が、他のＲＮＡｉ因子の型（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）についても有用であることに留意すべきである。したがって、例えば、レンチウイルスベクターなどのＲＮＡｉベクターが、喘息またはアレルギー性鼻炎の病状の動物モデルにおいてそのような症状を軽減する場合、ＲＮＡｉベクターによって得られるテンプレートと同一の二重鎖部分を有するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡはまた、一般に、喘息またはアレルギー性鼻炎の症状の軽減に有用である。したがって、上記方法は、有効なＲＮＡｉ因子自体の同定よりもむしろ適切な配列（すなわち、二重鎖部分の配列）を含むＲＮＡｉ因子の同定に関して記載されている。しかし、適切な配列を含むＲＮＡｉ因子の同定により、本質的にＲＮＡｉ因子自体が同定され、同一配列を含む二重鎖部分を有するＲＮＡｉ因子も同定されると理解すべきである。
【０１８６】
潜在的な阻害ＲＮＡｉ因子を、アレルギーおよび／または喘息について開発された任意の種々の動物モデル（例えば、げっ歯類、ヒツジ、または非ヒト霊長類モデル）を使用して試験することができる。本発明の治療薬の試験に有用な適切な動物モデルの例については、Ｉｓｅｎｂｅｒｇ−Ｆｅｉｇ，Ｈ．ら，“Ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ａｓｔｈｍａ”，Ｃｕｒｒ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｒｅｐ．，３（１）：７０−８，２００３およびその参考文献を参照のこと。Ｗｅｇｎｅｒ  ＣＤ，Ｇｕｎｄｅｌ  ＲＧ，Ａｂｒａｈａｍ  ＷＭら，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，９１：９１７−２９，１９９３；Ｔｅｍｅｌｋｏｖｓｋｉ，Ｊ．ら，Ｔｈｏｒａｘ，Ｖｏｌｕｍｅ  ５３（１０）：８４９−８５６，１９９８も参照のこと。多くのこのようなモデルは、オボアルブミンなどのタンパク質抗原の全身投与およびその後の吸入攻撃誘発後の種々の応答の評価に基づく。これらは、抗原に特異的な血清ＩｇＥレベル、抗原特異的Ｔ細胞の増殖、気道炎症（例えば、気道内でのリンパ球、好中球、および好酸球（ｅｏｓｏｐｈｉｎｉｌ）などの炎症細胞の蓄積）、気道反応性（例えば、メタコリン攻撃誘発への応答）、気道壁再構築（例えば、気道肥厚）、および肺機能などの指標を含む。ＴＬＲ（例えば、ＴＬＲ４）を標的化するＲＮＡｉ因子を、任意の種々の動物モデルにおいて、敗血症、ショック、または熱傷関連損傷について試験することができる。
【０１８７】
候補ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ構築物または宿主細胞内でのこのようなｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの合成を指示することができるベクターを含む（すなわち、適切な発現シグナルに作動可能に連結されたｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの転写のためのテンプレートを含む）組成物、または候補ＲＮＡｉ因子を含むように加工もしくは操作された細胞を、抗原への曝露前、同時、もしくは曝露後、または公知の曝露を行わずに、ヒトまたは動物被験体に投与することができる。潜在的なインヒビターを受容していない類似の曝露被験体と比較して、組成物がＩｇＥ媒介性過敏症を予防または軽減するか、このような過敏症に関連する病状および疾患（例えば、アレルギー性鼻炎および喘息）に関連する症状の出現を遅延もしくは予防し、および／またはその重症度を低下させる能力を評価する。
【０１８８】
上記のように、ＩｇＥ媒介性応答において重要な種々のタンパク質を標的化する多数のＲＮＡｉ因子が設計されている。いくつかの強力な阻害剤を利用することができるため、それらは容易に、組み合わせて最適に使用される。例えば、異なる転写物を標的化するＲＮＡｉ因子は、ＩｇＥ産生および／またはＩｇＥに対する応答が得られる複数の経路の阻害またはＩｇＥ媒介性応答に関与する複数の細胞型における経路の阻害による相乗効果（すなわち、各効果の和を超える効果）を有し得る。したがって、最も有効な組み合わせを見出すために、ＲＮＡｉ因子を、２つまたはそれ以上組み合わせて試験することができる。
【０１８９】
他方では、望ましくない副作用を回避するために、その標的転写物の発現を最大より弱く阻害するＲＮＡｉ因子を使用することが望ましくあり得る。したがって、本発明は、上記転写物を標的化するＲＮＡｉ因子を単独または組み合わせて体系的に試験する工程を含む。１つのアプローチによれば、その配列が転写物全体にわたる非重複ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを、上記のように細胞または細胞株中においてインビトロで合成および試験するか、アレルギーマウスなどの動物モデルにおいてインビボで合成および試験する。さらに、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの潜在性を、トランスフェクションのために使用したＲＮＡ量の適定によって比較することができる。例えば、異なる量（０．０２５ｎｍｏｌ、０．０５ｎｍｏｌ、０．１ｎｍｏｌ、および０．２５ｎｍｏｌなど）のＲＮＡを、単独または組み合わせて、肥満細胞にトランスフェクションするかエレクトロポレーションし得、刺激に対する脱顆粒（ヒスタミン、プロスタグランジン、アラキドン酸などのメディエーターの放出）を測定することができる（詳細については、実施例２を参照のこと）。本発明のＲＮＡｉ因子がＴｈ２応答を減少または排除する能力を、インビトロ（例えば、Ｔ細胞とＤＣとの混合培養物中）またはインビボのいずれかで測定することもできる。ＲＮＡｉ因子の有効性を、アレルギー性気道炎症のマウスモデルを使用して評価することもできる。種々の量のＲＮＡｉ因子を、感作マウスに投与することもできる。これらのマウスの抗原攻撃誘発に対する応答を、種々の方法（炎症性サイトカイン（例えば、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３など）の発現の測定、肺中の好酸球数および好中球数の測定、ならびに肺機能試験の実施が含まれる）で評価することができる（詳細については、実施例３を参照のこと）。このような実験からの結果は、各ＲＮＡｉ因子の相対的潜在性だけでなく、最大阻害に必要な最小量の決定のための一助となる。後者は、それぞれどの程度を組み合わせて使用すべきであるかを決定するのに有用である。
【０１９０】
（ＶＩＩＩ．送達因子を含むＲＮＡｉ組成物）
本発明者らは、有効なＲＮＡｉ療法（ＩｇＥ媒介性反応に関連する病状および疾患の予防および治療が含まれる）は、一般に、細胞へのＲＮＡｉ因子（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびＲＮＡｉベクターなど）の有効な導入によって増強されることを認識する。本発明の特定の実施形態により、ＲＮＡｉ因子を、呼吸管中の細胞または他の粘膜面の内層細胞に投与する。一般に、ＲＮＡｉ因子を、体内または体表の任意の部位（肥満細胞の脱顆粒またはＡＰＣとＩｇＥ産生Ｂ細胞との間で細胞相互作用が起こり得る場所が含まれるが、これらに限定されない）または肥満細胞、好塩基球、ＡＰＣ、ＩｇＥ産生Ｂ細胞、および／またはＴｈ２細胞が生じ得る任意の場所に送達することができる。したがって、本発明は、インタクトな生物（例えば、哺乳動物）中の細胞へのｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、および／またはＲＮＡｉベクターの送達を増強するための任意の種々の非ウイルス送達因子を含む組成物を提供する。本明細書中で使用される、「送達」の概念には、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはベクターの細胞取り込み、および細胞内ＲＮＡｉ機構（例えば、エンドソームからのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの放出）に利用可能なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの作製に関与するその後の任意の工程に加えて、身体への侵入部位からそれが機能する細胞の位置へのｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはＲＮＡｉベクターの輸送が含まれる。
【０１９１】
したがって、本発明は、以下を含む組成物を包含する：（ｉ）上記で考察される任意の転写物を標的化するｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ因子、および／またはその細胞内での存在によって上記で考察される任意の転写物を標的化する、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ因子が産生されるＲＮＡｉベクター、ならびに（ｉｉ）任意の種々の送達因子（カチオン性ポリマー、修飾カチオン性ポリマー、ペプチド分子トランスポーター（アルギニンまたはヒスチジンリッチペプチドが含まれる）、炭水化物、脂質（カチオン性脂質、中性脂質、およびその組み合わせが含まれる）、リポソーム、リポポリプレックス、非カチオン性ポリマー、肺への導入に適切な界面活性物質、または上記の任意の混合物などが含まれるが、これらに限定されない）。特定の送達因子は、転写物が阻害されることが望ましい細胞へのＲＮＡｉ因子またはベクターの送達を増加させるか選択的送達を増加させる部分を組み込む。本発明の特定の実施形態では、送達因子は生分解性である。本発明での使用に適切な特定の送達因子は、以下、および発明の名称「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｓｈｏｒｔ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ａｎｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ  ｔｏ  Ｍａｍｍａｌｓ」である同時係属中の米国特許出願１０／６７４，０８７号に記載されている。送達因子は、組み合わせて使用することができる。
【０１９２】
ＤＮＡトランスフェクションのためのキャリアとしてカチオン性ポリマーベースの系が調査されている（Ｈａｎ，Ｓ．−Ｏ．ら，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：３０２−３１７，２０００）。カチオン性ポリマーがＤＮＡの細胞内取り込みを促進する能力は、ＤＮＡに結合して、巨大なプラスミドＤＮＡ分子をより有効なエンドサイトーシスのためのより小さなＤＮＡ／ポリマー複合体に縮合する能力に部分的に起因すると考えられる。ＤＮＡ／カチオン性ポリマー複合体はまた、細胞表面糖タンパク質の負電荷のシラン酸残基とのその静電相互作用のために、生体接着剤として作用する（Ｓｏａｎｅ，Ｒ．Ｊ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ  Ｐｈａｒｍ．１７８：５５−６５，１９９９）。さらに、イミダゾール基修飾ポリリジン（ＰＬＬ）などのいくつかのポリマーは、エンドソーム膜の破壊を明らかに促進し、それにより、サイトゾルにＤＮＡを放出させる（Ｐｕｔｎａｍ，Ｄ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１２００−１２０５，２０００）。したがって、本発明は少なくとも１つのＲＮＡｉ因子およびカチオン性ポリマーを含む組成物ならびにこのような組成物の投与による標的遺伝子発現の阻害方法を提供する。ＲＮＡｉ因子は、阻害によってＩｇＥ媒介性過敏症が軽減されるタンパク質またはペプチドをコードする転写物（例えば、その阻害によって以下のいずれかが起こるタンパク質またはペプチドをコードする転写物に標的化する：（１）Ｂ細胞によるＩｇＥ産生の減少、（２）肥満細胞数の減少、（３）肥満細胞活性化の減少、（４）Ｔｈ２細胞数の減少（例えば、アレルゲンが被験体の過敏症を誘発するものであるアレルゲン特異的Ｔｈ２細胞数の減少）、（５）Ｔｈ２細胞活性化の減少（例えば、アレルゲンが被験体の過敏症を誘発するものであるアレルゲン特異的Ｔｈ２細胞活性化の減少））。本発明の特定の実施形態によれば、ＲＮＡｉ因子の投与により、ＦＣεＲＩα鎖、ＦＣεＲＩβ鎖、ｃ−Ｋｉｔ、Ｌｙｎ、Ｓｙｋ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、４−１ＢＢリガンド、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＣＤ８３、ＳＬＡＭ、共通γ鎖、およびＣＯＸ−２からなる群から選択されるタンパク質の発現が減少する。本発明の特定の実施形態によれば、ＤＣおよび／またはマクロファージにおける発現が阻害される。本発明の特定の実施形態によれば、ＲＮＡｉ因子を、上記タンパク質の１つをコードする転写物を標的し、それにより、そのタンパク質発現が減少する。しかし、本発明の他の実施形態によれば、ＲＮＡｉ因子は、コードされた産物が上記の任意のタンパク質の発現または活性に必要であるか、またはそれに寄与する、いくつかの他の転写物を標的化する。このような産物には、例えば、上記タンパク質の１つをコードする転写物の転写またはプロセシングに関与する転写因子またはＲＮＡプロセシング因子が含まれる。ＩｇＥ媒介性過敏症に関連する疾患または病状の処置のために、本発明のＲＮＡｉ因子を、単独で、または相互に組み合わせておよび／もしくは他の治療と組み合わせて、投与することができる。
【０１９３】
本発明は、上記の種々のＲＮＡｉ因子およびこれらを含む組成物を提供する。特に、本発明は、（ｉ）ＦＣεＲＩα鎖、ＦＣεＲＩβ鎖、ｃ−Ｋｉｔ、Ｌｙｎ、Ｓｙｋ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、４−１ＢＢリガンド、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＣＤ８３、ＳＬＡＭ、共通γ鎖、およびＣＯＸ−２からなる群から選択されるタンパク質をコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子、および（ｉｉ）カチオン性ポリマーを含む組成物を投与する工程を含む、ＩｇＥ媒介性過敏症に関連する病状および疾患を処置および／または予防する方法を提供する。本発明は、種々のこのようなＲＮＡｉ因子およびこれらを含む組成物を提供する。
【０１９４】
一般に、カチオン性ポリマーは、およそ生理学的ｐＨ（例えば、約７．０〜７．６、好ましくは約７．２〜７．６、より好ましくは７．４のｐＨ範囲）で正電荷のポリマーである。このようなカチオン性ポリマーには、イミダゾール基修飾ＰＬＬ（Ｐｕｔｎａｍら）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｂｏｕｓｓｉｆ，Ｏ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７２９７−７３０１，１９９５）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（Ａｓｔａｆｉｅｖａ，Ｉ．ら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３８９：２７８−２８０，１９９６）、およびキトサン（Ｄａｖｉｓ，Ｓ．Ｓ．，Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２：４５０−４５７，１９９９；Ｒｏｙ，Ｋ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：３８７−３９１，１９９９）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９５】
特定のこれらのポリマーが、第一級アミン基、イミン基、グアニジン基、および／またはイミダゾール基を含むことが認識される。好ましいカチオン性ポリマーは、比較的低い毒性、および高いＤＮＡトランスフェクション効率を有する。好ましいカチオン性ポリマーは、比較的低い毒性、および高いＤＮＡトランスフェクション効率を有する。
【０１９６】
適切なカチオン性ポリマーには、任意の上記のポリマーのサブセットを含むコポリマー（例えば、リジン−ヒスチジンコポリマーなど）も含まれる。コポリマー中において、種々のサブユニットの比率は等しい必要はなく、例えば、細胞傷害性を最小にしながら核酸と複合体を形成する能力などの性質を最適にするように選択することができる。さらに、サブユニットは、規則正しく交互に並ぶ必要はない。所望の性質に関して種々のポリマーを評価するための適切なアッセイを、実施例に記載する。好ましいカチオン性ポリマーには、上記の任意の種々の修飾がさらに組み込まれたポリマーなどのポリマーも含まれる。適切な修飾には、アセチル基、スクシニル基、アシル基、またはイミダゾール基での修飾が含まれるが、これらに限定されない。一般に、特定の好ましい修飾により、カチオン性ポリマーの正電荷が減少する。特定の好ましい修飾により、第一級アミンが第二級アミンに変換される。このようなさらなる基を組み込むためのカチオン性ポリマーの修飾方法は、当該分野で周知である（例えば、引例３２を参照のこと）。例えば、ポリマー合成後に、共役によって種々の残基のε−アミノ基を所望の修飾基に置換することができる。一般に、ポリマーがＲＮＡｉ因子の送達を増強する能力を過度に減少させることなく、非置換ポリマーと比較して細胞傷害性を適切に減少させるのに十分な置換率を選択することが望ましい。したがって、本発明の特定の実施形態では、ポリマー中の２５％と７５％との間の残基が置換される。本発明の特定の実施形態では、ポリマー中の約５０％の残基が置換される。最初の適切に選択した単量体サブユニットのコポリマー（すなわち、いくつかに既に所望の修飾が組み込まれているサブユニット）の形成によって類似の効果を得ることができることに留意すべきである。
【０１９７】
いかなる理論にも拘束されることを望まないが、ＰＥＩなどのカチオン性ポリマーは、ＤＮＡを細胞表面でアニオン性プロテオグリカンと相互作用することができる正電荷の粒子に小型化または縮合されて、エンドサイトーシスによって細胞に侵入すると考えられる。このようなポリマーは、エンドソームｐＨを緩衝してＤＮＡを分解から保護する「プロトンスポンジ」として作用する性質を有し得る。連続的プロトン流入により、エンドソームの浸透圧による膨潤および破壊も誘導され、ＤＮＡ粒子の細胞質への逃避機構が提供される（例えば、本発明の実施で有用なＰＥＩおよび他のカチオン性ポリマーに関するさらなる情報については、引例８５〜８７、米国特許第６，０１３，２４０号、ＷＯ９６０２６５５号を参照のこと）。本発明の特定の実施形態によれば、ｊｅｔＰＥＩＴＭ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）（ＰＥＩの直鎖形態）（米国特許第６，０１３，２４０号）として公知の市販のＰＥＩ試薬を使用する。
【０１９８】
本発明者らは、インフルエンザウイルスＲＮＡを標的化するＰＥＩ、ＰＬＬ、またはＰＬＡ、およびｓｉＲＮＡを含む組成物をインフルエンザウイルス感染の前または後のいずれかに静脈内投与した場合にマウスでインフルエンザウイルスの産生が有意に阻害されることを示した。阻害は、用量依存性であり、異なるインフルエンザウイルスＲＮＡを標的化する２つのｓｉＲＮＡを使用した場合にさらなる効果を示す。したがって、ｓｉＲＮＡは、ＰＥＩ、ＰＬＬ、またはＰＬＡなどのカチオン性ポリマーと組み合わせた場合、肺に達し、細胞に侵入し、ウイルス複製周期を有効に阻害することができる。これらの所見により、肺内で発現する他の転写物を標的化するｓｉＲＮＡを含む類似の組成物は、肺内の細胞に効率的に送達されてその標的遺伝子の発現を阻害することが示唆される。
【０１９９】
種々のさらなるカチオン性ポリマーを使用することもできる。ジアクリレートおよびアミン単量体由来の新規のカチオン性ポリマーおよびオリゴマーの巨大ライブラリーを開発し、ＤＮＡトランスフェクションで試験した。これらのポリマーを、本明細書中で、ポリ（β−アミノエステル）（ＰＡＥ）ポリマーという。例えば、７個のジアクリレート単量体および２０個のアミン単量体由来の１４０個のポリマーのライブラリーが記載されており（Ｌｙｎｎ，Ｄ．Ｍ．ら，Ｊ  Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：８１５５−８１５６，２００１）、類似または同一の方法を使用してより巨大なライブラリーを生成することができる。このライブラリーの１４０個のメンバーのうち、７０個が十分な水溶性を示すことが見出された（２ｍｇ／ｍＬ、２５ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ＝５．０）。７０個の水溶性ポリマーのうちの５６個が、電気泳動移動度の変化によって示されるように、ＤＮＡと相互作用した。より重要には、５６個のポリマーのうちの２個がＣＯＳ−７細胞へのＤＮＡトランスフェクションを媒介した。新規のポリマーのトランスフェクション効率は、ＰＥＩの４〜８倍高く、リポフェクタミン２０００と同等かそれ以上であった。したがって、本発明は、カチオン性ポリマーがポリ（β−アミノエステル）である、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子およびカチオン性ポリマーを含む組成物およびこのような組成物の投与による標的遺伝子発現の阻害方法を提供する。
【０２００】
研究により、転写因子（ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質（２７，２８）、単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２タンパク質（２９）、およびショウジョウバエのアンテナペディアタンパク質（３０）が含まれる）が細胞表面から原形質膜に浸透し得ることが示されている。膜貫通を担うペプチドセグメントは、１１〜３４個のアミノ酸残基からなり、非常にアルギニンに富み、アルギニンリッチペプチド（ＡＲＰ）と呼ばれる。非常に巨大なポリペプチドと共有結合した場合、ＡＲＰは、原形質膜を通過して融合ポリペプチドを輸送することができる（３１〜３３）。同様に、オリゴヌクレオチドがＡＲＰに共有結合した場合、これらはさらにより迅速に細胞によって取り込まれる（３４、３５）。最近の研究により、８個のアルギニンのポリマーはこの膜貫通輸送に十分であることが示されている（３６）。カチオン性ポリマーと同様に、ＡＲＰおよびポリアルギニン（ＰＬＡ）も正電荷であり、ｓｉＲＮＡに結合することができる可能性が高く、おそらくＡＲＰまたはＰＬＡにｓｉＲＮＡが共有結合する必要はないことが示唆される。
【０２０１】
したがって、本発明は、少なくとも１つのＲＮＡｉ因子およびアルギニンリッチペプチドを含む組成物およびこのような組成物ならびにこのような組成物の投与による標的遺伝子発現の阻害方法を提供する。特に、本発明は、（ｉ）その阻害によってＩｇＥ媒介性過敏症が低減される任意のタンパク質またはペプチドをコードする転写物を標的するＲＮＡｉ因子、および（ｉｉ）アルギニンリッチペプチド、を含む組成物を投与する工程を包含する、ＩｇＥ媒介性過敏症に関連する病状または障害を処置および／または予防する方法を提供する。本発明の特定の実施形態によれば、ＲＮＡｉ因子の投与は、ＦＣεＲＩα鎖、ＦＣεＲＩβ鎖、ｃ−Ｋｉｔ、Ｌｙｎ、Ｓｙｋ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、４−１ＢＢリガンド、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＣＤ８３、ＳＬＡＭ、共通γ鎖、およびＣＯＸ−２からなる群から選択されるタンパク質をコードする転写物を標的化する。本発明の特定の実施形態によれば、ＤＣおよび／またはマクロファージにおける発現が阻害される。アルギニンリッチペプチドには、引例４６〜５１に記載のものおよび当業者にあきらかなその変形形態が含まれるが、これらに限定されない。アルギニンリッチペプチドには、ポリアルギニン（すなわち、アルギニン残基のみからなるペプチド）が含まれる。
【０２０２】
一般に、好ましいアルギニンリッチペプチドは、約５０アミノ酸長未満である。本発明の特定の実施形態によれば、アルギニンリッチペプチドは、約７アミノ酸と３４アミノ酸長との間の長さを有するペプチドである。本発明の特定の実施形態によれば、ペプチドは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％のアルギニンを含む場合、アルギニンリッチである。本発明の特定の実施形態によれば、アルギニンリッチペプチドは、６個と２０個との間のアルギニン残基を含む（すなわち、アルギニンリッチペプチドは、６個のアルギニンを含むか、７個のアルギニンを含むか、または８個のアルギニンを含む、など）。本発明の特定の実施形態によれば、アルギニンリッチペプチド（ポリアルギニン）は、６個と２０個との間のアルギニン残基からなる（すなわち、アルギニンリッチペプチドは、６個のアルギニンを含むか、７個のアルギニンを含むか、または８個のアルギニンを含む、など）。本発明の特定の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡおよびアルギニンリッチペプチドが共有結合するのに対して、本発明の他の実施形態では、ＲＮＡｉ因子およびアルギニンリッチペプチドが混合するが、相互に共有結合しない。
【０２０３】
種々の他の送達因子を、本発明の種々の実施形態で使用することができる。例えば、米国特許出願番号１０／６７４，０８７号により詳細に記載されるように、肺への導入に適切な界面活性物質、標的細胞の表面上に存在する分子に結合する抗体またはリガンドなどの送達増強部分を組み込んだ送達因子、または上記のカチオン性ポリマーと異なる任意の種々のポリマーおよびポリマーマトリクスも使用することができる。このようなポリマーには、多数の非カチオン性ポリマー（すなわち、生理学的ｐＨで正電荷を持たないポリマー）が含まれる。このようなポリマーは、一定の利点（例えば、細胞傷害性が低く、いくつかの場合、ＦＤＡ承認されている）を有し得る。多数の適切なポリマーは、他の状況で薬物および遺伝子の送達を増強することが示されている。このようなポリマーには、例えば、本発明のＲＮＡｉ因子の送達のためのナノ粒子に処方することができるポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコリド）（ＰＬＧ）、およびポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）が含まれる。上記のコポリマーおよび組み合わせも使用することができる。本発明の特定の実施形態では、カチオン性ポリマーを使用して、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはベクターを縮合し、縮合した複合体を、ＰＬＧＡまたは別の非カチオン性ポリマーによって保護する。使用することができる他のポリマーには、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ８５と複合体化することができるポリビニルアルコールまたはポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジウムブロミド）等の非縮合ポリマーが含まれる。本発明で使用される他のポリマーには、カチオン性ポリマーと非カチオン性ポリマーとの間の組み合わせが含まれる。例えば、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）グラフティングポリ（Ｌ−リジン）および他の組み合わせ（ＰＬＡ、ＰＬＧ、またはＰＬＧＡおよび任意のカチオン性ポリマーまたは修飾カチオン性ポリマー（上記で考察のものなど）が含まれる）を使用することができる。
【０２０４】
（ＩＸ．処置への適用）
本発明のＲＮＡｉ因子を含む組成物を使用して、ＩｇＥによって媒介される任意の疾患または病状（例えば、ＩｇＥ媒介性過敏症に関連する任意の疾患または病状（アレルギー性鼻炎および喘息が含まれるが、これらに限定されない））を予防または処置することができる。好ましくは、ＲＮＡｉ因子の量は、ＩｇＥ媒介性過敏症の１つまたは複数の症状の軽減または予防に十分である。したがって、本発明は、（ｉ）ＩｇＥ媒介性過敏症によって特徴づけられる疾患もしくは病状の危険性があるかまたはその疾患もしくは病状に罹患している被験体を提供する工程と、（ｉｉ）ＦＣεＲＩα鎖、ＦＣεＲＩβ鎖、ｃ−Ｋｉｔ、Ｌｙｎ、Ｓｙｋ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、４−１ＢＢリガンド、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＣＤ８３、ＳＬＡＭ、共通γ鎖、およびＣＯＸ−２からなる群から選択されるタンパク質をコードする転写物を標的化するＲＮＡｉ因子を含む組成物を被験体に投与する工程とを含む、ＩｇＥ媒介性過敏症によって特徴づけられる疾患または病状を処置または予防する方法を提供する。本発明は、さらに、不適切もしくは過剰な肥満細胞活性によって特徴づけられる疾患もしくは病状の危険性があるかまたはその疾患もしくは病状に罹患している被験体を提供する工程と、肥満細胞の活性または肥満細胞の生存を減少させるＲＮＡｉ因子組成物を被験体に投与する工程とを含む、不適切もしくは過剰な肥満細胞活性またはＩｇＥ媒介性過敏症によって特徴づけられる疾患もしくは病状を処置または予防する方法を提供する。さらに、本発明は、不適切もしくは過剰なＴｈ２ヘルパー細胞応答によって特徴づけられる疾患もしくは病状の危険性があるかまたはその疾患もしくは病状に罹患している被験体を提供する工程と、Ｔｈ２細胞応答を減少させるか排除するＲＮＡｉ因子を含む組成物を被験体に投与することとを含む、不適切もしくは過剰なＴｈ２ヘルパー細胞応答またはＩｇＥ媒介性過敏症によって特徴づけられる疾患もしくは病状を処置または予防する方法を提供する。
【０２０５】
ＲＮＡｉ因子を含む本発明の組成物は、１つの標的転写物中の１つの部位を標的化する１つの種を含み得るか、１つまたは複数の転写物中の１つまたは複数の部位を標的化する複数の異なる種を含み得る。
【０２０６】
本発明のいくつかの実施形態では、異なる転写物を標的化する異なるＲＮＡｉ因子の集団を含む組成物を使用することが望ましい。例えば、異なる細胞型（例えば、ＤＣ、マクロファージ、Ｂ細胞、Ｔｈ２細胞）で発現する転写物を標的化する種々のＲＮＡｉ因子を使用することが望ましくあり得る。あるいは、１つの細胞型で多数の異なる転写物を阻害することが望ましくあり得る。これらのストラテジーのいずれかにより、単一転写物が阻害された場合に同等な治療効果を達成するために必要とされる阻害度と比較して、任意の単一転写物の阻害レベルを減少させる一方で、治療効果を得ることができる。
【０２０７】
本発明の特定の実施形態によれば、本発明の組成物は、１つの転写物を標的化する１つを超えるＲＮＡｉ因子を含み得る。一例を挙げれば、標的転写物のコード領域を標的化する少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡおよび３’ＵＴＲを標的化する少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含むことが望ましくあり得る。この戦略は、組成物中の少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが分解のために転写物を標的化することができる一方で、少なくとも１つの他のものが、分解を回避するための任意の転写物の翻訳を阻害するので、関連転写物によってコードされる産物が生成されないという別の確信を得ることができる。
【０２０８】
本発明は、「治療カクテル」（複数のｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡを投与するアプローチ、および１つのベクターが複数の標的を阻害するｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡの合成、またはプロセシングされて複数のｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡを生成し得るＲＮＡの合成を指示するアプローチが含まれるが、これらに限定されない）を含む。
【０２０９】
ＩｇＥ媒介性過敏症の１つまたは複数の症状または特徴を阻害、軽減、または予防するために、本発明のＲＮＡｉ因子と１つまたは複数の他の治療薬の投与を組み合わせることがしばしば望ましい。本発明の特定の好ましい実施形態では、本発明のＲＮＡｉ因子を、他の薬剤の１つまたは複数と組み合わせる。他の薬剤としては、例えば、以下が挙げられる：抗ヒスタミン薬（フェキソフェナジン、ロラタジン、セチリジンなどのＨ１レセプターアンタゴニストが含まれる）；コルチコステロイド（プレドニゾン、ベクロメタゾン、トリアムシノロン、フルチカゾンなど）；気管支拡張薬（エピネフリン、エピネフリンアナログ、およびイソプロテレノールなどのβ−アドレナリン作動性アゴニスト、ならびにアルブテロール、メタプロテロノール、サルメテロールなどのβ２選択性アドレナリン作動性アゴニストが含まれる）；クロモリンナトリウム、ネドクロミル、または関連化合物；テオフィリンなどのメチルキサンチンまたは関連化合物、など。上記リストは、包括よりもむしろ表示のみを意図することに留意すべきである。さらなる情報および他の適切な薬剤については、例えば、上記で参照したＧｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓを参照のこと。本発明の異なる実施形態では、用語「〜と組み合わせた」または「〜との組み合わせ」は、ＲＮＡｉ因子が他の薬剤と同一の混合物中に存在することか、個体の処置計画が１つまたは複数のＲＮＡｉ因子および他の薬剤の両方を含み、必ずしも同一の混合物中においてもしくは同時に送達されないことかの、いずれかを意味し得る。本発明の特定の実施形態によれば、薬剤は、喘息またはアレルギー性鼻炎などのＩｇＥ媒介性過敏症に関連する病状の処置について米国食品医薬品局で承認されている。
【０２１０】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明の組成物の投与を特定の細胞および／または細胞型（例えば、肥満細胞、ＤＣ、マクロファージ、Ｔｈ２細胞）に標的化することが望ましくあり得る。本発明のいくつかの実施形態では、本発明の組成物の投与を身体の特定の領域（例えば、上気道および／または下気道など）に標的化することが望ましくあり得る。本発明の他の実施形態では、最も広範な送達の選択肢が利用可能であることが望ましい。
【０２１１】
上記のように、本発明の治療プロトコールは、被験体が過敏性であるアレルゲンへの曝露前、曝露と同時、または曝露後における、有効量のＲＮＡｉ因子の投与を含み得る。例えば、予想される曝露前に、個体は、ｓｉＲＮＡを受容することができるか、あるいは推測されるか既知である曝露と実質的に同時（例えば、数秒、数分、または数時間以内）に処置することができる。勿論、任意の時間（継続的時間または慣習に基づく時間）に、個体は、本発明の処置を受けることができる。
【０２１２】
遺伝子療法プロトコールは、適切な発現シグナルに作動可能に連結された阻害ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの転写のためのテンプレートを含む有効量の遺伝子療法ベクターを被験体に投与する工程を含み得る。上記の代わりに、または上記に組み合わせて使用することができる別のアプローチは、被験体から細胞集団（例えば、幹細胞または免疫系細胞）を単離し、必要に応じて組織培養で細胞を増殖し、このような遺伝子療法ベクターをインビトロで細胞に投与することである。次いで、細胞を、被験体に戻すことができる。必要に応じて、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを発現する細胞を、これらを被験体に導入する前にインビトロで選択することができる。本発明のいくつかの実施形態では、細胞株または被験体ではない個体由来の細胞であり得る細胞集団を使用することができる。被験体からの幹細胞、免疫系細胞などの単離方法およびこれらを被験体へ戻す方法は、当該分野で周知である。このような方法は、例えば、化学療法を受けた患者における骨髄移植、末梢血幹細胞移植などのために使用される。
【０２１３】
さらに別のアプローチでは、経口遺伝子療法を使用することができる。例えば、米国特許第６，２４８，７２０号は、微粒子中に保護的に含まれて保護される、プロモーターの制御下にある遺伝子を、作動可能な形態で細胞に送達させ、それにより、非浸襲性遺伝子送達が達成される方法および組成物を記載している。微粒子の経口投与後、遺伝子は上皮細胞（吸収小腸上皮細胞が含まれる）に取り込まれ、腸管関連リンパ系組織に取り込まれ、さらに、粘膜上皮から離れた細胞に輸送される。本明細書中に記載のように、微粒子は、遺伝子を粘膜上皮から離れた部位に送達することができる（すなわち、微粒子は上皮バリアを通過して全身循環に入り、それにより、他の位置で細胞がトランスフェクトされる）。
【０２１４】
本発明は、非ヒト種（イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタ、およびウマが含まれるが、これらに限定されない）の処置のための本発明の組成物の使用を含む。
【０２１５】
好ましい実施形態では、本発明の遺伝子療法組成物および方法は、ヒトまたはヒトの一部を形成する細胞に対する特許請求を含まない。
【０２１６】
（Ｘ．薬学的処方物）
本発明の組成物を、任意の利用可能な経路（非経口（例えば、静脈内）、筋肉内、皮内、皮下、経口、鼻腔内、気管支、眼、経皮（局所）、経粘膜、直腸、および膣経路が含まれるが、これらに限定されない）による送達のために処方することができる。好ましい送達経路には、非経口、経粘膜、鼻腔内、気管支、および経口が含まれる。本発明の薬学的組成物は、代表的には、薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせた、送達後にｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが産生されるベクターを含む。本明細書中で使用される、用語「薬学的に許容可能なキャリア」には、薬物投与に適合する溶媒、分散媒、コーティング、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。補助的活性化合物を組成物に組み込むこともできる。
【０２１７】
意図する投与経路と適合するように薬学的組成物を処方する。非経口、皮内、または皮下への適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる：注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールもしくは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌薬、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、酢酸、クエン酸、またはリン酸などの緩衝液、塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの浸透圧調整剤。塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を使用してｐＨを調整することができる。非経口調製物を、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数回投与用バイアルに封入することができる。
【０２１８】
注射用途に適切な薬学的組成物は、代表的には、滅菌注射様の溶液または分散液の即時調製のための滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌粉末を含む。静脈内投与のためには、適切なキャリアとしては、生理学的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ  ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合、組成物は滅菌されているべきであり、シリンジで容易に利用可能な範囲の流動性であるべきである。好ましい薬学的処方物は、製造および保存条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。一般に、関連キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにこれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。例えば、レクチンなどのコーティングの使用、分散媒の場合の必要な粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって適切な流動性を維持することができる。種々の抗菌薬および抗真菌薬（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサールなど）によって、微生物作用を防止することができる。多くの場合、薬剤（例えば、糖、ポリアルコール（マンニトール、ソルビトールなど）、塩化ナトリウム）を組成物中に含めることによって等張性を調整することが好ましい。吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を組成物中に含めることによって、注射可能な組成物の吸収を延長することができる。
【０２１９】
滅菌注射溶液を、適切な溶媒中での必要量の活性化合物への必要に応じた上記列挙の成分の１つまたは組み合わせの組み込み、および必要な場合その後の濾過滅菌によって、調製することができる。一般に、基剤としての分散媒および上記列挙の成分由来の必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルへの活性化合物の組み込みによって、分散液を調製する。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、前に濾過滅菌した溶液から活性成分の粉末および任意のさらなる所望の成分が得られる、真空乾燥および凍結乾燥である。
【０２２０】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。経口治療薬投与の目的のために、活性化合物を賦形剤と共に組み込み、錠剤、トローチ、またはカプセル（例えば、ゼラチンカプセル）の形態で使用することができる。経口組成物を、含嗽剤として使用するための液体キャリアを使用して調製することもできる。薬学的に適合性の結合剤および／またはアジュバント物質を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、任意の以下の成分または類似の性質の化合物を含み得る：微結晶性セルロース、トラガカントガム、またはゼラチンなどの結合剤、デンプンまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅなどの滑沢剤、コロイド状二酸化ケイ素などの滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）、スクロースまたはサッカリンなどの甘味料、またはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料などの香味物質。経口送達用処方物は、薬剤を有利に組み込んで、胃腸管内での安定性を改善し得、そして／または吸収を増強し得る。
【０２２１】
吸入による投与のために、本発明のＲＮＡｉ因子を、好ましくは、適切な噴射剤（例えば、二酸化炭素などのガス）を含む加圧コンテナもしくは分注器、または噴霧器から、エアゾールスプレーの形態で送達する。本発明は、特に、上気道および／または下気道への鼻内噴霧剤、吸入器、または他の直接送達を使用した本発明の組成物の送達を企図する。さらに、本発明の特定の実施形態によれば、気道内での細胞による核酸取り込みを容易にするためのキャリアを、薬学的組成物に含める。（例えば、Ｓ．−Ｏ．Ｈａｎ，Ｒ．Ｉ．Ｍａｈａｔｏ，Ｙ．Ｋ．Ｓｕｎｇ，Ｓ．Ｗ．Ｋｉｍ，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：３０２３１７，２０００．を参照のこと）。本発明の特定の実施形態によれば、実施例３に詳細に記載するように、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ／キャリア組成物を、エアゾール投与のための巨大な多孔質粒子として処方する。
【０２２２】
経粘膜手段または経皮手段によって全身投与することもできる。経粘膜または経皮投与のために、透過すべきバリアに適切な浸透剤を処方において使用する。このような浸透剤は、当該分野で一般に公知であり、例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸、およびフシジン酸誘導体が含まれる。鼻内噴霧剤または坐剤の使用によって経粘膜投与を達成することができる。経皮投与のために、当該分野で公知のように、活性化合物を、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリームに処方する。
【０２２３】
化合物を、直腸送達のための座剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドなどの従来の座剤の基剤）または持続性浣腸剤（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｅｎｅｍａ）の形態で調製することもできる。
【０２２４】
１つの実施形態では、活性化合物を、化合物を身体からの急速な排除から保護するキャリアを使用して調製する（例えば、移植片およびマイクロカプセル化送達系を含む徐放性処方物）などの。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、およびポリ乳酸などの生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。このような処方物の調製方法は、当業者に明らかである。材料を、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から購入することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞を標的化するリポソームが含まれる）を、薬学的に許容可能なキャリアとして使用することもできる。これらを、例えば、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載の当業者に公知の方法にしたがって調製することができる。
【０２２５】
投与を容易にするためおよび投薬量を均一にするために、経口または非経口組成物を投薬単位形態で処方することが有利である。本明細書中で使用される、「投薬単位形態」は、処置される被験体の単位投薬に適切な物理的に個別の単位をいい、各単位は、必要な薬学的キャリアと組み合わせて、所望の治療効果が得られるように計算された所定量の活性化合物を含む。
【０２２６】
このような化合物の毒性および治療有効性を、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％が死滅する用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効である用量）の決定のための細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として示すことができる。高い処置指数を示す化合物が好ましい。有毒な副作用を示す化合物を使用することができるが、非感染細胞に対する潜在的な損傷を最小にし、それにより、副作用を軽減させるために、罹患組織部位にこのような化合物を標的化する送達系の設計には注意を払うべきである。
【０２２７】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータを、ヒトにおける使用のための投薬量範囲を処方することに使用することができる。このような化合物の投薬量は、毒性がほとんどないか全くないＥＤ５０を含む循環濃度範囲内であることが好ましい。投薬量は、使用される投薬形態および利用される投与経路に依存してこの範囲内で変化し得る。本発明の方法で使用される任意の化合物のために、処置有効用量を、最初に細胞培養アッセイから評価することができる。細胞培養物で決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するための用量を、動物モデル中に処方することができる。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿レベルを、例えば、高速液体クロマトグラフィの助けを使用して測定することができる。
【０２２８】
薬学的組成物の処置有効量は、代表的には、約０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、さらにより好ましくは約１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、２〜９ｍｇ／ｋｇ体重、３〜８ｍｇ／ｋｇ体重、４〜７ｍｇ／ｋｇ体重、または５〜６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。薬学的組成物を、必要に応じて種々の間隔および異なる期間で投与することができる（例えば、１週間に１回を、約１週間〜１０週間、２週間〜８週間、約３週間〜７週間、約４週間、５週間、６週間など）。当業者は、特定の要因（疾患または障害の重症度、以前の処置、全体的な健康状態、および／または被験体の年齢、ならびに他の疾患の存在が挙げられるが、これらに限定されない）が被験体の有効な処置に必要な投薬量およびタイミングに影響を与え得ることを認識する。一般に、本明細書中に記載のＲＮＡｉ因子での被験体の処置には、単回処置が含まれ得るか、多くの場合、一連の処置が含まれ得る。
【０２２９】
用量の例としては、被験体またはサンプル重量１ｋｇあたりでの、本発明のｓｉＲＮＡの量（ｍｇまたはμｇ）が挙げられる（例えば、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約１μｇ／ｋｇ〜約５０μｇ／ｋｇ）。ＲＮＡｉ因子の適切な用量は、その潜在能力に依存し、そして必要に応じて、例えば、事前に選択しておいた所望の応答が得られるまで用量を増加しながら投与することによって、特定のレシピエントに合わせることができることが、さらに理解される。任意の特定の動物被験体についての特定の用量レベルは種々の要因（使用される特定の化合物の活性、被験体の年齢、体重、全体的健康状態、性別、および食事、投与時間、投与経路、排泄速度、任意の薬物の組み合わせ、および調節すべき発現または活性の程度が挙げられる）に依存し得ることが、理解される。
【０２３０】
上記のように、本発明は、非ヒト動物の処置のための本発明の組成物の使用を含む。したがって、投与用量および投与方法を、獣医学用薬物学および医薬品の公知の原理にしたがって選択することができる。指針は、例えば、Ａｄａｍｓ，Ｒ．（編），Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第８版，Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；ＩＳＢＮ：０８１３８１７４３９；２００１に見出すことができる。
【０２３１】
プラスミドまたは遺伝子療法ベクターを、例えば、静脈内注射、局所投与、または定位注入によって被験体に送達することができる（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）。本発明の特定の実施形態では、プラスミドまたは遺伝子療法ベクターを、経口または吸入で送達させ得、カプセル化するかもしくは他の方法で操作してこれらを分解から保護し得、組織または細胞への取り込みを増強し得る。プラスミドを、遺伝子療法ベクターとして使用することができ、したがって、用語「遺伝子療法ベクター」はプラスミドを含み得ることに留意すること。しかし、一般に、用語「遺伝子療法ベクター」は、しばしば、例えば、細胞内での複製および／または細胞ゲノムへの核酸配列の組み込みによって裸のＤＮＡベクターを哺乳動物細胞に導入した場合に代表的に得られるよりも、より持続的に治療薬を発現させることができるベクターをいうために使用される。プラスミドまたは遺伝子療法ベクターの薬学的調製物は、許容可能な希釈剤中の遺伝子療法ベクターを含み得るか、遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放マトリクスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターを、組換え細胞からインタクトなままで産生することができる場合（例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）、薬学的調製物は、この遺伝子送達系を産生する１つまたは複数の細胞を含み得る。
【０２３２】
本発明の薬学的組成物は、投与のための使用説明書と共にコンテナ、パック、または分注器中に備えられ得る。
【実施例】
【０２３３】
（実施例１：ｓｉＲＮＡの設計）
表１〜２６に列挙した配列を標的およびセンス鎖として選択した。各配列について、列挙した配列と完全に相補的な配列を、対応するアンチセンス鎖として選択した。ｄＴｄＴからなる２ｎｔの３’突出部を、各鎖に添加した。例えば、ｃＤＮＡ配列ＦＣεＲα−２６８（ＴＴＧＧＴＣＡＴＴＧＴＧＡＧＴＧＣＣＡ＝配列番号３１６）に基づいてｓｉＲＮＡを設計するために、配列５’−ＵＵＧＧＵＣＡＵＵＧＵＧＡＧＵＧＣＣＡ−３’（配列番号１）をセンス鎖のコア領域として選択し、相補配列５’−ＵＧＧＣＡＣＵＣＡＣＡＡＵＧＡＣＣＡＡ−３’（配列番号３１７）を、アンチセンス鎖のコア領域として選択する。ｄＴｄＴからなる２ｎｔの３’突出部を、各鎖に付加し、配列５’−ＵＵＧＧＵＣＡＵＵＧＵＧＡＧＵＧＣＣＡｄＴｄＴ−３’（配列番号３１８）（センス鎖）および５’−ＵＧＧＣＡＣＵＣＡＣＡＡＵＧＡＣＣＡＡｄＴｄＴ−３’（配列番号３１９）（アンチセンス鎖）を得た。
【０２３４】
センス鎖とアンチセンス鎖とのハイブリダイズにより、各鎖が２ヌクレオチドの３’ＯＨ突出部を有する、１９塩基対のコア二重鎖領域を有するｓｉＲＮＡが得られる。
【０２３５】
（実施例２：抗原誘導性肥満細胞応答に対する本発明のｓｉＲＮＡの効果）
本実施例は、抗原に応答した好塩基球および肥満細胞による炎症の種々のメディエーターの放出に対する本発明のｓｉＲＮＡ組成物の投与効果を決定するための実験を記載する。
【０２３６】
（試薬）  他で記載しない限り、試薬は、Ｍｏｒｉｙａ，Ｋ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：１２５３９−１２５４４，１９９７に記載の供給元から入手する。
【０２３７】
（細胞、細胞培養、および細胞調製）  ＲＢＬ−２Ｈ３は、高親和性ＩｇＥレセプターを有する好塩基球白血病細胞株である。これらの細胞を、これらのレセプターの凝集によってか、またはカルシウムイオノフォアによって、ヒスタミンおよび他のメディエーターを分泌するように活性化する。Ｂａｒｓｕｍｉａｎ  ＥＬら，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｉｍｍｎｕｎｏｌ．１１：３１７−３２３，１９８１。これらは、肥満細胞中の分泌のためのＦｃＥＲＩおよび生化学的経路を研究するために広範に使用した。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞（ＣＲＬ−２２５６株）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から入手し、Ｍｏｒｉｙａ，Ｋ．らに記載のように培養で維持する。Ｍｏｒｉｙａらに記載のように、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を、ＤＮＰ特異的ＩｇＥ、ならびに放射性標識ｍｙｏ−イノシトール、アラキドン酸、および５−ヒドロキシトリプタミンと一晩インキュベートする。細胞を、抗原（ＤＮＰ−ＢＳＡ、１０ｎｇ／ｍＬ）または分泌刺激薬Ａ２３１８７およびホルボール１２−ミリステート−１３−アセテート（それぞれ、１００ｎｍおよび２０Ｍ）により、３７℃で１５分間刺激する。
【０２３８】
Ｈｏｌｇａｔｅ，Ｓ．Ｔ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２４：２０９３−２０９９，１９８０に記載のようにラット腹腔内肥満細胞を得る。ＤＮＰ−ＢＳＡ（０．３μｇ／ｍｌ）との３７℃で１５分間のインキュベーションによって細胞を刺激する。Ｓａｉｔｏら，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０７：６３−６５，１９９５に記載の方法によって、培養ヒト肥満細胞を得る。Ｍｏｒｉｙａらに記載のように、細胞を培養中に維持する。記載されるように（Ｍｏｒｉｙａら）、感作のために、ヒト肥満細胞をヒトＩｇＥおよび放射性標識アラキドン酸と一晩インキュベートし、次いで、抗ヒトＩｇＥで刺激する。
【０２３９】
（ｓｉＲＮＡ）  上記のようにｓｉＲＮＡを設計する。ＧＣ含量に関する詳細な説明に記載の選択基準の遵守および連続した同一ヌクレオチドの文字列の排除に加えて、ｓｉＲＮＡを、通常、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃  ００３−Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  Ｂ，“ｓｉＲＮＡ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡｉ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ  ８００２６（ＲＮＡ試薬の供給業者）に記載の原理にしたがって設計した。Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎｓ  ＃００３。げっ歯類細胞株および動物モデルにおける試験効率を高めるために、選択したｓｉＲＮＡは、複数の種（例えば、ヒトおよび１つまたは複数のげっ歯類（例えば、マウス、ラット））で同一の配列部分に対応する。
【０２４０】
２’ＡＣＥ保護化学を使用したＤｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）によって、全ｓｉＲＮＡを合成する。製造者の説明書にしたがってｓｉＲＮＡ鎖を脱保護し、等モル比で混合し、９５℃への加熱および３５℃までは３０秒毎に１℃、５℃までは１分毎に１℃のゆっくりとした温度低下によってアニーリングする。
【０２４１】
（ｓｉＲＮＡ投与）  Ｌｉ，Ｌ．ら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７８（７）：４７２５−４７２９，２００３に記載のようなリポソームトランスフェクションアプローチを使用して、ＦＣεＲＩα鎖、ＦＣεＲＩβ鎖、ｃ−Ｋｉｔ、Ｌｙｎ、Ｓｙｋ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、４−１ＢＢリガンド、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＣＤ８３、ＳＬＡＭ、共通γ鎖、およびＣＯＸ−２（単独または組み合わせのいずれか）を標的化するｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ組成物を、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞、ラット腹腔肥満細胞、およびヒト肥満細胞に導入する。あるいは、米国特許出願６０／４４６、３７７号に記載のように、細胞にｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションする。
【０２４２】
（メディエーター放出の測定）  Ｃｕｎｈａ−Ｍｅｌｈｏ，Ｊ．Ｒ．ら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４３：２６１７−２６２５，１９８９、およびＣｏｌｌａｄｏ−Ｅｓｃｏｂａｒら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４：３４４９−３４５７，１９９０に記載のように、標識リン酸イノシトールおよびアラキドン酸および５−ＨＴ全体の蓄積を決定した。ヒスタミンの放出を、酵素免疫アッセイによって決定する。Ｍｏｒｉｙａらに記載のように、ペプチドロイコトリエン、プロスタグランジン、およびＴＮＦαの放出の測定を、酵素免疫アッセイを使用して行う。本発明のｓｉＲＮＡで処置した細胞中のこれらのメディエーターの１つまたは複数の放出の、ｓｉＲＮＡで処置していない細胞の放出レベルに対する減少は、ｓｉＲＮＡが肥満細胞応答の阻害およびＩｇＥ媒介性応答の減少およびＩｇＥ媒介性過敏症に関連する疾患または病状の徴候および症状の軽減に有効であることを示す。類似の方法を使用して、ｓｈＲＮＡまたはＲＮＡｉベクターを試験することができる。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはＲＮＡｉベクターを、上記の任意の送達因子と組み合わせて投与することができる。
【０２４３】
（実施例３：マウスモデルにおける本発明のｓｉＲＮＡの効果）
この実施例は、アレルギー性気道炎症および反応性亢進の代表的なマウスモデルにおける、肺の種々の炎症応答に対する特定の本発明のｓｉＲＮＡの投与の効果の評価を記載する（Ｐｏｙｎｔｅｒ，Ｍ．ら，Ａｍ．Ｊ  Ｐａｔｈ．１６０（４）：１３２５−１３３４，２００２）。
【０２４４】
６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入し、収容し、標準的な条件下で維持する。マウスを、多数の群に分け、各群に下記の異なるプロトコールにしたがってｓｉＲＮＡ組成物を投与する。以前に記載のように（Ｃｉｅｓｌｅｗｉｃｚ，Ｇ．ら，Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０４：３０１−３０８，１９９９；Ｔａｋｅｄａ，Ｔ．ら，Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６：４４９−４５４，１９９７）、０日目および１４日目の腹腔内注射によって、各群のマウスに、Ａｌｕｍ（２．２５  ｍｇ、Ｉｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）と共にＯＶＡ（２０μｇ、グレードＶオボアルブミン、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を投与し、２１、２２、および２３日目にエアゾール化ＯＶＡで攻撃誘発する。腹腔内注射による致死量のペントバルビタールによってマウスを安楽死させる。
【０２４５】
ＦＣεＲＩα鎖、ＦＣεＲＩβ鎖、ｃ−Ｋｉｔ、Ｌｙｎ、Ｓｙｋ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、４−１ＢＢリガンド、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＣＤ８３、ＳＬＡＭ、共通γ鎖、およびＣＯＸ−２（単独または組み合わせのいずれか）を標的化するｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ組成物を、抗原攻撃誘発に関して種々の異なる時間で個々のマウス群に投与する。例えば、いくつかの群に、抗原攻撃誘発の数週間前、数日前、または数時間前にｓｉＲＮＡ組成物を投与する。いくつかの群に、２１日目、２２日目、および／または２３日目にｓｉＲＮＡ組成物を投与する。いくつかの群に、抗原攻撃誘発後にｓｉＲＮＡ組成物を投与する。特定の群に、種々の異なる経路（吸入、静脈内など）によって単回用量のｓｉＲＮＡを投与する一方で、他の群に種々の時間間隔によって分離した一連の処置を施す。種々の範囲の用量を使用する。これらの種々の処置スキームの有効性の比較により、最適な投与計画を選択可能である。
【０２４６】
一般に、任意の利用可能な経路（経口または静脈内が含まれる）を使用して、ｓｉＲＮＡを送達することができる。しかし、アレルギー性鼻炎および喘息は、鼻腔路、上気道、および肺中の細胞による応答に関与するので、気道中の細胞にｓｉＲＮＡを送達する方法が注目される。多数の異なる方法（点滴注入、エアゾール（液体および乾燥粉末の両方）吸入、気管内投与、および静脈内注射が含まれる）を使用して、小分子薬物、タンパク質、およびＤＮＡ／ポリマー複合体をマウスの上気道および／または肺に送達した。点滴注入により、通常、マウスを軽度に麻酔し、垂直方向に直立させたままにした。少量（例えば、３０〜５０μＬ）の治療薬（すなわち、下記のｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体）を、流体が吸入される一方の鼻腔にゆっくりと適用する（Ｄｅｎｓｍｏｒｅ，Ｃ．Ｌ．ら，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１８０−１８８，１９９９）。動物を短時間直立させたままにして、点滴注入した流体を肺に到達させる（Ａｒｐｐｅ，Ｊ．ら，Ｉｎｔｌ．Ｊ  Ｐｈａｒｍ．１６１：２０５−２１４，１９９８）。点滴注入は上気道および肺の両方への治療薬の送達に有効であり、同一マウスに対して複数回繰り返すことができる。
【０２４７】
エアゾールによって、通常、液体および乾燥粉末は異なる方法で適用される。液体エアゾールは、マウスがおかれた密封プラスチックケージ中に噴霧器によって生成される（Ｄｅｎｓｍｏｒｅら）。エアゾールは、動物の呼吸によって吸入されるので、この方法は非効率かつ不正確であり得る。乾燥粉末エアゾールは、通常、麻酔マウスに対する強制換気によって投与される。エアゾール粒子が巨大かつ多孔質である限り、この方法は、非常に有効であり得る（以下を参照のこと）（Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｄ．Ａ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：１８６８−１８７１，１９９７）。気管内投与のためには、治療薬を含む溶液を、チューブを介して麻酔したマウスの肺に注入する（Ｇｒｉｅｓｅｎｂａｃｈ，Ｕ．ら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：１８１−１８８，１９９８）。これは、肺への送達には非常に有効であるが、上気道では失敗する。タンパク質およびポリエチレンイミンと複合体形成した少量のＤＮＡ（約１μｇ）の静脈内注射は、肺の上皮細胞および間質組織中の細胞をトランスフェクトすることが示されている（Ｏｒｓｏｎ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：４６３−４７１，２００２）。
【０２４８】
抗原攻撃誘発の４８時間後の気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）の実施および洗浄液中に存在する炎症細胞数の測定によって気道炎症を評価する。簡単に述べれば、点滴注入による安楽死の直後にＢＡＬを回収し、８００μＬの０．９％ＮａＣｌで回復させる。ＢＡＬ中の総細胞を計数し、２×１０４細胞をガラススライド上で８００ｒｐｍにて遠心分離する。Ｃｙｔｏｓｐｉｎを、Ｈｅｍａ３２キット（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｗｅｄｅｓｂｏｒｏ，ＮＪ）を使用して染色し、５００細胞について示差的細胞計数を行う。異なるｓｉＲＮＡおよび種々の処置プロトコールによって処置したマウス由来のＢＡＬ中のマクロファージ数、好酸球数、好中球数、およびリンパ球数を、異なる群間で比較し、かつｓｉＲＮＡを受容していないコントロール（ビヒクルのみ）または関連のないｓｉＲＮＡを受容したコントロールと比較する。いくつかの動物では、ＢＡＬを行うよりもむしろ、肺を取り出し、ＰＢＳで洗浄し、１０％ホルマリン中で固定し、Ｈ＆Ｅで染色する。細胞数を、視覚的に計数する。本発明のｓｉＲＮＡで処置したマウスに由来するＢＡＬまたは肺切片中のマクロファージ数、好酸球数、好中球数、および／またはリンパ球数の、処置していないマウス中の数に対する減少は、そのｓｉＲＮＡが有効であることを示す。ｓｉＲＮＡを受容していないか関連のないｓｉＲＮＡを受容したマウスで認められる粘液の多量の細胞質内蓄積および増殖性円柱上皮細胞の存在に対する、本発明のｓｉＲＮＡで処置したマウスにおける粘液蓄積の減少および少数の立方細胞の存在は、そのｓｉＲＮＡがＩｇＥ媒介性応答の減少ならびにＩｇＥ媒介性過敏症に関連する疾患または病状の徴候および症状の減少において有効であることを示す。
【０２４９】
より慢性の応答を、上記で引用したＴｅｍｅｌｋｏｖｓｋｉらおよびＦｏｓｔｅｒ，Ｐ．Ｓ．ら，Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．，８２（４）：４５５−４６２，２００２に記載の慢性喘息炎症の改良マウスモデル（これらの引用文献においては、感作マウスは、低レベルのＯＶＡによる慢性吸入攻撃誘発に供される）を使用して評価する。このプロトコールに供したいくつかの群では、慢性吸入攻撃誘発中に間隔をあけてｓｉＲＮＡ処置を行う一方で、別の群では、最初の抗原攻撃誘発前または数日後までのみにｓｉＲＮＡ処置を行う。上皮下線維症、気道上皮の肥大、および肺気道の粘液細胞過形成／異常形成などの慢性炎症の指標を、Ｆｏｓｔｅｒらに記載のように評価する。本発明のｓｉＲＮＡで処置したマウスにおける上皮下線維症、気道上皮の肥大、および肺気道の粘液細胞過形成／異常形成の、ｓｉＲＮＡを受容していないか関連のないｓｉＲＮＡを受容したマウスで観察されるレベルに対する減少の程度は、そのｓｉＲＮＡがＩｇＥ媒介性応答ならびにＩｇＥ媒介性過敏症に関連する疾患または病状の徴候および症状の軽減に有効であることを示す。
【０２５０】
ＯＶＡに特異的な血清ＩｇＥを、標準的技術を使用して測定する。本発明のｓｉＲＮＡで処置したマウスにおけるＯＶＡ特異的血清ＩｇＥレベルの、ｓｉＲＮＡを受容していないか関連のないｓｉＲＮＡを受容したマウスにおけるＯＶＡ特異的血清ＩｇＥレベルに対する低下は、そのｓｉＲＮＡがＩｇＥ媒介性応答ならびにＩｇＥ媒介性過敏症に関連する疾患または病状の徴候および症状の軽減に有効であることを示す。
【０２５１】
肺機能を以下のように評価する。マウスを、ペントバルビタールで麻酔する。Ｉｒｖｉｎ，Ｃ．Ｇ．ら，Ａｍ．Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７２：Ｌ１０５３−１０５８，１９９７に記載のように、各群由来の気管切開マウスを、肺機能の評価のために機械的に換気する。以前に記載のように（Ｔａｋｅｄａら）、圧力、流れ、および体積を使用して、吸入用量のエアゾール化メタコリンによる攻撃誘発後の肺耐性を計算する。処置していないマウスにおける肺耐性に対する本発明のｓｉＲＮＡで処置したマウスにおける肺耐性レベルの低下は、そのｓｉＲＮＡがＩｇＥ媒介性応答ならびにＩｇＥ媒介性過敏症に関連する疾患または病状の徴候および症状の軽減に有効であることを示す。あるいは、Ｈａｎｓｅｎ，Ｇ．ら，Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０３：１７５−１８３，１９９９に記載の全身プレチスモグラフにおかれた覚醒マウスにおけるメタコリン誘導性気道閉塞の測定によって気道応答を評価する。類似の方法を使用して、ｓｈＲＮＡベクターまたはＲＮＡｉベクターを試験することができる。上述のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはＲＮＡｉベクターを、上記の任意の送達因子と組み合わせて投与することができる。
【０２５２】
（実施例４：ＲＮＡｉ因子の細胞取り込みを容易にする送達因子の評価）
本実施例は、種々の送達因子の、ＲＮＡｉ因子の細胞取り込みを増強する能力についての試験を記載する。
【０２５３】
（カチオン性ポリマー）  カチオン性ポリマーがＤＮＡの細胞内取り込みを促進する能力は、ＤＮＡと結合して、巨大なプラスミドＤＮＡ分子をより有効なエンドサイトーシスのためのより小さなＤＮＡ／ポリマー複合体に縮合する能力に部分的に由来すると考えられる。ｓｉＲＮＡ二重鎖は、約２１ヌクレオチド長でしかなく、おそらくさらにより縮合することはできないことが示唆される。しかし、カチオン性ポリマーが負電荷のｓｉＲＮＡと結合して負電荷の細胞表面と相互作用する能力により、ｓｉＲＮＡの細胞内取り込みを容易にすることができる。したがって、ｓｉＲＮＡトランスフェクションにおける公知のカチオン性ポリマー（イミダゾール基修飾ＰＬＬ（１７）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（２２）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（２３）、およびキトサン（２４，２５）が挙げられるが、これらに限定されない）の能力を調査する。
【０２５４】
さらに、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｌａｎｇｅｒの研究室で開発された新規のカチオン性ポリマーおよびオリゴマーを調査する。ＤＮＡトランスフェクションにおけるジアクリレート単量体およびアミン単量体由来の新規のカチオン性ポリマーおよびオリゴマーの巨大ライブラリーを合成および試験するための有効な戦略は、Ｌａｎｇｅｒおよび共同研究者によって開発された。これらのポリマーを、本明細書中で、ポリ（β−アミノエステル）（ＰＡＥ）ポリマーという。その最初の「原理の証明（ｐｒｏｏｆ−ｏｆ−ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）」研究では、７個のジアクリレート単量体および２０個のアミン単量体から１４０個のポリマーのライブラリーを合成した（１９）。１４０個のメンバーのうち、７０個が十分な水溶性を示すことが見出された（２ｍｇ／ｍｌ、２５ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ＝５．０）。７０個の水溶性ポリマーのうちの５６個が、電気泳動移動度の変化によって示されるように、ＤＮＡと相互作用した。より重要には、５６個のポリマーのうちの２個がＣＯＳ−７細胞へのＤＮＡトランスフェクションを媒介した。新規のポリマーのトランスフェクション効率は、ＰＥＩより４〜８倍高く、リポフェクタミン２０００と同等かそれ以上であった。
【０２５５】
最初の研究から、より巨大な群を構築し、２，４００個のカチオン性ポリマーのライブラリーをスクリーニングし、有効なＤＮＡトランスフェクションを促進する別の約４０個のポリマーを得た（Ｄ．ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＲ．Ｌａｎｇｅｒ、私信）。構造のばらつきはＤＮＡ結合およびトランスフェクション効率に有意に影響を与え得るので（１８）、ｓｉＲＮＡの細胞内取り込みを促進する能力について多数のポリマーを試験することが好ましい。さらに、インビボ系への移行中に、特定のポリマーがインビボでの性能、吸収、分布、代謝、および排出（ＡＤＭＥ）の研究結果として排除され得る可能性がある。したがって、インビボ試験は重要である。
【０２５６】
まとめると、少なくとも約５０個のカチオンポリマーを、ｓｉＲＮＡトランスフェクション実験で試験する。上記のように、これらのほとんどはＰＡＥおよびイミダゾール基修飾ＰＬＬである。ＰＥＩ、ＰＶＰ、およびキトサンを、業者から購入する。これらのポリマーを迅速かつ効率よくスクリーニングするために、首尾よく細胞をトランスフェクトするＰＡＥポリマーのライブラリーを、９６ウェルプレート中の溶液に予め移す。この標準的な９６ウェル形式でのポリマーの保存により、滅菌Ｌａｂｃｙｔｅ  ＥＤＲ  ３８４Ｓ／９６Ｓマイクロピペッターロボットを使用して半自動化スクリーニングを容易に開発することが可能である。適切なポリマーｓｉＲＮＡ比および最も効率的な送達条件を規定するために、ポリマー量を適定する（所定量のｓｉＲＮＡを使用する）。下記のように、特定のアッセイに依存して、半自動化スクリーニングはわずかに異なる。
【０２５７】
（ｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体の特徴付け）  ｓｉＲＮＡの細胞内取り込みを容易にするための種々のカチオン性ポリマーについて、これらは、ｓｉＲＮＡと複合体を形成し得るべきである。（１９）に記載のプロトコールと類似のプロトコールに従った電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によってこの問題を試験する。簡単に述べれば、上記で考察した任意のタンパク質（ＦＣεＲＩα鎖、ＦＣεＲＩβ鎖、ｃ−Ｋｉｔ、Ｌｙｎ、Ｓｙｋ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、４−１ＢＢリガンド、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＣＤ８３、ＳＬＡＭ、共通γ鎖、およびＣＯＸ−２）をコードする転写物を標的化するｓｉＲＮＡを、マイクロピペッターロボットを使用して、９６ウェルプレート中で約５０個のポリマーの各々と１：０．１、１：０．３、１：０．９、１：２．７、１：８．１、および１：２４．３の比（ｓｉＲＮＡ／ポリマー、ｗ／ｗ）で混合する。混合物を、マルチチャネルピペッターを使用して、５００サンプルまでアッセイできる４％アガロースゲルスラブ（ｓｌａｂ）にロードする。ｓｉＲＮＡの移動パターンを、臭化エチジウム染色によって視覚化する。ポリマーの存在下でｓｉＲＮＡの移動度が減少する場合、ｓｉＲＮＡはポリマーと複合体を形成している。ｓｉＲＮＡ−ポリマー比に基づいて、中和比（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｒａｔｉｏ）を同定することが可能であり得る。種々のカチオン性ポリマーは、ＤＮＡと複合体を形成することが示されているので、それらはｓｉＲＮＡと複合体を形成することが予想される。ｓｉＲＮＡと結合しないポリマーはあまり好ましくなく、さらなる実験はｓｉＲＮＡと結合するポリマーに注目する。
【０２５８】
イミダゾール基修飾ＰＬＬ、ＰＥＩ、ＰＶＰ、キトサン、およびいくつかのＰＡＥポリマーの細胞傷害性を、細胞株中で単独またはＤＮＡとの複合体で測定した。細胞傷害性は結合した分子に依存して変化するため、ｓｉＲＮＡとの複合体形成した種々のポリマーの細胞傷害性を、種々の細胞中（例えば、上皮細胞株、肥満細胞株、Ｔ細胞株、ＤＣ細胞株）で測定する。適切な細胞株には、例えば、ＭＤＣＫ細胞が含まれる。簡単に述べれば、滅菌Ｌａｂｃｙｔｅマイクロピペッターロボットを使用して、ｓｉＲＮＡを種々の量の上記ポリマーと混合する。複合体を、９６ウェルプレート中で上皮細胞に４時間適用する。次いで、ポリマー含有培地を、通常の増殖培地と交換する。２４時間後、細胞の代謝活性を、ＭＴＴアッセイ（２６）を使用して９６ウェル形式で測定する。ｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体の細胞傷害性はＤＮＡ／ポリマー複合体の細胞傷害性と類似すると予想される。最も低い使用量で９０％またはそれ以上の細胞を死滅させるポリマーはあまり好ましくなく、さらなる調査は、最も低い使用量で９０％を超える細胞を死滅させないポリマーに注目する。
【０２５９】
培養細胞によるｓｉＲＮＡ取り込み。一旦ｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体が特徴づけられた場合、それらのｓｉＲＮＡの細胞取り込みを促進する能力を試験する。この試験は、２つの異なるアッセイ系を使用して培養細胞から開始する。蛍光強度の測定によってＧＦＰ発現が容易に定量されるため、第１のアプローチでは、ＧＦＰ発現細胞におけるＧＦＰ発現に対する本明細書中でＧＦＰ−９４９と呼ばれるＧＦＰ特異的ｓｉＲＮＡ（センス：５’−ＧＧＣＵＡＣＧＵＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＵＵ−３’（配列番号３２０）；アンチセンス：５’−ＵＧＣＧＣＵＣＣＵＧＧＡＣＧＵＡＧＣＣＵＵ−３’（配列番号３２１））の効果を測定する。簡単に述べれば、上記と同一の比率のＧＦＰ−９４９／ポリマーを、９６ウェルプレート中の細胞に適用する。種々の異なる細胞型を使用することができる。便宜上、ＭＤＣＫ細胞など十分に特徴づけられている細胞株を使用することができる。他の適切な細胞には、肥満細胞株、樹状細胞株などが挙げられる。ネガティブコントロールとして、ｓｉＲＮＡを含まないか任意の試験ｓｉＲＮＡと配列が無関係のｓｉＲＮＡを使用する。ポジティブコントロールとして、エレクトロポレーションによってＧＦＰ−９４９を細胞に導入する。３６時間後、細胞を９６ウェルプレート中で溶解し、溶解物の蛍光強度を蛍光プレートリーダーによって測定する。種々のポリマーのｓｉＲＮＡの細胞取り込みを促進する能力は、ＧＦＰ強度の全体的減少によって示される。あるいは、細胞を、９６ウェル形式でサンプルを取扱うように装備されたフローサイトメトリーを使用して、ＧＦＰ発現について分析する。種々のポリマーがｓｉＲＮＡの細胞取り込みを促進する能力を、ＧＦＰ強度が減少した細胞のパーセンテージおよびＧＦＰ強度の減少程度によって示す。これらのアッセイ由来の結果により、最も効率的なトランスフェクションに最適なｓｉＲＮＡ：ポリマー比が明らかになる。
【０２６０】
第２のアプローチでは、肥満細胞活性の阻害を直接測定する。上記のように、種々の比率でのｓｉＲＮＡ／ポリマー（例えば、ＦｃεＲＩα鎖、ＦＣεＲＩβ鎖、ｃ−Ｋｉｔ、Ｌｙｎ、Ｓｙｋなどを標的化するｓｉＲＮＡ）を、９６ウェルプレート中で肥満細胞に適用する。ポジティブコントロールとして、トランスフェクションまたはエレクトロポレーションによってｓｉＲＮＡを導入する。ネガティブコントロールとして、ＧＦＰ−９４９などの無関係のｓｉＲＮＡを使用するか、ｓｉＲＮＡを使用しない。
【０２６１】
ｓｉＲＮＡ／ポリマーで処置した肥満細胞培養物において、処置していないものよりメディエーター放出が実質的に低い場合、このポリマーがｓｉＲＮＡトランスフェクションを促進すると結論づける。トランスフェクションまたはエレクトロポレーションによってｓｉＲＮＡが導入された培養物中のメディエーター放出の比較により、ｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ／ポリマー組成物の相対トランスフェクション効率を評価する。
【０２６２】
最初の２つのスクリーニングからの最も有効なカチオン性ポリマーを、ｓｉＲＮＡおよびポリマーの両方の滴定によって９６ウェルプレートにおけるウイルス感染アッセイにおいて検証する。得られた結果に基づいて、最も有効なｓｉＲＮＡ：ポリマー比での多数の最も有効なポリマーの能力を、２４ウェルプレートおよび６ウェルプレートにてＭＤＣＫ細胞および／または肥満細胞でさらに分析する。多数の最も有効なポリマーを、実施例５に記載のマウスでのさらなる研究のために選択する。
【０２６３】
（他の送達因子）培養細胞へのｓｉＲＮＡの細胞内取り込みの有効な促進のための別のカチオン性ポリマーとして、アルギニンリッチペプチドを、ｓｉＲＮＡトランスフェクション実験で調査する。ＡＲＰが負電荷のリン脂質との相互作用によって原形質膜を直接透過すると考えられるのに対して（３３）、ほとんどの現在使用されているカチオン性ポリマーはエンドサイトーシスによるＤＮＡの細胞取り込みを促進すると考えられるため、ＡＲＰのｓｉＲＮＡ細胞内取り込みの促進効率を調査する。カチオン性ポリマーと同様に、ＡＲＰおよびポリアルギニン（ＰＬＡ）も正に荷電し、ｓｉＲＮＡに結合することができる可能性が高く、ＡＲＰまたはＰＬＡへのｓｉＲＮＡの共有結合はおそらく必要ないことが示唆される。したがって、ＡＲＰまたはＰＬＡを、他のカチオン性ポリマーと同様に処理する。Ｔａｔおよび異なる長さのＰＬＡ（Ｓｉｇｍａから入手される）由来のＡＲＰがｓｉＲＮＡの細胞取り込みを促進する能力を、上記のように決定する。
【０２６４】
（実施例５：マウスにおけるｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ／キャリア組成物の試験）
同定されたポリマーがマウスの気道中の細胞によるｓｉＲＮＡ取り込みを促進する能力を、米国特許出願番号１０／６７４，１５９号に記載のように評価し、マウスにおけるアレルギーおよび喘息の徴候および症状の防止および処置における、ｓｉＲＮＡ／キャリア組成物（ｓｉＲＮＡ／ポリマー組成物、ｓｉＲＮＡ／カチオン性ポリマー組成物、ｓｉＲＮＡ／アルギニンリッチペプチド組成物など）の有効性を、実施例３に記載のように試験する。マウスにおけるこのような徴候および／または症状のｓｉＲＮＡ阻害の証明により、例えば、ｓｉＲＮＡの鼻腔内投与または肺投与によってアレルギー性鼻炎および／または喘息を予防または処置するためのヒトにおける潜在的用途に関する証拠が得られる。類似の方法を使用して、ｓｈＲＮＡまたはＲＮＡｉベクターを試験することができる。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはＲＮＡｉベクターを、上記の任意の送達因子と組み合わせて投与することができる。
【０２６５】
（実施例６：ＤＮＡベクターから転写された本発明のｓｈＲＮＡの効果）
有効なｓｉＲＮＡ療法は、インビボで適切な細胞に十分な量のｓｉＲＮＡを送達する能力に依存する。上記アプローチの代わりとして、ｓｉＲＮＡ前駆体を転写して有効なｓｉＲＮＡにプロセシングするＤＮＡベクターを使用することができる。
【０２６６】
本発明者らは、以前に、ＤＮＡベクターから転写されたＲＮＡｉ因子が同一細胞に導入された合成ｓｉＲＮＡと同程度にＣＤ８α発現を阻害することができることを示した。詳細には、本発明者らは、マウスＣＤ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株においてＣＤ８−６１と呼ばれるＣＤ８α遺伝子を標的化するように設計された５つのｓｉＲＮＡのうちの１つがＣＤ８を阻害するが、ＣＤ４発現を阻害しないことを見出した（１２）。ＣＤ８−６１  ｓｉＲＮＡの種々のヘアピン誘導体の試験により、本発明者らは、ＣＤ８−６１ＦがＣＤ８−６１と類似の阻害活性を有することを見出した（４４）。ＣＤ８−６１ＦをｐＳＬＯＯＰ  ＩＩＩ（Ｈ１  ＲＮＡプロモーターによって転写が駆動されるＤＮＡベクター）に構築し、プラスミドｐＳＬＯＯＰ  ＩＩＩ−ＣＤ８−６１Ｆを得た。Ｈ１  ＲＮＡプロモーターは小型であり（４５）、ポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ）によって転写される。Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターを使用した、なぜならこれは、通常小さなＲＮＡを転写し、以前にｓｉＲＮＡ型サイレンシングを行うために使用されていたからである（４６）。ＤＮＡベクターを試験するために、本発明者らは、ＣＤ８α発現ベクターでトランスフェクトされているＨｅＬａ細胞を使用した。ｐＳＬＯＯＰ  ＩＩＩ−ＣＤ８−６１ＦプラスミドのＣＤ８α発現ＨｅＬａ細胞への一過性トランスフェクションにより、合成ＣＤ８−６１  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞と同程度までＣＤ８α発現を減少させた。対照的に、プロモーターのない（ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｌｅｓｓ）ベクターのトランスフェクションでは、ＣＤ８α発現は有意に減少されなかった。これらの結果は、ＤＮＡベクターからＲＮＡヘアピンを転写し、ＲＮＡサイレンシングのためのｓｉＲＮＡへとプロセシングすることができることを示す。類似のアプローチを使用して、本明細書中に記載の転写物（例えば、ＦＣεＲＩα鎖、ＦＣεＲＩβ鎖、ｃ−Ｋｉｔ、Ｌｙｎ、Ｓｙｋ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、４−１ＢＢリガンド、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＣＤ８３、ＳＬＡＭ、共通γ鎖、およびＣＯＸ−２をコードする転写物）に特異的なｓｉＲＮＡ前駆体を発現するＤＮＡベクターを設計することができる。
【０２６７】
（培養細胞および動物モデルにおけるＤＮＡベクターから転写したｓｈＲＮＡから生成されたｓｉＲＮＡの研究）  ＤＮＡベクターからｓｉＲＮＡ前駆体を発現するために、ｓｉＲＮＡ二重鎖へとプロセシングすることができるｓｉＲＮＡのヘアピン誘導体（標的転写物に特異的）を同定する。例えば、図７Ａは、ＨＦｃεＲα−３３８およびＧＦＰ−９４９  ｓｉＲＮＡならびにそのヘアピン誘導体／前駆体の模式図を示す。類似のヘアピン誘導体／前駆体を、本明細書中に記載の任意の本発明のｓｉＲＮＡのために構築することができる。（ｓｈＲＮＡの設計が対応するｓｉＲＮＡ（すなわち、同一または実質的に同一の二重鎖部分を有するｓｉＲＮＡ）の設計に基づき得る（すなわち、由来し得る）ため、ｓｈＲＮＡを対応するｓｉＲＮＡの「誘導体」ということができることに留意のこと。しかし、細胞内で、ｓｈＲＮＡは対応するｓｉＲＮＡの「前駆体」として機能する（すなわち、ヘアピンがプロセシングされて対応するｓｉＲＮＡが生成する）。したがって、当業者に明らかなように、この用語を、文脈に依存して交換可能または代替的に使用することができる）。図７Ｂは、２つの異なる順序でのＨＦｃεＲα−３３８およびＧＦＰ−９４９Ｈのヘアピンタンデムアレイを示す。類似のヘアピンタンデムアレイを、本明細書中に記載の任意の本発明のｓｉＲＮＡのために構築することができる（すなわち、任意の２つの本発明のｓｉＲＮＡを１つのヘアピンタンデムアレイに組み込むことができる）。
【０２６８】
図７Ｃは、ｐＳＬＯＯＰ  ＩＩＩ発現ベクターを示す。ｓｉＲＮＡのヘアピン誘導体／前駆体を、ｐＳＬＯＯＰ  ＩＩＩに、ベクターのみで（上）、タンデムアレイ中に（中央）、または独立プロモーターおよび終結配列と同時に（下）クローン化する。さらに、２つまたはそれ以上のｓｉＲＮＡ前駆体を転写することができるベクターを産生する。米国特許出願番号１０／６７４，１５９号における記載と同一の一般的アプローチを使用する（ｓｉＲＮＡヘアピン誘導体を、インフルエンザウイルス産生を阻害する能力について試験するのではなく、ｓｉＲＮＡヘアピン誘導体を、マウスまたは他の動物モデルにおいて肥満細胞応答（例えば、メディエーター放出）、Ｔ細胞応答、ＩｇＥ産生、および／またはＩｇＥ媒介性過敏症の徴候および症状を阻害する能力について試験するということを除く）。
【０２６９】
（等価物）
当業者は、慣習的実験のみを使用して、本明細書中に記載の本発明の特定の実施形態の多数の等価物を認識するか、または確認することができる。本発明の範囲は、上記説明に制限されることを意図しない、むしろ本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載事項に示される。
【０２７０】
【化１】
2007527240.tif 000031
【０２７１】
【化２】
2007527240.tif 000032
【０２７２】
【化３】
2007527240.tif 000033
【０２７３】
【化４】
2007527240.tif 000034
【０２７４】
【化５】
2007527240.tif 000035
【図面の簡単な説明】
【０２７５】
【図１】図１は、ショウジョウバエ系で認められるｓｉＲＮＡの構造を示す。
【図２】図２は、ショウジョウバエにおけるＲＮＡ干渉に関与する工程の略図を示す。
【図３】図３は、本発明で有用な種々の例示的ＲＮＡｉ因子の構造を示す。
【図４】図４は、ＤＩＣＥＲ酵素がステム中に塩基ミスマッチを有する基質を切断して標的転写物の３’ＵＴＲに結合して翻訳を阻害する阻害産物を生成する別の阻害経路（マイクロＲＮＡ翻訳抑制経路）の図である。
【図５】図５は、本発明のｓｉＲＮＡの両鎖を転写するために使用され得る構築物の一例を示す。
【図６】図６は、ハイブリダイズして本発明のｓｈＲＮＡを形成する１つのＲＮＡ分子を転写するために使用され得る構築物の一例を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、ＨＦｃεＲα−３３８およびＧＦＰ−９４９  ｓｉＲＮＡならびにそのヘアピン誘導体／前駆体の略図を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、２つの異なる順序でのＨＦｃεＲα−３３８ＨおよびＧＦＰ−９４９Ｈのタンデムアレイを示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ｐＳＬＯＯＰ  ＩＩＩ発現ベクターを示す。ｓｉＲＮＡのヘアピン前駆体（すなわち、ｓｈＲＮＡ配列）を、ｐＳＬＯＯＰ  ＩＩＩベクターのみ（上）、タンデムアレイ（中央）、または独立プロモーターおよび終結配列と同時に（下）クローニングする。
【図１】
2007527240.tif 000036
【図２】
2007527240.tif 000037
【図３】
2007527240.tif 000038
【図４】
2007527240.tif 000039
【図５】
2007527240.tif 000040
【図６】
2007527240.tif 000041
【図７Ａ】
2007527240.tif 000042
【図７Ｂ】
2007527240.tif 000043
【図７Ｃ】
2007527240.tif 000044
【国際調査報告】
2007527240.tif 000045
2007527240.tif 000046
2007527240.tif 000047
2007527240.tif 000048
2007527240.tif 000049
2007527240.tif 000050