(57)【要約】  本発明は、式（Ｉ）による化合物に関するものであり、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立してアルキルを含む群より選択され、ｎは、１から４の間の任意の整数であり、Ｒ３は、リシル、オルニチル、２，４−ジアミノブチリル、ヒスチジル、および式（ＩＩ）によるアシル部分を含む群より選択されるアシルであり、ここで、ｍは、１から３の任意の整数であり、ＹＥは薬学的に許容されうる陰イオンである。
2007536324.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2007536324.tif 000018
［式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立してアルキルを含む群より選択され、
ｎは、１から４の間の任意の整数であり、
Ｒ３は、リシル、オルニチル、２，４−ジアミノブチリル、ヒスチジル、および式（ＩＩ）：
【化２】
2007536324.tif 000019
（式中、ｍは、１から３の任意の整数であり、
Ｙ−は薬学的に許容されうる陰イオンである）
のアシル部分を含む群より選択されるアシルである］
の化合物。
【請求項２】
Ｒ１およびＲ２が、それぞれ独立してラウリル、ミリスチル、パルミチルおよびオレイルを含む群より選択される、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１がラウリルであり、Ｒ２がミリスチルであるか、またはＲ１がパルミチルであり、Ｒ２がオレイルである、請求項１および２のいずれか記載の化合物。
【請求項４】
ｍが１または２である、請求項１から３のいずれか記載の化合物。
【請求項５】
化合物が陽イオン性脂質であり、好ましくは陰イオンＹ−と会合している、請求項１から４のいずれか記載の化合物。
【請求項６】
Ｙ−が、ハロゲン化物イオン、酢酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンを含む群より選択される、請求項１から５のいずれか記載の化合物。
【請求項７】
化合物が、
−  β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリド
【化３】
2007536324.tif 000020
と、
−  β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドトリヒドロクロリド
【化４】
2007536324.tif 000021
と、
−  ε−アルギニル−リシン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドトリヒドロクロリド
【化５】
2007536324.tif 000022
とを含む群より選択される、請求項１から６のいずれか記載の化合物。
【請求項８】
脂質構成要素として請求項１から７のいずれか記載の化合物と、担体とを含む組成物。
【請求項９】
組成物がさらなる構成成分を含む、請求項７記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１から７のいずれか記載の化合物と、薬学的活性化合物と、好ましくは薬学的に許容されうる担体とを含む薬学的組成物。
【請求項１１】
薬学的活性化合物および／またはさらなる構成成分が、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよび核酸を含む群より選択される、請求項８から１０のいずれか記載の組成物。
【請求項１２】
タンパク質が抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
核酸がＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡおよびＬＮＡを含む群より選択される、請求項１１記載の組成物。
【請求項１４】
核酸が機能的核酸であり、好ましくは該機能的核酸が、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマーおよびシュピーゲルマーを含む群より選択される、請求項１１または１３のいずれか記載の組成物。
【請求項１５】
さらに少なくとも一つのヘルパー脂質構成要素を含み、好ましくは該ヘルパー脂質構成要素が、リン脂質およびステロイドを含む群より選択される、請求項８から１４のいずれか記載の組成物。
【請求項１６】
ヘルパー脂質構成要素が、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンおよび１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含む群より選択される、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
ヘルパー脂質構成要素の含有量が組成物の全脂質含有量の約２０mol%から約８０mol%である、請求項１５から１６のいずれか記載の組成物。
【請求項１８】
ヘルパー脂質構成要素の含有量が約３５mol%から約６５mol%である、請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
脂質がβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリドであり、ヘルパー脂質が１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンである、請求項１６から１８のいずれか記載の組成物。
【請求項２０】
脂質が組成物の全脂質含有量の５０mol%であり、ヘルパー脂質が５０mol%である、請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】
組成物が少なくとも二つのヘルパー脂質を含有する、請求項８から２０のいずれか記載の組成物。
【請求項２２】
少なくとも一つのヘルパー脂質が、ＰＥＧ部分、ＨＥＧ部分、ポリヒドロキシエチルデンプン（ｐｏｌｙＨＥＳ）部分、およびポリプロピレン部分を含む群より選択される部分を含み、該部分が、好ましくは約５００から１００００Da、さらに好ましくは約２０００から５０００Daの分子量を提供する、請求項２１記載の組成物。
【請求項２３】
ＰＥＧ部分を含むヘルパー脂質が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、およびセラミド−ＰＥＧを含む群より選択される、請求項２１または２２記載の組成物。
【請求項２４】
ＰＥＧ部分が、約５００Daから１００００Daの分子量、好ましくは約２０００から５０００Da、さらに好ましくは２０００Daの分子量を有する、請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
組成物が、脂質構成要素としてβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリドを、第１ヘルパー脂質としてｌ，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを、第２ヘルパー脂質として１，２−ジステロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ＰＥＧ２０００を含む、請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
第２ヘルパー脂質の含有量が約０．０５mol%から４．９mol%、好ましくは約１から３mol%である、請求項２５記載の組成物。
【請求項２７】
脂質の含有量が４５mol%から５０mol%であり、第１ヘルパー脂質の含有量が４５から５０mol%であり、ただし、ＰＥＧ化第２ヘルパー脂質が存在する場合には、該第２ヘルパー脂質の含有量が約０．１mol%から約５mol%、好ましくは約１から４mol%、さらに好ましくは約２%であり、ここで、該脂質、該第１ヘルパー脂質、および該第２ヘルパー脂質の脂質含有量の合計が１００mol%であり、該第１ヘルパー脂質および該第２ヘルパー脂質の合計が５０mol%である、請求項２６記載の組成物。
【請求項２８】
ａ）５０mol%のβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリドと、
４８mol%の１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンと、
２mol%の１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ＰＥＧ２０００と、または
ｂ）５０mol%のβ−Ｌ−アルギニル−２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリドと、
４９mol%の１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンと、
１mol%のＮ（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、好ましくはそのナトリウム塩と
を含有する、請求項２１から２７のいずれか記載の組成物。
【請求項２９】
機能的核酸が二本鎖リボ核酸であり、組成物がさらに核酸、好ましくは機能的核酸を含み、該機能的核酸が、より好ましくは二本鎖リボ核酸、最も好ましくはＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸およびリボザイムを含む群より選択される核酸であり、ここで、好ましくは陽イオン性脂質に対するＲＮＡｉのモル比が約０から０．０７５、好ましくは約０．０２から０．０５、なおさらに好ましくは０．０３７である、請求項８から２８のいずれか記載の組成物。
【請求項３０】
化合物および／またはヘルパー脂質構成要素が水性媒質中に分散体として存在する、請求項８から２９のいずれか記載の組成物。
【請求項３１】
化合物および／またはヘルパー脂質構成要素が水混和性溶媒中に溶液として存在し、ここで、好ましくは該溶媒が、エタノールおよびｔｅｒｔ−ブタノールを含む群より選択される、請求項８から２９のいずれか記載の組成物。
【請求項３２】
機能的核酸が二本鎖リボ核酸、好ましくはＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸およびリボザイムを含む群より選択される核酸であり、ここで、好ましくは陽イオン性脂質に対するＲＮＡｉのモル比が約０から０．０７５、好ましくは約０．０２から０．０５、なおさらに好ましくは０．０３７である、請求項８から３１のいずれか記載の組成物。
【請求項３３】
組成物が核酸を含有し、核酸主鎖ホスフェート対陽イオン性脂質窒素原子の電荷比が約１：１．５〜７、好ましくは１：４である、請求項８から３２、好ましくは２９から３２のいずれか記載の組成物。
【請求項３４】
分散体の粒径が約１２０nmである、請求項８から３３、好ましくは２９から３３のいずれか記載の組成物。
【請求項３５】
分散体が約１から１００μM  ｓｉＲＮＡを含有するストック分散体であり、好ましくは該ストック分散体がインビボまたはインビトロで１：１００から１：１００００、さらに好ましくは１：１０００に希釈される、請求項８から３４、好ましくは２９から３４のいずれか記載の組成物。
【請求項３６】
薬剤の製造のための、好ましくは癌および／または心血管関連疾患の処置のための、請求項１から７のいずれか記載の化合物または請求項８から３５のいずれか記載の組成物の使用。
【請求項３７】
薬剤が癌の処置のためのものであり、ここで、好ましくは該癌が、固形および非固形腫瘍を含む群より選択され、さらに好ましくは該固形腫瘍が、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌、および肝細胞癌を含む群より選択される、請求項３６記載の使用。
【請求項３８】
癌が血管形成および血管新生を含む群より選択される過程を伴う、請求項３５または３６記載の使用。
【請求項３９】
薬剤が、内皮細胞、上皮細胞、および腫瘍細胞を含む群より選択される細胞に核酸を投与するためのものであり、好ましくは該細胞が内皮細胞である、請求項３６記載の使用。
【請求項４０】
内皮細胞が脈管構造の内皮細胞である、請求項３９記載の使用。
【請求項４１】
脈管構造が、血管新生、好ましくは腫瘍関連血管新生から発生する脈管構造である、請求項４０記載の使用。
【請求項４２】
脈管構造が、肝臓脈管構造、心臓脈管構造、腎臓脈管構造、膵臓脈管構造、および肺脈管構造を含む群より選択される、請求項４０記載の使用。
【請求項４３】
薬剤が全身投与のためのものである、請求項３６から４２のいずれか記載の使用。
【請求項４４】
薬剤が局所投与のためのものである、請求項３６から４２のいずれか記載の使用。
【請求項４５】
薬剤が診断薬である、請求項３６から４４のいずれか記載の使用。
【請求項４６】
移動剤としての請求項１から７のいずれか記載の化合物または請求項８から３５のいずれか記載の組成物の使用。
【請求項４７】
移動剤が、薬学的活性構成要素および／またはさらなる構成成分を細胞、好ましくは哺乳動物細胞、さらに好ましくはヒト細胞内に移動させる、請求項４６記載の使用。
【請求項４８】
細胞が、内皮細胞、好ましくは血管関連内皮細胞である、請求項４７記載の使用。
【請求項４９】
薬学的活性化合物および／またはさらなる構成成分を細胞内に、または膜、好ましくは細胞膜を通過して移動させるための方法であって、以下の工程：
−  該細胞または該膜を提供する工程；
−  請求項１から７のいずれか記載の化合物を提供する工程；
−  該薬学的活性化合物および／または該さらなる構成成分を提供する工程；
−  該細胞または該膜を、該薬学的活性化合物および／または該さらなる構成成分ならびに請求項１から７のいずれか記載の化合物と接触させる工程
を含む方法。
【請求項５０】
薬学的活性化合物および／またはさらなる構成成分を細胞に、または膜、好ましくは細胞膜を通過して移動させるための方法であって、以下の工程：
−  該細胞または該膜を提供する工程；
−  請求項８から３５のいずれか記載の組成物を提供する工程；
−  該細胞または該膜を請求項８から３５のいずれか記載の組成物と接触させる工程
を提供する方法。
【請求項５１】
薬学的活性化合物が、さらなる工程として
−  細胞中の、および／または膜の向こうの、該薬学的活性化合物および／またはさらなる構成成分を検出する工程
を含む、請求項４９または５０記載の方法。
【請求項５２】
下記工程：
−  オレイン酸を提供する工程；
−  パルミチルアミンを提供する工程；
−  該オレイン酸および該パルミチルアミンを反応させてＮ−パルミチル−オレオイルアミドを形成させる工程；ならびに
−  該Ｎ−パルミチル−オレオイルアミドをＮ−パルミチル−オレイルアミンに還元する工程
を含む、Ｎ−パルミチル−オレイルアミンの合成のための方法であって、ここで、該オレイン酸が少なくとも９０%、さらに好ましくは９５%、最も好ましくは９９%の純度であり、該百分率がオレイン酸およびオレイン酸と異なる任意の脂肪酸のモル比である方法。
【請求項５３】
オレイン酸およびパルミチルアミンが室温で反応される、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
オレイン酸がパルミチルアミンと反応される前に、該オレイン酸が前処理に供される方法であって、該前処理が、該オレイン酸をクロロギ酸エチルと、好ましくは無水ジクロロメタンまたは無水テトラヒドロフラン中で反応させる工程を含む、請求項５２または５３記載の方法。
【請求項５５】
反応が０℃で好ましくは不活性ガス下で行われる、請求項５２から５４のいずれか記載の方法。
【請求項５６】
反応物がさらに酸捕捉剤と反応され、該酸捕捉剤が好ましくはトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンおよびピリジンを含む群より選択される、請求項５４または５５記載の方法。
【請求項５７】
クロロギ酸エチルエステル、オレイン酸、トリエチルアミンおよびパルミチルアミンのモル比が約１〜１．０５：１：１：１〜３：１〜１．１０である、請求項５２から５６のいずれか記載の方法。
【請求項５８】
Ｎ−パルミチル−オレオイルアミドからＮ−パルミチル−オレイルアミンへの還元がＬｉＡｌＨ４を用いて行われる、請求項５２から５７のいずれか記載の方法。
【請求項５９】
オレイン酸がパルミチルアミンと反応された直後に、反応物が洗浄され、沈殿され、そのように得られた沈殿が場合により再結晶化される、請求項５２から５７のいずれか記載の方法。
【請求項６０】
全身投与、好ましくは脊椎動物への全身投与のための、請求項１から７のいずれか記載の化合物または請求項８から３５のいずれか記載の組成物の使用。
【請求項６１】
脊椎動物が哺乳動物であり、さらに好ましくはマウス、ラット、モルモット、ネコ、イヌ、サルおよびヒトを含む群より選択される哺乳動物である、請求項６０記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、陽イオン性脂質、それを有する組成物、およびその使用、ならびに細胞に化学化合物を移動させるための方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学および分子医学の両方が、細胞への生物学的活性化合物の導入に大きく依存している。当該生物学的活性化合物は、何よりもＤＮＡ、ＲＮＡ、ならびにペプチドおよびタンパク質をそれぞれ典型的には含む。乗り越えなければならない障壁は、典型的には負に荷電した外表面を有する脂質二重層である。当技術分野において、細胞膜を通過して、したがって生物学的活性化合物を導入するために、多数の技法が開発された。しかし、実験室での使用を考えている一部の方法は医学分野に使用することができず、さらに特定すれば薬物送達に適切ではない。例えば、当技術分野で公知のエレクトロポレーション法およびバリスティック法は、たとえあったとしても生物学的活性化合物の局所送達を可能にするだけであろう。前記脂質二重層は別として、細胞膜も輸送系を備える。したがって、細胞膜を通過して生物学的活性化合物を移動させるためにこの種の輸送系を使用する努力がなされた。しかし、当該輸送系の特異性または交差反応性が原因で、これらの使用は一般的に適用できる方法ではない。
【０００３】
細胞に生物学的活性化合物を移動させるために当技術分野において記載されたより一般に適用できる方法は、ウイルスベクターの使用である。しかし、ウイルスベクターは、ある種の細胞に効率的に遺伝子を移動させるためにのみ使用することができるが、細胞に化学合成された分子を導入するためには使用できない。
【０００４】
代替的な方法は、いわゆるリポソームの使用であった（Bangham, J. Mol. Biol. 13, 238-252）。リポソームは、水中で両親媒性脂質が会合した際に発生する小胞である。リポソームは、典型的にはリン脂質が同心状に配列した二重層を含む。層の数に応じて、リポソームを小さな単膜小胞、多重膜小胞および大きな多重膜小胞に分類することができる。リポソームは水性中間層に親水性化合物を取込むことを可能にするが、疎水性化合物は脂質層に取込まれることから、有効な送達剤であることが証明された。脂質製剤の組成およびその調製方法の両方が、結果として生じる脂質凝集物の構造および大きさに、したがってリポソームに作用を及ぼすことは、当技術分野において周知である。リポソームは、陽イオン性脂質を取込むことも公知である。
【０００５】
リポソームの構成要素であることに加えて、陽イオン性脂質は、生体高分子の細胞送達にそれとして使用できることから、かなりの注目も集めた。陽イオン性脂質を使用して、静電相互作用により本質的に定量的に任意の陰イオン化合物を封入できる。さらに、陽イオン性脂質は陰性荷電した細胞膜と相互作用して、細胞膜輸送を開始すると考えられている。陽イオン性脂質を含有するリポソーム製剤を使用すること、または当該陽イオン性脂質を生物学的活性化合物と共に使用することは、発見的解釈方法を必要とすることが見出された。それは、普通は血清の不在下で全てではなく一部の種類の細胞にしか各製剤がプラスミドを典型的には送達できないことが原因で、その使用が限定されているからである。
【０００６】
脂質およびそれらの脂質によって輸送される生物学的活性化合物の電荷および／または質量比は、様々な種類の前記生物学的活性化合物の送達に決定的な因子であることが判明した。例えば、大きさが５０００から１００００塩基を含むプラスミドの送達に適した脂質製剤は、典型的には約１０から約５０塩基を含む合成リボザイムまたはアンチセンス分子のようなオリゴヌクレオチドの送達に一般に有効ではない。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムに最適な送達条件は、同じ種類の細胞であっても異なることが最近示された。
【０００７】
米国特許第６，３９５，７１３号は、親油性基、リンカーおよび頭基から典型的にはなる陽イオン性脂質系組成物、ならびに細胞に生物学的活性化合物を移動させるための当該組成物の使用を開示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の根底にある問題は、細胞、好ましくは動物細胞に生物学的活性化合物を導入する手段を提供することであった。本発明の根底にあるさらなる問題は、核酸、特にｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡおよびＲＮＡｉ、またはアプタマーおよびシュピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）のような低分子核酸のための送達剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
これらの問題は、添付の独立クレームの主題によって解決される。好ましい態様は、それに関する添付の従属クレームから解釈することができる。
【００１０】
第一の局面では、本発明の根底にある問題は、式（Ｉ）：
【００１１】
【化６】
2007536324.tif 000003
【００１２】
［式中、Ｒ１およびＲ２は、アルキルを含む群よりそれぞれ独立して選択され、
ｎは１から４の間の任意の整数であり、
Ｒ３はリシル、オルニチル、２，４−ジアミノブチリル、ヒスチジル、および式（ＩＩ）：
【００１３】
【化７】
2007536324.tif 000004
【００１４】
（式中、ｍは１から３の任意の整数であり、
Ｙ−は薬学的に許容されうる陰イオンである）
のアシル部分を含む群より選択されるアシルである］
による化合物によって解決される。
【００１５】
一態様では、Ｒ１およびＲ２は、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、およびオレイルを含む群よりそれぞれ独立して選択される。
【００１６】
一態様では、Ｒ１はラウリルであり、Ｒ２はミリスチルであるか、または
Ｒ１はパルミチルであり、Ｒ２はオレイルである。
【００１７】
一態様では、ｍは１または２である。
【００１８】
一態様では、その化合物は陽イオン性脂質であり、好ましくは陰イオンＹ−と会合している。
【００１９】
一態様では、Ｙ−は、ハロゲン化物イオン、酢酸イオンおよびおよびトリフルオロ酢酸イオンを含む群より選択される。
【００２０】
一態様では、その化合物は、以下を含む群より選択される：
−  β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリド
【００２１】
【化８】
2007536324.tif 000005
【００２２】
−  β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドトリヒドロクロリド
【００２３】
【化９】
2007536324.tif 000006
【００２４】
および
−  ε−アルギニル−リシン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドトリヒドロクロリド。
【００２５】
【化１０】
2007536324.tif 000007
【００２６】
第２の局面では、本発明の根底にある問題は、脂質構成要素として第１の局面による化合物と、担体とを含む組成物によって解決される。
【００２７】
一態様では、その組成物はさらなる構成成分を含む。
【００２８】
第３の局面では、本発明の根底にある問題は、第１の局面による化合物と、薬学的活性化合物と、好ましくは薬学的に許容されうる担体とを含む薬学的組成物によって解決される。
【００２９】
第２および第３の局面の一態様では、薬学的活性化合物および／またはさらなる構成成分は、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよび核酸を含む群より選択される。
【００３０】
第２および第３の局面の一態様では、そのタンパク質は抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００３１】
第２および第３の局面の一態様では、その核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡおよびＬＮＡを含む群より選択される。
【００３２】
第２および第３の局面の一態様では、その核酸は機能的核酸であり、ここで、その機能的核酸は、好ましくはＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、およびｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒを含む群より選択される。
【００３３】
第２および第３の局面の一態様では、その組成物は、少なくとも一つのヘルパー脂質構成要素をさらに含み、ここで、そのヘルパー脂質構成要素は、好ましくはリン脂質およびステロイドを含む群より選択される。
【００３４】
第２および第３の局面の好ましい態様では、そのヘルパー脂質構成要素は、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、および１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含む群より選択される。
【００３５】
第２および第３の局面の一態様では、ヘルパー脂質構成要素の含有量は、その組成物の全脂質含有量の約２０mol%から約８０mol%である。
【００３６】
第２および第３の局面の好ましい態様では、ヘルパー脂質構成要素の含有量は、約３５mol%から約６５mol%である。
【００３７】
第２および第３の局面の一態様では、その脂質は、β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリドであり、そのヘルパー脂質は、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンである。
【００３８】
第２および第３の局面の好ましい態様では、その脂質は、その組成物の全脂質含有量の５０mol%であり、そのヘルパー脂質は５０mol%である。
【００３９】
第２および第３の局面の一態様では、その組成物は、少なくとも二つのヘルパー脂質を含有する。
【００４０】
第２および第３の局面の好ましい態様では、少なくとも一つのヘルパー脂質は、ＰＥＧ部分、ＨＥＧ部分、ポリヒドロキシエチルデンプン（ポリＨＥＳ）部分、およびポリプロピレン部分を含む群より選択される部分を含み、ここで、当該部分は、好ましくは約５００から１００００Da、さらに好ましくは約２０００から５０００Daの分子量を提供する。
【００４１】
第２および第３の局面の好ましい態様では、ＰＥＧ部分を含むヘルパー脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、およびセラミド−ＰＥＧを含む群より選択される。
【００４２】
第２および第３の局面のさらに好ましい態様では、ＰＥＧ部分は約５００Daから１００００Da、好ましくは約２０００から５０００Daの分子量、さらに好ましくは２０００Daの分子量を有する。
【００４３】
第２および第３の局面のなおさらに好ましい態様では、その組成物は、脂質構成要素としてβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリド、第１ヘルパー脂質として１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、および第２ヘルパー脂質として１，２−ジステロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ＰＥＧ２０００を含む。
【００４４】
第２および第３の局面のよりさらに好ましい態様では、第２ヘルパー脂質の含有量は、約０．０５mol%から４．９mol%、好ましくは約１から３mol%である。
【００４５】
第２および第３の局面のよりなおさらに好ましい態様では、脂質の含有量は４５mol%から５０mol%であり、第１ヘルパー脂質の含有量は４５から５０mol%であり、ＰＥＧ化第２ヘルパー脂質が存在するという条件ならば、第２ヘルパー脂質の含有量は約０．１mol%から約５mol%、好ましくは約１から４mol%、さらに好ましくは約２%であり、ここで、第１ヘルパー脂質と第２ヘルパー脂質との脂質の脂質含有量の合計は、１００mol%であり、ここで、第１ヘルパー脂質と第２ヘルパー脂質との合計は５０mol%である。
【００４６】
第２および第３の局面の好ましい態様では、その組成物は、
ａ）５０mol%のβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリドと、
４８mol%の１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンと、
２mol%の１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ＰＥＧ２０００と、または、
ｂ）５０mol%のβ−Ｌ−アルギニル−２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリドと、
４９mol%の１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンと、
１mol%のＮ（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、好ましくはそのナトリウム塩と
のいずれかを含有する。
【００４７】
第２および第３の局面の好ましい態様では、機能的核酸は二本鎖リボ核酸であり、ここで、その組成物はさらに核酸、好ましくは機能的核酸を含み、その機能的核酸はさらに好ましくは二本鎖リボ核酸、最も好ましくは、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸およびリボザイムを含む群より選択される核酸であり、ここで、好ましくは陽イオン性脂質に対するＲＮＡｉのモル比は、約０から０．０７５、好ましくは約０．０２から０．０５、なおさらに好ましくは０．０３７である。
【００４８】
第２および第３の局面の好ましい態様では、その組成物および／またはヘルパー脂質構成要素は、水性媒質中に分散体として存在する。
【００４９】
第２および第３の局面の好ましい態様では、その組成物および／またはヘルパー脂質構成要素は、水混和性溶媒に溶かした溶液として存在し、ここで、その溶媒は、好ましくはエタノールおよびｔｅｒｔ−ブタノールを含む群より選択される。
【００５０】
第２および第３の局面の好ましい態様では、機能的核酸は二本鎖リボ核酸、好ましくはＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸、およびリボザイムを含む群より選択される核酸であり、ここで、好ましくは陽イオン性脂質に対するＲＮＡｉのモル比は、約０から０．０７５、好ましくは約０．０２から０．０５、なおさらに好ましくは０．０３７である。
【００５１】
第２および第３の局面の好ましい態様では、その組成物は核酸を含有し、ここで、核酸主鎖ホスフェート対陽イオン性脂質窒素原子の電荷比は約１：１．５〜７、好ましくは１：４である。
【００５２】
第２および第３の局面の好ましい態様では、分散体中の粒子径は約１２０nmである。
【００５３】
第２および第３の局面の好ましい態様では、その分散体は約１から１００μM  ｓｉＲＮＡを含有するストック分散体であり、ここで、好ましくはそのストック分散体はインビボまたはインビトロで１：１００から１：１００００、さらに好ましくは１：１０００に希釈される。
【００５４】
第４の局面では、本発明の根底にある問題は、薬剤の製造のための、好ましくは癌および／または心血管関連疾患の処置のための、第１の局面による化合物の使用または第２もしくは第３の局面による組成物の使用によって解決される。
【００５５】
第４の局面の一態様では、その薬剤は癌の処置のためのものであり、ここで、好ましくはその癌は、固形および非固形腫瘍を含む群より選択され、ここで、その固形腫瘍は、さらに好ましくは膵臓癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌および肝細胞癌を含む群より選択される。
【００５６】
第４の局面の一態様では、その癌は、血管形成および血管新生を含む群より選択される過程を伴う。
【００５７】
第４の局面の一態様では、その薬剤は、内皮細胞、上皮細胞、および腫瘍細胞を含む群より選択される細胞に核酸を投与するためのものであり、好ましくはその細胞は内皮細胞である。
【００５８】
第４の局面の一態様では、その内皮細胞は脈管構造の内皮細胞である。
【００５９】
第４の局面の一態様では、その脈管構造は、血管新生、好ましくは腫瘍関連血管新生から発生する脈管構造である。
【００６０】
第４の局面の一態様では、その脈管構造は肝臓脈管構造、心臓脈管構造、腎臓脈管構造、膵臓脈管構造および肺脈管構造を含む群より選択される。
【００６１】
第４の局面の一態様では、その薬剤は全身投与のためのものである。
【００６２】
第４の局面の一態様では、その薬剤は局所投与のためのものである。
【００６３】
第４の局面の一態様では、その薬剤は、心血管関連疾患の処置のためのものであり、ここで、その心血管疾患は、冠状動脈性心疾患、心不全、高血圧、血栓症、心筋梗塞、狭心症のような虚血性心疾患、および動脈硬化を含む群より選択される。
【００６４】
第４の局面の一態様では、その薬剤は、血管形成関連疾患の処置のためのものである。好ましくは、当該血管形成は、以下の器官と、血管形成が引き起こすと記載された疾患とに関係し、したがって、本発明による組成物の使用を考慮している（Carmeliet P., Nature Medicine 9, 653-660 (2003)）：
血管    血管奇形、ディジョージ症候群、ＨＨＴ、海綿状血管腫、アテローム性動脈硬化症、移植動脈症、高血圧症、糖尿病、再狭窄
脂肪組織    肥満
皮膚    乾癬、いぼ、アレルギー性皮膚炎、ケロイド瘢痕、化膿性肉芽腫、水疱形成疾患、エイズ患者におけるカポジ肉腫、脱毛、皮膚紫斑病、毛細血管拡張症、静脈湖形成
眼    硝子体過形成遺残症候群、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、脈絡膜血管新生
肺    原発性肺高血圧症、喘息、鼻ポリープ、新生児呼吸促迫、肺線維症、気腫
腸    炎症性腸歯周疾患、腹水、腹膜癒着
生殖器系    子宮内膜症、子宮出血、卵巣嚢胞、卵巣過剰刺激、子癇前症
骨、関節    関節炎、滑膜炎、骨髄炎、骨棘形成、骨粗しょう症、骨折治癒不良
神経系    アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病性ニューロパシー、卒中
胃腸    胃または口腔内潰瘍、クローン病
腎臓    ネフロパシー
【００６５】
第５の局面では、本発明の根底にある問題は、診断薬の製造のための、第１の局面による化合物ならびに／または第２および／もしくは第３の局面による組成物の使用によって解決される。
【００６６】
第６の局面では、本発明の根底にある問題は、移動剤としての、第１の局面による化合物または第２および／もしくは第３の局面による組成物の使用によって解決される。
【００６７】
第６の局面の一態様では、その移動剤は、細胞、好ましくは哺乳動物細胞、さらに好ましくはヒト細胞に薬学的活性構成要素および／またはさらなる構成成分を移動させる。
【００６８】
第６の局面の一態様では、その細胞は内皮細胞、好ましくは血管関連内皮細胞である。
【００６９】
第７の局面では、本発明の根底にある問題は、細胞に、または膜、好ましくは細胞膜を通過して、薬学的活性化合物および／またはさらなる構成成分を移動させるための方法によって解決され、その方法は以下の工程を含む：
−  細胞または膜を提供する工程；
−  第１の局面のいずれかによる化合物を提供する工程；
−  薬学的活性化合物および／またはさらなる構成成分を提供する工程；
−  細胞または膜を薬学的活性化合物および／またはさらなる構成成分ならびに第１の局面による化合物と接触させる工程。
【００７０】
第８の局面では、本発明の根底にある問題は、細胞に、または膜、好ましくは細胞膜を通過して、薬学的活性化合物および／またはさらなる構成成分を移動させるための方法によって解決され、その方法は以下の工程を提供する：
−  細胞または膜を提供する工程；
−  第２または第３の局面による組成物を提供する工程；
−  細胞または膜を、第２または第３の局面による組成物と接触させる工程。
【００７１】
第７または第８の局面の一態様では、その薬学的活性化合物はさらなる工程として
−  細胞中の、および／または膜の向こうの薬学的活性化合物および／またはさらなる構成成分を検出する工程
を含む。
【００７２】
第９の態様では、本発明の根底にある問題は、以下の工程を含むＮ−パルミチル−オレイルアミンの合成のための方法によって解決される：
−  オレイン酸を提供する工程；
−  パルミチルアミンを提供する工程；
−  オレイン酸およびパルミチルアミンを反応させて、Ｎ−パルミチル-オレオイルアミドを形成させる工程；
−  Ｎ−パルミチル−オレオイルアミドをＮ−パルミチル−オレイルアミンに還元する工程。
ここで、オレイン酸は少なくとも９０%、さらに好ましくは９５%、最も好ましくは９９%の純度であり、ここで、この百分率は、オレイン酸およびオレイン酸とは異なる任意の脂肪酸のモル比である。
【００７３】
第９の局面の一態様では、オレイン酸およびパルミチルアミンを室温で反応させる。
【００７４】
第９の局面の一態様では、オレイン酸をパルミチルアミンと反応させる前に前処理に供し、ここで、その前処理は、オレイン酸をクロロギ酸エチルと、好ましくは無水ジクロロメタンまたは無水テトラヒドロフラン中で反応させる工程を含む。
【００７５】
第９の局面の一態様では、その反応を０℃で、好ましくは不活性ガス下で行う。
【００７６】
第９の局面の一態様では、その反応物を酸捕捉剤とさらに反応させ、ここで、その酸捕捉剤は、好ましくはトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、およびピリジンを含む群より選択される。
【００７７】
第９の局面の一態様では、クロロギ酸エチルエステル、オレイン酸、トリエチルアミンおよびパルミチルアミンのモル比は、約１〜１．０５：１：１：１〜３：１〜１．１０である。
【００７８】
第９の局面の一態様では、Ｎ−パルミチル−オレオイルアミドからＮ−パルミチ−オレイルアミンへの還元を、ＬｉＡｌＨ４を用いて行う。
【００７９】
第９の局面の一態様では、オレイン酸をパルミチルアミンと反応させた直後に、反応物を洗浄し、沈殿させ、そのように得られた沈殿を場合により再結晶化する。
【００８０】
第１０の局面では、本発明の根底にある問題は、全身投与、好ましくは脊椎動物への全身投与のための、第１の局面による化合物または第２もしくは第３の局面による組成物の使用によって解決される。
【００８１】
第１０の局面の一態様では、その脊椎動物は哺乳動物、さらに好ましくはマウス、ラット、モルモット、ネコ、イヌ、サルおよびヒトを含む群より選択される哺乳動物である。
【００８２】
本発明による化合物を、図１に示すようにＲ１−Ｎ−Ｒ２部分により形成される親油基と、Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（ＮＨ３＋）（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ部分により形成されるリンカー基と、Ｒ３部分により形成される頭基とを含むとみなすことができる。本発明者らは、リンカー基で正の電荷を示すこの種の化合物が細胞膜を経て、好ましくは細胞内に、さらに好ましくは動物細胞内に生物学的活性化合物を移動させるのに特に適することを驚くことに見出した。本発明者らは、その生物学的活性化合物が核酸、さらに好ましくはｓｉＲＮＡおよびｓｉＮＡであるならば、本発明による化合物によって仲介される移動が特に有効であろうということも驚くことに見出した。
【００８３】
本明細書に好ましくは使用されるように、アルキルという用語は、８から２０個の炭素原子、好ましくは１２から１８個の炭素原子を含む飽和脂肪族基であるか、または少なくとも一つの二重および三重結合をそれぞれ含む８から３０個の炭素原子を含むモノもしくはポリ不飽和脂肪族炭化水素基を指す。このように、好ましい態様では、アルキルという用語はアルケニルおよびアルキニルも含む。アルキルは、分岐および非分岐の両方、すなわち非直鎖または直鎖アルキル基を指す。好ましい直鎖アルキル基は、８から３０個の炭素原子を含む。さらに好ましい直鎖アルキル基は、１２から１８個の炭素原子を含む。好ましい分岐アルキル基は、８から３０個の炭素原子を含み、ここで、８から３０個の炭素原子の数は、当該分岐アルキル基の主鎖を形成している炭素原子の数を指す。分岐アルキル基の主鎖は、主鎖からの分岐として少なくとも一つのアルキル基を含み、そのアルキル基は本明細書の通り定義され、さらに好ましくは、そのアルキル基は、短鎖アルキル基、さらに好ましくは１から６個、なおさらに好ましくは１から３個、最も好ましくは１個のＣ原子を含む。主鎖に１２から１８個の炭素原子を含む分岐アルキル基がより好ましく、その分岐アルキル基は、前記の通り定義される。特に好ましいアルキル基はフィタニル基である。
【００８４】
代替の態様では、アルキルは上に定義された通り不飽和分岐または非分岐アルキル基である。さらに好ましくは、当該不飽和脂肪族炭化水素基は、１、２または３または４個の二重結合を含み、ここで、一つの二重結合を有する基が特に好ましい。Ｃ１８：１デルタ９、すなわち１８個のＣ原子を有し、９番目のＣ原子から１０番目のＣ原子への単結合よりもむしろ位置９でｃｉｓ配置の二重結合がみられる脂肪族炭化水素基であるオレイルが最も好ましい。
【００８５】
本明細書に使用されるように、ｎは、１から４の間の任意の整数であり、これは、ｎが１、２、３、および４であり得ることを意味する。本明細書に使用されるように、ｍは、１から３の間の任意の整数であり、これは、ｍは１、２および３であり得ることを意味する。
【００８６】
本発明による化合物は、好ましくは陽イオン性脂質であるものとする。さらに好ましくは、本発明による化合物に存在する任意のＮＨまたはＮＨ２基は、プロトン化された形態で存在する。本発明による化合物の任意の正電荷は、陰イオンの存在によって典型的には、補償される。そのような陰イオンは一価または多価陰イオンであり得る。好ましい陰イオンは、ハロゲン化物イオン、酢酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンである。本明細書に使用されるハロゲン化物は、好ましくはフッ化物、塩化物、ヨウ化物、および臭化物である。最も好ましいのは塩化物である。陽イオン性脂質および細胞内に移動させる生物活性化合物が会合すると、ハロゲン化物陰イオンは一つまたは数個の負電荷を好ましくは示す生物学的活性化合物と置換するが、生物学的活性化合物の全体的な電荷は必ずしも負ではないことを了承しなければならない。
【００８７】
式（Ｉ）による任意の化合物は、少なくとも二つの不斉Ｃ原子を含むと認められる。当該化合物の任意の可能な鏡像異性体、すなわち特にＲ−Ｒ、Ｓ−Ｓ、Ｒ−Ｓ、およびＳ−Ｒ鏡像異性体が本明細書に開示されることは本発明の範囲内である。
【００８８】
本発明による化合物は、組成物を形成できるか、または組成物の一部であることがあり、ここで、当該組成物は担体を含む。本明細書において脂質組成物とも呼ばれる当該組成物において、本発明による化合物は脂質構成要素とも呼ばれる。当該担体は、好ましくは液体担体である。好ましい液体担体は、水性担体および非水性担体である。好ましい水性担体は、水、水性緩衝系、さらに好ましくは生理学的緩衝強度および生理学的塩濃度を有する緩衝系である。好ましい非水性担体は、溶媒、好ましくはエタノール、ｔｅｒｔ−ブタノールのような有機溶媒である。任意の理論に縛られることを望むわけではないが、任意の水混和性有機溶媒を原則として使用することができる。その組成物、さらに特定すれば液体組成物は、このようにリポソームとして存在できるか、またはリポソームを形成できると認められる。
【００８９】
本発明による組成物は、本明細書においてヘルパー脂質構成要素としても呼ばれる一つまたは複数のヘルパー脂質を含み得る。ヘルパー脂質構成要素は、リン脂質およびステロイドを含む群より好ましくは選択される。リン脂質は、好ましくはリン酸のジエステルおよびモノエステルである。リン脂質の好ましいメンバーは、ホスホグリセリドおよびスフィンゴ脂質である。本明細書に使用されるステロイドは、部分水素化シクロペンタ［ａ］フェナントレンに基づく天然および合成化合物である。好ましくは、ステロイドは２１から３０個のＣ原子を含む。特に好ましいステロイドはコレステロールである。特に好ましいヘルパー脂質は、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。
【００９０】
本発明による特に好ましい組成物は、ＤＰｈｙＰＥと組み合わせたβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリド［＃６］、β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドトリヒドロクロリド［＃１１］、またはε−アルギニル−リシン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドトリヒドロクロリド［＃１５］のいずれかを含み、ここで、ＤＰｈｙＰＥの含有量は、好ましくは８０mol%、６５mol%、５０mol%、および３５mol%であり、用語mol%は組成物の全脂質含有量に対する百分率、すなわち本発明による陽イオン性脂質と、任意のヘルパー脂質を非限定的に含めた任意の追加の脂質とを含めた、組成物の脂質含有量の百分率を指す。
【００９１】
本発明による組成物が好ましくは本発明による化合物および／または本明細書に開示された一つもしくは数個のヘルパー脂質を含むことは、本発明の範囲内であり、ここで、本発明による化合物、すなわち陽イオン性脂質および／またはヘルパー脂質構成要素のいずれかは水性媒質中で分散体として存在する。または、本発明による化合物、すなわち陽イオン性脂質および／またはヘルパー脂質構成要素は、水混和性溶媒に溶かした溶液として存在する。水性媒質として、好ましくは本明細書に開示された任意の水性担体が使用される。好ましい水混和性溶媒は任意の比で水と均質相を形成する任意の溶媒である。好ましい溶媒はエタノールおよびｔｅｒｔ−ブタノールである。組成物、さらに特定すれば脂質組成物は、このようにリポソームとして存在できるか、またはリポソームを形成できると認められる。
【００９２】
本発明による組成物は、その多様な態様において薬学的組成物としても使用できると認められる。後者の場合、薬学的組成物は、薬学的活性化合物と、場合により薬学的に許容されうる担体とを含む。そのような薬学的に許容されうる担体は、本発明による組成物に関連して本明細書に定義された担体の群より好ましくは選択できる。当業者は、本明細書に記載された任意の組成物の成分およびその任意の組合せが薬学的に許容されうるという条件ならば、その組成物を原則として薬学的組成物としても使用できることを了解するであろう。薬学的組成物は、薬学的活性化合物を含む。当該薬学的活性化合物は、好ましくは任意の生物学的活性化合物、さらに好ましくは本明細書に開示された任意の生物学的活性化合物である、本発明による組成物のさらなる構成成分と同じであり得る。さらなる構成成分、薬学的活性化合物および／または生物学的活性化合物は、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、および核酸を含む群より好ましくは選択される。
【００９３】
好ましくは、任意の当該生物学的活性化合物は負荷電した分子である。本発明者は、任意の理論に縛られることを望むわけではないが、負荷電した分子という用語は、本発明による陽イオン性脂質の正荷電した基とイオン対を形成できる少なくとも一つの負荷電した基を有する分子を含むことを意味する。原則として、リンカー部分での正電荷は、当該脂質、または陽イオン性脂質と、負荷電した分子、すなわち生物学的活性化合物との間に形成した任意の複合体のいずれかの全体構造に対してある作用も有することがあろう。それは別として、米国特許第６，３９５，７１３号に開示された陽イオン性脂質に比べて、本発明による脂質に導入された追加の正電荷は、Xu Y, Szoka FC Jr.; Biochemistry; 1996 May 07, 35 (18): 5616-23に教示されたようにこの脂質の毒性増加に寄与するはずである。当業者が従来技術のこの文書から期待したであろうこととは対照的に、本発明による化合物は本明細書に開示された多様な目的に特に適し、特に毒性の増加を全く欠いている。
【００９４】
本明細書に好ましくは使用されるペプチドは、好ましくはペプチド結合を介して相互に共有結合している、少なくとも２個のアミノ酸からなる任意のポリマーである。さらに好ましくは、ペプチドは２から１０個のアミノ酸からなる。ペプチドの特に好ましい態様はオリゴヌクレオチドであり、そのオリゴヌクレオチドは、なおさらに好ましくは約１０から約１００個のアミノ酸を含む。本明細書に好ましくは使用されるタンパク質は、相互に共有結合している多数のアミノ酸からなるポリマーである。当該タンパク質は、少なくとも約１００個のアミノ酸またはアミノ酸残基を好ましくは含む。
【００９５】
陽イオン性脂質および本発明による組成物と共に使用できる好ましいタンパク質は、任意の抗体、好ましくは任意のモノクローナル抗体である。
【００９６】
特に好ましい生物学的活性化合物、すなわち薬学的活性化合物および本発明による組成物と共に使用されるようなさらなる構成成分は核酸である。当該核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、またはその任意の混合物のいずれかであり得る。さらに好ましくは、その核酸は機能的核酸である。本明細書に好ましくは使用される機能的核酸は、それぞれペプチドおよびタンパク質をコードしている核酸ではない核酸である。好ましい機能的核酸は、当技術分野で全て公知であるｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、ＲＮＡｉ、アンチセンス−核酸、リボザイム、アプタマー、およびｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒである。
【００９７】
ｓｉＲＮＡは、例えば国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０８６６６に記載されたような低分子干渉ＲＮＡである。これらの分子は、ワトソン−クリック型塩基対形成によって典型的には仲介される、相互に塩基対を形成している、すなわち相互に本質的に相補的である１５から２５個の間、好ましくは１８から２３個の間のヌクレオチド対を含む二本鎖ＲＮＡ構造から典型的にはなる。この二本鎖ＲＮＡ分子の一方の鎖は、標的核酸、好ましくはｍＲＮＡに本質的に相補的であるが、前記二本鎖ＲＮＡ分子の２番目の鎖は前記標的核酸のストレッチに本質的に同一である。数個の追加のオリゴヌクレオチドがそれぞれｓｉＲＮＡ分子の各側および各ストレッチに隣接することがあるが、それらのオリゴヌクレオチドは必ずしも相互に塩基対を形成する必要はない。
【００９８】
ＲＮＡｉはｓｉＲＮＡと本質的に同じ設計を有するが、その分子は、ｓｉＲＮＡに比べてかなり長い。ＲＮＡｉ分子は、典型的には５０個以上のヌクレオチドおよび塩基対をそれぞれ含む。
【００９９】
ｓｉＲＮＡおよびＲＮＡｉと同じ作用機序に基づき活性である、さらなるクラスの機能的核酸はｓｉＮＡである。ｓｉＮＡは、例えば国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７４６５４に記載されている。さらに特定すれば、ｓｉＮＡはｓｉＲＮＡに対応し、ここで、ｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを全く含まない。
【０１００】
本明細書に好ましくは使用されるアンチセンス核酸は、標的ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡとの塩基相補性に基づいてハイブリダイズすることによってＲＮアーゼＨを活性化するオリゴヌクレオチドである。ＲＮアーゼＨは、ホスホジエステル結合したＤＮＡおよびホスホチオエート結合したＤＮＡの両方によって活性化する。しかし、ホスホジエステル結合したＤＮＡは、ホスホチオエート結合したＤＮＡを除き、細胞ヌクレアーゼによって速やかに分解される。このように、アンチセンスポリヌクレオチドは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド複合体としてのみ有効である。アンチセンス核酸の好ましい長さは、１６から２３ヌクレオチドに及ぶ。この種のアンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、とりわけ米国特許第５，８４９，９０２号および米国特許第５，９８９，９１２号に記載されている。
【０１０１】
さらなる群の機能的核酸は、二つの部分を基本的に含むＲＮＡから好ましくはなる触媒活性核酸であるリボザイムである。第１部分は触媒活性を示すが、第２部分は標的核酸との特異的相互作用を担う。典型的には、２本のハイブリダイズする鎖上の本質的に相補的なストレッチの塩基のハイブリダイゼーションとワトソン−クリック型塩基対形成とによって、標的核酸とリボザイムの前記部分との間で相互作用が生じると、触媒活性部分は活性になることができ、それは、リボザイムの触媒活性がホスホジエステラーゼ活性である場合は、触媒活性部分が標的核酸を分子内または分子間のいずれかで開裂することを意味する。リボザイム、その使用および設計原理は当業者に公知であり、例えばDohertyおよびDoudna（Annu. Ref. Biophys. Biomolstruct. 2000; 30: 457- 75）に記載されている。
【０１０２】
なおさらなる機能的核酸の群はアプタマーである。アプタマーは、一本鎖または二本鎖のいずれかであり、標的分子と特異的に相互作用するＤ−核酸である。アプタマーの製造または選択は、例えば欧州特許ＥＰ０５３３８３８に記載されている。ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス−ヌクレオチド、およびリボザイムとは対照的に、アプタマーは標的ｍＲＮＡを全く分解しないが、タンパク質のような標的化合物の二次および三次構造と特異的に相互作用する。標的と相互作用すると、その標的は生物学的活性の変化を典型的には示す。アプタマーの長さは、典型的には下は１５ヌクレオチドから上は８０ヌクレオチドに及び、好ましくは約２０から約５０ヌクレオチドに及ぶ。
【０１０３】
別の群の機能的核酸は、例えば国際特許出願ＷＯ９８／０８８５６に記載されたｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒである。ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒはアプタマーに類似した分子である。しかし、ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒは、アプタマーとは対照的にＤ−ヌクレオチドよりむしろＬ−ヌクレオチドから全面的に、または大部分なる。その他の点では、特に可能な長さのｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒに関しては、アプタマーに関連して概説したのと同じことがｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒにあてはまる。
【０１０４】
先に述べたように、本発明者は、本発明による化合物および当該化合物を含むそれぞれの組成物がＲＮＡｉ、さらに特定すればｓｉＲＮＡおよびｓｉＮＡを細胞内に移動させるのに特に有効であり得ることを驚くことに見出した。任意の理論に縛られることを望むわけではないが、本発明による脂質組成物に含有され、無ＰＥＧヘルパー脂質または特にＰＥＧ含有ヘルパー脂質のいずれかであり得る、特定のモル百分率のヘルパー脂質が原因で、さらに特定すると、この種の任意のヘルパー脂質の含有量が本明細書に特定された濃度範囲内に入るならば、驚くべき作用を実現できることに留意すべきである。それに関連して、本発明による組成物がＰＥＧ部分を含むヘルパー脂質を含有するならば、当該ＰＥＧ由来ヘルパー脂質を含有する組成物を用いた任意の送達またはトランスフェクション行為は、核酸、特にＲＮＡｉ分子、最も特定すればｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンスヌクレオチド、およびリボザイムの送達に特に有効であることが特に注目に値する。この理由は、本発明者らがＰＥＧ含有ヘルパー脂質を約４%よりも大きく含有するリポソームは活性ではないが、４%未満（好ましくは３%未満）を有するリポソームは、機能的送達を仲介することを驚くことに見出したからである。基本的には、本発明者らは、本発明による脂質組成物中の特定量のＰＥＧが有効なトランスフェクションおよび送達をそれぞれ提供するのに適することを発見した。
【０１０５】
さらなる局面では、本発明者らは、リポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）またはリポソームとして好ましくは存在する、本発明による脂質組成物が、全体としては陽イオン電荷を、したがって少なくとも一つ過剰の正電荷を好ましくは示すことを驚くことに見出した。さらに好ましくは、その脂質組成物は約１：１．３から１：５の負：正電荷比を示す。したがって、本発明は、このようにさらなる局面では少なくとも一つの陽イオン性脂質と、核酸、好ましくはＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、もしくはｓｉＮＡ、または本明細書に定義された他の任意の機能的核酸を含む任意の脂質組成物にこのように関するものであり、その脂質組成物は、約１：１．３から１：５の負：正電荷比を有する。陽イオン性脂質は、好ましくは本明細書に記載された任意の陽イオン性脂質である。その脂質組成物は、好ましい態様では本明細書に記載された任意のヘルパー脂質またはヘルパー脂質の組合せを含む。好ましい態様では、核酸を含有する本発明による組成物は、リポプレックスを形成する。好ましい態様では、本明細書に使用されるリポプレックスという用語は、陽イオン性脂質、中性ヘルパー脂質、および核酸から構成される組成物を指す。
【０１０６】
本発明者らは、特に核酸含有脂質製剤の全体としての陽イオン電荷に関係して上に記述したことを考慮して、特にｓｉＲＮＡと陽イオン性脂質とのモル比が、本発明による脂質組成物の適用の成功に決定的であり得ることも見出した。任意の理論に縛られることを望むわけではないが、特に本明細書に開示された陽イオン性脂質１molは、１分子あたり最大３個の正電荷を提供できるが、核酸、さらに特定すれば本明細書に開示されたｓｉＲＮＡ分子は、１分子あたり最大４０個の負電荷を提供する。本発明によるｓｉＲＮＡ含有脂質製剤の全体としての正電荷に到達するために、モル比は０から最大０．０７５に及ぶことがある。好ましいモル比範囲は約０．０２から０．０５であり、なおさらに好ましくは約０．０３７のモル比範囲である。
【０１０７】
本発明者らの別の驚くべき発見は、本発明による組成物が核酸、好ましくはｓｉＲＮＡ分子またはｓｉＮＡ分子を含有し、核酸主鎖ホスフェート対陽イオン性脂質の窒素原子の電荷比が約１：１．５〜７、さらに好ましくは１：４であるならば、その組成物が特に有用な性質を示すことである。本明細書に使用される核酸主鎖ホスフェートという用語は、当該核酸を形成している個別のヌクレオチドにより提供される核酸のホスフェート部分を指す。本明細書に使用される陽イオン性脂質の窒素原子という用語は、合計３個の正電荷を好ましくは含む陽イオン脂質によって提供される窒素原子を指す。前記３個の正電荷は、二つの第一アミノ基および一つのグアニジン基により提供される。核酸主鎖ホスフェートにより提供される電荷を決定するために、以下の推定を行う：二つのヌクレオシドの間の各ホスフェートは一つの負電荷を提供し、３’末端ホスフェートがもしも存在するならば、それは二つの負電荷を提供する。有効な電荷比は、インビトロおよび／またはインビボ適用で観察された特定の環境では、上記に特定されたものと異なるおそれがあることが認められるが、陽イオン脂質の窒素原子によって提供される電荷と、ホスフェートの原子によって提供される電荷との比を決定するために、上記のように電荷が存在することとする。
【０１０８】
上に定義された電荷比は、細胞膜のようなリン脂質二重層膜を通過した核酸の効率的な移動を提供する。
【０１０９】
送達性質を提供する、本発明による組成物のさらなる特性は、その粒径分布である。好ましくは、分散体として存在する、本発明による組成物の粒径分布は、約１２０nmである。粒径は、実施例の部でさらに詳細に記載される準弾性光散乱法（Quasi Elastic Light Scattering）で好ましくは決定される。
【０１１０】
本発明者らは、本発明による組成物が核酸、好ましくはｓｉＲＮＡおよびｓｉＮＡ分子のような機能的核酸を細胞内に送達するのに特に適することを驚くことに見出した。実施例にさらに詳細に概説するように、本発明による組成物は、内皮細胞、上皮細胞、および癌細胞の細胞内間隙に前記核酸を送達するのに非常に活性である。他の内皮細胞も本発明による組成物を用いて感染させることができるが、なおさらに増加した特異性により送達が脈管構造の内皮細胞で特に活性であると思われる。特に有効なトランスフェクションは、脈管構造、さらに具体的には腫瘍によって誘導されるような血管新生の結果である脈管構造の内皮細胞で生じる。取扱うことができるであろう他の脈管構造は、腎臓、心臓、肺、肝臓、および膵臓の脈管構造である。
【０１１１】
本発明による組成物は、特に低刺激性または無毒である限りにおいて有益であることも了承されているものとする。当該毒性の欠如は、副作用を回避することにより患者のコンプライアンスと、ボーラス投与のような特定形態の投与とが増加することによって、この種の組成物を用いた任意の処置の医学的有用性に顕著に貢献するであろうことから、従来技術の組成物よりも明らかに好都合である。後者は、本明細書における実施例部分から解釈することができるように、動物研究から明白である。
【０１１２】
その組成物およびさらに特定すれば薬学的組成物が、それぞれ薬学的活性化合物およびさらなる構成成分として、本発明による組成物に含有され得る一つまたは複数の前記生物学的活性化合物を含み得ることは、本発明の範囲内である。原則としてこれらの任意の化合物を薬学的活性化合物として使用できることは、当業者に了承されるであろう。当該薬学的活性化合物は、典型的には疾患の病態メカニズムに関与する標的分子に対するものである。本発明の任意の局面と共に使用される多様な生物学的活性化合物の、したがって薬学的活性化合物の根底にある一般的な設計原理および作用機序のおかげで、事実上任意の標的を取扱うことができる。したがって、この種の生物学的活性化合物を用いて取扱い、予防し、かつ／または処置できる任意の疾患または疾的状態の処置または予防に、本発明による化合物およびそれを含有するそれぞれの組成物を使用できる。これらの生物学的活性化合物は別として、他の任意の生物学的活性化合物も本発明の任意の態様による組成物の一部であり得ることが了承されているものとする。好ましくはそのような他の生物学的活性化合物が本発明による化合物と、さらに好ましくは陽イオン性脂質として存在する本発明による化合物と相互作用または複合体形成している条件で、そのような他の生物学的活性化合物は、好ましくは少なくとも一つの負電荷を含む。
【０１１３】
本明細書に使用されるように、生物学的活性化合物は、好ましくは生体系に任意の生物学的、化学的および／または物理的作用を示す、好ましくは生物学的に活性な任意の化合物である。当該生体系は、任意のヒト細胞、任意の組織、任意の器官、および任意の生物を含めるがそれに限定されるわけではない好ましくは任意の生化学反応、任意の細胞、好ましくは任意の動物細胞、さらに好ましくは任意の脊椎動物細胞、最も好ましくは任意の哺乳動物細胞である。任意の当該生物は、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、サルおよびヒトを含む群より選択される。
【０１１４】
本発明による任意の組成物、さらに特別には本発明による任意の薬学的組成物は、さらなる任意の薬学的活性化合物を含み得ることも本発明の範囲内である。
【０１１５】
その組成物、特に本発明による薬学的組成物を多様な形態の投与に使用でき、ここで、局所投与および全身投与が特に好ましい。筋肉内、経皮、皮下、静脈内、および肺投与を含む群より選択される投与経路がなおさらに好ましい。本明細書に好ましくは使用されるように、局所投与は、その組成物および生物学的活性化合物がそれぞれ投与される細胞、組織および器官それぞれにそれぞれの組成物が密接な空間的関係で投与されることを意味する。本明細書に使用されるように、全身投与は局所投与とは異なる投与を意味し、さらに好ましくはそれぞれ血液および液のような体液への投与であり、ここで、その体液は、その組成物および生物学的活性化合物がそれぞれ送達される細胞、組織および器官にその組成物をそれぞれ輸送する。
【０１１６】
本明細書に使用されるように、生物学的活性化合物がそれぞれ本発明による化合物および組成物によって細胞膜を通過して移動する細胞は、好ましくは真核細胞、さらに好ましくは脊椎動物細胞、なおより好ましくは哺乳動物細胞である。最も好ましくは、その細胞はヒト細胞である。
【０１１７】
本発明による化合物および組成物をそれぞれ用いて製造できる任意な薬剤は、罹患体の処置および予防のためのものである。当該罹患体は、好ましくは脊椎動物、さらに好ましくは哺乳動物、なおさらに好ましくは当該哺乳動物は、マウス、ラット、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、サルおよびヒトを含む群より選択される。さらなる局面では、移動剤、さらに好ましくはトランスフェクション剤として本発明による化合物および組成物を使用できる。
【０１１８】
本明細書に好ましくは使用されるように、移動剤は化合物を、さらに好ましくは薬学的活性化合物のような生物学的活性化合物を、膜、好ましくは細胞膜を通過して移動させるのに、より好ましくは当該化合物を本明細書に予め記載されたような細胞内に移動させるのに適した任意の薬である。好ましくは、細胞は内皮細胞、より好ましくは脊椎動物の内皮細胞、最も好ましくはマウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、サルおよびヒトのような哺乳動物の内皮細胞である。
【０１１９】
なおさらなる局面では、本発明は、細胞に生物学的活性化合物を移動させる、さらに特定すればトランスフェクトするための方法に関するものである。第１工程では、工程の順序は必ずしも限定されず、細胞ならびに膜および細胞がそれぞれ提供される。第２工程では、本発明による化合物および薬学的活性化合物のような生物学的活性化合物が提供される。この反応物にそれぞれ細胞および膜を接触させることができ、本発明による化合物および組成物の生物物理的性質が原因で、その生物学的活性化合物は、膜の一方の側からもう一方の側に、またはその膜が細胞を形成している場合は、細胞の外側から細胞内に輸送されるであろう。細胞および膜とそれぞれ接触させる前に、その生物学的活性化合物および本発明による化合物、すなわち陽イオン性脂質を接触させることは、本発明の範囲内である。その際、好ましくは複合体が形成し、当該複合体を細胞および膜とそれぞれ接触させる。
【０１２０】
本発明のさらなる局面では、生物学的活性化合物および薬学的活性化合物をそれぞれ移動させるための方法は、それぞれ細胞および膜を提供する工程、本発明による組成物を提供する工程、ならびに組成物とそれぞれ細胞および膜との両方を接触させる工程を含む。細胞および膜とそれぞれ接触させる前または間に、組成物が形成し得ることは本発明の範囲内である。
【０１２１】
本明細書に開示された生物学的活性化合物を移動させる任意の方法の一態様では、その方法は、さらなる工程、好ましくはその生物学的活性化合物が移動したかどうかを検出する工程を含み得る。そのような検出反応は、その方法により移動した生物学的活性化合物の種類に強く依存し、当業者に容易に明白なところであろう。当該方法が本明細書に記載された任意の細胞、組織、器官および生物で行われることは本発明の範囲内である。
【０１２２】
本発明のさらなる特性、態様および利点を解釈することができる以下の図および実施例を参照することにより、本発明をさらに例示する。
【０１２３】
実施例１：従来技術によるＮ−オレイル−パルミチルアミンの合成
Ｎ−オレイル−パルミチルアミンは、本発明による化合物の重要な出発物質である。Ｎ−オレイル−パルミチルアミンは、原則としてＵＳ６，３９５，７１３に記載されたように合成できる。それぞれの反応スキームを図２に示す。しかし、出発物質は、例えばFlukaによって提供される工業用オレイルアミンである。この出発物質のガスクロマトグラフィーによる分析は、≧７０%の純度を示し、ここで、その出発物質の３０%は、種々の鎖長を有するアミンからなる。この原因は、当該物質が植物起原から得られることであり得るであろう。オレイルアミンおよび１−ブロモヘキサデカン（パルミチルブロミド）の両方を混合することで、両出発物質を１００から１２０℃で３０分間反応させた後にＮ−オレイル−パルミチルアミンが生じる。収率は約８３%である。
【０１２４】
実施例２：本発明によるＮ−パルミチル−オレイルアミンの合成
本発明による化合物に関連して、本発明者は新しい合成に気づいた（図３）。この新しい反応スキームは、多量の不純物がこの出発物質に基づいて調製された移動剤の品質に影響していると本発明者が見出したことに基づく。したがって、ガスクロマトグラフィーにより示される純度≧９９%を有するオレイン酸を用いて、当該オレイン酸をクロロギ酸エチル、ＴＥＡ、およびＣＨ２Ｃｌ２と接触させ、そのように得られた混合カルボン酸−炭酸無水物をガスクロマトグラフィーにより示される純度≧９９%をこれも有するヘキサデシルアミン（パルミチルアミン）と反応させて、反応を開始する。反応生成物Ｎ−パルミチル−オレオイルアミド［＃１］を続いてＬｉＡｌＨ４（ＴＨＦ中）と反応させる結果、無色結晶状固体として存在する８５%Ｎ−パルミチル−オレイルアミン［＃２］が生じる。
【０１２５】
さらに詳細な反応条件を以下に概説する。
【０１２６】
Ｎ−パルミチル−オレオイルアミド［＃１］の合成
クロロギ酸エチルエステル２．６２ml（２７．５mmol）をアルゴン不活性ガス下で２５０mlシュレンク窒素管中で無水ジクロロメタン３０mlに溶解させ、０℃に冷却する。無水ジクロロメタン４０mlに溶かしたオレイン酸７．９３ml（２５mmol）およびトリエチルアミン４．１６ml（３０mmol）の溶液を、撹拌しながら２０分以内に滴下する。氷浴で３０分間撹拌した後で、ＣＨＣｌ３５０mlに溶かしたパルミチルアミン６．６４g（２７．５mmol）の溶液を速やかに滴下し、得られた混合物を室温で２時間撹拌する。続いて、得られた溶液をそれぞれ水４０mlで３回洗浄し、有機相をＮａ２ＳＯ４で脱水して、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去する。残渣をアセトン１００mlで再結晶化する。８９%の収率に対応する無色固体１１．２５g（２２．３mmol）を得る。
【０１２７】
Ｎ−パルミチル−オレイルアミン［＃２］の合成
エーテルに溶かした１M  ＬｉＡｌＨ４２０mlを滴下漏斗および還流凝縮器を有する２５０ml三首フラスコ中にアルゴン不活性ガス下で提供し、続いてパルミチルオレオイルアミド７．５９g（１５mmol）のＴＨＦ８０ml溶液を２０分間以内に滴下する。得られた混合物を２．５時間還流し、次にエーテルに溶かした別の１M  ＬｉＡｌＨ４５mlを添加してさらに２．５時間還流する。氷浴で冷却しながら６M  ＮａＯＨを用いて過剰の水素化物を分解して、沈殿をろ過する。沈殿を熱ＭｔＢＥ各４０mlで２回抽出して、合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で脱水して、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去する。残渣を−２０℃でＭｔＢＥ１００mlで結晶化する。収率８５%に対応する無色結晶状固体６．２３g（１２．７mmol）を得る。
【０１２８】
実施例３：  Ｂｏｃ−Ｄａｐ（Ｆｍｏｃ）−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド［＃３］の合成
Ｎ−オレイル-パルミチルアミン５２１mg（１．０６mmol）を５０ml容丸底フラスコ中で無水ジクロロメタン１０mlに溶かし、ＥＥＤＱ２８９mg（１．１７mmol）を添加する。続いて、Ｂｏｃ−Ｄａｐ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ５００mg（１．１７mmol）を撹拌しながら添加して、得られた混合物を室温で２０時間撹拌する。この溶液をジクロロメタン８０mlと共に分液漏斗に移し、０．１N  ＨＣｌ各２０mlで３回、飽和ＮａＨＣＯ３溶液２０mlで１回洗浄する。Ｎａ２ＳＯ４で脱水後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去する（図４）。帯黄粘性油を得て、それをそれ以上精製しない。ヘキサン／酢酸エチル１：１を用いた薄層クロマトグラフィーでＲｆ値０．７０を観察した。
【０１２９】
実施例４：  Ｂｏｃ−Ｄａｐ−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド［＃４］の合成
Ｂｏｃ−Ｄａｐ（Ｆｍｏｃ）−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド粗生成物１gを５０ml丸底フラスコ中で無水ジクロロメタン溶液８mlに溶かした。ジエチルアミン３mlを添加して、室温で撹拌した（図４）。薄層クロマトグラフィーを用いた反応の管理によると、４．５時間後に出発生成物の反応は完了したことが示された。揮発性構成要素をロータリーエバポレーターで除去して、ヘキサン／酢酸エチル５：１を用いてシリカゲル６０（Merck）４０gを用いて残渣をクロマトグラフィーにより精製する。酢酸エチル、酢酸エチル／メタノール４：１、およびジクロロメタン／メタノール４：１からなる段階勾配を用いて生成物を溶出させた。Ｂｏｃ−Ｄａｐ−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド５７６mg（０．８５mmol）を黄色粘性油として得た。
【０１３０】
実施例５：  テトラ−Ｂｏｃ−［β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド］［＃５］の合成
Ｂｏｃ−Ｄａｐ−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド５７６mg（０．８５mmol）を１００容丸底フラスコ中で無水ジクロロメタン１０mlに溶かし、ＥＥＤＱ２１０mg（０．８５mmol）およびＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＯＨ４０３mg（０．８５mmol）を撹拌しながら加えた（図５）。得られた混合物をアルゴン雰囲気下で室温で２０時間撹拌した。続いて、ジクロロメタンをロータリーエバポレーターで除去して、ＭｔＢＥ１００mlに入れた残渣を分液漏斗に移した。有機相を０．１N  ＨＣｌ、１N  ＮａＯＨ、および飽和ＮａＨＣＯ３溶液で徹底的に洗浄して、Ｎａ２ＳＯ４で脱水して、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。続いて、溶出液としてヘキサン／酢酸エチルを用いたフラッシュクロマトグラフィー（Combiflash Retrieve; Isco Inc.）で粗生成物を精製した。収率７２%に対応する無色粘性油６９４mg（０．６１mmol）を得た。
【０１３１】
実施例６：  β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリド［＃６］の合成
十分に乾燥したテトラ−Ｂｏｃ−［β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド］６９４mg（０．６１mmol）を２５mlシュレンク窒素管中にアルゴン雰囲気下で提供して、ジオキサンに溶かした４N  ＨＣｌ８mlを添加した（図５）。得られた混合物をアルゴン不活性ガス下で室温で２４時間撹拌し、ここで、生成物は非晶質の部分的ワックス様固体として約６から８時間後に溶液から沈殿した。反応完了（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ６５：２５：４を用いた薄層による管理）後に、高真空下でどのような揮発性構成要素も除去した。β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パミチル−Ｎ−オレイル−アミド４８９mg（０．５８mmol）をトリヒドロクロリドとして得た。
【０１３２】
実施例７：  Ｎ−ラウリル−ミリスチルアミン［＃７］の合成
還流凝縮器および滴下漏斗を有する５００ml三首フラスコ中で無水ＤＭＦ１００mlにドデシルアミン（ラウリルアミン）１８．５４ｇ（１００mmol）、Ｎａ２ＣＯ３６．３６g（６０mmol）、およびテトラブチルアンモニウムヨージド（ＴＢＡＩ）５０mgを懸濁した。無水ジオキサン１００mlに溶かした１−ブロモテトラデカン１６．４ml（６０mmol）の溶液を１００℃で１１０分間かけて滴下し、得られた混合物を１００℃でさらに３．５時間撹拌した（図６）。この溶液をできるだけ高い温度でろ過した。４℃で一晩沈殿した結晶状固体を取り出し、少量の冷メタノールで洗浄した。続いて、得られた固体をメタノール２００mlで再結晶化した。無色板状結晶９gを得て、それをＭｔＢＥ１００mlで再結晶化する。冷却したフリットから−１８℃で沈殿した結晶を吸引し、冷ＭｔＢＥで洗浄した。収率３５%に対応する無色結晶状固体７．９４g（２１mmol）を得た。
【０１３３】
実施例８：  Ｂｏｃ−Ｄａｐ（Ｆｍｏｃ）−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミド［＃８］の合成
Ｂｏｃ−Ｄａｐ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ７１５mg（１．６８mmol）を５０ml丸底フラスコ中で無水ジクロロメタン１５mlに溶かして、ＥＥＤＱ４２０mg（１．７mmol）を添加した。得られた混合物を室温で４５分間撹拌して、続いてＮ−ラウリル−ミリスチルアミン６４１mg（１．６８mmol）の２５ml無水ジクロロメタン溶液を６０分間以内にゆっくりと滴下した（図６）。２０時間の反応時間の後で、溶媒をロータリーエバポレーターで除去して、残渣をＭｔＢＥ１００mlと共に分液漏斗に移した。この溶液を０．１N  ＨＣｌおよび飽和ＮａＨＣＯ３溶液で徹底的に洗浄して、有機相をＮａ２ＳＯ４で脱水して、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。粗生成物１．０２gを得て、溶出液としてヘキサン／酢酸エチルを用いたフラッシュクロマトグラフィー（Combiflash Retrieve; Isco Inc.）によりそれを精製した。純粋な生成物６０７mgを無色で非常に粘性の油として得た。ヘキサン／酢酸エチル１：１を用いた薄層クロマトグラフィーはＲｆ値０．５８を提供した。
【０１３４】
実施例９：  Ｂｏｃ−Ｄａｐ−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミド［＃９］の合成
Ｂｏｃ−Ｄａｐ（Ｆｍｏｃ）−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミド６０７mgを５０ml丸底フラスコ中で無水ジクロロメタン８mlに溶かした（図６）。ジエチルアミン３mlを添加して、反応物を室温で４．５時間撹拌した。ロータリーエバポレーターを用いて揮発性構成成分を除去して、ヘキサン／酢酸エチル５：１を用いたシリカゲル６０（Merck）４０gを用いたクロマトグラフィーによって残渣を精製した。酢酸エチル、ジクロロメタン、およびジクロロメタン／メタノール３：１からなる段階勾配により生成物を溶出させた。Ｂｏｃ−Ｄａｐ−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミド３７２mg（０．６５５mmol）を帯黄色粘性油として得た。
【０１３５】
実施例１０：  テトラ−Ｂｏｃ−［β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミド］［＃１０］の合成
Ｂｏｃ−Ｄａｐ−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミド３７２mg（０．６５５mmol）を５０ml丸底フラスコ中で無水ジクロロメタン８mlに溶かし、ＥＥＤＱ１６２mg（０．６５５mmol）およびＢｏｃ−Ａｒｇ−（Ｂｏｃ）２−ＯＨ３１１mg（０．６５５mmol）を撹拌しながら添加した（図７）。得られた混合物を室温で２０時間撹拌した。続いて、ロータリーエバポレーターを用いてジクロロメタンを除去して、残渣をＭｔＢＥ８０mlと共に分液漏斗に移した。有機相を０．１N  ＨＣｌ、１N  ＮａＯＨ、および飽和ＮａＨＣＯ３溶液で徹底的に洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。続いて、ヘキサン／酢酸エチルの段階勾配を用いてフラッシュクロマトグラフィー（Combiflash Retrieve; Isco Inc.）により粗生成物を精製した。収率７６%に対応する無色粘性油５００mg（０．５mmol）を得た。
【０１３６】
実施例１１：  β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミドトリヒドロクロリド［＃１１］の合成
十分に乾燥したテトラ−Ｂｏｃ−［β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミド］５１１mg（０．５mmol）を２５mlシュレンクアルゴン管にアルゴン下で提供し、ジオキサンに溶かした４N  ＨＣｌ  １０mlを添加した（図７）。得られた混合物を室温で２４時間アルゴン不活性ガス下で撹拌し、ここで、生成物は６から８時間後に溶液から部分的非晶質の部分的ワックス様の固体として沈殿した。反応の完了（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ６５：２５：４を用いた薄層クロマトグラフィーによる管理）時に、全ての揮発性構成要素を高真空で除去した。トリヒドロクロリドの形態のβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミド３２３mg（０．５mmol）を得た。
【０１３７】
実施例１２：  Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミド［＃１２］の合成
Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ９３７mg（２mmol）を５０ml丸底フラスコ中で無水ジクロロメタン１０mlに溶かし、ＥＥＤＱ４９５mg（２mmol）を添加した（図８）。得られた混合物を室温で６０分間撹拌し、続いてＮ−ラウリル−ミリスチルアミン７６４mg（２mmol）の３０ml無水ジクロロメタン溶液を１２０分以内にゆっくりと滴下した。２０時間の反応時間の後で、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去して、ＭｔＢＥ１００mlと共に残渣を分液漏斗に移した。溶液を０．１N  ＨＣｌおよび飽和ＮａＨＣＯ３で徹底的に洗浄して、有機相をＮａ２ＳＯ４で脱水して、溶媒をロータリーエバポレーターを用いて除去した。粗生成物１．７５７gを得て、溶出液としてヘキサン／酢酸エチル４：１を用いたフラッシュクロマトグラフィーを用いてそれを精製した。純粋な生成物１．３７７gを無色の非常に粘性の油として得る。ヘキサン／酢酸エチル１：１を用いた薄層クロマトグラフィーはＲｆ値０．５７を与えた。
【０１３８】
実施例１３：  Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミド［＃１３］の合成
Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド１．３７７gを５０ml丸底フラスコ中で無水ジクロロメタン１６mlに溶かした。ジエチルアミン６mlを添加して、得られた混合物を室温で５時間撹拌した（図８）。ロータリーエバポレーターを用いて揮発性構成要素を除去して、ヘキサン／酢酸エチル５：１を用いたシリカゲル６０（Merck）４０gを用いたクロマトグラフィーによって残渣を精製した。酢酸エチル、ジクロロメタン、およびジクロロメタン／メタノール３：１からなる段階勾配を用いて生成物を溶出させた。帯黄色粘性油としてＢｏｃ−Ｌｙｓ−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミド５５６mg（０．９１１mmol）を混合画分１１９mgと共に得た。
【０１３９】
実施例１４：  テトラ−Ｂｏｃ−［ε−アルギニル−リシン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミド］［＃１４］の合成
Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド５５６mg（０．９１１mmol）を無水ジクロロメタン４０mlに溶解し、ＥＥＤＱ２２６mg（０．９１１mmol）およびＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＯＨ４３３mg（０．９１１mmol）を撹拌しながら添加した（図９）。得られた混合物を室温で２０時間撹拌した。続いて、ロータリーエバポレーターを用いてジクロロメタンを除去して、残渣をＭｔＢＥ８０mlと共に分液漏斗に移した。有機相を０．１N  ＨＣｌおよび飽和ＮａＨＣＯ３溶液で徹底的に洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水して、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去した。続いてヘキサン／酢酸エチルの段階勾配を用いてフラッシュクロマトグラフィー（Combiflash Retrieve; Isco Inc.）により粗生成物を精製した。７５%に対応する収量７３０mg（０．６８４mmol）の無色粘性油を得た。
【０１４０】
実施例１５：  ε−アルギニル−リシン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミドトリヒドロクロリド［＃１５］の合成
十分に乾燥したテトラ−Ｂｏｃ−［ε−アルギニル−リシン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミド］７３０mg（０．６８４mmol）を２５mlシュレンクアルゴン管にアルゴン下で提供して、ジオキサンに溶かした４N  ＨＣｌ  １０mlを添加した（図９）。得られた混合物を室温で２４時間アルゴン不活性ガス下で撹拌し、そのとき、生成物は約８時間後に非晶質の部分的ワックス様固体として溶液から沈殿した。ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ６５：２５：４を用いた薄層クロマトグラフィーにより管理した反応が完了したときに、全ての揮発性構成要素を高真空で除去した。ε−アルギニル−リシン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミド４９１mg（０．６３３mmol）をトリヒドロクロリドとして得た。
【０１４１】
実施例１６：  トリ−Ｂｏｃ−γ−カルバミジノ−α，γ−ジアミノ酪酸［＃１６］の合成
Ｂｏｃ−Ｄａｂ−ＯＨ１．３１ｇ（６mmol）を１００ml丸底フラスコ中でアセトニトリル１５mlに入れて提供して、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）１２mmolを添加した（図１０）。続いて、一部のＢｏｃ−Ｄａｂ−ＯＨが溶解するまで水を滴下して、続いて１，３−ジ−Ｂｏｃ−２−（トリフルオロメチルスルホニル）グアニジン１．９６g（５mmol）を添加した。得られた混合物を室温で１２時間撹拌して、さらにロータリーエバポレーターを用いてアセトニトリルを除去した。水性残渣を水５mlで希釈してジクロロメタン５０mlを添加した。撹拌しながら２N  ＨＣｌを添加することによって反応物をｐＨ２に酸性化して、続いて有機相を分離した。ジクロロメタン５０mlで水相を抽出して、合わせた有機相を続いて適量の希ＨＣｌおよび飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で脱水して、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去した。ヘキサン／酢酸エチル２：１を用いたシリカゲル６０のクロマトグラフィーを用いて残渣を精製した。収率５０%に対応する無色非晶質固体１．１３８g（２．４７mmol）を得た。
【０１４２】
実施例１７：  ベータ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリド［＃６］の合成
滴下漏斗を備える２５０mlシュレンク管中にアルゴン雰囲気下で無水ＣＨ２Ｃｌ２  １５mlにＢｏｃ−Ｄａｐ−ＯＨ１．２２５g（６mmole）を懸濁し、トリメチルアミン１．７２mlを添加する。ＴＭＳＣＩ１．５２ml（１２mmole）の３０ml無水ＣＨ２Ｃｌ２溶液を激しく撹拌しながら室温で１５から２０分以内に滴下する。その間にアルゴン雰囲気下で１００mlシュレンク管中にカルボニルジイミダゾール９４１mg（５．８mmole）を無水ＣＨ２Ｃｌ２  ８mlに溶解する。撹拌しながら室温で１５から２０分以内にＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＯＨ２．６６g（５．６mmole）の２５ml無水ＣＨ２Ｃｌ２溶液を滴下する。両反応溶液を室温で４時間撹拌する。続いて、トリエチルアミン８３２μl（６mmole）を最初の溶液に加えて、アルゴン雰囲気下で室温で滴下漏斗により１５から２０分以内に２番目の溶液を滴下する。１５から２０分後に水３０mlを添加し、４５分間激しく撹拌し、得られた溶液をｐＨ２に調整する。有機相を分離して水相をＣＨ２Ｃｌ２で数回抽出する。合わせた有機相をＮａＣｌおよび硫酸ナトリウムの飽和溶液で脱水して、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去する。溶出液としてジクロロメタンを用いてシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーを用いてガラス様残渣を精製する。無色非晶質固体２．７４g（４．１５mmole；７４%）を得る［化合物１７］。
【０１４３】
実施例１０の条件と本質的に類似した条件で、この固体をオレイルパルミチルアミン［＃２］と反応させ、ここで、温度は３５から４０℃に調整する（収率７２%）。実施例１１に記載されたようにＢｏｃ保護基の開裂により目的の最終生成物β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリド［＃６］を得る。溶出液としてＭｅＯＨ／水を用いたＲＰ−１８シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーを用いて、このように得られた生成物をさらに精製できる。
【０１４４】
実施例１８：  陽イオン性リポソームおよびｓｉＲＮＡから成る複合体（リポプレックス）の製造
脂質フィルム／ケーキ再水和、エタノール注入法、逆相蒸発または界面活性剤透析法［Liposomes as Tools in Basic Research and Industry; Jean R. Philippot and Francis Schuber; CRC Press January 1995およびLiposome Technology: Preparation of Liposomes:001 Gregory Gregoriadis CRC Press I Llc. April 1984参照］のような当技術分野で公知の標準的な技法を用いて、陽イオン性リポソームおよびｓｉＲＮＡからなるリポプレックスを製造した。
【０１４５】
本明細書においてリポプレックスとも呼ばれる、ｓｉＲＮＡのような核酸と組み合わせた、このように得られたリポソームは、脂質としてβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリドと、追加的に１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンまたは１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンのいずれかを含み、ここで、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンの使用が好ましい。当該リポソームおよびリポプレックスそれぞれの脂質画分は、５０mol%ベータ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリドと、５０mol%１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンまたは５０mol%１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンのいずれかであった。
【０１４６】
５０mol%β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリドと、５０mol%１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンとの組合せは、本明細書においてａｔｕＦｅｃｔとも呼ばれる。
【０１４７】
本明細書に開示された他の任意の脂質および脂質組成物は、原則として以前に言及された技法およびさらなる加工工程を用いて製造できるものとする。
【０１４８】
リポソームおよびリポプレックスそれぞれは、粒径、多分散度、およびラメラ性に関して調節するためにさらなる加工工程に供される。これらの性質を超音波処理、多孔質膜を通過するような押出し、および均質化、好ましくは高圧均質化によって調整できる。
【０１４９】
このように形成したリポソームまたはリポプレックスをBeckman-Coulter N5サブミクロン粒子分析装置を用いた光子相関分光法によって特徴づけ、押出しまたは高圧均質化のいずれかによって粒径を調節した当該リポソームの結果を図１２Ａおよび１２Ｂにそれぞれ示す。
【０１５０】
図１２Ａから、異なるサイズ排除を有する異なる膜、この場合は１０００nmおよび４００nmの膜をそれぞれ用いて、リポソームの粒径分布を修正できると解釈できる。両方の場合で、押出し工程を２１回繰り返した。しかし、本発明の範囲内でサイズ排除は約５０から５０００nmのことがあり、押出し工程を１０から５０回繰り返すことができる。
【０１５１】
図１２Ｂから解釈できるように、高圧均質化もリポソームの粒径分布を修正する適切な手段であり、ここで、当該高圧均質化を適用した場合に、リポソームの粒径はリポソームが供された均質化のサイクル数に依存する。典型的な圧範囲は１００〜２５００barであり、ここで、この場合は適用された圧は１５００barであった。
【０１５２】
実施例１９：  ａｔｕＦｅｃｔの保存安定性
本明細書に開示された組成物が典型的には薬学的組成物として使用されるならば、当該薬学的製剤が保存条件で安定なことが不可欠である。保存安定性を研究するために、腫瘍抑制因子ＰＴＥＮに対するｓｉＲＮＡを設計して、実施例１８に記載されたようなａｔｕＦｅｃｔを用いて処方した。
【０１５３】
さらに特定すれば、以下に引用する最終原液濃度を有する脂質原液を用いて、３００mMスクロース溶液中で脂質フィルムの再水和を行った後に、それぞれ押出しおよび高圧均質化を行うことによってリポソームを製造した。このように得られたリポソームを下記のｓｉＲＮＡと共に１：１のモル比で混合したが、その代わりに、脂質層をｓｉＲＮＡの存在下で再水和することにより、得られたリポプレックスを押出しまたは均質化することもできた。
【０１５４】
ｓｉＲＮＡ分子は以下の通りであった：
【０１５５】
【表１】
2007536324.tif 000008
【０１５６】
配列中、太字のヌクレオチドは、それぞれのヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルであることを示す。
【０１５７】
血清含有培地の存在下でＨｅＬａ細胞と共に種々の濃度（ｓｉＲＮＡ分子のnMを図１３に示す）でリポプレックスを４８時間インキュベートした。以前に記載されたように、ｐ１１０ａ（負荷対照）およびＰＴＥＮ特異的抗体を用いた全細胞抽出物のイムノブロットを行った（標準ウエスタンプロトコール）。
【０１５８】
しかし、適切な凍結保護剤にはスクロース、トレハロース、マルトース、セロビオース、ラフィノース、ガラクトース、マンニトールおよびＰＥＧがあるが、それに限定されるわけではない。本実施例では、ＰＴＥＮターゲッティングｓｉＲＮＡを含有するａｔｕＦｅｃｔ製剤用の担体として３００mMスクロース溶液を使用した。最終原液濃度は、総脂質１４４５mg/mlおよび１５μM  ＰＴＥＮ−ｓｉＲＮＡであった。溶液を、室温で保管、４℃で７日間保存、または−８０℃で７日間保存した。前記溶液を表示された終濃度に血清含有培地で希釈した（２０、１０、５nM）。４００００／ウェルの細胞密度でＨｅＬａ細胞を用いて試験を行った。結果を図１３に示す。これらの結果から、凍結保護剤に入れてｓｉＲＮＡを含有するａｔｕＦｅｃｔを凍結して、それを−８０℃で７日間保存すると、融解後に４℃で保管したときと同程度有効であると解釈することができる。
【０１５９】
実施例２０：  脂質組成物およびｓｉＲＮＡの負荷
二つの異なる種類の脂質製剤を調製した。脂質製剤０１は、陽イオン性脂質として５０mol%β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリドおよび５０mol%１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンからなり、一方、脂質製剤０２は、陽イオン性脂質として５０mol%β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリドおよび５０mol%１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンから成った。各脂質製剤は、ＰＴＥＮに対するｓｉＲＮＡを含有し（原液濃度は１５μM  ｓｉＲＮＡおよび１４４５mg/ml脂質）、ここで、ｓｉＲＮＡのモル濃度を細胞に対して調節して、それぞれ１μM、５００nM、１００nMおよび５０nMの終濃度にした。
【０１６０】
１．５g/L重炭酸ナトリウムおよび４．５g/Lグルコースを９０%、ウシ胎仔血清を１０%含有するように調整した、４mM  Ｌ−グルタミンを有するダルベッコ変法イーグル培地に標準細胞培養条件で成長したマウス細胞系（Ｂ１６Ｖ、ＡＴＣＣＮｏ．：ＣＲＬ６４７５）に、これらのＰＴＥＮ特異的ＲＮＡｉ含有脂質製剤を投与した。細胞密度は４００００細胞／６ウェルであり、４８時間後に細胞を溶解させ、ウエスタンブロット分析に供した。その結果を図１４に示す。キナーゼＰＲＫ２に特異的なモノクローナル抗体（Becton Dickinson）を用いて得たシグナルを、ＰＴＥＮシグナルに比べた負荷対照として使用した（モノクローナル抗体、Santa Cruze, CA）。
【０１６１】
図１４から、脂質製剤０１、すなわち１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含有する製剤は、ｓｉＲＮＡ含有量が５０nMであった場合に依然として有効であったが、ヘルパー脂質として１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含有する脂質製剤０２は、ＰＴＥＮ特異的抗体（Santa Cruze, CA）によって検出されるｓｉＲＮＡ含有量が約１μM以上であった場合に限りＰＴＥＮのノックダウンを発生できたと解釈できる。無関係のキナーゼＰＲＫ２のシグナルを負荷対照として使用し、それに対する抗体によって検出した。
【０１６２】
実施例２１：  脂質組成物およびＰＥＧ含有量
脂質構成要素としてβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリド（陽イオン性脂質）と、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ポリエチレングリコール−２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）とを含む脂質組成物のトランスフェクションおよび送達に対する有効性に及ぼすＰＥＧの影響を試験するために、本明細書に開示された方法により以下の製剤を作成した。
製剤Ｃ１〜Ｃ５：
【０１６３】
【表２】
2007536324.tif 000009
【０１６４】
製剤Ｈ１〜Ｈ５：
【０１６５】
【表３】
2007536324.tif 000010
【０１６６】
任意の前記製剤に関して、脂質濃度は１．４４５mg/ml、ｓｉＲＮＡ濃度は３００ｍＭスクロース中に１５μMであった。形成した濃縮複合体原液を細胞培地に希釈することによって、終濃度２０、１０、５nM  ｓｉＲＮＡをもたらした。
【０１６７】
前記製剤に含有されるＲＮＡｉ分子はＰＴＥＮに対するものであったが、その配列を実施例２２に記載する。それぞれ細胞４００００細胞／ウェルを含有する６ウェルプレートの中に入ったＨｅＬａ細胞に、これらの脂質製剤を投与した。ＰＴＥＮの発現について細胞を分析し、ウエスタンブロットの結果を図１５に示した。ｐ１１０ａの発現を負荷対照として使用し、ｐ１１０ａに特異的なモノクローナル抗体によって検出した。図１５に示したどのウエスタンブロットからも、ＰＥＧを含有している約１から２mol%のヘルパー脂質がＰＴＥＮ発現の効率的なノックダウンを提供するのに適していたと解釈することができる。
【０１６８】
陽イオン性脂質構成要素をＰＥＧ化ヘルパー脂質と交換するよりもむしろ、ＤＰｈｙＰＥ構成要素をＰＥＧ化ヘルパー脂質と交換すべきであると好ましくは結論できる。Ｈ製剤がＣ製剤よりも効力が高いと思われる上記実験からこのように解釈できる。ＰＥＧ化ヘルパー脂質の含有量は、約０．０５%から４．９%、好ましくは１から３%、より好ましくは２から３%である。
【０１６９】
実施例２２：  ｓｉＲＮＡ含有脂質製剤のインビボ使用
本発明によるｓｉＲＮＡ含有脂質製剤の適切性を試験するために、脂質製剤をマウスモデルで使用した。インビボで肝臓にｓｉＲＮＡを送達するのに使用されることが多いいわゆる流体力学的加圧注射では、体重の約１０%に対応する体積、すなわちマウス１匹あたり約２．５mlの液体が尾静脈に速やかに注射されるが、その流体力学的加圧注射とは対照的に、ｓｉＲＮＡ含有脂質製剤を低体積（２００から３００μl）で全身投与して、その体積をゆっくりと、すなわち数秒かけてマウスの尾静脈に注入することにより、臨床的に関連する投与様式を実践した本インビボ実験を実施した。実験の設定を図１６に示す。
【０１７０】
機能的に正常なラット胚線維芽細胞（ＲＡＴ２、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７４）を発癌性Ｒａｓ（ＲａｓＶ１２）を用いて形質転換した。続いて、形質転換されたＲａｓＶ１２依存性線維芽細胞をマウス（１群６匹、８週齢雄性Ｓｈｏｅ：ＮＭＲＩ−ｎｕ／ｎｕ、DIMED, Germany）に注射し、これらのマウスは１０日後に腫瘍を発現した。この工程で、前記動物は形質転換線維芽細胞の注射後１９日目まで無処置であるか、または１１日目に様々な製剤を用いた処置を開始するかのいずれかとした。さらなる対照として機能的に正常なラット胚線維芽細胞をマウスに注射したが、そのマウスは腫瘍を発現しなかった。
【０１７１】
本明細書においてＴ−Ｒａｓと呼ぶｓｉＲＮＡ分子は、５’から３’方向に配列：
【０１７２】
【表４】
2007536324.tif 000011
【０１７３】
を有する第一鎖Ｔ−Ｒａｓ  ３Ａと、５’から３’方向に配列：
【０１７４】
【表５】
2007536324.tif 000012
【０１７５】
を有するＴ−Ｒａｓ  ３Ｂとからなった。太字で印刷したヌクレオチドおよび下線を付したヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであることに注意されたい。任意の鎖で、３’末端は、上記配列においてＰで表されるホスフェートで開始する。
【０１７６】
配列：
【０１７７】
【表６】
2007536324.tif 000013
【０１７８】
および第２配列
【０１７９】
【表７】
2007536324.tif 000014
【０１８０】
を有するＰＴＥＮ特異的ｓｉＲＮＡ分子を対照として設計した。ここで、修飾パターンはそれぞれＴ−Ｒａｓ  ３ＡおよびＴ−Ｒａｓ  ３Ｂに関して概説したものと同様である。
【０１８１】
以下の製剤をマウスモデルに投与した：
製剤パネルＡ：
ＰＢＳ；
Ｔ−Ｒａｓ３：１０mg/kg／ａｔｕＦｅｃｔ／３．７mg/kg；
ネイクドのＴ−Ｒａｓ３  １０mg/kg；および
Ｔ−Ｒａｓ３  ５mg/kg／ａｔｕＦｅｃｔ３８．５mg/kg。
製剤パネルＢ：
ＰＢＳ；
ａｔｕＦｅｃｔのみ３８．５mg/kg；
ＰＴＥＮ１０mg/kg／ａｔｕＦｅｃｔ３８．５mg/kg；および
Ｔ−Ｒａｓ３  ５mg/kg／ａｔｕＦｅｃｔ  ３８．５mg/kg。
製剤パネルＣ：
スクロース（５０mM）；
Ｔ−Ｒａｓ３  ３．７５mg/kg／ａｔｕＦｅｃｔ−ＰＥＧ２８．９mg/kg、ｉ．ｖ．投与；および
Ｔ−Ｒａｓ３  ３．７５mg/kg／ａｔｕＦｅｃｔ−ＰＥＧ２８．９mg/kg、ｉ．ｐ．投与。
【０１８２】
本明細書において使用されるａｔｕＦｅｃｔ−ＰＥＧは、５０mMスクロースに入れた５０mol%β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリド、４８mol%１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、および２mol%１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ポリエチレングリコールー２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）を意味する。
【０１８３】
動物における薬用量は、ｓｉＲＮＡ５mg/kg  および総脂質３８．５mg/kgであり、注射液中の構成要素の濃度は、ｓｉＲＮＡ０．５mg/mlおよび総脂質３．８５mg/mlであった。モル比は、ｓｉＲＮＡでは０．５mg/mlが０．０４μmole/mlに対応した（分子量約１２５００Da。脂質は、全市質３．８５mg/mlであり、ここで、２．３μmole/mlに対応して、陽イオン性脂質の含有量は１．９７mg/ml（分子量８４３．６）であった。ｓｉＲＮＡ対陽イオン性脂質のモル比は０．０１７４対１であった。
【０１８４】
これらの実験結果を、時間、すなわち細胞による攻撃後の日数の関数として腫瘍体積を示している図１７Ａ（製剤パネルＡ）、図１７Ｂ（製剤パネルＢ）、および図１７Ｃ（製剤パネルＣ）に示す。
【０１８５】
図１７Ａおよび１７Ｂの両方から解釈できるように、ａｔｕＦｅｃｔと共に配合したＴ−Ｒａｓ特異的ｓｉＲＮＡからなるリポプレックスが最も強い阻害を示しており、これは、ターゲッティングの特異性を示している。ａｔｕＦｅｃｔのみと比較した場合に、陰性対照分子ＰＴＥＮＶ１０が腫瘍の成長阻害の向上を示していないことに注目すべきである（図１７Ｂ）。
【０１８６】
図１７Ｃから解釈できるように、ａｔｕＦｅｃｔ−ＰＥＧも非常に有効であり、ｉ．ｐ．およびｉ．ｖ．投与の両方が可能であり、同様の有効性を招く。これに関連して、ＰＥＧ化複合体が機能的に活性であり、ＰＥＧ化により、当該脂質組成物がＰＥＧ化（ヘルパー）脂質を欠如している類似の脂質組成物よりも毒性が低いと仮定できることに注目すべきであり明白である。
【０１８７】
実施例２３：  実施例２４から２７についての材料および方法
ｓｉＲＮＡ−リポプレックスの調製
陽イオン性脂質β−Ｌ−アルギニル−２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリド、中性リン脂質１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL）、およびＰＥＧ化脂質Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩（Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Germany）をモル比５０／４９／１で含む陽イオン性リポソームを、３００mM無ＲＮアーゼ滅菌スクロース溶液中での脂質フィルム再水和により総脂質濃度４．３４mg/mlとなるように調製した。続いて、EmulsiFlex C3装置（Avestin, Inc., Ottawa, CanaDa）を用いた高圧均質化（７５０barで２２サイクルおよび１０００barで５サイクル）により、多ラメラ分散体をさらに加工した。得られたリポソーム分散体を等体積の０．５６２５mg/ml  ｓｉＲＮＡの３００mMスクロース溶液と混合して、核酸主鎖ホスフェート対陽イオン性脂質窒素原子の電荷比の計算値を約１対４とした。リポプレックス分散体の粒径は、Quasi Elastic Light Scattering（N5サブミクロン粒子径分析装置、Beckman Coulter, Inc., Miami, FL）により決定された約１２０nmであった。インビトロ実験には、この分散体を１０%血清含有細胞培地に５〜２０nM  ｓｉＲＮＡの濃度にさらに希釈した。
【０１８８】
動物実験
喘息雄性ヌードマウス（Ｈｓｄ：ＮＭＲＩ−ｎｕ／ｎｕ、８週齢）をこの研究にわたり使用した。樹立した腫瘍異種移植片に関する腫瘍治療実験には、合計５．０×１０６個／１００μlの細胞を（３Ｙ１−ＲａｓＶ１２には５０%マトリゲルの存在下で）を皮下（ｓ．ｃ．）に移植した。腫瘍治療実験には、リポソームｓｉＲＮＡ複合体溶液を低圧低体積尾静脈注射によりｉ．ｖ．投与した。３０ｇのマウスについて０．２８mg/ml  ｓｉＲＮＡおよび２．１７mg/ml脂質（１．８８mg/kg  ｓｉＲＮＡおよび１４．５mg/kg脂質の用量に相当）を含有する原液の注射体積２００μｌを用いて、多様な注射スケジュール（毎日対１日２回）により種々の投薬量を実現した。腫瘍体積をノギスを用いて決定して、体積＝（長さ×幅２）／２という式により計算した。承認されたプロトコールにより、the Landesamt fur Arbeits-, Gesundheitsschutz und technische Sicherheit Berlin, Germany （No. G0264/99）のガイドラインに従って、この研究における全ての動物実験を行った。
【０１８９】
統計解析
データを平均±ＳＥＭとして表現する。差の統計的有意性をＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定により決定した。Ｐ値＜０．０５を統計的に有意とみなした。
【０１９０】
細胞培養およびマウスにおけるｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３取込み実験
細胞培養での非配合ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３分子の取込み研究のために、ＨｅＬａ細胞を所定量のｓｉＲＮＡ溶液と共に無血清培地中で一晩インキュベートした。下記に挙げるように一晩トランスフェクションすることによって、リポプレックス化したｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３細胞の取込みを実施した。処置後の細胞を氷冷ＰＢＳですすぎ、顕微鏡観察の前に４%ホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液で１５分間固定した。後期エンドソームおよびライソソームを標識するために、細胞を製造業者の勧めにより蛍光色素LysoTracker（Molecular Probes）と共にインキュベートして、固定後に共焦点顕微鏡で検査した。配合ｓｉＲＮＡおよび裸のｓｉＲＮＡを静脈内投与することによって、蛍光標識ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３を用いたインビボ送達実験を実施した。最終用量１．８８mg/kg  ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３および１４．５mg/kg脂質の単回２００μl  ｉ．ｖ．注射でマウスを処置した。所定の時点でマウスを屠殺し、蛍光の取込みをホルマリン固定、パラフィン包埋またはＯＣＴに取付けた凍結組織切片のいずれかで顕微鏡により検査した。
【０１９１】
インビトロトランスフェクション
ヒトＨＵＶＥＣ、ＨｅＬａ、ＰＣ−３細胞系およびマウスＥＯＭＡおよびＮＩＨ３Ｔ３細胞系をAmerican Type Culture Collectionから入手し、ＡＴＣＣの推奨に従って培養した。ヒト肝細胞癌細胞系ＨｕＨ−７はMDC, Berlinで入手できた。記載されたように誘導性ＲａｓＶ１２の形質導入によって、発癌性ＲａｓＶ１２を発現しているラット３Ｙ１細胞を作成した３８。
【０１９２】
上記の陽イオン性リポソームを用いて細胞系にｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。簡潔には、細胞接種の約１２時間後に、血清含有培地に希釈した種々の量のｓｉＲＮＡ−リポプレックス溶液を細胞に添加して、１〜５０nM  ｓｉＲＮＡの範囲のトランスフェクション濃度を実現した。トランスフェクション後（４８ｈ）に、細胞を溶解させて、記載されたようにイムノブロットに供した２０。以下の抗体をイムノブロットに使用した：ウサギ抗ＰＴＥＮ（Ａｂ−２、Neomarkers）、モノクローナルｐ１１０α／ｐ８５３９、ウサギ抗ＰＫＮ３３８、ヤギ抗ＣＤ３１（Santa Cruz Biotechnology）、ウサギ抗ＣＤ３４（Santa Cruz Biotechnology）、ウサギ抗リン酸化Ａｋｔ（Ｓ４７３）（Cell Signaling Technology）。
【０１９３】
インビボＢｒｄＵアッセイ
インビボ細胞増殖を測定するために、腹腔内注射によりマウスをＢｒｄＵ（Sigma、２５０mg/kg）で処置して、２時間後に屠殺した。肝臓または腫瘍組織のホルマリン固定パラフィン包埋切片を製造業者のプロトコールによりＢｒｄＵ染色に供した（BrdU In situ detection kit, Pharmingen）。
【０１９４】
毛細血管密度（ＭＶＤ）の決定
単一腫瘍切片からランダムに選択した領域３〜８か所でのＣＤ３１／ＣＤ３４陽性血管を計数することによって、毛細血管の数を決定した２４。形状、分岐点、および管腔の大きさとは無関係に、血管単位としての血管数を調べた（「血管数」と呼ぶ）。追加的に、Axiovision 3.0ソフトウェア（Zeiss）を用いてＣＤ３１／ＣＤ３４陽性血管構造の合計長（「合計血管長」と呼ぶ）の決定により血管密度を評価した。計数をZeiss Axioplan光学顕微鏡を用いて倍率×２００で腫瘍切片をスキャンすることによって行った。
【０１９５】
組織分析および顕微鏡観察
マウスを屠殺した後で、組織を直ちに４．５%緩衝ホルマリン中で１６時間固定して、結果的にパラフィン包埋用に加工し、４μm切片を切り出し、スライドガラスに載せた。ヤギポリクローナル抗ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１（1:1000, Santa Cruz Biotechnology） （凍結切片には代替的にラットＣＤ３１、１：１００、Pharmingen）およびラットモノクローナル抗ＣＤ３４（CeDarlane）で組織切片を染色して、パラフィン切片中の内皮細胞を可視化した。パラフィン組織切片に関する免疫組織化学およびヘマトキシリン/エオシン（Ｈ＆Ｅ）対比染色を標準的なプロトコールにより行った。蛍光標識ｓｉＲＮＡのインビボ取込み研究には、Zeiss Axioplan顕微鏡を用いた落射蛍光によりパラフィン切片を直接検査した。画像を記録して、Zeiss LSM5画像化ソフトウェアを用いて処理した。ｓｉＲＮＡ取込みの徹底的な顕微鏡分析をZeiss LSM510 Meta共焦点顕微鏡で行った。このために、切片をキシレンでパラフィン除去して、工程的エタノール洗浄により再水和して、Sytox Green色素（Molecular Probes１００nM、10分間）で対比染色し、すすぎ、最終的に顕微鏡用FluorSave（Calbiochem）にマウントした。以下の抗体を用いて、すでに記載されたようにＮＩＨ３Ｔ３細胞の免疫蛍光染色を行った４０：免疫組織化学特異的ウサギ抗リン酸化Ａｋｔ（Ｓ４７３）（Cell Signaling Technology）およびマウス抗α-チューブリン（ＤＭ１Ａ、Calbiochem）。
【０１９６】
【表８】
2007536324.tif 000015
【０１９７】
実施例２４： インビトロおよびインビボでの裸のｓｉＲＮＡおよび配合ｓｉＲＮＡの送達
本研究では、両鎖を交互に２’−Ｏ−メチル糖修飾することにより化学的に安定化した、３’−突出を欠如した１９塩基長ｓｉＲＮＡ二本鎖を採用し１６、ここで、未修飾ヌクレオチドは反対側の鎖の修飾ヌクレオチドに向かっている。実際に使用したｓｉＲＮＡ分子を実施例２３に示す。
【０１９８】
第一段階で、我々はこれらの分子が送達ビヒクルの不在下での細胞培養においてＲＮＡｉを仲介するかどうか分析した。イムノブロット分析は、ｓｉＲＮＡ−リポプレックスに使用したナノモル濃度に比べて、マイクロモル濃度で裸のｓｉＲＮＡが適用された場合でも遺伝子サイレンシングが起こらなかったことを実証した。結果を図１８ａに示す。
【０１９９】
図１８ａからさらに詳細に解釈できるように、イムノブロットから評価されるようにリポプレックス化ｓｉＲＮＡではＰＫＮ３タンパク質発現の濃度依存性阻害が存在したが、ＨｅＬａ細胞での裸のｓｉＲＮＡではそうではなかった。ＰＴＥＮ３を負荷対照とした。
【０２００】
我々は未修飾従来型ｓｉＲＮＡ（２１塩基長、ヌクレオチド２個、３’−突出）６およびコレステロール結合ｓｉＲＮＡまたはペプチド連結ｓｉＲＮＡを含めたいくつかの結合分子も試験したが、送達ビヒクルの不在下で内因性タンパク質発現の標的特異的低減を全く検出しなかった（データは示さず）。
【０２０１】
遺伝子サイレンシングの欠如が、陰イオン性ｓｉＲＮＡと負に荷電した細胞膜との間の反発作用が原因の非効率的な細胞取込みの結果であるかどうかを分析するために、我々は、３’蛍光（Ｃｙ３）標識ｓｉＲＮＡを採用して共焦点顕微鏡観察によりそれらの取込みを研究した。我々および他の人々は、送達ビヒクルと共にトランスフェクトしたときに、アンチセンス分子の３’末端での蛍光標識がＲＮＡサイレンシング活性を障害しないと以前に示した１６，１７。我々は、驚くことに高濃度のｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３分子が適用されたときに、トランスフェクション試薬の不在下で蛍光標識ｓｉＲＮＡの有意な取込みを観察した。しかし、大部分の蛍光標識は、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒマーカーの共局在によって実証されるように、後期エンドソーム／ライソソーム小胞で終わるようであった。これは、非配合ｓｉＲＮＡがエンドソーム経路にトラップされたままであることを示唆している。対照的に、リポソーム複合体としてトランスフェクトされたｓｉＲＮＡは、これらの小胞から解離して細胞質に放出された。これらの結果は、ｓｉＲＮＡのリポソーム製剤が、ｓｉＲＮＡの機能的送達に関して少なくとも二つの有益作用、すなわち細胞取込みの改善、および重要なことにはエンドサイトーシス／エンドソーム経路から、ＲＮＡｉ介在性ｍＲＮＡ分解が起こる細胞質への逃避を提供することを示している１８。
【０２０２】
図１８ｂの詳細は以下の通りである。
【０２０３】
図１８ｂは、ネイクドのｓｉＲＮＡおよび配合ｓｉＲＮＡの細胞内分布を示す。左および中央の欄のＨｅＬａ細胞では、蛍光標識ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３を共焦点顕微鏡観察により分析した。右の欄は、LysoTrackerで対比染色後の細胞内分布をマージした写真を示す（緑色：矢印、エンドソーム／ライソソーム区画に関するｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３の局在）。上列：裸のｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３、下列：リポプレックス化されたｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３。
【０２０４】
リポソーム製剤がインビボでｓｉＲＮＡの薬理学的性質を変化させるかどうかを分析するために、マウスの尾静脈に単回用量のｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３分子（１．８８mg/kg  ｓｉＲＮＡ）を注射した（低体積および低圧）。膵臓、肺、腎臓、および前立腺を含めたいくつかの器官の顕微鏡分析から、配合ｓｉＲＮＡでＣｙ３特異的蛍光の有意な増加が示された（データは示さず）。全ての分析時点（注射後１h、４h、２４h、図１８ｃ）で、リポソームに配合されたｓｉＲＮＡで処置されたマウスの肝臓から最大量の蛍光を検出した。この結果は、裸のｓｉＲＮＡを投与したときに比べて、リポプレックスに配合したｓｉＲＮＡ分子がよりよく生体分布することを示す。
【０２０５】
しかし、器官全体での生体分布の改善は、送達されたｓｉＲＮＡの機能性に欠くことができないこれらの分子が細胞内または細胞型特異的に取込まれることを必ずしも示さない。共焦点顕微鏡観察による肝臓への配合ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３の取込みのさらに詳細な分析から、細胞レベルで蛍光染色が血管および洞様血管の内面に主に存在することが明らかとなった（図１８ｃ、下欄）。肝臓血管のさらに精密な検査は、ＰＢＳ対照に比べて内皮層が蛍光ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３ではっきりと標識されていることを明らかにした（図１８ｄ、上列）。内皮細胞内部で、ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３は細胞質に専ら存在する（図１８ｄ、下列）。固定されていない肝凍結切片で同じ染色パターンが観察され、このことから、ホルマリン固定のどのようなアーチファクトも除外される（データは示さず）。蛍光標識したリポプレックス化ｓｉＲＮＡも腫瘍脈管構造を標的とするかどうかを試験するために、我々は、種々の実験腫瘍を保持するマウスをｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３リポプレックスの単回ｉ．ｖ．注射で処置した。三つの実験的腫瘍異種移植片（皮下（ｓ．ｃ．）２個、肝臓内（ｉ．ｈｅｐ）１個）の全てで、我々は、腫瘍脈管構造に有意な蛍光シグナルを検出した（図１８ｅ、矢印）。内皮細胞マーカーである抗ＣＤ３４抗体を用いた対比染色により、腫瘍脈管構造の内皮層によるｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３の取込みを確認した（図１８ｅ、下欄）。さらに、蛍光標識脂質を用いて、内皮によるリポプレックス−ｓｉＲＮＡの取込みを確認した（示さず）。まとめると、これらのデータは、ｓｉＲＮＡの陽イオン性脂質系製剤がｓｉＲＮＡの動特性および分布性を改善して内皮細胞へのｓｉＲＮＡの主な取込みを可能にすることを実証している。
【０２０６】
図１８ｃに示した結果の実験的設定は以下の通りであった。単回ｉ．ｖ．注射によって裸のｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３またはリポプレックス化ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３を投与し、指示した時点の肝臓組織切片を落射蛍光顕微鏡観察により分析した（上欄）。下欄：リポプレックス（右の写真、ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３、赤色；核、Sytox Greenを用いた対比染色による緑色）に比べた非配合ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３（左の写真）の分布を示す肝切片の共焦点顕微鏡拡大像。画像を同設定で記録した。肝臓血管（矢印）および洞様血管（二重矢印）の染色強度を比較されたい。
【０２０７】
図１８ｄの詳細は以下の通りである。ＰＢＳ処置対照切片（左欄）に比べて、肝臓血管の内皮内面は蛍光ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３（右欄）で装飾されている。共焦点顕微鏡観察から、肝臓内皮細胞において配合ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３（赤色、マージ）が細胞質に送達されているのが明らかになった（赤血球、二重矢印）。核では蛍光は検出できない（緑色、矢印）。
【０２０８】
図１８ｅに示した結果についての実験設定は以下の通りであった。矢印で示すようにリポソームに配合したｓｉＲＮＡで、種々の腫瘍の内皮細胞をターゲッティングした（ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３、赤色。核、緑色）。上列は、皮下で成長したＰＣ−３腫瘍（左欄）およびＲａｓＶ１２形質転換３Ｙ１ラット線維芽細胞腫瘍（中央欄）または肝臓内で成長したＨｕＨ−７腫瘍（右欄）からの切片の蛍光像を示す。下列は、ＨｕＨ−７腫瘍の内皮細胞におけるリポソームにより送達されたｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３の検出を示す。Ｈ＆Ｅ染色（左欄）により、薄い細胞質および顕著な核（矢印）が特徴的な腫瘍内皮細胞を示す。連続切片は、内皮細胞の対応するｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３蛍光（赤色、中央欄）および抗ＣＤ３４免疫染色（右欄）をそれぞれ示す。
【０２０９】
実施例２５：  肝臓および腫瘍の内皮細胞へのＰＴＥＮ特異的ｓｉＲＮＡの機能的送達
ｓｉＲＮＡ−リポプレックスがインビボ内皮細胞における内因性遺伝子発現をサイレンシングする能力を実証するために、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）のアンタゴニストである腫瘍抑制因子ＰＴＥＮを標的として選択した。我々は、内皮細胞核でのＢｒｄＵ取込みによるＤＮＡ合成増加を測定することによって、正の読出し系でのＰＴＥＮの機能的遺伝子サイレンシングを監視しようとした。ＰＴＥＮ発現の欠如は、ＰＩ３−キナーゼシグナル伝達を慢性的に活性化することが知られており、それを下流のキナーゼＡｋｔのリン酸化の増加から測定できる１９（図１９ａ）。ＰＩ３−キナーゼの慢性活性化もＤＮＡ合成速度増加に伴う２０。
【０２１０】
最初に、マウスおよびヒトＰＴＥＮ  mＲＮＡをターゲッティングする、選択されたｓｉＲＮＡＰＴＥＮ（実施例２３参照）のＲＮＡｉ活性を、インビトロ脂質介在性トランスフェクションにより立証した（図１９ａ）。各ヌクレオチドに２’−Ｏ−メチル修飾を保有している同一のｓｉＲＮＡ配列を陰性対照として使用した（ｓｉＲＮＡｃｏｎｔｒｏｌ）。それは、この一様な修飾パターンがＲＮＡｉ活性を完全に打ち消すからであり１６、ＰＴＥＮタンパク質のノックダウンおよびＡｋｔのリン酸化増加がイムノブロットにより観察された。免疫蛍光研究から、活性ｓｉＲＮＡＰＴＥＮ分子の存在下でＡｋｔのリン酸化増強が確認された（図１９ａ）。これは、細胞培養においてｓｉＲＮＡＰＴＥＮ分子がＰＩ３−キナーゼシグナル伝達を活性化できることを実証している。
【０２１１】
ＰＴＥＮのインビボ遺伝子サイレンシングを試験するために、ＰＢＳ、裸のｓｉＲＮＡＰＴＥＮ、ｓｉＲＮＡＰＴＥＮ−リポプレックスまたは脂質ビヒクルのいずれかで連続３日間低圧尾静脈注射により、マウス（１群４匹）を処置した（方法の項参照）。処置の４日目にマウスにＢｒｄＵを注射して、２時間後にマウスを屠殺して、ＢｒｄＵの取込みを、ＢｒｄＵ陽性核について肝臓切片を免疫組織染色することにより測定した。内皮細胞のサイズが小さいことおよびリン酸化Ａｋｔ特異的抗体およびＰＴＥＮ特異的抗体を用いて信頼できるシグナルを検出するのが困難であることから、その場でタンパク質のノックダウンを検出できなかった。しかし、内皮細胞への蛍光標識ｓｉＲＮＡの細胞特異的送達が観察されたことに一致して、我々はリポソームｓｉＲＮＡＰＴＥＮの場合にのみ肝臓内皮のＢｒｄＵ陽性核が有意に増加することを観察した（図１９ｂ）。担腫瘍マウスを用いた類似の実験から、リポソームに配合した活性ＰＴＥＮ−ｓｉＲＮＡを用いた処置後に腫瘍内皮のＢｒｄＵ陽性核数が同様に有意に増加することが明らかになった（図１９ｃ）。不活性な、完全メチル化対照分子であるｓｉＲＮＡｃｏｎｔｒｏｌは、ＰＢＳ対照群に比べてＢｒｄＵ取込みの増加を引き起こさなかった。我々は、これらのデータから、陽イオン性脂質と配合された安定化したＰＴＥＮ特異的ｓｉＲＮＡがインビボで機能的であって、全身投与後に内皮細胞に遺伝子サイレンシングを誘導すると結論する。
【０２１２】
図１９ａの詳細は以下の通りである。安定化したＰＴＥＮ特異的ｓｉＲＮＡ（１０nM）のインビトロトランスフェクションは、ＰＴＥＮタンパク質レベルを低減して、イムノブロットにより明らかな下流のキナーゼＡｋｔ（Ｐ＊−Ａｋｔ）のリン酸化を増加させた（右上欄：ＰＩ３−キナーゼサブユニットｐ１１０α、ｐ８５、未影響の負荷対照）。ｓｉＲＮＡｃｏｎｔｒｏｌは、完全メチル化不活性ｓｉＲＮＡＰＴＥＮ分子、ｕｔは未処置細胞を表す。リン酸化Ａｋｔの増加は、ｓｉＲＮＡＰＴＥＮをトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞での免疫蛍光染色によっても可視化された（リン酸化Ａｋｔ、赤色。細胞形態のマーカーとして抗α−チューブリン、緑色）。
【０２１３】
図１９ｂは、ＰＢＳ、裸のｓｉＲＮＡＰＴＥＮ、リポプレックス化ｓｉＲＮＡＰＴＥＮ、および陽イオン性リポソームでそれぞれ処置された動物からの肝臓試料における代表的な写真（上欄）および対応する定量（下図）を表し、ＢｒｄＵ陽性内皮核（矢印）の数に有意差があることを示している（処置毎に写真２枚を示す）。統計的有意：裸のｓｉＲＮＡＰＴＥＮ対ｓｉＲＮＡＰＴＥＮ−リポプレックス、＊Ｐ＝０．０２８６。リポソーム対ｓｉＲＮＡＰＴＥＮ−リポプレックス、＊Ｐ  ＝０．０２８６。
【０２１４】
図１９ｃの詳細は以下の通りである。ＤＮＡ合成に及ぼすリポプレックス化ｓｉＲＮＡＰＴＥＮの配列特異性を、腫瘍脈管構造についてのＢｒｄＵアッセイで確認した。ＢｒｄＵ陽性核（矢印）の増加を、ｓｉＲＮＡｃｏｎｔｒｏｌ−リポプレックスに比べたときのｓｉＲＮＡＰＴＥＮ−リポプレックスで処置された動物からの腫瘍血管（Ｖ）から検出した。Ｔｕ：腫瘍組織。内皮細胞でのＢｒｄＵ陽性核の定量は有意に増加した：ｓｉＲＮＡｃｏｎｔｏｒｏｌ−リポプレックス対ｓｉＲＮＡＰＴＥＮ−リポプレックス、＊Ｐ＝０．０３２。
【０２１５】
実施例２６：  ＣＤ３１のインビボ遺伝子サイレンシング
インビボｓｉＲＮＡ介在性遺伝子サイレンシングをより直接的に実証するために、我々は、内皮細胞に選択的に発現した遺伝子のターゲッティングに集中した。我々は、適切な標的としてＣＤ３１としても公知である血小板−内皮細胞接着分子１（ＰＥＣＡＭ−１）を選択した。それは、その発現が脈管構造の細胞、主に内皮細胞ならびに血小板、単球、好中球、および選択されたＴ細胞に限られるからである２１−２３。
【０２１６】
マウスおよびヒト由来内皮細胞系（ＨＵＶＥＣ、ＥＯＭＡ）を用いた２’−Ｏ−メチル修飾ｓｉＲＮＡ分子のスクリーニング（実施例２３参照）から、いくつかの強力なヒトおよびマウス特異的ＣＤ３１−ｓｉＲＮＡ分子の同定に至った（図２０ａ）。最も強力なｓｉＲＮＡ分子であるｓｉＲＮＡＣＤ３１−８を、実施例２３に記載されたようにリポソームに配合し、２または７日間連続して担腫瘍マウスに全身投与した。等張スクロース溶液またはリポプレックス化ｓｉＲＮＡＰＴＥＮで対照マウスを処置して、特異性を試験した。処置後に、マウスを屠殺して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（TaqMan）およびイムノブロットにより多様な組織で遺伝子サイレンシングを分析した。
【０２１７】
ｓｉＲＮＡＣＤ３１−８−リポプレックスで処置されたマウスにおけるＣＤ３１  ｍＲＮＡレベルの低減が、腫瘍、肝臓、および肺試料で観察されたが、脾臓組織試料では観察されなかった。ＣＤ３１  ｍＲＮＡレベルの観察された低減は、ＲＮＡｉの作用機序がｍＲＮＡ開裂に基づくことを指摘している（図２０ｂ）。さらに、対照マウスで変化していないタンパク質レベルが観察されたことに比べて、ｓｉＲＮＡＣＤ３１−８−リポプレックスで連続する２日間処置されたマウスの腫瘍および肝臓溶解液から、ＣＤ３１タンパク質レベルの有意な低減が検出された（図２０ｃ、左欄）。
【０２１８】
特異性および等しい負荷を試験するために、我々は、これらの溶解液中の、別の内皮細胞マーカータンパク質であるＣＤ３４およびＰＴＥＮのタンパク質レベルを平行して分析した。我々は、脾臓および肺からの全細胞抽出物も検査したが、これらの器官から、信頼できるＣＤ３１タンパク質の発現はイムノブロット分析により検出されなかった（データは示さず）。ＣＤ３１タンパク質のノックダウンが１日１回７日間のｉ．ｖ．注射により非担腫瘍マウスでの独立した実験で確認された（図２０ｃ、右欄）。
【０２１９】
さらに、異種移植片腫瘍マウスモデルにおける内皮マーカーＣＤ３１およびＣＤ３４についての毛細血管密度（ＭＶＤ）の差を測定することによって、ＣＤ３１発現の低減もその場で明らかとなった。ＭＶＤ測定は、腫瘍血管形成についての代理マーカーであり、ＣＤ３１またはＣＤ３４特異的抗体を用いた血管の免疫組織化学染色により分析される２４−２６。配合されたＣＤ３１およびＰＴＥＮ特異的ｓｉＲＮＡを、一定体積（２００μl）および一定圧で２日間担腫瘍マウス（腫瘍サイズ８００ｍｍ３）に尾静脈注射により投与した。３日目にマウスを屠殺して、それぞれＣＤ３１およびＣＤ３４抗体を用いた免疫染色後に、連続した切片の間でＭＶＤを比較した。
【０２２０】
リポプレックス化ｓｉＲＮＡＣＤ３１−８で処置されたマウスは、血管の総数および血管長により測定されるＣＤ３１陽性血管の総量に統計的に有意な減少を示した（図２０ｄ）。ＣＤ３４特異的抗体を用いた染色は、ＭＶＤの変化を明らかにせず、これは、特異的ＣＤ３１サイレンシングが生じたことをもう一度示している。両対照群、すなわちｓｉＲＮＡＰＴＥＮおよび等張スクロース処置群は、ＣＤ３１またはＣＤ３４染色のどちらでもＭＶＤ評価の差を示さなかった。この結果は、ｍＲＮＡおよびタンパク質ノックダウンに関する分子データと共に、リポプレックス化ｓｉＲＮＡＣＤ３１−８の全身投与に応答してＣＤ３４陽性内皮細胞が減少せずにＣＤ３１発現が特異的に低減することを示している。我々は、陽イオン性脂質に配合したｓｉＲＮＡを投与することによって、腫瘍および肝臓の脈管構造におけるインビボＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）遺伝子サイレンシングを実現できると結論した。
【０２２１】
図２０ａの詳細は以下の通りである。図２０ａは、効果的なＣＤ３１ノックダウンのための強力な安定化ｓｉＲＮＡの同定を示す。ＨＵＶＥＣおよびマウスＥＯＭＡ細胞にＣＤ３１をターゲッティングしている４つの異なるヒト、マウス特異的ｓｉＲＮＡ（ＣＤ３１−１、−２、−６、−８）および対照ＰＴＥＮ−ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。抗ＣＤ３１および抗ＰＴＥＮを用いたイムノブロットにより特異的タンパク質ノックダウンを評価し、ｓｉＲＮＡＣＤ３１−８分子が最高の有効性であることを実証した。
【０２２２】
図２０ｂの詳細は以下の通りである。２日間連続でリポプレックス化ｓｉＲＮＡＣＤ３１−８のｉ．ｖ．注射により処置されたマウスは、定量的TaqMan  ＲＴ−ＰＣＲにより明らかとなるように、ある組織でのＣＤ３１  ｍＲＮＡレベルの低減を示した。ＰＴＥＮ  mＲＮＡレベルに対してＣＤ３１  ｍＲＮＡの相対量を標準化した。
【０２２３】
図２０ｃの詳細は以下の通りである。抗ＣＤ３１抗体および抗ＰＴＥＮならびにタンパク質負荷が等しいことを示すための抗ＣＤ３４（別の内皮マーカータンパク質）を用いて肝臓および腫瘍からの抽出物を用いたイムノブロット分析によって、ｓｉＲＮＡＣＤ３１−８−リポプレックスで全身処置されたマウスにおけるＣＤ３１タンパク質ノックダウンを確認した。２日間（左欄：肝臓および腫瘍）または７日間連続（右欄：肝臓）でｉ．ｖ．注射することによりマウスを処置した。ｓｉＲＮＡＣＤ３１−リポプレックス処置動物では、肝臓および腫瘍におぇりＣＤ３１タンパク質ノックダウンが観察された（動物２、左欄参照）が、等張スクロース溶液またはｓｉＲＮＡＰＴＥＮ−リポプレックスで処置されたマウスでは観察されなかった（動物１、３参照）。７日間の処置方式で、対照動物４、７、および８（右欄）に比べて動物５および６で、実質的なＣＤ３１ノックダウンが観察された。インビボ研究に使用したｓｉＲＮＡＣＤ３１−８−リポプレックスの機能性をＨＵＶＥＣ細胞で平行して立証した（１０nm  ｓｉＲＮＡ）。
【０２２４】
図２０ｄの詳細は以下の通りである。等張スクロース、ｓｉＲＮＡＣＤ３１−８−リポプレックス、およびｓｉＲＮＡＰＴＥＮ−リポプレックスで処置された対応するマウスからのパラフィン腫瘍切片の免疫染色により、ＣＤ３１タンパク質のインビボノックダウンを直接評価した。それぞれ抗ＣＤ３１および抗ＣＤ３４抗体で連続する切片を染色して、腫瘍脈管構造を可視化した。ＣＤ３４ではなくＣＤ３１に対する染色強度の低減が、ｓｉＲＮＡＣＤ３１−８−リポプレックスで処置されたマウスからの腫瘍切片で見出された。ｓｉＲＮＡＣＤ３１−８−リポプレックスで処置されたマウスからの試料で低減したＭＶＤを示している、ＣＤ３１陽性血管の（血管数（上図）および血管の合計長（下図）により決定された）ＭＶＤの定量。この差は、ＣＤ３４陽性血管のＭＶＤ測定では観察されなかった。
【０２２５】
本明細書に開示された抗ＣＤ３１  ｓｉＲＮＡ分子に関連して、本出願の開示は、任意の抗ＣＤ３１  ｓｉＲＮＡ分子に、さらに好ましくは抗ＣＤ３１−８  ｓｉＲＮＡ分子に関連して開示された、本明細書に示されて記載された修飾パターンを示している任意の抗ＣＤ３１  ｓｉＲＮＡ分子に関するものであることに留意すべきである。
【０２２６】
実施例２７：  腫瘍モデルにおける全身投与されたｓｉＲＮＡＣＤ３１−リポプレックスの有効性
本実施例では、ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１に対する配合ｓｉＲＮＡが腫瘍の成長に任意の治療的潜在性を表すかどうかという問題に取組んだ。
【０２２７】
ＣＤ３１は、血管／血小板の形成および機能に関する多様な細胞メカニズムに関与すると意味づけられている２３，２７，２８が、腫瘍成長時の血管新生に対するＣＤ３１の潜在的寄与についてはまだ取組まれていない。治療方法に選択されたｓｉＲＮＡ分子は、対照分子として特異的ｓｉＲＮＡＣＤ３１−８およびｓｉＲＮＡＰＴＥＮを含んだ。インビボ実験の前にＨＵＶＥＣでの用量依存性トランスフェクション実験で、インビボ有効性研究用のｓｉＲＮＡＣＤ３１−８−リポプレックスおよびｓｉＲＮＡＰＴＥＮ−リポプレックスを試験した。これらのｓｉＲＮＡ−リポプレックスの機能性および効力を実証している代表的なイムノブロットを図２１ａに示す。
【０２２８】
これらの製剤を用いて低サブナノモル濃度範囲でのｓｉＲＮＡＣＤ３１−８を用いて、ＣＤ３１タンパク質のノックダウンを実現した。ＰＴＥＮ、リン酸化Ａｋｔ、およびＣＤ３４に関してプロービングすることによって、ｓｉＲＮＡＣＤ３１−８介在性遺伝子サイレンシングの特異性を実証した。ｓｉＲＮＡＰＴＥＮを用いたトランスフェクションとは異なり、ＨＵＶＥＣ細胞において、Ａｋｔのリン酸化状態はＣＤ３１の低減により影響されなかった。未処置対照と比べたとき、ＣＤ３４タンパク質レベルは、両リポプレックスで変化しなかった。２つの異なる種類のｓ．ｃ．腫瘍異種移植片を保持するマウスで、全身投与したＣＤ３１−ｓｉＲＮＡ−リポプレックスの潜在的治療効果を検討した。
【０２２９】
最初に、我々は種々のリポプレックス１日量を用いた繰返し全身処置を可能にする方式を樹立した。リポプレックス溶液２００μlの１日１回または１日２回尾静脈注射の投与によって種々の総用量を実現した（単回用量１．８８mg/kg/d  ｓｉＲＮＡ、１４．５mg/kg/d脂質）。我々は、全身の健康の全般的なマーカーとして体重変化を監視することによって評価したとき、動物の健康状態に重篤な毒性作用は観察されなかった（図２１ｂ）。
【０２３０】
次に、我々は、腫瘍成長の阻害に及ぼすｓｉＲＮＡＣＤ３１−８−リポプレックスの有効性研究で１日１回または１日２回いずれかのｉ．ｖ．処置を表す二つの投与方式を分析した。両処置方式は、リポプレックスｓｉＲＮＡＣＤ３１−８を用いて樹立した速やかに成長している３Ｙ１−ＲａｓＶ１２のｓ．ｃ．異種移植片の腫瘍成長に明らかな阻害作用を招いた（図２１ｃ）。とりわけ、この特定の腫瘍異種移植片について１日２回の方式が腫瘍成長に及ぼす阻害作用を改善した。ｓｉＲＮＡＰＴＥＮ−リポプレックス処置対照群およびスクロース処置対照群に比べたときに、この阻害は統計的に有意であった（図２１ｃ）。
【０２３１】
追加の実験では、リポソームに配合したｓｉＲＮＡＣＤ３１−８を用いた低成長性ｓ．ｃ．ＰＣ−３腫瘍異種移植片の全身処置は、ｓｉＲＮＡＰＴＥＮ対照に比べて腫瘍成長に有意な遅延を同様に引き起こした（図２１ｄ）。まとめると、インビボ異種移植片実験は、リポソームに配合したＣＤ３１−ｓｉＲＮＡの全身投与によって、ヌードマウスにおける腫瘍細胞の成長を抑制できることをはっきりと実証している。これらのデータは、非古典的薬物標的であるＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）がＲＮＡｉに基づく抗血管形成治療介入に対する適切な標的と思われることも暗示している。
【０２３２】
図２１ａの詳細は以下の通りである。全身腫瘍処置に使用したリポプレックス化ｓｉＲＮＡの、ＨＵＶＥＣでの品質管理および有効性試験。抗ＣＤ３１抗体を用いたイムノブロットから、対照ｓｉＲＮＡＰＴＥＮではなく、ｓｉＲＮＡＣＤ３１−８の場合にＣＤ３１の濃度の依存したノックダウンが明らかとなった。ＣＤ３１の低減は、Ａｋｔリン酸化状態（Ｐ＊−Ａｋｔ）を監視することによって明らかになるように、ｓｉＲＮＡＰＴＥＮ対照に比べてＰＩ３−キナーゼシグナル伝達に作用を有さなかった。ＣＤ３４タンパク質レベルは影響されなかった。
【０２３３】
図２１ｂの詳細は以下の通りである。体重に及ぼす二つの異なるｓｉＲＮＡ−リポプレックス用量の影響を監視した。異なるｓｉＲＮＡＰＴＥＮ−リポプレックス用量（四角：１．８８mg/kg/d  ｓｉＲＮＡおよび１４．５mg/kg/d脂質となる１日１回の注射、菱形：３．７５mg/kg/d  ｓｉＲＮＡおよび２８．９mg/kg/dとなる１日２回注射（８時間間隔））を連続７日間投与して、体重変化を測定して、平均値としてプロットした（ｎ＝マウス７匹）。比較のために、等張スクロース溶液（丸印）で処置された動物の体重（平均±ＳＥＭ）を示す。
【０２３４】
図２１ｃおよび２１ｄの詳細は以下の通りである。ＣＤ３１−ｓｉＲＮＡ−リポプレックス処置による腫瘍成長の阻害。ヌードマウスに二つの異なる腫瘍異種移植片（ｃ：３Ｙｌ−ＲａｓＶ１２、ｄ：ＰＣ−３）をｓ．ｃ．で樹立した（ｃ：左図：ｎ＝一群マウス８匹、右：ｎ＝一群マウス７匹。ｄ：ｎ＝一群マウス８匹）。担腫瘍マウスをｓｉＲＮＡＣＤ３１−８−リポプレックス（菱形）、ｓｉＲＮＡＰＴＥＮ−リポプレックス（三角）、または等張スクロース（黒四角）で処置した。示したように異なる処置方式を適用した：一重矢印１日１回、二重矢印１日２回。（ｃ）樹立した３Ｙ１−ＲａｓＶ１２腫瘍の成長は、１日２回投与方式を適用することによってｓｉＲＮＡＰＴＥＮ−リポプレックスに比べたときにｓｉＲＮＡＣＤ３−８−リポプレックスにより有意に阻害された（右図）。（ｄ）樹立したＰＣ−３異種移植片の成長は、示されたように投与されたｓｉＲＮＡＰＴＥＮ−リポプレックスに比べて、ｓｉＲＮＡＣＤ３１−８−リポプレックスで有意に阻害された（１．８８mg/kg/d  ｓｉＲＮＡ、１４．５mg/kg/d脂質、矢印）。データは平均±ＳＥＭを表す。有意：Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙにより＊Ｐ＜０．０５。
【０２３５】
以下の参照は、実施例２３から２８に固有であり、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０２３６】
【表９】
2007536324.tif 000016
2007536324.tif 000017
【０２３７】
明細書、特許請求の範囲、および／または図面に開示された本発明の特性は、個別に、およびその任意の組み合わせの両方で、本発明を多様な形態で実現するための材料であり得る。
【図面の簡単な説明】
【０２３８】
【図１】本発明による陽イオン性脂質の基本設計を示す図である。
【図２】本発明による化合物を合成するための可能な出発物質であるＮ−オレイル−パルミチルアミンの合成を示す図であり、ここで、当該合成はＵＳ６，３９５，７１３に記載された従来技術によるものである。
【図３】本発明による重要な出発物質であるＮ−オレイル−パルミチルアミンの合成を示す図である。
【図４】β−アルギニル−２，３−アミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリド、β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドトリヒドロクロリド、およびε−アルギニル−リシン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドトリヒドロクロリドの合成を示す図である。
【図５】β−アルギニル−２，３−アミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリド、β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドトリヒドロクロリド、およびε−アルギニル−リシン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドトリヒドロクロリドの合成を示す図である。
【図６】β−アルギニル−２，３−アミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリド、β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドトリヒドロクロリド、およびε−アルギニル−リシン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドトリヒドロクロリドの合成を示す図である。
【図７】β−アルギニル−２，３−アミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリド、β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドトリヒドロクロリド、およびε−アルギニル−リシン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドトリヒドロクロリドの合成を示す図である。
【図８】β−アルギニル−２，３−アミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリド、β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドトリヒドロクロリド、およびε−アルギニル−リシン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドトリヒドロクロリドの合成を示す図である。
【図９】β−アルギニル−２，３−アミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリド、β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドトリヒドロクロリド、およびε−アルギニル−リシン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドトリヒドロクロリドの合成を示す図である。
【図１０】本発明による陽イオン性脂質の合成のための代替構成要素である代替陽イオン性頭基の合成を示す図である。
【図１１−１】ベータ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリドの合成のための代替合成経路を示す図である。
【図１１−２】ベータ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリドの合成のための代替合成経路を示す図である。
【図１２Ａ】本発明による脂質製剤の粒径分布および押出しおよび高圧均質化それぞれの影響を示す図である。
【図１２Ｂ】本発明による脂質製剤の粒径分布および押出しおよび高圧均質化それぞれの影響を示す図である。
【図１３】凍結保護剤に曝露されて異なる温度で保存されたＲＮＡｉ含有脂質製剤のウエスタンブロット分析の結果を示す図である。
【図１４】ヘルパー脂質が異なる脂質製剤に及ぼす種々のｓｉＲＮＡ負荷の影響に関するウエスタンブロット分析の結果を示す図である。
【図１５】ウエスタンブロット分析の結果および種々の濃度のＰＥＧ置換脂質の影響を示す図である。
【図１６】ＲａｓＶ１２依存性腫瘍マウスモデルを作成するために使用した実験設定および多様な製剤の試験におけるその使用を示す図である。
【図１７Ａ】種々の製剤を用いた、細胞による攻撃後の日数の関数としての腫瘍体積を示す図である。
【図１７Ｂ】種々の製剤を用いた、細胞による攻撃後の日数の関数としての腫瘍体積を示す図である。
【図１７Ｃ】種々の製剤を用いた、細胞による攻撃後の日数の関数としての腫瘍体積を示す図である。
【図１８−１】（ａ）裸のＰＫＮ３特異的ｓｉＲＮＡおよびリポプレックス化ＰＫＮ３特異的ｓｉＲＮＡの作用のウエスタンブロット分析の結果を示す図である。  （ｂ）裸のｓｉＲＮＡおよび配合ｓｉＲＮＡ細胞内分布を示す共焦点顕微鏡写真である。
【図１８−２】（ｃ）肝臓でのリポソーム製剤および裸のｓｉＲＮＡの分布を示す落射蛍光顕微鏡写真（上欄）および共焦点顕微鏡写真（下欄）である。  （ｄ）リポソームに配合したｓｉＲＮＡでターゲッティングした内皮細胞の落射蛍光顕微鏡写真および共焦点顕微鏡写真である。
【図１８−３】（ｅ）種々の腫瘍内皮細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図１９−１】（ａ）ＤＮＡ合成に及ぼすＰＴＥＮに対するｓｉＲＮＡの作用機序の略図であり、異なるｓｉＲＮＡ種を用いたウエスタンブロット分析の結果および前記異なるｓｉＲＮＡ種で処置されたＨＥＬＡ細胞の免疫蛍光顕微鏡写真を示す図である。
【図１９−２】（ｂ）異なるｓｉＲＮＡ分子で処置された内皮細胞の写真および肝臓内皮細胞におけるＢｒｄＵアッセイの結果を表わす図である。  （ｃ）異なるｓｉＲＮＡ分子で処置された内皮細胞の写真および腫瘍内皮細胞におけるＢｒｄＵアッセイの結果を表わす図である。
【図２０−１】（ａ）効果的なＣＤ３１ノックダウンのための強力なｓｉＲＮＡ分子を決定するためのウエスタンブロット分析の結果を示す図である。  （ｂ）マウスの種々の器官におけるＣＤ３１  ｍＲＮＡレベルに及ぼす抗ＣＤ３１ｓｉＲＮＡの作用を例示する図である。  （ｃ）抗ＣＤ３１  ｓｉＲＮＡ分子を用いてマウスの種々の器官におけるＣＤ３１タンパク質のノックダウンの有効性を決定するためのウエスタンブロット分析の結果を示す図である。
【図２０−２】（ｄ）抗ＣＤ３１  ｓｉＲＮＡ分子で処置されたマウスのパラフィン腫瘍切片の直接免疫染色によるＣＤ３１タンパク質のインビボノックダウンの結果を示す図である。
【図２１】（ａ）ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＰＴＥＮ、およびｐ−Ａｋｔのノックダウンに及ぼす抗ＣＤ３１  ｓｉＲＮＡおよび抗ＰＴＥＮ  ｓｉＲＮＡ分子の有効性を研究するウエスタンブロット分析の結果を示す図である。  （ｂ）時間の関数として被験動物の体重に及ぼす異なるパターンのリポプレックス投与の作用を例示する図である。  （ｃ）二つの異なる腫瘍異種移植片の体積に及ぼす異なる抗ＣＤ３１  ｓｉＲＮＡの処置方式の作用を例示する図である。  （ｄ）抗ＣＤ３１処置方式での、樹立されたＰＣ−３異種移植片の成長阻害を例示する図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
2007536324.tif 000033
【図１１−２】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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