(57)【要約】【課題】多数の細胞を凍結保存する動物細胞の凍結保存において、凍結融解後の高い生存率と優れた細胞活性が達成される動物細胞のガラス化凍結保存方法を提供する。【解決手段】ガラス化液中で１×１０３個以上の細胞を１〜１×１０６個／μｌの細胞濃度で凍結保存するガラス化凍結保存方法であって、凍結された細胞の融解操作において、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する培養液に細胞を暴露しながら融解し、その後に細胞から該培養液を除き、新鮮な培養液に細胞を暴露する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラス化液中で１×１０３個以上の細胞を１〜１×１０６個／μｌの細胞濃度で凍結保存するガラス化凍結保存方法であって、凍結された細胞の融解操作において、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する培養液に細胞を暴露しながら融解し、その後に細胞から該培養液を除き、新鮮な培養液に細胞を暴露することを特徴とする、動物細胞のガラス化凍結保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞のガラス化凍結保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物の細胞又は組織の優れた保存技術は、様々な産業分野で求められている。一般に、生体内から採取された細胞又は組織は、たとえ培養液の中であっても、次第に活性が失われていくことから、生体外での細胞又は組織の長期間の培養は好ましくない。そのため、生体活性を失わせずに長期間保存するための技術が重要である。優れた保存技術によって、採取された細胞又は組織をより正確に分析することが可能となり、より高い生体活性を保ったまま細胞又は組織を移植に用いることで、移植後の生着率の向上が望める。さらには、生体外で培養した培養皮膚、生体外で構築したいわゆる細胞シートのような移植のための人工の組織を、順次生産して保存しておき、必要なときに使用することも可能となり、研究・医療の面だけではなく、産業面においても大きなメリットが期待できる。
【０００３】
細胞の保存方法として、例えば緩慢凍結法が知られている。この方法では、まず、例えばリン酸緩衝生理食塩水等の生理的溶液に耐凍剤を含有させることで得られた保存液に、細胞又は組織を浸漬する。該耐凍剤としては、グリセロール、エチレングリコール等の化合物が用いられる。該保存液に、細胞又は組織を浸漬後、比較的遅い冷却速度（例えば０．３〜０．５℃／ｍｉｎの速度）で、−３０〜−３５℃まで冷却することにより、細胞内外又は組織内外の溶液が十分に冷却され、粘性が高くなる。このような状態で、該保存液中の細胞又は組織をさらに液体窒素の温度（−１９６℃）まで冷却すると、細胞内又は組織内とその周囲の微少溶液がいずれも非結晶のまま固体となるガラス化が起こる。ガラス化により、細胞内外又は組織内外が固化すると、実質的に分子の動きがなくなるので、ガラス化された細胞又は組織を液体窒素中に保存することで、半永久的に保存できると考えられる。
【０００４】
しかしながら、前記緩慢凍結法では、比較的遅い冷却速度で冷却する必要があるために、凍結保存のための操作に時間を要する。また、温度制御をするための装置又は治具を必要とする問題がある。加えて、前記緩慢凍結法では、細胞外又は組織外の保存液中に氷晶が形成されるので、細胞又は組織が該氷晶により物理的に損害を受けるおそれがある。
【０００５】
上記した緩慢凍結法での問題点を解決するための方法として、ガラス化凍結保存法が提案されている。ガラス化凍結保存法とは、グリセロール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシドなどの耐凍剤を多量に含む水溶液の凝固点降下により、氷点下でも氷晶ができにくくなる原理を用いたものである。この水溶液を急速に液体窒素中で冷却させると氷晶を生じさせないまま固体化させることができる。このように固体化することをガラス化凍結という。また、耐凍剤を多量に含む水溶液をガラス化液という。
【０００６】
前記ガラス化法の具体的な操作としては、ガラス化液に細胞を浸漬させ、その後、液体窒素の温度（−１９６℃）で冷却する。ガラス化法は、このような簡便かつ迅速な工程であるために、凍結保存のための操作に長い時間を必要としない他、温度制御をするための装置又は治具を必要としないという利点がある。
【０００７】
ガラス化凍結保存法を用いると、細胞内外のいずれにも氷晶が生じないために凍結時及び融解時の細胞への物理的障害（凍害）を回避することができるが、ガラス化液に含まれる高濃度の耐凍剤には化学的毒性がある。
【０００８】
前記したガラス化凍結保存法の適用は、一般的には、低耐凍性の観点から緩慢凍結法では凍結融解後の生存率・細胞活性の点で満足できない細胞に限られる。具体的な細胞種としては、胚、卵子、精子、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等に未だ限られるのが現状である。その他の培養細胞については緩慢凍結法が一般的な凍結方法であると同時に、緩慢凍結法による凍結融解後の生存性がたとえ悪くても、培養・増殖により、産業や試験研究への利用が可能である。このような背景から、培養細胞におけるガラス化凍結保存についての報告は極めて限定的である。
【０００９】
胚や卵子のガラス化凍結保存法は、ストロー法やクライオトップ法などの方法で行われるが、いずれの方法においても、前記緩慢凍結法と比較して、極少量のガラス化液と共に胚や卵子を凍結することで、胚や卵子の凍結速度を向上させ、細胞がガラス化液に暴露される時間、つまりは凍結までの時間を短縮し、ガラス化液の化学的毒性を回避する手法がとられている。これらの方法は、一般に数個程度（多くても２０個以内）の細胞の凍結保存に適用される方法である。
【００１０】
ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等に代表される動物細胞のガラス化凍結保存は、耐凍剤を含むガラス化液中に動物細胞を分散し、凍結バイアルに充填し、凍結バイアルを液体窒素に浸漬させ、凍結する方法が行われている。一般に、ガラス化凍結保存法を用いた場合、動物細胞の凍結融解後の生存率は５０％以下であり、依然として低い。しかしながら、前記緩慢凍結法を用いた場合には、生存率が数％であることから、前記したＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の動物細胞の保存にあたっては、化学的毒性が高いにもかかわらずガラス化凍結保存法が使用されている。このような背景のもとに、より生存率の高い凍結保存方法の開発が望まれている。また、凍結バイアルを用いた凍結保存方法は、一般に１×１０３個以上の動物細胞の凍結保存に用いられ、凍結バイアル中の保存液に対し、１〜１×１０６個／μｌの細胞密度で保存される。
【００１１】
特許文献１には、約３０容量％のエチレングリコールと１Ｍのスクロースを含有するガラス化液または約４０容量％のエチレングリコールと１Ｍのスクロースを含有するガラス化液を用いて哺乳動物の胚または卵子を保存する方法が記載されている。また、ガラス化液に暴露する前に約１５容量％のエチレングリコール溶液または約１０容量％のグリセロール溶液で５〜１０分間平衡処理する方法が記載されている。
【００１２】
特許文献２では、ヒトの不妊治療分野で使用されている前記クライオトップ法という方法で、卵付着保持用ストリップとして短冊状の可撓性かつ無色透明なフィルムを使用した卵凍結保存用具を使用して、該フィルム上に極少量のガラス化液と共に卵子又は胚を顕微鏡下で付着させ、凍結保存する方法が提案されている。
【００１３】
特許文献３では、多能性幹細胞を凍結保存するための媒体として、ジメチルスルホキシド、プロピレングリコール、アセトアミド、保存が企図される前記多能性幹細胞に応じた培地を含む媒体が提案されている。
【００１４】
特許文献４では、１０〜２０個の分散された哺乳動物前胞状卵胞をコラーゲンゲル内に包埋し、凍結保護剤溶液に浸漬させた後、凍結保存する方法が提案されている。
【００１５】
特許文献５では、１×１０３個以上の多数の幹細胞の緩慢凍結保存方法において、ヒドロキシエチルスターチとジメチルスルホキシドとエチレングリコールを含有する媒体を用いると好適に緩慢凍結保存できることが記載されている。なお、凍結・解凍工程の後に、ＲＯＣＫ阻害剤を添加した培地で培養することによって好適な細胞生存性が得られることも記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開２０００−１８９１５５号公報
【特許文献２】特開２００６−２７１３９５号公報
【特許文献３】特許第４７０５４７３号公報
【特許文献４】特開２００１−２２６２０１号公報
【特許文献５】国際公開第２０１３／１８７０７７号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
特許文献１で提案されている方法は、ストローの内径が制限されるために、通常、１×１０３個以上の細胞を凍結保存するような動物細胞の凍結保存には適さない。また、特許文献１では、ガラス化液の液量を胚または卵子１個あたり０．５μｌ以下とすることで凍結が迅速となり、生存率が高く維持されることが記載されている。特許文献１で提案されている方法を用いて、単純に１×１０３個以上の多数の動物細胞を一度に凍結保存すると、使用するガラス化液の液量が多くなるために迅速な凍結速度が得られずに、ガラス化液の毒性が強く発現し、満足な生存率は得られない。
【００１８】
特許文献２で提案されている方法は、幅０．５〜２．０ｍｍ程度の樹脂フィルム上に極少量のガラス化液と共に胚を凍結する方法であり、特許文献１の場合と同様に、多数の動物細胞を凍結保存するような動物細胞の凍結保存には適さない。
【００１９】
特許文献３で提案されている媒体を動物細胞のガラス化凍結保存法に用いて凍結保存しても、凍結融解後の細胞の生存率は不十分であった。
【００２０】
特許文献４で提案されている方法は、細胞の回収率は９０％程度と高いものの、生存率が２０％程度と極端に低く、十分満足できるものではなかった。
【００２１】
特許文献５で提案されている方法は緩慢凍結法に関し、ガラス化凍結法と比較してプログラムフリーザーのような特殊な装置を必要とするほか、凍結工程にも時間がかかるなど煩雑な工程ではあるが、培養時のＲＯＣＫ阻害剤の添加が細胞の生存率に好適に作用することを記載している。
【００２２】
本発明は、多数の動物細胞を凍結保存する動物細胞のガラス化凍結保存において、ガラス化凍結融解後に高い生存率と回収率が達成される動物細胞のガラス化凍結保存方法を提供することを主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下の方法によって、上記課題を解決できることを見出した。
【００２４】
ガラス化液中で１×１０３個以上の細胞を１〜１×１０６個／μｌの細胞濃度で凍結保存するガラス化凍結保存方法であって、凍結された細胞の融解操作において、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する培養液に細胞を暴露しながら融解し、その後に細胞から該培養液を除き、新鮮な培養液に細胞を暴露することを特徴とする、動物細胞のガラス化凍結保存方法。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、１×１０３個以上の多数の細胞を凍結保存する際、細胞の高い生存率と優れた細胞活性が達成される動物細胞のガラス化凍結保存方法を提供することができる。また、本発明のガラス化凍結保存方法は、特別な装置・器具を必要とせず、従来の哺乳動物細胞の培養に用いられる装置・器具を用いて簡便に行うことができる。さらに、本発明のガラス化凍結保存方法を用いると、従来の緩慢凍結法よりもより短時間で細胞の凍結保存操作を行うことができる。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明のガラス化凍結保存方法は、動物細胞のコロニー又はシングルセルの凍結保存に用いることができる。コロニー又はシングルセルを形成する該細胞として、例えば、動物の培養細胞を挙げることができる。培養細胞は、ヒト細胞又はヒト以外の動物の細胞であって、例えば、初代培養細胞、継代培養細胞、及び細胞株細胞等が挙げられる。また、細胞種としては、線維芽細胞、肝ガン細胞等のがん細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、神経細胞、組織幹細胞、胚性幹細胞、及び免疫細胞等の接着性細胞が挙げられる。本発明のガラス化凍結保存方法は、特に、肝細胞の凍結保存において好適に利用できる。本発明において、コロニーとは数個又はそれ以上の細胞からなる細胞集団をさし、シングルセルとは、１個の細胞をさす。コロニー又はシングルセルの形態で、複数の種類の細胞を単一の保存液中に含んでいても良い。また、複数の種類の細胞からなるクラスター状の細胞塊の形態で複数の種類の細胞を単一の保存液中に含んでいても良い。また、細胞以外に細胞外マトリックスのような非細胞性の物質を含むものであっても良い。
【００２７】
本発明におけるガラス化凍結保存方法とは、細胞を極低温下で凍結させる「凍結操作」と、極低温下で細胞を保存する「貯蔵操作」と、貯蔵された細胞を再度使用するために融解又は解凍する「融解操作」の一連の操作手順を含むものとする。
【００２８】
本発明におけるガラス化凍結とは、比較的遅い冷却速度（例えば０．３〜０．５℃／ｍｉｎの速度）で凍結する所謂緩慢凍結法とは異なり、極低温の冷媒（例えば液体窒素）を用いて速い冷却速度で、氷晶形成を抑制しながら凍結させる方法をさす。ガラス化凍結における冷却速度は、例えば、チノー社製シース型熱電対（先端外径０．３ｍｍ）を用いて測定される０℃から−１５０℃までの冷却速度が２００℃／ｍｉｎ以上である。
【００２９】
本発明のガラス化凍結保存方法は、通常の緩慢凍結法を用いて凍結保存されるような、例えば、１つの凍結バイアル当たり１×１０３個以上の動物細胞、より好ましくは１×１０３〜１×１０８個の動物細胞の凍結保存に用いることができる。また、凍結保存される際の細胞密度は、通常の緩慢凍結法と同様に、凍結バイアル中の保存液（ガラス化液）に対して、１〜１×１０６個／μｌである。細胞密度がこの範囲よりも小さい場合、主に遠心分離、フィルタリング等の工程での細胞のロスが多くなり、凍結保存・融解後に、満足できる細胞数（回収率）が得られない。一方で、細胞密度がこの範囲よりも大きい場合、ガラス化液中への細胞の分散が困難であったり、細胞中へのガラス化液の浸透が不十分となり、満足できる生存率と回収率が得られない。
【００３０】
本発明のガラス化凍結保存方法における凍結操作について説明する。本発明のガラス化凍結保存方法における凍結操作は、培養された細胞をトリプシン処理などによって剥離・分散し、その後に細胞を高濃度の耐凍剤を含むガラス化液中に浸漬・分散させ、さらには、極低温の冷媒に、細胞又は細胞を含有する容器（例えば凍結バイアル）を浸漬させガラス化凍結させる工程である。
【００３１】
本発明のガラス化凍結保存方法における凍結操作で用いられるガラス化液は、高濃度の耐凍剤を含有する。本発明のガラス化凍結保存方法に用いられるガラス化液が含有する耐凍剤としては、ジメチルスルホキシド、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、プロパンジオール等を用いることができる。また、国際公開第２００９／１５７２０９号パンフレットに記載されるような非細胞浸透性のポリリジンからなる耐凍剤についても好ましく用いることができる。好ましい耐凍剤は、ジメチルスルホキシド、エチレングリコールである。ガラス化液に用いられる耐凍剤は１種類を含有しても良いし、２種類以上を含有しても良い。耐凍剤の総濃度は２０〜５０容量％が好ましく、より好ましくは２５〜４５容量％である。
【００３２】
本発明のガラス化凍結保存方法に用いられるガラス化液に含有されるその他組成として、培養液又は生理食塩水に、糖類を０．２〜１Ｍ程度含有しても良い。ガラス化液に含有しても良い糖類としては、スクロース、トレハロース、グルコース、ラフィノース、ラクトース、マルトース、マンノース、ガラクトース、フルクトースが挙げられる。ガラス化液に糖類を含有する場合、１種類を含有しても良いし、２種類以上の糖類が含有されていても良い。
【００３３】
本発明のガラス化凍結保存方法に用いられるガラス化液は、高分子化合物を含有することができる。該高分子化合物としては、例えば、ポリエチレングリコール、フィコール（スクロースとエピクロロヒドリンの共重合体）、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アルブミン等の高分子化合物、または、ヒアルロン酸、ジェランガム、キサンタンガム、カラギーナン、アルギン酸ナトリウム等のアルギン酸誘導体およびその塩、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース等のセルロース誘導体およびその塩等の増粘性多糖類等の高分子化合物を含有することができる。上記高分子化合物の含有による細胞保護効果やガラス化液の粘度上昇により、凍結融解後の細胞の生存性を向上させることが知られている。
【００３４】
本発明のガラス化凍結保存方法に用いられるガラス化液は、その他、血清のような生物由来材料を含有することができる。血清は、その構成成分が未だ完全に解明されていないものの、凍結時の細胞保護効果を目的として、広く用いられている。
【００３５】
本発明のガラス化凍結保存方法における凍結操作において、細胞をガラス化液に浸漬させる時間（細胞をガラス化液と接触させてから、冷却溶媒で冷却を開始するまでの時間）は、用いるガラス化液の組成によるものの、多くの場合ガラス化液の化学的毒性を避けるという観点で、１分以内が好ましい。より好ましくは４５秒以内である。
【００３６】
本発明のガラス化凍結保存方法における凍結操作において、細胞をガラス化液に浸漬・分散させる前に、ガラス化液よりも耐凍剤濃度の低い前処理液に細胞を浸漬・分散させる所謂平衡化処理を行うこともできる。平衡化処理は、浸透圧ショックや耐凍剤濃度の急激な変化への耐性の弱い細胞には、凍結融解後の生存率を維持する上で特に有用である。
【００３７】
前記凍結操作における液交換の際には、遠心分離、フィルタリングなどの手法によって、溶液と細胞を分離し、細胞を次の溶液に浸漬させることが好ましい。より簡便に細胞を分離できるという観点から、遠心分離を用いることが好ましい。例えば、培養された細胞をトリプシン処理により剥離し、トリプシンを含む培養液中に分散された細胞について、遠心分離を行い、細胞と前記溶液を分離した後に、前記溶液を廃棄し、その後、ガラス化液を添加し、細胞をガラス化液中に浸漬・分散することができる。
【００３８】
次に、本発明のガラス化凍結保存方法における貯蔵操作について説明する。凍結操作によりガラス化凍結された細胞は、細胞のガラス化状態が維持される極低温環境下で保存することで半永久的に保存することができる。ガラス化状態が維持される温度は、ガラス化液の組成によって異なるが、多くの場合−１５０℃以下が好ましい。このような温度が維持される環境としては、液体窒素保存容器中、気相窒素保存容器中が好ましい。
【００３９】
次に、本発明のガラス化凍結保存方法における融解操作について説明する。本発明のガラス化凍結保存方法における融解操作では、凍結された細胞を極低温環境下から取り出し、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する培養液に細胞を暴露しながら融解し、その後細胞から該培養液を除き、新鮮な培養液に細胞を暴露することを特徴とする。操作の一例としては、例えば、凍結バイアル中に凍結されたガラス化液と細胞に、温調されたＲＯＣＫ阻害剤を含有する培養液を直接接触させ、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する培養液に細胞を暴露するとともに、ガラス化液と細胞を融解し、さらにはガラス化液を希釈する。このような操作により、再氷晶形成やガラス化液の毒性を緩和し、同時に細胞へのダメージを抑制することができる。その後、遠心分離等により、細胞とＲＯＣＫ阻害剤を含む培養液を分離し、該培養液を除いたのちに、新鮮な培養液に細胞を分散させることで、細胞を新鮮な培養液に暴露する。新鮮な培養液に暴露した細胞は、その後のアプリケーションに応じて用いることができる。例えば、凍結融解後、培養・増殖を試みる場合には、培養シャーレ中に培養液とともに添加し、静置培養することができる。
【００４０】
本発明におけるＲＯＣＫ阻害剤を含有する培養液を構成する培養液とは、対象の細胞の活性や増殖に対して毒性を示すものでなければ、特に限定されないが、その後の培養に用いる培養液であることが好ましい。この場合、その後の培養に用いる培養液の組成から、血清や増殖因子を除いた組成にすることもできる。
【００４１】
本発明におけるＲＯＣＫ阻害剤を含有する培養液におけるＲＯＣＫ阻害剤とは、Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌキナーゼ（ＲＯＣＫ）を阻害する任意の物質を使用することができ、例えば、Ｙ−２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）、Ｈ−１１５２、Ｗｆ−５３６（これらはすべて和光純薬工業株式会社から入手できる）及びそれらの誘導体、並びにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸やこれらを含むベクターが例示される。
【００４２】
本発明におけるＲＯＣＫ阻害剤を含有する培養液におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、１〜１００μＭが好ましく、より好ましくは１０μＭ程度である。
【００４３】
本発明のガラス化凍結保存方法で用いるＲＯＣＫ阻害剤は、例えば、特表２０１１−５１９５７６号公報や国際公開第２０１１／０９００６８号パンフレットに記載されるように、培地に添加し維持培養するような比較的長時間にわたって細胞に暴露することにより、細胞の増殖に好適に作用することが知られている。また、緩慢凍結時のガラス化液に添加することにより、細胞が凍結されるまでの比較的長時間にわたり暴露される（加えて、現象的には、細胞の凍結後もガラス化状態のまま暴露され続けている）ことになり、凍結・融解後の生存率に好適に作用することが、一般に知られている。
【００４４】
一方で、ＲＯＣＫ阻害剤のような細胞内シグナル伝達の制御に関与する物質は、意図した以外の影響が細胞に発現する可能性を完全には否定できないため、可能であれば短時間での暴露が望ましい。
【００４５】
本発明のガラス化凍結保存方法における融解操作において、凍結された細胞を極低温環境下から取り出した後、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する培養液により細胞を融解するまでの時間は短時間であることが好ましい。極低温環境下から細胞を取り出し、培養液中に細胞を完全に分散するまでの時間として、好ましくは、２分以内であり、より好ましくは１分以内である。特に、所謂クライオトップ法のような急速ガラス化法を用いる場合には、氷晶の再形成を避けるために、可能な限り素早く融解することが重要である。
【００４６】
本発明のガラス化凍結保存方法における融解操作では、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する培養液の添加量は、融解速度を高める観点から、貯蔵操作の際に細胞とともにガラス化状態で凍結されたガラス化液の液量に対し、多い方が好ましい。好ましくは、ガラス化液量に対し、４倍以上であり、より好ましくは４０倍以上である。
【００４７】
本発明のガラス化凍結保存方法における融解操作では、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する培養液の液温は、融解速度を高める観点から、温調することが好ましい。好ましくは２０℃以上であり、より好ましくは３５℃以上である。
【００４８】
本発明のガラス化凍結保存方法における融解操作において、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する培養液中に細胞を分散させる作業は、例えば、マイクロピペットを用いたピペッティングを好適に使用できる。
【００４９】
本発明のガラス化凍結保存方法における融解操作では、細胞をＲＯＣＫ阻害剤を含有する培養液中に暴露しながら融解した後に、細胞から該培養液を除き、新鮮な培養液に細胞を暴露する。これらの融解操作における液交換の際には、遠心分離、フィルタリングなどの手法によって、溶液と細胞を分離し、細胞を次の溶液（新鮮な培養液）に浸漬させることができる。
【００５０】
本発明のガラス化凍結保存方法における融解操作では、ＲＯＣＫ阻害剤を細胞に暴露する時間（すなわち、凍結された細胞に、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する培養液を添加してから、該培養液を除き、新鮮な培養液に細胞を暴露するまでの時間）は、好ましくは３〜３０分であり、より好ましくは５〜１０分である。細胞を暴露する時間が３分より短い場合には、凍結融解後の優れた生存性が得られないことがある。一方で、暴露時間が３０分よりも長い場合には、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する培養液により希釈したガラス化液の毒性や分散状態による細胞の浮遊ストレスの問題から、細胞の活性に悪影響を及ぼす場合がある。
【００５１】
本発明のガラス化凍結保存方法における融解操作において、新鮮な培養液とは、対象の細胞の活性や増殖に対して毒性を示すものでなければ、特に限定されないが、その後の培養に用いる培養液であることが好ましい。その後の培養に用いるという観点から、血清や増殖因子を添加することもできる。さらには、新鮮な培養液は、ＲＯＣＫ阻害剤を例えば１〜１００μＭ含有していても良い。
【実施例】
【００５２】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５３】
（実施例１）
＜細胞の準備＞
ウシ血清を１０容量％添加したＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）中で培養されたマウス胚性線維芽細胞（初代培養後、５回程度継代操作を行った継代培養細胞）をプラスチックシャーレ上からトリプシン処理によって回収した。回収された細胞の生存率をトリパンブルー染色によって測定したところ、９５％以上であった。なお、回収された細胞は、単一の細胞（１個の細胞）と複数の細胞からなるクラスター状の細胞集団が混在する状態であった。
【００５４】
＜凍結操作＞
回収した上記マウス胚性線維芽細胞に、培養液（ウシ血清を１０％添加したＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを含有するＤＭＥＭ）を加え、１×１０７個／ｍｌの細胞濃度の細胞分散液に調製した。そのうち５０μｌ（５×１０５個）を１．５ｍｌ凍結バイアルに滴下した。凍結バイアル中の細胞分散液に対し、下記組成のガラス化液２００μｌを加え、細胞をガラス化液中に分散させた。この時の細胞濃度は２×１０３個／μｌであった。その後、凍結バイアルを液体窒素に浸漬することで、凍結操作を行った。細胞とガラス化液を接触させてから、凍結バイアルを液体窒素に浸漬させるまでの時間は３０秒であった。
【００５５】
＜実施例１のガラス化液の組成＞
エチレングリコール                                                  ３０容量％
グリセリン                                                        ０．５容量％
スクロース                                                          ５００ｍＭ
ＤＭＥＭを加えて総量が１００容量％となるように調整した。
【００５６】
＜貯蔵操作＞
凍結操作を実施した凍結バイアルを少なくとも２日間液体窒素保存容器中で保管した。
【００５７】
＜融解操作＞
貯蔵操作を実施した凍結バイアルを液体窒素中から取り出し、ＲＯＣＫ阻害剤であるＹ−２７６３２を１０μＭ含有し３７℃に温調した培養液（ウシ血清を１０％添加したＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを含有するＤＭＥＭ）１ｍｌを凍結バイアル中に直接添加し、マイクロピペットでピペッティングした。ガラス化液が完全に融解した後に、凍結バイアル中の細胞分散液を３７℃に温調した上記ＲＯＣＫ阻害剤を含有した培養液９ｍｌ中に添加した。この際の細胞濃度は５×１０４個／ｍｌである。次いで、３２０×ｇで５分間遠心分離し、該細胞を沈降させ、上清のＲＯＣＫ阻害剤を含有した培養液を除いた。さらに、新鮮な培養液（ウシ血清を１０％添加したＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを含有するＤＭＥＭ）を添加し、該細胞を分散させた。該細胞をＲＯＣＫ阻害剤を含有する培養液に暴露した時間は８分であった。
【００５８】
上記のようにして、実施例１のガラス化凍結保存方法における融解操作、貯蔵操作、融解操作を実施した。
【００５９】
（実施例２）
実施例１のガラス化凍結保存方法の凍結操作において、ガラス化液の組成を下記のように変更した以外は、実施例１と同様にして、実施例２のガラス化凍結保存方法を実施した。
【００６０】
＜実施例２のガラス化液の組成＞
エチレングリコール                                                  １５容量％
ジメチルスルホキシド                                                １５容量％
スクロース                                                          ５００ｍＭ
ＤＭＥＭを加えて総量が１００容量％となるように調整した。
【００６１】
（実施例３）
実施例３のガラス化凍結保存方法は、実施例１のガラス化凍結保存方法における凍結操作を下記のように変更して実施した。
【００６２】
５×１０５個の細胞を下記前処理液中に１×１０５個／ｍｌの細胞濃度で分散させた。この分散状態を室温環境下で３分間維持した。
【００６３】
＜前処理液の組成＞
エチレングリコール                                                  １０容量％
グリセリン                                                        ０．５容量％
ＤＭＥＭを加えて総量が１００容量％となるように調整した。
【００６４】
次いで、３２０×ｇの遠心力で５分間遠心分離し、前記したマウス胚性線維芽細胞を沈降させ前処理液と分離した。上清の前処理液を除いた後、実施例１のガラス化液２００μｌを加え、細胞をガラス化液中に分散させた。その後の凍結操作、貯蔵操作、融解操作は実施例１と同様に行い、実施例３のガラス化凍結保存方法を実施した。
【００６５】
（実施例４）
＜細胞の準備＞
ウシ血清を１０容量％添加したＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを含有するＥａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）中で培養されたヒト肝ガン由来細胞セルラインＨｅｐＧ２細胞をプラスチックシャーレ上からトリプシン処理によって回収し、培養液（ウシ血清を１０％添加したＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを含有するＥＭＥＭ）を加え、１×１０７個／ｍｌの細胞濃度の細胞分散液を調製した。回収された細胞の生存率をトリパンブルー染色によって測定したところ、９５％以上であった。なお、回収された細胞は、単一の細胞（１個の細胞）と複数の細胞からなるクラスター状の細胞集団が混在する状態であった。
【００６６】
回収した上記ＨｅｐＧ２細胞分散液５０μｌ（５×１０５個）を凍結バイアルに滴下した。凍結バイアル中の細胞分散液に対し、下記組成のガラス化液２００μｌを加え、細胞をガラス化液中に分散させた。この時の細胞濃度は２×１０３個／μｌであった。その後、凍結バイアルを液体窒素に浸漬することで、凍結操作を行った。細胞とガラス化液を接触させてから、凍結バイアルを液体窒素に浸漬させるまでの時間は３０秒であった。
【００６７】
＜実施例４のガラス化液の組成＞
エチレングリコール                                                  ３０容量％
グリセリン                                                        ０．５容量％
スクロース                                                          ５００ｍＭ
ＥＭＥＭを加えて総量が１００容量％となるように調整した。
【００６８】
＜貯蔵操作＞
凍結操作を実施した凍結バイアルを少なくとも２日間液体窒素保存容器中で保管した。
【００６９】
＜融解操作＞
貯蔵操作を実施した凍結バイアルを液体窒素中から取り出し、ＲＯＣＫ阻害剤であるＹ−２７６３２を１０μＭ含有し３７℃に温調した培養液（ウシ血清を１０％添加したＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを含有するＥＭＥＭ）１ｍｌを凍結バイアル中に直接添加し、マイクロピペットでピペッティングした。ガラス化液が完全に融解した後に、凍結バイアル中の細胞分散液を３７℃に温調した上記ＲＯＣＫ阻害剤を含有した培養液９ｍｌ中に添加した。この際の細胞濃度は５×１０４個／ｍｌである。次いで、３２０×ｇで５分間遠心分離し、該細胞を沈降させ、上清のＲＯＣＫ阻害剤を含有した培養液を除いた。さらに、新鮮な培養液（ウシ血清を１０％添加したＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを含有するＥＭＥＭ）を添加し、該細胞を分散させた。該細胞をＲＯＣＫ阻害剤を含有する培養液に暴露した時間は８分であった。
【００７０】
（実施例５）
実施例４のガラス化凍結保存方法の凍結操作において、ガラス化液の組成を下記のように変更した以外は、実施例４と同様にして、実施例５のガラス化凍結保存方法を実施した。
【００７１】
＜実施例５のガラス化液の組成＞
エチレングリコール                                                  １５容量％
ジメチルスルホキシド                                                １５容量％
スクロース                                                          ５００ｍＭ
ウシ血清由来アルブミン（ＢＳＡ）                                  １．５質量％
ＥＭＥＭを加えて総量が１００容量％となるように調整した。
【００７２】
（比較例１）
実施例１のガラス化凍結保存方法の融解操作において、貯蔵操作を実施した凍結バイアルを液体窒素中から取り出した後に、細胞に添加・暴露する培養液にＲＯＣＫ阻害剤であるＹ−２７６３２を添加しなかった以外は、実施例１と同様にして、比較例１のガラス化凍結保存方法を実施した。
【００７３】
（比較例２）
実施例４のガラス化凍結保存方法の融解操作において、貯蔵操作を実施した凍結バイアルを液体窒素中から取り出した後に、細胞に添加・暴露する培養液にＲＯＣＫ阻害剤であるＹ−２７６３２を添加しなかった以外は、実施例４と同様にして、比較例２のガラス化凍結保存方法を実施した。
【００７４】
＜凍結融解後の細胞の生存性の評価＞
上記操作により得たマウス胚性線維芽細胞分散液（実施例１〜３及び比較例１）またはヒト肝ガン由来細胞セルラインＨｅｐＧ２細胞分散液（実施例４、５及び比較例２）の一部をとり、トリパンブルー染色により、血球計算盤上で該細胞の生存率を測定した。生存率は、全細胞数（上記操作により得た細胞分散液の細胞総数）に対する生細胞数の割合である。生存性の評価は、生存率８０％以上を○、６０％以上８０％未満を△、６０％未満を×とした。これらの結果を表１に示す。
【００７５】
【表１】
2019110799.tif 000002
【００７６】
＜凍結速度の測定＞
実施例１〜５及び比較例１、２の凍結保存方法の凍結操作において凍結バイアルを液体窒素に浸漬する際に、凍結バイアル中の温度降下の様子をチノー社製シース型熱電対（先端外径０．３ｍｍ）を用いて測定した。０℃から−１５０℃までの冷却速度は、全て５００℃／ｍｉｎ以上であった。
【００７７】
＜細胞の活性の評価＞
実施例１〜５及び比較例１、２のガラス化凍結保存方法を行ったマウス胚性線維芽細胞またはヒト肝ガン由来細胞セルラインＨｅｐＧ２細胞を融解操作の後に、１０ｍｌの培養液（マウス胚性線維芽細胞についてはウシ血清を１０％添加したＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを含有するＤＭＥＭ、ヒト肝ガン由来細胞セルラインＨｅｐＧ２細胞についてはＥＭＥＭ）を含むプラスチックシャーレ（１００ｍｍディッシュ）上で２４時間培養後に細胞の形態を確認し、凍結融解後の細胞活性の評価を行った。細胞活性の評価は、下記の基準で行い、これらの結果を表２に示す。
【００７８】
○：浮遊細胞がほとんど無く、ほとんどの細胞において細胞接着と伸展が観察される
△：浮遊細胞が少なく、多くの細胞において細胞接着と伸展が観察される
×：浮遊細胞が多い
【００７９】
【表２】
2019110799.tif 000003
【００８０】
以上の結果から、本発明のガラス化凍結保存方法を用いると、多数の動物細胞を高い生存率と優れた細胞活性でガラス化凍結保存することができる。また、本発明のガラス化凍結保存方法における凍結操作は、特別な装置・器具を必要としない。従来の緩慢凍結法では、凍結操作の終了までに、プログラムフリーザーを用いて、半日から１日程度を要することから、本発明のガラス化凍結保存方法を用いるとより短時間で細胞の凍結保存操作を行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明は、コロニー又はシングルセルの状態で分散させることが可能なヒト細胞又はヒト以外の動物の細胞であって、初代培養細胞、継代培養細胞、及び細胞株細胞等の凍結保存に用いることができる。そのため、化粧品、医薬、製薬等のバイオテクノロジー分野において有用である。