(57)【要約】本発明は、機能化ミクロスフェアを用いた、試料中の分析物の検出および多重定量方法に関し、このミクロスフェアは試料をこれと接触させた後に磁化される。本発明方法は、特に、フローサイトメトリーによりいくつかの分析物を検出および多重定量するのに適している。また、本発明は、機能化非磁性ミクロスフェアの懸濁液、強磁性流体溶液および少なくとも１種の複合体を有する溶液を含む、本発明方法を実施するための、複数の分析物を検出および／または定量するのに使用されるキットに関する。
2007504474.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を含むことを特徴とする、機能化非磁性ミクロスフェアを用い、試料中に含まれているかもしれない分析物を検出および／または多重定量する方法であり、場合により前記分析物が予め標識されることがありうる方法：
a)前記試料を、機能化非磁性ミクロスフェア集団の懸濁液に接触させる工程、但し該ミクロスフェアはその表面に以下を有する：
−全てのミクロスフェア集団については、結合対の第１の部分を形成し、かつ前記分析物と結合できないことを特徴とする化合物Ａ、および、
−ミクロスフェア集団のそれぞれについては、各集団毎に異なっており、試料中の前記分析物の１つと特異的結合対を形成しうる化合物Ｂ、
b)工程a)で得られた反応媒体に、化合物Ａと特異的結合対を形成しうる第２の結合性部分をその表面に有する磁性粒子を含有する強磁性流体を添加する工程、
c)工程b)において磁化されたミクロスフェアの磁気分離による洗浄からなる少なくとも１つの工程、
d)場合により、前記分析物が予め標識されない場合、工程c)において得られた磁化されたミクロスフェアの懸濁液を、少なくとも１つの複合体の溶液に接触させる工程、但し、該複合体は、前記分析物の１つを認識し、かつ特異的に結合することができる化合物Ｃ、および標識を含み、この工程d)の後、好ましくは、磁気分離によるミクロスフェアの洗浄からなる少なくとも１つの工程が続き、および
e)ミクロスフェアの表面で前記標識を検出および／または定量する工程。
【請求項２】
前記ミクロスフェア集団のうちの少なくとも２つが、それらを互いに区別することを可能にする少なくとも１つの固有の物理的性質を有することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
化合物Ａと強磁性流体の表面に結合した第２の部分との間に形成される前記結合対が、好ましくはビオチン／アビジン、またはビオチン／ストレプトアビジン、酵素／コファクター、レクチン／炭水化物、および抗体／ハプテン型の特異的結合対からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ミクロスフェアが、ラテックス、重合体、共重合体、ガラスおよびシリカからなる群より選択される材料から製造されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかの項記載の方法。
【請求項５】
標識が蛍光であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかの項記載の方法。
【請求項６】
方法の工程e)における前記標識の検出および／または定量が、フローサイトメトリーによって行われることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかの項記載の方法。
【請求項７】
少なくとも２つのミクロスフェア集団を区別することを可能にする前記固有の物理的性質が、前記ミクロスフェアのサイズおよび／または光学的性質であることを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ミクロスフェアが直径0.3 〜100 μm のサイズを有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれかの項記載の方法。
【請求項９】
光学的性質が、前記ミクロスフェアの発光波長および／または蛍光強度であることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記分析物が、タンパク質、誘導体型、または核酸であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかの項記載の方法。
【請求項１１】
前記分析物が、液体溶液中に存在するか、または、試料の懸濁液中の細胞または粒子の表面に存在するかもしれない化合物であることを特徴とする、請求項１〜10のいずれかの項記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物がタンパク質性の毒素であるか、または前記細胞もしくは粒子が、細菌もしくはウイルスなどの微生物であることを特徴とする、請求項１〜11のいずれかの項記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物Ｂが、タンパク質および核酸からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１〜12のいずれかの項記載の方法。
【請求項１４】
工程d)において使用する前記複合体の前記化合物Ｃが、タンパク質および核酸からなる群より選択される、請求項１〜13のいずれかの項記載の方法。
【請求項１５】
前記分析物が核酸であり、そして、工程a)において化合物Ｂが前記分析物の１つと特異的にハイブリッド形成しうる核酸であることを特徴とする、請求項１〜14のいずれかの項記載の方法。
【請求項１６】
前記分析物が、ＰＣＲ生成物であることを特徴とする、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＣＲ生成物が、標識されて得られることを特徴とする、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
前記複合体の前記化合物Ｃが、前記分析物の１つに特異的にハイブリッド形成しうる核酸であることを特徴とする、請求項15または16記載の方法。
【請求項１９】
ＳＮＰの検出および／または多重定量のための、請求項18記載の方法の使用。
【請求項２０】
ＳＮＰの検出および／または多重定量をＯＬＡ法により行うことを特徴とする、請求項19記載の方法の使用。
【請求項２１】
以下を含むことを特徴とする、試料中に含まれるかもしれない分析物の検出および／または多重定量のためのキット：
a)その表面に以下を有する、機能化非磁性ミクロスフェアの集団の懸濁液を含む試薬１：
−結合対の第１部分を形成する化合物Ａ、
- 試料の前記分析物の１つと特異的結合を形成しうる化合物Ｂ、
b)前記化合物Ａと特異的結合対を形成しうる第２の結合部分をその表面に有する磁性粒子を含有する強磁性流体を含む試薬２、および
c)前記分析物と特異的に反応しうる化合物Ｃ、および検出しうる標識を含有する、少なくとも１つの複合体の溶液を含む試薬３。
【請求項２２】
試料中に含まれているかもしれない前記分析物を含有する試薬４をさらに含むことを特徴とする、請求項21記載のキット。
【請求項２３】
希釈用緩衝液からなる試薬５、および洗浄用緩衝液からなる試薬６をさらに含むことを特徴とする、請求項21または22記載のキット。
【請求項２４】
種々のミクロスフェアの凝集を中和するための緩衝液を含有する試薬７をさらに含むことを特徴とする、請求項21〜23のいずれかの項記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能化 (機能付与、functionalized) ミクロスフェア（微小球）を用いた、試料中の分析物の検出および多重定量のための方法であり、このミクロスフェアは、試料をミクロスフェアと接触させた後に磁化される方法に関する。本発明の方法は、フローサイトメトリーによりいくつかの分析物を検出および多重定量するのに特に適している。本発明はまた、機能化非磁性ミクロスフェアの懸濁液、強磁性流体の溶液、および少なくとも１種の複合体の溶液を含む、本発明方法を実施するための、複数の分析物の検出および／または定量のためのキットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
試験管内診断の発展および多様化により、様々な化合物および微生物の迅速な検出および同定のための手段を備えることがますます必要となってくる。この必要性は、また、ヒトまたは動物の健康分野、例えば特異的抗原もしくは病原体の検索または検定、農産物食品（agrofood) の分野、例えば食品用製品中にありうる汚染物質の品質管理およびスクリーニング、または環境分野、例えば生物学的リスクを防止するか、または不純物、農薬もしくは各種汚染物質を検出することに関与する環境分野とも関係する。
【０００３】
フローサイトメトリー型の分析システムと組み合わせたミクロビーズ上での免疫検定法の使用は、これらの要求にもっとも適した技術的方法の１つであり、この原理に基づく多くの方法が技術の現状において提案されてきた。
【０００４】
例えば、WO 98/51435 、WO 94/09368 およびWO 90/15666 として公開された国際特許出願、およびEP 180384 として公開された欧州特許出願には、診断方法で使用できる特殊なタイプの磁性粒子もしくは蛍光粒子が記載されている。
【０００５】
従来技術のその他の文献には、ミクロビーズ上での複数の分析物の同定および／または検定のための種々の手順が提案されている。このように、例えば、WO 90/05305 として公開された国際出願は、蛍光ビーズのいくつかの副次集団を用いた凝集方法によって、試料中の複数の分析物を検出および／または検定するための方法、およびその対応するキットに関する。形成された凝集物の蛍光は、フローサイトメトリー、画像分析またはレーザー走査系で測定することができる。
【０００６】
米国特許第4,665,020 号は、異なる直径の球の２つの集団を用いるフローサイトメトリーによって、抗原を検定する方法に関し、最大のものは抗原に特異的な抗体で被覆され、最小のものは蛍光性である。この検定法は、蛍光性の球に結合したリガンド（抗体もしくは抗原）によるサンドイッチ法、または競合方法の原理に基づいて行なわれる。
【０００７】
WO 97/14028 として公開された国際出願は、関心のあるいくつかの分析物の検出のための、フローサイトメトリーによる分析方法に関し、この方法においては、フローサイトメトリーによる分析のための分類パラメータの少なくとも１つが副次集団によって異なる、多数のビーズ副次集団が使用される。各々の副次集団は、検定されるべき分析物の１つと特異的に反応する化合物に結合している。ビーズ副次集団、従って、対応する分析物と反応した化合物の性質を、各副次集団の分類パラメータすべての解析によって、サイトメトリーにより同定する。
【０００８】
WO 98/20351 として公開された国際出願は、試料中の１または２以上の分析物の存在を測定する方法に関し、この方法においては、微小粒子の「試験」集団、分析物に特異的なリガンドを有するそれぞれの集団、および調査される分析物のいずれとも反応しない参照微小粒子が使用される。検定は、各「試験」集団中の遊離の微小粒子の数を計数し、それを参照微小粒子の数と比較することによって行われる。計数は、好ましくはサイトメトリーを含む各種方法によって行われる。
【０００９】
WO 96/31777 として公開された国際出願は、調査される微生物に特異的なリガンドを有する少なくとも１種の検出可能な粒子を用いる、試料中の微生物の検出のための方法に関する。次いで、粒子に結合した微生物が、蛍光標識を有する第２のリガンドを使用して明らかにされる。
【００１０】
米国特許第6,280,618 号は、互いに区別することができ、それぞれが異なるリガンドを有する磁性微小粒子の集団の混合物を使用する、多数の分析物を個々に検出する方法に関する。各群の微小粒子を、媒体から分離し、次いで、第２の液状媒体中に懸濁し、そこでフローサイトメトリーにより分析する。
【００１１】
WO 93/02260 として公開された国際出願は、同じ試料中ののいくつかの分析物を同時に検出するためのフローサイトメトリーの方法、およびその実施のための試薬に関する。この試薬はミクロスフェアのいくつかの副次集団の混合物から成り、各副次集団は、調査される分析物の１つと特異的結合対を形成しうる特異的リガンドをその表面に有する。ミクロスフェアに結合した分析物の検出を、形成される結合対に結合しうる蛍光色素を有する試薬の添加後に行う。
【００１２】
同じ試料中の複数の分析物の同時検出のためのこれらの方法は、また、１または２以上の磁気分離工程を含んでいてもよい。
実際、この種の磁気分離工程は、関心ある抗原が特異的に分離されなければならない（ある種の微小粒子が存在する場合には、サイトメトリー分析は実施不可能であると判明することがありうる）、ある種の複合媒体中での検定を容易にしうる。これは、検定される分析物を消失する危険性のため調製物を濾過できないような、各種の液化破砕材料（パルプ、マスト、乳製品もしくはなめらかなチーズ、果汁、破砕した野菜材料、発酵液など）中に存在する分子／粒子を調べる場合、例えば、農産物食品、製紙および廃水処理における分析の場合も同様である。
【００１３】
これは、また、多量の空気中の粒子状含有物がバイオサンプラー (biosampler) によって液体中に濃縮されるような、環境科学およびヒトの健康科学における分析の場合も同様である。この場合もまた、バイオコレクション (biocollection)後に液体中に濃縮されて見出され、そのサイズが、i)捕捉用ビーズのサイズ（1 〜30μm ）を包含し、光散乱パラメータだけではそれらを同定することが困難もしくは不可能であるか、ii）サイトメーターを塞ぐことにより分析を不適合とする（100 μm 以上で高い危険性）、空気のサスペンジョン中の全ての粒子、ダスト、微小繊維、花粉などを取り除くことが避けられない。
【００１４】
さらに、サイトメーターの流体工学が正しく機能することと両立しない、油状（脂肪性の）粒子も除去しなければならない。
さらに、磁気分離の使用はまた、検定されるべき物質を急速に濃縮することを可能にし、そして捕捉用ビーズを洗浄するための遠心分離法工程の使用を不要とする。
【００１５】
ミクロビーズ上への特異的捕捉工程と磁気分離とのかかる組み合わせは既に、技術の現状、特に米国特許第6,280,618 号に報告されている。
しかしながら、試料中に含まれる分析物の同定および検定方法において磁性ミクロスフェアを使用することは、様々な工業的制約をもたらし、また懸濁液の取扱いおよびサンプリングの均一性を損なうことがある。これは、異なるサイズの（そして、しばしば異なる含有量の磁化可能な材料を有する）磁性ミクロスフェアが磁気分離中に異なる挙動、即ちより長いかより短い磁化時間、を示すことがあるためである。存在するミクロビーズの系統により変化する分離収率は、それに由来し、従って、結果の不均一性または磁気分離相の延長をもたらす。この問題を解決するために、磁化可能な材料の含有量がサイズによって調整される磁性ミクロスフェアを有することが必要である。これは、もちろん製造または供給に関して工業上の制約を作り出す。
【００１６】
加えて、磁性ミクロスフェアは高密度であり、このため、貯蔵中の沈降、再懸濁および分析中の急速な沈降という実施上の問題を生じる。事実、磁性ビーズの密度は通常1.15より大きく、磁鉄鉱の量によって、1.15および1.50の間で変動し、特に、大きな径（>2μm ）の粒子の場合は、非常に急速な沈降速度をもたらす（EP 1248110として公開された欧州特許出願参照）。
【００１７】
このように、現在、磁性ミクロスフェアを用いた場合のかかる欠点を回避しうる、１または２以上の磁気分離工程を含む、液体試料中に含まれる複数の分析物を同定および検定する新規な特殊な方法を開発する必要がある。
【００１８】
米国特許第5,998,224 号の主題（1999年12月７日公開、出願人：アボットラボラトリーズ）は、試験試料中の分析物の存在または量を測定する方法である。
第１の好適態様によれば、この方法は、試験試料を可動性固相と磁性試薬に接触させて、分析物が可動性固相および磁性試薬に結合して複合体を形成する反応混合液を形成させ、次いで磁場をかけることを含む。
【００１９】
第２の好適態様によれば、この方法は、分析物を磁性試薬と接触させて第１の複合体を形成させ、そして磁性試薬を可動性固相と接触させて第２の複合体を形成させ、次いで磁場をかけることを含む。
【００２０】
この第２の好適態様の変法によれば、分析物を可動性相に結合させて第１の複合体を形成させ、そして磁性試薬を可動性相に結合させて第２の複合体を形成させ、次いで磁場をかける。
【００２１】
US 2001/0054580 として2001年12月27日に公開された米国特許出願（Bio-Rad Laboratories,Inc. EP 1248110と関連）の主題は、試料中のいくつかの分析物を区別するための多重試験である。この試験は、固相として磁性粒子を使用して、各分析物について個々の結果を生じる。磁性粒子は、それらを群に分けうる特性によって互いに区別することができ、各群は粒子の表面に結合した試薬を有し、これは他の群の粒子上に存在する試薬とは異なる。
【００２２】
この多重試験においては、前記分析物を含んでいる試料を磁性粒子と接触させる。
EP 230768 として1987年８月５日に公開された欧州特許出願（Syntex Inc.)の主題は、液体媒体から物質を分離する方法である。この方法は、磁性または非磁性粒子を使用する。
【００２３】
非磁性粒子は、特異的結合対の一方または磁性粒子に結合するように機能化される。
強磁性流体は、懸濁液中の粒子が強磁性粒子である磁性流体として記載される。磁性流体のコロイド状磁性粒子は、鉄を含むタンパク質、アルブミン、γグロブリンなどのタンパク質材料で被覆することができる。磁性粒子のタンパクによる被覆は、物理的結合、例えば吸収、または化学結合により行うことができる。
【発明の開示】
【００２４】
本発明の主題は、以下の工程を含むことを特徴とする、機能化非磁性ミクロスフェアを使用する、試料中に含まれているかもしれない分析物の検出および／または多重定量のための方法であり、場合により前記分析物は予め標識することができる：
a)前記試料を機能化非磁性ミクロスフェア集団に接触させる工程、但し、該ミクロスフェアは表面に以下を有する：
−全てのミクロスフェア集団については、前記分析物と結合することができないことを特徴とし、結合対の第１部分を形成している化合物Ａ、および
−ミクロスフェア集団の各集団については、試料中の前記分析物の１つと特異的結合対を形成でき、各集団毎に異なる化合物Ｂ、
b)工程a)で得られた反応媒体に、化合物Ａと特異的結合対を形成できる第２の結合性部分をその表面に有する磁性粒子を含有する強磁性流体を添加する工程、
c)工程b)において磁化されたミクロスフェアの磁気分離による洗浄からなる少なくとも１つの工程、
d)前記分析物が予め標識されていない場合、必要に応じて、工程c)において得られた磁化ミクロスフェアの懸濁液を少なくとも１種の複合体に接触させる工程、但し、該複合体は前記分析物の１つを認識し特異的に結合しうる化合物Ｃ、および標識を含み、この工程d)の後に好ましくは、磁気分離によるミクロスフェアの洗浄からなる少なくとも１つの工程が続く、および、
e)ミクロスフェアの表面で前記標識を検出および／または定量する工程。
【００２５】
「検出および／または多重定量のための方法」なる表現は、本明細書において、１回の試験において関心あるいくつかの分析物を検出および／または定量する方法を意味する。
「試料」なる用語は、本発明によれば、前記試料中で検出および／または定量することが望まれるいくつかの分析物を含みうる任意の試料を意味する。
【００２６】
本発明による前記分析物を含有しているかもしれない試料の中で、特に、生物学的試料（特に、全血、血漿もしくは血清、脳脊髄液、粘膜など）または殊にヒトもしくは動物の健康、農産食品または環境分野における採取された全ての種類の試料に由来する化学的試料、または化学工業由来のものが挙げられ、これらの試料は採取された試料に含まれているかもしれない関心ある複数の分析物を検出および／または定量するために採取される。
【００２７】
「分析物」なる用語は、本明細書において、本発明により検出および／または定量することができる関心ある任意の化合物を意味する。
好ましくは、前記分析物は、タンパク質性および誘導体型のものであるか、または核酸である。
【００２８】
「タンパク質」、「ポリペプチド」または「ペプチド」なる用語は、本明細書において、アミノ酸の配列、またはアミノ酸配列を含むその誘導体を意味するために区別されずに用いられる。
【００２９】
「核酸」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」または「ヌクレオチド配列」なる用語は、本明細書においては区別なく使用されるであろうが、改変されていてもいなくてもよい、ヌクレオチドの正確な鎖を意味し、非天然のヌクレオチドを含んでいるかもしれない、核酸の断片または領域を定めることを可能にし、また等しく二本鎖DNA 、一本鎖DNA およびこれらのDNA の転写産物に対応してもよい。これらの核酸は、それらの自然の環境から単離され、天然物または人工物である。
【００３０】
特定の好適態様によれば、上述の分析物は、液体溶液中に存在するか、試料の懸濁液中の細胞または粒子の表面に存在する、化学的または生化学的有機化合物である。
その表面に分析物を有する細胞または粒子の例としては、真核細胞 (例えば、哺乳類細胞もしくは酵母) 、原核細胞 (例えば細菌) 、および粒子 (例えば、ウイルス粒子、胞子もしくは花粉) 、または任意の微生物、特に真菌が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００３１】
本発明の第１の好適態様は、基体に結合した抗原、例えば微生物の表面抗原、受容体およびその他の膜構造物、または試料中で遊離の状態の分析物、例えばタンパク質、酵素、代謝生成物およびその他の分泌産物などの生物学的物質を試料中で同定および／または多重検定することに関する。
【００３２】
関心ある分析物の例として、タンパク質およびその誘導体、例えば糖蛋白質またはリポ蛋白質、核酸、炭水化物、自然界で脂質である化合物、および全ての天然の化合物または化学合成により得られる化合物が特に挙げられるが、これらに限定されない。分析物の例としては、また、機能的な特殊性を示す化合物、例えばサイトカイン、細胞受容体、抗体、抗原、毒素、アレルゲン、薬剤、殺虫剤もしくは除草剤、または任意の汚染物質、溶液中に存在しても、または場合により細胞もしくは粒子の表面に保持されていても、試料中で検出および／または定量することが望まれる分析物が挙げられる。
【００３３】
特に好ましくは、かかる化合物はタンパク質毒素であるか、または前記細胞もしくは粒子が微生物、例えば細菌もしくはウイルスである。
分析物が細胞または粒子の表面に存在する場合、選ばれた前記分析物がこれらの細胞または粒子に特異的であるならば、前記分析物の検出および／または定量は前記細胞または粒子の検出および／または定量を可能にする。
【００３４】
試料に含まれているかもしれない関心ある分析物の別の例としては、自然にまたは偶然に、大気中に存在する化合物が挙げられ、それは、例えば大気中に存在する粒子を採取し、液体、通常ＰＢＳなどの緩衝液や油状物、に詰め込むバイオサンプラーによって、液体中に収集しうる。
【００３５】
バイオサンプラーの典型的例は、SKC 社（PA）製のBioSamplerTMの説明書、またUS5902385 およびUS 5904752、およびButtner et al.「環境細菌学のマニュアル、空気中の微生物のサンプリングおよび解析」ASM Press, Wash.DC、1997、pp.629-640、「詰め込みおよび遠心運動の組み合わせによる改良されたエアゾール捕集」Willeke K. et al,. Aerol Sci. Tech., 28 ：439-456 (1998 ）、US 6468330 Irving et al.などの技術刊行物に記載されている。
【００３６】
「予め標識された分析物」なる表現は、本発明において、試料中で検出および／または定量を行うことを意図し、前記方法を行う前に標識された形態である任意の分析物を意味する。
【００３７】
予め標識された分析物の例としては、限定されないが、核酸または PCR (ポリメラーゼ連鎖反応) などの酵素増幅から得られる PCR生成物 (アンプリコン) が挙げられ、これらは標識された形態、特に蛍光標識により得ることができ、これらの核酸−標識技術は当業者にとって周知である。
【００３８】
「機能化非磁性ミクロスフェア」なる表現は、本発明において、その表面に化合物Ａおよび化合物Ｂを有する非磁性ミクロスフェアを意味する。
化合物ＡおよびＢは、共有結合、親和性、または受動的もしくは強制的吸着による結合などの当業者に周知の方法によって、非磁性ミクロスフェアに結合しうる。かかる方法はまた、化合物を強磁性流体の磁性粒子の表面に結合させるために用いられる。
【００３９】
各種基体を機能化させるかかる方法は、文献に広く記載されている。例えばUS 4,181,636、US 4,264,766、US 4,419,444、US 4,775,619などの米国特許、および、Legastelois S. et al.,「ラテックスおよび診断学」1996、またはLe Technoscope Biofutur, 161：1-11、Duke scientific Corp. カタログ、パロアルト、CA、Technical Note-013Ａ「試薬  ミクロスフェア−表面特性および結合方法」。
【００４０】
共有結合による結合の場合、使用されるミクロスフェアは、化合物ＡまたはＢが有する別の化学基と反応して、共有結合を形成しうる化学基を有する。
ミクロスフェアの表面に存在してもよい化学基の例として、カルボキシル、アミノ、アルデヒドおよびエポキシ基が例示されるが、これらに限定されない。特性決定しようとする分析物が反応性の化学種である特殊な場合、非磁性ミクロスフェアが有する化学基の１つは、検出および／または定量しようとする分析物の反応性化学種と特異的に反応できてもよく、この化学基は従って化合物Ｂの役割も果たす。
【００４１】
ミクロスフェアを機能化するためには、限定されないが、特に (ポリ）炭水化物／レクチン、ビオチンもしくはビオチン化化合物／アビジンもしくはストレプトアビジン、受容体／特異的リガンド、抗原もしくはハプテン／抗体の対などの高親和性結合対の２つの相手により一般的に行われる、親和性による相互作用が用いられる。
【００４２】
ミクロスフェアの機能化はまた、直接に、あるいは「リンカー」または「スペーサー」と称されるスペーサーアームを用いて行うことができる。
受動的もしくは強制的吸着による機能化は当業者に知られており、前述の米国特許に既に記載されている。受動的吸着による機能化には、例えば、BSA-biotin (ウシ血清アルブミン) （Sigma 、リヨン、フランス−Ref.A-8549）を使用してもよい。
【００４３】
本明細書における機能化非磁性ミクロスフェアは、磁気成分を含有しないならば、いかなる種類もの材料から成ってもよい。試料中の分析物およびその他の分析的試薬に関して不活性であり、試料中および本発明方法で使用されるその他のすべての反応媒体中で不溶性であり、そして機能化されうる材料を選択するのが好ましいであろう。例えば、重合体または共重合体であるか、あるいはラテックス、ガラスまたはシリカからなっていてもよい。
【００４４】
これらのミクロスフェアが磁性でない場合、それらが製造されうる材料の選択に関して特に制約はない。このように、広範囲の非磁性ラテックスからなる任意の種類のミクロスフェアが使用できる。非磁性形態の様々なサイズで市販されている、検出および／または定量されるべき分析物に多かれ少なかれ適した、その他の材料からなるミクロスフェアを使用することもまた可能である。このように、本発明の方法は、例えば、ガラスまたはシリカミクロビーズ、血小板および核酸を捕捉するためにそれぞれ好ましく用いられる材料を使用できる（特に、WO 94/19600 として公開された国際出願参照、これは活性化凝集血小板の捕捉用 (およびこの特殊な場合では除去用の) のガラスミクロビーズの使用を記載している) 。
【００４５】
重合体または共重合体の例としては、ジビニルベンゼン、ポリスチレン、ポリビニルピリジン、スチレンブタジエン共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン共重合体、ポリエステル、ビニルエステルアクリレート−アセテート共重合体、ビニルエステルアクリレート−クロリド共重合体、ポリエーテル、ポリオレフィン、ポリアルキレンオキサイド、ポリアミド、ポリウレタン、多糖類、セルロールおよびポリイソプレンが挙げられるが、これらに限定されない。架橋は、前記ミクロスフェアに構造的完全性および堅さを与えるために、多くの重合体にとって有用である。
【００４６】
このように、本発明のある特定の好適態様によれば、本方法は、ミクロスフェアがラテックス、ポリマー、共重合体、ガラスまたはシリカからなる群より選択される材料からなることを特徴とする。
【００４７】
ポリマーもしくは共重合体、ラテックス、ガラスまたはシリカ製の非磁性ミクロスフェアは当業者にとって周知であり、市販されている。例えば、Spherotech（リバティービル、US）、 Polysciences （ウォリントン、US）、Merch Eurolab SA for Estapor range (フォントネー- スー- ボア、FR）、Duke Scientific （パロアルト、US）、Seradyn （インディアナポリス、US）、Dyna Biotec for Dyno Particles（オスロ, NO）などにより供給されるミクロスフェア製品などがある。その他のミクロスフェア製品は、Bang' Labs（フィッシャーズ, US) 、およびPolymer Laboratories Ltd（Chruch Stretton, UK ）により提供されうる。
【００４８】
同様に、核酸のシリカビーズ上への吸着／からの脱着のための操作は、核酸の捕捉のためのTechNote #302, Bang's Labs（フィッシャーズ, US）に記載されている。
さらに、本発明方法で使用できるミクロスフェアの材料の選択に幅があるため、沈降が少なく (例えば非磁性ラテックスビーズ) 、そのため、特に自動化装置においてより使いやすいミクロスフェアを使用することが可能である。
【００４９】
「化合物Ａ」なる用語は、本明細書において、全てのミクロスフェア集団について、強磁性流体の磁性粒子の表面に結合した別の化合物に特異的に結合しうる、上述のように前記機能化非磁性ミクロスフェアの表面に存在する任意の化合物を意味し、この化合物Ａは特異的結合対の第１の部分を形成し、別の化合物は第２の部分を形成し、化合物Ａはまた、分析物と結合できないことを特徴とする。
【００５０】
「強磁性流体」は、本明細書中では、液体担体中の磁性粒子の安定コロイド懸濁液を意味する。平均サイズが約 100Å(10nm)である磁性粒子は、強磁性流体に強磁場勾配がかけられた場合でさえ粒子の凝集を防止する、安定化分散剤（界面活性剤）によって被覆されている。磁場がない場合、粒子の磁気モーメントはランダムに分布し、流体ははっきりした磁化を有しない。
【００５１】
強磁性流体の磁性粒子は、微小粒子の表面で化合物Ａとの特異的結合対の第２部分を形成している前記化合物で被覆されている。このように、これらの磁性粒子は、形成された前記結合対によってミクロスフェアの表面に結合することができ、このミクロスフェアはこのような方法で磁化される。
【００５２】
本発明のある特定の態様では、本方法は、化合物Ａと強磁性流体の表面に結合された第２部分との間で形成される前記結合対が、好ましくはビオチン／アビジンもしくはビオチン／ストレプトアビジン、酵素／補因子、レクチン／炭水化物、および抗体／ハプテンからなる群より選択されることを特徴とする。
【００５３】
強磁性流体の例としては、特にMolecular Probes Europe(ライデン、NL）のFF-SＡ（強磁性流体−ストレプトアビジン）（Ref. C-21476（バッチ #71Ａ1-1 ）が挙げられるが、これに限定されない。
【００５４】
従って、ミクロスフェアの各集団に配置される磁化可能な材料（強磁性流体の磁性粒子）の量は、ミクロビーズの集団当たりの結合点（結合対の形成）の量を修正することによって容易に制御することができる。
【００５５】
加えて、強磁性流体の沈降も非常に制限され、これは懸濁液の取り扱い性およびサンプリングの均一性を容易にする。
微小粒子の磁化は、磁石（例えば、Dynal MPC)を使用して、従来の手順により行われる。
【００５６】
「化合物Ｂ」なる用語は、本明細書において、各々のミクロスフェア集団について、集団の１つのミクロスフェアの表面に存在する任意の化合物を意味し、機能化非磁性ミクロスフェアは上記の通りであり、この化合物は、試料に含まれているかもしれず、その検出および／または定量が求められている分析物の１つと特異的結合を形成できる。
【００５７】
化合物Ｂの例としては、タンパク質もしくはそれ由来の構造をもつ断片、受容体、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体またはその断片、１価の抗体、一本鎖もしくは二本鎖核酸またはそれ由来の任意の断片もしくは構築物、およびこれらの成分のいくつかの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。化合物Ｂおよび分析物の間の特異的結合の例としては、抗原−抗体もしくはリガンド−膜受容体の結合、または核酸間のハイブリダイゼーションが挙げられ、ミクロスフェア表面にグラフトされた化合物Ｂのヌクレオチド配列は分析物のそれに相補的である。
【００５８】
好ましくは、化合物Ｂは、前記分析物の１つを認識しうるタンパク質またはその断片であり、例えば、検出および／または定量を目的とする分析物に対して特異的なポリクローナルもしくはモノクローナル抗体またはその断片であり、あるいは、逆に、化合物Ｂは検出および／または定量を目的とする抗体を認識しうる抗原またはハプテン、その他、受容体に対する特異的リガンド、補因子に対して特異的な酵素、または検出および／または定量を目的とする核酸と特異的にハイブリッド形成しうる核酸であってもよい。
【００５９】
化合物ＢまたはＣが抗体である場合、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体またはその断片、あるいは組換え抗体の製造については、当業者に周知の、特に「抗体」マニュアル (Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Hrabor Publications pp. 726,1988）に記載の技術、またはKohler et al. により記載されたハイブリドーマからの製造のための技術（Kohler and Milstein, Nature,256 : 495-497, 1975)を参照してもよい。特異的抗体は、例えば、抗原に対して特異的に免疫した動物の血清、または細胞から得ることができる。
【００６０】
「特異的に抗原を認識しうる抗体」なる表現は、その断片が由来する抗体に結合する抗原のエピトープに、特異的に結合しうる抗体の任意の断片を含む抗体断片を、特に意味する。この種の断片の例には、特に、由来する抗体と同じ結合特異性を有する、単鎖抗体（scFv）または一価のFab もしくはFab'断片、およびF(ab')2 のような二価の断片がある。これらの抗体断片は、酵素、例えばペプシンまたはパパインによる消化などの方法によって、および／または化学的還元によるジスルフィド架橋の開裂によって、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体から得ることができる。これらの抗体またはその断片は、遺伝的組換えによって、別の方法で得てもよい（組換え抗体）。
【００６１】
このように、本発明のある特定の態様によれば、本方法は、前記化合物Ｂがタンパク質および核酸からなる群より選択されることを特徴とする。
ある特定の態様によれば、各々の集団のミクロスフェアの表面に存在する化合物Ｂが抗体であり、、検出および／または定量される分析物が抗原である。
【００６２】
上述のように、同定および／または定量することを目的とする前記分析物が、予め標識されなかった場合にのみ、本発明方法の工程d)が実施される。この場合、前記工程d)は、検出および／または定量の次の工程e)を実施するために必要である。これは、試料中の検出および／または定量しようとする前記分析物の１つに特異的に結合しうる少なくとも１つの複合体を含む溶液を必要とする。
【００６３】
本発明方法の前記複合体は、前記分析物のうちの１つを認識し、特異的に結合しうる化合物Ｃ、およびそれと結びつく標識を含む。
好ましくは、本発明方法は、試料中で検出および／または定量しようとする前記分析物が、それぞれ、タンパク質または核酸である場合、工程d)において使用される前記複合体の化合物Ｃが、タンパク質および核酸からなる群より選択される化合物であることを特徴とする。
【００６４】
本発明方法の工程d)を実施する場合、その後に、磁気選別による洗浄からなる少なくとも１つの工程を実施することが好ましく、この工程は、その表面に分析物のみを有するミクロスフェアから標識された磁化ミクロスフェアを分離するために必要である。
【００６５】
本発明方法の工程e)は、粒子を検出して計数するための、任意の自動化した電子的もしくは光学的方法により行うことができる。フローサイトメトリーは、この種の分析に特に適している。
【００６６】
今日広く使用されているこの方法は、反応媒体の懸濁液中のミクロスフェア上で非常に高い感度の光強度の測定を実施することを可能にする。これらの計測は、高い処理量（１秒当たり数百から数千のミクロスフェアが分析／試験される) で各々のミクロスフェアに対して個々に実施され、これにより多数のミクロスフェア上でこれらの計測を実施することが数十秒のうちに可能となる。いくつかの光パラメータを、各々のミクロスフェア上で同時に計測することができる：
i)第１に、そのサイズおよび構造（粒度、密度）の特徴づけ／評価のためのレーザー光散乱／回折パラメータ、および
ii) 第２に、波長によって区別でき、通常、ミクロスフェア中に内在するか、または複合体の特異的結合に関連する蛍光色素または蛍光標識の存在に関連するいくつかの蛍光パラメータ。
【００６７】
実際には、フローサイトメトリー(FCM）は、焦点を合せたレーザービームの前を１つずつ、液体懸濁液状態でミクロスフェアを通過させ、各ミクロスフェア上で個々に、第１に、レーザー光散乱／回折を、そして第２に、関連する蛍光信号を測定することからなる。この情報はすべて、ユーザーが、考慮中の１または２以上のパラメータ（例えば、サイズまたは蛍光）に関して均一である副次集団を容易に位置決定する度数分布（ヒストグラム）の形でユーザに提供される。１つの（または２以上の）蛍光パラメータは、サイズ／構造パラメータに加えて、同じ種類のミクロスフェアに属する個々のものをまとめるために使用できる（多重分析）。１つの（または２以上の）その他の蛍光パラメータが、その強度が、考慮中の種類のミクロスフェア上に存在する分析物の量に直接比例する、視覚化剤として使用できる。
【００６８】
工程e)において使用できるフローサイトメトリーの例は、FACS（蛍光活性化セルソーター) 技法であり、これは、サイズおよび各種の標識化の後に発光する蛍光の強度によってミクロスフェアを分別する電子システムから成る。この装置は、ミクロスフェア懸濁液の微小液滴を作製し、これを１つのミクロスフェアのみを有するように希釈する。この微小液滴を、レーザー光線の光ビームの前を通過させ、ミクロスフェアをその蛍光および／またはそのサイズにより分析（ヒストグラム）および分別する。
【００６９】
化合物Ｃに標識を付けるために、または試料中で検出および／または定量される分析物に標識を付けために使用できる標識の中で、特にフルオレセインおよびその誘導体（例、フルオレセインイソチオシアネート（FITC））、またはアロフィコシアニン（APC)、フィコエリトリン−シアニン５（PC5)およびフィコエリトリン（PE) 、R-フィコエリトリン  (R-PE)、あるいは、ローダミンおよびその誘導体、クマリンおよびその誘導体、ルシフェラーゼおよびその誘導体、クロモマイシン、ミトラマイシン、GFP ( 「緑色蛍光タンパク質」用）、eGFP（「強化緑色蛍光タンパク質」用）、RFP （「赤色蛍光タンパク質」用）、BFP （「青色蛍光タンパク質」用）、eBFP（「強化青色蛍光タンパク質」用）、YFP （「黄色蛍光タンパク質」用）、eYFP（「強化黄色蛍光タンパク質」用）、ダンシル、ウンベリフェロン、臭化エチジウム、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、ヨウ化プロピジウム（PI）などの蛍光標識が好ましいが、それらに限定されない。
【００７０】
このように、本発明方法は、好ましくは、使用する標識が蛍光であることを特徴とする。
より好ましくは、本発明方法は、方法の工程e)における前記標識の検出および／または定量がフローサイトメトリーによって行われることを特徴とする。
【００７１】
これらの標識を結合するための方法は、当業者にとって周知であり、本明細書において発展はさせないであろう。しかしながら、ある種の分析物については、検出および／または定量しようとする分析物に対するこの種の蛍光標識を含む複合体は市販されている。
【００７２】
いくつかの分析物の検出および／または多重定量のためのこの種の方法において、特異的に検出でき、および／または同時に定量できる一連の標識が好ましく使用され、好ましいのは蛍光標識である。特に好ましくは、フローサイトメトリーが、前記一連の蛍光標識を直接的かつ同時に検出および／または定量するのに用いられるであろう。
【００７３】
このように、ミクロスフェア集団の懸濁液は、構成するミクロスフェアが各々のその表面に化合物B1を結合して有する第１の集団n1、構成するミクロスフェアが各々のその表面に化合物B2を結合して有する第２の集団n2、構成するミクロスフェアが各々のその表面に化合物B3を結合して有する第３の集団n3、等々を含んでもよい。従って、分析物1 は化合物B1により認識され、分析物2 は化合物B2により認識され、分析物3 は化合物B3により認識される等々であろう。
【００７４】
ある特定の態様によれば、本発明方法は、前記集団のうちの少なくとも２つが、それらを互いに区別しうる少なくとも１つの固有の物理的性質を有することを特徴とする。
当業者は、それらを互いに区別でき、従って、試料中の検出および／または定量されるべき異なる分析物の数を増やすことを可能にする、固有の物理的性質を示す入手しうるミクロスフェア集団を用いてもよく、この固有の物理的性質は、そのサイズおよび／または光学的性質（各々の集団に特有の蛍光）によって、区別可能である。
【００７５】
このように、好ましくは、少なくとも２つのミクロスフェア集団を区別することを可能にする本発明方法のミクロスフェアの固有の物理的性質は、ミクロスフェアのサイズおよび／または光学的性質である。
【００７６】
より好ましくは、本発明方法は、ミクロスフェアが0.3 〜100 μm のサイズであることを特徴とする。
さらに好ましくは、本発明方法は、ミクロスフェアが１〜20μm のサイズであることを特徴とする。
【００７７】
これらのサイズの範囲は、可能な限り、通常のフローサイトメーターの分析サイズ範囲に対応する。これらの直径範囲内で、かつ、あまり厳格な規制を付与しない状態で（磁気、蛍光）、いくつかの異なる群（例えば、１、３、５、８、10および15μm ）を形成するように、前方光散乱（FSまたはFLS)と称されるパラメータにより測定して、それらのサイズパラメータのみによって互いに区別できるビーズを見出すことは容易である。これらの直径のいくつかは、蛍光変法において、または区別可能な強度レベルによってさえ利用できる。
【００７８】
別の態様によれば、本発明方法は、光学的性質が前記ミクロスフェアの放出波長および／または蛍光強度であることを特徴とする。
従って、前記懸濁液のミクロスフェアのｎ集団を互いに区別することが可能である。
【００７９】
このように、例えば、Bang's Labs ( フィッシャーズ, US) の QuantumPlexTM、Duke Scientific ( パロアルト, US) のCytoPlex TM により、一定のサイズについて、赤色蛍光における強度レベルにより区別可能なサブファミリーのビーズを得ることが可能となり、4 μm のビーズ（CytoPlex）については10のレベルまでの、または4.4 〜5.5 μm のビーズ（QuantumPlex)については２×５レベルである。上述した直径およびそれぞれ赤色蛍光強度が５つのレベルであるビーズを特別に利用できると仮定すると、本発明により可能な多重検出は、６×５＝30の分析物となる。
【００８０】
有利にも、本発明方法は、少なくとも６つの異なる分析物の迅速な検出および／または定量を可能にする。
使用する複合体の集団に必要な特異性は、検出および／または定量化の工程e)の複雑さ、および求める分析物の種類および数に依存する。このように、１種類の標識を含み、従って遍在する可視化機能を有する、ただ１つの複合体集団を使用することができる。この場合、特異性は、各々の捕捉用ビーズの選択性だけによって提供される。逆に、検定される分析物と同数の異なる複合体集団を使用することもまた可能である。当業者は当然、実施される試験に応じて、これらの２つの極端な変形から適切な代替物を選ぶことができる。
【００８１】
有利な態様によれば、本発明方法は、前記分析物が核酸であり、そして、工程a)において、化合物Ｂが前記分析物の１つと特異的にハイブリッド形成しうる核酸であることを特徴とする。
【００８２】
好ましくは、前記分析物は、ＰＣＲ生成物である。
より好ましくは、前記ＰＣＲ生成物は標識されて得られる。
場合により標識された、この種のＰＣＲ生成物は既に報告されている。この態様で使用する機能化非磁性ミクロスフェアは、その表面にオリゴヌクレオチド型の化合物Ｂを担持し、この化合物Ｂは求める増幅生成物の１つに相補性である。生成物が予め標識されている場合、磁化ミクロスフェアを複合体に接触させることからなる工程d)は必要でない。ミクロスフェアの表面における標識化は、ミクロスフェアが捕捉したＰＣＲ生成物に担持される標識により提供される。
【００８３】
さらに好ましくは、本発明方法は、工程d)で使用する前記複合体の化合物Ｃが、前記分析物の１つと特異的にハイブリッド形成しうる核酸であることを特徴とする。
この種の複合体は、例えば、いくつかの分析物、特に予め増幅されていないゲノム材料、または予め増幅されていない誘導体、例えばこのゲノム材料のための制限酵素を使用した酵素開裂によって生じる断片などを検出および／または定量するために使用してもよい。
【００８４】
次いで、信号増幅工程が、ミクロスフェアの化合物Ｂおよび複合体の化合物Ｃとの間のライゲーション（または連結）からなる工程により提供されうる。
このように、本発明の主題はまた、SNP(一塩基多型）の検出および／または多重定量のための本発明方法の使用である。
【００８５】
この場合、本発明の方法は、好ましくは、鋳型DNA 鎖に完全に相補性であるという条件でのみ２つの隣接オリゴヌクレオチドを共有結合的に連結するリガーゼの作用に基づく、「オリゴヌクレオチドライゲーション分析法」のための OLA法（Landegren et al., Proc.Natl.Aced.Sci. US 1990; 87 ：8923-8927;米国特許第4988617 号）と組み合わせて用いられる。上記のように、鋳型DNA 鎖は、アンプリコン（ＰＣＲ／ポリメラーゼ連鎖反応法または別の酵素的増幅反応により増幅された断片）であるか、または予め増幅されていないゲノム材料もしくは予め増幅されていないその誘導体、例えば、このゲノムの材料のための制限酵素による酵素開裂により生成される断片でありうる。
【００８６】
このように、好ましくは、本発明の使用は、SNP の検出および／または多重定量がOLA 法により実施されることを特徴とする。
この変法において、上記の一般的定義の意味の範囲内の複合体は、蛍光標識を担持している可視化のためのプローブ (化合物Ｃ) である。ライゲーション工程は、前記方法の工程d)および工程e)の間の追加工程となる。
【００８７】
以下に記載され、概略的に図１に示される手順は、本発明の一般的原理を説明する。この態様は、３つの異なる抗原の検出に関する。当然、これに基づき、検出および／または定量される異なる分析物の性質および数、試験の感度、試験が実施される速度、使用する材料などに応じて、多くの変法が当業者により案出されてもよい。これらの変法は、例えば、機能化ミクロスフェアの数、および／またはサイズ、および／または光学的性質、その表面に結合した求める分析物に特異的なリガンド (化合物Ｂ) の数、連続的洗浄と交替して数回反復しうる磁化工程、複合体に結合した標識の性質 (混合物の全複合体について同じであるか、または複合体の特異性により全く異なってよい) などに関する。
【００８８】
機能化ミクロスフェアの集団を、試験することが望まれる分析物と接触させる。単純性および明快さのために、この明細書においては、異なるサイズのラテックスミクロスフェアの３つの集団（検出および／または定量される３つの分析物）があると考える。集団の各々は、その表面に、求める３つの分析物のうちの１つに特異的な捕捉用抗体である化合物Ｂを担持する。この説明では、また、化合物Ａは、ビオチン−ストレプトアビジン結合を介して強磁性流体の磁性粒子の結合を可能にするように、ミクロスフェアの表面にグラフトされるビオチン分子であると考える。ミクロスフェアを試料と混合する場合、求める各々の分析物は特異的抗体を担持している集団に結合するであろう。次いで、ストレプトアビジンに結合した強磁性流体の磁性粒子を媒体に添加すると、ミクロスフェアの表面に結合するであろう。このように磁化可能にされたミクロスフェアを、適当な緩衝液で洗浄することからなる１または２以上の工程と交互に行う１または２以上の磁化工程によって、媒体のその他の妨害産物から分離することができる。
【００８９】
ミクロスフェア集団を次いで３種類の複合体の混合物と接触させる。この概要では、各々の種類の複合体が蛍光標識を担持している特異的抗体である化合物Ｃによって表される。
【００９０】
前記複合体をその特異的分析物に結合させ、それ自身をミクロスフェアの表面に保持させるのに十分、ミクロスフェアを複合体溶液と共に温置することからなる段階の後、蛍光色素と結合したミクロスフェアを分析することができる。この場合、それらは、サイズによるフローサイトメトリーによって分析される。
【００９１】
複合体は、ミクロスフェアに結合した分析物の最適標識化を確実にするように、通常、過剰に使用される。その結果、ミクロスフェアの分析を行う前に、懸濁液に残った過剰の複合体を含む媒体からミクロスフェアを分離することが好ましい。この分離は、１または２以上の一連の磁化および洗浄工程で再度行うのが有利である。
【００９２】
すでに示したように、本発明方法の有利な変法は、ｎの核酸の検出および／または定量に関する。その最も単純な態様では、この変法は、以下に記載し概略的に図２に示される手順による。
【００９３】
この場合、分析は、異なるサイズのビーズを使用した３つの蛍光ＰＣＲ生成物に関する。機能化ミクロスフェア集団の各々は、ＰＣＲ生成物の１つに対して相補的なオリゴヌクレオチドである化合物Ｂ（捕捉用プローブ）によって被覆され、特異的抗体では被覆されない。ミクロスフェアを混合し、磁化することからなる工程は、前述の態様に記載したと同様である。磁化および洗浄工程の後、表面に蛍光生成物を捕捉したミクロスフェアをフローサイトメトリーにより分析する。
【００９４】
本発明の主題は、また、以下の試薬をその表面に含む機能化非磁性ミクロスフェアの集団の懸濁液を含むことを特徴とする、試料に含まれているかもしれない分析物の検出および／または多重定量のためのキットである：
a)以下を含む試薬１：
- 結合対の第１部分を形成する化合物Ａ、
- 試料の分析物の１つと特異的結合を形成しうる化合物Ｂ、および、
b)前記化合物Ａと特異的結合対を形成しうる第２の結合性部分をその表面に有する磁性粒子を含有する強磁性流体を含む試薬２、および
c)特異的に前記分析物と反応しうる化合物Ｃ、および検出しうる標識を有する少なくとも１つの複合体の溶液を含む試薬３。
【００９５】
より好ましくは、本発明のキットは、試料中に含まれているかもしれない前記分析物を含む試薬４も含む。
さらに好ましくは、本発明のキットは、希釈用緩衝液からなる試薬５、および洗浄用緩衝液からなる試薬６も含む。
【００９６】
最後に、別のより好ましい態様によれば、本発明のキットは、各種ミクロスフェアの凝集を中和する (防止する) ための緩衝液を含有する試薬７も含む。
前記緩衝液は、例えば、PBS 系緩衝液（例、PBS/Tween20 ）である。
【００９７】
試薬７は、ミクロスフェアの表面の化合物Ａがビオチン型化合物であるときに、特に使用される。前記中和用緩衝液は、磁化の間、化合物Ａで被覆された各種ミクロスフェアの凝集を防止することを可能にする。ビオチン化ミクロスフェアが関与するこの場合、中和用緩衝液は、例えば、ビオチンの水溶液から成る。
【００９８】
上に既に記載し、そして、以下の実施例から明らかなように、本発明方法は、試料中のいくつかの物質を同時に比較的短時間に同定することを可能にする。
以下の図面の説明および実施例は、本発明を例証することを目的とするが、決してその範囲を制限するものではない。
【実施例１】
【００９９】
FCM によるサイズの関数としてのミクロスフェアの集団の認識
以下に一覧で示すミクロスフェアを同じ割合で混合し、この混合物をEPICS XLフローサイトメーター（Coulter)で分析した (図５）。
・サイズ、2 、3.1 、6 、7.6 、10.2および15.1μm のビーズの６つの集団の混合物をフローサイトメトリー分析すると、ビーズのさまざまな集団の一重線が二重散乱解析によって区別できることが示された。パラメーターを、対数的増幅の後に測定する（FS log/SS log ）（前方光散乱についてはFS; 側面光散乱についてはSS）。
【０１００】
使用するミクロスフェアの６つの集団の一覧：
【０１０１】
【表１】
2007504474.tif 000003
【０１０２】
サイズ、約３、８、10および15μm のビーズの４つの集団の混合物をフローサイトメトリー分析すると、ビーズのさまざまな集団の一重線がFS log/SS log によって容易に区別でき、そして、可能な多重線が妨害を示さないことを示した。
【０１０３】
使用するミクロスフェアの４つの集団の一覧：
【０１０４】
【表２】
2007504474.tif 000004
図5A〜5C参照
【実施例２】
【０１０５】
サイズおよび蛍光を組み合わせた関数としてのFCM によるミクロスフェアの多重(6) 集団の区別
赤色蛍光（FL4 検出器で測定）を有する4.4 μm のミクロスフェアを、実施例１の混合物に添加した。4.4 μm ミクロスフェアと上記混合物との組み合わせは、さらに２つの集団を認識することを可能にする；３μm のミクロスフェアと4.4 μm ミクロスフェアとの間の前方散乱（log FS）における差は小さいままであり、容易には識別されない（図5Aおよび5B参照）。組み合わせるパラメータとしてFL4 を導入すると、4.4 μm のミクロスフェアをその他の全て（特に３μm ）に関して、そして、4.4 μm ミクロスフェアの２つの集団を互いに関して、完全に区別することを可能にする。
【実施例３】
【０１０６】
受動吸着による８、10、および15μm のミクロスフェアの機能化
IgG 精製：
モデル細菌のB.globigii、B.pseudomalleiもしくはY.pestis、またはモデル可溶性抗原のオボアルブミン(OVA) およびリシンＡ鎖 (Ricin)に対して免疫したウサギからのポリクローナル血清を製造した。ウサギ免疫グロブリンＧ（IgG)をプロティンＧ上のアフィニティークロマトグラフィにより精製した。
【０１０７】
簡単に述べると、50mlの希釈血清を、Na2HPO4 緩衝液（pH=7）中で予め平衡化したプロティンＧセファロース４fast flow （ファルマシア）５mlを含むカラムに注入した。その後、結合したIgG が0.1Mのグリシン／塩酸緩衝液（pH 2.7）中に溶離され、次いで、トリス／塩酸緩衝液（pH=9）により直ちに中和された。
【０１０８】
溶出液を４℃で150mM のPBS 緩衝液（pH=7.2）に対して透析し、次に逆浸透により濃縮した。IgG 濃縮物を、280 nmでの吸光度の読みから推定した（280nm でのε0.1%= 1.41）。
８、10および15μm のビーズの製造：
直径８μm （Polymer Laboratories）、10μm (Dynal Particles）または15μm (Polymer Laboratories)の固形材料10% を含む１mlのラテックスビーズ（即ち、100 mgのラテックス）を、500gで10分間遠心分離した。上澄600 μl の除去の後、２mlのPBS 緩衝液／0.25% トリトンX-100 ／0.09% NaN3（PBS/トリトン）を添加した。ビーズを室温で10分間温置し、2.4ml のPBS 緩衝液で洗浄し、次いで最終容量６mlのこの同じ緩衝液に再懸濁し、30分間４℃に静置した。
抗体 (Ab) 製造：
AbをPBS 緩衝液で希釈して１ml容量中200 μg/mlの濃度とし、４℃に30分間静置した。１mlの150mM PBS/0.1% BSA/0.09% NaN3 (PBS/BSA）を含む２つの試験管を、非負荷ビーズを得るために用意した。
【０１０９】
BSA-ビオチン（シグマ、Ref.Ａ-8549 ）をPBS 緩衝液に希釈して、１ml容量中500 μg/mlとし、４℃において30分間静置した。
ビーズの負荷 (担持) ：
１mlのビーズ（８、10または15μm ）を、強く撹拌（vortex）しながら各種抗体溶液に添加した。次いで、各種混合物を回転振盪しながら４℃に12時間置いた。この温置の後、混合物を500gで10分間遠心分離した。上澄の除去の後、負荷したビーズを、500 μg/mlのBSA-ビオチン２ml中で３時間、4 ℃に温置することによってビオチン化した。上澄の除去の後、負荷したビーズを、２mlのPBS 緩衝液/2% BSA 中で２時間温置することによって飽和させた。1ml のPBS/BAにビーズをとる前に、PBS 緩衝液で２回洗浄した。得られた懸濁液に番号をつけ、その濃度を2.5 ×104 / μl に調整した。
【実施例４】
【０１１０】
共有結合による4.4 μm ミクロスフェアの機能化
抗-OVAおよび抗−リシンAbを、ビーズのCOOH−活性化の後に共有結合させた（手順は、Bang's Labs procedure, Ref. TechNote #205 ：「共有結合」から適用）。ビーズを活性化するために使用するカルボジイミドは、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC 、Pierce-Brebieres, Fr-, Ref. 1853160 ）である。
Ab製造：
抗-OVA (それぞれ、抗−リシン)IgGをPBS 緩衝液に希釈して、1ml 容量中200 μg/mlの濃度とした。
ビーズ活性化：
Bang's Labs QuantumPlex #5および#3ラテックスビーズ（直径4.4 μm)の１mlを、1900g で10分間遠心分離した。上澄の除去の後、0.1MのMES 緩衝液（pH=5.5）２mlを添加した。この操作を繰り返した後、0.1M MES緩衝液/10mg/ml EDC（pH=5.5）を500 μl 添加した。こうして得られた混合物を、15分間回転振盪機に入れ、２mlのPBS 緩衝液で２回洗浄し、次いで同じ緩衝液１ml量に取った。
ビーズへのAbの結合：
１mlのQuantumPlex #5ビーズを強く撹拌（voltex）しながら抗−リシンIgG 溶液に添加した。同じ操作を、QuantumPlex #3ビーズを予め調製した抗-OVA IgG溶液と混合することにより行った。次いで、各種混合物を回転振盪しながら４時間室温に置いた。
ビーズのビオチン化：
混合物を1900g で10分間遠心分離した。上澄の除去の後、負荷したビーズを、２mlのPBS/0.05% BSA-ビオチン/30mM グリシン中で４℃に一晩温置することによって、ビオチン化した。
【０１１１】
ビーズのビオチン負荷を、ストレプトアビジン- PE（シグマ、Ref. S-3402 ）での標識の後、FCM によって確認した。
ビーズの飽和：
この温置の後、ビーズを1900g で10分間遠心分離した。上澄の除去の後、負荷したビーズを、２mlのPBS 緩衝液/2% BSA 中での30分間の温置によって飽和させた。ビーズを１mlのPBS/BAに取る前に、PBS 緩衝液での洗浄を行った。得られた懸濁液に番号を付け、その濃度を2.5 ×104 ビーズ/ μl に調整した。
【実施例５】
【０１１２】
最初非磁性である4.4 、８、10および15μｍミクロスフェアの磁気分離および区別的 (differential) 認識
1.目的
・最初非磁性であるが、ストレプトアビジン／ビオチン結合により強磁性流体の磁性粒子が結合されると磁性となるラテックスビーズを磁化により分離する可能性を実証すること・この結合が、FS LOG/SS LOG 中のさまざまなカテゴリーのビーズの重複を生じないことを示すこと。
・ビーズ回収率がサイトメトリー分析を可能にするのに十分高いことを示すこと。
【０１１３】
2.材料
−以下から成る機能化ビーズの混合物（各々の特異性をもつ5000ビーズ/ μl ）：
4.4 μm QuantumPlex #3ビーズ/ 抗OVA Ab/BSA−ビオチン（バッチ # 682）
4.4 μm QuantumPlex #5ビーズ/ 抗−リシンAb/BSA- ビオチン（バッチ# 681 ）
8 μm Polymer Laboratoriesビーズ/ 抗−Y.pestis Ab/BSA-ビオチン（バッチ# 041 ）
10μm Dynoビーズ/ 抗、B.pseudomallei Ab/BSA-ビオチン（バッチ# 042)
15μm Polymer Laboratoriesビーズ/ 抗-B.globigii Ab/BSA- ビオチン（バッチ# 043 ）
−0.5mg Fe/ml の強磁性流体−ストレプトアビジン（FF-SA ）Molecular Probes（Ref. C-21476）（バッチ#71A1-1 ）
−蒸留水中 200μg/mlのd-ビオチン
−PBS 緩衝液/0.1% Tween 
−PBS 緩衝液/BA 
−１ml IMS試験管
−Dynal 磁石。
−5.1 μm Duke XPR  緑色ビーズ（バッチ#1938 ）。
【０１１４】
3.手順
790 μl のPBS/0.1%Tween （IMS 試験管）または490 μl のPBS/0.1% BSA/0.09%のNaN3（PBS/BA）（参照試験管）を１mlのIMS 試験管に導入する。
【０１１５】
10μl の機能化ビーズ混合物（即ち、各々のカテゴリーにつき50000 個のビーズ）を添加する。
混合物を攪拌する。
【０１１６】
IMS 試験管についてのみ、30μl のFF-SA を添加する。
混合物を攪拌する。
混合物を５分間回転式振盪機に入れる
200 μg/mlのビオチン100 μl を添加する。
混合物を１分間温置する。
混合物を攪拌する。
試験管を２分30秒間磁化する。
緩衝液を除去する。
800 μl のPBS/BAを添加する。
試験管を２分30秒間磁化する。
緩衝液を除去する。
500 μl のPBS/BAを添加する。
PBS/0.1%Tween 中で1/50に希釈されたDuke XPRビーズ15μl ( サイトメトリー解析の間計数される事象の数を標準化するための参照ビーズ）を添加する。
【０１１７】
以下に示すように、２つの試験管をCoulter EPICS XLサイトメーターで分析する：
FS LOG/SS LOG ヒストグラムを作成する。４つの分析領域（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）をこのヒストグラムに作成する（図7A）。
【０１１８】
領域Ｂ、ＣおよびＤをそれぞれ、８、10および15μm のビーズ上に置く。
領域Ａを、計数用ビーズ（5.1 μm 、Duke XPR）および、4.4 μm の捕捉用ビーズからなる集団に置く。
【０１１９】
ウィンドウＡにゲートをもつFS LOG/SS LOG ヒストグラムを作成する（図7b）。
３つの分析領域（Ｅ、ＦおよびＧ）を作成する。
領域ＥおよびＦをそれぞれ、4.4 μm のQuantumPlex #3および#5ビーズの集団に置く。領域Ｇを計測用ビーズ（Duke XPR）集団に置く。
【０１２０】
領域Ｇにゲートをもつ単一パラメーターのヒストグラムを作成する。10000 の事象での自動解析停止をこのヒストグラムに置く。
領域Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦにおいて計数される事象の数を記録する。ビーズの各カテゴリーについての回収率は、IMS 試験管で計数した事象の数を、参照試験管で計数した事象の数で分ることによって算出される。
4.結果
4.1.FF-SＡの結合の間の、各種ビオチン−ビーズ集団のFS LOGによる分布の変化（図８）
ビオチン-BSA／ビーズにFF-SA が結合すると、FSにわずかな減少が生じる。この変化により、各種ビーズ集団の重複が生じることはない。
4.2.回収率
第３章において開示した条件での３つの異なる分析法で得られた回収率（回収ビーズの％割合）を下記の表に示す。
【０１２１】
【表３】
2007504474.tif 000005
回収率は50〜95％であった。
【０１２２】
5.結論
・ FF-SAの結合によって磁性となるビオチン化ラテックスビーズの磁化による分離が可能である（充分な回収率）と決定される。
・この磁気分離は、多重検定の実施と適合する（各種ミクロスフェアのカテゴリーの重複がない) 。
・この実施例は、完全にシステムの順応性を例証する。
【０１２３】
多重化用ミクロスフェア、および分離用ナノスフェアの別々の使用は、必要とされる特性（サイズ、自己蛍光、密度、材料、界面化学など）を有するミクロスフェアの利用性の分野を広げる。実際に、非磁性ラテックスは上述した特性の全ての範囲において非常に容易に入手できるのに対し、磁性ミクロスフェアの範囲は非常に限られている（参照カタログでは＜１％）。例えば、選択は、多数の系列の多重化用集団を作成するには異なる供給者が必要であることを意味するか、または特別な（従って、高価な）製造が必要であることを意味するかもしれない。
【０１２４】
逆に、提案されたシステムでは、非常に広い範囲の非磁性ラテックスの範囲の中で、任意の多重化用ミクロスフェアを使うことができる。
【実施例６】
【０１２５】
本発明キットのモデル例
試薬１−機能化ミクロスフェア：検定されるAgに特異的なAbで被覆したビオチン化ミクロスフェアの混合物。ビーズ濃度：各特異性を有する2500のミクロスフェア／μl ( 下記表) 。
【０１２６】
【表４】
2007504474.tif 000006
【０１２７】
試薬２−強磁性流体−ストレプトアビジン：ストレプトアビジン、捕捉性強磁性流体複合体（Molecular Probes, Ref. C-21476）。
試薬３−可視化用試薬：検定されるAgに特異的な蛍光複合体の混合物 (下記表) 。
【０１２８】
【表５】
2007504474.tif 000007
【０１２９】
試薬４−標準：検定される６種のAgの濃縮混合物（規定濃度）。
一連の希釈度のこの試薬はその場で準備される（試薬１における希釈）。分析される試料と同じ条件下で扱われる場合、この範囲（測定すべき位置の数）は試料中に存在するAgを定量することを可能にする。
【０１３０】
試薬５−希釈用緩衝液：PBS 緩衝液/0.1% Tween20 （pH=7.2）。
試薬6 −洗浄用緩衝液：決定すべき（PBS/0.1% BSA/0.09% NaNs3またはPBS/0.1%Tween20 など）。
【０１３１】
試薬７−中和用緩衝液：蒸留水中200 μg/mlのd-ビオチンの溶液。
d-ビオチンは、磁化の間、各種ビオチン化ミクロスフェアの凝集を防止する（ミクロスフェア／ビオチン−SA/FF/SA−ビオチン／ミクロスフェア凝集は、SA/FF/SAをビオチンで中和してビオチン-SA/FF/SA-ビオチンとすることにより避けられ、これは、各種ビオチン−ミクロスフェア間の架橋を生じさせることはできない）。
【０１３２】
供給されない必要な材料：Dynal MPC 磁石。
【実施例７】
【０１３３】
３種類の細菌および３種類のタンパク質を多重検定するための操作手順のモデル
1.標準範囲を、下記に示すように試薬４および５を混合することにより調製する。
【０１３４】
【表６】
2007504474.tif 000008
【０１３５】
2.分析される試料800 μl または標準液800 μl を、1ml 試験管 (試験管T0〜Tn）に導入する。
3.試薬１を20μl 添加する。
4.試験管を攪拌する。
5.試験管を８分間（この時間を５分に減少させる可能性を検討中）回転式振盪機に入れる。
6.試薬２を30μl 添加する。
7.試験管を攪拌する。
8.試験管を５分間回転式振盪機に入れる。
9.試薬７を100 μl 導入する。
10. 試験管を攪拌する。
11. 室温で１分間温置する（この１分間の温置は必ずしも必要ではない）。
12. 試験管を２分30秒間（この時間を２分に減少させる可能性を検討中）磁石上に置く。
13. 媒体を除去する。
14. 試薬３を200 μl 添加する。
15. 試験管を攪拌する。
16. 室温で10分間温置する。
17. 試薬６を600 μl 添加する。
18. 試験管を２分30秒間（この時間を２分に減少させる可能性を検討中）磁石上に置く。
19. 媒体を除去。
20. 試薬６を500 μl 添加する。
21. FCM により解析を行なう。
【実施例８】
【０１３６】
磁気分離後の15μm ミクロスフェア上での細菌の検出および検定
目的：抗-B.globigii PAb を負荷したビオチン化15μm のビーズ上でB.globigiiを検出して濃度を測定すること。
材料および手順：実施例６および７に対応する材料および手順。
分析する試料：試薬１中のB.globigii胞子の希釈物。160000、80000 、40000 、20000 、10000 、および5000胞子/ml のAg濃度。
結果：
【０１３７】
【表７】
2007504474.tif 000009
図９を参照。
【実施例９】
【０１３８】
：磁気分離後の蛍光4.4 μm ミクロスフェア上でのオボアルブミンの多重検定
目的：抗−オボアルブミンPAb を負荷したビオチン化蛍光4.4 μm ビーズ上でのオボアルブミンの検出および濃度測定。
材料および手順：材料および使用する手順は、実施例６および７に記載した通りである。
分析する試料：試薬１中のオボアルブミンの希釈物。1.6 、0.8 、0.4 、0.2 、0.1 および0.05ng/ml のオボアルブミン濃度。
結果：
【０１３９】
【表８】
2007504474.tif 000010
【実施例１０】
【０１４０】
SNPの検索のために分子遺伝学に適用した多重フローサイトメトリー解析
OLA 型試験
1)ある遺伝子に特異的な通常５〜100 塩基のサイズを有する捕捉用オリゴヌクレオチドプローブを、化学的方法によって、ビオチン化ラテックスミクロスフェアに結合させる（Iannone MA et al., 2000 、Cytometry 39：131-140 ）。ラテックスミクロスフェアのビオチン化からなる工程は、ミクロスフェアに捕捉用プローブを結合した後に行うこともできる。ストレプトアビジン強磁性流体（FF-SＡ）、可視化用プローブ（図３の例のＡ１およびＡ２）、およびアンプリコンまたはＰＣＲにより予め増幅されていない生物学的試料から抽出されたゲノムのDNA 、もしくはＰＣＲにより予め増幅されていないこのDNA 由来の断片の存在下で、ラテックスビーズを１つの試験管中に温置する。Ａ1 およびＡ2 プローブは、異なる蛍光プローブ（例えば、Cy3 およびCy5 ）であるか、次の免疫反応（例えば、異なる蛍光色素[FITC 対PE] で標識された２つの抗体との）のための別個のハプテンでありえる。多重化はラテックスビーズ系の差によって得られ、それは、サイズについて変化するか、および／または、別個の蛍光特性を有することができる。
2)1)において述べたのと同じ原理で、ラテックスミクロスフェアへの捕捉用プローブのグラフト化に関してさらに特異性の度合いを追加することにより、試験を発展させることができる。このグラフト化は、特異的抗原−抗体結合、特異的ハプテン−抗体結合、またはG+C （グアニン、シトシン）の多いオリゴヌクレオチドプローブにより行うことができる。この第３の場合において、ミクロスフェアに共有結合したG+C リッチなオリゴヌクレオチド配列は、捕捉用プローブの5'位に付加された相補的配列とハイブリッド形成する（図４）。加えて、ヌクレオチドハイブリダイゼーションの場合、アンカーヌクレオチド配列のTm（融解温度）が理想的には60℃より高い、および／または、少なくとも15のグアニンまたはシトシン残基の、または２種類のヌクレオチド塩基の混合物のポリマーから構成される。しかしながら、これらの条件下では、捕捉されたゲノム材料またはアンプリコンのハイブリダイゼーションおよび脱ハイブリダイゼーション (dehybridization)（一般に、15℃〜40℃で行なわれる）は、ミクロスフェアから捕捉用プローブを脱ハイブリダイゼーションすることなく可能である。
【実施例１１】
【０１４１】
標識されたＰＣＲ断片の区別的検出
1.材料
ＰＣＲを実施するためのある方法においては、ＰＣＲ生成物を、標識したヌクレオチドを使用して蛍光性とする。本発明により提案される技術的方法（初期には磁性でないビーズの磁気選別による洗浄からなる工程を使用する）は、図11および19に図式的に示される原理により、３つの異なる特異性に関する、標識されたＰＣＲ生成物の区別的検出に適用することができた。
【０１４２】
強磁性流体でミクロスフェア（μS ）を洗浄した後の、FCM による多重解析の実現可能性は、下記の実施例において例証され、２つの異なる特異性に関する。標識されたＰＣＲ生成物は、この場合、フルオレセインで標識されたオリゴヌクレオチド（O.N.）を使用してモデル化され、その配列が、ビーズ表面に予め結合された各捕捉用プローブの配列に相補的な配列である。実際には：
【０１４３】
・直径6.7 μm のビーズ（SpheroTMカルボキシルポリスチレン粒子、CP-60-10、Spherotech、Libertyville、IL）は、5'末端から3'末端までを以下に示す構造により作成された因子Ｖ捕捉用プローブを担持する：
μS-FV：NH2 (C6) TTT TTT TTT TTT ggA cAA AAT Acc TgT ATT ccT c（SEQ ID No.1 ）；
【０１４４】
・直径9.6 μm のビーズ（PL-Microspheres SuperCarboxyl White 10μm , Polymer Laboratories、英国）は、下記構造により作成された因子II捕捉用プローブを担持する：
μS-FII ：NH2 (C6) TTT TTT TTT TTT aat agc act ggg agc att gag gct c（SEQ ID No.2 ）
２つの捕捉用プローブは、カルボキシル化ビーズ（μS-COOH）への共有結合の観点から、5'位のアミノ基（-NH2）を用いて作成される。それらは、６つの炭素（C6）および12のチミジン（T)から構成されるブレースアーム (またはスペーサー）を含有する。言及された全てのオリゴヌクレオチドは、Proligo （パリ、フランス）によって特別に合成された。
【０１４５】
・以下の実施例において本発明のシステムに必要なビーズの表面のビオチン基は、3'- 位にビオチンで標識され、5'- 位にNH2 ブレース（Ｃ6 ）を有するポリ（T)30オリゴヌクレオチド（polyT-biotと称する）により導入される。これは、下記の構造に基づき作成され、同様の方法で各捕捉用プローブと同時に結合される：
NH2 (C6) TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT- ビオチン（SEQID No.3）
・捕捉用プローブに相補的なオリゴヌクレオチドは、下記構造に従って作成し、5'位をフルオレセイン（Fluoro- ）で標識する：
FVについては：Fluor-g Agg AAT AcA ggT ATT TTg Tcc （SEQ ID No.4 ）
FII については：Fluor -g agc ctc aat gct ccc agt gct att  (SEQID No.5 ）。
【０１４６】
対応する直径を有するカルボキシル化ビーズへの捕捉用プローブの結合は、以下のようにして、EDAC (N-( ジメチルアミノプロピル）-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩、シグマ) で活性化した後に行う：
各種類のビーズについて、1000万個のビーズを遠心分離によってPBS 緩衝液で洗浄し、５×106 μS/mlの濃度に調整する。ビーズを、0.8mg のEDAC（10mg/ml で80μl ）を添加し、30分間温置することにより活性化する。次いでプローブを活性化ビーズに接触させる。特異的プローブおよびビオチン担持プローブの結合を同時に行うために、捕捉用オリゴヌクレオチドおよびpolyT-biotプローブの等モルの混合物を、活性化ビーズと接触させる（合計で17nmol/ml の最終濃度、すなわち、各々のO.N.〜250pmol ）。
【０１４７】
ビーズをAT（室温）で２時間、断続的に攪拌（voltex）しながらによりガラス試験管中に温置する。結合の後、活性化カルボキシル基を、0.2 M エタノールアミンの400 μl を添加し、4 ℃で16時間温置することより中和する。
【０１４８】
最後に、ビーズの疎水性相互作用部位を、PBS-2%BSA 中攪拌しながら30分間温置することによって飽和させる。
以下に記載する、ビーズへのO.N.のハイブリダイゼーション試験について、緩衝液は、検出が効果的に二本鎖 DNAに関する、以下の実施例（実施例12）で使用するのと同じである。それぞれ、i)対になったアンプリコンの脱ハイブリダイゼーション、およびii) 固定化捕捉用プローブへの少なくとも部分的再ハイブリダイゼーション（注）（参照、実施例12のパート２（材料）のメモ）に有利な条件下での中和を可能にする、これらのストリンジェントまたは非ストリンジェントな最適pH緩衝液は、全て、それぞれ「ハイブリダイゼーション用緩衝液」/ および「ライゲーション用緩衝液」の名称で/ ここでは中和用緩衝液と称する、Genecolor TM  FV Leiden キット（BioCytex、マルセーユ、フランス）由来である。
【０１４９】
フローサイトメトリー解析のための洗浄用／希釈用緩衝液は、PBS-0.1%Tween20 TMである。
注：以下の実施例のメモ参照（実施例12のパート２（材料）のメモ参照）
2.方法
ビーズ（５μl 試験、即ち、各種類について100000μS/検査) および相補的オリゴヌクレオチド（O.N.）（5 μl 、即ち最大量に関しては、各々のO.N.について3pmol/検査、または指示により1/10希釈）を、ＰＣＲ試験管（Simport 、ケベック、カナダ）中で、ハイブリダイゼーション用緩衝液中にATで15分間、次いで、中和用緩衝液中にATで15分間、温置し、相補鎖をハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイゼーションの後、ビーズに結合していないO.N.を、磁気選別により洗い流す。このために、10μl のCaptivate TM、ストレプトアビジンを負荷した強磁性流体（SA-FF と称する、Molecular Probes, Eugene、オレゴン、米国）を反応液に添加し、この混合物を10分間温置し、ＰＣＲ試験管の内容物をFCM 用試験管に移し、洗浄用緩衝液（PBS-0.1% Tween20TM）1ml を添加し、試験管を５分間強力な磁石（MPC-L 、Dynal F, Compiegne, F ）に対して置く。磁化されたビーズを管壁に対して固定したままで、液相を除去し、そしてビーズを次の相（選択的脱ハイブリダイゼーション）のために洗浄用緩衝液２mlに再懸濁する。
【０１５０】
選択的脱ハイブリダイゼーションのために、特異的ハイブリダイゼーション（完全な配列相補性、即ち100%に相当する）のみを維持し、非特異的ハイブリダイゼーション（部分的な配列相補性、即ち<35%に相当する）を解離するように、試験管をプローブの融解温度（Tm）近くに加温する。このために、試験管をPBS 緩衝液/0.1% Tween20 TM中に54℃で温置し、この条件は、それらの非相補的配列、それぞれ「FII 」および「FV」からの、FVおよびFII 蛍光プローブの選択的脱離を可能にする。試験管を、指示した温度で５分間水浴中に保持し、次いでFMC により直ちに分析する。
【０１５１】
完全な脱ハイブリダイゼーションのために、十分融解温度（Tm）を越えて、実際には80℃で10分加温する。
3.結果
図11〜19は、二重サイトメトリー解析における、それぞれ、FVおよびFII 遺伝子に代表的な標識化オリゴヌクレオチド断片の区別的検出を図示する。
【０１５２】
全例において、FV特異性を有する6.7 μm 直径の捕捉用ビーズ（μS-FV）を、それらの蛍光の解析のためにR1領域において正確に示す。FII 特異性を有する9.6 μm 直径の捕捉用ビーズ（μS-FII ）を、R2領域において正確に示す。
a)同時に２つの標識化オリゴヌクレオチドが存在する場合には、それぞれ以下の最大平均強度に対応する、各種類のビーズの最大標識化が観察される（図12および13）：
・μS-FVについては 831不定単位（a.u.）
・μS-FII については 247不定単位（a.u.）
b)同じビーズが、80℃で10分間の加熱によって完全な脱ハイブリダイゼーションを受ける場合は（図14および15）、以下の最小平均強度に対応する、各種類のビーズの最小標識化が観察される（図14および15）：
μS-FVについては6 a.u.
μS-FII については18 a.u. 
従って、これらの結果は、それぞれ以下の２つの変動する範囲の最大幅に対応する：
6 〜840 a.u.（μS-FV）
18〜250 a.u.（μS-FII ）。
c)２種類の標識化オリゴヌクレオチドのうちのただ１つ（FV）が低下させた量（最大量の1/10）で存在する場合には、μS-FVに強い標識化が観察され（図16および17、266a.u. 、即ち、最大可能な幅の〜25％）、一方、μS-FII については信号は、図15に見られる18a.u.のBN近くにとどまる（21a.u.、即ち、最大可能な幅の＜２％）。
d)逆に、２種類の標識化オリゴヌクレオチドのうちのただ１つ（FII)が低下させた量（最大量の1/10）で存在する場合には、μS-FII に陽性の標識化が観察され（77a.u.、即ち、最大可能な幅の〜30％）、一方、μS-FVについては、信号は弱いままである（11a.u.、即ち、最大可能な幅の＜２％）が、にもかかわらず図15に示される6a.u. のBNよりは大きく、これはわずかに残った非特異的標識化の存在を示唆する。
【０１５３】
下記の表は、因子IIおよび因子Ｖ遺伝子に代表的なO.N.の二重FCM 解析に関する結果をまとめており、蛍光標識ＤＮＡ断片の検出が簡単であり、単一の試験管において行いうることを示す。
【０１５４】
【表９】
2007504474.tif 000011
【実施例１２】
【０１５５】
SNP突然変異の区別的検出：
1.原理
点突然変異（SNP)の検出は、OLＡ方法に基づく（Landegren 、Science 1988、241: 1077-80) 。この方法は、以下を含む：
・捕捉用プローブ（この場合、一系統のビーズ上に固定化される）、対応する遺伝子のアンプリコン由来の相補的一本鎖のＤＮＡ鎖、および捕捉用プローブに隣接する可視化用プローブの間の三元複合体の形成、
・正確に隣接し完全にハイブリッド形成した鎖のみを一緒に連結するリガーゼの特異的作用による、捕捉用プローブと可視化用プローブ−相補鎖とハイブリッド形成している−との共有結合。突然変異をもつ唯一の塩基上の相補性の欠如は、この結合（ここではライゲーションと称する）を防止するのに十分である、
・ストリンジェントな条件下での、DNA 二本鎖の解離。
【０１５６】
リガーゼがその作用に必要な特異性の条件下にある場合に、そして、この場合のみ、可視化用プローブは捕捉用プローブと、従って、対応する基体（この場合ビーズ）と結合したままである。
【０１５７】
本発明に関するこの原理の適用は、図20および21に図示されている。
注：FMC は、別のパラメータ（サイズまたは異なる波長の蛍光）に基づいて区別されうるビーズのグループにおける、非常に異なるレベル（ハックグラウンドノイズから++++標識まで）の蛍光強度を同時に計測することを可能にする。
2.材料
点突然変異（SNP)の検出（その原理は図21により図示される）は、区別的検出のための２種類のμS の使用を必要とする。ここで使用するμS は、実施例11にて説明したように、その場で捕捉用プローブを負荷され、以下のようなものである：
・直径6.7 μm のビーズは、5'から3'末端までを示した、以下の構造に従い作成した野生型の因子Ｖ捕捉用プローブを有する（μS-FVwt）：
μS-FVwt：NH2 (C6 ）TTT TTT TTT TTT ggA cAA AAT Acc TgT ATT ccT c （SEQ ID No.1 ）、
・直径9.6 μm のビーズは、5'から3'末端までを示した、以下の構造に従い作成した変異型の因子Ｖ捕捉用プローブを有する（μS-FVmut)：
μS-FVmut ：NH2 (C6) TTT TTT TTT TTT ggA cAA AAT Acc TgT ATT ccT T（SEQ ID No.6 ）。
【０１５８】
以下の実施例における本発明システムに必要な、ビーズの表面のビオチン基は、ポリ（T ）30オリゴヌクレオチド法によりＡ章におけると同様にして導入され、ストレプトアビジン−強磁性流体（Captivate TM、Molecular Probes、Eugene、OR、米国）の特異的結合を可能にする。
【０１５９】
ライゲーションの可視化を可能にする捕捉用プローブに隣接するプローブは、5'- 位にリン酸基を、3'- 位にフルオレセイン標識を有する；これは Proligo（パリ、フランス）により特別に合成され、以下の配列を有する：
PO4-2-gcc TgT ccA ggg ATc TgcTcc-fluo（SEQ ID No.7 ）。
【０１６０】
三元複合体の形成のためのアプリコンは、ゲノムDNＡまたは特異的プラスミドからの野生型および／または変異型因子Ｖ遺伝子の断片のＰＣＲ増幅に由来し、ＰＣＲはGenecolor TM FV Leidenキット（BioCytex、マルセーユ、フランス）において利用できる「Ａmpli- Mix 」試薬ＰＣＲmix の存在下で行われる。
【０１６１】
捕捉用プローブおよびシグナルプローブ間の共有結合の形成のためのリガーゼ溶液は、Genecolor TM FV Leidenキット（Biocytex、マルセーユ、フランス）において用いられているような、「ライゲーション溶液」試薬、即ちその特別な「ライゲーション用緩衝液」中のT4リガーゼである。
【０１６２】
以下で使用する緩衝液は、最適pHを有し、スクリンジェントまたは非スクリンジェントであり、それぞれ以下を可能にする：
i)対になったアンプリコンの脱ハイブリダイゼーション、および固定化捕捉用プローブへのその部分的な再ハイブリダイゼーション（注）（参照、実施例12のパート２（材料）のメモ）、
ii) リガーゼの作用、そして最後に、
iii)ライゲーションの後で結合していないアンプリコンおよびプローブの脱ハイブリダイゼーション。
【０１６３】
それらはすべて、それぞれ「ハイブリダイゼーション用緩衝液」/ 「ライゲーション用緩衝液」（実施例11では中和用緩衝液とも称される) および「洗浄用緩衝液」の名称の、Genecolor TM FV Leidenキットに由来する。
【０１６４】
フローサイトメトリー解析のための希釈用緩衝液は、PBS-0.1%Tween20 TMである。
(注) その相補鎖に対してよりも、固定化捕捉用プローブに２つのＤＮＡ鎖のうちの１つの有意な部分を再ハイブリダイゼーションさせるように、化学量論的状態を予め最適化する（過剰のアンプリコン、過剰のシグナルプローブ）。
3.手順
２種類のビーズ（μS-FVwtおよびμS-FVmut ）を等量混合し、全体で40000 μS/μl の割合となるようハイブリダイゼーション用緩衝液に希釈する。ビーズ懸濁液5 μl （即ち、各種類について100000μS/試験）、アンプリコン（3.75μl/試験）およびFV可視化用プローブ（ハイブリダイゼーション用緩衝液1.25μl 中の1pmol ）を、特殊なＰＣＲマイクロチューブ（ＰＣＲ T 320-1N 、Simport 、ケベック、カナダ）に入れる。反応媒体をホモジナイズし（voltex）、室温（AT）に30分間温置する。
【０１６５】
次いで、ライゲーション工程を、ライゲーション用溶液100 μl の添加の後1 時間温置することによって行う。
ライゲーションの後、三元複合体に関係しない過剰なアンプリコンおよび過剰なシグナルプローブを、磁気分離によって除去する。このために、反応混合液（Vt= 110 μl ）に強磁性流体懸濁液（SA-FF ）10μl を添加する。攪拌（voltex）および10分間の温置の後、混合物を1ml の試験管（リンゲル試験管）に移し、強力な磁石（MPC-S 、Dynal 、Compiegne 、フランス）によって磁化を５分間行う。ビーズ（管壁に固定された）を、液体の吸引によって乾燥し、洗浄用溶液100 μl に再懸濁する。適切な特性を有する洗浄用溶液は、非共有結合的相互作用（ライゲーションのないハイブリダイゼーション）によってのみビーズに結合した生成物の脱離を可能にするが、共有結合したプローブの脱離もSA-FF の脱離も可能にしない。この洗浄を２回繰り返す。
【０１６６】
最後に、ビーズを1ml の希釈用緩衝液（PBS-Tween20 TM）で希釈して、サイトメトリーのための試験管（4ml)に移し、FCM により分析する。
4.結果
a)本システムによって認識できないＰＣＲ生成物（この場合、Genecolor TM P2Y12 G52T キット (BioCytex、マルセーユ、フランス) の試薬によって製造された、P2Y12 遺伝子の野生型のアレルの増幅から生じた生成物）の存在下では、２種類のビーズの各々は、その固有のバックグラウンドノイズ（BN）に類似した標識化を与える。実際には（図23および24）；
・μS-FVwt：6.0 a.u.
・μS-FVmut :15.3 a.u.
b)因子Ｖ遺伝子の野生型アレルに対応するＰＣＲ生成物（FVwt、Genecolor TM因子Ｖ Leiden キット（BioCytex、マルセーユ、フランス）の試薬によって製造されるＰＣＲ生成物）の存在下では、μS-FVwtビーズは明らかに陽性の標識化を示すのに対し、μS-FVmut ビーズは、その固有のバックグラウンドノイズに類似した標識化を与える。実際には（図25〜28）：
・μS-FVwt：313 a.u.（6.0 a.u.のBNに対して）
・μS-FVmut: 17.4 a.u.（15.3a.u.のBNに対して）。
【０１６７】
試験における各ビーズの信号を、その非特異的BN上に置く（μS-FVwt：図27、μS-FVmut ：図28）。これは、その特異的リガンド（FVmut アンプリコン）が存在しない場合、FVwt特異性について広く変動する範囲（６〜300a.u以上）、およびFVmut ビーズ上の実質的に０の非特異的標識化を示唆する。
c)因子Ｖ遺伝子の変異型アレルに対応するＰＣＲ生成物（FVmut 、Genecolor TM FV Leidenキット（BioCytex、マルセーユ、フランス）の試薬によって製造されるＰＣＲ生成物）がある場合には、μS-FVmut ビーズは、市販の材料で可能な限りの最大の陽性信号レベルに対応するBNとは明らかに異なる標識化を示す。μS-FVwtビーズは、その固有のバックグラウンドノイズとは異なるにもかかわらず、最大の陽性信号と比較して弱い標識（14.8対313 a.u.、すなわち変化の最大幅の＜２％）を与える。これは、FVmut アンプリコンが存在する場合には、これらのビーズ上の、弱いが真正の非特異的標識化の存在を示唆する。実際には（図29〜32）：
・μS-FVwt：14.8 a.u（6.0 a.u のBNに対して）
・μS-FVmut ：43.4 a.u（15.3a.u のBNに対して）。
【０１６８】
場合によりその他のアレルが存在する場合、このFV変異の検出には、それぞれの変動幅（範囲）は多くて以下の通りである：
FVwt：15〜300a.u
FVmut ：17〜43a.u 
最大強度（300 a.u.対43 a.u. ）に関して観察されるシフトは、μS-FVmut ビーズではより劣った被覆効率によることがある；実施例11のように、これらの9.7 μm ビーズはより低いレベルの被覆を与える。本発明の原理によって、それらの磁性について心配せずに、負荷容量および／または固有のBNの最適特性を得るために、他のビーズバッチ、種類、起源および直径を自由に使うことができる点に留意すべきであり、それは供給の選択をかなり広げる。
d)同時に因子Ｖ遺伝子の２つのアレルに対応するＰＣＲ生成物（FVmut およびFVwt、Genecolor TMFV Leiden キット (BioCytex、マルセーユ、フランス) の試薬によって製造されるＰＣＲ生成物）がある場合には、μS-FVmut ビーズおよびμS-FVwtビーズは、単独で使用される単一のアレルに特異的なアンプリコンで観察されるより弱い強度レベルではあるが、明らかに陽性の標識化を示す、実際には（図33〜36）：
・μS-FVwt：187 a.u. (すなわち、最大特異的標識の幅の2/3 ：[187-15]/[300-15] ）
・μS-FVmut ：33 a.u. （すなわち、最大特異的標識の幅の2/3 ：[33-17]/[43-17])
下記の表は、因子ＶのLeiden突然変異の二重FCM 解析の結果をまとめており、FV遺伝子型の決定が簡単であり、、単一の試験管において行うことができることを示す。
【０１６９】
【表１０】
2007504474.tif 000012
【０１７０】
5.拡張
上記実施例、特に、既に説明した実施例１、２および５は、免疫学的検出に関して、それらのサイズおよび／または測定に使用したものとは異なる第２の蛍光の変化しうるレベルによって、より多くの系列のビーズを使用する可能性をすでに例証した。これらの全ての例との一致から、例えば、以下を用いてFVおよびFII 遺伝子の２つのアレルを単一の試験管において多重解析することが非常に容易であろうことが明らかである：
・FII の野生型および変異型アレルに特異的な２つのプローブを担持するために、実施例12で説明したと同じカルボキシル化ビーズ（直径9.6 μm のFVmut および直径6.7 μm のFVwt）、および実施例４および５で説明した、異なる２レベルの赤色蛍光を有するの4.4 μm カルボキシル化ビーズ、
・１変異につきただ１種類のビーズを必要とする、図20の原理による計測のための２つの異なる蛍光。
【０１７１】
これらの２つの方法は、以下を考慮することによって一般化しうる：
・第１に、計測のために１種類の蛍光だけを用いると、同時に区別しうるビーズ系統の数と同数の異なるアレルを検出することが可能になる、
・第２に、計測のために２種類の異なる蛍光を使用すると、同時に区別しうるビーズ系統の数と同数の遺伝子の遺伝子型を決めることが可能になる。
【０１７２】
全例において、本発明により提供される主要な効果は、多重解析のためのビーズの選択が、それらの固有の磁性に何ら制限的条件を課さないということである。
【実施例１３】
【０１７３】
SNP突然変異の区別的検出
1.図37の原理：
図21同様、図37において、重要な塩基（SNP 特異性）は、各々のアレル特異的な捕捉用プローブに担持され、各々が異なるビーズ（サイズにより区別される）に結合されている。このシステムは、FCM による信号解析のために、サイズおよび構造パラメータに基づくビーズの計数による解析のみを必要とし、蛍光検出器を備えておらず、従って、より低価格の装置を使用するか、または互いに関してビーズ系統を区別するために他のサイズを利用することを可能にする。
2.材料：
点突然変異（SNP)の検出（その原理は図37において図示される）は、区別的検出のために２種類のμS の使用を必要とする。ここで使用するμS は、Ａ章にて説明したように、その場で捕捉用プローブを負荷され、以下のようなものである：
・直径6.7 μm のビーズは、5'末端から3'末端までを示す下記の構造に従って作成される、野生型の因子Ｖ捕捉用プローブを担持する（μS-FVwt）：
μS-FVwt：NH2 (C6) TTT TTT TTT TTT ggA cAA AAT Acc TgT ATT ccT c（SEQID No.1）、
・直径9.6 μm のビーズは、5'末端から3'末端まで示される下記の構造に従って作成される、変異型因子Ｖ捕捉用プローブを担持する（μS-FVmut ）：
μS-FVmut ：NH2 （C6）TTT TTT TTT TTT ggＡ cAA AAt Acc TgT Att ccT T（SEQ ID No.6 ）。
【０１７４】
ライゲーションを可視化することを可能にする、捕捉用プローブに隣接するプローブは、5'- リン酸基および3'- ビオチン基を担持する；これは、Proligo （パリ、フランス）によって特別に合成され、以下の配列を有する：
PO42- -gcc、TgT ccＡ ggg ATc TgcTcc TTT TTT TTT TTT TTT TTT-ビオチン (SEQ ID No.8 ) 。
【０１７５】
捕捉用プローブ上のビオチン基（以下の実施例において本発明システムに必要である）は、強磁性流体- ストレプトアビジン（Captivate TM、Molecular Probe 、Eugene、OR、米国）の特異的結合を可能にする。三元複合体の形成を可能にするアンプリコンは、ゲノムのDNA または特異的プラスミドからの、野生型および／または変異型因子Ｖ遺伝子の断片のＰＣＲ増幅に由来し、ＰＣＲはGenecolor TM FV Leidenキット（BioCytex、マルセーユ、フランス）で利用できる「Ampli- Mix」試薬ＰＣＲmix の存在下で行われる。
【０１７６】
捕捉用プローブおよびシグナルプローブ間の共有結合の形成のためのリガーゼ溶液は、Genecolor TM FV Leidenキット（Biocytex、マルセーユ、フランス）において用いられている、「ライゲーション用溶液」試薬、即ち、その特別な「ライゲーション用緩衝液」中のT4リガーゼである。
【０１７７】
以下で使用する緩衝液は最適pHを有し、ストリンジェントまたは非ストリンジェントであり、それぞれ以下を可能にする：
i)対になったアンプリコンの脱ハイブリダイゼーションおよび固定化捕捉用プローブによるその部分的再ハイブリダイゼーション (注)(以下、参照) 、
ii) リガーゼの作用、そして、最後に
iii)ライゲーションの後で結合していないアンプリコンおよびプローブの脱ハイブリダイゼーション。
【０１７８】
それらは、それぞれ「ハイブリダイゼーション用緩衝液」、「ライゲーション用緩衝液」（実施例Ａにおいては中和用緩衝液とも称される）および、「洗浄用溶液」の名称の、Genecolor TM FV Leidenキットに由来するものである。
【０１７９】
フローサイトメトリー解析のための希釈用緩衝液は、PBS-0.1%Tween20 TMである。
（注）化学量論的状態は、その相補鎖でよりも、固定化された捕捉用プローブでの、２つのＤＮＡ鎖のうちの１つの有意な部分の再ハイブリダイゼーションを得るように、予め最適化される（過剰なアンプリコン、過剰なシグナルプローブ）。
3.手順：
２種類のビーズ（μS-FVwtおよびμS-FVmut ）を等量混合し、全体で40000 μS/μl の割合となるようハイブリダイゼーション用緩衝液に希釈する。ビーズ懸濁液5 μl （即ち、各種類に対して100000μS/試験）、アンプリコン（3.75μl/試験）およびFV可視化用プローブ（ハイブリダイゼーション用緩衝液1.25μl 中1pmol ）を特殊なＰＣＲマイクロチューブ（ＰＣＲ T 320-1N 、Simport 、ケベック、カナダ）に入れる。反応媒体をホモジナイズし（voltex）、室温（AT）で30分間温置する。
【０１８０】
次いでライゲーション工程を、ライゲーション用溶液100 μl を添加した後、１時間の温置によって行う。
ライゲーションの後、過剰のアンプリコンおよび三元複合体に関連しないシグナルプローブを磁気分離によって除去する。このために、反応混合物（Vt=110μl ）に強磁性流体懸濁液（SA-FF ）10μl を添加する。攪拌（voltex）および10分間の温置の後、混合物を1ml 試験管（リンゲル試験管）に移し、磁化を強力な磁石（MPC-S 、Dynal 、Compiege、フランス）で５分間実施する。ビーズ（管壁に固定）を液体の吸引によって乾燥し、洗浄用溶液100 μl に再懸濁する。適切な特性を有する洗浄用溶液は、非共有結合的相互作用（ライゲーションのないハイブリダイゼーション）のみによりビーズと結合した生成物の選択的脱離を可能にするが、共有結合したプローブ、およびSA-FF の選択的脱離は可能にしない。この洗浄を２回繰り返す。
【０１８１】
最後に、ビーズを1ml の希釈用緩衝液（PBS-Tween20 TM）に希釈して、サイトメトリーのための試験管（4ml)に移し、FCM により分析する。
4.結果：
a)本システムにより、認識できないＰＣＲ生成物（この場合、Genecolor TM P2Y12 G52T キット（BioCytex、マルセーユ、フランス）の試薬によって製造されたP2Y12 遺伝子、野生型のアレル、の増幅から生じた生成物）がある場合には、２つのビーズの各々は、その固有のバックグラウンドノイズ（BN）に類似した標識化を与える、実際には（図40）：
μS-FVwtの数：125 
μS-FVmut の数：15
b)因子Ｖ遺伝子の野生型のアレルに対応するＰＣＲ産物（FVwt、Genecolor TM factor V Leidenキット（BioCytex、マルセーユ、フランス）の試薬により産生するＰＣＲ生成物）がある場合には、μS-FVwtビーズは明らかに陽性の標識を示し、一方、μS-FVmut ビーズはその固有のバックグラウンドノイズに類似した標識化を与える。実際には( 図41および42) ：
μS-FVwtの数：2222
μS-FVmut の数：294 
c)因子Ｖ遺伝子の変異型アレルに対応するＰＣＲ生成物（FVmut 、Genecolor TM FV Leidenキット（BioCytex、マルセーユ、フランス）の試薬によって生成するＰＣＲ生成物）がある場合には、μS-FVmut ビーズは、陽性の市販材料で可能な限りの陽性信号の最大レベルに対応するBNとは明らかに異なる標識化を示すのに対し、μS-FVwtビーズはその固有のバックグラウンドノイズに類似した標識化を示す。実際には (図43および44）：
μS-FVwtの数：32
μS-FVmut の数：600 
下記の表は、因子ＶのLeiden突然変異の二重FCM 解析の結果をまとめており、FV遺伝子型の決定が簡単であり、単一の試験管において実施しうることを示す。
【０１８２】
【表１１】
2007504474.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】異なるサイズのビーズを使用する３つの抗原の検出および／または定量に適用した、本発明による検出および／または定量（多重検定）方法の原理の概略図。
【図２】異なるサイズのビーズを使用する３つの蛍光ＰＣＲ生成物の多重検定に適用した、本発明方法の原理の概略図。
【図３】SNP 検索のために分子遺伝学に適用した、本発明による多重検定方法の原理の概略図。
【図４】可視化用プローブのグラフト化に関して特異性の程度が追加された、上記と同じ原理を図示する概略図。
【図５ＡＢＣ】サイズによる、３、８、10および15μm のビーズの混合物のFCM 解析。R1:  Estapor３μm + Polymer Laboratories８および15μm ＋ Dynal Particles 10 μm 、R2およびR6：Estapor 3 μm 、R3およびR7：Polymer Laboratories８μm 、R4およびR8：Dynal Particles 10μm 、R5およびR9：Polymer Laboratories15μm 。
【図６ＡＢＣＤ】サイズおよび蛍光による、３、4.4 、8 、10および15μm のビーズの混合物のFCM 解析。R1: Estapor 3 μm +Bangs QuantumPlex 4.4μm + Polymer Laboratories８および15μm ＋ Dynal Particles 10 μm 、R2およびR6：Estapor 3 μm +Bangs QuantumPlex 4.4μm R3およびR7：Polymer Laboratories８μm 、R4およびR8：Dynal Particles 10μm 、R5およびR9：Polymer Laboratories 15 μm 、R10: Estapor 3μm ；R11: Bangs QuantumPlex #3 、R12: Bangs QuantumPlex #5 （R10,R11 およびR12 は、R2の範囲内に含まれる）。
【図７ＡＢ】最初は非磁性である4.4 、８、10および15μm のビーズの混合物のFCM 解析。
【図８】FF-SA の結合中の各種ビーズ−ビオチン集団の、FS LOGによる分布の変化。
【図９】抗B.globigiiの 15 μm ミクロスフェア上でのB.globigiiの検定。
【図１０ＡＢ】抗−オボアルブミン4.4 μm のQuantumPlex #3ミクロスフェア上でのオボアルブミンの検定。
【図１１】二重混合物でのFCM 解析：２種類のビーズ、領域R1にゲートをもつμS-FV（直径6.7 μm)、および領域R2にゲートをもつμS-FII （直径9.6 μm ）を、二重散乱解析によってそのサイズにより区別する。このサイズに基づく選択的解析を以下の全ての図において繰り返す。
【図１２】二重陽性試験の二重混合物でのFCM 解析：ビーズを、同時に２つの遺伝子を表す２種類のO.N.と接触させる。図12は、サイズ−μS-FV  (R4 領域）およびμS-FII （R3領域）−の関数としての蛍光のレベルを示す。
【図１３】二重陽性試験の二重混合物でのFCM 解析：ビーズを、同時に２つの遺伝子を表す２種類のO.N.と接触させる。図13は、各タイプのビーズのそれぞれの緑色蛍光ヒストグラムを重ねて示し、μS-FVビーズについては中実の曲線、μS-FII ビーズについては空の曲線で示す。平均の緑色蛍光強度（MFI)は、それぞれウィンドウM1およびM2において計測される。
【図１４】二重混合物でのFCM 解析；陰性対照：同時に２種類のO.N.と接触させたビーズを加熱によって脱ハイブリダイゼーションし、非特異的バックグラウンドノイズ標識を示す。図14は、サイズ−μS-FV（R4領域）およびμS-FII （R3領域）−の関数としての蛍光レベルを示す。
【図１５】二重混合物でのFCM 解析；陰性対照：同時に２種類のO.N.と接触させたビーズを加熱によって脱ハイブリダイゼーションし、非特異的バックグラウンドノイズ標識を示す。図15は、各タイプのビーズの緑色の蛍光ヒストグラムを重ねて示し、μS-FVビーズについては中実の曲線、μS-FII ビーズについては空の曲線で示す。MFI は、各々のウィンドウM1およびM2において計測される。
【図１６】FVについての単一陽性試験の二重混合物でのFCM 解析：ビーズをFVに対応する単一のO.N.と接触させる。図16は、サイズ−μS-FV（R4領域）およびμS-FII （R3領域）−の関数としての蛍光レベルを示す。
【図１７】FVについての単一陽性試験の二重混合物でのFCM 解析：ビーズをFVに対応する単一のO.N.と接触させる。図17は、各タイプのビーズのそれぞれの緑色蛍光ヒストグラムを重ねて示し、μS-FVビーズについては中実の曲線、μS-FII ビーズについては空の曲線で示す。MFI は、それぞれウィンドウM1およびM2において計測される。
【図１８】FII についての単一陽性試験の二重混合物でのFCM 解析：ビーズを、FII に対応する１種類のO.N.と接触させる。図18は、サイズ−μS-FV（R4領域）およびμS-FII （R3領域）−の関数としての蛍光レベルを示す。
【図１９】FII についての単一陽性試験の二重混合物でのFCM 解析：ビーズを、FII に対応する１種類のO.N.と接触させる。図19は、各タイプのビーズのそれぞれの緑色蛍光ヒストグラムを重ねて示し、μS-FVビーズについては中実の曲線、μS-FII ビーズについては空の曲線で示す。MFI は、それぞれウィンドウM1およびM2において計測される。
【図２０】重要な塩基（SNP 特異性）は、各々異なる蛍光色素（または蛍光性の抗-tag MAbで可視化されうるハプテン／タグ）を有する各々のアレル特異的可視化用プローブにより担持されている。このシステムは、FCM により行なうことができる多色解析を利用する。各々の種類のビーズは、突然変異の区別的検出を可能にする。
【図２１】重要な塩基（SNP 特異性）は、異なる種類のビーズ（例えば、サイズにより区別される）にそれぞれ結合した各々のアレル特異的捕捉用プローブにより担持される。FCM による信号解析のために、このシステムはただ１種類の蛍光を必要とし、より簡単でより安価な装置を使用するか、または、多色解析において、ビーズの系統を互いに区別するためにその他の色を利用することを可能にする。
【図２２】二重混合でのFCM 解析：２種類のビーズ、μS-FVwt (直径6.7 μm 、R1領域にゲートをもつ) 、およびμS-FVmut （直径9.6 μm 、R1領域にゲートをもつ) が、二重散乱解析によりそのサイズで区別される。以下の全ての図において、サイズ（FS）および粒度（SS）に基づくこの選択的解析を繰り返す。
【図２３】陰性対照の二重混合物でのFCM 解析：ビーズを、検討する突然変異に特異的でないが、「Ａmpli-Mix」ＰＣＲmix の存在下では陰性対照として作用するアンプリコンと接触させる。図23は、サイズ−μS-FVwt（R4領域）およびμS-FVmut （R3領域）−の関数としての蛍光レベルを示す。
【図２４】陰性対照の二重混合物でのFCM 解析：ビーズを、検討する突然変異に特異的でないが、「Ａmpli-Mix」ＰＣＲmix の存在下では陰性対照として作用するアンプリコンと接触させる。図24は、各タイプのビーズのそれぞれの緑色蛍光ヒストグラムを重ねて示し、μS-FVwtビーズについては中実の曲線、μS-FVmut ビーズについては空の曲線で示す。ウィンドウM1およびM2において計測した、平均の蛍光強度（MFI)を、各種類のビーズについて示す。
【図２５】野生型アレルについての単一陽性試験の二重混合物でのFCM 解析：ビーズを、１種類のアレル（FVwt）のアンプリコンと接触させる。図25は、サイズ−μS-FVwt（R4領域）およびμS-FVmut （R3領域）−の関数としての蛍光レベルを示す。
【図２６】野生型アレルについての単一陽性試験の二重混合物でのFCM 解析：ビーズを、１種類のアレル（FVwt）のアンプリコンと接触させる。図26は、ビーズの各タイプのそれぞれの緑色蛍光ヒストグラムを重ねて示し、μS-FVwtビーズについては中実の曲線、μS-FVmut ビーズについては空の曲線で示す。
【図２７】野生型アレルについての単一陽性試験の二重混合物でのFCM 解析：ビーズを、１種類のアレル（FVwt）のアンプリコンと接触させる。図27は、μS-FVwtについての、試験（右側曲線）およびBN（左側曲線、図24の繰り返し）のヒストグラムを示す。
【図２８】野生型アレルについての単一陽性試験の二重混合物でのFCM 解析：ビーズを、１種類のアレル（FVwt）のアンプリコンと接触させる。図28は、μS-FVmut についての、試験（右側曲線）およびBN（左側曲線、図24の繰り返し）のヒストグラムを示す。
【図２９】変異アレルについての単一陽性試験の二重混合物でのFCM 解析：このμFVmut の場合、ビーズを、１種類のアレルのアンプリコンと接触させる。図29は、サイズ−μS-FVwt（R4領域）およびμS-FVmut （R3領域）−の関数としての蛍光レベルを示す。
【図３０】変異アレルについての単一陽性試験の二重混合物でのFCM 解析：このμFVmut の場合、ビーズを、１種類のアレルのアンプリコンと接触させる。図30は、ビーズの各タイプのそれぞれの緑色蛍光ヒストグラムを重ねて示し、μS-FVwtビーズについては中実曲線、μS-FVmut ビーズについては空の曲線で示す。
【図３１】変異アレルについての単一陽性試験の二重混合物でのFCM 解析：このμFVmut の場合、ビーズを、１種類のアレルのアンプリコンと接触させる。図31は、μS-FVwtについての、試験（右の曲線）およびBN（左の曲線、図24の繰り返し）のヒストグラムを示す。
【図３２】変異アレルについての単一陽性試験の二重混合物でのFCM 解析：このμFVmut の場合、ビーズを、１種類のアレルのアンプリコンと接触させる。図32は、S-FVmut についての、試験（右の曲線）およびBN（左の曲線、図24の繰り返し）のヒストグラムを示す。
【図３３】二重陽性試験の二重混合物でのFCM 解析：ビーズを同時に２種類のアレルのアンプリコンと接触させる。図33は、サイズ−μS-FVwt（R4領域）およびμS-FVmut （R3領域）−の関数としての蛍光レベルを示す。
【図３４】二重陽性試験の二重混合物でのFCM 解析：ビーズを同時に２種類のアレルのアンプリコンと接触させる。図34は、各タイプのビーズのそれぞれの緑色蛍光ヒストグラムを重ねて示し、μS-FVwtビーズについては中実の曲線、μS-FVmut ビーズについては空の曲線で示す。
【図３５】二重陽性試験の二重混合物でのFCM 解析：ビーズを同時に２種類のアレルのアンプリコンと接触させる。図35は、S-FVwtについての、試験（右の曲線）およびBN（左の曲線、図24の繰り返し）のヒストグラムを示す。
【図３６】二重陽性試験の二重混合物でのFCM 解析：ビーズを同時に２種類のアレルのアンプリコンと接触させる。図36は、S-FVmut についての、試験（右の曲線）およびBN（左の曲線、図24の繰り返し）のヒストグラムを示す。
【図３７】図21と同様、図37において、重要な塩基（SNP 特異性）は各々のアレル特異的捕捉用プローブに担持され、各々が異なる種類のビーズ（サイズにより区別される）に結合される。FCM による信号解析のために、このシステムは、サイズおよび構造パラメータに基づくビーズの計数による解析のみを必要とし、蛍光検出器を備えず、従って、より安価な装置を使用するか、またはビーズの系統を互いに区別するためのその他のサイズを利用することを可能にする。
【図３８】二重混合でのFCM 解析：２種類のビーズ、μS-FVwt（直径は、6.7 μm 、R1領域にゲートをもつ）およびμS-FVmut （直径9.6 μm 、R2領域にゲートをもつ）を、二重散乱解析によってそのサイズにより区別する。サイズ（FS）および粒度（SS）に基づくこの選択的解析は以下の全ての図において繰り返される。
【図３９】陰性対照の二重混合物でのFCM 解析：ビーズを、検討する突然変異に特異的でなく、「Ａmpli-Mix」ＰＣＲmix の存在下では陰性対照として作用するアンプリコンと接触させる。図39は、サイズ−μS-FVwt（R1領域）およびμS-FVmut （R2領域）−の関数としてのμS の数のレベル、を示す。
【図４０】陰性対照の二重混合物でのFCM 解析：ビーズを、検討する突然変異に特異的でなく、「Ａmpli-Mix」ＰＣＲmix の存在下では陰性対照として作用するアンプリコンと接触させる。図40は、各種類のビーズのμS の数のそれぞれのヒストグラムを重ねて示す。μS の数（ウィンドウM1およびM2において計測される）を、各々の種類のビーズについて示す。
【図４１】野生型のアレルについての単一陽性試験の二重混合物でのFCM 解析：ビーズを、１種類のアレル（FVwt）のアンプリコンと接触させる。図41は、サイズ−μS-FVwt（R1領域）およびμS-FVmut （R2領域）−の関数としてのμS の数のレベル、を示す。
【図４２】野生型のアレルについての単一陽性試験の二重混合物でのFCM 解析：ビーズを、１種類のアレル（FVwt）のアンプリコンと接触させる。図42は、各種類のビーズのμS の数のそれぞれのヒストグラムを重ねて示す。μS の数（ウィンドウM1およびM2において計測される）を、各々の種類のビーズについて示す。
【図４３】変異アレルについての単一陽性試験の二重混合物でのFCM 解析：このFVmut の場合、ビーズを、１種類のアレルのアンプリコンと接触させる。図43は、サイズ−μS-FVwt（R1領域）およびμS-FVmut （R2領域）−の関数としてのμS の数のレベルを示す。
【図４４】変異アレルについての単一陽性試験の二重混合物でのFCM 解析：このFVmut の場合、ビーズを、１種類のアレルのアンプリコンと接触させる。図44は、各種類のビーズのμS の数のそれぞれのヒストグラムを重ねて示す。μS の数（ウィンドウM1およびM2において計測される）を、各々の種類のビーズについて示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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