(57)【要約】      （修正有）【課題】ポリペプチドをイオン交換クロマトグラフィーで分離するための、最適な分離条件を決定するための方法を提供する。【解決手段】ポリペプチドのアミノ酸組成に基づいて、選択された温度での正味電荷ｚ対ｐＨの曲線を得た後、中性ｐＨ又はその近傍での変曲点を決定する。最適なイオン交換分離条件は、温度及び変曲点に基づいて決定される。最適な分離条件で使用するためのバッファーは、その温度による酸解離定数の変化が、ポリペプチドの温度による変曲点の変化にほぼ等しいものから選択される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の組成物を分析するために最適なイオン交換クロマトグラフィーの分離条件を同定するための方法であって、各組成物が一以上の混入物を有するポリペプチドを含み、該方法が、
ａ）組成物の二以上のポリペプチドのアミノ酸組成に基づいて、選択された温度での正味電荷対ｐＨの曲線をプロットすること、及び
ｂ）工程ａ）のプロットの二次導関数を決定することにより中性ｐＨで又はその近傍での正味電荷対ｐＨの曲線の変曲点を決定することを含み；
最適なイオン交換クロマトグラフィーの分離条件が、一以上の組成物のポリペプチドについてほぼ共通の変曲点でのｐＨである、方法。
【請求項２】
変曲点での正味電荷が正である場合、陽イオン交換材料がイオン交換クロマトグラフィーのために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
陽イオン交換クロマトグラフィー材料が、スルホン化クロマトグラフィー材料又はカルボキシル化クロマトグラフィー材料である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
変曲点での正味電荷が負である場合、陰イオン交換材料がイオン交換クロマトグラフィーのために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
陰イオン交換クロマトグラフィー材料が、第四級アミンのクロマトグラフィー材料又は第三級アミンクロマトグラフィー材料である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
混合モードクロマトグラフィー材料が、クロマトグラフィーのために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
混合モードイオン交換材料が、スルホン化クロマトグラフィー材料又はカルボキシル化クロマトグラフィー材料及び第四級アミンのクロマトグラフィー材料又は第三級アミンクロマトグラフィー材料を順次充填した混合物である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ｃ）組成物の二以上のポリペプチドについて温度変化による正味電荷対ｐＨ曲線の変曲点のｐＨの変化（ｄＩＰ／ｄＴ）を決定すること、
ｄ）温度変化によるバッファーの酸解離定数の変化（ｄｐＫａ／ｄＴ）がポリペプチドのｄＩＰ／ｄＴと本質的に同じである、クロマトグラフィーに使用のためのバッファーを選択することを更に含む、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
バッファーが、変曲点のｐＨで効果的な緩衝能を提供する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
一以上の組成物のポリペプチドのｄＩＰ／ｄＴが、約−０．０２ｐＨ単位である、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
温度変化が、約２０℃から約７０℃である、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
温度変化が、約２０℃から約５０℃である、請求項１から１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ｄｐＫａ／ｄＴ＝ｄＩＰ／ｄＴ±５０％である、請求項８から１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程ｄ）で選択されたバッファー中のポリペプチドの正味電荷が、３０℃を超えて０．５未満変化する、請求項８から１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
工程ｄ）で選択されたバッファーが、約５ｍＭから約２５０ｍＭの範囲の濃度でクロマトグラフィーに使用される、請求項８から１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
バッファー組成物が更に塩を含む、請求項１から１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
塩が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、又はＮａ２ＳＯ４である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
塩の濃度が、約１ｍＭから約１Ｍの範囲である、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
ポリペプチドが、抗体若しくはイムノアドヘシン又はその断片である、請求項１から１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ポリペプチドが、モノクローナル抗体又はその断片である、請求項１から１９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
抗体が、ヒト抗体である、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
抗体が、ヒト化抗体である、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２３】
抗体が、キメラ抗体である、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２４】
抗体が、抗体断片である、請求項１９から２３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５】
混入物が、ポリペプチドの変異体である、請求項１から１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６】
混入物が、ポリペプチドの分解生成物である、請求項１から２５の何れか一項に記載の方法。
【請求項２７】
混入物が、ポリペプチドの電荷変異体である、請求項１から２６の何れか一項に記載の方法。
【請求項２８】
一以上の混入物と共にポリペプチドを含む組成物を分析するために最適なイオン交換クロマトグラフィーの分離条件を同定するための方法であって、該方法は、
ａ）ポリペプチドのアミノ酸組成に基づいて、選択された温度での正味電荷対ｐＨの曲線をプロットすること、及び
ｂ）工程ａ）のプロットの二次導関数を決定することにより中性ｐＨで又はその近傍での正味電荷対ｐＨの曲線の変曲点を決定することを含み；
最適なイオン交換クロマトグラフィーの分離条件が、ポリペプチドについてほぼ変曲点でのｐＨである、方法。
【請求項２９】
変曲点での正味電荷が正である場合、陽イオン交換材料がイオン交換クロマトグラフィーのために使用される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
陽イオン交換クロマトグラフィー材料が、スルホン化クロマトグラフィー材料又はカルボキシル化クロマトグラフィー材料である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
変曲点での正味電荷が負である場合、陰イオン交換材料がクロマトグラフィーのために使用される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
陰イオン交換クロマトグラフィー材料が、第四級アミンのクロマトグラフィー材料又は第三級アミンクロマトグラフィー材料である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
混合モードクロマトグラフィー材料が、クロマトグラフィーのために使用される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
混合モードイオン交換材料が、スルホン化クロマトグラフィー材料又はカルボキシル化クロマトグラフィー材料及び第四級アミンのクロマトグラフィー材料又は第三級アミンクロマトグラフィー材料を順次充填した混合物である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ｃ）ポリペプチドについて温度変化による正味電荷対ｐＨ曲線の変曲点のｐＨの変化（ｄＩＰ／ｄＴ）を決定し、
ｄ）温度変化によるバッファーの酸解離定数の変化（ｄｐＫａ／ｄＴ）がポリペプチドのｄＩＰ／ｄＴと本質的に同じである、クロマトグラフィーに使用のためのバッファーを選択することを更に含む、請求項２８から３４の何れか一項に記載の方法。
【請求項３６】
バッファーが、変曲点のｐＨで効果的な緩衝能を提供する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
一以上の組成物のポリペプチドのｄＩＰ／ｄＴが、約−０．０２ｐＨ単位である、請求項２８から３６の何れか一項に記載の方法。
【請求項３８】
温度変化が、約２０℃から約７０℃である、請求項２８から３７の何れか一項に記載の方法。
【請求項３９】
温度変化が、約２０℃から約５０℃である、請求項２８から３８の何れか一項に記載の方法。
【請求項４０】
ｄＩＰ／ｄＴ＝ｄｐＫａ／ｄＴ±５０％である、請求項２８から３９の何れか一項に記載の方法。
【請求項４１】
工程ｄ）で選択されたバッファー中のポリペプチドの正味電荷が、３０℃を超えて０．５未満変化する、請求項２８から４０の何れか一項に記載の方法。
【請求項４２】
工程ｄ）で選択されたバッファーが、約５ｍＭから約５０ｍＭの範囲の濃度でクロマトグラフィーに使用される、請求項２８から４１の何れか一項に記載の方法。
【請求項４３】
バッファー組成物が更に塩を含む、請求項２８から４２の何れか一項に記載の方法。
【請求項４４】
塩が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、又はＮａ２ＳＯ４である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
塩の濃度が、約１０ｍＭから約１Ｍの範囲である、請求項４３又は４４に記載の方法。
【請求項４６】
ポリペプチドが、抗体若しくはイムノアドヘシン又はその断片である、請求項２８から４５の何れか一項に記載の方法。
【請求項４７】
ポリペプチドが、モノクローナル抗体又はその断片である、請求項２８から４６の何れか一項に記載の方法。
【請求項４８】
抗体が、ヒト抗体である、請求項４６又は４７に記載の方法。
【請求項４９】
抗体が、ヒト化抗体である、請求項４６又は４７に記載の方法。
【請求項５０】
抗体が、キメラ抗体である、請求項４６又は４７に記載の方法。
【請求項５１】
抗体が、抗体断片である、請求項３８から５０の何れか一項に記載の方法。
【請求項５２】
混入物が、ポリペプチドの変異体である、請求項２８から５１の何れか一項に記載の方法。
【請求項５３】
混入物が、ポリペプチドの分解生成物である、請求項２８から５２の何れか一項に記載の方法。
【請求項５４】
混入物が、ポリペプチドの電荷変異体である、請求項２８から５３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５５】
組成物がポリペプチド及び一以上の混入物を含む組成物を分析するための方法であって、ここで、該方法は混入物からポリペプチドを効果的に分離し、該方法が、
ａ）請求項１の方法に従って、各組成物が標的ポリペプチド及び一以上の混入物を含有する複数の組成物についての最適ｐＨ及び温度のイオン交換分離条件を決定すること、
ｂ）ローディングバッファーが請求項８から１５の何れか一項に記載の方法によって同定されるバッファーを含むローディングバッファーを用いて、イオン交換クロマトグラフィー材料へ組成物からのポリペプチド及び一以上の混入物を結合させること；
ｃ）溶出バッファーがバッファー及び塩を含み、塩の濃度が経時的に勾配で増加し、ポリペプチド及び一以上の混入物がその勾配によって分離される溶出バッファーの勾配を用いてイオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチド及び一以上の混入物を溶出させること；及び
ｄ）ポリペプチド及び一以上の混入物を検出すること含む、方法。
【請求項５６】
ポリペプチド及び一以上の混入物を含む組成物を分析するための方法であって、該方法は混入物からポリペプチドを効果的に分離し、該方法が、
ａ）ローディングバッファーがバッファーを含み、クロマトグラフィーのｐＨ及び温度が、ｉ）曲線が二以上の標的ポリペプチドのポリペプチドのアミノ酸組成に基づいている、選択された温度での正味電荷対ｐＨの曲線をプロットし、ｉｉ）工程ｉ）のプロットの二次導関数を決定することによって正味電荷対ｐＨの曲線の変曲点を決定すること（ここで最適なイオン交換クロマトグラフィーの条件は、二以上の標的ポリペプチドについての共通の変曲点でのｐＨである）によって、複数の標的ポリペプチドに対して最適化される、ローディングバッファーを使用してイオン交換クロマトグラフィー材料にポリペプチド及び一以上の混入物を結合させること；
ｂ）溶出バッファーがバッファー及び塩を含み、ポリペプチド及び一以上の混入物が勾配により分離される溶出バッファーの勾配を用いてイオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチド及び一以上の混入物を溶出させること；及び
ｃ）ポリペプチド及び一以上の混入物を検出することを含む、方法。
【請求項５７】
選択される温度が大気温度である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
バッファーが、
ａ）二以上の標的ポリペプチドについて温度変化による正味電荷対ｐＨ曲線の変曲点のｐＨの変化（ｄＩＰ／ｄＴ）を決定すること、
ｂ）温度変化によるバッファーの酸解離定数の変化（ｄｐＫａ／ｄＴ）が共通の変曲点を有する二以上の標的ポリペプチドのｄＩＰ／ｄＴと本質的に同じであるバッファーを選択することによって同定される、請求項５６又は５７に記載の方法。
【請求項５９】
バッファーが、変曲点のｐＨで効果的な緩衝能を提供する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
ポリペプチド及び一以上の混入物を含む組成物を分析するための方法であって、該方法は混入物からポリペプチドを効果的に分離し、該方法が、
ａ）ローディングバッファーがバッファーを含み、かつクロマトグラフィーのｐＨ及び温度が複数の標的ポリペプチドに対して最適化されている、ローディングバッファーを使用してイオン交換クロマトグラフィー材料にポリペプチド及び一以上の混入物を結合させること；
ｂ）溶出バッファーがバッファー及び塩を含み、溶出バッファーの勾配を用いてイオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチド及び一以上の混入物を溶出させること；及び
ｃ）ポリペプチド及び一以上の混入物を検出することを含む、方法。
【請求項６１】
バッファーが、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）又は４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
バッファーの濃度が、約５ｍＭから約２０ｍＭの範囲である、請求項５５から６１の何れか一項に記載の方法。
【請求項６３】
バッファーのｐＨが、約２０℃から約７０℃の温度範囲で約６．５から約８．５の範囲である、請求項５５から６２の何れか一項に記載の方法。
【請求項６４】
バッファーのｐＨが、約２０℃から約５０℃の温度範囲で約６．５から約８．５の範囲である、請求項５５から６３の何れか一項に記載の方法。
【請求項６５】
変曲点でのバッファー及びポリペプチドのｐＨが、約２２℃で約７．８、約３７℃で約７．５、約５０℃で約７．２である、請求項５５から６４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６６】
塩勾配が、直線勾配である、請求項５５から６５の何れか一項に記載の方法。
【請求項６７】
塩勾配が、段階勾配である、請求項５５から６６の何れか一項に記載の方法。
【請求項６８】
塩勾配が、ＮａＣｌ勾配、ＫＣｌ勾配、（ＮＨ４）２ＳＯ４勾配又はＮａ２ＳＯ４勾配である、請求項５５から６７の何れか一項に記載の方法。
【請求項６９】
塩濃度が、約０ｍＭから約１Ｍまで勾配で増加する、請求項５５から６８の何れか一項に記載の方法。
【請求項７０】
塩濃度が、約１００分で約０ｍＭから約１００ｍＭまで増加する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
塩濃度が、約４０分で約０ｍＭから約８０ｍＭまで増加する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
ポリペプチドが、抗体若しくはイムノアドヘシン又はその断片である、請求項５５から７１の何れか一項に記載の方法。
【請求項７３】
ポリペプチドが、モノクローナル抗体又はその断片である、請求項５５から７２の何れか一項に記載の方法。
【請求項７４】
抗体が、ヒト抗体である、請求項７２又は７３に記載の方法。
【請求項７５】
抗体が、ヒト化抗体である、請求項７２又は７３に記載の方法。
【請求項７６】
抗体が、キメラ抗体である、請求項７２又は７３に記載の方法。
【請求項７７】
抗体が、抗体断片である、請求項７２から７６の何れか一項に記載の方法。
【請求項７８】
混入物が、ポリペプチドの変異体である、請求項５５から７７の何れか一項に記載の方法。
【請求項７９】
混入物が、ポリペプチドの分解生成物である、請求項５５から７８の何れか一項に記載の方法。
【請求項８０】
混入物が、ポリペプチドの電荷変異体である、請求項５５から７９の何れか一項に記載の方法。
【請求項８１】
クロマトグラフィー材料が、陽イオン交換クロマトグラフィー材料である、請求項５５から８０の何れか一項に記載の方法。
【請求項８２】
陽イオン交換クロマトグラフィー材料が、スルホン化クロマトグラフィー材料又はカルボキシル化クロマトグラフィー材料である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
複数のポリペプチド組成物を分析するための方法であって、各ポリペプチド組成物がポリペプチド及びポリペプチドの一以上の電荷変異体を含み、該方法はポリペプチドをその電荷変異体から効果的に分離し；
各ポリペプチド組成物に対して、
ａ）ローディングバッファーが約４０℃でｐＨが約７．６で１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファーを含み、ローディングバッファーを約１ｍＬ／分の流速で使用してイオン交換クロマトグラフィー材料にポリペプチド及び一以上の荷電変異体を結合させること；
ｂ）溶出バッファーがｐＨが約７．６で約１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー及びＮａＣｌを含み、ＮａＣｌの濃度が約４０分で約０ｍＭから約８０ｍＭまで勾配で増加し、ポリペプチド及びその荷電変異体が勾配により分離される溶出バッファーの勾配を用いてイオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチド及び荷電変異体混入物を溶出させること；及び
ｃ）ポリペプチド及び一以上の荷電変異体を検出することを含む、方法。
【請求項８４】
複数のポリペプチド組成物が異なるポリペプチドを含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
複数のポリペプチド組成物が異なるｐＩを有するポリペプチドを含む、請求項８３又は８４に記載の方法。
【請求項８６】
ポリペプチド組成物が抗体組成物である、請求項８３から８５の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は２０１３年７月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／８４５，８９０号の優先権を主張し、その開示は、その全体が参照により本明細書に包含される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、タンパク質の荷電変異体について、イオン強度勾配、イオン交換クロマトグラフィーを使用してポリペプチドの調製物を分析するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のようなタンパク質は、水性環境下で、大抵は電荷で極性のアミノ酸を表面に有する（Barlow, DJ and Thornton, JM (1986) Biopolymers 25:1717）。溶液成分との分子間相互作用により、表面残留物は、多数の化学的及び酵素的修飾を受ける可能性があり、これは、その静電表面上で僅かに異なるタンパク質変異体の不均一混合物をもたらす（Dick, LW et al., (2009) J. Chromatogr. B 877:3841; Liu, HW et al., (2008) Rapid Commun. Mass Spectrom. 22:4081; Miller, AK, et al., (2011) J. Pharm. Sci. 100:2543; Wang, WR et al., (2011) Mol. Immunol. 48:860）。陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＣ）は、Vlasak, J and Ionescu, R (2008 Curr. Pharm. Biotechnol. 9:468)による最近の総説により、タンパク質治療の電荷不均一性をプロファイルする代表的な基準であると考えられている。電荷敏感分離方法は、製造中の生産整合性を保証するため及びタンパク質治療の分解レベルをモニターするために、規制当局により典型的に必要とされる(Miller, AK, et al., (2011) J. Pharm. Sci. 100:2543; He, XPZ (2009) Electrophoresis 30:714; Sosic, Z et al., (2008) Electrophoresis 29:4368; Kim, J et al.,(2010) J. Chromatogr. 8781973 Teshima, G et al., (2010) J. Chromatogr. 1218:2091)。
【０００４】
イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）は、典型的には、結合及び溶出モードで実行される。一般に、タンパク質サンプル、例えば、ｍＡｂは、カラムへのタンパク質の結合を促進する条件下で（すなわち、１００％バッファーＡ中で）固定相に導入される。塩又はｐＨ勾配（すなわち、バッファーＢの割合（％）を増加させる）が、異なる電荷タンパク質を順番に溶出させるために適用される。ＩＥＣ法は、典型的には生成物に特異的である。両方とも堅牢である、すなわち、温度及びｐＨの変動に耐えることができ、かつ十分に充電不均一性を解決することができる方法の開発は資源集約的である。複数のポリペプチド生成物中の混入物の存在を決定するための堅牢なアッセイの開発を可能にする最適な緩衝系を開発する方法が望まれる。本発明は、ポリペプチド及び緩衝系の両方の数学的モデルに基づく、イオン交換のための最適な条件を予測するための方法を提供する。
【０００５】
本明細書に引用される全ての参考文献は、特許出願及び刊行物を含み、その全体が参考により援用される。
【発明の概要】
【０００６】
簡潔な要旨
幾つかの態様において、本発明は、複数の組成物を分析するために最適なイオン交換クロマトグラフィーの分離条件を同定するための方法を提供し、ここで各組成物は一以上の混入物を有するポリペプチドを含み、該方法は、ａ）組成物の二以上のポリペプチドのアミノ酸組成に基づいて、選択された温度での正味電荷対ｐＨの曲線をプロットすること、ｂ）工程ａ）のプロットの二次導関数を決定することにより中性ｐＨで又はその近傍での正味電荷対ｐＨの曲線の変曲点を決定することを含み；ここで最適なイオン交換クロマトグラフィーの分離条件は、一以上の組成物のポリペプチドについてほぼ共通の変曲点でのｐＨである。幾つかの実施態様において、本方法は更に、ｃ）組成物の二以上のポリペプチドについて温度変化による正味電荷対ｐＨ曲線の変曲点のｐＨの変化（ｄＩＰ／ｄＴ）を決定し、ｄ）温度変化によるバッファーの酸解離定数の変化（ｄｐＫａ／ｄＴ）がポリペプチドのｄＩＰ／ｄＴと本質的に同じである、クロマトグラフィーに使用のためのバッファーを選択することを含む。
【０００７】
他の態様において、本発明は、一以上の混入物と共にポリペプチドを含む組成物を分析するために最適なイオン交換クロマトグラフィーの分離条件を同定するための方法を提供し、該方法は、ａ）ポリペプチドのアミノ酸組成に基づいて、選択された温度での正味電荷対ｐＨの曲線をプロットすること、ｂ）工程ａ）のプロットの二次導関数を決定することにより中性ｐＨで又はその近傍での正味電荷対ｐＨの曲線の変曲点を決定することを含み；ここで最適なイオン交換クロマトグラフィーの分離条件は、ポリペプチドについてほぼ変曲点でのｐＨである。
【０００８】
幾つかの実施態様において、変曲点での正味電荷が正である場合、陽イオン交換材料がイオン交換クロマトグラフィーのために使用される。幾つかの実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、スルホン化クロマトグラフィー材料又はカルボキシル化クロマトグラフィー材料である。他の実施態様において、変曲点での正味電荷が負である場合、陰イオン交換材料がクロマトグラフィーのために使用される。幾つかの実施態様において、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、第四級アミンのクロマトグラフィー材料又は第三級アミンクロマトグラフィー材料である。更に他の実施態様において、混合モードクロマトグラフィー材料が、クロマトグラフィーのために使用される。幾つかの実施態様において、混合モードクロマトグラフィー材料は、スルホン化クロマトグラフィー材料又はカルボキシル化クロマトグラフィー材料及び第四級アミンのクロマトグラフィー材料又は第三級アミンクロマトグラフィー材料を順次充填した混合物である。
【０００９】
幾つかの実施態様において、バッファーは、変曲点のｐＨで効果的な緩衝能を提供する。幾つかの実施態様において、一以上の組成物のポリペプチドのｄＩＰ／ｄＴは、約−０．０２ｐＨ単位である。幾つかの実施態様において、温度変化は、約２０℃から約７０℃である。更なる実施態様において、温度変化は、約２０℃から約５０℃である。幾つかの実施態様において、ｄｐＫａ／ｄＴ＝ｄＩＰ／ｄＴ±５０％。幾つかの実施態様において、工程ｄ）で選択されたバッファー中のポリペプチドの正味電荷は、３０℃を超えて０．５未満変化する。幾つかの実施態様において、工程ｄ）で選択されたバッファーが、約５ｍＭから約２５０ｍＭの範囲の濃度でクロマトグラフィーに使用される。
【００１０】
上記実施態様の幾つかの実施態様において、バッファー組成物は更に塩を含む。更なる実施態様において、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、又はＮａ２ＳＯ４である。幾つかの実施態様において、塩の濃度は、約１ｍＭから約１Ｍの範囲である。
【００１１】
本発明の方法の幾つかの実施態様において、ポリペプチドは、抗体若しくはイムノアドヘシン又はその断片である。幾つかの実施態様において、ポリペプチドはモノクローナル抗体又はその断片である。幾つかの実施態様において、抗体はヒト抗体である。他の実施態様において、抗体はヒト化抗体である。更に他の実施態様において、抗体はキメラ抗体である。幾つかの実施態様において、抗体は抗体断片である。
【００１２】
本発明の方法の幾つかの実施態様において、混入物は、ポリペプチドの変異体である。幾つかの実施態様において、混入物は、ポリペプチドの分解生成物である。幾つかの実施態様において、混入物は、ポリペプチドの荷電変異体である。
【００１３】
幾つかの態様において、本発明は、組成物がポリペプチド及び一以上の混入物を含む組成物を分析するための方法を提供し、ここで、ａ）各組成物が本発明の方法に従って、標的ポリペプチド及び一以上の混入物を含有する複数の組成物についての最適ｐＨ及び温度のイオン交換分離条件を決定し、ｂ）ローディングバッファーが本発明の方法によって同定されるバッファーを含むローディングバッファーを用いてイオン交換クロマトグラフィー材料へ、組成物からのポリペプチド及び一以上の混入物を結合させ、ｃ）溶出バッファーがバッファー及び塩を含み、塩の濃度が経時的に勾配で増加し、ポリペプチド及び一以上の混入物がその勾配によって分離される溶出バッファーの勾配を用いてイオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチド及び一以上の混入物を溶出させること、及びｄ）ポリペプチド及び一以上の混入物を検出すること含む本方法は混入物からポリペプチドを効果的に分離する。
【００１４】
幾つかの態様において、本発明は、ポリペプチド及び一以上の混入物を含む組成物を分析するための方法を提供し、ここで、
ａ）ローディングバッファーがバッファーを含み、クロマトグラフィーのｐＨ及び温度が、ｉ）曲線が二以上の標的ポリペプチドのポリペプチドのアミノ酸組成に基づいている、選択された温度での正味電荷対ｐＨの曲線をプロットし、ｉｉ）工程ｉ）のプロットの二次導関数を決定することによって正味電荷対ｐＨの曲線の変曲点を決定すること（ここで最適なイオン交換クロマトグラフィーの条件は、二以上の標的ポリペプチドについての共通の変曲点でのｐＨである）によって、複数の標的ポリペプチドに対して最適化される、ローディングバッファーを使用してイオン交換クロマトグラフィー材料にポリペプチド及び一以上の混入物を結合させること；ｂ）溶出バッファーがバッファー及び塩を含み、ポリペプチド及び一以上の混入物が勾配により分離される溶出バッファーの勾配を用いてイオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチド及び一以上の混入物を溶出させること、及びｃ）ポリペプチド及び一以上の混入物を検出することを含む方法は、効果的に混入物からポリペプチドを分離する。幾つかの実施態様において、選択される温度は大気温度である。幾つかの実施態様において、バッファーが、ａ）二以上の標的ポリペプチドについて温度変化による正味電荷対ｐＨ曲線の変曲点のｐＨの変化（ｄＩＰ／ｄＴ）を決定し、ｂ）温度変化によるバッファーの酸解離定数の変化（ｄｐＫａ／ｄＴ）が共通の変曲点を有する二以上の標的ポリペプチドのｄＩＰ／ｄＴと本質的に同じであるバッファーを選択することによって同定される。幾つかの実施態様において、バッファーは、変曲点のｐＨで効果的な緩衝能を提供する。
【００１５】
幾つかの態様において、本発明は、ポリペプチド及び一以上の混入物を含む組成物を分析するための方法を提供し、ここで、ａ）ローディングバッファーがバッファーを含み、かつクロマトグラフィーのｐＨ及び温度は複数の標的ポリペプチドに対して最適化されている、ローディングバッファーを用いてイオン交換クロマトグラフィー材料にポリペプチド及び一以上の混入物を結合させること；ｂ）溶出バッファーがバッファー及び塩を含み、ポリペプチド及び一以上の混入物が勾配により分離される溶出バッファーの勾配を用いてイオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチド及び一以上の混入物を溶出させること、及びｃ）ポリペプチド及び一以上の混入物を検出することを含む方法は、効果的に混入物からポリペプチドを分離する。幾つかの実施態様において、バッファーは、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）又は４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）である。幾つかの実施態様において、バッファーの濃度は、約５ｍＭから約２０ｍＭの範囲である。幾つかの実施態様において、温度変化は、約２０℃から約７０℃である。更なる実施態様において、温度変化は、約２０℃から約５０℃である。幾つかの実施態様において、ｄｐＫａ／ｄＴ＝ｄＩＰ／ｄＴ±５０％。幾つかの実施態様において、バッファー中のポリペプチドの正味電荷は、３０℃を超えて０．５未満変化する。幾つかの実施態様において、バッファーは、約５ｍＭから約２５０ｍＭの範囲の濃度でクロマトグラフィーに使用される。
【００１６】
上記実施態様の幾つかの実施態様において、バッファー組成物は更に塩を含む。更なる実施態様において、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、又はＮａ２ＳＯ４である。幾つかの実施態様において、塩の濃度は、約１ｍＭから約１Ｍの範囲である。幾つかの実施態様において、塩濃度は、約１００分で約０ｍＭから約１００ｍＭまで増加する。幾つかの実施態様において、塩濃度は、約４０分で約０ｍＭから約８０ｍＭまで増加する。
【００１７】
本発明の方法の幾つかの実施態様において、ポリペプチドは、抗体若しくはイムノアドヘシン又はその断片である。幾つかの実施態様において、ポリペプチドはモノクローナル抗体又はその断片である。幾つかの実施態様において、抗体はヒト抗体である。他の実施態様において、抗体はヒト化抗体である。更に他の実施態様において、抗体はキメラ抗体である。幾つかの実施態様において、抗体は抗体断片である。
【００１８】
本発明の方法の幾つかの実施態様において、混入物は、ポリペプチドの変異体である。幾つかの実施態様において、混入物は、ポリペプチドの分解生成物である。幾つかの実施態様において、混入物は、ポリペプチドの荷電変異体である。
【００１９】
幾つかの実施態様において、クロマトグラフィー材料は、陽イオン交換クロマトグラフィー材料である。更なる実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、スルホン化クロマトグラフィー材料又はカルボキシル化クロマトグラフィー材料である。
【００２０】
幾つかの態様において、本発明は、各ポリペプチド組成物がポリペプチド及びそのポリペプチドの一以上の荷電変異体を含む、複数のポリペプチド組成物を効果的に分析するための方法を提供し、ここで、各ポリペプチド組成物に対して、方法は、ａ）ローディングバッファーが約４０℃で約７．６のｐＨで１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファーを含む、ローディングバッファーを用いて、約１ｍＬ／分の流速でイオン交換クロマトグラフィー材料にポリペプチド及び一以上の荷電変異体を結合させ；ｂ）溶出バッファーが約７．６のｐＨで約１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー及びＮａＣｌを含み、ＮａＣｌの濃度が約４０分で約０ｍＭから約８０ｍＭまで勾配で増加し、ポリペプチド及びその荷電変異体が勾配により分離される溶出バッファーの勾配を用いてイオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチド及び荷電変異体混入物を溶出し；及びｃ）ポリペプチド及び一以上の荷電変異体を検出することを含む方法はポリペプチドをその荷電変異体から効果的に分離する。幾つかの実施態様において、複数のポリペプチド組成物が異なるポリペプチドを含む。幾つかの実施態様において、複数のポリペプチド組成物が異なるｐＩを有するポリペプチドを含む。幾つかの実施態様において、ポリペプチド組成物は抗体組成物である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、モノクローナル抗体ｍＡｂ１（実線の黒い行）及びその２つの荷電変異体について、計算された正味電荷対ｐＨをプロットしたグラフである。示されるように、破線は２つの負電荷を有する酸性変異体と２つの正電荷を有する塩基性変異体を表す。曲線はｍＡｂ１及びその変異体のアミノ酸配列の組成物を使用して作成された。星は、曲線の変曲点を表す。変曲点のｐＨで実行されるプラットフォームＩＥＣ法は、ｐＨに関して最適な分解能及び堅牢性を提供する。
【図２Ａ】図２Ａは、ｐＨスケールに対して集団（例えば、ポリペプチド溶液）内のプロトン化されたヒスチジン（正に帯電した）の割合のグラフを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ｐＨ６．５及びｐＨ７．５で１０個のヒスチジン残基を含むポリペプチド中で脱プロトン化ヒスチジン（電荷頻度）の数を示す。これは、変曲点（ｐＨ７．５）では、ヒスチジン残基の大部分が脱プロトン化し、荷電していないことを示している。
【図２Ｃ】図２Ｃは、各々が２個のヒスチジン残基を有する４つのポリペプチド分子の例を示す。ＨｉｓのｐＫａ（ｐＨ６．０）で、Ｈｉｓ残基の５０％がプロトン化され、５０％が脱プロトン化されている。これらの４つの分子におけるＨｉｓ残基の電荷状態の組み合わせはｐＫａで二項分布である：１つは両方のＨｉｓがプロトン化され；２つは片方のＨｉｓがプロトン化され他方のＨｉｓが脱プロトン化され；１つは両方のＨｉｓが脱プロトン化されている。
【図３】図３は、ｐＨの関数としての極性アミノ酸の電荷頻度に関連した典型的なモノクローナル抗体を示すグラフである。３７℃での電荷計算に寄与する６つのアミノ酸について異なるｐＨで最も豊富な電荷状態の確率が実線としてプロットされ、ｍＡｂ１についてこれらのアミノ酸残基の加重組み合わせが破線としてプロットされている。
【図４】図４は、２２℃での異なるｐＨでのｍＡｂ１のシャノンエントロピーを示している。アミノ酸残基のタイプ及び数は、表３に記載されている正味電荷の算出に寄与している。
【図５】図５は、３７℃で異なるｐＨでのｍＡｂ１の集団における電荷分布の３次元表示及び電荷分布の頻度を示す。正味電荷対ｐＨの曲線の変曲点において、電荷分布は約０．７の頻度で最も均質であるが；一方変曲点から離れたｐＨでは、電荷分布は０．１５の頻度でより広範である。ＩＥＣ分離は電荷に基づいているので、電荷分布頻度が高いほど、ピークはより狭くかつ分解能がより高い。
【図６】図６は、図５の２次元表示、ｍＡｂ１の正味電荷対ｐＨ曲線である。温度が３７℃である場合、変曲点はｐＨ７．５においてである。
【図７】図７は、３７℃でのｍＡｂ生成物のｐＨの関数として正味電荷を示すグラフである。各ｍＡｂの計算された正味電荷はｍＡｂのアミノ酸配列に基づいて計算された。一部のｍＡｂは異なるフレームワークのアミノ酸配列を有していた。全ての曲線の変曲点は３７℃で約ｐＨ７．５である。
【図８】図８は、２２℃（菱形）、３７℃（三角形）及び５０℃（四角）での多数のｍＡｂ生成物について計算された変曲点を示すグラフである。
【図９】図９は、２２℃から５０℃の範囲の温度での、ｍＡｂについてｐＨに対する正味電荷の関係を示すグラフである。
【図１０Ａ】図１０Ａは、変曲点の変化率を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、選択されたｍＡｂについて温度の関数としてのｄＩＰの変化を示す。変化率はほぼ同一である。
【図１１】図１１は、指定されたバッファー（リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＡＣＥＳ、及びトリス）中の温度の関数としてのｍＡｂの正味電荷を示すグラフである。
【図１２】図１２は、同じクロマトグラフィーの手順を使用して、異なるｐＩを有する多数のｍＡｂの重ね合わされたクロマトグラムを示す。バッファーＡは、３７℃で５ｍＭのＡＣＥＳ（ｐＨ７．５）であった。バッファーＢはバッファーＡ中に１８０ｍＭのＮａＣｌであった。塩勾配は３７℃で１００分間又は１ｍＭ／分で０ｍＭのＮａＣｌから１００ｍＭのＮａＣｌであった。流速は０．８ｍＬ／分であった。カラムはＭａｂＰａｃ ＳＣＸ−１０カラム（４×２５０ｍｍ）であった。
【図１３】図１３は、ｐＨの関数としてｍＡｂ４のＩＥＣの堅牢性を示している。クロマトグラフィーの条件は、勾配が１．５ｍＭのＮａＣｌ／分であったことを除き、図１２の通りである。
【図１４】図１４は、温度の関数として３つのｍＡｂについてＩＥＣの堅牢性を示している。クロマトグラフィーの条件は、図１３で説明したように３つ全ての抗体において同じであった。
【図１５】図１５は、温度の関数として３つのｍＡｂについてＩＥＣの堅牢性を示している。クロマトグラフィーの条件は３つ全ての抗体について同じであった。クロマトグラフィーの条件は、バッファーが１０ｍＭのＨＥＰＥＳであったことを除き、図１３の通りである。
【図１６】図１６は、多生成物の手順を使用しかつ各ｍＡｂに対して開発された手順を使用して、３つのｍＡｂのＩＥＸクロマトグラフィーを比較したグラフを示す。多生成物法は、５０分間で０ｍＭのＮａＣｌから７５ｍＭのＮａＣｌの勾配（１．５ｍＭ／分）及び流速０．８ｍＬ／分を用いた３７℃で５ｍＭのＡＣＥＳ（ｐＨ７．５）であった。生成物特異的な方法に対するバッファー及び温度は異なっていた。ｍＡｂ８については３０℃で２０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．５）：ｍＡｂ２５については４２℃で２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）：及びｍＡｂ２６については４０℃で２０ｍＭのＡＣＥＳ（ｐＨ７．１）であった。カラムはＭａｂＰａｃ ＳＣＸ−１０カラム（４×２５０ｍｍ）であった。
【図１７】図１７は、４つの異なるクロマトグラフィーカラム；ＰｒｏＰａｃ ＷＣＸ−１０（１０μｍ、４×２５０ｍｍ）、ＹＭＣ（５μｍ、４×１００ｍｍ）、ＡｎｔｉＢｏｄｉｘ（５μｍ、４×２５０ｍｍ）、及びＭａｂＰａｃ ＳＣＸ−１０（１０μｍ、４×２５０ｍｍ）におけるｍＡｂ８を用いた多生成物クロマトグラフィーの条件の使用を示す。クロマトグラフィーの条件は図１３で説明された通りであった。挿入は変異体ピークの拡大を示す。
【図１８】図１８は、異なるサイズ；４×２５０ｍｍ、４×１００ｍｍ、４×５０ｍｍのＰｒｏＰａｃ ＷＣＸ−１０クロマトグラフィーカラムにおけるｍＡｂ８を用いた多生成物クロマトグラフィーの条件の使用を示す。実行時間はカラムが短いほど短かった。クロマトグラムは主ピークに対して正規化される。クロマトグラフィーの条件は、勾配時間を除いて図１５に対して説明された通りであった。
【図１９】図１９は、ＧＭＰロバストネストＤＯＥ試験の主ピークの相対的な割合のグラフを示す。
【図２０】図２０は、ＧＭＰロバストネストＤＯＥ試験の主ピークの相対的な割合のグラフを示す。
【図２１】図２１は、ＧＭＰロバストネストＤＯＥ試験の主ピークの相対的な割合のグラフを示す。
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は、一以上の混入物と共にポリペプチドを含む組成物を分析するために最適なイオン交換クロマトグラフィーの分離条件を同定するための方法を提供し、該方法は、ａ）ポリペプチドのアミノ酸組成に基づいて、選択された温度での正味電荷対ｐＨの曲線をプロットすること、ｂ）工程ａ）のプロットの二次導関数を決定することにより中性ｐＨで又はその近傍での正味電荷対ｐＨの曲線の変曲点（ＩＰ）を決定することを含み；ここで最適なイオン交換クロマトグラフィーの分離条件は、ポリペプチドについてほぼ変曲点でのｐＨである。幾つかの実施態様において、電荷頻度の分布は、所定の温度において異なるｐＨ値でのポリペプチドのシャノンエントロピーを計算することによって決定される。シャノンエントロピーが減少するにつれて、組成物中のポリペプチドの電荷分布がより均一になる。その結果、ポリペプチド及びその荷電変異体との間で分離する能力が向上する。
【００２３】
幾つかの実施態様において、本発明は、一以上の混入物と共にポリペプチドを含む組成物を分析するための最適なイオン交換クロマトグラフィーの分離条件で使用のためのバッファーを同定する方法を提供する。幾つかの実施態様において、温度による酸解離定数の変化（ｄｐＫａ／ｄＴ）が、上述されるように温度による変曲点の変化（ｄＩＰ／ｄＴ）にほぼ等しいバッファーが選択される。
【００２４】
幾つかの態様において、本発明は、複数の組成物を分析するために最適なイオン交換クロマトグラフィーの分離条件を同定するための方法を提供し、ここで各組成物は一以上の混入物を有するポリペプチドを含み、該方法は、ａ）組成物の二以上のポリペプチドのアミノ酸組成に基づいて、選択された温度での正味電荷対ｐＨの曲線をプロットすること、ｂ）工程ａ）のプロットの二次導関数を決定することにより中性ｐＨで又はその近傍での正味電荷対ｐＨの曲線の変曲点を決定することを含み；ここで最適なイオン交換クロマトグラフィーの分離条件は、一以上の組成物のポリペプチドについてほぼ共通の変曲点でのｐＨである。このように、本方法は、各生成物について特異的なプロトコルの開発を必要とせずに複数の生成物を分析するために使用され得る。
【００２５】
Ｉ．定義
用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、本明細書においては、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために互換的に使用される。ポリマーは、直鎖状でも分枝状でもよく、改変されたアミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸が割り込んでいてもよい。この用語はまた、自然に又は介入により改変されているアミノ酸ポリマーを包含しており；その例として、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは改変、例えば、標識化成分又は毒素とのコンジュゲーションが挙げられる。この定義には、例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸等を含む）の一又は複数の類似体を含むポリペプチド、並びに、当該技術分野において公知の他の改変体も含まれる。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において使用される場合、特に抗体を包含する。
【００２６】
用語「ポリペプチド荷電変異体」は、本明細書において使用される場合、ポリペプチドの電荷が変更されるように、自然の状態から改変されているポリペプチドを指す。幾つかの例において、荷電変異体は、親ポリペプチドよりも酸性である；即ち、親ペプチドよりも低いｐＩを有する。その他の例において、荷電変異体は、親ポリペプチドよりも塩基性である；即ち、親ペプチドよりも高いｐＩを有する。このような改変は操作されてもよく、又は、酸化、脱アミド化、リジン残基のＣ末端プロセシング、Ｎ末端ピログルタミン酸形成及び糖化等の天然のプロセスの結果であってもよい。幾つかの例において、ポリペプチド荷電変異体は、タンパク質に結合するグリカンが、親糖タンパク質と比較して、例えば、シアル酸又はその誘導体の付加により、糖タンパク質の電荷が変更されるように改変されている、糖タンパク質である。「抗体荷電変異体」とは、本明細書において使用される場合、抗体又はその断片が、抗体又はその断片の電荷が変更されるように、その自然な状態から改変されている、抗体又はその断片である。
【００２７】
「精製された」ポリペプチド（例えば、抗体又はイムノアドヘシン）とは、ポリペプチドの純度が増加し、その天然環境に存在するよりも、及び／又は実験室条件下で最初に合成及び／又は増幅された時よりも純粋な形態で存在することを意味する。純度は相対用語であり、必ずしも絶対純度を意味するのではない。
【００２８】
用語「アンタゴニスト」は最も広い意味で使用され、天然ポリペプチドの生物学的活性を部分的に又は完全に阻止、阻害、又は中和する任意の分子を含む。同様に用語「アゴニスト」は最も広い意味で使用され、天然ポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を含む。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然ポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体等を含む。ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定するための方法は、ポリペプチドを候補アゴニスト又はアンタゴニスト分子に接触させること及びポリペプチドに通常関連する一又は複数の生物学的活性における検出可能な変化を測定することを含む。
【００２９】
目的とする抗原、例えば、腫瘍関連ポリペプチド抗原標的と「結合する」ポリペプチドとは、十分な親和性で抗原と結合することから、その抗原を発現する細胞又は組織の標的化における診断剤及び／又は治療剤として有用であり、他のポリペプチドとはそれほど交差反応しないような、ポリペプチドである。そのような実施態様において、ポリペプチドと「非標的」ポリペプチドとの結合度は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析又は放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）により決定した場合、ポリペプチドとその特定の標的ポリペプチドとの結合の約１０％未満であろう。
【００３０】
ポリペプチドと標的分子との結合に関しては、特定のポリペプチド、又は特定のポリペプチド標的上のエピトープについて、その「特異的結合」、又はそれと「特異的に結合する」、又はそれに対して「特異的である」という用語は、非特異的相互作用とは測定可能な程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、分子の結合を対照分子の結合との比較で決定することにより測定でき、対照分子は、一般に、結合活性を有さない類似構造の分子である。例えば、特異的結合は、標的と類似している対照分子、例えば過剰な非標識標的との競合により決定され得る。この場合、プローブに対する標識した標的の結合が、標識していない過剰な量の標的により競合的に阻害された場合、特異的結合が示される。
【００３１】
用語「抗体」とは、本明細書では最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも二つのインタクトな抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び、所望の生物学的活性を示す限り、抗体断片を含む。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書では抗体と互換的に使用される。
【００３２】
抗体は、全て免疫グロブリンフォールドに基づく、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子である。例えば、ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されて機能的抗体を形成する、二つの「重」鎖及び二つの「軽」鎖を有する。各重鎖及び軽鎖自体は、「定常」（Ｃ）及び「可変」（Ｖ）領域を含む。Ｖ領域は抗体の抗原結合特異性を決定し、一方、Ｃ領域は、構造的な支持をもたらし、免疫エフェクターとの非抗原特異的相互作用において機能する。抗体又は抗体の抗原結合断片の抗原結合特異性とは、抗体が特定の抗原と特異的に結合する能力のことである。
【００３３】
抗体の抗原結合特異性は、Ｖ領域の構造的特徴により決定される。可変性は、可変ドメインの１１０個のアミノ酸全長にわたり一様に分布してはいない。その代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９〜１２アミノ酸長である「超可変領域」（ＨＶＲ）と呼ばれる極度の可変性のより短い領域で分割されている、１５〜３０個のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変のストレッチから成る。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ四つのＦＲを含み、大部分がβシート立体配置をとり、三つの超可変領域により繋がっており、この三つの超可変領域はβシート構造と繋がり、場合によってはβシート構造の一部を形成している、ループを形成する。各鎖における超可変領域は、ＦＲにより互いに極めて近接した状態で保持され、他の鎖由来の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md, (1991)を参照のこと）。定常ドメインは、抗原との抗体の結合には直接関わっていないが、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与など、多様なエフェクター機能を呈する。
【００３４】
各Ｖ領域は典型的には三つのＨＶＲ、例えば相補性決定領域（それぞれが「高頻度可変ループ」を含む「ＣＤＲ」）と四つのフレームワーク領域を含む。特定の所望の抗原に対して実質的な親和性で結合するのに必要とされる最少の構造単位である抗原結合部位は、したがって三つのＣＤＲと、適切な高次構造でＣＤＲを保持し提示するためにそれらの間に散在した少なくとも三つ、好ましくは四つのフレームワーク領域を含むであろう。古典的な四本鎖抗体は、ＶＨ及びＶＬドメインが協働して定める抗原結合部位を有している。ある種の抗体、例えばラクダ及びサメ抗体は、軽鎖を欠き、重鎖のみによって形成される結合部位に依存する。結合部位が重鎖又は軽鎖のみによって形成され、ＶＨ及びＶＬの間に協働がない単一ドメイン操作型免疫グロブリンを調製することができる。
【００３５】
「可変」なる用語は、可変ドメインのある部分が、抗体間で配列が広範囲に相違しているという事実を指し、それぞれの特定の抗体のその特定の抗原への結合及び特異性に使用される。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。それは、軽鎖及び重鎖可変ドメインの双方において、高頻度可変領域と称される三つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存されている部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ四つのＦＲを含み、大部分がβシート立体配置をとり、三つの超可変領域により繋がっており、この三つの超可変領域はβシート構造と繋がり、場合によってはβシート構造の一部を形成している、ループを形成する。各鎖における超可変領域は、ＦＲにより互いに極めて近接した状態で保持され、他の鎖由来の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md, (1991)を参照のこと）。定常ドメインは、抗原との抗体の結合には直接関わっていないが、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与など、多様なエフェクター機能を呈する。
【００３６】
「超可変領域」（ＨＶＲ）なる用語は、本明細書において使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、ＶＬの残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）、並びにＶＨの３１−３５Ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）及び／又は「超可変ループ」からの残基（例えば、ＶＬの残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）及び９１−９６（Ｌ３）、並びにＶＨの残基２６−３２（Ｈ１）、５２Ａ−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）（Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)）を含み得る。
【００３７】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書で定義している高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００３８】
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）及びＦｖ断片；ダイアボディ；タンデムダイアボディ（ｔａＤｂ）、線状抗体（例えば、米国特許第５６４１８７０号、実施例２；Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)）；１アーム抗体、単一可変ドメイン抗体、ミニボディ、単鎖抗体分子；抗体断片（例えば、限定されるものではないが、Ｄｂ−Ｆｃ、ｔａＤｂ−Ｆｃ、ｔａＤｂ−ＣＨ３、（ｓｃＦＶ）４−Ｆｃ、ジ−ｓｃＦｖ、バイ−ｓｃＦｖ、又はタンデム（ジ，トリ）−ｓｃＦｖが挙げられる）から形成される多特異性抗体；及び二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）が挙げられる。
【００３９】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる二つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。パパイン処置は、２つの抗原結合部位を有し、なお抗原を架橋することが可能なＦ（ａｂ’）２断片を産生する。
【００４０】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した一本の重鎖と一本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの三つの超可変領域は相互作用し、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つの超可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に対して特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有する。
【００４１】
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において、Ｆａｂ’の一般名称であり、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つ。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生産された。抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００４２】
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる二つの明確に区別される型の一つが割り当てられ得る。
【００４３】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体は異なるクラスが割り当てられ得る。インタクトな抗体には５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けられ得る。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られている。
【００４４】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。幾つかの実施態様において、ｓｃＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦＶが抗原結合に所望の構造を形成することを可能にする。ｓｃＦｖの総説については、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照のこと。
【００４５】
用語「ダイアボディ」は、二つの抗原結合部位を持つ抗体断片を指し、その断片は、同一ポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。非常に短いために同一鎖上で２つのドメインの対形成ができないリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、２つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４０９７；国際公開第９３／１１１６１号；及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)においてより詳しく説明される。
【００４６】
用語「多特異性抗体」は、最も広い意味で使用され、ポリエピトープ特異性を有する抗体を特に網羅する。そのような多特異性抗体としては、限定されるものではないが、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含みＶＨＶＬ単位がポリエピトープ特異性を有する抗体、２つ以上のＶＬ及びＶＨドメインを有し各ＶＨＶＬ単位が異なるエピトープと結合する抗体、２つ以上の単一可変ドメインを有し各単一可変ドメインが異なるエピトープと結合する抗体、完全長抗体、抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性を有するダイアボディ、トリアボディ、三重機能性抗体、共有結合的又は非共有結合的に連結している抗体断片が挙げられる。「ポリエピトープ特異性」とは、同じ又は異なる標的（複数可）上で２つ以上の異なるエピトープと特異的に結合する能力を指す。「単一特異性の」とは、１つのエピトープのみと結合できることを指す。一実施態様によれば、多特異性抗体は、親和性が５μＭから０．００１ｐＭ、３μＭから０．００１ｐＭ、１μＭから０．００１ｐＭ、０．５μＭから０．００１ｐＭ、又は０．１μＭから０．００１ｐＭである各エピトープと結合するＩｇＧ抗体である。
【００４７】
単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）又は「単一可変ドメイン（ＳＶＤ）抗体」という表現は、一般的に、単一可変ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）が抗原結合をもたらし得る抗体を指す。言い換えれば、単一可変ドメインは、標的抗原を認識するために別の可変ドメインと相互作用する必要がない。単一ドメイン抗体の例としては、ラクダ科の動物（ラマ及びラクダ）並びに軟骨魚（例えば、テンジクザメ）に由来するもの、並びに、ヒト及びマウス抗体からの組換法に由来するものが挙げられる（Nature (1989) 341:544-546; Dev Comp Immunol (2006) 30:43-56; Trend Biochem Sci (2001) 26:230-235; Trends Biotechnol (2003):21:484-490；国際公開第２００５／０３５５７２号；国際公開第０３／０３５６９４号；Febs Lett (1994) 339:285-290；国際公開第００／２９００４号；国際公開第０２／０５１８７０号）。
【００４８】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、モノクローナル抗体の産生中に生じ得る変異体（通常少量で存在する変異体など）を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンで汚染されていないという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で作製しなければならないことを意味するものではない。例えば、本明細書において提供される方法により使用されることになるモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法により作製されてもよく、又は、組換えＤＮＡ法により作製されてもよい（例えば、米国特許第４８１６５６７号を参照のこと）。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)及びMarks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)に記載されている手法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。
【００４９】
本明細書においては、モノクローナル抗体は、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、即ち、重鎖及び／又は軽鎖の一部分は特定の種に由来する抗体又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一若しくは相同であるが、鎖（複数可）の残りの部分は別の種に由来する抗体又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一若しくは相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びに、所望の生物学的活性を呈するものである限りそのような抗体の断片を、特に含む（米国特許第４８１６５６７号； Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)）。本明細書における目的のキメラ抗体は、非ヒト霊長動物（例：旧世界サル、例えばヒヒ、アカゲザル、又はカニクイザル）に由来する可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む（米国特許第５６９３７８０号）。
【００５０】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大抵の場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、非ヒト種、例えば、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長動物の超可変領域（ドナー抗体）由来の残基により置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。幾つかの例においては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。更に、ヒト化抗体はレシピエント抗体又はドナー抗体において見い出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能を更に改良するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの全てを実質的に含み、超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、上記のＦＲ置換基（複数可）を除く、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。また、ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン、通常はヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。更なる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
【００５１】
本明細書での目的に関して、「インタクトな抗体」は、重及び軽可変ドメイン並びにＦｃ領域を含むものである。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体であり得る。好ましくは、インタクトな抗体は、一又は複数のエフェクター機能を有する。
【００５２】
「天然抗体」は、通常、二つの同一の軽（Ｌ）鎖及び二つの同一の重（Ｈ）鎖からなる、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン（ＶＨ）を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、他端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基は、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられる。
【００５３】
「ネイキッド抗体」は、細胞傷害性部分又は放射性標識などの異種分子とコンジュゲートされない、（本明細書において定義する）抗体である。
【００５４】
幾つかの実施態様において、抗体「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因しうる生物学的活性を指し、抗体のアイソタイプにより変化する。抗体のエフェクター機能の例は：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害；Ｆｃ受容体結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；貪食作用；細胞表面受容体のダウンレギュレーションを含む。
【００５５】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的な細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が、標的細胞上の結合された抗体を認識し、引き続き標的細胞を溶解させる、細胞媒介性の反応を指す。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の４６４ページの表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施してもよい。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞は、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。代替的又は追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価され得る。
【００５６】
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を実行する白血球である。幾つかの実施態様において、その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球を含むが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が好適である。
【００５７】
「補体依存性細胞傷害」又は「ＣＤＣ」は、分子が補体の存在下で標的を溶解する能力を指す。補体活性化経路は、補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）が、同種抗原と複合体化された分子（例えばポリペプチド（例：抗体））と結合することにより引き起こされる。補体活性化を検討評価するために、ＣＤＣアッセイ、例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているようなＣＤＣアッセイを実施してもよい。
【００５８】
用語「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域と結合する受容体を説明するために使用される。幾つかの実施態様において、ＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。更に、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）と結合するものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これらの受容体の対立遺伝子変異体及び代替的にスプライスされた形態も含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化型受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「抑制型受容体」）を含み、これらは、その細胞質ドメインが主に異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化型受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン中に免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。抑制型受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)を参照のこと）。ＦｃＲは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)において総説されている。将来的に同定されることになるものを含め、他のＦｃＲは、本明細書においては用語「ＦｃＲ」に包含される。この用語には、胎児への母親のＩｇＧの移行に関与している新生児の受容体ＦｃＲｎも含まれる（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim et al., J. Immunol. 249 (1994)）。
【００５９】
「混入物」とは、所望のポリペプチド生成物とは異なる物質を指す。本発明の幾つかの実施態様において、混入物はポリペプチドの荷電変異体を含む。本発明の幾つかの実施態様において、混入物は抗体又は抗体断片の荷電変異体を含む。本発明の他の実施態様において、混入物は、限定するものではないが：宿主細胞物質、例えばＣＨＯＰ；浸出されたタンパク質Ａ；核酸；所望のポリペプチドの変異体、断片、凝集体又は誘導体；別のポリペプチド；エンドトキシン；ウイルス性混入物；細胞培養培地成分等を含む。幾つかの例において、混入物は、例えば限定されるものではないが、細菌細胞（大腸菌細胞など）、昆虫細胞、原核細胞、真核細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、真菌細胞に由来する宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）であってもよい。
【００６０】
本明細書において使用される場合、用語「イムノアドヘシン」は、異種ポリペプチドの結合特異性を免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能と組み合わせた抗体様の分子を指している。構造的に、イムノアドヘシンは、抗原認識以外の所望の結合特異性を有するアミノ酸配列と、抗体の結合部位との融合（すなわち、「異種の」である）、及び免疫グロブリン定常ドメイン配列を含む。イムノアドヘシン分子のアドヘシン部は、典型的には、少なくとも受容体又はリガンドの結合部位を含む近接するアミノ酸配列である。イムノアドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３若しくはＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭから得てもよい。
【００６１】
本明細書において使用される場合、「基本的に同一」とは、値又はパラメータが有意な影響により変更されていないことを示す。例えば、カラム出口のクロマトグラフィー移動相は、イオン強度が有意に変化していない場合、移動相の初期イオン強度と基本的に同一である。例えば、初期イオン強度の１０％、５％又は１％内のカラム出口のイオン強度は、初期イオン強度と基本的に同一である。
【００６２】
本明細書中の「約」の値又はパラメーターへの言及は、その値又はパラメーター自体に対するバリエーションを含む（記載する）。例えば、「約Ｘ」との記載には「Ｘ」の記載が含まれる。
【００６３】
本明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「ｏｒ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を指さない限り複数系を含む。本明細書に記載の本発明の態様及び変形形態は、態様及び変形形態「からなる」及び／又は「基本的にからなる」を含む。
【００６４】
ＩＩ．クロマトグラフィーの方法
Ａ．最適なイオン交換クロマトグラフィーの分離条件を決定する
本発明は、分解能の損失がｐＨ及び温度の変化により最小化されるように、ポリペプチドにおいてＩＥＣを実行するために最適なイオン交換条件を予測するための方法を提供する。幾つかの実施態様において、イオン交換クロマトグラフィーは、ポリペプチドを含む組成物中の混入物を検出するために使用される。幾つかの実施態様において、ポリペプチドは抗体又はその抗原結合性断片である。幾つかの実施態様において、混入物は荷電変異体；例えば、抗体又は抗体断片の塩基性荷電変異体及び／又は酸性荷電変異体を含む、ポリペプチドの塩基性荷電変異体及び／又は酸性荷電変異体である。
【００６５】
本発明の幾つかの実施態様において、ポリペプチドが電荷平衡である条件が同定される。ポリペプチドの正味電荷状態（ｚ）対ｐＨをグラフ化すると、この平衡を実証する。曲線は、ポリペプチドのアミノ酸配列を使用して作成される。ゼロに最も近い勾配を有する曲線の領域は、電荷平衡を表している。平衡状態で、ポリペプチドの正味の電荷状態は、曲線上の平坦領域としてグラフで示される（図１）ｐＨの変化に起因する変化に抵抗する。ポリペプチドの電荷状態の安定性は、堅牢性をアッセイするために寄与する。ポリペプチドが平衡状態である条件は、ｐＨに対するｚの直線の方程式の二次導関数を０に等しく設定することによって解くことができる。これは、曲線が凹から凸へ又はその逆へと遷移する曲線の変曲点にある。この曲線上には複数の変曲点（ＩＰ）があるが（図１には図示せず）、目的の変曲点は、傾きの絶対値がもはや減少していない生物学的領域内にある。このＩＰは、ｐＨに関する電荷状態の安定性に起因して著しく堅牢な方法を生成する。
【００６６】
標的ポリペプチドと比較して正味電荷に僅かな違いを有する混入物をｐＨ値の範囲にわたって検出することができるため、ポリペプチドの電荷平衡はＩＥＣの分解能において理想的な最適電荷である。これはポリペプチドを含むアミノ酸の構造及び特性によるためである。６つのアミノ酸が、それらがタンパク質のｐＨ依存性の特性を定義する上で重要な役割を果たしているので正味荷電状態（ｚ）を計算するために使用される（表１）。酸解離定数、（−ｌｏｇ１０Ｋａ）として定義され、一定の比率［Ａ−］／［ＨＡ］に基づいたｐＫａが、アミノ酸の電荷状態を計算するために使用される。その結果は実際の値ではなく、その電荷状態の確率、Ｐである。
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【００６７】
例えば、ｐＨ６．５でヒスチジンについて式１を用いると、Ｐ＝１０（６．５−６）／（１０（６．５−６）＋１）＝０．７６。これは、ｐＨ６．５において、１０個のヒスチジン残基を含むポリペプチド内の各ヒスチジン残基は、＋０．２４の電荷よりもむしろ脱プロトン化されている可能性７６％を有するであろうことを示している。言い換えると、ｐＨ６．５で、ポリペプチド内の４個全てのヒスチジン残基のうちおよそ３つが非プロトン化されているであろう。これは、ほぼ全てのヒスチジン残基が脱プロトン化されているｐＨ７．５でのポリペプチドについての計算と比較することができる（図２Ｂ）。ｐＨがアミノ酸の側鎖のｐＫａに近づくと、最も優勢な電荷状態の頻度が減少する。
【００６８】
重要なアミノ酸にこの式を適用すると、平衡状態で動作させると最適な分解能を提供する理由を実証する。ｐＨの範囲にわたって６つの電荷決定アミノ酸の確率を重み付けすると、最も均質な電荷状態を解くことができる（図３）。プロトン化された種の推定分布に起因する異なる電荷状態の存在は、その結果を曖昧にし、かつ対象ポリペプチドと比較して正味電荷分布のわずかな変化を有する混入物を検出する能力を妨害するであろう。幾つかの実施態様において、正味電荷分布対ｐＨの３Ｄグラフがプロットされる。正味電荷のピーク対ｐＨ対頻度が最もシャープである場合に、より高い分解能が達成される（図５）。従って、堅牢性のためにｐＨ及び温度の同一条件が最適な分解能を創成する。
【００６９】
本発明の幾つかの実施態様において、電荷頻度の分布は、確率変数における不確実性の尺度であるシャノンエントロピー（式２）を介して決定される。ポリペプチド中に存在する各６つのアミノ酸（リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン及びアルギニン）の残基の数に基づいて、ポリペプチドの所定のｐＨでのシャノンエントロピーは、所定の温度でｐＨの関数としてプロットされる（図４）。シャノンエントロピーが低いほど、電荷分布はより均一である。本発明の幾つかの実施態様において、クロマトグラフィーは、シャノンエントロピーがおよそ最小であるｐＨ及び温度で行われる。
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ここで：
ｎ＝結果の可能性（ｎ＝２、プロトン化又は非プロトン化の何れか）
ｐ＝結果又は事象（ｘｉ）の確率（式１を参照）
ｂ＝＃トライアル（荷電アミノ酸残基の＃）
【００７０】
本発明の幾つかの実施態様において、共通のクロマトグラフィー手順が複数のポリペプチド生成物；例えば複数の抗体生成物を分析するために使用されるように、最適なイオン交換クロマトグラフィーの分離条件が複数の異なるポリペプチドについて決定される。幾つかの実施態様において、複数のポリペプチド生成物（例えば、複数の抗体生成物）が、本明細書に記載の方法によって同定される共通のクロマトグラフィー手順を使用して荷電変異体などの混入物の存在について分析される。本発明の重要な利点は、多数のｍＡｂを含む多数のポリペプチドのＩＰが、同じｐＨで生じ（図７）、その点での電荷の数によって異なるだけであることである。従って、これらのポリペプチドの全てのＩＥＣの最適条件は同じになる；すなわち、ポリペプチドが電荷平衡であるｐＨ及び温度においてである。
【００７１】
ＩＰからの逸脱を生じないであろう条件の変化を確実にするために、用語ｄＩＰ／ｄＴ値が使用される。タンパク質のｄＩＰ／ｄＴは、温度の変化に関する正味電荷対ｐＨの曲線におけるポリペプチドの変曲点の変化である。所与のポリペプチドの変曲点は、正味電荷対ｐＨのプロットが決定される温度に基づいて変動することとなる。しかし、変曲点のｐＨは温度の上昇とともに減少するが（例えば、図８及び９を参照）、正味の電荷は一定のままである。従って、変曲点に対してクロマトグラフィーを最適化することは、温度変動に対するイオン交換法の堅牢性をも提供する。
【００７２】
幾つかの実施態様において、本発明は、複数のポリペプチドの所定のポリペプチドに使用するイオン交換クロマトグラフィーのタイプを決定するための手段を提供する。例えば、変曲点での正味の電荷が正である場合、陽イオン交換クロマトグラフィー材料が用いられる。陽イオン交換クロマトグラフィー材料の非限定的な例を以下に提供する。幾つかの実施態様において、複数のポリペプチドが共通の変曲点での正味の正電荷を有する共通の陽イオン交換クロマトグラフィーの手順が、複数のポリペプチド（例えば、抗体）を分析するために使用される。変曲点での正味の電荷が負である場合、陰イオン交換クロマトグラフィー材料が用いられる。陰イオン交換クロマトグラフィー材料の非限定的な例を以下に提供する。幾つかの実施態様において、複数のポリペプチドが共通の変曲点での正味の負電荷を有する共通の陰イオン交換クロマトグラフィーの手順が、複数のポリペプチド（例えば、抗体）を分析するために使用される。
【００７３】
Ｂ．最適な緩衝系を決定する
幾つかの実施態様において、本発明は、クロマトグラフィー法において使用するために最適なバッファーを選択するための方法を提供する。幾つかの実施態様において、温度変化による変曲点の変化と同様の酸解離定数（ｐＫａ）変化率を有する緩衝系がクロマトグラフィーの手順で使用される。タンパク質のｄＩＰ／ｄｔにほぼ等しい温度の変化によるｐＫａの変化（すなわちｄｐＫａ／ｄＴ）を用いてバッファーを選択することは、温度のいかなる変化もタンパク質をそのＩＰでとどまらせることを確実にし、それによって分析クロマトグラフィーの堅牢性に貢献することとなる。幾つかの実施態様において、（ｄＩＰ／ｄＴ）ポリペプチド（複数）＝（ｄｐＫａ／ｄＴ）バッファー。幾つかの実施態様において、バッファーはＡＣＥＳバッファー又はＨＥＰＥＳバッファーである。例えば、バッファーのＡＣＥＳ又はＨＥＰＥＳを用いて、変曲点での例示的なｍＡｂの電荷状態は３０℃を超えて０．５未満変化する（図１１）。
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【００７４】
幾つかの実施態様において、バッファーは、変曲点のｐＨで効果的な緩衝能を提供する。幾つかの実施態様において、ポリペプチドのｄＩＰ／ｄＴは、約−０．０２である。幾つかの実施態様において、温度変化は、約２０℃から約５０℃である。幾つかの実施態様において、ｄＩＰ／ｄＴ＝ｄｐＫａ／ｄＴ±１％、ｄＩＰ／ｄＴ＝ｄｐＫａ／ｄＴ±２％、ｄＩＰ／ｄＴ＝ｄｐＫａ／ｄＴ±３％、ｄＩＰ／ｄＴ＝ｄｐＫａ／ｄＴ±４％、ｄＩＰ／ｄＴ＝ｄｐＫａ／ｄＴ±５％、ｄＩＰ／ｄＴ＝ｄｐＫａ／ｄＴ±６％、ｄＩＰ／ｄＴ＝ｄｐＫａ／ｄＴ±７％、ｄＩＰ／ｄＴ＝ｄｐＫａ／ｄＴ±８％、ｄＩＰ／ｄＴ＝ｄｐＫａ／ｄＴ±９％、ｄＩＰ／ｄＴ＝ｄｐＫａ／ｄＴ±１０％、ｄＩＰ／ｄＴ＝ｄｐＫａ／ｄＴ±２０％、ｄＩＰ／ｄＴ＝ｄｐＫａ／ｄＴ±３０％、ｄＩＰ／ｄＴ＝ｄｐＫａ／ｄＴ±４０％、又はｄＩＰ／ｄＴ＝ｄｐＫａ／ｄＴ±５０％．幾つかの実施態様において、選択されたバッファー中のポリペプチドの正味電荷は、約５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、又は３０℃以上にわたって１未満だけ変化する。
【００７５】
幾つかの実施態様において、本発明は、荷電変異体などの混入物を検出する高解像度で堅牢な多生成物ポリペプチドのＩＥＣを開発するための方法を提供する。条件は、ポリペプチド（例えば、ｍＡｂ）が親ポリペプチドからの荷電変異体の分離を向上させる電荷平衡にあるように設計される。電荷平衡は、計算される正味電荷状態（ｚ）対ｐＨをグラフ化することにより、多数のポリペプチド生成物（例えは、ｍＡｂ生成物）について決定される。ポリペプチドが平衡状態である条件は、ｐＨに対するｚの直線の方程式の二次導関数を０に等しく設定することによって解かれる。
【００７６】
与えられたｐＨでのポリペプチドの正味の電荷は、それらの側鎖によってタンパク質のｐＨ依存性の特性を定義する際に重要な役割を果たしているｍＡｂの６つのアミノ酸の含有量に基づいて決定される。６つのアミノ酸は、アスパラギン、グルタミン酸、ヒスチジン、チロシン、リジン及びアルギニンである。６つのアミノ酸の酸解離定数（−ｌｏｇ１０Ｋａとして定義されるｐＫａ）が、正味荷電状態（ｚ）を計算するために使用される（表１）。例えば、６．０２以下のｐＨ値では、平均してヒスチジンはプロトン化されておりと正の電荷を帯びているが、一方６．０２を超えるのｐＨ値では平均してヒスチジンは脱プロトン化され、電荷を帯びていない。与えられたｐＨ値における最も豊富な荷電状態の確率が６つのアミノ酸のそれぞれについて決定され、与えられたｐＨでのｍＡｂ１の電荷の重み付き確率が、抗体中に存在するこれらの６つのアミノ酸のそれぞれの残基数に基づいて決定された。電荷頻度の分布もまた、確率変数における不確実性の尺度であるシャノンエントロピー（式３）を介して決定することができる。ポリペプチド中に存在するこれらの６つのアミノ酸のそれぞれの残基数に基づいて、ポリペプチドに対する所与のｐＨにおけるシャノンエントロピーをｐＨの関数としてプロットすることができる。シャノンエントロピーが低いほど、電荷分布はより均一である。このデータから、ｐＨの関数としてのポリペプチドの正味の電荷の分布をプロットし、中性ｐＨに最も近い変曲点（ＩＰ）が決定される。これは、最も均質な電荷状態であるｐＨであり、ＩＥＣの分離において最もシャープなピークを生じることとなる。多生成物ＩＥＣプロトコルを開発するために、異なるｐＩを有する多数の標的ポリペプチド（例えば、標的のＭＡｂ）についての変曲点が決定される。ＩＰを標的にすると、ＩＥＣのｐＨ堅牢性を向上させることができる。
【００７７】
用語ｄＩＰ／ｄＴは、温度の変化による分子のＩＰの変化を表している。これらの結果から、温度の影響を最小にし、アッセイの堅牢性を向上させるために、温度の関数としてのバッファーの酸解離定数の変化がｄＩＰ／ｄＴに近づいた場合に（すなわち、ｄＩＰ／ｄＴ＝ｄｐＫａ／ｄＴ）最適なバッファーを選択することができる。多数のバッファーについて温度の関数（ｄｐＫａ／ｄＴ）としてのｐＫａの変化の公表値は以下のとおりである：リン酸塩：−０．００２８、ＨＥＰＥＳ：−０．０１４、ＡＣＥＳ：−０．０２，トリス：−０．０２８，ビシン：−０．０１８、トリシン：−０．０２１、ＴＡＰＳ：−０．０２、及びＣＨＥＳ：−０．０１８（Benyon, RJ & Easterby, JS, Buffer Solutions The Basics, IRL Press, 1996）。
【００７８】
幾つかの態様において、本発明は、各抗体組成物が抗体及びその抗体の一以上の電荷変異体を含む、複数の抗体組成物を分析するための方法を提供し、ここで、各抗体組成物に対して、方法は、ａ）ローディングバッファーが約４０℃で約７．６のｐＨで１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファーを含む、ローディングバッファーを用いて、約１ｍＬ／分の流速でイオン交換クロマトグラフィー材料に抗体及び一以上の電荷変異体を結合させ；ｂ）溶出バッファーが約７．６のｐＨで約１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー及びＮａＣｌを含み、ＮａＣｌの濃度が約４０分で約０ｍＭから約８０ｍＭまで勾配で増加し、抗体及びその電荷変異体が勾配により分離される溶出バッファーの勾配を用いてイオン交換クロマトグラフィー材料から抗体及び電荷変異体混入物を溶出し；及びｃ）抗体及び一以上の電荷変異体を検出することを含む方法は抗体をその電荷変異体から効果的に分離する。幾つかの実施態様において、複数の抗体組成物が異なる抗体を含む。幾つかの実施態様において、複数の抗体組成物が異なるｐＩを有する抗体を含む。
【００７９】
Ｃ．クロマトグラフィー
幾つかの態様において、本発明は、初期イオン強度を有するローディングバッファーを用いてポリペプチド及び一以上の混入物をイオン交換クロマトグラフィー材料に結合させ、ポリペプチド及び一以上の混入物が別個の独立した実体としてクロマトグラフィー材料から溶出するように溶出バッファーのイオン強度がイオン強度勾配によって変更される溶出バッファーを用いてイオン交換カラムからポリペプチド及び一以上の混入物を溶出させることを含む、ポリペプチド及び一以上の混入物、例えば、ポリペプチド変異体を含む組成物の分析方法を提供する。幾つかの実施態様において、クロマトグラフィー法は、様々なｐＩを有する複数のポリペプチド（例えば、ポリペプチド生成物）に適している。例えば、方法は、ｐＩが６．０から９．５までの範囲を有する多数の異なる抗体生成物のために使用することができる。他の実施態様において、クロマトグラフィー法は、本明細書に記載の方法によって同定される最適なバッファーの使用を含む。
【００８０】
本明細書に記載される方法の何れかの幾つかの実施態様において、クロマトグラフィー材料は、陽イオン交換材料である。幾つかの実施態様において、ポリペプチドが本明細書に記載される変曲点で正に荷電される場合、陽イオン交換材料が使用される。幾つかの実施態様において、陽イオン交換材料は、負に荷電され、固相を通過し又は通じて水溶液中の陽イオンとの交換のための遊離の陽イオンを有する固相である。本明細書に記載される方法の何れかの幾つかの実施態様において、陽イオン交換材料は、膜、モノリス、又は樹脂であってもよい。幾つかの実施態様において、陽イオン交換材料は、樹脂であってもよい。陽イオン交換材料は、限定されないが、スルホン酸、カルボン酸、カルボキシメチルスルホン酸、スルホイソブチル、スルホエチル、カルボキシル、スルホプロピル、スルホニル、スルホキシエチル（ｓｕｌｐｈｏｘｙｅｔｈｙｌ）、又はオルトリン酸塩などのカルボン酸官能基又はスルホン酸官能基を含んでいてもよい。上記の幾つかの実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムである。幾つかの実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィー材料が、異なるポリペプチド、例えば、ｐＩが約７．０から約９．５までの範囲である異なる抗体又はその断片に対して使用される。幾つかの実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、本明細書に記載の方法によって同定される最適なバッファーを用いてクロマトグラフィー法において使用される。
【００８１】
陽イオン交換材料の例は、当該技術分野で知られており、限定されないが、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｓ，Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｓ，ＳＯ３ Ｍｏｎｏｌｉｔｈ，Ｓ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ，Ｐｏｒｏｓ ＸＳ，Ｐｏｒｏｓ ＨＳ５０，Ｐｏｒｏｓ ＨＳ２０，ＳＰＳＦＦ，ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ（ＳＰＸＬ），ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ，Ｃａｐｔｏ Ｓ，Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ Ｓｅ ＨｉＣａｐ，Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＳＯ３，又はＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＣＯＯを含む。本明細書に記載される方法の何れかの幾つかの実施態様において、陽イオン交換材料はＰｏｒｏｓ ＨＳ５０である。幾つかの実施態様において、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ５０樹脂は、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ５０μｍ又はＰｏｒｏｓ ＨＳ２０μｍ粒子であって良い。本発明の方法で使用するための陽イオン交換クロマトグラフィーカラムの例としては、限定されるものではないが、ＰｒｏＰａｃ ＷＣＸ−１０、ＰｒｏＰａｃ ＷＣＸ−１０ＨＴ、ＭａｂＰａｃ ＳＣＸ−１０ ５μｍ、及びＭａｂＰａｃ ＳＣＸ−１０ １０μｍを含む。
【００８２】
本明細書に記載される方法の何れかの幾つかの実施態様において、クロマトグラフィー材料は陽イオン交換材料である。幾つかの実施態様において、ポリペプチドが本明細書に記載される変曲点で負に荷電される場合、陰イオン交換材料が使用される。幾つかの実施態様において、陰イオン交換材料は、正に荷電され、固相を通過し又は通じて水溶液中の陰イオンとの交換のための遊離の陰イオンを有する固相である。本明細書に記載される方法の何れかの幾つかの実施態様において、陰イオン交換材料は、膜、モノリス、又は樹脂であってもよい。幾つかの実施態様において、陰イオン交換材料は、樹脂であってもよい。幾つかの実施態様において、陰イオン交換材料は、一級アミン、二級アミン、三級アミン又は第四級アンモニウムイオン官能基、ポリアミン官能基、又はジエチルアミノエチル官能基を含んでいてもよい。上記の幾つかの実施態様において、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムである。幾つかの実施態様において、陰イオン交換クロマトグラフィー材料が、ポリペプチド、例えば、ｐＩが約７未満である抗体又はその断片に対して使用される。幾つかの実施態様において、陰イオン交換クロマトグラフィー材料が、異なるポリペプチド、例えば、ｐＩが約４．５から約７．０までの範囲である異なる抗体又はその断片に対して使用される。幾つかの実施態様において、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、本明細書に記載の方法によって同定される最適なバッファーを用いてクロマトグラフィー法において使用される。
【００８３】
陰イオン交換材料の例は、当該技術分野で公知であり、限定されないが、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ ５０、Ｐｏｒｏｓ ＰＩ ５０、Ｐｏｒｏｓ Ｄ、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、及びＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを含む。本発明の方法で使用するための陰イオン交換クロマトグラフィーカラムの例としては、限定されるものではないが、Ｄｉｏｎｅｘ ＰｒｏＰａｃ １０ ＳＡＸ及びＴｏｓｏｈ ＧＳＫｇｅｌ Ｑ ＳＴＡＴ ７μＭ ＷＡＸを含む。
【００８４】
本明細書に記載される方法の何れかの幾つかの実施態様において、クロマトグラフィー材料は、以下の機能：陰イオン交換、陽イオン交換、水素結合、及び疎水性相互作用のうちの一又は複数が可能な官能基を含む混合モード材料である。幾つかの実施態様において、混合モード材料は、陰イオン交換及び疎水性相互作用が可能な官能基を含む。混合モード材料は、リガンドとしてＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミン、４−メルカプト−エチル−ピリジン、ヘキシルアミン、又はフェニルプロピルアミンを含むか、又は架橋ポリアリルアミンを含む。混合モード材料の例は、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ樹脂、ＱＭＡ樹脂、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ樹脂、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂、ＨＥＡ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂、ＰＰＡ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂、又はＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜又はＳａｒｔｏｂｉｎｄ ＳＴＩＣを含む。幾つかの実施態様において、混合モード材料は、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ樹脂である。上記の幾つかの実施態様において、混合モード材料は、混合モードクロマトグラフィーカラムである。
【００８５】
本明細書に記載される方法の何れかの幾つかの実施態様において、イオン交換材料は、従来のクロマトグラフィー材料又は対流性クロマトグラフィー材料を利用することができる。従来のクロマトグラフィー材料は、例えば、灌流性材料（例えば、ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）樹脂）及び拡散性材料（例えば、架橋されたアガロース樹脂）を含む。幾つかの実施態様において、ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）樹脂は、Ｐｏｒｏｓ樹脂であり得る。幾つかの実施態様において、架橋アガロース樹脂は、スルホプロピル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（「ＳＰＳＦ」）樹脂であってもよい。対流性クロマトグラフィー材料は、膜（例えば、ポリエーテルスルホン）、又はモノリス材料（例えば、架橋ポリマー）であってもよい。ポリエーテルスルホン膜は、Ｍｕｓｔａｎｇであって良い。架橋ポリマーモノリス材料は、架橋ポリ（グリシジルメタクリレート−コ−エチレンジメタクリレート）であっても良い。
【００８６】
本発明の方法の何れかの幾つかの実施態様において、クロマトグラフィー材料は、クロマトグラフィーカラむ；例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーカラム又は陰イオン交換クロマトグラフィーカラムの中にある。幾つかの実施態様において、クロマトグラフィーカラムは、液体クロマトグラフィーに使用される。幾つかの実施態様において、クロマトグラフィーカラムは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のために使用される。幾つかの実施態様において、クロマトグラフィーカラムは、ＨＰＬＣクロマトグラフィーカラム；例えば、陽イオン交換ＨＰＬＣカラム又は陰イオン交換ＨＰＬＣカラムである。
【００８７】
本発明の多生成物クロマトグラフィー法のために使用することができる例示的なＨＰＬＣの手順は以下の通りである；しかしながら、本発明の方法は、これらの手順に拘束されるとは解釈されない。サンプルをオートサンプラーに付加し、冷蔵する（５±３℃）。カラムをカラムコンパートメントに置き、分析中、コンパートメントの温度を設定点から狭い範囲内（±１℃）に維持するために温度調節機能を用いてもよい。カラム溶出物を２８０ｎｍでモニターする。
【００８８】
サンプルを移動相でおよそ１〜２ｍｇ／ｍＬの目標ポリペプチド濃度に希釈する。幾つかの実施態様において、ポリペプチドはカルボキシペプチダーゼＢ（ＣｐＢ）で消化され、１：１００（ｗ／ｗ）の比率で付加され、３７℃で２０分間インキュベートされてもよい。サンプルは分析するまで５℃で保管されてもよい。
【００８９】
機器は、低圧四元勾配ポンプ、温度調節能力を有する高速分離オートサンプラー、熱制御カラムコンパートメント及びダイオードアレイＵＶ検出器を含んでもよい。ＰＣＭ−３０００ ｐＨ及び導電率モニターは、検出器の出口で、リアルタイムでｐＨ及び導電率データを収集するように接続されてもよい。機器制御、データ習得及びデータ分析は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェア、バージョン６．８を使用して実施され得る。
【００９０】
サンプルは、脱イオン水で２ｍｇ／ｍＬに希釈され、オートサンプラーに５±３℃で保持され得る。ＭａｂＰａｃ ＳＣＸ−１０、４ × ２５０ｍｍカラムは、温度設定３７±１℃でカラムコンパートメントに配置される。各クロマトグラフィーの実行のために、タンパク質（２０μｇ）の１０μＬが注入される。バッファーＡは、３７℃で５ｍＭのＡＣＥＳ（ｐＨ７．５）である。バッファーＢはバッファーＡ中に１８０ｍＭのＮａＣｌである。勾配はバッファーＢをバッファーＡ中に混合することにより、１００分間、１ｍＭ／分で０〜１００ｍＭのＮａＣｌである。流速は０．８ｍＬ／分である。タンパク質は２８０ｎｍでの吸光度によって検出される。幾つかの実施態様において、バッファーＡは、４０℃で１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．６）、バッファーＢは１００ｍＭのＮａＣｌである。
【００９１】
溶出とは、本明細書において使用される場合、クロマトグラフィー材料から生成物、例えばポリペプチド及び／又は混入物を除去することである。溶出バッファーは、クロマトグラフィー材料からポリペプチド又は目的とするその他の生成物を溶出するために使用されるバッファーである。幾つかの実施態様において、溶出バッファーは、クロマトグラフィーの移動相の一部である。幾つかの実施態様において、ポリペプチド及び混入物を含む組成物は、移動相の一部としてクロマトグラフィー材料に適用される。次いで、ポリペプチド及び混入物がクロマトグラフィー材料から溶出する際、移動相は、混入物からのポリペプチドの分離が可能になるように変更される。多くの場合、溶出バッファーは、ロードバッファーとは異なる物理的特性を有する。幾つかの実施態様において、溶出バッファーのｐＨ及び溶出バッファーのイオン強度は、ロードバッファーと比較して、溶出中に増加する。幾つかの実施態様において、クロマトグラフィーは、多生成物のクロマトグラフィーの手順である。幾つかの実施態様において、溶出バッファーは、本明細書に記載の方法によって同定される最適なバッファーを含む。
【００９２】
幾つかの実施態様において、イオン強度勾配は、塩勾配である。幾つかの実施態様において、塩勾配は、約０ｍＭ塩から約２００ｍＭ塩までの勾配である。幾つかの実施態様において、塩勾配は、約０ｍＭから約１００ｍＭまで、０ｍＭから約６０ｍＭまで、０ｍＭから約５０ｍＭまで、０ｍＭから約４０ｍＭまで、０ｍＭから約３０ｍＭまで、０ｍＭから約２０ｍＭまで、０ｍＭから約１０ｍＭまで、１０ｍＭから約２００ｍＭまで、１０ｍＭから約１００ｍＭまで、１０ｍＭから約５０ｍＭまで、１０ｍＭから約４０ｍＭまで、１０ｍＭから約３０ｍＭまで、１０ｍＭから約２０ｍＭまで、２０ｍＭから約２００ｍＭまで、２０ｍＭから約１００ｍＭまで、２０ｍＭから約５０ｍＭまで、２０ｍＭから約３０ｍＭまで、３０ｍＭから約２００ｍＭまで、３０ｍＭから約１００ｍＭまで、及び３０ｍＭから約５０ｍＭまでの何れかである。
【００９３】
本発明の幾つかの実施態様において、移動相、例えば溶出バッファーのイオン強度は、移動相の導電率により測定される。導電率とは、二つの電極間の電流を導電する水溶液の能力を指す。溶液中では、電流はイオン輸送により流れる。したがって、水溶液中のイオン量が増加すると、溶液はより高い導電率を有することになる。導電率の基本測定単位は、Ｓｉｅｍｅｎ（又はｍｈｏ）、ｍｈｏ（ｍＳ／ｃｍ）であり、Ｏｒｉｏｎ導電率計の様々なモデル等の導電率計を使用して測定され得る。電解導電率は溶液中のイオンの電流を流す能力であるため、溶液の導電率は、その中のイオンの濃度を変化させることにより変更されてもよい。例えば、溶液中のバッファー剤の濃度及び／又は塩（例えば塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム及び塩化カリウム）の濃度は、所望の導電率を達成するために変更されてもよい。好ましくは、様々なバッファーの塩濃度は、所望の導電率を達成するために改変される。
【００９４】
幾つかの実施態様において、クロマトグラフィーの移動相は、約０．０ｍＳ／ｃｍ、０．５ｍＳ／ｃｍ、１．０ｍＳ／ｃｍ、１．５ｍＳ／ｃｍ、２．０ｍＳ／ｃｍ、２．５ｍＳ／ｃｍ、３．０ｍＳ／ｃｍ、３．５ｍＳ／ｃｍ、４．０ｍＳ／ｃｍ、４．５ｍＳ／ｃｍ、５．０ｍＳ／ｃｍ、５．５ｍＳ／ｃｍ、６．０ｍＳ／ｃｍ、６．５ｍＳ／ｃｍ、７．０ｍＳ／ｃｍ、７．５ｍＳ／ｃｍ、８．０ｍＳ／ｃｍ、８．５ｍＳ／ｃｍ、９．０ｍＳ／ｃｍ、９．５ｍＳ／ｃｍ、１０ｍＳ／ｃｍ、１１ｍＳ／ｃｍ、１２ｍＳ／ｃｍ、１３ｍＳ／ｃｍ、１４ｍＳ／ｃｍ、１５ｍＳ／ｃｍ、１６ｍＳ／ｃｍ、１７．０ｍＳ／ｃｍ、１８．０ｍＳ／ｃｍ、１９．０ｍＳ／ｃｍ、又は２０．０ｍＳ／ｃｍの何れかより大きい初期導電率を有する。幾つかの実施態様において、移動相の導電率は、例えばイオン強度勾配により、クロマトグラフィー中に増加する。幾つかの実施態様において、溶出完了時の移動相の導電率は、約１．０ｍＳ／ｃｍ、１．５ｍＳ／ｃｍ、２．０ｍＳ／ｃｍ、２．５ｍＳ／ｃｍ、３．０ｍＳ／ｃｍ、３．５ｍＳ／ｃｍ、４．０ｍＳ／ｃｍ、４．５ｍＳ／ｃｍ、５．０ｍＳ／ｃｍ、５．５ｍＳ／ｃｍ、６．０ｍＳ／ｃｍ、６．５ｍＳ／ｃｍ、７．０ｍＳ／ｃｍ、７．５ｍＳ／ｃｍ、８．０ｍＳ／ｃｍ、８．５ｍＳ／ｃｍ、９．０ｍＳ／ｃｍ、９．５ｍＳ／ｃｍ、１０ｍＳ／ｃｍ、１１ｍＳ／ｃｍ、１２ｍＳ／ｃｍ、１３ｍＳ／ｃｍ、１４ｍＳ／ｃｍ、１５ｍＳ／ｃｍ、１６ｍＳ／ｃｍ、１７．０ｍＳ／ｃｍ、１８．０ｍＳ／ｃｍ、１９．０ｍＳ／ｃｍ、又は２０．０ｍＳ／ｃｍの何れかより大きい。幾つかの実施態様において、移動相の導電率は、直線勾配により増加する。幾つかの実施態様において、移動相の導電率は、一又は複数の工程を含む段階勾配により増加する。
【００９５】
本明細書に記載される方法の何れかの幾つかの実施態様において、例えば、本明細書に記載される方法により同定される多生成物クロマトグラフィー手順又はクロマトグラフィー手順において、ポリペプチド及び一以上の混入物を含む組成物は、約１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、又は５０μｇの何れかより大きい量でクロマトグラフィー材料にロードされる。幾つかの実施態様において、組成物は、約０．５ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ、及び５．０ｍｇ／ｍＬの何れかより大きい濃度でクロマトグラフィー材料にロードされる。幾つかの実施態様において、組成物は、クロマトグラフィー材料にロードされる前に希釈される；例えば、１：１、１：２、１：５、１：１０又は１：１０超で希釈される。幾つかの実施態様において、組成物はクロマトグラフィーの移動相中に希釈される。幾つかの実施態様において、組成物はローディングバッファー中に希釈される。
【００９６】
本明細書に記載の方法の何れかの幾つかの実施態様において、流量は、約０．５ｍＬ／分、０．６ｍＬ／分、０．７ｍＬ／分、０．８ｍＬ／分、０．９ｍＬ／分、１．０ｍＬ／分、１．１ｍＬ／分、１．２ｍＬ／分、１．３ｍＬ／分、１．４ｍＬ／分、１．５ｍＬ／分、１．７５ｍＬ／分及び２．０ｍＬ／分の何れかより大きい。
【００９７】
本明細書に記載の方法の何れかの幾つかの実施態様において、クロマトグラフィー材料はカラムである。幾つかの実施態様において、カラムはＨＰＬＣカラムである。幾つかの実施態様において、カラムは以下の寸法の何れか一つを有する：４×５０ｍｍ、４×１００ｍｍ、４×１５０ｍｍ、４×２００ｍｍ、４×２５０ｍｍ、又は２×２５０ｍｍ。
【００９８】
Ｄ． 電荷変異体の検出
幾つかの態様において、本発明は、ポリペプチド（例えば、抗体）の組成物中にポリペプチド及び一又は複数の変異体を含む組成物中のポリペプチドの変異体を検出する方法を提供する。幾つかの実施態様において、ポリペプチドの変異体は、上記のように最適化されたイオン交換クロマトグラフィーの分離条件を用いて分析される。幾つかの実施態様において、ポリペプチドの変異体は、バッファーが上記のように最適化されたイオン交換クロマトグラフィーを用いて分析される。幾つかの実施態様において、ポリペプチドの変異体は、分離条件及びバッファーが上記のように最適化されるイオン交換クロマトグラフィーを用いて分析される。幾つかの実施態様において、イオン交換クロマトグラフィーの分離条件及び／又はバッファーは、複数のポリペプチドに対して、例えば、一以上の標的ポリペプチド（例えば、一以上の抗体）に対して共通のｄＩＰ／ｄＴを同定することにより最適化される。方法は、初期イオン強度を有するローディングバッファーを用いてポリペプチド及び一以上の変異体をイオン交換クロマトグラフィー材料に結合させ、ポリペプチド及び一以上の混入物が別個の独立した実体としてクロマトグラフィー材料から溶出するように溶出バッファーのイオン強度がイオン強度勾配によって変更される溶出バッファーを用いてイオン交換カラムからポリペプチド及び一以上の混入物を溶出させることを含む。次いで、クロマトグラフィーの溶出物は、親ポリペプチドに関して、及び変異体の有無に関して分析される。ポリペプチドの変異体は、ポリペプチドの酸性変異体及び親ポリペプチドの塩基性変異体を含んでもよい。酸性変異体、即ち親ポリペプチドのｐＩより小さいｐＩを有する変異体の例は、一若しくは複数のグルタミン及び／又はアスパラギン残基が脱アミド化されているポリペプチドを含むが、これらに限定されない。塩基性変異体、即ち親ポリペプチドのｐＩより大きいｐＩを有する変異体の例は、アスパラギン残基がスクシンイミド部分に修飾を受けている変異体を含むが、これらに限定されない。幾つかの実施態様において、ポリペプチドは、約６．０から約９，５の範囲のｐＩを有する。幾つかの実施態様において、ポリペプチドは、約６．０から約９，５の範囲のｐＩを有する抗体である。
【００９９】
Ｅ．組成物中のポリペプチドの純度を決定する
幾つかの態様において、本発明は、ポリペプチドを含む組成物中のポリペプチドの純度を決定する方法を提供する。幾つかの実施態様において、組成物中のポリペプチドの純度は、上記のように最適化されたイオン交換クロマトグラフィーの分離条件を用いて分析される。幾つかの実施態様において、組成物中のポリペプチドの純度は、バッファーが上記のように最適化されているイオン交換クロマトグラフィーを用いて分析される。幾つかの実施態様において、組成物中のポリペプチドの純度は、分離条件及びバッファーが上記のように最適化されるイオン交換クロマトグラフィーを用いて分析される。幾つかの実施態様において、イオン交換クロマトグラフィーの分離条件及び／又はバッファーは、複数のポリペプチドに対して、例えば、一以上の標的ポリペプチド（例えば、一以上の抗体）に対して共通のｄＩＰ／ｄＴを同定することにより最適化される。方法は、初期イオン強度を有するローディングバッファーを用いてポリペプチド及び一以上の混入物をイオン交換クロマトグラフィー材料に結合させ、ポリペプチド及び一以上の混入物が別個の独立した実体としてクロマトグラフィー材料から溶出するように溶出バッファーのイオン強度がイオン強度勾配によって変更される溶出バッファーを用いてイオン交換カラムからポリペプチド及び一以上の混入物を溶出させることを含む。ポリペプチドの純度は、クロマトグラフィー材料から溶出するポリペプチドの量の、クロマトグラフィー材料から溶出する混入物、例えば電荷変異体の総量に対する比率を決定することによって評価することができる。幾つかの実施態様において、ポリペプチドは、約６．０から約９，５の範囲のｐＩを有する。幾つかの実施態様において、ポリペプチドは、約６．０から約９，５の範囲のｐＩを有する抗体である。
【０１００】
Ｆ．組成物中のポリペプチドの安定性を決定する
幾つかの態様において、本発明は、ポリペプチドを含む組成物中のポリペプチドの安定性を決定するための方法を提供する。幾つかの実施態様において、組成物中のポリペプチドの安定性は、分離条件が上記のように最適化されるイオン交換クロマトグラフィーを用いて決定される。幾つかの実施態様において、組成物中のポリペプチドの安定性は、バッファーが上記のように最適化されているイオン交換クロマトグラフィーを用いて決定される。幾つかの実施態様において、組成物中のポリペプチドの安定性は、分離条件及びバッファーが上記のように最適化されるイオン交換クロマトグラフィーを用いて決定される。幾つかの実施態様において、イオン交換クロマトグラフィーの分離条件及び／又はバッファーは、複数のポリペプチドに対して、例えば、一以上の標的ポリペプチド（例えば、一以上の抗体）に対して共通のｄＩＰ／ｄＴを同定することにより最適化される。幾つかの実施態様において、ポリペプチドを含む組成物のサンプルは経時的に分析される。幾つかの実施態様において、組成物は、分析の前に様々な時点でインキュベートされる。幾つかの実施態様において、組成物は、分析前に約０℃、２０℃、３７℃又は４０℃の何れか一つよりも高温でインキュベートされる。幾つかの実施態様において、組成物は、分析前に１日間、２日間、３日間、５日間、１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、２か月間、３か月間、６か月間、１年間の一又は複数でインキュベートされる。次いで組成物は、初期イオン強度を有するローディングバッファーを用いてポリペプチド及び一以上の混入物をイオン交換クロマトグラフィー材料に結合させ、ポリペプチド及び一以上の混入物が別個の独立した実体としてクロマトグラフィー材料から溶出するように溶出バッファーのイオン強度がイオン強度勾配によって変更される溶出バッファーを用いてイオン交換カラムからポリペプチド及び一以上の混入物を溶出させることにより分析される。ポリペプチド対混入物の比率における変化は、組成物中のポリペプチドの安定性を示す。例えば、ポリペプチド対混入物の比率が経時的に変化しない場合、ポリペプチドは安定していると考えられてもよいのに対し、組成物中のポリペプチドの量における混入物減少を有する混入物の高速蓄積は、組成物中のポリペプチドはより不安定であることを示す。幾つかの実施態様において、組成物中のポリペプチドの安定性は、分離条件が上記のように最適化されるイオン交換クロマトグラフィーを用いて分析される。幾つかの実施態様において、組成物中のポリペプチドの安定性は、バッファーが上記のように最適化されているイオン交換クロマトグラフィーを用いて分析される。幾つかの実施態様において、組成物中のポリペプチドの安定性は、分離条件及びバッファーが上記のように最適化されるイオン交換クロマトグラフィーを用いて分析される。幾つかの実施態様において、イオン交換クロマトグラフィーの分離条件及び／又はバッファーは、複数のポリペプチドに対して、例えば、一以上の標的ポリペプチド（例えば、一以上の抗体）に対して共通のｄＩＰ／ｄＴを同定することにより最適化される。幾つかの実施態様において、ポリペプチドは、約６．０から約９，５の範囲のｐＩを有する。幾つかの実施態様において、ポリペプチドは、約６．０から約９，５の範囲のｐＩを有する抗体である。ポリペプチドの例としては、限定されないが、抗体及び抗体断片を含む。
【０１０１】
Ｇ．ポリペプチドの精製
幾つかの実施態様において、本発明は、ポリペプチド及び一以上の混入物を含有する組成物から抗体などのポリペプチドを精製する方法を提供する。方法は、クロマトグラフィーの分離条件を最適化することを含む。幾つかの実施態様において、ポリペプチドは、バッファーが上記のように最適化されたクロマトグラフィーを用いて精製される。幾つかの実施態様において、ポリペプチドは、分離条件及びバッファーが上記のように最適化されるクロマトグラフィーを用いて精製される。幾つかの実施態様において、クロマトグラフィーの分離条件及び／又はバッファーは、複数のポリペプチドに対して、例えば、一以上の標的ポリペプチド（例えば、一以上の抗体）に対して共通のｄＩＰ／ｄＴを同定することにより最適化される。幾つかの実施態様において、クロマトグラフィーは、イオン交換クロマトグラフィー；例えば陽オン交換クロマトグラフィー又は陰イオン交換クロマトグラフィーである。幾つかの実施態様において、クロマトグラフィーは混合モードクロマトグラフィーである。
【０１０２】
幾つかの実施態様において、クロマトグラフィ温度におけるポリペプチドの変曲点でのｐＨのローディングバッファーを用いて、イオン交換クロマトグラフィー材料又は混合モードクロマトグラフィー材料にポリペプチド及び混入物を結合させる。ローディングバッファーは初期イオン強度を有する。ポリペプチドは、次いで、ポリペプチド及び一以上の混入物が別個の独立した実体としてクロマトグラフィー材料から溶出するように、溶出バッファーのイオン強度がイオン強度勾配によって変更される溶出バッファーを使用してイオン交換クロマトグラフィー媒体又は混合モードクロマトグラフィー媒体から溶出される。画分がクロマトグラフィーの溶出段階の間に収集され、混入物が含まれないか又は最小であるポリペプチドを含む画分が、更なる処理のために、又は医薬製剤のためにプールされる。ポリペプチドの例としては、限定されないが、抗体及び抗体断片を含む。
【０１０３】
ＩＩＩ．ポリペプチド
ポリペプチドが、本明細書に記載されるように分離条件が最適化されたイオン交換クロマトグラフィーの方法の何れかで使用のために提供される。本発明の幾つかの実施態様において、ポリペプチドの組成物は、イオン交換クロマトグラフィーにより分析される。かかる方法は、組成物中のポリペプチドの電荷変異体を同定するのに有用である。幾つかの実施態様において、ポリペプチドは抗体又はその断片である。幾つかの実施態様において、ポリペプチドは、約６．０から約９，５の範囲のｐＩを有する。幾つかの実施態様において、ポリペプチドは、約６．０から約９，５の範囲のｐＩを有する抗体である。幾つかの実施態様において、ポリペプチドの電荷対ｐＨの曲線における変曲点（ＩＰ）が、本発明の方法により提供される。幾つかの実施態様において、温度の変化によるＩＰの変化（ｄＩＰ／ｄＴ）が本発明の方法により提供される。
【０１０４】
幾つかの実施態様において、ポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。幾つかの実施態様において、ポリペプチドは抗体である。幾つかの実施態様において、ポリペプチドはイムノアドヘシンである。
【０１０５】
幾つかの実施態様において、ポリペプチドは、約５０００ダルトン、１００００ダルトン、１５０００ダルトン、２５０００ダルトン、５００００ダルトン、７５０００ダルトン、１０００００ダルトン、１２５０００ダルトン、又は１５００００ダルトンの何れかより大きい分子量を有する。ポリペプチドは、約５００００ダルトンから２０００００ダルトン又は１０００００ダルトンから２０００００ダルトンの何れかの分子量を有してもよい。あるいは、本明細書における使用のためのポリペプチドは、約１２００００ダルトン又は約２５０００ダルトンの分子量を有してもよい。
【０１０６】
ｐＩは、等電点であり、特定の分子又は表面が正味電荷を持たないｐＨのことである。幾つかの実施態様において、本発明の方法は、組成物中のポリペプチド、例えば抗体のｐＩが約６．０から約９，５の範囲であるポリペプチドを含む複数の組成物に対して使用することができる。幾つかの実施態様において、ポリペプチドは約９，５より大きい；例えば約９，５から約１２のｐＩを有する。本明細書に記載される方法の何れかの幾つかの実施態様において、ポリペプチド、例えば抗体のｐＩは、約７未満；例えば約４から約７であり得る。
【０１０７】
本明細書に記載の方法の何れかの実施態様において、ポリペプチド及び一又は複数の混入物を含む組成物中の一又は複数の混入物は、ポリペプチド電荷変異体である。幾つかの実施態様において、ポリペプチド電荷変異体は、ポリペプチドの電荷が変更されるように、自然の状態から改変されているポリペプチドである。幾つかの実施態様において、電荷変異体は、親ポリペプチドよりも酸性である；即ち、親ペプチドよりも低いｐＩを有する。その他の実施態様において、電荷変異体は、親ポリペプチドよりも塩基性である；即ち、親ペプチドよりも高いｐＩを有する。幾つかの実施態様において、ポリペプチド電荷変異体は操作される。幾つかの実施態様において、ポリペプチド電荷変異体は、例えば、酸化、脱アミド化、リジン残基のＣ末端プロセシング、Ｎ末端ピログルタミン酸形成及び糖化等の天然のプロセスの結果であってもよい。幾つかの実施態様において、ポリペプチド電荷変異体は、タンパク質に結合するグリカンが、親糖タンパク質と比較して、例えば、シアル酸又はその誘導体の付加により、糖タンパク質の電荷が変更されるように改変されている、糖タンパク質である。幾つかの実施態様において、ポリペプチド電荷変異体は、抗体電荷変異体である。
【０１０８】
本明細書に記載の方法を使用して分析されることになるポリペプチドは、一般に、組換え技術を使用して産生される。組換えタンパク質を産生するための方法は、例えば、参照により本明細書に具体的に援用されている米国特許第５５３４６１５号及び第４８１６５６７号に記載されている。幾つかの実施態様において、目的のタンパク質は、ＣＨＯ細胞において産生される（例えば、国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと）。幾つかの実施態様において、目的のポリペプチドは大腸菌細胞中で産生される。発現及び分泌を最適化するための翻訳開始領域（ＴＩＲ）及びシグナル配列を記載している、例えば米国特許第５，６４８，２３７号；米国特許第５，７８９，１９９号及び米国特許第５，８４０，５２３号を参照のこと。また、大腸菌中における抗体断片の発現について記載している、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 245-254も参照されたい。組換え技術を使用した場合、ポリペプチドは細胞周辺腔内で細胞内に生成されるか又は培地中に直接分泌されうる。
【０１０９】
ポリペプチドは、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。ポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。ポリペプチドが細胞内に生成される場合、最初の工程として、宿主細胞か又は溶解断片の何れかである微粒子状破片は、例えば遠心分離又は限外濾過により除去されうる。Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞周辺腔に分泌されるポリペプチドを単離するための手順を記載する。簡潔には、細胞ペーストは、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ及びフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で、約３０分間にわたって融解される。細胞破片は遠心分離により除去することができる。ポリペプチドが培地中に分泌される場合、一般的に、そのような発現系からの上清はまず、市販のポリペプチド濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮される。ＰＭＳＦ等のプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するように前述の工程の何れかに含まれてよく、抗生物質は、偶発性混入物の成長を防止するために含まれてよい。
【０１１０】
幾つかの実施態様において、ポリペプチド及び一又は複数の混入物を含む組成物中のポリペプチドは、本発明の方法により、分析前に精製されているか又は部分的に精製されている。例えば、該方法のポリペプチドは、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーからの溶出物中にある。幾つかの実施態様において、ポリペプチドは、プロテインＡクロマトグラフィーからの溶出物である。
【０１１１】
本発明の方法により分析されてもよいポリペプチドの例は、限定するものではないが、免疫グロブリン、イムノアドヘシン、抗体、酵素、ホルモン、融合タンパク質、Ｆｃ含有タンパク質、免疫抱合体、サイトカイン及びインターロイキンを含む。（Ａ）抗体
【０１１２】
本明細書に記載の方法の何れかの幾つかの実施態様において、ポリペプチド及び本明細書に記載の方法によるポリペプチドを含む製剤を分析する方法の何れかにおける使用のためのポリペプチドは、抗体である。
【０１１３】
抗体の分子標的は、ＣＤタンパク質及びそのリガンド、例えば限定するものではないが以下を含む：（ｉ）ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、及びＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）；（ｉｉ）ＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバー、例えば、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体又はＨＥＲ４受容体；（ｉｉｉ）細胞接着分子、例えば、ＬＦＡ−１、Ｍａｃ１、ｐ１５０，９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ及びαｖ／β３インテグリン（そのアルファ又はベータサブユニットの何れかを含む）等（例：抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８又は抗ＣＤ１１ｂ抗体）；（ｉｖ）成長因子、例えばＶＥＧＦ；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ−４；タンパク質Ｃ、ＢＲ３、ｃ−ｍｅｔ、組織因子、β７等；並びに（ｖ）細胞表面及び膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、例えば米国特許第７５２１５４１号に記載されるもの。
【０１１４】
その他の例示的な抗体は、限定するものではないが、抗エストロゲン受容体抗体、抗プロゲステロン受容体抗体、抗ｐ５３抗体、抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗カテプシンＤ抗体、抗Ｂｃｌ−２抗体、抗Ｅ−カドヘリン抗体、抗ＣＡ１２５抗体、抗ＣＡ１５−３抗体、抗ＣＡ１９−９抗体、抗ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体、抗Ｐ−糖タンパク質抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗網膜芽細胞腫タンパク抗体、抗ｒａｓがんタンパク抗体、抗Ｌｅｗｉｓ Ｘ抗体、抗Ｋｉ−６７抗体、抗ＰＣＮＡ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ７抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ９／ｐ２４抗体、抗ＣＤ１０抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤ１３抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１５抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３５抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ４１抗体、抗ＬＣＡ／ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、抗ＣＤ３９抗体、抗ＣＤ１００抗体、抗ＣＤ９５／Ｆａｓ抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ１０６抗体、抗ユビキチン抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ｃ−ｍｙｃ抗体、抗サイトケラチン抗体、抗ビメンチン抗体、抗ＨＰＶタンパク抗体、抗カッパ軽鎖抗体、抗ラムダ軽鎖抗体、抗メラノソーム抗体、抗前立腺特異抗原抗体、抗Ｓ−１００抗体、抗タウ抗原抗体、抗フィブリン抗体、抗ケラチン抗体及び抗Ｔｎ−抗原抗体から選択されるものを含む。
【０１１５】
（ｉ）モノクローナル抗体
幾つかの実施態様において、抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られ、即ち、モノクローナル抗体の産生中に生じ得る変異体（通常少量で存在する変異体など）を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。したがって、修飾語「モノクローナル」は、個別抗体又はポリクローナル抗体の混合物ではないという抗体の性質を示す。
【０１１６】
例えば、モノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法により作製されてもよく、又は、組換えＤＮＡ法により作製されてもよい（米国特許第４８１６５６７号）。
【０１１７】
ハイブリドーマ法において、マウス又はハムスター等のその他適切な宿主動物は、免疫付与に使用されるポリペプチドと特異的に結合することになる抗体を産生するか又は産生する能力があるリンパ球を引き起こすように、本明細書に記載されるように免疫を与えられる。あるいは、リンパ球はインビトロで免疫を与えられてもよい。次いで、リンパ球は、ポリエチレングリコール等の好適な融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)）。
【０１１８】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう（ＨＡＴ培地）。
【０１１９】
幾つかの実施態様において、骨髄腫細胞は、効率的に融合するものであり、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベルの産生をサポートし、ＨＡＴ培地等の培地に対して感受性がある。幾つかの実施態様において、これらの中で、骨髄腫細胞株は、マウス骨髄種株、例えば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍から誘導されるもの及びＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞である。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまた記載されている（Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
【０１２０】
ハイブリドーマ細胞が成長する培養培地は、抗原に対するモノクローナル抗体の産生のためにアッセイされる。幾つかの実施態様において、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降により又はインビトロ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定される。
【０１２１】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Scatchard analysis of Munson et al., Anal. Biochem. 107:220 (1980)により決定され得る。
【０１２２】
ハイブリドーマ細胞が所望の特異性、親和性及び／又は活性の抗体を産生するとして同定された後、クローンは、限定希釈手順によりサブクローンされ、標準的な方法により培養されてもよい（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice pp. 59-103 (Academic Press, 1986)）。この目的のための好適な培養培地は、例えば、Ｄ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地である。また、このハイブリドーマ細胞は、動物の腹水症腫瘍として、インビボで増殖させることができる。
【０１２３】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、ポリペプチドＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィー等により、培養培地、腹水又は血清から適切に分離される。
【０１２４】
モノクローナル抗体をコードしたＤＮＡは、容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定される。幾つかの実施態様において、ハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡのソースとして機能する。ＤＮＡは、単離されると、発現ベクター中に配置され、次いで、これは、他の形では免疫グロブリンポリペプチドを産生しない宿主細胞中、例えば、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞中にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞中のモノクローナル抗体の合成を得てもよい。抗体をコードするＤＮＡの最近における組換え発現に関する総説は、Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262 (1993)及びPluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)を含む。
【０１２５】
更なる実施態様において、抗体又は抗体断片は、McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)に記載される技術を使用して生成される抗体ファージライブラリーから単離され得る。Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)及びMarks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリーを使用した、それぞれ、マウス及びヒト抗体の単離を記載する。後の出版物は、鎖シャッフリングによる高親和性（ｎＭレンジ）ヒト抗体の産生（Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)）、並びに、非常に大きなファージライブラリーを構成するための戦略としてのコンビナトリアル感染及びインビボ組換え（Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)）を記載する。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体を単離するための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の実行可能な代替手段である。
【０１２６】
ＤＮＡは、例えば相同マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより（米国特許第４８１６５６７号；Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)）、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部若しくは一部を共有結合することにより改変され得る。
【０１２７】
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに置換され、あるいは抗体の一の抗原結合部位の可変ドメインに置換されて、抗原に対して特異性を有する一の抗原結合部位と異なる抗原に対して特異性を有する別の抗原部位とを含むキメラ二価抗体が創出される。
【０１２８】
本明細書に記載の任意の方法の幾つかの実施態様において、抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭである。幾つかの実施態様において、抗体はＩｇＧモノクローナル抗体である。
【０１２９】
（ｉｉ）ヒト化抗体
幾つかの実施態様において、抗体はヒト化抗体である。非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野で記載されている。幾つかの実施態様において、ヒト化抗体は、非ヒトであるソースから導入された一又は複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と呼ばれ、典型的には「インポート」可変ドメインから取得される。ヒト化は、基本的には、Winter and co-workers (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)）の方法に従って、超可変領域の配列をヒト抗体の対応する配列と置換することにより、実施され得る。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ないドメインが、非ヒト種由来の対応する配列により置換されている、キメラ抗体（米国特許第４８１６５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかの超可変領域残基及び可能であればいくつかのＦＲ残基が齧歯動物抗体における相似部位由来の残基により置換されているヒト抗体である。
【０１３０】
ヒト化抗体を作製する際に使用することになるヒト可変ドメイン（軽鎖と重鎖の両方）の選定は、抗原性を低下させることが非常に重要である。いわゆる「最も適した」方法によれば、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメインの配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次いで、その齧歯動物の配列と最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク領域（ＦＲ）として採択する（Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 (1987)）。別の方法は、軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループである、全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体について使用してもよい（Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)）。
【０１３１】
抗体が、抗原に対する高親和性及び他の望ましい生物学的特性を保持した状態でヒト化されることは、更に重要である。この目標を達成するために、本方法の幾つかの実施態様において、ヒト化抗体は、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用した、親配列及び多様な概念的ヒト化産物の分析のプロセスにより調製される。三次元の免疫グロブリンモデルは、一般に入手可能であり、当業者にはなじみがある。選択された候補免疫グロブリン配列の推定される三次元立体配座構造を図示及び表示するコンピュータープログラムは、入手可能である。これらの表示を精査することにより、候補免疫グロブリン配列が機能する際に残基が果たすと考えられる役割の分析、即ち、候補免疫グロブリンがその抗原と結合する能力に影響する残基の分析が可能になる。この方式では、ＦＲ残基は、レシピエント配列及びインポート配列から選択され、組み合わされることで、所望の抗体特徴（例えば、標的抗原（複数可）に対する親和性の向上）が達成されるようにすることができる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合への影響を及ぼすことに直接かつ最も実質的に関わっている。
【０１３２】
（ｉｉｉ）ヒト抗体
幾つかの実施態様において、抗体はヒト抗体である。ヒト化の代替策として、ヒト抗体が生成され得る。例えば、免疫化の際に、内因性の免疫グロブリンが産生されなくてもヒト抗体の完全なレパートリーを産生する能力があるトランスジェニック動物（例えばマウス）を作製することが、現在可能である。例えば、キメラマウス及び生殖細胞系突然変異マウスにおいて、抗体の重鎖接合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性が欠失していると、内因性抗体産生は完全に阻害されることが記載されている。そのような生殖細胞系突然変異マウスにおいてヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイを移入することにより、抗原による攻撃を行った際にヒト抗体が産生されるであろう。例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993)；並びに米国特許第５５９１６６９号；第５５８９３６９号；及び第５５４５８０７号を参照のこと。
【０１３３】
あるいは、ファージディスプレイ技術（McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)）が使用され、免疫化されていないドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメインの遺伝子レパートリーからインビトロでヒト抗体及び抗体断片が産生され得る。この技術によれば、抗体のＶドメインの遺伝子は、インフレームでクローニングされて、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄの主要又は微働何れかのコートポリペプチド遺伝子となり、ファージ粒子の表面上で機能的抗体断片としてディスプレイされる。繊維状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡのコピーを含んでいるため、抗体の機能特性に基づいて選択すれば、それらの特性を呈する抗体をコードする遺伝子を選択したことにもなる。したがって、ファージは、Ｂ細胞の特性の一部を模倣する。ファージディスプレイは、さまざまなフォーマットで実施され得、それらの総説については、例えば、Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)を参照のこと。複数のソースのＶ遺伝子セグメントが、ファージディスプレイに使用され得る。Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)は、免疫化されたマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小規模なランダムコンビナトリアルライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多種多様なアレイを単離した。免疫化されていないヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーが構築され、抗原の多種多様なアレイに対する抗体（自己抗原を含む）は、Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)、又はGriffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)により記載された技術に基本的に従って、単離され得る。米国特許第５５６５３３２号及び第５５７３９０５号も参照のこと。
【０１３４】
ヒト抗体は、また、インビトロ活性化されたＢ細胞により生成されてもよい（米国特許第５５６７６１０号及び第５２２９２７５号を参照のこと）。
【０１３５】
（ｉｖ）抗体断片
幾つかの実施態様において、抗体は抗体断片である。様々な技術が抗体断片の産生のために開発されてきた。従来、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク分解性消化を介して誘導された（例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan et al., Science 229:81 (1985)を参照のこと）。しかしながら、これらの断片は、今では組換え宿主細胞により直接産生され得る。例えば、抗体断片は、前述の抗体ファージライブラリーから単離され得る。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、大腸菌から直接回収され、化学的に結合してＦ（ａｂ’）２断片を形成し得る（Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992))。Ｆ（ａｂ’）２断片は、別の方法によって、組換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。抗体断片の産生のためのその他の技術は、当業者にとって明らかであろう。その他の実施態様において、抗体の選定は、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。抗体断片はまた、例えば、米国特許第５６４１８７０号に記載されるように「直線抗体」であってもよい。そのような直線抗体断片は、単一特異的であってよく、又は二重特異的であってもよい。
【０１３６】
幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体の断片が提供される。幾つかの実施態様において、抗体断片は抗原結合断片である。幾つかの実施態様において、抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ及びダイアボディからなる群より選択される。
【０１３７】
（ｖ）二重特異的抗体
幾つかの実施態様において、抗体は二重特異的抗体である。二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、二つの異なるエピトープに結合してもよい。あるいは、二重特異性抗体の結合アームは、白血球上のトリガー分子、例えばＴ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２若しくはＣＤ３）、又は、ＩｇＧのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）、例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）と結合するアームと組み合わせて、細胞防御機構を細胞に集中させるようにしてもよい。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片（例えばＦ（ａｂ’）２二重特性抗体）として調製され得る。
【０１３８】
二重特異性抗体を作製するための方法は、当該技術分野において公知である。完全長の二重特異性抗体の従来の産生は、二つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づいており、この場合の二本の鎖は、異なる特異性を有する（Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)）。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖はランダムに取り合わされるため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生し、１個のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、通常はアフィニティークロマトグラフィー工程により行われるが、相当に面倒であり、産物の収率は低い。類似の手順は、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【０１３９】
異なるアプローチによれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原合体部位）は、免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合される。幾つかの実施態様において、融合は、ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖の定常ドメインとの間で行われる。幾つかの実施態様において、軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）が、融合体のうち少なくとも一に存在する。免疫グロブリン重鎖融合体と、所望により免疫グロブリン軽鎖とをコードしているＤＮＡを別々の発現ベクター中に挿入し、好適な宿主生物の中に共にトランスフェクトする。これは、不均等な比率の三本のポリペプチド鎖が構造中で使用された場合に最適な収率が得られる実施態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合を調節する際に大きな柔軟性を提供する。ただし、少なくとも二本のポリペプチド鎖が等しい比率で発現することで収率が高くなるとき、又はその比率が特に重要性をもたないときは、一つの発現ベクター中の二本又は全三本のポリペプチド鎖のコード配列を挿入することが可能である。
【０１４０】
このアプローチの幾つかの実施態様において、二重特異性抗体は、第１の結合特異性を一方のアームに、複合免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）を他方のアームに有する、複合免疫グロブリン重鎖から構成される。この非対称構造は、望ましくない免疫グロブリン鎖の組合せからの所望の二重特異性化合物の分離を容易にすることが見出されたが、これは、二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することが容易な分離方式を提供するからである。このアプローチは、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体の生成の更なる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)を参照のこと。
【０１４１】
米国特許第５７３１１６８号に記載されている別のアプローチによれば、抗体分子対の間の接点は工学操作され、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の比率（％）が最大化され得る。幾つかの実施態様において、接点は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子の接点由来の一又は複数の小さいアミノ酸側鎖は、より大きい側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で置き換えられる。大きい側鎖（複数可）と同一又は類似のサイズの代償的な「空洞」は、大きいアミノ酸側鎖をより小さい側鎖（例えばアラニン又はトレオニン）で置き換えることにより、第２の抗体分子の接点上に創出される。これは、ヘテロ二量体の収率をホモ二量体等の他の望ましくない最終産物より高くするメカニズムを提供する。
【０１４２】
二重特異性抗体は、架橋抗体又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体のうち一方はアビジンと、他方はビオチンと、カップリングされ得る。そのような抗体は、例えば、望ましくない細胞に対して免疫系細胞を標的化すること（米国特許第４６７６９８０号）、及びＨＩＶ感染症の治療に用いること（国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／２００３７３号及び欧州特許第０３０８９号）が提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋方法を使用して作製され得る。好適な架橋剤は当該技術分野において公知であり、米国特許第４６７６９８０号において、いくつかの架橋手法と共に開示されている。
【０１４３】
抗体断片から二重特異性抗体を生成させるための技術も、文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学的連結を使用して調製され得る。Brennan et al., Science 229: 81 (1985)は、インタクト抗体をタンパク質分解的に開裂してＦ（ａｂ’）２断片を生成させる手順が記載されている。これらの断片は、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元され、隣接するジチオールを安定化させ、分子間のジスルフィド形成を防止する。次いで、生成されたＦａｂ’断片をチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に変換させる。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体のうち一方を、メルカプトエチルアミンを用いた還元によりＦａｂ’−チオールに再変換させ、等モル量の他方のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合させて二重特異性抗体を形成させる。産生された二重特異性抗体は、酵素の選択的な固定化のための作用剤として使用され得る。
【０１４４】
組換え細胞培養物から直接、二重特異性抗体断片を作製し単離するための様々な技術も記載されている。例えば、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体が産生されている（Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合により、二つの異なる抗体のＦａｂ’部分と連結された。抗体ホモ二量体は、ヒンジ領域で還元されて単量体を形成し、次いで、再酸化されて抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法は、抗体ホモ二量体の産生にも利用することができる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)により記載された「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替的メカニズムを提供した。この断片は、きわめて短いために同一鎖上の二つのドメイン間の対形成を可能にするリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と繋がっている重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは、もう一つの断片の相補的なＶＬ及びＶＨドメインとの対形成を強いられ、それにより、二つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用により二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略も報告されている。Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)を参照のこと。
【０１４５】
３価以上の抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体が調製され得る（Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991)）。
【０１４６】
（ｖ）多価抗体
幾つかの実施態様において、抗体は多価抗体である。多価抗体は、抗体が結合する対象である抗原を発現する細胞により、二価抗体より速く内部移行（及び／又は異化）してもよい。本明細書において提供される抗体は、三つ以上の抗原結合部位を有する多価抗体（ＩｇＭクラスの抗体以外である）であってもよく（例えば四価抗体）、そのような抗体は、抗体のポリペプチド鎖をコードしている核酸の組換え発現により、容易に産生され得る。多価抗体は、二量体化ドメイン及び三つ以上の抗原結合部位を含み得る。好ましい二量体化ドメインは、Ｆｃ領域又はヒンジ領域を含む（又は、それらからなる）。この場合、抗体は、一つのＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に三つ以上の抗原結合部位を含むであろう。本明細書における好ましい多価抗体は、三つから約八つ、ただし好ましくは四つの抗原結合部位を含む（又は、それらからなる）。多価抗体は、少なくとも一本のポリペプチド鎖（好ましくは二本のポリペプチド鎖）を含み、そのポリペプチド鎖（複数可）は、二つ以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖（複数可）は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃ（ここで、ＶＤ１は、第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の可変ドメインであり、Ｆｃは、Ｆｃ領域の一方のポリペプチド鎖であり、Ｘ１及びＸ２は、アミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは、０又は１である）を含んでもよい。例えば、ポリペプチド鎖（複数可）は、ＶＨ−ＣＨ１−柔軟なリンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖、又はＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を含んでもよい。本明細書における多価抗体は、好ましくは、少なくとも二つ（好ましくは四つ）の軽鎖可変ドメインポリペプチドを更に含む。本明細書における多価抗体は、例えば、約二つから約八つの軽鎖可変ドメインポリペプチドを含んでもよい。ここで企図される軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、場合により、ＣＬドメインを更に含む。
【０１４７】
幾つかの実施態様において、抗体は多重特異性抗体である。特異性抗体の例としては、限定されるものではないが、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含みＶＨＶＬ単位がポリエピトープ特異性を有する抗体、２つ以上のＶＬ及びＶＨドメインを有し、各ＶＨＶＬ単位が異なるエピトープと結合する抗体、２つ以上の単一可変ドメインを有し、各単一可変ドメインが異なるエピトープと結合する抗体、完全長抗体、抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性を有するダイアボディ、トリアボディ、三重機能性抗体、共有結合的又は非共有結合的に連結している抗体断片が挙げられる。幾つかの実施態様において、当該抗体は、ポリエピトープ特異性、例えば、同じ又は異なる標的（複数可）に対して二つ以上の異なるエピトープと特異的に結合する能力を有する。幾つかの実施態様において、抗体は、単一特異性の抗体、例えば、一つのエピトープのみと結合する抗体である。一実施態様によれば、多特異性抗体は、親和性が５μＭから０．００１ｐＭ、３μＭから０．００１ｐＭ、１μＭから０．００１ｐＭ、０．５μＭから０．００１ｐＭ、又は０．１μＭから０．００１ｐＭである各エピトープと結合するＩｇＧ抗体である。
【０１４８】
（ｖｉ）その他の抗体改変体
本明細書において提供される抗体を改変することは、エフェクター機能、例えば、抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を強化するためのエフェクター機能に関して、望ましい場合がある。これは、抗体のＦｃ領域において一又は複数のアミノ酸置換基を導入することにより達成してもよい。代替的又は追加的に、システイン残基（複数可）をＦｃ領域に導入して、それにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成が可能になるようにしてもよい。このようにして生成されたホモ二量体型抗体は、内部移行の可能性が向上してもよく、及び／又は、補体媒介性細胞殺傷及び抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）が増加していてもよい。Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)及びShopes, B. J., Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照のこと。抗腫瘍活性が強化されているホモ二量体型抗体は、Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載されているように、ヘテロ二官能性の架橋剤を使用して調製されてもよい。あるいは、二つのＦｃ領域を有しており、それにより補体媒介性溶解及びＡＤＣＣの能力が強化されていてもよい抗体は工学操作され得る。Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照のこと。
【０１４９】
抗体の血清中半減期を長期化するために、アミノ酸の変性は、米国特許公開第２００６／００６７９３０号に記載されているように抗体中で行うことができ、同文献は、出典明示によりその全体が本明細書に援用される。
【０１５０】
（Ｂ）ポリペプチドの変異体及び改変体
本明細書に記載されているポリペプチド（抗体を含む）のアミノ酸配列改変体（複数可）は、本明細書に記載されているポリペプチド（例えば、抗体）を精製する方法において使用してもよい。
【０１５１】
（ｉ）変異体ポリペプチド
「ポリペプチド変異体」は、本明細書において定義するポリペプチド、好ましくは活性のあるポリペプチドであり、完全長天然配列のポリペプチド、シグナルペプチドが欠如しているポリペプチド配列、ポリペプチドの細胞外ドメイン（シグナルペプチドの有無を問わない）と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するものを意味する。そのようなポリペプチド変異体は、例えば、完全長天然アミノ酸配列のＮ又はＣ末端で一又は複数のアミノ酸残基が付加され又は欠失しているポリペプチドを含む。通常、ＴＡＴポリペプチド変異体は、完全長天然配列ポリペプチドの配列、シグナルペプチドが欠如しているポリペプチド配列、ポリペプチドの細胞外ドメイン（シグナルペプチドの有無を問わない）と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の何れかのアミノ酸配列同一性を有するであろう。場合により、変異体ポリペプチドは、天然ポリペプチド配列と比較して一以下の保存的なアミノ酸置換、あるいは、天然ポリペプチド配列と比較して、約２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の何れか以下の保存的なアミノ酸置換を有するであろう。
【０１５２】
変異体ポリペプチドは、Ｎ末端又はＣ末端で切断されていてもよく、又は、例えば、完全長天然ポリペプチドと比較して内部残基が欠如していてもよい。特定の変異体ポリペプチドは、所望の生物活性に必須ではないアミノ酸残基が欠如していてもよい。切断、欠失、及び挿入がみられるこれらの変異体ポリペプチドは、いくつかの従来の技術のうちのあらゆるものにより調製してもよい。所望の変異体ポリペプチドは、化学合成されてもよい。別の好適な技術は、所望の変異体ポリペプチドをコードしている核酸断片を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により単離及び増幅することを含んでいる。核酸断片の所望の末端を規定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲにおいて５’及び３’プライマーの位置で用いられる。好ましくは、変異体ポリペプチドは、本明細書において開示する天然ポリペプチドと、少なくとも一の生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
【０１５３】
アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体又は細胞傷害性ポリペプチドと融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合、又は抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
【０１５４】
例えば、ポリペプチドの結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。ポリペプチドのアミノ配列変異体は、適切なヌクレオチド変化を抗体核酸に導入することにより、又はペプチド合成により調整される。このような改変は、例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終構築物に到達させるために作製され得る。アミノ酸の変更により、グリコシル化部位の数又は位置が変更されるなど、ポリペプチド（例えば抗体）の翻訳後プロセスが変化することもある。
【０１５５】
所望の活性に悪影響を及ぼすことなくどのアミノ酸残基を挿入、置換、又は欠失させ得るかを決定する際の指標は、ポリペプチドの配列を相同の既知のポリペプチド分子の配列と比較して、相同性の高い領域においてなされるアミノ酸配列変更の数を最小限にすることにより見出してもよい。
【０１５６】
突然変異誘発にとって好ましい場所である、ポリペプチド（例えば抗体）の一定の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)により記載されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。ここでは、標的残基の残基又は基が同定され（例：荷電残基、例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕ）、中性の又は負に帯電したアミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）により置き換えられ、抗原とのアミノ酸の相互作用に影響を及ぼさせる。次いで、置換に対する機能的感受性を示している当該アミノ酸の場所を、更なる又は他の変異体を置換部位に、又は置換部位の代わりに導入することにより精密化される。したがって、アミノ酸配列バリエーションを導入するための部位は予め決めておくが、突然変異の性質自体は、予め決まっている必要はない。例えば、所与の部位での突然変異の成果を分析するために、ａｌａスキャニング又はランダム突然変異誘発が標的コドン又は領域で行われ、発現された抗体変異体が所望の活性についてスクリーニングされる。
【０１５７】
別のタイプの変異体は、アミノ酸置換変異体である。この変異体では、抗体分子中の少なくとも一のアミノ酸残基が、異なる残基により置き換えられている。置換による突然変異誘発のための最も関心の高い部位としては、超可変領域が挙げられるが、ＦＲの変性も企図される。保存的置換は、表１の「好ましい置換基」の見出しの下に示されている。そのような置換により生物活性が変わる場合は、より実質的な変更（表１で「例示的な置換基」と名付けられている変更、又はアミノ酸クラスに関連して更に後述するような変更）を導入してから産物をスクリーニングしてもよい。
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【０１５８】
ポリペプチドの生物学的特性の実質的な改変は、（ａ）置換エリアにおけるポリペプチド骨格の構造（例えば、シート若しくは螺旋の立体配座として）の維持、（ｂ）標的部位での分子の電荷若しくは疎水性の維持、又は（ｃ）側鎖の嵩高さの維持に及ぶ効果が有意に異なる置換基を選択することにより達成される。アミノ酸は、側鎖の特性の類似性によってグルーピングしてもよい（A. L. Lehninger, Biochemistry second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)中）：
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）非電荷極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）
【０１５９】
あるいは、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて、以下の群に分けてもよい：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
【０１６０】
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを他のクラスと交換することを必要とするであろう。
【０１６１】
また、抗体の正確な立体配座の維持に関わっていない一切のシステイン残基は、一般にはセリンで置き換えられ、分子の酸化的安定性を改善し異常な架橋を防止してもよい。逆に、システイン結合（複数可）がポリペプチドに付加され、その安定性を改善してもよい（特に、抗体が、Ｆｖ断片等の抗体断片である場合）。
【０１６２】
特に好ましいタイプの置換型変異体には、親抗体（例えばヒト化抗体）の一又は複数の超可変領域残基の置換えが関わっている。一般に、その結果得られる、更なる開発のために選択される変異体（複数可）は、その変異体が生成された元である親抗体と比較して生物学的特性が改善されることになる。そのような置換型変異体を生成するための簡便な方式は、ファージディスプレイを使用した親和性成熟を含んでいる。簡潔に言えば、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）を突然変異させて、各部位で、可能なアミノ置換を全て生成させる。このようにして生成された抗体変異体は、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合物として、繊維状ファージ粒子から一価の様式でディスプレイされる。次いで、ファージディスプレイされた変異体は、本明細書において開示するように、その生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。改変について候補となる超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャニング突然変異誘発が実施され、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基が同定され得る。代替的又は追加的に、抗原抗体複合体の結晶構造が分析され、抗体と標的との間の接点が同定されることが有益である場合がある。そのような接触残基及び隣接残基は、本明細書において詳述した技術による置換のための候補である。そのような変異体が生成されると、本明細書に記載されているように、変異体のパネルはスクリーニングにかけられ、一又は複数の関連するアッセイにおいて優れた特性を示した抗体が、さらなる開発のために選択されてもよい。
【０１６３】
ポリペプチドの別のタイプのアミノ酸変異体は、抗体の元のグリコシル化パターンを変性させる。ポリペプチドは、非アミノ酸部分を含んでもよい。例えば、ポリペプチドは、グリコシル化されてもよい。そのようなグリコシル化は、宿主細胞又は宿主生物におけるポリペプチドの発現の間に自然に起きてもよく、又は、ヒトの介入により生じる計画的な改変であってもよい。変性とは、ポリペプチドにおいて見出される一又は複数の炭水化物部分を欠失させること、及び／又は、そのポリペプチドに存在しない一又は複数のグリコシル化部位を加えることを意味する。
【０１６４】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ−連結型又はＯ−連結型の何れかである。Ｎ−連結型は、炭水化物部分がアスパラギン残基の側鎖に付着していることを指す。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、炭水化物部分をアスパラギン側鎖に酵素的に付着させるための認識配列である。したがって、これらのトリペプチド配列の何れかがポリペプチド中に存在していると、潜在的なグリコシル化部位が創出される。Ｏ−連結型グリコシル化は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースのうち一つを、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はトレオニンに付着させることを指すが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンも使用されてもよい。
【０１６５】
ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を改変させて前述のトリペプチド配列のうち一又は複数を含むようにすることにより、簡便に達成される（Ｎ−連結型グリコシル化部位の場合）。この改変は、一又は複数のセリン又はトレオニン残基を元の抗体の配列に付加する、又は該残基により置換することによってもなされ得る（Ｏ−連結型グリコシル化部位の場合）。
【０１６６】
ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的若しくは酵素的に、又は、グリコシル化のための標的として役立つアミノ酸残基をコードするコドンの突然変異置換により、達成され得る。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的開裂は、様々なエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼの使用により達成され得る。
【０１６７】
他の改変は、グルタミニル残基及びアスパラギニル残基の、それぞれ対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基への脱アミド化、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化、Ｎ末端アミンのアセチル化、並びに、任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０１６８】
（ｉｉ）キメラポリペプチド
本明細書に記載されているポリペプチドは、別の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列と融合されるポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方式で改変されてもよい。幾つかの実施態様において、キメラ分子は、ポリペプチドと、抗タグ抗体が選択的に結合することができるエピトープをもたらすタグポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般に、ポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に配置される。そのようなエピトープタグが付加された形態のポリペプチドの存在は、タグポリペプチドに対する抗体を使用して検出され得る。また、エピトープタグがもたらされることで、抗タグ抗体、又は、エピトープタグと結合する別のタイプの親和性マトリックスを使用したアフィニティー精製により、ポリペプチドを容易に精製することができるようになる。
【０１６９】
代替的な一実施態様において、キメラ分子は、ポリペプチドと免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合を含んでもよい。二価の形態のキメラ分子は、「イムノアドヘシン」と称される。
【０１７０】
本明細書において使用される場合、用語「イムノアドヘシン」は、異種ポリペプチドの結合特異性を免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能と組み合わせた抗体様の分子を指している。構造的に、イムノアドヘシンは、抗原認識以外の所望の結合特異性を有するアミノ酸配列と、抗体の結合部位との融合（すなわち、「異種の」である）、及び免疫グロブリン定常ドメイン配列を含む。イムノアドヘシン分子のアドヘシン部は、典型的には、少なくとも受容体又はリガンドの結合部位を含む近接するアミノ酸配列である。イムノアドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３若しくはＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭから得てもよい。
【０１７１】
Ｉｇ融合は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも一の可変領域の代わりに、可溶性の（膜貫通ドメインが欠失又は不活性化されている）形態のポリペプチドを置換することを含む。特に好ましい一実施態様において、免疫グロブリン融合体は、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域、又は、ＩｇＧ１分子の、ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を含む。
【０１７２】
（ｉｉｉ）ポリペプチドコンジュゲート
ポリペプチド製剤において使用するためのポリペプチドは、細胞傷害剤、例えば化学療法剤、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、若しくは動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位元素（即ち、ラジオコンジュゲート）とコンジュゲートしてもよい。
【０１７３】
そのようなコンジュゲートの生成に有用な化学療法剤が使用され得る。加えて、酵素的に活性な毒素及び使用され得るその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォーディタンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラカ・アメリカーナタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチアインヒビター、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリスインヒビター、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンを含む。様々な放射性核種は、ラジオコンジュゲートされたポリペプチドの産生のために入手可能である。その例は、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅを含む。ポリペプチドと細胞障害剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ）、活性エステル類（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン−２，６−ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製され得る。例えば、リシンイムノトキシンは、Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987)に記載されるように調製され得る。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドのポリペプチドへの抱合のためのキレート剤の例である。
【０１７４】
ポリペプチドと一又は複数の小分子毒素（例えば、カリケアマイシン、マイタンシノイド、トリコテセン、及びＣＣ１０６５、並びに、毒素活性を有する、これらの毒素の誘導体）とのコンジュゲートもまた、本明細書において企図される。
【０１７５】
マイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することにより作用する有糸分裂阻害剤である。マイタンシンは、東アフリカの低木マイテヌス・セルラタから最初に単離された。続いて、ある微生物も、マイタンシノイド、例えばマイタンシノール及びＣ−３マイタンシノールエステル等のマイタンシノイドを産生することが発見された。合成のマイタンシノール並びにその誘導体及び類似体も企図される。ポリペプチド−マイタンシノイドコンジュゲートを作製するための、当該技術分野において公知の多くの連結基（例えば、米国特許第５２０８０２０号において開示されているものを含む）がある。そのような連結基は、上で同定した特許において開示されている、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸解離性基、光解離性基、ペプチダーゼ解離性基、又はエステラーゼ解離性基を含み、ジスルフィド基及びチオエーテル基が好ましい。
【０１７６】
リンカーは、連結のタイプに応じて、多様な位置でマイタンシノイド分子と付着させてもよい。例えば、エステル連結は、従来のカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることにより形成されてもよい。この反応は、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ−１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ−２０位で起きることがある。好ましい一実施態様において、連結は、マイタンシノール又はマイタンシノール類似体のＣ−３位で形成される。
【０１７７】
別の目的コンジュゲートは、一又は複数のカリケアマイシン分子とコンジュゲートされたポリペプチドを含む。カリケアマイシンファミリーの抗生物質は、ピコモル濃度未満で二本鎖ＤＮＡ切断を生じさせる能力がある。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、例えば、米国特許第５７１２３７４号を参照のこと。使用してもよいカリケアマイシンの構造類似体は、限定されるものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθ１Ｉを含む。抗体をコンジュゲートすることができる別の抗腫瘍薬は、抗葉酸薬であるＱＦＡである。カリケアマイシンとＱＦＡはどちらも、細胞内作用部位を有しており、原形質膜を容易に越えない。したがって、細胞がポリペプチド（例えば、抗体）媒介性の内部移行を通じてこれらの薬剤を取り込むと、その細胞傷害効果は大きく強化される。
【０１７８】
本明細書に記載されているポリペプチドとコンジュゲートすることができる他の抗腫瘍剤は、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５−フルオロウラシル、総称的にＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤ファミリー、並びにエスペラマイシンを含む。
【０１７９】
幾つかの実施態様において、ポリペプチドは、ポリペプチドと、核酸分解活性を有する化合物（例：リボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅ）との間のコンジュゲートであってもよい。
【０１８０】
また別の実施態様において、ポリペプチド（例えば、抗体）は、腫瘍の事前標的化において利用するための「受容体」（例えばストレプトアビジン）とコンジュゲートしてもよく、この場合、ポリペプチド受容体コンジュゲートが患者に投与され、続いて、洗浄剤を使用して、結合されていないコンジュゲートの循環からの除去、次いで、細胞傷害剤（例えば、放射性ヌクレオチド）とコンジュゲートされている「リガンド」（例えば、アビジン）の投与が行われる
【０１８１】
幾つかの実施態様において、ポリペプチドは、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤）を活性のある抗癌薬に変換させるプロドラッグ活性化酵素とコンジュゲートされてもよい。免疫コンジュゲートの酵素成分は、プロドラッグに対して、それをより活性のある細胞傷害性の形態に変換させるような方式で作用する能力がある任意の酵素を含む。
【０１８２】
有用である酵素としては、限定されるものではないが、以下を含む：リン酸塩含有プロドラッグを遊離薬剤に変換させるのに有用なアルカリホスファターゼ；スルフェート含有プロドラッグを遊離薬剤に変換させるのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性の５−フルオロシトシンを抗癌薬の５−フルオロウラシルに変換させるのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬剤に変換させるのに有用なプロテアーゼ、例えば、セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ、及びカテプシン（例えばカテプシンＢ及びＬ）；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換させるのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化されたプロドラッグを遊離薬剤に変換させるのに有用な炭水化物開裂酵素、例えばβ−ガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼ；β−ラクタムで誘導体化されている薬剤を遊離薬剤に変換させるのに有用なβ−ラクタマーゼ；並びに、アミン窒素の位置にてそれぞれフェノキシアセチル基又はフェニルアセチル基で誘導体化されている薬剤を遊離薬剤に変換させるのに有用なペニシリンアミダーゼ、例えばペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼ。あるいは、酵素活性を有する抗体は、当該技術分野においては「アブザイム」としても公知であるが、これを使用してプロドラッグを遊離活性薬物に変換させることができる。
【０１８３】
（ｉｖ）その他
ポリペプチドの、別のタイプの共有結合性改変は、ポリペプチドを、様々な非タンパク質ポリマーの一つ、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又は、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーと連結させることを含む。ポリペプチドは、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合法によって、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタシレート）マイクロカプセル）、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロ・エマルジョンなどの調製されたマイクロカプセルに封入されてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Gennaro, A.R., Ed., (1990)に開示される。
【０１８４】
ＩＶ．製剤及び方法において使用するためのポリペプチドの入手
本明細書に記載されている精製方法において使用されるポリペプチドは、組換え法を含め、当該技術分野において公知の方法を使用して入手し得る。次の項では、これらの方法に関する手引きを提供する。
【０１８５】
（Ａ）ポリヌクレオチド
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、本明細書においては互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、その例としてはＤＮＡ及びＲＮＡが挙げられる。
【０１８６】
ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、任意の供給源から入手されてもよく、そのような供給源としては、限定されるものではないが、ポリペプチドｍＲＮＡが備わっており検出可能なレベルでそれを発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーを含む。したがって、ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、ヒト組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に入手され得る。ポリペプチドをコードしている遺伝子はまた、ゲノムライブラリーから、又は、公知の合成手順（例えば、自動化された核酸合成）により、入手されてもよい。
【０１８７】
例えば、ポリヌクレオチドは、免疫グロブリン分子鎖全体、例えば軽鎖又は重鎖をコードしていてもよい。完全な重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）だけでなく重鎖定常領域（ＣＨ）を含み、ＣＨは、典型的には、三つの定常ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３；並びに「ヒンジ」領域を含むであろう。状況状況によっては、定常領域が存在することが望ましい。
【０１８８】
ポリヌクレオチドによりコードされ得る他のポリペプチドは、抗原結合抗体断片、例えば単一ドメイン抗体（「ｄＡｂ」）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、並びに「ミニボディ」が挙げられる。ミニボディは、そこからＣＨ１及びＣＫ又はＣＬドメインが切り取られる、（典型的には）二価の抗体断片である。ミニボディは従来の抗体より小さいため、臨床的／診断的用途において、より良好な組織浸透を達成するはずであるが、二価であることから、ｄＡｂ等の一価抗体断片より高い結合親和性を保持するはずである。したがって、文脈でそうでないことが指示されない限り、用語「抗体」は、本明細書において使用される場合、全抗体分子だけでなく、上述のタイプの抗原結合抗体断片を包含する。好ましくは、コードされているポリペプチド中に存在する各フレームワーク領域は、対応するヒトアクセプターフレームワークに関連する少なくとも一のアミノ酸置換を含むであろう。したがって、例えば、フレームワーク領域は、アクセプターフレームワーク領域に関して合計で３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５のアミノ酸置換基を含んでもよい。
【０１８９】
ＶＩ．例示的な実施態様
【０１９０】
１  複数の組成物を分析するために最適なイオン交換クロマトグラフィーの分離条件を同定するための方法であって、ここで各組成物は一以上の混入物を有するポリペプチドを含み、該方法は、ａ）組成物の二以上のポリペプチドのアミノ酸組成に基づいて、選択された温度での正味電荷対ｐＨの曲線をプロットすること、ｂ）工程ａ）のプロットの二次導関数を決定することにより中性ｐＨで又はその近傍での正味電荷対ｐＨの曲線の変曲点を決定することを含み；ここで最適なイオン交換クロマトグラフィーの分離条件が、一以上の組成物のポリペプチドについてほぼ共通の変曲点でのｐＨである、方法。
【０１９１】
２  変曲点での正味電荷が正である場合、陽イオン交換材料がイオン交換クロマトグラフィーのために使用される、実施態様１に記載の方法。
【０１９２】
３  陽イオン交換クロマトグラフィー材料が、スルホン化クロマトグラフィー材料又はカルボキシル化クロマトグラフィー材料である、実施態様２に記載の方法。
【０１９３】
４  変曲点での正味電荷が負である場合、陰イオン交換材料がイオン交換クロマトグラフィーのために使用される、実施態様１に記載の方法。
【０１９４】
５  陰イオン交換クロマトグラフィー材料が、第四級アミンのクロマトグラフィー材料又は第三級アミンクロマトグラフィー材料である、実施態様４に記載の方法。
【０１９５】
６  混合モードクロマトグラフィー材料が、クロマトグラフィーのために使用される、実施態様１に記載の方法。
【０１９６】
７  混合モードイオン交換材料が、スルホン化クロマトグラフィー材料又はカルボキシル化クロマトグラフィー材料及び第四級アミンのクロマトグラフィー材料又は第三級アミンクロマトグラフィー材料を順次充填した混合物である、実施態様６に記載の方法。
【０１９７】
８  ｃ）組成物の二以上のポリペプチドについて温度変化による正味電荷対ｐＨ曲線の変曲点のｐＨの変化（ｄＩＰ／ｄＴ）を決定すること、ｄ）温度変化によるバッファーの酸解離定数の変化（ｄｐＫａ／ｄＴ）がポリペプチドのｄＩＰ／ｄＴと本質的に同じである、クロマトグラフィーに使用のためのバッファーを選択することを更に含む、実施態様１から７の何れか一に記載の方法。
【０１９８】
９  バッファーが、変曲点のｐＨで効果的な緩衝能を提供する、実施態様８に記載の方法。
【０１９９】
１０  一以上の組成物のポリペプチドのｄＩＰ／ｄＴが、約−０．０２ｐＨ単位である、実施態様１から９の何れか一に記載の方法。
【０２００】
１１  温度変化が、約２０℃から約７０℃である、実施態様１から１０の何れか一に記載の方法。
【０２０１】
１２  温度変化が、約２０℃から約５０℃である、実施態様１から１１の何れか一に記載の方法。
【０２０２】
１３  ｄｐＫａ／ｄＴ＝ｄＩＰ／ｄＴ±５０％である、実施態様８から１２の何れか一に記載の方法。
【０２０３】
１４  工程ｄ）で選択されたバッファー中のポリペプチドの正味電荷が、３０℃を超えて０．５未満変化する、実施態様８から１３の何れか一に記載の方法。
【０２０４】
１５  工程ｄ）で選択されたバッファーが、約５ｍＭから約２５０ｍＭの範囲の濃度でクロマトグラフィーに使用される、実施態様８から１４の何れか一に記載の方法。
【０２０５】
１６  バッファー組成物が更に塩を含む、実施態様１から１５の何れか一に記載の方法。
【０２０６】
１７  塩が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、又はＮａ２ＳＯ４である、実施態様１６に記載の方法。
【０２０７】
１８  塩の濃度が、約１ｍＭから約１Ｍの範囲である、実施態様１６又は１７に記載の方法。
【０２０８】
１９  ポリペプチドが、抗体若しくはイムノアドヘシン又はその断片である、実施態様１から１８の何れか一に記載の方法。
【０２０９】
２０  ポリペプチドが、モノクローナル抗体又はその断片である、実施態様１から１９の何れか一に記載の方法。
【０２１０】
２１  抗体が、ヒト抗体である、実施態様１９又は２０に記載の方法。
【０２１１】
２２  抗体が、ヒト化抗体である、実施態様１９又は２０に記載の方法。
【０２１２】
２３  抗体が、キメラ抗体である、実施態様１９又は２０に記載の方法。
【０２１３】
２４  抗体が、抗体断片である、実施態様１９から２３の何れか一に記載の方法。
【０２１４】
２５  混入物が、ポリペプチドの変異体である、実施態様１から１４の何れか一に記載の方法。
【０２１５】
２６  混入物が、ポリペプチドの分解生成物である、実施態様１から２５の何れか一に記載の方法。
【０２１６】
２７  混入物が、ポリペプチドの電荷変異体である、実施態様１から２６の何れか一に記載の方法。
【０２１７】
２８  一以上の混入物と共にポリペプチドを含む組成物を分析するために最適なイオン交換クロマトグラフィーの分離条件を同定するための方法であって、該方法は、ａ）ポリペプチドのアミノ酸組成に基づいて、選択された温度での正味電荷対ｐＨの曲線をプロットすること、ｂ）工程ａ）のプロットの二次導関数を決定することにより中性ｐＨで又はその近傍での正味電荷対ｐＨの曲線の変曲点を決定することを含み；ここで最適なイオン交換クロマトグラフィーの分離条件が、ポリペプチドについてほぼ変曲点でのｐＨである、方法。
【０２１８】
２９  変曲点での正味電荷が正である場合、陽イオン交換材料がイオン交換クロマトグラフィーのために使用される、実施態様２８に記載の方法。
【０２１９】
３０  陽イオン交換クロマトグラフィー材料が、スルホン化クロマトグラフィー材料又はカルボキシル化クロマトグラフィー材料である、実施態様２９に記載の方法。
【０２２０】
３１  変曲点での正味電荷が負である場合、陰イオン交換材料がクロマトグラフィーのために使用される、実施態様２８に記載の方法。
【０２２１】
３２  陰イオン交換クロマトグラフィー材料が、第四級アミンのクロマトグラフィー材料又は第三級アミンクロマトグラフィー材料である、実施態様３１に記載の方法。
【０２２２】
３３  混合モードクロマトグラフィー材料が、クロマトグラフィーのために使用される、実施態様２８に記載の方法。
【０２２３】
３４  混合モードイオン交換材料が、スルホン化クロマトグラフィー材料又はカルボキシル化クロマトグラフィー材料及び第四級アミンのクロマトグラフィー材料又は第三級アミンクロマトグラフィー材料を順次充填した混合物である、実施態様３３に記載の方法。
【０２２４】
３５  ｃ）ポリペプチドについて温度変化による正味電荷対ｐＨ曲線の変曲点のｐＨの変化（ｄＩＰ／ｄＴ）を決定し、ｄ）温度変化によるバッファーの酸解離定数の変化（ｄｐＫａ／ｄＴ）がポリペプチドのｄＩＰ／ｄＴと本質的に同じである、クロマトグラフィーに使用のためのバッファーを選択することを更に含む、実施態様２８から３４の何れか一に記載の方法。
【０２２５】
３６  バッファーが、変曲点のｐＨで効果的な緩衝能を提供する、実施態様３５に記載の方法。
【０２２６】
３７  一以上の組成物のポリペプチドのｄＩＰ／ｄＴが、約−０．０２ｐＨ単位である、実施態様２８から３６の何れか一に記載の方法。
【０２２７】
３８  温度変化が、約２０℃から約７０℃である、実施態様２８から３７の何れか一に記載の方法。
【０２２８】
３９  温度変化が、約２０℃から約５０℃である、実施態様２８から３８の何れか一に記載の方法。
【０２２９】
４０  ｄＩＰ／ｄＴ＝ｄｐＫａ／ｄＴ±５０％である、実施態様２８から３９の何れか一に記載の方法。
【０２３０】
４１  工程ｄ）で選択されたバッファー中のポリペプチドの正味電荷が、３０℃を超えて０．５未満変化する、実施態様２８から４０の何れか一に記載の方法。
【０２３１】
４２  工程ｄ）で選択されたバッファーが、約５ｍＭから約５０ｍＭの範囲の濃度でクロマトグラフィーに使用される、実施態様２８から４１の何れか一に記載の方法。
【０２３２】
４３  バッファー組成物が更に塩を含む、実施態様２８から４２の何れか一に記載の方法。
【０２３３】
４４  塩が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、又はＮａ２ＳＯ４である、実施態様４３に記載の方法。
【０２３４】
４５  塩の濃度が、約１０ｍＭから約１Ｍの範囲である、実施態様４３又は４４に記載の方法。
【０２３５】
４６  ポリペプチドが、抗体若しくはイムノアドヘシン又はその断片である、実施態様２８から４５の何れか一に記載の方法。
【０２３６】
４７  ポリペプチドが、モノクローナル抗体又はその断片である、実施態様２８から４６の何れか一に記載の方法。
【０２３７】
４８  抗体が、ヒト抗体である、実施態様４６又は４７に記載の方法。
【０２３８】
４９  抗体が、ヒト化抗体である、実施態様４６又は４７に記載の方法。
【０２３９】
５０  抗体が、キメラ抗体である、実施態様４６又は４７に記載の方法。
【０２４０】
５１  抗体が、抗体断片である、実施態様３８から５０の何れか一に記載の方法。
【０２４１】
５２  混入物が、ポリペプチドの変異体である、実施態様２８から５１の何れか一に記載の方法。
【０２４２】
５３  混入物が、ポリペプチドの分解生成物である、実施態様２８から５２の何れか一に記載の方法。
【０２４３】
５４  混入物が、ポリペプチドの電荷変異体である、実施態様２８から５３の何れか一に記載の方法。
【０２４４】
５５  組成物がポリペプチド及び一以上の混入物を含む組成物を分析するための方法であって、ここで、該方法は混入物からポリペプチドを効果的に分離し、該方法は、ａ）実施態様１の方法に従って、各組成物が標的ポリペプチド及び一以上の混入物を含有する複数の組成物についての最適ｐＨ及び温度のイオン交換分離条件を決定すること、ｂ）ローディングバッファーが実施態様８から１５の何れか一項に記載の方法によって同定されるバッファーを含むローディングバッファーを用いて、イオン交換クロマトグラフィー材料へ組成物からのポリペプチド及び一以上の混入物を結合させること、ｃ）溶出バッファーがバッファー及び塩を含み、塩の濃度が経時的に勾配で増加し、ポリペプチド及び一以上の混入物がその勾配によって分離される溶出バッファーの勾配を用いてイオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチド及び一以上の混入物を溶出させること、及びｄ）ポリペプチド及び一以上の混入物を検出すること含む、方法。
【０２４５】
５６  ポリペプチド及び一以上の混入物を含む組成物を分析するための方法であって、該方法は混入物からポリペプチドを効果的に分離し、該方法は、ａ）ローディングバッファーがバッファーを含み、クロマトグラフィーのｐＨ及び温度が、ｉ）曲線が二以上の標的ポリペプチドのポリペプチドのアミノ酸組成に基づいている、選択された温度での正味電荷対ｐＨの曲線をプロットし、ｉｉ）工程ｉ）のプロットの二次導関数を決定することによって正味電荷対ｐＨの曲線の変曲点を決定すること（ここで最適なイオン交換クロマトグラフィーの条件は、二以上の標的ポリペプチドについての共通の変曲点でのｐＨである）によって、複数の標的ポリペプチドに対して最適化される、ローディングバッファーを使用してイオン交換クロマトグラフィー材料にポリペプチド及び一以上の混入物を結合させること；ｂ）溶出バッファーがバッファー及び塩を含み、ポリペプチド及び一以上の混入物が勾配により分離される溶出バッファーの勾配を用いてイオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチド及び一以上の混入物を溶出させること；及びｃ）ポリペプチド及び一以上の混入物を検出することを含む、方法。
【０２４６】
５７  選択される温度が大気温度である、実施態様５６に記載の方法。
【０２４７】
５８  バッファーが、ａ）二以上の標的ポリペプチドについて温度変化による正味電荷対ｐＨ曲線の変曲点のｐＨの変化（ｄＩＰ／ｄＴ）を決定し、ｂ）温度変化によるバッファーの酸解離定数の変化（ｄｐＫａ／ｄＴ）が共通の変曲点を有する二以上の標的ポリペプチドのｄＩＰ／ｄＴと本質的に同じであるバッファーを選択することによって同定される、方法。
【０２４８】
５９  バッファーが、変曲点のｐＨで効果的な緩衝能を提供する、実施態様５８に記載の方法。
【０２４９】
６０  ポリペプチド及び一以上の混入物を含む組成物を分析するための方法であって、該方法は混入物からポリペプチドを効果的に分離し、該方法が、ａ）ローディングバッファーがバッファーを含み、かつクロマトグラフィーのｐＨ及び温度が複数の標的ポリペプチドに対して最適化されている、ローディングバッファーを使用してイオン交換クロマトグラフィー材料にポリペプチド及び一以上の混入物を結合させること；ｂ）溶出バッファーがバッファー及び塩を含み、ポリペプチド及び一以上の混入物が勾配により分離される溶出バッファーの勾配を使用してイオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチド及び一以上の混入物を溶出させること；及びｃ）ポリペプチド及び一以上の混入物を検出することを含む、方法。
【０２５０】
６１  バッファーが、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）又は４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）である、実施態様６０に記載の方法。
【０２５１】
６２  バッファーの濃度が、約５ｍＭから約２０ｍＭの範囲である、実施態様５５から６１の何れか一に記載の方法。
【０２５２】
６３  バッファーのｐＨが、約２０℃から約７０℃の温度範囲で約６．５から約８．５の範囲である、実施態様５５から６２の何れか一に記載の方法。
【０２５３】
６４  バッファーのｐＨが、約２０℃から約５０℃の温度範囲で約６．５から約８．５の範囲である、実施態様５５から６３の何れか一に記載の方法。
【０２５４】
６５  変曲点でのバッファー及びポリペプチドのｐＨが、約２２℃で約７．８、約３７℃で約７．５、約５０℃で約７．２である、実施態様５５から６４の何れか一に記載の方法。
【０２５５】
６６  塩勾配が、直線勾配である、実施態様５５から６５の何れか一に記載の方法。
【０２５６】
６７  塩勾配が、段階勾配である、実施態様５５から６６の何れか一に記載の方法。
【０２５７】
６８  塩勾配が、ＮａＣｌ勾配、ＫＣｌ勾配、（ＮＨ４）２ＳＯ４又はＮａ２ＳＯ４勾配である、実施態様５５から６７の何れか一に記載の方法。
【０２５８】
６９  塩濃度が、約０ｍＭから約１Ｍまで勾配で増加する、実施態様５５から６８の何れか一に記載の方法。
【０２５９】
７０  塩濃度が、約１００分で約０ｍＭから約１００ｍＭまで増加する、実施態様６９に記載の方法。
【０２６０】
７１  塩濃度が、約４０分で約０ｍＭから約８０ｍＭまで増加する、実施態様６９に記載の方法。
【０２６１】
７２  ポリペプチドが、抗体若しくはイムノアドヘシン又はその断片である、実施態様５５から７１の何れか一に記載の方法。
【０２６２】
７３  ポリペプチドが、モノクローナル抗体又はその断片である、実施態様５５から７２の何れか一に記載の方法。
【０２６３】
７４  抗体が、ヒト抗体である、実施態様７２又は７３に記載の方法。
【０２６４】
７５  抗体が、ヒト化抗体である、実施態様７２又は７３に記載の方法。
【０２６５】
７６  抗体が、キメラ抗体である、実施態様７２又は７３に記載の方法。
【０２６６】
７７  抗体が、抗体断片である、実施態様７２から７６の何れか一に記載の方法。
【０２６７】
７８  混入物が、ポリペプチドの変異体である、実施態様５５から７７の何れか一に記載の方法。
【０２６８】
７９  混入物が、ポリペプチドの分解生成物である、実施態様５５から７８の何れか一に記載の方法。
【０２６９】
８０  混入物が、ポリペプチドの電荷変異体である、実施態様５５から７９の何れか一に記載の方法。
【０２７０】
８１  クロマトグラフィー材料が、陽イオン交換クロマトグラフィー材料である、実施態様５５から８０の何れか一に記載の方法。
【０２７１】
８２  陽イオン交換クロマトグラフィー材料が、スルホン化クロマトグラフィー材料又はカルボキシル化クロマトグラフィー材料である、実施態様８１に記載の方法。
【０２７２】
８３  複数のポリペプチド組成物を分析するための方法であって、各ポリペプチド組成物がポリペプチド及びポリペプチドの一以上の電荷変異体を含み、該方法は、ポリペプチドをその電荷変異体から効果的に分離し；
各ポリペプチド組成物に対して、該方法が、ａ）ローディングバッファーが約４０℃でｐＨが約７．６で１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファーを含み、ローディングバッファーを約１ｍＬ／分の流速で使用してイオン交換クロマトグラフィー材料にポリペプチド及び一以上の荷電変異体を結合させること；ｂ）溶出バッファーがｐＨが約７．６で約１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー及びＮａＣｌを含み、ＮａＣｌの濃度が約４０分で約０ｍＭから約８０ｍＭまで勾配で増加し、ポリペプチド及びその荷電変異体が勾配により分離される溶出バッファーの勾配を用いてイオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチド及び荷電変異体混入物を溶出させること；及びｃ）ポリペプチド及び一以上の荷電変異体を検出することを含む、方法。
【０２７３】
８４  複数のポリペプチド組成物が異なるポリペプチドを含む、実施態様８３に記載の方法。
【０２７４】
８５  複数のポリペプチド組成物が異なるｐＩを有するポリペプチドを含む、実施態様８３又は８４に記載の方法。
【０２７５】
８６  ポリペプチド組成物は抗体組成物である、実施態様８３から８５の何れか一に記載の方法。
【０２７６】
本明細書に開示される特徴の全ては、任意の組合せで組み合わされてもよい。本明細書に開示される各特徴は、同一の、等価な、又は類似の目的を果たす代替的な特徴により置き換えられてもよい。したがって、別段の明示的な指定のない限り、開示される各特徴は、一般的な一連の同等物又は類似の特徴の一例に過ぎない。
【０２７７】
本発明の更なる詳細は、以下の非限定的な実施例により説明される。本明細書中の全ての参考文献の開示内容は、参照により本明細書中に明示的に援用される。
【実施例】
【０２７８】
以下の実施例は、単に本発明の例示であると意図されており、したがって、決して本発明を限定するものと考えられるべきではない。以下の実施例及び詳細な記述は、説明のために提供されるものであり、限定のために提供されるものではない。
【０２７９】
実施例のための材料及び方法
別段の注記がない限り、以下の物質及び方法が実施例で使用された。
材料
安定したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株又は大腸菌細胞を使用して、全てのｍＡｂを製造した。
【０２８０】
ＭａｂＰａｃ ＳＣＳ−１０及びＰｒｏｐａｃ ＷＣＸ−１０カラムはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから購入した。ＡｎｔｉＢｏｄｉｘカラムはＳｅｐａｘからであった。ＹＭＣカラムはＹＭＣから購入した。Ｔｒｉｓｍａ（トリス）をＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｂａｋｅｒ Ｉｎｃ．又はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手し、ＨＥＰＥＳ、ＡＣＥＳ、Ｔｒｉｚｍａ塩基及びＣＡＰＳをＳｉｇｍａから入手した。塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム（１０Ｎ）及び塩化水素酸（１２Ｎ）をＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｂａｋｅｒ Ｉｎｃ．から入手した。リン酸（８５％）をＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手した。
【０２８１】
ＨＰＬＣ設定
陽イオン交換クロマトグラフィー実験を、主にＷａｔｅｒｓ ２７９６ ＢｉｏＡｌｌｉａｎｃｅ液体クロマトグラフィー機器、Ａｇｉｌｉｅｎｔ １２００ＳＬ ＨＰＬＣシステム又はＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ Ｒａｐｉｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｄｉｏｎｅｘ）上で実施した。機器には、低圧四元勾配ポンプ又はバイナリポンプ、温度調節能力を有するオートサンプラー、正確な温度調節のための熱カラムコンパートメント、及び二波長ダイオードアレイＵＶ検出器が含まれた。Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェア、バージョン６．８を用いて、機器制御、データ収集及びデータ分析を実施した。
【０２８２】
実施例１.  多生成物分析イオン交換クロマトグラフィーの最適化。
電荷変異型などの混入物を検出するために、高分解能かつ堅牢な多生成物ＩＥＣを開発するため、ｍＡｂが電荷平衡であるような条件を設計した。電荷平衡は、正味電荷状態（ｚ）対ｐＨをグラフ化することにより、多数のｍＡｂについて決定された。ｍＡｂが平衡である条件は、ｐＨに対するｚの直線の方程式の二次導関数を０に等しく設定することによって解かれた。
【０２８３】
与えられたｐＨでのｍＡｂの正味の電荷は、それらの側鎖によってタンパク質のｐＨ依存性の特性を定義する際に重要な役割を果たしているｍＡｂの６つのアミノ酸の含有量に基づいて決定された。６つのアミノ酸は、アスパラギン、グルタミン酸、ヒスチジン、チロシン、リジン及びアルギニンである。６つのアミノ酸の酸解離定数（−ｌｏｇ１０Ｋａとして定義されるｐＫａ）が、正味荷電状態（ｚ）を計算するために使用された。例えば、ＭＡｂ１は１０のヒスチジン残基を有する。図２は、ｐＨの関数としてヒスチジンのプロトン化を示している。ヒスチジンのｐＫａの６．０２未満のｐＨで、ヒスチジンは、プロトン化され、正の電荷を有する（図２Ａ）。６．０２を超えるｐＨで、ヒスチジンは脱プロトン化され、電荷を帯びていない。式１を使用して、特定のｐＨでのヒスチジンの特定の荷電状態の確率を決定した。図２Ｂは、ｐＨ６．５において及びｐＨ７．５においてのｍＡｂ１における脱プロトン化ヒスチジンの推定分布を示す。ｐＨは６．５では、ｍＡｂ１は８つの脱プロトン化ヒスチジン残基の中央値を有していたが、一方ｐＨ７．５では、ほぼ全てヒスチジン残基が脱プロトン化された。図２Ｃは、各々が２個のヒスチジン残基を有する４つのポリペプチド分子による例を示す。ｐＫａ（ｐＨ６．０２）で、Ｈｉｓ残基の５０％がプロトン化され、５０％が脱プロトン化されている。これらの４つの分子におけるヒスチジン残基の電荷状態の組み合わせはｐＫａで二項分布である：１つは両方のヒスチジンがプロトン化され；２つは片方のヒスチジンがプロトン化され他方のヒスチジンが脱プロトン化され；１つは両方のヒスチジンが脱プロトン化されている。
【０２８４】
与えられたｐＨ値における最も豊富な荷電状態の確率が６つのアミノ酸のそれぞれについて決定され、与えられたｐＨでのｍＡｂ１の電荷の重み付き確率が、抗体中に存在するこれらの６つのアミノ酸のそれぞれの残基数に基づいて決定された（図３）。電荷頻度の分布もまた、確率変数における不確実性の尺度であるシャノンエントロピー（式３）を介して決定することができる。ｍＡｂ１中に存在するこれらの６つのアミノ酸のそれぞれの残基数に基づいて（表３）、ｍＡｂ１に対する所与のｐＨにおけるシャノンエントロピーが図４にプロットされる。シャノンエントロピーが低いほど、電荷分布はより均一である。
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【０２８５】
このデータから、ｐＨの関数としてｍＡｂ１の正味の電荷の分布がプロットされ（図５）、変曲点は３７℃でｐＨ７．５であると決定された（図５の上面図である図６）。これが図５において最も高くかつ最もシャープなピークとして示される、最も均質な電荷状態を有するｐＨであることに留意のこと。最も均質な電荷状態はまた、ＩＥＣの分離において最もシャープなピークを生じることとなる。
【０２８６】
上述される方法を使用して、７．６から９．４の範囲のｐＩを有する多数のｍＡｂについて変曲点が決定された（図７）。驚くべきことに、ほぼ全てのｍＡｂにおいて、変曲点は３７℃でｐＨ７．５で同じであった。ＩＰを標的にすると、ＩＥＣのｐＨ堅牢性を向上させることができる。図７に示されるように、全ての抗体において、ｐＨ７とｐＨ８の間で正味電荷はほとんど変わらない。
【０２８７】
ｍＡｂの変曲点は、２２℃、３７℃及び５０℃のときに決定された。図８に示されるように、変曲点は、温度に依存していたが、試験した全ての抗体について、変曲点は所定の温度で同様であった。
【０２８８】
ｍＡｂ２についての変曲点は、２２℃から５０℃の範囲の温度に対して決定された。図９に見られるように、温度の上昇とともに変曲点のｐＨは低下するが、正味電荷は一定のままである。従って、変曲点に対してクロマトグラフィーを最適化することは、温度変動に対するＩＥＸ法の堅牢性をも提供する。用語ｄＩＰ／ｄＴは、温度の変化による分子のＩＰの変化を表している。これらの結果から、温度の影響を最小にし、アッセイの堅牢性を向上させるために、温度の関数としてのバッファーの酸解離定数の変化がｄＩＰ／ｄＴに近づいた場合に（すなわち、ｄＩＰ／ｄＴ＝ｄｐＫａ／ｄＴ）最適なバッファーを選択することができる。
【０２８９】
変曲点のｐＨと温度との関係がプロットされ、線形回帰の傾き、ｄｉＰ／ｄＴ値、が異なるｐＩ値を有する多数のｍＡｂについて計算された（図１０及び表４）。これら６つのｍＡｂについてのｄｉＰ／ｄＴの値が本質的に同じ（−０．０１７７から−０．０１８３）であることが見いだされた。このように、約−０．０１８のｄｐＫａ／ｄＴの値を有するバッファーが、図１０に提示されるｍＡｂの全てのＩＥＣ分析のために最適であり、従って多生成物ＩＥＣについて最適となるであろう。
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【０２９０】
多数のバッファーについて温度の関数（ｄｐＫａ／ｄＴ）としてのｐＫａの変化の公表値は以下のとおりである：
リン酸塩：−０．００２８
ＨＥＰＥＳ：−０．０１４
ＡＣＥＳ：−０．０２
トリス：−０．０２８
ビシン：−０．０１８
トリシン：−０．０２１
ＴＡＰＳ：−０．０２
ＣＨＥＳ：−０．０１８
Benyon, RJ & Easterby, JS, Buffer Solutions The Basics, IRL Press, 1996を参照。
【０２９１】
図１１は、温度の関数として、リン酸バッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、ＡＣＥＳ緩衝、及びトリスバッファー中におけるｍＡｂ２の変曲点での正味電荷のグラフを示す。ＡＣＥＳバッファー又はＨＥＰＥＳバッファーにおけるｍＡｂ２の正味電荷のグラフは、３０℃超える範囲で０．５未満のほぼ平坦な変化であった。一方、トリス及びリン酸塩のグラフは平坦ではなく、温度変化による正味電荷のより大きな変化を示していた。ＡＣＥＳ又はＨＥＰＥＳが、多生成物クロマトグラフィーのために最適なバッファーであると結論された。
【０２９２】
実施例２.  多生成物ＩＥＣプロトコルの開発
変曲点並びにＡＣＥＳ及びＨＥＰＥＳについてのｄｐＫａ／ｄＴの値と多数のｍＡｂに対して決定されたｄＩＰ／ｄＴの値との関係を考慮して、多生成物ＩＥＣプロトコルが開発された。１９のｍＡｂが試験された。ｍＡｂサンプルは、バッファーＡで１ｍｇ／ｍＬに希釈され、オートサンプラーに５±３℃で保持された。ＭａｂＰａｃ ＳＣＸ−１０、４×２５０ｍｍカラムが、温度設定３７±１℃でカラムコンパートメントに配置された。各クロマトグラフィーの実行のために、タンパク質（２０μｇ）の１０μＬが注入された。バッファーＡは、３７℃で５ｍＭのＡＣＥＳ（ｐＨ７．５）であった。バッファーＢはバッファーＡ中に１８０ｍＭのＮａＣｌである。勾配はバッファーＢをバッファーＡ中に混合することにより、１００分間、１ｍＭ／分で０〜１００ｍＭのＮａＣｌであった。流速は０．８ｍＬ／分であった。タンパク質は２８０ｎｍでの吸光度によって検出された。図１２に示されるように、多生成物ＩＥＣは、広範囲のｍＡｂ生成物に対して良好な分解能を与えた。
【０２９３】
実施例３.  多生成物ＩＥＣのｐＨ堅牢性
多生成物ＩＥＣのｐＨ堅牢性は、勾配が１．５ｍＭのＮａＣｌ／分であり、かつ３つの異なるｐＨ値、ｐＨ７．３、ｐＨ７．５及びｐＨ７．７であることを除いて、実施例２に記載の方法を用いて調べられた。ｍＡｂ４が、この研究のための非限定的な例示的抗体として用いられた。
【０２９４】
図１３に示すように、抗体の主ピークとその電荷変異体との間の良好な分解能が試験した全てのｐＨ値で見られた。ピーク面積の定量化は、ｐＨに関して分析に有意な変化がないことを明らかにした（表５）。
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ここでＲは分解能であり
Ｔｒ１及びＴｒ２は、二つの直接隣接するピークの保持時間であり
ｗ１及びｗ２は、２つの直接隣接するピークのピーク幅がある。
【０２９５】
実施例４.  温度堅牢性
多生成物ＩＥＣの温度堅牢性は、勾配が１．５ｍＭのＮａＣｌ／分であり、かつ３つの異なる温度、３２℃、３７℃、及び４２℃であることを除いて、実施例２に記載の方法を用いて調べられた。ｍＡｂ２、ｍＡｂ６及びｍＡｂ １０が、この研究のための非限定的な例示的抗体として用いられた。
【０２９６】
図１４に示されるように、抗体及びそれらの電荷変異体の間で良好な分解能が、抗体ごとに試験された全ての温度で見られた。ほぼ同一のクロマトグラムが、各抗体について、各温度で見られた。
【０２９７】
第２の実験では、ｍＡｂ１９、７及び８が、１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー中で温度堅牢性について試験された。図１５に見られるように、抗体及びそれらの電荷変異体の間で良好な分解能が、抗体ごとに試験された全ての温度で見られた。ピーク面積の定量化は、ｐＨに関して分析に有意な変化がないことを明らかにした。
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【０２９８】
実施例５.  多生成物ＩＥＣの生成物特異的ＩＥＣとの比較
多生成物ＩＥＣが、ｍＡｂ８、ｍＡｂ２５及びｍＡｂ２６に対して開発された生成物特異的ＩＥＣと比較された。ｍＡｂ８、ｍＡｂ２８及びｍＡｂ２６のＩＥＣが、勾配が１．５ｍＭのＮａＣｌ／分であるのを除き実施例２に記載される多生成物ＩＥＣ法を使用して実施された［Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ−確認して下さい］。生成物特異的な方法に対するバッファー及び温度は異なっていた。ｍＡｂ８については３０℃で２０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．５）：ｍＡｂ２５については４２℃で２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）：及びｍＡｂ２６については４０℃で２０ｍＭのＡＣＥＳ（ｐＨ７．１）であった。図１６に見られるように、多生成物ＩＥＣ（左のパネル）が、同様に又は生成物特異的ＩＥＣ法（右のパネル）よりも良好な分解能で実施された。
【０２９９】
実施例６.  異なるカラムを用いた多生成物ＩＥＣの使用
多生成物ＩＥＣがクロマトグラフィーカラムの選択のために使用された。ｍＡｂ８が、勾配が１．５ｍＭのＮａＣｌ／分であるのを除き実施例２に記載される方法を使用して４つの異なる陽イオン交換カラムで試験された。試験されたカラムは、ＰｒｏＰａｃ ＷＣＸ−１０、４×２５０、１０μｍ；ＹＭＣ、４．６×１００、５μｍ；Ａｎｔｉｂｏｄｉｘ ＮＰ５、４．６×２５０、５μｍ；及びＭａｂＰａｃ ＳＣＸ−１０、４×２５０、１０μｍであった（実施例２で使用）。図１７で見ることができるように、４つ全てのカラムは十分な分解能を生じた。ピーク面積の定量化及び主ピークとの酸性ピーク及び塩基性ピーク間の分解能が表７に示される。
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【０３００】
実施例７.  拡張性
異なるサイズの陽イオン交換クロマトグラフィーカラムの使用が、多生成物ＩＥＣにおける使用のために評価された。カラムの長さを減らすと実行時間が短くなることとなる。ｍＡｂ８は、実施例２に記載される多生成物ＩＥＣ法を使用して、３つの異なるサイズのＰｒｏＰａｃ ＷＣＸ−１０カラム上でクロマトグラフィー処理された。カラムは異なるサイズであったので、クロマトグラフィーの実行は異なる時間に対してであった。カラムのサイズ及び各実行時間が以下の通りであった：６３分に対して４×２５０ｍｍ、１９分に対して４×１００ｍｍ、１５分に対して４×５０ｍｍ。結果は図１８に提示される。一部の分解能は短いカラムで失われるものの、一貫性のある定量的結果を伴う適切な分離が、ハイスループットアプリケーション用の短いカラムを用いて得られる。ピーク面積の定量化は一貫性があり、表８に示される。
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実施例８.  アッセイの堅牢性
試験手順の検証は適切に堅牢である方法が必要である。堅牢性を評価するための実験の設計（ＤｏＥ）アプローチが、相互作用的な効果を含むアッセイ条件下における小さな変動の効果を総合的に評価する。各実験の特異的多変量条件は、相互作用の可能性のある因子を結び付けるために選択された。連続的に変化させることはできなかったが、効果を有することが知られている因子、すなわち、カラム（例えば、ロット間の変動性、年齢）及び装置（例えば、２つのモデルタイプ）は一時一事法により検討された。効果は、標的条件での応答の変動性を、要因計画に従って変動される条件での応答の変動性に対して比較することによって決定された。
【０３０１】
実験計画
以下は、プラットフォームメソッドコントロールアプローチのための組換えモノクローナル抗体タンパク質の電荷不均一性を監視するために使用されるイオン交換条件を説明している。本研究の目的は、実験の６要因プラケット・バーマン計画を用いたアッセイの堅牢性を調査することであった（表９及び１０）。検討される因子は、溶媒のｐＨ、終了の塩濃度、カラム温度、流速、注入量、及びバッファーのモル濃度であった。この研究のための応答変数は、主ピーク、酸性及び塩基性変異体の相対的な割合を含んでいた。合計２１回の実行が、１２回の実行が要因条件で、９回の実行が標的で行われた。
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【０３０２】
統計解析
標的応答値のサンプルは、全ての可変因子が、標的条件においてである場合に生じる変動性を示す。要因応答値のサンプルは、多因子が組み合わせで可変される場合に生じる変動性を示す。
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【０３０３】
平均、標準偏差（ＳＤ）及び相対的標準偏差（ＲＳＤ）は、全ての標的及びＤｏＥ要因応答値に対して計算された。僅かな違いが、標的条件と要因条件のアイソフォームのＳＤとＲＳＤとの間で見られているが、それらは前例のないほどに低い。結果は図１９〜２１に示される。
【０３０４】
ＩＥＣの検証のために典型的には、許容可能な％ＲＳＤの限界は次のとおりである：主ピークに対して＜５％、酸性及び塩基性変異体に対して＜１０％。
【０３０５】
要因条件の全てが、標的条件の結果から算出される９５／９９許容差内にある％主ピークと％塩基性についての結果を生成する。
【０３０６】
２つの要因条件＃１０（− ＋−− ＋ −）及び＃１２（− ＋−＋ ＋ ＋）が、標的条件の結果から計算される低い９５／９９ＴＩの要求値以下の％酸性変異体値を生成した。その他全ての要因条件は、区間内に値を生成した。
【０３０７】
標的条件の９５／９９ＴＩを外れる値を生成した条件は、アッセイの高レベルの精度の結果であり、ＤｏＥ試験の範囲内の無制限の変動性（機器＆カラム）を制限した。
【０３０８】
ＩＥＣの正常な９５／９９ＴＩは、主ピーク、酸性及び塩基性変異体に対して３〜５％の範囲内とすることができる。
【０３０９】
材料と方法
タンパク質又は抗体の薬物物質の荷電変異体を定量するために、臨床製品の製剤又は毒性物質はプラットフォームメソッドコントロール（ＰＭＣ）アプローチを用いる。プラットフォームメソッドコントロールアプローチは、この多生成物陽イオン交換クロマトグラフィー法におけるシステム適合性の決定のためのメソッドコントロールとして代表的な抗体を利用する。多生成物の試験手順は、正の正味電荷を有するタンパク質分子に適用できる（およそｐＩ＞７．２で）。
【０３１０】
装置及び材料
１．１  ＨＰＬＣシステム：調節可能なＵＶ（ＴＵＶ）を用いるＷａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ Ｈ−Ｃｌａｓｓ Ｂｉｏ；Ｗａｔｅｒｓ ２４８７検出器を有するＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５、及びＷａｔｅｒｓ ２４８９ ＵＶ／Ｖｉｓ検出器又は装置を有するＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ｅ２６９５。
１．２  ２８０ｎｍでのモニタリングが可能なインラインＵＶ検出器
１．３  ＨＰＬＣは、セットポイント±２℃で温度を維持することができるカラムコンパートメントが含まれている必要がある。
１．４  電子積分器及びピーク面積積分が可能なコンピュータシステム。
１．５  ２−８℃に冷却することが可能なオートサンプラー。
１．６  カラム：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＭａｂＰａｃＲ ＳＣＸ−１０、１０μｍ、４  ２５０ｍｍ（Ｔｈｅｒｍｏ、製品番号０７４６２５）。
１．７  温度補償付きｐＨメーター。
１．８  ３７℃±２℃で加熱が可能な水槽。
１．９  水槽中への部分的な浸漬での使用のために指定された、１℃分割で較正された温度計
【０３１１】
試薬
記：レシピは、試薬の名目上の量のためのものでり、アッセイの要件に応じて比例的に調整することができる。
２．１  ＨＰＬＣ分析に適した精製水（Ｓｕｐｅｒ−Ｑ又は同等物）
２．２  溶媒Ａ：５ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．５±０．１
ＨＥＰＥＳ Ｆｒｅｅ Ａｃｉｄ、試薬グレード（ＦＷ ２３８．３，Ｃｏｒｎｉｎｇ ＣｅｌｌＧｒｏ；製品番号６１−０３４−ＲＯ）、１．８７ｇ
ＨＥＰＥＳ Ｓｏｄｉｕｍ Ｓａｌｔ、試薬グレード（ＦＷ ２６０．３，ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ；製品番号Ｈ３７８４）、１．８７ｇ
精製水  ３Ｌにメスアップ
メスシリンダー中で約２９００ｍＬの精製水により記載されている化学物質を混合する。溶解するまで攪拌する。精製水で３ＬまでメスアップしｐＨを測定する。周囲温度でｐＨが７．５±０．１であることを確認する。ｐＨ値が指定された範囲外にある場合、破棄し、調製を繰り返す。０．２−μｍの膜を通してろ過する。
２．３  溶媒Ｂ：溶媒Ａ中１００ｍＭの塩化ナトリウム
塩化ナトリウム（ＦＷ ５８．４４ Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒカタログ番号３６２４−０１又は同等物）、５．８４４ｇ
溶媒Ａ（工程２．２）１Ｌにメスアップ
メスシリンダー中で約４５０ｍＬの溶媒Ａにより塩化ナトリウムを混合させて、溶解するまで撹拌する。溶媒Ａで１Ｌにメスアップし、０．２−ｍの膜を通してろ過する。
２．４  溶媒Ｃ：溶媒Ａ中１Ｍの塩化ナトリウム
塩化ナトリウム（ＦＷ ５８．４４ Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒカタログ番号３６２４−０１）、２９．２２ｇ
溶媒Ａ（工程２．２）、５００ｍＬにメスアップ
メスシリンダー中で約４５０ｍＬの溶媒Ａにより塩化ナトリウムを混合させて、溶解するまで撹拌する。溶媒Ａで５００ｍＬにメスアップし、０．２−ｍの膜を通してろ過する。
２．５  カラムストレージソリューション：溶媒Ｂ中０．０５％アジ化ナトリウム、ｐＨ７．５±０．１
注意：アジ化ナトリウムは非常に毒性でかつ変異原性である。粉塵の吸入を避け、皮膚との接触を避ける（それは容易に皮膚から吸収される）。
アジ化ナトリウム（ＦＷ ６５．０１，ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ ００６６８８４Ｒ又は同等物）、２．２５ｇ；溶媒Ｂ（工程２．２）、５００ｍＬにメスアップ
メスシリンダー中で約４５０ｍＬの溶媒Ｂによりアジ化ナトリウムを混合させて、溶解するまで撹拌する。溶媒Ｂで５００ｍＬにメスアップし、０．２２−ｍの膜を通してろ過する。
２．６  カラム及びシステムクリーニング液：０．１Ｎ 水酸化ナトリウム（ＪＴ Ｂａｋｅｒ ５６３６−０２）、以下の手順ごとに調製する：
１Ｎ ＮａＯＨ １００μＬ
精製水 ９００μＬ
記載されている化学物質を混合し、よく混ぜる。
２．７  サンプル及び標準品の処方バッファー
２．８  １０％ポリソルベート２０ストック（ｗ／ｖ）
ポリソルベート２０（ポリソルベートＴＭ２０，Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．Ｐ７９４９又は同等物）１０ｇ、精製水、１００ｍＬにメスアップ。
ポリソルベート２０を釣り合い重りメスシリンダー中に計量する。界面活性剤とシリンダーの首との接触を避ける。気泡の形成を回避しながら、注意深く精製水で１００ｍＬにメスアップする。シリンダー内に磁気撹拌棒を穏やかに下げる。全ての界面活性剤が溶解するまで１５〜２０分間溶液を撹拌する。
２．９  メソッドコントロール処方バッファー
ＭＡｂ８処方バッファー：２０ｍＭヒスチジンＨＣｌ、１２０ｍＭスクロース、０．０２％ポリソルベート２０、ｐＨ６．０±０．３
Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ、一水和物（ＦＷ ２０９．６）  ２．３１ｇ
Ｌ−ヒスチジン、遊離塩基（ＦＷ １５５．２）  １．４０ｇ
スクロース（ＦＷ ３４２．３）  ４１．０８ｇ
ポリソルベート２０  ０．２０ｇ
又は１０％ポリソルベート２０（ｗ／ｖ）ストック溶液  ２．０ｍＬ
精製水  １．０Ｌにメスアップ
約８００ｍＬの精製水に記載されている化学物質を混合させて、溶解するまで撹拌する。ｐＨが６．０±０．３であることを確認する。ｐＨ値が指定された範囲外にある場合、破棄し、調製を繰り返す。溶液を精製水で１．０Ｌにメスアップする。０．４５−ｍｍｐ膜を通してろ過する。
２．１０  ５ｍｇ／ｍＬ  カルボキシペプチダーゼＢ、ＤＦＰ処理型（Ｒｏｃｈｅ  １０３２３３）又は同等物、およそ１５０Ｕ／ｍｇの活性
２．１１  １ｍｇ／ｍＬ  ＣｐＢ
５ｍｇ／ｍＬ  カルボキシペプチダーゼＢ、ＤＦＰ処理型  ２０μＬ
精製水  ８０μＬ
精製水中に５ｍｇ／ｍｌのカルボキシペプチダーゼＢを正確に追加する。５ｍｇ／ｍＬ以外の購入されたカルボキシペプチダーゼＢの濃度について、容積への調整は１ｍｇ／ｍＬの最終濃度を確保するようになされ得る。新しく調製する。
【０３１２】
メソッドコントロール、サンプル、リファレンス及び処方バッファーのブランクの調製
３．１  メソッドコントロール（ＭＡｂ８）、名目濃度：５０ｍｇ／ｍＬ
メソッドコントロールを溶媒Ａ（工程２．２）で最終濃度がおよそ２．０ｍｇ／ｍＬまで希釈する（例えば、５０ｍｇ／ｍＬのメソッドコントロールに対して、４０μＬのサンプル及び９６０μＬの溶媒Ａを混合する）。
３．２  メソッドコントロールブランク
メソッドコントロール処方バッファーを工程３．１に記載されるのと同一の希釈スキームを使用して溶媒Ａで希釈する。
３．３  サンプル及び標準品の調製
サンプル及び標準品を溶媒Ａで２ｍｇ／ｍＬに希釈する。
３．３  サンプル及び標準品ブランクの調製
３．４．１  工程３．４と同一の希釈スキームを使用して生成物用の処方バッファーを希釈する。
３．５  データシート上に希釈を記録する。
３．６  ＣｐＢ消化によるサンプル調製は、ＣｐＢ消化の必要性について、生成物特異的情報及び指示を言及する。
３．６．１  希釈されたメソッドコントロール、サンプル、標準品及び処方バッファーブランクへの１ｍｇ／ｍＬのＣｐＢ（工程２．１２）の１％（ｗ／ｗ）添加を行う（例えば、２．０ｍｇ／ｍＬのサンプルの１０００Ｌへ１ｍｇ／ｍＬのＣｐＢの２０Ｌを添加する）。
３．６．２  ＣｐＢ処理されたメソッドコントロール、サンプル、標準品及び処方バッファーブランクを３７℃±２℃で２０±２分間穏やかに攪拌しインキュベートする。
３．６．３  データシート上に調製を記録する。
３．７  希釈されたメソッドコントロール、標準品、サンプル及び処方バッファーブランクを分析用に適当なバイアルに移す。
３．８  ＨＰＬＣ分析は、サンプル調製の４８時間以内に完了しなければならない。サンプルは、分析前に２〜８℃で保管されなければならない。
【０３１３】
クロマトグラフィー条件
４．１  両方のＷａｔｅｒｓのＨＰＬＣ装置に共通のクロマトグラフィー条件：
４．１．１  流速：１．５ｍＬ／分
４．１．２  オートサンプラー温度：５±３℃
４．１．３  カラム温度：４０±２°Ｃ
４．１．４  ＵＶ検出波長：２８０ｎｍ
４．１．５  注入量：２５Ｌ（〜５０ｇ）
４．２  ＷａｔｅｒｓのＡｑｃｕｉｔｙ Ｈ−ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣ及び多波長又はダイオードアレイ検出器のための機器の設定
４．２．１  原点オフセットアナログアウトプット：５％
４．２．２  減衰アナログ出力：５００ｍＡＵ
４．２．３  洗浄設定：ニードル洗浄による注入（１０％のＩＰＡ）
注入前  １０ｓ
注入後  ２０ｓ
４．２．４  吸引及び分注速度：１００μＬ／分
４．２．５  加速  ２．０ｍＬ／分／０．０２分（１００ｍＬ／分／分）
４．２．６  検出器設定：
４．２．６．１  サンプリングレート：１ｐｔ／秒
４．２．６．２  フィルター：ハミング
４．２．６．３  時定数  １．０
４．２．６．４  比率最小  最小比率  ０．００  最大比率  ２．００
４．２．６．５  オートゼロ  チャンネルＡ：（時間０及び時間５０）
４．２．６．６  感度：２．０００ＡＵＦＳ
４．３  Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７を備えたＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ（ｅ）２６９５ ＨＰＬＣの機器設定
４．３．１  行程容積：１００μＬ
４．３．２  ニードル洗浄時間：延長される（１０％ ＩＰＡ）
４．３．３  溶媒脱気：「ｏｎ」モードに設定
４．３．４  加速  １０．０ｍＬ／分／０．１分（１００ｍＬ／分／分）
４．３．５  吸引及び分注速度：低（５０μＬ／分）
４．３．６  検出器設定：
４．３．６．１  サンプリングレート：１ｐｔ／秒
４．３．６．２  フィルター：ハミング
４．３．６．３  時定数  １．０
４．３．６．４  比率の最小  ０．１０００
４．３．６．５  オートゼロ  時間０及び時間５０でチャンネルＡ
４．３．６．６  感度：２．０００ＡＵ
４．４  勾配：
2019090818.tif 000019
【０３１４】
機器の調整
５．１  ＨＰＬＣを使用するための適切なプロトコルに従う
５．２  １０％ＩＰＡによるニードル洗浄線を含む、適切な溶媒の〜２０ｍＬによるプライムライン
【０３１５】
カラムの洗浄及び調整
６．１  以下の均一濃度プログラムを使用して、システム及びカラム洗浄を行う。０．１ＮのＮａＯＨ１００μＬを注入する。
2019090818.tif 000020
６．２  工程６．１を少なくとも５回繰り返す。
６．３  工程６．１で均一濃度プログラムを使用して、溶媒Ａの１００μＬの単回注入を行う。
６．４  工程４．４における勾配プログラムの初期条件で〜２０分間、又は安定したベースラインが観察されるまでカラムを平衡化する（１．５ｍＬ／分で１００％溶媒Ａ）。
【０３１６】
注入プロトコル
７．１  調整：一貫性のあるクロマトグラムが最低２回の注入に対して観察されるまでＣｐＢ消化せずにメソッドコントロールを注入する。酸性領域、メインピーク及び塩基性領域の分解能は、典型的なクロマトグラムと目視で一致していなければならない。
７．２  ＣｐＢ消化をしないプラットフォームメソッドコントロール（単回注入）
７．３  メソッドコントロールのための処方バッファーブランク
７．４  標準品＊  （単回注入）
７．５  サンプル（複数）＊  （重複注入）
７．６  標準品＊  （単回注入）
７．７  標準品（複数）のための処方バッファーブランク（複数）（単回注入）
７．８  ＣｐＢ消化をしないプラットフォームメソッドコントロール（単回注入）
＊生成物が保証される場合、ＣｐＢの有無にかかわらない。
記：１）処方バッファーが標準品によって異なる場合、標準品とサンプル用に別のブランクを注入する。
２）メソッドコントロールが必要とされている間に、１５以上の注入の場合（標準品と各生成物処方バッファーブランク製剤バッファーブランクを含む）、メソッドコントロール注入による１５回の注入ごとにひとまとめにする。試験データシートのシステム適合性セクションでは、報告されているサンプルをひとまとめにするメソッドコントロール注入のみ報告する。
３）標準品はサンプルとみなされ、試験セッションのシステム適合性を評価するために使用されない。
【０３１７】
カラムのシャットダウン及びストレージ
カラムストレージソリューション（工程２．４）の少なくとも３０ｍＬでカラムを洗浄することにより、カラムを格納する。
【０３１８】
システム適合性
記：メソッドコントロールのため、メソッドコントロール処方バッファーをブランクとメソッドコントロールプロファイルを重ねることによって、積分エンドポイントを決定する。重ねプロファイルを展開し、メソッドコントロールプロファイルにブランクを比較することにより、積分エンドポイントを同定する。
９．１  タンパク質に起因する全てのピークを積分する。メソッドコントロール処方バッファーブランククロマトグラム中に存在する任意のピークは、ブランクにおける対応するピークが、ＰＭＣにおけるピークの＜１％である場合を除き、含めない。
９．２  ひとまとめにするメソッドコントロール注入のクロマトグラムプロファイルの、お互いに及び典型的なクロマトグラフィープロファイルとの整合性を視覚的に確認する。典型的なクロマトグラムにおける全ての命名されたピークが存在している必要がある。
記：命名されたピークのプロファイルは、カラム及び機器の変動性に起因して、例のプロファイルからピーク形状が多少異なる場合がある。
９．３  各ひとまとめにするメソッドコントロール注入について主ピーク、酸性領域及び塩基性領域の割合を計算する。
９．４  システム適合性の範囲
2019090818.tif 000021
９．５  システム適合性データシートに結果を記録する。
【０３１９】
データ分析
１０．１  サンプル及び標準品のクロマトグラムの両方においてピークを同定するためにプロファイルを視覚的に比較する。
１０．２  タンパク質に起因する全てのピークを積分する。生成物処方バッファーブランククロマトグラム中に存在する任意のピークは、ブランクにおける対応するピークが、ＰＭＣにおけるピークの＜１％である場合を除き、含めない。
記：積分エンドポイントを決定するために、サンプル及び標準品プロファイルを生成物処方バッファーブランクと重ね合わせる。重ねプロファイルを展開し、生成物処方バッファーブランクをサンプル及び標準品プロファイルと比較することにより、積分エンドポイントを同定する。
１０．３  主ピークのピーク面積、酸性領域及び塩基性領域の割合を計算するために各サンプル及び標準品注入を分析する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2019090818.tif 000027
【図７】
2019090818.tif 000028
【図８】
2019090818.tif 000029
【図９】
2019090818.tif 000030
【図１０Ａ】
2019090818.tif 000031
【図１０Ｂ】
2019090818.tif 000032
【図１１】
2019090818.tif 000033
【図１２】
2019090818.tif 000034
【図１３】
2019090818.tif 000035
【図１４】
2019090818.tif 000036
【図１５】
2019090818.tif 000037
【図１６】
2019090818.tif 000038
【図１７】
2019090818.tif 000039
【図１８】
2019090818.tif 000040
【図１９】
2019090818.tif 000041
【図２０】
2019090818.tif 000042
【図２１】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年1月24日(2019.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
2019090818000001.pdf