(57)【要約】      （修正有）【課題】合成単一ドメイン抗体ライブラリー（ｈｓ２ｄ Ａｂ−Ｌ１）、安定な単一ドメイン抗体骨格を含む抗原結合タンパク質を提供する。【解決手段】合成単一ドメイン抗体ライブラリーを作成する方法であって、ｉ．ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をコードする多様な核酸を、合成単一ドメイン抗体のそれぞれのフレームワークコード領域間に導入して、その同じ合成単一ドメイン抗体骨格のアミノ酸配列を有する多様な合成単一ドメイン抗体をコードする核酸を作製する工程を含み、前記の合成単一ドメイン抗体骨格のアミノ酸配列は、少なくとも以下のアミノ酸残基：Ｆ３７、Ｅ４４、Ｒ４５、Ｆ４７；及び、少なくとも以下のアミノ酸残基：Ｐ１５、Ｓ４９、Ｓ８１、Ｒ９３、Ａ９４を含有し、場合によりさらに、Ｑ８、Ｑ１０８、及びＴ９９の残基を含み、アミノ酸残基の位置は、ＶＨアミノ配列のために使用されたＫａｂａｔ命名法に従って示されている方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成単一ドメイン抗体ライブラリーを作成する方法であって、該方法は、
ｉ．ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をコードする多様な核酸を、合成単一ドメイン抗体のそれぞれのフレームワークコード領域間に導入して、その同じ合成単一ドメイン抗体骨格のアミノ酸配列を有する多様な合成単一ドメイン抗体をコードする核酸を作製する工程を含み、
前記の合成単一ドメイン抗体骨格のアミノ酸配列は、少なくとも以下のアミノ酸残基：Ｆ３７、Ｅ４４、Ｒ４５、Ｆ４７；及び、少なくとも以下のアミノ酸残基：Ｐ１５、Ｓ４９、Ｓ８１、Ｒ９３、Ａ９４を含有し、場合によりさらに、Ｑ８、Ｑ１０８、及びＴ９９の残基を含み、アミノ酸残基の位置は、ＶＨアミノ配列のために使用されたＫａｂａｔ命名法に従って示されている、該方法。
【請求項２】
前記の合成単一ドメイン抗体の骨格がラマ種のＶＨＨに由来し、それは以下のヒト化アミノ酸残基：Ｆ１２、Ｐ１５、Ｓ４９、Ｓ８１、Ｋ８２、Ｖ８５、Ｙ８６、Ｓ９１、Ｒ９３及びＡ９４を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記の合成単一ドメイン抗体の骨格が以下のアミノ酸残基：Ｑ８、Ａ９、Ｆ１２、Ｐ１５、Ｆ３７、Ｋ４３、Ｅ４４、Ｒ４５、Ｆ４７、Ｓ４９、Ａ５０、Ｓ８１、Ｋ８２、Ｖ８５、Ｙ８６、Ｓ９１、Ｒ９３、Ａ９４、Ｔ９９、Ｑ１０８を含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記の合成単一ドメイン抗体の骨格が、配列番号１のＦＲ１、配列番号２のＦＲ２、配列番号３のＦＲ３、及び配列番号４のＦＲ４からなる前記のフレームワーク領域、又は、各フレームワーク領域内に１、２若しくは３つ以下の保存的アミノ酸置換を有する機能的な変異フレームワーク領域を含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
合成ＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸残基が、以下の原則：
ＣＤＲ１の１位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ又はＤ；
ＣＤＲ１の２位には：Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ｔ又はＴ；
ＣＤＲ１の３位には：Ｙ、Ｓ、Ｆ又はＷ；
ＣＤＲ１の４位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＮ；
ＣＤＲ１の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ又はＬ；
ＣＤＲ１の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ又はＥ;
ＣＤＲ１の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ又はＶ；
ＣＤＲ２の１位には：Ｒ、Ｓ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ又はＹ；
ＣＤＲ２の２位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ又はＹ；
ＣＤＲ２の３位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｑ、Ｐ；
ＣＤＲ２の４位には：Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｎ又はＤ；
ＣＤＲ２の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ又はＭ；
ＣＤＲ２の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ又はＫ;
ＣＤＲ２の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、又はＶ
によって決定され；
ＣＤＲ３のアミノ酸配列が、以下のアミノ酸：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ、Ｍの１つ以上の中から無作為に選択された９〜１８個のアミノ酸を含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項の方法によって得ることのできる合成単一ドメイン抗体ライブラリー。
【請求項７】
少なくとも３×１０９個の明確に異なる抗体コード配列を含む、請求項６の合成単一ドメイン抗体ライブラリー。
【請求項８】
対象の標的に結合する合成単一ドメイン抗体を同定するためのスクリーニング法における、請求項６又は７の合成単一ドメイン抗体ライブラリーの使用。
【請求項９】
前記のスクリーニング法がファージディスプレイである、請求項８の使用。
【請求項１０】
以下の式：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の合成単一ドメイン抗体を含む抗原結合タンパク質であって、該フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４は、少なくとも以下の元来のラクダ科の動物のＶＨＨアミノ酸残基：Ｆ３７、Ｅ４４、Ｒ４５、Ｆ４７；及び少なくとも以下のヒト化アミノ酸残基：Ｐ１５、Ｓ４９、Ｓ８１、Ｒ９３、Ａ９４を含有する、該抗原結合タンパク質。
【請求項１１】
合成単一ドメイン抗体が、以下のアミノ酸残基：Ｑ８、Ａ９、Ｆ１２、Ｐ１５、Ｆ３７、Ｋ４３、Ｅ４４、Ｒ４５、Ｆ４７、Ｓ４９、Ａ５０、Ｓ８１、Ｋ８２、Ｖ８５、Ｙ８６、Ｓ９１、Ｒ９３、Ａ９４、Ｔ９９、Ｑ１０８を含む、請求項１０の抗原結合タンパク質。
【請求項１２】
前記の合成単一ドメイン抗体が、以下の機能的な特性：
ｉ．それをＥ．ｃｏｌｉペリプラズムにおいて可溶性の単一ドメイン抗体として発現させることができる：
ｉｉ．それをＥ．ｃｏｌｉの細胞質基質において可溶性の細胞内発現抗体として発現させることができる、
ｉｉｉ．それは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ融合アッセイの還元性環境において安定である、
ｉｖ．それは、蛍光タンパク質との融合物として哺乳動物細胞株において発現させた場合に凝集しない
の１つ以上を有する、請求項１０〜１１のいずれか一項の抗原結合タンパク質。
【請求項１３】
前記のフレームワーク領域が、ラマ種のＶＨＨフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４に由来する、請求項１０〜１２のいずれか一項の抗原結合タンパク質。
【請求項１４】
前記のフレームワーク領域が、配列番号１のＦＲ１、配列番号２のＦＲ２、配列番号３のＦＲ３、及び配列番号４のＦＲ４、又は、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の各々に０、１、２若しくは３つ以下の保存的アミノ酸置換を有するその機能的変異体からなる、請求項１０〜１３のいずれか一項の抗原結合タンパク質。
【請求項１５】
合成ＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸残基が、
ＣＤＲ１の１位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ又はＤ；
ＣＤＲ１の２位には：Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ｔ又はＴ；
ＣＤＲ１の３位には：Ｙ、Ｓ、Ｆ又はＷ；
ＣＤＲ１の４位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＮ；
ＣＤＲ１の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ又はＬ；
ＣＤＲ１の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ又はＥ;
ＣＤＲ１の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ又はＶ；
ＣＤＲ２の１位には：Ｒ、Ｓ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ又はＹ；
ＣＤＲ２の２位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ又はＹ；
ＣＤＲ２の３位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｑ、Ｐ；
ＣＤＲ２の４位には：Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｎ又はＤ；
ＣＤＲ２の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ又はＭ；
ＣＤＲ２の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ又はＫ;
ＣＤＲ２の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、又はＶ
であり、ＣＤＲ３のアミノ酸配列が、以下のアミノ酸：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ、Ｍの１つ以上の中から選択された９〜１８個のアミノ酸を含む、請求項１０〜１４のいずれか一項の抗原結合タンパク質。
【請求項１６】
タンパク質をプロテアソームに標的化させるためのＦボックスドメインをさらに含む、請求項１０〜１５のいずれか一項の抗原結合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、非常に安定な合成単一ドメイン抗体骨格の同定、及び、合成単一ドメイン抗体ライブラリーの作成におけるその使用に関する。本発明はまた、前記の安定な単一ドメイン抗体骨格を含む抗原結合タンパク質、及び、特に治療薬としてのその使用に関する。
【０００２】
発明の背景
過去十年間にわたって抗体は、特に腫瘍学の分野において最も有望な治療アプローチの１つとしてだけでなく、研究又は診断のツールの重要な入手源としての役目が課されてきた。
【０００３】
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、ジスルフィド結合によって互いに結合した重鎖と軽鎖の２つのヘテロダイマーを含む、典型的な抗体の基本的な構造である。しかし、天然の一本鎖抗体が、ラクダ科（Hamers-Casterman et al, 1993, Nature, 363, pp446-448）及びサメ（Greenberg et al, Nature. 1995, Mar 9;374(6518):168-73）の少なくとも２つの動物群において発見されている。これらの一本鎖抗体は、軽鎖を欠失したさらに他のクラスのＩｇＧを構成する。これらの一本鎖天然抗体の認識部分は、ＶＨＨと呼ばれる重鎖の可変ドメインのみを含む。ＶＨＨは、ＩｇＧドメインの骨格を形成する４つのフレームワーク（ＦＲ）、及び、抗原との結合に関与する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。
【０００４】
ＶＨＨ骨格の多くの利点が報告されている：鎖間のジスルフィド結合がないので、それらは一般的に、還元性環境においてより溶解度が高くかつより安定である（Wesolowski et al, 2009 Med Microbiol Immunol. Aug;198(3):157-74）。ＶＨＨはまた、そのサイズが小さいために（１５kDa）、より高い溶解度、より高い発現収率、及びより高い熱安定性を有すると報告されている（Jobling SA et al, Nat Biotechnol. 2003 Jan; 21 (1): 77-80）。さらに、ＶＨＨのフレームワークはファミリーＩＩＩのヒトＶＨドメインと高い配列相同性及び構造相同性を示し（Muyldermans et al, 2001. J Biotechnol. Jun; 74 (4): 277-302）、ＶＨＨはヒトＶＨと同等な免疫原性を有するので、治療適用のための非常に興味深い薬剤の構成要素となり、その中のいくつかは第ＩＩ相臨床試験中である（Ablynx社のナノボディ（登録商標））。ヒトとは異なる１０個のアミノ酸上で、ＶＨＨの４つの特徴的なアミノ酸がフレームワーク−２領域において同定された。
【０００５】
ＶＨＨ骨格の特性は、療法に使用する上で多くの利点を有し：それらは、組織へのより良好な浸透、腎臓におけるより迅速なクリアランス、高い特異性であるがしかしまた低減された免疫原性を有する。
【０００６】
ラクダ科の動物の抗体ライブラリーは、例えば、米国特許第２００６／０２４６０５８号（カナダ国立研究機関）に記載されている。記載されているファージディスプレイライブラリーは、ラマの抗体断片、特に可変重鎖の単一ドメイン断片（ＶＨＨ及びＶＨ）を含む。ライブラリーは、免疫化されていない動物のリンパ球ゲノムを使用して作成された（ナイーブライブラリー）。得られたファージディスプレイライブラリーはまた、従来のＶＨ抗体断片の混入物も含有する。
【０００７】
米国特許第７，３７１，８４９号（Institute For Antibodies Co., Ltd）はまた、ラクダ科の動物のＶＨＨ遺伝子からＶＨＨライブラリーを作成する方法も報告する。このようなライブラリーの多様性は、ナイーブなレパートリーからＶＨＨ可変領域を単離する従来のプロセスを改良することによって得られた。しかし、これらの先行技術は、非ヒトに由来する抗体の免疫原性の問題に対処しない。それらの中のいくつかは対象の特定の標的に結合することが同定されているが、それらを、ヒト免疫系を賦活するリスクを伴うことなく、治療薬として使用するために患者に投与することはできない。
【０００８】
ラクダ科の動物の単一ドメイン抗体をヒト化するための方法は、Vincke et al, 2008, JBC Vol 284(5) pp 3273-3284に記載されている。
【０００９】
米国特許第８，３６７，５８６号は、合成抗体又はその断片のコレクションを開示している。これらの抗体は、可変重鎖と可変軽鎖の対を含み、そのフレームワーク領域には、最適な生殖系列上の遺伝子配列の一部を有する。このようなヒト配列の組込みは、治療用途の際の免疫原性のリスクを低減することを可能とする。
【００１０】
Monegal et al（2012, Dev Comp Immunol. 36(1):150-6）は、ＶＨの特徴を有する単一ドメイン抗体が、ラマのナイーブライブラリーのバイオパニングの間に繰り返し同定されることを報告する。事実、ＶＨＨの特徴よりもＶＨの特徴が、ＶＨＨナイーブライブラリーから選択された結合物質においてより頻繁に同定される。例えば、Monegal et alは、ＶＨの特徴の５％がナイーブライブラリーに見られ、一方、これらのＶＨの特徴の２０％が、抗原に対するバイオパニング後に選択された抗体の中に見られる。
【００１１】
それ故、この知見にも関わらず、高度な多様性を有し、かつ、所望の標的に対して高い親和性を有する非常に安定なヒト化単一ドメイン抗体を生じることのできる、単一ドメイン抗体ライブラリーを提供する必要性が依然として存在する。
【００１２】
したがって、本発明の１つの態様は、高度な多様性を有し、特定の抗原に対して高い親和性を有する非常に安定な単一ドメイン抗体ライブラリーを生じることのできる、非免疫原性の組換え単一ドメイン抗体ライブラリーを提供することである。別の態様は、細胞内環境において活性である単一ドメイン抗体の豊富なライブラリーを提供することである。さらに別の態様は、高い熱安定性を有する単一ドメイン抗体の豊富なライブラリーを提供することである。
【００１３】
発明の概要
本発明の目的は、合成単一ドメイン抗体ライブラリーを作成する方法によって成し遂げられ、該方法は、
ｉ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をコードする多様な核酸を、合成単一ドメイン抗体（これは本明細書において以後、「ｈｓ２ｄＡｂ」と称され得る）のそれぞれのフレームワークコード領域間に導入して、合成単一ドメイン骨格のアミノ酸配列を有する同合成単一ドメイン抗体をコードする多様な核酸を作製する工程を含み、
前記の合成単一ドメイン骨格のアミノ酸配列は、少なくとも以下の元来のラクダ科の動物のＶＨＨアミノ酸残基：Ｆ３７、Ｅ４４、Ｒ４５、Ｆ４７；及び少なくとも以下のヒト化アミノ酸残基：Ｐ１５、Ｓ４９、Ｓ８１、Ｒ９３、Ａ９４を含有し、場合によりさらに元来のラクダ科の動物のＶＨＨ残基であるＱ８、Ｑ１０８及びＴ９９を含む。
【００１４】
１つの具体的な実施態様では、合成単一ドメイン抗体（ｈｓ２ｄＡｂ）はラマ種のＶＨＨに由来し、かつ以下のヒト化アミノ酸残基：Ｆ１２、Ｐ１５、Ｓ４９、Ｓ８１、Ｋ８２、Ｖ８５、Ｙ８６、Ｓ９１、Ｒ９３及びＡ９４を含む。１つの関連した具体的な実施態様では、合成単一ドメイン抗体は、以下の全てのアミノ酸残基：Ｑ８、Ａ９、Ｆ１２、Ｐ１５、Ｆ３７、Ｋ４３、Ｅ４４、Ｒ４５、Ｆ４７、Ｓ４９、Ａ５０、Ｓ８１、Ｋ８２、Ｖ８５、Ｙ８６、Ｓ９１、Ｒ９３、Ａ９４、Ｔ９９、Ｑ１０８を含み得る。
【００１５】
１つの具体的な実施態様では、合成単一ドメイン抗体は、配列番号１のＦＲ１、配列番号２のＦＲ２、配列番号３のＦＲ３、及び配列番号４のＦＲ４からなる前記のフレームワーク領域、又は、各フレームワーク領域内に例えば１、２若しくは３つ以下の保存的アミノ酸置換を有する機能的な変異フレームワーク領域を含む。
【００１６】
１つの好ましい実施態様では、合成ＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸残基は、以下の原則：
ＣＤＲ１の１位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ又はＤ；
ＣＤＲ１の２位には：Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ｔ又はＴ；
ＣＤＲ１の３位には：Ｙ、Ｓ、Ｆ又はＷ；
ＣＤＲ１の４位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＮ；
ＣＤＲ１の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ又はＬ；
ＣＤＲ１の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ又はＥ;
ＣＤＲ１の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ又はＶ；
ＣＤＲ２の１位には：Ｒ、Ｓ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ又はＹ；
ＣＤＲ２の２位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ又はＹ；
ＣＤＲ２の３位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｑ、Ｐ；
ＣＤＲ２の４位には：Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｎ又はＤ；
ＣＤＲ２の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ又はＭ；
ＣＤＲ２の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ又はＫ;
ＣＤＲ２の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、又はＶ
によって決定される。
【００１７】
前の実施態様と合わせられ得る１つの関連した実施態様では、前記のＣＤＲ３のアミノ酸配列は、９〜１８個のアミノ酸を含む。前の実施態様と合わせられ得る１つの関連した実施態様では、前記のＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ、Ｍの１つ以上の中から選択されたアミノ酸残基を含む。
【００１８】
本発明はまた、上記の方法によって得ることができ、かつ、少なくとも３×１０９個の明確に異なる単一ドメイン抗体コード配列を含む、合成単一ドメイン抗体ライブラリーに関する。
【００１９】
本発明はさらに、対象の標的、例えばヒトタンパク質に結合する合成単一ドメイン抗体を同定するためのスクリーニング法、例えばファージディスプレイにおける、前記の合成単一ドメイン抗体ライブラリーの使用に関する。
【００２０】
最後に、本発明は、以下の式：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の合成単一ドメイン抗体を含む抗原結合タンパク質を扱い、該フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４は、少なくとも以下の元来のラクダ科の動物のＶＨＨアミノ酸残基：Ｆ３７、Ｅ４４、Ｒ４５、Ｆ４７、及び少なくとも以下のヒト化アミノ酸残基：Ｐ１５、Ｓ４９、Ｓ８１、Ｒ９３、Ａ９４を含有する。該フレームワーク領域はさらに、少なくとも以下のアミノ酸残基：Ｑ８、Ｑ１０８及びＴ９９を含有し得る。１つの好ましい実施態様では、抗原結合タンパク質は、少なくとも以下の特定のアミノ酸残基：Ｑ８、Ａ９、Ｆ１２、Ｐ１５、Ｆ３７、Ｋ４３、Ｅ４４、Ｒ４５、Ｆ４７、Ｓ４９、Ａ５０、Ｓ８１、Ｋ８２、Ｖ８５、Ｙ８６、Ｓ９１、Ｒ９３、Ａ９４、Ｔ９９、及びＱ１０８の組合せを有する、合成単一ドメイン抗体を含む。
【００２１】
前の実施態様と合わせられ得る１つの具体的な実施態様では、抗原結合タンパク質は、以下の機能的特性の１つ以上を有する合成単一ドメイン抗体を含む：
ａ）それをＥ．ｃｏｌｉペリプラズムにおいて可溶性の単一ドメイン抗体として発現させることができる、
ｂ）それをＥ．ｃｏｌｉ、酵母又は他の真核生物の細胞質基質において可溶性の細胞内発現抗体として発現させることができる、
ｃ）それは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ融合アッセイに示されているような還元性環境において安定である、
ｄ）それは、例えば融合タンパク質（例えば蛍光タンパク質との融合物）として哺乳動物細胞株において発現させた場合に凝集しない。
【００２２】
１つの好ましい実施態様では、抗原結合タンパク質のフレームワーク領域は、配列番号１のＦＲ１、配列番号２のＦＲ２、配列番号３のＦＲ３、及び配列番号４のＦＲ４からなるラマ種のＶＨＨのフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４、又は、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の各々に例えば０、１、２若しくは３つ以下の保存的アミノ酸置換を有するその機能的な変異体に由来する。
【００２３】
前の実施態様と合わせられ得る別の好ましい実施態様では、合成ＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸残基は、以下のように分配され：
ＣＤＲ１の１位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ又はＤ；
ＣＤＲ１の２位には：Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ｔ又はＴ；
ＣＤＲ１の３位には：Ｙ、Ｓ、Ｓ、Ｓ、Ｆ又はＷ；
ＣＤＲ１の４位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＮ；
ＣＤＲ１の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ又はＬ；
ＣＤＲ１の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ又はＥ;
ＣＤＲ１の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ又はＶ；
ＣＤＲ２の１位には：Ｒ、Ｓ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ又はＹ；
ＣＤＲ２の２位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ又はＹ；
ＣＤＲ２の３位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｑ、Ｐ；
ＣＤＲ２の４位には：Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｎ又はＤ；
ＣＤＲ２の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ又はＭ；
ＣＤＲ２の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ又はＫ;
ＣＤＲ２の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、又はＶ、
ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ、Ｍの１つ以上の中から選択された９〜１８個のアミノ酸を含む。
【００２４】
発明の詳細な説明
本明細書では、合成単一ドメイン抗体又はその断片におけるアミノ酸残基の位置は、本明細書において以後に示されているようにＫａｂａｔの番号付け命名法に従って示される。
【００２５】
【表１】
2019194237.tif 000002
【００２６】
本発明は、合成単一ドメイン抗体ライブラリーを作成する方法を提供し、該方法は、
ｉ．ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をコードする多様な合成核酸を、合成単一ドメイン抗体のそれぞれのフレームワークコード領域間に導入して、合成単一ドメイン抗体骨格のアミノ酸配列を有する多様な同合成単一ドメイン抗体をコードする核酸を作製する工程を含み、
前記の合成単一ドメイン骨格のアミノ酸配列は、少なくとも以下の元来のラクダ科の動物のアミノ酸残基：Ｆ３７、Ｅ４４、Ｒ４５、Ｆ４７；及び、少なくとも以下のヒト化アミノ酸残基：Ｐ１５、Ｓ４９、Ｓ８１、Ｒ９３、Ａ９４を含有し、場合によりさらに、元来のラクダ科の動物のＶＨＨ残基のＱ８、Ｑ１０８、及びＴ９９を含む。
【００２７】
本発明の合成単一ドメイン抗体骨格
本発明は、非常に安定な単一ドメイン抗体骨格を得るための、単一ドメイン抗体のフレームワーク領域における独特な特色の同定、及び、合成単一ドメイン抗体ファージディスプレイライブラリーなどの合成単一ドメイン抗体ライブラリーを作成する際のその使用に関する。前記の独特な骨格を有する、結果として得られたｈｓ２ｄＡｂは非常に安定で、かつ免疫原性のリスクが低い。
【００２８】
ライブラリーを作成するための出発物質として、単一ドメイン抗体をコードする核酸が提供され得る。
【００２９】
本明細書において使用される「単一ドメイン抗体」という用語は、重鎖に由来する単一のモノマーの可変抗体ドメインからなる、僅か１２〜１５kDaの分子量を有する抗体断片を指す。該単一ドメイン抗体は、軽鎖を欠失した天然の抗体断片、例えば、ラクダ科の動物の抗体に由来するいわゆるＶＨＨ抗体、又はサメ種の抗体に由来するいわゆるＶＮＡＲ断片から誘導され得る。該単一ドメイン抗体はまた、特定の以下の突然変異：Ｆ３７、Ｅ４４、Ｒ４５及びＦ４７を有するヒト抗体からも誘導され得る。したがって、単一ドメイン抗体は、３つの超可変ＣＤＲ領域の間に配置された少なくとも４つのフレームワーク領域を含有し、結果として、以下の典型的な抗体可変ドメイン構造：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４が得られる。該単一ドメインは、抗体の軽鎖可変領域と相互作用しないで、重鎖と軽鎖の従来のヘテロダイマーの抗原に結合するＶＨ構造を形成する。
【００３０】
本明細書において使用される「合成」という用語は、このような抗体が天然の抗体断片から得られておらず、人工的なコード配列を含む組換え核酸から産生されたことを意味する。
【００３１】
特に、本発明の合成単一ドメイン抗体ライブラリーは、人工的なフレームワーク及びＣＤＲコード配列の合成によって作成された。免疫化されていないラマ動物のナイーブレパートリーの増幅によって得られたライブラリーとは異なり、本発明の合成単一ドメイン抗体ライブラリーは従来のＶＨ抗体を含有しない。
【００３２】
有利には、本発明の合成単一ドメイン抗体ライブラリーの１つの好ましい実施態様では、全ての単一ドメイン抗体クローンが同じフレームワーク領域を含有し、よって、独特な合成単一ドメイン抗体骨格が得られる。
【００３３】
本明細書において使用される「骨格」という用語は、本発明のライブラリーの合成単一ドメイン抗体の４つのフレームワーク領域を指す。典型的には、本発明のライブラリーの全ての単一ドメイン抗体は同じ骨格アミノ酸配列を有するが、そのＣＤＲは異なり得る（各ライブラリーの多様性はＣＤＲ領域にのみ存する）。
【００３４】
本発明に記載の合成単一ドメイン抗体骨格は、少なくとも以下の元来のラクダ科の動物のＶＨＨアミノ酸残基：Ｆ３７、Ｅ４４、Ｒ４５、Ｆ４７；及び、少なくとも以下のヒト化アミノ酸残基：Ｐ１５、Ｓ４９、Ｓ８１、Ｒ９３、Ａ９４を含有する。本発明の該合成単一ドメイン骨格は、場合によりさらに、元来のラクダ科の動物のＶＨＨ残基であるＱ８、Ｑ１０８及びＴ９９を含み得る。このような独特な特色は、免疫原性のリスクの低い非常に安定な合成単一ドメイン抗体を与える。
【００３５】
１つの具体的な実施態様では、合成単一ドメイン抗体骨格は、ラマ種の骨格の抗体のＶＨＨのコード配列を突然変異させて、アミノ酸配列中に少なくとも以下のヒト化アミノ酸残基：Ｐ１５、Ｓ４９、Ｓ８１、Ｒ９３、Ａ９４、好ましくは以下のヒト化アミノ酸残基：Ｆ１２、Ｐ１５、Ｓ４９、Ｓ８１、Ｋ８２、Ｖ８５、Ｙ８６、Ｓ９１、Ｒ９３及びＡ９４を得ることによって得られる。
【００３６】
前の実施態様と合わせられ得る１つの具体的な実施態様では、合成単一ドメイン抗体の骨格は、
（ｉ）生殖系列上のラマＦＲ２アミノ酸配列と同一なＦＲ２アミノ酸配列；
（ｉｉ）生殖系列上のヒトＦＲ３（ＶＨ３）アミノ酸配列と同一なＦＲ３アミノ酸配列；及び
（ｉｉｉ）生殖系列上のラマＦＲ４アミノ酸配列と同一なＦＲ４アミノ酸配列
を含む。
【００３７】
前の実施態様と合わせられ得る１つの具体的な実施態様では、よって、合成単一ドメイン抗体の骨格は、以下の特定のアミノ酸残基の組合せを含む：Ｑ８、Ａ９、Ｆ１２、Ｐ１５、Ｆ３７、Ｋ４３、Ｅ４４、Ｒ４５、Ｆ４７、Ｓ４９、Ａ５０、Ｓ８１、Ｋ８２、Ｖ８５、Ｙ８６、Ｓ９１、Ｒ９３、Ａ９４、Ｔ９９及びＱ１０８。
【００３８】
別の具体的な実施態様では、合成単一ドメイン抗体の骨格は、配列番号１のＦＲ１、配列番号２のＦＲ２、配列番号３のＦＲ３、及び配列番号４のＦＲ４からなる前記のフレームワーク領域、又は、各フレームワーク領域内に、より好ましくは唯１つのフレームワーク領域内に、例えば１、２若しくは３つ以下の保存的なアミノ酸置換を有する機能的な変異フレームワーク領域を含む。
【００３９】
合成単一ドメイン抗体の骨格の一例を図１に示す。
【００４０】
保存的なアミノ酸の置換は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電の極性側鎖を有するアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
【００４１】
別の実施態様では、合成単一ドメイン抗体の骨格は、それぞれ配列番号１〜４に対して少なくとも９０％、好ましくは９５％の同一率を有する、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４フレームワーク領域の機能的変異体を含む。
【００４２】
本明細書において使用される２つの配列間の同一率は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要がある、ギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一位置の数の関数（すなわち、同一％＝同一位置の数／位置の総数×１００）である。２つの配列間の配列の比較及び同一率の決定は、下記されているような数学的アルゴリズムを使用して成し遂げられ得る。
【００４３】
２つのアミノ酸配列間の同一率は、ＡＬＩＧＮプログラムに組み込まれたE. Myers及びW. Miller（Comput. Appl. Biosci. 4: 1 1-17, 1988）のアルゴリズムを使用して決定され得る。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一率は、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれたNeedleman及びWunsch（J. Mol. Biol. 48:443- 453, 1970）のアルゴリズムを使用して決定され得る。同一率を決定するためのさらに別のプログラムは、独立型プログラムとして又はウェブサーバー（http://www.clustal.org/を参照）を介して利用できるＣＬＵＳＴＡＬ（M. Larkin ef a/. , Bioinformatics 23:2947-2948, 2007;D. Higgins and P. Sharpによって初めて記載、Gene 73:237-244, 1988）である。
【００４４】
機能的変異体を、本発明の該合成単一ドメイン骨格の有利な特性を保持するその能力について試験し得る。特に、それらを、以下の特性の少なくとも１つ以上を保持するその能力について試験し得る：
ｉ．それをＥ．ｃｏｌｉペリプラズムにおいて可溶性の単一ドメイン抗体として発現させることができる、
ｉｉ．それをＥ．ｃｏｌｉ、酵母又は他の真核生物の細胞質基質において可溶性の細胞内発現抗体として発現させることができる、
ｉｉｉ．それは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ融合アッセイの還元性環境において安定である、
ｉｖ．それは、例えば融合タンパク質（例えば蛍光タンパク質との融合物）として哺乳動物細胞株において発現させた場合に凝集しない。
【００４５】
上記の特性を試験するためのアッセイを実施例に記載する。
【００４６】
例えば、基準の合成単一ドメイン抗体のコード配列は、基準のＣＤＲコード配列（例えば配列番号９のクローンＤ１０のＣＤＲ）を、試験しようとする変異骨格コード配列（配列番号１〜４に対して相同な配列を有する）に移植することによって構築される。この基準の合成単一ドメイン抗体のコード配列は、上記の特性についてアッセイされることのできる基準の合成単一ドメイン抗体を作製することを可能とする。
【００４７】
選択された単一ドメイン抗体骨格へのＣＤＲの多様性の導入
特にＣＤＲコード配列の無作為な合成又は指向的な合成によって、抗体ライブラリーにおいてＣＤＲの多様性を生じさせ、これを対応するフレームワーク配列にクローニングするための方法は、当技術分野において広く記載されている。
【００４８】
本発明の合成単一ドメイン抗体ライブラリーは、例えば、Lindner, T., H. Kolmar, U. Haberkorn、及びW. Mier. 2011. Molecules. 16:1625-1641に記載のように、高度な多様性を有するＣＤＲを独特な選択された骨格配列に導入することによって同じように作成される。
【００４９】
本発明の１つの好ましい実施態様では、合成ＣＤＲ１及びＣＤＲ２の各アミノ酸配列の位置は、ヒトレパートリーにおけるＣＤＲの天然の多様性を模倣するように合理的に設計される。
【００５０】
システインは、細胞内での発現及び機能を妨害する可能性があるそのチオール基のために、自発的に回避される。その上、アルギニン及び疎水性残基も、結果として生じる抗体の高い凝集リスクのために回避され得る。プロリンの割合も低いことが好ましい。なぜなら、それはＣＤＲに、より多くの多様性を与えるからである。好ましくは、セリン、トレオニン及びチロシンは、エピトープとの結合に関与しているので、３つ全てのＣＤＲにおいて最も頻繁に出現する残基である。アスパラギン酸及びグルタミン酸も、可溶性を高めるためにいくつかの位置において豊富であり得る。ＣＤＲ３配列では、長さが、様々なエピトープの形状、特に空洞に結合する能力に影響を及ぼし得る。それ故、様々な長さのＣＤＲ３配列がライブラリーに導入され得る。
【００５１】
１つの具体的な実施態様では、当業者は、以下の原則：
ＣＤＲ１の１位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ又はＤ；
ＣＤＲ１の２位には：Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ｔ又はＴ；
ＣＤＲ１の３位には：Ｙ、Ｓ、Ｆ又はＷ；
ＣＤＲ１の４位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＮ；
ＣＤＲ１の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ又はＬ；
ＣＤＲ１の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ又はＥ;
ＣＤＲ１の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ又はＶ；
ＣＤＲ２の１位には：Ｒ、Ｓ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ又はＹ；
ＣＤＲ２の２位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ又はＹ；
ＣＤＲ２の３位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｑ、Ｐ；
ＣＤＲ２の４位には：Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｎ又はＤ；
ＣＤＲ２の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ又はＭ；
ＣＤＲ２の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ又はＫ;
ＣＤＲ２の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、又はＶ
に従って合成ＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸残基を選択し得る。
【００５２】
さらに、別の具体的な実施態様では、ＣＤＲ３アミノ酸配列は、以下のアミノ酸：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ、Ｍの１つ以上の中から選択された９〜１８個のアミノ酸を含む。
【００５３】
上記の出現の原則は、本発明の好ましいライブラリーを作成するための指針として使用されるが、異なる出現の原則を有する他のライブラリーも、本発明の有利な合成単一ドメイン抗体骨格を含有している限り、本発明の一部である。
【００５４】
具体的な実施態様では、ライブラリーのクローンの有意な割合のみが、上記の出現の原則に厳密に従い得る。例えば、統計学的には、ライブラリーのクローンの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、又は少なくとも９０％が、上記のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の位置におけるアミノ酸残基の出現の原則に従う。
【００５５】
これらのアミノ酸位置の出現頻度に配慮するために、及びフレーム内での終止又はシステインの出現を回避するために、又はフレームシフトを減らすために、進歩した遺伝子合成アプローチが好ましくは使用される。これらの方法は、Van den Brulle et al., 2008, Biotechniques 45(3): 340-3に記載のような二本鎖ＤＮＡトリプルブロック、トリヌクレオチド合成、又は他のコドンの制御された、より一般的には位置の制御された縮重合成アプローチを包含するがこれらに限定されない。
【００５６】
具体的な実施態様では、コドンの偏りはさらに、例えば、周知の方法を使用して、宿主細胞種、例えば哺乳動物宿主細胞での発現のために最適化され得る。
【００５７】
１つの具体的な実施態様では、コード配列は、望ましくない制限酵素部位、例えば、コード配列を適切なクローニングベクター又は発現ベクターにクローニングするために使用される制限酵素部位を含有しないように設計される。
【００５８】
結果として得られた多様なコード配列を、抗体ライブラリーのための適切な発現ベクター又はクローニングベクターに導入する。具体的な実施態様では、発現ベクターはプラスミドである。別の好ましい実施態様では、発現ベクターは、ファージディスプレイライブラリーを作成するのに適している。２種類の異なるベクター（ファージミドベクター及びファージベクター）を、ファージディスプレイライブラリーの作成のために使用し得る。
【００５９】
ファージミドは、プラスミドの複製起点を含有する線維状ファージ（Ｆｆ−ファージに由来）ベクターから得られる。ファージミドの基本成分は主に、プラスミドの複製起点、選択マーカー、遺伝子間領域（ＩＧ領域、通常、パッケージング配列とマイナス鎖及びプラス鎖の複製起点とを含有する）、ファージコートタンパク質の遺伝子、制限酵素の認識部位、プロモーター、及びシグナルペプチドをコードするＤＮＡセグメントを含む。さらに、分子タグを含めて、ファージミドをベースとしたライブラリーのスクリーニングを容易にすることができる。ファージミドを、Ｒ４０８、Ｍ１３ＫＯ７、及びＶＣＳＭ１３（Stratagene）などのヘルパーファージと同時感染させることによって、Ｆｆファージと同じ形態を有する線維状ファージ粒子へと変換させることができる。ファージベクターの一例は、ｆｄファージゲノムと、ファージゲノムの複製起点の近くに挿入されたＴｎ１０セグメントとからなる、Ｆｄ−ｔｅｔ（Zacher et al, gene, 1980, 9, 127-140）である。ファージミドベクターに使用するためのプロモーターの例としては、ＰｌａｃＺ又はＰＴ７が挙げられるがこれらに限定されず、シグナルペプチドの例としては、ｐｅｌＢリーダー、ｇＩＩＩ、ＣＡＴリーダー、ＳＲＰ又はＯｍｐＡシグナルペプチドが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６０】
他のファージディスプレイ法は、Ｔ４又はＴ７のような溶菌ファージを使用する。ディスプレイライブラリーを作成するために、ファージ以外のベクター、例えば細菌細胞でのディスプレイ（Daugherty et al., 1999  Protein Eng. Jul;12(7):613-21., Georgiou et al., 1997 Nat Biotechnol. 1997 Jan;15(1):29-34）、酵母細胞でのディスプレイ（Boder and Wittrup, Nat Biotechnol. 1997 Jun;15(6):553-7）、又はリボソームでのディスプレイのためのベクター（Zahnd C, Amstutz P, Pluckthun A. Nat Methods. 2007 Mar;4(3):269-79）も使用され得る。哺乳動物細胞上でのＤＮＡディスプレイ（Eldridge et al., Protein Engineering, Design & Selection vol. 22 no. 11 pp. 691-698, 2009）及び表面ディスプレイ（Rode HJ, et al. Biotechniques. 1996 Oct;21(4):650, 652-3, 655-6, 658）も報告されている。酵母ツーハイブリッド法などのディスプレイではない方法も、ライブラリーから関連した結合物質を選択するのに使用され得る（Visintin et al., 1999 Proc Natl Acad Sci U S A 96, 11723-11728）。
【００６１】
１つの好ましい実施態様では、空ベクターの発生を回避するために、自殺遺伝子を有するクローニングベクターにおける組換えコード配列の正の選択が適用される（例えば、Philippe Bernard, 1996, BioTechniques, Vol 21, No 2 “Positive Selection of Recombinant DNA by CcdB”を参照）。
【００６２】
好ましくは、抗体ライブラリーの作成のために設計されたＣＤＲアミノ酸残基の全ての可能な組合せによって計算された理論的な多様性は、少なくとも１０１１個又は少なくとも１０１２個の独特な配列である。
【００６３】
本発明の合成単一ドメイン抗体ライブラリー及びその使用
結果として、別の態様によると、本発明は、以前の方法によって得ることのできるか又は得られた合成単一ドメイン抗体ライブラリーに関する。
【００６４】
したがって、本明細書において使用される「合成単一ドメイン抗体ライブラリー」という用語は、場合によりクローニングベクター又は発現ベクターに含まれた、高度な多様性を有する該合成単一ドメイン抗体コード配列を含む、核酸ライブラリーを包含する。「合成単一ドメイン抗体ライブラリー」という用語はさらに、該核酸ライブラリーで形質転換された任意の宿主細胞又は生物、より具体的には、該核酸ライブラリーで、又は該核酸ライブラリーを含有するバクテリオファージ若しくはウイルスで形質転換された細菌、酵母、又は線維状真菌、又は哺乳動物細胞を含む。「合成単一ドメイン抗体ライブラリー」という用語はさらに、該核酸ライブラリーによってコードされる多様な抗体の対応する混合物を含む。本明細書において使用される「クローン」という用語は、核酸、宿主細胞、又は単一ドメイン抗体のいずれであれ、該抗体ライブラリーの独特なそれぞれの個体を指す。
【００６５】
本発明の１つの具体的な実施態様では、本発明の合成単一ドメイン抗体ライブラリーは少なくとも３×１０９個の多様なクローンを含む。
【００６６】
このライブラリーは、対象の標的に特異的に結合する合成単一ドメイン抗体を同定するためのスクリーニング法に使用され得る。対象の標的に対する特異的な親和性を有する結合物質を同定するための任意の公知のスクリーニング法を、本発明の合成単一ドメイン抗体ライブラリーに使用し得る。このような方法としては、ファージディスプレイ技術、細菌細胞でのディスプレイ、酵母細胞でのディスプレイ、哺乳動物細胞でのディスプレイ又はリボソームでのディスプレイが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６７】
好ましくは、スクリーニング法はファージディスプレイである。
【００６８】
好ましくは、対象の標的は治療標的であり、合成単一ドメイン抗体ライブラリーを使用して、該治療標的に特異的に結合する合成単一ドメイン抗体を同定する。具体的な実施態様では、対象の標的は、少なくとも１つの抗原性決定基を含む。具体的な実施態様では、標的は糖類又は多糖類、タンパク質又は糖タンパク質、脂質である。１つの具体的な実施態様では、前記の対象の標的は、植物、酵母、真菌、昆虫、哺乳動物、又は他の真核細胞を起源とする。別の具体的な実施態様では、前記の対象の標的は、細菌、原虫、又はウイルスを起源とする。
【００６９】
１つの具体的な実施態様では、「対象の標的に特異的に結合する単一ドメイン抗体」は、１mM以下、１００μM以下、１０μM以下のＫＤで対象の標的に結合する単一ドメイン抗体を指すことを意味する。これは、該単一ドメイン抗体が他の抗原にも結合することを除外しない。
【００７０】
本明細書において使用される「ＫＤ」という用語は、ＫｄとＫａの比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られた解離定数を指すことを意味し、モル濃度−１（Ｍ−１）として表現される。抗体のＫＤ値は、当技術分野において十分に確立された方法を使用して決定され得る。抗体のＫＤを決定するための方法は、表面プラズモン共鳴を使用することによるか、又はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム若しくはＰｒｏｔｅｏｎ（登録商標）などのバイオセンサーシステムを使用することによる。
【００７１】
本発明の抗原結合タンパク質
本発明の合成単一ドメイン抗体ライブラリーの高度な多様性を考慮して、当業者は、ファージディスプレイなどの従来のスクリーニング法によって、対象の標的に対して高い親和性及び高い特異性を有する合成単一ドメイン抗体を得ることができる。
【００７２】
結果として得られた合成単一ドメイン抗体は次いで、適切な抗原結合タンパク質を生じるために修飾され得る。特に、ＣＤＲ残基を、例えば対象の標的に対する抗体の親和性を高めるために、そのフォールディング又はその産生を高めるために、当技術分野において公知の技術（突然変異誘発、親和性成熟）を使用して修飾し得る。
【００７３】
したがって、本発明の別の態様はさらに、以下の式：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の合成単一ドメイン抗体を含む抗原結合タンパク質に関し、該フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４は、少なくとも以下の元来のラクダ科の動物のＶＨＨアミノ酸残基：Ｆ３７、Ｅ４４、Ｒ４５、Ｆ４７、及び；少なくとも以下のヒト化アミノ酸残基：Ｐ１５、Ｓ４９、Ｓ８１、Ｒ９３、Ａ９４を含有する。
【００７４】
１つの実施態様では、フレームワーク領域はさらに、少なくとも以下のアミノ酸残基：Ｑ８、Ｑ１０８及びＴ９９を含有する。別の実施態様では、合成単一ドメイン抗体は、少なくとも以下のアミノ酸残基の特定の組合せを含む：Ｑ８、Ａ９、Ｆ１２、Ｐ１５、Ｆ３７、Ｋ４３、Ｅ４４、Ｒ４５、Ｆ４７、Ｓ４９、Ａ５０、Ｓ８１、Ｋ８２、Ｖ８５、Ｙ８６、Ｓ９１、Ｒ９３、Ａ９４、Ｔ９９、Ｑ１０８。
【００７５】
１つの好ましい実施態様では、フレームワーク領域は、ラマ種のＶＨＨのフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４から得られる。別の具体的な実施態様では、単一ドメイン抗体の骨格は、
（ｉ）生殖系列上のラマＦＲ２アミノ酸配列と同一なＦＲ２アミノ酸配列；
（ｉｉ）生殖系列上のＦＲ３（ＶＨ３）アミノ酸配列と同一なＦＲ３アミノ酸配列；及び
（ｉｉｉ）生殖系列上のラマＦＲ４アミノ酸配列と同一なＦＲ４アミノ酸配列
を含む。
【００７６】
１つの好ましい実施態様では、合成単一ドメイン抗体は、以下の特色のいずれかを含む：
（ｉ）配列番号１のフレームワーク領域ＦＲ１、配列番号２のＦＲ２、配列番号３のＦＲ３、及び配列番号４のＦＲ４、
（ｉｉ）１、２又は３個以下のアミノ酸保存的置換を有し、有利な合成単一ドメイン特性を保持した、機能的な変異フレームワーク領域、
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１〜４に対して少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一率を有し、有利な合成単一ドメイン特性を保持した、機能的な変異フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４。
【００７７】
典型的には、フレームワーク領域内の１つ以上のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーに由来する他のアミノ残基で置換してもよく、新規なポリペプチド変異体を、本明細書に記載の機能的アッセイを使用して、保持された有利な特性について試験することができる。
【００７８】
このような有利な特性は、以下の特性の１つ以上である：
ｉ．それをＥ．ｃｏｌｉペリプラズムにおいて可溶性の単一ドメイン抗体として発現させることができる
典型的には、ｐｅｌＢリーダーペプチドを用いて５mg/Lを超える収率が好ましくはＥ．ｃｏｌｉ株において得られる。
ｉｉ．それをＥ．ｃｏｌｉの細胞質基質において可溶性の細胞内発現抗体として発現させることができる
例えば、抗体は、Ｔ７プロモーターを用いて５０mg/Lを超える収率でＥ．ｃｏｌｉのＢＬ２１株（ＤＥ３）において発現させることができる。
ｉｉｉ．それは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ融合アッセイにおいて示されるように還元性環境において安定である
上記の特性についての機能的アッセイが実施例に記載されている。Ｃ末端タグとしてクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼと融合した本発明の合成単一ドメイン抗体を含有する、該抗原結合タンパク質を発現している細菌細胞は、クロラムフェニコールに対して、特に培養培地中で３００μg/mlより高いクロラムフェニコール濃度で耐性であろう。
ｉｖ．それは、蛍光タンパク質との融合物として哺乳動物細胞株において発現させた場合に凝集しない
好ましくは、合成単一ドメイン抗体を含有する抗原結合タンパク質が蛍光タンパク質との融合物として発現される場合に、凝集は全く検出されないだろう。
【００７９】
好ましくは、合成ＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸残基は：
ＣＤＲ１の１位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ又はＤ；
ＣＤＲ１の２位には：Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ｔ又はＴ；
ＣＤＲ１の３位には：Ｙ、Ｓ、Ｓ、Ｓ、Ｆ又はＷ；
ＣＤＲ１の４位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＮ；
ＣＤＲ１の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ又はＬ；
ＣＤＲ１の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ又はＥ;
ＣＤＲ１の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ又はＶ；
ＣＤＲ２の１位には：Ｒ、Ｓ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ又はＹ；
ＣＤＲ２の２位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ又はＹ；
ＣＤＲ２の３位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｑ、Ｐ；
ＣＤＲ２の４位には：Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｎ又はＤ；
ＣＤＲ２の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ又はＭ；
ＣＤＲ２の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ又はＫ;
ＣＤＲ２の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、又はＶ
であり得；
ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ、Ｍの１つ以上の中から選択された９〜１８個のアミノ酸を含む。
【００８０】
したがって、１つの好ましい実施態様では、本発明の抗原結合タンパク質は特に、一般式ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の合成単一ドメイン抗体からなる。このような実施態様では、より好ましくは、ＦＲ１は、配列番号１、又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有する配列番号１の機能的変異体であり、ＦＲ２は、配列番号２、又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有する配列番号２の機能的変異体であり、ＦＲ３は、配列番号３、又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有する配列番号３の機能的変異体であり、ＦＲ４は、配列番号４、又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有する配列番号４の機能的変異体であり、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、以下のようなアミノ酸残基を有し：
ＣＤＲ１の１位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ又はＤ；
ＣＤＲ１の２位には：Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ｔ又はＴ；
ＣＤＲ１の３位には：Ｙ、Ｓ、Ｓ、Ｓ、Ｆ又はＷ；
ＣＤＲ１の４位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＮ；
ＣＤＲ１の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ又はＬ；
ＣＤＲ１の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ又はＥ;
ＣＤＲ１の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ又はＶ；
ＣＤＲ２の１位には：Ｒ、Ｓ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ又はＹ；
ＣＤＲ２の２位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ又はＹ；
ＣＤＲ２の３位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｑ、Ｐ；
ＣＤＲ２の４位には：Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｎ又はＤ；
ＣＤＲ２の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ又はＭ；
ＣＤＲ２の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ又はＫ;
ＣＤＲ２の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、又はＶ、
ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ、Ｍの１つ以上の中から選択された９〜１８個のアミノ酸を含む。
【００８１】
本発明の別の態様は、本発明の抗原結合タンパク質をコードする核酸分子に関する。したがって、本発明は、抗原結合タンパク質の少なくとも該合成単一ドメイン抗体部分をコードする単離された核酸を提供する。
【００８２】
核酸は、完全な細胞中、細胞溶解液中に存在しても、又は、部分的に精製された形若しくは実質的に純粋な形の核酸であってもよい。核酸は、アルカリ／ＳＤＳによる処理、ＣｓＣＩのバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当技術分野において周知のその他の技術をはじめとする標準的な技術によって、他の細胞性成分又は他の混入物、例えば他の細胞性核酸又はタンパク質から精製された場合に、「単離された」又は「実質的に純粋となる」。F. Ausubel, ef al., ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照されたい。本発明の核酸は、例えばＤＮＡ又はＲＮＡであり得、イントロン配列を含有していても含有していなくてもよい。
【００８３】
１つの実施態様では、核酸はＤＮＡ分子である。核酸は、ファージディスプレイベクターなどのベクターに、又は組換えプラスミドベクターに存在し得る。したがって、１つの具体的な実施態様では、本発明は、単離された核酸、或いは、以下の核酸配列：配列番号１〜４のそれぞれのフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４をコードする配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は、配列番号１〜４のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４の機能的変異体をコードする前記の配列番号５〜８に対して少なくとも９０％の同一率を有する変異体の対応する配列、の少なくとも１つ以上を含む、クローニングベクター若しくは発現ベクターを提供する。
【００８４】
上記及び実施例に記載のような抗原結合タンパク質をコードするＤＮＡ断片をさらに、標準的な組換えＤＮＡ技術によって操作して、例えば、発現系における適切な分泌のための任意のシグナル配列、さらなる精製工程のための任意の精製タグ及び切断可能なタグを含めることができる。これらの操作で、ＤＮＡ断片は、別のＤＮＡ分子に、又は別のタンパク質、例えば精製／分泌タグ若しくは可動性リンカーなどをコードする断片に作動可能に連結される。この文脈において使用される「作動可能に連結」という用語は、２つのＤＮＡ断片が機能的に、例えば、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がフレーム内に留まるように、又は、該タンパク質が所望のプロモーターの制御下で発現されるように接続されることを意味することを意図する。
【００８５】
本発明の抗原結合タンパク質は、例えば、当技術分野において周知である組換えＤＮＡ技術と遺伝子トランスフェクション法の組合せを使用して、宿主細胞のトランスフェクトーマにおいて産生され得る。宿主細胞のトランスフェクトーマにおける本発明の組換え抗原結合タンパク質の発現及び産生のために、当業者は有利には、抗体分子又は単一ドメイン抗体分子の発現及び組換え産生に関連した彼ら自身の一般的な知識を使用することができる。
【００８６】
したがって、本発明は、核酸及び場合により分泌シグナルを含む、本発明の該抗原結合タンパク質の産生に適した組換え宿主細胞を提供する。好ましい態様では、本発明の宿主細胞は、哺乳動物細胞株である。本発明はさらに、抗原結合タンパク質の産生のための適切な条件下で宿主細胞を培養し、該タンパク質を単離することを含む、前記したような抗原結合タンパク質の産生プロセスを提供する。
【００８７】
本発明の抗原結合タンパク質を分泌するための哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ細胞、例えばR.J. Kaufman and P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621に記載のようなＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220によって記載される）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、又はMoutel, S., El Marjou, A., Vielemeyer, O., Nizak, C., Benaroch, P., Dubel, S., and Perez, F. (2009). A multi-Fc-species system for recombinant antibody production. BMC Biotechnol 9, 14に記載のようなInvivogen社のｐＦｕｓｅ発現系、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞又はヒト細胞株（例えばＰＥＲ−Ｃ６細胞株、Ｃｒｕｃｅｌｌ、又はＨＥＫ２９３細胞、Yves Durocher et al. , 2002, Nucleic acids research vol. 30, No 2 p9）が挙げられる。本発明の抗原結合タンパク質をコードする該核酸が哺乳動物の宿主細胞に導入されると、宿主細胞における組換えポリペプチドの発現又は宿主細胞が増殖している培養培地中への組換えポリペプチドの分泌及び適切なリフォールディングを可能とするに十分な時間をかけて宿主細胞を培養して、該抗原結合タンパク質を産生することによって抗原結合タンパク質は産生される。
【００８８】
その後、抗原結合タンパク質を、標準的なタンパク質精製法を使用して培養培地から回収することができる。
【００８９】
１つの具体的な実施態様では、本発明は、本発明の少なくとも２つの同一な又は異なる合成単一ドメイン抗体アミノ酸配列を含む、例えば複合体の形態での、本発明の多価抗原結合タンパク質を提供する。１つの実施態様では、多価タンパク質は、少なくとも２つ、３つ、又は４つの合成単一ドメイン抗体アミノ酸配列を含む。合成単一ドメインアミノ酸配列は、タンパク質の融合又は共有結合若しくは非共有結合を介して、互いに連結され得る。
【００９０】
別の態様では、本発明は、１つ以上の薬学的に許容されるビヒクル又は担体と一緒に製剤化された、本発明の１つ又は組合せの抗原結合タンパク質を含有する、組成物、例えば医薬組成物を提供する。
【００９１】
本発明の医薬製剤は、所望の純度を有するタンパク質を、任意選択の生理学的に許容される担体、賦形剤、又は安定化剤（Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)）と混合することによって、水溶液、凍結乾燥製剤、又は他の乾燥製剤の形態で保存用に調製され得る。
【００９２】
本発明の医薬組成物に使用され得る適切な水性及び非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）及びその適切な混合物、植物油、例えばオリーブ油、並びに注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、コーティング材料、例えばレシチンなどの使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。
【００９３】
これらの組成物はまた、補助剤、例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤を含有し得る。微生物の存在の防御は、上記の滅菌手順によって、並びに様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの封入の両方によって確実となり得る。また、等張化剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを組成物に含めることが望ましくあり得る。さらに、注射剤形の延長吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤の封入によってもたらされ得る。
【００９４】
薬学的に許容される担体は、無菌水溶液又は分散液、及び、無菌注射溶液又は分散液の即時調製のための無菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は当技術分野において公知である。どの従来の媒体又は薬剤も活性化合物と不適合性ではない限りにおいて、本発明の医薬組成物におけるその使用が考えられる。補助的な活性化合物も、組成物に取り込まれてもよい。
【００９５】
治療用組成物は、典型的には、製造及び保存の条件下で無菌かつ安定でなければならない。
【００９６】
以下において、本発明は、以下の実施例及び図面を用いて説明されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】（Ａ）クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのカルボキシ末端の融合物は、可溶性のアミノ末端のＶＨＨの選択を可能とする折りたたみレポーターである。ｐＡＯ−ＶＨＨ−ＣＡＴＨａベクターから発現された構築物の図。（Ｂ）クロラムフェニコール選択培地（Ｃａｍ）上で選択されたＶＨＨの相対的なコロニーの増殖。（Ｃ）ラマ骨格ｌｓｄＡｂと、ライブラリーｈｓ２ｄＡｂのヒト化合成骨格とのアミノ酸配列アラインメント。位置（ＩＭＧＴ番号付け）を、ＶＨＨの固有の可溶性特性についてＤ１０細胞内発現抗体骨格に由来する保存されたアミノ酸（黒色）、及びヒトの従来のＶＨ３と共に保存されたヒト化残基（灰色）に従って強調した。
【図２】（Ａ）両方の骨格を提示するファージをＥ．ｃｏｌｉにおいて産生し、上清をウェスタンブロットで抗ｐＩＩＩ抗体（Biolabs）を用いて検出した。２本のバンドが見られ、１本はｐＩＩＩについてであり、１本は単一ドメインを含む融合物についてである。（Ｂ）ドットブロットによって分析された、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞又はＣＨＯ細胞における両方の骨格の産生。上清の連続希釈液を、抗Ｈｉｓタグ抗体（Sigma）を用いて顕現させた。（Ｃ）核ラミナに特徴的な核の辺縁部の構造を標識する、両方の骨格に由来する組換え抗体を用いてのＨｅＬａ細胞の免疫蛍光。（Ｄ）ＨｅＬａ細胞に、ＧＦＰに融合させた抗ラミン抗体発現プラスミドを一過性にトランスフェクトし、生細胞を２４時間後に画像撮影した。これは、両方の合成抗体の骨格が、細胞内ラミン標的の認識を可能とすることを示した。
【図３】（Ａ）ｓ２ｄＡｂ Ｄ５は、ＨｅＬａ細胞内の微小管を免疫蛍光により染色した。細胞を固定し、ＶＨＨで染色し、これを抗Ｈｉｓタグ抗体（Sigma）及び抗マウスＣｙ３二次抗体（Jackson）によって顕現させた。Ｄ５はまた、ＨＲＰ二次抗体（Jackson）で顕現されるＨｅＬａ細胞抽出物を用いるウェスタンブロット実験においてもチューブリンを検出する。（Ｂ）ウサギＦｃに融合したＨｅｒ２上、対、等モル濃度のウサギＦｃに結合しているＨｅｒ２上での、抗Ｈｅｒ２抗体を用いてのクローンＤ１０のファージＥＬＩＳＡ。ＳＫＢＲ３ Ｈｅｒ２陽性細胞対ＭＣＦ１０Ａ Ｈｅｒ２陰性細胞上での抗Ｈｅｒ２抗体によるＨＤ１０のＦＡＣＳ分析。（Ｃ）Ｈ１２は、ＧＴＰに結合した活性化状態のＲｈｏＡ ＧＴＰアーゼにしか結合しない立体構造を認識する抗体である。ＣＢＤでタグ化されたＨ１２は、インプットとして１００μM ＧＴＰγＳ（ＧＴＰ）又は１mM ＧＤＰのいずれかをローディングされたＨｅＬａ細胞抽出物から引き出す。ウェスタンブロット実験では、両方のインプットの５％においては同じようなレベルのＲｈｏＡが顕現するが、ＣＢＤ−Ｈ１２によるプルダウンではＧＴＰのローディングされた抽出物上にしか顕現しない。Ｄ５抗チューブリン抗体は陰性対照であり、従来のＧＳＴ−ＲＢＤ（ロテキンのＲｈｏ結合ドメイン）は、活発なＲｈｏのプルダウンの陽性対照として示される。
【図４】ｈｓ２ｄＡｂの細胞内発現。（Ａ）ＨｅＬａ細胞に、ＧＦＰでタグ化したＲａｂ６プラスミド及びｍＣｈｅｒｒｙでタグ化したｈｓ２ｄＡｂ抗ＧＦＰ抗体プラスミドを同時トランスフェクトした。ｈｓ２ｄＡｂ−ｍＣｈｅｒｒｙ抗ＧＦＰ抗体はインビボにおいてその標的と相互作用し、ｍＣｈｅｒｒｙシグナルはＧＦＰ−Ｒａｂ６と完全に同じ場所に局在した。（Ｂ）ＨｅＬａ細胞にＭｙｒ−ｐａｌｍ−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミド及びｈｓ２ｄＡｂ−ＧＦＰ抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体プラスミドを同時トランスフェクトした。ｈｓ２ｄＡｂ−ＧＦＰ抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体はインビボにおいてその標的と相互作用し、形質膜に局在するｍＣｈｅｒｒｙと完全に同じ場所に局在した。（Ｃ）Ｈｅｌａ細胞（ｐ５３＋／＋）及びＵ２ＯＳ（ｐ５３−／−）細胞に、ｈｓ２ｄＡｂ−ｍＣｈｅｒｒｙ抗ｐ５３抗体又はｈｓ２ｄＡｂ−ｍＣｈｅｒｒｙ抗ラミン抗体のいずれかをトランスフェクトした。抗ラミン細胞内発現抗体は両方の細胞型を標識したが、抗ｐ５３細胞内発現抗体はｐ５３陽性細胞の核のみ標識した。
【図５】固定された抗原へのｈｓ２ｄＡｂ抗ＧＦＰ抗体、抗ｐ５３抗体、及び抗Ｈｅｒ２抗体の結合についてのセンサーグラム。様々な濃度のｈｓ２ｄＡｂを２５℃でローディングし、１：１のラングミュア相互作用モデルに当てはめた。
【００９８】
実施例
機能的アッセイ
Ｅ．ｃｏｌｉペリプラズムにおける可溶性発現
単一ドメイン抗体断片を、ｐＨＥＮ６に由来する細菌ペリプラズム発現ベクターにサブクローニングし、ｐｅｌＢ分泌配列の下流において発現させた。新たに形質転換されたコロニーを、１％グルコース及び３０μg/mlの抗生物質カナマイシンの補充されたテリフィックブロス培地中で、Ａ６００＝０．６〜０．８に達するまで増殖させた。その後、６つのＨｉｓでタグ化された抗体断片の発現を、５００μMのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを用いて２８℃で１６時間かけて誘導し、その後、遠心沈殿した。遠心分離後、細胞ペレットをトリス−ＥＤＴＡ−スクロース浸透圧ショック緩衝液中でインキュベートし、再度遠心分離にかけた。細胞溶解液を清澄にし、ポリヒスチジンタグのためにＩＭＡＣ樹脂親和性カラムにローディングした。溶出した画分を透析し、タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【００９９】
Ｅ．ｃｏｌｉの細胞質基質における細胞内発現抗体の可溶性発現
単一ドメイン抗体断片を、Ｔ７プロモーターの制御下で細菌発現ベクターにサブクローニングした。プラスミド構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。１つのコロニーを、１％グルコース及び３０μg/mlの抗生物質カナマイシンの補充されたＬＢ培地中で、Ａ６００＝０．６〜０．８に達するまで増殖させた。その後、抗体断片の発現を、５００μMのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを用いて２８℃で６時間から８時間かけて誘導し、その後、遠心沈殿した。遠心分離後、細胞ペレットを溶解し、再度遠心分離にかけた。細胞溶解液を清澄にし、ポリヒスチジンタグのためにＩＭＡＣ樹脂親和性カラムにローディングした。溶出した画分を透析し、タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１００】
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ融合アッセイ
単一ドメイン抗体断片を、ｐＡＯＣＡＴ細菌ペリプラズム発現ベクターにサブクローニングした。クロラムフェニコール耐性アッセイを、ｐＡＯＣＡＴ−ＶＨＨ融合構築物を用いて形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を使用して行なった。細菌を、カナマイシン（３５μg/mL）及びグルコース（０．２％）を含有するＬＢ ５００μＬへの接種のために使用し、３７℃で、ＯＤ６００が０．８となるまで増殖させた。ＶＨＨ−ＣＡＴ−融合タンパク質の細胞質内発現を、０．２mMのＩＰＴＧの添加によって２時間かけて誘導した。誘導期間の終了時に、４μLの細菌アリコートを、ＩＰＴＧ（０．１mM）及び０〜５００μg/mlの範囲のクロラムフェニコール漸増濃度を含有するＬＢ寒天プレート上に蒔いた。細菌を３０℃で２０時間インキュベートし、その後、コロニーの形成を定量した。耐性レベルを、様々なクロラムフェニコール濃度におけるコロニー増殖速度に従って評価した。５００μg/ml以下のコロニーを与えるいくつかのＶＨＨを、ＧＦＰ（ｎｂ ＧＦＰ４）又はラミン（Ｌａｍ）に対して生じた以前に特徴付けられた細胞内発現抗体と、並びに、熱安定性ＶＨＨ Ｒｅ３及び細胞内発現抗体ではないＣ８と比較した。上記のように２時間の間に誘導された液体培養液を連続希釈によって希釈し、２５０μg/mlのクロラムフェニコール（Ｃａｍ）を含有する寒天プレート上に１０μlをスポットし、３０℃で２０時間インキュベートした。各希釈液についてコロニーを定量し、Ｄ１０クローンで常に見られたより多くの量に対して標準化した。
【０１０１】
哺乳動物細胞発現系における凝集アッセイ
真核細胞における細胞内抗体としての機能的発現
単一ドメイン抗体断片を、蛍光タンパク質との融合物として、及びＣＭＶプロモーターの制御下で発現させるために、哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした。哺乳動物細胞株にトランスフェクトし、細胞内の蛍光を、トランスフェクトから２４時間後又は４８時間後に観察した。トランスフェクトされた細胞におけるこれらの蛍光タンパク質の１つと融合したＶＨＨの蛍光分布は、ＧＦＰ又はｍＣｈｅｒｒｙと融合していないものと比較して、均一に広がり、４８時間の構成的発現後に明白な凝集物は示されなかった。
【０１０２】
Ｆｃ融合物としての機能的分泌
プラスミドは、インターロイキン−２（ＩＬ２）シグナル配列を含有するInvivogen社（サンディエゴ、米国）のｐＦＵＳＥ−Ｆｃ２（ＩＬ２ｓｓ）（商標）シリーズをベースとし、哺乳動物細胞によるＦｃ−融合タンパク質の分泌を可能とする。ｈｓ２ｄＡｂをＩｇＧのヒンジドメインに融合させたので、Ｆｃドメインはジスルフィド結合を形成し、ｈｓ２ｄＡｂ−Ｆｃはダイマーとして発現される。それらは、原核細胞及び真核細胞の両方においてゼオシン（商標）（Ｚｅｏ）を使用して選択可能である。これらのプラスミドは、部位特異的突然変異誘発及びアダプター挿入によって改変され（Moutel S, et al. BMC Biotechnol. 2009 Feb 26;9:14. doi: 10.1186/1472-6750-9-14）、一般的な組換え抗体の大規模な選別コレクション及び発現プラスミド（例えばｐＨＥＮ、ｐＳＥＸ、ｐＨＡＬ、ｐＣＡＮＴＡＢ、ｐＨＯＧ、ｐＯＰＥ、ｐＳＴＥ）から抽出された組換え抗体の簡単な１工程のカセットクローニングが可能となった。ｓ２ｄＡｂが、そのＣ末端でヒトＩｇＧ２（及びＩｇＧ１）（ｈ）、マウスＩｇＧ２ａ（ｍ）又はウサギＩｇＧ（ｒ）Ｆｃドメイン（Ｆｃ領域は、ＩｇＧ重鎖のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインとヒンジ領域とを含む）のいずれかと融合することができる４つのプラスミドを構築した。
【０１０３】
これらの発現プラスミドを用いてＣＨＯ細胞又はＨＥＫ細胞を一過性にトランスフェクトしてから４日後、分泌された抗体は、それぞれのＦｃ種に対して指向される抗ＩｇＧ抗体を使用して入手可能であり得る。これは、多様な多重化を可能とする。
【０１０４】
酵母ツーハイブリッドシステムにおける機能的発現
抗原コード配列を、酵母ツーハイブリッドのｂａｉｔプラスミドのｌｅｘＡ（Vojtek and Hollenberg (1995). Methods Enzymol. 255:331-42）又はｇａｌ４（Fromont-Racine, M., Rain, J.C.、及びLegrain, P. (1997). Nat. Genet. 16: 277-282）にクローニングした。試験しようとするＤＮＡ結合ドメインＳＤＡＢ集団を、酵母ツーハイブリッドのｐｒｅｙプラスミドのｐＧＡＤＧＨ（Bartel, P.L., et al (1993) in Cellular interactions in development: A practical approach. ed. Hartley, D.A.. (Oxford University Press, Oxford) pp. 153-179）にＰＣＲ及びギャップ修復（Orr-Weaver, T. L. and Szostak, J. W. (1983). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4417-4421）によって導入した：ｐＨＥＮ２−３ｍｙｃプラスミドプールのＤＮＡ調製物（１つのクローンから３×１０９個まで）を調製した。ミニプレップＤＮＡを、マトリックスとしてＤＮＡ １０ngを使用してｐＦｕポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して、オリゴヌクレオチド５ｐ ８３２８ CCCACCAAACCCAAAAAAAGAGATCCTAGAACTAGCTATGGCCGGACGGGCCATGGCGGAAGTGCAGCTGCAGGCTTC（配列番号１１）及びオリゴヌクレオチド３ｐ ８３２９ ACCGGGCCTCTAGACACTAGCTACTCGAGGGGCCCCAGTGGCCCTATCTATGCGGCCGCGCTACTCACAGTTAC（配列番号１２）を用いてＰＣＲによって増幅した。チューブの数はＤＮＡ品質の必要性に依存し、必要とされる形質転換体の数に関連する。典型的には１００万個の酵母形質転換体を得るために、本発明者らは５０μlの８回のＰＣＲを行なった。
【０１０５】
【数１】
2019194237.tif 000003
【０１０６】
ＰＣＲをアガロースゲル上で確認し、酢酸アンモニウム沈降法を使用して２０倍濃縮し、水に再度懸濁する。
【０１０７】
ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩによって消化されたプラスミドｐｒｅｙ ｐＧＡＤＧＨ ８μg及び濃縮されたＰＣＲ ２μlを、古典的なＬｉＡｃ／ＰＥＧ形質転換によって酵母において形質転換する。クローンを、トリプトファン、ロイシン及びヒスチジンの除去された選択培地に広げる。この方法によって同定されたｂａｉｔ特異的クローンは、酵母細胞内において機能的であるライブラリーからの細胞内発現抗体である。
【０１０８】
合成単一ドメイン抗体ライブラリーの作成、及び、該ライブラリーから得られた結合物質の特徴付け
本発明者らは、細胞内発現及び高い熱安定性について最適化された、高度に機能的な骨格ファミリーを選択した。この選択は、抗生物質耐性遺伝子とＶＨＨのコレクションとの間の融合タンパク質を使用して行なわれた。
【０１０９】
機能的ＶＨＨドメイン（凝集しない、分解しない）を発現している細菌のみが増殖することができた。発現収率、哺乳動物細胞の細胞質におけるＧＦＰ融合物としての可溶性をさらに評価して［及び、選択されたクロモボディ（chromobody）と比較し］、一連の適切な抗体を選択した。これらの抗体の配列をアラインさせ、共通配列をクローンＤ１０の共通ｓｄＡｂフレームワーク配列によって定義した（配列番号９参照）。このラマｓｄＡｂ（ｌｓｄＡｂ）の他にも本発明者らは配列を改変して、それはヒトＶＨにより類似し、したがって進化した共通部分は、合成ｓｄＡｂ（本明細書において以後、「ｈｓ２ｄＡｂ」と称される、配列番号１０を参照）として定義した。本発明者らは、ＶＬと疎水性界面を形成するために従来のＶＨに保存され、ｓｄＡｂの固有な可溶性特性にとって重要であるようであった、ＦＲ２の４つの位置（３７、４４、４５、４７）におけるＶＨＨの特異的な特徴を維持した（Kastelic D, et al. 2009 J Immunol Methods. Oct 31; 350(1-2):54-62）（図１ａ）。その後、本発明者らは、骨格が頑丈であり、予想された通り、公知の抗体のＣＤＲをｌｓｄＡｂ及びｓ２ｄＡｂフレームワークに移植することによって挙動することを確認した。これらの実験は、ｌｓｄＡｂ及びｈｓ２ｄＡｂの両方が、細菌細胞及びＣＨＯ細胞における効率的なディスプレイ、効率的な産生を可能とし、酸化条件及び還元条件において発現させたどちらの場合においても移植されたＣＤＲの適切な反応性を維持することを可能としたことを示した。よって本発明者らは、本発明者らのライブラリーを構築するためのフレームワークとしてｈｓ２ｄＡｂを選択することを決断した。
【０１１０】
その後、本発明者らは、クローンの機能に影響を及ぼすことなく、３つのＣＤＲに合成による多様性を導入した。数百個のラマｓｄＡｂ配列のアラインメントに基づいて、本発明者らは、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２の各々の位置について、天然の多様性を依然として模倣する一連のアミノ酸を合理的に設計した。本発明者らは自発的にシステイン残基を回避した。なぜなら、チオール基は後に、適切な細胞内での発現及び機能を妨害する可能性があるからである。本発明者らは、疎水性残基又はアルギニンの出現頻度を下げると、凝集が回避され（De Marco A. 2011,  Microb Cell Fact. Jun 9;10:44の総説）、同様にプロリンの出現頻度を下げると、ループにおける大半の可動性は保持されるであろうと推論した。セリン、トレオニン及びチロシンはエピトープとの結合に関与するＣＤＲループ内で最も頻繁に出現する残基であるので、アスパラギン酸及びグルタミン酸は可溶性を高めると提唱された（Lodish H, et al. Molecular Cell Biology. 4th edition. New York: W. H. Freeman, 2000）。本発明者らは、いくつかの位置におけるこれらの５つの残基を自発的に増やした。対照的に、本発明者らは、システインを除く全てのアミノ酸を導入することによって、ＣＤＲ２のいくつかの位置、並びに、ＣＤＲ３の各々の位置を完全に無作為化した。それにも関わらず、ＣＤＲ３配列に長さの多様性も導入し、様々なエピトープの形状に対する結合能を高めた。なぜなら、ナノボディは、平坦な表面又は空洞の両方（De Genst, E., et al. Proc Natl Acad Sci, (2006) Mar 21;103(12):4586-91）又はさらにはハプテン（Harmsen MM, et al 2007, Appl Microbiol Biotechnol., Nov;77(1):13-22の総説）にさえ結合することが示されているからである。これらの統計に配慮するために、疎水性が高すぎる残基又はアミノ酸により促進される凝集の発生率を下げるために、対照的には極性アミノ酸を豊富にするために、及びさらにはフレーム内での終止又はシステインの発生を回避しフレームシフトを減少させるために、多様なライブラリーの合成を、各コドンに対応する二本鎖ＤＮＡトリプレットブロックを使用する独特な遺伝子合成技術によって達成した（Van den Brulle J, et al. 2008. Biotechniques. Sep;45(3):340-3）。全てのコドンを哺乳動物細胞での発現のために最適化し、さらなるＣＤＲ３ループの移植又は工学操作のためにＳｎａｂＩ制限酵素部位をＦＲ３に加え、一方、任意の他の所望ではない制限酵素部位は骨格において回避された。
【０１１１】
高度な複雑さを生じさせ、空プラスミドの数を減少させるために、本発明者らは、非適合性クローニングサイト間に自殺遺伝子（ｃｃｄＢ）を有する新規クローニングベクターを構築した。毒性遺伝子を欠失したプラスミドのみが、細菌の増殖を可能とした。したがって、ＳＤＡＢ挿入断片を有するプラスミドのみが得られた。ｃｃｄＢ遺伝子は陽性選択マーカーとして使用される。結合活性を検出するために行なわれた大半の試験は、一価の選択された抗体を使用して行なわれ、その後、検出手段は、抗タグ抗体による免疫染色に基づく。しかし一価抗体上の一価のタグでは強力な検出ができないので、本発明者らは、検出力を高めるために、トリプルタグを、本発明者らが構築した新規ファージミドに付加することを決断した。
【０１１２】
クローニングされたｈｓ２ｄＡｂの十分な多様性を確実にするために、合理的な設計による理論的多様性の数は、合成された分子のそれをはるかに超え、これはまた形質転換されたコロニー数のｌｏｇの４倍を上回った。最も重要なのは合成されたｈｓ２ｄＡｂの非常に高度な分子の多様性であり、独特である十分な確率を有する配列は１０１２個超に達した。なぜなら、それは設計によって課される理論的な多様性を依然として上回っていたからであった。完全合成のｈｓ２ｄＡｂ−Ｌ１ライブラリーをｐＨＥＮ２−３ｍｙｃベクターにクローニングし、３×１０９個以下のコロニーを形質転換した。
【０１１３】
ｈｓ２ｄＡｂ−Ｌ１ライブラリーの品質及び機能を、１０５個のランダムなクローンをシークエンスすることによって評価した。その後、本発明者らはいくつかの選択手順を用いて様々な種類のＡｇに対して指向されるスクリーニングを行なった。試験された様々な標的のために、本発明者らはＥＧＦＰ、β−チューブリン、アクチン、構造的Ｒｈｏ、ｐ５３及びＨｅｒ２に対して良好な親和性を有する結合物質を得た。選択されたｈｓ２ｄＡｂ結合物質の特異性、親和性及び生産性の特徴付けを記載する。
【０１１４】
材料及び方法
プラスミド及びクローニング
６Ｈｉｓ−タグ及びトリプルｃ−ｍｙｃタグから構成される合成遺伝子（Mister Gene）をｐＨＥＮ２ファージミドベクター（Griffin 1.ライブラリー）のＮｏｔＩ部位とＢａｍＨＩ部位の間に挿入した。ｐＥＮＴＲ（商標）４ベクター（Invitrogen）からのｃｃｄＢ遺伝子をｐＨＥＮ２ベクターのＮｃｏＩ部位とＮｏｔＩ部位との間に挿入した。哺乳動物発現ベクターについては、ＶＨＨ又はｈｓ２ｄＡｂをＮｃｏＩとＮｏｔＩによって消化し、ｐＡＯＩＮＴ又はｐｍＣｈｅｒｙｙベクター（Clontech）にライゲートした。
【０１１５】
Ｃａｔアッセイフィルター
ｐＡＯ−ＣＡＴは、カルボキシ末端のＨＡでタグ化されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をＶＨＨ配列に融合させることのできる細胞質内発現ベクターである。それは、ＶＨＨ−ＣＡＴ配列を、ＸｂａＩ及びＫｐｎＩで消化されたｐＡＯＤ−Ｔｕｂ１−ｍＧＦＰベクター（Olichon A, et al. 2007. J Biol Chem. Dec 14;282(50):36314-20）にクローニングして、ＤｓｂＣ−Ｔｕｂ１−ｍＧＦＰを除去することによって構築された。ＶＨＨ−ＣＡＴ配列は、多段階ＰＣＲ戦略によって得られた。ＶＨＨを、5’CCTTGATTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGCTGATGTCCAGCTGCAGGCGT3’（フォワード、配列番号１３）及び5’CCACCGCTACCGCCGCTGCGG CCGCGTGAGGAGACGGTGACCTGG G3’（リバース、配列番号１４）を使用して増幅した。ＣＡＴの２つの配列を独立して、ｐＲｉｌｌプラスミドを鋳型として使用して増幅し、内部ＮｃｏＩ部位を除去した。Ｎ末端については以下のプライマーを使用した：5’ GCGGCCGCAGCGGCGGTAGCGGTGGCGAGAAAAAAATCACTGGATATACC 3’（フォワード、配列番号１５）及び5’ GCCCATCGTGAAAACGGGGGCG 3’（リバース、配列番号１６）。Ｃ末端を5’ CGCCCCCGTTTTCACGATGGGC 3’（フォーワード、配列番号１７）及び5’AGAATAGGTACCAGCGTAATCTGGGACATCATAAGGGTAGCCACCCGCCCCGCCCTGCACTCATCG 3’（リバース、配列番号１８）を使用して増幅した。３つの配列を最後のＰＣＲで構築し、産物をＸｂａＩ及びＫｐｎＩで消化し、その後、ベクターにライゲートした。
【０１１６】
ナイーブライブラリーから以前に選択されたＶＨＨを、ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ制限酵素部位を使用してｐＡＯＣＡＴにサブクローニングした。クロラムフェニコール耐性アッセイを、ｐＡＯＣＡＴ−ＶＨＨ融合構築物を用いて形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を使用して行なった。細菌を、カナマイシン（３５μg/mL）及びグルコース（０．２％）を含有するＬＢ ５００μLに接種するのに使用し、３７℃でＯＤ６００が０．８となるまで増殖させた。ＶＨＨ−ＣＡＴ融合タンパク質の細胞質内発現を、０．２mMのＩＰＴＧの添加によって２時間かけて誘導した。誘導期間終了時に、細菌アリコート ４μLを、ＩＰＴＧ（０．１mM）及び０〜５００μg/mlの範囲のクロラムフェニコール漸増濃度を含有するＬＢ寒天プレート上に蒔いた。細菌を３０℃で２０時間インキュベートし、その後、コロニーの形成を定量した。耐性レベルを、様々なクロラムフェニコール濃度でのコロニー増殖速度に従って評価した。５００μg/ml以下のコロニーを与えるいくつかのＶＨＨを、ＧＦＰ（ｎｂ ＧＦＰ４）又はラミン（Ｌａｍ）に対して生じた以前に特徴付けられた細胞内発現抗体と、並びに、熱安定性ＶＨＨ Ｒｅ３及び細胞内発現抗体ではないＣ８と比較した。上記のように２時間の間に誘導された液体培養液を連続希釈によって希釈し、１０μl以下を、２５０μg/mlのクロラムフェニコール（Ｃａｍ）を含有する寒天プレート上にスポットし、３０℃で２０時間インキュベートした。各希釈率についてのコロニーを定量し、Ｄ１０クローンで常に見られたより多い量に対して標準化した。
【０１１７】
Ｄ１０クローンをさらに、ｐＨＥＮ６発現ベクターにサブクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１１ｂｌｕｅ株の培養液において５mg/Lよりも高いペリプラズムでの発現となった。
【０１１８】
それをｐＡＯｉｎｔ−ｍＧＦＰにサブクローニングし、ＭＲＣ５、ＨＥＫ２９３又はＨｅＬａ Ｓ３細胞にトランスフェクトした。ＣＭＶプロモーター制御下のＤ１０−ＧＦＰの一過性発現により、２４時間後及び４８時間後においてＬａｍ１−ＧＦＰ又はＲｅ３−ＧＦＰと比較して、高いＧＦＰの蛍光がもたらされ、検出可能な凝集はない。
【０１１９】
ライブラリーの構築
ＦＲ及びＣＤＲの設計に対応する遺伝子コレクションをインビトロで合成した（Sloning, GeneArt）。多様な合成物 １μL（１０ng）（１×１０１０個の分子に相当、したがって、標的ライブラリー多様性の１０倍）をＰＣＲによって総容量５０μLでPhusion DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）１μLを以下のプライマーの等モル混合物と共に使用して増幅した：
5’-AACATGCCATCACTCAGATTCTCG-3’（配列番号１９）
5’-GTTAGTCCATATTCAGTATTATCG-3’（配列番号２０）。
【０１２０】
ＰＣＲプロトコールは、９８℃で４５秒間の初回の変性工程、続いて、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、及び７２℃で３０秒間を２０サイクル、並びに、７２℃で１０分間の最終工程の伸張からなった。ＰＣＲ ７×１５０μLを、ＰＣＲクリーンアップキット（Macherey-Nagel）の７つのカラムで精製した。得られた精製ＰＣＲ断片 ５５μg及びｐＨＥＮ２−ｃｃｄＢ−３ｍｙｃファージミド ８０μgを、３７℃でＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ（NEB）を用いて総容量５００μL中で２時間かけて消化した。仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（Sigma）を用いての脱リン酸化工程を３７℃で３０分間ファージミドに加えた。最終容量８０及び１２０μL中の消化物を、それぞれゲル抽出キット（Macherey-Nagel）の４つ及び６つのカラムでゲル上で精製した。その後、精製されたＰＣＲ断片を、ｐｅｌＢリーダーシグナルとｐＩＩＩ遺伝子との間のｐＨＥＮ２−ｃｃｄＢ−３ｍｙｃにライゲートした。ファージミド ５０μg及び挿入断片 １９．２μgを、総容量４００μL中の高濃度のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（NEB）１０μLを用いて１６℃で一晩かけてライゲートした。総容量１５０μLのライゲート物を、６つのカラム（Macherey-Nagel）で精製した。ライゲートされたＤＮＡ材料を使用して、エレクトロコンピテントなE.coli ＴＧ１細胞（Lucigen）を形質転換した。１μlのライゲート液を用いて２０回の電気穿孔を製造業者の説明書（１８００Ｖ；１０μF；６００Ω）に従って行なった。各々の電気穿孔液を加温２×ＹＴ（１％グルコース）培地 １mLを用いて再懸濁し、振盪撹拌しながら３７℃で１時間インキュベートした。２×ＹＴ（１％グルコース）３８０mLを懸濁液に加え、４３０個の２×ＹＴ−アンピシリン寒天皿（１４０mm）上で３７℃で一晩培養した。ライブラリーのサイズを、連続希釈アリコート液を蒔くことによって計算した。コロニーを、液体２×ＹＴを用いてプレートから剥がし、ライブラリーを３０％グリセロールの存在下で−８０℃で保存し、１mLのアリコートの吸光度は３８．４であった。３×１０９個の個々の組換えクローンが得られた。
【０１２１】
ライブラリーのシークエンス：
ライブラリーからの個々のクローンの異質性を、ion Torrentチップ（Invitrogen）で６×１０５個の挿入断片をシークエンスすることによって確認した。
【０１２２】
Ion Torrentシークエンスライブラリーは、製造業者の説明書に従ってAB Library Builderシステム（Life Technologies）のためのIon Plus Fragment Libraryキットを用いて調製され、High Sensitivity DNAキット（Agilent Technologies）を用いてAgilent 2100バイオアナライザ（Agilent Technologies）で制御された。シークエンス用の鋳型は、Ion OneTouch 2システム及びIon PGM Template OT2 400キット（Life Technologies）を用いてのエマルジョンＰＣＲによって調製された。シークエンスは、Ion PGM Sequencing 400キット及び314v2 Ionチップ（Life Technologies）を使用してIonTorrent Personal Genome Machineで行なった。
【０１２３】
抗原
ヒトβアクチンはSigmaから購入した。アミノ末端のキチン結合ドメイン又はストレプトアクチン結合ペプチドに融合したＲｈｏＡ ＧＴＰアーゼを、ＨＥＫ２９３細胞において産生した。ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）と融合したＧＦＰをインビトロでの翻訳システム（Roche）を通して産生し、精製を必要することなくスクリーニングに直接使用された（Moutel S, et al. 2009. Biotechnol J. Jan;4(1):38-43）。ビオチニル化チューブリンはCytoskeletonから購入した。ｐ５３については、NP_000537.3アイソフォームの最初の７２アミノ酸を、ＳＮＡＰタグと共に細菌内で産生させ、インビトロでビオチニル化した。Ｈｅｒ２については、天然受容体をＳＫＢＲ３細胞上の膜タンパク質標的として使用した。
【０１２４】
ファージディスプレイの選択
βアクチン、Ｈ１ヒストン、又はＦＩＴＣについてのスクリーニングが、Marks JD et al, 1991 J Mol Biol. Dec 5;222(3):581-97に記載のようにイムノチューブでのパニングによって行なわれた。ＧＦＰ、チューブリン及びｐ５３についてのスクリーニングが、Nizak et al. 2003 Science. May 9;300(5621):984-7に記載のようなナイーブな条件で行なわれた。Ｒｈｏに対するスクリーニングが、ＨＥＫ２９３細胞において発現されたタグが恒常的に活性であるＲｈｏＡの突然変異体に対してナイーブな条件で行なわれた。Ｈｅｒ２についてのスクリーニングが、Even-Desrumeaux K, Chames P. 2012 Methods Mol Biol.; 907:225-35に記載のような表面細胞上で行なわれた。
【０１２５】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
個々のクローンを、モノクローナルファージＥＬＩＳＡによって何処にでも記載されているようにスクリーニングした（Lee. et al; 2007, Nat Protoc. 2(11): 3001-8）。
【０１２６】
ウェスタンブロット
ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液中で煮沸した後、試料を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜（Whatman GmbH）上に転写した。膜を、室温で１時間又は４℃で一晩かけて、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む３％無脂肪ミルク−ＰＢＳ中で遮断した。ＳＤＡＢを１/１００で使用し、１/３０００の抗ｈｉｓタグ抗体（Sigma）と共に膜に９０分間かけて加えた。その後、ブロットを洗浄し、二次抗マウスＨＲＰで標識された抗体（ＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中で１/１００００に希釈）（Jakson ImmunoResearch Laboratories）と共に１時間インキュベートした。ＰＢＳ ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて５回洗浄した後、次いで、二次抗体を、SuperSignal化学発光試薬（Pierce）及びHyperfilm ECL（GE HealthCare）を使用して顕現させた。
【０１２７】
免疫蛍光
免疫蛍光スクリーニングを、以前に記載されているように（Nizak et al. 2003. Science. May 9;300(5621):984-7）ＨｅＬａ細胞に対して行なった。
【０１２８】
一過性トランスフェクション
カバーガラス上で培養したＨｅｌａ細胞を、１ウェルあたり１μgのＤＮＡ（２４ウェルプレート）又は１０μgのＤＮＡ（直径１０cm2の皿）を用いてＣａＰＯ４手順に従ってトランスフェクトした。細胞をトランスフェクションから１２時間後に観察することができる。
【０１２９】
フローサイトメトリー
細胞表面染色を、１％ＳＦＶの補充されたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で行なった。１００μlの上清（ファージ ８０μl＋ＰＢＳ/ミルク１％ ２０μl）を、１×１０５個の細胞上で氷上で１時間インキュベートした。ファージの結合を、氷上で１時間かけて１：３００の希釈率の抗Ｍ１３抗体（GE healthcare）によって検出し、次いで、４５分間かけてＰＥにコンジュゲートした１：１０００の希釈率の抗マウス抗体（BD Pharmingen）によって検出した。試料を、CellQuest Proソフトウェア（BD Biosciences、サンノゼ、ＣＡ）を使用してFACSCaliburでのフローサイトメトリーによって分析した。
【０１３０】
親和性の測定
ライブラリーから選択されかつＧＦＰ及びＥｒＢＢ２に特異的である、ｈｓ２ｄＡｂ抗体の結合親和性を、それぞれProteOn XPR36（BioRad）及びBiacore T200（GE Healthcare）を使用して２５℃で行ない、１：１のラングミュア相互作用モデルに当てはめた。リガンドＧＦＰ（２４kDa）を酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で１．６μMに希釈し、７３０ＲＵでＧＬＣチップ（BioRad）上にアミンカップリングによって固定した。一価単一ドメイン抗体（１４kDa）１００μLを分析物として使用し、１０００〜３μMの濃度で１００μL/分で注入した（６０秒間かけて注入、６００秒間かけて解離）。完全な動態の設定が一回の実行（ワンショット）で収集され、それ故、表面を再生する必要がなかった。ＥｒｂＢ２細胞外ドメイン−Ｆｃ（９６kDa）を酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で４００μg/mLに希釈し、９９１ＲＵでＣＭ５チップ（GE Healthcare）上にアミンカップリングによって固定した。一価単一ドメイン抗体（１４kDa）をＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液で希釈し、３００〜３μMの濃度の分析物として３０μL/分で１回サイクルの様式を使用して注入した（１２０秒間かけて注射、１２０秒間かけて中期の解離、６００秒間かけて最後の解離）。独特な注射順序における動態を収集し、表面再生（１０mM グリシンＨＣｌ、ｐＨ２．５、３０μL/分で３０秒間）は２回の連続したシリーズの間においてのみ行なわれた。
【０１３１】
結果
ライブラリーの設計
非常に安定しかつ機能的な抗体断片の豊富な大きな単一ドメイン抗体ライブラリーを作成する観点から、本発明者らは、単一のＶＨＨ骨格を同定することを目標とした。本発明者らは以前に、免疫性の又はナイーブなラマＶＨＨライブラリーから数百個のクローンを選択した（Monegal A, et al. 2012 Dev Comp Immunol. Jan;36(1):150-6）。本発明者らは、細菌細胞質において凝集又はアンフォールディングしがちなクローンから非常に安定なクローンを区別するクロラムフェニコールフィルターアッセイ（Olichon）を使用して、一連の高度に発現されたクローンをスクリーニングした。本発明者らは、カルボキシ末端のＨＡでタグ化されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をＶＨＨ配列に融合させることを可能とする、ｐＡＯ−ＣＡＴ細胞質内発現ベクターを使用した。公表されている熱安定性ＶＨＨ（Olichon A, et al BMC Biotechnol. 2007 Jan 26;7:7）又は細胞内発現抗体（Rothbauer U, et al Nat Methods. 2006 Nov;3(11):887-9）と比較することにより、ある骨格であるクローンＤ１０は、クロラムフェニコールに対するより高い耐性を示した（図１ａ）。Ｄ１０のＶＨＨはさらに本発明者らの溶解度、熱安定性、及び、どのような公知の抗原も全く認識しない状況で哺乳動物細胞内で細胞内発現抗体として発現されても凝集しないという全ての基準に当てはまった。その後、本発明者らは、骨格の部分的なヒト化（Vincke C, et al. J Biol Chem. 2009 Jan 30;284(5):3273-84）が、ヒトＶＨ３に見られる７個の残基に標的化することによって、その固有の特性に影響を及ぼすかどうかを評価した。固有の可溶性特性にとって重要であると思われたフレームワーク−２領域における４個のＶＨＨ特異的アミノ酸（４２位、４９位、５０位及び５２位）の特徴は（図１ｃ）はそのままとした。
【０１３２】
この骨格が抗原との結合に適切であり得、ライブラリー構築のための一般的な骨格として使用され得るかどうかを試験するために、本発明者らは、ラミンＢタンパク質に特異的なラマ１ＶＨＨのループを移植した（Rothbauer U, et al. Nat Methods. 2006 Nov;3(11):887-9）。図２ａは、どちらの骨格も（ｌｓｄＡｂＢ及びｈｓ２ｄＡｂ）、ここで抗ｐＩＩＩ抗体で標識されたファージ上への組換え抗体のディスプレイを妨害しないことを示す。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞又は哺乳動物ＣＨＯ細胞のいずれかの培養上清からの産生収率もまた（Moutel S, et al BMC Biotechnol. 2009 Feb 26;9:14. doi: 10.1186/1472-6750-9-14）、どちらの骨格についても高く同等であった（図２ｂ参照）。次いで、移植された合成抗体を使用して、間接的な免疫蛍光によりＨｅＬａ細胞を染色した。どちらの移植された単一ドメイン抗体も予想された染色を生じ、このことは、それらが内因性ラミンＢを効率的に染色したことを示す（図２ｃ）。その後、２つの合成抗体をＥＧＦＰに融合させ、細胞内発現抗体として使用した。ＨｅＬａ細胞の一過性トランスフェクションの後、元来のラマ１ＶＨＨ抗体を使用した場合に観察されたように（Rothbauer U, et al 2006）、どちらの蛍光抗体も可溶性であり、その細胞内標的を標識した（図２ｄ）。ラマ１ＣＤＲループと共に移植されたラマ及びヒト化Ｄ１０の両方の骨格が、親ＶＨＨの結合特性を保持していた。
【０１３３】
要するに、これらの実験は、ヒト化Ｄ１０の合成骨格（本明細書では合成単一ドメイン抗体すなわちｈｓ２ｄＡｂと呼ばれる）が、ＣＤＲループを提示するのに効率的かつ頑強なフレームワークであることを示した。
【０１３４】
ライブラリーの構築
本発明者らは、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２の各々の位置について（公表されているＶＨＨ結合物質に見られるＣＤＲの統計学的分析に基づいて）、天然の多様性を依然として模倣している一連のアミノ酸を合理的に設計することによって３つのＣＤＲに合成的な多様性を導入した。合成ＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸残基は以下の原則：
ＣＤＲ１の１位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ又はＤ；
ＣＤＲ１の２位には：Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ｔ又はＴ；
ＣＤＲ１の３位には：Ｙ、Ｓ、Ｓ、Ｓ、Ｆ又はＷ；
ＣＤＲ１の４位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＮ；
ＣＤＲ１の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ又はＬ；
ＣＤＲ１の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ又はＥ;
ＣＤＲ１の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ又はＶ；
ＣＤＲ２の１位には：Ｒ、Ｓ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ又はＹ；
ＣＤＲ２の２位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ又はＹ；
ＣＤＲ２の３位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｑ、Ｐ；
ＣＤＲ２の４位には：Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｎ又はＤ；
ＣＤＲ２の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ又はＭ；
ＣＤＲ２の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ又はＫ;
ＣＤＲ２の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、又はＶ
によって決定された。ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ、Ｍの１つ以上の中から選択された９、１２、１５又は及び１８個のアミノ酸を含む。
【０１３５】
ＰＣＲに基づいた突然変異の付加を防ぐために少数のＰＣＲサイクルを使用して、合成ＤＮＡを増幅した。本発明者らは、２×１０１１個の異なる分子を用いて構築を開始した。本発明者らは、合成遺伝子（Proteogenix）と共に２つの補助的なｍｙｃ−タグを、組換え抗体とｐＩＩＩ遺伝子との間に付加することによって改変されたｐＨＥＮ２ファージミドベクターの合成ライブラリーをクローニングした。これらの付加的なｍｙｃ−タグは、一価抗体のより良好な顕現を可能とする（データは示されていない）。クローニングのために、本発明者らはまた、ライブラリーに挿入したクローンの正の選択を可能とする自殺遺伝子（ｃｃｄＢ）をＮｃｏＩとＮｏｔＩとの間に付加した。大量のファージミド及び挿入断片を使用して、大量の材料を得て、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞を電気穿孔した。２０回の電気穿孔を行なって、ｈｓ２ｄＡｂ−Ｌ１ライブラリーを作成した。形質転換された細菌を４３０個の大きな寒天プレート（１４０mm）上に蒔いた。連続希釈アリコート液を蒔くことによってライブラリーのサイズを計算し、３×１０９個の個々のクローンであると推定された。
【０１３６】
ライブラリーのシークエンス：
本発明者らはまず、３１５個のランダムなクローンをサンガーシークエンス法を用いてシークエンスすることによって機能的な多様性を評価した。９個の配列が終止コドンを有するか又は１塩基が欠失しているかのいずれかで見い出され、１つの配列が全てのＣＤＲ１を欠失し、もう１つはＣＤＲ１、ＦＲ１及びＣＤＲ２を欠失し、最後の２つの配列は空であることが認められた。したがって、ほんの非常に少数（４．１％）の欠陥クローンしか得られなかった。このことは、３×１０９個のクローンの大半が組換えｈｓ２ｄＡｂを発現しているであろうことを示唆する。
【０１３７】
ライブラリーの個々のクローンの異質性をさらに、ion Torrentチップ（Life Technologies）上で５．６×１０５個の挿入断片をシークエンスすることによって確認した。ＣＤＲ３について、４つのサイズの長さの配列の分布は均一であった。アミノ酸の多様性及び位置の出現頻度は、全てのＣＤＲについて本発明者らの設計と一致した（データは示されていない）。３つの重複クローンが認められたが、この観察は、次世代シークエンス手順の最中に行なわれたＰＣＲ増幅に関連している可能性がある。
【０１３８】
ライブラリーのスクリーニング
ｈｓ２ｄＡｂ−Ｌ１ライブラリーを、表１に報告された一連の異なる抗原に対して標準的な方法（Hoogenboom HR, et al. 1998 Jun;4(1):1-20）を使用してファージディスプレイによってスクリーニングした。様々なスクリーニングアプローチにおけるｈｓ２ｄＡｂ−Ｌ１の使用を検証するために、本発明者らはビーズ上での選択（これは大容量の抗原提示をもたらし、天然タンパク質に近い抗原のコンフォメーションを保つ）、イムノチューブ上でのパニング（標準的な方法として参照される）又は哺乳動物細胞の表面上に天然に提示される天然抗原上でのパニング（治療上関心のあるものに対してインビトロで選択をかける場合にしばしば行なわれるように）のいずれかを行なった。
【０１３９】
１回目のスクリーニングを、標的としてビオチニル化チューブリン（Cytoskeleton）を使用して天然の条件（Nizak、2005、上記参照）で行なった。２回の選択後、４０個のクローンを、メタノールで固定されたＨｅＬａ細胞上での免疫蛍光によってランダムにスクリーニングした。３つの組換え抗体が内因性チューブリンを染色した（図３Ａ）。これらの３つのクローンはまた、ヒトタンパク質試料のウェスタンブロットにおいても使用可能であった（図３Ａ）。２回目のスクリーニングを、ＳＫＢＲ３細胞の表面で発現されている内因性Ｈｅｒ２受容体に対して行なった。非ＳＫＢＲ３特異的抗体を対抗選択するために、ファージの事前吸着を、Ｈｅｒ２陰性ＭＣ１０Ａ細胞上で３回のそれぞれにおいて行なった。ＦＡＣＳアッセイを使用して、分析された８４個の中から１７個の特異的な抗ＳＫＢＲ３結合物質が見い出され、これを、１７個の非重複配列に分類することができた。標的としてＨｅｒ２細胞外ドメイン−Ｆｃ（９６kDa）を使用したＥＬＩＳＡによる分析は、その中の１２個がＨＥＲ２に対して指向されたことを示した（図３Ｂ）。免疫蛍光により、抗体がＳＫＢＲ３形質膜を装飾したことを確認した（データは示されていない）。腫瘍サプレッサーｐ５３タンパク質に対して指向された３回目のスクリーニングが行なわれた。細菌においてNP_000537.3アイソフォームの７２個の最初のアミノ酸がＳＮＡＰタグと融合して産生され、インビトロでビオチニル化され、ビーズ上での標的として使用された。３回の選択後、８０個の中の１２個のクローンがファージＥＬＩＳＡにおいて陽性と判明し（データは示されていない）、６個のクローンがＡ４３１細胞上での免疫蛍光で内因性ｐ５３を明瞭に標識し（データは示されていない）、一方、２個のクローンがＨｅＬａ細胞上での細胞内発現抗体として使用可能であった（図４参照）。予想された通り、ｐ５３−/−であるＵ２ＯＳ細胞では全く染色が観察されなかった。４回目のスクリーニングを行なって、Ｒｈｏ−ＧＴＰタンパク質の構造認識的結合物質を得た。４回の競合的選択後（材料及び方法を参照）、８０個の独特なクローンを、ＧＤＰ又は加水分解不可能なＧＴＰγＳがローディングされた組換えＧＳＴ−ＲｈｏＡタンパク質を使用してＥＬＩＳＡで試験した。２４個の抗体が、ＧＤＰ−Ｒｈｏに対するよりもＧＴＰγＳ−ＲｈｏＡに対してより強力なシグナルを生じ、このことは構造認識的な結合を示す。抗体の１つであるＨ１２クローンがスクリーニングを支配し、これは追加の５回の選択時に得られた唯一のクローンであった。本発明者らは、ＲｈｏＡ陰性突然変異体Ｎ１９（ＧＤＰに結合）又は恒常的に活性な突然変異体Ｌ６３（ＧＴＰに結合）のＳＦ−ＧＦＰ（スーパーフォールダーＧＦＰ）融合体を発現しているＨｅＬａ細胞上での免疫蛍光でこれらの構造認識的結合物質を試験した。どのクローンもＮ１９陰性突然変異体を発現している細胞を染色しなかったが、その中の８個のクローンは、活性形のＲｈｏＡを過剰発現している細胞を効率的に染色した。本発明者らはさらにクローンＨ１２を特徴付け、ＧＴＰγＳ又はＧＤＰと共にインキュベートされたＨｅＬａ細胞抽出物から内因性ＲｈｏＡを引き出すその能力を試験した。本発明者らは、精製されたＨ１２抗体が、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、及びインビトロでのプルダウン実験において使用可能なＲｈｏ活性の効果的な構造認識的なバイオセンサーであったことを示した。本発明者らはさらに、従来のＲＢＤ活性アッセイよりも効果的であることを観察したので、エフェクタータンパク質のＲｈｏ結合ドメインをバイオセンサーとして使用する。（図３Ｃ、ＩＦ及びＥＬＩＳＡ、データは示されていない）。天然条件での５回目のスクリーニングを、標的としてＧＦＰタンパク質を使用して行なった。分析された８０個の中の３７個の重複していないクローンが、ファージＥＬＩＳＡにおいて陽性であった（データは示されていない）。その中の１０個がＧＦＰ−ｍｙｒ−ｐａｌｍを免疫蛍光によって検出した（データは示されていない）。重要なことには、本発明者らは、これらの中の４つの抗体が、Ｈｅｌａ細胞内で発現された組換えＧＦＰに対する細胞内発現抗体として利用できたことを観察した（図４）。最後の選別は、天然の市販のβアクチン（Sigma）でコーティングされたイムノチューブを使用して行なわれた。この最後のスクリーニングは、ファージＥＬＩＳＡによって観察されたように８０個中１６個の独特な結合物質の選択を可能とし（データは示されていない）、その中の７個が、ＨｅＬａ細胞内の内因性アクチンストレス線維を明瞭に装飾し（データは示されていない）、４個がウェスタンブロット実験に使用できた（データは示されていない）。
【０１４０】
【表２】
2019194237.tif 000004
【０１４１】
親和性の測定
ＧＦＰ、Ｈｅｒ２及びｐ５３に対する単一ドメイン抗体の親和性を、ProteOn XPR36（BioRad）又はBiacore T200（GE Healthcare）を使用して測定した。親和性はナノモル範囲であると推定され（抗ＧＦＰ抗体については３．０６×１０−８Ｍで、抗Ｈｅｒ２抗体については１．９４×１０−８Ｍで、抗ｐ５３抗体については３．２５×１０−８Ｍ）、このことは、高親和性結合物質が、本発明者らの合成で非免疫原性の単一ドメイン抗体のｈｓ２ｄＡｂ−Ｌ１ライブラリーから得ることができたことを実証する（図５）。
【０１４２】
阻害性の細胞内発現抗体
遮断性抗体の同定は困難な課題である。しかし、その標的機能を阻害するために、非遮断性の細胞内発現抗体を官能基化することが可能である。１つのアプローチは、Caussinus et al. 2011（Caussinus et al. 2011, Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 117-121）に記載のような認識された標的のユビキチン化及び分解に依拠する。このアプローチは、タンパク質をプロテアソーム依存性細胞分解へと標的化させる、複合体Ｅ１／Ｅ２／Ｅ３ユビキチン化機序のＥ３ユビキチンリガーゼである、ＳＣＦ複合体の一員である、Ｓｋｉｐ１との相互作用を可能とする、Ｆ−ボックスドメインへの細胞内発現抗体の融合に基づく。このアプローチは当初、免疫ライブラリーから初めて単離された頑強な高親和性のＧＦＰラマ細胞内発現抗体である、ＧＦＰ４と命名された、単一抗ＧＦＰ細胞内発現抗体を使用してショウジョウバエにおけるいくつかのＧＦＰ融合タンパク質を標的化するために開発された（Rothbauer, U. et al.Nat. Methods 3, 887-889）。このようなタンパク質ノックダウンアプローチのためのｈｓ２ｄＡｂの相対的機能に関する洞察を得るために、本発明者らは、本発明者らの抗ＧＦＰ ｈｓ２ｄＡｂのいくつかをそのアミノ末端においてＦボックスドメインに融合させ、その効力をＦボックス−ＧＦＰ４抗体の効力と比較した。Ｆボックス−細胞内発現抗体の融合タンパク質（Ｆ−Ｉｂ）を発現している細胞を検出するために、本発明者らは、ミトコンドリアに標的化されたｍＣｈｅｒｒｙと一緒に（Ｍｉｔｏ−ｍＣｈｅｒｒｙ）Ｆ−Ｉｂの共発現を駆動するビシストロン性ベクターを構築した。本発明者らは、ヒストンＨ２Ｂに融合したＧＦＰを安定に発現しているＨｅＬａクローンにおいてＦ−Ｉｂ抗体を発現し（Sillje, H. H. W., Nagel, S., Korner, R. & Nigg, E. A., 2006, Curr. Biol. CB 16, 731-742）、ＧＦＰ−Ｈ２Ｂの欠失を探した。予想された通り、ｄｅｇｒａｄＦＰとしても知られる、Ｆ−ＧＦＰ４は、ウェスタンブロットによって分析されるようなＨ２Ｂ−ＧＦＰ発現の強力な減少を誘導した（データは示されていない）。したがって、核における蛍光強度の強力な減少が、Ｆ−ＧＦＰ４を発現している細胞において観察された。ＧＦＰ４単独、又は、切断短縮された非機能的なＦボックスドメインに融合したＧＦＰ４のいずれかを発現している場合には全く効果は観察されなかった。本発明者らが本発明者らの新規ライブラリーから選択された抗ＧＦＰクローンを試験した時に、本発明者らは、蛍光細胞内発現抗体として使用された場合に効果的であることが判明したいくつかのｈｓ２ｄＡｂは、Ｆ−Ｉｂとして発現された場合にＨ２Ｂ−ＧＦＰを分解することができなかったことを観察した。このことは、全ての細胞内発現抗体が、Ｆ−ボックスを用いて効果的に官能基化されることができるわけではないという事実を強調する。しかし、ある抗ＧＦＰ ｈｓ２ｄＡｂは、Ｆ−Ｉｂとして発現された場合に核におけるＨ２Ｂ−ＧＦＰシグナルの完全な消失を誘導した。ＦＡＣＳ分析は、７０％も減少した蛍光強度を示した。予想された通り、この効果は、プロテアソーム阻害剤による処理の存在下で逆転した。
【０１４３】
要するに、これらの実験は、ｈｓ２ｄＡｂ骨格が、蛍光細胞内発現抗体又は阻害性細胞内発現抗体として使用するために哺乳動物細胞の細胞質内で発現させることができる抗体の頻繁な選択を可能とすることを示す。
【０１４４】
【表３】
2019194237.tif 000005
2019194237.tif 000006
【図１】
2019194237.tif 000007
【図２】
2019194237.tif 000008
【図３】
2019194237.tif 000009
【図４】
2019194237.tif 000010
【図５】
2019194237.tif 000011
【配列表】
2019194237000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月8日(2019.8.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成単一ドメイン抗体ライブラリーを作成する方法であって、該方法は、
ｉ．ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をコードする多様な核酸を、合成単一ドメイン抗体のそれぞれのフレームワークコード領域間に導入して、その同じ合成単一ドメイン抗体骨格のアミノ酸配列を有する多様な合成単一ドメイン抗体をコードする核酸を作製する工程を含み、
前記の合成単一ドメイン抗体骨格は、配列番号１のＦＲ１、配列番号２のＦＲ２、配列番号３のＦＲ３、及び配列番号４のＦＲ４からなるフレームワーク領域、又は、各フレームワーク領域内に１、２若しくは３つ以下の保存的アミノ酸置換を有する機能的な変異フレームワーク領域を含み、機能的な変異フレームワーク領域は、以下のアッセイ：
ｉ．  アッセイするために、変異フレームワーク領域に移植した配列番号９のクローンＤ１０のＣＤＲを有する基準の単一ドメイン抗体を提供すること、
ｉｉ．  そのような基準の単一ドメイン抗体が、以下の機能的特性
a. それをＥ．ｃｏｌｉペリプラズムにおいて可溶性の単一ドメイン抗体として発現させることができる、
ｂ．それをＥ．ｃｏｌｉ、酵母又は他の真核生物の細胞質基質において可溶性の細胞内発現抗体として発現させることができる、
ｃ．それは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ融合アッセイにおける還元性環境において安定である、
ｄ．それは、蛍光タンパク質との融合物として哺乳動物細胞株において発現させた場合に凝集しない
の１つ以上を有するか否かをアッセイすること
により選択される、方法。
【請求項２】
ライブラリーのクローンの少なくとも７０％、８０％又は少なくとも９０％の合成ＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸残基が、以下の原則：
ＣＤＲ１の１位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ又はＤ；
ＣＤＲ１の２位には：Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ｔ又はＴ；
ＣＤＲ１の３位には：Ｙ、Ｓ、Ｆ又はＷ；
ＣＤＲ１の４位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＮ；
ＣＤＲ１の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ又はＬ；
ＣＤＲ１の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ又はＥ;
ＣＤＲ１の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ又はＶ；
ＣＤＲ２の１位には：Ｒ、Ｓ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ又はＹ；
ＣＤＲ２の２位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ又はＹ；
ＣＤＲ２の３位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｑ、Ｐ；
ＣＤＲ２の４位には：Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｎ又はＤ；
ＣＤＲ２の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ又はＭ；
ＣＤＲ２の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ又はＫ;
ＣＤＲ２の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、又はＶ
によって決定され；
ＣＤＲ３のアミノ酸配列が、以下のアミノ酸：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ、Ｍの１つ以上の中から無作為に選択された９〜１８個のアミノ酸を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
請求項１〜２のいずれか一項の方法によって得ることのできる合成単一ドメイン抗体ライブラリー。
【請求項４】
少なくとも３×１０９個の明確に異なる抗体コード配列を含む、請求項３の合成単一ドメイン抗体ライブラリー。
【請求項５】
対象の標的に結合する合成単一ドメイン抗体を同定するためのスクリーニング法における、請求項４の合成単一ドメイン抗体ライブラリーの使用。
【請求項６】
前記のスクリーニング法がファージディスプレイである、請求項５の使用。
【請求項７】
以下の式：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の合成単一ドメイン抗体を含む抗原結合タンパク質であって、該フレームワーク領域は、配列番号１のＦＲ１、配列番号２のＦＲ２、配列番号３のＦＲ３、及び配列番号４のＦＲ４、又は各ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３又はＦＲ４内に１、２若しくは３つ以下の保存的アミノ酸置換を有する機能的な変異体からなり、合成単一ドメイン抗体は、以下の機能的性質：
ｉ．  それをＥ．ｃｏｌｉペリプラズムにおいて可溶性の単一ドメイン抗体として発現させることができる、
ｉｉ．  それをＥ．ｃｏｌｉの細胞基質において可溶性の細胞内発現抗体として発現させることができる、
ｉｉｉ．  それは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ融合アッセイにおける還元性環境において安定である、
ｉｖ．それは、蛍光タンパク質との融合物として哺乳動物細胞株において発現させた場合に凝集しない
の１つ以上を有する、抗原結合タンパク質。
【請求項８】
合成ＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸残基が、
ＣＤＲ１の１位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ又はＤ；
ＣＤＲ１の２位には：Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ｔ又はＴ；
ＣＤＲ１の３位には：Ｙ、Ｓ、Ｆ又はＷ；
ＣＤＲ１の４位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＮ；
ＣＤＲ１の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ又はＬ；
ＣＤＲ１の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ又はＥ;
ＣＤＲ１の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ又はＶ；
ＣＤＲ２の１位には：Ｒ、Ｓ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ又はＹ；
ＣＤＲ２の２位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ又はＹ；
ＣＤＲ２の３位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｑ、Ｐ；
ＣＤＲ２の４位には：Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｎ又はＤ；
ＣＤＲ２の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ又はＭ；
ＣＤＲ２の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ又はＫ;
ＣＤＲ２の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、又はＶ
であり、ＣＤＲ３のアミノ酸配列が、以下のアミノ酸：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ、Ｍの１つ以上の中から選択された９〜１８個のアミノ酸を含む、請求項７の抗原結合タンパク質。
【請求項９】
タンパク質をプロテアソームに標的化させるためのＦボックスドメインをさらに含む、請求項７〜８のいずれか一項の抗原結合タンパク質。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか一項の抗原結合タンパク質をコードする、単離された核酸。
【請求項１１】
請求項１０の単離された核酸であって、以下の核酸配列：
それぞれ配列番号１〜４のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４のフレームワーク領域をコードする、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１〜４のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の機能的な変異体をコードする、配列番号５〜８に対して少なくとも９０％の同一率を有する変異体の対応する配列
を含み、配列番号１〜４のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の機能的な変異体は請求項１に記載された通りである、
単離された核酸。
【請求項１２】
請求項１０又は１１の核酸を含む、請求項７〜９のいずれかの抗原結合タンパク質の産生のための組換え宿主細胞。
【請求項１３】
抗原結合タンパク質の産生のための適切な条件下で請求項１２の宿主細胞を培養し、そしてタンパク質を単離することを含む、請求項７〜９のいずれかの抗原結合タンパク質の産生のためのプロセス。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、非常に安定な合成単一ドメイン抗体骨格の同定、及び、合成単一ドメイン抗体ライブラリーの作成におけるその使用に関する。本発明はまた、前記の安定な単一ドメイン抗体骨格を含む抗原結合タンパク質、及び、特に治療薬としてのその使用に関する。
【０００２】
発明の背景
過去十年間にわたって抗体は、特に腫瘍学の分野において最も有望な治療アプローチの１つとしてだけでなく、研究又は診断のツールの重要な入手源としての役目が課されてきた。
【０００３】
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、ジスルフィド結合によって互いに結合した重鎖と軽鎖の２つのヘテロダイマーを含む、典型的な抗体の基本的な構造である。しかし、天然の一本鎖抗体が、ラクダ科（Hamers-Casterman et al, 1993, Nature, 363, pp446-448）及びサメ（Greenberg et al, Nature. 1995, Mar 9;374(6518):168-73）の少なくとも２つの動物群において発見されている。これらの一本鎖抗体は、軽鎖を欠失したさらに他のクラスのＩｇＧを構成する。これらの一本鎖天然抗体の認識部分は、ＶＨＨと呼ばれる重鎖の可変ドメインのみを含む。ＶＨＨは、ＩｇＧドメインの骨格を形成する４つのフレームワーク（ＦＲ）、及び、抗原との結合に関与する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。
【０００４】
ＶＨＨ骨格の多くの利点が報告されている：鎖間のジスルフィド結合がないので、それらは一般的に、還元性環境においてより溶解度が高くかつより安定である（Wesolowski et al, 2009 Med Microbiol Immunol. Aug;198(3):157-74）。ＶＨＨはまた、そのサイズが小さいために（１５kDa）、より高い溶解度、より高い発現収率、及びより高い熱安定性を有すると報告されている（Jobling SA et al, Nat Biotechnol. 2003 Jan; 21 (1): 77-80）。さらに、ＶＨＨのフレームワークはファミリーＩＩＩのヒトＶＨドメインと高い配列相同性及び構造相同性を示し（Muyldermans et al, 2001. J Biotechnol. Jun; 74 (4): 277-302）、ＶＨＨはヒトＶＨと同等な免疫原性を有するので、治療適用のための非常に興味深い薬剤の構成要素となり、その中のいくつかは第ＩＩ相臨床試験中である（Ablynx社のナノボディ（登録商標））。ヒトとは異なる１０個のアミノ酸上で、ＶＨＨの４つの特徴的なアミノ酸がフレームワーク−２領域において同定された。
【０００５】
ＶＨＨ骨格の特性は、療法に使用する上で多くの利点を有し：それらは、組織へのより良好な浸透、腎臓におけるより迅速なクリアランス、高い特異性であるがしかしまた低減された免疫原性を有する。
【０００６】
ラクダ科の動物の抗体ライブラリーは、例えば、米国特許第２００６／０２４６０５８号（カナダ国立研究機関）に記載されている。記載されているファージディスプレイライブラリーは、ラマの抗体断片、特に可変重鎖の単一ドメイン断片（ＶＨＨ及びＶＨ）を含む。ライブラリーは、免疫化されていない動物のリンパ球ゲノムを使用して作成された（ナイーブライブラリー）。得られたファージディスプレイライブラリーはまた、従来のＶＨ抗体断片の混入物も含有する。
【０００７】
米国特許第７，３７１，８４９号（Institute For Antibodies Co., Ltd）はまた、ラクダ科の動物のＶＨＨ遺伝子からＶＨＨライブラリーを作成する方法も報告する。このようなライブラリーの多様性は、ナイーブなレパートリーからＶＨＨ可変領域を単離する従来のプロセスを改良することによって得られた。しかし、これらの先行技術は、非ヒトに由来する抗体の免疫原性の問題に対処しない。それらの中のいくつかは対象の特定の標的に結合することが同定されているが、それらを、ヒト免疫系を賦活するリスクを伴うことなく、治療薬として使用するために患者に投与することはできない。
【０００８】
ラクダ科の動物の単一ドメイン抗体をヒト化するための方法は、Vincke et al, 2008, JBC Vol 284(5) pp 3273-3284に記載されている。
【０００９】
米国特許第８，３６７，５８６号は、合成抗体又はその断片のコレクションを開示している。これらの抗体は、可変重鎖と可変軽鎖の対を含み、そのフレームワーク領域には、最適な生殖系列上の遺伝子配列の一部を有する。このようなヒト配列の組込みは、治療用途の際の免疫原性のリスクを低減することを可能とする。
【００１０】
Monegal et al（2012, Dev Comp Immunol. 36(1):150-6）は、ＶＨの特徴を有する単一ドメイン抗体が、ラマのナイーブライブラリーのバイオパニングの間に繰り返し同定されることを報告する。事実、ＶＨＨの特徴よりもＶＨの特徴が、ＶＨＨナイーブライブラリーから選択された結合物質においてより頻繁に同定される。例えば、Monegal et alは、ＶＨの特徴の５％がナイーブライブラリーに見られ、一方、これらのＶＨの特徴の２０％が、抗原に対するバイオパニング後に選択された抗体の中に見られる。
【００１１】
それ故、この知見にも関わらず、高度な多様性を有し、かつ、所望の標的に対して高い親和性を有する非常に安定なヒト化単一ドメイン抗体を生じることのできる、単一ドメイン抗体ライブラリーを提供する必要性が依然として存在する。
【００１２】
したがって、本発明の１つの態様は、高度な多様性を有し、特定の抗原に対して高い親和性を有する非常に安定な単一ドメイン抗体ライブラリーを生じることのできる、非免疫原性の組換え単一ドメイン抗体ライブラリーを提供することである。別の態様は、細胞内環境において活性である単一ドメイン抗体の豊富なライブラリーを提供することである。さらに別の態様は、高い熱安定性を有する単一ドメイン抗体の豊富なライブラリーを提供することである。
【００１３】
発明の概要
本発明の目的は、合成単一ドメイン抗体ライブラリーを作成する方法によって成し遂げられ、該方法は、
ｉ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をコードする多様な核酸を、合成単一ドメイン抗体（これは本明細書において以後、「ｈｓ２ｄＡｂ」と称され得る）のそれぞれのフレームワークコード領域間に導入して、合成単一ドメイン骨格のアミノ酸配列を有する同合成単一ドメイン抗体をコードする多様な核酸を作製する工程を含み、
前記の合成単一ドメイン骨格のアミノ酸配列は、少なくとも以下の元来のラクダ科の動物のＶＨＨアミノ酸残基：Ｆ３７、Ｅ４４、Ｒ４５、Ｆ４７；及び少なくとも以下のヒト化アミノ酸残基：Ｐ１４、Ｓ４９、Ｓ７４、Ｒ８３、Ａ８４を含有し、場合によりさらに元来のラクダ科の動物のＶＨＨ残基であるＱ５、Ｑ１０８及びＴ８９を含む。
【００１４】
１つの具体的な実施態様では、合成単一ドメイン抗体（ｈｓ２ｄＡｂ）はラマ種のＶＨＨに由来し、かつ以下のヒト化アミノ酸残基：Ｆ１１、Ｐ１４、Ｓ４９、Ｓ７４、Ｋ７５、Ｖ７８、Ｙ７９、Ｓ８２ｂ、Ｒ８３及びＡ８４を含む。１つの関連した具体的な実施態様では、合成単一ドメイン抗体は、以下の全てのアミノ酸残基：Ｑ５、Ａ８、Ｆ１１、Ｐ１４、Ｆ３７、Ｋ４３、Ｅ４４、Ｒ４５、Ｆ４７、Ｓ４９、Ａ５０、Ｓ７４、Ｋ７５、Ｖ７８、Ｙ７９、Ｓ８２ｂ、Ｒ８３、Ａ８４、Ｔ８９、Ｑ１０８を含み得、ここでアミノ酸残基の位置は、ＶＨ及びＶＨＨアミノ酸配列について用いたＫａｂａｔの命名法により示される。
【００１５】
１つの具体的な実施態様では、合成単一ドメイン抗体は、配列番号１のＦＲ１、配列番号２のＦＲ２、配列番号３のＦＲ３、及び配列番号４のＦＲ４からなる前記のフレームワーク領域、又は、各フレームワーク領域内に例えば１、２若しくは３つ以下の保存的アミノ酸置換を有する機能的な変異フレームワーク領域を含む。
【００１６】
１つの好ましい実施態様では、合成ＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸残基は、以下の原則：
ＣＤＲ１の１位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ又はＤ；
ＣＤＲ１の２位には：Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ｔ又はＴ；
ＣＤＲ１の３位には：Ｙ、Ｓ、Ｆ又はＷ；
ＣＤＲ１の４位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＮ；
ＣＤＲ１の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ又はＬ；
ＣＤＲ１の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ又はＥ;
ＣＤＲ１の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ又はＶ；
ＣＤＲ２の１位には：Ｒ、Ｓ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ又はＹ；
ＣＤＲ２の２位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ又はＹ；
ＣＤＲ２の３位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｑ、Ｐ；
ＣＤＲ２の４位には：Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｎ又はＤ；
ＣＤＲ２の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ又はＭ；
ＣＤＲ２の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ又はＫ;
ＣＤＲ２の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、又はＶ
によって決定される。
【００１７】
前の実施態様と合わせられ得る１つの関連した実施態様では、前記のＣＤＲ３のアミノ酸配列は、９〜１８個のアミノ酸を含む。前の実施態様と合わせられ得る１つの関連した実施態様では、前記のＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ、Ｍの１つ以上の中から選択されたアミノ酸残基を含む。
【００１８】
本発明はまた、上記の方法によって得ることができ、かつ、少なくとも３×１０９個の明確に異なる単一ドメイン抗体コード配列を含む、合成単一ドメイン抗体ライブラリーに関する。
【００１９】
本発明はさらに、対象の標的、例えばヒトタンパク質に結合する合成単一ドメイン抗体を同定するためのスクリーニング法、例えばファージディスプレイにおける、前記の合成単一ドメイン抗体ライブラリーの使用に関する。
【００２０】
最後に、本発明は、以下の式：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の合成単一ドメイン抗体を含む抗原結合タンパク質を扱い、該フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４は、少なくとも以下の元来のラクダ科の動物のＶＨＨアミノ酸残基：Ｆ３７、Ｅ４４、Ｒ４５、Ｆ４７、及び少なくとも以下のヒト化アミノ酸残基：Ｐ１４、Ｓ４９、Ｓ７４、Ｒ８３、Ａ８４を含有する。該フレームワーク領域はさらに、少なくとも以下のアミノ酸残基：Ｑ５、Ｑ１０８及びＴ８９を含有し得る。１つの好ましい実施態様では、抗原結合タンパク質は、少なくとも以下の特定のアミノ酸残基：Ｑ５、Ａ８、Ｆ１１、Ｐ１４、Ｆ３７、Ｋ４３、Ｅ４４、Ｒ４５、Ｆ４７、Ｓ４９、Ａ５０、Ｓ７４、Ｋ７５、Ｖ７８、Ｙ７９、Ｓ８２ｂ、Ｒ８３、Ａ８４、Ｔ８９、Ｑ１０８の組合せを有する、合成単一ドメイン抗体を含む。
【００２１】
前の実施態様と合わせられ得る１つの具体的な実施態様では、抗原結合タンパク質は、以下の機能的特性の１つ以上を有する合成単一ドメイン抗体を含む：
ａ）それをＥ．ｃｏｌｉペリプラズムにおいて可溶性の単一ドメイン抗体として発現させることができる、
ｂ）それをＥ．ｃｏｌｉ、酵母又は他の真核生物の細胞質基質において可溶性の細胞内発現抗体として発現させることができる、
ｃ）それは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ融合アッセイに示されているような還元性環境において安定である、
ｄ）それは、例えば融合タンパク質（例えば蛍光タンパク質との融合物）として哺乳動物細胞株において発現させた場合に凝集しない。
【００２２】
１つの好ましい実施態様では、抗原結合タンパク質のフレームワーク領域は、配列番号１のＦＲ１、配列番号２のＦＲ２、配列番号３のＦＲ３、及び配列番号４のＦＲ４からなるラマ種のＶＨＨのフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４、又は、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の各々に例えば０、１、２若しくは３つ以下の保存的アミノ酸置換を有するその機能的な変異体に由来する。
【００２３】
前の実施態様と合わせられ得る別の好ましい実施態様では、合成ＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸残基は、以下のように分配され：
ＣＤＲ１の１位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ又はＤ；
ＣＤＲ１の２位には：Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ｔ又はＴ；
ＣＤＲ１の３位には：Ｙ、Ｓ、Ｓ、Ｓ、Ｆ又はＷ；
ＣＤＲ１の４位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＮ；
ＣＤＲ１の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ又はＬ；
ＣＤＲ１の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ又はＥ;
ＣＤＲ１の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ又はＶ；
ＣＤＲ２の１位には：Ｒ、Ｓ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ又はＹ；
ＣＤＲ２の２位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ又はＹ；
ＣＤＲ２の３位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｑ、Ｐ；
ＣＤＲ２の４位には：Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｎ又はＤ；
ＣＤＲ２の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ又はＭ；
ＣＤＲ２の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ又はＫ;
ＣＤＲ２の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、又はＶ、
ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ、Ｍの１つ以上の中から選択された９〜１８個のアミノ酸を含む。
【００２４】
発明の詳細な説明
本明細書では、合成単一ドメイン抗体又はその断片におけるアミノ酸残基の位置は、本明細書において以後に示されているようにＫａｂａｔの番号付け命名法に従って示される。
【００２５】
【表１】
2019194237.tif 000012
【００２６】
本発明は、合成単一ドメイン抗体ライブラリーを作成する方法を提供し、該方法は、
ｉ．ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をコードする多様な合成核酸を、合成単一ドメイン抗体のそれぞれのフレームワークコード領域間に導入して、合成単一ドメイン抗体骨格のアミノ酸配列を有する多様な同合成単一ドメイン抗体をコードする核酸を作製する工程を含み、
前記の合成単一ドメイン骨格のアミノ酸配列は、少なくとも以下の元来のラクダ科の動物のアミノ酸残基：Ｆ３７、Ｅ４４、Ｒ４５、Ｆ４７；及び、少なくとも以下のヒト化アミノ酸残基：Ｐ１４、Ｓ４９、Ｓ７４、Ｒ８３、Ａ８４を含有し、場合によりさらに、元来のラクダ科の動物のＶＨＨ残基のＱ５、Ｑ１０８、及びＴ８９を含む。
【００２７】
本発明の合成単一ドメイン抗体骨格
本発明は、非常に安定な単一ドメイン抗体骨格を得るための、単一ドメイン抗体のフレームワーク領域における独特な特色の同定、及び、合成単一ドメイン抗体ファージディスプレイライブラリーなどの合成単一ドメイン抗体ライブラリーを作成する際のその使用に関する。前記の独特な骨格を有する、結果として得られたｈｓ２ｄＡｂは非常に安定で、かつ免疫原性のリスクが低い。
【００２８】
ライブラリーを作成するための出発物質として、単一ドメイン抗体をコードする核酸が提供され得る。
【００２９】
本明細書において使用される「単一ドメイン抗体」という用語は、重鎖に由来する単一のモノマーの可変抗体ドメインからなる、僅か１２〜１５kDaの分子量を有する抗体断片を指す。該単一ドメイン抗体は、軽鎖を欠失した天然の抗体断片、例えば、ラクダ科の動物の抗体に由来するいわゆるＶＨＨ抗体、又はサメ種の抗体に由来するいわゆるＶＮＡＲ断片から誘導され得る。該単一ドメイン抗体はまた、特定の以下の突然変異：Ｆ３７、Ｅ４４、Ｒ４５及びＦ４７を有するヒト抗体からも誘導され得る。したがって、単一ドメイン抗体は、３つの超可変ＣＤＲ領域の間に配置された少なくとも４つのフレームワーク領域を含有し、結果として、以下の典型的な抗体可変ドメイン構造：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４が得られる。該単一ドメインは、抗体の軽鎖可変領域と相互作用しないで、重鎖と軽鎖の従来のヘテロダイマーの抗原に結合するＶＨ構造を形成する。
【００３０】
本明細書において使用される「合成」という用語は、このような抗体が天然の抗体断片から得られておらず、人工的なコード配列を含む組換え核酸から産生されたことを意味する。
【００３１】
特に、本発明の合成単一ドメイン抗体ライブラリーは、人工的なフレームワーク及びＣＤＲコード配列の合成によって作成された。免疫化されていないラマ動物のナイーブレパートリーの増幅によって得られたライブラリーとは異なり、本発明の合成単一ドメイン抗体ライブラリーは従来のＶＨ抗体を含有しない。
【００３２】
有利には、本発明の合成単一ドメイン抗体ライブラリーの１つの好ましい実施態様では、全ての単一ドメイン抗体クローンが同じフレームワーク領域を含有し、よって、独特な合成単一ドメイン抗体骨格が得られる。
【００３３】
本明細書において使用される「骨格」という用語は、本発明のライブラリーの合成単一ドメイン抗体の４つのフレームワーク領域を指す。典型的には、本発明のライブラリーの全ての単一ドメイン抗体は同じ骨格アミノ酸配列を有するが、そのＣＤＲは異なり得る（各ライブラリーの多様性はＣＤＲ領域にのみ存する）。
【００３４】
本発明に記載の合成単一ドメイン抗体骨格は、少なくとも以下の元来のラクダ科の動物のＶＨＨアミノ酸残基：Ｆ３７、Ｅ４４、Ｒ４５、Ｆ４７；及び、少なくとも以下のヒト化アミノ酸残基：Ｐ１４、Ｓ４９、Ｓ７４、Ｒ８３、Ａ８４を含有する。本発明の該合成単一ドメイン骨格は、場合によりさらに、元来のラクダ科の動物のＶＨＨ残基であるＱ５、Ｑ１０８及びＴ８９を含み得る。このような独特な特色は、免疫原性のリスクの低い非常に安定な合成単一ドメイン抗体を与える。
【００３５】
１つの具体的な実施態様では、合成単一ドメイン抗体骨格は、ラマ種の骨格の抗体のＶＨＨのコード配列を突然変異させて、アミノ酸配列中に少なくとも以下のヒト化アミノ酸残基：Ｐ１４、Ｓ４９、Ｓ７４、Ｒ８３、Ａ８４、好ましくは以下のヒト化アミノ酸残基：Ｆ１１、Ｐ１４、Ｓ４９、Ｓ７４、Ｋ７５、Ｖ７８、Ｙ７９、Ｓ８２ｂ、Ｒ８３及びＡ８４を得ることによって得られる。
【００３６】
前の実施態様と合わせられ得る１つの具体的な実施態様では、合成単一ドメイン抗体の骨格は、
（ｉ）生殖系列上のラマＦＲ２アミノ酸配列と同一なＦＲ２アミノ酸配列；
（ｉｉ）生殖系列上のヒトＦＲ３（ＶＨ３）アミノ酸配列と同一なＦＲ３アミノ酸配列；及び
（ｉｉｉ）生殖系列上のラマＦＲ４アミノ酸配列と同一なＦＲ４アミノ酸配列
を含む。
【００３７】
前の実施態様と合わせられ得る１つの具体的な実施態様では、よって、合成単一ドメイン抗体の骨格は、以下の特定のアミノ酸残基の組合せを含む：Ｑ５、Ａ８、Ｆ１１、Ｐ１４、Ｆ３７、Ｋ４３、Ｅ４４、Ｒ４５、Ｆ４７、Ｓ４９、Ａ５０、Ｓ７４、Ｋ７５、Ｖ７８、Ｙ７９、Ｓ８２ｂ、Ｒ８３、Ａ８４、Ｔ８９、Ｑ１０８。
【００３８】
別の具体的な実施態様では、合成単一ドメイン抗体の骨格は、配列番号１のＦＲ１、配列番号２のＦＲ２、配列番号３のＦＲ３、及び配列番号４のＦＲ４からなる前記のフレームワーク領域、又は、各フレームワーク領域内に、より好ましくは唯１つのフレームワーク領域内に、例えば１、２若しくは３つ以下の保存的なアミノ酸置換を有する機能的な変異フレームワーク領域を含む。
【００３９】
合成単一ドメイン抗体の骨格の一例を図１に示す。
【００４０】
保存的なアミノ酸の置換は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電の極性側鎖を有するアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
【００４１】
別の実施態様では、合成単一ドメイン抗体の骨格は、それぞれ配列番号１〜４に対して少なくとも９０％、好ましくは９５％の同一率を有する、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４フレームワーク領域の機能的変異体を含む。
【００４２】
本明細書において使用される２つの配列間の同一率は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要がある、ギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一位置の数の関数（すなわち、同一％＝同一位置の数／位置の総数×１００）である。２つの配列間の配列の比較及び同一率の決定は、下記されているような数学的アルゴリズムを使用して成し遂げられ得る。
【００４３】
２つのアミノ酸配列間の同一率は、ＡＬＩＧＮプログラムに組み込まれたE. Myers及びW. Miller（Comput. Appl. Biosci. 4: 1 1-17, 1988）のアルゴリズムを使用して決定され得る。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一率は、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれたNeedleman及びWunsch（J. Mol. Biol. 48:443- 453, 1970）のアルゴリズムを使用して決定され得る。同一率を決定するためのさらに別のプログラムは、独立型プログラムとして又はウェブサーバー（http://www.clustal.org/を参照）を介して利用できるＣＬＵＳＴＡＬ（M. Larkin ef a/. , Bioinformatics 23:2947-2948, 2007;D. Higgins and P. Sharpによって初めて記載、Gene 73:237-244, 1988）である。
【００４４】
機能的変異体を、本発明の該合成単一ドメイン骨格の有利な特性を保持するその能力について試験し得る。特に、それらを、以下の特性の少なくとも１つ以上を保持するその能力について試験し得る：
ｉ．それをＥ．ｃｏｌｉペリプラズムにおいて可溶性の単一ドメイン抗体として発現させることができる、
ｉｉ．それをＥ．ｃｏｌｉ、酵母又は他の真核生物の細胞質基質において可溶性の細胞内発現抗体として発現させることができる、
ｉｉｉ．それは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ融合アッセイの還元性環境において安定である、
ｉｖ．それは、例えば融合タンパク質（例えば蛍光タンパク質との融合物）として哺乳動物細胞株において発現させた場合に凝集しない。
【００４５】
上記の特性を試験するためのアッセイを実施例に記載する。
【００４６】
例えば、基準の合成単一ドメイン抗体のコード配列は、基準のＣＤＲコード配列（例えば配列番号９のクローンＤ１０のＣＤＲ）を、試験しようとする変異骨格コード配列（配列番号１〜４に対して相同な配列を有する）に移植することによって構築される。この基準の合成単一ドメイン抗体のコード配列は、上記の特性についてアッセイされることのできる基準の合成単一ドメイン抗体を作製することを可能とする。
【００４７】
選択された単一ドメイン抗体骨格へのＣＤＲの多様性の導入
特にＣＤＲコード配列の無作為な合成又は指向的な合成によって、抗体ライブラリーにおいてＣＤＲの多様性を生じさせ、これを対応するフレームワーク配列にクローニングするための方法は、当技術分野において広く記載されている。
【００４８】
本発明の合成単一ドメイン抗体ライブラリーは、例えば、Lindner, T., H. Kolmar, U. Haberkorn、及びW. Mier. 2011. Molecules. 16:1625-1641に記載のように、高度な多様性を有するＣＤＲを独特な選択された骨格配列に導入することによって同じように作成される。
【００４９】
本発明の１つの好ましい実施態様では、合成ＣＤＲ１及びＣＤＲ２の各アミノ酸配列の位置は、ヒトレパートリーにおけるＣＤＲの天然の多様性を模倣するように合理的に設計される。
【００５０】
システインは、細胞内での発現及び機能を妨害する可能性があるそのチオール基のために、自発的に回避される。その上、アルギニン及び疎水性残基も、結果として生じる抗体の高い凝集リスクのために回避され得る。プロリンの割合も低いことが好ましい。なぜなら、それはＣＤＲに、より多くの多様性を与えるからである。好ましくは、セリン、トレオニン及びチロシンは、エピトープとの結合に関与しているので、３つ全てのＣＤＲにおいて最も頻繁に出現する残基である。アスパラギン酸及びグルタミン酸も、可溶性を高めるためにいくつかの位置において豊富であり得る。ＣＤＲ３配列では、長さが、様々なエピトープの形状、特に空洞に結合する能力に影響を及ぼし得る。それ故、様々な長さのＣＤＲ３配列がライブラリーに導入され得る。
【００５１】
１つの具体的な実施態様では、当業者は、以下の原則：
ＣＤＲ１の１位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ又はＤ；
ＣＤＲ１の２位には：Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ｔ又はＴ；
ＣＤＲ１の３位には：Ｙ、Ｓ、Ｆ又はＷ；
ＣＤＲ１の４位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＮ；
ＣＤＲ１の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ又はＬ；
ＣＤＲ１の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ又はＥ;
ＣＤＲ１の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ又はＶ；
ＣＤＲ２の１位には：Ｒ、Ｓ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ又はＹ；
ＣＤＲ２の２位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ又はＹ；
ＣＤＲ２の３位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｑ、Ｐ；
ＣＤＲ２の４位には：Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｎ又はＤ；
ＣＤＲ２の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ又はＭ；
ＣＤＲ２の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ又はＫ;
ＣＤＲ２の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、又はＶ
に従って合成ＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸残基を選択し得る。
【００５２】
さらに、別の具体的な実施態様では、ＣＤＲ３アミノ酸配列は、以下のアミノ酸：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ、Ｍの１つ以上の中から選択された９〜１８個のアミノ酸を含む。
【００５３】
上記の出現の原則は、本発明の好ましいライブラリーを作成するための指針として使用されるが、異なる出現の原則を有する他のライブラリーも、本発明の有利な合成単一ドメイン抗体骨格を含有している限り、本発明の一部である。
【００５４】
具体的な実施態様では、ライブラリーのクローンの有意な割合のみが、上記の出現の原則に厳密に従い得る。例えば、統計学的には、ライブラリーのクローンの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、又は少なくとも９０％が、上記のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の位置におけるアミノ酸残基の出現の原則に従う。
【００５５】
これらのアミノ酸位置の出現頻度に配慮するために、及びフレーム内での終止又はシステインの出現を回避するために、又はフレームシフトを減らすために、進歩した遺伝子合成アプローチが好ましくは使用される。これらの方法は、Van den Brulle et al., 2008, Biotechniques 45(3): 340-3に記載のような二本鎖ＤＮＡトリプルブロック、トリヌクレオチド合成、又は他のコドンの制御された、より一般的には位置の制御された縮重合成アプローチを包含するがこれらに限定されない。
【００５６】
具体的な実施態様では、コドンの偏りはさらに、例えば、周知の方法を使用して、宿主細胞種、例えば哺乳動物宿主細胞での発現のために最適化され得る。
【００５７】
１つの具体的な実施態様では、コード配列は、望ましくない制限酵素部位、例えば、コード配列を適切なクローニングベクター又は発現ベクターにクローニングするために使用される制限酵素部位を含有しないように設計される。
【００５８】
結果として得られた多様なコード配列を、抗体ライブラリーのための適切な発現ベクター又はクローニングベクターに導入する。具体的な実施態様では、発現ベクターはプラスミドである。別の好ましい実施態様では、発現ベクターは、ファージディスプレイライブラリーを作成するのに適している。２種類の異なるベクター（ファージミドベクター及びファージベクター）を、ファージディスプレイライブラリーの作成のために使用し得る。
【００５９】
ファージミドは、プラスミドの複製起点を含有する線維状ファージ（Ｆｆ−ファージに由来）ベクターから得られる。ファージミドの基本成分は主に、プラスミドの複製起点、選択マーカー、遺伝子間領域（ＩＧ領域、通常、パッケージング配列とマイナス鎖及びプラス鎖の複製起点とを含有する）、ファージコートタンパク質の遺伝子、制限酵素の認識部位、プロモーター、及びシグナルペプチドをコードするＤＮＡセグメントを含む。さらに、分子タグを含めて、ファージミドをベースとしたライブラリーのスクリーニングを容易にすることができる。ファージミドを、Ｒ４０８、Ｍ１３ＫＯ７、及びＶＣＳＭ１３（Stratagene）などのヘルパーファージと同時感染させることによって、Ｆｆファージと同じ形態を有する線維状ファージ粒子へと変換させることができる。ファージベクターの一例は、ｆｄファージゲノムと、ファージゲノムの複製起点の近くに挿入されたＴｎ１０セグメントとからなる、Ｆｄ−ｔｅｔ（Zacher et al, gene, 1980, 9, 127-140）である。ファージミドベクターに使用するためのプロモーターの例としては、ＰｌａｃＺ又はＰＴ７が挙げられるがこれらに限定されず、シグナルペプチドの例としては、ｐｅｌＢリーダー、ｇＩＩＩ、ＣＡＴリーダー、ＳＲＰ又はＯｍｐＡシグナルペプチドが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６０】
他のファージディスプレイ法は、Ｔ４又はＴ７のような溶菌ファージを使用する。ディスプレイライブラリーを作成するために、ファージ以外のベクター、例えば細菌細胞でのディスプレイ（Daugherty et al., 1999  Protein Eng. Jul;12(7):613-21., Georgiou et al., 1997 Nat Biotechnol. 1997 Jan;15(1):29-34）、酵母細胞でのディスプレイ（Boder and Wittrup, Nat Biotechnol. 1997 Jun;15(6):553-7）、又はリボソームでのディスプレイのためのベクター（Zahnd C, Amstutz P, Pluckthun A. Nat Methods. 2007 Mar;4(3):269-79）も使用され得る。哺乳動物細胞上でのＤＮＡディスプレイ（Eldridge et al., Protein Engineering, Design & Selection vol. 22 no. 11 pp. 691-698, 2009）及び表面ディスプレイ（Rode HJ, et al. Biotechniques. 1996 Oct;21(4):650, 652-3, 655-6, 658）も報告されている。酵母ツーハイブリッド法などのディスプレイではない方法も、ライブラリーから関連した結合物質を選択するのに使用され得る（Visintin et al., 1999 Proc Natl Acad Sci U S A 96, 11723-11728）。
【００６１】
１つの好ましい実施態様では、空ベクターの発生を回避するために、自殺遺伝子を有するクローニングベクターにおける組換えコード配列の正の選択が適用される（例えば、Philippe Bernard, 1996, BioTechniques, Vol 21, No 2 “Positive Selection of Recombinant DNA by CcdB”を参照）。
【００６２】
好ましくは、抗体ライブラリーの作成のために設計されたＣＤＲアミノ酸残基の全ての可能な組合せによって計算された理論的な多様性は、少なくとも１０１１個又は少なくとも１０１２個の独特な配列である。
【００６３】
本発明の合成単一ドメイン抗体ライブラリー及びその使用
結果として、別の態様によると、本発明は、以前の方法によって得ることのできるか又は得られた合成単一ドメイン抗体ライブラリーに関する。
【００６４】
したがって、本明細書において使用される「合成単一ドメイン抗体ライブラリー」という用語は、場合によりクローニングベクター又は発現ベクターに含まれた、高度な多様性を有する該合成単一ドメイン抗体コード配列を含む、核酸ライブラリーを包含する。「合成単一ドメイン抗体ライブラリー」という用語はさらに、該核酸ライブラリーで形質転換された任意の宿主細胞又は生物、より具体的には、該核酸ライブラリーで、又は該核酸ライブラリーを含有するバクテリオファージ若しくはウイルスで形質転換された細菌、酵母、又は線維状真菌、又は哺乳動物細胞を含む。「合成単一ドメイン抗体ライブラリー」という用語はさらに、該核酸ライブラリーによってコードされる多様な抗体の対応する混合物を含む。本明細書において使用される「クローン」という用語は、核酸、宿主細胞、又は単一ドメイン抗体のいずれであれ、該抗体ライブラリーの独特なそれぞれの個体を指す。
【００６５】
本発明の１つの具体的な実施態様では、本発明の合成単一ドメイン抗体ライブラリーは少なくとも３×１０９個の多様なクローンを含む。
【００６６】
このライブラリーは、対象の標的に特異的に結合する合成単一ドメイン抗体を同定するためのスクリーニング法に使用され得る。対象の標的に対する特異的な親和性を有する結合物質を同定するための任意の公知のスクリーニング法を、本発明の合成単一ドメイン抗体ライブラリーに使用し得る。このような方法としては、ファージディスプレイ技術、細菌細胞でのディスプレイ、酵母細胞でのディスプレイ、哺乳動物細胞でのディスプレイ又はリボソームでのディスプレイが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６７】
好ましくは、スクリーニング法はファージディスプレイである。
【００６８】
好ましくは、対象の標的は治療標的であり、合成単一ドメイン抗体ライブラリーを使用して、該治療標的に特異的に結合する合成単一ドメイン抗体を同定する。具体的な実施態様では、対象の標的は、少なくとも１つの抗原性決定基を含む。具体的な実施態様では、標的は糖類又は多糖類、タンパク質又は糖タンパク質、脂質である。１つの具体的な実施態様では、前記の対象の標的は、植物、酵母、真菌、昆虫、哺乳動物、又は他の真核細胞を起源とする。別の具体的な実施態様では、前記の対象の標的は、細菌、原虫、又はウイルスを起源とする。
【００６９】
１つの具体的な実施態様では、「対象の標的に特異的に結合する単一ドメイン抗体」は、１mM以下、１００μM以下、１０μM以下のＫＤで対象の標的に結合する単一ドメイン抗体を指すことを意味する。これは、該単一ドメイン抗体が他の抗原にも結合することを除外しない。
【００７０】
本明細書において使用される「ＫＤ」という用語は、ＫｄとＫａの比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られた解離定数を指すことを意味し、モル濃度−１（Ｍ−１）として表現される。抗体のＫＤ値は、当技術分野において十分に確立された方法を使用して決定され得る。抗体のＫＤを決定するための方法は、表面プラズモン共鳴を使用することによるか、又はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム若しくはＰｒｏｔｅｏｎ（登録商標）などのバイオセンサーシステムを使用することによる。
【００７１】
本発明の抗原結合タンパク質
本発明の合成単一ドメイン抗体ライブラリーの高度な多様性を考慮して、当業者は、ファージディスプレイなどの従来のスクリーニング法によって、対象の標的に対して高い親和性及び高い特異性を有する合成単一ドメイン抗体を得ることができる。
【００７２】
結果として得られた合成単一ドメイン抗体は次いで、適切な抗原結合タンパク質を生じるために修飾され得る。特に、ＣＤＲ残基を、例えば対象の標的に対する抗体の親和性を高めるために、そのフォールディング又はその産生を高めるために、当技術分野において公知の技術（突然変異誘発、親和性成熟）を使用して修飾し得る。
【００７３】
したがって、本発明の別の態様はさらに、以下の式：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の合成単一ドメイン抗体を含む抗原結合タンパク質に関し、該フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４は、少なくとも以下の元来のラクダ科の動物のＶＨＨアミノ酸残基：Ｆ３７、Ｅ４４、Ｒ４５、Ｆ４７、及び；少なくとも以下のヒト化アミノ酸残基：Ｐ１４、Ｓ４９、Ｓ７４、Ｒ８３、Ａ８４を含有する。
【００７４】
１つの実施態様では、フレームワーク領域はさらに、少なくとも以下のアミノ酸残基：Ｑ５、Ｑ１０８及びＴ８９を含有する。別の実施態様では、合成単一ドメイン抗体は、少なくとも以下のアミノ酸残基の特定の組合せを含む：Ｑ５、Ａ８、Ｆ１１、Ｐ１４、Ｆ３７、Ｋ４３、Ｅ４４、Ｒ４５、Ｆ４７、Ｓ４９、Ａ５０、Ｓ７４、Ｋ７５、Ｖ７８、Ｙ７９、Ｓ８２ｂ、Ｒ８３、Ａ８４、Ｔ８９、Ｑ１０８。
【００７５】
１つの好ましい実施態様では、フレームワーク領域は、ラマ種のＶＨＨのフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４から得られる。別の具体的な実施態様では、単一ドメイン抗体の骨格は、
（ｉ）生殖系列上のラマＦＲ２アミノ酸配列と同一なＦＲ２アミノ酸配列；
（ｉｉ）生殖系列上のＦＲ３（ＶＨ３）アミノ酸配列と同一なＦＲ３アミノ酸配列；及び
（ｉｉｉ）生殖系列上のラマＦＲ４アミノ酸配列と同一なＦＲ４アミノ酸配列
を含む。
【００７６】
１つの好ましい実施態様では、合成単一ドメイン抗体は、以下の特色のいずれかを含む：
（ｉ）配列番号１のフレームワーク領域ＦＲ１、配列番号２のＦＲ２、配列番号３のＦＲ３、及び配列番号４のＦＲ４、
（ｉｉ）１、２又は３個以下のアミノ酸保存的置換を有し、有利な合成単一ドメイン特性を保持した、機能的な変異フレームワーク領域、
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１〜４に対して少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一率を有し、有利な合成単一ドメイン特性を保持した、機能的な変異フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４。
【００７７】
典型的には、フレームワーク領域内の１つ以上のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーに由来する他のアミノ残基で置換してもよく、新規なポリペプチド変異体を、本明細書に記載の機能的アッセイを使用して、保持された有利な特性について試験することができる。
【００７８】
このような有利な特性は、以下の特性の１つ以上である：
ｉ．それをＥ．ｃｏｌｉペリプラズムにおいて可溶性の単一ドメイン抗体として発現させることができる
典型的には、ｐｅｌＢリーダーペプチドを用いて５mg/Lを超える収率が好ましくはＥ．ｃｏｌｉ株において得られる。
ｉｉ．それをＥ．ｃｏｌｉの細胞質基質において可溶性の細胞内発現抗体として発現させることができる
例えば、抗体は、Ｔ７プロモーターを用いて５０mg/Lを超える収率でＥ．ｃｏｌｉのＢＬ２１株（ＤＥ３）において発現させることができる。
ｉｉｉ．それは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ融合アッセイにおいて示されるように還元性環境において安定である
上記の特性についての機能的アッセイが実施例に記載されている。Ｃ末端タグとしてクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼと融合した本発明の合成単一ドメイン抗体を含有する、該抗原結合タンパク質を発現している細菌細胞は、クロラムフェニコールに対して、特に培養培地中で３００μg/mlより高いクロラムフェニコール濃度で耐性であろう。
ｉｖ．それは、蛍光タンパク質との融合物として哺乳動物細胞株において発現させた場合に凝集しない
好ましくは、合成単一ドメイン抗体を含有する抗原結合タンパク質が蛍光タンパク質との融合物として発現される場合に、凝集は全く検出されないだろう。
【００７９】
好ましくは、合成ＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸残基は：
ＣＤＲ１の１位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ又はＤ；
ＣＤＲ１の２位には：Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ｔ又はＴ；
ＣＤＲ１の３位には：Ｙ、Ｓ、Ｓ、Ｓ、Ｆ又はＷ；
ＣＤＲ１の４位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＮ；
ＣＤＲ１の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ又はＬ；
ＣＤＲ１の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ又はＥ;
ＣＤＲ１の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ又はＶ；
ＣＤＲ２の１位には：Ｒ、Ｓ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ又はＹ；
ＣＤＲ２の２位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ又はＹ；
ＣＤＲ２の３位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｑ、Ｐ；
ＣＤＲ２の４位には：Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｎ又はＤ；
ＣＤＲ２の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ又はＭ；
ＣＤＲ２の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ又はＫ;
ＣＤＲ２の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、又はＶ
であり得；
ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ、Ｍの１つ以上の中から選択された９〜１８個のアミノ酸を含む。
【００８０】
したがって、１つの好ましい実施態様では、本発明の抗原結合タンパク質は特に、一般式ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の合成単一ドメイン抗体からなる。このような実施態様では、より好ましくは、ＦＲ１は、配列番号１、又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有する配列番号１の機能的変異体であり、ＦＲ２は、配列番号２、又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有する配列番号２の機能的変異体であり、ＦＲ３は、配列番号３、又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有する配列番号３の機能的変異体であり、ＦＲ４は、配列番号４、又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有する配列番号４の機能的変異体であり、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、以下のようなアミノ酸残基を有し：
ＣＤＲ１の１位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ又はＤ；
ＣＤＲ１の２位には：Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ｔ又はＴ；
ＣＤＲ１の３位には：Ｙ、Ｓ、Ｓ、Ｓ、Ｆ又はＷ；
ＣＤＲ１の４位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＮ；
ＣＤＲ１の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ又はＬ；
ＣＤＲ１の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ又はＥ;
ＣＤＲ１の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ又はＶ；
ＣＤＲ２の１位には：Ｒ、Ｓ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ又はＹ；
ＣＤＲ２の２位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ又はＹ；
ＣＤＲ２の３位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｑ、Ｐ；
ＣＤＲ２の４位には：Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｎ又はＤ；
ＣＤＲ２の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ又はＭ；
ＣＤＲ２の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ又はＫ;
ＣＤＲ２の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、又はＶ、
ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ、Ｍの１つ以上の中から選択された９〜１８個のアミノ酸を含む。
【００８１】
本発明の別の態様は、本発明の抗原結合タンパク質をコードする核酸分子に関する。したがって、本発明は、抗原結合タンパク質の少なくとも該合成単一ドメイン抗体部分をコードする単離された核酸を提供する。
【００８２】
核酸は、完全な細胞中、細胞溶解液中に存在しても、又は、部分的に精製された形若しくは実質的に純粋な形の核酸であってもよい。核酸は、アルカリ／ＳＤＳによる処理、ＣｓＣＩのバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当技術分野において周知のその他の技術をはじめとする標準的な技術によって、他の細胞性成分又は他の混入物、例えば他の細胞性核酸又はタンパク質から精製された場合に、「単離された」又は「実質的に純粋となる」。F. Ausubel, ef al., ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照されたい。本発明の核酸は、例えばＤＮＡ又はＲＮＡであり得、イントロン配列を含有していても含有していなくてもよい。
【００８３】
１つの実施態様では、核酸はＤＮＡ分子である。核酸は、ファージディスプレイベクターなどのベクターに、又は組換えプラスミドベクターに存在し得る。したがって、１つの具体的な実施態様では、本発明は、単離された核酸、或いは、以下の核酸配列：配列番号１〜４のそれぞれのフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４をコードする配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は、配列番号１〜４のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４の機能的変異体をコードする前記の配列番号５〜８に対して少なくとも９０％の同一率を有する変異体の対応する配列、の少なくとも１つ以上を含む、クローニングベクター若しくは発現ベクターを提供する。
【００８４】
上記及び実施例に記載のような抗原結合タンパク質をコードするＤＮＡ断片をさらに、標準的な組換えＤＮＡ技術によって操作して、例えば、発現系における適切な分泌のための任意のシグナル配列、さらなる精製工程のための任意の精製タグ及び切断可能なタグを含めることができる。これらの操作で、ＤＮＡ断片は、別のＤＮＡ分子に、又は別のタンパク質、例えば精製／分泌タグ若しくは可動性リンカーなどをコードする断片に作動可能に連結される。この文脈において使用される「作動可能に連結」という用語は、２つのＤＮＡ断片が機能的に、例えば、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がフレーム内に留まるように、又は、該タンパク質が所望のプロモーターの制御下で発現されるように接続されることを意味することを意図する。
【００８５】
本発明の抗原結合タンパク質は、例えば、当技術分野において周知である組換えＤＮＡ技術と遺伝子トランスフェクション法の組合せを使用して、宿主細胞のトランスフェクトーマにおいて産生され得る。宿主細胞のトランスフェクトーマにおける本発明の組換え抗原結合タンパク質の発現及び産生のために、当業者は有利には、抗体分子又は単一ドメイン抗体分子の発現及び組換え産生に関連した彼ら自身の一般的な知識を使用することができる。
【００８６】
したがって、本発明は、核酸及び場合により分泌シグナルを含む、本発明の該抗原結合タンパク質の産生に適した組換え宿主細胞を提供する。好ましい態様では、本発明の宿主細胞は、哺乳動物細胞株である。本発明はさらに、抗原結合タンパク質の産生のための適切な条件下で宿主細胞を培養し、該タンパク質を単離することを含む、前記したような抗原結合タンパク質の産生プロセスを提供する。
【００８７】
本発明の抗原結合タンパク質を分泌するための哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ細胞、例えばR.J. Kaufman and P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621に記載のようなＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220によって記載される）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、又はMoutel, S., El Marjou, A., Vielemeyer, O., Nizak, C., Benaroch, P., Dubel, S., and Perez, F. (2009). A multi-Fc-species system for recombinant antibody production. BMC Biotechnol 9, 14に記載のようなInvivogen社のｐＦｕｓｅ発現系、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞又はヒト細胞株（例えばＰＥＲ−Ｃ６細胞株、Ｃｒｕｃｅｌｌ、又はＨＥＫ２９３細胞、Yves Durocher et al. , 2002, Nucleic acids research vol. 30, No 2 p9）が挙げられる。本発明の抗原結合タンパク質をコードする該核酸が哺乳動物の宿主細胞に導入されると、宿主細胞における組換えポリペプチドの発現又は宿主細胞が増殖している培養培地中への組換えポリペプチドの分泌及び適切なリフォールディングを可能とするに十分な時間をかけて宿主細胞を培養して、該抗原結合タンパク質を産生することによって抗原結合タンパク質は産生される。
【００８８】
その後、抗原結合タンパク質を、標準的なタンパク質精製法を使用して培養培地から回収することができる。
【００８９】
１つの具体的な実施態様では、本発明は、本発明の少なくとも２つの同一な又は異なる合成単一ドメイン抗体アミノ酸配列を含む、例えば複合体の形態での、本発明の多価抗原結合タンパク質を提供する。１つの実施態様では、多価タンパク質は、少なくとも２つ、３つ、又は４つの合成単一ドメイン抗体アミノ酸配列を含む。合成単一ドメインアミノ酸配列は、タンパク質の融合又は共有結合若しくは非共有結合を介して、互いに連結され得る。
【００９０】
別の態様では、本発明は、１つ以上の薬学的に許容されるビヒクル又は担体と一緒に製剤化された、本発明の１つ又は組合せの抗原結合タンパク質を含有する、組成物、例えば医薬組成物を提供する。
【００９１】
本発明の医薬製剤は、所望の純度を有するタンパク質を、任意選択の生理学的に許容される担体、賦形剤、又は安定化剤（Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)）と混合することによって、水溶液、凍結乾燥製剤、又は他の乾燥製剤の形態で保存用に調製され得る。
【００９２】
本発明の医薬組成物に使用され得る適切な水性及び非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）及びその適切な混合物、植物油、例えばオリーブ油、並びに注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、コーティング材料、例えばレシチンなどの使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。
【００９３】
これらの組成物はまた、補助剤、例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤を含有し得る。微生物の存在の防御は、上記の滅菌手順によって、並びに様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの封入の両方によって確実となり得る。また、等張化剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを組成物に含めることが望ましくあり得る。さらに、注射剤形の延長吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤の封入によってもたらされ得る。
【００９４】
薬学的に許容される担体は、無菌水溶液又は分散液、及び、無菌注射溶液又は分散液の即時調製のための無菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は当技術分野において公知である。どの従来の媒体又は薬剤も活性化合物と不適合性ではない限りにおいて、本発明の医薬組成物におけるその使用が考えられる。補助的な活性化合物も、組成物に取り込まれてもよい。
【００９５】
治療用組成物は、典型的には、製造及び保存の条件下で無菌かつ安定でなければならない。
【００９６】
以下において、本発明は、以下の実施例及び図面を用いて説明されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】（Ａ）クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのカルボキシ末端の融合物は、可溶性のアミノ末端のＶＨＨの選択を可能とする折りたたみレポーターである。ｐＡＯ−ＶＨＨ−ＣＡＴＨａベクターから発現された構築物の図。（Ｂ）クロラムフェニコール選択培地（Ｃａｍ）上で選択されたＶＨＨの相対的なコロニーの増殖。（Ｃ）ラマ骨格ｌｓｄＡｂと、ライブラリーｈｓ２ｄＡｂのヒト化合成骨格とのアミノ酸配列アラインメント。位置（ＩＭＧＴ番号付け）を、ＶＨＨの固有の可溶性特性についてＤ１０細胞内発現抗体骨格に由来する保存されたアミノ酸（黒色）、及びヒトの従来のＶＨ３と共に保存されたヒト化残基（灰色）に従って強調した。
【図２】（Ａ）両方の骨格を提示するファージをＥ．ｃｏｌｉにおいて産生し、上清をウェスタンブロットで抗ｐＩＩＩ抗体（Biolabs）を用いて検出した。２本のバンドが見られ、１本はｐＩＩＩについてであり、１本は単一ドメインを含む融合物についてである。（Ｂ）ドットブロットによって分析された、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞又はＣＨＯ細胞における両方の骨格の産生。上清の連続希釈液を、抗Ｈｉｓタグ抗体（Sigma）を用いて顕現させた。（Ｃ）核ラミナに特徴的な核の辺縁部の構造を標識する、両方の骨格に由来する組換え抗体を用いてのＨｅＬａ細胞の免疫蛍光。（Ｄ）ＨｅＬａ細胞に、ＧＦＰに融合させた抗ラミン抗体発現プラスミドを一過性にトランスフェクトし、生細胞を２４時間後に画像撮影した。これは、両方の合成抗体の骨格が、細胞内ラミン標的の認識を可能とすることを示した。
【図３】（Ａ）ｓ２ｄＡｂ Ｄ５は、ＨｅＬａ細胞内の微小管を免疫蛍光により染色した。細胞を固定し、ＶＨＨで染色し、これを抗Ｈｉｓタグ抗体（Sigma）及び抗マウスＣｙ３二次抗体（Jackson）によって顕現させた。Ｄ５はまた、ＨＲＰ二次抗体（Jackson）で顕現されるＨｅＬａ細胞抽出物を用いるウェスタンブロット実験においてもチューブリンを検出する。（Ｂ）ウサギＦｃに融合したＨｅｒ２上、対、等モル濃度のウサギＦｃに結合しているＨｅｒ２上での、抗Ｈｅｒ２抗体を用いてのクローンＤ１０のファージＥＬＩＳＡ。ＳＫＢＲ３ Ｈｅｒ２陽性細胞対ＭＣＦ１０Ａ Ｈｅｒ２陰性細胞上での抗Ｈｅｒ２抗体によるＨＤ１０のＦＡＣＳ分析。（Ｃ）Ｈ１２は、ＧＴＰに結合した活性化状態のＲｈｏＡ ＧＴＰアーゼにしか結合しない立体構造を認識する抗体である。ＣＢＤでタグ化されたＨ１２は、インプットとして１００μM ＧＴＰγＳ（ＧＴＰ）又は１mM ＧＤＰのいずれかをローディングされたＨｅＬａ細胞抽出物から引き出す。ウェスタンブロット実験では、両方のインプットの５％においては同じようなレベルのＲｈｏＡが顕現するが、ＣＢＤ−Ｈ１２によるプルダウンではＧＴＰのローディングされた抽出物上にしか顕現しない。Ｄ５抗チューブリン抗体は陰性対照であり、従来のＧＳＴ−ＲＢＤ（ロテキンのＲｈｏ結合ドメイン）は、活発なＲｈｏのプルダウンの陽性対照として示される。
【図４】ｈｓ２ｄＡｂの細胞内発現。（Ａ）ＨｅＬａ細胞に、ＧＦＰでタグ化したＲａｂ６プラスミド及びｍＣｈｅｒｒｙでタグ化したｈｓ２ｄＡｂ抗ＧＦＰ抗体プラスミドを同時トランスフェクトした。ｈｓ２ｄＡｂ−ｍＣｈｅｒｒｙ抗ＧＦＰ抗体はインビボにおいてその標的と相互作用し、ｍＣｈｅｒｒｙシグナルはＧＦＰ−Ｒａｂ６と完全に同じ場所に局在した。（Ｂ）ＨｅＬａ細胞にＭｙｒ−ｐａｌｍ−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミド及びｈｓ２ｄＡｂ−ＧＦＰ抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体プラスミドを同時トランスフェクトした。ｈｓ２ｄＡｂ−ＧＦＰ抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体はインビボにおいてその標的と相互作用し、形質膜に局在するｍＣｈｅｒｒｙと完全に同じ場所に局在した。（Ｃ）Ｈｅｌａ細胞（ｐ５３＋／＋）及びＵ２ＯＳ（ｐ５３−／−）細胞に、ｈｓ２ｄＡｂ−ｍＣｈｅｒｒｙ抗ｐ５３抗体又はｈｓ２ｄＡｂ−ｍＣｈｅｒｒｙ抗ラミン抗体のいずれかをトランスフェクトした。抗ラミン細胞内発現抗体は両方の細胞型を標識したが、抗ｐ５３細胞内発現抗体はｐ５３陽性細胞の核のみ標識した。
【図５】固定された抗原へのｈｓ２ｄＡｂ抗ＧＦＰ抗体、抗ｐ５３抗体、及び抗Ｈｅｒ２抗体の結合についてのセンサーグラム。様々な濃度のｈｓ２ｄＡｂを２５℃でローディングし、１：１のラングミュア相互作用モデルに当てはめた。
【００９８】
実施例
機能的アッセイ
Ｅ．ｃｏｌｉペリプラズムにおける可溶性発現
単一ドメイン抗体断片を、ｐＨＥＮ６に由来する細菌ペリプラズム発現ベクターにサブクローニングし、ｐｅｌＢ分泌配列の下流において発現させた。新たに形質転換されたコロニーを、１％グルコース及び３０μg/mlの抗生物質カナマイシンの補充されたテリフィックブロス培地中で、Ａ６００＝０．６〜０．８に達するまで増殖させた。その後、６つのＨｉｓでタグ化された抗体断片の発現を、５００μMのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを用いて２８℃で１６時間かけて誘導し、その後、遠心沈殿した。遠心分離後、細胞ペレットをトリス−ＥＤＴＡ−スクロース浸透圧ショック緩衝液中でインキュベートし、再度遠心分離にかけた。細胞溶解液を清澄にし、ポリヒスチジンタグのためにＩＭＡＣ樹脂親和性カラムにローディングした。溶出した画分を透析し、タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【００９９】
Ｅ．ｃｏｌｉの細胞質基質における細胞内発現抗体の可溶性発現
単一ドメイン抗体断片を、Ｔ７プロモーターの制御下で細菌発現ベクターにサブクローニングした。プラスミド構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。１つのコロニーを、１％グルコース及び３０μg/mlの抗生物質カナマイシンの補充されたＬＢ培地中で、Ａ６００＝０．６〜０．８に達するまで増殖させた。その後、抗体断片の発現を、５００μMのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを用いて２８℃で６時間から８時間かけて誘導し、その後、遠心沈殿した。遠心分離後、細胞ペレットを溶解し、再度遠心分離にかけた。細胞溶解液を清澄にし、ポリヒスチジンタグのためにＩＭＡＣ樹脂親和性カラムにローディングした。溶出した画分を透析し、タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１００】
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ融合アッセイ
単一ドメイン抗体断片を、ｐＡＯＣＡＴ細菌ペリプラズム発現ベクターにサブクローニングした。クロラムフェニコール耐性アッセイを、ｐＡＯＣＡＴ−ＶＨＨ融合構築物を用いて形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を使用して行なった。細菌を、カナマイシン（３５μg/mL）及びグルコース（０．２％）を含有するＬＢ ５００μＬへの接種のために使用し、３７℃で、ＯＤ６００が０．８となるまで増殖させた。ＶＨＨ−ＣＡＴ−融合タンパク質の細胞質内発現を、０．２mMのＩＰＴＧの添加によって２時間かけて誘導した。誘導期間の終了時に、４μLの細菌アリコートを、ＩＰＴＧ（０．１mM）及び０〜５００μg/mlの範囲のクロラムフェニコール漸増濃度を含有するＬＢ寒天プレート上に蒔いた。細菌を３０℃で２０時間インキュベートし、その後、コロニーの形成を定量した。耐性レベルを、様々なクロラムフェニコール濃度におけるコロニー増殖速度に従って評価した。５００μg/ml以下のコロニーを与えるいくつかのＶＨＨを、ＧＦＰ（ｎｂ ＧＦＰ４）又はラミン（Ｌａｍ）に対して生じた以前に特徴付けられた細胞内発現抗体と、並びに、熱安定性ＶＨＨ Ｒｅ３及び細胞内発現抗体ではないＣ８と比較した。上記のように２時間の間に誘導された液体培養液を連続希釈によって希釈し、２５０μg/mlのクロラムフェニコール（Ｃａｍ）を含有する寒天プレート上に１０μlをスポットし、３０℃で２０時間インキュベートした。各希釈液についてコロニーを定量し、Ｄ１０クローンで常に見られたより多くの量に対して標準化した。
【０１０１】
哺乳動物細胞発現系における凝集アッセイ
真核細胞における細胞内抗体としての機能的発現
単一ドメイン抗体断片を、蛍光タンパク質との融合物として、及びＣＭＶプロモーターの制御下で発現させるために、哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした。哺乳動物細胞株にトランスフェクトし、細胞内の蛍光を、トランスフェクトから２４時間後又は４８時間後に観察した。トランスフェクトされた細胞におけるこれらの蛍光タンパク質の１つと融合したＶＨＨの蛍光分布は、ＧＦＰ又はｍＣｈｅｒｒｙと融合していないものと比較して、均一に広がり、４８時間の構成的発現後に明白な凝集物は示されなかった。
【０１０２】
Ｆｃ融合物としての機能的分泌
プラスミドは、インターロイキン−２（ＩＬ２）シグナル配列を含有するInvivogen社（サンディエゴ、米国）のｐＦＵＳＥ−Ｆｃ２（ＩＬ２ｓｓ）（商標）シリーズをベースとし、哺乳動物細胞によるＦｃ−融合タンパク質の分泌を可能とする。ｈｓ２ｄＡｂをＩｇＧのヒンジドメインに融合させたので、Ｆｃドメインはジスルフィド結合を形成し、ｈｓ２ｄＡｂ−Ｆｃはダイマーとして発現される。それらは、原核細胞及び真核細胞の両方においてゼオシン（商標）（Ｚｅｏ）を使用して選択可能である。これらのプラスミドは、部位特異的突然変異誘発及びアダプター挿入によって改変され（Moutel S, et al. BMC Biotechnol. 2009 Feb 26;9:14. doi: 10.1186/1472-6750-9-14）、一般的な組換え抗体の大規模な選別コレクション及び発現プラスミド（例えばｐＨＥＮ、ｐＳＥＸ、ｐＨＡＬ、ｐＣＡＮＴＡＢ、ｐＨＯＧ、ｐＯＰＥ、ｐＳＴＥ）から抽出された組換え抗体の簡単な１工程のカセットクローニングが可能となった。ｓ２ｄＡｂが、そのＣ末端でヒトＩｇＧ２（及びＩｇＧ１）（ｈ）、マウスＩｇＧ２ａ（ｍ）又はウサギＩｇＧ（ｒ）Ｆｃドメイン（Ｆｃ領域は、ＩｇＧ重鎖のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインとヒンジ領域とを含む）のいずれかと融合することができる４つのプラスミドを構築した。
【０１０３】
これらの発現プラスミドを用いてＣＨＯ細胞又はＨＥＫ細胞を一過性にトランスフェクトしてから４日後、分泌された抗体は、それぞれのＦｃ種に対して指向される抗ＩｇＧ抗体を使用して入手可能であり得る。これは、多様な多重化を可能とする。
【０１０４】
酵母ツーハイブリッドシステムにおける機能的発現
抗原コード配列を、酵母ツーハイブリッドのｂａｉｔプラスミドのｌｅｘＡ（Vojtek and Hollenberg (1995). Methods Enzymol. 255:331-42）又はｇａｌ４（Fromont-Racine, M., Rain, J.C.、及びLegrain, P. (1997). Nat. Genet. 16: 277-282）にクローニングした。試験しようとするＤＮＡ結合ドメインＳＤＡＢ集団を、酵母ツーハイブリッドのｐｒｅｙプラスミドのｐＧＡＤＧＨ（Bartel, P.L., et al (1993) in Cellular interactions in development: A practical approach. ed. Hartley, D.A.. (Oxford University Press, Oxford) pp. 153-179）にＰＣＲ及びギャップ修復（Orr-Weaver, T. L. and Szostak, J. W. (1983). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4417-4421）によって導入した：ｐＨＥＮ２−３ｍｙｃプラスミドプールのＤＮＡ調製物（１つのクローンから３×１０９個まで）を調製した。ミニプレップＤＮＡを、マトリックスとしてＤＮＡ １０ngを使用してｐＦｕポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して、オリゴヌクレオチド５ｐ ８３２８ CCCACCAAACCCAAAAAAAGAGATCCTAGAACTAGCTATGGCCGGACGGGCCATGGCGGAAGTGCAGCTGCAGGCTTC（配列番号１１）及びオリゴヌクレオチド３ｐ ８３２９ ACCGGGCCTCTAGACACTAGCTACTCGAGGGGCCCCAGTGGCCCTATCTATGCGGCCGCGCTACTCACAGTTAC（配列番号１２）を用いてＰＣＲによって増幅した。チューブの数はＤＮＡ品質の必要性に依存し、必要とされる形質転換体の数に関連する。典型的には１００万個の酵母形質転換体を得るために、本発明者らは５０μlの８回のＰＣＲを行なった。
【０１０５】
【数１】
2019194237.tif 000013
【０１０６】
ＰＣＲをアガロースゲル上で確認し、酢酸アンモニウム沈降法を使用して２０倍濃縮し、水に再度懸濁する。
【０１０７】
ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩによって消化されたプラスミドｐｒｅｙ ｐＧＡＤＧＨ ８μg及び濃縮されたＰＣＲ ２μlを、古典的なＬｉＡｃ／ＰＥＧ形質転換によって酵母において形質転換する。クローンを、トリプトファン、ロイシン及びヒスチジンの除去された選択培地に広げる。この方法によって同定されたｂａｉｔ特異的クローンは、酵母細胞内において機能的であるライブラリーからの細胞内発現抗体である。
【０１０８】
合成単一ドメイン抗体ライブラリーの作成、及び、該ライブラリーから得られた結合物質の特徴付け
本発明者らは、細胞内発現及び高い熱安定性について最適化された、高度に機能的な骨格ファミリーを選択した。この選択は、抗生物質耐性遺伝子とＶＨＨのコレクションとの間の融合タンパク質を使用して行なわれた。
【０１０９】
機能的ＶＨＨドメイン（凝集しない、分解しない）を発現している細菌のみが増殖することができた。発現収率、哺乳動物細胞の細胞質におけるＧＦＰ融合物としての可溶性をさらに評価して［及び、選択されたクロモボディ（chromobody）と比較し］、一連の適切な抗体を選択した。これらの抗体の配列をアラインさせ、共通配列をクローンＤ１０の共通ｓｄＡｂフレームワーク配列によって定義した（配列番号９参照）。このラマｓｄＡｂ（ｌｓｄＡｂ）の他にも本発明者らは配列を改変して、それはヒトＶＨにより類似し、したがって進化した共通部分は、合成ｓｄＡｂ（本明細書において以後、「ｈｓ２ｄＡｂ」と称される、配列番号１０を参照）として定義した。本発明者らは、ＶＬと疎水性界面を形成するために従来のＶＨに保存され、ｓｄＡｂの固有な可溶性特性にとって重要であるようであった、ＦＲ２の４つの位置（３７、４４、４５、４７）におけるＶＨＨの特異的な特徴を維持した（Kastelic D, et al. 2009 J Immunol Methods. Oct 31; 350(1-2):54-62）（図１ａ）。その後、本発明者らは、骨格が頑丈であり、予想された通り、公知の抗体のＣＤＲをｌｓｄＡｂ及びｓ２ｄＡｂフレームワークに移植することによって挙動することを確認した。これらの実験は、ｌｓｄＡｂ及びｈｓ２ｄＡｂの両方が、細菌細胞及びＣＨＯ細胞における効率的なディスプレイ、効率的な産生を可能とし、酸化条件及び還元条件において発現させたどちらの場合においても移植されたＣＤＲの適切な反応性を維持することを可能としたことを示した。よって本発明者らは、本発明者らのライブラリーを構築するためのフレームワークとしてｈｓ２ｄＡｂを選択することを決断した。
【０１１０】
その後、本発明者らは、クローンの機能に影響を及ぼすことなく、３つのＣＤＲに合成による多様性を導入した。数百個のラマｓｄＡｂ配列のアラインメントに基づいて、本発明者らは、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２の各々の位置について、天然の多様性を依然として模倣する一連のアミノ酸を合理的に設計した。本発明者らは自発的にシステイン残基を回避した。なぜなら、チオール基は後に、適切な細胞内での発現及び機能を妨害する可能性があるからである。本発明者らは、疎水性残基又はアルギニンの出現頻度を下げると、凝集が回避され（De Marco A. 2011,  Microb Cell Fact. Jun 9;10:44の総説）、同様にプロリンの出現頻度を下げると、ループにおける大半の可動性は保持されるであろうと推論した。セリン、トレオニン及びチロシンはエピトープとの結合に関与するＣＤＲループ内で最も頻繁に出現する残基であるので、アスパラギン酸及びグルタミン酸は可溶性を高めると提唱された（Lodish H, et al. Molecular Cell Biology. 4th edition. New York: W. H. Freeman, 2000）。本発明者らは、いくつかの位置におけるこれらの５つの残基を自発的に増やした。対照的に、本発明者らは、システインを除く全てのアミノ酸を導入することによって、ＣＤＲ２のいくつかの位置、並びに、ＣＤＲ３の各々の位置を完全に無作為化した。それにも関わらず、ＣＤＲ３配列に長さの多様性も導入し、様々なエピトープの形状に対する結合能を高めた。なぜなら、ナノボディは、平坦な表面又は空洞の両方（De Genst, E., et al. Proc Natl Acad Sci, (2006) Mar 21;103(12):4586-91）又はさらにはハプテン（Harmsen MM, et al 2007, Appl Microbiol Biotechnol., Nov;77(1):13-22の総説）にさえ結合することが示されているからである。これらの統計に配慮するために、疎水性が高すぎる残基又はアミノ酸により促進される凝集の発生率を下げるために、対照的には極性アミノ酸を豊富にするために、及びさらにはフレーム内での終止又はシステインの発生を回避しフレームシフトを減少させるために、多様なライブラリーの合成を、各コドンに対応する二本鎖ＤＮＡトリプレットブロックを使用する独特な遺伝子合成技術によって達成した（Van den Brulle J, et al. 2008. Biotechniques. Sep;45(3):340-3）。全てのコドンを哺乳動物細胞での発現のために最適化し、さらなるＣＤＲ３ループの移植又は工学操作のためにＳｎａｂＩ制限酵素部位をＦＲ３に加え、一方、任意の他の所望ではない制限酵素部位は骨格において回避された。
【０１１１】
高度な複雑さを生じさせ、空プラスミドの数を減少させるために、本発明者らは、非適合性クローニングサイト間に自殺遺伝子（ｃｃｄＢ）を有する新規クローニングベクターを構築した。毒性遺伝子を欠失したプラスミドのみが、細菌の増殖を可能とした。したがって、ＳＤＡＢ挿入断片を有するプラスミドのみが得られた。ｃｃｄＢ遺伝子は陽性選択マーカーとして使用される。結合活性を検出するために行なわれた大半の試験は、一価の選択された抗体を使用して行なわれ、その後、検出手段は、抗タグ抗体による免疫染色に基づく。しかし一価抗体上の一価のタグでは強力な検出ができないので、本発明者らは、検出力を高めるために、トリプルタグを、本発明者らが構築した新規ファージミドに付加することを決断した。
【０１１２】
クローニングされたｈｓ２ｄＡｂの十分な多様性を確実にするために、合理的な設計による理論的多様性の数は、合成された分子のそれをはるかに超え、これはまた形質転換されたコロニー数のｌｏｇの４倍を上回った。最も重要なのは合成されたｈｓ２ｄＡｂの非常に高度な分子の多様性であり、独特である十分な確率を有する配列は１０１２個超に達した。なぜなら、それは設計によって課される理論的な多様性を依然として上回っていたからであった。完全合成のｈｓ２ｄＡｂ−Ｌ１ライブラリーをｐＨＥＮ２−３ｍｙｃベクターにクローニングし、３×１０９個以下のコロニーを形質転換した。
【０１１３】
ｈｓ２ｄＡｂ−Ｌ１ライブラリーの品質及び機能を、１０５個のランダムなクローンをシークエンスすることによって評価した。その後、本発明者らはいくつかの選択手順を用いて様々な種類のＡｇに対して指向されるスクリーニングを行なった。試験された様々な標的のために、本発明者らはＥＧＦＰ、β−チューブリン、アクチン、構造的Ｒｈｏ、ｐ５３及びＨｅｒ２に対して良好な親和性を有する結合物質を得た。選択されたｈｓ２ｄＡｂ結合物質の特異性、親和性及び生産性の特徴付けを記載する。
【０１１４】
材料及び方法
プラスミド及びクローニング
６Ｈｉｓ−タグ及びトリプルｃ−ｍｙｃタグから構成される合成遺伝子（Mister Gene）をｐＨＥＮ２ファージミドベクター（Griffin 1.ライブラリー）のＮｏｔＩ部位とＢａｍＨＩ部位の間に挿入した。ｐＥＮＴＲ（商標）４ベクター（Invitrogen）からのｃｃｄＢ遺伝子をｐＨＥＮ２ベクターのＮｃｏＩ部位とＮｏｔＩ部位との間に挿入した。哺乳動物発現ベクターについては、ＶＨＨ又はｈｓ２ｄＡｂをＮｃｏＩとＮｏｔＩによって消化し、ｐＡＯＩＮＴ又はｐｍＣｈｅｒｙｙベクター（Clontech）にライゲートした。
【０１１５】
Ｃａｔアッセイフィルター
ｐＡＯ−ＣＡＴは、カルボキシ末端のＨＡでタグ化されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をＶＨＨ配列に融合させることのできる細胞質内発現ベクターである。それは、ＶＨＨ−ＣＡＴ配列を、ＸｂａＩ及びＫｐｎＩで消化されたｐＡＯＤ−Ｔｕｂ１−ｍＧＦＰベクター（Olichon A, et al. 2007. J Biol Chem. Dec 14;282(50):36314-20）にクローニングして、ＤｓｂＣ−Ｔｕｂ１−ｍＧＦＰを除去することによって構築された。ＶＨＨ−ＣＡＴ配列は、多段階ＰＣＲ戦略によって得られた。ＶＨＨを、5’CCTTGATTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGCTGATGTCCAGCTGCAGGCGT3’（フォワード、配列番号１３）及び5’CCACCGCTACCGCCGCTGCGG CCGCGTGAGGAGACGGTGACCTGG G3’（リバース、配列番号１４）を使用して増幅した。ＣＡＴの２つの配列を独立して、ｐＲｉｌｌプラスミドを鋳型として使用して増幅し、内部ＮｃｏＩ部位を除去した。Ｎ末端については以下のプライマーを使用した：5’ GCGGCCGCAGCGGCGGTAGCGGTGGCGAGAAAAAAATCACTGGATATACC 3’（フォワード、配列番号１５）及び5’ GCCCATCGTGAAAACGGGGGCG 3’（リバース、配列番号１６）。Ｃ末端を5’ CGCCCCCGTTTTCACGATGGGC 3’（フォーワード、配列番号１７）及び5’AGAATAGGTACCAGCGTAATCTGGGACATCATAAGGGTAGCCACCCGCCCCGCCCTGCACTCATCG 3’（リバース、配列番号１８）を使用して増幅した。３つの配列を最後のＰＣＲで構築し、産物をＸｂａＩ及びＫｐｎＩで消化し、その後、ベクターにライゲートした。
【０１１６】
ナイーブライブラリーから以前に選択されたＶＨＨを、ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ制限酵素部位を使用してｐＡＯＣＡＴにサブクローニングした。クロラムフェニコール耐性アッセイを、ｐＡＯＣＡＴ−ＶＨＨ融合構築物を用いて形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を使用して行なった。細菌を、カナマイシン（３５μg/mL）及びグルコース（０．２％）を含有するＬＢ ５００μLに接種するのに使用し、３７℃でＯＤ６００が０．８となるまで増殖させた。ＶＨＨ−ＣＡＴ融合タンパク質の細胞質内発現を、０．２mMのＩＰＴＧの添加によって２時間かけて誘導した。誘導期間終了時に、細菌アリコート ４μLを、ＩＰＴＧ（０．１mM）及び０〜５００μg/mlの範囲のクロラムフェニコール漸増濃度を含有するＬＢ寒天プレート上に蒔いた。細菌を３０℃で２０時間インキュベートし、その後、コロニーの形成を定量した。耐性レベルを、様々なクロラムフェニコール濃度でのコロニー増殖速度に従って評価した。５００μg/ml以下のコロニーを与えるいくつかのＶＨＨを、ＧＦＰ（ｎｂ ＧＦＰ４）又はラミン（Ｌａｍ）に対して生じた以前に特徴付けられた細胞内発現抗体と、並びに、熱安定性ＶＨＨ Ｒｅ３及び細胞内発現抗体ではないＣ８と比較した。上記のように２時間の間に誘導された液体培養液を連続希釈によって希釈し、１０μl以下を、２５０μg/mlのクロラムフェニコール（Ｃａｍ）を含有する寒天プレート上にスポットし、３０℃で２０時間インキュベートした。各希釈率についてのコロニーを定量し、Ｄ１０クローンで常に見られたより多い量に対して標準化した。
【０１１７】
Ｄ１０クローンをさらに、ｐＨＥＮ６発現ベクターにサブクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１１ｂｌｕｅ株の培養液において５mg/Lよりも高いペリプラズムでの発現となった。
【０１１８】
それをｐＡＯｉｎｔ−ｍＧＦＰにサブクローニングし、ＭＲＣ５、ＨＥＫ２９３又はＨｅＬａ Ｓ３細胞にトランスフェクトした。ＣＭＶプロモーター制御下のＤ１０−ＧＦＰの一過性発現により、２４時間後及び４８時間後においてＬａｍ１−ＧＦＰ又はＲｅ３−ＧＦＰと比較して、高いＧＦＰの蛍光がもたらされ、検出可能な凝集はない。
【０１１９】
ライブラリーの構築
ＦＲ及びＣＤＲの設計に対応する遺伝子コレクションをインビトロで合成した（Sloning, GeneArt）。多様な合成物 １μL（１０ng）（１×１０１０個の分子に相当、したがって、標的ライブラリー多様性の１０倍）をＰＣＲによって総容量５０μLでPhusion DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）１μLを以下のプライマーの等モル混合物と共に使用して増幅した：
5’-AACATGCCATCACTCAGATTCTCG-3’（配列番号１９）
5’-GTTAGTCCATATTCAGTATTATCG-3’（配列番号２０）。
【０１２０】
ＰＣＲプロトコールは、９８℃で４５秒間の初回の変性工程、続いて、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、及び７２℃で３０秒間を２０サイクル、並びに、７２℃で１０分間の最終工程の伸張からなった。ＰＣＲ ７×１５０μLを、ＰＣＲクリーンアップキット（Macherey-Nagel）の７つのカラムで精製した。得られた精製ＰＣＲ断片 ５５μg及びｐＨＥＮ２−ｃｃｄＢ−３ｍｙｃファージミド ８０μgを、３７℃でＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ（NEB）を用いて総容量５００μL中で２時間かけて消化した。仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（Sigma）を用いての脱リン酸化工程を３７℃で３０分間ファージミドに加えた。最終容量８０及び１２０μL中の消化物を、それぞれゲル抽出キット（Macherey-Nagel）の４つ及び６つのカラムでゲル上で精製した。その後、精製されたＰＣＲ断片を、ｐｅｌＢリーダーシグナルとｐＩＩＩ遺伝子との間のｐＨＥＮ２−ｃｃｄＢ−３ｍｙｃにライゲートした。ファージミド ５０μg及び挿入断片 １９．２μgを、総容量４００μL中の高濃度のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（NEB）１０μLを用いて１６℃で一晩かけてライゲートした。総容量１５０μLのライゲート物を、６つのカラム（Macherey-Nagel）で精製した。ライゲートされたＤＮＡ材料を使用して、エレクトロコンピテントなE.coli ＴＧ１細胞（Lucigen）を形質転換した。１μlのライゲート液を用いて２０回の電気穿孔を製造業者の説明書（１８００Ｖ；１０μF；６００Ω）に従って行なった。各々の電気穿孔液を加温２×ＹＴ（１％グルコース）培地 １mLを用いて再懸濁し、振盪撹拌しながら３７℃で１時間インキュベートした。２×ＹＴ（１％グルコース）３８０mLを懸濁液に加え、４３０個の２×ＹＴ−アンピシリン寒天皿（１４０mm）上で３７℃で一晩培養した。ライブラリーのサイズを、連続希釈アリコート液を蒔くことによって計算した。コロニーを、液体２×ＹＴを用いてプレートから剥がし、ライブラリーを３０％グリセロールの存在下で−８０℃で保存し、１mLのアリコートの吸光度は３８．４であった。３×１０９個の個々の組換えクローンが得られた。
【０１２１】
ライブラリーのシークエンス：
ライブラリーからの個々のクローンの異質性を、ion Torrentチップ（Invitrogen）で６×１０５個の挿入断片をシークエンスすることによって確認した。
【０１２２】
Ion Torrentシークエンスライブラリーは、製造業者の説明書に従ってAB Library Builderシステム（Life Technologies）のためのIon Plus Fragment Libraryキットを用いて調製され、High Sensitivity DNAキット（Agilent Technologies）を用いてAgilent 2100バイオアナライザ（Agilent Technologies）で制御された。シークエンス用の鋳型は、Ion OneTouch 2システム及びIon PGM Template OT2 400キット（Life Technologies）を用いてのエマルジョンＰＣＲによって調製された。シークエンスは、Ion PGM Sequencing 400キット及び314v2 Ionチップ（Life Technologies）を使用してIonTorrent Personal Genome Machineで行なった。
【０１２３】
抗原
ヒトβアクチンはSigmaから購入した。アミノ末端のキチン結合ドメイン又はストレプトアクチン結合ペプチドに融合したＲｈｏＡ ＧＴＰアーゼを、ＨＥＫ２９３細胞において産生した。ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）と融合したＧＦＰをインビトロでの翻訳システム（Roche）を通して産生し、精製を必要することなくスクリーニングに直接使用された（Moutel S, et al. 2009. Biotechnol J. Jan;4(1):38-43）。ビオチニル化チューブリンはCytoskeletonから購入した。ｐ５３については、NP_000537.3アイソフォームの最初の７２アミノ酸を、ＳＮＡＰタグと共に細菌内で産生させ、インビトロでビオチニル化した。Ｈｅｒ２については、天然受容体をＳＫＢＲ３細胞上の膜タンパク質標的として使用した。
【０１２４】
ファージディスプレイの選択
βアクチン、Ｈ１ヒストン、又はＦＩＴＣについてのスクリーニングが、Marks JD et al, 1991 J Mol Biol. Dec 5;222(3):581-97に記載のようにイムノチューブでのパニングによって行なわれた。ＧＦＰ、チューブリン及びｐ５３についてのスクリーニングが、Nizak et al. 2003 Science. May 9;300(5621):984-7に記載のようなナイーブな条件で行なわれた。Ｒｈｏに対するスクリーニングが、ＨＥＫ２９３細胞において発現されたタグが恒常的に活性であるＲｈｏＡの突然変異体に対してナイーブな条件で行なわれた。Ｈｅｒ２についてのスクリーニングが、Even-Desrumeaux K, Chames P. 2012 Methods Mol Biol.; 907:225-35に記載のような表面細胞上で行なわれた。
【０１２５】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
個々のクローンを、モノクローナルファージＥＬＩＳＡによって何処にでも記載されているようにスクリーニングした（Lee. et al; 2007, Nat Protoc. 2(11): 3001-8）。
【０１２６】
ウェスタンブロット
ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液中で煮沸した後、試料を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜（Whatman GmbH）上に転写した。膜を、室温で１時間又は４℃で一晩かけて、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む３％無脂肪ミルク−ＰＢＳ中で遮断した。ＳＤＡＢを１/１００で使用し、１/３０００の抗ｈｉｓタグ抗体（Sigma）と共に膜に９０分間かけて加えた。その後、ブロットを洗浄し、二次抗マウスＨＲＰで標識された抗体（ＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中で１/１００００に希釈）（Jakson ImmunoResearch Laboratories）と共に１時間インキュベートした。ＰＢＳ ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて５回洗浄した後、次いで、二次抗体を、SuperSignal化学発光試薬（Pierce）及びHyperfilm ECL（GE HealthCare）を使用して顕現させた。
【０１２７】
免疫蛍光
免疫蛍光スクリーニングを、以前に記載されているように（Nizak et al. 2003. Science. May 9;300(5621):984-7）ＨｅＬａ細胞に対して行なった。
【０１２８】
一過性トランスフェクション
カバーガラス上で培養したＨｅｌａ細胞を、１ウェルあたり１μgのＤＮＡ（２４ウェルプレート）又は１０μgのＤＮＡ（直径１０cm2の皿）を用いてＣａＰＯ４手順に従ってトランスフェクトした。細胞をトランスフェクションから１２時間後に観察することができる。
【０１２９】
フローサイトメトリー
細胞表面染色を、１％ＳＦＶの補充されたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で行なった。１００μlの上清（ファージ ８０μl＋ＰＢＳ/ミルク１％ ２０μl）を、１×１０５個の細胞上で氷上で１時間インキュベートした。ファージの結合を、氷上で１時間かけて１：３００の希釈率の抗Ｍ１３抗体（GE healthcare）によって検出し、次いで、４５分間かけてＰＥにコンジュゲートした１：１０００の希釈率の抗マウス抗体（BD Pharmingen）によって検出した。試料を、CellQuest Proソフトウェア（BD Biosciences、サンノゼ、ＣＡ）を使用してFACSCaliburでのフローサイトメトリーによって分析した。
【０１３０】
親和性の測定
ライブラリーから選択されかつＧＦＰ及びＥｒＢＢ２に特異的である、ｈｓ２ｄＡｂ抗体の結合親和性を、それぞれProteOn XPR36（BioRad）及びBiacore T200（GE Healthcare）を使用して２５℃で行ない、１：１のラングミュア相互作用モデルに当てはめた。リガンドＧＦＰ（２４kDa）を酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で１．６μMに希釈し、７３０ＲＵでＧＬＣチップ（BioRad）上にアミンカップリングによって固定した。一価単一ドメイン抗体（１４kDa）１００μLを分析物として使用し、１０００〜３μMの濃度で１００μL/分で注入した（６０秒間かけて注入、６００秒間かけて解離）。完全な動態の設定が一回の実行（ワンショット）で収集され、それ故、表面を再生する必要がなかった。ＥｒｂＢ２細胞外ドメイン−Ｆｃ（９６kDa）を酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で４００μg/mLに希釈し、９９１ＲＵでＣＭ５チップ（GE Healthcare）上にアミンカップリングによって固定した。一価単一ドメイン抗体（１４kDa）をＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液で希釈し、３００〜３μMの濃度の分析物として３０μL/分で１回サイクルの様式を使用して注入した（１２０秒間かけて注射、１２０秒間かけて中期の解離、６００秒間かけて最後の解離）。独特な注射順序における動態を収集し、表面再生（１０mM グリシンＨＣｌ、ｐＨ２．５、３０μL/分で３０秒間）は２回の連続したシリーズの間においてのみ行なわれた。
【０１３１】
結果
ライブラリーの設計
非常に安定しかつ機能的な抗体断片の豊富な大きな単一ドメイン抗体ライブラリーを作成する観点から、本発明者らは、単一のＶＨＨ骨格を同定することを目標とした。本発明者らは以前に、免疫性の又はナイーブなラマＶＨＨライブラリーから数百個のクローンを選択した（Monegal A, et al. 2012 Dev Comp Immunol. Jan;36(1):150-6）。本発明者らは、細菌細胞質において凝集又はアンフォールディングしがちなクローンから非常に安定なクローンを区別するクロラムフェニコールフィルターアッセイ（Olichon）を使用して、一連の高度に発現されたクローンをスクリーニングした。本発明者らは、カルボキシ末端のＨＡでタグ化されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をＶＨＨ配列に融合させることを可能とする、ｐＡＯ−ＣＡＴ細胞質内発現ベクターを使用した。公表されている熱安定性ＶＨＨ（Olichon A, et al BMC Biotechnol. 2007 Jan 26;7:7）又は細胞内発現抗体（Rothbauer U, et al Nat Methods. 2006 Nov;3(11):887-9）と比較することにより、ある骨格であるクローンＤ１０は、クロラムフェニコールに対するより高い耐性を示した（図１ａ）。Ｄ１０のＶＨＨはさらに本発明者らの溶解度、熱安定性、及び、どのような公知の抗原も全く認識しない状況で哺乳動物細胞内で細胞内発現抗体として発現されても凝集しないという全ての基準に当てはまった。その後、本発明者らは、骨格の部分的なヒト化（Vincke C, et al. J Biol Chem. 2009 Jan 30;284(5):3273-84）が、ヒトＶＨ３に見られる７個の残基に標的化することによって、その固有の特性に影響を及ぼすかどうかを評価した。固有の可溶性特性にとって重要であると思われたフレームワーク−２領域における４個のＶＨＨ特異的アミノ酸（４２位、４９位、５０位及び５２位）の特徴は（図１ｃ）はそのままとした。
【０１３２】
この骨格が抗原との結合に適切であり得、ライブラリー構築のための一般的な骨格として使用され得るかどうかを試験するために、本発明者らは、ラミンＢタンパク質に特異的なラマ１ＶＨＨのループを移植した（Rothbauer U, et al. Nat Methods. 2006 Nov;3(11):887-9）。図２ａは、どちらの骨格も（ｌｓｄＡｂＢ及びｈｓ２ｄＡｂ）、ここで抗ｐＩＩＩ抗体で標識されたファージ上への組換え抗体のディスプレイを妨害しないことを示す。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞又は哺乳動物ＣＨＯ細胞のいずれかの培養上清からの産生収率もまた（Moutel S, et al BMC Biotechnol. 2009 Feb 26;9:14. doi: 10.1186/1472-6750-9-14）、どちらの骨格についても高く同等であった（図２ｂ参照）。次いで、移植された合成抗体を使用して、間接的な免疫蛍光によりＨｅＬａ細胞を染色した。どちらの移植された単一ドメイン抗体も予想された染色を生じ、このことは、それらが内因性ラミンＢを効率的に染色したことを示す（図２ｃ）。その後、２つの合成抗体をＥＧＦＰに融合させ、細胞内発現抗体として使用した。ＨｅＬａ細胞の一過性トランスフェクションの後、元来のラマ１ＶＨＨ抗体を使用した場合に観察されたように（Rothbauer U, et al 2006）、どちらの蛍光抗体も可溶性であり、その細胞内標的を標識した（図２ｄ）。ラマ１ＣＤＲループと共に移植されたラマ及びヒト化Ｄ１０の両方の骨格が、親ＶＨＨの結合特性を保持していた。
【０１３３】
要するに、これらの実験は、ヒト化Ｄ１０の合成骨格（本明細書では合成単一ドメイン抗体すなわちｈｓ２ｄＡｂと呼ばれる）が、ＣＤＲループを提示するのに効率的かつ頑強なフレームワークであることを示した。
【０１３４】
ライブラリーの構築
本発明者らは、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２の各々の位置について（公表されているＶＨＨ結合物質に見られるＣＤＲの統計学的分析に基づいて）、天然の多様性を依然として模倣している一連のアミノ酸を合理的に設計することによって３つのＣＤＲに合成的な多様性を導入した。合成ＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸残基は以下の原則：
ＣＤＲ１の１位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ又はＤ；
ＣＤＲ１の２位には：Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ｔ又はＴ；
ＣＤＲ１の３位には：Ｙ、Ｓ、Ｓ、Ｓ、Ｆ又はＷ；
ＣＤＲ１の４位には：Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＮ；
ＣＤＲ１の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ又はＬ；
ＣＤＲ１の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ又はＥ;
ＣＤＲ１の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ又はＶ；
ＣＤＲ２の１位には：Ｒ、Ｓ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ又はＹ；
ＣＤＲ２の２位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ又はＹ；
ＣＤＲ２の３位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｑ、Ｐ；
ＣＤＲ２の４位には：Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｎ又はＤ；
ＣＤＲ２の５位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ又はＭ；
ＣＤＲ２の６位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ又はＫ;
ＣＤＲ２の７位には：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、又はＶ
によって決定された。ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｋ、Ｍの１つ以上の中から選択された９、１２、１５又は及び１８個のアミノ酸を含む。
【０１３５】
ＰＣＲに基づいた突然変異の付加を防ぐために少数のＰＣＲサイクルを使用して、合成ＤＮＡを増幅した。本発明者らは、２×１０１１個の異なる分子を用いて構築を開始した。本発明者らは、合成遺伝子（Proteogenix）と共に２つの補助的なｍｙｃ−タグを、組換え抗体とｐＩＩＩ遺伝子との間に付加することによって改変されたｐＨＥＮ２ファージミドベクターの合成ライブラリーをクローニングした。これらの付加的なｍｙｃ−タグは、一価抗体のより良好な顕現を可能とする（データは示されていない）。クローニングのために、本発明者らはまた、ライブラリーに挿入したクローンの正の選択を可能とする自殺遺伝子（ｃｃｄＢ）をＮｃｏＩとＮｏｔＩとの間に付加した。大量のファージミド及び挿入断片を使用して、大量の材料を得て、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞を電気穿孔した。２０回の電気穿孔を行なって、ｈｓ２ｄＡｂ−Ｌ１ライブラリーを作成した。形質転換された細菌を４３０個の大きな寒天プレート（１４０mm）上に蒔いた。連続希釈アリコート液を蒔くことによってライブラリーのサイズを計算し、３×１０９個の個々のクローンであると推定された。
【０１３６】
ライブラリーのシークエンス：
本発明者らはまず、３１５個のランダムなクローンをサンガーシークエンス法を用いてシークエンスすることによって機能的な多様性を評価した。９個の配列が終止コドンを有するか又は１塩基が欠失しているかのいずれかで見い出され、１つの配列が全てのＣＤＲ１を欠失し、もう１つはＣＤＲ１、ＦＲ１及びＣＤＲ２を欠失し、最後の２つの配列は空であることが認められた。したがって、ほんの非常に少数（４．１％）の欠陥クローンしか得られなかった。このことは、３×１０９個のクローンの大半が組換えｈｓ２ｄＡｂを発現しているであろうことを示唆する。
【０１３７】
ライブラリーの個々のクローンの異質性をさらに、ion Torrentチップ（Life Technologies）上で５．６×１０５個の挿入断片をシークエンスすることによって確認した。ＣＤＲ３について、４つのサイズの長さの配列の分布は均一であった。アミノ酸の多様性及び位置の出現頻度は、全てのＣＤＲについて本発明者らの設計と一致した（データは示されていない）。３つの重複クローンが認められたが、この観察は、次世代シークエンス手順の最中に行なわれたＰＣＲ増幅に関連している可能性がある。
【０１３８】
ライブラリーのスクリーニング
ｈｓ２ｄＡｂ−Ｌ１ライブラリーを、表１に報告された一連の異なる抗原に対して標準的な方法（Hoogenboom HR, et al. 1998 Jun;4(1):1-20）を使用してファージディスプレイによってスクリーニングした。様々なスクリーニングアプローチにおけるｈｓ２ｄＡｂ−Ｌ１の使用を検証するために、本発明者らはビーズ上での選択（これは大容量の抗原提示をもたらし、天然タンパク質に近い抗原のコンフォメーションを保つ）、イムノチューブ上でのパニング（標準的な方法として参照される）又は哺乳動物細胞の表面上に天然に提示される天然抗原上でのパニング（治療上関心のあるものに対してインビトロで選択をかける場合にしばしば行なわれるように）のいずれかを行なった。
【０１３９】
１回目のスクリーニングを、標的としてビオチニル化チューブリン（Cytoskeleton）を使用して天然の条件（Nizak、2005、上記参照）で行なった。２回の選択後、４０個のクローンを、メタノールで固定されたＨｅＬａ細胞上での免疫蛍光によってランダムにスクリーニングした。３つの組換え抗体が内因性チューブリンを染色した（図３Ａ）。これらの３つのクローンはまた、ヒトタンパク質試料のウェスタンブロットにおいても使用可能であった（図３Ａ）。２回目のスクリーニングを、ＳＫＢＲ３細胞の表面で発現されている内因性Ｈｅｒ２受容体に対して行なった。非ＳＫＢＲ３特異的抗体を対抗選択するために、ファージの事前吸着を、Ｈｅｒ２陰性ＭＣ１０Ａ細胞上で３回のそれぞれにおいて行なった。ＦＡＣＳアッセイを使用して、分析された８４個の中から１７個の特異的な抗ＳＫＢＲ３結合物質が見い出され、これを、１７個の非重複配列に分類することができた。標的としてＨｅｒ２細胞外ドメイン−Ｆｃ（９６kDa）を使用したＥＬＩＳＡによる分析は、その中の１２個がＨＥＲ２に対して指向されたことを示した（図３Ｂ）。免疫蛍光により、抗体がＳＫＢＲ３形質膜を装飾したことを確認した（データは示されていない）。腫瘍サプレッサーｐ５３タンパク質に対して指向された３回目のスクリーニングが行なわれた。細菌においてNP_000537.3アイソフォームの７２個の最初のアミノ酸がＳＮＡＰタグと融合して産生され、インビトロでビオチニル化され、ビーズ上での標的として使用された。３回の選択後、８０個の中の１２個のクローンがファージＥＬＩＳＡにおいて陽性と判明し（データは示されていない）、６個のクローンがＡ４３１細胞上での免疫蛍光で内因性ｐ５３を明瞭に標識し（データは示されていない）、一方、２個のクローンがＨｅＬａ細胞上での細胞内発現抗体として使用可能であった（図４参照）。予想された通り、ｐ５３−/−であるＵ２ＯＳ細胞では全く染色が観察されなかった。４回目のスクリーニングを行なって、Ｒｈｏ−ＧＴＰタンパク質の構造認識的結合物質を得た。４回の競合的選択後（材料及び方法を参照）、８０個の独特なクローンを、ＧＤＰ又は加水分解不可能なＧＴＰγＳがローディングされた組換えＧＳＴ−ＲｈｏＡタンパク質を使用してＥＬＩＳＡで試験した。２４個の抗体が、ＧＤＰ−Ｒｈｏに対するよりもＧＴＰγＳ−ＲｈｏＡに対してより強力なシグナルを生じ、このことは構造認識的な結合を示す。抗体の１つであるＨ１２クローンがスクリーニングを支配し、これは追加の５回の選択時に得られた唯一のクローンであった。本発明者らは、ＲｈｏＡ陰性突然変異体Ｎ１９（ＧＤＰに結合）又は恒常的に活性な突然変異体Ｌ６３（ＧＴＰに結合）のＳＦ−ＧＦＰ（スーパーフォールダーＧＦＰ）融合体を発現しているＨｅＬａ細胞上での免疫蛍光でこれらの構造認識的結合物質を試験した。どのクローンもＮ１９陰性突然変異体を発現している細胞を染色しなかったが、その中の８個のクローンは、活性形のＲｈｏＡを過剰発現している細胞を効率的に染色した。本発明者らはさらにクローンＨ１２を特徴付け、ＧＴＰγＳ又はＧＤＰと共にインキュベートされたＨｅＬａ細胞抽出物から内因性ＲｈｏＡを引き出すその能力を試験した。本発明者らは、精製されたＨ１２抗体が、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、及びインビトロでのプルダウン実験において使用可能なＲｈｏ活性の効果的な構造認識的なバイオセンサーであったことを示した。本発明者らはさらに、従来のＲＢＤ活性アッセイよりも効果的であることを観察したので、エフェクタータンパク質のＲｈｏ結合ドメインをバイオセンサーとして使用する。（図３Ｃ、ＩＦ及びＥＬＩＳＡ、データは示されていない）。天然条件での５回目のスクリーニングを、標的としてＧＦＰタンパク質を使用して行なった。分析された８０個の中の３７個の重複していないクローンが、ファージＥＬＩＳＡにおいて陽性であった（データは示されていない）。その中の１０個がＧＦＰ−ｍｙｒ−ｐａｌｍを免疫蛍光によって検出した（データは示されていない）。重要なことには、本発明者らは、これらの中の４つの抗体が、Ｈｅｌａ細胞内で発現された組換えＧＦＰに対する細胞内発現抗体として利用できたことを観察した（図４）。最後の選別は、天然の市販のβアクチン（Sigma）でコーティングされたイムノチューブを使用して行なわれた。この最後のスクリーニングは、ファージＥＬＩＳＡによって観察されたように８０個中１６個の独特な結合物質の選択を可能とし（データは示されていない）、その中の７個が、ＨｅＬａ細胞内の内因性アクチンストレス線維を明瞭に装飾し（データは示されていない）、４個がウェスタンブロット実験に使用できた（データは示されていない）。
【０１４０】
【表２】
2019194237.tif 000014
【０１４１】
親和性の測定
ＧＦＰ、Ｈｅｒ２及びｐ５３に対する単一ドメイン抗体の親和性を、ProteOn XPR36（BioRad）又はBiacore T200（GE Healthcare）を使用して測定した。親和性はナノモル範囲であると推定され（抗ＧＦＰ抗体については３．０６×１０−８Ｍで、抗Ｈｅｒ２抗体については１．９４×１０−８Ｍで、抗ｐ５３抗体については３．２５×１０−８Ｍ）、このことは、高親和性結合物質が、本発明者らの合成で非免疫原性の単一ドメイン抗体のｈｓ２ｄＡｂ−Ｌ１ライブラリーから得ることができたことを実証する（図５）。
【０１４２】
阻害性の細胞内発現抗体
遮断性抗体の同定は困難な課題である。しかし、その標的機能を阻害するために、非遮断性の細胞内発現抗体を官能基化することが可能である。１つのアプローチは、Caussinus et al. 2011（Caussinus et al. 2011, Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 117-121）に記載のような認識された標的のユビキチン化及び分解に依拠する。このアプローチは、タンパク質をプロテアソーム依存性細胞分解へと標的化させる、複合体Ｅ１／Ｅ２／Ｅ３ユビキチン化機序のＥ３ユビキチンリガーゼである、ＳＣＦ複合体の一員である、Ｓｋｉｐ１との相互作用を可能とする、Ｆ−ボックスドメインへの細胞内発現抗体の融合に基づく。このアプローチは当初、免疫ライブラリーから初めて単離された頑強な高親和性のＧＦＰラマ細胞内発現抗体である、ＧＦＰ４と命名された、単一抗ＧＦＰ細胞内発現抗体を使用してショウジョウバエにおけるいくつかのＧＦＰ融合タンパク質を標的化するために開発された（Rothbauer, U. et al.Nat. Methods 3, 887-889）。このようなタンパク質ノックダウンアプローチのためのｈｓ２ｄＡｂの相対的機能に関する洞察を得るために、本発明者らは、本発明者らの抗ＧＦＰ ｈｓ２ｄＡｂのいくつかをそのアミノ末端においてＦボックスドメインに融合させ、その効力をＦボックス−ＧＦＰ４抗体の効力と比較した。Ｆボックス−細胞内発現抗体の融合タンパク質（Ｆ−Ｉｂ）を発現している細胞を検出するために、本発明者らは、ミトコンドリアに標的化されたｍＣｈｅｒｒｙと一緒に（Ｍｉｔｏ−ｍＣｈｅｒｒｙ）Ｆ−Ｉｂの共発現を駆動するビシストロン性ベクターを構築した。本発明者らは、ヒストンＨ２Ｂに融合したＧＦＰを安定に発現しているＨｅＬａクローンにおいてＦ−Ｉｂ抗体を発現し（Sillje, H. H. W., Nagel, S., Korner, R. & Nigg, E. A., 2006, Curr. Biol. CB 16, 731-742）、ＧＦＰ−Ｈ２Ｂの欠失を探した。予想された通り、ｄｅｇｒａｄＦＰとしても知られる、Ｆ−ＧＦＰ４は、ウェスタンブロットによって分析されるようなＨ２Ｂ−ＧＦＰ発現の強力な減少を誘導した（データは示されていない）。したがって、核における蛍光強度の強力な減少が、Ｆ−ＧＦＰ４を発現している細胞において観察された。ＧＦＰ４単独、又は、切断短縮された非機能的なＦボックスドメインに融合したＧＦＰ４のいずれかを発現している場合には全く効果は観察されなかった。本発明者らが本発明者らの新規ライブラリーから選択された抗ＧＦＰクローンを試験した時に、本発明者らは、蛍光細胞内発現抗体として使用された場合に効果的であることが判明したいくつかのｈｓ２ｄＡｂは、Ｆ−Ｉｂとして発現された場合にＨ２Ｂ−ＧＦＰを分解することができなかったことを観察した。このことは、全ての細胞内発現抗体が、Ｆ−ボックスを用いて効果的に官能基化されることができるわけではないという事実を強調する。しかし、ある抗ＧＦＰ ｈｓ２ｄＡｂは、Ｆ−Ｉｂとして発現された場合に核におけるＨ２Ｂ−ＧＦＰシグナルの完全な消失を誘導した。ＦＡＣＳ分析は、７０％も減少した蛍光強度を示した。予想された通り、この効果は、プロテアソーム阻害剤による処理の存在下で逆転した。
【０１４３】
要するに、これらの実験は、ｈｓ２ｄＡｂ骨格が、蛍光細胞内発現抗体又は阻害性細胞内発現抗体として使用するために哺乳動物細胞の細胞質内で発現させることができる抗体の頻繁な選択を可能とすることを示す。
【０１４４】
【表３】
2019194237.tif 000015
2019194237.tif 000016
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2019194237.tif 000017
【外国語明細書】
2019194237000001.pdf