(57)【要約】本発明は、消化管粘膜炎を予防および処置するための組成物および方法に関する。より具体的には、本発明により、ＦＧＦ−２０、その断片、誘導体、改変体、ホモログ、またはアナログを含む組成物を使用することによる、消化管粘膜炎を予防および／または処置するための方法が提供される。本発明は、消化管粘膜炎を予防または処置する方法であって、その必要がある被験体に、配列番号２４、２６、２８、または３０のアミノ酸配列を有している単離されたタンパク質を含有する組成物の予防有効量または治療有効量を投与する工程を包含する、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
消化管粘膜炎を予防または処置する方法であって、その必要がある被験体に、配列番号２４、２６、２８、または３０のアミノ酸配列を有している単離されたタンパク質を含有する組成物の予防有効量または治療有効量を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
消化管粘膜炎を予防または処置する方法であって、ただし、該消化管粘膜炎は口腔粘膜炎ではなく、その必要がある被験体に、以下：
（ａ）配列番号２、４、７、１０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、または４０のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）（ａ）のタンパク質に対して１つ以上のアミノ酸置換を有しているタンパク質であって、ここで、該置換は、配列番号２、４、７、１０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、または４０のアミノ酸配列の１５％以下であり、１つ以上のアミノ酸置換を有している該タンパク質は細胞増殖刺激活性を保持している、タンパク質；および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のタンパク質の断片であって、細胞増殖刺激活性を保持している、断片、
からなる群より選択される単離されたタンパク質を含有する組成物の予防有効量または治療有効量を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３】
前記組成物がさらに薬学的に受容可能なキャリアを含有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物が、０．０４Ｍの酢酸ナトリウム、３％のグリセロール（容積／容積）、０．２Ｍのアルギニン−ＨＣｌ（ｐＨ５．３）、および３ｍｇ／ｍｌの前記単離されたタンパク質を含有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物が、０．１〜１Ｍのアルギニンまたはその塩、０．０１〜０．１Ｍの塩基性リン酸ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ）、０．０１〜０．１重量／容積（「ｗ／ｖ」）％のポリソルベート８０またはポリソルベート２０、および２〜５０ｍｇ／ｍｌの前記単離されたタンパク質を含有する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記アルギニンまたはその塩が、アルギニン、硫酸アルギニン、リン酸アルギニン、および塩酸アルギニンからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記アルギニンまたはその塩が０．５Ｍである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記塩基性リン酸ナトリウムが０．０５Ｍである、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリソルベート８０またはポリソルベート２０が０．０１％（ｗ／ｖ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記単離されたタンパク質が５〜３０ｍｇ／ｍｌの濃度である、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記単離されたタンパク質が１０ｍｇ／ｍｌの濃度である、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記単離されたタンパク質が配列番号２４のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記単離されたタンパク質が２つ以上のタンパク質を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物が、配列番号２４、２８、３０、および３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む２つ以上のタンパク質を含有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物が、配列番号２、２４、２８、３０、および３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む２つ以上のタンパク質を含有し、１つ以上のタンパク質がカルバミル化されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物が凍結乾燥されている、請求項５に記載の方法。
【請求項１７】
前記単離されたタンパク質が少なくとも９８％の純度を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項１８】
前記消化管粘膜炎が口腔粘膜炎である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記消化管粘膜炎が腸炎である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２０】
前記消化管粘膜炎が、食道炎、胃炎、または直腸炎である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２１】
前記消化管粘膜炎が、化学的原因、生物学的原因、放射線、またはそれらの組み合わせによって引き起こされる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２２】
前記有効量が０．００１〜３ｍｇ／ｋｇの間である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２３】
前記有効量が０．０１〜１ｍｇ／ｋｇの間である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２４】
前記有効量が０．０１〜０．５ｍｇ／ｋｇの間である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２５】
前記有効量が約０．０３ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、または約３ｍｇ／ｋｇである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２６】
前記投与が、０．００１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、または０．２ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される単回投与である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２７】
前記投与が、０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、または０．２ｍｇ／ｋｇの各単位投与量で投与される複数回投与である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２８】
前記投与が非経口投与である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２９】
前記非経口投与が、静脈内投与または皮下投与である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記投与が、直腸投与、経皮投与、または経粘膜的投与である、請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（１．発明の分野）
本発明は、消化管粘膜炎を予防および処置するための組成物および方法に関する。より具体的には、本発明は、ＦＧＦ−２０、その断片、誘導体、改変体、ホモログ、またはアナログを含有する組成物、および消化管粘膜炎の予防および処置におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（２．発明の背景）
（２．１  消化管粘膜炎）
消化管粘膜炎は、消化管への粘膜関門の損傷の形成を意味する。消化管粘膜炎は、例えば、食道、胃、小腸、結腸、および直腸を経る口から肛門までの消化管の一部または複数の部分に生じ得る。消化管粘膜炎の限定ではない例は、口腔粘膜炎、食道炎、胃炎、腸炎、および直腸炎である。例えば、非特許文献１；および非特許文献２を参照のこと。
【０００３】
消化管粘膜炎は、通常は、１つ以上の原因によって引き起こされ、最も一般的には、化学物質（単数または複数）または放射線、あるいはそれらの組み合わせによる。放射線は、例えば、放射線治療、不慮の放射線被曝、およびテロリストの攻撃による放射線被爆の結果であり得る。例えば、非特許文献３を参照のこと。化学的原因は、一般的には化学療法によるものである。
【０００４】
口腔粘膜炎は、一般的には、化学療法および放射線治療（特に、癌患者において）の痛みを伴う用量規定毒性として生じる。この障害は、例えば、潰瘍性の病変の形成を生じる口腔粘膜の破壊を特徴とする。骨髄抑制された患者においては、粘膜炎を伴う潰瘍が多くの場合に固有の口腔細菌の侵入口となり、これによって多くの場合、敗血症または菌血症に至る。口腔粘膜炎は、抗腫瘍薬による治療を受けている患者の３分の１超においてある程度生じる。頻度および重篤度は、白血病についての導入療法で処置された患者、または骨髄移植のための多くの馴化レジメンで処置された患者の間で明らかに高い。これらの個体の間では、中度から重症の口腔粘膜炎は患者の４分の３以上にとっては珍しいことではない。頭頸部の腫瘍についての放射線治療を受けた実質的に全ての患者に生じる中度から重症の粘膜炎は、１５Ｇｙの累積暴露で代表的に始まり、６０Ｇｙまたはそれ以上の総線量に達するとさらに悪化する（例えば、非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；および非特許文献７を参照のこと）。
【０００５】
口腔粘膜炎に対して現在利用可能な医療は、大部分は、症状を軽減させるものであり、これには、リドカインのような局所鎮痛剤の塗布、ならびに／または麻酔薬および抗生物質の全身投与が挙げられる（例えば、非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７を参照のこと）。いくつかの薬剤は、口腔粘膜炎の予防または処置における安全性および効力について評価されている（例えば、非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；および非特許文献１１を参照のこと）。これらとしては、粘膜保護剤、抗生物質、トランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）が挙げられる。最近、天然に存在しているヒトＫＧＦの修飾された種類のもの（Ｐａｌｉｆｅｒｍｉｎ，Ａｍｇｅｎ）が、米国において、造血幹細胞によるサポートが必要な骨髄毒性療法を受けた悪性血液疾患の患者の重症の口腔粘膜炎の発症および持続期間を減少させることについて認可された。
【０００６】
食道炎（食道の炎症）の主な臨床症状は、嚥下困難（飲み込むことが難しいこと）、嚥下痛（飲み込む際に痛みが伴うこと）、胸骨下胸痛（放射線により誘導された食道炎におけるもの）および／または胸骨後面胸痛（化学療法により誘導された食道炎におけるもの）である。例えば、非特許文献２を参照のこと。食道炎は、一般的には、局所麻酔剤、鎮痙薬、鎮痛剤の局所的な使用、および胃酸の逆流の処置によって処置される。ラニチジンまたはオメプラゾールが、特定の化学療法の後の上腹部痛および胸焼けの予防的減少のために推奨されている。一部の症例においては、食道炎の重篤度には、処置の一時的な中断、または処置プランの変更が必要である。例えば、非特許文献２を参照のこと。
【０００７】
胃炎（胃の炎症）は、放射線によって誘導される場合があり、例えば、消化不良および症候性胃炎（これは通常は一時的である）を特徴とする。一部の症例においては、胃潰瘍が起こる場合もある。化学療法により誘導される胃炎については、それほど多くの報告が公開されているわけではない。現在は、ヒスタミン−２レセプターアンタゴニストまたはプロトンポンプインヒビターが、胃炎を伴う症状を処置するために一般的に使用されている。例えば、非特許文献２；非特許文献１２を参照のこと。
【０００８】
腸炎（腸、特に、小腸の炎症）は、腹部または骨盤の放射線治療、細胞毒性薬、またはそれらの組み合わせが投与された患者において一般的である。主な症状は、吐き気、腹部の痛み、腹部膨満感、および下痢である。放射線により誘導された下痢は、代表的に、放射線治療の開始後の最初の２週間の間に起こる。放射線により誘導された下痢の機構には、消化管の上皮陰窩細胞に対する急性の物理的な損傷が含まれる。このような損傷によって、細胞死（壊死）、炎症、および腸粘膜の潰瘍が生じ、これはその後、刺激性の胆汁酸塩にさらされて、日和見感染しやすくなる。例えば、非特許文献１３を参照のこと。一般的に下痢を伴う化学療法薬としては、フルオロピリミジン（例えば、５−フルオロウラシル）、トポイソメラーゼ（ｔｏｐｉｓｏｍｅｒａｓｅ）Ｉインヒビター（例えば、イリノテカン、トポテカン）、および他の薬剤（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、シタラビン）が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、非特許文献１４を参照のこと。慢性的な腸毒性もまた、放射線治療の後で、通常は、治療後６ヶ月から３年で起こり得る。患者は頻繁に断続的な便秘および下痢に見舞われ、これによって、栄養失調や電解質のバランスの異常が起こる場合もある。重症の症例においては、急性の腸閉塞、瘻孔、または腸の穿孔が生じる場合もある。例えば、非特許文献２を参照のこと。
【０００９】
最近の研究によって、２つの転写因子ｐ５３およびｐ２１が、化学療法によって誘導された腸炎において重要な役割を担い得ることが示唆された。非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；および非特許文献１８を参照のこと。Ｂｃｌ−２ファミリーのタンパク質はまた、ほとんどの化学療法薬に対する小腸の感受性にも関与し得る。例えば、非特許文献２を参照のこと。
【００１０】
結腸の粘膜炎は、例えば、下痢および痙攣性の腹痛を特徴とする。結腸の慢性的な損傷は、繊維化した狭窄および偽性の閉塞によって引き起こされる断続的な下痢および便秘の症状を有する。イリノテカン（ＣＰＴ−１１）は、深刻な下痢を引き起こすことが報告されている。例えば、非特許文献１９を参照のこと。
【００１１】
現在、腸炎は主に、例えば、従来の下痢止め薬、制吐薬、鎮痙薬、および消泡剤を患者に投与することによって、症状が処置されている。ソマトスタチンアナログ（例えば、オクトレオチド）、５−ＨＴアンタゴニスト、またはＮＫ１アンタゴニストもまた使用される場合がある。例えば、非特許文献２を参照のこと。
【００１２】
直腸炎（直腸の炎症）は、骨盤腫瘍のための放射線治療を受けた患者に一般的である。直腸炎は急性の放射線直腸炎である場合も、また、慢性の放射線直腸炎である場合もある。急性の放射線直腸炎の主な症状は、下痢、テネスムス（痙攣様の直腸の痛みを伴う急な便）および血便（血の混じった便）である。多くの患者にはまた、小腸が照射野に入っていない場合にもなお、上腹部から症状がでる。慢性の放射線直腸炎の主な症状は、頻繁に起こるかまたはまとまった排便、肛門の排出（ａｎａｌ  ｄｉｓｃｈａｒｇｅ）、直腸の痛み、尿意促迫、テネスムス、失禁、および血便である。例えば、非特許文献２を参照のこと。局所麻酔薬調製物ロペラミド（ステロイドを含む坐剤）は、いくつかの症状を緩和することの助けとなり得る。ステロイドである５−アミノサリチル酸、スクラルファート浣腸剤、局所ホルマリンでの局所（内視鏡による）介入、電気焼灼器、レーザー治療、アルゴンプラズマビーム凝固、および外科手術を、出血を伴う放射線直腸炎を処置するために使用することができる。高圧酸素処置は、直腸壁の線維症または直腸の潰瘍によって引き起こされる難治性の痛みの重症の症状を有している患者において検討され得る。例えば、非特許文献２を参照のこと。
【００１３】
まとめると、消化管粘膜炎を効率よく予防または処置することができる方法または薬剤についての臨床的な必要性は高い。このような方法または薬剤は、放射線治療、化学療法、またはそれらの併用療法を受けているか、受ける予定がある癌患者、および放射線に被曝したかまたは被爆する予定がある人に特に有効である。
【００１４】
（２．２  線維芽細胞増殖因子）
線維芽細胞増殖因子（「ＦＧＦ」）ファミリーには２０を超えるメンバーが含まれ、それぞれが、保存されたアミノ酸コアを有している（例えば、非特許文献２０を参照のこと）。ＦＧＦは、増殖、生存、アポトーシス、運動性、および分化のような種々の細胞機能を調節する（例えば、非特許文献２１を参照のこと）。ＦＧＦファミリーのメンバーには、胚発生および一生の間の種々の生理学的および病理学的プロセス（形態形成、四肢発生、組織修復、炎症、新脈管形成、ならびに腫瘍の増殖および浸潤を含む）に関与している（例えば、非特許文献２０；および非特許文献２１を参照のこと）。
【００１５】
ＦＧＦは、細胞表面チロシンキナーゼＦＧＦレセプター（ＦＧＦＲ）との高い親和性相互作用によってシグナルを伝達する。これらのＦＧＦレセプターは、組織培養物中のほとんどのタイプの細胞上で発現される。例えば、ＦＧＦレセプター−１（ＦＧＦＲ−１）（これは、４種の既知のＦＧＦレセプターのうちで最も幅広い発現パターンを示す）には、少なくとも７個のチロシンリン酸化部位が含まれる。多数のシグナル伝達分子は、これらのリン酸化部位に対して異なる親和力で結合することによって作用する。
【００１６】
ＦＧＦはまた、ほとんどの細胞表面マトリックスおよび細胞外マトリックス（ＥＣＭ）上に存在するヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）にも、低い親和力ではあるが、結合する。ＦＧＦとＨＳＰＧとの間での相互作用は、ＦＧＦ／ＦＧＦＲ相互作用を安定化させ、そしてＦＧＦを隔離して、それらを分解から保護するように作用し得る（非特許文献２２）。
【００１７】
別のＦＧＦファミリーのメンバーである神経膠活性化因子（「ＧＡＦ」）は、ヒトの神経膠腫細胞株の培養上清から精製されたヘパリン結合増殖因子である。非特許文献２３を参照のこと。ＧＡＦは、他の既知の増殖因子の活性のスペクトルとはわずかに異なる活性のスペクトルを示し、ＦＧＦ−９と命名されている。ヒトＦＧＦ−９  ｃＤＮＡは、２０８個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。ＦＧＦファミリーの他のメンバーに対する配列類似性はおよそ３０％と概算された。他のファミリーのメンバーに見られる２つのシステイン残基および他のコンセンサス配列は、ＦＧＦ−９配列においても十分に保存されていた。ＦＧＦ−９には、酸性ＦＧＦおよび塩基性ＦＧＦのものと同様の代表的なシグナル配列は、そのＮ末端に含まれていないことが明らかになった。
【００１８】
酸性ＦＧＦおよび塩基性ＦＧＦは、従来の様式では細胞からは分泌されないことが知られている。しかし、ＦＧＦ−９は、それが代表的なシグナル配列を欠いているにもかかわらず、ｃＤＮＡでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞から効率よく分泌されることが明らかにされている。これは、細胞の培養培地中でのみ検出することができた。分泌されたタンパク質は、ｃＤＮＡ配列によって予想されるものに関して、開始メチオニンを除くＮ末端のアミノ酸残基を欠失していなかった。ラットのＦＧＦ−９  ｃＤＮＡもまたクローニングされており、構造分析によって、ＦＧＦ−９遺伝子が高度に保存されていることが示されている。
【００１９】
相同性に基づくゲノム検索プロセスにより、新規のヒトＦＧＦであるＦＧＦ−２０が発見された。２０００年１月１３日に出願された特許文献１および２０００年７月３日に提出された特許文献２を参照のこと。これらの参考文献の開示は参考として本明細書中に援用される。ＦＧＦ−２０のアミノ酸配列は、ヒトＦＧＦ−９（７０％の同一性）およびＦＧＦ−１６（６４％の同一性）と近い相同性を示す。
【特許文献１】米国特許出願公開第０９／４９４，５８５号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第０９／６０９，５４３号明細書
【非特許文献１】Ｂｌｉｊｌｅｖｅｎｓら、「Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ」、２０００年、第２５巻、ｐ．１２６９−１２７８
【非特許文献２】Ｋｅｅｆｅら、「Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ」、２００４年、第２０巻、ｐ．３８−４７
【非特許文献３】Ｍｏｕｌｄｅｒ、「Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｂｉｏｌ．」、２００４年、第８０巻、ｐ．３−１０
【非特許文献４】Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、「Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｎｃｏｌ」、１９９９年、第１１巻、第４号、ｐ．２６１−２６６
【非特許文献５】Ｐｌｅｖｏｖａ、「Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ．」、１９９９年、第３５巻、第５号、ｐ．４５３−４７０
【非特許文献６】Ｋｎｏｘら、「Ｄｒｕｇｓ  Ａｇｉｎｇ」、２０００年、第１７巻、第４号、ｐ．２５７−２６７
【非特許文献７】Ｓｏｎｉｓら、「Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ」、２００１年、第１９巻、第８号、ｐ．２２０１−２２０５
【非特許文献８】Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら、「Ａｎｔｉｂｉｏｔ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．」、２０００年、第５０巻、ｐ．１１５−１３２
【非特許文献９】Ｃｒａｗｆｏｒｄら、「Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．」、１９９９年、第５巻、第４号、ｐ．１８７−１９３
【非特許文献１０】Ｂｅｚら、「Ｏｒａｌ  Ｓｕｒｇ．Ｏｒａｌ  Ｍｅｄ．Ｏｒａｌ  Ｐａｔｈｏｌ．Ｏｒａｌ  Ｒａｄｉｏｌ．Ｅｎｄｏｄ．」、１９９９年、第８８巻、第３号、ｐ．３１１−３１５
【非特許文献１１】Ｄａｎｉｌｅｎｋｏ、「Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ」、１９９９年、第２７巻、第１号、ｐ．６４−７１
【非特許文献１２】Ｓａｒｔｏｒｉ、「Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．」、２０００年、第１８巻、ｐ．４６３−４６７
【非特許文献１３】Ｇｗｅｄｅ、「Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｎｕｒｓｉｎｇ」、２００３年、第１９巻、ｐ．６−１０
【非特許文献１４】Ｖｉｅｌｅ、「Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｎｕｒｓｉｎｇ」、２００３年、第１９巻、ｐ．２−５
【非特許文献１５】Ｐｒｉｔｃｈａｒｄら、「Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．」、２０００年、第６巻、ｐ．４３８９−４３９５
【非特許文献１６】Ｐｒｉｔｃｈａｒｄら、「Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．」、１９９８年、第５８巻、ｐ．５４５３−５４６５
【非特許文献１７】Ｂｉｌｉｍら、「Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．」、２０００年、第１９巻、ｐ．４８３−４８８
【非特許文献１８】Ｐｏｔｔｅｎら、「Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ」、１９９７年、第１５巻、ｐ．８２−９３
【非特許文献１９】Ｇｉｂｓｏｎら、「Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ．」、２００３年、第１８巻、ｐ．１０９５−１１００
【非特許文献２０】Ｐｏｗｅｒｓら、「Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｌａｔ．Ｃａｎｃｅｒ」、２０００年、第７巻、第３号、ｐ．１６５−１９７
【非特許文献２１】Ｓｚｅｂｅｎｙｉら、「Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．」、１９９９年、第１８５巻、ｐ．４５−１０６
【非特許文献２２】ＳｚｅｂｅｎｙｉおよびＦａｌｌｏｎ、「Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．」、１９９９年、第１８５巻、ｐ．４５−１０６
【非特許文献２３】Ｍｉｙａｍｏｔｏら、「Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．」、１９９３年、第１３巻、第７号、ｐ．４２５１−４２５９
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
（３．発明の要旨）
本発明により、１つ以上のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物を、その組成物を必要とする被験体に投与する工程を包含する、消化管粘膜炎を予防および／または処置する方法が提供される。
【００２１】
１つの実施形態においては、本発明により、以下からなる群より選択される単離されたタンパク質の予防有効量および／または治療有効量を、それを必要とする被験体に投与する工程を包含する、消化管粘膜炎を予防および／または処置する方法が提供される：（ａ）配列番号２、４、７、１０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、または４０のアミノ酸配列を含むタンパク質；（ｂ）（ａ）のタンパク質に対して１つ以上のアミノ酸置換を有しているタンパク質であって、ここで、上記置換は、配列番号２、４、７、１０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、または４０のアミノ酸配列の１５％以下であり、１つ以上のアミノ酸置換を有している上記タンパク質は、細胞増殖刺激活性を保持しているタンパク質；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のタンパク質の断片であって、この断片は細胞増殖刺激活性を保持している、断片。
【００２２】
別の実施形態においては、本発明によって、以下からなる群より選択される単離された核酸分子を含む培養された宿主細胞から単離されたタンパク質の予防有効量または治療有効量を、それを必要とする被験体に投与する工程を包含する、消化管粘膜炎を予防および／または処置する方法が提供される：（ａ）配列番号１、３、５、６、８、９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、および４１からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子；（ｂ）配列番号２、４、７、１０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、または４０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子；ならびに、（ｃ）配列番号１、３、５、６、８、９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、または４１のヌクレオチド配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子あるいは上記核酸分子の相補体。特異的な実施形態においては、ストリンジェントな条件には、約０．１Ｍから約１．０Ｍまでのナトリウムイオンの塩濃度、約７．０から約８．３までのｐＨ、少なくとも約６０℃である温度と、０．２×ＳＳＣ、０．０１％のＢＳＡの中での少なくとも１回の洗浄が含まれる。いくつかの特異的な実施形態においては、１つ以上のＣＧ５３１３５タンパク質が培養された真核生物細胞から単離される。いくつかの他の特異的な実施形態においては、１つ以上のＣＧ５３１３５タンパク質が培養された原核生物細胞から単離される。好ましい実施形態においては、１つ以上のＣＧ５３１３５タンパク質が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から単離される。特異的な実施形態においては、培養された宿主細胞から単離された１つ以上のＣＧ５３１３５タンパク質は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の純度を有する。
【００２３】
別の実施形態においては、本発明によって、薬学的に受容可能なキャリアおよび以下からなる群より選択される単離されたタンパク質を含有する組成物の予防有効量または治療有効量を、それを必要とする被験体に投与する工程を包含する、消化管粘膜炎を予防および／または処置する方法が提供される：（ａ）配列番号２、４、７、１０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、または４０のアミノ酸配列を含むタンパク質；（ｂ）（ａ）のタンパク質に対して１つ以上のアミノ酸置換を有しているタンパク質であって、ここで、上記置換は、配列番号２、４、７、１０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、または４０のアミノ酸配列の１５％以下であり、１つ以上のアミノ酸置換を有している上記タンパク質は、細胞増殖刺激活性を保持している、タンパク質；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のタンパク質の断片であって、細胞増殖刺激活性を保持している、断片。
【００２４】
特異的な実施形態においては、本発明にしたがって使用される薬学的に受容可能なキャリアには、０．０４Ｍの酢酸ナトリウム、３％のグリセロール（容積／容積）、および０．２Ｍのアルギニン−ＨＣｌ（ｐＨ５．３）が含まれる。
【００２５】
別の特異的な実施形態においては、本発明にしたがって使用される薬学的に受容可能なキャリアには、０．１〜１Ｍのアルギニンまたはその塩、０．０１〜０．１Ｍの塩基性リン酸ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ）、および０．０１〜０．１重量／容積（「ｗ／ｖ」）％のポリソルベート８０またはポリソルベート２０が含まれる。１つの実施形態においては、本発明の薬学的に受容可能なキャリアにおいて使用されるアルギニンまたはその塩は、アルギニン、硫酸アルギニン、リン酸アルギニン、および塩酸アルギニンからなる群より選択される。好ましい実施形態においては、薬学的に受容可能なキャリア中のアルギニンまたはその塩は、０．５Ｍである。別の実施形態においては、本発明の薬学的に受容可能なキャリアの中で使用される塩基性リン酸ナトリウムは、０．０５Ｍである。別の実施形態においては、本発明にしたがって使用される薬学的に受容可能なキャリアの中のポリソルベート８０またはポリソルベート２０は、０．０１％（ｗ／ｖ）である。
【００２６】
いくつかの実施形態においては、本発明の組成物には、薬学的に受容可能なキャリアと、０．００５〜５０ｍｇ／ｍｌ、０．５〜３０ｍｇ／ｍｌ、１〜３０ｍｇ／ｍｌ、または１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度の１つ以上のＣＧ５３１３５タンパク質が含まれる。特異的な実施形態においては、本発明の組成物には、配列番号２４のアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質が含まれる。別の特異的な実施形態においては、本発明の組成物には、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質が含まれる。いくつかの実施形態においては、本発明の組成物には、２つ以上のＣＧ５３１３５タンパク質が含まれる。１つの実施形態においては、本発明の組成物には、配列番号２４のアミノ酸配列を含む第１のタンパク質、および配列番号２のアミノ酸配列を含む第２のタンパク質が含まれる。別の実施形態においては、本発明の組成物には、配列番号２４のアミノ酸配列を含む第１のタンパク質、配列番号２のアミノ酸配列を含む第２のタンパク質、および配列番号２６、２８、３０、および３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む１つ以上の単離されたタンパク質が含まれる。なお別の実施形態においては、本発明の組成物には、配列番号２４のアミノ酸配列を含む第１のタンパク質、配列番号２のアミノ酸配列を含む第２のタンパク質、配列番号２８のアミノ酸配列を含む第３のタンパク質、配列番号３０のアミノ酸配列を含む第４のタンパク質、および配列番号３２のアミノ酸配列を含む第５のタンパク質が含まれる。１つの実施形態においては、本発明の組成物は凍結乾燥される。
【００２７】
本発明にしたがうと、予防または処置することができる消化管粘膜炎としては、口腔粘膜炎、腸炎、食道炎、胃炎、および直腸炎が挙げられるが、これらに限定されない。このような消化管粘膜炎は、化学物質による原因、生物学的原因、放射線、またはそれらの組み合わせによって引き起こされ得る。
【００２８】
１つの実施形態においては、消化管粘膜炎を予防および／または処置するための有効量は、０．００１〜３ｍｇ／ｋｇの間、０．０１〜１ｍｇ／ｋｇの間、または０．０１〜０．５ｍｇ／ｋｇの間（タンパク質濃度はＵＶアッセイによって測定される）である。別の実施形態においては、消化管粘膜炎を予防および／または処置するための有効量は、約０．０３ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、または約３ｍｇ／ｋｇ（タンパク質濃度はＵＶアッセイによって測定される）である。いくつかの実施形態においては、１つ以上のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物が、０．００１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、または０．２ｍｇ／ｋｇ（タンパク質濃度はＵＶアッセイによって測定される）の投与量の単回投与として、それを必要とする被験体に投与される。いくつかの実施形態においては、１つ以上のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物が、０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、または０．２ｍｇ／ｋｇの単位投与量をそれぞれが含む複数回投与として、それを必要とする被験体に投与される。いくつかの実施形態においては、１つ以上のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物が、それを必要とする被験体に非経口投与される（例えば、静脈内投与または皮下投与）。いくつかの実施形態においては、１つ以上のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物が、それを必要とする被験体に、直腸投与、経皮投与、または経粘膜的投与（例えば、鼻腔投与）によって投与される。
【００２９】
（３．１  専門用語）
本明細書中で使用される場合は、用語「ＣＧ５３１３５」は、タンパク質の１つのクラス（ペプチドおよびポリペプチドを含む）、あるいは、そのようなタンパク質をコードする核酸またはそれらの相補鎖を意味する。ここで、タンパク質には、配列番号２のアミノ酸配列（２１１個のアミノ酸）、またはその断片、誘導体、改変体、ホモログ、もしくはアナログが含まれる。好ましい実施形態においては、ＣＧ５３１３５タンパク質は、ＦＧＦ−２０（配列番号２）の少なくともいくらかの生物学的活性を保持している。本明細書中で使用される場合は、用語「生物学的活性」は、ＣＧ５３１３５タンパク質が、ＦＧＦ−２０の同じ特性を、必ずしも全てではないがいくらか有している（そして、ＦＧＦ−２０と同じ程度である必要はない）ことを意味する。
【００３０】
ＣＧ５３１３５ファミリーのメンバー（例えば、タンパク質および／またはタンパク質をコードする核酸）には、さらに、識別名が与えられている場合がある。例えば、ＣＧ５３１３５−０１（配列番号１および２）は、最初に同定されたＦＧＦ−２０を示す（米国特許出願番号第０９／４９４，５８５号を参照のこと）；ＣＧ５３１３５−０５（配列番号８および２）は、コドンが最適化された全長のＦＧＦ−２０を示す（すなわち、ＦＧＦ−２０をコードする核酸配列はコドン最適化されているが、アミノ酸配列は最初に同定されたＦＧＦ−２０から変化していない）；ＣＧ５３１３５−１２（配列番号２１および２２）は、ＣＤ５３１３５−１２の中の１つのアミノ酸が配列番号２とは異なる（２０６位のアスパラギン酸がアスパラギンに変化している、「２０６Ｄ→Ｎ」）ＦＧＦ−２０の一塩基多型（「ＳＮＰ」）を示す。ＣＧ５３１３５ファミリーのいくつかのメンバーは、それらの核酸配列が異なる場合があるが、同じＣＧ５３１３５タンパク質をコードする。例えば、ＣＧ５３１３５−０１、ＣＧ５３１３５−０３、およびＣＤ５３１３５−０５は全て同じＣＧ５３１３５タンパク質をコードする。識別名はまた、インフレームクローン（ｉｎ−ｆｒａｍｅ  ｃｌｏｎｅ；「ＩＦＣ」）の数である場合もあり、例えば、ＩＦＣ２５００５９６２９（配列番号３３および３４）は、全長のＦＧＦ−２０のアミノ酸６３〜１９６を示す（ベクターにインフレームでクローニングされた）。表１は、ＣＧ５３１３５ファミリーのメンバーのいくつかのまとめを示す。１つの実施形態においては、本発明には、その中のいくつかのアミノ酸残基（例えば、ＦＧＦ−２０（配列番号２）のアミノ酸配列の１％以下、２％以下、３％以下、５％以下、１０％以下、または１５％以下）が変化しているＦＧＦ−２０タンパク質の改変体が含まれる。別の実施形態においては、本発明には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＦＧＦ−２０にハイブリダイズすることができる核酸分子が含まれる。
【００３１】
（表１  ＣＧ５３１３５ファミリーのメンバーのいくつかのまとめ）
【００３２】
【表１−１】
2007536381.tif 000002
【００３３】
【表１−２】
2007536381.tif 000003
本明細書中で使用される場合は、用語「有効量」は、消化管粘膜炎またはその１つ以上の症状の重篤度および／もしくは期間を低下させるおよび／または緩和するため、消化管粘膜炎の進行を防ぐため、消化管粘膜炎の退縮を生じるため、消化管粘膜炎に伴う１つ以上の症状の再発、進行、または発症を防ぐため、あるいは、別の治療の予防効果または治療効果（単数または複数）を高めるかまたは改善するために十分な、治療薬（例えば、ＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物）の量を意味する。
【００３４】
本明細書中で使用される場合は、用語「ＦＧＦ−２０」は、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、あるいは、そのようなタンパク質をコードする核酸配列またはその相補鎖を意味する。
【００３５】
本明細書中で使用される場合は、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、互いに少なくとも３０％（好ましくは、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％）同一であるヌクレオチド配列が代表的には互いにハイブリダイズしたままでいられるハイブリダイゼーションおよび洗浄についての条件を記載する。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出され得る。１つの限定ではない例においては、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、約０．１Ｍから約１．０Ｍまでのナトリウムイオンの塩濃度、約７．０から約８．３までのｐＨ、少なくとも約６０℃である温度と、０．２×ＳＳＣ、０．０１％のＢＳＡの中での少なくとも１回の洗浄が含まれる。別の限定ではない例においては、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で約４５℃でのハイブリダイゼーション、その後の、０．１×ＳＳＣ、０．２％のＳＤＳ中で約６８℃での１回以上の洗浄である。なお別の限定ではない例においては、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣで約４５℃でのハイブリダイゼーション、その後の、０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で約５０〜６５℃での１回以上の洗浄（すなわち、５０℃、５５℃、６０℃、または６５℃での１回以上の洗浄）である。本発明の核酸には、これらの条件下ではＡまたはＴヌクレオチドのみから構成されるヌクレオチド配列にしかハイブリダイズしない核酸分子は含まれないことが理解される。
【００３６】
本明細書中で使用される場合は、用語「単離された」は、タンパク質物質の文脈においては、それが導かれる細胞または組織供給源に由来する細胞性の物質または混入している複数のタンパク質を実質的に含まないか、あるいは、化学合成される場合には、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないタンパク質物質を意味する。語句「細胞性の物質を実質的に含まない」には、タンパク質物質が、それが単離されるかまたは組み換えによって生成される細胞の細胞成分と分離されているタンパク質物質の調製物が含まれる。したがって、細胞性の物質を実質的に含まないタンパク質物質には、宿主の細胞タンパク質（「混入しているタンパク質」とも呼ばれる）を約３０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満（乾燥重量で）含むタンパク質物質の調製物が含まれる。タンパク質物質が組み換えによって生成される場合には、これには、培養培地が実質的には含まれないことが好ましい。すなわち、培養培地は、タンパク質物質調製物の容積の約２０％未満、１０％未満、または５％未満を占める。タンパク質物質が化学合成によって生成される場合には、これには、化学的前駆体または他の化学物質が実質的には含まれないことが好ましい。すなわち、これは、タンパク質物質の合成に関与している化学的前駆体または他の化学物質から分離されている。したがって、このようなタンパク質物質の調製物は、目的のタンパク質物質以外の化学的前駆体または化合物を約３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満（乾燥重量で）含む。特異的な実施形態においては、本明細書中で開示されるタンパク質物質は単離されている。
【００３７】
本明細書中で使用される場合は、用語「単離された」は、核酸分子の文脈においては、核酸分子の自然界での供給源の中に存在している他の核酸分子とは分離されている核酸分子を意味する。さらに、「単離された」核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）は、組み換え技術によって生成される場合には、他の細胞性の物質または培養培地を実質的に含まないようにすることができ、また、化学的に合成される場合には、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないようにすることもできる。特異的な実施形態においては、核酸分子は単離されている。
【００３８】
本明細書中で使用される場合は、用語「防ぐ（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「防ぐこと（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、および「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、治療薬（例えば、ＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物）の投与または治療薬の組み合わせの投与によって生じる、被験体の消化管粘膜炎の再発、発症、もしくは進行、または、その１つ以上の症状の予防を意味する。
【００３９】
本明細書中で使用される場合は、用語「予防有効量」は、消化管粘膜炎の進行、再発、もしくは発症、またはその１つ以上の症状の予防を生じるか、あるいは、別の治療の予防効果（単数または複数）を高めるかまたは改善するために十分である、治療薬（例えば、ＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物）の量を意味する。
【００４０】
本明細書中で使用される場合は、用語「被験体」（単数または複数）は動物を意味し、好ましくは、哺乳動物（霊長類以外の哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、またはイヌ）、霊長類（例えば、サル、チンパンジー、またはヒト）を含む）であり、より好ましくは、ヒトである。特定の実施形態においては、被験体は哺乳動物であり、好ましくは、消化管粘膜炎を誘導し得る原因（例えば、放射線、化学療法、化学兵器、または生物学的原因）に曝されているか、またはそれに曝されるヒトである。別の実施形態においては、被験体は、同様の原因に曝されているかまたはそれに曝される家畜（例えば、ウマ、ブタ、またはウシ）あるいはペット（例えば、イヌまたはネコ）である。用語「被験体」は、本発明においては、「患者」と相互変換可能に使用される。
【００４１】
本明細書中で使用される場合は、用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、および「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、消化管粘膜炎の進行、重篤度、および／または期間の減少、あるいは、その１つ以上の症状の緩和を意味する。ここでは、そのような減少および／または緩和は、１つ以上の治療薬（例えば、ＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物）の投与によって生じる。
【００４２】
本明細書中で使用される場合は、用語「治療有効量」は、消化管粘膜炎の重篤度を低下させるため、消化管粘膜炎の期間を短くするため、消化管粘膜炎の進行を防ぐため、消化管粘膜炎の退縮を生じるため、消化管粘膜炎を伴う１つ以上の症状を緩和するため、あるいは、別の治療薬の治療効果（単数または複数）を高めるかまたは改善するために十分である、治療薬（例えば、ＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物）の量を意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
（５．発明の詳細な説明）
本発明によって、消化管粘膜炎の予防および／または処置のための方法が提供される。具体的には、本発明によって、消化管粘膜炎の処置および／または予防に使用することができる、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）２０、その改変体、誘導体、ホモログ、およびアナログ（まとめて「ＣＧ５３１３５」と呼ばれる）が提供される。いずれの理論にも束縛されないが、本発明は、ＣＧ５３１３５が上皮細胞および間葉細胞の増殖に対する刺激作用、ならびに、幹細胞（例えば、腸幹細胞および造血幹細胞であるがこれらに限定されない）に対する刺激作用を有しており、したがって、消化管粘膜炎の予防および／または処置に有効であるという、出願人らの発見に一部基づく。
【００４４】
開示を明確にするためであって、限定ではないが、本発明の詳細な説明を以下のサブセクションに分ける：
（ｉ）ＣＧ５３１３５
（ｉｉ）ＣＧ５３１３５の調製方法
（ｉｉｉ）ＣＧ５３１３５活性の特徴づけおよび実証、ならびに処置の間の効果のモニタリング
（ｉｖ）予防的使用および治療的使用
（ｖ）投薬レジメン
（ｖｉ）薬学的組成物。
【００４５】
（５．１  ＣＧ５３１３５）
本発明により、消化管粘膜炎の予防および／または処置のためのＣＧ５３１３５を含む組成物が提供される。本明細書中で使用される場合は、用語「ＣＧ５３１３５」は、タンパク質の１つのクラス（ペプチドおよびポリペプチドを含む）、あるいは、そのようなタンパク質をコードする核酸またはそれらの相補鎖を意味する。ここで、タンパク質には、配列番号２のアミノ酸配列（２１１個のアミノ酸）、またはその断片、誘導体、改変体、ホモログ、もしくはアナログが含まれる。
【００４６】
１つの実施形態においては、ＣＧ５３１３５タンパク質はＦＧＦ−２０の改変体である。ＦＧＦ−２０タンパク質のアミノ酸配列に変化を生じるＤＮＡ配列多形が集団（例えば、ヒトの集団）の中に存在する場合があることは、当業者に明らかであろう。このようなＦＧＦ−２０遺伝子の遺伝的多形は、天然の対立遺伝子のバリエーションが原因で、集団の中の個体間に存在する場合がある。このような天然の対立遺伝子のバリエーションは、代表的に、ＦＧＦ−２０遺伝子のヌクレオチド配列の１〜５％の相違を生じ得る。ＦＧＦ−２０タンパク質の天然の対立遺伝子のバリエーションの結果である、任意のおよび全てのこのようなＦＧＦ−２０タンパク質中のヌクレオチドのバリエーションおよび生じるアミノ酸多形は、本発明の範囲内であると意図される。１つの実施形態においては、ＣＧ５３１３５はＣＧ５３１３５−１２（配列番号２１および２２）であり、これは、ＦＧＦ−２０の一塩基多形（「ＳＮＰ」）（すなわち、２０６Ｄ→Ｎ）である（ＣＧ５３１３５−１２のさらに詳細な記載については、例えば、２００３年１１月４日に出願された米国特許出願公開第１０／７０２，１２６号（その開示はその全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと）。ＦＧＦ−２０のＳＮＰの他の例はまた、米国特許出願公開第１０／４３５，０８７号（その内容は参考として本明細書中に援用される）にも記載されている。
【００４７】
別の実施形態においては、ＣＧ５３１３５は、他の種に由来するＦＧＦ−２０タンパク質をコードする核酸分子、またはそれによってコードされるタンパク質を意味し、したがって、ＦＧＦ−２０のヒト配列とは異なるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有している。本発明のＦＧＦ−２０  ｃＤＮＡの天然の対立遺伝子改変体およびホモログに対応する核酸分子は、ヒトｃＤＮＡまたはその一部を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での標準的なハイブリダイゼーション技術にしたがってハイブリダイゼーションプローブとして使用して、本明細書中に開示されるヒトＦＧＦ−２０核酸に対するそれらの相同性に基づいて単離することができる。
【００４８】
別の実施形態においては、本発明により、ＣＧ５３１３５タンパク質の断片が提供される。その断片としては、改変体ＦＧＦ−２０タンパク質の断片、成熟ＦＧＦ−２０タンパク質、および成熟ＦＧＦ−２０タンパク質の改変体、さらには、ＦＧＦ−２０核酸の対立遺伝子改変体および一塩基多形によってコードされるＦＧＦ−２０タンパク質が挙げられる。ＣＧ５３１３５タンパク質断片の例としては、ＦＧＦ−２０（配列番号２）の残基２〜２１１、３〜２１１、９〜２１１、１２〜２１１、１５〜２１１、２４〜２１１、５２〜２１１、５４〜２１１、５５〜２１１、６３〜１９６、６３〜２１１、または６３〜１９４が挙げられるが、これらに限定はされない。１つの実施形態においては、核酸は、配列番号２の残基２〜２１１、３〜２１１、９〜２１１、１２〜２１１、１５〜２１１、２４〜２１１、５２〜２１１、５４〜２１１、５５〜２１１、６３〜１９６、６３〜２１１、または６３〜１９４を含むタンパク質断片をコードする。
【００４９】
本発明にはまた、ＦＧＦ−２０の誘導体およびアナログも含まれる。ＦＧＦ−２０に関連する誘導体およびアナログの生成および使用は、本発明の範囲内である。
【００５０】
特異的な実施形態においては、誘導体またはアナログは機能的に活性であり、すなわち、全長の野生型ＦＧＦ−２０に関係している１つ以上の機能的活性を示すことができる。ＦＧＦ−２０の誘導体またはアナログは、当該分野で公知の手順によって所望される活性について試験することができ、これには、適切な細胞株、動物モデル、および臨床試験を使用することが含まれるが、これらに限定はされない。
【００５１】
特に、ＦＧＦ−２０誘導体は、機能的に等価な分子を提供する置換、挿入、または欠失によってＦＧＦ−２０配列を変化させることにより作成することができる。１つの実施形態においては、このようなＦＧＦ−２０配列の変更は、ＦＧＦタンパク質ファミリーにおいて保存されていない領域の中に行われる。ヌクレオチドコード配列の縮重によって、ＦＧＦ−２０と実質的に同じアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を、本発明の実施において使用することができる。これらには、配列の中での機能的に同等のアミノ酸残基をコードし、したがってサイレントな変化を生じる異なるコドンの置換によって変更される、ＦＧＦ−２０全体または一部を含む核酸配列が含まれるが、これに限定はされない。好ましい実施形態においては、野生型ＦＧＦ−２０核酸配列は、配列番号８（ＣＧ５３１３５−０５）の核酸配列にコドン最適化される。同様に、本発明のＦＧＦ−２０誘導体には、一次アミノ酸配列として、配列内の残基が機能的に同等のアミノ酸残基で置換され、それによってサイレントな変化を生じる、変更された配列を含むＦＧＦ−２０のアミノ酸配列全体またはその一部を含むものが含まれるが、これに限定はされない。例えば、配列内の１つ以上のアミノ酸残基は、機能的に同等に作用する類似する極性の別のアミノ酸で置換することができ、これによって、サイレントな変化が生じる。配列内のアミノ酸の置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれる。極性の中性のアミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。正電荷を帯びている（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれる。負電荷を帯びている（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。本発明のＦＧＦ−２０誘導体にはまた、一次アミノ酸配列として、アミノ酸残基が類似する化学的性質を有している残基で置換されている変更された配列を含むＦＧＦ−２０のアミノ酸配列全体またはその一部を含むものが含まれるが、これに限定はされない。特異的な実施形態においては、１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸が置換される。
【００５２】
ＦＧＦ−２０の誘導体またはアナログとしては、ＦＧＦ−２０またはその断片と実質的に相同であるか、あるいは、それをコードする核酸がＦＧＦ−２０核酸配列にハイブリダイズすることができるタンパク質が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００５３】
ＦＧＦ−２０の誘導体またはアナログはまた、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００４／０１８４９９  Ａ２、ならびに、米国特許公開番号ＵＳ２００４／００８７５０５  Ａ１および同ＵＳ２００４／００３８３４８  Ａ１（それぞれの内容はその全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されている方法にしたがって作成することもできる。
【００５４】
本発明のＦＧＦ−２０誘導体およびアナログは、当該分野で公知の種々の方法によって生成することができる。それらの生成を生じる操作は、遺伝子またはタンパク質レベルで行うことができる。例えば、クローン化されたＦＧＦ−２０遺伝子配列は、当該分野で公知の任意の多数の方法のいずれかによって修飾することができる（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。配列は、インビトロで、制限エンドヌクレアーゼ（単数または複数）を用いて適切な部位で切断することができ、その後、所望される場合には、さらに酵素で修飾し、単離し、そして連結させることができる。ＦＧＦ−２０の誘導体またはアナログをコードする遺伝子の産生においては、所望されるＦＧＦ−２０活性がコードされる遺伝子領域の中に翻訳終結シグナルにより中断されることなく、ＦＧＦ−２０と同じ翻訳リーディングフレーム内に修飾された遺伝子が残ることを確実にするように注意しなければならない。
【００５５】
さらに、ＦＧＦ−２０をコードする核酸配列は、配列の翻訳、開始、および／または終結を実行および／または破壊するため、あるいは、コード領域にバリエーションを作成するため、および／または新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を形成するため、あるいは既存の制限エンドヌクレオチドクレアーゼ部位を破壊するため、さらなるインビトロでの修飾を容易にするために、インビトロまたはインビボで変異させることができる。当該分野で公知の突然変異誘発のための任意の技術を使用することができ、これには、インビトロでの部位特異的突然変異誘発（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ｃ．ら、１９７８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２５３：６５５１）、ＴＡＢ．ＲＴＭ．リンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用などが含まれるが、これらに限定はされない。
【００５６】
ＦＧＦ−２０配列の操作は、タンパク質レベルで行うこともできる。翻訳の間または翻訳後に異なる方法で（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／封鎖基による誘導体化、タンパク質分解的切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの連結などによる）修飾されるＦＧＦ−２０断片または他の誘導体もしくはアナログが、本発明の範囲に包含される。多数の化学修飾の任意のものを、公知の技術によって行うことができ、これには、遊離のＮＨ２−基、遊離のＣＯＯＨ−基、ＯＨ−基、Ｔｒｐ−、Ｔｙｒ−、Ｐｈｅ−、Ｈｉｓ−、Ａｒｇ−、もしくはＬｙｓ−の側鎖の保護または修飾；臭化シアン、ヒドロキシルアミン、ＢＮＰＳ−スカトール、酸もしくはアルカリ加水分解による特異的な化学的切断；トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による酵素的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成；などに有用な試薬が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００５７】
加えて、ＦＧＦ−２０のアナログおよび誘導体は化学合成することができる。例えば、所望されるドメインを含むか、またはインビトロでの所望される凝集活性もしくはレセプターへの結合を媒介する、ＦＧＦ−２０の一部に対応するタンパク質は、ペプチド合成装置の使用によって合成することができる。さらに、所望される場合には、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸アナログを、ＦＧＦ−２０配列への置換または付加として導入することができる。非古典的アミノ酸としては、一般的なアミノ酸のＤ型異性体、α−アミノ酸イソ酪酸、４−アミノ酪酸、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、デザイナーアミノ酸（例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、およびＮα−メチルアミノ酸）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００５８】
特異的な実施形態においては、ＦＧＦ−２０誘導体は、ＦＧＦ−２０アミノ酸以外の配列に対してそのアミノ末端および／またはカルボキシ末端でペプチド結合によって融合されたＦＧＦ−２０またはその断片を含む、キメラタンパク質あるいは融合タンパク質である。１つの実施形態においては、ＦＧＦ−２０アミノ酸以外の配列は、ＦＧＦ−２０またはその断片のアミノ末端に融合される。別の実施形態においては、このようなキメラタンパク質は、（ＦＧＦ−２０をコードする配列以外の配列に対してインフレームで連結されたＦＧＦ−２０をコードする配列を含む）タンパク質をコードする核酸の組み換え発現によって生成される。このようなキメラ生成物は、様々な会社（例えば、Ｒｅｔｒｏｇｅｎ，Ｏｐｅｒｏｎなど）によってオーダーメードすることができ、また、当該分野で公知の方法によって所望されるアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を適切なコードフレーム内で互いに連結させ、そして当該分野で一般的に知られている方法によってキメラ産物を発現させることによって作成することもできる。あるいは、このようなキメラ生成物は、タンパク質合成技術によって（例えば、ペプチド合成装置の使用によって）作成される場合もある。特異的な実施形態においては、異種シグナル配列を有しているＦＧＦ−２０をコードするキメラ核酸が発現させられる。この場合は、キメラタンパク質は細胞によって発現されて、成熟ＦＧＦ−２０タンパク質となるようにプロセシングされる。ＦＧＦ−２０とＦＧＦ−２０遺伝子以外の遺伝子の一次配列はまた、コンピューターによるシミュレーション（ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７８：３８２４−３８２８）を使用して分子の三次構造を予想するために使用することもできる；キメラ組み換え遺伝子は、三次構造と生物学的機能との間での相関関係を考慮して設計することができる。同様に、異種（ＦＧＦ−２０以外）のタンパク質をコードする配列に融合させられたＦＧＦ−２０分子の必須の部分を含むキメラ遺伝子を構築することができる。特異的な実施形態においては、このようなキメラの構築は、ＦＧＦ−２０の安定性、可溶性、またはプロテアーゼに対する耐性を含むがこれらに限定はされない、ＦＧＦ−２０の１つ以上の所望される特性を増強させるために使用することができる。別の実施形態においては、キメラの構築は、特異的な部位に対してＦＧＦ−２０を標的化させるために使用することができる。なお別の実施形態においては、キメラの構築は、本発明のＦＧＦ−２０を同定または精製するために使用することができ、例えば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質（ＭａｌＥ）、セルロース結合タンパク質（ＣｅｎＡ）、またはマンノースタンパク質などである。１つの実施形態においては、ＣＧ５３１３５タンパク質はカルバミル化される。
【００５９】
いくつかの実施形態においては、ＣＧ５３１３５タンパク質はそれが改善された可溶性および／またはインビボでの長い半減期を有するように、当該分野で公知の任意の方法を使用して修飾することができる。例えば、ヒトＩｇＧのＦｃ断片、または高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような不活性なポリマー分子を、タンパク質のＮ末端またはＣ末端に対するＰＥＧの部位特異的結合により多機能リンカーを用いて、または、それを用いることなく、あるいは、リジン残基上に存在しているε−アミノ基を介して、ＣＧ５３１３５タンパク質に結合させることができる。生物学的活性の損失を最小限にとどめることができる、直鎖状または分岐したポリマー誘導体が使用される。結合の程度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析によって詳しくモニタリングすることができ、ＣＧ５３１３５タンパク質へのＰＥＧ分子の適切な結合を確実にすることができる。未反応のＰＥＧは、サイズ排除クロマトグラフィーによって、またはイオン交換クロマトグラフィーによって、ＣＧ５３１３５−ＰＥＧ結合体から分離することができる。ＰＥＧから誘導された結合体は、当業者に公知の方法を使用して、インビボでの効力について試験することができる。
【００６０】
ＣＧ５３１３５タンパク質はまた、タンパク質をインビボでより安定なものにするため、またはインビボでより長い半減期を有するものにするために、アルブミンに結合させることもできる。この技術は当該分野で周知である。例えば、国際公開番号ＷＯ９３／１５１９９，同ＷＯ９３／１５２００、および同ＷＯ０１／７７１３７；ならびに欧州特許第ＥＰ４１３，６２２号（これらの全てが参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。
【００６１】
いくつかの実施形態においては、ＣＧ５３１３５は、ＣＧ５３１３５−０１（配列番号１および２）、ＣＧ５３１３５−０２（配列番号３および４）、ＣＧ５３１３５−０３（配列番号５および２）、ＣＧ５３１３５−０４（配列番号６および７）、ＣＧ５３１３５−０５（配列番号８および２）、ＣＧ５３１３５−０６（配列番号９および１０）、ＣＧ５３１３５−０７（配列番号１１および１２）、ＣＧ５３１３５−０８（配列番号１３および１４）、ＣＧ５３１３５−０９（配列番号１５および１６）、ＣＧ５３１３５−１０（配列番号１７および１８）、ＣＧ５３１３５−１１（配列番号１９および２０）、ＣＧ５３１３５−１２（配列番号２１および２２）、ＣＧ５３１３５−１３（配列番号２３および２４）、ＣＧ５３１３５−１４（配列番号２５および２６）、ＣＧ５３１３５−１５（配列番号２７および２８）、ＣＧ５３１３５−１６（配列番号２９および３０）、ＣＧ５３１３５−１７（配列番号３１および３２）、ＩＦＣ  ２５００５９６２９（配列番号３３および３４）、ＩＦＣ  ２００５９６６９（配列番号３５および３６）、ＩＦＣ  ３１７４５９５５３（配列番号３７および３８）、ＩＦＣ  ３１７４５９５７１（配列番号３９および４０）、ＩＦＣ  ２５００５９５９６（配列番号４１および１０）、ＩＦＣ  ３１６３５１２２４（配列番号４１および１０）、またはそれらの組み合わせを意味する。特異的な実施形態においては、ＣＧ５３１３５はカルバミル化され、例えば、カルバミル化されたＣＧ５３１３５−１３タンパク質またはカルバミル化されたＣＧ５３１３５−０５タンパク質である。
【００６２】
（５．２  ＣＧ５３１３５を調製する方法）
ＣＧ５３１３５タンパク質を単離する方法は、以前の出願、例えば、２０００年７月３日に提出された米国特許出願番号０９／６０９，５４３（その内容は本明細書中に参考として援用される）に記載されている。当該分野で公知の任意の技術をＣＧ５３１３５タンパク質の精製に使用することができ、これには、沈殿による分離、吸着による分離（例えば、カラムクロマトグラフィー、膜吸着、渦巻カラム、バッチ吸着、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、無機吸着剤、疎水性吸着剤、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー）、または溶液中での分離（例えば、ゲル濾過、電気泳動、液相分配、洗浄剤による分配、有機溶媒での抽出、および限外濾過）が含まれるが、これらに限定はされない。例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ，ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ，第３版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９４）を参照のこと。精製の間に、ＣＧ５３１３５の生物学的活性を、１つ以上のインビトロまたはインビボでのアッセイによってモニタリングすることができる。ＣＧ５３１３５の純度は、当該分野で公知の任意の方法によってアッセイすることができ、その方法は、例えば、ゲル電気泳動であるが、これに限定はされない。Ｓｃｏｐｅｓ（前出）を参照のこと。いくつかの実施形態においては、本発明の組成物に使用されるＣＧ５３１３５タンパク質は、８０から１００％の純度の範囲内、または少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の純度であり得る。１つの実施形態においては、本発明の組成物に使用される１つ以上のＣＧ５３１３５タンパク質は、少なくとも９９％の純度を有する。別の実施形態においては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動によってアッセイした場合には、ＣＧ５３１３５は見かけ上均質になるように精製される。
【００６３】
当該分野で公知の方法を、ＣＧ５３１３５タンパク質を組み換えによって生成するために利用することができる。ＣＧ５３１３５タンパク質をコードする核酸配列は、宿主細胞の中での増殖および発現のための発現ベクターに挿入することができる。
【００６４】
発現構築物は、本明細書中で使用される場合は、適切な宿主細胞の中でＣＧ５３１３５タンパク質を発現することができる１つ以上の調節領域に作動可能に結合した、ＣＧ５３１３５タンパク質をコードする核酸配列を意味する。「作動可能に結合した」は、調節領域と発現するＣＧ５３１３５配列とが連結され、そして転写、および最終的には翻訳が可能である形で配置されている結合を意味する。
【００６５】
ＣＧ５３１３５の転写に不可欠な調節領域は、発現ベクターによって提供することができる。翻訳開始コドン（ＡＴＧ）もまた、その同起源の開始コドンが欠失しているＣＧ５３１３５遺伝子配列が発現される場合には、提供することができる。適合する宿主−構築物システムにおいては、細胞性の転写因子（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ）が発現構築物の調節領域に結合して、宿主生物中で修飾されたＣＧ５３１３５配列の転写を行う。遺伝子発現に必要な調節領域の正確な性質は、個々の宿主細胞によって異なり得る。一般的には、ＲＮＡポリメラーゼを結合させて、作動可能に結合された核酸配列の転写を促進することができるプロモーターが必要である。このような調節領域には、転写および翻訳の開始に関与する５’非コード配列（例えば、ＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列など）が含まれ得る。コード配列の３’にある非コード領域には、転写終結調節配列（例えば、ターミネーターおよびポリアデニル化部位）が含まれ得る。
【００６６】
調節機能（例えば、プロモーター）を有しているＤＮＡ配列をＣＧ５３１３５遺伝子配列に結合させるため、または、ベクターのクローニング部位にＣＧ５３１３５遺伝子配列を挿入するために、適切な適合する制限部位を提供するリンカーまたはアダプターが、当該分野で周知の技術によって、ｃＤＮＡの末端に連結させられる場合がある（例えば、Ｗｕら、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５２：３４３−３４９を参照のこと）。制限酵素での切断の後には、連結の前に消化部分を削り取ること、または一本鎖ＤＮＡ末端を埋めてしまうことによって、平滑末端を作成するための修飾を行うことができる。あるいは、所望される制限酵素部位を、所望される制限酵素部位を含むプライマーを用いるＰＣＲを使用して、ＤＮＡの増幅によってＤＮＡの断片に導入することもできる。
【００６７】
調節領域と作動可能に結合されたＣＧ５３１３５配列を含む発現構築物を、さらなるクローニングを行うことなく、ＣＧ５３１３５タンパク質を発現および生成させるために、適切な宿主細胞に直接導入することができる。例えば、米国特許第５，５８０，８５９号を参照のこと。発現構築物にはまた、例えば、相同組み換えによる、宿主細胞のゲノムへのＣＧ５３１３５配列の組み込みを容易にするＤＮＡ配列を含めることもできる。この場合には、宿主細胞中でのＣＧ５３１３５の増殖および発現のために、適切な宿主細胞に適している複製起点を含む発現ベクターを使用することは不要である。
【００６８】
種々の発現ベクターを使用することができ、これには、プラスミド、コスミド、ファージ、ファージミド、または修飾されたウイルスが含まれ得るが、これらに限定はされない。このような宿主発現システムは、ＣＧ５３１３５遺伝子のコード配列が生成され得、その後、精製され得るビヒクルであるが、また、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされると、ＣＧ５３１３５をインサイチュで発現することができる細胞である場合もある。これらには、ＣＧ５３１３５をコードする配列を含む組み換え体バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌のような微生物（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））；ＣＧ５３１３５をコードする配列を含む組み換え体酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ））；ＣＧ５３１３５をコードする配列を含む組換え体ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させられた昆虫細胞システム；ＣＧ５３１３５をコードする配列を含む組換え体ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染させられたか、またはＣＧ５３１３５をコードする配列を含む組換え体プラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞システム；あるいは、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物のウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組み換え発現構築物を有している哺乳動物細胞システム（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＮＳ０、および３Ｔ３細胞）が含まれるが、これらに限定はされない。好ましくは、細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）および真核生物細胞が、組み換え体ＣＧ５３１３５分子の発現に使用される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞を、ＣＧ５３１３５配列の効率的な発現のためのサイトメガロウイルスの主要中初期遺伝子に由来するプロモーターエレメントを有しているベクターと共に使用することができる（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、１９８６，Ｇｅｎｅ  ４５：１０１；およびＣｏｃｋｅｔｔら、１９９０，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２）。
【００６９】
細菌システムにおいては、発現させられるＣＧ５３１３５分子について意図される用途に応じて、多数の発現ベクターを有利であるように選択することができる。例えば、多量のＣＧ５３１３５が産生される場合には、ＣＧ５３１３５分子の薬学的組成物の作成のためには、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を指示するベクターが所望される場合がある。このようなベクターとしては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ｐＩＮベクター（ＩｎｏｕｙｅおよびＩｎｏｕｙｅ，１９８５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９；Ｖａｎ  ＨｅｅｋｅおよびＳｃｈｕｓｔｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９）などが挙げられるが、これらに限定はされない。ｐＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ）、ｐＭＡＬ（ＮＥＢ）、およびｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のようなベクターのシリーズもまた、ＦＬＡＧペプチド、ｍａｌＥタンパク質、またはＣＢＤタンパク質を有している融合タンパク質として外来タンパク質を発現させるために使用することができる。これらの組み換え体タンパク質は、正確な折り畳みおよび成熟のために、ペリプラズム空間に向けられる場合がある。融合された部分は、発現されたタンパク質の親和性による精製のために使用することができる。エンテロキナーゼのような特異的プロテアーゼの切断部位が存在することにより、ＣＧ５３１３５タンパク質を切断することができる。ｐＧＥＸベクターは、グルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を有している融合タンパク質として、外来タンパク質を発現させるためにもまた使用される場合がある。一般的には、このような融合タンパク質は可溶性であり、そして、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合、その後の遊離のグルタチオンの存在下での溶出によって、溶解させた細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子の産物をＧＳＴ部分から切り離すことができるように、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【００７０】
昆虫システムにおいては、多くのベクターを、外来遺伝子を発現させるために使用することができる。例えば、オートグラファ核多角体ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）を、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして使用することができる。このウイルスは、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の細胞のような細胞中で増殖する。ＣＧ５３１３５をコードする配列は、このウイルスの必須ではない領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個別にクローニングすることができ、そしてＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置することができる。
【００７１】
哺乳動物細胞システムにおいては、多数のウイルスをベースとする発現システムを利用することができる。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合には、目的のＣＧ５３１３５をコードする配列を、アデノウイルスの転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーターおよび３成分から構成されるリーダー配列）に連結することができる。このキメラ遺伝子は、その後、インビトロまたはインビボでの組み換えによってアデノウイルスのゲノムに挿入することができる。ウイルスのゲノムの必須ではない領域（例えば、領域ＥＩまたはＥ３）への挿入によって、感染された宿主の中で生存することができ、その中でＣＧ５３１３５を発現することができる組み換え体ウイルスが得られる（例えば、ＬｏｇａｎおよびＳｈｅｎｋ，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３５５−３５９を参照のこと）。挿入されたＣＧ５３１３５をコードする配列の効率的な翻訳のために、特異的な開始シグナルが必要である場合もある。これらのシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。さらに、開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするためには、所望されるコード配列のリーディングフレームと一致していなければならない。これらの外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、様々な起源のものであってよく、自然界に存在しているものであっても、また合成のものであってもいずれでもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることによって高めることができる（例えば、Ｂｉｔｔｎｅｒら、１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４を参照のこと）。
【００７２】
加えて、挿入される配列の発現を調節するか、所望される特異的様式で遺伝子産物を修飾し、そしてプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能に重要である場合がある。種々の宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾について、特徴的であり特異的である機構を有する。適切な細胞株または宿主システムは、発現される外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするように選択することができる。この目的のためには、遺伝子産物の一次転写物の適切なプロセシングおよび遺伝子産物の翻訳後修飾（例えば、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化）のための細胞性機構を有している真核生物宿主細胞を使用することができる。このような哺乳動物宿主細胞としては、ＰＣ１２、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＢＴ２、ＢＴ２Ｏ、およびＴ４７Ｄ、ＮＳ０（いずれの免疫グロブリン鎖をも内性的には生成しないマウス骨髄腫細胞株）、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、およびＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が挙げられるが、これらに限定はされない。翻訳後修飾がＣＧ５３１３５の所望される活性に必須ではないことが明らかになっている場合は、細菌システムまたは酵母システムでの発現を使用することができる。好ましい実施形態においては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）がＣＧ５３１３５配列を発現させるために使用される。
【００７３】
適切にプロセシングされたＣＧ５３１３５の長期間の多量の生成のためには、細胞中での安定な発現が好ましい。ＣＧ５３１３５を安定に発現する細胞株は、選択マーカーを含むベクターを使用することによって操作することができる。限定ではないが例として、発現構築物の導入の後、操作された細胞は富化培地の中で１〜２日間増殖され、その後、選択培地に移され得る。発現構築物中の選択マーカーによって、選択のための耐性が付与され、そして最適に、細胞にはそれらの染色体に発現構築物を安定に組み込ませ、細胞が培養物中で増殖させられ、細胞株へと成長させることが可能になる。このような細胞は、ＣＧ５３１３５を持続的に発現させながら、長期間培養することができる。
【００７４】
多数の選択システムを使用することができ、これには、抗生物質耐性（Ｎｅｏ（ゲネチシンに対する耐性を付与する）またはＧ−４１８（ＷｕおよびＷｕ，１９９１、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７；１９９３年５月，ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５）；Ｚｅｏ（ゼオシンに対する耐性のため）；Ｂｓｄ（ブラスチシジンに対する耐性のため）などのようなマーカー）；代謝拮抗剤耐性（Ｄｈｆｒ（メトトレキセートに対する耐性を付与する），Ｗｉｇｌｅｒら、１９８０，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５７；Ｏ’Ｈａｒｅら、１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：１５２７のようなマーカー）；ｇｐｔ（ミコフェノール酸に対する耐性を付与する）（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：２０７２）；およびｈｙｇｒｏ（ハイグロマイシンに対する耐性を付与する）（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、１９８４，Ｇｅｎｅ  ３０：１４７）が含まれるが、これらに限定はされない。加えて、変異体細胞株（ｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞、またはａｐｒｔ細胞を含むがこれらに限定されない）を、チミジンキナーゼ、ヒポキサンチン、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼまたはアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼについての対応する遺伝子を有しているベクターと組み合わせて使用することができる。組み換えＤＮＡ技術についての当該分野で一般的に知られている方法を、所望される組み換え体クローンを選択するために日常的に行われているように適用することができ、そのような方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）；およびＤｒａｃｏｐｏｌｉら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）の第１２章および第１３章；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１に記載されている。
【００７５】
組み換え体細胞は、温度、インキュベーション時間、光学密度、および培地組成について標準的な条件下で培養することができる。しかし、組み換え体細胞の増殖のための条件は、ＣＧ５３１３５の発現のためのそれらの条件とは異なる場合がある。修飾された培養条件および培地が、ＣＧ５３１３５の生成を増強させるために使用される場合もある。当該分野で公知の任意の技術が、ＣＧ５３１３５を産生するための最適条件を確立させるために適用される場合もある。
【００７６】
組み換え技術によってＣＧ５３１３５またはその断片を産生することに代替する方法は、ペプチド合成である。例えば、ＣＧ５３１３５全体、またはＣＧ５３１３５の一部に対応するタンパク質を、ペプチド合成装置の使用によって合成することができる。当該分野で周知である従来のペプチド合成または他の合成プロトコールを使用することができる。
【００７７】
ＣＧ５３１３５またはその一部のアミノ酸配列を有しているタンパク質は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９によって記載されている手順と同様の手順を使用して、固相ペプチド合成によって合成することができる。合成の間に、保護された側鎖を有しているＮ−α−保護アミノ酸を、そのＣ末端に連結させられた成長するポリペプチド鎖に対して、および不溶性の高分子支持体（すなわちポリスチレンビーズ）に対して一滴ずつ添加される。タンパク質は、それをジシクロヘキシルカルボジイミドのような試薬と反応させることによって活性化させられている、Ｎ−α−保護アミノ酸のα−カルボキシル基に対してＮ−α−脱保護アミノ酸のアミノ基を連結させることによって合成される。活性化させられたカルボキシルへの遊離のアミノ基の結合によって、ペプチド結合の形成が生じる。ほとんどの一般的に使用されているＮ−α−保護基としては、Ｂｏｃ（これは酸に不安定である）およびＦｍｏｃ（これは塩基に不安定である）が挙げられる。適切な化学的性質、樹脂、保護基、保護されたアミノ酸、および試薬についての詳細は当該分野で周知であり、したがって、本明細書においては詳細には議論されない（Ａｔｈｅｒｔｏｎら、１９８９，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｙｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，およびＢｏｄａｎｓｚｋｙ，１９９３，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ，第２版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇを参照のこと）。
【００７８】
得られるＣＧ５３１３５タンパク質の精製は、従来の手順（例えば、ゲル浸透を使用する分配ＨＰＬＣ、分配および／またはイオン交換クロマトグラフィー）を使用して行うことができる。適切なマトリックスおよび緩衝液の選択は当該分野で周知であり、したがって、本明細書中では詳細には議論されない。
【００７９】
ＣＧ５３１３５タンパク質を調製するための方法についての限定ではない例は、以下のセクション６に見ることができる。
【００８０】
（５．３  ＣＧ５３１３５の活性の特性決定と実証、および処置の間の効果のモニタリング）
当該分野で公知である任意の方法を、本発明にしたがって使用される組成物中の精製されたＣＧ５３１３５タンパク質の実体を決定するために使用することができる。このような方法としては、ウェスタンブロット、配列決定（例えば、エドマン配列決定）、液体クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、ＵＶとエレクトロスプレー質量分析法の両方を用いるＲＰ−ＨＰＬＣ）、質量分析法、全アミノ酸の分析、ペプチドマッピング、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥが挙げられるが、これらに限定はされない。ＣＧ５３１３５タンパク質の二次構造、三次構造、および／または四次構造は、当該分野で公知の任意の方法によって分析することができる。例えば、遠紫外線円偏光二色性分光法を使用して、二次構造を分析することができ、近紫外線円偏光二色性分光法と二次導関数ＵＶ吸光度測定を使用して三次構造を分析することができ、そして光散乱ＳＥＣ−ＨＰＬＣを使用して四次構造を分析することができる。
【００８１】
本発明にしたがって使用される組成物中のＣＧ５３１３５タンパク質の純度は、当該分野で公知の任意の方法によって分析することができ、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」）、逆相高速液体クロマトグラフィー（「ＲＰ−ＨＰＬＣ」）、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（「ＳＥＣ−ＨＰＬＣ」）、およびウェスタンブロット（例えば、宿主細胞のタンパク質のウェスタンブロット）であるが、これらに限定はされない。好ましい実施形態においては、本発明にしたがって使用される組成物中のＣＧ５３１３５タンパク質は、密度測定によると、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の純度である。別の好ましい実施形態においては、本発明にしたがって使用される組成物中のＣＧ５３１３５タンパク質は、密度測定によると、９７％を超えるか、９８％を超えるか、または９９％を超える純度である。
【００８２】
本発明にしたがって使用されるＣＧ５３１３５の生物学的活性および／または効力は、当該分野で公知の任意の方法によって決定することができる。例えば、本発明の方法に従う治療において使用される組成物は、ＦＧＦ−２０が保有している１つ以上の活性（例えば、細胞増殖刺激活性）について適切な細胞株の中で試験することができる。このようなアッセイの限定ではない例は、以下のセクション６．４に記載される。
【００８３】
本発明の方法に従う治療に使用される組成物はまた、ヒトでの試験の前に適切な動物モデルシステムにおいて試験することもできる。このような動物モデルシステムとしては、ラット、マウス、ハムスター、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなどの粘膜炎モデルが挙げられるが、これらに限定はされない。当該分野で公知の粘膜炎についての主要な動物モデルとしては、マウスの口腔粘膜炎モデル（Ｘｕら，Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ  Ｏｎｃｏｌ  １：３６９−３７４（１９８４））；ハムスターの口腔粘膜炎モデル，Ｓｏｎｉｓ，：Ｔｅｉｃｈｅｒ  Ｂ（編）Ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（２００２）；ラットの胃腸粘膜炎モデル、Ｇｉｂｓｏｎら，Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏ  １８：１０９５−１１００（２００３）；マウスの腸幹細胞、Ｐｏｔｔｅｎら，Ｇｕｔ  ３６（６）：８６４−８７３（１９９５）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００８４】
粘膜炎モデルでの実験における薬剤の活性の推定を確立するためには、動物の観察的試験、さらにはそれらの生存状態を組み合わせた指数を開発することができる。限定的ではない例は、以下のセクション６．５に記載される。当該分野で公知のヒト患者についてのステージ決定／スコアリングシステムもまた使用することができ、例えば、Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ）口腔粘膜炎（ＯＭ）スコアリングシステムおよび／またはＯｒａｌ  Ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｓｃａｌｅ（ＯＭＡＳ）を、口腔粘膜炎を予防および／または処置することにおける本発明の組成物の有効性を評価するために使用することができる。
【００８５】
さらに、当業者に公知の任意のアッセイを、消化管粘膜炎の予防および／または処置のための本明細書中に開示される併用療法の予防的有用性および／または治療的有用性を評価するために使用することができる。
【００８６】
消化管粘膜炎を予防および／または処置することに対するＣＧ５３１３５の有効性は、当業者に公知の任意の方法によってモニタリングすることができ、これには、臨床的評価、および生体試料中のＣＧ５３１３５生体マーカーのレベルの測定が含まれるが、これらに限定はされない。ＣＧ５３１３５生体マーカーとしては、ＣＸＣＬ１、ＩＬ−６、およびＩＬ−８が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００８７】
単独でのＣＧ５３１３５の使用、または別の治療法（例えば、別の治療薬または予防薬）と組み合わせたＣＧ５３１３５の使用の間の全ての有害な作用もまたモニタリングされることが好ましい。癌の処置の間の化学療法についての有害な作用の例としては、胃腸毒性（例えば、初期および後期に生じる下痢および膨満であるが、これらに限定はされない）；吐き気；嘔吐；拒食症；白血球減少症；貧血；好中球減少症；無力症；腹部痙攣；発熱；疼痛；体重の減少；脱水；脱毛症；呼吸困難；不眠症；眩暈；粘膜炎；口内乾燥、および腎不全、ならびに便秘、神経および筋肉の作用、腎臓および膀胱に対する一時的または永久的な損傷、インフルエンザに似た症状、体液貯留ならびに一時的な不妊または永久的な不妊が挙げられるが、これらに限定はされない。放射線治療による有害な作用としては、疲労、口の乾燥、および食欲不振が挙げられるが、これらに限定はされない。他の有害な作用としては、胃腸毒性（例えば、初期および後期に生じる下痢および膨満であるが、これらに限定はされない）；吐き気；嘔吐；拒食症；白血球減少症；貧血；好中球減少症；無力症；腹部痙攣；発熱；疼痛；体重の減少；脱水；脱毛症；呼吸困難；不眠症；眩暈；粘膜炎；口内乾燥、および腎不全が挙げられるが、これらに限定はされない。生物療法／免疫療法による有害な作用としては、投与部位の発疹または腫れ、インフルエンザに似た症状（例えば、発熱、悪寒、および疲労）、消化管の不調およびアレルギー反応が挙げられるが、これらに限定はされない。ホルモン療法による有害な作用としては、吐き気、不妊の問題、鬱病、食欲不振、眼疾患、頭痛、および体重の変化が挙げられるが、これらに限定はされない。患者が一般的に見舞われるさらなる望ましくない作用は多数あり、当該分野で公知である。多くは、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（第５８版、２００４年）に記載されている。
【００８８】
（５．４  予防的および治療的使用）
本発明により、１つ以上の単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物の有効量を、それが必要な被験体に投与する工程を含む、消化管粘膜炎を予防および／または処置する方法が提供される。
【００８９】
本発明の方法によって予防または処置することができる消化管粘膜炎としては、口腔粘膜炎、食道炎、胃炎、腸炎、および直腸炎が挙げられるが、これらに限定はされない。いくつかの実施形態においては、本発明の方法には、１つ以上の単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物の有効量を、消化管の１つ以上の領域に粘膜炎を有している被験体（例えば、口腔粘膜炎と腸炎の両方を有している被験体）に投与する工程が含まれる。いくつかの実施形態においては、本発明の方法には、１つ以上の単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物の有効量を、消化管の１つの領域だけに粘膜炎を有している被験体（例えば、口腔粘膜炎だけを有している被験体、または腸炎だけを有している被験体）に投与する工程が含まれる。好ましい実施形態においては、本発明の方法によって予防および／または処置することができる消化管粘膜炎は口腔粘膜炎である。いくつかの実施形態においては、本発明の方法によって予防または処置することができる消化管粘膜炎は、口腔粘膜炎ではない。消化管粘膜炎は、例えば、化学物質による原因、放射線である原因、生物学的原因（例えば、細菌）、またはそれらの組み合わせによって誘導され得る。
【００９０】
本発明によって、消化管粘膜炎を有している患者の集団、および消化管粘膜炎を発症するリスクがある集団において、消化管粘膜炎を予防および／または処置する方法が提供される。１つの実施形態においては、本発明によって、放射線治療および／または化学療法で処置された被験体において、消化管粘膜炎を予防および／または処置する方法が提供される。別の実施形態においては、本発明によって、１つ以上のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物を、放射線治療および／または化学療法で処置される予定の被験体に投与することによって、消化管粘膜炎を予防する方法が提供される。特定の実施形態においては、本発明によって、自己造血幹細胞移植または同種造血幹細胞移植の準備において、馴化骨髄機能破壊的放射線治療および／または化学療法で処置された被験体の消化管粘膜炎を予防および／または処置する方法が提供される。別の特定の実施形態においては、本発明によって、粘膜炎を誘導する物質での粘膜毒性化学療法を受けた被験体または受けている被験体（例えば、シタラビンで処置された白血病患者）において、消化管粘膜炎を予防および／または処置する方法が提供される。なお別の特定の実施形態においては、本発明によって、アジュバント化学治療を用いるかまたは用いずに、放射線治療で処置された頭部および／または頸部の癌の被験体の消化管粘膜炎を予防および／または処置する方法が提供される。
【００９１】
１つの実施形態においては、本発明によって、被験体に消化管粘膜炎の発症を誘導し得る原因（例えば、化学物質である原因、放射線である原因、生物学的原因、またはそれらの組み合わせ）が生じる前に、１つ以上のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物を投与する工程を含む、消化管粘膜炎を予防する方法が提供される。別の実施形態においては、本発明によって、被験体に消化管粘膜炎の発症を誘導し得る原因（例えば、化学物質である原因、放射線である原因、生物学的原因、またはそれらの組み合わせ）が生じた後に、しかし、被験体において消化管粘膜炎が発症する前に、１つ以上のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物を投与する工程を含む、消化管粘膜炎を予防する方法が提供される。なお別の実施形態においては、本発明によって、１つ以上のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物を、被験体において消化管粘膜炎が発症した後に投与する工程を含む、消化管粘膜炎を処置する方法が提供される。
【００９２】
いくつかの実施形態においては、本発明によって、１つ以上のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物をサイクル投与する工程を含む、消化管粘膜炎を予防および／または処置する方法が提供される。１つの実施形態においては、サイクリング療法には、治療薬の１つの副作用を回避もしくは低減させるため、および／または治療薬の効力を改善するための、しばらくの間の第１の治療薬の投与、その後の、しばらくの間の第２の治療薬の投与、ならびに、この連続投与を繰り返すこと、すなわち、サイクルが含まれる。別の実施形態においては、サイクリング療法には、しばらく間の１つの治療薬の投与、しばらくの間の治療の停止、および治療薬の投与を繰り返すことが含まれる。本発明にしたがうと、１つ以上のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物は、放射線治療および／または化学療法の投与の前、その間、またはその後に被験体に投与することができる。この場合、そのような放射線治療および／または化学療法は、サイクリング療法である。
【００９３】
本発明にしたがうと、１つ以上の単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物はまた、消化管粘膜炎を予防および／または処置するために他の治療薬と組み合わせて使用することもできる。１つの実施形態においては、１つ以上の単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物は、消化管粘膜炎を予防および／または処置するために、被験体に対して、消化管粘膜炎に対して予防および／または治療効果（単数または複数）を有している、ならびに／あるいは、消化管粘膜炎に伴う１つ以上の症状に対して緩和効果（単数または複数）を有している１つ以上の他の薬剤と組み合わせて投与される。このような薬剤の限定ではない例は、粘膜保護剤（例えば、スクラルファート、コロイド状ビスマス）、抗生物質、抗真菌剤（例えば、フルコナゾール、アンホテリシンＢ）、抗ウイルス剤（例えば、アシクロビル）、制吐剤（例えば、フェノチアジン、ブチルフェノン、ベンゾチアゼピン、コルチコステロイド、カンナビノイド、５−ＨＴ３セロトニンレセプター遮断薬）、下痢止剤（例えば、ジフェノキシレート、ロペラミド、カオリン、ペクチン、メチルアセルロース、活性化アタパルジャイト、ケイ酸アルミニウム・マグネシウム、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ））、トランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、Ｌ−グルタミン、アミフォステン、および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。別の実施形態においては、１つ以上の単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物が、消化管粘膜炎に対して緩和効果を有している１つ以上の他の治療薬と組み合わせて投与される。このような治療薬の限定ではない例は：リドカインのような局所鎮痛剤の塗布、ならびに／または麻酔薬および抗生物質の全身投与、リン酸カルシウムを伴うかまたは伴わない局所フッ化物塗布、機械的プラークの除去、ｔｏｏｔｈ  ｓｐｏｎｇｅｓ、氷の小片を口に含んで口腔の冷却を生じること、種々の感染防止剤での口腔洗浄、局所麻酔剤を含む口腔洗浄剤である。
【００９４】
（５．５  投薬レジメン）
本発明の予防および／または治療プロトコールの毒性および効力は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効である用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性作用と治療効果との間での用量比が治療指数であり、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きい治療指数を示す予防薬および／または治療薬が好ましい。毒性の副作用を示す予防薬および／または治療薬が使用され得る場合には、感染していない細胞を損傷させてしまう可能性を最小にし、それによって副作用を減少させるために、罹患した組織部位に対してそのような薬剤を標的化する送達システムを設計するように注意を払わなければならない。
【００９５】
細胞培養アッセイおよび動物実験によって得られたデータは、ヒトで使用するための予防薬および／または治療薬の投与量の範囲を策定することに使用することができる。このような薬剤の投与量は、ほとんど毒性がないか、または毒性が全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲にあることが好ましい。投与量は、使用される投与形態と利用される投与経路に応じて、この範囲内で変化させることができる。本発明の方法で使用される任意の薬剤について、治療有効用量は、細胞培養アッセイによって最初に推定することができる。用量は、細胞培養物中で決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大の阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲に達するように、動物モデルにおいて策定される。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中でのレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【００９６】
特定の障害または症状の処置に有効であり得る本発明の組成物の量は、障害または症状の性質に応じて様々であり、そして標準的な臨床的技術によって決定することができる。処方物中で使用される正確な用量はまた、投与経路、疾患または障害の重傷度に応じて様々であり、そして医師による判断と個々の患者の状況にしたがって決定されるべきである。
【００９７】
１つの実施形態においては、本発明によって提供されるヒト患者への投与のための１つ以上のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物の投与量は、少なくとも０．００１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．００５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．０３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．０５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも９ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ（ＵＶアッセイによって測定した場合）である。別の実施形態においては、本発明によって提供されるヒト患者への投与のための１つ以上のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物の投与量は、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇの間、０．００５〜５ｍｇ／ｋｇの間、０．０１〜１ｍｇ／ｋｇの間、０．０１〜０．９ｍｇ／ｋｇの間、０．０１〜０．８ｍｇ／ｋｇの間、０．０１〜０．７ｍｇ／ｋｇの間、０．０１〜０．６ｍｇ／ｋｇの間、０．０１〜０．５ｍｇ／ｋｇの間、または０．０１〜０．３ｍｇ／ｋｇの間（ＵＶアッセイによって測定した場合）である。
【００９８】
タンパク質濃度は、当該分野で公知の方法、例えば、ＢｒａｄｆｏｒｄアッセイまたはＵＶアッセイによって測定することができ、濃度は、どのアッセイが使用されるかによって変化し得る。限定ではない例においては、本発明の薬学的組成物中のタンパク質濃度は、２８０ｎｍの波長でのＵＶ吸収の直接の測定と、ＣＧ５３１３５タンパク質についての十分に特性決定されている参照標準物（ＩｇＧの代わりに）での較正を使用するＵＶアッセイによって測定される。（ＣＧ５３１３５参照標準物を使用した）このＵＶ法を用いて得られた試験結果は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（較正にＩｇＧを使用した）を用いた同じ試料（単数または複数）についての試験結果の３分の１である。例えば、本発明によって提供されるヒト患者に投与するための１つ以上のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物の投与量は、ＵＶアッセイによって測定すると０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇの間である場合には、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイによって測定すると、投与量は０．００３〜３０ｍｇ／ｋｇである。
【００９９】
１つの実施形態においては、第１の全用量を投与する前に、個々の患者には、任意の急激な不耐症を検出するために、少量（例えば、所定の用量の１／１００から１／１０）の本発明の組成物の皮下注射が投与されることが好ましい。注射部位は、試験後１時間および２時間でチェックされる。反応が検出されなければ、全用量が投与される。
【０１００】
（５．６  薬学的組成物）
本発明にしたがって使用される組成物は、消化管粘膜炎を予防および／または処置するための予防有効量または治療有効量で被験体に投与することができる。種々の送達システムが公知であり、本発明の方法にしたがって使用される組成物を投与するために使用することができる。このような送達システムとしては、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロカプセルへのカプセル化、組み換え体細胞による発現、レセプターによって媒介されるエンドサイトーシス、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての本発明の核酸の構築などが挙げられるが、これらに限定はされない。導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、脳室内、硬膜外、静脈内、皮下、鼻腔内、腫瘍内、経皮、経粘膜、直腸、および経口の経路が挙げられるが、これらに限定はされない。本発明の方法にしたがって使用される組成物は、任意の従来的な経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮もしくは粘膜内層（例えば、眼粘膜、口腔粘膜、膣粘膜、直腸および小腸粘膜など）を介する吸収によって投与することができ、また、他の生物学的に活性な物質と一緒に投与することもできる。投与は、全身的であっても、また、局所的であってもよい。特定の実施形態においては、本発明には、１つ以上のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物が予め充填されている、１室または２室の注射器（好ましくは、針を安全にするためのデバイスと細い針が取り付けられているもの）を使用することが含まれる。１つの実施形態においては、２室注射器（例えば、Ｖｅｔｔｅｒ  Ｐｈａｒｍａｒ−ＦｅｒｔｉｇｕｎｇによるＶｅｔｔｅｒ  Ｌｙｏ−Ｊｅｃｔ二室注射器）が使用される。このようなシステムは、凍結乾燥させられた処方物について所望され、そして緊急時に特に有用である。
【０１０１】
いくつかの実施形態においては、本発明の薬学的組成物を、処置が必要な領域に局所的に投与することが所望される場合がある。これは、例えば、外科手術の間の局所注入、または局所塗布（例えば、外科手術後の創傷包帯と組み合わせて）、注射によって、カテーテルによって、坐剤によって、または移植によって（上記移植物は、多孔性、非孔性、またはゼラチン状物質（例えば、シラスティック膜または繊維のような膜を含む）である）行うことができる。１つの実施形態においては、投与は、原因（例えば、放射線、化学療法、または化学兵器／生物兵器）に対して最も敏感な迅速に増殖している組織の部位（またはそれよりも前の部位）への直接の注射によって行うことができる。
【０１０２】
本発明の組成物が予防薬または治療薬をコードする核酸であるいくつかの実施形態においては、核酸は、適切な核酸発現ベクターの一部として核酸を構築すること、およびそれが、例えば、レトロウイルスベクターの使用によって細胞内に存在するようにそれを投与することによって、または直接の注射によって、あるいはマイクロ粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃）または脂質もしくは細胞表面レセプターもしくはトランスフェクトする物質でのコーティングの使用によって、あるいは、核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドに連結させてそれを投与することなどによって、それらのコードするタンパク質（例えば、ＣＧ５３１３５タンパク質）の発現を促進するように、インビボで投与することができる。あるいは、本発明の核酸は、相同組み換えによって、発現のための宿主細胞内に導入することができ、そして宿主細胞ＤＮＡに取り込ませることができる。
【０１０３】
本発明には、単位投与量形態の調製に使用することができる薬学的組成物の製造に有用であるバルクの薬剤組成物が含まれる。好ましい実施形態においては、本発明の組成物は薬学的組成物である。このような組成物には、ＣＧ５３１３５の予防有効量または治療有効量と、薬学的に受容可能なキャリアが含まれる。好ましくは、薬学的組成物は、被験体への投与経路に適切であるように処方される。
【０１０４】
１つの実施形態においては、用語「薬学的に受容可能な」は、連邦政府または州政府の監督機関によって承認されていること、または米国薬局方に列挙されていること、あるいは、他の「人への使用について一般的に安全であると認められた」もの（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｇａｒｄｅｄ  ａｓ  Ｓａｆｅ（ＧＲＡＳ））を意味する。用語「キャリア」は、ＣＧ５３１３５がともに投与される希釈剤、アジュバント、膨張性薬剤（例えば、種々の塩の形態のアルギニン、スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム、またはスクロース）、賦形剤、またはビヒクルを意味する。このような薬学的キャリアは、滅菌の液体（例えば、水および油（例えば、ワセリン、動物性油脂、植物性油脂、または合成起源の油脂、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など））、あるいは固体キャリア（例えば、希釈剤、香味剤、可溶化剤、潤滑剤、懸濁剤、またはカプセル化剤としても作用し得る１つ以上の物質）であり得る。薬学的組成物が静脈内に投与される場合には、水が好ましいキャリアである。生理食塩溶液および水溶性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、液体のキャリアとして、特に注射可能な溶液に使用することができる。適切な薬学的賦形剤としては、デンプンまたはその合成によって改変された誘導体（例えば、ヒドロキシエチルデンプン）、ステアリン酸塩、グリセロール、グルコース、ラクトース、スクロース、トレハロース、ゼラチン、スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定はされない。組成物には、所望される場合は、主要ではない量の湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝化剤もまた含めることができる。
【０１０５】
ＣＧ５３１３５を含む組成物は、任意の多くの可能な投与形態に処方することができ、例えば、液体、懸濁液、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル、軟質ゲル、丸剤、散剤、浣腸剤、徐放処方物などであるが、これらに限定はされない。ＣＧ５３１３５を含む組成物はまた、水性媒体、非水性媒体、または混合媒体中の懸濁液として処方される場合もある。水性懸濁液にはさらに、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む、懸濁液の粘性を増大させる物質が含まれる場合がある。懸濁液にはまた、安定剤も含まれる場合がある。組成物はまた、従来の結合剤とトリグリセリドのようなキャリアを用いて、坐剤として処方することもできる。経口用処方物には、標準的なキャリア（例えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプンまたは合成によって改変されたその誘導体（例えば、ヒドロキシエチルデンプン）、ステアリン酸塩、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど）が含まれ得る。
【０１０６】
ＣＧ５３１３５を含む薬学的組成物は、その意図される投与経路に適合するように処方される。特定の実施形態においては、組成物は、日常的に使用される手順にしたがって、ヒトへの静脈内、皮下、筋肉内、経口、鼻腔内、腫瘍内、または局所投与に適合させられた薬学的組成物として処方される。通常、静脈内投与のための組成物は、滅菌の等張性または高浸透圧の水性緩衝液中の溶液である。必要である場合には、組成物には、可溶化剤と局所麻酔剤（例えば、ベンジルアルコールまたはヨードカイン）が、注射部位の痛みを和らげるために含まれる場合もある。
【０１０７】
ＣＧ５３１３５を含む組成物が局所投与される場合には、組成物は、経皮パッチ、軟膏、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、ドロップ剤、坐剤、噴霧剤、液剤、および散剤の形態に処方することができる。従来の薬学的キャリア、水性基剤、粉末基剤、または油状の基剤、増粘剤などが必要である場合も、また所望される場合もある。コーティングされたコンドーム、手袋などもまた有用である場合がある。好ましい局所処方物としては、本発明の組成物が局所送達用物質（例えば、脂質、リポソーム、ミセル、乳濁液、スフィンゴミエリン、脂質−タンパク質複合体、または脂質−ペプチド複合体、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤、および界面活性剤であるが、これらに限定はされない）と混合されているものが含まれる。ＣＧ５３１３５を含む組成物は、リポソームの中にカプセル化することができ、また、それらに対する、具体的には、陽イオン性リポソームに対して錯体形成することもできる。あるいは、ＣＧ５３１３５を含む組成物は、脂質、具体的には、陽イオン性脂質に対して錯体形成させられる場合もある。噴霧することができない局所投与形態については、局所投与に適合するキャリアまたは１つ以上の賦形剤を含み、そして好ましくは、水より大きな動的粘性係数を有している、半固体または固体の形態になるような粘性の投与形態が、一般的には使用される。他の適切な局所投与形態としては、噴霧することができるエアゾール調製物が挙げられる。この場合、有効成分は、好ましくは、固体または液体の不活性なキャリアと混合されており、加圧された揮発性物質（例えば、気体推進剤（例えば、Ｆｒｅｏｎまたはヒドロフルオロカーボン））と混合されてパッケージされるか、または小型容器の中にパッケージされる。湿潤剤または加湿剤もまた、所望される場合には、薬学的組成物および投与形態に添加することができる。このような添加される成分の例は当該分野で周知である。
【０１０８】
ＣＧ５３１３５を含む組成物は、鼻腔内投与が好ましい場合には、エアゾール形態、噴霧、霧、または液滴もしくは粉末の形態に処方することができる。具体的には、ＣＧ５３１３５を含む組成物は、従来は、適切な推進剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、他のヒドロフルオロカーボン、二酸化炭素、または他の適切な気体）の使用によって、加圧されたパックまたはネブライザーからのエアゾールスプレーの提示の形態で送達され得る。加圧されたエアゾールの場合には、投与単位は、定量を送達するバルブを提供することによって決定される場合がある。化合物と適切な粉末基剤（例えば、二糖またはデンプン）の粉末混合物を含む、吸入器または吸入装置で使用されるマイクロカプセル（例えば、重合された表面から構成される）が処方される場合もある。
【０１０９】
１つ以上のＣＧ５３１３５タンパク質はまた、マイクロカプセルの表面を形成する１つ以上の高分子（例えば、ヒドロキシエチルデンプン）とともにマイクロカプセルに処方することもできる。このような処方物は、例えば、持続処方に有効である。
【０１１０】
ＣＧ５３１３５を含む組成物は、経口投与が好ましい場合には、粉末、顆粒、マイクロ粒子、ナノ粒子、水または非水性の媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、サシェ（ｓａｃｈｅｔ）、錠剤、または小さい錠剤の形態に処方することができる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、結合剤もまた望ましい場合がある。錠剤またはカプセル剤は、結合剤（例えば、予めゼラチン状にされたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン、またはグリコール酸ナトリウムデンプン）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）のような薬学的に受容可能な賦形剤を用いて、従来の手段によって調製することができる。錠剤は、当該分野で周知の方法によってコーティングすることができる。経口投与のための液体調製物は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用油脂）；乳化剤（例えば、レシチン、またはアカシア）；非水性のビヒクル（例えば、アーモンド油、油状のエステル、エチルアルコール、または分画された植物油）；および保存剤（例えば、メチル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸もしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）のような薬学的に受容可能な添加剤を用いて、従来の手段によって調製することができる。調製物にはまた、適切である場合には、緩衝塩、香味剤、着色剤、および甘味剤も含まれる場合がある。経口投与のための調製物は、予防薬または治療薬（単数または複数）の持続放出、制御放出、または徐放に適するように処方することができる。
【０１１１】
１つの実施形態においては、本発明の組成物は、１つ以上の浸透促進剤（例えば、アルコール、界面活性剤、およびキレート化剤）と組み合わせて経口投与される。好ましい界面活性剤としては、脂肪酸およびそのエステルもしくは塩、胆汁酸およびその塩が挙げられるが、これらに限定はされない。いくつかの実施形態においては、複数の浸透促進剤の組み合わせ（例えば、胆汁酸／塩と組み合わせたアルコール、脂肪酸／塩）が使用される。特定の実施形態においては、ラウリル酸、カプリル酸のナトリウム塩が、ＵＤＣＡと組み合わせて使用される。さらなる浸透促進剤としては、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが挙げられるが、これらに限定はされない。本発明の組成物は、噴霧された乾燥粒子、またはマイクロ粒子もしくはナノ粒子を形成するように錯体形成させられたものを含むがこれらに限定されない顆粒の形態で経口投与することができる。本発明の組成物と一緒に錯体形成させるために使用することができる錯化剤としては、ポリ−アミノ酸、ポリイミン、ポリアクリレート、ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリレート、陽イオン化ゼラチン、アルブミン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＤＥＡＥ誘導ポリイミン、ポルラン（ｐｏｌｌｕｌａｎｓ）、セルロースおよびデンプンが挙げられるが、これらに限定はされない。特に好ましい錯化剤としては、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノ−メチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミン、およびＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、アルギン酸、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１１２】
ＣＧ５３１３５を含む組成物は、エアロゾル化剤と共に処方される組成物の肺投与によって（例えば、吸入器またはネブライザーの使用によって）被験体に送達することができる。
【０１１３】
好ましい実施形態においては、ＣＧ５３１３５を含む組成物は、注射による（例えば、ボーラス注射による、または点滴による）非経口投与のために処方される。注射用の処方物は、保存剤が添加された単位投与形態（例えば、アンプルの中、または多用量の容器の中）で提示され得る。組成物は、油性ビヒクルもしくは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、または乳濁液のような形態とすることができ、また、処方剤（例えば、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤）を含めることもできる。あるいは、有効成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば、滅菌の発熱物質を含まない水）で構成するための粉末形態にすることもできる。
【０１１４】
好ましい実施形態においては、組成物は、ヒトへの静脈内投与に適応させられた薬学的組成物として日常的に行われている手順にしたがって処方される。通常、静脈内投与用の組成物は、滅菌の等張性の水性緩衝液中の溶液である。必要な場合には、組成物には、可溶化剤と局所麻酔剤（例えば、ベンジルアルコールまたはヨードカイン）が、注射部位の痛みを和らげるために含まれる場合もある。一般的には、成分は、有効成分の量が示されている単位投与形態（例えば、シールされた容器（例えば、バイアル、アンプル、サシェ）の中の乾燥した凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として）として、別々にか、または一緒に混合されるかのいずれかで供給される。組成物が注入によって投与される場合には、これは、滅菌の薬学的グレードの水または生理食塩水を含む注入容器を用いて投与することができる。組成物が注射によって投与される場合には、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルまたはバイアルを提供することができ、これによって、成分を投与前に混合することができる。
【０１１５】
ＣＧ５３１３５を含む組成物は、中性の形態または塩の形態として処方することができる。薬学的に受容可能な塩としては、遊離のアミノ基とともに形成されるもの（例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもの）、および遊離のカルボキシル基とともに形成されるもの（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインに由来するもの）などが挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１１６】
上記の処方物に加えて、ＣＧ５３１３５を含む組成物はまた、デポー調製物として処方することもできる。このような長期作用型の処方物は、移植によって（例えば、皮下または筋肉内）あるいは筋肉注射によって投与され得る。したがって、例えば、組成物は、適切な高分子材料もしくは疎水性材料（例えば、許容される油中の乳濁物として）、またはイオン交換樹脂とともに処方され得るか、あるいは難溶性の誘導体として（例えば、難溶性の塩）として処方することができる。リポソームおよび乳濁物は、親水性薬剤についての送達ビヒクルまたはキャリアについての周知の例である。
【０１１７】
１つの実施形態においては、本発明の方法にしたがって使用される組成物の成分は、そのような組成物のレシピエントと同種起源であるか、または同種反応性である被験体に由来する。
【０１１８】
いくつかの実施形態においては、本発明の方法にしたがって使用される処方物には、０．０２Ｍ〜０．２Ｍの酢酸塩、０．５〜５％のグリセロール、０．２〜０．５Ｍのアルギニン−ＨＣｌ、および１つ以上のＣＧ５３１３５タンパク質（好ましくは、０．５〜５ｍｇ／ｍｌ（ＵＶ））が含まれる。１つの実施形態においては、本発明の方法にしたがって使用される処方物には、０．０４Ｍの酢酸ナトリウム、３％のグリセロール（容積／容積）、０．２Ｍのアルギニン−ＨＣｌ（ｐＨ５．３）、および１つ以上の単離されたＣＧ５３１３５タンパク質（好ましくは、０．８ｍｇ／ｍｌ（ＵＶ））が含まれる。いくつかの実施態様においては、本発明の方法にしたがって使用される処方物には、０．０１〜１Ｍの安定剤（例えば、種々の塩の形態のアルギニン、スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム、またはスクロース）、０．０１〜０．１Ｍのリン酸一ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ）、および０．０１％〜０．１％重量／容積（「ｗ／ｖ」）のポリソルベート８０またはポリソルベート２０と、１つ以上のＣＧ５３１３５タンパク質（好ましくは、０．００５〜５０ｍｌ（ＵＶ））が含まれる。１つの実施形態においては、本発明の方法にしたがって使用される処方物には、３０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．１）、２ｍＭのＥＤＴＡ，２００ｍＭのソルビトール、５０ｍＭのＫＣｌ、２０％のグリセロール、および１つ以上の単離されたＣＧ５３１３５タンパク質が含まれる。
【０１１９】
本発明によってはまた、本発明の治療レジメンを実行するためのキットも提供される。このようなキットには、１つ以上の容器の中に、予防有効量または治療有効量の薬学的に受容可能な形態の本発明の組成物（例えば、１つ以上のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物）が含まれる。本発明のキットのバイアルの中の組成物は、薬学的に受容可能な溶液の形態（例えば、滅菌の生理食塩水、デキストロース溶液、または緩衝溶液、あるいは他の薬学的に受容可能な滅菌の流体と組み合わせられた形態）であり得る。あるいは、組成物は、凍結乾燥させられる場合も、また乾燥させられる場合もある；この場合、キットには、状況に応じてさらに、容器の中に、薬学的に受容可能な溶液（例えば、生理食塩水、デキストロース溶液など）（好ましくは、滅菌のもの）が、注射の目的のための溶液を形成するために組成物を再構成するために含まれる。
【０１２０】
別の実施形態においては、本発明のキットにはさらに、処方物の注射用の針もしくは注射器（好ましくは滅菌の形態にパッケージされて）、および／またはパッケージされたアルコールパッドが含まれる。状況に応じて、医師または患者による本発明の処方物の投与のための説明書が含まれる。
【０１２１】
いくつかの実施形態においては、本発明によって、一回の投与に十分な本発明の組成物（例えば、１つ以上のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物）の用量を含む薬学的処方物または組成物をそれぞれが含む、複数の容器を含むキットが提供される。
【０１２２】
任意の薬学的製品と同様に、パッケージ材料および／または容器は、保存および輸送の際に製品の安定性を保護するように設計される。１つの実施形態においては、本発明の組成物は、生体適合性の界面活性剤（レシチン、タウロコール酸、およびコレステロールが挙げられるがこれらに限定されない）；または他のタンパク質（γ−グロブリンおよび血清アルブミンを含むがこれらに限定されない）と一緒に、容器内で保存される。さらに、本発明の製品には、目的の疾患または障害を適切に予防または処置する方法について医師、技術者、または患者に助言する、使用のための説明書または他の資料が含まれる。
【実施例】
【０１２３】
（６．実施例）
本発明の特定の実施形態は、以下の限定ではない例によって説明される。
【０１２４】
（６．１  実施例１：ＦＧＦ−２０核酸配列における一塩基変異多型の同定）
本実施例では、ＦＧＦ−２０の一塩基変異多型（ＳＮＰ）のいくつかを同定した方法を説明する。ＳＮＰは、いくつかの場合には、ＳＮＰを含むヌクレオチド配列がｃＤＮＡとして生じることを示すように「ｃＳＮＰ」と呼ぶことができる。遺伝子内に生じるＳＮＰは、ＳＮＰの位置にある遺伝子によってコードされるアミノ酸の変化を生じ得る。遺伝子内ＳＮＰはまた、ＳＮＰを含むコドンが遺伝子コードの縮重の結果として同じアミノ酸をコードする場合には、サイレントである場合もある。遺伝子の領域の外側、または遺伝子内のイントロンの中に存在しているＳＮＰは、タンパク質のいずれのアミノ酸配列にも変化を生じることはないが、発現パターンの調節の変更を生じる場合がある。限定ではない例としては、一時的な発現、生理学的応答の調節、細胞型による発現調節、発現の強度、および転写されるメッセージの安定性の変更が挙げられる。
【０１２５】
エキソン連結プロセスによって生産したＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）アセンブリを、以下の基準を使用して選択し、伸張させた：最初の配列または伸張した配列の全てまたは一部に対して９８％の同一性を有している領域を含むゲノムクローンを、ヒトゲノムデータベースを検索するために関連配列を使用してＢＬＡＳＴＮ検索によって同定した。この同一性が、これらのクローンにこれらのＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）アセンブリについてのゲノム遺伝子座が含まれていることを示すので、得られたゲノムクローンを、さらなる分析のために選択した。これらの配列を、推定されるコード領域について、さらに、既知のＤＮＡおよびタンパク質配列に対する類似性について分析した。これらの分析に使用したプログラムには、Ｇｒａｉｌ、Ｇｅｎｓｃａｎ、ＢＬＡＳＴ、ＨＭＭＥＲ、ＦＡＳＴＡ、Ｈｙｂｒｉｄ、および他の関連するプログラムが含まれている。
【０１２６】
選択したＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）アセンブリがこれらの領域にマップされたので、いくつかのさらなるゲノム領域もまた、同定することができた。このようなＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）配列は、相同性またはエキソンの推定によって定義された領域と重複している可能性があった。これらもまた、類似性、またはもともと推定された配列中に含まれているエキソンの推定によって同定されたゲノム領域の近傍にこの断片の位置があったので、含めることができる。このように同定した配列を、手作業でアセンブリさせ、その後、ＣｕｒａＧｅｎ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのヒトＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）データベースから得た１つ以上のさらなる配列を使用して伸張させることができた。含めるのに適しているＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）断片は、ＣｕｒａＴｏｏｌｓ（登録商標）プログラムＳｅｑＥｘｔｅｎｄによって、または、分析したゲノムクローンの適切な領域へのＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ断片のマッピングを同定することによって、同定した。
【０１２７】
上記の手順によって定義した領域を手作業で組み込み、その後、起こり得る明らかな矛盾点（例えば、もともとの断片の中の誤って読まれた塩基によるか、または推定されるエキソン結合部、ＥＳＴ位置、および配列類似性の領域の間での不一致による）を、本明細書中に開示される最終的な配列を導くために補正した。必要であれば、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）アセンブリおよびゲノムクローンを同定し、そして分析するためのプロセスを、全長の配列を導くために繰り返し行った（Ａｌｄｅｒｂｏｒｎら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０（８）１２４９−１２６５（２０００））。
【０１２８】
変異体を表２に別個に報告する。しかし、これらの変異体の全てまたは選択したサブセットの任意の組み合わせもまた、本発明に含まれる。
【０１２９】
（表２．ＣＧ５３１３５−０１のＳＮＰ（配列番号１および２））
【０１３０】
【表２】
2007536381.tif 000004
（６．２  実施例２：ＣＧ５３１３５の発現）
いくつかの異なる発現構築物を、ＣＧ５３１３５タンパク質を発現させるために作製した（表３）。ＣＧ５３１３５−０５構築物（全長の遺伝子をコードするコドン最適化したファージを含まない構築物（表３の構築物＃３））を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬＲ（ＤＥ３）の中で発現させ、そして精製したタンパク質産物を、毒性試験と臨床試験に使用した。
【０１３１】
（表３：ＣＧ５３１３５を発現させるために作製した構築物）
【０１３２】
【表３−１】
2007536381.tif 000005
【０１３３】
【表３−２】
2007536381.tif 000006
１つの構築物においては、ＣＧ５３１３５−０１（全長のＣＧ５３１３５遺伝子）を、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１Ｖ５Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位にＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片としてクローニングした。得られた構築物ｐＦＧＦ−２０（構築物１ａ）は、ＣＧ５３１３５−０１のカルボキシ末端にインフレームで融合させられた９アミノ酸のＶ５タグと、６アミノ酸のヒスチジンタグ（Ｈｉｓ）を有している。これらのタグは、ＣＧ５３１３５−０１タンパク質の精製と検出を助ける。ｐＦＧＦ−２０のマウスＮＩＨ  ３Ｔ３細胞へのトランスフェクションの後、ＣＧ５３１３５−０１タンパク質を、抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して馴化培地の中で検出した。
【０１３４】
全長のＣＧ５３１３５−０１遺伝子をまた、哺乳動物発現ベクターｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ（ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位にＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片としてクローニングした。得られた構築物ｐＩｇＫ−ＦＧＦ−２０（構築物１ｂ）は、ＣＧ５３１３５−０１の分泌を助けることができる異種免疫グロブリンκ（ＩｇＫ）シグナル配列を有している。ｐＩｇＫ−ＦＧＦ−２０をヒト２９３  ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｅｓｂａｄ，ＣＡ；カタログ番号Ｒ６２０−０７）にトランスフェクションした後、ＣＧ５３１３５−０１を、抗Ｖ５抗体を使用して馴化培地の中で検出した。
【０１３５】
ＣＧ５３１３５タンパク質の収量を増加させるために、全長のＣＧ５３１３５−０１遺伝子をコードするＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＥＴＭＹ（ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングした。得られた構築物ｐＥＴＭＹ−ＦＧＦ−２０（構築物２）は、ＣＧ５３１３５のアミノ末端にインフレームで融合させられた６アミノ酸のヒスチジンタグと、Ｔ７タグを有している。ＢＬ２１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｎｏｖａｇｅｎ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）へのｐＥＴＭＹ−ＦＧＦ−２０の形質転換、その後のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの誘導の後、ＣＧ５３１３５−０１タンパク質を、細胞の可溶性画分の中で検出した。
【０１３６】
タグを含まないＣＧ５３１３５を発現させるために、ＣＧ５３１３５−０５（コドン最適化した、全長のＦＧＦ−２０遺伝子）およびＣＧ５３１３５−０２（Ｎ末端のアミノ酸２〜５４が取り除かれている、コドン最適化したＦＧＦ−２０の欠失構築物）を合成した。全長の構築物（ＣＧ５３１３５−０５）については、開始コドンを含むＮｄｅＩ制限部位（ＣＡＴＡＴＧ）を、コード配列の５’末端においた。３’末端には、コード配列の後ろに２つの連続する終止コドン（ＴＡＡ）とＸｈｏＩ制限部位（ＣＴＣＧＡＧ）を続けた。合成した遺伝子を、ｐＣＲＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）にクローニングして、ｐＣＲＳｃｒｉｐｔ−ＣＧ５３１３５を作製した。コドン最適化したＣＧ５３１３５遺伝子を含むＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ断片をｐＣＲｓｃｒｉｐｔ−ＣＧ５３１３５から単離し、ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩで消化したｐＥＴ２４ａにサブクローニングして、ｐＥＴ２４ａ−ＣＧ５３１３５（構築物３）を作製した。ＣＧ５３１３５全長のコドン最適化したバージョンを、ＣＧ５３１３５−０５と呼ぶ。
【０１３７】
ＣＧ５３１３５についてのコドン最適化した欠失構築物を作製するために、オリゴヌクレオチドプライマーを、ｐＣＲＳｃｒｉｐｔ−ＣＧ５３１３５から欠失させられたＣＧ５３１３５遺伝子を増幅するように設計した。正方向プライマーには、ＮｄｅＩ部位（ＣＡＴＡＴＧ）を含め、その後ろに、アミノ酸５５から始まるコード配列を含めた。逆方向プライマーには、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含めた。およそ４８０塩基対の１つのＰＣＲ産物が得られ、これをｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングして、ｐＣＲ２．１−ＣＧ５３１３５ｄｅｌを作製した。ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＣＲ２．１−５３１３５ｄｅｌから単離し、ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴ２４ａにサブクローニングして、ｐＥＴ２４ａ−ＣＧ５３１３５−０２（構築物４）を作製した。
【０１３８】
プラスミドｐＥＴ２４ａ−ＣＧ５３１３５−０５（構築物３）とｐＥＴ２４ａ−ＣＧ５３１３５−０２（構築物４）は、タグを有していない。それぞれのベクターを、イソプロピルチオガラクトピラノシドで誘導した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬＲ（ＤＥ３）に形質転換した。全長のＣＧ５３１３５タンパク質およびＮ末端短縮型のＣＧ５３１３５タンパク質の両方を、細胞の可溶性画分の中で検出した。
【０１３９】
（６．３  実施例３：ＣＧ５３１３５−０５のタンパク質分解切断産物）
ｐＥＴ２４ａ−ＣＧ５３１３５−０５（構築物３、実施例２を参照のこと）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＥ３）で発現させ、そしてタンパク質を、セクション６．１８．１に記載するプロセス１、およびセクション６．１８．２に記載するプロセス２にしたがってそれぞれ精製した場合には、それぞれのプロセスによる最終的な精製されたタンパク質産物を、液体クロマトグラフィー、質量スペクトル分析、およびＮ末端配列決定のような技術を使用して分析した。このような分析は、最終的な精製されたタンパク質産物に、全長のＦＧＦ−２０に加えて、いくつかの短縮型のＦＧＦ−２０（例えば、ＣＧ５３１３５−１３（配列番号２４）、ＣＧ５３１３５−１５（配列番号２８）、ＣＧ５３１３５−１６（配列番号３０）、およびＣＧ５３１３５−１７（配列番号３２））が含まれていること、そして、ＦＧＦ−２０のアミノ酸３〜２１１からなるタンパク質（ＣＧ５３１３５−１３、配列番号２４）が、最終的な精製されたタンパク質産物の大部分を占めることを示した。
【０１４０】
最終的な精製された産物中の改変体／断片の全ては、増殖アッセイにおいて高い活性を有している。したがって、これらの改変体／断片は、ＦＧＦ−２０の有用性と同じ有用性を有していると予想した。便宜目的のために、用語「ＣＧ５３１３５−０５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精製産物」は、本明細書中では、ＣＧ５３１３５−０５構築物を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から精製されたタンパク質産物を意味するように使用する。例えば、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精製産物には、全長のＣＧ５３１３５−０５タンパク質（配列番号２）、ＣＧ５３１３５−１３（配列番号２４）、ＣＧ５３１３５−１５（配列番号２８）、ＣＧ５３１３５−１６（配列番号３０）、およびＣＧ５３１３５−１７（配列番号３２）の混合物が含まれ得、その内容物の大部分はＣＧ５３１３５−１３（配列番号２４）である。
【０１４１】
（ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイ：ピークの同定）
精製した薬剤（それぞれ、以下のセクション６．１８に記載するプロセス１およびプロセス２の両方によって）を、ＵＶおよびエレクトロスプレー質量スペクトル検出の両方を用いる逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によってさらに分析した。プロセス１またはプロセス２のいずれかによって精製したタンパク質を、水、アセトニトリル、およびトリフルオロ酢酸を含む移動相の中の標準的なＨＰＬＣシステムを使用して、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ４カラム（Ｖｙｄａｃ，５μｍ、１５０ｍｍ×４．６ｍｍ）にロードした。この方法の溶出勾配は、それぞれ、２６．６分、２７．３分、２８．５分、および３０．０分の４つの異なるクロマトグラフィーのピーク溶出を分解するように変更した（図１）。これらのピークを、エレクトロスプレー質量スペクトルによって特性決定した。クロマトグラムから観察できるように、４つの等電位のイソ型が、プロセス１および２によって精製された最終産物に存在していた。しかし、これらのピーク（１、３、および４）の割合は、プロセス２によって精製された最終産物においてかなり少なく、ピーク２が主な形態であった。
【０１４２】
ＲＰ−ＨＰＬＣ分離によるそれぞれのピークの同定を表４に示した。
【０１４３】
（表４：正確な分子量の決定に基づくＣＧ５３１３５−０５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精製産物のＲＰ−ＨＰＬＣ分離によるピークの同定。）
【０１４４】
【表４】
2007536381.tif 000007
（エドマン配列決定と全アミノ酸の分析）
プロセス１の参照標準物であるＤＥＶ１０およびプロセス２の中間参照標準物の実験用Ｎ末端アミノ酸配列を、定性的に決定した。参照標準物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、ポリビニリデンフルオライド膜に電気泳動によって移動させた。それぞれの参照標準物に対応するクマシー染色された約２３ｋＤａの主要なバンドを膜から切り出し、自動エドマン配列決定装置（Ｐｒｏｃｉｓｅ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって分析した。２つの主要な配列の比較を以下の表５に示す。それぞれの参照標準物についての主な配列は同じであり、これは、ＣＧ５３１３５−０５の理論上のＮ末端配列の残基３〜２０に対応していた。
【０１４５】
（表５：プロセス１および２のそれぞれのＣＧ５３１３５−０５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精製産物の最初の２０アミノ酸についてのエドマン配列決定データ）
【０１４６】
【表５】
2007536381.tif 000008
ＤＥＶ１０参照標準物およびＰＸ３５３６Ｇ００１−Ｈ参照標準物の実験アミノ酸組成を同時に決定した。それぞれの参照標準物の４連の試料を、内部標準物としての２ｎｍｏｌのノルロイシンを含む１００μＬの６ＮのＨＣｌ、０．２％のフェノール中で、１１５℃で１６時間加水分解した。試料をＳｐｅｅｄ  Ｖａｃ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒの中で乾燥させ、内部標準物としての２ｎｍｏｌのホモセリンを含む１００μＬの試料緩衝液中に溶解させた。それぞれの試料中のアミノ酸をＢｅｃｋｍａｎ  Ｍｏｄｅｌ  ７３００アミノ酸分析装置で分離した。両方の参照標準物のアミノ酸組成は、以下の表６に示したように、有意な差は示さなかった。ｃｙｓとｔｒｐがタンパク質の酸加水分解の間に破壊されたことに留意されたい。ａｓｎとｇｌｎは、それぞれ、酸加水分解の間にａｓｐとｇｌｕに変換される。したがって、これらのそれぞれの合計はａｓｘおよびｇｌｘと報告する。ｍｅｔとｈｉｓはいずれも、この手順では成分に分解されなかった。
【０１４７】
（表６：プロセス１およびプロセス２のそれぞれに由来するＣＧ５３１３５−０５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精製産物についての定量的アミノ酸分析）
【０１４８】
【表６】
2007536381.tif 000009
（ＲＰ−ＨＰＬＣによるトリプシンマッピング）
プロセス１および２によって精製した薬剤を還元し、そしてヨード酢酸でアルキル化（ａｌｋｌａｔｅ）し、そして配列決定グレードのトリプシンで消化した。トリプシンペプチドを、ＵＶおよびエレクトロスプレー質量スペクトル検出の両方を用いる逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって分離した。プロセス１またはプロセス２のいずれかによるトリプシン消化物を、水、アセトニトリル、およびトリフルオロ酢酸を含む移動相の中の標準的なＨＰＬＣシステムを使用して、ＯＤＳ−１非孔性シリカカラム（Ｍｉｃｒａ，１．５μｍ、５３ｍｍ×４．６ｍｍ）にロードした。溶出ペプチドを、２１４ｎｍでＵＶによって（図２）、そして陽イオンエレクトロスプレー質量スペクトル分析によって検出した。プロセス１およびプロセス２についての２つのクロマトグラムの間の主要な差は、プロセス１の図において明らであるピークのピーク面積の減少である（８．２分のピーク；図２）。このピークは、Ｔ１ペプチド（残基１〜４０）に対応する。完全なＣＧ５３１３５に由来する場合には、このペプチドの供給源は、プロセス１の材料の中により多く存在する（ピーク３、図１）との理由から、この観察は予想されていた。
【０１４９】
（生体アッセイ）
ＬＣおよびＭＳによって同定した４つのピークから回収したＣＧ５３１３５−０５関連種の生物学的活性を、種々の用量の単離したＣＧ５３１３５−０５関連種での血清枯渇培養したＮＩＨ  ３Ｔ３マウスの胚線維芽細胞の処理、ならびにＤＮＡ合成の間のブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みの測定によって測定した。このアッセイのために、細胞を、１０％のウシ胎児血清を補充したダルベッコ改変イーグル（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ）培地中で培養した。細胞を、９６ウェルプレートの中でコンフルエンスになるまで、３７℃で、１０％のＣＯ２／空気中で増殖させ、その後、ダルベッコ改変イーグル（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ）培地中で２４〜７２時間枯渇させた。ＣＧ５３１３５−０５関連種を添加し、３７℃で、１０％のＣＯ２／空気中で１８時間インキュベートした。ＢｒｄＵ（１０ｍＭの最終濃度）を添加し、３７℃で、１０％のＣＯ２／空気中で２時間、細胞とともにインキュベートした。ＢｒｄＵの取り込みを、製造業者（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の説明書にしたがって酵素結合免疫吸着アッセイによって測定した。
【０１５０】
ピーク４は、このアッセイに含めなかった。なぜなら、十分な材料が回収できなかったからである（ピーク４は、ＣＧ５３１３５−０５についての全ピーク面積の３％未満である）。ＣＧ５３１３５−０５および３つの残りの画分の全てから回収した物質（すなわち、ピーク１、２、および３）は、用量依存性の様式で、ＮＩＨ  ３Ｔ３マウス線維芽細胞の中でＤＮＡの合成を誘導した（表７）。ＰＩ２００は、バックグラウンドの２倍のＢｒｄＵの取り込みを生じるタンパク質濃度と定義した。ＣＧ５３１３５−０５および３つの測定可能なピークの全てから回収したＣＧ５３１３５−０５関連種は、０．７〜１１ｎｇ／ｍｌのＰＩ２００と同様の生物学的活性を示した（表７）。
【０１５１】
（表７：ＣＧ５３１３５−０５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精製産物（ＤＥＶ１０）の生物学的活性；ＤＮＡ合成の誘導）
【０１５２】
【表７】
2007536381.tif 000010
（６．４  実施例４：ＣＧ５３１３５を用いた細胞増殖応答（Ｌ−１１７．０１試験とＬ−１１７．０２試験））
ＣＧ５３１３５（例えば、全長のタグ化改変体（ＣＧ５３１３５−０１）、欠失改変体（ＣＧ５３１３５−０２）、および全長のコドン最適化したタグを含まない改変体（ＣＧ５３１３５−０５））に対するそれぞれの細胞型の増殖応答を評価するための実験を行った。
【０１５３】
（材料および方法）
異種タンパク質の発現：ＣＧ５３１３５−０１（バッチ４Ａおよび６）をこれらの実験で使用した。タンパク質を、ｐＥＴＭＹ−ｈＦＧＦ２０Ｘ／ＢＬ２１発現ベクターの中の全長のＣＧ５３１３５−０１で形質転換した大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ））ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して発現させた。細胞を回収し、破壊し、その後、可溶性タンパク質画分を、濾過によって明澄化させ、金属キレート化カラムに通過させた。最終的なタンパク質画分を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）＋１ＭのＬ−アルギニンに対して透析した。タンパク質試料を−７０℃で保存した。
【０１５４】
ＣＧ５３１３５−０２（バッチ１および１３）もまたこの実験に使用した。タンパク質を、ｐＥＴ２４ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入された欠失改変体ＣＧ５３１３５−０２で形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬＲ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）で発現させた。研究用細胞バンク（ＲＣＢ）を作製し、ＣＧ５３１３５−０２を含む細胞ペーストを、ＲＣＢを起源とする細胞の発酵によって生産した。細胞膜を高圧ホモジナイゼーションによって破壊させ、溶解物を遠心分離によって明澄化させた。ＣＧ５３１３５−０２をイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。最終的なタンパク質画分を、処方緩衝液（１００ｍＭのクエン酸、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、および１ＭのＬ−アルギニン）に対して透析した。
【０１５５】
ＣＧ５３１３５−０５、ＤＥＶ１０（これもまた、これらの実験に使用した）を、以下のセクション６．１８．１に記載するプロセス１にしたがって、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）によって調製した。
【０１５６】
ＢｒｄＵの取り込み：増殖活性を、血清枯渇培養した細胞の所定の薬剤での処理と、ＤＮＡ合成の間のＢｒｄＵの取り込みの測定によって測定した。細胞を、製造業者に推奨されるように１０％のウシ胎児血清または１０％のウシ血清を補充した、それぞれの製造業者が推奨する基本増殖培地の中で培養した。細胞を、９６ウェルプレートの中でコンフルエンスになるまで、３７℃で、１０％のＣＯ２／空気中で増殖させた（脱分化させた軟骨細胞およびＮＨＯｓｔについては、５％のＣＯ２でサブコンフルエントになるまで）。その後、細胞を、それぞれの基本増殖培地中で２４〜７２時間枯渇させた。ＣＧ５３１３５タンパク質を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から精製したか、または、ｐＣＥＰ４／ＳｅｃもしくはｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−ＦＧＦ  ２０×富化馴化培地を１８時間かけて添加した（１０μＬ／１００μＬの培養物）。その後、ＢｒｄＵ（１０μＭの最終濃度）を添加し、細胞とともに５時間インキュベートした。ＢｒｄＵの取り込みを、製造業者の説明書（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）にしたがってアッセイした。
【０１５７】
増殖アッセイ：増殖活性を、記載した時間の間、所定の薬剤で培養した細胞を処理した後で細胞数を測定することによって得た。一般的には、６ウェル皿で約２０％の集密度にまで増殖させた細胞を、ＣＧ５３１３５または対照を補充した基本培地で処理し、数日間インキュベートし、トリプシン化し、そしてＣｏｕｌｔｅｒ  Ｚ１  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒを使用して数えた。
【０１５８】
（結果）
間葉細胞中での増殖：組み換え体ＣＧ５３１３５が線維芽細胞中でのＤＮＡ合成を刺激できるかどうかを決定するために、ＢｒｄＵの取り込みアッセイを、ＣＧ５３１３５−０１で処理したＮＩＨ  ３Ｔ３マウス胚性肺線維芽細胞を使用して行った。組み換え体ＣＧ５３１３５−０１は、用量依存性の様式でＮＩＨ  ３Ｔ３マウス線維芽細胞中でのＤＮＡ合成を誘導した（図３）。ＤＮＡ合成は、一般的には、約１０ｎｇ／ｍＬの半値最大濃度で誘導された。対照的に、細胞から精製したビヒクル対照での処理によっては、ＤＮＡ合成は全く誘導されなかった。
【０１５９】
ＣＧ５３１３５−０１はまた、間葉に起源する他の細胞（ＣＣＤ−１０７０Ｓｋ正常ヒト陰茎包皮線維芽細胞、ＭＧ−６３骨肉種細胞株、およびウサギ滑膜細胞株ＨＩＧ−８２を含む）においてもＤＮＡ合成を誘導した。対照的に、ＣＧ５３１３５−０１は、初代ヒト骨芽細胞（ＮＨＯｓｔ）、ヒト肺動脈平滑筋細胞、ヒト冠状動脈平滑筋細胞、ヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＳＭＣ）、またはマウスの骨格筋細胞においてはＤＮＡ合成の有意な増大を誘導することは全くなかった。
【０１６０】
組み換え体ＣＧ５３１３５−０１が細胞増殖を持続させるかどうかを決定するために、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を、１μｇのＣＧ５３１３５−０１とともに、または対照とともに、４８時間培養し、その後、数えた（図４）。ＣＧ５３１３５は、このアッセイの対照と比較して、細胞数の約２倍の増加を誘導した。これらの結果は、ＣＧ５３１３５が増殖因子として作用することを示している。
【０１６１】
上皮細胞の増殖：組み換え体ＣＧ５３１３５がＤＮＡ合成を刺激し、上皮細胞中において細胞増殖を持続させることができるかどうかを決定するために、ＢｒｄＵの取り込みアッセイを、ＣＧ５３１３５で処理した代表的な上皮細胞株中で行った。タンパク質処理の後の細胞数もまた、いくつかの細胞株について決定した。
【０１６２】
ＣＧ５３１３５は、７８６−Ｏヒト腎臓癌細胞株中でのＤＮＡ合成を用量依存性の様式で誘導することが明らかになった（図５）。加えて、ＣＧ５３１３５−０１は、ＣＣＤ  １１０６  ＫＥＲＴｒヒトケラチン生成細胞、Ｂａｌｂ  ＭＫマウスケラチノサイト、および乳房上皮細胞株Ｂ５５８９を含む上皮起源の他の細胞中でも、ＤＮＡ合成を誘導した。
【０１６３】
造血細胞の増殖：ＣＧ５３１３５−０１でのＴＦ−１（赤芽球性白血病細胞）の処理によっては、ＤＮＡ合成に対して刺激作用がないことを観察した。これらのデータは、ＣＧ５３１３５−０１が赤血球起源の細胞中では増殖を誘導しないことを示唆している。加えて、Ｊｕｒｋａｔ（急性Ｔリンパ芽球性白血病細胞株）は、ＣＧ５３１３５−０１で処理した場合には、全く応答を示さなかったが、一方、ＢｒｄＵの取り込みの強い刺激が、血清での処理によって観察された。
【０１６４】
内皮細胞に対するＣＧ５３１３５の作用：タンパク質治療薬は、内皮細胞が毛細血管に分化するプロセスである血管形成を阻害または促進することができる。ＣＧ５３１３５は線維芽細胞増殖因子のファミリーに属するので、そのいくつかのメンバーは、血管形成性の特性を有しており、内皮細胞株に対するＣＧ５３１３５の抗血管形成作用またはプロ血管形成作用は高かった。以下の細胞株を、それらが癌における血管形成を理解することに使用される細胞型であるとの理由から選択した：ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）、ＢＡＥＣ（ウシ大動脈内皮細胞）、ＨＭＶＥＣ−ｄ（ヒト内皮、皮膚毛細血管）。これらの内皮細胞型は形態学的分化を受け、大きな血管（ＨＵＶＥＣ、ＢＡＥＣ）、および、毛細血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−ｄ）の典型的なものである。
【０１６５】
ＣＧ５３１３５−０１での処理は、細胞の生存性を変化させることはなく、ヒトの臍帯静脈内皮細胞、ヒト皮膚微小血管内皮細胞、またはウシ大動脈内皮細胞中へのＢｒｄＵの取り込みに対する刺激作用を有さなかった。さらに、ＣＧ５３１３５−０１での処置によっては、ＨＵＶＥＣＳにおいては、新しい血管の形成における重要な事象である管の形成は阻害されることはなかった。この結果は、ＣＧ５３１３５が抗血管形成性の特性は有していないことを示唆している。最後に、ＣＧ５３１３５−０１は、ＨＵＶＥＣにおいてはＶＥＧＦによって誘導される細胞の移動に対しては効果を有しておらず、このことは、これが転移においては役割を担っていないことを示唆している。
【０１６６】
上記の実験を、ＣＧ５３１３５−０２タンパク質産物およびＣＧ５３１３５−０５タンパク質産物を使用して行い、結果を、以下の結論のセクションにまとめた。
【０１６７】
（結論）
組み換え体ＣＧ５３１３５−０１（ＣＧ５３１３５−０５と同じタンパク質をコードする）は、インビトロで、間葉細胞および上皮細胞（すなわち、ＮＩＨ  ３Ｔ３マウス線維芽細胞、ＣＣＤ−１０７０正常ヒト皮膚線維芽細胞、ＣＣＤ−１１０６ヒトケラチノサイト、７８６−Ｏヒト腎臓癌細胞、ＭＧ−６３ヒト骨肉種細胞、およびヒト乳房上皮細胞）中では増殖応答を誘導するが、ヒトの平滑筋細胞、赤血球細胞、または内皮細胞においては誘導しない。ＣＧ５３１３５−０１およびＣＧ５３１３５−０５と同様に、ＣＧ５３１３５−０２もまた、間葉細胞および上皮細胞の増殖を誘導する。加えて、ＣＧ５３１３５−０２は内皮細胞の増殖を誘導する。
【０１６８】
（６．５  実施例５：急性の放射線による口腔粘膜炎のハムスターモデルにおけるＣＧ５３１３５の活性（Ｎ−１５２試験））
ＣＧ５３１３５タンパク質を、放射線による口腔粘膜炎のハムスターモデルにおいて、活性について評価し、その活性を、別のＦＧＦ−ファミリーのメンバーであるＫＧＦ−２と比較した。ＫＧＦ−２はＦＧＦ−１０とも呼ばれ、これは、創傷治癒および炎症性腸疾患のモデルにおいて活性である（Ｍｉｃｅｌｉら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９０：４６４−４７１（１９９９））。この実施例では、タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって測定した。
【０１６９】
ハムスターの急性の放射線照射モデル（Ｓｏｎｉｓら，Ｏｒａｌ  Ｓｕｒｇ  Ｏｒａｌ  Ｍｅｄ  Ｐａｔｈｏｌ  ６９：４３７−４４３（１９９０））は、成長因子およびサイトカインを含む、抗粘膜炎化合物の事前の評価を提供するための、正確であり、効率的であり、そしてコスト効果の高い技術であることが証明されている（Ｓｏｎｉｓら，Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ  ３６：３７３−３８１（２０００）；Ｓｏｎｉｓら，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ９：６０５−６１２（１９９７）；Ｓｏｎｉｓら，Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ  ３３：４７−５４（１９９７））。急性のモデルは、全身的な毒性がほとんどなく、これによって、動物の死亡がごくわずかしか生じず、最初の活性試験に小さいグループを使用することができる。これはまた、粘膜炎の発病における特異的な機構的要因を研究するためにも使用されている。急性放射線照射モデルにおいて活性を示す分子はさらに、分割放射線照射、化学療法、または併用療法のより複雑なモデルにおいて評価することができる。このモデルにおいては、０日目のおよそ４０Ｇｙの急性放射線照射を、重症の粘膜炎を誘導するために投与した。この照射によって、１６日〜１８日あたりで一般的にはピークを生じる、予測された潰瘍性口腔粘膜炎が生じた。
【０１７０】
（材料および方法）
この実験に使用したＣＧ５３１３５−０５タンパク質は、Ｂａｔｃｈ  Ｄｅｖ  ０８−０２として精製した。組み換え体ヒトＤＮＡタンパク質であるＣＧ５３１３５−０５を、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＢＬＲ（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して発現させた。これらの細胞を、ｐＥＴ２４ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して、全長のコドン最適化したＣＧ５３１３５−０５で形質転換した。これらの細胞のＧＭＰ製造細胞バンク（ＭＣＢ）を生産した。ＭＣＢを起源とする細胞の発酵によって生産したＣＧ５３１３５−０５タンパク質を含む細胞のペーストを、溶解緩衝液中での高圧ホモジナイゼーションによって溶解させ、遠心分離によって明澄化させた。ＣＧ５３１３５−０５を、２サイクルのイオン交換クロマトグラフィーと硫酸アンモニウム沈殿とによって、明澄化させた細胞溶解物から精製した。最終的な沈殿物を精製水で洗浄し、以下のような処方緩衝液中に懸濁させた：３０ｍＭのクエン酸（ｐＨ６．０）、２ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのソルビトール、５０ｍＭのＫＣｌ、２０％のグリセリン。
【０１７１】
実験の開始時に６〜７週齢であり、全てのグループにおいて類似した体重（平均体重７７．４ｇ）を有している雄のゴールデンハムスター（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｓｙｒｉａｎ  ｈａｍｓｔｅｒ）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓまたはＨａｒｌａｎ）をこの実験に使用した。６４匹のハムスターを、放射線照射の前に、それぞれ８匹の動物ずつの８個のグループにランダムに分けた。それぞれのグループに、表８に示した種々の処置を割り当てた。
【０１７２】
（表８．処置グループ）
【０１７３】
【表８】
2007536381.tif 000011
動物に、０日目に左頬の粘膜に単一線量の放射線（４０Ｇｙ／１回の照射）を急性放射線照射した。動物を、急性放射線照射の後に、１日に１回、ビヒクルまたはＣＧ５３１３５−０５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精製産物で腹腔内で（ＩＰ）、あるいは局所で処置した。グループ１から５の動物には、１日に１回、試験物質をＩＰ注射によって投与した。グループ６から８については、試験物質を、１日あたり３回、頬袋に局所塗布した。以下の投与スケジュールを使用した：３日目から１５日目（グループ２、３、および７）、および−５日目（すなわち、放射線照射の５日前）から−２日目（すなわち、放射線照射の２日前）、その後、３日目から１５日目（グループ１，４、５、６、および８）。ＣＧ５３１３５−０５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精製産物の用量は、３００μｇ／日（グループ２、４、７、および８）および６００μｇ／日（グループ３）とした。ＫＧＦ−２の用量は３００μｇ／日（グループ５）とした。粘膜炎を、６日目に開始して一日おきに評価し、２８日目に実験が終了するまで継続した（すなわち、６日目、８日目、１０日目、１２日目、１４日目、１６日目、１８日目、２０日目、２２日目、２４日目、２６日目、および２８日目）。臨床的に関連する口腔粘膜炎（例えば、粘膜炎スコア≧３）は、放射線照射後約１４日で発症した。
【０１７４】
粘膜炎の重篤度または処置によって生じる可能性がある毒性についての指標としての処置グループの間での動物の体重について起こりうる差を評価するために、個々のハムスターについて、実験期間の間中（すなわち、−５日目から２８日目）、毎日体重を測定し、その生存性を記録した。粘膜炎を、０（正常）から５（重症の潰瘍）までの範囲の有効な写真によるスケールに対する比較によって、視覚的にスコアした。臨床的なスケールを表９に記載する。
【０１７５】
（表９．粘膜炎スコアの定義）
【０１７６】
【表９】
2007536381.tif 000012
１〜２のスコアは、疾患の軽症段階を呈すると考えられるが、３〜５のスコアは、中度から重症の粘膜炎を示すと考えられる。臨床的スコアリングの後、標準的な技術を使用して個々の動物の粘膜の写真を撮影した。実験の終了時に、全てのフィルムを現像し、そして写真を、盲検スコアリングのためにランダムに番号をつけた。その後、２人の無関係な訓練された観察者によって、上記のスケールを使用して盲検様式で写真を等級付けした。それぞれの写真について、実際の盲検スコアは、２人の盲検による独立した評価者によって割り当てられたスコアの平均に基づいた。盲検による写真の評価によるスコアだけを統計学的に分析し、結果に報告する。
【０１７７】
ビヒクル対照グループと比較した粘膜炎に対する個々の処置の効果を、表１０に列挙したパラメーターにしたがって評価した。
【０１７８】
（表１０．活性の評価のためのパラメーター）
【０１７９】
【表１０】
2007536381.tif 000013
（結果）
２つのビヒクル対照グループとそれらのそれぞれの試験グループの間では、経時的な生存性または体重の変化に統計学的に有意な差はなかった。
【０１８０】
放射線照射の前および後（−５日目から−２日目、その後、３日目から１５日目）にＩＰで投与した３００μｇ／動物／日のＣＧ５３１３５−０５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精製産物またはＫＧＦ−２のいずれかでの予防的処置によっては、中度から重症の粘膜炎の発生率を下げることにおいて有意な活性を誘発することができなかった（図６）。３日目から１５日目までにＩＰで投与した３００μｇ／動物／日のＣＧ５３１３５−０５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精製産物での処置によってもまた、中度から重症の粘膜炎の発生率を下げることにおいて有意な活性を誘発することはできなかった（図６）。
【０１８１】
３日目から１５日目までにＩＰで投与した６００μｇ／動物／日のＣＧ５３１３５−０５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精製産物での処置によっては、ランク和分析によって、わずか１日だけ、有意な活性が示された（ｐ＜０．００１）（図６）。この分析についての処置の成功の基準は、２日以上の有意な活性と定義されているが、この観察は、この処置が粘膜炎に対して好ましい作用を有していることを示唆している。このグループはまた、カイ二乗検定によれば、対応する対照での処置よりも統計学的に有意に低いスコアを有していた（ｐ＜０．００１）。したがって、用量、スケジュール、および投与経路のこの組み合わせが、このモデルの粘膜炎の処置に有効である。
【０１８２】
３日目から１５日目までに局所投与した３００μｇ／動物／日のＣＧ５３１３５−０５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精製産物での処置は、カイ二乗検定によって、中度から重症の粘膜炎の発生率を下げることにおいて有意な活性を示した（ｐ＜０．００１）。処置はまた、粘膜炎が１２日あるスコア日のうちの５日について有意に軽減されていた場合に、ランク和分析によって成功であると考えられた。したがって、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精製産物の用量、スケジュール、および投与経路のこの組み合わせが、このモデルの粘膜炎の処置に有効である。３００μｇ／動物／日のＣＧ５３１３５−０５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精製産物を、放射線照射の前および後（すなわち、−５日目から−２日目、および、３日目から１５日目）に局所投与した場合には、カイ二乗検定による処置の成功の基準は満たされた（ｐ＝０．０１２）。したがって、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精製産物の用量、スケジュール、および投与経路のこの組み合わせが、中度から重症の粘膜炎の発生率を下げることにおける活性を示した。
【０１８３】
さらなる実験において、３日目から１５日目の３００μｇ／動物／日のＣＧ５３１３５−０１（ＣＧ５３１３５のタグ化した全長の形態）でのＩＰ処置もまた、ゴールデンハムスター（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｓｙｒｉａｎ  ｈａｍｓｔｅｒ）の粘膜炎の急性放射線照射モデルにおける粘膜炎の経過および重篤度に対して有用な作用を有していた（Ｎ−１３５試験）。
【０１８４】
なお別の実験においては、未処置の対照およびビヒクルを注射した対照動物を、３日目から１５日目までに、３００μｇ、６００μｇ、または１２００μｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精製産物（上記の実験で使用したものとはわずかに異なる処方を有しているＣＧ５３１３５のタグ化されていない全長の形態）で腹腔内で処置した動物と比較した（Ｎ−１９７試験）。３００μｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精製産物で処置した雄の動物においては、有用な作用は観察されなかった。しかし、上記に報告した結果と一致して、６００μｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精製産物での処置によっては、未処置の対照と比較して、粘膜炎の重篤度の有意な低下が生じ（カイ二乗検定によってｐ＜０．００１）、そして、ビヒクル対照グループと比較して、１２日あるスコア日のうちの３日について、有意に低い１日の粘膜炎スコアの平均が得られた。加えて、１，２００μｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精製産物の投与によっては、ビヒクル対照グループと比較して粘膜炎の重篤度が有意に低下し（カイ二乗検定によってｐ＜０．００１）、そして５日あるスコア日について１日の粘膜炎スコアの平均の有意な低下が生じた。体重については、対照と比較すると、いずれの処置レジュメについても有意な差は観察されなかった。
【０１８５】
（結論）
ＣＧ５３１３５の活性を、０日目に１回の放射線（４０Ｇｙ）のボーラス照射量を照射したハムスターにおいて誘導された口腔粘膜炎のモデルにおいて評価した。臨床的に関連する口腔粘膜炎（例えば、≧３の粘膜炎スコア）は、放射線照射後約１４日で発症した。一般的には、放射線照射である原因の後のＣＧ５３１３５での処置によって、臨床的に関連する粘膜炎はわずかに減少した。ＣＧ５３１３５での処置（１８日間の３ｍｇ／ｋｇ／日の局所投与、または１８日までの６〜１２ｍｇ／ｋｇ／日の腹腔内投与）によっては、粘膜炎の重篤度は下がった。静脈内（ＩＶ）投与経路を使用した実験は行わなかった。なぜなら、ハムスターでのＩＶ投与は技術的な手腕を問われるものであり、その結果として、データは非常に変わりやすいからである。
【０１８６】
（６．６  実施例６：化学療法による口腔粘膜炎のハムスターモデルにおけるＣＧ５３１３５の活性（Ｎ−２１２試験））
ＣＧ５３１３５を、雄のゴールデンハムスター（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｓｙｒｉａｎ  ｈａｍｓｔｅｒ）の化学療法による口腔粘膜炎の処置について評価した（この実施例では、タンパク質の濃度はＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって測定した）。
【０１８７】
（材料および方法）
この実験に使用したＣＧ５３１３５−０５（バッチ２９−ＮＢ８４９：７６）は、最終的なタンパク質画分を、３０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ，２００ｍＭのソルビトール、５０ｍＭのＫＣｌ、２０％のグリセロール（ｐＨ６．１）を含む処方緩衝液に対して透析したことを除いて、セクション６．５に記載したように発現させ、精製した。
【０１８８】
実験の開始時に５〜６週齢であり、全てのグループにおいて類似した体重を有している雄のゴールデンハムスター（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｓｙｒｉａｎ  ｈａｍｓｔｅｒ）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をこの実験に使用した。６０匹の雄のハムスターを、放射線照射の前に、それぞれ１０匹の動物ずつの６個のグループにランダムに分けた。処置グループを、表１１に説明する。
【０１８９】
（表１１．処置グループ）
【０１９０】
【表１１】
2007536381.tif 000014
粘膜炎を、−４日目および−２日目に１回のボーラス（６０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）として投与した５−フルオロウラシルを使用して誘導した。１回の粘膜毒性未満の（ｓｕｂｍｕｃｏｓａｔｏｘｉｃ）線量の放射線照射（４０Ｇｙ／照射）を０日目に全ての動物に局所投与した。動物を、表１１に示したスケジュールにしたがって、粘膜毒性である原因の後に、１日に１回、０．１ｍＬのビヒクルまたは１２ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５のＩＰで処置した。粘膜炎を、６日目に開始して、そして、３０日目に実験が終了するまで１日おきに（すなわち、８日目、１０日目、１２日目、１４日目、１６日目、１８日目、２０日目、２２日目、２４日目、２６日目、２８日目、および３０日目）、セクション６．５（表９）に記載したように視覚的にスコアした。それぞれのハムスターを、実験期間の間中（すなわち、０日目から３０日目）、毎日体重を測定した。粘膜炎の重篤度、または処置によって生じる可能性がある毒性についての指標として、体重と生存性をモニタリングした。
【０１９１】
対照グループと比較した粘膜炎に対するそれぞれの処置の効果を、表１２に列挙したパラメーターにしたがって評価した。処置グループ間での統計学的な差を、スチューデントｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）、マン・ホイットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）Ｕ検定、およびカイ二乗検定を使用して、０．０５の基準値を用いて決定した。
【０１９２】
（表１２．活性の評価のためのパラメーター）
【０１９３】
【表１２】
2007536381.tif 000015
（結果）
ビヒクル対照グループ（グループ１）と、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精製産物で処置したグループ（グループ２〜６）との間では、経時的な体重または生存性において統計学的に有意な差はなかった。
【０１９４】
主に化学療法によって誘導された粘膜炎のこのモデルにおいては、投与スケジュールが、口腔粘膜炎の処置に重要であった。６日目から１４日目、または１日目から９日目までのＣＧ５３１３５−０５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精製産物（１２ｍｇ／ｋｇ／日）の投与は、粘膜炎の経過または重篤度に有意な改善は生じなかった（図７）。１日目から１８日目、または１日目から６日目までのＣＧ５３１３５−０５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精製産物（１２ｍｇ／ｋｇ／日）の投与によっては、重症粘膜炎の期間の有意な改善が生じた（カイ二乗検定）。しかし、これらの処置は、毎日の粘膜炎のスコアには有意な改善は生じなかった（ランク和分析）。１２ｍｇ／ｋｇ／日のＣＧ５３１３５−０５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精製産物（１日目から２日目）での処置は、この試験において粘膜炎の経過と重篤度の両方に対して有意な効果を有していた（図７）。これらの結果は、化学療法と放射線照射のレジメンの併用の直後の、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精製産物での短期間の処置によって、この粘膜炎モデルにおいて疾患の結果に改善が生じたことを示唆している。
【０１９５】
別の実験においては、放射線照射後（１日目から１８日目）に開始した１２ｍｇ／ｋｇ／日のＣＧ５３１３５−０５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精製産物でのハムスターの処置によって、ランク和分析（Ｎ−１９８試験）によって決定すると、粘膜炎スコアが有意に低下した７日間と組み合わせて、潰瘍の有意な減少（ｐ＜０．００１）が生じた。このことは、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精製産物の投与によって、粘膜毒性の原因の後で投与した場合には、放射線による口腔粘膜炎の有意な有益な処置が生じることを示唆している。
【０１９６】
なお別の実験においては、１日目から２日目の１２ｍｇ／ｋｇ／日のＣＧ５３１３５−０５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精製産物（４０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．２ＭのＬ−アルギニン、および３％のグリセロール中に処方した）の投与によって、粘膜炎の重篤度が有意に低下した（Ｎ−２３７試験）。これらの結果によって、上記の知見を確認した。
【０１９７】
（結論）
ＣＧ５３１３５の活性を、−４日目および−２日目に６０ｍｇ／ｋｇの５−フルオロウラシルで処置し、その後０日目に１回の粘膜毒性用量未満の（ｓｕｂ−ｍｕｃｏｓａｔｏｘｉｃ）用量の放射線照射（約３０Ｇｙ）を照射したハムスターにおいて誘導された粘膜炎のモデルにおいて評価した。臨床的に関連する口腔粘膜炎（≧３の粘膜炎スコア）は、約１５日目に発症した。２日間、６日間、または１８日間のＣＧ５３１３５の腹腔内投与によって、粘膜炎の重篤度が有意に下がった。
【０１９８】
（６．７  実施例７：インビボでのハムスターの上皮の増殖に対するＣＧ５３１３５−０５の投与の効果（Ｎ−２２５試験））
本明細書中に記載する実験によって、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物（この実験では、タンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって測定した）の１回の投与後の、消化管上皮および骨髄へのＢｒｄＵのインビボでの取り込みを評価した。
【０１９９】
（材料および方法）
実験の開始時に５〜６週齢であり、８２ｇの平均体重を有している、雄のゴールデンハムスター（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｓｙｒｉａｎ  ｈａｍｓｔｅｒ）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓまたはＨａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）を使用した。２５匹の雄のハムスターを、表１３に概要を示すように、それぞれ５匹の動物ずつの５個のグループにランダムに分けた。
【０２００】
（表１３．処置グループ）
【０２０１】
【表１３】
2007536381.tif 000016
１２ｍｇ／ｋｇのＩＰのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物の単回用量を投与し、ハムスターを、投与後２時間、４時間、８時間、および２４時間で屠殺した。
【０２０２】
ＢｒｄＵの投与と免疫組織化学：全ての動物に、屠殺の２時間前に５０ｍｇ／ｋｇのＢｒｄＵをＩＰで投与して、増殖しつつある組織に試薬を取り込ませた。安楽死させた時点で、以下の組織を回収した：頬袋の粘膜、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、および胸骨。全ての組織試料を、１０％の中性の緩衝化ホルマリン中で２４時間固定し、その後、７０％のエタノールに移した。試料を切り、パラフィンに包埋し、切片とし、そしてマウントした。上皮組織を、ＢｒｄＵの取り込みについて、製造業者の説明書にしたがって、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈの製品であるＢｒｄＵ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙキット、カタログ番号ＨＣＳ２４を使用して免疫組織化学によって染色した。
【０２０３】
（結果）
全ての組織へのＢｒｄＵの取り込みに対するＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物の効果は、本質的には同じであった：ＢｒｄＵで標識された核の数の比較的小さな増加が、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物の投与後２時間で観察された。これには、その後、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物の投与の４時間後に、標識された核の数の減少が続いた。全ての組織が、投与後８時間で、ＢｒｄＵの標識の劇的な増加を示した。２４時間では、直腸を除く全ての組織が、未処置の対照と比較して、標識された核の数の減少を示したが、直腸組織は、対照を上回るわずかな増加を示した。未処置の動物に由来する直腸組織試料の中では標識された細胞は見られなかったので、２４時間の時点での２つの標識された細胞の観察は、観察誤差またはデータの散乱であるとみなさなければならない。なぜなら、この組織では細胞複製のレベルは低はずだからである。
【０２０４】
（結論）
ＣＧ５３１３５のインビボでの機構的活性を、粘膜組織に対する１回のボーラス用量（１２ｍｇ／ｋｇ）のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物の効果を２４時間にわたって評価するために、ブロモデオキシウリジン標識を使用してインビボで評価した。ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物は、頬袋、空腸、および直腸の上皮細胞、ならびに、骨髄の造血細胞の分裂を刺激した。これらの組織へのＢｒｄＵの取り込みの増加のピークは、ＣＧ５３１３５−０５の投与後８時間で見られた。全ての組織が、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物の投与に対して同じタイミングで応答を示した。
【０２０５】
（６．８  実施例８：マウスへのＣＧ５３１３５−０５の投与による腸陰窩細胞の増殖およびアポトーシスの調節（Ｎ−３４２））
この実験では、娘細胞の効果に対する幹細胞の効果を区別し、そして胃腸の幹細胞損傷（例えば、粘膜炎）を伴う症候群におけるＣＧ５３１３５の作用の形式に関する見識を図式化するために、小腸陰窩細胞の代謝回転に対するＣＧ５３１３５の効果を評価した。さらに、幹細胞の放射線感受性に対するＣＧ５３１３５の効果もまた、評価した。この実施例では、タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイによって測定した。
【０２０６】
「陰窩」は、陰窩基部に向かう幹細胞を含む階層構造である。細胞がさらに成熟するのに伴って、これらは、陰窩の先端に向かって陰窩の低部から徐々に移動する。したがって、それらの娘細胞の一時的な増幅に対して幹細胞に影響し得る変化は、それぞれの細胞位置での事象の頻度の変化を見ることによって検出することができる。細胞の位置は図８にマークする。したがって、陰窩の微細構造に対するＣＧ５３１３５の効果を、陰窩細胞質との関連において分析した。
【０２０７】
（実験の設計）
動物を、１２ｍｇ／ｋｇ（ＩＰ）のＣＧ５３１３５大腸菌精製産物の単回投与後の様々なタイミングで屠殺した。屠殺の直前に、マウスを、ブロモデオキシウリジンの１回の注射によって標識して、Ｓ期の細胞を標識し、陰窩細胞の増殖／アポトーシスに対する薬剤の効果を決定した。マウスの体重を測定し、その後、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物（１２ｍｇ／ｋｇ、１回の注射、ｉｐ）を投与した。６匹の動物の複数のグループを、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物の注射後、０時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、２４時間、４８時間で屠殺した。全ての動物に、屠殺の４０分前にブロモデオキシウリジンの単回投与を行った（表１４を参照のこと）。
【０２０８】
６匹のマウスの別の２つのグループを使用して、幹細胞の放射線感受性に対するＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物の作用を評価した（グループ８および９、表１４を参照のこと）。１つのグループは、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物（１２ｍｇ／ｋｇ、単回投与、ｉｐ）で処置し、別のグループには、プラセボ対照を注射した。注射の２４時間後、動物に１ＧｙのＸ線を照射し（幹細胞のアポトーシスを誘導するために特異的に）、その後、日常的に行われるようにインビボでＢｒｄＵ標識した。動物を、４．５時間後（アポトーシスがピークであるタイミング）に屠殺した。
【０２０９】
（表１４．実験の設計）
【０２１０】
【表１４】
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（腸陰窩細胞の増殖およびアポトーシスの調節：手順）
Ｓ期の分裂している細胞の全てが注射されたブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を取り込み、したがって、循環している細胞としてマークされる。放射線照射した動物を、麻酔していない状態で、パースペックスジグ（ｐｅｒｓｐｅｘ  ｊｉｇ）にいれ、０．７Ｇｙ／分の線量率で１ＧｙのＸ線の全身照射に供した。この低レベルの放射線照射によって、小腸の幹細胞集団においてアポトーシスを誘導したが、より成熟した細胞においては誘導しないようにした。
【０２１１】
小腸を取り出し、カルノワ（Ｃａｒｎｏｙ’ｓ）固定剤中に固定し、そして組織学的分析のために処理した（パラフィンに包埋した）。１セットの３ｍｍの切片を、ＢｒｄＵについて免疫標識し、１セットの切片をＨ＆Ｅで染色した。小腸陰窩の長手方向の切片を、ＢｒｕＵまたはアポトーシス／有糸分裂核のいずれかの存在について分析した。１匹の動物あたり５５個の陰窩をスコアした。
【０２１２】
グループ１〜７（結果のグループＡ）を、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物の効果を決定するために４８時間にわたって試験した。グループ８〜９（結果のグループＢ）は、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物が低い線量の放射線での照射後に生じるアポトーシス細胞の数を変化させるかどうか、すなわち、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物が放射線感受性の幹細胞集団に影響を与えるかどうかを決定するために試験した。
【０２１３】
得られた結果は、それぞれのグループの動物の陰窩についての度数分布を示しており、これをさらに、統計学的な差について分析した。組織試料を、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物での処置の３時間後、６時間後、９時間後、１２時間後、２４時間後、および４８時間後に回収した。アポトーシス、有糸分裂指数、および増殖を、この試験の評価項目とした。
【０２１４】
（結果）
（グループＡ）
グループ１〜７（表１４）においては、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物は自発的なアポトーシスに対しては有意な効果を有さなかった。同様の結果が、有糸分裂指数によっても得られた（表１５）。しかし、表１５に示したように、ＢｒｄＵの取り込みの結果は以下のように明らになった：
ａ）３時間では、増殖領域の拡大／増大があった（位置１２〜２２）。
ｂ）９時間までは、大きな増殖効果が多くの位置で記録された。
ｃ）１２時間までは、４〜８個の位置でのみ、取り込みの増加が示された（幹細胞）。
ｄ）２４時間までは、増殖の有意な阻害があった。
ｅ）４８時間までは、取り込みは対照レベルと同程度であった。
【０２１５】
（表１５．アポトーシス、有糸分裂、および増殖の評価後の、陰窩における有意な細胞位置のまとめ）
【０２１６】
【表１５】
2007536381.tif 000018
表１５に示した比較を、処置グループ対未処置のグループの間で行った。示した細胞の位置は、未処置の対照とは有意に異なる位置であった（ｐ＜０．０５）。
【０２１７】
（グループＢ）
グループ８および９（表１４）においては、幹細胞の放射線感受性を評価した。表１４に示したように、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物またはＰＢＳを、１Ｇｙの放射線を照射する１日前に投与した。組織を、放射線照射後４．５時間で回収した。放射線によって誘導されるアポトーシスおよび有糸分裂指数のいずれにも有意な効果はなかった。しかし、１２時間までには、４〜８個の位置での取り込みの増大と、増殖の有意な阻害が、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物で予め処置し、そして放射線照射したマウスにおいて見られ、これは、グループＡの結果と一致した（表１５）。
【０２１８】
（６．９  実施例９：放射線傷害後のマウスの腸陰窩の生存性に対するＣＧ５３１３５−０５の予防的投与の効果（Ｎ−３４３））
この実験の目的は、インビボでの放射線によって誘導された陰窩細胞の死亡に対するＣＧ５３１３５の効力を、ＣｌｏｎｏｑｕａｎｔＴＭアッセイを使用して評価することであった。この実施例では、タンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって測定した。
【０２１９】
マウスの体重を測定し、その後、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物（１２ｍｇ／ｋｇ）またはプラセボを投与した。単回投与を、放射線照射の２４時間前に、腹腔内（ｉｐ）に投与した。６匹の動物からなるそれぞれのグループに、以下の表にしたがって放射線を照射した。それぞれの放射線量について、薬剤で処置したグループとプラセボで処置したグループの応答を比較した。
【０２２０】
小腸を取り出し、カルノワ（Ｃａｒｎｏｙ’ｓ）固定剤中に固定し、そして組織学的分析のために処理した（パラフィンに包埋した）。Ｈ＆Ｅ切片を、以下の従来のプロトコールにしたがって調製した。それぞれの動物について、小腸の周囲１０箇所を分析し、１つの周囲箇所あたりの生存している陰窩の数をスコアし、そしてグループあたりの平均を決定した。１０またはそれ以上の強くＨ＆Ｅ染色された細胞（パネート（Ｐａｎｅｔｈ）細胞を除く）を含み、そして完全な周囲だけ（パイエル板は含まない）を含む陰窩のみをスコアした。
【０２２１】
陰窩の大きさの差が原因である採点誤差を補正するために、陰窩の幅（その最大点を測定した）の平均もまた測定した。補正を以下のように行った：
補正した１つの周囲箇所辺りの陰窩の数＝処置グループにおける周囲箇所あたりの生存している陰窩の数の平均×（未処置の対照の陰窩幅の平均／処置した動物の陰窩幅の平均）。
【０２２２】
（表１６．実験の設計）
【０２２３】
【表１６】
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（結果）
予防的なＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物の投与後の陰窩の生存性は、照射した線量と逆相関を示した。照射した線量が少ないほど、陰窩の生存性は高かった（図９および１０）。ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物の予防的投与によって、陰窩の数は有意に増加した（Ｐ＜０．００１）。表１７は、タンパク質（ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物の予防的投与後の放射線量に対して得られる防護係数を示す。防護係数（表１７）は、処置した細胞と未処置の細胞の間での比を示す。放射線による傷害の前にＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物を動物に投与した場合には、平均すると、１．５５倍多い細胞が、１２Ｇｙの放射線照射を生き残った。
【０２２４】
（表１７）
【０２２５】
【表１７】
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（６．１０  実施例１０：口腔粘膜炎の化学療法／放射線照射モデルに対するＣＧ５３１３５の投与の効果（Ｎ−３４６試験））
（材料および方法）
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、ｐＥＴ２４ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して全長のコドン最適化したＣＧ５３１３５−０５で形質転換し、これらの細胞の製造マスター細胞バンク（ＭＭＣＢ）を作成した。ＭＭＣＢを起源とする細胞の発酵によって生産したＣＧ５３１３５−０５を含む細胞ペーストを、溶解緩衝液中での高圧ホモジナイゼーションによって溶解させ、遠心分離によって明澄化させた。ＣＧ５３１３５−０５を、２サイクルのイオン交換クロマトグラフィーと硫酸アンモニウム沈殿とによって、明澄化させた細胞溶解物から精製した。最終的なタンパク質画分を処方緩衝液（３０ｍＭのクエン酸（ｐＨ６．０）、２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２００ｍＭのソルビトール、５０ｍＭのＫＣｌ、２０％のグリセロール）に対して透析した。ビヒクルには、３０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．１）、２ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのソルビトール、５０ｍＭのＫＣｌ、２０％のグリセロールが含まれていた。この実施例では、タンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって測定した。
【０２２６】
実験の開始時５〜６週齢であり、８４ｇの平均体重を有しているゴールデンハムスター（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｓｙｒｉａｎ  ｈａｍｓｔｅｒ）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓまたはＨａｒｌａｎ）をこの実験に使用した。動物を、耳パンチを使用して個々に番号を付け、そして１つのケージあたり７匹までの動物の小さいグループに分けて入れた。動物を、実験の開始前に環境に順応させた。この期間の間に、動物を、動物が劣悪な条件を拒絶するように毎日観察した。
【０２２７】
６０匹のハムスターを、放射線照射の前に、それぞれ１０匹の動物ずつの６個のグループにランダムに分けた。それぞれのグループに、表１８に列挙した種々の処置を割り当てた。動物には、−４日目および−２日目に６０ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵを投与し、そして０日目に左の頬粘膜に急性放射線照射を行った。動物を、急性放射線照射後、１日目にだけ、６ｍｇ／ｋｇ／日、１２ｍｇ／ｋｇ／日、２４ｍｇ／ｋｇ／日、または４８ｍｇ／ｋｇ／日のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物で１日に１回、あるいは、１日目と２日目に１２ｍｇ／ｋｇ／日のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物で１日に１回、ＩＰで処置した。粘膜炎を、６日目に開始して一日おきに評価し、２８日目に実験が終了するまで継続した（すなわち、８日目、１０日目、１２日目、１４日目、１６日目、１８日目、２０日目、２２日目、２４日目、２６日目、および２８日目）。
【０２２８】
（表１８．処置グループ）
【０２２９】
【表１８】
2007536381.tif 000021
＊粘膜炎を、６日目に開始して１日おきに評価し、２８日目に実験が終了するまで一日おきに評価した（すなわち、８日目、１０日目、１２日目、１４日目、１６日目、１８日目、２０日目、２２日目、２４日目、２６日目、および２８日目）。
【０２３０】
口腔粘膜炎の化学療法モデル／放射線照射モデル：ハムスターの口腔粘膜炎についての５−ＦＵ／急性放射線照射モデルは、粘膜炎についての急性放射線照射モデルを用いて行われる臨床観察に拡大されるように設計された実験用モデルである（Ｏｒａｌ  Ｓｕｒｇ  Ｏｒａｌ  Ｍｅｄ  Ｏｒａｌ  Ｐａｔｈｏｌ．６９（４）：４３７（１９９０））。より早期の急性放射線照射モデルは、成長因子およびサイトカインを含む抗粘膜炎化合物の事前の評価を提供するための、正確であり、効率的であり、そしてコスト効果の高い技術であることが証明されている（例えば、Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ  ３６（４）：３７３−３８１（２０００）、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ９（８）：６０５−６１２（１９９７）；Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ  ３３（１）：４７−５４（１９９７）を参照のこと）。
【０２３１】
粘膜炎は、−４日目および−２日目に腹腔内（ＩＰ）投与（６０ｍｇ／ｋｇ）として投与した５−フルオロウラシルを使用して誘導した。単回線量の放射線照射（３０Ｇｙ／照射）を０日目に全ての動物に投与した。放射線照射は、３．０ｍｍのＡｌ濾過システムで固められた、２１ｃｍの焦点距離を有している１６０キロボルトの電源（１８．７５−ｍａ）を用いて行った。放射線照射は、１．３２Ｇｙ／分の線量率で左頬袋の粘膜を標的とした。放射線照射の前に、動物を、ケタミン（１６０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（８ｍｇ／ｋｇ）のＩＰ注射で麻酔した。左の頬袋を裏返し、固定し、そして鉛遮蔽体を使用して隔離した。これによって、およそ１４日目がピークとなる潰瘍性口腔粘膜炎が生じた。
【０２３２】
粘膜炎の評価：粘膜炎の評価のために、動物を吸入麻酔で麻酔し、左の頬を裏返した。粘膜炎を、有効な写真スケールと比較することによって、正常に対する０から重症の潰瘍に対する５までの範囲で、視覚的にスコアした。スケールを表１９に記載する。
【０２３３】
（表１９．粘膜炎スコア値の説明）
【０２３４】
【表１９】
2007536381.tif 000022
１〜２のスコアは、疾患の軽症段階を呈すると考えられるが、３〜５のスコアは、中度から重症の粘膜炎を示すと考えられる。臨床的スコアリングの後、標準的な技術を使用して個々の動物の粘膜の写真を撮影した。実験の終了時に、全てのフィルムを現像し、そして写真を、盲検スコアリングのためにランダムに番号をつけた。２人の無関係な訓練された観察者によって、上記のスケールを使用して盲検様式で写真を等級付けした。それぞれの写真についての最終的な盲検スコアは、２人の独立した評価者によって割り当てられたスコアの平均とした。盲検による写真の評価によるスコアを統計学的に分析した。
【０２３５】
体重および生存性：それぞれのハムスターの体重を、実験期間中（すなわち、−４日目から２８日目）、毎日測定した。体重と生存性をモニタリングし、処置によって生じる粘膜炎の重篤度および／または毒性が生じる可能性についての指標として、処置グループ間に生じうる差を評価するために記録した。適切である場合には、生存性を、カプラン・マイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）ログランク（ｌｏｇ−ｒａｎｋ）検定を使用して分析した。体重増加の差を、個々の動物についての体重の増加の割合についての曲線下面積（ＡＵＣ）値の一元ＡＮＯＶＡ分析を使用して、０．０５の基準値を用いて評価した。
【０２３６】
活性の評価：対照グループと比較した粘膜炎に対する個々の処置の効果を、３以上のスコアを有している動物の日数のカイ二乗（χ２）分析を使用して、そして評価を行ったそれぞれの日について各グループの盲検粘膜炎スコアを比較するためのマン・ホイットニー順位和試験を使用することによって、評価した。それぞれの場合において、処置グループを、０．０５の基準値を用いて対照グループと比較した。マン・ホイットニー順位和試験については統計学的に有意な２日間の改善を、一般的に、ポジティブな結果について必要な最小の改善とみなした。
【０２３７】
（結果）
粘膜炎：１日の粘膜炎スコアの平均をそれぞれのグループについて計算し、そして図１１に示す。対照グループの粘膜炎のピークは、このグループの平均スコアが３．２に達した１４日目であった。ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物で処置したグループの全てが、１６日目にそれらのスコアのピークを有しており、これは、最大で、１日目に２４ｍｇ／ｋｇまたは４８ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物で処置したグループの３．０から、最小で、１日目に１２ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物で処置したグループの２．６３であった。粘膜炎スコアを評価するために、３以上のスコアを有している日数の分析を、カイ二乗検定を使用して行った。この分析の結果を、表２０と図１１に示す。さらに、図１２には、カイ二乗検定によって計算した場合に、＞３の粘膜炎スコアを有している、動物における重症の粘膜炎の期間を示す。１２ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物で処置した両方のグループが、３以上のスコアを有している日数に関して有意な減少を示した。１日目にしか処置を行わなかったグループ（Ｐ＝０．００３）は、１日目および２日目に処置したグループ（Ｐ＝０．０１８）よりもわずかに有意であった。１日目に６ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物で処置したグループは、いくらかの改善を示したが、有意性には到達しなかった（Ｐ＝０．０９２）。２４ｍｇ／ｋｇおよび４８ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物で処置したグループは、この試験においては対照と本質的には同じであった。
【０２３８】
（表２０．３以上の粘膜炎スコアを有している動物の日数についてのカイ二乗検定）
【０２３９】
【表２０】
2007536381.tif 000023
開放性の潰瘍の提示によって定義されるような臨床的に有意な粘膜炎のレベル（＞３のスコア）を試験するために、動物が高いスコアを示した日数の合計を足し算し、それぞれのグループについてスコアした日数の合計の割合として表した。観察された差異の統計学的有意性を、カイ二乗検定を使用して計算した。有意性の改善は、表において強調する。
【０２４０】
粘膜炎スコアの差の有意性についてのさらなる分析を、各評価日について対照グループと試験グループを比較するために、マン・ホイットニー順位和試験を使用することによって行った。この分析の結果を表２１に示す。これは、１日目にだけ６ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物で処置したグループが、１４日目（Ｐ＝０．０１０）および２６日目（Ｐ＝０．０３１）の対照と比較して有意な改善を示したことを示している。１日目にだけ１２ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物で処置したグループは、１４日目（Ｐ＝０．０１１）、１６日目（Ｐ＝０．０３１）、１８日目（Ｐ＝０．００５）、および２０日目（Ｐ＝０．０３７）の対照と比較して、有意な改善を示した。２４ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物で処置したグループは、対照と比較しても何ら有意な改善は示さなかった。４８ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物で処置したグループは、１２日目に有意な改善を示した（Ｐ＝０．０３５）が、これはまた、２６日目（Ｐ＝０．０３６）および２８日目（Ｐ＝０．００６）には、有意な悪化を示した。１日目および２日目に１２ｍｇ／ｋｇ／日のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物で処置したグループは、対照と比較して、１４日目（Ｐ＝０．０１０）および１８日目（Ｐ＝０．０４５）に有意な改善を示した。この試験での意味のある改善についての基準は、対照と比較した粘膜炎スコアの２日間の統計学的有意な改善であるので、１日目に６ｍｇ／ｋｇまたは１２ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物で処置したグループ、および１日目および２日目に１２ｍｇ／ｋｇ／日のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物で処置したグループは、有意な改善を示した。
【０２４１】
（表２１．マン・ホイットニー順位和試験を使用することによって行った粘膜炎スコア）
【０２４２】
【表２１】
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グループ間の差の有意性を、毎日の粘膜炎スコア（順位和試験）において観察した。このノンパラメトリック統計分析は、視覚的な粘膜炎スコアリングスケールに適している。それぞれの計算のためのｐ値を示す。有意な改善を強調する。
【０２４３】
生存性：５匹の動物が実験の間に死亡した。死亡は、４日目に２４ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物を投与したグループにおいて、７日目に６ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物を投与したグループにおいて、９日目と１１日目に１２ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物を投与したグループにおいて、そして１日目のみ投与したグループおよび１１日目に４８ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物を投与したグループにおいて生じた。対照グループ、または１日目および２日目に１２ｍｇ／ｋｇ／日のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物を投与したグループのいずれについても、死亡は起こらなかった。生存性は、化学療法モデル／放射線照射モデルにおいて通常観察される死亡率と一致した。
【０２４４】
体重の変化：各グループについての毎日の体重の変化の割合の平均を図１３に示す。未処置の対照グループの動物についてのこの実験の経過の間の体重の全体的な増加は、４７．５％であった。これを、１日目に６ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物で処置したグループの４５．９％、１日目に１２ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物で処置したグループの５３．８％、１日目に２４ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物で処置したグループの４１．２％、１日目に４８ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物で処置したグループの４９．７％、そして、１日目および２日目に１２ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物で処置したグループの４６．９％と比較した。それぞれの動物についての曲線下面積（ＡＵＣ）の計算によって、グループの体重の増加の分析を行った。全ての実験グループ間で、体重についてのグループＡＵＣ値の一元ＡＮＯＶＡ分析は、この実験においてはいずれのグループの間にも有意な差はなかったことを示した（Ｐ＝０．６８７）。この実験でのそれぞれのグループのＡＵＣ値の平均の比較を図１４に示す。この結果は、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物で処置したグループの動物が、未処置の対照グループの体重の増加と同じ様式で体重が増加したことを示している。
【０２４５】
（６．１１  実施例１１：ハムスターの化学療法モデル／放射線照射モデルにおける確立された口腔粘膜炎の処置に対するＣＧ５３１３５の効果（Ｎ−３１８））
動物、タイプ、および年齢、ならびに化学療法モデル／放射線照射モデルは、セクション６．１０に記載したものと同じである。この実施例では、タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって測定した。
【０２４６】
６０匹のハムスターを、放射線照射の前に、それぞれ１０匹の動物ずつの６個のグループにランダムに分けた。それぞれのグループに列挙した種々の処置を割り当て、表２２に示したように、１２ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５大腸菌精製産物をＩＰで処置した。この実験では、動物には、−４日目および−２日目に６０ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵを投与し、その後、１５日ごろに重症の粘膜炎を生じさせるために、０日目におよそ３０Ｇｙの急性放射線照射を行った。この実験期間は３５日とした。処置スケジュールおよび投与を、動物の口腔粘膜炎スコアが２に達した後に開始した。粘膜炎のスコアリングに加えて、この実験では、実験グループの個々の動物について、下痢の発生、体重の減少、および死亡を評価した。
【０２４７】
（表２２．処置グループ）
【０２４８】
【表２２】
2007536381.tif 000025
粘膜炎を、６日目に開始して一日おきに評価し、２８日目に実験が終了するまで１日おきに評価した（すなわち、８日目、１０日目、１２日目、１４日目、１６日目、１８日目、２０日目、２２日目、２４日目、２６日目、および２８日目）。
【０２４９】
粘膜炎をハムスターにおいて誘導した。評価項目、粘膜炎、体重、および生存性を評価した。利用した統計学は、カイ二乗検定およびマン・ホイットニー順位和試験である。全ての３つのパラメーターは、セクション６．１０に記載する。
【０２５０】
（結果）
粘膜炎：未処置の対照グループにおいては、粘膜炎のピークは１４日目に生じ、３の平均スコアを有していた。ビヒクル対照グループにおいては、粘膜炎のピークは１６日目に生じ、３．４の平均スコアを有していた。２のスコアに達した後、第１日および第２日に、１２ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物をＩＰで投与したグループは、対照グループと同様の粘膜炎スコアのパターンを示した（図１２Ａ）。２のスコアに達した後、第３日および第４日に、１２ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物をＩＰで投与したグループは、対照グループと比較して、粘膜炎スコアの減少を示し、これは主に粘膜炎のピークよりも後ろで生じた（図１２Ｂ）。
【０２５１】
これらのグループの間での粘膜炎スコアの差を、カイ二乗検定を使用して３以上のスコアを有している日数を比較することによって評価した。ビヒクル対照グループにおける動物の日数の４１．１％と比較して、未処置の対照グループにおいては、評価した動物の日数の３２．３％が３以上のスコアを有していた。２つの対照グループの間でのこの差の結果として、２つの処置グループ（２のスコアに達した後、２日間および３日間、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物を投与したグループ）は、ビヒクル対照と比較した場合には有意な改善を示したが、未処置の対照と比較した場合には有意な改善は示さなかった。２日間ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物で処置したグループについては、Ｐ値は、未処置の対照と比較した場合には０．３４７であり、ビヒクル対照と比較した場合には０．００７であった。そして、３日間ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物で処置したグループについては、Ｐ値は、未処置の対照と比較した場合には０．５８０であり、ビヒクル対照と比較した場合には０．０２０であった。２のスコアに達した後、４日間ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物で処置したグループは、未処置の対照と比較した場合（Ｐ＝０．００３）およびビヒクル対照と比較した場合（Ｐ＜０．００１）の両方と比較して有意な改善を示した。２のスコアに達した後、１日だけＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物で処置したグループは、いずれの対照グループと比較した場合にも、有意性は示さなかった。
【０２５２】
対照と処置グループとの間で見られたこれらの差の有意性についてのさらなる評価を、スコアを得たそれぞれの日について各グループの粘膜炎スコアを評価するために、マン・ホイットニー順位和試験を使用することによって行った。この分析においては、種々の処置グループを、未処置の対照グループまたはビヒクル対照グループのいずれかと比較した。未処置の対照グループとのこの比較の結果は、２日間処置したグループと、未処置の対照グループとの間には、１０日目にのみ統計学的に有意な差があった（Ｐ＝０．０１１）ことを示した。３日間処置したグループと未処置の対照グループとの間には、１４日目（Ｐ＝０．０３６）および２２日目（Ｐ＝０．０１３）に統計学的に有意な差があった。４日間処置したグループと未処置の対照グループとの間には、１０日目（Ｐ＝０．００９、）１２日目（Ｐ＝０．０２９）、１４日目（Ｐ＝０．００２）、２２日目（Ｐ＝０．０２１）、および２４日目（Ｐ＝０．０３２）に統計学的に有意な差があった。１日だけＣＧ５３１３５で処置したグループと未処置の対照グループとの間には、統計学的に有意な差はなかった。
【０２５３】
ビヒクル対照グループとの間での順位和試験の比較の結果は、３日間処置したグループとビヒクル対照グループとの間には、１４日目（Ｐ＝０．０２０）および２２日目（Ｐ＝０．０２０）に統計学的に有意な差があったことを示した。４日間処置したグループとビヒクル対照との間での統計学的に有意な差は、１０日目（Ｐ＝０．０３６）、１４日目（Ｐ＜０．００１）、１８日目（Ｐ＝０．０２４）、２２日目（Ｐ＝０．０４８）、２４日目（Ｐ＝０．０２１）、２６日目（Ｐ＝０．０４８）、および２８日目（Ｐ＝０．００４）に見られた。１日だけ、または２日間ＣＧ５３１３５で処置したグループとビヒクル対照グループとの間には統計学的に有意な差はなかった。
【０２５４】
体重の変化：未処置の対照グループの動物は、この実験の終わりまでに、平均して、それらの開始時の体重の５０．５％の増加を示した。ビヒクル対照グループは、平均したこの実験の間の体重の増加が最も少なく、平均して４１．１％の増加であった。４日間毎日ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物を投与したグループは、５３．４％のもっとも大きい体重の増加を実験期間の間に生じた。一方、１日、２日、および３日間、毎日投与したグループは、それぞれ、平均して、４８．１％、４６．８％、および４４．４％の増加であった。これらの差を、それぞれの動物についての毎日の体重増加の割合について、曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することによって計算し、一元ＡＮＯＶＡ分析を使用してＡＵＣ値を評価することによって、評価した。これらのグループの間には有意な差はなかった（Ｐ＝０．２６６）。平均のＡＵＣデータを図１５に示す。
【０２５５】
（６．１２  実施例１２：ＣＧ５３１３５はヒト患者の粘膜炎について単回投与治療として安全に使用することができる（Ｃ−２１４試験およびＣ−３２５試験））
進行した（第４期）の癌を有しているヒト患者に静脈内投与したＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物（セクション６．１８．１に記載した処方物、本実施例では「ＣＧ５３１３５−０５薬剤物質」と呼ぶ）の安全性、耐受性、および薬物動態的評価（単一漸増薬剤量耐受性試験（ｓｉｎｇｌｅ  ｒｉｓｉｎｇ  ｄｏｓｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ））を行った。この漸増用量耐受性試験の目的は、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３３ｍｇ／ｋｇ、および１ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）での、４人の患者の集団におけるＣＧ５３１３５−０５薬剤物質の安全性、耐受性、および薬物動態を評価することである。漸増用量は、１５分間、０．３３ｍｇ／ｋｇを投与した（第Ｉ期試験Ｃ−３２５）際の耐受性の情報を理由として中止し、そしてプロトコールを０．２ｍｇ／ｋｇの用量を加えるように補正した。
【０２５６】
試験の間に、口腔粘膜を、熟練した研究スタッフによって試験し、そして世界保健機構（ＷＨＯ）のＯＭスコアリングシステムと口腔粘膜炎評価スケール（Ｏｒａｌ  Ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｓｃａｌｅ（ＯＭＡＳ））の両方による粘膜炎スコアを割り当てた。ＷＨＯ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  １９７９  ＷＨＯ．ＷＨＯ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．：ＷＨＯ  Ｏｆｆｓｅｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．４８．Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ：Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ；１９７９を参照のこと。ＯＭＡＳによっては、損傷についてのより定量的な評価が提供される。退院後、患者に、彼らが毎日１つのＷＨＯスコアを記録する日記を提供した。研究スタッフが、口腔粘膜炎についてのスコアを自己評価し、当てはめるための方法を患者に説明した。
【０２５７】
（表２３．ＷＨＯスコアリングシステム）
【０２５８】
【表２３】
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ＯＭＡＳシステムの値は、紅斑および潰瘍／偽膜スコアを足し算することによって得た。
【０２５９】
（表２４．ＯＭＡＳスコアリングシステム）
【０２６０】
【表２４】
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１１人の患者に、ＣＴの終了の３日後に投与した１回の１００ｍｌの静脈内注射として、０．０３ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝４）、０．１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝６）、および０．２ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）（ｎ＝１）のＣＧ５３１３５−０５薬剤物質を投与した。耐受性情報は１１人の患者全てから得ることができた。９人の患者からは完全な臨床データを得ることができた。
【０２６１】
事前の薬物動態データは、０．０３ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）用量レベルでの５６４．３ｎｇ／ｍｌ（ｎ＝３；範囲１７５．６〜１１９２．６ｎｇ／ｍｌ）、および０．１ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）用量レベルでの５６４．７ｎｇ／ｍｌ（ｎ＝３；範囲４２０．９〜７９７．５ｎｇ／ｍｌ）の平均のＣｍａｘを有するプラズマ照射を示した。注入後、ＣＧ５３１３５−０５薬剤物質は、１時間以内に最大血漿濃度に達した（注入の完了後、１５から３５分）。平均した最終的な指数的半減期は４９分であった（範囲：１６．２〜８７分、ｎ＝５）。有害な事象により試験が継続できなかった患者はなかった。実験薬剤に関係し得る有害な事象（患者の数）としては、以下が挙げられる：吐き気（２）；悪寒（２）；発熱（２）；嘔吐（１）；眩暈（１）；光視症（１）（１５日目の視覚−「点滅」）、および乱視（１）（２８日目の軽度の乱視）；神経障害（１）（１５日目に足の裏に）；頻脈（１）；頭痛（１）；およびＥＣＧで記録された無症候性の１つの未成熟の心房波形（１）。全ての報告された症状は、軽度から中度であった。実験薬剤に伴う悪性度３または４の研究室での毒性は記録されなかった。２００４年９月３日から薬剤を投与した１１人の患者の間で、実験薬剤とは無関係であると決定された６つの重症の悪性事象が、３人の患者から記録された。これらの事象には、癌の進行（ｎ＝２）、カテーテルによる感染、小腸の閉塞、食道炎／粘膜炎、および好中球減少性発熱が含まれる。
【０２６２】
実験が完了した１１人の患者のうち、６人の患者は口腔粘膜炎を発症しなかった。４人の患者が悪性度１（ｎ＝１）または悪性度２（ｎ＝３）の口腔粘膜炎を発症した。１人の患者については悪性度３の口腔粘膜炎を有していることが観察された。完全な非経口的栄養補給の必要な患者はなかった。ＣＰＴ−１１を投与した患者は、一般的には、下痢について高い発症率を有していた。この実験では、７人の患者にＣＴの一部としてＣＰＴ−１１を投与し、そしてわずかに２人の患者（いずれも０．０３ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）のＣＧ５３１３５−０５薬剤物質を投与した）が軽度から中度の下痢を経験し、そしてわずか１人の患者だけが、ＣＧ５３１３５−０５薬剤物質での処置を受けた直後に下痢を発症した。本発明者らは、ＣＧ５３１３５−０５薬剤物質が０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、および０．２ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）の単回用量の投与で十分に寛容化されたと結論付けた。
【０２６３】
自己幹細胞移植患者での平行単一漸増用量（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｉｎｇｌｅ  ｒｉｓｉｎｇ−ｄｏｓｅ）の第Ｉ相試験（Ｃ−３２５試験）が現在進行中であり、２７人の患者をＣＧ５３１３５−０５薬剤物質で処置している。ＰＢＳＣＴでのＨＤＣＴを受けた２２人の患者（ｐｔｓ）（年齢２５〜７５）は、０．０３ｍｇ／ｋｇ（２）、０．１ｍｇ／ｋｇ（１０）、０．２ｍｇ／ｋｇ（８）、および０．３３ｍｇ／ｋｇ（２）を含む（カッコ内は患者の数）、ＣＧ５３１３５−０５薬剤物質の増量を用いた実験を完了することができた。患者を、多発性骨髄腫（ｎ＝１１）、非ホジキンリンパ腫（ｎ＝９）、急性骨髄性白血病（ｎ＝１）、および線維形成性円形細胞癌（ｎ＝１）について処置し、そして、メルファラン（Ｍｅｌ２００）、シクロホスファミド、カルムスチンおよびエトポシド（ＣＢＶ）、カルボプラチンおよびチオテパ（ＣＴ）、ならびにブスルファン／シクロホスファミド（標的化されたＢｕＣｙ）を含む調整レジュメで処置した。この試験の主な目的は、ＣＧ５３１３５−０５薬剤物質の安全性、耐受性、および薬物動態を評価することであった。患者をまた、ＷＨＯおよびＯＭＡＳの両方の悪性度評価スケールを使用してＯＭの存在について毎日スコアした（上記の表２３および２４）。実験を完了することができた２２人の患者のうち、８人の患者はＯＭを経験しなかった（４人のＭｅｌ  ２００ｐｔｓを含む）；１０人の患者は、ＷＨＯによる悪性度１（ｎ＝７）または悪性度２（ｎ＝３）程度しかないＯＭを示し、４人の患者は、悪性度３（ｎ＝３）または悪性度４（ｎ＝１）の重症のＯＭを経験した。悪性度４のＯＭを示した１人の患者には、４日間のＴＰＮが必要であった。患者は、０．３３ｍｇ／ｋｇの用量まで、有意な副作用を生じることなく実験薬剤を十分に寛容化できた。この用量では、２人の患者が発熱、吐き気、および軽度の低血圧からなる注入投与に対する反応を示した。１３人の患者による事前の薬物動態の結果から、用量依存性のプラズマ照射を確認し、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、および０．３３ｍｇ／ｋｇの用量レベルで、それぞれ、１３５．５ｎｇ／ｍｌ、３４３．３ｎｇ／ｍｌ、および６５８．３ｎｇ／ｍｌの平均Ｃｍａｘであった。好中球移植の中央日（ｍｅｄｉａｎ  ｄａｙ）（ＡＮＣ＞５００／μＬによって決定した）は、幹細胞の注入後１３日目に生じた。事前のデータは、ＣＧ５３１３５−０５薬剤物質が、ＯＭを緩和または予防することにおいて、明らかな臨床的な効果を伴って、０．３３ｍｇ／ｋｇまでの用量でＰＢＳＣＴ患者において十分に寛容化されることを示唆している。したがって、２２人の患者のうちの１８人が、ＨＤＣＴ後の粘膜炎（ＷＨＯ悪性度３〜４）を回避できた。ＨＤＣＴによって誘導されるＯＭを予防することにおけるＣＧ５３１３５−０５薬剤物質の効力を評価するためのより大きな規模の第ＩＩ相臨床試験が、開始される。
【０２６４】
結論として、ＣＧ５３１３５−０５薬剤物質は、一般的には、現在までの２回の第Ｉ相試験において投与された３８人の患者の間では十分に寛容化された。試験した用量は、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、および０．３３ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）であった。注入投与に対する反応は、０．３３ｍｇ／ｋｇの薬剤を１５分間にわたって投与した場合、より低い用量で観察された明らかな活性と組み合わせて、この用量レベルの中断を導くこととなった。他には、一貫した薬剤に関係する有害事象または明らかに用量に関係する有害事象、あるいは実験室での異常は観察されなかった。実験薬剤に関係する深刻な有害事象は観察されなかった。耐受性および予備的な活性についての十分な情報は、第ＩＩ相試験において０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、および０．２ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）の用量を利用するために提示されることが考えられる。
【０２６５】
（６．１３  実施例１３：粘膜炎の予防または処置のためのＣＧ５３１３５の複数回投与）
有効なハムスターの口腔粘膜炎（「ＯＭ」）モデルを使用する前臨床試験によって、活動性ＯＭを有している患者の処置におけるＣＧ５３１３５の効果の研究がサポートされている。研究の結果によって、複数回投与のレジュメが、ＯＭの期間および重篤度を下げることにおいてより有効であることがさらに示された（実施例６．１１のＮ−３１８試験）。３回目の第Ｉ相臨床試験を、ＡＨＳＣＴへの馴化としてＴＢＩを用いてまたはそれを用いることなくＣＴによる活動性ＯＭを有している患者に、あるいは、化学療法を行った白血病患者に、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、または０．２ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）で、３回の連続する毎日の用量のＣＧ５３１３５−０５薬剤物質の安全性を評価するために行うことができる。加えて、ＯＭスコア、薬物動態、および薬効（ＰＤ）が評価される。
【０２６６】
提案された０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、または０．２ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）の単回投与を、単回投与のＣＧ５３１３５−０５薬剤物質の安全性および耐受性を評価するために行った２回の第Ｉ相臨床試験において癌患者に投与した。ＣＧ５３１３５−０５薬剤物質は、実験を完了することができた患者の間では、提案された試験用量で十分に寛容化された。３回目の第Ｉ相試験には、連続する３日間のＣＧ５３１３５−０５薬剤物質の薬理学的用量の毎日の投与を提案する。実験によって導かれた３日間の限定された治療期間と導かれた情報の有効である可能性（ポジティブな安全性のデータは、これらの安全性の問題のさらに詳細な研究の根拠を示すであろう）を前提とすると、リスク便益プロファイルが好ましいと考えられる。
【０２６７】
血液試料を、血液学および臨床化学の変化をモニタリングするため、ならびにＣＧ５３１３５−０５薬剤物質のレベルおよびＣＧ５３１３５に対する抗体のレベルを測定するために回収する。尿を、尿検査のパラメーターのために回収する。心電図（ＥＣＧ）、さらには、身体検査および眼の検査もまた、安全性の評価のために行う。血液試料を、薬剤活性の生体マーカーを評価するために採取する。この実験の状況では、生体マーカーは、ＣＧ５３１３５−０５薬剤物質での処置に対する薬理学的応答の指標として客観的に測定され、評価される特性として定義される。モニタリングされ得る生体マーカーとしては、サイトカインが挙げられる。
【０２６８】
（６．１４  実施例１４：化学療法によるか、または化学療法と放射線治療の併用によって誘導される口腔粘膜炎の予防）
第ＩＩ相臨床試験は、放射線治療とともに化学療法を行ったか、または放射線治療を行わずに化学療法を行った癌患者において口腔粘膜炎を予防することにおけるＣＧ５３１３５−０５薬剤物質の効力を評価するために行うことができる。これは、静脈内に投与した単回用量の０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、または０．２ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）のＣＧ５３１３５−０５薬剤物質を用いた、二重盲検プラセボ対照試験である。世界保健機構（ＷＨＯ）のＯＭスコアリングシステムを、効力を測定するために使用する。
【０２６９】
骨髄破壊的化学療法および／または全身照射（ＴＢＩ）後に自己幹細胞移植を受けた患者を、患者を登録するためにスクリーニングする。患者には、全身照射（ＴＢＩ）レジュメを伴う化学療法、または全身照射（ＴＢＩ）レジュメを伴わない化学療法の終了後２４時間で、自己幹細胞を投与する。
【０２７０】
患者に、幹細胞の注入の終了後、少なくとも２４時間で、ＣＧ５３１３５−０５薬剤物質を投与する。患者を、退院まで、または好中球移植の初日（ＡＮＣ＞５００／μｌ）まで、薬剤の投与後をモニタリングする。患者を、退院後２週間、ＣＧ５３１３５−０５薬剤物質の注入後３０日および９０日で、追跡のために戻って来させる。
【０２７１】
血液試料を、ＣＧ５３１３５、ＣＧ５３１３５に対する抗体のレベルを測定するために、ならびに、血液学および臨床化学の変化をモニタリングするために回収する。尿を、尿検査のパラメーターのために回収する。心電図（ＥＣＧ）、さらには、身体検査もまた、安全性の評価のために行う。血液試料を、薬剤活性についての生体マーカーを評価するために採取する。効力についての第１の評価項目は、口腔粘膜炎の期間と重篤度として示す。第２の評価項目には、発熱している日数、完全非経口栄養法、感染の数、静脈内麻薬性鎮痛薬の使用、移植までの時間、退院までの時間、下痢の発症と期間、さらには、９０日目での死亡率／進行していない疾患が含まれる。
【０２７２】
（６．１５  実施例１５：化学療法によって、または化学療法と放射線治療の併用によって誘導される口腔粘膜炎の処置）
第ＩＩ相臨床試験は、化学療法、放射線治療、または化学療法と放射線治療の併用を受けた癌患者の口腔粘膜炎の処置におけるＣＧ５３１３５−０５薬剤物質の効力を評価するために行うことができる。これは、静脈内に投与した単回投与または複数回投与のＣＧ５３１３５−０５薬剤物質を用いた、二重盲検プラセボ対照試験である。世界保健機構（ＷＨＯ）のＯＭスコアリングシステムを、処置の効力を測定するために使用する。
【０２７３】
患者を、口腔粘膜炎の発症について毎日モニタリングする。ＣＧ５３１３５−０５薬剤物質での処置は、患者が１または２のＷＨＯスコアの口腔粘膜炎を発症した時点で開始する。
【０２７４】
ＣＧ５３１３５−０５薬剤物質を、単回投与または複数回投与として投与する。患者を、退院まで、または骨髄移植患者においては好中球移植の初日（ＡＮＣ＞５００／μｌ）まで、薬剤の投与後をモニタリングする。患者を、退院後２週間、薬剤の注入後３０日および９０日で、追跡のために戻って来させる。
【０２７５】
血液試料を、ＣＧ５３１３５、ＣＧ５３１３５に対する抗体のレベルを測定するために、ならびに、血液学および臨床化学の変化をモニタリングするために回収する。尿を、尿検査のパラメーターのために回収する。心電図（ＥＣＧ）、さらには、身体検査もまた、安全性の評価のために行う。血液試料を、薬剤活性についての生体マーカーを評価するために採取する。効力についての第１の評価項目は、重症の口腔粘膜炎（ＷＨＯ  ＯＭ悪性度３または４）の発症として、または口腔粘膜炎の期間および重篤度として示す。第２の評価項目には、発熱している日数、完全非経口栄養法、感染の数、静脈内麻薬性鎮痛薬の使用、移植までの時間、退院までの時間、下痢の発症と期間、さらには、９０日目での死亡率／進行していない疾患が含まれる。
【０２７６】
（６．１６  実施例１６：ＣＧ５３１３５は放射線による下痢の発症、長さ、および重篤度を低下させる）
この実験は、下痢の発症と消化管形態によって測定される、全身照射によって誘導される胃腸障害に対するＣＧ５３１３５の活性を評価するために行った。この実施例では、タンパク質濃度はＵＶ吸光度によって測定した。
【０２７７】
（材料および方法）
投薬：マウスの体重を測定し、その後、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物（４ｍｇ／ｋｇまたは１６ｍｇ／ｋｇ）を投与したか、あるいは未処置のままとした。投薬は、表１および２に記載したように行った。それぞれ２０匹の動物の各グループに、以下の表に示したように放射線を照射した。０日目のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物の全ての投薬は、放射線照射の直後に行った。麻酔薬は投与しなかった。
【０２７８】
腸陰窩細胞の損傷の誘導：マウスに、０．７Ｇｙ／分の線量率で照射した１４Ｇｙまたは１４．５Ｇｙの線量で全身照射を行った。動物を、実験期間を通じて下痢の発症について追跡した。６日後、動物を屠殺し、マウスの腸管を組織学的分析のために回収した。
【０２７９】
体重：電離放射線への暴露に対する応答の指標として、起こりうる処置グループの間で動物の体重の差を評価するために、実験期間の間、毎日、それぞれの動物の体重を測定し、その生存性を記録した。
【０２８０】
遺体となって発見された動物または瀕死の状態で発見された動物：下痢の発症／進行を正確に評価し、動物が死亡する前に瀕死の状態を検出するために、動物を、３日目から１日に２回評価した。このような瀕死の状態の動物を、頚椎脱臼によって屠殺した。回腸と結腸の中ほど（ｍｉｄ−ｃｏｌｏｎ）を取り出し、保存、および必要に応じたさらなる分析／ＩＨＣのためにホルマリン中に固定し、パラフィンに包埋した（１ブロックあたり１匹の動物、１ブロックあたり２つの組織）。遺体となって発見された動物からは組織は取り出さなかった。
【０２８１】
（表２５．実験の設計）
【０２８２】
【表２５】
2007536381.tif 000028
（表２６．被験物質の要件）
【０２８３】
【表２６】
2007536381.tif 000029
（結果）
１４Ｇｙまたは１４．５Ｇｙで放射線照射した動物についての下痢のスコアと体重を含むエクセル（Ｅｘｃｅｌ）（登録商標）集計表を添付した。それぞれの放射線量によるデータが極めて類似しているとの理由から、１４Ｇｙを照射した動物の分析だけを提供する。
【０２８４】
体重：質量比増殖速度（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒａｔｅ）は以下によって計算した：
【０２８５】
【数１】
2007536381.tif 000030
有意性は、一元ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｅｔｔの多重比較試験法を使用して計算した。グループ間には、実験の間の体重の変化に有意な差は見られなかった（図１７Ａおよび１７Ｂ）。
【０２８６】
下痢のスコア：マウスを、放射線照射後４日目に開始して３日間、１日に２回、０〜３のスケールで下痢の重篤度についてスコアした。３日間にわたる平均の下痢のスコアと、さらに、３日間の下痢のスコアの合計を測定し、グラフに表した。有意性は、一元ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの多重比較試験法によって得た（図１８Ａおよび１８Ｂ）。
【０２８７】
下痢のピーク日の差を決定するために、各観察日についての分析もまた行った。有意性を、上記のように決定した（＊−Ｐ＜０．０５、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊＊＊−Ｐ＜０．００１）（図１９）。
【０２８８】
（結論）
放射線照射に対して−１日目、０日目、および＋１日目に１６ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５をそれぞれ投与した動物は、放射線による下痢の発症、長さ、および重篤度において極めて有意な減少を生じた。４ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５を１日目に６時間おきに投与した動物もまた、下痢の発症の有意な減少を生じた。下痢のピーク日は、放射線照射の５日後であり、この時点では、１６ｍｇ／ｋｇの用量のＣＧ５３１３５によってのみ、下痢の有意な減少がもたらされた。実験期間中の体重の減少については、処置グループ間に有意な差はなかった。
【０２８９】
（６．１７  実施例１７：ＣＧ５３１３５は、ラットのＣＰＴ−１１によって誘導される下痢を減少させる（Ｎ−３９２試験））
イリノテカン（ＣＰＴ−１１）は、重症の下痢による消化管（ＧＩ）粘膜炎の発症を引き起こす固形腫瘍に対して一般的に使用されている化学療法薬である。この実験の主要目的は、ＣＧ５３１３５がインビボの動物モデルにおいてＣＰＴ−１１によって誘導されるＧＩ粘膜炎を軽減させるかどうかを研究することであった。第２の目的は、種々のＣＧ５３１３５の投与スケジュールを試験することであった。
【０２９０】
（方法論）
下痢は、ＣＰＴ−１１（２００ｍｇ／ｋｇ）の単回の腹腔内投与を用いて、腫瘍を有しているラットにおいて誘導した。動物を、以下のセクション６．１８．２に記載するプロセス２にしたがって、化学療法による処置の前、処置の前と処置の間、または処置後のいずれかに、１６ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物で腹腔内で処置した（０．５Ｍのアルギニン、０．０５Ｍのリン酸一ナトリウム、０．０１％のポリソルベート８０のビヒクル中であり、これは、硫酸でｐＨ７．０になるようにｐＨを調整した）。ラットを、下痢の発症、および重篤度、さらには、死亡率について綿密にモニタリングした。動物を、下痢の誘導の１６８時間後に安楽死させた。安楽死させる際には、組織を、消化管の組織病理学的評価のために回収した。
【０２９１】
（結果）
重症または中度の下痢が、ＣＰＴ−１１のみで処置したラットのおよそ４０％に生じた。これには、化学療法後４日目には５０％の死亡率が伴った。ＣＰＴ−１１での処置の前、または処置前と処置の間にＣＧ５３１３５を投与したラットは、重症または中度の下痢を発症したが、低い発生率であり、また、これに伴う死亡はなかった。他の投与レジュメは有効ではなかった。
【０２９２】
（結論）
ＣＧ５３１３５で予め処置した動物（１６ｍｇ／ｋｇ）は、下痢の発症の減少によって測定される消化管粘膜炎の改善を示した。全体的な死亡率の低下もまた、このグループで記録された。このことは、ヒトのＧＩ粘膜炎でのＣＧ５３１３５の使用に重要な意味を持ち、これはさらに研究すべきであった。
【０２９３】
（６．１８  実施例１８：ＣＧ５３１３５−０５および薬学的処方物の製造）
臨床開発に適している構築物を目的として、タグを付けていない分子を、ファージを含まない細菌宿主の中で作成した。コドン最適化した全長のタグを付けていない分子（ＣＧ５３１３５−０５）は、最も好ましい薬学的プロフィールを有しており、これを使用して、安全性試験と臨床試験のための生成物を調製した。
【０２９４】
（６．１８．１  生産プロセスおよび薬学的処方物（プロセス１））
ＣＧ５３１３５−０５を、コドン最適化構築物を使用して大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＢＬＲ（ＤＥ３）で発現させ、均質になるように精製し、そして標準的なタンパク質化学技術によって特性決定した。単離したＣＧ５３１３５−０５タンパク質は、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ技術を使用し、クマシーブルーで染色すると、１本のバンド（２３キロダルトン）として移動していた。ＣＧ５３１３５−０５タンパク質を電気泳動によってポリビニリデンフルオライド膜に移し、染色された２３ｋＤのバンドを膜から切り出し、自動エドマン（Ｅｄｍａｎ）配列決定装置（Ｐｒｏｃｉｓｅ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって分析した；最初の１０個のアミノ酸のＮ−末端アミノ酸配列が、予想したタンパク質配列と同一であると確認した。
【０２９５】
（発酵および初期回収組み換え体）
ＣＧ５３１３５−０５を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＢＬＲ（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して発現させた。これらの細胞を、ｐＥＴ２４ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して全長のコドン最適化したＣＧ５３１３５−０５で形質転換した。これらの細胞の製造マスター細胞バンク（ＭＭＣＢ）を作成し、そして認定した。発酵と初回回収プロセスを、１００Ｌ（すなわち、作業容量）のスケールで再現可能に行った。
【０２９６】
播種（ｓｅｅｄ）の調製を、ＭＭＣＢの１個から６個のバイアルを融解させ、プールすること、そして７５０ｍＬの播種培地をそれぞれ含む４〜７個の震盪フラスコに接種することによって開始した。この時点で、３〜６Ｌの接種物を、６０〜８０Ｌの開始培地を含む生産発酵装置に移した。生産発酵装置を、３７℃の温度および７．１のｐＨで操作した。溶存酸素を飽和濃度の３０％またはそれ以上に、攪拌速度、空気散布速度、および純酸素での空気の濃縮を操作することによって、制御した。供給培地の添加を、３０〜４０ＡＵ（６００ｎｍ）の細胞密度で開始し、発酵が終了するまで維持した。細胞を、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を使用して４０〜５０ＡＵ（６００ｎｍ）の細胞密度に誘導し、ＣＧ５３１３５−０５タンパク質を、誘導後４時間の間生産させた。発酵は１０〜１４時間で完了し、約１００〜１１０Ｌの細胞培養液を連続的な遠心分離を使用して濃縮した。得られた細胞ペーストを、−７０℃で凍結して保存した。
【０２９７】
凍結した細胞ペーストを溶解緩衝液（３Ｍの尿素（最終濃度）を含む）に懸濁し、高圧ホモジナイゼーションによって破壊した。細胞溶解物を、連続流遠心分離を使用して明澄化させた。得られた明澄化させた溶解物を、ＳＰ平衡緩衝液（３Ｍの尿素、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で平衡化したＳＰ−セファロース高速流カラムに直接ロードした。ＣＧ５３１３５−０５タンパク質を、ＳＰ溶出緩衝液（１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、１Ｍのアルギニン、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．０）を使用してカラムから溶出させた。その後、回収した物質を等量のＳＰ溶出緩衝液で稀釈した。十分な混合の後、ＳＰセファロースＦＦプールを、０．２μｍのＰＥＳフィルターを通して濾過し、−８０℃で凍結させた。
【０２９８】
（薬剤物質の精製）
ＳＰ−セファロース高速流プールを硫酸アンモニウムで沈殿させた。４℃で一晩のインキュベーションの後、沈殿を、ボトル遠心分離によって回収し、続いて、フェニルローディング緩衝液（１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、５００ｍＭのＬ−アルギニン、７５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．０）に可溶化させた。得られた溶液を、０．４５μＭのＰＥＳフィルターを通して濾過し、フェニル−セファロースＨＰカラムにロードした。カラムを洗浄した後、タンパク質を、フェニル溶出緩衝液（１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、５００ｍＭのＬ−アルギニン、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．０）を含む直線的勾配で溶出させた。フェニル−セファロースＨＰプールを、０．２μｍのＰＥＳフィルターを通して濾過し、１．８Ｌのアリコートとして−８０℃で凍結させた。
【０２９９】
（処方物および充填／仕上げ）
精製した薬剤物質の４個のバッチを、２〜８℃で２４〜４８時間融解させ、接線流限外濾過（ＴＦＦ）装置の回収タンクにプールした。プールした薬剤物質を、ＴＦＦによって約５倍に濃縮し、その後、処方緩衝液（４０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．２ＭのＬ−アルギニン、３％のグリセロール）で約５倍のダイアフィルトレーションを行った。この緩衝液交換した薬剤物質を、＞１０ｍｇ／ｍＬの標的濃度になるようにさらに濃縮した。回収タンクに移す際に、処方緩衝液を用いて濃度を約１０ｍｇ／ｍＬに調節した。処方された薬剤産物を滅菌濾過して滅菌タンクに入れ、無菌的に充填し（２０ｍＬのバイアル１つにつき１０．５ｍＬ）、そしてシールした。充填し、シールしたバイアルを、充填の正確さと視覚的な欠陥について検査した。特定の数のバイアルを取り出し、放出アッセイ、安定性の試験、安全性の試験のためにラベルし、そして試料を保持した。残りのバイアルを、臨床試験のためにラベルし、完成した薬剤産物を−８０±１５℃で保存した。
【０３００】
完成した薬剤産物は、注射用の使い捨ての滅菌バイアル中の滅菌の透明な無色の溶液であった。ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物を、８．２ｍｇ／ｍＬの最終濃度に処方した（表２７）。
【０３０１】
（表２７．薬剤産物の比較）
【０３０２】
【表２７】
2007536381.tif 000031
最適に処方したＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物の薬物動態を、動物モデルにおいて有効用量での暴露を比較し、ヒトでの暴露を予想するために、静脈内、皮下、および腹腔内投与後にラットで評価した。ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物の静脈内投与によっては、高い血漿濃度（最大血漿濃度＝１９，６８０−４７，２５２ｎｇ／ｍＬ）が生じた。これは、最初の２時間のうちに３０〜７０ｎｇ／ｍＬにまで急速に低下した；暴露の減少は、第３の日用量の投与後に観察された（最大血漿濃度＝５３７３〜７４５３ｎｇ／ｍＬ）。ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物の皮下投与によっては、ゆっくりとした吸収（１０時間での最大血漿濃度）と、投与後４８時間までの４０〜８０ｎｇ／ｍＬの血漿濃度が生じた；血漿中へのいくらかの蓄積が、第３の日用量の投与後に見られた。ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物の腹腔内投与によっては、ゆっくりとした吸収（２〜４時間での最大血漿濃度）と、投与後１０時間までの４０〜７０ｎｇ／ｍＬの血漿濃度が生じた；暴露の減少が、第３の日用量の投与後に見られた。性別による有意な差は、いずれの投与経路によっても観察されなかった。
【０３０３】
ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物の静脈内投与（連続する１４日間に０．０５ｍｇ／ｋｇ／日、５ｍｇ／ｋｇ／日、または５０ｍｇ／ｋｇ／日（Ｂｒａｄｆｏｒｄ））の安全性を、極めて重要なラットでの毒性試験において評価した。０．０５ｍｇ／ｍＬ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物を１４日間投与したラットにおいては、処置に関係する所見はなかった。５ｍｇ／ｋｇ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）ＣＧ５３１３５を１４日間投与したラットにおいては、飼料の消費量が減少し、体重が減少した；この投与グループにおいては、臓器の重さ、尿検査のパラメーター、眼科学的パラメーター、組織学的パラメーターには処置に関係する変化はなかったが、この処置グループには、血液学的パラメーターおよび臨床化学的パラメーターにおいて処置に関係する変化があった。５０ｍｇ／ｋｇ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物を１２日間投与したラット（有効用量を２０〜３０倍上回る推測される最大血漿濃度）においては、飼料消費量は減少し、体重は明らかに減少した；眼科的には処置に関係する変化はなかったが、この処置グループにおいては、臓器の重さ、尿検査、血液学、臨床化学、および組織病理学において有意な処置に関係する変化があった。
【０３０４】
ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物の静脈内投与（連続する７日間、０または１０ｍｇ／ｋｇ／日（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）で）の安全性を、アカゲザルでの安全性薬理学試験においてさらに評価した。１ｍｇ／ｋｇ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物を７日間投与した動物においては、処置に関係する臨床的な所見はなかった。１０ｍｇ／ｋｇ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物を７日間投与した動物においては、体重に対する比較的重要ではない効果が記録され、これには、より少ない飼料消費量の定量的観察が付随していた。いずれの用量グループにおいても、血液学、臨床化学、眼科学、または電気生理学に対しては明らかな処置に関係する効果はなかった。
【０３０５】
（ＣＧ５３１３５−０５薬剤物質の安定性）
ｃＧＭＰの製造の間に生産されるＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物に対する安定性試験を行った。精製された薬剤物質についての安定性を示すアッセイとして使用した分析方法を表２８に列挙する。
【０３０６】
（表２８．薬剤物質の安定性アッセイ）
【０３０７】
【表２８】
2007536381.tif 000032
ＰＩ２００＝バックグラウンドの２倍のＢｒｄＵの取り込みを生じるＣＧ５３１３５−０５の濃度
ＳＤＳ＝ＰＡＧＥ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、およびＢｒａｄｆｏｒｄアッセイは、タンパク質分解または全体的な凝集の指標である。ＳＥＣ−ＨＰＬＣアッセイによってタンパク質の凝集またはオリゴマー形成の変化を検出し、そして生体アッセイによっては、タンパク質の生物学的活性の消失を検出する。精製された薬剤物質についての安定性試験を、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、および２４ヶ月の間隔で試験した試料を用いて、−８０℃から１５℃で行った。
【０３０８】
１つの実験においては、完成した薬剤産物の安定性試験を、Ｃａｍｂｒｅｘによって、−８０±１５℃と−２０±５℃で、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、および２４ヶ月の間隔で試験した試料を用いて行った。１ヵ月後に得た安定性のデータは、完成した薬剤産物が、−８０±１５℃または−２０±５℃で保存した場合には、少なくとも１ヶ月間は安定であったことを示している（表２９）。
【０３０９】
（表２９．１ヶ月の間隔の後の薬剤産物についての安定性のデータ）
【０３１０】
【表２９−１】
2007536381.tif 000033
【０３１１】
【表２９−２】
2007536381.tif 000034
ロット番号０２５０２００１を、Ｃａｍｂｒｅｘによって、−８０±１５℃、または−２０±５℃で保存し、１ヵ月後に試験した；ＰＩ２００＝バックグラウンドの２倍のＢｒｄＵの取り込みを生じるＣＧ５３１３５−０５の濃度；パス＝安定性についての基準を満たす結果；ＮＴ＝実験しなかった。
【０３１２】
別の実験では、完成した薬剤産物の試料を、−８０±１５℃で保存したか、または５±３℃、２５±２℃、もしくは３７±２℃でストレスをかけ、様々な間隔で１ヶ月間試験した。安定性についてのデータは、完成した薬剤産物が、−８０±１５℃、または５±３℃での１ヶ月の保存後には有意な不安定性は示さなかったことを示している。２５±２℃でストレスをかけた場合には、完成した薬剤産物は少なくとも４８時間安定であった；分解は、この温度では１週間後に見られた。３７±２℃でストレスをかけた場合には、完成した薬剤産物の分解は４時間以内に見られた。
【０３１３】
（６．１８．２  改良された薬学的処方物とＣＧ５３１３５−０５の生産プロセス（プロセス２））
市販される製品についての以下の３つの用件を満たすために、新しい処方物を開発した：（１）流通を容易にするためには、最低限の保存温度は２〜８℃でなければならない；（２）製品は、商業的流通システムに対して少なくとも１８ヶ月間保存温度で安定でなければならない；そして（３）製品は、商業的スケールの設備によって製造されなければならず、プロセスは種々の商業的製造委託業者に譲渡可能でなければならない。
【０３１４】
新しい処方物は、硫酸塩としての０．５Ｍのアルギニン、０．０５Ｍのリン酸一ナトリウム、および０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０中の、１０ｍｇ／ｍＬ（ＵＶ）の以下に記載されるプロセスによって生産されたタンパク質産物（「プロセス２タンパク質」）からなる。凍結乾燥させた生成物は、増進された安定性のデータに基づくと２〜８℃で少なくとも１８ヶ月間安定であると予想される。新しい処方物とは対照的に、米国特許出願番号１０／４３５，０８７に記載されている以前の処方物は、以下の理由から凍結乾燥させることはできない：第１に、酢酸緩衝液の酸性成分が酢酸であり、これは凍結乾燥の間に昇華するからである。凍結乾燥後、酢酸の減少は、塩基成分である酢酸ナトリウムが１００％のレベルであり、緩衝化剤のみとなる。凍結乾燥によるこの酢酸の消失によって、ｐＨは＜７．５にまで上昇し、これは、標的である５．３のｐＨからは程遠い。２つ目は、グリセロールが＜−４５℃の崩壊温度を有することであり、これが原因で、この処方物を商業的に凍結乾燥させることができない。市販の凍結乾燥装置のほとんどは、−４５℃から−５０℃の範囲の棚（ｓｈｅｌｆ）温度を有しており、±３℃の温度の変動がある。
【０３１５】
ＣＧ５３１３５について以下の４つの意外な特性を見出し、これらを使用して新しい処方物を開発した：（１）高濃度のアルギニン（＞０．４Ｍ）によって、溶解度が＞３０ｍｇ／ｍＬに上昇する；（２）アルギニンの硫酸塩を使用することによって溶解度が少なくとも２〜６倍増大する；（３）緩衝化塩としてのリン酸ナトリウムの最適濃度は５０ｍＭであり、２５ｍＭ、７５ｍＭおよび１００ｍＭの濃度と比較した場合には溶解度は少なくとも１〜２倍増大する；そして、（４）ダイアフィルトレーション／限外濾過工程の間に界面活性剤を添加することによって、凝集物の形成が最小となる。凍結乾燥処方物の開発においては、新しい処方物の個々の成分を、別個に溶解度について評価した。ＣＧ５３１３５−０５を、沈殿緩衝液（５０ｍＭのＮａＰｉ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１ＭのＬ−アルギニンＨＣｌ、２．５Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４）を使用して沈殿させた。この沈殿を、ｐＨ６．５の２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄して、残留アルギニンと硫酸アンモニウムを除去した。その後、洗浄した沈殿を、表に列挙する以下のそれぞれの緩衝液に再度溶解させた。以下はデータの例である。
【０３１６】
（表３０．高濃度のアルギニン（＞０．４Ｍ）によって溶解度が＞３０ｍｇ／ｍＬに増大する）
【０３１７】
【表３０】
2007536381.tif 000035
＊：溶解度は、実験において十分なタンパク質を溶解させることができなかったので低い
（表３１．アルギニンの硫酸塩を使用することにより溶解度は少なくとも２〜６倍増大する）
【０３１８】
【表３１】
2007536381.tif 000036
全ての処方物に０．２Ｍのアルギニンが含まれている。
【０３１９】
緩衝化塩としてのリン酸ナトリウムの最適濃度を観察した（表３２）。リン酸ナトリウムの最適濃度は５０ｍＭであり、２５ｍＭ、７５ｍＭおよび１００ｍＭの濃度と比較した場合には溶解度は少なくとも１〜２倍増大した。
【０３２０】
（表３２．緩衝化塩としてのリン酸ナトリウムの最適濃度は５０ｍＭである）
【０３２１】
【表３２】
2007536381.tif 000037
表３３は、凝集物の形成を最小限にするためのダイアフィルトレーション／限外濾過の工程の間に界面活性剤を添加することの必要性を示している。実験は、０．２Ｍのアルギニンおよび０．０５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中の２．５ｍｇ／ｍＬのＣＧ５３１３５−０５で限外濾過／ダイアフィルトレーションを実施することによって行った。７倍容量の最終緩衝液（０．５Ｍのアルギニンおよび０．０５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）での交換の後、ダイアフィルトレーション産物（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｅ）を約２０ｍｇ／ｍＬに濃縮する。その後、ダイアフィルトレーション産物を最終緩衝液で約１２．５ｍｇ／ｍＬに稀釈し、凍結乾燥させる。ポリソルベート８０を、０．０１％の最終濃度になるようにダイアフィルトレーションの前または後のいずれかに添加する。
【０３２２】
（表３３．ダイアフィルトレーション／限外濾過工程の間に界面活性剤を添加することにより凝集物の形成を最小限にする）
【０３２３】
【表３３】
2007536381.tif 000038
全ての処方物は、０．５Ｍのアルギニン、０．０５Ｍのリン酸一ナトリウム、および０．０１％のポリソルベート８０を含む。
【０３２４】
新しい処方物は、以下の利点を有している：（１）２〜８℃の保存温度を有している凍結乾燥産物であること；（２）２〜８℃で保存される場合、少なくとも１８ヶ月の貯蔵寿命を有していると予想される凍結乾燥産物は、＞３０ｍｇ／ｍＬの溶解度に達すること；ならびに、（３）凍結乾燥産物は−３０℃の崩壊温度を有しており、これは商業的設備によって容易に凍結乾燥され得ること。アルギニン、流酸塩、リン酸塩、および界面活性剤と、ＣＧ５３１３５との間での相互作用は予期していなかった。
【０３２５】
薬剤物質および製剤の製造のための改良されたプロセスの工程を表３４に記載し、それぞれの工程を以下に説明する。
【０３２６】
（表３４）
【０３２７】
【表３４−１】
2007536381.tif 000039
【０３２８】
【表３４−２】
2007536381.tif 000040
細胞バンク：動物性の成分を含まない複合培地中の製造マスター細胞バンク（ＭＭＣＢ）を、先に記載したプロセスに使用した。動物性の成分を含まない化学的に定義された培地中の第２の製造マスター細胞バンク（ＭＭＣＢ）を、最初のＭＭＣＢから誘導し、そして製造作業細胞バンク（Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（ＭＷＣＢ））を、第２のＭＭＣＢから作成した。このＭＷＣＢを、表３４に記載した製造プロセスに使用した。
【０３２９】
接種物の調製：最初の細胞の増殖は震盪フラスコの中で行う。播種の調製は、化学的に定義された培地の中にＭＷＣＢの２〜３個のバイアルを融解させてプールし、そしてそれぞれ５００ｍＬの化学的に定義された播種培地を含む３〜４個の震盪フラスコに接種することによって行う。
【０３３０】
播種および最終発酵：指数増殖期の細胞を含む震盪フラスコ（２．５〜４．５のＯＤ６００単位）を、播種培地を含む１つの２５Ｌ（すなわち、作業容量）の播種発酵槽に接種するために使用する。２５Ｌの播種醗酵槽の中で指数増殖期（３．０〜５．０のＯＤ６００単位）に達した時点で、細胞を、７８０〜８２０Ｌの化学的に定義されたバッチ培地を含む１５００Ｌの生産用発酵槽に移す。発酵の間、温度は３７±２℃、ｐＨは７．１±０．１に、攪拌は１５０〜２５０ｒｐｍに制御し、そして０．５〜１．５（ｖｖｍ）で空気または酸素富化空気を噴霧して２５％以上の溶存酸素となるように制御する。消泡剤（Ｆｅｒｍａｘアジュバント２７）を、発酵槽内での泡立ちを制御するために必要な場合には使用する。培養物のＯＤ（６００ｎｍ）が２５〜３５単位に達した時点で、追加の化学的に定義された培地を、最初は０．７ｇ／ｋｇ培養液／分で供給し、その後、必要応じて供給速度を調整して供給する。ＣＧ５３１３５−０５タンパク質の発現の誘導を、６００ｎｍでのＯＤが１３５〜１６５単位に達した時点で開始する。誘導の４時間後に、発酵を終了させる。最終的な発酵培養液の容積はおよそ１５００Ｌである。その後、培養物を１０〜１５℃に冷却する。
【０３３１】
ホモジナイゼーション：冷却した培養物を、２部の細胞溶解緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、６０ｍＭのＥＤＴＡ，７．５ｍＭのＤＴＴ，４．５Ｍの尿素（ｐＨ７．２））に対して１部の発酵培養液の割合で、細胞溶解緩衝液で希釈する。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（凝集剤）を、稀釈した発酵培養液に添加して、最終ＰＥＩ濃度を０．０３３％（Ｗ／Ｖ）とする。細胞を、高圧ホモジナイザーによって７５０〜８５０ｂａｒで３回、１０〜１５℃で溶解させる。
【０３３２】
捕捉および回収：冷却した細胞溶解物を、予め平衡化したストリームライン（Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ）ＳＰ膨張層陽イオン交換カラム（ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｂｅｄ  ｃａｔｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｏｌｕｍｎ）に上向流方向で直接ロードする。ローディングの間は、層の膨張係数を、充填した層のカラム容積の２．５〜３．０倍の間に維持する。ローディングの後、カラムを別のストリームラインＳＰ平衡緩衝液（１００ｍＭのリン酸ナトリウム、４０ｍＭのＥＤＡＴ、１０ｍＭの硫酸ナトリウム、３Ｍの尿素（ｐＨ７．０））を用いて上向流方向でフラッシュする。その後、カラムをさらにＳＰストリームライン洗浄緩衝液（１００ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ，２５ｍＭの硫酸ナトリウム、２．２２Ｍのデキストロース（ｐＨ７．０））を用いて下向流方向で洗浄する。タンパク質は、ストリームラインＳＰ溶出緩衝液（１００ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ，２００ｍＭの硫酸ナトリウム、１ＭのＬ−アルギニン（ｐＨ７．０））のカラムを用いて下向流方向で溶出させる。
【０３３３】
ＰＰＧ  ６５０Ｍクロマトグラフィー：ＳＰストリームライン溶出物を、予め平衡化したＰＰＧ  ６５０Ｍ、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム上にロードする。カラムを平衡化させ、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、２００ｍＭの硫酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、１Ｍのアルギニン（ｐＨ７．０）で洗浄する。さらに、カラムを１００ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．９Ｍのアルギニン（ｐＨ７．０）で洗浄する。生成物を、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．２Ｍのアルギニン（ｐＨ７．０）で溶出させる。
【０３３４】
ＣＵＮＯ濾過：ＰＰＧ溶出物を、内毒素結合ＣＵＮＯ  ３０ＺＡデプス型フィルター（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｅｒ）に通す。このフィルターを、最初に注射用水（ＷＦＩ）で、その後、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．２Ｍのアルギニン（ｐＨ７．０）（ＰＰＧ溶出緩衝液）でフラッシュする。フラッシュした後、ＰＰＧ溶出物をフィルターに通す。大気圧を使用して、フィルターとその枠を通過して最終的な液体となるように押し出す。
【０３３５】
フェニルセファロースクロマトグラフィー：次いで、ＣＵＮＯ濾液を予め平衡化したフェニルセファロース疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム上にロードする。カラムを平衡化させ、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、５０ｍＭの硫酸アンモニウム、８００ｍＭの塩化ナトリウム、０．５Ｍのアルギニン（ｐＨ７．０）で洗浄する。生成物を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５Ｍのアルギニン（ｐＨ７．０）で溶出させる。
【０３３６】
濃縮およびダイアフィルトレーション：薬剤物質の最終濃度が０．０１％（ｗ／ｖ）になるように、１％のポリソルベート８０をフェニルセファロース溶出物に添加する。その後、溶出物を限外濾過システムにおいて約２〜３ｇ／Ｌに濃縮する。その後、保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を７倍のダイアフィルトレーション容積の、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５Ｍのアルギニン（ｐＨ７．０）（フェニルセファロース溶出緩衝液）でダイアフィルトレーションする。ダイアフィルトレーションの後、保持液を１２〜１５ｇ／Ｌの間に濃縮する。保持液を０．２２μｍのフィルターを通して濾過し、その後１０ｇ／Ｌに希釈する。
【０３３７】
多量の瓶詰め：濃縮およびダイアフィルトレーション工程からの保持液を、０．２２μｍの孔サイズのフィルターを通して濾過し、２Ｌの使い捨てのテフロン（登録商標）瓶に入れる。瓶を−７０℃で凍結させる。
【０３３８】
製剤／バイアル：凍結させた薬剤物質の瓶を室温で融解させる。薬剤物質が完全に融解した後、これを滅菌の容器に注ぎ、濾過し、バイアルに充填し、軽く（ｐａｒｔｉａｌｌｙ）栓をして、凍結乾燥させる。凍結−乾燥のプロセスが完了した後、バイアルに栓をして蓋をしめる。凍結乾燥した製剤を２〜８℃で保存する。
【０３３９】
ＣＧ５３１３５−０５参照標準物を、Ｄｉｏｓｙｎｔｈ  ＲＴＰ  Ｉｎｃで、１４０Ｌのスケールの製造プロセス（これは、多量の薬剤物質の製造プロセスの代表的なものである（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅに記載されているように））を使用して調製した。参照標準物を、２ｍＬのクライオバイアル（ｃｒｙｏｖｉａｌ）中で１ｍＬのアリコートとして、−８０℃±１５℃で保存した。
【０３４０】
最終産物の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、サイズ排除ＨＰＬＣ、およびウェスタンブロットによって分析した。薬剤の効力は、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物への応答におけるＮＩＨ  ３Ｔ３細胞の増殖によって測定した。全てのデータは、最終産物が臨床用途に適していることを示していた。
【０３４１】
（７．等価物）
当業者は、本明細書中に記載した本発明の特異的な実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または、そのような等価物を日常的に行われている実験以上のものを使用することなく確実に行うことができる。このような等価物は以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【０３４２】
したがって、本発明の好ましい実施形態が説明され、記載されているが、本発明にはバリエーションや変更が可能であり、示される正確な用語に限定されるべきではないことが理解される。本発明者らは、種々の使用方法および条件に対して本発明を適応させるために行われ得るそのような変更および修正自体を利用することを望んでいる。このような修正および変更としては、例えば、哺乳動物に本発明のタンパク質を投与するための異なる薬学的組成物；投与される組成物中のタンパク質の量が異なること；本発明のタンパク質の投与のタイミングおよび手段が異なること；ならびに、例えば、異なるタンパク質の組み合わせ、または本明細書中に具体的に開示されるタンパク質についての所望される有用性と同じ、それと同様の、またはそれとは異なる目的のための他の生物学的に活性な化合物との本発明のタンパク質の組み合わせを含む投与量中に含まれる異なる物質を挙げることができる。このような変更および修正もまた、本明細書中に記載される特異的な所望されるタンパク質のアミノ酸配列の修飾、ならびに同様の修飾を含むことが意図される。そのような変更により、タンパク質の所望される効力を変化させることはないが、投与される薬学的組成物中もしくは体内でのタンパク質の溶解度、体によるタンパク質の吸収、貯蔵寿命の間またはタンパク質の生物学的作用によって所望される効果をもたらすことができるような時点までの体内でのタンパク質の保護を変化させるような様式で配列が変化させられる。したがって、このような変更および修正は、等価物の完全な範囲内であることが適切に意図され、したがって、以下の特許請求の範囲内にある。
【０３４３】
したがって、本発明と、それを作成し使用する様式およびプロセスは、本発明が属するか、または最も密接に関係している分野の全ての当業者が、それを作成し、使用することができるように、このように完全に、明確に、簡潔に、そして正確な用語で記載されている。
【図面の簡単な説明】
【０３４４】
【図１】ＣＧ５３１３５−０５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精製産物のＲＰ−ＨＰＬＣ分析（それぞれ、プロセス１および２による、プロセスの記載については、セクション６．１８．１および６．１８．２を参照のこと）。
【図２】ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物のトリプシンマップ（それぞれ、プロセス１および２による）。
【図３】ＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞中でのＣＧ５３１３５によって誘導されたＤＮＡ合成の用量応答。血清枯渇ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を、精製したＣＧ５３１３５−０１（図中のＣＧ５３１３５）、１０％の血清、またはビヒクルのみ（コントロール）で処理した。ＤＮＡ合成を、それぞれの試料について、ＢｒｄＵ取り込みアッセイを使用して三連で測定した。データ点は、平均のＢｒｄＵの取り込みを示し、そして棒は標準誤差（ＳＥ）を示す。
【図４】ＣＧ５３１３５は、ＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞の増殖を刺激する。血清枯渇ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞の二連のウェルを、精製したＣＧ５３１３５−０１（１μｇ）またはビヒクルコントロールのみで１日処理した。それぞれのウェルについて細胞の数を二連で決定した。Ｙ軸は細胞の数を示す。これは、４つの細胞の数の平均（二連での処理×２回の計数）の平均および標準誤差（ＳＥ）である。
【図５】ＣＧ５３１３５は、７８６−Ｏ腎臓上皮細胞中でＤＮＡ合成を誘導する。血清枯渇７８６−Ｏ細胞を処理しないままにしたか、または、部分精製したＣＧ５３１３５−０１（５ｎｇ／μＬのストックから）で、もしくはビヒクルコントロール（擬似）で処理した。ＤＮＡ合成を、それぞれの試料について、ＢｒｄＵ取り込みアッセイを使用して三連で測定した。データ点は、平均のＢｒｄＵの取り込みを示し、そして棒は標準誤差（ＳＥ）を示す。
【図６】放射線により誘導された粘膜炎の処置におけるＣＧ５３１３５大腸菌精製産物の効果。それぞれのグループの動物が＞３の粘膜炎スコアを示した全ての日数を合計し、そしてスコアされた日数の合計の割合として表した。それぞれのビヒクルコントロールとの観察された差の統計学的有意性を、χ二乗検定を使用して計算した。
【図７】化学療法により誘導された粘膜炎の期間に対する粘膜炎の効果。＞３の粘膜炎スコアを有している日数を評価した。開放性の潰瘍（スコア＞３）の提示によって定義される臨床的に有意な粘膜炎のレベルを試験するために、動物が高いスコアを示した日数を全て合計し、それぞれのグループについてスコアされた日数の合計の割合として表した。観察された差についての統計学的有意性を、χ二乗検定を使用して計算した。ビヒクルコントロール＝疾患コントロール。
【図８】図８は、陰窩の中の細胞の位置を示す。
【図９】図９は、種々の放射線用量後にＰＢＳコントロールグループに対してＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物での処置の予防的投与を比較した、陰窩の生存曲線を示す。
【図１０】図１０は、放射線照射後のマウスの腸陰窩の生存に対するＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物の予防的投与の効果を示す。
【図１１】図１１（Ａ）および（Ｂ）は、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物での処置後の毎日の粘膜炎スコアの平均を示す。グループの粘膜炎スコアの平均を得た。エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。未処置のコントロールグループと、１日目と２日目にＣＧ５３１３５−０５を１２ｍｇ／ｋｇ、ＩＰで投与したグループの、−１日目のみにＣＧ５３１３５−０５を投与したグループとの比較を行った。（Ａ）６ｍｇ／ｋｇまたは１２ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５を投与したグループ；および（Ｂ）２４ｍｇ／ｋｇまたは４８ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５を投与したグループ。
【図１２】図１２は、１回、２回、３回、または４回のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物での処置後の毎日の粘膜炎スコアの平均を示す。グループの粘膜炎スコアの平均を得た。エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。未処置およびビヒクルコントロールグループの、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物を１２ｍｇ／ｋｇ、ＩＰで投与したグループとの比較を行った。（Ａ）１〜２日間ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物を投与したグループ；および（Ｂ）３日〜４日間ＣＧ５３１３５−０５精製産物を投与したグループ。
【図１３】図１３は、ＣＧ５３１３５−０５精製産物で処置した粘膜炎を有している動物における体重の増加の割合を示す。動物は毎日体重を測定し、−４日目からの体重の変化の割合を計算し、そしてグループの平均と平均の標準誤差（ＳＥＭ）をそれぞれの日について計算した。未処置のコントロールグループと、１日目と２日目にＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物を１２ｍｇ／ｋｇ、ＩＰで投与したグループの、−１日目のみにＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物を投与したグループとの比較を行った。（Ａ）６ｍｇ／ｋｇまたは１２ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物を投与したグループ；（Ｂ）２４ｍｇ／ｋｇまたは４８ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物を投与したグループ。
【図１４】図１４は、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物で処置した粘膜炎を有している動物における、曲線下面積（ＡＵＣ）の増加として表した体重の変化を示す。曲線下面積（ＡＵＣ）を、研究したそれぞれの動物が示した体重の変化の割合について計算した。この計算は、台形法則変換を使用して行った。グループの平均を計算し、これをそれぞれのグループについてのＳＥＭを示すエラーバーと共に示した。一元ＡＮＯＶＡを、複数のグループを比較するために行った。
【図１５】図１５は、１用量のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物で処置した動物についての１日、２日、３日、または４日間の曲線下面積（ＡＵＣ）として表した体重の変化を示す。曲線下面積（ＡＵＣ）を、研究したそれぞれの動物が示した体重の変化の割合について計算した。この計算は、台形法則変換を使用して行った。グループの平均を計算し、これをそれぞれのグループについてのＳＥＭを示すエラーバーと共に示した。一元ＡＮＯＶＡを、複数のグループを比較するために行った。
【図１６】図１６は、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製産物での処置後の重症粘膜炎の期間を示す。３以上の粘膜炎スコアを有している日数。開放性の潰瘍（スコア＞３）の提示によって定義される臨床的に有意な粘膜炎のレベルを試験するために、動物が高いスコアを示した日数を全て合計し、それぞれのグループについてスコアされた日数の合計の割合として表した。観察された差についての統計学的有意性を、カイ二乗検定を使用して計算した。アスタリスク（＊）は、コントロールとの有意な差を示す。
【図１７】図１７（Ａ）および（Ｂ）は、一元ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定法によってそれぞれ分析した、全身照射法によって誘導された胃腸の損傷を有している動物の体重に対するＣＧ５３１３５の効果を示す。
【図１８】図１８（Ａ）および（Ｂ）は、一元ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの多重比較検定法によってそれぞれ分析した、全身照射法によって誘導された胃腸の損傷を有しているマウスにおける、下痢スコアに対するＣＧ５３１３５の効果を示す。
【図１９】図１９は、各観察日についての下痢スコアの分析を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年3月23日(2007.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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