(57)【要約】【課題】本発明の課題は、免疫学的測定において、耐久性や視認性に優れるだけでなく、環境への負荷が小さい免疫学的測定用金属ナノ粒子−樹脂複合体を提供することにある。【解決手段】本発明では、セルロース粒子と、前記セルロース粒子よりも相対的に小さな複数の金属ナノ粒子とを備え、複数の前記金属ナノ粒子が、前記セルロース粒子に固定化されていることを特徴とする、免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体を用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース粒子と、
前記セルロース粒子よりも相対的に小さな複数の金属ナノ粒子と、
を備え、
複数の前記金属ナノ粒子が、前記セルロース粒子に固定化されていることを特徴とする、免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体。
【請求項２】
前記金属ナノ粒子の平均粒子径が１〜８０ｎｍの範囲内である、請求項１に記載の免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体。
【請求項３】
平均粒子径が５０〜１０００ｎｍの範囲内である、請求項１又は２に記載の免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体。
【請求項４】
免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体が、カルボキシル基及び／またはアミノ基を置換基として有するセルロースを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体。
【請求項５】
免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体が、キチン、キトサン、グルコサミン、ペクチンからなる群から選択される多糖類を含む、請求項４に記載の免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体。
【請求項６】
前記金属ナノ粒子の担持量が免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体の重量に対して３ｗｔ％〜７０ｗｔ％の範囲内である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体を備えた標識物質。
【請求項８】
前記免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体の表面に、抗原または抗体を吸着させて使用するものである請求項７に記載の標識物質。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の標識物質を用いる、免疫学的測定法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体を備えた免疫学的測定用試薬。
【請求項１１】
試料中に含まれるアナライトを検出又は定量するアナライトの測定方法であって、
メンブレン、及び当該メンブレンに前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部を含むラテラルフロー型クロマト用テストストリップを用い、下記工程（Ｉ）〜（ＩＩＩ）；
工程（Ｉ）：試料に含まれる前記アナライトと、該アナライトに特異的に結合する抗体を、請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体で標識した標識抗体と、を接触させる工程、
工程（ＩＩ）：前記判定部にて、工程（Ｉ）において形成された、アナライトと標識抗体とを含む複合体を、捕捉リガンドに接触させる工程、
工程（ＩＩＩ）：前記免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体の局在型表面プラズモン共鳴及び、電子遷移による光エネルギー吸収に由来する発色強度を測定する工程、
を含む工程を行うことを特徴とするアナライトの測定方法。
【請求項１２】
ラテラルフロー型クロマト用テストストリップを用いて、試料中に含まれるアナライトを検出又は定量するためのアナライト測定用キットであって、
メンブレン、及び当該メンブレンに、前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部を含むラテラルフロー型クロマト用テストストリップと、
前記アナライトに特異的に結合する抗体を、請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体で標識した標識抗体を含む検出試薬と、
を含むアナライトを検出又は定量するためのアナライト測定用キット。
【請求項１３】
試料中に含まれるアナライトを検出又は定量するためのラテラルフロー型クロマト用テストストリップであって、
メンブレンと、
前記メンブレンに、前記試料が展開する方向において、前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部と、
当該判定部よりも上流側に、前記アナライトに特異的に結合する抗体を請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体で標識した標識抗体が含まれる反応部と、
を含むラテラルフロー型クロマト用テストストリップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば免疫学的測定に使用可能な金属ナノ粒子−セルロース複合体、それを利用した標識物質、免疫学的測定法、免疫学的測定用試薬、アナライトの測定方法、アナライト測定用キット、及び、ラテラルフロー型クロマト用テストストリップに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫学的測定法（「イムノアッセイ」ともいう。）は、免疫反応の一つである、抗原−抗体間における特異的な反応を利用し、微量成分を定性的、定量的に分析する方法である。また、その測定原理により、様々な測定法がある。例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ラテックス等の凝集法（ＬＩＡ、ＰＡ）、イムノクロマトグラフィー法（ＩＣＡ）、赤血球凝集法（ＨＡ）、赤血球凝集抑制法（ＨＩ）等が挙げられる。なお、イムノアッセイの他には、物理・化学的測定法、生物学的測定法等がある。
【０００３】
イムノアッセイは、抗原及び抗体が反応し複合体を形成した際の変化（抗原、抗体又は複合体の濃度変化）から、抗原又は抗体を定性的又は定量的に検出する。これらを検出する際に、抗体、抗原又は複合体に標識物質を結合させることで、検出感度が増大する。
そのため、標識物質の標識能力は、イムノアッセイにおける検出能力を左右する重要な要素であるといえる。上記に例示したイムノアッセイにおいても、標識物質として、赤血球（ＨＡの場合）、ラテックス粒子（ＬＩＡの場合）、蛍光色素（ＦＩＡの場合）、放射性元素（ＲＩＡの場合）、酵素（ＥＩＡの場合）、化学発光物質（ＣＬＩＡの場合）等が用いられている。
【０００４】
ところで、標識物質として着色した微粒子を用いた場合、特別な分析装置を用いることなく目視により検出を確認することができるため、より簡便な測定ができることが期待される。このような着色した微粒子としては、金属及び金属酸化物のコロイド状粒子、色素で着色したラテックス粒子等が挙げられる（特許文献１、特許文献４等）。しかし、上記コロイド状粒子は、粒子径及び調製条件によって色調が決定されてしまうため、所望の鮮明な濃い色調のものを得難い、つまり視認性が不十分であるという問題がある。
また、上記着色したラテックス粒子は、色素による着色の効果が低く、目視判定性が不十分であるという問題がある。なお、この問題を解消するために色素の着色量を増やそうとすると、色素がラテックスの表面を覆い、ラテックス粒子本来の表面状態が損なわれるため、抗原又は抗体を結合させるのが困難になるという問題があった。また、メンブランフィルター等のクロマトグラフ媒体の細孔内に詰まったり、ラテックス粒子が非特異凝集を起こしたりして、色素の着色料を増やすことにより濃く着色することが、必ずしも、性能の向上に結び付かない、という問題もあった。
【０００５】
上記の材料系の課題を解決する新たな材料系として、ポリマー系ラテックス粒子の表面に結合した金ナノ粒子からなる着色ラテックスが開示されている（特許文献２）。
ポリマー系ラテックス粒子の表面に金ナノ粒子を結合させることにより、該金ナノ粒子自身が着色剤として目視判定性や検出感度の向上に役立つ一方、金ナノ粒子自身が抗原又は抗体に対する結合性にも優れることから、充分な濃色となる程度にまで金ナノ粒子を結合させても充分な量の抗原又は抗体を結合させ得るとされている。
【０００６】
上記着色ラテックスは、スチレン−アクリル酸共重合体ラテックス及び金ナノ粒子の前駆体であるＨＡｕＣｌの分散液にガンマ線を照射することで、上記ラテックスの表面に金ナノ粒子を結合させたものである。しかし、上記着色ラテックスは、金ナノ粒子がラテックスの表面のみに結合されることから、表面プラズモン共鳴が発現する金粒子の担持量に制限があるうえに、金ナノ粒子が脱離しやすい。その結果、免疫学的測定用試薬としての視認性や感度が十分でない恐れがある。また、ガンマ線等の電磁放射線を照射するため、ラテックスにダメージを与える恐れがある。さらに、特許文献２の明細書中には、上記ラテックス径や金ナノ粒子径の好ましい範囲を開示しているが、実施例においてこれらの好ましい範囲で検証されているか明らかでなく、好ましい範囲の規定の根拠がない等、実施に適した条件の開示がほとんどない。
【０００７】
また、特許文献３では、金属金で被覆されたポリマーラテックス粒子が開示され、顕微鏡検査法及びイムノアッセイ法に利用可能な試薬への適用が示唆されている。
【０００８】
しかし、上記金属金で被覆されたポリマーラテックス粒子は、ポリマーラテックス粒子の材質や粒径の開示がない。さらに、イムノアッセイ法に利用可能な試薬としての効果について検証がない。そのため、金属金及びポリマーラテックス粒子における試薬としての効果は不明である。
【０００９】
また、特許文献４では、金属コア超微粒子と、金属イオン配位性基を有し、該金属コア超微粒子を包囲する重合体とを含む複合微粒子が開示され、診断薬などのセンシング分野等、種々の分野への適用が示唆されている。また、実施例において、ビニルピリジン−ジビニルベンゼン共重合体の架橋微粒子に、塩化金酸を還元して得られた金ナノ粒子を包囲させた複合微粒子が開示されている。しかし、上記複合微粒子は、その詳細な構造や物性の検討は行っておらず、免疫学的測定試薬等の具体的な用途への効果は不明である。
【００１０】
以上より、金属ナノ粒子が結合又は被覆された樹脂粒子は、免疫学的測定用の試薬として期待されるものであるが、従来の技術では、耐久性や視認性が十分でなかった。また、視認性が高いものでも、適用可能な用途及び使用環境は限定されるものであった。
【００１１】
上記従来技術の状況に鑑み、本出願人は、特定の割合の金属ナノ粒子が樹脂粒子の表層部に存在する樹脂−金属複合体を見出し、先に提案した（例えば、特許文献５）。この樹脂−金属複合体は、特に免疫学的測定材料の用途において、耐久性及び視認性に優れ、かつ、特別な装置や作業工程の追加を必要とせずに高感度な判定を可能とするものである。
【００１２】
ところで、特許文献２乃至５で開示された樹脂粒子を構成する高分子は、いずれも化学的安定性に優る一方で、その廃棄時の処理の困難さが懸念される。従って、将来的には、樹脂粒子を免疫学的測定用の材料として適用する場合、免疫学的測定用の試薬としての耐久性や視認性に優れるだけでなく、環境への負荷が小さいことが重要な要素になると考えられる。
【００１３】
環境への負荷が小さい樹脂材料としては、生分解性高分子が挙げられる。環境への負荷のうち二酸化炭素の排出によるものでは、生分解性高分子は微生物により分解され、二酸化炭素と水が生成する。生分解性高分子も合成高分子と同様に、その分解過程で二酸化炭素を放出するが、その放出速度が遅いので放出した二酸化炭素が植物やバイオマスに吸収される。その結果、地球温暖化の原因になりにくいとされている。特に、植物由来のセルロース、カニの甲羅由来のキトサン等の天然物系生分解性高分子は、カーボンニュートラルであると考えられており、燃焼しても大気中の二酸化炭素の増減に影響を及ぼさないことから、注目されている。
しかしながら、金属ナノ粒子が結合又は被覆された樹脂粒子を用いた免疫学的測定用の試薬として、生分解性高分子を適用した例はなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開平５−１０９５０号公報
【特許文献２】特開２００９−１６８４９５号公報
【特許文献３】特開平３−２０６９５９号公報
【特許文献４】特開２００９−２２７８８３号公報
【特許文献５】国際公開ＷＯ２０１６／００２７４２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、免疫学的測定において、耐久性や視認性に優れるだけでなく、環境への負荷が小さい免疫学的測定用免疫学的測定用金属ナノ粒子−樹脂複合体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、生分解性高分子の一つであるセルロース粒子に複数の金属ナノ粒子が固定化された金属ナノ粒子−セルロース複合体によって上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
【００１７】
すなわち、本発明の免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体は、セルロース粒子と、前記セルロース粒子よりも相対的に小さな複数の金属ナノ粒子と、を備え、複数の前記金属ナノ粒子が、前記セルロース粒子に固定化されていることを特徴とする。
【００１８】
本発明の免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体は、前記金属ナノ粒子の平均粒子径が１〜８０ｎｍの範囲内であってもよい。この場合、金属ナノ粒子−セルロース複合体は、平均粒子径が５０〜１０００ｎｍの範囲内であってもよい。
【００１９】
本発明の免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体は、カルボキシル基及び／またはアミノ基を置換基として有するセルロースを含んでいてもよい。
【００２０】
本発明の免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体は、キチン、キトサン、グルコサミン、ペクチンからなる群から選択される多糖類を含んでいてもよい。
【００２１】
本発明の免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体は、前記金属ナノ粒子の担持量が免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体の重量に対して３ｗｔ％〜７０ｗｔ％の範囲内であってもよい。
【００２２】
本発明の標識物質は、上記いずれかに記載の免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体を備えている。この場合、前記免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体の表面に、抗原または抗体を吸着させて使用するものであってもよい。
【００２３】
本発明の免疫学的測定法は、上記いずれかの標識物質を用いるものである。
【００２４】
本発明の免疫学的測定用試薬は、上記いずれかの免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体を備えている。
【００２５】
本発明のアナライトの測定方法は、試料中に含まれるアナライトを検出又は定量する方法である。このアナライトの測定方法は、メンブレン、及び当該メンブレンに前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部を含むラテラルフロー型クロマト用テストストリップを用い、下記工程（Ｉ）〜（ＩＩＩ）；
工程（Ｉ）：試料に含まれる前記アナライトと、該アナライトに特異的に結合する抗体を、上記いずれかの免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体で標識した標識抗体と、を接触させる工程、
工程（ＩＩ）：前記判定部にて、工程（Ｉ）において形成された、アナライトと標識抗体とを含む複合体を、捕捉リガンドに接触させる工程、
工程（ＩＩＩ）：前記金属ナノ粒子−セルロース複合体の局在型表面プラズモン共鳴及び、電子遷移による光エネルギー吸収に由来する発色強度を測定する工程、
を含む工程を行うことを特徴とする。
【００２６】
本発明のアナライト測定用キットは、ラテラルフロー型クロマト用テストストリップを用いて、試料中に含まれるアナライトを検出又は定量するためのアナライト測定用キットである。このアナライト測定用キットは、メンブレン、及び当該メンブレンに、前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部を含むラテラルフロー型クロマト用テストストリップと、前記アナライトに特異的に結合する抗体を、上記いずれかの免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体で標識した標識抗体を含む検出試薬と、を含む。
【００２７】
本発明のラテラルフロー型クロマト用テストストリップは、試料中に含まれるアナライトを検出又は定量するためのものである。このラテラルフロー型クロマト用テストストリップは、メンブレンと、前記メンブレンに、前記試料が展開する方向において、前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部と、当該判定部よりも上流側に、前記アナライトに特異的に結合する抗体を上記いずれかの免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体で標識した標識抗体が含まれる反応部と、を含む。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロースは、セルロースが水酸基を多く含有するため、例えば抗体などのリガンドに結合させた状態での分散性に優れ、凝集が生じにくい。また、セルロース粒子に複数の金属ナノ粒子が固定化された構造を有するため、特許文献２及び３に例示される、樹脂粒子の表面に金属ナノ粒子又は金属膜が存在する複合体と比較して、金属ナノ粒子の担持量が多い。また、セルロースが生分解性を有する一方で、環境汚染の原因になりうる有機染料及び有機顔料を有さないので、生分解性を利用して無害化、分解する等、廃棄時に環境への負荷が小さい方法を選択し得る。従って、本発明の免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体は、ハンドリング性、耐久性及び視認性に優れ、かつ、環境への負荷が小さい高感度な材料として、例えば、ＥＩＡ、ＲＩＡ、ＣＬＩＡ、ＦＩＡ、ＬＩＡ、ＰＡ、ＩＣＡ、ＨＡ、ＨＩ等の免疫学的測定用標識物質、免疫学的測定用試薬などの目的で好ましく適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の一実施の形態に係る金属ナノ粒子−セルロース複合体の断面の構造を示す模式図である。
【図２】本発明の一実施の形態に係るラテラルフロー型クロマト用テストストリップを用いたアナライトの測定方法の概要を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、適宜図面を参照しながら、本発明の実施の形態について詳細に説明する。図１は、本発明の一実施の形態に係る金属ナノ粒子−セルロース複合体の断面模式図である。金属ナノ粒子−セルロース複合体１００は、セルロース粒子（以下、単に「樹脂粒子」ともいう。）１０と、金属ナノ粒子２０と、を備えている。金属ナノ粒子−セルロース複合体１００は、樹脂粒子１０に金属ナノ粒子２０が固定化されている。樹脂粒子１０は、金属ナノ粒子２０よりも相対的に大きな粒子である。つまり、金属ナノ粒子−セルロース複合体１００では、相対的に粒子径の大きな樹脂粒子１０に、相対的に粒子径の小さな多数の金属ナノ粒子２０が固定されている。図１に示すように、金属−樹脂複合体である金属ナノ粒子−セルロース複合体１００全体の粒子径Ｄ１と、樹脂粒子１０の粒子径Ｄ２と金属ナノ粒子２０の粒子径Ｄ３との関係は、Ｄ１＞Ｄ２＞Ｄ３である。
金属ナノ粒子−セルロース複合体１００は、金属−樹脂複合体の１つの実施形態であり、金属−樹脂複合体は、金−セルロース複合体、白金−セルロース複合体、金−樹脂複合体、白金−樹脂複合体等を含む。
【００３１】
［金属ナノ粒子−セルロース複合体］
金属ナノ粒子−セルロース複合体１００は、金属ナノ粒子２０の一部が樹脂粒子１０の表層部６０において三次元的に分布していてもよい。この場合、三次元的に分布した金属ナノ粒子２０の一部が部分的に樹脂粒子１０外に露出していてもよく、残りの一部が樹脂粒子１０に内包されていてもよい。具体的には、図１に示すように、金属ナノ粒子２０には、樹脂粒子１０に完全に内包された金属ナノ粒子（以下、「内包粒子３０」ともいう。）、樹脂粒子１０内に埋包された部位及び樹脂粒子１０外に露出した部位を有する金属ナノ粒子（以下、「一部露出粒子４０」ともいう。）及び樹脂粒子１０の表面に吸着している金属ナノ粒子（以下、「表面吸着粒子５０」ともいう。）が存在していることが好ましい。
【００３２】
金属ナノ粒子−セルロース複合体１００を免疫学的測定用標識物質又は免疫学的測定用試薬に使用する場合、樹脂粒子１０の表面又は一部露出粒子４０もしくは表面吸着粒子５０の表面に、抗体または抗原を固定化して使用する。その際、一部露出粒子４０及び表面吸着粒子５０には、前記抗体または抗原が固定化される一方で、内包粒子３０には、固定化されない。しかし、一部露出粒子４０、表面吸着粒子５０及び内包粒子３０のいずれも局在型表面プラズモン共鳴に加え、電子遷移による光エネルギー吸収を発現することから、一部露出粒子４０及び表面吸着粒子５０のみならず、内包粒子３０も、免疫学的測定用標識物質及び免疫学的測定用試薬の視認性向上に寄与する。さらに、一部露出粒子４０及び内包粒子３０は、表面吸着粒子５０と比較して樹脂粒子１０との接触面積が大きいことに加え、埋包状態によるアンカー効果等が奏されるため、物理的吸着力が強く、樹脂粒子１０から脱離しにくい。そのため、金属ナノ粒子−セルロース複合体１００を使用した免疫学的測定用標識物質及び免疫学的測定用試薬の耐久性、安定性を優れたものにすることができる。
【００３３】
また、金属ナノ粒子−セルロース複合体１００への金属ナノ粒子２０（内包粒子３０、一部露出粒子４０及び表面吸着粒子５０の合計）の担持量は、金属ナノ粒子−セルロース複合体１００の重量に対して、３ｗｔ％〜７０ｗｔ％であることが好ましい。この範囲であれば、金属ナノ粒子−セルロース複合体１００は、標識物質としての視認性、目視判定性及び検出感度に優れる。金属ナノ粒子２０の担持量が３ｗｔ％未満では、抗体または抗原の固定化量が少なくなり、検出感度が低下する傾向がある。金属ナノ粒子２０の担持量は、より好ましくは、３ｗｔ％〜７０ｗｔ％、さらに好ましくは、３ｗｔ％〜６０ｗｔ％である。
【００３４】
ここで、前記「表層部６０」とは、金属ナノ粒子−セルロース複合体１００の最も外側の位置（つまり、一部露出粒子４０又は表面吸着粒子５０の突出端部）を基準にして、樹脂粒子１０の表面から、深さ方向に粒子半径の５０％の範囲を意味する。また、前記「三次元的に分布」とは、金属ナノ粒子２０が、樹脂粒子１０の面方向だけでなく、深さ方向にも分散されていることを意味する。
【００３５】
なお、金属ナノ粒子−セルロース複合体１００は、内包粒子３０を有しなくもよい。例えば、金属ナノ粒子−セルロース複合体１００において、金属ナノ粒子２０のすべてが、樹脂粒子１０の径方向に重なり合うことなく、樹脂粒子１０の表面に固定されていてもよい。この場合、金属ナノ粒子２０は、一部露出粒子４０と表面吸着粒子５０とから構成される。
【００３６】
樹脂粒子１０を構成するセルロースは、分子中の水酸基を反応部位として、様々な置換基を導入することができる。
例えば、クロロ酢酸ナトリウムを前記水酸基と反応させることで、樹脂粒子１０にカルボキシル基を導入することができる。カルボキシル基は、金属ナノ粒子２０の前駆体であるＡｕ３＋やＰｔ２＋のようなカチオン性金属イオンを化学吸着することができる。そして、これを還元して金属ナノ粒子２０を形成することで、樹脂粒子１０に複数の金属ナノ粒子２０が固定化された構造を有する、金属ナノ粒子−セルロース複合体１００を作製することができる。
また、例えば、２−クロロエチルアミン塩酸塩や２−ジイソプロピルアミノエチルクロリド塩酸塩を前記水酸基と反応させることで、樹脂粒子１０にアミノ基を導入することができる。アミノ基は金属ナノ粒子２０の前駆体である［ＡｕＣｌ４］−、［ＰｔＣｌ６］２−のようなアニオン性金属イオンを化学吸着することができる。そして、これを還元して金属ナノ粒子２０を形成することで、樹脂粒子１０に複数の金属ナノ粒子２０が固定化された構造を有する、金属ナノ粒子−セルロース複合体１００を作製することができる。
樹脂粒子１０を構成するセルロースは、分子中に水酸基を豊富に含有するため、前記カルボキシル基やアミノ基を導入することにより、樹脂粒子１０中に金属ナノ粒子２０を安定的に、かつ十分な量を固定化することができる。
【００３７】
樹脂粒子１０における、前記カルボキシル基又はアミノ基（以下、併せて「金属イオン吸着基」という）の置換度は、標識物質として使用できる範囲であれば限定せず、置換基によっても好ましい範囲が異なるが、置換基が金属イオン吸着基である場合、０．１〜２．５であることが好ましい。ここで、置換度とは、置換度はセルロースのβ−グルコースユニット（水酸基数＝３）あたりの置換された水酸基の数を表し、セルロース分子を構成する全β−グルコースユニットの平均値である。置換度が２．５を超えると金属ナノ粒子−セルロース複合体の親水性が損なわれ、水溶液中での分散性が低下する傾向にある。一方、置換度が０．１未満であると金属ナノ粒子の担持量が十分でなく、標識物質としての視認性が低下する傾向にある。より好ましい上限は、１．０である。また、より好ましい下限は０．２である。
【００３８】
また、グルコース、ガラクトース、マンノース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸等の糖類がα又はβ結合し、主鎖又は側鎖を構成する公知の多糖類と複合化または組み合わせて使用しても良い。このような公知の多糖類としては、キチン、キトサン、グルコサミン、ペクチン等が挙げられるが、キトサンは、分子中に金属イオン吸着基であるアセチルアミノ基を有するため好ましい。
【００３９】
また、セルロースの種類は特に限定されない。再生セルロース、精製セルロース、天然セルロース等、公知のセルロースを用いることができる。これらの構造の一部が改質されたセルロースを用いてもよい。例えば、セルロース、微小繊維状セルロース、発酵セルロース、およびメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、及びそのナトリウム、カルシウム等のセルロース誘導体が挙げられる。
【００４０】
上記含窒素モノマーは、これを重合した際に主鎖または側鎖に窒素原子を有する樹脂を形成するものであり、例えば、ポリアミン、ポリアミド、ポリペプチド、ポリウレタン、ポリ尿素、ポリイミド、ポリイミダゾール、ポリオキサゾール、ポリピロール、ポリアニリンを形成するモノマーである。また、側鎖に窒素原子を有する場合は、例えば、アクリル樹脂、フェノール樹脂、エポキシ樹脂を構成するモノマーを適用できる。
また、上記カチオン性イオンを吸着可能なモノマーは、主鎖または側鎖に、カルボン酸基、スルホン酸基等を有する樹脂を形成するものであり、例えば、ポリアクリル酸、カルボン酸ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルスルホン酸、ポリスチレンスルホン酸を構成するモノマーを適用できる。
上記含窒素モノマーまたはカチオン性イオンを吸着可能なモノマーとの共重合体は、ランダム共重合体、ブロック共重合体、交互共重合体、重合体同士が架橋したものが例示される。また、２種類以上のモノマーを共重合させて樹脂粒子を形成しても良いし、樹脂粒子の表面に存在する官能基にモノマーを反応させ、それを重合活性末端としてさらに重合させても良い。
【００４１】
また、金属ナノ粒子２０が、金、白金、パラジウム、銀、ニッケル、銅、又はこれらの合金であることが好ましい。これらの金属は、単体もしくは合金等の複合体で使用することが可能である。ここで、例えば金合金としては、金と金以外の金属種からなり、金を１０重量％以上含有する合金を意味する。また、例えば白金合金としては、白金と白金以外の金属種からなり、白金を１重量％以上含有する合金を意味する。より好ましくは、視認性に優れ、抗原又は抗体の固定化が容易な金、白金及びパラジウムである。これらは、局在型表面プラズモン共鳴に由来する吸収を発現するため、好ましい。更に好ましくは、免疫学的測定における検出感度に優れる金及び白金である。
【００４２】
また、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察により測長される金属ナノ粒子２０の平均粒子径（つまり、図１における粒子径Ｄ３の平均）は、例えば１〜８０ｎｍであることが好ましい。金属ナノ粒子２０の平均粒子径が、１ｎｍ未満の場合や８０ｎｍを超える場合は、局在型表面プラズモン共鳴及び、電子遷移による光エネルギー吸収が発現しにくくなるため感度が低下する傾向がある。
金属ナノ粒子２０として白金粒子を使用する場合、白金粒子の平均粒子径は、免疫学的測定用標識物質及び免疫学的測定用試薬として高い検出感度を得る観点から、好ましくは１ｎｍ以上５０ｎｍ以下であり、より好ましくは１ｎｍ以上３０ｎｍ以下であり、さらに好ましくは１ｎｍ以上２０ｎｍ以下であり、最も好ましくは１ｎｍ以上１５ｎｍ以下である。特に、金属ナノ粒子２０の平均粒子径が１５ｎｍ以下である場合、イムノクロマトグラフの標識物質として使用する場合に、特に優れた検出感度が得られる。
また、金属ナノ粒子２０として金粒子を使用する場合、金粒子の平均粒子径は、免疫学的測定用標識物質及び免疫学的測定用試薬として高い検出感度を得る観点から、好ましくは１ｎｍ以上７０ｎｍ未満であり、より好ましくは、１ｎｍ以上５０ｎｍ未満である。
【００４３】
また、金属ナノ粒子−セルロース複合体１００の平均粒子径（つまり、図１における粒子径Ｄ１の平均）は、例えば５０〜１０００ｎｍであることが好ましい。金属ナノ粒子−セルロース複合体１００の平均粒子径が５０ｎｍ未満では、例えば、金属ナノ粒子２０の担持量が少なくなる傾向がある為、同サイズの金属ナノ粒子より着色が弱くなる傾向にあり、１０００ｎｍを超えると、標識物質又は試薬とした際に、メンブランフィルター等のクロマトグラフ媒体の細孔内に詰まりやすい傾向や、分散性が低下する傾向がある。金属ナノ粒子−セルロース複合体１００の平均粒子径は、標識物質又は試薬とした際の分散性を向上させるとともに、金属ナノ粒子−セルロース複合体１００を免疫学的測定に用いる場合に高い検出感度を得る観点から、好ましくは１００ｎｍ以上７００ｎｍ以下であり、より好ましくは２５０ｎｍ以上６５０ｎｍ以下である。特に、金属ナノ粒子−セルロース複合体１００の平均粒子径が２５０ｎｍ以上であると、金属ナノ粒子−セルロース複合体１００をイムノクロマトグラフの標識物質として使用する場合に安定して優れた検出感度が得られる。ここで、金属ナノ粒子−セルロース複合体１００の粒子径は、樹脂粒子１０の粒子径に、一部露出粒子４０又は表面吸着粒子５０の突出部位の長さを加えた値を意味し、レーザー回折／散乱法、動的光散乱法、又は遠心沈降法により測定することができる。
【００４４】
［免疫学的測定用金属ナノ粒子−セルロース複合体］
本明細書において、金属ナノ粒子−セルロース複合体が、免疫学的測定用であるとは、少なくとも、セルロースを含む複合体が、抗体と結合する性質を有する金属ナノ粒子を含むという要件を満たすことをいう。
免疫学的測定においては、検出すべき抗原と、金属ナノ粒子と結合した抗体とが、結合することにより、発色等、知覚による認識又は機器により検知可能な変化が生じる。
【００４５】
［金属−樹脂複合体の製造方法］
金属−樹脂複合体である金属ナノ粒子−セルロース複合体１００の製造方法は、特に限定されない。例えば、セルロース粒子を合成し、この分散液に塩化金、塩化白金等の公知の金属イオンを加え、さらに、水素化ホウ素ナトリウム、ヒドラジン、アルコール、アスコルビン酸、ジメチルアミンボラン等の公知の還元剤を加えて、金属イオンを還元し金属ナノ粒子を析出させる。その結果、析出した金属ナノ粒子はセルロース粒子に固定化される。
セルロール粒子は公知の方法により製造することができる。例えば、セルロースの溶液に凝固液を加えて微粒子化しても良いし、湿式や湿式により粉砕し分級して微粒子化してもよい。
セルロースの溶液に凝固液を加えて微粒子化する場合、例えば、セルロースリンターを、公知の方法で調製した銅アンモニア溶液に溶解させ、銅アンモニアセルロース溶液とする。次に凝固液として有機溶媒、水及びアンモニアの混合液を調製し、この凝固液に銅アンモニアセルロース溶液を加えて凝固し、さらに、硫酸等で中和し、乾燥等を行うことで、粒子を得ることができる。
【００４６】
次に、金属ナノ粒子−セルロース複合体１００を標識物質として使用したアナライトの測定方法、ラテラルフロー型クロマト用テストストリップ及びアナライト検出・定量キットについて説明する。
【００４７】
［ラテラルフロー型クロマト用テストストリップ］
まず、図２を参照しながら、本発明の一実施の形態に係るラテラルフロー型クロマト用テストストリップ（以下、単に「テストストリップ」と記すことがある）について説明する。このテストストリップ２００は、後述するように、本発明の一実施の形態のアナライトの測定方法に好ましく使用できるものである。
【００４８】
テストストリップ２００は、メンブレン１１０を備えている。メンブレン１１０には、試料の展開方向において順に、試料添加部１２０、判定部１３０及び吸液部１４０が設けられている。
【００４９】
＜メンブレン＞
テストストリップ２００に使用されるメンブレン１１０としては、一般的なテストストリップにおいてメンブレン材料として使用されるものを適用可能である。メンブレン１１０は、例えば毛管現象を示し、試料を添加すると同時に、試料が展開するような微細多孔性物質からなる不活性物質（アナライト１６０、各種リガンドなどと反応しない物質）で形成されているものである。メンブレン１１０の具体例としては、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、セルロース誘導体等で構成される繊維状又は不織繊維状マトリクス、膜、濾紙、ガラス繊維濾紙、布、綿等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはセルロース誘導体やナイロンで構成される膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等が用いられ、より好ましくはニトロセルロース膜、混合ニトロセルロースエステル（ニトロセルロースと酢酸セルロースの混合物）膜、ナイロン膜、濾紙が用いられる。
【００５０】
テストストリップ２００は、操作をより簡便にするため、メンブレン１１０を支持する支持体を備えていることが好ましい。支持体としては、例えばプラスチック等を用いることができる。
【００５１】
＜試料添加部＞
テストストリップ２００は、アナライト１６０を含む試料を添加するための試料添加部１２０を有していてもよい。試料添加部１２０は、テストストリップ２００に、アナライト１６０を含む試料を受け入れるための部位である。試料添加部１２０は、試料が展開する方向において、判定部１３０よりも上流側のメンブレン１１０に形成されていてもよいし、あるいは、例えばセルロース濾紙、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、綿布などの材料で構成された試料添加パッドがメンブレン１１０に設けられて試料添加部１２０を構成していてもよい。
【００５２】
＜判定部＞
判定部１３０には、アナライト１６０と特異的に結合する捕捉リガンド１３１が固定されている。捕捉リガンド１３１は、アナライト１６０と特異的な結合を形成するものであれば特に制限なく使用でき、例えばアナライト１６０に対する抗体などを好ましく用いることができる。捕捉リガンド１３１は、テストストリップ２００に試料を提供した場合においても、判定部１３０から移動することがないように不動化している。捕捉リガンド１３１は、物理的又は化学的な結合や吸着等によって、メンブレン１１０に直接的又は間接的に固定されていればよい。
【００５３】
また、判定部１３０は、標識抗体１５０とアナライト１６０とを含む複合体１７０が、アナライト１６０と特異的に結合する捕捉リガンド１３１に接触するような構成である限り特に限定されない。例えば、メンブレン１１０に、直接、捕捉リガンド１３１が固定されていてもよいし、あるいは、メンブレン１１０に固定されたセルロース濾紙、グラスファイバー、不織布等からなるパッドに捕捉リガンド１３１が固定されていてもよい。
【００５４】
＜吸液部＞
吸液部１４０は、例えば、セルロ−ス濾紙、不織布、布、セルロースアセテート等の吸水性材料のパッドにより形成される。添加された試料の展開前線（フロントライン）が吸液部１４０に届いてからの試料の移動速度は、吸液部１４０の材質、大きさなどにより異なるものとなる。従って、吸液部１４０の材質、大きさなどの選定により、アナライト１６０の検出・定量に最適な速度を設定することができる。なお、吸液部１４０は任意の構成であり、省略してもよい。
【００５５】
テストストリップ２００は、必要に応じて、さらに、反応部、コントロール部等の任意の部位を含んでいてもよい。
【００５６】
＜反応部＞
図示は省略するが、テストストリップ２００には、メンブレン１１０に、標識抗体１５０を含む反応部が形成されていてもよい。反応部は、試料が流れる方向において、判定部１３０よりも上流側に設けることができる。なお、図３における試料添加部１２０を反応部として利用してもよい。テストストリップ２００が反応部を有する場合、アナライト１６０を含む試料を、反応部又は試料添加部１２０に供すると、反応部において、試料に含まれるアナライト１６０と標識抗体１５０とを接触させることができる。この場合、試料を、単に反応部又は試料添加部１２０に供することで、アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を形成させることができるので、いわゆる１ステップ型のイムノクロマトグラフが可能になる。
【００５７】
反応部は、アナライト１６０と特異的に結合する標識抗体１５０を含む限り特に限定されないが、メンブレン１１０に、直接、標識抗体１５０が塗布されてなるものであってもよい。あるいは、反応部は、例えばセルロース濾紙、グラスファイバー、不織布等からなるパッド（コンジュゲートパッド）に標識抗体１５０を含浸したものを、メンブレン１１０に固定してなるものであってもよい。
【００５８】
＜コントロール部＞
図示は省略するが、テストストリップ２００は、メンブレン１１０に、試料が展開する方向において、標識抗体１５０と特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなるコントロール部が形成されていてもよい。判定部１３０とともに、コントロール部でも発色強度が測定されることにより、テストストリップ２００に供した試料が展開して、反応部及び判定部１３０に到達し、検査が正常に行われたことを確認することができる。なお、コントロール部は、捕捉リガンド１３１の代わりに、標識抗体１５０と特異的に結合する別の種類の捕捉リガンドを用いることを除いては、上述の判定部１３０と同様にして作製され、同様の構成を採ることができる。
【００５９】
［アナライトの測定方法］
次に、テストストリップ２００を用いて行われる本発明の一実施の形態のアナライト１６０の測定方法について説明する。
【００６０】
本実施の形態のアナライト１６０の測定方法は、試料中に含まれるアナライト１６０を検出又は定量するアナライト１６０の測定方法である。本実施の形態のアナライト１６０の測定方法は、メンブレン１１０、及び当該メンブレン１１０にアナライト１６０と特異的に結合する捕捉リガンド１３１が固定されてなる判定部１３０を含むテストストリップ２００を用いる。そして、本実施の形態のアナライト１６０の測定方法は、下記工程（Ｉ）〜（ＩＩＩ）；
工程（Ｉ）：試料に含まれる前記アナライト１６０と、該アナライト１６０に特異的に結合する抗体を、樹脂粒子１０に複数の金属ナノ粒子２０が固定化された構造を有する金属ナノ粒子−セルロース複合体１００で標識した標識抗体１５０と、を接触させる工程、
工程（ＩＩ）：判定部１３０にて、工程（Ｉ）において形成された、アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を、捕捉リガンド１３１に接触させる工程、
工程（ＩＩＩ）：金属ナノ粒子−セルロース複合体１００の局在型表面プラズモン共鳴及び、電子遷移による光エネルギー吸収に由来する発色強度を測定する工程、
を含むことができる。
【００６１】
工程（Ｉ）：
工程（Ｉ）は、試料に含まれるアナライト１６０を、標識抗体１５０に接触させる工程である。アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を形成する限り、接触の態様は特に限定されるものではない。例えば、テストストリップ２００の試料添加部１２０又は反応部（図示省略）に試料を供し、当該反応部においてアナライト１６０を標識抗体１５０に接触させてもよいし、テストストリップ２００に試料を供する前に、試料中のアナライト１６０を標識抗体１５０に接触させてもよい。
【００６２】
工程（Ｉ）で形成された複合体１７０は、テストストリップ２００上で展開して移動し、判定部１３０に至る。
【００６３】
工程（ＩＩ）：
工程（ＩＩ）は、テストストリップ２００の判定部１３０において、工程（Ｉ）において形成された、アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を、捕捉リガンド１３１に接触させる。複合体１７０を、捕捉リガンド１３１に接触させると、捕捉リガンド１３１は、複合体１７０のアナライト１６０に特異的に結合する。その結果、複合体１７０が判定部１３０において捕捉される。
【００６４】
なお、捕捉リガンド１３１は、標識抗体１５０には特異的に結合しないために、アナライト１６０と未結合の標識抗体１５０が判定部１３０に到達した場合、当該アナライト１６０と未結合の標識抗体１５０は、判定部１３０を通過する。ここで、テストストリップ２００に、標識抗体１５０に特異的に結合する別の捕捉リガンドが固定されたコントロール部（図示省略）が形成されている場合、判定部１３０を通過した標識抗体１５０は、展開を続け、コントロール部で当該別の捕捉リガンドと結合する。その結果、アナライト１６０と複合体１７０を形成していない標識抗体１５０は、コントロール部で捕捉される。
【００６５】
工程（ＩＩ）の後、必要に応じて工程（ＩＩＩ）の前に、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝液等の生化学検査で汎用される緩衝液で、テストストリップ２００を洗浄する洗浄工程を実施してもよい。洗浄工程によって、判定部１３０、又は、判定部１３０及びコントロール部に捕捉されなかった標識抗体１５０（アナライト１６０と結合しておらず、複合体１７０を形成していない標識抗体１５０）を除去することができる。
【００６６】
洗浄工程を実施することで、工程（ＩＩＩ）において、判定部１３０、又は、判定部１３０及びコントロール部における金属ナノ粒子−セルロース複合体１００の局在型表面プラズモン共鳴及び、電子遷移による光エネルギー吸収による発色を測定する際に、バックグラウンドの発色強度を低減させることができ、シグナル／バックグラウンド比を高め、一層、検出感度や定量性を向上させることができる。
【００６７】
工程（ＩＩＩ）：
工程（ＩＩＩ）は、金属ナノ粒子−セルロース複合体１００の局在型表面プラズモン共鳴及び、電子遷移による光エネルギー吸収に由来する発色強度を測定する工程である。上記工程（ＩＩ）又は必要に応じて洗浄工程を実施した後、テストストリップ２００において、金属ナノ粒子−セルロース複合体１００の局在型表面プラズモン共鳴及び、電子遷移による光エネルギー吸収に由来する発色強度を測定する。
【００６８】
なお、テストストリップ２００にコントロール部が形成されている場合、工程（ＩＩ）によって、コントロール部にて、標識抗体１５０が別の捕捉リガンドによって捕捉され複合体が形成される。そのため、工程（ＩＩＩ）では、テストストリップ２００おいて、判定部１３０だけでなく、コントロール部においても局在型表面プラズモン共鳴及び、電子遷移による光エネルギー吸収による発色を生じさせることができる。このように、判定部１３０とともにコントロール部においても発色強度を測定することで、テストストリップ２００に供した試料が正常に展開して、反応部及び判定部１３０に到達したか否かを確認できる。
【００６９】
＜試料及びアナライト＞
本実施の形態のアナライトの測定方法における試料は、アナライト１６０として、蛋白質などの抗原となり得る物質を含むものである限り特に限定されるものではない。例えば、目的のアナライト１６０を含む生体試料（すなわち、全血、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、鼻腔又は咽頭拭い液、髄液、羊水、乳頭分泌液、涙、汗、皮膚からの浸出液、組織や細胞及び便からの抽出液等）や食品の抽出液等が挙げられる。必要に応じて、標識抗体１５０及び捕捉リガンド１３１とアナライト１６０との特異的な結合反応が生じやすくするために、上記工程（Ｉ）に先立って、試料に含まれるアナライト１６０を前処理してもよい。ここで、前処理としては、酸、塩基、界面活性剤等の各種化学薬品等を用いた化学的処理や、加熱・撹拌・超音波等を用いた物理的処理が挙げられる。特に、アナライト１６０がインフルエンザウィルスＮＰ抗原等の、通常は表面に露出していない物質である場合、界面活性剤等による処理を行うことが好ましい。この目的に使用される界面活性剤として、特異的な結合反応、例えば、抗原抗体反応等の捕捉リガンド１３１とアナライト１６０との結合反応性を考慮して、非イオン性界面活性剤を用いることができる。
【００７０】
また、前記試料は、通常の免疫学的分析法で用いられる溶媒（水、生理食塩水、又は緩衝液等）や水混和有機溶媒で適宜希釈されていてもよい。
【００７１】
前記アナライト１６０としては、特に制限はなく公知のものが使用でき、アニオン性の性質が強いものや、カチオン性の性質が強いもの、それ以外のものも使用できる。例えば、腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモン等のタンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等を含む）、核酸（一本鎖又は二本鎖の、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等を含む）又は核酸を有する物質、糖（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等を含む）又は糖鎖を有する物質、脂質などその他の分子が挙げられ、標識抗体１５０及び捕捉リガンド１３１に特異的に結合するものである限り特に限定されないが、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ２タンパク、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＣＡ１９−９、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、免疫抑制酸性タンパク（ＩＡＰ）、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、便潜血、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ＣＫ−ＭＢ、ＣＲＰ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、梅毒抗体、インフルエンザウィルスヒトヘモグロビン、クラミジア抗原、Ａ群β溶連菌抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｓ抗原、ロタウイルス、アデノウイルス、アルブミン、糖化アルブミン等が挙げられる。これらの中でも非イオン性界面活性剤により可溶化される抗原が好ましく、ウィルスの核タンパク質のように自己集合体を形成する抗原がより好ましい。
【００７２】
＜標識抗体＞
標識抗体１５０は、工程（Ｉ）において、試料に含まれるアナライト１６０に接触させて、アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を形成するために使用される。標識抗体１５０は、アナライト１６０に特異的に結合する抗体を、樹脂粒子１０に複数の金属ナノ粒子２０が固定化された構造を有する金属ナノ粒子−セルロース複合体１００で標識化してなるものである。ここで、「標識化」とは、工程（Ｉ）〜（ＩＩＩ）において、標識抗体１５０から金属−樹脂複合体である金属ナノ粒子−セルロース複合体１００が脱離しない程度に、抗体に金属ナノ粒子−セルロース複合体１００が直接的に又は間接的に、化学的又は物理的な結合や吸着等で固定されていることを意味する。例えば、標識抗体１５０は、抗体に金属ナノ粒子−セルロース複合体１００が直接結合してなるものであってもよいし、抗体と金属ナノ粒子−セルロース複合体１００とが、任意のリンカー分子を介して結合してなるものや、それぞれが不溶性粒子に固定されてなるものであってもよい。
【００７３】
また、本実施の形態において、「抗体」としては、特に制限はなく公知のものが使用でき、アニオン性の性質が強いものや、カチオン性の性質が強いもの、それ以外のものも使用できる。例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、遺伝子組み換えにより得られた抗体のほか、抗原と結合能を有する抗体断片［例えば、Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等］などを用いることができる。また、免疫グロブリンとして、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれでもよい。抗体の産生動物種としては、ヒトをはじめ、ヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等）でもよい。抗体の具体例としては、抗ＰＳＡ抗体、抗ＡＦＰ抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗アデノウイルス抗体、抗インフルエンザウィルス抗体、抗ＨＣＶ抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＥ抗体等が挙げられる。
【００７４】
＜標識抗体の好ましい作製方法＞
次に、標識抗体１５０の好ましい作製方法を挙げて説明する。標識抗体１５０の製造は、少なくとも、次の工程Ａ；
工程Ａ）金属ナノ粒子−セルロース複合体１００を第１のｐＨ条件で抗体と混合して結合させることによって、標識抗体１５０を得る工程
を含み、好ましくは、さらに工程Ｂ； 
工程Ｂ）標識抗体１５０を第２のｐＨ条件で処理する工程
を含むことができる。
【００７５】
［工程Ａ］
工程Ａでは、金属ナノ粒子−セルロース複合体１００を第１のｐＨ条件で抗体と混合して標識抗体１５０を得る。工程Ａは、固体状の金属ナノ粒子−セルロース複合体１００を液相中に分散させた状態で抗体と接触させることが好ましい。
【００７６】
第１のｐＨ条件は、金属ナノ粒子−セルロース複合体１００の分散と抗体の活性を維持したまま金属ナノ粒子−セルロース複合体１００と抗体を均一に接触させる観点から、ｐＨ２〜１０の範囲内の条件が好ましく、さらに例えばｐＨ５〜９の範囲内がより好ましい。金属ナノ粒子−セルロース複合体１００と抗体とを結合させるときの条件が、ｐＨ２未満では強酸性により抗体が変質し失活する場合があり、ｐＨ１０を超えると金属ナノ粒子−セルロース複合体１００と抗体を混合した際に凝集し分散が困難となる。ただし、強酸性により抗体が失活しない場合はｐＨ２未満においても処理が可能である。
【００７７】
工程Ａは、第１のｐＨ条件に調整した結合用緩衝液（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）中で行うことが好ましい。例えば、上記ｐＨに調整した結合用緩衝液に所定量の金属−樹脂複合体である金属ナノ粒子−セルロース複合体１００を混合し、十分に混和する。結合用緩衝液としては、例えば、所定濃度に調整したホウ酸溶液などを用いることができる。結合用緩衝液のｐＨの調整は、例えば塩酸、水酸化ナトリウムなどを用いて行うことができる。
【００７８】
次に、得られた混合液に、所定量の抗体を添加し、十分に撹拌、混合することによって、標識抗体含有液を得ることができる。このようにして得られた標識抗体含有液は、例えば遠心分離などの固液分離手段により、固形部分として標識抗体１５０のみを分取できる。
【００７９】
［工程Ｂ］
工程Ｂでは、工程Ａで得られた標識抗体１５０を第２のｐＨ条件で処理することによって、標識抗体１５０への非特異的な吸着を抑制するブロッキングを行う。この場合、固液分離手段によって分取しておいた標識抗体１５０を、第２のｐＨ条件で液相中に分散させる。
【００８０】
第２のｐＨ条件は、抗体の活性を保ちかつ標識抗体１５０の凝集を抑制する観点から、例えばｐＨ２〜１０の範囲内が好ましく、標識抗体１５０の非特異的な吸着を抑制する観点から、ｐＨ５〜９の範囲内がより好ましい。ブロッキングの条件が、ｐＨ２未満では強酸性により抗体が変質し失活する場合があり、ｐＨ１０を超えると標識抗体１５０が凝集してしまい分散が困難となる。
【００８１】
工程Ｂは、ブロッキング剤を第２のｐＨの条件に調製したブロック用緩衝液（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）を用いて行うことが好ましい。例えば、所定量の標識抗体１５０に上記ｐＨに調整したブロック用緩衝液を添加し、ブロック用緩衝液中で標識抗体１５０を均一に分散させる。ブロック用緩衝液としては、例えば、被検出物と結合しない蛋白質の溶液を用いることが好ましい。ブロック用緩衝液に使用可能なブロッキング剤としては、特に制限はなく公知のものが使用でき、アニオン性の性質が強いものや、カチオン性の性質が強いもの、それ以外のものも使用できる。例えば、蛋白質であれば、牛血清アルブミン、卵白アルブミン、カゼイン、ゼラチン、乳清ホエイなどを挙げることができる。より具体的には、所定濃度に調整した牛血清アルブミン溶液などを用いることが好ましい。ブロック用緩衝液のｐＨの調整は、例えば塩酸、水酸化ナトリウムなどを用いて行うことができる。標識抗体１５０の分散には、例えば超音波処理などの分散手段を用いることが好ましい。このようにして標識抗体１５０が均一分散した分散液が得られる。
【００８２】
上記工程Ａおよび工程Ｂにおいて、金属ナノ粒子２０を有する金属ナノ粒子−セルロース複合体１００は、ｐＨによる凝集が起こりにくく、酸性〜アルカリ性まで広い範囲のｐＨで処理が可能である。一方、例えば金粒子を有する樹脂−金複合体の場合は、工程Ａにおいて、ｐＨ７超の条件では樹脂−金複合体同士で凝集する傾向にあり、また、工程Ｂにおいて、ｐＨ９超の条件では樹脂−金複合体同士で凝集する傾向にある。従って、本発明で用いる金属ナノ粒子−セルロース複合体１００は、標識抗体の作製条件の制限を受けにくいという利点もある。
【００８３】
以上のようにして、標識抗体１５０の分散液が得られる。この分散液から、例えば遠心分離などの固液分離手段により、固形部分として標識抗体１５０のみを分取できる。また、必要に応じて、洗浄処理、保存処理などを実施することができる。以下、洗浄処理、保存処理について説明する。
【００８４】
（洗浄処理）
洗浄処理は、固液分離手段によって分取した標識抗体１５０に洗浄用緩衝液を添加し、洗浄用緩衝液中で標識抗体１５０を均一に分散させる。分散には、例えば超音波処理などの分散手段を用いることが好ましい。洗浄用緩衝液としては、特に限定されるものではないが、例えばｐＨ８〜９の範囲内に調整した所定濃度の、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液、グリシンアミド緩衝液、アルギニン緩衝液などを用いることができる。洗浄用緩衝液のｐＨの調整は、例えば塩酸、水酸化ナトリウムなどを用いて行うことができる。標識抗体１５０の洗浄処理は、必要に応じて複数回を繰り返し行うことができる。
【００８５】
（保存処理）
保存処理は、固液分離手段によって分取した標識抗体１５０に保存用緩衝液を添加し、保存用緩衝液中で標識抗体１５０を均一に分散させる。分散には、例えば超音波処理などの分散手段を用いることが好ましい。保存用緩衝液としては、例えば、洗浄用緩衝液に、所定濃度の凝集防止剤及び／又は安定剤を添加した溶液などを用いることができる。凝集防止剤としては、例えば、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロースに代表される糖類や、グリセリン、ポリビニルアルコールに代表される多価アルコールなどを用いることができる。安定剤としては、特に限定されるものではないが、例えば牛血清アルブミン、卵白アルブミン、カゼイン、ゼラチンなどの蛋白質を用いることができる。このようにして標識抗体１５０の保存処理を行うことができる。
【００８６】
以上の各工程では、さらに必要に応じて、界面活性剤や、アジ化ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステルなどの防腐剤を用いることができる。
【００８７】
［アナライト測定用キット］
本発明の一実施の形態に係るアナライト測定用キットは、例えばテストストリップ２００を用いて、本実施の形態のアナライトの測定方法に基づき、試料中に含まれるアナライト１６０の検出又は定量するためのキットである。
【００８８】
本実施の形態のアナライト測定用キットは、
メンブレン１１０と
メンブレン１１０に、前記アナライト１６０と特異的に結合する捕捉リガンド１３１が固定されてなる判定部１３０を含むテストストリップ２００と、
アナライト１６０に特異的に結合する抗体を樹脂粒子１０に複数の金属ナノ粒子２０が固定化された構造を有する金属ナノ粒子−セルロース複合体１００で標識した標識抗体１５０を含む検出試薬と、
を含んでいる。本実施の形態のアナライト測定用キットは、必要に応じて、さらにその他の構成要素を含むものであってもよい。
【００８９】
本実施の形態に係るアナライト測定用キットを使用するにあたっては、試料中のアナライト１６０と検出試薬中の標識抗体１５０とを接触させて工程（Ｉ）を実施した後、テストストリップ２００の反応部又は試料添加部１２０に試料を供して、工程（ＩＩ）、工程（ＩＩＩ）を順次実施してもよい。あるいは、テストストリップ２００の判定部１３０よりも上流側に、検出試薬を塗布して、適宜乾燥させて反応部を形成した後、形成された反応部あるいは該反応部よりも上流側の位置（例えば、試料添加部１２０）に試料を添加して、工程（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を順次実施してもよい。
【実施例】
【００９０】
次に、本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。以下の実施例、比較例において特にことわりのない限り、各種測定、評価は下記によるものである。
【００９１】
＜金属ナノ粒子−セルロース複合体の吸光度測定＞
金属ナノ粒子−セルロース複合体及び金コロイド粒子の吸光度は、石英ガラス製セル（光路長１０ｍｍ）に０．０１ｗｔ％に調製した金属ナノ粒子−セルロース複合体または金コロイドの分散液（分散媒：水）を入れ、分光光度計（島津製作所社製、ＵＶ３６００）を用いて、金−セルロース複合体または金コロイド粒子の場合５７０ｎｍ、白金−セルロース複合体の場合４００ｎｍの吸光度を測定した。
【００９２】
＜固形分濃度測定及び金属担持量の測定＞
磁製るつぼに濃度調整前の分散液１ｇを入れ、７０℃、３時間乾燥を行った。乾燥前後の重量を測定し、下記式により固形分濃度を算出した。
【００９３】
固形分濃度（ｗｔ％）＝［乾燥後の重量（ｇ）／  乾燥前の重量（ｇ）］×  １００
【００９４】
また、上記乾燥処理後のサンプルを、さらに５００℃、５時間熱処理を行い、熱処理前後の重量を測定し、下記式より金属担持量を算出した。
金属担持量（ｗｔ％）＝
［熱処理後の重量（ｇ）／熱処理前の重量（ｇ）］×１００
【００９５】
＜金属ナノ粒子−セルロース複合体の平均粒子径の測定＞
ディスク遠心式粒度分布測定装置（ＣＰＳ  Ｄｉｓｃ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ＤＣ24000  ＵＨＲ、ＣＰＳ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ,  Ｉｎc.社製）を用いて測定した。測定は、金属ナノ粒子−セルロース複合体を水に分散させた状態で行った。
【００９６】
＜金属ナノ粒子の平均粒子径の測定＞
金属ナノ粒子−セルロース複合体分散液をカーボン支持膜付き金属性メッシュへ滴下して作成した基板を、電界放出形走査電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ；日立ハイテクノロジーズ社製、ＳＵ−９０００）により観測した画像から、任意の１００個の金属ナノ粒子の面積平均径を測定した。
【００９７】
＜置換度の測定＞
下記の条件で、日本電子製核磁気共鳴測定装置ＪＮＭ−ＥＣＸ４００を用いて１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、置換度を測定した。
・カルボキシル化セルロース微粒子：重水重苛性ソーダの１１ｗｔ％重水溶液を測定溶媒とし、グルコース骨格のＣ１位に結合するプロトンと、カルボキシルメチル基のメチレンプロトンとの積分値の比から、置換度を測定した。
・アミノ化セルロース微粒子：重水と重酢酸の混合溶液（重水：重酢酸＝４：６〜５：３で適宜調製）を測定溶媒とし、グルコース骨格のＣ１位に結合するプロトンと、アミノメチル基のメチレンプロトンとの積分値の比から、置換度を測定した。
【００９８】
［合成例１］
テトラヒドロフランと純水が８９：１１の重量比になるように調整した混合液５０００ｇを撹拌しながら、公知の方法で調製した銅アンモニアセルロース溶液（セルロース０．３７ｗｔ％、銅濃度０．１３ｗｔ％、アンモニア濃度１．００ｗｔ％）５００ｇを添加した。その後、１０ｗｔ％の硫酸１０００ｇを加え中和することで、セルロース微粒子を含有した懸濁液６５００ｇを得た。
得られた懸濁液を遠心分離し、上澄みを除去した後、純水を加えて再び懸濁させる操作を、上澄みを中性になるまで繰り返し、分散処理後、濃度を調整することで、１．０ｗｔ％のセルロース微粒子分散液１８０ｇを得た。得られたセルロース微粒子の平均粒径を測定した結果２６５ｎｍであり、ＣＶ値（変動係数）は１７％であった。
【００９９】
得られた１．０ｗｔ％のセルロース微粒子分散液２０ｇを遠心分離により上澄みを除去した後、イソプロピルアルコールと純水が８５：１５の重量比になるように調整した混合液１００ｇを加えセルロース微粒子を懸濁させた液を、５０℃、３０分間撹拌した。その後、１１ｗｔ％の水酸化ナトリウム水溶液０．５４ｇを加え、さらに３０分撹拌した。その後、反応液にクロロ酢酸ナトリウム（５６０ｍｇ）を加え、還流下で３時間撹拌を行った後、反応液の温度が２０℃になるまで冷却し、さらに１０％塩酸を加えて反応液のｐＨを酸性にした。得られた反応液を遠心分離し、上澄みを除去した後、純水を加えて再び懸濁させる操作を、上澄みを中性になるまで繰り返し行い、分散処理、濃度調整を行うことで、１．０ｗｔ％のカルボキシル化セルロース微粒子分散液２５ｇを得た。得られたカルボキシル化セルロース微粒子の平均粒径を測定した結果、２７１ｎｍだった。またそのＣＶ値は２１％であった。
さらに核磁気共鳴測定装置を用いて置換度を算出したところ、置換度は、０．４９２であった。
【０１００】
［合成例２］
合成例１で調製した１．０ｗｔ％のセルロース微粒子分散液２０ｇを遠心分離により上澄みを除去した後、９．０ｗｔ％の水酸化ナトリウム水溶液２０ｇを加えセルロース微粒子を懸濁させた液を、５０℃、３０分撹拌した。その後、２−クロロエチルアミン塩酸塩（７．１６ｇ）を加え、還流下で３時間撹拌した後、反応液の温度が２０℃になるまで冷却し、１０％塩酸を加えて反応液を酸性にした。得られた反応液を遠心分離し、上澄みを除去した後、純水を加えて再び懸濁させる操作を、上澄みを中性になるまで繰り返し行い、分散処理、濃度調整を行うことで、１．０ｗｔ％の１級アミノ化セルロース微粒子分散液２３ｇを得た。得られた１級アミノ化セルロース微粒子の平均粒径は２７０ｎｍ、ＣＶ値は２２％、置換度０．３５０であった。
［合成例３］
用いる反応剤を２−ジイソプロピルアミノエチルクロリド塩酸塩（１２．３６ｇ）にしたこと以外は合成例２と同様の方法で３級アミノ化セルロース微粒子を得た。得られた３級アミノ化セルロース微粒子は平均粒径２６９ｎｍ、ＣＶ値２４％であり、置換度０．２５０であった。
［実施例１］
＜金−セルロース複合体粒子Ａの合成＞
合成例１で得られたカルボキシル化セルロース微粒子（２０ｇ）に、４００ｍＭ塩化金酸水溶液（２．５ｇ）を加え、３０℃で３時間撹拌した。この混合液を遠心分離により上澄みを除去することで余分な塩化金を除去した。その後、濃度を調整して、１．００ｗｔ％の金イオン吸着カルボキシル化セルロース微粒子分散液Ａ２３ｇを得た。
【０１０１】
次に、純水２８０ｇに１．００ｗｔ％の金イオン吸着カルボキシル化セルロース微粒子分散液Ａ（２０ｇ）を加え、３℃で撹拌しながら、３０ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液（１０．０ｇ）を２分かけて滴下した後、３℃で１時間、室温で３時間撹拌することで、平均粒子径２８２ｎｍの金−セルロース複合体粒子Ａを得た。反応液を遠心分離により濃縮した後、透析処理により精製し、濃度を調整して、１ｗｔ％の金−セルロース複合体粒子分散液Ａを得た。１ｗｔ％の金−セルロース複合体粒子分散液Ａ中の金−セルロース複合体粒子Ａの吸光度は、０．２２であった。また、Ｆ−３における金ナノ粒子の平均粒子径は１１ｎｍ、金の担持量は７．７ｗｔ％であった。
［実施例２］
＜白金−セルロース複合体粒子Ｂの合成＞
合成例１で得られたカルボキシル化セルロース微粒子（２０ｇ）に、４００ｍＭ塩化白金酸水溶液（２．５ｇ）を加え、３０℃で３時間撹拌した。この混合液を遠心分離により上澄みを除去することで余分な塩化白金を除去した。その後、濃度を調整して、１．００ｗｔ％の白金イオン吸着カルボキシル化セルロース微粒子分散液Ｂ２４ｇを得た。
【０１０２】
次に、純水２８０ｇに１．００ｗｔ％の白金イオン吸着カルボキシル化セルロース微粒子分散液Ｂ（２０ｇ）を加え、３℃で撹拌しながら、７．５ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液（４０ｇ）を２０分かけて滴下した後、３℃で１時間、室温で３時間撹拌することで、平均粒子径２８５ｎｍの白金−セルロース複合体粒子を得た。反応液を遠心分離により濃縮した後、透析処理により精製し、濃度を調整して、１ｗｔ％の白金−樹脂複合体粒子分散液Ｂを得た。１ｗｔ％の白金−樹脂複合体粒子分散液Ｂ中の白金−セルロース複合体粒子Ｂの吸光度は０．３５であった。また、白金ナノ粒子の平均粒子径は３．０ｎｍ、白金の担持量は７．３ｗｔ％であった。
［実施例３］
＜金−セルロース複合体粒子Ｃの合成＞
合成例２で得られた１級アミノ化セルロース微粒子（２０ｇ）に、４００ｍＭ塩化金酸水溶液（２．５ｇ）を加え、３０℃で３時間撹拌した。この混合液を遠心分離により上澄みを除去することで余分な塩化金酸を除去した。その後、濃度を調整して、１．００ｗｔ％の金イオン吸着１級アミノ化セルロース微粒子分散液Ｃ４０ｇを得た。
【０１０３】
次に、純水２８０ｇに１．００ｗｔ％の金イオン吸着１級アミノ化セルロース微粒子分散液Ｃ（２０ｇ）を加え、３℃で撹拌しながら、３０ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液（１０．０ｇ）を２分かけて滴下した後、３℃で１時間、室温で３時間撹拌することで、平均粒子径２８９ｎｍの金−セルロース複合体粒子Ｃを得た。反応液を遠心分離により濃縮した後、透析処理により精製し、濃度を調整して、１ｗｔ％の金−セルロース複合体粒子分散液を得た。１ｗｔ％の金−セルロース複合体粒子分散液Ｃ中の金−セルロース複合体粒子Ｃの吸光度は、０．８０であった。また、金ナノ粒子の平均粒子径は２５ｎｍ、金の担持量は２９．０ｗｔ％であった。
［実施例４］
＜白金−セルロース複合体粒子Ｄの合成＞
合成例２で得られた１級アミノ化セルロース微粒子（２０ｇ）に、４００ｍＭ塩化白金酸水溶液（２．５ｇ）を加え、３０℃で３時間撹拌した。この混合液を遠心分離により上澄みを除去することで余分な塩化白金酸を除去した。その後、濃度を調整して、１．００ｗｔ％の白金イオン吸着１級アミノ化セルロース微粒子分散液Ｄ２９ｇを得た。
【０１０４】
次に、純水２８０ｇに１．００ｗｔ％の白金イオン吸着１級アミノ化セルロース微粒子分散液Ｄ（２０ｇ）を加え、３℃で撹拌しながら、７．５ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液（４０ｇ）を２０分かけて滴下した後、３℃で１時間、室温で３時間撹拌することで、平均粒子径２８７ｎｍの白金−セルロース複合体粒子Ｄを得た。反応液を遠心分離により濃縮した後、透析処理により精製し、濃度を調整して、１ｗｔ％の白金−樹脂複合体粒子分散液Ｄを得た。１ｗｔ％の白金−樹脂複合体粒子分散液Ｄ中の白金−セルロース複合体粒子Ｄの吸光度は０．６８であった。また、白金ナノ粒子の平均粒子径は３．１ｎｍ、白金の担持量は１４．３ｗｔ％であった。
［実施例５］
＜金−セルロース複合体粒子Ｅの合成＞
合成例３で得られた３級アミノ化セルロース微粒子（２０ｇ）に、４００ｍＭ塩化金酸水溶液（２．５ｇ）を加え、３０℃で３時間撹拌した。この混合液を遠心分離により上澄みを除去することで余分な塩化金酸を除去した。その後、濃度を調整して、１．００ｗｔ％の金イオン吸着３級アミノ化セルロース微粒子分散液Ｅ３１ｇを得た。
【０１０５】
次に、純水２８０ｇに１．００ｗｔ％の金イオン吸着３級アミノ化セルロース微粒子分散液Ｅ（２０ｇ）を加え、３℃で撹拌しながら、３０ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液（１０．０ｇ）を２分かけて滴下した後、３℃で１時間、室温で３時間撹拌することで、平均粒子径２７８ｎｍの金−セルロース複合体粒子Ｅを得た。反応液を遠心分離により濃縮した後、透析処理により精製し、濃度を調整して、１ｗｔ％の金−セルロース複合体粒子分散液Ｅを得た。１ｗｔ％の金−セルロース複合体粒子分散液Ｅ中の金−セルロース複合体粒子Ｅの吸光度は、０．４１であった。また、金ナノ粒子の平均粒子径は２２ｎｍ、金の担持量は１５．１ｗｔ％であった。
［実施例６］
＜白金−セルロース複合体粒子Ｆの合成＞
合成例３で得られた３級アミノ化セルロース微粒子（２０ｇ）に、４００ｍＭ塩化白金酸水溶液（２．５ｇ）を加え、３０℃で３時間撹拌した。この混合液を遠心分離により上澄みを除去することで余分な塩化白金酸を除去した。その後、濃度を調整して、１．００ｗｔ％の白金イオン吸着カルボキシル化セルロース微粒子分散液Ｆ２５ｇを得た。
【０１０６】
次に、純水２８０ｇに１．００ｗｔ％の白金イオン吸着１級アミノ化セルロース微粒子分散液Ｆ（２０ｇ）を加え、３℃で撹拌しながら、７．５ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液（４０ｇ）を２０分かけて滴下した後、３℃で１時間、室温で３時間撹拌することで、平均粒子径２７２ｎｍの白金−セルロース複合体粒子Ｆを得た。反応液を遠心分離により濃縮した後、透析処理により精製し、濃度を調整して、１ｗｔ％の白金−樹脂複合体粒子分散液Ｆを得た。１ｗｔ％の白金−樹脂複合体粒子分散液Ｆ中の白金−セルロース複合体粒子Ｆの吸光度は０．３８であった。また、白金ナノ粒子の平均粒子径は２．８ｎｍ、白金の担持量は７．８ｗｔ％であった。
［実施例７］
＜金−セルロース複合体粒子Ｇの合成＞
テトラヒドロフランと純水が８９：１１の重量比になるように調整した混合液５０００ｇを撹拌しながら、公知の方法で調整調製した銅アンモニアセルロース溶液（セルロース０．３７ｗｔ％、銅濃度０．１３ｗｔ％、アンモニア濃度１．００ｗｔ％）５００ｇとキトサン２ｇを添加した。その後、１０ｗｔ％の硫酸１０００ｇを加え中和することで、セルロース−キトサン複合体粒子を含有した懸濁液６５００ｇを得た。
得られた懸濁液を遠心分離し、上澄みを除去した後、純水を加えて再び懸濁させる操作を上澄みが中性になるまで繰り返し、分散処理後、濃度を調整することで、１．００ｗｔ％のセルロース−キトサン微粒子分散液３５０ｇを得た。
得られた１．００ｗｔ％のセルロース−キトサン微粒子分散液２０ｇを遠心分離により上澄みを除去した後、９．０ｗｔ％の水酸化ナトリウム水溶液２０ｇを加えセルロース−キトサン微粒子を懸濁させた液を、５０℃、３０分撹拌した。その後、２−クロロエチルアミン塩酸塩（７．１６ｇ）を加え、還流下で３時間撹拌した後、反応液の温度が２０℃になるまで冷却し、１０％塩酸を加えて反応液のｐＨを酸性にした。得られた反応液を遠心分離し、上澄みを除去した後、純水を加えて再び懸濁させる操作を上澄みのｐＨが中性になるまで繰り返し行い、分散処理、濃度調整を行うことで、１．００ｗｔ％の１級アミノ化セルロース微粒子分散液２３ｇを得た。得られた１級アミノ化セルロース−キトサン複合体粒子の平均粒径を測定した結果３８２ｎｍであり、ＣＶ値は２５％であった。
１級アミノ化セルロース−キトサン微粒子（２０ｇ）に、４００ｍＭ塩化金酸水溶液（２．５ｇ）を加え、３０℃で３時間撹拌した。この混合液を遠心分離により上澄みを除去することで余分な塩化金酸を除去した。その後、濃度を調整して、１．００ｗｔ％の金イオン吸着セルロース−キトサン複合体粒子分散液Ｇを得た。
【０１０７】
次に、純水２８０ｇに１．００ｗｔ％の金イオン吸着１級アミノ化セルロース複合体粒子分散液Ｇ（２０ｇ）を加え、３℃で撹拌しながら、３０ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液（１０．０ｇ）を２分かけて滴下した後、３℃で１時間、室温で３時間撹拌することで、平均粒子径３９８ｎｍの金−セルロース−キトサン複合体粒子Ｇを得た。反応液を遠心分離により濃縮した後、透析処理により精製し、濃度を調整して、１ｗｔ％の金−セルロース−キトサン複合体粒子分散液Ｇを得た。１ｗｔ％の金−セルロース−キトサン複合体粒子分散液中の金−セルロース−キトサン複合体粒子Ｇの吸光度は、１．０５であった。また、金ナノ粒子の平均粒子径は２３ｎｍ、金の担持量は３５．０ｗｔ％であった。
【０１０８】
［実施例８］
＜白金−セルロース複合体粒子Ｈの合成＞
実施例７で得られた１級アミノ化セルロース−キトサン微粒子（２０ｇ）に、４００ｍＭ塩化白金酸水溶液（２．５ｇ）を加え、３０℃で３時間撹拌した。この混合液を遠心分離により上澄みを除去することで余分な塩化白金酸を除去した。その後、濃度を調整して、１．００ｗｔ％の白金イオン吸着セルロース−キトサン複合体粒子分散液Ｈを得た。
【０１０９】
次に、純水２８０ｇに１．００ｗｔ％の白金イオン吸着１級アミノ化セルロース複合体粒子分散液Ｈ（２０ｇ）を加え、３℃で撹拌しながら、７．５ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液（４０．０ｇ）を２０分かけて滴下した後、３℃で１時間、室温で３時間撹拌することで、平均粒子径３９３ｎｍの白金−セルロース−キトサン複合体粒子Ｈを得た。反応液を遠心分離により濃縮した後、透析処理により精製し、濃度を調整して、１ｗｔ％の白金−セルロース−キトサン複合体粒子分散液Ｈを得た。１ｗｔ％の白金−セルロース−キトサン複合体粒子分散液Ｈ中の白金−セルロース−キトサン複合体粒子Ｈの吸光度は、１．３９であった。また、白金ナノ粒子の平均粒子径は５ｎｍ、白金の担持量は２９．８ｗｔ％であった。
【０１１０】
［比較例１］
＜金コロイド粒子Ｉの合成＞
５００ｍｌ三つ口丸底フラスコに１ｍＭ 塩化金酸水溶液を２５０ｍｌ入れ、加熱還流装置を用い、激しく攪拌しながら沸騰させ、沸騰後３８．８ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液を２５ｍｌ添加し、溶液が淡黄色から濃紅色に変化することを確認した。攪拌しながら１０分間加熱を続けた後、室温で３０分程度攪拌放冷をおこなった。孔径２μｍのメンブランフィルターを用いて溶液をろ過し、金コロイド粒子Ｉを得た。平均粒径は１２．３ｎｍであった。また、吸光度は上記方法に従って測定した結果、１．３２であった。
【０１１１】
次に、実施例で得られた金−セルロース複合体粒子、白金−セルロース複合体粒子及び比較例で得られた金コロイド粒子Ｉについて、これらを標識物質として診断試薬用担体に応用し、その性能評価を行った。
【０１１２】
［実施例９］
１ｗｔ％の金−セルロース複合体粒子分散液Ａ０．１ｍＬと、１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）とを混合した液に、抗インフルエンザＡ型モノクローナル抗体を添加し、室温で３時間かけて転倒撹拌を行った。次に、１００００ｒｐｍで遠心分離を行い、上澄みを除去した後、固形分残渣にブロック用緩衝液１ｍＬを添加し、１０〜２０秒間かけて超音波分散処理を行い、さらに、室温で２時間かけて転倒撹拌を行った。次いで、１００００ｒｐｍで遠心分離を行い、上澄みを除去した後、固形分残渣に５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍＬを添加し、１０〜２０秒間かけて超音波分散処理を行った。この操作を３回繰り返し、洗浄処理とした。次に、１００００ｒｐｍで遠心分離を行い、上澄みを除去した後、固形分残渣に保存用緩衝液（５ｍＭトリス溶液に、スクロースを１０重量％濃度になるように添加したもの）１ｍＬを添加し、１０〜２０秒間かけて超音波分散処理を行うことによって、標識抗体含有液ａを得た。
【０１１３】
＜性能評価＞
９６ウェルプレートの１行分の１２ウェルに、標識抗体分散液ａを３μｌずつ入れ、インフルエンザＡ型不活化抗原がそれぞれ２５００、１２５０、６２５、３１３、１５６、７８、４０、２０、１０ＦＦＵ/ｍｌの濃度に調整した液１００μｌを、公知の方法で作製したイムノクロマトグラフ用キットを用いて展開し、５分後、１０分後、１５分後のメンブランフィルター上での反応部位（テストライン）における着色性を目視観察した。着色が認められない場合を（−）、着色が認められる場合を（＋）、着色がはっきり認められる場合を（＋＋）、着色が強く認められる場合を（＋＋＋）とした。性能評価の結果を表１に示した。
【０１１４】
［実施例１０〜１７、比較例２］
金−セルロース複合体粒子分散液Ａに代えて、同じく金属−樹脂複合体である、白金−樹脂複合体粒子分散液Ｂ、金−セルロース複合体粒子分散液Ｃ、白金−樹脂複合体粒子分散液Ｄ、金−セルロース複合体粒子分散液Ｅ、白金−樹脂複合体粒子分散液Ｆ、金−セルロース−キトサン複合体粒子分散液Ｇ、白金−セルロース−キトサン複合体粒子分散液Ｈ、金コロイド粒子の１ｍｇ／０．１ｍＬ水分散液Ｉを使用した他は、実施例１と同じ方法で、標識抗体含有液ｂ〜ｉを得て、これらについて、診断試薬用担体としての性能評価を行った。性能評価の結果を表１に示した。
【０１１５】
【表１】
2019120497.tif 000002
【符号の説明】
【０１１６】
１０    樹脂粒子
２０    金属ナノ粒子
３０    内包粒子
４０    一部露出粒子
５０    表面吸着粒子
６０    表層部
１００  金属ナノ粒子−セルロース複合体
１１０  メンブレン
１２０  試料添加部
１３０  判定部
１３１  捕捉リガンド
１４０  吸液部
１５０  標識抗体
１６０  アナライト
１７０  複合体
２００  テストストリップ
【図１】
2019120497.tif 000003
【図２】
2019120497.tif 000004