(57)【要約】【課題】大腸炎又は大腸癌の予防又は治療剤をスクリーニングする技術を提供する。【解決手段】マウスインテグリンβ７タンパク質のアミノ酸配列の第４５〜６０番目のいずれかの位置に相当するアミノ酸残基のＣ末端側にタグペプチドを挿入した、変異インテグリンβ７タンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウスインテグリンβ７タンパク質のアミノ酸配列の第４５〜６０番目のいずれかの位置に相当するアミノ酸残基のＣ末端側にタグペプチドを挿入した、変異インテグリンβ７タンパク質。
【請求項２】
前記タグペプチドが、ＰＡタグ、ＦＬＡＧタグ又はｍｙｃタグである、請求項１に記載の変異インテグリンβ７タンパク質。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の変異インテグリンβ７タンパク質をコードする核酸。
【請求項４】
インテグリンα４タンパク質及び請求項１又は２に記載の変異インテグリンβ７タンパク質を発現する細胞。
【請求項５】
血球系細胞である、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
ＲＡＳ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１ａ（Ｒａｐ１ａ）及びＲＡＳ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１ｂ（Ｒａｐ１ｂ）を欠損している、請求項４又は５に記載の細胞。
【請求項７】
大腸炎又は大腸癌の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下で、請求項４〜６のいずれか一項に記載の細胞をインキュベートする工程と、
前記細胞における活性型インテグリンα４β７の存在量を定量する工程と、
被験物質の存在下における活性型インテグリンα４β７の存在量が、被験物質の非存在下における存在量と比較して低下することが、前記被験物質が大腸炎又は大腸癌の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法。
【請求項８】
活性型インテグリンα４β７の存在量を定量する前記工程を、前記細胞に、前記タグペプチドに対する特異的結合物質を接触させることにより行い、前記細胞への前記特異的結合物質の結合量が、活性型インテグリンα４β７の存在量に対応する、請求項７に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
活性型インテグリンα４β７に結合し、不活性型インテグリンα４β７に結合しない、特異的結合物質。
【請求項１０】
以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのモノクローナル抗体又はその断片。
（ｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１１〜１３のアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１４、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ、配列番号１５のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片
（ｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１１〜１３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１４、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ、配列番号１５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、活性型インテグリンα４β７に結合し、不活性型インテグリンα４β７に結合しない、モノクローナル抗体又はその断片
（ｉｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１１〜１３のアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１４、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ、配列番号１５のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片と競合し、活性型インテグリンα４β７に結合し、不活性型インテグリンα４β７に結合しない、モノクローナル抗体又はその断片
【請求項１１】
ヒト型抗体である、請求項１０に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項１２】
大腸炎又は大腸癌の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下で、活性型インテグリンα４β７を有する細胞をインキュベートする工程と、
前記細胞における活性型インテグリンα４β７の存在量を定量する工程と、
被験物質の存在下における活性型インテグリンα４β７の存在量が、被験物質の非存在下における存在量と比較して低下することが、前記被験物質が大腸炎又は大腸癌の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法。
【請求項１３】
活性型インテグリンα４β７を有する前記細胞が、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損した細胞である、請求項１２に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
活性型インテグリンα４β７の存在量を定量する前記工程を、前記細胞に、請求項９に記載の特異的結合物質又は請求項１０又は１１に記載のモノクローナル抗体若しくはその断片を接触させることにより行い、前記細胞への前記特異的結合物質又は前記モノクローナル抗体若しくはその断片の結合量が、活性型インテグリンα４β７の存在量に対応する、請求項１２又は１３に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸炎又は大腸癌の予防又は治療剤のスクリーニング方法に関する。より具体的には、変異インテグリンβ７タンパク質、変異インテグリンβ７タンパク質をコードする核酸、インテグリンα４タンパク質及び変異インテグリンβ７タンパク質を発現する細胞、大腸炎又は大腸癌の予防又は治療剤のスクリーニング方法、活性型インテグリンα４β７に結合し、不活性型インテグリンα４β７に結合しない特異的結合物質、モノクローナル抗体又はその断片に関する。
【背景技術】
【０００２】
インテグリンは、細胞膜に存在する細胞接着分子であり、細胞外マトリックスのレセプターとして機能していることが知られている。インテグリンは、α鎖とβ鎖の２つのサブユニットからなるヘテロダイマーである。インテグリンα鎖及びβ鎖には、それぞれ異なるタンパク質が多数存在し、多様な組み合わせが存在する。
【０００３】
インテグリンの１種であるインテグリンα４β７は、Ｔ細胞等で発現することが知られている。インテグリンα４β７には、いくつかのリガンドが存在し、そのうちの１つは、腸管の血管内皮細胞で発現しているＭｕｃｏｓａｌ  Ａｄｄｒｅｓｓｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１（ＭＡｄＣＡＭ−１）である。
【０００４】
図１に示すように、インテグリンα４β７には、不活性型であるｂｅｎｔ  ｆｏｒｍと、活性型であるｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｆｏｒｍの形態が存在する。不活性型のインテグリンα４β７はＭＡｄＣＡＭ−１への結合性を示さないが、活性型のインテグリンα４β７はＭＡｄＣＡＭ−１との結合性を示し、Ｔ細胞の大腸組織へのホーミングに関与している。
【０００５】
インテグリンα４β７の活性化は、潰瘍性結腸炎やクローン病等の炎症性腸疾患の発症に関与すると考えられており、インテグリンα４β７に対するヒト化抗体（ベドリズマブ）が炎症性腸疾患の治療薬として開発されている（例えば特許文献１を参照。）。
【０００６】
ところで、発明者らは、Ｔ細胞特異的にＲＡＳ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１ａ（Ｒａｐ１ａ）及びＲＡＳ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１ｂ（Ｒａｐ１ｂ）を欠損させたマウスが、大腸炎及び大腸癌を自然発症することを以前に明らかにした（非特許文献１を参照）。発明者らはまた、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したマウスでは、大腸組織へのＴ細胞のホーミングが亢進していることを以前に明らかにした。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４１７１０７１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ishihara S., et al., Dual functions of Rap1 are crucial for T-cell homeostasis and prevention of spontaneous colitis, Nat. Commun., 6: 8982, doi: 10.1038/ncomms9982, 2015.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
インテグリンα４β７とＭＡｄＣＡＭ−１との結合を阻害する物質は、炎症性腸疾患の治療薬として利用できると考えられる。インテグリンα４β７とＭＡｄＣＡＭ−１との結合を阻害する物質としては、例えば、特許文献１に記載されたような抗インテグリンα４β７抗体が挙げられる。
【００１０】
これに対し、発明者らは、インテグリンα４β７の活性化を阻害する物質も、大腸炎又は大腸癌の予防又は治療剤になり得ると着想した。ところが、従来、インテグリンα４β７の不活性型及び活性型を簡便に識別する技術は存在しなかった。このため、従来、インテグリンα４β７の不活性型及び活性型の形態変化を指標として、インテグリンα４β７の活性化を阻害する物質をスクリーニングすることはできなかった。
【００１１】
このような背景のもと、本発明は、大腸炎又は大腸癌の予防又は治療剤をスクリーニングする技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は以下の態様を含む。
［１］マウスインテグリンβ７タンパク質のアミノ酸配列の第４５〜６０番目のいずれかの位置に相当するアミノ酸残基のＣ末端側にタグペプチドを挿入した、変異インテグリンβ７タンパク質。
［２］前記タグペプチドが、ＰＡタグ、ＦＬＡＧタグ又はｍｙｃタグである、［１］に記載の変異インテグリンβ７タンパク質。
［３］［１］又は［２］に記載の変異インテグリンβ７タンパク質をコードする核酸。
［４］インテグリンα４タンパク質及び請求項１又は２に記載の変異インテグリンβ７タンパク質を発現する細胞。
［５］血球系細胞である、［４］に記載の細胞。
［６］ＲＡＳ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１ａ（Ｒａｐ１ａ）及びＲＡＳ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１ｂ（Ｒａｐ１ｂ）を欠損している、［４］又は［５］に記載の細胞。
［７］大腸炎又は大腸癌の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で、［４］〜［６］のいずれかに記載の細胞をインキュベートする工程と、前記細胞における活性型インテグリンα４β７の存在量を定量する工程と、被験物質の存在下における活性型インテグリンα４β７の存在量が、被験物質の非存在下における存在量と比較して低下することが、前記被験物質が大腸炎又は大腸癌の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法。
［８］活性型インテグリンα４β７の存在量を定量する前記工程を、前記細胞に、前記タグペプチドに特異的に結合する特異的結合物質を接触させることにより行い、前記細胞への前記特異的結合物質の結合量が、活性型インテグリンα４β７の存在量に対応する、［７］に記載のスクリーニング方法。
［９］活性型インテグリンα４β７に結合し、不活性型インテグリンα４β７に結合しない、特異的結合物質。
［１０］以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのモノクローナル抗体又はその断片。
（ｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１１〜１３のアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１４、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ、配列番号１５のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片
（ｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１１〜１３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１４、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ、配列番号１５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、活性型インテグリンα４β７に結合し、不活性型インテグリンα４β７に結合しない、モノクローナル抗体又はその断片
（ｉｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１１〜１３のアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１４、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ、配列番号１５のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片と競合し、活性型インテグリンα４β７に結合し、不活性型インテグリンα４β７に結合しない、モノクローナル抗体又はその断片
［１１］ヒト型抗体である、［１０］に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
［１２］大腸炎又は大腸癌の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で、活性型インテグリンα４β７を有する細胞をインキュベートする工程と、前記細胞における活性型インテグリンα４β７の存在量を定量する工程と、被験物質の存在下における活性型インテグリンα４β７の存在量が、被験物質の非存在下における存在量と比較して低下することが、前記被験物質が大腸炎又は大腸癌の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法。
［１３］活性型インテグリンα４β７を有する前記細胞が、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損した細胞である、［１２］に記載のスクリーニング方法。
［１４］活性型インテグリンα４β７の存在量を定量する前記工程を、前記細胞に、請求項９に記載の特異的結合物質又は［１０］又は［１１］に記載のモノクローナル抗体若しくはその断片を接触させることにより行い、前記細胞への前記特異的結合物質又は前記モノクローナル抗体若しくはその断片の結合量が、活性型インテグリンα４β７の存在量に対応する、［１２］又は［１３］に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、大腸炎又は大腸癌の予防又は治療剤をスクリーニングする技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】インテグリンα４β７の不活性型と活性型を説明する図である。
【図２】（ａ）及び（ｂ）は、実験例２におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。
【図３】実験例３におけるフローサイトメトリーの代表的な結果を示すグラフである。
【図４】（ａ）及び（ｂ）は、実験例４におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。（ｃ）は、（ａ）及び（ｂ）の結果を数値化したグラフである。
【図５】実験例５におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図６】実験例５におけるフローサイトメトリーの結果を数値化したグラフである。
【図７】（ａ）及び（ｂ）は、実験例７におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。（ｃ）及び（ｄ）は、フローサイトメトリーの結果を数値化したグラフである。
【図８】（ａ）〜（ｄ）は、実験例８におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。（ｅ）は、フローサイトメトリーの結果を数値化したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
［変異インテグリンβ７タンパク質］
１実施形態において、本発明は、マウスインテグリンβ７タンパク質のアミノ酸配列の第４５〜６０番目のいずれかの位置に相当するアミノ酸残基のＣ末端側にタグペプチドを挿入した、変異インテグリンβ７タンパク質を提供する。
【００１６】
本実施形態の変異インテグリンβ７タンパク質は、インテグリンα４β７が活性型になった場合にのみ露出する位置にタグペプチドを有していると考えられる。このため、本実施形態の変異インテグリンβ７タンパク質を有するインテグリンα４β７は、活性型になった場合に上記タグペプチドを特異的に認識する抗体等（以下、「タグ特異的結合物質」という場合がある。）が結合するが、不活性型の状態では結合しない。
【００１７】
実施例において後述するように、本実施形態の変異インテグリンβ７タンパク質によれば、インテグリンα４β７に、タグ特異的結合物質が結合するか否かを判定することにより、当該インテグリンα４β７が不活性型であるか活性型であるかを簡便に識別することができる。
【００１８】
タグペプチドを挿入する前のインテグリンβ７タンパク質は、ヒト由来のタンパク質であってもよいし、非ヒト動物由来のタンパク質であってもよい。非ヒト動物としては特に限定されず、例えば、マウス、ラット、ブタ、ヤギ、ヒツジ、サル等が挙げられる。
【００１９】
また、タグペプチドを挿入する前のインテグリンβ７タンパク質は、インテグリンα４タンパク質とヘテロダイマーを形成して活性化した場合にＭＡｄＣＡＭ−１に対する結合能を有している限り、野生型のインテグリンβ７のアミノ酸配列に対して１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有していてもよい。ここで、数個とは、１〜１０個であってもよく、１〜５個であってもよく、１〜３個であってもよく、１〜２個であってもよい。
【００２０】
本実施形態の変異インテグリンβ７タンパク質において、タグペプチドとしては、タグ特異的結合物質を用いて検出可能なものであれば特に限定されず、例えば、ＰＡタグ（配列番号１）、ＦＬＡＧタグ（配列番号２）、ｍｙｃタグ（配列番号３）等が挙げられるがこれらに限定されない。タグペプチドの長さは、例えば５〜２０アミノ酸であってもよく、５〜１８アミノ酸であってもよく、５〜１５アミノ酸であってもよい。
【００２１】
本明細書において、特異的結合物質としては、例えば、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。特異的結合物質が抗体又は抗体断片である場合、抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。また、アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。
【００２２】
本実施形態の変異インテグリンβ７タンパク質がマウス由来である場合、マウスインテグリンβ７タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）の第４５〜６０番目のいずれかの位置、好ましくは第４５〜５５番目のいずれかの位置、より好ましくは第４５〜５０番目のいずれかの位置、更に好ましくは第４８番目の位置のＣ末端側に、タグペプチドのアミノ酸配列を挿入したタンパク質が、本実施形態の変異インテグリンβ７タンパク質である。なお、マウスインテグリンβ７タンパク質は、第４５番目のシステイン残基と第６１番目のシステイン残基との間でＳ−Ｓ結合を形成する。
【００２３】
また、本実施形態の変異インテグリンβ７タンパク質が、マウス以外の種のインテグリンβ７タンパク質に由来する場合、マウスインテグリンβ７タンパク質のアミノ酸配列の、例えば第４８番目の位置に相当するアミノ酸残基は、次のようにして求めることができる。
【００２４】
まず、マウスインテグリンβ７タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）と、上記マウス以外の種のインテグリンβ７タンパク質のアミノ酸配列とを、最もホモロジーが高くなるようにアラインメントする。
【００２５】
アラインメントされた当該種のアミノ酸配列において、マウスインテグリンβ７タンパク質のアミノ酸配列の第４８番目に対応する位置にあるアミノ酸残基が、マウスインテグリンβ７タンパク質のアミノ酸配列の第４８番目の位置に相当するアミノ酸残基である。
【００２６】
例えば、本実施形態の変異インテグリンβ７タンパク質が、ヒトインテグリンβ７タンパク質に由来する場合、マウスインテグリンβ７タンパク質のアミノ酸配列の第４８番目に対応する位置にあるアミノ酸残基は、ヒトインテグリンβ７タンパク質のアミノ酸配列（配列番号５）の第４８番目のアラニン残基に対応する。
【００２７】
そして、当該アミノ酸残基のＣ末端側に、タグペプチドのアミノ酸配列を挿入したタンパク質が、本実施形態の変異インテグリンβ７タンパク質である。また、実施例において後述するように、タグペプチドの挿入において、遺伝子組換えの都合等により、タグペプチドに隣接する位置（Ｎ末端側又はＣ末端側又はその両方）に合計で１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加される場合があるが、これは許容される。ここで、数個とは、１〜５個であってもよく、１〜３個であってもよく、１〜２個であってもよい。
【００２８】
［変異インテグリンβ７タンパク質をコードする核酸］
１実施形態において、本発明は、上述した変異インテグリンβ７タンパク質をコードする核酸を提供する。
【００２９】
実施例において後述するように、本実施形態の核酸を、インテグリンα４を発現する細胞に導入して発現させることにより、インテグリンα４β７を発現した細胞を得ることができる。
【００３０】
あるいは、本実施形態の核酸の発現ベクターと、インテグリンα４の発現ベクターとを細胞中で共発現することによっても、インテグリンα４β７を発現した細胞を得ることができる。
【００３１】
これらの細胞が発現するインテグリンα４β７は、上述したタグ特異的結合物質が結合するか否かを判定することにより、不活性型であるか活性型であるかを簡便に識別することができる。
【００３２】
［細胞］
１実施形態において、本発明は、インテグリンα４タンパク質及び上述した変異インテグリンβ７タンパク質を発現する細胞を提供する。
【００３３】
本実施形態の細胞が発現するインテグリンα４β７は、上述したタグ特異的結合物質が結合するか否かを判定することにより、不活性型であるか活性型であるかを容易に識別することができる。このため、本実施形態の細胞は、例えば、後述する、大腸炎又は大腸癌の予防又は治療剤のスクリーニングに好適に用いることができる。
【００３４】
本実施形態の細胞は、内在性のインテグリンβ７タンパク質を発現しない細胞であることが好ましい。内在性のインテグリンβ７タンパク質を発現しない細胞は、例えば、内在性のインテグリンβ７タンパク質をコードする遺伝子をノックアウト又はノックダウンすることにより得ることができる。
【００３５】
実施例において後述するように、本実施形態の細胞は、血球系細胞であってもよい。また、実施例において後述するように、本実施形態の細胞は、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損していてもよい。実施例において後述するように、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損した細胞では、インテグリンα４β７が活性型になる。そこで、このような細胞を用いることにより、例えば、活性型のインテグリンα４β７を不活性型に変化させる物質をスクリーニングすることができる。
【００３６】
［大腸炎又は大腸癌の予防又は治療剤のスクリーニング方法］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、インテグリンα４タンパク質及び上述した変異インテグリンβ７タンパク質を発現する細胞をインキュベートする工程と、前記細胞における活性型インテグリンα４β７の存在量を定量する工程と、被験物質の存在下における活性型インテグリンα４β７の存在量が、被験物質の非存在下における存在量と比較して低下することが、前記被験物質が大腸炎又は大腸癌の予防又は治療剤であることを示す、大腸炎又は大腸癌の予防又は治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００３７】
第１実施形態のスクリーニング方法では、インテグリンα４タンパク質及び上述した変異インテグリンβ７タンパク質を発現する細胞を用いてスクリーニングを行う。この細胞が発現するインテグリンα４β７は、前記タグペプチドに対する特異的結合物質（上述したタグ特異的結合物質）が結合するか否かを判定することにより、不活性型であるか活性型であるかを容易に識別することができる。
【００３８】
したがって、活性型インテグリンα４β７の存在量を定量する前記工程を、前記細胞に、前記タグ特異的結合物質を接触させることにより行ってもよい。この場合、前記細胞への前記特異的結合物質の結合量が、活性型インテグリンα４β７の存在量に対応する。
【００３９】
被験物質としては特に制限されず、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等が挙げられる。
【００４０】
被験物質の存在下における活性型インテグリンα４β７の存在量が、被験物質の非存在下における存在量と比較して低下した場合、前記被験物質が大腸炎又は大腸癌の予防又は治療剤であると判断することができる。すなわち、被験物質は、大腸炎を惹起する病原性エフェクターＴ細胞が大腸粘膜固有層へホーミングするのを阻止することができるため、大腸炎を軽減し、続発する大腸癌を予防できると期待される。
【００４１】
本実施形態のスクリーニング方法によれば、例えば、低分子化合物である大腸炎又は大腸癌の予防又は治療剤をスクリーニングできる可能性がある。
【００４２】
例えば、特許文献１に記載された抗体は、常に注射で患者に投与する必要があり、患者に負担がかかる場合がある。これに対し、低分子化合物である薬物は、経口投与できる場合があり、患者への負担を軽減することができる。
【００４３】
［活性型インテグリンα４β７に結合し、不活性型インテグリンα４β７に結合しない特異的結合物質］
１実施形態において、本発明は、活性型インテグリンα４β７に結合し、不活性型インテグリンα４β７に結合しない、特異的結合物質を提供する。
【００４４】
特異的結合物質は、上述したものと同様であり、例えば、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。特異的結合物質が抗体又は抗体断片である場合、抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。また、アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。
【００４５】
実施例において後述するように、発明者らは、インテグリンα４β７が活性型になった場合にのみ露出する位置にタグペプチドを有する変異インテグリンβ７タンパク質の取得に成功した。この結果は、活性型インテグリンα４β７に結合し、不活性型インテグリンα４β７に結合しない特異的結合物質を取得できることを示す。
【００４６】
また、上記の変異インテグリンβ７タンパク質は、マウスインテグリンβ７タンパク質のアミノ酸配列の第４５〜６０番目のいずれかの位置に相当するアミノ酸残基のＣ末端側にタグペプチドを挿入したものである。したがって、本実施形態の特異的結合物質は、マウスインテグリンβ７タンパク質のアミノ酸配列の第４５〜６０番目に相当する領域に近い領域に結合するものであると考えられる。
【００４７】
このような特異的結合物質は、例えば、次のようにして取得することができる。まず、タグペプチドが挿入されていない、野生型のインテグリンβ７タンパク質に対する特異的結合物質を多数作製する。インテグリンβ７タンパク質は、ヒト由来のタンパク質であってもよいし、非ヒト動物由来のタンパク質であってもよい。非ヒト動物としては特に限定されず、例えば、マウス、ラット、ブタ、ヤギ、ヒツジ、サル等が挙げられる。
【００４８】
例えば、特異的結合物質が抗体又は抗体断片である場合、マウス等の動物にインテグリンβ７タンパク質又はその部分ペプチドを抗原として免疫することにより、インテグリンβ７タンパク質に対する抗体を作製することができる。あるいは、ファージライブラリー等の抗体ライブラリのスクリーニング等によりインテグリンβ７タンパク質に対する抗体断片を作製することもできる。
【００４９】
また、特異的結合物質が核酸アプタマーである場合、例えば、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法等により、インテグリンβ７タンパク質に対する核酸アプタマーを作成することができる。
【００５０】
また、特異的結合物質がペプチドアプタマーである場合、例えば、酵母を用いたＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法等により、インテグリンβ７タンパク質に対するペプチドアプタマーを作製することができる。
【００５１】
続いて、得られた特異的結合物質をスクリーニングし、活性型インテグリンα４β７に結合し、不活性型インテグリンα４β７に結合しないものをスクリーニングする。スクリーニングとの方法は特に限定されず、例えば次のようにして行うことができる。
【００５２】
例えば、インテグリンα４β７は、マンガンイオンの存在下で活性化することが知られている。そこで、インテグリンα４β７を発現する細胞の懸濁液にマンガンイオンを添加する。これにより、インテグリンα４β７が活性型になる。
【００５３】
続いて、この細胞に、スクリーニング対象である特異的結合物質を結合させる。続いて、細胞に特異的結合物質が結合したか否かを判定する。例えばフローサイトメトリーを用いて、細胞に特異的結合物質が結合したか否かを判定することができる。その結果、細胞に結合した特異的結合物質は、活性型インテグリンα４β７に結合するものである。
【００５４】
続いて、活性型インテグリンα４β７に結合した特異的結合物質から、不活性型インテグリンα４β７に結合しないものをスクリーニングする。例えば、インテグリンα４β７を発現する細胞に、マンガンイオンの非存在下でスクリーニング対象である特異的結合物質を結合させる。続いて、細胞に特異的結合物質が結合したか否かを判定する。例えばフローサイトメトリーを用いて、細胞に特異的結合物質が結合したか否かを判定することができる。
【００５５】
その結果、細胞に結合しなかった特異的結合物質は、活性型インテグリンα４β７に結合し、不活性型インテグリンα４β７に結合しない、特異的結合物質である。
【００５６】
［モノクローナル抗体又はその断片］
１実施形態において、本発明は、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのモノクローナル抗体又はその断片を提供する。
（ｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１１〜１３のアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１４、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ、配列番号１５のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片
（ｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１１〜１３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１４、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ、配列番号１５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、活性型インテグリンα４β７に結合し、不活性型インテグリンα４β７に結合しない、モノクローナル抗体又はその断片
（ｉｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１１〜１３のアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１４、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ、配列番号１５のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片と競合し、活性型インテグリンα４β７に結合し、不活性型インテグリンα４β７に結合しない、モノクローナル抗体又はその断片
【００５７】
ここで、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒとは、ロイシン、バリン、セリンがこの順に結合したアミノ酸配列を意味する。
【００５８】
実施例において後述するように、発明者らは、活性型インテグリンα４β７に結合し、不活性型インテグリンα４β７に結合しないモノクローナル抗体（以下、「Ｇ３＿１８モノクローナル抗体」という場合がある。）を得た。
【００５９】
発明者らはまた、Ｇ３＿１８モノクローナル抗体の重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３は、それぞれ配列番号１１〜１３に表されるアミノ酸配列からなることを明らかにした。また、Ｇ３＿１８モノクローナル抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３は、それぞれ配列番号１４、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ、配列番号１５に表されるアミノ酸配列からなることを明らかにした。
【００６０】
活性型インテグリンα４β７に結合し、不活性型インテグリンα４β７に結合しない、モノクローナル抗体又はその断片は、Ｇ３＿１８抗体に限定されず、Ｇ３＿１８抗体と同等以上の反応性を有するものであれば、Ｇ３＿１８抗体に対して変異を有していてもよい。
【００６１】
すなわち、上述のモノクローナル抗体又はその断片は、重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１１〜１３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１４、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ、配列番号１５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、活性型インテグリンα４β７に結合し、不活性型インテグリンα４β７に結合しない、モノクローナル抗体又はその断片であってもよい。
【００６２】
ここで、重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３における１若しくは数個とは、１〜４個、１〜３個又は１〜２個を意味する。また、軽鎖可変領域のＣＤＲ１又はＣＤＲ３における１若しくは数個とは、１〜４個、１〜３個又は１〜２個を意味する。また、軽鎖可変領域のＣＤＲ２における１若しくは数個とは１個を意味する。
【００６３】
あるいは、上述のモノクローナル抗体又はその断片は、重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１１〜１３のアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１４、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ、配列番号１５のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片と競合し、活性型インテグリンα４β７に結合し、不活性型インテグリンα４β７に結合しない、モノクローナル抗体又はその断片であってもよい。
【００６４】
ここで、対象の抗体が競合するとは、例えば、活性型インテグリンα４β７にＧ３＿１８抗体を反応させた後に、対象の抗体を反応させた場合に、Ｇ３＿１８抗体と活性型インテグリンα４β７との結合を少なくとも一部解離させて、活性型インテグリンα４β７と結合することを意味する。
【００６５】
ここで、少なくとも一部とは、上記の活性型インテグリンα４β７のモル数の１０％以上であってもよく、３０％以上であってもよく、５０％以上であってもよく、７０％以上であってもよく、９０％以上であってもよい。
【００６６】
活性型インテグリンα４β７は、例えば、細胞表面にインテグリンα４β７を発現させ、インテグリンα４β７が活性化する条件下に置くことで用意することができる。インテグリンα４β７が活性化する条件とは、例えば、インテグリンα４β７を発現する細胞の懸濁液にマンガンイオンを添加する条件であってもよいし、例えばインテグリンα４β７を発現する細胞においてＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂをノックアウト又はノックダウンする条件であってもよい。
【００６７】
抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを適切なリンカーで連結したｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ（ｓｃＦｖ）等が挙げられる。ｓｃＦｖのリンカーとしては、例えば、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号１６）等のペプチドが挙げられるがこれに限定されない。
【００６８】
本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片はヒト型抗体であってもよい。ヒト型抗体としては、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体等が挙げられる。ここで、キメラ抗体とは、可変領域が非ヒト動物由来の抗体であり、定常領域の少なくとも一部がヒト由来の抗体である抗体を意味する。また、ヒト化抗体とは、重鎖及び軽鎖の相補性決定領域のみが非ヒト動物由来の抗体であり、定常領域及びフレームワーク領域がヒト由来の抗体である抗体を意味する。また、完全ヒト抗体とは、相補性決定領域を含めて全体がヒト由来の抗体を意味する。モノクローナル抗体又はその断片が、ヒト型抗体又はその断片であれば、ヒトに投与しても免疫原性が低いため、アナフィラキシーショック等の副作用を抑制することができる。
【００６９】
［大腸炎又は大腸癌の予防又は治療剤のスクリーニング方法］
（第２実施形態）
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、活性型インテグリンα４β７を有する細胞をインキュベートする工程と、前記細胞における活性型インテグリンα４β７の存在量を定量する工程と、被験物質の存在下における活性型インテグリンα４β７の存在量が、被験物質の非存在下における存在量と比較して低下することが、前記被験物質が大腸炎又は大腸癌の予防又は治療剤であることを示す、大腸炎又は大腸癌の予防又は治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００７０】
第２実施形態のスクリーニング方法は、第１実施形態のスクリーニング方法と比較して、スクリーニングに使用する細胞が主に異なる。第１実施形態のスクリーニング方法では、インテグリンα４タンパク質及び上述した変異インテグリンβ７タンパク質を発現する細胞を用いてスクリーニングを行う。これに対し、第２実施形態のスクリーニング方法では、インテグリンα４タンパク質及びタグペプチドが挿入されていないインテグリンβ７タンパク質を発現する細胞、すなわち、野生型のインテグリンα４β７を発現する細胞を用いてスクリーニングを行う。
【００７１】
被験物質としては第１実施形態のスクリーニング方法と同様のものを用いることができる。活性型インテグリンα４β７を有する細胞としては、例えば、上述した、インテグリンα４β７を発現する細胞の懸濁液にマンガンイオンを添加して、インテグリンα４β７を活性型に変化させた細胞を用いることができる。
【００７２】
あるいは、活性型インテグリンα４β７を有する細胞として、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損した細胞を用いてもよい。実施例において後述するように、発明者らは、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損した細胞では、インテグリンα４β７が活性型に変化することを明らかにした。
【００７３】
第２実施形態のスクリーニング方法では、活性型インテグリンα４β７の存在量を定量する前記工程を、前記細胞に、上述した、活性型インテグリンα４β７に結合し、不活性型インテグリンα４β７に結合しない特異的結合物質又はモノクローナル抗体若しくはその断片を接触させることにより行ってもよい。この場合、前記細胞への前記特異的結合物質の結合量が、活性型インテグリンα４β７の存在量に対応する。
【００７４】
被験物質の存在下における活性型インテグリンα４β７の存在量が、被験物質の非存在下における存在量と比較して低下した場合、前記被験物質が大腸炎又は大腸癌の予防又は治療剤であると判断することができる。
【００７５】
第２実施形態のスクリーニング方法によれば、天然型のインテグリンα４β７を用いてスクリーニングすることができるため、有効な大腸炎又は大腸癌の予防又は治療剤をスクリーニングできる可能性が高まる。
【実施例】
【００７６】
［実験例１］
（変異インテグリンβ７タンパク質をコードする遺伝子断片の調製）
さまざまな位置にＰＡタグ（配列番号１）を挿入した、変異インテグリンβ７タンパク質をコードする遺伝子断片を作製した。インテグリンβ７タンパク質としては、マウスインテグリンβ７タンパク質を使用した。
【００７７】
作製した遺伝子断片がコードする変異インテグリンβ７タンパク質の概要を表１に示す。表１中、「タグ挿入位置」に記載の数字は、マウスインテグリンβ７タンパク質の当該位置のアミノ酸残基のＣ末端側にタグペプチドを挿入したことを示す。
【００７８】
【表１】
2019110893.tif 000002
【００７９】
［実験例２］
（ＢＡＦ細胞の内在性のインテグリンβ７遺伝子のノックアウト）
マウス血球系の細胞であるＢＡＦ細胞は、インテグリンα４β７を発現している。そこで、まず、ＢＡＦ細胞の内在性のインテグリンβ７遺伝子をゲノム編集によりノックアウトした。
【００８０】
図２（ａ）は、ＢＡＦ細胞におけるインテグリンβ７タンパク質の発現量をフローサイトメトリーで解析した結果を示すグラフである。また、図２（ｂ）は、インテグリンβ７遺伝子をノックアウトしたＢＡＦ細胞（ＢＡＦ／β７  ＫＯ細胞）におけるインテグリンβ７タンパク質の発現量をフローサイトメトリーで解析した結果を示すグラフである。各グラフには、アイソタイプコントロール抗体を反応させた結果を対照として同時に示す。
【００８１】
その結果、ＢＡＦ／β７  ＫＯ細胞はインテグリンβ７タンパク質を発現しておらず、目的通りノックアウトできたことが確認された。
【００８２】
［実験例３］
（ＢＡＦ／β７  ＫＯ細胞における変異インテグリンβ７タンパク質の発現）
実験例２で作製したＢＡＦ／β７  ＫＯ細胞に、実験例１で作製した各変異インテグリンβ７タンパク質をコードする遺伝子の発現ベクターを導入し、安定発現細胞株を得た。
【００８３】
図３は、変異インテグリンβ７タンパク質を発現させたＢＡＦ／β７  ＫＯ細胞におけるインテグリンβ７タンパク質の発現量をフローサイトメトリーで解析した代表的な結果を示すグラフである。グラフには、アイソタイプコントロール抗体を反応させた結果を対照として同時に示す。その結果、ＢＡＦ／β７  ＫＯ細胞は導入した変異インテグリンβ７タンパク質を発現したことが確認された。
【００８４】
これにより、ＢＡＦ／β７  ＫＯ細胞の内在性のインテグリンα４タンパク質と、導入した変異インテグリンβ７タンパク質がヘテロダイマーを形成し、インテグリンα４β７タンパク質が形成される。
【００８５】
［実験例４］
（インテグリンα４β７の活性化の検出）
インテグリンα４β７は、マンガンイオンの存在下で活性化することが知られている。そこで、フローサイトメトリーにより、マンガンイオンの存在下及び非存在下において、実験例３で作製した各安定発現細胞株と抗ＰＡ抗体との反応性を検討した。
【００８６】
その結果、変異インテグリンβ７タンパク質として、実験例１で作製したｉＰＡ４を発現させたＢＡＦ／β７  ＫＯ細胞（以下、「ｉＰＡ４細胞」という場合がある。）において、インテグリンα４β７の活性化を検出することができることが明らかとなった。
【００８７】
図４（ａ）は、マンガンイオンの非存在下（インテグリンα４β７が不活性型の状態）のｉＰＡ４細胞における抗ＰＡ抗体の結合量をフローサイトメトリーで解析した結果を示すグラフである。また、図４（ｂ）は、マンガンイオンの存在下（インテグリンα４β７が活性型の状態）のｉＰＡ４細胞における抗ＰＡ抗体の結合量をフローサイトメトリーで解析した結果を示すグラフである。各グラフには、アイソタイプコントロール抗体を反応させた結果を対照として同時に示す。また、図４（ｃ）は、図４（ａ）及び（ｂ）を数値化したグラフである。
【００８８】
その結果、不活性型のインテグリンα４β７に対する抗ＰＡ抗体の結合量と比較して、活性型のインテグリンα４β７に対する抗ＰＡ抗体の結合量が顕著に増加することが明らかとなった。なお、実験例１で作製したｉＰＡ４以外の変異インテグリンβ７タンパク質を発現させたＢＡＦ／β７  ＫＯ細胞では、マンガンイオンの存在下及び非存在下で抗ＰＡ抗体の結合量の顕著な差は認められなかった。
【００８９】
この結果から、変異インテグリンβ７タンパク質（ｉＰＡ４）を用いることにより、インテグリンα４β７の不活性型及び活性型を簡便に識別することができることが明らかとなった。
【００９０】
［実験例５］
（Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂのノックダウンによるインテグリンα４β７の活性化）
発明者らは、以前に、Ｔ細胞におけるＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損させたマウスが大腸炎及び大腸癌を自然発症することを明らかにした（非特許文献１を参照。）。そこで、実験例３で作製したｉＰＡ４細胞においてＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂをノックダウンし、インテグリンα４β７が活性化されるか否かを検討した。
【００９１】
まず、ｓｈＲＮＡの導入により、ｉＰＡ４細胞のＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂをノックダウンした。図５は、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂをノックダウンしたｉＰＡ４細胞において、Ｒａｐ１タンパク質の発現を検出したウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。ローディングコントロールとしてβアクチンを検出した。図５中、「対照」は、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂのノックダウンを行っていないｉＰＡ４細胞を解析した結果を示す。
【００９２】
その結果、ｉＰＡ４細胞においてＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂをノックダウンできたことが確認された。
【００９３】
続いて、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂをノックダウンしたｉＰＡ４細胞に抗ＰＡ抗体を反応させ、その結合量をフローサイトメトリーで解析した。また、対照として、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂのノックダウンを行っていないｉＰＡ４細胞についても同様の検討を行った。
【００９４】
図６は、対照のｉＰＡ４細胞及びＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂをノックダウンしたｉＰＡ４細胞への抗ＰＡ抗体の結合量を測定した結果を示すグラフである。図６中、「Ｒａｐ１  ａ／ｂ  ＫＤ」はＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂをノックダウンしたｉＰＡ４細胞の結果であることを示す。
【００９５】
その結果、図６に示すように、ｉＰＡ４細胞におけるＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂをノックダウンすることにより、ｉＰＡ４細胞への抗ＰＡ抗体の結合量が顕著に増加することが明らかとなった。
【００９６】
この結果は、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂのノックダウンによってインテグリンα４β７の活性化が誘導されたことを示す。また、この結果から、Ｔ細胞におけるインテグリンα４β７の活性化が、大腸炎及び大腸癌の発症に関連することが明らかとなった。更に、この結果は、ｉＰＡ４細胞を用いて大腸炎又は大腸癌の予防又は治療剤をスクリーニングできることを示す。
【００９７】
［実験例６］
（モノクローナル抗体の作製及びスクリーニング）
配列番号１７のアミノ酸配列からなる融合タンパク質を抗原として、マウスを免疫し、常法により、ハイブリドーマを作製した。上記の融合タンパク質は、Ｎ末端側から順に、マルトース結合タンパク質、リンカーペプチド、及び、マウスインテグリンβ７の第２０〜４７７番目を含んでいた。
【００９８】
続いて、得られたハイブリドーマをクローニングし、フローサイトメトリーによる解析により、活性型インテグリンα４β７に結合し、不活性型インテグリンα４β７に結合しないモノクローナル抗体を産生するクローンをスクリーニングした。その結果、このような反応性を示すモノクローナル抗体として、Ｇ３＿１８抗体を得た。
【００９９】
続いて、Ｇ３＿１８抗体を産生するハイブリドーマからＲＮＡを抽出し、縮重プライマーを用いた常法により、抗体重鎖遺伝子及び抗体軽鎖遺伝子をそれぞれクローニングした。続いて、クローニングした遺伝子の塩基配列を決定し、Ｇ３＿１８抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３、及び、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を同定した。
【０１００】
その結果、Ｇ３＿１８抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３は、それぞれ配列番号１１〜１３に記載のアミノ酸配列からなることが明らかになった。また、Ｇ３＿１８抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３は、それぞれ配列番号１４、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ、配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなることが明らかになった。
【０１０１】
［実験例７］
（Ｇ３＿１８抗体の結合量の解析）
活性型及び不活性型のマウスインテグリンα４β７に対する、Ｇ３＿１８抗体の結合量を、フローサイトメトリーを用いて解析した。
【０１０２】
マウス血球系の細胞であるＢＡＦ細胞は、インテグリンα４β７を発現している。そこで、この細胞株を用いて、Ｇ３＿１８抗体の結合量をフローサイトメトリーで解析した。また、不活性型インテグリンα４β７及び活性型インテグリンα４β７の双方を認識するＦＩＢ５０４抗体（カタログ番号「ａｂ９５８１７」、アブカム社製）の結合量を解析し、この細胞株におけるマウスインテグリンα４β７の発現量を定量した。
【０１０３】
図７（ａ）は、マンガンイオンの非存在下（インテグリンα４β７が不活性型の状態）のＧ３＿１８抗体の結合量をフローサイトメトリーで解析した結果を示すグラフである。また、図７（ｂ）は、マンガンイオンの存在下（インテグリンα４β７が活性型の状態）のＧ３＿１８抗体の結合量をフローサイトメトリーで解析した結果を示すグラフである。各グラフには、アイソタイプコントロール抗体を反応させた結果を対照として同時に示す。また、図７（ｃ）は、図７（ａ）及び（ｂ）におけるＧ３＿１８抗体の結合量を、ＦＩＢ５０４抗体の結合量により標準化し、数値化したグラフである。図７（ｃ）中、「Ｃａ／Ｍｇ」は、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンの存在下（マンガンイオンの非存在下）で測定した結果であることを示し、「Ｍｎ」はマンガンイオンの存在下で測定した結果であることを示す。
【０１０４】
その結果、不活性型のインテグリンα４β７に対するＧ３＿１８抗体の結合量と比較して、活性型のインテグリンα４β７に対するＧ３＿１８抗体の結合量が顕著に増加することが明らかとなった。
【０１０５】
図７（ｄ）は、ＢＡＦ細胞、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂをノックダウンしたＢＡＦ細胞をＣＸＣＬ１２で刺激し、Ｇ３＿１８抗体の結合量をフローサイトメトリーで解析した結果を、ＦＩＢ５０４抗体の結合量により標準化し、数値化したグラフである。ケモカインであるＣＸＣＬ１２は、インテグリンを活性化することが知られている。図７（ｄ）中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＢＡＦ細胞の結果であることを示し、「Ｒａｐ１  ＫＤ」はＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂをノックダウンしたＢＡＦ細胞の結果であることを示す。
【０１０６】
その結果、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂのノックダウン、又は、ＣＸＣＬ１２で刺激することにより、Ｇ３＿１８抗体の結合量が増加することが明らかになった。
【０１０７】
［実験例８］
（Ｇ３＿１８抗体の結合量の解析）
ヒト急性Ｔ細胞性白血病由来の細胞株であるＪｕｒｋａｔ細胞はα４β１インテグリンを発現することが知られている。そこで、Ｊｕｒｋａｔ細胞にヒトβ７インテグリンの発現ベクターを導入し、ヒトインテグリンα４β７を発現する細胞株を得た。
【０１０８】
続いて、作製した細胞株を用いて、活性型及び不活性型のヒトインテグリンα４β７に対するＧ３＿１８抗体の結合量を、フローサイトメトリーを用いて解析した。
【０１０９】
図８（ａ）は、マンガンイオンの非存在下（ヒトインテグリンα４β７が不活性型の状態）のＧ３＿１８抗体の結合量をフローサイトメトリーで解析した結果を示すグラフである。また、図８（ｂ）は、マンガンイオンの存在下（ヒトインテグリンα４β７が活性型の状態）Ｇ３＿１８抗体の結合量をフローサイトメトリーで解析した結果を示すグラフである。各グラフには、アイソタイプコントロール抗体を反応させた結果を対照として同時に示す。
【０１１０】
また、図８（ｃ）は、マンガンイオンの非存在下のＦＩＢ５０４抗体の結合量をフローサイトメトリーで解析した結果を示すグラフである。また、図８（ｄ）は、マンガンイオンの存在下のＦＩＢ５０４抗体の結合量をフローサイトメトリーで解析した結果を示すグラフである。各グラフには、アイソタイプコントロール抗体を反応させた結果を対照として同時に示す。また、図８（ｅ）は、図８（ａ）及び（ｂ）におけるＧ３＿１８抗体の結合量を、ＦＩＢ５０４抗体の結合量により標準化し、数値化したグラフである。図８（ｅ）中、「Ｃａ／Ｍｇ」は、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンの存在下（マンガンイオンの非存在下）で測定した結果であることを示し、「Ｍｎ」はマンガンイオンの存在下で測定した結果であることを示す。
【０１１１】
その結果、不活性型のヒトインテグリンα４β７に対するＧ３＿１８抗体の結合量と比較して、活性型のヒトインテグリンα４β７に対するＧ３＿１８抗体の結合量が顕著に増加することが明らかになった。この結果は、Ｇ３＿１８抗体が、活性型マウスインテグリンα４β７だけでなく、活性型ヒトインテグリンα４β７にも特異的に結合することを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明によれば、大腸炎又は大腸癌の予防又は治療剤をスクリーニングする技術を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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