(57)【要約】  本発明は、増殖ＣＤ３４発現細胞の集団、および使用方法を提供する。特定の実施形態は、これらの細胞を成長させるのに有用な特定培地、およびこれらの細胞を含む移植体を提供する。本発明は、損傷組織を復元、修復、再生するための方法に使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカインカクテルで増殖された幹細胞及び前駆細胞の集団であって、
該集団がＣＤ３４＋細胞集団およびＣＤ３４ｂｒ細胞集団を含み、前記ＣＤ３４ｂｒ細胞集団が、前記ＣＤ３４＋細胞集団についての細胞当たりの結合抗体値の少なくとも１．５倍の細胞当たりの結合抗体値を有することを特徴とする、
前記幹細胞及び前駆細胞の集団。
【請求項２】
請求項１に記載の集団であって、
前記カクテルが、フィブロネクチン、ＳＤＦ−１アルファ、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＩＬ−５、ＢＤＮＦ、ＰＤ−ＥＣＧＦ、ＩＬ−１１、ＩＬ−３、ＥＰＯ、Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンド、ＢＭＰ−４、トロンボスポンジン、ＩＧＦ−１、ｂＦＧＦ、アンギオテンシン、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＴＧＦ−ベータ１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、ＰｌＧＦ、アミノ酸配列ＶＴＣＧを含む造血接着ペプチド、ＴＲＡＮＣＥ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｔｐｏ、ＬＩＦ、ＳＣＧＦ−アルファ、およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも８のサイトカインを含むことを特徴とする集団。
【請求項３】
請求項２に記載の集団であって、
前記カクテルは、Ｇ２、Ｆ２、Ｄ６、Ｆ２Ｎ、Ｆ４またはＧ８であることを特徴とする集団。
【請求項４】
請求項３に記載の集団であって、
前記細胞の実質的な部分は造血前駆細胞であることを特徴とする集団。
【請求項５】
請求項３に記載の集団であって、
前記細胞の実質的な部分は内皮前駆細胞であることを特徴とする集団。
【請求項６】
請求項３に記載の集団であって、
前記細胞の実質的な部分は血管芽細胞であることを特徴とする集団。
【請求項７】
請求項３に記載の集団であって、
前記細胞の実質的な部分は、ＢＦＵ−Ｅ／ＣＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−Ｇ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、およびそれらの組合せからなる群から選択される幹細胞および前駆細胞を含むことを特徴とする集団。
【請求項８】
請求項３に記載の集団であって、
前記細胞の実質的な部分は、ＣＤ３１、ＣＤ３３またはＣＤ７１、またはそれらの組合せを発現することを特徴とする集団。
【請求項９】
請求項３に記載の集団であって、
５％を上回る前記細胞はＣＤ３４ｂｒ細胞であることを特徴とする集団。
【請求項１０】
請求項３に記載の集団であって、
細胞表面マーカーを発現する増殖細胞の百分率が、１０％未満の細胞がＣＤ１４を発現すること、１％未満の細胞がＣＤ１６を発現すること、１％未満の細胞がＣＤ３を発現すること、５０％を上回る細胞がＣＤ３１を発現すること、５０％を上回る細胞がＣＤ３３を発現すること、１０％を上回る細胞がＣＤ３４を発現すること、１０％未満の細胞がＣＤ３８を発現すること、４０％を上回る細胞がＣＤ７１を発現すること、５％を上回る細胞がＣＤ１３３を発現すること、およびそれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする集団。
【請求項１１】
幹細胞または前駆細胞の集団を増殖させるための細胞培地であって、
フィブロネクチン、ＳＤＦ−１アルファ、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＩＬ−５、ＢＤＮＦ、ＰＤ−ＥＣＧＦ、ＩＬ−１１、ＩＬ−３、ＥＰＯ、Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンド、ＢＭＰ−４、トロンボスポンジン、ＩＧＦ−１、ｂＦＧＦ、アンギオテンシン、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＴＧＦ−ベータ１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、ＰｌＧＦ、アミノ酸配列ＶＴＣＧを含む造血接着ペプチド、ＴＲＡＮＣＥ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｔｐｏ、ＬＩＦ、ＳＣＧＦ−アルファ、およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも８のサイトカインを含むことを特徴とする細胞培地。
【請求項１２】
請求項１１に記載の細胞培地であって、
前記サイトカインは、フィブロネクチン、ＳＤＦ−１アルファ、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＩＬ−５、ＢＤＮＦ、ＰＤ−ＥＣＧＦ、ＩＬ−１１、ＩＬ−３、ＥＰＯ、Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンド、ＢＭＰ−４、トロンボスポンジン、ＩＧＦ−１およびｂＦＧＦを含むことを特徴とする細胞培地。
【請求項１３】
増殖された間質細胞の集団を生成する方法であって、請求項１２に記載の前記細胞培地で臍帯血由来総有核細胞（ＴＮＣ）を培養することを含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の培地であって、
前記サイトカインは、アンギオテンシン、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＢＤＮＦ、ＩＬ−３、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＢＭＰ−４、ＴＧＦ−ベータ１、トロンボスポンジン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＭＣＰ−１を含むことを特徴とする培地。
【請求項１５】
請求項１１に記載の細胞培地であって、
前記サイトカインは、ＰｌＧＦ、ＳＤＦ−１アルファ、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＩＬ−５、ＢＤＮＦ、ＩＬ−１１、ＩＬ−３、ＥＰＯ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンド、アミノ酸配列ＶＴＣＧを含む造血接着ペプチド、ＴＲＡＮＣＥ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦおよびＧ−ＣＳＦを含むことを特徴とする培地。
【請求項１６】
幹細胞及び前駆細胞の集団を増殖、分化させる方法であって、請求項１５に記載の前記培地で前記集団を培養することを含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、
前記培地は、前記集団の少なくとも一部を赤血球に分化させることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１１に記載の細胞培地であって、
前記サイトカインは、ＢＤＮＦ、ｂＦＧＦ、ＥＰＯ、フィブロネクチン、Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンド、ＩＧＦ−１、ＩＬ−１１、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＳＣＦ、ＴＧＦ−ベータ１、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦを含むことを特徴とする培地。
【請求項１９】
請求項１１に記載の細胞培地であって、
前記サイトカインは、ｂＦＧＦ、ＥＰＯ、Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンド、ＩＬ−１１、ＩＬ−６、ＰＤ−ＥＣＧＦ、トロンボスポンジンおよびＴｐｏを含むことを特徴とする培地。
【請求項２０】
請求項１１に記載の細胞培地であって、
前記サイトカインは、ＢＤＮＦ、ｂＦＧＦ、Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＰＤ−ＥＣＧＦ、ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦおよびＳＣＧＦ−アルファを含むことを特徴とする培地。
【請求項２１】
増殖された幹細胞及び前駆細胞の集団を生成する方法であって、
フィブロネクチン、ＳＤＦ−１アルファ、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＩＬ−５、ＢＤＮＦ、ＰＤ−ＥＣＧＦ、ＩＬ−１１、ＩＬ−３、ＥＰＯ、Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンド、ＢＭＰ−４、トロンボスポンジン、ＩＧＦ−１、ｂＦＧＦ、アンギオテンシン、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＴＧＦ−ベータ１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、ＰｌＧＦ、アミノ酸配列ＶＴＣＧを含む造血接着ペプチド、ＴＲＡＮＣＥ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｔｐｏ、ＬＩＦ、ＳＣＧＦ−アルファ、およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも８のサイトカインを含む細胞培地で、幹細胞及び前駆細胞の集団を培養することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、
前記集団はＣＤ３４＋細胞集団およびＣＤ３４ｂｒ細胞集団を含み、前記ＣＤ３４ｂｒ細胞集団は、前記ＣＤ３４＋細胞集団に対する細胞当りの結合抗体値の少なくとも１．５倍の細胞当たりの結合抗体値を有することを特徴とする方法。
【請求項２３】
増殖された幹細胞及び前駆細胞の集団を、それを必要とする患者に対して投与することを含む、幹細胞及び前駆細胞を移植する方法であって、前記増殖された集団はＣＤ３４＋細胞集団およびＣＤ３４ｂｒ細胞集団を含み、前記ＣＤ３４ｂｒ細胞集団は、前記ＣＤ３４＋細胞集団に対する細胞当りの結合抗体値の少なくとも１．５倍の細胞当りの結合抗体値を有することを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、
前記増殖された幹細胞及び前駆細胞の集団を、リンパまたは骨髄細胞の生成を回復させるのに有効な量、投与されることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２３に記載の方法であって、
前記増殖された幹細胞及び前駆細胞の集団を、前記患者のある部位における血管新生を促進させるのに有効な量、投与されることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、
前記部位は損傷組織であることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、
前記組織は心臓組織であることを特徴とする方法。
【請求項２８】
前記増殖された幹細胞及び前駆細胞の集団は、移植に先立って生体適合骨格に含浸されることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
請求項２３に記載の方法であって、
前記増殖された幹細胞及び前駆細胞の集団が、損傷組織を修復するのに有効な量、投与されることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、
前記組織は心臓組織であることを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項２９に記載の方法であって、
前記増殖された幹細胞及び前駆細胞の集団が、移植に先立って生体適合骨格に含浸されることを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項２３に記載の方法であって、
巨大核細胞の移植を必要とする患者に、巨大核細胞の移植を提供するのに有効な量の前記増殖された幹細胞及び前駆細胞の集団を移植することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞集団、およびこれらの幹細胞集団を増殖させる方法に関する。本発明は、増殖された幹細胞集団を使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
一生を通じて、小集団の自己再生幹細胞は、身体の細胞および組織を連続的に補充する。骨髄（ＢＭ）、動員末梢血（ＭＰＢ）、胎児肝臓、胎盤、胚芽幹細胞および臍帯血（ＵＣＢ）などの幹細胞供給源はいずれも、様々な細胞系統を再構成することが可能な様々な幹細胞及び前駆細胞（ＳＰＣ）を含む。これらのＳＰＣは、特定の生物シグナルが分化および増殖を誘発するまで静止状態にとどまる。しかし、それらの特定シグナルは希にしか知られていない。
【０００３】
造血は、成体骨髄に存在する幹細胞からの血球発生のプロセスである（非特許文献１）。成体における造血幹細胞（ＨＳＣ）は、典型的には、骨髄、および身体の長骨（胸骨、頭蓋骨、臀部、骨盤、肋骨および脊椎）の内部の腔を埋める結合組織に存在する（非特許文献２および非特許文献３）が、臍帯血（ＵＣＢ）、動員末梢血および胎盤にも見られ、それらは胚芽幹細胞から誘導されたものである。結合組織は、洞様構造（ｓｉｎｕｓｏｉｄｓ）によって分離された複雑な固体帯網からなる。それらの帯は、間質および造血細胞で構成され、大規模かつ繁殖性の細胞外基質（ＥＣＭ）によって接合されている（非特許文献１）。骨内の動脈および毛細血管は、骨髄の細胞に血液および栄養素を与える。
【０００４】
造血幹細胞は、それらの自己再生能力、および特定の細胞系統への拘束に基づいて、（ｉ）無限の自己再生能力を有する多能性幹細胞、（ｉｉ）やはり無限の自己再生能力を有するが、リンパ細胞系統または非リンパ細胞系統へと拘束される多分化前駆細胞、（ｉｉｉ）自己再生能力が制限され、個別の血液細胞系統へと拘束される単分化前駆細胞、および（ｉｖ）自己再生能力のない分化前駆細胞の４つの範疇に基づいて分類することができる（非特許文献１及び非特許文献４）。
【０００５】
造血幹細胞は、一般には、細胞表面抗原（表面マーカー）の存否によって分類される。造血幹細胞に対する最も広く受け入れられているマーカーであるＣＤ３４は、ＨＳＣ、ならびに大多数の拘束前駆体（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｐｒｏｊｅｎｉｔｏｒ）上に発現されると考えられる。例えば、非特許文献５を参照されたい。したがって、骨髄、末梢血または臍帯血からＣＤ３４＋細胞を選択すると、原生ＨＳＣのみならずより成熟な系統特異的前駆体を含む異種細胞混合物が得られることになる（同上）。ヒト造血幹細胞でのＣＤ３４発現は可逆的である。例えば、非特許文献６を参照されたい。ｂｎｘマウスにおける長期間（７〜８カ月間）の移植後のヒトＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞は、深い静止状態になるとＣＤ３４を発現しなくなった（同上）。長期間のＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の移植後にマウスの骨髄から回収されたＣＤ４５＋ＣＤ３４−系統−細胞集団は、コロニー形成単位含有長期培養誘発細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）を形成することができ、二次免疫不全マウスにおいてＣＤ３４発現の上方制御を伴う多系統移植を誘発させた（同上）。ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞は、今日までに同定された幹細胞および前駆細胞の最も原始的な集団の一つであると考えられる。例えば非特許文献６を参照されたい。ＨＬＡ−ＤＲ（ヒト白血球抗原−ＤＲ領域）の発現の欠如、またはそのレベルが非常に低いことは、広範な生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）増殖能力および生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）幹細胞機能に対応付けられた。例えば特許文献５を参照されたい。成体の骨髄または末梢血誘導細胞上のＨＬＡ−ＤＲ発現の増加は、系統拘束（ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）に関連することが確認された（同上）。対照的に、胎児ならびに臍帯血ＨＳＣは、ＨＬＡ−ＤＲを発現することが報告された（同上）。低レベルで発現されるＴｈｙ−１は、幹細胞機能を有するＣＤ３４＋の部分集合体（ｓｕｂｓｅｔ）を特徴付ける（同上）。ＡＣ１３３と呼ばれることもあるＣＤ１３３は、造血幹細胞と広く対応付けられる他の細胞表面マーカーである。
【０００６】
何人かの研究者は、動物由来の血清を有する、または有さない、かつ細胞供給層を有する、または有さない限定されたサイトカインカクテルを使用して生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で幹細胞を増殖させることを試みた。例えば非特許文献２、非特許文献３、非特許文献７および非特許文献８を参照されたい。間質のないサイトカイン補充培養物を使用すると大規模な成熟細胞の増殖が生じることが広く認められている。実際、たいていの場合において、長期培養誘発細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）の数が着実に減少し、増殖された幹細胞が培養においてその発育能力を失うことを示唆すること、およびこの能力は究極的には投入レベル未満に低下することが確認されている。例えば非特許文献５を参照されたい。動物由来の血清または外生供給細胞を必要とする系は、受容体における有害な免疫原性反応および感染の発生のリスクを高める。したがって、当該技術分野では、細胞の量が投入レベル未満に低下しないように、ＨＳＣを長時間にわたって支えるサイトカイン補充培養物の如き、化学的に明確な培養物が必要とされる。
【０００７】
特定の系統を再生することが可能な幹細胞を生体外で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で増殖させ、発育能力を維持することができれば、治療に必要な供与体物質の量を減少させることによって治療を向上させることができる。増殖されたＳＰＣは、癌治療における幹細胞移植に使用される潜在性がある。加えて、糖尿病、心臓病、肝臓再生および神経変性等の他の細胞治療におけるＳＰＣの潜在的使用が実証された。
【０００８】
増殖されたＳＰＣに対する他の潜在的応用分野は組織工学である。培養増殖細胞を使用して、任意の大きさまたは形状の特製の移植片を作製して、損傷または疾患組織を再生、修復、交換することができる組織工学分野で遭遇する共通の課題は、一定の大きさを上回る培養固形組織の内部に存在する細胞に十分な栄養素を供給することである。内皮前駆細胞の如き特定のＳＰＣは、血管新生を誘発することが最近証明された。血管新生（新しい血管の形成）は、２つの異なるプロセス、すなわち血管形成および脈管形成の一方に起因しうる。血管形成は、胚形成中に内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を内皮細胞に分化させることを含む。脈管形成は、既存の血管からの毛細血管の出芽を含む。血管新生を誘発させるための一般的に用いられる手法は、成長因子またはＤＮＡの放出を制御して、脈管形成を促進させることが中心であり、内皮前駆細胞を成長因子送達と併用することを試みた研究はわずかであった。重要なことは、幹細胞培養系は、幹細胞を凍結させ、次いで使用前に増殖させることができるため、新鮮な供与体物質に伴う実用性の制限を回避することになる。したがって、ＳＰＣを増殖させるための方法が必要とされる。
【０００９】
巨大核細胞は、骨髄に存在し、血小板に対する前駆体である。骨髄（ＢＭ）および動員末梢血幹細胞（ｍＰＢＳＣ）移植と比較すると、臍帯血幹細胞移植では血小板に対する移植は著しく遅く、ｍＰＢＳＣでは９日間であるのに対して、５６から２００日間もかかる。この時間中、患者は出血し、血小板輸血を受けて、この問題を緩和する。したがって、臍帯血幹細胞移植を受ける患者に対する血小板移植の時間を短くすることで、出血のリスク、すなわち長時間にわたる血小板輸血の必要性を低減し、究極的には移植後の入院期間を縮めることが必要とされる。
【００１０】
【特許文献１】米国特許第６，０４０，１３８号
【特許文献２】米国特許第５，８００，９２２号
【特許文献３】米国特許第６，０２０，１３５号
【特許文献４】米国特許第６，３４４，３１６号
【特許文献５】米国特許第６，０３３，８６０号
【特許文献６】米国特許第５，１４３，８５４号
【特許文献７】米国特許第５，４４５，９３４号
【特許文献８】米国特許第５，７４４，３０５号
【特許文献９】米国特許第５，６７７，１９５号
【特許文献１０】米国特許第６，０４０，１９３号
【特許文献１１】米国特許５，４２４，１８６号
【特許文献１２】米国特許第６，３２９，１４３号
【特許文献１３】米国特許第６，３０９，８３１号
【特許文献１４】米国特許出願公開第２００４００６３２０６号
【特許文献１５】米国特許第６，４７９，０６４号
【特許文献１６】国際公開第９９／１４３１３号
【特許文献１７】国際公開第９９／３２５３６号
【特許文献１８】国際公開第００／５６３７６号
【特許文献１９】米国特許第５，４５１，６１３号
【非特許文献１】Bonner et al., “The Blood and the Lymphoid Organs”, in Pathology (Rubin et al., eds., 1999), pp. 1051-1061
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【非特許文献３】Verfaillie et al. (1999) , Annu. Rev. Cell. Biol.4: 321
【非特許文献４】Cabrinaet al.(2003) Trends Bioechnol. 21:233.
【非特許文献５】Yu et al. (1996), J. Formos. Med. Assoc. 95: 281
【非特許文献６】Nolta et al. (2002) Leukemia 16(3): 352-61
【非特許文献７】Donovan and Gearhart (2001) Nature 414: 92
【非特許文献８】Dexter et al. (1984) Blood Cells 10: 315
【非特許文献９】Osawa et al. (1996) Science 273: 242
【非特許文献１０】Goodell et al. (1996) J. Exp. Med. 183: 1797
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【非特許文献１２】Yu (1996) J. Formos. Med. Assoc. 95: 281-293
【非特許文献１３】Fallon et al. (2003) Br. J. Haematol. 121: 1
【非特許文献１４】「ＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ（商標）Ｗｈｉｔｅ  Ｐａｐｅｒ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｆｏｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ」、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）
【非特許文献１５】Lu et al. (1993) Blood 81: 41
【非特許文献１６】Eaves, “Assays of Hematopoietic Progenitor Cells” in Williams (1995) Hematology at L22-6 (5th ed., E. Beutler et al. eds.)
【非特許文献１７】Flores-Guzman et al. (2002) Arch. Med. Res. 33: 107
【非特許文献１８】Fodor et al. (1991) Science 251: 767-77
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【非特許文献３２】Mahoney and Saltzman (2001) Nature Biotech. 19: 934
【非特許文献３３】Smith (1992) Hematother. 1: 155
【非特許文献３４】Rubinstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 10119-22 (1995)
【非特許文献３５】Yahata et al., Blood, 101, 2905-13 (2003)
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、造血幹細胞および前駆細胞の増殖を促進するための組成物および方法を提供する。好ましい実施形態において、これらの細胞の増殖は、６つの異なる培地組成物（サイトカインカクテル）、すなわちＧ２、Ｆ２、Ｄ６、Ｆ２Ｎ、Ｆ４またはＧ８の１つを使用することによる。これらのカクテルを使用して細胞を増殖させると、細胞の大部分はＣＤ３４発現を維持する。本発明は、さらに、高レベルのＣＤ３４発現によって特徴付けられる、増殖された造血幹細胞および前駆細胞集団に関する。高レベルのＣＤ３４発現を含む細胞は、ＣＤ３４ｂｒ細胞と称する。Ｇ２、Ｆ２、Ｄ６、Ｆ２Ｎ、Ｆ４またはＧ８媒体中の造血幹細胞および前駆細胞を増殖させることによって、ＣＤ３４を高レベルで発現する細胞（たとえばＣＤ３４ｂｒ）の数が著しく増加する。ＣＤ３４発現のレベルは、典型的には、造血幹細胞および前駆細胞の体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での発現の結果として低下するため、この知見は有意である。ＣＤ３４がＨＳＣおよび多くの拘束前駆体上で発現されるとき、多数のＣＤ３４＋細胞を含む体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での培養物から生じる細胞集団は望ましい。該集団は様々な細胞を表し、そのため細胞治療にとって理想的であるからである。また、本発明のＣＤ３４ｂｒ細胞は、新たに単離されたＣＤ３４＋細胞と同様の高い平板効率を維持する。これは、ＣＤ３４ｂｒ集団は、新たに単離されたＣＤ３４＋細胞に匹敵する多くのの幹細胞および前駆細胞を含むという結論を裏付けるものである。加えて、コロニー形成試験において、ＣＤ３４ｂｒ細胞は、多数の混合コロニーを発生させ、そのことは、多分化幹細胞及び前駆細胞の存在をさらに示唆する。増殖された細胞を移植すると、巨大核細胞および好中球細胞を含む多くの細胞型を再生することができる。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態において、多数の成熟細胞を除去し、より未成熟のＣＤ３４＋細胞の濃度を高くすることによって、臍帯血（ＵＢＣ）細胞から細胞培養の初期集団を得る。純度は、一般的に７５％より高い。骨髄および末梢血細胞または胎児肝臓の如き他のＣＤ３４＋細胞源を使用することができる。あるいは、これらの細胞源からのＣＤ１３３＋細胞を使用してもよい。
【００１３】
本発明は、ＣＤ３４＋ＨＳＣおよび前駆細胞を増殖、濃縮させるための方法をも包括する。当該技術分野で知られている直接的かつ／または間接的単離方法により、それらの細胞を濃縮することができる。次いで、流動細胞計測法（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）の如き当該技術分野で知られている方法によって、それらの細胞の純度を測定することができる。次いで、濃縮細胞を、細胞増殖を支える媒体に接種し、培養する。場合によっては、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の如き成長因子を添加してもよい。あるいは、最初に培養中でＨＳＣおよび前駆細胞を増殖させ、次いで単離および精製法によりＣＤ３４＋またはＣＤ３４ｂｒの濃度を高くすることができる。あるいは、これらの細胞源からのＣＤ１３３＋を使用してもよい。
【００１４】
シート、スライド、皿（例えばペトリ皿）、培養フラスコ、袋、およびウェルの数および形状が任意のマルチウェル培養皿（ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｄｉｓｈｅｓ）の使用を含む様々な培養方法を本発明の方法に採用できる。本発明の好ましい実施形態において、これらの細胞を培養するのに際して三次元構造［３−Ｄ；一般的には骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）と呼ばれる］が使用される。細胞を新たに単離し、増殖させ、増殖させて内皮前駆細胞（ＥＰＣ）または内皮細胞へと分化させ、ＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ３１＋等の表現型に基づいて予め分類することができる。ＶＥＧＦまたはｂＦＧＦの如き成長因子を使用して、または使用せずに細胞を増殖または分化させることができる。３−Ｄ骨格は生体細胞により近く、該骨格は細胞治療において適合性を有する故に本発明において特に興味深い。
【００１５】
本発明はまた、増殖細胞およびアルギン酸塩またはヒアルロン酸の如き任意の骨格物質を含む、血管組織を形成するための組成物に関し、また島細胞、インシュリン生成細胞、肝細胞、骨、腎臓および心臓等の治療細胞と組み合わせた、微小球をベースとした到達法、または繊維をベースとした到達法に関する。
【００１６】
本発明のさらなる態様において、治療細胞、脈管形成細胞または血管形成細胞を用いて細胞／骨格構造体を生成する方法、これらの構造体を培養する方法、および移植にこの組成物を使用できる。
【００１７】
本発明の他の態様は、濃縮され増殖された細胞集団を、高用量の放射線または化学療法後の造血系の再生、骨髄切除治療後の巨大核細胞（およびそれによる血小板）の再生、生体内での骨格の血管形成の誘発のような種々の細胞治療のために用いる方法及び使用、および虚血性心筋症、および糖尿病治療における該細胞の応用に関する。
【００１８】
一実施形態において、増殖された幹細胞集団、およびそれらの使用方法が提供される。増殖された細胞集団は、クローン原性の潜在力を維持し、そのことは、それらの細胞集団が、未成熟および成熟前駆細胞および多分化造血幹細胞を含むことを示唆する。したがって、本発明の方法は、細胞の発育能力を低下させることなく、培養における長期間の再増殖細胞を生成するのに用いられる。増殖された細胞集団は、癌、糖尿病、心臓病、神経変性病、肝臓再生および組織工学の治療における治療用途に有用である。特に、増殖された細胞集団は、癌および貧血症の如き疾病を緩和するのに使用できるとともに、虚血性心筋症および糖尿病の如きより多くの拘束細胞型を得ることが望ましい状況において使用することができる。組織移植片または虚血性心臓組織の血管形成の促進を含めて、血管形成を改善または促進するのにそれらの細胞集団を使用することができる。同様に、損傷器官または組織を再生または修復するのに、それらの細胞を使用することができる。増殖された細胞集団を遺伝子改質して、対象となる外来遺伝子を発現させることができる。遺伝子改質された細胞を使用して、対象となる遺伝子、例えば治療剤を発現する形質転換、形質移入または形質導入幹細胞、を安定的に生成することができる。当該細胞は、疾病、特に患者における遺伝子病の治療に有用である。
【００１９】
一態様において、本発明は、造血幹細胞および前駆細胞の増殖に好適な成長因子の組合せおよび培地を提供する。好ましい実施形態において、それらの成長因子の組合せおよび培地は、臍帯血由来ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋またはＬｉｎ−細胞の増殖に有効であり、それを使用することで、高レベルのＣＤ３４発現を特徴とするＣＤ３４＋細胞の集団が得られる。骨髄および末梢血細胞を使用してもよい。Ｇ２、Ｆ２、Ｄ６、Ｆ２Ｎ、Ｆ４およびＧ８で示される６つの培地組成物（サイトカイン・カクテル）を開示する。すべてのサイトカイン・カクテルは、栄養培地に添加されると、ＣＤ３４＋細胞の増殖を支持または維持し、あるいは支持かつ維持することが可能である。実際、それらのカクテルは、造血幹細胞、ならびに成熟および未成熟前駆細胞を増殖させることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
増殖された幹細胞集団、およびそれらの使用方法を提供する。サイトカインの混合物を含む異なる培地で幹細胞を増殖させる。増殖された幹細胞集団は、様々な造血および間葉細胞型を生成する能力によって特徴付けられ、該細胞型は、これらの細胞を、必要とする患者に対して移植することにより、損傷器官を復元、修復、かつ再生することができる。「増殖される」という用語は、生じる細胞集団が、サイトカインの混合物を含む培地組成物における幹細胞の生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）培養に由来することを意味し、該培養では出て行く細胞数（ｏｕｔｇｏｉｎｇ  ｎｕｍｂｅｒ）（培養数）が入ってくる細胞数（ｉｎｇｏｉｎｇ）（非培養数）を上回る。「増殖される」という用語は、細胞由来の何らかのメカニズムまたは理論によって解釈または限定されることはなく、培養において新たに発生する細胞、ＣＤ３４抗原の発現が単に高められた細胞、またはそれらの組合せを含むことができる。
【００２１】
いくつかの実施形態において、増殖された幹細胞集団は、細胞型の混合物を含むものとして特徴付けられ、該細胞型にはＢＦＵ−Ｅ／ＣＦＵ−Ｅ［群発（ｂｕｒｓｔ）形成単位−赤血球系／コロニー形成単位赤血球系、例えば赤血球前駆細胞に対して特徴的なコロニー］、ＣＦＵ−ＧＭ（コロニー形成単位−顆粒球／マクロファージ、例えば好中球／単球前駆体）、ＣＦＵ−Ｇ（好中球前駆細胞）、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ（コロニー形成単位−顆粒球、−赤血球、単球および巨大核細胞、例えばより未成熟な骨髄幹細胞に対して特徴的なもの）、内皮前駆細胞の如き間葉前駆体、およびそれらの組合せを含むが、それらに限定されない。さらに他の実施形態において、増殖された前駆細胞は、Ｔ細胞（ＣＤ３）、Ｂ細胞（ＣＤ１９）、成熟顆粒球、ＮＫリンパ球またはマクロファージ（ＣＤ１６）が実質的に存在しない。
【００２２】
「実質的に存在しない」という用語は、細胞集団内の５％未満、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満の細胞が、対象となるマーカーを発現することを意味するものである。少数の単球（ＣＤ１４）および血小板または巨大核細胞（ＣＤ４２ａ）が集団内に存在していてもよい。実質的な割合の細胞が、内皮細胞、血小板、白血球及びそれらの前駆体（ＣＤ３１）、骨髄前駆細胞（ＣＤ３３）、造血幹細胞及び前駆細胞（ＣＤ３４）、増殖細胞および赤血球前駆体（ＣＤ７１）、ならびにＣＤ３４ｂｒ幹細胞及び前駆細胞または神経もしくは造血幹細胞（ＣＤ１３３）に特徴的な表面マーカーを発現することができる。「実質的な割合」という用語は、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％以下の細胞が、対象となるマーカーを発現することを意味するものである。ＣＤ３８、すなわち典型的には分化造血細胞上に発現されるマーカーは、培養後に実質的に低下する。「実質的に低下」という用語は、少なくとも１０％未満または５％未満の細胞が、対象となるマーカーを発現することを意味するものである。
【００２３】
これらの増殖細胞は、また、自己再生の能力によって特徴付けられるため、クローン原性である。「クローン原性」とは、単一細胞の子孫を識別できることを意味するものである。さらに、それらの細胞は、多系統発生へと拘束する能力によって特徴付けられる。「多系統発生」とは、細胞が、造血または内皮起源の細胞型に分化することが可能であることを意味するものである。自己再生多系統幹細胞は、長期間の移植が可能である。「長期間の移植」とは、宿主に移植されると、幹細胞は６週間を上回る期間にわたって移植され続けることを意味するものである。例えば、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２および非特許文献１を参照されたい。逆に、短期移植幹細胞は、「前駆細胞」と呼ばれる。これらの細胞は、限定された自己再生の能力を有し、様々なリンパおよび骨髄細胞へと拘束された発生に限定される。
【００２４】
「血管芽細胞」という用語は、造血幹細胞および内皮前駆細胞の双方を生成する多能性幹細胞を意味し、これら細胞はそれぞれ、さらに内皮細胞はもちろんのこと、あらゆる造血系統（骨髄およびリンパ）の細胞に分化することができる。「造血幹細胞」という用語は、骨髄およびリンパ細胞の両方を生成する幹細胞を意味するものである。「骨髄」という用語は、赤血球、血小板、好中球、単球、好酸球および好塩基球の如き細胞を意味するものである。「リンパ」という用語は、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞のような細胞を意味するものである。「内皮前駆体」という用語は、血管内皮細胞を生成する前駆細胞を意味するものである。本明細書に用いられているように、「間葉幹または前駆細胞」という用語は、前駆体が、間葉系統の細胞を生成することを意味するのに対して、「造血幹または前駆細胞」は、細胞が、造血系統の細胞を生成することを意味するものである。
【００２５】
増殖された幹細胞集団は、ＣＤ３４細胞表面マーカーを発現する細胞をさらに含む。「細胞表面マーカー」という用語は、細胞の表面に発現されるタンパク質を意味し、該タンパク質は特定の抗体を使用して検出できる。細胞表面マーカーＣＤ３４の発現は、幹細胞及び前駆細胞集団と関連付けられる。ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞は、初期のの幹細胞及び前駆細胞であると考えられる。例えば、非特許文献５を参照されたい。したがって、一実施形態において、細胞の集団は、ＣＤ３４＋細胞を含み、少なくとも９０％から１００％の細胞は、ＣＤ３８を発現しない。
【００２６】
さらに、本発明の増殖された幹細胞集団に含まれる細胞の部分集合体は、細胞表面に増加した量のＣＤ３４を発現する。ＣＤ３４発現が増加した細胞は、流動細胞計測分類および抗体パンニング等を含む任意の手段によって検出、単離されうることを当業者は認識している。いずれの検出方法にも限定されないが、細胞表面に多量のＣＤ３４を発現する細胞は、蛍光標識抗体で着色されると明るい蛍光を発する傾向があるため、「ＣＤ３４ｂｒ」細胞と呼ばれる。「bright」または「ｂｒ」という用語は、対象となる標識細胞表面マーカーが、そのマーカーを発現する他の細胞より多くの蛍光を発する（流動細胞計測法、または当業者に知られている任意の他の手段を用いる場合）ことを意味するものである。一般には、流動細胞計測分析において、当業者は、最初に蛍光に対する検出閾値を設定しなければならない。次いで、９７％以上の細胞が蛍光を発しないように、検出閾値を調整する。検出閾値が設定されると、対象となる細胞集団の蛍光が記録される。本明細書に用いられているように、「bright」または「ｂｒ」という用語は、対象となる細胞集団が、対照細胞集団と比較して、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍、約１００倍、約２００倍、約３００倍、約４００倍、約５００倍、約６００倍、約７００倍、約８００倍、約９００倍、約１０００倍、またはそれ以上を超える蛍光を発することを意味するものである。「ｄｉｍ」または「ｄｉｍ」という用語を用いることにより、対象となる細胞集団は、マーカーを発現するが、「ｂｒｉｇｈｔ」または「ｂｒ」集団のレベルでの蛍光は発しないことを意味するものである。細胞は、タンパク質であっても遺伝子であっても、対象となるマーカーを発現すると「発現に対して陽性である」と見なされる。遺伝子発現プロファイル、および蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）等の任意の方法を用いて発現を測定することができる。「＋」という用語は、前述したように細胞が発現に対して陽性であることを示す。「−」という用語は、細胞が、流動細胞計測法で測定される場合に、対象となるマーカーの検出可能なレベルの発現を有しないことを示す。本発明の目的では、ＣＤ３４ｂｒ細胞集団は、増殖培養を誘導するのに使用される新たに単離されたＣＤ３４＋細胞集団の大多数（ＣＤ３４発現レベルのピーク）、または他の実施形態では、ＣＤ３４ｄｉｍ集団の大多数、よりも実測蛍光が高い集団と定義付けられる。
【００２７】
様々な系統を検出するのに使用される抗体を、異なる蛍光色素に結合させることができる。これらは、例えばフィコエリスリンおよびアロフィコシアニンのようなフィコビリンタンパク質、フルオロセイン、およびテキサスレッドを含む。選択的に死細胞に蓄積する染料（例えばヨウ化プロピジウムおよび７−アミノアクチノミシンＤ）を使用して、死細胞を検出することもできる。任意の適切な培地［約２％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）または０．２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）など］で細胞を回収することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれている非特許文献１３を参照されたい。
【００２８】
本発明の増殖された幹細胞及び前駆細胞は、対象となる細胞マーカーの組合せを発現することもできる。対象となるマーカーとしては、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４２ａ、ＣＤ７１、ＣＤ９０、ＣＤ１１７（ｃ−キット）、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＶＥＧＦ受容体、アルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）、ｖＷＦ（フォンウィレブランド因子受容体）、およびこれらのマーカーの任意の組合せが挙げられる。いくつかの実施形態において、実質的な割合の細胞が、対象となる細胞表面マーカーを発現する。場合によっては、細胞表面マーカーの発現の欠如は、幹細胞集団、例えばＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ１６、ＣＤ３８、ＣＤ４２ａ、およびこれらのマーカーの任意の組合せの範囲を定める。
【００２９】
したがって、一実施形態において、細胞の集団は、本明細書に開示されているサイトカインカクテルの如き特定培地にて増殖されたＣＤ３４ｂｒ細胞を含み、少なくとも１０％から１００％の細胞が、ＣＤ３１、ＣＤ１３３、ＣＤ１１７、またはそれらの組合せから選択される少なくとも１つのマーカーを発現する。成体骨髄細胞または末梢血誘導細胞におけるＨＬＡ−ＤＲ発現の増加は、一般には、発現が高い臍帯血造血幹細胞と対照的に、骨髄および末梢血誘導細胞における系統拘束（ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）と関連付けられる。例えば、非特許文献５を参照されたい。したがって、０．１％から１００％の細胞においてＨＬＡ−ＤＲを発現することができる。
【００３０】
いくつかの実施形態において、増殖された細胞の集団は少なくともＣＤ３４ｂｒ細胞を含み、該ＣＤ３４ｂｒ細胞は臍帯血から誘導され、本明細書に開示されているような特定培地で増殖される。ＣＤ３４ｂｒ細胞は造血系統細胞を生成することができ、該造血系統細胞として骨髄細胞（顆粒球、樹状細胞、単球、血小板、巨大核細胞および赤血球等）、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および抗原提示細胞等）および内皮細胞（内皮細胞前駆体および内皮組織を含む）を挙げることができるが、これらに限定されない。また、ＣＤ３４ｂｒ細胞は恐らくは肝臓および膵臓の細胞を生成することもできる。
【００３１】
一実施形態において、増殖された細胞の集団は、較正された標準フィコエリスリン（ＰＥ）接合ビーズおよび試薬［Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）から市販されている］を使用する流動細胞計測法による蛍光定量によって定められる。これらのビーズ標準品を使用して、細胞当たりの結合する蛍光体量を測定することができる。このように、ＰＥの既知量を基準としたＰＥビーズの蛍光を蛍光光度計で測定することができる。
【００３２】
１つの当該実施形態において、蛍光定量に関するＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ（商標）システムが使用される（非特許文献１４に記載）。ＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ（商標）システムは、ＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ（商標）ＰＥビーズおよびＱｕａｎｔｉＱｕｅｓｔソフトウェアからなる。ＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ（商標）ＰＥビーズは、ＰＥ分子に換算してＦＬ２軸を較正するための凍結乾燥ペレットの形の４つの較正済ビーズレベル一式を含む。ＱｕａｎｔｉＱｕｅｓｔは、蛍光をＰＥ分子に関係付ける一次関数を計算するＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商標）［Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）］取得ソフトウェア（バージョン３．１以降）内の定量較正機能である。ＰＥ着色細胞に対するＰＥコピー数は、細胞のＦＬ２値および線形回帰方程式から求められる。
【００３３】
抗体接合体のＰＥ：抗体の比が知られている場合は、細胞当たりのＰＥ分子の数を細胞当たりの接合抗体（ＡＢＣ）値に変換することができる。「細胞当たりの接合抗体」または「ＡＢＣ」とは、選択された細胞集団における細胞に結合した対象となる選択抗体の数を意味するものである。一実施形態において、細胞当たりのＰＥ分子数がＡＢＣ値に等しくなるように、ＰＥ：ｍＡｂ比は１：１になる。当該技術分野で知られている任意の好適な方法を用いて抗体結合のレベルを検出することができる。一実施形態において、ＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ（商標）システム［Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｙｓｔｍｓ（カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）から市販］を使用して、ＣＤ３４ｂｒ集団に対するＡＢＣ値および全ＣＤ３４＋集団を検出する。
【００３４】
ＡＢＣ値を決定してしまえば、抗原に対する抗体の結合化学量論比により細胞当たりの抗原数を求めることができる。したがって、例えば、抗原に対する抗体の結合化学量論比がＰＥ接合抗ＣＤ３４抗体について１：１である場合は、ＣＤ３４抗原の数はＡＢＣ値に等しくなる。
【００３５】
一実施形態において、増殖された細胞の集団はＣＤ３４ｂｒ細胞の集団を含み、該ＣＤ３４ｂｒ細胞の集団は、全ＣＤ３４＋集団に対して測定されたＡＢＣ値の少なくとも約１．５倍であるＡＢＣ値を有する（すなわち、ＣＤ３４ｂｒ／全ＣＤ３４＋ＡＢＣ比が約１．５である）。したがって、いくつかの実施形態において、本発明はＣＤ３４ｂｒ細胞を含む増殖細胞の集団を提供し、該ＣＤ３４ｂｒ細胞は全ＣＤ３４＋集団に対して測定されたＡＢＣ値の少なくとも約１．５倍、１．６倍、約１．７倍、約１．８倍、約１．９倍、約２．０倍、約２．１倍、約２．２倍、約２．３倍、約２．４倍、約２．５倍、約２．６倍、約２．７倍、約２．８倍、約２．９倍、約３．０倍または約３．１倍のＡＢＣ値を有する。
【００３６】
体外法および生体内法の双方を用いて、幹細胞機能を検定することができる。体外試験は、半固形培地中で幹細胞および前駆細胞を培養し、得られたコロニーを調べることを含む。例えば、非特許文献１５、非特許文献１６および非特許文献１７を参照されたい。生体内試験は、一般には、照射マウスに対象となる幹細胞を移植することを含む。細胞をこれらの動物から回収し、表現型について調べることができる。一般に、より多くの細胞系統を復元する細胞はより原始的であるため、より大きな発育潜在性を有する。例えば、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２および非特許文献１を参照されたい。
【００３７】
本発明の増殖された細胞を遺伝子発現プロファイルに基づいて分析することができる。このようにして、多系統への拘束潜在能力を測定することができる。本明細書に用いられているように、「発現プロファイル」は、遺伝子発現生成物の相対的存在量の測定値に対応する１つまたは複数の値を含む。当該値は、ＲＮＡレベルまたはタンパク質存在量の測定値も含むことができる。したがって、発現プロファイルは、遺伝子の転写状態または翻訳状態の測定値を表す値を含むことができる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４および特許文献５を参照されたい。
【００３８】
試料の転写状態は、ＲＮＡ種、特に試料中に存在するｍＲＮＡの個性および相対的存在量を含む。好ましくは、試料中のすべての構成ＲＮＡ種の実質的な部分が測定されるが、少なくとも試料の転写状態を特徴付けるのに十分な部分が測定される。いくつかの既存の遺伝子発現技術のいずれかにより転写物存在量を測定することによって、転写状態を簡便に測定することができる。翻訳状態は、試料中の構成タンパク質種の個性および相対的存在量を含む。当業者に知られているように、転写状態と翻訳状態は関連している。
【００３９】
いくつかの実施形態において、本発明の増殖された細胞は、表現型と関連する遺伝子の発現を変化させる。例えば、一実施形態において、遺伝子の発現は、増殖されたＣＤ３４ｂｒ細胞とＣＤ３４ｄｉｍ細胞との間で異なる。いくつかの実施形態において、１５，０００を上回る遺伝子転写レベルが変化せず、５００以上のレベルが上方に調節され、２００以上のレベルが下方に調節され、７００の「署名」遺伝子プロファイルを生成する。いくつかの実施形態において、署名遺伝子（ｓｕｇｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｓ）の発現のレベルは、ＣＤ３４ｂｒ細胞とＣＤ３４ｄｉｍ細胞との間で２倍を超えて異なることになる。例えば、いくつかの実施形態において、幹細胞転写マーカーであるＣＤ１３３は、ＣＤ３４ｄｉｍ集団に対してＣＤ３４ｂｒ集団では２倍を超えて増加する。他の実施形態において、Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ１ホモローグ（ＨＳＣ分化の阻害に関与）は、ＣＤ３４ｄｉｍと比較してＣＤ３４ｂｒでは２倍を超えて増加する。さらに他の実施形態において、発生段階の胚血管系での平滑筋細胞増殖の促進および脱分化に関与するＣＳＲＰ２は、ＣＤ３４ｄｉｍと比較してＣＤ３４ｂｒでは２倍を超えて増加する。いくつかの実施形態において、恒常性を調節するＤＬＫ１は、ＣＤ３４ｄｉｍと比較してＣＤ３４ｂｒでは少なくとも２倍増加する。いくつかの実施形態において、細胞増殖において役割を担うＳＴＭＮ３は、ＣＤ３４ｄｉｍと比較してＣＤ３４ｂｒでは少なくとも２倍増加する。他の実施形態において、増殖および脱分化を促進する転写因子であるＣＳＲＰ２は、ＣＤ３４ｄｉｍと比較してＣＤ３４ｂｒでは２．６倍を超えて増加する。これらの遺伝子の単独または組合せのいずれか１つの発現の増強は、細胞が初期段階の前駆細胞である可能性が高いことを示す。
【００４０】
いくつかの実施形態において、ＣＤ３４ｄｉｍ集団に対するＣＤ３４ｂｒ集団の遺伝子転写物の相対的減少は、初期段階の多分化性幹または前駆細胞集団であることを示す。例えば、いくつかの実施形態において、ＣＥＢＰＤ（脂肪細胞分化マーカー）は、ＣＤ３４ｄｉｍ集団に対してＣＤ３４ｂｒ集団では２分の１未満に減少し、ＥＭＰ２（上皮細胞分化マーカー）は、ＣＤ３４ｄｉｍ集団に対してＣＤ３４ｂｒ集団では２分の１未満に減少し、ＣＳＦＩＲ（骨髄細胞分化マーカー）は、ＣＤ３４ｄｉｍ集団に対してＣＤ３４ｂｒ集団では３分の１未満に減少し、ＤＣＮＰ１（樹状細胞分化マーカー）は、ＣＤ３４ｄｉｍ集団に対してＣＤ３４ｂｒ集団では３分の１未満に減少し、ＰＲＧ１（造血細胞分化マーカー）は、ＣＤ３４ｄｉｍ集団に対してＣＤ３４ｂｒ集団では４分の１未満に減少し、ＣＸＣＲ４（白血球形成に関与するＳＤＦ１受容体）は、ＣＤ３４ｄｉｍ集団に対してＣＤ３４ｂｒ集団では２分の１未満に減少し、ＩＬ−１０ＲＡ（Ｔ細胞およびマクロファージ増殖の阻害の媒介物質）は、ＣＤ３４ｄｉｍ集団に対してＣＤ３４ｂｒ集団では３分の１未満に減少し、ＥＢ１２（ＥＢＶリンパ球機能によって誘発される受容体）は、ＣＤ３４ｄｉｍ集団に対してＣＤ３４ｂｒ集団では３分の１未満に減少し、またはそれらの何らかの組合せが挙げられる。
【００４１】
いくつかの実施形態において、ＣＤ３４ｄｉｍ細胞は、ＣＤ３４ｂｒと比較して２倍を超えて増加するＨＣＫ（造血分化に関与する）、ＣＤ３４ｂｒと比較して９倍を超えて増加するＬＹＺ（単球マクロファージ・マーカー）、ＣＤ３４ｂｒと比較して２倍を超えて増加するＩＬ−８（単球マーカー）、ＣＤ３４ｂｒと比較して３倍を超えて増加するＬＧＡＬＳ１（分化およびアポトーシス・マーカー）、ＣＤ３４ｂｒと比較して４倍を超えて増加するＰＬＡ２Ｇ７（血小板調節マーカー）、ＣＤ３４ｂｒと比較して４倍を超えて増加するＣＬＣ（好酸球および好塩基球マーカー）、ＣＤ３４ｂｒと比較して３倍を超えて増加するＲＮＡＳＥ２（好酸球マーカー）、ＣＤ３４ｂｒと比較して２倍を超えて増加するＰＮＡＳＥ３（好酸球マーカー）、ＣＤ３４ｂｒと比較して３倍を超えて増加するＳ１００Ａ１２またはカルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ、好中球）、ＣＤ３４ｂｒと比較して３倍を超えて増加するＡＯＡＨ（好中球マーカー）、ＣＤ３４ｂｒと比較して３倍超えて増加するＭＰＯ（好中球マーカー）、ＣＤ３４ｂｒと比較して２倍以上のＣＴＳＧ（好中単球マーカー）、ＣＤ３４ｂｒと比較して９倍を超えて増加するＳ１００Ａ９またはカルグラヌリンＢ（マクロファージ・マーカー）、ＣＤ３４ｂｒと比較して５倍を超えて増加するＳＣＹＡ１３（単球化学誘引タンパク質４）、ＣＤ３４ｂｒと比較して５倍超えて増加するＳＣＹＡ２（マクロファージ誘導マーカー）、ＣＤ３４ｂｒと比較して４倍超えて増加するＳＣＹＢ１３（Ｂリンパ球化学誘引物質）、ＣＤ３４ｂｒと比較して５倍超えて増加するＣＤ１４、またはそれらの組合せのような遺伝子の転写に対する上方への調節を示す。
【００４２】
いくつかの実施形態において、本発明の増殖された細胞は、培養において経時的に特異的に遺伝子を発現する。例えば、いくつかの実施形態において、ＣＤ３４ｂｒ細胞は、ＣＤ１６４転写物質、ＳＥＬＬ転写物質、ＳＤＦＲ１転写物質、およびそれらの組合せの量が経時的に減少する。他の実施形態において、ＣＤ３４ｂｒ細胞は、発現するＦＡＤＤの量が経時的に増加する。いくつかの実施形態において、ＣＤ３４ｄｉｍ細胞は、発現するＦＡＤＤ転写物質、ＩＴＧＢ２転写物質、Ｓ１００Ａ９転写物質、およびそれらの組合せが経時的に増加する。
【００４３】
本発明の一実施形態において、発現プロファイルに含められる値を測定するのにマイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）が使用される。マイクロアレイは、異なる実験の間の再現性があるため、この目的には特に好適である。ＤＮＡマイクロアレイは、多数の遺伝子の発現レベルの同時測定のための１つの方法を提供する。各アレイは、固体の担体に結合した捕捉プローブの再現可能パターンからなる。標識ＲＮＡまたはＤＮＡをアレイ上の相補的プローブにハイブリッド形成させ、次いでレーザ走査により検出する。アレイ上の各プローブに対するハイブリッド形成強度を測定し、相対的な遺伝子発現レベルを表す定量値に変換する。実験のセクションを参照されたい。また、参照により本明細書に組み込まれている特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献５および特許文献４を参照されたい。高密度オリゴヌクレオチドアレイは、試料中の多数のＲＮＡに対する遺伝子発現を測定するのに特に有用である。
【００４４】
「アレイ」とは、ペプチドまたは核酸プローブが結合した固体の担体または基体を意味するものである。アレイは、典型的には、基体の表面の異なる既知の個所に結合する複数の異なる核酸またはペプチド捕捉プローブを含む。「マイクロアレイ」または口語的に「チップ」とも表現されるこれらのアレイは、当該技術分野において、例えばそれぞれが全面的に本明細書に組み込まれている特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３および非特許文献１８を参照されたい。
【００４５】
統計的に設計された実験の使用を通じて、特定の薬剤の組合せを、本発明の幹細胞及び前駆細胞の生体外増殖について識別した。一実施形態において、特定の組合せは、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５または少なくとも１６のサイトカインを含む。本発明の特定の組合せは、フィブロネクチン、間質細胞由来因子１α（ＳＤＦ−１α）、ＩＬ−６、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ−５、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、ＩＬ−１１、ＩＬ−３、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、Ｆｌｔ３−／Ｆｌｋ−２リガンド、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−４）、トロンボスポンジン、インシュリン類似成長因子（ＩＧＦ−１）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、アンギオテンシン、Ａ鎖およびＢ鎖ヘテロダイマーを有する血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ＡＢ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ−ベータ１）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、単球化学走性タンパク質−１／ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）、アミノ酸配列ＶＴＣＧを含む造血接着ペプチド、ＴＮＦ関連活性誘発サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を含むことができる。
【００４６】
一実施形態において、特定のサイトカインカクテルは、「Ｇ２」と呼ばれ、フィブロネクチン、ＳＤＦ−１α、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＩＬ−５、ＢＤＮＦ、ＰＤ−ＥＣＧＦ、ＩＬ−１１、ＩＬ−３、ＥＰＯ、Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンド、ＢＭＰ−４、トロンボスポンジン、ＩＧＦ−１およびｂＦＧＦの組合せを含む。
【００４７】
１％未満のＧ２増殖集団が、増殖後にＴ細胞（ＣＤ３）、Ｂ細胞（ＣＤ１９）または成熟顆粒球、ＮＫリンパ球またはマクロファージ（ＣＤ１６）を含み、１０％未満の集団が、増殖後に単球（ＣＤ１４）、分化造血細胞（ＣＤ３８）および血小板または巨大核細胞（ＣＤ４２ａ）を含む。２５％を超える集団が、内皮細胞、血小板、白血球またはそれらの前駆体（ＣＤ３１）、骨髄前駆細胞（ＣＤ３３）、造血幹細胞及び前駆細胞（ＣＤ３４）、増殖細胞および赤血球前駆体（ＣＤ７１）を含む。１０％を超える細胞が、神経幹細胞（ＣＤ１３３）、およびＣＤ３４ｂｒ幹細胞及び前駆細胞を含む。一実施形態において、Ｇ２増殖細胞集団は、幹細胞集団を含み、１％未満の細胞がＣＤ３を発現し、１０％未満の細胞がＣＤ１４を発現し、１％未満の細胞がＣＤ１６を発現し、１％未満の細胞がＣＤ１９を発現し、８０％を超える細胞がＣＤ３１を発現し、６０％を超える細胞がＣＤ３３を発現し、２５％を超える細胞がＣＤ３４を発現し、５％未満の細胞がＣＤ３８を発現し、１０％未満の細胞がＣＤ４２ａを発現し、４０％を超える細胞がＣＤ７１を発現し、１５％を超える細胞がＣＤ１３３を発現し、１０％を超える細胞がＣＤ３４ｂｒを発現し、そしてそれらの組合せが挙げられる。
【００４８】
他の実施形態において、特定のサイトカインカクテルは、「Ｆ２」と呼ばれ、アンギオテンシン、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＢＤＮＦ、ＩＬ−３、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＢＭＰ−４、ＴＧＦ−ベータ１、トロンボスポンジン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＭＣＰ−１を含む。
【００４９】
Ｆ２増殖集団の１％未満が、増殖後にＴ細胞（ＣＤ３）、Ｂ細胞（ＣＤ１９）または成熟顆粒球、ＮＫリンパ球、またはマクロファージ（ＣＤ１６）を含み、集団の１５％未満が、増殖後に単球（ＣＤ１４）、分化造血細胞（ＣＤ３８）、および血小板または巨大核細胞（ＣＤ４２ａ）を含み、集団の１０％を超える細胞が、内皮細胞、血小板、白血球またはそれらの前駆体（ＣＤ３１）、骨髄前駆細胞（ＣＤ３３）、造血幹細胞及び前駆細胞（ＣＤ３４）、増殖細胞および赤血球前駆体（ＣＤ７１）を含み、２％を超える細胞が、神経幹細胞（ＣＤ１３３）、およびＣＤ３４ｂｒ幹細胞及び前駆細胞を含む。一実施形態において、Ｆ２増殖細胞集団は、幹細胞集団を含み、１％未満の細胞がＣＤ３を発現し、１５％未満の細胞がＣＤ１４を発現し、１％未満の細胞がＣＤ１６を発現し、１％未満の細胞がＣＤ１９を発現し、５０％を超える細胞がＣＤ３１を発現し、５０％を超える細胞がＣＤ３３を発現し、１５％を超える細胞がＣＤ３４を発現し、５％未満の細胞がＣＤ３８を発現し、１０％未満の細胞がＣＤ４２ａを発現し、４０％を超える細胞がＣＤ７１を発現し、１％を超える細胞がＣＤ１３３を発現し、７％を超える細胞がＣＤ３４ｂｒを発現し、そしてそれらの組合せが挙げられる。
【００５０】
さらなる実施形態において、特定のサイトカインカクテルは、「Ｄ６」と呼ばれ、ＰｌＧＦ、ＳＤＦ−１アルファ、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＩＬ−５、ＢＤＮＦ、ＩＬ−１１、ＩＬ−３、ＥＰＯ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンド、アミノ酸配列ＶＴＣＧを含む造血接着ペプチド、ＴＲＡＮＣＥ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦおよびＧ−ＣＳＦを含む。
【００５１】
Ｄ６増殖集団の１％未満が、増殖後にＴ細胞（ＣＤ３）、Ｂ細胞（ＣＤ１９）または成熟顆粒球、ＮＫリンパ球、またはマクロファージ（ＣＤ１６）を含み、集団の１０％未満が、増殖後に単球（ＣＤ１４）、分化造血細胞（ＣＤ３８）、および血小板または巨大核細胞（ＣＤ４２ａ）を含み、集団の２０％を超える細胞が、内皮細胞、血小板、白血球またはそれらの前駆体（ＣＤ３１）、骨髄前駆細胞（ＣＤ３３）、造血幹細胞及び前駆細胞（ＣＤ３４）、増殖細胞および赤血球前駆体（ＣＤ７１）を含み、５％を超える細胞が、神経幹細胞（ＣＤ１３３）、およびＣＤ３４ｂｒ幹細胞及び前駆細胞を含む。一実施形態において、Ｄ６増殖細胞集団は、幹細胞集団を含み、１％未満の細胞がＣＤ３を発現し、１０％未満の細胞がＣＤ１４を発現し、１％未満の細胞がＣＤ１６を発現し、１％未満の細胞がＣＤ１９を発現し、８０％を超える細胞がＣＤ３１を発現し、６０％を超える細胞がＣＤ３３を発現し、２０％を超える細胞がＣＤ３４を発現し、５％未満の細胞がＣＤ３８を発現し、５％未満の細胞がＣＤ４２ａを発現し、５０％を超える細胞がＣＤ７１を発現し、１０％を超える細胞がＣＤ１３３を発現し、５％を超える細胞がＣＤ３４ｂｒを発現し、そしてそれらの組合せが挙げられる。
【００５２】
さらなる実施形態において、特定のサイトカインカクテルは、「Ｆ２Ｎ」と呼ばれ、ＢＤＮＦ、ｂＦＧＦ、ＥＰＯ、フィブロネクチン、Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンド、ＩＧＦ−１、ＩＬ−１１、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＳＣＦ、ＴＧＦ−ベータ１、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦを含む。
【００５３】
さらなる実施形態において、特定のサイトカインカクテルは、「Ｆ４」と呼ばれ、ｂＦＧＦ、ＥＰＯ、Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンド、ＩＬ−１１、ＩＬ−６、ＰＤ−ＥＣＧＦ、トロンボスポンジンおよびトロンボポイエチン（Ｔｐｏ）を含む。
【００５４】
さらなる実施形態において、特定のサイトカインカクテルは、「Ｇ８」と呼ばれ、ＢＤＮＦ、ｂＦＧＦ、Ｆｌｔ−３／Ｆｌｔ−２リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＰＤ−ＥＣＧＦ、ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、白血病阻害因子（ＬＩＦ）および幹細胞成長因子−アルファ（ＳＣＧＦ−アルファ）を含む。
【００５５】
これらの特定のサイトカイン混合物（ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を基本栄養培地に添加して、臍帯血由来細胞および／または他の細胞を維持または増殖させるのに好適な培地を提供することができる。哺乳類細胞、特に幹細胞の培養に好適な任意の栄養培地、例えばＳｔｅｍｌｉｎｅ（商標）［Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州）］を使用することができる。栄養培地におけるこれらのサイトカインの最終濃度は、１フェムトグラム／ｍｌ〜１ピコグラム／ｍｌ〜１ナノグラム／ｍｌ〜１ミリグラム／ｍｌの範囲でありうる。いくつかの実施形態において、サイトカインのいずれか１つの濃度は、１ｐｇ／ｍｌ、５ｐｇ／ｍｌ、１０ｐｇ／ｍｌ、１５ｐｇ／ｍｌ、２０ｐｇ／ｍｌ、２５ｐｇ／ｍｌ、３０ｐｇ／ｍｌ、３５ｐｇ／ｍｌ、４０ｐｇ／ｍｌ、４５ｐｇ／ｍｌ、５０ｐｇ／ｍｌ、５５ｐｇ／ｍｌ、６０ｐｇ／ｍｌ、６５ｐｇ／ｍｌ、７０ｐｇ／ｍｌ、７５ｐｇ／ｍｌ、８０ｐｇ／ｍｌ、８５ｐｇ／ｍｌ、９０ｐｇ／ｍｌ、９５ｐｇ／ｍｌ、１００ｐｇ／ｍｌ、１１０ｐｇ／ｍｌ、１２０ｐｇ／ｍｌ、１３０ｐｇ／ｍｌ、１４０ｐｇ／ｍｌ、１５０ｐｇ／ｍｌ、１６０ｐｇ／ｍｌ、１７０ｐｇ／ｍｌ、１８０ｐｇ／ｍｌ、１９０ｐｇ／ｍｌ、２００ｐｇ／ｍｌ、２１０ｐｇ／ｍｌ、２２０ｐｇ／ｍｌ、２３０ｐｇ／ｍｌ、２４０ｐｇ／ｍｌ、２５０ｐｇ／ｍｌ、２６０ｐｇ／ｍｌ、２７０ｐｇ／ｍｌ、２８０ｐｇ／ｍｌ、２９０ｐｇ／ｍｌ、３００ｐｇ／ｍｌ、３１０ｐｇ／ｍｌ、３２０ｐｇ／ｍｌ、３３０ｐｇ／ｍｌ、３４０ｐｇ／ｍｌ、３５０ｐｇ／ｍｌ、３６０ｐｇ／ｍｌ、３７０ｐｇ／ｍｌ、３８０ｐｇ／ｍｌ、３９０ｐｇ／ｍｌ、４００ｐｇ／ｍｌ、４１０ｐｇ／ｍｌ、４２０ｐｇ／ｍｌ、４３０ｐｇ／ｍｌ、４４０ｐｇ／ｍｌ、４５０ｐｇ／ｍｌ、４６０ｐｇ／ｍｌ、４７０ｐｇ／ｍｌ、４８０ｐｇ／ｍｌ、４９０ｐｇ／ｍｌ、５００ｐｇ／ｍｌ、５１０ｐｇ／ｍｌ、５２０ｐｇ／ｍｌ、５３０ｐｇ／ｍｌ、５４０ｐｇ／ｍｌ、５５０ｐｇ／ｍｌ、５６０ｐｇ／ｍｌ、５７０ｐｇ／ｍｌ、５８０ｐｇ／ｍｌ、５９０ｐｇ／ｍｌ、６００ｐｇ／ｍｌ、６１０ｐｇ／ｍｌ、６２０ｐｇ／ｍｌ、６３０ｐｇ／ｍｌ、６４０ｐｇ／ｍｌ、６５０ｐｇ／ｍｌ、６６０ｐｇ／ｍｌ、６７０ｐｇ／ｍｌ、６８０ｐｇ／ｍｌ、６９０ｐｇ／ｍｌ、７００ｐｇ／ｍｌ、７１０ｐｇ／ｍｌ、７２０ｐｇ／ｍｌ、７３０ｐｇ／ｍｌ、７４０ｐｇ／ｍｌ、７５０ｐｇ／ｍｌ、７６０ｐｇ／ｍｌ、７７０ｐｇ／ｍｌ、７８０ｐｇ／ｍｌ、７９０ｐｇ／ｍｌ、８００ｐｇ／ｍｌ、８１０ｐｇ／ｍｌ、８２０ｐｇ／ｍｌ、８３０ｐｇ／ｍｌ、８４０ｐｇ／ｍｌ、８５０ｐｇ／ｍｌ、８６０ｐｇ／ｍｌ、８７０ｐｇ／ｍｌ、８８０ｐｇ／ｍｌ、８９０ｐｇ／ｍｌ、９００ｐｇ／ｍｌ、９１０ｐｇ／ｍｌ、９２０ｐｇ／ｍｌ、９３０ｐｇ／ｍｌ、９４０ｐｇ／ｍｌ、９５０ｐｇ／ｍｌ、９６０ｐｇ／ｍｌ、９７０ｐｇ／ｍｌ、９８０ｐｇ／ｍｌ、９９０ｐｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１．５ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、３．５ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、４．５ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２���ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、４５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、５５ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、６５ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、７５ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、８５ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、９５ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１１０ｎｇ／ｍｌ、１２０ｎｇ／ｍｌ、１３０ｎｇ／ｍｌ、１４０ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、１６０ｎｇ／ｍｌ、１７０ｎｇ／ｍｌ、１８０ｎｇ／ｍｌ、１９０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、２１０ｎｇ／ｍｌ、２２０ｎｇ／ｍｌ、２３０ｎｇ／ｍｌ、２４０ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、２６０ｎｇ／ｍｌ、２７０ｎｇ／ｍｌ、２８０ｎｇ／ｍｌ、２９０ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、３１０ｎｇ／ｍｌ、３２０ｎｇ／ｍｌ、３３０ｎｇ／ｍｌ、３４０ｎｇ／ｍｌ、３５０ｎｇ／ｍｌ、３６０ｎｇ／ｍｌ、３７０ｎｇ／ｍｌ、３８０ｎｇ／ｍｌ、３９０ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、４１０ｎｇ／ｍｌ、４２０ｎｇ／ｍｌ、４３０ｎｇ／ｍｌ、４４０ｎｇ／ｍｌ、４５０ｎｇ／ｍｌ、４６０ｎｇ／ｍｌ、４７０ｎｇ／ｍｌ、４８０ｎｇ／ｍｌ、４９０ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、５１０ｎｇ／ｍｌ、５２０ｎｇ／ｍｌ、５３０ｎｇ／ｍｌ、５４０ｎｇ／ｍｌ、５５０ｎｇ／ｍｌ、５６０ｎｇ／ｍｌ、５７０ｎｇ／ｍｌ、５８０ｎｇ／ｍｌ、５９０ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、６１０ｎｇ／ｍｌ、６２０ｎｇ／ｍｌ、６３０ｎｇ／ｍｌ、６４０ｎｇ／ｍｌ、６５０ｎｇ／ｍｌ、６６０ｎｇ／ｍｌ、６７０ｎｇ／ｍｌ、６８０ｎｇ／ｍｌ、６９０ｎｇ／ｍｌ、７００ｎｇ／ｍｌ、７１０ｎｇ／ｍｌ、７２０ｎｇ／ｍｌ、７３０ｎｇ／ｍｌ、７４０ｎｇ／ｍｌ、７５０ｎｇ／ｍｌ、７６０ｎｇ／ｍｌ、７７０ｎｇ／ｍｌ、７８０ｎｇ／ｍｌ、７９０ｎｇ／ｍｌ、８００ｎｇ／ｍｌ、８１０ｎｇ／ｍｌ、８２０ｎｇ／ｍｌ、８３０ｎｇ／ｍｌ、８４０ｎｇ／ｍｌ、８５０ｎｇ／ｍｌ、８６０ｎｇ／ｍｌ、８７０ｎｇ／ｍｌ、８８０ｎｇ／ｍｌ、８９０ｎｇ／ｍｌ、９００ｎｇ／ｍｌ、９１０ｎｇ／ｍｌ、９２０ｎｇ／ｍｌ、９３０ｎｇ／ｍｌ、９４０ｎｇ／ｍｌ、９５０ｎｇ／ｍｌ、９６０ｎｇ／ｍｌ、９７０ｎｇ／ｍｌ、９８０ｎｇ／ｍｌ、９９０ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌでありうる。これらのサイトカインを濃縮し、場合によっては栄養培地に添加する前に凍結乾燥して、上記の最終濃度の例を得ることができることを当業者は認識している。培養に添加する質量は、サイトカイン調製物の具体的な生物活性に依存することも当業者は認識している。サイトカインの生物学的効果を判断するための生物検定は、当該技術分野でよく知られている。したがって、生物活性を質量に関連付ける場合は、検定によって規定されるような生物「単位」を用いる。
【００５６】
本発明の方法は、サイトカインカクテルを含む栄養培地中で幹細胞源からの幹細胞を培養または増殖させることを含む。細胞の培養方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、非特許文献１９を参照されたい。「細胞培養」とは、人工的な生体内環境に細胞を維持することを意味する。「細胞培養」という用語は、総称であり、個々の細胞ばかりでなく、組織、器官系または生体全体の培養を包括するのに用いることができることが理解されるべきである。ある実施形態では、幹細胞源由来の細胞は栄養培地を含む培養容器内に置かれる。該培地は、サイトカイン混合物を含んでいてもよく、またはサイトカインを後で添加することができる。次いで、細胞をサイトカイン混合物とともに、細胞成長に好適な温度（いくつかの実施形態では約３７℃）にて少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、またはそれより長い時間にわたってインキュベートする。当該技術分野で知られている任意の方法で細胞を収穫することができ、該収穫方法としては、非接着細胞を回収するための遠心分離、接着細胞のトリプシン処理、または表面から細胞を擦り取ることを含むが、それらに限定されない。
【００５７】
間質細胞は、骨髄における造血細胞の増殖および分化のための重要な役割を果たす。例えば、非特許文献２０、非特許文献２１、非特許文献２２および非特許文献２３を参照されたい。したがって、骨髄由来造血細胞調製物、またはＡＦＴ０２４の如きマウス培養細胞の培養物中に形成された間質供給層を利用して、造血幹細胞または前駆細胞を生体外で維持することができる場合もある。例えば、非特許文献６を参照されたい。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の細胞の増殖化は、誘導された細胞を間質支持細胞と接触させることを含むことができる。他の実施形態において、幹細胞源由来の非分割（ｕｎｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ）白血球（総有核細胞、ＴＮＣ）を本明細書に開示されたサイトカインカクテルで培養するときに、間質細胞を臍帯血から誘導する。当該技術分野で知られている方法を用いて、骨髄からの間質細胞の単離および培養を成し遂げることができるが、臍帯血源から間質細胞を導く方法を記載した報告書はわずかしか存在しない（例えば非特許文献２４および非特許文献２５参照）。本発明の方法に従って、接着間質細胞の増殖は、本明細書に開示されているサイトカインカクテル、特に上記のＧ２培地で臍帯血由来総有核細胞を培養することによってなされる。本明細書に記載されている方法のいずれかのために、サイトカインカクテルでの培養から導かれた間質細胞を、増殖されたＣＤ３４ｂｒ細胞集団と組み合わせることができる。いくつかの実施形態において、増殖された間質細胞は、間葉起源の少なくとも１つまたは複数の細胞型を生成することが可能な間葉幹細胞を含む。
【００５８】
代替的な造血幹細胞及び前駆細胞源、例えば臍帯血、動員末梢血またが胎盤は、間質支持層を自動的には供給しない。加えて、治療用途のための細胞は、細胞受容体に対する免疫原性または感染発生のリスクのない十分に特定された培養物中に維持されなければならない。治療用途では、治療細胞と未特定の支持層とを直接に接触させることは望ましくない。代替的な培養系が、研究され、当該技術分野で知られている。例えば非特許文献２６を参照されたい。
【００５９】
したがって、未特定の間質支持層は、特に患者の疾病により自己移植が可能でない場合は、一般的に望ましくない。したがって、本発明は、無間質培養を含めて、幹細胞及び前駆細胞の増殖のための十分に制御され、かつ十分に特定された培養条件を提供する。本発明は、細胞の量が投入レベル未満に低下しないように、ＳＰＣ成長を長期にわたって持続させるサイトカイン補充をさらに提供する。
【００６０】
培養に使用される細胞は、臍帯血、末梢血、胎児肝臓、胎盤、胚幹細胞または骨髄の如き任意の幹細胞源から導かれた細胞を含むことができる。これらの試料は、新鮮な試料、凍結試料または冷蔵試料であってもよい。細胞を凍結させる方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば非特許文献２７を参照されたい。
【００６１】
培養前の幹細胞の細胞凍結、または本明細書に開示されている増殖細胞の細胞凍結を知られている方法に従って実施することができる。例えば、細胞を「凍結培地」に懸濁させることができ、該凍結培地として例えば５〜１０％のグリセロールを有する、または有さない１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）をさらに含む培地を挙げることができ、その密度は例えば約０．５〜４×１０６個／ｍｌの密度である。細胞をガラスまたはプラスチックバイアルに分配し、次いでそれらを密封し、プログラム式フリーザーまたはパッシブ（ｐａｓｓｉｖｅ）フリーザーである冷凍室に移す。最適な凍結速度を実験的に決定することができる。例えば、融解熱による−１℃／分の温度変化を与える凍結プログラムを用いることができる。細胞を含むバイアルが−８０℃に達すると、それらを液体窒素保存部に移す。低温保存細胞を数年間にわたって保存することができる。
【００６２】
いくつかの実施形態において、任意の幹細胞源から新たに単離された細胞を低温保存して、細胞バンク（ｃｅｌｌ  ｂａｎｋ）を構成することができ、そのいくつかの部分を解凍により取り出し、次いで必要に応じて本発明の増殖細胞を生成するのに使用することができる。解凍は、一般には迅速に実施される必要があり、例えばバイアルを液体窒素から３７℃の水槽に移すことによって行われる。バイアルの解凍内容物を、栄養培地の如き適切な培地を含む培養容器に、無菌条件下で即座に移す必要がある。培養を始めたら、細胞を、例えば倒立顕微鏡で毎日検査して、細胞増殖を検出し、適切な密度に達するとすぐに継代培養することができる。
【００６３】
細胞を必要に応じて細胞バンクから取り出し、体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、例えば以下に記載される三次元骨格培養物として）で、または生体内で（ｉｎ  ｖｉｖｏ、例えば組織復元または修復が必要とされる部位に対する細胞の投与により）新たな幹細胞または組織の生成に使用することができる。本明細書に記載されているように、本発明の増殖細胞を使用して被検体における組織を復元または修復することができ、該増殖細胞は被検体自身の血液またはその他の組織から単離された（すなわち自己由来細胞）ものに由来する。あるいは、本明細書に開示されている増殖細胞を、任意の被検体における組織を復元または修復するための遍在的な供与体細胞として使用できる（すなわち異種由来細胞）。
【００６４】
培養に先だって、分化細胞の消極的選択により、終末分化細胞の大部分を幹細胞源から除去することができる。例えば、多数の系統拘束細胞を選択的な磁性ビーズの分別により除去することができる。いくつかの実施形態において、少なくとも約８０％、通常は少なくとも約７０％の分化細胞が、培養に先立って除去されることになる。
【００６５】
当該技術分野で知られている任意の方法を用いて培養ＳＰＣをさらに特徴付けることができる。一般には、細胞は、細胞表面から導かれたモノクローナル抗体と接触し、積極的または消極的に選択される。選択のための当該技術は、当該技術分野でよく知られており、免疫磁性ビーズ、補体媒介溶菌、固体基質に結合した抗体を用いた「パンニング法」、凝集反応法、磁性活性細胞分類（ＭＡＣＳ）またはＦＡＣＳ、による分類を含む。
【００６６】
本発明の増殖細胞は、疾病および傷害の治療および緩和における広範な用途を有する。本発明の増殖細胞は、遺伝子送達はもちろんのこと、組織の修復、復元および再生を含む多くの治療用途に有用である。本発明の細胞は、系統拘束、また非拘束細胞の双方を含むことができるため、双方の細胞型を併用して、複数の治療目標を、いくつかの実施形態ではさらに同時に達成することができる。例えば、いくつかの実施形態において、本発明の増殖細胞を免疫不全症の治療に使用することができ、または幹細胞移植体として使用することができ、または懸濁物中もしくは支持骨格上の幹細胞移植片において使用することができる。
【００６７】
本発明の増殖細胞を投与前に担体培地に仕込むことができる。注入については、本発明の増殖細胞を生理的に許容可能な媒体で、通常は血管内投与（静脈内投与を含む）により投与することができるが、骨髄（細胞にとって再生および分化のための好適な部位でありうる）の如き他の都合のよい部位に導入してもよい。通常は、少なくとも１×１０５細胞／ｋｇ、少なくとも５×１０５細胞／ｋｇ、少なくとも１×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも２×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも３×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも４×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも５×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも６×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも７×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも８×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも９×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも１０×１０６細胞／ｋｇ、またはそれよりも多くの細胞が投与されることになる。例えば非特許文献２８を参照されたい。注射およびカテーテル法等を含む任意の方法によって細胞を導入することができる。所望により、さらなる薬物または成長因子を共投与することができる。対象となる薬物としては、５−フルオロウラシル、およびサイトカインを含む成長因子（ＩＬ−２、ＩＬ−３、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮガンマおよびＥＰＯ等）が挙げられる。
【００６８】
投与細胞は、本発明の細胞の混合物、および対象となるさらなる細胞を含むこともできる。対象となる細胞としては、分化肝細胞、分化心筋、分化脾臓細胞、またはこれらの分化細胞の前駆対等が挙げられる。これらの組合せは、本発明の増殖細胞が本明細書に開示されている三次元骨格に接種される場合は特に有用である。
【００６９】
いくつかの実施形態において、集団の増殖細胞を使用して、免疫応答を調節することができる。例えば、前駆および幹細胞はリンパ球に成長するため、抗原をこれらの細胞に充填することができる。それらの細胞は、成長するに従って、治療用途および抗原に応じて特定の抗原に対する耐性または免疫を誘発することができる。
【００７０】
いくつかの実施形態において、本発明の増殖細胞は骨髄機能を復元する際に有用であり、例えば骨髄が癌放射線療法または癌化学療法等において切除された場合に有用である。骨髄機能が損なわれる疾病の例としては、白血病類、貧血症類（鎌形細胞、地中海貧血、フォンウィルブランド病等）、リンパ腫類（ホジキン病および多発性骨髄腫等）、ならびに固形器官癌類（肺癌、乳癌、精巣癌、卵巣癌および結腸癌等）が挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、患者からの幹細胞を除去し、増殖させ、かつ再導入することができる。このような場合は、増殖のための幹細胞源は、動員末梢血および骨髄を含む。増殖後、これらの細胞を分類し、再導入して、癌細胞が受容体に戻る機会を低下させることによって、自己由来幹細胞移植体に対する成果を向上させることが得きる。
【００７１】
治療は、造血幹細胞のより従来的な使用に限定されない。本明細書に記載されているように、本発明の増殖された幹細胞及び前駆細胞は、造血系統および間葉系統の双方に分化することができる。例えば非特許文献２９を参照されたい。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の増殖された細胞集団を使用して、損傷間葉組織または疾患間葉組織（心臓、膵臓、肝臓、骨、軟骨、内皮、神経、星状膠細胞および真皮等）の修復および復元を行うことができる。増殖された細胞は、帰巣するか、あるいは損傷部位に仕込まれると、分化して、新たな組織を形成し補足器官機能を果たすことができる。いくつかの実施形態において、それらの細胞を使用して、血管新生を促進することができるため、酸素添加反応、および組織からの廃棄物除去を向上させることができる。これらの実施形態において、本発明の増殖された細胞を使用して、分化組織および器官（心不全等における虚血心臓または卒中等における虚血神経等）の機能を高めることができる。したがって、本発明の幹細胞は、細胞機能または器官機能が低下したあらゆる疾病に有用である。
【００７２】
移植の前に、細胞を組織工学構造体（ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）と接触させることにより、本発明の増殖された細胞を移植に使用することができる。次いで、これらの細胞を含む該構造体を、当該移植体を必要とする宿主に移植する。本発明の細胞は、移植体での血管形成および脈管形成を促進させることによって、酸素添加反応および廃棄物除去を容易にし、移植体における虚血性壊死および炎症のリスクを低減するのに特に有用である。いくつかの実施形態において、本発明の組織工学構造体は、少なくとも血管系促進幹細胞、すなわち三次元生体適合骨格上の分化細胞を含み、それによって修復または交換されるべき器官の少なくとも１つの生理的機能を果たす。本発明の増殖細胞は、血管系促進幹細胞として特に有用である。「血管新生促進」または「血管系促進」とは、新たな血管の成長（血管形成）を促進すること、または既存の血管からの成長（脈管形成）を誘発すること、またはそれらの任意の組合せを意味するものである。
【００７３】
「分化細胞」とは、限定された組織発生へと拘束された細胞を意味するものである。いくつかの実施形態において、本発明の増殖細胞は、系統拘束細胞、非拘束細胞の双方を含むことができる。したがって、いくつかの構造体において、幹細胞は、分化組織を生成するとともに、血管系促進細胞源として作用することができる。他の実施形態において、分化組織源は、目的とする移植体受容体または他の供与体からの細胞または組織を含むことができる。細胞または組織源を移植前に分化させることができる。例えば、非特許文献３０および非特許文献３１に詳述されている胚様体形成について記載されている条件を用いて、脾臓ベータ細胞を分化させることができる。
【００７４】
分化細胞と組み合わされる血管系促進細胞は、例えば、臍帯血を含む任意の幹細胞源から導かれるＣＤ３４ｂｒ細胞、新たに単離された、または体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でＣＤ３４ｂｒ細胞から分化された内皮前駆細胞、任意の幹細胞源からの新たに単離された幹細胞、および細胞表面マーカーＣＤ３４、ＣＤ１３３と共発現するＣＤ３４、およびＣＤ３１と共発現するＣＤ３４の発現のために選択される任意の細胞源からの細胞を含むことができる。いくつかの実施形態において、血管系促進細胞をＶＥＧＦおよびｂＦＧＦの如き脈管形成成長因子と接触させる。細胞を骨格に接種する前または後に脈管形成成長因子と接触させてから、構造体を損傷器官に移植することができる。いくつかの実施形態において、サイトカイン含浸ポリマーは、ある期間にわたってＶＥＧＦおよびｂＦＧＦを放出することができる。他の実施形態において、接種細胞の増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）および分裂（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を誘導するように、該骨格を条件付けすることができる。例えば、特許文献１４を参照されたい。他の実施形態において、微小球を血管系促進幹細胞と接触させ、目標部位に仕込むことができる。微小球をベースとした骨格は、当該技術分野でよく知られている。例えば、非特許文献３２を参照されたい。
【００７５】
「損傷器官を補足する」とは、最適な能力未満で機能する器官の機能を高め、強化し、かつ向上させることを意味するものである。その用語は、器官が被検体にとって生理的に許容可能な能力で機能するように機能を獲得することを意味するものである。例えば、小児の器官、例えば腎臓または心臓にとって生理的に許容可能な能力は、成人または高齢患者の生理的に許容可能な能力とは異なる。器官全体または器官の一部を補足することができる。補足結果が、本来の器官と同じ生理的応答を有する器官をもたらすことが好ましい。一実施形態において、器官は、その自然の能力の少なくとも約１０％で機能しているときに能力が補足される。
【００７６】
三次元生体適合骨格が、本発明の血管系促進増殖細胞と接触した後に（例えば器官内の）目標部位において宿主組織と接触される場合、またはその器官組織を移植前に該骨格上で成長させる場合には、移植体は、目標部位内で成長、増殖し、器官の低下した活性を交換または補足することが可能である。構造物を宿主の単一個所に添加することができる。あるいは、複数の構造体を形成し、宿主の複数の部位に添加することができる。
【００７７】
本明細書に用いられている「目標部位」という用語は、交換または補足を必要とする宿主または器官における領域を意味する。目標部位は、器官または宿主における単一領域、あるいは器官または宿主における複数の領域でありうる。いくつかの実施形態において、補足または交換は、正常器官と同じ生理的応答をもたらす。
【００７８】
骨格の形状および寸法は、交換または補足されている器官、および構造体を形成するのに使用されている骨格材料の種類に基づいて決定される。例えば、ポリマー骨格が腎臓交換または補足に使用される場合は、そのポリマー骨格の寸法は、そのポリマー骨格の幅および長さの点で変化しうる。ポリマー骨格の大きさおよび寸法は、交換または補足されている器官の面積に基づいて決定されることを当業者は認識している。
【００７９】
本明細書に用いられている「脱細胞化される」または「脱細胞化」という用語は、生物構造体（例えば器官、または器官の一部）から細胞および組織内容物を除去して、無傷の無細胞基礎構造を残した該生物構造体を意味する。脱細胞化の方法は、特定組織を除去し、結合組織の複雑な三次元網を残すものである。結合組織基礎構造は、主にコラーゲンからなる。脱細胞化構造体は基質材料を提供し、その上に異なる細胞集団を注入することができる。脱細胞化生物構造体は、硬質、または半硬質で、その形状を変化させることができる。例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれている特許文献１５に記載されているように、脱細胞化生物構造体の培養および作製を実施することができる。
【００８０】
本発明の組織工学構造体は、骨格材料を基体として使用して、その上に細胞を堆積させ、その上で細胞を成長させ及び接着させて形成される。
【００８１】
本発明は組織工学構造体を形成する方法を提供し、該方法では、さらなる培養細胞の生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での成熟、成長および分化を支持する骨格材料を使用して、それらの生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）相当物に類似した生体組織の成分を形成させる。該骨格は、最適な細胞−細胞相互作用を可能にすることによって、細胞表現型および組織微小環境のより自然な形成を可能にする。該骨格は、また、細胞が活発に成長し、増殖し、分化して、組織工学構造体を生成し続けることを可能にし、該組織工学構造体は必要であれば、さらなる培養細胞集団の成長、増殖および分化を支持することも可能である。
【００８２】
骨格材料上で成長する細胞は、本発明によれば、多層で成長して、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）に見られる生理的条件に類似した細胞構造体を形成することができる。骨格は、異なる型の細胞の増殖、およびいくつかの異なる組織の形成を支持することができる。例としては、胃腸および泌尿管、および循環系はもちろんのこと、腎臓、心臓、皮膚、肝臓、膵臓、副腎および神経組織、ならびに胃腸および泌尿管の組織が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８３】
接種された骨格を様々な用途に使用できる。例えば、骨格を被検体に移植することができる。本発明によれば、移植体を使用して既存の組織を交換または補足することができ、例えば、自然の膵臓を交換または補足することにより膵臓疾患の被検体を治療することによってすることができる。膵臓疾患を改善するための移植の後で被検体をモニタリングすることができる。
【００８４】
いくつかの実施形態において、骨格はポリマー材料である。好適なポリマーとしては、アルギネート、ヒアルロネート、コラーゲン、ポリ（アルファエステル）［ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリオルソエステルおよびポリ無水物およびそれらのコポリマー等］、セルロースエーテル、セルロース、セルロースエステル、フッ化ポリエチレン、フェノール類、ポリ−４−メチルペンテン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリアクリレート、ポリベンゾキサゾール、ポリカーボネート、ポリシアノアリールエーテル、ポリエステルカーボネート、ポリエーテル、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルイミド、ポリエーテルケトン、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン、ポリフルオロエチレン、ポリイミド、ポリオレフィン、ポリオキサジアゾール、酸化ポリフェニレン、ポリフェニレン、スルフィド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルフィド、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリチオエーテル、ポリトリアゾール、ポリウレタン、フッ化ポリビニリデン、再生セルロース、尿素−ホルムアルデヒド、またはそれらのコポリマーもしくは物理的混合物が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８５】
ポリグリコール酸の如きポリマーは、器官増強構造体を生成するための好適な生体適合構造体である。溶液流延、圧縮成型、フィラメント絞り成形（ｆｉｌａｍｅｎｔ  ｄｒａｗｉｎｇ）、網目形成（ｍｅｓｈｉｎｇ）、浸出、製織（ｗｅａｖｉｎｇ）およびコーティングの如き方法を用いて生体適合ポリマーを成形することができる。
【００８６】
他の骨格材料としては、ポリグリコール酸ポリマー（ＰＧＡ）、ポリ乳酸ポリマー（ＰＬＡ）、ポリセバシン酸ポリマー（ＰＳＡ）、ポリ（乳酸・グリコール酸）コポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリ（乳酸・セバシン酸）コポリマー（ＰＬＳＡ）、ポリ（グリコール酸・セバシン酸）コポリマー（ＰＧＳＡ）およびポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を含む生物分解性ポリマーが挙げられる。ＰＨＡおよびそれらの生成は、例えば、特許文献１６、特許文献１７および特許文献１８に記載されている。生物分解性ポリマー、例えばＰＧＡとＰＬＧＡの組合せを使用することもできる。
【００８７】
本発明に有用な他の生物分解性ポリマーとしては、カプロラクトン、カーボネート、アミド、アミノ酸、オルトエステル、アセタール、シアノアクリレートおよび分解性ウレタンのポリマーまたはコポリマーが挙げられ、これらと直鎖状または枝分れした、置換または無置換のアルカニル、ハロアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、アルケニル、または芳香族ヒドロキシもしくは芳香族ジカルボン酸とのコポリマーももちろん挙げられる。加えて、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、チロシンおよびシステイン、またはそれらの鏡像異性体の如き反応性側鎖基を有する生物学的に重要なアミノ酸を上記材料のいずれかとともにコポリマーに含めることができる。
【００８８】
本発明は、治療組織を調製するための細胞接種骨格を採用するため、骨格が生体適合性を有し、細胞結合および後の組織成長に貢献することが必要である。したがって、機械強度または熱特性の如き骨格の他の特性を変えることなく、目標とする用途に適合するように表面特性を改良することができる。有用な表面改良としては、例えば、化学基機能、表面帯電、疎水性、親水性および濡れ性の改変を挙げることが可能である。例えば、細胞結合を促進させる生物活性化合物またはペプチドを表面に結合または被覆することによって、細胞接着を容易にすることができる。コーティング剤または生物活性化合物を共有結合または非共有結合的に結合させることができる。当該技能は当該技術分野で知られている。
【００８９】
骨格に細胞を接種する前に滅菌を行う。熱処理はデバイスを変形させうるため、熱滅菌は非実用的であることが多く、特に材料が熱滅菌処理に必要な温度を下回る溶融温度を有する場合はそうである。したがって、いくつかの実施形態では低温のエチレンオキシドガスを滅菌剤として使用することができる。あるいは、ガンマ放射線または電子ビーム滅菌を用いることもできる。
【００９０】
培養における細胞のための好適な成長条件および培地は、当該技術分野でよく知られている。細胞培地は、典型的には、必須栄養分を含むが、場合によっては、特定の細胞型の成長および分化に合わせて個別調整できるさらなる要素（例えば成長因子、塩および鉱物）をも含む。
【００９１】
培地からの栄養分が堆積細胞集団に到達するが、培養細胞が孔を通じて移動することを防ぐことを可能にする調節孔構造を有するように、ポリマー基質を作製することができる。走査電子顕微鏡法、組織検査（ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ）、および放射性同位元素による定量評価を用いて、体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）細胞結合および細胞生存度を評価することができる。
【００９２】
ポリマー基質を任意の数の所望の形状に成形して、任意の数の全体系、幾何学構造または空間制限を満たすことができる。ポリマー基質を異なるサイズに成形して、異なるサイズの患者の器官に対応させることができる。
【００９３】
組織工学構造体は、平坦、管状、または複雑な形状でありうる。構造体の形状は、その目的とする用途によって決定されることになる。構造体を移植して、器官の疾患または損傷部を修復、補足または交換することができる。
【００９４】
一実施形態において、骨格材料は、典型的には水に不溶または難溶の架橋ポリマー網で構成されたヒドロゲルであるが、過剰の水の存在下で平衡サイズまで膨張することができる。例えば、細胞をヒドロゲルに仕込み、ヒドロゲルを器官内の所望の個所に注入することができる。一実施形態において、細胞をコラーゲンのみで注入することができる。他の実施形態において、細胞をコラーゲンおよび他のヒドロゲルで注入することができる。ヒドロゲル組成物としては、例えば、ポリ（エステル）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（ラクトン）、ポリ（アミド）、ポリ（エステル−アミド）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（オルト−エステル）、ポリ（カーボネート）、ポリ（ホスファジン）、ポリ（チオエステル）、多糖類およびそれらの混合物を挙げることができるが、それらに限定されない。また、該組成物としては、例えば、ポリ（アルファ−ヒドロキシ）酸およびポリ（ベータヒドロキシ）酸を含むポリ（ヒドロキシ）酸を挙げることもできる。当該ポリ（ヒドロキシ）酸としては、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロン酸、ポリ酪酸、ポリ吉草酸、ならびにそれらのコポリマーおよび混合物が挙げられる。ヒドロゲルの独自の特性、ならびに薬物送達のような分野におけるそれらの潜在的な用途により、様々な種類のヒドロゲルが合成され、特徴付けられてきた。本発明の基質材料は、従来の泡およびスポンジ材料と、いわゆる「ヒドロゲルスポンジ」の双方を包括する。例えば特許文献１９を参照されたい。
【００９５】
他の実施形態において、自然の脱細胞化器官の部分を使用して、骨格を形成する。器官から全細胞および組織内容物を除去することによって器官の部分を脱細胞化することができる。例えば、特許文献１５を参照されたい。
【００９６】
本発明の増殖細胞を、それを必要とする患者における遺伝子治療に使用することができる。いくつかの実施形態において、より成熟した系統拘束細胞は、特に一時的な遺伝子発現が必要とされる場合、または細胞の成熟および分裂によって遺伝子形質導入が促進される場合に特に有用である。例えば、いくつかのレトロウィルスベクターは、細胞が、統合される遺伝子に対して循環することを必要とする。幹細胞及び前駆細胞を形質導入して、新たな治療遺伝子を送達する方法は、当該技術分野で知られている。例えば、非特許文献３３を参照されたい。遺伝子治療によって治療できる先天性疾患としては、ベータ地中海貧血、鎌形細胞貧血、リコンビナーゼ不全およびアデノシンデアミナーゼ不全を治療するための遺伝子の如き新たな機能的遺伝子を導入することが挙げられるが、それに限定されない。感染病および癌において、本発明の増殖細胞に、病原または化学治療剤に対する特異的抵抗を与える遺伝子を形質導入することによって、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での形質導入細胞の長期間の生存を確保することができる。
【００９７】
他の実施形態において、培養におけるＳＰＣから分化細胞を導くことができる。輸血医療では、感染病伝染のリスクはもちろんのこと、献血量が限られていることによる不足によって影響を受けているように、代替的な血液細胞源が必要とされている。本明細書に開示されている培地での並行分化による造血ＳＰＣの増殖を利用して、輸血用血液細胞を体外で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）成長させることができる。特に、Ｇ２培地を使用して、赤血球を成長させることができる。
【００９８】
以下に提示する実施例は、例示を目的とし、制限することを目的とするものではない。
【００９９】
実験
これらの実施例において、表１に記載した濃度で、上記した定義済みのサイトカイン培地Ｇ２、Ｆ２、Ｄ６、Ｆ２Ｎ、Ｆ４、およびＧ８中、非制限法にてサイトカイン類を用いた。
【０１００】
【表１−１】
2007536936.tif 000002
【０１０１】
【表１−２】
2007536936.tif 000003
【実施例１】
【０１０２】
培地の同定
臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞の増殖を支持する培地組成を同定した。６０の異なる組成で３０因子を含む９６ウェルプレートを用いて、スクリーニングプレートを調製した。１０００の臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞を７日間それぞれのウェル中でインキュベートした。それぞれの実験を３回繰り返し、全体で３つの異なる臍帯血調製が試験されるようにそれぞれのスクリーニングをさらに２回繰り返した。７日間インキュベーションを行った後、４色フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ノースカロライナ州）により培養細胞を特性付けた。７ＡＡＤ（死細胞を選択するため）、ＣＤ３４（幹細胞及び前駆細胞を選択するため）、ＣＤ３３（骨髄性細胞を選択するため）およびＣＤ３８（成熟造血細胞を選択するため）の組合せを用いて、増殖細胞を染色した。それぞれのスクリーニングからの繰り返しから得られた生細胞とＣＤ３４＋細胞の平均数を基に、最適の培地組成を選択した。
【０１０３】
それぞれの因子に対して、文献値または報告されているＥＤ５０値を基に、因子濃度を選択した。成長因子およびサイトカインを加える際に造血幹および前駆増殖を支持することが知られている、市販されている細胞培養用基本培地（Ｓｔｅｍｌｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ）を選択した。
【０１０４】
サイトカインスクリーニングの最適なウェルに「適合（ｈｉｔｓ）」したのは、それぞれＧ２、Ｆ２、およびＤ６ウェルであった。
【０１０５】
Ｇ２ウェルは、サイトカイン類であるフィブロネクチン、ＳＤＦ−１アルファ、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＩＬ−５、ＢＤＮＦ、ＰＤ−ＥＣＧＦ、ＩＬ−１１、ＩＬ−３、ＥＰＯ、Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンド、ＢＭＰ−４、トロンボスポンジン、ＩＧＦ−１、およびｂＦＧＦを含んでいた。
【０１０６】
Ｆ２ウェルは、サイトカイン類であるアンジオテンシン、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＢＤＮＦ、ＩＬ−３、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＢＭＰ−４、ＴＧＦ−ベータ１、トロンボスポンジン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、Ｍ−ＣＳＦ、およびＭＣＰ−１を含んでいた。
【０１０７】
Ｄ６ウェルは、サイトカイン類であるＰｌＧＦ、ＳＤＦ−１アルファ、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＩＬ−５、ＢＤＮＦ、ＩＬ−１１、ＩＬ−３、ＥＰＯ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンド、アミノ酸配列ＶＴＣＧを含む造血性接着ペプチド、ＴＲＡＮＣＥ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦ、およびＧ−ＣＳＦを含んでいた。
【０１０８】
ウェルＧ２、Ｆ２、およびＤ６のサイトカイン組成物は、以後それぞれ「Ｇ２」、「Ｆ２」および「Ｄ６」と称する。増殖細胞の詳細な特徴付け、例えば表現型検査、遺伝子配列研究および生体内動物移植研究などを行った後、以下に記載する通りに、Ｇ２の組合せを使用して、致死量以下の照射を受けたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスをうまく移植することができる機能性臍帯血細胞の増殖を支持した。
【０１０９】
一例として、Ｇ２培地は、高度複合混合物を表現する１５の因子を含んでいた。上記した通りにＧ２で得られた結果を基に、因子の他の組合せも増殖を支持するか否かを確認するために、２次スクリーニングを行った。
【０１１０】
２１の因子を有するＰｌａｃｋｅｔｔ−Ｂｕｒｍａｎ計画を用いて２次スクリーニングを計画した結果、６０の独特な複合組合せが９６ウェルプレートの内部６０ウェル中の細胞培養用基本培地（Ｓｔｅｍｌｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ）で作製された。
【０１１１】
１０００の臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞をそれぞれのウェルでインキュベートした。３回繰り返し、スクリーニングをさらに２回繰り返して、３つの異なる臍帯血調製をカバーした。１次スクリーニングからの最適ウェルに「適合」したＧ２をコントロールとして使用し、７日間インキュベートした後に生存細胞およびＣＤ３４＋細胞が、Ｇ２と比較してより多くなる条件を「適合」として定義した。
【０１１２】
７日間インキュベートした後に、４色フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ノースカロライナ州）により培養細胞を特性付けた。７ＡＡＤ（死細胞を選択するため）、ＣＤ３４（幹細胞及び前駆細胞を選択するため）、ＣＤ３３（骨髄性細胞を選択するため）およびＣＤ３８（成熟造血細胞を選択するため）の組合せを用いて、増殖細胞を染色した。それぞれのスクリーニングからの繰り返しから得られた生存細胞とＣＤ３４＋細胞の平均数を基に、最適の培地組成を選択した。
【０１１３】
３つの臍帯血調製の間には応答に対してかなりの変動があるけれども、最適なウェルとして「適合」したのは一貫してＦ２Ｎ、Ｆ４、およびＧ８ウェルであった。
【０１１４】
Ｆ２Ｎウェルは、サイトカイン類であるＢＤＮＦ、ｂＦＧＦ、ＥＰＯ、フィブロネクチン、Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンド、ＩＧＦ−１、ＩＬ−１１、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＳＣＦ、ＴＧＦ−ベータ１、Ｇ−ＣＳＦ、およびＧＭ−ＣＳＦを含んでいた。
【０１１５】
Ｆ４ウェルは、サイトカイン類であるｂＦＧＦ、ＥＰＯ、Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンド、ＩＬ−１１、ＩＬ−６、ＰＤ−ＥＣＧＦ、トロンボスポンジン、およびＴｐｏを含んでいた。
【０１１６】
Ｇ８ウェルは、サイトカイン類であるＢＤＮＦ、ｂＦＧＦ、Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＰＤ−ＥＣＧＦ、ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、およびＳＣＧＦ−アルファを含んでいた。
【０１１７】
Ｆ４を除くこれらすべての適合したウェルは、１次スクリーニングからの前の「最適ウェル」培地Ｇ２よりも、７日間の増殖後に生存細胞がより多かった。驚くべきことに、ウェルＦ４における増殖は他の条件よりも極めて低かったけれども、ウェルＦ４における細胞組成物は、およそ５０％のＣＤ３４ｂｒ細胞を含んでいた（実施例２参照）。ウェルＦ２Ｎ、Ｆ４、およびＧ８のサイトカイン組成物は、以後それぞれ「Ｆ２Ｎ」、「Ｆ４」、および「Ｇ８」と称する。
【０１１８】
この実施例は、治療上の価値を有する１次ホ乳類細胞の増殖に導くような、成長因子の複合混合物を同定できたことを説明している。必要とされる成長因子数は、細胞増殖を維持または促進さえしながら、減少することができる。上記因子の任意の３次スクリーニングを、必要とされる成長因子数をさらに減少させるために使用することができ、またはそれぞれの培地成分濃度を最適化するために使用することができる。加えて、以下に示すように、動物モデルにおけるこれらの移植能など、これらの細胞の機能的特徴を維持しながら増殖することが観察された。
【実施例２】
【０１１９】
臍帯血ＨＳＣ類の生体外増殖
培地（Ｇ２、Ｆ２、およびＤ６）
細胞調製
６％ヘタスターチ（ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）溶液を臍帯血に加え、４５〜６０分間インキュベートした。このインキュベート段階の間、ヘタスターチは優先的に赤血球に取り込まれる。結果として、赤血球はコニカルチューブの底に沈殿し、血液は、チューブ上部の軽い血漿／軟層画分とチューブ底部の赤血球を含む暗赤色画分とに分離する。白血球は、軟層中はもちろんのこと血漿中にも含まれる。５ｍｌのピペットを、軟層上部の中間にある透明層にゆっくり浸けた。次いで透明層をゆっくり攪拌し、該透明層に含まれる軟層および任意の細胞を、赤血球層の外に、かつ血漿中に移動させた。次いで透明層（血漿および軟層混合物）を集め、５分間３０９ｇで遠心分離し、上澄み液を除去し、廃棄した。次いでＡＣＫ溶解緩衝液を細胞ペレットに加え、室温で１０分間インキュベートして、残っている赤血球を溶解した。１０分間インキュベートした後、２％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を細胞懸濁液に加え、懸濁液を再度５分間３０９ｇで遠心分離した。細胞ペレット上の上澄み液を除去し、廃棄した。
【０１２０】
白血球ペレットに公知量の培地を加え、少量の得られた細胞懸濁液を除去し、この部分を公知の比にてトリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）で希釈し、血球計数器でこの懸濁液から細胞を計数する（本アッセイにて死細胞は青色になる）ことにより、生存する有核細胞の全数を得た。元の懸濁液に含まれる生存細胞数は、トリパンブルー含有試料を作製するために使用した希釈液を元に計数した。
【０１２１】
ＣＤ３４＋細胞濃縮
磁気ビーズ技術［ＡｕｔｏＭＡＣＳ（商標）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、カリフォルニア州］を用いて、臍帯血の有核細胞画分からＣＤ３４＋細胞を濃縮した。上記した手順に従って調製した有核細胞を、２％ＦＣＳおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳに再懸濁させた。直接法および間接法の２つの単離方法を、ＣＤ３４＋細胞を単離するために使用した。間接法において、Ｆｃ受容体遮断剤を加え、細胞懸濁液とよく混合した。ＣＤ３４ハプテン−抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、カリフォルニア州）を加え、よく混合し、６〜１２℃で１５分間インキュベートした。次いで、２％ＦＣＳ／２ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳで細胞を洗浄した。２％ＦＣＳ／２ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳに細胞を再懸濁させ、抗−ハプテンマイクロビーズを加えた。細胞／マイクロビーズ懸濁液をよく混合し、６〜１２℃で１５分間インキュベートした。２％ＦＣＳ／２ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳで細胞を洗浄し、７０μＭフィルターを通して濾過した。直接法において、ＦｃＲ遮断剤およびＣＤ３４マイクロビーズを懸濁液に加え、よく混合し、６〜１２℃で３０分間インキュベートした。次いで２％ＦＣＳ／２ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳで細胞を洗浄し、７０μＭフィルターを通して濾過した。間接法および直接法の両方において濾過した後、ＡｕｔｏＭＡＣＳ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、カリフォルニア州）で細胞懸濁液を分離し、得られたＣＤ３４＋細胞画分の純度をフローサイトメトリーを用いて決定した。
【０１２２】
培地調製
１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび４ｍＭグルタミンで補充したＳｔｅｍｌｉｎｅ（商標）培地（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州、Ｓ−０１８９）中に細胞を維持した。成長因子を解凍し、適切な濃度で培地中に直接加えた。培地および成分は研究するその日に調製した。
【０１２３】
細胞培養
１）９６ウェルプレート：１，０００のＣＤ３４＋濃縮細胞を、例えばＧ２、Ｆ２、またはＤ６培地などの培地１００μｌに加え、研究期間中、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。
２）４８ウェルプレート：２，５００のＣＤ３４＋濃縮細胞を、例えばＧ２、Ｆ２、またはＤ６培地などの培地１ｍｌに加え、研究期間中、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。
３）Ｔ−２５フラスコ：５００，０００の細胞を、例えばＧ２、Ｆ２、またはＤ６培地などの培地１０ｍｌに加え、研究期間中、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。
【０１２４】
フローサイトメトリー分析
フローサイトメトリー研究のための細胞（新鮮濃縮ＣＤ３４＋細胞またはＧ２、Ｆ２、またはＤ６培地中で増殖した細胞）を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳに懸濁させた。マウスＦｃブロック（商標）を加え、４℃で５分間インキュベートした。１／１０に希釈した蛍光標識抗体混合物を加え、細胞懸濁液とともに４℃で１５分間インキュベートした。新鮮濃縮ＣＤ３４＋細胞の純度またはＧ２、Ｆ２、またはＤ６培地中で増殖した後の細胞免疫表現型を決定するために、ＣＤ３４−ＰＥ、ＣＤ３３−ＦＩＴＣ、およびＣＤ３８−ＡＰＣ抗体の混合物を加えた（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州）。増殖後完全に免疫表現型検査するために、単一の蛍光標識抗体を細胞懸濁液に加えた。
【０１２５】
抗体でインキュベートした後、２％ＦＣＳを含むＰＢＳで細胞を洗浄した。次いで２％ＦＣＳおよび７−アミノアクチノマイシンＤを含むＰＢＳ中に細胞を再懸濁させ、死細胞を検出するために最終濃度を０．２５μｇ／ｍｌにした（７−ＡＡＤ；ＶｉａＰｒｏｂｅ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ノースカロライナ州）。細胞を分析するためにＦＡＣＳ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ノースカロライナ州）を使用した。細胞試料毎に少なくとも１０，０００の事象を採集した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトを用いてフローサイトメトリーデータを解析した。
【０１２６】
コロニー形成単位アッセイ
新鮮単離細胞および１４日目までにＧ２、Ｆ２、またはＤ６培地中で増殖した細胞のクローン原性能を評価するために、成長因子含有半固形培地［ＭｅｔｈＣｕｌｔ  ＧＦ  Ｈ４４３４（商標）、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、カリフォルニア州］中の培養液を使用した。この特殊な半固形培地は、ＳＣＦ、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥＰＯを含んでいた。Ｓｔｅｍｌｉｎｅ（商標）培地（Ｓｉｇｍａ）に細胞を懸濁させ、次いでＭｅｔｈＣｕｌｔ  ＧＦ  Ｈ４４３４（商標）に加えた。半固形培地中の細胞を３５ｍｍ培養皿で培養し、半固体培養液からの蒸発を最小化するために、開放された滅菌水含有３５ｍｍペトリ皿を含む１５０ｍｍペトリ皿にそれぞれを設置した。３５ｍｍ皿を含む１５０ｍｍペトリ皿を、５％ＣＯ２雰囲気下、少なくとも９５％湿度で３７℃のインキュベーター中に保持した。製造業者の推薦に従い、１４〜１６日インキュベートした後にコロニーを調べた。
【０１２７】
結果
増殖収量
Ｇ２、Ｆ２、およびＤ６培地中で培養する間、細胞数は時間の関数で増加した。例えば、４８ウェルプレートで培養する際、培養１９日後に、全生存細胞数が最も増加していたのは、Ｄ６培地にて４０８倍であり、２番目はＧ２培地にて２０８倍であり、続いてＦ２培地により１８８倍の増加であった。
【０１２８】
細胞数の増加倍率は、培地中の細胞濃度に強く依存してことが見出された。培地１ｍｌ当たりの細胞数が少ないと、細胞数の増加倍率が高い結果になることが見出された。表面積の増加も増殖収量に明確に影響する。細胞成長に対するこれらの培養条件の効果を表２に示す。
【０１２９】
【表２】
2007536936.tif 000004
【０１３０】
増殖細胞の表現型
増殖臍帯血細胞集団に含まれる細胞表現型を特徴付けるために、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ノースカロライナ州）を使用した。これに関し、上記した通りにＣＤ３４＋細胞を単離し、Ｇ２、Ｆ２、またはＤ６培地を用いて培養液に置き、上記した通りに７日間培養した。増殖細胞集団を、それぞれ異なる抗体を含む異なるチューブに分配し、上記の通りに当該抗体で標識した。本研究においてＣＤ３４＋濃縮細胞の免疫表現型検査に使用した抗体を以下の表３に記載し、細胞を免疫表現型検査するためのフローサイトメトリー分析の結果を表４に記載する。
【０１３１】
【表３】
2007536936.tif 000005
【０１３２】
【表４】
2007536936.tif 000006
【０１３３】
Ｔ細胞（ＣＤ３）、Ｂ細胞（ＣＤ１９）もしくは好中球（ｍａｔｕｒｅ  ｇｌａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ）、ＮＫリンパ球、またはマクロファージ（ＣＤ１６）は、Ｆ２、Ｇ２、またはＤ６培地の何れにも増殖後にほとんど見られなかった。少数の単球（ＣＤ１４）および血小板または巨核球（ＣＤ４２ａ）が、増殖細胞集団に見られた。多数の細胞が、内皮細胞、血小板、白血球もしくはこれらの前駆体（ＣＤ３１）の、骨髄性前駆細胞（ＣＤ３３）の、造血幹細胞及び前駆細胞（ＣＤ３４）の、増殖性細胞および赤血球前駆体（ＣＤ７１）の、ならびに造血性およびＣＤ３４＋幹と前駆細胞または神経幹細胞（ＣＤ１３３）の、表面マーカー特性を発現することが見出された。驚くべきことに、造血細胞を分化する際に通常発現されるマーカーであるＣＤ３８の発現が、すべての３つの培地中、７日間培養した後ほとんど消失した。
【０１３４】
他の驚くべき発見は、Ｇ２、Ｆ２、およびＤ６培地中での増殖後の増殖ＣＤ３４発現パターンであった。明瞭なＣＤ３４ｂｒ集団が、Ｇ２培地で７日間増殖した後に存在し、投入ＣＤ３４＋細胞集団に比較してより高いレベルでＣＤ３４を発現する細胞を極めてより多く含んでいた。これはＦ２およびＤ６培地でも程度はこれより低いものの、観測された。
【０１３５】
上記した通りに細胞培養およびフローサイトメトリー方法を用いて、Ｇ２培地中で細胞を増殖した後、さらなる免疫表現型検査研究を行った。７日間培養後の総有核細胞（ＴＮＣ）に関する増殖倍率およびＣＤ３４発現結果を表５に要約する。ＣＤ３４ｂｒ細胞における多くの細胞受容体／マーカーを発現するこれらの増殖細胞の百分率を表６に示す（３つの実験を反復したものとして）。ＣＤ３４ｄｉｍ細胞における多くの細胞受容体マーカーを発現するこれらの増殖細胞の百分率を表７に示す（３つの実験を反復したものとして）。
【０１３６】
【表５】
2007536936.tif 000007
【０１３７】
【表６】
2007536936.tif 000008
【０１３８】
【表７】
2007536936.tif 000009
【０１３９】
ＣＤ３４＋およびＣＤ３４ｂｒ細胞の増殖
Ｇ２、Ｆ２、およびＤ６培地中でのＣＤ３４＋およびＣＤ３４ｂｒ細胞の増殖を決定するために、成長曲線研究を行った。ＣＤ３４＋濃縮細胞を上記の通りに調製した。上記の通りに４８ウェルプレート中、Ｇ２、Ｆ２、またはＤ６培地中で細胞を培養した。０、４、７、１１、１４、および１９日目に上記の通りにフローサイトメトリーによりＣＤ３４発現を決定した。表８は、Ｇ２、Ｆ２、およびＤ６培地中でそれぞれＣＤ３４＋およびＣＤ３４ｂｒ細胞の増殖を示す。Ｇ２培地において、７日目でＣＤ３４＋細胞が２８倍まで増加し、１４日目でＣＤ３４ｂｒ細胞が２６９倍まで増加したことが認められた。
【０１４０】
【表８】
2007536936.tif 000010
【０１４１】
Ｄ６培地において、大きな増殖が観察され、１９日目までに培養液がピンク色に変色し始め、これはヘモグロビンの存在を示し、いくらかの細胞が赤血球に分化したことを示している。
【０１４２】
増殖細胞の機能−生体外コロニー形成単位
コロニー形成アッセイにおけるコロニー形成能により、増殖細胞の機能を調査した。上記の通りにアッセイを行った。コロニー形成単位は３６倍までに増加した（Ｄ６培地、１１日目）。１１日目までに培養したこれら３つのサイトカインカクテル培地に維持された細胞は、クローン原性の可能性を未だに有しており、未成熟な前駆細胞がこれらの培養液に維持されていることが示されている。
【０１４３】
増殖細胞集団中のコロニー形成細胞の表現型を決定するために、このアッセイにて形成されるコロニーの顕微鏡分析を行った。Ｄ６培地中で増殖された細胞は主にＢＦＵ−Ｅ／ＣＦＵ−Ｅ［バースト形成単位−赤血球／コロニー形成単位赤血球（例えば赤血球前駆細胞に特徴のあるコロニーなど）；データは示していない］を形成した。Ｇ２およびＦ２中で増殖された細胞は主にＢＦＵ−Ｅ／ＣＦＵ−ＥとＣＦＵ−ＧＭ［コロニー形成単位−顆粒球／マクロファージ（例えば好中球／単球前駆体など）］との混合物を、およびいくらかのＣＦＵ−ＧＥＭＭ［コロニー形成単位−顆粒球、−赤血球、−マクロファージ、および−巨核球（例えばより未成熟な骨髄性幹細胞に特徴のあるなど）］（データは示していない）を形成した。
【０１４４】
Ｇ２、Ｆ２、およびＤ６培地中で増殖されたＣＤ３４＋濃縮臍帯血細胞のためのコロニー形成単位アッセイからのデータを表９に示す。
【０１４５】
【表９】
2007536936.tif 000011
【０１４６】
Ｇ２培地中で７日間増殖後のＣＤ３４＋およびＣＤ３４ｂｒ細胞の機能
７日間Ｇ２培地中で増殖された細胞についての新鮮単離・濃縮したＣＤ３４＋細胞（８２．４％純度）の、ならびに７日間Ｇ２培地中で増殖された細胞集団からフローサイトメトリーでの分別により単離したＣＤ３４ｂｒ細胞のプレーティング効率を、上記したコロニー形成アッセイを用いて実験的に決定した。本実験におけるプレーティング効率は、下記表１０に示すように、それぞれ１６．５％、７％、および２１．３％であった。
【０１４７】
【表１０】
2007536936.tif 000012
【０１４８】
増殖前後で１００％純粋なＣＤ３４＋細胞のプレーティング効率を決定しておらず、また新鮮単離された１００％純粋なＣＤ３４ｂｒ細胞のプレーティング効率を決定することは、これらの細胞は大変稀少で多量の臍帯血が必要なために実際的ではないけれども、これらの数の見積りを得ることはまだ可能である（表１０参照）。これらの例において、投入ＣＤ３４＋細胞（８０〜９０％純度の投入ＣＤ３４＋）および７日目のＴＮＣ（３０〜４０％純度の投入ＣＤ３４＋）のＣＦＵプレーティング効率は、試料ＵＣＢ−２９からであり、７日目のＣＤ３４ｂｒ（およそ９０％純度の投入ＣＤ３４＋）のＣＦＵプレーティング効率は、試料ＵＣＢ−３１からである。新鮮単離・濃縮したＣＤ３４＋細胞集団は８２．４％純度であり、言い方を変えると、１００の細胞のうちの８２．４がＣＤ３４＋であった。この集団のプレーティング効率は１６．５％と決定され、それゆえ８２．４％純度のＣＤ３４＋集団からの１００の細胞のうち、１６．５の細胞がコロニーを形成する。１００の細胞の８２．４がＣＤ３４＋であったので、この細胞集団からの約２０のＣＤ３４＋細胞がコロニーを形成し、例えば、増殖前の１００％純粋なＣＤ３４＋細胞のプレーティング効率はおよそ２０％である。表１１は、投入ＣＤ３４＋細胞および７日間Ｇ２培地中で培養された細胞におけるＣＦＵプレーティング効率を示す。表中の範囲の記載は、およその値を示す。
【０１４９】
【表１１】
2007536936.tif 000013
【０１５０】
ＣＤ３４ｂｒ細胞は、これらのＣＤ３４＋細胞の小部分であり、それゆえ、これらの細胞のプレーティング効率が、増殖前の１００％純粋なＣＤ３４＋細胞のプレーティング効率に近いと仮定することは妥当である。しかしながら、ＣＤ３４の高発現のため、極めて幹様の細胞がこの集団に含まれており、それゆえに、この集団は最も高いコロニー形成能を有していると仮定することも妥当である。それゆえ、増殖前の１００％純粋なＣＤ３４ｂｒ細胞のプレーティング効率の上限が仮定される。しかしながら、ＣＤ３４の高発現のため、極めて幹様の細胞がこの集団に含まれており、それゆえに、この集団は最も高いコロニー形成能を有していると仮定することも妥当である。
【０１５１】
増殖後、細胞集団を含む４１．５％ＣＤ３４＋のプレーティング効率は６．７％と決定された。これは、増殖細胞集団から単離された１００％純粋なＣＤ３４＋細胞のプレーティング効率の下限とも見積もられる。増殖細胞集団から単離された１００％純粋なＣＤ３４＋細胞のプレーティング効率の上限として、投入細胞集団に関して、上記した計算と同様の計算を行った。増殖細胞集団からの１００の細胞のうち、６．７細胞はコロニーを形成し、これら１００の細胞の４１．５はＣＤ３４＋細胞である。観察されたすべてのコロニーがＣＤ３４＋細胞のみが起源であると仮定すると、増殖細胞集団から単離された１００％純粋なＣＤ３４＋細胞のプレーティング効率は１６．１％であると算出された。
【０１５２】
下記表１２に示した、これらＣＦＵプレーティング効率の見積りおよび細胞数を元に、ＣＦＵ数および７日間Ｇ２培地中で培養した後のＣＦＵの増加倍率を算出した。表中の範囲の記載は、およその値を示す。表１２は、投入ＣＤ３４＋細胞数、Ｇ２培地中で７日後のＣＤ３４＋細胞数、および増加倍率を示す。表１３は、同じカテゴリーでのＣＦＵ数を示す。
【０１５３】
【表１２】
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【０１５４】
【表１３】
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【０１５５】
図１は、Ｇ２培地中で７日間、ＵＣＢからＣＤ３４＋濃縮細胞を増殖した結果を要約する。この図は、全生存細胞数が５７倍増加し、ＣＤ３４＋細胞は２９倍増加していることおよびＣＤ３４ｂｒ細胞は１８３倍増加していることを示しており、全ＣＦＵは２３倍増加し、ＣＦＵ起源のＣＤ３４＋は１０から２３倍増加していること、およびＣＦＵは３９から１９７倍増加していることを示している。
【０１５６】
培地（Ｆ２Ｎ、Ｇ８、およびＦ４）
培地製剤Ｆ２Ｎ、Ｇ８、およびＦ４でも、上記のように、細胞調製、細胞濃縮、培地調製、細胞培養、およびフローサイトメーター分析を用いて、ＣＤ３４細胞の生体外増殖を支持する能力を試験した。
【０１５７】
細胞数は、およそ３週間（２２日）かけたＧ２、Ｇ８、Ｆ２Ｎ、およびＦ４培地中での培養の間、時間の関数として増加した。例えば、培養２２日後、Ｆ２培地に関して４５．７０倍の増加が見られ、Ｇ２培地では３７．７７倍の増加、Ｇ８培地では２４．８６倍の増加、およびＦ４培地では２．２１倍の増加が見られた。Ｆ４培地の結果は、他の培地よりも極めて低い増殖となったけれども、本明細書の他の箇所に記載したように、好ましい幹細胞または前駆細胞表現型を実際に維持していた。
【０１５８】
ＣＤ３４＋濃縮細胞を７日間Ｇ２、Ｆ２Ｎ、Ｇ８、およびＦ４培地中で培養し、その後、上記の通りにＣＦＵアッセイを行った。表１４に示すように、Ｆ２ＮおよびＦ４培地中で増殖されたＣＤ３４ｂｒ細胞は、投入細胞と比較して同様のプレーティング効率を有している。加えて、Ｆ２Ｎ培地中で増殖されたＣＤ３４ｂｒ細胞は、Ｆ４培地中で増殖されたＣＤ３４ｂｒ細胞と比較して、より高いＢＦＵ−Ｅ百分率およびより低いＣＦＵ−ＧＭ百分率を有していた。Ｆ４培地中の増殖ＴＮＣは、他の３つの培地と比較して最も高いプレーティング効率を与えることを、表１５は示している。
【０１５９】
【表１４】
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【０１６０】
【表１５】
2007536936.tif 000017
【実施例３】
【０１６１】
異なる酸素分圧条件下での増殖収量
Ｇ２培地を用いて実施例２に記載した通りに、ＣＤ３４＋濃縮細胞を調製し、培養した。Ｔ−２５フラスコ（横倒しかまたは逆さまのいずれか）または４８ウェルプレート中で、細胞培養を行った。フローサイトメトリー分析およびコロニー形成単位アッセイを、実施例２に記載した通りに行った。
【０１６２】
細胞培養液
１）Ｔ−２５フラスコ（横倒し）
ａ）Ｇ２培地１０ｍｌに２，５００の細胞を加え、研究期間中、５％または２０％のＯ２中３７℃でインキュベートした。
【０１６３】
ｂ）Ｇ２培地１０ｍｌに８，３００の細胞を加え、研究期間中、５％のＯ２中３７℃でインキュベートした。
【０１６４】
２）Ｔ−２５フラスコ（逆さま）
ａ）Ｇ２培地５０ｍｌに２，５００の細胞を加え、研究期間中、５％または２０％のＯ２中３７℃でインキュベートした。
【０１６５】
ｂ）Ｇ２培地１０ｍｌに２，７００の細胞を加え、研究期間中、５％または２０％のＯ２中３７℃でインキュベートした。
【０１６６】
３）４８ウェルプレート
ａ）Ｇ２培地１ｍｌに２，５００の細胞を加え、研究期間中、５％または２０％のＯ２中３７℃でインキュベートした。
【０１６７】
ｂ）Ｇ２培地１ｍｌに５，０００の細胞を加え、研究期間中、５％または２０％のＯ２中３７℃でインキュベートした。
【０１６８】
結果
増加倍率は、培養条件の酸素分圧に強く依存することが見られた。それぞれの場合、５％のＯ２条件では、２０％のＯ２条件と比較してより大きな増加倍率が得られた。表１６は、細胞成長に対するこれらの培養条件の効果を示す。
【０１６９】
【表１６】
2007536936.tif 000018
【実施例４】
【０１７０】
Ｌｉｎ−およびＣＤ１３３＋細胞出発集団を用いる増殖収量
Ｌｉｎ−細胞濃縮
Ｇ２およびＤ６培地を用いてＬｉｎ−細胞濃縮を行った。実施例２に記載した通りに臍帯血から細胞を単離し、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中、２×１０７細胞／ｍｌと８×１０７細胞／ｍｌとの間の密度（好ましくは、５×１０７細胞／ｍｌ）で再懸濁させた。ＳｔｅｍＳｔｅｐ  Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー、カナダ）を、１００μ／ｍｌ濃度の細胞溶液に加え、よく混合した。細胞を、氷上で３０分間または室温で１５分間インキュベートした。
【０１７１】
製造業者（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、カリフォルニア州）により記載されている通りに磁気ビーズ技術を用いて、Ｌｉｎ−細胞を濃縮した。磁石中にカラムを設置し、組み立て、製造業者の使用説明書に従い、ＰＢＳで抗原刺激（ｐｒｉｍｅｄ）した。２％ＦＣＳを含むＰＢＳ（２５ｍｌ）でカラムを洗浄した。６０μｌ／ｍｌの濃度の細胞溶液に磁気コロイドを加え、よく混合し、氷上で３０分間または室温で１５分間インキュベートした。試料を充填し、続いて２％ＦＣＳを含むＰＢＳ（２５ｍｌ）で洗浄した。試料を採集し、ＦＡＣＳ分析により純度を調べた。トリパンブルー色素排除法により細胞生存度を調べた。
【０１７２】
実施例２記載した通りに、Ｇ２およびＤ６培地中で細胞を維持した。実施例２記載した通りに、細胞培養法、フローサイトメーター分析、およびコロニー形成単位アッセイを行った。
【０１７３】
結果
Ｇ２およびＤ６培地の両方がＬｉｎ−細胞の増殖を支持し、得られた細胞集団はＣＤ３４＋幹細胞及び前駆細胞を含んでいた。表１７は、Ｇ２培地中でＬｉｎ−細胞を増殖すると、これらのＣＤ３４＋細胞を９．５％有して細胞が平均４５．７倍増加する結果となり、Ｄ６培地中で増殖すると、これらのＣＤ３４＋細胞を７．３％有して細胞が平均７３．６倍増加する結果となったことを示している。
【０１７４】
【表１７】
2007536936.tif 000019
【０１７５】
ＣＤ１３３＋細胞濃縮
磁気ビーズ技術［ＡｕｔｏＭＡＣＳ（商標）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、カリフォルニア州］を用いて、臍帯血の有核細胞画分からＣＤ１３３＋細胞を濃縮した。実施例２に上記した手順に従って調製した有核細胞を、２％ＦＣＳおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳに再懸濁させた。ＦｃＲ遮断剤およびＣＤ１３３マイクロビーズを懸濁液に加え、よく混合し、６〜１２℃で３０分間インキュベートした。次いで２％ＦＣＳ／２ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳで細胞を洗浄し、７０μＭフィルターを通して濾過した。間接法および直接法の両方において濾過した後、ＡｕｔｏＭＡＣＳ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、カリフォルニア州）で細胞懸濁液を分離し、得られたＣＤ１３３＋細胞画分の純度をフローサイトメトリーを用いて決定した。濃縮したＣＤ１３３＋の純度は８４％であり、ＣＤ１３３＋細胞の約９４％がＣＤ３４抗原を発現した。
【０１７６】
細胞培養
４８ウェルプレート：２，５００のＣＤ３４＋濃縮細胞を、例えばＧ２、Ｆ２、またはＤ６培地などの培地１ｍｌに加え、研究期間中、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。
【０１７７】
フローサイトメトリー分析
フローサイトメトリー研究のための細胞（新鮮濃縮ＣＤ３４＋細胞またはＧ２、Ｆ２、またはＤ６培地中で増殖した細胞）を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳに懸濁させた。マウスＦｃブロック（商標）を加え、４℃で５分間インキュベートした。１：１０に希釈した蛍光標識抗体混合物を加え、細胞懸濁液とともに４℃で１５分間インキュベートした。新鮮濃縮ＣＤ３４＋細胞の純度またはＧ２、Ｆ２、またはＤ６培地中で増殖した後の細胞免疫表現型検査を決定するために、ＣＤ３４−ＰＥ、ＣＤ３３−ＦＩＴＣ、およびＣＤ３８−ＡＰＣ抗体の混合物を加えた（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州）。以下の組合せも本研究に使用した：ＣＤ３４ＦＩＴＣ／ＣＤ１３３ＰＥ、ＣＤ３４ＦＩＴＣ／ＣＤ９０ＰＥ／ＣＤ１１７ＡＰＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州）。
【０１７８】
抗体でインキュベートした後、２％ＦＣＳを含むＰＢＳで細胞を洗浄した。次いで２％ＦＣＳおよび７−アミノアクチノマイシンＤを含むＰＢＳに細胞を再懸濁させ、死細胞を検出するために最終濃度を０．２５μｇ／ｍｌにした（７−ＡＡＤ；ＶｉａＰｒｏｂｅ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ノースカロライナ州）。細胞を分析するためにＦＡＣＳ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ノースカロライナ州）を使用した。細胞試料毎に少なくとも１０，０００の事象を採集した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトを用いてフローサイトメトリーデータを解析した。
【０１７９】
結果
表１８に示すように、ＣＤ１３３＋細胞は、出発集団としてのＣＤ３４＋細胞と比較して、Ｇ２、Ｆ２、およびＤ６培地中で７日間増殖した後の総有核細胞がより多くなっている（表１８参照）。
【０１８０】
【表１８】
2007536936.tif 000020
【実施例５】
【０１８１】
連続的増殖方法を用いる増殖収量
ＣＤ３４＋細胞を単離し、Ｇ２培地を用いて実施例２に記載した通りに７日間培養した。増殖細胞をＣＤ３４−ＰＥで染色し、実施例２に記載した通りにＣＤ３４ｂｒおよびＣＤ３４ｄｉｍ細胞にＦＡＣＳ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ノースカロライナ州）により分別した。次いで分別したＣＤ３４ｂｒおよびＣＤ３４ｄｉｍ細胞を、さらに７日間４８ウェルプレート中、Ｇ２培地中２５００細胞／ｍｌの密度で再度培養した。実施例２に記載した通りに、細胞培養方法、ならびにフローサイトメトリー分析およびコロニー形成単位アッセイを含む細胞分析を行った。
【０１８２】
結果
Ｇ２培地中の増殖の連続的ステージは、増殖の単一ステージと比較して、ＣＤ３４ｂｒ、ＣＤ３４ｄｉｍ、およびＣＤ３４−細胞のさらなる増殖を支持した。表１９に示すように、ＣＤ３４ｂｒ細胞は、ＣＤ３４ｄｉｍ細胞（平均２７．７倍の増加）およびＣＤ３４−細胞（平均８．２倍の増加）と比較して、より大きな増殖能（平均５３．６倍の増加）を示した。
【０１８３】
【表１９】
2007536936.tif 000021
【実施例６】
【０１８４】
ＳＣＩＤ／ＮＯＤマウスモデルにおけるＣＤ３４ｂｒ細胞の生体内機能
ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞の精製
非特許文献３４に刊行されている手順に従い、３つの臍帯血（ＵＣＢ）単位を処理した。簡潔には、６（重量／容量）％のヒドロキシエチルデンプン（Ｓｉｇｍａ）を加えることによりＵＣＢから赤血球を除去して最終濃度を１．２％とし、続いて室温で１時間インキュベートして、白血球−濃縮血漿画分を得た。血漿画分を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、血漿上澄み液を除去し、細胞ペレットを塩化アンモニウム溶解緩衝液２０ｍｌを用いて室温で８分間処理した。２％ＦＣＳを含むＰＢＳで細胞を洗浄し、計数した。この特殊のケースでは、１×１０９の総有核細胞が得られた。この白血球集団は、１．４５％のＣＤ３４＋および０．５５％のＴｈｙ−１＋細胞を含んでいた（フローサイトメトリーにより決定、ＦＡＣＳ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ノースカロライナ州）。次いで白血球−濃縮ペレットを、製造業者の使用説明書に従い、磁気的活性化細胞分離装置（ＡｕｔｏＭＡＣＳ（商標）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、カリフォルニア州）を用いてＣＤ３４＋細胞濃縮のために使用した。濃縮後の総有核細胞数は２．４４×１０６細胞であり、細胞集団は９１．１３％のＣＤ３４＋細胞から構成されていた（フローサイトメトリーにより決定、ＦＡＣＳ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ノースカロライナ州）。
【０１８５】
ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞の増殖
濃縮ＣＤ３４＋ＵＣＢ細胞をＧ２サイトカイン混合物とともにＳｔｅｍｌｉｎｅ（商標）培地（Ｓｉｇｍａ）中に懸濁させ、６ウェルプレートに３０，０００細胞／ウェル（６ｍｌ／ウェル）で蒔いた。５％ＣＯ２、９９％湿度で７日間何ら中間体を加えることなく、細胞を培養した。トリパンブルー色素排除法によって、培養後の細胞生存度を決定し、９５％より大きいことを確認した。培養後、抗−ヒト−ＣＤ３４ＰＥ（ＢＤ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で細胞を染色し、ＦＡＣＳ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ノースカロライナ州）を用いてＣＤ３４ｂｒおよびＣＤ３４ｄｉｍ集団に分別した［これら２つの細胞集団間を区別するために使用したゲーティング戦略（ｇａｔｉｎｇ  ｓｔａｒａｔｅｇｙ）に関して図２を参照のこと］。両方の細胞集団の見積り純度は、フローサイトメーター分別後に約９５％であった。
【０１８６】
増殖ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞のコロニー形成アッセイ
ＦＡＣＳ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ノースカロライナ州）によって分別した後、増殖ＣＤ３４ｂｒ集団からの約６００の細胞および増殖ＣＤ３４ｄｉｍ集団からの約２５００の細胞を、ＳＣＦ、ＩＬ−３、ＥＰＯ、およびＧＭ−ＣＳＦを含むメチルセルロース培地に蒔いた。コントロールとして、培養前の新鮮単離・濃縮したＣＤ３４＋細胞集団からの約６００の細胞を、同じ条件に置いた。
【０１８７】
プレーティング効率は、
・  新鮮単離ＣＤ３４＋細胞（９１．１％純度）で１７．９％（１６．４５％〜３１．５％）
・  ＣＤ３４ｂｒ（約９５％純度）で９．１％（９．１％〜２１．３％）
・  ＣＤ３４ｄｉｍ（約９５％純度）で６．１％
であることが見出された。
【０１８８】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス移植
７週齢の雄のＮＯＤ／ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ−ＳＣＩＤ／Ｊマウスを得（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メイン州）、マイクロ分離ケージラックに収容し、高圧滅菌した詞料および水を与えた。Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＢＤＴ）およびＤｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒの動物管理使用委員会がすべての実験を承認した。
【０１８９】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（６〜８週齢）は、セシウムＣｓ１３７源から３００ｃＧｙの全照射量を受けた。照射後２４時間内で、７日間事前に増殖させたヒトＵＣＢ  ＣＤ３４ｂｒおよびＣＤ３４ｄｉｍ細胞を、マウスの骨髄内（ｉＢＭ）に移植した。非特許文献３５によりすでに記載されている通りに、これをわずかに修正して、ｉＢＭ移植を行った。簡潔には、２９−ゲージ針を麻酔下にあるマウスの右大腿部の関接表面に挿入した。４０μｌのＰＢＳに懸濁させた増殖ＵＣＢ  ＣＤ３４＋細胞を、ＢＭ腔に移植した。送達された細胞投与量を表２０に概略する。
【０１９０】
【表２０】
2007536936.tif 000022
【０１９１】
移植結果分析
マウスＢＭ、脾臓、および末梢血（ＰＢ）を移植後７週で収集した。文献に記載されている方法を用いて、ヒト用再形成（ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）のための分析を行った。簡潔には、ＢＭ、脾臓、およびＰＢからの細胞を、２色フローサイトメトリー分析により分析した。末梢血（ＰＢ）からの赤血球（ＲＢＣ）（または必要であれば脾臓およびＢＭ）を、３〜４ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液を用いて溶解した（室温で１０分間インキュベート）。細胞を洗浄し、２％ＦＣＳを含むＰＢＳに再懸濁させて、最終容量を５０μｌ／チューブにした。全部で１０のチューブをＢＭ分析のためにマウス毎に使用し、それぞれさらに２つのチューブを脾臓およびＰＢ試料分析のために使用した。ＲＢＣ溶解後の細胞を、４℃で５分間、ＦｃｇＩＩ／ＩＩＩＲ−媒介非特異的結合をブロックするために、８μｌのマウスＦｃブロックでインキュベートし、引き続き適切なモノクローナル抗体でインキュベートし（それぞれ約５μｌを用いて４℃で３０分間インキュベート）、洗浄し、ＰＢＳ中１％パラホルムアルデヒドに再懸濁させ、ＦＡＣＳ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ノースカロライナ州）フローサイトメーターで分析した。アイソタイプ・コントロール（ＩｇＧ１ＦＩＴＣ／ＩｇＧ１ＰＥ）に加えて、非移植マウスからの細胞を、同じ抗体の組合せで染色した。非交差反応性ＰＥ−抗−ヒトＣＤ４５とＦＩＴＣ−抗−マウスＣＤ４５との組合せを使用して、マウス白血球に対するヒト白血球の比を決定した。ヒト部分母集団のさらなる明確化のために、多くの二重抗体パネルを使用した。すなわち、リンパ様細胞系統検出のためのＣＤ４５ＦＩＴＣ／ＣＤ３ＰＥおよびＣＤ４５ＦＩＴＣ／ＣＤ１９ＰＥ；骨髄性細胞系統検出のためのＣＤ４５ＦＩＴＣ／ＣＤ１４ＰＥおよびＣＤ４５ＦＩＴＣ／ＣＤ３３ＰＥ；ＮＫ細胞検出のためのＣＤ４５ＦＩＴＣ／ＣＤ１６ＰＥ；前駆細胞検出のためのＣＤ４５ＦＩＴＣ／ＣＤ３４ＰＥ；巨核球（ＭＫ）細胞系統検出のためのＣＤ４５ＦＩＴＣ／ＣＤ４２ａＰＥ；および赤血球細胞系統検出のためのＣＤ４５ＦＩＴＣ／グリコホリンＡＰＥである。最小でもＢＭ、脾臓からの１００，０００の細胞、およびＰＢからの１００，０００の細胞を、それぞれのマウスについてＦＡＣＳ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ノースカロライナ州）を用いて分析した。少なくとも０．１％のヒト用再形成（マウスＣＤ４５発現に対するヒトＣＤ４５発現）（最小でも１００，０００ＢＭ細胞当たりそれぞれ１０の陽性事象）を示した場合、ＳＣＩＤ再構築細胞（ＳＲＣ）再形成により定義されるヒトの細胞移植（骨髄およびリンパ球移植を含む）について陽性としてマウスを分類した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商標）ソフトを用いて、ＦＡＣＳ分析を行った。
【０１９２】
結果
Ｇ２培地中で増殖された臍帯血細胞を、照射を受けたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの骨髄、脾臓、およびＰＢに移植した。図３に示すように、骨髄への確実な移植を成し遂げるために、細胞投与量は１００，０００のＣＤ３４ｂｒ細胞で十分であった。骨髄、脾臓、およびＰＢに５００，０００のＣＤ３４ｂｒ細胞を用いると２０％を超える移植が観測され、対照的に、このモデルへの移植を成し遂げるために、１，０００，０００のＣＤ３４ｄｉｍ細胞は十分でなかった。増殖ＣＤ３４ｂｒ細胞は、Ｂ細胞（ＣＤ１９）、骨髄性前駆細胞（ＣＤ３３）、造血幹細胞及び前駆細胞（ＣＤ３４）を、極小範囲のＮＫ細胞（ＣＤ１６）、単球（ＣＤ１４）、および血小板前駆体（ＣＤ４２ａ）（データは示していない）に再形成できた。
【実施例７】
【０１９３】
増殖細胞集団の直接骨髄移植によるＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの巨核球増殖
Ｇ２培地中で増殖したＵＣＢ細胞をマウスの骨髄に移植し、照射を受けたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの骨髄に直接移植した場合にかなりの巨核球増殖に導くことを、本実施例は例示している。
【０１９４】
全臍帯血をＮＤＲＩから受け、実施例６に記載した通りに処理した。ＣＤ３４＋細胞をＧ２培地中で７日間培養し、次いでＣＤ３４ｄｉｍおよびＣＤ３４ｂｒ細胞に分別し、次いで実施例６に記載した通りに、亜致死量（ｓｕｂ−ｌｅｔｈａｌｌｙ）で照射を受けたマウスへ骨髄に直接注入することにより移植した。新鮮単離ＣＤ３４＋細胞をコントロールとして使用した。使用した細胞投与量、移植動物の数、移植マウスの数および移植のレベルを、移植後７週でマウスの骨髄に見られるヒトＣＤ４５＋細胞の百分率として定義される通りに、表２１に示す。
【０１９５】
【表２１】
2007536936.tif 000023
【０１９６】
表２１におけるデータに従い、１００，０００のＣＤ３４＋、５００，０００のＣＤ３４ｂｒ、または１，９００，０００のＣＤ３４ｄｉｍ細胞を投与すると、マウス骨髄中におよそ１５％のヒトＣＤ４５＋細胞というほぼ同じ移植レベルになる。
【０１９７】
驚くべきことに、ＣＤ３４ｂｒ細胞集団を投与すると、ヒトＣＤ４２ａ＋細胞によって定義されるように、マウス骨髄に含まれるヒト巨核球が最も多数になった（表２２参照）。
【０１９８】
【表２２】
2007536936.tif 000024
【０１９９】
新鮮単離ＣＤ３４＋細胞、Ｇ２培地中で増殖したＣＤ３４ｂｒ細胞、またはＧ２培地中で増殖したＣＤ３４ｄｉｍ細胞を骨髄内に注入した後の、マウスＢＭ、脾臓、およびＰＢ中に存在するヒトＣＤ４５＋細胞の百分率を、それぞれ表２３、２４、および２５に示す。
【０２００】
【表２３】
2007536936.tif 000025
【０２０１】
【表２４】
2007536936.tif 000026
【０２０２】
【表２５】
2007536936.tif 000027
【実施例８】
【０２０３】
尾静脈注入によるＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの増殖細胞集団の移植後の帰巣および巨核球移植
本発明の種々の培地中で増殖されたＵＣＢ細胞を、照射を受けたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの末梢血循環に尾静脈を通して注入して、マウス骨髄に帰巣及び移植して（ｈｏｍｅ  ａｎｄ  ｅｎｇｒａｆｔ）、優先的に巨核球移植に導くことを、本実施例は例証している。
【０２０４】
Ｇ２培地
全臍帯血をＮＤＲＩから受け取り、実施例６に記載した通りに処理した。ＣＤ３４＋細胞をＧ２培地中で７日間培養し、次いでＣＤ３４ｄｉｍおよびＣＤ３４ｂｒ細胞に分別し、次いで実施例６に記載した通りに、亜致死量で照射を受けたマウスに尾静脈注入することにより移植した。新鮮単離ＣＤ３４＋細胞をコントロールとして使用した。使用した細胞投与量、移植動物の数、移植マウスの数および移植のレベルを、移植後７週でマウス骨髄に見られるヒトＣＤ４５＋細胞の百分率として定義したものを、表２５に示す。Ｇ２培地中で増殖されたＵＣＢ細胞は、尾静脈注入により末梢血循環へと注入する際に、受容マウスの骨髄に帰巣することができることを、表２６のデータは確認した。
【０２０５】
【表２６】
2007536936.tif 000028
【０２０６】
驚くべきことに、マウス骨髄細胞からの移植されたヒトＣＤ４５＋をさらに特徴付ける際、新鮮単離ＣＤ３４＋細胞と比較してヒトＣＤ３４ｂｒ細胞を同等数投与すると、マウス骨髄に含まれるヒトＣＤ４２ａ＋細胞によって明らかなように、ヒト巨核球が最も多数になった（表２７参照）。
【０２０７】
【表２７】
2007536936.tif 000029
【０２０８】
新鮮単離ＣＤ３４＋細胞、Ｇ２培地中で増殖したＣＤ３４ｂｒ細胞、およびＧ２培地中で増殖したＣＤ３４ｄｉｍ細胞を尾静脈注入後に、マウスＢＭ、脾臓、およびＰＢ中に存在するヒトＣＤ４５＋細胞の百分率を、それぞれ表２８、２９、および３０に示す。
【０２０９】
【表２８】
2007536936.tif 000030
【０２１０】
【表２９】
2007536936.tif 000031
【０２１１】
【表３０】
2007536936.tif 000032
【０２１２】
Ｇ２培地中で７または９日間増殖した後、ＴＮＣを尾静脈注入した後の、マウスＢＭ中に存在するヒトＣＤ４５＋細胞の百分率を、それぞれ表３１および３２に示す。Ｇ２培地中で７日間増殖した後、２，０００，０００のＴＮＣを尾静脈注入した後の、マウス脾臓中に存在するヒトＣＤ４５＋細胞の百分率は、４．３％から３５．５％の範囲であった。Ｇ２培地中で７日間増殖した後、２，０００，０００のＴＮＣを尾静脈注入した後の、マウスＰＢ中に存在するヒトＣＤ４５＋細胞の百分率は、１．１％から１１．３％の範囲であった。
【０２１３】
【表３１】
2007536936.tif 000033
【０２１４】
【表３２】
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【０２１５】
Ｇ８培地
Ｇ８培地中で７日間増殖した後、ＴＮＣを尾静脈注入した後の、マウスＢＭ中に存在するヒトＣＤ４５＋細胞の百分率を、表３３に示す。Ｇ８培地中で７日間増殖した後、２，０００，０００のＴＮＣを尾静脈注入した後の、マウス脾臓中に存在するヒトＣＤ４５＋細胞の百分率は、２３．２％から２３．７％の範囲であった。Ｇ８培地中で７日間増殖した後、２，０００，０００のＴＮＣを尾静脈注入した後の、マウスＰＢ中に存在するヒトＣＤ４５＋細胞の百分率は、２．２％から１０．２％の範囲であった。
【０２１６】
【表３３】
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【０２１７】
Ｆ４培地
Ｆ４培地中で７または９日間増殖した後、ＴＮＣを尾静脈注入した後の、マウスＢＭ、脾臓、およびＰＢ中に存在するヒトＣＤ４５＋細胞の百分率を、それぞれ表３４および３５に示す。
【０２１８】
【表３４】
2007536936.tif 000036
【０２１９】
【表３５】
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【実施例９】
【０２２０】
二次マウス移植研究
これらの研究に関し、一次マウス移植について、実施例６に上記した通りの方法を行った。増殖ＣＤ３４ｂｒまたはＣＤ３４ｄｉｍ細胞で移植したマウスは、移植後７週で屠殺した。大腿骨および脛骨の両方からのマウスＢＭを、２５ゲージの針を用いて流し出した。ＢＭ細胞を洗浄し、２％ＦＣＳを含むＰＢＳで再懸濁させた。細胞をトリパンブルーを用いて計数し、亜致死量で照射を受けたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの第２群に尾静脈を通して注入した。マウスの第２群を、移植後７週で屠殺した。実施例６に上記した通りにマウス骨髄を分析した。
【０２２１】
結果
Ｇ２培地中で増殖したＣＤ３４ｂｒおよびＣＤ３４ｄｉｍ細胞の両方は、ヒト造血細胞の長期間移植を誘発でき、第２照射を受けたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの骨髄を再形成できた。表３６は、Ｇ２培地中で増殖したＣＤ３４ｂｒまたはＣＤ３４ｄｉｍ細胞の一次および２次移植後の、マウスＢＭ中のヒトＣＤ４５＋細胞百分率を示す。
【０２２２】
【表３６】
2007536936.tif 000038
【実施例１０】
【０２２３】
ＵＣＢから由来する接着、ストローマ様細胞の培養および増殖
本実施例は、Ｇ２培地を用いると、ＵＣＢからの柔軟な組織培養表面に接着することにより、ストローマ様細胞を濃縮できることを例証している。
【０２２４】
全血をＮＤＲＩから受け取り、最初にヘタスターチを使用することにより赤血球を除去し、続いて実施例２に記載した通りに溶解緩衝液処理することにより、白血球画分を単離した。全有核白血球画分を、６ウェルプレート中Ｇ２培地の１，０００，０００ＴＮＣ／ウェル／６ｍｌの播種密度で、またはＧ２培地の５，０００，０００ＴＮＣ／Ｔ−２５フラスコ／１５ｍｌの播種密度で播種し、１６日間インキュベートした。接着細胞層が培養開始約２４時間内で形成した。接着細胞の形態は、ストローマ様上皮細胞を示している。
【実施例１１】
【０２２５】
増殖ＣＤ３４ｂｒ細胞の遺伝子発現プロファイル
ＲＮＡ精製
第０日目に、および細胞培養後第１日目と第７日目に、２日間冷凍したＵＣＢから分離したＣＤ３４＋細胞から、ＲＮＡ精製を精製した。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ法（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７４１０４）を用いてＲＮＡ精製を行った。室温で１０分間４００ｘｇで遠心分離することにより、およそ２×１０６のＣＤ３４＋細胞を採集し、培地を除去した。
【０２２６】
使用する直前に、ＲＬＴ溶解緩衝液にメルカプトエタノールを１０μｌ／ｍｌ（容量／容量）で加えた。ＲＬＴカオトロープ−溶解緩衝液３５０μｌを加え、数回ピペットで混合し、次いで渦巻き状に混合（ｖｏｒｔｅｘ  ｍｉｘｅｄ）することにより、細胞を溶解させた。溶解物を２ｍｌのコレクションチューブ中、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムに移液し、最大速度（約１６，０００ｘｇ）で２分間遠心分離して均一化した。１容量の７０％エタノールを溶解物に加え、ピペット混合した。溶解物を２ｍｌのコレクションチューブ中、ＲＮｅａｓｙスピンカラムに移液し、１０，０００ｘｇで１５秒間遠心分離して、カラムマトリックスにＲＮＡを結合させた。フロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｕ）を廃棄し、ＲＷ１洗浄緩衝液３５０μｌを加えてカラムマトリックスを洗浄し、上記のように遠心分離した。
【０２２７】
以下に簡潔に記載するように、Ｑｉａｇｅｎ  Ｒｎａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅセット（ｃａｔ＃７９２５４）を用いて、カラム上でのＤＮａｓｅ処理を行った。再構成され／希釈されたＤＮＡｓｅ（１０μｌの再構成されたＤＮＡｓｅ＋７０μｌのＲＤＤ緩衝液）８０μｌを、スピンカラム膜の中心に加え、室温で１５分間インキュベートした。次いでＲＷ１（３５０μｌ）を加えることによりスピンカラムを２回洗浄し、次いで１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【０２２８】
次いでスピンカラムを新しいコレクションチューブに設置し、ＲＰＥ緩衝液（５００μｌ）を加えることにより洗浄し、１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。フロースルーを廃棄し、さらに５００μｌのＲＰＥ緩衝液をスピンカラムに適用し、続いて１３，２００ｒｐｍで３分間遠心分離した。スピンカラムを新しい１．７ｍｌの蓋付マイクロチューブに移した。スピンカラム上にエタノールが残っていないことを確かめるために、試料を再度最大速度で１分間遠心分離した。カラムを清浄なマイクロチューブに移し、膜中心にＲＮＡｓｅ不含の水３０μｌを２度加えることによりＲＮＡを溶離し、１０，０００ｘｇで１分間遠心分離した。
【０２２９】
マイクロアレイ
ＡｇｉｌｅｎｔヒトオリゴＩＡ２２Ｋアレイを用いて、ＲＮＡ試料を遺伝子発現（転写）プロファイルの差異について比較した。マイクロアレイハイブリッド形成／スキャンはＰａｒａｄｉｇｍ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓと契約した。彼らは、ＡｇｉｌｅｎｔスキャナーおよびＲｏｓｅｔｔａレゾルバを用いて、データの抽出および正規化を行った。また、ＢＤＴバイオインフォマティクスにより、ＢＤＴで開発したアルゴリズムを用いて抽出したデータを正規化した。
【０２３０】
次いで、７日目のＣＤ３４ｂｒ対ＣＤ３４ｄｉｍ細胞集団において、および０日目対１日目に培養されたＣＤ３４＋細胞において、転写変動調整（ｕｐ  ｎａｄ  ｄｏｗｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ）されているかどうかについて、両者の正規化データを評価した。作動的に発現した遺伝子の分類を、文献から認められた遺伝子機能に関連するパターンに対して研究した。関連する遺伝子機能を基に、興味あるサブグループを確認し、これらの関係は、さらに試験可能または試験済みのある特異的な生物学的解釈を示唆した。例えば、Ｒｏｓｅｔｔａアレイ規準化からの１６，０００を越える観測できる転写から、７日目のＣＤ３４ｂｒ細胞集団が有する転写のうち、ＣＤ３４ｄｉｍ集団に比較して２．５倍以上増加したのは１９の転写のみであった。これらの転写のいくつかは、すなわちＤＬＫ１、ＣＳＲＰ２、およびＰＲＯＭＬ１（ＣＤ１３３）は、増殖および非分化により特徴付けられる多分化能幹細胞及び前駆細胞と関連する、文献記載の機能または関連性を有する。ＢＤＴ規準化を基に、１５の転写のみが２倍以上増加し、これは統計的に重要な変化と決定された。これらは再度ＤＬＫ１およびＣＳＲＰ２の両方を含んでいた。加えて、この分類に属する転写ＳＴＭＮ３も含んでいた。幹細胞転写ＰＲＯＭＬ１（ＣＤ１３３）は２．０倍増加したが、ＢＤＴ規準化にとって、これらの試料を用いる測定での変動を基にすると、統計的に重要な変化とは決定されなかった。
【０２３１】
ｄｉｍ集団と比較して、ＣＤ３４ｂｒ集団においては、多数の転写（ＢＤＴ正規化データとして８１）が下方調整された。ｂｒｉｇｈｔ集団において発現されにくかったこれらの転写の多くは、さらに造血細胞分化と関連または関係する機能を有する。これらの結果は、より分化されたｄｉｍ細胞集団と比較して、ＣＤ３４ｂｒ細胞集団が初期段階として、より多能性幹細胞であると特徴付けられる。しかしながら、ＣＤ３４、ＣＤ９０（Ｔｈｙ１）、ＳＺＦ１、Ｃ１７、ＩＫ、ＰＯＤＬＸ３、ＦＬＴ１、ＦＬＴ３、ＦＬＴ４、ＣＤ３３、ＫＩＴＬＧなどの他のいくつかの知られている幹細胞関連転写は、ｂｒｉｇｈｔおよびｄｉｍ集団におけるレベルと同様のレベルであった。
【０２３２】
Ｐａｒａｄｉｇｍ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｒｏｓｅｔｔａアレイでは、１６，３８８の全転写を測定した。ＣＤ３４ｂｒ細胞において、１９の遺伝子が２．５倍以上向上しＰ＜０．０１であったが、他方、９５の遺伝子は１／２．５以下への低下でＰ＜０．０１であった。ＢＤ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓアレイにおいては、１５の遺伝子が２倍の向上であった。例えば、血液新生を調整し、分化を抑制するＤＬＫ１は、３．０倍の向上であった。細胞増殖の役割を有するＳＴＭＮ３は、２．０倍の向上であった。増殖および分化を促進する転写要因であるＣＳＲＰ２は、２．６倍の向上であった。ＢＤ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓアレイにおいては、８１の遺伝子は１／２以下への低下であった。分化および炎症に関連する遺伝子は、培養後下方調整された。時間の経過につれて、細胞帰巣（ｃｅｌｌ  ｈｏｍｉｎｇ）に関係する転写発現は異なった。示されたＣＤ３４ｂｒ細胞は、デルタ様タンパク質−１、システインおよびグリシン−リッチプロテイン２（ｇｌｙｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）、ＦＡＤＤ、Ｓ１００Ａ９、ならびにＩＴＢ２ｍＲＮＡ転写のレベルを減少させた。
【実施例１２】
【０２３３】
ＣＤ３４ｂｒ細胞を含む３−Ｄ骨格の新血管形成
結果
アルギネート骨格を濃縮ＣＤ３４＋臍帯血細胞（８０〜９０％純度）で播種し、Ｇ２培地（ＶＥＧＦ添加及び非添加）と混合したＳｔｅｍｌｉｎｅ（商標）栄養培地中で７日間培養し、次いでＳＣＩＤ／ＮＯＤマウスに皮下移植すると、ＣＤ３４−細胞を含む骨格と比較して新血管形成が観測された。ＶＥＧＦが存在すると、ＣＤ３４＋細胞を含む骨格内での新血管形成が大きく高められた。
【実施例１３】
【０２３４】
膵臓修復モデルにおけるＣＤ３４ｂｒ細胞による新血管形成
全臍帯血をＮＤＲＩから受け取り、実施例６に記載した通りに処理した。ＣＤ３４＋細胞をＧ２培地中で７日間培養し、次いでＣＤ３４ｄｉｍおよびＣＤ３４ｂｒ細胞に分別し、次いでマウス再生膵臓モデルに移植した。
【０２３５】
結果
マウス再生膵臓モデルに移植後４週で、ＣＤ３４ｂｒ細胞は、、長いチューブ様構造（潜在的に脈管構造）を形成する再生膵臓組織に組み込まれた。ところがＣＤ３４ｄｉｍ細胞は、活発に再構築する膵臓組織の境界で、高密度かつ組み込まれない状態の小瘤のみを形成した。
【実施例１４】
【０２３６】
ＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ（商標）ＰＥビーズを用いるＣＤ３４発現の定量化
本実施例は、本明細書の他の箇所に記載したように、ＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ（商標）ＰＥビーズ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国）を用いて、Ｇ２培地からの増殖ＣＤ３４ｂｒ細胞へのＣＤ３４発現を定量化する。
【０２３７】
ＣＤ３４＋細胞を単離し、Ｇ２培地を用いて実施例１に記載した通りに７日間培養した。増殖細胞を、ＴｒｕＣＯＵＮＴ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）チューブ中、１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むＰＢＳに、１×１０６細胞／１００μｌで懸濁させ、暗闇で室温下１５分間、２０μｌのＣＤ３４−ＰＥ  １：１（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、カリフォルニア州）で細胞を染色した。インキュベートした後、調製したての１×ＰｈａｒＭＬｙｓｅ（商標）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）（１ｍｌ）およびＶｉａＰｒｏｂｅ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）（２０μｌ）を細胞懸濁液に加え、続いて暗闇で室温下１０分間インキュベートした。
【０２３８】
インキュベートする間、ＱｕａｎｔｉＱｕｅｓｔソフトによりＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ（商標）ＰＥビーズを解析して、細胞当たりの結合抗体（ＡＢＣ）値に関する検量線を構築した。
【０２３９】
ＦＡＣＳ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ノースカロライナ州）によりインキュベートした後、３０分以内に試料を採集し、ＩＳＨＡＧＥ方法によりデータを解析して、（ヒストグラム中央値／ピークチャネル）値（ｈｙｓｔｏｇｒａｍ  ｍｅｄｉａｎ／ｐｅａｋ  ｃｈａｎｎｅｌ）を求めた。ＣＤ３４−ＰＥのための（中央値／ピークチャネル）値を検量線と比較して、ＣＤ３４発現のためのＡＢＣ値を得た。
【０２４０】
結果
ＣＤ３４抗原発現量を、増殖ＣＤ３４＋細胞について定量的に測定した。表３７は、ＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ（商標）ＰＥビーズを用いて測定したときの、ＣＤ３４ｂｒおよび全ＣＤ３４＋細胞からのＡＢＣ値の比を示す。１０の実験を行い、１．５５から３．０３の範囲でＡＢＣ比の値を得た。
【０２４１】
ＱｕａｎｔｉＢｒｉｔｅ（商標）ＰＥビーズを用いる増殖ＣＤ３４ｂｒ細胞についてのＣＤ３４発現量の定量
【０２４２】
【表３７】
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【０２４３】
本明細書に述べたすべての刊行物および出願特許は、本発明に関係する当業者のレベルを示すものである。すべての刊行物および出願特許は、それぞれ個々の刊行物および出願特許が参照により組み込まれるべきであると特におよび個々に示したのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２４４】
前述の発明を、理解を明確にする目的のために説明や実施例の方法でいくらか詳しく記載してきたけれども、添付した特許請求の範囲内で変更や修飾を行うことができることは明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【０２４５】
【図１】Ｇ２での培養後の総有核細胞、ＣＤ３４＋細胞集団およびＣＤ３４ｂｒ細胞集団の相対的増加を示す図である。
【図２】ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス試験に対するＣＤ３４ｂｒおよびＣＤ３４ｄｉｍ細胞への増殖細胞の分類のためのゲーティング手法（ｇａｔｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙ）を示す図である。
【図３】それぞれの接種用量におけるマウス骨髄への増殖ヒト細胞の移植レベルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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