(57)【要約】      （修正有）【課題】エビ目生物の飼育、養殖において有用な、エビ目用経口投与組成物および組成物を摂取させることを含む方法の提供。【解決手段】５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を含むエビ目用経口投与組成物。本エビ目用経口投与組成物は、エビ目の飼育、養殖に使用されることが可能であり、Vibrio parahaemolyticusを原因菌とする、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ（早期死亡症候群／急性肝膵臓壊死病）を有効に予防および治療することが可能である。また、本エビ目用経口投与組成物を所定の量で投与することにより、エビ目の成長を促進させることが可能である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ)若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を含むエビ目用経口投与組成物。
【請求項２】
５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ)若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を含むエビ目早期死亡症候群／急性肝膵臓壊死病（ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ）の予防・治療用経口投与組成物。
【請求項３】
エビ目がクルマエビ科である請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
組成物が飼料または飼料用添加剤である請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ)若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種をエビ目の生物に摂取させることを含む方法。
【請求項６】
５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ)若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種をエビ目の生物に摂取させることを含む、エビ目早期死亡症候群／急性肝膵臓壊死病（ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ）を予防・治療する方法。
【請求項７】
エビ目がクルマエビ科である請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ)若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を、５−ＡＬＡリン酸塩換算でエビ目の生物の体重１ｇあたりかつ一日あたりで、０．２５μｇ／ｇ・日〜２．５μｇ／ｇ・日の量で、エビ目の生物に摂取させることを含む、エビ目の生物の成長を促進させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を含むエビ目用経口投与組成物、飼料および飼料用添加剤に関し、より詳細には、５−ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を含むエビ目早期死亡症候群／急性肝膵臓壊死病（ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ）の予防・治療用経口投与組成物に関する。また、本発明は５−ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種をエビ目の生物に摂取させることを含む方法に関し、より詳細には、５−ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種をエビ目の生物に摂取させることを含む、エビ目早期死亡症候群／急性肝膵臓壊死病（ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ）を予防・治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界のエビの生産量は、平成４（１９９２）年の３０１万トンから平成２４（２０１２）年の７６８万トンへと急増している。このうち養殖による生産量の割合をみると、平成４（１９９２）年の３０％から平成２４（２０１２）年は生産量の過半数を超えて５６％になるなど、近年のエビの養殖の発展には目を見張るものがある（非特許文献１）。エビの養殖においては、天然の環境とは異なり、一般的に高密度で飼育され、過剰なストレスがかかるなどの理由から、エビの養殖場において様々な病気の発生が認められてきた。養殖水産動植物の生存率は養殖経営に大きく影響するため、養殖業においては病気への適切な対応が求められている。
【０００３】
近年、稚エビに発生し、死亡率がほぼ１００％となるＥＭＳ（Early Mortality Syndrome：早期死亡症候群）と呼ばれるエビの疾病により、一部の国においてエビ養殖業は危機的な状況に直面している。この疾病は２００９年に中国で最初に報告され、次いでベトナム、タイ、マレーシア等の東南アジアにも広がってきており、２０１３年にはメキシコでの発生が報告されている。ＥＭＳにおいては、エビの肝膵臓に変色等の症状が現れ、壊死してしまうので、この早期死亡症候群は、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ（Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease：急性肝膵臓壊死病）とも呼ばれている。そして、このＥＭＳ／ＡＨＰＮＤは特殊なタイプの腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）の感染によるものであることも知られている（非特許文献２）。
【０００４】
エビにおけるビブリオ感染に対してワクチンを使用するという方法が開発されている（特許文献１）。しかし、この特許文献１には、対象菌として腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）が示唆されているものの、具体的に腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）に対するワクチンを製造したことは開示されておらず、ましてやこのワクチン療法がＥＭＳ／ＡＨＰＮＤを予防・治療するのに有効であるかは全く不明である。さらに、特殊なワクチンよりも安価かつ簡単に入手できる物質によってＥＭＳ／ＡＨＰＮＤを予防・治療する方法があれば、その方が望ましいのは明らかである。また、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤの予防・治療以外にもエビの養殖において有利な効果をもたらすような物質があればさらに望ましい。
【０００５】
５−ＡＬＡは、細胞のミトコンドリアに存在し、動物においてはミトコンドリアで生合成され、鉄分と結びついてヘムやシトクロムの原料となるなど代謝に必須の成分であり、植物においては、葉緑体で生合成され、マグネシウムと結びついてクロロフィルとなり光合成に必須の成分であることが知られている。そして、特許文献２には５−ＡＬＡリン酸塩の製造方法が開示されており、さらに５−ＡＬＡ塩酸塩の合成方法がすでに知られていたことも記載されている。また、微生物による５−ＡＬＡの製造方法も知られている（特許文献３）。
【０００６】
特許文献４には、５−ＡＬＡを有効成分として含有する魚類病原性微生物の感染予防および治療用組成物が記載されており、さらに前記魚類病原性微生物として、エドワードジエラタルダ細菌（Edwardsiella tarda）、ストレプトコッカス属細菌（Streptococcus sp.）スタフィロコッカス属細菌（Staphylococcus sp.）、スタフィロコッカスエピデルミディス細菌(Staphilococcus epidermidis)、シュードモナス属細菌（Pseudomonas sp.）、またはビブリオアングイラルム細菌（Vibrio anguillarum）が記載されている。しかし、特許文献４においては、エビ目の生物に対する５−ＡＬＡの影響については何ら検討されていない。さらに、特許文献４に記載されているビブリオアングイラルム（Vibrio anguillarum）はエビ目のＥＭＳ／ＡＨＰＮＤの原因菌である腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）とは異なるため、エビ目の生物においてＥＭＳ／ＡＨＰＮＤを生じさせない。よって、特許文献４の記載からは、エビ目の生物における５−ＡＬＡによるＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ予防・治療効果は何ら予想できない。また、５−ＡＬＡがエビ目の生物の成長を促進させることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１５−１３７２５４号公報
【特許文献２】特開２００６−１８２７５３号公報
【特許文献３】特開２００５−３３３９０７号公報
【特許文献４】特開２００１−３１６２５５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】平成２５年度水産白書、（６）世界の養殖業の生産状況
【非特許文献２】Mohammad Jalil Zorriehzahra, Reza Banaederakhshan; Early Mortality Syndrome (EMS) as new Emerging Threat in Shrimp Industry; Advances in Animal and Veterinary Sciences, March 2015, Volume 3, Special issue 2, Pages 64-72
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、クルマエビ科をはじめとするエビ目の生物の飼育、養殖において有用な、特に、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤを予防・治療できるエビ目用経口投与組成物の開発が長年の間強く求められていた。また、エビ目の生物のＥＭＳ／ＡＨＰＮＤを予防・治療できるだけでなく、その成長を促進させることもできるエビ目用経口投与組成物の開発も求められていた。しかし、このようなエビ目用経口投与組成物は実現されていなかった。
本発明者らは、上記問題点を解決できるようなエビ目用経口投与組成物について鋭意検討を行ったところ、５−ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも一種を含む組成物が極めて有用であることを見いだし、これに基づいて本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を含むエビ目用経口投与組成物。
［２］５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を含むエビ目早期死亡症候群／急性肝膵臓壊死病（ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ）の予防・治療用経口投与組成物。
［３］エビ目がクルマエビ科である前記［１］または［２］に記載の組成物。
［４］組成物が飼料または飼料用添加剤である前記［１］〜［３］のいずれか１つに記載の組成物。
［５］５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種をエビ目の生物に摂取させることを含む方法。
［６］５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種をエビ目の生物に摂取させることを含む、エビ目早期死亡症候群／急性肝膵臓壊死病（ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ）を予防・治療する方法。
［７］エビ目がクルマエビ科である前記［５］または［６］に記載の方法。
［８］５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ)若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を、５−ＡＬＡリン酸塩換算でエビ目の生物の体重１ｇあたりかつ一日あたりで、０．２５μｇ／ｇ・日〜２．５μｇ／ｇ・日の量で、エビ目の生物に摂取させることを含む、エビ目の生物の成長を促進させる方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の５−ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を含むエビ目用経口投与組成物は、エビ目の生物の飼育、養殖において、エビ目ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤを予防・治療できるという効果をもたらしうる。その結果、従来であれば死亡率がほぼ１００％となるＥＭＳ／ＡＨＰＮＤを予防・治療でき、エビ目の生物の飼育、養殖における経済的な寄与をもたらしうる。また、本発明のエビ目用経口投与組成物は、所定の投与量でエビ目の生物に投与した場合に、成長を促進させるという有利な効果をもたらす。この有利な効果は、従来知られていなかった効果であって、かつエビ目の生物の飼育、養殖の技術分野の当業者が予期していなかった効果である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】５−ＡＬＡリン酸塩を投与したバナメイエビに対してＥＭＳ／ＡＨＰＮＤの原因菌（Vibrio parahaemolyticus）による攻撃試験を行った結果を、５−ＡＬＡリン酸塩を投与していない対照群と比較して経時的に示すグラフである。
【図２】３ヶ月の飼育期間中の５−ＡＬＡを投与したバナメイエビの脱皮の累積的頻度を、５−ＡＬＡを投与していない対照群と比較して示すグラフである。
【図３】２週間にわたって５−ＡＬＡを投与したバナメイエビの肝膵臓のＡＴＰレベルを、５−ＡＬＡを投与していない対照群と比較して示すグラフである。
【図４】３ヶ月間にわたって５−ＡＬＡを投与したバナメイエビに対して高用量のＥＭＳ／ＡＨＰＮＤの原因菌（Vibrio parahaemolyticus）による攻撃試験を行った結果を、５−ＡＬＡを投与していない対照群と比較して経時的に示すグラフである。
【図５】３ヶ月間にわたって５−ＡＬＡを投与したバナメイエビに対して低用量のＥＭＳ／ＡＨＰＮＤの原因菌（Vibrio parahaemolyticus）による攻撃試験を行った結果を、５−ＡＬＡを投与していない対照群と比較して経時的に示すグラフである。
【図６】３ヶ月間にわたって５−ＡＬＡを投与したバナメイエビに対してＥＭＳ／ＡＨＰＮＤの原因菌（Vibrio parahaemolyticus）による感染処理を行った際の血リンパ中の全血球数を、５−ＡＬＡを投与していない対照群と比較して示すグラフである。
【図７】３ヶ月間にわたって５−ＡＬＡを投与したバナメイエビに対してＥＭＳ／ＡＨＰＮＤの原因菌（Vibrio parahaemolyticus）による感染処理を行った際の肝膵臓におけるヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）の遺伝子発現を、５−ＡＬＡを投与していない対照群と比較して示すグラフである。
【図８】３ヶ月間にわたって５−ＡＬＡを投与したバナメイエビに対してＥＭＳ／ＡＨＰＮＤの原因菌（Vibrio parahaemolyticus）による感染処理を行った際の肝膵臓におけるフェノール酸化酵素前駆体（ｐｒｏＰＯ）の遺伝子発現を、５−ＡＬＡを投与していない対照群と比較して示すグラフである。
【図９】３ヶ月間にわたって５−ＡＬＡを投与したバナメイエビの肝膵臓における核内受容体Ｅ７５の遺伝子発現を、５−ＡＬＡを投与していない対照群と比較して示すグラフである。
【図１０】３ヶ月間にわたって５−ＡＬＡを投与したバナメイエビの肝膵臓における一酸化窒素合成酵素の遺伝子発現を、５−ＡＬＡを投与していない対照群と比較して示すグラフである。
【図１１】２週間にわたって５−ＡＬＡを投与したバナメイエビの肝膵臓における一酸化窒素合成酵素の遺伝子発現を、５−ＡＬＡを投与していない対照群と比較して示すグラフである。
【図１２】２週間にわたって５−ＡＬＡを投与したバナメイエビの肝膵臓におけるＣ型レクチンの遺伝子発現を、５−ＡＬＡを投与していない対照群と比較して示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の一実施態様は、５−ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を含むエビ目用経口投与組成物である。
本発明において、５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）はδ−アミノレブリン酸とも称される化合物である。本発明において、「５−ＡＬＡ若しくはそのエステル」とは、「５−ＡＬＡ若しくは５−ＡＬＡエステル」であり、下記式（Ｉ）で表されうる。本発明において、「５−ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩」の記載における「それらの塩」とは、５−ＡＬＡの塩、若しくは５−ＡＬＡエステルの塩をいう。この塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、メチルリン酸、エチルリン酸、亜リン酸塩、次亜リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の酸付加塩、及びナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の金属塩、アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１４】
【化１】
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【００１５】
前記式（Ｉ）において、Ｒ１は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基である。Ｒ１が水素の場合には前記式（Ｉ）は５−ＡＬＡを表す。Ｒ１が直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基である場合には、前記式（Ｉ）は５−ＡＬＡエステルを表す。
【００１６】
Ｒ１において示される直鎖若しくは分岐状のアルキル基は、好ましくは、炭素数が１〜１８のアルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、２−メチルブチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、３−メチルペンチル基、エチルブチル基、ｎ−ヘプチル基、２−メチルヘキシル基、ｎ−オクチル基、イソオクチル基、ｔｅｒｔ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、３−メチルヘプチル基、ｎ−ノニル基、イソノニル基、１−メチルオクチル基、エチルヘプチル基、ｎ−デシル基、１−メチルノニル基、ｎ−ウンデシル基、１，１−ジメチルノニル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−トリデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ペンタデシル基、ｎ−ヘキサデシル基、ｎ−ヘプタデシル基、ｎ−オクタデシル基等が挙げられる。シクロアルキル基としては、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基などが挙げられるだけでなく、アルキル置換基を有するシクロアルキル基、例えば、炭素数１〜６のアルキル置換基を有するシクロアルキル基、例えば、３−メチルシクロヘキシル基、４−メチルシクロヘキシル基、４−エチルシクロヘキシル基、２−メチルシクロオクチル基等も挙げられる。直鎖若しくは分岐状のアルキル基としては、炭素数１〜１６のアルキル基がより好ましく、メチル基、エチル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ヘキサデシル基又は２−エチルヘキシル基が特に好ましい。
【００１７】
Ｒ１において示されるアリール基としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。当該アリール基は、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロヘキシル基等の炭素数１〜６のアルキル基、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基等の炭素数１〜６のアルコキシ基、水酸基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン原子、カルボキシ基等の置換基１〜３個によって置換されていてもよい。
【００１８】
Ｒ１において示されるアラルキル基としては、炭素数１〜６のアルキル基と炭素数６〜２０のアリール基とから構成されるものが好ましい。炭素数１〜６のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロヘキシル基等が挙げられ、炭素数６〜２０のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。アラルキル基のうち、ベンジル基又はフェネチル基が好ましく、ベンジル基が特に好ましい。当該アラルキル基のアリール基は、上記記載の炭素数１〜６のアルキル基、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基等の炭素数１〜６のアルコキシ基、水酸基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン原子、カルボキシ基等の置換基１〜３個によって置換されていてもよい。
【００１９】
本発明においては、５−ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種が有効成分として使用されればよく、この有効成分は一種だけの使用であってもよいし、またはこの有効成分は複数種類の組み合わせの形態であってもよい。例えば、本発明において使用される有効成分は、５−ＡＬＡ、５−ＡＬＡエステル、５−ＡＬＡ塩、または５−ＡＬＡエステルの塩のいずれであってもよい。また、例えば、５−ＡＬＡと５−ＡＬＡエステルの塩の組み合わせなどであってもよい。本発明において使用される５−ＡＬＡ若しくはエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種は精製された状態のものであっても良いし、粗精製された状態のもの、または合成されて得られた混合物の状態のものであっても良い。本発明においては５−ＡＬＡ塩が有効成分として使用されるのが好ましく、より好ましくは５−ＡＬＡ塩酸塩および／または５−ＡＬＡリン酸塩が有効成分として使用される。
【００２０】
本発明において「エビ目」とは、十脚目（Decapoda）とも称される、甲殻類の分類群の一つであり、エビ・カニ・ヤドカリを含む生物群である。本発明の対象としては、好ましくはエビ目の生物はエビであり、より好ましくは、根鰓亜目（Dendrobranchiata）とも称されるクルマエビ亜目の生物である。より好ましくは、本発明の対象となるエビ目の生物は、クルマエビ亜目のクルマエビ科（Penaeidae）に属する生物である。さらにより好ましくは、本発明の対象となるエビ目の生物は、クルマエビ科のバナメイエビ（Litopenaeus vannamei）、クルマエビ（Marsupenaeus japonicus）、ウシエビ（ブラックタイガー）（Penaeus monodon）、コウライエビ（タイショウエビ）（Fenneropenaeus chinensis）、フトミゾエビ（Melicertus latisulcatus）、ヨシエビ （Metapenaeus ensis）、アカエビ（Metapenaeopsis barbata）、クマエビ（Penaeus semisulcatus）などが挙げられるがこれらに限定されない。また、さらにより好ましくは、本発明の対象となるエビ目の生物はバナメイエビである。また、エビ目ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤが稚エビに発生するという観点から、好ましくは、本発明の対象となるエビ目の生物は稚エビであり、さらにより好ましくは本発明の対象となるエビ目の生物はクルマエビ科の稚エビである。
【００２１】
本発明において、エビ目用経口投与組成物はエビ目の生物に経口投与される組成物であれば特に限定されない。例えば、有効成分である５−ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を水などの媒体に溶解してエビ目の生物が飼育されている環境に投与するような形態の組成物であってもよい。この場合、投与された環境中の有効成分がエビ目の生物に経口的に摂取されることにより、その効果がもたらされる。
【００２２】
５−ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種をより効率的にエビ目の生物に摂取させるという観点から、本発明の経口投与組成物は、好ましくは、エビ目用飼料もしくはエビ目用飼料添加剤である。エビ目用飼料は通常エビ目の生物の飼育、養殖に使用される成分であれば任意の成分を含んでいて良く、任意の製造方法において製造されたものであっても良い。本発明の飼料においては、従来のエビ用飼料の原材料とほぼ同じものを用いることができ、例えば、一般のエビ用飼料に用いられるイカミール、オキアミミール、ホワイトミール、大豆油かす、コーングルテンミールなどのタンパク質源、グルテン、デンプンなどのバインダー類、その他ビタミン混合物，ミネラル混合物，微量金属を含有するものであっても良いが、これに限定されない。また、本発明のエビ目用飼料は、飼育されるエビ目の生物の種類および大きさなどに応じて任意の形状、大きさであってよい。また、本発明のエビ目用飼料は種々の形態に製造することができる。例えば、本発明のエビ目用飼料は、乾燥原料を混合、粉砕した粉末状飼料、粉体を固形化した固形化飼料、例えばドライペレット、または水分を含んだ固形化飼料、例えば、ペースト状の飼料、もしくはモイストペレットなどであってもよい。例えば、一般の粉末のエビ養殖用飼料と５−ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種の有効成分とを、任意に混合用の媒体、例えば、水などと共に混合し、この混合物を成形し、例えば、この混合物を５０ｍＬのシリンジから押し出し成形して、成形物を乾燥させ、例えば、６０〜６５℃で２時間程度乾燥させることにより、本発明の５−ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を含むエビ目用飼料が形成されうる。飼料の形、乾燥の程度などは、投与に不都合がない限りは、特に限定されるものではない。この有効成分の効果をエビ目の生物内で充分に発揮させるという観点から、飼料中に含まれる有効成分（すなわち、飼料中に含まれうる５−ＡＬＡ、５−ＡＬＡエステル、５−ＡＬＡの塩、および５−ＡＬＡエステルの塩）の合計量が５−ＡＬＡリン酸塩換算で、望ましくは１〜１００ｐｐｍ、より望ましくは２〜５０ｐｐｍ、更に望ましくは３〜２０ｐｐｍである。特に、エビ目の生体の成長を促進させるとの観点からは、飼料中に含まれる有効成分の合計量は５−ＡＬＡリン酸塩換算で、望ましくは５〜５０ｐｐｍ、より望ましくは１０〜４０ｐｐｍ、更により望ましくは１５〜３０ｐｐｍである。
【００２３】
また、エビ目用経口投与組成物はエビ目用飼料添加剤であってよい。ここでの飼料添加剤とは、通常のエビ目用の飼料に添加できる添加剤であればよく、特に限定されるものではない。例えば、本発明における飼料添加剤は、５−ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種と、この有効成分をエビ目用飼料に付着させることができる展着剤などを含むものであってよいし、この有効成分をエビ目用飼料に吸収させるような媒体を含むものであってもよいし、またはこの有効成分をエビ目用飼料の原料に混合しやすくするような媒体を含むものであってもよい。本発明の飼料添加剤は、飼料中に含まれる有効成分の合計量が上述の範囲となるように飼料に添加されるのが好ましい。
【００２４】
本発明の別の実施態様は、５−ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種をエビ目の生物に摂取させることを含む方法である。ここでの摂取とは経口的な摂取である。有効成分である５−ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種をエビ目の生物に摂取させることができるのであればその方法は特に限定されない。例えば、エビ目の生物を飼育している環境下に５−ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を添加して、当該有効成分をエビ目に摂取させる方法がある。しかし、より効率的に有効成分である５−ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種をエビ目に摂取させるという観点から、５−ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩からから選択される少なくとも一種を含む飼料をエビ目の生物に摂取させるのが好ましい。
【００２５】
本発明の別の実施態様は、所定の量の５−ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種をエビ目の生物に摂取させることを含む、エビ目の生物の成長を促進させる方法である。この実施態様においては、エビ目の生物に摂取させる、有効成分である５−ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種の合計量は、好ましくは、５−ＡＬＡリン酸塩換算でエビ目の生物の体重１ｇあたりかつ一日あたりで、０．２５μｇ／ｇ・日〜２．５μｇ／ｇ・日であり、より好ましくは０．５μｇ／ｇ・日〜２．０μｇ／ｇ・日であり、更により好ましくは０．７５〜１．５μｇ／ｇ・日である。理論に拘束されるものではないが、本発明のこの実施態様におけるエビ目の生物の成長促進のメカニズムの１つとしては、エビ目の生物の生体内において、摂取した餌からエネルギーを取り出す効率を５−ＡＬＡが高めていることが考えられる。
【００２６】
本発明の別の実施態様は５−ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を含むエビ目早期死亡症候群／急性肝膵臓壊死病（ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ）の予防・治療用経口投与組成物である。また、本発明のさらに別の実施態様は、５−ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種をエビ目の生物に摂取させることを含む、エビ目早期死亡症候群／急性肝膵臓壊死病（ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ）を予防・治療する方法である。本発明における「エビ目早期死亡症候群／急性肝膵臓壊死病（ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ）」の「予防・治療」とは、エビ目の生物の養殖において重大な問題となっている、Vibrio parahaemolyticusを原因菌とする、早期死亡症候群／急性肝膵臓壊死病（ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ）と呼ばれるエビの疾病の予防および／または治療をいう。ここで、予防とは、５−ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種の投与下で、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤの発症を抑制すること、すなわち発症を完全に抑制するかまたは発症率を低下させることをいう。また、治療とは、Vibrio parahaemolyticusに感染したか、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤを発症したエビ目の生物の当該感染およびＥＭＳ／ＡＨＰＮＤを治癒させることをいう。本発明のこの実施形態は、有効成分である５−ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種が、このエビ目のＥＭＳ／ＡＨＰＮＤを予防および／又は治療できるという有利な効果を奏するものである。この効果は、実施例において、原因菌の攻撃後の死亡率の低減という形で明確に示されている。有効成分である５−ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種によりもたらされるこの有利な効果は従来知られていなかった効果であって、エビ目の飼育、養殖の技術分野の当業者が予期していなかった効果である。エビ目ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤの予防・治療においては、エビ目の生物に摂取させる、有効成分である５−ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種の合計量は、５−ＡＬＡリン酸塩換算でエビ目の生物の体重１ｇあたりかつ一日あたりで、好ましくは０．０５μｇ／ｇ・日〜５μｇ／ｇ・日であり、より好ましくは０．１μｇ／ｇ・日〜２．５μｇ／ｇ・日であり、更により好ましくは０．１５〜１μｇ／ｇ・日である。
【００２７】
本発明が適用されるエビ目の生物が飼育、養殖されている環境は特に限定されず、東南アジア等で大規模に行われている池での養殖にも本発明は適用可能であるし、また水槽などでの小規模での飼育においても本発明は適用可能である。
以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
【実施例】
【００２８】
実施例１：５−ＡＬＡを含む飼料の作成
５−ＡＬＡリン酸塩（Ｃ５Ｈ９ＮＯ３・Ｈ３ＰＯ４）が濃度１５ｐｐｍとなるように、粉末飼料（タイ国でバナメイエビの養殖のために使用されている一般的な市販餌を粉末化して使用した）と良く混合し、粉末飼料と等量の蒸留水を添加し良く混合した。次いで、得られた混合物を５０ｍＬのシリンジに詰め、押し出すことによりスパゲッティー状の成型飼料を作成した。これを６０〜６５℃で２時間程度乾燥した。乾燥後、投与しやすいようにスパゲッティー状の成型飼料小さく粉砕してペレット状にした。このペレットは使用まで冷蔵庫で保管した。
【００２９】
実施例２：Vibrio parahaemolyticusによる攻撃を受けたバナメイエビの生存率に対して５−ＡＬＡが及ぼす影響
体重約２ｇのバナメイエビを使用した。一群あたり２０匹のバナメイエビを１００Ｌの水槽に入れ、２８日間飼育を行った。５−ＡＬＡ投薬群においては実施例１で作成した飼料を投与し、対照群においては５−ＡＬＡを含まない以外は同じ飼料を投与した。給餌量はエビの体重の５％とし、給餌は１日に４回で、自動給餌器を使用して行った。
試験開始から２週間目に、バナメイエビをVibrio parahaemolyticusを３×１０５ｃｆｕ／ｍｌの量で含む海水を入れた１５Ｌ水槽に移し、バナメイエビに対するVibrio parahaemolyticusの感染処理を行った。感染処理からさらに２週間にわたってバナメイエビの生存率を確認した。結果を図１に示す。図１においては、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」が対照群を表し、「ＡＬＡ」が５−ＡＬＡ投薬群を表す。
【００３０】
図１に示されるように、５−ＡＬＡを投与していない対照群においては感染後７日目から生存率の顕著な低下を示し、感染後１３日目には全てのバナメイエビが死亡した。一方、５−ＡＬＡをあらかじめ投与していた投薬群においては、観察期間中、わずか１匹が死亡しただけであり、対照群に対して有意な生存率（ｐ値＜０．０００１）を示した。よって、５−ＡＬＡはエビ目の生物において、Vibrio parahaemolyticusを原因菌とする、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤに対して有効な予防・治療薬であることが明らかとなった。なお、実際のエビ養殖場でＥＭＳ／ＡＨＰＮＤが発生すると、ほぼ１００％のエビが死亡するので、実施例２の実験条件は実際のエビ養殖場でのＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ発生をシミュレートするものであると考えられる。よって、５−ＡＬＡは実際のエビ養殖場でのＥＭＳ／ＡＨＰＮＤの予防・治療に有効であると推察される。
【００３１】
実施例３：以下の試験で使用されたバナメイエビの飼育条件
平均体重０．８４±０．３３グラムのバナメイエビ４００匹を、１００匹ずつ以下の４群に分け、各群ごとに別の水槽で飼育した。飼育開始時、飼育開始から２週目および３ヶ月目に、以下に示される様々な項目を測定した。
（ａ）１５ｐｐｍの５−ＡＬＡを含む飼料を投与した、１５ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群。
（ｂ）３０ｐｐｍの５−ＡＬＡを含む飼料を投与した、３０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群。
（ｃ）６０ｐｐｍの５−ＡＬＡを含む飼料を投与した、６０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群。
（ｄ）５−ＡＬＡを含まない飼料を投与した対照群。
バナメイエビへの一日あたりの給餌量はバナメイエビの平均体重の５％とした。一日あたりの給餌量を４回（８：００、１３：００、１８：００および２３：００）に分けて、バナメイエビに飼料が与えられた。一週間ごとに、各群のバナメイエビ全体の重量を測定することにより、バナメイエビの体重をモニターし、測定した体重に基づいて一日当たりの給餌量を調節した。食べ残した飼料および排泄物は一日一回取り除かれた。飼育中は水質パラメータもモニターされた。
【００３２】
１５ｐｐｍの５−ＡＬＡを含む飼料は以下のように作成された。１５０ｍｇの１％５−ＡＬＡ粉体（５−ＡＬＡリン酸塩（Ｃ５Ｈ９ＮＯ３・Ｈ３ＰＯ４）含有）を１００ｍｌの水に溶解し、得られた溶液が１００グラムのエビ用粉末飼料（タイ国でバナメイエビの養殖のために使用されている一般的な市販餌を粉末化して使用した）と良く混合され、飼料混合物を得た。次いで、マッシャーを用いて、飼料混合物がペレットにされた。このペレットをインキュベータ内で６０〜６５℃で２〜３時間程度乾燥させて、１５ｐｐｍの５−ＡＬＡを含む飼料を得た。この飼料は使用まで冷蔵庫内で４℃で保管した。３０ｐｐｍの５−ＡＬＡを含む飼料および６０ｐｐｍの５−ＡＬＡを含む飼料は、添加された１％５−ＡＬＡ粉体の量がそれぞれ３００ｍｇおよび６００ｍｇであったこと以外は、１５ｐｐｍの５−ＡＬＡを含む飼料の製造方法と同じ方法で製造された。対照群に使用された５−ＡＬＡを含まない飼料は、１％５−ＡＬＡ粉体が添加されなかったこと以外は、１５ｐｐｍの５−ＡＬＡを含む飼料の製造方法と同じ方法で製造された。
【００３３】
実施例４：バナメイエビの成長に対する５−ＡＬＡの影響
実施例３に記載された条件下でのバナメイエビの飼育において、３ヶ月の飼育期間での体重増加を測定することにより、５−ＡＬＡによるバナメイエビの成長に及ぼす影響を検討した。飼育開始時および飼育開始から３ヶ月目に、各群のバナメイエビの個々の体重が測定された。結果が以下の表１に示される。表中、当初体重は飼育開始時（０日目）の体重であり、最終体重は３ヶ月目の体重であり、体重増加は最終体重−当初体重であり、ＳＧＲは瞬間成長率（Specific Growth Rate）（％）であって、ＳＧＲ＝［（ｌｎ最終重量−ｌｎ当初重量）／給餌日数］×１００の式から算出したものであり、ＦＣＲは飼料要求率（Feed Conversion Rate）であって、ＦＣＲ＝飼料消費／体重増加である。表中の当初体重、最終体重、体重増加、およびＳＧＲの数値は平均±標準偏差（ｍｅａｎ±ＳＤ）である。表中の１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍの記載は、それぞれ、１５ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群、３０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群、および６０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群を表す。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
表１に示されるように、１５ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群および３０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群においては、対照群と比較して体重増加および瞬間成長率（ＳＧＲ）が大きかった。このことから、バナメイエビへの１５ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与および３０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与はバナメイエビの成長を促進させることが明らかとなった。また、１５ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群および３０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群においては、対照群と比較して飼料要求率（ＦＣＲ）が若干低下していた。このことから、理論に拘束されるものではないが、１５ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群および３０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群における５−ＡＬＡによるバナメイエビの成長促進の原因の１つが、バナメイエビ生体内での５−ＡＬＡによる飼料からのエネルギー取り出し効率の向上である可能性が推察される。
【００３６】
また、３ヶ月間の飼育期間中のバナメイエビの脱皮の頻度が測定され、その脱皮の累積的頻度が図２に示される。図２中の１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍの記載は、それぞれ、１５ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群、３０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群、および６０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群を表す。図２においては、脱皮の累積的頻度が最も高かった３０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群の１２週目における脱皮の累積的頻度を１００％として各群の脱皮の累積的頻度を表している。図２に示されるように、脱皮の累積的頻度は３０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群において最も高く、次いで１５ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群であり、脱皮の頻度が最も低かったのは対照群であった。エビは成長に伴って脱皮するので、３０ｐｐｍおよび１５ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与による脱皮の累積的頻度の向上も、５−ＡＬＡ投与によるバナメイエビの成長促進を示していると推察される。
【００３７】
実施例５：肝膵臓のＡＴＰレベルに対する５−ＡＬＡの影響
飼育開始から２週間目に、バナメイエビの肝膵臓におけるＡＴＰレベルを測定した。このＡＴＰレベルの測定は、一群あたり３匹のバナメイエビについて行われた。ＡＴＰ濃度測定用サンプルは以下のように調製された。それぞれのバナメイエビから約１０ｍｇの肝膵臓が採取された。採取した肝膵臓がリン酸緩衝生理食塩水（１×ＰＢＳ）で洗浄された。洗浄された肝膵臓は氷冷した２Ｎの過塩素酸（ＰＣＡ）１００μｌ中でホモジナイズされ、ホモジネートが氷上に３０分間保持され、次いで１３０００×ｇ、４℃で、２分間遠心分離されて、上清を得た。この上清がＡＴＰアッセイバッファーで５００μｌに希釈された。次いで、希釈された上清に５０〜１００μｌの氷冷ＫＯＨ（２Ｍ）が添加されて、過剰なＰＣＡを沈殿させた。必要に応じて、この上清に０．１ＭのＫＯＨまたはＰＣＡが添加されて、ｐＨが調整された。得られたサンプルは、次いで、１３０００×ｇで１５分間遠心分離され、上清が回収され、ＡＴＰ濃度測定用サンプルとして使用された。ＡＴＰ濃度測定には、ＡＴＰ比色分析キット（カタログ番号：ａｂ８３３５５：アブカム（Abcam）（登録商標）、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国）が使用された。ＡＴＰ濃度の測定は、当該キットの製造者の指示に従って行われた。結果が図３に示される。図３中の１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍの記載は、それぞれ、１５ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群、３０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群、および６０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群を表す。
【００３８】
図３に示されるように、バナメイエビの肝膵臓におけるＡＴＰレベルは対照群と比べて、全ての５−ＡＬＡ投与群において高かった。バナメイエビの肝膵臓におけるＡＴＰレベルは５−ＡＬＡの用量依存的に増大していた。３０ｐｐｍおよび６０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群においては、対照群に対するＡＴＰレベルの上昇について統計的に有意差が認められた。有意差検定はｔ検定法を用い、図３におけるアスタリスクはｐ＜０．０５を表す。６０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群においては、ＡＴＰレベルの上昇と体重増加は相関していなかった。理論に拘束されるものではないが、これは過剰な５−ＡＬＡにより電子伝達系が過剰に活性化され、電子伝達系へ還元力を供給するＴＣＡ回路により多量の脂質や炭水化物が消費された為と考えられる。しかし、１５ｐｐｍおよび３０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群におけるＡＴＰレベルの上昇は、５−ＡＬＡによるバナメイエビの成長促進の原因の１つと推察されるバナメイエビ生体内での５−ＡＬＡによる飼料からのエネルギー取り出し効率の向上を支持するものである。
【００３９】
実施例６：Vibrio parahaemolyticusによるＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ感染試験
Vibrio parahaemolyticusによる攻撃を受けたバナメイエビの生存率に対して５−ＡＬＡが及ぼす影響について検討した。
Vibrio parahaemolyticusを３×１０６ｃｆｕ／ｍｌの量（高用量）で含む海水を入れた１０Ｌ水槽、およびVibrio parahaemolyticusを３×１０５ｃｆｕ／ｍｌの量（低用量）で含む海水を入れた１０Ｌ水槽をそれぞれの群に対して準備した。飼育開始から３ヶ月目のバナメイエビを各群１０匹ずつ、これら水槽に移し、バナメイエビに対するVibrio parahaemolyticusの感染処理を行った。感染処理から２週間にわたって、感染処理前に投与されていたのと同じ飼料（１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍもしくは６０ｐｐｍの５−ＡＬＡを含む飼料、または５−ＡＬＡを含まない飼料）が各群のバナメイエビに給餌された。感染処理から２週間にわたって１日ごとに、各群および各Vibrio parahaemolyticus用量におけるバナメイエビの生存率を確認した。Vibrio parahaemolyticusを３×１０６ｃｆｕ／ｍｌの量（高用量）で含む海水でバナメイエビを処理した結果を図４に示し、Vibrio parahaemolyticusを３×１０５ｃｆｕ／ｍｌの量（低用量）で含む海水でバナメイエビを処理した結果を図５に示す。図４および図５中の１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍの記載は、それぞれ、１５ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群、３０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群、および６０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群を表す。
【００４０】
図４に示されるように、Vibrio parahaemolyticusを３×１０６ｃｆｕ／ｍｌの量（高用量）で含む海水でバナメイエビを処理した場合には、６０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群は対照群と比べてかなり高い生存率を示した。１５ｐｐｍおよび３０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群は、６０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群と比べて生存率は低かったが、対照群と比べて高い生存率を示した。Vibrio parahaemolyticusを３×１０５ｃｆｕ／ｍｌの量（低用量）で含む海水でバナメイエビを処理した場合には、図５に示されるように、１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍおよび６０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群は、いずれも、対照群と比べてかなり高い生存率を示した。よって、５−ＡＬＡはエビ目の生物において、Vibrio parahaemolyticusを原因菌とする、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤに対して有効な予防・治療薬であることが明らかとなった。
【００４１】
実施例７：Vibrio parahaemolyticusによる感染処理での、全血球数に対する５−ＡＬＡの影響
飼育開始から３ヶ月目のバナメイエビを実施例６におけるのと同じ方法でVibrio parahaemolyticus（高用量）によって感染処理した。感染処理前（０時間）、感染処理から６時間後、および感染処理から１２時間後に各群３匹ずつバナメイエビの腹部静脈洞（ventral sinus）から２００μｌの血リンパ（hemolymph）が採取され、８００μｌの抗凝固液で希釈された。Ｃ−チップ（C-chip）血球計（ナノエンテック（NanoEntek）、ドイツ国）を用いて、血リンパ中の全血球数を測定した。図６中の１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍの記載は、それぞれ、１５ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群、３０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群、および６０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群を表す。図６に示されるように、感染処理前および感染処理後の全ての時点で、５−ＡＬＡ投与群においては、対照群と比較して全血球数が増大していた。感染処理から６時間後での６０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群においては、他の群と比較して統計的に優位に高い全血球数を示した。有意差検定はｔ検定法を用いた。理論に拘束されるものではないが、エビにおいては顆粒球などの血球は免疫担当細胞として重要な役割を担っているので、５−ＡＬＡ投与によるＥＭＳ／ＡＨＰＮＤに対する予防・治療効果の原因の１つが５−ＡＬＡによる全血球数の増大による自然免疫系の活性化であるという可能性が考えられる。
【００４２】
実施例８：Vibrio parahaemolyticusによる感染処理での、ヘムオキシゲナーゼ−１およびフェノール酸化酵素前駆体の遺伝子発現に対する５−ＡＬＡの影響
飼育開始から３ヶ月目のバナメイエビを実施例６におけるのと同じ方法でVibrio parahaemolyticus（高用量）によって感染処理した。感染処理前（０時間）、感染処理から６時間後、および感染処理から１２時間後に各群５匹ずつバナメイエビから肝膵臓を採取し、RNAiso Plus試薬（タカラバイオ、日本国）を用いて、当該試薬の製造者の指示に従って、それぞれのバナメイエビの肝膵臓から全ＲＮＡが抽出された。ハイキャパシティー逆転写キット（High-Capacity Reverse Transcription kit）（アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）、米国）を用いて、当該キットの製造者の指示に従って、１μｇの全ＲＮＡ抽出物からｃＤＮＡが合成された。合成されたｃＤＮＡが５倍に希釈され、ｑＰＣＲのためのテンプレートとして使用された。このｃＤＮＡをＳＹＢＲグリーン蛍光色素を使用するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にかけることによって、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）およびフェノール酸化酵素前駆体（ｐｒｏＰＯ）の遺伝子発現を測定した。この測定は、Thunderbird（登録商標）SYBR qPCR Mix（東洋紡、日本）を使用して行われた。増幅反応はMicroAmp Optical 96−ウェル反応プレート（アプライドバイオシステムズ、米国）を使用して行われた。各ウェルは１０μｌのｑＰＣＲ  Ｍｉｘ、０．６μｌの各プライマー、０．４μｌのＲＯＸ参照色素、および２μｌのｃＤＮＡテンプレートを収容していた。サイクル条件は以下の通りであった。９５℃で１分、次いで、９０℃で１５秒および６０℃で６０秒を４０サイクル。各ｑＰＣＲ反応の終わりに、解離分析が行われて、１種類だけの生成物の検出であることを確認した。２−ΔΔＣｔ法（LivakおよびSchmittgen、２００１）を用いて、ｑＰＣＲによる遺伝子発現データの相対的な変化が決定された。Ｃｔ値（サイクル閾値：Threshold Cycle）の計算のために、内部標準としてＥＦ１αの遺伝子発現を測定した。対照群の相対的発現を用いて正規化された比率が計算された。データは分析の前に対数（底＝２）変換された。ヘムオキシゲナーゼ−１の発現を測定するために、配列１（５’−ＣＴＧＡＧＧＡＧＣＴＣＧＡＴＧＡＧＧＡＧ−３’）を有するフォワードプライマーおよび配列２（５’−ＣＡＴＧＧＣＣＡＣＡＡＣＡＣＴＡＣＣＡＧ−３’）を有するリバースプライマーが使用された。フェノール酸化酵素前駆体の発現を測定するために、配列３（５’−ＧＧＡＡＴＴＧＴＴＴＴＡＣＴＡＣＡＴＧＣＡＴＣＡＧＣ−３’）を有するフォワードプライマーおよび配列４（５’−ＧＧＡＡＣＡＡＧＴＣＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＴＴ−３’）を有するリバースプライマーが使用された。ＥＦ１αの発現を測定するために、配列５（５’−ＡＴＴＧＣＣＡＣＡＣＣＧＣＴＣＡＣＡ−３’）を有するフォワードプライマーおよび配列６（５’−ＴＣＧＡＴＣＴＴＧＧＴＣＡＧＣＡＧＴＴＣＡ−３’）を有するリバースプライマーが使用された。結果は図７〜８に表される。各時点での対照群の遺伝子発現の平均値が０とされ、各群の遺伝子発現はこの平均値に対する相対的な値である。図７〜８におけるエラーバーは標準偏差である。図７〜８中の１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍの記載は、それぞれ、１５ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群、３０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群、および６０��ｐｍの５−ＡＬＡ投与群を表す。
【００４３】
図７に示されるように、感染処理から６時間後に、５−ＡＬＡ投与群においては、対照群と比較してヘムオキシゲナーゼ−１の遺伝子発現が用量依存的に増大していた。図８に示されるように、感染処理から６時間後に、５−ＡＬＡ投与群においては、対照群と比較してフェノール酸化酵素前駆体の遺伝子発現が増大していた。ヘム蛋白質の１種であるヘムオキシゲナーゼ−１はヘム代謝にかかわる酵素であると共に、細胞を酸化ストレスによる傷害から守る細胞保護タンパク質であることが知られている。フェノール酸化酵素前駆体は真菌や細菌の細胞壁成分を認識し、その認識結果をｔｏｌｌ受容体のリガンド生成につなげる仕組みに関与している可能性が示唆されている。よって、理論に拘束されるものではないが、５−ＡＬＡ投与によるＥＭＳ／ＡＨＰＮＤに対する予防・治療効果の原因の１つが５−ＡＬＡによるヘムオキシゲナーゼ−１およびフェノール酸化酵素前駆体の遺伝子発現の増大であるという可能性が考えられる。
【００４４】
実施例９：核内受容体Ｅ７５および一酸化窒素合成酵素の遺伝子発現に対する５−ＡＬＡの影響
飼育開始から３ヶ月目に、各群３〜４匹のバナメイエビから肝膵臓を採取し、それぞれのバナメイエビの肝膵臓から全ＲＮＡを抽出し、全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡをＳＹＢＲグリーン蛍光色素を使用するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にかけることによって、核内受容体遺伝子Ｅ７５および一酸化窒素合成酵素の遺伝子発現を測定した。Ｃｔ値の計算のために、内部標準としてＥＦ１αの遺伝子発現を測定した。核内受容体遺伝子Ｅ７５の発現を測定するために、配列７（５’−ＧＣＣＴＡＣＡＡＣＡＡＧＣＣＣＣＡＴＡＡ−３’）を有するフォワードプライマーおよび配列８（５’−ＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＡＧＴＣＴＧＧＴＧ−３’）を有するリバースプライマーが使用された。一酸化窒素合成酵素の発現を測定するために、配列９（５’−ＧＧＡＡＧＡＣＣＣＡＣＧＴＣＴＧＧＡＡＧ−３’）を有するフォワードプライマーおよび配列１０（５’−ＴＣＧＡＧＣＧＡＴＣＴＣＣＴＴＧＡＡＧＣ−３’）を有するリバースプライマーが使用された。測定に使用された装置、条件などは実施例８におけるのと同じであった。結果は図９〜１０に表される。対照群の遺伝子発現の平均値が０とされ、各群の遺伝子発現はこの平均値に対する相対的な値である。図９〜１０におけるエラーバーは標準偏差である。図９および１０中の１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍの記載は、それぞれ、１５ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群、３０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群、および６０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群を表す。
【００４５】
図９に示されるように、全ての５−ＡＬＡ投与群においては、対照群と比較して核内受容体Ｅ７５の遺伝子発現が統計的に有意に増大していた。有意差検定はｔ検定法を用いた。図１０に示されるように、５−ＡＬＡ投与群においては、対照群と比較して一酸化窒素合成酵素の遺伝子発現が増大していた。核内受容体Ｅ７５はエクダイソン合成に必要とされるタンパク質であって、ヘムを補欠分子族として含み、細胞内のヘム濃度のセンサーとして機能する他、一酸化窒素を細胞内シグナル伝達分子として感知する可能性があることが知られている。一酸化窒素合成酵素は細菌感染などにおいて強力な抗菌活性を有するパーオキシナイトライトの発生に必要となる一酸化窒素の合成に関与する酵素であって、ヘムタンパク質であることが知られている。Ｅ７５はその構造を安定させる為にヘムを必要とし更にヘム濃度のセンサーとなり、一酸化窒素合成酵素はそれ自体がヘム蛋白質であることからこれらの発現を調べることにより５−ＡＬＡの投与がエビの体内におけるヘム合成に関連していることを確認するための指標となる可能性がある。
【００４６】
実施例１０：一酸化窒素合成酵素およびＣ型レクチンの遺伝子発現に対する５−ＡＬＡの影響
飼育開始から２週間目に、各群３〜４匹のバナメイエビから肝膵臓を採取し、それぞれのバナメイエビの肝膵臓から全ＲＮＡを抽出し、全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡをＳＹＢＲグリーン蛍光色素を使用するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にかけることによって、核内受容体遺伝子Ｅ７５および一酸化窒素合成酵素の遺伝子発現を測定した。Ｃｔ値の計算のために、内部標準としてＥＦ１αの遺伝子発現を測定した。一酸化窒素合成酵素の発現を測定するために、配列９（５’−ＧＧＡＡＧＡＣＣＣＡＣＧＴＣＴＧＧＡＡＧ−３’）を有するフォワードプライマーおよび配列１０（５’−ＴＣＧＡＧＣＧＡＴＣＴＣＣＴＴＧＡＡＧＣ−３’）を有するリバースプライマーが使用された。Ｃ型レクチンの発現を測定するために、配列１１（５’−ＣＡＡＧＡＴＧＧＣＴＣＣＣＡＣＣＡＡＣＡ−３’）を有するフォワードプライマーおよび配列１２（５’−ＧＴＣＧＡＡＣＴＣＧＧＣＧＴＴＡＴＣＧＧ−３’）を有するリバースプライマーが使用された。測定に使用された装置、条件などは実施例８におけるのと同じであった。結果は図１１〜１２に表される。対照群の遺伝子発現の平均値が０とされ、各群の遺伝子発現はこの平均値に対する相対的な値である。図１１〜１２におけるエラーバーは標準偏差である。図１１〜１２中の１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍの記載は、それぞれ、１５ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群、３０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群、および６０ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群を表す。
【００４７】
図１１に示されるように、５−ＡＬＡ投与群においては、対照群と比較して一酸化窒素合成酵素の遺伝子発現が用量依存的に増大していた。図１２に示されるように、１５ｐｐｍの５−ＡＬＡ投与群においては、対照群と比較してＣ型レクチンの遺伝子発現が増大していた。Ｃ型レクチンは初期の免疫応答に最も重要なノジュール反応を誘起する可能性が示唆されている。理論に拘束されるものではないが、Ｃ型レクチンは顆粒細胞が細菌を取り込み、更に細菌の拡散を阻止する反応であるノジュール形成反応において重要な役割を担うことからＥＭＳへの有効性の一因が５−ＡＬＡ投与によるＣ型レクチンの発現増加によるノジュール反応促進作用である可能性を示唆していると考えられる。一酸化窒素合成酵素は一酸化窒素の合成に関与する酵素であって、ヘムタンパク質であり、５−ＡＬＡの投与によりその合成が促進される。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本願発明の５−ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を含むエビ目用経口投与組成物は、エビ目の生物の飼育、養殖に使用されることが可能であり、Vibrio parahaemolyticusを原因菌とする、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤを有効に予防および治療することが可能である。また、本願発明の５−ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を含むエビ目用経口投与組成物は、所定の投与量でエビ目の生物の成長を促進させることが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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