(57)【要約】  本発明は、疎水性ブロックのヒドロキシル基末端基がトコフェロール基又はコレステロール基に置換された疎水性ブロックと親水性ブロックとからなる両親性ブロック共重合体、及び末端に少なくとも一つのカルボキシル基を有するポリ乳酸誘導体を含む高分子組成物で製造される高分子薬物担体を使用して、生物活性剤を細胞内に伝達する方法に関するものである。前記ポリ乳酸誘導体のカルボキシル基は、前記高分子組成物に２価金属又は３価金属を添加することによって得られる２価又は３価金属に固定されている。
2007536219.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子薬物担体及び前記薬物担体内の水溶液に捕集された生物活性剤を含み、
前記高分子薬物担体は、（ａ）疎水性ブロックの末端ヒドロキシル基がトコフェロール基又はコレステロール基に置換された疎水性ブロックと親水性ブロックとからなる両親性ブロック共重合体、及び（ｂ）末端に少なくとも一つのカルボキシル基を有するポリ乳酸誘導体を含む高分子組成物で製造され；
前記薬物担体が細胞と接触する時、前記高分子薬物担体に捕集された生物活性剤がより多くの量で細胞内に伝達されるようにする、生物活性剤の細胞内伝達システム。
【請求項２】
ａ）少なくとも１種の生物活性剤を選択し；
ｂ）疎水性ブロックの末端ヒドロキシル基がトコフェロール基又はコレステロールに置換された疎水性ブロックと親水性ブロックとからなる両親性ブロック共重合体、及び末端に少なくとも一つのカルボキシル基を有するポリ乳酸誘導体を含む高分子組成物を製造し；
ｃ）溶媒中に前記高分子組成物と生物活性剤を混合及び溶解した後、溶媒を蒸発させ；
ｄ）水溶液を添加して、薬物担体内の水溶液に生物活性剤が捕集された高分子薬物担体を製造し；並びに
ｅ）前記薬物担体を細胞と接触させて、前記生物活性剤を細胞内に容易に伝達する段階を含む、生物活性剤の細胞内伝達方法。
【請求項３】
前記ポリ乳酸誘導体は下記の化学式を有する化合物である、請求項２に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法：
ＲＯ-ＣＨＺ-［Ａ］ｎ-［Ｂ］ｍ-ＣＯＯＭ  （Ｉ）
上記の式で、Ａは、―ＣＯＯ-ＣＨＺ-であり；
Ｂは、―ＣＯＯ-ＣＨＹ-、-ＣＯＯ-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２-又は―ＣＯＯ-ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２であり；
Ｒは、水素、アセチル、ベンゾイル、デカノイル、パルミトイル、メチル又はエチル基であり；
Ｚ及びＹは、各々、水素、メチル又はフェニル基であり；
Ｍは、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、又はＬｉであり；
ｎは１乃至３０の整数であり、ｍは０乃至２０の整数である。
【請求項４】
前記ポリ乳酸誘導体は下記の化学式を有する化合物である、請求項２に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法：
ＲＯ-ＣＨＺ-［ＣＯＯ-ＣＨＸ］ｐ-［ＣＯＯ-ＣＨＹ´］ｑ-ＣＯＯ-ＣＨＺ-ＣＯＯＭ  （ＩＩ）
上記の式で、
Ｘはメチル基であり；
Ｙ´は、水素原子又はフェニル基であり；
ｐは０乃至２５の整数であり；
ｑは、ｐとｑの合計が５乃至２５の整数であるならば０乃至２５の整数であり；
Ｒは、水素、アセチル、ベンゾイル、デカノイル、パルミトイル、メチル又はエチル基であり；
Ｚは、水素、メチル又はフェニル基であり；
Ｍは、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、又はＬｉである。
【請求項５】
前記ポリ乳酸誘導体は下記の化学式を有する化合物である、請求項２に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法：
ＲＯ-ＰＡＤ-ＣＯＯ-Ｗ-Ｍ´  （ＩＩＩ）
ここで、
Ｗ-Ｍ´は、
【化１】
2007536219.tif 000013
又は
【化２】
2007536219.tif 000014
であり；
ＰＡＤは、Ｄ,Ｌ-ポリ乳酸、Ｄ-ポリ乳酸、ポリマンデル酸、Ｄ,Ｌ-乳酸及びグリコール酸の共重合体、Ｄ,Ｌ-乳酸及びマンデル酸の共重合体、Ｄ,Ｌ-乳酸及びカプロラクトンの共重合体、並びにＤ,Ｌ-乳酸及び１,４-ジオキサン-２-オンの共重合体からなる群より選択されるものであり；
Ｒは、水素原子、アセチル、ベンゾイル、デカノイル、パルミトイル、メチル又はエチル基であり；
Ｍは、水素Ｎａ、Ｋ、又はＬｉである。
【請求項６】
前記ポリ乳酸誘導体は下記の化学式を有する化合物である、請求項２に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法：
Ｓ-Ｏ-ＰＡＤ-ＣＯＯ-Ｑ  （ＩＶ）
上記の式で、
Ｓは
【化３】
2007536219.tif 000015
であり；
Ｌは、―ＮＲ１-又は―Ｏ-であり；
Ｒ１は、水素原子又はＣ１-１０アルキル基であり；
Ｑは、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、又はＣＨ２Ｃ６Ｈ５であり；
ａは０乃至４の整数であり；
ｂは１乃至１０の整数であり；
Ｒは、水素、アセチル、ベンゾイル、デカノイル、パルミトイル、メチル又はエチル基であり；
Ｍは、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、又はＬｉであり；
ＰＡＤは、Ｄ,Ｌ-ポリ乳酸、Ｄ-ポリ乳酸、ポリマンデル酸、Ｄ,Ｌ-乳酸及びグリコール酸の共重合体、Ｄ,Ｌ-乳酸及びマンデル酸の共重合体、Ｄ,Ｌ-乳酸及びカプロラクトンの共重合体、並びにＤ,Ｌ-乳酸及び１,４-ジオキサン-２-オンの共重合体からなる群より選択されるものである。
【請求項７】
前記ポリ乳酸誘導体は下記の化学式を有する化合物である、請求項２に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法：
【化４】
2007536219.tif 000016
上記の式で、
Ｒ´は、―ＰＡＤ-Ｏ-Ｃ（Ｏ）-ＣＨ２ＣＨ２-Ｃ（Ｏ）-ＯＭであり；
ＰＡＤは、Ｄ,Ｌ-ポリ乳酸、Ｄ-ポリ乳酸、ポリマンデル酸、Ｄ,Ｌ-乳酸及びグリコール酸の共重合体、Ｄ,Ｌ-乳酸及びマンデル酸の共重合体、Ｄ,Ｌ-乳酸及びカプロラクトンの共重合体、並びにＤ,Ｌ-乳酸及び１,４-ジオキサン-２-オンの共重合体からなる群より選択され；
Ｍは、前記化学式１で定義したものと同一であり；及び
ａは１乃至４の整数である。
【請求項８】
前記親水性ブロックは、ポリアルキレングリコール類、ポリビニレンピロリドン類、ポリビニルアルコール類、及びポリアクリールアミド類からなる群より選択され、前記疎水性ブロックは、ポリラクチド類、ポリグリコリド類、ポリジオキサン-２-オン、ポリカプロラクトン、ポリラクチック-コ-グリコリド、ポリラクチック-コ-カプロラクトン、ポリラクチック-コ-ジオキサン-２-オン、及びこれらの誘導体からなる群より選択され、前記カルボキシル末端がコハク酸トコフェロール又はコハク酸コレステロール基に置換されたものである、請求項２に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法。
【請求項９】
前記親水性ブロック及び疎水性ブロックは、各々、数平均分子量が５００乃至５０,０００ダルトンである、請求項２に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法。
【請求項１０】
前記両親性ブロック共重合体中の疎水性ブロックに対する親水性ブロックの混合比が３：７乃至８：２である、請求項２に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法。
【請求項１１】
前記ポリ乳酸誘導体は、数平均分子量が５００乃至２,５００ダルトンである、請求項２に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法。
【請求項１２】
前記ポリ乳酸誘導体は、触媒を使用しない縮合反応に次いで、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、又は炭酸カリウムを利用した中和反応で得られたナトリウム又はカリウム塩形態である、請求項２に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法。
【請求項１３】
前記高分子組成物は、前記両親性ブロック共重合体とポリ乳酸誘導体の全体において、０.１乃至９９.９ｗｔ％の両親性ブロック共重合体、及び０.１乃至９９.９ｗ％のポリ乳酸誘導体を含む、請求項２に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法。
【請求項１４】
前記高分子組成物に対する生物活性剤の混合重量比は０.１乃至２０.０：８０.０乃至９９.９である、請求項２に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法。
【請求項１５】
前記薬物担体の粒子の大きさは１乃至４００ｎｍ範囲内である、請求項２に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法。
【請求項１６】
前記生物活性剤は、蛋白質及びポリペプチド薬物からなる群より選択されたものである、請求項２に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法。
【請求項１７】
前記生物活性剤は、抗癌剤、抗炎剤、抗菌剤、抗高血圧剤、制吐剤、及び抗生物質からなる群より選択されるものである、請求項２に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法。
【請求項１８】
前記生物活性剤は核酸である、請求項２に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法。
【請求項１９】
前記薬物担体は高分子ミセルである、請求項２に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法。
【請求項２０】
ａ）少なくとも１種の生物活性剤を選択し；
ｂ）疎水性ブロックの末端カルボキシル基がコハク酸トコフェロール基又はコハク酸コレステロール基に置換された疎水性ブロックと親水性ブロックとからなる両親性ブロック共重合体、末端に少なくとも一つのカルボキシル基を有するポリ乳酸誘導体、及び前記ポリ乳酸誘導体のカルボキシル末端基１当量に対して０.０１乃至１０当量の２価金属又は３価金属を含む高分子組成物を製造し；
ｃ）溶媒中に前記高分子組成物と生物活性剤を混合及び溶解した後、溶媒を蒸発させ；
ｄ）水溶液を添加して、薬物担体内の水溶液に生物活性剤が捕集された高分子薬物担体を製造し；並びに
ｅ）前記薬物担体を細胞と接触させて、前記生物活性剤を細胞内に容易に伝達する段階を含む、生物活性剤の細胞内伝達方法。
【請求項２１】
前記２価金属又は３価金属は、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｂａ２＋、Ｃｒ３＋、Ｆｅ３＋、Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、及びＡｌ３＋からなる群より選択されるものである、請求項２０に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法。
【請求項２２】
前記ポリ乳酸誘導体は下記の化学式を有する化合物である、請求項２０に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法：
ＲＯ-ＣＨＺ-［Ａ］ｎ-［Ｂ］ｍ-ＣＯＯＭ  （Ｉ）
上記の式で、Ａは、―ＣＯＯ-ＣＨＺ-であり；
Ｂは、―ＣＯＯ-ＣＨＹ-、-ＣＯＯ-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２-又は―ＣＯＯ-ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２であり；
Ｒは、水素、アセチル、ベンゾイル、デカノイル、パルミトイル、メチル又はエチル基であり；
Ｚ及びＹは、各々、水素、メチル又はフェニル基であり；
Ｍは、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、又はＬｉであり；
ｎは１乃至３０の整数であり、ｍは０乃至２０の整数である。
【請求項２３】
前記ポリ乳酸誘導体は下記の化学式を有する化合物である、請求項２０に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法：
ＲＯ-ＣＨＺ-［ＣＯＯ-ＣＨＸ］ｐ-［ＣＯＯ-ＣＨＹ´］ｑ-ＣＯＯ-ＣＨＺ-ＣＯＯＭ  （ＩＩ）
上記の式で、
Ｘはメチル基であり；
Ｙ´は、水素原子又はフェニル基であり；
Ｐは０乃至２５の整数であり；
ｑは、ｐとｑの合計が５乃至２５の整数を満足する条件下で、０乃至２５の整数であり；
Ｒは、水素、アセチル、ベンゾイル、デカノイル、パルミトイル、メチル又はエチル基であり；
Ｚは、水素、メチル又はフェニル基であり；
Ｍは、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、又はＬｉである。
【請求項２４】
前記ポリ乳酸誘導体は下記の化学式を有する化合物である、請求項２０に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法：
ＲＯ-ＰＡＤ-ＣＯＯ-Ｗ-Ｍ´  （ＩＩＩ）
上記の式で、
Ｗ-Ｍ´は
【化５】
2007536219.tif 000017
又は
【化６】
2007536219.tif 000018
であり；
ＰＡＤは、Ｄ,Ｌ-ポリ乳酸、Ｄ-ポリ乳酸、ポリマンデル酸、Ｄ,Ｌ-乳酸及びグリコール酸の共重合体、Ｄ,Ｌ-乳酸及びマンデル酸の共重合体、Ｄ,Ｌ-乳酸及びカプロラクトンの共重合体、並びにＤ,Ｌ-乳酸及び１,４-ジオキサン-２-オンの共重合体からなる群より選択されるものであり；
Ｒは、水素原子、アセチル、ベンゾイル、デカノイル、パルミトイル、メチル又はエチル基であり；
Ｍは、水素、Ｎａ、Ｋ、又はＬｉである。
【請求項２５】
前記ポリ乳酸誘導体は下記の化学式を有する化合物である、請求項２０に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法：
Ｓ-Ｏ-ＰＡＤ-ＣＯＯ-Ｑ  （ＩＶ）
上記の式で、
Ｓは
【化７】
2007536219.tif 000019
であり；
Ｌは、―ＮＲ１-又は―Ｏ-であり；
Ｒ１は、水素原子又はＣ１-１０アルキル基であり；
Ｑは、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、又はＣＨ２Ｃ６Ｈ５であり；
ａは０乃至４の整数であり；
ｂは１乃至１０の整数であり；
Ｒは、水素、アセチル、ベンゾイル、デカノイル、パルミトイル、メチル又はエチル基であり；
Ｍは、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、又はＬｉであり；
ＰＡＤは、Ｄ,Ｌ-ポリ乳酸、Ｄ-ポリ乳酸、ポリマンデル酸、Ｄ,Ｌ-乳酸及びグリコール酸の共重合体、Ｄ,Ｌ-乳酸及びマンデル酸の共重合体、Ｄ,Ｌ-乳酸及びカプロラクトンの共重合体、並びにＤ,Ｌ-乳酸及び１,４-ジオキサン-２-オンの共重合体からなる群より選択されるものである。
【請求項２６】
前記ポリ乳酸誘導体は下記の化学式を有する化合物である、請求項２０に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法：
【化８】
2007536219.tif 000020
上記の式で、
Ｒ´は、―ＰＡＤ-Ｏ-Ｃ（Ｏ）-ＣＨ２ＣＨ２-Ｃ（Ｏ）-ＯＭであり；
ＰＡＤは、Ｄ,Ｌ-ポリ乳酸、Ｄ-ポリ乳酸、ポリマンデル酸、Ｄ,Ｌ-乳酸及びグリコール酸の共重合体、Ｄ,Ｌ-乳酸及びマンデル酸の共重合体、Ｄ,Ｌ-乳酸及びカプロラクトンの共重合体、並びにＤ,Ｌ-乳酸及び１,４-ジオキサン-２-オンの共重合体からなる群より選択され；
Ｍは、前記［化学式１］で定義したものと同一であり；並びに
Ａは１乃至４の整数である。
【請求項２７】
前記親水性ブロックは、ポリアルキレングリコール類、ポリビニレンピロリドン類、ポリビニルアルコール類、及びポリアクリールアミド類からなる群より選択され、前記疎水性ブロックは、ポリラクチド類、ポリグリコリド類、ポリジオキサン-２-オン、ポリカプロラクトン、ポリラクチック-コ-グリコリド、ポリラクチック-コ-カプロラクトン、ポリラクチック-コ-ジオキサン-２-オン、及びこれらの誘導体からなる群より選択され、前記カルボキシル末端がコハク酸トコフェロール又はコハク酸コレステロール基に置換される、請求項２０に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法。
【請求項２８】
前記親水性ブロック及び疎水性ブロックは、各々、数平均分子量が５００乃至５０,０００ダルトンである、請求項２０に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法。
【請求項２９】
前記両親性ブロック共重合体中の疎水性ブロックに対する親水性ブロックの混合比が３：７乃至８：２である、請求項２０に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法。
【請求項３０】
前記ポリ乳酸誘導体は、数平均分子量５００乃至２,５００ダルトンである、請求項２０に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法。
【請求項３１】
前記ポリ乳酸誘導体は、触媒を使用しない縮合反応の次で、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、又は炭酸カリウムを利用した中和反応で得られたナトリウム又はカリウム塩形態である、請求項２０に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法。
【請求項３２】
前記高分子組成物は、前記両親性ブロック共重合体とポリ乳酸誘導体の全体において、０.１乃至９９.９ｗｔ％の両親性ブロック共重合体、及び０.１乃至９９.９ｗ％ｏｆポリ乳酸誘導体を含む、請求項２０に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法。
【請求項３３】
前記高分子組成物に対する生物活性剤の混合重量比は、０.１乃至２０.０：８０.０乃至９９.９である、請求項２０に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法。
【請求項３４】
前記薬物担体の粒子の大きさは１乃至４００ｎｍ範囲内である、請求項２０に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法。
【請求項３５】
前記生物活性剤は、蛋白質及びポリペプチド薬物からなる群より選択されたものである、請求項２０に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法。
【請求項３６】
前記生物活性剤は、抗癌剤、抗炎剤、抗菌剤、抗高血圧剤、制吐剤、及び抗生物質からなる群より選択されるものである、請求項２０に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法。
【請求項３７】
前記生物活性剤が核酸である、請求項２０に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法。
【請求項３８】
前記薬物担体が高分子ミセル又はナノ粒子である、請求項２０に記載の生物活性剤の細胞内伝達方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、高分子薬物担体を利用して生物活性剤を細胞内に伝達する方法、及び伝達システムに関するものである。より詳しくは、本発明は、（ａ）疎水性ブロックの末端ヒドロキシル基がトコフェロール又はコレステロール基に置換された疎水性ブロックと親水性ブロックとからなる両親性ブロックと、（ｂ）高分子の末端に少なくとも一つのカルボキシル基を有するポリ乳酸誘導体とを含む高分子組成物で製造される高分子薬物担体を利用して、生物活性剤を細胞内に伝達する方法に関するものである。
【０００２】
〔背景技術〕
生物活性剤が目的とする治療効果を達成するために、投与された薬物の適切な量が身体の標的細胞内に伝達されなければならない。薬物の細胞内伝達を増加させるために、適切な濃度の薬物を好ましい時間間隔で標的組織に投与されなければならない。さらに、前記薬物は、組織の細胞内に伝達されなければならない。血液循環期間が長い製剤を使用することによって、組織内の高い薬物濃度を達成することができる。したがって、リポソームと高分子ミセルのようなナノ粒子の大きさの薬物伝達システムを開発するために、今まで相当な努力がなされている。
【０００３】
生物活性剤の細胞内摂取（uptake）を増加させる多くの方法が提案されてきた。また、オリゴヌクレオチドのような生物活性剤の細胞内伝達に、リポソームのような伝達体が使用されてきた（Felgner, et al., U.S. Pat. No. 5,264,618 (1993); Eppstein, et al., U.S. Pat. No. 4,897,355 (1990);及び Wang, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 84: 7851-7855 (1987); U.S. Pat. No. 5,759,519 (1998)）。しかし、リポソームの低い封入効率、速い薬物放出（leakage）、薬物の不安定性、及び低い貯蔵安定性などの問題により、リポソームを薬物担体としての使用は非常に制限される。低分子界面活性剤ミセルは、身体に投与された後、体液と接触すると分解され易いため、薬物担体として使用するには難しい。
【０００４】
最近、高分子ミセルの製剤化、特性化、及び薬学的応用に関する研究が行われてきた。このような研究に対して、Journal  of  Controlled  Release  73  (2001pp.132-172)でV.Torchilinが検討した。高分子ミセルは、疎水性（コア）及び親水性（シェル）部分を有する両親性ブロック共重合体から得られ、水溶性媒質内でコア-シェル構造を有する。水溶性が非常に低い薬物はミセルの疎水性コア内に封入される。親水性Ａブロックと疎水性Ｂブロックを有するＡ-Ｂ、Ａ-Ｂ-Ａ、又はＢ-Ａ-Ｂブロック共重合体に対する可なりの研究が進められてきた。薬物担体として使用するために、疎水性Ｂ（ミセルの内部コアブロック）は、生分解性高分子類、例えば、ポリ-ＤＬ-ラクチド、ポリ-ε-カプロラクトン又はポリ（γ-ベンジル-Ｌ-アスパラギン酸）を含み、親水性Ａ（ミセルの外部シェルブロック）は、細胞膜及び細胞質蛋白質と相互作用できる高分子、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であるのが好ましい。
【０００５】
高分子ミセルが細網内皮系（ＲＥＳ）又は単核食細胞系（ＭＰＳ）による生体内薬物摂取を防止することができ、したがって、長期間血液内を循環できるという点は大きな長所である。このような高分子ミセルの長所はミセル構造に起因する。両親性ブロック共重合体の親水性の部分が外部シェルを形成し、体液に露出するので、血液内細胞膜及び血漿蛋白質との相互作用からミセルを効果的に保護することができる［V. Torchilin et al., Advanced Drug Delivery Reviews 16(1995) pp.141-155］。
【０００６】
R.Savic等は、ポリ（カプロラクトン）-ｂ-ポリ（エチレンオキシド）ブロック共重合体から製造されたミセルが前記高分子のＰＣＬ末端に共有結合されたテトラメチルローダミン-５-カルボニルアジド（ＴＭＲＣＡ）を有するミセルを利用して、生物活性剤を生きている細胞に伝達できるということを実験的に立証した［R. Savic et al., Sceince 300(2003) pp.615-618］。しかし、前記蛍光ミセルは細胞質においてのみ観察され、核区画では観察されず、したがって、ＤＮＡ結合抗癌剤のような生物活性剤は前記ミセルに使用するのに適していない。
【０００７】
前記研究結果から見れば、生物活性剤を標的細胞に伝達できる高分子ミセル又はナノ粒子の開発が必要である。したがって、本発明は、高分子ミセル又はナノ粒子の薬物担体を利用して、生物活性剤を標的細胞内に伝達する方法を提供するものである。
【０００８】
〔発明の要約〕
本発明の目的は、（ａ）疎水性ブロックの末端ヒドロキシル基がトコフェロール基又はコレステロール基に置換された疎水性ブロックと親水性ブロックとからなる両親性ブロック共重合体、（ｂ）末端に少なくとも一つのカルボキシル基を有するポリ乳酸誘導体、及び任意に前記ポリ乳酸誘導体のカルボキシル末端基１当量に対して０.０１乃至１０当量の２価金属又は３価金属を含む高分子組成物で製造される高分子薬物を利用して、生物活性剤を細胞内に伝達する方法を提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、高分子薬物担体及び水溶液に封入された生物活性剤を含み、
前記高分子薬物担体は、（ａ）親水性ブロックと高分子の末端ヒドロキシル基がトコフェロール基又はコレステロール基に置換された疎水性ブロックで構成された両親性ブロック共重合体、及び（ｂ）末端に少なくとも一つのカルボキシル基を有するポリ乳酸誘導体を含む高分子組成物で製造され；
前記薬物担体が細胞と接触する際、前記高分子薬物担体に封入された生物活性剤のより多くの量が細胞内に伝達されるようにする、生物活性剤の細胞内伝達システムを提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、高分子薬物担体及び水溶液に封入された生物活性剤を含み、前記高分子薬物担体は、（ａ）疎水性ブロックの末端ヒドロキシル基がトコフェロール基又はコレステロール基に置換された疎水性ブロックと親水性ブロックとからなる両親性ブロック共重合体、及び（ｂ）末端に少なくとも一つのカルボキシル基を有するポリ乳酸誘導体を含む高分子組成物で製造され；
前記薬物担体が細胞と接触する際、前記高分子薬物担体に封入された生物活性剤がより多くの量で細胞内に伝達されるようにする、生物活性剤及び水溶液内に生物活性剤を封入した高分子薬物担体を含む生物活性剤の細胞内伝達用組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明は、生物活性剤を標的細胞に伝達することができる高分子薬物担体に関するものである。
【００１２】
〔発明の詳細な説明〕
本発明による高分子組成物とその製造及び使用方法を説明する前に、本発明は、ここに開示された特定形態、製造段階と材料に限定されず、その形態、製造段階、及び材料は変化することができることを理解しなければならない。また、ここに使用された用語は、特定の具体例を説明するための目的にのみ使用され、添付された請求範囲とその均等物によってのみ制限される本発明の範囲を制限しようとするわけではないことを理解しなければならない。
【００１３】
本明細書及び請求の範囲に記載された通り、単数形態“ａ”、“ａｎ”、及び“ｔｈｅ”は、具体的文脈で特に反対の意味に特定しない限り、複数形態も含むものである。例えば、“末端基（a  terminal  group）”を含む高分子と言っても、そのような末端基を二つ以上含有することも含むものである。
【００１４】
本発明を説明し、請求することにおいて、下記用語は、下記の定義により使用される。
【００１５】
本明細書において、、用語“生物活性剤（bioactive  agent）”とは、生体内で（in  vivo）好ましい生物学的活性又は機能、即ち、生物学的効果又は薬理学的効果を有する有機化合物又は薬物を意味する。例えば、治療剤を含有する生物学的活性剤は、細胞内機能、例えば、遺伝子機能などを変更することができる。あるいは、診断剤、例えば、磁気共鳴イメージ（ＭＲＩ）又はコンピュータ断層撮影（ＣＴ）剤を含有する生物活性剤などは、組織及び/又は器官の診断イメージを向上させる生物学的機能を有する。
【００１６】
本明細書において、用語“生分解性（biodegradable）”又は“生分解（biodegradation）”とは、溶解加水分解、又は酵素や生物体の他の産物のような生物学的に形成された物質（entities）の作用により、あまり複雑でない中間体から最終産物に転換することを意味する。
【００１７】
本明細書において、用語“生体適合性（biocompatible）”とは、溶解加水分解又は酵素や生物体の他の産物のような生物学的に形成された物質の作用によって形成される物質、中間体、又は最終産物を意味する。
【００１８】
“ポリ（ラクチド）”又は“ＰＬＡ”とは、乳酸の縮合反応又はラクチドの開環合成反応によって生成される高分子を意味する。用語“ラクチド”及び“乳酸塩”は、互いに交換して使用可能である。
【００１９】
例示的な具体例が基準となり、具体的な言語がこれらを説明するために使用される。しかし、これらが本発明の保護範囲を制限するという意図を有するものではない。本明細書に記載された本発明の特徴を変更又は追加的に変形することができ、本発明の原理を追加的に適用するのが、本技術分野の通常の知識を有する者には可能なことであり、これもまた本発明の範囲に属する。
【００２０】
本発明は、疎水性ブロックの末端ヒドロキシル基がトコフェロール基又はコレステロールに置換された疎水性ブロックと親水性ブロックとからなる両親性ブロック共重合体、及び末端に少なくとも一つのカルボキシル基を有するポリ乳酸誘導体を含む高分子組成物で製造された高分子薬物担体を使用して、生物活性剤を細胞内に伝達する方法に関するものである。また、本発明は、疎水性ブロックの末端ヒドロキシル基がコハク酸トコフェロール基又はコハク酸コレステロール基に置換された疎水性ブロックと親水性ブロックとからなる両親性ブロック共重合体、末端に少なくとも一つのカルボキシル基を有するポリ乳酸誘導体、及び前記ポリ乳酸誘導体は、そのカルボキシル末端基１当量に対して０.０１乃至１０当量の２価金属又は３価金属を含む高分子組成物で製造された薬物担体を使用して、生物活性剤を細胞内に伝達する方法に関するものである。
【００２１】
追加的に、本発明は、高分子薬物担体及び水溶液に封入された生物活性剤を含み、
前記高分子薬物担体は、（ａ）疎水性ブロックの末端ヒドロキシル基がトコフェロール基又はコレステロール基に置換された疎水性ブロックと親水性ブロックとからなる両親性ブロック共重合体、及び（ｂ）末端に少なくとも一つのカルボキシル基を有するポリ乳酸誘導体を含む高分子組成物で製造され；
前記薬物担体が細胞と接触する際、前記高分子薬物担体に封入された生物活性剤がより多くの量で細胞内に伝達されるようにする、生物活性剤の細胞内伝達システムに関するものである。
【００２２】
本発明の具体的な一例において、前記生物活性剤は、前記高分子薬物担体のない場合に比べて、より多くの量で、そして好ましくは、より効果的な方式で細胞内に伝達されることができる。
【００２３】
更に、本発明は、標的細胞内に生物活性剤を伝達することができる高分子薬物担体を提供するものである。
【００２４】
詳しくは、本発明は、ａ）少なくとも１種の生物活性剤を選択し；
ｂ）疎水性ブロックの末端ヒドロキシル基がトコフェロール基又はコレステロールに置換された疎水性ブロックと親水性ブロックとからなる両親性ブロック共重合体、及び末端に少なくとも一つのカルボキシル基を有するポリ乳酸誘導体を含む高分子組成物を製造し；
ｃ）溶媒中に前記高分子組成物と生物活性剤を混合及び溶解した後、溶媒を蒸発させ；
ｄ）水溶液を添加して、薬物担体内の水溶液に生物活性剤が捕集された高分子薬物担体を製造し；並びに
ｅ）前記薬物担体を細胞と接触させて、前記生物活性剤を細胞内に容易に伝達する；段階を含む、生物活性剤の細胞内伝達方法を提供する。
【００２５】
少なくとも１種の生物活性剤を選択
本発明による生物活性剤は、好ましい生物学的活性を示すいかなる有機化合物又は薬物であってもよい。これらは、蛋白質類；テストステロン、エストラジオール、エストロゲン、プロゲステロン、トリアムシノロンアセテート、デキサメタソーンなどのようなホルモン類；遺伝子；ポリペプチド；オリゴヌクレオチド；ヌクレオチド；抗体、抗癌剤、抗炎剤、抗菌剤、抗生物質、痲酔剤、抗高血圧剤、及び糖尿病治療剤、抗高脂血剤、抗ウイルス制、パーキンソン病治療剤、制吐剤、免疫抑制剤、抗潰瘍薬物、下剤、抗マラリア薬物、及び診断放射線薬物のような薬物などを含むが、これに限られない。抗癌剤の例としては、パクリタキシェル、エピルビシン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトマイシン、ドセタキシェル、５-フルオロウラシル、メトトレキセート、カムプトテシン、エトポシド、ドキソルビシン、ダウソルビシン、イダルビシン、アラ-Ｃ、シクロスポリンＡなど、及びこれらの誘導体を含む。
【００２６】
前記生物活性剤を前記高分子組成物に０.１〜２０：８０.０〜９９.９重量比、両親性ブロック共重合体及びポリ乳酸誘導体で製造されたミセルがコアに適切に含まれるように添加することができる。
【００２７】
高分子組成物の製造
本発明による両親性ブロック共重合体は、好ましくは、親水性Ａブロック及び疎水性Ｂブロックを含むＡ-Ｂ類型の二重ブロック共重合体又はＢ-Ａ-Ｂ類型三重ブロック共重合体である。水相で、両親性ブロック共重合体は、疎水性Ｂブロックがコアを形成し、親水性Ａブロックがシェルを形成して、コア-シェル構造の高分子ミセルを形成する。好ましくは、親水性Ａブロックは、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリールアミド、及びこれらの誘導体からなる群より選択される。より好ましくは、親水性Ａブロックは、モノメトキシポリエチレングリコール、モノアセトキシポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレン-コ-プロピレングリコール、及びポリビニルピロリドンからなる群より選択される。好ましくは、親水性Ａブロックは、数平均分子量が５００乃至５０,０００ダルトン、より好ましくは、１,０００乃至２０,０００ダルトンである。
【００２８】
本発明による両親性ブロック共重合体中の疎水性Ｂブロックは、ポリエステル、ポリアンヒドリド、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、及びポリフォスファジンからなる群より選択される高い生分解性及び生体適合性高分子である。より好ましくは、前記疎水性Ｂブロックは、ポリラクチド、ポリグリコール酸塩、ポリカプロラクトン、ポリジオキサン-２-オン、ポリラクチック-コ-グリコレート、ポリラクチック-コ-ジオキサン-２-オン、ポリラクチック-コ-カプロラクトン、及びポリグリコリック-コ-カプロラクトンからなる群より選択される１種以上である。疎水性ブロックの末端基はヒドロキシル基であり、前記末端ヒドロキシル基は、優れた疎水性を有する疎水性トコフェロール基又はコレステロール基に置換されることができ、これは、疎水性Ｂブロックの分子量は維持しながら、疎水性を向上させる目的で使用される。トコフェロール又はコレステロール基は、疎水性Ｂブロックの末端ヒドロキシル基に、連結剤、例えば、ジカルボン酸（コハク酸、マロン酸、グルタル酸、及びアジピン酸）を通じて共有結合されている。トコフェロール及びコレステロールは、全て生体適合性及び疎水性化合物として環構造を有し、高分子ミセルの内部疎水性を増加させることができるので、高分子ミセルの物理的安定性を向上させる。好ましくは、両親性ブロック共重合体中の疎水性Ｂブロックは、数平均分子量５００乃至５０,０００ダルトン、より好ましくは、１,０００乃至２０,０００ダルトンを有する。
【００２９】
本発明による両親性ブロック共重合体中の疎水性Ｂブロックに対する親水性Ａブロックの比率は、好ましくは３：７乃至８：２重量比であり、より好ましくは４：６乃至７：３重量比である。親水性Ａブロックの含有量が低過ぎると、高分子が水溶液内で適切な高分子ミセルを形成することができず、高過ぎると、高分子ミセルが安定的でない。
【００３０】
本発明の一例で、本発明による両親性ブロック共重合体は、下記の化学式を有する化合物である：
Ｒ１´-Ｏ-［Ｒ３´］ｌ´-［Ｒ４´］ｍ´-［Ｒ５´］ｎ´-Ｃ（=Ｏ）-（ＣＨ２）ｘ´-Ｃ（＝Ｏ）-Ｏ-Ｒ２´  （Ｉ´）
上記の式で、
Ｒ１´は、ＣＨ３-、Ｈ-［Ｒ５´］ｎ´-［Ｒ４´］ｍ´-、又はＲ２´-Ｏ-Ｃ（＝Ｏ）-（ＣＨ２）ｘ´-Ｃ（＝Ｏ）-［Ｒ５´］ｎ´-［Ｒ４´］ｍ´-であり；
Ｒ２´は、トコフェロール又はコレステロール基であり；
Ｒ３´は、-ＣＨ２ＣＨ２-Ｏ-、-ＣＨ（ＯＨ）-ＣＨ２-、-ＣＨ（Ｃ（＝Ｏ）-ＮＨ２）-ＣＨ２-、又は
【００３１】
【化１】
2007536219.tif 000003
【００３２】
であり；
Ｒ４´は、-Ｃ（＝Ｏ）-ＣＨＺ´-Ｏ-であり、ここで、Ｚ´は水素又はメチル基であり；
Ｒ５´は、-Ｃ（＝Ｏ）-ＣＨＹ”-Ｏ-であり、ここで、Ｙ”は、水素、メチル基、-Ｃ（＝Ｏ）-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２-Ｏ-、又は-Ｃ（＝Ｏ）-ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２-Ｏ-であり；
ｌ´は４-１１５０の整数であり；
ｍ´は１-３００の整数であり；
ｎ´は０-３００の整数であり；そして
Ｘ´は０-４の整数である。
【００３３】
トコフェロール又はコレステロールに置換された末端ヒドロキシル基を有する疎水性ブロックを含むブロック共重合体は、下記の方法により製造することができる。本発明の一例で、例えば、コハク酸、マロン酸、グルタル酸又はアジピン酸のようなジカルボン酸の連結剤をトコフェロール又はコレステロールのヒドロキシル基に導入し、前記カルボキシル化されたトコフェロール又はコレステロールを疎水性Ｂブロックの末端ヒドロキシル基に化学的に連結することである。
【００３４】
本発明の一例で、米国特許第６,３２２,８０５号によって、モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ；Ｍｎ＝２,０００）とポリラクチド（ＰＬＡ；Ｍｎ＝１,７５０）を含む両親性ブロック共重合体（ｍＰＥＧ-ＰＬＡ）を秤取し、真空ポンプを使用して１２０℃で脱水し、アセトニトリル又は塩化メチレンに溶解する。その後、コハク酸トコフェロール又はコハク酸コレステロールを添加し、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）及び４-ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を秤取して、反応開始剤及び触媒を各々添加し、室温で反応させる。前記反応物は、ｍＰＥＧ-ＰＬＡの末端ヒドロキシル基及び疎水性化合物の―ＣＯＯＨの間で行われる反応によって形成されたジシクロヘキシルウレア（ＤＣＵ）によって不透明になる。２４時間後に、ガラスフィルターでＤＣＵを除去し、ＤＭＡＰを抽出し、塩酸水溶液で除去する。得られた錠剤反応溶液にＭｇＳＯ４を添加して残留水分を除去した後、コハク酸トコフェロールが又はコハク酸コレステロールが連結された両親性ブロック共重合体（ここで、コハク酸ジエステルを通じて、トコフェロール又はコレステロールがＰＬＡに結合される）を得るために、ヘキサン/ジエチルエーテル溶媒で沈殿物を形成する。沈殿した高分子産物を濾過し、真空下で乾燥して、白い粒子の高分子を得る。
【００３５】
また他の具体例で、カルボキシル化疎水性化合物を触媒なしで塩化オキサリルで活性化させ、ｍＰＥＧ-ＰＬＡの末端に結合させる。つまり、コハク酸トコフェロール（又はコレステロール）を塩化オキサリルと反応させ、過剰の塩化オキサリルを室温で真空で除去する。ｍＰＥＧ-ＰＬＡの重量を量って前記反応物に添加し、１００℃で１２時間反応させてｍＰＥＧ-ＰＬＡ-トコフェロール（又はコレステロール）を得る。合成された高分子をアセトニトリル又は塩化メチレンに溶解し、ヘキサン/ジエチルエーテルで沈殿させ、濾過する。
【００３６】
前記二つの製造方法で、マロン酸トコフェロール（又はコレステロール）、グルタル酸トコフェロール（又はコレステロール）、又はアジピン酸コフェロール（又はコレステロール）などをコハク酸トコフェロール（又はコレステロール）の代わりに使用することができる。
【００３７】
本発明の他の具体例で、連結剤としてジクロライド化合物を使用して、トコフェロール又はコレステロールをｍＰＥＧ-ＰＬＡ末端に結合させる。詳しくは、トコフェロール又はコレステロールの重量を量って、５０℃で真空ポンプで脱水する。過剰の連結剤を添加し、１２時間の間反応させる。反応が完了した後、過剰で添加された連結剤を１００℃で真空ポンプで除去する。ここに、前記秤取されたｍＰＥＧ-ＰＬＡを添加し、１００℃で１２時間の間反応させる。合成された高分子を塩化メチレンに溶解し、トコフェロール又はコレステロールがコハク酸ジエステルを通じてＰＬＡに連結された両親性ブロック共重合体、つまり、ｍＰＥＧ-ＰＬＡ-トコフェロール又はｍＰＥＧ-ＰＬＡ-コレステロールを製造するために、ヘキサン/ジエチルエーテルで沈殿させる。沈殿物を濾過し、真空下で乾燥して、白い粒子の高分子を得る。前記反応に用いられる連結剤は、塩化スクシニル、塩化オキサリル、塩化マロニル、塩化グルタリル、塩化アジピンなどのようなジクロライド化合物から選択される。
【００３８】
本発明によるポリ乳酸誘導体の一つ以上の末端は、少なくとも一つのカルボン酸又はカルボン酸塩に共有結合されている。本発明によるポリ乳酸誘導体の他の末端は、ヒドロキシル基、アセトキシ、ベンゾイルオキシ、デカノイルオキシ、及びパルミトイルオキシ基からなる群より選択されたグループに共有結合で連結されている。前記カルボン酸又はカルボン酸塩は、ｐＨ４以上の水溶液で親水性基に作用して、ポリ乳酸誘導体が高分子ミセルを形成できるようにする。本発明によるポリ乳酸誘導体を水溶液に溶解した場合、高分子ミセルを形成するためには、ポリ乳酸誘導体に存在する親水性及び疎水性の部分が平衡にならなければならない。したがって、本発明によるポリ乳酸誘導体の数平均分子量は、５００乃至２,５００ダルトンであるのが好ましい。製造過程中に反応温度、時間などを調節することによって、ポリ乳酸誘導体の分子量を調節することができる。
【００３９】
前記ポリ乳酸誘導体は、下記の化学式を有する化合物であるのが好ましい：
［化学式１］
ＲＯ-ＣＨＺ-［Ａ］ｎ-［Ｂ］ｍ-ＣＯＯＭ  （Ｉ）
上記の式で、Ａは、―ＣＯＯ-ＣＨＺ-であり；
Ｂは、―ＣＯＯ-ＣＨＹ-、-ＣＯＯ-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２-又は―ＣＯＯ-ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２であり；
Ｒは、水素、アセチル、ベンゾイル、デカノイル、パルミトイル、メチル又はエチル基であり；
Ｚ及びＹは、各々、水素、メチル又はフェニル基であり；
Ｍは、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、又はＬｉであり；
ｎは１乃至３０の整数であり、ｍは０乃至２０の整数である。
【００４０】
前記ポリ乳酸誘導体の一側末端は、カルボキシル基又はこれらのアルカリ金属塩に共有結合で連結されている。好ましくは、アルカリ金属塩に連結されている。アルカリ金属塩の金属イオンは１価金属、例えば、ナトリウム、カリウム又はリチウムである。金属イオン塩のポリ乳酸誘導体は常温で固体であり、相対的に中性ｐＨであって非常に安定している。
【００４１】
より好ましくは、前記ポリ乳酸誘導体は、下記の化学式を有する化合物である：
ＲＯ-ＣＨＺ-［ＣＯＯ-ＣＨＸ］ｐ-［ＣＯＯ-ＣＨＹ´］ｑ-ＣＯＯ-ＣＨＺ-ＣＯＯＭ  （ＩＩ）
上記の式で、
Ｘはメチル基であり；
Ｙ´は、水素原子又はフェニル基であり；
Ｐは０乃至２５の整数であり；
ｑは、ｐとｑの合計が５乃至２５の整数を満足する条件下で、０乃至２５の整数であり；
Ｒ、Ｚ、及びＭは、化学式（Ｉ）で定義したものと同一である。
【００４２】
下記の化学式３、４、及び５のポリ乳酸誘導体は、本発明に好適にに使用することができる：
ＲＯ-ＰＡＤ-ＣＯＯ-Ｗ-Ｍ´  （ＩＩＩ）
Ｗ-Ｍ´は、
【００４３】
【化２】
2007536219.tif 000004
【００４４】
又は
【００４５】
【化３】
2007536219.tif 000005
【００４６】
であり；
ＰＡＤは、Ｄ,Ｌ-ポリ乳酸、Ｄ-ポリ乳酸、ポリマンデル酸、Ｄ,Ｌ-乳酸及びグリコール酸の共重合体、Ｄ,Ｌ-乳酸及びマンデル酸の共重合体、Ｄ,Ｌ-乳酸及びカプロラクトンの共重合体、並びにＤ,Ｌ-乳酸及び１,４-ジオキサン-２-オンの共重合体からなる群より選択されるものであり；
Ｒ、及びＭは、前記化学式（Ｉ）で定義したものと同一である。
【００４７】
Ｓ-Ｏ-ＰＡＤ-ＣＯＯ-Ｑ  （ＩＶ）
Ｓは
【００４８】
【化４】
2007536219.tif 000006
【００４９】
であり；
Ｌは、―ＮＲ１-又は―Ｏ-であり；
Ｒ１は、水素原子又はＣ１-１０アルキル基であり；
Ｑは、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、又はＣＨ２Ｃ６Ｈ５であり；
ａは０乃至４の整数であり；
ｂは１乃至１０の整数であり；
ＲとＭは、前記化学式（Ｉ）で定義したものと同一であり、ＰＡＤは、前記化学式（ＩＩＩ）で定義したものと同一である。
【００５０】
【化５】
2007536219.tif 000007
【００５１】
上記の式で、
Ｒ´は、―ＰＡＤ-Ｏ-Ｃ（Ｏ）-ＣＨ２ＣＨ２-Ｃ（Ｏ）-ＯＭであり；
ＰＡＤは、Ｄ,Ｌ-ポリ乳酸、Ｄ-ポリ乳酸、ポリマンデル酸、Ｄ,Ｌ-乳酸及びグリコール酸の共重合体、Ｄ,Ｌ-乳酸及びマンデル酸の共重合体、Ｄ,Ｌ-乳酸及びカプロラクトンの共重合体、並びにＤ,Ｌ-乳酸及び１,４-ジオキサン-２-オンの共重合体からなる群より選択され；
Ｍは、前記［化学式１］で定義したものと同一であり；
ＰＡＤは、前記化学式（ＩＩＩ）で定義したものと同一であり；
ａは１乃至４の整数である（ａ＝１であれば３-ａｒｍＰＬＡ-ＣＯＯＮａであり、ａ＝２であれば４-ａｒｍＰＬＡ-ＣＯＯＮａであり、ａ＝３であれば５-ａｒｍＰＬＡ-ＣＯＯＮａであり、ａ＝４であれば６-ａｒｍＰＬＡ-ＣＯＯＮａである）。
【００５２】
高分子合成の出発物質（化学式Ｖ）は、グリセロール、エリスリトール、スレルトール、ペンタエリスリトール、キシリトール、アドニトール、ソルビトール、及びマンニトールを含む。
【００５３】
本発明の高分子組成物は、両親性ブロック共重合体及びポリ乳酸誘導体を含んだ全重量に対して０.１乃至９９.９ｗｔ％の両親性ブロック共重合体及び０.１乃至９９.９ｗｔ％のポリ乳酸誘導体、好ましくは、２０乃至９５ｗｔ％の両親性ブロック共重合体及び５乃至８０ｗｔ％のポリ乳酸誘導体、より好ましくは、５０乃至９０ｗｔ％の両親性ブロック共重合体及び１０乃至５０ｗｔ％のポリ乳酸誘導体を含むことができる。
【００５４】
本発明によるポリ乳酸誘導体は、ｐＨ４以上の水溶液では単独でミセルを形成することができ、両親性ブロック共重合体及びポリ乳酸誘導体を含む高分子組成物も、溶液のｐＨとは関係なしに、水溶液でミセルを形成することができ、本発明の高分子組成物をｐＨ１乃至１０の範囲で、好ましくは、ｐＨ４乃至８で使用することができる。本発明による高分子組成物に製造されるミセル又はナノ粒子の粒子の大きさは１乃至４００ｎｍ、好ましくは５乃至２００ｎｍに調製することができ、高分子の分子量及び両親性ブロック共重合体に対するポリ乳酸誘導体の比率に依存的である。
【００５５】
本発明の具体例で、ポリ乳酸誘導体のカルボキシル末端基は、２価又は３価金属イオンに結合又は固定されている。両親性ブロック共重合体及びポリ乳酸誘導体を含む高分子組成物に２価金属又は３価金属を添加して、前記金属イオン-固定高分子を製造することができる。ポリ乳酸誘導体のカルボキシル末端基に結合又は固定させるために添加される２価又は３価金属イオンの量を変化させて、前記高分子ミセル又はナノ粒子を製造することができる。
【００５６】
２価又は３価金属イオンは、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｂａ２＋、Ｃｒ３＋、Ｆｅ３＋、Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、及びＡｌ３＋からなる群より選択されるのがよい。両親性ブロック共重合体及びポリ乳酸誘導体を含む高分子組成物に、前記２価又は３価金属イオンを硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、燐酸塩又は水酸塩形態、好ましくは、ＣａＣｌ２,ＭｇＣｌ２,ＺｎＣｌ２,ＡｌＣｌ３、ＦｅＣｌ３、ＣａＣＯ３、ＭｇＣＯ３、Ｃａ３（ＰＯ４）２,Ｍｇ３（ＰＯ４）２,ＡｌＰＯ４、ＭｇＳＯ４、Ｃａ（ＯＨ）２,Ｍｇ（ＯＨ）２,Ａｌ（ＯＨ）３、又はＺｎ（ＯＨ）２の形態で添加することができる。
【００５７】
添加される金属イオンの当量数を変化させて、高分子ミセル又はナノ粒子を製造することができる。具体的には、２価金属をカルボキシル基当量に対して０.５当量以下に添加すると、ポリ乳酸誘導体のカルボキシル末端基と結合できる金属イオンが不充分になる。したがって、高分子ミセルが形成される。２価金属をカルボキシル基１当量に対して０.５当量以上に添加すると、ポリ乳酸誘導体のカルボキシル末端基と結合できる金属イオンが充分であるため、ミセをル固く固定し、ナノ粒子が形成される。
【００５８】
更に、添加される金属イオンの当量数を調節することによって、高分子ミセル又はナノ粒子から薬物の放出速度を調節することができる。２価金属をカルボキシル基当量に対して１当量以下に添加すると、ポリ乳酸誘導体のカルボキシル末端基と結合に用いることができる数が減少するため、薬物放出速度が増加する。仮に、金属イオンが１当量以上で存在すると、ポリ乳酸誘導体のカルボキシル末端基と結合に用いることができる数が増加するため、薬物放出速度が減少する。したがって、血液内薬物抜出速度を増加させるためには金属イオン使用当量数が少なくなければならず、薬物放出速度を減少させるためには金属イオンの使用当量数が多くなければならない。
【００５９】
本発明によって金属イオンが固定された高分子組成物は、５乃至９５ｗｔ％の両親性ブロック共重合体、５乃至９５ｗｔ％のポリ乳酸誘導体及びポリ乳酸誘導体のカルボキシル末端基の当量数に対して、０.０１乃至１０当量の２価又は３価金属イオンを含むことができる。好ましくは、前記高分子組成物は、２０乃至８０ｗｔ％の両親性ブロック共重合体、２０乃至８０ｗｔ％のポリ乳酸誘導体及びポリ乳酸誘導体のカルボキシル末端基の当量数に対して、０.１乃至５当量の２価又は３価金属イオンを含むことができ、より好ましくは、組成物は、２０乃至６０ｗｔ％の両親性ブロック共重合体、４０乃至８０ｗｔ％のポリ乳酸誘導体及びポリ乳酸誘導体のカルボキシル末端基の当量数に対して、０.２乃至２当量の２価又は３価金属イオンを含むことができる。
【００６０】
溶媒中で前記高分子組成物と生物活性剤を混合及び溶解し、溶媒を蒸発させ、封入された生物活性剤で薬物担体溶液を製剤化
前記高分子薬物担体は、疎水性ブロックの末端ヒドロキシル基がトコフェロール基又はコレステロール基に置換された疎水性ブロックと親水性ブロックとからなる両親性ブロック共重合体、及び末端に少なくとも一つのカルボキシル基を有するポリ乳酸誘導体を含む高分子組成物から製造される高分子ミセル又はナノ粒子であることができる。
【００６１】
本発明によるナノ粒子又はミセルは、末端ヒドロキシル基がコハク酸トコフェロール基又はコハク酸コレステロール基に置換された疎水性ブロックと親水性ブロックとからなる両親性ブロック共重合体、２価金属又は３価金属固定されたり結合された、末端に少なくとも一つのカルボキシル基を有するポリ乳酸誘導体とを含む高分子組成物から形成されることができる。
【００６２】
前記生物活性剤は本発明によるナノ粒子又はミセルに封入されることができ、生物活性剤によっては、生分解性ポリ乳酸誘導体のカルボキシル基と安定したイオン複合体を合成してミセル又はナノ粒子に含ませることができる。
【００６３】
前記両親性ブロック共重合体、ポリ乳酸誘導体、及び難水溶性薬物を、特定比率でアセトン、エタノール、メタノール、エチルアセテート、アセトニトリル、塩化メチレン、クロロホルム、酢酸、及びジオキサンからなる群より選択される１種以上の有機溶媒に溶解することができる。前記有機溶媒を除去して、難水溶性薬物と高分子の均一な混合物を製造することができる。難水溶性薬物と高分子の均一な混合物を０乃至８０℃温度でｐＨ４乃至８の水溶液に添加して、難水溶性薬物を含む高分子ミセル水溶液を得る。前記薬物-含有高分子ミセル水溶液を凍結乾燥して、固形の高分子ミセルを製造する。
【００６４】
０.００１乃至２Ｍの２価又は３価金属イオンを含む水溶液を、難水溶性薬物と高分子ミセル水溶液に添加する。前記混合物を、室温で０.１乃至１時間の間ゆっくり撹拌した後、凍結乾燥して、金属イオン-固定高分子ミセル又はナノ粒子を固形で得る。
【００６５】
前記薬物担体と細胞の接触
生物活性剤の経口又は非経口投与のために、前記生物活性剤は、薬物担体に封入してはじめて安定になる。特に、金属イオン-固定高分子ミセル又はナノ粒子は長期間血流内に維持され、標的領域に蓄積される。生物活性剤はミセルが分解される間、ミセルの疎水性コアから放出されて、薬理学的効果を示す。
【００６６】
非経口伝達用として、前記高分子組成物を、経皮、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、直腸内、眼球内、及び肺内に投与することができる。経口伝達用には、前記生物活性剤を本発明の薬物担体と混合して、錠剤、カプシェル、又は水溶液形態で投与することができる。具体的薬物の要件によって、本発明の高分子組成物を多様な含有量範囲で投与することができる。医薬分野で知らされている通り、患者に投与される投与量は、患者の体重、表面積、投与薬物、性別、時間、投与経路、及び健康状態などの色々な因子により決定され、他の薬物と同時に投与することもできる。
【００６７】
生物活性剤の細胞内伝達
薬物含有組成物を使用して、細胞流動分析器と共焦点顕微鏡により、生物活性剤の細胞内伝達に関して研究することができる。本発明の一例として、ヒトの子宮癌細胞株（ＭＥＳ-ＳＡ；ＭＥＳ-ＳＡ/Ｄｘ-５）及びヒトの乳癌細胞株（ＭＣＦ-７；ＭＣＦ-７/ＡＤＲ）を本発明の組成物で処理した。細胞株ＭＥＳ-ＳＡ及びＭＣＦ-７はドキソルビシン-敏感性であり、細胞株ＭＥＳ-ＳＡ/Ｄｘ-５及びＭＣＦ-７/ＡＤＲはドキソルビシン-抵抗性である。
【００６８】
図２Ａ乃至３Ｂ、及び表２Ａと２Ｂに示したように、薬物は、従来の溶液製剤（Free-Dox）からより、本発明の組成物から細胞により効果的に伝達される（組成物１）。より注目すべきは、薬物を吸収する細胞の数が、従来の製剤に比べて本発明の場合が５倍さらに高い。特に、ドキソルビシンの細胞内伝達は、薬物抵抗性細胞株において非常に卓越する。したがって、化学療法で多薬剤の耐性問題を克服するために、本発明の薬物組成物を用いる可能性が高い。
【００６９】
図４Ａ乃至４Ｈに示す共焦点顕微鏡のイメージは、細胞誘導の分析結果を視覚化して見せる。本発明の薬物組成物で細胞を処理した場合に、細胞がより多くの量の薬物を吸収することが分かる。図４Ａ乃至４Ｈに示したように、左側写真は、従来の溶液製剤で処理した後で得られた共焦点顕微鏡イメージであり、右側写真は、本発明の組成物で処理した後で得られたものである。図４Ｂ、４Ｄ、４Ｆ、及び４Ｈに示したように、ミセル又はナノ粒子を細胞質及び核区画で探知した。
【００７０】
さらに、ＭＴＴ分析結果を図５Ａ乃至図５Ｂ及び表３に示したが、これは細胞流動分析及び共焦点顕微鏡結果を裏付ける。ＭＴＴ分析のために、本発明によるドキソルビシン-含有組成物（組成物１）及び従来のドキソルビシン製剤（Free-Dox）をヒトの子宮癌細胞株ＭＥＳ-ＳＡ（ドキソルビシン-敏感性細胞株）及びＭＥＳ-ＳＡ/Ｄｘ-５（ドキソルビシン-抵抗性細胞株）で試験した。ドキソルビシン-敏感性細胞で、細胞の毒性は二つの組成物全てが類似しており、結果を図５Ａに示した。しかし、図５Ｂに示したように、ドキソルビシン-抵抗性細胞株を処理して３日経過後、本発明の薬物組成物が、従来の製剤に比べて６.７倍高い活性を示した。前記活性の差は、Ｐ-糖蛋白質（Ｐ-ｇｐ）が過剰発現されて、細胞毒性薬物を細胞から継続して排出する、薬物-抵抗性細胞株の特性に起因する。遊離された薬物は薬物-抵抗性細胞内に濃縮されないので、このような結果は、薬物担体に封入された薬物と共に本発明の薬物担体が細胞に伝達されることを意味する。
【００７１】
本発明による薬物担体の物理的安定性と細胞内封入研究結果から、本発明によれば、生物活性剤-含有組成物の大部分は、ミセル又はナノ粒子形態でその構造の破壊をせずに飲食作用（endocytosis）によって細胞質内に伝達されると結論付けることができる。このような細胞内封入過程の模式図を図１に示した：１薬物；２ミセル又はナノ粒子の内部コア；３ミセル又はナノ粒子の外部シェル；４細胞外体液；５細胞膜；及び６細胞質。
【００７２】
本発明によるドキソルビシン-含有組成物（組成物１乃至５）及び従来のドキソルビシン製剤（Free-Dox）を使用してSprague-Dawleyネズミ（２００〜２５０ｇ）で薬理力学実験を行った。図６及び表４に示したように、本発明による組成物は、従来のドキソルビシン製剤に比べてさらに長い血液循環時間を示した。本発明による組成物１の血中濃度-時間曲線（ＡＵＣ）の下の面積から計算された生体利用率は、従来のドキソルビシン製剤に比べて６３倍もさらに高かった。
【００７３】
本発明による薬物担体は、小さい粒子の大きさ（<１００ｎｍ）によって遅延された全身循環時間を提供し、疎水性シェルは、ＭＰＳによって摂取を最小化し、高い分子量によって小便として排出することを防止する。本発明による薬物担体は、難水溶性薬物だけでなく、水溶性薬物、ペプチド、及び蛋白質にも適用することができる。細胞封入研究で例示したように、本発明による生物活性剤-含有組成物は、水性媒質で安定したミセル又はナノ粒子を形成するので、構造の破壊をせずに、飲食作用によってミセル又はナノ粒子の形態で細胞質に伝達されることができる。さらに、本発明による組成物は、癌組織内で生物活性剤がさらに高い濃度で蓄積できるようにすることができる。
【００７４】
［実施例］
下記の実施例は、本発明が属する技術分野の専門家が本発明をより明確に理解し、本発明を遂行する方法を提供するであろう。下記の好ましい具体例と共に本発明を説明するが、実施例は本発明を例示するためだけのものであり、本発明の保護範囲がこれに限定されるわけではない。本発明の他の一面は、本発明が属する技術分野の当業者にとって明白なものであろう。
【００７５】
製造例１
ＰＥＧ及びＰＬＡ（ｍＰＥＧ-ＰＬＡ）で構成された両親性ブロック共重合体
２０ｇのモノメトキシポリエチレングリコール（分子量２,０００のｍＰＥＧ）、エチルアセテートから再結晶化されたＤ,Ｌ-ラクチド２０ｇ、及びスズオクトエート０.２ｇの混合物を５ｍｌのトルエンに溶解し、これを機械撹拌機及び蒸留機セットが装着された反応器に注入した。残留トルエンを１２０℃で蒸発させた。反応を真空下で（２５ｍｍＨｇ）行った。重合反応を６時間行った後に得られた高分子をジクロロメタンに溶解させ、冷たいジエチルエーテル（４℃）に注入して、高分子を沈殿させた。沈殿した高分子をジエチルエーテルで２回洗浄し、真空下で（０.１ｍｍＨｇ）２４時間乾燥させた。核磁気共鳴分光法で測定したブロック共重合体の分子量が２,０００-１,８００であった（２,０００はＰＥＧブロックに対するものであり、１,８００はＰＬＡブロックに対するものである）。
【００７６】
製造例２
ＰＥＧ及びＰＬＧＡ（ｍＰＥＧ-ＰＬＧＡ）で構成された両親性ブロック共重合体
２０ｇのＤ,Ｌ-ラクチドの代わりに、１４ｇのＤ,Ｌ-ラクチド及び６ｇグリコレートを使用した他は製造例１の方法と同様にして、２重ブロック共重合体（ｍＰＥＧ-ＰＬＧＡ、ＬＡ：ＧＡ＝７０：３０重量比）を製造した。ＮＭＲで測定したブロック共重合体の分子量は２,０００-１,７５０（２,０００はＰＥＧブロック、１,７５０はＰＬＧＡブロックに対する値である）。
【００７７】
製造例３
ＰＥＧ及びＰＣＬ（ｍＰＥＧ-ＰＣＬ）で構成された両親性ブロック共重合体
Ｄ,Ｌ-ラクチドの代わりに、２０ｇのε-カプロラクトンを使用した他は製造例１の方法と同様にして、２重ブロック共重合体（ｍＰＥＧ-ＰＣＬ）を製造した。ＮＭＲで測定したブロック共重合体の分子量は２,０００-１,８００であった（２,０００はＰＥＧブロック、１,８００はＰＣＬブロックに対する値である）。
【００７８】
製造例４
ＰＥＯ及びＰＬＡ（ＰＬＡ-ＰＥＯ-ＰＬＡ）で構成された両親性ブロック共重合体
モノメトキシポリエチレングリコール（分子量２,０００ＰＥＧ）の代わりに、２０ｇのポリエチレングリコール（分子量２,０００ＰＥＧ）を使用した他は製造例１の方法と同様にして、３重ブロック共重合体（ＰＬＡ-ＰＥＯ-ＰＬＡ）を製造した。ＮＭＲで測定したブロック共重合体の分子量は８５０-２,０００-８５０であった（２,０００：ＰＥＯブロック、９００：各ＰＬＡブロックに対する値である）。
【００７９】
製造例５
コハク酸トコフェロール
機械撹拌機が装着された反応器で、８.６ｇのトコフェロール、２.４ｇのスクシニックアンヒドリド、及び２.９ｇの４-（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）の混合物を１００ｍｌの１,４-ジオキサンに溶解した。反応は室温で行った。２４時間攪拌した後に、反応物をＨＣｌ溶液に添加してコハク酸トコフェロールを沈殿させた（１０.２ｇ；収率＝９６％）。
【００８０】
製造例６
コハク酸コレステロール
トコフェロールの代わりに、７.７ｇのコレステロールを使用した他は製造例５の方法と同様にして、てコハク酸コレステロールを製造した（９.１ｇ；収率＝９４％）。
【００８１】
製造例７
疎水性ブロックの末端にトコフェロール基を有する両親性ブロック共重合体（ｍＰＥＧ-ＰＬＡ-Ｔｏｃｏ）
機械撹拌機が装着された反応器で、製造例１で製造した１０.０ｇ（２.６ｍｍｏｌｅ）のｍＰＥＧ-ＰＬＡ、及び製造例５で製造した１.７ｇ（３.２ｍｍｏｌｅ）のコハク酸トコフェロールの混合物を、５０ｍｌアセトニトリルに溶解した。０.７８ｇ（３.８ｍｍｏｌｅ）のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）及び０.０４６ｇ（０.３８ｍｍｏｌｅ）の４-（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）を触媒として使用した。室温で２４時間攪拌した後に、前記混合物をガラスフィルターで濾過して、ジシクロヘキシルカルボウレアを除去した。水性ＨＣｌ溶液で残留触媒を除去し、硫酸マグネシウムを高分子溶液に添加して、水を除去した。得られた産物（ｍＰＥＧ-ＰＬＡ-Ｔｏｃｏ）を、ｎ-ヘキサン/ジエチルエーテル（６/４、ｖ/ｖ）溶媒から再結晶化した。再結晶化された産物を濾過し、真空下で乾燥して、白い粉末の産物を得た（９.９ｇ；収率＝８７％）。
【００８２】
製造例８
疎水性ブロックの末端にトコフェロール基を有する両親性ブロック共重合体（ｍＰＥＧ-ＰＬＧＡ-Ｔｏｃｏ）
製造例１で得られたｍＰＥＧ-ＰＬＡの代わりに、製造例２で得られた９.８ｇ（２.６ｍｍｏｌｅ）のｍＰＥＧ-ＰＬＧＡを使用した他は製造例７の方法と同様にして、両親性ブロック共重合体（ｍＰＥＧ-ＰＬＧＡ-Ｔｏｃｏ）を製造した（９.５ｇ；収率＝８３％）。
【００８３】
製造例９
疎水性ブロックの末端にトコフェロール基を有する両親性ブロック共重合体（ｍＰＥＧ-ＰＣＬ-Ｔｏｃｏ）
製造例１で得られたｍＰＥＧ-ＰＬＡの代わりに、製造例３で得られた１０.０ｇ（２.６ｍｍｏｌｅ）のｍＰＥＧ-ＰＣＬを使用した他は製造例７の方法と同様にして、両親性ブロック共重合体（ｍＰＥＧ-ＰＣＬ-Ｔｏｃｏ）を製造した（１０.１ｇ；収率＝８９％）。
【００８４】
製造例１０
疎水性ブロックの末端にトコフェロール基を有する両親性ブロック共重合体（Ｔｏｃｏ-ＰＬＡ-ＰＥＯ-ＰＬＡ-Ｔｏｃｏ）
製造例１で得られたｍＰＥＧ-ＰＬＡの代わりに、製造例４で得られた９.６ｇ（２.６ｍｍｏｌｅ）のＰＬＡ-ＰＥＯ-ＰＬＡを使用した他は製造例７の方法と同様にして、両親性ブロック共重合体（Ｔｏｃｏ-ＰＬＡ-ＰＥＯ-ＰＬＡ-Ｔｏｃｏ）を製造した（９.２ｇ；収率＝８４％）。
【００８５】
製造例１１
疎水性ブロックの末端にコレステロール基を有する両親性ブロック共重合体（ｍＰＥＧ-ＰＬＡ-Ｃｈｏｌ）
製造例５で得られたコハク酸トコフェロールの代わりに、１.６ｇ（３.２ｍｍｏｌｅ）の製造例６で製造したコハク酸コレステロールを使用した他は製造例７の方法と同様にして、両親性ブロック共重合体（ｍＰＥＧ-ＰＬＡ-Ｃｈｏｌ）を製造した（９.７ｇ；収率＝８６％）。
【００８６】
製造例１２
生分解性ポリエステル（ＰＬＭＡ-ＣＯＯＮａ）
（１）ＰＬＭＡ-ＣＯＯＨの製造
７.５ｇのＤ,Ｌ-乳酸（０.０８３ｍｏｌｅ）及び２.５ｇのＤ,Ｌ-マンデル酸（０.０１６ｍｏｌｅ）の混合物を、機械撹拌機と蒸留機セットが装着された反応器に注入した。吸入機を利用して、減圧（２５ｍｍＨｇ）下の８０℃で、１時間水分を蒸発させた。加熱した後、１８０℃で５時間の間真空（１０ｍｍＨｇ）下で反応を行った。反応産物を蒸溜水に添加し、沈殿した高分子を蒸溜水で洗浄した。高分子産物を０.１Ｌの蒸溜水に添加し、前記水溶液に炭酸水素ナトリウムを添加して、ｐＨ６乃至８に調節して、高分子を溶解した。前記水不溶性高分子を遠心分離又は濾過で分離除去した。１Ｎの塩酸溶液を滴下して、水溶液中に高分子を沈殿させた。沈殿した高分子を蒸溜水で２回洗浄し、分離し、減圧下で乾燥して、カルボキシル末端基を有する高分子を製造した（６.７ｇのＰＬＭＡ-ＣＯＯＨ、収率＝６７％）。ＮＭＲで測定した高分子の数平均分子量は１,１００であった。
【００８７】
（２）ＰＬＭＡ-ＣＯＯＮａの製造
機械撹拌機と蒸留機セットが装着された反応器で、アセトンに５ｇのＰＬＭＡ-ＣＯＯＨ高分子溶液を溶解した。室温で溶液をゆっくり攪拌し、１Ｎの炭酸水素ナトリウムをゆっくり添加してｐＨ７に合わせた。無水硫酸マグネシウムを添加して、残留水分を除去した。前記混合物を濾過し、残留アセトンをロータリー蒸発器で蒸発させて除去して、白い固形産物を得た。前記固形産物を無水アセトンに溶解し、濾過して不溶性粒子を除去し、アセトンを蒸発させて、最終産物のＰＬＭＡ-ＣＯＯＮａを、白い固体状で得た（収率：９５％）。
【００８８】
製造例１３
生分解性ポリエステル（３ａｒｍ-ＰＬＡ-ＣＯＯＫ）
（１）３ａｒｍ-ＰＬＡ-ＯＨの製造
１.０ｇ（０.０１１ｍｏｌｅ）のグリセロールを、機械撹拌機と蒸留機セットが装着された反応器に注入した。８０℃で３０分間水分を除去した。トルエンに溶解した０.０３６ｇ（０.０８９ｍｍｏｌｅ）のスズオクトエートを添加し、残留トルエンを１２０℃で除去し、エチルアセテートから再結晶化された３６ｇ（０.２５ｍｏｌｅ）のＤ,Ｌ-ラクチドを反応器に導入した。１３０℃、真空（２０ｍｍＨｇ）下で反応させた。重合反応６時間後に、得られた高分子をアセトンに溶解させ、ＮａＨＣＯ３水溶液（０.２Ｎ）を滴下して、高分子を沈殿させた。沈殿した高分子を蒸溜水で３回洗浄し、減圧下で乾燥して、白い高分子粉末を得た（３ａｒｍ-ＰＬＡ-ＯＨ）。ＮＭＲで測定した高分子の数平均分子量は３,０５０であった。
【００８９】
（２）３ａｒｍ-ＰＬＡ-ＣＯＯＨの製造
前記で製造した１０ｇ（３.２８ｍｍｏｌｅ）の３ａｒｍ-ＰＬＡ-ＯＨを、機械撹拌機と蒸留機セットが装着された反応器に注入した。１２０℃で１時間の間水分を除去した。１.９６ｇ（１９.６ｍｍｏｌｅ）のスクシニックアンヒドリドを添加し、１２５℃で６時間の間反応を行った。得られた高分子をアセトンに溶解し、蒸溜水を滴下して、高分子を沈殿させた。沈殿した高分子をＮａＨＣＯ３水溶液（０.２Ｎ）に、６０℃で添加し、ＨＣｌ水溶液（１Ｎ）を滴下して、高分子を沈殿させた。沈殿した高分子を蒸溜水で３回洗浄し、真空で乾燥して、白い粉末の高分子を得た（３ａｒｍ-ＰＬＡ-ＣＯＯＨ）。ＮＭＲで測定した高分子の分子量は３,２００であった。
【００９０】
（３）３ａｒｍ-ＰＬＡ-ＣＯＯＫの製造
最後に、ＰＬＭＡ-ＣＯＯＨ高分子及び炭酸水素ナトリウム水溶液（１Ｎ）の代わりに、前記で製造した３ａｒｍ-ＰＬＡ-ＣＯＯＨ５ｇと炭酸水素カリウム水溶液（１Ｎ）を使用した他は製造例１２の方法と同様にして、生分解性ポリエステル（３ａｒｍ-ＰＬＡ-ＣＯＯＫ）を製造した（収率＝９０％）。
【００９１】
製造例１４
生分解性ポリエステル（４ａｒｍ-ＰＬＡ-ＣＯＯＮａ）
（１）４ａｒｍ-ＰＬＡ-ＯＨの製造
グリセロールの代わりに、ペンタエリスリトール１.５ｇ（０.０１１ｍｏｌｅ）を使用した他は製造例１３の方法と同様にして、４ａｒｍ-ＰＬＡ-ＯＨ高分子を製造した。前記高分子の数平均分子量をＮＭＲで決定したが、３,１００であった。
【００９２】
（２）４ａｒｍ-ＰＬＡ-ＣＯＯＨの製造
１０ｇ（３.２８ｍｍｏｌｅ）の３ａｒｍ-ＰＬＡ-ＯＨ高分子及び１.９６ｇ（１９.６ｍｍｏｌｅ）のスクシニックアンヒドリドの代わりに、１０ｇ（３.２３ｍｍｏｌｅ）の４ａｒｍ-ＰＬＡ-ＯＨ高分子及び２.５８ｇ（２５.８ｍｍｏｌｅ）のスクシニックアンヒドリドを使用した他は製造例１３の方法と同様にして、４ａｒｍ-ＰＬＡ-ＣＯＯＨ高分子を製造した。高分子（４ａｒｍ-ＰＬＡ-ＣＯＯＨ）の分子量はＮＨＲによると３,３００であった。
【００９３】
（３）４ａｒｍ-ＰＬＡ-ＣＯＯＮａの製造
最後に、ＰＬＭＡ-ＣＯＯＨ高分子の代わりに、前記４ａｒｍ-ＰＬＡ-ＣＯＯＨ５ｇを使用した他は製造例１２の方法と同様にして、生分解性ポリエステル（４ａｒｍ-ＰＬＡ-ＣＯＯＮａ）を製造した（収率＝９２％）。
【００９４】
製造例１５
生分解性ポリエステル（ＰＬＡ-ＣＯＯＮａ）
（１）ＰＬＡ-ＣＯＯＨの製造
１０ｇのＤ,Ｌ-乳酸（０.１１ｍｍｏｌｅ）を使用した他は製造例１２の方法と同様にして、ＰＬＡ-ＣＯＯＨを製造した（収率＝７８％）。前記高分子の数平均分子量をＮＭＲで決定したが、１,１００であった。
【００９５】
（２）ＰＬＡ-ＣＯＯＮａの製造
ＰＬＭＡ-ＣＯＯＨ高分子の代わりに、前記５ｇのＰＬＡ-ＣＯＯＨを使用した他は製造例１２の方法と同様にして、生分解性ポリエステル（ＰＬＡ-ＣＯＯＮａ）を製造した（収率＝９２％）。
【００９６】
実施例１
薬物含有組成物
（組成物１：ドキソルビシン/ｍＰＥＧ-ＰＬＡ-Ｔｏｃｏ/ＰＬＭＡ-ＣＯＯＮａ）
円低フラスコで、１０ｍｇのドキソルビシン塩酸塩を５ｍｌのエタノール-水混合物（９：１ｖ/ｖ）に溶解した。製造例７で得られた両親性ブロック共重合体（ｍＰＥＧ-ＰＬＡ-Ｔｏｃｏ）８１０ｍｇ及び製造例１２で得られた生分解性ポリエステル（ＰＬＭＡ-ＣＯＯＮａ）１８０ｍｇを添加し、透明な溶液になるまで完全に溶解した。前記溶媒を、ロータリー蒸発機を使用して、真空下で６０℃で蒸発させた。ラクトース水溶液３ｍｌ（２０重量％）を添加し、ロータリー蒸発機を使用して６０℃で１００ｒｐｍで回転させて、水性媒質中にミセル又はナノ粒子を形成した。前記溶液を０.２２μｍ気孔のＰＶＤＦ膜フィルターを用いて濾過した。濾過液を凍結乾燥させ、使用するまでに冷蔵庫に保管した。濾過液のミセル又はナノ粒子の粒子の大きさを、動的光散乱法（DLS,  ZetaPlus,  Brookhaven  Instruments  Ltd.）で測定した。標準物質としてダウノルビシンを用いてＨＰＬＣで測定したドキソルビシン含量から薬物積載効率（loading  efficienty、最初に使用した薬物に対するミセル又はナノ粒子に封入された薬物の重量％）を計算した。ＨＰＬＣ分析条件は次の通りである：
注入容量：７５μｌ
流速：１.０ｍｌ/ｍｉｎ
移動状：溶媒Ｂの濃度勾配：１５％乃至８５％、４０分間
（溶媒Ａ：１％の酢酸；溶媒Ｂ：アセトニトリル）
温度：室温
カラム：Ｃ-１８（Vydac, multi-ring, 気孔の大きさ:5μｍ）
波長：４８５ｎｍ；及び
粒子の大きさの測定は、動的光散乱（ＤＬＳ）方法によって行った。
【００９７】
前記実験結果を下記の表１に要約した。
【００９８】
実施例２
薬物含有組成物
（組成物２：ドキソルビシン/ｍＰＥＧ-ＰＬＧＡ-Ｔｏｃｏ/ＰＬＭＡ-ＣＯＯＮａ）
ｍＰＥＧ-ＰＬＡ-Ｔｏｃｏの代わりに、製造例８のｍＰＥＧ-ＰＬＧＡ-Ｔｏｃｏを使用した他は実施例１の方法と同様にして、薬物含有組成物（組成物２）を製造した。前記実験結果を下記の表１に要約した。
【００９９】
実施例３
薬物含有組成物
（組成物３：ドキソルビシン/ｍＰＥＧ-ＰＣＬ-Ｔｏｃｏ/３ａｒｍ-ＰＬＡ-ＣＯＯＫ）
ｍＰＥＧ-ＰＬＡ-Ｔｏｃｏ及びＰＬＭＡ-ＣＯＯＮａの代わりに、製造例９で得られたｍＰＥＧ-ＰＣＬ-Ｔｏｃｏ及び製造例１３で得られた３ａｒｍ-ＰＬＡ-ＣＯＯＫを使用した他は実施例１の方法と同様にして、薬物含有組成物（組成物３）を製造した。前記実験結果を下記の表１に要約した。
【０１００】
実施例４
薬物含有組成物
（組成物４：ドキソルビシン/Ｔｏｃｏ-ＰＬＡ-ＰＥＯ-ＰＬＡ-Ｔｏｃｏ/４ａｒｍ-ＰＬＡ-ＣＯＯＮａ）
ｍＰＥＧ-ＰＬＡ-Ｔｏｃｏ及びＰＬＭＡ-ＣＯＯＮａの代わりに、製造例１４で得られた４ａｒｍ-ＰＬＡ-ＣＯＯＮａ及び製造例１０で得られたＴｏｃｏ-ＰＬＡ-ＰＥＯ-ＰＬＡ-Ｔｏｃｏを使用した他は実施例１の方法と同様にして、薬物含有組成物（組成物４）を製造した。前記実験結果を下記の表１に要約した。
【０１０１】
実施例５
薬物含有組成物
（組成物５：ドキソルビシン/ｍＰＥＧ-ＰＬＡ-Ｃｈｏｌ/ＰＬＭＡ-ＣＯＯＮａ）
ｍＰＥＧ-ＰＬＡ-Ｔｏｃｏの代わりに、製造例１１で得られたｍＰＥＧ-ＰＬＡ-Ｃｈｏｌを使用した他は実施例１の方法と同様にして、薬物含有組成物（組成物５）を製造した。
【０１０２】
実施例６
薬物含有組成物
（組成物６：エピルビシン/ｍＰＥＧ-ＰＬＡ-Ｔｏｃｏ/ＰＬＭＡ-ＣＯＯＮａ）
ドキソルビシンの代わりに、エピルビシンを使用した他は実施例１の方法と同様にして、薬物含有組成物（組成物６）を製造した。前記実験結果を下記の表１に要約した。
【０１０３】
実施例７
薬物含有組成物
（組成物７：Ｃａ２＋―固定パクリタキシェル/ｍＰＥＧ-ＰＬＡ-Ｔｏｃｏ/ＰＬＡ-ＣＯＯＮａ）
（１）パクリタキシェル-含有水溶液の製造
製造例１５で得られたＰＬＡ-ＣＯＯＮａの２４８.１ｍｇ,７.５ｍｇのパクリタキシェル、及び製造例７で得られたｍＰＥＧ-ＰＬＡ-Ｔｏｃｏの７４４.３ｍｇの混合物を５ｍｌのエタノールに完全に溶解して、透明な溶液を得た。エタノールを除去してパクリタキシェル-含有高分子組成物を得た。蒸溜水（６.２ｍｌ）を添加し、６０Ｃで３０分間攪拌して、パクリタキシェル-含有水溶液を得た。
【０１０４】
（２）２価金属イオンの固定
０.１２１ｍｌ（０.１０９ｍｍｏｌ）の０.９Ｍの無水塩化カルシウム水溶液を前記パクリタキシェル-含有水溶液に添加し、混合物を室温で２０分間攪拌した。前記混合物を０.２２μｍの気孔大きさを有するＰＶＤＦ膜フィルターを使用して濾過し、濾液を凍結乾燥して、使用するまで冷蔵庫に保管した。前記実験結果を下記の表１に要約した。
【０１０５】
実施例８
薬物含有組成物
（組成物８：Ｍｇ２＋―固定パクリタキシェル/ｍＰＥＧ-ＰＬＧＡ-Ｔｏｃｏ/ＰＬＭＡ-ＣＯＯＮａ）
製造例１２から得られたＰＬＭＡ-ＣＯＯＮａ（Ｍｎ：１,０９６）２４８.１ｍｇ、７.５ｍｇパクリタキシェル、製造例８のｍＰＥＧ-ＰＬＧＡ-Ｔｏｃｏの７４４.３ｍｇ、及び塩化マグネシウム６水和物（Ｍｗ：２０３.３１）０.５Ｍの水溶液０.２３０ｍｌ（０.１１３ｍｍｏｌ）を使用した他は実施例７の方法と同様にして、Ｍｇ２＋―固定パクリタキシェル-含有組成物を製造した。前記実験結果を下記の表１に要約した。
【０１０６】
実施例９
薬物含有組成物
（組成物９：Ｃａ２＋―固定パクリタキシェル/ｍＰＥＧ-ＰＬＡ-Ｔｏｃｏ/ＰＬＭＡ-ＣＯＯＮａ）
製造例１２から得られたＰＬＭＡ-ＣＯＯＮａ（Ｍｎ：１,０９６）２４８.１ｍｇ、７.５ｍｇパクリタキシェル、製造例７で得られたｍＰＥＧ-ＰＬＡ-Ｔｏｃｏ７４４.４ｍｇ、及び０.９Ｍの無水塩化カルシウム水溶液０.２３０ｍｌ（０.１１３ｍｍｏｌ）を使用した他は製造例７の方法と同様にして、Ｃａ２＋―固定パクリタキシェル-含有組成物を製造した。前記実験結果を下記の表１に要約した。
【０１０７】
実施例１０
薬物含有組成物
（組成物１０：Ｃａ２＋-固定パクリタキシェル/ｍＰＥＧ-ＰＬＡ-Ｃｈｏｌ/ＰＬＭＡ-ＣＯＯＮａ）
製造例１２で得られたＰＬＭＡ-ＣＯＯＮａ２４８.１ｍｇ、７.５ｍｇのパクリタキシェル、製造例１１で得られたｍＰＥＧ-ＰＬＡ-Ｃｈｏｌ７４４.４ｍｇ、及び０.９Ｍ無水塩化カルシウム水溶液０.２３０ｍｌ（０.１１３ｍｍｏｌ）を使用した他は製造例７の方法と同様にして、Ｃａ２＋―固定パクリタキシェル-含有組成物を製造した。前記実験結果を下記表１に示した。
【０１０８】
【表１】
2007536219.tif 000008
【０１０９】
実施例１１
薬物の細胞内伝達評価：細胞流動分析法
生物活性剤の細胞内伝達を測定するために、本発明によるドキソルビシン-含有組成物（実施例１で得られた組成物１）、及び従来のドキソルビシン製剤（ドキソルビシンヒドロクロライド水溶液、Free-Dox）をヒトの子宮癌細胞株、ＭＥＳ-ＳＡ（ドキソルビシン-敏感性細胞株）、及びＭＥＳ-ＳＡ/Ｄｘ-５（ドキソルビシン-抵抗性細胞株）に処理した。
【０１１０】
Walker（Experimental Cell Research 207: 142(1993)）に記載された方法により、FACStarPlus（Becton  Dickinson）を使用して、細胞流動分析を行った。前記方法を要約すれば、細胞（１.０×１０６）を１０％のウシ胎仔血清及び１％ペニシリンストレプトマイシンを添加したＭｃＣｏｙ´ｓ５Ａ培地（Invitrogen  Corp.）で培養した。２４時間培養後に、１.０μｇ/ｍｌの薬物組成物で前記細胞を処理した。１２×７５Falconチューブに含まれている細胞をFACStarPlusに置き、４８８ｎｍ（励起）及び５１９ｎｍ（放出）波長で蛍光を測定した。実験データをCell  Questソフトウェウで分析して、その結果を図３Ａ乃至図４Ｂ、及び要約された表２Ａ及び表２Ｂに示した。
【０１１１】
【表２Ａ】
2007536219.tif 000009
【０１１２】
【表２Ｂ】
2007536219.tif 000010
【０１１３】
図２Ａ乃至図３Ｂ、及び表２Ａ及び図２Ｂに示したように、従来の溶液製剤（Free-Dox）に比べて、本発明による組成物から細胞への前記薬物（組成物１）伝達がより効果的に行われた。特に、ドキソルビシンの細胞内伝達は、薬物-抵抗性細胞株で顕著であった。
【０１１４】
実施例１２Ａ
共焦点顕微鏡分析：ＭＥＳ-ＳＡ細胞内のドキソルビシン-含有組成物
生物活性剤の細胞内伝達を視覚化するために、本発明のドキソルビシン-含有組成物（実施例１で得られた組成物１）、及び従来のドキソルビシン製剤（ドキソルビシンヒドロクロライド、Free-Dox）をヒトの子宮癌細胞株、ＭＥＳ-ＳＡ（ドキソルビシン-敏感性細胞株）、及びＭＥＳ-ＳＡ/Ｄｘ-５（ドキソルビシン-抵抗性細胞株）に対して試験した。
【０１１５】
逆相蛍光顕微鏡が装着されたZeiss（Thornwood,  NY）ＬＳＭ５１０共焦点イメージ分析システム上で細胞をイメージ化した。簡略に説明すれば、細胞（３×１０５）を１０％のウシ胎仔血清及び１％ペニシリンストレプトマイシンを添加したＭｃＣｏｙ´ｓ５Ａ培地（Invitrogen  Corp.）を用いて、３７℃で一夜間、ガラスカバースライドで培養した。培養後に、１.０μｇ/ｍｌ容量を取り、薬物組成物で前記細胞を処理した。前記カバースライドを顕微鏡に乗せ、一定の時間間隔で４８４ｎｍ励起波長雰囲気で蛍光を測定した。その結果を図４Ａ乃至図４Ｄに示した。
【０１１６】
図４Ａ乃至図４Ｄに示す共焦点イメージは、細胞誘導分析結果を視覚化したものである：本発明によるドキソルビシン含有組成物で処理した場合、遥かに多量のドキソルビシンが細胞内に伝達された。図４Ａ乃至図４Ｄに示したように、左側の写真は、従来の溶液製剤で処理した後に得られた共焦点イメージであり、右側の写真は、本発明による組成物で処理した後に得られた共焦点イメージである。図４Ｂ及び図４Ｄに示したように、ミセル又はナノ粒子が細胞質及び核区画で探知された。
【０１１７】
実施例１２Ｂ
共焦点顕微鏡分析：ＭＣＦ-７細胞内のエピルビシン-含有組成物
生物活性剤の細胞内伝達を視覚化するために、本発明のエピルビシン-含有組成物（実施例６で得られた組成物６）、及び従来のエピルビシン製剤（エピルビシンヒドロクロライドの水溶液）を、ヒトの乳癌細胞株、ＭＣＦ-７（エピルビシン-敏感性細胞株）、及びＭＣＦ-７/ＡＤＲ（エピルビシン-抵抗性細胞株）に処理した。
【０１１８】
ＭｃＣｏｙ´ｓ５Ａ培地（Invitrogen  Corp.）の代わりに、ＲＰＭＩ培地（Invitrogen  Corp.）を使用したことを除いては、実施例１２Ａの方法と同様にして、共焦点イメージを得た。その実験結果を図４Ｅ乃至図４Ｈに示した。
【０１１９】
図４Ｅ乃至図４Ｈに示す共焦点イメージは、細胞誘導分析結果を視覚化したものである：本発明によるエピルビシン含有組成物で処理した場合、遥かに多量のエピルビシンが細胞内に伝達された。図４Ｅ乃至４Ｈに示したように、左側の写真は、従来の溶液製剤で処理した後に得られた共焦点イメージであり、右側の写真は、本発明による組成物で処理した後に得られた共焦点イメージである。図４Ｆ及び図４Ｈに示したように、ミセル又はナノ粒子が細胞質及び核区画で探知された。
【０１２０】
実施例１３
試験管内（In  vitro）細胞毒性
本発明による組成物の試験管内細胞毒性を研究するために、本発明によるドキソルビシン-含有組成物（実施例１による組成物１,Ｄｏｘｏ-ＰＮＰ）、及び従来のドキソルビシン製剤（ドキソルビシン塩酸水溶液、Free-Dox）を、ヒトの子宮癌細胞株、ＭＥＳ-ＳＡ（ドキソルビシン-敏感性細胞株）、及びＭＥＳ-ＳＡ/Ｄｘ-５（ドキソルビシン-抵抗性細胞株）に処理した。細胞の毒性を試験するよく知られた方法はＭＴＴ分析法である。ＭＴＴ（methylthiazoletetrazolium）で細胞を処理した場合、生きている細胞にのみ存在する酵素によってＭＴＴ-テトラゾリウムが還元されてＭＴＴ-フォルマザンが生成される（死んだ細胞は、ＭＴＴ-テトラゾリウムをＭＴＴ-フォルマザンに還元できない）。蛍光判読機でＭＴＴ-フォルマザンの蛍光を探知するが、前記光学密度は細胞数と相関性がある。このような過程は自動化されており、細胞生存性及びＩＣ５０（５０％細胞成長阻害濃度）数値をマイクロプレートリーダーに装着されたソフトウェアで計算する。
【０１２１】
各組成物の細胞毒性を、ヒトの癌細胞株で、前記組成物を０.０１乃至１００μｇ/ｍｌの濃度範囲となるように希釈して試験した。以降３日間露出させ、細胞をＭＴＴで処理した。生きている細胞内に存在する酵素によってＭＴＴテトラブリウムが還元されて生成されたＭＴＴ-ホルマザンを、蛍光判読機で測定した。前記光学密度は細胞数と相関性がある。２回の独立的実験の結果を、各細胞株のＩＣ５０（５０％阻害濃度）で示した。Carmichael等（Cancer Research 47: 936(1987)）の方法によってＭＴＴ実験を行った。要約すれば、１０％のウシ胎仔血清及び１％ペニシリンストレプトマイシンを添加したＭｃＣｏｙ´ｓ５Ａ培地（Invitrogen  Corp.）で培養した指数細胞を収穫し、計数し、９６のウエルの平底マイクロプレートで培養した（１００細胞懸濁液、各細胞株に対して５×１０４細胞/ｍｌの濃度）。細胞が指数増殖を再び開始するように２４時間置いた後、培養培地（プレート当り２４対照ウエル）又は薬物を含む培養培地を前記ウエルに添加した。各薬物濃度で３回行った。３日間持続的に薬物に露出させた後に、細胞を、滅菌水中２５μｌのＭＴＴ溶液（２ｍｇ/ｍｌ）で処理した。５４９ｎｍ波長で自動マイクロプレート判読機（automatic microplate reader, SpectraMax 190, Molecular Devices）を使用して蛍光を測定し、生存細胞の数を光学密度から計算した。細胞生存研究の結果を図５Ａ及び図５Ｂに示し、各細胞株のＩＣ５０値を表３に要約した。
【０１２２】
【表３】
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【０１２３】
図５Ａに示したように、ドキソルビシン-敏感性細胞に対する細胞毒性は二つの組成物において類似していたが、図５Ｂに示したように、ドキソルビシン-抵抗性細胞株に処理して３日経過後に、従来の製剤に比べて、本発明の薬物組成物が６.７倍高い活性を示した。前記活性の差は、Ｐ-糖蛋白質（Ｐ-ｇｐ）が過剰発現されて、細胞毒性薬物を細胞から継続して排出する、薬物-抵抗性細胞株の特性に起因する。遊離された薬物は、薬物-抵抗性細胞内に濃縮されないので、このような結果は、薬物担体に封入された薬物と共に本発明の薬物担体が細胞に伝達されることを意味する。
【０１２４】
実施例１４
ネズミで薬理力学実験
本発明によるドキソルビシン-含有組成物（実施例１乃至５で得られた組成物１乃至５）及び従来のドキソルビシン製剤（ドキソルビシンヒドロクロライド水溶液、Free-Dox）を７-乃至８-週齢のSprague-Dawleyネズミ（２００〜２５０ｇ）に静脈注射し、血漿内薬物濃度を測定した。
【０１２５】
ネズミ（各製剤当り５匹）に５ｍｇ/ｋｇの投与量で尻尾を通して静脈注射した。薬物注入後、１、５、１５、３０分、及び１、２、４、８、及び２４時間経過後に、尻尾静脈から血液サンプルを得た。前記血液サンプルを直ちに遠心分離し、血漿を分離した。血漿サンプルが分析されるまで、-５０℃で保管した。ドキソルビシン分析は、実施例１に記載されたＨＰＬＣ分析法によって行った。
【０１２６】
血液濃度-時間曲線（C-t  curve）を図６に示したが、線状梯形公式を使用して前記曲線の下面積（ＡＵＣ）を計算し、その結果を表４に要約した。
【０１２７】
【表４】
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【０１２８】
前記で言及された例は、本発明の一例として提示したことに理解されるべきのものである。本発明の思想及び範囲から外れずに多様な変形と変化を行うことができる。最も実用的であり好ましい例とともに、図面及び詳細な説明に詳しく本発明を説明しているが、提示された原理及び基本概念から外れない限り、多様な変形を遂行することができることは本発明が属する技術分野の当業者に明白なことであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】本発明の組成物を投与した後に、体液から生物活性剤が細胞内に伝達されることを示す模式図である。
【図２Ａ】ドキソルビシン-敏感性細胞（ＭＥＳ-ＳＡ）を薬学組成物で処理した後に、薬物が細胞内に伝達された細胞の数を示すものである。
【図２Ｂ】ドキソルビシン-抵抗性細胞（ＭＥＳ-ＳＡ/Ｄｘ-５）を薬学組成物で処理した後に、薬物が細胞内に伝達された細胞の数を示すものである。
【図３Ａ】ドキソルビシン-敏感性細胞（ＭＥＳ-ＳＡ）を薬学組成物で処理した後に、ＦＡＣＳで探知した蛍光の強さを示すものである。
【図３Ｂ】ドキソルビシン-抵抗性細胞（ＭＥＳ-ＳＡ/Ｄｘ-５）を薬学組成物で処理した後に、ＦＡＣＳで探知した蛍光の強さを示すものである。
【図４Ａ】ドキソルビシン-敏感性細胞（ＭＥＳ-ＳＡ）を、ドキソルビシン-含有組成物（組成物１,右側）と従来の溶液製剤（左側）で処理し、２時間後に得られた共焦点顕微鏡イメージを示す。
【図４Ｂ】ドキソルビシン-敏感性細胞（ＭＥＳ-ＳＡ）を、ドキソルビシン-含有組成物（組成物１,右側）と従来の溶液製剤（左側）で処理し、８時間後に得られた共焦点顕微鏡イメージを示す。
【図４Ｃ】ドキソルビシン-抵抗性細胞（ＭＥＳ-ＳＡ/Ｄｘ-５）を、ドキソルビシン-含有組成物（組成物１,右側）と従来の溶液製剤（左側）で処理し、２時間後に得られた共焦点顕微鏡イメージを示す。
【図４Ｄ】ドキソルビシン-抵抗性細胞（ＭＥＳ-ＳＡ/Ｄｘ-５）を、ドキソルビシン-含有組成物（組成物１,右側）と従来の溶液製剤（左側）で処理し、８時間後に得られた共焦点顕微鏡イメージを示す。
【図４Ｅ】エピルビシン-敏感性細胞（ＭＣＦ-７）を、エピルビシン-含有組成物（組成物６）及び従来の溶液製剤で処理し、２時間後に得られた共焦点顕微鏡イメージを示す。
【図４Ｆ】エピルビシン-敏感性細胞（ＭＣＦ-７）を、エピルビシン-含有組成物（組成物６）及び従来の溶液製剤で処理し、８時間後に得られた共焦点顕微鏡イメージを示す。
【図４Ｇ】エピルビシン-抵抗性細胞（ＭＣＦ-７/ＡＤＲ）を、エピルビシン-含有組成物（組成物６）及び従来の溶液製剤で処理し、２時間後に得られた共焦点顕微鏡イメージを示す。
【図４Ｈ】エピルビシン-抵抗性細胞（ＭＣＦ-７/ＡＤＲ）を、エピルビシン-含有組成物（組成物６）及び従来の溶液製剤で処理し、８時間後に得られた共焦点顕微鏡イメージを示す。
【図５Ａ】ドキソルビシン-敏感性細胞（ＭＥＳ-ＳＡ）を薬学組成物（０.１μｇ/ｍｌ）で処理した後の細胞生存を示すものである。
【図５Ｂ】ドキソルビシン-抵抗性細胞（ＭＥＳ-ＳＡ/Ｄｘ-５）を薬学組成物（１.０μｇ/ｍｌ）で処理した後の細胞生存を示すものである。
【図６】ネズミに本発明の薬学組成物を静脈注射した後の、血漿内薬物濃度を示すものである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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