(57)【要約】  血清中におけるＧＰ７３レベルの上昇は、肝細胞癌の診断に役立つ。また、経時的な血清ＧＰ７３レベルの増加は、この病気の危険性がある被検体における肝細胞癌の発症をも示し得る。
2007506945.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体のＨＣＣを診断する方法において、
（１）ＨＣＣに罹患している疑いのある被検体から血清試料を得、
（２）該血清試料中におけるＧＰ７３又はその断片のレベルを決定し、及び
（３）該血清試料中におけるＧＰ７３又はその断片のレベルと、対照におけるＧＰ７３の血清レベルとを比較することを含み、
該対照に対する該血清試料中ＧＰ７３又はその断片レベルの上昇が、該被検体がＨＣＣに罹患したことを示す、
被検体のＨＣＣを診断する方法。
【請求項２】
血清試料中におけるＧＰ７３又はその断片のレベルが、対照におけるＧＰ７３のレベルに対して、少なくとも２倍上昇する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血清試料中におけるＧＰ７３又はその断片のレベルが、対照におけるＧＰ７３又はその断片のレベルに対して、少なくとも３倍、少なくとも４倍又は少なくとも５倍上昇する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
血清試料中におけるＧＰ７３又はその断片のレベルが、対照におけるＧＰ７３又はその断片のレベルに対して、少なくとも６倍、少なくとも７倍又は少なくとも８倍上昇する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
血清試料中におけるＧＰ７３又はその断片のレベルを生体分子相互作用検定法によって検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
生体分子相互作用検定法が免疫学的検定法である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
免疫学的検定法が、ウエスタンブロット分析、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫蛍光検定法、化学発光検定法又は酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）よりなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
血清試料中におけるＧＰ７３又はその断片のレベルをアプタマーによって検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
血清試料中におけるＧＰ７３又はその断片のレベルを抗体によって検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
抗体がポリクローナル又はモノクローナル抗ＧＰ７３抗体を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
抗体が抗体断片を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ＨＣＣを発症する危険性のある被検体を監視する方法において、
（１）被検体から少なくとも第１血清試料を第１時点で得、そして少なくとも第２血清試料を第２時点で得、及び
（２）該第１及び第２血清試料中におけるＧＰ７３又はその断片のレベルを決定すること
を含み、
該第１血清試料中におけるＧＰ７３又はその断片のレベルに対する、該第２血清試料中におけるＧＰ７３又はその断片のレベルの増加が、該被検体がＨＣＣを発症したことを示す、
ＨＣＣを発症する危険性のある被検体を監視する方法。
【請求項１３】
第２血清試料中におけるＧＰ７３又はその断片のレベルが、第１血清試料中におけるＧＰ７３又はその断片のレベルに対して、少なくとも２倍上昇する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
第２血清試料中におけるＧＰ７３又はその断片のレベルが、第１血清試料中におけるＧＰ７３又はその断片のレベルに対して、少なくとも３倍、少なくとも４倍又は少なくとも５倍上昇する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
第２血清試料中におけるＧＰ７３又はその断片のレベルが、第１血清試料中におけるＧＰ７３又はその断片のレベルに対して、少なくとも６倍、少なくとも７倍又は少なくとも８倍上昇する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
血清試料中におけるＧＰ７３又はその断片のレベルを生体分子相互作用検定法によって検出する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
血清試料中におけるＧＰ７３又はその断片のレベルをアプタマーによって検出する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
生体分子相互作用検定法が免疫学的検定法である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
免疫学的検定法が、ウエスタンブロット分析、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫蛍光検定法、化学発光検定法又は酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）よりなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
血清試料中におけるＧＰ７３又はその断片のレベルを抗体によって検出する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
抗体がポリクローナル又はモノクローナル抗ＧＰ７３抗体を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
抗体が抗体断片を含む、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
米国政府補助金への言及
ここに記載される発明は、一部、ＮＩＨ／ＮＣＩ補助金５Ｕ０１ＣＡ９４９５１−０４からの援助でなされた。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、血清中で肝細胞癌（ＨＣＣ）の生物学的マーカーを検出することによって、特に血清中でのＧＰ７３蛋白質の検出によって、ＨＣＣを診断することに関する。また、本発明は、血清中のＧＰ７３レベルの評価により、ＨＣＣの発症について患者を監視することに関するものでもある。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ＨＣＣは、世界中で５番目に多く蔓延している癌である。しかしながら、この病気は、多くの場合、治療が無効であるため、ＨＣＣは、世界中の癌死亡率の主原因の第３位であり、診断後の５年生存率は５パーセント未満である。
【０００４】
ＨＣＣの主要な病因は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）又はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のいずれかによる慢性感染である。この高リスク集団におけるＨＢＶ又はＨＣＶ感染とＨＣＣの発症との間の長い潜伏期間は、重大な病状の発症前に、早期発見のためのよい機会を与える。従って、ＨＣＣの危険性がある集団は、病気のバイオマーカーが利用できるようになると、これらについて監視できる。さらに、さらに多くの治療法の選択肢が利用できるようになるときに、患者の予後を改善させるにはＨＣＣの早期発見が重要である。
【０００５】
近年、ＨＣＣの疾病状態は、物理的評価である肝臓の超音波画像診断又はマーカーパネルについての血清分析によって典型的に監視されている。α−胎児性蛋白質（ＡＦＰ）レベルの上昇とＨＣＣの出現との間には良好な相関があるため、ＡＦＰレベルの決定が、しばしば病気の血清マーカーとして含まれる。しかしながら、ＨＣＣの唯一の指標としてのＡＦＰは効果が限られている。というのは、この蛋白質は、多くの場合、重大な病気が存在しないときに上昇するからである。ＨＣＶ関連ＨＣＣの検出に際してのその値は、さらに明確さに乏しい。それにもかかわらず、ＡＦＰとＨＣＣとの間の限られた相関でさえも、肝臓疾患のバイオマーカー源としての血清の可能性を明確に示している。
【０００６】
ＨＢＶ及びＨＣＶキャリアの臨床的性質は、一般に、４つの臨床カテゴリー：不活性、活性、肝硬変及びＨＣＣに分類できる。与えられるカテゴリーは、必ずしもその次の前駆状態であるわけではないが、ＨＣＣは、感染した被検体における肝臓疾患の進行の末期であるとみなされ得る。早期発見及び病気の予後を助成するために、血清分子マーカー（ポリペプチド、糖脂質及びプロテオグリカン）であってその数度がこれらの臨床カテゴリーと相関するものの同定が非常に望ましいであろう。
【０００７】
ＧＰ７３は、ウイルス性肝炎患者の肝細胞内で高レベルに発現するゴルジII型膜貫通蛋白質である（Ｋｌａｄｎｅｙ外，２０００，Ｇｅｎｅ  ２４９，５３−６５）。ＧＰ７３は、胆管上皮細胞内で構成的に発現し、そして正常の肝細胞内で最小に発現する。対照的に、巨細胞性肝炎患者の肝臓は、多核肝細胞内でＧＰ７３に対する強い免疫反応性を示す。ＧＰ７３のｍＲＮＡ及び蛋白質は、アデノウイルスを含むウイルスの感染後に、高度に分化したＨｅｐＧ２肝細胞癌細胞内で発現する。ＧＰ７３はゴルジ膜貫通蛋白質であるため、損傷を受けた又は罹病した肝臓を有する患者でさえも、血清中に有意な量で存在することは予期されない。
【０００８】
ウイルス性の原因（ＨＢＶ、ＨＣＶ）又は非ウイルス性の原因（アルコール誘発肝臓病、自己免疫性肝炎）による肝臓病において、全器官レベルでのＧＰ７３の増加が認められた。Ｋｌａｄｎｅｙ外，２００２，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３５（６）：１４３１−４０を参照されたい。ＧＰ７３の肝細胞での発現は、病因にもかかわらず、罹病した肝臓では調節されないのに対し、胆管上皮細胞での発現はさほど変化しない。
【０００９】
これらの報告は興味深いが、肝臓細胞内でのＧＰ７３の検出は、患者が苦痛を伴い且つ不都合な肝生検を受けることを必要とする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、必要なのは、肝炎ウイルス感染が原因の肝臓病及び損傷の程度を決定するための単純且つ迅速な検定法である。ＨＣＣのバイオマーカー用の血清検定法がその速さ及び単純さを与えるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の概要
被検体の血清中における高レベルのＧＰ７３又はその断片の存在は、該被検体がＨＣＣに罹っているのか又はそれを発症しているのかどうかを示す。非癌性又は前癌性肝臓疾患は、ＧＰ７３の血清レベルの上昇を生じさせるようには見えない。
【００１２】
従って、本発明は、被検体におけるＧＰ７３、ＧＰ７３の断片又はその両方の血清レベルを、対照におけるＧＰ７３又はＧＰ７３の断片の血清レベルに対して決定することを含む、被検体におけるＨＣＣの検査方法を提供する。被検体における血清ＧＰ７３、ＧＰ７３断片又はその両方のレベルの上昇は、該被検体がＨＣＣに罹患していることを示す。
【００１３】
また、本発明は、ＨＣＣを発症する危険性のある被検体を監視する方法において、該被検体におけるＧＰ７３、ＧＰ７３の断片又はその両方の血清レベルを少なくとも２つの時点にわたって決定することを含む被検体の監視方法も提供する。より早い時点に対する、被検体における血清ＧＰ７３、ＧＰ７３断片又はその両方の増加は、該被検体がＨＣＣを発症したことを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
略語
本明細書においては、次の略語を使用している：
ＡＦＰ：α−胎児性蛋白質
ＡＬＴ：アラニンアミノトランスフェラーゼ
ＡＮＯＶＡ：分散分析
ＡＳＴ：アスパラギントランスアミナーゼ
ＡＵＲＯＣ：ＲＯＣ曲線下面積
ＥＣＬ：向上した化学発光
ＥＬＩＳＡ：酵素免疫測定法
ＧＳＴ：グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
ＨＢＶ：Ｂ型肝炎ウイルス
ＨＢｓＡｇ：ＨＢＶ表面抗原
ＨＣＣ：肝細胞癌
ＨＣＶ：Ｃ型肝炎ウイルス
ＨＩＶ：ヒト免疫不全ウイルス
ＭＥＬＤ：末期肝臓病評点用のモデル
ＲＩＡ：放射免疫測定法
ＲＯＣ：受信者動作特性
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法
【００１５】
図１は、ＨＣＶに感染した患者におけるＧＰ７３の免疫ブロット分析である。「ＧＰ７３」の印のある上のパネルは、次のものに対する抗ＧＰ７３ウサギポリクローナル抗体による免疫ブロット分析を示している：ＨＣＣ組織溶解物（レーン１及び２；２５μｇ／レーン）、肝硬変組織溶解物（レーン３及び４；２５μｇ／レーン）及び２名のＨＣＶ感染したＨＣＣ患者からの血清（レーン５及び６；１μＬ／レーン）。「アクチン」の印のある下のパネルは、上のパネルにおいて示された同一のブロットであるが、ただし、これは、取り除かれ、次いで蛋白質ローディング用の対照としてアクチンを再プローブとした後のものを表している。
【００１６】
図２Ａ及び図２Ｂは、次のヒト被験者：ＨＢＶ陰性（Ａ群）、不活性感染のＨＢＶキャリア（Ｂ群）、活性感染のＨＢＶキャリア（Ｃ群）、ＨＢＶ関連ＨＣＣ（Ｄ群）、ＨＣＶ陰性（１群）、慢性ＨＣＶ感染（２群）、ＨＣＶ関連肝硬変（３群）、ＨＣＶ関連ＨＣＣ（４群）から得られたヒト血清（０．５μＬ）に対する抗ＧＰ７３特異的抗体による免疫ブロット分析の結果を示している。同定の目的のためにそれぞれの研究被験者に割り当てられた番号がそれぞれのレーンの上に示されている。ＨＣＶ陰性、ＨＩＶ陰性及びＨＢＶ陰性の被験者（Ｓ）からの市販のプール血清を正常の対照のために使用した。
【００１７】
図３Ａ及び３Ｂは、図２Ａ及び２Ｂの免疫ブロット像のデンシトメトリー分析の結果を示している。
【００１８】
図４Ａ及び図４Ｂは、ＨＣＶ関連肝臓疾患の患者及び対照の患者におけるＧＰ７３（図４Ａ）血清レベル及びα−胎児性蛋白質（ＡＦＰ）（図４Ｂ）血清レベルを測定する研究の結果を示している。示されたＧＰ７３レベルは、対照の血清（シグマ社）で測定されたＧＰ７３レベルにまで正常化される。ＡＦＰレベルは、ｎｇ／ｍＬの血清として報告されている。誤差バーは、標準誤差を表している。
【００１９】
図５Ａ及び５Ｂは、図４Ａ及び４Ｂのデータに基づいて作成された受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を表している。ＧＰ７３及びＡＦＰについてのＲＯＣ下面積（ＡＵＲＯＣ）曲線は、挿入で示されている。
【００２０】
発明の詳細な説明
ＧＰ７３は、機能が知られていない４００個のアミノ酸のゴルジII型膜蛋白質であり、およそ７３ｋＤａの見掛けの分子量を有する（Ｋｌａｄｎｅｙ外，２０００，Ｇｅｎｅ２４９，５３−６５）。ＧＰ７３のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列は、Ｋｌａｄｎｅｙ外，２０００（前出）及びＧｅｎＢａｎｋ登録Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ２３６０５６に開示されている。これらの開示の全体は、引用によってここに加入するものとする。３０４２塩基対を含み且つ１２００塩基対の単一のオープンリーディングフレームを含有する全長ＧＰ７３ｃＤＮＡは、ここでは、配列番号１と表す。ＧＰ７３のアミノ酸配列は、ここでは、配列番号２と表す。
【００２１】
現在、ＧＰ７３及びおよそ２５ｋＤａ±５ｋＤａの分子量を有するポリペプチド（これはＧＰ７３特異的抗体と交差反応する）のかなりの量がＨＣＣの個体の血清中に存在することが分かっている。当業者であれば、ＧＰ７３特異的抗体と交差反応するほぼ２５ｋＤａ±５ｋＤの分子量を有するポリペプチドがＧＰ７３の断片であることを合理的に予期するであろう。肝臓疾患若しくは肝臓感染症を有しない個体又は非癌性若しくは前癌性肝臓疾患を有する個体は、それらの血清中にＧＰ７３又はＧＰ７３断片をほとんど又は全く有しない。予め非癌性又は前癌性肝臓疾患であると診断された個体の血清中にＧＰ７３又はＧＰ７３断片が出現することは、該肝臓疾患が癌状態に進行したことを示している。内在ゴルジ膜貫通蛋白質としてのＧＰ７３の初期の特徴に基づけば、ＧＰ７３が、罹病した又は損傷を受けた肝臓を有する患者においてさえも、循環において見出されるうることは予期されなかった。この開示全体を通して、検出可能な分子的実体としてのＧＰ７３に対する任意の言及は、全長ＧＰ７３蛋白質並びに任意の及び全てのＧＰ７３ポリペプチド断片を包含することを意味する。
【００２２】
従って、本発明は、ＨＣＣに罹患している疑いのある被検体のＨＣＣを診断する方法を提供する。この診断方法は、該被検体から血清試料を得、そして該血清試料のＧＰ７３レベルと対照の血清ＧＰ７３レベルとを比較することを含む。対照と比較して、該被検体からの血清試料中におけるＰ７３レベルの上昇は、該被検体がＨＣＣに罹患していることを示す。
【００２３】
対照と比較して、被検体からの血清試料中におけるＧＰ７３の「レベルの上昇」とは、単位容量又は単位質量当たりのＧＰ７３蛋白質の量が、対照よりも被検体の血清試料中の方が多いことを意味する。このＧＰ７３レベルは、単位容量又は単位質量当たりの蛋白質の質量の絶対単位で、例えば、ピコグラム／μＬとして表され得る。また、ＧＰ７３レベルは、対照の試料に対して決定されるような任意の単位、例えば蛍光単位又はデンシトメトリー単位でも表され得る。以下の実施例では、ＧＰ７３レベルは、任意のデンシトメトリー単位で表されている。
【００２４】
ＧＰ７３のいかなるレベルの上昇も本発明の実行において病気の前兆となり得るが、好ましくは、被検体の血清試料中におけるＧＰ７３蛋白質レベルは、対照におけるＧＰ７３レベルよりも少なくとも２倍、例えば、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、又は少なくとも８倍大きい。
【００２５】
本明細書において使用するときに、「被検体」とは、ＨＣＣに罹患していることが疑われる任意の動物である。好ましくは、この被検体は、ほ乳類、例えば、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ科、ネコ科、齧歯類又は霊長類である。より好ましくは、被検体は、齧歯類、例えば、マウス又はラットである。さらに好ましくは、被検体は、霊長類、例えば、ヒトである。特に好ましい具体例では、被検体はヒトである。
【００２６】
本明細書において使用するときに、「血清試料」とは、血清を含む任意の生物学的試料である。本方法において使用するための血清試料は、その他の成分、特に血液成分を含有し得るものとする。従って、本発明の目的上、全血液試料、又は部分的にしか分画若しくは分離されていないが、なお血清を含有する血液試料は、「血清試料」であるとみなされる。当業者であれば、例えば、慣用の採血技術を使用することによって容易に血清試料を得ることができる。さらに、血清試料中の防腐剤、抗凝血剤又はその他の化学剤の存在は、ＧＰ７３の検出を妨げてはならない。また、ここで使用するときに、「血清試料」は、対照試料をも包含する。
【００２７】
ここで使用するときに、「対照」又は「対照試料」とは、少なくとも１の個体であって任意の肝炎感染について検査で陰性との結果がでたもの又はＨＣＣ若しくは任意のその他の肝臓疾患に罹っていないものから得られた１種以上の血清試料をいう。好ましくは、該対照又は対照血清試料は、少なくとも１の個体であって任意の肝炎感染について検査で陰性の結果がでたもの及びＨＣＣ又は任意のその他の肝臓疾患に罹っていないものから得られる。特に好ましい具体例では、対照は、個体の集団であって任意の肝炎感染について検査で陰性がでたもの及びＨＣＣ又は任意の他の肝臓疾患に罹っていないものから得られた血清試料を含む。該対照が複数の血清試料を含むときに、血清ＧＰ７３レベルは、それぞれの血清試料中で測定されるＧＰ７３レベルの相加平均、中央値、最頻値又はその他の好適な統計的尺度として表され得る。また、複数の対照血清試料はプールすることもでき、そしてこのプールされた試料のＧＰ７３レベルを決定し、被検体の血清試料と比較できる。
【００２８】
当業者であれば、例えば、慣用の採血技術によって又はＨＣＣ若しく任意の肝臓疾患に罹っていない個体由来の市販の血清試料を得ることによって容易に対照血清試料を得ることができる。本方法において対照として使用するのに好適な市販血清試料は、例えば、シグマ・ケミカル社（ミズーリ州セントルイス）から得られる。
【００２９】
例えば、ＧＰ７３特異的生体分子相互作用のような、血清ＧＰ７３レベルを検出するために好適な任意の技術を本方法と共に使用することができる。その例としては、抗体ベースの検定法、アプタマーベースの検定法、受容体及びリガンド検定法、酵素活性検定法及びアロステリック調節結合検定法が挙げられるが、これらに限定されない。血清試料中の蛋白質濃度を検出するための技術は当業者の技術内にある。好ましくは、ＧＰ７３レベルは、ウエスタンブロット分析、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫蛍光検定法、化学発光検定法又は酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）のような免疫学的検定法によって検出される。本方法に使用するのに好適な免疫学的検定法は、例えば、米国特許第５９７６８０９号、同５９６５３７９号、同５５７１６８０号、同５２７９９５６号及び同６５７９６８４号に記載されている。これらの開示の全体は、引用によってここに加入するものとする。
【００３０】
ウエスタンブロット分析による血清ＧＰ７３レベルの検出は、例えば、Ｋｌａｄｎｅｙ外，２００２，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３５：１４３１−１４４０（この開示の全体は、引用によってここに加入するものとする。）及び以下の実施例に記載されている。
【００３１】
血清試料中のＧＰ７３レベルを検出ために使用される抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を含むことができる。この抗体は、そのままの抗体又はＧＰ７３蛋白質に特異的に結合し得る抗体断片を含むことができる。このような断片としては、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ'）2断片が挙げられるが、これらに限定されない。しかして、ここで使用されるときに、用語「抗体」には、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方が含まれる。用語「抗体」は、そのままの抗体分子を意味するだけでなく、抗原結合能を保持するそれらの断片をも包含する。
【００３２】
適切なポリクローナル抗体は、適切な宿主動物をＧＰ７３蛋白質で免疫化し、そしてその抗血清を当業者に周知の慣用技術に従って集め、そして精製することによって調製できる。ポリクローナル抗ＧＰ７３抗体の調製法は、例えば、Ｋｌａｄｎｅｙ外，２０００（前出）に記載されている。
【００３３】
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５４：４９３−４９７（１９７５）の古典的な技術に従い、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔ外著，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク及びロンドン（１９８０）のような後期の研究でさらに詳しく述べられているように調製できる。これらの開示の全体は、引用によってここに加入するものとする。
【００３４】
血清ＧＰ７３レベルは、抗体ベースの検定法に非常に類似するが、ただし、抗体の代わりにアプタマーを使用するアプタマーベースの検定法によって検出できる。さらに、アプタマーベースの検定法は、核酸の増幅（例えば、ＰＣＲ）及び検出検定法（例えば、ハイブリダイゼーションブロット法）がＧＰ７３の検出にも使用できるという点で、より幅広い。アプタマーは、生化学的活性又は分子認識特性の点で有用な生物学的活性を有する任意のポリヌクレオチド、一般にはＲＮＡ又はＤＮＡであることができる。通常、アプタマーは、酵素活性を有するような又はある種のポリペプチドに該ポリペプチドの特定の領域（即ち、抗体に対するエピトープに類似する）で結合するような分子活性を有する。一般的には、アプタマーは、インビトロセレクション法によって作製できることが知られている。
【００３５】
インビトロセレクション法としては、指数関数的富化によるリガンドの系統的進化（systematic evolution of ligand by exponential enrichment：ａ．ｋ．ａ．ＳＥＬＥＸ）と呼ばれる周知の方法が挙げられる。簡単に言えば、インビトロセレクション法は、ポリペプチドのような生体分子に結合し又は検出可能な特定の活性を有する特定のポリヌクレオチドについてランダムポリヌクレオチドのプールをスクリーニングすることを伴う。一般に、この特定のポリヌクレオチドは、該プールの非常に小さな画分に相当するため、通常ポリメラーゼ連鎖反応を介した増幅ラウンドを使用して有用かもしれないアプタマーの発現量を増大させる。選択（セレクション）及び増幅の連続ラウンドを使用して特定のアプタマーの存在量を指数関数的に増加させる。インビトロセレクション法は、Ｆａｍｕｌｏｋ，Ｍ．；Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１９９２，１０４，１００１（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１９９２，３１，９７９−９８８）；Ｆａｍｕｌｏｋ，Ｍ．；Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ＤＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第７巻，Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ著，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，ベルリン，１９９３，ｐｐ．２７１；Ｋｌｕｇ，Ｓ．；Ｆａｍｕｌｏｋ，Ｍ．，Ａｌｌ  ｙｏｕ  ｗａｎｔ  ｔｏ  ｋｎｏｗ  ａｂｏｕｔ  ＳＥＬＥＸ；Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｓ  １９９４，２０，９７−１０７；及びＢｕｒｇｓｔａｌｌｅｒ，Ｐ．；Ｆａｍｕｌｏｋ，Ｍ．Ｓｙｔｈｅｔｉｃ  ｒｉｂｏｚｉｍｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｚｙｍｅ；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１９９５，１０７，１３０３−１３０６（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１９９５，３４，１１８９−１１９２）、米国特許第６２８７７６５号、同６１８０３４８号、同６００１５７０号、同５８６１５８８号、同５５６７５８８号、同５４７５０９６号及び同５２７０１６３号に記載されている。これらの開示の全体は、引用によってここに加入するものとする。
【００３６】
ポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体を生じさせるための免疫原として、又はアプタマーを選択するための基質として使用できる実質的に純粋なＧＰ７３は、例えば、組換えＤＮＡ方法によって調製できる。例えば、配列番号１のｃＤＮＡを、当該技術分野の範囲内にある技術によって発現ベクターにクローン化できる。次いで、ＧＰ７３をコードする配列を含む発現ベクターを、適切な、例えば細菌の宿主に導入する。そうすると、ＧＰ７３が発現する。次いで、この発現したＧＰ７３を任意の好適な技術によって単離できる。
【００３７】
例えば、ＧＰ７３蛋白質は、細菌で発現するグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合蛋白質として調製できる。このような融合蛋白質は、市販の発現系を使用し、標準的な発現プロトコール、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９０）の「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，補遺１０，単元１６．７並びにＳｍｉｔｈ及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ６７：３４−４０（１９８８）；Ｆｒａｎｇｉｏｎｉ及びＮｅｅｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１０：１７９−１８７（１９９３）に従って調製できる。これらの開示の全体は、引用によってここに加入するものとする。
【００３８】
簡単に言えば、ＧＰ７３をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号１）を、ｐＧＥＸ２Ｔベクターに正確なリーディングフレームでサブクローニングし、そしてＥ．ｃｏｌｉ細胞に導入する。３７℃で１２〜１５時間のインキュベーション後にＬＢ／アンピシリンプレート上で形質転換体を選択する。次いで、選択された形質転換体を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドを含有する液体培地中で増殖させてＧＰ７３融合蛋白質の発現を誘導する。これらの細胞を遠心分離によって該液体培地から集め、該細菌ペレットを再懸濁し、そして超音波処理して細胞を溶解させる。
【００３９】
ＧＳＴ−ＧＰ７３融合蛋白質を単離するために、次いで該溶解液をグルタチオン−アガロースビーズと接触させる。ＧＳＴ−ＧＰ７３融合蛋白質を結合させるビーズを遠心分離によって集め、そしてＧＳＴ−ＧＰ７３融合蛋白質を溶離させる。ＧＳＴアガロースビーズを、該融合蛋白質をトロンビン開裂用緩衝液で処理することによって除去する。解放されたＧＰ７３蛋白質を回収し、そしてこれを使用して上記のように抗体を生じさせる。
【００４０】
また、ＧＰ７３に対する抗体を、全ＧＰ７３蛋白質の免疫原性断片、特に、該分子のカルボキシ末端に相当するペプチドで適切な宿主を免疫化することによって生じさせることもできる。ＧＰ７３蛋白質の断片は、単離されたＧＰ７３蛋白質の化学的開裂又は酵素的開裂によって得られ得る。別法として、ＧＰ７３蛋白質断片は、配列番号２の小さな（例えば、７〜１０個のアミノ酸）配列の化学合成によって得られ得る。
【００４１】
好ましくは、本方法で使用するための抗ＧＰ７３抗体は、検出可能な標識を含む。この検出可能な標識は、一次抗ＧＰ７３抗体に直接結合できる。また、検出可能標識は、抗ＧＰ７３抗体と、検出可能標識を保有する二次抗体、例えば、ヤギ抗ウサギＩｇＧとを反応させることによって該抗ＧＰ７３抗体に間接的に結合することもできる。
【００４２】
検出可能標識は、例えば、放射免疫測定法の場合には放射性核種、免疫蛍光検定法の場合には蛍光部分、化学発光検定法の場合には化学発光部分又は酵素免疫測定法の場合には発色基質を開裂させる酵素を含むことができる。
【００４３】
血清ＧＰ７３レベルを検出するための生体分子相互作用検定法は、典型的には、非常に少量、例えば、ほぼ０．５μＬの血清試料しか必要としない。しかしながら、任意の好適な容量の血清試料を本方法で使用できることが理解される。また、血清試料は液体である必要はないが、乾燥された（凍結乾燥された）生物学的試料であって血清を含むものを含むことができることも理解される。乾燥血清試料の任意の量を本方法で使用できる。
【００４４】
肝硬変の被検体を含め、慢性ＨＢＶ及びＨＣＶ感染症の被検体の検査から、ＧＰ７３レベルは、対照と比較して統計上有意な程度にまでは上昇しなかったことが示された。しかしながら、ＨＣＣを有する被検体におけるＧＰ７３レベルは、有意に上昇した。従って、ＨＣＣの危険性がある被検体の血清中におけるＧＰ７３レベルの上昇は、該被検体がＨＣＣを発症したことを示す。
【００４５】
従って、本発明は、ＨＣＣの危険性がある被検体を監視する方法において、該被検体の血清中におけるＧＰ７３レベルを経時的に検査する、該監視方法を提供する。ここで使用するときに、「ＨＣＣの危険性がある」被検体には、正式にはＨＣＣであるとは診断されていないが、家族性のＨＣＣの病歴があり、ＨＢＶ若しくはＨＣＶに感染し又はＨＣＣへと進行し得る任意の病因の肝臓障害を有する被検体が含まれる。
【００４６】
本方法を実施するにあたり、血清試料は、少なくとも２つの時点にわたり被検体から得られる。該血清試料中におけるＧＰ７３レベルを決定し、そして互いに比較する。早い時点からの試料に対する、遅い時点で得られた試料中の血清ＧＰ７３レベルの上昇は、該被検体がＨＣＣを発症したことを示す。
【００４７】
好ましくは、複数の血清試料は、数ヶ月から数年の期間にわたって被検体から採取される。例えば、血清試料は、被検体がＨＢＶ又はＨＣＶ感染と診断された時から３ヶ月毎に、該ウイルス感染の期間中３年まで、５年まで又は１０年までにわたって採取できる。血清試料は、さらに長い又は短い時間にわたってさらに短い間隔又は長い間隔で採取できることが理解される。
【００４８】
早い時点で採取された被検体の血清試料中における血清ＧＰ７３と比較して、遅い時点で採取された被検体の血清試料中におけるＧＰ７３の「レベルの上昇」とは、単位容量又は単位質量当たりのＧＰ７３蛋白質の量が、早い血清試料中よりも遅い血清試料中の方が多いことを意味する。ＧＰ７３のレベルは、単位容量若しくは単位質量当たりの蛋白質質量の絶対単位で、又は上記のような任意の単位として表現できる。
【００４９】
好ましくは、遅い時点で採取された血清試料中におけるＧＰ７３蛋白質のレベルは、早い時点で採取された血清試料中におけるＧＰ７３レベルよりも少なくとも２倍、例えば、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍大きい。
【００５０】
血清試料を得るための技術及びＧＰ７３レベルを検出するための技術は上記の通りである。
【００５１】
本発明の実施を次の実施例で例示するが、これに限定されない。
【実施例】
【００５２】
例１：肝細胞癌患者の血清中におけるＧＰ７３の検出
血清試料及び患者の病歴
血清試料は、患者の同意を得、及び、該当する場合には、フォックス・チェース癌センター、トマス・ジェファーソン大学及びミシガン大学の施設内倫理委員会の承認を受けた手順に従って集めた。これらの試料をその後の実施例でも同様に使用した。患者の２つ群が含まれた。ＨＢＶ感染患者及び対照患者の群は、最少年齢３５歳の中華民族的背景をもつ３８名の女性被験者であって試料収集の時点で米国に居住していたものから構成された。これらの患者は、ＨＢＶが高度に風土病性であるところの集団に由来し、恐らく、全員が幼年期又は幼児期に感染したものと思われる。ＨＢＶ感染は、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）陽性及び血清中におけるＨＢＶ−ＤＮＡの検出に基づき立証された。ＨＢＶのＤＮＡは、「ドットブロット」法によって検出されたが、これは、１ｍＬ当たりおよそ３×１０5ゲノム当量の敏感度の検出限界を有する（Ｅｖａｎｓ外，１９９８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ，ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，７：５５９−５６５）。ＨＣＶ感染した患者及び対照の患者の群は、２００１年９月から２００２年５月の間にミシガン大学メディカルセンターにある肝臓及び肝臓移植診療所から選ばれた。ＨＣＶ感染の診断は、血清におけるＨＣＶ抗体の陽性及びＨＣＶ−ＲＮＡの存在によって立証された。肝臓病の非ウイルス性の原因を有する患者及び複数の病気の病因を有する患者は除外した。慢性肝炎、肝硬変又はＨＣＣは、肝生検又は外移植試料の組織学的試験によって立証した。ＨＣＣの診断は、超音波画像診断及び生検によって確認された。肝機能検査（ＡＬＴ又はＡＳＴ）を免疫学的検定法によって決定し、そしてその上限値を５０ＩＵ／ｍＬであるとみなした。血清を血液から収集後直ちに単離し、そして血清アリコートを検査まで−８０℃で保存した。ＨＣＣ被験者からの血液試料をＨＣＣ治療の開始前に抜き出した。
次いで、ＧＰ７３の発現を、ＨＣＶ感染した個体の大きな群から連続して集めた血清試料で評価した。診断及び組織学的分類を上記の通りに行った。
【００５３】
α−胎児性蛋白質（ＡＦＰ）の測定
ＡＦＰは、ミシガン大学ホスピタル・クリニカル・ダイアグノスティック・ラボラトリーにおいて、増強された化学発光を使用して市販の免疫学的検定法によって上記血清試料中で測定した。正常の上限値は、８ｎｇ／ｍＬのＡＦＰであった。この人口統計学的データ及び実験室データを全ての患者について得た。ＨＣＣ患者を、ＵＮＯＳ  ＴＮＭ病期分類システムに従って病期分類した。
【００５４】
免疫ブロット分析及び試薬
等容量の患者血清（０．５又は１．０μＬ／レーン）を４〜２０％のポリアクリルアミド勾配ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離させた。正規化のために、いくつかのゲルは、ＨＣＶ及びＨＢＶ陰性源のプール由来の０．５μＬの血清を含有するレーンも含んでいた（シグマ社，ミズーリ州セントルイス）。電気泳動による分離の後に、それらの蛋白質を免疫ブロット法によってＰＶＤＦ膜に移行させた。これらの膜をインキュベーションブロック用緩衝液（１×ＴＢＳは、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５％の脱脂粉乳及び０．１％のＴｗｅｅｎ２０である）によって室温で１時間にわたってブロックした。これらのブロットを、ブロック用緩衝液で１：１０００に希釈した抗ＧＰ７３ウサギポリクローナル抗体と共に４℃で一晩穏やかに振盪させながらインキュベートした（Ｋｌａｄｎｅｙ，２０００，Ｇｅｎｅ，前出）。これらのブロットをブロック用緩衝液中で室温で２回洗浄し、そしてホースラディッシュペルオキシダーゼ結合マウス抗ウサギ二次抗体（１：４０００ｖ／ｖ）と共に室温で２時間インキュベートした。これらのブロットを１×ＴＢＳ−Ｔ（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳ）中で室温で２回洗浄し、そしてＥＣＬプラス化学発光検出システム（アマーシャム・ファルマシアバイオテック社，イリノイ州アーリントンハイツ）を使用して発現させた。
ＨＣＶ感染ＨＣＣ試料の肝臓組織及びＨＣＶ感染肝硬変組織からの全細胞蛋白質溶解物を先に記載した通りに調製した（Ｋｌａｄｎｅｙ外，２００２，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３５：１４３１−１４４０）。蛋白質濃度をブラッドフォードアッセイ法（バイオラド社）によって決定した。肝硬変又はＨＣＣを有するＨＣＶ感染患者の肝臓組織からの全細胞蛋白質溶解物の２５μｇを４〜２０％のポリアクリルアミド勾配ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、そして上記のような抗ＧＰ７３ウサギポリクローナル抗体による免疫ブロット分析に付した。これらの技術をその後の例でも同様に使用した。
【００５５】
結果
ＧＰ７３レベルを、肝硬変又はＨＣＣをも有するＨＣＶ感染患者で比較した。結果を図１に示している。レーン１及び２はＨＣＣ組織の溶解物である。レーン３及び４は肝硬変組織溶解物である。レーン５及び６は、ＨＣＣを有する２名のＨＣＶ感染患者からの血清である。
ＧＰ７３は、この２名のＨＣＶ感染患者の血清中で明らかに検出できた（図１のレーン５及び６）。さらに、ＨＣＣを有するＨＣＶ患者の肝臓生検材料から得られた細胞溶解物中において、肝硬変を有するＨＣＶ患者と比較して、より高レベルのＧＰ７３が検出された（図１のレーン１〜４）。
ウエスタンブロットで、ＧＰ７３蛋白質を表すおよそ７３ｋＤａ（ダルトン×１０3）のバンドのほかに、恐らくＧＰ７３の断片であるおよそ２５ｋＤａ±５ｋＤのバンドがＨＣＣ患者及びＨＣＶ患者からの血清で検出されたが、正常の対照個体からの血清では検出されなかった。
【００５６】
例２：肝細胞癌患者の血清中におけるＧＰ７３の検出
方法
上記のように、血清試料を得、そして免疫ブロット分析を実行した。免疫ブロットのデンシトメトリー分析を実行して、患者の血清中のＧＰ７３蛋白質量をシグマ社製対照血清中に存在するシグナルに対して定量した。
７３ｋＤａ種からのＧＰ７３特異的シグナルを、アルファイノテック社製ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ  ＣＣＤカメラをＡｌｐｈａＥａｓｅスポットデンシトメトリーソフトウェアと共に使用してＸ線フィルムから定量し、そしてこれをシグマ社製対照血清（それぞれのブロット上のレーンＳ）で検出されたＧＰ７３シグナルに対する積分強度単位として表した。それぞれの血清試料及び結果についての二重又は三重決定の平均として値を算出した。
ヒト血清のアリコート（０．５μＬ）を次のＨＢＶ研究被験者から得た：ＨＢＶ陰性（Ａ群）、不活性感染のＨＢＶキャリア（Ｂ群）、活性感染のＨＢＶキャリア（Ｃ群）、ＨＢＶ関連ＨＣＣ（Ｄ群）。ヒト血清のアリコート（０．５μＬ）を次のＨＣＶ研究被験者から得た：ＨＣＶ陰性（１群）、慢性ＨＣＶ感染（２群）、ＨＣＶ関連肝硬変（３群）、ＨＣＶ関連ＨＣＣ（４群）。試料を４〜２０％のポリアクリルアミド勾配ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そして抗ＧＰ７３特異的抗体による免疫ブロット分析に付した。商業的に得られる、ＨＣＶ陰性、ＨＩＶ陰性及びＨＢＶ陰性被験者からのプール血清（Ｓ）を正常の対照のために使用した。対照の被験者及び患者の人口統計及び血清学的プロファイルを以下の表１（ＨＢＶ患者）及び２（ＨＣＶ患者）にまとめている。
【００５７】
結果
ＨＣＣを有する又はＨＣＣを有しないＨＢＶ感染患者の血清中におけるＧＰ７３レベルと、ＨＣＣを有する又はＨＣＣを有しないＨＣＶ感染患者の血清中におけるＧＰ７３レベル及び対照被験者におけるＧＰ７３レベルとを比較した。それらの結果を図２Ａ及び２Ｂに示している。識別する目的でそれぞれの研究被験者に割り当てられている番号は、それぞれのレーンの上に示されている。
【００５８】
高レベルのＧＰ７３が慢性ＨＢＶ又はＨＣＶ関連ＨＣＣを有する２４名の患者のうち２３名の血清中に存在していたが、ウイルス性肝炎を有しない健康な個体には存在しなかった。また、ＨＣＣを有しない肝硬変患者の一部にも上昇した血清レベルが存在した（図２Ａ及び２Ｂ）。対照血清（Ｓ）で見られるレベルと同様の低レベルのＧＰ７３が、感染していない個体の循環において検出された。
【００５９】
図２Ａ及び２Ｂの免疫ブロットのデンシトメトリー分析を上記のように実行して、患者の血清中のＧＰ７３蛋白質量をシグマ社製対照血清中に存在するシグナルに対して定量した。デンシトメトリー分析の結果を図３Ａ及び３Ｂに図示している。
【００６０】
図３Ａの統計学的分析は、唯一の有意な差がＤ群（ＨＣＣ患者）対Ａ、Ｂ及びＣ群の間に存在することを示している（ｐ＜０．００１）。図３Ｂに示すように、ＨＣＶ患者及び対照の統計学的分析は、唯一の有意な差が４群（ＨＣＣ患者）対１、２及び３群の間に存在することを示している（ｐ＜０．００１）。
【００６１】
ＨＢＶ又はＨＣＶ関連非悪性肝臓疾患を有する数名は、幾分上昇した血清中ＧＰ７３レベルを有していたが、最も高いレベルは、ＨＣＣと診断された患者で見出された（図３Ａ及び３Ｂ）。ＨＢＶ関連ＨＣＣを有する８名のうち７名は、その他の３つの群内の任意の患者よりも大きな増加を示した（図２ＡのＤ群及び図３Ａ）。ＨＣＶ関連ＨＣＣを有する１６名のうち１１名は、この実験セットのその他の群内の任意の患者よりも高いＧＰ７３レベルを示した（図２Ｂの４群及び図３Ｂ）。
【００６２】
統計学的分析から、他の全ての診断群と比較して、ＨＣＣ患者における血清ＧＰ７３レベルの統計学的に有意な全体的な増加が明らかになった（ｐ＜０．００１）（図３）。ＨＢＶ又はＨＣＶ感染に従う分散分析（ＡＮＯＶＡ）は、この差がウイルス物質にかかわらず存在したことを示している。それぞれの群について、４つの被験者群間では差がないという帰無仮説は却下された（ＨＢＶ群について、Ｆ＝４９．４７、ｐ＜０．０００１、ＨＣＶ群について、Ｆ＝１７．５１、ｐ＜０．０００１）。複数の比較のために調節されたペアワイズ試験において、群のそれぞれについての平均を比較した。ＨＢＶ及びＨＣＶデータセットの個別分析では、ＨＣＣ群は、その他３つの群のそれぞれとは有意に相違した（ｐ＜０．０００１）。しかしながら、３つの非ＨＣＣ群は、互いにさほど相違しなかった。いかなる特定の理論に拘泥されることを望まないが、これらの結果は、高レベルの循環性ＧＰ７３の出現が、ウイルスが原因の肝炎（ＨＢＶ又はＨＣＶ）にも関わらず、ウイルス誘発肝細胞癌の特徴であり得ることを示している。
【００６３】
【表１】
2007506945.tif 000003
【００６４】
【表２】
2007506945.tif 000004
【００６５】
例３：ＨＣＣ検出における血清ＧＰ７３とＡＦＰの比較
例２で得られた結果に基づき、よく特徴付けられたＨＣＶ感染コホートに重点を置いた、さらに大規模な二重盲検試験を実行した（ｎ＝１４２）。ＧＰ７３及びＡＦＰのレベルを、ＨＣＶ関連肝臓疾患の患者及び対照の患者からの血清で測定した。患者群及び人口統計を表３に明示する。
【００６６】
【表３】
2007506945.tif 000005
【００６７】
方法
免疫ブロット及びデンシトメトリー分析を上記の通りに実行した。
【００６８】
統計学的分析
ＡＦＰ値について広範囲の値を説明するためにログ変換を使用した。ＡＦＰとＧＰ７３についての記述統計をボックスプロットで比較し、次いでＡＮＯＶＡで比較した。平均での群の差異を、一般的な線形モデルを適合させるために最小二乗法を使用する分散分析用ＳＡＳ  Ｖ  ８．０１（ＳＡＳ研究所，ノースカロライナ州カリー）ＰＲＯＣ  ＧＬＭを連続変数のために使用することによって試験した。２値変数については、カイ二乗を利用して群を比較した。多重比較を説明するために、ＡＮＯＶＡ内での個体平均についてのｐ値を、テューキー・クレーマー検定を使用して調節した。ＨＣＣ診断におけるＧＰ７３及びＡＦＰについての最適なカットオフ値を決定するために、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を、それぞれの検定法について全ての可能なカットオフを使用して作成した。ＲＯＣ下面積（ＡＵＲＯＣ）曲線を算出し、そしてこれを前記の通りに比較した（Ｇｒｉｎｅｒ外，１９８１，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．９４：５５５−６００；Ｍｅｔｚ，１９９８，Ｓｅｍｉｎ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．８：２８３−２９８。これらの開示の全体は、引用によってここに加入するものとする。）。この２つのマーカーについての二変量正規分布を推定した。＜０．０５の両側ｐ値を使用して統計的有意性を決定した。全ての分析は、ＳＡＳ（米国ノースカロライナ州カリー）を使用して実行した。
【００６９】
免疫ブロット分析を使用して血清中のＧＰ７３レベルを検出し、そして定量した。統計学的分析について、被験者を前述のように４つのカテゴリーに分類した：正常の対照（ＨＢＶ又はＨＣＶに非感染）、肝硬変なしの慢性ＨＣＶ、肝硬変を有する慢性ＨＣＶ並びに肝硬変及びＨＣＣを有する慢性ＨＣＶ。これらの群は、年齢、性及び民族性について調和されている（表３参照）。
【００７０】
結果
これらの結果（図４Ａ）は、ＨＣＣと診断された患者における血清ＧＰ７３が、悪性でない肝臓疾患又は対照群と比較して、統計学的に有意に上昇したことを示した（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．００１）。ＧＰ７３の上昇頻度（図４Ａ）を、この集団からの患者におけるＡＦＰの上昇と比較した（図４Ｂ）。ＡＦＰレベルは、上記のような標準的な臨床検定によって決定した。一般に、ＡＦＰレベルは、ＨＣＣ患者で増加したが、この分析においてＨＣＣ患者とその他の群との間でのＡＦＰレベルではいかなる統計学的に有意な差も立証できなかった（ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．２９２）。
【００７１】
また、ＨＣＶに慢性的に感染した個体の集団内で肝硬変患者と肝硬変＋ＨＣＣ患者とを区別する際に、ＲＯＣ曲線分析も実行してＧＰ７３とＡＦＰの敏感度及び特異度を比較した。図４において３及び４群について得られたデータをＲＯＣ分析のためにプロットした。これを図５に与えている。このＲＯＣ曲線は、ＧＰ７３レベルがＨＣＣの指標としてＡＦＰよりも予測に役立つことを示している。ＧＰ７３は、０．８５の敏感度及び０．６５の特異度を有するが、ＡＦＰは、敏感度（０．７０）と特異度（０．６０）の両方がそれよりも低い。使用した検定法に基づき、ＧＰ７３についての最適カットオフ値を、対照試料からのＧＰ７３シグナル以上の８．４相対単位であると決定し、そしてＡＦＰについての最適カットオフ値は９．９ｎｇ／ｍＬであった。ＡＦＰとＧＰ７３との間の差についてはｐ＝０．１４９であった。
【００７２】
いかなる特定の理論にも拘泥されることを望まないが、これらの研究は、血清ＧＰ７３レベルが、ＨＣＣとＨＢＶ又はＨＣＶ感染のいずれかに関連する悪性でない肝臓病との臨床診断を区別するために、ＡＦＰよりも予測に役立ち得ることを示している。
【００７３】
ここに言及した全ての文献は、引用によって加入するものとする。本発明を好ましい具体例及び様々な図表と共に説明してきたが、本発明の同一の作用をそれから逸脱することなく実現させるためにその他の類似する具体例を使用し又はこの説明した具体例に改変及び付加をなし得ることを理解すべきである。従って、本発明は、任意の単一の具体例に限定されるべきではなく、むしろ、添付した請求の範囲の文言に従う範囲内で解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】ＨＣＶに感染した患者におけるＧＰ７３の免疫ブロット分析図である。
【図２Ａ】次のヒト被験者：ＨＢＶ陰性（Ａ群）、不活性感染のＨＢＶキャリア（Ｂ群）、活性感染のＨＢＶキャリア（Ｃ群）、ＨＢＶ関連ＨＣＣ（Ｄ群）、ＨＣＶ陰性（１群）、慢性ＨＣＶ感染（２群）、ＨＣＶ関連肝硬変（３群）、ＨＣＶ関連ＨＣＣ（４群）から得られたヒト血清（０．５μＬ）に対する抗ＧＰ７３特異的抗体による免疫ブロット分析の結果を示す図である。
【図２Ｂ】次のヒト被験者：ＨＢＶ陰性（Ａ群）、不活性感染のＨＢＶキャリア（Ｂ群）、活性感染のＨＢＶキャリア（Ｃ群）、ＨＢＶ関連ＨＣＣ（Ｄ群）、ＨＣＶ陰性（１群）、慢性ＨＣＶ感染（２群）、ＨＣＶ関連肝硬変（３群）、ＨＣＶ関連ＨＣＣ（４群）から得られたヒト血清（０．５μＬ）に対する抗ＧＰ７３特異的抗体による免疫ブロット分析の結果を示す図である。
【図３Ａ】図２Ａ及び２Ｂの免疫ブロット像のデンシトメトリー分析の結果を示す図である。
【図３Ｂ】図２Ａ及び２Ｂの免疫ブロット像のデンシトメトリー分析の結果を示す図である。
【図４Ａ】ＨＣＶ関連肝臓疾患の患者及び対照の患者におけるＧＰ７３血清レベルを測定する研究の結果を示す図である。
【図４Ｂ】ＨＣＶ関連肝臓疾患の患者及び対照の患者におけるα−胎児性蛋白質（ＡＦＰ）を測定する研究の結果を示す図である。
【図５Ａ】図４Ａ及び４Ｂのデータに基づいて作成された受信者動作特性（ＲＯＣ）を表す図である。
【図５Ｂ】図４Ａ及び４Ｂのデータに基づいて作成された受信者動作特性（ＲＯＣ）を表す図である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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