(57)【要約】【課題】新規の作用メカニズムを指標とした、皮膚状態改善剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。【解決手段】トロンビンの抑制作用を指標とすることで、皮膚状態改善剤のスクリーニングを行うことができる。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
トロンビンの抑制作用を指標とした、皮膚状態改善剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記皮膚状態改善剤が、美白剤、かゆみ抑制剤、及び皮膚バリア向上剤からなる群からえらばれる、請求項１に記載のスクリーニング剤。
【請求項３】
前記スクリーニング方法が、
プロトロンビン又はトロンビンと、候補薬剤とを接触させる工程、
トロンビン活性を測定する工程、
候補薬剤のトロンビン抑制作用に基づき、皮膚状態改善剤を選択する工程、
を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
トロンビン作用の測定が、トロンビン基質の分解量又は血液凝固時間により測定される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記スクリーニング方法が、
プロトロンビン又はトロンビンおよび候補薬剤を含む培地中で、ＰＡＲ‐１発現細胞を培養する工程、
トロンビン活性を測定する工程
候補薬剤のトロンビン抑制作用に基づき、皮膚状態改善剤を選択する工程、
を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
トロンビン作用の測定が、カルシウムイメージングで行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
トロンビン作用阻害剤を含む、皮膚状態改善剤。
【請求項８】
前記皮膚状態改善剤が、美白剤、かゆみ抑制剤、及び皮膚バリア向上剤からなる群からえらばれる、請求項７に記載の皮膚状態改善剤。
【請求項９】
トロンビン作用阻害剤が、ＰＡＲ‐１による細胞作用の抑制を介して、皮膚状態を改善する、請求項７又は８に記載の皮膚状態改善剤。
【請求項１０】
トラネキサム酸又はその塩を含む、トロンビン作用阻害剤。
【請求項１１】
前記トロンビン作用阻害剤が、ＰＡＲ‐１による細胞作用を抑制する、請求項１０に記載のトロンビン作用阻害剤。
【請求項１２】
トロンビン作用の阻害が、プロトロンビンからトロンビンへの分解を抑制することにより奏される、請求項１１に記載のトロンビン作用阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚状態改善の技術分野に関し、具体的には化粧、美容又は医療技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、生体の最外層に存在することから、常に外界からの刺激にさらされている。外界からの刺激としては、紫外線や温度などの物理的な刺激の他、化学物質や抗原物質による刺激も含まれる。花粉症を引き起こすスギ花粉は、粘膜を介して作用して、花粉症特有の呼吸器症状や咽頭症状を引き起こす他に、皮膚への接触によりスギ花粉皮膚炎を引き起こす。スギ抗原として知られているＣｒｙｊ１は、ケラチノサイトにおいてセリンプロテアーゼを活性化することが知られており、活性化されたセリンプロテアーゼが、ケラチノサイトに発現する膜タンパク質であるＰＡＲ‐２タンパク質の活性化を介して、層板顆粒（lamellar granule）が減少を引き起こすと考えられている（非特許文献１：Arch Dermatol Res 308:49-54, 2016）。層板顆粒は、顆粒層のケラチノサイトの細胞質内においてみられる顆粒であり、ケラチノサイトがアポトーシスを起こすことにより細胞外に分泌される。層板顆粒は、セラミド、コレステロール、脂肪酸といった、細胞間脂質が含まれており、層板顆粒の減少は皮膚バリア機能の低下をもたらす。
【０００３】
一方、抗プラスミン作用を有する止血剤として開発されたトラネキサム酸は、皮膚において美白効果をもたらすことが発見され、シミや乾斑の治療薬として皮膚外用剤が開発されている（特許文献１）。トラネキサム酸は、トリプシンタイプのセリンプロテアーゼの一種であるプラスミンの作用を阻害することで、凝血作用を発揮する。プラスミンは、表皮中では主に基底層に存在し、プロスタグランジンの産生を介し、メラノサイトの活性に寄与することから、トラネキサム酸によるプラスミンの抑制が、美白効果をもたらすと考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１４−１５２１５９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Arch Dermatol Res 308:49-54, 2016
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新規の作用メカニズムを指標とした、皮膚状態改善剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、花粉抗原に応答して層板顆粒の分泌を抑制するシグナル伝達の起点のメカニズムを解明すべく鋭意研究を行ったところ、従来かかるシグナル伝達の起点となると考えられていたトリプシンタイプセリンプロテアーゼによるＰＡＲ−２の活性化ではなく、トロンビンまたはトロンビン様タンパクによるＰＡＲ−１の活性化が、層板顆粒の分泌を抑制するシグナル伝達の起点となることをはじめて見出した。そこで、トロンビンを抑制する作用を指標とすることで、皮膚状態改善剤をスクリーニングできるという新たなスクリーニング方法を発明した。
【０００８】
そこで、本発明は以下の発明に関する：
［１］  トロンビンの抑制作用を指標とした、皮膚状態改善剤のスクリーニング方法。
［２］  前記皮膚状態改善剤が、美白剤、かゆみ抑制剤、及び皮膚バリア向上剤からなる群からえらばれる、項目１に記載のスクリーニング剤。
［３］  前記スクリーニング方法が、
プロトロンビン又はトロンビンと、候補薬剤とを接触させる工程、
トロンビン活性を測定する工程、
候補薬剤のトロンビン抑制作用に基づき、皮膚状態改善剤を選択する工程、
を含む、項目１又は２に記載の方法。
［４］  トロンビン作用の測定が、トロンビン基質の分解量又は血液凝固時間により測定される、項目３に記載の方法。
［５］  前記スクリーニング方法が、
プロトロンビン又はトロンビンおよび候補薬剤を含む培地中で、ＰＡＲ‐１発現細胞を培養する工程、
トロンビン活性を測定する工程
候補薬剤のトロンビン抑制作用に基づき、皮膚状態改善剤を選択する工程、
を含む、項目１又は２に記載の方法。
［６］  トロンビン作用の測定が、カルシウムイメージングで行われる、項目５に記載の方法。
［７］  トロンビン作用阻害剤を含む、皮膚状態改善剤。
［８］  前記皮膚状態改善剤が、美白剤、かゆみ抑制剤、及び皮膚バリア向上剤からなる群からえらばれる、項目７に記載の皮膚状態改善剤。
［９］  トロンビン作用阻害剤が、ＰＡＲ‐１による細胞作用の抑制を介して、皮膚状態を改善する、項目７又は８に記載の皮膚状態改善剤。
［１０］  トラネキサム酸又はその塩を含む、トロンビン作用阻害剤。
［１１］  前記トロンビン作用阻害剤が、ＰＡＲ‐１による細胞作用を抑制する、項目１０に記載のトロンビン作用阻害剤。
［１２］  トロンビン作用の阻害が、プロトロンビンからトロンビンへの活性化を抑制することにより奏される、項目１１に記載のトロンビン作用阻害剤。
【発明の効果】
【０００９】
トロンビンの抑制作用を指標とすることで、皮膚状態改善剤のスクリーニングが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１Ａは、培養ケラチノサイトにおけるカルシウムイメージングの結果を示しており、Ｃｒｙｊ１の添加で、蛍光の励起がみ見られる一方で、Ｃｒｙｊ１とトラネキサム酸（Ｔ−ＡＭＣＨＡ）の添加では励起が抑えられることが示される。また、Ｃｒｙｊ１とダイズトリプシン阻害剤（ＳＢＴＩ）、Ｃｒｙｊ１とビバリルジン（Ｂｉｖａｌｉｒｕｄｉｎ）の添加によっても励起が抑制される。図１Ｂは、各場合における試薬導入後２分以内における活性化された細胞の割合をグラフにして示す。
【図２】図２Ａは、培養ケラチノサイトにおけるプロテアーゼの活性を示すグラフである。培地中にＣｒｙｊ１、Ｃｒｙｊ１とトラネキサム酸（Ｔ−ＡＭＣＨＡ）、Ｃｒｙｊ１とダイズトリプシン阻害剤（ＳＢＴＩ）、Ｃｒｙｊ１とビバリルジンをそれぞれ含め、対照として試薬未添加群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）を用い、蛍光基質を添加した際の蛍光変化を示す。図２Ｂは、各場合における試薬導入後２分以内における活性化された細胞の割合をグラフにして示す。
【図３】図３は、Ｃｒｙｊ１（図３Ａ）、及びＣｒｙｊ１とトラネキサム酸（Ｔ−ＡＭＣＨＡ）（図３Ｂ）を含む溶液を皮膚に適用した後の皮膚切片の電子顕微鏡写真を示す。写真中において層板顆粒（lamellar granule）を矢印で示した。
【図４】図４は、Ｃｒｙｊ１、Ｃｒｙｊ１とトラネキサム酸（Ｔ−ＡＭＣＨＡ）、Ｃｒｙｊ１とビバリルジンを含む溶液、対照として試薬未添加溶液（Ｃｏｎｔｒｏｌ）を皮膚に適用した後の、適用箇所のＴＥＷＬ値を示す。
【図５】図５Ａは、ケラチノサイトにおけるプラスミノーゲン（プラスミン）の遺伝子発現を、リアルタイムＰＣＲで調べた結果を示す。そして、図５Ｂは、その増幅産物の電気泳動の結果を示す。
【図６】図６Ａは、培養ケラチノサイトにおけるカルシウムイメージングの結果を示しており、トロンビンの添加で、蛍光の励起が見られる一方で、トロンビンとトラネキサム酸（Ｔ−ＡＭＣＨＡ）の添加、及びトロンビンとビバリルジンの添加では励起が抑えられることが示される。図６Ｂは、各場合における試薬導入後２分以内における活性化された細胞の割合をグラフにして示す。
【図７】図７Ａは、トロンビン遺伝子発現を抑制した場合（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ＫＤ）、ＰＡＲファミリーの遺伝子発現をそれぞれ抑制した場合（ＰＡＲ−１〜ＰＡＲ−４  ＫＤ）、ＰＡＲ−１及びＰＡＲ−２の両方の遺伝子発現を抑制した場合（ＰＡＲ−１，２  ＤＫＤ）及び抑制していない場合（ｓｃＲＮＡ）の培養ケラチノサイトにおけるカルシウムイメージングの結果を示している。ＰＡＲ−１〜ＰＡＲ−４遺伝子発現またはトロンビン遺伝子発現を抑制していない場合（ｓｃＲＮＡ）ではＣｒｙｊ１の添加により、励起がみられる一方で、ＰＡＲ−１遺伝子発現またはトロンビン遺伝子発現を抑制した場合、励起がみられなかった。図７Ｂは、同じ実験系で、Ｃｒｙｊ１添加の２分後における活性化された細胞の割合をグラフにして示す。
【図８】図８は、各酵素の蛍光基質または発色基質を用いて酵素活性を蛍光で示したグラフである。図８Ａは、トロンビン（Ｆ２）に対する基質を用いており、トロンビン活性がビバリルジンでは抑制された一方で、トラネキサム酸では抑制できなかったことを示す。また、プロトロンビン（Ｐｒｏ−Ｆ２）は酵素活性を有さないことが示される。図８Ｂは、第Ｘａ因子（Ｆｘａ）に対する基質を用いており、第Ｘａ因子の活性が、その抑制作用を有するＧＧＡＣＫにより抑制される一方、トラネキサム酸では抑制されないことを示す。図８Ｃは、トロンビン（Ｆ２）に対する基質を用いており、プロトロンビン（Ｐｒｏ−Ｆ２）と第Ｘａ因子が用いられている。プロトロンビンが第Ｘａ因子により活性化され、それによりトロンビン活性が生じる。トロンビン活性が、ビバリルジンやＧＧＡＣＫでは抑制されることが示されており、またトラネキサム酸の用量依存的に抑制されることが示された。以上の結果からトラネキサム酸はプロトロンビンからトロンビンへの活性化を抑制していることが示された。
【図９】図９は、プロトロンビンと、プラスミノーゲンにおけるトラネキサム酸の作用部位を示す構造解析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の一の態様において、本発明は、トロンビンの抑制作用を指標とした、皮膚状態改善剤のスクリーニング方法に関する。
【００１２】
皮膚状態とは、皮膚の状態をいう。悪化した皮膚状態としては、かゆみの誘発、色素沈着、肌荒れ、皮膚バリア機能低下、しみ、しわ、たるみなどが挙げられる。本発明においては、皮膚状態の改善は、主に美白、かゆみの抑制、及び／又は皮膚バリア機能の向上に関する。したがって、皮膚状態改善剤としては、美白剤、かゆみ抑制剤、皮膚バリア向上剤が挙げられる。
【００１３】
トロンビンとは、血液の凝固にかかわるセリンプロテアーゼの一種であり、第ＩＩａ因子とも呼ばれる。凝血系ではフィブリノーゲンのフィブリンへの反応を触媒するほか、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子を活性化させる。プロトロンビン（第ＩＩ因子）として血中に存在しており、第Ｘａ因子や第Ｖａ因子の作用により活性化されてトロンビンとなる。
【００１４】
トロンビンの抑制作用とは、トロンビン又はトロンビン様タンパク質の作用が結果として抑制されればよく、例えばトロンビンの活性中心に対する阻害の他、プロトロンビンからトロンビンへの活性化の抑制も含まれうる。さらに、本発明では、特にトロンビンのケラチノサイトへの作用が抑制されることが好ましく、ケラチノサイトへの作用は、主にトロンビン受容体であるＰＡＲ‐１の活性化を介して発揮される。したがって、トロンビンの抑制作用は、ＰＡＲ‐１阻害作用であってもよい。トロンビン様タンパク質とは、トロンビンと同じくＰＡＲ−１を活性化するタンパク質のことをいう。かかるトロンビン様タンパク質として、トロンビンのホモログやオルソログであってもよいし、非ヒト由来のタンパク質であってもよい。また、トロンビン様タンパク質としては、ヒト又は非ヒトのプロトロンビンのトロンビン活性を有する部分ペプチドであってもよい。本発明のスクリーニング方法では、トロンビンと同じくＰＡＲ−１活性化作用を有するトロンビン様タンパク質を用いることで、トロンビン抑制作用を指標とすることもできる。トロンビンの抑制作用を指標とするとは、トロンビンの活性を直接計測してもよいし、トロンビンが制御する下流の現象を観察することで間接的に計測をしてもよい。トロンビン作用の直接的な計測として、トロンビンの基質となる物質を導入し、基質の分解量に基づいてトロンビンの作用を決定することができる。トロンビンの抑制作用の間接的な計測の一例として、血液を用いた試験や、培養細胞を用いた試験が挙げられる。
【００１５】
トロンビンの作用を測定するために用いるトロンビンの基質としては、トロンビンが分解できるペプチド又はタンパク質が挙げられる。かかるペプチド又はタンパク質を蛍光物質と、消光物質とで標識し、トロンビンにより切断された場合にのみ蛍光の検出を可能にする蛍光基質や、発色物質で標識されており、トロンビンにより切断された場合にのみ吸光の検出を可能にする発色基質が市販されており、このような蛍光基質や発色基質を用いることが好ましい。
【００１６】
本発明の皮膚状態改善剤のスクリーニング方法の一例として、以下の：
トロンビンと、候補薬剤とを接触させる工程、
トロンビン活性を測定する工程、
候補薬剤のトロンビン抑制作用に基づき、皮膚状態改善剤を選択する工程
を含む方法が挙げられる。
【００１７】
トロンビンと、候補薬剤とを接触させる工程は、トロンビンを含む溶液に候補薬剤を添加するか、又はトロンビンと候補薬剤とを含む溶液を調製することとで行われる。トロンビン活性を測定する工程は、例えばトロンビン作用を測定するためのトロンビン基質を添加し、基質の分解量をもとにトロンビン活性が測定される。上述の蛍光基質または発色基質が用いられる場合、基質の分解量は、蛍光または吸光を測定することで決定することができる。対照におけるトロンビン活性に比べて、候補薬剤を添加した場合のトロンビン活性が減少した場合、候補薬剤がトロンビン抑制作用を有するものと決定することができる。トロンビン抑制作用を有する候補薬剤を、皮膚状態改善剤として選択することができる。対照のトロンビン活性は、候補薬剤のみを含まない実験系であらかじめ決定されていてもよいし、同時に実験を行って比較してもよい。
【００１８】
本発明のスクリーニング方法は、トロンビンの代わりに、トロンビンの前駆物質であるプロトロンビンを用いることもできる。その場合、プロトロンビンがトロンビンへと変換するための物質、例えば第ＩＸａ因子やその複合体も含まれる。
【００１９】
本発明で使用するトロンビンやプロトロンビンは、血液から精製されたものであってもよいし、培養細胞で組み換え発現されたタンパク質を生成されたものであってもよい。さらに別の態様では、トロンビン及び／又はプロトロンビンを含む溶液として血液をそのまま又は加工して用いてもよい。血液を用いた場合、トロンビン活性を血液凝固時間に基づき決定することができる。その場合、血液凝固時間が延長された場合に、候補薬剤がトロンビン抑制作用を有する物質として選択することができる。血液における具体的なトロンビン活性の測定手法は、プロトロンビン時間測定法やトロンボテストに基づいて行われうる。血液において、血液凝固作用は、複数の因子の協働により達成される。したがって、血液凝固時間の延長のみにより選択された候補薬剤は、トロンビン抑制作用を有していない可能性もある。その場合、トロンビンの基質を用いた試験を行って、実際にトロンビン抑制作用が達成されているかをさらに確かめることもできる。
【００２０】
トロンビンによる細胞作用を伝達する受容体でとしてＰＡＲ‐１（protease-activated receptor-1）が挙げられる。ＰＡＲ‐１は、血小板や血管内皮細胞、血管平滑筋細胞により細胞膜上に発現されていることが報告されている。トロンビンにより、細胞外領域のＮ末端ペプチドが切断されることで活性化し、血小板においてはトロンビン凝集のシグナルを伝達する。本発明のスクリーニング方法の一例として、ＰＡＲ‐１を発現する細胞を用いて、トロンビンの抑制作用を決定することができる。
【００２１】
具体的に、本発明に係るトロンビン抑制作用を指標とした皮膚状態改善剤のスクリーニング方法は、一例として、以下の：
トロンビン及び候補薬剤を含む培地中でＰＡＲ‐１発現細胞を培養する工程、
トロンビン活性を測定する工程、及び
候補薬剤のトロンビン抑制作用に基づき、皮膚状態改善剤を選択する工程
を含む。
【００２２】
ここで、トロンビン活性は、ＰＡＲ‐１発現細胞の活性を測定することで測定することができる。一例として、ＰＡＲ‐１が活性化されると、細胞内におけるＣａ2+の細胞濃度が増大することから、Ｃａ2+のイメージングを行うことで、トロンビン活性を測定することができる。より具体的に、トロンビン及び候補薬剤を含む培地中でＰＡＲ−１発現細胞を培養し、Ｃａ2+イメージングを行った場合、トロンビンによる細胞内Ｃａ2+濃度の増加が抑制される場合に、トロンビン作用を抑制する物質として候補薬剤を選択することができる。ここで、培地にトロンビンが添加されてもよいし、その前駆物質であるプロトロンビンを活性化することで生成されてもよい。プロトロンビンは、添加されてもよいし、細胞自身により発現されて分泌されたものであってもよい。プロトロンビンの活性化は、任意の抗原、例えばＣｒｙｊ１、の添加により行われてもよい。こうして選択されたトロンビン作用を抑制する物質は、ＰＡＲ‐１の阻害剤、すなわちＰＡＲ‐１アンタゴニストであってもよい。こうして選択された物質は、皮膚状態改善剤、すなわち美白剤、かゆみ抑制剤、及びバリア機能改善剤として作用しうる。
【００２３】
トラネキサム酸は、抗プラスミン作用に基づいて凝血作用や抗アレルギー作用を発揮することが知られており、止血薬や抗炎症剤として開発されている。その一方で、美白に対する効果が見出されており、美白剤としても開発されている。美白作用や抗アレルギー作用も、トラネキサム酸が有する抗プラスミン作用に基づくものと考えられているが、その作用メカニズムの解明は未だなされていない。
【００２４】
スギ花粉の抗原であるＣｒｙｊ１は、セリンプロテアーゼの作用を介して、層板顆粒（lamellar granule）の減少を引き起こすことが報告されていた。そしてそのセリンプロテアーゼは、ＰＡＲ‐２を介して細胞作用を及ぼすと考えられていた。
【００２５】
本発明者らの研究により、Ｃｒｙｊ１によるケラチノサイトに対する細胞作用は、トラネキサム酸の投与により抑制されることが分かった（図１Ａ−Ｂ）。このトラネキサム酸の作用は、細胞外におけるセリンプロテアーゼの活性の抑制によるものであることが分かった（図２Ａ−Ｂ）。そして実際に経皮投与試験において、トラネキサム酸は、Ｃｒｙｊ１による層板顆粒の減少を妨げることが示され（図３Ａ−Ｂ）、またＣｒｙｊ１によるＴＥＷＬの増加（皮膚バリア機能の低下）を抑制することができた（図４）。
【００２６】
Ｃｒｙｊ１による細胞作用は、セリンプロテアーゼの活性化により基づくものであることから、トラネキサム酸による細胞作用の抑制も、従来知られていたセリンプロテアーゼの基質の一種であるＰＡＲ‐２を介した細胞作用であると考えられた。しかしながら、ＰＡＲ‐2活性化に寄与するプラスミンの前駆体であるプラスミノーゲンがケラチノサイト中に存在しないことが示された（図５）。また、ケラチノサイトにおいて、ＰＡＲ−２のノックダウンした場合であっても、Ｃｒｙｊ１に対するケラチノサイトの応答性の変化がみられなかった一方で、ＰＡＲ‐１のノックダウンにより、Ｃｒｙｊ１に対するケラチノサイトの応答性が減少したことから、ＰＡＲ‐１が、Ｃｒｙｊ１による細胞作用に重要であることが示された（図６）。ＰＡＲ‐１は、トロンビン受容体として知られていることから、トラネキサム酸のＣｒｙｊ１による細胞作用の抑制作用は、抗プラスミン作用ではなく、抗トロンビン作用に基づくものであることが予測された。
【００２７】
実際に、培養ケラチノサイトにトロンビンを投与したところ、細胞作用が発揮された（図７Ａ）。また、トラネキサム酸は、トロンビン抑制剤であるビバリルジンと同様に、その細胞作用を抑制した（図７Ａ−Ｂ）。ケラチノサイトにおいて、トロンビンをノックダウンした場合に、Ｃｒｙｊ１による細胞作用が失われることから（図８Ａ−Ｂ）、Ｃｒｙｊ１による細胞作用が、トロンビンとＰＡＲ−１との相互作用により生じることが明らかになった。そして、トラネキサム酸は、かかるトロンビン作用を抑制することで、細胞作用を抑制することが見いだされた。トラネキサム酸のトロンビン抑制作用をより詳しく解析した結果、トラネキサム酸は、トロンビンや、トロンビン活性化因子である第Ｘａ因子には作用しない一方で（図９ＡおよびＢ）、プロトロンビンに作用していることが示された（図９Ｃ）。したがって、トラネキサム酸によるケラチノサイトにおける細胞作用は、プロトロンビンの活性化を抑制することにより達成されることが示された。
【００２８】
本発明者らが新たに見出したように、トラネキサム酸は、抗プラスミン作用の他、抗トロンビン作用を有する。しかし、ケラチノサイトではプラスミノーゲンの発現が見られない。また、ケラチノサイトでは、ＰＡＲ‐１が発現されており、抗原物質であるＣｒｙｊ１による細胞の活性化が、ＰＡＲ‐１経路を介していることが示されている。プラスミンによる細胞作用の標的は、ＰＡＲ−２であることから、トラネキサム酸の皮膚における作用は、従来知られていた抗プラスミン作用によるものではなく、本発明で見出された抗トロンビン作用に基づく蓋然性が高い。
【００２９】
本発明の別の態様では、本発明は、トロンビン作用阻害剤を含む、皮膚状態改善剤に関する。トロンビン作用阻害剤は、血液学の分野において十分に研究されており、またいくつもの化合物が、トロンビン作用抑制剤として開発されている。例えば、ダビガトラン、アルガトロバンは、トロンビンの競合阻害作用を有する薬剤として開発されており、またＰＡＲ‐１アンタゴニストとしても、ＳＣＨ５０３４５８、Ｅ５５５５などの化合物が開発されている。血液学の技術分野において既知のトロンビン作用阻害剤が知られており、これらのトロンビン作用阻害剤を、皮膚状態改善剤として開発することができる。トロンビン作用阻害剤は任意の投与経路で用いることができるが、皮膚に直接作用させる観点から経皮投与が好ましい。経皮投与とすることで、全身投与では副作用が生じる薬剤であっても皮膚状態改善の観点で許容されうる。本発明の皮膚改善剤は、美白剤、かゆみ抑制剤、及び皮膚バリア向上剤として用いることができる。本発明の皮膚改善剤は、ＰＡＲ‐１の抑制を介して皮膚状態を改善することができる。
【００３０】
本発明の別の態様では、本発明は、トラネキサム酸又はその塩を含む、トロンビン作用阻害剤に関する。トラネキサム酸は、これまで抗プラスミン作用を介した凝血剤、抗炎症剤、美白剤として開発されてきている。その一方で、トロンビン作用に対する効果は全く知られていない。かかるトロンビン作用阻害剤は、皮膚バリア機能向上剤として使用しうる。また、アレルゲンによる反応を抑制することから、抗アレルギー剤、かゆみ抑制剤、抗炎症剤として使用しうる。トロンビン作用阻害剤により改善又は治療しうる皮膚状態としては、乾燥肌、敏感肌、鱗屑、ふけなどの美容上の問題が挙げられる。さらに、トロンビン作用阻害剤により、アトピー性皮膚炎、乾癬、湿疹などの皮膚疾患、ならびに花粉症などのアレルギー性疾患の治療に使用しうる。
【００３１】
血液学の分野では、トロンビン作用の阻害は、血液の抗凝固作用となることから、これまでプラスミンの作用として知られてきた抗プラスミン作用とは逆の作用となる。トロンビン作用は、トロンビン受容体であるＰＡＲを介した細胞作用と、フィブリノーゲンに作用して生じるフィブリン血栓形成作用とに大別される。本発明におけるトロンビン作用は、主にＰＡＲ‐１を介した作用をいう。したがって、トロンビン作用阻害剤は、ＰＡＲ、好ましくはＰＡＲ‐１、を介したトロンビン作用の阻害剤ということができる。トロンビン阻害作用は、ＰＡＲ‐１の受容体に対するアンタゴニスト作用であってもよいし、プロトロンビンからトロンビンへの分解を抑制することで発揮されてもよい。
【００３２】
本発明により、スクリーニングされた皮膚状態改善剤は、美白、かゆみ抑制、皮膚バリア向上を目的として、機能性食品、化粧料、医薬部外品、医薬品に配合しうる。配合される化粧品としては、日焼け止め、化粧水、美容液、美容クリーム、アフターケアローション、サンオイルなどが挙げられるが、皮膚に適用されるものであれば任意の化粧料に配合することができる。医薬品としては、抗炎症用の皮膚外用剤、抗炎症用の経口薬剤などが挙げられる。また、皮膚に直接適用することができる皮膚外用剤として配合されることが好ましい。本発明の皮膚状態改善剤は、その効果を損なわない範囲で、化粧品や医薬品等に用いられる任意配合成分を、必要に応じて適宜配合することができる。前記任意配合成分としては、例えば、油分、界面活性剤、粉末、色材、水、アルコール類、増粘剤、キレート剤、シリコーン類、酸化防止剤、紫外線吸収剤、保湿剤、香料、各種薬効成分、防腐剤、ｐＨ調整剤、中和剤などが挙げられる。他の薬効成分として、例えば抗炎症成分、美白成分などが含まれていてもよい。
【００３３】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【００３４】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【実施例】
【００３５】
実施例１：Ｃｒｙｊ１による細胞活性化、およびトラネキサム酸またはビバリルジン添加による活性化の抑制
培養ケラチノサイト（販売元：クラボウ）を、ＥＰＩＬＩＦＥ−ＫＧ２培地（販売元：クラボウ）で、３７℃加湿雰囲気下で２日間培養した。コンフルエントになった培養物に対し、培地をＥＰＩＬＩＦＥ−ＫＧ２＋Ｃａ１．８ｍＭ（販売元：クラボウ）に置換し、２８〜４８時間培養し、次いでＦｕｒａ２  ＡＭ（販売元：life technology）を５μＭで含むＥＰＩＬＩＦＥ−ＫＧ２＋Ｃａ１．８ｍＭ（販売元：クラボウ）に置換し、１時間培養した。その後、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＫＣｌ  ５ｍＭ、ＣａＣｌ2  １．８ｍＭ、ＭｇＣｌ2  １．２ｍＭ、ＨＥＰＥＳ  ２５ｍＭ、Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ  １０ｍＭを含むバッファー（ｐＨ７．４）に置換し、Ｃｒｙｊ１（販売元：HAYASHIBARA）を１００ｎｇ／ｍｌの濃度で、単独で、又はトラネキサム酸（Ｔ−ＡＭＣＨＡ）（販売元：LKT Laboratories）（１０ｍＭ）、ビバリルジン（販売元：ＰＲＯＳＰＥＣ）（１００ｎｇ／ｍｌ）、又はダイズトリプシン阻害剤（ＳＢＴＩ）（1μＭ）をバッファーに添加した。蛍光を蛍光顕微鏡で測定し、細胞内のカルシウム濃度変化を測定した。結果を図１（Ａ）に示す。Ｃｒｙｊ１添加約２分後の細胞内カルシウム濃度値を、Ａｑｕａ  Ｃｏｓｍｏｓソフトウェアを用いて計算し、図１（Ｂ）に示した（ｐ＜０．０００１）。Ｃｒｙｊ１単独添加により活性化された細胞が、トラネキサム酸、ビバリルジン又はダイズトリプシン阻害剤の添加により抑制されることが示された。
【００３６】
実施例２：セリンプロテアーゼ活性の測定
培養ケラチノサイト（販売元：クラボウ）を、ＥＰＩＬＩＦＥ−ＫＧ２培地（販売元：クラボウ）で、３７℃加湿雰囲気下で２日間培養した。コンフルエントになった培養物に対し、培地をＥＰＩＬＩＦＥ−ＫＧ２＋Ｃａ１．８ｍＭ（販売元：クラボウ）に置換し、２８〜４８時間培養した後、セリンプロテアーゼ活性測定試薬（販売元：ＡＡＴ  Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）を培地に添加した。培養物に対し、Ｃｒｙｊ１（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｃｒｙｊ１（１００ｎｇ／ｍｌ）＋トラネキサム酸（１０ｍＭ）、Ｃｒｙｊ１（１００ｎｇ／ｍｌ）＋ダイズトリプシン阻害剤（ＳＢＴＩ）（１μＭ）、およびＣｒｙｊ１（１００ｎｇ／ｍｌ）＋ビバリルジン（１００ｎｇ／ｍｌ）をそれぞれ添加し、対照として試薬未添加群を用いた。試薬添加後、蛍光顕微鏡で蛍光（波長：５４５ｎｍ）を測定し、セリンプロテアーゼ活性を測定した。結果を図２（Ａ）に示す。試薬添加後約1分におけるセリンプロテアーゼ基質分解の割合を、Ａｑｕａ  Ｃｏｓｍｏｓソフトウェアを用いて計算し、図２（Ｂ）に示した（トラネキサム酸：ｐ＜０．０００１、ＳＢＴＩ：ｐ＜０．０００１、ビバリルジン：ｐ＜０．０００１）。
【００３７】
実施例３：ヒト皮膚におけるＣｒｙｊ１およびトラネキサム酸との作用
ヒト被験者（女性３４歳）の腹部位に、Ｃｒｙｊ１（１μｇ／ｍｌ）、Ｃｒｙｊ１（１μｇ／ｍｌ）＋トラネキサム酸（１００ｍＭ）を２０分間適用し、適用後の表皮切片を取得した。取得した皮膚試料を電子顕微鏡（販売元：日立ハイテクノロジーズ）にて、皮膚試料の断面を撮影した（図３）。撮影した電子顕微鏡写真において、表皮の顆粒層のラメラ顆粒（ＬＧ）を矢印で示した。Ｃｒｙｊ１を単独適用された皮膚では、Ｃｒｙｊ１とトラネキサム酸を適用された皮膚に比較して、ラメラ顆粒が減少していた。
【００３８】
実施例４：ヒト皮膚におけるＣｒｙｊ１およびトラネキサム酸とビバリルジンの作用
ヒト被験者（女性３４歳）の腹部位に、セロハンテープによるテープストリッピング（ＴＳ）＋Ｃｒｙｊ１（１μｇ／ｍｌ）、ＴＳ＋Ｃｒｙｊ１（１μｇ／ｍｌ）＋トラネキサム酸（１００ｍＭ）、ＴＳ＋Ｃｒｙｊ１（１μｇ／ｍｌ）＋ビバリルジン（１μｇ／ｍｌ）を２時間、４時間、及び６時間適用し、それぞれ適用後に電子天秤を用いて、適用箇所のＴＥＷＬを測定した。その結果を図４に示す。
【００３９】
実施例５：ケラチノサイトにおけるプラスミンおよびプラスミノーゲンの発現
培養ケラチノサイト（販売元：クラボウ）を、ＥＰＩＬＩＦＥ−ＫＧ２培地で、３７℃加湿雰囲気下で２日間培養した。コンフルエントになった培養物を回収し、Ｔｒｉｚｏｌ（販売元：ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ）を用いて、ｃＤＮＡをＶＩＬＯ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（販売元：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の製品説明書にしたがって調製した。プラスミノーゲンの増幅用の下記のプライマーセット、ＰＬＧ−Ｆｗ：ggatgtgcctcggtagctc（配列番号１）、ＰＬＧ−Ｒｖ：gaacaattggctcccacag（配列番号２）及び内部標準のGapdh増幅用のプライマーセットを用いて、リアルタイムPCRを行ったが、プラスノーゲンの発現は見られなかった（図５）。
【００４０】
実施例６：ＰＡＲファミリーノックダウンケラチノサイトにおけるＣｒｙｊ１反応性
培養ケラチノサイト（販売元：クラボウ）にＰＡＲファミリー（ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−２、ＰＡＲ−３、ＰＡＲ−４）のｓｉＲＮＡ（販売元：GE Dharmacon）又はトロンビンｓｉＲＮＡ（販売元：GE Dharmacon）を導入しての遺伝子発現をノックダウンした。対照としてｓｃＲＮＡ（販売元：GE Dharmacon）を導入した。導入された培養ケラチノサイトを、ＥＰＩＬＩＦＥ−ＫＧ２（販売元：クラボウ）で、３７℃加湿雰囲気下で１日間培養した。コンフルエントになった培養物に対し、培地をＥＰＩＬＩＦＥ−ＫＧ２＋Ｃａ１．８ｍＭ（販売元：クラボウ）に置換し、１〜２日間培養し、次いでＦｕｒａ２  ＡＭ（販売元：life technology）を５μＭで含むＥＰＩＬＩＦＥ−ＫＧ２＋Ｃａ１．８ｍＭ（販売元：クラボウ）に置換し、１時間培養した。その後、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＫＣｌ  ５ｍＭ、ＣａＣｌ2  １．８ｍＭ、ＭｇＣｌ2  １．２ｍＭ、ＨＥＰＥＳ  ２５ｍＭ、Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ  １０ｍＭを含むバッファー（ｐＨ７．４）に置換し、Ｃｒｙｊ１（販売元：HAYASHIBARA）を１００ｎｇ／ｍｌの濃度で、単独でバッファーに添加した。蛍光を蛍光顕微鏡で測定し、細胞内のカルシウム濃度変化を測定した。結果を図７（Ａ）に示す。Ｃｒｙｊ１添加約２分後の細胞内カルシウム濃度値を、Ａｑｕａ  Ｃｏｓｍｏｓソフトウェアを用いて計算し、図７（Ｂ）に示した。ＰＡＲ−１のノックダウンにより、ケラチノサイトのＣｒｙｊ１への反応性が失われた。また、Ｃｒｙｊ１の添加による細胞の活性化が、トロンビンノックダウンケラチノサイトでは生じないことが示された。
【００４１】
実施例７：トロンビン添加による培養ケラチノサイトの活性化
培養ケラチノサイト（販売元：クラボウ）を、ＥＰＩＬＩＦＥ−ＫＧ２培地（販売元：クラボウ）で、３７℃加湿雰囲気下で２日間培養した。コンフルエントになった培養物に対し、培地をＥＰＩＬＩＦＥ−ＫＧ２＋Ｃａ１．８ｍＭ（販売元：クラボウ）に置換し、２８〜４８時間培養し、次いでＦｕｒａ２  ＡＭ（販売元：life teqnology）を５μＭで含むＥＰＩＬＩＦＥ−ＫＧ２＋Ｃａ１．８ｍＭ（販売元：クラボウ）に置換し、１時間培養した。その後、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＫＣｌ  ５ｍＭ、ＣａＣｌ2  １．８ｍＭ、ＭｇＣｌ2  １．２ｍＭ、ＨＥＰＥＳ  ２５ｍＭ、Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ  １０ｍＭ  を含むバッファー（ｐＨ７．４）に置換し、トロンビン（販売元：ナカライテスク）を１００ｐｇ／ｍｌの濃度で、単独で、又はトラネキサム酸（Ｔ−ＡＭＣＨＡ）（１０ｍＭ）又はビバリルジン（販売元：PROSPEC）（１００ｎｇ／ｍｌ）と組み合わせて、バッファーに添加した。蛍光を蛍光顕微鏡で測定し、細胞内のカルシウム濃度変化を測定した。結果を図６（Ａ）に示す。トロンビン添加約2分後の細胞内カルシウム濃度値を、Ａｑｕａ  Ｃｏｓｍｏｓソフトウェアを用いて計算し、図６（Ｂ）に示した（トラネキサム酸：ｐ＜０．０００１、ビバリルジン：ｐ＜０．０００１）。トロンビンの添加により、細胞が活性化されたこと、及びトロンビンの添加が、トラネキサム酸又はビバリルジンの同時添加により妨げられたことが示された。
【００４２】
実施例８：トラネキサム酸のトロンビン作用抑制の作用機序の同定
トロンビン（Ｆ２）（４０ｎｇ）（販売元：ナカライテスク）、プロトロンビン（ｐｒｏ−Ｆ２）（４０ｎｇ）（販売元：Invitrogen）、トロンビン＋トラネキサム酸（１００μＭ）（Ｆ２＋ＴＡＭＣＨＡ）、及びトロンビン＋ビバリルジン（1μg）（Ｆ２＋Ｂｉｖ）を含む溶液をそれぞれ準備し、トロンビン蛍光基質（販売元：コスモバイオ）（２０μＭ）を添加し、蛍光を蛍光測度計で測定した。結果を図８（Ａ）に示す。ビバリルジンはトロンビンの活性中心に作用して抗トロンビン作用を発揮する薬剤である。トロンビン活性が、ビバリルジンにより抑制される一方で、トラネキサム酸はトロンビン活性を抑制しなかった。
【００４３】
第Ｘａ因子（ＦＸａ）（９．５ｎｇ）（販売元：abcam）、第Ｘａ因子（９．５ｎｇ）＋ＧＧＡＣＫ（販売元：abcam）（１００μＭ）（ＦＸａ＋ＧＧＡＣＫ）、第Ｘａ因子（９．５ｎｇ）＋ＧＧトラネキサム酸（１０ｍＭ）（ＦＸａ＋Ｔ−ＡＭＣＨＡ）を含む溶液をそれぞれ準備し、第Ｘａ因子の蛍光基質（販売元：abcam）を添加し、蛍光を蛍光測度計で測定した。結果を図８（Ｂ）に示す。ＧＧＡＣＫは第Ｘａ因子の活性中心に作用する第Ｘａ因子抑制作用を発揮する薬剤である。第Ｘａ因子の活性が、ＧＧＡＣＫにより抑制される一方で、トラネキサム酸は第Ｘａ因子活性を抑制しなかった。
【００４４】
プロトロンビン（Ｐｒｏ−Ｆ２）（４０ｎｇ）＋第Ｘａ因子（ＦＸａ）溶液に、さらにトラネキサム酸（Ｔ−ＡＭＣＨＡ）を１０ｍＭ、１ｍＭ、及び１００μＭでそれぞれ添加した。さらに別のプロトロンビン（Ｐｒｏ−Ｆ２）（４０ｎｇ）＋第Ｘａ因子（ＦＸａ）溶液に、ビバリルジン（１μｇ）、及びＧＧＡＣＫ（１０μＭ）をそれぞれ添加した。これらの試験溶液に、トロンビンの発色基質（販売元：Rossix）を添加し、吸光を吸光光度系で測定した。結果を図８（Ｃ）に示す。トラネキサム酸が、濃度依存的に、トロンビン活性を抑制することが示された。
【００４５】
図８（Ａ）〜（Ｃ）の結果を参照すると、トラネキサム酸は、トロンビンや第Ｘａ因子の活性を抑制することはなく、プロトロンビンのトロンビンへの活性化を抑制することが示された。
【００４６】
実施例９：構造解析
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａ  ｂａｎｋ（ＰＤＢ）よりトラネキサム酸が結合しているプラスミノーゲン（ＫＲ１ドメイン）の立体構造データ（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＣＥＢ）とプロトロンビンの立体構造データ（ＰＤＢ  ＩＤ：５ＥＤＭ）を入手し、解析ソフトChimeraを用いて立体構造の比較を行った（図９）。その結果、トラネキサム酸が結合しているプラスミノーゲン（ＫＲ１ドメイン）の立体構造がプロトロンビン中の２つのＫＲドメインに非常によく重なることが示された。このことからトラネキサム酸はプロトロンビンのＫＲドメインに結合することが示唆された。
【００４７】
実施例１０：スクリーニング方法
（１）  ９６ウェルプレートの各ウェルにトロンビン（Ｆ２）と候補薬剤とを含む溶液を注入する。次にトロンビン蛍光基質（販売元：コスモバイオ）を添加する。添加後の蛍光をプレートリーダーで測定し、対照と比較することで候補薬剤のトロンビン活性抑制作用を決定することができる。トロンビン活性抑制作用を有する候補薬剤を、皮膚状態改善剤、好ましくは美白剤、かゆみ抑制剤、及び皮膚バリア向上剤としてスクリーニングすることができる。
【００４８】
（２）  ９６ウェルプレートの各ウェルにプロトロンビン（ｐｒｏ−Ｆ２）、第ＩＸａ因子、及び候補薬剤とを含む溶液を注入する。次にトロンビン発色基質(販売元：Rossixs)を添加する。添加後の吸光をプレートリーダーで測定し、対照と比較することで候補薬剤のトロンビン活性抑制作用を決定することができる。トロンビン活性抑制作用を有する候補薬剤を、皮膚状態改善剤、好ましくは美白剤、かゆみ抑制剤、及び皮膚バリア向上剤としてスクリーニングすることができる。
【００４９】
（３）培養ケラチノサイト（販売元：クラボウ）を、ＥＰＩＬＩＦＥ−ＫＧ２培地で、３７℃加湿雰囲気下で２日間培養する。コンフルエントになった培養物に対し、培地をＥＰＩＬＩＦＥ−ＫＧ２＋Ｃａ１．８ｍＭ（販売元：クラボウ）に置換し、２８〜４８時間培養し、次いでＦｕｒａ２  ＡＭ（販売元：life teqnology）を５μＭで含むＥＰＩＬＩＦＥ−ＫＧ２＋Ｃａ１．８ｍＭ（販売元：クラボウ）に置換する。Ｃｒｙｊ１（販売元：HAYASHIBARA）および候補薬剤を培地に添加する。蛍光を蛍光顕微鏡で測定し、細胞内のカルシウム濃度変化を測定する。対照と比較してカルシウム濃度が低下した場合に候補薬剤を、トロンビン活性抑制作用を有すると決定することができる。トロンビン活性抑制作用を有する候補薬剤を、皮膚状態改善剤、好ましくは美白剤、かゆみ抑制剤、及び皮膚バリア向上剤としてスクリーニングすることができる。
【００５０】
（４）培養ケラチノサイト（販売元：クラボウ）を、ＥＰＩＬＩＦＥ−ＫＧ２培地で、３７℃加湿雰囲気下で２日間培養する。コンフルエントになった培養物に対し、培地をＥＰＩＬＩＦＥ−ＫＧ２＋Ｃａ１．８ｍＭに置換し、２４〜４８時間培養し、次いでＦｕｒａ２ AM（販売元：life teqnology）を５μＭで含むＥＰＩＬＩＦＥ−ＫＧ２＋Ｃａ１．８ｍＭに置換する。トロンビン又はプロトロンビンおよび候補薬剤を培地に添加する。蛍光を蛍光顕微鏡で測定し、細胞内のカルシウム濃度変化を測定する。対照と比較してカルシウム濃度が低下した場合に、候補薬剤を、トロンビン活性抑制作用を有すると決定することができる。トロンビン活性抑制作用を有する候補薬剤を、皮膚状態改善剤、好ましくは美白剤、かゆみ抑制剤、及び皮膚バリア向上剤としてスクリーニングすることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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