(57)【要約】【課題】生物医学研究、医学的診断、予後診断、モニタリングおよび処置の選択、バイオテロの検出、並びに体積および濃度の小さい被分析物の複数の試料分析を含む他の分野において、試料中の粒子を低濃度で高感度検出できる試料分析システムを提供する。【解決手段】単一分子分析器であって、（ａ）試料を含む試料容器に電磁放射線を与えるための電磁放射線源；（ｂ）電磁放射線源からの電磁放射線を、試料中の測定領域に向けるためのシステム；（ｃ）測定領域を試料の少なくとも一部を通って移動させ、それによって可動測定領域を形成するための移動システム；および（ｄ）分子が存在する場合に、測定領域における単一分子から放射される電磁放射線を検出するための検出器であって、検出器が操作可能であるように測定領域に接続され、単一分子は、閾値レベルより大きい光子のビンにおける計数によって検出される、検出器を含む、単一分子分析器。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被分析物を測定するための分析器であって、
（ａ）処理試料を保持するための複数のマイクロウェルを備えるマイクロタイタープレートの一のマイクロウェルに電磁放射線を与えるための電磁放射線源；
（ｂ）電磁放射線源からの電磁放射線を、前記一のマイクロウェルに保持される処理試料中の測定領域に向けるためのシステム；
（ｃ）測定領域を前記一のマイクロウェルの少なくとも一部を通って移動させ、それによって可動測定領域を形成するための移動システム；
（ｄ）光子放出種が存在する場合に、測定領域における光子放出種から放射される電磁放射線を検出するための検出器であって、検出器が操作可能であるように測定領域に接続される、検出器；ならびに
（ｅ）操作可能であるように検出器に接続される処理器であって、処理器は、以下の工程：
（ｉ）測定領域におけるバックグラウンド信号に対応する閾値光子値を決定する工程、
（ｉｉ）閾値より大きい光子の値を有する個別のビンの同定により複数の個別のビンの各々における測定領域中の被分析物を含む又は該被分析物に対応する光子放出種の存在を決定する工程であって、閾値レベルより大きい光子の値を有する個別のビンは各々、個別の検出イベントを表し、一の個別のビンにおいて光子の総数が閾値レベルを上回らない場合には、該個別のビンに対して検出イベントは記録されない、工程、
（ｉｉｉ）個別の検出イベントの総和として総信号を決定する工程、および
（ｉｖ）試料中の被分析物の存在または量を総信号の関数として決定する工程
に従って、試料中の被分析物の存在または量を決定する、処理器
を含む、分析器。
【請求項２】
移動システムが、マイクロタイタープレートに対して測定領域を円状の経路で１５〜２３５ｃｍ／分の速度にて移動させることにより、測定領域を移動させ得る、請求項１に記載の分析器。
【請求項３】
電磁放射線源からの電磁放射ビームは、固定されたマイクロタイタープレートに対して移動可能である、請求項１に記載の分析器。
【請求項４】
マイクロタイタープレートは、電磁放射線源からの固定された電磁放射ビームに対して移動可能である、請求項１に記載の分析器。
【請求項５】
マイクロタイタープレートと、電磁放射線源からの電磁放射ビームとが、互いに対して移動可能である、請求項１に記載の分析器。
【請求項６】
移動システムが、走査モーターシャフトの端に取り付けられた傾いた鏡を含み、鏡は電磁放射線源からの電磁放射ビームをマイクロタイタープレートへと屈折させる、請求項１に記載の分析器。
【請求項７】
移動システムが、電磁放射線源のシャフトに取り付けられた光学くさびを含む、請求項１に記載の分析器。
【請求項８】
測定領域の体積が１５μｍ３〜１１０００μｍ３である、請求項１に記載の分析器。
【請求項９】
閾値光子値がバックグラウンド光子レベルの関数である、請求項１に記載の分析器。
【請求項１０】
閾値光子値が、バックグラウンド光子レベルより大きい固定された数の標準偏差である、請求項９に記載の分析器。
【請求項１１】
処理器が、被分析物の単一分子を含む又は該単一分子に対応する光子放出種として、閾値光子値より大きい光子のビンにおける計数を表す検出イベントを決定し、それにより、各ビンが、光子放出種の存在に関して「イエス」または「ノー」として分析される、請求項１に記載の分析器。
【請求項１２】
電磁放射線源が、１〜１００ｍＷの出力を有するレーザーである、請求項１に記載の分析器。
【請求項１３】
光子放出種が、電磁エネルギーによって刺激されると光子を放出するラベルを含み、ラベルは、被分析物に対して特異的な結合パートナーを含む、請求項１に記載の分析器。
【請求項１４】
ラベルが更に蛍光部分を含む、請求項１３に記載の分析器。
【請求項１５】
ビンが１０〜２０００マイクロ秒の継続時間を有する、請求項１に記載の分析器。
【請求項１６】
電磁放射線源が、連続波電磁放射線源である、請求項１に記載の分析器。
【請求項１７】
連続波電磁放射線源が発光ダイオードまたは連続波レーザーである、請求項１６に記載の分析器。
【請求項１８】
顕微鏡対物レンズを更に含み、顕微鏡対物レンズの被写界深度および顕微鏡対物レンズに結像される開口部の直径が共に測定領域を規定する、請求項１に記載の分析器。
【請求項１９】
顕微鏡対物レンズを更に含み、顕微鏡対物レンズの被写界深度および電磁放射ビームの横方向範囲が共に測定領域を規定する、請求項１に記載の分析器。
【請求項２０】
測定領域と検出器との間に操作可能であるように接続され、且つ測定領域から放射される電磁放射線を受けるように構成される減衰器を更に含み、処理器が更に、１以上のビンにおいて検出される光子の数が飽和閾値を上回るときに測定領域からの電磁放射線を減衰させるという命令を減衰器に対して出力するように構成される、請求項１に記載の分析器。
【請求項２１】
処理器が更に、ビン当たりの光子の総数を測定することにより、光子放出種の存在または量を決定するように構成される、請求項１に記載の分析器。
【請求項２２】
レーザービームを前記測定領域へと屈折させるため、および刺激された光子放出種を結像させるための共焦点光学配置を更に含み、前記共焦点光学配置は少なくとも０．６の開口数を有する対物レンズを含む、請求項１に記載の分析器。
【請求項２３】
各ビンの間に電磁放射線源から測定領域が受け取る全エネルギーが０．１〜１０マイクロジュールである、請求項１に記載の分析器。
【請求項２４】
電磁放射線源が、１０００マイクロ秒より短い継続時間にわたって蛍光部分を刺激する、請求項１に記載の分析器。
【請求項２５】
ビン時間は、蛍光部分が測定領域を横切る時間より長い、請求項１に記載の分析器。
【請求項２６】
ビン時間は、蛍光部分が測定領域を横切る時間の１／２〜２倍長い、請求項１に記載の分析器。
【請求項２７】
ビン時間は、蛍光部分が測定領域を横切る時間と同じである、請求項１に記載の分析器。
【請求項２８】
移動システムが、１回目および２回目に処理試料の同じ部分を通って移動し、それにより、光子放出種が存在する場合、１回目に測定領域が処理試料の当該部分を通って移動する際に検出される光子放出種が、１回目に処理試料の当該部分が測定領域によって取り調べられた後に試料の当該部分から拡散することが可能となり、更に、次の光子放出種が存在する場合、２回目に処理試料の当該部分が測定領域によって取り調べられる際に、次の光子放出種が試料の当該部分の中に拡散することが可能となるように構成および配置される、請求項１に記載の分析器。
【請求項２９】
移動システムが、測定領域を円状のパターンで移動させるように構成および配置され、システムは、１００〜１０００ＲＰＭの速度で測定領域を移動させることができる、請求項２８に記載の分析器。
【請求項３０】
移動システムが、測定領域を処理試料の同じ部分を通って１回より多い回数、移動させるように構成および配置されており、
移動システムは、１回目の通過において検出された光子放出種が当該部分から拡散し得かつ他の光子放出種が当該部分の中に拡散し得るように十分な時間が経過した後に、測定領域が処理試料の当該部分に戻るように、測定領域を移動させるように構成および配置される、請求項１に記載の分析器。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれか１項に記載の分析器と、蛍光部分であって、当該部分の励起波長の光を放射するレーザーによって刺激されると少なくとも２００の光子を放出することができる蛍光部分とを含む分析器システムであって、レーザーは、当該部分を含む直径５ミクロン以上のスポットにおいて焦点が合わされ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーが３マイクロジュール以下である、システム。
【請求項３２】
蛍光部分の光退色性が低い、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
試料中の被分析物の存在または量を検出する方法であって、
（ａ）電磁放射線源からの電磁放射線を、複数のマイクロウェルを備えるマイクロタイタープレートの一のマイクロウェルに保持された処理試料中の測定領域に向ける工程；
（ｂ）測定領域におけるバックグラウンド信号に対応する閾値光子値を決定する工程；
（ｃ）個別のビンの間に閾値より大きい光子の値を決定することによって、処理試料の第１位置に設けられる測定領域における被分析物を含む又は該被分析物に対応する光子放出種の有無を検出する工程であって、閾値レベルより大きい光子の値は個別の検出イベントを表し、一の個別のビンにおいて光子の総数が閾値レベルを上回らない場合には、該個別のビンに対して検出イベントは記録されない、工程；
（ｄ）測定領域を、処理試料を通って試料の次の位置に移動させる工程；
（ｅ）次の個別のビンの間に、処理試料の次の位置において被分析物を含む又は該被分析物に対応する次の光子放出種の有無を検出する工程；
（ｆ）複数の個別のビンの間に、処理試料の複数の位置において光子放出種の有無を検出するのに必要なだけ、工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程；
（ｇ）個別の検出イベントの総和として総信号を決定する工程；
（ｈ）総信号を検量線と比較することによって、試料中の被分析物の存在または量を決定する工程；ならびに
（ｉ）マイクロタイタープレートの別のマイクロウェルについて、工程（ａ）〜（ｈ）を繰り返す工程
を含む、方法。
【請求項３４】
閾値光子値が、バックグラウンド光子レベルの関数である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
閾値光子値が、バックグラウンド光子レベルより大きい固定された数の標準偏差である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
処理器が、被分析物の単一分子に対応する光子放出種として、閾値光子値より大きい光子のビンにおける計数を表す検出イベントを決定し、それにより、各ビンが、光子放出種の存在に関して「イエス」または「ノー」として分析される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
測定領域の体積が１５μｍ３〜１１０００μｍ３である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
マイクロタイタープレートに対して測定領域を円状の経路で１５〜２３５ｃｍ／分の速度にて移動させることで、測定領域が移動させられる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
測定領域が、処理試料の第１位置を通って移動し、それにより、光子放出種が存在する場合、１回目に測定領域が処理試料の当該位置を通って移動させられる際に検出される光子放出種が、１回目に試料の当該位置が測定領域によって取り調べられた後に、処理試料の当該位置から拡散することが可能となり、更に、次の光子放出種が存在する場合、２回目に試料の当該位置が測定領域によって取り調べられる際に、次の光子放出種が処理試料の当該位置の中に拡散することが可能となる、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
測定領域が、１回より多い回数、処理試料の第１位置を通って移動させられ、
測定領域は、１回目の通過において検出された光子放出種が第１位置から拡散し得、別の光子放出種が第１位置の中に拡散し得るように十分な時間が経過した後に、測定領域が処理試料の第１位置に戻るように移動させられる、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［相互参照］
本願明細書は、２００７年１２月１９日に提出された米国仮出願第６１／０１５，１４２号の利益を主張し、この明細書は引用することにより本願明細書に包含される。
【背景技術】
【０００２】
生物医学研究、医学的診断、予後診断、モニタリングおよび処置の選択、バイオテロの検出、並びに体積および濃度の小さい被分析物の複数の試料分析を含む他の分野における進歩は、試料中の粒子をますます低い濃度で高感度検出できる試料分析システムの発展をもたらした。米国特許第４，７９３，７０５号および５，２０９，８３４号には、極めて高感度の検出を達成する従来のシステムが記載されている。本発明は、この分野における更なる発展を提供する。
【発明の概要】
【０００３】
本願明細書において、以下のものを有する単一分子検出器を提供する：（ａ）試料を含む試料容器に電磁放射線を与えるための電磁放射線源；（ｂ）電磁放射線源からの電磁放射線を、試料中の測定領域（またはインタロゲーション・スペース、ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ  ｓｐａｃｅ）に向けるためのシステム；（ｃ）測定領域を試料の少なくとも一部を通って移動させ、それによって可動測定領域を形成するための移動（ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ）システム；および（ｄ）分子が存在する場合に測定領域における単一分子から放射される電磁放射線を検出するために、操作可能であるように測定領域に接続される検出器。いくつかの態様において、単一分子分析器は移動システムを有し、その移動システムは、一つ又はそれより多くの直線状および非直線状経路で測定領域を移動させることができる。いくつかの態様において、非直線状経路は実質的に円状（または環状）の経路である。いくつかの態様において、非直線状経路は、実質的に螺旋状のパターンである。いくつかの態様において、非直線状経路は、実質的にラスターパターンである。いくつかの態様において、本明細書に記載の単一分子分析器は、少なくとも一つの試料を表面に有し且つ収容するように適合させられ且つ構成された表面を有する容器を更に有する。いくつかの態様において、容器はプレートである。別の態様において、プレートはマイクロタイタープレートである。
【０００４】
単一分子検出器のいくつかの態様において、測定領域は、約１μｍ３より大きい、約２μｍ３より大きい、約３μｍ３より大きい、約４μｍ３より大きい、約５μｍ３より大きい、約１０μｍ３より大きい、約１５μｍ３より大きい、約３０μｍ３より大きい、約５０μｍ３より大きい、約７５μｍ３より大きい、約１００μｍ３より大きい、約１５０μｍ３より大きい、約２００μｍ３より大きい、約２５０μｍ３より大きい、約３００μｍ３より大きい、約４００μｍ３より大きい、約４５０μｍ３より大きい、約５００μｍ３より大きい、約５５０μｍ３より大きい、約６００μｍ３より大きい、約７５０μｍ３より大きい、約１０００μｍ３より大きい、約２０００μｍ３より大きい、約４０００μｍ３より大きい、約６０００μｍ３より大きい、約８０００μｍ３より大きい、約１００００μｍ３より大きい、約１２０００μｍ３より大きい、約１３０００μｍ３より大きい、約１４０００μｍ３より大きい、約１５０００μｍ３より大きい、約２００００μｍ３より大きい、約３００００μｍ３より大きい、約４００００μｍ３より大きい、または約５００００μｍ３より大きい有効体積を有する。いくつかの態様において、測定領域の体積は、約５００００μｍ３より小さく、約４００００μｍ３より小さく、約３００００μｍ３より小さく、約２００００μｍ３より小さく、約１５０００μｍ３より小さく、約１４０００μｍ３より小さく、約１３０００μｍ３より小さく、約１２０００μｍ３より小さく、約１１０００μｍ３より小さく、約９５００μｍ３より小さく、約８０００μｍ３より小さく、約６５００μｍ３より小さく、約６０００μｍ３より小さく、約５０００μｍ３より小さく、約４０００μｍ３より小さく、約３０００μｍ３より小さく、約２５００μｍ３より小さく、約２０００μｍ３より小さく、約１５００μｍ３より小さく、約１０００μｍ３より小さく、約８００μｍ３より小さく、約６００μｍ３より小さく、約４００μｍ３より小さく、約２００μｍ３より小さく、約１００μｍ３より小さく、約７５μｍ３より小さく、約５０μｍ３より小さく、約２５μｍ３より小さく、約２０μｍ３より小さく、約１５μｍ３より小さく、約１４μｍ３より小さく、約１３μｍ３より小さく、約１２μｍ３より小さく、約１１μｍ３より小さく、約１０μｍ３より小さく、約５μｍ３より小さく、約４μｍ３より小さく、約３μｍ３より小さく、約２μｍ３より小さく、または約１μｍ３より小さい。いくつかの態様において、測定領域の体積は、約１μｍ３〜約１００００μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約１μｍ３〜約１０００μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約１μｍ３〜約１００μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約１μｍ３〜約５０μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約１μｍ３〜約１０μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約２μｍ３〜約１０μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約３μｍ３〜約７μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約１５μｍ３〜約１１０００μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約２００μｍ３〜約３０００μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約５００μｍ３〜約６００��ｍ３である。
【０００５】
単一分子分析器のいくつかの態様において、単一分子は容器表面に結合する。いくつかの態様において、単一分子は、非共有結合によって容器表面に結合する。別の態様において、非共有結合は、分子と、容器表面と共有結合または非共有結合する抗体との間に形成される。別の態様において、非共有結合は、分子と、容器表面に位置する抗体との間に形成される。いくつかの態様において、単一分子分析器は顕微鏡対物レンズを更に有し、顕微鏡対物レンズの被写界深度およびレーザービームの横方向範囲が共に測定領域を規定する。いくつかの態様において、被写界深度および顕微鏡対物レンズに結像した開口部の直径が共に測定領域を規定する。いくつかの態様において、顕微鏡対物レンズは、測定領域中に位置する単一分子から放射される電磁放射線を集光するように適合させられ且つ構成される。いくつかの態様において、測定領域は、試料の一部を通って移動させることができる。いくつかの態様において、移動システムは、１回より多い回数、試料の一部を通って移動するように構成および配置される。いくつかの態様において、移動システムは、１回目および２回目に試料の同じ部分を通って、１回目に測定領域が試料の当該部分を通って移動する際に検出される件の分子が、１回目に試料の当該部分が測定領域によって取り調べられた後に試料の当該部分から実質的に拡散することを可能とし、更に、次の件の分子が存在する場合、２回目に試料の当該部分が測定領域によって取り調べられる際に、次の分子が試料の当該部分の中に実質的に拡散することを可能とする十分に遅い速度で移動するように構成および配置される。いくつかの態様において、移動システムは、十分な時間が経過した後に検出スポットが試料の当該部分に戻り、それにより１回目の通過において検出された分子が当該部分から拡散し得、他の分子が当該部分の中に拡散し得るように測定領域を移動させるように構成および配置される。いくつかの態様において、単一分子分析器は、測定領域を実質的に円状のパターンで移動させることができるシステムを更に有する。そのような態様において、システムは、約１００〜約１０００ＲＰＭの速度で測定領域を移動させることができる。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は１００ＲＰＭより速い。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は３００ＲＰＭより速い。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は５００ＲＰＭより速い。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は７００ＲＰＭより速い。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は９００ＲＰＭより速い。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は１０００ＲＰＭより遅い。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は８００ＲＰＭより遅い。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は６００ＲＰＭより遅い。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は４００ＲＰＭより遅い。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は２００ＲＰＭより遅い。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は約１００ＲＰＭ〜約１０００ＲＰＭである。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は約２００ＲＰＭ〜約９００ＲＰＭである。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は約３００ＲＰＭ〜約８００ＲＰＭである。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は約４００ＲＰＭ〜約７００ＲＰＭである。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は約４５０ＲＰＭ〜約６００ＲＰＭである。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は約４５０ＲＰＭ〜約５５０ＲＰＭである。
【０００６】
いくつかの態様において、単一分子分析器は、連続的に、第１試料中の特定の種類の単一分子の有無を検出し、第２試料中の当該種類の単一分子の有無を検出するように適合させられ且つ構成され、第１試料と第２試料との間でキャリーオーバーがない。
【０００７】
本明細書において、以下のものを含むマイクロタイタープレートが更に提供される：（ａ）５５０ｎｍ〜８００ｎｍの波長の光に対して実質的に透明である材料からなり、かつ一つ又はそれより多くの部分を含む基部であって、当該部分が、当該部分の第２の側（または面もしくはサイド）に配置される高開口数のレンズによって当該部分の第１の側において像が形成され得るような厚さであり、像のどの部分も基部内に形成されない基部；および（ｂ）少なくとも一つの流体（または液体）試料を表面に収容し且つ閉じこめる（または保つ若しくは制限する）ように適合させられ且つ構成される表面。いくつかの態様において、基部は６００ｎｍ〜７５０ｎｍの波長の光に対して透明である。いくつかの態様において、基部は６３０ｎｍ〜７４０ｎｍの波長の光に対して透明である。いくつかの態様において、基部は６３０ｎｍ〜６４０ｎｍの波長の光に対して透明である。いくつかの態様において、プレート表面は、一連のマイクロウェルを有する。いくつかの態様において、プレートはポリスチレンより小さい蛍光を放射する材料で構成される。
【０００８】
連続的に、第１試料中の特定の種類の単一分子の有無を検出し、第２試料中の当該種類の単一分子の有無を検出し得る機器であって、第１試料と第２試料との間でキャリーオーバーがないように適合させられ且つ構成される機器が、本明細書において更に提供される。
【０００９】
連続的に、第１試料中の特定の種類の単一分子の有無を検出し、第２試料中の当該種類の単一分子の有無を検出する方法であって、第１試料と第２試料との間でキャリーオーバーがない方法が、本明細書において更に提供される。いくつかの態様において、件の単一分子は第１試料および第２試料において検出され、第１試料および第２試料は使い捨てでない装置に収容され且つ閉じこめられる。
【００１０】
本明細書において、試料中の単一分子の有無を検出するための方法が提供され、その方法は以下の工程を含む：（ａ）電磁放射線源からの電磁放射線を試料中の測定領域に向ける工程；（ｂ）試料の第１位置に設けられる測定領域における第１の単一分子の有無を検出する工程；（ｃ）測定領域を、試料を通って試料の次の位置に移動させる工程；（ｄ）試料の次の位置において次の単一分子の有無を検出する工程；および（ｅ）試料の一つより多くの位置において単一分子の有無を検出するのに必要なだけ、工程（ｃ）および（ｄ）を繰り返す工程。本発明のいくつかの態様において、測定領域は、約１μｍ３より大きい、約２μｍ３より大きい、約３μｍ３より大きい、約４μｍ３より大きい、約５μｍ３より大きい、約１０μｍ３より大きい、約１５μｍ３より大きい、約３０μｍ３より大きい、約５０μｍ３より大きい、約７５μｍ３より大きい、約１００μｍ３より大きい、約１５０μｍ３より大きい、約２００μｍ３より大きい、約２５０μｍ３より大きい、約３００μｍ３より大きい、約４００μｍ３より大きい、約４５０μｍ３より大きい、約５００μｍ３より大きい、約５５０μｍ３より大きい、約６００μｍ３より大きい、約７５０μｍ３より大きい、約１０００μｍ３より大きい、約２０００μｍ３より大きい、約４０００μｍ３より大きい、約６０００μｍ３より大きい、約８０００μｍ３より大きい、約１００００μｍ３より大きい、約１２０００μｍ３より大きい、約１３０００μｍ３より大きい、約１４０００μｍ３より大きい、約１５０００μｍ３より大きい、約２００００μｍ３より大きい、約３００００μｍ３より大きい、約４００００μｍ３より大きい、または約５００００μｍ３より大きい有効体積を有する。いくつかの態様において、測定領域の体積は、約５００００μｍ３より小さく、約４００００μｍ３より小さく、約３００００μｍ３より小さく、約２００００μｍ３より小さく、約１５０００μｍ３より小さく、約１４０００μｍ３より小さく、約１３０００μｍ３より小さく、約１２０００μｍ３より小さく、約１１０００μｍ３より小さく、約９５００μｍ３より小さく、約８０００μｍ３より小さく、約６５００μｍ３より小さく、約６０００μｍ３より小さく、約５０００μｍ３より小さく、約４０００μｍ３より小さく、約３０００μｍ３より小さく、約２５００μｍ３より小さく、約２０００μｍ３より小さく、約１５００μｍ３より小さく、約１０００μｍ３より小さく、約８００μｍ３より小さく、約６００μｍ３より小さく、約４００μｍ３より小さく、約２００μｍ３より小さく、約１００μｍ３より小さく、約７５μｍ３より小さく、約５０μｍ３より小さく、約２５μｍ３より小さく、約２０μｍ３より小さく、約１５μｍ３より小さく、約１４μｍ３より小さく、約１３μｍ３より小さく、約１２μｍ３より小さく、約１１μｍ３より小さく、約１０μｍ３より小さく、約５μｍ３より小さく、約４μｍ３より小さく、約３μｍ３より小さく、約２μｍ３より小さく、または約１μｍ３より小さい。いくつかの態様において、測定領域の体積は約１μｍ３〜約１００００μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約１μｍ３〜約１０００μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約１μ��３〜約１００μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約１μｍ３〜約５０μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約１μｍ３〜約１０μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約２μｍ３〜約１０μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約３μｍ３〜約７μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約１５μｍ３〜約１１０００μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約２００μｍ３〜約３０００μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約５００μｍ３〜約６００μｍ３である。
【００１１】
本発明の方法のいくつかの態様において、測定領域は、非直線状経路で移動させられる。別の態様において、非直線状経路は、実質的に円状（または環状）の経路を含む。別の態様において、非直線状経路は、実質的に螺旋状の経路を含む。別の態様において、試料は、試料内に設けられる測定領域に向けられる電磁放射線に対して実質的に固定されたままである。いくつかの態様において、試料はｘ−ｙ軸において移動させられ、電磁放射線源は実質的に静止したままである。いくつかの態様において、電磁放射線と試料の両方が互いに対して移動させられる。いくつかの態様において、測定領域は１回より多い回数、試料の第１位置を通って移動させられる。いくつかの態様において、測定領域は、次の回において、試料の第１位置を通って、件の分子が存在する場合、１回目に測定領域が試料の当該位置を通って移動させられる際に検出される件の分子が、１回目に試料の当該位置が測定領域によって取り調べられた後に、試料の当該位置から実質的に拡散することを可能し、更に、次の件の分子が存在する場合、２回目に試料の当該位置が測定領域によって取り調べられる際に、次の件の分子が試料の当該位置の中に実質的に拡散することを可能とする十分に遅い速度で移動する。いくつかの態様において、測定領域は、十分な時間が経過した後に検出スポットが第１位置に戻り、その結果、１回目の通過において検出された分子が当該位置から拡散し得、他の分子が当該位置の中に拡散し得るように移動させられる。いくつかの態様において、方法は、連続的に、試料中の特定の種類の単一分子の有無を検出し、次に第２試料中の同じ種類の単一分子の有無を検出する工程を更に含み、第１試料と第２試料との間でキャリーオーバーがない。方法のいくつかの態様において、第１試料および第２試料は、使い捨てでない装置に収容されかつ閉じこめられる。
【００１２】
［引用による取り込み］
本明細書において言及する全ての刊行物および特許出願は、各々の個別の刊行物または特許出願が引用されることにより組み込まれることが明確かつ個別に示されるように、本明細書において引用することにより同程度に組み込まれる。
【００１３】
本発明の新しい特徴は、添付の特許請求の範囲において詳細に明記される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用されている例示的態様が明記された以下の詳細な説明および添付の図面を参照することにより得られるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１Ａは、上面から見た場合の単一分子走査分析器を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、側面から見た場合の単一分子走査分析器を示す。
【図２】図２は、分子量が１５５ｋＤａの分子に関する拡散時間を分子の拡散半径の関数として示すグラフを示す。
【図３】図３は、単一分子走査分析器を用いて発生する検出イベントデータを示す。
【図４】図４は、単一分子走査分析器を用いて既知の濃度範囲にわたって試料を検出することにより作成される検量線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
［Ｉ．序論］
本発明は、単一分子の高感度検出、および試料中の分子濃度測定のための機器、キット、組成物および方法を提供する。いくつかの態様において、本発明の機器、組成物、方法およびキットの感度および精度は、適切な波長および出力の電磁波源、適切な測定領域寸法、高開口数のレンズ、一つの光子を検出できる検出器、および単一分子を計数するためのデータ分析システムから選択される要素の組み合わせによって達成され得るが、これらに限定されない。本発明の機器は、「単一分子検出器」または「単一粒子検出器」と呼ばれ、用語「単一分子分析器」および「単一粒子分析器」にも包含される。いくつかの態様において、本発明のキットおよび方法の感度および精度は、本発明の機器を、分子の一分子レベルでの検出を可能にする特性を示す分子のラベル、および本明細書に記載の機器においてラベルを分析する方法から選択される要素の組み合わせと一緒に用いることによって達成されるが、これらに限定されない。
【００１６】
本発明の機器、キットおよび方法は、単一分子または小分子の高感度かつ精確な検出、および試料中の分子濃度の測定に特に有用である。
【００１７】
いくつかの態様において、本発明は、単一分子の検出による分子の高感度検出および濃度測定のための機器およびキット、そのような検出および測定のためのラベル、並びに試料分析においてそのような機器およびラベルを用いる方法を提供する。特に、本発明の機器、キットおよび方法の感度および精度によって、極めて低い濃度、例えば約１００、１０、１、０．１、０．０１または０．００１フェムトモル濃度より低い濃度における、分子、例えば生物学的状態に関するマーカーの検出および濃度測定が可能となる。別の態様において、本発明の機器およびキットは、試料の希釈または他の処理を必要とすることなく、濃度の広いダイナミックレンジにわたって、例えば、１０５倍、１０６倍または１０７倍より大きい濃度範囲にわたって、試料中の種の濃度、例えば分子の濃度を測定し得る。
【００１８】
本発明の機器、キットおよび方法の高感度によって、以前は検出感度の不足により有用でなかったマーカー、例えば生物学的マーカーの使用が可能となる。本発明の機器、キットおよび方法の高感度は、新たなマーカーの確立も促進する。生物学的状態を測定するのに有用であり得る多数のマーカーが、現在入手可能であるが、それらの低濃度領域の測定が現在のところ制限されているので、現在のところ実用的でない。いくつかの場合において、異常に高いレベルのマーカーは現在の方法で検出できるが、正常な範囲は知られていない。いくつかの場合において、異常に高いレベルのマーカーは現在の方法で検出できるが、正常な範囲は確立されていない。いくつかの場合において、マーカーの正常範囲の上方は検出できるが、正常範囲の下方または正常範囲より下は検出できない。いくつかの場合、例えば癌または感染症のマーカーにおいて、いずれのレベルのマーカーも生物学的状態の存在を示し得、検出感度の増大は早期診断に対して有利である。いくつかの場合において、複数の時点にわたるマーカー濃度の変化速度または変化の欠如は最も有用な情報を提供するが、現在の分析方法においては、通常は最も処理しやすい早期段階の状態におけるタイムポイントサンプリングは許容されない。いくつかの場合において、マーカーは、臨床状況において実用的でない又は有用でない扱いにくい方法（試料の複雑な処理および時間を要する分析を必要とする方法等）を使用することによってのみ、臨床的に有用なレベルで検出され得る。更に、生物学的状態の潜在的マーカーであって、それらの存在を現在の方法により検出することが極めて困難または不可能なままであるほど十分低い濃度のマーカーが存在する。
【００１９】
本発明の分析方法および組成物は、以前はマーカーを検出し得なかった濃度における生物学的状態に関するマーカーの検出を可能にし、従って、そのようなマーカーが、確認マーカーまたは限定された研究状況でのみ有用なマーカーから、臨床的状況および／または臨床試験を含む大規模な臨床的状況において有用な診断用マーカー、予後マーカー、処置目的のマーカーまたは他の種類のマーカーへと「再目的化（ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ）」し得るレベルの感度、精度およびロバスト性を提供する。そのような方法により、そのようなマーカーに対して正常および異常な範囲の測定が可能となる。
【００２０】
このように再目的化されたマーカーは、例えば、正常な状態（正常な範囲）の検出、（例えば薬物の投与等の処置に対する）レスポンダー（または反応者）／ノンレスポンダー（または非反応者）の検出；早期疾患または病理発生の検出（例えば、癌の早期検出、心虚血の早期検出））；疾患（例えば癌）の病期分類、疾患のモニタリング（例えば糖尿病のモニタリング、処置後の癌の再発のモニタリング）；疾患メカニズムの研究；および薬物治療の毒性等の治療の毒性に関する研究に使用し得る。
【００２１】
従って、本発明は、マーカーを高感度で検出する方法および組成物、並びにマーカーの正常および異常なレベルに関する値を設定する別の方法を提供する。別の態様において、本発明は、マーカーに関して設定された値に基づいて、診断、予後診断および／または処置を選択する方法を提供する。本発明は、そのような方法で用いるための組成物（例えばマーカーの超高感度検出のための検出試薬）も提供する。
【００２２】
［ＩＩ．走査分析器システムの機器およびシステム］
本発明の方法は、走査分析器、例えば単一分子検出器を使用する。そのような単一分子検出器には、以下に記載の態様が含まれる。
【００２３】
［Ａ．装置／システム］
一の要旨において、本明細書に記載のシステムおよび方法は、試料中の単一分子を検出し得る走査分析器システムを使用する。一の態様において、走査分析器システムは、電磁放射線源からの電磁放射線を、試料容器内にある試料に与えることができる。単一分子分析器は、電磁放射線源からの電磁放射線を、試料中の測定領域に向けるためのシステムを有する。単一分子分析器は、測定領域を、試料の少なくとも一部を通って移動させるための移動システムも有し、それによって、可動測定領域が形成される。いくつかの態様において、単一分子分析器の検出器は、操作可能であるように、単一分子分析器の測定領域に接続され、その結果、分子が存在する場合、その検出器は測定領域中の単一分子から放射される放射線を検出する。
【００２４】
一の要旨において、走査分析器システムは、蛍光ラベルでラベリングされた単一分子を励起させるための電磁放射線源を有する。一の態様において、分析器システムの電磁放射線源はレーザーである。別の態様において、電磁放射線源は、連続波レーザーである。
【００２５】
通常の態様において、電磁放射線源は、測定領域がラベルに直面する際に、ラベルに結合した蛍光部分を励起する。いくつかの態様において、蛍光ラベル部分は、１個またはそれより多くの蛍光色素分子を有する。いくつかの態様において、蛍光ラベル部分は量子ドットである。本明細書に記載のいずれの適切な蛍光部分も、ラベルとして用いることができる。
【００２６】
通常の態様において、走査分析器システムは、電磁放射線を試料中の測定領域に向けるためのシステムを有する。いくつかの態様において、試料濃度は、測定領域が件の単一分子を１個より多く含有する可能性が低い、例えば測定領域が、ほとんどの場合において件の単一分子をゼロ個または１個含有するような濃度である。その後、測定領域は、試料全体に存在する単一分子を検出するために、試料を通って移動させられる。通常の態様において、電磁放射線源からの電磁放射線は、電磁放射線および電磁放射線が向けられる測定領域が試料を通って移動させられる際に、ラベルに結合した蛍光部分を励起する。
【００２７】
通常、走査分析器システムは、測定領域を試料の少なくとも一部を通って移動させるための移動システムを更に有し、それによって、可動測定領域が形成される。可動測定領域は、試料の異なる部分に存在する複数の件の単一分子を検出し得る。
【００２８】
測定領域はラベルを通過し、その後、ラベルは、電磁放射線源によって励起される時に、検出可能な量のエネルギーを放出する。通常の態様において、単一分子分析器は、測定領域中の単一分子から放射される電磁放射線を検出するために、操作可能であるように測定領域に接続された検出器を有する。電磁放射線検出器は、ラベルによって、例えばラベルの蛍光部分によって放出されるエネルギーを検出し得る。
【００２９】
［Ｂ．単一分子走査分析器］
図１Ａおよび１Ｂに示すように、走査分析器システム１００の一の態様をここで説明する。分析器システム１００は、電磁放射線源１１０、第１位置合わせ鏡１１２、第２位置合わせ鏡１１４、二色性鏡１６０、走査モーター１２０のシャフト１２４に取り付けられた回転走査鏡１２２を有する。図１Ｂに示すように、回転走査鏡１２２は、第１走査レンズ１３０、第２走査レンズ１３２、および顕微鏡対物レンズ１４０を通して試料プレート１７０へと電磁放射線源を屈折させる。試料プレート１７０上に存在する単一分子に関連する蛍光が、結像レンズ１８０、開口部１８２、検出器フィルター１８８、検出器レンズ１８６および検出器１８４を用いて検出される。信号はその後、操作可能であるように検出器１８４と組み合わされた処理器（図示せず）によって処理される。いくつかの態様において、走査分析器システム１００全体は、ベースボード１９０に取り付けられる。
【００３０】
操作において、電磁放射線源１１０は、その出力１２６、例えばビームが、第１位置合わせ鏡１１２の前面１１１に反射して第２位置合わせ鏡１１４の前面１１３に向かい、二色性鏡架台１６２に取り付けられた二色性鏡１６０に向かうように位置合わせされる。その後、二色性鏡１６０は、電磁放射線１２６を、走査モーター１２０のシャフト１２４の先端に設置される走査鏡１２２の前面に向けて反射する。その後、電磁放射線１２６は、第１走査レンズ１３０および第２走査レンズ１３２を通過して顕微鏡対物レンズ１４０に向かう。対物レンズ１４０は、試料プレート１７０の基部１７４を通るビーム１２６の焦点を合わせ、ビーム１２６を、ビーム１２６が入った試料プレート１７０の対向する側に設けられる測定領域に向ける。電磁放射線ビーム１２６が第１走査レンズ１３０および第２走査レンズ１３２を通過することにより、対物レンズ１４０に向かう全ての光の効率的なカップリングが確保される。ビーム１２６は、試料プレート１７０上に存在する件の単一分子に結合したラベルを励起させる。ラベルは放射線を放射し、その放射線は対物レンズ１４０によって集光される。その後、電磁放射線は走査レンズ１３０、１３２を通して送り返され、それにより、対物レンズ１４０からの放射のカップリング効率が確保される。検出された放射線を、走査鏡１２２の前面から二色性鏡１６０へと反射させる。検出される蛍光が電磁放射線源１１０の色と異なるので、二色性鏡１６０を通過する蛍光は、結像レンズ１８０、開口部１８２、検出器フィルター１８８および検出器レンズ１８６を通過して検出器１８４に向かう。検出器フィルター１８８によって、光散乱または周囲の光に起因する異常なノイズ信号が最小になり、一方、粒子と結合した蛍光部分が励起することにより放射される信号が最大になる。処理器は、本明細書に記載の方法に従って粒子からの光信号を処理する。
【００３１】
好ましい態様において、顕微鏡対物レンズ１４０は開口数を有する。本明細書において用いる場合、「高開口数のレンズ」には、開口数が０．６に等しい又はそれより大きいレンズが含まれる。開口数は、対物レンズによって捕捉される高度に回折された像形成光の数の尺度である。開口数が高いほど、傾きのより大きい光線が対物レンズに入ることが可能になり、それによって、より解像度の高い像が形成される。像の輝度もまた、開口数が高くなるにつれて増加する。高開口数のレンズは様々な製造業者から商業的に入手可能であり、開口数が約０．６に等しい又はそれより大きいレンズであれば分析器システムに用いることができる。いくつかの態様において、レンズは約０．６〜約１．３の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは約０．６〜約１．０の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは約０．７〜約１．２の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは約０．７〜約１．０の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは約０．７〜約０．９の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは約０．８〜約１．３の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは約０．８〜約１．２の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは約０．８〜約１．０の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは少なくとも約０．６の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは少なくとも約０．７の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは少なくとも約０．８の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは少なくとも約０．９の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは少なくとも約１．０の開口数を有する。いくつかの態様において、顕微鏡対物レンズ１４０の開口数は約１．２５である。
【００３２】
試料プレート１７０の壁または基部を通して単一分子の検出を行う場合に通常必要とされる開口数（ＮＡ）の高い顕微鏡対物レンズは作動距離が短い。作動距離は、レンズの前面から焦点が合っている対物レンズの距離である。いくつかの態様において、対物レンズは、３５０ミクロン以内の対物レンズでなければならない。ＮＡが０．８である顕微鏡対物レンズ１４０が用いられるいくつかの態様において、オリンパス４０Ｘ／０．８ＮＡ水浸対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｉｎｃ．（米国））を用いることができる。この対物レンズは、作動距離が３．３ｍｍである。いくつかの態様において、作動距離が２ｍｍであるオリンパス６０Ｘ／０．９ＮＡ水浸対物レンズを用いることができる。後者のレンズは水浸レンズであるので、対物レンズと試料との間の空間１４２を水で満たさなければならない。これは、水バブラー（ｗａｔｅｒ  ｂｕｂｂｌｅｒ）（図示せず）または他の適切な配管を用いて対物レンズと試料プレートの基部との間に水を挿入することによって達成することができる。
【００３３】
全ての態様において、電磁放射線源は、レーザー波長が、粒子に結合した蛍光ラベルを励起させるのに十分であるように設定される。いくつかの態様において、電磁放射線源１１０は、可視スペクトルの光を放射するレーザーである。いくつかの態様において、レーザーは、波長が６３９ｎｍである連続波レーザーである。他の態様において、レーザーは、波長が５３２ｎｍである連続波レーザーである。他の態様において、レーザーは、波長が４２２ｎｍである連続波レーザーである。他の態様において、レーザーは、波長が４０５ｎｍである連続波レーザーである。本発明の方法および組成物に用いられる場合に蛍光部分を励起するのに適した波長を有するいずれの連続波レーザーも、本発明の範囲から逸脱することなく用いることができる。
【００３４】
単一分子分析器システム１００において、測定領域がラベリングされた単一分子を通過する際に、測定領域に向けられる電磁放射線源のビーム１２６は、ラベルを励起状態にする。粒子がその励起状態から緩和すると、検出可能な光の爆発が放射される。測定領域が粒子を通過するのに要する長さの時間において、各粒子によって励起−放射サイクルが何度も繰り返される。これにより、測定領域が粒子を通過する際に、分析器システム１００は各粒子に対して数十〜数千の光子を検出し得る。蛍光性粒子によって放出される光子は、測定領域がラベリングされた粒子を通過する時間を表す時間遅延と共に検出器１８４によって記録される。光子の強度は検出器１８４によって記録され、サンプリング時間はビン（ｂｉｎ）へと分割され、ビンは、自由に選択可能な時間チャンネル幅を有する均一で任意の時間セグメントである。各ビンに含まれる信号の数が評価される。様々な統計分析方法の一つ又はそれより多くが、粒子が存在する場合を決定するために用いられる。これらの方法には、検出器からの偽陽性信号を軽減するための、分析器システムのベースラインノイズの測定、およびベースラインノイズより大きい統計的レベルにおける蛍光ラベルの信号強度の測定が含まれる。
【００３５】
［１．電磁放射線源］
分析器システムのいくつかの態様において、化学発光ラベルが用いられる。これらの態様は、粒子検出のためのＥＭ源を必要としないことがある。他の態様において、粒子の外的ラベル（ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ  ｌａｂｅｌ）または固有特性は、蛍光ラベルまたは光散乱ラベル等の光相互作用である。そのような態様において、ＥＭ放射線源は、ラベルおよび／または粒子を照射するのに用いられる。蛍光ラベルを励起させるためのＥＭ放射線源が好ましい。
【００３６】
いくつかの態様において、分析器システムは電磁放射線源１１０を含んでなる。任意の数の放射線源を、本発明の範囲から逸脱することなく走査分析器システム１００において用いることができる。複数の電磁放射線源が先に開示されており、先の米国特許出願第１１／０４８，６６０号から引用することによって組み込まれる。いくつかの態様において、異なる連続波電磁（ＥＭ）放射線源は、同じ波長の電磁放射線を放射する。他の態様において、異なる放射線源は波長の異なるＥＭ放射線を放射する。
【００３７】
一の態様において、ＥＭ源１１０は、２００ｎｍ〜１０００ｎｍの波長を発生させる連続波レーザーである。連続波レーザーは、それらの照射を遮断するための補助的な電子または機械装置（シャッター等）を用いずに、連続的照射を提供する。そのようなＥＭ源は、小型で、耐久性があり、かつ比較的安価であるという利点を有する。更に、それらは一般に、他の光源よりも大きい蛍光信号を発生させる能力を有する。適切な連続波ＥＭ源の特定の例には以下のものが含まれるが、これらに限定されない：アルゴン、クリプトン、ヘリウム−ネオン、ヘリウム−カドミウム型のレーザー、および調節可能なダイオードレーザー（赤色〜赤外領域）であり、各々は周波数倍増の可能性を有する。連続波レーザーが用いられる態様において、３ｍＷの電磁放射線源は、蛍光ラベルを励起させるのに十分なエネルギーを有し得る。そのようなエネルギー出力のビームは、直径が２〜５μｍであり得る。３ｍＷで曝露する場合、ラベリングされた粒子は、約１ｍ秒間レーザービームに曝され得る。別の態様において、粒子は、約５００マイクロ秒に等しい又はそれより短い時間、レーザービームに曝され得る。別の態様において、曝露時間は、約１００マイクロ秒に等しい又はそれより短い時間であり得る。別の態様において、曝露時間は、約５０マイクロ秒に等しい又はそれより短い時間であり得る。別の態様において、曝露時間は、約１０マイクロ秒に等しい又はそれより短い時間であり得る。
【００３８】
発光ダイオード（ＬＥＤ）は、もう一つの低コストで信頼性の高い照射源である。超高輝度のＬＥＤならびに高い吸収断面および量子収率を有する色素における進歩によって、単一分子検出に応用可能なＬＥＤが作製された。そのようなＬＥＤ光は、単独で又は他の光源（水銀アークランプ、元素アークランプ、ハロゲンランプ、アーク放電、プラズマ放電、およびこれらの組み合わせ等）と組み合わせて、粒子の検出に使用され得る。
【００３９】
一の態様において、ＥＭ源はパルス波レーザーを有する。そのような態様において、パルス寸法、寸法、焦点スポット、およびレーザーによって放射される全エネルギーは、蛍光ラベルを励起させるのに十分でなければならない。いくつかの態様において、１ナノ秒より短いレーザーパルスを用いることができる。この継続時間のパルスは、パルスレーザー用途において好ましいことがある。他の態様において、１ナノ秒のレーザーパルスを用いることができる。他の態様において、２ナノ秒のレーザーパルスを用いることができる。他の態様において、３ナノ秒のレーザーパルスを用いることができる。他の態様において、４ナノ秒のレーザーパルスを用いることができる。他の態様において、５ナノ秒のレーザーパルスを用いることができる。更に他の態様において、２〜５ナノ秒のパルスを用いることができる。他の態様において、継続時間がより長いパルスを用いることができる。
【００４０】
最適なレーザー強度は、各色素の光退色特性、および測定領域を横断するのに必要とされる時間の長さ（粒子の速度、一つより多くの測定領域を用いる場合の測定領域間の距離、および（一つ又は複数の）測定領域寸法が算入される）に依存する。最大の信号を得るために、高い割合の色素を光退色させない最も高い強度で試料を照射することができる。好ましい強度は、粒子が測定領域を横断した時間によって退色する色素が５％以下であるような強度である。
【００４１】
レーザーの出力は、色素分子の種類、および色素分子が刺激される時間の長さに応じて設定される。出力は、測定領域が試料を通過する速度にも依存し得る。レーザー出力は、エネルギーがビームによって供給される速度として定義され、ジュール／秒またはワットの単位で測定される。粒子が通過する際に一定量のエネルギーを測定領域に供給するために、レーザー出力が増加すると、レーザーが粒子を照射し得る時間が短くなる。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間との組み合わせは、照射時間の間に測定領域が受け取る全エネルギーが、約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００マイクロジュールより大きくなるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間との組み合わせは、照射時間の間に測定領域が受け取る全エネルギーが、約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１１０マイクロジュールより小さくなるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間との組み合わせは、照射時間の間に測定領域が受け取る全エネルギーが約０．１〜１００マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間との組み合わせは、照射時間の間に測定領域が受け取る全エネルギーが約１〜１００マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間との組み合わせは、照射時間の間に測定領域が受け取る全エネルギーが約１〜５０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間との組み合わせは、照射時間の間に測定領域が受け取る全エネルギーが約２〜５０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間との組み合わせは、照射時間の間に測定領域が受け取る全エネルギーが約３〜６０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間との組み合わせは、照射時間の間に測定領域が受け取る全エネルギーが約３〜５０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間との組み合わせは、照射時間の間に測定領域が受け取る全エネルギーが約３〜４０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間との組み合わせは、照射時間の間に測定領域が受け取る全エネルギーが約３〜３０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間との組み合わせは、照射時間の間に測定領域が受け取る全エネルギーが約１マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間との組み合わせは、照射時間の間に測定領域が受け取る全エネルギーが約３マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間との組み合わせは、照射時間の間に測定領域が受け取る全エネルギーが約５マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間との組み合わせは、照射時間の間に測定領域が受け取る全エネルギーが約１０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間との組み合わせは、照射時間の間に測定領域が受け取る全エネルギーが約１５マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間との組み合わせは、照射時間の間に測定領域が受け取る全エネルギーが約２０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間との組み合わせは、照射時間の間に測定領域が受け取る全エネルギーが約３０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間との組み合わせは、照射時間の間に測定領域が受け取る全エネルギーが約４０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間との組み合わせは、照射時間の間に測定領域が受け取る全エネルギーが約５０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間との組み合わせは、照射時間の間に測定領域が受け取る全エネルギーが約６０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間との組み合わせは、照射時間の間に測定領域が受け取る全エネルギーが約７０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間との組み合わせは、照射時間の間に測定領域が受け取る全エネルギーが約８０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間との組み合わせは、照射時間の間に測定領域が受け取る全エネルギーが約９０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間との組み合わせは、照射時間の間に測定領域が受け取る全エネルギーが約１００マイクロジュールであるような組み合わせである。
【００４２】
いくつかの態様において、レーザー出力は、少なくとも約１ｍＷ、２ｍＷ、３ｍＷ、４ｍＷ、５ｍＷ、６ｍＷ、７ｍＷ、８ｍＷ、９ｍＷ、１０ｍＷ、１３ｍＷ、１５ｍＷ、２０ｍＷ、２５ｍＷ、３０ｍＷ、４０ｍＷ、５０ｍＷ、６０ｍＷ、７０ｍＷ、８０ｍＷ、９０ｍＷ、１００ｍＷに設定され、または１００ｍＷより大きく設定される。いくつかの態様において、レーザー出力は少なくとも約１ｍＷに設定される。いくつかの態様において、レーザー出力は少なくとも約３ｍＷに設定される。いくつかの態様において、レーザー出力は少なくとも約５ｍＷに設定される。いくつかの態様において、レーザー出力は少なくとも約１０ｍＷに設定される。いくつかの態様において、レーザー出力は少なくとも約１５ｍＷに設定される。いくつかの態様において、レーザー出力は少なくとも約２０ｍＷに設定される。いくつかの態様において、レーザー出力は少なくとも約３０ｍＷに設定される。いくつかの態様において、レーザー出力は少なくとも約４０ｍＷに設定される。いくつかの態様において、レーザー出力は少なくとも約５０ｍＷに設定される。いくつかの態様において、レーザー出力は少なくとも約６０ｍＷに設定される。いくつかの態様において、レーザー出力は少なくとも約９０ｍＷに設定される。
【００４３】
レーザーが測定領域を照射する時間は、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００または１０００マイクロ秒以上に設定し得る。レーザーが測定領域を照射する時間は、約２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００または２０００マイクロ秒以下に設定し得る。レーザーが測定領域を照射する時間は、約１〜１０００マイクロ秒に設定し得る。レーザーが測定領域を照射する時間は、約５〜５００マイクロ秒に設定し得る。レーザーが測定領域を照射する時間は、約５〜１００マイクロ秒に設定し得る。レーザーが測定領域を照射する時間は、約１０〜１００マイクロ秒に設定し得る。レーザーが測定領域を照射する時間は、約１０〜５０マイクロ秒に設定し得る。レーザーが測定領域を照射する時間は、約１０〜２０マイクロ秒に設定し得る。レーザーが測定領域を照射する時間は、約５〜５０マイクロ秒に設定し得る。レーザーが測定領域を照射する時間は、約１〜１００マイクロ秒に設定し得る。いくつかの態様において、レーザーが測定領域を照射する時間は、約１マイクロ秒である。いくつかの態様において、レーザーが測定領域を照射する時間は、約５マイクロ秒である。いくつかの態様において、レーザーが測定領域を照射する時間は、約１０マイクロ秒である。いくつかの態様において、レーザーが測定領域を照射する時間は、約２５マイクロ秒である。いくつかの態様において、レーザーが測定領域を照射する時間は、約５０マイクロ秒である。いくつかの態様において、レーザーが測定領域を照射する時間は、約１００マイクロ秒である。いくつかの態様において、レーザーが測定領域を照射する時間は、約２５０マイクロ秒である。いくつかの態様において、レーザーが測定領域を照射する時間は、約５００マイクロ秒である。いくつかの態様において、レーザーが測定領域を照射する時間は、約１０００マイクロ秒である。
【００４４】
いくつかの態様において、レーザーは、測定領域を１ミリ秒、２５０マイクロ秒、１００マイクロ秒、５０マイクロ秒、２５マイクロ秒または１０マイクロ秒の間、３ｍＷ、４ｍＷ、５ｍＷの出力、または５ｍＷより大きい出力を与えるレーザーによって照射する。いくつかの態様において、ラベルは、３ｍＷの出力を与え、ラベルを約１０００マイクロ秒の間照射するレーザーで照射される。他の態様において、ラベルは、１０００ミリ秒より短い時間、約２０ｍＷ以下の出力を与えるレーザーで照射される。他の態様において、ラベルは、２０ｍＷのレーザー出力で、約２５０マイクロ秒より短い時間または約２５０マイクロ秒と等しい時間照射される。いくつかの態様において、ラベルは、約５ｍＷのレーザー出力で、約１０００マイクロ秒より短い時間または約１０００マイクロ秒と等しい時間照射される。
【００４５】
［２．光走査システム］
ここで説明する走査分析器システムは、以前に他の場所で記載された従来の単一分子分析器とは異なる。蛍光分光法のフローサイトメトリーおよび他の方法において、試料は測定領域を通って流れる。対照的に、ここで提供される分析器における測定領域は、試料に対して移動させられる。これは、試料容器を機器に対して固定し、電磁放射ビームを動かせることによって行われ得る。別法として、電磁放射ビームを固定し得、試料プレートをビームに対して移動させる。いくつかの態様において、両方を組み合わせて使用し得る。可動測定領域を作り出すために試料プレートを移動させる態様において、限定的要素は、プレートを、試料プレートに存在する試料が振動せず且つ測定領域が所望の位置にあるように十分滑らかに移動させる能力である。
【００４６】
一の態様において、電磁放射線源１１０は、分析器システム１００の試料プレート１７０上に焦点を合わせる。連続波電磁放射線源１１０からのビーム１２６は、試料プレートの基部を通って、試料プレート１７０上に存在する試料内の特定の深さ平面に光学的に焦点が合わされる。試料の光走査は、鏡またはレンズを用いて行われ得る。いくつかの態様において、鏡１２２は走査モーター１２０の走査モーターシャフト１２４の端に取り付けられるが、シャフト１２４に対して僅かな角度で傾いている。いくつかの態様において、鏡１２２が回転すると、その鏡は電磁放射ビーム１２６を屈折させ得、それによって小さい円が形成される。鏡１２２を対物レンズ１４０と二色性鏡１６０との間に設置することによって、対物レンズの焦点におけるスポットが試料の周りを移動し得る。いくつかの態様において、試料は、円状（または環状）に走査される。そのような態様において、直径が約５００μｍ〜約７５０μｍの走査円が形成され得る。いくつかの態様において、直径が約５５０μｍ〜７００μｍの走査円が形成され得る。いくつかの態様において、直径が約６００μｍ〜６５０μｍの走査円が形成され得る。いくつかの態様において、直径が約６３０μｍの走査円が形成され得る。いくつかの態様において、直径が６３０μｍの走査円を用いる場合、走査円は１秒当たり約８回転（または約５００ＲＰＭ）で旋回し得、これは、流源を通して約５μｌ／分の速度で試料をポンピングすることに相当する。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は１００ＲＰＭより速い。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は３００ＲＰＭより速い。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は５００ＲＰＭより速い。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は７００ＲＰＭより速い。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は９００ＲＰＭより速い。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は１０００ＲＰＭより遅い。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は８００ＲＰＭより遅い。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は６００ＲＰＭより遅い。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は４００ＲＰＭより遅い。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は２００ＲＰＭより遅い。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は約１００ＲＰＭ〜約１０００ＲＰＭである。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は約２００ＲＰＭ〜約９００ＲＰＭである。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は約３００ＲＰＭ〜約８００ＲＰＭである。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は約４００ＲＰＭ〜約７００ＲＰＭである。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は約４５０ＲＰＭ〜約６００ＲＰＭである。いくつかの態様において、測定領域の走査速度は約４５０ＲＰＭ〜約５５０ＲＰＭである。改良された電子機器および光学機器の発展と共に、同じ分子を二重に走査することを回避するために、２次元パターンでの走査に加えて、ｚ軸における走査が必要とされることがある。前に言及した態様のいくつかにおいて、光走査パターンによって、試料の一部が走査される各時間において実質的に異なる体積の走査が可能となる。
【００４７】
いくつかの態様において、試料は電磁放射線源によって走査され、電磁放射線は試料の一部を取り調べる。件の単一分子は、測定領域に存在してよく、または存在しなくてよい。いくつかの態様において、試料の一部が一回目に走査され、その後、二回目に走査される。いくつかの態様において、試料の同じ部分が複数回走査される。いくつかの態様において、試料は、１回目の通過において検出された分子が前記部分から漂い又は拡散し、他の分子が前記部分の中に漂う又は拡散するように十分な時間が経過した後に、検出スポットが二回目に試料の一部に戻るように走査される。試料の同じ部分が少なくとも一回またはそれより多く走査される場合、走査速度は十分低速であり得、それにより、分子は、取り調べられている（または測定されている）区域中に拡散する又は取り調べられている（または測定されている）区域から拡散することが可能となる。いくつかの態様において、測定領域は、十分遅い速度で１回目および２回目に試料の同じ部分を通って移動させられ、それによって、１回目に測定領域が試料の当該部分を通って移動する際に検出される件の分子が、１回目に試料の当該部分が測定領域によって取り調べられた後に、試料の当該部分から実質的に拡散することが可能となり、更に、次の件の分子が存在する場合、２回目に試料の当該部分が測定領域によって取り調べられる際に、次の件の分子が試料の当該部分の中に実質的に拡散することが可能となる。図２は、分子量が１５５ＫＤａの分子の対応する拡散半径に対する拡散時間のグラフを示す。本明細書において用いられる場合、「拡散半径」は、ｘ軸に示される時間において分子が拡散する可能性が最も高い出発地点からの距離の標準偏差を指す。
【００４８】
いくつかの態様において、代替の走査パターンが用いられる。いくつかの態様において、走査パターンは円弧に近似し得る。いくつかの態様において、走査パターンは、少なくとも一つの９０°の角を有する。いくつかの態様において、走査パターンは、少なくとも一つの９０°より小さい角を有する。いくつかの態様において、走査パターンは、少なくとも一つの９０°より大きい角を有する。いくつかの態様において、走査パターンは実質的に正弦波である。いくつかの態様において、光走査は、前述のように１個の鏡と共に行い得る。別の態様において、光走査は、少なくとも二つの鏡と共に行い得る。複数の鏡により、直線状の走査が可能となり、かつシステムを前後に走査することが可能となり、その結果、蛇行パターンが形成される。別法として、複数の鏡による光走査構造物によって、ラスターパターンで走査することが可能となる。
【００４９】
別の態様において、光走査は、光学くさび（ｏｐｔｉｃａｌ  ｗｅｄｇｅ）を用いて行われ得る。くさびスキャナによって円状走査パターンが提供され、走査レンズを必要としないので光路が短くなる。光学くさびは非常に小さい角度を有するプリズムに近似する。光学くさびは、電磁放射線源のシャフトに取り付けられ得る。光学くさびは、回転して光走査パターンを形成する。別の態様において、走査鏡は電気機械取り付け具を用いて取り付けられ得る。そのような態様において、電気機械取り付け具は、二つの音声コイルを有するだろう。一の音声コイルは垂直方向における鏡の移動をもたらすだろう。もう一つの音声コイルは水平方向における鏡の移動をもたらすだろう。この態様を用いることによって所望の走査パターンを形成し得る。
【００５０】
いくつかの態様において、粒子走査分析器は、試料プレートに存在する試料を２次元方向に、例えば試料のｘ−ｙ平面に従って走査する。いくつかの態様において、試料は、３次元方向に走査され得、それはｘ−ｙ平面およびｚ方向の走査からなる。いくつかの態様において、試料は、ｘ−ｙ方向およびｚ方向に沿って同時に走査され得る。例えば、試料は螺旋状パターンで走査され得る。いくつかの態様において、試料はｚ方向のみに走査され得る。
【００５１】
いくつかの態様において、走査レンズ（図１Ａおよび１Ｂに示す１３０）は、走査光路を対物レンズの瞳（ｐｕｐｉｌ）へと向け直し得る。走査レンズは、走査鏡における光軸の像の焦点を対物レンズの射出瞳に合わせる。走査レンズは、走査鏡と顕微鏡対物レンズとの間の距離に関わらず、走査ビームを対物レンズに集中させたままであることを確保し、従って、走査ビームの像および光収集効率が改良される。
【００５２】
［３．測定領域］
本明細書に記載の発明は、測定領域の使用を包含し、その測定領域は、件の単一分子が存在する場合に検出され得る有効な試料体積成分として考えられ得る。試料の測定領域を計算する様々な方法が存在するが、測定領域の有効体積（Ｖ）を決定する簡単な方法は、検出体積成分の有効断面積を計算することである。検出体積成分は通常、検出体積成分を固定された試料を通して移動させることによって、試料を通って掃引させられるので、体積は通常、測定時間の間にいくらかの距離を通って掃引される検出体積成分の断面積の計算結果である。試料濃度（Ｃ）が既知であり、かつある期間に検出される分子の数（Ｎ）が既知である場合、試料体積は、検出された分子の数を試料濃度で割ったもの、またはＶ＝Ｎ／Ｃ（試料濃度は単位体積当たりの分子の単位を有する）で構成される。
【００５３】
例えば、本明細書に記載のシステムのいくつかの態様において、検出された全ての光子は計数され、１ｍ秒のセグメント（光子計数ビン）において加算される。件の分子が１ｍ秒のセグメントに存在する場合、検出された光子の数は通常、バックグラウンドよりかなり大きい。従って、検出体積成分が試料に対して移動した距離は、単一セグメントにおいて採取された体積、即ち測定領域を計算するために使用するのに適切な距離である。この例において、試料が６０秒間分析される場合、６０，０００のセグメントが有効に走査される。有効体積を複数のセグメントで分割する場合、得られる体積は実質的に単一セグメント、即ち測定領域の体積である。数学的には、単一セグメントの体積、即ち測定領域の体積（Ｖｓ）は、検出された分子の数（Ｎ）を、試料濃度にセグメントビンの数を乗じたもの（Ｃ・ｎ（ｎは、Ｎ個の分子が計数された期間のセグメントビンの数を表す））で除したものに等しい。例示的目的のためだけに、濃度が１フェムトモル濃度である既知の標準物質が６０，０００セグメントを通じて実行され、２０分子の標準物質が検出されることを考えること。従って、測定領域の体積（Ｖｓ）は、Ｎ／（Ｃ・ｎ）または２０／（６０２．２１４・６Ｅ４）または５５３．５１３μｍ３に等しい。従って、この例において、測定領域の体積は、１光子計数ビンに対応する一つの試料の有効体積であり、５５３．５１３μｍ３である。
【００５４】
加えて、本明細書に記載の発明と類似した光学機器によるキャピラリーフローシステムを用いて、前述のインタロゲーション体積から試料セグメントの断面積を概算し得る。断面積（Ａ）は、インタロゲーション体積（Ｖｓ）を検出セグメントが移動する距離（ｔ）で除することによって概算される。検出セグメントが移動する距離（ｔ）は、ｉ・ｒ・ｓ／ｘで与えられ、ｔは流速（ｒ）、試料の粘度（ｉ）、セグメントのビン時間（ｓ）およびキャピラリーの断面積（ｘ）の関数である。例示的目的のためだけに、１ｍ秒のビン時間（ｓ）、５μＬ／分の流速（ｒ）、２の粘度係数および１０，０００μｍ２のキャピラリー断面積（ｘ）を考えること。従って、測定領域が移動する距離（ｔ）は、ｉ・ｒ・ｓ／ｘまたは（２・５μＬ／分・１Ｅ−３秒）／（１０，０００μｍ２）または１６．７μｍで与えられる。検出器スポットの有効断面積（Ａ）は、Ｖｓ／ｔまたは（５５３．５１３μｍ３）／（１６．７μｍ）または３３μｍ２として更に計算し得る。インタロゲーション体積の値（Ｖｓ）およびインタロゲーション体積の断面積はいずれもビニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）時間に依存することに留意すること。
【００５５】
測定領域の寸法の下限は、現在利用可能な励起エネルギーの波長によって境界が示される。測定領域寸法の上限は、所望の信号−ノイズ比によって決まる（測定領域が大きいほど、例えばラマン散乱からのノイズが大きくなる）。いくつかの態様において、測定領域の体積は約１μｍ３より大きく、約２μｍ３より大きく、約３μｍ３より大きく、約４μｍ３より大きく、約５μｍ３より大きく、約１０μｍ３より大きく、約１５μｍ３より大きく、約３０μｍ３より大きく、約５０μｍ３より大きく、約７５μｍ３より大きく、約１００μｍ３より大きく、約１５０μｍ３より大きく、約２００μｍ３より大きく、約２５０μｍ３より大きく、約３００μｍ３より大きく、約４００μｍ３より大きく、約５００μｍ３より大きく、約５５０μｍ３より大きく、約６００μｍ３より大きく、約７５０μｍ３より大きく、約１０００μｍ３より大きく、約２０００μｍ３より大きく、約４０００μｍ３より大きく、約６０００μｍ３より大きく、約８０００μｍ３より大きく、約１００００μｍ３より大きく、約１２０００μｍ３より大きく、約１３０００μｍ３より大きく、約１４０００μｍ３より大きく、約１５０００μｍ３より大きく、約２００００μｍ３より大きく、約３００００μｍ３より大きく、約４００００μｍ３より大きく、または約５００００μｍ３より大きい。いくつかの態様において、測定領域の体積は、約５００００μｍ３より小さく、約４００００μｍ３より小さく、約３００００μｍ３より小さく、約２００００μｍ３より小さく、約１５０００μｍ３より小さく、約１４０００μｍ３より小さく、約１３０００μｍ３より小さく、約１２０００μｍ３より小さく、約１１０００μｍ３より小さく、約９５００μｍ３より小さく、約８０００μｍ３より小さく、約６５００μｍ３より小さく、約６０００μｍ３より小さく、約５０００μｍ３より小さく、約４０００μｍ３より小さく、約３０００μｍ３より小さく、約２５００μｍ３より小さく、約２０００μｍ３より小さく、約１５００μｍ３より小さく、約１０００μｍ３より小さく、約８００μｍ３より小さく、約６００μｍ３より小さく、約４００μｍ３より小さく、約２００μｍ３より小さく、約１００μｍ３より小さく、約７５μｍ３より小さく、約５０μｍ３より小さく、約２５μｍ３より小さく、約２０μｍ３より小さく、約１５μｍ３より小さく、約１４μｍ３より小さく、約１３μｍ３より小さく、約１２μｍ３より小さく、約１１μｍ３より小さく、約１０μｍ３より小さく、約５μｍ３より小さく、約４μｍ３より小さく、約３μｍ３より小さく、約２μｍ３より小さく、または約１μｍ３より小さい。いくつかの態様において、測定領域の体積は約１μｍ３〜約１００００μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約１μｍ３〜約１０００μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約１μｍ３〜約１００μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約１μｍ３〜約５０μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約１μｍ３〜約１０μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約２μｍ３〜約１０μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約３μｍ３〜約７μｍ３である。
【００５６】
［４．試料プレート］
本明細書に記載の発明のいくつかの態様において、件の単一分子に関して検出される試料を保持するための試料プレート１７０が使用される。いくつかの態様において、試料プレートはマイクロタイタープレートである。マイクロタイタープレートは、基部１７２および上面１７４からなる。いくつかの態様において、マイクロタイタープレートの上面１７４は、件の試料を入れるための少なくとも一つのウェルを有する。いくつかの態様において、マイクロタイタープレートは、複数の試料を入れるための複数のウェルを有する。本明細書に記載のシステムは十分に高感度であるので、小さい試料寸法のみが必要とされる。いくつかの態様において、試料は約１００μｌより小さい寸法であり得る。いくつかの態様において、試料は約１０μｌより小さい寸法であり得る。いくつかの態様において、試料は約１μｌより小さい寸法であり得る。いくつかの態様において、試料は約０．１μｌより小さい寸法であり得る。いくつかの態様において、試料は約０．００１μｌより小さい寸法であり得る。いくつかの態様において、マイクロタイタープレートは微細加工技術を用いて作製されるものであり得る。いくつかの態様において、プレートの上面は平坦であり得る。試料は、試料が試料自体の表面張力によって内蔵（または収容）されるように大きさが決められ得る。そのような態様において、試料はプレート表面において滴を形成する。いくつかの態様において、試料はその後、件の分子に関して走査され得る。
【００５７】
通常、試料は、試料プレート材料を通して、例えばマイクロウェルの壁を通して走査される。いくつかの態様において、試料は、試料プレートの基部を通して走査される。いくつかの態様において、試料プレートの基部は光に対して透明な材料から作製される。いくつかの態様において、試料プレートの基部は、電磁放射線に対して透明な材料から作製される。試料プレートは、件の励起波長に対して透明である。透明な材料を用いることによって、励起ビームの波長が試料プレートを通過することが可能となり、励起ビームの波長が件の分子または件の分子と共役した蛍光ラベルを励起させることが可能となる。更に、プレートの透明性により、検出器が、励起した件の分子からの放射線を検出することが可能となる。いくつかの態様において、基部材料は５５０ｎｍ〜８００ｎｍの波長の光に対して実質的に透明である。いくつかの態様において、基部材料は６００ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光に対して実質的に透明である。いくつかの態様において、プレート材料は６２０ｎｍ〜６８０ｎｍの波長の光に対して透明である。いくつかの態様において、プレート材料は６３０ｎｍ〜６６０ｎｍの波長の光に対して透明である。いくつかの態様において、プレート材料は６３０ｎｍ〜６４０ｎｍの波長の光に対して透明である。
【００５８】
試料厚さも考慮される。試料は、プレート材料の一部を通過する電磁放射線源によって走査される。プレート厚さによって、走査されるプレート部分の第２の側に配置される高開口数のレンズによって走査されるプレート部分の第１の側に、像を形成することが可能となる。そのような態様によって、基部中でなく試料中に像を形成することが容易になる。形成される像は、システムの測定領域に一致する。像は、件の単一分子の深度で形成されるべきである。前述のように、プレート厚さは、使用するレンズの作動距離および被写界深度に依存する。入手可能な市販のプレートは通常、厚さ６５０ミクロンである。
【００５９】
プレートは、励起エネルギーがプレートを通過し得る任意の適切な材料から作製され得る。いくつかの態様において、プレートはポリスチレンから作製される。いくつかの態様において、プレートはポリカーボネートから作製される。いくつかの態様において、プレートはポリエチレンから作製される。いくつかの態様において、ＮＵＮＣ（商標）ブランドのプレート等の市販のプレートを使用し得る。適切な材料から作製された適切な厚さの任意のプレートを使用し得る。好ましい態様において、プレートは低蛍光材料から作製され、それにより、バックグラウンドの蛍光が減少する。例えば、好ましい材料は、ポリスチレンから作製されるプレートより小さい蛍光を放射してよい。プレート材料に起因するバックグラウンドの蛍光は、プレート厚さを最小にすることによって更に防ぎ得る。
【００６０】
いくつかの態様において、試料は、特定の種類の分子を含有し得る少量の流体（または液体）からなる。そのような態様において、件の単一分子は、存在する場合、流体体積成分中のいずれの場所においても検出および計数され得る。いくつかの態様において、試料の走査には、より少量の濃縮試料の走査が含まれる。そのような態様において、例えば分子が試料プレートの表面において最も高い濃度で存在する場合、光走査は試料プレートの表面で起こり得る。これは、単一分子がプレート表面に吸着する場合、または単一分子がプレート表面に接着している抗体もしくは他の結合分子と結合する場合に起こり得る。件の単一分子を捕捉するために抗体が用いられる場合、抗体は、試料プレートの表面、例えば（１または複数の）マイクロウェルの基部に適用され得る。その後、件の単一分子は、マイクロウェル内に存在する抗体と結合する。いくつかの態様において、結合した件の単一分子を取り除くために溶出工程が行われる。その後、非結合分子の有無は、より小さい試料体積で検出され得る。溶出工程が行われるいくつかの態様において、単一分子は常磁性ビーズと結合してよく、または結合しなくてよい。ビーズが用いられない場合、溶出緩衝液を試料ウェルに加え得、件の単一分子の有無を検出し得る。いくつかの態様において、常磁性ビーズが件の単一分子を捕捉するための捕捉ビーズとして用いられる。
【００６１】
本明細書に記載の単一分子走査分析器のいくつかの態様において、電磁（ＥＭ）放射線源は、試料プレート材料を通過することなく、試料の測定領域に向けられる。像の形成は、試料において、試料に向けられたビームと同じ側で起こる。そのような態様において、水浸レンズを使用し得るが、空気−液体界面を通して試料を結像することは必要とされない。対物レンズが試料と接触しないゼロキャリーオーバーシステムにおいて、試料間の試料キャリーオーバーは発生しない。
【００６２】
［５．検出器］
一の態様において、電磁放射線曝露後に蛍光ラベルによって放射される光が検出される。放射光は、例えば紫外光、可視光または赤外光であり得る。図１Ａおよび１Ｂを参照すると、検出器１８４（または他の態様）は、蛍光部分からの光子バーストの振幅および継続時間を捕捉し得、光子バーストの振幅および継続時間を電気信号に変換し得る。ＣＣＤカメラ、ビデオ入力モジュールカメラおよびストリークカメラ等の検出装置を、連続信号を有する像を生成するために使用し得る。他の態様においては、ボロメーター、フォトダイオード、フォトダイオードアレイ、アヴァランシェ・フォトダイオード、および連続信号を生成する光電子増倍管等の装置が使用される。上述の検出器のいずれの組み合わせも用いることができる。
【００６３】
測定領域とそれに対応する検出器１８０との間で放射される電磁放射線のいくつかの顕著な特徴を検出することができ、それには以下のものが含まれる：放射波長、放射強度、バーストサイズ、バーストの継続時間および蛍光偏光。いくつかの態様において、検出器１８０は、逆バイアスで用いられるフォトダイオードである。そのようなフォトダイオードセットは通常、非常に高い抵抗を有する。この抵抗は、適切な振動数の光がＰ／Ｎ接合部を照射する場合に減少する。従って、逆バイアスダイオードは、その逆バイアスダイオードを流れる電流をモニタリングすることによって検出器として使用され得る。この効果に基づく回路は、ゼロバイアスに基づく回路よりも光に対して敏感である。
【００６４】
分析器システムの一の態様において、フォトダイオードはアヴァランシェ・フォトダイオードであり得る。これらのフォトダイオードは、常套的なフォトダイオードよりかなり大きい逆バイアスで操作され得、従って、各光生成キャリアがアヴァランシェ・ブレークダウン（ａｖａｌａｎｃｈｅ  ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）によって増加することが可能となる。このことはフォトダイオード内の内部増幅をもたらし、それにより、装置の有効反応性および感度が増大する。フォトダイオードの選択は、蛍光ラベルされた粒子によって放射されるエネルギーまたは放射波長によって決まる。いくつかの態様において、検出器は、３００ｎｍ〜１７００ｎｍのエネルギーを検出するアヴァランシェ・フォトダイオード検出器である。もう一つの態様において、３００ｎｍ〜１１００ｎｍの波長を検出するために、シリコンアヴァランシェ・フォトダイオードが使用され得る。もう一つの態様において、フォトダイオードは、８００〜２６００ｎｍの範囲のエネルギーを検出するインジウムガリウムヒ素フォトダイオードである。もう一つの態様において、インジウムガリウムヒ素フォトダイオードは、９００ｎｍ〜１７００ｎｍの波長を検出するのに使用され得る。いくつかの態様において、フォトダイオードは、１９０〜１１００ｎｍの範囲のエネルギーを検出するシリコンフォトダイオードである。もう一つの態様において、フォトダイオードは、８００〜１７００ｎｍの範囲のエネルギーを検出するゲルマニウムフォトダイオードである。更に他の態様において、フォトダイオードは、１０００ｎｍ未満〜３５００ｎｍの範囲のエネルギーを検出する硫化鉛フォトダイオードである。いくつかの態様において、アヴァランシェ・フォトダイオードは、４００ｎｍ〜１１００ｎｍの波長範囲のエネルギーを検出するように設計された１光子検出器である。１光子検出器は市販されている（例えばマサチューセッツ州ウェルズリーのＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）。
【００６５】
いくつかの態様において、分析器システムは少なくとも一つの検出器を有し得る。他の態様において、分析器システムは少なくとも二つの検出器を有し得、各検出器は、特定の波長範囲の光エネルギーを検出するように選択および構成され得る。例えば、二つの別々の検出器は、ＥＭ源による励起において異なるスペクトルのエネルギーを有する光子を放出する異なるラベルで標識された粒子を検出するのに使用され得る。一の態様において、分析器システムは、緑色色素（例えばＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６）によって放射される蛍光エネルギー等の、４５０〜７００ｎｍの範囲の蛍光エネルギーを検出し得る第１検出器、および遠赤色色素（例えばＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７）によって放射される蛍光エネルギー等の、６２０〜７８０ｎｍの範囲の蛍光エネルギーを検出し得る第２検出器を有し得る。他の態様において、青色色素（例えばＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２）によって放射される蛍光エネルギー等の、４００〜６００ｎｍの範囲の蛍光エネルギーを検出し、かつ赤色色素（例えばＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６およびＣｙ３）によって放射されるエネルギー等の、５６０〜７００ｎｍの範囲のエネルギーを検出する検出器が用いられる。
【００６６】
２またはそれより多くの検出器を有するシステムは、異なるスペクトルの光を放射する２またはそれより多くのラベルによって各々が標識されている個別の粒子を検出するのに使用され得る。例えば、二つの異なる検出器は、二つの異なる色素ラベルで標識された一つの抗体を検出し得る。別法として、二つの検出器を有する分析器システムは、異なる種類の粒子を検出するのに使用され得、各々の種類の粒子は、異なる色素分子または２もしくはそれより多くの色素分子の混合物で標識される。例えば、二つの異なる検出器は、二つの異なるタンパク質を認識する二つの異なる種類の抗体を検出するために使用され得、各々の種類の抗体は、異なる色素ラベルまたは２またはそれより多くの色素ラベル分子の混合物で標識される。２またはそれより多くの色素ラベル分子の割合を変化させることによって、２またはそれより多くの異なる粒子の種類を、二つの検出器を用いて個別に検出し得る。本発明の範囲から逸脱することなく３またはそれより多くの検出器を使用し得ることが理解される。
【００６７】
当業者は、一またはそれより多くの検出器が各測定領域において設定され得ること、一またはそれより多くの測定領域がフロー・セル内で規定されること、および各検出器が、放射される上記の電磁放射線の任意の特性を検出するように構成され得ることを理解するはずである。例えば複数の測定領域に対する、複数の検出器の使用は、先の特許出願において既に開示されており、米国特許出願第１１／０４８，６６０号から引用することによって本明細書に組み込まれる。粒子が一旦ラベリングされて検出可能になると（または粒子が、その粒子を検出可能にする固有の特性を有する場合）、当該技術分野において公知の適切な任意の検出機構、例えばＣＣＤカメラ、ビデオ入力モジュールカメラ、ストリークカメラ、ボロメーター、フォトダイオード、フォトダイオードアレイ、アヴァランシェ・フォトダイオードおよび連続信号を生成する光電子増倍管、ならびにそれらの組み合わせが、本発明の範囲から逸脱することなく使用され得る。電磁放射線の異なる特性を検出し得、その特性には以下のものが含まれる：放射波長、放射強度、バーストサイズ、バーストの継続時間、蛍光偏光、およびそれらのいずれかの組み合わせ。
【００６８】
［ＩＩＩ．単一分子検出に関する分子］
本発明の機器、キットおよび方法は、多数の異なる種類の単一分子の高感度検出および濃度測定に使用され得る。特に、機器、キットおよび方法は、生物学的状態のマーカーの高感度検出および濃度測定において有用である。「単一分子の検出」は、この用語が本明細書において用いられる場合、直接的および間接的検出の両方を指す。例えば、単一分子は蛍光ラベルでラベリングされ得、分子ラベル錯体が本明細書に記載の機器において検出される。別法として、単一分子は蛍光ラベルでラベリングされ得、その後、蛍光ラベルが単一分子から分離され、そのラベルが本明細書に記載の機器において検出される。用語「単一分子の検出」は、両方の検出形態を包含する。
【００６９】
［Ａ．概要］
本発明の分析器および関連する方法を用いて検出し得る分子の例として、以下のものが挙げられる：タンパク質、核酸、炭水化物等の生体高分子、並びに有機および無機の小分子。特に、本明細書に記載の機器、キットおよび方法は、生物学的試料中のタンパク質および小分子の単一分子の検出、並びに試料中のそのような分子の濃度測定に有用である。
【００７０】
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「オリゴペプチド」は、本明細書において互いに入れ替えて（または同じ意味で）用いられ、ペプチド結合によって共に結合された二つ又はそれより多くのアミノ酸を含む組成物が含まれる。ポリペプチドには、２０の天然に存在するアミノ酸と一般に呼ばれる２０のアミノ酸以外のアミノ酸が含まれ得ることが理解されるだろう。また、ポリペプチドには、末端アミノ酸を含む一つ又はそれより多くのアミノ酸が含まれ得、それらは、当該技術分野で公知のいずれかの方法によって（自然に又は非自然的に）修飾され得る。ポリペプチド修飾の例には、例えば、グリコシル化による修飾または他の翻訳後修飾が含まれる。本発明のポリペプチドにおいて存在し得る修飾には以下のものが含まれるが、これらに限定されない：アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスフォチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、糖化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加（アルギニル化等）、およびユビキチン化。
【００７１】
本発明の機器、キットおよび方法によって検出される分子は遊離分子であり得、または錯体、例えば抗体−抗原錯体、若しくはより一般的にはタンパク質−タンパク質錯体（例えばトロポニン錯体または前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の錯体）の一部であり得る。
【００７２】
［Ｂ．生物学的状態のマーカー］
いくつかの態様において、本発明は、生物学的マーカーの敏感な検出のため、並びに診断、予後診断および／または処置方法の決定においてそのようなマーカーを使用するための組成物および方法を提供する。
【００７３】
本発明のマーカーは、例えば、生物の生物学的状態（例えば、病状または病気でない状態等の状態）に関連する任意の組成物および／もしくは分子、または組成物および／もしくは分子の錯体であり得る。マーカーは、例えば、小分子、ポリペプチド、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ等）、脂質（リン脂質またはミセル等）、細胞成分（ミトコンドリアまたは葉緑体等）等であり得る。本発明で意図されるマーカーは、既に公知であり得、または未知であり得る。例えば、いくつかの態様において、本発明の方法は、件の生物学的状態または件の病状に関するマーカーとして使用され得る新規のポリペプチドを同定し得、一方、他の態様において、既知のポリペプチドが、件の生物学的状態または病状に関するマーカーとして同定される。本発明のシステムを用いると、生物の生物学的状態の測定において潜在能力の高い用途を有するが、低濃度でのみ存在する、病変組織から「リークした」マーカー等のそれらのマーカー（例えばポリペプチド）を、観察し得ることが可能である。他の潜在能力の高い有用なマーカーまたはポリペプチドは、疾患に関連するマーカー、例えば腫瘍−宿主環境において生じるマーカーであり得る。生物学的状態に関する情報を提供するいずれの適切なマーカーも、本発明の方法および組成物において使用され得る。「マーカー」は、その用語が本明細書において用いられる場合、生物からの試料において検出され得るいずれの分子も包含し、そのマーカーの検出または定量によって、生物の生物学的状態に関する情報が提供される。
【００７４】
生物学的状態には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない。表現型の状態；生物に影響を及ぼす条件；成長の状態；年齢；健康；病理；疾患の検出、処置、または病期分類；感染；毒性；または化学的因子、環境学的因子もしくは薬物の因子の反応（薬物反応表現型検査、薬物毒性表現型検査、または薬物有効性表現型検査等）。
【００７５】
用語「生物」は、本明細書において用いられる場合、少なくとも一つの細胞を有する生物を指す。生物は、単細胞生物と同じくらい単純であり得、またはほ乳類と同じくらい複雑であり得る。本発明の生物は、好ましくはほ乳類である。そのようなほ乳類は、例えば、ヒト、または霊長類（例えばサル、チンパンジー等）、飼育動物（例えばイヌ、ネコ、ウマ等）、家畜（例えばヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ等）、もしくは実験動物（例えばネズミ、ラット等）等の動物であり得る。好ましくは、生物はヒトである。
【００７６】
いくつかの態様において、本発明の方法および組成物は、マーカー分類、例えば、サイトカイン、成長因子、腫瘍マーカー、炎症マーカー、内分泌マーカー、自己免疫マーカー、甲状腺マーカー、心血管マーカー、糖尿病マーカー、感染症マーカー、神経学的マーカー、呼吸器マーカー、胃腸マーカー、筋骨格マーカー、皮膚疾患および代謝マーカーに向けられている。
【００７７】
下記の表１は、本発明の方法および組成物によって測定されたこれらのマーカー分類の例を提供し、また、本発明の方法および組成物によって検出されたマーカー濃度、および特定のマーカーに関して本発明の単一分子分析器システムによって計数された粒子の数を提供する。
【００７８】
【表１】
2019090817.tif 000002
2019090817.tif 000003
2019090817.tif 000004
【００７９】
［サイトカイン］
研究および診断の両方に関して、サイトカインは、多数の病状、疾患、病理等のマーカーとして有用であり、本発明の組成物および方法には、サイトカインを検出および定量するためのラベル、並びにそのようなラベルを用いてサイトカインの正常レベルおよび異常レベルを測定する方法、並びにそのようなレベルに基づいて診断、予後診断および／または処置の決定を行う方法が含まれる。
【００８０】
現在、その同調調節または非調和（ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ）調節が臨床的に注目されている１００を超えるサイトカイン／ケモカインが存在する。特定の疾患の経過をサイトカインレベルの変化と関連付けるために、理想的なアプローチは、試料を、所定のサイトカインまたは複数のサイトカインに対して高感度で分析することを必要とする。現在マーカーパネルに用いられており、かつ本発明の方法および組成物に使用され得る例示的サイトカインには以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない。ＢＤＮＦ、ＣＲＥＢ  ｐＳ１３３、ＣＲＥＢ  Ｔｏｔａｌ、ＤＲ−５、ＥＧＦ、ＥＮＡ−７８、エオタキシン、脂肪酸結合タンパク質、塩基性ＦＧＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＧＣＰ−２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子ＧＭ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、成長関連癌遺伝子ケラチノサイト（ＧＲＯ−ＫＣ）、ＨＧＦ、ＩＣＡＭ−１、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、インターロイキンＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１２ｐ４０／ｐ７０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１Ｆ３、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、インターフェロン誘導性タンパク質（１０  ＩＰ−１０）、ＪＥ／ＭＣＰ−１、ケラチノサイト（ＫＣ）、ＫＣ／ＧＲＯａ、ＬＩＦ、リンホタクチン、Ｍ−ＣＳＦ、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、ＭＣＰ−１（ＭＣＡＦ）、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−５、ＭＤＣ、ＭＩＧ、マクロファージ炎症（ＭＩＰ−１α）、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−１γ、ＭＩＰ−２、ＭＩＰ−３β、ＯＳＭ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、活性化に応じて調節され、発現および分泌された正常Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｐｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）（ＲＡＮＴＥＳ）、Ｒｂ（ｐＴ８２１）、Ｒｂ（ｔｏｔａｌ）、Ｒｂ  ｐＳｐＴ２４９／２５２、タウ（ｐＳ２１４）、タウ（ｐＳ３９６）、タウ（ｔｏｔａｌ）、組織因子、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＶＣＡＭ−１およびＶＥＧＦ。いくつかの態様において、サイトカインはＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１０、ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−１８、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、エオタキシン、ＩＬ−１６、ＭＩＧ、ＩＬ−８、ＩＬ−１７、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１３、ＩＬ−２Ｒ（可溶性）、ＩＬ−２、ＬＩＦ／ＨＩＬＤＡ、ＩＬ−１β、Ｆａｓ／ＣＤ９５／Ａｐｏ−１およびＭＣＰ−１である。
【００８１】
［成長因子］
本発明の方法および組成物において使用され得る成長因子には、以下のものが含まれる。アンフィレグリン、ＬＲＩＧ３、ベータセルリン、ニューレグリン−１／ＮＲＧ１、ＥＧＦ、ニューレグリン−３／ＮＲＧ３、エピゲン（Ｅｐｉｇｅｎ）、ＴＧＦ−α、エピレグリン、ＴＭＥＦＦ１／トモレグリン（Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ）−１、ＨＢ−ＥＧＦ、ＴＭＥＦＦ２、ＬＲＩＧ１等のＥＧＦリガンド；ＥＧＦ  Ｒ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ４等のＥＧＦ  Ｒ／ＥｒｂＢ受容体ファミリー；ＦＧＦリガンド、酸性ＦＧＦ、ＦＧＦ−１２、塩基性ＦＧＦ、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−２２、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−２３、ＦＧＦ−１１、ＫＧＦ／ＦＧＦ−７、ＦＧＦ受容体、ＦＧＦ  Ｒ１−４、ＦＧＦ  Ｒ３、ＦＧＦ  Ｒ１、ＦＧＦ  Ｒ４、ＦＧＦ  Ｒ２、ＦＧＦ  Ｒ５、ＦＧＦ調節因子、ＦＧＦ−ＢＰ等のＦＧＦファミリー；ヘッジホッグファミリー、デザート・ヘッジホッグ（Ｄｅｓｅｒｔ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）、ソニック・ヘッジホッグ（Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）、インディアン・ヘッジホッグ（Ｉｎｄｉａｎ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）；ヘッジホッグ関連分子および調節因子、ＢＯＣ、ＧＬＩ−３、ＣＤＯ、ＧＳＫ−３α／β、ＤＩＳＰ１、ＧＳＫ−３α、Ｇａｓ１、ＧＳＫ−３β、ＧＬＩ−１、Ｈｉｐ、ＧＬＩ−２；ＩＧＦファミリー、ＩＧＦリガンド、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体（ＣＤ２２１）、ＩＧＦ−ＩＲ、およびＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）ファミリー、ＡＬＳ、ＩＧＦＢＰ−５、ＣＴＧＦ／ＣＣＮ２、ＩＧＦＢＰ−６、Ｃｙｒ６１／ＣＣＮ１、ＩＧＦＢＰ−Ｌ１、エンドカン（Ｅｎｄｏｃａｎ）、ＩＧＦＢＰ−ｒｐ１／ＩＧＦＢＰ−７、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−ｒＰ１０、ＩＧＦＢＰ−２、ＮＯＶ／ＣＣＮ３、ＩＧＦＢＰ−３、ＷＩＳＰ−１／ＣＣＮ４、ＩＧＦＢＰ−４；受容体型チロシンキナーゼ  Ａｘ１、ＦＧＦ  Ｒ４、Ｃ１ｑＲ１／ＣＤ９３、ＦＧＦ  Ｒ５、ＤＤＲ１、Ｆｌｔ−３、ＤＤＲ２、ＨＧＦ  Ｒ、Ｄｔｋ、ＩＧＦ−Ｉ  Ｒ、ＥＧＦ、ＲＩＧＦ−ＩＩ  Ｒ、Ｅｐｈ、ＩＮＳＲＲ、ＥｐｈＡ１、インスリンＲ／ＣＤ２２０、ＥｐｈＡ２、Ｍ−ＣＳＦ  Ｒ、ＥｐｈＡ３、Ｍｅｒ、ＥｐｈＡ４、ＭＳＰ  Ｒ／Ｒｏｎ、ＥｐｈＡ５、ＭｕＳＫ、ＥｐｈＡ６、ＰＤＧＦ  Ｒα、ＥｐｈＡ７、ＰＤＧＦ  Ｒβ、ＥｐｈＡ８、Ｒｅｔ、ＥｐｈＢ１、ＲＴＫ様オーファン受容体１／ＲＯＲ１、ＥｐｈＢ２、ＲＴＫ様オーファン受容体  ２／ＲＯＲ２、ＥｐｈＢ３、ＳＣＦ  Ｒ／ｃ−ｋｉｔ、ＥｐｈＢ４、Ｔｉｅ−１、ＥｐｈＢ６、Ｔｉｅ−２、ＥｒｂＢ２、ＴｒｋＡ、ＥｒｂＢ３、ＴｒｋＢ、ＥｒｂＢ４、ＴｒｋＣ、ＦＧＦ、Ｒ１−４  ＶＥＧＦ  Ｒ、ＦＧＦ  Ｒ１、  ＶＥＧＦ  Ｒ１／Ｆｌｔ−１、ＦＧＦ  Ｒ２、ＶＥＧＦ  Ｒ２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、ＦＧＦ  Ｒ３、ＶＥＧＦ  Ｒ３／Ｆｌｔ−４；プロテオグリカンおよび調節因子プロテオグリカンアグリカン、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）、アグリン（Ａｇｒｉｎ）、ＮＧ２／ＭＣＳＰ、バイグリカン、オステオアドヘリン（Ｏｓｔｅｏａｄｈｅｒｉｎ）、デコリン、ポドカン（Ｐｏｄｏｃａｎ）、ＤＳＰＧ３、δ−サルコグリカン、エンドカン、シンデカン−１／ＣＤ１３８、エンドグリカン（Ｅｎｄｏｇｌｙｃａｎ）、シンデカン−２、エンドレペリン（Ｅｎｄｏｒｅｐｅｌｌｉｎ）／ペルレカン（Ｐｅｒｌｅｃａｎ）、シンデカン−３、グリピカン２、シンデカン−４、グリピカン３、テスチカン（Ｔｅｓｔｉｃａｎ）１／ＳＰＯＣＫ１、グリピカン５、テスチカン２／ＳＰＯＣＫ２、グリピカン６、テスチカン３／ＳＰＯＣＫ３、ルミカン、バーシカン、プロテオグリカン調節因子、アリールスルファターゼＡ／ＡＲＳＡ、グルコサミン（Ｎ−アセチル）−６−スルファターゼ／ＧＮＳ、Ｅｘｏｓｔｏｓｉｎ−ｌｉｋｅ  ２／ＥＸＴＬ２、ＨＳ６ＳＴ２、Ｅｘｏｓｔｏｓｉｎ−ｌｉｋｅ  ３／ＥＸＴＬ３、イズロン酸２−スルファターゼ／ＩＤＳ、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ；ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３リガンドおよびＭ−ＣＳＦ  Ｆｌｔ−３、Ｍ−ＣＳＦ  Ｒ、Ｆｌｔ−３リガンド、ＳＣＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ  Ｒ／ｃ−ｋｉｔ；ＴＧＦ−βスーパーファミリー（炎症マーカーに関して列挙したものと同じ）；ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリー、ニューロピリン−１、ＰｌＧＦ、ニューロピリン−２、ＰｌＧＦ−２、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ  Ｒα、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ  Ｒβ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＶＥＧＦ  Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ  Ｒ１／Ｆｌｔ−１、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ  Ｒ２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ  Ｒ３／Ｆｌｔ−４；Ｗｎｔ関連分子、ディックコップ（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ）タンパク質およびＷｎｔ阻害因子Ｄｋｋ−１、Ｄｋｋ−４、Ｄｋｋ−２、Ｓｏｇｇｙ−１、Ｄｋｋ−３、ＷＩＦ−１、フリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）および関連タンパク質、フリズルド−１、フリズルド−８、フリズルド−２、フリズルド−９、フリズルド−３、ｓＦＲＰ−１、フリズルド−４、ｓＦＲＰ−２、フリズルド−５、ｓＦＲＰ−３、フリズルド−６、ｓＦＲＰ−４、フリズルド−７、ＭＦＲＰ  ＷｎｔリガンドＷｎｔ−１、Ｗｎｔ−８ａ、Ｗｎｔ−２ｂ、Ｗｎｔ−８ｂ、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−９ａ、Ｗｎｔ−４、Ｗｎｔ−９ｂ、Ｗｎｔ−５ａ、Ｗｎｔ−１０ａ、Ｗｎｔ−５ｂ、Ｗｎｔ−１０ｂ、Ｗｎｔ−７ａ、Ｗｎｔ−１１、Ｗｎｔ−７ｂ；他のＷｎｔ関連分子、ＡＰＣ、クレメン（Ｋｒｅｍｅｎ）−２、アキシン−１、ＬＲＰ−１、β−カテニン、ＬＲＰ−６、ディシブルド（Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ）−１、ノリン（Ｎｏｒｒｉｎ）、ディシブルド−３、ＰＫＣ  β１、グリピカン３、ピゴパス（Ｐｙｇｏｐｕｓ）−１、グリピカン５、ピゴパス−２、ＧＳＫ−３α／β、Ｒ−スポンジン（Ｓｐｏｎｄｉｎ）１、ＧＳＫ−３α、Ｒ−スポンジン２、ＧＳＫ−３β、Ｒ−スポンジン３、ＩＣＡＴ、ＲＴＫ様オーファン受容体１／ＲＯＲ１、クレメン−１、ＲＴＫ様オーファン受容体２／ＲＯＲ、および他の成長因子ＣＴＧＦ／ＣＣＮ２、β−ＮＧＦ、Ｃｙｒ６１／ＣＣＮ１、ノリン、ＤＡＮＣＥ、Ｎ０Ｖ／ＣＣＮ３、ＥＧ−ＶＥＧＦ／ＰＫ１、オステオクリン（Ｏｓｔｅｏｃｒｉｎ）、ヘパソシン（Ｈｅｐａｓｓｏｃｉｎ）、ＰＤ−ＥＣＧＦ、ＨＧＦ、プログラヌリン（Ｐｒｏｇｒａｎｕｌｉｎ）、ＬＥＣＴ２、トロンボポエチン、ＬＥＤＧＦおよびＷＩＳＰ−１／ＣＣＮ４。
【００８２】
［炎症マーカー］
本発明の方法および組成物に使用され得る炎症マーカーには、ＩＣＡＭ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−２、ＭＩＰ−１−β、ＭＩＰ−１−αおよびＭＭＰ−３が含まれる。更なる炎症マーカーには以下のものが含まれる。インテグリンα１β１、α２β１、α３β１、α４β１、α５β１、α６β１、α７β１、α８β１、α９β１、αＶβ１、α４β７、α６β４、αＤβ２、αＬβ２、αＭβ２、αＶβ３、αＶβ５、αＶβ６、αＶβ８、αＸβ２、αＩＩｂβ３、αＩＥＬｂβ７、β−２インテグリン、β−３インテグリン、β−２インテグリン、β−４インテグリン、β−５インテグリン、β−６インテグリン、β−７インテグリン、β−８インテグリン、α−１インテグリン、α−２インテグリン、α−３インテグリン、α−４インテグリン、α−５インテグリン、α−６インテグリン、α−７インテグリン、α−８インテグリン、α−９インテグリン、α−Ｄインテグリン、α−Ｌインテグリン、α−Ｍインテグリン、α−Ｖインテグリン、α−Ｘインテグリン、α−ＩＩｂインテグリン、αＩＥＬｂインテグリン等の接着分子；β  ＩＧ−Ｈ３、メルシン（Ｍｅｌｕｓｉｎ）、ＣＤ４７、ＭＥＰＥ、ＣＤ１５１、オステオポンチン、ＩＢＳＰ／シアロタンパク質ＩＩ、ＲＡＧＥ、ＩＧＳＦ８等のインテグリン関連分子；Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン等のセレクチン；並びにＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＰＳＧＬ−１、ビトロネクチン、ビトロネクチン受容体、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−３、ＢＬ−ＣＡＭ、ＬＦＡ−２、ＶＣＡＭ−１、ＮＣＡＭおよびＰＥＣＡＭ等のリガンド。更なる炎症マーカーには以下のものが含まれる。ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、−κ、−τおよび−ζ、ＩＦＮ−ω、ＩＦＮ−γ、ＩＬ２９、ＩＬ２８ＡおよびＩＬ２８Ｂ、ＩＬ−１、ＩＬ−１αおよびβ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０並びにＴＣＣＲ／ＷＳＸ−１等のサイトカイン。更なる炎症マーカーには以下のものが含まれる。共通β鎖（Ｃｏｍｍｏｎ  ｂｅｔａ  Ｃｈａｉｎ）、ＩＬ−３Ｒα、ＩＬ−３Ｒβ、ＧＭ−ＣＳＦ  Ｒ、ＩＬ−５Ｒα、共通γ鎖／ＩＬ−２Ｒγ、ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−９Ｒ、ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−２１Ｒ、ＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−７Ｒα／ＣＤ１２７、ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１Ｆ３、ＩＬ−１Ｒ８、ＩＬ−１ＲＩ、ＩＬ−１Ｒ９、ＩＬ−１ＲＩＩ、ＩＬ−１８Ｒα／ＩＬ−１Ｒ５、ＩＬ−１Ｒ３／ＩＬ−１Ｒ  ＡｃＰ、ＩＬ−１８Ｒβ／ＩＬ−１Ｒ７、ＩＬ−１Ｒ４／ＳＴ２  ＳＩＧＩＲＲ、ＩＬ−１Ｒ６／ＩＬ−１Ｒｒｐ２、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−３１ＲＡ、ＣＮＴＦ  Ｒα、レプチンＲ、Ｇ−ＣＳＦ  Ｒ、ＬＩＦ  Ｒα、ＩＬ−６Ｒ、ＯＳＭ  Ｒβ、ＩＦＮ−α／βＲ１、ＩＦＮ−α／βＲ２、ＩＦＮ−γＲ１、ＩＦＮ−γＲ２、ＩＬ−１０Ｒα、ＩＬ−１０Ｒβ、ＩＬ−２０Ｒα、ＩＬ−２０Ｒβ、ＩＬ−２２Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１７ＲＤ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−１７ＢＲ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＩＬ−２３Ｒ、ＩＬ−１２Ｒβ１、ＩＬ−１２Ｒβ２、ＴＣＣＲ／ＷＳＸ−１およびＩＬ−１３Ｒα１等のサイトカイン受容体。更なる炎症マーカーには以下のものが含まれる。ＣＣＬ−１、ＣＣＬ−２、ＣＣＬ−３、ＣＣＬ−４、ＣＣＬ−５、ＣＣＬ−６、ＣＣＬ−７、ＣＣＬ−８、ＣＣＬ−９、ＣＣＬ−１０、ＣＣＬ−１１、ＣＣＬ−１２、ＣＣＬ−１３、ＣＣＬ−１４、ＣＣＬ−１５、ＣＣＬ−１６、ＣＣＬ−１７、ＣＣＬ−１８、ＣＣＬ−１９、ＣＣＬ−２０、ＣＣＬ−２１、ＣＣＬ−２２、ＣＣＬ−２３、ＣＣＬ−２４、ＣＣＬ−２５、ＣＣＬ−２６、ＣＣＬ−２７、ＣＣＬ−２８、ＭＣＫ−２、ＭＩＰ−２、ＣＩＮＣ−１、ＣＩＮＣ−２、ＫＣ、ＣＩＮＣ−３、ＬＩＸ、ＧＲＯ、胸腺ケモカイン−１、ＣＸＣＬ−１、ＣＸＣＬ−２、ＣＸＣＬ−３、ＣＸＣＬ−４、ＣＸＣＬ−５、ＣＸＣＬ−６、ＣＸＣＬ−７、ＣＸＣＬ−８、ＣＸＣＬ−９、ＣＸＣＬ−１０、ＣＸＣＬ−１１、ＣＸＣＬ−１２、ＣＸＣＬ−１３、ＣＸＣＬ−１４、ＣＸＣＬ−１５、ＣＸＣＬ−１６、ＣＸＣＬ−１７、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２およびケメリン等のケモカイン。更なる炎症マーカーには以下のものが含まれる。ＣＣＲ−１、ＣＣＲ−２、ＣＣＲ−３、ＣＣＲ−４、ＣＣＲ−５、ＣＣＲ−６、ＣＣＲ−７、ＣＣＲ−８、ＣＣＲ−９、ＣＣＲ−１０、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣｈｅｍＲ２３等のケモカイン受容体。更なる炎症マーカーには以下のものが含まれる。ＴＮＦ  α、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３、リンホトキシン、ＢＡＦＦ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、リンホトキシンβ／ＴＮＦＳＦ３、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦ１Ａ、ＥＤＡ、ＴＮＦ−β／ＴＮＦＳＦ１Ｂ、ＥＤＡ−Ａ２、ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦＳＦ１０、Ｆａｓリガンド／ＴＮＦＳＦ６、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８およびＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２等の腫瘍壊死因子（ＴＮＦｓ）。更なる炎症マーカーには以下のものが含まれる。４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９、ＮＧＦ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１６、ＢＡＦＦ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、オステオプロテジェリン／ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＢＣＭＡ／ＴＮＦＲＳＦ１７、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＲＡＮＫ／ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＤｃＲ３／ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＴＮＦ  ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＤｃＴＲＡＩＬ  Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ２３、ＴＮＦ  ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＤｃＴＲＡＩＬ  Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ２２、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＤＲ６／ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＲＡＩＬ  Ｒ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＥＤＡＲ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ４／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ���、ＴＲＯＹ／ＴＮＦＲＳＦ１９、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＴＷＥＡＫ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１２、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４およびＸＥＤＡＲ等のＴＮＦスーパーファミリー受容体。更なる炎症マーカーには、ＦＡＤＤ、ＴＲＡＦ−２、ＲＩＰ１、ＴＲＡＦ−３、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ−４、ＴＲＡＦ−１およびＴＲＡＦ−６等のＴＮＦスーパーファミリー調節因子が含まれる。更なる炎症マーカーには急性期反応物質および急性期タンパク質が含まれる。更なる炎症マーカーには以下のものが含まれる。アクチビン、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、ＢＭＰｓ（骨形成タンパク質）、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−３ｂ／ＧＤＦ−１０、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−１５／ＧＤＦ−９Ｂ、ＢＭＰ−６、デカペンタプレジック、成長／分化因子（ＧＤＦｓ）、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−１５、ＧＤＦ−７、ＧＤＮＦファミリーリガンド、アルテミン、ニュールツリン、ＧＤＮＦ、パーセフィン、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β５、ＬＡＰ（ＴＧＦ−β１）、潜在型ＴＧＦ−βｂｐ１、潜在型ＴＧＦ−β１、潜在型ＴＧＦ−βｂｐ２、ＴＧＦ−β１．２、潜在型ＴＧＦ−βｂｐ４、ＴＧＦ−β２、レフティー（Ｌｅｆｔｙ）、ＭＩＳ／ＡＭＨ、レフティー−１、ノーダル（Ｎｏｄａｌ）、レフティー−Ａ、アクチビンＲＩＡ／ＡＬＫ−２、ＧＦＲα−１／ＧＤＮＦ  Ｒα−１、アクチビンＲＩＢ／ＡＬＫ−４、ＧＦＲα−２／ＧＤＮＦ  Ｒα−２、アクチビンＲＩＩＡ、ＧＦＲα−３／ＧＤＮＦ  Ｒα−３、アクチビンＲＩＩＢ、ＧＦＲα−４／ＧＤＮＦ  Ｒα−４、ＡＬＫ−１、ＭＩＳ  ＲＩＩ、ＡＬＫ−７、Ｒｅｔ、ＢＭＰＲ−ＩＡ／ＡＬＫ−３、ＴＧＦ−βＲＩ／ＡＬＫ−５、ＢＭＰＲ−ＩＢ／ＡＬＫ−６、ＴＧＦ−βＲＩＩ、ＢＭＰＲ−ＩＩ、ＴＧＦ−βＲＩＩｂ、エンドグリン／ＣＤ１０５およびＴＧＦ−βＲＩＩＩ等のＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンド。更なる炎症マーカーには以下のものが含まれる。アムニオンレス（Ａｍｎｉｏｎｌｅｓｓ）、ＮＣＡＭ−１／ＣＤ５６、ＢＡＭＢＩ／ＮＭＡ、ノギン、ＢＭＰ−１／ＰＣＰ、ＮＯＭＯ、カロンテ（Ｃａｒｏｎｔｅ）、ＰＲＤＣ、ケルベロス１、ＳＫＩ、コーディン、Ｓｍａｄ１、Ｃｈｏｒｄｉｎ−Ｌｉｋｅ  １、Ｓｍａｄ２、Ｃｈｏｒｄｉｎ−Ｌｉｋｅ  ２、Ｓｍａｄ３、ＣＯＣＯ、Ｓｍａｄ４、ＣＲＩＭ１、Ｓｍａｄ５、クリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）、Ｓｍａｄ７、クロスベインレス（Ｃｒｏｓｓｖｅｉｎｌｅｓｓ）−２、Ｓｍａｄ８、クリプティック（Ｃｒｙｐｔｉｃ）、ＳＯＳＴ、ＤＡＮ、潜在型ＴＧＦ−βｂｐ１、デコリン、潜在型ＴＧＦ−βｂｐ２、ＦＬＲＧ、潜在型ＴＧＦ−βｂｐ４、フォリスタチン、ＴＭＥＦＦ１／トモレグリン（Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ）−１、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ  １、ＴＭＥＦＦ２、ＧＡＳＰ−１／ＷＦＩＫＫＮＲＰ、ＴＳＧ、ＧＡＳＰ−２／ＷＦＩＫＫＮ、ＴＳＫ、グレムリンおよびバソリン（Ｖａｓｏｒｉｎ）等のＴＧＦ−βスーパーファミリー調節因子。更なる炎症マーカーには、アンフィレグリン、ＬＲＩＧ３、ベータセルリン、ニューレグリン−１／ＮＲＧ１、ＥＧＦ、ニューレグリン−３／ＮＲＧ３、エピゲン（Ｅｐｉｇｅｎ）、ＴＧＦ−α、エピレグリン、ＴＭＥＦＦ１／トモレグリン−１、ＨＢ−ＥＧＦ、ＴＭＥＦＦ２およびＬＲＩＧ１等のＥＧＦリガンドが含まれる。更なる炎症マーカーには、ＥＧＦ  Ｒ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ４等のＥＧＦ  Ｒ／ＥｒｂＢ受容体ファミリーが含まれる。更なる炎症マーカーにはフィブリノーゲンが含まれる。更なる炎症マーカーにはＳＡＡが含まれる。更なる炎症マーカーには、α．１−アンチトリプシン、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、α．２−マクログロブリン、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、Ｍａｃ−１およびＦ４／８０等のグリアマーカーが含まれる。更なる炎症マーカーにはミエロペルオキシダーゼが含まれる。更なる炎症マーカーには、Ｃ３ｄ、Ｃ１ｑ、Ｃ５、Ｃ４ｄ、Ｃ４ｂｐおよびＣ５ａ−Ｃ９等の補体マーカーが含まれる。更なる炎症マーカーには、ＨＬＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−Ａ、Ｄ、Ｃ等の主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）糖タンパク質が含まれる。更なる炎症マーカーには、ＣＲ３受容体、ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩ、ＣＤ３１、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ６８、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＤ、ＣＤ１８、ＣＤ５９、ＣＲ４、ＣＤ４５、ＣＤ６４およびＣＤ４４等のミクログリアマーカーが含まれる。更なる炎症マーカーには以下のものが含まれる。α．２マクログロブリン受容体、線維芽細胞増殖因子、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＣＤ８、ＬＣＡ（ＣＤ４５）、ＣＤ１８（）、ＣＤ５９、ＡｐｏＪ、クラスタリン、２型プラスミノーゲン活性化因子インヒビター、ＣＤ４４、マクロファージコロニー刺激因子受容体、ＭＲＰ１４、２７Ｅ１０、４−ヒドロキシノネナール−タンパク質複合体、Ｉ．ｋａｐｐａ．Ｂ、ＮＦ．ｋａｐｐａ．Ｂ、ｃＰＬＡ．ｓｕｂ．２、ＣＯＸ−２、マトリックスメタロプロテアーゼ、膜脂質過酸化およびＡＴＰａｓｅ活性。ＨＳＰＣ２２８、ＥＭＰ１、ＣＤＣ４２、ＴＬＥ３、ＳＰＲＹ２、ｐ４０ＢＢＰ、ＨＳＰＣ０６０およびＮＡＢ２、またはＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＭＡＰＲＥ２およびＯＡＳ１発現のダウンレギュレーション、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７、α−１−酸性糖タンパク質
、アンジオポエチン−１、ＭＩＦ、アンジオポエチン−２、ＣＤ１４、β−デフェンシン２、ＭＭＰ−２、ＥＣＦ−Ｌ／ＣＨＩ３Ｌ３、ＭＭＰ−７、ＥＧＦ、ＭＭＰ−９、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＭＳＰ、ＥＮ−ＲＡＧＥ、酸化窒素、エンドセリン−１、オステオアクチビン／ＧＰＮＭＢ、ＦＰＲ１、ＰＤＧＦ、ＦＰＲＬ１、ペントラキシン３／ＴＳＧ−１４、ＦＰＲＬ２、Ｇａｓ６、ＰＬＵＮＣ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＧＥ、Ｓ１００Ａ１０、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＨＩＦ−１α、Ｐ物質（またはサブスタンスＰ）、ＴＦＰＩ、ＴＧＦ−β１、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３、ＴＩＭＰ−４、ＴＬＲ４、ＬＢＰ、ＴＲＥＭ−１、ロイコトリエンＡ４、ヒドロラーゼＴＳＧ−６、リポカリン−１、ｕＰＡ、Ｍ−ＣＳＦおよびＶＥＧＦ。
【００８３】
［混合型マーカー］
本発明の方法および組成物に使用され得る腫瘍マーカーには、ＥＧＦ、ＴＮＦ−α、ＰＳＡ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β１、ＦＧＦｂ、ＴＲＡＩＬおよびＴＮＦ−ＲＩ（ｐ５５）が含まれる。
【００８４】
本発明の方法および組成物に使用され得る内分泌機能マーカーには、１７β−エストラジオール（Ｅ２）、ＤＨＥＡ、ＡＣＴＨ、ガストリンおよび成長ホルモン（ｈＧＨ）が含まれる。
【００８５】
本発明の方法および組成物に使用され得る自己免疫マーカーには、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｃ反応性タンパク質およびＧ−ＣＳＦが含まれる。
【００８６】
本発明の方法および組成物に使用され得る甲状腺機能マーカーには、環状ＡＭＰ、カルシトニンおよび副甲状腺ホルモンが含まれる。
【００８７】
本発明の方法および組成物に使用され得る心血管マーカーには、心筋トロポニンＩ、心筋トロポニンＴ、Ｂ−ナトリウム利尿ペプチド、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、Ｃ反応性タンパク質ＨＳおよびβ−トロンボグロブリンが含まれる。
【００８８】
本発明の方法および組成物に使用され得る糖尿病マーカーには、Ｃ−ペプチドおよびレプチンが含まれる。
【００８９】
本発明の方法および組成物に使用され得る感染症マーカーには、ＩＦＮ−γおよびＩＦＮ−αが含まれる。
【００９０】
本発明の方法および組成物に使用され得る代謝マーカーには、Ｂｉｏ−ｉｎｔａｃｔ  ＰＴＨ（１−８４）およびＰＴＨが含まれる。
【００９１】
［生物学的状態のマーカー］
マーカーは、件の特定の表現型の状態の存在を示し得る。表現型の状態の例として、１種類の生物または生物の綱もしくは亜綱の環境変化、薬物治療、遺伝子操作もしくは遺伝子変異、損傷、食物の変化、老化、または他の何らかの特性によって生じる表現型が挙げられる。
【００９２】
いくつかの態様において、件の表現型の状態は、臨床学的に診断された疾患の状態である。そのような疾患の状態には、例えば、癌、循環器疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、神経系疾患、感染症および妊娠関連障害が含まれる。別法として、健康状態はマーカーを用いて検出され得る。
【００９３】
癌の表現型が本発明のいくつかの要旨に含まれる。本発明における癌の例として以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：乳癌、皮膚癌、骨癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、脳腫瘍、喉頭癌、胆嚢癌、膵臓癌、直腸癌、副甲状腺癌、甲状腺癌、副腎癌、神経組織癌、頭部および頸部癌、結腸癌、胃癌、気管支癌、腎臓癌、基底細胞癌、潰瘍性および乳頭状の扁平上皮癌、転移性皮膚癌、骨肉腫、ユーイング肉腫、細網肉腫（ｖｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｃｅｌｌ  ｓａｒｃｏｍａ）、骨髄腫、巨細胞腫、小細胞肺腫瘍、非小細胞肺癌胆石、島細胞腫、原発性脳腫瘍、急性および慢性のリンパ性および顆粒球性腫瘍、有毛細胞腫瘍、腺腫、過形成、髄様癌、褐色細胞腫、粘膜神経腫、腸神経節細胞腫、過形成角膜神経腫瘍、マルファン体質腫瘍（ｍａｒｆａｎｏｉｄ  ｈａｂｉｔｕｓ  ｔｕｍｏｒ）、ウィルムス腫瘍、精上皮腫、卵巣腫瘍、平滑筋腫瘍、子宮頚部異形成およびｉｎ  ｓｉｔｕ癌腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、軟部組織肉腫、悪性カルチノイド、局所的皮膚病変、菌状息肉腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、骨形成および他の肉腫、悪性高カルシウム血症、腎細胞腫瘍、真性赤血球増加症、腺癌、多形神経膠芽腫、白血病、リンパ腫、悪性黒色腫、類表皮癌、ならびに他の癌腫および肉腫。
【００９４】
循環器疾患は本発明の他の応用に含まれ得る。本発明における循環器疾患の例として以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。鬱血性心不全、高血圧、不整脈、アテローム性動脈硬化症、コレステロール、ウォルフ・パーキンソン・ホワイト症候群、ＱＴ延長症候群、狭心症、頻脈、徐脈、心房細動、心室細動、心筋虚血、心筋梗塞、心タンポナーデ、心筋炎、心膜炎、不整脈原性右室異形成、肥大型心筋症、ウィリアムズ症候群、心臓弁膜症、心内膜炎、細菌性疾患、肺動脈閉鎖、大動脈弁狭窄、レイノー病、コレステロール塞栓症、ワレンベルグ症候群、ヒッペル・リンダウ病および毛細血管拡張症。
【００９５】
炎症性疾患および自己免疫疾患は本発明の他の態様に含まれ得る。炎症性疾患および自己免疫疾患の例として以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。関節リウマチ、非特異的関節炎、喉頭の炎症性疾患、炎症性腸疾患、乾癬、甲状腺機能低下（例えば橋本病甲状腺炎）、大腸炎、１型糖尿病、骨盤内炎症性疾患、中枢神経系の炎症性疾患、側頭動脈炎、リウマチ性多発筋痛、強直性脊椎炎、結節性多発動脈炎、ライター症候群、強皮症、全身性紅斑性狼瘡およびエリテマトーデス。
【００９６】
本発明の方法および組成物は、感染症のマーカーに関する実験情報も提供し得、そのマーカーには以下のもののマーカーも含まれる。アデノウイルス、百日咳菌、肺炎クラミジア、クラミジア・トラコマチス、コレラ毒素、コレラ毒素β、カンピロバクター・ジェジュニ、サイトメガロウイルス、ジフテリア毒素、エプスタイン・バールＮＡ、エプスタイン・バールＥＡ、エプスタイン・バールＶＣＡ、ヘリコバクターピロリ菌、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コア、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）エンベロープ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原（Ａｙ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コア、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＮＳ３、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＮＳ４、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＮＳ５、Ａ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）ｏｒｆ２  ３ＫＤ、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）ｏｒｆ２  ６ＫＤ、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）ｏｒｆ３  ３ＫＤ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−１ｐ２４、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−１ｇｐ４１、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−１ｇｐ１２０、ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）、単純ヘルペスウイルスＨＳＶ−１／２、単純ヘルペスウイルスＨＳＶ−１ｇＤ、単純ヘルペスウイルスＨＳＶ−２ｇＧ、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）−１／２、Ａ型インフルエンザ、Ａ型インフルエンザＨ３Ｎ２、Ｂ型インフルエンザ、ドノバン・リーシュマニア、ライム病、おたふく風邪、肺炎マイコプラズマ、ヒト型結核菌、パラインフルエンザ１、パラインフルエンザ２、パラインフルエンザ３、ポリオウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、風疹、麻疹、ストレプトリジンＯ、破傷風毒素、梅毒トレポネーマ１５ｋｄ、梅毒トレポネーマｐ４７、クルーズ・トリパノソーマ、トキソプラズマおよび水痘帯状疱疹。
【００９７】
［ＩＶ．ラベル］
いくつかの態様において、本発明は分子、例えばマーカーの高感度検出および定量のためのラベルで構成される方法および組成物を提供する。
【００９８】
当業者は、ターゲット分子をラベリングして粒子混合物中のそのターゲット分子の検出および識別を可能にするために、多数の戦略が用いられ得ることを理解するだろう。ラベルは、いずれの公知手段によっても結合され得、その手段には、ラベルとターゲットとの非特異的または特異的相互作用を利用する方法が含まれる。ラベルは、検出可能な信号を提供し得、または電場における粒子の移動度に影響を及ぼし得る。ラベリングは、直接的に又は結合パートナーを通じて実施され得る。
【００９９】
いくつかの態様において、ラベルは件の分子に対する結合パートナーを有し、ラベルにおいて、結合パートナーは蛍光部分に結合される。本発明の組成物および方法は、蛍光性の高い部分を使用し得る。本発明の組成物および方法に適した蛍光部分を、以下により詳細に説明する。
【０１００】
いくつかの態様において、本発明は、生体分子を検出するためのラベルを提供し、そのラベルは、蛍光部分に結合される生体分子のための結合パートナーを有し、蛍光部分は、その蛍光部分の励起波長の光を放射するレーザーによって刺激される場合に少なくとも約２００個の光子を放出することができ、レーザーは、蛍光部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わされ、また、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、蛍光部分は複数の蛍光性要素、例えば、約２〜４、２〜５、２〜６、２〜７、２〜８、２〜９、２〜１０、または約３〜５、３〜６、３〜７、３〜８、３〜９もしくは３〜１０の蛍光性要素を含有する。いくつかの態様において、蛍光部分は約２〜４の蛍光性要素を含有する。いくつかの態様において、生体分子はタンパク質または小分子である。いくつかの態様において、生体分子はタンパク質である。蛍光性要素は、蛍光色素分子であり得る。いくつかの態様において、蛍光色素分子は少なくとも一つの置換インドリウム環系を有し、その置換インドリウム環系において、インドリウム環の３位の炭素における置換基は化学反応性基または共役物質（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）を有する。いくつかの態様において、色素分子は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００からなる群から選択されるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ分子である。いくつかの態様において、色素分子は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００からなる群から選択されるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ分子である。いくつかの態様において、色素分子は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７色素分子である。いくつかの態様において、色素分子は、第１種および第２種の色素分子、例えば二つの異なるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ分子であって、例えば色素分子の第１種および第２種が異なる放射スペクトルを有する色素分子からなる。第２種の色素分子に対する第１種の色素分子の数の比は、例えば、４対１、３対１、２対１、１対１、１対２、１対３または１対４であり得る。結合パートナーは例えば抗体であり得る。
【０１０１】
いくつかの態様において、本発明はマーカーを検出するためのラベルを提供し、ラベルは、マーカーに対する結合パートナーおよび蛍光部分を有し、蛍光部分は、蛍光部分の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激される場合に少なくとも約２００個の光子を放出することができ、レーザーは、蛍光部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わされ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、蛍光部分は蛍光分子を有する。いくつかの態様において、蛍光部分は複数の蛍光分子、例えば、約２〜１０、２〜８、２〜６、２〜４、３〜１０、３〜８または３〜６の蛍光分子を有する。いくつかの態様において、ラベルは、約２〜４の蛍光分子を有する。いくつかの態様において、蛍光色素分子は、少なくとも一つの置換インドリウム環系を有し、その置換インドリウム環系において、インドリウム環の３位の炭素における置換基は化学反応性基または共役物質を有する。いくつかの態様において、蛍光分子は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００からなる群から選択される。いくつかの態様において、蛍光分子は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００からなる群から選択される。いくつかの態様において、蛍光分子はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子である。いくつかの態様において、結合パートナーには抗体が含まれる。いくつかの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。他の態様において、抗体はポリクローナル抗体である。
【０１０２】
抗体は、適切なマーカーに対して特異的であり得る。いくつかの態様において、抗体は、下記のものからなる群から選択されるマーカーに対して特異的である。サイトカイン、成長因子、腫瘍マーカー、炎症マーカー、内分泌マーカー、自己免疫マーカー、甲状腺マーカー、心血管マーカー、糖尿病マーカー、感染症マーカー、神経学的マーカー、呼吸器マーカー、胃腸マーカー、筋骨格マーカー、皮膚疾患および代謝マーカー。
【０１０３】
いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるサイトカインに対して特異的である。いくつかの態様において、サイトカインは以下のものからなる群から選択される。ＢＤＮＦ、ＣＲＥＢ  ｐＳ１３３、ＣＲＥＢ  Ｔｏｔａｌ、ＤＲ−５、ＥＧＦ、ＥＮＡ−７８、エオタキシン、脂肪酸結合タンパク質、塩基性ＦＧＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＧＣＰ−２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子ＧＭ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、成長関連癌遺伝子ケラチノサイト（ＧＲＯ−ＫＣ）、ＨＧＦ、ＩＣＡＭ−１、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、インターロイキンＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１２ｐ４０／ｐ７０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１Ｆ３、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、インターフェロン誘導性タンパク質（１０ＩＰ−１０）、ＪＥ／ＭＣＰ−１、ケラチノサイト（ＫＣ）、ＫＣ／ＧＲＯａ、ＬＩＦ、リンホタクチン、Ｍ−ＣＳＦ、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、ＭＣＰ−１（ＭＣＡＦ）、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−５、ＭＤＣ、ＭＩＧ、マクロファージ炎症（ＭＩＰ−１α）、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−１γ、ＭＩＰ−２、ＭＩＰ−３β、ＯＳＭ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、活性化に応じて調節され、発現および分泌された正常Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｐｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｎｏｒｍａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）（ＲＡＮＴＥＳ）、Ｒｂ（ｐＴ８２１）、Ｒｂ（ｔｏｔａｌ）、ＲｂｐＳｐＴ２４９／２５２、タウ（ｐＳ２１４）、タウ（ｐＳ３９６）、タウ（ｔｏｔａｌ）、組織因子、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＶＣＡＭ−１およびＶＥＧＦ。
【０１０４】
いくつかの態様において、サイトカインは以下のものからなる群から選択される。ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１０、ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−１８、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、エオタキシン、ＩＬ−１６、ＭＩＧ、ＩＬ−８、ＩＬ−１７、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１３、ＩＬ−２Ｒ（可溶性）、ＩＬ−２、ＬＩＦ／ＨＩＬＤＡ、ＩＬ−１β、Ｆａｓ／ＣＤ９５／Ａｐｏ−１およびＭＣＰ−１。
【０１０５】
いくつかの態様において、抗体は、マーカーである成長因子（ＧＦ）に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーである成長因子ＴＧＦ−βに対して特異的である。いくつかの態様において、成長因子は、以下のものである。アンフィレグリン、ＬＲＩＧ３、ベータセルリン、ニューレグリン−１／ＮＲＧ１、ＥＧＦ、ニューレグリン−３／ＮＲＧ３、エピゲン（Ｅｐｉｇｅｎ）、ＴＧＦ−α、エピレグリン、ＴＭＥＦＦ１／トモレグリン−１、ＨＢ−ＥＧＦ、ＴＭＥＦＦ２、ＬＲＩＧ１等のＧＦリガンド；ＥＧＦ  Ｒ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ４等のＥＧＦ  Ｒ／ＥｒｂＢ受容体ファミリー；ＦＧＦリガンド、酸性ＦＧＦ、ＦＧＦ−１２、塩基性ＦＧＦ、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−２２、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−２３、ＦＧＦ−１１、ＫＧＦ／ＦＧＦ−７、ＦＧＦ受容体ＦＧＦ  Ｒ１−４、ＦＧＦ  Ｒ３、ＦＧＦ  Ｒ１、ＦＧＦ  Ｒ４、ＦＧＦ  Ｒ２、ＦＧＦ  Ｒ５、ＦＧＦ調節因子ＦＧＦ−ＢＰ等のＦＧＦファミリー；ヘッジホッグファミリー、デザート・ヘッジホッグ、ソニック・ヘッジホッグ、インディアン・ヘッジホッグ；ヘッジホッグ関連分子および調節因子ＢＯＣ、ＧＬＩ−３、ＣＤＯ、ＧＳＫ−３α／β、ＤＩＳＰ１、ＧＳＫ−３α、Ｇａｓ１、ＧＳＫ−３β、ＧＬＩ−１、Ｈｉｐ、ＧＬＩ−２；ＩＧＦファミリー、ＩＧＦリガンドＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体（ＣＤ２２１）  ＩＧＦ−ＩＲ、およびＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）ファミリー、ＡＬＳ、ＩＧＦＢＰ−５、ＣＴＧＦ／ＣＣＮ２、ＩＧＦＢＰ−６、Ｃｙｒ６１／ＣＣＮ１、ＩＧＦＢＰ−Ｌ１、エンドカン（Ｅｎｄｏｃａｎ）、ＩＧＦＢＰ−ｒｐ１／ＩＧＦＢＰ−７、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−ｒＰ１０、ＩＧＦＢＰ−２、ＮＯＶ／ＣＣＮ３、ＩＧＦＢＰ−３、ＷＩＳＰ−１／ＣＣＮ４、ＩＧＦＢＰ−４；受容体型チロシンキナーゼＡｘｌ、ＦＧＦ  Ｒ４、Ｃ１ｑＲ１／ＣＤ９３、ＦＧＦ  Ｒ５、ＤＤＲ１、Ｆｌｔ−３、ＤＤＲ２、ＨＧＦ  Ｒ、Ｄｔｋ、ＩＧＦ−Ｉ  Ｒ、ＥＧＦ、Ｒ  ＩＧＦ−ＩＩ  Ｒ、Ｅｐｈ、ＩＮＳＲＲ、ＥｐｈＡ１、インスリンＲ／ＣＤ２２０、ＥｐｈＡ２、Ｍ−ＣＳＦ  Ｒ、ＥｐｈＡ３、Ｍｅｒ、ＥｐｈＡ４、ＭＳＰ  Ｒ／Ｒｏｎ、ＥｐｈＡ５、ＭｕＳＫ、ＥｐｈＡ６、ＰＤＧＦ  Ｒα、ＥｐｈＡ７、ＰＤＧＦ  Ｒβ、ＥｐｈＡ８、Ｒｅｔ、ＥｐｈＢ１、ＲＴＫ様オーファン受容体１／ＲＯＲ１、ＥｐｈＢ２、ＲＴＫ様オーファン受容体２／ＲＯＲ２、ＥｐｈＢ３、ＳＣＦ  Ｒ／ｃ−ｋｉｔ、ＥｐｈＢ４、Ｔｉｅ−１、ＥｐｈＢ６、Ｔｉｅ−２、ＥｒｂＢ２、ＴｒｋＡ、ＥｒｂＢ３、ＴｒｋＢ、ＥｒｂＢ４、ＴｒｋＣ、ＦＧＦ、Ｒ１−４  ＶＥＧＦ  Ｒ、ＦＧＦ  Ｒ１、ＶＥＧＦ  Ｒ１／Ｆｌｔ−１、ＦＧＦ  Ｒ２、ＶＥＧＦ  Ｒ２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、ＦＧＦ  Ｒ３、ＶＥＧＦ  Ｒ３／Ｆｌｔ−４；プロテオグリカンおよび調節因子プロテオグリカンアグリカン、ミメカン、アグリン、ＮＧ２／ＭＣＳＰ、バイグリカン、オステオアドヘリン、デコリン、ポドカン、ＤＳＰＧ３、δ−サルコグリカン、エンドカン、シンデカン−１���ＣＤ１３８、エンドグリカン、シンデカン−２、エンドレペリン／ペルレカン、シンデカン−３、グリピカン２、シンデカン−４、グリピカン３、テスチカン１／ＳＰＯＣＫ１、グリピカン５、テスチカン２／ＳＰＯＣＫ２、グリピカン６、テスチカン３／ＳＰＯＣＫ３、ルミカン、バーシカン、プロテオグリカン調節因子、アリールスルファターゼＡ／ＡＲＳＡ、グルコサミン（Ｎ−アセチル）−６−スルファターゼ／ＧＮＳ、Ｅｘｏｓｔｏｓｉｎ−ｌｉｋｅ  ２／ＥＸＴＬ２、ＨＳ６ＳＴ２、Ｅｘｏｓｔｏｓｉｎ−ｌｉｋｅ  ３／ＥＸＴＬ３、イズロン酸２−スルファターゼ／ＩＤＳ、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ；ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３リガンドおよびＭ−ＣＳＦ  Ｆｌｔ−３、Ｍ−ＣＳＦ  Ｒ、Ｆｌｔ−３リガンド、ＳＣＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ  Ｒ／ｃ−ｋｉｔ；ＴＧＦ−βスーパーファミリー（炎症マーカーに関して列挙したものと同じ）；ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリー  ニューロピリン−１、ＰｌＧＦ、ニューロピリン−２、ＰｌＧＦ−２、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ  Ｒα、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ  Ｒβ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＶＥＧＦ  Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ  Ｒ１／Ｆｌｔ−１、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ  Ｒ２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ  Ｒ３／Ｆｌｔ−４；Ｗｎｔ関連分子、ディックコップ（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ）タンパク質およびＷｎｔ阻害因子、Ｄｋｋ−１、Ｄｋｋ−４、Ｄｋｋ−２、Ｓｏｇｇｙ−１、Ｄｋｋ−３、ＷＩＦ−１、フリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）および関連タンパク質、フリズルド−１、フリズルド−８、フリズルド−２、フリズルド−９、フリズルド−３、ｓＦＲＰ−１、フリズルド−４、ｓＦＲＰ−２、フリズルド−５、ｓＦＲＰ−３、フリズルド−６、ｓＦＲＰ−４、フリズルド−７、ＭＦＲＰ  Ｗｎｔリガンド、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−８ａ、Ｗｎｔ−２ｂ、Ｗｎｔ−８ｂ、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−９ａ、Ｗｎｔ−４、Ｗｎｔ−９ｂ、Ｗｎｔ−５ａ、Ｗｎｔ−１０ａ、Ｗｎｔ−５ｂ、Ｗｎｔ−１０ｂ、Ｗｎｔ−７ａ、Ｗｎｔ−１１、Ｗｎｔ−７ｂ；他のＷｎｔ関連分子、ＡＰＣ、クレメン−２、アキシン−１、ＬＲＰ−１、β−カテニン、ＬＲＰ−６、ディシブルド−１、ノリン、ディシブルド−３、ＰＫＣ  β１、グリピカン３、ピゴパス−１、グリピカン５、ピゴパス−２、ＧＳＫ−３α／β、Ｒ−スポンジン１、ＧＳＫ−３α、Ｒ−スポンジン２、ＧＳＫ−３β、Ｒ−スポンジン３、ＩＣＡＴ、ＲＴＫ様オーファン受容体１／ＲＯＲ１、クレメン−１、ＲＴＫ様オーファン受容体２／ＲＯＲ、および他の成長因子、ＣＴＧＦ／ＣＣＮ２、β−ＮＧＦ、Ｃｙｒ６１／ＣＣＮ１、ノリン、ＤＡＮＣＥ、ＮＯＶ／ＣＣＮ３、ＥＧ−ＶＥＧＦ／ＰＫ１、オステオクリン、ヘパソシン、ＰＤ−ＥＣＧＦ、ＨＧＦ、プログラヌリン、ＬＥＣＴ２、トロンボポエチン、ＬＥＤＧＦまたはＷＩＳＰ−１／ＣＣＮ４。
【０１０６】
いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカー（腫瘍マーカー）であるマーカーに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるマーカー、ＥＧＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるマーカー、ＴＮＦ−αに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるマーカー、ＰＳＡに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるマーカー、ＶＥＧＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるマーカー、ＴＧＦ−βに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるマーカー、ＦＧＦｂに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるマーカー、ＴＲＡＩＬに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるマーカー、ＴＮＦ−ＲＩ（ｐ５５）に対して特異的である。
【０１０７】
別の態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるα−フェトプロテインに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＥＲ  β／ＮＲ３Ａ２に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＥｒｂＢ２に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるカリクレイン３／ＰＳＡに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＥＲα／ＮＲ３Ａ１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるプロゲステロンＲ／ＮＲ３Ｃ３に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＡ３３に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＭＩＡに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるオーロラ（Ａｕｒｏｒａ）Ａに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＭＭＰ−２に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＢｃｌ−２に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＭＭＰ−３に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるカドヘリン−１３に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＭＭＰ−９に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＥ−カドヘリンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＮＥＫ２に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーである炭酸脱水酵素ＩＸに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるネスチンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるβ−カテニンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＮＧ２／ＭＣＳＰに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるカテプシンＤに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるオステオポンチンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＣＤ４４に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるｐ２１／ＣＩＰ１／ＣＤＫＮ１Ａに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＣＥＡＣＡＭ−６に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるｐ２７／Ｋｉｐ１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＣｏｒｎｕｌｉｎに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるｐ５３に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＤＰＰＡ４に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるプロ��クチンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＥＣＭ−１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＰＳＰ９４に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＥＧＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＳ１００Ｂに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＥＧＦ  Ｒに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＳ１００Ｐに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＥＭＭＰＲＩＮ／ＣＤ１４７に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＳＣＦ  Ｒ／ｃ−ｋｉｔに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーである線維芽細胞活性化タンパク質α／ＦＡＰに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるセルピンＥ１／ＰＡＩ−１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーである酸性ＦＧＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーである血清アミロイドＡ４に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーである塩基性ＦＧＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるサバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるガレクチン−３に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＴＥＭ８に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるグリピカン３に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＴＩＭＰ−１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＨＩＮ−１／セクレトグロブリン（Ｓｅｃｒｅｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）３Ａ１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＴＩＭＰ−２に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＩＧＦ−Ｉに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＴＩＭＰ−３に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＩＧＦＢＰ−３に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＴＩＭＰ−４に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＩＬ−６に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦ１Ａに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるカリクレイン６／ニューロシン（Ｎｅｕｒｏｓｉｎ）に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＴＲＡＦ−４に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＭ−ＣＳＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるｕＰＡに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるマトリプターゼ／ＳＴ１４に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるｕＰＡＲに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるメソセリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＶＣＡＭ−１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるメチオニンアミノペプチダーゼに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるＶＥＧＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌に対するマーカーであるメチオニンアミノペプチダーゼ２に対して特異的である。
【０１０８】
いくつかの態様において、抗体は、炎症に対するマーカーであるマーカーに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、炎症に対するマーカーであるマーカー、ＩＣＡＭ−１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、炎症に対するマーカーであるマーカー、ＲＡＮＴＥＳに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、炎症に対するマーカーであるマーカー、ＭＩＰ−２に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、炎症に対するマーカーであるマーカー、ＭＩＰ−１βに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、炎症に対するマーカーであるマーカー、ＭＩＰ−１αに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、炎症に対するマーカーであるマーカー、ＭＭＰ−３に対して特異的である。
【０１０９】
いくつかの態様において、抗体は、内分泌機能に対するマーカーであるマーカーに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、内分泌機能に対するマーカーであるマーカー、１７−β−エストラジオール（Ｅ２）に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、内分泌機能に対するマーカーであるマーカー、ＤＨＥＡに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、内分泌機能に対するマーカーであるマーカー、ＡＣＴＨに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、内分泌機能に対するマーカーであるマーカー、ガストリンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、内分泌機能に対するマーカーであるマーカー、成長ホルモンに対して特異的である。
【０１１０】
いくつかの態様において、抗体は、自己免疫疾患に対するマーカーであるマーカーに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、自己免疫疾患に対するマーカーであるマーカー、ＧＭ−ＣＳＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、自己免疫疾患に対するマーカーであるマーカー、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、自己免疫疾患に対するマーカーであるマーカー、Ｇ−ＣＳＦに対して特異的である。
【０１１１】
いくつかの態様において、抗体は、甲状腺機能に対するマーカーに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、甲状腺機能に対するマーカーである環状ＡＭＰに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、甲状腺機能に対するマーカーに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、甲状腺機能に対するマーカーであるカルシトニンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、甲状腺機能に対するマーカーに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、甲状腺機能に対するマーカーである副甲状腺ホルモンに対して特異的である。
【０１１２】
いくつかの態様において、抗体は、心血管機能に対するマーカーに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、心血管機能に対するマーカーであるＢ−ナトリウム利尿ペプチドに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、心血管機能に対するマーカーであるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、心血管機能に対するマーカーであるＣ反応性タンパク質、ＨＳに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、心血管機能に対するマーカーであるβ−トロンボグロブリンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、心血管機能に対するマーカーである心筋トロポニンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、心血管機能に対するマーカーである心筋トロポニンＩに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、心血管機能に対するマーカーである心筋トロポニンＴに対して特異的である。
【０１１３】
いくつかの態様において、抗体は、糖尿病に対するマーカーに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、糖尿病に対するマーカーであるＣ−ペプチドに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、糖尿病に対するマーカーであるレプチンに対して特異的である。
【０１１４】
いくつかの態様において、抗体は、感染症に対するマーカーに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、感染症に対するマーカーであるＩＦＮγに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、感染症に対するマーカーであるＩＦＮαに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、感染症に対するマーカーであるＴＲＥＭ−１に対して特異的である。
【０１１５】
いくつかの態様において、抗体は、代謝に対するマーカーに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、代謝に対するマーカーであるｂｉｏ−ｉｎｔａｃｔ  ＰＴＨ（１−８４）に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、代謝に対するマーカーであるＰＴＨに対して特異的である。
【０１１６】
いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−１βに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＴＮＦ−αに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−６に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＴｎＩ（心筋トロポニンＩ）に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−８に対して特異的である。
【０１１７】
いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＡβ４０に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＡβ４２に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるｃＡＭＰに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＦＡＳリガンドに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーである塩基性ＦＧＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＧＭ−ＣＳＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＦＮ−αに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＦＮ−γに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−１ａに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−２に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−４に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−５に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−７に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−１２に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−１３に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−１７に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＭＣＰ−１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＭＩＰ−１ａに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＲＡＮＴＥＳに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＶＥＧＦに対して特異的である。
【０１１８】
いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＡＣＥに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるアクチビンＡに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるアディポネクチンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるアジプシンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＡｇＲＰに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＡＫＴ１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるアルブミンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるベータセルリンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるボンベシンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＣＤ１４に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＣＤ−２６に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＣＤ−３８に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＣＤ−４０Ｌに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＣＤ−４０ｓに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＣＤＫ５に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーである補体Ｃ３に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーである補体Ｃ４に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＣ−ペプチドに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＣＲＰに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＥＧＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＥ−セレクチンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＦＡＳに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＦＡＳＬＧに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるフェチュインＡに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるフィブリノーゲンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるグレリンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるグルカゴンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーである成長ホルモンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるハプトグロブリンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーである肝細胞成長因子に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＨＧＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＣＡＭ１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＦＮＧに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＧＦ１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−１ＲＡに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−６ｓｒに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−８に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−１０に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−１８に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬＧＦＢＰ１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬＧＦＢＰ３に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるインスリン様成長因子１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＬＥＰに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＭ−ＣＳＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＭＭＰ２に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＭＭＰ９に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＮＧＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＰＡＩ−１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＲＡＧＥに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＲＳＰ４に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるレジスチンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーである性ホルモン結合グロブリンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＳＯＣＸ３に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＴＧＦβに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるトロンボプラスチンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＴＮＦ  Ｒ１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＶＣＡＭ−１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＶＷＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＴＳＨに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＥＰＩＴＯＭＥに対して特異的である。
【０１１９】
いくつかの態様において、抗体は、件の分子に対応するマーカーに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーである心筋トロポニンＩに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＴＲＥＭ−１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−６に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−８に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるロイコトリエンＴ４に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＡｋｔ１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＴＧＦ−βに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＦａｓリガンドに対して特異的である。
【０１２０】
［Ａ．結合パートナー］
検出すべき分子（例えばマーカー）の形態に対して必要な特異性を有する任意の適切な結合パートナーが使用され得る。分子（例えばマーカー）がいくつかの異なる形態を有する場合、結合パートナーの様々な特異性が可能である。適切な結合パートナーは当該技術分野において公知であり、抗体、アプタマー、レクチンおよび受容体が含まれる。有用で且つ用途の広い結合パートナーの種類は抗体である。
【０１２１】
［１．抗体］
いくつかの態様において、結合パートナーは、検出すべき分子に対して特異的な抗体である。用語「抗体」は、本明細書において用いる場合、広い意味を有する用語であり、その通常の意味で用いられ、その意味には、自然に存在する抗体および自然に存在しない抗体を指すことが含まれるがそれに限定されず、その抗体には、例えば、１本鎖抗体、キメラ抗体、二機能性抗体およびヒト化抗体、並びにそれらの抗原結合フラグメントが含まれる。抗体が引き寄せられる（または結合する）分子の領域またはエピトープの選択により、例えば分子が存在する場合にその分子の様々な形態に対して、または全体（例えば、全ての分子または実質的に全ての分子）に対してその特異性が決定されることが理解されるだろう。
【０１２２】
抗体を製造する方法は十分確立されている。当業者は、例えば『Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（抗体  実験マニュアル）』（Ｅｄ  ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８年）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク）に記載されているように、抗体を製造するために多数の手法を利用できることを理解するだろう。当業者は、抗体に類似した結合フラグメントまたは抗原結合性フラグメントを遺伝情報から様々な手法によって作製し得ることも理解するだろう（『Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（抗体工学：実用的研究方法）』（Ｃ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編著、１９９５年、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード）；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１４９号第３９１４〜３９２０頁（１９９２年））。分子（例えばタンパク質）に対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、並びにマーカーもまた、商業的に入手可能である（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス）；ＨｙＴｅｓｔ、ＨｙＴｅｓｔ  Ｌｔｄ．（フィンランド、トゥルク）；Ａｂｃａｍ  Ｉｎｃ．（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）；Ｌｉｆｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（米国ペンシルバニア州ウエストチェスター）；Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（米国マサチューセッツ州０１７４２−３０４９コンコード）；ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ（カリフォルニア州エメリービル）。
【０１２３】
いくつかの態様において、抗体はポリクローナル抗体である。他の態様において、抗体はモノクローナル抗体である。
【０１２４】
捕捉結合パートナーおよび検出結合パートナーのペア、例えば捕捉抗体および検出抗体のペアが、本発明の態様において使用され得る。従って、いくつかの態様において、通常は二つの結合パートナー（例えば二つの抗体）が使用される異種分析手順（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｓｓａｙ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）が用いられる。一方の結合パートナーは、通常は固体支持物上に固定された捕捉パートナーであり、他方の結合パートナーは、通常は検出可能ラベルが取り付けられている検出結合パートナーである。そのような抗体ペアは、上述の製造元、例えばＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ（カリフォルニア州エメリービル）から入手可能である。抗体ペアは、当該技術分野でよく知られている方法によっても設計および作製され得る。本発明の組成物には抗体ペアが含まれ、抗体ペアの一方の構成要素は本明細書に記載のラベルであり、他方の構成要素は捕捉抗体である。
【０１２５】
いくつかの態様において、様々な種と交差反応する抗体を、捕捉抗体、検出抗体、またはその両方として用いることが有用である。そのような態様には、例えば心臓障害のマーカーとして血中に放出される心筋トロポニンを測定することによる、薬物毒性の測定が含まれる。交差反応抗体によって、一の種、例えばヒト以外の種において毒性の研究を行うこと、および、分析試薬中の同じ抗体または抗体ペアを用いてその結果を他の種、例えばヒトの研究または臨床的観察に直接応用すること、従って分析間のばらつきを減少させることが可能となる。従って、いくつかの態様において、件の分子（例えば心筋トロポニンＩ等の心筋トロポニン）のマーカーに対する結合パートナーとして使用するための一またはそれより多くの抗体は、交差反応抗体であり得る。いくつかの態様において、抗体は、ヒト、サル、イヌおよびネズミからなる群から選択される少なくとも二つの種からのマーカー（例えば心筋トロポニン）と交差反応する。いくつかの態様において、抗体は、ヒト、サル、イヌおよびネズミからなる群全体からのマーカー（例えば心筋トロポニン）と交差反応する。
【０１２６】
［Ｂ．蛍光部分］
本発明において用いられるラベルのいくつかの態様において、結合パートナー（例えば抗体）は蛍光部分に結合される。蛍光部分の蛍光は、本明細書に記載の単一分子検出器等の単一分子検出器における検出を可能にするのに十分であり得る。
【０１２７】
「蛍光部分」は、この用語が本明細書において用いられる場合、一またはそれより多くの蛍光性要素を含有し、その蛍光の総量は、その蛍光部分を本明細書に記載の単一分子検出器において検出し得るようなものである。従って、蛍光部分は単一の要素（例えば量子ドットまたは蛍光分子）または複数の要素（例えば複数の蛍光分子）を含有し得る。「部分」が、この用語が本明細書において用いられる際に、蛍光性要素の群（例えば複数の蛍光色素分子）を指す場合、個々の要素が結合パートナーに対して別々に結合し得、または、群としての要素が検出するのに十分な蛍光を与える限りにおいては、それらの要素が一緒に結合し得ることが理解されるだろう。
【０１２８】
通常、蛍光部分の蛍光は、所望の検出限界、精度および分析精度に必要な一貫性（整合性）を有する、単一分子検出器において蛍光部分をバックグラウンドレベルより上で検出し得るのに十分な、量子効率および光退色しないことの組み合わせを伴う。例えば、いくつかの態様において、蛍光部分の蛍光は、本明細書に記載の機器において、約１０、５、４、３、２、１、０．１、０．０１、０．００１、０．００００１または０．０００００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界で、約２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％より小さい、またはそれより小さい、例えば約１０％またはそれより小さい変動係数で、分子（例えばマーカー）の検出および／または定量を可能にするようなものである。いくつかの態様において、蛍光部分の蛍光は、本明細書に記載の機器において、約５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界で、約１０％より小さい変動係数で、分子（例えばマーカー）の検出および／または定量を可能にするようなものである。
【０１２９】
「検出限界」は、この用語が本明細書において用いられる場合、試料に件の物質の分子が含まれていると同定し得る最も低い濃度、例えば最初の非ゼロ値を含む。それは、ゼロ値および検量線（または標準曲線、ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｕｒｖｅ）の傾きの変動によって定義され得る。例えば、分析の検出限界は、検量線を描き、検量線のゼロ値を決定し、その値に２標準偏差（または２σ）を加えることによって決定され得る。この値に等しい信号を発する件の物質の濃度が「検出下限」濃度である。
【０１３０】
更に、蛍光部分は、最適な分析におけるその蛍光部分の使用に合致する特徴を有する。いくつかの態様において、分析は免疫測定であり、その免疫測定において、蛍光部分は抗体に結合される；蛍光部分は他の抗体もしくはタンパク質と一緒に凝集してはならず、または必要とされる分析の確度および精度に合致する凝集よりも多く凝集してはならない。いくつかの態様において、好ましい蛍光部分は、蛍光部分、例えば、１）高い吸収係数；２）高い量子収率；３）高い光安定性（低い光退色性）；および４）件の分子（例えばタンパク質）へのラベリング適合性の組み合わせを有し、その結果、本発明の分析器およびシステムを用いて分析し得る（例えば、件のタンパク質の沈殿または蛍光部分を結合したタンパク質の沈殿を引き起こさない）色素分子である。
【０１３１】
本発明のいくつかの態様において有用な蛍光部分、例えば単一の蛍光色素分子または複数の蛍光色素分子は、ＥＭ照射によって刺激される際のそれらの光子放出特性の観点から定義され得る。例えば、いくつかの態様において、本発明は、蛍光部分の励起波長の光を放射するレーザーによって刺激されると平均で少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３５０、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００個の光子を放出することができる蛍光部分、例えば単一の蛍光色素分子または複数の蛍光色素分子を有する部分を使用し、レーザーは、その蛍光部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わされ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。全エネルギーが、レーザー出力と色素部分の曝露時間の長さとの多数の異なる組み合わせによって達成され得ることが理解されるだろう。例えば、出力が１ｍＷのレーザーは３ｍｓの間使用され得、出力３ｍＷのレーザーは１ｍｓの間使用され得、出力６ｍＷのレーザーは０．５ｍｓの間使用され得、出力１２ｍＷのレーザーは０．２５ｍｓの間使用され得る等である。
【０１３２】
いくつかの態様において、蛍光部分は平均で少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の蛍光性要素、例えば蛍光分子を有する。いくつかの態様において、蛍光部分は平均で約２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１以下の蛍光性要素、例えば蛍光分子を有する。いくつかの態様において、蛍光部分は平均で約１〜１１、または約２〜１０、または約２〜８、または約２〜６、または約２〜５、または約２〜４、または約３〜１０、または約３〜８、または約３〜６、または約３〜５、または約４〜１０、または約４〜８、または約４〜６、または約２、３、４、５、６、または約６より多くの蛍光性要素を有する。いくつかの態様において、蛍光部分は、平均で約２〜８の結合された蛍光部分を含む。いくつかの態様において、蛍光部分は平均で約２〜６の蛍光性要素を有する。いくつかの態様において、蛍光部分は平均で約２〜４の蛍光性要素を有する。いくつかの態様において、蛍光部分は平均で約３〜１０の蛍光性要素を有する。いくつかの態様において、蛍光部分は平均で約３〜８の蛍光性要素を有する。いくつかの態様において、蛍光部分は平均で約３〜６の蛍光性要素を含む。「平均」は、本発明のラベル群を代表する任意の試料であって、試料が複数の結合パートナー−蛍光部分ユニットを含有する試料において、標準的な分析方法によって測定された、結合パートナーに対する特定の蛍光性要素のモル比が、規定の数または数の範囲に一致することを意味する。例えば、ラベルが、結合パートナー（即ち抗体）および特定の吸光度を有する複数の蛍光色素分子を含有する蛍光部分を含む態様において、分光光度分析が用いられ得、この分光光度分析において、ラベル溶液が適切なレベルに希釈され、タンパク質（抗体）のモル濃度を決定するために２８０ｎｍにおける吸光度が取得され、蛍光色素分子のモル濃度を決定するために、例えば６５０ｎｍ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７の場合）における吸光度が取得される。前者に対する後者のモル濃度比は、各抗体に結合された蛍光部分における蛍光性要素（色素分子）の平均数を表す。
【０１３３】
［１．色素］
いくつかの態様において、本発明は、蛍光色素分子を含む蛍光部分を用いる。いくつかの態様において、本発明は、分子の励起波長における光を放射するレーザーによって刺激されると平均で少なくとも約５０の光子を放出することができる蛍光色素分子を使用し、レーザーは、分子を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わされ、レーザーによってそのスポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、本発明は、分子の励起波長における光を放射するレーザーによって刺激されると平均で少なくとも約７５の光子を放出することができる蛍光色素分子を使用し、レーザーは、分子を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わされ、レーザーによってそのスポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、本発明は、分子の励起波長における光を放射するレーザーによって刺激されると平均で少なくとも約１００の光子を放出することができる蛍光色素分子を使用し、レーザーは、分子を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わされ、レーザーによってそのスポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、本発明は、分子の励起波長における光を放射するレーザーによって刺激されると平均で少なくとも約１５０の光子を放出することができる蛍光色素分子を使用し、レーザーは、分子を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わされ、レーザーによってそのスポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、本発明は、分子の励起波長における光を放射するレーザーによって刺激されると平均で少なくとも約２００の光子を放出することができる蛍光色素分子を使用し、レーザーは、分子を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わされ、レーザーによってそのスポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である。
【０１３４】
いくつかの態様において、本発明は、蛍光部分の励起波長の光を放射するレーザーによって刺激されると平均で少なくとも約５０の光子を放出することができる蛍光色素部分、例えば、単一の蛍光色素分子または複数の蛍光色素分子を使用し、レーザーは、蛍光色素部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わされ、レーザーによってそのスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、本発明は、蛍光部分の励起波長の光を放射するレーザーによって刺激されると平均で少なくとも約１００の光子を放出することができる蛍光色素部分、例えば、単一の蛍光色素分子または複数の蛍光色素分子を使用し、レーザーは、蛍光色素部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わされ、レーザーによってそのスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、本発明は、蛍光部分の励起波長の光を放射するレーザーによって刺激されると平均で少なくとも約１５０の光子を放出することができる蛍光色素部分、例えば、単一の蛍光色素分子または複数の蛍光色素分子を使用し、レーザーは、蛍光色素部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わされ、レーザーによってそのスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、本発明は、蛍光部分の励起波長の光を放射するレーザーによって刺激されると平均で少なくとも約２００の光子を放出することができる蛍光色素部分、例えば、単一の蛍光色素分子または複数の蛍光色素分子を使用し、レーザーは、蛍光色素部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わされ、レーザーによってそのスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、本発明は、蛍光部分の励起波長の光を放射するレーザーによって刺激されると平均で少なくとも約３００の光子を放出することができる蛍光色素部分、例えば、単一の蛍光色素分子または複数の蛍光色素分子を使用し、レーザーは、蛍光色素部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わされ、レーザーによってそのスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、本発明は、蛍光部分の励起波長の光を放射するレーザーによって刺激されると平均で少なくとも約５００の光子を放出することができる蛍光色素部分、例えば、単一の蛍光色素分子または複数の蛍光色素分子を使用し、レーザーは、蛍光色素部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わされ、レーザーによってそのスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。
【０１３５】
本発明の蛍光部分において使用するのに有用な蛍光性要素の包括的でない一覧を下記の表２に示す。いくつかの態様において、蛍光色素は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、フルオレセイン、Ｂ−フィコエリトリン、アロフィコシアニン、ＰＢＸＬ−３およびＱｄｏｔ  ６０５からなる群から選択される。いくつかの態様において、蛍光色素は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、フルオレセイン、Ｂ−フィコエリトリン、アロフィコシアニン、ＰＢＸＬ−３およびＱｄｏｔ  ６０５からなる群から選択される。
【０１３６】
【表２】
2019090817.tif 000005
2019090817.tif 000006
【０１３７】
本発明において使用するのに適した色素には、修飾されたカルボシアニン色素が含まれる。そのような修飾には、３位における反応性基または共役物質を可能にするための、カルボシアニン色素のインドリウム環の修飾が含まれる。インドリウム環の修飾は、１位における窒素原子によって結合される構造的に類似したカルボシアニン色素でラベリングされた共役よりも、タンパク質、核酸および他の生体高分子において、蛍光性が一様かつ実質的に高い色素の共役を提供する。実質的に同一の波長において構造的に類似した色素より強い蛍光放射を有すること、および生体高分子との共役によるそれらの吸収スペクトルにおける影響が減少することに加えて、修飾されたカルボシアニン色素は、ピーク吸光度の波長において、構造的に類似した色素よりも優れた光安定性および高い吸光度（吸光係数）を有する。従って、修飾されたカルボシアニン色素によって、修飾された色素およびその共役を用いる分析におけるより高い感度がもたらされる。好ましい修飾された色素には、少なくとも一つの置換インドリウム環系を有する化合物が含まれ、そのインドリウム環系において、インドリウム環の３位の炭素における置換基は、化学反応性基または共役物質を含む。他の色素化合物には、アザベンズアゾリウム（ａｚａｂｅｎｚａｚｏｌｉｕｍ）環部分および少なくとも一つのスルホネート部分を包含する化合物が含まれる。本発明の種々の態様において個々の分子を検出するのに使用され得る修飾されたカルボシアニン色素は、米国特許第６，９７７，３０５号に記載されており、それは、その全体を引用することにより本明細書に組み込まれる。従って、いくつかの態様において、本発明のラベルには、置換インドリウム環系を含む蛍光色素が使用され、その置換インドリウム環系において、インドリウム環の３位の炭素における置換基は、化学反応性基または共役物質基を含む。
【０１３８】
いくつかの態様において、ラベルは、一つ又はそれより多くのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製、オレゴン州ユージーン）を含む蛍光部分を有する。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素は、米国特許第６，９７７，３０５号、第６，９７４，８７４号、第６，１３０，１０１号および第６，９７４，３０５号に開示されており、これらの特許は、その全体を引用することによって本明細書に組み込まれる。本発明のいくつかの態様は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０からなる群から選択される色素を使用する。本発明のいくつかの態様は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０からなる群から選択される色素を使用する。本発明のいくつかの態様は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０からなる群から選択される色素を使用する。本発明のいくつかの態様は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子を使用し、これは、約６５０〜６６０ｎｍの吸収極大および約６６０〜６７０ｎｍの放射極大を有する。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７色素は、単独で又は他のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素と組み合わせて用いられる。
【０１３９】
現在入手可能な有機蛍光色素（ｏｒｇａｎｉｃ  ｆｌｕｏｒ）は、ポリエチレン等の親水基を加えて有機蛍光色素の疎水性を減少させることによって改良し得る。別法として、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７等の現時点でスルホン酸化されている有機蛍光色素は、それらを両性イオンにすることによって酸性度を低くすることができる。免疫測定において、修飾された蛍光色素でラベリングされている抗体等の粒子は、表面およびタンパク質と非特異的に結合する可能性がより低く、従って、より高い感度およびより小さいバックグラウンドを有する分析が可能となる。単一分子を検出するシステムの感度を高めることを目的として蛍光色素の特性を修飾および改良する方法は、当該技術分野において公知である。好ましくは、修飾によって、高い量子収率を維持しながらストークスシフトが改良される。
【０１４０】
［２．量子ドット］
いくつかの態様において、本発明の分析器システムを用いて試料中の分子を検出するのに用いられる蛍光ラベル部分は量子ドットである。量子ドット（ＱＤ）は、半導体ナノ結晶または人工原子としても知られており、１００〜１，０００の電子および２〜１０ｎｍの範囲を有する半導体結晶である。いくつかのＱＤは直径が１０〜２０ｎｍであり得る。ＱＤは高い量子収率を有し、それにより、ＱＤは光学的用途に対して特に有用である。ＱＤは、励起子を形成することによって蛍光を発するフルオロフォアであり、このフルオロフォアは、従来のフルオロフォアの励起状態と似ているが、２００ナノ秒までのより一層長い寿命を有する。この特徴により、ＱＤに低い光退色性が与えられる。ＱＤのエネルギー準位は、ＱＤの寸法および形状、並びにＱＤのポテンシャルの深さを変化させることによって制御し得る。小さい励起子ＱＤの一の光学的特徴は着色性であり、これはドットの寸法によって決まる。ドットが大きいほど、蛍光は赤くなり、またはスペクトルの赤色端へ更に向かう。ドットが小さいほど、蛍光は青くなり、またはスペクトルの青色端へ更に向かう。発生する蛍光のエネルギー、従って色を決定するバンドギャップエネルギーは、ＱＤ寸法の２乗に反比例する。ＱＤが大きいほど、より間隔の狭いより高いエネルギー準位を有し、従って、ＱＤが、より小さいエネルギーを有する光子、即ち、スペクトルの赤色端により近い光子を吸収することが可能となる。ドットの放射振動数がバンドギャップに依存するので、ドットの出力波長を非常に正確に制御し得る。いくつかの態様において、単一分子分析器システムによって検出されるタンパク質は、ＱＤによってラベリングされる。いくつかの態様において、単一分子分析器は、一つのＱＤによってラベリングされたタンパク質を検出するのに用いられ、フィルターを用いることにより、異なるタンパク質を異なる波長で検出することが可能となる。
【０１４１】
ＱＤは、広範な励起特性および狭い放射特性を有し、カラーフィルタリングと共に用いられる場合、単一試料中の複数のターゲットの多重分析の間に個々の信号を分解するために、単一の電磁波源のみを必要とする。従って、いくつかの態様において、分析器システムは、一つの連続波レーザーおよび各々が一つのＱＤでラベリングされている粒子を有する。コロイド状に調製されたＱＤは、浮遊しており、金属配位官能基を介して種々の分子に結合し得る。これらの基には、チオール、アミン、ニトリル、ホスフィン、ホスフィンオキシド、ホスホン酸、カルボン酸、または他の配位子が含まれるが、これらに限定されない。適切な分子を表面に結合させることによって、量子ドットは、ほとんど全ての溶媒中に分散もしくは溶解し得、または種々の無機もしくは有機フィルム中に組み込まれ得る。量子ドット（ＱＤ）は、マレイミドエステルカップリング反応によってストレプトアビジンと直接結合し得、またはマレイミド−チオールカップリング反応によって抗体と結合し得る。これにより、共有結合によって表面に結合する生体分子を有する材料が得られ、これによって高い特異的活性度を有する共役が形成される。いくつかの態様において、単一分子分析器によって検出されるタンパク質は、一つの量子ドットでラベリングされる。いくつかの態様において、量子ドットは直径が１０〜２０ｎｍである。他の態様において、量子ドットは直径が２〜１０ｎｍである。他の態様において、量子ドットは直径が約２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、１１ｎｍ、１２ｎｍ、１３ｎｍ、１４ｎｍ、１５ｎｍ、１６ｎｍ、１７ｎｍ、１８ｎｍ、１９ｎｍまたは２０ｎｍである。有用な量子ドットとして、ＱＤ６０５、ＱＤ６１０、ＱＤ６５５およびＱＤ７０５が挙げられる。好ましい量子ドットはＱＤ６０５である。
【０１４２】
［Ｃ．結合パートナー−蛍光部分組成物］
本発明のラベルは一般に、本明細書に記載の機器において検出および定量するのに必要とされる蛍光を提供するために、蛍光部分に結合する結合パートナー、例えば抗体を有する。本明細書に記載の単一分子検出器における検出のための結合パートナーと蛍光部分とのいずれの適切な組み合わせもまた、本発明におけるラベルとして使用され得る。いくつかの態様において、本発明は、生物学的状態のマーカーのためのラベルを提供し、ラベルには、マーカーに対する抗体および蛍光部分が含まれる。マーカーは、上述のいずれのマーカーであってもよい。抗体は、上述のいずれの抗体であってもよい。蛍光部分は、その蛍光部分の励起波長の光を放射するレーザーによって刺激されると、ラベルが平均で少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３５０、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００の光子を放出することができるように結合され得、レーザーは、ラベルを含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わされ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、蛍光部分は、その蛍光部分の励起波長の光を放射するレーザーによって刺激されると平均で少なくとも約５０、１００、１５０または２００の光子を放出することができる蛍光部分であり得、レーザーは、その蛍光部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わされ、レーザーによってそのスポットに向けられた全エネルギーは約３マイクロジュール以下である。蛍光部分は、置換インドリウム環系を含む構造を有する一つ又はそれより多くの色素分子を有し得、インドリウム環の３位の炭素における置換基は、化学反応性基または共役物質基を含む。ラベル組成物は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０からなる群から選択される一つ又はそれより多くの色素分子を有する蛍光部分を含み得る。ラベル組成物は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０からなる群から選択される一つ又はそれより多くの色素分子を有する蛍光部分を含み得る。ラベル組成物は、一つ又はそれより多くの色素分子であるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８を有する蛍光部分を含み得る。ラベル組成物は、一つ又はそれより多くの色素分子であるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５を有する蛍光部分を含み得る。ラベル組成物は、一つ又はそれより多くの色素分子であるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０を有する蛍光部分を含み得る。ラベル組成物は、一つ又はそれより多くの色素分子であるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７を有する蛍光部分を含み得る。ラベル組成物は、一つ又はそれより多くの色素分子であるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０を有する蛍光部分を含み得る。ラベル組成物は、一つ又はそれより多くの色素分子であるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００を有する蛍光部分を含み得る。ラベル組成物は、一つ又はそれより多くの色素分子であるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕ���ｒ  ７５０を有する蛍光部分を含み得る。
【０１４３】
いくつかの態様において、本発明は、生物学的状態のマーカーを検出するための組成物を提供し、その組成物には、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ分子、例えば、記載された群から選択されるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ分子（マーカーに対して特異的な抗体に結合されたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子等）が含まれる。いくつかの態様において、組成物には、平均で約１〜１１、または約２〜１０、または約２〜８、または約２〜６、または約２〜５、または約２〜４、または約３〜１０、または約３〜８、または約３〜６、または約３〜５、または約４〜１０、または約４〜８、または約４〜６、または約２、３、４、５、６、または約６より多くの、マーカーを検出し得る抗体に結合されたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子が含まれる。いくつかの態様において、本発明は、生物学的状態のマーカーを検出するための組成物を提供し、その組成物には、平均で約１〜１１、または約２〜１０、または約２〜８、または約２〜６、または約２〜５、または約２〜４、または約３〜１０、または約３〜８、または約３〜６、または約３〜５、または約４〜１０、または約４〜８、または約４〜６、または約２、３、４、５、６、または約６より多くの、マーカーに対して特異的な抗体に結合されたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子が含まれる。いくつかの態様において、本発明は、生物学的状態のマーカーを検出するための組成物を提供し、その組成物には、マーカーに対して特異的な抗体に結合された平均で約２〜１０のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子が含まれる。いくつかの態様において、本発明は、生物学的状態のマーカーを検出するための組成物を提供し、その組成物には、マーカーに対して特異的な抗体に結合された平均で約２〜８のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子が含まれる。いくつかの態様において、本発明は、生物学的状態のマーカーを検出するための組成物を提供し、その組成物には、マーカーに対して特異的な抗体に結合された平均で約２〜６のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子が含まれる。いくつかの態様において、本発明は、生物学的状態のマーカーを検出するための組成物を提供し、その組成物には、マーカーに対して特異的な抗体に結合された平均で約２〜４のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子が含まれる。いくつかの態様において、本発明は、生物学的状態のマーカーを検出するための組成物を提供し、その組成物には、マーカーに対して特異的な抗体に結合された平均で約３〜８のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子が含まれる。いくつかの態様において、本発明は、生物学的状態のマーカーを検出するための組成物を提供し、その組成物には、マーカーに対して特異的な抗体に結合された平均で約３〜６のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子が含まれる。いくつかの態様において、本発明は、生物学的状態のマーカーを検出するための組成物を提供し、その組成物には、マーカーに対して特異的な抗体に結合された平均で約４〜８のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子が含まれる。
【０１４４】
蛍光部分または蛍光部分を構成する蛍光性要素の、結合パートナー（例えば抗体）との結合は、いずれの適切な手段によるものであってもよい；そのような方法は当該技術分野において公知であり、例示的方法は実施例において示される。いくつかの態様において、蛍光部分を結合パートナーに結合して本発明の方法で用いるラベルを形成した後に、かつ件のマーカーをラベリングするためにそのラベルを用いる前に、濾過工程を行うことが有用である。例えば、抗体−色素ラベルは、例えば０．２ミクロンフィルターによって、または凝集物を除去するための任意の適切なフィルターによって使用前に濾過し得る。本発明の分析において用いる他の試薬もまた、例えば、０．２ミクロンフィルターによって、または任意の適切なフィルターによって濾過し得る。理論に縛られることなく、そのような濾過によって、例えば抗体−色素ラベルの凝集物の一部が除去されると考えられる。そのような凝集物は、ユニットとして件のタンパク質と結合し得るが、溶出緩衝液中に放出されると、凝集物は分散すると考えられる。従って、一つの件のタンパク質分子のみと結合した凝集物からいくつかのラベルが検出される場合、偽陽性（または誤検出）が生じ得る。理論にかかわらず、濾過によって、その後の分析における偽陽性が減少し、確度および精度が改良されることがわかった。
【０１４５】
免疫測定において、同じ分子（例えばマーカー）に対する結合パートナーのペア（例えば抗体）が用いられるサンドウィッチ型構成がしばしば採用されることが理解されるだろう。本発明は、結合パートナーのペア、例えば抗体であって、両方の抗体が同じ分子、例えば同じマーカーに対して特異的であり、そのペアの少なくとも一方の構成要素が本明細書に記載のラベルであるペアも包含する。従って、結合パートナーおよび蛍光部分を有するいずれのラベルに関しても、本発明は、結合パートナーのペアであって、第１結合パートナー（例えば抗体）がラベルの一部であり、第２結合パートナー（例えば抗体）が通常ラベリングされておらず、捕捉結合パートナーとして機能するペアも包含する。更に、結合パートナーのペアは、ＦＲＥＴ分析において頻繁に用いられる。本発明において有用なＦＲＥＴ分析は、米国特許出願第１１／０４８，６６０号に開示されており、これは、その全体を引用することにより本明細書に組み込まれる。本発明は、結合パートナーペアであって、その各々がＦＲＥＴラベルを有する結合パートナーペアも包含する。
【０１４６】
［Ｖ．分子の高感度分析］
一の要旨において、本発明は、試料中の単一分子（例えばマーカー分子）の有無を、ｉ）分子が存在する場合に分子をラベルでラベリングすることによって；およびｉｉ）ラベルの有無を検出することによって測定するための方法を提供し、ラベルの存在が検出されることは、試料中にその単一分子が存在することを意味する。いくつかの態様において、この方法は、約１００、８０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０５、０．０１、０．００５または０．００１フェムトモル濃度より小さい検出限界で分子を検出し得る。いくつかの態様において、この方法は、約１００フェムトモル濃度より小さい検出限界で分子を検出し得る。いくつかの態様において、この方法は、約１０フェムトモル濃度より小さい検出限界で分子を検出し得る。いくつかの態様において、この方法は、約１フェムトモル濃度より小さい検出限界で分子を検出し得る。いくつかの態様において、この方法は、約０．１フェムトモル濃度より小さい検出限界で分子を検出し得る。いくつかの態様において、この方法は、約０．０１フェムトモル濃度より小さい検出限界で分子を検出し得る。いくつかの態様において、この方法は、約０．００１フェムトモル濃度より小さい検出限界で分子を検出し得る。検出限界は、適切な標準、例えば、米国標準技術局の参照標準物質を用いることによって規定され得る。
【０１４７】
この方法は、試料中の分子（例えば生物学的状態を示すマーカー）の濃度を、試料中の分子の中の単一分子を検出することによって測定する方法も提供する。単一分子の「検出」には、分子の直接的または間接的検出が含まれる。間接的検出の場合、単一分子に対応するラベル、例えば単一分子に結合されたラベルが検出され得る。
【０１４８】
いくつかの態様において、本発明は、生物学的試料中のタンパク質の単一分子の有無を測定するする方法を提供し、この方法は、分子をラベルでラベリングすること、および単一分子検出器においてラベルの有無を検出することを含み、ラベルは蛍光部分を有し、その蛍光部分は、その蛍光部分の励起波長の光を放射するレーザーによって刺激されると少なくとも約２００の光子を放出することができ、レーザーは、その蛍光部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットにおいて焦点が合わされ、レーザーによってそのスポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、単一分子検出器は、一つ以下の測定領域を有してよい。試料中の単一分子の検出限界は、約１０、１、０．１、０．０１または０．００１フェムトモル濃度より小さくなり得る。いくつかの態様において、検出限界は約１フェムトモル濃度より小さい。検出には、蛍光部分によって放射される電磁放射線の検出が含まれる。本方法は、電磁放射線、例えばレーザー（出力が約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ｍＷのレーザー等）によって供給される電磁放射線に蛍光部分を曝すことを更に含み得る。いくつかの態様において、レーザーの刺激は、測定領域への光を約１０〜１０００マイクロ秒、または約１０００、２５０、１００、５０、２５または１０マイクロ秒の間提供する。いくつかの態様において、ラベルは、分子の結合に対して特異的な結合パートナー（抗体等）を更に有する。いくつかの態様において、蛍光部分は、インドリウム環の３位の炭素における置換基が化学反応性基または共役物質を有する少なくとも一つの置換インドリウム環系を含む色素分子等の蛍光色素分子を有する。いくつかの態様において、色素分子は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００からなる群から選択されるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ分子である。いくつかの態様において、色素分子はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７色素分子である。いくつかの態様において、蛍光部分は複数のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子を有する。いくつかの態様において、複数のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子は約２〜４のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子、または約３〜６のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子を含む。いくつかの態様において、蛍光部分は量子ドットである。本方法は、試料中のタンパク質の濃度測定を更に含み得る。
【０１４９】
いくつかの態様において、ラベルの有無の検出は以下の工程を含む：（ｉ）電子放射線源からの電磁放射線を測定領域に向ける工程；（ｉｉ）測定領域にラベルが存在する場合、ラベル（蛍光部分等）を刺激して光子を放出させるのに十分な電磁放射線を供給する工程；（ｉｉｉ）試料を通って測定領域を移動させ、それにより、測定領域を動かして他の単一分子の有無を検出する工程；および（ｉｖ）工程（ｉｉ）の曝露の間に放出される光子を検出する工程。この方法は、測定領域におけるバックグラウンド光子レベルの決定を更に含み得、バックグラウンドレベルは、工程（ｉｉ）と同じ方法で電磁放射線に曝されているが測定領域にラベルが無い場合における、測定領域の平均光子放出量を表している。この方法は、工程（ｉｖ）において検出される光子の量と、閾値光子レベルとの比較を更に含み得、閾値光子レベルはバックグラウンド光子レベルの関数であり、工程（ｉｖ）において検出される閾値レベルより多い光子量は、ラベルの存在を示し、工程（ｉｖ）において検出される閾値レベルと等しい又はそれより少ない光子量は、ラベルの不在を示す。
【０１５０】
［Ａ．試料］
試料は、任意の適切な試料であり得る。通常、試料は生物学的試料、例えば生物学的流体（または液体）である。そのような流体には以下のものが含まれるが、これらに限定されない。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）、血液、血清、血漿、尿、鼻腔スワブ、脳脊髄液、胸水、滑液、腹水、羊水、胃液、リンパ液、間質液、組織ホモジネート、細胞抽出物、唾液、痰、便、生理学的分泌物、涙液、粘液、汗、母乳、精液、精漿、膣分泌物、潰瘍ならびに他の表面皮疹、水疱および膿瘍からの体液、ならびに件のターゲット粒子を含有し得る正常組織、悪性組織および疑わしい組織または身体の他の構成物質の生検を含む組織抽出物。細胞または組織培養または培養ブロス等の他の同様の検体も対象としている。
【０１５１】
いくつかの態様において、試料は血液試料である。いくつかの態様において、試料は血漿試料である。いくつかの態様において、試料は血清試料である。いくつかの態様において、試料は尿試料である。いくつかの態様において、試料は鼻腔スワブである。
【０１５２】
［Ｂ．試料の調製］
一般に、件の分子、例えば測定すべき生物学的状態のマーカーに対応するラベルを作製するいずれの試料調製方法も用いることが可能であり、ラベルは、本明細書に記載の機器において検出可能である。当該技術分野において公知のように、一つ又はそれより多くの分子にラベルを加える試料調製は、均一形式または不均一形式で行われ得る。いくつかの態様において、試料調製は均一形式で形成される。均一形式を採用する分析器システムにおいて、結合しないラベルは試料から除去されない。例えば米国特許出願第１１／０４８，６６０号を参照のこと。いくつかの態様において、件の１粒子または複数の粒子は、ラベリングされた一つの抗体または複数の抗体を加えて、それを件の１粒子または複数の粒子と結合させることによってラベリングされる。
【０１５３】
いくつかの態様において、不均一分析形式が用いられ、非結合ラベルを取り除くための工程が通常採用される。そのような分析形式は、当該技術分野においてよく知られている。一の特に有用な分析形式は、サンドウィッチ分析、例えばサンドウィッチ免疫測定である。この形式において、件の分子、例えば生物学的状態のマーカーは、捕捉結合パートナーを用いて、例えば固体支持物において捕捉される。望ましくない分子および他の物質は、その後、場合により洗い流され、次いで検出結合パートナーおよび検出可能ラベル、例えば蛍光部分を含むラベルと結合する。更に洗浄して非結合ラベルを除去し、その後、検出可能なラベルが放出されるが、通常は検出結合パートナーと未だ結合しているとは限らない。別の態様において、試料およびラベルは、間に洗浄されることなく、例えば同時に捕捉結合パートナーに加えられる。他の変形は当業者に明らかであるだろう。
【０１５４】
いくつかの態様において、件の分子、例えば生物学的状態のマーカーを検出する方法は、捕捉結合パートナーとして抗体（例えばモノクローナル抗体）を用いるサンドウィッチ分析を使用する。この方法は、試料中の分子を結合表面上に固定化された捕捉抗体に結合させること、および検出抗体を有するラベルを分子と結合させて「サンドウィッチ」錯体を形成することを含む。ラベルは、本明細書に記載されているように検出抗体および蛍光部分を含み、そのラベルは、例えば本発明の単一分子分析器を用いて検出される。捕捉抗体および検出抗体は両方とも、分子と特異的に結合する。サンドウィッチ免疫測定法の多数の例が知られており、いくつかは米国特許第４，１６８，１４６号（Ｇｒｕｂｂら）および米国特許第４，３６６，２４１号（Ｔｏｍら）に記載されており、その両方は、引用することにより本明細書に組み込まれる。特異的マーカーに特有の更なる例を実施例において説明する。
【０１５５】
捕捉結合パートナーは、固体支持物、例えばマイクロタイタープレートまたは常磁性ビーズに結合され得る。いくつかの態様において、本発明は、常磁性ビーズに結合された、件の分子（例えば生物学的状態のマーカー）に対する結合パートナーを提供する。捕捉することが望まれる分子に対して特異的ないずれの適切な結合パートナーも用いることができる。結合パートナーは、抗体、例えばモノクローナル抗体であり得る。抗体の製造および製造元は、本明細書の他の場所に記載されている。捕捉抗体と同じくらい有用であると本明細書において認められる抗体は、検出抗体としても有用であり得、逆もまた同様であることが理解されるだろう。
【０１５６】
結合パートナー、例えば抗体の、固体支持物との結合は、共有的または非共有的であり得る。いくつかの態様において、結合は非共有結合である。当該技術分野においてよく知られている非共有結合の例は、ビオチン−アビジンとストレプトアビジンとの間の結合である。従って、いくつかの態様において、固体支持物（例えばマイクロタイタープレートまたは常磁性ビーズ）は、非共有結合（例えばビオチン−アビジン／ストレプトアビジン相互作用）によって捕捉結合パートナー（例えば抗体）と結合する。いくつかの態様において、結合は共有結合である。従って、いくつかの態様において、固体支持物（例えばマイクロタイタープレートまたは常磁性ビーズ）は、共有結合によって捕捉結合パートナー（例えば抗体）と結合する。
【０１５７】
捕捉抗体は、件の分子の捕捉を最適化する方向で共有結合され得る。例えば、いくつかの態様において、結合パートナー、例えば抗体は、配向するようにして固体支持物（例えばマイクロタイタープレートまたは常磁性微小粒子）と結合する。
【０１５８】
固体支持物に対する抗体の配向性結合に関する例示的プロトコルは以下の通りである。ＩｇＧを０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に、最終濃度が１ｍｇ／ｍｌになるまで溶解させる。等体積の氷冷した０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中の２０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムを加える。ＩｇＧを１／２時間氷上で酸化させる。過剰なヨウ素酸化物試薬を、体積０．１５の１Ｍグリセロールを加えることによって急冷する。酸化反応の低分子量の副生成物を限外ろ過によって取り除く。酸化されたＩｇＧフラクションを適切な濃度（通常は０．５ｍｇ／ｍｌ  ＩｇＧ）に希釈し、ヒドラジドで活性化されたマルチウェルプレートと室温で少なくとも２時間反応させる。マルチウェルプレートをホウ酸緩衝生理食塩水または他の適切な緩衝液で洗浄することによって、非結合ＩｇＧを取り除く。プレートは、所望であれば保管のために乾燥させ得る。マイクロビーズの材料がそのような結合に適している場合、抗体をマイクロビーズに結合させるために同様のプロトコルに従い得る。
【０１５９】
いくつかの態様において、固体支持物はマイクロタイタープレートである。いくつかの態様において、固体支持物は常磁性ビーズである。例示的な常磁性ビーズはストレプトアビジンＣ１（Ｄｙｎａｌ社製、６５０．０１−０３）である。他の適切なビーズは当業者に明らかであるだろう。抗体を常磁性ビーズと結合させる方法は当該技術分野においてよく知られている。一例を実施例２に示す。
【０１６０】
件の分子を、捕捉結合パートナー、例えば固体支持物上に固定化された捕捉抗体と接触させる。いくつかの試料調製、例えば血液試料からの血清の調製、または試料を捕捉抗体と接触させる前の濃縮手順を使用し得る。免疫測定におけるタンパク質の結合に関するプロトコルは当該技術分野においてよく知られており、実施例に含まれる。
【０１６１】
結合が許容される時間は条件に応じて変化するだろう；いくつかの状況、特に臨床状況においては、より短い結合時間が望ましいことが明らかであるだろう。例えば常磁性粒子を使用すると、結合に必要とされる時間を短縮し得る。いくつかの態様において、件の分子を捕捉結合パートナー、例えば抗体と結合させ得る時間は、約１２、１０、８、６、４、３、２もしくは１時間より短く、または約６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０もしくは５分より短い。いくつかの態様において、件の分子を捕捉結合パートナー、例えば抗体と結合させ得る時間は約６０分より短い。いくつかの態様において、件の分子を捕捉結合パートナー、例えば抗体と結合させ得る時間は約４０分より短い。いくつかの態様において、件の分子を捕捉結合パートナー、例えば抗体と結合させ得る時間は約３０分より短い。いくつかの態様において、件の分子を捕捉結合パートナー、例えば抗体と結合させ得る時間は約２０分より短い。いくつかの態様において、件の分子を捕捉結合パートナー、例えば抗体と結合させ得る時間は約１５分より短い。いくつかの態様において、件の分子を捕捉結合パートナー、例えば抗体と結合させ得る時間は約１０分より短い。いくつかの態様において、件の分子を捕捉結合パートナー、例えば抗体と結合させ得る時間は約５分より短い。
【０１６２】
いくつかの態様において、件の分子の粒子を捕捉結合パートナー、例えば捕捉抗体と結合させた後に、非特異的に結合した粒子は、試料中の他の望ましくない物質と共に、特異的に結合された件の分子の粒子のみを実質的に残して洗い流される。他の態様において、試料を加えることとラベルを加えることとの間に洗浄は用いられず、試料の調製時間を短くし得る。従って、いくつかの態様において、件の分子を捕捉結合パートナー、例えば抗体と結合させること、およびラベルを件の分子と結合させることの両方が可能である時間は、約１２、１０、８、６、４、３、２もしくは１時間より短く、または約６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０もしくは５分より短い。いくつかの態様において、件の分子を捕捉結合パートナー、例えば抗体と結合させること、およびラベルを件の分子と結合させることの両方が可能である時間は約６０分より短い。いくつかの態様において、件の分子を捕捉結合パートナー、例えば抗体と結合させること、およびラベルを件の分子と結合させることの両方が可能である時間は約４０分より短い。いくつかの態様において、件の分子を捕捉結合パートナー、例えば抗体と結合させること、およびラベルを件の分子と結合させることの両方が可能である時間は約３０分より短い。いくつかの態様において、件の分子を捕捉結合パートナー、例えば抗体と結合させること、およびラベルを件の分子と結合させることの両方が可能である時間は約２０分より短い。いくつかの態様において、件の分子を捕捉結合パートナー、例えば抗体と結合させること、およびラベルを件の分子と結合させることの両方が可能である時間は約１５分より短い。いくつかの態様において、件の分子を捕捉結合パートナー、例えば抗体と結合させること、およびラベルを件の分子と結合させることの両方が可能である時間は約１０分より短い。いくつかの態様において、件の分子を捕捉結合パートナー、例えば抗体と結合させること、およびラベルを件の分子と結合させることの両方が可能である時間は約５分より短い。
【０１６３】
件の分子を測定するのに用いられる捕捉および信号抗体を含む、いくつかの免疫測定の診断試薬は、動物の血清から得ることができる（または動物の血清に由来し得る）。他の種の免疫グロブリンと結合する能力を有する内因性ヒト異好性抗体またはヒト抗動物抗体は、１０％より多くの患者の血清または血漿中に存在する。これらの循環する異好性抗体は、免疫測定の計測を妨げ得る。サンドウィッチ免疫測定において、これらの異好性抗体は（診断用）捕捉および検出抗体を架橋し得、それによって偽陽性信号が発生し、あるいはこれらの異好性抗体は診断用抗体の結合を妨げ得、それによって偽陰性信号が発生する。競合的免疫測定において、異好性抗体は分析に関わる抗体と結合し得、その抗体の件の分子との結合を妨げ得る。特に抗種（ａｎｔｉｓｐｅｃｉｅｓ）抗体が分離システムにおいて用いられる場合、これらは、遊離している件の分子からの抗体−件の分子錯体の分離も阻害または増加し得る。従って、これらの異好性抗体の妨害の影響力は予測困難であり、異好性抗体の結合を阻害することが好都合であり得る。本発明のいくつかの態様において、免疫測定は、一つ又はそれより多くの異好性抗体ブロッカーを用いて試料中の異好性抗体を激減させる工程を含む。免疫測定において試験すべき試料から異好性抗体を取り除く方法は公知であり、以下のものを含む：酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中の試料を９０℃で１５分間加熱し、１２００ｇで１０分間遠心分離すること；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて異好性免疫グロブリンを沈殿させること；タンパク質Ａもしくはタンパク質Ｇを用いて試料から妨害異好性免疫グロブリンを免疫抽出（ｉｍｍｕｎｏｅｘｔｒａｃｔ）すること；または非免疫マウスＩｇＧを加えること。本発明の方法の態様は、単一分子検出器で分析する前に試料を調製することを意図している。前処理の方法の妥当性が決定され得る。異好性抗体によって引き起こされる免疫測定の妨害を最小にするための生化学物質が市販されている。例えば、ＭＡＫ３３と呼ばれる製品（これはｈ−ＣＫ−ＭＭに対するＩｇＧ１モノクローナル抗体である）は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手できる。ＭＡＫ３３プラス製品は、ＩｇＧ１とＩｇＧ１−Ｆａｂとの組み合わせを含有する。ｐｏｌｙＭＡＫ３３はＩｇＧ１と共に重合されたＩｇＧ１−Ｆａｂを含有し、ｐｏｌｙＭＡＣ  ２ｂ／２ａはＩｇＧ２ｂと共に重合されたＩｇＧ２ａ−Ｆａｂを含有する。Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．（ニューヨーク州イーストメドウ）は、免疫グロブリン抑制試薬として知られている異好性抗体を無効にするための生化学物質の二次的な商業的供給源を市販している。この製品は、複数の種（主にＢａｌｂ／ｃマウスからのマウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３）の免疫グロブリン（ＩｇＧおよびＩｇＭ）の調製品である。いくつかの態様において、異好性抗体は、当該技術分野において公知の方法（例えば、妨害する抗体をタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇと結合させることによって試料中の異好性抗体を激減させる方法）を用いて試料から免疫抽出され得る。いくつかの態様において、異好性抗体は、一つ又はそれより多くの異好性抗体ブロッカーを用いて無効化され得る。異好性ブロッカーは、抗アイソタイプ異好性抗体ブロッカー、抗イディオタイプ異好性抗体ブロッカー、および抗抗イディオタイプ異好性抗体ブロッカーからなる群から選択され得る。いくつかの態様において、異好性抗体ブロッカーの組み合わせが使用され得る。
【０１６４】
ラベルは、試料の添加および洗浄と共に、またはその後に加えられる。抗体および他の免疫ラベルをタンパク質および他の分子と結合させるためのプロトコルは、当該技術分野においてよく知られている。ラベル結合工程が捕捉結合工程から分けられる場合、ラベル結合が可能である時間は、例えば臨床的応用または他の時間に敏感な状況において重要である。いくつかの態様において、件の分子をラベル、例えば抗体−色素と結合させ得る時間は約１２、１０、８、６、４、３、２もしくは１時間より短く、または約６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０もしくは５分より短い。いくつかの態様において、件の分子をラベル、例えば抗体−色素と結合させ得る時間は約６０分より短い。いくつかの態様において、件の分子をラベル、例えば抗体−色素と結合させ得る時間は約５０分より短い。いくつかの態様において、件の分子をラベル、例えば抗体−色素と結合させ得る時間は約４０分より短い。いくつかの態様において、件の分子をラベル、例えば抗体−色素と結合させ得る時間は約３０分より短い。いくつかの態様において、件の分子をラベル、例えば抗体−色素と結合させ得る時間は約２０分より短い。いくつかの態様において、件の分子をラベル、例えば抗体−色素と結合させ得る時間は約１５分より短い。いくつかの態様において、件の分子をラベル、例えば抗体−色素と結合させ得る時間は約１０分より短い。いくつかの態様において、件の分子をラベル、例えば抗体−色素と結合させ得る時間は約５分より短い。過剰なラベルは洗浄によって除去される。
【０１６５】
いくつかの態様において、ラベルは件のタンパク質から溶出されない。他の態様において、ラベルは件のタンパク質から溶出される。好ましい溶出緩衝液は、著しいバックグラウンドを発生させることなくラベルを放出させるのに有効である。これは、溶出緩衝液が静菌性である場合に有用である。本発明において用いられる溶出緩衝液は、カオトロープ、緩衝液、マイクロタイタープレート表面を被覆するためのアルブミン、および比較的小さいバックグラウンドが生じるように選択される界面活性剤を含有し得る。カオトロープは、尿素、グアニジン化合物、または他の有用なカオトロープを含み得る。緩衝液は、ホウ酸塩緩衝食塩水または他の有用な緩衝液を含み得る。タンパク質担体は、例えばヒトアルブミン、ウシアルブミンもしくは魚アルブミン等のアルブミン、ＩｇＧまたは他の有用な担体を含み得る。界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等を含むイオン性または非イオン性洗剤を含み得る。
【０１６６】
もう一つの態様において、固相結合分析は、競合的結合分析であり得る。一のそのような方法は以下の通りである。まず、結合表面上に固定化された捕捉抗体を、ｉ）試料中の件の分子、例えば生物学的状態のマーカー、およびｉｉ）検出可能なラベルを有する分子のラベリングされた類似物（検出試薬）によって競合的に結合させる。次に、単一分子分析器を用いてラベルの量を測定する。もう一つのそのような方法は以下の通りである。まず、検出可能なラベルを有する抗体（検出試薬）を、ｉ）試料中の件の分子、例えば生物学的状態のマーカー、およびｉｉ）結合表面上で固定化された分子の類似物（捕捉試薬）と競合的に結合させる。次に、単一分子分析器において用いられるラベルの量を測定する。本明細書において、「分子の類似物」は、捕捉抗体と結合する分子と競合する種を指す。競合的免疫測定の例は、米国特許第４，２３５，６０１号（Ｄｅｕｔｓｃｈら）、米国特許第４，４４２，２０４号（Ｌｉｏｔｔａ）、および米国特許第５，２０８，５３５号（Ｂｕｅｃｈｌｅｒら）に開示されており、それらの全ては、引用することによって本明細書に組み込まれる。
【０１６７】
［Ｃ．件の分子の検出および濃度の決定］
溶出の後に、試料中のラベルの有無が、単一分子検出器を用いて検出される。試料は、ラベルを含有しないことがあり、単一のラベルを含有することがあり、または複数のラベルを含有することがある。ラベルの数は、捕捉工程の間に捕捉された件の分子、例えば生物学的状態のマーカーの分子数に一致し、または比例する（試料の希釈物またはフラクションが用いられる場合）。
【０１６８】
件の分子と共に用いられるラベルを検出し得る任意の適切な単一分子検出器が使用され得る。適切な単一分子検出器は本明細書に記載されている。通常、検出器は、調製された試料をサンプリングするための自動サンプラー、および場合により試料を回収する回収システムを有するシステムの一部である。
【０１６９】
いくつかの態様において、試料は、試料を含む測定領域を照射するためにレーザーが使用され、測定領域から放射される放射線を検出するために検出器が使用され、試料を通って測定領域を移動させるために走査モーターおよびモーターに取り付けられた鏡が使用される単一分子分析器において分析される。いくつかの態様において、単一分子分析器は、測定領域が試料を通って移動するときに試料から放射される光を集光する顕微鏡対物レンズ、例えば高開口数の顕微鏡対物レンズを更に有する。いくつかの態様において、レーザーおよび検出器は、共焦点配置に構成される。いくつかの態様において、レーザーは連続波レーザーである。いくつかの態様において、検出器はアヴァランシェ・フォトダイオード検出器である。いくつかの態様において、測定領域は、走査モーターに取り付けられた鏡を用いて試料を通って移動させられる。いくつかの態様において、測定領域は、走査モーターに取り付けられた複数の鏡またはプリズムを用いて試料を通って移動させられる。いくつかの態様において、本発明は、複数の試料を自動的にサンプリングすることができ、かつ後で測定する試料との間のキャリーオーバーがゼロであるサンプリングシステムを有する分析器システムを提供する。いくつかの態様において、測定領域は、約１μｍ３より大きい、約２μｍ３より大きい、約３μｍ３より大きい、約４μｍ３より大きい、約５μｍ３より大きい、約１０μｍ３より大きい、約１５μｍ３より大きい、約３０μｍ３より大きい、約５０μｍ３より大きい、約７５μｍ３より大きい、約１００μｍ３より大きい、約１５０μｍ３より大きい、約２００μｍ３より大きい、約２５０μｍ３より大きい、約３００μｍ３より大きい、約４００μｍ３より大きい、約５００μｍ３より大きい、約５５０μｍ３より大きい、約６００μｍ３より大きい、約７５０μｍ３より大きい、約１０００μｍ３より大きい、約２０００μｍ３より大きい、約４０００μｍ３より大きい、約６０００μｍ３より大きい、約８０００μｍ３より大きい、約１００００μｍ３より大きい、約１２０００μｍ３より大きい、約１３０００μｍ３より大きい、約１４０００μｍ３より大きい、約１５０００μｍ３より大きい、約２００００μｍ３より大きい、約３００００μｍ３より大きい、約４００００μｍ３より大きい、または約５００００μｍ３より大きい体積を有する。いくつかの態様において、測定領域の体積は約５００００μｍ３より小さく、約４００００μｍ３より小さく、約３００００μｍ３より小さく、約２００００μｍ３より小さく、約１５０００μｍ３より小さく、約１４０００μｍ３より小さく、約１３０００μｍ３より小さく、約１２０００μｍ３より小さく、約１１０００μｍ３より小さく、約９５００μｍ３より小さく、約８０００μｍ３より小さく、約６５００μｍ３より小さく、約６０００μｍ３より小さく、約５０００μｍ３より小さく、約４０００μｍ３より小さく、約３０００μｍ３より小さく、約２５００μｍ３より小さく、約２０００μｍ３より小さく、約１５００μｍ３より小さく、約１０００μｍ３より小さく、約８００μｍ３より小さく、約６００μｍ３より小さく、約４００μｍ３より小さく、約２００μｍ３より小さく、約１００μｍ３より小さ��、約７５μｍ３より小さく、約５０μｍ３より小さく、約２５μｍ３より小さく、約２０μｍ３より小さく、約１５μｍ３より小さく、約１４μｍ３より小さく、約１３μｍ３より小さく、約１２μｍ３より小さく、約１１μｍ３より小さく、約１０μｍ３より小さく、約５μｍ３より小さく、約４μｍ３より小さく、約３μｍ３より小さく、約２μｍ３より小さく、または約１μｍ３より小さい。いくつかの態様において、測定領域の体積は約１μｍ３〜約１００００μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約１μｍ３〜約１０００μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約１μｍ３〜約１００μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約１μｍ３〜約５０μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約１μｍ３〜約１０μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約２μｍ３〜約１０μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約３μｍ３〜約７μｍ３である。
【０１７０】
いくつかの態様において、本発明の方法で用いられる単一分子検出器において、試料プレート、試料が入っている試料プレートに向けられる連続波レーザー、測定領域が試料を通って移動させられる際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ（レンズは少なくとも約０．８の開口数を有する）、測定領域から放射される放射線を検出するためのアヴァランシェ・フォトダイオード検出器、および試料を通って測定領域を移動させるための可動鏡を備えた走査モーターが使用され、測定領域は約１μｍ３〜約１００００μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法で用いられる単一分子検出器において、試料プレート、試料中に設けられる測定領域に向けられる連続波レーザー、測定領域が試料を通って移動させられる際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ（レンズは少なくとも約０．８の開口数を有する）、測定領域から放射される放射線を検出するためのアヴァランシェ・フォトダイオード検出器、および試料を通って測定領域を移動させるための走査モーターが使用され、測定領域は約１μｍ３〜約１０００μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法で用いられる単一分子検出器において、試料プレート、試料中に設けられる測定領域に向けられる連続波レーザー、測定領域が試料を通って移動させられる際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ（レンズは少なくとも約０．８の開口数を有する）、測定領域から放射される放射線を検出するためのアヴァランシェ・フォトダイオード検出器、および試料を通って測定領域を移動させるための走査モーターが使用され、測定領域は約１μｍ３〜約１００μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法で用いられる単一分子検出器において、試料プレート、試料中に設けられる測定領域に向けられる連続波レーザー、測定領域が試料を通って移動させられる際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ（レンズは少なくとも約０．８の開口数を有する）、測定領域から放射される放射線を検出するためのアヴァランシェ・フォトダイオード検出器、および試料を通って測定領域を移動させるための走査モーターが使用され、測定領域は約１μｍ３〜約１０μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法で用いられる単一分子検出器において、試料プレート、試料中に設けられる測定領域に向けられる連続波レーザー、測定領域が試料を通って移動させられる際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ（レンズは少なくとも約０．８の開口数を有する）、測定領域から放射される放射線を検出するためのアヴァランシェ・フォトダイオード検出器、および試料を通って測定領域を移動させるための走査モーターが使用され、測定領域は約２μｍ３〜約１０μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法で用いられる単一分子検出器において、試料プレート、試料中に設けられる測定領域に向けられる連続波レーザー、測定領域が試料を通って移動させられる際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ（レンズは少なくとも約０．８の開口数を有する）、測定領域から放射される放射線を検出���るためのアヴァランシェ・フォトダイオード検出器、および試料を通って測定領域を移動させるための走査モーターが使用され、測定領域は約２μｍ３〜約８μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法で用いられる単一分子検出器において、試料プレート、試料中に設けられる測定領域に向けられる連続波レーザー、測定領域が試料を通って移動させられる際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ（レンズは少なくとも約０．８の開口数を有する）、測定領域から放射される放射線を検出するためのアヴァランシェ・フォトダイオード検出器、および試料を通って測定領域を移動させるための走査モーターが使用され、測定領域は約３μｍ３〜約７μｍ３である。これらのいずれの態様においても、分析器はたった一つの測定領域を含み得る。
【０１７１】
他の態様において、本発明の方法で用いられる単一分子検出器において、試料プレート、試料が入っている試料プレートに向けられる連続波レーザー、測定領域が試料を通って移動させられる際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ、測定領域から放射される放射線を検出するためのアヴァランシェ・フォトダイオード検出器、および試料を通って測定領域を移動させるための可動鏡を備えた走査モーターが使用され、測定領域は約１μｍ３〜約１００００μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法で用いられる単一分子検出器において、試料プレート、試料中に設けられる測定領域に向けられる連続波レーザー、測定領域が試料を通って移動させられる際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ、測定領域から放射される放射線を検出するためのアヴァランシェ・フォトダイオード検出器、および試料を通って測定領域を移動させるための走査モーターが使用され、測定領域は約１μｍ３〜約１０００μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法で用いられる単一分子検出器において、試料プレート、試料中に設けられる測定領域に向けられる連続波レーザー、測定領域が試料を通って移動させられる際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ、測定領域から放射される放射線を検出するためのアヴァランシェ・フォトダイオード検出器、および試料を通って測定領域を移動させるための走査モーターが使用され、測定領域は約１μｍ３〜約１００μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法で用いられる単一分子検出器において、試料プレート、試料中に設けられる測定領域に向けられる連続波レーザー、測定領域が試料を通って移動させられる際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ、測定領域から放射される放射線を検出するためのアヴァランシェ・フォトダイオード検出器、および試料を通って測定領域を移動させるための走査モーターが使用され、測定領域は約１μｍ３〜約１０μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法で用いられる単一分子検出器において、試料プレート、試料中に設けられる測定領域に向けられる連続波レーザー、測定領域が試料を通って移動させられる際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ、測定領域から放射される放射線を検出するためのアヴァランシェ・フォトダイオード検出器、および試料を通って測定領域を移動させるための走査モーターが使用され、測定領域は約２μｍ３〜約１０μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法で用いられる単一分子検出器において、試料プレート、試料中に設けられる測定領域に向けられる連続波レーザー、測定領域が試料を通って移動させられる際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ、測定領域から放射される放射線を検出するためのアヴァランシェ・フォトダイオード検出器、および試料を通って測定領域を移動させるための走査モーターが使用され、測定領域は約２μｍ３〜約８μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法で用いられる単一分子検出器において、試料プレート、試料中に設けられる測定領域に向けられる連続波レーザー、測定領域が試料を通って移動させられる際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ、測定領域から放射される放射線を検出するためのアヴァランシェ・フォトダイオード検出器、および試料を通って測定領域を移動させるための走査モーターが使用され、測定領域は約３μｍ３〜約７μｍ３である。これらのいずれの態様においても、分析器はたった一つの測定領域を含み得る。
【０１７２】
いくつかの態様において、単一分子検出器は、試料中の件の分子に関する濃度を測定することができ、試料は、少なくとも約１００倍、１０００倍、１０，０００倍、１００，０００倍、３００，０００倍、１，０００，０００倍、１０，０００，０００倍または３０，０００，０００倍の範囲にわたる濃度に及び得る。
【０１７３】
いくつかの態様において、本発明の方法において、試料プレートに入っている第１試料と第２試料との間で、被分析物の約５０％、４０％、３０％、２０％、１５％または１０％より小さい濃度差を検出し得る単一分子検出器が使用され、分析器に導入される第１試料および第２試料の体積は約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、５、４、３、２または１μｌより小さく、被分析物は、約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、５、４、３、２または１フェムトモル濃度より小さい濃度で存在する。いくつかの態様において、本発明の方法において、検出器に導入される第１試料と第２試料との間で、被分析物の約５０％より小さい濃度差を検出し得る単一分子検出器が使用され、分析器に導入される第１試料および第２試料の体積は約１００μｌより小さく、被分析物は約１００フェムトモル濃度より低濃度で存在する。いくつかの態様において、本発明の方法において、検出器に導入される第１試料と第２試料との間で、被分析物の約４０％より小さい濃度差を検出し得る単一分子検出器が使用され、分析器に導入される第１試料および第２試料の体積は約５０μｌより小さく、被分析物は約５０フェムトモル濃度より低濃度で存在する。いくつかの態様において、本発明の方法において、検出器に導入される第１試料と第２試料との間で、被分析物の約２０％より小さい濃度差を検出し得る単一分子検出器が使用され、分析器に導入される第１試料および第２試料の体積は約２０μｌより小さく、被分析物は約２０フェムトモル濃度より小さい濃度で存在する。いくつかの態様において、本発明の方法において、検出器に導入される第１試料と第２試料との間で、被分析物の約２０％より小さい濃度差を検出し得る単一分子検出器が使用され、分析器に導入される第１試料および第２試料の体積は約１０μｌより小さく、被分析物は約１０フェムトモル濃度より低濃度で存在する。いくつかの態様において、本発明の方法において、検出器に導入される第１試料と第２試料との間で、被分析物の約２０％より小さい濃度差を検出し得る単一分子検出器が使用され、分析器に導入される第１試料および第２試料の体積は約５μｌより小さく、被分析物は約５フェムトモル濃度より低濃度で存在する。
【０１７４】
本発明の機器および方法の極めて高い感度に寄与する特徴は、ラベルを検出および計数する方法であり、これらのラベルは、いくつかの態様において、検出すべき単一分子と結合され、または、より一般的には、検出すべき単一分子に一致する。簡潔に言うと、試料プレートに入っている試料は、試料プレートを通って測定領域を移動させることによって一連の検出イベントへと有効に分割され、ラベルにおいて用いられる蛍光部分に適した励起波長のレーザーからのＥＭ放射が所定の時間、当該波長に向けられ（または合わせられ）、その間に放出される光子が検出される。各々の所定の期間は「ビン（ｂｉｎ）」である。特定のビンにおいて検出される光子の総数が所定の閾値レベルを上回る場合、検出イベントはそのビンに対して記録される（即ち、ラベルは検出された）。光子の総数が所定の閾値レベルにない場合、検出イベントは記録されない。いくつかの態様において、処理試料の濃度は十分薄く、その結果、大部分の検出イベントに関して、検出イベントは、一つのラベルのみが窓を通過することを表し、これは原試料中の件の単一分子に対応する。従って、一つのビンにおいて一つより多くのラベルを表す検出イベントは僅かである。いくつかの態様において、処理試料中のより高濃度（即ち、２またはそれより多くのラベルが単一の検出イベントとして検出される可能性がもはや僅かでない濃度）のラベルの精確な検出を可能にするために、更なる改良が適用される。
【０１７５】
本発明の範囲から逸脱することなく他のビン時間を用いることができるが、いくつかの態様において、ビン時間は、約１マイクロ秒〜約５ｍｓの範囲で選択される。いくつかの態様において、ビン時間は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、７５０、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００または５０００マイクロ秒より長い。いくつかの態様において、ビン時間は約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、７５０、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００または５０００マイクロ秒より短い。いくつかの態様において、ビン時間は約１〜１０００マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１〜７５０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１〜５００マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１〜２５０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１〜１００マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１〜５０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１〜４０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１〜３０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１〜２５マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１〜２０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１〜１０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１〜７．５マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１〜５マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約５〜５００マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約５〜２５０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約５〜１００マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約５〜５０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約５〜２０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約５〜１０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１０〜５００マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１０〜２５０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１０〜１００マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１０〜５０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１０〜３０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１０〜２０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約２マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約３マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約４マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約５マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約６マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約７マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約８マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約９マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１１マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１２マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１３マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１４マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約５マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１５マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１６マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１７マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１８マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１９マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約２０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約２５マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約３０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約４０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約５０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１００マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約２５０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約５００マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約７５０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１０００マイクロ秒である。
【０１７６】
いくつかの態様において、試料中の粒子−ラベル錯体の濃度の決定には、バックグラウンドノイズレベルの決定が含まれる。いくつかの態様において、バックグラウンドノイズレベルは平均ノイズレベルまたは二乗平均平方根ノイズから決定される。他の態様において、通常のノイズ値または統計値が選択される。多くの場合、ノイズはポワソン分布に従うことが予想される。
【０１７７】
試料を通って測定領域を移動させる際に、測定領域に向けられているレーザービームは、ラベルに直面すると光子爆発（ｂｕｒｓｔ  ｏｆ  ｐｈｏｔｏｎ）を発生させる。ラベルによって放出される光子は、所定の閾値エネルギーレベルより大きいエネルギーを有する光子爆発のみを考慮することによって、バックグラウンド光またはバックグラウンドノイズ放射から識別され、それによって、試料中に存在するバックグラウンドノイズの量が明らかとなる。バックグラウンドノイズは通常、例えば、試料、分析のための試料調製に用いられる緩衝液または希釈剤中に存在するラベリングされていない粒子の固有の蛍光によって発生する低周波数放射線、ラマン散乱、および電子ノイズを含む。いくつかの態様において、バックグラウンドノイズに割り当てられる値は、複数のビンにおいて検出される平均バックグラウンド信号ノイズとして計算され、これらのビンは、所定の長さの時間に測定領域において検出される光子信号の測定である。いくつかの態様において、バックグラウンドノイズは、各試料に対して、その試料に固有の数として計算される。
【０１７８】
バックグラウンドノイズに関する値を仮定すると、閾値エネルギーレベルを割り当てることができる。上で論じたように、閾値は、ラベルの蛍光に由来する真の信号をバックグラウンドノイズから識別するために決定される。閾値は、ランダムなノイズからの偽陽性信号の数が最小となり、その一方で拒絶される真の信号の数も最小となるように選択され得る。閾値を選択する方法には、ノイズレベルより大きい固定値の決定、およびノイズ信号の分布に基づく閾値の計算を含む。一の態様において、閾値は、バックグラウンドレベルより大きい標準偏差の固定された数に設定される。ノイズのポアソン分布を仮定すると、この方法を用いて実験の時間経過にわたる偽陽性信号の数を推定し得る。いくつかの態様において、閾値レベルは、バックグラウンドノイズより大きい４標準偏差（σ）（または４σ）の値として計算される。例えば、２００の光子の平均バックグラウンドノイズレベルを仮定すると、分析器システムは、２００の光子の平均バックグラウンド／ノイズレベルより４√２００大きい、２５６の光子の閾値レベルを確定する。従って、いくつかの態様において、試料中のラベル濃度の決定には閾値レベルの規定が含まれ、そのレベルを超える光子信号が、ラベルの存在を示す。反対に、閾値レベルより大きいエネルギーレベルを有する光子信号が存在しないことは、ラベルが存在しないことを示す。
【０１７９】
試料の濃度を測定するために多数のビン測定が行われ、各ビン測定に対してラベルの不在または存在が確認される。通常、１分間に６０，０００回またはそれより多くの測定が行われ得る。ビンサイズが１ｍｓである場合、１分間に６０，０００回の測定が行われる。ビンサイズが小さくなるに従って、測定数はそれに対応して大きくなり、例えば、１分当たり６，０００，０００回の測定は１０マイクロ秒のビンサイズに等しい。非常に多くの測定が行われるので、１回の測定は重要でなく、従って、高マージンのエラーをもたらさない。ラベルを含有しないと測定されたビン（「ノー」ビン）は考慮に入れず、ラベルを含有すると測定されたビン（「イエス」ビン）において行われた測定のみを、処理試料中のラベル濃度の決定において考慮に入れる。「ノー」ビンまたはラベルを有しないビンにおいて行われた測定を考慮に入れないことによって、ノイズに対する信号の比および測定精度が増加する。従って、いくつかの態様において、試料中のラベル濃度の測定には、ラベルの存在を反映するビン測定の検出が含まれる。
【０１８０】
ノイズに対する信号の比または分析器システムの感度は、粒子−ラベル錯体が検出されるビン測定の間にバックグラウンドノイズが検出される時間を最小にすることによって増加し得る。例えば、１ミリ秒間継続するビン測定であって、その間に、一つの粒子−ラベル錯体が、２５０マイクロ秒間測定領域を横切る際に検出されるビン測定を考える。これらの条件下で、１ミリ秒の内７５０マイクロ秒がバックグラウンドノイズ放射の検出に費やされる。ノイズに対する信号の比は、ビン時間を短くすることによって改善され得る。いくつかの態様において、ビン時間は１ミリ秒である。他の態様において、ビン時間は７５０マイクロ秒、５００マイクロ秒、２５０マイクロ秒、１００マイクロ秒、５０マイクロ秒、２５マイクロ秒または１０マイクロ秒である。他のビン時間は、本明細書に記載されたものと同様である。
【０１８１】
測定に影響を及ぼす他の要因は、蛍光部分の輝度または暗さ（ｄｉｍｎｅｓｓ）、レーザービームの横方向範囲または開口像の寸法、測定領域が試料を通って移動させられる速度、およびレーザー出力である。ラベルの検出を可能にする関連要因の種々の組み合わせは当業者に明らかだろう。いくつかの態様において、ビン時間は、走査速度を変化させることなく調節される。当業者は、ビン時間が減少するにつれて、測定領域に向けられるレーザー出力は、ビン時間の間に測定領域に適用される総エネルギーを一定に保持するために増加させなければならないことを理解するだろう。例えば、ビン時間が１０００マイクロ秒から２５０マイクロ秒に減少する場合、第１近似として、レーザー出力は約４倍増加しなければならない。これらの設定により、前の設定を仮定して１０００マイクロ秒の間に計数される光子の数と同じ数の光子を２５０マイクロ秒の間に検出することが可能となり、バックグラウンドがより小さく感度がより高い、より高速の試料分析が可能となる。更に、測定領域が試料を通って移動する速度は、試料の処理を加速させるために調節され得る。これらの数は単に例示的なものであり、当業者は、所望の結果を得るために必要に応じてパラメーターを調節し得る。
【０１８２】
いくつかの態様において、例えば測定領域がレーザービームによって照射されるスポットの寸法によって規定される場合、測定領域は試料体積より小さい。いくつかの態様において、測定領域は、分析器の開口部１８２（図１Ａおよび１Ｂ）を調節すること、および対物レンズによって検出器に像形成される照射体積を減少させることによって規定され得る。測定領域が試料の断面積より小さいと規定される態様において、ラベル濃度は、既知の標準的濃度の一つ又はそれより多くの試料を用いて得られる検量線から、錯体によって発せられる信号を内挿することによって決定され得る。他の態様において、ラベル濃度は、測定された粒子を内部ラベル標準と比較することによって決定され得る。希釈された試料が分析される態様において、出発試料中の件の分子の濃度を計算する場合、希釈係数が説明される。
【０１８３】
処理試料中のラベル濃度を決定するために、「イエス」ビンに含まれるラベルの総数が、ビンの総数によって表される試料体積に対して決定される。従って、一の態様において、処理試料中のラベル濃度の決定は、「イエス」と検出されたラベルの総数を決定すること、および検出されたラベルの総数を分析された全試料体積と関連付けることを含む。分析される全試料体積は、測定領域が特定の時間間隔で移動する試料体積である。別法として、試料中のラベル錯体濃度は、複数のビンにおけるラベルによって発せられる信号を、既知の濃度のラベルを含有する標準試料によって同数のビンにおけるラベルによって発せられる信号を測定することによって得られる検量線から内挿することによって決定される。
【０１８４】
いくつかの態様において、ビンにおいて検出される個々のラベルの数は、処理試料中の粒子の相対濃度と関連付けられる。比較的低濃度において、例えば約１０−１６Ｍより低い濃度において、ラベルの数は、ビンにおいて検出される光子信号に比例する。従って、ラベルが低濃度であるとき、光子信号はデジタル信号として与えられる。比較的高濃度において、例えば約１０−１６Ｍより高い濃度において、２またはそれより多くのラベルがほぼ同時に測定領域を横切って一つのラベルとしてカウントされる尤度（または可能性）がかなりのものになるので、ラベルに対する光子信号の比例関係は失われる。従って、いくつかの態様において、濃度が約１０−１６Ｍより高い試料中の個々の粒子は、ビン測定時間の長さを短縮することによって分離される。
【０１８５】
他の態様において、各ビンにおいて存在する複数の粒子によって発せられる全光子信号が検出される。これらの態様によって、ダイナミックレンジが少なくとも３ｌｏｇ、３．５ｌｏｇ、４ｌｏｇ、４．５ｌｏｇ、５．５ｌｏｇ、６ｌｏｇ、６．５ｌｏｇ、７ｌｏｇ、７．５ｌｏｇ、８ｌｏｇである、または８ｌｏｇより大きい本発明の単一分子検出器が可能となる。
【０１８６】
「ダイナミックレンジ」は、本明細書においてその用語が用いられる場合、異なる濃度の一連の試料の濃度を変化させるための希釈または他の処理を必要とすることなく、機器によって定量され得る試料濃度の範囲であって、目的とする用途に適した精度で濃度が測定される範囲を指す。例えば、マイクロタイタープレートが、一のウェルにおいて件の被分析物に関する濃度が１フェムトモル濃度である試料を含有し、もう一つのウェルにおいて件の被分析物に関する濃度が１０，０００フェムトモル濃度である試料を含有し、かつ第３のウェルにおいて被分析物に関する濃度が１００フェムトモル濃度である試料を含有する場合、ダイナミックレンジが少なくとも４ｌｏｇで定量の下限が１フェムトモル濃度である機器は、濃度を調節するための更なる処理、例えば希釈を行うことなく、全ての試料の濃度を精確に定量し得る。精度は標準的な方法、例えば、ダイナミックレンジにわたる濃度の一連の標準物質を測定し、検量線を作図することによって決定され得る。得られる検量線をフィッティングする標準的基準は、精度の基準として使用され得る（例えば約０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８または０．９９より大きいｒ２）。
【０１８７】
ダイナミックレンジは、検出器からのデータを分析する方法を変化させることによって、および恐らく検出器と測定領域との間で減衰器を用いることによって増加し得る。ダイナミックレンジの下端において、処理試料は十分に希釈され、それによって、各検出イベント、即ちビンにおける閾値より大きい各光子爆発（「イベント光子」）は、恐らく一つのラベルのみを表す。これらの条件の下では、データは、検出イベントを単一分子として計数するために分析され、その結果、各ビンは、上述のように、ラベルの存在に関して単純な「イエス」または「ノー」として分析される。二つ又はそれより多くのラベルが一つのビンを占める尤度がかなりのものになる、より高濃度の処理試料に関して、かなりの数のビンにおけるイベント光子の数は、単一のラベルに対して予想される数より実質的に大きい。例えば、かなりの数のビンにおけるイベント光子の数は、単一のラベルに対して予想されるイベント光子の数の２倍、３倍またはそれより多くに一致する。これらの試料に関して、処理試料のビンに対するイベント光子の総数を積分するために、機器において、そのデータ分析方法が変更される。この総数は、全ビンにおけるラベルの総数に比例する。大部分のビンにおいて多数のラベルが存在する、より一層高濃度の処理試料に関して、バックグラウンドノイズは、各ビンからの全信号の有意でない部分になり、ビン一つ当たりの全光子（バックグラウンドを含む）を計数するために、機器において、そのデータ分析方法が変更される。より一層大きいダイナミックレンジは、試料プレートと検出器の間で減衰器を用いることによって達成することができ、このとき、濃度は、減衰器を用いなければ検出器に達する光の強度が光子を正確に計数する検出器の能力を上回る、即ち検出器を飽和状態にするような濃度である。
【０１８８】
機器は、検出器からの入力を受け取り、実行中の試料に対して適切な分析方法を決定し、そのような分析に基づいて値を出力するデータ分析システムを含み得る。データ分析システムは、減衰器が機器に含まれる場合、減衰器を使用するため又は使用しないための指示を更に出力し得る。
【０１８９】
そのような方法を用いることにより、機器のダイナミックレンジは飛躍的に増大し得る。いくつかの態様において、機器は、約１０００（３ｌｏｇ）、１０，０００（４ｌｏｇ）、１００，０００（５ｌｏｇ）、３５０，０００（５．５ｌｏｇ）、１，０００，０００（６ｌｏｇ）、３，５００，０００（６．５ｌｏｇ）、１０，０００，０００（７ｌｏｇ）、３５，０００，０００（７．５ｌｏｇ）または１００，０００，０００（８ｌｏｇ）より大きいダイナミックレンジにわたって試料濃度を測定し得る。いくつかの態様において、機器は、約１００，０００（５ｌｏｇ）より大きいダイナミックレンジにわたって試料濃度を測定し得る。いくつかの態様において、機器は、約１，０００，０００（６ｌｏｇ）より大きいダイナミックレンジにわたって試料濃度を測定し得る。いくつかの態様において、機器は、約１０，０００，０００（７ｌｏｇ）より大きいダイナミックレンジにわたって試料濃度を測定し得る。いくつかの態様において、機器は、約１〜１０フェムトモル濃度から少なくとも約１０００、１０，０００、１００，０００、３５０，０００、１，０００，０００、３，５００，０００、１０，０００，０００または３５，０００，０００フェムトモル濃度のダイナミックレンジにわたって試料濃度を測定し得る。いくつかの態様において、機器は、約１〜１０フェムトモル濃度から少なくとも約１０，０００フェムトモル濃度のダイナミックレンジにわたって試料濃度を測定し得る。いくつかの態様において、機器は、約１〜１０フェムトモル濃度から少なくとも約１００，０００フェムトモル濃度のダイナミックレンジにわたって試料濃度を測定し得る。いくつかの態様において、機器は、約１〜１０フェムトモル濃度から少なくとも約１，０００，０００フェムトモル濃度のダイナミックレンジにわたって試料濃度を測定し得る。いくつかの態様において、機器は、約１〜１０フェムトモル濃度から少なくとも約１０，０００，０００のダイナミックレンジにわたって試料濃度を測定し得る。
【０１９０】
いくつかの態様において、本発明の分析器または分析器システムは、約１ナノモル濃度、または１ピコモル濃度、または１フェムトモル濃度、または１アトモル濃度、または１ゼプトモル濃度より小さい検出限界で、被分析物、例えばバイオマーカーを検出し得る。いくつかの態様において、分析器または分析器システムは、バイオマーカーが試料中に約１ナノモル濃度、または１ピコモル濃度、または１フェムトモル濃度、または１アトモル濃度、または１ゼプトモル濃度より低濃度で存在する場合、かつ各試料の量が約１００、５０、４０、３０、２０、１０、５、２、１、０．１、０．０１、０．００１、または０．０００１μｌより少ない場合、一の試料からもう一つの試料への、被分析物または複数の被分析物、例えばバイオマーカーまたは複数のバイオマーカーの、約０．１％、１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％または８０％より小さい濃度変化を検出し得る。いくつかの態様において、分析器または分析器システムは、被分析物が約１ピコモル濃度より低濃度で存在し、かつ各々の試料の量が約５０μｌより少ない場合、第１試料から第２試料への、被分析物の約２０％より小さい濃度変化を検出し得る。いくつかの態様において、分析器または分析器システムは、被分析物が約１００フェムトモル濃度より低濃度で存在し、かつ各々の試料の量が約５０μｌより少ない場合、第１試料から第２試料への、被分析物の約２０％より小さい濃度変化を検出し得る。いくつかの態様において、分析器または分析器システムは、被分析物が約５０フェムトモル濃度より低濃度で存在し、かつ各々の試料の量が約５０μｌより少ない場合、第１試料から第２試料への、被分析物の約２０％より小さい濃度変化を検出し得る。いくつかの態様において、分析器または分析器システムは、被分析物が約５フェムトモル濃度より低濃度で存在し、かつ各々の試料の量が約５０μｌより少ない場合、第１試料から第２試料への、被分析物の約２０％より小さい濃度変化を検出し得る。いくつかの態様において、分析器または分析器システムは、被分析物が約５フェムトモル濃度より低濃度で存在し、かつ各々の試料の量が約５μｌより少ない場合、第１試料から第２試料への、被分析物の約２０％より小さい濃度変化を検出し得る。いくつかの態様において、分析器または分析器システムは、被分析物が約１フェムトモル濃度より低濃度で存在し、かつ各々の試料の量が約５μｌより少ない場合、第１試料から第２試料への、被分析物の約２０％より小さい濃度変化を検出し得る。
【０１９１】
［ＶＩ．試料のキャリーオーバー］
キャリーオーバーは診断において望ましくない。一の試料中の件の分子の検出は、その後試験される試料中の件の分子の検出精度を落とし得ない。本明細書に記載の単一分子分析器は、一の試料中の単一分子の有無を検出することができ、その後、試料間のキャリーオーバーがゼロの状態で、次の試料中の単一分子の有無を検出し得る。本明細書に記載の発明は、連続して、第１試料中の特定の種類の単一分子の有無を検出することができ、第２試料中の当該種類の単一分子の有無を検出し得る機器であって、第１試料と第２試料との間でキャリーオーバーが存在しないように適合させられ且つ構成される機器を提供する。連続して、第１試料中の特定の種類の単一分子の有無を検出し、第２試料中の当該種類の単一分子の有無を検出する方法であって、第１試料と第２試料との間でキャリーオーバーが存在しない方法が、本明細書において更に提供される。
【０１９２】
いくつかの態様において、複数の試料が同じ試料プレート上で測定される。いくつかの態様において、試料は、同じ種類の件の単一分子に関して試験される。いくつかの態様において、第１試料において試験される単一分子の種類は、第二試料において試験される分子と同じ種類でない。これは、例えばオリジナルの試料が複数の試料に分割され、その複数の試料の各々が異なる種類の件の単一分子に関して試験されるパネルを実行する場合にもあてはまる。
【０１９３】
いくつかの態様において、試料プレートは、試験すべき一つの試料を含む。いくつかの態様において、試料プレートは、試験すべき二つの試料を含む。いくつかの態様において、複数の試料を、同じ試料プレート上で試験し得る。理論上は、連続的に試験される任意の二つの試料間でキャリーオーバーがゼロの状態で、数十〜数百、数千、または数千より多くの試料を連続して測定することができる。システムは、試料プレートの制約によってのみ、試料数に対して制限される。
【０１９４】
試験される試料を入れる一つの容器または複数の容器が使い捨て可能であるシステムに、キャリーオーバーがゼロであるシステムを構築することは簡単である。そのようなシステムにおいて、検出手段が試料と接触しない限り、使い捨て容器においてキャリーオーバーの機会はない。使い捨て容器には、キュベットおよびキャピラリー管等の部材が含まれる。本明細書において提供される発明は、使い捨て容器および使い捨てでない容器内に入っている連続した試料の試験を可能にする。本発明は、試料間のキャリーオーバーが不可能である機器構造を開示する。
【０１９５】
［ＶＩＩ．単一分子分析器の使用方法］
試料中の単一分子の有無を検出する方法をここで更に提供し、その方法は以下の工程を含む：（ａ）電磁放射線源からの電磁放射線を、試料における測定領域に向ける工程；（ｂ）試料の第１の位置に設けられる測定領域中の第１の単一分子の有無を検出する工程；（ｃ）測定領域を、試料を通って試料の次の位置に移動させる工程；（ｄ）試料の次の位置において次の単一分子の有無を検出する工程；並びに（ｅ）試料の一つより多くの位置において単一分子の有無を検出するのに必要なだけ、工程（ｃ）および（ｄ）を繰り返す工程。いくつかの態様において、測定領域は、約１μｍ３より大きい、約２μｍ３より大きい、約３μｍ３より大きい、約４μｍ３より大きい、約５μｍ３より大きい、約１０μｍ３より大きい、約１５μｍ３より大きい、約３０μｍ３より大きい、約５０μｍ３より大きい、約７５μｍ３より大きい、約１００μｍ３より大きい、約１５０μｍ３より大きい、約２００μｍ３より大きい、約２５０μｍ３より大きい、約３００μｍ３より大きい、約４００μｍ３より大きい、約５００μｍ３より大きい、約５５０μｍ３より大きい、約６００μｍ３より大きい、約７５０μｍ３より大きい、約１０００μｍ３より大きい、約２０００μｍ３より大きい、約４０００μｍ３より大きい、約６０００μｍ３より大きい、約８０００μｍ３より大きい、約１００００μｍ３より大きい、約１２０００μｍ３より大きい、約１３０００μｍ３より大きい、約１４０００μｍ３より大きい、約１５０００μｍ３より大きい、約２００００μｍ３より大きい、約３００００μｍ３より大きい、約４００００μｍ３より大きい、または約５００００μｍ３より大きい体積を有する。いくつかの態様において、測定領域の体積は、約５００００μｍ３より小さく、約４００００μｍ３より小さく、約３００００μｍ３より小さく、約２００００μｍ３より小さく、約１５０００μｍ３より小さく、約１４０００μｍ３より小さく、約１３０００μｍ３より小さく、約１２０００μｍ３より小さく、約１１０００μｍ３より小さく、約９５００μｍ３より小さく、約８０００μｍ３より小さく、約６５００μｍ３より小さく、約６０００μｍ３より小さく、約５０００μｍ３より小さく、約４０００μｍ３より小さく、約３０００μｍ３より小さく、約２５００μｍ３より小さく、約２０００μｍ３より小さく、約１５００μｍ３より小さく、約１０００μｍ３より小さく、約８００μｍ３より小さく、約６００μｍ３より小さく、約４００μｍ３より小さく、約２００μｍ３より小さく、約１００μｍ３より小さく、約７５μｍ３より小さく、約５０μｍ３より小さく、約２５μｍ３より小さく、約２０μｍ３より小さく、約１５μｍ３より小さく、約１４μｍ３より小さく、約１３μｍ３より小さく、約１２μｍ３より小さく、約１１μｍ３より小さく、約１０μｍ３より小さく、約５μｍ３より小さく、約４μｍ３より小さく、約３μｍ３より小さく、約２μｍ３より小さく、または約１μｍ３より小さい。いくつかの態様において、測定領域の体積は、約１μｍ３〜約１００００μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約１μｍ３〜約１０００μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約１μｍ３〜約１００μｍ３である。いくつかの態様におい��、測定領域は約１μｍ３〜約５０μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約１μｍ３〜約１０μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約２μｍ３〜約１０μｍ３である。いくつかの態様において、測定領域は約３μｍ３〜約７μｍ３である。
【０１９６】
ここで、単一分子の有無を検出する方法であって、測定領域が非直線状経路で移動させられる方法が更に提供される。別の態様において、非直線状経路は、実質的に円状の経路を含む。もう一つの態様において、非直線状経路は、螺旋状パターンを含む。本発明は、測定領域中の単一分子の有無を検出する方法であって、測定領域が、試料を通って移動させられる方法を提供する。いくつかの態様において、この方法は、試料が機器に対して実質的に静止したままであることを提供する。いくつかの態様において、この方法は、試料が機器に対して移動させられることを提供する。いくつかの態様において、試料と電磁放射線の両方が互いに対して移動させられる。試料が機器に対して移動させられる態様において、試料は、その容器（例えばマイクロウェル）内に静止したままであり得る。単一分子が一つの測定領域または一連の測定領域の内外に拡散し得る間、単一分子が存在する媒体は静止したままである。従って、このシステムは、流れる流体を必要とすることなく単一分子検出を可能にする。
【実施例】
【０１９７】
［実施例１：分子検出および標準的な曲線の生成］
図３は、本発明の装置を用いた単一分子の検出を図示している。プロットは、横軸の時間（ｍ秒）に対して、検出された蛍光の代表的データを縦軸に示す。グラフに示されるスパイクは、単一分子走査分析器が測定領域内の一つ又はそれより多くのラベリングされた分子に遭遇すると発生した。全蛍光信号は、個々の検出イベント（ＤＥ）の合計からなり、検出イベントは、バックグラウンドノイズより上で検出された蛍光からなる。記録の間の全ての検出イベントの総数を「ＤＥ値」と呼ぶことができる。低濃度において、ＤＥ値は検出された分子の数に対応する。二つまたはそれより多くの分子が一度に検出スポットを通過し得る、より高い濃度において、検出される分子の数はＤＥの数より大きくなり得る。
【０１９８】
図４は、単一分子走査分析器によって得られる検量線を図示している。この曲線を得るために、既知の濃度で試料を調製し、本発明の装置を用いて測定した。三つの曲線をプロットで示す。上側の曲線は検出された全光子（ＴＰ）に対応する。中間の曲線は検出されたイベント光子（ＥＰ）に対応する。下側の曲線は、検出されたイベント（ＤＥ）に対応する。プロットは、横軸の既知の試料濃度（ｐｇ／ｍｌ）に対する、これらの測定の各々に対する値（「カウント数」）を縦軸に示す。プロットされた円は、それらの既知の濃度においてプロットされたカウント数である。実線の曲線は、四つのパラメーターのロジスティック曲線に対するデータの最小二乗法フィッティングである。「＋」記号は、それらの既知の濃度の代わりにそれらの内挿された濃度でプロットされたカウント数である。「＋」記号は、フィッティングされた曲線が上手く実際のデータを通る程度を示す。このデータは、試料濃度が変化するに従って、検出される分子の数が明確に変化することを表している。
【０１９９】
［実施例２：バイオマーカーのためのサンドウィッチ分析：心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）］
（分析）
この分析の目的は、ヒト血清中の心筋トロポニンＩ（ｃＴＮＩ）の存在を検出することである。分析フォーマットは、マウスモノクローナル捕捉抗体およびヤギポリクローナル検出抗体を用いた２段階サンドウィッチ免疫測定を含む。１０マイクロリットルの試料が必要とされる。分析の動作範囲は、０〜９００ｐｇ／ｍｌである（通常の分析の検出限界は１〜３ｐｇ／ｍｌである）。分析は、完了するのに約４時間のベンチタイムを必要とする。
【０２００】
（材料）
下記の材料を、以下に記載の手順において用いる。分析プレートを、透明な３８４ウェルＮＵＮＣ（商標）Ｍａｘｉｓｏｒｐ、製品４６４７１８からなる。プレートは、ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ  Ａ３４４４０２２８Ｐ、ロット番号Ａ０３１６（０．０５Ｍ酢酸ナトリウム中に５μｇ／ｍｌ（ｐＨ９．６））を含むモノクローナル抗体によって室温で一晩、受動的に被覆し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の５％スクロース、１％ＢＳＡによってブロックし、４℃で保管する。検量線のために、ヒト心筋トロポニンＩ（ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ、カタログ番号Ｊ３４０００３５２）が用いられる。標準的濃度に関する希釈剤は、アリコートされ−２０℃で保管された、内因性ｃＴＮＩが免疫枯渇（ｉｍｍｕｎｏ−ｄｅｐｌｅｔｅｄ）したヒト血清である。標準物質を、９６ウェルの、円錐形のポリプロピレンプレート（ＮＵＮＣ（商標）製品番号２４９９４４）において希釈する。以下の緩衝液および溶液を使用する：（ａ）分析緩衝液（１％ＢＳＡおよび０．１％トリトンＸ−１００を含むホウ酸緩衝生理食塩水（ＢＢＳ））；（ｂ）受動的ブロッキング溶液（ｐａｓｓｉｖｅ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（２ｍｇ／ｍｌマウスＩｇＧ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ  Ｂｉｏ）、２ｍｇ／ｍｌヤギＩｇＧ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ  Ｂｉｏ）、および２ｍｇ／ｍｌ  ＭＡＫ３３  ＩｇＧ１  Ｐｏｌｙ（Ｒｏｃｈｅ＃１１９３９６６１）を含有する分析緩衝液）；（ｃ）検出抗体（ペプチド３（ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ  Ｇ−１２９−Ｃ）に対してアフィニティー精製され、蛍光色素Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７でラベリングされ、４℃で保管されるヤギポリクローナル抗体）；（ｄ）検出抗体希釈剤（５０％分析緩衝液、５０％受動的ブロッキング溶液）；（ｅ）洗浄緩衝液（ホウ酸緩衝生理食塩水トリトン緩衝液（ＢＢＳＴ）（１．０Ｍホウ酸塩、１５．０Ｍ塩化ナトリウム、１０％トリトンＸ−１００、ｐＨ８．３））；（ｆ）溶出緩衝液（４Ｍ尿素、０．０２％トリトンＸ−１００および０．００１％ＢＳＡを含むＢＢＳ）；並びに（ｇ）カップリング緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３）。
【０２０１】
（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７でラベリングされた抗体の調製）
検出抗体Ｇ−１２９−Ｃを、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７と結合（または共役）させることによって調製する。１００μｇのＧ−１２９−Ｃを４００μｌのカップリング緩衝液に溶解させる。抗体溶液をＹＭ−３０フィルターの中に移して溶液およびフィルターを遠心分離にかけることによって、抗体溶液を５０μｌに濃縮する。ＹＭ−３０フィルターおよび抗体を、４００μｌのカップリング緩衝液を加えることによって３回洗浄する。５０μｌのカップリング緩衝液をフィルターに加え、フィルターを反転させ、そして５，０００ｘｇで１分間遠心分離することによって抗体を回収する。得られる抗体溶液の濃度は約１〜２μｇ／μｌである。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  ＮＨＳエステル原液（または貯蔵液）は、２０μｌ  ＤＭＳＯ中の１バイアルの再構成されたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７によって作製される。この溶液は、−２０℃で１ヶ月まで保管可能である。３μｌのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７原液を暗所で１時間、抗体溶液と混合する。その後、１Ｍトリス７．５μｌを抗体Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７溶液に加え、混合する。溶液をＹＭ−３０で限外ろ過し、低分子量成分を除去する。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７と結合（または共役）した抗体を含有する保持物の体積を、ＰＢＳを加えることによって２００〜４００μｌに調節する。３μｌの１０％ＮａＮ３を溶液に加える。得られる溶液を、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ０．２２遠心分離器ユニットに移し、１２，０００ｘｇで２分間遠心分離する。結合された（または共役された）抗体を含有するろ液を回収し、分析において用いる。
【０２０２】
（手順）
標準物質は、ｃＴｎｌ標準物質の原液（ｓｔｏｃｋ）を標準希釈剤中で連続して希釈して、１．２ｐｇ／ｍｌ〜４．３μｇ／ｍｌのｃＴｎｌ濃度範囲を達成することによって調製される（０〜９００ｐｇ／ｍｌ）。１０μｌの受動的阻害溶液、および１０μｌの標準物質または試料のいずれかを、適切なプレートの各ウェルに加える。標準物質は４重に測定する。プレートを、好ましくは低発光性シーリングフィルムによって封止し、３０００ＲＰＭで１分間遠心分離し、振動させながら２５℃で２時間培養する。プレートを５回洗浄し、ローターが３０００ＲＰＭに達するまで、ペーパータオル上で逆向きの状態で遠心分離する。１ｎＭの検出抗体の作業用希釈物（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を調製し、２０μｌの検出抗体が各ウェルに加える。プレートを封止して遠心分離し、分析物を振動させながら２５℃で１時間培養する。３０μｌの溶出緩衝液をウェル毎に加え、プレートを封止し、分析物を２５℃で１／２時間培養する。プレートは直ちに分析することができ、または分析の前に４℃で４８時間まで保管し得る。
【０２０３】
分析のために、ウェル一つ当たり２０μｌが４０μｌ／分で得られ、５μｌを１６．７ｍｍ／秒の走査速度で分析する。４標準偏差（σ）（または４σ）の閾値に基づいてデータを分析する。生の信号を、標準物質の濃度に対してプロットする。低濃度範囲に関して線形フィッティングを行い、全体の検量線に関して非線形フィッティングを行う。検出限界（ＬＯＤ）を、ＬＯＤ＝（３×（ゼロ試料のσ））／（線形フィッティングの傾き）として計算する。試料濃度を、試料信号に適した線形または非線型方程式から決定する。
【０２０４】
次に、試料プレートを単一分子走査分析器に取り付ける。レーザーによる励起の後に、たった一つの蛍光ラベルからの放射が規定された区域（または領域）において検出されるような速度にて、試料を通って測定領域を移動させることによって、個別にラベリングされた抗体を測定する。全蛍光信号は、前述のように個別の検出イベントの合計である。
【０２０５】
［実施例３：ＴｎＩに関するサンドウィッチビーズベース分析］
上述の分析は、ターゲット分子を固定するためにプラスチック表面が用いられるマイクロタイタープレート方式を用いる。単一粒子分析器システムは、結合要素および非結合要素を分離するために微小粒子またはビーズを用いて溶液中で行われる分析にも対応する。
【０２０６】
（物質）
ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＣ１微小粒子（ＭＰ）は、Ｄｙｎａｌ（６５０．０１−０３、１０ｍｇ／ｍｌ原液）から得られる。使用する緩衝液には以下のものが含まれる：（ａ）１ＯＸホウ酸塩緩衝食塩水トリトン緩衝液（ＢＢＳＴ）（１．０Ｍホウ酸塩、１５．０Ｍ塩化ナトリウム、１０％トリトンＸ−１００、ｐＨ８．３）；（ｂ）分析緩衝液（０．１Ｍトリス（ｐＨ８．１）中の２ｍｇ／ｍｌの正常なヤギＩｇＧ、２ｍｇ／ｍｌの正常なマウスＩｇＧおよび０．２ｍｇ／ｍｌのＭＡＢ−３３−ＩｇＧ−ポリマー、０．０２５ＭのＥＤＴＡ、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．１％のＢＳＡ、０．１％のトリトンＸ−１００および０．１％のＮａＮ３、４℃で保管）；並びに（ｃ）溶出緩衝液（４Ｍの尿素、０．０２％のトリトンＸ−１００および０．００１％のＢＳＡを含むＢＢＳ、２〜８℃で保管）。サンドウィッチビーズベース分析において用いられる抗体には以下のものが含まれる：（ａ）Ｂｉｏ−Ａｂ（ＩｇＧ一つ当たり１〜２のビオチンを有するＡ３４６５０２２８Ｐ（ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ））；および（ｂ）Ｄｅｔ−Ａｂ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７と結合した（または共役した）Ｇ−１２９−Ｃ（ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ）、ＩｇＧ一つ当たり２〜４の蛍光色素）。標準物質は、組み換えヒト心筋トロポニンＩ（ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ、カタログ番号Ｊ３４１２０３５２）である。較正希釈剤は、ＥＤＴＡを有するトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）中の３０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡである。
【０２０７】
（微小粒子コーティング）
ＭＰ原液１００μｌをエッペンドルフチューブに入れる。磁石を使用し、上澄みを除去し、磁石を除去し、洗浄緩衝液中で再懸濁させることによって、ＭＰを１００μｌのＢＢＳＴ洗浄緩衝液で３回洗浄する。洗浄後、ＭＰを１００μｌの分析緩衝液中で再懸濁させ、１５μｇのＢｉｏ−Ａｂを加える。混合物を室温で１時間、絶えず混合しながら培養する。ＭＰを、上述のように１ｍｌの洗浄緩衝液で５回洗浄する。洗浄の後、ＭＰを１５ｍｌの分析緩衝液（または４℃で保管するために１００μｌ）中で再懸濁させる。
【０２０８】
（標準物質および試料の調製）
標準物質を較正希釈剤で希釈して、通常は２００ｐｇ／ｍｌ〜０．１ｐｇ／ｍｌに及ぶ適切な検量線を作成する。凍結血清および血漿試料を室温で１０分間、１３，０００ｒｐｍにて遠心分離する。上澄みの血清または血漿を、沈殿物または浮遊物を避けて注意深く取り出し、新しいチューブに移す。５０μｌの各標準物質または試料を、ピペットで適切なウェルの中に入れる。
【０２０９】
（捕捉目標）
４００ｍＭのＮａＣｌを含有する分析緩衝液中で１５ｍｌに再懸濁させた後に、１５０μｌのＭＰを各ウェルに加える。混合物を、Ｂｏｅｋｅｌ  Ｊｉｔｔｅｒｂｕｇマイクロプレート培養撹拌器において室温で１時間培養する。
【０２１０】
（洗浄および検出）
プレートを磁石上に設置し、磁石がＭＰを捕捉することが可能となった後に、上澄みを除去する。プレートを磁石から取り除いた後に、２５０μｌの洗浄緩衝液を加える。プレートを再び磁石上に設置し、磁石がＭＰを捕捉することが可能となった後に、上澄みを除去する。ウェル一つ当たり２０μｌのＤｅｔ−Ａｂを加える。必要であれば、Ｄｅｔ−Ａｂをまず、４００ｍＭのＮａＣｌを含有する分析緩衝液中で５００ｎｇ／ｍｌに希釈する。混合物を、Ｂｏｅｋｅｌ  Ｊｉｔｔｅｒｂｕｇマイクロプレート培養撹拌器において室温で３０分間培養する。上述のようにプレートを洗浄緩衝液で３回洗浄する。洗浄の後に、２５０μｌの洗浄緩衝液を加え、試料を新しい９６−ウェルプレートに移す。洗浄工程を２回繰り返す。次に、２０μｌの溶出緩衝液を加え、混合物を、Ｂｏｅｋｅｌ  Ｊｉｔｔｅｒｂｕｇマイクロプレート培養撹拌器において室温で３０分間培養する。
【０２１１】
（ＭＰのろ過および３８４−ウェルプレートへの移動）
標準物質および試料を、３８４−ウェル分析プレートの上部に設けられた３８４−ウェルフィルタープレートに移す。プレートを室温で３０００ｒｐｍにて遠心分離する。フィルタープレートを取り出し、適切な較正物質（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）を加える。プレートを被覆し、単一分子検出器を走査する準備をする。
【０２１２】
（単一分子検出器の走査）
試料ウェル中の試料を、電磁放射線源を用いて走査する。測定領域を、試料を通って移動させる。個別にラベリングされた抗体を試料走査の間に測定するのに十分な低速で、試料を走査する。これは、レーザーによる励起の後に、蛍光分子が存在する場合、たった一つの蛍光分子からの放射が、規定された区域（または領域）において検出されるように測定領域を設定することによって達成される。各信号がデジタルイベントを表すことにより、この構成によって極めて高い分析感度が可能となる。全蛍光信号は、個別のデジタルイベントの合計として規定される。計数された各分子は、数百〜数千の検出されたイベント／試料による、有益なデータポイントである。本発明のｃＴｎＩ分析の検出限界は、平均値＋３σ（ｍｅａｎ  ｐｌｕｓ  ３σ）法によって規定される（上記参照のこと）。
【０２１３】
本発明の好ましい態様を本明細書において示し、説明してきたが、そのような態様が例示的目的でのみ提供されることは、当業者に明らかである。多数の変形、変更および置換が、本発明から逸脱することなく当業者によって行われるだろう。本明細書に記載の本発明の態様に対する種々の代替物を、本発明の実施において採用し得ることが、理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定すること、およびこれらの請求項およびそれらの均等物の範囲の方法および構造物がその範囲に含まれることが意図される。
本願発明は以下の態様を含む。
（態様１）
単一分子分析器であって、
（ａ）試料を含む試料容器に電磁放射線を与えるための電磁放射線源；
（ｂ）電磁放射線源からの電磁放射線を、試料中の測定領域に向けるためのシステム；
（ｃ）測定領域を試料の少なくとも一部を通って移動させ、それによって可動測定領域を形成するための移動システム；および
（ｄ）分子が存在する場合に、測定領域における単一分子から放射される電磁放射線を検出するための検出器であって、検出器が操作可能であるように測定領域に接続される検出器
を含む、単一分子分析器。
（態様２）
移動システムが、直線状経路および非直線状経路の一つ又はそれより多くにおいて測定領域を移動させ得る、態様１に記載の単一分子分析器。
（態様３）
非直線状経路が、実質的に円状の経路を含む態様２に記載の単一分子分析器。
（態様４）
非直線状経路が螺旋状経路を含む、態様２に記載の単一分子分析器。
（態様５）
非直線状経路がラスターパターンを含む、態様２に記載の単一分子分析器。
（態様６）
表面において少なくとも一つの試料を収容し且つ閉じこめるための表面を有する容器を更に含む、態様１に記載の単一分子分析器。
（態様７）
試料容器がプレートである、態様１に記載の単一分子分析器。
（態様８）
プレートがマイクロタイタープレートである、態様７に記載のプレート。
（態様９）
測定領域の体積が約１５μｍ３〜約１１０００μｍ３である、態様１に記載の単一分子分析器。
（態様１０）
測定領域の体積が約２００μｍ３〜約３０００μｍ３である、態様１に記載の単一分子分析器。
（態様１１）
測定領域の体積が約５００μｍ３〜約６００μｍ３である、態様１に記載の単一分子分析器。
（態様１２）
分子が容器表面に結合される、態様６に記載の単一分子分析器。
（態様１３）
非共有結合によって分子が容器表面に結合される、態様１２に記載の単一分子分析器。
（態様１４）
非共有結合が、分子と、容器表面に共有結合または非共有結合する一つ又はそれより多くの抗体との間に形成される、態様１３に記載の単一分子分析器。
（態様１５）
顕微鏡対物レンズを更に含み、顕微鏡対物レンズの被写界深度および顕微鏡対物レンズに結像される開口部の直径が共に測定領域を規定する、態様１に記載の単一分子分析器。
（態様１６）
顕微鏡対物レンズを更に含み、顕微鏡対物レンズの被写界深度および電磁放射ビームの横方向範囲が共に測定領域を規定する、態様１に記載の単一分子分析器。
（態様１７）
移動システムが、測定領域を試料の一部を通って１回より多い回数、移動させるように構成および配置される、態様１に記載の単一分子分析器。
（態様１８）
移動システムが、１回目および２回目に試料の同じ部分を通って、単一分子が存在する場合、１回目に測定領域が試料の当該部分を通って移動する際に検出される単一分子が、１回目に試料の当該部分が測定領域によって取り調べられた後に試料の当該部分から実質的に拡散することを可能とし、更に、次の単一分子が存在する場合、２回目に試料の当該部分が測定領域によって取り調べられる際に、次の単一分子が試料の当該部分の中に実質的に拡散することを可能とする十分に遅い速度で移動するように構成および配置される、態様１７に記載の単一分子分析器。
（態様１９）
移動システムが、測定領域を実質的に円状のパターンで移動させるように構成および配置され、システムは、約１００〜約１０００ＲＰＭの速度で測定領域を移動させることができる、態様１８に記載の分析器。
（態様２０）
移動システムが、１回目の通過において検出された分子が前記部分から拡散し得、かつ他の分子が前記部分の中に拡散し得るように十分な時間が経過した後に、検出スポットが試料の前記部分に戻るように、測定領域を移動させるように構成および配置される、態様１７に記載の単一分子分析器。
（態様２１）
分析器が、第１試料中の特定の種類の単一分子の有無を連続して検出し、第２試料中の当該種類の単一分子の有無を検出するように適合させられ且つ構成され、第１試料と第２試料との間でキャリーオーバーが存在しない、態様１に記載の単一分子分析器。
（態様２２）
（ａ）５５０ｎｍ〜８００ｎｍの波長の光に対して実質的に透明である材料からなり、かつ一つ又はそれより多くの部分を含む基部であって、当該部分が、当該部分の第２の側に配置される高開口数のレンズによって当該部分の第１の側において像が形成され得るような厚さであり、像のどの部分も基部内に形成されない基部；および
（ｂ）少なくとも一つの流体試料を表面に収容し且つ閉じこめるように適合させられ且つ構成される表面
を含むマイクロタイタープレート。
（態様２３）
基部が６００ｎｍ〜７５０ｎｍの波長の光に対して透明である、態様２２に記載のマイクロタイタープレート。
（態様２４）
基部が６３０ｎｍ〜７４０ｎｍの波長の光に対して透明である、態様２２に記載のマイクロタイタープレート。
（態様２５）
基部が６３０ｎｍ〜６４０ｎｍの波長の光に対して透明である、態様２２に記載のマイクロタイタープレート。
（態様２６）
表面がマイクロウェルを有する、態様２２に記載のマイクロタイタープレート。
（態様２７）
プレートが、ポリスチレンより小さい蛍光を放射する材料を含む、態様２２に記載のマイクロタイタープレート。
（態様２８）
試料中の単一分子の有無を検出する方法であって、
（ａ）電磁放射線源からの電磁放射線を試料中の測定領域に向ける工程；
（ｂ）試料の第１位置に設けられる測定領域における第１の単一分子の有無を検出する工程；
（ｃ）測定領域を、試料を通って試料の次の位置に移動させる工程；
（ｄ）試料の次の位置において次の単一分子の有無を検出する工程；および
（ｅ）試料の一つより多くの位置において単一分子の有無を検出するのに必要なだけ、工程（ｃ）および（ｄ）を繰り返す工程
を含む方法。
（態様２９）
測定領域の体積が約１５μｍ３〜約１１０００μｍ３である、態様２８に記載の方法。
（態様３０）
測定領域の体積が約２００μｍ３〜約３０００μｍ３である、態様２８に記載の方法。
（態様３１）
測定領域の体積が約５００μｍ３〜約６００μｍ３である、態様２８に記載の方法。
（態様３２）
測定領域が、非直線状経路で移動させられる、態様２８に記載の方法。
（態様３３）
非直線状経路が実質的に円状の経路を含む、態様３２に記載の方法。
（態様３４）
非直線状経路が螺旋状経路を含む、態様３２に記載の方法。
（態様３５）
試料が、試料中に配置された測定領域に向けられる電磁放射線に対して実質的に静止したままである、態様２８に記載の方法。
（態様３６）
測定領域が、１回より多い回数、試料の第１位置を通って移動させられる、態様２８に記載の方法。
（態様３７）
測定領域が、次の回において、試料の第１位置を通って、単一分子が存在する場合、１回目に測定領域が試料の当該位置を通って移動させられる際に検出される単一分子が、１回目に試料の当該位置が測定領域によって取り調べられた後に、試料の当該位置から実質的に拡散することを可能とし、更に、次の単一分子が存在する場合、２回目に試料の当該位置が測定領域によって取り調べられる際に、次の単一分子が試料の当該位置の中に実質的に拡散することを可能とする十分に遅い速度で移動する、態様３６に記載の方法。
（態様３８）
測定領域が、１回目の通過において検出された分子が前記部分から拡散し得、別の分子が前記部分の中に拡散し得るように十分な時間が経過した後に、検出スポットが試料の第１位置に戻るように移動させられる、態様３６に記載の方法。
（態様３９）
試料中の特定の種類の単一分子の有無を連続して検出し、次に、第２試料中の同じ種類の単一分子の有無を検出する工程であって、第１試料と第２試料との間でキャリーオーバーが存在しない工程を更に含む、態様２８に記載の方法。
（態様４０）
第１試料および第２試料が、使い捨てでない装置内に収容され且つ閉じこめられる、態様３９に記載の方法。
【図１Ａ】
2019090817.tif 000007
【図１Ｂ】
2019090817.tif 000008
【図２】
2019090817.tif 000009
【図３】
2019090817.tif 000010
【図４】
2019090817.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成31年1月24日(2019.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
処理試料中の蛍光部分の濃度を決定するための分析器であって、
（ａ）電磁放射線を電磁放射線源からマイクロタイタープレートのマイクロウェルに含まれる処理試料における移動可能な測定領域に方向付ける光学エレメント；
（ｂ）処理試料中の複数の位置において移動可能な測定領域中の蛍光部分から放射される電磁放射線を検出するための検出器；ならびに
（ｃ）以下の工程：
（ｉ）個別のビン時間の間に前記複数の位置の各々について、閾値光子値より大きい光子の値を有する個別のビンを同定し、ここに閾値光子値より大きい光子値を有する各々のビン時間が個別の検出イベントを表し、
（ｉｉ）個別の検出イベントの合計の関数として処理試料中の蛍光部分の濃度を決定する、
に従って処理試料中の蛍光部分の濃度を決定するための処理器
を含む、分析器。
【請求項２】
電磁放射線源からの電磁放射線がマイクロウェルに対して移動する、請求項１に記載の分析器。
【請求項３】
マイクロウェルが電磁放射線源からの固定された電磁放射ビームに対して移動する、請求項１に記載の分析器。
【請求項４】
マイクロウェルおよび電磁放射線源からの電磁放射線ビームが互いに対して移動する、請求項１に記載の分析器。
【請求項５】
処理器が、検出器に操作可能であるように接続されている、請求項１に記載の分析器。
【請求項６】
処理器が閾値光子値を決定する、請求項１に記載の分析器。
【請求項７】
閾値光子値が処理試料におけるバックグラウンド光子値に対応する、請求項６に記載の分析器。
【請求項８】
閾値光子値が処理試料におけるバックグラウンド光子値の関数である、請求項６に記載の分析器。
【請求項９】
閾値光子値がバックグラウンド光子値より大きい標準偏差の固定された数である、請求項７に記載の分析器。
【請求項１０】
処理器が、複数の位置の位置ごとの移動可能な測定領域からの光子放射の値からバックグラウンド光子値を決定する、請求項７に記載の分析器。
【請求項１１】
処理器が、蛍光部分が存在しない複数の位置からの位置の移動可能な測定領域からの光子放射の値からバックグラウンド光子値を決定する、請求項７に記載の分析器。
【請求項１２】
処理器が、蛍光部分が存在しない複数の位置からの位置の移動可能な測定領域からの平均光子放出としてバックグラウンド光子値を決定する、請求項７に記載の分析器。
【請求項１３】
処理器が、移動可能な測定領域における平均光子放出レベルまたは二乗平均平方根光子放出レベルとしてバックグラウンド光子値を決定する、請求項７に記載の分析器。
【請求項１４】
バックグラウンド光子値は、処理試料に固有の数として各々の処理試料に対して計算される、請求項７に記載の分析器。
【請求項１５】
さらに、走査モーターシャフトの端に取り付けられた傾いた鏡を含み、傾いた鏡は電磁放射線源からの電磁放射ビームを処理試料へと屈折させる、請求項１に記載の分析器。
【請求項１６】
さらに、電磁放射線の光学走査のために構成された光学くさびを含む、請求項１に記載の分析器。
【請求項１７】
光学エレメントが顕微鏡対物レンズを含み、顕微鏡対物レンズの被写界深度および顕微鏡対物レンズに結像される開口部の直径が共に移動可能な測定領域を規定する、請求項１に記載の分析器。
【請求項１８】
光学エレメントが顕微鏡対物レンズを含み、顕微鏡対物レンズの被写界深度および電磁放射ビームの横方向範囲が共に移動可能な測定領域を規定する、請求項１に記載の分析器。
【請求項１９】
移動可能な測定領域と検出器との間に操作可能であるように接続され、且つ移動可能な測定領域から放出される電磁放射線を受けるように構成された減衰器を更に含み、処理器が更に、１以上のビンにおいて検出される光子の数が飽和閾値を上回るときに測定領域からの電磁放射線を減衰させるという命令を減衰器に対して出力するように構成される、請求項１に記載の分析器。
【請求項２０】
処理器が更に、ビン当たりの光子の総数を測定することにより、蛍光部分の濃度を決定するように構成される、請求項１に記載の分析器。
【請求項２１】
レーザービームを移動可能な測定領域へと屈折させるため、および刺激された蛍光部分を結像させるための共焦点光学配置を更に含み、前記共焦点光学配置は少なくとも０．６の開口数を有する対物レンズを含む、請求項１に記載の分析器。
【請求項２２】
各ビンの間に電磁放射線源から測定領域が受け取る全エネルギーが０．１〜１０マイクロジュールである、請求項１に記載の分析器。
【請求項２３】
電磁放射線源が、１０００マイクロ秒より短い継続時間にわたって蛍光部分を刺激する、請求項１に記載の分析器。
【請求項２４】
ビン時間は、蛍光部分が測定領域を横切る時間より長い、請求項１に記載の分析器。
【請求項２５】
ビン時間は、蛍光部分が測定領域を横切る時間よりも１／１０〜２倍長い、請求項１に記載の分析器。
【請求項２６】
ビン時間は、蛍光部分が測定領域を横切る時間と同じである、請求項１に記載の分析器。
【請求項２７】
処理試料中の蛍光部分の濃度を決定する方法であって、
（ａ）電磁放射線源からの電磁放射線をマイクロタイタープレートのマイクロウェルに保持される処理試料の測定領域に向ける工程；
（ｂ）測定領域を処理試料を通して処理試料における複数の位置に移動させる工程；
（ｃ）複数の位置で測定領域における蛍光部分から発せられた電磁放射線を検出する工程；
（ｄ）複数の位置の各々の位置において個別のビン時間の間に閾値光子値より大きい光子の値を有する個々のビンを同定し、ここに閾値光子値より大きい光子の値を有する各々の個々のビン時間は、個々の検出イベントを表し；
（ｅ）個別の検出イベントの総和の関数として処理試料中の蛍光部分の濃度を決定する工程
を含む、方法。
【請求項２８】
電磁放射線源からの電磁放射ビームがマイクロウェルに対して移動する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
マイクロウェルが電磁放射線源からの固定された電磁放射ビームに対して移動する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
マイクロウェルおよび電磁放射線源からの電磁放射ビームが互いに対して移動する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
処理器が検出器に操作可能であるように接続されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
処理器が閾値光子値を決定する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
閾値光子値が処理試料中のバックグラウンド光子値に対応する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
閾値光子値が、処理試料中のバックグラウンド光子値の関数である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
閾値光子値が、バックグラウンド光子値より大きい固定された数の標準偏差である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
処理器が、複数の位置の位置ごとに移動可能な測定領域からの光子放出の値からバックグラウンド光子値を決定する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
処理器が、蛍光部分が存在しない複数の位置からの位置における移動可能な測定領域からの光子放出の値からバックグラウンド光子値を決定する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
処理器が、蛍光部分が存在しない複数の位置からの位置における移動可能な測定領域からの平均光子放出としてバックグラウンド光子値を決定する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
処理器が、移動可能な測定領域における平均光子放出レベルまたは二乗平均平方根光子放出レベルとしてバックグラウンド光子値を決定する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
バックグラウンド光子値を、処理試料に固有の数として各々の処理試料に対して計算する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
さらに、走査モーターシャフトの端に取り付けられた傾いた鏡を含み、ここに傾いた鏡は電磁放射線源からの電磁放射ビームを処理試料へと屈折させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項４２】
さらに、電磁放射線源のシャフトに取り付けられた光学くさびを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項４３】
光学エレメントが顕微鏡対物レンズを含み、顕微鏡対物レンズの被写界深度および顕微鏡対物レンズに結像される開口部の直径が共に移動可能な測定領域を規定する、請求項２７に記載の方法。
【請求項４４】
光学エレメントが顕微鏡対物レンズを含み、顕微鏡対物レンズの被写界深度および電磁放射ビームの横方向範囲が共に移動可能な測定領域を規定する、請求項２７に記載の方法。
【請求項４５】
さらに、運動可能な測定領域及び検出器の間に操作可能なように接続された減衰器を含む請求項２７に記載の方法であって、減衰器が移動可能な測定領域から放出された電磁放射線を受けるよう構成されており、かつ処理器が更に、１以上のビンにおいて検出される光子の数が飽和閾値を上回るときに測定領域からの電磁放射線を減衰させるという命令を減衰器に対して出力するように構成される、方法。
【請求項４６】
さらに、処理器がビン１つあたりの光子の総数を測定することによって蛍光部分の存在または量を決定する、請求項２７に記載の方法。
【請求項４７】
さらに、レーザービームを移動可能な測定領域に屈折させ、刺激した蛍光部分を結像するための共焦点光学配置を含み、ここに共焦点光学配置が少なくとも０.６の開口数を有する対物レンズを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項４８】
各ビンの間に電磁放射線源から測定領域が受け取る全エネルギーが０．１〜１０マイクロジュールである、請求項２７に記載の方法。
【請求項４９】
電磁放射線源が、１０００マイクロ秒より短い継続時間にわたって蛍光部分を刺激する、請求項２７に記載の方法。
【請求項５０】
ビン時間は、蛍光部分が測定領域を横切る時間より長い、請求項２７に記載の方法。
【請求項５１】
ビン時間は、蛍光部分が測定領域を横切る時間の１／１０〜２倍長い、請求項２７に記載の方法。
【請求項５２】
ビン時間は、蛍光部分が測定領域を横切る時間と同じである、請求項２７に記載の方法。