(57)【要約】  ＪＣＶのagnoproteinおよびラージＴ抗原の遺伝子から生成されるｍＲＮＡに対して特異的であるスモール干渉ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉によって、これらのポリオーマウイルスおよび他のポリオーマウイルスの遺伝子の発現を阻害する。霊長類ポリオーマウイルスによる感染および霊長類ポリオーマウイルス感染に付随する疾患に対して、スモール干渉ＲＮＡを投与することによる処置が可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖とがＲＮＡデュプレックスを形成し、当該センスＲＮＡ鎖がＪＣＶのagnoprotein遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子のｍＲＮＡ、或いはそれらの選択的スプライス形態または変異体中の約１９〜約２５の連続するヌクレオチドである標的配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を含むものであることを特徴とするセンスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖とを含む単離されたｓiＲＮＡ。
【請求項２】
当該ＪＣＶのagnoprotein遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子の標的配列が、ＢＫＶまたはＳＶ４０遺伝子から生成されるｍＲＮＡ中にも含まれることを特徴とする請求項１に記載のｓiＲＮＡ。
【請求項３】
当該センスＲＮＡ鎖が１つのＲＮＡ分子を含み、当該アンチセンスＲＮＡ鎖が１つのＲＮＡ分子を含むものであることを特徴とする請求項１に記載のｓiＲＮＡ。
【請求項４】
当該ＲＮＡデュプレックスを形成するセンスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖が一本鎖のヘアピンによって共有結合されていることを特徴とする請求項１に記載のｓiＲＮＡ。
【請求項５】
当該ｓiＲＮＡが更に非ヌクレオチド物質を含むことを特徴とする請求項１に記載のｓiＲＮＡ。
【請求項６】
当該ｓiＲＮＡが、１つまたはそれ以上のヌクレオチドを付加、除去、置換または変性されたものであることを特徴とする請求項１に記載のｓiＲＮＡ。
【請求項７】
当該センスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖がヌクレアーゼによる分解に対して安定化されたものであることを特徴とする請求項１に記載のｓiＲＮＡ。
【請求項８】
更に３’オーバーハングを含むことを特徴とする請求項１に記載のｓiＲＮＡ。
【請求項９】
当該３’オーバーハングが１〜約６のヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項８に記載のｓiＲＮＡ。
【請求項１０】
当該３’オーバーハングが約２のヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項８に記載のｓiＲＮＡ。
【請求項１１】
当該センスＲＮＡ鎖が第一の３’オーバーハングを含み、当該アンチセンスＲＮＡ鎖が第二の３’オーバーハングを含むことを特徴とする請求項３に記載のｓiＲＮＡ。
【請求項１２】
当該第一および第二の３’オーバーハングが、それぞれ１〜約６のヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１１に記載のｓiＲＮＡ。
【請求項１３】
当該第一の３’オーバーハングがジヌクレオチドを含み、当該第二の３’オーバーハングもジヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１２に記載のｓiＲＮＡ。
【請求項１４】
当該第一および第二の３’オーバーハングに含まれるジヌクレオチドが、ジチミジル酸（「ＴＴ」）またはジウリジル酸（「ｕｕ」）であることを特徴とする請求項１３に記載のｓiＲＮＡ。
【請求項１５】
当該３’オーバーハングがヌクレアーゼによる分解に対して安定化されたものであることを特徴とする請求項８に記載のｓiＲＮＡ。
【請求項１６】
センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖とがＲＮＡデュプレックスを形成し、当該センスＲＮＡ鎖がＪＣＶのagnoprotein遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子のｍＲＮＡ、或いはそれらの選択的スプライス形態または変異体中の約１９〜約２５の連続するヌクレオチドである標的配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を含むものであることを特徴とするセンスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖とを含むｓiＲＮＡを発現する核酸配列を含む組換えプラスミド。
【請求項１７】
当該ｓiＲＮＡを発現する核酸配列が、誘導性または制御可能なプロモーターを含むものであることを特徴とする請求項１６に記載の組換えプラスミド。
【請求項１８】
当該ｓiＲＮＡを発現する核酸配列が、ヒトＵ６ ＲＮＡプロモーターの制御下でポリＴ終止配列と操作可能に連結するセンスＲＮＡ鎖コード配列とヒトＵ６ ＲＮＡプロモーターの制御下でポリＴ終止配列と操作可能に連結するアンチセンスＲＮＡ鎖コード配列とを含むものであることを特徴とする請求項１６に記載の組換えプラスミド。
【請求項１９】
当該プラスミドがＣＭＶプロモーターを含むものであることを特徴とする請求項１６に記載の組換えプラスミド。
【請求項２０】
センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖とがＲＮＡデュプレックスを形成し、当該センスＲＮＡ鎖がＪＣＶのagnoprotein遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子のｍＲＮＡ、或いはそれらの選択的スプライス形態または変異体中の約１９〜約２５の連続するヌクレオチドである標的配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を含むものであることを特徴とするセンスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖とを含むｓiＲＮＡを発現する核酸配列を含む組換えウイルスベクター。
【請求項２１】
当該ｓiＲＮＡを発現する核酸配列が、誘導性または制御可能なプロモーターを含むものであることを特徴とする請求項２０に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項２２】
当該ｓiＲＮＡを発現する核酸配列が、ヒトＵ６ ＲＮＡプロモーターの制御下でポリＴ終止配列と操作可能に連結するセンスＲＮＡ鎖コード配列とヒトＵ６ ＲＮＡプロモーターの制御下でポリＴ終止配列と操作可能に連結するアンチセンスＲＮＡ鎖コード配列とを含むものであることを特徴とする請求項２０に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項２３】
当該組換えウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびヘルペスウイルスベクターからなる群から選択されることを特徴とする請求項２０に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項２４】
当該組換えウイルスベクターが、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、またはモコラウイルスからの表面タンパク質によって偽型とされたことを特徴とする請求項２０に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項２５】
当該組換えウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクターであることを特徴とする請求項２３に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項２６】
ｓiＲＮＡがセンスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖とを含み、当該センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖とがＲＮＡデュプレックスを形成し、当該センスＲＮＡ鎖がＪＣＶのagnoprotein遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子のｍＲＮＡ、或いはそれらの選択的スプライス形態または変異体中の約１９〜約２５の連続するヌクレオチドである標的配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を含むものであることを特徴とする当該ｓiＲＮＡと薬理学的に許容されるキャリヤとを含む薬学的組成物。
【請求項２７】
当該ＪＣＶのagnoprotein遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子の標的配列が、ＢＫＶまたはＳＶ４０遺伝子から生成されるｍＲＮＡ中にも含まれることを特徴とする請求項２６に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
更にリポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン、リポソームを含むことを特徴とする請求項２６に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
請求項１６に記載のプラスミドまたはその生理学的に許容される塩と薬理学的に許容されるキャリヤとを含むことを特徴とする薬学的組成物。
【請求項３０】
更にリポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン、リポソームを含むことを特徴とする請求項２９に記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
請求項２０に記載のウイルスベクターと薬理学的に許容されるキャリヤとを含むことを特徴とする薬学的組成物。
【請求項３２】
ｓiＲＮＡがセンスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖とを含み、当該センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖とがＲＮＡデュプレックスを形成し、当該センスＲＮＡ鎖がＪＣＶのagnoprotein遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子のｍＲＮＡ、或いはそれらの選択的スプライス形態または変異体中の約１９〜約２５の連続するヌクレオチドである標的配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を含むものである当該センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖とを含むｓiＲＮＡの効果量を被験者に投与する段階を含むことを特徴とする霊長類ポリオーマウイルス遺伝子の発現を阻害する方法。
【請求項３３】
当該霊長類ポリオーマウイルス遺伝子がＪＣＶのＶＰ１遺伝子であることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
当該ＪＣＶのagnoprotein遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子の標的配列がＢＫＶまたはＳＶ４０遺伝子から生成されるｍＲＮＡにも含まれ、当該霊長類のポリオーマウイルス遺伝子がＢＫＶまたはＳＶ４０からの遺伝子であることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
当該ｓiＲＮＡが導入剤と共に投与されることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
当該導入剤が、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン、およびリポソームからなる群から選択されることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
当該導入剤がリポソームであることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
当該リポソームが、ＪＣＶに感染した細胞を当該リポソームの標的とするリガンドを含むものであることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
当該ＪＣＶに感染した細胞がヒト細胞であることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
当該リガンドが単クローン抗体を含むものであることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
当該リポソームがオプソニン化阻害部分によって改質されるものであることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
当該オプソニン化阻害部分がＰＥＧ、ＰＰＧ、またはそれらの誘導体を含むものであることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
当該ｓiＲＮＡが組換えプラスミドから発現されるものであることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項４４】
当該ｓiＲＮＡが組換えウイルスベクターから発現されるものであることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項４５】
当該組換えウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターからなる群から選択されることを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
当該組換えウイルスベクターが、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、またはモコラウイルスからの表面タンパク質によって偽型とされたことを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
当該組換えウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクターであることを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
２種以上のｓiＲＮＡが被験者に投与され、それぞれのｓiＲＮＡが異なるＪＣＶのagnoprotein遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子のｍＲＮＡ標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項４９】
２種以上のｓiＲＮＡが被験者に投与され、投与されるそれぞれのｓiＲＮＡが異なる標的ｍＲＮＡからの標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項５０】
当該ｓiＲＮＡが経腸投与ルートによって投与されることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項５１】
当該経腸投与ルートが、口、直腸、鼻腔からなる群から選択されることを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
当該ｓiＲＮＡが非経口投与ルートによって投与されることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項５３】
当該非経口投与ルートが、血管内投与、組織周囲および組織内投与、皮下注射または皮下デポジション、皮下注入、眼内投与、およびＪＣＶ感染部位またはその近辺への直接塗布からなる群から選択されることを特徴とする請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
当該血管内投与が、静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入、および血管系へのカテーテル点滴からなる群から選択されることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
ｓiＲＮＡがセンスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖とを含み、当該センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖とがＲＮＡデュプレックスを形成し、当該センスＲＮＡ鎖がＪＣＶのagnoprotein遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子のｍＲＮＡ、或いはそれらの選択的スプライス形態または変異体中の約１９〜約２５の連続するヌクレオチドである標的配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を含むものである当該センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖とを含むｓiＲＮＡの効果量を被験者に投与する段階を含むことを特徴とする被験者におけるＪＣＶの複製または感染を阻害する方法。
【請求項５６】
ｓiＲＮＡがセンスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖とを含み、当該センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖とがＲＮＡデュプレックスを形成し、当該センスＲＮＡ鎖がＪＣＶのagnoprotein遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子のｍＲＮＡ、或いはそれらの選択的スプライス形態または変異体中の約１９〜約２５の連続するヌクレオチドである標的配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を含むものであり、当該ＪＣＶのagnoprotein遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子の標的配列がＢＫＶまたはＳＶ４０の遺伝子から生成されるｍＲＮＡ中にも含まれるものである当該センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖とを含むｓiＲＮＡの効果量を被験者に投与する段階を含むことを特徴とする被験者におけるＢＫＶまたはＳＶ４０の複製または感染を阻害する方法。
【請求項５７】
ｓiＲＮＡがセンスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖とを含み、当該センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖とがＲＮＡデュプレックスを形成し、当該センスＲＮＡ鎖がＪＣＶのagnoprotein遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子のｍＲＮＡ、或いはそれらの選択的スプライス形態または変異体中の約１９〜約２５の連続するヌクレオチドである標的配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を含むものである当該センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖とを含むｓiＲＮＡの効果量をそのような処置が必要な被験者に投与する段階を含むことを特徴とする被験者におけるＪＣＶ感染に付随する疾患を処置する方法。
【請求項５８】
当該ＪＣＶ感染に付随する疾患が癌または脱髄性疾患であることを特徴とする請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
当該癌が脊髄芽腫またはグリア芽腫であることを特徴とする請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
ｓiＲＮＡがセンスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖とを含み、当該センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖とがＲＮＡデュプレックスを形成し、当該センスＲＮＡ鎖がＪＣＶのagnoprotein遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子のｍＲＮＡ、或いはそれらの選択的スプライス形態または変異体中の約１９〜約２５の連続するヌクレオチドである標的配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を含むものであり、当該ＪＣＶのagnoprotein遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子の標的配列がＢＫＶまたはＳＶ４０の遺伝子から生成されるｍＲＮＡ中にも含まれるものである当該センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖とを含むｓiＲＮＡの効果量をそのような処置が必要な被験者に投与する段階を含むことを特徴とする被験者におけるＢＫＶまたはＳＶ４０感染に付随する疾患を処置する方法。
【請求項６１】
当該ＢＫＶ感染に付随する疾患がポリオーマウイルスに付随する腎障害であることを特徴とする請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
当該ＳＶ４０感染に付随する疾患がＳＶ４０に誘発される癌であることを特徴とする請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
当該ＳＶ４０に誘発される癌が中皮腫であることを特徴とする請求項６２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、siＲＮＡ(small interfering RNA)干渉による、ヒト向神経性ポリオーマＪＣＶ発現等の霊長類ポリオーマウイルス遺伝子発現の抑制に関する。
【背景技術】
【０００２】
進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）は、潜在するポリオーマウイルスＪＣＶの再活性化およびヒト脳のグリア細胞におけるその増殖的複製に起因する中枢神経系（ＣＮＳ）の致死性脱髄性疾患である（Berger and Concha, 1995; Clifford and Major, 2001）。ＰＭＬは主にリンパ球増殖性疾患及び骨髄増殖性疾患による免疫系障害の患者に見られる稀な病気であったが、後天性免疫不全症候群（エイズ）患者の主な神経系疾患の１つになってきている（Cinque et al, 2003）。エイズ患者の４〜８％にＰＭＬの兆候が見られ、これに冒された患者の髄液（ＣＳＦ）からはＪＣＶが検出されており、これは脳内におけるウイルスの活性的複製を示唆するものである。
【０００３】
ＰＭＬの組織学的特徴は、乏突起神経膠芽細胞中の肥大した過染色性核を有する多巣性脱髄病変および脳の白質路内の肥大した異様な星状膠細胞を含む(Walker and Padgett, 1983; Clinque et al, 2003)。幾つかのケースにおいては、脱髄の単巣性パターンおよび灰白質の関与を伴う異型的特徴も報告されている(Sweeney et al., 1994; Cinque et al., 2003 JNV参照)。初期の観察においては、インビトロでの細胞培養による研究および臨床サンプル中のＪＣＶのインビボ検査によって、乏突起神経膠芽細胞および星状膠細胞のみが増殖性のウイルス感染を補助する細胞であると仮定された(Frisque and White, 1992; Gordon and Khalili, 1998)。従って、ＣＮＳ由来の細胞中のウイルス性初期ゲノムの細胞種に特異な転写の証拠が分子的研究により提供されたことになる(Raj and Khalili, 1995)。しかしながら、それ以降の研究によって、Ｂ細胞を含む非神経細胞中の僅かではあるが検出可能なレベルのＪＣＶ遺伝子発現およびヒトの幾つかの神経および非神経腫瘍細胞におけるウイルス性初期タンパク質の顕著に高レベルな生成が示されている(Gordon and Khalili, 1998; Khalili et al, 2003)。
【０００４】
ＪＣＶは、他のポリオーマウイルスと同様に、ゲノムを転写制御部位を含む３つの部位に分けることが可能な小さなＤＮＡウイルスであり、その遺伝子はウイルス初期タンパク質であるＴ抗原、およびウイルス後期タンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、の発現に必要である。加えて、後期ゲノムもウイルス補助タンパク質であるAgnoproteinの生成に関与するものである。Ｔ抗原の発現はウイルス溶菌サイクルの開始に重要なものであり、それはこのタンパク質が後期遺伝子の転写を誘発し、ウイルスＤＮＡの複製工程を誘導するという理由による(Frisque and White, 1992)。最近の研究では、その生成を抑制するとウイルス遺伝子発現および複製の相当の減少が見られることから、AgnoproteinがＪＣＶの転写および複製に重要な役割を果たすものと考えられている(Safak et al, 非公開の観察)。更に、agnoproteinは幾種のサイクリンおよびそれらに付随するキナーゼの発現を変化させることによって細胞サイクルを不規則なものにする(Darbinyan et al, 2002)。
【０００５】
現在に至るまで、ＪＣＶ複製の抑制およびＰＭＬの治療について有効な手段はない。ＰＭＬ患者の治療にシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）がテストされ、幾つかのケースにおいてＪＣＶ付随の脱髄を緩和するという結果が得られた(Aksami et al., 2001 JNV 7:386 およびその中の引用文献を参照)。しかしながら、エイズ・クリニカル・トライアル・グループ（ＡＣＴＧ）のオーガナイズド・トライアル２４３からのレポートでは、ＰＭＬに冒されたＨＩＶ患者の生存率は対照群との比較において差異がないとの示唆がなされている(Hall et al., 1998)。但し、他のレポートでは、ＡＣＴＧトライアルにおけるＡｒａＣの失敗は静脈および鞘内のルートを経たＡｒａＣの到達が不十分であった可能性が示唆されている(Levy et al)。ＪＣＶのＤＮＡ複製を抑制するトポイソメラーゼ・インヒビターの効力を示すインビトロ研究(Kerr et al., 1993)に基づき、トポイソメラーゼ・インヒビターであるトポテカンがＡＩＤＳ/ＰＭＬ患者の治療に用いられ、その結果はトポテカン治療により病巣の大きさが縮小し、生存率が伸びる可能性を示唆するものである(Royal et al., 2003)。
【０００６】
加えて、ＪＣＶ感染は、脊髄芽腫、グリア芽腫等を含む中枢神経系（ＣＮＳ）を発生源とする様々な腫瘍に関連づけられている(上記Del Valle L et al., (2001a)、Khalili K (1999))。ＣＮＳ腫瘍組織中のＴ抗原発現試験により、全ての腫瘍細胞がＴ抗原を発現するわけではないことが明らかになった。これらの腫瘍の他のウイルスタンパク質についての評価は、ＪＣＶゲノムを含有する腫瘍中のagnoproteinの相当なレベルを示すものである。DeValle L et al. (2002), J. Nat. Cancer Inst. 94(4): 267-273。
【０００７】
脳腫瘍細胞におけるagnogene発現の重要性については未知数である。１つの仮説は、Ｔ抗原とagnoproteinの相互作用、および内在細胞タンパク質との相互作用により、腫瘍細胞の成長速度を調節できるというものである。しかしながら、上述の研究からは、ＪＣＶのagnoproteinが幾つかのＣＮＳ新生物の発達および生長に関与すると考えられる。
【０００８】
ＲＮＡ干渉（以下、「ＲＮＡi」は多くの真核生物種で保存されている転写後の遺伝子調節方法である。ＲＮＡiは細胞中に存在する短い（即ち、＜３０ヌクレオチド）二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）分子によって誘発される(Fire A et al. (1998), Nature 391: 806-811)。「short干渉ＲＮＡ」または「ｓiＲＮＡ」と呼ばれるこれらの短いｄｓＲＮＡ分子は、ｓiＲＮＡと１つのヌクレオチド範囲内の配列相同性を有するメッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）の破壊を引き起こす(Elbashir SM et al. (2001), Genes Dev, 15: 188-200)。ｓiＲＮＡとターゲットｍＲＮＡは結合して、ターゲットｍＲＮＡを切断する「RNA-induced silencing complex」または「ＲＩＳＣ」となると考えられている。ｓiＲＮＡは複数ターンオーバー型酵素のよう再利用され、１つのｓiＲＮＡは約１０００のｍＲＮＡ分子を切断することができる。従って、ｍＲＮＡのｓiＲＮＡ介在型ＲＮＡｉ分解は、ターゲット遺伝子の発現を抑制する現存の技術よりも効果的なものである。
【０００９】
上述のElbashir SM et al. (2001)は、２１〜２２ヌクレオチド長であって、短い3’オーバーハングを有する合成ｓiＲＮＡが、ショウジョウバエ細胞可溶化物中のターゲットｍＲＮＡのＲＮＡiを誘発可能であることを示した。培養された哺乳類の細胞も合成ｓiＲＮＡによるＲＮＡi分解を示すものであり(Elbashir SM et al. (2001) Nature, 411: 494-498)、合成ｓiＲＮＡによって誘発されるＲＮＡi分解については、生きたマウスにおいて最近証明されている(McCaffrey AP et al. (2002), Nature, 418: 38-39; Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010)。ｓiＲＮＡ誘発ＲＮＡi分解による治療可能性については、ＨＩＶ-１感染のｓiＲＮＡ特異的抑制 (Novina CD et al. (2002), Nat Med. 8: 681-686)および神経毒性ポリグルタミン病タンパク質発現の減少(上述のXia H et al. (2002))を含む最近の幾つかのインビトロ研究によって証明されている。
【００１０】
従って、ＪＣＶ感染および複製を効果的に減少または停止させ、ＪＣＶ感染に伴う病気を治療するために必要なのは、霊長類ポリオーマウイルスの遺伝子、特にagnoproteinおよびラージＴ抗原遺伝子、の発現を特異的に阻害する、触媒量またはほぼ理論量の薬剤および方法である
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、霊長類ポリオーマウイルスの遺伝子からのｍＲＮＡ、特にＪＣＶのagnoproteinおよびラージＴ抗原遺伝子からのｍＲＮＡ、を特異的標的としそのＲＮＡi誘発分解を生じるｓiＲＮＡを指向するものである。これらのｓiＲＮＡはほぼ理論量のagnoproteinおよびラージＴ抗原のｍＲＮＡを分解するものである。本発明のｓiＲＮＡ化合物および組成物を、ＪＣＶ、ＢＫＶおよび/またはＳＶ４０感染および複製の阻害、並びにＪＣＶ、ＢＫＶおよび/またはＳＶ４０感染に伴う疾患の治療に用いることができる。本発明のｓiＲＮＡは、特に、癌または進行性多巣性白質脳症（ＰＬＭ）の治療に有用である。
【００１２】
従って、本発明は、ＪＣＶのagnoprotein遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子のｍＲＮＡ或いはそれらの選択的スプライス形態または変異体を標的とする単離されたｓiＲＮＡを提供するものである。このｓiＲＮＡは、ＲＮＡデュプレックスを形成するセンスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖とを含むものである。センスＲＮＡ鎖は、標的ｍＲＮＡ中の約１９〜約２５の連続するヌクレオチドである標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有する。ＢＫＶおよび/またはＳＶ４０遺伝子から生成されるｍＲＮＡはＪＣＶのｍＲＮＡと共通の配列を有することができ、従って、ＪＣＶのｍＲＮＡを標的とし分解する本発明のｓiＲＮＡは、ＢＫＶおよび/またはＳＶ４０のｍＲＮＡがＪＣＶのｍＲＮＡと共通の標的配列を含む場合に、ＢＫＶおよび/またはＳＶ４０のｍＲＮＡも標的とし分解するものである。
【００１３】
また、本発明は、本発明のｓiＲＮＡを発現する組換えプラスミドおよびウイルスベクター並びに本発明のｓiＲＮＡおよび薬理学的に許容されるキャリヤを含む薬学的組成物を提供するものである。
【００１４】
更に、本発明は、標的ｍＲＮＡが分解するように１種またはそれ以上の効果量のｓiＲＮＡを被験者に投与することを含む、ＪＣＶのagnoprotein遺伝子および/またはラージＴ抗原遺伝子のｍＲＮＡ、或いはそれらの選択的スプライス形態または変異体の発現を阻害する方法を提供するものである。
【００１５】
また、本発明は、ＪＣＶのagnoprotein遺伝子および/またはラージＴ抗原遺伝子のｍＲＮＡ、或いはそれらの選択的スプライス形態または変異体を標的とする１種またはそれ以上の効果量のｓiＲＮＡを被験者に投与することを含む、ＪＣＶのＶＰ１タンパク質の発現を阻害する方法を提供するものである。
【００１６】
更に、本発明は、ＪＣＶのagnoprotein遺伝子および/またはラージＴ抗原遺伝子のｍＲＮＡ、或いはそれらの選択的スプライス形態または変異体を標的とする効果量のｓiＲＮＡを被験者に投与することを含む、ＪＣＶの感染または複製を阻害する方法を提供するものである。
【００１７】
また、本発明は、ＪＣＶのagnoprotein遺伝子および/またはラージＴ抗原遺伝子のｍＲＮＡ、或いはそれらの選択的スプライス形態または変異体を標的とする効果量のｓiＲＮＡをそのような治療が必要な被験者に投与することを含む、癌またはＰＭＬ等のＪＣＶ感染に付随する疾患の処置方法を提供するものである。
【００１８】
本明細書中の全ての核酸配列は、それに反する記載がない限り、５’から３’方向に記載される。また、核酸配列中の全てのデオキシリボヌクレオチドは大文字（例えば、デオキシチミジンは「Ｔ」）で標記され、核酸配列中のリボヌクレオチドは小文字（例えば、ウリジンは「ｕ」）で標記される。
【００１９】
ヒトポリオーマウイルスであるＪＣＶは、２つの制御タンパク質をウイルス感染の初期（Ｔ抗原）および後期（agnoprotein）においてエンコードし、それらの活性はウイルスカプシドタンパク質の生成並びに幾つかのホスト・ファクターおよびそれらの機能を不規則なものにするために重要である。そこで我々はヒトの星状膠細胞中においてＴ抗原およびagnoproteinの発現を標的とするｓiＲＮＡによるＲＮＡ干渉方法を設計し、利用した。Ｔ抗原の保存された部位であるnt４２５６〜４２７６（Ｍａｄ−１株）を標的とする特定のｓiＲＮＡによる細胞の処置は、Ｔ抗原のレベルおよびそのウイルスカプシド遺伝子についての転写活性を５０％以上減少させた。同様に、agnoproteinのnt３２４〜３４２を標的とする単一のｓiＲＮＡは、ウイルスの初期および後期タンパク質の生産を顕著に減少させた。Ｔ抗原およびagnoproteinのｓiＲＮＡを組み合わせて感染細胞を処置することにより、ウイルスカプシドタンパク質の生成が完全に抑止され、これは感染細胞内におけるウイルスの増幅を効果的に停止させることができることを示すものである。これらの観察は、ＪＣＶに誘発される脱髄性疾患である進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）に冒された患者の新規な治療方法の可能性を提供するものである。
【００２０】
ＪＣＶのagnoprotein遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子のｍＲＮＡを標的とするｓiＲＮＡを含む組成物および方法は、ＪＣＶの感染および増幅を阻害するために、特にＪＣＶに付随する疾患を治療するために、好都合に用いられる。本発明のｓiＲＮＡはＲＮＡiを媒介とするこれらのｍＲＮＡの分解を誘発し、それによってＪＣＶのagnoprotein遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子によるタンパク質生成物が生成されなくなるか、量が減少して生成されるようになると考えられる。ＪＣＶのagnoprotein遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子はＪＣＶのライフサイクルに必要であるので、ｓiＲＮＡを媒介とするＪＣＶのagnoprotein遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子のｍＲＮＡの分解は、ＪＣＶ感染および、例えばＪＣＶに関連する脱髄性疾患といった、そのような感染に関連する全ての病状を抑制する。
【００２１】
ここで用いられる、「ＪＣＶのagnoprotein遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子のｍＲＮＡを標的とする」ｓiＲＮＡとは、二本鎖の第一鎖がＪＣＶのagnoprotein遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子のｍＲＮＡ配列の一部のヌクレオチド配列と実質的に同一であるｓiＲＮＡを意味する。ｓiＲＮＡの二本鎖の第二鎖は、ｓiＲＮＡの二本鎖の第一鎖とＪＣＶのagnoprotein遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子のｍＲＮＡの同一部分の双方に対して相補的ということになる。
【００２２】
本発明は、従って、標的ｍＲＮＡを標的とする長さが約１７ヌクレオチドから約２９ヌクレオチド、好ましくは約１９から約２５ヌクレオチド、である短い二本鎖ＲＮＡを含む単離されたｓiＲＮＡを提供するものである。このｓiＲＮＡは、標準的なワトソン−クリック塩基ペア相互作用によってアニールされたセンスＲＮＡ鎖および相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖（今後は「塩基ペア」と記す）を含むものである。以下に詳細に示されるように、センス鎖は標的ｍＲＮＡ中に含まれる標的配列と実質的に同一の核酸配列を含むものである。
【００２３】
ここで用いられる、標的ｍＲＮＡ中に含まれる標的配列と「実質的に同一」の核酸配列とは、標的配列と同一の或いはヌクレオチドの１つまたはそれ以上が標的配列と異なる核酸配列のことである。標的配列と実質的に同一の配列を含む本発明のセンス鎖は、そのようなセンス鎖を含むｓiＲＮＡが標的配列を含むｍＲＮＡのＲＮＡiを媒介とした分解を誘発することに特徴付けられる。例えば、本発明のｓiＲＮＡは、そのｓiＲＮＡによって標的ｍＲＮＡのＲＮＡiを媒介とした分解が誘発される限り、標的配列と１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のヌクレオチドが異なる核酸配列を含むセンス鎖を含むことができる。
【００２４】
本発明のｓiＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖は、２つの相補的な１本鎖ＲＮＡ分子を含むことができ、またはその中で２つの相補部分が塩基ペアであり、１本鎖の「ヘアピン」エリアによって共有結合されている単一分子を含むことができる。如何なる理論にとらわれることを望むものではなく、後者のタイプのｓiＲＮＡ分子のヘアピンエリアは「ダイサー」タンパク質（またはその均等物）によって細胞内で切断され、２つの個別の塩基ペアＲＮＡ分子を含むｓiＲＮＡを形成すると考えられている(上述のTuschi, T. (2002)を参照のこと)。以下に説明されるように、このｓiＲＮＡは１つまたはそれ以上のリボヌクレオチドの変性体、置換体、または改質体を含むことができる。例えば、本発明のｓiＲＮＡを変性、置換、または改質して１つ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基を含むようにすることが可能である。
【００２５】
ここで用いられる「単離された」とは、合成された、または自然の状態から人の手によって変性または取り出されたことを意味する。例えば、生きた動物中に自然に存在するｓiＲＮＡは「単離された」ものではないが、合成ｓiＲＮＡ、或いはその自然の状態における共存物質から部分的または完全に切り離されたｓiＲＮＡは「単離された」ものである。単離されたｓiＲＮＡは実質的に精製された形態、または例えばｓiＲＮＡを導入された細胞のような非自然的な環境、で存在することが可能である。一例として、自然のプロセスによって細胞内に精製されたｓiＲＮＡであるが、「単離された」前駆体分子から生成されたものはそれ自体「単離された」分子である。従って、単離されたｄｓＲＮＡを標的細胞中に導入することができ、そこでそれがダイサータンパク質（またはその均等物）によって操作され単離されたｓiＲＮＡとなる。
【００２６】
ここで用いられる「標的ｍＲＮＡ」とは、ＪＣＶのagnoprotein遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子のｍＲＮＡ或いはＪＣＶのagnoprotein遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子のｍＲＮＡの変異体または選択的スプライス形態である。他の霊長類のポリオーマウイルス（ＢＫＶまたはＳＶ４０等）からの遺伝子がＪＣＶの遺伝子と共通のヌクレオチド配列を含むものであることは理解される。従って、ＪＣＶのｍＲＮＡと共通のヌクレオチド配列を含むこれらの他の霊長類のポリオーマウイルスの遺伝子から生成されるｍＲＮＡ（例えば、図５および６を参照のこと）は、本発明の目的において「標的ｍＲＮＡ」である。ここで用いられる「霊長類のポリオーマウイルス」とは、霊長類、特にヒト、に感染する全てのポリオーマウイルスであり、ＪＣＶ、ＢＫＶ、およびＳＶ４０を含むものである。
【００２７】
霊長類のポリオーマウイルスの全ての種および株(strain)からのagnoprotein遺伝子ｍＲＮＡおよびラージＴ抗原遺伝子ｍＲＮＡを本発明の実施に用いることができる。好ましいagnoprotein遺伝子およびラージＴ抗原遺伝子のｍＲＮＡは、ＪＣＶ由来のものである。ＪＣＶのagnoprotein遺伝子のｍＲＮＡをエンコードする核酸配列は、ｃＤＮＡ均等物としてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に与えられている。
【００２８】
斯界に知られている他のＪＣＶのagnoprotein遺伝子のｍＲＮＡは、GenBank records Accession No. AF187236 (SEQ ID NO: 2)、Accession No. AF281599 (SEQ ID NO: 3)、Accession No. AF187234 (SEQ ID NO: 4)、Accession No. AF295737 (SEQ ID NO: 5)、およびAccession No. AF295739 (SEQ ID NO: 6)に（ｃＤＮＡ均等物として）開示されているものを含み、その開示全体がここに援用される。
【００２９】
ヒトＢＫポリオーマウイルス（ＢＫＶ）株またはＳＶ４０ポリオーマウイルスからのagnoproteinも知られている。ＢＫＶのagnoprotein遺伝子のｍＲＮＡの例は、GenBank record Accession No. M23122 (SEQ ID NO: 7)、およびD00678 (SEQ ID NO: 8)に（ｃＤＮＡ均等物として）与えられており、その開示はここに援用される。ＳＶ４０のagnoproteinの例は、GenBank record Accession No. M99359 (SEQ ID NO: 9)に（ｃＤＮＡ配列として）与えられており、その開示はここに援用される。
【００３０】
ＪＣＶのagnoproteinおよびラージＴ抗原の遺伝子から転写されるｍＲＮＡについても、斯界に広く知られる技術を用いて選択的スプライス形態について分析することが可能である。そのような技術には、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、およびインサイチュ・ハイブリダイゼーションが含まれる。ｍＲＮＡ配列の分析技術については、例えばBusting SA (2000)のJ. Mol. Endocrinol. 25： 169-193に記載されており、その開示はここに援用される。選択的スプライス形態のｍＲＮＡを確認する代表的方法については以下にも記載される。
【００３１】
例えば、ある病原遺伝子に関するヌクレオチド配列を含むデータベースを、選択的スプライス形態を確認するために用いることができる。そのようなデータベースはGenBankおよびEmbaseを含む。ｍＲＮＡまたはＪＣＶのagnoproteinおよびラージＴ抗原の遺伝子からの遺伝子配列をそのようなデータベースに問い合わせるために用いて、選択的スプライス形態を代表するＥＳＴが検出されたかについて決定することが可能である。
【００３２】
「ＲＮＡｓｅプロテクション」と呼ばれる技術も、ＪＣＶのagnoproteinおよびラージＴ抗原の遺伝子のｍＲＮＡの選択的スプライスを確認するために用いることができる。ＲＮＡｓｅプロテクションは遺伝子配列を合成ＲＮＡに翻訳することを含み、その合成ＲＮＡは他の細胞、例えば、agnoproteinおよびラージＴ抗原を発現するように誘発される細胞、に由来するＲＮＡにハイブリダイズされる。次に、ハイブリダイズされたＲＮＡは、ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッド不適正を認識する酵素と共に培養される。予想されるものよりも小さなフラグメントは選択的にスプライスされたｍＲＮＡの存在を示唆するものである。選択的スプライスと推定されるｍＲＮＡは、斯界の当業者に良く知られている方法を用いてクローン化し、配列することができる。
【００３３】
ＲＴ−ＰＣＲも、選択的にスプライスされたＪＣＶのagnoproteinおよびラージＴ抗原の遺伝子のｍＲＮＡを確認するために用いることができる。ＲＴ−ＰＣＲにおいては、斯界の当業者の範疇にある方法を用いて、既知の細胞またはＪＣＶのagnoproteinおよびラージＴ抗原を発現するように誘発された細胞からのｍＲＮＡが逆転写酵素によってｃＤＮＡに転換される。次に、ｃＤＮＡの全コード配列が、３’未翻訳部位に位置する順方向プライマーおよび５’未翻訳部位に位置する逆方向プライマーを用いるＰＣＲによって増幅される。増幅された生成物は、例えばその大きさを通常にスプライスされたｍＲＮＡから予想される生成物のそれと、例えばアガロースゲル電気泳動法を用いて、比較することによって分析することが可能である。増幅された生成物の大きさにおける如何なる変化も選択的スプライスを示唆する可能性がある。
【００３４】
ＪＣＶのagnoproteinおよびラージＴ抗原の遺伝子の変異体から生成されたｍＲＮＡについても、ＪＣＶのagnoproteinおよびラージＴ抗原の遺伝子のｍＲＮＡスプライス形態を識別するための上記の技術により容易に確認することができる。ここで用いられるＪＣＶのagnoproteinおよびラージＴ抗原の遺伝子またはｍＲＮＡの「変異体」は、ここで説明されるＪＣＶのagnoproteinおよびラージＴ抗原の遺伝子とは配列の異なるＪＣＶのagnoproteinおよびラージＴ抗原の遺伝子またはｍＲＮＡを含む。従って、ＪＣＶのagnoproteinおよびラージＴ抗原の遺伝子の対立形態、並びにそれらから生成されるｍＲＮＡ、は本発明の目的において「変異体」と考えられる。例えば、その開示がここに援用されるJobes DV et al. (1999), J. Human Virol. 2(6): 350-358に記載されるＣ末端部位において７−アミノ酸欠失を有するagnoproteinをエンコードするＪＣＶのagnoprotein遺伝子のｍＲＮＡを参照のこと。
【００３５】
ＪＣＶのagnoproteinの遺伝子およびラージＴ抗原の遺伝子のｍＲＮＡが、その各々の選択的スプライス形態または変異体と共通の標的配列、或いは霊長類ポリオーマウイルスの異なる株または種に由来する類似の遺伝子と共通の標的配列、を含む場合があるというのは理解される。従って、そのような共通の標的配列を含む単一のｓiＲＮＡは、共通の標的配列を含むこれらの異なるｍＲＮＡのＲＮＡiを媒介した分解を誘発することができる。例えば、ＪＣＶ遺伝子配列を標的とする本発明のあるｓiＲＮＡは、ＢＫＶおよびＳＶ４０遺伝子配列についても標的とすることができる。ＢＫＶ配列を標的とする本発明のｓiＲＮＡを、腎臓移植者に発生するポリオーマウイルス付随の腎障害（ＰＶＮ）を治療するために用いることが可能である。ＰＶＮはgraft lossの主要な原因であり、現在のところその治療法はない。ＳＶ４０遺伝子配列を標的とする本発明のｓiＲＮＡを、中皮腫を含むＳＶ４０に誘発される癌の治療に用いることが可能である。
【００３６】
例えば、塩基配列の同一性および非同一性部位を示すＪＣＶ、ＢＫＶ、およびＳＶ４０のagnoprotein遺伝子の核酸配列のアライメントは、図５に示されている。同様に、塩基配列の同一性および非同一性部位を示すＪＣＶ、ＢＫＶ、およびＳＶ４０のラージＴ抗原遺伝子の核酸配列のアライメントは、図６に示されている。
【００３７】
本発明のｓiＲＮＡは、部分的に精製されたＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、または組換えにより生成されたＲＮＡ、並びに１つまたはそれ以上のヌクレオチドの付加、除去、置換および/または変性によって自然発生によるＲＮＡとは異なる改質ＲＮＡ、を含むことができる。そのような改質には、ｓiＲＮＡの（両）端またはｓiＲＮＡの１つまたはそれ以上の内部ヌクレオチド等へ非ヌクレオチド物質を付加すること；ｓiＲＮＡをヌクレアーゼによる分解に抵抗性を持たせるように改質すること（例えば、２’−置換リボヌクレオチドの使用または糖−リン酸塩主鎖の改質）；或いはｓiＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドによって置換すること、が含まれる。血清、涙液、または他のヌクリアーゼ・リッチな環境に晒されるｓiＲＮＡ、或いは（例えば、点眼器によって）局所的に供給されるｓiＲＮＡが、そのヌクレアーゼに対する抵抗性を増加させるために改質されることが好ましい。例えば、血管を経てまたは局所的に目に投与されるｓiＲＮＡは、１つまたはそれ以上のホスホロチオエート結合を含むことができる。
【００３８】
本発明のｓiＲＮＡの片方または両方の鎖は、３’オーバーハングを含むこともできる。ここで用いられる「３’オーバーハング」とは、ＲＮＡ鎖の３’末端から延びる少なくとも１つの不対ヌクレオチドを指す。
【００３９】
従って、１つの実施例において、本発明のｓiＲＮＡは、（リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを含む）長さが１から約６のヌクレオチド、好ましくは長さが１から約５のヌクレオチド、より好ましくは長さが１から約４のヌクレオチド、特に好ましくは長さが約２から約４のヌクレオチド、の少なくとも１つの３’オーバーハングを含むものである。
【００４０】
ｓiＲＮＡ分子の両鎖が３’オーバーハングを含む実施例においては、オーバーハングの長さはそれぞれの鎖について同一でも異なっていてもよい。最も好ましい実施例においては、３’オーバーハングがｓiＲＮＡの両方の鎖に存在しており、その長さは２ヌクレオチドである。例えば、本発明のｓiＲＮＡのそれぞれの鎖は、ジチミジル酸（「ＴＴ」）またはジウリジル酸（「ｕｕ」）の３’オーバーハングを含むことができる。
【００４１】
本願のｓiＲＮＡの安定性を高めるために、３’オーバーハングについても分解に対して安定化させることが可能である。一つの実施例において、オーバーハングはアデノシンまたはグアノシンのヌクレオチド等のプリンのヌクレオチドを包含させることによって安定化させられる。その代わりに、例えば３’オーバーハング中のウリジンヌクレオチドを２’−デオキシチミジンにより置換する等によって改質された類似物によってピリミジンヌクレオチドを置換することは許容され、ＲＮＡi分解の効率に影響するものではない。特に、２’−デオキシチミジンに２’−ヒドロキシル基がない場合には、組織培養媒体中の３’オーバーハングのヌクレアーゼ抵抗を相当増加させる。
【００４２】
ある実施例においては、本発明のｓiＲＮＡは、ＡＡ（Ｎ１９）ＴＴまたはＮＡ（Ｎ２１）配列を含み、Ｎはどのヌクレオチドであってもよい。これらのｓiＲＮＡは約３０〜７０％のＧＣを含むものであり、約５０％のＧ/Ｃを含むことが好ましい。このセンスｓiＲＮＡ鎖の配列は（Ｎ１９）ＴＴまたはＮ２１（即ち、３〜２３位置）にそれぞれ対応するものである。後者の場合、センスｓiＲＮＡの３’末端はＴＴに転換される。この配列転換の原理は、センスおよびアンチセンス鎖の３’オーバーハングの配列組成に対して対称的な二重鎖を生成するということである。次に、アンチセンスＲＮＡ鎖は、センス鎖の１〜２１位置に対する相補鎖として合成される。
【００４３】
これらの実施例における２３−ヌクレオチドセンス鎖の１位置はアンチセンス鎖によって配列特異的には認識されないため、アンチセンス鎖の３’最端残基を慎重に選択することができる。しかしながら、アンチセンス鎖の最後から２番目のヌクレオチド（何れの実施例においても２３−ヌクレオチドセンス鎖の２位置に相補的である）は、一般的に標的配列に相補的である。
【００４４】
他の実施例において、本発明のｓiＲＮＡはＮＡＲ（Ｎ１７）ＹＮＮ配列を含み、Ｒはプリン（例えば、ＡまたはＧ）であり、Ｙはピリミジン（例えば、Ｃまたはｕ/Ｔ）である。従って、この実施例の２１−ヌクレオチドセンスおよびアンチセンスＲＮＡのそれぞれは、一般的にプリンヌクレオチドから始まる。そのようなｓiＲＮＡは標的サイトを変更することなくpol III発現ベクターにより発現させることが可能であり、この理由は最初に転写されるヌクレオチドがプリンの場合にのみpol IIIプロモーターからのＲＮＡの発現が有効であると考えられているということによる。
【００４５】
本発明のｓiＲＮＡは、全ての標的ｍＲＮＡ配列（「標的配列」）中の約１９〜２５の連続するヌクレオチドの如何なるストレッチをも標的とすることができる。ｓiＲＮＡの標的配列を選択するための技術は、例えば、２００２年１０月１１日に改訂されたTuschl T et al.による「ｓiＲＮＡユーザーガイド」に掲載されており、その全開示がここに援用される。「ｓiＲＮＡユーザーガイド」はDepartment of Cellular Biochemistry, AG 105, Max-Planck-Institute for Biophysical Chemistry, 37077 Goettingen, GermanyのDr. Thomas Tuschlによって管理されるワールドワイドウェブのウェブサイトで閲覧することができ、Max Planck Instituteのウェブサイトにアクセスして「ｓiＲＮＡ」をキーワードとして検索することによって検出することが可能である。従って、本願のｓiＲＮＡのセンス鎖は、標的ｍＲＮＡ中の約１９〜約２５のヌクレオチドの全ての連続ストレッチと実質的に同一のヌクレオチド配列を含んでいる。
【００４６】
一般的に、標的ｍＲＮＡの標的配列は標的ｍＲＮＡに対応する与えられたｃＤＮＡ配列から選択することができ、（３’方向からみて）開始コドンから５０〜１００ｎｔ下流から始まるものであることが好ましい。しかしながら、標的配列は、５’または３’未翻訳部分、或いは開始コドンに近い部位に位置していてもよい。適切な標的配列は表１に与えられている。表１には、ＡＡおよびＴＴジヌクレオチドも示されており、それらはそれぞれ標的配列の５’−および/３’−最末端に位置している。表１中の標的配列および標的鎖は、本発明の好ましいｓiＲＮＡのセンス鎖を含むものである。
【００４７】
【表１Ａ】
2007536937.tif 000002
【表１Ｂ】
2007536937.tif 000003
【００４８】
表１に記載されている標的配列はagnoprotein遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子のｃＤＮＡについてのものであることは理解され、従って、これらの配列は「Ｔ」によって示されるデオキシチミジンを含んでいる。斯界の当業者は、実際のｍＲＮＡの標的配列においては、デオキシチミジンはウリジン（「ｕ」）によって置き換えられることを理解するであろう。同様に、本発明のｓiＲＮＡに含まれる標的配列も、ｓiＲＮＡがジチミジル酸３’−オーバーハングを含む場合を除いて、デオキシチミジンの代わりにウリジンを含むものである。
【００４９】
本発明のｓiＲＮＡは、斯界の当業者に知られる数多くの技術を用いて得ることができる。例えば、ここにその全開示が援用されるTuschl et al.による米国公開公報2002/0086356に記載されるショウジョウバエ・インビトロシステム等の斯界に知られる方法を用いて、ｓiＲＮＡを化学的に合成または組換え生成することが可能である。
【００５０】
本発明のｓiＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクオシドホスホラミダイトおよび慣習的ＤＮＡ/ＲＮＡ合成装置を用いて化学的に合成されることが好ましい。ｓiＲＮＡは、２つの分離した相補的ＲＮＡ分子、または２つの相補的部位を有する１つのＲＮＡ分子として合成することが可能である。合成ＲＮＡ分子または合成薬剤の市販先には、Proligo社 (ハンブルグ,ドイツ)、Dharmacon Research社 (Lafayete, コロラド州,米国)、Pierce Chemical社 (Perbio Science社の一部, Rockford, イリノイ州,米国)、Glen Research社 (Sterling, バージニア州, 米国)、ChemGenes社 (Ashland, マサチューセッツ州, 米国)、およびCruachem社 (グラスゴー, 英国)が含まれる。
【００５１】
その代わりに、ｓiＲＮＡを適切なプロモーターを用いて、組換え環状または直鎖ＤＮＡプラスミドから発現することが可能である。プラスミドから本発明のｓiＲＮＡを発現するのに適切なプロモーターには、例えば、Ｕ６またはＨ１ ＲＮＡ pol IIIプロモーター配列およびサイトメガロスウイルス・プロモーターが含まれる。他の適切なプロモータの選択については視界の当業者の範疇にある。本発明の組換えプラスミドは、特定の組織または特定の細胞内環境におけるｓiＲＮＡの発現を誘発可能なまたは調節可能なプロモーターも包含することが可能である。
【００５２】
組換えプラスミドから発現されたｓiＲＮＡは、標準的な方法によって培養細胞発現システムから単離させるか、細胞内で発現させることが可能である。本発明のｓiＲＮＡをインビボで細胞に送るための組換えプラスミドの使用については、以下に詳細に説明される。
【００５３】
本発明のｓiＲＮＡは、２つの分離した相補的ＲＮＡ分子、または２つの相補的部位を有する１つのＲＮＡ分子として組換えプラスミドから発現することが可能である。
【００５４】
本発明のｓiＲＮＡを発現するのに適したプラスミドの選択、ｓiＲＮＡを発現するための核酸配列をプラスミドに導入する方法、目的とする細胞へ組換えプラスミドを到達させるための方法、については斯界の当業者の範疇にある。例えば、ここにその全開示が援用される、Tuschl, T. (2002), Nat. Biotechnol, 20: 446-448; Brummelkamp TR et al. (2002), Science 296: 550-553; Miyagishi M et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 497-500; Paddison PJ et al. (2002), Genes Dev. 16: 948-958; Lee NS et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 500-505;およびPaul CP et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 505-508を参照のこと。
【００５５】
１つの実施例において、本発明のｓiＲＮＡを発現するプラスミドは、ヒトＵ６ ＲＮＡプロモーターの制御下でポリＴ終止配列と操作可能に連結するセンスＲＮＡ鎖コード配列、およびヒトＵ６ ＲＮＡプロモーターの制御下でポリＴ終止配列と操作可能に連結するアンチセンスＲＮＡ鎖コード配列を含むものである。そのようなプラスミドを、本発明のｓiＲＮＡを発現するための組換えアデノ随伴ウイルスベクターを生成するために用いることが可能である。
【００５６】
ここで用いられる「ポリＴ終止配列と操作可能に連結する」とは、センスまたはアンチセンス鎖をコード化する核酸配列が、ポリＴ終止信号に対して５’方向に直接隣接するということを意味する。プラスミドからのセンスまたはアンチセンス配列の転写において、ポリＴ終止信号が転写を終結させるように作用する。
【００５７】
ここで用いられるプロモーターの「制御下」とは、センスまたはアンチセンス鎖をコード化する核酸配列がプロモーターの３’に位置していることを意味し、それによってプロモーターがセンスまたはアンチセンス・コード配列の転写を開始できる。
【００５８】
本発明のｓiＲＮＡは、インビボの細胞内において組換えウイルスベクターから発現させることも可能である。本発明の組換えウイルスベクターは、本発明のｓiＲＮＡをコード化する配列およびｓiＲＮＡ配列を発現するのに適したプロモーターを含むものである。適切なプロモータには、例えば、Ｕ６またはＨ１ ＲＮＡ pol IIIプロモーター配列およびサイトメガロウイルスプロモーターが含まれる。他の適切なプロモーターの選択は視界の当業者の範疇にある。本発明の組換えウイルスベクターは、特定の組織または特定の細胞内環境におけるｓiＲＮＡの発現を誘発可能なまたは調節可能なプロモーターも包含することが可能である。本発明のｓiＲＮＡをインビボの細胞に到達させるための組換えウイルスベクターの使用については以下により詳細に説明される。
【００５９】
本発明のｓiＲＮＡは、２つの分離した相補的ＲＮＡ分子、または２つの相補的部位を有する１つのＲＮＡ分子として組換えウイルスベクターから発現することが可能である。
【００６０】
発現されるｓiＲＮＡ分子のためのコード配列を受け入れることのできる全てのウイルスベクター、例えば、アデノウイルス（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）、ヘルペスウイルス等、を用いることができる。ウイルスベクターの親和性については、エンベロープたんぱく質または他のウイルスからの別の表面抗原を用いてベクターを偽型にすることによって、或いは異なるウイルスカプシドタンパク質を適切に置換することによって、改質することが可能である。
【００６１】
例えば、本発明のレンチウイルスを、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、モコラウイルス等からの表面タンパク質によって偽型とすることができる。本発明のＡＡＶベクターは、異なるカプシドタンパク質セロタイプを発現するように操作することによって、他の細胞を標的とするように作り変えることが可能である。例えば、セロタイプ２ゲノム上のセロタイプ２カプシドを発現するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２/２と呼ばれる。ＡＡＶ２/２ベクター中のこのセロタイプ２カブシド遺伝子を、ＡＡＶ２/５ベクターを生成するために、セロタイプ５カブシド遺伝子と置き換えることが可能である。異なるカプシドタンパク質セロタイプを発現するＡＡＶベクターを作る技術は斯界の当業者の範疇にあり、例えばその全開示がここに援用されるRabinowitz JE et al. (2002), J Virol 76: 791-801を参照のこと。
【００６２】
本発明において適切に用いられる組換えウイルスベクターの選択、ｓiＲＮＡを発現するための核酸配列をベクターに導入する方法、目的とする細胞へ組換えウイルスベクターを到達させるための方法、については斯界の当業者の範疇にある。例えば、ここにその全開示が援用される、Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis MA (1988), Biotechniques 6: 608-614; Miller AD (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; Anderson WF (1988), Nature 392: 25-30;およびRubinson DA et al., Nat. Genet. 33: 401-406を参照のこと。
【００６３】
好ましいウイルスベクターはＡＶおよびＡＡＶ由来のものである。特に好ましい実施例において、本発明のｓiＲＮＡは、例えば、Ｕ６またはＨ１ ＲＮＡプロモーターの何れか、或いはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む組換えＡＡＶベクターからの２つの分離した相補的単一鎖ＲＮＡ分子として発現される。
【００６４】
本発明のｓiＲＮＡを発現するのに適したＡＶベクター、組換えＡＶベクターを作る方法、標的細胞にベクターを到達させる方法、については、Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010に記載されている。
【００６５】
本発明のｓiＲＮＡを発現するのに適したＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターを作る方法、標的細胞にベクターを到達させる方法、については、その全開示が援用されるSamulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher KJ et al. (1996), J. Virol., 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; U.S. Pat. No. 5,252,479; U.S. Pat. No. 5,139,941; International Patent Application No. WO 94/13788およびInternational Patent Application No. WO 93/24641に記載されている。
【００６６】
与えられた標的配列を含有するｓiＲＮＡの標的ｍＲＮＡのＲＮＡiを媒介とする分解能は、細胞中のＲＮＡまたはタンパク質のレベルを測定する標準的な技術を用いて評価することが可能である。例えば、本発明のｓiＲＮＡをＪＣＶに感染した培養細胞に導入することができ、標的ｍＲＮＡのレベルをノーザンプロット法またはドットブロット法、或いは量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定することができる。その代わりに、培養細胞中のagnoproteinまたはラージＴ抗原のレベルをＥＬＩＳＡまたはウエスタンプロット法により測定することもできる。培養細胞をＪＣＶに感染させる適切なプロトコール、培養細胞へのｓiＲＮＡの導入、培養細胞中のタンパク質およびｍＲＮＡレベルの検出法については斯界の当業者の範疇である（例えば、下記の実施例を参照のこと）。
【００６７】
上述のように、本発明の目的であるｓiＲＮＡは、ＪＣＶのagnoprotein遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子のｍＲＮＡ或いはそれらの選択的スプライス形態または変異体のＲＮＡiを媒介とする分解を起こすことができる。本発明のｓiＲＮＡが他の霊長類ポリオーマウイルス遺伝子（例えば、ＢＫＶおよび/またはＳＶ４０の遺伝子）と共通の標的配列を含む場合には、当該ｓiＲＮＡはこれらの他の霊長類ポリオーマウイルス遺伝子から生成されるｍＲＮＡについても同様に分解することが可能である。本願のｓiＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの分解は、これらの遺伝子からの機能的遺伝子生成物の生成を減少させ、他のＪＣＶ遺伝子（ＶＰ１遺伝子等）の発現についてもこれを妨げるか減少させる。従って、本発明は、標的とするｍＲＮＡを分解するように被験者に対して効果量のｓiＲＮＡを投与することを含む、被験者中のagnoprotein遺伝子、ラージＴ抗原遺伝子、またはその他のＪＣＶ遺伝子（ＶＰ１等）の発現を抑制する方法を提供するものである。また、本発明は、本願のｓiＲＮＡによるＲＮＡiを媒介とする分解によって被験者中のＪＣＶウイルス感染および/または複製を抑制する方法を提供するものである。
【００６８】
本発明のｓiＲＮＡを、斯界に知られるＪＣＶに付随の疾患または他の霊長類ポリオーマウイルスによる疾患の治療に用いることも可能である。例えば、ＪＣＶ感染は、脱髄性疾患であるＰＭＬを起源とする（脊髄芽腫、グリア芽腫を含む）中枢神経系（ＣＮＳ）の癌に付随するものである。従って、本願は、被験者に本発明の１種以上の効果量のｓiＲＮＡを投与することを含む、ＪＣＶ、ＢＫＶおよび/またはＳＶ４０感染に付随する疾患の処置方法を提供するものである。
【００６９】
ここで用いられる「ＪＣＶ感染に付随する疾患」とは、活性的または潜在的ＪＣＶ感染の存在に関連する全ての疾患および障害を意味する。ＪＣＶ感染に付随する疾患の例は、脊髄芽腫、グリア芽腫等のＣＮＳ癌、およびＰＭＬ等の脱髄性疾患である。ここで用いられる「ＢＫＶ感染に付随する疾患」とは、活性的または潜在的ＢＫＶ感染の存在に関連する全ての疾患および障害を意味し、ポリオーマウイルス付随の神経障害を含む。ここで用いられる「ＳＶ４０感染に付随する疾患」とは、活性的または潜在的ＳＶ４０感染の存在に関連する全ての疾患および障害を意味し、中皮腫等のＳＶ４０誘発性癌を含む。
【００７０】
ここで用いられるＪＣＶ感染に付随する疾患を「処置する」とは、疾患に付随する症状が悪化せず、これを軽減するか防止することを意味する。ＪＣＶに付随する疾患の症状についての評価は斯界の当業者の範疇にある。
【００７１】
本発明の実施において、ＪＣＶのagnoprotein遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子のｍＲＮＡ中の異なる標的配列を含む２種以上のｓiＲＮＡを被験者に投与することが可能である。好ましい実施例においては、そのそれぞれがＪＣＶのagnoprotein遺伝子およびラージＴ抗原遺伝子ｍＲＮＡからの標的配列を含む２種以上のｓiＲＮＡが被験者に投与される。
【００７２】
ここで用いられる「被験者」には、ヒトおよびヒト以外の動物が含まれる。被験者は、好ましくはヒトである。
【００７３】
ここで用いられるｓiＲＮＡの「効果量」とは、標的とするｍＲＮＡのＲＮＡiを媒介とする分解を起こすのに十分な量、または被験者のＪＣＶ、ＢＫＶ、および/またはＳＶ４０感染に付随する疾患を処置するのに十分な量である。
【００７４】
標的ｍＲＮＡのＲＮＡiを媒介とする分解は、上述のようにｍＲＮＡまたはタンパク質を単離し定量化する標準的な技術を用いて、被験者の細胞中の標的ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを測定することによって検出することが可能である。
【００７５】
本発明のｓiＲＮＡが亜当量のＲＮＡ干渉を媒介することができることは理解される。如何なる理論にも拘束されることを望むものではなく、本発明のｓiＲＮＡは標的ｍＲＮＡを分解するためのＲＩＳＣを触媒的手段で誘発するものと考えられる。従って、霊長類のポリオーマウイルス（例えば、ＪＣＶ、ＢＫＶおよび/またはＳＶ４０）の複製または感染を阻害する標準的な技術と比較して、相当に少ないｓiＲＮＡを被験者に投与しても治療効果を得ることができる。
【００７６】
斯界の当業者は、被験者の身長および体重、ＪＣＶ感染または疾患の程度、年齢、被験者の健康状態および性別、投与のルート、投与が部分的なものか全身的なものか、等の要素を考慮して、被験者に投与される本発明のｓiＲＮＡの効果量を容易に決定することができる。一般的に、本発明のｓiＲＮＡの効果量は、新血管形成部位またはその近辺の細胞間濃度にして約１ナノモル（ｎＭ）から約１００ｎＭ、好ましくは約２ｎＭから約５０ｎＭ、より好ましくは約２．５ｎＭから約１０ｎＭである。本発明のｓiＲＮＡの特に好ましい効果量は、新血管形成部位またはその近辺の細胞間濃度にして約１ｎＭ、約５ｎＭ、または約２５ｎＭである。それ以上または以下の効果量のｓiＲＮＡを投与することも考慮される。
【００７７】
ＪＣＶ、ＢＫＶおよび/またはＳＶ４０感染に付随する疾患を治療するために、本発明のｓiＲＮＡを本願のｓiＲＮＡとは異なる薬剤と組み合わせて被験者に投与することが可能である。例えば、本発明のｓiＲＮＡの投与を、癌の治療または腫瘍の転移防止のために現在用いられている治療方法（放射線療法、化学療法、外科手術等）と組み合わせて行うことが可能である。腫瘍の治療に関して、放射線治療、またはシスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン、タモキシフェン等の化学療法剤と組み合わせて本発明のｓiＲＮＡを被験者に投与することが好ましい。
【００７８】
本発明の方法において、ｓiＲＮＡをそのままの形態、または導入剤と組み合わせて、あるいはｓiＲＮＡを発現する組換えプラスミドまたはウイルスベクターとして被験者に投与することが可能である。
【００７９】
本願のｓiＲＮＡと組み合わせての投与に適した導入剤には、Mirus Transit TKO 親油性剤、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン（ポリリシン等）、リポソームが含まれる。好ましい導入剤はリポソームである。
【００８０】
リポソームはｓiＲＮＡを網膜または腫瘍組織等の特定の組織に導入する補助となり、ｓiＲＮＡの血中半減期を増加させることができる。本発明において使用に適したリポソームは、中性または負電荷のリン脂質およびコレステロール等のステロールを一般的に含む標準的なベシクル形成脂質から形成される。脂質については、通常は、所望されるリポソームの大きさ、血流中でのリポソームの半減期等の要素を考慮することによって選択される。リポソームを調製するための様々な方法が知られており、例えば、ここにその全開示が援用されるSzoka et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467および米国特許第4,235,871号、第4,501,728号、第4,837,028号、第5,019,369号に記載されている。
【００８１】
本発明のｓiＲＮＡを包むリポソームは、ＪＣＶ、ＢＫＶおよび/またはＳＶ４０等の霊長類ポリオーマウイルスに感染した細胞を当該リポソームの標的とすることができるリガンド分子を含むものであることが好ましい。
【００８２】
本発明のｓiＲＮＡを包むリポソームは、例えば、その構造表面にオプソニン化阻害部分を結合させることによって、単核マクロファージおよび細網内皮系による排除を避けるように改質されることが特に好ましい。１つの実施例において、本発明のリポソームはオプソニン化阻害部分とリガンドの両方を有することが可能である。
【００８３】
本発明のリポソームの調製に用いられるオプソニン化阻害部分は、典型的には、リポソーム膜に結合するラージ親水性ポリマーである。ここで用いられるように、例えば、膜自体との相互作用によって、または膜脂質の活性基へ直接結合することによって、脂溶性アンカーが化学的または物理的に膜に付着したときに、オプソニン化阻害部分はリポソーム膜に「結合する」。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、例えばここにその全開示が援用される米国特許第4,920,016号に記述されているように、マクロファージ-単球系（ＭＭＳ）および細網内皮系（ＲＥＳ）によるリポソームの摂取を相当減少させる保護表面を形成する。従って、オプソニン化阻害部分によって改質されたリポソームは、未改質のリポソームに比較して遥かに長く循環に留まる。この理由により、そのようなリポソームはときに「ステルス」リポソームと呼ばれる。
【００８４】
ステルスリポソームは、多孔性または「漏出性」微小血管系により栄養を与えられる組織に蓄積することが知られている。従って、そのような微小血管系の欠陥によって特徴付けられる組織、例えば、固形腫瘍は、これらのリポソームを十分に蓄積する（Gabizon, et al. (1988), P.N.A.S., USA, 18: 6949-53参照）。加えて、ＲＥＳによる摂取の減少は、肝臓および脾臓への過剰な蓄積を妨げることによってステルスリポソームの毒性を低下させる。従って、オプソニン化阻害部分によって改質された本発明のリポソームは、本発明のｓiＲＮＡを腫瘍細胞に移送するのに特に適している。
【００８５】
リポソームの改質に適したオプソニン化阻害部分は、数平均分子量が約５００〜約４００００ダルトン、より好ましくは約２０００〜約２００００ダルトン、である水溶性ポリマーであることが好ましい。そのようなポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、例えば、メトキシＰＥＧまたはメトキシＰＰＧ、およびＰＥＧステアレートまたはＰＰＧステアレート；合成ポリマー、例えば、ポリアクリルアミドまたはポリＮ−ビニルピロリドン；直鎖、分枝、またはデンドリマー、ポリアミドアミン；ポリアクリル酸；ポリアルコール、例えば、カルボキシル基またはアミノ基とガングリオシドＧＭ１等のガングリオシドとが化学的に結合したポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、が含まれる。ＰＥＧコポリマー、メトキシＰＥＧコポリマー、またはメトキシＰＰＧコポリマー、或いはそれらの誘導体も適している。加えて、オプソニン化阻害ポリマーは、ＰＥＧとポリアミノ酸、ポリサッカリド、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドの何れかとのブロックコポリマーであることができる。また、オプソニン化阻害ポリマーは、例えば、ガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギナン酸等のアミノ酸またはカルボン酸を含む天然ポリサッカリド；アミノ化ポリサッカリドまたはオリゴサッカリド（直鎖または分枝）；例えば、カルボン酸の誘導体と反応し生じたカルボキシル基と結合したカルボキシル化ポリサッカリドまたはオリゴサッカリド、であることができる。
【００８６】
オプソニン化阻害部分は、ＰＥＧ、ＰＰＧ、またはそれらの誘導体であることが好ましい。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体によって改質されたリポソームはときに「ＰＥＧ化リポソーム」と呼ばれる。
【００８７】
オプソニン化阻害部分は、数多くの良く知られた技術の何れかを用いてリポソーム膜に結合させることができる。例えば、ＰＥＧのＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステルをホスファチジル-エタノールアミン脂溶性アンカーに結合させた後、膜に結合させることが可能である。同様に、Na(CN)BH3とテトラヒドロフラン及び水の３０：１２混合溶媒とを６０℃で用いて、デキストランポリマーをステアリルアミン脂溶性アンカーとの還元的アミノ化によって誘導体化することが可能である。
【００８８】
本発明のｓiＲＮＡを発現する組換えプラスミドは上述されている。そのような組換えプラスミドについても、直接、またはMirus Transit LT1 親油性剤、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン（ポリリシン等）、またはリポソーム等の適切な導入剤と組み合わせて、投与することが可能である。本発明のｓiＲＮＡを発現する組換えウイルスベクターについても上述されており、そのようなベクターをＪＣＶに感染した被験者の細胞に導入する方法は斯界の当業者の範疇にある。
【００８９】
本発明のｓiＲＮＡを、例えば、ＪＣＶ、ＢＫＶおよび/またはＳＶ４０等の霊長類ポリオーマウイルスに感染した細胞にｓiＲＮＡを導入するのに適した全ての手段により被験者に投与することが可能である。例えば、遺伝子ガン、エレクトロポレーション、或いは他の適切な非経口的または経腸的投与ルートによってｓiＲＮＡを投与することができる。
【００９０】
適切な経腸的投与ルートには、口、直腸、鼻腔が含まれる。
【００９１】
適切な非経口的投与ルートには、血管内投与（例えば、静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入、および血管系へのカテーテル点滴）；組織周囲または組織内投与（例えば、腫瘍周囲および腫瘍内注射、網膜内注射または網膜下注射）、皮下注射または（浸透圧ポンプによる）皮下注入を含む皮下デポジション；例えば、カテーテルまたは（角膜ペレットまたは座薬、点眼剤、或いは多孔性、非多孔性、またはゼラチン状物質を含むインプラント等の）他のプレースメント機器による、新血管形成箇所またはその近辺部位への直接（局所的）塗布；および吸入が含まれる。適切なプレースメント機器には、ここにその全開示が援用される米国特許第5,902,598号および第6,375,972号に記載される眼内インプラント、並びに米国特許第6,331,313号に記載される生分解性眼内インプラントが含まれる。そのような眼内インプラントは、Control Delivery Systems, Inc. (Watertown、マサチューセッツ州)およびOculex Pharmaceuticals, Inc. (Sunnyvale、カリフォルニア州)から入手可能である。
【００９２】
好ましい実施例において、ｓiＲＮＡの注射または注入は、霊長類ポリオーマウイルスの感染部位またはその近辺に対して行われる。
【００９３】
本発明のｓiＲＮＡは単回投与されてもよいし、複数回投与されてもよい。本発明のｓiＲＮＡの投与が注入によるものである場合、注入は１回の徐放的投与であってもよいし、複数回の注入であってもよい。
【００９４】
斯界の当業者は、特定の被験者に対する本発明のｓiＲＮＡの投与についての適切な投与計画を容易に決定することができる。例えば、霊長類ポリオーマウイルスの感染部位またはその近辺に１回注射またはデポジションすることによって、本発明のｓiＲＮＡを被験者に対して１回投与することが可能である。その代わりに、被験者に対して本発明のｓiＲＮＡを、毎日または毎週、複数回投与することもできる。例えば、本発明のｓiＲＮＡを約３週間〜約２８週間、より好ましくは約７週間〜約１０週間、の期間に渡って週に１回被験者に投与することが可能である。好ましい投与計画において、本発明のｓiＲＮＡは週に１回、７週間に渡って霊長類ポリオーマウイルスの感染部位またはその近辺に注射される。ＰＭＬ等の脱髄性疾患を患っている被験者に対しては、本発明のｓiＲＮＡの期間投与が無期限にならざるを得ない場合があることは理解される。
【００９５】
投与計画がｓiＲＮＡの複数回の投与またはそれぞれが異なる標的配列を含む２種以上のｓiＲＮＡの投与である場合には、被験者に投与されるｓiＲＮＡの効果量は投与計画全体を通じて投与されたｓiＲＮＡの総量となり得ることは理解される。
【００９６】
本発明のｓiＲＮＡは、斯界に知られる技術に従って、被験者に投与される前に医薬組成物として配合されることが好ましい。本発明の医薬組成物は、少なくとも滅菌されていて発熱物質を含まないものであることに特徴付けられる。ここに用いられる「医薬的配合」とはヒトおよび動物に使用される配合を含むものである。本発明の医薬組成物を調製する方法は斯界の当業者の範疇にあり、例えば、その全開示がここに援用されるRemington’s Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)に記載されている。
【００９７】
本発明の医薬的配合は、本願のｓiＲＮＡ（例えば、０．１〜９０重量％）または生理学的に許容されるキャリア媒体と混合された生理学的に許容されるその塩を含むものである。好ましい生理学的に許容されるキャリア媒体は、水、緩衝水、通常生理食塩水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸、等である。
【００９８】
本発明の医薬組成物は、従来の医薬賦形剤および/または添加剤も含むことができる。適切な医薬賦形剤には、安定剤、抗酸化剤、重量オスモル調整剤、緩衝剤、およびｐＨ調整剤が含まれる。適切な添加剤には、生理学的に生体適合性の緩衝剤（例えば、塩酸トロメタミン）、chelantの付加物（例えば、ＤＴＰＡまたはＤＴＰＡ−ビスアミド等）、カルシウムキレート錯体（例えば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド）、或いは、任意に、カルシウムまたはナトリウム塩の付加物（例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、乳酸カルシウム）が含まれる。本発明の医薬組成物は、使用に際して液体形体で容器に入れることも、凍結乾燥させることも可能である。
【００９９】
固体の組成物に関しては、従来の無毒性固体キャリア、例えば、医薬レベルのマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウム、等を用いることができる。
【０１００】
例えば、経口投与用の固体医薬組成物は、上述のリストにある全てのキャリアおよび賦形剤と１０〜９５％、好ましくは２５％〜７５％、の１種以上の本発明のｓiＲＮＡを含むことができる。エアロゾル（吸入用）投与のための医薬組成物は、上述のリポソームに包含された０．０１〜２０重量％、好ましくは１〜１０重量％、の１種またはそれ以上の本発明のｓiＲＮＡと噴射剤とを含むことができる。例えば、鼻腔導入用のレシチンといったキャリアについても必要に応じて包含することが可能である。
【０１０１】
次に、本発明を以下の非制限的実施例によって説明する。
実施例
【０１０２】
ＰＭＬの治療においては、ＪＣＶ遺伝子の発現と複製とを効果的に阻害することが第一のそして最も重要なステップであるので、初期（Ｔ抗原）および後期（Agnoprotein）ゲノムによって発現されるウイルス制御タンパク質の発現を標的とするためにＲＮＡ干渉を用いた。結果は、Ｔ抗原とagnoproteinとを標的とするｓiＲＮＡを組み合わせて感染細胞を処置することによって、神経膠細胞内のウイルス性カプシドタンパク質の生成が完全に抑止されたことを示した。
【０１０３】
実験の第一段階において、私たちが設計したｓiＲＮＡがＪＣＶのＴ抗原の発現を抑制する能力について評価を行った。ヒト胎児の一次星状膠細胞にＴ抗原（ｐＣＭＶ−Ｔ抗原）を発現するプラスミドを導入し、次に、細胞にＴ抗原を標的とするｓiＲＮＡオリゴヌクレオチドを導入した。図１に示すように、Ｔ抗原のｓiＲＮＡによる細胞の処置はＴ抗原のレベルを減少させたが、無関係の細胞タンパク質であるｇｒｂ−２の生成について減少させることはなかった。ｓiＲＮＡによるＴ抗原の抑制を更に証明するために、Ｔ抗原のｓiＲＮＡによる細胞の処置において、星状膠細胞内におけるＴ抗原によるＪＣＶ後期プロモーター（ＪＣＶ１）の活性化のレベルを試験する機能アッセイを行った。結果は、Ｔ抗原によるＪＣＶ１転写活性が５０％以上減少したことを示し、観察されたｓiＲＮＡによるＴ抗原レベルの減少は、ウイルス後期ゲノムの発現を誘発するその能力についての機能的帰結を示唆するものであった。感染の間にＴ抗原のｓiＲＮＡがウイルス遺伝子発現を抑制する能力を調べるために、ヒト胎児の一次星状膠細胞をＪＣＶのＭａｄ−４株に感染させ、感染後１、５、１０日目に、細胞にＴ抗原のｓiＲＮＡオリゴヌクレオチドを導入した。感染後１５日目のウイルスタンパク質の分析結果は、対照の細胞と比較して、ｓiＲＮＡ処置細胞におけるＴ抗原の劇的な抑制、agnoproteinの最低限の減少、ウイルスカプシドタンパク質であるＶＰ１のレベルの顕著な減少を示した。ウイルス感染とｓiＲＮＡ処置の何れもｇｒｂ-２の生成レベルに影響を与えるものではなかった。
【０１０４】
ｓiＲＮＡによってＴ抗原を標的とする私たちの戦略が、agnoproteinおよび主要なカプシドタンパク質であるＶＰ１の生成において部分的な効果しか有さなかったため、第二段階として、ＪＣＶのagnoproteinの発現を標的とするｓiＲＮＡを設計し、これを用いた。前回と同様、agnoproteinのサイレンシング発現におけるagnoproteinのｓiＲＮＡの有効性を導入アッセイにより最初にテストした。図２Ａに示されるように、ＹＦＰ−agnoproteinを発現する細胞にagnoproteinのｓiＲＮＡオリゴヌクレオチドを導入することによって細胞中のagnoproteinの生成が劇的に抑制された。興味深いことに、ＪＣＶゲノムの類似部位とは２つのヌクレオチドが異なるだけのポリオーマウイルスであるＢＫＶからのagnoprotein用に設計されたｓiＲＮＡは、導入された細胞中でのＪＣＶのagnoproteinの発現を抑制することができず、設計されたｓiＲＮＡの高い特異性レベルが証明された。同様に、ＪＣＶのagnoproteinのｓiＲＮＡであってＢＫＶのagnoproteinのｓiＲＮＡではないものが、ＪＣＶに感染したヒト胎児星状膠細胞におけるＪＣＶのagnoproteinの生成を劇的に抑制した。特筆すべきことは、ｓiＲＮＡによるagnoproteinの消滅がウイルス初期タンパク質であるＴ抗原の生成に影響を及ぼしたということである。この観察は、agnoproteinがＴ抗原の発現を促進させることを示唆するものである。また、ＶＰ１レベルの顕著な減少が、ＪＣＶのagnoproteinのｓiＲＮＡによって処置された細胞中に見出された。
【０１０５】
次段階の実験において、Ｔ抗原およびagnoproteinの両方のｓiＲＮＡの組み合わせを、ウイルス初期および後期制御タンパク質の発現を阻止し、ウイルスの主要なカプシドタンパク質の発現レベルを試験するために用いた。Ｔ抗原およびＹＦＰ-agnoproteinを発現するプラスミドを導入した細胞から得られた結果は、両方のｓiＲＮＡによって処置された細胞におけるＴ細胞およびagnoproteinの双方のレベルの劇的な減少を示すものであった。感染後、処置された細胞からのタンパク質抽出物のウェスタンプロット分析によってはいずれのタンパク質に対応するバンドも検出されなかったことから、ＪＣＶに感染した細胞におけるｓiＲＮＡによる処置はＴ抗原およびＶＰ１の発現を完全に抑止するものであった。両方のｓiＲＮＡによる細胞の処置によって、感染細胞におけるagnoproteinのレベルが減少した。Ｔ抗原およびagnoproteinのｓiＲＮＡによるＴ抗原およびＶＰ１の完全な抑制は、ウイルス遺伝子発現およびタンパク質生成についての組み合わせ処置の有効性を示すものである。
【０１０６】
代わりの手法として、ウイルス制御タンパク質の１方または両方を標的とするｓiＲＮＡによる処置において、感染細胞中のウイルスタンパク質のレベルおよび細胞下の位置を評価するために免疫細胞化学を用いた。図４に示されるように、高レベルのＴ抗原およびＶＰ１が発現され、ＪＣＶに感染したヒト胎児一次星状膠細胞の核中に適正に集中した。また、前述のレポート(Del Valle et al, 2001b; Radhakrishnan et al, 2003; Okada et al, 2001)に一致して、ＪＣＶ感染細胞において細胞質内の核周囲蓄積による高レベルのagnoproteinが観察された。これらの細胞をＴ抗原のｓiＲＮＡによって処置することにより、Ｔ抗原およびＶＰ１の両方の発現が劇的に減少したが、agnoproteinの生成については最低限の効果しか得られなかった。AgnoproteinのｓiＲＮＡによる処置は、agnoproteinおよびＶＰ１のレベルの大幅な減少を生じ、全部ではないが幾つかの感染細胞の核中でのＴ抗原の出現の抑制につながった。類似の条件下においてＢＫＶのagnoproteinのｓiＲＮＡは、Ｔ抗原、ＶＰ１、またはagnoproteinの生成について何の効果も有さなかったことから、観察された現象は特異的なものであるといえる。ＪＣＶのＴ抗原およびagnoproteinを標的とするｓiＲＮＡによる感染細胞の処置は、ウイルス初期および後期遺伝子の双方の発現をサイレンシングし、２つのウイルス制御タンパク質用のｓiＲＮＡによる感染細胞の処置は、ＪＣＶに感染したヒト星状膠細胞中におけるウイルス遺伝子の発現を効果的に阻害することを示唆するものである。
【０１０７】
哺乳類の細胞中におけるウイルス複製に対する細胞内免疫化は、ウイルス遺伝子の発現と効果的に干渉するタンパク質および/またはＲＮＡの発現によって行うことが可能である。この点に関し、スモール干渉ＲＮＡおよびｓiＲＮＡ等の小さな分子を用いることによって遺伝子の発現を干渉するＲＮＡの使用は、近年、そのウイルス遺伝子発現に影響を与える能力によって特に注目されている(Gitlin et al, 2002; Jacque et al, 2002; Ying et al, 2003; Chang and Taylor, 2003)。一旦形成されると、ｓiＲＮＡは標的ｍＲＮＡを認識して分解するタンパク質複合体中に組み込まれることができる(Gitlin and Andino, 2003)。この研究において、我々はウイルス初期制御タンパク質であるＴ抗原およびウイルス後期制御タンパク質であるagnoproteinに対応するＪＣＶゲノムの２つの部位に対して、２１ヌクレオチドのｓiＲＮＡデュプレックスを導入した。ＪＣＶの初期ゲノムを標的とする理論的根拠は、ウイルスＤＮＡの複製およびカプシドタンパク質に責任を有するウイルス後期ゲノムの発現を含むウイルス溶解サイクルを開始するためにＴ抗原の発現が必須の初期イベントであるということを示す確立された情報に基づくものである。結果は、Ｔ抗原用の１種のｓiＲＮＡデュプレックスがＴ抗原のレベルを減少させることができる一方で、減少したレベル、即ち５０％以上、であろうとも後期遺伝子発現およびカプシド生成を誘発するのに十分なＴ抗原が存在することを示した。Ｔ抗原のｓiＲＮＡが感染細胞中におけるより強い効果を示した一方で、一過性的な導入アッセイにおいてはｓiＲＮＡがＴ抗原プラスミドの２４時間後に導入されたため、Ｔ抗原発現ベクターが導入されたのと同一の細胞に到達しなかった可能性について注意すべきである。更に、安定した細胞系の研究においては、このｓiＲＮＡがＴ抗原の発現を完全に抑止したことを示している（データ非表示）。
【０１０８】
Agnoproteinの制御機能に帰する前述の結果に照らして、我々はagnoproteinの生成を標的とするｓiＲＮＡを発展させ、その使用によってウイルス初期および後期タンパク質の生成についても５０％以上減少させることができることを示した。我々はagnoproteinのｓiＲＮＡが、ＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方でＴ抗原の発現を相当抑制することについても観察した(Safak et al, 非公開の観察)。何れのｓiＲＮＡもＪＣＶのカプシドタンパク質であるＶＰ１を直接の標的とするものではなかったが、我々はそれらの組み合わせることによって当該タンパク質の生成を完全に停止させることに成功した。主要なカプシドタンパク質であるＶＰ１が感染性ビリオンの生成に必須であるということに照らして、ＶＰ１の発現をＴ抗原およびagnoproteinを標的とすることを通して阻害することができ、増殖的感染を抑止することが可能になることは非常に興味深いことである。これらのデータは、ＲＮＡ干渉技術によってＪＣＶゲノムの発現を効果的に制御することができることを示すものである。ＪＣＶ等の二重鎖ＤＮＡウイルスのゲノム安定性並びにＴ抗原およびagnoproteinの両方がウイルスの複製に必須であるという事実は、これらの２つのタンパク質を魅力的な医療用の標的とするものである。
〔参照文献〕
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【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】一過性導入され感染したヒト一次星状膠細胞におけるＪＣＶのＴ抗原のｓiＲＮＡによるＪＣＶタンパク質発現の減少。  ヒト胎児の一次星状膠細胞を以前に記述されたように調製し、５０００００細胞/wellの密度で６個のウェル・プレートに接種した（Radhakrishnan et al, 2003）。一過性導入に関して、ＦｕＧＥＮＥ６を用いてＪＣＶのＴ抗原を発現するプラスミドを細胞に導入した（Kerr et al, 1993）。その翌日、ＪＣＶのＭａｄ−１株のｎｔ４２５６-４２７６（センス鎖５’-ＡＡＧＵＣＵＵＵＡＧＧＧＵＣＵＵＣＵＡＣＣＵｄＴｄＴ−３’）標的とするＪＣＶのＴ抗原の二重鎖２１ｂｐのｓiＲＮＡを細胞に導入した。このｓiＲＮＡは、二重鎖、２’-脱保護、脱塩オリゴヌクレオチドとして調製され、製造元（Dharmacon社）の用法に基づいて使用された。ｓiＲＮＡの導入に関して、１００ｐｍｏｌのｓiＲＮＡを３ｕｌのオリゴフェクタミン（Invitrogen社）と混合し、ＯｐｔｉＭＥＭ（Invitrogen社）によって希釈し、血清および抗生物質のない状況下において細胞培養地と共に３７℃で４時間培養した。導入の後、ｓiＲＮＡ導入混合物を除去することなく、細胞に血清含有培地を与えた。Ａ．  ｓiＲＮＡの導入から２４時間後に感染星状膠細胞から調製された全細胞抽出物について、Ｔ抗原（pAb416, Oncogene Science社）および無関係のタンパク質であるgrb-2の存在をウエスタンブロット法によって分析した（それぞれ上および下パネル）。Ｂ．  平行して、１．０ｕｇのＪＣＶＴ抗原発現プラスミドとＪＣＶ後期プロモーター（Ｍａｄ−１株）を含む０．５ｕｇのルシフェラーゼ・レポーター構成物とを導入した検体をｓiＲＮＡで処置した２４時間後に取り出し、製造元の指示（Promega luciferase assay system）に従ってルシフェラーゼ活性を測定した。活性は、１〜４の実験において任意に設定されたＪＣＶの後期プロモーターの背景活性に対する変化で示されている。標準偏差は誤差棒によって表されている。Ｃ．  一次星状膠細胞を血清を含まない培地中でM.O.Iが１においてＪＣＶのＭａｄ-４株に３７℃で３時間感染させた。次に、感染の１、５、１０日後にＴ抗原のｓiＲＮＡを非感染および感染細胞に導入して１５日目に取り出した。ＪＣＶの初期および後期タンパク質、Ｔ抗原（pAb416, Oncogene Research Products社）、agnoprotein（Del Valle et al, 2001a）、ＶＰ１（pAb597, Brown UniversityのWalter Atwood氏より提供）に加えて細胞タンパク質であるgrb-2（pAb81, BD Biosciences社）についてもその存在を全細胞抽出物についてウエスタンブロット法によって分析した。ホースラディッシュペルオキシダーゼを接合した二次抗体およびＥＣＬ-Ｐｌｕｓシステム（Amersham社）を用いてタンパク質を可視化した。
【図２】ヒト一次星状膠細胞におけるＪＣＶのagnoproteinのｓiＲＮＡによるagnogeneの発現および他のウイルスタンパク質の減少。  ヒト胎児の一次星状膠細胞の調製、一過性導入、ｓiＲＮＡ処置、およびウエスタンブロット法を明細書本文および図１の説明に記載されるように行った。ＹＦＰに融合させたＪＣＶのagnoproteinを含むプラスミド（Darbinyan et al, 2002）を細胞に導入した。ＪＣＶのagnoproteinのｓiＲＮＡは、ＪＣＶのＭａｄ−１株のｎｔ３２４-３４２（センス鎖５’-ＡＡＣＣＵＧＧＡＧＵＧＧＡＡＣＵＡＡＡｄＴｄＴ−３’）を標的とし、一方、非特異性ｓiＲＮＡ（ｎｓ ｓiＲＮＡ）は、ＢＫＪのダンロップ株のｎｔ４３５-４５３（センス鎖５’-ＡＡＣＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＡＣＡＡＡＡｄＴｄＴ−３’）を標的とした。ＪＣＶとＢＫＶのagnoprotein配列間の２つの塩基対の不一致はアンダーラインで示されている。Ａ．  特異的または非特異的なｓiＲＮＡの導入から２４時間後に感染星状膠細胞から調製された全細胞抽出物について、agnoproteinおよび無関係の細胞要素であるgrb-2の存在をウエスタンブロット法によって分析した（それぞれ上および下パネル）。Ｂ．  次に、ＪＣＶのＭａｄ-４株に感染/非感染の一次星状膠細胞にＪＣＶのagnoproteinまたは非特異的なＢＫＶのagnoproteinのｓiＲＮＡを感染の１、５、１０日後に導入し、１５日目に取り出した。ＪＣＶのＴ抗原、agnoprotein、ＶＰ１に加えて細胞タンパク質であるgrb-2についてもその存在を全細胞抽出物についてウエスタンブロット法によって分析した。
【図３】ＪＣＶのＴ抗原およびagnoproteinを標的とするｓiＲＮＡの処置によるヒト一次星状膠細胞におけるそれらの発現並びに感染細胞におけるＪＣＶ後期タンパク質であるＶＰ１の発現の抑止。  ヒト胎児の一次星状膠細胞の調製、一過性導入、ｓiＲＮＡ処置、およびウエスタンブロット法を明細書本文および図１の説明に記載されるように行った。Ａ．  ＪＣＶのＴ抗原、ＹＦＰ-agnoprotein、またはその両方を発現するプラスミドを導入した星状膠細胞からの全細胞抽出物をｓiＲＮＡによる処置の２４時間後の培養物から調製し、Ｔ抗原、agnoproteinに加えて無関係のgrb-2についてもその存在をウエスタンブロット法によって分析した。Ｂ．  星状膠細胞培養物をＪＣＶのＭａｄ-４株に感染させ、感染の１、５、１０日後にＪＣＶのＴ抗原、agnoprotein、またはその両方を標的とするｓiＲＮＡを導入した。感染の１５日後に取り出した全細胞抽出物について、ＪＣＶのＴ抗原、agnoprotein、に加えてウイルス後期タンパク質であるＶＰ１と細胞タンパク質であるgrb-2についてもその存在をウエスタンブロット法によって分析した。
【図４】ＪＣＶに感染した一次星状膠細胞の免疫細胞化学により判明したＪＣＶのＴ抗原およびagnoproteinのｓiＲＮＡ処置によるＪＣＶタンパク質のレベルの変化。  細胞をＪＣＶに感染させ、感染の１、５、１０日後にＪＣＶのＴ抗原、agnoprotein、またはその両方を標的とするｓiＲＮＡで処置した。細胞をＢＫＶのｓiＲＮＡによっても処置した。細胞を継代培養し、第１３日目にポリ-Ｌ-リシンで被覆されたチャンバースライド（Falcon）に移植し、感染後１５日目に氷で冷やしたアセトンを用いて３分間固定した。ウイルスタンパク質をウエスタンブロット法と同様の一次抗体を用いて以前に述べた免疫細胞化学（Radhakrishan et al, 2003）によって検出した。フルオレセインを接合した二次抗体を用いてタンパク質を可視化した。
【図５】ＪＣＶ、ＢＫウイルス（ＢＫＶ）、およびＳＶ４０のagnoproteinの遺伝子からの核酸配列のアラインメントを示す。同一の塩基は灰色で示されており、非同一の塩基は白で示されている。
【図６ａ】ＪＣＶ、ＢＫＶ、およびＳＶ４０のＴ抗原の遺伝子からの核酸配列のアラインメントを示す。同一の塩基は灰色で示されており、非同一の塩基は白で示されている。
【図６ｂ】ＪＣＶ、ＢＫＶ、およびＳＶ４０のＴ抗原の遺伝子からの核酸配列のアラインメントを示す。同一の塩基は灰色で示されており、非同一の塩基は白で示されている。
【図６ｃ】ＪＣＶ、ＢＫＶ、およびＳＶ４０のＴ抗原の遺伝子からの核酸配列のアラインメントを示す。同一の塩基は灰色で示されており、非同一の塩基は白で示されている。
【図６ｄ】ＪＣＶ、ＢＫＶ、およびＳＶ４０のＴ抗原の遺伝子からの核酸配列のアラインメントを示す。同一の塩基は灰色で示されており、非同一の塩基は白で示されている。
【図６ｅ】ＪＣＶ、ＢＫＶ、およびＳＶ４０のＴ抗原の遺伝子からの核酸配列のアラインメントを示す。同一の塩基は灰色で示されており、非同一の塩基は白で示されている。
【図６ｆ】ＪＣＶ、ＢＫＶ、およびＳＶ４０のＴ抗原の遺伝子からの核酸配列のアラインメントを示す。同一の塩基は灰色で示されており、非同一の塩基は白で示されている。
【図６ｇ】ＪＣＶ、ＢＫＶ、およびＳＶ４０のＴ抗原の遺伝子からの核酸配列のアラインメントを示す。同一の塩基は灰色で示されており、非同一の塩基は白で示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図６ｆ】
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【図６ｇ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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