(57)【要約】  チミジンホスホリラーゼの遷移状態構造が、遷移状態阻害剤のデザインのための青写真として提供される。チミジンホスホリラーゼの遷移状態の電荷および形状に似ている幾つかのチミジンホスホリラーゼ阻害剤が、提供される。チミジンホスホリラーゼを阻害する方法、ガンを処置する方法、および血管新生を阻害する方法も提供され、これらの方法は、チミジンホスホリラーゼの該遷移状態阻害剤を利用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
チミジンホスホリラーゼの遷移状態阻害剤であって、該遷移状態阻害剤が、該チミジンホスホリラーゼの遷移状態の電荷および形状に似ている化合物である、遷移状態阻害剤。
【請求項２】
図２の化合物１〜２２、それらの塩、およびそれらのホスホン酸エステル誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載の遷移状態阻害剤。
【請求項３】
図２の化合物９〜１２、それらの塩、およびそれらのホスホン酸エステル誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載の遷移状態阻害剤。
【請求項４】
図７の化合物２３〜２９、それらの塩、およびそれらのホスホン酸エステル誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載の遷移状態阻害剤。
【請求項５】
図７の化合物３０〜３２、それらの塩、およびそれらのホスホン酸エステル誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載の遷移状態阻害剤。
【請求項６】
図７の化合物２３、２６、および２９、それらの塩、およびそれらのホスホン酸エステル誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載の遷移状態阻害剤。
【請求項７】
医薬的に許容可能な賦形剤中の、請求項１に記載の遷移状態阻害剤。
【請求項８】
チミジンホスホリラーゼを阻害する方法であって、該チミジンホスホリラーゼを、請求項１に記載の遷移状態阻害剤と組み合わせることを含む方法。
【請求項９】
前記遷移状態阻害剤が、図２の化合物１〜２２、それらの塩、およびそれらのホスホン酸エステル誘導体からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記遷移状態阻害剤が、図２の化合物９〜１２、それらの塩、およびそれらのホスホン酸エステル誘導体からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記遷移状態阻害剤が、図７の化合物２３〜２９、それらの塩、およびそれらのホスホン酸エステル誘導体からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記遷移状態阻害剤が、図７の化合物３０〜３２、それらの塩、およびそれらのホスホン酸エステル誘導体からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記遷移状態阻害剤が、図７の化合物２３、２６、および２９、それらの塩、およびそれらのホスホン酸エステル誘導体からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記チミジンホスホリラーゼが、哺乳類チミジンホスホリラーゼである、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記チミジンホスホリラーゼが、ヒトチミジンホスホリラーゼである、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
前記チミジンホスホリラーゼが、生存細胞中にある、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が、生存哺乳類の一部である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳類が癌を有するヒトである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記癌が、結腸癌、結腸直腸癌、消化管癌、もしくはアデノカルシノーマである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記癌の組織が、チミジンホスホリラーゼを発現させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヒトが、前記チミジンホスホリラーゼの化学療法ヌクレオシド基質を用いて処置されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記化学療法ヌクレオシドが、５−フルオロ−２’−デオキシウリジンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
哺乳類において癌を処置する方法であって、該哺乳類へ、請求項１に記載の遷移状態阻害剤を投与することを含む方法。
【請求項２４】
前記遷移状態阻害剤が、図２の化合物１〜２２、それらの塩、およびそれらのホスホン酸エステル誘導体からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記遷移状態阻害剤が、図２の化合物９〜１２、それらの塩、およびそれらのホスホン酸エステル誘導体からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記遷移状態阻害剤が、図７の化合物２３〜２９、それらの塩、およびそれらのホスホン酸エステル誘導体からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記遷移状態阻害剤が、図７の化合物３０〜３２、それらの塩、およびそれらのホスホン酸エステル誘導体からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記遷移状態阻害剤が、図７の化合物２３、２６、および２９、それらの塩、およびそれらのホスホン酸エステル誘導体からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記癌が、結腸癌、結腸直腸癌、消化管癌、もしくはアデノカルシノーマである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記癌の組織が、チミジンホスホリラーゼを発現させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記哺乳類が、前記チミジンホスホリラーゼの化学療法ヌクレオシド基質を用いて処置されているヒトである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記化学療法ヌクレオシドが、５−フルオロ−２’−デオキシウリジンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
哺乳類において血管新生を阻害する方法であって、該哺乳類へ、請求項１に記載の遷移状態阻害剤を投与することを含む方法。
【請求項３４】
前記遷移状態阻害剤が、図２の化合物１〜２２、それらの塩、およびそれらのホスホン酸エステル誘導体からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記遷移状態阻害剤が、図２の化合物９〜１２、それらの塩、およびそれらのホスホン酸エステル誘導体からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記遷移状態阻害剤が、図７の化合物２３〜２９、それらの塩、およびそれらのホスホン酸エステル誘導体からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記遷移状態阻害剤が、図７の化合物３０〜３２、それらの塩、およびそれらのホスホン酸エステル誘導体からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記遷移状態阻害剤が、図７の化合物２３、２６、および２９、それらの塩、およびそれらのホスホン酸エステル誘導体からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記哺乳類が、癌を有するヒトである、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記癌が、結腸癌、結腸直腸癌、消化管癌、もしくはアデノカルシノーマである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記癌の組織が、チミジンホスホリラーゼを発現させる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記哺乳類が、リューマチ関節を有するヒトである、請求項３３に記載の方法。
【請求項４３】
前記哺乳類が、過剰な血管新生を特徴とする網膜疾患を有するヒトである、請求項３３に記載の方法。
【請求項４４】
前記哺乳類が、粥状硬化を有するヒトである、請求項３３に記載の方法。
【請求項４５】
前記哺乳類が、子宮内膜症を有するヒトである、請求項３３に記載の方法。
【請求項４６】
前記哺乳類が、肥満のヒトである、請求項３３に記載の方法。
【請求項４７】
チミジンホスホリラーゼの阻害剤をデザインする方法であって、該チミジンホスホリラーゼの遷移状態の電荷および形状に似ている化合物をデザインすることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００３年９月５日出願の米国仮出願第６０／５００，８４７号の利益を請求する。
【０００２】
連邦協賛研究開発についての陳述
米国政府は本発明において支払い済みのライセンスを持っており、限られた条件下、ＮＩＨにより承認された第ＧＭ４１９１６号の支払いにより準備されるような合理的な状況において、本特許権者が他者にライセンスを付与するよう要求する権利を持っている。
【０００３】
（１）本発明分野
本発明は一般的に、酵素阻害剤に関する。より具体的には、本発明は、チミジンホスホリラーゼの遷移状態構造、チミジンホスホリラーゼの遷移状態類似体阻害剤のデザインのための青写真としてのその使用、チミジンホスホリラーゼの遷移状態類似体阻害剤、ならびにそれら阻害剤を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
（２）関連技術の記載
文献
Aoki T et al. (2002) Correlation between malignancy grade and p53 in relation to thymidine phosphorylase activity in colorectal cancer patients. Oncol. Rep. 9 (6): 1267-71.
Bainbridge JW et al. (2003) Gene therapy for ocular angiogenesis. Clin. Sci. (Lond) 104 (6): 561-75.
Brown NS, Bicknell R. (1998) Thymidine phosphorylase, 2-deoxy-D-ribose and angiogenesis. Biochemical Journal 334 (Pt1): 1-8.
Burke-Gaffney A et al. (2002) Regulation of chemokine expression in atherosclerosis. Vascul. Pharmacol. 38 (5): 283-92.
Cole C et al. (1999) A similarity model for the human angiogenic factor, thymidine phosphorylase/platelet derived-endothelial cell growth factor. Anticancer Drug Des. 14 (5): 411-20.
Crandall DL et al. (1997) A review of the microcirculation of adipose tissue: anatomic, metabolic, and angiogenic perspectives. Microcirculation 4 (2): 211-32.
Gudas LJ, Ullman B, Cohen A, Martin DW Jr. (1978) Deoxyguanosine toxicity in a mouse T lymphom: relationship to purine nucleoside phosphorylase-associated immune dysfunction. Cell 14 (3): 531-8.
Hotchkiss KA et al. (2003) Mechanisms by which tumor cells and monocytes expressing the angiogenic factor thymidine phosphorylase mediate human endothelial cell migration. Cancer Res. 63 (2): 527-33.
Igawa H et al. (2003) Influence of platelet-derived entothelial cell growth factor/thymidine phosphorylase on the cell cycle in head and neck squamous cell carcinoma in vitro. Oncol. Rep. 10 (4): 967-71.
Kicska GA et al. (2001) Immucillin H, a powerful transition-state analog inhibitor of purine nucleoside phosphorylase, selectively inhibits human T lymphocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (8): 4593-8.
Moghaddam A, Zhang HT, Fan TP, Hu DE, Lees VC, Turley H, Fox SB, Gatter KC, Harris AL, Bicknell R. (1995) Thymidine phosphorylase is angiogenic and promotes tumor growth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 (4): 998-1002.
Paleolog EM (2002) Angiogenesis in rheumatoid arthritis. Arthritis Res. 4 (suppl 3): S81-S90.
Reynolds LP et al. (2002) Angiogenesis in the female reproductive organs: pathological implications. Int. J. Exp. Pathol. 83 (4): 151-63.
Reynolds K, Farzaneh F, Collins WP, Campbell S, Bourne TH, Lawton F, Moghaddam A, Harris AL, Bicknell R. (1994) Association of ovarian malignancy with expression of platelet-derived endothelial cell growth factor. Journal of the National Cancer Institute. 86 (16): 1234-8.
Sato J et al. (2003) Role of thymidine phosphorylase on invasiveness and metastasis in lung adenocarcinoma. Int. J. Cancer 106 (6): 863-70.
Takao S, Akiyama Sl, Nakajo A, Yoh H, Kitazono M, Natsugoe S, Mivadera K, Fukushime M, Yamada Y, Ailcou T. (2000) Suppression of metastasis by thymidine phosphorylase inhibitor. Cancer Research. 60 (19): 5345-8.
Taylor RN et al. (2002) Angiogenic factors in endometriosis. Ann. NY Acad. Sci. 955: 89-100.
Tokunaga Y et al. (2002) Prognostic value of thymidine phosphorylase/platelet-derived endothelial cell growth factor in advanced colorectal cancer after surgery: evaluation with a new monoclonal antibody. Surgery 131 (5): 541.
Tsukagoshi S et al. (2003) Thymidine phosphorylase-mediated angiogenesis regulated by thymidine phosphorylase inhibitor in human ovarian cancer cells in vivo. Int. J. Oncol. 22 (5): 961-7.
【０００５】
ヌクレオシドホスホリラーゼは、幾つかのタイプのヒト癌において、統合的な役割を演じる。例えば、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）は、リンパ球白血病におけるＴ細胞増殖に関しては必須であることがよく知られている（Ｇｕｄａｓら、１９７８年）。より最近では、チミジンホスホリラーゼ（ａｋａ血小板由来内皮細胞成長因子；ＰＤ−ＥＣＧＦ）が、多くのタイプの固形腫瘍において、有意に血管新生へ寄与するものとして、示されてきた（Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、１９９４年）。ＴＰ発現は、幾つかの異なるタイプのヒト腫瘍の攻撃性および侵襲性に相関することが示されているが、これらヒト腫瘍は、乳癌および結腸癌初代細胞を包含している（Ｍｏｇｈａｄｄａｍら、１９９５年；Ａｏｋｉら、２００２年）。加えて、最も潜在能力のあるＴＰ阻害剤（ＴＰＩ、図７、Ｋｉ＝２０ｎＭ）が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて幾らかの抗血管新生活性を持つことが示されている（Ｔａｋａｏら、２０００年）。
【０００６】
チミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）は、チミジングリコシド結合の可逆的リン酸分解を触媒し、チミンおよび２−デオキシリボース−１−リン酸を形成してゆき（図１）、引き続いて、２−デオキシリボースへと代謝される。２−デオキシリボースが結局、ＴＰの血管新生効果に応答性であると考えられている（ＢｒｏｗｎおよびＢｉｃｋｎｅｌｌ、１９９８年）。ＴＰはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて内皮細胞の転移を促進するが、これも明らかに２−デオキシリボースによるものである（Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓら、２００３年）。
【０００７】
チミジン代謝および血管新生におけるその役割に加えて、ＴＰは、フルオロピリミジン抗代謝剤分解の第１義的な酵素である（例えば、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン［ＦｄＵｒｄ］）。フルオロピリミジン類は、結腸直腸癌を包含する悪性ＧＩの処置用に最も頻繁に使用される化学療法剤の１種である。結腸直腸癌から肝臓への転移を処置するのに臨床的に使用される１つのアプローチは、肝動脈へのＦｄＵｒｄの点滴である。ＦｄＵｒｄはチミジンキナーゼにより、その活性代謝物ＦｄＵＭＰへと変換される。この対立している反応はＴＰにより触媒されるが、ＦｄＵｒｄを５−フルオロウラシル（ＦＵｒａ）へと変換する。ＦＵｒａはＦｄＵｒｄよりも１００〜１，０００倍潜在能力がないので、ＴＰによるＦｄＵｒｄ代謝は、この抗癌剤の活性を減少させる傾向にある。ＴＰ阻害剤はこれゆえ、ＦｄＵｒｄと組み合わせて使用されてその抗腫瘍活性を付与する場合、特に高濃度のＴＰを発現する、より攻撃的な腫瘍において、臨床的に有用であると思われる。
【０００８】
血管新生の不適切な誘導が、癌に加えて他の疾患、例えばリューマチ関節（Ｐａｌｅｏｌｏｇ、２００２年）、糖尿病性網膜症および年齢に伴う黄斑変性のような網膜疾患（Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅら、２００３年）、粥状硬化（Ｂｕｒｋｅ−Ｇａｆｆｎｅｔら、２００２年）、子宮内膜症のような雌生殖器官の種々の疾患（Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、２００２年；Ｔａｙｌｏｒら、２００２年）、ならびに肥満（Ｃｒａｎｄａｌｌら、１９９７年）において、重要な役割を演じている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
これゆえ、改良されたＴＰ阻害剤を求める必要性がある。本発明は、そのような必要性に応えるものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
以上を受けて、本発明は、チミジンホスホリラーゼの遷移状態構造を確立した。該遷移状態構造は、これに似ているチミジンホスホリラーゼ阻害剤をデザインするための青写真を提供する。これら阻害剤は例えば、血管新生の阻害や癌の処置において、有用である。
【００１１】
これゆえ、ある幾つかの実施形態において、本発明は、チミジンホスホリラーゼの遷移状態阻害剤に関する。これら実施形態において、本遷移状態阻害剤は、チミジンホスホリラーゼの遷移状態の電荷および形状に似ている化合物である。
【００１２】
他の実施形態において、本発明は、チミジンホスホリラーゼを阻害する方法に関する。本方法は、チミジンホスホリラーゼを、上記遷移状態阻害剤のいずれかと組み合わせることを含む。
【００１３】
加えて、本発明は、哺乳類において癌を処置する方法に関する。本方法は、上記遷移状態阻害剤のいずれかを、哺乳類へと投与することを含む。
【００１４】
本発明は、哺乳類において血管新生を阻害する方法にも関する。これら方法もまた、上記遷移状態阻害剤のいずれかを、哺乳類へと投与することを含む。
【００１５】
本発明は加えて、チミジンホスホリラーゼ阻害剤をデザインする方法に関する。本方法は、チミジンホスホリラーゼの遷移状態の電荷および形状に似ている化合物をデザインすることを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、チミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）の遷移状態構造の発見に基づいている。該遷移状態構造の発見に至る実験結果を、実施例１に記載する。
【００１７】
ＴＰの遷移状態構造のこの発見は、ＴＰの強い阻害剤であるものと期待される遷移状態類似体のデザインを可能にする。これは、ある関連した酵素、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）の研究により確立され、ある酵素の遷移状態化合物と同様な電荷および形状を持っている遷移状態類似体が、その酵素の強い阻害剤であることが多いことを示している（Ｋｉｃｓｋａら、２００１年）。
【００１８】
ＴＰの遷移状態が以下の実施例１に与えられるが、驚くべき構造を持っており、というのは、該遷移状態がオキサカルベニウムイオンであると予期されたのに、明らかに僅かなオキサカルベニウム電荷しか生じていないからである（Ｃｏｌｅら、１９９９年）。
【００１９】
従って、ある幾つかの実施形態において、本発明は、チミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）の遷移状態阻害剤に関する。該遷移状態阻害剤は、チミジンホスホリラーゼの遷移状態の電荷および形状に似ている化合物である。ＴＰの遷移状態阻害剤の非限定例は、図２の化合物１〜２２および図７の化合物２３〜３２として与えられる。より好ましい阻害剤は、化合物９〜１２、２３、２６、および２９であるが、これは、これら化合物がＴＰの遷移状態に最も近似しているからである。当業者であれば、図２の化合物はホスホン酸として示されているが、他の塩の形態が同等に有効であること、ならびに、それらが生体液体中および緩衝化水溶液中に、該生体液体もしくは緩衝液に依存して、塩および酸の形態の混合物として存在することを、理解するものである。図２および図７の阻害剤化合物がホスホン酸エステル誘導体の形態であってもよいこと、ならびに、これらがこれら化合物のプロドラッグの形態をなすことも理解されるものであり、プロドラッグはエステル開裂により、その活性形態へと変換され得る。
【００２０】
本明細書において使用される場合、図２の化合物１〜２２もしくは図７の化合物２３〜３２のいずれかと同程度、ある化合物がＴＰの遷移状態の電荷および形状において似ていれば、該化合物がＴＰの遷移状態の電荷および形状に似ているものとする。
【００２１】
これら実施形態の遷移状態阻害剤であれば、如何なる古細菌、バクテリア、もしくは哺乳類種（ヒトも包含して）由来のチミジンホスホリラーゼをも阻害するものと予期されるが、これは、本酵素が構造的に、（動物）界の間で非常に似通っているからである（Ｃｏｌｅら、１９９９年）。
【００２２】
上記のＴＰ遷移状態阻害剤は、ヒトも包含している哺乳類への医薬投与用に、医薬的に許容可能な賦形剤中に処方され得る。これら処方は、如何なる特定適用のための投与用にも、過度の実験なしに、調製され得る。本阻害剤組成物はまた、単独で、または、化学療法剤のような他の医薬品と組み合わされて、調製され得る。加えて、本阻害剤の適切な用量は、過度の実験なしに、標準的な用量−応答プロトコールを使用して、求められ得る。
【００２３】
従って、経口、舌、舌下、口腔、および口腔内投与用にデザインされた本阻害剤組成物は、過度な実験なしに、当業界において既知の手段により、例えば、不活性希釈剤もしくは浸食性担体を用いて、調製され得る。本組成物は、ゼラチンカプセル中に封じ込められてもよく、錠剤へと圧縮されてもよい。経口投与治療目的では、本発明の阻害剤医薬組成物は賦形剤と共に取り込まれてもよく、錠剤、トローチ、カプセル、チンキ、懸濁、シロップ、ウェハウス、チューイングガム、および同様なものの形態で使用されてもよい。
【００２４】
錠剤、ピル、カプセル、トローチ、および同様なものは、バインダー、受容物質、崩壊剤、滑剤、甘味料、および香料をも含有してよい。バインダーの、とある幾つかの例は、微結晶セルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチンを包含する。賦形剤の例は、スターチもしくはラクトースを包含する。崩壊剤の、ある幾つかの例は、アルギン酸、コーン・スターチ、および同様なものを包含する。滑剤の例は、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カリウムを包含する。滑沢剤の、とある１例は、コロイド状二酸化硅素である。甘味料の、とある幾つかの例は、スクロース、サッカリン、および同様なものを包含する。香料の例は、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香料、および同様なものを包含する。これら種々の組成物を調製するのに使用される材料は医薬的に純粋であり、使用量では無毒であるべきである。
【００２５】
本発明の阻害剤組成物は容易に、例えば、静脈内、筋内、くも膜下、もしくは皮下注入によるように、単独で、もしくは、もう１つ別の医薬品、例えば化学療法剤と組み合わせて、非経口投与され得る。非経口投与は、本発明の組成物を溶液もしくは懸濁中へと取り込ませることにより、達成され得る。このような溶液もしくは懸濁は、注射用水、生理食塩水、固定化油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、もしくは他の合成溶媒のような無菌希釈剤をも包含してよい。非経口用処方は、例えば、ベンジルアルコールもしくはメチルパラベンのような抗菌剤、例えばアスコルビン酸もしくは重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤、ならびにＥＤＴＡのようなキレート剤をも包含してよい。アセテート、シトレート、もしくはホスフェートのような緩衝剤、ならびに、塩化ナトリウムもしくはデキストロースのような浸透圧調整剤も、加えられてよい。本非経口用調製品は、ガラスもしくはプラスチックでできたアンプル、使い捨てシリンジ、もしくは多数回用バイアル中に封じ込められ得る。
【００２６】
直腸投与は、本阻害剤医薬組成物を、直腸もしくは大腸中へと投与することを包含する。これは、坐薬もしくは浣腸を使用して達成され得る。坐薬用処方は容易に、当業界において既知の方法により、調製され得る。例えば、坐薬用処方は、グリセリンを約１２０℃まで熱し、本組成物を該グリセリンに溶解させ、熱せられた該グリセリンを混合し、その後に精製水が加えられてもよいが、熱い該混合物を坐薬の型中へと注ぐことにより、調製され得る。
【００２７】
経皮投与は、皮膚を通した本阻害剤組成物の経皮吸収を包含する。経皮用処方は、パッチ（よく知られているニコチンパッチのような）、軟膏、クリーム、ゲル、軟膏剤、および同様なものを包含する。
【００２８】
本発明は、哺乳類へと、治療に有効な量の本阻害剤組成物を、鼻から投与することを包含する。本明細書において使用される場合、「鼻から投与すること」もしくは「鼻からの投与」は、本組成物を、患者の鼻道もしくは鼻腔の粘膜へと投与することを包含する。本明細書において使用される場合、組成物の鼻からの投与用の医薬組成物は、よく知られた方法により、例えば、鼻用スプレー、鼻用ドロップ、懸濁、ゲル、軟膏、クリーム、もしくは粉末として、治療に有効な量の投与されるべき本組成物を包含する。本組成物の投与は、鼻用栓もしくは鼻用スポンジを使用しながら行われてもよい。
【００２９】
他の実施形態において、本発明は、チミジンホスホリラーゼを、遷移状態類似体を用いて阻害する方法に関する。本方法は、チミジンホスホリラーゼを、ＴＰの遷移状態の電荷および形状に似ているいずれの遷移状態阻害剤と組み合わせることを含む。ある幾つかの実施形態において、本阻害剤は第１に、該遷移状態に似るようデザインされ、次いで合成される。好ましい実施形態において、本遷移状態阻害剤は、図２の化合物１〜２２もしくは図７の化合物２３〜３２のうちの１種、それらの塩、またはそれらのホスホン酸エステル誘導体である。より好ましくは、本遷移状態阻害剤は、化合物９〜１２、２３、２６、もしくは２９のうちの１種、それらの塩、またはそれらのホスホン酸エステル誘導体である。
【００３０】
これらの方法は、如何なる、つまり、如何なるバクテリア、古細菌、もしくは真核生物種由来のチミジンホスホリラーゼをも利用し得るが、チミジンホスホリラーゼが哺乳類のものであること、最も好ましくはヒトチミジンホスホリラーゼであることが好ましく、これは、この酵素が哺乳類の血管新生にはっきりした効果を持っていて、ヒト疾患、特に癌に関係しているからである。
【００３１】
結果的に、これらの方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、チミジンホスホリラーゼを用いつつ利用され得るが、これらの方法が生存細胞中、最も好ましくは生存哺乳類の一部である細胞中、チミジンホスホリラーゼを用いる場合、それらの最大の有用性を持つものと期待される。本方法は特に、血管新生の不適切な誘導、例えば癌、特に結腸癌、結腸直腸癌、消化管癌、およびアデノカルシノーマと関連した疾患を患うヒトにおいて有用であるものと仮定され（Ａｏｋｉら、２００２年；Ｔｏｋｕｎａｇａら、２００２年；Ｔｓｕｋａｇｏｓｈｉら、２００３年；Ｓａｔｏら、２００３年）、ここではチミジンホスホリラーゼ活性が、より毒性の表現型および／またはＴＰの基質である化学療法剤に対する耐性と関連している。これゆえ、好ましい実施形態において、癌組織はチミジンホスホリラーゼを発現するものである（Ｉｇａｗａら、２００３年）。他の好ましい実施形態において、ヒトは、チミジンホスホリラーゼの化学療法ヌクレオシド基質、例えば５−フルオロ−２’−デオキシウリジンを用いて処置されていく。
【００３２】
あるいは、チミジンホスホリラーゼ阻害の必要なヒトは、過剰もしくは不適切な血管新生、例えば、リューマチ関節、糖尿病性網膜症および年齢に伴う黄斑変性のような網膜疾患、粥状硬化、子宮内膜症のような雌生殖器官の種々の疾患、または肥満により特徴付けられる疾患を持ち得る。
【００３３】
関連した実施形態において、本発明は、哺乳類において癌を処置する方法に関する。本方法は、哺乳類へ、ＴＰ遷移状態の電荷および形状に似ている遷移状態阻害剤を投与することを含む。前の実施形態と共に、好ましい阻害剤は、図２の化合物１〜２２もしくは図７の化合物２３〜３２のいずれか、それらの塩、またはそれらのホスホン酸エステル誘導体であり；より好ましい阻害剤は、化合物９〜１２、２３、２６、もしくは２９、それらの塩、またはそれらのホスホン酸エステル誘導体である。
【００３４】
上記実施形態に関連して論じられたとおり、本方法が特に、結腸癌、結腸直腸癌、消化管癌、もしくはアデノカルシノーマ、または、癌組織がチミジンホスホリラーゼを発現する場合の処置に関して有用であるものと期待される。また、この処置が、チミジンホスホリラーゼの化学療法ヌクレオシド基質、例えば５−フルオロ−２’−デオキシウリジンの有効性を増強するものと期待される。
【００３５】
本発明は加えて、哺乳類において血管新生を阻害する方法に関し、本方法は、哺乳類へ、ＴＰ遷移状態の電荷および形状に似ている遷移状態阻害剤を投与することを含む。前の実施形態と共に、好ましい阻害剤は、図２の化合物１〜２２および図７の化合物２３〜２９のいずれか、それらの塩、またはそれらのホスホン酸エステル誘導体であり；より好ましい阻害剤は、化合物９〜１２、２３、２６、および２９、それらの塩、またはそれらのホスホン酸エステル誘導体である。
【００３６】
これらの方法は、少なくとも一部チミジンホスホリラーゼにより引き起こされている、過剰もしくは不適切な血管新生により特徴付けられる如何なる疾患にも有効であるものと思われ、例えば、癌、特に結腸癌、結腸直腸癌、消化管癌、もしくはアデノカルシノーマ、特に該癌組織がチミジンホスホリラーゼを発現する場合である。過剰もしくは不適切な血管新生により特徴付けられる他の疾患の例は、リューマチ関節、糖尿病性網膜症および黄斑変性のような網膜疾患、粥状硬化、子宮内膜症のような雌生殖器官の種々の疾患、ならびに肥満である。
【実施例】
【００３７】
本発明の好ましい実施形態が、以下の実施例に記載される。本明細書における請求項の範囲内の他の実施形態は、本明細書において開示されるような本発明の明細もしくは実施の考慮から、当業者にとって明らかなものである。本明細書は、本実施例と共に、例示的なだけと考慮されるべきと意図され、本発明の範囲および思想は、本請求項により指し示され、本実施例を以下に伴う。
【００３８】
実施例１．チミジンホスホリラーゼの遷移状態の決定
はじめに
酵素は、高度に反応しにくい反応を、その遷移状態を安定化させることにより、触媒することができる。これゆえ、反応性のない遷移状態類似体は、強力な阻害剤である筈である。例えば、ＰＮＰの遷移状態類似体阻害剤は、Ｋｉ＜１０ｐＭで結合する。該遷移状態の決定は、速度論的同位体効果（ＫＩＥ）解析の使用、次いでコンピューター・モデリングを通じて、達成され得る。本実施例は、チミジンホスホリラーゼの遷移状態の、ＫＩＥ解析による決定を記載する。
【００３９】
材料および方法
標識チミジン合成
ＴＰの場合、放射標識チミジンは、種々の出発材料、まずはグルコースから酵素合成され得る。チミジンを標識する方法に関しては、例えば図３参照。
【００４０】
速度論的同位体効果（ＫＩＥ）の決定
放射標識位置に関するＫＩＥは、興味の対象である該標識を、遠隔標識（３ＨのＫＩＥに関しては［５’−１４Ｃ］ｄＴ、１４ＣのＫＩＥに関しては［４’−３Ｈ］ｄＴ）と、少なくとも３：１＝３Ｈ：１４Ｃで混合することにより、測定された。砒酸ナトリウムおよびＴＰが加えられ、この反応が２０〜３０％完結するまで進行するようにされ、３つに分取された。分取２つが除かれ、未反応ｄＴが２−デオキシリボースから活性炭クロマトグラフィーにより分離された。分取の残りが、１００％完結するまで反応せられ、活性炭クロマトグラフィーにより分離された。溶出した２−デオキシリボースは、シンチレーション液と混合され、カウントされた。
【００４１】
この３Ｈおよび１４Ｃスペクトルがデコンボリューションされ、１４Ｃに対する３Ｈの精確な比を、これら〜２５％および１００％反応させた混合物両方において与えた。測定されたＫＩＥは、式１におけるように定義される。
【００４２】
【数１】
2007504246.tif 000002
【００４３】
［１−１５Ｎ］ｄＴの場合、ＨＰＬＣを使用して基質を生成物から分離し、同位体比を電子噴射イオン化質量スペクトルにより求めた。［１−１５Ｎ］ｄＴのＫＩＥを、チミンを観測することにより算出した。
【００４４】
［１’−１４Ｃ］のＫＩＥが、使用された遠隔標識（［４’−３Ｈ］ｄＴ）のＫＩＥに関して修正され、［１−１５Ｎ］ｄＴのＫＩＥが、「標識されていない」化合物の天然量の同位体に関して修正された。次いで全てのＫＩＥが、式２に従う同位体枯渇に関して修正された。
【００４５】
【数２】
2007504246.tif 000003
【００４６】
結果
触媒反応に対するコミットメント
反応の可逆性および触媒反応に対するコミットメントは典型的に、ＫＩＥを抑える最重要の源である。この研究では、酵素の可逆性が、リン酸の代わりの砒酸の、求核攻撃剤としての使用により、妨げられた。触媒反応に対するコミットメントは、結合した基質が生成物まで進行するか溶液中へ放出されるかという傾向を記述するものであり、これが測定された。触媒反応に対する高いコミットメント（全ての結合基質が生成物まで進行する）は、実験によるＫＩＥを抑えることになる。
【００４７】
図４は、ＴＰによるチミジンの砒素分解が、触媒反応に対する０．７０％のコミットメントをＴＰ２３μＭにおいて実証することを示し、これゆえ、この実験によるＫＩＥおよび内因性のＫＩＥは、実質的に同一である。内因性ＫＩＥが、表１および図５に与えられる。
【００４８】
【表１】
2007504246.tif 000004
【００４９】
遷移状態の計算
ＴＳ構造が、Ｇａｕｓｓｉａｎ９８に意図されるような密度官能基理論（Ｂ１ＬＹＰ／６−３１Ｇ＊）を使用しながらモデル化された。出発構造は無拘束で、Ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ−Ｇｕｉｄｅｄ  Ｑｕａｓｉ−Ｎｅｗｔｏｎ法を使用しながら求められた。次いで理論ＫＩＥが、Ｉｓｏｅｆｆ９８を使用しながら算出された。拘束（条件）が次いで加えられ、ＴＳがＢｅｒｎｙアルゴリズムを使用しながら再び求められ、ＫＩＥが再び算出された。該拘束条件は、計算ＫＩＥがおよそそれらの測定値に合うまで、系統的に変えられる。図６に与えられる構造が、ＴＳであると見なされる。最終的な距離拘束は、１−Ｎおよび１’−Ｃ、１’−ＣおよびＯ（リン酸の）、ならびに１’−Ｃおよび１’−Ｈの間であった。最後の拘束条件が加えられ、平面からはみ出る振動を制御した。その算出および内因性ＫＩＥが、各位置に関するΔＫＩＥと共に、表２に与えられる。
【００５０】
【表２】
2007504246.tif 000005
【００５１】
結論
本明細書において与えられる遷移状態モデルは、該遷移状態が以前に仮定されたように解離性でもＳＮ１様でもないとの明確な証拠を与える。ＴＳはＳＮ２タイプの反応を実証し、求核剤および脱離基両者の実質的な参画を伴う。上記モデルは、０．２４および０．２２の、それぞれ該脱離基および該求核剤に対する結合オーダーを持つ。これら新規な結果に基づき、ＴＳは、該求核攻撃剤および該脱離基両者に対して、およそ実質的な結合オーダーを持って対称性である。オキソカルベニウム電荷の成立は、僅かしか見られない。１−ＮのＫＩＥにおける違いは、活性部位のＡｒｇおよびＬｙｓ残基からのある脱離基の活性化により説明され、これらは計算に入れられていない。この新たに発見された遷移状態構造に基づく阻害剤デザインが、遷移状態類似体阻害剤を構築させる。
【００５２】
実施例２．電子ポテンシャルマッピングを使用してのチミジンホスホリラーゼ阻害剤のデザイン
図７に示された化合物が、チミジンホスホリラーゼを阻害する能力に関して解析され、電子ポテンシャルに関してマッピングされた。
【００５３】
実験の部：
２’−デオキシ−５−ニトロウリジン（５ＮｄＵ）を基質として使用しながら、結合定数が、ＵＶ−可視スペクトルにより求められた（Ｋｍ＝５０μＭ、ｐＨ６．０１において）。この反応混合物は、計１ｍＬ中、阻害剤（およそ１／１０×Ｋｉ〜１０×Ｋｉ）、５０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．０１）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの無機リン酸、および２５０μＭの５ＮｄＵからなった。チミジンホスホリラーゼが、およそ１０ｎＭまで加えられ（Ｄ７２３３３３−Ｐに関しては、酵素１ｎＭが使用された）、該反応はλ＝３４７ｎｍにおいて、３０分間モニターされた。少なくとも５種の濃度の阻害剤が各化合物に関して使用され、実験が３度繰り返された。初期速度が、直線−最小自乗法により求められた。次いで各化合物に関するＫｉが求められ、以下の式：
【００５４】
【数３】
2007504246.tif 000006
【００５５】
を使用しており、式中、νが反応速度であり、Ｖが阻害剤がない時の最大速度である。
【００５６】
コンピューター関連：
電子ポテンシャル密度のマッピングが、Ｇａｕｓｓｉａｎ９８およびＭｏｌｅｋｅｌ  ｖ４．３を使用しながら、構築された。ピリミジン環を有する化合物が真空中で、ＨＦ／３−２１Ｇにおいて最小化され、または、ピリミジン類似体が、算出された遷移状態（２面角−４０．３°、Ｈ１’−Ｃ１’−Ｎ１−Ｃ６の結合）のものに類似した回転角へと拘束された。次いで表面が、Ｍｏｌｅｋｅｌの「電子密度コンピューター計算」機能を使用して、生成された。電子ポテンシャルがこの表面上へとマッピングされ、スケールは＋０．３（青）〜−０．７（赤）であった。
【００５７】
以上に鑑みて、本発明の幾つかの利点が達成され、他の利点が獲得されることが、理解されよう。
【００５８】
種々の変更が、本発明範囲を逸脱することなく、以上の方法および組成物においてなされ得ると思われるので、以上の記載に含有され添付の図面に示される全事項は例示的なものとして解釈され、限定的な意味合いではないと意図される。
【００５９】
この明細書において引用された全文献が、本明細書において援用される。本明細書におけるこれら文献についての議論は、その著者によりなされた主張を単に要約するよう意図され、如何なる文献も、先行技術を構成すると認められるものではない。出願人は、これら引用文献の正確さおよび適切さに挑む権利を留保する。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、チミジンホスホリラーゼ反応を与える。
【図２】図２は、遷移状態類似体であるチミジンホスホリラーゼ阻害剤の好ましい例を与える。
【図３】図３は、放射標識チミジンを合成する化学的方法のスキームを示す。    パネルａ．グルコースからのＡＴＰ合成。    パネルｂ．ＡＴＰからのチミジン合成。太字で示された化合物は、精製される。使用されている略号は：    ＡＤ：アデノシン脱アミノ化酵素；    ＡＫ：アデニル酸キナーゼ；    ＡＰ：アルカリホスファターゼ；    ＡＰＲＴ：アデノシンホスホリボシル転移酵素；    Ｇ６ＰＤＨ：Ｇ６Ｐ脱水素酵素；    ６ＰＧＤＨ：６−ホスホグルコン酸脱水素酵素；    ＨＫ：ヘキソキナーゼ；    ＰＫ：ピルビン酸キナーゼ；    ＰＮＰ：プリンヌクレオシドホスホリラーゼ；    ＰＰａｓｅ：無機ピロリン酸化酵素；    ＰＲＩ：ホスホリボイソメラーゼ；    ＰＲＰＳ：５−リボシル−１−ピロリン酸合成；    ＲＴＲ：リボヌクレオチド３リン酸還元酵素；    ＴＰ：チミジンホスホリラーゼ。
【図４】図４は、ＴＰによるチミジンの砒素分解の実験結果のグラフを示す。
【図５】図５は、チミジンの内因性ＫＩＥを示す。
【図６】図６は、ＴＰ遷移状態構造の、実験的に派生させたモデルを示す。
【図７】図７は、電子ポテンシャルマッピングに付された化合物の例、および、チミジンホスホリラーゼを阻害する能力の決定を示す。
【図１】
2007504246.tif 000007
【図２】
2007504246.tif 000008
【図３】
2007504246.tif 000009
【図４】
2007504246.tif 000010
【図５】
2007504246.tif 000011
【図６】
2007504246.tif 000012
【図７】
2007504246.tif 000013
【図７−２】
2007504246.tif 000014
【図７−３】
2007504246.tif 000015
【図７−４】
2007504246.tif 000016
【図７−５】
2007504246.tif 000017
【図７−６】
2007504246.tif 000018
【図７−７】
2007504246.tif 000019
【図７−８】
2007504246.tif 000020
【国際調査報告】
2007504246.tif 000021