(57)【要約】本発明は、ＣＤ８０（Ｂ７．１）をコードする核酸およびＨＬＡ抗原をコードする核酸を発現するように遺伝的に改変された腫瘍細胞を提供する。本発明はまた、ＣＤ８０（Ｂ７．１）をコードする核酸およびＨＬＡ抗原をコードする核酸を発現するように遺伝的に改変された肺癌細胞のような同種異系の腫瘍細胞を投与することによって、腫瘍に対する免疫応答を刺激する方法を提供する。本発明は、さらに、ＣＤ８０（Ｂ７．１）をコードする核酸およびＨＬＡ抗原をコードする核酸を発現するように遺伝的に改変された肺癌細胞のような同種異系の腫瘍細胞を投与することによって、腫瘍を阻害する方法を提供する。
2007506764.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ８０（Ｂ７．１）をコードする核酸およびＨＬＡ抗原をコードする核酸を発現するように遺伝的に改変された、肺癌細胞。
【請求項２】
請求項１に記載の肺癌細胞であって、前記ＨＬＡ抗原は、ＨＬＡ  Ａ１、ＨＬＡ  Ａ２、ＨＬＡ  Ａ３およびＨＬＡ  Ａ２７から選択される、肺癌細胞。
【請求項３】
請求項１に記載の肺癌細胞であって、前記肺癌細胞は、腺癌である、肺癌細胞。
【請求項４】
肺癌に対する免疫応答を刺激する方法であって、該方法は、ＣＤ８０（Ｂ７．１）をコードする核酸およびＨＬＡ抗原をコードする核酸を発現するように遺伝的に改変された同種異系の肺癌細胞を投与する工程を包含する、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記ＨＬＡ抗原が、前記肺癌細胞を投与された個体に合わせられている、方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法であって、前記ＨＬＡ抗原は、ＨＬＡ  Ａ１、ＨＬＡ  Ａ２、ＨＬＡ  Ａ３およびＨＬＡ  Ａ２７から選択される、方法。
【請求項７】
請求項４に記載の方法であって、前記肺癌細胞は、腺癌である、方法。
【請求項８】
肺癌を阻害する方法であって、該方法は、ＣＤ８０（Ｂ７．１）をコードする核酸およびＨＬＡ抗原をコードする核酸を発現するように遺伝的に改変された同種異系の肺癌細胞を投与する工程を包含する、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記ＨＬＡ抗原が、前記肺癌細胞を投与された個体に合わせられている、方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法であって、前記ＨＬＡ抗原は、ＨＬＡ  Ａ１、ＨＬＡ  Ａ２、ＨＬＡ  Ａ３およびＨＬＡ  Ａ２７から選択される、方法。
【請求項１１】
請求項８に記載の方法であって、前記肺癌細胞は、腺癌である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮特許出願第６０／５０６，６５６号（２００３年９月２６日出願）の優先権の利益を主張し、この出願の全体の内容は本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＣＡ３９２０１−１４の下、合衆国政府の援助によってなされた。合衆国政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、医学、免疫学、および腫瘍学の分野に関連する。より具体的には、本発明は、動物被験体の腫瘍に対する免疫応答を誘導するための方法および組成物に関連する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
肺癌は、合衆国において癌に起因する死亡の中で最も一般的な原因である。２００２年の間に、アメリカ癌学会は、ほぼ１７０，０００の肺癌の新しい症例が診断され、そして１５５，０００人がこの疾患によって死亡すると予測した。局所的に進行したかまたは転移性の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する患者は、その新たに診断された症例の７０％を構成する。
【０００５】
手術不能な疾患を有する患者に対する現在の推奨としては、局所的に進行した疾患については白金に基づく化学療法に加えて放射線治療を、または転移を有する患者には化学療法のみが挙げられる。代表的な応答率は、１年未満の生存期間の中央値では１５％から３０％の間である。最良の支持療法と化学療法との間の転移ＮＳＣＬＣ患者をランダム化する５２のＩＩＩ相臨床試験のメタアナリシスは、化学療法が、１年の生存期間の可能性を１０％増加し、そして生存期間の中央値を６週間増加すると結論付けた。Ｂｉｇ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒｉａｌグループ（ＢＬＴ）からの最近の報告は、類似の結果を報告した。ＮＳＣＬＣの攻撃性は、おそらくＣＤ４調節細胞による免疫応答の初回免疫を抑制することよって、および／または免疫抑制サイトカイン（例えば、ＴＧＦ−β）を産生することによって、免疫系を回避するＮＳＣＬＣの能力に関連すると考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、腫瘍（癌（例えば、肺癌）が挙げられる）を処置する効果的な治療法を開発する必要性が存在する。本発明は、この必要性を満たし、そして関連する利点も提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（要旨）
本発明は、ＣＤ８０（Ｂ７．１）をコードする核酸およびＨＬＡ抗原をコードする核酸を発現するように遺伝的に改変された腫瘍細胞（例えば、肺癌細胞または他の腫瘍細胞）を提供する。本発明はまた、ＣＤ８０（Ｂ７．１）をコードする核酸およびＨＬＡ抗原をコードする核酸を発現するように遺伝的に改変された同種異系の肺癌腫瘍細胞を投与することによって、腫瘍（癌腫瘍（例えば、肺癌腫瘍）が挙げられる）への免疫応答を刺激する方法を提供する。本発明は、さらに、ＣＤ８０（Ｂ７．１）をコードする核酸およびＨＬＡ抗原をコードする核酸を発現するように遺伝的に改変された異種同系の腫瘍細胞（例えば、癌腫瘍細胞（例えば、肺癌腫瘍細胞））を投与することによって、腫瘍（癌（例えば、肺癌）が挙げられる）を阻害する方法を提供する。
【０００８】
（詳細な説明）
本発明は、ＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＨＬＡ抗原を発現するか、またはＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＨＬＡ抗原を発現する原因となる、同種異系の腫瘍細胞を癌患者に投与することが、患者内において抗腫瘍免疫応答をもたらしたという発見に関連する。より詳しくは、ＣＤ８を介した免疫応答は、ＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＨＬＡ−Ａ１またはＡ２をトランスフェクトした同種異系のＮＳＣＬＣ細胞を用いて数回免疫されたＩＩＩＢ／ＩＶ段階のＮＳＣＬＣ患者に引き起こされた。免疫は、（後に）より詳細に考察されるように１人を除いた全ての試験された患者におけるインターフェロン−γ分泌ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度を有意に増加した。１組の患者の臨床分析において、１４人中５人の患者が、安定的な疾患または部分的に腫瘍の退行を伴って免疫に応答した。さらなる特徴付けが、さらなる患者において実行された。
【０００９】
肺の癌腫は、癌死の主な原因であり、そして合衆国の男性と女性との両方において二番目に最も一般的に発生する癌である（Ｊｅｍａｌら、ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．５３：５−４３（２００３））。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は、最小限であるかまたは非免疫原性であると考えられ、そして細胞障害性リンパ球（ＣＴＬ）の産生を抑制するＣＤ４調節細胞を含み得る（Ｗｏｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：４２７２−４２７６（２００２））。ＮＳＣＬＣは免疫治療の適切な候補として考えられていないが、本明細書において開示される研究は、腫瘍細胞は免疫攻撃に露出されてなく、そしてまだ耐性メカニズムを発達させていないので、ＮＳＣＬＣは好結果のワクチン治療に実際には適切であるという仮説に基づいている。肺癌に対する免疫治療試行は、これまでヒトに一貫した利益を生み出してはいない（Ｒａｔｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ  ７８：２４４−２５１（１９９６）；Ｌｉｓｓｏｎｉら、Ｔｕｍｏｒｉ  ８０：４６４−４６７（１９９４）；Ｒａｔｔｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２３：１６１−１６７（２０００））。Ｂ７．１（ＣＤ８０）をトランスフェクトした同種異系のまたは自系の細胞を用いたワクチン試行は、本明細書において開示される研究の前には、ＮＳＣＬＣを有する患者に関して報告されていないが、類似のワクチンは、他のヒト研究において良好な活性を示している（Ａｎｔｏｎｉａら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１６７：１９９５−２０００（２００２）；Ｈｏｒｉｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４９：５０４−５１４（２０００）；Ｈｕｌｌら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．６：４１０１−４１０９（２０００）；ｖｏｎ  Ｍｅｈｒｅｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６：２２１９−２２２８（２０００））。本明細書において開示される研究の目的は、安全性、免疫原性、および進行した転移性ＮＳＣＬＣを有する患者に投与された、ＣＤ８０およびＨＬＡ  Ａ１またはＨＬＡ  Ａ２をトランスフェクトした同種異系の全菌体腫瘍ワクチンに対する臨床応答を、評価することである。ワクチンの安全性、臨床応答、および総合的な生存期間の結果が、本明細書において開示される。
【００１０】
本明細書中に開示されるように、ＣＤ８を介する免疫応答が、ＩＩＩＢ／ＩＶ段階のＮＳＣＬＣ患者に誘発され得るか否かを決定するために、当初１４人の被験体が、ＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＨＬＡ−Ａ１またはＨＬＡ−Ａ２をトランスフェクトした同種異系のＮＳＣＬＣ細胞を用いて数回免疫された。さらに患者が加わった。参加した患者は、ＨＬＡ  Ａ１またはＨＬＡ  Ａ２遺伝子座に合わされているかまたは合わされておらず、この患者らの免疫応答が比較された。免疫は、１人を除く全ての患者において、ＮＳＣＬＣ細胞を用いたエキソビボの抗原投与に応答したインターフェロン−γ分泌ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度を有意に増加した。合わされた患者および合わされていない患者のＣＤ８応答は、統計学的に異ならなかった。ＮＳＣＬＣに反応するＣＤ８細胞は、Ｋ５６２に反応しなかった。臨床的に、１４人の患者中５人は、安定的な疾患または部分的に腫瘍の退行を伴って免疫に応答した。この研究は、非免疫原性であるかまたは免疫抑制腫瘍に対するＣＤ８  ＩＦＮ−γ応答が、疾患の進行した段階においても細胞ワクチンによって引き起こされ得ることを示す。正の臨床結果は、非免疫原性腫瘍が、免疫によって産生された免疫エフェクター細胞に非常に感受性であり得ることを示唆する。
【００１１】
従って、ＣＤ８０およびＨＬＡ抗原を発現する改変された腫瘍細胞の、腫瘍患者への投与は、望ましい治療効果をもたらすことが発見された。それゆえ、１つの実施形態において、本発明は、ＣＤ８０をコードする第一の核酸およびＨＬＡ抗原をコードする第二の核酸が導入された腫瘍肺癌細胞を提供する。
【００１２】
本明細書において使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は具体的にまた、その内容が明確に他に指示されない限り、それらが参照する用語の複数形も包含する。本明細書において使用される場合、具体的に他に示されない限り、単語「あるいは、または、もしくは（ｏｒ）」は、「排他的な（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ）」意味の「いずれか／または（ｅｉｔｈｅｒ／ｏｒ）」ではなく、「包括的な（ｉｎｃｌｕｓｉｖｅ）」意味の「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」で使用される。本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形は、その内容が明確に他に指示されない限り、複数の対象物を含む。
【００１３】
用語「約（ａｂｏｕｔ）」は本明細書において、約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）、ほぼ（ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ）、およそ（ｒｏｕｇｈｌｙ）、またはおよそ（ａｒｏｕｎｄ）を意味するように使用される。用語「約（ａｂｏｕｔ）」が、数値的な範囲と共に使用される場合、それは、示される数値の上および下の境界を伸長することによって、その数値的範囲を改変する。概して、用語「約（ａｂｏｕｔ）」とは本明細書において、記述された値の上および下の数値を２０％の分散まで改変するように使用される。本明細書において使用される場合、移行句においてまたは本文においてのいずれかであっても、用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含んでいる、包含している（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、制限のない意味を有するものとして解釈されるべきである。すなわち、この用語は、句「少なくとも有している（ｈａｖｉｎｇ  ａｔ  ｌｅａｓｔ）」または「少なくとも含んでいる、少なくとも包含している（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｔ  ｌｅａｓｔ）」と同意語として解釈されるべきである。プロセスの内容について使用される場合、用語「含んでいる、包含している」とは、そのプロセスが、少なくとも列挙された工程を包含することを意味するが、さらなる工程を包含し得ることを意味する。化合物または組成物の内容について使用される場合、用語「含んでいる、包含している」とは、その化合物または組成物が、少なくとも列挙された特徴または要素を含むが、さらなる特徴または要素もまた含み得ることを意味する。
【００１４】
用語「腫瘍」とは、良性（例えば、転移を形成せず、そして隣接する正常組織を破壊しない腫瘍）かまたは悪性／癌（例えば、周囲の組織に侵入し、そして通常転移を生じ得、試みられた除去後に再発し得、そして適切に処置されない限り宿主の死をもたらしやすい腫瘍）であり得る腫瘍性の増殖を示すために使用される（Ｓｔｅａｄｍａｎ’ｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、第２６版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ（１９９５）を参照のこと）。
【００１５】
本発明はまた、ＣＤ８０をコードする第一の核酸およびＨＬＡ抗原をコードする第二の核酸を導入された同種異系の腫瘍細胞を患者に投与することによって、患者の腫瘍負荷を安定化するかまたは戻す方法を提供する。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、ＣＤ８０（Ｂ７．１）をコードする核酸およびＨＬＡ抗原をコードする核酸を発現するように遺伝的に改変された腫瘍癌細胞（例えば、肺癌細胞）であり得る、腫瘍細胞を提供する。
【００１７】
例示的なＨＬＡ抗原としては、これらに限定されないが、ＨＬＡ  Ａ１、ＨＬＡ  Ａ２、ＨＬＡ  Ａ３、ＨＬＡ  Ａ２７などが挙げられる。特定の実施形態において、ＨＬＡ抗原は、ＨＬＡ  Ａ１またはＨＬＡ  Ａ２であり得る（実施例を参照のこと）。当業者は、本発明から逸脱することなく、本発明によって使用され得るＨＬＡ抗原をコードする、多数の異なる核酸配列があることを理解する（以下を参照のこと）。当業者に公知の任意の適切な材料および／または方法は、本発明を実行する際に利用され得る。しかし、好ましい材料および方法が、記載されている。以下の説明および実施例において参照がなされる材料、試薬などは、他に示されていない限り、市販の供給源から入手可能である。
【００１８】
本明細書において使用される技術用語および科学用語は、他に規定されていない限り、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。当業者に公知の種々の方法論および材料についての参照が本明細書中でなされる。組み換えＤＮＡ技術の一般原則を示す標準的な参考研究としては、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（補遺  ５６）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（２００１）；Ｋａｕｆｍａｎら（編）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（１９９５）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（編）、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１）が挙げられる。薬理学の一般原則を示す標準的な参考研究としては、ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎのＴｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１０版、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）が挙げられる。本発明による組成物は、必要に応じて、任意の周知の薬学的に受容可能なキャリアと共に薬学的に受容可能なビヒクル中に処方され、この薬学的に受容可能なビヒクルは、希釈剤および賦形剤を含んでいる（ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ  １９９０およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、１９９５を参照のこと）。本発明の組成物を生成する際に利用される薬学的に受容可能なキャリア／ビヒクルのタイプは、哺乳動物への組成物の投与の様式に依存して変動するが、概して、薬学的に受容可能なキャリアは、生理学的に不活性でありそして無毒性である。本発明による組成物の処方物は、１つを超えるタイプの本発明の化合物ならびに処置される症状／状態の処置に有用な任意の他の薬理学的活性成分を含有し得る。
【００１９】
いくつかの実施形態において、癌細胞は、肺組織癌細胞（「肺癌細胞」ともいわれる）（例えば、腺癌細胞タイプ、例えば、肺癌細胞は、下に例示されるようにＡＤ１００細胞株であり得る）であり得る。
【００２０】
本発明は、さらに、ＣＤ８０（Ｂ７．１）をコードする核酸およびＨＬＡ抗原をコードする核酸を発現するように遺伝的に改変された同種異系の腫瘍細胞を投与することによって、患者内の腫瘍（例えば、癌（例えば、肺癌））に対する免疫応答を刺激する方法を提供する。この腫瘍細胞は、癌細胞（例えば、肺癌腫瘍細胞）であり得る。
【００２１】
本発明の方法は、本発明の方法の利益を経験し得る任意の被験体での使用を意図されている。従って、本発明に記載の「被験体」、「患者」ならびに「個体」（相互変換可能に使用される）は、ヒトならびに非ヒト被験体（特に家畜）を包含する。
【００２２】
１つの実施形態において、本発明の方法は、腫瘍肺癌細胞を投与された個体にＨＬＡを合わせる工程を包含し得る。ＨＬＡハプロタイプを決定する方法は、当業者に周知であり、例えば、ＨＬＡ対立遺伝子または混合リンパ球反応に対する抗体を使用した周知の血清学的アッセイを使用する。特定の実施形態において、本発明の方法は、ＨＬＡ抗原（ＨＬＡ  Ａ１、ＨＬＡ  Ａ２、ＨＬＡ  Ａ３またはＨＬＡ  Ａ２７）を用いて実行され得る。本発明の方法は、種々の腫瘍細胞（例えば、肺癌細胞）（例えば、腺癌（例えば、下に例示されるＡＤ１００細胞株）が挙げられる）を使用し得る。
【００２３】
さらに別の実施形態において、本発明は、ＣＤ８０（Ｂ７．１）をコードする核酸およびＨＬＡ抗原をコードする核酸を発現するように遺伝的に改変された同種異系の腫瘍細胞を投与することによって腫瘍を阻害する方法を提供する。腫瘍は、例えば、癌腫瘍細胞（例えば、肺癌腫瘍細胞）であり得る。特定の実施形態において、ＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＨＬＡ抗原を発現するように改変された同種異系の癌細胞の投与によって阻害される腫瘍は、肺癌である。
【００２４】
本明細書において使用される場合、「同種異系の細胞」とは、投与される細胞がその個体に由来しない細胞をいい、すなわち、その個体と異なる遺伝子構成を有する細胞をいう。同種異系の細胞は、概して、その細胞が投与される個体と同じ腫から得られる。例えば、同種異系の細胞は、本明細書において開示されるように、ヒト患者（例えば、癌患者）に投与するためのヒト細胞であり得る。本明細書において使用される場合、「同種異系の腫瘍細胞」とは、同種異系の細胞が投与される個体に由来しない腫瘍細胞をいう。概して、同種異系の腫瘍細胞は、この細胞が投与される個体中の腫瘍に対して免疫応答を刺激し得る１種以上の腫瘍抗原を発現する。本明細書において使用される場合、「同種異系の癌細胞」（例えば、肺癌細胞）とは、同種異系の細胞が投与される個体に由来しない癌細胞をいう。概して、同種異系の癌細胞は、この細胞を投与される個体中の癌（例えば、肺癌）に対して免疫応答を刺激し得る１種以上の腫瘍抗原を発現する。
【００２５】
本明細書において使用される場合、「遺伝的に改変された細胞」とは、例えば、トランスフェクションまたは形質導入によって、外因性の核酸を発現するように遺伝的に改変された細胞をいう。本明細書において開示されるように、細胞は、例えば、ＣＤ８０（Ｂ７．１）をコードする核酸および／またはＨＬＡ抗原をコードする核酸を発現するように遺伝的に改変され得る。細胞が１種を超えるポリペプチド（例えば、ＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＨＬＡ抗原）を発現するように遺伝的に改変される場合、このポリペプチドは、もし所望ならば、別個の核酸（実施例Ｉを参照のこと）上にまたは同じ核酸上にコードされ得ることが理解される。細胞を遺伝的に改変する方法は、当業者に周知である。
【００２６】
本発明は、癌患者における免疫応答を刺激するための方法および組成物を提供する。この組成物および方法は、非免疫原性腫瘍に対する免疫応答を刺激するために特に有用である。本明細書において使用される場合、非免疫原性腫瘍は、例えば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）中にインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）を産生するＣＤ８  Ｔ細胞のかなりの刺激によっても検出可能な自発的な免疫応答を誘発しない腫瘍である。
【００２７】
伝統的に、メラノーマおよび他の免疫原性腫瘍は、免疫治療による処置に関して好まれてきた。本発明において、腫瘍細胞は、ＣＴＬ応答の回避に関して免疫選択されていないので、非免疫原性腫瘍は、活性免疫治療にとって優れた標的であると考えられている。例示的な非免疫原性腫瘍としては、肺、膵臓などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
特に有用な非免疫原性腫瘍タイプは、本明細書において例示されるように、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。ＮＳＣＬＣ腫瘍は非免疫原性であり、自発的にＣＴＬ応答を生成しないので、ＮＳＣＬＣ腫瘍は、活性免疫治療にとって優れた標的である。それゆえ、ＮＳＣＬＣ腫瘍細胞は、細胞障害性Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対する回避メカニズムを発達せず、そしてＮＳＣＬＣ腫瘍は、細胞障害性の攻撃を受けやすい。本明細書において開示されるように、本発明の組成物は、ＮＳＣＬＣ患者の腫瘍の成長を首尾よく遅らせるために使用された（実施例ＩＩおよびＩＩＩを参照のこと）。
【００２９】
ＮＳＣＬＣ腫瘍はまた、ｇｐ９６を発現および分泌し、そしてワクチンの有効性を増大するように遺伝的に操作され得る。ワクチンが、アジュバント活性を多価ペプチド特異性と組み合わせるからである。多価性は、免疫選択および回避を予防する。腫瘍分泌ｇｐ９６は、樹状細胞（ＤＣ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、および細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を活性化し、先天免疫および適応免疫を活性化する。腫瘍細胞は、ＮＫに特異的なメカニズムによって、ＮＫＧ２Ｄを通じたＣＤ８  ＣＴＬの無差別な殺作用によって、およびＭＨＣに限定されたＣＤ８  ＣＴＬ活性によって死滅され得る。腫瘍分泌ｇｐ９６によるＤＣおよびＮＫの活性化はまた、ＮＳＣＬＣ腫瘍中に見い出される免疫抑制ＣＤ４調節細胞の産生の作用を打ち消し得る。腫瘍分泌ｇｐ９６は、ＤＣおよびマクロファージ上のＣＤ９１レセプターを介して抗原交差提示を刺激する。ＮＳＣＬＣは、メラノーマにおいても見い出される腫瘍抗原を共有することが公知であり、そしてさらに共有された抗原を与えられ得る。それゆえ、ワクチンとして使用される同種異系のｇｐ９６分泌腫瘍細胞は、患者の自己の腫瘍に対して免疫を生成することが予想される。同様に、ＣＤ８０およびＨＬＡ抗原を発現する同種異系の腫瘍細胞を含む本発明の組成物は、患者の自己の腫瘍に対して免疫を生成し得る。
【００３０】
肺腫瘍は、調節細胞によって、ＴＧＦ−β分泌によって、およびＭＨＣクラスＩのダウンレギュレーションによって、ＣＴＬの初回免疫を予防する。それゆえ、免疫原性ワクチンが、ＣＴＬ応答を生成するために必要とされる。肺腫瘍は、ＣＴＬ回避のために選択されていないので、肺腫瘍は、ＣＴＬ殺作用の影響を受けやすい。肺腫瘍ＴＩＬは、初回免疫を抑制する多数のＣＤ４調節細胞を含む。対照的に、メラノーマＴＩＬは、抗原特異性ＣＤ８  ＣＴＬを含み、このＣＤ８  ＣＴＬの殺作用活性は遮断されており、このことは、初回免疫が既に行われたことを示している。本明細書において開示されるように、肺癌患者は、ＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＨＬＡ抗原を発現するように遺伝的に改変された同種異系の腫瘍細胞を含むワクチンを用いて首尾よく処置された（実施例ＩＩおよびＩＩＩ）。従って、ＮＳＣＬＣの免疫治療（ワクチン治療）は、この、別のやり方では致死の疾患を処置するために有用である。
【００３１】
本明細書において開示されるように、腺癌は、ＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＨＬＡ抗原を発現する本発明の組成物および方法において使用され得る例示的な肺癌である。他のタイプの肺癌が周知であり、そして他のタイプの肺癌に由来する細胞は、同様に本発明の組成物および方法において使用され得る。例示的な肺癌としては、例えば、腺癌、扁平上皮細胞癌種、または大細胞癌種、小細胞肺癌、およびカルチノイドであり得る、非小細胞肺癌が挙げられる。当業者は、種々のタイプの肺癌から組織サンプルを容易に得ることができ、本明細書において開示される方法と類似の方法を使用して、肺癌を処置するために有用な細胞株を産生し得る。同様に、他のタイプの非免疫原性腫瘍が、ＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＨＬＡ抗原を発現するように遺伝的に改変され得る同種異系の腫瘍細胞を産生するために使用され得、そして類似のタイプの腫瘍または類似のタイプの腫瘍抗原を発現する腫瘍を処置するために使用され得る。
【００３２】
例示的な同種異系の腫瘍細胞は、ＡＤ１００細胞株であり、この細胞株は、本明細書において開示されるようなヒト肺腺癌細胞株である。他の肺癌細胞株は、当業者に周知であり、そして同様にＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＨＬＡ抗原を用いて遺伝的に改変される同種異系の細胞を産生するために使用され得る。例えば、多くの細胞株（肺癌細胞株が挙げられる）は周知であり、そしてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）から入手可能である。例示的なＮＳＣＬＣ細胞株としては、これらに限定されないが、ＮＣＩ−Ｈ２１２６［Ｈ２１２６］（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２５６）；ＮＣＩ−Ｈ２３［Ｈ２３］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５８００）；ＮＣＩ−Ｈ１２９９［Ｈ１２９９］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５８０３）；ＮＣＩ−Ｈ３５８［Ｈ３５８］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５８０７）；ＮＣＩ−Ｈ８１０［Ｈ８１０］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５８１６）；ＮＣＩ−Ｈ５２２［Ｈ５２２］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５８１０）；ＮＣＩ−Ｈ１１５５［Ｈ１１５５］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５８１８）；ＮＣＩ−Ｈ６４７［Ｈ６４７］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５８３４）；ＮＣＩ−Ｈ６５０［Ｈ６５０］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５８３５）；ＮＣＩ−Ｈ８３８［Ｈ８３８］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５８４４）；ＮＣＩ−Ｈ９２０［Ｈ９２０］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５８５０）；ＮＣＩ−Ｈ９６９［Ｈ９６９］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５８５２）；ＮＣＩ−Ｈ１３８５［Ｈ１３８５］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５８６７）；ＮＣＩ−Ｈ１４３５［Ｈ１４３５］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５８７０）；ＮＣＩ−Ｈ１４３７［Ｈ１４３７］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５８７２）；ＮＣＩ−Ｈ１５６３［Ｈ１５６３］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５８７５）；ＮＣＩ−Ｈ１５６８［Ｈ１５６８］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５８７６）；ＮＣＩ−Ｈ１５８１［Ｈ１５８１］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５８７８）；ＮＣＩ−Ｈ１６２３［Ｈ１６２３］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５８８１）；ＮＣＩ−Ｈ１６５１［Ｈ１６５１］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５８８４）；ＮＣＩ−Ｈ１６９３［Ｈ１６９３］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５８８７）；ＮＣＩ−Ｈ１７０３［Ｈ１７０３］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５８８９）；ＮＣＩ−Ｈ１７３４［Ｈ１７３４］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５８９１）；ＮＣＩ−Ｈ１７５５［Ｈ１７５５］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５８９２）；ＮＣＩ−Ｈ１７７０［Ｈ１７７０］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５８９３）；ＮＣＩ−Ｈ１７９３［Ｈ１７９３］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５８９６）；ＮＣＩ−Ｈ１８３８［Ｈ１８３８］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５８９９）；ＮＣＩ−Ｈ１８６９［Ｈ１８６９］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５９００）；ＮＣＩ−Ｈ１９１５［Ｈ１９１５］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５９０４）；ＮＣＩ−Ｈ１９４４［Ｈ１９４４］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５９０７）；ＮＣＩ−Ｈ１９７５［Ｈ１９７５］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５９０８）；ＮＣＩ−Ｈ１９９３［Ｈ１９９３］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５９０９）；ＮＣＩ−Ｈ２０２３［Ｈ２０２３］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５９１２）；ＮＣＩ−Ｈ２０３０［Ｈ２０３０］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５９１４）；ＮＣＩ−Ｈ２０７３［Ｈ２０７３］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５９１８）；ＮＣＩ−Ｈ２０８５［Ｈ２０８５］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５９２１）；ＮＣＩ−Ｈ２０８７［Ｈ２０８７］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５９２２）；ＮＣＩ−Ｈ２１０６［Ｈ２１０６］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５９２３）；ＮＣＩ−Ｈ２１１０［Ｈ２１１０］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５９２４）；ＮＣＩ−Ｈ２１３５［Ｈ２１３５］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５９２６）；ＮＣＩ−Ｈ２１７２［Ｈ２１７２］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５９３０）；ＮＣＩ−Ｈ２２２８［Ｈ２２２８］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５９３５）；ＮＣＩ−Ｈ２２９１［Ｈ２２９１］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５９３９）；ＮＣＩ−Ｈ２３４２［Ｈ２３４２］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５９４１）；ＮＣＩ−Ｈ２３４７［Ｈ２３４７］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５９４２）；ＮＣＩ−Ｈ２４０５［Ｈ２４０５］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５９４４）；ＮＣＩ−Ｈ２４４４［Ｈ２４４４］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５９４５）；およびＮＣＩ−Ｈ２１２２［Ｈ２１２２］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５９８５）が挙げられる。これらおよび他の腫瘍細胞株（特に非免疫原性腫瘍の細胞株）は、同様に、本発明の組成物および方法に使用され得る。
【００３３】
本明細書において開示されるように、これらおよび他の腫瘍細胞株は、腫瘍抗原に対する免疫応答を増大する外因性分子を発現するように遺伝的に改変され得る。そのような分子としては、これらに限定されないが、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ヒトＨＬＡ抗原（例えば、ＨＬＡ  Ａ１、ＨＬＡ  Ａ２、ＨＬＡ  Ａ３、ＨＬＡ  Ａ２７など）が挙げられる。当業者は、周知の方法を使用して、そのような分子をコードする適切な配列を容易に得ることができる。当業者は、周知の方法を使用して、そのような分子の改変体が、入手可能であるかまたは容易に得られ得ることを容易に理解する。公知の完全な配列または部分的な配列に基づいて、当業者は、本明細書において開示されるような、腫瘍細胞を遺伝的に改変するために適切な核酸配列を得るために、周知の分子生物学上の方法を使用し得る。これらの例示的な配列ならびにそのような配列の天然の改変体は、本発明の範囲内であると考えられることが理解される。
【００３４】
免疫応答を増大する分子をコードする例示的な核酸配列（完全なｃＤＮＡ配列および部分的なｃＤＮＡ配列ならびにゲノム配列を含む）は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋから入手可能であり、そしてそのような配列は、所望の免疫促進分子をコードする適切な核酸配列を得るために使用され得る。ＧｅｎＢａｎｋから入手可能なそのような配列の代表的な選択としては、これらに限定されないが、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＴ＿００５６１２；ＮＭ＿０１２０９２；ＮＭ＿１７５８６２；ＮＭ＿００６８８９；ＮＭ＿００５１９１；ＢＣ０４２６６５；ＮＭ＿０１２０９２；ＮＭ＿１７５８６２；ＮＭ＿００６８８９；ＮＭ＿１５２８５４；ＮＭ＿００５２１４；ＮＭ＿００５５１４；ＮＭ＿００２１１６；Ｚ７０３１５；ＮＭ＿００２１２７；ＡＨ０１３６３４；Ｌ３４７０３；Ｌ３４７３４；ＡＦ３８９３７８；Ｕ３０９０４；ＡＨ００６７０９；ＡＨ００６６６１；ＡＨ００６６６０；Ｘ５５７１０；Ｕ０４２４４；Ｕ３５４３１；Ｍ２４０４３；Ｕ０３８５９；ＮＭ＿００５５１４；ＮＭ＿００２１１６；Ｚ３０３４１；ＮＭ＿０１２２９２；ＮＭ＿００２１２７；ＮＭ＿００２１１７；ＡＨ００７５６０；ＡＨ００００４２；ＡＢ０４８３４７；ＡＢ０３２５９４；ＡＪ２９３２６４；ＡＪ２９３２６３；ＡＢ０３０５７５  ＡＢ０３０５７４；ＡＢ０３０５７３；ＡＦ２２１１２５；ＡＦ２２１１２４；ＡＨ００９１３６；Ｘ６０７６４；ＡＢ０３２５９７；Ｌ１７００５；Ｙ１３２６７；ＡＨ００３５８６；Ｚ４６６３３；Ｚ２７１２０；Ｚ３３４５３；Ｚ２３０７１；Ｘ０２４５７；Ｘ５７９５４；Ｋ０２８８３；Ｕ２１０５３；Ｕ０４２４３；Ｕ１８９３０；Ｌ３６３１８；Ｌ３６５９１；Ｌ３８５０４；Ｌ３３９２２；Ｍ２０１７９；Ｍ２０１３９；Ｍ２４０４２；Ｍ１５４９７；Ｍ３１９４４；Ｕ０４７８７；Ｕ０１８４８；Ｍ２７５３７；Ｕ１１２６７；Ｕ０３９０７；Ｕ０３８６３；Ｕ０３８６２；Ｕ０３８６１；ＮＭ＿００２１１６；Ｌ３４７２４；Ｌ３４７２３；Ｌ３４７２１；Ｌ３４７３７；Ｌ３４７０１；Ｚ９７３７０；Ｌ１５３７０；ＡＨ００３０７０；Ｍ２０１７９；Ｍ１６２７３；Ｍ１６２７２；Ｍ１５４９７；Ｍ１９７５６；Ｍ１９７５７；ＮＴ＿００８４１３などが挙げられる。
【００３５】
本発明の組成物および方法は、腫瘍に対する免疫応答を刺激するために有用である。そのような免疫応答は、腫瘍に関連する徴候または症状を処置または緩和する工程に有用である。そのような免疫応答は、肺癌に関連した徴候または症状を回復し得る。本明細書において使用される場合、「処置」することによって、本発明によって処置されていない個体の症状と比較して、本発明の化合物が投与された個体の症状を減少、予防、および／または戻すことが意味される。専門家は、本明細書に記載された組成物および方法が、当業者（医師または獣医師）によってその後の治療を決定するために、連続した臨床評価と同時に使用されるべきであることを理解する。それゆえ、処置に続いて、実施者は、標準的な方法論に従って肺炎症の処置におけるいかなる改善も評価する。そのような評価は、特定の処置用量を増加させるか減少させるか、投与の様式などを続けるか否かを評価する工程を補助し、そして情報を与える。
【００３６】
従って、本発明の方法は、腫瘍（例えば、癌（例えば、肺癌）が挙げられる）を処置するために使用され得る。本発明の方法は、例えば、さらなる腫瘍の増殖を予防することによって、腫瘍の増殖を遅らせることによって、または腫瘍の退行を引き起こすことによって、腫瘍の増殖を阻害するために使用され得る。従って、本発明の方法は、例えば、癌（例えば、肺癌）を処置するために使用され得る。本発明の化合物が投与される被験体は、特定の外傷状態に苦しむ必要がないことが理解される。実際に、本発明の化合物は、症状のいかなる発達の前にも（例えば、癌からの寛解の患者）予防的に投与され得る。用語「治療の（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）」「治療的に（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ）」およびこれらの用語の変化形は、治療上の使用、一次的な緩和のための使用ならびに予防的使用を含むように使用される。それゆえ、本明細書において使用される場合、「症状を処置または緩和」することによって、治療有効量の本発明の組成物が投与された個体の症状を、そのような投与を受けていない個体の症状と比較して、減少、予防、および／または戻すことが意味される。
【００３７】
用語「治療有効量」とは、求められる治療結果を達成するために効果的な投薬での処置を意味するように使用される。さらに、当業者は、微調整によっておよび／または本発明の１つを超える組成物を投与することによって（例えば、２つの異なる遺伝的に改変された腫瘍細胞の同時投与によって）、または治療効果を増強するために本発明の組成物を別の化合物と共に投与することによって（例えば、相乗的に）、治療有効量の本発明の組成物が、減少または増加され得ると理解する。従って、本発明は、所定の哺乳動物に特異的な特定の要求に対する投与／処置に適合する方法を提供する。以下の実施例において説明されるように、治療有効量は、例えば、経験的に比較的低量で開始することによって、および有効な効果の一致した評価を伴った段階的な増加によって、容易に決定され得る。
【００３８】
従って、本発明の方法は、腫瘍を有する患者を処置するために、単独でまたは他の周知の腫瘍治療との組み合わせで使用され得る。当業者は、本発明の有利な使用（例えば、肺癌患者の平均余命を延長することおよび／または肺癌患者の生活の質を改善すること）を容易に理解する。
【００３９】
局所的に進行した手術不能な疾患（ＩＩＩＢ段階）を有するＮＳＣＬＣ患者のための現在の推奨としては、白金に基づく化学療法に加えて放射線治療が挙げられ、そして転移を有する患者（ＩＶ段階）には化学療法のみが挙げられる（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｕｎｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ；１９９７年５月１６日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙによって採用された、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１５：２９９６−３０１８、１９９７）。それにもかかわらず、これらのアプローチの結果は乏しく、そして生存期間の増加は限られている。現在まで刊行された最も大きいメタアナリシスは、化学療法が、１年の生存期間の可能性を１０％増加し、そして生存期間の中央値を６週間増加すると結論付けた（非小細胞肺癌における化学療法：５２のランダム化された臨床試験の個体患者に関する最新のデータを使用したメタアナリシス。Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐ．ＢＭＪ  ３１１：８９９、１９９５）。Ｂｉｇ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒｉａｌグループ（ＢＬＴ）からの最近の報告は、類似の結果を報告した（Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２１：２００２（要約１６６１））。ＩＩＩ相臨床試行において、転移疾患を有する患者は、１年未満の生存期間の中央値を有する（Ｓｃｈｉｌｌｅｒら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：９２−９８（２００２））。２つのＩＩＩ相試行は、初回化学治療の失敗の後、標準的な第二次化学療法を受けた患者の６％だけが、約６ヶ月の生存期間の中央値を有し、応答すると予想し得ることを示した（Ｓｈｅｐｈｅｒｄら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１８：２０９５−２１０３（２０００）；Ｆｏｓｓｅｌｌａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１８：２３５４−２３６２（２０００））。本明細書において記載された実験において、患者の群は、再発したかまたは転移疾患状態の結果として、非常に乏しい予後を有し、そしてほとんどの患者は、手術、放射線、および／または一時的化学療法で処置されたが成功せず、６ヶ月未満と予測された生存期間をもたらした。
【００４０】
ワクチン接種アプローチ（例えば、本明細書において開示されたもの）は、非免疫原性腫瘍を有する患者における免疫応答を誘発し得る効果的な手段であり得る。ＮＳＣＬＣ腫瘍が、腫瘍抗原を含む証拠が存在する（Ｙａｍａｚａｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：４６４２−４６５０（１９９９）；Ｗｅｙｎａｎｔｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１５９：５５−６２（１９９９）；Ｂｉｘｂｙら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７８：６８５−６９４（１９９８）；Ｙａｍａｄａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：２８２９−２８３５（２００３））。しかし、肺腫瘍は、弱い免疫原性であり、そして潜在的に免疫抑制的であり（Ｗｏｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：４２７２−４２７６（２００２）；Ｗｏｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：４７６６−４７７２（２００１）；Ｎｅｕｎｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１０１：２８７−２９２（２００２）；Ｎｅｕｎｅｒら、Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ３４（補遺  ２）：Ｓ７９−８２（２００１）；Ｄｏｈａｄｗａｌａら、Ｊ．Ｂｉｅｌ  Ｃｈｅｍ．２７６：２０８０９−２０８１２（２００１））、それによってＴ細胞をアネルギー化または寛容化するので（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：１−８（１９９６）；Ｌｏｍｂａｒｄｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：１５８７−１５８９（１９９４））、肺腫瘍は、免疫治療に関して劣った候補であると考えられてきた。従って、肺腫瘍は、免疫攻撃を被っておらず、そしてそれゆえ免疫エフェクター細胞に抵抗するための回避メカニズムを発達し得なかった。従って、肺腫瘍は、腫瘍浸潤リンパ球を定着する免疫原性腫瘍とは異なり、特に複数のモデル系での腫瘍拒絶におけるＣＤ８  ＣＴＬの関与の観点から、キラーＣＴＬに屈し得る（Ｐｏｄａｃｋ，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｅｌ．５７：５４８−５５２（１９９５））。
【００４１】
本明細書において開示されるように、全菌体ワクチンがこれまで最良の臨床結果を生じているので、同種異系の全菌体ワクチンが選択された。例えば、全菌体メラノーマワクチンが投与された場合に、統計学的に有意な生存期間の利益が発生した（Ｍｏｒｔｏｎら、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２３６：４３８−４４９（２００２））。対照的に、１つのエピトープで導かれたワクチンは、腫瘍回避変異体のために効用を制限され得た（Ｖｅｌｄｅｒｓら、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５：６９７−７０６（１９９８））。全菌体ワクチンアプローチのさらなる利点は、それが特異的な肺腫瘍抗原の推測的な描写を必要としないことである。本明細書において開示される実験において見い出されるように、ワクチンが成功し、そしてＣＴＬが産生される場合、原因となる抗原部位がその後同定され得る。肺腫瘍抗原は異なる患者の肺腫瘍において共有され、そしてこの抗原は、患者の抗原提示細胞によって交差提示され得るという仮定の下、同種異系の細胞に基づくワクチンは、自己のワクチンに対して良好な代替物を提供する。肺腫瘍において共有された抗原に関して限られた証拠しかない（Ｙａｍａｚａｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：４６４２−４６５０（１９９９）；Ｙａｍａｄａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：２８２９−２８３５（２００３））が、このことは、他の腫瘍において示されている（Ｆｏｎｇら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：２４５−２７３（２０００）；Ｂｏｏｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：３３７−３６５（１９９４））。
【００４２】
同種異系のワクチン接種に応答して産生されるＣＤ８細胞が自己の腫瘍細胞を認識するという直接の証拠を得るために、腫瘍の標本が手術の際に得られるべきである。腫瘍の標本は、本明細書において開示される進行した疾患を有する患者の試行において入手可能ではなかった（実施例ＩＩおよびＩＩＩを参照のこと）。しかし、ＡＤ１００にインビトロで反応する高頻度の患者ＣＤ８細胞の長期間の維持および外部のワクチン接種の中止後でさえも何人かの患者（Ｎｏ．１００４およびＮｏ．１００７；図５）におけるこれらの増加は、自己の腫瘍および同種異系のワクチンとの交差反応による患者ＣＤ８細胞の免疫刺激と一致する。
【００４３】
本明細書において開示される実験において、唯一１人の患者が部分的に応答したが、５人の他の患者は、安定的な疾患を有していた。増加した免疫応答性が、ＣＤ８を介した腫瘍特異性免疫応答によって示された。非常に乏しい予後を有する１９人の患者中の６人（３２％）が、全体のコホートの生存期間の中央値がかなり進行した疾患にも関わらず１８ヶ月に達し、急速な致死状態の疾患の安定化を表した事実は、励みとなる。本明細書において開示される結果は、腫瘍の進行がワクチン接種によって遅らせられること、およびこの効果は、患者がワクチンのＨＬＡ  Ａ１またはＨＬＡ  Ａ２遺伝子座に対して同種異系か否かに関わらず発生することを示す。この発見はまた、間接的な抗原提示は抗腫瘍活性を促進する工程において効果的であり得ること、および同種異系のＭＨＣ分子はこの効果を増大させることを示唆する。
【００４４】
本明細書において開示される結果において、上記ワクチンは良好な耐性を示し、そして患者の生活の質は非常によく、従って、患者の転帰を改善した。これは、免疫の産生物であるので、いくつかの免疫を介した副作用が考えられると推定された。予想された耐えられる副作用のそのような現象のありうる例は、例えば、５人の患者におけるワクチン接種部位での局所的紅斑および１人の患者により経験された関節炎の疼痛のエピソードであった（実施例ＩＩＩを参照のこと）。
【００４５】
ＣＤ８０およびＨＬＡ抗原を発現するように遺伝的に改変された腫瘍細胞を含有する本発明の組成物は、免疫に関して有用な任意の周知の成分を含有することによって、ワクチンに有用な生理学的に受容可能なキャリアと組み合わされ得る。この生理学的キャリアの成分は、ワクチン中に投与された抗原に対する免疫応答を促進または増大することが意図される。この処方物は、抗原に対する免疫応答を刺激する組成物中で個体に抗原を提示する好ましいｐＨ範囲、塩または他の成分を維持するために、緩衝液を含有し得る。生理学的に受容可能なキャリアはまた、抗原に対する免疫応答を増大する１種以上のアジュバントを含み得る。処方物は、皮下に、筋肉内に、皮内に、または免疫に関して受容可能な任意の様式において投与され得る。
【００４６】
アジュバントとは、本発明の免疫原性因子（例えば、ＣＤ８０およびＨＬＡ抗原を発現するように遺伝的に改変された腫瘍細胞）に添加された場合、その混合物に露出する際に、レシピエント宿主中の因子に対する免疫応答を非特異的に増大または増加する、物質をいう。アジュバントとしては、例えば、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、ミョウバン（アルミニウム塩）、リポソームおよび微粒子（例えば、ポリスチレン、デンプン、ポリホスファゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ）およびポリ乳酸／ポリグリコシドが挙げられる。アジュバントとしてはまた、例えば、スクアレン混合物（ＳＡＦ−Ｉ）、ムラミルペプチド、サポニン誘導体、ミコバクテリアム属細胞壁調製物、モノホスホリルリピドＡ、ミコール酸誘導体、非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤、Ｑｕｉｌ  Ａ、コレラトキシンＢサブユニット、ポリホスファゼンおよび誘導体、および例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：８７３−８７５（１９９０）によって記載された免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）が挙げられる。獣医学上の使用のためにおよび動物中における抗体の産生のために、フロイントアジュバント（完全と不完全との両方）の分裂促進成分が使用され得る。ヒトにおいて、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）は、有用なアジュバントである。種々の適切なアジュバントが、当該分野において周知である（例えば、ＷａｒｒｅｎおよびＣｈｅｄｉｄ、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８：８３（１９８８）；ＡｌｌｉｓｏｎおよびＢｙａｒｓ、Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｎｅｗ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ、Ｅｌｌｉｓ（編）、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ、Ｂｏｓｔｏｎ（１９９２）を参照のこと）。さらなるアジュバントとしては、例えば、カルメット−ゲラン杆菌（ＢＣＧ），ＤＥＴＯＸ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉの細胞壁骨格（ＣＷＳ）およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ由来のモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）を含んでいる）などが挙げられる（例えば、Ｈｏｏｖｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１１：３９０（１９９３）；Ｗｏｏｄｌｏｃｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２２：２５１−２５９（１９９９）を参照のこと）。
【００４７】
本明細書において開示される本発明の組成物および方法は、腫瘍を有する患者を処置するために有用である。特定の実施形態が肺癌を用いて例示されているが、類似のアプローチがまた、適切な同種異系の細胞を使用して、他のタイプの腫瘍（癌が挙げられる）を処置するために使用され得ることが理解される。
【００４８】
本発明の種々の実施形態の活性に実質的に影響しない改変もまた、本明細書において提供される本発明の定義の範囲内において提供されることが理解される。従って、以下の実施例は、本発明を限定しないが、本発明を説明することを意図されている。特許請求の範囲に記載されている本発明は、詳細におよびその具体的な実施形態に関連して記載されているが、種々の変更および改変が、その精神および範囲から逸脱することなく、特許請求の範囲に記載されている本発明になされ得ることは、当業者にとって明白である。従って、例えば、当業者は、日常の実験法に過ぎない、本明細書において記載される具体的な物質および手順に対する多数の等価物を使用して、認識または確認し得る。そのような等価物は、本発明の範囲内であると考えられ、そして添付の特許請求の範囲によって網羅されている。
【実施例】
【００４９】
（実施例Ｉ）
（進行した非小細胞肺癌を有する患者中のＢ７．１  ＨＬＡ−Ａ遺伝子を改変された腺癌細胞株を用いた同種異系のワクチン接種）
この実施例は、進行した非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する患者中でのＢ７．１  ＨＬＡ−Ａ遺伝子を改変された腺癌細胞株を用いた同種異系のワクチン接種のために使用されたプロトコルを記載する。この実施例は、使用された実験プロトコルを記載する。
【００５０】
以下の実験を、（ａ）免疫治療のために使用されたＣＤ８０およびＨＬＡ  Ａをトランスフェクトした同種異系の肺腫瘍細胞が、ＩＦＮ‐γ用のＥＬＩスポットによって評価される腫瘍特異性ＣＤ８−ＣＴＬ活性化および増殖を誘発し得るか否かを測定するために；（ｂ）非小細胞肺癌種（ＮＳＣＬＣ）を有する患者にＢ７．１およびＨＬＡ  ＡｌまたはＨＬＡ  Ａ２をトランスフェクトした同種異系の腫瘍細胞ワクチンを投与することの安全性および毒性を評価するために；ならびに（ｃ）ＮＳＣＬＣを有する患者に関する臨床結果におけるこのＢ７．１ワクチンの抗腫瘍効果を評価するために設計した。
【００５１】
患者の選択。当初、新しく診断または再発した転移非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する１５人の患者を処置した。これら１５人の患者の分析を、実施例ＩＩに記載する。さらに４人の患者を加え、計１９人の患者に関して、および１９人の患者のさらなる結果を実施例ＩＩＩに記載する。これらの患者は、既に化学治療、放射線治療、手術または全ての組み合わせに失敗していた。適格者基準は、以下のようなものであった：年齢１８歳を超えていること、Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ（ＥＣＯＧ）実施状態０〜２、測定可能な疾患、署名されたインフォームドコンセント、および組織学的に確認されたＮＳＣＬＣ（悪性の胸水を有するＩＩＩＢ段階、ＩＶ段階、または再発）。脳転移を有する患者を、この患者らが既に処置されていた場合、含めた。患者が化学治療、放射線治療または生物学的に改変する因子を先の４週間の間に受けていた場合、この患者は研究に適格ではなかった。全ての患者を、Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ／Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉａｍｉの外来患者診療所において処置した。ＥＣＯＧ基準によって評価されたパフォーマンスステータスによって完全な歴史および身体的検査（体重および生命徴候を含む）を実行した。以下の試験を、登録の前に、実行した：完全血球算定；血小板算定；化学的性質（尿酸、カルシウム、リン、トランスアミナーゼ（血清グルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＳＧＯＴ）および血清グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＳＧＰＴ）、アルカリホスファターゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、全および直接ビリルビン、血液尿素窒素（ＢＵＮ），クレアチニン、アルブミン、全タンパク質、電解質、およびグルコースが挙げられる）；および心電図（ＥＫＧ）。ＨＬＡ型別を得た。患者はワクチン接種されている間、月毎に２回腫瘍応答を計算された断層撮影法（ＣＴ）スキャンによって評価した。腫瘍測定を、Ｘ線写真研究（関連部位のＣＴスキャンを含む）の結果から得た。
【００５２】
ワクチン細胞株および遺伝子改変。Ｄｒ．Ｎ．Ｓａｖａｒａｊ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉａｍｉ、  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）により、１９９４年に、肺癌患者の生検からヒト肺腺癌細胞株が確立された（ＡＤ１００と命名されている）。この患者は、転移肺腺癌に起因して腸骨稜の骨びらん（ｂｏｎｅ  ｅｒｏｓｉｏｎ）からの骨盤の疼痛の症状を始めに、１９９３年に呈した７４歳の白人男性であった。培養のための癌細胞を、骨盤の破壊された領域から骨髄吸引によって得た。この患者を、骨盤への放射線治療で処置したが、診断後１ヶ月で終了した。この患者由来の細胞株を、標準培地の培養中に維持し（以下に記載される）、そしてこの細胞株には、マイコプラスマ属、ウイルス、または他の外来物質による汚染がない。この細胞株は、均質であり、プラスチックに付着し、そして約２６時間の分裂の速さで成長する。
【００５３】
遺伝的改変。ＡＤ１００を、プラスミドｃＤＮＡ、ｐＢＭＧ‐Ｎｅｏ‐Ｂ７．１およびｐＢＭＧ‐Ｈｉｓ‐ＨＬＡ  Ａ２でまたはＢ４５‐Ｎｅｏ‐ＣＭ‐Ａ１‐Ｂ７．１（Ｙａｍａｚａｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５９：４６４２、１９９９）でトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、Ｇ４１８およびヒスチジノールを用いて選択した。正確な配列の立証は、制限分析および関連遺伝子生成物（すなわち、Ｇ４１８）の発現、またはベクター配列に関するヒスチジノール耐性、トランスフェクトしたｃＤＮＡに関するＨＬＡ  Ａ１、ＨＬＡ  Ａ２、およびＢ７．１発現に基づいていた。この細胞を、その複製を防ぐために、例えば、コバルト（Ｃｏ）照射器の１２，０００Ｒａｄで放射線照射し、そして使用するまで、１０％  ＤＭＳＯの５×１０７細胞のアリコート中に冷凍保存した。組織培養に再びプレートする際、この細胞は約１４日間生きているようであったが、コロニーを形成し得ず、このことは、複製する能力がないことを示していた。それゆえ、この細胞は、ワクチン細胞としての使用に関して安全であると考えられた。ワクチンとしてのこの使用のための最小限の必要条件は、ワクチン細胞の代表的なバッチに関して図１Ａに示されているように、少なくとも７０％の細胞において、ＨＬＡ  Ａ１またはＨＬＡ  Ａ２に加えてのＢ７．１の同時発現であった。トランスフェクトしていないＡＤ１００株は、抗ＨＬＡ  Ａ１または抗ＨＬＡ  Ａ２または抗Ｂ７．１で染色するためのＦＡＣＳによって陰性であった。図１Ａは、免疫のために使用された、ＣＤ８０およびＨＬＡ  Ａ１またはＨＬＡ  Ａ２でトランスフェクトしたＡＤ１００ワクチン細胞のフローサイトメトリー分析による精度管理を示す。
【００５４】
免疫。皮内注射を、局所的皮膚反応の程度を減少させるために、複数の体の部位に与えた。ＨＬＡ  Ａ１またはＨＬＡ  Ａ２であった患者は、対応するＨＬＡに合わせたワクチンを受けたが、ＨＬＡ  Ａ１でもＨＬＡ  Ａ２でもない患者は、ＨＬＡ  Ａ１でトランスフェクトしたワクチン（すなわち、ＨＬＡを不適当に合わせられたワクチン）を受けた。所定のワクチン接種の日に、患者は、先端における各アリコートの２〜５の皮内注射のような投与のための２〜５アリコートに分割された全投与量の５×１０７の放射線照射された細胞（１２，０００ｒａｄ）を受け、各投与は、最も近い隣接の注射から注射針の進入口において少なくとも５ｃｍ離れていた。治療の下、腫瘍の進行は起こらなかったという前提で、合計９回の免疫（４．５×１０８細胞）を、治療の過程にわたって、２週間毎に１回行った（表１）。その後のワクチン接種において、注射部位を、異なる四肢へと右回りの様式で回転した。１つのワクチン接種の過程は、３回の２週間毎の注射を含んでいた。安定的な疾患の証拠を有する患者、またはイメージ評価（ＣＴスキャン）によるＮＳＣＬＣの応答の証拠を有する患者、および中位の毒性（等級≦２）の証拠を有さない患者を、同じ投与量によるさらなる過程によって処置した。注射の第二の過程は、第一の過程を完了した第三のワクチン接種の後の２週間後に開始した。ＣＴスキャンによる腫瘍の進行の非存在下において、および重度のまたは生命を脅かす毒性（等級≧３）のない状態で、同じ量の治療の第三の過程を、治療の第二の過程の第三のワクチン接種の２週間後に開始した。各過程を実行する前および後に、血液試験による臨床評価、毒性評価、および免疫学的評価を行った。患者は、血液算定および基本的化学的性質をモニタリングすることを含めて、研究の間毎週臨床的に続けられた（表１）。
【００５５】
表１は、ＮＳＣＬＣ（ＩＩＩＢ／ＩＶ）患者の処置および評価スケジュールを示す。患者を、上で考察したように、２週間ごとの間隔で９回免疫した。免疫アッセイを、各３回の免疫の前におよび後に行った。
【００５６】
（表１．免疫および免疫学的評価）
【００５７】
【表１】
2007506764.tif 000003
免疫学的試験。インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）のための皮膚試験遅延型過敏症（ＤＴＨ）アッセイおよび酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを含む、免疫学的試験を実行した。ＣＤ４細胞によって媒介された免疫応答を、１０５のＡ１、Ａ２またはトランスフェクトしていないＡＤ１００−Ｂ７ワクチン細胞の皮内注射に続くＤＴＨ反応によって検査した。精製されたＣＤ８細胞を、３回の免疫の各過程の前および後に患者から得た。ＣＤ８細胞を、Ｓｐｉｎ‐ｓｅｐ  ｐｒｅｐ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ４および他の抗体を用いて取り除く（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）ことによって濃縮した。精製度は、８０％よりも良く（図１Ｂ）、主な汚染している細胞は、Ｂ細胞であった（示さず）。ＣＤ８細胞を、研究患者の全てのワクチン接種が完了するまで、分析のための培地を含む１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）の中に冷凍した。免疫前およびワクチン接種後のＥＬＩＳＰＯＴ頻度の分析を同じ日に同じマイクロタイタープレート中で実行した。アッセイを、４連で行い、それぞれ、１０３のＡ１またはＡ２をトランスフェクトしたＡＤ１００で、またはトランスフェクトしていないＡＤ１００で、Ｋ５６２を使用して、または培地のみを使用して、３日間２×１０４の精製された患者のＣＤ８細胞を刺激し、そしてＥＬＩＳＰＯＴによってＩＦＮ−γ産生細胞の頻度を決定した。免疫アッセイを、免疫の前に、および３回目、６回目、および９回目の免疫の後に実行した。
【００５８】
統計分析。患者の特徴を、パーセンテージを用いる算定として、または平均値および範囲として提示する。全生存期間（Ｋａｐｌａｎ‐Ｍｅｉｅｒ生成物−制限方法によって推定される）を、研究への参加から任意の原因に由来する死亡までの時間として規定する。死亡のない状態で、追跡を、最後の患者との接触の日にセンサーした。一変量の比例ハザード退行（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  ｈａｚａｒｄｓ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）および多変量の比例ハザード退行を、患者の生存期間が年齢（連続的）、性別、人種（他の人種対白人非ヒスパニック）、腫瘍病理学（腺癌対その他）、およびワクチンがＨＬＡに合うことに関連するか否かを決定するために使用した。ロジスティック回帰を、臨床応答の、対応する分析のために使用した。ハザード率および患者の生存している割合について、９０％の信頼区間（ＣＩ）Ｌ９０‐Ｕ９０を報告する。これらを、推定されるパラメータ（例えば、ハザード率）が、Ｌ９０を超える９５％の信頼を提供すると解釈し得る。
【００５９】
（実施例ＩＩ）
（同種異系のワクチンを用いた全菌体免疫に対する進行した肺癌患者の特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の応答）
この実施例は、同種異系のワクチンを用いた全菌体免疫に対する１５人の患者グループの研究の結果を記載する。
【００６０】
ＩＩＩＢ／ＩＶ段階の進行したＮＳＣＬＣを有する患者は、ＨＬＡ型であった。ＨＬＡ  Ａ１陽性患者は、ＡＤ‐Ａ１‐Ｂ７ワクチンを受けた；ＨＬＡ  Ａ２陽性患者は、ＡＤ‐Ａ２‐Ｂ７ワクチンを受けた；そしてＨＬＡ  Ａ１陽性でもＨＬＡ  Ａ２陽性でもない患者は、ＡＤ‐Ａ１‐Ｂ７ワクチンまたはＡＤ‐Ａ２‐Ｂ７ワクチンのいずれかを受けた。ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８細胞の頻度を、ＨＬＡ  Ａ１またはＨＬＡ  Ａ２をトランスフェクトしたＡＤ１００またはトランスフェクトしていないＡＤ１００を用いて、インビトロでの精製された患者ＣＤ８細胞の再刺激後、ＥＬＩＳＰＯＴによって決定した。コントロールは、Ｋ５６２を用いた刺激および刺激物質細胞を伴わないＣＤ８細胞のインキュベーションを含んでいた。
【００６１】
免疫された腫瘍患者のＥＬＩＳＰＯＴ応答を、ＨＬＡに合わせられた応答として提示し（図２Ａ）、３日間、それぞれ、ＨＬＡ  Ａ１またはＨＬＡ  Ａ２をトランスフェクトしたＡＤ１００細胞をインビトロで抗原投与されたＨＬＡ  Ａ１患者またはＨＬＡ  Ａ２患者から得られたＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８細胞の数を示す。ＨＬＡに不適当に合わせられた応答は、Ａ１患者またはＡ２患者由来のＣＤ８細胞を、それぞれ、Ａ２またはＡ１をトランスフェクトしたＡＤ１００を用いて抗原投与した場合の、形成されたスポットの数を示す（図２Ｂ）。この合わせられた応答は、６回の免疫後、６±４（平均値の標準誤差、ＳＥＭ）のＩＦＮ−γ分泌、免疫前のＣＤ８細胞（２０，０００につき）から最大限の９０±３５（ＳＥＭ）ＩＦＮ‐γ分泌細胞まで、１５倍増加し、そして次の３回の免疫の間このレベルにとどまった。この不適当に合わせられた応答は、２４±１８から最大限１４２±４２まで、５．７倍増加した。９人の患者のこのグループの中に、３回の免疫の前かまたは後に応答を示さなかった（０スポット）１人の患者が含まれ、この時に、腫瘍が進行し、そしてこの患者を試行から除いた。
【００６２】
残りの５人の患者は、ＨＬＡ  Ａ１またはＨＬＡ  Ａ２に関して陰性であった。Ａ１またはＡ２をトランスフェクトしたＡＤ１００を用いた抗原投与へのこれらの患者のＣＤ８応答を、合わされていない応答として図２Ｃに示す。ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８細胞の頻度は、免疫前の４．８±１．８から３回の免疫後の１０５±２４まで２１倍増加し、そしてこの試行の全体を通して一定に保たれた。頻度におけるこの増加は、トランスフェクトしていない野生型ＡＤ１００を用いて抗原投与された場合の全ての患者のＣＤ８細胞の頻度に類似する（図２Ｄ）。最終的に、この応答の特異性は、Ｋ５６２への応答の増加の非存在（図２Ｅ）または抗原投与されないＣＤ８細胞の増加の非存在から明らかである。野生型におけるまたは遺伝子改変後のＫ５６２およびＡＤ１００に対するＣＤ８応答は、ワクチン後の各時点において、有意に異なる（図２Ｆ）。
【００６３】
表２に列挙されるＣＤ８応答は、Ａ１またはＡ２陽性患者に対する合わせられたワクチンへの応答を報告する。非Ａ１、Ａ２患者にとって、それがＡＤ１００−Ａ２に対する応答である。１５人の患者の１人は、免疫の第一の過程を完了する前に、この試行に関連のない腎不全に起因して分析し得なかった。処置された１５人の患者のうち、５人の患者が臨床上の応答を有した：１人の患者は、部分的な応答（ＰＲ）を有し、そして４人の患者は安定的な疾患（ＳＤ）を有した。臨床応答を有するこれらの患者のうち４人（ＰＲ＋３ＳＤ）は、さらなる治療なしに３１ヶ月、２８ヶ月、２５ヶ月、および１２ヶ月の間、これらの疾患の安定化を伴ってさらに生存している。死亡した患者は、もともと５ヶ月間ＳＤを有しており、次いで疾患が進行し、そして一時的化学療法のいくつかの過程にも関わらず、１５ヵ月後死亡した。対照的に、ワクチン接種に応答しなかった他の１０人の患者のうち９人は、１人を除いて死亡し、この１人の患者は、ＩｒｅｓｓａＴＭを用いた治療後安定した疾患を達成した。表２は、試行前の処置、免疫に対する臨床上の応答、および免疫応答を含めた、全ての患者のデータをまとめる。処置の下にも関わらず進行した疾患を有した患者は、表２に示したように研究から除いた。
【００６４】
表２は、同種異系のＢ７／ＨＬＡ  ＡをトランスフェクトしたＮＳＣＬＣワクチンを用いて処置した、進行したＩＩＩＢ／ＩＶ段階のＮＳＣＬＣを有する１５人の患者の臨床上の応答、免疫学的ＣＤ８応答、生存期間、および治療前のまとめを示す。表２の略語は、以下の通りである：ＰＤ−進行性の疾患；ＮＥ−免疫応答に関して評価し得ないが、右の生存期間分析には含まれる；ＰＲ−部分的な応答；ＳＤ−安定的な疾患；Ｃ−化学療法；Ｒ−放射線；Ｓ−手術。生存期間は、この研究の初めからの生存の時間を示す；＋は、生きている患者を示す；ｎ．ｄ．行われていない、進行のため、患者が研究から離れた。
【００６５】
（表２．１５人のＮＳＣＬＣ患者の臨床上の応答、免疫学的ＣＤ８応答、生存期間、および前処置のまとめ）
【００６６】
【表２】
2007506764.tif 000004
５人の患者が、臨床上の応答を有し、そしてＩＦＮスポット形成ＣＤ８細胞の頻度が、トランスフェクトしたかまたはトランスフェクトしていないＡＤ１００を用いたエキソビボでの抗原投与によって測定された連続した免疫に対して増加したが、Ｋ５６２への反応性は、低くそして変化しないままでいた（図２Ｅ）。臨床上で応答した患者の３人において（図２；１００４，１００７，１０１０）、１８週間目の治療の完了後、試験開始後３５〜７５週間において血液サンプルを得、そしてＡＤ１００に対して応答するＣＤ８細胞のかなりの力価を示した（図２Ｇ）。実際に、２人の患者中２人において（１００４、１００７）、この力価は、さらに１８週間目に免疫が終了した後でさえも増加した。
【００６７】
分析期間の全ての患者の生存期間の中央値は、１８ヶ月であり、このグループの患者の予想された生存期間の中央値の１年未満を超えていた（図３）。９０％の信頼区間を、図３に示す。合わせられたＭＨＣによる生存期間の分析および臨床上の応答による生存期間の分析は、ＨＬＡに合わせられなかった患者はｐ＝０．０７で統計学的に有意ではないという生存期間の利点を示が、非応答者と比較した場合、臨床上の応答者は有意な（ｐ＝０．００８）生存期間の利点を有していたことを明らかにした。
【００６８】
安全性。試行に参加した１５人の患者の誰もが、重度の有害な事象（死亡かまたは入院を必要とする事象として規定される）に関連するいかなる処置も経験しなかった。副作用に関連する処置は、局所的紅斑および３〜４日で消散した腫脹からなった。１人の患者は、関連処置を受け得た一過性の関節通について苦痛を訴えた。１人の患者は、肺不全に起因して最後の免疫の３０日以内に死亡した；心膜炎のこれまでのエピソードを有した１人の患者は、免疫の最後の過程の間に心内膜液浸出を経験し、心膜窓（ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ  ｗｉｎｄｏｗ）を必要とした。流体の中に腫瘍細胞は、検出されなかった。患者は免疫に応答し、そしてなお安定的な疾患を有している。上で述べたように、１人の患者は、免疫の１つの過程の完了前に、腎不全を有していた。これらの事象はどれも、独立の安全性監視委員会（ｓａｆｅｔｙ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｂｏａｒｄ）に関連する処置であるようには考えられなかった。
【００６９】
（実施例ＩＩＩ）
（同種異系のワクチンを用いた全菌体免疫に対する進行した肺癌患者のさらなる特徴付け）
この実施例は、さらなる患者および研究期間を含む、実施例ＩＩに記載された研究の継続を記載する。
【００７０】
実験を、本質的に実施例ＩＩおよびＲａｅｚら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：２８００‐２８０７（２００４）に記載されるように実行した。
【００７１】
患者の特徴。１９人の研究のための患者の特徴を表３に概要をまとめた。Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ実施状態は、１８人の患者において０〜１（７４％）であった。１３人の患者は、ＨＬＡ  Ａ１（３人の患者）かまたはＨＬＡ  Ａ２（１０人の患者）のいずれかに合わせられたワクチンを受けたが、Ａ１でもＡ２でもない６人の患者は、合わせられていないワクチン（すなわち、ＨＬＡ−Ａ１ワクチン）を受けた。ＨＬＡ  Ａに合わせられた患者は、ワクチン細胞による直接的な抗原提示によってＣＤ８応答を媒介することが可能であり得るが、合わせられていない患者は、それにも関わらず、ワクチン細胞の死後の間接的な抗原提示および抗原提示細胞による抗原接種を介してＣＤ８応答を増やし得ると判断された。研究に参加する前に、全ての患者は、これまで以下のように処置されていた：９人（４７％）は手術、６人（３２％）は放射線治療、そして１７人（８９％）は化学治療。化学治療で処置された患者の中で、１０人（５３％）は、１つ以上の化学治療管理を用いて処置されたが、不成功に終わった。
【００７２】
（表３．研究に参加した１９人の患者の特徴）
【００７３】
【表３】
2007506764.tif 000005
臨床結果。１８人の患者は、合計３０過程のワクチン、合計９０のワクチン接種を受けた（表４）。５人の患者は、３つの完全な過程を受け、そして２人の患者は、２つの完全な過程を受けた。第一のワクチン接種の後、重度の有害な事象（ＳＡＥ）が発生したので、研究から除いた（１つの過程も完了しなかった）１人の患者の例外を除いて、残りの１１人の患者は、１つの完全な過程を行い、その後、この患者らを、疾患の進行のため研究から除いた。４人の患者が、ワクチン接種後ＳＡＥを経験し、このどれもがワクチンに関連していると判断されなかった。
【００７４】
（表４．研究に参加した１９人の患者の結果）
【００７５】
【表４】
2007506764.tif 000006
ワクチン接種の第一の過程の間、５８歳の女性が、悪性の心内膜液浸出を発生し、心膜窓を必要とした；この患者を研究から除き、ホスピスに送り出し、そして１週間後に死亡した。彼女は、研究の参加前に、５種類の一時的化学療法でこれまで処置されてきたが、不成功に終わった。７６歳の男性患者もまた、心膜窓を必要とする心内膜液浸出を発現したが、スキャン前の検査は、研究の開始前の発達した心内膜液浸出を明らかにした。ＳＡＥが発現する前にワクチンの３つの過程を受けたこの患者は、安定的な疾患を有し続ける。彼は、現在も生きており、そしていかなるさらなる治療を受けずとも３１ヵ月後も健全である。
【００７６】
５５歳の男性は、１週間前に彼が既に同意書に署名した後の彼の第一回目のワクチン接種の日に、化学療法誘導腎臓機能障害を悪化していることを発見され、そして仮の皮膚試験を経験した。彼の腎機能は、それ以降の日も悪化を続け、そして３ヵ月後に死亡した。ＳＡＥを経験した４人目の患者は、脳転移を有した５６歳の女性であった。彼女の第二のワクチン接種の過程の間、彼女は、呼吸不全を発生し、次いで研究から除き、そして彼女の疾患の進行から３０日以内に死亡した。この患者は、４種類の一時的化学療法をこれまで処置されてきたが、不成功に終わった。
【００７７】
他の副作用に関して、１人の患者が、注射部位における一過性の疼痛の苦痛を訴えた。４人の患者が、ワクチン接種部位におけるいくつかの紅斑を発生し、この紅斑は、１週間以内に消散した。１人の患者が、第一の過程の後、いくつかの関節において中位の関節炎の疼痛を経験した。本発明者らは、患者らの研究室のパラメータ（完全な血液および血小板算定、クレアチニン／ＢＵＮ、カルシウム、および肝臓機能試験が挙げられる）の有意な変化を有するいかなる患者も発見しなかった。
【００７８】
表５は、研究に応答を有した６人の患者の応答までの時間、応答の期間、および生存期間を示す。
【００７９】
（表５．研究において応答を有した６人の患者の応答までの時間、応答の期間、および生存期間）
【００８０】
【表５】
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１人の患者は、１３ヶ月間続いた部分的な応答を有し、そして５人は、１．６〜３９＋月の範囲の安定的な疾患を示した（表５）。この臨床上の応答率は、３２％（１９人の患者中６人）であった。２００４年２月現在、この患者らは、２３〜４０＋月の範囲の生存期間を有し、そして５人の患者は、なお生きていた。
【００８１】
部分的な応答を有した患者が、陽電子断層撮影法スキャンによって立証された新しい悪性の病変を発生した後、彼女の疾患が臨床的に非攻撃的であると判断されたので、彼女を２ヶ月間観察下に置いた。いくつかの病変は、その後その大きさが減少するか、または消えた。この患者は、ワクチン接種を完了した３６ヶ月後、一時的化学療法の必要性のない安定的な疾患を有し続ける。処置に対する応答を有した６人の患者のうち１人のみが、その後の一時的化学療法を必要とした。残りの５人の患者は、さらなる処置の必要のない安定的な疾患を有し続ける。
【００８２】
治療に応答しなかった他の１３人の患者のうち、２人のみが２００４年２月の時点で生きていた。これらの患者の１人はゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）（ＩｒｅｓｓａＴＭ）を用いて疾患の安定化を経験し、そしてもう１人は、一時的化学療法を受けている。
【００８３】
年齢、性別、人種、病理学、およびワクチンのＨＬＡに合わされていることに関するロジスティック回帰分析は、これらの因子のどれもが、臨床上の応答（すなわち、部分的な応答または安定的な疾患）に対して統計学的に有意に関連していなかった（全ての例においてＰ＞．１０）ことを示した。
【００８４】
図４は、１９人の研究患者の総合的な生存期間のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ推定を示す（縦のチェックマークは、センサーされた追跡を示す）。推定された生存期間の中央値は、１８ヶ月である（９０％ＣＩ、７〜２３ヶ月）。１年、２年、および３年の総合的な生存の推定は、それぞれ、５２％（９０％ＣＩ、３２％〜７１％）３０％（９０％ＣＩ、１１％〜４９％）、および３０％（９０％ＣＩ、１１％〜４９％）である。２００４年２月現在、１２人の患者において研究の開始後１〜２３ヵ月で死亡が発生した（表２）。なお生存している７人の患者について、現在研究開始からの追跡は、現在１０〜４０ヶ月の範囲であり、追跡期間の中央値は３６ヶ月である。
【００８５】
一変量の比例ハザード回帰分析は、ＨＬＡに合わせられたワクチンを受けている患者のおそらくより高い死亡率（ハザード率＝４．５；９０％ＣＩ、１．１〜１７．２）および腺癌を有する患者のおそらくより低い死亡率（ハザード率＝０．３；９０％ＣＩ、０．１〜１．０）を示唆した。しかし、５つの共変量（ＨＬＡに合わせること、年齢、性別、人種、病状）に関与する多変量分析は、総合的な死亡率に対するワクチンをＨＬＡに合わせることの有害な効果を低く評価した；対応している調節されたハザード率は１．９（Ｐ＝．５１）であった。腺癌対他の病状に関する調節されたハザード率は、０．２（Ｐ＝．１１）であって、これは従来の有意水準における可能性の範囲内である。
【００８６】
ワクチン接種に対する免疫応答。患者のこのコホートは、大量に前処置され、そして免疫抑制的であると考えられる大量の腫瘍負荷を保有していた。従って、この腫瘍ワクチン接種プロトコルがこれらの患者において特異的な免疫応答を誘発し得るか否かを確立することは、重要であった。ＣＤ８  ＣＴＬ応答は、腫瘍拒絶に関して重要であると考えられるので、研究を、免疫系のこの部門に焦点を当てた。非特異的ナチュラルキラー（ＮＫ）活性とＣＤ８  ＣＴＬ活性とを区別するために、二重の計画を使用した。第一に、ＣＤ８細胞を、抗体の陰性選択混液中に抗ＣＤ５６を含有することによってＮＫ細胞を除去するために精製した。第二に、ＣＤ８細胞に、ＮＫ標的であるＫ５６２を抗原投与した。ＮＫの汚染は、Ｋ５６２抗原投与に対して応答する細胞の高い力価を生じる。
【００８７】
１人を除く全ての患者が、６週間（３回のワクチン接種）後、測定可能なＣＤ８応答を有し、この応答は、１２週間後に増加し、そして１８週間までに安定化する傾向があった（表６）。野生型Ａ１またはＡ２をトランスフェクトしたＡＤ１００を用いた患者ＣＤ８細胞のインビトロ抗原投与は、有意な違いを示さなかった。早期の疾患の進行または有害な事象に起因して、分析のために利用可能な追跡サンプルが存在しなかったので、２人の患者（患者番号１０１２および１０１９）を、免疫学的に評価し得なかった。１人の患者は、非常に中位な応答のみを有していたが、他のほとんどの患者は、ワクチン接種に対して、強い、統計学的に高度に有意な応答を示した（ワクチン細胞を用いた抗原投与に対する免疫前および免疫後の力価、およびＫ５６２コントロールに対する応答の欠如を参照のこと；図５、上部パネル）。１人を除く全ての患者が、６週間（３回のワクチン接種）後、測定可能なＣＤ８応答を有し、この応答は、１２週間後に増加し、そして１８週間までに安定化する傾向があった（表６）。野生型Ａ１またはＡ２をトランスフェクトしたＡＤ１００を用いた患者ＣＤ８細胞のインビトロ抗原投与は、有意な違いを示さなかった。早期の疾患進行または有害な事象に起因して分析のために利用可能な追跡サンプルが存在しなかったので、２人の患者（患者番号１０１２および１０１９）を、免疫学的に評価し得なかった。１人の患者は、非常に適度な応答のみを有していたが、他のほとんどの患者は、ワクチン接種に対して、強い、統計学的に高度に有意な応答を示した（ワクチン細胞を用いた抗原投与に対する免疫前および免疫後の力価、ならびにＫ５６２コントロールに対する応答の欠如を参照のこと；図５、上部パネル）。
【００８８】
（表６．ワクチン接種された患者のＣＤＢ応答）
【００８９】
【表６】
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患者がワクチンに対してＨＬＡに合わせられたか否かに依存して、ＣＤ８応答における統計学的に有意な違いは存在しなかった（表６）。ワクチン接種の前のほとんどの患者は、ワクチン細胞に対して弱い免疫応答のみかまたは免疫応答を有せず、そしてＫ５６２を用いた抗原投与に対して同様に低い活性を有していた。１人の患者（番号１０１６）は、ＡＤ１００に対して強い予防接種前のＣＤ８活性を有し、そしてＫ５６２に対しては最小限の活性のみ有し（図５、最後のパネル）、腫瘍に対して既に存在している免疫活性を示唆していた。別の患者（番号１００２）は、ＣＤ８細胞の強いワクチン接種前のＫ５６２応答性およびＡＤ１００に対する弱い活性を有していた。ワクチン接種は、ＡＤ１００に対する応答性を増加させ、そしてＫ５６２が存在する場合、Ｋ５６２に対するＣＤ８応答性を減少する傾向があった。
【００９０】
この６人の臨床応答した患者の免疫応答（図５Ｂ、下部のパネル）は、ＡＤ１００刺激に対するＣＤ８力価が、ワクチン接種の中止後１５０週間まで上昇し続けることを示す。
【００９１】
本明細書において開示される研究に参加した患者の進行した段階の疾患において、いくつかの臨床上の利益の証拠は、予想しておらず、有望であった。その上、ここで試験されたＢ７ワクチンが、ＣＤ８  ＣＴＬ応答を誘発したので、このＣＤ８応答は、ここにおいて観察される臨床結果に因果的に関連し得る。さらなる研究を、最小限の疾患の設定において実行する。ＮＳＣＬＣの初期段階（Ｉ／ＩＩ段階）の患者を、再発の可能性を減少し、そして潜在的に生存期間を延長するために、手術後ワクチン接種する。
【００９２】
この実施例において記載された結果は、腫瘍の進行をワクチン接種によって遅らせ得ること、およびこの効果は、患者がワクチンのＨＬＡ  Ａ１またはＨＬＡ  Ａ２遺伝子座に対して同種異系であるか否かに関わらず発生することを示す。これらの発見はまた、間接的な抗原提示が抗腫瘍活性を促進する工程において効果的であること、および同種異系のＭＨＣ分子はこの効果を増大させることを支持する。
【００９３】
この出願の全体を通して、種々の刊行物が参照されている。これらの刊行物の全体の開示は、各刊行物が具体的におよび個々に参考として援用されていると示されたように同じ程度まで本発明が属する分野の状態をより完全に記載するために、本明細書中にこの出願の参考として援用される。本明細書において参照される特許、公開された出願、および科学文献は、当業者の知識を確立し、そしてそれぞれが具体的におよび個々に参考として援用されていると示されたように同じ程度まで本明細書中にその全体が参考として援用される。本明細書において引用されるいかなる参考文献と本明細書の具体的な教義との間のいかなる矛盾も、後者を支持することによって解決される。同様に、単語または句の技術的に理解される定義と本明細書において具体的に教示される単語または句の定義との間のいかなる矛盾も、後者を支持することによって解決される。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１ＡおよびＢは、フローサイトメトリー分析を示す。パネルＡ：ワクチン細胞の品質管理。フローサイトメトリーによって分析されたＢ７．１（ＣＤ８０）とＨＬＡ  Ａ１（左のパネル）またはＢ７．１（ＣＤ８０）とＨＬＡ  Ａ２（右のパネル）を同時発現するワクチン細胞の代表的なサンプル。二重に陽性である細胞の割合を示す。免疫するに適したものにするために、ＣＤ８０およびＨＬＡ  Ａ対立遺伝子は、７０％以上の細胞に、同時発現されていなければならない。パネルＢ。ＥＬＩ−スポットアッセイのために精製された患者ＣＤ８細胞。陰性選択によって精製され、そしてＥＬＩ−スポット分析のために使用された患者ＣＤ８（右のパネル）細胞の代表的サンプルのフローサイトメトリー；細胞の精製度は、％で示されている。左のパネルは、アイソタイプコントロールを示す。
【図２】図２は、ＣＤ８免疫応答の分析を示す。進行した肺腫瘍患者の免疫は、強度のＣＤ８応答を発生させる。肺腫瘍患者から得られたＣＤ８細胞を形成するＩＦＮ−γ−スポットの頻度を、週単位の研究において時間に対してプロットする。免疫は、２週間毎に与えられ、ゼロは、免疫前の状態を示す。２０，０００個の精製されたＣＤ８細胞を、ＥＬＩ−スポットアッセイのために使用した。パネルＡ：ＣＤ８：ＡＤ１００＝２０：１の比率で、ＨＬＡ  Ａ１またはＡ２トランスフェクトした（合わせられた）ＡＤ１００腫瘍細胞を用いて抗原投与されたＨＬＡ  Ａ１およびＨＬＡ  Ａ２陽性患者由来の、スポットを形成するＣＤ８細胞の頻度。パネルＢ：Ａ２−ＡＤ１００またはＨＬＡ  Ａ２−ＣＤ８を用いて抗原投与されたＨＬＡ  Ａ１陽性患者由来の、スポットを形成するＣＤ８細胞の頻度、細胞を、（不適当に合わせられた）Ａ１−ＡＤ１００を用いて抗原投与した。パネルＣ：ＨＬＡ  Ａ１およびＨＬＡ  Ａ２をトランスフェクトした（合わせられていない）ＡＤ１００を用いて抗原投与した非ＨＬＡ  Ａ１またはＡ２患者細胞由来の、スポットを形成するＣＤ８細胞の頻度。パネルＤ：トランスフェクトしていない野生型ＡＤ１００を用いて抗原投与した全ての患者由来の、スポットを形成するＣＤ８細胞の頻度、またはパネルＥ：Ｋ５６２を用いて抗原投与した全ての患者由来の、スポットを形成するＣＤ８細胞の頻度。パネルＦ：ＡＤ１００野生型またはトランスフェクトした細胞のどちらかで抗原投与した全ての患者由来の、スポットを形成するＣＤ８細胞の平均頻度。パネルＧ：個々の、臨床的に応答している患者のＣＤ８スポット形成応答。４連のウェル中にＡＤ１００野生型、ＡＤ１００−Ａ１、ＡＤ１００−Ａ２、Ｋ５６２を用いてまたは何も適用せずに再刺激した後のスポットの平均数を、研究開始後の時間に対してプロットする。矢印は、最後の免疫の時間を示す。患者１００４、１００７、１０１０は、９つの免疫の完了後（１８週間）に示された点において分析された追跡データを含む。各患者のＨＬＡタイプを、カッコ内に示す。
【図３】図３は、分析の時間における全ての患者の生存期間の中央値を示す。生存期間の中央値は、１８ヶ月であり、このグループの患者に対して予想された生存期間の中央値である１年未満を超えていた。
【図４】図４は、１９  Ｂ７ワクチン処置された非小細胞肺癌研究患者の全体の生存期間を示す。
【図５】図５ＡおよびＢは、ＣＤ８免疫応答の分析を示す。図５Ａ（上部の２つのパネル）は、免疫前の、またはトランスフェクトしていない（ＡＤ野生型）ワクチン細胞もしくはＫ５６２コントロールを用いて抗原投与した６週間後、１２週間後および１８週間後の、ＣＤ８を示す。図５Ｂ（下部の６つのパネル）は、臨床応答を有する患者のワクチン終了後（矢印）のＣＤ８応答を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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