(57)【要約】  疎水性活性物質、ポリマーおよび再構成促進剤を含む組成物を開示する。凍結乾燥形態の組成物の再構成は、該促進剤が存在しない場合より少ない時間でなされる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性の生理活性物質と、前記疎水性活性物質を水溶液に可溶性にするポリマーと、再構成促進剤とを含む凍結乾燥組成物であって、水溶液における前記組成物の再構成時間が、前記組成物が前記促進剤を含有しない場合より短時間である組成物。
【請求項２】
前記疎水性活性物質が、抗癌薬である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記疎水性活性物質が、タキサン、カンプトテシン、エポチロン、エトポシドおよびテニポシドからなる群から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記疎水性活性物質が、タキサンを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記疎水性活性物質が、パクリタキセルを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記疎水性活性物質が、ドセタキセルを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記疎水性活性物質が、カンプトテシンを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記疎水性活性物質が、２０−Ｓ−カンプトテシンを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリマーが、ホモポリマーである請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ポリマーが、ポリペプチドを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ポリペプチドの大部分のアミノ酸残基がグルタミン酸残基である請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが、ポリ（Ｌ）−グルタミン酸である請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ポリマーおよび前記疎水性活性物質を結合体(conjugate)の形態で含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記促進剤が、マンニトールを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記促進剤が、スクロースを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記促進剤が、トレハロースを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記促進剤が、マンニトールおよびトレハロースを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
第二再構成促進剤をさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記第二再構成促進剤が、Ｔｗｅｅｎ  ８０を含む請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
疎水性タキサンと、前記タキサンを水溶液に可溶性にするポリマーと、再構成促進剤とを含む凍結乾燥組成物であって、水溶液における前記組成物の再構成時間が、前記組成物が前記促進剤を含有しない場合より短時間である組成物。
【請求項２１】
前記ポリマーが、ホモポリマーである請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ポリマーが、ポリペプチドを含む請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ポリペプチドの大部分のアミノ酸残基がグルタミン酸残基である請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが、ポリ（Ｌ）−グルタミン酸である請求項２０に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ポリマーおよび前記疎水性活性物質を結合体(conjugate)の形態で含む請求項２０に記載の組成物。
【請求項２６】
前記促進剤が、マンニトールを含む請求項２０に記載の組成物。
【請求項２７】
前記促進剤が、スクロースを含む請求項２０に記載の組成物。
【請求項２８】
前記促進剤が、トレハロースを含む請求項２０に記載の組成物。
【請求項２９】
前記促進剤が、マンニトールおよびトレハロースを含む請求項２０に記載の組成物。
【請求項３０】
第二再構成促進剤をさらに含む請求項２０に記載の組成物。
【請求項３１】
前記第二再構成促進剤が、Ｔｗｅｅｎ  ８０を含む請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記タキサンが、パクリタキセルである請求項２０に記載の組成物。
【請求項３３】
前記タキサンがパクリタキセルであり、前記ポリマーが大部分のアミノ酸残基がグルタミン酸残基であるペプチドを含み、前記パクリタキセルおよび前記ポリマーが結合体(conjugate)の形態である請求項２０に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ポリマーが、ポリ（Ｌ）−グルタメートを含む請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記促進剤が、マンニトールを含む請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記マンニトールが、前記組成物の約４重量％の量で存在する請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記促進剤が、スクロースを含む請求項３４に記載の組成物。
【請求項３８】
前記促進剤が、トレハロースを含む請求項３４に記載の組成物。
【請求項３９】
前記促進剤が、マンニトールおよびトレハロースを含む請求項３４に記載の組成物。
【請求項４０】
前記マンニトールが前記組成物の約４重量％の量で存在し、前記トレハロースが前記組成物の約５重量％の量で存在する請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
第二再構成促進剤をさらに含む請求項３５に記載の組成物。
【請求項４２】
前記第二再構成促進剤が、Ｔｗｅｅｎ  ８０を含む請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記Ｔｗｅｅｎ  ８０が、前記組成物の約０．０５〜０．１重量％の量で存在する請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
ｐＨ約５．４〜約５．８を有する請求項３５に記載の組成物。
【請求項４５】
ｐＨ約５．７を有する請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
緩衝液をさらに含む請求項４４に記載の組成物。
【請求項４７】
前記緩衝液が、リン酸緩衝液を含む請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記緩衝液の濃度が、約１５０ｍＭ〜約２２０ｍＭである請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
前記緩衝液の前記濃度が、約２００ｍＭである請求項４８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００３年９月５日に出願された米国仮出願第６０／５００，９０８号の優先権を主張し、該出願は、全体として、引用することにより本明細書の１部をなす。
【背景技術】
【０００２】
パクリタキセルおよびその類似体ドセタキセルのような種々の抗癌薬を包含する疎水性薬剤は、水または水溶液に実質的に不溶である。従って、パクリタキセルは、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（ポリオキシエチル化ヒマシ油）および無水アルコール（５０％ｖ／ｖ）を含有する担体または賦形剤１ｍＬにつきパクリタキセル６ｍｇの濃厚溶液に処方され、次に、これを投与前に希釈している（Ｇｏｄｓｐｉｌｅ，１９９４）。Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬは、血管拡張、呼吸困難および低血圧のような毒性作用を生じることが示されている（Ｅｗｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。従って、パクリタキセルの処方においてＣｒｅｍｏｐｈｏｒの使用を避ける試みがなされている。いくつかの試みでは、担体の種類に焦点を当てている。例えば、トコフェロール（ビタミンＥ）および／またはビタミンＥ誘導体、例えばビタミンＥ  ＴＰＧＳを含有する担体において、パクリタキセルを処方するという報告がいくつかなされている。例えば米国特許第６，３５８，３７３号を参照。他の試みは、活性物質自体に焦点を当て、その結果、水に可溶性のパクリタキセル類似体、プロドラッグおよび誘導体を製造している。例えば米国特許第６，３４４，５７１号および第６，１７５，０２３号を参照。場合によっては、パクリタキセルを、ポリアミノ酸との結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）によって誘導体化している。例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，９７７，１６３号、第６，２６２，１０７号、第６，４４１，０２５号および第６，５１５，０１７号参照。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明の１つの態様は、下記：（ｉ）疎水性の生理活性分子または活性物質、（ｉｉ）活性物質を水に可溶性にするポリマー担体、および（ｉｉｉ）再構成促進剤または促進物質を含む凍結乾燥組成物に関する。本発明の他の態様は、該凍結乾燥組成物を含有する製品に関する。
【０００４】
本発明の他の態様は、凍結乾燥組成物を水溶液において再構成する時間を短縮する方法に関しており、この方法は、疎水性の生理活性分子または活性物質、活性物質を水に可溶性にするポリマー担体、および再構成促進剤または促進物質を含む凍結乾燥組成物を調製するステップと、凍結乾燥組成物に水溶液を添加し、それによって、凍結乾燥組成物を、再構成促進剤不含の場合より短い時間で、水溶液において再構成するステップとを含む。
【０００５】
本出願人は、疎水性活性物質とポリマー担体とを含有する凍結乾燥組成物中の再構成促進剤の存在が、該促進剤不含の場合より短い時間で組成物を再構成できることを見出した。本発明の実施形態は、１つまたは複数の付加的利益、即ち、再構成時の強烈撹拌の必要性の減少、より少ない発泡（他の場合には、過度に発泡し、活性物質を捕捉し、再構成時間を延長させ得る）、リオケーキ（ｌｙｏｃａｋｅ）（即ち、凍結乾燥物質）の収縮の減少、凍結乾燥組成物の物理特性、例えば結晶性におけるより高い安定性、約９６時間未満、ある実施形態においては約６５時間の短い周期長を備えた強固な凍結乾燥サイクル（即ち、凍結乾燥を、より短い時間および長い目標保存寿命で行うことができる）、も提供し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
凍結乾燥は、昇華および脱離によって、生成物から水を除去する工程である。凍結乾燥装置は、可変温度調節器付きの乾燥室、生成物から除去された水を収集する凝縮器、および乾燥室内の圧力を減少させる真空システムから一般になる。凍結乾燥工程は、一般に、凍結、一次乾燥および二次乾燥の３段階からなる。所望最終生成物の種々の化学特性および物理特性を得るために、温度および圧力を種々の段階の間に変化させることができる。凍結段階の目的は、生成物中の遊離水を凍結することである。冷却速度は、凍結マトリックスの構造に影響を及ぼし得る。凍結水を昇華させる一次乾燥段階のために、乾燥室における圧力を減少させ、温度を上昇させる。一次乾燥段階後、生成物には凍結水がもはや存在しない。二次乾燥段階は、生成物に結合し得る水を除去するように設計される。この段階のために温度をさらに上昇させ、圧力は、変化させるか、増加させるか、または減少させてよい。二次乾燥後、生成物は最終凍結形態にある。
【０００７】
疎水性の生理活性分子は、一般に、治療または診断目的で人または他の動物に投与される。「疎水性」という用語は、非イオン化形態において、水より脂質または脂肪に、より可溶性である分子または活性物質を意味する。米国特許第６，００４，９２７号を参照。一般に、そのような物質は、水および／または水溶液に不溶性または実質的に不溶性である。疎水性の生理活性分子のいくつかの代表例は、治療薬、コントラスト剤および薬剤、例えば、タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）、エトポシド、テニポシド、フルダラビン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エモジン、５−フルオロウラシル、ＦＵＤＲ、エストラジオール、カンプトテシン、レチン酸、ベラパミル、エポチロンおよびシクロスポリンである。抗癌薬、特に、タキサン、カンプトテシンン、エポチロン、エトポシドおよびテニポシド系の抗癌薬が、本発明における使用に好適である。本発明の好ましい実施形態において、疎水性活性物質は、タキサンまたはカンプトテシン、より好ましくは、パクリタキセル、ドセタキセルまたは２０−Ｓ−カンプトテシンである。
【０００８】
本発明のポリマーは、疎水性活性物質を水溶液に可溶性にする担体である。それは、本発明の組成物にどのような付加的治療または診断作用も付与するものではない（例えば、それは、治療的および診断的に不活性である）。ポリマーは、幾通りかの方法で、物理的または化学的に疎水性活性物質と結びつかせることができる。例えば、ポリマーは、活性物質と単に混合することができるか、活性物質を封入または捕捉することができるか、または、生理活性分子に付着するか、または例えば共有結合によって化学的に結合することができる。例えば米国特許第６，０９６，３３１号、第６，３６５，１９１号、第５，６４８，５０６号および第５，３６２，８３１号を参照。ポリマーの代表的な例は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび非ペプチドポリマーであって、それらは、ホモポリマー、または２種類以上の異なるモノマーを含有するコポリマーである。そのようなポリマーの例は、アルブミン、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリアクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアクリル酸、ポリエチルオキサゾリン、ポリアクリルアミド、ポリイソプロピルアクリルアミド、ポリビニルピロリジノン、ポリアクチド／グリコリド、線状ポリエチレングリコール、枝分れポリエチレングリコール、星型ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールと他の官能性モノマーとの枝分れコポリマー、多糖類、およびそれらの組合せを含む（Ｄｅｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．,２００３；Ｄｅｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．,１９９７）。好ましくは、ポリマーはペプチドまたはポリペプチドであり、および／または親水性である。好ましいポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリ（ｌ−グルタミン酸）、ポリ（ｄ−グルタミン酸）、ポリ（ｄｌ−グルタミン酸）、ポリ（ｌ−アスパラギン酸）、ポリ（ｄ−アスパラギン酸）、ポリ（ｄｌ−アスパラギン酸）、ポリエチレングリコール、前記ポリアミノ酸と、ポリエチレングリコール、ポリカプロラクトン、ポリグリコール酸およびポリ乳酸とのコポリマー、ならびにポリアクリル酸、ポリ（２−ヒドロキシエチル１−グルタミン）、カルボキシメチルデキストラン、ヒアルロン酸、ヒト血清アルブミンおよびアルギン酸を包含するが、それらに限定されるわけではなく、ポリエチレングリコール、ポリアスパラギン酸およびポリグルタミン酸が特に好ましい。本発明のポリグルタミン酸またはポリアスパラギン酸は、好ましくは分子量約５，０００〜約１００，０００を有し、約２０，０００〜約８０，０００または約３０，０００〜約６０，０００、および約３２，０００が好ましい。特に、最も好ましい本発明のポリマーは、ポリ（Ｌ）−グルタミン酸である。全てＬｉ  ｅｔ  ａｌ．へ付与された米国特許第５，９７７，１６３号、第６，２６２，１０７号、第６，４４１，０２５号および第６，５１５，０１７号を参照。本発明の組成物中に存在する疎水性活性物質およびポリマーの相対量は、組成物の意図する使用、活性物質およびポリマーの種類、およびそれらの関係の仕方のような要素を考慮して、標準的手法によって決定することができる。
【０００９】
再構成促進剤は、凍結乾燥組成物に添加または含有された場合に、再構成促進剤を含有していない該凍結乾燥組成物が溶解するより速く、凍結乾燥組成物を水および／または水溶液に溶解させる物質である。本発明において、再構成促進剤を、疎水性生理活性分子およびポリマーと共に凍結乾燥させるのが好ましい。本発明に使用するのに好適な再構成促進剤は、スクロースおよびトレハロースのような二糖類を包含する。マンニトールも好適な促進剤である。これらの賦形剤は、凍結乾燥形態の生理活性タンパク質を安定化する１つまたは複数の態様において、有用であることが開示されている。具体的には、スクロースおよびトレハロースは、タンパク質変性および凝集を減じ、他の種々の賦形剤、例えば、他の糖、ポリオール、特定アミノ酸、メチルアミンおよび塩析塩と共に、生理活性タンパク質を含有する凍結乾燥組成物の非晶相成分（特に、タンパク質、非晶質賦形剤および水を包含する）を安定化し、凍結または凍結融解の際にタンパク質を安定化することが既知である。Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ：  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ”，Ｃｈａｐｔｅｒ  ５  ｉｎ  “Ｒａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ”，Ｖｏｌ．１３  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂ．（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），２００２を参照。Ｃａｒｐｅｎｔｅｒは、そのような凍結乾燥組成物に、増量剤、例えば、マンニトール、グリシンおよびヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を含有させることも開示している。タンパク質安定剤も、Ａｒａｋａｗａ，  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．４６：３０７〜３２６（２００１）に開示されている（該文献は、糖（スクロース、ラクトースおよびグルコース）、アミノ酸（グリシン、アニリンおよびプロリン）、アミン（ベタインおよびトリメチルアミンＮ−オキシド）、ポリオール（マンニトールおよびソルビトール）および特定の塩（硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムおよび硫酸マグネシウム）を包含するタンパク質安定剤を開示している）。
【００１０】
しかし、再構成に関して、本出願人は、グリシンおよびＨＥＳは、本発明における再構成促進剤として好適でないことを示している。同様に、Ｚｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３９（１／２）：１０３〜１０８（１９９６）は、リン脂質およびアントラサイクリン薬アナマイシンを含有する凍結乾燥組成物におけるＴｗｅｅｎ  ２０の存在は、再構成段階を２時間未満から１分に短縮し、遊離薬剤結晶の早期形成を回避し、リポソーム小胞を破壊せずに平均粒径を減少させるのに必須であることを報告している。しかし、本出願人は、関連界面活性剤Ｔｗｅｅｎ  ８０が、それを試験したいくつかの実施形態において、再構成を促進しないことを見出した。しかし、例えば下記に示すように、他の再構成促進剤と一緒に、それを使用することができる。このように、タンパク質安定剤が、本発明との関連で、再構成促進剤として機能することは予測可能でなかった。とはいえ、当業者は、所与のタンパク質安定剤、例えば、糖、二糖、ポリオール、アミノ酸、アミン、塩または増量剤が、本発明の目的のために再構成促進剤として機能するか否かを、例えば実施例部分に示すプロトコルに従って、試験するだけで判断することができる。
【００１１】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、再構成促進剤がマンニトールを含む。しかし、本発明は、１つの再構成促進剤を含有する組成物に限定されない。他の好ましい実施形態において、組成物は、マンニトールとトレハロースとの組合せを含有する。１つまたは複数の再構成促進剤の量は、凍結乾燥組成物の全重量に基づいて、一般に約０．５％〜約１０％の範囲である。さらに他の実施形態において、再構成の際に行われる撹拌によって生じることが多い気泡を減少させるために、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ  ２０およびＴｗｅｅｎ  ８０のような界面活性剤を、比較的少量（例えば、０．００５〜０．２％、好ましくは約０．０５〜約０．１％）で添加するとよい。いくつかの実施形態では、Ｔｗｅｅｎ  ８０の添加は再構成時間も減少させる。
【００１２】
本発明の組成物は、薬学的に許容される他の不活性成分、例えば、緩衝剤（例えばリン酸緩衝液）、アミノ酸（例えば、グリシン、アルギニン、ヒスチジン）、塩（例えば塩化ナトリウム）、ポリマー（例えばポリエチレングリコール）または他の増量剤または担体物質を含有し得る。本発明の組成物は、バイアルおよびシリンジのような種々の容器に入れることができる。これらの容器を入れたパッケージに、凍結乾燥組成物を再構成するためのある容量の水、例えば静菌水を含有する追加容器を入れてもよい。
【００１３】
当業者は、凍結乾燥手順に関連する他のパラメーターの調節が、組成物にプラスの作用をし得ることも理解するであろう。例えば、マンニトールを再構成促進剤として含有する組成物は、マンニトール水和物の形成による増加した水分レベルを示し、それによって貯蔵安定性に影響を及ぼす可能性がある。このような場合、例えば、組成物を比較的高い二次乾燥温度、例えば約４０℃〜５０℃で凍結乾燥することによって、凍結乾燥組成物の水分レベルを減じることができる。凍結乾燥サイクルは、一次乾燥所要時間に影響を与えるアニーリングパラメーターを最適化することによって減じることができる。より高い温度でのアニーリングは、オストワルド熟成、即ち、より大きい氷晶の形成を生じ、これは、次に、一次乾燥中の昇華速度を増加させることができる。さらに、再構成時間の短縮は、組成物に含有される薬学的不活性成分のモル濃度（濃度）、または組成物の化学特性、例えばｐＨを変化させることによって達成できる。例えば、実施例に示す実施形態において（例えば、好ましくはパクリタキセルの２’ヒドロキシル部位で共有結合した、α−ポリ−（Ｌ）−グルタミン酸とパクリタキセルとのエステル結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を含有する組成物）、ｐＨを調節することによって（例えば、５．４〜５．８、好ましくは５．７の範囲で）、再構成をさらに最適化できる。緩衝液を使用する場合は、緩衝液を１５０〜２２０ｍＭ、好ましくは２００ｍＭの量で存在させる。
【００１４】
本発明を以下の詳細な実施例に関してさらに説明する。これらの実施例は、例示目的にすぎず、本明細書に記載する本発明の範囲を限定することを意図としない。
【実施例】
【００１５】
材料
ＣＴ−２１０３は、以下の実施例に使用される活性薬学的成分（ＡＰＩ）の呼称である。ＣＴ−２１０３は、パクリタキセルの２’ヒドロキシル部位で主に結合したα−ポリ−（Ｌ）−グルタミン酸（ＰＧ）とパクリタキセルとのエステル結合体である。ベースのＰＧポリマーは約１７，０００ダルトン（ゲル透過クロマトグラフィーおよび多角度レーザー光散乱による見掛平均分子量）である。パクリタキセルは、結合形態において、結合体中に約３７％（３２％〜４３％添加、ｗｔ／ｗｔ）で存在し、これは、ポリマーの１１モノマー単位当たり約１つのパクリタキセルエステル結合に相当する。最終生成物（ＦＰ）処方物は、９ｍｇ／ｍＬ結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）パクリタキセル（約２５ｍｇ／ｍＬ  ＣＴ−２１０３）および２６０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．０、および０．５％ｗ／ｗ  Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８（Ｆ−６８）（例えば、３ブロックコポリマー、ポリ（エチレン）オキシド−ポリ（プロピレン）オキシド−ポリ（エチレン）オキシド）からなる。ＦＰは、注射用滅菌水、ＵＳＰを使用して、９ｍｇパクリタキセル／ｍＬ（２５ｍｇ  ＣＴ−２１０３  ＡＰＩ／ｍＬ）に再構成される。
【００１６】
スクロース（カタログ  Ｓ１２４−１、ロット  ＃２８４０９Ａ）、トレハロース（カタログ  Ｔ１０４−１、ロット  ＃２７８８１Ａ）、マンニトール（カタログ  Ｍ１０９−２、ロット  ＃２７２１４Ａ）は、Ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌから入手した。Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８、ＮＦ（Ｆ−６８）は、ＢＡＳＦから入手した（ロット  ＃ＷＰＤＸ−５７７Ｂ）。リン酸一ナトリウム一水和物、ＵＳＰ（カタログ  ＳＯ１３０）およびリン酸二ナトリウム七水和物、ＵＳＰ（カタログ  ＳＯ１４０）は、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。水は、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＭｉｌｌｉＱシステムを使用して精製した。
【００１７】
Ｓｃｈｏｔｔガラスバイアル（Ｗｅｓｔ  Ｃｏ．から入手した）およびＷｅｓｔグレーストッパー（ｇｒａｙ  ｓｔｏｐｐｅｒｓ）４４３２／５０を使用した。２０ｍｍの開口を有する５ｍＬおよび２０ｍＬの２つのバイアルサイズを試験に使用した。２ｍＬ充填容量および１０ｍＬ充填容量を使用する試験を、それぞれ、５ｍＬおよび２０ｍＬバイアルサイズにおいて行った。バイアルは、使用前に少なくとも３回濯いで乾燥させた。ストッパーは、どのような追加処理も行わずに使用した。
【００１８】
実験計画法および分析
ＥＣＨＩＰ  Ｄｅｓｉｇｎ−ｏｆ−Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ（ＤＯＥ）ソフトウエアを使用して、実験計画を立て、分析し、データを解釈した。応答局面二次計画（ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｑｕａｄｒａｔｉｃ  ｄｅｓｉｇｎ）を、実験に選択した。そのような計画は最適数の実験を提供し、分析結果は、種々の賦形剤およびそれらの濃度の論理的根拠、および、評価される実験変数間に存在し得る相互作用の優れた可視化を提供する。直交法によってＥＣＨＩＰから引き出された結論を確認するために、プリンシプル（ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）潜在構造（ＰＬＳ）分析ソフトウエアを使用して、データをさらに分析した。全ての計画は、実験計画における質の尺度である少なくとも５０％の実験Ｇ有効性を満たすかまたは超えていた。
【００１９】
遠紫外線円偏光二色性による二次構造
遠紫外線円偏光二色性を行う目的は、ＣＴ２１０３  ＦＰの再構成ロットから二次構造情報を得ることであった。遠紫外線円偏光二色性（ＦＵＶ−ＣＤ）を使用して、種々のＣＴ−２１０３ロットの構造を特性決定した。試料の遠視外線円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを、Ａｖｉｖモデル６２  ＤＳ分光偏光計（Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）によって収集した。各試料を、０．１ｃｍ経路長石英セルに装填し、サーモスタット付きセルホルダーに配置した。１．５ｎｍバンド幅を使用し、各点での平均化時間５秒で、０．５ｎｍ間隔でデータを収集した。適切なバッファーブランク（ｂｕｆｆｅｒ  ｂｌａｎｋ）を収集し、各スペクトルから減じた。
【００２０】
二次導関数紫外線分光法
二次導関数紫外線分光法を使用して、再構成ＣＴ−２１０３  ＦＰから三次構造情報を得た。二次導関数紫外線分光法を行って、吸収発色団の局所ミクロ環境によるＣＴ−２１０３の種々のロットに生じ得るあらゆるかすかな構造特徴を比較した。紫外線データは、１ｃｍ経路長の石英セルにおいて、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ８４５２Ａダイオードアレー分光測光器によって、積分時間２５秒で収集した。データをＧｒａｍｓ  ３８６ソフトウエアにインポートする。データを２１５〜３５０ｎｍに切り捨て、Ｓａｖｉｔｓｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ変換を使用して二次導関数を処理する。３データ点ウインド（ｗｉｎｄｏｗ）および７点より以上を使用して、曲線を平滑化し、データ点を３２Ｘのスプライン関数に挿入する。
【００２１】
フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）
ＦＴＩＲを使用して、ＣＴ−２１０３  ＦＰロットの固体状態における二次構造情報を特性決定した。ＤＴＧＳ検出器を取り付けたＢｏｍｅｍ  Ｐｒｏｔａ  ＦＴＩＲ分光器（Ｑｕｅｂｅｃ  Ｃｉｔｙ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、赤外線スペクトルを得た。該装置を乾燥空気で継続的にパージした。各試料について、合計１２８のインターフェログラムを収集し、４ｃｍ-1の解像度で平均した。乾燥タンパク質スペクトルを単光束透過モードで収集し、乾燥空気に対する比率を求めて、吸光スペクトルを形成した。必要な場合に、水蒸気の二次導関数スペクトルを引いて、水蒸気干渉を除去した。Ｂｏｍｅｍ  Ｇｒａｍｓ／３２ソフトウエア（Ｇａｌａｃｔｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を使用し、７点ウインドで二次多項式（ｓｅｃｏｎｄ  ｄｅｇｒｅｅ  ｐｏｌｙｎｏｍｉａｌ）のＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ関数を使用して、二次導関数スペクトルを形成した。６種類のＣＴ−２１０３  ＦＰロットを代表する固体試料について、ＦＴＩＲを行った。
【００２２】
高温示差走査熱量測定
高温ＤＳＣを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＤＳＣ装置を使用して行って、固体状態におけるあらゆる結晶化およびガラス転移事象を監視した。試料を、一般に、２５℃／分で、１００℃まで走査し、−２０℃に冷却し、１５０℃まで再走査した。ＦＰにおけるガラス転移温度の測定を向上させるために、ＳｔｅｐＳｃａｎ  ＤＳＣ法を使用し、該方法は、他の熱事象、例えば、結晶化、エンタルピー緩和（ｅｎｔｈａｌｐｉｃ  ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ）および水分損失からの干渉を減少させ、明確なガラス転移温度を与え、これは、この分析の時間尺度において動的または不可逆的事象ではなく可逆的事象である。
【００２３】
低温示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
液体窒素冷却を使用してＳｅｉｋｏ  ＤＳＣ  ６１００によって、凍結溶液の示差走査熱量測定を行った。インジウム基準を用いて、ＤＳＣ装置を校正した。再構成溶液の試料（パクリタキセル９ｍｇ／ｍＬの溶液２０μＬまたは５０μＬ）を、アルミ試料皿に入れ、熱分析のために気密密閉した。全ての試料について使用した基準は、空のアルミ皿であった。窒素を５０ｍＬ／分の速度でパージガスとして使用した。試料を、約−７０℃まで２℃／分の制御された速度で凍結させ、２℃／分で室温に昇温した。試料の凍結および加温中に、サーモグラムを記録した。
【００２４】
０．５秒間隔でデータを取り込み、Ｓｅｉｋｏソフトウエアで分析した。熱転移温度、例えば、過冷却温度（Ｔsc）、凍結溶液のガラス転移温度（Ｔg’）、再結晶温度（Ｔer）および共融温度（Ｔeu）を、熱流データから求めた。
【００２５】
凍結乾燥
ストッパリング棚（ｓｔｏｐｐｅｒｉｎｇ  ｓｈｅｌｖｅｓ）３つおよび外部凝縮器を取り付けたＧｅｎｅｓｉｓ  Ｐｉｌｏｔ−ｓｃａｌｅ  Ｖｉｒｔｉｓ  １  ２ＸＬ凍結乾燥器を使用して、凍結乾燥を行った。ランプ（ｒａｍｐ）速度、棚温度、時間および真空のようなパラメーターを、サイクルラン（ｃｙｃｌｅ  ｒｕｎ）にプログラムし、生成物温度を、Ｖｉｒｔｉｓ  Ｃｏｍｐａｎｙから供給されているＷｉｚａｒｄコントロールシステムソフトウエアによって、４つの利用可能熱電対を使用して記録した。次に、データを処理し、ＩＧＯＲ科学グラフ化ソフトウエアを使用してグラフで示した。
【００２６】
再構成法
真空下に栓をしたバイアルの側壁にＭｉｌｌｉＱ精製水を添加することによって、ＦＰの再構成を査定した。３０秒間放置後、％ケーキ水和を目視評価し、可視固形分がすべて溶解するまでバイアルをゆっくり回した。最終再構成時間を、ケーキが透明溶液に溶解するのに要した合計時間（ケーキ水和を評価するための３０秒を含む）として記録した。場合によっては、生成物が完全に水和して、３０秒未満で溶解して透明溶液になった。気泡量が実験間で変化し得るので、バイアルを、気泡度を変化させた５グループに分け、１〜５の尺度評価を査定し、ここで、１は気泡がほとんどない／全くないことを表し、５はいくらかの気泡を表した。
【００２７】
Ｘ線回折法（ＸＲＤ）
生成物の結晶度および処方成分の種々の多形の特性決定についての情報を得るために、凍結乾燥ＣＴ−２１０３  ＦＰ上でＸＲＤを行った。凍結乾燥生成物をサイドドリフト法（ｓｉｄｅ−ｄｒｉｆｔ  ｍｅｔｈｏｄ）によってアルミホルダーに充填し、広角Ｘ線粉末回折計（Ｍｏｄｅｌ  Ｄ５００５，Ｓｉｅｍｅｎｓ）においてＣｕＫα輻射線（４５ｋＶ×４０ｍＡ）に暴露した。装置を、ステップスキャンモード（ｓｔｅｐ−ｓｃａｎ  ｍｏｄｅ）で、増分０．０５°２θで走査した。角度範囲は５°〜４０°２θであり、各段階で１秒間、計数を累算した。使用したデータ収集プログラムは、ＪＡＤＥ  ５．０であった。
【００２８】
走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）
種々のＣＴ−２１０３処方物のケーキ構造を視覚化し、種々の凍結乾燥処方物の再構成特性との可能な相関を見出すために、ＳＥＭを行った。新しく作った清浄な竹の棒を使用して、凍結乾燥ケーキを迅速に小片にカッティングすることによって、ＣＴ−２１０３  ＦＰをＳＥＭ用に処理した（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＰＡ）。スタブに取り付けた両面カーボン導電性タブ上に、試料の薄い層を広げることによって、小片を、１２ｍｍ  ＯＤアルミニウムＳＥＭ試料装着スタブに取り付けた。試料取り扱いによるあらゆるアーチファクトを回避するために、これを室温で迅速（１〜２分）に行った。試料スタブを、迅速にスパッターコーターに移し、真空下に置いた。スパッターコーター（Ｂｉｏｒａｄ  Ｅ５０００Ｍ）を使用して、約４０ｎｍ金／パラジウムで試料を被覆した。試料の検査を、１０ｋＶで走査されるＨｉｔａｃｈｉ  Ａ６０電界放出ＳＥＭで行った。
【００２９】
残留水分分析
無水メタノールで凍結乾燥物から水を抽出した後に、残留水分を、Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｈｅｒ電量分析法によって測定した。この方法は、直接的な試料取り扱いおよび大気湿度への暴露によるあらゆるアーチファクトを最少限にした。凍結乾燥ＣＴ−２１０３  ＦＰを含有するバイアルに無水メタノールを添加し、渦を巻かせることによってケーキをメタノールに懸濁させた。未溶解賦形剤を約１時間沈降させ、ケーキから抽出した水を含有するメタノールを、含水量について分析した。無水メタノール溶液を使用して、メタノール中のバックグラウンド水分を差し引いた。
【００３０】
バイオアナライザータンパク質チップ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用の高処理分析法を提供するタンパク質チップサイジング法を使用して、再構成ＣＴ−２１０３  ＦＰ試料を分析した。原理は、ミクロ液体細管電気泳動法に基づく。ＡｇｉｌｅｎｔからのＰｒｏｔｅｉｎ  ２００  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）を使用して、試料を分析した。
【００３１】
処方試験
薬学的に許容され、一般に安全と認識される（ＧＲＡＳ）賦形剤の多くは、マンニトールおよびＴｗｅｅｎ−８０含有処方物を包含する。対照Ｆ−６８処方物の他に、１３の処方マトリックスを評価した（表Ｉ）。ＣＴ−２１０３活性薬学的成分（ＡＰＩ）および賦形剤を、２００ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ６．５に、５０℃〜５５℃で溶解させることによって、処方物ＣＴ−１〜ＣＴ−１４を調製した。溶液を０．２２μｍ  ＧＶ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターで濾過し、２ｍＬを、５ｍＬのＳｃｈｏｔｔ  Ｔｙｐｅ  Ｉガラスバイアルに入れ、これを、−１０℃でのアニーリング段階、−２５℃で３０時間の一次乾燥、次に、＋２０℃で１０時間以上の二次乾燥の保存的サイクル（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｃｙｃｌｅ）を使用して凍結乾燥した。非晶相からの結晶化に影響されやすい賦形剤のあらゆる結晶化を促進するために、アニーリングを凍結段階に組み込んだ。
【００３２】
【表１】
2007504267.tif 000002
【００３３】
水２ｍＬを添加し、３０秒後またはそれ以内にケーキ水和を確認し、次に、全固形分が完全に溶解するまでバイアル含有物をゆっくり渦巻かせることによって、再構成特性を評価した。結果を表ＩＩに示す（表中、Ｓ＝ｓｕｃｒ＝スクロース、ＴＷ＝Ｔｗｅｅｎ−８０、Ｇ＝グリシン、Ｔ＝トレハロース、Ｍ＝マンニトール、および文字の前の数字は％ｗ／ｖを表す）。
【００３４】
【表２】
2007504267.tif 000003
【００３５】
処方物ＣＴ−４、ＣＴ−８およびＣＴ−１１は、対照および他の処方物と比較して、比較的短い再構成時間を示した。結果は、マンニトールがＣＴ−２１０３の再構成特性をかなり向上させたことを示す。スクロースおよびトレハロースも再構成時間を短縮させたが、Ｔｗｅｅｎ−８０の機能は処方依存性のようであり、従って、単独再構成促進剤として有用でないと考えられた。一方、グリシンは、明らかに、どのような利益も与えず、ＣＴ−２１０３の再構成にマイナスの作用を有していたと考えられる。
【００３６】
次の一連の試験では、Ｔｗｅｅｎ−８０を添加して、または添加せずに、これら３つの処方物（すなわち、ＣＴ−４、ＣＴ−８、ＣＴ−１１）をさらに試験した。ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）の作用も評価した。処方物を、１０ｍＬ／バイアルの最終投与形態で調製し、再構成時間および気泡特性を評価した。結果を表ＩＩＩに要約する（表中、Ｓ＝スクロース、Ｔ＝トレハロース、Ｍ＝マンニトール、ＨＥ＝ヒドロキシエチルデンプン、ＴＷ＝Ｔｗｅｅｎ−８０、対照＝０．５％Ｆ−６８、および数字は処方物に対する％レベルを表す）。
【００３７】
【表３】
2007504267.tif 000004
【００３８】
この試験の結果は、トレハロースまたはスクロースに対して、ＨＥＳがＣＴ−２１０３の再構成を向上させなかったことを示す。Ｔｗｅｅｎ−８０は、マンニトール−糖処方物に使用した場合、再構成時間を増加させたと考えられる。トレハロース／マンニトール処方物は、スクロース／マンニトール処方物より有意に速く再構成した（６０秒に対して８秒）。対照（ＣＴ−１４）は、約６分の長い再構成時間を示した。この処方物へのマンニトールの添加は、ＣＴ−２１０３の再構成特性をごく僅か向上させた。処方物の気泡特性を、１〜５段階で等級付けし、１は気泡の非存在を表し、５はいくらかの気泡を表す。
【００３９】
これらの処方物の結果は、二糖（スクロースまたはトレハロース）、マンニトールおよびＴｗｅｅｎ−８０が、ＣＴ−２１０３の再構成特性を向上させたことを示す。
【００４０】
これらの賦形剤の機能、それらの相対濃度、および処方物マトリックス中のあらゆる相互作用を評価するために、表ＩＶに示す以下の変量を使用して、多変量統計的実験計画を実施した。
【００４１】
【表４】
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【００４２】
全ての処方物は、２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５（ＡＰＩとの混合前）を使用して製造された（ＮＥＡＴ＝２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に溶解したＣＴ−２１０３）。
【００４３】
この一連の試験は、２ｍＬ／バイアル投与形態で実施した。２つのバイアルを再構成し、２０〜３０秒における％水和、合計再構成時間（秒）および気泡（等級１〜５）について評価した。この試験の結果を表Ｖに示す。
【００４４】
【表５】
2007504267.tif 000006
【００４５】
ＥＣＨＩＰを使用して結果を分析した。結果（データは示さず）は、再構成時間に関して、マンニトールが最も重要な変量であり、再構成時間に負の相関関係を有すことを示し、このことは、より高い濃度のマンニトールは、ＣＴ−２１０３のより速い再構成時間を与えることを示している。さらに、結果は、再構成時間と正の相関関係にあった、マンニトールとＴｗｅｅｎ−８０との相互作用が存在したことも示し、このことは、マンニトール処方物へのＴｗｅｅｎ−８０の添加は、ＣＴ−２１０３の再構成時間を増加し得ることを示した。結果はさらに、トレハロース対マンニトールの比率の変化が、再構成時間に影響し得ることも示した。
【００４６】
最少再構成時間、最少気泡および最大水和のために反応を最適化し、かつ至適処方物を実験計画から予測した。計画（示さず）は、ＣＴ−２１０３のさらに好ましい処方物を、４％マンニトール、５％トレハロースおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−８０から構成し得ることを予測した。
【００４７】
これらの結果に基づいて、ＣＴ−２１０３の処方物を最終投与形態１０ｍＬ／バイアルにスケールアップし、％水和、再構成時間および気泡について評価した。これらの結果は、ＥＣＨＩＰが実験計画から主要な処方物を厳密に予測し、より好ましい２つの処方物が４％マンニトール、および４％マンニトール／５％トレハロース／０．１％Ｔｗｅｅｎ−８０を含有することを示した。
【００４８】
これらの処方物を、対照と共に、ＸＲＤでさらに特性決定した。全てのマンニトールに基づく処方物は、マンニトールの結晶δ多形を含有すると考えられる。９．６°、１７．９°、２５．７°および２７．０°２θにおけるピークによって立証されるように、少量のマンニトール水和物が、４％マンニトール処方物（ＣＴ−３１）において観察された。この処方物は、全ての処方物の中で最も高い結晶度を示した。純粋トレハロースおよび対照Ｆ−６８処方物は、主として非晶質であった。しかし、Ｆ−６８処方物における、割当てられていない（ｕｎａｓｓｉｇｎｅｄ）ピークの存在は、いくらかの結晶度を示唆している。結果を表ＶＩに要約する。
【００４９】
【表６】
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【００５０】
本明細書に引用した全ての刊行物（例えば、下記の引用リスト）は、本発明に関係した技術分野の熟練者の技術レベルを示すものである。これら全ての刊行物は、個々の刊行物が参照により組み込まれることが明確にかつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
【００５１】
特定の実施形態に関して本発明を説明したが、これらの実施形態は本発明の原理および適用を例示するものにすぎないと理解すべきである。従って、添付の請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲を逸脱せずに、例示的実施形態に多くの変更を加えることができ、他の調整も考えられるものと理解される。
【国際調査報告】
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