(57)【要約】  本発明は、リノール酸（ＬＡ）からγ−リノレン酸（ＧＬＡ）、α−リノール酸（ＡＬＡ）からステアリドン酸（ＳＴＡ）、ＧＬＡからジホモ−γ−リノール酸（ＤＧＬＡ）、ＳＴＡからエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）、ＤＧＬＡからＥＴＡ、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）からドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、およびアラキドン酸（ＡＲＡ）からＥＰＡへの転換を触媒できる脂肪酸デサチュラーゼおよび鎖長延長酵素に関する。コドン最適化デサチュラーゼおよび鎖長延長酵素をコードする核酸配列、それにハイブリダイズする核酸配列、コドン最適化デサチュラーゼまたは鎖長延長酵素を含んでなるＤＮＡ構築物、および増大するレベルのデサチュラーゼまたは鎖長延長酵素を発現する組換え宿主微生物について記載される。
2007504838.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号２５に記載のΔ６デサチュラーゼをコードする単離された核酸分子、または
ｂ）（ａ）と完全に相補的である単離された核酸分子
よりなる群から選択される単離された核酸分子。
【請求項２】
少なくとも１４４個のコドンがヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における発現のためにコドン最適化される、配列番号２に記載のΔ６デサチュラーゼをコードする単離された核酸分子。
【請求項３】
ａ）配列番号６２に記載のΔ１７デサチュラーゼをコードする単離された核酸分子、または
ｂ）（ａ）と完全に相補的である単離された核酸分子
よりなる群から選択される単離された核酸分子。
【請求項４】
少なくとも１１７個のコドンがヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における発現のためにコドン最適化されている、配列番号４に記載のΔ１７デサチュラーゼをコードする単離された核酸分子。
【請求項５】
ａ）配列番号９１に記載の鎖長延長酵素をコードする単離された核酸分子、または
ｂ）（ａ）と完全に相補的である単離された核酸分子
よりなる群から選択される単離された核酸分子。
【請求項６】
少なくとも８５個のコドンがヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における発現のためにコドン最適化されている、配列番号６に記載の鎖長延長酵素をコードする単離された核酸分子。
【請求項７】
適切な調節配列に作動可能に連結された、請求項１〜６のいずれかに記載の単離された核酸分子を含んでなる、キメラ遺伝子。
【請求項８】
請求項７に記載のキメラ遺伝子を含んでなる、形質転換されたヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種。
【請求項９】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号８８６２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号１８９４４、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号７６９８２、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＧＡＭＳ（７）１よりなる群から選択される、請求項８に記載の形質転換されたヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種。
【請求項１０】
ａ）（ｉ）適切な調節配列の制御下にあり、Δ６デサチュラーゼポリペプチドをコードする、請求項１または２に記載の核酸分子、および
（ｉｉ）リノール酸からなるデサチュラーゼ基質の供給源
を含んでなるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を提供し、
ｂ）ステップ（ａ）のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を適切な発酵性炭素源存在下で生育させ、請求項１または２に記載の核酸分子が発現し、前記リノール酸がγ−リノレン酸に変換し、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のγ−リノレン酸を回収すること
を含んでなるγ−リノレン酸の生産方法。
【請求項１１】
デサチュラーゼ基質の供給源が前記ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種に内因性である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ａ）（ｉ）適切な調節配列の制御下にあり、Δ６デサチュラーゼポリペプチドをコードする、請求項１または２に記載の核酸分子、および
（ｉｉ）α−リノール酸からなるデサチュラーゼ基質の供給源
を含んでなるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を提供し、
ｂ）ステップ（ａ）のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を適切な発酵性炭素源存在下で生育させ、請求項１または２に記載の核酸分子が発現し、前記α−リノール酸がステアリドン酸に変換し、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のステアリドン酸を回収すること
を含んでなるステアリドン酸の生産方法。
【請求項１３】
デサチュラーゼ基質の供給源が前記ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種に内因性である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）（ｉ）適切な調節配列の制御下にあり、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする、請求項３または４に記載の核酸分子、および
（ｉｉ）ジホモ−γ−リノール酸からなるデサチュラーゼ基質の供給源
を含んでなるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を提供し、
ｂ）ステップ（ａ）のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を適切な発酵性炭素源存在下で生育させ、請求項３または４に記載の核酸分子が発現し、ジホモ−γ−リノール酸がエイコサテトラエン酸に変換し、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のエイコサテトラエン酸を回収すること
を含んでなるエイコサテトラエン酸の生産方法。
【請求項１５】
デサチュラーゼ基質の供給源が前記ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種に内因性である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ａ）（ｉ）適切な調節配列の制御下にあり、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする、請求項３または４に記載の核酸分子、および
（ｉｉ）アラキドン酸からなるデサチュラーゼ基質の供給源
を含んでなるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を提供し、
ｂ）ステップ（ａ）のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を適切な発酵性炭素源存在下で生育させ、請求項３または４に記載の核酸分子が発現し、前記アラキドン酸がエイコサペンタエン酸に変換し、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のエイコサペンタエン酸を回収すること
を含んでなるエイコサペンタエン酸の生産方法。
【請求項１７】
デサチュラーゼ基質の供給源が前記ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種に内因性である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ａ）（ｉ）適切な調節配列の制御下にあり、鎖長延長酵素ポリペプチドをコードする、請求項５または６に記載の核酸分子、および
（ｉｉ）γ−リノレン酸からなる鎖長延長酵素基質の供給源
を含んでなるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を提供し、
ｂ）ステップ（ａ）のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を適切な発酵性炭素源存在下で生育させ、請求項５または６に記載の核酸分子が発現し、前記γ−リノレン酸がジホモ
−γ−リノール酸に変換し、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）の前記ジホモ−γ−リノール酸を回収すること
を含んでなるジホモ−γ−リノール酸の生産方法。
【請求項１９】
鎖長延長酵素基質の供給源が前記ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種に内因性である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ａ）（ｉ）適切な調節配列の制御下にあり、鎖長延長酵素ポリペプチドをコードする、請求項５または６に記載の核酸分子、および
（ｉｉ）ステアリドン酸からなる鎖長延長酵素基質の供給源
を含んでなるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を提供し、
ｂ）ステップ（ａ）の前記ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を適切な発酵性炭素源存在下で生育させ、請求項５または６に記載の核酸分子が発現し、前記ステアリドン酸がエイコサテトラエン酸に変換し、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）の前記エイコサテトラエン酸を回収すること
を含んでなるエイコサテトラエン酸の生産方法。
【請求項２１】
鎖長延長酵素基質の供給源が前記ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種に内因性である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ａ）（ｉ）適切な調節配列の制御下で鎖長延長酵素ポリペプチドをコードする、請求項５または６に記載の核酸分子、および
（ｉｉ）エイコサペンタエン酸からなる鎖長延長酵素基質の供給源
を含んでなるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を提供し、
ｂ）ステップ（ａ）のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を適切な発酵性炭素源存在下で生育させ、請求項５または６に記載の核酸分子が発現し、前記エイコサペンタエン酸がドコサペンタエン酸に変換し、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のドコサペンタエン酸を回収すること
を含んでなるドコサペンタエン酸の生産方法。
【請求項２３】
鎖長延長酵素基質の供給源が前記ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種に内因性である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ａ）油性酵母菌種について、ヌクレオチドコード領域配列および対応するポリペプチド配列を得て、コドンのデータベースを形成し、
ｂ）前記コドンのデータベースを分析し、いずれのコドンが各アミノ酸を優先的にコードするのか判定し、
ｃ）油性酵母菌種において発現させる遺伝子の配列を得て、
ｄ）ステップ（ｃ）の配列において好ましくないコドンをステップ（ｂ）の好ましいコドンで置き換えことで、前記遺伝子が油性酵母菌種における発現のためにコドン最適化されること
を含んでなる、油性酵母菌における発現のために遺伝子を最適化する方法。
【請求項２５】
油性酵母菌が、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）よりなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
宿主細胞が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）
ＡＴＣＣ番号２０３６２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号８８６２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号１８９４４、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号７６９８２、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＧＡＭＳ（７）１よりなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
最適化させる遺伝子が、Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、鎖長延長酵素、Δ５デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、およびΔ１５デサチュラーゼよりなる群から選択される酵素をコードする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）翻訳開始部位を含んでなる、配列番号１２２に記載の単離された核酸分子。
【請求項２９】
ａ）ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）において発現させる外来遺伝子を提供し、
ｂ）ステップ（ａ）の遺伝子を請求項２８の単離された核酸分子と作動可能に連結して、前記外来遺伝子がヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における発現のために最適化されること
を含んでなる、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）宿主における遺伝子の発現を最適化する方法。
【請求項３０】
外来遺伝子が、Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、鎖長延長酵素、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、およびΔ４デサチュラーゼよりなる群から選択される酵素をコードする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１０〜２７のいずれか一項の方法によって生産される微生物油。
【発明の詳細な説明】
【関連出願との関係】
【０００１】
本願は２００３年５月７日に出願された米国仮出願第６０／４６８６７７号、および２００３年５月７日に出願された米国仮特許出願第６０／４６８７１８号の優先権の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明はバイオテクノロジー分野に関する。より具体的には本発明は、油性酵母菌における長鎖多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の生産に有用な酵素をコードする核酸断片の合成に関する。
【背景技術】
【０００３】
特定の多不飽和脂肪酸、すなわちＰＵＦＡが健康な細胞の重要な生物学的構成要素であることが、長期にわたり認識されている。例えばこのようなＰＵＦＡは、
哺乳類において新規に（ｄｅ  ｎｏｖｏ）合成できず、食餌中で得られなくてはならない、またはリノール酸（ＬＡ）またはα−リノレン酸（ＡＬＡ）のさらなる不飽和化と延長によって誘導されなくてはならない「必須」脂肪酸、
リン脂質またはトリグリセリドなどの形態で見いだされてもよい細胞原形質膜の構成物、
特に成長中の幼児の脳において適切な発育、そして組織形成および修復に必要である、
プロスタサイクリン、エイコサノイド、ロイコトリエン、およびプロスタグランジンをはじめとする、哺乳類において重要ないくつかの生物学的に活性なエイコサノイドの前駆物質として認識されている。
【０００４】
１９７０年代に、グリーンランドのエスキモーの観察から、心疾患の低発生率と長鎖ω−３ＰＵＦＡの高摂取量とが結びつけられた（非特許文献１、非特許文献２）。より最近の研究はω−３ＰＵＦＡの心臓血管保護効果を確証した（非特許文献３、非特許文献４）。さらに血管形成術後の再狭窄率、炎症および関節リウマチ、喘息、乾癬および湿疹の症状などのいくつかの障害はω−３脂肪酸による処置に反応することが見いだされている。γ−リノレン酸（ＧＬＡ、ω−６ＰＵＦＡ）はストレスに関係した血圧上昇を低下させ、算術試験能力を改善することが示されている。ＧＬＡおよびジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ、もう１つのω−６ＰＵＦＡ）は、血小板凝集を阻害し、血管拡張を引き起こし、コレステロールレベルを低下させ、血管壁平滑筋および繊維組織の増殖を阻害することが示されている（非特許文献５）。ＧＬＡまたはＤＧＬＡの単独でのまたはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、ω−３ＰＵＦＡ）との組み合わせでの投与は、非ステロイド性抗炎症薬によって引き起こされる消化管出血およびその他の副作用を低下させ、または防止することが示されている（特許文献１）。さらにＧＬＡおよびＤＧＬＡは、子宮内膜症および月経前症候群を防止または治療し（特許文献２）、筋痛性脳脊髄炎およびウィルス感染後の慢性疲労（特許文献３）を治療することが示されている。その他の証拠は、ＰＵＦＡがカルシウム代謝調節に関与するかもしれないことを示唆し、骨粗鬆症および腎臓または尿道結石の治療または防止においてそれらが有用であるかもしれないことを示唆する。最後にＰＵＦＡは癌および糖尿病の治療において使用できる（特許文献４、非特許文献６）。
【０００５】
ＰＵＦＡは、必須脂肪酸であるＬＡおよびＡＬＡそれぞれの不飽和化および延長によって誘導される、２つの主要なクラス（ω−６およびω−３脂肪酸からなる）に概して分けられる（図１）。天然供給源からの多様なＰＵＦＡの商業的供給源（例えば月見草、ルリヂサ、およびクロフサスグリの種子や糸状菌（モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ））、チノリモ属（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）（紅藻）、魚油および海洋性プランクト
ン（キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）、クリプテコジニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ））にもかかわらず、これらの生産方法と結びついたいくつかの不都合がある。第１に魚および植物などの天然供給源は、高度に不均一な油組成物を有しがちである。したがってこれらの供給源から得られた油は、所望のＰＵＦＡの１つもしくはそれ以上を分離または濃縮するために大規模な精製を必要とすることがある。天然供給源はまた、制御できない供給のばらつきを被りやすい（例えば天候、疾患、または魚資源の乱獲による）。ＰＵＦＡを生産する作物は、食物生産のために開発されたハイブリッド作物と、経済的競争力がないことが多い。またＰＵＦＡを自然に生産するいくつかの生物体（例えばポルフィリディウム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ））の大規模発酵は、商業的規模で培養するのが高価および／または困難なことがある。
【０００６】
上述の限界の結果として、以下に向けた大規模な研究が行われている。１．）商業的に容易に生産できるＰＵＦＡの組換え供給源の開発、および２．）所望のＰＵＦＡ生産を可能にする脂肪酸生合成経路の修正。例えば過去数年間にわたり、様々な生物体からの脂肪酸デサチュラーゼおよび鎖長延長酵素（ｅｌｏｎｇａｓｅ）遺伝子の単離、クローン化、および操作において進歩があった。これらの遺伝子配列の知識は、ＰＵＦＡを自然に生産しない新しい宿主生物体中で、所望の脂肪酸および／または脂肪酸組成物を生産する見込みを提供する。文献は、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における以下のようないくつかの例を報告する。
１．非特許文献７では、海洋珪藻フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）からの２個のデサチュラーゼがＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中にクローン化され、ＥＰＡの生産をもたらす。
２．非特許文献８では、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）からの遺伝子を使用して、ω−３およびω−６ＰＵＦＡ生合成経路がＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中に再構成される。
３．非特許文献９では、植物脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ２およびＦＡＤ３）がＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中に発現し、ＡＬＡの生産をもたらす。
４．アボット・ラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のナットゾン（Ｋｎｕｔｚｏｎ）らに付与された特許文献５では西洋油菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）からの１つのデサチュラーゼおよび菌・カビ類モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）からの２個のデサチュラーゼが、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中にクローン化され、ＬＡ、ＧＬＡ、ＡＬＡ、およびＳＴＡの生産をもたらす。
【０００７】
しかしこれらのタイプの遺伝子を発現させて、商業的量の１つもしくはそれ以上のＰＵＦＡの経済的生産を提供できる適切な微生物のシステムに対する必要性がなおもある。さらに特にＥＰＡおよびＤＨＡである特定のＰＵＦＡが濃縮されている油に対する必要性が存在する。
【０００８】
ＰＵＦＡの生産プラットフォームとしてこれまで調査されていない１つのクラスの微生物が、油性酵母菌である。これらの生物体は、乾燥細胞重量の８０％までの油を蓄積できる。高い油含量で油性酵母菌を生育させる技術は十分に開発されており（例えば特許文献６、非特許文献１０を参照）、ω−３またはω−６ＰＵＦＡ生産のための商業的な微細藻類発酵と比べてコスト優位性を提供するかもしれない。そのままの酵母菌細胞はまた、機能食品および動物飼料サプリメントで使用するためのω−３またはω−６ＰＵＦＡ−濃縮油を封入する都合よい方法になるかもしれない。
【０００９】
【特許文献１】米国特許第４，６６６，７０１号明細書
【特許文献２】米国特許第４，７５８，５９２号明細書
【特許文献３】米国特許第５，１１６，８７１号明細書
【特許文献４】米国特許第４，８２６，８７７号明細書
【特許文献５】米国特許第６，１３６，５７４号明細書
【特許文献６】欧州特許第０００５２７７Ｂ１号明細書
【非特許文献１】ダイヤーバーグ（Ｄｙｅｒｂｅｒｇ）Ｊ．ら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ．２８：９５８〜９６６（１９７５）
【非特許文献２】ダイヤーバーグ（Ｄｙｅｒｂｅｒｇ）Ｊ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  ２（８０８１）：１１７〜１１９（１９７８年７月１５日）
【非特許文献３】シモカワ（Ｓｈｉｍｏｋａｗａ）Ｈ．、Ｗｏｒｌｄ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ  Ｄｉｅｔ、８８：１００〜１０８（２００１）
【非特許文献４】フォン・シャッキー（ｖｏｎ  Ｓｃｈａｃｋｙ）Ｃ．およびダイヤーバーグ（Ｄｙｅｒｂｅｒｇ）Ｊ．、Ｗｏｒｌｄ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ  Ｄｉｅｔ、８８：９０〜９９（２００１）
【非特許文献５】ブレナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）ら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．８３：８５〜１０１（１９７６）
【非特許文献６】（Ｈｏｒｒｏｂｉｎ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．５７（付録）：７３２Ｓ〜７３７Ｓ（１９９３）
【非特許文献７】ドマーグ（Ｄｏｍｅｒｇｕｅ）Ｆ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：４１０５〜４１１３（２００２）
【非特許文献８】ボードイン（Ｂｅａｕｄｏｉｎ）Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７（１２）：６４２１〜６（２０００）
【非特許文献９】ダイヤー（Ｄｙｅｒ）Ｊ．Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｉｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５９：２２４〜２３０（２００２）
【非特許文献１０】ラトレッジ（Ｒａｔｌｅｄｇｅ）Ｃ．、Ｐｒｏｇ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６：１１９〜２０６（１９８２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述の利点にもかかわらず、油性酵母菌中の自然に生産されるＰＵＦＡは、１８：２脂肪酸（そしてあまり一般的ではなく１８：３脂肪酸）に限定されるので、これらの生物体は自然にはω−６およびω−３ＰＵＦＡを欠いている。したがって解決すべき問題は、ω−３および／またはω−６脂肪酸が濃縮された油を蓄積する油性酵母菌を開発することである。このような目的で、油性酵母菌におけるω−３および／またはω−６脂肪酸の合成および蓄積を可能にする、飽和化酵素および鎖長延長酵素を導入することが必要である。多数の供給源から多様なデサチュラーゼおよび鎖長延長酵素遺伝子が入手できるにもかかわらず、これらの遺伝子は油性酵母菌などの別の宿主中では、遺伝子中のコドンが別の宿主生物体の典型的なコドン使用を反映しないので、最適効率で発現しない。したがって油性酵母菌におけるＰＵＦＡ遺伝子の発現を最適化し、これらの特定の宿主生物体におけるω−３および／またはω−６脂肪酸の高レベルの生産および蓄積を可能にするために、コドン使用に関連した問題を克服しなくてはならない。
【００１１】
出願人は、油性宿主、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現に適したデサチュラーゼおよび鎖長延長酵素遺伝子をコドン最適化する手段を開発することで既述の問題を解決した。ここで最適化される例示的な遺伝子は、Δ６デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、および高親和力ＰＵＦＡ鎖長延長酵素をコードする遺伝子であり、コドン最適化は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中でＬＡからＧＬＡへの％基質変換（Δ６デサチュラーゼ）をおよそ４０％改善し、ＡＲＡからＥＰＡへの％基質変換（Δ１７デサチュラーゼ）を約２倍にし、ＧＬＡからＤＧＬＡへの％基質変換（鎖長延長酵素）を約５７％改善した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種における最適発現のためのω−３／ω−６脂肪酸生合成経路における様々な遺伝子の最適化に関する。したがって本発明は、
ａ）配列番号２５に記載のΔ６デサチュラーゼをコードする単離された核酸分子、または
ｂ）（ａ）と完全に相補的である単離された核酸分子
よりなる群から選択される単離された核酸分子を提供する。
【００１３】
同様に本発明は、配列番号２に記載のΔ６デサチュラーゼをコードする単離された核酸分子を提供し、そこではヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種における発現のために少なくとも１４４個のコドンがコドン最適化される。
【００１４】
本発明の別の実施態様では、
ａ）配列番号６２に記載のΔ１７デサチュラーゼをコードする単離された核酸分子、または
ｂ）（ａ）と完全に相補的である単離された核酸分子
よりなる群から選択される、単離された核酸分子が提供される。
【００１５】
本発明の別の実施態様では、配列番号４に記載のΔ１７デサチュラーゼをコードする単離された核酸分子が提供され、そこではヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種における発現のために少なくとも１１７個のコドンがコドン最適化される。
【００１６】
同様に本発明は、
ａ）配列番号９１に記載の鎖長延長酵素をコードする単離された核酸分子、または
ｂ）（ａ）と完全に相補的である単離された核酸分子よりなる群から選択される単離された核酸分子を提供する。
【００１７】
代案としては本発明は、配列番号６に記載の鎖長延長酵素をコードする単離された核酸分子を提供し、そこではヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種における発現のために少なくとも８５個のコドンがコドン最適化される。
【００１８】
さらに本発明は、本発明の遺伝子の遺伝的キメラ、および該物質で形質転換された宿主細胞を提供する。
【００１９】
本発明の特定の実施態様では、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種中で本発明のコドン最適化遺伝子を使用して、適切な前駆物質からの一段階酵素的反応によって、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）、ジホモ−γ−リノール酸（ＤＧＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＴＡ）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、およびドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）などの特定のω−３およびω−６脂肪酸生産が提供される。
【００２０】
本発明の別の実施態様では、
ａ）油性酵母菌種についてヌクレオチドコード領域および対応するポリペプチドの配列を得て、コドンのデータベースを形成し、
ｂ）コドンのデータベースを分析し、いずれのコドンが各アミノ酸を優先的にコードするのか判定し、
ｃ）油性酵母菌種中で発現させる遺伝子の配列を得て、
ｄ）ステップ（ｃ）の配列中の好ましくないコドンをステップ（ｂ）の好ましいコドンで置き換えて、遺伝子が油性酵母菌種における発現のためにコドン最適化すること
を含んでなる、油性酵母菌における発現のために遺伝子を最適化する方法が提供される。
【００２１】
本発明の代案の実施態様では、配列番号１２２に記載のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）翻訳開始部位を含んでなる単離された核酸分子が提供される。さらに
ａ）ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中で発現させる外来遺伝子を提供し、
ｂ）ステップ（ａ）の遺伝子を配列番号１２２に記載のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）翻訳開始部位に作動可能に連結させ、外来遺伝子をヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における発現のために最適化すること
を含んでなる、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）宿主における遺伝子の発現を最適化するための方法も提供される。
【００２２】
配列説明
本願明細書の一部を形成する以下の詳細な説明および添付の配列説明によって、本発明をより完全に理解できるであろう。
【００２３】
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ  −  ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
【００２４】
配列番号１は、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列を示し、他方配列番号２は、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼのアミノ酸配列を示す。
【００２５】
配列番号３は、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列を示し、他方配列番号４は、Ｓ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼの対応するアミノ酸配列を示す。
【００２６】
配列番号５は、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）高親和力鎖長延長酵素遺伝子のＤＮＡ配列を示し、他方配列番号６はＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）高親和力鎖長延長酵素のアミノ酸配列を示す。
【００２７】
配列番号７および８は、ＴＥＦプロモーターを単離するのに使用されるプライマーＴＥＦ５’およびＴＥＦ３’にそれぞれ対応する。
【００２８】
配列番号９および１０は、ＸＰＲ２転写ターミネーターを単離するのに使用される、プライマーＸＰＲ５’およびＸＰＲ３’にそれぞれ対応する。
【００２９】
配列番号１１〜２４は、プラスミド構築のために使用されるプライマーＹＬ１、ＹＬ２、ＹＬ３、ＹＬ４、ＹＬ２３、ＹＬ２４、ＹＬ５、ＹＬ６、ＹＬ９、ＹＬ１０、ＹＬ７、ＹＬ８、ＹＬ６１、およびＹＬ６２にそれぞれ対応する。
【００３０】
配列番号２５は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化された、合成Δ６デサチュラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
【００３１】
配列番号２６〜５３は、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼ遺伝子
のコドン最適化コード領域全体を一緒に構成する、１４対のオリゴヌクレオチドに対応する（例えばそれぞれＤ６−１Ａ、Ｄ６−１Ｂ、Ｄ６−２Ａ、Ｄ６−２Ｂ、Ｄ６−３Ａ、Ｄ６−３Ｂ、Ｄ６−４Ａ、Ｄ６−４Ｂ、Ｄ６−５Ａ、Ｄ６−５Ｂ、Ｄ６−６Ａ、Ｄ６−６Ｂ、Ｄ６−７Ａ、Ｄ６−７Ｂ、Ｄ６−８Ａ、Ｄ６−８Ｂ、Ｄ６−９Ａ、Ｄ６−９Ｂ、Ｄ６−１０Ａ、Ｄ６−１０Ｂ、Ｄ６−１１Ａ、Ｄ６−１１Ｂ、Ｄ６−１２Ａ、Ｄ６−１２Ｂ、Ｄ６−１３Ａ、Ｄ６−１３Ｂ、Ｄ６−１４Ａ、およびＤ６−１４Ｂ）。
【００３２】
配列番号５４〜６１は、コドン最適化Δ６デサチュラーゼ遺伝子の合成中に、ＰＣＲ増幅のために使用されるプライマーＤ６−１、Ｄ６−４Ｒ、Ｄ６−５、Ｄ６−７Ｒ、Ｄ６−８、Ｄ６−１０Ｒ、Ｄ６−１１、およびＤ６−１４Ｒにそれぞれの対応する。
【００３３】
配列番号６２は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化された、合成Δ１７デサチュラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
【００３４】
配列番号６３〜８４は、Ｓ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ遺伝子のコドン最適化コード領域全体を一緒に構成する、１１対のオリゴヌクレオチドに対応する（例えばそれぞれＤ１７−１Ａ、Ｄ１７−１Ｂ、Ｄ１７−２Ａ、Ｄ１７−２Ｂ、Ｄ１７−３Ａ、Ｄ１７−３Ｂ、Ｄ１７−４Ａ、Ｄ１７−４Ｂ、Ｄ１７−５Ａ、Ｄ１７−５Ｂ、Ｄ１７−６Ａ、Ｄ１７−６Ｂ、Ｄ１７−７Ａ、Ｄ１７−７Ｂ、Ｄ１７−８Ａ、Ｄ１７−８Ｂ、Ｄ１７−９Ａ、Ｄ１７−９Ｂ、Ｄ１７−１０Ａ、Ｄ１７−１０Ｂ、Ｄ１７−１１Ａ、およびＤ１７−１１Ｂ）。
【００３５】
配列番号８５〜９０は、コドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子の合成中に、ＰＣＲ増幅のために使用されるプライマーＤ１７−１、Ｄ１７−４Ｒ、Ｄ１７−５、Ｄ１７−８Ｄ、Ｄ１７−８Ｕ、およびＤ１７−１１にそれぞれ対応する。
【００３６】
配列番号９１は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化された、合成高親和力鎖長延長酵素遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
【００３７】
配列番号９２〜１１１は、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）高親和力鎖長延長酵素遺伝子のコドン最適化コード領域全体を一緒に構成する、１０対のオリゴヌクレオチドに対応する（例えばそれぞれＥＬ−１Ａ、ＥＬ−１Ｂ、ＥＬ−２Ａ、ＥＬ−２Ｂ、ＥＬ−３Ａ、ＥＬ−３Ｂ、ＥＬ−４Ａ、ＥＬ−４Ｂ、ＥＬ−５Ａ、ＥＬ−５Ｂ、ＥＬ−６Ａ、ＥＬ−６Ｂ、ＥＬ−７Ａ、ＥＬ−７Ｂ、ＥＬ−８Ａ、ＥＬ−８Ｂ、ＥＬ−９Ａ、ＥＬ−９Ｂ、ＥＬ−１０Ａ、およびＥＬ−１０Ｂ）。
【００３８】
配列番号１１２〜１１５は、コドン最適化鎖長延長酵素遺伝子の合成中に、ＰＣＲ増幅のために使用されるプライマーＥＬ−１、ＥＬ−５Ｒ、ＥＬ−６、およびＥＬ−１０Ｒにそれぞれ対応する。
【００３９】
配列番号１１６および１１７は、部位特異的変異誘発のために使用されてｐＥＬＳを生じる、プライマーＥＬ−Ｍ１およびＥＬ−Ｍ２に対応する。
【００４０】
配列番号１１８および１１９は、プラスミドｐＲＳＰ１９からＳ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）の野生型Δ１７デサチュラーゼ遺伝子を増幅するために使用される、プライマーＹＬ２１ＡおよびＹＬ２２に対応する。
【００４１】
配列番号１２０および１２１は、部位特異的変異誘発のために使用されてｐＹＳＤ１７
Ｍを生じる、プライマーＹＬ５３およびＹＬ５４に対応する。
【００４２】
配列番号１２２は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種中で最適に発現する遺伝子のためのコドン最適化翻訳開始部位に対応する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
主題の発明にしたがって、出願人は油性酵母菌中、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における構造的な遺伝子のコドン使用を判定した。Δ６デサチュラーゼ（配列番号２５）、Δ１７デサチュラーゼ（配列番号６２）および高親和力鎖長延長酵素（配列番号９１）をコードするコドン最適化遺伝子、ならびにＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）宿主細胞における前記遺伝子に発現のためのＤＮＡカセットが提示される。さらにＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などの油性酵母菌の長鎖多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）含量の修正を可能にする、方法および組成物が提供される。
【００４４】
主題発明には多くの用途がある。ここで開示される方法によって製造されるＰＵＦＡ、またはその誘導体は、食餌代用品、またはサプリメント、特に乳児用調製粉乳として、静脈内栄養補給を受けている患者のために、または栄養不良を防止または処置するために使用できる。代案としては、精製されたＰＵＦＡ（またはその誘導体）は、正常な使用で受領者が食餌栄養補給のための所望量を受容するように調合された、料理用油、脂肪またはマーガリンに組み込まれてもよい。ＰＵＦＡはまた、乳児用調製粉乳、栄養サプリメントまたはその他の食物生産物に組み込まれてもよく、抗炎症薬またはコレステロール低下剤としての用途があるかもしれない。場合により組成物は、医薬品用途（ヒトまたは獣医学）のために使用されてもよい。この場合、ＰＵＦＡは概して経口投与されるが、例えば非経口的（例えば皮下、筋肉内または静脈内）、経直腸、経腟または局所的（例えば皮膚用軟膏またはローションとして）など、それによって成功裏に吸収されるあらゆる経路で投与することができる。
【００４５】
組換え手段によって製造されたＰＵＦＡによるヒトまたは動物の栄養補給は、追加的なＰＵＦＡ、ならびにそれらの代謝子孫の増大したレベルをもたらすことができる。例えばアラキドン酸（ＡＲＡ）による処置は、ＡＲＡの増大したレベルだけでなく、プロスタグランジンなどのＡＲＡの下流生産物をももたらすことができる。複雑な制御機序は、このような機序を防止、制御または克服して、個々の特定のＰＵＦＡの所望のレベルを達成するために、様々なＰＵＦＡを組み合わせ、または異なるＰＵＦＡコンジュゲートを追加することを望ましいものにできる。
【００４６】
定義
本開示では、いくつかの用語および略語が使用される。以下の定義が提供される。
【００４７】
「読み取り枠」はＯＲＦと略記する。
【００４８】
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略記する。
【００４９】
「米国微生物系統保存機関」はＡＴＣＣと略記する。
【００５０】
「多不飽和脂肪酸」はＰＵＦＡと略記する。
【００５１】
「脂肪酸」という用語は、（より長い、およびより短い鎖長の酸の双方も知られているが）約Ｃ１２〜Ｃ２２の様々な鎖長の長鎖脂肪族酸（アルカン酸）を指す。優勢な鎖長は、Ｃ１６〜Ｃ２２の間である。脂肪酸の構造は単純な表記法システム「Ｘ：Ｙ」によって
表され、ここでＸは特に脂肪酸の炭素（Ｃ）原子の総数であり、Ｙは二重結合の数である。
【００５２】
概して脂肪酸は、飽和または不飽和として分類される。「飽和脂肪酸」という用語は、炭素主鎖間に「二重結合」を有さない脂肪酸を指す。対照的に「不飽和脂肪酸」は、それらの炭素主鎖に沿って「二重結合」を有するｃｉｓ−異性体である。「一不飽和脂肪酸」は、（例えばパルミトレイン酸（１６：１）およびオレイン酸（１８：１）のように通常９および１０番目の炭素原子の間に）炭素主鎖に沿って１つの「二重結合」のみを有し、他方「多不飽和脂肪酸」（または「ＰＵＦＡ」）は、（例えばリノール酸（１８：２）のように９番目および１０番目、および１２番目および１３番目の炭素原子間、およびα−リノレン酸（１８：３）のように９番目および１０番目、１２番目および１３番目目、および１５番目および１６番目の炭素原子間に）炭素主鎖に沿って少なくとも２個の二重結合を有する。
【００５３】
「ＰＵＦＡ」は、（脂肪酸炭素鎖のメチル末端に最も近い第１の二重結合の位置（ｎ）次第で）２つの主要ファミリーに分類できる。したがって「オメガ−６脂肪酸」（ω−６またはｎ−６）は、第１の不飽和二重結合を分子のω（メチル）末端から６個めの炭素原子に有し、さらに分子のカルボキシル末端に向かって３個めの追加的な炭素原子にそれぞれの続く不飽和がある、全部で２つ以上の二重結合を有する。対照的に「オメガ−３脂肪酸」（ω−３またはｎ−３）は、第１の不飽和二重結合を分子のω末端から３個離れた炭素原子に有し、さらに分子のカルボキシル末端に向かって３個目の追加的な炭素原子にそれぞれの続く不飽和がある、全部で３個以上の二重結合を有する。
【００５４】
本開示の目的のために、ω参照システムを使用して、炭素数、二重結合数、およびω炭素（この目的では１番目とする）から数えたω炭素に最も近い二重結合の位置を示す。この命名法を下の表１で、「省略表記法」と題された欄に示す。表の残りは、ω−３およびω−６脂肪酸の共通の名称、明細書全体で使用される略語、および各化合物の化学名をまとめる。
【００５５】
【表１】
2007504838.tif 000003
【００５６】
「必須脂肪酸」と言う用語は、固体が特定の必須脂肪酸を新規に（ｄｅ  ｎｏｖｏ）合成できないことから、生きるために摂取しなくてはならない特定のＰＵＦＡを指す。例えば、哺乳類は必須脂肪酸ＬＡ（１８：２、ω−６）を合成できない。その他の必須脂肪酸としては、ＧＬＡ（ω−６）、ＤＧＬＡ（ω−６）、ＡＲＡ（ω−６）、ＥＰＡ（ω−３）、およびＤＨＡ（ω−３）が挙げられる。
【００５７】
「脂肪」と言う用語は、２５℃で固体であり、通常、飽和である脂質物質を指す。
【００５８】
「油」と言う用語は、２５℃で液体であり、通常、多不飽和である脂質物質を指す。ＰＵＦＡは、いくつかの藻類、油性酵母菌および糸状菌の油に見られる。「微生物油」または「単細胞油」は、微生物がそれらの寿命中に自然に生産する油である。このような油は長鎖ＰＵＦＡを含有することができる。
【００５９】
「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」と言う用語は、ＰＵＦＡの生合成に関連した以下の酵素（および前記酵素をコードする遺伝子）のいずれかを指す。Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、および／または鎖長延長酵素。
【００６０】
「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」と言う用語は、適切な条件下で発現すると、ω−３およびω−６脂肪酸の片方または双方の生産を触媒する酵素をコードする一組の遺伝子を指す。典型的にω−３／ω−６脂肪酸生合成経路に関与する遺伝子は、以下の酵素のいくつかまたは全てをコードする。Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、鎖長延長酵素、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、およびΔ４デサチュラーゼ。共通の供給源からいかにしてω−３およびω−６脂肪酸の双方が生産できるかを実証する代表的な経路は図１に示され、ＤＨＡへの様々な中間体を通じて、オレイン酸の変換を提供する。
【００６１】
「デサチュラーゼ」と言う用語は、１つもしくはそれ以上の脂肪酸を不飽和化して関心のある一不飽和または多不飽和脂肪酸または前駆物質を生産できる、多酵素複合体のポリペプチド構成要素を指す。特定の脂肪酸に関して、本願明細書全体を通じてω参照システムを使用するのにもかかわらず、Δシステムを使用して基質のカルボキシル末端から数えることで、デサチュラーゼの活性を示す方が都合よい。ここで特に関心が高いのは、１．）分子のカルボキシル末端から数えて１７番目および１８番目の炭素原子間で脂肪酸を不飽和化し、例えばＡＲＡからＥＰＡへのおよび／またはＤＧＬＡからＥＴＡへの転換を触媒するΔ１７デサチュラーゼ、２．）ＬＡからＧＬＡへのおよび／またはＡＬＡからＳＴＡへの転換を触媒するΔ６デサチュラーゼ、３．）ＤＧＬＡからＡＲＡへのおよび／またはＥＴＡからＥＰＡへの転換を触媒するΔ５デサチュラーゼ、４．）ＤＰＡからＤＨＡへの転換を触媒するΔ４デサチュラーゼ、５．）オレイン酸からＬＡへの転換を触媒するΔ１２デサチュラーゼ、６．）ＬＡからＡＬＡへの転換を触媒するΔ１５デサチュラーゼ、および７．）パルミチン酸からパルミトレイン酸（１６：１）および／またはステアリン酸からオレイン酸（１８：１）への転換を触媒するΔ９デサチュラーゼである。
【００６２】
「鎖長延長酵素」と言う用語は、脂肪酸炭素鎖を伸長して、鎖長延長酵素が作用した脂肪酸基質よりも炭素２個分長い一不飽和または多不飽和脂肪酸が生産できる、多酵素複合体のポリペプチド構成要素を指す。この延長プロセスは、ＣｏＡがアシルキャリアである脂肪酸合成酵素と関連した多段階機序で起きる（ラスナー（Ｌａｓｓｎｅｒ）ら、Ｔｈｅ
Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ８：２８１〜２９２（１９９６））。手短に述べると、マロニル−ＣｏＡが長鎖アシル−ＣｏＡと縮合して、ＣＯ２およびβ−ケトアシル−ＣｏＡ（アシル部分が炭素原子２個分伸長された）を生じる。引き続く反応には、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡへの還元、エノイル−ＣｏＡへの脱水、および伸長されたアシル−ＣｏＡを生じる第２の還元が含まれる。鎖長延長酵素によって触媒される反応の例は、ＧＬＡからＤＧＬＡ、ＳＴＡからＥＴＡ、およびＥＰＡからＤＰＡへの転換である。したがって鎖長延長酵素は、異なる特異性を有することができる（例えばＣ１６／１８鎖長延長酵素はＣ１６基質を好み、Ｃ１８／２０鎖長延長酵素はＣ１８基質を好み、Ｃ２０／２２鎖長延長酵素はＣ２０基質を好む）。
【００６３】
「高親和力鎖長延長酵素」と言う用語は、その基質特異性が、好ましくはＧＬＡに向けたものである（鎖長延長酵素反応の生産物としてのＤＧＬＡを伴う）鎖長延長酵素を指す。このような鎖長延長酵素の１つについて、国際公開第００／１２７２０号パンフレットで述べられている。
【００６４】
「変換効率」および「％基質変換」と言う用語は、それによって特定の酵素（例えばデサチュラーゼまたは鎖長延長酵素）が基質から生産物に変換できる効率を指す。変換効率は以下の式に従って測定される。（［生産物］／［基質＋生産物］）×１００（式中、「生産物」には即時の生産物およびそれから誘導される経路中の全生産物が含まれる）。
【００６５】
「油性」と言う用語は、それらのエネルギー源を脂質の形態で保存する傾向がある生物
体を指す（ウィーテ（Ｗｅｅｔｅ）「真菌脂質生化学（Ｆｕｎｇａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」第二版、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）、１９８０）。概してこれらの微生物の細胞ＰＵＦＡ含量はＳ字形曲線に従い、対数後期または初期定常増殖相において脂質濃度が最大に達するまで増大し、次に後期定常および死滅期中に徐々に減少する（ヨンマニットチャイ（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ）およびワード（Ｗａｒｄ）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：４１９〜２５（１９９１））。
【００６６】
「油性酵母菌」と言う用語は、少なくとも２５％のそれらの乾燥細胞重量を油として蓄積できる酵母菌として分類される微生物を指す。油性酵母菌の例としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属が挙げられるが、決してこれに限定されるものではない。
【００６７】
「発酵性炭素源」と言う用語は、微生物が代謝してエネルギーを引き出す炭素源を意味する。本発明の典型的な炭素源としては、単糖類、少糖類、多糖類、アルカン、脂肪酸、脂肪酸のエステル、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、および炭素含有アミンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６８】
「コドン最適化された」と言う用語は、様々な宿主の形質転換のための遺伝子または核酸分子のコード領域を指し、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを改変することなく、宿主生物体の典型的なコドン使用を反映するための遺伝子または核酸分子のコード領域中のコドンの改変を指す。本発明の文脈で、遺伝子およびＤＮＡコード領域は、表４で収集された情報を使用して、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種における最適発現のためにコドン最適化される。
【００６９】
ここでの用法では、「単離された核酸断片」とは、場合により合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含有する一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡポリマーである。ＤＮＡポリマーの形態の単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つもしくはそれ以上のセグメントを含んでなってもよい。
【００７０】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「かなりの部分」とは、当業者による配列の手動評価によって、あるいはＢＬＡＳＴ（「基礎的局在性整列化検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）」アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９３））などのアルゴリズムを使用したコンピュータ支援配列比較および同定によって、遺伝子またはポリペプチドの推定上の同定を得るのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなる部分である。概してヌクレオチド配列の「かなりの部分」は、配列を含んでなる核酸断片を特異的に同定および／または単離できるようにする十分な配列（例えば２０〜３０個の連続（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）ヌクレオチド）を含んでなる。本願明細書は、１つもしくはそれ以上の特定のタンパク質をコードする、部分的または完全なヌクレオチド配列を教示する。ここで報告される配列の利点を有した当業者は、当業者には既知の目的のために、開示される配列の全てまたはかなりの部分を使用することができる。したがって本発明は、添付の配列表で報告される完全な配列、ならびに上述の配列のかなりの部分を含んでなる。
【００７１】
「相補的」と言う用語は、互いにハイブリッドできるヌクレオチド塩基間の関係について述べるために用いられる。例えばＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって本発明はまた、添付の配列表で報告さ
れる完全な配列に相補的な単離された核酸断片、ならびに実質的に同様の核酸配列を含む。
【００７２】
「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響しないヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝子コードの性質を指す。当業者は、特定のアミノ酸を特定化するヌクレオチドコドンの使用における、特定の宿主細胞によって示される「コドン−バイアス」についてよく知っている。したがって宿主細胞中の改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好むコドン使用頻度に近くなるように遺伝子をデザインすることが望ましい。
【００７３】
「化学的に合成された」とは、ＤＮＡ配列に関連して構成要素ヌクレオチドが、生体外で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）構築されたことを意味する。ＤＮＡの手動化学合成は確立した手順を使用して達成されてもよく、あるいはいくつかの市販の機器の１つを使用して自動化学合成を実施できる。「合成遺伝子」は、当業者に知られる手順を使用して、化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成単位から構築できる。これらの構成単位をライゲートしアニールして、遺伝子断片を形成し、次にそれを酵素的に構築して所望の遺伝子全体を構成する。したがって遺伝子をヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のために調整し、宿主細胞のコドンバイアスを反映させることができる。当業者は、コドン利用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合の遺伝子発現成功の見込みを理解する。好ましいコドンの判定は、配列情報が利用できる宿主細胞から誘導される遺伝子の調査に基づくことができる。
【００７４】
「遺伝子」とは、コード配列に先行する（５’非コード配列）およびそれに続く（３’非コード配列）制御配列をはじめとする、特定のタンパク質を発現する核酸断片を指す。「天然遺伝子」とは、自然界にそれ自体の制御配列と共に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界に共に見られない制御およびコード配列を含んでなる天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる供給源から誘導される制御配列およびコード配列、あるいは同一供給源から誘導されるが、自然界に見られるのとは異なるやり方で配列される制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内因性の遺伝子」とは、生物体ゲノムにおいてその天然位置にある天然遺伝子を指す。「外来性の」遺伝子とは、宿主生物体において常態では見られないが、遺伝子移入によって宿主生物体に導入される遺伝子を指す。外来性の遺伝子は、非天然生物体中に挿入された天然遺伝子、あるいはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」とは、形質転換によってゲノム中に導入される遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」とは、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好むコドン使用頻度を模倣するようにデザインされる遺伝子である。
【００７５】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な調節配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列内、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、およびステム−ループ構造を含んでもよい。
【００７６】
「プロモーター」とは、コード配列または機能ＲＮＡの発現を調節できるＤＮＡ配列を指す。概してコード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターは、そっくりそのまま天然遺伝子から誘導されてもよく、あるいは自然界に見られる異なるプロモーターから誘導される異なる要素からなってもよく、あるいは合成ＤＮＡセグメントを含んでなってさえよい。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞タイプ中で、あるいは異なる発達段階において、あるいは異なる環境または生理学的条件に呼応して、
遺伝子の発現を導いてもよいことが当業者には理解される。ほとんどの細胞タイプ中でほとんどの場合に遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構成プロモーター」と称される。ほとんどの場合、制御配列のはっきりした境界は完全に限定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有してもよいこともさらに認識される。
【００７７】
「３’非翻訳配列」または「転写ターミネーター」と言う用語は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これには、ｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響できる調節シグナルをコードするポリアデニル化認識配列およびその他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆物質の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響することで特性決定される。３’領域は、転写、ＲＮＡプロセッシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響できる。
【００７８】
「ＲＮＡ転写物」とは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼが触媒する転写から得られる生産物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と称され、あるいはそれは一次転写物の転写後プロセッシングから誘導されるＲＮＡ配列であるかもしれず、成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」とはイントロンがなく、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに対して相補的であり、それから誘導される二重鎖ＤＮＡを指す。「センスＲＮＡ」とは、ｍＲＮＡを含み、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的であり、標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１７０，０６５号明細書、国際公開第９９／２８５０８号パンフレット）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物のあらゆる部分、すなわち５’非コード配列、３’非コード配列、またはコード配列にあっても良い。「機能ＲＮＡ」とは、翻訳されないがそれでもなお細胞過程に影響するアンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、またはその他のＲＮＡを指す。
【００７９】
「作動可能に連結した」と言う用語は、１つの機能が他方の機能によって影響される、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターはコード配列の発現に影響できる場合、そのコード配列と作動可能に連結する（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節の下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンスオリエンテーションで制御配列に作動可能に連結できる。
【００８０】
「発現」と言う用語は、ここでの用法では、本発明の核酸断片から誘導されるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指してもよい。
【００８１】
「成熟した」タンパク質とは、翻訳後にプロセスされたポリペプチド、すなわちそれから一次翻訳産物中に存在するあらゆるプレ−またはプロペプチドが除去されたものを指す。「前駆」タンパク質とは、ｍＲＮＡの一次翻訳産物、すなわちプレ−およびプロペプチドが未だに存在するものを指す。プレ−およびプロペプチドは細胞内局在化シグナルであってもよい（がそれに限定されない）。
【００８２】
「形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、宿主生物体中への核酸分子の転移を指す。核酸分子は、例えば自律的に複製するプラスミドであってもよく、またはそれは宿主生物体のゲノム中に組み込まれてもよい。形質転換核酸断片を含有する宿主生物体は、「遺伝子組換え」または「組換え」または「形質転換」生物体と称される。
【００８３】
「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」と言う用語は、細胞の中心的代謝
の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外因子を指す。このような因子は、あらゆる供給源から誘導される一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの配列、ゲノム一体化配列、直鎖または環状のファージまたはヌクレオチド配列を自律的に複製するかもしれず、そこではいくつかのヌクレオチド配列が独自の構成に連結または組み換えされ、それは選択された遺伝子産物のために、適切な３’非翻訳配列と共にプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞中に導入することができる。
【００８４】
「形質転換カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする因子を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて外来性宿主におけるその遺伝子の促進された発現を可能にする因子を有する特定のベクターを指す。
【００８５】
「改変された生物学的活性」と言う用語は、アッセイ法によって測定できるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質に関連した活性を指し、そこでは活性は、未変性配列に関連した活性を超えるか、またはそれ未満である。「増強された生物学的活性」とは、未変性配列に結びついたものを超える改変された活性を指す。「低下した生物学的活性」とは、未変性配列に結びついたもの未満の改変された活性を指す。
【００８６】
「配列分析ソフトウェア」と言う用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のために有用なあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものでも、あるいは独立して開発されても良い。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、１．）ウィスコンシン州マディソンのジェネティック・コンピュータ・グループからのＧＣＧパッケージプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（アルシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０））、および３．）ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、および４．スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）・アルゴリズムを組み入れたＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）著、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４）、１９９２年会議、１１１〜２０、編集者：スハイ，サンドール（Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ）、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）、ニューヨーク州ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ））が挙げられるが、これに限定されるものではない。本願明細書の文脈内では、配列分析ソフトウェアを分析のために使用する場合、分析結果は特に断りのない限り、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。ここでの用法では、「デフォルト値」とは、最初に初期化されたときにソフトウェアに元々ロードされた、あらゆる値またはパラメータの組を意味する。
【００８７】
ここで使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は技術分野で良く知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」第二版、コールドスプリングハーバーラボラトリ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）（１９８９）（以下マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））；シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）Ｔ．Ｊ．、ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）Ｍ．Ｌ．およびエンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）Ｌ．Ｗ．「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）」コールドスプリングハーバーラボラトリ：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏ
ｒ、ＮＹ）（１９８４）；およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）Ｆ．Ｍ．ら「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」グリーンパブリッシングアッソシエーツ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．）およびワイリーインターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）による出版（１９８７）で述べられている。
【００８８】
脂肪酸の微生物生合成
一般に油性微生物中の脂質の蓄積は、増殖培地中に存在する全体的な炭素と窒素の比率に応答してトリガーされる。細胞が利用できる窒素供給を消耗した場合（例えば炭素と窒素の比率が約４０を超える場合）、細胞アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）の枯渇は、ミトコンドリア中のＡＭＰ−依存イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性の休止、およびクエン酸の蓄積、クエン酸の細胞質ゾル内への輸送、そして引き続くＡＴＰ−クエン酸リアーゼによるクエン酸の切断をもたらして、アセチル−ＣｏＡが生産する。アセチル−ＣｏＡは、脂肪酸の新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）生合成の主要（ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）構成ブロックである。効果的に代謝されてアセチル−ＣｏＡを生産できるあらゆる化合物が、脂肪酸前駆物質の役割を果たせるが、このタイプの反応ではグルコースが炭素の主な供給源である。グルコースは解糖を通じてピルビン酸に変換され、次にピルビン酸はミトコンドリア中に輸送され、そこでピルビン酸デヒドロゲナーゼによってアセチル−ＣｏＡに変換される。アセチル−ＣｏＡはミトコンドリア膜を越えて細胞質中に直接輸送できないので、アセチル−ＣｏＡからの２個の炭素がオキサロ酢酸と縮合して、クエン酸を生産する（クエン酸合成酵素によって触媒される）。クエン酸は細胞質内に直接輸送されて、そこでにＡＴＰ−クエン酸リアーゼによって切断され、アセチル−ＣｏＡおよびオキサロ酢酸が再生する。オキサロ酢酸は、リンゴ酸への転換を通じて、トリカルボン酸サイクルに再び入る。
【００８９】
マロニル−ＣｏＡの合成は、細胞質内で起きる脂肪酸生合成の第１の前駆ステップである。マロニル−ＣｏＡは、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼによって、アセチル−ＣｏＡのカルボキシル化を通じて生産される。脂肪酸合成は、多酵素脂肪酸合成酵素複合体（「ＦＡＳ」）によって触媒され、８個の二炭素断片（アセチル−ＣｏＡからのアセチル基）の縮合によって起き、炭素１６個の飽和脂肪酸であるパルミチン酸が形成する。より具体的には、ＦＡＳは以下が関与する一連の７つの反応を触媒する（スミス（Ｓｍｉｔｈ）Ｓ．、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、８（１５）：１２４８〜５９（１９９４））。
１．アセチル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡがＦＡＳのアシルキャリアペプチド（ＡＣＰ）に転移される。次にアセチル基がマロニル基に転移されてβ−ケトブチリル−ＡＣＰが形成し、ＣＯ２を放出する。
２．β−ケトブチリル−ＡＣＰが還元（β−ケトアシル還元酵素による）および脱水（β−ヒドロキシアシルデヒドラターゼによる）を被り、トランス−単不飽和脂肪アシル基が形成する。
３．二重結合がＮＡＤＰＨによって還元され、最初のものよりも炭素が２個分長い飽和脂肪−アシル基が生じる。次に新しいマロニル基と縮合して延長プロセスを繰り返すブチリル基の能力が再生する。
４．脂肪アシル基が炭素１６個の長さになったら、チオエステラーゼ活性がそれを加水分解して遊離パルミチン酸を放出する。
【００９０】
パルミチン酸（１６：０）は、小胞体膜に存在する鎖長延長酵素およびデサチュラーゼの作用を通じた、より鎖長が長い飽和および不飽和脂肪酸（例えばステアリン酸（１８：０）、パルミトレイン酸（１６：１）、およびオレイン酸（１８：１））の前駆物質である。パルミチン酸およびステアリン酸は、Δ９デサチュラーゼの作用によってそれらの不飽和（ｕｎｓａｔｕａｒｅｄ）誘導体であるパルミトレイン酸（１６：１）およびオレイン酸（１８：１）酸にそれぞれ変換する。
【００９１】
トリアシルグリセロール（脂肪酸の主な貯蔵単位）は、リン酸１，２−ジアシルグリセロール（一般にホスファチジン酸として同定される）を生じる、アシル−ＣｏＡの２個の分子からグリセロール−３−リン酸へのエステル化によって形成される。次にホスファチジン酸ホスファターゼによってリン酸が除去され、１，２−ジアシルグリセロールが生産する。第３の脂肪酸を添加すると、ジアシルグリセロール−アシルトランスフェラーゼの作用によってトリアシルグリセロールが形成する。
【００９２】
Ω脂肪酸の生合成
非常に単純化すると、ＬＡをＧＬＡ、ＤＧＬＡ、およびＡＲＡ（ω−６経路）に、ＡＬＡをＳＴＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、およびＤＨＡ（ω−３経路）に変換する代謝プロセスは、炭素原子の付加を通じた炭素鎖の延長と、二重結合の添加を通じた分子の不飽和化を伴う（図１）。これは小胞体膜に存在する一連の特別な不飽和化および延長酵素を必要とする。
【００９３】
ω−６脂肪酸
オレイン酸は、Δ１２デサチュラーゼの作用によって、最初のω−６脂肪酸であるＬＡ（１８：２）に変換される。引き続くω−６脂肪酸は、次のようにして生産される。１．）ＬＡがΔ６デサチュラーゼ活性によってＧＬＡに変換され、２．）ＧＬＡが鎖長延長酵素の作用によってＤＧＬＡに変換され、３．）ＤＧＬＡがΔ５デサチュラーゼの作用によってＡＲＡに変換される。
【００９４】
ω−３脂肪酸
リノール酸（ＬＡ）は、Δ１５デサチュラーゼの作用によって、最初のω−３脂肪酸であるＡＬＡに変換される。引き続くω−３脂肪酸は、ω−６脂肪酸と類似した一連のステップで生産される。具体的には、１．）ＡＬＡがΔ６デサチュラーゼ活性によってＳＴＡに変換され、２．）ＳＴＡが鎖長延長酵素活性によってＥＴＡに変換され、３．）ＥＴＡがΔ５デサチュラーゼ活性によってＥＰＡに変換される。代案としては、ＥＴＡおよびＥＰＡは、Δ１７デサチュラーゼ活性によって、ＤＧＬＡおよびＡＲＡからそれぞれ生産できる。ＥＰＡは、鎖長延長酵素およびΔ４デサチュラーゼ活性によって、ＤＨＡにさらに変換できる。
【００９５】
Ω脂肪酸生産に関与する遺伝子
藻類、細菌、カビおよび酵母菌をはじめとする多くの微生物は、通常の細胞代謝経路内でＰＵＦＡおよびω脂肪酸を合成できる。特によく適するのは、ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の種であるスキゾキトリウム・アグレガトム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｇｇｒｅｇａｔｍ）、およびモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｅｒｉｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）をはじめとする菌・カビ類である。さらに多くの渦鞭毛藻類（渦鞭毛藻綱（Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａａｅ））は、高濃度のＰＵＦＡを自然に生産する。したがって油生産に関与する多様な遺伝子が遺伝的手段を通じて同定されており、これらのいくつかの遺伝子のＤＮＡ配列は公的に入手できる（制限を意図しない例を下の表２に示す）。
【００９６】
【表２】
2007504838.tif 000004
【００９７】
【表３】
2007504838.tif 000005
【００９８】
さらに特許文献は、ＰＵＦＡ生産に関与する多くの追加的な遺伝子のＤＮＡ配列（および／または上の遺伝子のいくつかに関する詳細およびそれらの単離方法）を提供する。例えば米国特許第５，９６８，８０９号明細書（Δ６デサチュラーゼ）、米国特許出願公開第２００３／０１９６２１７  Ａ１号明細書（Δ１７デサチュラーゼ）、米国特許第５，９７２，６６４号明細書および米国特許第６，０７５，１８３号明細書（Δ５デサチュラーゼ）、国際公開第９１／１３９７２号パンフレットおよび米国特許第５，０５７，４１９号明細書（Δ９デサチュラーゼ）、国際公開第９３／１１２４５号パンフレット（Δ１５デサチュラーゼ）、国際公開第９４／１１５１６号パンフレット、米国特許第５，４４３，９７４号明細書および国際公開第０３／０９９２１６号パンフレット（Δ１２デサチュラーゼ）、国際公開第０２／０９０４９３号パンフレット（Δ４デサチュラーゼ）、および国際公開第００／１２７２０号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００２／０１３９９７４  Ａ１号明細書（鎖長延長酵素）を参照されたい。これらの各特許および出願は、その内容全体を参照によってここに援用したものとする。
【００９９】
当業者には明らかなように、特定のＰＵＦＡ最終生産物の生産のために宿主生物体に導入する必要がある特定機能は、宿主細胞（およびその未変性ＰＵＦＡプロフィールおよび／またはデサチュラーゼプロフィール）、基質の入手可能性および所望の最終生産物に左右される。同時係属の米国仮特許出願第６０／４６７６７７号（その内容全体を本願明細書に引用したものとする）で述べられ、図１に示すように、ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、Ａ
ＲＡ、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡは、以下のＰＵＦＡ酵素機能の様々な組み合わせを導入することで、全て油性酵母菌中で生産されてもよい。Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、および／または鎖長延長酵素。当業者は、公的に入手できる文献（例えばジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ））、特許文献、およびＰＵＦＡを製造する能力を有する微生物の実験的分析に従って、上の各酵素をコードする様々な候補遺伝子を同定できるであろう。配列は、例えば天然供給源などから（細菌、藻類、菌・カビ類、植物、動物などから）単離され、半合成または新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）合成経路を通じて生産される、あらゆる供給源に由来してもよい。しかし当業者には明らかなように、異種性遺伝子は別の宿主中では様々な効率で発現する。したがってω−３および／またはω−６ＰＵＦＡの生産は、異種性宿主における発現レベルが、関心のある宿主生物体における別のデサチュラーゼまたは鎖長延長酵素の発現に比べて好ましい、特定のデサチュラーゼまたは鎖長延長酵素の選択によって最適化されてもよい。
【０１００】
宿主に導入されるデサチュラーゼおよび鎖長延長酵素遺伝子の特定の供給源は重要でないが、デサチュラーゼまたは鎖長延長酵素活性を有する特定のポリペプチドを選択する上での考慮としては、次が挙げられる。１．）ポリペプチドの基質特異性、２．）ポリペプチドまたはその構成要素が律速酵素であるかどうか、３．）デサチュラーゼまたは鎖長延長酵素が所望のＰＵＦＡの合成のために必須であるかどうか、および／または４．）ポリペプチドによって必要とされる補助因子。発現するポリペプチドは、好ましくは宿主細胞内のその位置の生化学的環境と適合性のパラメーターを有する。例えばポリペプチドは、宿主細胞内で基質獲得のためにその他の酵素と競争しなくてはならないかもしれない。したがってポリペプチドのＫＭおよび特異的活性分析は、特定の宿主細胞内でＰＵＦＡ生産を修正するために、特定のポリペプチドの適性を判定する上で考慮される。特定の宿主細胞で使用されるポリペプチドは、意図される宿主細胞中に存在する生化学的条件下で機能できるものであるが、その他の点では所望のＰＵＦＡを修正できる、デサチュラーゼまたは鎖長延長酵素活性を有するあらゆるポリペプチドであることができる。
【０１０１】
しかし究極の目的がω−３および／またはω−６脂肪酸が濃縮された油を蓄積する油性酵母菌の開発である、ここでの研究目的のためには、油性酵母菌中において比較的効率的に機能する、デサチュラーゼおよび鎖長延長酵素活性を有するポリペプチドを同定することが望ましかった。したがって、様々なデサチュラーゼおよび鎖長延長酵素が油性酵母菌中において発現され、基質供給試験においてω−３および／またはω−６脂肪酸を生産するそれらの能力についてスクリーンされた。ひとたび適切な酵素が同定されると（全体的％基質変換に基づいて）、次にこれらの遺伝子に後述するコドン最適化技術を施して、別の油性酵母菌宿主における各酵素の発現をさらに最適化した。これによってω−３および／またはω−６脂肪酸の最大の生産が可能になった。
【０１０２】
当業者は、ここでコドン最適化のために選択される特異的ＰＵＦＡ遺伝子が単に例示的であり、ここで本発明を制限することを意図しないことを理解するであろう。様々な供給源からの多数のその他の異種性デサチュラーゼ（Δ４、Δ５、Δ６、Δ９、Δ１２、Δ１５、および／またはΔ１７デサチュラーゼ活性を有する）および鎖長延長酵素は、コドン最適化して油性酵母菌宿主におけるそれらの発現を改善できる。
【０１０３】
油性酵母菌における発現のためのΩ脂肪酸遺伝子コドンの最適化
当業者にはよく知られているように、宿主が好むコドンの使用は、ポリペプチドをコードする外来遺伝子の発現を実質的に増強できる。一般に宿主が好むコドンは、タンパク質中のコドン使用を調べてどのコドンが最高頻度で使用されるか判定することで、関心のある特定の宿主種（好ましくは最大量を発現するもの）中で判定できる。次に宿主種で好ま
しいコドンを使用して、デサチュラーゼまたは鎖長延長酵素活性を有する関心のあるポリペプチドのためのコード配列の全体または一部が合成できる。したがって関心のある特定の宿主生物体における発現のために遺伝子を最適化する方法は、概して
ａ）関心のある特定の宿主生物体についてヌクレオチドコード領域および対応するポリペプチドの配列を得て、コドンのデータベースを形成し、
ｂ）コドンのデータベースを分析し、いずれのコドンが各アミノ酸を優先的にコードするのか判定し、
ｃ）関心のある特定の宿主生物体中で発現させる遺伝子の配列（例えばデサチュラーゼまたは鎖長延長酵素）を得て、
ｄ）ステップ（ｃ）の配列中の好ましくないコドンをステップ（ｂ）の好ましいコドンで置き換えて、遺伝子が関心のある特定の宿主生物体における発現のためにコドン最適化されることを必要とする。
【０１０４】
またＤＮＡの全部（または一部）を合成して、転写ｍＲＮＡ中に存在する、二次構造のあらゆる不安定化配列または領域を除去できる。またＤＮＡの全部（または一部）を合成して、塩基組成物を所望の宿主細胞中でより好ましいものに変更できる。
【０１０５】
本発明の目的のためには、修正されたポリペプチドが、別の宿主（すなわち油性酵母菌）によって好ましいコドンを使用するように、外来宿主中で発現させるＰＵＦＡデサチュラーゼおよび鎖長延長酵素活性を有する特定のポリペプチドをコードするコドンの一部を修正することが望ましかった。具体的にはΔ１７デサチュラーゼ活性、Δ６デサチュラーゼ活性、および鎖長延長酵素活性を有するポリペプチドをコードするコドンの一部を修正して、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における遺伝子の発現を増強することが望ましかった。したがってＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドン使用プロフィールは表４（実施例３）に示すように決定された。さらに翻訳開始コドン「ＡＴＧ」を取り囲むヌクレオチド配列は、酵母菌細胞における発現に影響することが分かっている。酵母菌におけるポリペプチドの発現が不良であれば、外来性遺伝子のヌクレオチド配列を修正し、効率的な酵母菌翻訳開始配列を含めて、最適な遺伝子発現を得ることができる。したがってＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における遺伝子発現をさらに最適化するために、「ＡＴＧ」開始コドン周囲の共通配列もまた決定された（図４、配列番号１２２）。
【０１０６】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドン使用プロフィールおよび「ＡＴＧ」開始コドン周囲の共通配列に基づいて、Δ１７デサチュラーゼ遺伝子、Δ６デサチュラーゼ遺伝子、および鎖長延長酵素遺伝子の核酸を配列を修正して、宿主が好むコドンを用いた。より具体的には、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）（ＡＴＣＣ番号１６２６６）Δ６デサチュラーゼ（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号ＡＦ４６５２８１、米国特許第５，９６８，８０９号明細書）を選択して、ＬＡをＧＬＡに、および／またはＡＬＡをＳＴＡに変換する酵素的能力を導入した。この野生型デサチュラーゼは、４５７個のアミノ酸（配列番号２）および５１．８ｋＤの予想分子量を有した。ここで作り出したコドン最適化遺伝子では、１３７４ｂｐのコード領域（１４４個のコドンに対応する）の１５２ｂｐがコドン最適化され、翻訳開始部位が修正された。同様にして野生型サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）（ＡＴＣＣ番号５６８５１）Δ１７デサチュラーゼ（配列番号４、米国特許出願公開２００３／０１９６２１７Ａ１号明細書）を選択して、ＤＧＬＡをＥＴＡに、および／またはＡＲＡをＥＰＡに変換する酵素的能力を導入したが、翻訳開始部位は修正され、１０７７ｂｐコード領域（１１７個のコドンを含んでなる）の１２７ｂｐがコドン最適化された。最後にＧＬＡからＤＧＬＡ、ＳＴＡからＥＴＡ、および／またはＥＰＡからＤＰＡへの転換のため、油性酵母菌におけるその発現の最適化のために、３１８個のアミノ酸（配列番号６）および４０．５ｋＤの予想分子量を有する野生型Ｍ．アルピナ（Ｍ．
ａｌｐｉｎａ）高親和力ＰＵＦＡ鎖長延長酵素（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号ＡＸ４６４７３１、国際公開第００／１２７２０号パンフレット）を選択した。具体的には９５７ｂｐのコード領域（８５個のコドンに対応する）の９４ｂｐをコドン最適化し、翻訳開始部位を修正した。したがって本発明は、添付の配列表で報告するような合成コドン最適化遺伝子の完全な配列、これらの完全な配列の相補的配列、およびこれらの配列のかなりの部分を含んでなる。
【０１０７】
当業者は、ここで述べる最適化方法がその他の遺伝子（例えばω−３／ω−６脂肪酸生合成経路中の遺伝子）に等しく適用でき、Ｓ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ、およびＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼ、およびＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）鎖長延長酵素の調節が、単に例示的であることを理解するであろう。
【０１０８】
遺伝子変異を通じたコドン最適化遺伝子の最適化
コドン最適化は、油性酵母菌における機能のためのより望ましい物理的および動力学的パラメーターがあるデサチュラーゼまたは鎖長延長酵素活性をそれぞれ有する、ポリペプチドを生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で生産する有用な手段であるが、宿主細胞におけるポリペプチドの活性をさらに増強する追加的手段が利用できる。具体的には配列を合成する方法および配列を一緒にする方法は、文献においてよく確立している。例えば生体外（ｉｎ
ｖｉｔｒｏ）変異誘発および選択、部位特異的変異誘発、誤りがちなＰＣＲ（メルニコフ（Ｍｅｌｎｉｋｏｖ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２７（４）：１０５６〜１０６２（１９９９年２月１５日））、「遺伝子シャフリング」またはその他の手段を用いて、自然発生的またはコドン最適化デサチュラーゼまたは鎖長延長酵素遺伝子の変異を得ることができる。これによって例えば生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で所望のＰＵＦＡの半減期がより長く、または生産速度がより早い、デサチュラーゼまたは鎖長延長酵素ポリペプチドそれぞれの生産が可能になる。
【０１０９】
必要に応じて、酵素活性に重要なコドン最適化デサチュラーゼまたは鎖長延長酵素ポリペプチドの領域は、ルーチンの変異誘発、得られる変異体ポリペプチドの発現、およびそれらの活性の判定を通じて判定できる。変異体は、欠失、挿入、および点変異、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。典型的な機能分析は、欠失変異誘発に始まって機能に必要なタンパク質のＮ−およびＣ−末端限界を判定し、次に内部欠損、挿入または点変異体を作り出し、機能に必要な領域をさらに判定する。カセット変異誘発または完全合成などのその他の技術もまた使用できる。欠失変異誘発は例えば、エキソヌクレアーゼを使用して、５’または３’コード領域を逐次除去して達成される。このような技術のためのキットが利用できる。欠失後、開始または停止コドンを含有するオリゴヌクレオチドをそれぞれ５’または３’欠失後に、欠失コード領域にライゲーションして、コード領域が完成する。代案としては、部位特異的変異誘発、変異原性ＰＣＲをはじめとする多様な方法によって、または既存の制限部位において消化されたＤＮＡ上へのライゲーションによって、開始または停止コドンをコードするオリゴヌクレオチドをコード領域に挿入する。内部欠損は、部位特異的変異誘発または変異原性ＰＣＲを通じた変異原性プライマーの使用によって、ＤＮＡ中の既存の制限部位の使用をはじめとする多様な方法を通じて同様に作り出せる。挿入は、リンカー−スキャニング変異誘発、部位特異的変異誘発または変異原性ＰＣＲなどの方法を通じて作り出される。点変異は、部位特異的変異誘発または変異原性ＰＣＲなどの技術を通じて作り出される。
【０１１０】
化学変異誘発もまた、活性に重要なデサチュラーゼまたは鎖長延長酵素ポリペプチドの領域を同定するために使用できる。変異したコンストラクトが発現し、得られる改変タンパク質がデサチュラーゼまたは鎖長延長酵素として機能する能力がアッセイされる。このような構造−機能分析は、どの領域が欠失してもよいか、どの領域が挿入を許容するか、
どの点変異によって変異体タンパク質が、未変性（またはコドン最適化）デサチュラーゼまたは未変性鎖長延長酵素と実質的に同じように機能できるようにするかを判定できる。
【０１１１】
ω−３および／またはω−６脂肪酸の微生物による生産
微生物によるω−３および／またはω−６脂肪酸の生産には、魚または植物などの天然供給源からの精製に比べて、例えば以下のようないくつかの利点がある。
１．）多くの微生物は、油組成が高等生物のものと比べてはるかに単純であることが知られており、所望の構成要素の精製を容易にする。
２．）微生物による生産には、天候および食物供給などの外部変数によって引き起こされるばらつきがない。
３．）微生物的に生産された油は、実質的に環境汚染物質による混入物がない。
４．）微生物は特定用途を有するかもしれない特定の形態で、ＰＵＦＡを提供できる。
５．）微生物による油生産は、培養条件を制御することで、特に微生物的に発現される酵素のために特定の基質を提供することで、または化合物の添加または遺伝子工学アプローチによって望まれない生化学的経路を抑制することで操作できる。
【０１１２】
これらの利点に加えて、組換え微生物からのω−３および／またはω−６脂肪酸の生産は、宿主中に新しい生合成経路を提供することで、または望まれない経路を抑制することで、所望のＰＵＦＡまたはそれらのコンジュゲートされた形態のレベルを増大させて、望まれないＰＵＦＡのレベルを低下させ、自然発生的な微生物の脂肪酸プロフィールを変更する能力を提供する。例えばこのようにして生産したω−３とω−６脂肪酸の比率を修正する、他のω脂肪酸生産を排除しながらω−３またはω−６脂肪酸のどちらか一方だけを生産する、または他のＰＵＦＡの下流または上流生産物の顕著な蓄積なしに特異的ＰＵＦＡの生産を操作することが可能である。
【０１１３】
発現システム、カセット、およびベクター
ここで述べるコドン最適化遺伝子および関心のある配列の遺伝子生産物は、異種性微生物の宿主細胞、特に油性酵母菌（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））の細胞中で生産されてもよい。組換え微生物宿主における発現は、様々なＰＵＦＡ経路中間体を生産するため、またはこれまで宿主を使用してできなかった新しい生産物を合成するため、宿主に既存のＰＵＦＡ経路を調節するのに有用かもしれない。
【０１１４】
微生物の発現システム、および外来タンパク質の高レベル発現を導く調節配列を含有する発現ベクターは、当業者によく知られている。これらのいずれも本コドン最適化配列のあらゆる遺伝子生産物を生産するためのキメラ遺伝子を構築するのに使用できる。次に形質転換を通じてこれらのキメラ遺伝子を適切な微生物に導入して、コードされた酵素の高レベル発現を提供できる。
【０１１５】
したがって適切なプロモーター制御下における、ＰＵＦＡ生合成経路（例えばここで述べるコドン最適化Δ６デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、および鎖長延長酵素）をコードするキメラ遺伝子の導入は、ω−３および／またはω−６脂肪酸の増大する生産をもたらすことが予期される。本コドン最適化遺伝子の様々な組み合わせを宿主微生物中で一緒に発現することが有用であることが考察される。
【０１１６】
さらにベクターがまた、ここで述べるコドン最適化遺伝子の１つもしくはそれ以上に加えて、その他の酵素をコードする１つもしくはそれ以上の遺伝子を含んでなってもよいことが考察される。例えばΔ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、および／または鎖長延長酵素の１つもしくはそれ以上の酵素活性をコードする遺
伝子（それによってこれらのあらゆる遺伝子が、場合により特定の宿主生物体での増強された発現のためにコドン最適化される）を含んでなる発現カセットを構築することが望ましいかもしれない。当業者にはよく知られているように、特定の発現カセット内に含まれる特定の遺伝子は、宿主細胞（おそびそのＰＵＦＡプロフィールおよび／またはデサチュラーゼプロフィール）、基質の入手可能性、および所望の最終生産物に左右される。
【０１１７】
したがって本発明は、基質が所望の脂肪酸生産物に変換するように、脂肪酸基質をここで述べるＰＵＦＡ酵素に暴露することを含んでなる、ＰＵＦＡを生産する方法を包含する。したがってここで述べる各ＰＵＦＡ遺伝子および対応する酵素生産物は、ＰＵＦＡの生産のために直接にまたは間接に使用できる。ＰＵＦＡの直接的生産は、脂肪酸基質が中間ステップまたは経路中間体なしに直接に所望の脂肪酸生産物に変換する場合に起きる。例えばＥＰＡの生産は、Δ１７デサチュラーゼ活性を提供する発現カセットを細胞に添加または導入することで、ＡＲＡを生産する宿主細胞、またはＡＲＡが提供される宿主細胞中で起きる。
【０１１８】
対照的にＰＵＦＡ生合成経路をコードする複数遺伝子を一連の反応が起きて所望のＰＵＦＡを生産するように組み合わせて使用してもよい。例えば鎖長延長酵素、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、およびΔ４デサチュラーゼ活性（そこでは各遺伝子が場合により宿主における発現のためにコドン最適化される）をコードする発現カセットは、自然にＧＬＡを生産する宿主細胞が、代わりにＤＨＡを生産できるようにする（ＧＬＡが鎖長延長酵素によってＤＧＬＡに変換し、次にＤＧＬＡはΔ５デサチュラーゼによってＡＲＡに変換し、次にＡＲＡはΔ１７デサチュラーゼによってＥＰＡに変換し、それは次には鎖長延長酵素によってＤＰＡに変換してもよく、ＤＰＡはΔ４デサチュラーゼによってＤＨＡに変換する）。宿主細胞が油性酵母菌である好ましい実施態様では、これらの生物体において自然に生産されるＰＵＦＡは１８：２脂肪酸（すなわちＬＡ）、もっとまれには１８：３脂肪酸（すなわちＡＬＡ）に限られるので、ＰＵＦＡ生合成に必要な各酵素をコードする発現カセットを生物体に導入しなくてはならない。代案としては基質供給が必要かもしれない。
【０１１９】
適切な宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはＤＮＡカセットは、技術分野でよく知られている。コンストラクト中に存在する配列の特定の選択は、所望の発現生産物（上述）、宿主細胞の性質、および提案される形質転換細胞と非形質転換細胞とを分離する手段に左右される。しかし典型的に、ベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を導く配列、選択性マーカー、および自律性複製または染色体組み込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始を制御する遺伝子の５’領域、および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域を含んでなる。双方の制御領域が、形質転換された宿主細胞の遺伝子に由来することが最も好ましいが、このような制御領域は、必ずしも生産宿主として選択された特定種に天然の遺伝子に由来しなくてよいものと理解される。
【０１２０】
所望の宿主細胞中で、デサチュラーゼおよび／または鎖長延長酵素ＯＲＦの発現を推進するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは多数あり、当業者にはなじみが深い。選択された宿主細胞中でのこれらの遺伝子の発現を導くことができる、実質的にあらゆるプロモーターが本発明に適する。宿主細胞中での発現は、一過性または安定様式で達成できる。一過性発現は、関心のある遺伝子に作動可能に連結された、調節可能プロモーターの活性を誘導することで達成できる。安定発現は、関心のある遺伝子に作動可能に連結された構成プロモーターの使用によって達成できる。一例として宿主細胞が酵母菌の場合、酵母菌細胞中で機能する転写および翻訳領域が、特に宿主種から提供される。転写開始調節領域は、例えば、以下から得ることができる。１．）アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（米国特許出願第６０／４８２２６３号明細書参照）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（米国特許出願第６０／４８２２６３号明細
書参照）、フルクトース−ビスリン染色体外因子アルドラーゼ（米国特許出願第６０／５１９９７１号明細書参照）、ホスホグルコース−異性化酵素、ホスホグリセラートキナーゼなどの解糖経路中の遺伝子、または２．）酸ホスファターゼ、ラクターゼ、メタロチオネイン、グルコアミラーゼ、翻訳延長因子ＥＦ１−α（ＴＥＦ）タンパク質（米国特許第６，２６５，１８５号明細書）、リボソームタンパク質Ｓ７（米国特許第６，２６５，１８５号明細書）などの調節可能遺伝子。構成または誘導転写が所望されるかどうか、関心のあるＯＲＦを発現する上でのプロモーター効率、構築の容易さなど次第で、いくつかの調節配列のいずれの１つでも使用できる。
【０１２１】
酵母菌での最適遺伝子発現は、それらが効率的な酵母菌翻訳開始列を含むように、外来性遺伝子の翻訳開始コドン「ＡＴＧ」を取り囲むヌクレオチド配列を修正することで得ることができる。具体的には非効率的に発現する遺伝子の発現は部位特異的変異誘発によって増大でき、そこでは非効率的に発現する遺伝子が、好ましくは高度に発現する遺伝子である内因性酵母菌遺伝子にインフレーム融合する。代案としてはここでの発明でヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において実証されるように、宿主におけるコンセンサス翻訳開始配列を判定して、関心のある宿主でのそれらの最適発現のために、この配列を異種性遺伝子内に遺伝子操作できる。
【０１２２】
終結領域は、遺伝子の３’領域から誘導されることができ、開始領域はそれから、または異なる遺伝子から得られた。多数の終結領域が知られており、多様な宿主において満足に機能する（それらが由来する同一のおよび異なる、属および種の双方で使用した際に）。終結領域は、通常、特定の特性のためと言うよりも、便宜上で選択される。好ましくは、終結領域は、特にサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）またはクリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）である酵母菌遺伝子から誘導される。γ−インターフェロンおよびα−２インターフェロンをコードする哺乳類の遺伝子の３’−領域もまた、酵母菌中で機能することが知られている。終結制御領域もまた、好ましい宿主に天然の様々な遺伝子から誘導されてもよい。場合により終結部位は不必要かもしれないが、含まれることが最も好ましい。
【０１２３】
当業者は気づいているように、遺伝子をクローン化ベクターに単に挿入するだけでは、それが必要なレベルで成功裏に発現することを確証しない。高発現率の必要性に答えて、転写、翻訳、タンパク質安定性、酸素限界、および宿主細胞からの分泌の側面を制御するいくつかの異なる遺伝的要素を操作することで、多くの特殊化した発現ベクターが作り出されている。より具体的には、遺伝子発現を制御するように操作される分子の特徴のいくつかとして以下が挙げられる。１．）関連転写プロモーターおよびターミネーター配列の性質、２．）クローンされた遺伝子のコピー数、および遺伝子がプラスミド上にあるかまたは宿主細胞のゲノム中に組み込まれているかどうか、３．）合成された外来タンパク質の最終細胞内位置、４．）宿主生物体中の翻訳効率、および５．）宿主細胞内のクローン化遺伝子タンパク質の本質的な安定性。これらの各タイプの修正は、コドン最適化ＰＵＦＡ生合成経路酵素の発現をさらに最適化する手段として、本発明中に包含される。
【０１２４】
微生物宿主の形質転換
油性酵母菌中での発現に適したコドン最適化デサチュラーゼまたは鎖長延長酵素ポリペプチドをコードするＤＮＡがひとたび得られると、それは宿主細胞中で自律複製できるプラスミドベクター中に入れられ、またはそれは宿主細胞のゲノム中に直接組み込まれる。発現カセットの組み込みは、宿主ゲノム内で無作為に起きることができ、または宿主遺伝子座内で遺伝子組み換えを標的とするのに十分な宿主ゲノムとの相同性領域を含有するコンストラクトの使用を通じて、標的を定めることができる。コンストラクトが内因性遺伝子座に標的を定めると、全てまたはいくつかの転写および翻訳調節領域が、内因性遺伝子
座によって提供できる。
【０１２５】
別々の複製ベクターから２つ以上の遺伝子が発現する場合、各ベクターが異なる選択手段を有することが望ましく、他のコンストラクトに対する相同性を欠いて、安定した発現を維持し、コンストラクト中における要素の再集合を防止すべきである。調節領域、選択手段、および導入コンストラクト増殖方法の思慮深い選択は、全ての導入された遺伝子が必要なレベルで発現して、所望の生産物の合成を提供するように実験的に判定できる。
【０１２６】
関心のある遺伝子を含んでなるコンストラクトは、あらゆる標準的技術によって宿主細胞に導入してもよい。これらの技術としては、形質転換（例えば酢酸リチウム形質転換［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９４：１８６〜１８７（１９９１）］）、プロトプラスト融合、弾道衝撃（ｂｏｌｉｓｔｉｃ  ｉｍｐａｃｔ）、電気穿孔、マイクロインジェクション、または宿主細胞中に関心のある遺伝子を導入するその他のあらゆる方法が挙げられる。油性酵母菌（すなわち、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））に適用できるより具体的な教示としては、米国特許第４，８８０，７４１号明細書および米国特許第５，０７１，７６４号明細書、およびチェン（Ｃｈｅｎ）Ｄ．Ｃ．ら（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８（２）：２３２〜２３５（１９９７））が挙げられる。
【０１２７】
便宜上、ＤＮＡ配列（例えば発現カセット）を取り込むように、あらゆる方法によって操作されている宿主細胞を「形質転換された」または「組換え」とここで称する。形質転換された宿主は、遺伝子がゲノム中に組み込まれるか、増幅されるか、または複数のコピー数を有する染色体外因子上に存在するかどうか次第で、発現コンストラクトの少なくとも１つのコピーを有し、２つ以上を有してもよい。形質転換された宿主細胞は、導入されたコンストラクト上に含有されるマーカーの選択によって同定できる。多くの形質転換技術は、多くのＤＮＡ分子を宿主細胞中に導入するので、代案としては、別々のマーカーコンストラクトを所望のコンストラクトと共に同時形質転換してもよい。典型的に、形質転換された宿主は、選択的培地上で生育するそれらの能力について選択される。選択培地には抗生物質が組み込まれていてもよく、または栄養素または成長因子などの非形質転換宿主の生育に必要な要素が欠如していてもよい。導入されたマーカー遺伝子は、形質転換された宿主中で発現すると、抗生物質抵抗性を与え、または必須成長因子または酵素をコードしてもよく、それによって選択培地上での生育を可能にしてもよい。また発現したマーカータンパク質が直接または間接に検出できる場合に、形質転換された宿主の選択ができる。マーカータンパク質は単独で、または別のタンパク質と融合して発現してもよい。マーカータンパク質は、次によって検出できる。１．）その酵素活性（例えばβ−ガラクトシダーゼは、基質Ｘ−ｇａｌ［５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド］を着色生産物に変換でき、ルシフェラーゼはルシフェリンを発光生産物に変換できる）、または２．）その光生産または修正特性（例えばオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）の緑色蛍光タンパク質は青色光で照明されると蛍光を発する）。代案としては、抗体を使用して、マーカータンパク質、または例えば関心のあるタンパク質の上の分子タグを検出できる。マーカータンパク質またはタグを発現する細胞は、例えば視覚的に、またはＦＡＣＳ、または抗体を使用したパニングなどの技術によって選択できる。酵母菌形質転換体の選択のためには、酵母菌で機能するあらゆるマーカーを使用してもよい。望ましくは、重要であるカナマイシン、ハイグロマイシン、およびアミノグリコシドＧ４１８に対する抵抗性、ならびにウラシルまたはロイシン欠乏培地上で生育する能力である。
【０１２８】
形質転換に続いて、本コドン最適化配列の遺伝子産物（そして場合により、宿主細胞内で発現するその他のＰＵＦＡ酵素）に適した基質が、宿主によって自然にまたは遺伝子組換え的に生産されてもよく、またはそれらは外来性に提供されてもよい。
【０１２９】
微生物中でのω−３および／またはω−６脂肪酸生合成の代謝エンジニアリング
本遺伝子のコドン最適化配列の知識、および油性酵母菌における発現のためにその他のＰＵＦＡ遺伝子を最適化するのに必要な方法は、油性酵母菌、特にヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるω−３および／またはω−６脂肪酸生合成を操作するために有用であろう。これは直接ＰＵＦＡ生合成経路内での代謝エンジニアリング、または炭素をＰＵＦＡ生合成経路に与える経路の追加的操作を必要とするかもしれない。生化学的経路を操作するのに有用な方法は、当業者にはよく知られている。
【０１３０】
望ましい生合成経路を上方制御する技術
デサチュラーゼおよび鎖長延長酵素遺伝子の追加的コピーを宿主に導入して、ω−３および／またはω−６脂肪酸生合成経路の産出量を増大させてもよい。デサチュラーゼまたは鎖長延長酵素遺伝子の発現はまた、ｍＲＮＡまたはコードされたタンパク質のいずれかから不安定化配列を除去／消去することで、または安定化配列をｍＲＮＡ（米国特許第４，９１０，１４１号明細書）に追加することで、（制御されたまたは構成的な）より強力なプロモーターの使用を通じて増大する発現を引き起こして、転写レベルで増大できる。本発明で実証されるように、デサチュラーゼまたは鎖長延長酵素遺伝子の発現を増大させるさらに別のアプローチは、選択された宿主微生物中での最適遺伝子発現のためのコドンで、未変性遺伝子中のコドンを置換することにより、コードされたｍＲＮＡの翻訳効率を増大させることである。
【０１３１】
望ましくない生合成経路を下方制御する技術
反対に、エネルギーまたは炭素についてω−３および／またはω−６脂肪酸生合成経路と競合する生化学的経路、または特定のＰＵＦＡ最終生産物の生産を妨げる未変性ＰＵＦＡ生合成経路酵素を遺伝子混乱によって除去またはその他の手段（例えばアンチセンスｍＲＮＡ）によって下方制御してもよい。遺伝子混乱では、そのコード配列を妨害し、それによって遺伝子を機能的に不活性化するために、混乱させたい構造的遺伝子中に外来ＤＮＡ断片（典型的に選択可能マーカー遺伝子）を挿入し、混乱させる。混乱カセットの宿主細胞中への形質転換は、相同的組み換えによって、機能的未変性遺伝子の非機能的混乱遺伝子による置換をもたらす（例えばハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：４６１７〜４６２２（１９８９）；バルバス（Ｂａｌｂａｓ）ら、Ｇｅｎｅｓ、１３６：２１１〜２１３（１９９３）；ゲルデナー（Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２４：２５１９〜２５２４（１９９６）；およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２７０〜２７７（１９９６）参照）。
【０１３２】
アンチセンス技術は、標的遺伝子配列が知られている場合に遺伝子を下方制御する別の方法である。これを達成するために、所望の遺伝子からの核酸セグメントをクローン化して、ＲＮＡのアンチセンス鎖が転写されるようにプロモーターに作動可能に連結する。次にこのコンストラクトを宿主細胞に導入し、ＲＮＡのアンチセンス鎖を生産する。アンチセンスＲＮＡは、関心のあるタンパク質をコードするｍＲＮＡの蓄積を防止することで、遺伝子発現を阻害する。当業者は、特定の遺伝子の発現を低下させるために、特別な考察がアンチセンス技術の使用に関連することを理解する。例えば、アンチセンス遺伝子の適切な発現レベルは、当業者には知られている異なる調節因子を使用した、異なるキメラ遺伝子の使用を必要とするかもしれない。
【０１３３】
配列が知られている場合、標的を定めた遺伝子混乱およびアンチセンス技術が遺伝子を下方制御する効果的手段を提供するが、配列ベースではないその他のより特異性が低い方法が開発されている。例えば細胞をＵＶ放射線暴露して、次に所望の表現型についてスク
リーンしてもよい。変異体を作り出すために、化学薬品による変異誘発もまた効果的であり、一般に使用される物質としては、非複製ＤＮＡに影響する化学物質（例えばＨＮＯ２およびＮＨ２ＯＨ）、ならびに複製ＤＮＡに影響する薬剤（例えばフレームシフト変異を引き起こすことで注目に値するアクリジン染料）が挙げられる。放射線または化学薬品を使用して変異体を作り出す特定の方法は、技術分野でよく文書化されている。例えばトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）著「バイオテクノロジー：工業微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」第二版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ）、またはデシュパンデ，ムカンド（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ）Ｖ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６：２２７（１９９２）を参照されたい。
【０１３４】
別の非特異的遺伝子混乱方法は、転移因子またはトランスポゾンの使用である。トランスポゾンは、ＤＮＡに無作為に挿入される遺伝的因子であるが、後で配列に基づいて検索して、挿入がどこで起きたのか判定できる。生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）および生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）転位法の双方が知られている。どちらの方法にもトランスポザーゼ酵素と組み合わされた転移因子の使用が関与する。転移因子またはトランスポゾンがトランスポザーゼ存在下で核酸断片に接触すると、転移因子が核酸断片中に無作為に挿入される。混乱された遺伝子は転移因子配列に基づいて同定されてもよいので、技術は、ランダム変異誘発のため、そして遺伝子単離のために有用である。生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）転位のためのキットは市販される。例えば１．）ニュージャージー州ブランチバーグのパーキン・エルマー・アプライド・バイオシステムズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＮＪ））から入手できる酵母菌Ｔｙ１因子に基づく、プライマー・アイランド転位キット、２．）マサチューセッツ州ビバリーのニュー・イングランド・バイオ・ラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ））から入手できる細菌性トランスポゾンＴｎ７に基づくゲノム・プライミング・システム、および３．）ウィスコンシン州マディソンのエピセンター・テクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））から入手できる、Ｔｎ５細菌性転移因子に基づくＥＺ：：ＴＮトランスポゾン挿入システムを参照されたい。
【０１３５】
本発明の文脈では、上述のいずれか１つの方法によって脂肪酸生合成経路の発現を調節することが有用であるかもしれない。例えば本発明は、ω−３および／またはω−６脂肪酸の生産をもたらす生合成経路中の重要な酵素をコードするコドン最適化遺伝子を提供する。これらのコドン最適化遺伝子には、Δ６デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、およびＰＵＦＡ鎖長延長酵素が含まれる。ω−３および／またはω−６脂肪酸生合成経路を自然に有さない油性酵母菌中でこれらの遺伝子を発現させ、これらおよびその他のＰＵＦＡ生合成遺伝子の遺伝子の発現を調節して、宿主生物体の代謝工学のための様々な手段を使用して好ましいＰＵＦＡ生産物の生産を最大化することが特に有用であろう。同様にこれらの遺伝子によってＰＵＦＡ生産を最大化するためには、ＰＵＦＡ生合成に向けて導かれる炭素の流れと競合する経路を混乱させることが必要かもしれない。
【０１３６】
コドン最適化遺伝子の組換え発現のための好ましい微生物宿主
本コドン最適化遺伝子および核酸断片の発現のための宿主細胞は、広範な温度およびｐＨで、単純または複合炭水化物、有機酸およびアルコール、および／または炭化水素をはじめとする多様な原材料上で生育する微生物の宿主を含んでもよい。本発明で述べられる遺伝子は、油性酵母菌、特にヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化されているが、転写、翻訳、およびタンパク質生合成器官は高度に保存されているので、あらゆる細菌、酵母菌および／または糸
状菌が、本核酸断片の発現に適した宿主になることが考察される。
【０１３７】
好ましい微生物の宿主は、油性酵母菌である。これらの生物体は自然に油の合成および蓄積ができ、油は、細胞乾燥重量の約２５％を超え、より好ましくは細胞乾燥重量の約３０％を超え、最も好ましくは細胞乾燥重量の約４０％を超える量を構成できる。油性酵母菌として典型的に同定されている属としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。より具体的には、例証的な油合成酵母菌としては、ロドスポリジウム・トルイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェラス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プルケリマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルティナス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）として分類された）が挙げられる。
【０１３８】
最も好ましいのは油性酵母菌ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であり、さらなる実施態様で最も好ましいのは、ＡＴＣＣ番号２０３６２、ＡＴＣＣ番号８８６２、ＡＴＣＣ番号１８９４４、ＡＴＣＣ番号７６９８２および／またはＬＧＡＭＳ（７）１と称されるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株である（パパニコラオウ（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ）Ｓ．、およびアゲリス（Ａｇｇｅｌｉｓ）Ｇ．、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８２（１）：４３〜９（２００２））。
【０１３９】
ＰＵＦＡ生産のための発酵プロセス
形質転換された微生物宿主細胞をデサチュラーゼおよび鎖長延長酵素活性を最適化させる条件下で生育させ、好ましいＰＵＦＡの最大かつ最も経済的な収率を得る。一般に最適化されてもよい培地条件としては、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素−対−窒素比率、酸素レベル、生育温度、ｐＨ、バイオマス生産相の長さ、油蓄積相の長さ、および細胞収穫時間が挙げられる。油性酵母菌などの関心のある微生物を複合培地（例えば酵母菌抽出物−ペプトン−デキストロース液体培地（ＹＰＤ））上で生育させ、または生育に必要な構成要素が欠如する合成（ｄｅｆｉｎｅｄ）最少培地（例えばミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ））からの酵母菌窒素塩基）上で生育させて、所望の発現カセットの選択を強要する。
【０１４０】
本発明における発酵培地は、適切な炭素源を含有しなくてはならない。適切な炭素源としては、単糖類（例えばグルコース、フルクトース）、二糖類（例えばラクトース、スクロース）、少糖類、多糖類（例えばデンプン、セルロースまたはそれらの混合物）、糖アルコール（例えばグリセロール）または再生可能原材料からの混合物（例えば乳清透過液、コーンスティープリーカー、甜菜モラセス、大麦の麦芽）が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに炭素源としては、アルカン、脂肪酸、脂肪酸エステル、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、および植物油（例えばダイズ油）および動物脂肪をはじめとする脂肪酸の様々な商業的供給源が挙げられる。さらに炭素源としては、重要な生化学的中間体への代謝転換が実証されている一炭素源（例えば二酸
化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸および炭素−含有アミン）が挙げられる。したがって本発明で使用される炭素源は多種多様な炭素含有源を包含し、および宿主生物体の選択によってのみ制限されることが考察された。上述の全ての炭素源およびそれらの混合物が本発明で適切であることが期待されるが、好ましい炭素源は糖および／または脂肪酸である。最も好ましいのは、１０〜２２個の炭素含有グルコースおよび／または脂肪酸である。
【０１４１】
窒素は、無機（例えば（ＮＨ４）２ＳＯ４）または有機源（例えば尿素またはグルタミン酸）から供給されてもよい。適切な炭素および窒素源に加えて、発酵培地はまた、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、ビタミン、および当業者には知られている微生物の生育とＰＵＦＡ生産に必要な酵素的経路の促進に適したその他の構成要素を含有しなくてはならない。脂質およびＰＵＦＡの合成を促進するいくつかの金属イオン（例えばＭｎ＋２、Ｃｏ＋２、Ｚｎ＋２、Ｍｇ＋２）が注目されている（ナカハラ（Ｎａｋａｈａｒａ）Ｔ．ら、「単細胞油の工業的応用（Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｏｉｌｓ）」、Ｄ．Ｊ．カイル（Ｋｙｌｅ）およびＲ．コリン（Ｃｏｌｉｎ）編、ｐ６１〜９７（１９９２））。
【０１４２】
本発明における好ましい増殖培地は、ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ））からの酵母菌窒素塩基などの一般的な商業的調製培地である。またその他の合成（ｄｅｆｉｎｅｄ）または合成（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）増殖培地が使用されてもよく、特定の微生物の生育に適した培地は、微生物学または発酵科学の当業者に知られている。発酵に適したｐＨ範囲は、典型的に約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０の間であり、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．０が最初の生育条件の範囲として好ましい。発酵は好気性または好気性条件下で実施されてもよく、マイクロ好気性条件が好ましい。
【０１４３】
典型的に、油性酵母菌細胞におけるＰＵＦＡの高レベルの蓄積は、代謝状態が生育と脂肪合成／貯蔵間で「バランスが取れて」いなくてはならないので、二段階プロセスを必要とする。したがって最も好ましくは、油性酵母菌におけるＰＵＦＡ生産には、二段階発酵プロセスが必要である。このアプローチでは、第１の発酵状態が細胞集団の生産および蓄積に供され、迅速な細胞生育および細胞分割によって特徴づけられる。発酵の第２段階では、培養内の窒素欠乏条件を確立して、高レベルの脂質蓄積を促進することが好ましい。この窒素欠乏の効果は、細胞内のＡＭＰの効果的濃度を低下させることにより、ミトコンドリアのＮＡＤ−依存イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させることである。これが起きるとクエン酸が蓄積するので、細胞質中にアセチル−ＣｏＡの豊富なプールが形成し、脂肪酸合成の下準備をする。したがってこの相は、細胞分割休止と、それに続く脂肪酸合成および油蓄積によって特徴づけられる。
【０１４４】
細胞は典型的に約３０℃で生育させるが、いくつかの研究は、より低い温度における不飽和脂肪酸の増大した合成を示している（ヨンマニットチャイ（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ）およびワード（Ｗａｒｄ）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：４１９〜２５（１９９１））。プロセスの経済に基づけば、この温度シフトは、大部分の生物体の生育が起きる二段階発酵の第１相後に起きるはずである。
【０１４５】
このコドン最適化遺伝子を使用したω脂肪酸の商業生産が所望される場合、多様な発酵プロセスデザインを適用してもよいことが考察される。例えば組換え微生物宿主からのＰＵＦＡの商業生産は、バッチ、供給バッチまたは連続発酵プロセスによって生産されてもよい。
【０１４６】
バッチ発酵プロセスは閉鎖システムであり、培地組成物がプロセス開始時に定められ、
プロセス中にｐＨおよび酸素レベル維持のために必要とされるもの以外は、さらなる追加を受けない。したがって培養プロセスの始めに所望の生物体を培地に接種し、培地への追加的供給源（すなわち炭素および窒素源）の添加なしに、生育または代謝活性を生じさせる。バッチプロセスでは、システムの代謝産物およびバイオマス組成物は、培養が終結するまで絶えず変化する。典型的なバッチプロセスでは、細胞は静止対数相から高生育対数相を通過して、最終的に発育速度が減少または停止する定常相に進む。処置されない場合、定常相の細胞は次第に死滅する。標準バッチプロセスのバリエーションが供給バッチプロセスであり、炭素源は発酵プロセス経過中に発酵槽に連続的に添加される。供給バッチプロセスもまた、本発明に適している。供給バッチプロセスは分解産物抑制が、細胞代謝を阻害する傾向がある場合に、またはあらゆる時点で培地中に限定量の源を有することが望ましい場合に有用である。供給バッチシステム中の炭素源濃度の測定は困難であるので、ｐＨ、溶解酸素、および排ガス（例えばＣＯ２）などの測定可能な要素の変化に基づいて推定してもよい。バッチおよび供給バッチ培養方法は一般的で技術分野でよく知られており、実例が以下にある。トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）Ｄ．ブロック（Ｂｒｏｃｋ）著、「バイオテクノロジー：工業的微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ
Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」第二版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ）（１９８９）、またはデシュパンデ，ムカンド（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ）Ｖ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６：２２７（１９９２）。これらは参照によってここに援用される。
【０１４７】
このコドン最適化遺伝子を使用したω脂肪酸の商業生産はまた、連続発酵プロセスによって達成されてもよく、そこでは生産物の回収のため等量の培養物を除去するのと同時に、合成培地をバイオリアクター内に連続的に添加する。連続培養は、概して細胞を一定細胞密度の対数増殖期に保つ。連続または半連続培養法は、細胞生育または最終生産物濃度に影響する１つの因子またはあらゆるいくつかの因子の調節を可能にする。例えば１つのアプローチでは炭素源を制限して、あらゆるその他のパラメータが代謝を調節できるようにしてもよい。その他のシステムでは、培地濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、生育に影響するいくつかの因子を連続的に変化させてもよい。連続システムは定常状態生育を維持することを目指すので、細胞生育率は、培養から培地が抜き取られることによる細胞損失に対してバランスが取れていなくてはならない。連続的培養プロセスのために栄養素および成長因子を調節する方法、ならびに生産物形成速度を最大化する技術は工業微生物学の技術分野でよく知られており、多様な方法が上記のブロック（Ｂｒｏｃｋ）で詳述される。
【０１４８】
ＰＵＦＡの精製
ＰＵＦＡは、遊離脂肪酸として、またはアシルグリセロール、リン脂質、スルホリピドまたは糖脂質などのエステル化形態で宿主微生物中に見ることができ、技術分野でよく知られている多様な手段を通じて宿主細胞から抽出されてもよい。酵母菌脂質の抽出技術、品質分析、および許容性基準に関する１つのレビューは、Ｚ．ジェーコブス（Ｊａｃｏｂｓ）（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２（５／６）：４６３〜４９１（１９９２））である。下流プロセスに関する簡潔なレビューは、Ａ．シン（Ｓｉｎｇｈ）およびＯ．ワード（Ｗａｒｄ）（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５：２７１〜３１２（１９９７））にもある。
【０１４９】
一般にＰＵＦＡ精製手段は、有機溶剤、超音波処理、超臨界流体抽出（例えば二酸化炭素を使用して）による抽出と、鹸化と、圧搾などの物理的手段またはそれらの組み合わせを含んでもよい。特に興味深いのは、水存在下でのメタノールおよびクロロホルムによる抽出である（Ｅ．Ｇ．ブライ（Ｂｌｉｇｈ）およびＷ．Ｊ．ダイヤー（Ｄｙｅｒ）、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：９１１〜９１７（１９５９））。望ま
しい場合、水性層を酸性化して負の電荷を帯びた部分をプロトン化することで、有機層中への所望の生産物の分配を増大できる。抽出後、有機溶剤は窒素流の下で蒸発によって除去できる。コンジュゲートされた形態で単離されると、生産物は酵素的にまたは化学的に切断されて、関心のある遊離脂肪酸またはより単純なコンジュゲートを放出してもよく、次にさらに操作されて所望の最終生産物を生産してもよい。望ましくはコンジュゲートされた形態の脂肪酸は、水酸化カリウムによって切断される。
【０１５０】
さらに精製が必要ならば、標準法を用いることができる。このような方法としては、抽出、尿素処理、分別結晶化、ＨＰＬＣ、分留、シリカゲルクロマトグラフィー、高速遠心分離または蒸留、またはこれらの技術の組み合わせが挙げられる。酸またはアルケニル基などの反応性基の保護は、既知の技術（例えばアルキル化、ヨウ素化）を通じて、あらゆるステップで実施してもよい。使用される方法としては、メチルエステルを生産するための脂肪酸のメチル化が挙げられる。同様に、保護基はあらゆるステップで除去されてもよい。望ましくはＧＬＡ、ＳＴＡ、ＡＲＡ、ＤＨＡ、およびＥＰＡを含有する画分の精製は、尿素および／または分留による処置によって達成されてもよい。
【０１５１】
好ましい実施態様の説明
ここで述べる研究の究極の目的は、ω−３および／またはω−６脂肪酸が濃縮された油を蓄積する油性酵母菌の開発である。このような目的で、油性酵母菌中において効率的に機能するω−３および／またはω−６脂肪酸生合成経路のデサチュラーゼおよび鎖長延長酵素を同定し、これらの宿主におけるω脂肪酸の合成および蓄積を可能にしなくてはならない。
【０１５２】
本発明では、出願人は、デサチュラーゼおよび鎖長延長酵素遺伝子のコドン最適化に適する技術を実証し、そこでは得られた合成コドン最適化遺伝子が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などの油性酵母菌において増大する変換効率で機能する。これらの方法は、ここでの教示において具現化され、具体的にはコドン最適化Δ６デサチュラーゼ（ＬＡをＧＬＡに、および／またはＡＬＡをＳＴＡに変換する酵素的能力を有する）、コドン最適化Δ１７デサチュラーゼ（ＤＧＬＡをＥＴＡに、および／またはＡＲＡをＥＰＡに変換する役割を果たす）、およびコドン最適化高親和力ＰＵＦＡ鎖長延長酵素（ＧＬＡをＤＧＬＡに、ＳＴＡをＥＴＡに、および／またはＥＰＡをＤＰＡに変換できる）の合成に標的を定める。当業者は、容易にここで述べる技術を適用して、ω−３および／またはω−６生合成脂肪酸経路中のその他の遺伝子を最適化させ、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中で発現すると増大する変換効率を有することが期待される合成遺伝子を作り出せるであろう。したがってここでの教示は、ω−３および／またはω−６脂肪酸が濃縮された油を蓄積する油性酵母菌の開発において大きな有用性を持つ。
【０１５３】
出願人は、モデル油性酵母菌、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるコドン最適化のために３つの例示的な野生型遺伝子を選択した。これらの各野生型遺伝子は、下の表３で述べるようにオハイオ州コロンバスのロス・プロダクツ（Ｒｏｓｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ））からのプラスミド中で得られた。
【０１５４】
【表４】
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【０１５５】
微生物宿主における各野生型酵素活性の確証（基質供給試験による）に続いて、各遺伝子をコドン最適化した（少なくとも９％の未変性コドンが、宿主の好むコドンを用いるように修正された）。
【０１５６】
Δ６デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、および高親和力ＰＵＦＡ鎖長延長酵素遺伝子のコドン最適化は、最初にヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるコドン使用および構造遺伝子のシグネチャの判定を必要とした。次にコドン最適化遺伝子をデザインし、遺伝子配列全長を合成する所要時間を実質的に短縮するプロトコルを使用して、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で合成した。このプロトコルは、ここで合成される特定の遺伝子に限定されないので、多様な一般用途に広く適用できる。生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）遺伝子合成に伴う基本的ステップは、以下からなった。
１．複数の対のオリゴヌクレオチド（各約１００ｂｐ長さ）を合成する。各オリゴヌクレオチド配列は、合成される遺伝子配列全長の一部に対応し、各センス鎖オリゴヌクレオチド配列は、配列の５’末端で対応するアンチセンス−鎖オリゴヌクレオチドと約４ｂｐの重なりを有する。
２．全オリゴヌクレオチドの５’および３’末端をキナーゼ反応でリン酸化し、次にセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド対に個々のアニール反応を施して、短い（約１００ｂｐ）二本鎖ＤＮＡ断片を生産する。
３．次にオリゴヌクレオチド合成時にデザインされた約４ｂｐの重なりを使用して、短い（約１００ｂｐ）二本鎖ＤＮＡ断片のプールを一緒にライゲーションし、より長い（約３００〜４００ｂｐ）ＤＮＡ断片を生産する。
４．ライゲーションに続いて、より長い断片をＰＣＲによって増幅し、その生産物を適切なベクター中にクローン化し、宿主細胞中に形質転換する。
５．各ＰＣＲ生産物を含有するプラスミドＤＮＡを宿主細胞から精製し、次に合成する遺伝子の各約３００〜４００ｂｐの断片に対応するＰＣＲ生産物単離のための制限酵素消化を施す。
６．合成する約３００〜４００ｂｐの遺伝子断片を一緒にライゲーションし、次にＰＣＲ増幅を施して合成配列全長を生産する。
【０１５７】
コドン最適化Δ６デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、および高親和力ＰＵＦＡ鎖長延長酵素遺伝子が合成されると、それぞれ個々にヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中に形質転換した。供給実験（適切な基質を使用した）は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）においてコドン最適化遺伝子が、対応する未変性野生型遺伝子よりも効率的に発現すると判定した。具体的にはＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において発現すると、同一生物学的条件下で、コド
ン最適化Δ６デサチュラーゼは野生型対応酵素よりもおよそ４０％多くのＬＡをＧＬＡに変換し、コドン最適化Δ１７デサチュラーゼは野生型酵素の約２倍のＡＲＡをＥＰＡにを変換し、コドン最適化高親和力ＰＵＦＡ鎖長延長酵素はおよそ５７％より多くのＧＬＡをＤＧＬＡに変換した。
【実施例】
【０１５８】
以下の実施例で本発明をさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示しながら、例証のみの目的で提供されるものとする。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の必須特性を把握でき、その精神と範囲を逸脱することなく、本発明の様々な変更および修正を行って、それを様々な使用法および条件に適合できる。
【０１５９】
一般方法
実施例で使用する標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、技術分野でよく知られており、１．）サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、コールドスプリングハーバーラボラトリ：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）（１９８９）（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））、２．）Ｔ．Ｊ．シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）およびＬ．Ｗ．エンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）、「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）」（コールドスプリングハーバーラボラトリ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８４）、および３．）オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）Ｆ．Ｍ．ら「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（グリーンパブリッシングおよびワイリーインターサイエンスによる出版；１９８７）で述べられる。
【０１６０】
微生物培養の維持および生育に適した材料および方法は、技術分野でよく知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術は、次で述べられる。「一般微生物学方法マニュアル（Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」、フィリップス・ゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレー（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスティロウ（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）、およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシントンＤ．Ｃ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）（１９９４）またはトーマス（Ｔｈｏｍａｓ）Ｄ．ブロック（Ｂｒｏｃｋ）著、バイオテクノロジー：工業的微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）第二版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ）（１９８９）。微生物細胞の生育および維持のために使用される全ての試薬、制限酵素および材料は、特に断りのない限り、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ））、ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ））、メリーランド州ゲーサーズバーグのギブコ／ＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ））、またはミズーリ州セントルイスのシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））から得た。
【０１６１】
カリフォルニア州カールスバッドのインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ））から大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エレクトロマックス（ｅｌｅｃｔｒｏｍａｘ）ＤＨ１０Ｂ細胞を得た。メリーランド州ゲイサーズバーグのギブコ／ＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ））から大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αの最大効率コンピテント細胞を得た。カリフォルニア州サンディエゴのストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））から大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）コンピテント細胞を購入した。大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）株は典型的にルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）プレート上で３７℃で生育させた。
【０１６２】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ロイシン独立栄養株（ＡＴＣＣ番号７６９８２）をメリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）の米国微生物系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入し、機能性アッセイで使用した。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は通常、ＹＰＤ寒天（１％酵母菌抽出物、２％バクトペプトン、２％グルコース、２％寒天）上で２８℃で生育させた。形質転換体の選択のために、ミシガン州デトロイトのジフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ））からの最少培地（硫酸アンモニウムまたはアミノ酸を含まない０．１７％酵母菌窒素ベース、２％グルコース、０．１％プロリン、ｐＨ６．１）を使用した。アデニン、ロイシン、リジン、および／またはウラシルサプリメントを最終濃度０．０１％で添加した。
【０１６３】
一般分子クローニングは、標準法に従って実施された（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、同上）。オリゴヌクレオチドはシグマ−ジェノシス（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ、テキサス州スプリング（Ｓｐｒｉｎｇ、ＴＸ））によって合成した。部位特異的変異誘発は、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のクイックチェンジ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ）ＴＭ部位特異的変異誘発キットを製造業者の説明書に従って使用して実施した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または部位特異的変異誘発がサブクローニングに関与する場合、コンストラクトは、配列中に確実にいかなる誤りも導入されないように配列された。ＰＣＲ生産物は、ウィスコンシン州マディソンのプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））からのｐＧＥＭ−Ｔ−イージーベクター中にクローン化した。
【０１６４】
ウィスコンシン州マディソンのジーンズ・コンピューター・グループ（ＧＣＧ）社（Ｇｅｎｅｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））から入手できる一組のプログラム、ウィスコンシン・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ９．０）を使用して、遺伝的配列の操作が達成された。ギャップ作成デフォルト値１２、およびギャップ延長デフォルト値４でＧＣＧプログラム「パイルアップ（Ｐｉｌｅｕｐ）」を使用した。デフォルトギャップ作成ペナルティ５０、およびデフォルトギャップ延長ペナルティ３で、ＧＣＧ「ギャップ（ギャップ）」または「ベストフィット（Ｂｅｓｔｆｉｔ）」プログラムを使用した。特に断りのない限り、全てのその他の場合において、ＧＣＧプログラムのデフォルトパラメータを使用した。
【０１６５】
略語の意味は以下の通り。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモル（ｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ）を意味し、「ｍＭ」はミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌａｒ）を意味し、「Ｍ」はモル（ｍｏｌａｒ）を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌｅ）を意味し、「μｍｏｌｅ」マイクロモル（ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ）を意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋＢ」はキロベースを意味する。
【０１６６】
実施例１
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の異種性遺伝子発現に適したプラスミドの構造
図２に図解するように、ｐＩＮＡ５３２誘導体であるプラスミドｐＹ５（Ｉｎｓｉｔｕｔ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｒｏｎｏｍｉｃｓ、Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ  Ａｇｒｏ−Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｌｌｅ、ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  ｄｅ  Ｇｅｎｅｔｉｑｕｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ  ｅｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒｉｅ  ＩＮＲＡ−ＣＮＲＳ、Ｆ−７８８５０、Ｔｈｉｖｅｒｖａｌ−Ｇｒｉｇｎｏｎ、Ｆｒａｎｃｅのクロード・ガィヤルダン（Ｃｌａｕｄｅ  Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ）博士からの贈与）をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における異種性遺伝子発現のために構築した。
【０１６７】
最初に、ｐＩＮＡ５３２のＡＲＳ１８配列およびＬＥＵ２遺伝子を含有する、部分的に消化された３５９８ｂｐのＥｃｏＲＩ断片をカリフォルニア州サンディエゴのストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））からのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＩ部位中にサブクローン化してｐＹ２を生産した。
【０１６８】
ＴＥＦ５’（配列番号７）およびＴＥＦ３’（配列番号８）をプライマーとして使用して、ＰＣＲによりヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムのＤＮＡからＴＥＦプロモーターを増幅した（ミュラー（Ｍｕｌｌｅｒ）Ｓ．ら「酵母菌（Ｙｅａｓｔ）」１４：１２６７〜１２８３（１９９８））。１００ｎｇのヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムＤＮＡと、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．７５）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（最終濃度）を含有するＰＣＲ緩衝液と、各２００ミュートμＭのデオキシリボヌクレオチド三リン酸と、１０ｐｍｏｌｅの各プライマーと、カリフォルニア州サンディエゴのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からの１μＬのＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼとを含有する、５０μＬの総容積でＰＣＲ増幅を実施した。増幅は以下のように実施した。９５℃で３ｍｉｎの初期変性、それに続いて９５℃で１ｍｉｎ、５６℃で３０ｓｅｃ、７２℃で１ｍｉｎを３５サイクル。７２℃で１０ｍｉｎの最終延長サイクル実施し、それに続いて４℃での反応終結。４１８ｂｐのＰＣＲ生産物をｐＣＲ−ＢｌｕｎｔにライゲーションしてｐＩＰ−ｔｅｆを生産した。ｐＩＰ−ｔｅｆのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ断片をｐＹ２のＢａｍＨＩ／ＳｍａＩ部位にサブクローン化して、ｐＹ４を生産した。
【０１６９】
テンプレートとしてｐＩＮＡ５３２、プライマーとしてＸＰＲ５’（配列番号９）およびＸＰＲ３’（配列番号１０）を使用して、ＰＣＲによってＸＰＲ２転写ターミネーターを増幅した。上述の構成要素および条件を使用して、ＰＣＲ増幅を５０μＬの総容積中で実施した。１７９ｂｐのＰＣＲ生産物をＳａｃＩＩで消化し、ｐＹ４のＳａｃＩＩ部位にライゲーションしてｐＹ５を生産した。したがってｐＹ５（図２および３に示す）は、以下を含有するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）−大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）シャトルプラスミドとして有用である。
１）ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）自律性複製配列（ＡＲＳ１８）、
２）ＣｏｌＥ１プラスミド複製起点、
３）大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の選択のためのアンピシリン−抵抗性遺伝子（ＡｍｐＲ）、
４）ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の選択のためのヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＬＥＵ２遺伝子、
５）ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における異種性遺伝子発現のための翻訳延長プロモーター（ＴＥＦＰ）、
６）ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における異種性遺伝子発現の転写終結のための細胞外プロテアーゼ遺伝子ターミネーター（ＸＰＲ２）。
【０１７０】
ｐＹ５−４およびｐＹ５−１３（図３）をｐＹ５の誘導体として構築して、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中のサブクローン化および異種性遺伝子発現を容易にした。
【０１７１】
具体的にはｐＹ５をテンプレートとして使用して、３ラウンドの部位特異的変異誘発によってｐＹ５−４を構築した。オリゴヌクレオチドＹＬ１およびＹＬ２（配列番号１１および１２）を使用して、ＬＥＵ２レポーター遺伝子内に位置するＮｃｏＩ部位をｐＹ５から除去し、ｐＹ５−１を生産した。オリゴヌクレオチドＹＬ３およびＹＬ４（配列番号１３および１４）を使用して、特異的変異誘発によって、ＮｃｏＩ部位をＴＥＦプロモーターとＸＰＲ２転写ターミネーター部位の間でｐＹ５−１内に導入し、ｐＹ５−２を生産した。次にオリゴヌクレオチドＹＬ２３およびＹＬ２４（配列番号１５および１６）を使用して、ＰａｃＩ部位をＴＥＦプロモーターとＸＰＲ２転写ターミネーターの間でＹ５−２に導入し、ｐＹ５−４を生産した。
【０１７２】
ｐＹ５をテンプレートとして使用して、６ラウンドの部位特異的変異誘発によってｐＹ５−１３構築した。オリゴヌクレオチドＹＬ５およびＹＬ６（配列番号１７および１８）を使用して、部位特異的変異誘発によって、ＳａｌＩおよびＣｌａＩ部位の双方をｐＹ５から除去して、ｐＹ５−５を生産した。オリゴヌクレオチドＹＬ９およびＹＬ１０（配列番号１９および２０）を使用して、部位特異的変異誘発によって、ＳａｌＩ部位をＬＥＵ２遺伝子とＴＥＦプロモーターの間でｐＹ５−５中に導入し、ｐＹ５−６を生産した。オリゴヌクレオチドＹＬ７およびＹＬ８（配列番号２１および２２）を使用して、ＰａｃＩ部位をＬＥＵ２遺伝子とＡＲＳ１８の間でｐＹ５−６中に導入し、ｐＹ５−８を生産した。オリゴヌクレオチドＹＬ３およびＹＬ４（配列番号１３および１４）を使用して、ＮｃｏＩ部位をＴＥＦプロモーターの翻訳開始コドン周囲のｐＹ５−８中に導入しｐＹ５−９を生産した。ＹＬ１およびＹＬ２オリゴヌクレオチド（配列番号１１および１２）を使用して、ｐＹ５−９のＬＥＵ２遺伝子中のＮｃｏＩ部位を除去し、ｐＹ５−１２を生産した。最後にオリゴヌクレオチドＹＬ６１およびＹＬ６２（配列番号２３および２４）を使用して、ＢｓｉＷＩ部位をＣｏｌＥＩとＸＰＲ２領域の間でｐＹ５−１２中に導入し、ｐＹ５−１３を生産した。
【０１７３】
実施例２
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における野生型Δ６およびΔ１７デサチュラーゼおよび高親和力ＰＵＦＡ鎖長延長酵素の変換効率分析
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における野生型Δ６デサチュラーゼ、鎖長延長酵素、およびΔ１７デサチュラーゼの機能性を（コドン最適化に先だって）確証するために、各野生型タンパク質の変換効率を測定した。具体的にはモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼ、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ、およびＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）高親和力ＰＵＦＡ鎖長延長酵素を別の宿主において発現させ、基質供給試験で活性についてスクリーニングした。各酵素は基質の少なくとも２３％を生産物に変換できることが分かった。
【０１７４】
野生型モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）（登録番号ＡＦ４６５２８１）Δ６デサチュラーゼ
Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼ遺伝子（配列番号１）を含有するｐＣＧＲ５（米国特許第５，９６８，８０９号明細書）の１３８４ｂｐのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片をｐＹ５−２（実施例１）のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位に挿入し、ｐＹ５４を生
産した。
【０１７５】
野生型サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）（ＡＴＣＣ番号５６８５１）Δ１７デサチュラーゼ
プライマーとしてオリゴヌクレオチドＹＬ２１Ａ（配列番号１１８）およびＹＬ２２（配列番号１１９）を使用して、ＰＣＲによって、プラスミドｐＲＳＰ１９（米国特許出願公開第２００３／０１９６２１７  Ａ１号明細書）からＳ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）の野生型Δ１７デサチュラーゼ遺伝子を増幅した。ＰＣＲ増幅は、１０ｎｇのテンプレート、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．７５）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、および１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（最終濃度）を含有するＰＣＲ緩衝液と、２００μＭの各デオキシリボヌクレオチド三リン酸と、１０ｐｍｏｌｅの各プライマーと、カリフォルニア州サンディエゴのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からの１μＬのＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼを含んでなる５０μＬの総容積で実施した。増幅を以下のようにして実施した。９５℃で３ｍｉｎの初期変性、それに続いて９５℃で１ｍｉｎ、５６℃で３０ｓｅｃ、７２℃で１ｍｉｎを３５サイクル。７２℃で１０ｍｉｎの最終延長サイクルの実施と、それに続く４℃での反応終結。ＰＣＲ生産物をＮｃｏＩ／ＰａｃＩで消化し、次にＮｃｏＩ／ＰａｃＩで消化したｐＹ５−４（図３、実施例１で述べられる）にライゲーションしてｐＹＳＤ１７を生産した。
【０１７６】
野生型モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）（登録番号ＡＸ４６４７３１）高親和力鎖長延長酵素
Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）高親和力ＰＵＦＡ鎖長延長酵素遺伝子（配列番号５）のコード領域を含有するｐＲＰＢ２（国際公開第００／１２７２０号パンフレット）の９７３ｂｐのＮｏｔＩ断片をｐＹ５のＮｏｔＩ部位（実施例１、図２および３）に挿入し、ｐＹ５８を生産した（図１３Ｂ）。
【０１７７】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換
チェン（Ｃｈｅｎ）Ｄ．Ｃ．ら（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８（２）：２３２〜２３５（１９９７））の方法に従って、プラスミドｐＹ５４、ｐＹＳＤ１７、およびｐＹ５８を別々にＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号７６９８２中に形質転換した。
【０１７８】
簡単に述べると、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）のロイシン栄養要求株をＹＰＤプレート上に画線し、３０℃でおよそ１８時間生育させた。いくつかの大型白金耳を満たす細胞をプレートからこすり取り、以下を含有する１ｍＬの形質転換緩衝液に再懸濁した。
２．２５ｍＬの５０％ＰＥＧ、平均分子量３３５０、
０．１２５ｍＬの２Ｍ酢酸Ｌｉ、ｐＨ６．０、
０．１２５ｍＬの２ＭＤＴＴ、および
５０μｇの剪断サケ精子ＤＮＡ。
【０１７９】
約５００ｎｇのプラスミドＤＮＡを１００μＬの再懸濁細胞内で培養し、１５ｍｉｎ間隔でボルテックス混合しながら３９℃に１ｈｒ維持した。細胞をロイシン欠乏最少培地プレートに蒔いて、３０℃で２〜３日間維持した。
【０１８０】
％基質変換の判定
ｐＹ５４、ｐＹＳＤ１７またはｐＹ５８を含有する形質転換体Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の単一コロニーをそれぞれ３ｍＬの最少培地（２０ｇ／Ｌグルコース、１．７ｇ／Ｌのアミノ酸なしの酵母窒素ベース、１ｇ／ＬのＬ−プロリン、０．１ｇ／ＬのＬ−アデニン、０．１ｇ／ＬのＬ−リジン、ｐＨ６．１）中で、３０℃でＯＤ６
００が約１．０になるまで生育させた。基質供給のために、次に１０μｇの基質を含有する３ｍＬの最少培地内で１００μＬの細胞を３０℃で約２４ｈｒ継代培養した。引き続いてブライ（Ｂｌｉｇｈ）Ｅ．Ｇ．およびダイヤー（Ｄｙｅｒ）Ｗ．Ｊ．（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：９１１〜９１７（１９５９））で述べられるように、細胞を遠心分離し収集して脂質を抽出した。ナトリウムメトキシド（ローガン（Ｒｏｕｇｈａｎ）Ｇ．およびニシダ（Ｎｉｓｈｉｄａ）Ｉ．、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７６（１）：３８〜４６（１９９０））による脂質抽出物のエステル交換反応によって、脂肪酸メチルエステルを調製し、３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）カラムを装着したヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０  ＧＣで引き続き分析した。オーブン温度は１７０℃（２５分間保持）から１８５℃に３．５℃／ｍｉｎで上昇させた。％基質変換を以下のように計算した（［生産物］／［基質＋生産物］）×１００）。
【０１８１】
野生型Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼによる％基質変換
Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼは、ＬＡをＧＬＡに、および／またはＡＬＡをＳＴＡに変換する。ｐＹ５４を含有するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を上述のように（基質供給は必要でない）生育させ、脂質を分析した。結果は、ｐＹ５４のあるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株が、約３０％のＬＡをＧＬＡに変換することを示した。
【０１８２】
野生型Ｓ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼの％基質変換
Ｓ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼは、ＡＲＡをＥＰＡに、および／またはＤＧＬＡをＥＴＡに変換する。ｐＹＳＤ１７を含有するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を単一コロニーから生育させ、１０μｇのＡＲＡを含有する最少培地で継代培養し、上述のように脂質分析にかけた。ＡＲＡ供給実験の結果は、ｐＹＳＤ１７を有するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株が約２３％の細胞内ＡＲＡをＥＰＡに変換したことを示した。
【０１８３】
野生型Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）高親和力鎖長延長酵素の％基質変換
Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）高親和力ＰＵＦＡ鎖長延長酵素は、ＧＬＡをＤＧＬＡに、ＳＴＡをＥＴＡに、および／またはＥＰＡをＤＰＡに変換する。ｐＹ５８を含有するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を単一コロニーから生育させ、１０μｇのＧＬＡを含有する最少培地で継代培養し、上述のように脂質分析にかけた。ＧＬＡ供給実験の結果は、ｐＹ５８を有するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株が、約３０％の細胞内ＧＬＡをＤＧＬＡに変換したことを示した。
【０１８４】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において好まれるコドン使用の判定
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のおよそ１００個の遺伝子が、アメリカ国立バイオテクノロジー情報センター公共データベースにある。１２１，１６７ｂｐを含んでなるこれらの遺伝子のコード領域をＤＮＡＳｔａｒのＥｄｉｔｓｅｑプログラムによって対応する４０，３８９個のアミノ酸に翻訳し、表４に示すＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のコドン使用プロフィールを判定するために表にした。「Ｎｏ．」と題された欄は、特定のコドンが、４０，３８９個のアミノ酸のサンプル中で特定のアミノ酸をコードする回数を指す。「％」と題された欄は、特定のコドンが特定のアミノ酸をコードする頻度を指す。太字で示されるエントリはＹ・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で好まれるコドンを表す。
【０１８５】
【表５】
2007504838.tif 000007
【０１８６】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中でのさらなる遺伝子発現の最適化の
ために、７９個の遺伝子の「ＡＴＧ」開始コドン周囲の共通配列を調査した。図４では、下線を引いたＡＴＧ翻訳開始コドンの第１の「Ａ」は、＋１と見なされる。分析された遺伝子の７７％が、−３の位置に「Ａ」を有し、この位置における「Ａ」に対する強い優先度が示された。また−４、−２および−１の位置で「Ａ」または「Ｃ」に、＋５の位置で「Ａ」、「Ｃ」または「Ｔ」に、＋６の位置で「Ｇ」または「Ｃ」に対する優先度があった。したがってＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中における遺伝子の最適発現のためのコドン最適化翻訳開始部位の好ましい共通配列は、「ＭＡＭＭＡＴＧＮＨＳ」（配列番号１２２）であり、そこで使用された核酸退縮コードは、以下のようである。Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｓ＝Ｃ／Ｇ、Ｈ＝Ａ／Ｃ／Ｔ、およびＮ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ。
【０１８７】
実施例４
コドン最適化Δ６デサチュラーゼ遺伝子の合成
モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）（配列番号１）からのΔ６デサチュラーゼ遺伝子は長さが１３７４ｂｐであった（米国特許第５，９６８，８０９号明細書、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）＃ＡＦ４６５２８１）。ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン使用パターン、ＡＴＧ翻訳開始コドン周囲の共通配列、およびＲＮＡ安定性の一般規則（グハニヨギ（Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ）Ｇ．およびＪ．ブルーアー（Ｂｒｅｗｅｒ）、Ｇｅｎｅ  ２６５（１〜２）：１１〜２３（２００１））に従って、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ＤＮＡ配列に基づいて、コドン最適化Δ６デサチュラーゼ遺伝子をデザインした。翻訳開始部位を修正するのに加えて、１３４７ｂｐのコード領域（１４４のコドンを含んでなる）の１５２ｂｐもまたコドン最適化した。このコドン最適化遺伝子（配列番号２５）とＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）からの野生型配列全長（配列番号１）との比較を図５に示し、そこでは太字のヌクレオチドが、コドン最適化遺伝子において修正されたヌクレオチドに対応する。コドン最適化遺伝子中の修正のいずれも、コードされたタンパク質（配列番号２）のアミノ酸配列を変化させなかった。
【０１８８】
コドン最適化Δ６デサチュラーゼ遺伝子を合成するのに使用される方法は、図６で図示される。最初に１４対のオリゴヌクレオチドがデザインされて、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼ遺伝子（例えば配列番号２６〜５３に対応するＤ６−１Ａ、Ｄ６−１Ｂ、Ｄ６−２Ａ、Ｄ６−２Ｂ、Ｄ６−３Ａ、Ｄ６−３Ｂ、Ｄ６−４Ａ、Ｄ６−４Ｂ、Ｄ６−５Ａ、Ｄ６−５Ｂ、Ｄ６−６Ａ、Ｄ６−６Ｂ、Ｄ６−７Ａ、Ｄ６−７Ｂ、Ｄ６−８Ａ、Ｄ６−８Ｂ、Ｄ６−９Ａ、Ｄ６−９Ｂ、Ｄ６−１０Ａ、Ｄ６−１０Ｂ、Ｄ６−１１Ａ、Ｄ６−１１Ｂ、Ｄ６−１２Ａ、Ｄ６−１２Ｂ、Ｄ６−１３Ａ、Ｄ６−１３Ｂ、Ｄ６−１４ＡおよびＤ６−１４Ｂ）のコドン最適化コード領域の全長（すなわち１３７４ｂｐ）が延長される。各５’末端の４ｂｐのオーバーハングを例外として、センス（Ａ）およびアンチセンス（Ｂ）オリゴヌクレオチドの各対は相補的である。引き続くサブクローン化のために、プライマーＤ６−１Ａはその５’末端にＮｃｏＩ部位を含有し、プライマーＤ６−４ＢおよびＤ６−５ＡはＳｔｕＩ部位を含有し、プライマーＤ６−７Ｂ、Ｄ６−８Ａ、およびＤ６−１０ＢはそれぞれＢａｍＨＩ部位を含有した。５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭスペルミジン、０．５ｍＭ  ＡＴＰおよび１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含有する２０μＬの容積中で、１００ｎｇの各オリゴヌクレオチドを３７℃で１ｈｒリン酸化した。センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの各対を混合し、以下のパラメーターを使用して、サーモサイクラー中でアニールした。９５℃（２ｍｉｎ）、８５℃（２ｍｉｎ）、６５℃（１５ｍｉｎ）、３７℃（１５ｍｉｎ）、２４℃（１５ｍｉｎ）および４℃（１５ｍｉｎ）。このようにしてＤ６−１Ａ（配列番号２６）をＤ６−１Ｂ（配列番号２７）にアニールし、二本鎖生産物「Ｄ６−１ＡＢ」を生産した。同様に、Ｄ６−２Ａ（配列番号２８）をＤ６−２Ｂ（配列番号２９）にアニールし、二本鎖生産物「Ｄ６−２ＡＢ」を生産した。
【０１８９】
次に以下に示すように４個の別個のアニールされた二本鎖オリゴヌクレオチドのプールを一緒にライゲーションした。
・プール１：Ｄ６−１ＡＢ、Ｄ６−２ＡＢ、Ｄ６−３ＡＢ、およびＤ６−４ＡＢを含んでなる、
・プール２：Ｄ６−５ＡＢ、Ｄ６−６ＡＢ、およびＤ６−７ＡＢを含んでなる、
・プール３：Ｄ６−８ＡＢ、Ｄ６−９ＡＢ、およびＤ６−１０ＡＢを含んでなる、
・プール４：Ｄ６−１１ＡＢ、Ｄ６−１２ＡＢ、Ｄ６−１３ＡＢ、およびＤ６−１４ＡＢを含んでなる。
【０１９０】
アニールされたオリゴヌクレオチドの各プールを２０μＬの容積中で１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼと共に混合し、ライゲーション反応を一晩１６℃で培養した。
【０１９１】
次に各ライゲーション反応の生産物をＰＣＲによって増幅した。具体的には、テンプレートとしてライゲーションされた「プール１」混合物（すなわちＤ６−１ＡＢ、Ｄ６−２ＡＢ、Ｄ６−３ＡＢ、およびＤ６−４ＡＢ）、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＤ６−１（配列番号５４）およびＤ６−４Ｒ（配列番号５５）を使用して、コドン最適化Δ６デサチュラーゼ遺伝子の第１の部分をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ増幅を１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．７５）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（最終濃度）を含有するＰＣＲ緩衝液と、各２００μＭのデオキシリボヌクレオチド三リン酸と、１０ｐｍｏｌｅの各プライマーと、カリフォルニア州サンディエゴのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からの１μＬのＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼを含んでなる５０μＬの総容積中で実施した。増幅を以下のようにして実施した。９５℃で３ｍｉｎの初期変性、それに続いて９５℃で１ｍｉｎ、５６℃で３０ｓｅｃ、７２℃で４０ｓｅｃの３５サイクル。７２℃で１０ｍｉｎの最終延長サイクルの実施と、それに続く４℃での反応終結。３８０ｂｐのＰＣＲ断片をｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））中にサブクローン化して、ｐＴ６（１−４）を生産した。
【０１９２】
テンプレートとしてライゲーションされた「プール２」混合物（すなわちＤ６−５ＡＢ、Ｄ６−６ＡＢ、およびＤ６−７ＡＢ）、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＤ６−５（配列番号５６）およびＤ６−７Ｒ（配列番号５７）を使用して、コドン最適化Δ６デサチュラーゼ遺伝子の第２の部分を同様にＰＣＲによって増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ−イージーベクター中にクローン化してｐＴ６（５−７）を生産した。テンプレートとして「プール３」ライゲーション混合物（すなわち、Ｄ６−８ＡＢ、Ｄ６−９ＡＢ，およびＤ６−１０ＡＢ）、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＤ６−８（配列番号５８）およびＤ６−１０Ｒ（配列番号５９）を使用して、同様にＰＣＲによってコドン最適化Δ６デサチュラーゼ遺伝子の第３の部分を増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ−イージーベクター中にクローン化してｐＴ６（８−１０）を生産した。最後にテンプレートとして「プール４」ライゲーション混合物（すなわちＤ６−１１ＡＢ、Ｄ６−１２ＡＢ、Ｄ６−１３ＡＢ、およびＤ６−１４ＡＢ）、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＤ６−１１（配列番号６０）およびＤ６−１４Ｒ（配列番号６１）を使用して、同様にＰＣＲによってコドン最適化Δ６デサチュラーゼ遺伝子の第４の部分を増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ−イージーベクター中にクローン化してｐＴ６（１１−１４）を生産した。
【０１９３】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をｐＴ６（１−４）、ｐＴ６（５−７）、ｐＴ６（８−１０）、およびｐＴ６（１１−１４）で別々に形質転換し、アンピシリン−抵抗性形質転換体から単離されたプラスミドＤＮＡを精製して適切な制限エンドヌクレアーゼで消化し、３８０ｂｐのｐＴ６（１〜４）のＮｃｏＩ／ＳｔｕＩ断片、３１０ｂｐのｐＴ６（５−７）のＳｔｕＩ／ＢａｍＨＩ断片、３２０ｂｐのｐＴ６（８−１０）のＢａｍＨＩ断片、および
４１０ｂｐのｐＴ６（１１―１４）のＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ断片を遊離した。次にこれらの断片を組み合わせて正しい方向に一緒にライゲーションし、ｐＹ５−１３のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位に挿入してｐＹＤ６Ｓを生産した（図７）。
【０１９４】
実施例５
コドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子の合成
サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）（配列番号３）からのΔ１７デサチュラーゼ遺伝子は長さが１０７７ｂｐであった。ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン使用パターン、ＡＴＧ翻訳開始コドン周囲の共通配列、およびＲＮＡ安定性の一般規則（グハニヨギ（Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ）およびブルーアー（Ｂｒｅｗｅｒ）前出）に従って、Ｓ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）ＤＮＡ配列に基づいて、コドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子をデザインした。翻訳開始部位の修正に加えて、１０７７ｂｐのコード領域（１１７のコドンを含んでなる）の１２７ｂｐをコドン最適化した。このコドン最適化ＤＮＡ配列（配列番号６２）とＳ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ遺伝子ＤＮＡ配列（配列番号３）との比較を図８に示し、そこでは太字のヌクレオチドが、コドン最適化遺伝子において修正されたヌクレオチドに対応する。コドン最適化遺伝子中の修正のいずれも、コードされたタンパク質（配列番号４）のアミノ酸配列を変化させなかった。
【０１９５】
コドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子を合成するのに使用される方法は、図９で図示される。最初に１１対のオリゴヌクレオチドがデザインされて、Ｓ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ遺伝子（例えば配列番号６３〜８４に対応するＤ１７−１Ａ、Ｄ１７−１Ｂ、Ｄ１７−２Ａ、Ｄ１７−２Ｂ、Ｄ１７−３Ａ、Ｄ１７−３Ｂ、Ｄ１７−４Ａ、Ｄ１７−４Ｂ、Ｄ１７−５Ａ、Ｄ１７−５Ｂ、Ｄ１７−６Ａ、Ｄ１７−６Ｂ、Ｄ１７−７Ａ、Ｄ１７−７Ｂ、Ｄ１７−８Ａ、Ｄ１７−８Ｂ、Ｄ１７−９Ａ、Ｄ１７−９Ｂ、Ｄ１７−１０Ａ、Ｄ１７−１０Ｂ、Ｄ１７−１１ＡおよびＤ１７−１１Ｂ、対応する）のコドン最適化コード領域の全長が延長される。各５’末端の４ｂｐのオーバーハングを例外として、センス（Ａ）およびアンチセンス（Ｂ）オリゴヌクレオチドの各対は相補的である。さらにプライマーＤ１７−１Ａ、Ｄ１７−４Ｂ、Ｄ１７−５Ａ、Ｄ１７−８Ａ、およびＤ１７−８Ｂもまた、引き続くサブクローン化のためにＮｃｏＩ、ＢｇｌＩＩおよびＳａｌＩ制限部位にそれぞれ導入される。
【０１９６】
実施例４で使用した方法に続いて、１００ｎｇの各オリゴヌクレオチドをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。次に各センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド対を混合し、アニールした。したがって、Ｄ１７−１Ａ（配列番号６３）をＤ１７−１Ｂ（配列番号６４）にアニールして二本鎖生産物「Ｄ１７−１ＡＢ」を生産した。同様にＤ１７−２Ａ（配列番号６５）をＤ１７−２Ｂ（配列番号６６）にアニールして二本鎖生産物「Ｄ１７−２ＡＢ」などを生産した。
【０１９７】
次に以下に示すように３個の別個のアニールされた二本鎖オリゴヌクレオチドのプールを一緒にライゲーションした。
・プール１：Ｄ１７−１ＡＢ、Ｄ１７−２ＡＢ、Ｄ１７−３ＡＢ、およびＤ１７−４ＡＢを含んでなる、
・プール２：Ｄ１７−５ＡＢ、Ｄ１７−６ＡＢ、Ｄ１７−７ＡＢ、およびＤ１７−８ＡＢを含んでなる、そして
・プール３：Ｄ１７−９ＡＢ、Ｄ１７−１０ＡＢ、およびＤ１７−１１ＡＢを含んでなる。
【０１９８】
アニールされたオリゴヌクレオチドの各プールを２０μＬの容積中で一晩１６℃でライゲーションした。
【０１９９】
次に各ライゲーション反応の生産物をＰＣＲによって増幅した。具体的には、テンプレートとしてライゲーションされた「プール１」混合物（すなわちＤ１７−１ＡＢ、Ｄ１７−２ＡＢ、Ｄ１７−３ＡＢ、およびＤ１７−４ＡＢ）、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＤ１７−１（配列番号８５）およびＤ１７−４Ｒ（配列番号８６）を使用して、コドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子の第１の部分をＰＣＲによって増幅した。実施例４で述べられるＰＣＲ条件およびサーモサイクリングプログラムを使用して、ＰＣＲ増幅を５０μＬの総容積中で実施した。４３０ｂｐのＰＣＲ断片をｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））中にサブクローン化して、ｐＴ１７（１−４）を生産した。
【０２００】
テンプレートとしてライゲーションされた「プール２」混合物（すなわちＤ１７−５ＡＢ、Ｄ１７−６ＡＢ、Ｄ１７−７ＡＢ、およびＤ１７−８ＡＢ）、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＤ１７−５（配列番号８７）およびＤ１７−８Ｄ（配列番号８８）を使用して、コドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子の第２の部分を同様にＰＣＲによって増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ−イージーベクター中にクローン化してｐＴ１７（５−８）を生産した。最後に、テンプレートとして「プール３」ライゲーション混合物（すなわちＤ１７−９ＡＢ、Ｄ１７−１０ＡＢ、およびＤ１７−１１ＡＢ）、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＤ１７−８Ｕ（配列番号８９）、Ｄ１７−１１（配列番号９０）を使用して、同様にＰＣＲによってコドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子の第３の部分を増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ−イージーベクター中にクローン化してｐＴ１７（９−１１）を生産した。
【０２０１】
大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）をｐＴ１７（１−４）、ｐＴ１７（５−８）、およびｐＴ１７（９−１１）で別々に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン−抵抗性形質転換体から単離した。プラスミドＤＮＡを適切な制限エンドヌクレアーゼで精製し消化して、ｐＴ１７（１―４）の４２０ｂｐ  ＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩ断片、ｐＴ１７（５−８）の４００ｂｐ  ＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ断片、およびｐＴ１７（９−１１）の３００ｂｐ  ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ断片を遊離した。次にこれらの断片を組み合わせて一緒にライゲーションして、合成Δ１７デサチュラーゼ遺伝子全体の増幅のためのテンプレートとして使用し、Ｄ１７−１（配列番号８５）およびＤ１７−１１（配列番号９０）をプライマーとして使用した。上述のΔ１７デサチュラーゼ遺伝子の各部分のための条件、および以下のサーモサイクリングを使用して、５０μＬの総容積中でＰＣＲ増幅を実施した。９５℃で３ｍｉｎの初期変性、それに続いて９５℃で１ｍｉｎ、５６℃で３０ｓｅｃ、７２℃で１．１ｍｉｎの３５サイクル。７２℃で１０ｍｉｎの最終延長サイクルの実施と、それに続く４℃での反応終結。１．１ｋＢのＰＣＲ生産物をＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで消化し、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ消化したｐＹ５−１３中にサブクローン化して、ｐＹＳＤ１７Ｓを生産した（図１０Ａ）。
【０２０２】
野生型およびコドン最適化Δ１７デサチュラーゼと共に比較基質供給試験で使用するための追加的な「対照」として、プライマーとしてＹＬ５３（配列番号１２０）およびＹＬ５４（配列番号１２１）を使用して、部位特異的変異誘発によってｐＹＳＤ１７中のＡＴに富んだＰａｃＩ部位（実施例２で述べられる）を除去し、ｐＹＳＤ１７Ｍを生産した（図１０Ｂ）。
【０２０３】
実施例６
コドン最適化高親和力ＰＵＦＡ鎖長延長酵素遺伝子の合成
Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）（配列番号５）からの高親和力ＰＵＦＡ鎖長延長酵素遺伝子は長さが９５７ｂｐであった（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）＃ＡＸ４６４７３１、国際公開第００／１２７２０号パンフレット）。ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン使用パターン、「ＡＴＧ」翻訳開始コドン周囲の共通配列、およびＲＮＡ安定性の
一般規則（グハニヨギ（Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ）およびブルーアー（Ｂｒｅｗｅｒ）前出）に従って、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ＤＮＡ配列に基づいて、コドン最適化高親和力ＰＵＦＡ鎖長延長酵素遺伝子をデザインした。翻訳開始部位を修正するのに加えて、９５７ｂｐのコード領域（８５のコドンを含んでなる）の９４ｂｐもまたコドン最適化した。このコドン最適化遺伝子（配列番号９１）とＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）からの野生型配列全長（配列番号５）との比較を図１１に示し、そこでは太字のヌクレオチドが、コドン最適化遺伝子において修正されたヌクレオチドに対応する。コドン最適化遺伝子中の修正のいずれも、コードされたタンパク質（配列番号６）のアミノ酸配列を変化させなかった。
【０２０４】
高親和力鎖長延長酵素遺伝子を合成するのに使用される方法は、図１２で図示される。具体的には１０対のオリゴヌクレオチドがデザインされて、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）高親和力鎖長延長酵素のコード領域（すなわち配列番号９２−１１１に対応するＥＬ−１Ａ、ＥＬ−１Ｂ、ＥＬ−２Ａ、ＥＬ−２Ｂ、ＥＬ−３Ａ、ＥＬ−３Ｂ、ＥＬ−４Ａ、ＥＬ−４Ｂ、ＥＬ−５Ａ、ＥＬ−５Ｂ、ＥＬ−６Ａ、ＥＬ−６Ｂ、ＥＬ−７Ａ、ＥＬ−７Ｂ、ＥＬ−８Ａ、ＥＬ−８Ｂ、ＥＬ−９Ａ、ＥＬ−９Ｂ、ＥＬ−１０Ａ、およびＥＬ−１０Ｂ）の長さに沿って延長される。５’末端の４ｂｐのオーバーハングを例外として、センス（Ａ）およびアンチセンス（Ｂ）オリゴヌクレオチドの各対は相補的である。
【０２０５】
実施例４の方法に続いて、１００ｎｇの各オリゴヌクレオチドをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。次に各センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド対を混合し、アニールした。したがってＥＬ−１Ａ（配列番号９２）をＥＬ１−１Ｂ（配列番号９３）にアニールして、二本鎖生産物「ＥＬ−１ＡＢ」を生産した。同様にＥＬ−２Ａ（配列番号９５）をＥＬ−２Ｂ（配列番号９５）にアニールして、二本鎖生産物「ＥＬ−２ＡＢ」などを生産した。
【０２０６】
次に以下に示すように２個の別個のアニールされた二本鎖オリゴヌクレオチドのプールを一緒にライゲーションした。
・プール１：ＥＬ−１ＡＢ、ＥＬ−２ＡＢ、ＥＬ−３ＡＢ、ＥＬ−４ＡＢおよびＥＬ−５ＡＢを含んでなる、そして
・プール２：ＥＬ−６ＡＢ、ＥＬ−７ＡＢ、ＥＬ−８ＡＢ、ＥＬ−９ＡＢおよびＥＬ−１０ＡＢを含んでなる。
【０２０７】
アニールされたオリゴヌクレオチドの各プールを１０ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼと共に２０μＬの容積中で一晩１６℃でライゲーションした。
【０２０８】
次に各ライゲーション反応の生産物をＰＣＲによって増幅した。具体的にはテンプレートとしてライゲーションされた「プール１」混合物（すなわち、ＥＬ−１ＡＢ、ＥＬ−２ＡＢ、ＥＬ−３ＡＢ、ＥＬ−４ＡＢ、およびＥＬ−５ＡＢ）、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＥＬ−１（配列番号１１２）およびＥＬ−５Ｒ（配列番号１１３）を使用して、コドン最適化鎖長延長酵素の第１の部分をＰＣＲによって増幅した。実施例４述べられるようにしてＰＣＲ増幅を５０μＬの反応混合物中で実施した。増幅を以下のようにして実施した。９５℃で３ｍｉｎの初期変性、それに続いて９５℃で１ｍｉｎ、５６℃で３０ｓｅｃ、７２℃で１ｍｉｎの３５サイクル。７２℃で１０ｍｉｎの最終延長サイクルの実施と、それに続く４℃での反応終結。５００ｂｐのＰＣＲ断片をｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））中にサブクローン化して、ｐＴＥＬ（１−５）を生産した。
【０２０９】
テンプレートとしてライゲーションされた「プール２」混合物（すなわち、ＥＬ−６ＡＢ、ＥＬ−７ＡＢ、ＥＬ−８ＡＢ、ＥＬ−９ＡＢおよびＥＬ−１０ＡＢ）、プライマーと
してオリゴヌクレオチドＥＬ−６（配列番号１１４）およびＥＬ−１０Ｒ（配列番号１１５）を使用して、コドン最適化鎖長延長酵素遺伝子の第２の部分を同様にＰＣＲによって増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ−イージーベクター中にサブクローン化してｐＴＥＬ（６−１０）を生産した。
【０２１０】
大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）細胞をｐＴＥＬ（１−５）およびｐＴＥＬ（６−１０）で別々に形質転換し、アンピシリン抵抗性形質転換体からのプラスミドＤＮＡを精製し、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化して、５００ｂｐのｐＴＥＬ（１−５）のＮｃｏＩ／ＳａｌＩ断片および４７０ｂｐのｐＴＥＬ（６−１０）のＳａｌＩ／ＮｏｔＩ断片を遊離した。次にこれらの断片を混合し、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ消化したｐＹ５−１３にライゲーションしてｐＥＬＳ−１を生産した。
【０２１１】
ｐＥＬＳ−１インサートのＤＮＡ配列分析は、Ｔｈｒ（ＡＣＣ）からＳｅｒ（ＡＧＣ）へのアミノ酸変化をもたらす、＋６５の位置における１つの「Ｃ」から「Ｔ」への塩基置換の存在を同定した（「ＡＴＧ」翻訳コドンの「Ａ」を＋１とする）。引き続きプライマーとしてオリゴヌクレオチドＥＬ−Ｍ１（配列番号１１６）およびＥＬ−Ｍ２（配列番号１１７）を使用して、部位特異的変異誘発によってこの変異を修正して、ｐＥＬＳ（図１３Ａ）を生産した。
【０２１２】
実施例７
コドン最適化Δ６デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、および高親和力ＰＵＦＡ鎖長延長酵素遺伝子によるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換
実施例２で述べた方法に従って、野生型およびコドン最適化Δ６デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、および高親和力ＰＵＦＡ鎖長延長酵素遺伝子を含有するプラスミドをＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号７６９８２中で別々に形質転換した。この技術を使用して、以下のプラスミドを含有する形質転換体を得た。
【０２１３】
【表６】
2007504838.tif 000008
【０２１４】
実施例８
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるコドン最適化Δ６およびΔ１７デサチュラーゼおよび高親和力鎖長延長酵素の変換効率の分析
以下の野生型およびコドン最適化Δ６デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、および高親和力鎖長延長酵素それぞれの変換効率の比較では、コドン最適化がＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において、ＬＡからＧＬＡ（Δ６デサチュラーゼ）への％基質変換をおよそ４０％、ＡＲＡからＥＰＡ（Δ１７デサチュラーゼ）への％基質変換を
約２倍に、そしてＧＬＡからＤＧＬＡ（鎖長延長酵素）への％基質変換を約５７％改善したと判定された。
【０２１５】
コドン最適化Δ６デサチュラーゼによる％基質変換
Δ６デサチュラーゼは、ＬＡをＧＬＡに、および／またはＡＬＡをＳＴＡに変換する（図１参照）。野生型とコドン最適化Δ６デサチュラーゼ遺伝子の変換効率を比較するために、それぞれ別のプラスミドコンストラクト（すなわちｐＹＳＤ６またはｐＹＤ６Ｓ）を含有するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において、％基質変換（［生産物］／［基質＋生産物］）×１００）を求めた。具体的には３ｍＬの最少培地中でｐＹＳＤ６またはｐＹＤ６Ｓのいずれかを含有するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を単一コロニーから生育させ、１０μｇのＬＡを含有する最少培地中で継代培養して、実施例２で述べるように脂質分析を施した。
【０２１６】
実験の結果は、ｐＹＳＤ６を含有するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株が、約３０％の基質ＬＡをＧＬＡに変換し（図１４Ａ）、他方ｐＹＤ６Ｓを含有するものは約４２％のＬＡをＧＬＡに変換する（図１４Ｂ）ことを示唆した。これに基づき、コドン最適化Δ６デサチュラーゼ遺伝子を含有するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の野生型Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼ遺伝子よりもおよそ４０％多くのＬＡを変換した。
【０２１７】
コドン最適化Δ１７デサチュラーゼによる％基質転換
Δ１７デサチュラーゼはＤＧＬＡをＥＴＡに、および／またはＡＲＡをＥＰＡに変換する（図１参照）。野生型とコドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子の変換効率を比較するために、ｐＹＳＤ１７、ｐＹＳＤ１７Ｍ、およびｐＹＳＤ１７Ｓを含有するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における％基質変換を求めた。３ｍＬの最小培地中で各形質転換体を単一コロニーから生育させ、１０μｇのＡＲＡを含有する最少培地中で継代培養して、実施例２で述べるように脂質分析を施した。
【０２１８】
ＡＲＡ供給実験の結果は、対照プラスミドｐＹＳＤ１７またはｐＹＳＤ１７Ｍを有するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株が約２３％の細胞内ＡＲＡをＥＰＡに変換し（図１５Ａ）、他方ｐＹＳＤ１７Ｓ上にコドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子を含有するものが約４５％の細胞内ＡＲＡをＥＰＡに変換する（図１５Ｂ）ことを示した。したがってコドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子を含有するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）は、野生型Ｓ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）遺伝子を含有する株よりも約２倍多いＡＲＡを変換した。
【０２１９】
コドン最適化鎖長延長酵素による％基質転換
Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）の高親和力ＰＵＦＡ鎖長延長酵素は、主にＧＬＡからＤＧＬＡへの転換を触媒する役目を果たす（図１参照、国際公開第００／１２７２０号パンフレット）。野生型とコドン最適化鎖長延長酵素遺伝子の変換効率を比較するために、ｐＹ５８およびｐＥＬＳを含有するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で％基質変換を求めた。形質転換体を３ｍＬの最少培地中で単一コロニーから生育させ、１０μｇのＧＬＡを含有する最少培地中で継代培養し、実施例２で述べるように脂質分析を施した。
【０２２０】
ＧＬＡ供給実験の結果は、ｐＹ５８を含有するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が約３０％の細胞内基質ＧＬＡをＤＧＬＡに変換し（図１６Ａ）、他方ｐＥＬＳを含有するものが約４７％のＧＬＡをＤＧＬＡに変換する（図１６Ｂ）ことを示した。これに基づいて、コドン最適化鎖長延長酵素遺伝子は、Ｙ．リポリ
ティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の野生型Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）鎖長延長酵素遺伝子よりもおよそ５７％多いＧＬＡを変換した。
【図面の簡単な説明】
【０２２１】
【図１】ω−３およびω−６脂肪酸生合成経路を図示する。
【図２】ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で使用するためのプラスミドベクターｐＹ５の構築を図示する。
【図３】Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における遺伝子発現のためのプラスミドベクターｐＹ５−１３およびｐＹ５−４の構築を図示する。
【図４】Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の翻訳開始コドン「ＡＴＧ」周囲の好ましい共通配列を図示する。
【図５】モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼ遺伝子と、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化された合成遺伝子とのＤＮＡ配列の比較を示す。
【図６】コドン最適化Δ６デサチュラーゼ遺伝子の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）合成のために用いられるストラテジーを図示する。
【図７】Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるコドン最適化Δ６デサチュラーゼ遺伝子の発現のためのプラスミドを示す。
【図８】サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ遺伝子と、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化された合成遺伝子とのＤＮＡ配列の比較を示す。
【図９】コドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）合成のために用いられるストラテジーを図示する。
【図１０】Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるコドン最適化および野生型Δ１７デサチュラーゼ遺伝子発現のためのプラスミドを示す。
【図１１】モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）鎖長延長酵素遺伝子と、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化された合成遺伝子とのＤＮＡ配列の比較を示す。
【図１２】コドン最適化鎖長延長酵素遺伝子の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）合成のために用いられるストラテジーを図示する。
【図１３】Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるコドン最適化および野生型鎖長延長酵素遺伝子発現のためのプラスミドを示す。
【図１４Ａ】約３０％の基質ＬＡからＧＬＡへの変換を示す、コドン最適化および野生型Δ６デサチュラーゼ遺伝子で形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で生産された脂肪酸のガスクロマトグラフィー分析の結果を示す。
【図１４Ｂ】約４２％の基質ＬＡからＧＬＡへの変換を示す、コドン最適化および野生型Δ６デサチュラーゼ遺伝子で形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で生産された脂肪酸のガスクロマトグラフィー分析の結果を示す。
【図１５】約２３％の細胞内ＡＲＡからＥＰＡへの変換を示す、コドン最適化および野生型Δ１７デサチュラーゼ遺伝子で形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で生産された脂肪酸のガスクロマトグラフィー分析の結果を示す。
【図１５Ｂ】約４５％の細胞内ＡＲＡからＥＰＡへの変換を示す、コドン最適化および野生型Δ１７デサチュラーゼ遺伝子で形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で生産された脂肪酸のガスクロマトグラフィー分析の結果を示す。
【図１６】約３０％の細胞内ＧＬＡからＤＧＬＡへの変換を示す、コドン最適化および野生型鎖長延長酵素遺伝子で形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で生産された脂肪酸のガスクロマトグラフィー分析の結果を示す。
【図１６Ｂ】約４７％の細胞内ＧＬＡからＤＧＬＡへの変換を示す、コドン最適化および野生型鎖長延長酵素遺伝子で形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で生産された脂肪酸のガスクロマトグラフィー分析の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ａ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ａ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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