(57)【要約】本発明はヒドロキシアルキルデンプンとタンパク質とのコンジュゲートに関し、これらのコンジュゲートはヒドロキシアルキルデンプンまたはヒドロキシアルキルデンプンの誘導体とタンパク質との間の共有結合によって形成される。本発明はこれらのコンジュゲートを製造する方法およびこれらのコンジュゲートの使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質とヒドロキシアルキルデンプン（HAS）であるポリマーまたはその誘導体とを含むコンジュゲートを製造する方法であって、ポリマーまたはその誘導体の少なくとも一つの官能基Aを、タンパク質の少なくとも一つの官能基Zと反応させることによって共有結合を形成させることを含み、Zはアミノ基、チオール基、アルデヒド基およびケト基からなる群より選択され、
・Zがアルデヒド基またはケト基である場合、AはZとの前記結合を形成するアミノ基を含み、かつタンパク質はIFNベータ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、第VII因子、第VIII因子、および第IX因子からなる群より選択され、
・Zがアミノ基である場合、Aは反応性カルボキシ基およびアルデヒド基からなる群より選択され、かつタンパク質はIFNアルファ、IFNベータ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、第VII因子、第VIII因子、および第IX因子からなる群より選択され、
・・Aがアルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基である場合、本方法は、
・・・ポリマーを少なくとも二官能性である化合物（そのうち、一つの官能基はポリマーと反応し、少なくとも一つの他の官能基は、アルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基であるか、さらなる化学修飾を受けてアルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基を与える官能基である）と反応させることによって、もしくは
・・・ポリマーを酸化して少なくとも一つ（特に少なくとも二つ）のアルデヒド基を得ることによって、
ポリマーにAを導入してポリマー誘導体を得ることをさらに含み、
・・Aが反応性カルボキシ基である場合、本方法は、
・・・ポリマーをその還元末端で選択的に酸化し、結果として生じるカルボキシ基を活性化することによって、もしくは
・・・ポリマーをその非酸化型還元末端で炭酸ジエステルと反応させることによって、
ポリマーにAを導入してポリマー誘導体を得ることをさらに含み、または
・Zがチオール基である場合、タンパク質は、IFNアルファ、IFNベータ、tPA、A1AT、第VII因子および第IX因子からなる群より選択され、かつAは、Zとの前記結合を形成する
・・マレイミド基、もしくは
・・ハロゲンアセチル基
を含む、前記方法。
【請求項２】
ヒドロキシアルキルデンプンがヒドロキシエチルデンプンである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ヒドロキシエチルデンプンが2〜200kD、好ましくは4〜130kD、より好ましくは4〜70kDの分子量を持つ、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
Zがアルデヒド基またはケト基であり、タンパク質がIFNベータ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、第VII因子、第VIII因子、および第IX因子からなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
アルデヒド基またはケト基がタンパク質の糖側鎖中および/またはタンパク質のN末端基に位置する、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
アルデヒド基およびケト基を得るために、タンパク質の糖側鎖を酸化することおよび/またはタンパク質のN末端基を酸化することをさらに含む、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
酸化反応が酵素的にまたは過ヨウ素酸塩を使って（いずれの場合も必要であれば末端シアル酸を除去した後に）行なわれる、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
Aを含むポリマー誘導体とZを含むタンパク質との反応に先だって、ポリマーを、その非酸化型還元末端で、ポリマーの非酸化型還元末端と反応する能力を持つ官能基および基Aを含む少なくとも二官能性である連結化合物と反応させることをさらに含む、請求項4〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
Aがアミノオキシ基またはヒドラジド基である、請求項4〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも二官能性である連結化合物がホモ二官能性化合物である、請求項8または9に記載の方法。
【請求項１１】
ホモ二官能性化合物が二つのアミノオキシ基を含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
ホモ二官能性化合物がO-[2-(2-アミノオキシ-エトキシ)-エチル]ヒドロキシルアミンである、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
ポリマーと少なくとも二官能性である連結化合物との反応が水性媒質中で行なわれる、請求項8〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ポリマーと少なくとも二官能性である連結化合物との反応がオキシム結合および/またはオキシアミノ結合をもたらす、請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
Zがアミノ基であり、タンパク質がIFNアルファ、IFNベータ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、第VII因子、第VIII因子、および第IX因子からなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ポリマーをその還元末端で選択的に酸化し、酸化されたポリマーを炭酸N,N'-ジスクシンイミジルとその酸化型還元末端で反応させて、反応性カルボキシ基Aを含むポリマー誘導体を得ることをさらに含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
還元末端が酸化されていないポリマーの少なくとも一つのヒドロキシ基を炭酸ジエステルと反応させて反応性カルボキシ基Aを得ることをさらに含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１８】
炭酸ジエステルが対称ジステルである、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
エステルのアルコール成分がN-ヒドロキシスクシンイミド、スルホン化N-ヒドロキシスクシンイミド、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール、ニトロ置換フェノール類、およびハロゲン置換フェノール類からなる群より選択される、請求項17または18に記載の方法。
【請求項２０】
ハロゲン置換フェノールがニトロフェノール、ジニトロフェノール、トリクロロフェノール、トリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、およびペンタフルオロフェノールからなる群より選択される、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
還元末端が酸化されていないポリマーの少なくとも一つのヒドロキシ基と炭酸ジエステルとの反応による反応性エステル基Aの生成が無水非プロトン性極性溶媒中で行なわれる、請求項17〜20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
溶媒がジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミドまたはその混合物である、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
Aがアルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基であり、ポリマーを少なくとも二官能性である化合物の官能基Mと反応させてポリマー誘導体を得ることをさらに含み、少なくとも二官能性である化合物はアルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基Aである少なくとも一つの他の官能基Qをさらに含む、請求項15に記載の方法。
【請求項２４】
Mがアミノ基を含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
Aがアルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基であり、ポリマーを少なくとも二官能性である化合物の官能基Mと反応させてポリマー誘導体を得ることをさらに含み、少なくとも二官能性である化合物がアルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基ではない少なくとも一つの他の官能基Qをさらに含み、官能基Qを少なくとも一つの適切な化合物と反応させてアルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基Aを含むポリマー誘導体を得ることをさらに含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２６】
MおよびQがアミノ基を含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも一つの適切な化合物がカルボキシ基とアルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基とを含む、請求項25または26に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも一つの適切な化合物がホルミル安息香酸または4-(4-ホルミル-3,5-ジメトキシフェノキシ)酪酸である、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
Mがアミノ基を含み、Qがベータヒドロキシアミノ基を含む、請求項25または26に記載の方法。
【請求項３０】
ポリマーをその酸化型還元末端で少なくとも二官能性である化合物の官能基Mと反応させる、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
ベータヒドロキシアミノ基を酸化してアルデヒド基を得ることをさらに含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３２】
酸化反応が過ヨウ素酸塩を使って行なわれる、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
ポリマーを過ヨウ素酸塩を使った開環酸化反応に付して、少なくとも一つ（特に少なくとも二つ）のアルデヒド基Aを持つポリマー誘導体を得る、請求項15に記載の方法。
【請求項３４】
ポリマーまたはポリマー誘導体とタンパク質との反応が還元的アミノ化である、請求項23〜33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
還元的アミノ化がNaCNBH3の存在下で行なわれる、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
還元的アミノ化が7以下のpHで行なわれる、請求項34または35に記載の方法。
【請求項３７】
pHが6以下である、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
還元的アミノ化が0〜25℃の温度で行なわれる、請求項34〜37のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
還元的アミノ化が水性媒質中で行なわれる、請求項34〜38のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
Zがチオール基であり、タンパク質がIFNアルファ、IFNベータ、tPA、A1AT、APC、第VII因子、および第IX因子からなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
Aがハロゲンアセチル基を含み、ポリマーを、その酸化されていてもよい還元末端で、それぞれにアミノ基を含む少なくとも二つの官能基を持つ少なくとも二官能性である化合物と反応させて、アミノ基を含む少なくとも一つの官能基を持つポリマー誘導体を得ることをさらに含み、ポリマーをモノハロゲン置換酢酸および/または反応性モノハロゲン置換酢酸誘導体と反応させることをさらに含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
ハロゲンがBrまたはIである、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも二官能性である化合物が2〜10個の炭素原子を持つジアミノアルカンである、請求項41または42に記載の方法。
【請求項４４】
少なくとも二官能性である化合物が1〜5個のアルキレン単位を持つジアミノポリエチレングリコールである、請求項41または42に記載の方法。
【請求項４５】
ポリマーをその酸化型還元末端で少なくとも二官能性である化合物と反応させる、請求項41〜44のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
ハロゲンアセチル基を含むポリマー誘導体を、ジメチルホルムアミドと水との混合物を含む溶媒の存在下で、タンパク質と反応させる、請求項41〜45のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
Aがマレイミド基を含み、ポリマーをその酸化されていてもよい還元末端で、酸化されていてもよい還元末端と反応する能力を持つ官能基Uを含む少なくとも二官能性である化合物（この少なくとも二官能性である化合物は化学修飾を受けてマレイミドを与えることができる官能基Wをさらに含む）と反応させることをさらに含み、官能基Wを化学修飾してマレイミド基を得ることをさらに含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４８】
Uがアミノ基を含む、請求項47に記載の方法。
【請求項４９】
Wがアミノ基を含む、請求項47または48に記載の方法。
【請求項５０】
Wを含むポリマー誘導体を、Wと反応させることができる官能基を含みかつマレイミド基をさらに含む少なくとも二官能性である化合物と反応させる、請求項47〜49のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
少なくとも二官能性である化合物がN-(アルファ-マレイミドアセトキシ)スクシンイミドエステルである、請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
請求項1〜51のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるコンジュゲート。
【請求項５３】
Aが反応性カルボキシ基であり、ポリマーの少なくとも一つのヒドロキシ基を炭酸ジエステルと反応させることによって、還元末端が酸化されていないポリマーにAが導入され、当該コンジュゲートが少なくとも一つのポリマー分子と、アミド結合を介してポリマーに連結された少なくとも一つ（特に1〜10個の）タンパク質分子とを含み、タンパク質がIFNアルファ、IFNベータ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、第VII因子、第VIII因子、および第IX因子からなる群より選択される、請求項52に記載のコンジュゲート。
【請求項５４】
タンパク質とポリマーまたはその誘導体とを含むコンジュゲートであって、ポリマーがヒドロキシアルキルデンプン（HAS）であり、タンパク質がIFNベータ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、第VII因子、第VIII因子、および第IX因子からなる群より選択され、前記コンジュゲートが式
【化１】
2007527891.tif 000125
および/または
【化２】
2007527891.tif 000126
［式中、R1、R2およびR3は、独立して、水素、または2〜10個の炭素原子を持つヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基もしくはヒドロキシアルカリール基、好ましくは水素またはヒドロキシアルキル基、より好ましくは水素またはヒドロキシエチル基であり、
GはOおよびSからなる群より選択され、好ましくはOであり、
Lは適切に置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状および/または環状炭化水素残基であって、少なくとも一つのヘテロ原子を含んでもよく、好ましくは2〜60個の炭素原子を持つアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル残基である］
の構造を持つコンジュゲート。
【請求項５５】
-L-が-(CH2)n-であり、n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10、好ましくは2、3、4、5、6、より好ましくは2、3、4、特に好ましくは4である、請求項54に記載のコンジュゲート。
【請求項５６】
タンパク質とポリマーまたはその誘導体とを含むコンジュゲートであって、ポリマーがヒドロキシアルキルデンプン（HAS）であり、タンパク質がIFNベータ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、第VII因子、第VIII因子、および第IX因子からなる群より選択され、前記コンジュゲートが式
【化３】
2007527891.tif 000127
および/または
【化４】
2007527891.tif 000128
［式中、R1、R2およびR3は、独立して、水素、または2〜10個の炭素原子を持つヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基もしくはヒドロキシアルカリール基、好ましくは水素またはヒドロキシアルキル基、より好ましくは水素またはヒドロキシエチル基であり、
GはOおよびSからなる群より選択され、好ましくはOである］
の構造を持つコンジュゲート。
【請求項５７】
タンパク質とポリマーまたはその誘導体とを含むコンジュゲートであって、ポリマーがヒドロキシアルキルデンプン（HAS）であり、タンパク質がIFNベータ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、第VII因子、第VIII因子、および第IX因子からなる群より選択され、前記コンジュゲートが式
【化５】
2007527891.tif 000129
および/または
【化６】
2007527891.tif 000130
［式中、R1、R2およびR3は、独立して、水素、または2〜10個の炭素原子を持つヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基もしくはヒドロキシアルカリール基、好ましくは水素またはヒドロキシアルキル基、より好ましくは水素またはヒドロキシエチル基であり、
Lは適切に置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状および/または環状炭化水素残基であって、少なくとも一つのヘテロ原子を含んでもよく、好ましくは2〜60個の炭素原子を持つアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル残基である］
の構造を持つコンジュゲート。
【請求項５８】
-L-が
-[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-
［式中、Ra、Rb、Rc、Rdは、独立して、水素、アルキル、アリール、好ましくは水素であり、
GはOおよびSからなる群より選択され、好ましくはOであり、
mは1、2、3または4であって、残基RaおよびRbはm個のCRaRb基中で同じであっても異なってもよく、
nは0〜20、好ましくは0〜10、より好ましくは1、2、3、4、5、最も好ましくは1または2であり、
oは0〜20、好ましくは0〜10、より好ましくは1、2、3、4、5、最も好ましくは1または2であり、残基RcおよびRdはo個のCRcRd基中で同じであっても異なってもよく、
nおよびoに関する整数は、上式においてペルオキシ部分が生じないように選択される（例えばnおよびoは同時には0でない）］
である、請求項57に記載のコンジュゲート。
【請求項５９】
Ra、Rb、Rc、Rdが水素であり、m＝2、n＝1、およびo＝2である、請求項57または58に記載のコンジュゲート。
【請求項６０】
タンパク質とポリマーまたはその誘導体とを含むコンジュゲートであって、ポリマーがヒドロキシアルキルデンプン（HAS）であり、タンパク質がIFNアルファ、IFNベータ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、第VII因子、第VIII因子、および第IX因子からなる群より選択され、前記コンジュゲートが式
【化７】
2007527891.tif 000131
［式中、R1、R2およびR3は、独立して、水素、または2〜10個の炭素原子を持つヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基もしくはヒドロキシアルカリール基、好ましくは水素またはヒドロキシアルキル基、より好ましくは水素またはヒドロキシエチル基である］
の構造を持つコンジュゲート。
【請求項６１】
タンパク質とポリマーまたはその誘導体とを含むコンジュゲートであって、ポリマーがヒドロキシアルキルデンプン（HAS）であり、タンパク質がIFNアルファ、IFNベータ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、第VII因子、第VIII因子、および第IX因子からなる群より選択され、式
【化８】
2007527891.tif 000132
［式中、R1、R2およびR3は、独立して、水素、または2〜10個の炭素原子を持つヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基もしくはヒドロキシアルカリール基、好ましくは水素またはヒドロキシアルキル基、より好ましくは水素またはヒドロキシエチル基であり、
結合-O-(C=O)-は、カルボキシ基または反応性カルボキシ基とHAS分子のヒドロキシ基との反応によって形成されたものであり、HAS''は前記ヒドロキシ基を除くHAS分子を指す］
の構造を持つコンジュゲート。
【請求項６２】
タンパク質とポリマーまたはその誘導体とを含むコンジュゲートであって、ポリマーがヒドロキシアルキルデンプン（HAS）であり、タンパク質がIFNアルファ、IFNベータ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、第VII因子、第VIII因子、および第IX因子からなる群より選択され、前記コンジュゲートが式
【化９】
2007527891.tif 000133
および/または
【化１０】
2007527891.tif 000134
［式中、R1、R2およびR3は、独立して、水素、または2〜10個の炭素原子を持つヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基もしくはヒドロキシアルカリール基、好ましくは水素またはヒドロキシアルキル基、より好ましくは水素またはヒドロキシエチル基であり、
Lは置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状および/または環状炭化水素残基であって、少なくとも一つのヘテロ原子を含んでもよく、1〜60個、好ましくは1〜40個、より好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜6個、より好ましくは1〜2個の炭素原子、特に好ましくは1個の炭素原子を持ち、Lは特にCH2である］
の構造を持つコンジュゲート。
【請求項６３】
タンパク質とポリマーまたはその誘導体とを含むコンジュゲートであって、ポリマーがヒドロキシアルキルデンプン（HAS）であり、タンパク質がIFNアルファ、IFNベータ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、第VII因子、第VIII因子、および第IX因子からなる群より選択され、前記コンジュゲートが式
【化１１】
2007527891.tif 000135
［式中、R1、R2およびR3は、独立して、水素、または2〜10個の炭素原子を持つヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基もしくはヒドロキシアルカリール基、好ましくは水素またはヒドロキシアルキル基、より好ましくは水素またはヒドロキシエチル基であり、
L1およびL2は、独立して、置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状および/または環状炭化水素残基であって、少なくとも一つのヘテロ原子を含んでもよく、アルキル、アリール、アラルキルヘテロアルキル、および/またはヘテロアラルキル部分を含み、前記残基は1〜60個、好ましくは1〜40個、より好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個の炭素原子を持ち、
Dは結合、好ましくはL1に連結された適切な官能基F2とL2に連結された適切な官能基F3とによって形成された共有結合である］
の構造を持つコンジュゲート。
【請求項６４】
L1が-(CH2)n-であり、n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10、好ましくは2、3、4、5、6、より好ましくは2、3、4、特に好ましくは4である、請求項63に記載のコンジュゲート。
【請求項６５】
L2が適切に置換されていてもよいアリール部分、好ましくは6個の炭素原子を含有するアリール部分、特に好ましくはC6H4である、請求項63または64に記載のコンジュゲート。
【請求項６６】
F2が、
・C-C二重結合またはC-C三重結合または芳香族C-C結合；
・チオ基またはヒドロキシ基；
・アルキルスルホン酸ヒドラジド、アリールスルホン酸ヒドラジド；
・1,2-ジオール；
・1,2-アミノ-チオアルコール；
・アジド；
・1,2-アミノアルコール；
・アミノ基-NH2、または構造単位-NH-を含むアミノ基の誘導体、例えばアミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリールアミノ基；
・ヒドロキシルアミノ基-O-NH2、または構造単位-O-NH-を含むヒドロキシルアミノ基の誘導体、例えばヒドロキシルアルキルアミノ基、ヒドロキシルアリールアミノ基、ヒドロキシルアラルキルアミノ基、またはヒドロキシルアルカリールアミノ基；
・それぞれに構造単位-NH-O-を含む、アルコキシアミノ基、アリールオキシアミノ基、アラルキルオキシアミノ基、またはアルカリールオキシアミノ基；
・カルボニル基を持つ残基-Q-C(=G)-M
［式中、GはOまたはSであり、Mは例えば
・・-OHまたは-SH；
・・アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、またはアルカリールオキシ基；
・・アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルチオ基、またはアルカリールチオ基；
・・アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、アラルキルカルボニルオキシ基、アルカリールカルボニルオキシ基；
・・活性化エステル、例えばイミド構造を持つヒドロキシルアミン（例えばN-ヒドロキシスクシンイミド）のエステル、もしくは構造単位O-Nを持ち、Nがヘテロアリール化合物の一部であるヒドロキシルアミンのエステル、またはG＝OでありかつQが存在しない場合に、例えばペンタフルオロフェニル、パラニトロフェニルもしくはトリクロロフェニルなどの置換アリール残基を持つアリールオキシ化合物；
であり、Qは存在しないか、NHまたはSもしくはOなどのヘテロ原子である］；
・-NH-NH2、または-NH-NH-；
・-NO2；
・ニトリル基；
・カルボニル基、例えばアルデヒド基またはケト基；
・カルボキシ基；
・-N=C=O基または-N=C=S基；
・ハロゲン化ビニル基、例えばヨウ化ビニル基もしくは臭化ビニル基、またはトリフラート；
・-C≡C-H；
・-(C=NH2Cl)-Oアルキル
・基-(C=O)-CH2-Hal［式中、HalはCl、Br、またはIである］；
・-CH=CH-SO2-；
・構造-S-S-を含むジスルフィド基；
・基
【化１２】
2007527891.tif 000136
・基
【化１３】
2007527891.tif 000137
からなる群より選択され、F3がF2と化学結合を形成する能力を持つ官能基であって、好ましくは上記の群から選択され、F2は好ましくは部分-NH-、より好ましくはアミノ基を含み、F3は好ましくは部分-(C=G)-、より好ましくは-(C=O)-、より好ましくは部分-(C=G)-G-、さらに好ましくは-(C=O)-G-、特に好ましくは-(C=O)-Oを含み、Dは特に好ましくはアミド結合である、請求項63〜65のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項６７】
タンパク質とポリマーまたはその誘導体とを含むコンジュゲートであって、ポリマーがヒドロキシアルキルデンプン（HAS）であり、タンパク質がIFNアルファ、IFNベータ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、第VII因子、第VIII因子、および第IX因子からなる群より選択され、前記コンジュゲートが式
【化１４】
2007527891.tif 000138
［式中、部分-CH2-NH-の炭素原子は開環酸化反応によってポリマーに導入されたアルデヒド基に由来し、窒素原子はタンパク質のアミノ基に由来し、HAS''は反応に関与する前記アルデヒドの炭素原子を除くHAS分子を指す］
の構造を持つコンジュゲート。
【請求項６８】
タンパク質とポリマーまたはその誘導体とを含むコンジュゲートであって、ポリマーがヒドロキシアルキルデンプン（HAS）であり、タンパク質がIFNアルファ、IFNベータ、tPA、A1AT、第VII因子、および第IX因子からなる群より選択され、前記コンジュゲートが式
【化１５】
2007527891.tif 000139
［式中、R1、R2およびR3は、独立して、水素、または2〜10個の炭素原子を持つヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基もしくはヒドロキシアルカリール基、好ましくは水素またはヒドロキシアルキル基、より好ましくは水素またはヒドロキシエチル基であり、
Lは、置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状および/または環状炭化水素残基であって、少なくとも一つのヘテロ原子を含んでもよく、アルキル、アリール、アラルキルヘテロアルキル、および/またはヘテロアラルキル部分を含み、前記残基は2〜60個、好ましくは2〜40個、より好ましくは2〜20個、より好ましくは2〜10個の炭素原子を持ち、
硫黄原子はタンパク質のシステイン残基またはジスルフィド基に由来する］
の構造を持つコンジュゲート。
【請求項６９】
-L-が
-[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-
［式中、Ra、Rb、Rc、Rdは、独立して、水素、アルキル、アリール、好ましくは水素であり、
GはOおよびSからなる群より選択され、好ましくはOであり、
mは1、2、3または4、最も好ましくは2であって、残基RaおよびRbはm個のCRaRb基中で同じであっても異なってもよく、
nは1〜20、好ましくは1〜10、最も好ましくは1、2、3、または4であり、
oは1〜20、好ましくは1〜10、より好ましくは1、2、3、4、5、より好ましくは1または2、最も好ましくは1であり、残基RcおよびRdはo個のCRcRd基中で同じであっても異なってもよいか、
あるいは、
nは0であり、
oは2〜20、好ましくは2〜10、より好ましくは2、3、4、5、6、7、または8であり、残基RcおよびRdはo個のCRcRd基中で同じであっても異なってもよい］
である、請求項68に記載のコンジュゲート。
【請求項７０】
タンパク質とポリマーまたはその誘導体とを含むコンジュゲートであって、ポリマーがヒドロキシアルキルデンプン（HAS）であり、タンパク質がIFNアルファ、IFNベータ、tPA、A1AT、APC、第VII因子および第IX因子からなる群より選択され、前記コンジュゲートが式
【化１６】
2007527891.tif 000140
［式中、R1、R2およびR3は、独立して、水素、または2〜10個の炭素原子を持つヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基もしくはヒドロキシアルカリール基、好ましくは水素またはヒドロキシアルキル基、より好ましくは水素またはヒドロキシエチル基であり、
Lは、置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状および/または環状炭化水素残基であって、少なくとも一つのヘテロ原子を含んでもよく、アルキル、アリール、アラルキルヘテロアルキル、および/またはヘテロアラルキル部分を含み、前記残基は2〜60個、好ましくは2〜40個、より好ましくは2〜20個、より好ましくは2〜10個の炭素原子を持ち、
硫黄原子はタンパク質のシステイン残基またはジスルフィド基に由来する］
の構造を持つコンジュゲート。
【請求項７１】
-L-が
-[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-
［式中、Ra、Rb、Rc、Rdは、独立して、水素、アルキル、アリール、好ましくは水素であり、
GはOおよびSからなる群より選択され、好ましくはOであり、
mは1、2、3または4、最も好ましくは2であって、残基RaおよびRbはm個のCRaRb基中で同じであっても異なってもよく、
nは1〜20、好ましくは1〜10、最も好ましくは1、2、3、または4であり、
oは1〜20、好ましくは1〜10、より好ましくは1、2、3、4、5、より好ましくは1または2、最も好ましくは1であり、残基RcおよびRdはo個のCRcRd基中で同じであっても異なってもよいか、
あるいは、
nは0であり、
oは2〜20、好ましくは2〜10、より好ましくは2、3、4、5、6、7、または8であり、残基RcおよびRdはo個のCRcRd基中で同じであっても異なってもよい］
である、請求項70に記載のコンジュゲート。
【請求項７２】
ヒドロキシアルキルデンプンがヒドロキシエチルデンプンである、請求項54〜71のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項７３】
ヒドロキシエチルデンプンが2〜200kD、好ましくは4〜130kD、より好ましくは4〜70kDの分子量を持つ、請求項72に記載のコンジュゲート。
【請求項７４】
ヒトまたは動物の身体を処置する方法に用いられる、請求項52〜73のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項７５】
請求項52〜73のいずれか一項に記載のコンジュゲートを治療有効量で含む薬学的組成物。
【請求項７６】
少なくとも一つの薬学的に許容できる希釈剤、佐剤、または担体をさらに含む、請求項75に記載の薬学的組成物。
【請求項７７】
白血病、例えばヘアリー細胞白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、癌、例えばカルチノイド腫瘍、悪性黒色腫ならびに肝炎、例えば慢性B型肝炎および慢性C型肝炎を処置するための医薬品の製造を目的とする、タンパク質がIFNアルファである、請求項52〜73のいずれか一項に記載のHAS-タンパク質コンジュゲート（好ましくはHES-タンパク質コンジュゲート）の使用。
【請求項７８】
多発性硬化症（好ましくは再発型多発性硬化症）を処置するための医薬品の製造を目的とする、タンパク質がIFNベータである、請求項52〜73のいずれか一項に記載のHAS-タンパク質コンジュゲート（好ましくはHES-タンパク質コンジュゲート）の使用。
【請求項７９】
骨髄移植後、急性骨髄性白血病を持つ高齢者における誘導化学療法後、骨髄移植生着不全または骨髄移植生着遅延、動員、および自家末梢血前駆細胞の移植後の骨髄再構築のための医薬品の製造を目的とする、タンパク質がGM-CSFである、請求項52〜73のいずれか一項に記載のHAS-タンパク質コンジュゲート（好ましくはHES-タンパク質コンジュゲート）の使用。
【請求項８０】
重症敗血症、血栓症、血栓塞栓症または閉塞性疾患、特に閉塞性動脈疾患を処置するための医薬品の製造を目的とする、タンパク質がAPCである、請求項52〜73のいずれか一項に記載のHAS-タンパク質コンジュゲート（好ましくはHES-タンパク質コンジュゲート）の使用。
【請求項８１】
心筋梗塞（心臓発作）、血栓症、血栓塞栓症または閉塞性疾患、特に閉塞性動脈疾患を処置するための医薬品の製造を目的とする、タンパク質がtPAである、請求項52〜73のいずれか一項に記載のHAS-タンパク質コンジュゲート（好ましくはHES-タンパク質コンジュゲート）の使用。
【請求項８２】
肺気腫、嚢胞性線維症、アトピー性皮膚炎、および/または気管支炎を処置するための医薬品の製造を目的とする、タンパク質がA1ATである、請求項52〜73のいずれか一項に記載のHAS-タンパク質コンジュゲート（好ましくはHES-タンパク質コンジュゲート）の使用。
【請求項８３】
遺伝性欠損症、静脈閉塞性疾患、熱傷および冠動脈バイパス移植（CABG）術におけるヘパリン抵抗性の処置、換気療法に付随する微小血塊形成の予防、外傷もしくは胃腸手術に起因する腸穿孔、播種性血管内血液凝固（DIC）および/または敗血症の処置を行なうための医薬品の製造を目的とする、請求項52〜73のいずれか一項に記載のHAS-タンパク質コンジュゲート（好ましくはHES-タンパク質コンジュゲート）の使用。
【請求項８４】
第VIII因子または第IX因子に対する阻害因子を持つ血友病AまたはB患者におけるエピソードを処置するための医薬品の製造を目的とする、タンパク質が第VII因子である、請求項52〜73のいずれか一項に記載のHAS-タンパク質コンジュゲート（好ましくはHES-タンパク質コンジュゲート）の使用。
【請求項８５】
血友病Aを処置するための医薬品の製造を目的とする、タンパク質が第VIII因子である、請求項52〜73のいずれか一項に記載のHAS-タンパク質コンジュゲート（好ましくはHES-タンパク質コンジュゲート）の使用。
【請求項８６】
血友病B（好ましくは先天性第IX因子欠損症またはクリスマス病）を持つ患者における出血エピソードを管理および予防（手術状況下での出血の管理および予防を含む）するための医薬品の製造を目的とする、タンパク質が第IX因子である、請求項52〜73のいずれか一項に記載のHAS-タンパク質コンジュゲート（好ましくはHES-タンパク質コンジュゲート）の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒドロキシアルキルデンプンまたはヒドロキシアルキルデンプンの誘導体とタンパク質との間の共有結合によって形成されるヒドロキシアルキルデンプンとタンパク質とのコンジュゲートに関する。また本発明は、これらのコンジュゲートを製造する方法およびこれらのコンジュゲートの使用に関する。
【０００２】
タンパク質をポリマー分子に結合させると、そのタンパク質の安定性を改善することができ、そのタンパク質に対する免疫応答が減少することは、広く一般に受け入れられている。WO 94/28024は、ポリエチレングリコール（PEG）で修飾された生理活性タンパク質が、低下した免疫原性および抗原性を示し、非コンジュゲート化タンパク質よりもかなり長く血流中を循環する（すなわち低下したクリアランス率を持つ）ことを開示している。
【０００３】
WO 02/09766には、とりわけ、生物活性タンパク質と生体適合性ポリマー誘導体とのコンジュゲーションによって製造される生体適合性タンパク質-ポリマー化合物が開示されている。使用される生体適合性ポリマーは高反応性分岐ポリマーであり、結果として生じるコンジュゲートはポリマー誘導体とタンパク質との間に長いリンカーを含有する。生体適合性ポリマーとしては、式：(P-OCH2CO-NH-CHR-CO-)n-L-Qk-Aのポリマーが記載されている（式中、PおよびQはポリマー残基であり、kは1または0であることができる）。PおよびQについては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリトリメチレングリコール、ポリ乳酸およびその誘導体、ポリアクリル酸およびその誘導体、ポリアミノ酸、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリ(L-リジン)、ポリアルキレンオキシド、ポリアクリルアミド、およびデキストランまたは多糖などの水溶性ポリマーが挙げられている。タンパク質としては、とりわけ、アルファ、ベータおよびガンマ-インターフェロン、血液因子、サイトカイン、例えばインターロイキン、G-CSF、GM-CSFなどが挙げられている。WO 02/09766の実施例には、もっぱらインターフェロンおよび上皮成長因子、ならびにヒト成長ホルモンに結合されたモノ-、ジ-およびトリ-ポリエチレングリコール誘導体だけが開示されている。
【０００４】
WO 94/01483には、薬学的に純粋な合成親水性ポリマーに生物不活性なポリマーまたはポリマー誘導体を特殊なタイプの化学結合で共有結合することによって形成される生体適合性ポリマーコンジュゲートが開示されている。天然ポリマーおよびその誘導体として、ヒアルロン酸などの多糖、コンドロイチン硫酸A、BおよびC、キチン、ヘパリン、ヘパリン硫酸などのプロテオグリカン、シクロデキストリン、ヒドロキシエチルセルロール、セルロースエーテルおよびデンプンなどのデキストラン、トリグリセリドおよびリン脂質などの脂質が開示されている。合成ポリマーとしては、とりわけ、約100〜約100,000の平均分子量を持つポリエチレンおよびその誘導体が記載されている。ポリマーまたはポリマー誘導体に連結されるタンパク質としては、インターフェロン、腫瘍壊死因子、インターロイキン、コロニー刺激因子、成長因子、例えば骨原性因子抽出物（osteogenic factor extract）、上皮成長因子、トランスフォーミング成長因子、血小板由来成長因子、酸性線維芽細胞成長因子などといった、サイトカインおよび成長因子が記載されている。WO 94/01483ではどの実施例でも、ポリエチレングリコール誘導体がポリマーとして使用されている。
【０００５】
WO 96/11953には、N末端化学修飾タンパク質化合物およびそれらの製造方法が開示されている。具体的には、水溶性ポリマーをG-CSFのN末端に結合させることによって得られるG-CSF組成物が記載されている。WO 96/11953との関連では、水溶性ポリマーにN末端結合されたコンセンサスインターフェロンも開示されている。WO 96/11953には、広範囲にわたる種々の水溶性ポリマーが列挙されているが（例えばエチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマー）、ポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマーまたはポリオキシエチル化ポリオール）、WO 96/11953の実施例に記載されているのは、PEG化G-CSF組成物またはPEG化コンセンサスIFN組成物だけである。
【０００６】
WO 97/30148は、二つ以上のポリペプチド分子が結合されているポリマー担体分子を含む、低下したアレルゲン性を持つポリペプチドコンジュゲートに関する。これらのコンジュゲートは、好ましくは、介護市場で使用される組成物の一部である。前記コンジュゲートは、ポリマー担体分子を活性化し、二つ以上のポリペプチド分子を活性化ポリマー担体分子と反応させ、コンジュゲート上の残存活性基をブロックすることによって製造される。WO 97/30148には、ポリマー担体分子として、ポリオール、ポリアミン、ポリカルボン酸などの天然または合成ホモポリマーや、少なくとも二つの異なる付属基を含むヘテロポリマーのような、種々の化合物群を含む非常に多様な分子が列挙されている。スターPEG、分岐PEG、ポリビニルアルコール、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドンおよびポリ-D,L-アミノ酸を含む例が挙げられている。とりわけ、カルボキシメチルデキストランなどのデキストラン類、ヒドロキシエチルセルロールまたはヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース類、キトサンの加水分解物、ヒドロキシエチルデンプンまたはヒドロキシプロピルデンプンなどのデンプン類、グリコーゲン、アガロース、グアーゴム、イヌリン、プルラン、キサンタンゴム、カラゲニン、ペクチン、アルギン酸なども開示されている。ポリペプチドとして明示的に開示されているのは、いくつかの酵素だけである。
【０００７】
Baldwin,J.E.ら, Tetrahedron, vol.27 (1981), pp.1723-1726には、ヘモグロビンと反応させると可溶性ポリマー結合型ヘモグロビンを生じるアルデヒド置換ポリマーを得るための、デキストランおよびヒドロキシエチルデンプンの化学修飾が記載されている。これらは酸素を結合する能力を持つことが示されているが、心灌流実験は、これらのポリマー結合型ヘモグロビンが代用血液としての使用には適さないことを、明確に示した。
【０００８】
WO 99/49897には、デキストランまたはヒドロキシエチルデンプンなどの多糖をヘモグロビンのアミノ基と反応させることによって形成されるヘモグロビンのコンジュゲートが記載されている。多糖の官能基としては、酸化的糖開環によって生じるアルデヒド基が用いられる。使用される好ましい還元剤として、ジメチルアミンボランが開示されている。しかもWO 99/49897はもっぱらヘモグロビンに限定される。
【０００９】
WO 03/074087は、タンパク質をデンプン由来の修飾多糖に結合させる方法に関する。タンパク質と多糖ヒドロキシアルキルデンプンとの間の結合作用は、ヒドロキシアルキルデンプン分子の末端アルデヒド基または前記末端アルデヒド基の化学修飾によって得られる官能基と、タンパク質の官能基との間に形成される共有結合である。タンパク質の反応性基として、アミノ基、チオ基およびカルボキシル基が開示されており、タンパク質のアルデヒド基は言及されていない。しかも、極めて多種多様な結合の可能性が、種々の官能基、理論上適切な種々のリンカー分子、および種々の化学手法を含めて、数多くの一覧という形で記載されているが、実施例には二つの選択肢しか記載されていない。すなわち第一に、酸化型ヒドロキシエチルデンプンを使用し、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（EDC）活性化を利用してそれをタンパク質に直接結合させるか、非酸化型ヒドロキシエチルデンプンを使用し、それをタンパク質に直接結合させてシッフ塩基を形成させ、次にそれを個々のアミンに還元する。したがって、WO 03/074087の実施例には、タンパク質のチオ基またはカルボキシ基を介して結合されたコンジュゲートは一つも開示されていないし、ヒドロキシエチルデンプン、タンパク質、および一つ以上のリンカー分子を含むコンジュゲートも記載されていない。
【００１０】
ポリマーをタンパク質に結合させる技法に関する文献はほとんど全てが、PEG化法およびPEG化タンパク質（例えばインターフェロンアルファ、インターフェロンベータ）について記載している。単官能性PEG分子の結合方法および使用方法の進歩にもかかわらず、PEG化薬物の一般的欠点は、非天然ポリマーであるPEGの代謝経路が詳細にはわからないということである。
【００１１】
アミノ酸の置換によるインターフェロンの修飾、グリコシル化の増加、または多量体の形成が、いくつかの特許に記載されている。これらの方法は高度な技術的努力（組換え技法）を必要とし、天然タンパク質（例えばインターフェロン）とは著しく異なっていて、異なる性質を示しうる、新しい実体をもたらす可能性がある。
【００１２】
さらにまた、当技術分野では、金属錯体形成により、例えばIFN-ベータと多糖との複合体を形成させることも教示されている。しかし、複合体は共有結合型コンジュゲートほど安定ではなく、望ましくない副作用を持つかもしれない金属イオン（例えばZn2+）を含有する。
【００１３】
したがって本発明の目的は、これらのコンジュゲーション技法が持つ上述の短所を克服し、明確に定義された生分解性水溶性ポリマーに基づくインターフェロンベータコンジュゲートであって、ポリマーがタンパク質に共有結合されるものを提供することだった。
【００１４】
本発明のもう一つの目的は、これらのコンジュゲーション技法が持つ上述の短所を克服し、明確に定義された生分解性水溶性ポリマーに基づくインターフェロンアルファコンジュゲートであって、ポリマーがタンパク質に共有結合されるものを提供することだった。
【００１５】
本発明のさらにもう一つの目的は、これらのコンジュゲーション技法が持つ上述の短所を克服し、明確に定義された生分解性水溶性ポリマーに基づくAT IIIコンジュゲートであって、ポリマーがタンパク質に共有結合されるものを提供することだった。
【００１６】
本発明のさらにもう一つの目的は、これらのコンジュゲーション技法が持つ上述の短所を克服し、明確に定義された生分解性水溶性ポリマーに基づくGM-CSFコンジュゲートであって、ポリマーがタンパク質に共有結合されるものを提供することだった。
【００１７】
本発明のさらにもう一つの目的は、これらのコンジュゲーション技法が持つ上述の短所を克服し、明確に定義された生分解性水溶性ポリマーに基づくA1ATおよび/またはtPAおよび/またはAPCおよび/または第VII因子および/または第VIII因子および/または第IX因子コンジュゲートであって、ポリマーがタンパク質に共有結合されるものを提供することだった。
【００１８】
本発明のさらにもう一つの目的は、これらのコンジュゲートを製造する方法を提供することである。
【００１９】
したがって本発明は、タンパク質とヒドロキシアルキルデンプン（HAS）であるポリマーまたはその誘導体とを含むコンジュゲートを製造する方法であって、ポリマーまたはその誘導体の少なくとも一つの官能基Aを、タンパク質の少なくとも一つの官能基Zと反応させることによって共有結合を形成させることを含み、Zはアミノ基、チオール基、アルデヒド基およびケト基からなる群より選択され、
・Zがアルデヒド基またはケト基である場合、AはZとの前記結合を形成するアミノ基を含み、かつタンパク質はIFNベータ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、第VII因子、第VIII因子、および第IX因子からなる群より選択され、
・Zがアミノ基である場合、Aは反応性カルボキシ基およびアルデヒド基からなる群より選択され、かつタンパク質はIFNアルファ、IFNベータ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、第VII因子、第VIII因子、および第IX因子からなる群より選択され、
・・Aがアルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基である場合、本方法は、
・・・ポリマーを少なくとも二官能性である化合物（そのうち、一つの官能基はポリマーと反応し、少なくとも一つの他の官能基は、アルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基であるか、さらなる化学修飾を受けてアルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基を与える官能基である）と反応させることによって、もしくは
・・・ポリマーを酸化して少なくとも一つ（特に少なくとも二つ）のアルデヒド基を得ることによって、
ポリマーにAを導入してポリマー誘導体を得ることをさらに含み、
・・Aが反応性カルボキシ基である場合、本方法は、
・・・ポリマーをその還元末端で選択的に酸化し、結果として生じるカルボキシ基を活性化することによって、もしくは
・・・ポリマーをその非酸化型還元末端で炭酸ジエステルと反応させることによって、
ポリマーにAを導入してポリマー誘導体を得ることをさらに含み、または
・Zがチオール基である場合、タンパク質は、IFNアルファ、IFNベータ、tPA、A1AT、第VII因子および第IX因子からなる群より選択され、かつAは、Zとの前記結合を形成する
・・マレイミド基、もしくは
・・ハロゲンアセチル基
を含む、方法に関する。
【００２０】
したがって本発明は、上述の方法に従って得ることができるコンジュゲートにも関する。
【００２１】
本発明に従ってコンジュゲート化することができるタンパク質は、以下のように特徴づけることができる。
【００２２】
インターフェロンは、ウイルス感染および他の生物学的誘導因子に応答して抗ウイルス活性、抗増殖活性および免疫調整活性を媒介するサイトカインである。IFNアルファとは対照的に、IFNベータは高度に種特異的である。IFNベータには二つのサブタイプ、IFNベータ1aおよびIFNベータ1bがある。工業生産に関して言うと、IFNベータ1aとIFNベータ1bとの主な違いは、それらの生産に利用されるそれぞれの細胞系であり、その結果としてグリコシル化およびアミノ酸数が異なる。IFNベータ1aは哺乳動物細胞によって産生され、そのアミノ酸配列が天然インターフェロンベータのアミノ酸配列と同一であるため、1aと命名された。IFNベータ1bは細菌によって産生される。他の大半の哺乳動物タンパク質と同様に、インターフェロンもグリコシル化による翻訳後修飾を受ける。しかし細菌はタンパク質をグリコシル化する能力を欠き、したがってIFNベータ1bは天然物に見いだされる糖側鎖を含まない。IFNベータ1aは166個のアミノ酸を有し、分子量は約22,500Dであるが、IFNベータ1bは、細菌生産法のせいでグリコシル化を欠いているだけでなく、N-末端メチオニンも欠いているので、IFNベータ1bは165個のアミノ酸を有し、分子量は約18,500Dである。ヒトインターフェロンベータのアミノ酸配列は、例えばEP 0 218 825 A1に記載されている。インターフェロンベータの結晶構造は、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) pp.11813-11818, Biochemistry, Karpusas M, Nolte M, Benton CB, Meier W, Lipscomb WN, Goelz Sに報告された。市販のインターフェロンベータ製剤はBetaseron（IFNベータ1b）、AvonexおよびRebif（IFNベータ1a）である。インターフェロンベータ1bは、ヒトインターフェロンベータSer17の遺伝子を含有する遺伝子改変プラスミドを保持している大腸菌株の細菌発酵によって製造される。ネイティブ遺伝子はヒト線維芽細胞から取得され、17位に見いだされるシステイン残基がセリンで置換されるように改変された。インターフェロンベータ1aは、ヒトインターフェロンベータ遺伝子が導入されている遺伝子改変チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を使って、組換えDNA技術により製造される。IFNベータ1aのアミノ酸配列は、天然線維芽細胞由来ヒトインターフェロンベータのアミノ酸配列と同一である。天然インターフェロンベータおよびインターフェロンベータ1aはグリコシル化され、それぞれAsn80に一つのN結合型複合型糖質部分を含有する。インターフェロンベータ薬は、再発寛解型多発性硬化症の処置に適応を持つ。しかしインターフェロンベータ製剤の投与に関係する重篤な副作用は数多くある。さらにまた、それらは、付加的なリスクをもたらす注射によって（筋肉内または皮下に）投与される。副作用を低減し投与を容易にすること（例えば頻度を減らすこと）が、IFNベータの性質を改善するために多くの開発研究が行なわれる理由である。タンパク質のポリマー修飾は、タンパク質の性質を改善するために応用される技法である。主に用いられる技法は、ポリエチレングリコールによるインターフェロンの修飾であり、これはPEG化と呼ばれている。
【００２３】
IFNアルファ型は、自然界では、ウイルス、核酸、グルココルチコイドホルモン、および他の誘導因子による誘導後に、単球/マクロファージ、リンパ芽球様細胞、線維芽細胞およびいくつかの異なる細胞タイプによって産生される。IFNアルファには少なくとも23種類の変種が知られている。個々のタンパク質は19〜26kDの分子量を持ち、156〜166または172アミノ酸の長さを持つタンパク質からなる。全てのIFNアルファサブタイプはアミノ酸位置115〜151に共通する保存された配列領域を有し、アミノ末端は不定である。多くのIFNアルファサブタイプは、その配列が一つまたは二つの位置で異なるだけである。位置1/98および29/138のシステイン間にジスルフィド結合が形成される。ジスルフィド結合29/138は生物活性には必須であるが、1/98結合は生物活性に影響を及ぼさずに還元することができる。全てのIFNアルファ型は潜在的グリコシル化部位を含有するが、ほとんどのサブタイプはグリコシル化されない。IFNガンマとは対照的に、IFNアルファタンパク質はpH2で安定である。IFNアルファの工業生産は遺伝子改変大腸菌を使って行なわれる。細菌はタンパク質をグリコシル化する能力を欠くので、承認された製剤に用いられるINFアルファの二つの変種（IFNアルファ2aおよびIFNアルファ2b）は、どちらもグリコシル化されていない。従来のIFNアルファの主な短所は副作用である。C型肝炎の処置に適応を持つインターフェロンアルファ薬の改善に対して多くの研究がなされてきた。タンパク質のポリマー修飾は、タンパク質の性質を改善するために応用される技法である。主に用いられる技法は、ポリエチレングリコールによるインターフェロンの修飾であり、これはPEG化と呼ばれている。PEGIntron（SP）とPegasys（Roche）の二つは、IFNアルファの市販のPEG化変種である。
【００２４】
アンチトロンビンIII（AT III）は、トロンビンおよび第Xa因子を阻害するセリンプロテアーゼ阻害因子である（Travis, Annu. Rev. Biochem. 52:655, 1983）。程度は下がるものの、第IXa因子、第XIIa因子、tPA、ウロキナーゼ、トリプシン、プラスミンおよびカリクレインも阻害される（Menache, Semin. Hematol. 28:1, 1991；Menache, Transfusion 32:580, 1992；Lahiri, Arch. Biochem. Biophys. 175:737, 1976）。ヒトAT IIIは、約58,000Dの分子量（MW）を持つ432アミノ酸の一本鎖糖タンパク質として、肝臓で合成される。その正常血漿濃度は14〜20mg/dLの範囲にある（Rosenberg, Rev. Hematol. 2:351, 1986；Murano, Thromb. Res. 18:259, 1980）。このタンパク質は三つのジスルフィド橋（Cys 8-128、Cys 21-95、Cys 247-430）および全質量の15％を占める四つのN結合型糖鎖（Asn 96、-135、-155、-192）を有する（Franzen, J. Biol. Chem. 255:5090, 1980；Peterson「The Physiological Inhibitions of Blood Coagulation and Fibrinolysis」Elsevier/North-Holland Biomedical Press 1979, p.43）。アンチトロンビンは、血液凝固の制御にとても重要なセルピンタイプのセリンプロテアーゼ阻害因子である。AT IIIはヒト血漿中を循環する最も豊富な内在性抗凝固因子であり、生理的状態および病的状態の両方で凝固の調節に関与する（Opal, Crit. Care Med. 2002, 30:325）。これは、低いトロンビン阻害能力を持つ二つの形態で循環する（Pike, J. Biol. Chem. 272:19562, 1997；Ersdal-Badju, Fed. Proc. 44:404, 1985）（85-95％は四つの二側鎖型モノ-およびジ-シアリル化オリゴ糖鎖を持つアルファ・アイソフォームであり、5〜15％は、Asn135のグリコシル化、2〜6個の末端シアル酸結合を欠く、高ヘパリン親和性ベータ・アイソフォームである）。循環AT IIIのごく一部は通常、血管内皮細胞表面上のプロテオグリカンに結合する。これらのプロテオグリカンは主にヘパラン硫酸である。ヘパラン硫酸はヘパリンと類似する構造を持つ分子であり、ヘパリンと同じようにトロンビンの阻害を触媒することができる。明確に定義されたヘパリンの五糖単位にAT IIIが結合すると、タンパク質のコンフォメーション変化が起こる（Choay, Ann. NY Acad. Sci. 370:644, 1981；Choay, Biochem. Biophys. Res. Commun. 116:492, 1983；Olson, J. Biol. Chem. 266:6353, 1991；Bauer, Semin. Hematol. 28:10, 1991；Carell, Thromb. Haemost. 78:516, 1997）。この結合は、トロンビンおよび第Xa因子に対するAT III阻害活性の1000倍増を触媒する（Rosenberg, Fed. Proc. 44:404, 1985；Bjork著「Antithrombin and related inhibitors of coagulation proteinases（アンチトロンビンおよび凝固プロテイナーゼの関連阻害因子）」［Barett, Salvesen編「Proteinase Inhibitor」第17巻（オランダ・アムステルダム，Elsevier Science Publishers (Biomedical Division), 1986）の489頁］；Olson, J. Biol. Chem. 267:12528, 1992）。内因系凝固カスケードの酵素が共通して生成する内皮表面上でATの一部が起こすこの局在化により、AT IIIはこれらの止血酵素を迅速に中和し、天然の表面を血栓形成から保護することができる。したがって、血栓事象の予防におけるAT IIIの重要な性質は、触媒ヘパリンを結合して、その阻害特性を変化させるコンフォメーション変化を起こし、トロンビンまたは第Xa因子に不可逆的に結合することによって、それらの活性を阻害するというその能力である。AT IIIは抗炎症性も持ち、そのうちのいくつは凝固カスケードにおけるその作用によってもたらされる（Roemisch, Blood Coagul Fibrinolysis. 2002, 13:657）。活性化第X因子および活性化トロンビンのよう��活性化凝固プロテアーゼは、例えば炎症促進性媒介物質の放出などにより、炎症の一因となる。これらのプロテアーゼがAT IIIによって阻害されると、それらと細胞との特異的相互作用および後続の反応が妨げられる（Roemisch, Blood Coagul Fibrinolysis. 2002, 13:657）。凝固とは無関係なAT IIIの抗炎症性は、例えばプロスタサイクリンなどの放出につながる細胞との直接相互作用を伴う。最近同定された細胞受容体シンデカン4へのAT IIIの結合は、リポ多糖のような媒介物質によって誘導される細胞内シグナルの妨害につながり、その結果として、炎症応答の下方調整につながる（Roemisch, Blood Coagul Fibrinolysis. 2002, 13:657）。AT IIIの生理機能にとってはヘパリン-AT III複合体が重要であることから、遊離AT III構造の解析に加えて、ヘパリンのオリゴ糖単位に対する複合体化部位を評価する研究が、数多く行なわれている（Choay, Ann. NY Acad. Sci. 370:644, 1981；Choay, Biochem. Biophys. Res. Commun. 116:492, 1983；Olson, J. Biol. Chem. 266:6353, 1991；Bauer, Semin. Hematol. 28:10, 1991；Carell, Thromb. Haemost. 78:516, 1997）。AT IIIは古典的なヒト血漿分画技法に従って生産することができる。AT IIIに対するヘパリンの高い親和性を利用するアフィニティークロマトグラフィー（ヘパリン-セファロース）と、それに続くウイルス不活化のための熱処理が、血漿からの分離に用いられる。AT III生産に利用することができる最近の代替法は、この治療タンパク質をより安全に入手することができる組換え生産技法である（Levi, Semin Thromb Hemost 27:405, 2001）。ATryn（商標）はGenzyme Transgenics Corp.（GTC）がトランスジェニックヤギで生産した組換えヒトAT III（rhAT III）である。血漿由来AT III（phAT III）とrhAT IIIの構造的および機能的性質を比較する詳細な研究が行なわれている（Edmunds, Blood, 91:4561, 1998）。この実験によれば、rhAT IIIはグリコシル化を除けばphAT IIIと構造的に同一である。遺伝子導入によって生産された物質のAsn155上にはオリゴマンノース構造が見いだされたのに対して、血漿由来タンパク質の場合は複合型構造が検出される。pdAT IIIのガラクトース単位の一部は、rhAT IIIにおいてはGalNac単位で置換される。rhAT IIIの方がフコシル化度が高いことは、もう一つの相違である。最後に、両タンパク質のシアリル化パターンは二つの点で異なる。すなわち、rhAT IIIはシアリル化度が低く、N-アセチルノイラミン酸およびN-グリコリルノイラミン酸を含有する。両分子のこれら二つの糖質部分間に見られるこの構造上の相違は、生化学的性質の相違ももたらす。欧州の病院市場では以下のAT III薬を入手することができる。（出典：IMS-ATCグループ2001）：Kybernin（Aventis Behring）、AT III（Baxter, Grifols）、Atenativ（Pharmacia）、Aclotine（LFB）、Grifols（Anbin）。
【００２５】
第VII因子はプロテイナーゼの内因系血液凝固カスケードに関与し、凝固カスケードの内因系経路を活性化することによって止血を促進する。第VII因子は、第Xa因子、第XIIa因子、第IXa因子、またはトロンビンにより、小タンパク質分解によって第VIIa因子に変換される。次に、第VIIa因子は、組織因子およびカルシウムイオンの存在下で、限定的タンパク質分解により、第X因子を第Xa因子に変換する。第VIIa因子は、組織因子およびカルシウムの存在下で、第IX因子を第IXa因子にも変換する。第VII因子は、406個のアミノ酸残基からなるビタミンK依存性糖タンパク質（MW 50Kダルトン）である。第VII因子は、献血されたヒト血漿から従来の抽出法によって生産されるか、あるいは最近では組換え系を使って生産される。Novo Nordiskは、NovoSeven（登録商標）の生産に、ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞を使用する。55KDaの公称分子量を持つ406アミノ酸の一本鎖タンパク質として発現される（Thim,L.ら, Biochemistry 27:7785-7793 (1988)）。この分子は四つの糖側鎖を有する。Ser 52、60のO結合型糖側鎖二つと、Asn 145、322のN結合型糖側鎖二つである（Thim,L.ら, Biochemistry 27:7785-7793 (1988)）。
【００２６】
第VIII因子はプロテイナーゼの内因系凝固カスケードに関与し、第IXa因子が第X因子を活性型である第Xa因子に変換する反応（これは最終的にフィブリン塊の形成につながる）において補因子として役立つ。第VIII因子の欠如または不安定性は、よく見られる劣性x連鎖凝固障害である血友病Aにつながる。血友病Aの頻度は、全ての民族で、男児の出生10,000件あたり1〜2件である。患者は、正常レベルをかなり下回るレベルの第VIII因子を発現させるか、または血漿中にかなりの量（正常値の少なくとも30％）の第VIII因子を持つが、そのタンパク質が非機能的であるという、いわゆるcrm（交差反応性物質）陽性患者群（患者の約5％）に属する。全患者の約50％は、第VIII活性が正常値の1％未満である重症血友病Aを持ち、彼らは関節、筋および内臓への特発出血を頻繁に起こす。
【００２７】
患者の30〜40％に見いだされる軽度血友病Aは、正常値の5〜30％の活性を伴う。出血は著しい外傷または外科手術後だけに起こる。中等度の血友病Aは患者の約10％に見いだされ、この場合、第VIII因子活性は正常値の2〜5％であり、出血はわずかな外傷後でも起こる。第VIII因子のヒトインビボ半減期は通常10〜15時間であるが、その放出、安定性および分解動態はもう一つの因子フォンウィルブランド因子の影響も受けることに注意する必要がある。
【００２８】
第VIII因子は、献血されたヒト血漿から従来の抽出法によって生産されるか、あるいは最近では組換え系を使って生産される。BayerではKogenateの生産にベビーハムスター腎臓（BHK）細胞が使用され、一方、Baxterでは、267kDの公称分子量を持つ2351アミノ酸の完全な一本鎖タンパク質として（Tooleら, 1984, Nature 312:342）、または製品の安定性を増し生産収率を向上させる目的でBドメイン全体もしくはその一部が削除された異なる形態で（Bhattacharyyaら 2003, CRIPS 4/3:2-8）、その製品Recombinateに、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞が使用される。前駆体生成物はゴルジで200kDaと80kDaの二本のポリペプチド鎖に加工され、金属イオンによって一つにつなぎ止められたそれら二本の鎖が血中に発現される（Kaufmanら, 1988, J. Biol. Chem., 263:6352）。
【００２９】
凝血促進活性には、トロンビン切断による重鎖の54kDaおよび44kDa断片と72kDa軽鎖断片との生成が、さらに必要である（Alyら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA:4933）。したがって、ヒト血漿由来の第VIII因子濃縮物には、断片化された完全に活性な第VIII因子の形態がいくつか記述されている（Andersonら, 1986, Proc. Natl. Acad, Sci. 83:2979）。
【００３０】
血漿第VIII因子投与または組換え第VIII因子投与の一般的な副作用は、極めて多数の患者（最高30％）に見られる免疫反応であり、これにより治療価値が失われる。これまで、認容性の経口誘導によって患者の認容性を増すために、さまざまな試みが着手されたが、その結果はあまり期待できるものではなかった。認容性を誘導する新しい遺伝学的手段が提案されているが、まだ広く応用されてはいない。HES化タンパク質は免疫原性の程度が下がっていると予想され、それゆえにこの合併症を低減することができるだろう。
【００３１】
第VIII因子はリジン残基に極めて富んでおり（全部で2350アミノ酸のうち220を超える；添付資料1（attachment 1）参照）、それらは還元的アミノ化アプローチに使用することができるだろう。
【００３２】
第IX因子は、Ca(2+)イオン、リン脂質および第VIIIa因子の存在下で第X因子をその活性型に変換することによって内因系血液凝固経路に関与するビタミンK依存性血漿タンパク質である。第IX因子は一本鎖中の415アミノ酸からなる分子量約55,000Daの糖タンパク質である（Yoshitake S.ら, Biochemistry 24:3736-3750(1985)）。第IX因子は献血されたヒト血漿から従来の抽出法によって生産されるか、あるいは最近では組換え系を使って生産される。Wyethでは、BeneFIX（登録商標）の生産に、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を使用している。これは、血漿由来第IX因子のAla148対立遺伝子型と同じ一次アミノ酸配列を持ち、内在性第IX因子に似た構造上および機能上の特徴を持つ。このタンパク質は八つの糖側鎖を有する。Ser 53、61およびスレオニン159、169、172、179の六つのO結合型糖側鎖ならびにAsn 157、167の二つのN結合型糖側鎖である（Yoshitake S.ら, Biochemistry 24:3736-3750(1985)；Balland A.ら, Eur J Biochem. 1988;172(3):565-72）。
【００３３】
ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（hGM-CSF）は、造血前駆細胞の調節および分化ならびに成熟細胞集団の機能的活性化の刺激に不可欠な初期作用因子である。これはクローニングされ、酵母、細菌、昆虫、植物および哺乳動物細胞で発現されて、構造、組成、血清半減期および生体内での機能が異なるタンパク質が得られている（Donahue,R.E., Wang,E.A., Kaufman,R.J., Foutch,L., Leary,A.C., Witek-Giannetti,J.S., Metzeger,M., Hewick,R.M., Steinbrink,D.R., Shaw,G., Kamen,R., Clark,S.C.「Effects of N-linked carbohydrates on the in vivo properties of human GM-CSF（N結合型糖質がヒトGM-CSFのインビボ特性に及ぼす影響）」Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1986, 51, pp.685-692）。天然のおよび哺乳動物細胞由来のhGM-CSFは127アミノ酸タンパク質であり、N-グリカンとO-グリカンの両方を含有している。これは、一つまたは二つのN-グリコシル化部位およびO-グリコシル化部位の占有状態が異なるために、高度に不均一である（Cebon,J., Nicola,N., Ward,M., Gardner,I., Dempsey,P., Layton,J., Duerhrsen,U., Burgess,A., Nice,E., Morstyn,G.「Granulocyte-macrophage colony stimulating factor from human lymphocytes. The effect of glycosylation on receptor binding and biological activity（ヒトリンパ球由来の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子．グリコシル化が受容体結合および生物活性に及ぼす影響）」J. Biol. Chem. 1990, 265, 4483-4491；Kaushansky,K., O'Hara,P.J., Hart,C.E., Forstran,J.W., Hagen,F.S.「Role of carbohydrate in the function of human Granulocyte-Macrophage Colony-stimulating Factor（ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子の機能における糖質の役割）」Biochemistry 1987, 26, pp.4861-4867；Armitage,J.O.「Emerging applications of recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor（組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の新しい用途）」Blood 1998, 92, pp.4491-4508）。このリンホカインは、骨髄性白血病の処置に役立つ可能性があり、免疫不全症を患っている患者または疾患もしくは放射線照射および/または化学療法によって抑制されている患者における顆粒球およびマクロファージ産生を刺激する能力を持つので、臨床上重要である（Moonen,P., Mermod,J.J., Ernst,J.F., Hirschi, M., DeLamarter,J.F.「Increased biological activity of deglycosylated recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor produced by yeast or animal cells（酵母または動物細胞によって産生された脱グリコシル化組換えヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子の増加した生物活性）」Proc. Natl. Acad. Sci. US. 1987, 84, pp.4428-4431に概説されている）。N結合型糖質を欠くhGM-CSFがネイティブ組換えサイトカインと比較して有意に高い比活性を持つことは、いくつかの研究によって示唆されている（Armitage,J.O.「Emerging applications of recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor（組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の新しい用途）」Blood 1998, 92, pp.4491-4508；Okamoto,M., Nakai,M., Nakayama,C., Yanagi,H., Matsui,H., Noguchi,H., Namiki,M., Sakai,J., Kadota,K., Fukui,M., Hara,H.「Purification and characterization of three forms of differently glycosylated recombinant human Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor（グリコシル化様式が異なる三形態の組換えヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子の精製および特性解析）」Arch. Biochem. Biophys. 1991, 286, pp.562-568；Hovgaard,D., Mortensen,B.T., Schifter,S., Nissen,N.I.「Clinical pharmacokinetic studies of a human haemopoietic growth factor, GM-CSF（ヒト造血成長因子GM-CSFの臨床薬物動態研��）」Eur. J. Clin. Inv. 1992, 22, pp.45-49）。しかし、hGM-CSFの機能、例えば薬物動態（Cebon,J., Nicola,N., Ward,M., Gardner,I., Dempsey,P., Layton,J., Duerhrsen,U., Burgess,A., Nice,E., Morstyn,G.「Granulocyte-macrophage colony stimulating factor from human lymphocytes. The effect of glycosylation on receptor binding and biological activity（ヒトリンパ球由来の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子．グリコシル化が受容体結合および生物活性に及ぼす影響）」J. Biol. Chem. 1990, 265, pp.4483-4491；Hovgaard,D., Mortensen,B.T., Schifter,S., Nissen,N.I.「Clinical pharmacokinetic studies of a human haemopoietic growth factor, GM-CSF（ヒト造血成長因子GM-CSFの臨床薬物動態研究）」Eur. J. Clin. Inv. 1992, 22, pp.45-49；Denzlinger,C., Tetzloff,W., Gerhartz,H.H., Pokorny,R., Sagebiel,S., Haberl,C., Wilmanns,W.「Differential activation of the endogenous leukotriene biosynthesis by two different preparations of Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor in healthy volunteers（健常ボランティアにおける二種類の顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子調製物による内在性ロイコトリエン生合成の差別的活性化）」Blood 1993, 81, pp.2007-2013）、毒性（Denzlinger,C., Tetzloff,W., Gerhartz,H.H., Pokorny,R., Sagebiel,S., Haberl,C., Wilmanns,W.「Differential activation of the endogenous leukotriene biosynthesis by two different preparations of Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor in healthy volunteers（健常ボランティアにおける二種類の顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子調製物による内在性ロイコトリエン生合成の差別的活性化）」Blood 1993, 81, pp.2007-2013）および免疫原性（Donahue,R.E., Wang,E.A., Kaufman,R.J., Foutch,L., Leary,A.C., Witek-Giannetti,J.S., Metzeger,M., Hewick,R.M., Steinbrink,D.R., Shaw,G., Kamen,R., Clark,S.C.「Effects of N-linked carbohydrates on the in vivo properties of human GM-CSF（N結合型糖質がヒトGM-CSFのインビボ特性に及ぼす影響）」Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1986, 51, pp.685-692；Revoltella,R., Laricchia-Robbio,L., Moscato,S., Genua,A., Liberati,A「Natural and therapy-induced anti-GM-CSF and anti-G-CSF antibodies in human serum（ヒト血清における天然のおよび治療誘発性の抗GM-CSFおよび抗G-CSF抗体）」Leukemia and Lymphoma 1997, 26, pp.29-34；Ragnhammar,P., Friesen,H-J., Froedin,J-E., Lefvert,A-K., Hassan,M., Oesterborg,A., Mellstedt,H.「Induction of anti-recombinant human Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor (Escherichia coli-derived) antibodies and clinical effects in nonimmunocompromised patients（非免疫障害患者における抗組換えヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（大腸菌由来）抗体の誘導と臨床効果）」Blood 1994, 84, pp.4078-4087；Wadhwa,M., Hjelm Skog,A-L., Bird,C., Ragnhammar,P., Lilljefors,M., Gaines-Das,R., Mellstedt,H., Thorpe,R.「Immunogenicity of Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor (GM-CSF) products in patients undergoing combination therapy with GM-CSF（GM-CSFを使った併用療法を受けている患者における顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）の免疫原性）Clinical Cancer Research 1999, 5, pp.1351-1361；Gribben,J.G., Devereix,S., Thomas,N.S.B., Keim,M., Jones,H.M., Goldstone,A.H., Linch,D.C.「Development of antibodies to unprotected glycosylation sites on recombinant GM-CSF（組換えGM-CSF上の非保護グリコシル化部位に対する抗体の発生）」Lancet 1990, 335, pp.434-437）などにおける糖鎖の重要な役割を裏付ける証拠は、非常に数多くある。大腸菌由来および酵母由来のGM-CSF臨床製品についてしばしば報告されてきた抗原性を考慮すると、非哺乳動物発現系から製造されたものを含めて、この製品には、化学修飾ストラテジーが有望なアプローチになると考えら��る。GM-CSF調製物はLeukine（Immunex）およびLeucomax（Novartis）の名称で入手することができる。GM-CSFは、骨髄移植後、骨髄移植生着不全または骨髄移植生着遅延、動員、および自家末梢血前駆細胞の移植後、および急性骨髄性白血病を持つ高齢者における誘導化学療法後の骨髄再構築に使用される。
【００３４】
アルファ1-アンチトリプシン（A1AT、アルファ1-プロテイナーゼ阻害因子ともいう）は、好中球エラスターゼ、トロンビン、第Xa因子および第XIa因子を含む事実上全ての哺乳動物セリンプロテアーゼを阻害することが示されているプロテイナーゼ阻害因子である（Travis Ann. Rev. Biochem. 52 (1983) p.655）。A1ATは、肝臓で合成される一本鎖糖タンパク質であり、394個のアミノ酸および53kDの分子量を持つ。血漿濃度は1〜1.3g/lの範囲にある。タンパク質全体にシステインが一つしか存在しないので、分子内ジスルフィド橋を形成することはできない。この分子は、分子量の12％に相当する三つの糖側鎖を有する（Asn 46、83、247）（Mega J. Biol. Chem. 255 (1980) p.4057；Mega J. Biol. Chem. 255 (1980) p.4053；Carell FEBS Letters 135 (1981) p.301；Hodges Biochemistry 21 (1982) p.2805）。それぞれ二側鎖型構造または三側鎖型構造を持つ似つ2タイプの糖鎖が見いだされた（Hodges J. Biol. Chem. 254 (1979) p.8208）。ヒトA1ATは一般集団に少なくとも20の異なる形態で見いだされる。この微小不均一性は、2タイプの糖鎖がさまざまな量で存在する結果である。重要な機能は好中球エラスターゼの活性制御である（Travis Ann. Rev. Biochem. 52 (1983) p.655）。無制御なエラスターゼ活性は上皮組織への攻撃を引き起こして、回復不能な損傷をもたらす。不活化の過程において、A1ATはエラスターゼの基質として作用して、このプロテーゼの活性中心に結合し、次にこの複合体形成によってプロテアーゼを不活化する。A1ATが不足すると、例えば肺上皮の損傷に関係する肺気腫が起こる。A1ATの三つのN-グリコシル化部位に対するA1ATの2タイプの糖側鎖の分布は、A1ATの各アイソタイプごとに異なる。A1ATの古典的生産はさまざまなアフィニティークロマトグラフィー段階を用いるヒト血漿分画法で行なわれる。しかし、最近のA1AT生産法では組換え技術が使用される。PPL Therapeuticsは、トランスジェニックヒツジの乳汁からの組換えヒトA1AT（rHA1AT）の回収を可能にする方法を開発した（Olman Biochem. Soc. Symp. 63 (1998) p.141；Tebbutt Curr. Opin. Mol. Ther. 2 (2000) p.199；Carver Cytotechnology 9 (1992) p.77；Wright Biotechnology (NY) 9 (1991) p.830）。分子のタンパク質部分に関して、rhA1ATはpdA1ATと比較して同じ構造を示す。しかし、組換え生産された他のヒトタンパク質がそうであるように、糖側鎖に（特にシアル酸残基の量に関して）相違が存在する。
【００３５】
組織型プラスミノゲン活性化因子（tPA）は、クロット溶解に重要なトリプシン様セリンプロテアーゼである。フィブリンクロットの存在下で、tPAはプラスミノゲンをプラスミンに変換し、それがフィブリンを分解する。tPAはフィブリンの存在下では増大した活性を示し、その結果として、フィブリン特異的なプラスミノゲン活性化を引き起こす（M.W.Spellman, L.J.Basa, C.K.Leonard, J.A.Chakel, J.V.O'Connor, The Journal of Biological Chemistry 264 (1989) p.14100）。プラスミンはフィブリンを可溶化してフィブリン分解産物を生じる。正のフィードバック機構により、フィブリンは、tPAによるプラスミノゲン活性化を刺激することによって、自分自身の分解を増進する（R.J. Stewartら The Journal of Biological Chemistry 275 (2000) pp.10112-10120）。htPAはさまざまなタイプの組織に存在する線維素溶解の生理的活性化因子である。これは約68kDの分子量を持つ糖タンパク質である。ネイティブ型の場合、tPAは単鎖型（一本鎖組織型プラスミノゲン活性化因子，sctPA）として存在し、これはペプチド結合Arg275-Ile276におけるプラスミンの切断により、二本鎖構造（二本鎖組織型プラスミノゲン活性化因子，tctPA）に変換されうる。これは、線維素溶解治療のために、rtPA（組換え組織型プラスミノゲン活性化因子）として組換え生産される。異なるタイプのtPAが存在し、糖質構造の構造的相違を示す。I型tPAはAsn117、Asn184およびAsn448にN結合型オリゴ糖を持つ。II型tPAはAsn117およびAsn448がグリコシル化される。どちらの型もThr61にO結合型フコース残基を含有する（K. Moriら The Journal of Biological Chemistry 270 (1995) pp.3261-3267）。CHO細胞で発現させたtPAの糖質構造が調べられ、多種多様な二側鎖型、三側鎖型および四側鎖型糖鎖構造が示された（M.W.Spellman, L.J.Basa, C.K.Leonard, J.A.Chakel, J.V.O'Connor, The Journal of Biological Chemistry 264 (1989) p.14100）。tPAの一次構造は数個のシステインを含有する。これらは架橋されると共に、部位83には遊離のシステイン残基を持ち、これがもう一つのtPAと相互作用することで二量体を形成しうる。tPAのインビボクリアランスは糖質構造の影響（特にAsn117に結合した高マンノース型オリゴ糖の影響）を受けることを、いくつかの結果が示している。提案されたもう一つのクリアランス機序には、肝細胞上の高親和性受容体によるThr61のO結合型フコース残基の認識が関与する。この残基はCys83に近い。半減期を延ばすために、生物工学を適用したtPA（TNK-tPA）が開発された。部位117のアスパラギンをグルタミンで置換し、部位103のスレオニンをアスパラギンで置換することにより、117位のグリコシル化部位が103位に移された。TNK-tPAは、プロテアーゼドメイン中にテトラアラニン置換を持つため、プラスミノゲン活性化因子阻害因子1による不活化に対して耐性である（R.J.Stewartら The Journal of Biological Chemistry 275 (2000) pp.10112-10120）。TNK-tpAはTenecteplase（登録商標）（Boehringer Ingelheim）として販売されており、tPAがボーラスとそれに続く注入という形で投与する必要があるのに対して、単回静脈内ボーラスとして投与することができる。
【００３６】
活性化プロテインC（APC）は、凝固および重症敗血症に関連する炎症の調整物質である。活性化プロテインCはトロンボモジュリンに結合したトロンビンによってその不活性前駆体（プロテインC）から変換される。この複合体はプロテインCの重鎖から短いN末端活性化ペプチドを切り落として、活性化プロテインCをもたらす。ドロトレコギン・アルファ（活性型）は、血漿由来の活性化プロテインCと同じアミノ酸配列を持ち、類似する性質を示す、組換えヒト活性化プロテインC（rhAPC）である。活性化プロテインCはEli LillyによりXigris（登録商標）として販売されている。これは、プロテインC発現ベクターが導入されたヒト細胞株（HEK293）で生産される。この細胞株が特に使用されたのは、この細胞株が機能的活性に必要な一連の複雑な翻訳後修飾を正しく行なう能力を持つからである。組換えヒト活性化プロテインCは、四つのN-グリコシル化部位と12個のジスルフィド結合を含有する二本鎖糖タンパク質である。重鎖は250アミノ酸を含有し、そのうちの7残基がシステインであり、三つのN結合型グリコシル化部位を持っている（Asn-248、Asn-313およびAsn-329）。7個のシステイン残基は、重鎖内で三つのジスルフィド結合を形成すると共に、鎖間に一つのジスルフィド結合を形成する。軽鎖は一つのN結合型グリコシル化部位（Asn-97）を含有すると共に、17個のシステイン残基を含有し、それらは軽鎖内に八つのジスルフィド結合を形成すると共に、重鎖へのジスルフィド結合を一つ形成する。軽鎖上の最初の9個のグルタミン酸はガンマ-カルボキシル化され（Gla）、アスパラギン酸71はベータ-ヒドロキシル化される。rhAPCはヒト血漿由来活性化プロテインCと同じアミノ酸配列を持つが、後者とはそのグリコシル化パターンが異なる。活性化プロテインCはセリンプロテアーゼファミリーに属するプロテアーゼであり、凝固の調節に主要な役割を果たす。活性化プロテインCが持つ抗血栓機能の根拠は、トロンビン機能を阻害するというその能力である。加えて、活性化プロテインCは、重症敗血症に関連する炎症の重要な調節物質でもある。内在性セリンプロテアーゼ阻害因子は活性化プロテインCの天然阻害因子であり、インビボにおける活性化プロテインCの循環活性半減期を著しく短縮する（30分未満）。循環からの活性化プロテインCのクリアランスは、内在性プロテアーゼ阻害因子による活性化プロテインCの酵素活性の阻害、肝臓および腎臓などの臓器による活性化プロテインCおよび/または活性化プロテインC-セリンプロテアーゼ阻害因子複合体のクリアランス、ならびに循環プロテーゼまたは組織プロテアーゼによる活性化プロテインCおよび/または活性化プロテインC-セリンプロテアーゼ阻害因子複合体の分解を含む少なくとも三つの過程の組み合わせによって媒介される。24μg/kg/時間の24時間注入による第I相臨床試験では、70ng/mlの定常状態血漿濃度が得られた。注入終了時に測定したrhAPCの半減期は0.5〜1.9時間だった。血漿rhAPC濃度は注入終了後2時間以内に10ng/mlの検出限界未満に低下した。活性化プロテインCは、その生理的半減期および薬物動態的半減期が短いため、敗血症治療で臨床的に使用する場合には、望ましい血漿濃度を維持するために、ある速度で持続注入される。活性化プロテインCの薬物動態プロファイルを改善するための努力がいくつかなされている。例えばD.T.Bergら Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 (2003) pp.4423-4428には、血漿半減期が長くなった活性化プロテインCの改変変種が記載されている。
【００３７】
本発明に関して、用語「ヒドロキシアルキルデンプン」（HAS）は、少なくとも一つのヒドロキシアルキル基によって置換されているデンプン誘導体を指す。本発明の好ましいヒドロキシアルキルデンプンは、式（I）の構成を持つ：
【化１】
2007527891.tif 000002
（Ｉ）
［式中、デンプン分子の還元末端は非酸化型で示され、末端糖単位はアセタール型で示されているが、このアセタール型は溶媒などに依存してアルデヒド型との平衡状態にあることができる］。
【００３８】
本発明で使用する用語ヒドロキシアルキルデンプンは、式（I）に簡略化して描いたように末端糖質部分がヒドロキシアルキル基R1、R2、および/またはR3を含む化合物に限定されるわけではなく、末端糖質部分中および/またはそのデンプン分子の残りの部分HAS'中のどこかに存在する少なくとも一つのヒドロキシ基がヒドロキシアルキル基R1、R2、またはR3で置換されている化合物も指す。
【００３９】
二つ以上の異なるヒドロキシアルキル基を含むヒドロキシアルキルデンプンも考えられる。
【００４０】
HASに含まれる少なくとも一つのヒドロキシアルキル基は、二つ以上のヒドロキシ基を含有しうる。好ましい実施形態によれば、HASに含まれる少なくとも一つのヒドロキシアルキル基は一つのヒドロキシル基を含有する。
【００４１】
「ヒドロキシアルキルデンプン」という表現は、アルキル基が一置換または多置換される誘導体も包含する。これに関連して、アルキル基はハロゲン、特にフッ素で置換されるか、アリール基で置換されることが好ましい。さらに、ヒドロキシアルキル基の末端ヒドロキシ基を、エステル化またはエーテル化することもできる。
【００４２】
さらにまた、アルキルの代わりに、直鎖状または分岐鎖状の置換または無置換アルケン基も使用することができる。
【００４３】
ヒドロキシアルキルデンプンはデンプンのエーテル誘導体である。前記エーテル誘導体の他に、他のデンプン誘導体も、本発明に関連して使用することができる。例えばエステル化されたヒドロキシ基を含む誘導体は有用である。これらの誘導体は、例えば2〜12個の炭素原子を持つ無置換モノカルボン酸もしくは無置換ジカルボン酸またはその置換誘導体の誘導体であることができる。2〜6個の炭素原子を持つ無置換モノカルボン酸の誘導体、特に酢酸の誘導体は、とりわけ有用である。これに関連して、アセチルデンプン、ブチリルデンプンおよびプロピオニルデンプンは好ましい。
【００４４】
さらにまた、2〜6個の炭素原子を持つ無置換ジカルボン酸の誘導体も好ましい。
【００４５】
ジカルボン酸の誘導体の場合、ジカルボン酸の第2のカルボキシ基もエステル化することが有用である。さらにまた、本発明との関連では、ジカルボン酸のモノアルキルエステルの誘導体も適切である。
【００４６】
置換モノカルボン酸または置換ジカルボン酸の場合、置換基は好ましくは置換アルキル残基について上述したものと同じであることができる。
【００４７】
デンプンをエステル化する技法は当技術分野では知られている（例えばKlemm D.ら「Comprehensive Cellulose Chemistry」Vol.2（1998, Whiley-VCH, ワインハイム, ニューヨーク）、特に4.4章「Esterification of Cellulose（セルロースのエステル化）」（ISBN 3-527-29489-9）を参照されたい）。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態によれば、式（I）のヒドロキシアルキルデンプンが使用される。
【００４９】
式（I）では、明示的に記載された糖環と、HAS'と表示された残基とが、全体として、好ましいヒドロキシアルキルデンプン分子を表す。HAS'に含まれる他の糖環構造は、明示的に記載された糖環と同じであってもよいし、異なってもよい。
【００５０】
式（I）の残基R1、R2およびR3に関する限り、特別な制約はない。好ましい実施形態によれば、R1、R2およびR3は、独立して、水素であるか、各アルキル残基中に2〜10個の炭素原子を持つヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基またはヒドロキシアルカリール基であるか、基：(CH2CH2O)n-H［式中、nは整数、好ましくは1、2、3、4、5または6である］である。水素および2〜10個の炭素原子を持つヒドロキシアルキル基は好ましい。より好ましくは、ヒドロキシアルキル基は2〜6個の炭素原子、さらに好ましくは2〜4個の炭素原子、より一層好ましくは2〜4個の炭素原子を持つ。したがって、「ヒドロキシアルキルデンプン」は、好ましくは、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプンおよびヒドロキシブチルデンプンを含み、ヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプンは特に好ましく、ヒドロキシエチルデンプンは最も好ましい。
【００５１】
アルキル、アリール、アラルキルおよび/またはアルカリール基は直鎖または分枝鎖であることができ、要すれば適切に置換されていてもよい。
【００５２】
したがって本発明は、R1、R2およびR3が独立して水素または1〜6個の炭素原子を持つ直鎖もしくは分枝鎖ヒドロキシアルキル基である上述の方法にも関する。
【００５３】
したがってR1、R2およびR3は、好ましくは、ヒドロキシヘキシル、ヒドロキシペンチル、ヒドロキシブチル、ヒドロキシプロピル、例えば2-ヒドロキシプロピル、3-ヒドロキシプロピル、2-ヒドロキシイソプロピル、ヒドロキシエチル、例えば2-ヒドロキシエチル、水素であることができ、2-ヒドロキシエチル基はとりわけ好ましい。
【００５４】
したがって本発明は、R1、R2およびR3が独立して水素または2-ヒドロキシエチル基である上述の方法およびコンジュゲートにも関し、少なくとも一つの残基R1、R2およびR3が2-ヒドロキシエチルである実施形態はとりわけ好ましい。
【００５５】
ヒドロキシエチルデンプン（HES）は本発明の全ての実施形態にとって最も好ましい。
【００５６】
したがって本発明は、ポリマーがヒドロキシエチルデンプンであり、ポリマー誘導体がヒドロキシエチルデンプン誘導体である、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【００５７】
ヒドロキシエチルデンプン（HES）は天然アミロペクチンの誘導体であり、体内ではアルファ-アミラーゼによって分解される。HESは、トウモロコシデンプン中に最高95重量％の濃度で存在する糖質ポリマー・アミロペクチンの置換誘導体である。HESは有利な生物学的性質を示し、血液用補液剤として、診療所における血液希釈療法に使用されている（(Sommermeyerら, 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278；Weidlerら, 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, 494-498）。
【００５８】
アミロペクチンはグルコース部分からなり、主鎖にはアルファ-1,4-グリコシド結合が存在し、分岐部位にはアルファ-1,6-グリコシド結合が見いだされる。この分子の物理的化学的性質は主にグリコシド結合のタイプによって決まる。アルファ-1,4-グリコシド結合にニックが入ることにより、一巻きにつきグルコースモノマー約6個のらせん構造が生成する。ポリマーの物理化学的性質および生化学的性質は置換によって修飾することができる。ヒドロキシエチル基の導入はアルカリヒドロキシエチル化によって達成することができる。反応条件を適合させることにより、ヒドロキシエチル化に関して無置換グルコースモノマー中の各ヒドロキシル基が持つ異なる反応性を、利用することができる。この事実のおかげで、当業者は置換パターンにある程度の影響を及ぼすことができる。
【００５９】
HESは主として分子量分布および置換度によって特徴づけられる。置換度を記述する方法は二つ考えられる。すなわち、
1．置換度は、全グルコース部分に対する置換グルコースモノマーの割合に関して記述することができる。
2．置換度は、モル置換度として記述することができ、この場合は1グルコース部分あたりのヒドロキシエチル基の数が記述される。
本発明に関して、DSと表記される置換度は、上述のモル置換度に関する（上に引用したSommermeyerら, 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278（特に273頁）も参照されたい）。
【００６０】
HES溶液は、各分子が重合度、分岐部位の数およびパターン、ならびに置換パターンに関して他の分子とは異なっている多分散組成物として存在する。それゆえHESは異なる分子量を持つ化合物の混合物である。したがって個々のHES溶液は統計的手段を活用して平均分子量によって決定される。これに関連して、Mnは、分子数に依存する算術平均として計算される。もう一つの選択肢として、重量平均MW（またはMW）は、HESの質量に依存する単位を表す。
【００６１】
本発明に関して、ヒドロキシエチルデンプンは、好ましくは、1〜300kDの平均分子量（重量平均）を持つことができる。ヒドロキシエチルデンプンはさらに、0.1〜3（好ましくは0.1〜2、より好ましくは0.1〜0.9、好ましくは0.1〜0.8）という好ましいモル置換度と、ヒドロキシエチル基に関して2〜20の範囲の好ましいC2：C6置換比とを示すことができる。
【００６２】
本発明に関して使用する用語「平均分子量」は、Sommermeyerら, 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278およびWeidlerら, 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, 494-498に記載のLALLS（低角レーザー光散乱）-GPC法によって決定される分子量をいう。10kD以下の平均分子量については、さらに、LALLS-GPCによって予め検定された標準を使って較正を行なった。
【００６３】
本発明の好ましい実施形態によれば、使用されるヒドロキシエチルデンプンの平均分子量は、1〜300kD、好ましくは2〜200kD、より好ましくは3〜100kD、より好ましくは4〜70kDである。
【００６４】
約130kDの平均分子量を持つHESの一例は、0.2〜0.8（例えば0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、または0.8）の置換度、好ましくは0.4〜0.7（例えば0.4、0.5、0.6、または0.7）の置換度を持つHESである。
【００６５】
約130kDの平均分子量を持つHESの一例はFreseniusのVoluven（登録商標）である。Voluven（登録商標）は、例えば血液量減少の治療および予防の治療的適応に補液として使用される人工コロイドである。Voluven（登録商標）は平均分子量130,000±20,000D、モル置換度0.4、およびC2：C6比約9：1である。
【００６６】
したがって本発明は、ヒドロキシアルキルデンプンが4〜100kD（好ましくは4〜70kD）の平均分子量を持つヒドロキシエチルデンプンである上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【００６７】
好ましい平均分子量の範囲は、例えば4〜70kDまたは10〜70kDまたは12〜70kDまたは18〜70kDまたは50〜70kDまたは4〜50kDまたは10〜50kDまたは12〜50kDまたは18〜50kDまたは4〜18kDまたは10〜18kDまたは12〜18kDまたは4〜12kDまたは10〜12kDまたは4〜10kDである。
【００６８】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、使用されるヒドロキシエチルデンプンの平均分子量は、4kD超〜70kD未満の範囲、例えば約10kD、または9〜10kDもしくは10〜11kDもしくは9〜11kDの範囲、または約12kD、または11〜12kDもしくは12〜13kDもしくは11〜13kDの範囲、または約18kD、または17〜18kDもしくは18〜19kDもしくは17〜19kDの範囲、または約30kD、または29〜30kDもしくは30〜31kDの範囲、または約50kD、または49〜50kDもしくは50〜51kDもしくは49〜51kDの範囲にある。
【００６９】
モル置換度（DS）の上限については、3.0までの値、例えば0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9または2.0も考えられ、2.0未満の値は好ましく、1.5未満の値はより好ましく、1.0未満の値、例えば0.7、0.8または0.9はさらに好ましい。
【００７０】
したがって、好ましいモル置換度の範囲は、0.1〜2または0.1〜1.5または0.1〜1.0または0.1〜0.9または0.1〜0.8である。より好ましいモル置換度の範囲は、0.2〜2または0.2〜1.5または0.2〜1.0または0.2〜0.9または0.2〜0.8である。さらに好ましいモル置換度の範囲は、0.3〜2または0.3〜1.5または0.3〜1.0または0.3〜0.9または0.3〜0.8である。より一層好ましいモル置換度の範囲は、0.4〜2または0.4〜1.5または0.4〜1.0または0.4〜0.9または0.4〜0.8である。
【００７１】
置換度（DS）に関する限り、DSは、好ましくは少なくとも0.1、より好ましくは少なくとも0.2、より好ましくは少なくとも0.4である。好ましいDSの範囲は0.1〜0.8、より好ましくは0.2〜0.8、より好ましくは0.3〜0.8、さらに好ましくは0.4〜0.8、より一層好ましくは0.1〜0.7、より好ましくは0.2〜0.7、より好ましくは0.3〜0.7、より好ましくは0.4〜0.7である。特に好ましいDSの値は、例えば0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7または0.8であり、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7または0.8はより好ましく、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7または0.8はさらに好ましく、0.4、0.5、0.6、0.7または0.8はより一層好ましく、例えば0.4および0.7は特に好ましい。
【００７２】
本発明に関して、与えられたモル置換度の値、例えば0.8は、正確な値であってもよいし、0.75〜0.84の範囲にあると理解することもできる。したがって、例えば0.1という与えられた値は、0.1という正確な値であるか、0.05〜0.14の範囲にあることができ、0.4という与えられた値は、0.4という正確な値であるか、0.35〜0.44の範囲にあることができ、0.7という与えられた値は、0.7という正確な値であるか、0.65〜0.74の範囲にあることができる。
【００７３】
ヒドロキシアルキルデンプン（好ましくはヒドロキシエチルデンプン）の分子量とその置換度DSとの特に好ましい組み合わせは、例えば10kDと0.4または10kDと0.7または12kDと0.4または12kDと0.7または18kDと0.4または18kDと0.7または30kDと0.4または30kDと0.7、または50kDと0.4または50kDと0.7または100kDと0.7である。
【００７４】
C2：C6置換比に関する限り、前記置換は、好ましくは2〜20の範囲、より好ましくは2〜15の範囲、さらに好ましくは3〜12の範囲にある。
【００７５】
本発明のさらなる実施形態によれば、異なる平均分子量および/または異なる置換度および/または異なるC2：C6置換比を持つヒドロキシエチルデンプンの混合物も使用することができる。したがって、異なる平均分子量および異なる置換度および異なるC2：C6置換比を持つヒドロキシエチルデンプンの混合物、または異なる平均分子量および異なる置換度および同じもしくはほぼ同じC2：C6置換比を持つヒドロキシエチルデンプンの混合物、または異なる平均分子量および同じもしくはほぼ同じ置換度および異なるC2：C6置換比を持つヒドロキシエチルデンプンの混合物、または同じもしくはほぼ同じ平均分子量および異なる置換度および異なるC2：C6置換比を持つヒドロキシエチルデンプンの混合物、または異なる平均分子量および同じもしくはほぼ同じ置換度および同じもしくはほぼ同じC2：C6置換比を持つヒドロキシエチルデンプンの混合物、または同じもしくはほぼ同じ平均分子量および異なる置換度および同じもしくはほぼ同じC2：C6置換比を持つヒドロキシエチルデンプンの混合物、または同じもしくはほぼ同じ平均分子量および同じもしくはほぼ同じ置換度および異なるC2：C6置換比を持つヒドロキシエチルデンプンの混合物、またはほぼ同じ平均分子量およびほぼ同じ置換度およびほぼ同じC2：C6置換比を持つヒドロキシエチルデンプンの混合物を使用することができる。
【００７６】
本発明の異なるコンジュゲートおよび/または異なる方法では、異なるヒドロキシアルキルデンプン（好ましくは異なるヒドロキシエチルデンプン）および/または異なるヒドロキシアルキルデンプン混合物（好ましくは異なるヒドロキシエチルデンプン混合物）を使用することができる。
【００７７】
本発明の一実施形態によれば、タンパク質の官能基Zはアルデヒド基またはケト基である。したがって本発明は、タンパク質の官能基Zがアルデヒド基またはケト基である上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【００７８】
タンパク質内でのアルデヒド基またはケト基の位置に関して一般的制限はないが、本発明の好ましい実施形態によれば、アルデヒド基またはケト基は、タンパク質の糖側鎖中に位置する。したがって、この実施形態については、グリコシル化タンパク質が使用される。
【００７９】
グリコシル化タンパク質として、グリコシル化型のIFNベータ（例えば天然ヒトIFNベータまたはIFNベータ1a）、N-グリカンおよびO-グリカンをどちらも含有する天然または真核細胞由来のhGM-CSF、四つのN-グリコシル化部位を含有する二本鎖糖タンパク質である組換えヒト活性化プロテインC（rhAPC）、ヒトtPA（htPA）または組換えヒトtPA（rhtPA）、例えばAsn117、Asn118およびAsn448にN結合型オリゴ糖を持つI型tPAまたはAsn117およびAsn448がグリコシル化されるII型tPA、血漿由来A1ATまたは組換えヒトA1TA（pdA1ATまたはrhA1AT）、組換えヒトAT III（rhAT III）、第VII因子、第VIII因子および第IX因子は好ましい。
【００８０】
グリコシル化型のIFNベータ、AT IIIおよびGM-CSFはとりわけ好ましい。
【００８１】
本明細書に関して、用語「グリコシル化タンパク質」、すなわち「糖側鎖」を持つタンパク質は、ヒドロキシアルデヒドまたはヒドロキシケトンなどの糖質部分を含むタンパク質ならびにその化学修飾体を指す（「Roempp Chemielexikon」（Thieme Verlag, ドイツ・シュトゥットガルト）第9版（1990）の第9巻、2281〜2285頁およびそこに引用されている文献を参照されたい）。さらに、例えばガラクトース、N-アセチルノイラミン酸、およびN-アセチルガラクトサミンなどといった天然糖質部分の誘導体も指す。
【００８２】
さらに好ましい実施形態では、アルデヒド基またはケト基が、糖側鎖のガラクトース残基の一部である。このガラクトース残基は、後述するように末端シアル酸の除去とそれに続く酸化とによって、ポリマーまたはポリマー誘導体に含まれる官能基Aとの反応に利用できる状態にすることができる。
【００８３】
さらにもう一つの好ましい実施形態では、官能基Aを含むポリマーまたはポリマー誘導体が、糖側鎖のシアル酸残基（好ましくは糖側鎖の末端シアル酸残基）に連結される。
【００８４】
末端糖質部分の酸化は化学的または酵素的に行なうことができる。
【００８５】
ポリペプチドの糖質部分を化学的に酸化する方法は当技術分野では知られており、過ヨウ素酸塩による処理が含まれる（Chamowら, 1992, J. Biol. Chem., 267, 15916-15922）。
【００８６】
化学的酸化では、原理的に、糖質部分は末端に位置するものもそうでないものも全て酸化することができる。しかし、穏和な反応条件を選択することにより、糖側鎖の末端シアル酸を優先的に酸化してアルデヒド基またはケト基を生じさせることができる。
【００８７】
本発明の一実施形態によれば、前記穏和な反応条件は、タンパク質を、1〜50mMの範囲の好ましい過ヨウ素酸塩濃度（より好ましくは1〜25mM、特に好ましくは1〜10mM、例えば約1mM）を持つ適切な過ヨウ素酸塩水溶液と、0〜40℃の好ましい反応温度（特に好ましくは0〜21℃、例えば約0℃）で、5分〜5時間の好ましい反応時間（より好ましくは10分〜2時間、特に好ましくは10分〜1時間、例えば約1時間）にわたって反応させることをいう。過ヨウ素酸塩：タンパク質の好ましいモル比は1：200〜1：1、より好ましくは1：50〜1:5、例えば約15：1である。
【００８８】
したがって本発明は、タンパク質とポリマーまたはポリマー誘導体との反応に先だって、酸化型糖側鎖内に位置するアルデヒド基またはケト基を持つタンパク質を得るために、グリコシル化タンパク質を過ヨウ素酸塩溶液と反応させる（前記反応は好ましくは穏和な酸化反応で行なわれる）、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。この文脈で使用される用語「穏和な酸化条件」は、10mM過ヨウ素酸塩溶液および反応温度20〜25℃というような厳しい条件とは対照的に、例えば1mM過ヨウ素酸塩溶液および反応温度0℃などを指す。
【００８９】
もう一つの選択肢として、糖側鎖を酵素的に酸化することもできる。個々の糖側鎖を酸化するための酵素は当技術分野では知られており、例えばガラクトースの場合には、酵素はガラクトースオキシダーゼである。末端ガラクトース部分を酸化しようとする場合、そのポリペプチドが糖鎖にシアル酸を結合させる能力を持つ細胞（例えば哺乳動物細胞、または糖鎖にシアル酸を結合する能力を持つように遺伝子改変された細胞）中で生産されたのであれば、最終的には末端シアル酸を（部分的にまたは完全に）除去する必要があるだろう。シアル酸を除去するための化学的方法または酵素的方法は当技術分野では知られている（ChaplinおよびKennedy編, 1996「Carbohydrate Analysis: a practical approach」、特に第5章、Montreuill「Glycoproteins」175〜177頁, IRL Press Practical approach series (ISBN 0-947946-44-3)）。
【００９０】
本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、アルデヒド基またはケト基はタンパク質のN末端に位置してもよく、適切な酸化によって入手することができる。特に、スレオニンまたはセリンなどのヒドロキシ基含有アミノ酸がタンパク質のN末端で-1位に位置する場合、そのN末端アミノ酸の酸化を行なうことにより、前記ケト基またはアルデヒド基（好ましくはアルデヒド基）を生じさせることができる。適切なN末端アミノ酸を化学的に酸化する方法としては、考えうる方法をどれでも適用することができ、過ヨウ素酸塩による酸化は好ましく、穏和な酸化条件は特に好ましい。
【００９１】
本発明のさらにもう一つの好ましい実施形態によれば、前記穏和な反応条件は、タンパク質を、1〜50mMの範囲の好ましい過ヨウ素酸塩濃度（より好ましくは1〜25mM、特に好ましくは1〜10mM、例えば約1mM）を持つ適切な過ヨウ素酸塩水溶液と、0〜40℃の好ましい反応温度（特に好ましくは0〜21℃、例えば約0℃）で、5分〜5時間の好ましい反応時間（より好ましくは10分〜2時間、特に好ましくは10分〜1時間、例えば約1時間）にわたって反応させることをいう。過ヨウ素酸塩：タンパク質の好ましいモル比は1：200〜1：1、より好ましくは1：50〜1:5、例えば約15：1である。
【００９２】
したがって本発明は、アルデヒド基またはケト基がタンパク質の糖側鎖中および/またはタンパク質のN末端基に位置する、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【００９３】
真核細胞中で生産され、それゆえ翻訳後にグリコシル化されているタンパク質のオリゴ糖パターンは、ヒト由来タンパク質と同一ではない。さらにまた、多くのグリコシル化タンパク質は、ガラクトース残基などのさらなる糖質部分を遮蔽する望ましい数のシアル酸残基を持っていない。しかし、ガラクトース残基などの、それらさらなる糖質部分は、遮蔽されないと、そのタンパク質を医薬として使用した場合に、そのタンパク質の血漿半減期が短くなるなどといった欠点の原因になりうる。驚くべきことに、例えば後述するオキシム結合などによってタンパク質の糖側鎖の糖質部分に直接共有結合されるまたは少なくとも一つのリンカー化合物（例えば一つもしくは二つのリンカー化合物）を介して共有結合されるヒドロキシアルキルデンプンポリマー（好ましくはヒドロキシエチルデンプンポリマー）が形成するタンパク質コンジュゲートを用意することにより、少なくとも上述の欠点を克服できることが明らかになった。したがって、適切な末端糖質残基が糖側鎖になくても、それは、ヒドロキシアルキルデンプンポリマーまたはその誘導体、好ましくはヒドロキシエチルデンプンポリマーまたはその誘導体を、グリコシル化タンパク質の少なくとも一つの糖側鎖に結合することによって補償されると考えられる。本発明のもう一つの実施形態によれば、ヒドロキシアルキルデンプンポリマーまたはその誘導体（好ましくはヒドロキシエチルデンプンポリマーまたはその誘導体）が上述のように酸化型糖質部分に結合している各コンジュゲートを用意することで、上記の欠点が補償されるだけでなく、、所望の使用分野において各天然タンパク質よりも良い特徴を持つタンパク質コンジュゲートも得られる。したがって、本発明の各コンジュゲートがタンパク質に及ぼす効果は、補償的であり、相乗的でさえある。ヒトタンパク質と同一であるタンパク質またはヒトタンパク質であるタンパク質であっても、天然の糖質部分に望ましい数の適切な遮蔽末端糖質残基（例えばシアル酸残基）を持たない場合もありうる。そのような場合は、ヒドロキシアルキルデンプンポリマーまたはその誘導体、好ましくはヒドロキシエチルデンプンポリマーまたはその誘導体を、上述の酸化型糖質部分に結合させた各コンジュゲートを用意することにより、人工的に生産されるタンパク質の欠点が克服され補償されるだけでなく、天然の自然界に存在するタンパク質の特徴が改善されることにもなる。タンパク質の酸化型糖質部分のアルデヒド基またはケト基に結合されるヒドロキシアルキルデンプン（好ましくはヒドロキシエチルデンプン）またはその誘導体の官能基については、後述の官能基Aが挙げられる。この一般概念はグリコシル化G-CSFに適用することができるだけでなく、前記のように末端糖質残基を欠く基本的に全てのグリコシル化タンパク質に適用することができる。なかんずく、エリスロポエチン（EPO）、インターフェロンベータ1a（IFNベータ1a）、ATIII、第VIII因子、アルファ1-アンチトリプシン（A1AT）、htPA、またはGM-CSFを挙げることができる。
【００９４】
したがって本発明は、タンパク質の天然糖質部分または翻訳後に結合された糖質部分における末端糖質残基（好ましくはシアル酸残基）の欠如を、少なくとも一つのケト基またはアルデヒド基を持つタンパク質の少なくとも一つの酸化型糖質部分にデンプンまたはその誘導体を共有結合させることによって補償するための、ヒドロキシアルキルデンプン（好ましくはヒドロキシエチルデンプン）またはその誘導体の使用にも関する。
【００９５】
したがって本発明は、少なくとも一つのケト基またはアルデヒド基を持つタンパク質の少なくとも一つの酸化型糖質部分にヒドロキシアルキルデンプン（好ましくはヒドロキシエチルデンプン）またはその誘導体を（好ましくはオキシム結合を介して）共有結合させることによって、タンパク質の天然糖質部分または翻訳後に結合された糖質部分における末端糖質残基（好ましくはシアル酸残基）の欠如を補償するための方法にも関する。
【００９６】
さらにまた本発明は、タンパク質（自然源から単離されるか、哺乳動物細胞、昆虫細胞または酵母細胞などの真核細胞における発現によって生産されるもの）の少なくとも一つの酸化型糖質部分（少なくとも一つのケト基またはアルデヒド基を持つもの）へのヒドロキシアルキルデンプン（好ましくはヒドロキシエチルデンプン）またはその誘導体の共有結合によって形成されるコンジュゲートであって、所望の使用分野において、好ましくは医薬としての使用において、各未修飾タンパク質と同じかそれより優れた特徴を持つコンジュゲートにも関する。
【００９７】
タンパク質の官能基Zがアルデヒド基またはケト基である場合、ポリマーまたはその誘導体の官能基Aは、構造-NH-のアミノ基を含む。
【００９８】
したがって本発明は、ポリマーの酸化されていてもよい還元末端と反応させることができる官能基Aが構造-NH-のアミノ基を含む、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【００９９】
本発明の好ましい一実施形態によれば、この官能基Aは構造R'-NH-を持つ基であって、R'は水素であるか、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリールまたはシクロアルキルアリール残基であり、そのシクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリールまたはシクロアルキルアリール残基はNH基に直接連結されていてもよいし、あるいはもう一つの実施形態として、NH基に酸素橋を介して連結されていてもよい。アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリール、またはシクロアルキルアリール残基は、適切に置換されていてもよい。好ましい置換基として、F、ClまたはBrなどのハロゲンを挙げることができる。特に好ましい残基R'は水素、アルキル基およびアルコキシ基であり、さらに好ましくは水素ならびに無置換アルキル基および無置換アルコキシ基である。
【０１００】
アルキル基およびアルコキシ基のなかでは、1、2、3、4、5、または6個のC原子を持つ基が好ましい。より好ましいのはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、およびイソプロポキシ基である。特に好ましいのはメチル、エチル、メトキシ、エトキシであり、メチルまたはメトキシはとりわけ好ましい。
【０１０１】
したがって本発明は、R'が水素またはメチル基もしくはメトキシ基である上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０１０２】
本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、官能基Aは構造R'-NH-R''-を持ち、R''は好ましくは構造単位-NH-および/または構造単位-(C=G)-［GはOまたはSである］および/または構造単位-SO2-を含む。より好ましい実施形態によれば、官能基R''は
【化２】
2007527891.tif 000003
［Gが二つ存在する場合、それらは独立してOまたはSである］
からなる群より選択される。
【０１０３】
したがって、アミノ基-NH2を含む好ましい官能基Aは、例えば
【化３】
2007527891.tif 000004
［式中、GはOまたはS（二つ存在する場合は、独立してOまたはS）であり、R'はメチルである］
である。
【０１０４】
アミノ基を含む特に好ましい官能基Aはアミノオキシ基
【化４】
2007527891.tif 000005
（H2N-O-は特に好ましい）、およびヒドラジド基
【化５】
2007527891.tif 000006
［式中、Gは好ましくはOである］
である。
【０１０５】
したがって本発明は、タンパク質の官能基Zがアルデヒド基またはケト基であり、官能基Aがアミノオキシ基またはヒドラジド基である上述の方法にも関する。本発明の特に好ましい実施形態によれば、Aはアミノオキシ基である。
【０１０６】
したがって本発明は、タンパク質の官能基Zがアルデヒド基またはケト基であり、官能基Aがアミノオキシ基またはヒドラジド基である上述のコンジュゲートにも関する。本発明の特に好ましい実施形態によれば、Aはアミノオキシ基である。
【０１０７】
ポリマーまたはポリマー誘導体のアミノオキシ基をタンパク質のアルデヒド基またはケト基と反応させると、オキシム結合が形成される。
【０１０８】
したがって本発明は、タンパク質とポリマーまたはポリマー誘導体の間の共有結合が、アルデヒドまたはケト基であるタンパク質の官能基Zと、アミノオキシ基であるポリマーまたはポリマー誘導体の官能基Aとの反応によって形成されるオキシム結合である、上述のコンジュゲートにも関する。
【０１０９】
ポリマーまたはポリマー誘導体のヒドラジド基をタンパク質のアルデヒド基またはケト基と反応させると、ヒドラゾン結合が形成される。
【０１１０】
したがって本発明は、タンパク質とポリマーまたはポリマー誘導体の間の共有結合が、アルデヒド基またはケト基であるタンパク質の官能基Zと、ヒドラジド基であるポリマーまたはポリマー誘導体の官能基Aとの反応によって形成されるヒドラゾン結合である、上述のコンジュゲートにも関する。
【０１１１】
ポリマー誘導体が結果として官能基Aを含むのであれば、ポリマーに官能基Aを導入するために、特に制限はない。
【０１１２】
本発明の好ましい一実施形態によれば、官能基Aは、ポリマーを少なくとも二官能性である化合物（そのうち、一つの官能基はポリマーの少なくとも一つの官能基と反応させることができ、少なくとも二官能性である化合物の少なくとも一つの他の官能基は、官能基Aであるか、化学修飾を受けて官能基Aを与えることができる）と反応させることによって、ポリマー中に導入される。
【０１１３】
さらにもう一つの好ましい実施形態によれば、ポリマーを、少なくとも二官能性である化合物と、その酸化されていてもよい還元末端で反応させる。
【０１１４】
ポリマーをその非酸化型還元末端で反応させる場合、ポリマーは、好ましくは、
【化６】
2007527891.tif 000007
（Ｉ）
［式（I）には、アルデヒド型の非酸化型還元末端が含まれる］。
の構成を持つ。
【０１１５】
ポリマーをその酸化型還元末端で反応させる場合、ポリマーは好ましくは式（IIa）：
【化７】
2007527891.tif 000008
（ＩＩａ）
および/または式（IIb）：
【化８】
2007527891.tif 000009
（ＩＩｂ）
の構成を持つ。ポリマー（好ましくはヒドロキシエチルデンプン）の還元末端の酸化は、上述の構造（IIa）および/または（IIb）を持つ化合物をもたらす各方法またはそのような方法の組み合わせによって行なうことができる。
【０１１６】
酸化はヒドロキシアルキルデンプンの酸化型還元末端をもたらす適切な方法のどれに従って行なってもよいが、好ましくは、例えばDE 196 28 705 A1（その内容のそれぞれ（実施例A、第9欄6〜24行）は参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているようにアルカリ性ヨウ素溶液を使って行なわれる。
【０１１７】
ポリマーの酸化されていてもよい還元末端と反応させることができる少なくとも二官能性である化合物の官能基としては、ヒドロキシアルキルデンプンの酸化されていてもよい還元末端と化学結合を形成することができる各官能基を使用することができる。
【０１１８】
本発明の好ましい実施形態によれば、この官能基は化学構造-NH-を含む。
【０１１９】
したがって本発明は、少なくとも二官能性である化合物の官能基であって、ポリマーの酸化されていてもよい還元末端と反応させることのできる官能基が、構造-NH-を含む、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０１２０】
本発明の好ましい一実施形態によれば、少なくとも二官能性である化合物のこの官能基は、構造R'-NH-を持つ基であって、R'は水素であるか、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリールまたはシクロアルキルアリール残基であり、そのシクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリールまたはシクロアルキルアリール残基はNH基に直接連結されていてもよいし、あるいはもう一つの実施形態として、NH基に酸素橋を介して連結されていてもよい。アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリール、またはシクロアルキルアリール残基は、適切に置換されていてもよい。好ましい置換基として、F、ClまたはBrなどのハロゲンを挙げることができる。特に好ましい残基R'は水素、アルキル基およびアルコキシ基であり、さらに好ましくは水素ならびに無置換アルキル基および無置換アルコキシ基である。
【０１２１】
アルキル基およびアルコキシ基のなかでは、1、2、3、4、5、または6個のC原子を持つ基が好ましい。より好ましいのはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、およびイソプロポキシ基である。特に好ましいのはメチル、エチル、メトキシ、エトキシであり、メチルまたはメトキシはとりわけ好ましい。
【０１２２】
したがって本発明は、R'が水素またはメチル基もしくはメトキシ基である上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０１２３】
本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、少なくとも二官能性である化合物の官能基は構造R'-NH-R''-を持ち、R''は好ましくは構造単位-NH-および/または構造単位-(C=G)-［GはOまたはSである］および/または構造単位-SO2-を含む。より好ましい実施形態によれば、官能基R''は
【化９】
2007527891.tif 000010
［Gが二つ存在する場合、それらは独立してOまたはSである］
からなる群より選択される。
【０１２４】
したがって本発明は、少なくとも二官能性である化合物の官能基であって、ポリマーの酸化されていてもよい還元末端と反応させることのできる官能基が、
【化１０】
2007527891.tif 000011
［式中、GはOまたはS（二つ存在する場合は、独立してOまたはS）であり、R'はメチルである］
からなる群より選択される、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０１２５】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、少なくとも二官能性である化合物の官能基であって、ポリマーの酸化されていてもよい還元末端と反応させることができかつアミノ基を含む官能基は、
【化１１】
2007527891.tif 000012
（H2N-O-は特に好ましい）、またはヒドラジド基
【化１２】
2007527891.tif 000013
［式中、Gは好ましくはOである］
である。
【０１２６】
したがって本発明は、タンパク質の官能基Zがアルデヒド基またはケト基であり、少なくとも二官能性である化合物の官能基であって、ポリマーの酸化されていてもよい還元末端と反応させることのできる官能基が、アミノオキシ基またはヒドラジド基（好ましくはアミノオキシ基）である、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０１２７】
したがって本発明は、タンパク質の官能基Zがアルデヒド基またはケト基であり、少なくとも二官能性である化合物の官能基であって、ポリマーの酸化されていてもよい還元末端と反応させることのできる官能基が、アミノオキシ基またはヒドラジド基（好ましくはアミノオキシ基）である、上述のコンジュゲートにも関する。
【０１２８】
本発明のさらにもう一つの好ましい実施形態によれば、少なくとも二官能性である化合物を、ポリマーと、その非酸化型還元末端で反応させる。
【０１２９】
本発明のさらにもう一つの好ましい実施形態によれば、ポリマーの酸化されていてもよい還元末端と反応させる少なくとも二官能性である化合物は、官能基Aを含む。
【０１３０】
少なくとも二官能性である化合物をまずポリマーと反応させてポリマー誘導体を得てから、次にそれを官能基Aを介してタンパク質と反応させることができる。また、少なくとも二官能性である化合物をまず、官能基Aを介してタンパク質と反応させてタンパク質誘導体を得てから、次にそれをタンパク質誘導体に含まれる少なくとも二官能性である化合物の残基の少なくとも一つの官能基を介してポリマーと反応させることも可能である。
【０１３１】
本発明の好ましい実施形態によれば、少なくとも二官能性である化合物を、まずポリマーと反応させる。
【０１３２】
したがって本発明は、上述の方法およびコンジュゲートであって、前記方法が、Aを含むポリマー誘導体とZを含むタンパク質との反応に先だって、ポリマーを、その非酸化型還元末端で、ポリマーの非酸化型還元末端と反応する能力を持つ官能基および基Aを含む少なくとも二官能性である連結化合物と反応させることをさらに含むものに関する。
【０１３３】
本発明に関して使用する用語「ポリマー（またはHAS）を還元末端を介して反応させる」または「ポリマー（またはHAS）を選択的に酸化された還元末端を介して反応させる」は、ポリマー（またはHAS）を主としてその（選択的に酸化された）還元末端を介して反応させる過程をいう。
【０１３４】
この用語「主としてその（選択的に酸化された）還元末端を介して」は、与えられた反応に使用されるヒドロキシアルキルデンプン分子のうち統計的に50％を超える量、好ましくは少なくとも55％、より好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも65％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、およびさらにより好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％、または99％を、1ポリマー（またはHAS）分子あたり少なくとも一つの（選択的に酸化された）還元末端を介して反応させる過程をいい、この場合、少なくとも一つの還元末端を介して反応させる与えられたポリマー（またはHAS）分子は、上記と同じ与えられた反応において、前記ポリマー（またはHAS）分子に含まれかつ還元末端ではない少なくとも一つのさらなる適切な官能基を介して反応させることができる。1分子以上のポリマー（またはHAS）分子を、少なくとも一つの還元末端を介して反応させると同時に、この（これらの）ポリマー（またはHAS）分子に含まれかつ還元末端ではない少なくとも一つのさらなる適切な官能基を介して反応させる場合は、これらのポリマー（またはHAS）分子の反応させる全官能基（還元末端を含む）のうち、統計的に好ましくは50％を超える量、好ましくは少なくとも55％、より好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも65％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも 85％、より好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％、または99％が、還元末端である。
【０１３５】
本発明に関連して使用する用語「還元末端」は、ポリマー（またはHAS）分子の末端アルデヒド基をいい、これはアルデヒド基として、そして/または対応するアセタール型として存在することができる。還元末端が酸化されると、アルデヒド基またはアセタール基は、カルボキシ基の形態および/または対応するラクトンの形態をとる。
【０１３６】
少なくとも二官能性である連結化合物の官能基（ポリマーと反応させるもの）と、その少なくとも二官能性である連結化合物の官能基A（タンパク質の官能基Zと反応させるもの）とは、任意の適切なスペーサーによって分離することができる。なかんずく、スペーサーは置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状および/または環状の炭化水素残基であることができる。一般に、この炭化水素残基は60個まで、好ましくは40個まで、より好ましくは20個まで、より好ましくは6個まで、特に好ましくは4個までの炭素原子を持つ。ヘテロ原子が存在する場合、分離基は一般に1〜20個、好ましくは1〜8個、より好ましくは1〜6個、より好ましくは1〜4個、特に好ましくは1〜2個のヘテロ原子を含む。ヘテロ原子としてはOが好ましい。炭化水素残基は、例えば5〜7個の炭素原子を持つ分岐していてもよいアルキル鎖またはアリール基またはシクロアルキル基を含むか、アラルキル基、アルカリール基（アルキル部分は直鎖状および/または環状アルキル基であることができる）であることができる。本発明のさらに好ましい実施形態によれば、官能基は、4個の炭素原子を持つ直鎖状炭化水素鎖によって分離される。本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、官能基は、4個の炭素原子および少なくとも1個（好ましくは1個）のヘテロ原子（特に好ましくは酸素原子）を持つ直鎖状炭化水素鎖によって分離される。
【０１３７】
さらにもう一つの好ましい実施形態によれば、少なくとも二官能性である連結化合物は、ホモ二官能性連結化合物である。したがって本発明は、少なくとも二官能性である連結化合物がホモ二官能性化合物である、上述のコンジュゲートを製造する方法にも関する。
【０１３８】
したがって、連結化合物の上述した好ましい官能基に関して、前記ホモ二官能性連結化合物は、好ましくは、二つのアミノオキシ基H2N-O-または二つのアミノオキシ基R'-O-NH-または二つのヒドラジド基H2N-NH-(C=G)-のいずれかを含み、アミノオキシ基H2N-O-およびヒドラジド基H2N-NH-(C=O)-は好ましく、アミノオキシ基H2N-O-は特に好ましい。
【０１３９】
二つのヒドラジド基H2N-NH-(C=O)-を含む考えうる全てのホモ二官能性化合物のなかで、二つのヒドラジド基が60個まで、好ましくは40個まで、より好ましくは20個まで、より好ましくは10個まで、より好ましくは6個まで、特に好ましくは4個までの炭素原子を持つ炭化水素残基によって分離されているヒドラジドは好ましい。より好ましくは、炭素水素残基が1〜4個の炭素原子、例えば1、2、3、または4個の炭素原子を持つ。最も好ましくは炭化水素残基が4個の炭素原子を持つ。したがって式
【化１３】
2007527891.tif 000014
のホモ二官能性化合物は好ましい。
【０１４０】
タンパク質のアルデヒド基またはケト基を二つのヒドラジド基H2N-NH-(C=O)-を含む化合物と反応させる上述の実施形態において、特に好ましいヒドロキシエチルデンプンは、例えば約10kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプンである。また、例えば約10kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、約50kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約100kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプンも考えられる。
【０１４１】
平均分子量とDSのこれらの組み合わせのそれぞれに関して、約0.8のDS値も好ましい。
【０１４２】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、二官能性連結化合物はカルボヒドラジド
【化１４】
2007527891.tif 000015
である。
【０１４３】
タンパク質のアルデヒド基またはケト基をカルボヒドラジドと反応させる上述の実施形態において、特に好ましいヒドロキシエチルデンプンは、例えば約10kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプンである。また、例えば約10kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、約50kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約100kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプンも考えられる。
【０１４４】
平均分子量とDSのこれらの組み合わせのそれぞれに関して、約0.8のDS値も好ましい。
【０１４５】
上述のように本発明は、少なくとも二官能性である連結化合物がホモ二官能性化合物であり、かつ二つのアミノオキシ基を含む、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。したがって本発明は、少なくとも二官能性である連結化合物がホモ二官能性化合物であり、かつ二つのアミノオキシ基H2N-O-を含む、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０１４６】
上述のように、ポリマーを、好ましくは、二官能性連結化合物との反応に先だって、酸化されていないその還元末端で反応させる。したがって、二つのアミノオキシ基H2N-O-を含む好ましいホモ二官能性化合物をポリマーと反応させることにより、オキシム結合を含むポリマー誘導体がもたらされる。
【０１４７】
したがって、タンパク質の官能基Zはアルデヒド基またはケト基であり、好ましくはそれをポリマー誘導体のアミノオキシ基と反応させるので、本発明は、それぞれがオキシム結合または環状アミナール結合によって連結化合物に共有結合されているポリマーおよびタンパク質を含む、上述のコンジュゲートにも関する。
【０１４８】
二つのアミノオキシ基H2N-O-を含む考えうる全てのホモ二官能性化合物のなかで、二つのアミノオキシ基が1〜60個、好ましくは1〜40個、より好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜6個、特に好ましくは1〜4個の炭素原子を持つ炭化水素残基によって分離されている二官能性化合物は好ましい。より好ましくは、炭素水素残基が1〜4個の炭素原子、例えば1、2、3、または4個の炭素原子を持つ。最も好ましくは炭化水素残基が4個の炭素原子を持つ。さらに好ましくは、炭化水素残基が少なくとも一つのヘテロ原子、より好ましくは一つのヘテロ原子、最も好ましくは一つの酸素原子を持つ。式
【化１５】
2007527891.tif 000016
の化合物O-[2-(2-アミノオキシエトキシ)エチル]ヒドロキシルアミンは特に好ましい。
【０１４９】
したがって本発明は、式
【化１６】
2007527891.tif 000017
および/または
【化１７】
2007527891.tif 000018
［HAS'は好ましくはHES'である］
の構成を持つ上述のコンジュゲートに関する。特に好ましいヒドロキシエチルデンプンは、例えば、約10kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約10kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約100kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプンである。
【０１５０】
平均分子量とDSのこれらの組み合わせのそれぞれに関して、約0.8のDS値も好ましい。
【０１５１】
タンパク質のアルデヒド基またはケト基をポリマーまたはポリマー誘導体のヒドロキシアミノ基と反応させる上述の実施形態において、特に好ましいヒドロキシエチルデンプンは、例えば、約10kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、および約10kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、および約18kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、および約50kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプンである。また、例えば約12kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約100kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプンも考えられる。
【０１５２】
タンパク質として、グリコシル化IFNベータ、グリコシル化AT IIIおよびグリコシル化GM-CSFは、特に好ましい。したがって、ヒドロキシアルキルデンプンが好ましくはヒドロキシエチルデンプンであるとすると、本発明は、コンジュゲート
【化１８】
2007527891.tif 000019
および/またはコンジュゲート
【化１９】
2007527891.tif 000020
および/またはコンジュゲート
【化２０】
2007527891.tif 000021
および/またはコンジュゲート
【化２１】
2007527891.tif 000022
および/またはコンジュゲート
【化２２】
2007527891.tif 000023
および/またはコンジュゲート
【化２３】
2007527891.tif 000024
にも関する。
【０１５３】
HES'は特に好ましくは、各タンパク質について独立して、約10kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、および/または約10kDの平均分子量および/または約0.7のDSのDSを持つヒドロキシエチルデンプン、および/または約18kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、および/または約50kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、および/または約50kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、および/または約100kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプンから誘導される。
【０１５４】
ポリマーがその非酸化型還元末端で連結化合物と起こす反応は、特に前記連結化合物が二つのアミノオキシ基H2N-O-を含むホモ二官能性連結化合物である場合には、好ましくは水系で行なわれる。
【０１５５】
本発明に関して用いられる用語「水系」は、関与する溶媒の重量を基準にして、少なくとも10重量％、好ましくは少なくとも50重量％、より好ましくは少なくとも80重量％、さらに好ましくは少なくとも90重量％、または100重量％までの範囲の水を含む溶媒または溶媒の混合物を指す。好ましい反応媒質は水である。
【０１５６】
もう一つの実施形態によれば、HAS（好ましくはHES）が可溶である少なくとも一つの他の溶媒を使用することができる。これらの溶媒の例は、DMF、ジメチルアセトアミドまたはDMSOなどである。
【０１５７】
反応中に適用される温度に関する限り、反応が所望のポリマー誘導体をもたらす限り、特別な制約は存在しない。
【０１５８】
ポリマーを、二つのアミノオキシ基H2N-O-を含むホモ二官能性連結化合物（好ましくはO-[2-(2-アミノオキシ-エトキシ)-エチル]ヒドロキシルアミン）と反応させる場合、温度は好ましくは5〜45℃の範囲、より好ましくは10〜30℃の範囲、特に好ましくは15〜25℃の範囲にある。
【０１５９】
ポリマーと、二つのアミノオキシ基H2N-O-を含むホモ二官能性連結化合物（好ましくはO-[2-(2-アミノオキシ-エトキシ)-エチル]ヒドロキシルアミン）との反応の反応時間は、一般に1時間〜7日間の範囲、好ましくは1時間〜3日間の範囲、より好ましくは2時間〜48時間の範囲にある。
【０１６０】
ポリマーと、二つのアミノオキシ基H2N-O-を含むホモ二官能性連結化合物（好ましくはO-[2-(2-アミノオキシ-エトキシ)-エチル]ヒドロキシルアミン）との反応のpH値は、反応物の化学的性質などといった特定の必要に適合させることができる。pH値は好ましくは4.5〜6.5の範囲にある。
【０１６１】
上述した反応条件の具体例は、例えば、約25℃の反応温度および約5.5のpHである。
【０１６２】
反応混合物の適切なpH値は、少なくとも一つの適切な緩衝液を加えることによって調節することができる。好ましい緩衝液のうち、酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液またはホウ酸緩衝液を挙げることができる。
【０１６３】
ポリマーと、そこに連結された二官能性連結化合物とを含むポリマー誘導体が形成されたら、それを、少なくとも一つの適切な方法によって、反応混合物から単離することができる。必要であれば、単離に先だって、少なくとも一つの適切な方法によって、ポリマー誘導体を沈殿させることができる。
【０１６４】
ポリマー誘導体をまず沈殿させる場合は、反応混合物を、反応混合物中に存在する溶媒または溶媒混合物以外の少なくとも一つの溶媒または溶媒混合物と適切な温度で（例えば適切な体積/体積比（例えば1/1 v/v）のアセトン/エタノール混合物またはイソプロパノールと、例えば-20℃〜50℃または0℃〜25℃などの温度で）接触させることができる。水性媒質（好ましくは水）を溶媒として使用する本発明の特に好ましい実施形態によれば、反応混合物を2-プロパノールの混合物と、好ましくは-20〜＋50℃の範囲の（特に好ましくは0〜25℃の範囲の）温度で接触させる。
【０１６５】
ポリマー誘導体の単離は、一段階以上を含みうる適切な工程によって行なうことができる。本発明の好ましい実施形態によれば、ポリマー誘導体をまず反応混合物または反応混合物と例えば水性2-プロパノール混合物との混合物から、遠心分離または濾過などの適切な方法によって分離する。第2段階では、分離したポリマー誘導体をさらなる処理、例えば透析、遠心濾過もしくは加圧濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、HPLC、MPLC、ゲル濾過および/または凍結乾燥のような後処理に付すことができる。さらに好ましい実施形態によれば、分離したポリマー誘導体をまず（好ましくは水に対して）透析し、次に、所望する生成物の仕様に応じて反応生成物の溶媒含量が十分に低くなるまで、凍結乾燥する。凍結乾燥は20〜35℃、好ましくは20〜30℃の温度で行なうことができる。
【０１６６】
次に、このようにして単離されたポリマー誘導体を、官能基Aを介して、タンパク質の官能基Z（Zはアルデヒド基またはケト基である）とさらに反応させる。Aがアミノオキシ基H2N-O-であってポリマー誘導体とタンパク質との間にオキシム結合をもたらす特に好ましい例では、反応は、好ましくは、水性媒質（好ましくは水）中、0〜40℃の範囲（より好ましくは4〜25℃の範囲、特に好ましくは15〜25℃の範囲）の好ましい温度で行なわれる。反応媒質のpH値は、好ましくは、4〜10の範囲、より好ましくは5〜9の範囲、特に好ましくは5〜7の範囲にある。反応時間は好ましくは1〜72時間の範囲、より好ましくは1〜48時間の範囲、特に好ましくは4〜24時間の範囲にある。
【０１６７】
コンジュゲートは、さらなる処置、例えば透析、遠心濾過もしくは加圧濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、HPLC、MPLC、ゲル濾過および/または凍結乾燥のような後処理に付すことができる。
【０１６８】
本発明のもう一つの実施形態によれば、タンパク質の官能基Zはアミノ基であり、タンパク質はIFNアルファ、IFNベータ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、第VII因子、第VIII因子および第IX因子からなる群より選択される。したがって本発明は、タンパク質の官能基Zがアミノ基であり、タンパク質がIFNアルファ、IFNベータ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、第VII因子、第VIII因子および第IX因子からなる群より選択される、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０１６９】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、アミノ基である官能基Zと反応させる官能基Aは、反応性カルボキシ基である。したがって本発明は、官能基Zがアミノ基であり、ポリマーまたはポリマー誘導体の官能基Aが反応性カルボキシ基である、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０１７０】
本発明の第1の好ましい実施形態によれば、反応性カルボキシ基は、ポリマーをその還元末端で選択的に酸化することによって、ポリマーに導入される。
【０１７１】
したがって、反応性カルボキシ基が導入されるポリマーは、好ましくは式（IIa）
【化２４】
2007527891.tif 000025
（ＩＩａ）
および/または式（IIb）
【化２５】
2007527891.tif 000026
（ＩＩｂ）
の構成を持つ。式（I）
【化２６】
2007527891.tif 000027
（Ｉ）
のポリマー（好ましくはヒドロキシエチルデンプン）の還元末端の酸化は、上述の構造（IIa）および/または（IIb）を持つ化合物をもたらす各方法またはそのような方法の組み合わせによって行なうことができる。
【０１７２】
酸化はヒドロキシアルキルデンプンの酸化型還元末端をもたらす全ての適切な方法によって行ないうるが、好ましくは、例えばDE 196 28 705 A1（その内容のそれぞれ（実施例A、第9欄6〜24行）は参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているようにアルカリ性ヨウ素溶液を使って行なわれる。
【０１７３】
還元末端で選択的に酸化されるポリマーへの反応性カルボキシ基の導入は、考えうる全ての方法によって行なうことができる。
【０１７４】
酸化型ポリマーはそのままの形で、または塩として、例えばアルカリ金属塩として、好ましくはナトリウム塩および/またはカリウム塩として使用することができる。
【０１７５】
本発明の好ましい方法によれば、還元末端で選択的に酸化されるポリマーを、その酸化型還元末端で、少なくとも一つのアルコール（好ましくは少なくとも一つの酸性アルコール）と反応させる。25℃で6〜12の範囲、より好ましくは7〜11の範囲のpKA値を持つ酸性アルコールはさらに好ましい。酸性アルコールの分子量は好ましくは80〜500g/モルの範囲、より好ましくは90〜300g/モルの範囲、特に好ましくは100〜200g/モルの範囲にある。
【０１７６】
適切な酸性アルコールは酸性プロトンを持つ全てのアルコールH-O-RAであり、酸化型ポリマーと反応させると、好ましくは式
【化２７】
2007527891.tif 000028
さらに好ましくは式
【化２８】
2007527891.tif 000029
の各反応性ポリマーエステルを生成することができる。
【０１７７】
好ましいアルコールはN-ヒドロキシスクシンイミド類、例えばN-ヒドロキシスクシンイミドまたはスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド、適切に置換されたフェノール類、例えばp-ニトロフェノール、o,p-ジニトロフェノール、o,o'-ジニトロフェノール、トリクロロフェノール、例えば2,4,6-トリクロロフェノールもしくは2,4,5-トリクロロフェノール、トリフルオロフェノール、例えば2,4,6-トリフルオロフェノールもしくは2,4,5-トリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、ペンタフルオロフェノール、またはヒドロキシアゾール類、例えばヒドロキシベンゾトリアゾールである。特に好ましいのはN-ヒドロキシスクシンイミド類であり、N-ヒドロキシスクシンイミドおよびスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミドはとりわけ好ましい。全てのアルコールは単独で使用するか、それらの二つ以上を適切に組み合わせて使用することができる。本発明においては、例えば炭酸のジエステルを加えることなどによって各アルコールを放出する化合物を使用することもできる。
【０１７８】
したがって本発明は、還元末端で選択的に酸化されるポリマーが、酸化型ポリマーを酸性アルコール（好ましくはN-ヒドロキシスクシンイミドおよび/またはスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド）と反応させることによって活性化される、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０１７９】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、還元末端で選択的に酸化されるポリマーを、その酸化型還元末端で、少なくとも一つの炭酸ジエステルRB-O-(C=O)-O-RC［式中、RBおよびRCは同じであっても異なってもよい］と反応させる。好ましくは、この方法により、式
【化２９】
2007527891.tif 000030
［式中、HAS'は好ましくはHES'である］
の反応性ポリマーが得られる。
【０１８０】
適切な炭酸ジエステル化合物としては、アルコール成分が、独立して、N-ヒドロキシスクシンイミド類、例えばN-ヒドロキシスクシンイミドもしくはスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド、適切に置換されたフェノール類、例えばp-ニトロフェノール、o,p-ジニトロフェノール、o,o'-ジニトロフェノール、トリクロロフェノール、例えば2,4,6-トリクロロフェノールもしくは2,4,5-トリクロロフェノール、トリフルオロフェノール、例えば2,4,6-トリフルオロフェノールもしくは2,4,5-トリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、ペンタフルオロフェノール、またはヒドロキシアゾール類、例えばヒドロキシベンゾトリアゾールである化合物を使用することができる。特に好ましいのは炭酸N,N'-ジスクシンイミジルおよび炭酸スルホ-N,N'-ジスルクシンイミジルであり、炭酸N,N'-ジスクシンイミジルはとりわけ好ましい。
【０１８１】
したがって本発明は、還元末端で選択的に酸化されるポリマーが、酸化型ポリマーを炭酸N,N'-ジスクシンイミジルと反応させることによって活性化される、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０１８２】
酸性アルコールは、酸化型ポリマーまたは酸化型ポリマーの塩と、酸性アルコール：ポリマーのモル比を好ましくは5：1〜50：1、より好ましくは8：1〜20：1にして、2〜40℃の好ましい反応温度（より好ましくは10〜30℃、特に好ましくは15〜25℃）で反応させる。反応時間は好ましくは1〜10時間、より好ましくは2〜5時間、より好ましくは2〜4時間、特に2〜3時間の範囲にある。
【０１８３】
炭酸ジエステル化合物は、酸化型ポリマーまたは酸化型ポリマーの塩と、ジエステル化合物：ポリマーのモル比を好ましくは1：1〜3：1、より好ましくは1：1〜1.5：1にして反応させる。反応時間は好ましくは0.1〜12時間、より好ましくは0.2〜6時間、より好ましくは0.5〜2時間、特に0.75〜1.25時間の範囲にある。
【０１８４】
本発明の好ましい実施形態によれば、酸化型ポリマーと酸性アルコールおよび/または炭酸ジエステルとの反応は、少なくとも一つの非プロトン性溶媒中で、特に好ましくは、0.5重量％を超えない（好ましくは0.1重量％を超えない）含水率を持つ無水非プロトン性溶媒中で行なわれる。適切な溶媒は、なかんずく、ジメチルスルホキシド（DMSO）、N-メチルピロリドン、ジメチルアセトアミド（DMA）、ジメチルホルムアミド（DMF）およびそれらの二つ以上の混合物である。反応温度は好ましくは2〜40℃、より好ましくは10〜30℃の範囲にある。
【０１８５】
酸化型ポリマーを少なくとも一つの酸性アルコールと反応させるために、少なくとも一つのさらなる活性化剤を使用する。
【０１８６】
適切な活性化剤は、なかんずく、カルボニルジイミダゾール、カルボジイミド類、例えばジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、ジシクロヘキシルカルボジイミド類（DCC）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）であり、ジシクロヘキシルカルボジイミド類（DCC）および1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）はとりわけ好ましい。
【０１８７】
したがって本発明は、還元末端で酸化されるポリマーをさらなる活性化剤の存在下で酸性アルコールと反応させて反応性ポリマーエステルを得る、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０１８８】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、酸化型ポリマーと炭酸ジエステルおよび/または酸性アルコールとの反応は、反応混合物を水に水対反応混合物の体積比を10：1にして加えることによって決定することができる低い塩基活量で行なわれる。添加前に、基本的に緩衝液を含まない水は25℃で7のpH値を持つ。反応混合物の添加後は、pH値を測定することにより、好ましくは9.0を超えない値、より好ましくは8.0を超えない値、特に好ましくは7.5を超えない値を持つ反応混合物の塩基活量が得られる。
【０１８９】
本発明の好ましい実施形態によれば、酸化型ポリマーを、EDCを使って、水の不在下に、乾燥DMA中でN-ヒドロキシスクシンイミドと反応させることにより、式
【化３０】
2007527891.tif 000031
［より好ましくはHAS'はHES'である］
のポリマーN-ヒドロキシスクシンイミドエステルを選択的に得る。
【０１９０】
驚くべきことに、この反応では、EDCとHESのOH基との反応に由来する副生成物が生成せず、EDCと酸化型ポリマーとによって形成されるO-アシルイソ尿素から各N-アシル尿素への転位反応は、驚くほど抑制される。
【０１９１】
本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、酸化型ポリマーを、炭酸N,N'-ジスクシンイミジルと、無水DMF中、活性化剤の不在下で反応させることにより、式
【化３１】
2007527891.tif 000032
［より好ましくはHAS'はHES'である］
のポリマーN-ヒドロキシスクシンイミドエステルを選択的に得る。
【０１９２】
上述の反応性ポリマーを、さらに、タンパク質の少なくとも一つのアミノ基と優先的に反応させて、アミド結合を得る。本発明の好ましい実施形態によれば、反応性ポリマーをタンパク質の一つのアミノ基と反応させる。
【０１９３】
タンパク質のアミノ基は、タンパク質の適切なアミノ酸残基（例えばリジン残基もしくはヒスチジン残基）のアミノ基またはタンパク質のN末端に位置するアミノ基であることができる。
【０１９４】
したがって本発明は、好ましくは式
【化３２】
2007527891.tif 000033
［式中、アミド結合のN原子はタンパク質のアミノ基に由来し、HAS'は好ましくはHES'であり、ヒドロキシエチルデンプンは、好ましくは、約10kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約10kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約100kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプンである］
の構成を持つコンジュゲートに関する。
【０１９５】
平均分子量とDSのこれらの組み合わせのそれぞれに関して、約0.8のDS値も好ましい。
【０１９６】
上述のアミド結合を介してヒドロキシアルキルデンプン（好ましくはヒドロキシエチルデンプン）に結合される特に好ましいタンパク質は、AT IIIである。したがって本発明はコンジュゲート
【化３３】
2007527891.tif 000034
［式中、アミド結合のN原子はAT IIIのアミノ基に由来し、HAS'は好ましくはHES'であり、さらに好ましくは約10kDの平均分子量および約0.4のDS値を持つヒドロキシエチルデンプンである］
にも関する。
【０１９７】
上述のアミド結合を介してヒドロキシアルキルデンプン（好ましくはヒドロキシエチルデンプン）に結合されるもう一つの特に好ましいタンパク質は、IFNアルファである。したがって本発明はコンジュゲート
【化３４】
2007527891.tif 000035
［式中、アミド結合のN原子はIFNアルファのアミノ基に由来し、HAS'は好ましくはHES'であり、さらに好ましくは約18kDの平均分子量および約0.8のDS値を持つヒドロキシエチルデンプンである］
にも関する。
【０１９８】
タンパク質のアミノ基をポリマーまたはポリマー誘導体の反応性カルボキシ基と反応させる上述の実施形態において、特に好ましいヒドロキシエチルデンプンは、例えば約10kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.8のDSを持つヒドロキシエチルデンプンである。また、約10kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、および約18kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、および約50kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約100kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプンも考えられる。
【０１９９】
平均分子量とDSのこれらの組み合わせのそれぞれに関して、約0.8のDS値も好ましい。
【０２００】
反応性ポリマーとタンパク質との反応は、少なくとも10、より好ましくは少なくとも30、さらに好ましくは少なくとも50重量パーセントの反応性ポリマーを含む反応性ポリマー製造時の反応混合物を（すなわち反応性ポリマーを単離せずに）、タンパク質の水溶液と混合することによって行なうことができる。タンパク質の好ましい水溶液は、5.0〜9.0、より好ましくは6.0〜9.0、特に好ましくは7.5〜8.5の好ましいpHで、0.05〜10、より好ましくは0.5〜5、特に好ましくは0.5〜2重量パーセントのタンパク質を含む。
【０２０１】
本発明によれば、少なくとも一つの適切な沈殿剤（例えば無水エタノール、イソプロパノールおよび/またはアセトン）を使った少なくとも一回（好ましくは複数回）の沈殿で反応性ポリマーを精製することにより、少なくとも10、より好ましくは少なくとも30、さらに好ましくは少なくとも50重量パーセントの反応性ポリマーを含む固体を得ることもできる。
【０２０２】
精製した反応性ポリマーは、タンパク質の水溶液に加えることができる。精製した反応性ポリマーの溶液をタンパク質の水溶液に加えることもできる。
【０２０３】
本発明の好ましい実施形態によれば、反応性ポリマーとタンパク質との反応によるアミド結合の生成は、2〜40℃、より好ましくは5〜35℃、特に10〜30℃の温度、および7.0〜9.0、好ましくは7.5〜9.0、特に好ましくは7.5〜8.5の好ましいpHで、0.1〜12時間、より好ましくは0.5〜5時間、より好ましくは0.5〜3時間、さらに好ましくは0.5〜2時間、特に好ましくは0.5〜1時間の好ましい反応時間にわたって行なわれ、反応性ポリマーエステル：タンパク質のモル比は、好ましくは1：1〜70：1、より好ましくは5：1〜50：1、特に好ましくは10：1〜50：1である。
【０２０４】
本発明のもう一つの実施形態によれば、還元末端で選択的に酸化されるポリマーを、その酸化型還元末端でアゾリド（例えばカルボニルジイミダゾールまたはカルボニルジベンゾイミダゾール）と反応させて、反応性カルボキシ基を持つポリマーを得る。カルボニルジイミダゾールの場合、式
【化３５】
2007527891.tif 000036
［式中、HAS'は好ましくはHES'である］
の反応性ポリマー誘導体が得られる。ポリマーとアゾリドとの反応によって生じるイミダゾリドを、タンパク質のアミノ基と優先的に反応させて、アミド結合を得ることができる。タンパク質にヒドロキシ基が存在する場合は、そのヒドロキシ基との反応によってエステル結合を得ること、またはタンパク質にチオ基が存在する場合は、そのチオ基との反応によってチオエステル結合を得ること、またはタンパク質にカルボキシ基が存在する場合は、そのカルボキシ基との反応によって-(C=O)-O-(C=O)-結合を得ることも可能である。
【０２０５】
ポリマーまたはポリマー誘導体に反応性カルボキシ基を導入するためにアゾリドを使用する上述の実施形態において、特に好ましいヒドロキシエチルデンプンは、例えば約10kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約10kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約100kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプンである。
【０２０６】
平均分子量とDSのこれらの組み合わせのそれぞれに関して、約0.8のDS値も好ましい。
【０２０７】
本発明のもう一つの実施形態によれば、ポリマーの選択的に酸化された還元末端と上述の化合物の一つ（好ましくは酸性アルコールの少なくとも一つおよび/または炭酸ジエステル化合物の少なくとも一つ）との反応によってもたらされる反応性カルボキシ基Aを持つポリマーは、少なくとも一つのリンカー化合物を介して、タンパク質の官能基Zに連結することができる。リンカー化合物を使用する場合、当該化合物は、ポリマー誘導体の官能基Aと反応させることができる少なくとも一つの官能基F1と、タンパク質の官能基Zと反応させることができる少なくとも一つの官能基F2またはタンパク質の官能基Zと反応させるために化学修飾することができる官能基F2とを持つ、少なくとも二官能性の化合物である。化学修飾は、例えば官能基F2とさらなるリンカー化合物の官能基F3との反応、または適切な官能基F2の酸化もしくは還元であることができる。少なくとも一つのリンカー化合物を使用する場合、反応はタンパク質のアミノ基に制限されるわけではなく、リンカー化合物の官能基の化学的性質に応じて、タンパク質の適切な官能基のそれぞれ（例えばカルボキシ基、反応性カルボキシ基、アルデヒド基、ケト基、チオ基、アミノ基またはヒドロキシ基）との結合を形成させるために使用することができる。二つのリンカー化合物を使用する場合は、ポリマーの反応性カルボキシ基Aと反応させることができる少なくとも一つの官能基F1（例えばアミノ基、チオ基、ヒドロキシ基、またはカルボキシ基）を持つ第1リンカー化合物を使用する。さらに第1リンカー化合物は、第2リンカー化合物の少なくとも一つの官能基F3と反応させることができる少なくとも一つの他の官能基F2を持つ。官能基F2については、なかんずく、以下の官能基が挙げられる：
・C-C二重結合またはC-C三重結合または芳香族C-C結合；
・チオ基またはヒドロキシ基；
・アルキルスルホン酸ヒドラジド、アリールスルホン酸ヒドラジド；
・1,2-ジオール；
・1,2-アミノアルコール；
・1,2-アミノ-チオアルコール；
・アジド；
・アミノ基-NH2、または構造単位-NH-を含むアミノ基の誘導体、例えばアミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリールアミノ基；
・ヒドロキシルアミノ基-O-NH2、または構造単位-O-NH-を含むヒドロキシルアミノ基の誘導体、例えばヒドロキシルアルキルアミノ基、ヒドロキシルアリールアミノ基、ヒドロキシルアラルキルアミノ基、またはヒドロキシアルカリールアミノ基；
・それぞれに構造単位-NH-O-を含む、アルコキシアミノ基、アリールオキシアミノ基、アラルキルオキシアミノ基、またはアルカリールオキシアミノ基；
・カルボニル基を持つ残基-Q-C(=G)-M
［式中、GはOまたはSであり、Mは例えば
・・-OHまたは-SH；
・・アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、またはアルカリールオキシ基；
・・アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルチオ基、またはアルカリールチオ基；
・・アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、アラルキルカルボニルオキシ基、アルカリールカルボニルオキシ基；
・・活性化エステル、例えばイミド構造を持つヒドロキシルアミン（例えばN-ヒドロキシスクシンイミド）のエステル、もしくは構造単位O-Nを持ち、Nがヘテロアリール化合物の一部であるヒドロキシルアミンのエステル、またはG＝OでありかつQが存在しない場合に、例えばペンタフルオロフェニル、パラニトロフェニルもしくはトリクロロフェニルなどの置換アリール残基を持つアリールオキシ化合物；
であり、Qは存在しないか、NHまたはSもしくはOなどのヘテロ原子である］；
・-NH-NH2、または-NH-NH-；
・-NO2；
・ニトリル基；
・カルボニル基、例えばアルデヒド基またはケト基；
・カルボキシ基；
・-N=C=O基または-N=C=S基；
・ハロゲン化ビニル基、例えばヨウ化ビニル基もしくは臭化ビニル基、またはトリフラート；
・-C≡C-H；
・-(C=NH2Cl)-Oアルキル
・基-(C=O)-CH2-Hal［式中、HalはCl、Br、またはIである］；
・-CH=CH-SO2-；
・構造-S-S-を含むジスルフィド基；
・基
【化３６】
2007527891.tif 000037
・基
【化３７】
2007527891.tif 000038
この場合、F3は上述の基の一つと化学結合を形成する能力を持つ基であり、好ましくは上述の基から選択される。さらにまた、第2リンカー化合物は、タンパク質の官能基Zと反応させることができる少なくとも一つの官能基、例えばアミノ基、チオ基、カルボキシ基、反応性カルボキシ基、アルデヒド基、ケト基、またはヒドロキシ基を持つ。ポリマーとタンパク質とを共有結合するために連結化合物を一つ使用する場合は、ポリマーを連結化合物と反応させ、得られたポリマー誘導体をタンパク質と反応させるか、タンパク質を連結化合物と反応させ、得られたタンパク質誘導体をポリマーと反応させることができる。二つの連結化合物L1およびL2を使用する場合は、ポリマーをL1と反応させ、得られたポリマー誘導体をL2と反応させ、得られたポリマー誘導体をタンパク質と反応させるか、タンパク質をL2と反応させ、得られたタンパク質誘導体をL1と反応させ、得られたタンパク質誘導体をポリマーと反応させることができる。また、ポリマーをL1と反応させ、タンパク質をL2と反応させ、ポリマー誘導体をタンパク質誘導体と反応させることもできる。さらにまた、L1をL2と反応させ、得られた化合物をポリマーと反応させ、得られたポリマー誘導体をタンパク質と反応させることもできる。さらにまた、L1をL2と反応させ、得られた化合物をタンパク質と反応させ、得られたタンパク質誘導体をポリマーと反応させることもできる。
【０２０８】
リンカー化合物を酸性アルコールおよび/または炭酸ジエステルおよび/またはアゾリドと組み合わせて使用する上述の実施形態において、特に好ましいヒドロキシエチルデンプンは、例えば約10kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約10kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約100kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプンである。
【０２０９】
平均分子量とDSのこれらの組み合わせのそれぞれに関して、約0.8のDS値も好ましい。
【０２１０】
ポリマーへの反応性カルボキシ基の導入に関する本発明の第2の好ましい実施形態によれば、反応性カルボキシ基が、還元末端が酸化されていないポリマーに、ポリマーの少なくとも一つのヒドロキシ基を炭酸ジエステルと反応させることによって導入される。
【０２１１】
したがって本発明は、Aが反応性カルボキシ基であり、Aが、還元末端が酸化されていないポリマーに、ポリマーの少なくとも一つのヒドロキシ基を少なくとも一つの炭酸ジエステルRB-O-(C=O)-O-RC［式中、RBおよびRCは同じであっても異なってもよい］と反応させることによって導入される、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０２１２】
本発明のもう一つの実施形態によれば、還元末端が酸化されていないポリマーを、少なくとも一つのヒドロキシ基で、カルボニルジイミダゾール、カルボニル-ジ-(1,2,4-トリアゾール)またはカルボニルジベンゾイミダゾールなどのアゾリドと反応させて、反応性カルボキシ基を持つポリマーを得る。
【０２１３】
適切な炭酸ジエステル化合物として、アルコール成分が、独立して、N-ヒドロキシスクシンイミド類、例えばN-ヒドロキシスクシンイミドもしくはスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド、適切に置換されたフェノール類、例えばp-ニトロフェノール、o,p-ジニトロフェノール、o,o'-ジニトロフェノール、トリクロロフェノール、例えば2,4,6-トリクロロフェノールもしくは2,4,5-トリクロロフェノール、トリフルオロフェノール、例えば2,4,6-トリフルオロフェノールもしくは2,4,5-トリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、ペンタフルオロフェノール、またはヒドロキシアゾール類、例えばヒドロキシベンゾトリアゾールである化合物を使用することができる。
【０２１４】
特に好ましいのは対称炭酸ジエステル化合物であり、したがってRBとRCとが同じである。炭酸ジエステルのアルコール成分は、好ましくは、N-ヒドロキシスクシンイミド、スルホン化N-ヒドロキシスクシンイミド、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール、ならびにニトロ置換フェノールおよびハロゲン置換フェノールからなる群より選択される。なかんずく、ニトロフェノール、ジニトロフェノール、トリクロロフェノール、トリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、およびペンタフルオロフェノールは好ましい。特に好ましいのは、炭酸N,N'-ジスクシンイミジルおよび炭酸スルホ-N,N'-ジスクシンイミジルであり、炭酸N,N'-ジスクシンイミジルはとりわけ好ましい。
【０２１５】
したがって本発明は、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体（好ましくはヒドロキシエチルデンプン誘導体）であって、そのデンプンの少なくとも一つのヒドロキシ基（好ましくは少なくとも二つのヒドロキシ基）が炭酸ジエステル化合物との反応により各反応性エステルになっているもの、およびそれを製造する方法にも関する。
【０２１６】
本発明の好ましい実施形態によれば、還元末端が酸化されていないポリマーと、少なくとも一つの炭酸ジエステル化合物との反応は、2〜40℃、より好ましくは10〜30℃、特に15〜25℃の温度で、0.5〜5時間、より好ましくは1〜3時間、特に好ましくは2〜3時間にわたって行なわれる。
【０２１７】
本発明のもう一つの実施形態によれば、還元末端が酸化されていないポリマーを、少なくとも一つのヒドロキシ基で、カルボニルジイミダゾール、カルボニル-ジ-(1,2,4-トリアゾール)またはカルボニルジベンゾイミダゾールなどのアゾリドと反応させて、反応性カルボキシ基を持つポリマーを得る。
【０２１８】
炭酸ジエステルおよび/またはアゾリド（好ましくは炭酸ジエステル化合物）：ポリマーのモル比は、未反応ポリマー中に存在するヒドロキシ基の数に対する炭酸ジエステル化合物と反応させるヒドロキシ基の数に関するポリマーの置換度に依存する。
【０２１９】
本発明の好ましい一実施形態によれば、炭酸ジエステル化合物：ポリマーのモル比は、0.5〜0.001、好ましくは0.33〜0.01、特に好ましくは0.1〜0.02の範囲の置換度が得られるように、1：2〜1：1000、より好ましくは1：3〜1：100、特に好ましくは1：10〜1：50の範囲にある。置換度はUV分光法によって決定される。
【０２２０】
本発明の好ましい実施形態によれば、還元末端が酸化されていないポリマーと炭酸ジエステルとの反応は、少なくとも一つの非プロトン性溶媒中で、特に好ましくは、0.5重量％を超えない（好ましくは0.1重量％を超えない）含水率を持つ無水非プロトン性溶媒中で行なわれる。適切な溶媒は、なかんずく、ジメチルスルホキシド（DMSO）、N-メチルピロリドン、ジメチルアセトアミド（DMA）、ジメチルホルムアミド（DMF）およびそれらの二つ以上の混合物である。
【０２２１】
したがって本発明は、還元末端が酸化されていないポリマーの少なくとも一つのヒドロキシ基と炭酸ジエステルとの反応による反応性エステル基Aの生成が、無水非プロトン性極性溶媒中で行なわれ、その溶媒が好ましくはジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミドまたはその混合物である、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０２２２】
少なくとも一つの反応性エステル基（好ましくは少なくとも二つの反応性エステル基）を含む反応性ポリマーとタンパク質との反応による少なくとも一つのアミド結合（好ましくは少なくとも二つのアミド結合）の生成は、少なくとも5、より好ましくは少なくとも10、さらに好ましくは少なくとも15重量パーセントの反応性ポリマーを含む反応性ポリマー製造時の反応混合物を（すなわち反応性ポリマーを単離せずに）、タンパク質の水溶液と混合することによって行なうことができる。タンパク質の好ましい水溶液は、7.0〜9、より好ましくは7.5〜9、特に好ましくは7.5〜8.5の好ましいpHで、0.05〜10、より好ましくは0.5〜5、特に好ましくは0.5〜2重量パーセントのタンパク質を含む。
【０２２３】
本発明によれば、少なくとも一つの適切な沈殿剤（例えば無水エタノール、イソプロパノールおよび/またはアセトン）を使った少なくとも一回（好ましくは複数回）の沈殿で反応性ポリマーを精製することにより、少なくとも20、より好ましくは少なくとも50、さらに好ましくは少なくとも80重量パーセントの反応性ポリマーを含む固体を得ることもできる。
【０２２４】
精製した反応性ポリマーは、タンパク質の水溶液に加えることができる。精製した反応性ポリマーの溶液をタンパク質の水溶液に加えることもできる。
【０２２５】
本発明の好ましい実施形態によれば、反応性ポリマーとタンパク質との反応による少なくとも一つ（好ましくは少なくとも二つ）のアミド結合の生成は、2〜40℃、より好ましくは5〜35℃、特に10〜30℃の温度、および7.0〜9.5の好ましいpH（好ましくは7.5〜9、特に好ましくは7.5〜8.5）で、0.5〜5時間の好ましい反応時間（より好ましくは0.5〜3時間、特に好ましくは0.5〜1時間）にわたって行なわれ、反応性ポリマーエステル：タンパク質のモル比は、好ましくは1：1〜70：1、より好ましくは5：1〜50：1、特に好ましくは10：1〜50：1である。
【０２２６】
本発明の好ましい実施形態によれば、タンパク質分子がアミド結合を介してポリマーに連結されるオリゴタンパク質置換ポリマーまたは多重タンパク質置換ポリマーが得られる。
【０２２７】
PDSは0.001〜1、好ましくは0.005〜0.5、より好ましくは0.005〜0.2の範囲にある。
【０２２８】
少なくとも一つの反応性カルボキシ基がポリマーまたはポリマー誘導体にポリマーまたはポリマー誘導体の少なくとも一つのヒドロキシ基との反応によって導入される上述の実施形態において、特に好ましいヒドロキシエチルデンプンは、例えば約10kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約10kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または50kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約100kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプンである。
【０２２９】
平均分子量とDSのこれらの組み合わせのそれぞれに関して、約0.8のDS値も好ましい。
【０２３０】
本発明のもう一つの実施形態によれば、ポリマーの少なくとも一つのヒドロキシ基と、上述の化合物の一つ（好ましくは炭酸ジエステル化合物の少なくとも一つ）との反応によってもたらされる反応性カルボキシ基Aを持つポリマーは、少なくとも一つのリンカー化合物を介して、タンパク質の官能基Zに連結することができる。リンカー化合物を使用する場合、当該化合物は、ポリマー誘導体の官能基Aと反応させることができる少なくとも一つの官能基F1と、タンパク質の官能基Zと反応させることができる少なくとも一つの官能基F2またはタンパク質の官能基Zと反応させるために化学修飾することができる官能基F2とを持つ、少なくとも二官能性の化合物である。化学修飾は、例えば官能基F2とさらなるリンカー化合物の官能基F3との反応、または適切な官能基F2の酸化もしくは還元であることができる。少なくとも一つのリンカー化合物を使用する場合、反応はタンパク質のアミノ基に制限されるわけではなく、リンカー化合物の官能基の化学的性質に応じて、タンパク質の適切な官能基のそれぞれ（例えばカルボキシ基、反応性カルボキシ基、アルデヒド基、ケト基、チオ基、アミノ基またはヒドロキシ基）との結合を形成させるために使用することができる。二つのリンカー化合物を使用する場合、ポリマーの反応性カルボキシ基Aと反応させることができる少なくとも一つの官能基F1（例えばアミノ基、チオ基、ヒドロキシ基、またはカルボキシ基）を持つ第1リンカー化合物を使用する。さらに第1リンカー化合物は、第2リンカー化合物の少なくとも一つの官能基F3と反応させることができる少なくとも一つの他の官能基F2を持つ。官能基F2については、なかんずく、以下の官能基が挙げられる：
・C-C二重結合またはC-C三重結合または芳香族C-C結合；
・チオ基またはヒドロキシ基；
・アルキルスルホン酸ヒドラジド、アリールスルホン酸ヒドラジド；
・1,2-ジオール；
・1,2-アミノアルコール；
・アジド；
・1,2-アミノ-チオアルコール；
・アミノ基-NH2、または構造単位-NH-を含むアミノ基の誘導体、例えばアミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリールアミノ基；
・ヒドロキシルアミノ基-O-NH2、または構造単位-O-NH-を含むヒドロキシルアミノ基の誘導体、例えばヒドロキシルアルキルアミノ基、ヒドロキシルアリールアミノ基、ヒドロキシルアラルキルアミノ基、またはヒドロキシアルカリールアミノ基；
・それぞれに構造単位-NH-O-を含む、アルコキシアミノ基、アリールオキシアミノ基、アラルキルオキシアミノ基、またはアルカリールオキシアミノ基；
・カルボニル基を持つ残基-Q-C(=G)-M
［式中、GはOまたはSであり、Mは例えば
・・-OHまたは-SH；
・・アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、またはアルカリールオキシ基；
・・アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルチオ基、またはアルカリールチオ基；
・・アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、アラルキルカルボニルオキシ基、アルカリールカルボニルオキシ基；
・・活性化エステル、例えばイミド構造を持つヒドロキシルアミン（例えばN-ヒドロキシスクシンイミド）のエステル、もしくは構造単位O-Nを持ち、Nがヘテロアリール化合物の一部であるヒドロキシルアミンのエステル、またはG＝OでありかつQが存在しない場合に、例えばペンタフルオロフェニル、パラニトロフェニルもしくはトリクロロフェニルなどの置換アリール残基を持つアリールオキシ化合物；
であり、Qは存在しないか、NHまたはSもしくはOなどのヘテロ原子である］；
・-NH-NH2、または-NH-NH-；
・-NO2；
・ニトリル基；
・カルボニル基、例えばアルデヒド基またはケト基；
・カルボキシ基；
・-N=C=O基または-N=C=S基；
・ハロゲン化ビニル基、例えばヨウ化ビニル基もしくは臭化ビニル基、またはトリフラート；
・-C≡C-H；
・-(C=NH2Cl)-Oアルキル
・基-(C=O)-CH2-Hal［式中、HalはCl、Br、またはIである］；
・-CH=CH-SO2-；
・構造-S-S-を含むジスルフィド基；
・基
【化３８】
2007527891.tif 000039
・基
【化３９】
2007527891.tif 000040
この場合、F3は上述の基の一つと化学結合を形成する能力を持つ基であり、好ましくは上述の基から選択される。さらにまた、第2リンカー化合物は、タンパク質の官能基Zと反応させることができる少なくとも一つの官能基、例えばアミノ基、チオ基、カルボキシ基、反応性カルボキシ基、アルデヒド基、ケト基、またはヒドロキシ基を持つ。ポリマーとタンパク質とを共有結合するために連結化合物を一つ使用する場合は、ポリマーを連結化合物と反応させ、得られたポリマー誘導体をタンパク質と反応させるか、タンパク質を連結化合物と反応させ、得られたタンパク質誘導体をポリマーと反応させることができる。二つの連結化合物L1およびL2を使用する場合は、ポリマーをL1と反応させ、得られたポリマー誘導体をL2と反応させ、得られたポリマー誘導体をタンパク質と反応させるか、タンパク質をL2と反応させ、得られたタンパク質誘導体をL1と反応させ、得られたタンパク質誘導体をポリマーと反応させることができる。また、ポリマーをL1と反応させ、タンパク質をL2と反応させ、ポリマー誘導体をタンパク質誘導体と反応させることもできる。さらにまた、L1をL2と反応させ、得られた化合物をポリマーと反応させ、得られたポリマー誘導体をタンパク質と反応させることもできる。さらにまた、L1をL2と反応させ、得られた化合物をタンパク質と反応させ、得られたタンパク質誘導体をポリマーと反応させることもできる。
【０２３１】
リンカー化合物を使用する上述の実施形態において、特に好ましいヒドロキシエチルデンプンは、例えば約10kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約10kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約100kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプンである。
【０２３２】
平均分子量とDSのこれらの組み合わせのそれぞれに関して、約0.8のDS値も好ましい。
【０２３３】
本発明のさらにもう一つの特に好ましい実施形態によれば、アミノ基である官能基Zと反応させる官能基Aは、アルデヒド基、ケト基、またはヘミアセタール基である。したがって本発明は、官能基Zがアミノ基であり、ポリマーまたはその誘導体の官能基Aがアルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基であって、タンパク質がIFNアルファ、IFNベータ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、第VII因子、第VIII因子、および第IX因子からなる群より選択される、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０２３４】
特に好ましい実施形態によれば、官能基Zおよび官能基Aを還元的アミノ化反応によって反応させる。
【０２３５】
ポリマーまたはポリマー誘導体が少なくとも一つのアルデヒド基を介して還元的アミノ化によってタンパク質の少なくとも一つのアミノ基に共有結合される本発明の還元的アミノ化反応は、好ましくは0〜40℃、より好ましくは0〜37℃、より好ましくは0〜25℃、特に4〜21℃（ただしとりわけ好ましくは0〜21℃）の温度で行なわれる。反応時間は好ましくは0.5〜72時間、より好ましくは2〜48時間、特に好ましくは4〜7時間の範囲である。反応の溶媒としては水性媒質が好ましい。
【０２３６】
したがって本発明は、還元的アミノ化が4〜21℃（ただしとりわけ好ましくは0〜21℃）で行なわれる、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０２３７】
したがって本発明は、還元的アミノ化が水性媒質で行なわれる、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０２３８】
したがって本発明は、還元的アミノ化が水性媒質中、4〜21℃（ただしとりわけ好ましくは0〜21℃）の温度で行なわれる、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０２３９】
本発明に関して使用する用語「水性媒質」は、関与する溶媒の重量を基準にして、少なくとも10重量％、より好ましくは少なくとも20重量％、より好ましくは少なくとも30重量％、より好ましくは少なくとも40重量％、より好ましくは少なくとも50重量％、より好ましくは少なくとも60重量％、より好ましくは少なくとも70重量％、より好ましくは少なくとも80重量％、さらに好ましくは少なくとも90重量％、または100重量％までの範囲の水を含む溶媒または溶媒の混合物をいう。好ましい反応媒質は水である。
【０２４０】
反応媒質のpH値は一般に4〜9または4〜8または4〜7.3の範囲にある。
【０２４１】
本発明の好ましい実施形態によれば、還元的アミノ化反応を行なうpHは、10未満、好ましくは7.5未満、好ましくは7.3未満、より好ましくは7以下、最も好ましくは7未満（すなわち酸性領域）である。したがって好ましい範囲は3〜7未満、より好ましくは3.5〜6.5、さらに好ましくは4〜6、さらに好ましくは4.5〜5.5、特に好ましくは約5.0、すなわち4.6または4.7または4.8または4.9または5.0.または5.1または5.2または5.3または5.4である。好ましい範囲は、なかんずく、3〜6.9または3〜6.5または3〜6または3〜5.5または3〜5または3〜4.5または3〜4または3〜3.5または3.5〜6.9または3.5〜6.5または3.5〜6または3.5〜5.5または3.5〜5または3.5〜4.5または3. 5〜4または4〜6.9または4〜6.5または4〜6.または4〜5.5または4〜5または4〜4.5または4.5〜6.9または4.5〜6.5または4.5〜6または4.5〜5.5または4.5〜5または5〜6.9または5〜6.5または5〜6または5〜5.5または5.5〜6.9または5.5〜6.5または5.5〜6または6〜6.9または6〜6.5または6.5〜6.9である。
【０２４２】
したがって本発明は、還元的アミノ化が7以下のpH、より好ましくは6以下のpHで行なわれる、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。.
【０２４３】
したがって本発明は、還元的アミノ化が0〜21℃、好ましくは4〜21℃の温度、および7.5以下、好ましくは7以下、好ましくは6以下のpHで行なわれる、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０２４４】
したがって本発明は、還元的アミノ化がpH7以下、好ましくはpH6以下の水性媒質中で行なわれる、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０２４５】
したがって本発明は、還元的アミノ化がpH7以下、好ましくはpH6以下の水性媒質中、4〜21℃の温度で行なわれる、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０２４６】
反応に使用するポリマー誘導体：タンパク質のモル比は、好ましくは、200：1〜5：1、より好ましくは100：1〜10：1、特に好ましくは75：1〜20：1の範囲にある。
【０２４７】
驚くべきことに、特に上述の好ましいpH範囲（特にpH7未満かつ4以上）では、ポリマー誘導体を主としてタンパク質のN末端に位置するアミノ基と反応させうることがわかった。本発明に関連して用いられる用語「主として」は、利用可能なN末端アミノ基の少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％を、還元的アミノ化によって反応させる実施形態をいう。利用可能なN末端アミノ基の少なくとも90％または少なくとも95％または少なくとも96％または少なくとも97％または少なくとも98％または少なくとも99％を反応させることもできる。N末端アミノ基以外のアミノ基への結合を完全に排除できたわけではないが、7未満（好ましくは6未満）のpHにおける本発明の還元的アミノ化による結合は、基本的にN末端アミノ基で選択的に起こった。特にこれらの反応条件は、これらの条件で安定なタンパク質にとって好ましい。タンパク質が酸不安定性である場合（例えばアルファ1-アンチトリプシン）は、適当な反応条件（特に7.5未満〜5超のpH）を選択することが好ましい。
【０２４８】
したがって本発明は、タンパク質がN末端アミノ基および少なくとも一つのさらなるアミノ基を含み、前記コンジュゲートが主としてN末端アミノ基に結合されたポリマーを含む、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０２４９】
特に好ましい実施形態によれば、本発明は、アルデヒドもしくはケトもしくはヘミアセタール官能化ヒドロキシアルキルデンプンまたはアルデヒドもしくはケトもしくはヘミアセタール官能化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、主としてタンパク質のN末端アミノ基に連結する方法であって、前記ヒドロキシアルキルデンプンまたはその誘導体を、7以下のpH、好ましくは6以下のpHで還元的アミノ化反応に付すことを含み、前記還元的アミノ化反応が好ましくは水性媒質中で行なわれる方法に関する。
【０２５０】
本発明によれば、アルデヒド官能化ヒドロキシアルキルデンプンまたはアルデヒド官能化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体が好ましい。
【０２５１】
さらにもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、アルデヒドもしくはケトもしくはヘミアセタール官能化ヒドロキシエチルデンプンまたはアルデヒドもしくはケトもしくはヘミアセタール官能化ヒドロキシエチルデンプン誘導体を、タンパク質のN末端アミノ基に選択的に連結する方法であって、前記ヒドロキシアルキルデンプンまたはその誘導体を7以下のpH、好ましくは6以下のpHで還元的アミノ化反応に付すことを含み、前記還元的アミノ化反応が好ましくは水性媒質中で行なわれる方法に関する。また、ここで使用される使用されるヒドロキシエチルデンプンは、好ましくは、約10kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約10kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または
【０２５２】
反応に使用するポリマー誘導体：タンパク質のモル比は、好ましくは、200：1〜10：1、より好ましくは100：1〜10：1、特に好ましくは75：1〜20：1の範囲にある。
【０２５３】
したがって本発明は、コンジュゲートを製造する方法であって、アルデヒド基を含むポリマーまたはポリマー誘導体を、水性媒質中で、還元剤（好ましくはNaCNBH3）の存在下にタンパク質のアミノ基と反応させることを含む方法にも関する。
【０２５４】
開環酸化反応によってポリマーに導入される少なくとも二つのアルデヒド基をポリマーが含む、本発明の第1の好ましい実施形態によれば、ポリマーは、好ましくは、式
【化４０】
2007527891.tif 000041
の構造を少なくとも一つは含む。
【０２５５】
本発明のこの実施形態によれば、少なくとも一つの糖環を酸化することによって少なくとも一つ（好ましくは少なくとも二つ）のアルデヒド基を持つ開いた糖環を生成させることができる各酸化剤または酸化剤の組み合わせを使用することができる。この反応は以下の反応式によって図解される。以下の反応式では、酸化されて二つのアルデヒド基を持つ開いた環を与えるポリマーの糖環が示されている。
【化４１】
2007527891.tif 000042
【０２５６】
適切な酸化剤は、なかんずく、過ヨウ素酸アルカリ金属などの過ヨウ素酸塩、またはそれらの二つ以上の混合物であり、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウムは好ましい。
【０２５７】
したがって本発明は、ポリマーが過ヨウ素酸塩を使った開環酸化反応に付されて少なくとも一つ（好ましくは少なくとも二つ）のアルデヒド基を持つポリマー誘導体を与える、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０２５８】
この酸化反応には、酸化型の還元末端または非酸化型の還元末端を持つポリマーを使用することができ、非酸化型が好ましい。
【０２５９】
したがって本発明は、非酸化型の還元末端を持つポリマーが使用される、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０２６０】
反応温度は好ましくは0〜40℃の好ましい範囲（より好ましくは0〜25℃、特に好ましくは0〜5℃）にある。反応時間は1分〜5時間の好ましい範囲（特に好ましくは10分〜4時間）にある。所望する酸化度（すなわち酸化反応の結果として得られるアルデヒド基の数）に応じて、過ヨウ素酸塩：ポリマーのモル比は適宜選択することができる。
【０２６１】
したがって本発明は、開環酸化反応が0〜5℃の温度で行なわれる、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０２６２】
過ヨウ素酸塩によるポリマーの酸化反応は、好ましくは水性媒質中、最も好ましくは水中で行なわれる。
【０２６３】
したがって本発明は、開環酸化反応が水性媒質中で行なわれる、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。反応混合物の適切なpH値は、少なくとも一つの適切な緩衝液を加えることによって調節することができる。好ましい緩衝液のうち、酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液またはホウ酸緩衝液を挙げることができる。
【０２６４】
前記開環酸化反応に付されるヒドロキシエチルデンプンは、好ましくは、約10kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約10kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または12kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または18kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または30kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または50kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約100kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプンである。
【０２６５】
平均分子量とDSのこれらの組み合わせのそれぞれに関して、約0.8のDS値も好ましい。
【０２６６】
得られたポリマー誘導体は、少なくとも一つの適切な方法によって、反応混合物から精製することができる。必要であれば、少なくとも一つの適切な方法により、単離に先だってポリマー誘導体を沈殿させてもよい。
【０２６７】
ポリマー誘導体をまず沈殿させる場合は、例えば反応混合物を、反応混合物中に存在する溶媒または溶媒混合物以外の少なくとも一つの溶媒または溶媒混合物と、適切な温度で接触させることができる。水性媒質（好ましくは水）を溶媒として使用する本発明の特に好ましい実施形態によれば、反応混合物を2-プロパノールまたはアセトンとエタノールの混合物（好ましくは1：1（v/v）混合物、すなわち等体積の前記化合物）と、好ましくは-20〜＋50℃の範囲の温度、特に好ましくは-20〜25℃の範囲の温度で接触させる。
【０２６８】
ポリマー誘導体の単離は、一段階以上を含みうる適切な工程によって行なうことができる。本発明の好ましい実施形態によれば、ポリマー誘導体をまず反応混合物または反応混合物と例えば水性2-プロパノール混合物との混合物から、遠心分離または濾過などの適切な方法によって分離する。第2段階では、分離したポリマー誘導体をさらなる処理、例えば透析、遠心濾過もしくは加圧濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、HPLC、MPLC、ゲル濾過および/または凍結乾燥のような後処理に付すことができる。さらに好ましい実施形態によれば、分離したポリマー誘導体をまず（好ましくは水に対して）透析し、次に、所望する生成物の仕様に応じて反応生成物の溶媒含量が十分に低くなるまで、凍結乾燥する。凍結乾燥は20〜35℃、好ましくは20〜30℃の温度で行なうことができる。
【０２６９】
好ましい実施形態によれば、例えば望ましくない低分子量の塩類およびポリマー成分を除去するために、またそれによって酸化型ポリマーの分子量範囲を制御する手段とするために、酸化反応によってもたらされる酸化型ポリマーを、少なくとも一つの適切な方法、例えば限外濾過および/または透析などを使って精製する。
【０２７０】
酸化型ポリマーは、タンパク質との反応に直接使用することができるか、または第1段階として例えば凍結乾燥などによって適切に回収し、水に再溶解してから、第2段階としてタンパク質へのコンジュゲーションを行なう。タンパク質の少なくとも一つのアミノ基をポリマーの少なくとも一つのアルデヒド基と還元的アミノ化によって結合させる反応については、還元的アミノ化反応の具体的反応パラメータ（例えばpHまたは温度）に関する上記の詳細な開示を参照されたい。本発明の特に好ましい実施形態によれば、還元的アミノ化が、好ましくは、0〜5℃の温度（例えば約4℃）、約4.5〜5.5のpH（例えば約5.0）で、約20〜30時間の反応時間（例えば約24時間）にわたって行なわれる。
【０２７１】
第2の好ましい実施形態によれば、ポリマーと反応させることができる少なくとも一つの官能基Mを含み、かつアルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基である少なくとも一つの官能基Q（タンパク質のアミノ基と還元的アミノ化によって反応させるもの）を含む少なくとも二官能性である化合物と、ポリマーを反応させる。
【０２７２】
アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基の他に少なくとも一つのカルボキシ基または少なくとも一つの反応性カルボキシ基、好ましくは一つのカルボキシ基または一つの反応性カルボキシ基を持つ化合物を使用することが好ましい。アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基およびカルボキシ基または反応性カルボキシ基は、任意の適切なスペーサーによって分離することができる。なかんずく、スペーサーは置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状および/または環状炭化水素残基であることができる。一般に、この炭化水素残基は1〜60個、好ましくは1〜40個、より好ましくは1〜20個、より好ましくは2〜10個、より好ましくは2〜6個、特に好ましくは2〜4個の炭素原子を持つ。ヘテロ原子が存在する場合、分離基は一般に1〜20個、好ましくは1〜8個、特に好ましくは1〜4個のヘテロ原子を含む。炭化水素残基は、例えば5〜7個の炭素原子を持つ分岐していてもよいアルキル鎖またはアリール基またはシクロアルキル基を含むか、アラルキル基、アルカリール基（アルキル部分は直鎖状および/または環状アルキル基であることができる）であることができる。
【０２７３】
好ましい実施形態によれば、炭化水素残基は2〜6個（好ましくは2〜4個）の炭素原子を持つアルキル基である。アルデヒド基またはケト基とカルボキシ基の間には炭素原子が存在しなくてもよい。あるいは、炭化水素残基は3〜11個（好ましくは3〜6個または3〜5個）の炭素原子を持つ置換または無置換環状炭化水素基であることができる。環状炭化水素基が置換される場合、置換基は、置換もしくは無置換アミノ基または置換もしくは無置換アルコキシ基からなる群より選択することができる。置換基が存在する場合、置換基の数は好ましくは1〜3個である。さらに、アルキル基および/または環状炭化水素基は、OまたはSなどの一つ以上のヘテロ原子（特にO）を含有することができる。その場合は、好ましくは1〜3個、特に1〜2個のヘテロ原子が存在する。これに関連して好ましい化合物は、以下の化合物群から選択される。
【化４２】
2007527891.tif 000043
【０２７４】
さらに好ましい実施形態によれば、炭化水素残基は5〜7個（好ましくは6個）の炭素原子を持つアリール残基である。最も好ましくは、炭化水素残基はベンゼン残基である。この好ましい実施形態によれば、カルボキシ基およびアルデヒド基はベンゼン環の1,4位、1,3位または1,2位に位置することができ、1,4位は好ましい。
【０２７５】
反応性カルボキシ基としては、反応性エステル、イソチオシアネートまたはイソシアネートを挙げることができる。好ましい反応性エステルは、N-ヒドロキシスクシンイミド類、例えばN-ヒドロキシスクシンイミドもしくはスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド、適切に置換されたフェノール類、例えばp-ニトロフェノール、o,p-ジニトロフェノール、o,o'-ジニトロフェノール、トリクロロフェノール、例えば2,4,6-トリクロロフェノールもしくは2,4,5-トリクロロフェノール、トリフルオロフェノール、例えば2,4,6-トリフルオロフェノールもしくは2,4,5-トリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、ペンタフルオロフェノール、またはヒドロキシアゾール類、例えばヒドロキシベンゾトリアゾールから誘導される。特に好ましいのはN-ヒドロキシスクシンイミド類であり、N-ヒドロキシスクシンイミドおよびスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミドはとりわけ好ましい。アルコール類は全て単独で、またはその二つ以上の適切な組み合わせとして、使用することができる。反応性エステルとして、ペンタフルオロフェニルエステルおよびN-ヒドロキシスクシンイミドエステルは、特に好ましい。
【０２７６】
反応性カルボキシ基を得るために反応させることができるカルボキシ基を含む少なくとも二官能性である化合物の具体例は、上の一覧の化合物1〜11である。この文脈において用語「カルボキシ基」はラクトンおよびジカルボン酸化合物の分子内無水物をもいう。
【０２７７】
したがって、好ましい実施形態によれば、本発明は、ポリマーをホルミル安息香酸と反応させる、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０２７８】
もう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、ポリマーをホルミル安息香酸ペンタフルオロフェニルエステルと反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０２７９】
さらにもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、ポリマーをホルミル安息香酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０２８０】
さらにもう一つの実施形態によれば、本発明は、ポリマーを4-(4-ホルミル-3,5-ジメトキシフェノキシ)酪酸と反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０２８１】
M（Mは好ましくはカルボキシ基または反応性カルボキシ基であり、Qはアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基である）を含む化合物との反応に付されるヒドロキシエチルデンプンは、最も好ましくは、約10kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプンである。また、約10kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約100kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプンも考えられる。
【０２８２】
平均分子量とDSのこれらの組み合わせのそれぞれに関して、約0.8のDS値も好ましい。
【０２８３】
特に好ましくは、酸化型の還元末端を持つヒドロキシアルキルデンプン（さらに好ましくはヒドロキシエチルデンプン）を使用する。
【０２８４】
アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を持つ得られたポリマー誘導体を、次に、還元的アミノ化によってタンパク質のアミノ基と反応させる。タンパク質の少なくとも一つのアミノ基をポリマーの少なくとも一つのアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基と還元的アミノ化によって結合させる反応については、還元的アミノ化反応の具体的反応パラメータ（例えばpHまたは温度）に関する上記の詳細な開示を参照されたい。本発明の特に好ましい実施形態によれば、タンパク質のアミノ基との反応は、好ましくは、0〜40℃、より好ましくは0〜25℃、特に好ましくは4〜21℃の温度で行なわれる。反応時間は好ましくは30分〜72時間、より好ましくは2〜48時間、特に好ましくは4時間〜17時間の範囲である。反応の溶媒としては水性媒質が好ましい。反応媒質のpH値は好ましくは4〜9の範囲、より好ましくは4〜8の範囲、特に好ましくは4.5〜5.5の範囲にある。
【０２８５】
第3の好ましい実施形態によれば、ポリマーを、その酸化されていてもよい還元末端で、アミノ基Mおよび官能基Qを含む少なくとも二官能性である化合物と反応させる。この場合、前記アミノ基Mを、ポリマーの酸化されていてもよい還元末端と反応させ、官能基Qを化学修飾してアルデヒド官能化ポリマー誘導体とし、それをタンパク質のアミノ基と還元的アミノ化によって反応させる。
【０２８６】
官能基Qについては、なかんずく、以下の官能基が挙げられる：
・C-C二重結合またはC-C三重結合または芳香族C-C結合；
・チオ基またはヒドロキシ基；
・アルキルスルホン酸ヒドラジド、アリールスルホン酸ヒドラジド；
・1,2-ジオール；
・1,2-アミノ-チオアルコール；
・アジド；
・1,2-アミノアルコール；
・アミノ基-NH2、または構造単位-NH-を含むアミノ基の誘導体、例えばアミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリールアミノ基；
・ヒドロキシルアミノ基-O-NH2、または構造単位-O-NH-を含むヒドロキシルアミノ基の誘導体、例えばヒドロキシルアルキルアミノ基、ヒドロキシルアリールアミノ基、ヒドロキシルアラルキルアミノ基、またはヒドロキシルアルカリールアミノ基；
・それぞれに構造単位-NH-O-を含む、アルコキシアミノ基、アリールオキシアミノ基、アラルキルオキシアミノ基、またはアルカリールオキシアミノ基；
・カルボニル基を持つ残基-Q-C(=G)-M
［式中、GはOまたはSであり、Mは例えば
・・-OHまたは-SH；
・・アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、またはアルカリールオキシ基；
・・アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルチオ基、またはアルカリールチオ基；
・・アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、アラルキルカルボニルオキシ基、アルカリールカルボニルオキシ基；
・・活性化エステル、例えばイミド構造を持つヒドロキシルアミン（例えばN-ヒドロキシスクシンイミド）のエステル、もしくは構造単位O-Nを持ち、Nがヘテロアリール化合物の一部であるヒドロキシルアミンのエステル、またはG＝OでありかつQが存在しない場合に、例えばペンタフルオロフェニル、パラニトロフェニルもしくはトリクロロフェニルなどの置換アリール残基を持つアリールオキシ化合物；
であり、Qは存在しないか、NHまたはSもしくはOなどのヘテロ原子である］；
・-NH-NH2、または-NH-NH-；
・-NO2；
・ニトリル基；
・カルボニル基、例えばアルデヒド基またはケト基；
・カルボキシ基；
・-N=C=O基または-N=C=S基；
・ハロゲン化ビニル基、例えばヨウ化ビニル基もしくは臭化ビニル基、またはトリフラート；
・-C≡C-H；
・-(C=NH2Cl)-Oアルキル
・基-(C=O)-CH2-Hal［式中、HalはCl、Br、またはIである］；
・-CH=CH-SO2-；
・構造-S-S-を含むジスルフィド基；
・基
【化４３】
2007527891.tif 000044
・基
【化４４】
2007527891.tif 000045
【０２８７】
本発明の好ましい実施形態によれば、用語「官能基Q」は、化学構造-NH-を含む官能基Qをいう。
【０２８８】
本発明の好ましい一実施形態によれば、官能基Mは構造R'-NH-を持つ基であって、R'は水素であるか、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリールまたはシクロアルキルアリール残基であり、そのシクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリールまたはシクロアルキルアリール残基はNH基に直接連結されていてもよいし、あるいはもう一つの実施形態として、NH基に酸素橋によって連結されていてもよい。アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリール、またはシクロアルキルアリール残基は適切に置換されていてもよい。好ましい置換基として、F、ClまたはBrなどのハロゲンを挙げることができる。特に好ましい残基R'は水素、アルキル基およびアルコキシ基であり、さらに好ましいものは水素ならびに無置換アルキル基および無置換アルコキシ基である。
【０２８９】
アルキル基およびアルコキシ基のなかでは、1、2、3、4、5、または6個のC原子を持つ基が好ましい。より好ましいのはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、およびイソプロポキシ基である。特に好ましいのはメチル、エチル、メトキシ、エトキシであり、メチルまたはメトキシはとりわけ好ましい。
【０２９０】
本発明のもう一つの実施形態によれば、官能基Mは構造R'-NH-R''を持ち、ここにR''は好ましくは構造単位-NH-および/または構造単位-(C=G)-［式中、GはOまたはSである］および/または構造単位-SO2-を含む。官能基R''の具体例は
【化４５】
2007527891.tif 000046
［Gが二つ存在する場合、それらは独立してOまたはSである］
である。
【０２９１】
したがって本発明は、官能基Mが
【化４６】
2007527891.tif 000047
［式中、GはOまたS（二つ存在する場合は、独立してOまたはS）であり、R'はメチルである］
からなる群より選択される、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０２９２】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、官能基Mはアミノ基-NH2である。
【０２９３】
用語「アミノ基Q」は、化学構造-NH-を含む官能基Qをいう。
【０２９４】
本発明の好ましい実施形態によれば、官能基Qは構造R'-NH-を持つ基であって、R'は水素であるか、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリールまたはシクロアルキルアリール残基であり、そのシクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリールまたはシクロアルキルアリール残基はNH基に直接連結されていてもよいし、あるいはもう一つの実施形態として、NH基に酸素橋によって連結されていてもよい。アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリール、またはシクロアルキルアリール残基は、適切に置換されていてもよい。好ましい置換基として、F、ClまたはBrなどのハロゲンを挙げることができる。特に好ましい残基R'は水素、アルキル基およびアルコキシ基であり、さらに好ましくは水素ならびに無置換アルキル基および無置換アルコキシ基である。
【０２９５】
アルキル基およびアルコキシ基のなかでは、1、2、3、4、5、または6個のC原子を持つ基が好ましい。より好ましいのはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、およびイソプロポキシ基である。特に好ましいのはメチル、エチル、メトキシ、エトキシであり、メチルまたはメトキシはとりわけ好ましい。
【０２９６】
本発明のもう一つの実施形態によれば、官能基Qは構造R'-NH-R''を持ち、R''は好ましくは構造単位-NH-および/または構造単位-(C=G)-［GはOまたはSである］および/または構造単位-SO2-を含む。より好ましい実施形態によれば、官能基R''は
【化４７】
2007527891.tif 000048
［Gが二つ存在する場合、それらは独立してOまたはSである］
からなる群より選択される。
【０２９７】
したがって本発明は、官能基Qが
【化４８】
2007527891.tif 000049
［式中、GはOまたはS（二つ存在する場合は、独立してOまたはS）であり、R'はメチルである］
からなる群より選択される、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０２９８】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、官能基Qはアミノ基-NH2である。
【０２９９】
本発明のさらにもう一つの好ましい実施形態によれば、MおよびQはどちらもアミノ基-NH-を含む。特に好ましい実施形態によれば、MおよびQはどちらもアミノ基-NH2である。
【０３００】
本発明の好ましい実施形態によれば、MおよびQを含む化合物はホモ二官能性化合物であり、より好ましくは官能基MおよびQとしてアミノ基-NH2を含むホモ二官能性化合物であるか、別の実施形態によれば、ヒドロキシアミノ基-O-NH2または基
【化４９】
2007527891.tif 000050
［Gは好ましくはOである］
を持つホモ二官能性化合物である。MおよびQを含むこれらの化合物の具体例は、
【化５０】
2007527891.tif 000051
または
【化５１】
2007527891.tif 000052
または
【化５２】
2007527891.tif 000053
である。
【０３０１】
Mを含む化合物（Mは好ましくはアミノ基-NH-であり、より好ましくはアミノ基-NH2であり、さらに好ましくはMおよびQはどちらもアミノ基-NH-を含み、特に好ましくはMおよびQがどちらもアミノ基-NH2を含む）との反応に付されるヒドロキシエチルデンプンは、好ましくは、約10kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約10kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプンである。また、約12kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約100kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプンも考えられる。
【０３０２】
平均分子量とDSのこれらの組み合わせのそれぞれに関して、約0.8のDS値も好ましい。
【０３０３】
MおよびQがどちらもアミノ基-NH2である場合、MおよびQは任意の適切なスペーサーによって分離することができる。なかんずく、スペーサーは置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状および/または環状炭化水素残基であることができる。一般に、この炭化水素残基は1〜60個、好ましくは1〜40個、より好ましくは1〜20個、より好ましくは2〜10個、より好ましくは2〜6個、特に好ましくは2〜4個の炭素原子を持つ。ヘテロ原子が存在する場合、分離基は一般に1〜20個、好ましくは1〜8個、特に好ましくは1〜4個のヘテロ原子を含む。炭化水素残基は、例えば5〜7個の炭素原子を持つ分岐していてもよいアルキル鎖またはアリール基またはシクロアルキル基を含むか、アラルキル基、アルカリール基（アルキル部分は直鎖状および/または環状アルキル基であることができる）であることができる。さらに好ましい実施形態によれば、炭化水素残基は炭素原子数1〜20、好ましくは2〜10、より好ましくは2〜6、特に好ましくは2〜4のアルキル鎖である。
【０３０４】
したがって本発明は、ポリマーを1,4-ジアミノブタン、1,3-ジアミノプロパンまたは1,2-ジアミノエタンと反応させてポリマー誘導体を得る、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０３０５】
第1の選択肢によれば、アミノ基NH2である官能基Mをポリマーの酸化型還元末端と反応させて、ポリマーとMおよびQを含む化合物とを連結するアミド基を得る。
【０３０６】
第2の選択肢によれば、アミノ基NH2である官能基Mをポリマーの非酸化型還元末端と還元的アミノ化によって反応させてイミノ基を形成させ、好ましくはそれを次に水素添加してアミノ基を得る（それぞれイミノ基およびアミノ基は、ポリマーとMおよびQを含む化合物とを連結する）。この場合、官能基Qはアミノ基であることができる。得られたポリマー誘導体を、後述するようにカルボキシ基もしくは反応性カルボキシ基を介して、またはアミノ基と反応させるべき少なくとも二官能性である化合物の別の基を介して、少なくとも二官能性である化合物との後続の反応に付す場合、MおよびQを含む化合物は、官能基としてアミノ基を一つだけ含有する1級アミンであることが好ましい。この具体例では、化合物は官能基を一つしか含有しないが、これはMおよびQを含む二官能性化合物とみなされ、この場合、Mはポリマーの還元末端との還元的アミノ化に付される化合物に含有されるアミノ基であり、Qは還元的アミノ化とそれに続く水素添加の結果として得られる2級アミノ基である。
【０３０７】
第3の選択肢によれば、ポリマーの非酸化型還元末端を還元的アミノ化によってアンモニアと反応させて、ポリマーの末端イミノ基を生成させ、好ましくはそれを次に水素添加してポリマーの末端アミノ基、したがって末端1級アミノ基とする。この具体例では、アンモニアがMおよびQを含む二官能性化合物とみなされ、この場合、Mは使用するアンモニアに含まれるNH2であり、Qは還元的アミノ化とそれに続く水素添加の結果として得られる1級アミノ基である。
【０３０８】
MおよびQを含む少なくとも二官能性である化合物とポリマーとの反応は、好ましくは、0〜100℃、より好ましくは4〜80℃、特に好ましくは20〜80℃の温度で行なわれ、反応時間は好ましくは4時間〜7日間、より好ましくは10時間〜5日間、特に好ましくは17〜4時間の範囲である。少なくとも二官能性である化合物：ポリマーのモル比は、好ましくは10〜200、具体的には50〜100の範囲にある。
【０３０９】
少なくとも二官能性である化合物とポリマーとの反応の溶媒としては、少なくとも一つの非プロトン性溶媒、特に好ましくは、0.5重量パーセントを超えない（好ましくは0.1重量％を超えない）含水率を持つ無水非プロトン性溶媒が好ましい。適切な溶媒は、なかんずく、ジメチルスルホキシド（DMSO）、N-メチルピロリドン、ジメチルアセトアミド（DMA）、ジメチルホルムアミド（DMF）およびそれらの二つ以上の混合物である。
【０３１０】
少なくとも二官能性である化合物とポリマーとの反応の溶媒としては、水性媒質も使用することができる。
【０３１１】
好ましい実施形態によれば、ポリマーと少なくとも二官能性である化合物とを含むポリマー誘導体を、遊離の官能基Qで化学修飾して、アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を含むポリマー誘導体を得る。この実施形態によれば、官能基Qと反応させることができる官能基と、アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基とを含む少なくとも一つの少なくとも二官能性である化合物と、ポリマー誘導体を反応させることが好ましい。
【０３１２】
少なくとも二官能性である化合物としては、アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基と、ポリマー誘導体の官能基Qとの結合を形成する能力を持つ少なくとも一つの官能基とを持つ各化合物が、適切である。少なくとも一つの官能基は、Qと同じ官能基群から選択され、Qと反応させることができるように選ばれる。Qがアミノ基-NH2である好ましい例では、アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基の他に少なくとも一つのカルボキシ基または少なくとも一つの反応性カルボキシ基（好ましくは一つのカルボキシ基または一つの反応性カルボキシ基）を持つ化合物を使用することが好ましい。アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基とカルボキシ基または反応性カルボキシ基は、任意の適切なスペーサーによって分離することができる。なかんずく、スペーサーは置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状および/または環状の炭化水素残基であることができる。一般に、この炭化水素残基は1〜60個、好ましくは1〜40個、より好ましくは1〜20個、より好ましくは2〜10個、より好ましくは2〜6個、特に好ましくは2〜4個の炭素原子を持つ。ヘテロ原子が存在する場合、分離基は一般に1〜20個、好ましくは1〜8個、特に好ましくは1〜4個のヘテロ原子を含む。炭化水素残基は、例えば5〜7個の炭素原子を持つ分岐していてもよいアルキル鎖またはアリール基またはシクロアルキル基を含むか、アラルキル基、アルカリール基（アルキル部分は直鎖状および/または環状アルキル基であることができる）であることができる。
【０３１３】
好ましい実施形態によれば、炭化水素残基は2〜6個（好ましくは2〜4個）の炭素原子を持つアルキル基である。アルデヒド基またはケト基とカルボキシ基の間には炭素原子が存在しなくてもよい。あるいは、炭化水素残基は3〜11個（好ましくは3〜6個または3〜5個）の炭素原子を持つ置換または無置換環状炭化水素基であることができる。環状炭化水素基が置換される場合、置換基は、置換もしくは無置換アミノ基または置換もしくは無置換アルコキシ基からなる群より選択することができる。置換基が存在する場合、置換基の数は好ましくは1〜3個である。さらに、アルキル基および/または環状炭化水素基は、OまたはSなどの一つ以上のヘテロ原子（特にO）を含有することができる。その場合は、好ましくは1〜3個、特に1〜2個のヘテロ原子が存在する。これに関連して好ましい化合物は、以下の化合物群から選択される。
【化５３】
2007527891.tif 000054
【０３１４】
さらに好ましい実施形態によれば、炭化水素残基は5〜7個（好ましくは6個）の炭素原子を持つアリール残基である。最も好ましくは、炭化水素残基はベンゼン残基である。この好ましい実施形態によれば、カルボキシ基およびアルデヒド基はベンゼン環の1,4位、1,3位または1,2位に位置することができ、1,4位は好ましい。
【０３１５】
反応性カルボキシ基としては、反応性エステル、イソチオシアネートまたはイソシアネートを挙げることができる。好ましい反応性エステルは、N-ヒドロキシスクシンイミド類、例えばN-ヒドロキシスクシンイミドもしくはスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド、適切に置換されたフェノール類、例えばp-ニトロフェノール、o,p-ジニトロフェノール、o,o'-ジニトロフェノール、トリクロロフェノール、例えば2,4,6-トリクロロフェノールもしくは2,4,5-トリクロロフェノール、トリフルオロフェノール、例えば2,4,6-トリフルオロフェノールもしくは2,4,5-トリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、ペンタフルオロフェノール、またはヒドロキシアゾール類、例えばヒドロキシベンゾトリアゾールから誘導される。特に好ましいのはN-ヒドロキシスクシンイミド類であり、N-ヒドロキシスクシンイミドおよびスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミドはとりわけ好ましい。アルコール類は全て単独で、またはその二つ以上の適切な組み合わせとして、使用することができる。反応性エステルとして、ペンタフルオロフェニルエステルおよびN-ヒドロキシスクシンイミドエステルは、特に好ましい。
【０３１６】
具体的一実施形態によれば、官能基Q（Qは好ましくはNH2または構造単位-NH-を含むアミノ基の誘導体、例えばアミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリールアミノ基であり、特にNH2である）と化学結合を形成することができる官能基は、反応性カルボキシ基である。
【０３１７】
この場合は、官能基Qと化学結合を形成する能力を持ちかつカルボキシ基である官能基を適切に反応させて、上述の反応性カルボキシ基を得る。したがって、カルボキシ基およびアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を含む少なくとも一つの少なくとも二官能性である化合物を、カルボキシ基が反応性カルボキシ基に変換される反応に付すことが好ましく、その結果得られる少なくとも二官能性である化合物を精製し、ポリマー誘導体の官能基Qと反応させる。
【０３１８】
反応性カルボキシ基を得るために反応させることができるカルボキシ基を含む少なくとも二官能性である化合物の具体例は、上の一覧の化合物1〜11である。この文脈において用語「カルボキシ基」はラクトンおよびジカルボン酸化合物の分子内無水物をもいう。
【０３１９】
したがって好ましい実施形態によれば、本発明は、Qを含むポリマー誘導体（Qはアミノ基-NH2である）をさらにホルミル安息香酸と反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０３２０】
もう一つの実施形態によれば、本発明は、Qを含むポリマー誘導体（Qはアミノ基である）をさらにホルミル安息香酸ペンタフルオロフェニルエステルと反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０３２１】
さらにもう一つの実施形態によれば、本発明は、Qを含むポリマー誘導体（Qはアミノ基である）をさらにホルミル安息香酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０３２２】
さらにもう一つの実施形態によれば、本発明は、Qを含むポリマー誘導体（Qはアミノ基である）をさらに4-(4-ホルミル-3,5-ジメトキシフェノキシ)酪酸と反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０３２３】
もう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、Qを含むポリマー誘導体（Qはアミノ基である）をさらに、アルファ-ケトカルボン酸、シアル酸またはその誘導体およびピリドキサールリン酸からなる群より選択される生体適合性化合物である二官能性化合物と反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０３２４】
アルファ-ケトカルボン酸について述べると、これらは好ましくはアミノ酸から誘導されるアルファ-ケトカルボン酸であり、ほとんどの場合、人体にも見いだすことができる。アミノ酸から誘導される好ましいアルファ-ケトカルボン酸は、ケト-バリン、ケト-ロイシン、ケト-イソロイシンおよびケト-アラニンからなる群より選択される。アルファ-ケトカルボン酸のカルボキシ基を、アミノ基であるポリマーの基Qと反応させる。それによってアミド基が形成される。次に、アルファ-ケトカルボン酸の残りの遊離ケト基を、タンパク質の官能基（特にアミノ基）と反応させることができる。それによってイミノ基が形成され、それを水素添加することができる。
【０３２５】
したがって本発明は、Qを含むポリマー誘導体（Qはアミノ基である）をさらにアルファ-ケトカルボン酸と反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０３２６】
シアル酸またはその誘導体について述べると、それらは好ましくは生体適合性であり、特にそれらは人体に見いだされる糖類であって、N-および/またはO-アセチル化されている。好ましい実施形態では、ノイラミン酸またはシアル酸がN-アセチルノイラミン酸である。これらの化合物は、そのピラノース構造ゆえに、スペーサーとしての機能を満たすために、望ましい剛性を持つ。一方、これらの化合物には選択的酸化によってアルデヒド基を導入することが可能であるだろう。シアル酸は人体に、例えばグリコシル化タンパク質のグリカン鎖中の末端単糖などとして見いだされる。
【０３２７】
好ましい実施形態では、シアル酸をアルデヒド基に選択的に酸化することができる。
【０３２８】
シアル酸またはノイラミン酸を選択的に酸化する方法は、当技術分野においては、例えばL.W.Jaques, B.F.Riesco, W.Weltner, Carbohydrate Research, 83(1980), 21-32、およびT.Masuda, S.Shibuya, M.Arai, S.Yoshida, T.Tomozawa, A.Ohno, M.Yamashita, T.Honda, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 13(2003), 669-673などから知られている。好ましくは、Qを含有するポリマー（Qはアミノ基である）との反応に先だって、シアル酸の酸化を行なうことができる。
【０３２９】
酸化されていてもよいシアル酸を、次に、そのカルボン酸基を介して、ポリマーのアミノ基と反応させることができる。
【０３３０】
結果として得られる化合物はアルデヒド基を含有し、それは次に、タンパク質のアミノ基と還元的アミノ化によってさらに反応させることができる。
【０３３１】
したがって本発明は、Qを含むポリマー誘導体（Qはアミノ基である）を酸化されていてもよいシアル酸とさらに反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０３３２】
ピリドキサールリン酸（PyP）について述べると、これは高い生体適合性を持つ二官能性化合物であり、ビタミンB6とも呼ばれる。PyPはアミノ基転移、脱炭酸、ラセミ化、およびアミノ酸側鎖の数多くの修飾に関与する補酵素である。PyP要求酵素は全て、アミノ酸と補酵素の間のシッフ塩基の形成を介して作用する。
【０３３３】
PyPのリン酸基を、ポリマー（好ましくはヒドロキシアルキルデンプン、特にヒドロキシエチルデンプン）のアミノ基と反応させて、ホルホルアミドを形成させることができる。次に、PyPのアルデヒド基をタンパク質のアミノ基と反応させて、シッフ塩基を形成させ、次にそれを還元することができる。好ましい実施形態では、コンジュゲートの構造が、HES-NH-P(O)2-O-(ピリドキサール)-CH-NH-タンパク質である。
【０３３４】
PyPの場合、ポリマーの官能基Qは、好ましくは、上述のジアミノ化合物を使ってポリマーに導入される。
【０３３５】
したがって本発明は、Qを含むポリマー誘導体（Qはアミノ基である）をさらにピリドキサールリン酸と反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０３３６】
アミノ基を含むポリマー誘導体と例えばホルミル安息香酸との反応の溶媒としては、少なくとも一つの非プロトン性溶媒または少なくとも一つの極性溶媒が好ましい。適切な溶媒は、なかんずく、水、ジメチルスルホキシド（DMSO）、N-メチルピロリドン、ジメチルアセトアミド（DMA）、ジメチルホルムアミド（DMF）およびそれらの二つ以上の混合物である。
【０３３７】
アミノ基を含むポリマー誘導体とカルボキシ基をふくむ少なくとも二官能性である化合物との反応の溶媒としては、水性媒質を使用することもできる。本発明のこの文脈で使用する用語「水性媒質」は、関与する溶媒の重量を基準にして、少なくとも10重量％または少なくとも20重量％または少なくとも30重量％または少なくとも40重量％または少なくと50重量％または少なくとも60重量％または少なくとも70重量％または少なくとも80重量％または少なくとも90重量％または100重量％までの範囲の水を含む溶媒または溶媒の混合物をいう。
【０３３８】
反応は、好ましくは、0〜40℃、より好ましくは0〜25℃、特に好ましくは15〜25℃の温度で、好ましくは0.5〜24時間、特に好ましくは1〜17時間の反応時間にわたって行なわれる。
【０３３９】
好ましい実施形態によれば、反応は活性化剤の存在下で行なわれる。適切な活性化剤は、なかんずく、カルボジイミド類、例えばジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、ジシクロヘキシルカルボジイミド類（DCC）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）などであり、ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）は特に好ましい。
【０３４０】
得られたポリマー誘導体は、少なくとも一つの適切な方法によって、反応混合物から精製することができる。必要であれば、少なくとも一つの適切な方法により、単離に先だってポリマー誘導体を沈殿させてもよい。
【０３４１】
ポリマー誘導体をまず沈殿させる場合は、例えば反応混合物を、反応混合物中に存在する溶媒または溶媒混合物以外の少なくとも一つの溶媒または溶媒混合物と、適切な温度で接触させることができる。水性媒質（好ましくは水）を溶媒として使用する本発明の特に好ましい実施形態によれば、反応混合物を2-プロパノールまたはアセトンとエタノールの混合物（好ましくは1：1（v/v）混合物、すなわち等体積の前記化合物）と、好ましくは-20〜＋50℃の範囲の温度、特に好ましくは-20〜25℃の範囲の温度で接触させる。
【０３４２】
ポリマー誘導体の単離は、一段階以上を含みうる適切な工程によって行なうことができる。本発明の好ましい実施形態によれば、ポリマー誘導体をまず反応混合物または反応混合物と例えば水性2-プロパノール混合物との混合物から、遠心分離または濾過などの適切な方法によって分離する。第2段階では、分離したポリマー誘導体をさらなる処理、例えば透析、遠心濾過もしくは加圧濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、HPLC、MPLC、ゲル濾過および/または凍結乾燥のような後処理に付すことができる。さらに好ましい実施形態によれば、分離したポリマー誘導体をまず（好ましくは水に対して）透析し、次に、所望する生成物の仕様に応じて反応生成物の溶媒含量が十分に低くなるまで、凍結乾燥する。凍結乾燥は20〜35℃、好ましくは20〜30℃の温度で行なうことができる。
【０３４３】
次に、アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を持つ得られたポリマー誘導体を、タンパク質のアミノ基と、還元的アミノ化によって反応させる。タンパク質の少なくとも一つのアミノ基をポリマーの少なくとも一つのアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基と還元的アミノ化によって結合させる反応については、還元的アミノ化反応の具体的反応パラメータ（例えばpHまたは温度）に関する上記の詳細な開示を参照されたい。本発明の特に好ましい実施形態によれば、還元的アミノ化が、好ましくは、温度0〜10℃、例えば1〜8℃または2〜6℃、例えば約4℃の温度、および約4.5〜5.5、例えば約5.0のpHで行なわれる。反応時間は約10〜20時間、例えば12〜19時間もしくは14〜18時間、例えば約17時間、または約20〜30時間、例えば約24時間である。
【０３４４】
したがって上述の好ましい実施形態によれば、本発明は、ポリマーをその酸化型還元末端を介して反応させた場合に、式
【化５４】
2007527891.tif 000055
のコンジュゲートに関する。
【０３４５】
特に好ましい実施形態によれば、上述のように、ポリマーはヒドロキシエチルデンプン（すなわちHAS'はHES'）であり、n＝2、3、または4（最も好ましくは4）である。したがって、ポリマーをその酸化型還元末端を介して反応させた場合、本発明は、式
【化５５】
2007527891.tif 000056
のコンジュゲートにも関する。
【０３４６】
もう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、ポリマーをその酸化型還元末端を解して反応させた場合に、式
【化５６】
2007527891.tif 000057
［式中、n＝2、3、または4であり、R4は、独立して、水素またはメトキシ基であり、R4が水素である場合はm＝0であり、R4がメトキシである場合はm＝1であり、HASは好ましくはHES'である］
のコンジュゲートにも関する。
【０３４７】
上式のそれぞれにおいて、タンパク質に結合している窒素は、ポリマー誘導体がアルデヒド基を介して連結されるタンパク質のアミノ基に由来する。
【０３４８】
官能基MおよびQがアミノ基-NH2を含む上述の実施形態については、Mがアミノ基-NH2であり、Qがベータヒドロキシアミノ基-CH(OH)-CH2-NH2を含む（好ましくはベータヒドロキシアミノ基である）こともできる。
【０３４９】
したがって本発明は、二つのアミノ基MおよびQを含む化合物のアミノ基Qがベータヒドロキシアミノ基-CH(OH)-CH2-NH2である、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０３５０】
この場合、MおよびQは、任意の適切なスペーサーによって分離することができる。なかんずく、スペーサーは置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状および/または環状の炭化水素残基であることができる。一般に、この炭化水素残基は1〜60個、好ましくは1〜40個、より好ましくは1〜20個、より好ましくは2〜10個、より好ましくは1〜6個、特に好ましくは1〜2個の炭素原子を持つ。ヘテロ原子が存在する場合、分離基は一般に1〜20個、好ましくは1〜8個、特に好ましくは1〜4個のヘテロ原子を含む。炭化水素残基は、例えば5〜7個の炭素原子を持つ分岐していてもよいアルキル鎖またはアリール基またはシクロアルキル基を含むか、アラルキル基、アルカリール基（アルキル部分は直鎖状および/または環状アルキル基であることができる）であることができる。さらに好ましい実施形態によれば、炭化水素残基は炭素原子数1〜20、好ましくは1〜10、より好ましくは1〜6、より好ましくは1〜4、特に好ましくは炭素原子数1〜2のアルキル鎖である。さらに好ましくは、MおよびQはメチレン基によって分離される。
【０３５１】
したがって本発明は、ポリマーを1,3-ジアミノ-2-ヒドロキシプロパンと反応させる、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０３５２】
ポリマーをその酸化型還元末端を介して反応させると、式
【化５７】
2007527891.tif 000058
［特に好ましくはHAS'＝HES'である］
のポリマー誘導体が得られる。
【０３５３】
MおよびQを含む少なくとも二官能性である化合物（特に好ましくは1,3-ジアミノ-2-ヒドロキシプロパン）とポリマーとの反応は、好ましくは、40〜120℃、より好ましくは40〜90℃、特に好ましくは60〜80℃の温度で行なわれる。反応時間は、好ましくは、17〜168時間、より好ましくは17〜96時間、特に好ましくは48〜96時間の範囲である。少なくとも二官能性である化合物：ポリマーのモル比は、好ましくは200：1〜10：1、具体的には50：1〜100：1の範囲にある。
【０３５４】
少なくとも二官能性である化合物とポリマーとの反応の溶媒としては、少なくとも一つの非プロトン性溶媒（好ましくは、0.5重量パーセントを超えない（好ましくは0.1重量％を超えない）含水率を持つ無水非プロトン性溶媒）が好ましい。適切な溶媒は、なかんずく、ジメチルスルホキシド（DMSO）、N-メチルピロリドン、ジメチルアセトアミド（DMA）、ジメチルホルムアミド（DMF）およびそれらの二つ以上の混合物である。
【０３５５】
ポリマー誘導体のベータヒドロキシアミノ基Qは、一般に、Qと反応させることができる少なくとも一つの官能基を含みかつアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基である少なくとも一つの官能基またはアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基が生じるように修飾することができる官能基を含む少なくとも二官能性である化合物と、反応させることができる。本発明のもう一つの実施形態によれば、化学的酸化によってアルデヒド基を生じるように、ベータヒドロキシアミノ基を直接化学修飾する。
【０３５６】
この酸化は、ベータヒドロキシアミノ基をアルデヒド基に変換する能力を持つ適切な酸化剤のどれを使っても行なうことができる。好ましい酸化試薬は過ヨウ素酸アルカリ金属などの過ヨウ素酸塩である。特に好ましいのは過ヨウ素酸ナトリウムであり、好ましくはこれを水溶液として使用する。この溶液は、1〜50mMの好ましいヨウ素酸塩濃度（より好ましくは1〜25mM、特に好ましくは1〜10mM）を持つ。酸化は0〜40℃、好ましくは0〜25℃、特に好ましくは4〜20℃の温度で行なわれる。
【０３５７】
得られたポリマー誘導体は、少なくとも一つの適切な方法によって、反応混合物から精製することができる。必要であれば、少なくとも一つの適切な方法により、単離に先だってポリマー誘導体を沈殿させてもよい。
【０３５８】
ポリマー誘導体をまず沈殿させる場合は、例えば反応混合物を、反応混合物中に存在する溶媒または溶媒混合物以外の少なくとも一つの溶媒または溶媒混合物と、適切な温度で接触させることができる。水性媒質（好ましくは水）を溶媒として使用する本発明の特に好ましい実施形態によれば、反応混合物を2-プロパノールまたはアセトンとエタノールの混合物（好ましくは1：1（v/v）混合物、すなわち等体積の前記化合物）と、好ましくは-20〜＋50℃の範囲の温度、特に好ましくは-20〜25℃の範囲の温度で接触させる。
【０３５９】
ポリマー誘導体の単離は、一段階以上を含みうる適切な工程によって行なうことができる。本発明の好ましい実施形態によれば、ポリマー誘導体をまず反応混合物または反応混合物と例えば水性2-プロパノール混合物との混合物から、遠心分離または濾過などの適切な方法によって分離する。第2段階では、分離したポリマー誘導体をさらなる処理、例えば透析、遠心濾過もしくは加圧濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、HPLC、MPLC、ゲル濾過および/または凍結乾燥のような後処理に付すことができる。さらに好ましい実施形態によれば、分離したポリマー誘導体をまず（好ましくは水に対して）透析し、次に、所望する生成物の仕様に応じて反応生成物の溶媒含量が十分に低くなるまで、凍結乾燥する。凍結乾燥は20〜35℃、好ましくは20〜30℃の温度で行なうことができる。
【０３６０】
したがって本発明は、過ヨウ素酸塩を使ってベータヒドロキシアミノ基Qの酸化を行なう、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０３６１】
したがって本発明は、酸化型還元末端を持つポリマーを使用する場合に、ベータヒドロキシアミノ基を持つポリマー誘導体、特に好ましくは
【化５８】
2007527891.tif 000059
［特にHAS'＝HES'］
を、好ましくは過ヨウ素酸塩を使って、アルデヒド基を持つポリマー誘導体、特に好ましくは
【化５９】
2007527891.tif 000060
［特にHAS'＝HES'］
に酸化する、コンジュゲートの製造方法にも関する。
【０３６２】
本発明によれば、上記の1-アミノ2-ヒドロキシ構造を含む化合物を、カルボキシ基または反応性カルボキシ基およびアルデヒド基、ケト基またはアセタール基を含む上述の少なくとも二官能性である化合物と反応させてポリマー誘導体を取得し、それをタンパク質のアミノ基との還元的アミノ化に付すこともできる。
【０３６３】
その結果得られるアルデヒド基Aを持つポリマー誘導体を、次に、タンパク質と反応させる。したがって本発明は、コンジュゲートの製造方法であって、ベータヒドロキシアミノ基を持つポリマー誘導体（酸化型還元末端を持つポリマーを使用した場合、特に好ましくは式
【化６０】
2007527891.tif 000061
［特にHAS'＝HES'］
のポリマー誘導体）を、タンパク質のアミノ基と反応させることを含む方法にも関する。
【０３６４】
アルデヒド基を持つ得られたポリマー誘導体を、次に、タンパク質のアミノ基と還元的アミノ化によって反応させる。タンパク質の少なくとも一つのアミノ基をポリマーの少なくとも一つのアルデヒド基と還元的アミノ化によって結合させる反応については、上記の詳細な開示を参照されたい。
【０３６５】
したがって上述の好ましい実施形態によれば、本発明は、式
【化６１】
2007527891.tif 000062
［特にHAS'＝HES'］
のコンジュゲートにも関する（酸化型還元末端を持つポリマーを使用した場合）。上式において、タンパク質に結合している窒素は、ポリマー誘導体がアルデヒド基を介して連結されるタンパク質のアミノ基に由来する。
【０３６６】
本発明のさらなる実施形態によれば、ポリマーをまず適切な化合物と反応させて、少なくとも一つの反応性カルボキシ基を含む第1ポリマー誘導体を得る。次に、この第1ポリマー誘導体を、さらなる少なくとも二官能性である化合物と反応させる。ここでは、このさらなる化合物の少なくとも一つの官能基を、ポリマー誘導体の少なくとも一つの反応性カルボキシ基と反応させ、そのさらなる化合物の少なくとも一つの他の官能基はアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基であるか、化学修飾を受けてアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を与える官能基であり、前記アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を含む得られたポリマー誘導体を、上述のように、還元的アミノ化によってタンパク質の少なくとも一つのアミノ基と反応させる。各化合物を互いに反応させる順序は変更することもできる。
【０３６７】
前記さらなる実施形態の第1の選択肢によれば、少なくとも一つの反応性カルボキシ基を含むポリマーは、ポリマーをその還元末端で選択的に酸化し、次に、ラクトン
【化６２】
2007527891.tif 000063
（ＩＩａ）
および/またはカルボン酸
【化６３】
2007527891.tif 000064
（ＩＩｂ）
またはカルボン酸の適切な塩（例えばアルカリ金属塩、好ましくはナトリウム塩および/またはカリウム塩）である酸化型ポリマー（HAS'は好ましくはHES'である）を、少なくとも一つの反応性カルボキシ基を含むポリマーが得られるように適切な化合物と反応させることによって製造される。
【０３６８】
ポリマー（好ましくはヒドロキシエチルデンプン）の酸化は、上述の構造（IIa）および/または（IIb）を持つ化合物をもたらす各方法またはそれらの方法の組み合わせに従って行なうことができる。
【０３６９】
酸化はヒドロキシアルキルデンプンの酸化型還元末端をもたらす適切な方法のどれに従って行なってもよいが、好ましくは、例えばDE 196 28 705 A1（その内容のそれぞれ（実施例A、第9欄6〜24行）は参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているように、アルカリ性ヨウ素溶液を使って行なわれる。
【０３７０】
還元末端で選択的に酸化されるポリマーへの反応性カルボキシ基の導入は、全ての考えうる方法および全ての適切な化合物によって行なうことができる。
【０３７１】
本発明の具体的一方法によれば、還元末端で選択的に酸化されるポリマーを、その酸化型還元末端で、少なくとも一つのアルコール、好ましくは少なくとも一つの酸性アルコール、例えば6〜12の範囲または7〜11の範囲のpHA値を持つ酸性アルコールと、25℃で反応させる。酸性アルコールの分子量は80〜500g/モルの範囲、例えば90〜300g/モルの範囲、または100〜200g/モルの範囲にあることができる。
【０３７２】
適切な酸性アルコールは酸性プロトンを持つ全てのアルコールH-O-RAであり、酸化型ポリマーと反応させると、好ましくは式
【化６４】
2007527891.tif 000065
さらに好ましくは式
【化６５】
2007527891.tif 000066
の各反応性ポリマーエステルを生成することができる。
【０３７３】
好ましいアルコールはN-ヒドロキシスクシンイミド類、例えばN-ヒドロキシスクシンイミドまたはスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド、適切に置換されたフェノール類、例えばp-ニトロフェノール、o,p-ジニトロフェノール、o,o'-ジニトロフェノール、トリクロロフェノール、例えば2,4,6-トリクロロフェノールもしくは2,4,5-トリクロロフェノール、トリフルオロフェノール、例えば2,4,6-トリフルオロフェノールもしくは2,4,5-トリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、ペンタフルオロフェノール、またはヒドロキシアゾール類、例えばヒドロキシベンゾトリアゾールである。特に好ましいのはN-ヒドロキシスクシンイミド類であり、N-ヒドロキシスクシンイミドおよびスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミドはとりわけ好ましい。全てのアルコールは単独で使用するか、それらの二つ以上を適切に組み合わせて使用することができる。本発明においては、例えば炭酸のジエステルを加えることなどによって各アルコールを放出する化合物を使用することもできる。
【０３７４】
したがって本発明は、還元末端を選択的に酸化されるポリマーが、酸化型ポリマーを酸性アルコール（好ましくはN-ヒドロキシスクシンイミドおよび/またはスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド）と反応させることによって活性化される、上述の方法にも関する。
【０３７５】
本発明の好ましい実施形態によれば、還元末端で選択的に酸化されるポリマーを、その酸化型還元末端で、少なくとも一つの炭酸ジエステルRB-O-(C=O)-O-RC［式中、RBおよびRCは同じであっても異なってもよい］と反応させる。好ましくは、この方法により、式
【化６６】
2007527891.tif 000067
［式中、HAS'は好ましくはHES'である］
の反応性ポリマーが得られる。
【０３７６】
適切な炭酸ジエステル化合物としては、アルコール成分が、独立して、N-ヒドロキシスクシンイミド類、例えばN-ヒドロキシスクシンイミドもしくはスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド、適切に置換されたフェノール類、例えばp-ニトロフェノール、o,p-ジニトロフェノール、o,o'-ジニトロフェノール、トリクロロフェノール、例えば2,4,6-トリクロロフェノールもしくは2,4,5-トリクロロフェノール、トリフルオロフェノール、例えば2,4,6-トリフルオロフェノールもしくは2,4,5-トリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、ペンタフルオロフェノール、またはヒドロキシアゾール類、例えばヒドロキシベンゾトリアゾールである化合物を使用することができる。特に好ましいのは炭酸N,N'-ジスクシンイミジルおよび炭酸スルホ-N,N'-ジスルクシンイミジルであり、炭酸N,N'-ジスクシンイミジルはとりわけ好ましい。.
【０３７７】
したがって本発明は、還元末端で選択的に酸化されるポリマーが、酸化型ポリマーを炭酸N,N'-ジスクシンイミジルと反応させることによって活性化される、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０３７８】
酸性アルコールは、酸化型ポリマーまたは酸化型ポリマーの塩と、酸性アルコール：ポリマーのモル比を好ましくは5：1〜50：1、より好ましくは8：1〜20：1にして、2〜40℃の好ましい反応温度（より好ましくは10〜30℃、特に好ましくは15〜25℃）で反応させる。反応時間は好ましくは1〜10時間、より好ましくは2〜5時間、より好ましくは2〜4時間、特に2〜3時間の範囲にある。
【０３７９】
炭酸ジエステル化合物は、酸化型ポリマーまたは酸化型ポリマーの塩と、ジエステル化合物：ポリマーのモル比を一般的には1：1〜3：1、例えば1：1〜1.5：1にして反応させる。反応時間は一般に0.1〜12時間、例えば0.2〜6時間、または0.5〜2時間、または0.75〜1.25時間の範囲にある。
【０３８０】
本発明の好ましい実施形態によれば、酸化型ポリマーと酸性アルコールおよび/または炭酸ジエステルとの反応は、少なくとも一つの非プロトン性溶媒中で、例えば0.5重量％を超えない（好ましくは0.1重量％を超えない）含水率を持つ無水非プロトン性溶媒中で行なわれる。適切な溶媒は、なかんずく、ジメチルスルホキシド（DMSO）、N-メチルピロリドン、ジメチルアセトアミド（DMA）、ジメチルホルムアミド（DMF）およびそれらの二つ以上の混合物である。反応温度は好ましくは2〜40℃、より好ましくは10〜30℃の範囲にある。
【０３８１】
酸化型ポリマーを少なくとも一つの酸性アルコールと反応させるために、少なくとも一つのさらなる活性化剤を使用する。
【０３８２】
適切な活性化剤は、なかんずく、カルボニルジイミダゾール、カルボジイミド類、例えばジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、ジシクロヘキシルカルボジイミド類（DCC）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）であり、ジシクロヘキシルカルボジイミド類（DCC）および1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）はとりわけ好ましい。
【０３８３】
したがって本発明は、還元末端で酸化されるポリマーをさらなる活性化剤の存在下で酸性アルコールと反応させて反応性ポリマーエステルを得る、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０３８４】
本発明の一実施形態によれば、酸化型ポリマーと炭酸ジエステルおよび/または酸性アルコールとの反応は、反応混合物を水に水対反応混合物の体積比を10：1にして加えることによって決定することができる低い塩基活量で行なわれる。添加前に、基本的に緩衝液を含まない水は25℃で7のpH値を持つ。反応混合物の添加後は、pH値を測定することにより、好ましくは9.0を超えない値、より好ましくは8.0を超えない値、特に好ましくは7.5を超えない値を持つ反応混合物の塩基活量が得られる。
【０３８５】
本発明のもう一つの実施形態によれば、酸化型ポリマーを、EDCを使って、水の不在下に、乾燥DMA中でN-ヒドロキシスクシンイミドと反応させることにより、式
【化６７】
2007527891.tif 000068
［より好ましくはHAS'はHES'である］
のポリマーN-ヒドロキシスクシンイミドエステルを選択的に得る。
【０３８６】
驚くべきことに、この反応では、EDCとHESのOH基との反応に由来する副生成物が生成せず、EDCと酸化型ポリマーとによって形成されるO-アシルイソ尿素から各N-アシル尿素への転位反応は、驚くほど抑制される。
【０３８７】
本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、酸化型ポリマーを、炭酸N,N'-ジスクシンイミジルと、無水DMF中、活性化剤の不在下で反応させることにより、式
【化６８】
2007527891.tif 000069
［より好ましくはHAS'はHES'である］
のポリマーN-ヒドロキシスクシンイミドエステルを選択的に得る。
【０３８８】
本発明のもう一つの実施形態によれば、還元末端で選択的に酸化されるポリマーを、その酸化型還元末端で、カルボニルジイミダゾールまたはカルボニルジベンゾイミダゾールなどのアゾリドと反応させて、反応性カルボキシ基を持つポリマーを得る。カルボニルジイミダゾールの場合、式
【化６９】
2007527891.tif 000070
［HAS'は好ましくはHES'である］
の反応性イミダゾリドポリマー誘導体が得られる。
【０３８９】
ポリマーへの少なくとも一つの反応性カルボキシ基の導入に関する本発明の前記さらなる実施形態の第2の選択肢によれば、還元末端が酸化されていないポリマーに、ポリマーの少なくとも一つのヒドロキシ基を炭酸ジエステルと反応させることによって、反応性カルボキシ基が導入される。
【０３９０】
したがって本発明は、還元末端が酸化されていないポリマーに、ポリマーの少なくとも一つのヒドロキシ基を少なくとも一つの炭酸ジエステルRB-O-(C=O)-O-RC［式中、RBおよびRCは同じであっても異なってもよい］と反応させることによって、反応性カルボキシ基が導入される、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０３９１】
本発明のもう一つの実施形態によれば、還元末端が酸化されていないポリマーを、少なくとも一つのヒドロキシ基で、カルボニルジイミダゾール、カルボニル-ジ-(1,2,4-トリアゾール)またはカルボニルジベンゾイミダゾールなどのアゾリドと反応させて、反応性カルボキシ基を持つポリマーを得る。
【０３９２】
適切な炭酸ジエステル化合物として、アルコール成分が、独立して、N-ヒドロキシスクシンイミド類、例えばN-ヒドロキシスクシンイミドもしくはスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド、適切に置換されたフェノール類、例えばp-ニトロフェノール、o,p-ジニトロフェノール、o,o'-ジニトロフェノール、トリクロロフェノール、例えば2,4,6-トリクロロフェノールもしくは2,4,5-トリクロロフェノール、トリフルオロフェノール、例えば2,4,6-トリフルオロフェノールもしくは2,4,5-トリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、ペンタフルオロフェノール、またはヒドロキシアゾール類、例えばヒドロキシベンゾトリアゾールである化合物を使用することができる。
【０３９３】
特に好ましいのは対称炭酸ジエステル化合物であり、したがってRBとRCとが同じである。炭酸ジエステルのアルコール成分は、好ましくは、N-ヒドロキシスクシンイミド、スルホン化N-ヒドロキシスクシンイミド、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール、ならびにニトロ置換フェノールおよびハロゲン置換フェノールからなる群より選択される。なかんずく、ニトロフェノール、ジニトロフェノール、トリクロロフェノール、トリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、およびペンタフルオロフェノールは好ましい。特に好ましいのは、炭酸N,N'-ジスクシンイミジルおよび炭酸スルホ-N,N'-ジスクシンイミジルであり、炭酸N,N'-ジスクシンイミジルはとりわけ好ましい。
【０３９４】
したがって本発明は、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体（好ましくはヒドロキシエチルデンプン誘導体）であって、そのデンプンの少なくとも一つのヒドロキシ基（好ましくは少なくとも二つのヒドロキシ基）が炭酸ジエステル化合物との反応により各反応性エステルになっているものにも関する。
【０３９５】
本発明の一実施形態によれば、還元末端が酸化されていないポリマーと、少なくとも一つの炭酸ジエステル化合物との反応は、2〜40℃、より好ましくは10〜30℃、特に15〜25℃の温度で行なわれる。好ましい反応時間は0.5〜5時間、より好ましくは1〜3時間、特に好ましくは2〜3時間の範囲である。
【０３９６】
炭酸ジエステル化合物：ポリマーのモル比は、未反応ポリマー中に存在するヒドロキシ基の数に対する炭酸ジエステル化合物と反応させるヒドロキシ基の数に関するポリマーの置換度に依存する。
【０３９７】
本発明の一実施形態によれば、炭酸ジエステル化合物：ポリマーの無水グルコース単位のモル比は、0.5〜0.001、好ましくは0.33〜0.01、特に好ましくは0.1〜0.02の範囲の置換度が得られるように、1：2〜1：1000、より好ましくは1：3〜1：100、特に好ましくは1：10〜1：50の範囲にある。
【０３９８】
本発明の一実施形態によれば、還元末端が酸化されていないポリマーと炭酸ジエステルとの反応は、少なくとも一つの非プロトン性溶媒中で、特に好ましくは0.5重量％を超えない（好ましくは0.1重量％を超えない）含水率を持つ無水非プロトン性溶媒中で行なわれる。適切な溶媒は、なかんずく、ジメチルスルホキシド（DMSO）、N-メチルピロリドン、ジメチルアセトアミド（DMA）、ジメチルホルムアミド（DMF）およびそれらの二つ以上の混合物である。
【０３９９】
したがって本発明は、還元末端が酸化されていないポリマーの少なくとも一つのヒドロキシ基と炭酸ジエステルとの反応による反応性カルボキシ基の生成が、無水非プロトン性極性溶媒中で行なわれ、その溶媒が好ましくはジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミドまたはその混合物である、上述の方法にも関する。
【０４００】
少なくとも一つの反応性カルボキシ基を含む反応性ポリマー誘導体（好ましくはポリマーと上述の酸性アルコール、カーボネートおよび/またはアゾリドとの反応によって生じるもの）を、さらなる少なくとも二官能性である化合物と、さらに反応させる。ここでは、このさらなる化合物の少なくとも一つの官能基F1を、ポリマー誘導体の少なくとも一つの反応性カルボキシ基と反応させる。上記さらなる化合物の少なくとも一つの官能基F1としては、ポリマーの少なくとも一つの反応性カルボキシ基との反応が可能である限り、特に制限はない。好ましい官能基F1は、例えばアミノ基またはヒドロキシ基またはチオ基またはカルボキシ基である。
【０４０１】
上記さらなる少なくとも二官能性である化合物は、アルデヒド基である少なくとも一つの他の官能基F2または化学修飾を受けてアルデヒド基を生じることができる官能基F2を含む。化学修飾は、例えば官能基F2とさらなるリンカー化合物の官能基F3との反応、または適切な官能基F2の酸化もしくは還元であることができる。
【０４０２】
F2をさらなる化合物の官能基F3と反応させる場合、官能基F2は、なかんずく、
・C-C二重結合またはC-C三重結合または芳香族C-C結合；
・チオ基またはヒドロキシ基；
・アルキルスルホン酸ヒドラジド、アリールスルホン酸ヒドラジド；
・1,2-ジオール；
・1,2-アミノアルコール；
・1,2-アミノ-チオアルコール；
・アジド；
・アミノ基-NH2、または構造単位-NH-を含むアミノ基の誘導体、例えばアミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリールアミノ基；
・ヒドロキシルアミノ基-O-NH2、または構造単位-O-NH-を含むヒドロキシルアミノ基の誘導体、例えばヒドロキシルアルキルアミノ基、ヒドロキシルアリールアミノ基、ヒドロキシルアラルキルアミノ基、またはヒドロキシルアルカリールアミノ基；
・それぞれに構造単位-NH-O-を含む、アルコキシアミノ基、アリールオキシアミノ基、アラルキルオキシアミノ基、またはアルカリールオキシアミノ基；
・カルボニル基を持つ残基-Q-C(=G)-M
［式中、GはOまたはSであり、Mは例えば
・・-OHまたは-SH；
・・アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、またはアルカリールオキシ基；
・・アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルチオ基、またはアルカリールチオ基；
・・アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、アラルキルカルボニルオキシ基、アルカリールカルボニルオキシ基；
・・活性化エステル、例えばイミド構造を持つヒドロキシルアミン（例えばN-ヒドロキシスクシンイミド）のエステル、もしくは構造単位O-Nを持ち、Nがヘテロアリール化合物の一部であるヒドロキシルアミンのエステル、またはG＝OでありかつQが存在しない場合に、例えばペンタフルオロフェニル、パラニトロフェニルもしくはトリクロロフェニルなどの置換アリール残基を持つアリールオキシ化合物；
であり、Qは存在しないか、NHまたはSもしくはOなどのヘテロ原子である］；
・-NH-NH2、または-NH-NH-；
・-NO2；
・ニトリル基；
・カルボニル基、例えばアルデヒド基またはケト基；
・カルボキシ基；
・-N=C=O基または-N=C=S基；
・ハロゲン化ビニル基、例えばヨウ化ビニル基もしくは臭化ビニル基、またはトリフラート；
・-C≡C-H；
・-(C=NH2Cl)-Oアルキル
・基-(C=O)-CH2-Hal［式中、HalはCl、Br、またはIである］；
・-CH=CH-SO2-；
・構造-S-S-を含むジスルフィド基；
・基
【化７０】
2007527891.tif 000071
・基
【化７１】
2007527891.tif 000072
から選択することができる。この場合、F3は上述の基の一つと化学結合を形成する能力を持つ基であり、好ましくは上述の基から選択される。さらにまた、第2リンカー化合物は、好ましくは、タンパク質のアミノ基と還元的アミノ化によって反応させることができる少なくとも一つのアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を持つ。
【０４０３】
ポリマーと反応させる少なくとも二官能性である連結化合物の官能基F1とアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基、および/またはポリマーと反応させる少なくとも二官能性である化合物の官能基F1とF2、および/またはさらなる少なくとも二官能性である連結化合物の官能基F3とアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基は、独立して、任意の適切なスペーサーによって分離することができる。なかんずく、スペーサーは置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状および/または環状の炭化水素残基であることができる。一般に、この炭化水素残基は60個まで、好ましくは40個まで、より好ましくは20個まで、より好ましくは10個までの炭素原子を持つ。ヘテロ原子が存在する場合、分離基は一般に1〜20個、好ましくは1〜8個、より好ましくは1〜6個、より好ましくは1〜4個、特に好ましくは1〜2個のヘテロ原子を含む。ヘテロ原子としてはOが好ましい。炭化水素残基は、例えば5〜7個の炭素原子を持つ分岐していてもよいアルキル鎖またはアリール基またはシクロアルキル基を含むか、アラルキル基、アルカリール基（アルキル部分は直鎖状および/または環状アルキル基であることができる）であることができる。
【０４０４】
官能基F1およびF2を持つ化合物の例は、例えば2〜20個の炭素原子を持つ置換されていてもよいジアミノアルカン、特に好ましくは1,2-ジアミノエタン、1,3-ジアミノプロパン、および1,4-ジアミノブタンである。官能基F3およびアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を持つ化合物の好ましい例は、例えばホルミル安息香酸、4-ホルミル安息香酸ペンタフルオロフェニルエステル、4-ホルミル安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルおよび4-(4-ホルミル-3,5-ジメトキシフェノキシ)酪酸である。
【０４０５】
したがって本発明は、コンジュゲートの製造方法であって、ポリマー（好ましくはヒドロキシエチルデンプン）を、その酸化されていてもよい還元末端で、酸性アルコール、炭酸ジエステルおよびアゾリドからなる群より選択される化合物と反応させて、少なくとも一つの反応性カルボキシ基を含むポリマー誘導体とし、前記ポリマー誘導体を少なくとも一つの少なくとも二官能性である化合物と反応させて、アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を含むか、あるいは化学修飾を受けてアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を与えることができる官能基を含むポリマー誘導体とし、要すれば、前記官能基を化学修飾して、アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を含むポリマー誘導体とし、アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を含むポリマー誘導体を還元的アミノ化によってタンパク質のアミノ基と反応させることを含む方法にも関する。
【０４０６】
したがって本発明は、互いに共有結合したポリマー（好ましくはヒドロキシエチルデンプン）とタンパク質とを含むコンジュゲートであって、ポリマーを、その酸化されていてもよい還元末端で、酸性アルコール、炭酸ジエステルおよびアゾリドからなる群より選択される化合物と反応させて、少なくとも一つの反応性カルボキシ基を含むポリマー誘導体とし、前記ポリマー誘導体を少なくとも一つの少なくとも二官能性である化合物と反応させて、アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を含むか、あるいは化学修飾を受けてアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を与えることができる官能基を含むポリマー誘導体とし、要すれば、前記官能基を化学修飾して、アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を含むポリマー誘導体とし、アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を含むポリマー誘導体を還元的アミノ化によってタンパク質のアミノ基と反応させることを含むコンジュゲートの製造方法によって得ることができるコンジュゲートにも関する。
【０４０７】
官能基F1および酸化されてアルデヒド基を与える官能基F2を持つ化合物の具体例は、例えばF1としてアミノ基を持ち、F2としてベータヒドロキシアミノ基を持つ化合物である。特に好ましい例は、1,3-ジアミノ-2-ヒドロキシプロパンである。この酸化は、ベータヒドロキシアミノ基をアルデヒド基に変換する能力を持つ適切な酸化剤のどれを使っても行なうことができる。好ましい酸化試薬は過ヨウ素酸アルカリ金属などの過ヨウ素酸塩である。特に好ましいのは過ヨウ素酸ナトリウムであり、好ましくはこれを水溶液として使用する。この溶液は、1〜50mMの好ましいヨウ素酸塩濃度（より好ましくは1〜25mM、特に好ましくは1〜10mM）を持つ。酸化は0〜40℃、好ましくは0〜25℃、特に好ましくは4〜20℃の温度で行なわれる。
【０４０８】
得られたポリマー誘導体は、少なくとも一つの適切な方法によって、反応混合物から精製することができる。必要であれば、少なくとも一つの適切な方法により、単離に先だってポリマー誘導体を沈殿させてもよい。
【０４０９】
ポリマー誘導体をまず沈殿させる場合は、例えば反応混合物を、反応混合物中に存在する溶媒または溶媒混合物以外の少なくとも一つの溶媒または溶媒混合物と、適切な温度で接触させることができる。水性媒質（好ましくは水）を溶媒として使用する本発明の特に好ましい実施形態によれば、反応混合物を2-プロパノールまたはアセトンとエタノールの混合物（好ましくは1：1（v/v）混合物、すなわち等体積の前記化合物）と、好ましくは-20〜＋50℃の範囲の温度、特に好ましくは-20〜25℃の範囲の温度で接触させる。
【０４１０】
ポリマー誘導体の単離は、一段階以上を含みうる適切な工程によって行なうことができる。本発明の好ましい実施形態によれば、ポリマー誘導体をまず反応混合物または反応混合物と例えば水性2-プロパノール混合物との混合物から、遠心分離または濾過などの適切な方法によって分離する。第2段階では、分離したポリマー誘導体をさらなる処理、例えば透析、遠心濾過もしくは加圧濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、HPLC、MPLC、ゲル濾過および/または凍結乾燥のような後処理に付すことができる。さらに好ましい実施形態によれば、分離したポリマー誘導体をまず（好ましくは水に対して）透析し、次に、所望する生成物の仕様に応じて反応生成物の溶媒含量が十分に低くなるまで、凍結乾燥する。凍結乾燥は20〜35℃、好ましくは20〜30℃の温度で行なうことができる。
【０４１１】
本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、ポリマーまたはポリマー誘導体の官能基Aと反応させるタンパク質の官能基Zがチオール基であり、この場合、タンパク質はIFNアルファ、IFNベータ、tPA、およびA1ATからなる群より選択される。最も好ましいのはIFNアルファおよびIFNベータである。
【０４１２】
チオール基はタンパク質そのものに存在しうる。さらにまた、適切な方法によってタンパク質にチオール基を導入することもできる。なかんずく、化学的方法を挙げることができる。タンパク質中にジスルフィド橋が存在する場合は、その-S-S-構造を還元してチオール基を得ることができる。ポリペプチドを少なくとも二つの異なる官能基（そのうちの一方はアミノ基と反応させることができ、他方はSH基であるか、SH基の前駆体であるもの）を持つ化合物とアミノ基を介して反応させることにより、ポリペプチド中に存在するアミノ基をSH基に変換することもできる。また、タンパク質の突然変異によって、例えばタンパク質中にシステインまたは適切なSH官能アミノ酸を導入することによって、またはタンパク質からシステインを除去することでタンパク質中のもう一つのシステインがジスルフィド橋を形成することができないようにすることによって、SH基を導入することもできる。
【０４１３】
最も好ましくは、タンパク質の遊離システインに、特に好ましくはIFNベータの17位にある遊離システイン（17位にシステインを持つ変種の場合）や、IFNアルファの1位および/または98位にあるシステインに、ポリマーを連結する。
【０４１４】
第1の実施形態によれば、タンパク質の官能基Zはチオール基であり、ポリマーの官能基Aはハロゲンアセチル基であって、Aは、ポリマーを、それぞれにアミノ基を含む少なくとも二つの官能基を持つ少なくとも二官能性である化合物と、その酸化されていてもよい還元末端で反応させて、アミノ基を含む少なくとも一つの官能基を持つポリマー誘導体とし、そのポリマー誘導体をモノハロゲン置換酢酸および/または反応性モノハロゲン置換酢酸誘導体と反応させることによって導入される。
【０４１５】
それぞれにアミノ基を含む少なくとも二つの官能基を持つ少なくとも二官能性である化合物については、ポリマーとその酸化されていてもよい還元末端で反応させて、モノハロゲン置換酢酸および/または反応性モノハロゲン置換酢酸誘導体と反応させることができるアミノ基を含むポリマー誘導体を得ることができる全ての化合物が考えられる。
【０４１６】
好ましい実施形態によれば、少なくとも二官能性である化合物の一つの官能基であってポリマーの酸化されていてもよい還元末端と反応させる官能基は、
【化７２】
2007527891.tif 000073
［式中、GはOまたはS（二つ存在する場合は、独立してOまたはS）であり、R'はメチルである］
からなる群より選択される。
【０４１７】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、少なくとも二官能性である化合物の官能基であって、酸化されていてもよい還元末端と反応させる官能基は、アミノ基-NH2である。本発明のさらにもう一つの好ましい実施形態によれば、この官能基（最も好ましくはアミノ基）をポリマーの酸化型還元末端と反応させる。
【０４１８】
本発明の好ましい実施形態によれば、少なくとも二官能性である化合物の官能基であって、モノハロゲン置換酢酸および/または反応性モノハロゲン置換酢酸誘導体と反応させる官能基は、アミノ基-NH2である。
【０４１９】
ポリマーとその酸化されていてもよい還元末端（好ましくは酸化型還元末端）で反応させると共に、モノハロゲン置換酢酸および/または反応性モノハロゲン置換酢酸誘導体とも反応させる、少なくとも二官能性である化合物の官能基（好ましくはどちらもアミノ基-NH2）は、任意の適切なスペーサーによって分離することができる。なかんずく、スペーサーは置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状および/または環状炭化水素残基であることができる。適切な置換基は、なかんずく、アルキル、アリール、アラルキル、アルカリール、ハロゲン、カルボニル、アシル、カルボキシ、カルボキシエステル、ヒドロキシ、チオ、アルコキシおよび/またはアルキルチオ基である。一般に、この炭化水素残基は1〜60個、好ましくは1〜40個、より好ましくは1〜20個、より好ましくは2〜10個、より好ましくは2〜6個、特に好ましくは2〜4個の炭素原子を持つ。ヘテロ原子が存在する場合、分離基は一般に1〜20個、好ましくは1〜8個、より好ましくは1〜4個のヘテロ原子を含む。炭化水素残基は、例えば5〜7個の炭素原子を持つ分岐していてもよいアルキル鎖またはアリール基またはシクロアルキル基を含むか、アラルキル基、アルカリール基（アルキル部分は直鎖状および/または環状アルキル基であることができる）であることができる。さらに好ましい実施形態によれば、炭化水素残基は炭素原子数1〜20、好ましくは2〜10、より好ましくは2〜8のアルキル鎖である。したがって、好ましい少なくとも二官能性である化合物は二官能性アミノ化合物であり、特に好ましくは1,8-ジアミノオクタン、1,7-ジアミノヘプタン、1,6-ジアミノヘキサン、1,5-ジアミノペンタン、1,4-ジアミノブタン、1,3-ジアミノプロパン、および1,2-ジアミノエタンである。さらにもう一つの好ましい実施形態によれば、少なくとも二官能性である化合物はジアミノポリエチレングリコールであり、好ましくは式
H2N-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-NH2
［式中、mは整数であり、mは好ましくは1、2、3、または4である］
のジアミノポリエチレングリコールである。
【０４２０】
したがって本発明は、ポリマーを1,8-ジアミノオクタン、1,7-ジアミノヘプタン、1,6-ジアミノヘキサン、1,5-ジアミノペンタン、1,4-ジアミノブタン、1,3-ジアミノプロパン、および1,2-ジアミノエタンとその酸化型還元末端で反応させて、式
【化７３】
2007527891.tif 000074
［n＝2、3、4、5、6、7、または8であり、ポリマーは特に好ましくはHESである］
のポリマー誘導体を得る、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０４２１】
したがって本発明は、ポリマーをH2N-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-NH2［式中、mは1、2、3、または4である］とその酸化型還元末端で反応させて式
【化７４】
2007527891.tif 000075
［m＝1、2、3、または4であり、ポリマーは特に好ましくはHESである］
のポリマー誘導体を得る、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０４２２】
ポリマー（好ましくはヒドロキシエチルデンプン）の還元末端の酸化は、構造（IIa）および/または（IIb）：
【化７５】
2007527891.tif 000076
（ＩＩａ）
【化７６】
2007527891.tif 000077
（ＩＩｂ）
を持つ化合物をもたらす各方法またはそのような方法の組み合わせによって行なうことができる。
【０４２３】
酸化はヒドロキシアルキルデンプンの酸化型還元末端をもたらす適切な方法のどれに従って行なってもよいが、好ましくは、例えばDE 196 28 705 A1（その内容のそれぞれ（実施例A、第9欄6〜24行）は参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているようにアルカリ性ヨウ素溶液を使って行なわれる。
【０４２４】
ポリマーと少なくとも二官能性である化合物との反応によって得られるポリマー誘導体を、さらに、モノハロゲン置換酢酸および/または反応性モノハロゲン置換酢酸誘導体と反応させる。
【０４２５】
モノハロゲン置換酢酸または反応性酸としては、Cl置換、Br置換およびI置換酢酸が好ましい。
【０４２６】
ハロゲン置換酸をそのまま使用する場合は、酸を活性化剤の存在下でポリマーと反応させることが好ましい。適切な活性化剤は、なかんずく、カルボジイミド類、例えばジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、ジシクロヘキシルカルボジイミド類（DCC）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）であり、ジシクロヘキシルカルボジイミド類（DCC）および1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）はとりわけ好ましい。
【０４２７】
したがって本発明は、ポリマー（好ましくはHES）をジアミノ化合物（好ましくは2〜8個の炭素原子を持つジアミノアルカンまたはH2N-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-NH2［m＝1、2、3、または4］）と反応させ、得られたポリマー誘導体をBr置換およびI置換酢酸と活性化剤（好ましくはEDC）の存在下で反応させる、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０４２８】
したがって本発明は、式
【化７７】
2007527891.tif 000078
［X＝Cl、BrまたはIであり、n＝2、3、4、5、6、7、または8であり、ポリマーは特に好ましくはHESである］
のポリマー誘導体、または式
【化７８】
2007527891.tif 000079
［X＝Cl、BrまたはIであり、m＝1、2、3、または4であり、ポリマーは特に好ましくはHESである］
のポリマー誘導体にも関する。
【０４２９】
ポリマー誘導体とハロゲン置換酢酸との反応は、好ましくは、3.5〜5.5の好ましいpH（より好ましくは4.0〜5.0、特に好ましくは4.5〜5.0）および4〜30℃の好ましい反応温度（より好ましくは15〜25℃、特に好ましくは20〜25℃）で、1〜8時間の好ましい反応時間（より好ましくは2〜6時間、特に好ましくは3〜5時間）にわたって、水系（好ましくは水中）で行なわれる。
【０４３０】
ポリマー、少なくとも二官能性である化合物およびハロゲン置換酢酸を含んでなるポリマー誘導体を含む反応混合物は、タンパク質との反応にそのまま使用することができる。本発明の好ましい実施形態によれば、ポリマー誘導体を、好ましくは限外濾過とそれに続く沈殿、随意の洗浄および真空乾燥によって、反応混合物から分離する。
【０４３１】
ポリマー誘導体とタンパク質との反応は、6.5〜8.5の好ましいpH（より好ましくは7.0〜8.5、特に好ましくは7.5〜8.5）および4〜30℃の好ましい反応温度（より好ましくは15〜25℃、特に好ましくは20〜25℃）で、0.5〜8時間の好ましい反応時間（より好ましくは1〜6時間、特に好ましくは2〜5時間）にわたって行なわれる。
【０４３２】
ポリマー誘導体とタンパク質のチオール基との反応は、ポリマー誘導体とタンパク質との間にチオエーテル結合をもたらす。
【０４３３】
したがって本発明は、ポリマー（好ましくはHES）をジアミノ化合物（好ましくは2〜8個の炭素原子を持つジアミノアルカンまたはH2N-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-NH2［m＝1、2、3、または4］）と反応させ、得られたポリマー誘導体をBr置換およびI置換酢酸と活性化剤（好ましくはEDC）の存在下で反応させ、得られたポリマー誘導体をタンパク質のチオール基と反応させて、タンパク質とポリマー誘導体の間にチオエーテル結合を含むコンジュゲートを得る、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０４３４】
したがって本発明は、式
【化７９】
2007527891.tif 000080
［n＝2、3、4、5、6、7、または8であり、ポリマーは特に好ましくはHESであり、タンパク質はIFNアルファ、IFNベータ、tPA、またはA1AT、好ましくはIFNアルファまたはIFNベータであり、S原子はIFNベータ1aの17位にある遊離システインまたは利用可能な遊離システインに由来する］
のコンジュゲート、または式
【化８０】
2007527891.tif 000081
［m＝1、2、3、または4であり、ポリマーは特に好ましくはHESであり、タンパク質はIFNアルファ、IFNベータ、tPA、またはA1ATまたはAPC、好ましくはIFNアルファまたはIFNベータであり、S原子は例えばIFNベータ1aの17位にある遊離システインに由来する］
のコンジュゲートにも関する。
【０４３５】
ヒドロキシエチルデンプンは、好ましくは、約10kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約10kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約100kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプンである。
【０４３６】
平均分子量とDSのこれらの組み合わせのそれぞれに関して、約0.8のDS値も好ましい。
【０４３７】
第2の実施形態によれば、タンパク質の官能基Zはチオール基であり、ポリマーの官能基Aはマレイミド基を含む。
【０４３８】
この実施形態によれば、コンジュゲートの製造に関していくつかの可能性が存在する。一般的には、ポリマーを、その酸化されていてもよい還元末端で、少なくとも一つの少なくとも二官能性である化合物と反応させる。この場合、この少なくとも二官能性である化合物は、ポリマーの酸化されていてもよい還元末端と反応させることができる一つの官能基と、マレイミド基を含む少なくとも一つの官能基、または化学修飾を受けてマレイミド基を含むポリマー誘導体を与える少なくとも一つの官能基とを含む。好ましい実施形態によれば、前記官能基は化学修飾を受けて、マレイミド基を含むポリマー誘導体を与える。
【０４３９】
したがって本発明は、マレイミド基を含むポリマー誘導体をタンパク質のチオール基と反応させることによる、上述の方法およびコンジュゲートに関し、前記方法は、ポリマーを、その酸化されていてもよい還元末端で、酸化されていてもよい還元末端と反応する能力を持つ官能基Uを含む少なくとも二官能性である化合物（この少なくとも二官能性である化合物は化学修飾を受けてマレイミドを与えることができる官能基Wをさらに含む）と反応させることを含み、また前記方法は、官能基Wを化学修飾してマレイミド基を得ることをさらに含む。
【０４４０】
官能基Uについては、ポリマーの酸化されていてもよい還元末端と反応させることができる各官能基が考えられる。
【０４４１】
本発明の好ましい実施形態によれば、官能基Uは化学構造-NH-を含む。
【０４４２】
したがって本発明は、官能基Uが構造-NH-を含む、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０４４３】
本発明の好ましい一実施形態によれば、官能基Uは構造R'-NH-を持つ基であって、R'は水素であるか、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリールまたはシクロアルキルアリール残基であり、そのシクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリールまたはシクロアルキルアリール残基は、NH基に直接連結されていてもよいし、あるいはもう一つの実施形態として、NH基に酸素橋を介して連結されていてもよい。アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリール、またはシクロアルキルアリール残基は、適切に置換されていてもよい。好ましい置換基として、F、ClまたはBrなどのハロゲンを挙げることができる。特に好ましい残基R'は水素、アルキル基およびアルコキシ基であり、さらに好ましくは水素ならびに無置換アルキル基および無置換アルコキシ基である。
【０４４４】
アルキル基およびアルコキシ基のなかでは、1、2、3、4、5、または6個のC原子を持つ基が好ましい。より好ましいのはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、およびイソプロポキシ基である。特に好ましいのはメチル、エチル、メトキシ、エトキシであり、メチルまたはメトキシはとりわけ好ましい。
【０４４５】
したがって本発明は、R'が水素またはメチル基もしくはメトキシ基である上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０４４６】
本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、官能基Uは構造R'-NH-R''-を持ち、R''は好ましくは構造単位-NH-および/または構造単位-(C=G)-［GはOまたはSである］および/または構造単位-SO2-を含む。より好ましい実施形態によれば、官能基R''は
【化８１】
2007527891.tif 000082
［Gが二つ存在する場合、それらは独立してOまたはSである］
からなる群より選択される。
【０４４７】
したがって本発明は、官能基Uが、
【化８２】
2007527891.tif 000083
［式中、GはOまたはS（二つ存在する場合は、独立してOまたはS）であり、R'はメチルである］
からなる群より選択される、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０４４８】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、Uはアミノ基-NH2を含む。
【０４４９】
本発明のある実施形態によれば、Wを含むポリマー誘導体を、Wと反応させることができる官能基を含むと共にマレイミド基をも含むさらにもう一つの少なくとも二官能性である化合物と反応させることによって、少なくとも二官能性である化合物の官能基Wを化学修飾する。
【０４５０】
官能基WおよびWと反応させることができる前記さらにもう一つの少なくとも二官能性である化合物の官能基については、なかんずく、以下の官能基が挙げられる：
・C-C二重結合またはC-C三重結合または芳香族C-C結合；
・チオ基またはヒドロキシ基；
・アルキルスルホン酸ヒドラジド、アリールスルホン酸ヒドラジド；
・1,2-ジオール；
・1,2-アミノアルコール；
・1,2-アミノ-チオアルコール；
・アジド；
・アミノ基-NH2、または構造単位-NH-を含むアミノ基の誘導体、例えばアミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリールアミノ基；
・ヒドロキシルアミノ基-O-NH2、または構造単位-O-NH-を含むヒドロキシルアミノ基の誘導体、例えばヒドロキシルアルキルアミノ基、ヒドロキシルアリールアミノ基、ヒドロキシルアラルキルアミノ基、またはヒドロキシルアルカリールアミノ基；
・それぞれに構造単位-NH-O-を含む、アルコキシアミノ基、アリールオキシアミノ基、アラルキルオキシアミノ基、またはアルカリールオキシアミノ基；
・カルボニル基を持つ残基-Q-C(=G)-M
［式中、GはOまたはSであり、Mは例えば
・・-OHまたは-SH；
・・アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、またはアルカリールオキシ基；
・・アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルチオ基、またはアルカリールチオ基；
・・アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、アラルキルカルボニルオキシ基、アルカリールカルボニルオキシ基；
・・活性化エステル、例えばイミド構造を持つヒドロキシルアミン（例えばN-ヒドロキシスクシンイミド）のエステル、もしくは構造単位O-Nを持ち、Nがヘテロアリール化合物の一部であるヒドロキシルアミンのエステル、またはG＝OでありかつQが存在しない場合に、例えばペンタフルオロフェニル、パラニトロフェニルもしくはトリクロロフェニルなどの置換アリール残基を持つアリールオキシ化合物；
であり、Qは存在しないか、NHまたはSもしくはOなどのヘテロ原子である］；
・-NH-NH2、または-NH-NH-；
・-NO2；
・ニトリル基；
・カルボニル基、例えばアルデヒド基またはケト基；
・カルボキシ基；
・-N=C=O基または-N=C=S基；
・ハロゲン化ビニル基、例えばヨウ化ビニル基もしくは臭化ビニル基、またはトリフラート；
・-C≡C-H；
・-(C=NH2Cl)-Oアルキル
・基-(C=O)-CH2-Hal［式中、HalはCl、Br、またはIである］；
・-CH=CH-SO2-；
・構造-S-S-を含むジスルフィド基；
・基
【化８３】
2007527891.tif 000084
・基
【化８４】
2007527891.tif 000085
ここに、Wおよびさらにもう一つの少なくとも二官能性である化合物の官能基は、それぞれ、上述の基の一つと化学結合を形成することができる基である。
【０４５１】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、Wはアミノ基-NH2を含む。
【０４５２】
本発明の好ましい実施形態によれば、Wと、他方の官能基が、どちらも、上に挙げた基の一覧から選択される基である。
【０４５３】
本発明の一実施形態によれば、これらの官能基の一方はチオ基である。この特定の例では、他方の官能基が、好ましくは
【化８５】
2007527891.tif 000086
［式中、HalはCl、Br、またはI、好ましくはBrまたはIである］
からなる群より選択される。
【０４５４】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、これらの官能基の一方は、反応性エステル、活性化エステル、例えばイミド構造を持つヒドロキシルアミン（例えばN-ヒドロキシスクシンイミド）のエステル、もしくは構造単位O-Nを持ち、Nがヘテロアリール化合物の一部であるヒドロキシルアミンのエステル、または例えばペンタフルオロフェニル、パラニトロフェニルもしくはトリクロロフェニルなどの置換アリール残基を持つアリールオキシ化合物、または要すれば反応性エステルに変換されるカルボキシ基からなる群より選択される。この特定の例では、他方の官能基は化学構造-NH-を含む。
【０４５５】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、Wは構造-NH-を含み、さらにもう一つの少なくとも二官能性である化合物は反応性エステルおよびマレイミド基を含む。
【０４５６】
構造-NH-を含む官能基Wについては、上述の官能基を参照することができ、WはUと同じであってもよいし、Uとは異なってもよい。本発明の好ましい実施形態によれば、UおよびWは同じである。より好ましくはUおよびWはどちらもアミノ基を含む。特に好ましくはUおよびWはどちらもアミノ基-NH2である。
【０４５７】
本発明の一実施形態によれば、ポリマーを、UおよびWを含む少なくとも二官能性である化合物と、その非酸化型還元末端で、水性媒質中で反応させることができる。UおよびWがどちらもアミノ基である好ましい実施形態によれば、反応は、酸化型の還元末端を持つポリマーを使って、少なくとも一つの非プロトン性溶媒中で、特に好ましくは、0.5重量パーセントを超えない（好ましくは0.1重量パーセントを超えない）含水率を持つ無水非プロトン性溶媒中で行なわれる。適切な溶媒は、なかんずく、ジメチルスルホキシド（DMSO）、N-メチルピロリドン、ジメチルアセトアミド（DMA）、ジメチルホルムアミド（DMF）およびそれらの二つ以上の混合物である。
【０４５８】
特に、UおよびWがどちらもアミノ基である場合、UおよびWは任意の適切なスペーサーによって分離することができる。なかんずく、スペーサーは置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状および/または環状炭化水素残基であることができる。適切な置換基は、なかんずく、アルキル、アリール、アラルキル、アルカリール、ハロゲン、カルボニル、アシル、カルボキシ、カルボキシエステル、ヒドロキシ、チオ、アルコキシおよび/またはアルキルチオ基である。一般に、この炭化水素残基は1〜60個、好ましくは1〜40個、より好ましくは1〜20個、より好ましくは2〜10個、より好ましくは2〜6個、特に好ましくは2〜4個の炭素原子を持つ。ヘテロ原子が存在する場合、分離基は一般に1〜20個、好ましくは1〜8個、特に好ましくは1〜4個のヘテロ原子を含む。炭化水素残基は、例えば5〜7個の炭素原子を持つ分岐していてもよいアルキル鎖またはアリール基またはシクロアルキル基を含むか、アラルキル基、アルカリール基（アルキル部分は直鎖状および/または環状アルキル基であることができる）であることができる。さらに好ましい実施形態によれば、炭化水素残基は炭素原子数1〜20、好ましくは2〜10、より好ましくは2〜6、特に好ましくは2〜4のアルキル鎖である。
【０４５９】
したがって本発明は、ポリマーをその酸化型還元末端で1,4-ジアミノブタン、1,3-ジアミノプロパンまたは1,2-ジアミノエタンと反応させて式
【化８６】
2007527891.tif 000087
［n＝2、3、または4であり、ポリマーは好ましくはHESである］
のポリマー誘導体を得る、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０４６０】
上述の好ましい実施形態によれば、アミノ基を含むポリマー誘導体を、反応性エステル基およびマレイミド基を含む少なくとも二官能性である化合物と、さらに反応させる。反応性エステル基とマレイミド基は、適切なスペーサーによって分離することができる。このスペーサーについては、官能基Uと官能基Wの間のスペーサーを参照することができる。本発明の好ましい実施形態によれば、反応性エステル基とマレイミド基が、1〜10個、好ましくは1〜8個、より好ましくは1〜6個、より好ましくは1〜4個、より好ましくは1〜2個、特に好ましくは1個の炭素原子を持つ炭化水素基によって分離される。さらにもう一つの好ましい実施形態によれば、反応性エステルはスクシンイミドエステルであり、特に好ましい実施形態によれば、マレイミド基および反応性エステル基を含む少なくとも二官能性である化合物は、N-(アルファ-マレイミドアセトキシ)スクシンイミドエステルである。
【０４６１】
したがって本発明は、式
【化８７】
2007527891.tif 000088
［式中、n＝2、3、または4であり、ポリマーは好ましくはHESである］
のポリマー誘導体にも関する。
【０４６２】
マレイミド基を含むポリマー誘導体を、タンパク質のチオール基とさらに反応させて、チオエーテル基を介してタンパク質に連結されたポリマー誘導体を含むコンジュゲートを得る。
【０４６３】
したがって本発明は、タンパク質およびポリマーを含む、式
【化８８】
2007527891.tif 000089
［式中、n＝2、3、または4、好ましくは4であり、ポリマーは好ましくはHESであり、タンパク質はIFNアルファ、IFNベータ、tPA、またはA1AT、好ましくはIFNアルファまたはIFNベータであり、上式中のS原子は、例えばIFNベータ1aのCys17などに由来する］
のコンジュゲートにも関する。
【０４６４】
ヒドロキシエチルデンプンは、好ましくは、約10kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約10kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約100kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプンである。
【０４６５】
平均分子量とDSのこれらの組み合わせのそれぞれに関して、約0.8のDS値も好ましい。
【０４６６】
マレイミド基を含むポリマー誘導体とタンパク質のチオール基との反応は、好ましくは、緩衝化した水系中、5.5〜8.5の好ましいpH（より好ましくは6〜8、特に好ましくは6.5〜7.5）、および0〜40℃の好ましい反応温度（より好ましくは0〜25、特に好ましくは4〜21℃）で、0.5〜24時間の好ましい反応時間（より好ましくは1〜20時間、特に好ましくは2〜17時間）にわたって行なわれる。反応混合物の適切なpH値は、少なくとも一つの適切な緩衝液を加えることによって調節することができる。好ましい緩衝液のうち、尿素を0〜8Mの好ましい濃度（より好ましくは2〜8M、特に好ましくは4〜8M）で含有し、そして/またはSDSを0〜1％（w/v）の好ましい濃度（より好ましくは0.4〜1％（w/v）、特に好ましくは0.8〜1％（w/v））で含有する、酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液またはホウ酸緩衝液を挙げることができる。
【０４６７】
コンジュゲートは、さらなる処理、例えば透析、遠心濾過もしくは加圧濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、HPLC、MPLC、ゲル濾過および/または凍結乾燥のような後処理に付すことができる。
【０４６８】
本発明のコンジュゲートを製造するための方法において、上述の方法における変換率は、少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、さらに好ましくは少なくとも80％、特に95％以上、例えば少なくとも98％または99％になりうる。
【０４６９】
本発明は、タンパク質とポリマーもしくはその誘導体とを含むコンジュゲートであって、ポリマーがヒドロキシアルキルデンプン（HAS）であり、タンパク質がIFNベータ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、第VII因子、第VIII因子、および第IX因子からなる群より選択され、前記コンジュゲートが式
【化８９】
2007527891.tif 000090
および/または
【化９０】
2007527891.tif 000091
［式中、R1、R2およびR3は、独立して、水素、または2〜10個の炭素原子を持つヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基もしくはヒドロキシアルカリール基、好ましくは水素またはヒドロキシアルキル基、より好ましくは水素またはヒドロキシエチル基であり、
GはOおよびSからなる群より選択され、好ましくはOであり、
Lは適切に置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状および/または環状炭化水素残基であって、少なくとも一つのヘテロ原子を含んでもよく、好ましくは2〜60個の炭素原子を持つアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル残基である］
の構造を持つコンジュゲートにも関する。
【０４７０】
本発明は、-L-が-(CH2)n-であり、n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10、好ましくは2、3、4、5、6、より好ましくは2、3、4、特に好ましくは4である、上述のコンジュゲートにも関する。
【０４７１】
本発明は、タンパク質とポリマーまたはその誘導体とを含むコンジュゲートであって、ポリマーがヒドロキシアルキルデンプン（HAS）であり、タンパク質がIFNベータ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、第VII因子、第VIII因子、および第IX因子からなる群より選択され、前記コンジュゲートが式
【化９１】
2007527891.tif 000092
および/または
【化９２】
2007527891.tif 000093
［式中、R1、R2およびR3は、独立して、水素、または2〜10個の炭素原子を持つヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基もしくはヒドロキシアルカリール基、好ましくは水素またはヒドロキシアルキル基、より好ましくは水素またはヒドロキシエチル基であり、
GはOおよびSからなる群より選択され、好ましくはOである］
の構造を持つコンジュゲートにも関する。
【０４７２】
本発明は、タンパク質とポリマーまたはその誘導体とを含むコンジュゲートであって、ポリマーがヒドロキシアルキルデンプン（HAS）であり、タンパク質がIFNベータ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、第VII因子、第VIII因子、および第IX因子からなる群より選択され、前記コンジュゲートが式
【化９３】
2007527891.tif 000094
および/または
【化９４】
2007527891.tif 000095
［式中、R1、R2およびR3は、独立して、水素、または2〜10個の炭素原子を持つヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基もしくはヒドロキシアルカリール基、好ましくは水素またはヒドロキシアルキル基、より好ましくは水素またはヒドロキシエチル基であり、
Lは適切に置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状および/または環状炭化水素残基であって、少なくとも一つのヘテロ原子を含んでもよく、好ましくは2〜60個の炭素原子を持つアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル残基である］
の構造を持つコンジュゲートにも関する。
【０４７３】
本発明は、-L-が
-[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-
［式中、Ra、Rb、Rc、Rdは、独立して、水素、アルキル、アリール、好ましくは水素であり、
GはOおよびSからなる群より選択され、好ましくはOであり、
mは1、2、3または4であって、残基RaおよびRbはm個のCRaRb基中で同じであっても異なってもよく、
nは0〜20、好ましくは0〜10、より好ましくは1、2、3、4、5、最も好ましくは1または2であり、
oは0〜20、好ましくは0〜10、より好ましくは1、2、3、4、5、最も好ましくは1または2であり、残基RcおよびRdはo個のCRcRd基中で同じであっても異なってもよく、
nおよびoに関する整数は、上式においてペルオキシ部分が生じないように選択される（例えばnおよびoは同時には0でない）］
である、上述のコンジュゲートにも関する。本発明は、Ra、Rb、Rc、Rdが水素であり、m＝2、n＝1、およびo＝2である、上述のコンジュゲートにも関する。
【０４７４】
本発明は、タンパク質とポリマーまたはその誘導体とを含むコンジュゲートであって、ポリマーがヒドロキシアルキルデンプン（HAS）であり、タンパク質がIFNアルファ、IFNベータ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、第VII因子、第VIII因子、および第IX因子からなる群より選択され、前記コンジュゲートが式
【化９５】
2007527891.tif 000096
［式中、R1、R2およびR3は、独立して、水素、または2〜10個の炭素原子を持つヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基もしくはヒドロキシアルカリール基、好ましくは水素またはヒドロキシアルキル基、より好ましくは水素またはヒドロキシエチル基である］
の構造を持つコンジュゲートにも関する。
【０４７５】
本発明は、タンパク質とポリマーまたはその誘導体とを含むコンジュゲートであって、ポリマーがヒドロキシアルキルデンプン（HAS）であり、タンパク質がIFNアルファ、IFNベータ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、第VII因子、第VIII因子、および第IX因子からなる群より選択され、式
【化９６】
2007527891.tif 000097
［式中、R1、R2およびR3は、独立して、水素、または2〜10個の炭素原子を持つヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基もしくはヒドロキシアルカリール基、好ましくは水素またはヒドロキシアルキル基、より好ましくは水素またはヒドロキシエチル基であり、
結合-O-(C=O)-は、カルボキシ基または反応性カルボキシ基とHAS分子のヒドロキシ基との反応によって形成されたものである］
の構造を持つコンジュゲートにも関する。
【０４７６】
本発明は、タンパク質とポリマーまたはその誘導体とを含むコンジュゲートであって、ポリマーがヒドロキシアルキルデンプン（HAS）であり、タンパク質がIFNアルファ、IFNベータ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、第VII因子、第VIII因子、および第IX因子からなる群より選択され、前記コンジュゲートが式
【化９７】
2007527891.tif 000098
および/または
【化９８】
2007527891.tif 000099
［式中、R1、R2およびR3は、独立して、水素、または2〜10個の炭素原子を持つヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基もしくはヒドロキシアルカリール基、好ましくは水素またはヒドロキシアルキル基、より好ましくは水素またはヒドロキシエチル基であり、
Lは置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状および/または環状炭化水素残基であって、少なくとも一つのヘテロ原子を含んでもよく、1〜60個、好ましくは1〜40個、より好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜6個、より好ましくは1〜2個の炭素原子、特に好ましくは1個の炭素原子を持ち、Lは特にCH2である］
の構造を持つコンジュゲートにも関する。
【０４７７】
本発明は、タンパク質とポリマーまたはその誘導体とを含むコンジュゲートであって、ポリマーがヒドロキシアルキルデンプン（HAS）であり、タンパク質がIFNアルファ、IFNベータ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、第VII因子、第VIII因子、および第IX因子からなる群より選択され、前記コンジュゲートが式
【化９９】
2007527891.tif 000100
［式中、R1、R2およびR3は、独立して、水素、または2〜10個の炭素原子を持つヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基もしくはヒドロキシアルカリール基、好ましくは水素またはヒドロキシアルキル基、より好ましくは水素またはヒドロキシエチル基であり、
L1およびL2は、独立して、置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状および/または環状炭化水素残基であって、少なくとも一つのヘテロ原子を含んでもよく、アルキル、アリール、アラルキルヘテロアルキル、および/またはヘテロアラルキル部分を含み、前記残基は1〜60個、好ましくは1〜40個、より好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個の炭素原子を持ち、
Dは結合、好ましくはL1に連結された適切な官能基F2とL2に連結された適切な官能基F3とによって形成される共有結合である］
の構造を持つコンジュゲートにも関する。
【０４７８】
本発明は、L1が-(CH2)n-であり、n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10、好ましくは2、3、4、5、6、より好ましくは2、3、4、特に好ましくは4である、上述のコンジュゲートにも関する。
【０４７９】
本発明は、L2が適切に置換されていてもよいアリール部分、好ましくは6個の炭素原子を含有するアリール部分、特に好ましくはC6H4である、上述のコンジュゲートにも関する。
【０４８０】
本発明は、  が、
・C-C二重結合またはC-C三重結合または芳香族C-C結合；
・チオ基またはヒドロキシ基；
・アルキルスルホン酸ヒドラジド、アリールスルホン酸ヒドラジド；
・1,2-ジオール；
・1,2-アミノ-チオアルコール；
・アジド；
・1,2-アミノアルコール；
・アミノ基-NH2、または構造単位-NH-を含むアミノ基の誘導体、例えばアミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリールアミノ基；
・ヒドロキシルアミノ基-O-NH2、または構造単位-O-NH-を含むヒドロキシルアミノ基の誘導体、例えばヒドロキシルアルキルアミノ基、ヒドロキシルアリールアミノ基、ヒドロキシルアラルキルアミノ基、またはヒドロキシルアルカリールアミノ基；
・それぞれに構造単位-NH-O-を含む、アルコキシアミノ基、アリールオキシアミノ基、アラルキルオキシアミノ基、またはアルカリールオキシアミノ基；
・カルボニル基を持つ残基-Q-C(=G)-M
［式中、GはOまたはSであり、Mは例えば
・・-OHまたは-SH；
・・アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、またはアルカリールオキシ基；
・・アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルチオ基、またはアルカリールチオ基；
・・アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、アラルキルカルボニルオキシ基、アルカリールカルボニルオキシ基；
・・活性化エステル、例えばイミド構造を持つヒドロキシルアミン（例えばN-ヒドロキシスクシンイミド）のエステル、もしくは構造単位O-Nを持ち、Nがヘテロアリール化合物の一部であるヒドロキシルアミンのエステル、またはG＝OでありかつQが存在しない場合に、例えばペンタフルオロフェニル、パラニトロフェニルもしくはトリクロロフェニルなどの置換アリール残基を持つアリールオキシ化合物；
であり、Qは存在しないか、NHまたはSもしくはOなどのヘテロ原子である］；
・-NH-NH2、または-NH-NH-；
・-NO2；
・ニトリル基；
・カルボニル基、例えばアルデヒド基またはケト基；
・カルボキシ基；
・-N=C=O基または-N=C=S基；
・ハロゲン化ビニル基、例えばヨウ化ビニル基もしくは臭化ビニル基、またはトリフラート；
・-C≡C-H；
・-(C=NH2Cl)-Oアルキル
・基-(C=O)-CH2-Hal［式中、HalはCl、Br、またはIである］；
・-CH=CH-SO2-；
・構造-S-S-を含むジスルフィド基；
・基
【化１００】
2007527891.tif 000101
・基
【化１０１】
2007527891.tif 000102
からなる群より選択され、F3はF2と化学結合を形成する能力を持つ官能基であって、好ましくは上記の群から選択され、F2は好ましくは部分-NH-、より好ましくはアミノ基を含み、F3は好ましくは部分-(C=G)-、より好ましくは-(C=O)-、より好ましくは部分-(C=G)-G-、さらに好ましくは-(C=O)-G-、特に好ましくは-(C=O)-Oを含み、Dは特に好ましくはアミド結合である、上述のコンジュゲートにも関する。
【０４８１】
本発明は、タンパク質とポリマーまたはその誘導体とを含むコンジュゲートであって、ポリマーがヒドロキシアルキルデンプン（HAS）であり、タンパク質がIFNアルファ、IFNベータ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、第VII因子、第VIII因子、および第IX因子からなる群より選択され、前記コンジュゲートが式
【化１０２】
2007527891.tif 000103
［式中、部分-CH2-NH-の炭素原子は開環酸化反応によってポリマーに導入されたアルデヒド基に由来し、窒素原子はタンパク質のアミノ基に由来し、HAS''は反応に関与する前記アルデヒドの炭素原子を除くHAS分子を指す］
の構造を持つコンジュゲートにも関する。
【０４８２】
本発明は、タンパク質とポリマーまたはその誘導体とを含むコンジュゲートであって、ポリマーがヒドロキシアルキルデンプン（HAS）であり、タンパク質がIFNアルファ、IFNベータ、tPA、A1AT、第VII因子および第IX因子からなる群より選択され、前記コンジュゲートが式
【化１０３】
2007527891.tif 000104
［式中、R1、R2およびR3は、独立して、水素、または2〜10個の炭素原子を持つヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基もしくはヒドロキシアルカリール基、好ましくは水素またはヒドロキシアルキル基、より好ましくは水素またはヒドロキシエチル基であり、
Lは、置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状および/または環状炭化水素残基であって、少なくとも一つのヘテロ原子を含んでもよく、アルキル、アリール、アラルキルヘテロアルキル、および/またはヘテロアラルキル部分を含み、前記残基は2〜60個、好ましくは2〜40個、より好ましくは2〜20個、より好ましくは2〜10個の炭素原子を持ち、  硫黄原子はタンパク質のシステイン残基またはジスルフィド基に由来する］
の構造を持つコンジュゲートにも関する。
【０４８３】
本発明は、-L-が
-[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-
［式中、Ra、Rb、Rc、Rdは、独立して、水素、アルキル、アリール、好ましくは水素であり、
GはOおよびSからなる群より選択され、好ましくはOであり、
mは1、2、3または4、最も好ましくは2であって、残基RaおよびRbはm個の(CRaRb)基中で同じであっても異なってもよく、
nは1〜20、好ましくは1〜10、最も好ましくは1、2、3、または4であり、
oは1〜20、好ましくは1〜10、より好ましくは1、2、3、4、5、より好ましくは1または2、最も好ましくは1であり、残基RcおよびRdはo個のCRcRd基中で同じであっても異なってもよいか、
あるいは、
nは0であり、
oは2〜20、好ましくは2〜10、より好ましくは2、3、4、5、6、7、または8であり、残基RcおよびRdはo個のCRcRd基中で同じであっても異なってもよい］
である、上述のコンジュゲートにも関する。
【０４８４】
本発明は、タンパク質とポリマーまたはその誘導体とを含むコンジュゲートであって、ポリマーがヒドロキシアルキルデンプン（HAS）であり、タンパク質がIFNアルファ、IFNベータ、tPA、A1AT、第VII因子および第IX因子からなる群より選択され、前記コンジュゲートが式
【化１０４】
2007527891.tif 000105
［式中、R1、R2およびR3は、独立して、水素、または2〜10個の炭素原子を持つヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基もしくはヒドロキシアルカリール基、好ましくは水素またはヒドロキシアルキル基、より好ましくは水素またはヒドロキシエチル基であり、
Lは、置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状および/または環状炭化水素残基であって、少なくとも一つのヘテロ原子を含んでもよく、アルキル、アリール、アラルキルヘテロアルキル、および/またはヘテロアラルキル部分を含み、前記残基は2〜60個、好ましくは2〜40個、より好ましくは2〜20個、より好ましくは2〜10個の炭素原子を持ち、
硫黄原子はタンパク質のシステイン残基またはジスルフィド基に由来する］
の構造を持つコンジュゲートにも関する。
【０４８５】
本発明は、-L-が
-[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-
［式中、Ra、Rb、Rc、Rdは、独立して、水素、アルキル、アリール、好ましくは水素であり、
GはOおよびSからなる群より選択され、好ましくはOであり、
mは1、2、3または4、最も好ましくは2であって、残基RaおよびRbはm個の(CRaRb)基中で同じであっても異なってもよく、
nは1〜20、好ましくは1〜10、最も好ましくは1、2、3、または4であり、
oは1〜20、好ましくは1〜10、より好ましくは1、2、3、4、5、より好ましくは1または2、最も好ましくは1であり、残基RcおよびRdはo個のCRcRd基中で同じであっても異なってもよいか、
あるいは、
nは0であり、
oは2〜20、好ましくは2〜10、より好ましくは2、3、4、5、6、7、または8であり、残基RcおよびRdはo個のCRcRd基中で同じであっても異なってもよい］
である、上述のコンジュゲートにも関する。
【０４８６】
本発明は、ヒドロキシアルキルデンプンがヒドロキシエチルデンプンである、上述のコンジュゲートにも関する。
【０４８７】
本発明は、ヒドロキシエチルデンプンが2〜200kD、好ましくは4〜130kD、より好ましくは4〜70kDの分子量を持つ、上述のコンジュゲートにも関する。
【０４８８】
さらにもう一つの態様によれば、本発明は、ヒトまたは動物の身体を処置する方法に用いられる、上述のコンジュゲートまたは上述の方法によって得ることができるコンジュゲートに関する。
【０４８９】
本発明のコンジュゲートは、少なくとも純度50％、さらに好ましくは少なくとも純度70％、さらに好ましくは少なくとも純度90％、特に少なくとも純度95％または少なくとも純度99％であることができる。最も好ましい実施形態では、コンジュゲートは純度100％であることができる。すなわち他の副生成物は存在しない。
【０４９０】
したがって、もう一つの態様によれば、本発明は、本発明のコンジュゲートを含みうる組成物であって、コンジュゲートの量が少なくとも50重量％、より好ましくは少なくとも70重量％、さらに好ましくは少なくとも90重量％、特に少なくとも95重量％または少なくとも99重量％でありうる組成物にも関する。最も好ましい実施形態では、組成物がコンジュゲートからなりうる。すなわちコンジュゲートの量は100重量％である。
【０４９１】
さらにまた、本発明は、上述のコンジュゲートまたは上述の方法によって得ることができるコンジュゲートを治療有効量で含む医薬組成物に関する。
【０４９２】
本発明のタンパク質-HASコンジュゲートは全て、適切な方法によって、例えば経腸法、腸管外法または経肺法などによって投与され、好ましくはi.v.、s.c.またはi.m経路によって投与される。選択される具体的経路は処置される病態に依存する。好ましくはコンジュゲートを、例えば当技術分野で知られているような適切な担体（例えば第1世代/無修飾バイオ医薬品に使用されるものであって、アルブミンを含まないもの、または賦形剤としてアルブミンを含むもの）、適切な希釈剤、例えばi.v.、i.m.、またはs.c.用の滅菌溶液などと一緒に投与する。必要量は処置される病態の重症度、患者の個別的応答、使用する投与方法などに依存する。当業者は正しい投薬量をその一般知識に基づいて確定することができる。
【０４９３】
もう一つの態様によれば、本発明は、血友病Aを処置するための医薬品の製造を目的とする、タンパク質が第VIII因子である、上述のHAS-（好ましくはHES-）タンパク質コンジュゲートまたは上述の方法によって得ることができるHAS-（好ましくはHES-）タンパク質コンジュゲートの使用にも関する。
【０４９４】
もう一つの態様によれば、本発明は、遺伝性AT III欠損症、静脈閉塞性疾患、熱傷および冠動脈バイパス移植（CABG）術におけるヘパリン抵抗性、外傷または胃腸手術に起因する腸穿孔、播種性血管内血液凝固（DIC）および/または敗血症を処置するための医薬品ならびに換気療法に付随する微小血塊形成を予防するための医薬品の製造を目的とする、上述のHAS-AT IIIコンジュゲートまたは上述の方法によって得ることができるHAS-タンパク質コンジュゲートの使用にも関する。したがって、本発明のHAS-AT IIIコンジュゲートを含む医薬組成物は、これらの目的に使用することができる。
【０４９５】
もう一つの態様によれば、本発明は、肺気腫、嚢胞性線維症、アトピー性皮膚炎、および/または気管支炎を処置するための医薬品の製造を目的とする、タンパク質がA1ATである、上述のHAS-（好ましくはHES-）タンパク質コンジュゲートまたは上述の方法によって得ることができるHAS-（好ましくはHES-）タンパク質コンジュゲートの使用にも関する。本発明のHAS-A1ATコンジュゲートを含む本発明の医薬組成物も、これらの目的に使用することができる。
【０４９６】
もう一つの態様によれば、本発明は、心筋梗塞（心臓発作）、血栓症、血栓塞栓症または閉塞性疾患、特に閉塞性動脈疾患を処置するための医薬品の製造を目的とする、タンパク質がtPAである、上述のHAS-（好ましくはHES-）タンパク質コンジュゲートまたは上述の方法によって得ることができるHAS-（好ましくはHES-）タンパク質コンジュゲートの使用にも関する。
【０４９７】
もう一つの態様によれば、本発明は、重症敗血症、血栓症、血栓塞栓症または閉塞性疾患、特に閉塞性動脈疾患を処置するための医薬品の製造を目的とする、タンパク質がAPCである、上述のHAS-（好ましくはHES-）タンパク質コンジュゲートまたは上述の方法によって得ることができるHAS-（好ましくはHES-）タンパク質コンジュゲートの使用にも関する。
【０４９８】
もう一つの態様によれば、本発明は、白血病、例えばヘアリー細胞白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、癌、例えばカルチノイド腫瘍、悪性黒色腫ならびに肝炎、例えば慢性B型肝炎および慢性C型肝炎を処置するための医薬品の製造を目的とする、タンパク質がIFNアルファである、上述のHAS-（好ましくはHES-）タンパク質コンジュゲートまたは上述の方法によって得ることができるHAS-（好ましくはHES-）タンパク質コンジュゲートの使用にも関する。
【０４９９】
もう一つの態様によれば、本発明は、多発性硬化症、好ましくは再発型多発性硬化症を処置するための医薬品の製造を目的とする、タンパク質がIFNベータである、上述のHAS-（好ましくはHES-）タンパク質コンジュゲートまたは上述の方法によって得ることができるHAS-（好ましくはHES-）タンパク質コンジュゲートの使用にも関する。
【０５００】
さらに本発明は、骨髄移植後、もしくは急性骨髄性白血病を持つ高齢者における誘導化学療法後、骨髄移植生着不全または骨髄移植生着遅延、動員、および自家末梢血前駆細胞の移植後の骨髄再構築のための医薬品の製造を目的とする、上述のGM-CSF-HASコンジュゲートの使用に関する。
【０５０１】
本発明は、第VIII因子または第IX因子に対する阻害因子を持つ血友病AまたはB患者におけるエピソードを処置するための医薬品の製造を目的とする、HAS-第VII因子コンジュゲートの使用にも関する。
【０５０２】
本発明は、血友病B（例えば先天性第IX因子欠損症またはクリスマス病）を持つ患者における出血エピソードを管理および予防（手術状況下での出血の管理および予防を含む）するための医薬品の製造を目的とする、HAS-第IX因子コンジュゲートの使用にも関する。
【０５０３】
以下に図、表および実施例を挙げて本発明をさらに例証するが、これらは決して本発明の範囲を制限しようとするものではない。
【実施例】
【０５０４】
実施例1：IFNベータコンジュゲートの合成
実施例1.1  ヒドロキシアミノ官能化ヒドロキシエチルデンプン誘導体の合成
実施例1.1(a)  ヒドロキシルアミノHES10/0.4の合成
HES10/0.4（MW＝10000D，DS＝0.4，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）2gを0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）17mLに溶解し、O-[2-(2-アミノオキシ-エトキシ)-エチル]-ヒドロキシルアミン20mmolを加えた。22℃で19時間振とうした後、反応混合物をアセトンとエタノールの氷冷1：1混合物（v/v）100mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、水50mLに再溶解し、水に対して21時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。LALLS-GPCで測定したところ、このHES10/0.4の分子量は8500D、DSは0.41だった。
【０５０５】
実施例1.1(b)  ヒドロキシルアミノHES10/0.7の合成
HES10/0.7（MW＝10000D，DS＝0.7，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）2gを0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）18mLに溶解し、O-[2-(2-アミノオキシ-エトキシ)-エチル]-ヒドロキシルアミン20mmolを加えた。22℃で19時間振とうした後、反応混合物をアセトンとエタノールの氷冷1：1混合物（v/v）100mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、水50mLに再溶解し、水に対して21時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。LALLS-GPCで測定したところ、このHES10/0.7の分子量は10500D、DSは0.76だった。
【０５０６】
実施例1.1(c)  ヒドロキシルアミノHES50/0.7の合成
HES50/0.7（MW＝50000D，DS＝0.7，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）2gを0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）20mLに溶解し、O-[2-(2-アミノオキシ-エトキシ)-エチル]-ヒドロキシルアミン4mmolを加えた。22℃で19時間振とうした後、反応混合物をアセトンとエタノールの氷冷1：1混合物（v/v）100mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、水50mLに再溶解し、水に対して21時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。LALLS-GPCで測定したところ、このHES50/0.7の分子量は47000D、DSは0.76だった。
【０５０７】
実施例1.1(d)  ヒドロキシルアミノHES50/0.4の合成
HES50/0.4（MW＝50000D，DS＝0.4，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）2gを0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）20mLに溶解し、O-[2-(2-アミノオキシ-エトキシ)-エチル]-ヒドロキシルアミン4mmolを加えた。22℃で17.5時間振とうした後、反応混合物をアセトンとエタノールの氷冷1：1混合物（v/v）70mLに加えた。沈殿した生成物を0℃で遠心分離することによって集め、アセトンとエタノールの氷冷1：1混合物（v/v）30mLで洗浄し、水50mLに再溶解し、水に対して19.5時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。LALLS-GPCで測定したところ、このHES50/0.4の分子量は56000D、DSは0.41だった。
【０５０８】
実施例1.1(e)  ヒドロキシルアミノHES18/0.4の合成
酸化型HESをDE 196 28 705 A1に記述されているように製造した。酸化型HES18/0.4（MW＝18000D，DS＝0.4）200mgを減圧下、80℃で17時間加熱し、乾燥DMSO（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）2mLに溶解した。その溶液にO-[2-(2-アミノオキシ-エトキシ)-エチル]-ヒドロキシルアミン2mmolを加えた。65℃で5日間インキュベートした後、反応混合物を氷冷2-プロパノール20mLに加え、-20℃で1時間インキュベートした。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、氷冷2-プロパノール42mlで洗浄し、水10mLに再溶解し、水に対して27時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。LALLS-GPCで測定したところ、このHES18/0.4の分子量は18000D、DSは0.41だった。
【０５０９】
実施例1.1(f)  ヒドラジドHES10/0.4の合成
酸化型HESをDE 196 28 705 A1に記述されているように製造した。酸化型HES10/0.4（MW＝10000D，DS＝0.4，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）200mgを減圧下、80℃で17時間加熱し、乾燥DMSO（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）2mLに溶解した。その溶液にアジピン酸ジヒドラジド（Lancaster Synthesis GmbH，ドイツ・フランクフルト/マイン）2mmolを加えた。65℃で5日間インキュベートした後、反応混合物を氷冷2-プロパノール20mLに加え、-20℃で1時間インキュベートした。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、氷冷2-プロパノール42mlで洗浄し、水10mLに再溶解し、水に対して27時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。LALLS-GPCで測定したところ、このHES10/0.4の分子量は11000D、DSは0.41だった。
【０５１０】
実施例1.1(g)  カルボヒドラジドHES10/0.4の合成
酸化型HESをDE 196 28 705 A1に記述されているように製造した。酸化型HES10/0.4（MW＝10000D，DS＝0.4，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）200mgを減圧下、80℃で17時間加熱し、乾燥DMSO（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）2mLに溶解した。その溶液にカルボヒドラジド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）2mmolを加えた。65℃で5日間インキュベートした後、反応混合物を氷冷2-プロパノール20mLに加え、-20℃で1時間インキュベートした。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、氷冷2-プロパノール42mlで洗浄し、水10mLに再溶解し、水に対して27時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。LALLS-GPCで測定したところ、このHES10/0.4の分子量は11000D、DSは0.41だった。
【０５１１】
実施例1.1(h)  ヒドラジドHES10/0.4の合成
HES10/0.4（MW＝10000D，DS＝0.4，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）200mgを0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）2mLに溶解した。その溶液にアジピン酸ジヒドラジド（Lancaster Synthesis GmbH，ドイツ・フランクフルト/マイン）2mmolを加えた。22℃で19時間撹拌した後、反応混合物を氷冷2-プロパノール21mLに加え、-20℃で1時間インキュベートした。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、氷冷2-プロパノール42mlで洗浄し、水10mLに再溶解し、水に対して27時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。LALLS-GPCで測定したところ、このHES10/0.4の分子量は8500D、DSは0.41だった。
【０５１２】
実施例1.1(i)  カルボヒドラジドHES10/0.4の合成
HES10/0.4（MW＝10000D，DS＝0.4，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）200mgを0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）2mLに溶解した。その溶液にカルボヒドラジド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）2mmolを加えた。22℃で19時間撹拌した後、反応混合物を氷冷2-プロパノール21mLに加え、-20℃で1時間インキュベートした。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、氷冷2-プロパノール42mlで洗浄し、水10mLに再溶解し、水に対して27時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。LALLS-GPCで測定したところ、このHES10/0.4の分子量は8500D、DSは0.41だった。
【０５１３】
実施例1.2  IFNベータコンジュゲートの合成
実施例1.2(a)  IFNベータの酸化
市販品AVONEX（商標）（BIOGEN）およびRebif（Serono）と同じアミノ酸配列を含む組換えヒトインターフェロンベータ1aを、記述（Dittmarら, 1989）されているようにトランスフェクトしたCHO細胞株から発現させ、実施例6.1で述べるように精製した。酸化を、基本的に実施例6.2で述べるように行った後、実施例6.3で述べるように緩衝液交換を行なった。
【０５１４】
実施例1.2(b)  実施例1.2(a)の酸化型IFN-ベータと実施例1.1(a)〜1.1(i)のHES誘導体との反応
酸化型IFN-ベータの0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）溶液25.9μLに、HES誘導体の0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）溶液5.27μLを加え、その溶液を22℃で16.5時間インキュベートした。以下の濃度を使用した：
（i）実施例1.1(a)、1.1(b)、1.1(f)、1.1(g)、1.1(h)および1.1(i)に従って製造したHES誘導体については78.9mg/mL、
（ii）実施例1.1(c)および1.1(d)に従って製造したHES誘導体については395mg/mL、
（iii）実施例1.1(e)に従って製造したHES誘導体については142mg/mL。
各反応混合物をゲル電気泳動によって分析した（図1参照）。
【０５１５】
実施例1.3  アルデヒド官能化ヒドロキシエチルデンプン誘導体の合成
実施例1.3(a)  アミノ-HES10/0.4および4-ホルミル安息香酸からのアルデヒド-HES10/0.4の合成
オキソ-HES10/0.4（MW＝10kD，DS＝0.4）は、Supramol Parenteral Colloids GmbH（ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）により、DE 196 28 705 A1に従って製造された。LALLS-GPCで測定したところ、このHES10/0.4の分子量は14500D、DSは0.41だった。
【０５１６】
オキソ-HES10/0.4 5.1g（0.51mmol）を無水ジメチルスルホキシド（DMSO，Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）15mlに溶解し、1,4-ジアミノブタン5.1ml（51mmol）の無水ジメチルスルホキシド（10ml）溶液に窒素下で滴下し、40℃で19時間撹拌した。反応混合物をエタノール80mlおよびアセトン80mlの混合物に加えた。得られた沈殿物を遠心分離によって分離し、エタノール20mlおよびアセトン20mlの混合物で洗浄し、水80mlに再溶解した。溶液を水に対して4日間透析した後（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Science Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。アミノ-HES10/0.4の収率は67％（3.4g）だった。
【０５１７】
4-ホルミル安息香酸150mgおよび1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾール230mg（どちらもAldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）をN,N-ジメチルホルムアミド（ペプチド合成用，Biosolve，オランダ・ファルケンスワルト）10mlに溶解し、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド204μlを加えた。21℃で30分間インキュベートした後、アミノ-HES10/0.4 1gを加えた。22℃で19時間振とうした後、反応混合物をアセトンとエタノールの氷冷1:1混合物（v/v）84mlに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、水50mlに再溶解し、水に対して2日間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。
【０５１８】
実施例1.3(b)  還元末端が酸化されたHES10/0.4の過ヨウ素酸酸化によるアルデヒド-HES10/0.4の合成
オキソ-HES10/0.4（MW＝10kD，DS＝0.4）は、Supramol Parenteral Colloids GmbH（ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）により、DE 196 28 705 A1に従って製造された。LALLS-GPCで測定したところ、このHES10/0.4の分子量は8500D、DSは0.41だった。
【０５１９】
オキソ-HES10/0.4 300mgを20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）15mlに溶解した。過ヨウ素酸ナトリウム（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）64.2mgを同じ緩衝液15mlに溶解した。両溶液を混合し、21℃で30分間インキュベートした後、グリセロール2mlを加え、反応混合物を21℃で10分間インキュベートした。反応混合物を水に対して24時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。
【０５２０】
実施例1.4  実施例1.3(a)および1.3(b)に従って合成したアルデヒド官能化ヒドロキシエチルデンプンを使った還元的アミノ化によるIFNベータコンジュゲートの合成
市販品AVONEX（商標）（BIOGEN）およびRebif（Serono）と同じアミノ酸配列を含む組換えヒトインターフェロンベータ1aを、記述（Dittmarら, 1989）されているようにトランスフェクトしたCHO細胞株から発現させ、実施例6.1で述べるように精製した。IFN-ベータの0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）溶液（0.5mg/ml）40μlに、同じ緩衝液中のHES誘導体（実施例1.3(a)または1.3(b)で述べるように合成したもの）の溶液（200mg/mL）5μlを加えた。その混合物を4℃に冷却し、4℃の同じ緩衝液中の120mMシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液9μlを加え、その混合物を4℃で24時間インキュベートした。粗製反応混合物をゲル電気泳動によって分析した。タンパク質バンドの高分子量側への移動によって示されるとおり、コンジュゲーションの成功が観察された（図2参照）。バンド幅の増加は使用したHES誘導体の分子量分布およびタンパク質に連結されたHES誘導体の数によるものである。
【０５２１】
実施例1.5  IFNベータ抗ウイルス活性バイオアッセイの説明−概論
欧州薬局方には、現在、インターフェロン-αおよびインターフェロン-γの活性を決定するためのアッセイしか記載されていない。しかし、インターフェロン-αの抗ウイルス力価は、これらの試験では、追補2001（Supplement 2001）（第5.6章）に記載のインビトロ細胞変性効果（CPE）バイオアッセイを使って測定され、それは今までに承認されたINF-β製剤に適用されるので、抗ウイルス活性はインターフェロン-αと同様に試験することができる。
【０５２２】
IFN-βの抗ウイルス活性は、特異的インビトロ細胞変性効果バイオアッセイを利用して、例えば肺癌細胞（A549）と脳心筋炎ウイルス（EMCV）とを使って、試験することができる。その他、インターフェロンの抗ウイルス活性の決定に使用することができる組み合わせとして、WISH細胞株またはMadin-Darbyウシ腎臓（MDBK）細胞株とVSV（水疱性口内炎ウイルス）の組み合わせも考えられる。
【０５２３】
インターフェロン抗ウイルスアッセイ-概略
第1段階として、HES-IFN-ベータ-コンジュゲートのインビトロ抗ウイルス活性を、無修飾IFN-ベータと比較した。
【０５２４】
CPEアッセイ（MDBK/VSV）で、標準インターフェロンおよびHES-IFN-ベータコンジュゲートの希釈液を比較した。細胞を試験試料で約48時間にわたって前処理した後、それらをウイルスと接触させた。
【０５２５】
インキュベーション期間（約22時間）後に、ウイルスの細胞変性効果に対するインターフェロンの保護効果を見積った。
【０５２６】
インターフェロン抗ウイルスアッセイ−実験の詳細
以下のステップを実行した：
・インターフェロン溶液をMDBK細胞用の細胞培養培地で予備希釈した（1：10）。これらの溶液を1：2〜1：2,097,152（＝1：221）に連続希釈した。
・重複試料は4つ（各ウェルに100μl）
・新鮮なトリプシン処理MDBK細胞を加えた（50μl中、5,000細胞/ウェル）
・インキュベーション：37℃で48時間
・予備希釈したVSV溶液50μlを加えた（250ウイルス/ウェル）
・インキュベーション：37℃で22時間
・ウイルス細胞変性効果に対するインターフェロンの保護効果の決定
・Spearman-Kaerberの方法を使ってインターフェロン力価を計算。
【０５２７】
対照：
インターフェロン溶液を含み、ウイルスを含まない、MDBK細胞（陰性対照）
インターフェロンを含まず、ウイルスを含む、MDBK細胞（陽性対照）。
【０５２８】
結果：
二つのインターフェロンベータ試料および各HESコンジュゲートを、二種類の希釈液（推定1,000,000U/mlおよび200,000UI/ml）を使って、CPEアッセイで試験した。
【０５２９】
SpearmanとKaerberの式に従ってインターフェロン力価を計算した。異なる試料の活性の比を計算した。試料の推定比活性を考慮して、ウイルスインキュベーションに対して50％の細胞が保護されるEC50濃度を計算し、比較した（データ未掲載）。
【０５３０】
修飾IFN-ベータは生物活性を保っていた。
【０５３１】
実施例2  IFNアルファコンジュゲートの合成
実施例2.1(a)  アミノ-HES10/0.4および4-ホルミル安息香酸からのアルデヒド-HES10/0.4の合成
アルデヒド-HES10/0.4を実施例1.3(a)に従って製造した。
【０５３２】
実施例2.1(b)  アミノ-HES10/0.4および4-ホルミル安息香酸からのアルデヒド-HES10/0.4の合成
アルデヒド-HES10/0.4を実施例1.3(b)に従って製造した。
【０５３３】
実施例2.2  実施例2.1(a)および2.1(b)に従って合成したアルデヒド官能化ヒドロキシエチルデンプンを使った還元的アミノ化によるIFNアルファコンジュゲートの合成
市販のrhIFNアルファ（Strathmann Biotec，ドイツ・ハンブルク，製品コードhIFNa）を使用した。
【０５３４】
IFNベータの0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）溶液（1mg/ml）15μlに、同じ緩衝液中のHES誘導体（実施例2.1(a)または2.1(b)で述べるように合成したもの）の溶液（200mg/mL）3.91μlを加えた。その混合物を4℃に冷却し、同じ緩衝液中の120mMシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液3.78μlを加え、その混合物を4℃で24時間インキュベートした。粗製反応混合物をゲル電気泳動によって分析した。タンパク質バンドの高分子量側への移動によって示されるとおり、コンジュゲーションの成功が観察された（図3参照）。バンド幅の増加は使用したHES誘導体の分子量分布およびタンパク質に連結されたHES誘導体の数によるものである。
【０５３５】
実施例3  AT IIIコンジュゲートの合成
実施例3.1  ヒドロキシアミノ官能化ヒドロキシエチルデンプン誘導体の合成
実施例3.1(a)  ヒドロキシルアミノHES10/0.4の合成
HES10/0.4（MW＝10000D，DS＝0.4，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）2gを0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）17mLに溶解し、O-[2-(2-アミノオキシ-エトキシ)-エチル]-ヒドロキシルアミン20mmolを加えた。22℃で19時間振とうした後、反応混合物をアセトンとエタノールの氷冷1：1混合物（v/v）100mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、水50mLに再溶解し、水に対して21時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。LALLS-GPCで測定したところ、このHES10/0.4の分子量は8500D、DSは0.41だった。
【０５３６】
実施例3.1(b)  ヒドロキシルアミノHES10/0.7の合成
HES10/0.7（MW＝10000D，DS＝0.7，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）2gを0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）18mLに溶解し、O-[2-(2-アミノオキシ-エトキシ)-エチル]-ヒドロキシルアミン20mmolを加えた。22℃で19時間振とうした後、反応混合物をアセトンとエタノールの氷冷1：1混合物（v/v）100mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、水50mLに再溶解し、水に対して21時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。LALLS-GPCで測定したところ、このHES10/0.7の分子量は10500D、DSは0.76だった。
【０５３７】
実施例3.1(c)  ヒドロキシルアミノHES50/0.7の合成
HES50/0.7（MW＝50000D，DS＝0.7，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）2gを0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）20mLに溶解し、O-[2-(2-アミノオキシ-エトキシ)-エチル]-ヒドロキシルアミン4mmolを加えた。22℃で19時間振とうした後、反応混合物をアセトンとエタノールの氷冷1：1混合物（v/v）100mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、水50mLに再溶解し、水に対して21時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。LALLS-GPCで測定したところ、このHES50/0.7の分子量は47000D、DSは0.76だった。
【０５３８】
実施例3.1(d)  ヒドロキシルアミノHES18/0.4の合成
酸化型HESを基本的にDE 19628705A1に記述されているように製造した。酸化型HES18/0.4（MW＝18000D，DS＝0.4）200mgを減圧下、80℃で17時間加熱し、乾燥DMSO（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）2mLに溶解した。その溶液にO-[2-(2-アミノオキシ-エトキシ)-エチル]-ヒドロキシルアミン2mmolを加えた。65℃で5日間インキュベートした後、反応混合物を氷冷2-プロパノール20mLに加え、-20℃で1時間インキュベートした。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、氷冷2-プロパノール42mlで洗浄し、水10mLに再溶解し、水に対して27時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。LALLS-GPCで測定したところ、このHES18/0.4の分子量は18000D、DSは0.41だった。
【０５３９】
実施例3.1(e)  ヒドラジドHES10/0.4の合成
酸化型HESを基本的にDE 19628705A1に記述されているように製造した。酸化型HES10/0.4（MW＝10000D，DS＝0.4，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）200mgを減圧下、80℃で17時間加熱し、乾燥DMSO（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）2mLに溶解した。その溶液にアジピン酸ジヒドラジド（Lancaster Synthesis GmbH，ドイツ・フランクフルト/マイン）2mmolを加えた。65℃で5日間インキュベートした後、反応混合物を氷冷2-プロパノール20mLに加え、-20℃で1時間インキュベートした。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、氷冷2-プロパノール42mlで洗浄し、水10mLに再溶解し、水に対して27時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。LALLS-GPCで測定したところ、このHES10/0.4の分子量は11000D、DSは0.41だった。
【０５４０】
実施例3.1(f)  カルボヒドラジドHES10/0.4の合成
酸化型HESを基本的にDE 19628705A1に記述されているように製造した。酸化型HES10/0.4（MW＝10000D，DS＝0.4，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）200mgを減圧下、80℃で17時間加熱し、乾燥DMSO（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）2mLに溶解した。その溶液にカルボヒドラジド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）2mmolを加えた。65℃で5日間インキュベートした後、反応混合物を氷冷2-プロパノール20mLに加え、-20℃で1時間インキュベートした。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、氷冷2-プロパノール42mlで洗浄し、水10mLに再溶解し、水に対して27時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。LALLS-GPCで測定したところ、このHES10/0.4の分子量は11000D、DSは0.41だった。
【０５４１】
実施例3.1(g)  ヒドラジドHES10/0.4の合成
HES10/0.4（MW＝10000D，DS＝0.4，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）200mgを0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）2mLに溶解した。その溶液にアジピン酸ジヒドラジド（Lancaster Synthesis GmbH，ドイツ・フランクフルト/マイン）2mmolを加えた。22℃で19時間撹拌した後、反応混合物を氷冷2-プロパノール21mLに加え、-20℃で1時間インキュベートした。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、氷冷2-プロパノール42mlで洗浄し、水10mLに再溶解し、水に対して27時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。LALLS-GPCで測定したところ、このHES10/0.4の分子量は8500D、DSは0.41だった。
【０５４２】
実施例3.1(h)  カルボヒドラジドHES10/0.4の合成
HES10/0.4（MW＝10000D，DS＝0.4，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）200mgを0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）2mLに溶解した。その溶液にカルボヒドラジド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）2mmolを加えた。22℃で19時間撹拌した後、反応混合物を氷冷2-プロパノール21mLに加え、-20℃で1時間インキュベートした。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、氷冷2-プロパノール42mlで洗浄し、水10mLに再溶解し、水に対して27時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。LALLS-GPCで測定したところ、このHES10/0.4の分子量は8500D、DSは0.41だった。
【０５４３】
実施例3.2  AT IIIコンジュゲートの合成
実施例3.2(a)  AT IIIの酸化
使用したAT IIIは組換えヒトAT III（GTC BiotherapeuticsのATryn（登録商標））である。酸化を、基本的に実施例7.2で述べるように行なった後、実施例7.3で述べるように緩衝液交換を行なった。
【０５４４】
実施例3.2(b)  実施例3.2(a)の酸化型AT IIIと実施例3.1(a)〜3.1(h)のHES誘導体との反応
酸化型ATIIIの0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）溶液4μLに、HES誘導体の0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）溶液3μLを加え、その溶液を22℃で16.5時間インキュベートした。以下の濃度を使用した：
（i）実施例3.1(a)、3.1(b)、3.1(e)、3.1(f)、3.1(g)および3.1(h)に従って製造したHES誘導体については57mg/mL、
（ii）実施例3.1(c)に従って製造したHES誘導体については287mg/mL、
（iii）実施例3.1(d)に従って製造したHES誘導体については103mg/mL。
各反応混合物をゲル電気泳動によって分析した（図4参照）。
【０５４５】
実施例3.3  AT IIIコンジュゲートの合成
実施例3.3(a)  アミノ-HES10/0.4および4-ホルミル安息香酸からのアルデヒド-HES10/0.4の合成
アルデヒド-HES10/0.4を実施例1.3(a)に従って製造した。
【０５４６】
実施例3.3(b)  アミノ-HES10/0.4および4-ホルミル安息香酸からのアルデヒド-HES10/0.4の合成
アルデヒド-HES10/0.4を実施例1.3(b)に従って製造した。
【０５４７】
実施例3.4  実施例3.3(a)および3.3(b)に従って合成したアルデヒド官能化ヒドロキシエチルデンプンを使った還元的アミノ化によるAT IIIコンジュゲートの合成
使用したAT IIIは組換えヒトAT III（GTC BiotherapeuticsのATryn（登録商標））である。
【０５４８】
AT IIIの0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）溶液（3mg/ml）6.67μlに、同じ緩衝液中のHES誘導体（実施例3.3(a)または3.3(b)で述べるように合成したもの）の溶液（200mg/mL）1.73μlを加えた。その混合物を4℃に冷却し、4℃の同じ緩衝液中の120mMシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液1.68μlを加え、その混合物を4℃で24時間インキュベートした。粗製反応混合物をゲル電気泳動によって分析した。タンパク質バンドの高分子量側への移動によって示されるとおり、コンジュゲーションの成功が観察された（図5参照）。バンド幅の増加は使用したHES誘導体の分子量分布およびタンパク質に連結されたHES誘導体の数によるものである。
【０５４９】
実施例3.5  反応性エステル基を持つヒドロキシエチルデンプンとAT IIIとの反応によるAT IIIコンジュゲートの合成
この実施例では、5mMクエン酸ナトリウム緩衝液、66mMグリセロール、67mM NaCl、pH約7中で約25mg/mlの濃度を持つAT III溶液を使用した。使用したAT IIIは組換えヒトAT III（GTC BiotherapeuticsのATryn（登録商標））である。
【０５５０】
AT IIIを、限外濾過により、リン酸緩衝液(pH7.2）およびカットオフ10kDの膜を使って、望ましくないグリセロールから分離した。得られた精製溶液の最終濃度は約25mg/1.25mlだった。タンパク質の品質はHPGPC分析によって管理した（図6参照）。
【０５５１】
このHPGPC分析では以下のパラメータを使用した。
カラム：Superose 12 HR 10/30 300×10 mm I.D.（Pharmacia）
溶離液：脱塩水1リットル中に、27.38mM Na2HPO4；12.62mM NaH2PO4；0.2M NaCl；0.005％ NaN3
流速：0.24ml/時間
検出器1：MALLS検出器
検出器2：UV（280nm）
検出器3：RI。
【０５５２】
オキソ-HES10/0.4（MW＝10,559D，DS＝0.4）は、Supramol Parenteral Colloids GmbH（ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）により、DE 196 28 705 A1に従って製造された。オキソ-HESの酸化度は95％だった。
【０５５３】
オキソ-HES10/0.4 52mgを無水DMF 0.2mlに溶解した。この溶液に炭酸N,N'-ジスクシンイミジル2.6mgを加え、その混合物を室温で2時間撹拌した。
【０５５４】
0.1M重炭酸ナトリウム溶液0.5mlをAT III溶液0.5mlに加えることにより、約10mg/mlのAT III濃度を持つ溶液（pH8.2）を得た。この溶液に、上で製造した反応性オキソ-HES含有溶液を、約30分後に反応が終了するまで、50μlずつ加えた。次に、その混合物のpHを0.1N HClで7に調節し、コンジュゲートの収率が約60％であることをHPGPC分析（高速ゲル透過クロマトグラフィー）によって決定するまで、-18℃で凍結した。この結果を図7に示す。
【０５５５】
このHPGPC分析では以下のパラメータを使用した。
カラム：Superose 12 HR 10/30 300×10 mm I.D.（Pharmacia）
溶離液：脱塩水1リットル中に、27.38mM Na2HPO4；12.62mM NaH2PO4；0.2M NaCl；0.005％ NaN3
流速：0.24ml/時間
検出器1：MALLS検出器
検出器2：UV（280nm）
検出器3：RI。
【０５５６】
実施例4  GM-CSFコンジュゲートの合成
実施例4.1  ヒドロキシアミノ官能化ヒドロキシエチルデンプン誘導体の合成
実施例4.1(a)  ヒドロキシルアミノHES10/0.4の合成
HES10/0.4（MW＝10000D，DS＝0.4，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）2gを0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）17mLに溶解し、O-[2-(2-アミノオキシ-エトキシ)-エチル]-ヒドロキシルアミン20mmolを加えた。22℃で19時間振とうした後、反応混合物をアセトンとエタノールの氷冷1：1混合物（v/v）100mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、水50mLに再溶解し、水に対して21時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。LALLS-GPCで測定したところ、このHES10/0.4の分子量は8500D、DSは0.41だった。
【０５５７】
実施例4.1(b)  ヒドロキシルアミノHES10/0.7の合成
HES10/0.7（MW＝10000D，DS＝0.7，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）2gを0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）18mLに溶解し、O-[2-(2-アミノオキシ-エトキシ)-エチル]-ヒドロキシルアミン20mmolを加えた。22℃で19時間振とうした後、反応混合物をアセトンとエタノールの氷冷1：1混合物（v/v）100mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、水50mLに再溶解し、水に対して21時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。LALLS-GPCで測定したところ、このHES10/0.7の分子量は10500D、DSは0.76だった。
【０５５８】
実施例4.1(c)  ヒドロキシルアミノHES50/0.7の合成
HES50/0.7（MW＝50000D，DS＝0.7，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）2gを0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）20mLに溶解し、O-[2-(2-アミノオキシ-エトキシ)-エチル]-ヒドロキシルアミン4mmolを加えた。22℃で19時間振とうした後、反応混合物をアセトンとエタノールの氷冷1：1混合物（v/v）100mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、水50mLに再溶解し、水に対して21時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。LALLS-GPCで測定したところ、このHES50/0.7の分子量は47000D、DSは0.76だった。
【０５５９】
実施例4.1(d)  ヒドロキシルアミノHES50/0.4の合成
HES50/0.4（MW＝50000D，DS＝0.4，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）2gを0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）20mLに溶解し、O-[2-(2-アミノオキシ-エトキシ)-エチル]-ヒドロキシルアミン4mmolを加えた。22℃で17.5時間振とうした後、反応混合物をアセトンとエタノールの氷冷1：1混合物（v/v）70mLに加えた。沈殿した生成物を0℃で遠心分離することによって集め、アセトンとエタノールの氷冷1：1混合物（v/v）30mLで洗浄し、水50mLに再溶解し、水に対して19.5時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。LALLS-GPCで測定したところ、このHES50/0.4の分子量は56000D、DSは0.41だった。
【０５６０】
実施例4.1(e)  ヒドロキシルアミノHES18/0.4の合成
酸化型HESをDE 19628705A1に記述されているように製造した。酸化型HES18/0.4（MW＝18000D，DS＝0.4）200mgを減圧下、80℃で17時間加熱し、乾燥DMSO（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）2mLに溶解した。その溶液にO-[2-(2-アミノオキシ-エトキシ)-エチル]-ヒドロキシルアミン2mmolを加えた。65℃で5日間インキュベートした後、反応混合物を氷冷2-プロパノール20mLに加え、-20℃で1時間インキュベートした。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、氷冷2-プロパノール42mlで洗浄し、水10mLに再溶解し、水に対して27時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。LALLS-GPCで測定したところ、このHES18/0.4の分子量は18000D、DSは0.41だった。
【０５６１】
実施例4.1(f)  ヒドラジドHES10/0.4の合成
酸化型HESを基本的にDE 19628705A1に記述されているように製造した。酸化型HES10/0.4（MW＝10000D，DS＝0.4，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）200mgを減圧下、80℃で17時間加熱し、乾燥DMSO（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）2mLに溶解した。その溶液にアジピン酸ジヒドラジド（Lancaster Synthesis GmbH，ドイツ・フランクフルト/マイン）2mmolを加えた。65℃で5日間インキュベートした後、反応混合物を氷冷2-プロパノール20mLに加え、-20℃で1時間インキュベートした。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、氷冷2-プロパノール42mlで洗浄し、水10mLに再溶解し、水に対して27時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。LALLS-GPCで測定したところ、このHES10/0.4の分子量は11000D、DSは0.41だった。
【０５６２】
実施例4.1(g)  カルボヒドラジドHES10/0.4の合成
酸化型HESをDE 19628705A1に記述されているように製造した。酸化型HES10/0.4（MW＝10000D，DS＝0.4，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）200mgを減圧下、80℃で17時間加熱し、乾燥DMSO（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）2mLに溶解した。その溶液にカルボヒドラジド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）2mmolを加えた。65℃で5日間インキュベートした後、反応混合物を氷冷2-プロパノール20mLに加え、-20℃で1時間インキュベートした。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、氷冷2-プロパノール42mlで洗浄し、水10mLに再溶解し、水に対して27時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。LALLS-GPCで測定したところ、このHES10/0.4の分子量は11000D、DSは0.41だった。
【０５６３】
実施例4.1(h)  ヒドラジドHES10/0.4の合成
HES10/0.4（MW＝10000D，DS＝0.4，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）200mgを0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）2mLに溶解した。その溶液にアジピン酸ジヒドラジド（Lancaster Synthesis GmbH，ドイツ・フランクフルト/マイン）2mmolを加えた。22℃で19時間撹拌した後、反応混合物を氷冷2-プロパノール21mLに加え、-20℃で1時間インキュベートした。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、氷冷2-プロパノール42mlで洗浄し、水10mLに再溶解し、水に対して27時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。LALLS-GPCで測定したところ、このHES10/0.4の分子量は8500D、DSは0.41だった。
【０５６４】
実施例4.1(i)  カルボヒドラジドHES10/0.4の合成
HES10/0.4（MW＝10000D，DS＝0.4，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）200mgを0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）2mLに溶解した。その溶液にカルボヒドラジド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）2mmolを加えた。22℃で19時間撹拌した後、反応混合物を氷冷2-プロパノール21mLに加え、-20℃で1時間インキュベートした。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、氷冷2-プロパノール42mlで洗浄し、水10mLに再溶解し、水に対して27時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。LALLS-GPCで測定したところ、このHES10/0.4の分子量は8500D、DSは0.41だった。
【０５６５】
実施例4.2  GM-CSFコンジュゲートの合成
実施例4.2(a)  GM-CSFの酸化
GM-CSFを実施例8.1で述べるように精製した。酸化を基本的に実施例8.2で述べるように行なった後、実施例8.3で述べるように緩衝液交換を行なった。
【０５６６】
実施例4.2(b)  実施例4.2(a)の酸化型GM-CSFと実施例4.1(a)〜4.1(i)のHES誘導体との反応
酸化型GM-CSFの0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）溶液27μLに、HES誘導体の0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）溶液3.81μLを加え、その溶液を22℃で16.5時間インキュベートした。以下の濃度を使用した：
（i）実施例4.1(a)、4.1(b)、4.1(f)、4.1(g)、4.1(h)および4.1(i)に従って製造したHES誘導体については78.9mg/mL、
（ii）実施例4.1(c)および4.1(d)に従って製造したHES誘導体については395mg/mL、
（iii）実施例4.1(e)に従って製造したHES誘導体については142mg/mL。
反応混合物をゲル電気泳動によって分析した（図8参照）。
【０５６７】
実施例4.3  GM-CSFコンジュゲートの合成
実施例4.3(a)  アミノ-HES10/0.4および4-ホルミル安息香酸からのアルデヒド-HES10/0.4の合成
アルデヒド-HES10/0.4を実施例1.3(a)に従って製造した。
【０５６８】
実施例4.3(b)  アミノ-HES10/0.4および4-ホルミル安息香酸からのアルデヒド-HES10/0.4の合成
アルデヒド-HES10/0.4を実施例1.3(b)に従って製造した。
【０５６９】
実施例4.4  実施例4.3(a)および4.3(b)に従って合成したアルデヒド官能化ヒドロキシエチルデンプンを使った還元的アミノ化によるGM-CSFコンジュゲートの合成
GM-CSFの0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）溶液（1mg/ml）20μlに、同じ緩衝液中のHES誘導体（実施例3.3(a)または3.3(b)で述べるように合成したもの）の溶液（200mg/mL）1.91μlを加えた。その混合物を4℃に冷却し、4℃の同じ緩衝液中の120mMシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液4.38μlを加え、その混合物を4℃で24時間インキュベートした。粗製反応混合物をゲル電気泳動によって分析した。タンパク質バンドの高分子量側への移動によって示されるとおり、コンジュゲーションの成功が観察された（図9参照）。バンド幅の増加は使用したHES誘導体の分子量分布およびタンパク質に連結されたHES誘導体の数によるものである。
【０５７０】
実施例5  ヒドロキシルアミノ官能化ヒドロキシエチルデンプンを用いたAT III、IFNベータおよびGM-CSFコンジュゲートの合成
実施例5.1  ヒドロキシルアミノ官能化ヒドロキシエチルデンプンの合成
（a）ヒドロキシルアミノHES10/0.4を上記実施例1.1(a)で述べたように合成した。
（b）ヒドロキシルアミノHES50/0.7を上記実施例1.1(c)で述べたように合成した。
【０５７１】
実施例5.2  実施例5.1(b)のヒドロキシルアミノHES50/0.7を使ったIFNベータコンジュゲートの合成
酸化型IFNベータの0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）溶液（実施例6.3のステップ後に得られるもの）1190μLに、0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）200μL中のヒドロキシルアミノHES50/0.7 81.4mgの溶液を加え、その溶液を22℃で19時間インキュベートした。反応混合物をゲル電気泳動によって分析した（図10参照）。
【０５７２】
実施例5.3  実施例5.1(a)のヒドロキシルアミノHES10/0.4を使ったAT IIIコンジュゲートの合成
酸化型AT IIIの0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）溶液（実施例7.3のステップ後に得られるもの）500μLに、0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）1500μL中のヒドロキシルアミノHES10/0.4 21.6mgの溶液を加え、その溶液を22℃で20.5時間インキュベートした。
【０５７３】
実施例5.4  実施例5.1(a)のヒドロキシルアミノHES10/0.4を使ったGM-CSFコンジュゲートの合成
酸化型GM-CSFの0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）溶液（実施例8.3のステップ後に得られるもの）720μLに、0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）180μL中のヒドロキシルアミノHES10/0.4 14.0mgの溶液を加え、その溶液を22℃で18時間インキュベートした。
【０５７４】
実施例6  IFN-ベータ1aのコンジュゲートのさらなる特性解析
実施例6.1(a)  ヒト組換えインターフェロンベータの精製と分析
市販品AVONEX（商標）（BIOGEN）およびRebif（Serono）と同じアミノ酸配列を含む組換えヒトインターフェロンベータ-1aを、記述（Dittmarら, 1989）されているようにトランスフェクトしたCHO細胞株から発現させた。Blue Sepharoseへの細胞上清の吸着、0.7M NaCl＋60％エチレングリコールを含有する0.05Mリン酸Na緩衝液（pH7.0）による溶出、および周囲温度における10ml FF Zn-キレートカラムでのクロマトグラフィーを含む3段階法によって、IFN-βを精製した。カラムは前もって、20mMリン酸Na緩衝液、0.3M NaCl（pH7.4）30mlで平衡化した。試料を20mMリン酸Na（pH7.2〜7.5）15mlで1：2希釈してから適用した。次に、カラムを20mMリン酸Na、0.3M NaCl（pH7.4）25mlで洗浄した後、溶離I（20mlの0.1M酢酸Na、0.5M NaCl、pH5.9）および溶離II（15mlの0.1M酢酸Na、0.5M NaCl、pH7.4）を行なった。最終精製は、0.1％TFA（溶媒A）で平衡化したVydac C4カラムでのRP-HPLCにより、0→100％の溶媒B（0.1％TFA中の80％アセトニトリル）の勾配を使って行なった。
【０５７５】
実施例6.1(b)
使用したIFN-ベータ1aは95％を超える純度（SDS-PAGE分析およびRP-HPLC分析に基づく）を持ち、二量体含有量は5％未満だった（非還元条件）。調製物の糖質構造はAVONEX（商標）の場合と基本的に同じであり、二側鎖型構造42％、二側鎖型−近位フコース16％、三側鎖型12％、四側鎖型7％および三側鎖型＋1N-アセチルラクトサミンリピート9％を示した（残り12％はアガラクト構造、および末端フコースを持つ少量の鎖だった）。HPAEC-PAD応答によれば、オリゴ糖鎖の約14％がアシアロであり、21％がモノシアロ、35％がジシアロ、そして19％がトリシアロだった。少量のテトラシアロ構造が存在した。シアル酸の大半はN-アセチルノイラミン酸として見いだされ、調製物中に存在するN-グリコリルノイラミン酸は5％未満だったので、使用した調製物は市販品AVONEX（商標）に、より似ている。というのも、Rebif（Seronoの製品）は15％を超えるN-グリコリルノイラミン酸を含有するからである（データ未掲載）。
【０５７６】
実施例6.2  CHO細胞から得たIFN-β1aの穏和な過ヨウ素酸処理によるN-アセチルノイラミン酸残基の過ヨウ素酸酸化
IFN-βの500μg/ml溶液（前もって冷却して0℃に保った0.1M酢酸Na緩衝液(pH5.5）溶液）に、10mMメタ過ヨウ素酸ナトリウムの氷冷溶液を加えて、メタ過ヨウ素酸ナトリウムの最終濃度を1mMにした。その混合物を暗所、氷浴中、0℃で1時間インキュベートし、グリセロール20μlの添加によって反応を停止し、さらに5分間インキュベートした。次に、IFN-β試料をVivaspin濃縮ユニットを使って後述するように濃縮した。
【０５７７】
実施例6.3  過ヨウ素酸酸化したIFN-β1aの、以後のHES化に備えた緩衝液交換
緩衝液交換は、ポリエーテルスルホン（PES）膜および10Kdaカットオフを持つ0.5ml Vivaspin 2濃縮ユニット（Vivaspin AG，ドイツ・ハノーバー）を使って行なった。まず、0.1M酢酸Na緩衝液（pH5.5）0.5mlを加え、Megafuge 1.0R（Kendro Laboratory Equipement，ドイツ・オステローデ）中、6℃、4000rpmで遠心分離することにより、濃縮ユニットを洗浄した。次に、過ヨウ素酸酸化したIFN-β溶液0.5mlを濃縮ユニットに加え、少なくとも5倍の濃縮が達成されるまで、4000rpmで25分間遠心分離した。0.1M酢酸Na緩衝液（pH5.5）を濃縮物に加えて最終体積を0.5mlにし、それを上述のように遠心分離した。この遠心分離サイクルを3回繰り返し、最終濃縮物を取り出して2mlプラスチックバイアル（Eppendorff，ドイツ）に移し、HAS修飾反応でさらに使用するまで、氷上に保った。
【０５７８】
実施例6.4  HASとIFN-βとのコンジュゲートの合成
合成は上記実施例5.2で述べたとおりに行なった。
【０５７９】
実施例6.5  過ヨウ素酸酸化したタンパク質とヒドロキシルアミノ-HES50/0.7とのインキュベーションからのHES化IFN-βおよび過剰なHAS誘導体の分離
要約：RP-HPLC操作は、AEKTA explorer 10装置および1.25ml/分の流速を使って、室温で行なった。IFN-β400μgを含有するインキュベーション混合物の一部を、1.25CVの11％溶媒B（0.1％TFA、90％アセトニトリル）および89％溶媒A（0.1％TFA）で平衡化した250mm×10mm C18相カラムに適用した。次に、試料（約1.25ml）を注入し、試料ループを11mlの11％溶媒Bで洗浄した。0.2CVの11％溶媒Bでカラムを洗浄した後、2CVで11％→90％溶媒Bの直線的勾配を適用した。0.8CVの90％溶媒Bを使ってカラムの溶出を継続し、最後にカラムを1.0CVの11％溶媒Bで再平衡化した。IFN-βタンパク質は62％溶媒Bの濃度で7.5mlの体積に溶出した。タンパク質の回収率は、同じ装置を使ってC4相カラムで標準IFN-β調製物を使って得た790mAU×ml×mg-1という比ピーク面積によれば、60％（HES IFN-β CHO）だった。
【０５８０】
実施例6.5に関する材料および方法
装置および材料
装置：AEKTA explorer 10（Amersham Pharmacia Biotech）
・ポンプP-903
・混合器M-925，0.6mlチャンバ付き
・モニターUV-900，10mmフローセル付き
・モニターpH/C-900
・フラクションコレクターFrac-900
・試料ループ2ml
・ソフトウェアUnicornバージョン3.21
を装備。
カラム：250mm×10mm，Macherey-Nagel 250-1/2"-10 Nucleosil 7 C18，カタログ番号715002，ロット番号4020854
カラム体積：20ml
流速：1.25ml/分
溶媒A：HPLC水中の0.1％TFA
溶媒B：HPLC水中の90％アセトニトリル，0.1％TFA
【０５８１】
実施例6.5のRP-HPLC操作の方法
【表１】
2007527891.tif 000106
検出：
・A280nm
・A221nm
・A206nm
・伝導度
分画：
・1.25ml/画分
【０５８２】
実施例6.6  分析実験：
実施例6.6(a)  組換えポリペプチドN-グリコシダーゼ（Roche，ドイツ・ペンツベルク）によるN結合型オリゴ糖の遊離
50mMリン酸Na緩衝液（pH7.2）中のネイティブ過ヨウ素酸酸化またはHAS修飾IFN-β1a 100〜120μgに、組換えポリペプチドN-グリコシダーゼ（Roche,ドイツ・ペンツベルク；250単位/250μl，ロット：101610420）25μlを加えた。反応混合物を37℃で12〜18時間インキュベートし、タンパク質3〜5μgを還元条件下でSDS-PAGE分析にかけた後、タンパク質バンドをクーマシーブルー（Carl Roth GmbH，ドイツ・カールスルーエ）で染色し、脱N-グリコシル化型の移動位置へのIFN-ベータタンパク質バンドの特異的シフトを検出することによって、N-グリコシド結合型オリゴ糖の放出を調べた。
【０５８３】
実施例6.6(b)
放出されたN-グリカンを、-20℃の100％エタノール3体積を加えることによってポリペプチドから分離した。-20℃でのインキュベーションを少なくとも2時間は行なった。沈殿したタンパク質を4℃、13,000rpmで10分間の遠心分離によって除去した。次にペレットを、氷冷70％エタノール500μlによるさらに2回の洗浄に付した。プールした上清中のオリゴ糖を真空遠心機（Speed Vac濃縮機，Savant Instruments Inc.，米国）で乾燥した。Hypercarbカートリッジ（100または200mg）を使って、グリカン試料を以下のように脱塩した。使用に先だって、カートリッジを0.1％（v/v）TFA中の80％（v/v）アセトニトリル500μlで3回洗浄し、次に水500μlで3回洗浄した。試料を水で最終体積が少なくとも300μlになるように希釈してから、カートリッジに負荷した。カートリッジを水で十分に洗浄した。0.1％（v/v）TFAを含有する25％アセトニトリル1.2mlでオリゴ糖を溶出させた。溶出したオリゴ糖を2M NH4OHで中和し、Speed Vac濃縮機で乾燥した。それらをH2O中、-20℃で保存した。
【０５８４】
実施例6.6(c)  穏和な酸加水分解
オリゴ糖の穏和な酸加水分解（N-グリカンからのシアル酸およびHAS修飾シアル酸誘導体の遊離）は以下のように行なった。脱塩したオリゴ糖またはHAS修飾オリゴ糖の一部を同体積の10mM H2SO4と混合し、80℃で90分間インキュベートした。50mM NaOHで中和した後、脱シアリル化グリカン混合物をspeed-vac濃縮機で乾燥し、HPAEC-PAD（高pHアニオン交換クロマトグラフィー-パルスアンペロメトリック検出）での分析に適した濃度に調節した。後続の中性オリゴ糖のMALDI/TOF MS分析用に、黒鉛化炭素25〜40μlを200μlピペットチップに加えることによって調製した小さなHypercarbカラムを使って、試料（0.05〜1nmol）を脱塩した。
【０５８５】
実施例6.6(d)  HPAEC-PAD（high-pH-anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection：高pHアニオン交換クロマトグラフィー-パルスアンペロメトリック検出）によるオリゴ糖マッピング
AS50オートサンプラー、AS50サーマルコンパートメント、ED50電気化学検出器、GS50勾配ポンプ、ソフトウェアChromeleonクロマトグラフィー管理システムからなるBioLCシステム（Dionex，サニーベール）を、CarboPac PA-100分離カラム（4×250mm）およびCarboPac PA-100プレカラム（4×50mm）と共に使用した。オリゴ糖のマッピングおよび定量には二つの異なるモードを使用した。
【０５８６】
I）アシアロモード：
中性オリゴ糖を、以下の表に示す溶媒A（200mM NaOH）と溶媒B（200mM NaOH＋600mM酢酸Na）の勾配を使ったHPAEC-PADマッピングに付した。
【表２】
2007527891.tif 000107
流速：1ml/分
【０５８７】
電気化学検出器の検出器電位は以下のとおりとした。
【表３】
2007527891.tif 000108
【０５８８】
II）オリゴモード
ネイティブオリゴ糖を、以下の表に示す溶媒C（100mM NaOH）と溶媒D（100mM NaOH＋600mM酢酸Na）の勾配を使ったHPAEC-PADマッピングにかけた。
【表４】
2007527891.tif 000109
流速：1ml/分
【０５８９】
電気化学検出器の検出器電位は以下のとおりとした。
【表５】
2007527891.tif 000110
【０５９０】
明確なオリゴ糖標準（N-アセチルラクトサミンリピートを持つ、およびN-アセチルラクトサミンリピートを持たない、ジシアリル化二側鎖型構造、トリシアリル化三側鎖型構造、およびテトラシアリル化四側鎖型構造）を使って得られる応答係数を用いて、比ピーク面積（nC×分×nmol-1）を計算した（Nimtzら, 1993、Schroeterら, 1999、Grabenhorstら, 1999）。
【０５９１】
HAS修飾IFN-βに関する結果
C-18相でのRP-HPLCでは、HAS修飾IFN-βが画分32〜37に検出された。HAS-IFN-βの回収率を計算した。
【０５９２】
図11の矢印は、おそらく末端シアル酸誘導体を欠く形態に起因する無修飾IFN-βの移動位置を示す。一方、HAS修飾IFN-βは35Kda〜120Kdaの分子量範囲にわたる幅広い拡散したクーマシー染色領域として検出された。
【０５９３】
RP-HPLC溶出液の画分32〜37をプールし、中和後にspeed Vac濃縮機で濃縮した。通例、IFN-β試料が100〜200μgずつ乾燥され、それを50mMリン酸Na（pH7.2）＋0.05％Tween-20に溶解し、ポリペプチドN-グリコシダーゼと共に37℃で20〜30時間インキュベートした。得られたオリゴ糖を、穏和な酸処理の前および後に、HPAEC-PAD分析（実施例6.6d）に付した。
【０５９４】
図12に示すように、アシアロ体、モノシアリル体、ジシアリル体およびトリシアリル体がそれぞれ16〜20分、21〜26分、28〜33分および34〜38分に検出される条件下で、HAS修飾IFN-β由来のオリゴ糖材料は52分後にカラムから溶出した。シアル酸の完全な遊離が達成される条件でのオリゴ糖試料の穏和な酸処理後は、IFN-βの予想される中性複合型N-グリカンが、HPAEC-PADプロファイルに検出され、放出されたHAS誘導体は保持時間46〜49分に検出された（勾配アシアロモードを使用。実施例6.6dI参照）。これは、HASがIFN-βのN結合型オリゴ糖に、予想どおり酸不安定結合を介して結合していることを示している（図13）。
【０５９５】
実施例7  AT IIIのコンジュゲートのさらなる特性解析
実施例7.1  ヒトAT III
使用したAT IIIは組換ヒトAT III（GTC BiotherapeuticsのATryn（登録商標））である。
【０５９６】
実施例7.2  AT IIIの穏和な過ヨウ素酸処理によるN-アセチルノイラミン酸残基の過ヨウ素酸酸化
過ヨウ素酸酸化は、基本的に、IFN-βについて実施例6.2で述べたように行なった。
【０５９７】
実施例7.3  過ヨウ素酸酸化したAT IIIの、以後のHES化に備えた緩衝液交換
緩衝液交換は、基本的に、IFN-βについて実施例6.3で述べたように行なった。
【０５９８】
実施例7.4  HASとAT IIIとのコンジュゲートの合成
合成は上記実施例5.3で述べたとおりに行なった。
【０５９９】
実施例7.5  HAS修飾AT IIIを過剰のHAS試薬から分離するためのAT IIIイオン交換クロマトグラフィー
7.5.1．以後の精製に備えてイオン交換クロマトグラフィーによるアンチトロンビンIII試料の緩衝液交換をVivaspin濃縮機（10,000MW CO PES，Vivascienceカタログ番号VS0602，ロット番号03VS0633）を使って行なった。HAS修飾反応によって得た試料（1.6ml中2mgのAT III）を緩衝液A（NaOHでpH8.0に調節した20mM N-モルホリノ-プロパンスルホン酸，MOPS）で5mlに希釈した。試料を製造者の推奨に従って約0.4〜0.6mlまで遠心し、この希釈/濃縮ステップを2回繰り返した。最後にタンパク質試料を濃縮ユニットから洗い出した。
【０６００】
7.5.2．AT III試料の精製は、ポンプP-903、混合器M-925（0.6mlチャンバ付き）、モニターUV-900（10mmフローセルを使用）、モニターpH/C-900、試料ポンプP-950、5ml試料ループからなるAEKTA explorer 10システム（Amersham Pharmacia Biotech）を使って、周囲温度で行なった。このAEKTAシステムをソフトウェアUnicornバージョン3.21で稼働させた。緩衝液A（20mM MPOS，pH8.0）中のインキュベーション混合物を、6CVの緩衝液Aを使って流速1ml/分で平衡化した2ml Q-Sepharose Fast Flow（Amersham，コード番号17-0510-01，ロット番号254665）カラム（Amersham Biosciences C 10/10）を含有するカラムに、0.6ml/分の流速で適用した。そのカラムを6CVの緩衝液Aを使って0.8ml/分の流速で洗浄し、4CVの緩衝液B（20mMリン酸Na中の0.5M NaCl，pH6.5）を使って0.6ml/分の流速で溶出を行なった。4CVの緩衝液C（20mMリン酸Na中の1.5M NaCl，pH6.5）を使って0.6ml/分の流速でカラムを再生し、緩衝液Aで再び平衡化した。AT IIIタンパク質はカラムから約4mlの体積に溶出した。
【０６０１】
方法
【表６】
2007527891.tif 000111
緩衝液A：20mM MOPS/NaOH，pH8.0；緩衝液B：20mMリン酸Na，0.5M NaCl，pH6.5；緩衝液C：20mMリン酸Na，1.5M NaCl，pH 6.5。タンパク質溶出をA280で検出し、各1mlの画分を集めた。
【０６０２】
実施例7.6  分析実験：
実施例7.6(a)  無修飾AT III、過ヨウ素酸酸化AT IIIおよびHAS修飾AT IIIからのN-グリカンの遊離を組換え  を使って行なった。
AT III試料300〜600μgを、5mMジチオエリトリトールの存在下、0.6％SDSの存在下に、pH8.1、90℃で10分間還元した後、NP40を最終濃度が0.6％になるように加えた。50mMリン酸Na緩衝液（pH7.2）中のネイティブ過ヨウ素酸酸化またはHAS修飾AT III 0.3〜0.6mgに、組換えポリペプチドN-グリコシダーゼ（Roche，ドイツ・ペンツベルク；250単位/250μl，ロット：101610420）を加えた。反応混合物を37℃で12〜18時間インキュベートし、タンパク質5〜10μgを還元条件下でSDS-PAGE分析にかけた後、タンパク質バンドをクーマシーブルー（Carl Roth GmbH，ドイツ・カールスルーエ）で染色し、脱N-グリコシル化タンパク質型の移動位置へのAT IIIタンパク質バンドの特異的シフトを検出することによって、N-グリコシド結合型オリゴ糖の放出を調べた。
【０６０３】
実施例7.6(b)
放出されたN-グリカンを、-20℃の100％エタノール3体積を加えることによってポリペプチドから分離した。-20℃でのインキュベーションを少なくとも2時間は行なった。沈殿したタンパク質を4℃、13,000rpmで10分間の遠心分離によって除去した。次にペレットを、氷冷70％エタノール500μlによるさらに2回の洗浄に付した。プールした上清中のオリゴ糖を真空遠心機（Speed Vac濃縮機，Savant Instruments Inc.，米国）で乾燥した。Hypercarbカートリッジ（100または200mg）を使って、グリカン試料を以下のように脱塩した。使用に先だって、カートリッジを0.1％（v/v）TFA中の80％（v/v）アセトニトリル500μlで3回洗浄し、次に水500μlで3回洗浄した。試料を水で最終体積が少なくとも300μlになるように希釈してから、カートリッジに負荷した。カートリッジを水で十分に洗浄した。0.1％（v/v）TFAを含有する25％アセトニトリル1.2mlでオリゴ糖を溶出させた。溶出したオリゴ糖を2M NH4OHで中和し、Speed Vac濃縮機で乾燥した。それらをH2O中、-20℃で保存した。
【０６０４】
実施例7.6(c)  穏和な酸加水分解
オリゴ糖の穏和な酸加水分解（N-グリカンからのシアル酸およびHAS修飾シアル酸誘導体の遊離）は以下のように行なった。脱塩したオリゴ糖またはHAS修飾オリゴ糖の一部を同体積の10mM H2SO4と混合し、80℃で90分間インキュベートした。50mM NaOHで中和した後、脱シアリル化グリカン混合物をspeed-vac濃縮機で乾燥し、HPAEC-PAD（high-pH-anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection：高pHアニオン交換クロマトグラフィー-パルスアンペロメトリック検出）での分析に適した濃度に調節した。後続の中性オリゴ糖のMALDI/TOF MS分析用に、黒鉛化炭素25〜40μlを200μlピペットチップに加えることによって調製した小さなHypercarbカラムを使って、試料（0.05〜1nmol）を脱塩した。
【０６０５】
実施例7.6(d)  HPAEC-PAD（high-pH-anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection：高pHアニオン交換クロマトグラフィー-パルスアンペロメトリック検出）によるオリゴ糖マッピング
AS50オートサンプラー、AS50サーマルコンパートメント、ED50電気化学検出器、GS50勾配ポンプ、ソフトウェアChromeleonクロマトグラフィー管理システムからなるBioLCシステム（Dionex，サニーベール）を、CarboPac PA-100分離カラム（4×250mm）およびCarboPac PA-100プレカラム（4×50mm）と共に使用した。オリゴ糖のマッピングおよび定量には二つの異なるモードを使用した。
【０６０６】
I）アシアロモード：
中性オリゴ糖を、以下の表に示す溶媒A（200mM NaOH）と溶媒B（200mM NaOH＋600mM酢酸Na）の勾配を使ったHPAEC-PADマッピングに付した。
【表７】
2007527891.tif 000112
流速：1ml/分
【０６０７】
電気化学検出器の検出器電位は以下のとおりとした。
【表８】
2007527891.tif 000113
【０６０８】
II）オリゴモード
ネイティブオリゴ糖を、以下の表に示す溶媒C（100mM NaOH）と溶媒D（100mM NaOH＋600mM酢酸Na）の勾配を使ったHPAEC-PADマッピングに付した。
【表９】
2007527891.tif 000114
流速：1ml/分
【０６０９】
電気化学検出器の検出器電位は以下のとおりとした。
【表１０】
2007527891.tif 000115
【０６１０】
明確なオリゴ糖標準（近位フコースを含有するN-アセチルラクトサミンリピートを持つ、および近位フコースを含有するN-アセチルラクトサミンリピートを持たない、ジシアリル化二側鎖型構造、トリシアリル化三側鎖型構造、およびテトラシアリル化四側鎖型構造）を使って得られる応答係数を用いて、比ピーク面積（nC×分×nmol-1）を計算した（Nimtzら, 1993、Schroeterら, 1999、Grabenhorstら, 1999）。
【０６１１】
結果
AT IIIのHAS修飾はSDS-PAGEに有意な分子量シフトをもたらし、タンパク質にHASが共有結合したことを示した（図14a参照）。
【０６１２】
HAS修飾に付したAT IIIのイオン交換クロマトグラフィーにより、AT III画分を得た（無処理AT IIIIとの比較に基づいて回収率＞85％）。
【０６１３】
Q-Sepharoseでのアニオン交換後に得られた無処理AT III、過ヨウ素酸処理したAT IIIおよびHAS修飾AT-IIIの脱N-グリコシル化は、図14Bに示すように、SDS-PAGEで同等の分子量シフトをもたらした。
【０６１４】
遊離させたAT III試料のN-グリカンを、Hypercarbカートリッジへの吸着およびHypercarbカートリッジからの溶出によって単離し、HPAEC-PAD分析に付した。HAS修飾AT IIIから得られるネイティブN-グリカンは、対照試料に検出される全ての中性オリゴ糖ピークの存在を示した（図15のトレース1参照）。穏和な酸処理を行なうと、3つのN-グリカン調製物は全て非常によく似たオリゴ糖パターンを示した。これはHAS修飾の酸不安定性を示し、それはオリゴ糖のシアル酸誘導体におけるHAS修飾と合致する（図16参照）。脱シアリル化構造の同等性をMALDI/TOF分析によって確認した（データ未掲載）。
【０６１５】
実施例8  GM-CSFのコンジュゲートのさらなる特性解析
実施例8.1  GM-CSFの説明
ヒト組換えGM-CSFを、基本的にFornoら, 2004（Guillermina Forno, Mariela Bollati Fogolin, Marcos Oggero, Ricardo Kratje, Marina Etcheverrigaray, Harald S. Conradt, Manfred Nimtz (2004)「N- and O-linked carbohydrates and glycosylation site occupancy in recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor secreted by a Chinese hamster ovary cell line（チャイニーズハムスター卵巣細胞株によって分泌された組換えヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子におけるN-およびO-結合型糖質およびグリコシル化部位占有）」Eur J Biochem, 271(5), 907-919））に記述されているとおりに、CHO K1細胞からの発現後に調製した。これは、同文献に記載されている糖質構造を持っていた。
【０６１６】
組換えGM-CSFは、従来のクロマトグラフィーステップによって、例えばOkamoto,M., Nakai,M., Nakayama,C., Yanagi,H., Matsui,H., Noguchi,H., Namiki,M., Sakai,J., Kadota,K., Fukui,M.およびHara,H.（1991)「Purification and characterization of three forms of differently glycosylated recombinant human Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor（グリコシル化様式が異なる三形態の組換えヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子の精製および特性解析）」Archives of Biochemistry and Biophysics, 286, 562-568に記述されているように、精製することもできる。
【０６１７】
この研究で使用したヒトGM-CSFのアミノ酸配列：
1APA RSPSPSTQPW EHVNAIQEAR RLLNLSRDTA AEMNETVEVI SEMFDLQEPT CLQTRLELYK QGLRGSLTKL KGPLTMMASH YKQHCPPTPE TSCATQIITF ESFKENLKDF LLVIPFDCWE PVQE127（前記Fornoらの文献による）。
【０６１８】
実施例8.2  組換えGM-CSFの穏和な過ヨウ素酸処理によるN-アセチルノイラミン酸残基の過ヨウ素酸酸化
0℃に保った0.1M酢酸Na（pH5.5）中、0.80mg/mlのGM-CSF溶液に、10mMメタ過ヨウ素酸ナトリウムの氷冷溶液を加えて、メタ過ヨウ素酸ナトリウムの最終濃度を1mMにした。その混合物を暗所、氷浴中、0℃で1時間インキュベートし、グリセロール20μlの添加によって反応を停止し、さらに5分間インキュベートした。
【０６１９】
実施例8.3  過ヨウ素酸酸化したGM-CSFの、以後のHES化に備えた緩衝液交換
緩衝液交換は、ポリエーテルスルホン（PES）膜を持つ5ml Vivaspin 6濃縮機（Vivaspin AG，ドイツ・ハノーバー）を使って行なった。0.1M酢酸Na緩衝液（pH5.5）5mlを加え、Megafuge 1.0R（Kendro Laboratory Equipement，ドイツ・オステローデ）中、6℃、4000rpmで濃縮ユニットの遠心分離を行なうことによって、濃縮ユニットを洗浄した。次に、過ヨウ素酸酸化したGM-CSF溶液1〜5mlを濃縮ユニットに加え、5倍の濃縮が達成されるまで、4000rpmで25分間遠心分離した。0.1M酢酸Na緩衝液（pH5.5）4mlを濃縮物に加え、それを上述のように遠心分離した。この遠心分離サイクルを3回繰り返し、最終濃縮物を取り出して2.0mlプラスチックバイアルに移し、濃縮ユニットを酢酸Na緩衝液（pH5.5）各150μlで2回洗浄した後、タンパク質の体積を酢酸Na緩衝液（pH5.5）で  に調節した。
【０６２０】
実施例8.4  HASとGM-CSFとのコンジュゲートの合成
合成は上記実施例5.4で述べたとおりに行なった。
【０６２１】
実施例8.5  HAS修飾後のGM-CSFの精製
過ヨウ素酸酸化したタンパク質とヒドロキシルアミノ-HES10/0.7とのインキュベーション後の過剰なHES誘導体からのHAS修飾GM-CSFの分離
要約：操作は、AEKTA explorer 10装置および1.25ml/分の流速を使って、室温で行なった。IFN-β400μgを含むインキュベーション混合物の一部を、1.25CVの11％溶離液B（0.1％TFA、90％アセトニトリル）および89％溶離液A（0.1％TFA）で平衡化した250mm×10mm C18相カラムに適用した。次に、試料（約1.25ml）を注入し、試料ループを11mlの11％溶離液Bで洗浄した。0.2CVの11％溶離液Bでカラムを洗浄した後、2CVで11％→90％溶離液Bの直線的勾配を適用した。0.8CVの90％溶離液Bを使ってカラムの溶出を継続し、最後にカラムを1.0CVの11％溶離液Bで再平衡化した。
【０６２２】
GM-CSFタンパク質は  ％溶離液Bの濃度で7.5mlの体積に溶出した。タンパク質の回収率は、カラム上で同じ勾配を使って行なった標準GM-CSF調製物での操作に基づき、60％（HES GM-CSF）だった。
【０６２３】
実施例8.5に関する材料および方法
装置および材料
装置：AEKTA explorer 10（Amersham Pharmacia Biotech）
・ポンプP-903
・混合器M-925，0.6mlチャンバ付き
・モニターUV-900，10mmフローセル付き
・モニターpH/C-900
・フラクションコレクターFrac-900
・試料ループ2ml
・ソフトウェアUnicornバージョン3.21
を装備。
カラム：250mm×10mm，Macherey-Nagel 250-1/2"-10 Nucleosil 7 C18，カタログ番号715002，ロット番号4020854
カラム体積：20ml
流速：1.25ml/分
溶媒A：HPLC水中の0.1％TFA
溶媒B：HPLC水中の90％アセトニトリル，0.1％TFA
【０６２４】
実施例8.5のRP-HPLC操作の方法
【表１１】
2007527891.tif 000116
検出：
・280nm
・221nm
・206nm
・伝導度
分画：
・1.25ml/画分
【０６２５】
実施例8.5の結果
過剰のHAS(10Kda)誘導体からのGM-CSFのRP-HPLC分離（実施例8.5）により、カラムから溶出するHAS修飾GM-CSFを全て含有する画分26〜32を得た。HAS修飾後のタンパク質のSDS-PAGEパターンは、35〜90Kdaの分子量領域に幅広い拡散したバンドを示し、一方、無修飾GM-CSFは、非グリコシル化、モノ-N-グリコシル化、およびジ-N-グリコシル化型のパターンを示した（図17，Fornoらの文献（2004）を参照）。
【０６２６】
実施例8.6  分析実験：
a）組換えポリペプチドN-グリコシダーゼによるN結合型オリゴ糖の遊離
50mMリン酸Na緩衝液（pH7.2）中のネイティブ過ヨウ素酸酸化またはHAS修飾GM-CSF 200μg〜1mgに、組換えポリペプチドN-グリコシダーゼ（Roche,ドイツ・ペンツベルク；250単位/250μl，ロット：101610420）25μlを加えた。反応混合物を37℃で12〜18時間インキュベートし、タンパク質5〜10μgを還元条件下でSDS-PAGE分析にかけた後、タンパク質バンドをクーマシーブルー（Carl Roth GmbH，ドイツ・カールスルーエ）で染色し、脱N-グリコシル化タンパク質型の移動位置へのGM-CSFタンパク質バンドのシフトを検出することによって、N-グリコシド結合型オリゴ糖の放出を調べた（図18参照）。
【０６２７】
b）  酵素的に放出されたN-グリカンおよびHAS修飾N-グリカンの単離および脱塩
放出されたN-グリカンを、冷100％エタノール3体積を加えて-20℃で少なくとも2時間インキュベートすることにより、ポリペプチドから分離した。沈殿したタンパク質を4℃、13,000rpmで10分間の遠心分離によって除去した。次にペレットを、氷冷70％エタノール500μlによるさらに2回の洗浄に付した。プールした上清中のオリゴ糖を真空遠心機（Speed Vac濃縮機，Savant Instruments Inc.，米国）で乾燥した。Hypercarbカートリッジ（100または200mg）を使って、グリカン試料を以下のように脱塩した。使用に先だって、カートリッジを0.1％（v/v）TFA中の80％（v/v）アセトニトリル500μlで3回洗浄し、次に水500μlで3回洗浄した。試料を水で最終体積が少なくとも300μlになるように希釈してから、カートリッジに負荷した。カートリッジを水（83カートリッジ体積）で十分に洗浄した。0.1％（v/v）TFAを含有する25％アセトニトリル1.2mlでオリゴ糖を溶出させた。溶出したオリゴ糖を2M NH4OHで中和し、Speed Vac濃縮機で乾燥した。それらを、さらに使用するまでH2O中、-20℃で保存した。
【０６２８】
c）オリゴ糖の穏和な酸加水分解（オリゴ糖からのシアル酸およびHAS修飾シアル酸誘導体の除去）
脱塩したオリゴ糖の一部を同体積の10mM H2SO4と混合し、80℃で90分間インキュベートした。50mM NaOHで中和した後、脱シアリル化グリカンをspeed-vac濃縮機で乾燥し、HPAEC-PAD（high-pH-anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection：高pHアニオン交換クロマトグラフィー-パルスアンペロメトリック検出）での分析に適した濃度に調節した。中性オリゴ糖のMALDI/TOF-MS分析用に、Hypercarb材料20〜30μlを含有するピペットチップを使用し、0.1％トリフルオロ酢酸水溶液中の25％アセトニトリルで洗浄、溶出することにより、中性N-グリカンを脱塩した。
【０６２９】
d）HPAEC-PAD（high-pH-anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection：高pHアニオン交換クロマトグラフィー-パルスアンペロメトリック検出）によるオリゴ糖マッピング
オリゴ糖のマッピングおよび定量は、基本的に、実施例7.6.d)に記述したように行なった。
【０６３０】
結果
実施例8.5で得たRP-HPLC精製材料を使って、タンパク質が、その糖鎖で、酸化されたシアル酸を介してHAS誘導体によって修飾されることを実証した。各トリメチルシアリル化誘導体のガスクロマトグラフィー分析による単糖組成分析から、グルコース、モノおよびジヒドロキシエチル化グルコース誘導体、ならびにマンノース、ガラクトース、N-アセチルグルコサミン、そして少量のN-アセチルガラクトサミンの存在が明らかになった。
【０６３１】
HAS修飾GM-CSFから遊離したネイティブオリゴ糖のHPAEC-PAD分析により、複合型オリゴ糖のHAS修飾に対応するピークが明らかになった（図19参照）。
【０６３２】
穏和な酸処理後は、HAS修飾タンパク質の試料中にGM-CSFの中性N-グリカンが検出され、47〜49分に溶出する修飾HAS誘導体も検出された。
【０６３３】
実施例9  AT IIIコンジュゲートの合成
実施例9.1  ヒドロキシルアミノ-HES誘導体の合成
実施例9.1(a)  ヒドロキシルアミノHES10/0.4の合成
HES10/0.4（MW＝10000D，DS＝0.4，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）0.8gを0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）8mLに溶解し、O-[2-(2-アミノオキシ-エトキシ)-エチル]-ヒドロキシルアミン8mmolを加えた。22℃で19時間振とうした後、反応混合物を-20℃の2-プロパノール40mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、水50mLに再溶解し、水に対して45時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。単離生成物収率は73％だった。LALLS-GPCで測定したところ、このHES10/0.4の分子量は8500D、DSは0.41だった。
【０６３４】
実施例9.1(b)  ヒドロキシルアミノHES10/0.7の合成
HES10/0.7（MW＝10000D，DS＝0.7，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）1.06gを0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）10mLに溶解し、O-[2-(2-アミノオキシ-エトキシ)-エチル]-ヒドロキシルアミン10.9mmolを加えた。22℃で19時間振とうした後、反応混合物を-20℃の2-プロパノール40mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、水50mLに再溶解し、水に対して45時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。単離生成物収率は60％だった。LALLS-GPCで測定したところ、このHES10/0.7の分子量は10500D、DSは0.76だった。
【０６３５】
実施例9.1(c)  ヒドロキシルアミノHES30/0.4の合成
HES30/0.4（MW＝30000D，DS＝0.4，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）2gを0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）18mLに溶解し、O-[2-(2-アミノオキシ-エトキシ)-エチル]-ヒドロキシルアミン6.67mmolを加えた。22℃で15.5時間振とうした後、反応混合物を-20℃の2-プロパノール80mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、水50mLに再溶解し、水に対して45時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。単離生成物収率は83％だった。LALLS-GPCで測定したところ、このHES30/0.4の分子量は33000D、DSは0.41だった。
【０６３６】
実施例9.1(d)  ヒドロキシルアミノHES30/0.7の合成
HES30/0.7（MW＝30000D，DS＝0.7，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）2gを0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）18mLに溶解し、O-[2-(2-アミノオキシ-エトキシ)-エチル]-ヒドロキシルアミン6.67mmolを加えた。22℃で15時間振とうした後、反応混合物を-20℃の2-プロパノール80mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、水50mLに再溶解し、水に対して45時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。単離生成物収率は86％だった。LALLS-GPCで測定したところ、このHES30/0.7の分子量は31000D、DSは0.76だった。
【０６３７】
実施例9.1(e)  ヒドロキシルアミノHES50/0.4の合成
HES50/0.4（MW＝50000D，DS＝0.4，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）2gを0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）20mLに溶解し、O-[2-(2-アミノオキシ-エトキシ)-エチル]-ヒドロキシルアミン4mmolを加えた。22℃で19.5時間振とうした後、反応混合物を-20℃の2-プロパノール80mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、水50mLに再溶解し、水に対して45時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。単離生成物収率は94％だった。LALLS-GPCで測定したところ、このHES50/0.4の分子量は56000D、DSは0.41だった。
【０６３８】
実施例9.1(f)  ヒドロキシルアミノHES50/0.7の合成
HES50/0.7（MW＝50000D，DS＝0.7，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）2.5gを0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）25mLに溶解し、O-[2-(2-アミノオキシ-エトキシ)-エチル]-ヒドロキシルアミン5mmolを加えた。22℃で19.5時間振とうした後、反応混合物を-20℃の2-プロパノール80mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、水50mLに再溶解し、水に対して45時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。単離生成物収率は85％だった。LALLS-GPCで測定したところ、このHES50/0.7の分子量は47000D、DSは0.76だった。
【０６３９】
実施例9.1(g)  ヒドロキシルアミノHES10/0.7の合成
HES10/0.7（MW＝10000D，DS＝0.7，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）2gを0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）18mLに溶解し、O-[2-(2-アミノオキシ-エトキシ)-エチル]-ヒドロキシルアミン20mmolを加えた。22℃で19時間振とうした後、反応混合物をアセトンとエタノールの氷冷1:1混合物（v/v）100mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、水50mLに再溶解し、水に対して21時間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。単離生成物収率は決定しなかった。LALLS-GPCで測定したところ、このHES10/0.7の分子量は10500D、DSは0.76だった。
【０６４０】
実施例9.2  アルデヒド-HES誘導体の合成
実施例9.2(a)  アミノHES10/0.7の合成
オキソ-HES10/0.7（MW＝10000D，DS＝0.7，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム、DE 196 28 705 A1に従って製造したもの）6.02gを窒素下で乾燥ジメチルスルホキシド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）32mLに溶解し、1,4-ジアミノブタン6.03mlを加えた。40℃で17時間撹拌した後、反応混合物をアセトンとエタノールの氷冷1：1混合物（v/v）150mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、アセトンとエタノールの氷冷1：1混合物（v/v）40mLで洗浄し、遠心分離によって集めた。粗生成物を水80mlに溶解し、水に対して4日間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Science Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。単離生成物収率は52％だった。LALLS-GPCで測定したところ、このHES10/0.7の分子量は15000D、DSは0.76だった。
【０６４１】
実施例9.2(b)  アルデヒドHES10/0.7の合成
4-ホルミル安息香酸150mgおよび1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾール230mg（どちらもAldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）をN,N-ジメチルホルムアミド（ペプチド合成用，Biosolve，オランダ・ファルケンスワルト）10mlに溶解し、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）204μLを加えた。21℃で30分間インキュベートした後、アミノHES10/0.7（9.2(a)で述べたように合成したもの）1gを加えた。22℃で19時間振とうした後、反応混合物をアセトンとエタノールの氷冷1:1混合物（v/v）84mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、水50mlに再溶解し、水に対して2日間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。単離生成物収率は83％だった。
【０６４２】
実施例9.2(c)  アミノHES50/0.7の合成
オキソ-HES50/0.7（MW＝50000D，DS＝0.7，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム、成分のモル比を適合させた上でDE 196 28 705 A1に従って製造したもの）6.09gを窒素下で乾燥ジメチルスルホキシド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）32mLに溶解し、1,4-ジアミノブタン1.22mlを加えた。40℃で17時間撹拌した後、反応混合物をアセトンとエタノールの氷冷1：1混合物（v/v）150mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、アセトンとエタノールの氷冷1：1混合物（v/v）40mLで洗浄し、遠心分離によって集めた。粗生成物を水80mlに溶解し、水に対して4日間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Science Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。単離生成物収率は67％だった。LALLS-GPCで測定したところ、このHES50/0.7の分子量は57000D、DSは0.76だった。
【０６４３】
実施例9.2(d)  アルデヒドHES50/0.7の合成
4-ホルミル安息香酸124mgおよび1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾール174mg（どちらもAldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）をN,N-ジメチルホルムアミド（ペプチド合成用，Biosolve，オランダ・ファルケンスワルト）38mlに溶解し、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）155μLを加えた。21℃で30分間インキュベートした後、アミノHES50/0.7（9.2(c)で述べたように合成したもの）3.8gを加えた。22℃で19時間振とうした後、反応混合物をアセトンとエタノールの氷冷1:1混合物（v/v）160mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、N,N-ジメチルホルムアミド20mlに再溶解し、アセトンとエタノールの氷冷1：1混合物（v/v）80mLで上述のように沈殿させた。遠心分離した後、沈殿物を水50mLに溶解し、水に対して2日間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。単離生成物収率は77％だった。
【０６４４】
実施例9.3  グリカンストラテジーによるATIIIコンジュゲートの合成
実施例9.3(a)  酸化型ATIIIと実施例9.1(a)〜9.1(g)の反応生成物との反応
酸化型ATIIIの0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）溶液（GlycoThera，B52 prej-ox STM LJ2-366，4.375mg/ml，実施例3.2参照）685μLに、0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）814μLおよびHES誘導体の0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）溶液1.5mLを加え、その溶液を22℃で26時間インキュベートした。以下の最終HES濃度を使用した：
・実施例9.1(a)および9.1(b)に従って製造したHES誘導体については0.46mg/mL、
・実施例9.1(c)および9.1(d)に従って製造したHES誘導体については1.38mg/mL、
・実施例9.1(e)に従って製造したHES誘導体については9.1mg/mL、
・実施例9.1(f)に従って製造したHES誘導体については10.5mg/mL、
・実施例9.1(g)に従って製造したHES誘導体については17.25mg/mL、
・反応対照として9mg/mLのHES50/0.7（Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）。LALLS-GPCで測定したところ、このHES50/0.7の分子量は47000D、DSは0.76だった。
【０６４５】
各反応混合物をゲル電気泳動によって分析した（図20参照）。
【０６４６】
実施例9.4  還元的アミノ化によるATIIIコンジュゲートの合成
実施例9.4(a)  緩衝液交換：
ATIII（Atryn，GTC Biotherapeutics，米国マサチューセッツ州フレーミングハム）を水10mlに溶解して、5mMクエン酸ナトリウム、67mMグリシンおよび68mM塩化ナトリウム（pH7.0）中、25mg/mlのATIII溶液を得た。この溶液0.1mlを冷0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）で希釈し、Vivaspin 20mL濃縮機（VS2001，10KD MWCO，PES膜，Vivascience AG，ドイツ・ハノーバー）を使った4℃におけるダイアフィルトレーションによって4mlまで濃縮し、再び緩衝液で20mlまで希釈した。このダイアフィルトレーションを2回繰り返した。最後のダイアフィルトレーションステップにおける最終濃度は3mg/mlだった。
【０６４７】
実施例9.4(b)  ATIIIと実施例9.2(b)および9.2(d)の反応生成物との反応
0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）への緩衝液交換後のATIIIの溶液1mLに、0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）中のHES誘導体の溶液1mLおよび同じ緩衝液中の60mMシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液1mLを加え、その溶液を4℃で15.5時間インキュベートした。混合前に全ての溶液を0℃に冷却した。以下の最終HES濃度を使用した：
・実施例9.2(b)に従って製造したHES誘導体については13mg/mL、
・実施例9.2(d)に従って製造したHES誘導体については64.7mg/mL、
・反応対照として64.7mg/mLのHES50/0.7（Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）。
【０６４８】
各反応混合物をゲル電気泳動によって分析した。
【０６４９】
実施例10  活性化アルドン酸によるIFN-アルファコンジュゲートの合成
使用したIFN-アルファは、組換えDNA技術により、Escherichia coli（E. coli：大腸菌）を使って製造された組換えヒトインターフェロンアルファ-2bである。これは165アミノ酸から構成され、天然ヒトインターフェロンアルファ2b（hIFN-アルファ2b）と同じアミノ酸配列を示す。
【０６５０】
実施例10.1  酸化型HES（オキソ-HES）の合成
DE 196 28 705 A1に従ってHES（MW＝57kD，DS＝0.76，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）から酸化型HESを製造した。
【０６５１】
実施例10.2  NHS活性化オキソ-HESの合成
実施例10.1で製造したox-HES50/0.7 4.81gを80℃の乾燥機で終夜乾燥した。そのox-HESを乾燥DMFに80℃で溶解し、室温まで冷却した。
【０６５２】
炭酸N,N'-ジスクシンイミジル（Aldrich）102.1mgの乾燥DMF（1ml）溶液から、400mlを撹拌した反応容器に滴下し、室温で2時間撹拌した。反応混合物を乾燥アセトン50mlに滴下し、沈殿した生成物を遠心分離によって集め、乾燥アセトン50ml×4で洗浄（再懸濁した生成物を遠心分離）した。残留溶媒を減圧下に室温で除去した。
【０６５３】
実施例10.3  活性化アルドン酸（AAA）によるIFN-アルファコンジュゲートの合成
冷却した遠心機（4℃）中でAmicon限外濾過モジュール4（5kDa分子量カットオフ（MWCO））を使って、最終濃度が10mg/mlになるまでタンパク質を濃縮した。この操作の間に緩衝液を等張リン酸緩衝液（pH8）に交換した。結合させるために、タンパク質溶液9mgを20倍モル量の実施例10.1のNHS活性化ox-HESと共に、室温で2時間インキュベートした。冷却した遠心機（4℃）中でAmicon限外濾過モジュール4（5kDa MWCO）を使って限外濾過を行なうことにより、反応混合物をNHSから精製した。この操作の間に緩衝液を25mMリン酸ナトリウム、30mM塩化ナトリウム、0.3mM EDTA（pH7.5）に交換した。
【０６５４】
この実験の反応収率はSECにより＞90％と決定された（図22参照）。
【０６５５】
実施例10.4  IFN-アルファ-HESの精製
試料の精製はAEKTA explorer 10装置を使って室温で行なった。Q-Sepharose Fast Flow 5mlを含有するカラムを、5CVの緩衝液A1（20mM Tris/HCl，pH8.0）で平衡化した。試料を緩衝液Aで1：16に希釈し、試料ポンプを使って6ml/分の流速で適用した。試料ポンプを緩衝液A1 20mlで洗浄した後、カラムをさらに流速1.0ml/分の緩衝液A1 15mlで洗浄した。溶出は、37.5分間で0-100％の緩衝液B1（20mM Tris/HCl（pH8.0）中の0.3M NaCl）の直線的勾配および緩衝液Bによる12.5分間の定組成操作を使って、0.8ml/分の流速で行なった。緩衝液B2（20mM Tris/HCl（pH8.0）中の1.5M NaCl）15mlの後、緩衝液B 5mlを、0.8ml/分の流速で使用することによって、カラムを再生した。次に運転のための再平衡化は緩衝液A1 25mlおよび流速1.0ml/分を使って行なった。
【０６５６】
装置：Aekta explorer 10（Amersham Pharmacia Biotech）
・ポンプP-903
・混合器M-925，0.6mlチャンバ付き
・モニターUV-900，10mmフローセル付き
・モニターpH/C-900
・ポンプP-950（試料ポンプ）
・ソフトウェアUnicornバージョン3.21
を装備。
カラム：Amersham Bioscience C 10/10
カラム材料：Q-Sepharose Fast Flow，ロット番号OD 06453
カラム体積：5ml
プログラム：Q Seph 5ml without Inject for IFN-α
溶離液A1：20mM トリス/HCl，pH8,0（PL0935）
溶離液B1：20mM Tris/HCl（pH8.0）中の0.3M NaCl（PL0938）
溶離液B2：20mM Tris/HCl（pH8.0）中の1.5M NaCl（PL0937)
【０６５７】
方法
【表１２】
2007527891.tif 000117
検出
・280nm，260nm，220nm
・pH
・伝導度
分画
各1ml画分
【０６５８】
実施例11  ＩＦＮアルファ抗ウイルス活性バイオアッセイの記載
細胞培地中の試験物質を前希釈した後、連続2倍希釈物を調製した。96ウェルマイクロタイタープレートにて希釈インターフェロンを−希釈物あたり4倍に複製して−新たにトリプシン処理MDBK細胞（ウェルあたり40.000細胞）に加えた。アッセイは37℃にて24時間インキュベーションした（ウェルあたりの全容積: 150 μL（実施例11.1）または175 μl（実施例11.2））。
【０６５９】
次に、50μL希釈VSV原液を各ウェルに加え（陽性対照ウェルを除く）、0.1の感染の多重度を生じた。
【０６６０】
次の対照が各アッセイに含まれた: インターフェロンの代わりに細胞培地を加えたウイルスを用いた１２ウェル（陰性対照）、およびインターフェロンとウイルスの代わりに細胞培地を用いた１２ウェル（陽性対照）。アッセイは37℃にて４２時間インキュベーションした。
【０６６１】
インキュベーション期間の終わりに、各ウェルの細胞培養上清をMTTの溶液50 mL（細胞培地中少なくとも2 mg/mL）で置き換えた。細胞を３時間インキュベーションした。細胞増殖により形成される紫色のホルマザン色素を、イソプロパノール/HClの100 mL溶液（40 mM HClを含むイソプロパノール）を各ウェルに加えることにより可溶化した。続いて、溶液の吸光度の値はマイクロタイタープレートリーダー中570/630 nmにて測定した。
【０６６２】
インターフェロンおよびVSVの存在下、増殖したMDBK細胞の増殖活性を次のようなインターフェロンの各希釈物について計算した：
((４つのインターフェロン処理ウェルの平均吸光度)−(陰性対照の平均吸光度))＊100／(陽性対照の平均吸光度)−(陰性対照の平均吸光度)
【０６６３】
インターフェロン-アルファの抗ウイルス活性を、各試験物質についての４つの別々のアッセイにて測定した。
【０６６４】
実施例11.1  NIH標準と比較したIntron（登録商標）Aの抗ウイルス活性
すべての実験において、NIH-標準rhIFN-アルファ 2a (NIAID, NIH, Bethesda, USA, Gxa01-901-535) に対して測定したIntron（登録商標）A（IFN-アルファ 2b, Schering-Plough）を内部標準（internal lab reference）として用いた。NIH-標準は9,000 IU/mlの特異的活性を有した。内部標準Intron（登録商標）Aは実施例11に記載の試験にて8,487,000 IU/mlの特異的活性を有した (Fig. 23を参照のこと)。
【０６６５】
実施例11.2  Intron（登録商標）Aと比較したIFN-アルファ-HESの抗ウイルス活性
実施例11に記載のアッセイ系において、実施例10.4からのコンジュゲートはIntron（登録商標）Aと比較試験した。両方の物質のCPE50濃度を計算した。IFN-アルファ-HESはIntron（登録商標）Aの活性の２５％を超えた (Fig. 24を参照のこと)。
【０６６６】
実施例12  IFN-アルファ-HES (マウスにおけるPK検討)のインビボ生物活性
実施例12.1  実施例11に記載のアッセイ系へのマウス血清の影響
インターフェロン-アルファの希釈物を細胞培地(対照)およびマウス血清(1:40希釈物および1:80希釈物)にて調製した。アッセイを実施例11に記載のように行った。
【０６６７】
インターフェロン-アルファの抗ウイルス活性を、対照、1:40に希釈したマウス血清ならびに1:80に希釈したマウス血清について、二つの別々のアッセイにて測定した。1:40希釈物および1:80におけるマウス血清がインターフェロン-アルファの抗ウイルス活性についてのバイオアッセイに影響しないことを結果は示した。
【０６６８】
実施例12.2  マウスにてインビボ検討
プールした血清の抗ウイルス活性を抗ウイルスアッセイにて試験した。二匹のマウス（雌BALB/cマウス、8週齢）から各時点、30 μg/kg（タンパク質含有量に基づく）のIFN-アルファまたはコンジュゲートの静脈注射後、２時間、４時間、１２時間および２４時間にて血清を集め、犠牲にした。
【０６６９】
血清サンプルを解凍し、ボルテックスすることにより徹底的に均一化した。連続２倍希釈物を細胞培地にて調製した。Intron（登録商標）Aのバイアルを解凍し、ボルテックスすることにより徹底的に均一化した。連続２倍希釈物を細胞培地にて調製した。
【０６７０】
CPE-アッセイにてEC50-希釈物を実施例11に記載の1:2連続希釈物の用量応答曲線から測定した。
【０６７１】
物質の半減期を非修飾出発材料およびPegasysと比較して測定した。半減期を注射後の時間に対するEC50-希釈物の半対数プロットから計算した (Fig. 25を参照のこと)。
【０６７２】
抗ウイルス活性をIFN-アルファ-HESについて２４時間まで検出した。IFN-アルファのHESとの誘導体化により増大した半減期を観察した（約５時間の半減期）。非修飾IFN-アルファについて、血清の抗ウイルス活性はあまりに低すぎて血清半減期を計算できなかった。
【０６７３】
実施例13  還元的アミノ化により合成したA1AT (α1AT, アルファ1aT) コンジュゲート
実施例13.1  酸化HESからのアミノ-HES (A)の合成
オキソ-HES 6.09 g (MW = 57,000 D, DS = 0.76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D、DE 196 28 705 A1に従い調製した) を減圧下８０℃にて一晩加熱し、乾燥ジメチルスルホキシド32 ml (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D,) 中に窒素雰囲気下溶解させ、1,4-ジアミノブタン1.22 ml (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) を加えた。４０℃にて１７時間撹拌した後、反応混合物をアセトンおよびエタノール（ｖ／ｖ）の氷冷１：１混合物150 mlに加えた。沈殿した生成物を４℃における遠心分離により集め、アセトンおよびエタノール（ｖ／ｖ）の氷冷１：１混合物40 mlで洗浄し、遠心分離により集めた。粗生成物を水80 mlに溶解させ、水に対して４日間透析し(SnakeSkin透析チューブ, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)、凍結乾燥した。単離した生成物の収率は８２％であった。
【０６７４】
実施例13.2  実施例13.1のアミノ-HES (A) からのアルデヒド-HES (A)の合成
4-ホルミル安息香酸125 mgおよび1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾール174 mg (ともにAldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)をN,N-ジメチルホルムアミド38 ml (ペプチド合成グレード, Biosolve, Valkenswaard, NL)に溶解させ、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド155 μL (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)を加えた。２１℃にて３０分間インキュベーションした後、アミノ-HES (A) 3.8 g（実施例13.1に記載のように調製した)を加えた。２２℃にて１９時間振盪した後、反応混合物をアセトンおよびエタノール（ｖ／ｖ）の氷冷１：１混合物160 mlに加えた。沈殿した生成物を４℃における遠心分離により集め、N,N-ジメチルホルムアミド20 mlに再溶解させ、実施例13.1に記載のようにアセトンおよびエタノール（ｖ／ｖ）の氷冷１：１混合物80 mlにより沈殿させた。遠心分離後、沈殿物を水50 mlに溶解させ、水に対して２日間透析し(SnakeSkin透析チューブ, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)、凍結乾燥した。単離した生成物の収率は７７％であった。
【０６７５】
実施例13.3  酸化HESからのアミノ-HES (B)の合成
オキソ-HES10 g (MW = 57 kD, DS = 0.76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D, DE 196 28 705 A1に従い調製した)を減圧下８０℃にて一晩加熱し、窒素雰囲気下、乾燥ジメチルスルホキシド52 ml (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)に溶解させ、1,4-ジアミノブタン2 ml (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)を加えた。４０℃にて１７時間撹拌後、反応混合物を氷冷2-プロパノール350 ml (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D)に加えた。沈殿した生成物を４℃における遠心分離により集め、氷冷2-プロパノール80 mlで洗浄し、遠心分離により集めた。粗生成物を水80 mlに溶解させ、水に対して２日間透析し (SnakeSkin透析チューブ, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)、凍結乾燥した。単離した生成物の収率は８５％であった。
【０６７６】
実施例13.4  実施例13.3のアミノ-HES (B)からのアルデヒド-HES (B)の合成
4-ホルミル安息香酸153 mgおよび1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾール241 mg (ともにAldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)をN,N-ジメチルホルムアミド51 ml (ペプチド合成グレード, Biosolve, Valkenswaard, NL)に溶解させ、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド170 μL (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)を加えた。２１℃における３０分間のインキュベーション後、アミノ-HES (B) 5.1 g (実施例13.3に記載のように調製した)を加えた。２２℃にて１６時間振盪した後、反応混合物をアセトンおよびエタノール（ｖ／ｖ）の氷冷１：１混合物360 mlに加えた。沈殿した生成物を４℃における遠心分離により集め、水50 mlに再溶解させ、実施例13.1に記載のようにアセトンおよびエタノール（ｖ／ｖ）の氷冷１：１混合物360 mlで沈殿させた。遠心分離後、沈殿物を水50 mlに溶解させ、水に対して２日間透析し (SnakeSkin透析チューブ, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)、凍結乾燥した。単離した生成物の収率は、87 %であった。
【０６７７】
実施例13.5  還元的アミノ化によるアルデヒド-HES (A)および(B)のA1ATへのコンジュゲーション
アルデヒド-HES (B) 189 mg (実施例13.4に記載のように調製した)およびアルデヒド-HES (A) 172 mg (実施例13.2に記載のように調製した)の混合物を反応緩衝液2.88 ml(0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液、150 mM 塩化ナトリウム、pH 7.2)に溶解させた。２０℃にて、同じ緩衝液中の60 mM シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液1.67 ml、次いでA1AT溶液0.455 ml (0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液中c (A1AT) = 11.0 mg/ml、150 mM 塩化ナトリウム、pH 7.2、A1AT= rh A1AT（GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MAにより提供）、ロット番号080604A)を加えた。混合物を２０℃にてインキュベーションした。１７時間後、さらに、反応緩衝液200 μlに溶解させたさらなるシアノ水素化ホウ素ナトリウム6.7 mgを加え、混合物を同温にてさらに２４時間インキュベーションした。この溶液10 μLを、ゲル電気泳動により２５時間の総インキュベーション時間後に分析した(Figure 26を参照のこと)。
【０６７８】
実施例13.6  還元的アミノ化 (反応対照)によるHESのA1ATへのコンジュゲーション
HES 362 mg (MW = 42 kD, DS = 0.41, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)を反応緩衝液2.88 ml (0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液、150 mM 塩化ナトリウム、pH 7.2)に溶解させた。２０℃にて、同一緩衝液中の60 mM シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液1.67 ml、次いでA1AT溶液0.455 ml (0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液中c (A1AT) = 11,0 mg/ml、150 mM 塩化ナトリウム、pH 7.2, α1AT= rh α1AT（GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MAにより提供）、ロット番号080604A)を加えた。混合物を２０℃にてインキュベーションした。１７時間後、反応緩衝液200μlに溶解させたさらなるシアノ水素化ホウ素ナトリウム6.7 mgを加え、混合物を同温にてさらに２４時間インキュベーションした。この溶液10μLをゲル電気泳動による２５時間の総インキュベーション時間の後に分析した (Figure 27を参照のこと)。
【０６７９】
実施例13.7  イオン交換クロマトグラフィー (IEC)によるHES-A1ATコンジュゲートの精製
A1ATのコンジュゲートを、AKTA-Explorer クロマトグラフィー系を用いたHiTrap Q HPカラム上のイオン交換クロマトグラフィーにより精製した (ともにAmersham Biosciencesより)。精製物は「Chen, Hammond, Lang and Lebing、イオン交換クロマトグラフィーによるヒト血漿画分IV-1からのα1プロテイナーゼ阻害剤の精製, VoxSanguinis 1998, 74, 232-241」に記載のようにヒト血漿からのA1ATの単離に従って行った。
【０６８０】
サンプル調製: 溶出液として20 mMリン酸ナトリウム、20 mM塩化ナトリウム、pH 8を用いたAKTA-Explorer クロマトグラフィー系と組み合わせたHiPrep 26/10脱塩カラム(Amersham Biosciences)上の緩衝液交換
【０６８１】
緩衝液交換を、次のパラメータを用いて脱塩水で最終容積10 mlまで粗製の反応混合物を希釈(実施例13.5に記載のように調製、約5 ml)した後に行った：
カラム：                          HiPrep 26/10脱塩
流速：                            10 ml／分
溶出液：                          20 mM リン酸ナトリウム
20 mM 塩化ナトリウム
pH 8
サンプル容積：                    10 ml
溶出液分画：                      2.5 ml
平衡：                            5カラム容積
溶出長：                          2カラム容積
【０６８２】
溶出液の最初の14 mlをプールし、結合緩衝液を加えて20 mlの最終容積とした。タンパク質約5 mgを含むこの溶液を、次のパラメータを用いてIECにより精製した：
カラム：                              HiTrap Q HP 1 ml
流速：                                1 ml／分
結合緩衝液 (BB)：                     20 mM リン酸ナトリウム
20 mM 塩化ナトリウム
pH 8
溶出緩衝液 (EB)：                     20 mM リン酸ナトリウム
1 M 塩化ナトリウム
pH 8
サンプル容積：                        20 ml
フローボウル分画：                    2 ml
溶出液分画：                          1 ml
開始濃度EB：                          0 %
平衡：                                5カラム容積
非結合サンプル洗浄：                  15 ml
標的濃度EB：                          15 %
勾配長：                              20 ml
【０６８３】
クロマトグラフィー後に集めた画分をSDS-Pageにより分析した。HES-A1ATコンジュゲートを含む画分をプールした（画分B1−C6に対応して40〜47 mlの溶出容積、figure 27を参照のこと)。いくつかのプールされた画分において、少量の未反応A1ATが検出可能であった。参照標準としてA1AT (GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, ロット番号080604Aにより提供)を用いたBCA (Pierceカタログ番号23225)により測定したクロマトグラフィー後のプールされた画分の初期濃度は170μg/mlであった。希釈および20 mM リン酸ナトリウム、150 mM 塩化ナトリウム中pH 7.2の緩衝液交換の後、得られたタンパク質濃度は54.5μg/ml (BCA (参照標準としてGTCからのA1ATを含むPierce))であった。この最終溶液を用いてコンジュゲートの阻害効率を測定した。
【０６８４】
実施例13.8  ヒト顆粒球エラスターゼについてのHES-A1ATコンジュゲートのインビトロ阻害能力の測定
コンジュゲートのエラスターゼ阻害活性試験を、Tecan UV-VIS-Platereader Model Sunriseを用いて文献（Castillo et al., Anal. Biochem. 1979, 99, 53-64）に従い行った。
【０６８５】
このアッセイは、エラスターゼにより触媒されたN-Met-O-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Val-p-NO2-アニリンからのp-ニトロアニリンの放出に基づく。この加水分解に続いて、405 nmにおける吸光度の増大が起こることができる。初期加水分解速度は酵素活性の密接な相関関係における。試験される阻害剤の異なる濃度の存在下および非存在下にてアッセイを行った。試験された物質の阻害活性による酵素活性の減少は、時間プロットに対するA405のスロープの減少に表される。ある阻害濃度の前の残存エラスターゼ活性は、非阻害曲線のスロープにより分けられた阻害曲線のスロープにより与えられる。残存酵素活性および阻害濃度の間には線形相関がある。直線回帰を用いることにより、線形滑線（linear smooth line）を達成することができ、与えられた阻害剤濃度についての残存酵素活性を算出することができる。このようにして異なる阻害剤の同一濃度の阻害活性（= 1-残存酵素活性）を比較することができる（Fig. 28を参照のこと)。
【０６８６】
次のパラメータを用いた：
基質濃度：                                1.5 mM
エラスターゼ活性：                        7.5 mU
波長：                                    405 nm
温度：                                    20℃
時間間隔：                                15 s
速度論的周期：                            25
測定モード：                              センター（Center）
【０６８７】
アッセイ溶液は、10 % DMSO、1.5 mM N-Met-O-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Val-p-NO2-アニリン、7.5 mUエラスターゼおよび変化量の阻害剤を含む300μl緩衝液 (0.1 M Hepes、0.5 M NaCl、0.05 % (m/v) Triton X-100, pH 7.5)からなる。
【０６８８】
エラスターゼはServa Electrophoresis GmbH, Heidelbergから購入した。すべての他の物質はSigma Aldrich, Taufkirchenから購入した。
【０６８９】
実施例13.5に記載のように合成されたコンジュゲートの阻害活性を、参照としてのProlastin（登録商標）HS (Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany ロット番号PR4HA43)およびコンジュゲーションの出発材料としてのA1AT (GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, ロット番号080604A)と比較して試験した。濃度プロットに対する残存酵素活性はfigure 28に示す。すべての曲線についての直線性はR2＞0.98であった。以下において、IC50-値およびc (阻害剤) = 1μg/mlについてのエラスターゼ阻害剤、ならびに参照に関する出発材料およびコンジュゲートの阻害活性が与えられる。以下の表に概略されるデータは、A1AT活性の主要部分がHESとのコンジュゲーション後に残存することを明らかに示す。
【０６９０】
実施例13.8の表
【表１３】
2007527891.tif 000118
【０６９１】
実施例13.9  rhアルファ1ATおよび血漿由来hアルファ1ATと比較したHES-rhアルファ1ATコンジュゲートのインビボ半減期の測定
８〜１０週齢の雌マウス(BALB/cOlaHsd, Harlan GmbH, Borchen, Germany)を供試生物（42マウス, サンプルあたり14）として利用した。各動物の「体重」を異なるサンプル溶液の投与の直前に検出した。以下に概略するサンプルの緩衝液pH = 7.2 (20 mmolリン酸ナトリウム、150 mmol 塩化ナトリウム)中の50μg/ml溶液100μlをマウスの尾静脈に静脈注射した。
【０６９２】
サンプル１：rhアルファ1AT (GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, ロット番号080604A)
サンプル２：実施例13.5のように調製したrhアルファ1AT-HESコンジュゲート
サンプル３：血漿由来hアルファ1AT (SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany)
【０６９３】
注射後1、2、4、10、24、31,5および48時間にて各群のマウス二匹を殺し、全血液サンプル（〜500μl）を動物の心臓から抜いた。Microvette（登録商標）500 Z-Gel (Sarstedt, Nuembrecht, Germany)を用いて血清を調製した。アルファ1AT濃度測定の開始まで血清サンプルを−８０℃にて保存した。
【０６９４】
アルファ1AT濃度を市販のアルファ1AT-ELISA (Immundiagnostik, Bensheim, Germany)を用いて説明書に従い検出した。
【０６９５】
得られた結果は、非修飾rhアルファ1AT出発材料と比較して、rhアルファ1AT-HESコンジュゲートについて有意な血漿半減期増大を示す。コンジュゲートの測定された半減期は、次の表による血漿由来hアルファ1ATの一つよりも同範囲内にある。
【０６９６】
実施例13.9の表：サンプル1-3の血漿半減期
【表１４】
2007527891.tif 000119
【０６９７】
実施例14  還元的アミノ化によるHES-IFN-アルファコンジュゲートの合成
用いたIFN-αは、Escherichia coli (E. coli)を用いた組換えDNA技術により製造された組換えヒトインターフェロンアルファ-2bであった。これは１６５アミノ酸からなり、天然のヒトインターフェロンアルファ2b (hIFN-アルファ2b)と同一のアミノ酸配列を示す。
【０６９８】
実施例14.1  オキソ-HESの合成
以下に記載の還元末端にて酸化されたHES (オキソ-HES) は、DE 196 28 705 A1 (実施例A、カラム9、6〜24行)（ここに、各内容は本明細書に引用される）に記載のアルカリヨウ素溶液を用いたHESから調製した。
【０６９９】
実施例14.2  HES誘導体の合成
二工程手順にて、実施例14.1のオキソ-HESをアミンで還元末端にて修飾し、アルデヒド基を第二反応中に導入した。得られたアルデヒド-HESを用いて実施例14.3記載の還元的アミノ化によりIFN-アルファ-HESコンジュゲートを製造した。
【０７００】
実施例14.2.1  実施例14.1のオキソ-HESからのアミノ-HESの合成
実施例14.1のオキソ-HES 5.12 g (MW = 14.5 kD, DS = 0.41, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) を減圧下８０℃にて一晩加熱し、窒素雰囲気下、乾燥ジメチルスルホキシド25 mL (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)中にて溶解させ、1,4-ジアミノブタン5.13 mLを加えた。４０℃にて１７時間撹拌した後、反応混合物をアセトンおよびエタノール（ｖ／ｖ）の氷冷１：１混合物150 mLに加えた。沈殿した生成物を４℃における遠心分離により集め、アセトンおよびエタノール（ｖ／ｖ）の氷冷１：１混合物40 mLで洗浄し、遠心分離により集めた。粗生成物を水80 mLに溶解させ、水に対して透析(SnakeSkin透析チューブ, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)し、凍結乾燥した。単離した生成物の収率は、67 %であった。
【０７０１】
実施例14.2.2  実施例14.2.1のアミノ-HESからのアルデヒド-HESの合成
4-ホルミル安息香酸105 mgおよび1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾール135 mg (ともにAldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)をN,N-ジメチルホルムアミド7 mL (ペプチド合成グレード, Biosolve, Valkenswaard, NL)に溶解させ、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド135μL (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)を加えた。２１℃にて３０分間インキュベーション後、アミノ-HES 0.7 g (実施例14.2.1に記載のように合成) を加えた。２２℃にて１８時間振盪後、反応混合物をアセトンおよびエタノール（ｖ／ｖ）の氷冷１：１混合物42 mLに加えた。沈殿した生成物を４℃における遠心分離により集め、DMF 5 mLに再溶解させ、上記のようにエタノール／アセトン42 mLで沈殿させた。遠心分離後、集めた沈殿物を水で溶解し、水に対して４日間透析し (SnakeSkin透析チューブ, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)、凍結乾燥した。単離した生成物の収率は、95 %であった。
【０７０２】
実施例14.2.3  実施例14.1のオキソ-HESからのアミノ-HESの合成
実施例14.1のオキソ-HES 6.02 g (MW = 14.7 kD, DS = 0.76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) を減圧下８０℃にて一晩加熱し、窒素雰囲気下、乾燥ジメチルスルホキシド 32 mL (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) に溶解し、1,4-ジアミノブタン 6.03 mLを加えた。４０℃にて１７時間撹拌した後、反応混合物をアセトンおよびエタノール（ｖ／ｖ）の氷冷１：１混合物150 mLに加えた。沈殿した生成物を４℃における遠心分離により集め、アセトンおよびエタノール（ｖ／ｖ）の氷冷１：１混合物40 mLで洗浄し、遠心分離により集めた。粗生成物を水80 mLに溶解させ、水に対して４日間透析(SnakeSkin透析チューブ, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)し、凍結乾燥した。単離した生成物の収率は、52 %であった。
【０７０３】
実施例14.2.4  実施例14.2.3のアミノ-HESからのアルデヒド-HESの合成
4-ホルミル安息香酸150 mgおよび1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾール230 mg (ともにAldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)をN,N-ジメチルホルムアミド10 mL (ペプチド合成グレード, Biosolve, Valkenswaard, NL)に溶解し、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド204μL (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)を加えた。２１℃にて３０分間インキュベーションした後、アミノ-HES 1 g (実施例14.2.3に記載のように合成) を加えた。２２℃にて１９時間振盪した後、反応混合物を氷冷2-プロパノール84 mLに加えた。沈殿した生成物を４℃における遠心分離により集め、水50 mLに再溶解させ、水に対して２日間透析(SnakeSkin透析チューブ, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)し、凍結乾燥した。単離した生成物の収率は、83 %であった。
【０７０４】
実施例14.2.5  実施例14.1のオキソ-HESからのアミノ-HESの合成
実施例14.1のオキソ-HES 5 g (MW = 28 kD, DS = 0.41, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)を減圧下８０℃にて一晩加熱した後、窒素雰囲気下、乾燥ジメチルスルホキシド28 mL (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)に溶解し、1,4-ジアミノブタン1.67 mLを加えた。４０℃にて１７時間撹拌した後、反応混合物をアセトンおよびエタノール（ｖ／ｖ）の氷冷１：１混合物175 mLに加えた。沈殿した生成物を４℃における遠心分離により集めた。粗生成物を水40 mLに溶解し、水に対して２日間透析(SnakeSkin透析チューブ, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)し、凍結乾燥した。単離した生成物の収率は、測定されなかった。
【０７０５】
実施例14.2.6  実施例14.2.5のアミノ-HESからのアルデヒド-HESの合成
4-ホルミル安息香酸 130 mgおよび1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾール 153 mg (ともにAldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)をN,N-ジメチルホルムアミド 36 mL (ペプチド合成グレード, Biosolve, Valkenswaard, NL)に溶解し、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド110μL (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)を加えた。２１℃にて３０分間インキュベーションした後、アミノ-HES 2.61 g (実施例14.2.5に記載のように合成)を加えた。２２℃にて２２．５時間振盪した後、反応混合物をアセトンおよびエタノール（ｖ／ｖ）の氷冷１：１混合物160 mLに加えた。沈殿した生成物を４℃における遠心分離により集め、アセトンおよびエタノール（ｖ／ｖ）の氷冷１：１混合物で洗浄した。遠心分離後、沈殿物を水30 mLに溶解し、水に対して１日間透析(SnakeSkin透析チューブ, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)し、凍結乾燥した。単離した生成物の収率は、81 %であった。
【０７０６】
実施例14.2.7  実施例14.1のオキソ-HESからのアミノ-HESの合成
実施例14.1のオキソ-HES 5 g (MW = 30.8 kD, DS = 0.76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)を減圧下８０℃にて一晩加熱した後、窒素雰囲気下に乾燥ジメチルスルホキシド28 mL (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)に溶解し、1,4-ジアミノブタン 1.67 mLを加えた。４０℃にて１７時間撹拌した後、反応混合物をアセトンおよびエタノール（ｖ／ｖ）の氷冷１：１混合物175 mLに加えた。沈殿した生成物を４℃における遠心分離により集めた。粗生成物を水40 mLに溶解し、水に対して２日間透析(SnakeSkin透析チューブ, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)し、凍結乾燥した。単離した生成物の収率は、測定されなかった。
【０７０７】
実施例14.2.8  実施例14.2.7のアミノ-HESからのアルデヒド-HESの合成
4-ホルミル安息香酸 122 mgおよび1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾール 144 mg (ともにAldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)をN,N-ジメチルホルムアミド 34 mL (ペプチド合成グレード, Biosolve, Valkenswaard, NL)に溶解し、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド 103μL (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)を加えた。２１℃にて３０分間インキュベーションした後、アミノ-HES 2.46 g (実施例14.2.7に記載のように合成)を加えた。２２℃にて２２．５時間振盪した後、反応混合物をアセトンおよびエタノール（ｖ／ｖ）の氷冷１：１混合物160 mLに加えた。沈殿した生成物を４℃における遠心分離により集め、アセトンおよびエタノール（ｖ／ｖ）の氷冷１：１混合物で洗浄した。遠心分離後、沈殿物を水30 mLに溶解し、水に対して４日間透析(SnakeSkin透析チューブ, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)し、凍結乾燥した。単離した生成物の収率は、87 %であった。
【０７０８】
実施例14.2.9  実施例14.1のオキソ-HESからのアミノ-HESの合成
オキソ-HES 10 g (MW = 42.1 kD, DS = 0.41, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) を減圧下８０℃にて２日間加熱した後、窒素雰囲気下、乾燥ジメチルスルホキシド53 mL (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)に溶解し、1,4-ジアミノブタン 2.01 mLを加えた。４０℃にて１７時間撹拌した後、反応混合物を氷冷2-プロパノール350 mL (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D)に加えた。沈殿した生成物を４℃における遠心分離により集め、氷冷2-プロパノール80 mLで洗浄し、遠心分離により集めた。粗生成物を水80 mLに溶解し、水に対して２日間透析(SnakeSkin透析チューブ, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)し、凍結乾燥した。単離した生成物の収率は、76 %であった。
【０７０９】
実施例14.2.10  実施例14.2.9のアミノ-HESからのアルデヒド-HESの合成
4-ホルミル安息香酸 900 mgおよび1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾール 1053 mg (ともにAldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)をN,N-ジメチルホルムアミド30 mL (ペプチド合成グレード, Biosolve, Valkenswaard, NL)に溶解し、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド930μL (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)を加えた。２１℃にて３０分間インキュベーションした後、アミノ-HES 3 g (実施例14.2.9に記載のように合成し、N,N-ジメチルホルムアミド20 mLに溶解した)を加えた。２２℃にて２２．５時間振盪した後、反応混合物をアセトンおよびエタノール（ｖ／ｖ）の氷冷１：１混合物 210 mLに加えた。沈殿した生成物を４℃における遠心分離により集め、アセトンおよびエタノール（ｖ／ｖ）の氷冷１：１混合物で洗浄した。遠心分離後、沈殿物を水30 mLに溶解し、水に対して２日間透析(SnakeSkin透析チューブ, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)し、凍結乾燥した。単離した生成物の収率は、97 %であった。
【０７１０】
実施例14.2.11  実施例14.1(A)のオキソ-HESからのアミノ-HESの合成
オキソ-HES 6.09 g (MW = 56.8 kD, DS = 0.76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)を減圧下８０℃にて一晩加熱し、窒素雰囲気下、乾燥ジメチルスルホキシド 32 mL (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)に溶解し、1,4-ジアミノブタン 1.22 mLを加えた。４０℃にて１７時間撹拌した後、反応混合物をアセトンおよびエタノール（ｖ／ｖ）の氷冷１：１混合物150 mLに加えた。沈殿した生成物を４℃における遠心分離により集め、アセトンおよびエタノール（ｖ／ｖ）の氷冷１：１混合物40 mLで洗浄し、遠心分離により集めた。粗生成物を水80 mLに溶解し、水に対して４日間透析(SnakeSkin透析チューブ, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)し、凍結乾燥した。単離した生成物の収率は、82 %であった。
【０７１１】
実施例14.2.12  実施例14.2.11のアミノ-HESからのアルデヒド-HESの合成
4-ホルミル安息香酸125 mgおよび1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾール 174 mg (ともにAldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)をN,N-ジメチルホルムアミド 38 mL (ペプチド合成グレード, Biosolve, Valkenswaard, NL)に溶解し、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド 155μL (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)を加えた。２１℃にて３０分間インキュベーションした後、アミノ-HES 3.8 g (実施例14.2.11に記載のように合成)を加えた。２２℃にて１９時間振盪した後、反応混合物をアセトンおよびエタノール（ｖ／ｖ）の氷冷１：１混合物160 mLに加えた。沈殿した生成物を４℃における遠心分離により集め、N,N-ジメチルホルムアミド20 mLに再溶解し、上記のようにアセトンおよびエタノール（ｖ／ｖ）の氷冷１：１混合物80 mLで沈殿させた。遠心分離後、沈殿物を水50 mLに溶解し、水に対して２日間透析(SnakeSkin透析チューブ, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)し、凍結乾燥した。単離した生成物の収率は、77 %であった。
【０７１２】
実施例14.2.13  実施例14.1(B)のオキソ-HESからのアミノ-HESの合成
オキソ-HES 10 g (MW = 56.8 kD, DS = 0.76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)を減圧下８０℃にて一晩加熱した後、窒素雰囲気下、乾燥ジメチルスルホキシド53 mL (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)に溶解し、1,4-ジアミノブタン 2 mLを加えた。４０℃にて１７時間撹拌した後、反応混合物を氷冷2-プロパノール 350 mL (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D)に加えた。沈殿した生成物を４℃における遠心分離により集め、氷冷2-プロパノール80 mLで洗浄し、遠心分離により集めた。粗生成物を水80 mLに溶解し、水に対して２日間透析(SnakeSkin透析チューブ, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)し、凍結乾燥した。単離した生成物の収率は、85 %であった。
【０７１３】
実施例14.2.14  実施例14.2.13のアミノ-HESからのアルデヒド-HESの合成
4-ホルミル安息香酸153 mgおよび1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾール241 mg (ともにAldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)をN,N-ジメチルホルムアミド51 mL (ペプチド合成グレード, Biosolve, Valkenswaard, NL)に溶解し、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド170μL (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)を加えた。２１℃にて３０分間インキュベーションした後、アミノ-HES5.1 g (実施例14.2.13に記載のように合成)を加えた。２２℃にて１６時間振盪した後、反応混合物をアセトンおよびエタノール（ｖ／ｖ）の氷冷１：１混合物360 mLに加えた。沈殿した生成物を４℃における遠心分離により集め、水50 mLに再溶解し、上記のようにアセトンおよびエタノール（ｖ／ｖ）の氷冷１：１混合物360 mLで沈殿させた。遠心分離後、沈殿物を水50 mLに溶解し、水に対して２日間透析(SnakeSkin透析チューブ, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)し、凍結乾燥した。単離した生成物の収率は、87 %であった。
【０７１４】
実施例14.2.15  実施例14.1のオキソ-HESからのアミノ-HESの合成
オキソ-HES 5.0 g (MW = 29.3 kD, DS = 0.86, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)を減圧下８０℃にて一晩加熱し、窒素雰囲気下、乾燥ジメチルスルホキシド 20 ml (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)に溶解し、1,4-ジアミノブタン 1,67 ml (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)を加えた。４０℃にて３０．５時間撹拌した後、反応混合物をアセトン (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D)およびエタノール (Sonnenberg, DAB, Braunschweig, D)の氷冷１：１（ｖ／ｖ）混合物175 mlに加えた。沈殿した生成物を４℃にて１２０分間遠心分離により集め、水40 mlに溶解し、水に対して２日間透析(SnakeSkin透析チューブ, 10 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)し、凍結乾燥した。単離した生成物の収率は、87 %であった。
【０７１５】
実施例14.2.16  実施例14.2.15のアミノ-HESからのアルデヒド-HESの合成
4-ホルミル安息香酸150 mgおよび1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾール230 mg (ともにAldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)をN,N-ジメチルホルムアミド 10 ml (ペプチド合成グレード, Biosolve, Valkenswaard, NL)に溶解し、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド 166μL (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)を加えた。２１℃にて３０分間インキュベーションした後、アミノHES 3.02 g (実施例14.2.15に記載のように合成)のDMF 20 ml溶液を加えた。２２℃にて１６時間振盪した後、反応混合物をアセトン (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D)およびエタノール (Sonnenberg, DAB, Braunschweig, D)の氷冷１：１混合物（ｖ／ｖ）215 mlに加えた。沈殿した生成物を４℃における遠心分離により集め、水 20 mlに再溶解し、上記のようにアセトン／エタノールで沈殿させた。遠心分離後、沈殿物を水30 mlに溶解し、水に対して２．５日間透析 (SnakeSkin透析チューブ, 10 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)し、凍結乾燥した。単離した生成物の収率は、87 %であった。
【０７１６】
実施例14.2.17  実施例14.1のオキソ-HESからのアミノ-HESの合成
オキソ-HES 5.0 g (MW = 97.9 kD, DS = 0.76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)を減圧下８０℃にて一晩加熱し、窒素雰囲気下、乾燥ジメチルスルホキシド20 ml (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)に溶解し、1,4-ジアミノブタン0.50 ml (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)を加えた。４０℃にて３０．５時間撹拌した後、反応混合物をアセトン (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D)およびエタノール (Sonnenberg, DAB, Braunschweig, D)の氷冷１：１（ｖ／ｖ）混合物175 mlに加えた。沈殿した生成物を４℃にて１２０分間遠心分離により集め、水40 mlに溶解し、水に対して２日間透析(SnakeSkin透析チューブ, 10 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)し、凍結乾燥した。単離した生成物の収率は、90 %であった。
【０７１７】
実施例14.2.18  実施例14.2.17のアミノ-HESからのアルデヒド-HESの合成
4-ホルミル安息香酸73 mgおよび1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾール 112 mg (ともにAldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)をN,N-ジメチルホルムアミド 10 ml (ペプチド合成グレード, Biosolve, Valkenswaard, NL)に溶解し、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド 81.3μL (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)を加えた。２１℃にて３０分間インキュベーションした後、アミノHES 3.09 g (実施例14.2.17に記載のように製造)のDMF 20 ml溶液を加えた。２２℃にて１６時間振盪した後、反応混合物をアセトン (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D)およびエタノール (Sonnenberg, DAB, Braunschweig, D)の氷冷１：１混合物（ｖ／ｖ）215 mlに加えた。沈殿した生成物を４℃における遠心分離により集め、水 20 mlに再溶解し、上記のようにアセトン／エタノールで沈殿させた。遠心分離後、沈殿物を水30 mlに溶解し、水に対して２．５日間透析 (SnakeSkin透析チューブ, 10 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)し、凍結乾燥した。単離した生成物の収率は、96 %であった。
【０７１８】
実施例14.3  還元的アミノ化によるIFN-アルファコンジュゲートの合成
実施例14.3.1  20μgスケールにおけるIFN-アルファへのコンジュゲーション
150 mM NaClおよび0.3 mM EDTAを含む25 mM リン酸ナトリウム緩衝液0.375 ml pH 7.5に溶解したIFN-アルファ0.675 mgに、反応緩衝液 4 ml (0.1 M酢酸ナトリウム緩衝液 pH 5.0)を加え、溶液をVivaspin 6コンセントレーター (Viva Science, 5 kD MWCO, Hannover, Germany)中3939 x gにて３０分間遠心分離した。反応緩衝液により6 mlまで残存溶液を希釈することにより、洗浄手順を２回繰り返し、上記のように遠心分離した。最終IFN-アルファ溶液の容積は0.236 mlであり、2.86 mg/ml IFN-アルファの算出された最終濃度に対応する。タンパク質濃度は実験的にチェックしなかった。
【０７１９】
上記のように調製し、０℃まで冷却したIFN-アルファ溶液7μlに、それぞれのアルデヒド-HES (以下の表を参照のこと)溶液10μl (50当量)および60 mM シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液11.3μl（ともに同一の緩衝液 (酢酸ナトリウム, pH 5.0)中０℃まで冷却）を加え、混合物を０℃にて１７時間インキュベーションした。反応混合物をゲル電気泳動により分析した。次のアルデヒド-HES溶液の濃度を用いた：
【０７２０】
実施例14.3.1の表
【表１５】
2007527891.tif 000120
コンジュゲートのSDS-Page分析をFig. 29に示す。
【０７２１】
実施例14.3.2  3 mgスケールにおけるIFN-アルファへのコンジュゲーション
150 mM NaClおよび0.3 mM EDTAを含む25 mM リン酸ナトリウム緩衝液 pH 7.5に溶解したIFN-アルファ20 mgに反応緩衝液8 ml (0.1 M酢酸ナトリウム緩衝液 pH 5.0)を加え、溶液をVivaspin 15Rコンセントレーター(Viva Science, 5 kD MWCO, Hannover, Germany)中3939 x gにて９９分間遠心分離した。反応緩衝液により18 mlまで残存溶液を希釈することにより、洗浄手順を２回繰り返し、上記のように遠心分離した。最終IFN-アルファ溶液を反応緩衝液で6.66 mlまで希釈し、3 mg/ml IFN-アルファの最終算出濃度を与えた。タンパク質濃度は実験的にチェックしなかった。
【０７２２】
上記のように調製し、０℃まで冷却したIFN-アルファ溶液1 mlに、アルデヒドHES溶液1 ml (75当量)および60 mM シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液1 ml（ともに同一の緩衝液 (酢酸ナトリウム, pH 5.0)中、０℃まで冷却）を加え、混合物を０℃にて２２時間インキュベーションした。反応混合物をゲル電気泳動により分析後精製した。エントリーＧに記載の反応について、対応する溶液0.666μlだけを用いた。次のアルデヒドHES溶液の濃度を用いた：
【０７２３】
実施例14.3.2の表
【表１６】
2007527891.tif 000121
コンジュゲートのSDS-Page分析をFig. 30に示す。
【０７２４】
実施例14.3.3  3 mgスケールにおけるIFN-アルファへのコンジュゲーション
14.3.3.1  還元的アミノ化による実施例14.2.16にて調製されたアルデヒドHESのIFNαへのコンジュゲーション
150 mM NaClおよび0.3 mM EDTAを含む25 mM リン酸ナトリウム緩衝液 pH 7.5に溶解したIFNα10 mgに、反応緩衝液8 ml (0.1 M酢酸ナトリウム緩衝液 pH 5.0)を加え、溶液をVivaspin 15Rコンセントレーター (Viva Science, 5 kD MWCO, Hannover, Germany)中3939 x gにて３０分間遠心分離した。反応緩衝液により18 mlまで残存溶液を希釈することにより、洗浄手順を２回繰り返し、上記のように遠心分離した。最終IFNα溶液を反応緩衝液で3.33 mlまで希釈し、3 mg/ml IFNαの最終算出濃度を得た。タンパク質濃度は実験的にチェックしなかった。
【０７２５】
上記のように調製し、０℃まで冷却したIFNα溶液1 mlに、実施例14.2.16にて調製したアルデヒドHES溶液1 ml (75当量, 352 mg/ml)および60 mM シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液1 ml（ともに同一の緩衝液中０℃まで冷却した）を加え、混合物を０℃にて２２時間インキュベーションした。反応混合物をゲル電気泳動による分析後精製した。ゲル電気泳動について、XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D)およびConsort E143パワーサプライ（power supply）(CONSORTnv, Turnhout, B)を用いた。還元条件下にてMOPS SDSランニング緩衝液と一緒に12 % Bis-Trisゲル (ともにInvitrogen GmbH, Karlsruhe, D)を説明書に従って用いた。
【０７２６】
14.3.3.2  還元的アミノ化による実施例14.3.18にて調製されたアルデヒドHESのIFNαへのコンジュゲーション
14.3.3.1に記載のように調製し、０℃まで冷却したIFNα溶液1 mlに、実施例14.3.18にて調製したアルデヒドHES溶液2 ml (75当量, 369 mg/ml)および60 mM シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液1.5 ml（ともに同一の緩衝液中０℃まで冷却した）を加え、混合物を０℃にて２２時間インキュベーションした。反応混合物をゲル電気泳動による分析後精製した。ゲル電気泳動について、XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D)およびConsort E143パワーサプライ (CONSORTnv, Turnhout, B)を用いた。還元条件下にてMOPS SDSランニング緩衝液と一緒に12 % Bis-Tris ゲル (ともにInvitrogen GmbH, Karlsruhe, D)を説明書に従って用いた。
【０７２７】
14.3.3.3  反応対照：還元的アミノ化によるHES10/0.4 (Mw 7.6 kD DS = 0.41)のIFNαへのコンジュゲーション
14.3.3.1に記載のように調製し、０℃まで冷却したIFNα溶液1 mlに、HES10/0.4溶液1 ml (75当量, 117 mg/ml)および60 mM シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液1 ml（ともに同一の緩衝液中０℃まで冷却した）を加え、混合物を０℃にて２２時間インキュベーションした。反応混合物をゲル電気泳動による分析後精製した。ゲル電気泳動について、XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D)およびConsort E143パワーサプライ (CONSORTnv, Turnhout, B)を用いた。還元条件下にてMOPS SDSランニング緩衝液と一緒に12 % Bis-Tris ゲル (ともにInvitrogen GmbH, Karlsruhe, D)を説明書に従って用いた。
コンジュゲートのSDS-Page分析をFig. 31に示す。
【０７２８】
実施例14.3.4  16 mgスケールにおけるIFN-アルファへのコンジュゲーション
IFN-アルファ溶液20 mgの緩衝液を実施例14.3.2に記載のように交換した。最終IFN-アルファ溶液を反応緩衝液で6.37 mlまで希釈し、3.14 mg/ml IFN-アルファの最終算出濃度を得た。この溶液100μlを反応緩衝液900μlで希釈し、タンパク質濃度を分光光度法的にモル吸光係数18000に基づき、279 nmにて3.01 mg/mlまで測定した。タンパク質濃度測定について用いた物質と混合した後、最終容積は2.74 mg/mlのタンパク質濃度を有する7.0 mlであった。
【０７２９】
この上記のように調製し、０℃まで冷却したIFN-アルファ溶液5.91 ml (16.2 mg)に、実施例14.2.14 (75当量)のアルデヒド-HES 3.152 gの反応緩衝液 5 mlの溶液および60 mM シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液6 ml（ともに同一の緩衝液 (酢酸ナトリウム, pH 5.0)中、０℃まで冷却した）を加え、混合物を０℃にて２２時間インキュベーションした(Fig. 32, Line Aを参照のこと)。
【０７３０】
反応対照として前冷却したIFN-アルファ溶液1.09 ml (3 mg)を非酸化HES 122 mg (Mw 7.6 kD, DS = 0.41)の反応緩衝液中の溶液1 mlおよび60 mM シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液1 ml（ともに同一の緩衝液中０℃まで冷却した）と混合した(Fig. 32, line Bを参照のこと)。
コンジュゲートのSDS-Page分析をFig. 32にて示す。
【０７３１】
実施例14.4  IFN-アルファ-HESコンジュゲートの精製
14.4.1  還元的にアミノ化されたタンパク質の活性化HES誘導体でのインキュベーションからのHES-IFN-αの精製(修飾および非修飾タンパク質のHES-誘導体からの分離)
すべてのサンプルの精製はAKTAエクスプローラー 10装置を用いて室温にて行った。3 ml Q-Sepharose Fast Flowを含むカラムを緩衝液A (20 mM Tris/HCl, pH 8.0) 10 CVで平衡させた。サンプルを緩衝液Aで1:10に希釈し、1 ml/分の流速にてサンプルポンプを用いることにより適用した。緩衝液A 10 mlでのサンプルポンプの洗浄後、カラムを緩衝液A 6 CV で1 ml/分の流速にてさらに洗浄した。溶出は、2 CVにわたる0-100%の緩衝液B (20 mM Tris/HCl中0.3 M NaCl, pH 8.0)からの直線勾配および0.8 ml/分の流速における緩衝液Bの0.5 CVでのアイソクラチックにより行った。カラムは、2 CVの緩衝液C (20 mM Tris/HCl中1.5 M NaCl, pH 8.0)次いで0.5 CVの緩衝液 Bを流速0.8 ml/分にて用いることにより再生した。次の実行のための再平衡は、6 CVの緩衝液Aおよび流速1.0 ml/分を用いることにより行った。
【０７３２】
14.4.2  物質および方法
装置：  Pump P-903、0.6 mlチャンバーを有するMixer M-925、10 mmフローセルを有するモニターUV-900、モニターpH/C-900、Pump P-950 (サンプルポンプ)、Software Unicorn Version 3.21を備えたAKTAエクスプローラー 10 (Amersham Pharmacia Biotech)、
カラム：  Amersham Biosciences C 10/10
カラム物質：  Q-Sepharose Fast Flow、コード番号17-0510-01、ロット番号OD 06453
カラム容積：  3 ml
緩衝液A:  20 mM Tris/HCl、pH 8.0、ロット番号PL0746
緩衝液B:  20 mM Tris/HCl中の0.3 M NaCl、pH 8.0、ロット番号PL0747
緩衝液C:  20 mM Tris/HCl中の1.5 M NaCl、pH 8.0、ロット番号PL0748
方法
2007527891.tif 000122
検出：  280 nm, 260 nm, 220 nm
pH
伝導度
分画:   1 ml画分
【０７３３】
14.4.3  結果
14.4.3.1  実施例14によるサンプル
サンプル組成物:  25 mM リン酸ナトリウム、0.13 M NaClおよび0.3 mM EDTA、pH 7.5 ± 0.2中のEP2001 1 mg (rhIFN-a2b)
開始容積:  0.5 ml、緩衝液 A = 5 ml中1:10に希釈
流水式／洗浄  9.3 ml
実施日:  2004-09-29
実施番号:  QS24 D39 (実施例14.4.4.1についての表を参照のこと）
【０７３４】
14.4.3.2  実施例14.3.2によるサンプル(エントリーA)
サンプル組成物:  0.1 M 酢酸ナトリウム, 20 mM シアノ水素化ホウ素ナトリウム, pH 5.0中のEP2001 2.5 mg＋アルデヒドHES10/0.4 97.5 mg (NZA256)
開始容積:  2.5 ml、緩衝液 A = 25 mlにて1:10に希釈
流水式／洗浄:  44 ml
実施日:  2004-09-29
実施番号:  QS25 D56 (実施例14.4.4.1についての表を参照のこと)
【０７３５】
14.4.3.3  実施例14.3.2によるサンプル(エントリーB)
サンプル組成物:  0.1 M 酢酸ナトリウム, 20 mM シアノ水素化ホウ素ナトリウム, pH 5.0中のEP2001 2.5 mg＋アルデヒドHES10/0.7 97.5 mg (NZA235A)
開始容積:  2.5 ml、緩衝液A = 25 mlにて1:10に希釈
流水式／洗浄:  41 ml
実施日:  2004-09-30
実施番号:  QS26 D57 (実施例14.4.4.1についての表を参照のこと)
【０７３６】
14.4.3.4  実施例14.3.2によるサンプル(エントリーC)
サンプル組成物:  0.1 M 酢酸ナトリウム, 20 mM シアノ水素化ホウ素ナトリウム, pH 5.0中のEP2001 2.5 mg＋アルデヒドHES30/0.4 292 mg (NZA328)
開始容積:  2.5 ml、緩衝液A = 25 mlにて1:10に希釈
流水式／洗浄:  42 ml
実施日:  2004-09-30
実施番号:  QS27 D58 (実施例14.4.4.1についての表を参照のこと)
【０７３７】
14.4.3.5  実施例14.3.2によるサンプル (エントリーD)
サンプル組成物:  0.1 M 酢酸ナトリウム, 20 mM シアノ水素化ホウ素ナトリウム, pH 5.0中のEP2001 2.5 mg＋アルデヒドHES30/0.7 292 mg (NZA329)
開始容積:  2.5 ml、緩衝液A = 25 mlにて1:10に希釈
流水式／洗浄:  40 ml
実施日:  2004-09-30
実施番号:  QS28 D59 (実施例14.4.4.1についての表を参照のこと)
【０７３８】
14.4.3.6  実施例14.3.2によるサンプル (エントリーE)
サンプル組成物:  0.1 M 酢酸ナトリウム, 20 mM シアノ水素化ホウ素ナトリウム, pH 5.0中のEP2001 2.5 mg＋アルデヒドHES50/0.4 487 mg (NZA303)
開始容積:  2.7 ml、緩衝液A = 27 mlにて1:10に希釈
流水式／洗浄:  50 ml
実施日:  2004-09-30
実施番号:  QS29 D60 (実施例14.4.4.1についての表を参照のこと)
【０７３９】
14.4.3.7  実施例14.3.2によるサンプル (エントリーF)
サンプル組成物:  0.1 M 酢酸ナトリウム, 20 mM シアノ水素化ホウ素ナトリウム, pH 5.0中のEP2001 2.5 mg＋アルデヒドHES50/0.7 487 mg (NZA309)
開始容積:  2.6 ml、緩衝液A = 26 mlにて1:10に希釈
流水式／洗浄:  50 ml
実施日:  2004-09-30
実施番号:  QS30 D61 (実施例14.4.4.1についての表を参照のこと)
【０７４０】
14.4.3.8  実施例14.3.2によるサンプル (エントリーG)
サンプル組成物:  0.1 M 酢酸ナトリウム, 20 mM シアノ水素化ホウ素ナトリウム, pH 5.0中のEP2001 1.7 mg＋HES10/0.4 98 mg (Supramol Lot. 407B)
開始容積:  2.5 ml、緩衝液A = 25 mlにて1:10に希釈
流水式／洗浄:  42 ml
実施日:  2004-10-01
実施番号:  QS31 D62 (実施例14.4.4.1についての表を参照のこと)
【０７４１】
14.4.4  結果の比較
14.4.4.1  IFN-アルファ溶出ピークのSDS-PAGE分析
実施例14.4.4.1についての表:  ピーク領域の比較は、HES化（HESylated）IFN-αのQ-セファロースクロマトグラフィー中280 nmにて検出した。
2007527891.tif 000123
＊定量分析のデータはRP-HPLC-3に由来した。
【０７４２】
実施例15  IFNアルファ抗ウイルス活性バイオアッセイの記載
試験手順の記載: インターフェロン-アルファの抗ウイルス活性
試験物質を細胞培地にて前希釈した後、連続２倍希釈物を調製した。９６ウェルマイクロタイタープレートにて、希釈インターフェロン−希釈ごとに４倍複製−を新たなトリプシン処理MDBK細胞 (ウェルあたり40.000細胞)に加えた。アッセイを３７℃にて２４時間インキュベーションした（ウェルあたり全容積: 150μL (実施例15.1)または175μl (実施例15.2, 15.3, 15.4, 15.5, 16.2, 16.3))。
【０７４３】
続いて、希釈VSV 原液50μLを各ウェルに加え(陽性対照ウェルを除く)、0.1の多重度0.1の感染の多重度を生じた。
【０７４４】
次の対照が各アッセイに含まれた: インターフェロンの代わりに細胞培地を加えたウイルスを用いた１２ウェル（陰性対照）、およびインターフェロンとウイルスの代わりに細胞培地を用いた１２ウェル（陽性対照）。
アッセイは37℃にて４２時間インキュベーションした。
【０７４５】
インキュベーション期間の終わりに、各ウェルの細胞培養上清をMTTの溶液50 mL（細胞培地中少なくとも2 mg/mL）で置き換えた。細胞を３時間インキュベーションした。細胞増殖により形成される紫色のホルマザン色素を、イソプロパノール/HClの100 mL溶液（40 mM HClを含むイソプロパノール）を各ウェルに加えることにより可溶化した。続いて、溶液の吸光度の値はマイクロタイタープレートリーダー中570/630 nmにて測定した。
【０７４６】
インターフェロンおよびVSVの存在下、増殖したMDBK細胞の増殖活性を次のようなインターフェロンの各希釈物について計算した：
((４つのインターフェロン処理ウェルの平均吸光度)−(陰性対照の平均吸光度))＊100／(陽性対照の平均吸光度)−(陰性対照の平均吸光度)
【０７４７】
インターフェロン-アルファの抗ウイルス活性を、各試験物質についての４つの別々のアッセイにて測定した。
【０７４８】
実施例15.1  NIH標準と比較したIntron（登録商標）Aの抗ウイルス活性
すべての実験において、NIH-標準rhIFN-アルファ 2a (NIAID, NIH, Bethesda, USA, Gxa01-901-535) に対して測定したIntron（登録商標）A（IFN-アルファ 2b, Schering-Plough）を内部標準（internal lab reference）として用いた。NIH-標準は9,000 IU/mlの特異的活性を有した。内部標準Intron（登録商標）Aは実施例15に記載の試験にて8,487,000 IU/mlの特異的活性を有した。
NIH標準rhIFN-アルファ2aと比較したIntron（登録商標）Aの増殖活性をFig. 33に示す。
【０７４９】
実施例15.2  非修飾出発材料と比較したモックインキュベーション（mock incubated）IFN-α-HESの抗ウイルス活性
実施例14.3.4に記載のように、モックインキュベーションIFN-アルファ-HES (実施例14.3.2に記載, エントリーG)を反応対照として用いた。物質の抗ウイルス活性を非修飾出発材料と比較して、カップリングおよび精製工程の生物活性への影響を調べた。モックインキュベーションは、IFN-アルファのインビトロ生物活性に影響しなかった。
【０７５０】
非修飾IFN-アルファ出発材料と比較したモックインキュベーションIFN-アルファ-HESの相対インビトロ活性をFig. 34に示す。
【０７５１】
実施例15.3  Intron（登録商標）Aと比較したIFN-アルファ-HESコンジュゲートの抗ウイルス活性
実施例15に記載のアッセイ系にて、コンジュゲート (実施例14.4により精製した実施例14.3.2からのエントリーA, B, C, D, E) を、非修飾IFN-アルファ出発材料、Intron（登録商標）AおよびPegasys (Roche)と比較して試験した。物質のCPE50濃度を算出した。すべてのIFN-アルファ-HESコンジュゲートは、Pegasysのものよりも実質的に高い抗ウイルス活性を保持した。
【０７５２】
非修飾IFN-アルファ出発材料、Intron（登録商標）AおよびPegasysと比較したIFN-アルファ-HESコンジュゲートの相対インビトロ活性をFig. 35に示す。
【０７５３】
実施例15.4  Intron（登録商標）Aと比較したIFN-アルファ-HESコンジュゲートの抗ウイルス活性
実施例15に記載のアッセイ系にて、実施例14.4により精製した実施例14.3.4のIFN-アルファ-HESコンジュゲートをIntron（登録商標）Aと比較して試験した。物質のCPE50濃度を算出した。IFN-アルファ-HESコンジュゲートをIntron（登録商標）Aと比較して約25%の高抗ウイルス活性を保持した。
【０７５４】
Intron（登録商標）Aと比較したIFN-アルファ-HESコンジュゲートの相対インビトロ活性をFig. 36に示す。
【０７５５】
実施例15.5  Intron（登録商標）Aと比較したIFN-アルファ-HESコンジュゲートの抗ウイルス活性
実施例15に記載のアッセイ系にて、実施例14.4により精製した実施例14.3.3のIFN-アルファ-HESコンジュゲートをIntron（登録商標）AおよびPegIntron（登録商標）と比較して試験した。物質のCPE50濃度を算出した。IFN-アルファ-HESコンジュゲートはIntron（登録商標）Aと比較して約25%の抗ウイルス活性を保持し、これはPegIntronのインビトロ活性と同レベルである。
【０７５６】
Intron（登録商標）Aと比較したIFN-アルファ-HESコンジュゲートの相対インビトロ活性をfigure 37に示す。
【０７５７】
実施例16  IFN-アルファ-HESコンジュゲートのインビボ生物活性(マウスのPK検討)
実施例16.1  マウス血清の実施例9に記載のアッセイ系への影響
インターフェロン-アルファの希釈を細胞培地 (対照)およびマウス血清 (1:40希釈および1:80希釈)にて調製した。アッセイを実施例15に記載のように行った。
【０７５８】
インターフェロン-アルファの抗ウイルス活性を、対照、1:40希釈のマウス血清ならびに1:80希釈のマウス血清について、二つの別々のアッセイにて測定した。1:40希釈および1:80におけるマウス血清はインターフェロン-アルファの抗ウイルス活性についてのバイオアッセイに影響しないことを結果は示した。
【０７５９】
実施例16.2  マウス(I)におけるインビボ検討
プールした血清の抗ウイルス活性を抗ウイルスアッセイにて試験した。二匹のマウス（雌BALB/cマウス、8週齢）から各時点、30μg/kg（タンパク質含有量に基づく）のIFN-アルファまたはIFN-アルファ-HESコンジュゲートの静脈注射後、２時間、４時間、１２時間および２４時間にて血清を集め、犠牲にした。
【０７６０】
血清サンプルを解凍し、ボルテックスすることにより徹底的に均一化し（、希釈し）た。連続２倍希釈物を細胞培地にて調製した。Intron（登録商標）Aのバイアル（希釈）を解凍し、ボルテックスすることにより徹底的に均一化した。連続２倍希釈物を細胞培地にて調製した。
【０７６１】
CPE-アッセイにてEC50-希釈物を実施例15に記載の1:2連続希釈物の用量応答曲線から測定した。
【０７６２】
物質の半減期を非修飾出発材料およびPegasysと比較して測定した。半減期を注射後の時間に対するEC50-希釈物の半対数プロットから計算した (Fig. 25を参照のこと)。
【０７６３】
抗ウイルス活性を(i) IFN-アルファ-HES (実施例14.3.2, 表のエントリーB)、(ii) IFN-アルファ-HES (実施例14.3.2, 表のエントリーD)、(iii) IFN-アルファ-HES (実施例14.3.4)について２４時間まで検出した。Fig. 38に見ることができるように、半減期は(i) (約3 h)から、(ii) (約5 h)にかけて (iii) (約7 h)まで増大した。
【０７６４】
非修飾IFN-アルファについて、血清の抗ウイルス活性はあまりに低すぎて血清半減期を計算できなかった。文献（K.R. Reddy et al. Advanced Drug Delivery Reviews 54 (2002) 571-586）にて、２時間のラットにおけるIFN-アルファ (静脈注射) の血清半減期を測定した。
【０７６５】
実施例16.3  マウス(II)におけるインビボ検討
プールした血清の抗ウイルス活性を抗ウイルスアッセイにて試験した。二匹のマウス（雌BALB/cマウス、8週齢）から各時点、30μg/kg（タンパク質含有量に基づく）のIFN-アルファまたはIFN-アルファ-HESコンジュゲートの静脈注射後、２時間、４時間、１２時間および２４時間にて血清を集め、犠牲にした。
【０７６６】
血清サンプルを解凍し、ボルテックスすることにより徹底的に均一化し（、希釈し）た。連続２倍希釈物を細胞培地にて調製した。Intron（登録商標）Aのバイアル（希釈）を解凍し、ボルテックスすることにより徹底的に均一化した。連続２倍希釈物を細胞培地にて調製した。
【０７６７】
CPE-アッセイにてEC50-希釈物を実施例15に記載の1:2連続希釈物の用量応答曲線から測定した。
【０７６８】
物質の半減期を非修飾出発材料およびPegasysと比較して測定した。半減期を注射後の時間に対するEC50-希釈物の半対数プロットから計算した。
【０７６９】
抗ウイルス活性を(i) PegIntron、(ii) IFN-アルファ-HES (実施例14.3.3.1)および(iii) IFN-アルファ-HES (実施例14.3.3.2)について２４時間まで検出した。Fig. 39に見ることができるように、半減期は(i) (約3.6 h)から、(ii)および(iii) (約6.5 hおよび6.8 h)まで増大した。
【０７７０】
実施例17  IFN-アルファ-HESコンジュゲートのインビボ生物活性(ウサギにおけるPK検討)
実施例17.1  IFN-アルファおよびIFN-アルファ-HESコンジュゲートの放射性標識
PK検討に用いたサンプルをクロラミンT法により125Iで標識した。クロラミンTをヨウ素と反応させ、ハロゲン間種 (I-Cl)を形成させる。ハロゲン間反応は、チロシンの芳香環上にて反応し、o-位にて置換する。
【０７７１】
実施例17.2  参照実験: 125Iによるオキソ-HES 50/0.4の標識
与えられた反応条件下の第一実験シリーズにて、微量のヨウ素が、例えばHESとの錯体を形成するヨウ素、ポリヨウ素またはポリヨウ化物により検出することができるかどうかを調査した。相対的に、オキソ-HES (Mw 42.1 kD, DS = 0.41)およびIFN-アルファ-HES (実施例14.3.2, 表のエントリーE)を同条件下、精製工程の後に標識し、サンプルの放射能を測定した。文献によれば、らせん構造が少なくとも１１のアンヒドログルコース単位を有するときに、アミロペクチンはヨウ素、ポリヨウ素またはポリヨウ化物と錯体を形成することができる。
【０７７２】
IFN-アルファ-HESサンプルにのみ、放射能が検出された。潜在的に物理的に結合したヨウ素によらないで、IFN-アルファのチロシン残基の共有結合修飾によって、放射能が排他的に生じ、これは精製工程において除去されなかったことをこの結果は示した。オキソ-HES 50/0.4 (Mw 42.1 kD, DS = 0.41) は陰性対照としてみなすことができる。このオキソ-HES種における高分子量および置換の低密度により、いずれも存在する場合、最も長いらせん構造が期待され、従ってこの場合、ヨウ素の錯体化の最も高い危険性があるだろう。
【０７７３】
実施例17.3  インターフェロン-アルファの非放射性ヨウ素による標識（「冷ヨウ素化」）
インターフェロンアルファを、IFN-アルファ-HES-コンジュゲートと同一の標識および精製工程にて、非放射性ヨウ素で標識した。抗ウイルスアッセイにて、抗ウイルス活性を保持した。しかし、標識および精製工程にて濃度が変化し、入手できる少量の物質により測定することができなかったため、定量を行わなかった。
【０７７４】
実施例17.4  IFN-アルファ-HESコンジュゲートの放射性標識
サンプルを実施例17.1に従い、放射性125Iで標識した。サンプルは、IFN-アルファ出発材料、IFN-アルファ-HES (実施例14.3.2, 表のエントリーD)であった。サンプルは、38μCi/μg (IFN-アルファ出発材料)、41μCi/μg (IFN-アルファ-HES 30/0.7)の特異的活性を有した。
【０７７５】
実施例17.5  ラビットにおけるインビボPK検討
実施例17.5.1  実験手順
試験物質を希釈物として用いた。4μCi/mlの溶液を調製した。希釈緩衝液はPBSであった。
【０７７６】
４匹のニュージーランド白ウサギHsdIf:NZW. Source Harlan Winkelmann GmbH, D-33178 Borchen, 性別: 雌; 検討開始時の体重: ＞2.5 kg. すべての動物に放射性標識された試験物質を静脈内で1 ml/体重kgの容積にて適用し、これは4μCi/体重kgの投与量と同等である。定義の時点にて血液サンプルを採取した。各サンプリング点にて、動物の耳介静脈から約600μlの血液をさらなる調査のために採取した。
【０７７７】
血液サンプリングのために、静脈内に内在するカテーテルを、一般的な麻酔 (ケタミン/Rompun) 下、耳介静脈に置いた。適用前の血液サンプリング点、適用時点、および適用後最初の三つの血液サンプリング (0.5時間, 1時間および2時間)について麻酔を休んだ。動物自体により切除されるまでのさらなるサンプリング点のために動物の中にカテーテルを置いた。耳介静脈の異なる領域を通したカニューレでさらなる血液サンプリングを測定した。
【０７７８】
血液サンプルのさらなる工程を血液サンプリングの後行った。血液中の放射性標識試験物質を測定するために、集めた血液サンプルを特異的可溶化プロトコールにより処理した。この血液サンプル250μlを新たなバイアルに移し、等容積のSolvable（登録商標）を加えた。サンプルを振盪した水浴中、５０℃にて１時間インキュベーションした。インキュベーション時間後、サンプルを室温まで冷却し、EDTA溶液 [100 mM] 100μlを加えた。続けてH2O2 [30 %] 300μlを加え、再び振盪後、サンプルを振盪した水浴中、５０℃にて１時間インキュベーションした。さらなる工程の前にサンプルを集めた。
【０７７９】
血液収集および可溶化の終わりに、サンプルを20 mlシンチレーションバイアルに移し、シンチレーションカクテルUltima GoldTM 10 mlを加えた。シンチレーションカウンター (カクテル添加後約72時間)中、同位元素125Iの測定まで、サンプルを暗所２〜８℃にて保存した。
【０７８０】
プロセシングおよびデータの統計的分析の前に、特異的実験条件下、活性検出のクエンチを測定した。回帰係数 (r2 = 0.9970) は線へのフィットの測定である。クエンチ因子[pCi/cpm] は3.315938であると分かった。
【０７８１】
結果 (Fig. 40を参照のこと):
IFN-アルファ-HESは、出発材料に対して半減期の明確な延長を示した。24時間 (約＜1000 pCi/ml) を超えて、非修飾物質の曲線は水平となり、ほとんど活性が軽減しないことが観察された。すべてのサンプルについての測定された放射能の小さな標準偏差は実験の質を示す。
【０７８２】
半減期は血液サンプル中のIFN-アルファの濃度から算出した。Fig. 41に示される評価について、4および24時間の間に取られる血液サンプルからのデータのみを考慮した。非修飾物質について、7時間の半減期を算出した。IFN-アルファ-HESにより、半減期の実質的な増大が観察された（約33時間）。
【０７８３】
Fig. 42 aおよびb (カットアウト 0-12時間)におけるダイアグラムに示されるように、異なるコンパートメントモデルにより統計的にデータを評価した。一つのコンパートメントモデルにて、IFN-アルファの濃度は注射後最初の２時間に急速に落ちることは明らかである。IFN-アルファ-HESについて、半減期は明らかに延長される。統計的に算出された半減期は、IFN-アルファについて0.26時間、IFN-アルファ-HESについて7.7時間であった。非コンパートメントモデルにより、統計的な評価は非修飾IFN-アルファについて147時間の半減期(24-120時間のデータに基づく)、IFN-アルファ-HESについて42.7時間の半減期 (36-120時間のデータに基づく)を生じる。上記のように、曲線が24時間を超えて水平となるため、非修飾IFN-アルファの半減期は実質的に延長する。
【０７８４】
二つのサンプルの半減期は次の表に概略され、算出について記載されたモデルに基づく。
【０７８５】
実施例17.5.1の表：
【表１７】
2007527891.tif 000124
＊評価データ24-120 h, ＊＊評価データ36-120 h
【０７８６】
実施例18.1  アミノ官能基化ヒドロキシエチルデンプンの合成
オキソ-HES (Mw = 41,000 D, DS = 0.76) をDE 196 28 705 A1に従い、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Dにより調製した。
オキソ-HES 0.51 g (19.15μmol)の乾燥ジメチルスルホキシド 2 ml (DMSO, Acros Organics BVBA, Geel, B) 溶液に、窒素雰囲気下、1,4-ジアミノブタン200μl (19.9 mmol) (Acros Organics BVBA, Geel, B)を滴加し、混合物を７０℃にて２４時間撹拌した。反応混合物を冷アセトン20 ml (0℃)に加えた。得られた沈殿物をろ過により分離し、アセトン40 mlで洗浄し、水20 mlに再溶解させた。溶液を水に対して１日間透析 (Snake-Skin透析チューブ, 4-6 kDカットオフ, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D)し、凍結乾燥した。収率は80 % (0.41 g) アミノ-HESであった。
【０７８７】
生成物の精製はAKTAエクスプローラー系 (Amersham Biosciences)を用いたHiPrep 26/10脱塩カラム (100 mm, Amersham Biosciences)に適用により達成した。それゆえHiPrep 26/10脱塩カラムは0.1 M NaCl溶液(10 ml/分)で平衡化させ、0.1 M NaCl中のアミノ-HES (5 mg/ml, 注射容積10 ml)を適用した。プールしたアミノ-HES画分を水で平衡化したHiPrep 26/10脱塩カラムに適用した (注射容積10 ml)。プールしたHES画分を同条件におけるカラムに適用した。純粋な生成物を凍結乾燥し、アミン量を2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸 (TNBSA (Pierce), Instructions TNBSA生成物番号28997)で誘導体化し、算出のためのBoc-Lys-OHで測定した。アミン量は34.02 nmol/mg (92 %)であることが分かった。
【０７８８】
実施例18.2  ヨードアセチル官能基化ヒドロキシエチルデンプンの合成
アミノ官能基化ヒドロキシエチルデンプン 101.9 mg (実施例18.1として調製したアミノ-HESμmol)の0.1 M Na2CO3 5 ml 溶液(pH = 8.3)に、ヨード酢酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル 12.63 mg (44.65μmol, Sigma, Taufkirchen, Germany)を加えた。混合物を暗所室温にて窒素雰囲気下１５時間撹拌した。水15 mlを水溶液に加え、生成物の精製をHiPrep 26/10脱塩カラム (Amersham Biosciences)への適用により達成した。それゆえHiPrep 26/10脱塩 (100 mm) カラムを0.1 M NaCl溶液 (10 ml/分)で平衡化し、ヨードアセチル官能基化ヒドロキシエチルデンプンを適用した (注射容積10 ml)。プールしたヨードアセチル-HES画分を水で平衡化したHiPrep 26/10脱塩カラムに適用し、プールした画分を同条件におけるカラムに再適用した。純粋な生成物を凍結乾燥し、ヨードアセチル量を上記のように、2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸でのアミン定量により間接的に測定した。アミン量は32.37 nmol/mgからのヨードアセチル量に対して1.65 nmol/mgであることが分かった (95 %)。
【０７８９】
実施例18.3  実施例18.1のアミノHESからのマレイミドHESの合成
〜29 nmolmg-1の算出されたアミノ含有量のアミノHES 25 mg (実施例18.1に記載のように調製)を反応緩衝液 (0.1M リン酸ナトリウム, 150 mM NaCl, 5.0 M EDTA, pH 7.0) 450μlに溶解した。別々にN-[a-マレイミドアセトキシ]スクシンイミドエステル (AMAS, Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) 9 mgを乾燥DMSO (Acros Organics BVBA, Geel, B) 200μlに溶解した。二つの溶液を一緒にプールした。
【０７９０】
最終溶液を22℃にて１００分間撹拌し、さらに40℃にて２２分間撹拌した。次いで得られた溶液を5 mlまで希釈し、非反応性AMAS, NHSおよびDMSOを除去するためにAKTAエクスプローラー系(Amersham Biosciences)を用いた脱塩カラムに適用した。
【０７９１】
それゆえ、HiPrep 26/10脱塩カラム (100 mm, Amersham Biosciences)を反応緩衝液 (0.1 M リン酸ナトリウム, 150 mM 塩化ナトリウム, 5 mM EDTA, pH 7.0)で平衡化し、マレイミド-HES溶液を注射し (注射容積5 ml)、分画した。精製パラメータを次のように選択した:
カラム：                            HiPrep 26/10脱塩
流速：                              10 ml/分
溶出液：                            0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液、
150 mM 塩化ナトリウム、
5 mM EDTA、
pH = 7.0
サンプル容積：                      5.0 ml
溶出分画：                          2.5 ml
平衡：                              0.5カラム容積
溶出長：                            2.0カラム容積
【０７９２】
プールしたHES画分7 mlを、最終溶液中AMAS, NHSおよびDMSOが存在しないことを確認するために同条件下にて再注射した。第二精製により、アルファ1ATとのカップリングに使用できる純粋なマレイミドHES10 mlを得る。
その後、溶出したポリマーを濃縮し、同じ緩衝液中250μlの最終容積とした。
【０７９３】
実施例18.4a  アルファ1ATのDL-ジチオスレイトール (DTT)による還元
アルファ1AT溶液(0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液0.5 ml中c (アルファ1AT) = 5.0 mg, 150 mM 塩化ナトリウム, pH 7.2, アルファ1AT= rh アルファ1AT GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MAにより提供, ロット番号080604A)に、反応緩衝液 (0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液, 150 mM 塩化ナトリウム, 5 mM EDTA, pH = 7.0) 4 mlおよびDTT (Sigma Taufkirchen, Germany) 68.77 mgを加えた。混合物を２０℃にて２時間インキュベーションし、還元タンパク質をAKTAエクスプローラー系 (Amersham Biosciences)を用いたサイズ排除クロマトグラフィー (SEC)により精製した。それゆえ、HiPrep 26/10脱塩カラム (100 mm, Amersham Biosciences) を0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液, 150 mM 塩化ナトリウム, 5 mM EDTA, pH = 7.0溶液で平衡化し、還元タンパク質の溶液を適用し(注射容積4.5 ml)、分画した。精製パラメータを以下の概略から選択した:
カラム：                            HiPrep 26/10脱塩
流速：                              10 ml/分
溶出液：                            0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液、
150 mM 塩化ナトリウム、
5 mM EDTA、
pH = 7.0
サンプル容積：                      4.5 ml
溶出液分画：                        2.5 ml
平衡：                              0.5カラム容積
溶出長：                            2.0カラム容積
【０７９４】
プールしたタンパク質画分8 mlを同条件下、タンパク質溶液中にDTTが存在しないことを確認して再注射した。第二精製により、約0.5 mg/mlの濃度で純粋な還元α1AT溶液10 mlを得、実施例18.5に記載のマレイミドHESとのカップリングに用いた。
【０７９５】
実施例18.4b  固定化塩酸トリス-(2-カルボキシエチル)-ホスフィン(TCEP)によるα1ATの前処理およびチオール含有タンパク質の単離
アルファ1AT (GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, ロット番号080604A) を潜在的なジスルフィド結合を還元するために固定化TCEP (Pierce 77712, タンパク質mgあたり2 mlゲルスラリー)で新たに処理した。固体化TCEPを、緩衝液 pH= 7.0 (100 mM リン酸ナトリウム, 150 mM 塩化ナトリウムおよび5 mM EDTA,)を用いた製造により記載されるように調製した。還元は製造業者の指示に従い行った。
【０７９６】
還元タンパク質を、チオール含有タンパク質と共有結合するためにチオール活性化セファロース (Amersham Biosciences  71-7106-00; タンパク質mgあたり0.15 gゲル)でインキュベーションした。未結合タンパク質をタンパク質が溶離液中に検出できなくなるまで、100 mM リン酸ナトリウム, 150 mM 塩化ナトリウムおよび5 mM EDTAを含む緩衝液, pH= 7で洗浄した。タンパク質検出について、BCA-アッセイを用いた (Pierce)。カラムに結合したタンパク質を放出し、20 mM TCEPを含む緩衝液 pH= 7.0 (100 mM リン酸ナトリウム, 150 mM 塩化ナトリウムおよび5 mM EDTA)を用いて溶出した。
【０７９７】
実施例18.5  システインカップリングにより実施例18.3のマレイミドHESからのHES-アルファ1AT コンジュゲートの精製
反応緩衝液 250μl (0.1 M リン酸ナトリウム, 150 mM NaCl, pH 7.0)に溶解したマレイミドHES 725 nmol (実施例18.3に記載のように調製)を、同緩衝液中0.5 mgml-1 アルファ1AT溶液 1540μlに加えた。タンパク質を実施例T8/4aに記載のようにDTTで前インキュベーションした。反応物を２２℃にて１８時間撹拌した後、液体窒素条件下の凍結により停止させ、−８０℃にて保存した。反応混合物をゲル電気泳動により分析した (Fig. 43を参照のこと)。
【０７９８】
実施例18.6  システインカップリングによる実施例18.2のヨードアセトアミドHESからのHES-α1AT コンジュゲートの精製
〜16 nmolmg-1の算出ヨウ素含有量のヨードアセトアミドHES 96 mg (実施例18.2に記載のように調製) を反応緩衝液 1.0 ml (1.0 M炭酸ナトリウム, 2.0 mM EDTA, pH 8.3)および蒸留水2.5 mlに溶解した。0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液, 150 mM NaCl (pH 7.0)中の3 mgml-1 アルファ1AT (実施例18.4bに記載のように前処理)溶液 500μlをポリマー溶液と混合し、最後にTCEP 7.2 mg (Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)を含む500μl溶液を加えて最終濃度5 mMの還元剤を得た。反応を暗所室温にて１８時間撹拌しながら進行させた。その後、液体窒素条件下凍結することにより停止させ、−８０℃にて保存した。
【０７９９】
実施例18.7  システインカップリングによる実施例18.2のヨードアセトアミドHESから調製されたHES-アルファ1AT コンジュゲートの精製
サンプル調製: 溶離液として20 mM リン酸ナトリウム, 20 mM 塩化ナトリウム, pH 8を用いたAKTA-エクスプローラークロマトグラフィー系と組み合わせたHiPrep 26/10脱塩カラム (Amersham biosciences)における緩衝液交換
緩衝液交換は、次のパラメータを用いた粗製反応混合物(実施例T8/6に記載のように調製, 約4 ml)により行った:
カラム：                              HiPrep 26/10脱塩
流速：                                10 ml/分
溶出液：                              20 mM リン酸ナトリウム、
20 mM 塩化ナトリウム、
pH 8
サンプル容積：                        10 ml
溶出液分画：                          2.5 ml
平衡：                                5カラム容積
溶出長：                              2カラム容積
【０８００】
6〜16 mlの画分をプールした。次のパラメータを用いたIECにより過剰のHES誘導体を排除した:
カラム：                              HiTrap Q HP 1 ml
流速：                                1 ml/分
結合緩衝液 (BB)：                     20 mM リン酸ナトリウム、
20 mM 塩化ナトリウム、
pH 8
溶出緩衝液 (EB)：                     20 mM リン酸ナトリウム、
1 M 塩化ナトリウム、
pH 8
次の容積の空の環：                    12 ml
フローボウル分画：                    2 ml
溶出液分画：                          1 ml
開始濃度EB：                          0 %
平衡：                                5カラム容積
非結合サンプル洗浄：                  15 ml
標的濃度EB：                          15 %
勾配長：                              50 ml
【０８０１】
43〜73 mlの画分を集め、超遠心分離により最終容積10 mlに濃縮した。上記のように脱塩後(サンプル容積10 ml, 最初の14 mlを含む画分を集めた)、未結合タンパク質からのコンジュゲートの分離のための第二IECを、次のパラメータを用いて行った:
カラム：                              HiTrap Q HP 1 ml
流速：                                1 ml/分
結合緩衝液 (BB)：                     20 mM リン酸ナトリウム、
20 mM 塩化ナトリウム、
pH 8
溶出緩衝液 (EB)：                     20 mM リン酸ナトリウム、
1 M 塩化ナトリウム、
pH 8
次の容積の空の環：                    15 ml
フローボウル分画：                    2 ml
溶出液分画：                          1 ml
開始濃度EB：                          0 %
平衡：                                1カラム容積
非結合サンプル洗浄：                  2 ml
勾配：                                5-15 %
勾配長：                              100 ml
【０８０２】
次の画分を集め、SDS-Pageにより分析した (Fig. 44を参照のこと)：
A: 26〜32 ml
B: 37〜45 ml
C: 55〜65 m
【図面の簡単な説明】
【０８０３】
【図１】実施例1.2に従って製造したHES-IFNベータコンジュゲートのSDSpage分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。12％Bis-Trisゲルを、還元条件のMOPS SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。レーンA：タンパク質マーカーSeeBlue（登録商標）Plus2（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。レーンB：酸化型IFNベータと実施例1.1(a)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンC：酸化型IFNベータと実施例1.1(b)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンD：酸化型IFNベータと実施例1.1(c)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンE：酸化型IFNベータと実施例1.1(d)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンF：酸化型IFNベータと実施例1.1(e)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンG：酸化型IFNベータと実施例1.1(f)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンH：酸化型IFNベータと実施例1.1(g)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンI：酸化型IFNベータと実施例1.1(h)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンJ：酸化型IFNベータと実施例1.1(i)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンK：実施例1.2(a)と同様に製造した酸化型IFNベータ。
【０８０４】
【図２】実施例1.4に従って製造したHES-IFNベータコンジュゲートのSDSpage分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。12％Bis-Trisゲルを、還元条件のMOPS SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。体積が15μLを超える試料は、減圧下でこの体積まで濃縮した。レーンA：タンパク質マーカーSeeBlue（登録商標）Plus2（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。レーンH：IFN-ベータと実施例1.3(a)で述べたように合成したアルデヒド-HESとのコンジュゲーション。レーンI：IFNベータと実施例1.3(b)で述べたように合成したアルデヒド-HESとのコンジュゲーション。レーンJ：対照：アルデヒド-HESなしで水素化ホウ素ナトリウムで処理したIFN-ベータ。
【０８０５】
【図３】実施例2.2に従って製造したHES-IFNアルファコンジュゲートのSDSpage分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。12％Bis-Trisゲルを、還元条件のMOPS SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。体積が15μlを超える試料は、減圧下でこの体積まで濃縮した。レーンA：タンパク質マーカーSeeBlue（登録商標）Plus2（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。レーンE：IFN-アルファと実施例2.1(a)で述べたように合成したアルデヒド-HESとのコンジュゲーション。レーンF：IFN-アルファと実施例2.1(b)で述べたように合成したアルデヒド-HESとのコンジュゲーション。レーンG：対照：アルデヒド-HESなしで水素化ホウ素ナトリウムで処理した実施例2.2のIFN-アルファ。
【０８０６】
【図４】実施例3.2に従って製造したHES-AT IIIコンジュゲートのSDSpage分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。NuPage 3-8％ Tris-酢酸ゲルを、還元条件のTris-酢酸 SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。レーンA：タンパク質マーカーSeeBlue（登録商標）Plus2（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。レーンB：酸化型ATIIIと実施例3.1(a)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンC：酸化型ATIIIと実施例3.1(b)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンD：酸化型ATIIIと実施例3.1(c)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンE：酸化型ATIIIと実施例3.1(d)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンF：酸化型ATIIIと実施例3.1(e)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンG：酸化型ATIIIと実施例3.1(f)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンH：酸化型ATIIIと実施例3.1(g)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンI：酸化型ATIIIと実施例3.1(h)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンK：実施例3.2の酸化型ATIII GlycoThera。
【０８０７】
【図５】実施例3.4に従って製造したHES-AT IIIコンジュゲートのSDSpage分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。3-8％ Tris-酢酸ゲルを、還元条件のTris-酢酸 SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。レーンA：タンパク質マーカーSeeBlue（登録商標）Plus2（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。レーンB：AT IIIと実施例3.3(a)で述べたように合成したアルデヒド-HESとのコンジュゲーション。レーンC：AT IIIと実施例3.3(b)で述べたように合成したアルデヒド-HESとのコンジュゲーション.レーンD：対照：アルデヒド-HESなしで水素化ホウ素ナトリウムで処理した実施例3.3のAT III。
【０８０８】
【図６】実施例3.5に従ってグリセロールから精製したAT IIIに関するHPGPC（高速ゲル浸透クロマトグラフィー）クロマトグラムを表す図である（UVおよびMALLS検出器により一つのクロマトグラムを得る。x軸は時間/分を表す）。このHPGPC分析では以下のパラメータを使用した。カラム：Superose 12 HR 10/30 300×10mm I.D.（Pharmacia）溶離液：脱塩水1リットル中に27.38mM Na2HPO4；12.62mM NaH2PO4；0.2M NaCl；0.005％ NaN3流速：0.24ml/時間検出器1：MALLS検出器検出器2：UV（280nm）検出器3：RI（屈折率検出器）
【０８０９】
【図７】実施例3.5のAT IIIに関するHPGPC（高速ゲル浸透クロマトグラフィー）クロマトグラムを表す図である（上側のクロマトグラムはMALLS検出器。下側のクロマトグラムはUV検出器。x軸は時間/分を表す）。このHPGPC分析では以下のパラメータを使用した。カラム：Superose 12 HR 10/30 300×10mm I.D.（Pharmacia）溶離液：脱塩水1リットル中に27.38mM Na2HPO4；12.62mM NaH2PO4；0.2M NaCl；0.005％ NaN3流速：0.24ml/時間検出器1：MALLS検出器検出器2：UV（280nm）検出器3：RI（屈折率検出器）
【０８１０】
【図８】実施例4.2に従って製造したHES-GM-CSFコンジュゲートのSDSpage分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。12％Bis-Trisゲルを、還元条件のMOPS SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。レーンA：タンパク質マーカーSeeBlue（登録商標）Plus2（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。レーンB：酸化型GM-CSFと実施例4.1(a)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンC：酸化型GM-CSFと実施例4.1(b)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンD：酸化型GM-CSFと実施例4.1(c)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンE：酸化型GM-CSFと実施例4.1(d)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンF：酸化型GM-CSFと実施例4.1(e)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンG：酸化型GM-CSFと実施例4.1(f)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンH：酸化型GM-CSFと実施例4.1(g)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンI：酸化型GM-CSFと実施例4.1(g)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンJ：酸化型GM-CSFと実施例4.1(h)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンK：実施例4.2の酸化型GM-CSF。
【０８１１】
【図９】実施例4.4に従って製造したHES-GM-CSFコンジュゲートのSDSpage分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。12％Bis-Trisゲルを、還元条件のMOPS SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。体積が15μLを超える試料は、減圧下でこの体積まで濃縮した。レーンA：タンパク質マーカーSeeBlue（登録商標）Plus2（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：188KD、98KD、62KD、49KD、38KD、28KD、17KD、14KD、6KD、3KDレーンH：GM-CSFと実施例4.3(a)で述べたように合成したアルデヒド-HESとのコンジュゲーションレーンI：GM-CSFと実施例4.3(b)で述べたように合成したアルデヒド-HESとのコンジュゲーションレーンJ：対照：アルデヒドHESなしで水素化ホウ素ナトリウムで処理した実施例4.4のGM-CSF。
【０８１２】
【図１０】実施例5.2に従って製造したIFNベータコンジュゲートのSDSpage分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。12％Bis-Trisゲルを、還元条件のMOPS SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。レーンA：タンパク質マーカーSeeBlue（登録商標）Plus2（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。レーンB：酸化型IFNベータと実施例1.1(c)で述べるように製造したヒドロキシルアミノHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンC：酸化型IFNベータ。
【０８１３】
【図１１】RP-HPLC精製したHAS修飾IFN-β（CHO細胞）のSDS-PAGEゲルを表す図である。矢印は、おそらく末端シアル酸誘導体を欠く形態に起因する無修飾IFN-βの移動位置を示す。一方、HAS修飾IFN-βは35Kda〜120Kdaの分子量範囲にわたる幅広い拡散したクーマシー染色領域として検出された。
【０８１４】
【図１２】HAS修飾IFN-βから酵素的に放出されたN結合型オリゴ糖のHPAEC-PAD分析を表す図である。
【０８１５】
【図１３】HAS修飾IFN-βから調製された穏和な加水分解後のN結合型オリゴ糖のHPAEC-PAD分析を表す図である。
【０８１６】
【図１４Ａ】アンチトロンビンIIIのSDS-PAGE分析を表す図である：1＝無処理AT III；2＝過ヨウ素酸処理AT III；3＝HAS修飾AT III；各10μgを10％ポリアクリルアミドゲルに適用した。
【０８１７】
【図１４Ｂ】アンチトロンビンIIIのSDS-PAGE分析を表す図である：1＝無処理AT III；2＝過ヨウ素酸処理AT III；3＝HAS修飾AT IIII；各10μgを10％ポリアクリルアミドゲルに適用した。1＋、2＋および3＋は、ポリペプチドN-グリコシダーゼによる脱N-グリコシル化後のAT III試料を示す。
【０８１８】
【図１５】実施例8.6.b)に記載のポリペプチド-N-グリコシダーゼ処理後に得られたAT III試料のN結合型グリカンのHPAEC-PAD分析を表す図である。1＝無処理AT III由来のN-グリカン；2＝穏和な過ヨウ素酸処理に付したAT III由来のN-グリカン；3＝HAS修飾AT IIII由来のN-グリカン。A＝オリゴマンノシドグリカン（6〜9個のマンノース残基）を含む中性オリゴ糖の溶出領域。B＝モノシアルリル化N-グリカンの溶出領域；C＝ジシアリル化N-グリカンの溶出領域；D＝トリシアリル化N-グリカンの溶出領域。HAS修飾N-グリカンの溶出をトレース番号3に示す。
【０８１９】
【図１６】ポリペプチド-N-グリコシダーゼ処理（実施例8.6.b)）後のAT III試料から得られたジシアリル化N-グリカン（穏和な酸処理に付した実施例8.6.c)から得たもの）のHPAEC-PAD分析を表す図である。1＝無処理AT III由来のN-グリカン；2＝穏和な過ヨウ素酸処理に付したAT III由来のN-グリカン；3＝HAS修飾AT由来のN-グリカン。トレース番号1では、16分に溶出するピークがN-アセチルノイラミン酸に相当し、38分のピークがN-グリコリルノイラミン酸に相当する。19分の主要ピークは、近位a1-6結合フコースを持つ二側鎖型構造を表す。残りのピークはフコースを持たない二側鎖型構造、二側鎖型構造-1ガラクトース、および主として6〜9個のマンノース残基を持つオリゴマンノシド構造である。HAS修飾シアル酸誘導体の溶出位置をトレース番号3に示す。
【０８２０】
【図１７】HAS(10Kda)修飾GM-CSFのSDS-PAGE分析を表す図である。1＝RP-HPLC溶出液；2＝組換えヒトGM-CSF出発材料。括弧は、C＝O-グリコシル化だけの形態および非グリコシル化型、B＝1箇所のN-グリコシル化部位が占有されている形態のGM-CSF、A＝2箇所のN-グリコシル化部位が糖質で占有されている形態のGM-CSF、の移動位置を示す（Fornoら, 2004参照）。
【０８２１】
【図１８】HAS(10Kda)修飾(10KDa)GM-CSFのSDS-PAGE分析を表す図である。1＝RP-HPLC溶出液；2＝ポリペプチドN-グリコシダーゼによる消化後のRP-HPLC溶出液；3＝穏和な酸処理後のRP-HPLC溶出液。括弧は、おそらくO-グリカンに結合している過ヨウ素酸酸化されたシアル酸鎖残基でHAS修飾されているGM-CSFを示す。
【０８２２】
【図１９】GM-CSFから単離されたN-グリカンのHPAEC-PAD分析を表す図である。トレース1＝無処理タンパク質、トレース2＝穏和な過ヨウ素酸酸化に付したGM-CSF；RP-HPLCによる精製後のHAS(10Kda)修飾GM-CSF。矢印A〜Eは、アシアロ、モノ-、ジ-、トリ-およびテトラシアロオリゴ糖の溶出位置を示す。出発材料のオリゴ糖組成は文献Fornoら, 2004に記載されているものと基本的に同じだった。
【０８２３】
【図２０】実施例9.3による酸化型AT IIIとHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物の電気泳動ゲルを表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。NuPage 3-8％ Tris-酢酸ゲルを、還元条件のTris-酢酸 SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。ゲルは、Roti-Blue（Carl Roth GmbH & Co. KG，ドイツ・カールスルーエ）で、製造者の指示に従って染色した。レーンA：タンパク質マーカーRoti-Mark STANDARD（Carl Roth GmbH & Co. KG，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：200KD、119KD、66KD、43KD、29KD、20KD、14.3KD。レーンB：酸化型ATIIIと実施例9.1(a)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンC：酸化型ATIIIと実施例9.1(b)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンD：酸化型ATIIIと実施例9.1(c)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンE：酸化型ATIIIと実施例9.1(d)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンF：酸化型ATIIIと実施例9.1(e)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンG：酸化型ATIIIと実施例9.1(f)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンH：酸化型ATIIIと実施例9.1(g)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンK：反応対照。
【０８２４】
【図２１】実施例9.4に従って製造したATIIIコンジュゲートの電気泳動を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。NuPage 3-8％ Tris-酢酸ゲルを、還元条件のTris-酢酸 SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。ゲルは、Roti-Blue（Carl Roth GmbH & Co. KG，ドイツ・カールスルーエ）で、製造者の指示に従って染色した。レーンA：タンパク質マーカーRoti-Mark STANDARD（Carl Roth GmbH & Co. KG，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：200KD、119KD、66KD、43KD、29KD、20KD、14.3KD。レーンB：ATIIIと実施例9.2(b)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンC： ATIIIと実施例9.2(d)で述べるように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンD：反応対照レーンE：タンパク質マーカーRoti-Mark STANDARD。
【０８２５】
【図２２】実施例10.3に従って活性化アルドン酸を介して結合させたIFN-アルファ-HESのSECを表す図である。MALLSおよびUV検出により、この反応におけるIFN-アルファの高い変換度が証明された。
【０８２６】
【図２３】NIH標準IFN-アルファ2aと比較したIntron（登録商標）Aの活性を表す図である（実施例11.1参照）。
【０８２７】
【図２４】Intron（登録商標）A（左側）と比較したIFN-アルファ-HES（右側）の相対的インビトロ活性を表す図である。実施例11.2参照。
【０８２８】
【図２５】実施例12.2の結果を表す図である（三角形はIFN-アルファ出発材料を表し、四角形はHES修飾IFNアルファを表す。ウイルス感染に対するMDBK細胞の50％保護を達成するのに必要な血清試料の希釈度対マウスにおける30μg/kgのi.v.注射後の時間）。無修飾出発材料で処置したマウスの血清が持つ抗ウイルス効果は極めて低かった。HESによるIFN-アルファの修飾は、血清の抗ウイルス効果を実質的に延長する。
【０８２９】
【図２６】実施例13の結果を表す図である（実施例13.5で述べるように製造した粗製α1AT-HESコンジュゲートのゲル電気泳動による分析）。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびPower Pac 200電源（Bio-Rad，ドイツ・ミュンヘン）を使用した。3-8％ Tris-酢酸ゲルを、還元条件のTris-酢酸 SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。レーンA：未染色SDS Pageタンパク質マーカー6.5-200KDa（SERVA Elektrophoresis GmbH，ドイツ・ハイデルベルク）分子量マーカー（上から下に）：200KD、116KD、67KD、45KD、29KD、21KD、14.3KD、6.5KD；レーンB：実施例13.5に記載のアルデヒド-HESへのコンジュゲーション；レーンC：実施例13.6に記載のHESへのコンジュゲーション。
【０８３０】
【図２７】実施例13の結果を表す図である（イオン交換クロマトグラフィー後に収集した画分B1-C6の分析）（実施例13.7参照））。ゲル電気泳動の条件については図26参照。レーンA：未染色SDS Pageタンパク質マーカー6.5-200KDa（SERVA Elektrophoresis GmbH，ドイツ・ハイデルベルク）分子量マーカー（上から下に）：200KD、116KD、67KD、45KD、29KD、21KD、14.3KD、6.5KD；レーンB：画分B1レーンC：画分C1レーンD：画分C2レーンE：画分C3レーンF：画分C4レーンG：画分C5レーンH：画分C6レーンI：A1AT（GTC Biotherapeutics Inc.，マサチューセッツ州フレーミングハム，ロット番号080604A）。
【０８３１】
【図２８】Prolastin（登録商標）HS（Bayer Vital GmbH，ドイツ・レバークーゼン，ロット番号PR4HA43）、A1AT（GTC Biotherapeutics Inc.，マサチューセッツ州フレーミングハム，ロット番号080604A）および実施例13.5で述べるように合成したHES-A1ATコンジュゲートの濃度に対する残存酵素活性のプロットを表す図である。
【０８３２】
【図２９】実施例14.3.1のIFN-アルファ-HESコンジュゲートのゲル電気泳動による分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。10％Bis-Trisゲルを、還元条件のMOPS SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。レーンX：Roti（登録商標）-Mark STANDARD（Carl Roth GmbH & Co. KG，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：200KD、119KD、88KD、43KD、29KD、20KD、14.3KD；レーンA：実施例14.3.1エントリーAに記載のアルデヒドHES10/0.4へのコンジュゲーション；レーンB：実施例14.3.1エントリーBに記載のアルデヒドHES10/0.7へのコンジュゲーション；レーンC：実施例14.3.1エントリーCに記載のアルデヒドHES30/0.4へのコンジュゲーション；レーンD：実施例14.3.1エントリーDに記載のアルデヒドHES30/0.7へのコンジュゲーション；レーンE：実施例14.3.1エントリーEに記載のアルデヒドHES50/0.4へのコンジュゲーション；レーンF：実施例14.3.1エントリーFに記載のアルデヒドHES50/0.7へのコンジュゲーション；レーンG：実施例14.3.1エントリーGに記載のアルデヒドHESなしの反応対照；レーンI：実施例14.3.1エントリーIに記載のアルデヒドHESなしおよびNaCNBH3なしの反応対照；レーンJ：実施例14.3.1エントリーJに記載のHES10/0.4を含む反応対照；レーンK：実施例14.3.1エントリーKに記載のHES10/0.4を含むがNaCNBH3は含まない反応対照。
【０８３３】
【図３０】実施例14.3.2のIFN-アルファ-HESコンジュゲートのゲル電気泳動による分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。10％Bis-Trisゲルを、還元条件のMOPS SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。レーンX：Roti（登録商標）-Mark STANDARD（Carl Roth GmbH & Co. KG，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：200KD、119KD、88KD、43KD、29KD、20KD、14.3KD；レーンA：実施例14.3.2エントリーAに記載のアルデヒド-HESへのコンジュゲーション；レーンB：実施例14.3.2エントリーBに記載のアルデヒド-HESへのコンジュゲーション：レーンC：実施例14.3.2エントリーCに記載のアルデヒド-HESへのコンジュゲーション；レーンD：実施例14.3.2エントリーDに記載のアルデヒド-HESへのコンジュゲーション；レーンE：実施例14.3.2エントリーEに記載のアルデヒド-HESへのコンジュゲーション；レーンF：実施例14.3.2エントリーFに記載のアルデヒド-HESへのコンジュゲーション；レーンG：実施例14.3.2エントリーGに記載のHESを含む反応対照。図30から明らかになるように、反応対照Gの場合、反応は認められなかった。
【０８３４】
【図３１】実施例14.3.3のIFN-アルファ-HESコンジュゲートのゲル電気泳動による分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。10％Bis-Trisゲルを、還元条件のMOPS SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。粗製IFNα-HESコンジュゲートのゲル電気泳動による分析。レーンA：Roti（登録商標）-Mark STANDARD（Carl Roth GmbH & Co. KG，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：200KD、119KD、66KD、43KD、29KD、20KD、14.3KD；レーンB：14.3.3に記載のアルデヒドHES30/0.8へのIFNαのコンジュゲーション；レーンC：14.3.3に記載のアルデヒドHES130/0.7へのIFNαのコンジュゲーション；レーンD：14.3.3に記載のHES10/0.4（反応対照）へのIFNαのコンジュゲーション。
【０８３５】
【図３２】実施例14.3.4のIFN-アルファ-HESコンジュゲートのゲル電気泳動による分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。10％Bis-Trisゲルを、還元条件のMOPS SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。レーンX：Roti（登録商標）-Mark STANDARD（Carl Roth GmbH & Co. KG，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：200KD、119KD、88KD、43KD、29KD、20KD、14.3KDレーンA：実施例14.3.4に記載のアルデヒドHESへのコンジュゲーション；レーンB：反応対照；実施例14.3.4に記載のHESへのコンジュゲーション。図32から明らかになるように、反応対照Bの場合、反応は認められなかった。
【０８３６】
【図３３】実施例15.1に従ってNIH標準rhIFN-アルファ2aと比較したIntron（登録商標）Aの増殖活性を表す図である。
【０８３７】
【図３４】実施例15.2に従って無修飾IFN-アルファ出発材料と比較した、モックインキュベートしたIFN-アルファ-HESの相対的インビトロ活性を表す図である。
【０８３８】
【図３５】実施例15.3に従って無修飾IFN-アルファ出発材料、Intron（登録商標）AおよびPegasysとそれぞれ比較したIFN-アルファ-HESコンジュゲートの相対的インビトロ活性を表す図である。
【０８３９】
【図３６】実施例15.4に従ってIntron（登録商標）Aと比較したIFN-アルファ-HESコンジュゲートの相対的インビトロ活性を表す図である。
【０８４０】
【図３７】実施例15.5の結果をグラフに表した図である（IFN-アルファ-HESコンジュゲートの抗ウイルス活性）。
【０８４１】
【図３８】ウイルス感染に対するMDBK細胞の50％保護を達成するのに必要な血清試料の希釈度をマウスにおける30μg/kgのi.v.注射後の時間に対して表した図である。無修飾出発材料で処置したマウスの血清が持つ抗ウイルス効果は極めて低かった。HESによるIFN-アルファの修飾は、血清の抗ウイルス効果を実質的に延長する。半減期は、IFN-アルファの修飾に使用したHESの分子量と共に増加する(実施例16参照）。
【０８４２】
【図３９】実施例16.3の結果をグラフに表した図である（IFN-アルファ-HESコンジュゲートの抗ウイルス活性）。
【０８４３】
【図４０】実施例17によるウサギにおけるPK研究で得たデータを表す図である。IFN-アルファ-HESは、IFN-アルファ出発材料と比較して、半減期の明確な延長を示す。24時間以降（約1000pCi/ml未満）は、無修飾材料の曲線が横ばい状態になり、活性のさらなる減少はほとんど観察することができない。
【０８４４】
【図４１】実施例17によるウサギにおけるPK研究を表す図である。4時間から24時間までデータを評価した。IFN-アルファ-HESは、無修飾IFN-アルファ出発材料と比較して、半減期の明確な延長を示す。
【０８４５】
【図４２】実施例17によるPK研究（12時間までの期間を図示）の統計的評価を表す図である。無修飾出発材料の場合（図42(a)参照）、濃度は最初の2時間でほとんどゼロまで低下したのに対し、IFNアルファ-HESは明確に延長された半減期を示す（図42(b)）。
【０８４６】
【図４３】実施例18.5で述べるように製造した粗製アルファ1AT-HESコンジュゲートのSDS-PAGE分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびPower Pac 200電源（Bio-Rad，ドイツ・ミュンヘン）を使用した。3-8％ Tris-酢酸ゲルを、還元条件のTris-酢酸 SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。レーンA：未染色SDS Pageタンパク質マーカー6.5-200KDa（SERVA Elektrophoresis GmbH，ドイツ・ハイデルベルク）分子量マーカー（上から下に）：200KD、116KD、67KD、45KD、29KD、21KD、14.3KD、6.5KD；レーンB：アルファ1AT（GTC Biotherapeutics Inc.，マサチューセッツ州フレーミングハム，ロット番号080604A）；レーンC：実施例18.5に記載のマレイミドHESへのコンジュゲーション；レーンD：実施例18.5に記載のマレイミドHESへのコンジュゲーション（二倍濃度）
【０８４７】
【図４４】イオン交換クロマトグラフィー後に収集した画分A、B、およびCの分析を表す図である（実施例18.7参照）。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびPower Pac 200電源（Bio-Rad，ドイツ・ミュンヘン）を使用した。3-8％ Tris-酢酸ゲルを、還元条件のTris-酢酸 SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。レーン1：未染色SDS Pageタンパク質マーカーMark12（登録商標）2.5-200KDa（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：200KD、116KD、97KD、66KD、55KD、36KD、31KD、21KD、14KD、4KDレーン2：画分Aレーン3：画分Bレーン4：画分Cレーン5：アルファ1AT（GTC Biotherapeutics Inc.，マサチューセッツ州フレーミングハム，ロット番号080604A）
【図１】
2007527891.tif 000141
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2007527891.tif 000146
【図７】
2007527891.tif 000147
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2007527891.tif 000150
【図１１】
2007527891.tif 000151
【図１２】
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【図１３】
2007527891.tif 000153
【図１４】
2007527891.tif 000154
【図１５】
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【図１６】
2007527891.tif 000156
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
2007527891.tif 000164
【図２５】
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【図２６】
2007527891.tif 000166
【図２７】
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【図２８】
2007527891.tif 000168
【図２９】
2007527891.tif 000169
【図３０】
2007527891.tif 000170
【図３１】
2007527891.tif 000171
【図３２】
2007527891.tif 000172
【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
2007527891.tif 000179
【図４０】
2007527891.tif 000180
【図４１】
2007527891.tif 000181
【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
2007527891.tif 000184
【誤訳訂正書】
【提出日】平成19年1月17日(2007.1.17)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２５１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２５１】
さらにもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、アルデヒドもしくはケトもしくはヘミアセタール官能化ヒドロキシエチルデンプンまたはアルデヒドもしくはケトもしくはヘミアセタール官能化ヒドロキシエチルデンプン誘導体を、タンパク質のN末端アミノ基に選択的に連結する方法であって、前記ヒドロキシアルキルデンプンまたはその誘導体を7以下のpH、好ましくは6以下のpHで還元的アミノ化反応に付すことを含み、前記還元的アミノ化反応が好ましくは水性媒質中で行なわれる方法に関する。また、ここで使用される使用されるヒドロキシエチルデンプンは、好ましくは、約10kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約10kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約30kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約100kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプンである。
平均分子量とDSのこれらの組み合わせのそれぞれに関して、約0.8のDS値も好ましい。
アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基とアミノ基との間で起こるポリマー誘導体とタンパク質との反応は、シッフ塩基が生成する還元的アミノ化である。次いでその反応後に、少なくとも一つの還元剤でこの塩基を還元することにより、ポリマー誘導体とタンパク質の間に安定な結合を得ることができる。少なくとも一つの還元剤の存在下で反応を行なうこともできる。好ましい実施形態によれば、還元的アミノ化反応は、少なくとも一つの還元剤の存在下で行なわれる。
好ましい還元剤は水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、有機ボラン錯体、例えば4-(ジメチルアミノ)ピリジンボラン錯体、N-エチルジイソプロピルアミンボラン錯体、N-エチルモルホリンボラン錯体、N-メチルモルホリンボラン錯体、N-フェニルモルホリンボラン錯体、ルチジンボラン錯体、トリエチルアミンボラン錯体、またはトリメチルアミンボラン錯体である。特に好ましいのはシアノ水素化ホウ素ナトリウムである。
したがって本発明は、還元的アミノ化がNaCNBH3の存在下で行なわれる、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
したがって本発明は、還元的アミノ化が還元剤（好ましくはNaCNBH3）の存在下にpH7以下、好ましくはpH6以下の水性媒質中で行なわれる、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
したがって本発明は、還元的アミノ化が還元剤（好ましくはNaCNBH3）の存在下にpH7以下、好ましくはpH6以下の水性媒質中、４〜21℃の温度で行なわれる、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【国際調査報告】
2007527891.tif 000185
2007527891.tif 000186
2007527891.tif 000187