(57)【要約】本発明は、所与の生物学的サンプル中のシトクロムｃを検出する方法であって、シトクロムｃの繰り返しの酸化還元を可能にする有効量の２つのレッドクス対を該サンプルに加える工程であり、該対は、シトクロムｃオキシダーゼ酵素からなる酸化剤とシトクロムｃに特異的な還元剤とを還元された補助因子と共に含む工程と、補助因子に依存しかつ補助因子の酸化型の形態を還元型の形態から区別することを可能にする生物物理学的システムによって、前記の繰り返しの酸化還元反応の間に酸化される補助因子の酸化を測定する工程であり、補助因子の酸化型の形態の量は、サンプル中のシトクロムｃの濃度と相関させられる工程とを包含する方法に関する。
2007536914.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所与の生物学的サンプル中のシトクロムｃを検出する方法であって、
−  シトクロムｃの繰り返しの酸化還元を可能にする有効量の２つのレドックス対を該サンプルに加える工程であり、該対は、シトクロムｃオキシダーゼ酵素からなる酸化剤と、シトクロムｃに特異的な還元剤とを還元型の補助因子とともに含む、工程と、
−  補助因子に依存しかつ補助因子の酸化型の形態を還元型の形態から区別することを可能にする生物物理学的なシステムによって、前記の繰り返しの酸化還元反応の間に酸化される補助因子の酸化を測定する工程であり、補助因子の酸化型の形態の量は、サンプル中のシトクロムｃの濃度に相関させられる、工程と
を包含する方法。
【請求項２】
前記測定は、標準のシトクロムｃにより行われた測定と比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
還元剤はＮＡＤＨ−シトクロムｃレダクターゼまたはＮＡＤＰＨ−シトクロムｃレダクターゼであり、還元型の補助因子はＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
補助因子は、３４０ｎｍでの吸光光度分析によって検出される、請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
前記の各剤は、限定されるわけではないが例えば、液体下にあるか、乾燥させられるかまたは凍結乾燥させられた形態であり、組み換えまたは天然の化合物の精製または化学合成によって得られる、請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
あらゆる新しいスクリーニングプロトコールのために最適化されるか、または、あらゆる既存のスクリーニング手順に適応させられる、請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
試験されるべきサンプル中のシトクロムｃを検出するためのキットであって、
−  シトクロムｃの繰り返しの酸化還元のための２つのレドックス対であって、シトクロムｃオキシダーゼ酵素からなる酸化剤と、シトクロムｃに特異的な還元剤とを還元型の補助因子と共に含む対を含むキット。
【請求項８】
還元剤はＮＡＤＨ−シトクロムｃレダクターゼであり、補助因子はＮＡＤＨである、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
還元剤はＮＡＤＰＨ−シトクロムｃレダクターゼであり、補助因子はＮＡＤＰＨである、請求項７に記載のキット。
【請求項１０】
参照基準としてシトクロムｃをさらに含む、請求項７〜９のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１１】
緩衝剤をさらに含む、請求項７〜１０のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１２】
前記の各剤は、限定されるわけではないが例えば、液体下にあるか、乾燥させられるか、または凍結乾燥させられた形態であり、組み換えまたは天然の化合物の精製または化学合成によって得られる、請求項７〜１１のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１３】
研究所での研究のみのために規定される、請求項７〜１２のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１４】
診断用途のために規定される、請求項７〜１２のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１５】
容器のあらゆるフォーマット、限定されるわけではないが例えば、９６ウェルのマイクロプレート、３８４ウェルのマイクロプレート、１ｍＬのキュベットに最適化される、請求項７〜１４のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１６】
ミトコンドリア上清中のシトクロムｃを検出するために最適化される、請求項７〜１５のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１７】
サイトゾル抽出物中のシトクロムｃを検出するために最適化される、請求項７〜１５のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１８】
シトクロムｃを含むことが予想される任意の他の生物学的サンプル中のシトクロムｃを検出するために最適化される、請求項７〜１５のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１９】
ミトコンドリアのおよび／またはサイトゾルの画分の調製のために供給される試薬を有する、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
ミトコンドリアのおよび／またはサイトゾルの画分の調製のための方法論を有する、請求項１９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試験されるべき生物学的サンプル中のミトコンドリアからのシトクロムｃの放出を検出する手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは、細胞のアポトーシスの調節において、タンパク質のサイトゾルへの放出を通して中心的な役割を果たす。
【０００３】
抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２がミトコンドリア内にあることが見出されて以来、科学者は、このオルガネラがアポトーシスにおいて重要な担い手であると考え始めた。２つの主たる所見が、Ｂｃｌ−２、ミトコンドリアおよびアポトーシス間の結び付きを補強した：Ｂｃｌ−２がＴＮＦ誘導型アポトーシスの間に観察されるミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）の降下を多くの細胞タイプにおいて防止することが分かった。一方、Newmeyerらは、ミトコンドリアの因子がカスパーゼの活性化のために必要とされることを発見した。アポトーシスの間にミトコンドリアから放出されるこの因子は、後に、シトクロムｃであると確認された。
【０００４】
２つの主要なアポトーシスの経路は、過去数年間にわたって記載されてきた：デスレセプター経路およびミトコンドリア経路である。最初のものは、デスレセプターによって連動させられ、これは、それらの適切なリガンドに結合する際に、死を誘導するシグナリングコンプレックスを形成し、結果として、プロカスパーゼ８の活性化を生じさせる。タイプＩ細胞（Ｔリンパ球）において、カスパーゼ８は、細胞を仕上げる下流のカスパーゼを切断する。タイプＩＩ（肝細胞Hepatocyte）において、カスパーゼ８は、Ｂｉｄを切断し、Ｃ末端のフラグメントがミトコンドリアに転位したＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質がミトコンドリア経路に連動する。デスレセプターの活性化とは無関係に、ミトコンドリア経路はまた、ＤＮＡ損傷、トポイソメラーゼ阻害または栄養因子枯渇を含む大多数の死の刺激に応答して活性化され得る。この過程は、膜間空間からサイトゾルへのミトコンドリアタンパク質の放出に終わる。
【０００５】
Wangのグループは、カスパーゼ活性の誘導がサイトゾル抽出物の調製の間に放出されるシトクロムｃの存在に依存していることを示した。シトクロムｃのバインディングの際、Ａｐａｆ−１（apoptotic protease-activating factor 1）は、コンフォメーションの変化を経、プロカスパーゼ９を活性化し、細胞死に至る。
【０００６】
アポトーシスのメカニズムに興味を持つ世界中の多くの研究所は、生物学的調製物（ミトコンドリアの上清、サイトゾル抽出物等）中のシトクロムｃの放出を研究しており、この放出は、アポトーシス実行の特質である。したがって、シトクロムｃの検出は、アポトーシス促進薬または抗アポトーシス薬を発見するために大きな興味を有し、単独でまたは他の測定（ΔΨｍ、ミトコンドリア膨張等）と組み合わされて、スクリーニング戦略と一体化される。
【０００７】
このタイプの調査は、一般に、免疫検出（例えば、ウエスタン・ブロッティングまたはＥＬＩＳＡ）を検出法として用いて実行される。しかしながら、ウエスタン・ブロッティングは、時間を消費する手順であり（約２日）、半定量的方法は正確性に乏しい。結果として、この方法は、種々の条件下でのシトクロムｃ放出の量および速度論の詳細な分析に用いられ得ず、薬物のスクリーニングに用いられ得ない。他方、ＥＬＩＳＡ定量法は、プレートコーティング、予めセッティングされたフォーマットの使用を必要とし、複数回の洗浄段階のため真にユーザーフレンドリーというわけではない。
【０００８】
ＨＰＬＣも、シトクロムｃの定量のために用いられてきた。ウエスタン・ブロッティングと比較して、ＨＰＬＣ法は、定量データを提供することができる。しかしながら、サンプルは、順番に定量化されなければならず、各定量化には、少なくとも２０分を必要とする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、シトクロムｃに特異的な薬剤を用いることによって、酵素法により種々の細胞下分画中のシトクロムｃの濃度を測定することが可能であることを見出した。
【００１０】
本発明の目的は、第１に、生物学的サンプル中のシトクロムｃの濃度を正確に定量化するためのツールを提供することである。本発明の別の目的は、所望のアッセイ法を行うための既製品のキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明によると、本方法は、
−  シトクロムｃの繰り返し（cycling）の酸化還元のために、研究されるサンプルに有効量の２つのレドックス対を加える工程であり、該対は、酸化剤であるシトクロムｃオキシダーゼ酵素（ＣＯＸ）およびシトクロムｃに特異的な還元剤中を補助因子と共に含む工程と、
−  酸化還元の繰り返しの間に酸化される補助因子の酸化を測定する工程であり、その酸化型の形態の量が、サンプル中のシトクロムｃの濃度に相関させられる工程と
を必要とする。
【００１２】
発生させられる繰り返しの酸化還元システムは、シトクロムｃの高特異的かつ高感度の検出を可能にする。還元剤は、シトクロムｃを特異的に還元し、この還元は、前記の補助因子の附随する酸化をモニタリングすることによって検出される。補助因子の酸化に起因するシグナルを増幅させるために、酸化剤であるシトクロムｃオキシダーゼが、シトクロムｃを再酸化するように反応培地に加えられ、これにより、このシトクロムｃが還元剤によって再度用いられることが可能となる。発生させられる繰り返しの酸化還元システムは、シトクロムｃの存在に厳密に依存する。したがって、補助因子の酸化の増幅は、シトクロムｃが試験されるサンプル中に存在することを示す。
【００１３】
補助因子の酸化は、補助因子に応じ、かつ酸化型の形態を還元型の形態から区別することが可能である生物物理学的なシステム（例えば、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ検出のための３４０ｎｍでの分子吸光光度分析法による吸光度測定；ただしこれに限定されない）によって手際よく測定される。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態では、還元剤は、ＮＡＤＨ−シトクロムｃレダクターゼまたはＮＡＤＰＨ−シトクロムｃレダクターゼであり、補助因子はＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨである。
【００１５】
有利には、前記の測定は、標準のシトクロムｃの既知濃度の測定と比較される。
【００１６】
前記の酸化および還元剤および補助因子は、例えば（ただし限定はされない）、液体下であるか、乾燥させられるか、または凍結乾燥させられた形態であり、組み換えまたは天然の化合物の精製または化学合成によって得られる。
【００１７】
検出は、シトクロムｃを含むと思われるあらゆる生物学的サンプル、例えば、ストレス、特にアポトーシス誘導ストレスに付されても付されなくてもよい、一次細胞、細胞系、組織、血液、臓器または腫瘍から精製される細胞の抽出物またはオルガネラについて行われてよい。
【００１８】
検出は、有利には、種々の実験条件下にインキュベーションを行った後にミトコンドリアを沈降させる際に得られる上清において、または、種々の実験条件下での細胞のインキュベーションの後のサイトゾルの精製の際に得られる細胞の抽出物において行われる。
【００１９】
本発明はまた、試験されるべきサンプル中のシトクロムｃを検出するためのキットに関する。このようなキットは、
−  シトクロムｃの繰り返しの酸化還元のための２つのレドックス対であって、該対は、酸化剤、すなわち、シトクロムｃオキシダーゼ酵素およびシトクロムｃに特異的な還元剤を含み、還元された補助因子を用いる、ものを含む。
【００２０】
還元剤は、有利には、ＮＡＤＨ−シトクロムｃレダクターゼまたはＮＡＤＰＨ−シトクロムｃレダクターゼであり、補助因子はＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨである。
【００２１】
前記キットにおいて、前記の各剤は、例えば（ただし制限はされない）、液体下にあるか、乾燥させられているか、または、凍結乾燥させられた形態にあり、組み換えまたは天然の化合物の精製または化学合成によって得られる。
【００２２】
場合によっては、前記のキットは、緩衝剤をさらに含む。
【００２３】
前記のキットはまた、対照標準として標準のシトクロムｃを含む。
【００２４】
前記手段は、生物学的サンプル中のシトクロムｃを検出するための、イムノアッセイ、ＨＰＬＣ検出またはウェスタンブロッティングの有利な代替物である。
【００２５】
本発明は、下記の実施例および図面によってさらに例示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の本実施形態では、測定は、２２０マイクロリットルの最終容積の透明な平底９６ウェルマイクロプレートにおいて行われる。酵素である調製された酵素緩衝剤（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ  ７．０，  ２５０ｍＭのサッカロース）が、１８０マイクロリットルのアッセイ緩衝剤（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ＝７．０，  １２０ｍＭのＫＣｌ、３００μＭのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）に加えられた（ウェル当たり２０マイクロリットル）。反応は、２２０マイクロリットルの最終容積を得るように、精製されたシトクロムｃまたは所望のサンプルのいずれかを２０マイクロリットル加えることによって開始される。
【００２７】
ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの両方が３４０ｎｍの波長を吸収するがＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋がそれを吸収しないので、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの酸化は、３４０ｎｍで分光分析法により測定される。補助因子の酸化の速度の測定のために、吸光度が、速度論のモードで、室温で３０分にわたりモニタリングされる。
【００２８】
ＮＡＤＨの消費の速度（Ｍ／分）
＝（ＤＯｔ＝１８０秒−ＤＯｔ＝１８００秒）・６０／（１８００−１８０）・６２３０
シトクロムｃおよびＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの原液は、蒸留水において調製される。
【００２９】
・シトクロムｃの検出のための繰り返しの酵素アッセイ（図１）。
【００３０】
酵素Ａは、シトクロムｃレダクターゼであり、シトクロムｃの還元および附随する補助因子（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）の酸化を触媒する。このため、酸化されたシトクロムｃは、レダクターゼによって還元される。酵素Ｂは、シトクロムｃオキシダーゼであり、それは、還元されたシトクロムｃを酸化し、電子を分子状酸素に移す。両酵素の存在は、シトクロムｃを用いた酸化還元の繰り返しを可能にする。繰り返しの速度は、過剰の両酵素の存在下にシトクロムｃによって制限された。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの酸化の速度は、利用可能なシトクロムｃの量に直接的に比例する。シアン化物（ＫＣＮ）は、シトクロムｃオキシダーゼ阻害剤である。
【００３１】
・ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの酸化は、酵素サイクルの種々の成分の同時の存在に依存し、シトクロムｃオキシダーゼ阻害に応じて完全に阻止される。測定は、３４０ｎｍでの吸光光度分析によって行われる（図２）。
【００３２】
完全培地：３００μＭのＮＡＤＨ、３００μＵのＮＡＤＨ−シトクロムｃレダクターゼ、３００μＵのシトクロムｃオキシダーゼ、２μＭのシトクロムｃ；１．ＮＡＤＨのみ；２．シトクロムｃオキシダーゼなしの完全培地；３．シトクロムｃなしの完全培地；４．ＮＡＤＨ−シトクロムｃレダクターゼなしの完全培地；５．シトクロムｃオキシダーゼの阻害に関して５００μＭのＫＣＮが加えられた完全培地；６．完全培地；特に、成分のいずれかの欠如は繰り返し操作を妨げるが、シトクロムｃオキシダーゼ調製のＮＡＤＨ−シトクロムｃレダクターゼによる汚染に起因して、加えられたＮＡＤＨ−シトクロムｃレダクターゼの欠如は別である。
【００３３】
・一定のシトクロムｃ濃度で、繰り返しの反応の速度は、加えられた酵素の量に依存する。測定は、３４０ｎｍでの吸光光度分析によって行われる（図３）。
【００３４】
酵素濃度の低い範囲では、ＮＡＤＨ（３００μＭ）の酸化は、酵素濃度と相関する。選択された例では、ＮＡＤＨ−シトクロムｃレダクターゼは、シトクロムｃオキシダーゼと比較して過剰に存在し、反応の速度は、この後者の酵素に依存する。したがって、大過剰の両酵素が、研究されるサンプルとともに潜在的に加えられる酵素から生じるかもしれないあらゆる干渉を避けるために必要とされる。
【００３５】
・飽和酵素濃度で、繰り返しのアッセイの速度は、シトクロムｃ濃度に依存するだけである。測定は、３４０ｎｍでの吸光光度分析によって行われる（図４）。
【００３６】
高い酵素濃度（ウェル当たり、２４０μＵのＮＡＤＨ−シトクロムｃレダクターゼ、２４０μＵのシトクロムｃオキシダーゼ）で、ＮＡＤＨ（３００μＭ）がシトクロムｃ濃度に比例して酸化された。低いシトクロムｃ濃度について、ＮＡＤＨの消費の速度とシトクロムｃ濃度との間に線形相関がある。それによって、この反応は、シトクロムｃを定量化するための簡単かつ便利な方法となる。
【００３７】
・飽和酵素濃度は、ミトコンドリア上清中の低濃度のシトクロムｃを検出することを可能にする。測定は、３４０ｎｍでの吸光光度分析によって行われる（図５）。
【００３８】
ミトコンドリアの調製およびインキュベーション：マウス肝臓のミトコンドリアが、標準的ではあるがわずかな改変を伴う手順によって調製された。簡単には、細かく切り刻まれた肝臓が、培地Ａ（０．３Ｍのサッカロース、０．２ｍＭのＥＧＴＡおよび５ｍＭのＴＥＳ，ｐＨ  ７．２）中でホモジナイズされた。ホモジネートは、低速で遠心分離され（７６０ｇ，４℃で１０分）、上清が集められて培地Ａに希釈され、さらに遠心分離された（８７４０ｇ，４℃で１０分）。洗浄されたミトコンドリアは、２つの連続するパーコール勾配（Percoll gradient）の超部上に層状に重ねられた。パーコール勾配は、培地Ｂ（０．３Ｍのサッカロース、０．２ｍＭのＥＧＴＡ、１０ｍＭのＴＥ；ｐＨ  ６．９）中の１８％、３０％および６０％（ｗ／ｖ）のパーコールの３層からなっている。遠心分離（８７４０ｇ，１０分）の後、損なわれていないミトコンドリアを含む画分は、３０％／６０％の界面から集められ、培地Ａにより洗浄され（８７４０ｇ，１０分）、ペレット状物が、５００μＬの培地Ａ中に再懸濁させられた。タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイによって測定された。
【００３９】
精製されたミトコンドリア（４ｍｇタンパク質／ｍＬ）は、次いで、培地Ｃ（０．２Ｍのサッカロース、５ｍＭのコハク酸塩、１０μＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＨ３ＰＯ４、２μＭのロテノンおよび１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＭＯＰＳ；ｐＨ  ７．４）中で室温下に３０分にわたり、シトクロムｃ放出の誘導剤としての５００μＭの塩化カルシウムまたは５μｇ／ｍＬのアラメチシンとともにインキュベートされた。
【００４０】
サンプルの調製：処理されたミトコンドリアは、遠心分離され（６８００ｇ，４℃で１０分）、上清は、１０，０００Ｄａの濃縮器マイクロチューブ（concentrator microtube）上で、１２，０００ｇで室温下１５分にわたり約２０倍に濃縮された。各サンプル（２０マイクロリットル）が２００マイクロリットルの反応溶液（１８０μＬのアッセイ緩衝液中の３００μＭのＮＡＤＨ、１０μＬの酵素緩衝液中の１ｍＵのＮＡＤＨ−シトクロムｃレダクターゼ、１０μＬの酵素緩衝液中の１ｍＵのシトクロムｃオキシダーゼ）に加えられた：１．蒸留水；２．精製されたシトクロムｃ  １００ｎＭ；３．損なわれていない精製ミトコンドリアの上清；４．カルシウム処理されたミトコンドリアからの上清；５．アラメチシン処理されたミトコンドリアからの上清。この実験のセットは、提案された繰り返しの酵素アッセイがミトコンドリア調製物から放出されたシトクロムｃを定量化するのに十分に高感度であることを確立する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】シトクロムｃの検出のための繰り返しの酵素アッセイ。
【図２】ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの酸化は、酵素サイクルの種々の成分の同時の存在に依存し、シトクロムｃオキシダーゼ阻害に応じて完全に阻止される。
【図３】一定のシトクロムｃ濃度で、繰り返し反応の速度は、加えられた酵素の量に依存する。
【図４】飽和酵素濃度で、繰り返しアッセイの速度は、シトクロムｃの濃度に依存するだけである。
【図５】飽和酵素濃度は、ミトコンドリアの上清中の低濃度のシトクロムｃを検出することを可能にする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2007536914.tif 000007
【国際調査報告】
2007536914.tif 000008
2007536914.tif 000009