(57)【要約】  豊胸、柔軟組織欠陥、および尿失禁等の状態について、患者を治療する方法を記載する。これらの方法は、患者から脂肪組織を取出し、該脂肪組織の一部を処理して、実質的に単離された再生細胞の集団を得、該再生細胞と脂肪組織の他の部分とを混合して、組成物を生成し、および該組成物を、該脂肪組織を取出した患者に投与する諸工程を含む。
2007536941.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から脂肪組織を取り出し；
該脂肪組織の第一の部分を処理して、再生細胞の実質的に単離された集団を得；
該脂肪組織の第二の部分を該再生細胞の実質的に単離された集団と混合して、脂肪組織組成物を生成し；および
該脂肪組織組成物を、該脂肪組織を取出した患者に投与して、該患者を治療することを特徴とする、患者の治療方法。
【請求項２】
該脂肪組織組成物を、該患者の乳房に投与する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
該脂肪組織組成物を、該患者の柔軟組織領域に投与して、柔軟組織欠陥を治療する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
該脂肪組織組成物を、該患者の尿道領域に投与して、尿失禁を治療する、請求項1記載の方法。
【請求項５】
該再生細胞が幹細胞で構成される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
該再生細胞が前駆細胞で構成される、請求項1記載の方法。
【請求項７】
該再生細胞が幹細胞と前駆細胞との組合せで構成される、請求項1記載の方法。
【請求項８】
該方法が、該脂肪組織組成物の、多重用量での投与を含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
該脂肪組織組成物が、更に1またはそれ以上の脈管形成性因子をも含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
該脂肪組織組成物が、更に1またはそれ以上の動脈形成性因子をも含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
該脂肪組織組成物が、更に1またはそれ以上の免疫抑制性薬物をも含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
該再生細胞を、脂肪組織の該第二の部分と混合する前に、細胞培養物中で増殖させる、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
該細胞培養条件が、内皮表現型への分化を促進する、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
該細胞培養を、スカフォールド材料上で行って、該患者の上またはその内部に配置することのできる、二次元または三次元の構築物を生成する、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
該スカフォールド材料が、インビボにて再吸収性である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
該再生細胞を、遺伝子導入によって変性させて、該変性された再生細胞内の1またはそれ以上の遺伝子の発現を変更する、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
該変性が、該対象における脈管形成性レベルの変更をもたらす、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
該変性が、該対象における動脈形成性レベルの変更をもたらす、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
該変性が、該対象におけるアポトーシスレベルの変更をもたらす、請求項16記載の方法。
【請求項２０】
該脂肪組織組成物の投与が、新血管形成性を促進する、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
該投与された脂肪組織組成物が、最早存在しなくなった後にも、該新血管形成性が、安定に維持されている、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
該脂肪組織組成物の投与が、壊死を減じる、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
該対象がヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
患者に投与するための再生細胞を含む、組成物の製造方法であって、
患者から脂肪組織を取り出し、および
該脂肪組織の細胞および脂質成分から、該脂肪組織に存在する再生細胞を分離して、該脂肪組織を取出した該患者に、直接的に投与するための再生細胞を含む組成物を生成する工程を含むことを特徴とする、上記方法。
【請求項２５】
該患者が、脂肪移植処置を必要とし、あるいは該移植が望まれるものである、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
患者に投与するための再生細胞を含む組成物を製造するためのデバイスであって、
患者から取出した脂肪組織を維持し、洗浄し、かつ消化するための、組織採集チャンバー、および
該脂肪組織の細胞および脂質成分から再生細胞を分離し、かつ濃厚化して、該脂肪組織を取出した該患者に、直接的に投与するための、再生細胞を含む組成物を生成するための処理チャンバー、
を含むことを特徴とする、上記デバイス。
【請求項２７】
該デバイスが、自動化されている、請求項26記載のデバイス。
【請求項２８】
該患者が、脂肪移植処置を必要とし、あるいは該移植が望まれるものである、請求項24記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本件出願は、2001年12月7日付で出願された、米国仮特許出願第60/338,856号の利益を請求する、「処理を施した脂質吸引細胞による、患者を治療するための装置および方法」と題する、2002年12月9日付で出願された、米国特許出願第10/316,127号の一部継続出願である。本件出願は、また2003年6月18日付で出願された、「オートロガス脂肪導入増進における、脂肪組織由来細胞の使用方法」と題する、米国仮特許出願第60/479,418号に係る優先権をも請求するものである。
【０００２】
本発明は、一般的には、脂肪組織由来の細胞に係り、またより詳しくは脂肪由来の再生細胞(例えば、幹細胞および/または前駆細胞)、脂肪組織由来の再生細胞の使用法、脂肪由来の再生細胞を含む組成物、および脂肪導入(または移植)の増進のために使用する、脂肪由来の再生細胞を製造し、またこれを使用するための装置に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
脂肪導入または移植(fat transfer)は、ある位置から脂肪組織(脂肪)を収穫し、他の位置に再移植することを含む、比較的一般的な化粧学的、治療学的および構造的処置である(Coleman 1995,; Coleman 2001)。小さな化粧学的欠陥、例えば顔の襞、皺、痘疹痕および窪みの修復のために広く利用されているが、脂肪導入も、化粧学的に豊胸および胸部の再生において利用されている(Bircoll & Novack 1987; Dixon 1988)。臀部の増強も、脂肪導入法を利用して行われている(Cardenas-Camarena, Lacouture等 1999; de Pedroza 2000; Peren, Gomez等 2000)。
【０００４】
しかし、既存の脂肪導入法は、感染 (Castello, Barros等 1999; Valdatta, Thione等 2001)およびマンモグラフィーおよび他の胸部撮像モダリティーを妨害する恐れのある、石灰化および瘢痕形成(Huck, Kunzi等 1998)を含む実質的な副作用と関連している。通常の脂肪導入法は、またしばしば調和のない移植と関連し、そこでは例えば該移植された材料が、部分的にまたは完全に再吸収され、あるいは瘢痕組織によって置換される(Eremia & Newman 2000)。例えば、豊胸マンモグラフィーにおける、脂肪組織の使用は、しばしば新たな血管が形成され、かつ該移植片に栄養供給するのに要する期間中に、部分的に、該移植された脂肪組織の壊死に寄与する恐れがある(Saunders, Keller等 1981; Eppley, Smith等 1990; Nishimura, Hashimoto等 2000)。同様に、長期間に及ぶ柔軟組織欠陥の修正に関連して、オートロガス脂肪を含む多くの材料が、瘢痕、皺、およびその他の柔軟組織欠陥を満たすために使用されている(Coleman 2001; Maas & Denton 2001)。しかし、上記の如く、これらの脂肪組織移植片は、また新血管形成の欠如および壊死という弊害をこうむる。
【０００５】
オートロガス脂肪導入も、柔軟組織の充填または支持構造が必要とされる、非-化粧学的な臨床的状況において適用されている。その一例は、ストレス性尿失禁であり、そこでは該導入された脂肪によって、尿道壁および尿道括約筋構造が支持されることになる(Palma, Riccetto等 1997; Lee, Kung等 2001)。しかし、該導入された脂肪の持久性の欠如が、この方法の広範囲に及ぶ受け入れを阻止している。同様な方法が、大便失禁においても利用されており、これはもう一つの括約筋障害である(Shafik 1995; Bernardi, Favetta等 1998)。脂肪導入が、非-化粧学的な臨床的状況において適用されている他の例は、声帯麻痺、声帯萎縮、挿管による外傷、片側喉頭部切除後の欠陥、および声帯移植(Koufman 1991; Mikaelian, Lowry等 1991; Hsiung, Woo等 2000; Perie, Ming等 2002)、輻射により生じる柔軟組織欠陥の修復(Jackson, Simman等 2001)、および戦傷(Ghobadi, Zangeneh等 1995)、腰部ディスク外科手術(Bernsmann, Kramer等 2001; Kanamori, Kawaguchi等 2001)および足底のフットパッドにおける萎縮組織の修復(Chairman 1994; Lauf, Freedman等 1998)を包含する。これら全ての方法は、化粧学的応用に関連して、上記した問題に遭遇した。
【０００６】
多くの研究グループが、長期に渡る生存性および回復性を改善するための、このような方法における、該移植片の補充方法を捜し求めている。一つの研究グループは、動物モデルにおける移植片の生存率を高めるために、血清を含まない細胞培養培地を用いた結果を報告しており(Ullmann, Hyams等 1998)、他方では、他の研究グループが、成長因子を含む移植組織の増大が、別のモデル系における移植片の生存率を高め得ることを明らかにした(Eppley, Snyders等 1992; Yuksel, Weinfeld等 2000; Yuksel, Weinfeld等 2000)。
【０００７】
違った方法が、Schoeller等により提案されており、そこでは、脂肪細胞の先駆細胞が、フィブリン製膠内に埋設され、次いで該細胞が生存し、かつスクラッチ(scratch)からの新たな脂肪組織の発生を期待して、移植される(Schoeller, Lille等 2001)。他の研究者等は、人工のポリマーにこれら細胞を播種する工程を含む、同様な方法を利用している(Patrick, Chauvin等 1999)。これら方法と関連する問題点は、脂肪組織(脂肪細胞)の一つの成分のみが、内因性のメカニズムに、新たな血管形成性(脈管形成性)をもたらすに過ぎないことである。更に、前-脂肪細胞の限られた自己-刷新能力を与えた場合には、長期間に渡る脂肪細胞の生成をもたらすことができない可能性がある。
従って、既存の方法と関連した問題点を軽減する、患者に脂肪組織を投与するための改善された方法に対する要望がある。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、少なくとも部分的に、本発明の脂肪組織由来の再生細胞(例えば、内皮先駆細胞)が、脈管形成性の支持体を与え、また長期に及ぶ血管内皮細胞および脂肪細胞両者の製造を可能とするという発見に基いている。従って、本発明は、脂肪導入(移植)性、例えばオートロガス脂肪導入性を高める方法を提供する。本発明は、また高い収率、整合性および純度で、しかも抽出後の操作の必要性を低下し、または不要とする、迅速かつ高信頼度の、脂肪組織由来の成熟再生細胞を製造するための、デバイス、系および方法をも提供する。本発明は、更に完全な脂肪組織と混合し、次いで直接レシピエントに、治療上の、構造的なまたは化粧学的な利点を高め、または維持するのに必要な添加剤と共に、配置することのできる、脂肪組織由来の細胞を使用するための組成物、方法並びに系をも提供する。
一態様において、本開示によって調製される該再生細胞は、その製造の後、完全な(凝集状態が維持された、または処理されていない)脂肪組織フラグメントと混合され、組成物とされる。このようにして、本発明の組成物は、脂肪組織と再生細胞との混合物を含む。この組成物は、レシピエントに移植して、輪郭上の欠点(皺、窪み、痘疹痕、およびより大きな欠損)の修正、または損傷を受けた構造、例えば尿道に、支持部をもたらす、オートロガス柔軟組織フィラーを与えることができる。この組成物は、また豊胸手順および柔軟組織欠陥との関連で、胸部領域に投与することも可能である。
【０００９】
この脂肪組織は、密閉された、無菌流体/組織経路を維持する装置において処理される。これは、密閉された、無菌容器および密閉された経路内への組織および流体の導入を可能とする管路との、予め組み立てられ、結合されたセットの使用によって達成される。この装置は、処理デバイスと結合することができ、該デバイスは、試薬の添加、処理温度およびそのタイミングの決定を自動化でき、かくしてこの工程を、作業者が手動で操作する必要性を軽減する。好ましい態様において、組織抽出から、その処理およびレシピエントへの配置までの全手順を、完全に同一の設備内で、実際にこの処置を行っている患者の同一の室内において実施される。
幾つかの態様では、患者の治療方法は、a) 脂肪組織取り出し装置を準備し；b) この組織取り出し装置を用いて、患者から脂肪組織を取り出し、ここで該脂肪組織はある濃度で再生細胞を含み；c) 処理前の該脂肪組織再生細胞の濃縮以外の処理を、該脂肪組織の少なくとも一部に施して、所定の濃度で再生細胞を得、およびd) 患者への投与に先立って、該組織取り出し装置から該再生細胞を除去すること無しに、該患者に該再生細胞を投与して、該患者を治療する各工程を含む。
【００１０】
他の態様では、患者の治療方法は、a) 脂肪組織取り出し装置を準備し；b) この組織取り出し装置を用いて、患者から脂肪組織を取り出し、ここで該脂肪組織はある濃度で再生細胞を含み；c) 該脂肪組織を処理して、該脂肪組織中の再生細胞の濃度を高め；d) 該濃厚化された再生細胞を含む該脂肪組織と、脂肪組織の他の単位部分と混合し；およびe) 該再生細胞の高い濃度を持つ脂肪組織を、患者に投与して、該患者を治療する各工程を含む。
特定の態様において、患者は、柔軟組織の欠陥について治療を受ける。他の態様においては、患者の乳房を治療する。更に別の態様では、該患者は、尿失禁について治療を受ける。ここに開示される治療方法は、オートロガスおよび非-オートロガス両者の、脂肪の導入を要する、あらゆる化粧学的または非-化粧学的障害の治療のために使用することができる。
好ましい態様においては、患者の治療において使用する該再生細胞は、幹細胞または前駆細胞である。他の態様においては、該再生細胞は、内皮前駆細胞である。更に別の態様では、該再生細胞は、ここに記載するような再生細胞の任意の集団である。付随的に、本発明に含まれる治療方法において使用する、該再生細胞集団は、細胞の均一なまたは不均一な集団であり得る。
【００１１】
本発明の更に別の局面では、該再生細胞は、他の細胞、組織、組織フラグメント、または細胞成長および/または分化に対する他の刺激物質との組合せで、該レシピエント内に配置することができる。例えば、該再生細胞は、成長因子および/またはサイトカイン、例えば脈管形成性または動脈形成性成長因子と組合せることができる。該再生細胞は、また免疫抑制性薬物と組合わせることも可能である。これら添加剤は、本発明の装置および方法を用いた、該再生細胞の濃厚化中または濃厚化した後に投与することができる。本発明の更に別の局面において、該再生細胞は、該レシピエントに配置する前に、他のターゲット、例えばインプラント材料、外科用デバイス、細胞培養デバイス、または増殖デバイスに向けられる。好ましい態様においては、上記添加物の何れかを含む該細胞は、該レシピエントに、治療上の、構造的なまたは化粧学的な利益を導く意図を持って、単一の手術手順との関連で、該細胞を採取したヒトの内部に配置される。
ここに記載する任意の特徴またはこれら特徴の組合せが、本発明の範囲内に含まれるが、任意のこのような組合わせに含まれる該特徴は、その内容、本明細書および当業者の知見から明らかであるように、相互に矛盾することはない。本発明の付随的な利点および局面は、以下の詳細な説明から明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、脂肪組織由来の再生細胞(ADCs)を用いた、オートロガス脂肪導入を増強する方法を提供する。例えば、本発明は、本発明の脂肪組織由来の再生細胞が、(1)脈管形成性の成長因子およびサイトカイン、例えばPIGF、VEGF、bFGF、IGF-II、エオタキシン(Eotaxin)、G-CSF、GM-CSF、IL-12p40p70、IL-12p70、IL-13、IL-6、IL-9、レプチン(Leptin)、MCP-1、M-CSF、MIG、PF-4、TIMP-1、TIMP-2、TNF-αおよびスロンボポエチン(Thrombopoetin)を発現し、(2)血管形成において十分に確立された機能を持つ、内皮前駆細胞(EPC)を含み、(3)インビトロにて血管内で発育し、かつ(4)インビボにおいて、乏血性組織の生存を維持する。従って、該再生細胞は、例えば投与サイトにおける、新血管形成の促進によって、オートロガス脂肪導入の増強を可能とする。
本発明をより容易に理解できるようにするために、まず、幾つかの用語を定義する。付随的な定義は、この詳細な説明全体を通して示される。
【００１３】
ここで使用する用語「再生細胞」とは、本発明の装置および方法を利用して得たあらゆる細胞を意味し、これらは器官、組織、または生理的な単位または系の、構造または機能の完全なまたは部分的な再生、復元、または置換を引起こし、あるいはこれらに寄与して、治療上の、構造的なまたは化粧学的な利益をもたらす。再生細胞の例は、ASCs、内皮細胞、内皮プリカーサ細胞、内皮前駆細胞、マクロファージ、線維芽細胞、周皮細胞、平滑筋細胞、前脂肪細胞、分化したまたは分化していない脂肪細胞、ケラチノサイト、単一分化性または多重分化性前駆およびプリカーサ細胞(およびその子孫)、およびリンパ細胞を包含する。
該再生細胞が、治療上の、構造的なまたは化粧学的な利益をもたらすメカニズムの一つは、これらをまたはその子孫を、新たに生成した、既存のまたは修復された組織または組織成分に、組込むことである。例えば、ASCsおよび/またはその後継を、新たに生成した骨、筋肉、または他の構造的または機能的組織に組込み、結果的に治療上の、構造的なまたは化粧学的な改善を引起こし、あるいはこれに寄与させることができる。同様に、内皮細胞または内皮プリカーサもしくは前駆細胞およびこれらの子孫を、既存の、新たに発生した、修復した、または拡張された血管に組込むことができ、その結果治療上の、構造的なまたは化粧学的な利益をもたらし、あるいはこれに寄与させることが可能となる。
【００１４】
該再生細胞が、治療上の、構造的なまたは化粧学的な利益をもたらす、もう一つのメカニズムは、与えられた組織または組織成分の構造または機能の発生、維持、復元および/または再生を促進する、成長因子等の分子を、発現および/または分泌することである。例えば、再生細胞は、組織または細胞の高い増殖性をもたらす分子を発現および/または分泌することができ、これらは次いで直接または間接的に改善された構造または機能に関与することができる。再生細胞は、例えば血管内皮成長因子(VEGF)、胎盤成長因子(PlGF)、および/またはこれらのイソタイプを包含する、以下に列挙する機能の一種以上を果たす、成長因子またはサイトカインを発現および/または分泌することを可能とする。該機能とは、新たな血管の発育を刺激、即ち脈管形成を促進し；先在する小さな血管(側枝)の血液搬送容量を拡大することによる、該血管への酸素供給を改善し；損傷のあるサイトから遠く離れたサイト由来の再生細胞の可動性を誘発して、このような細胞の該損傷のあるサイトへの回帰および移動を促進し；損傷のあるサイト内の細胞の成長を刺激しおよび/または該細胞の生存を促進し、結果的にその機能および/または構造の維持を促進し；抗-アポトーシス性を持つ分子を分配して、細胞の死および永続的な機能喪失の割合またはその可能性を減じ；また内在性の再生細胞および/または他の生理学的なメカニズムと相互作用する。
【００１５】
該再生細胞は、該組織中に存在する、または本発明の装置および方法を利用して該組織から抽出した、その「本来の」形状で使用することができ、あるいはこれらは、成長因子または他の生物学的応答の改良剤で刺激しまたは感作することにより、遺伝子導入(一時的なまたは安定な導入)により、物理的特性(例えば、サイズまたは密度)、分別的な固相材料に対する付着性、細胞表面の発現または細胞内分子、細胞培養または他のイクスビボまたはインビボ操作、変性、またはここで更に詳細に説明するような分画に基く、更なる得られた集団の、副次的分画によって、変性することができる。該再生細胞は、また他の細胞またはデバイス、例えば合成または生体スカフォールド、ここで更に詳細に説明するような、該細胞の関連する諸特性を変更し、あるいは高める因子、薬物、化学物質または他の試薬を放出する物質またはデバイスとの組合せで使用することができる。
【００１６】
ここで使用する用語「再生細胞組成物」とは、典型的には、脂肪組織等の組織を洗浄し、かつ少なくとも部分的にその凝集を壊した後の、所定体積の液体中に存在する細胞の組成物を意味する。例えば、本発明の再生細胞組成物は、多数の異なる型の再生細胞を含み、該細胞は、ASCs、内皮細胞、内皮プリカーサ細胞、内皮前駆細胞、マクロファージ、線維芽細胞、周皮細胞、平滑筋細胞、前脂肪細胞、分化したまたは分化していない脂肪細胞、ケラチノサイト、単一分化性または多重分化性前駆およびプリカーサ細胞(およびその子孫)、およびリンパ細胞を包含する。該再生細胞組成物は、1またはそれ以上の混入物、例えば該組織フラグメント中に存在する可能性のあるコラーゲン、あるいは残留コラーゲナーゼまたはその他の酵素、あるいはここに記載する組織凝集破壊過程由来の、またはそこで使用した薬剤をも含むことができる。
【００１７】
ここで使用する用語「再生性薬剤」とは、対象内に再生細胞を直接または間接的に配置したことによって生じる、任意の治療上の、構造的なまたは化粧学的な利益を意味する。ここで使用する成句「脂肪導入(移植)」とは、再生性薬剤の一形態であり、余分な脂肪細胞を、身体のある領域から取り出し、身体の他の領域に再移植する、全手順を含むものであるとする。脂肪導入は、オートロガスおよび非-オートロガス脂肪導入両者を含む。この成句「オートロガス脂肪導入」とは、該脂肪の取り出しおよびその再移植を、同一の対象について行う、全手順を包含するものとする。例示的な化粧学的脂肪導入手順は、口唇、鼻唇(口から鼻に伸びた襞)、皺およびその他の顔の襞(目の周り、前額並びに顔の残部領域における窩)、目の下部、頬、顎、側頭部、胸部、大腿部、脹脛、腕、腹部、臀部並びに身体の他の任意の領域に対する、脂肪移植片またはインプラントの挿入を包含する。化粧学的脂肪導入手順は、他の化粧学的な適用、例えば顔における移植、眼瞼形成術、前額引上げ、顔の引上げ、首部の引上げ、ボトックス(botox)適用、化学ピール、およびレーザーリサーフェーシング(laser resurfacing)と組合わせることができる。非-化粧学的脂肪導入手順は、括約筋の障害を治療するための、インプラントの適用、例えば胃食道、尿道および直腸括約筋への脂肪インプラントの挿入を包含する。脂肪導入手順は、また外傷(例えば、輻射による)、または柔軟組織の欠陥を誘発する疾患(例えば、腹部ヘルニア)、顔面半分の小体症、声帯の傷害および腰部脊椎障害の治療のために使用することも可能である。脂肪導入手順は、また異常脂血症、低脂肪ネクチネミア(hypoadiponectinemia)、高脂血症、脂肪増加症(lipatrophy)、高脂肪増加症(lipohypertrophy)を含むがこれらに限定されない、脂肪関連疾患または障害の治療のためにも使用できる。
【００１８】
ここで使用する用語「幹細胞」とは、様々な他の細胞型に分化する能力を持つ、多能性再生細胞を意味し、この細胞は、1またはそれ以上の特定の機能を果たし、また自己-刷新能力をもつ。ここに記載する該幹細胞の幾つかは、多能性であり得る。
ここで使用する用語「前駆細胞」とは、1またはそれ以上の細胞型に分化する能力を持つ、多能性再生細胞を意味する。ここで使用する用語「前駆細胞」は、また単一の細胞型のみに分化する能力を持つ、単一分化性再生細胞をも意味し、これは1またはそれ以上の特定の機能を果たし、また制限された自己-刷新能力を持つか、あるいはこれをもたない。特に、ここで使用する用語「内皮前駆細胞」とは、血管の内皮細胞に分化する能力を持つ多能性または単一分化性細胞を意味する。
ここで使用する用語「プリカーサ細胞」とは、一つの細胞型に分化する能力を持つ、単一分化性再生細胞を意味する。プリカーサ細胞およびその子孫は、広範な増殖能力を保持することができ、例えば適当な条件下で増殖できるリンパ細胞および内皮細胞を挙げることができる。
【００１９】
ここで使用する用語「脈管(血管)形成」とは、既存の脈管系および組織から、新たな血管が発生する過程を意味する(Folkman, 1995)。成句「修復または改造」とは、既存の血管系の再形成を意味する。組織乏血の緩和は、厳密に血管形成に依存する。新たな血管の一時的な成長は、乏血領域およびその周りにおける並立の循環路を与え、血流を改善し、この乏血により生じる症状を軽減する。血管形成によって媒介される疾患および傷害は、急性心筋梗塞、虚血性心筋症、末梢血管障害、虚血性発作、急性細管壊死、虚血性創傷-含有AFT、敗血症、虚血性腸疾患、糖尿病性網膜症、神経障害および腎障害、血管炎、虚血性脳障害、勃起不能-生理状態、虚血性または外傷性脊髄損傷、多臓器疾患、虚血性歯肉疾患、および移植関連性虚血症を包含する。
【００２０】
ここで使用する用語「脈管形成因子」または「脈管形成タンパク質」とは、既存の脈管系からの新たな血管の発生(脈管形成)を促進することのできる、あらゆる公知のタンパク質、ペプチド、またはその他の薬剤を意味する。本発明で使用する適当な脈管形成因子は、胎盤成長因子(Luttun等 2002)、マクロファージコロニー刺激因子(Aharinejad等 1995)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(Buschmann等 2003)、血管内皮成長因子(VEGF)-A、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E(Mints等 2002)、ニューロピリン(neuropilin) (Wang等 2003)、線維芽細胞成長因子(FGF)-1、FGF-2(bFGF)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6(Botta等 2000)、アンギオポエチン(Angiopoietin) 1、アンギオポエチン2(Sundberg等 2002)、エリスロポエチン(Ribatti等 2003)、BMP-2、BMP-4、BMP-7(Carono & Filvaroff 2003)、TGF-β(Xiong等 2002)、IGF-1(Shigematsu等 1999)、オステオポンチン(Osteoponpontin) (Asou等 2001)、プレイオトロピン(Pleiotropin) (Beecken等 2000)、アクチビン(Activin) (Lamouille等 2002)、エンドテリン(Endothelin)-1 (Bagnato & Spinella 2003)およびこれらの組合せを含むが、これらに限定されない。これらの脈管形成因子は、独立にまたは相互の組合せで作用させることができる。組合せで使用する場合、脈管形成因子は、また相乗的に作用することができ、結果として該因子の組合わせた効果は、別々に摂取した際の、個々の因子の効果の単なる和よりも大きい。該用語「脈管形成因子」または「脈管形成タンパク質」とは、このような因子の機能的類似体をも包含する。機能的類似体は、例えばこれら因子を含む機能性タンパク質を包含する。機能的類似体は、また該因子のレセプタと結合する抗-イディオタイプ抗体をも含み、従って脈管形成および/または組織改造を促進する上で、該因子の活性を模倣する。このような抗-イディオタイプ抗体を生成する方法は、当分野において周知であり、例えばWO 97/23510に記載されている。この特許の内容全体を本発明の参考とする。
【００２１】
本発明において使用する脈管形成因子は、製造できるか、あるいは任意の適当な製造元から入手できる。例えば、これら因子は、その本来の源から精製するか、合成により製造するか、あるいは組換え体の発現によって製造できる。これら因子は、タンパク質組成物として患者に投与することができる。あるいはまた、これら因子は、該因子をコードする発現プラスミドとして、投与することができる。適当な発現プラスミドの構築は、当分野において周知である。発現プラスミドを構築するための適当なベクタは、例えばアデノウイルスベクタ、レトロウイルスベクタ、アデノウイルス-伴性ウイルスベクタ、RNAベクタ、リポソーム、カチオン性脂質、レンチウイルスベクタおよびトランスポゾンを含む。
ここで使用する用語「幹細胞数」または「幹細胞頻度」とは、脂肪細胞由来の細胞(ADC)を、低細胞密度(<10,000細胞/ウエル)で配置し、またMSC成長を維持する生育媒体(例えば、10%の牛胎児血清、5%のウマ血清、および抗生物質/抗-真菌剤を補充した、DMEM/F12培地)中で生育させる、コロニー形成(colonogenic)アッセイにおいて観測されるコロニー数を意味する。細胞を2週間増殖させ、その後培養物をヘマトキシリンで染色し、50細胞を越えるコロニーをCFU-Fとして計数する。幹細胞頻度は、播種した100個の密集細胞当たりに観測されるCFU-Fの数(例えば、1000個の密集ADC細胞で開始した平板培養において計数された15コロニーは、1.5%なる幹細胞頻度を与える)。幹細胞数は、得られた密集ADC細胞の総数を乗じた幹細胞頻度として算出される。ADC細胞から成長したCFU-Fの高い百分率(〜100％)は、細胞表面分子CD105を表し、これはまた骨髄由来の幹細胞によって表される(Barry等 1999)。CD105は、また脂肪組織由来の幹細胞により表される(Zuk等 2002)。
【００２２】
ここで使用する用語「脂肪組織」とは、脂肪を貯蔵する結合組織を含む脂肪を意味する。脂肪組織は、ASCsおよび内皮前駆およびプリカーサ細胞を含む、多数の再生細胞型を包含する。
ここで使用する用語「脂肪組織の単位」とは、脂肪組織の個々のまたは測定可能な量を意味する。脂肪組織の単位は、該単位の質量および/または体積を測定することによって測定することができる。上で同定したデータに基いて、患者から取出された如き、処理された脂肪組織の単位は、細胞成分を含み、ここで該細胞成分の少なくとも0.1%が幹細胞であり、従ってこれは、少なくとも0.1%なる、上記のようにして決定された幹細胞頻度を持つ。本明細書の開示に照らして、脂肪組織の単位は、患者から取出された脂肪組織の全量、または患者から取出された脂肪組織の全量よりも少ない量を意味することができる。このようにして、脂肪組織の単位を、脂肪組織に関する別の単位と結合して、個々の単位の総和に当たる質量または体積を持つ、脂肪組織の単位を形成することができる。
ここで使用する用語「部分(portion)」とは、ある物質の全体よりも小さな量を意味する。少量部分とは、50%に満たない量を意味し、大量部分とは、50%を越える量を意味する。従って、患者から取出された脂肪組織の全量よりも少ない、脂肪組織の単位は、該取出された脂肪組織の一部分である。
【００２３】
ここで使用する用語「処理した脂質吸引」とは、処理することによって、成熟脂肪細胞および結合細胞由来の、活性な細胞成分(例えば、幹および前駆細胞を含む成分)が分離されている脂肪組織を意味する。この部分は、ここでは「脂肪(組織)由来の細胞」または「ADC」と呼ぶ。典型的にADCは、該脂肪組織から該細胞を洗い流し、かつ分離することによって得られる、再生細胞のペレットを意味する。このペレットは、典型的に細胞の懸濁液を遠心分離処理し、該細胞を、遠心分離機チャンバーのまたは細胞濃縮機の底部分に凝集させることによって得られる。
ここで使用する用語「投与(する)(administering)」、「導入(する)(introducing)」、「送達(する)(delivering)」、「配置(placement)」および「移植(する)(transplanting)」、とは、ここでは互換的に使用され、本発明のADCを、所定サイトへのADCの少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路によって、対象内に配置することを意味する。このADCは、任意の適当な経路によって投与することができ、該経路は、該対象内の所定の位置に、該細胞を送達し、そこで該細胞またはその成分の少なくとも一部は生存状態に維持される。対象への投与後の、該細胞の生存期間は、数時間程度、例えば24時間程度から、数日までの短期間、数年程度までの長期間であり得る。
【００２４】
ここで使用する用語「対象」とは、温血動物、好ましくはヒトを含む哺乳動物を包含する。好ましい態様において、該対象は、霊長類である。より一層好ましい態様において、該対象は、ヒトである。
次に、現時点において好ましい本発明の態様を、詳細に論じるが、その例は、添付図面に示されている。これら図面および説明において、可能な場合には、常に同一のまたは類似の参照番号を、同一のまたは類似の部品に対して使用する。これら図面は単純化された状態にあり、正確な縮尺で描かれているわけではないことに注意すべきである。ここにおける開示に関連して、便宜および明確化のみの目的で、方向に係る用語、例えば上部、底部、左、右、上、下、上部、上方、下方、背後、後方および前方は、添付した図面に関して使用される。このような方向に係る用語は、本発明の範囲を何等制限するものではないと理解すべきである。
【００２５】
本明細書の開示では、幾つかの例示した態様に言及するが、これらの態様は、例として提示されるのであり、限定のために提示するのではないものと理解すべきである。例示的な態様について論じているが、以下の詳細な説明の目的は、添付した特許請求の範囲によって規定されるような、本発明の精神および範囲に入ると考えられる、上記態様の改良、代替、および等価なもの全てをカバーするものである。本発明は、当分野において従来利用されている、様々な細胞または組織分離技術を利用して実施でき、またここには、本発明の理解のために必要とされるような、一般的に実施されている処理段階のみが含まれる。
本明細書において前に述べた如く、再生細胞、例えば幹細胞および前駆細胞は、広範囲に渡る組織から収穫することができる。本発明の装置は、このような全ての細胞について使用することができる。しかし、脂肪組織は、特に再生細胞に富む源である。従って、限定ではなく、例示として、脂肪組織を再生細胞の源として利用して、本発明の装置を、ここに例示する。
【００２６】
脂肪組織は、当業者には公知の任意の方法により得ることができる。例えば、脂肪吸入(シリンジまたは動力補助)または脂肪組織切除術、例えば吸引補助脂肪形成術、超音波補助脂肪形成術、および切除による脂肪組織切除術、またはこれらの組合わせによって、脂肪組織を患者から取出すことができる。該脂肪組織は、再生細胞を分離し、高密度化(濃厚化)する目的でここに記載される、本発明の装置によって取り出し、捕集し、かつ処理される。集められた組織の量は、ドナーの体重指数および年齢、採集に利用できる時間、入手し易い脂肪組織収穫サイトの入手性、随伴するおよび既に行われている薬剤処理および条件(例えば、抗-凝集剤治療)、および該組織を集める臨床的な目的等の様々な因子に依存する。例えば、痩せた個人から抽出した100mlの脂肪組織中の、幹細胞の割合は、肥満したドナーから抽出した場合の割合よりも高い(表1参照)。このことは、該肥満した個人における高い脂肪含有率の稀釈効果を反映しているものと考えられる。従って、本発明の一局面によれば、より痩身の患者から取出すべき量と比較して、体重過大のドナーからは、より多量の組織を得ることが望ましいものと考えられる。この観測は、また本発明の利用性が、多量の脂肪組織を含む個人のみに限定されるものではないことを示している。
【００２７】
【表１】
2007536941.tif 000003
【００２８】
該脂肪組織を処理した後に、得られる再生細胞は、実質的に成熟脂肪細胞および結合組織を含まないものである。従って、本発明の装置は、異種の多数の脂肪由来の再生細胞を発生し、これらは研究および/または治療の目的で使用することができる。好ましい態様において、これらの細胞は、該レシピエントの身体内に配置または再注入するのに適している。他の態様では、これら細胞は、研究のために使用でき、例えばこれら細胞を用いて、長期間に渡り生存でき、しかも更なる研究のために使用できる、幹細胞または前駆細胞系を樹立するために利用できる。
次に、現時点において好ましい本発明の態様を、詳細に論じるが、その例は添付図面に示されている。これら図面および説明において、可能な場合には、常に同一のまたは類似の参照番号を、同一のまたは類似の部品に対して使用する。これら図面は単純化された状態にあり、正確な縮尺で描かれているわけではないことに注意すべきである。ここにおける開示に関連して、便宜および明確化のみの目的で、方向に係る用語、例えば上部、底部、左、右、上、下、上部、上方、下方、背後、後方、前方、遠方および近位は、添付した図面との関連で使用される。このような方向に係る用語は、本発明の範囲を何等制限するものではないと理解すべきである。
【００２９】
本明細書の開示では、幾つかの例示した態様に言及するが、これらの態様は、例として提示されるのであり、限定のために提示するのではないものと理解すべきである。例示的な態様について論じているが、以下の詳細な説明の目的は、添付した特許請求の範囲によって規定されるような、本発明の精神および範囲に入ると考えられる、上記態様の改良、代替、および等価なもの全てをカバーするものである。本発明は、当分野において従来利用されている、様々な医学的手順と共に利用できる。
添付図を参照すると、本発明の装置10は、一般的に1またはそれ以上の組織採集チャンバー20、処理チャンバー30、廃棄チャンバー40、排出チャンバー50およびサンプルチャンバー60で構成される。これら様々なチャンバーは、1またはそれ以上の導管12を介して一緒に結合され、結果として生物学的物質を含む流体が、あるチャンバーから別のチャンバーに流れ、一方閉じた、無菌流体/組織通路を維持することができる。該導管は、ここでは互換的に内腔または管路と呼ばれる、例えば臨床的なセッティングにおいて従来から使用されているポリエチレン管路等の、剛性または可撓性の本体を含むことができる。使用する可撓性の管路は、崩壊の可能性を減じるために、負圧に耐え得るものである必要がある。使用する可撓性の管路は、この装置内で使用することのできる、容積式ポンプ等によって発生する正の圧力に耐え得るものである必要がある。
【００３０】
この装置のチャンバー全ては、1またはそれ以上の口、例えば出口22または入口21を含むことができ、これらは標準的なIVシリンジおよび吸入管路接続を受容れる。これらの口は、ゴムセプタム密閉シリンジニードルアクセス口51等の封止された口であり得る。該入口は、導管によって、1またはそれ以上のカニューレ(図示せず)と接続できる。例えば、組織入口21は、一体化された単一用途の脂肪吸入カニューレと結合しており、また該導管は、可撓性の管材料であり得る。これらの導管は、一般的にこの装置の一方のチャンバーから他方への、流体通路を与えるために配置されている。その末端に向かって、該管路および口は、例えば手動でまたは自動的に動作できる、吸引デバイス(図示せず)に接続することができる。この吸引デバイスは、例えばシリンジまたは電動ポンプであり得る。該吸引デバイスは、患者から組織を吸引するのに十分な負圧を設定できるものであるべきである。一般に、当業者、例えば外科医には公知の任意の適当な吸引デバイスを使用することができる。
【００３１】
導管12は、更に1またはそれ以上のクランプ(図示せず)を含み、該装置の様々な部品内の物質の流れを調節することができる。該クランプは、この装置の様々な領域を効果的に封止することにより、該装置の無菌性を維持するのに有用である。あるいはまた、導管12は、この装置を流通する物質の流れを調節する、1またはそれ以上のバルブ14を含むことができる。添付図において、これらのバルブ14は、白抜きの丸として示されている。好ましい態様において、これらバルブは、電気機械式ピンチ弁であり得る。他の態様では、これらバルブは、空気弁であり得る。更に別の態様では、これらのバルブは、油圧調整弁または機械式バルブであり得る。このようなバルブは、好ましくはレバーに接続できる制御装置によって動作させる。該レバーは、手動で扱って、動作させることができる。自動化した態様においては、該制御装置は、該レバー並びに予め決められた動作条件にて、該バルブを作動できる、処置デバイスと接続することができる。幾つかの自動化した態様においては、該バルブの作動は、部分的に自動化し、かつ部分的に該処理を最適化できるように、ユーザーの選択に付すことができる。更に他の態様では、幾つかのバルブを、手動で動作させ、かつその他のものを、該処理装置を介して自動的に動作させることも可能である。バルブ14は、また1またはそれ以上のポンプ、例えば蠕動ポンプ34または容積式ポンプ (図示せず)と接続して使用することができる。導管12およびバルブ14は、光学センサ、超音波センサ、圧力センサ、またはこの装置を流通する様々な流体成分および流体レベル間の識別を可能とする、当分野において公知の他の監視形態等の、センサ29を含むこともできる。好ましい態様において、センサ29は光学センサであり得る。
【００３２】
この装置は、また複数のフィルタ36をも含むことができる。幾つかの態様では、該フィルタは該装置28のチャンバー内に存在し得る。この装置内の様々なチャンバーが、様々なフィルタを含むことができる。これらのフィルタは、この装置に従って使用することのできる分解剤および望ましからぬ細胞から、幹細胞および/または前駆細胞等の再生細胞を分離するのに有効である。一態様において、フィルタアセンブリー36は中空繊維製の濾過デバイスを含む。他の態様では、フィルタアセンブリー36は浸透式濾過デバイスを含み、これを沈降法と組合わせて使用しても、またこのような態様で使用しなくても良い。更なる態様において、フィルタアセンブリー36は遠心分離デバイスを含む、これをエルトリエーションデバイスおよび方法と共に使用しても、またこのような態様で使用しなくても良い。更に別の態様では、この装置は、これら濾過デバイスの組合せを含む。本発明の装置の濾過機能は、最終的濃縮物から、コラーゲン、遊離脂質、遊離脂肪細胞および残留するコラーゲナーゼ等の物質を除去する幾つかのフィルタによる濾過、および最終生成物を濃縮するのに使用する他のフィルタによる濾過を含む、二重のものであり得る。この装置のフィルタは、20~800μmなる範囲の、径および/または長さを持つ、複数の口を持つことができる。好ましい態様において、採集チャンバー20は、80~400μmなる範囲の、複数の口を持つ、予め固定したフィルタ28を持つ。好ましい他の態様では、採集チャンバー20は、複数の265μmの口を持つ、予め固定したフィルタ28を持つ。他の態様では、このフィルタは、着脱自在および/または使い捨て可能である。
【００３３】
この装置は、また1またはそれ以上の温度制御デバイス(図示せず)を備えていても良く、これはこの装置の1またはそれ以上のチャンバー内に含まれている物質の温度を調節するために設けられている。この温度制御デバイスは、ヒータ、冷却器またはこれら両者、即ちヒータと冷却器との切替が可能なものであり得る。この温度デバイスは、組織、分解剤、再懸濁剤、濯ぎ剤、洗浄剤またはそのための添加剤を含む、この装置を流通する何れかの物質の温度を調節できる。例えば、脂肪組織の加熱はその分解を容易にし、一方該再生細胞出口の冷却は、その生存性を維持するのに望ましい。また、組織の最適処理のために、予備的に加温した試薬が必要とされる場合には、この温度デバイスの役割は、該温度の増減というよりも、予め決められた温度を維持することである。
閉じた、無菌流体/組織流路を維持するために、全ての口およびバルブは、この装置の封止された構成を維持するクロージャーを含むことができる。このクロージャーは、流体、空気および他の混入物に対して不透過性の膜であり得、あるいはこれは当分野において公知の任意の他の適当なクロージャーであり得る。更に、この装置の全ての口は、この装置の無菌性を害すること無しに、該チャンバー内の物質を取出すための、シリンジ、針またはその他のデバイスを収容できるように設計することができる。
ここに示すように、当分野において認識されている任意の方法により、患者から組織を取出すことができる。吸引された組織は、12a等の導管を介して、採集チャンバー20に移され、そこで洗浄並びに消化される。該吸引された組織は、典型的に封止された導入口、例えばゴムセプタムで密閉されたシリンジ針アクセス口(採集チャンバーには示されていない)を介して、採集チャンバー20に入る。
【００３４】
この採集チャンバー20は、複数の可撓性または剛性のキャニスタまたはシリンダもしくはこれらの組み合わせを備えていても良い。例えば、この採集チャンバー20は、1またはそれ以上の、変動するサイズを持つ、剛性キャニスタを備えていても良い。この採集チャンバー20は、また1またはそれ以上の可撓性バッグを備えていても良い。このような装置において、該バッグは、これに吸引力が印加された際に、その崩壊の可能性を低減するのに役立つ、内部または外部フレーム等の支持体を備えていることが好ましい。該採集チャンバー20は、処理チャンバー30内で行われる工程の、洗浄並びに濃縮段階に先立って、該組織を適当に洗浄し、消化するのに必要とされる量の塩水を維持するようなサイズを持つ。該採集チャンバー20内に存在する組織または流体の体積は、肉眼によって容易に確認できる。例えば、脂肪組織から再生細胞を分離し、高密度化するために、適当な採集チャンバーは、800mLの脂肪吸引体および1200mLの塩水を保持できる容量を持つ。従って、一態様において、該採集チャンバー20は、少なくとも2Lの容量を持つ。別の態様では、血液から赤血球を分離し、かつ濃縮するために、該採集チャンバー20は、少なくとも1.5Lの容量を持つ。一般に、この採集チャンバー20のサイズは、患者から集める組織の型および量に依存して変動する。該採集チャンバー20は、約5mLという小さな容量から、約2Lまでの組織を維持するようなサイズを持つことができる。より少量の組織体積、例えば5~100mLに対して、該組織は、該採集チャンバー20に移す前に、シリンジ内に集めることができる。
【００３５】
該採集チャンバー20は、滅菌可能な、任意の適当な生体適合性材料を用いて、構築することができる。好ましい態様において、この採集チャンバー20は、ISO 10993規格に記載された如き、血管内接触に関する生体適合性を満足する、使い捨て可能な材料で造られる。例えば、ポリカーボネート、アクリル樹脂またはABSを使用することができる。該採集チャンバー20の流路は、好ましくは発熱物質を含まず、即ち疾患媒介の危険性無しに、血液について使用するのに適したものである。一態様において、該採集チャンバー20は、その中に存在する組織のおよその体積を、ユーザーが視覚的に決定することを可能とする材料で作られる。他の態様では、該採集チャンバー20内の組織および/または流体の体積は、自動化されたセンサ29によって測定される。該採集チャンバー20は、好ましくは、該自動化装置が、妥当な精度で、該チャンバー内の組織および/または流体の体積を測定できるように設計される。好ましい態様において、この装置は、±15%なる精度で、該採集チャンバー内の体積を検知する。
【００３６】
例示のみの目的で与えられる、特定の一態様において、該採集チャンバー20は、例えばメッシュサイズ265μmの、医学的グレードのポリエステル製の、ほぼ円錐型の予め固定されたフィルタ28を含む、医学的グレードのポリカーボネートで作られたチャンバー等の、剛性チャンバー形態にある。この剛性組織採集容器は、高さ約20.3cm(約8 in)および径約12.7cm(約5 in)なるサイズを持つことができ、またその肉厚は約3.18mm(0.125 in)であり得る。該シリンダの内部は、例えば1またはそれ以上の吸引チューブ用の開口、1またはそれ以上の無菌ドッキング技術により接続するためのチューブを備えた開口、および/または1またはそれ以上のゴムセプタムを介する針貫通アクセスするための開口を通してアクセスできる。該採集チャンバー20内部の予め固定されたフィルタ28は、好ましくは脂肪組織を保持し、かつ脂肪組織以外の組織、例えば患者から取出された組織を通すための構造を持つ。より詳しくは、該フィルタ28は、脂肪組織の最初の収穫の際に、または別の態様では、該収穫の後に、該脂肪組織のフラグメントを維持しつつ、遊離脂質、血液および塩水の通過を可能とする。この点に関連して、このフィルタ28は、同一または異なるサイズを持つが、約20μm〜5mmなる範囲の径を持つ複数の開口を含む。好ましい態様において、このフィルタ28は、複数の400μmの開口を含む。好ましい態様において、このフィルタ28は、約200μmの肉厚、口径約265μmおよび約47％の開口率を持つ、医学的グレードのポリエステル製メッシュである。この材料は、洗浄中該組織を保持するが、組織の分解に伴って、細胞の該メッシュの通過を可能とする。従って、患者から組織を吸引した場合、脂肪組織以外の組織は、脂肪組織から分離することができる。同様な機能性を、異なる材料、メッシュサイズ、および開口の数および型に応じて達成できる。例えば、100μm未満または数千μm程度の大きなメッシュの孔径が、同様に、塩水および赤血球を通過し、一方で脂肪組織凝集体およびフラグメントを保持するように達成できる。同様に、同一の目的は、交互の剛性プラスチック材料の使用または当業者には公知の多くの他の改良法によって達成し得る。
【００３７】
該採集チャンバー20は、更に該組織を洗浄する手段並びに該組織を混合しおよび/または分解するための手段を備えていても良い。撹拌により、該組織を洗浄し、混合しまたは分解して、細胞の生存性を最大にし、かつ放出される遊離脂質の量を最小化することができる。一態様において、該組織は、様々な角度(例えば、約45度〜約90度)の弧によって、種々の速度、例えば約30rpmにて、該採集チャンバー20全体を回転させることによって撹拌する。他の態様では、様々な角度(例えば、約45度〜約90度)の弧によって、種々の速度、例えば約30rpmにて、該採集チャンバー20全体を回転させることによって、該組織を撹拌する。ここで、該採集チャンバー20は、その内側表面にしっかりと結合した、1またはそれ以上のパドルまたは突出部を備えている。幾つかの態様において、パドル25aまたは突出部がしっかりと結合している、該採集チャンバー20の内側表面は、予め固定されたフィルタ28である。他の態様では、該採集チャンバー20の内側表面は、予め固定されたフィルタ28のフィルタケージ27である。
【００３８】
該採集チャンバー20の回転は、該チャンバーに取付けられた、またはその近傍にある駆動機構によって達成し得る。該駆動機構は、簡単なベルトまたはギアーあるいは当分野において公知の他の駆動機構であり得る。この回転速度は、例えば30rpmであり得る。一般に、より高い速度は、より大容量の遊離脂質を生成し、また最適であるとはいえないことが分かっている。他の態様では、該組織を、該採集チャンバー20の内部に回転シャフト25を配置することによって撹拌するが、この回転シャフトは、その回転に伴って該混合物が通過する、該シャフトにしっかりと取付けられた、1またはそれ以上のパドル25aまたは突出部を備えている。幾つかの態様において、しっかりと取付けられたパドル25aを備えている、該回転シャフト25は、該採集チャンバー20の底部において静止していても良い。これは、例えば該パドル-様のデバイスを、旋回する磁場(例えば、磁気撹拌子)内に配置することによって実現できる。あるいはまた、該組織の撹拌は、当業者において公知の簡単な撹拌器、即ち回転すること無しに、上下に振とうを行うデバイスによって、実施することができる。
図5に示した、この装置の採集チャンバー20の一例は、ユーザーが補充したカニューレを用いて、ユーザーが組織を取出すことを可能とする、該チャンバーから空気を排気するのに使用できる、真空ライン11；入口21；廃液を排出しまたは除去するための出口22；およびパドル-様デバイスを持つ回転シャフト25を備えていても良い。ここで、該パドル-様デバイスでは、1またはそれ以上のパドル25aが、磁気撹拌子(図示せず)を用いた組織撹拌用の、予め固定したフィルタ28のフィルタケージ27に厳重に取付けられている。
【００３９】
この装置10は、また1またはそれ以上の洗浄溶液源22を備えていても良い。この洗浄溶液源は、塩水源23、および組織分解剤源24、例えばコラーゲナーゼを含むことができる。該洗浄溶液は、塩水または任意の他の緩衝された、または緩衝されていない電解液を包含する、当業者において公知の任意の溶液であり得る。使用可能な分解剤は、中性プロテアーゼ、コラーゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、ブレンザイム(Blendzyme)酵素混合物群の一員、例えばリベラーゼ(Liberase) H1、ペプシンおよび/またはこれらの組合せを含む。処理すべき組織の型は、使用する洗浄溶液の型または組合せを、指定するであろう。典型的に、塩水等の洗浄溶液は、患者から脂肪組織を取出した後に、該採集チャンバー20に入る。しかし、この洗浄溶液は、該脂肪組織を抽出する前に、あるいは該脂肪組織の取出し中に、該採集チャンバー20に送達することができる。該採集チャンバー20において、該洗浄溶液および該抽出された脂肪組織は、上記方法を含む任意の手段により混合できる。
該塩水23用の容器および/または該分解剤24用の容器は、その内容物を無菌状態に維持することのできる、任意の適当な容器、例えば崩壊性のバッグ、例えば臨床的セッティングにおいて使用されているIVバッグであり得る。これら容器は、該採集チャンバー20と結合した、導管12e等の導管12を有し、結果的に該塩水および/または該分解剤を、該採集チャンバー20の内部に送達することができる。該塩水および/または該分解剤は、任意の当分野において認識されている方法で、該採集チャンバー20内部に送達することができる。該当分野において認識されている方法は、該塩水23用の容器および/または該分解剤24用の容器の外側に、単純な重力圧を印加すること、あるいは該導管、例えば図4における導管12dに、容積式ポンプを設けることを含む。
【００４０】
該採集チャンバー内の組織および/または流体は、30〜40℃なる範囲の温度に維持すべきである。好ましい態様において、該採集チャンバー内の該懸濁液の温度は、37℃に維持される。幾つかの態様では、外科的手順または治療上の適用を遅らせる必要がある場合、選択された該組織は、後の使用のために保存することができる。該組織は、室温にて、あるいはその近辺で、または約4℃にて96時間まで保存することができる。
該分離および濃縮工程を補助するために、該採集チャンバー20は、該チャンバー内の弾性または非-弾性液体の識別を可能とする。この装置の自動化された態様においては、該採集チャンバーは、該弾性および非-弾性液体の界面に達した場合に、その検出を可能とするセンサ29を含むことができる。例えば、このセンサ29は、該採集チャンバーの流体出口通路を流れる流出液の、光の屈折率における変化を検出し、該装置の処理デバイスにシグナルを送り、該装置と結合している該処理デバイスに従って、1またはそれ以上のポンプおよび/またはバルブを動作させまたは停止させることのできる、光学的センサであり得る。
【００４１】
該弾性層は、更なる洗浄および濃縮を要する、該再生細胞で構成されるので、該採集チャンバー20は、好ましくは該チャンバーの最も低い位置における出口22を有し、そのため血液および該組織の他の非-弾性成分を、廃液容器に排出できる。従って、該採集チャンバー20を、ここに記載する1またはそれ以上の導管12を介して、1またはそれ以上の廃液容器40と結合して、該採集チャンバーからの廃液を、この装置から排出または除去することを可能とする。この排液は、受動的または能動的の何れであっても良い。例えば、上記の非-弾性成分は、重力を利用して、正のまたは負の圧を印加して、ポンプ34を使用して、あるいはベント32を利用して排出することができる。該採集チャンバーは、出口22が、該採集チャンバーの底部に、またはその近傍に位置するように配置することができる。該採集チャンバーは、好ましくは、例えば15秒〜数分間またはそれ以上、脂肪組織の浮遊を可能とする、この配向で配置される。自動化された態様において、この装置の処理デバイスは、ユーザーによって初めに入力されたデータ(例えば、処理すべき組織の体積)に基いて、様々なパラメータ、例えば該組織を洗浄するのに必要な塩水の体積および該組織を洗浄するのに必要な時間を計算する。この処理デバイスの制御論理に基いて、幾つかのバルブおよび/またはポンプを、動作または停止させて、該採集チャンバー20からの廃液を、この装置から除去する。光学センサ等のセンサ29は、この装置の該処理デバイスにシグナルを送って、この組織処理における次の段階を進めることができる。
【００４２】
好ましい態様において、該採集チャンバー20は、塩水および試薬を、無菌的に該組織に添加することを可能とする、閉じた流体流路を備えている。従って、該採集チャンバー20は、更に、ほぼ組織および流体の自由な通過を可能とするサイズとされた、可撓性または剛性の導管等の導管12を備えている。好ましい態様において、該導管12は、チューブ形状にある。該導管12は、流体または組織の何れの通過が望まれるかに依存して、そのサイズを変えることができる。該導管12は、またこの装置に循環させる組織または流体の量に依存して、そのサイズを変えることができる。例えば、流体を流通させるために、該導管は、約1.52mm(約0.060 in)〜約19.1mm(約0.750 in)なる範囲の径を持つことができ、また組織を通すためには、約0.792cm(0.312 in)〜約1.91cm(0.750 in)なる範囲の径を持つことができる。一般的に、該導管のサイズは、該導管の収容できる体積と、該導管を介して該組織または流体を輸送するに要する時間とを釣合わせるように選択される。この装置の自動化された態様では、上記パラメータ、即ち輸送体積およびその時間は、適当なシグナルが該装置の処理デバイスに伝達できるように関連付けられる。これは、該デバイスによる、一方のチャンバーから他方のチャンバーへの、正確な体積の液体および組織の移動を可能とする。
【００４３】
該採集チャンバー20は、また該洗浄した脂肪組織の、処理チャンバー30への取出しをも可能とする。従って、洗浄された脂肪組織の移動および貯蔵のために、該採集チャンバー20を、必要な管路12、バルブ14およびポンプ34と接続する必要がある。更に、該採集チャンバー20は、典型的に、該洗浄溶液の、該チャンバーの内部への放出を可能とする、1またはそれ以上の開口21、および廃液および他の材料を、該採集チャンバー20の外部に導くことを可能とする、1またはそれ以上の開口22を含む。例えば、該採集チャンバーは、本明細書に記載したように、1またはそれ以上の封止された導入口を含むことができる。該採集チャンバー20は、また1またはそれ以上のキャップ(図示せず)、例えば上部キャップおよび底部キャップを含むことができ、これにより該装置を無菌状態に維持し、しかも洗浄溶液を該採集チャンバーに放出し、および/または廃液を外部に送ることが、更に保証されることになる。該開口21は、該採集チャンバーのキャップ上に、あるいは該採集チャンバーの側壁上に設けることができる。
【００４４】
新鮮な洗浄溶液による洗浄工程は、該溶液中の非-弾性混入物の残留含量が、所定のレベルに達するまで繰り返すことができる。換言すれば、脂肪組織のフラグメントを含む、上記混合物の弾性物質を含有する、該採集チャンバー20内に残留する物質は、望ましからぬ物質の量が、所定の予め定められたレベルに達するまで、更に1回またはそれ以上に渡り、洗浄することができる。この洗浄の終点を決定する一つの方法は、該組織溶液中の赤血球の量を測定することである。これは、波長540nmにおける光の吸収を測定することによって達成できる。好ましい態様において、約0.546〜約0.842なる範囲が、許容できるものである。
所定回数の洗浄サイクル後、組織分解剤を、該採集チャンバー20に放出して、残留する脂肪組織性分を消化する。上記のような塩水源23から放出される塩水は、上記のようなコラーゲン源24から放出されるコラーゲンの添加と共に、あるいは該添加後即座に、該脂肪組織に添加することができる。次いで、該洗浄した脂肪組織および該組織分解剤を、上記撹拌法と同様な方法で、該洗浄した脂肪組織が分解されるまで、撹拌することができる。例えば、該洗浄した脂肪組織および該組織分解剤は、約90度の弧によって該採集チャンバー全体を回転することにより、1またはそれ以上のパドルを含むシャフトを設けることにより、ここで該パドルは、該シャフトの回転に伴って該溶液を通過し、および/または該採集チャンバーの内側表面にパドルまたは突出部を含む、該採集チャンバー全体を回転することにより、撹拌することができる。
一態様において、該脂肪組織フラグメントは、37℃にて、またはその近傍の温度にて、約20-60分間に渡り、コラーゲナーゼ-含有酵素溶液と混合する。他の態様では、より高濃度のコラーゲナーゼまたは同様な試薬を添加して、該消化時間を減らすことができる。上記と同様に、次に該採集チャンバー20を、直立位置に配置して、弾性細胞および組織フラグメントが浮遊するのに十分な時間、出口開口22を、該採集チャンバーの底部に位置させる。典型的に、この時間は約15秒〜数分の範囲にあるが、変更した態様において、それ以外の時間を使用しても良い。
【００４５】
該脂肪由来の細胞を使用する目的に応じて、該脂肪組織は、部分的に分解するか、あるいは完全に分解することができる。例えば、該脂肪由来の細胞を、脂肪組織の単位と組み合わせる態様においては、該収穫した脂肪組織を部分的に分解して、該部分的に分解された脂肪組織の一部を取出し、次いで該採集チャンバー内に残されている脂肪組織の残留部分の分解を続ける。あるいはまた、洗浄した脂肪組織の一部を取り出し、任意の消化に先立って、サンプル容器内に保存しておく。他の態様では、収穫した脂肪組織を部分的に分解して、患者に再度戻す前に、細胞を高密度化する。一態様においては、該脂肪組織を、一般的に約20分未満の期間、組織分解剤と混合する。該部分的に分解した組織の一部を、次に該採集チャンバーから取り出し、残りの部分的に分解した組織を、該脂肪組織と組織分解剤とを、追加の40分間に渡り混合することによって、更に分解することができる。該脂肪由来の細胞を、本質的に純粋な再生細胞集団として使用する場合、該脂肪組織は十分に分解することができる。
【００４６】
この洗浄並びに分解中に、必要に応じて、十分な結果を得るために、1またはそれ以上の添加剤を、様々な該容器に添加することができる。添加剤の幾つかの例は、洗浄および分解を最適化する薬剤、処理中の該活性な細胞集団の生存性を高める添加剤、抗-微生物剤(例えば、抗生物質)、脂肪細胞および赤血球を溶解する添加剤、または対象とする細胞集団を濃厚化する(固相部分に対する特異的接着により、あるいは細胞集団の実質的な減少またはその高密度化を促進することにより)添加剤を含む。その他の可能な添加剤は、再生細胞の回収率および生存性を高める添加剤(例えば、カスパーゼ阻害剤)または浸出または据付の際の有害な反応の起こる可能性を減じる添加剤(例えば、細胞または結合組織の再凝集に対する阻害剤)を含む。
十分なセッティング時間の経過後、洗浄した脂肪組織フラグメントおよび組織分解剤を含む、生成する混合物の非-弾性画分は、再生細胞、例えば幹細胞および他の脂肪由来の前駆細胞を含むであろう。ここで論じるように、該再生細胞を含む該非-弾性画分は、処理チャンバー30に移され、そこで該脂肪由来の前駆細胞等の対象とする再生細胞は、該混合物の非-弾性画分中に存在する、他の細胞および物質から分離されるであろう。
【００４７】
従って、該処理チャンバー30を、該洗浄しかつ消化した組織懸濁液が、管路12、バルブ14およびポンプ34によって、該採集チャンバー20から該処理チャンバー30に移動するように、該装置内に配置する。該処理チャンバーは、10mL〜1.2Lなる範囲の組織/流体混合物を収容するようなサイズとなっている。好ましい態様において、この該処理チャンバーは、800mLを収容するようなサイズである。幾つかの態様において、該採集チャンバー20からの全再生細胞組成物を、該処理チャンバー30に導く。しかし、他の態様では、該再生細胞組成物の一部を、該処理チャンバー30に導き、他の一部を該装置の異なる領域、例えばサンプルチャンバー60に導いて、後に該処理チャンバー30内で処理された細胞と組み合わせる。前に本明細書において示したように、本発明の該再生細胞組成物は、脂肪組織等の組織を洗浄し、かつ少なくとも部分的に分解した後に、典型的には所定体積の液体中に存在する細胞の組成物である。換言すれば、組織分解剤と混合した後に、該採集チャンバー20から搬送される該再生細胞組成物は、幹細胞、前駆細胞、内皮プリカーサ細胞、脂肪細胞およびここに記載する他の再生細胞を包含する、多数の異なる型の細胞を含む。該再生細胞組成物は、また1またはそれ以上の混入物、例えば該脂肪組織フラグメント内に存在する、コラーゲンおよび他の結合組織タンパク質およびそのフラグメント、または該組織分解工程由来の残留コラーゲナーゼをも含む可能性がある。
【００４８】
該処理チャンバー30は、滅菌可能な任意の適当な生体適合性材料を用いて作ることができる。好ましい態様において、該処理チャンバー30は、ISO 10993規格に記載されているような、血管内接触のための、生体適合性に関する要件を満たす、使い捨て材料で作ることができる。例えば、ポリカーボネート、アクリル樹脂、ABS、エチレン酢酸ビニルまたはスチレン-ブタジエンコポリマー(SBC)を使用することができる。別の態様では、使い捨て処理チャンバーの流路は、発熱物質を含まない。該処理チャンバーは、プラスチックバッグ、例えば血液銀行において、従来から血液の処理に使用されているもの等の形態であり得；あるいは他の態様では、これは構造的に堅牢なものであり得る(図参照)。一態様において、該処理チャンバー30は、本出願人の所有する、2001年12月7日付で出願された、米国特許出願10/316,127号および2002年12月20日付で出願された、米国特許出願10/325,728号に記載されている処理チャンバーと類似のものであり得る。これら特許出願の内容全体を、本発明の参考とする。
【００４９】
幾つかの態様においては、該採集チャンバー20からの該再生細胞組成物を、該処理チャンバー30に導入し、そこで該溶液を濾過し、特定の再生細胞組成物を分離および/または高密度化する。細胞濾過法は、特定の成分および細胞を、他の異なる成分または異なる型の細胞から分離する方法である。例えば、本発明の該再生細胞組成物は、幹細胞、前駆細胞および脂肪細胞を包含する、多数の異なる型の細胞並びに該脂肪組織フラグメント内に存在する、1またはそれ以上の混入物、例えばコラーゲン、または該組織分解工程由来の残留コラーゲナーゼを含む。該処理チャンバー30内に存在するフィルタ36は、再生細胞の特定の亜群、例えば幹細胞または内皮前駆細胞等の、分離および高密度化を可能とし得る。
液体からの細胞の濾過に係る幾つかの変数は、フィルタ媒体の孔径、該孔の幾何(形状)、該フィルタの表面積、濾過すべき溶液の流動方向、膜を横切る圧力、特定の細胞集団の稀釈率、粒径および形状並びに細胞の大きさおよび細胞の生存率を含むが、これらに制限されない。本明細書の開示に従って、分離または濾過することが望まれる特定の細胞は、典型的に脂肪由来の幹細胞である。しかし、幾つかの態様においては、該特定の細胞は、脂肪由来の前駆細胞、例えば内皮プリカーサ細胞単独または該幹細胞との組み合わせを含む。
【００５０】
該再生細胞組成物は、フィルタアセンブリー36等のフィルタアセンブリーにより得ることができる。幾つかの態様においては、該フィルタアセンブリー36は、複数のフィルタを含み、これらは異なる機能を果たすような、また該再生細胞組成物を、明確な部分または成分に分離するような構造とされている。例えば、該フィルタの一つは、該再生細胞組成物からコラーゲンを分離する形状とし、別の一つは、該再生細胞組成物から脂肪細胞および/または脂質成分を分離する形状とし、またその更に別の一つは、該再生細胞組成物から該組織分解剤等の残留酵素を分離する形状とすることができる。幾つかの態様においては、該フィルタの一つは、2つの機能、例えば該組成物から、コラーゲンを分離し、かつ該組織分解剤を分離する機能を果たすことができる。これら複数のフィルタは、典型的に直列形式で配列されるが、該フィルタの少なくとも一部を、並列状態に配列することも可能である。該フィルタアセンブリー36における複数のフィルタの、直列形式での配列を、図2に示す。該フィルタアセンブリー36における複数のフィルタの、並列形式での配列を、図3に示す。
【００５１】
一態様において、該フィルタアセンブリー36は、第一のフィルタ、第二のフィルタおよび第三のフィルタを含む。該第一のフィルタは、該再生細胞組成物中に存在するコラーゲン粒子を除去する形状とされている。これらのコラーゲン粒子は、典型的に約0.1μmなる径を持ち、また長さは約20μmまでであり得る。該コラーゲン粒子は、その消化に依存して、様々なサイズを持つことができる。これらは、またフィブリルであり得、従って捩れおよび屈曲部分を持つ。ここに記載するフィルタの何れも、ポリエーテルスルホン、ポリエステル、PTFE、ポリプロピレン、PVDF製または恐らくセルロースから作ることもできる。コラーゲンの濾過のためには、2つの可能な方法がある。その一つは、まず大きな粒子を除去し、一方で該細胞を通過させることである。これは、例えば10μm程度のフィルタを必要とする。第二の方法は、コラーゲンが十分に消化されているものとして、4.5μm程のより小さな孔径のフィルタを使用して、該細胞を捕獲し、一方でコラーゲンを通過させる。これは、該フィルタから離れた細胞を浮遊させる手段を必要とする。また、コラーゲン繊維を引き付け、かつ維持するフィルタを使用することも、恐らく可能である。
【００５２】
該第二のフィルタは、該再生細胞組成物中で弾性ではない、遊離の未成熟な脂肪細胞を除去するような形状とされている。一態様において、この第二のフィルタは、ポリエステルで作ることができ、また約30〜約50μmなる範囲、好ましくは約40μmの孔径を持つ。第二のフィルタと呼んではいるが、このようなデバイスの設置は、大きな細胞および粒子の、初期の除去を容易にするという意味で、第二というよりも寧ろ第一の位置にあり得る。該第三のフィルタは、該組成物中に存在する、未使用のまたは残留するコラーゲナーゼまたは他の組織分解剤を除去するような形状とされている。好ましい態様において、該コラーゲナーゼは、経時的に変質する。一態様において、この第三のフィルタは、1μmに満たない径または長さを持つ、複数の孔を含む。幾つかの態様においては、これらの孔は、1μmに満たない径を持つことができる。他の態様では、これらの孔は、10kD〜5μmなる範囲の径を持つ。幾つかの態様において、この第三のフィルタは、ここで論じるような、塩水または他の洗浄溶液の小さな体積内で、該再生細胞集団を高密度化するような形状とすることができる。現時点において好ましいが、最後のフィルタのみが、中空繊維ユニットである。これらフィルタの全てが中空繊維型のものである必要はない。該中空繊維ユニットは、好ましい態様における最後のフィルタとして使用される。というのは、これが該コラーゲンの除去において最も効果的であり、該再生細胞に対して最小の有害な作用を示すからである。このデバイスが棚アイテムを含まない集合である、一態様においては、これら3つのフィルタは、別々のハウジング内にある。第三のフィルタとして中空繊維ユニットを使用する場合には、一つのハウジング内で、該第一および第二フィルタを組合わせることも可能である。該最後のフィルタが、中空繊維構成ではない場合には、3個のフィルタ全てを、単一のハウジング内に収容できる。
【００５３】
該フィルタアセンブリー36のこれらフィルタは、該処理チャンバー30内に配置するか、あるいは該処理チャンバー30とは別の部材として与えることもできる。更に、該フィルタアセンブリー36におけるこれらフィルタは、複数の処理チャンバー内に、あるいはインライン式で与えることができる。幾つかの態様においては、該導管または管路が、処理チャンバー(1または複数)として機能できる。該処理チャンバーは、該フィルタを接続する該導管の内部体積と等しくなるように、そのサイズを減じることができる。この型の装置は、該組織溶液の体積が、適当なサイズとされている場合には、正確に機能するであろう。従って、これらの導管は、該細胞含有流体を収容することによって、該流体が該フィルタを流通する際に、該処理チャンバーとして機能することができる。この導管の体積が最小となるように注意して、該装置を準備し稼動する過程における、細胞/組織の不当な損失を防止する。
【００５４】
上記態様を参照すると、該洗浄された細胞および残留コラーゲン、脂肪細胞、および/または未消化の組織分解剤を含有する、該再生細胞組成物は、該第一のフィルタに通されて、少なくとも部分的にまたは好ましくは実質上全てのコラーゲン粒子を、該組成物から除去し、結果として該濾過された溶液中に、該コラーゲン粒子が少量でのみ存在し、好ましくは全く存在しないようにすることができる。該脂肪細胞および/または未消化の組織分解剤を含有する、該濾過後の再生細胞組成物は、次いで該第二のフィルタに通されて、該濾過後の再生細胞組成物から、少なくとも部分的にまたは好ましくは実質上全ての遊離状態の脂肪細胞を除去することができる。引続き、該未消化の組織分解剤を含有する、該2度濾過された再生細胞組成物を、ここで論じたような中空繊維濾過デバイス等の、該第三のフィルタに通して、該再生細胞組成物から、該未消化の組織分解剤を除去またはこれを減じることができる。
該三回濾過した該再生細胞組成物(即ち、該第一、第二および第三フィルタを通過した後に残される該組成物)は、次いで多数の出口に導かれるが、これらは多数の出口を含む該処理チャンバー30の一部を含むことができる。これらの出口は、所定の圧力を維持し、並びに導管を介して他の容器と接続するのに役立ち、該他の容器は、該採集チャンバー20、該産出チャンバー50、および/または廃液容器40を含むことができる。
【００５５】
一態様において、該フィルタアセンブリー36のフィルタは、中空繊維濾過部材を含む。あるいは、換言すれば、該フィルタは、フィルタ媒体で作られた、一群の中空チューブを含む。開示された装置10と共に使用できるフィルタ媒体は、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、または混合エステル材料等を含む。これら中空繊維またはフィルタ媒体の中空チューブは、該フィルタアセンブリー36の円筒状のカートリッジに収容することができる。フィルタ媒体の個々のチューブまたは繊維は、典型的に約0.1mm〜約1mmなる範囲、好ましくは約0.5mmの内径を持つ。適当な円筒状のカートリッジの径および長さは、該カートリッジ内に配置できる、フィルタ媒体の個々のチューブの数を決定するであろう。適当な中空繊維フィルタカートリッジの一例は、ファイバーフロー(FiberFloTM)タンジェンシャルフローフィルタ(Tangential Flow Filter)、カタログ#M-C-050-K(ミネソタ州、ミネアポリスのミンテック(Minntech)社)である。このフィルタ媒体の孔径は、約10kD(キロダルトン)〜約5μmなる範囲にあり、好ましい孔径は、約0.5μmである。
該中空繊維フィルタにおいて、各中空チューブは本体を含み、この本体は、第一端部、第二端部、および該本体内に位置し、また該第一端部と第二端部との間に伸びた孔を持つ。各中空チューブの本体は、複数の孔を含む。これらの孔は、一般的に、該本体内で、再生細胞組成物が、該本体の孔を流通することにより濾過され、また図12Aに示したように、濾過すべき生成物が、接線方向に該孔を通過するように配向されている。換言すれば、該液体中のより小さな粒子は、該本体の孔を介する流体の流れに対して、該孔を正接方向に流通する。該再生細胞を含む該組成物は、該組成物が濾過される際に、各中空チューブの孔を通過する。好ましくは、該組成物の流れは、各中空チューブ本体の孔に対して正接関係にある。
【００５６】
流体の接線方向の流れを利用して、該幹細胞の濾過の効率を、他の濾過技術に比して高めることができる。例えば、幾つかの濾過技術に従えば、該フィルタ媒体の孔は、該フィルタが、該流体の流れに対して垂直に配向し、結果として図12Bに示したように、濾過すべき流体の通路を遮断するように、配置される。この種の濾過では、該再生細胞組成物から濾別すべき粒子、例えば幹細胞は、該フィルタの一方の側に蓄積され、該孔を介する該流体の流れが遮断される傾向がある。この遮断は、該フィルタの効率を減じる恐れがある。更に、該細胞は、該流体の流れ並びに該フィルタの上流側に蓄積される細胞の重みによって絶えず圧縮される。これは、幹細胞の高い溶解率に導く。従って、該流体の流れが、該フィルタ内の孔の配向に対して平行である、このような濾過技術においては、大きな細胞および小さな粒子両者は、該流体が該孔を通過する際に、該フィルタ媒体に対して、望ましからぬ方向に導かれる恐れがある。結局、細胞等の、該液体中の大きな生成物は、該孔を遮断して、濾過効果を減じ、また細胞破壊またはその損傷の発生率を高める。
【００５７】
対照的に、本発明の装置10の中空繊維構成においては、濾過すべき流体は、該中空チューブの孔の内部を流動する。該フィルタ本体の孔を通過する能力を持つ該流体の部分は、該本体の内側に及ぼす、該流体の正の圧力並びに該本体の外側に働く負圧によって、該能力を発揮する。この態様において、細胞は、典型的に該流体流または他の細胞の重みによる圧力を受けることは無く、従って該幹細胞に作用する剪断力が減じられる。このように、この濾過の効率および有効性は、閉塞率における低下および再生細胞溶解率の減少によって、高められる。濾過中の、塩水および望ましからぬタンパク質分子のサイズのために、これら分子および他の小さな成分は、該中空チューブ本体の孔を、該中空チューブの外側まで通過し、該廃液容器40に導かれる。一態様において、該中空チューブフィルタ媒体の外側に真空を発生させることによって、濾過効率を高める。該再生細胞、例えば幹細胞または前駆細胞のサイズのために、これら細胞は、典型的に該本体の孔を通過できず、従って該中空チューブフィルタの内側(例えば、該チューブの孔の中に)に残され、該フィルタと該処理チャンバーとの間の導管を介して、該処理チャンバー30に、あるいは該産出チャンバー50に戻される。
【００５８】
特定の一態様において、該中空繊維フィルタは、約0.05μmなる孔径を持ち、また約550cm2なるフィルタ媒体の表面積を含む。個々の媒体チューブは、典型的に約0.5mmという径を持つ。130mLの該再生細胞組成物を処理する場合、約120mLの追加の塩水を、該組成物に添加することができる。該処理時間または濾過時間は、約8分である。該中空繊維チューブ本体の何れかの側の圧力の差(例えば、該本体孔の内側および該本体の外側の圧力差)は、貫膜圧力(trans-membrane pressure)であると考えられる。この貫膜圧力は、約0.133 kPa(約1 mmHg)〜約66.7 kPa(約500 mmHg)なる範囲内であり得、好ましい圧力は約26.7 kPa(約200mmHg)である。中空繊維濾過を利用した場合の、平均の凝集した細胞の回収率および生存率は、生細胞の約80％であり得る。
このような装置において典型的に除去される、コラーゲナーゼの量は、3なる対数的減少に等しい。例えば、該採集チャンバーから該処理チャンバーに移された、該再生細胞組成物中のコラーゲナーゼの初期濃度が0.078U/mLである場合、最終的な該再生細胞組成物の、コラーゲナーゼ濃度は、0.00078U/mLとなるであろう。このコラーゲナーゼは、該中空繊維フィルタ内で取出され、該中空繊維フィルタは、上で論じた第三のフィルタに相当する。
【００５９】
上記の1またはそれ以上の細胞濾過方法を例示する、処理チャンバーは、添付図面、特に図1-3に示されている。図1-3を参照すると、該処理チャンバー30と該フィルタアセンブリー36の濾過チャンバーとの間には、ポンプ34等のポンプが設けられている。更に、ベントおよび圧力センサ、例えばベント32および圧力センサ39が、該処理チャンバー30および該フィルタアセンブリー36と共に設けることができる。該産出チャンバー50の取付け部品を設けることも可能である。これら随意の部品(例えば、ポンプ34、ベント32、圧力センサ39、および該産出チャンバー50用の取付け部品)を、該処理チャンバー30と該フィルタアセンブリー36との間に設けて、該処理チャンバー30内に含まれる液体が、該フィルタアセンブリー36を流通する前に、これら随意の部品の1またはそれ以上を流通することが可能である。例えば、液体は、これが該フィルタアセンブリー36まで流される前に、該ポンプ34を通過することができる。あるいは、液体は、該フィルタアセンブリーを流通する前に、該圧力センサ39を通り、該装置内に濾過前の液体圧力を得ることができる。幾つかの状況下において、1またはそれ以上のこれら部品を、該処理チャンバー30の一要素、例えば図6に示されたようなベント32として設けることも可能である。例示した態様において、該圧力センサ39はライン内にあって、該フィルタアセンブリー36の濾過チャンバーに入った際に、ポンプ34によって発生する、該再生細胞組成物の圧力を測定する。この構成は、該フィルタ膜を横切る貫膜圧力の監視を容易にする可能性がある。追加の塩水または他のバッファー溶液および洗浄溶液を、該再生細胞組成物に添加して、該組成物が該フィルタアセンブリー36によって濾過される際に、望ましからぬタンパク質の除去を補助することができる。この反復的洗浄を、多数回に渡り行って、該再生細胞組成物の純度を高めることができる。幾つかの態様において、該塩水は、濾過効率を高める必要があると考えられる、任意の段階で添加できる。
【００６０】
例として与えられ、また限定的なものではない、具体的な一態様において、該望ましからぬタンパク質および塩水または他の洗浄溶液は、以下のようにして除去される。該再生細胞、並びにコラーゲンおよび結合組織粒子またはフラグメント、脂肪細胞、およびコラーゲナーゼを含む該組成物は、最小体積に達するまで、一連のフィルタを循環させる。この最小体積は、この装置の全維持体積および幾つかの予め決められた定数の関数である。この維持体積は、該処理チャンバー全てが空である場合には、該管路および導管内に収容されている液体の体積である。一態様において、この最小体積は15mLである。この最小体積に到達した場合、所定体積の洗浄溶液を該装置に導入して、該再生細胞組成物と混合する。この洗浄溶液と該再生細胞組成物との混合物を、次に再度最小体積に達するまで、フィルタを循環させる。この循環は、該再生細胞の純度を高めるために、あるいは換言すれば、該組成物中の再生細胞対該組成物中の他の物質の比を増大するために、多数回に渡り反復することができる。これについては、図10および11を参照のこと。
【００６１】
該再生細胞組成物が、望ましからぬタンパク質について浄化され、かつ十分に高密度化(濃厚化)(例示的態様では、約1×105〜約1×107細胞/mLなる範囲内の最小濃度を使用することができ、好ましい態様においては、該最小濃度は約1×107細胞/mLであり得る)されたことを決定した後、産出チャンバー50、例えば産出バッグを、特定の態様に応じて、該処理チャンバー30および/または該フィルタアセンブリー36の出口に、接続することができる。ベント、例えばベント32を、次に該濃厚化された再生細胞の取り出しを容易にすべく、開放することができる。一態様において、最小濃度に達した時点のこの決定は、実験を行い、該デバイスの電子的な制御をプログラムした後に、経験的に行うことができる。この決定は、何を製造したいのか、即ちどれ程の幹細胞/前駆細胞が必要か、あるいは細胞濃度の範囲を、該工程に入力することができる。科学的データに基いて、予め決定された量の脂肪組織を、所定の産出量を達成するために得、かつ該装置に配置する必要がある。該ベント32を開放することにより、ポンプ、例えばポンプ34を動作させて、該濃厚化された再生細胞を、該産出バッグに移すことができる。一態様において、該産出バッグ50は、一方の端部に取付部品と共にチューブを持つ、空の血液バッグに類似する。無菌様式で、該産出バッグの取付部品を該出口に取付け、また該濃厚化された再生細胞を、この産出バッグに移すことができる。
【００６２】
図1-3に示した如く、真空ポンプ26を該装置10に取付けて、とりわけ該装置における圧力を変えることができる。例えば、該真空ポンプ26を導管、例えば導管12bを介して該採集チャンバー20と結合して、該採集チャンバー20内の圧力を減じることが可能である。該真空ポンプ26は、また導管12g等の導管によって、該処理チャンバー30と結合することも可能である。ポンプ34と関連する、真空ポンプ26の作動について、2つの別々の真空ポンプまたは源を使用し、あるいは該工程の特定の時点において必要となる、種々の導管を真空引きするバルブを用いることにより、単一のポンプを使用することができる。更に、該真空ポンプ26は、導管12f等の導管を介して、該廃液容器40と結合することができる。
図10および11を参照すると、該真空ポンプ26により発生する圧は、該再生細胞を含む流体の流れを、導管12に導くのに利用することができる。この圧は、例えば該装置10における、1またはそれ以上のバルブ14の位置を調節することによって、多数の方向に与えることができる。この装置10は、正の圧力の使用、あるいは負圧の使用、あるいはこれらの組合わせにより、適当に作動するように設計できる。例えば、上記第一および第二フィルタを介して、第三のフィルタに接続されている、柔軟な側部を持つ容器に、該再生細胞を引き入れることができる。該柔軟な側部を持つ容器は、該第三のフィルタのヘッドと、インライン接続(直列)することができる。この最終の産出(output)チャンバーは、柔軟な側部を持つ容器であり得、これは該第三のフィルタの他方の側(例えば、下流側)にある。この態様では、一方の柔軟な側部を持つ容器から、他方の柔軟な側部を持つ容器に、該フィルタを通して、該再生細胞を移すのに使用される。
【００６３】
該装置10の他の態様では、該幹細胞および/または脂肪由来の前駆細胞の濾過は、浸透式濾過と沈降との組合せを利用して達成することができる。例えば、このような装置は、組織再生細胞組成物(即ち、該幹細胞および/または脂肪由来の前駆細胞を含む組成物)が通され、次いでフィルタに通される塩水を使用する。再生細胞組成物からの細胞の、浸透式濾過と関連する変数の幾つかは、該フィルタ媒体の孔径、孔の幾何または形状、該フィルタの表面積、濾過すべき該再生細胞組成物の流動方向、注入される塩水の流量、貫膜圧力、該細胞集団の稀釈率、細胞のサイズおよび生存率を含むが、これらに限定されない。
装置10の一態様において、該処理チャンバー30は、該再生細胞を分離し、かつ濃厚化するために、浸透式濾過および沈降を利用する、フィルタアセンブリー36を使用している。限定するものではなく、単なる例として、該処理チャンバー30は、一般に、図6に示すように、側壁30a、上部表面30b、および底部表面30cを持つ円筒体として規定される。無菌ベント32が、該上部表面30bに設けられている。
【００６４】
図6に示す態様において、該処理チャンバー30は、フィルタアセンブリー36を含むものとして示され、該アセンブリーは、2つのフィルタ、例えば大孔径を持つフィルタ36aおよび小さな孔径を持つフィルタ36bを含む。典型的に、これらフィルタ36aおよび36bの孔径は、約0.05μm〜約10μmなる範囲内にある。大孔径のフィルタ36aは、約5μmの径を持つ孔を含み、また該小孔径のフィルタ36bは、約1-3μmの径を持つ孔を含むことができる。一態様において、これらフィルタは、約785mm2なる表面積を持つ。フィルタ36aおよび36bは、該処理チャンバー30の内部を、第一のチャンバー37a、第二のチャンバー37bおよび第三のチャンバー37cに分割する。図6に示すように、第一チャンバー37aは、第二チャンバー37bと第三チャンバー37cとの間に位置している。その上、第一チャンバー37aは、入口31aおよび出口31bを持つ該処理チャンバー30の領域として示されている。例示した該処理チャンバー30は、その外部から、その内部への連絡路を与える複数の開口、例えば開口31a、31bおよび31cを含む。これら開口31a、31bおよび31cは、該処理チャンバー30の本体の側壁30aに設けられたものとして示されている。しかし、開口31a、31bおよび31cを、他の領域に配置することも可能である。開口31aは、サンプル入口として示され、再生細胞が該処理チャンバー30の内側を通ることができるように、導管と結合するように構成されている。開口31bは、該分離かつ濃厚化された細胞を、該処理チャンバー30に内部から取出せるように、導管と結合するように構成された、出口として示されている。開口31cは、新鮮な洗浄溶液、例えば塩水を、該処理チャンバー30の内部に放出するための導管と結合するように構成された、入口として示されている。
【００６５】
使用に際して、該再生細胞は、入口31aを介して中央チャンバー37aに導入することができる。塩水または他のバッファーを、約10mL/分なる速度で、チャンバー37a内の該再生細胞組成物に通すことができる。該塩水の流量は、重力に逆らうようなものである。この塩水の流れは、該チャンバー内の細胞に、その密度に基く分離能力を与える。典型的には、該塩水が、強制的に該組成物を介して上昇するにつれて、該組成物中の大きな細胞は、該中央チャンバー37aの底部に沈降し、かつ小さな細胞およびタンパク質は該第二フィルタ36bを介して、上部チャンバー37cに搬送されるであろう。この濾過操作は、該大きな細胞が所定の位置で回転され、該小さな粒子が解放され、かつ該塩水によって搬送されるように、該塩水の流量を調節することによって達成される。該無菌ベント32が該処理チャンバー30に収容されていて、正確な圧力勾配を、この処理ユニット内のこれら3つのチャンバー内で、確実に維持する。該上部チャンバー37cは、吸収媒体33を含むことができる。この吸収媒体を用いる目的は、該溶液中の望ましからぬタンパク質をトラップし、例えば該塩水の流量が低下した場合に、これらが該フィルタ媒体を横断して、該処理溶液内に戻らないことを保証する。吸収媒体は、吸収性の、あるいは濾別すべき物質または成分を引付ける型の、フィルタ媒体の一種であり得る。流出口を、該上部フィルタの上方に付加して、廃液の排出を補助することができる。これに関するもう一つの態様は、上部から穏やかな減圧を印加して、廃液の抜出しを補助することができる。吸収媒体は、例示した態様に置けるように、該流量が比較的小さい場合に使用できる。次いで、過剰の塩水およびタンパク質を、廃液容器に搬送する。
【００６６】
該大きな細胞(例えば、該脂肪由来の幹細胞および/または前駆細胞)が、より小さな細胞およびタンパク質から十分に分離された場合、該分離された細胞を含有する該組成物は、ここに議論するようにして、濃厚化することができる。該組成物は、更に出口31bを介してチャンバー37aから取出した後に、あるいは該チャンバー37a内に存在する間に、濃厚化することができる。一態様においては、該組成物中の細胞の濃度を、以下のような方法で高める。該細胞を十分に分離した後、該フィルタ、例えばフィルタ36aおよび36bを、相互に向けて移動することができる。この移動は、これら2つのフィルタ間の体積(例えば、チャンバー37aの体積)を減じる作用を持つ。また、振動部材を、該処理チャンバー30との関連で設けて、該組成物中の該細胞の高密度化を容易にすることが可能である。一態様において、該振動部材は、フィルタ36b(例えば、小孔径のフィルタ)と結合することができる。振動は、該フィルタによる細胞のトラップ率を減じ得る。該組成物の体積における減少は、過剰の塩水を廃液として除去し、また該細胞をより小体積にまで濃縮することを可能とする。
【００６７】
もう一つの態様では、該再生細胞の高密度化は、以下の方法で達成される。該細胞を十分に分離した後、該再生細胞組成物を、過剰な塩水を濾別するのに重力を利用するもう一つのチャンバー(図示せず)に搬送することができる。好ましい態様において、沈降が、該浸透と同時に起こる可能性がある。この沈降は、約10kD〜約2μmなる範囲の孔径を持つ、フィルタの上部に該組成物を導入することにより達成できる。一態様において、適当なフィルタは、約1μmの孔径を持つ。重力は、該塩水および小粒子による、該フィルタの通過を可能とし、一方で該組成物中の細胞の、該フィルタの通り抜けを阻止するであろう。細胞の所定の高密度化が達成され、かつ該濾別された小粒子が、該フィルタの下方から除去された後に、該再生細胞組成物を撹拌して、該フィルタから細胞を除去し、また引続き該高密度化された再生細胞を、産出バッグに搬送することができる。該小粒子は、廃液として出口を介して抜き出すことができる。
本発明の特定の態様において、該処理チャンバーは、該再生細胞組成物からの、該再生細胞の分離を容易にする、遠心分離チャンバーまたは細胞濃縮装置(図4、7および8参照)を備えている。例えば、該細胞濃縮装置は、例えばサイズまたは密度に基いて、該再生細胞組成物からの、該再生細胞の分離を可能とする、遠心分離デバイスまたは遠心分離デバイスの一部であり得る(図7および8参照)。該細胞濃縮装置は、また旋回膜フィルタであっても良い。
【００６８】
遠心分離は、当分野において、様々な密度を持つ多数の成分を含む溶液を分離し、また濃縮するための手段として認識されている。これは、該溶液に、例えば重力よりも高い求心力を印加することによって実施できる。この印加された力は、該細胞および/または粒子の密度に基いて、該組織溶液の分離を引起こす。該細胞を十分に濃縮した後、過剰量の塩水およびタンパク質を除去することができる。該溶液からの、該細胞の遠心分離と関連する変数の幾つかは、該ローターの速度、回転中心から該溶液までの距離、および/または時間を含むが、これらに制限されない。
該遠心分離デバイスは、該処理チャンバー30の一部品であり得、あるいは該処理チャンバーと分離されていても良い。該遠心分離デバイスは、部分的に該処理チャンバー内にあってもよく、また部分的に該処理チャンバーと分離されていても良い(図14および15参照)。典型的には、該遠心分離デバイスは、該細胞溶液を含む容器、例えば産出チャンバー50の、軸の周りにおける旋回を生じ、結果的に該溶液中の細胞に掛かる力を、重力を越えるレベルに高める。該溶液中のより高密度またはより重質の物質は、典型的に該産出チャンバー50の一端に沈降し、ペレットを生成する。次に、このペレットを再度分散させて、細胞の所定の濃度を持つ溶液を得、および/または細胞および媒体の所定の体積を達成することができる。
【００６９】
他の態様では、該処理チャンバー30それ自体が、遠心分離チャンバーまたは細胞濃縮装置の形態にあっても良い。一般に、このような処理チャンバーは、遠心力および重力両者を利用して、細胞を分離し、かつ濃縮するように構成されている。具体的には、この遠心分離中に、遠心力が、該再生細胞組成物のより高密度の成分、例えば該再生細胞を、該遠心分離チャンバーの最端部に導く。該遠心分離チャンバーが減速され、結局停止された場合、重力は、該再生細胞が、該遠心分離チャンバーの最端部に留まり、かつこれが、細胞ペレットを生成するのを助ける。従って、該再生細胞組成物の望ましからぬ成分、即ち廃液は、該細胞ペレットを乱すこと無しに除去できる。
この遠心分離工程の更なる態様においては、遠心エルトリエーションを応用することも可能である。この態様において、該細胞は、遠心作用により印加された方向性の(例えば、外向きの)力が、細胞および溶質の、異なる速度での沈降を生じるような、個々の細胞の沈降速度に基いて分離することができる。遠心エルトリエーションにおいて、目標とする細胞集団の沈降速度は、該遠心力と反対方向に、溶液をポンプ輸送することによって印加される、対向する(例えば、内向きの)流速と反対方向を持つ。この向流関係は、該溶液中の細胞および粒子を分離するように調節される。遠心エルトリエーションは、細胞分離の多くの例において応用されており(Inoue, Carsten等 1981; Hayner, Braun等 1984; Noga 1999)、また流動および遠心分離パラメータを最適化するのに利用される原理および実務は、当分野による現時点における開示に照らして、本発明に適用できる。
【００７０】
図9は、本発明に従うエルトリエーションの実施に関連する原理を示す。該エルトリエーションの態様は、旋回ローターを用いて、該溶液に力が印加される程度において、遠心分離の実施と同等であり得る。現時点で実施されている、エルトリエーション分離と関連する変数の幾つかは、該旋回チャンバーのサイズおよび形状、該ローターの径、該ローターの速度、上記向流式管路の径、該向流の流量、並びに溶液から除去すべき粒子および細胞のサイズおよび密度を包含するが、これらに限定されない。遠心分離におけるように、上記再生細胞は、個々の細胞の密度に基いて分離できる。
一態様において、該再生細胞組成物、例えば該再生細胞および上記コラーゲナーゼを含有する溶液は、図9.1に示されているように、旋回ローターのチャンバー内に導入される。該溶液を該チャンバーに添加した後、予め決められた流量で追加の塩水を該チャンバーに添加する。この塩水の流量は、該ローターの速度、該細胞の径、および経験的に設定されるチャンバー定数の関数として予め決めることができる。この流量は、例えばIVポンプと類似するデバイスを用いて制御される。上記追加の塩水を使用する目的は、該ローターチャンバー内に所定の状態をもたらすことであり、該チャンバーでは、図9.2に示されているように、より大きな粒子が該チャンバーの一方の側に移動し、かつより小さな粒子が、他方の側に移動する。この用途では、図9.3に示すように、該より小さな粒子がこのチャンバーを出て行き、かつ廃液チャンバーに移動するように、該流れを調節する。この移動の結果、該ローターチャンバー内の溶液は、細胞、例えば幹細胞の実質的に均一な集団を含む。
【００７１】
該幹細胞が該溶液(上記チャンバーから除去された、望ましからぬタンパク質および遊離の脂質を含む)中の諸成分の残りから分離されたことを確認した後、上記向流を停止する。該チャンバー内の細胞は、次にその外側の壁上に濃厚化されたペレットを生成する。該向流は、反転され、かつ該細胞ペレットは、産出バッグに移される。
図7および8に示されている、遠心分離チャンバーまたは細胞濃縮装置の形態にある、例示的処理チャンバー30は、回転封止30.1と、これは外側ハウジング30.2、1またはそれ以上の封止30.3、1またはそれ以上の軸受け30.4、およびこの処理チャンバーをこの装置の遠心分離デバイスに取付けるための付属品30.6を含み；該回転封止から延び、かつ各端部において、フレーム53内に収容された産出チャンバー50としての、遠心分離チャンバーにおいて終端している、導管形状にある、1またはそれ以上の流体通路とで構成され、ここで該フレームは、該産出チャンバー50を手動で再配置するように、1またはそれ以上の口52および1またはそれ以上のハンドルで構成されている。
【００７２】
幾つかの態様において、遠心分離チャンバー形状にある、該処理チャンバー30は、1またはそれ以上の流体通路30.5を備え、これらは該処理チャンバー、例えば産出チャンバー50の様々な成分を引き込み、また排出する。一態様において、一つの流体通路30.6は、該処理チャンバー30の中心軸から外側に放射状に広がり、該処理チャンバー30の外側端部近傍、即ち該産出チャンバー50を収容する該遠心分離チャンバー内で終端している。このような流体通路は、例えば採集チャンバー20からの再生細胞組成物を、該処理チャンバー30に輸送するために使用することができる。この流体通路は、また遠心分離処理後に生成された細胞ペレットを、再度懸濁するために使用することもできる。従って、該流体通路の配置およびサイズは、最適化する必要がある。該処理チャンバーも、流体通路30.5を含むことができ、これは該処理チャンバーの底部中心部分において終端している。このような流体通路は、該産出チャンバー50から上澄みまたは廃液を除去するのに使用できる。あるいは、この処理チャンバーは、該処理チャンバー30自体において生成した、上澄みまたは廃液を除去するのに使用される、該処理チャンバーの底部中心部分において終端している流体通路を含む。
【００７３】
幾つかの態様において、該処理チャンバー30は、2つの流体通路を含む。これら流体通路両者は、該処理チャンバーの上部(即ち、上記回転封止のシャフトの中心)を貫通している。流体通路の一つは、該処理チャンバーの底まで真直ぐに伸び、他方は2つに分かれ、該処理チャンバーの外側端部、即ち該産出チャンバーを収容する該遠心分離チャンバーまで延びている。構成を変更した態様において、該処理チャンバー30は、同一の一般的な形状を持つが、該流体通路の一つは、移動または交換される。この態様において、該流体通路の一つは、該処理チャンバーの底まで、該シャフトから該回転封止内を真直ぐに伸びている。しかし、第二の流体通路は、該処理チャンバーの外側に分かれ、次いで該処理チャンバーの外側端部と接続する。この態様においては、この流体通路が、添加物および再懸濁溶液を該遠心分離チャンバーおよび/または該産出チャンバーに直接添加するのに使用できる場合には、大きな産出体積が発生する。
上記の遠心分離デバイスを含む、処理チャンバーは、図4、7〜9および14〜15に示されている。図4および7〜9を参照すると、上記採集チャンバー20と該処理チャンバー30との間に、ポンプ34および1またはそれ以上のバルブ14が与えられている。好ましい態様において、これらバルブ14は、電気機械式バルブである。更に、センサ、例えば圧力センサ29を、該処理チャンバー30および該採集チャンバー36と調和するように設けることができる。図7および8に示した処理チャンバー30を使用して、本発明の再生細胞組成物を、上記回転封止網30.1を介する所定の通路に沿って、該採集チャンバー20からポンプ輸送することができる。ここで、該回転封止網は、外側ハウジング30.2、1またはそれ以上の封止30.3(例えば、リップ封止)、および1またはそれ以上の軸受0.4を含む。
【００７４】
好ましい態様において、回転シャフトを含む、該回転封止網30.1は、更に2またはそれ以上の軸受30.4、3またはそれ以上のリップ封止30.3および外側ハウジング30.2を備えている。この態様において、該軸受30.4は、更にここではレースと呼ぶ、外側および内側シャフト(図示せず)を含む。これらのレースは、正確に研磨された球によって分離することができる。この軸受を構成する該レースおよび球は、好ましくは体液と接触するのに適した材料で作られ、あるいは体液と接触するのに適した材料で被覆される。好ましい態様において、該レースおよび球は、例えば窒化珪素またはジルコニアを用いて作られる。更に、この態様において、上記3つのリップ封止は、円形「U」字型チャンネル(図示せず)並びに円形のバネで構成されている。該円形「U」字型チャンネルは、好ましくは、該回転封止網30.1の回転シャフトと、漏れ防止接続を形成するように、可撓性材料を用いて作られる。更に、該リップ封止は、好ましくは、該処理チャンバーを流通する、該再生細胞組成物由来の圧力が、高い張力によって、該回転シャフトとの接続を密にするために、封止アセンブリーを生じるように配向される。これら封止は、1またはそれ以上の円形クリップ(図示せず)によって、所定の位置に固定することができ、該クリップは、該回転封止網30.1の外側ハウジング30.2内の溝と嵌合するように、必要により膨張しおよび/または崩壊することができる。一般的に、該回転封止網30.1は、好ましくは多数の流体通路、例えば流体通路30.5が、無菌状態に維持でき、かつアクセス可能となり、一方で該処理チャンバーの遠心分離チャンバーが旋回するように設計されている。従って、この態様の利点の一つは、図7および8に示された該処理チャンバーの全領域が、該装置の分離および濃縮段階中の、任意の与えられた時点においてアクセスできることである。最後に、該回転封止網30.1によりまたはその近傍で発生した熱を制御して、上記通路を通して移動される、溶液中の細胞の溶解を防止する。これは、例えば該回転シャフトを製造するために硬質材料を選択し、該回転シャフトの該封止部と接触する領域を研磨し、かつ該回転シャフトと該封止との接触を最小化することによって達成することができる。
【００７５】
一態様において、該回転封止網30.1は、単一のゴム封止30.3およびエアーガスケット(図示せず)で構成されている。この封止およびガスケットは、該装置の無菌性を危うくする恐れのある、あらゆる生物学的な物質に対する、曲がりくねった通路を与える。他の態様では、該回転封止網30.1は、個々の流体通路を孤立させる、多数のバネ押しの封止30.3を備えている。この封止30.3は、滅菌でき、かつ潤滑剤無しに、該回転シャフトを封止できる材料で作られている。別の態様では、該回転封止網30.1は、異なる流体通路を生成し、該装置の回転に耐え、かつ細胞を溶解することのない、一対のセラミックディスク(図示せず)を備えている。別の態様では、この流体通路は、可撓性であり、該処理チャンバーに関して湾曲可能でも、湾曲不可能でもよい。これは、該処理チャンバー30の2回転当たり、該可撓性流体通路を一回転させることによって達成される。これにより、回転封止の必要性を全く不要とする。
【００７６】
一態様において、該処理チャンバー30は、該流体通路が、該回転封止網30.1の回転軸を通り抜け、次いで最低でも2つの流体通路30.5に分割され、その各々が上記産出チャンバー50に向かって、該処理チャンバー30の対向する両端に導かれるように設計される。従って、好ましい態様において、該処理チャンバー30は、図7および8に示したように、2またはそれ以上の産出チャンバー50を備えている。これらの産出チャンバー50は、加工30.7中一方の配向状態にあり、また濃厚化された再生細胞30.8を回収するために、別の配向状態にある。この処理チャンバー30のこれら2つの位置は、該処理チャンバー30から突出している、ハンドル53によって手動で操作することができる。一旦、該再生細胞組成物を、図4の処理チャンバーに移したら、この組成物に、約5分間に渡り、例えば重力の約400倍の負荷を掛ける。該産出チャンバー50は、該チャンバーの外側端部が、高密度の粒子および細胞用の小さなリザーバを形成するように作られる。該産出チャンバー50は、「細胞ペレット」と呼ばれる、高密度の粒子を保持し、一方より軽量の上澄みを、上記第二の流体通路(図示せず)を通して、除去することができる。該産出チャンバーは、更に該細胞ペレットを乱すこと無しに、該上澄みが除去できるように構成される。これは、該上澄みの除去を助ける、バルブ14およびポンプ34によって制御される流体通路によって達成できる。該第二の流体通路は、該回転封止網30.1の回転軸に沿っている。この流体通路は、該処理チャンバー30の中心部における下方の点から、該回転封止を介して、廃液容器40に移動する。
【００７７】
上記細胞ペレットは、本発明の濃厚化された再生細胞を含む。幾つかの態様においては、該上澄みを除去し、かつ該廃液容器40に導いた後、追加の溶液および他の添加剤を、該処理チャンバー30に、上記の方法で、該採集チャンバー20から添加することができる。このような該細胞ペレットの再懸濁は、該再生細胞を更に洗浄して、望ましからぬタンパク質および化合物を除去し、並びに該細胞への酸素の流れを増やすことができる。この得られる懸濁液には、更に約5分間に渡り、重力の約400倍の追加の負荷を掛けることができる。第二の「細胞ペレット」を生成し、得られた上澄みを除去して該廃液チャンバー40に送った後、上記の方法で、最後の洗浄を、塩水または幾つかの他の適当なバッファー溶液を用いて行う。次に、該産出チャンバー50内に存在するこの最終的なペレットは、該産出チャンバー50を、細胞の取り出しに適した配向に配置した後に、適当なシリンジを用いて回収することができる。他の態様では、取り出し、保存し、必要に応じて使用できる、該産出チャンバー50内の容器に、この最終的なペレットを自動的に移すことができる。この容器は、任意の適当な形状またはサイズを持つことができる。例えば、この容器はシリンジであり得る。全ての態様において、該最終的なペレットは、無菌的な方法で取出される。例えば、産出チャンバー50を、自動的に熱封止し、後で回収するための該処理チャンバーの他の部材から孤立させ、かつここに記載するような専有的治療用途において使用することができる。
【００７８】
図4に示された態様においては、該再生細胞組成物が、該処理チャンバー30に入った際に、ポンプ34によって発生する、該組成物の圧力を測定するために、圧力センサ29がライン内に設けられている。追加の塩水、または他のバッファーおよび洗浄液を、該再生細胞組成物に添加して、該溶液が該処理チャンバー30内で処理されている際の、望ましからぬタンパク質の除去を補助することができる。この洗浄を多数回に渡り繰り返して、該再生細胞溶液の純度を高めることができる。幾つかの態様においては、該塩水は、処理の増強を望む任意の段階において添加することができる。
他の態様では、該処理チャンバー30または該産出チャンバー50は、1またはそれ以上の口、例えば口51または52を含むことができる。これら口の1またはそれ以上を、該再生細胞、またはその一部を、他の標的、例えばインプラント材料(例えば、スカフォールドまたは骨片)、外科用デバイス、細胞培養デバイスまたは精製デバイスに導くように設計することができる。これらの態様において、該処理チャンバー30または該産出チャンバー50は、更に該再生細胞と添加剤とを混合するためのデバイスを含むことができる。混合は、当業者には公知の任意の手段によって達成でき、該手段は、撹拌、振とう、反転またはパルス式圧縮または可動ローラーを包含するが、これらに限定されない。これらの口は、また1またはそれ以上の添加剤、例えば成長因子、再懸濁流体、細胞培養試薬、細胞膨張試薬、細胞保存試薬、または遺伝子を該細胞内に転写する試薬を含む、細胞改良試薬を添加するためにも利用できる。添加剤の他の例は、洗浄および分解を最適化する試薬、処理中に活性細胞集団の生存性を高める添加剤、抗-微生物剤(例えば、抗生物質）、脂肪細胞および/または赤血球を溶解する添加剤、あるいは対象とする細胞集団を、(固体相部分に特異的に接着させ、または細胞集団の実質的な低減または濃厚化を促進することにより)濃厚化する添加剤を含む。
【００７９】
例えば、均質な再生細胞集団を得るためには、特定の型の再生細胞を分離するための任意の適当な方法を使用することができ、例えば幹細胞または前駆細胞(例えば、内皮プリカーサ細胞)等の上に存在する、抗原を認識し、かつこれと結合する、細胞-特異的抗体の止痒を含む。これらは、正の選別(該標的細胞の選別)、負の選別(望ましからぬ細胞の選択的除去)両者、またはこれらの組合せを包含する。細胞内マーカー、例えば酵素を、特定の酵素に作用した場合に蛍光を発する分子を用いた、選別において使用することも可能である。更に、特異的な接着および/または最終的な細胞ペレット内の再生細胞の特定の集団の溶出を可能とするように選択された、接着特性を持つ固相材料を、本装置の該産出チャンバー内に挿入することができる。
この特異的接着法のもう一つの態様は、標的再生細胞および望ましからぬ細胞上に特異的に発現される表面分子を識別する、抗体および/または抗体の組み合わせの使用を含む。特異的細胞表面マーカー(またはその組合わせ)の発現に基づく選別は、もう一つの一般的に応用される技術であり、そこでは抗体を、(直接または間接的に)固相担体構造に結合させる(Geiselhart等 1996; Formanek等 1998; Graepler等 1998; Kobari等 2001; Mohr等 2001)。
【００８０】
もう一つの態様において、該細胞ペレットは、再懸濁し、連続または不連続密度勾配状態にあり、また細胞の密度に基づいて細胞集団を分離するための、遠心機内に配置された、流体材料上に(またはその下に)、層として形成し得る。同様な態様において、連続的流れによる方法、例えば成分献血(Smith, 1997)、およびエルトリエーション(向流の存在下または不在下)(Lasch等 2000) (Ito & Shinomiya 2001)を使用することも可能である。
上記全ての態様において、該分離された脂肪由来の細胞の少なくとも一部は、2002年9月12日付出願の、「非-造血組織由来の非-胚細胞の保存(PRESERVATION OF NON EMBRYONIC CELLS FROM NON HEMATOPOIETIC TISSUES)」と題する米国特許出願第10/242,094号に記載されているように低温保存することができる。該米国特許出願は、2001年9月14日付のU.S.仮特許出願第60/322,070号の利益を請求するものであり、本件特許出願は、同一人に譲渡されており、またその内容全体を、本発明の参考とする。
好ましい態様においては、この装置全体を自動化する。別の態様では、この装置は、自動化部品および手動部品両者を含む。この装置は、再利用可能なハードウエアー部品またはモジュール上に搭載される、1またはそれ以上の使い捨て部品を含むことができる。この本発明の自動化された装置は、その適当な操作を指示する、スクリーンディスプレイ(図16参照)を備えている。この自動化された装置は、また実施手順の状態および/またはこの装置の該使い捨て部品の適当な組立、整備に関する段階的な指示を与えるスクリーンをも備えることができる。このスクリーンは、またこの装置に問題や故障が発生した場合に、これらを表示し、また適当な場合には、「障害追跡」の手引きをも与えることができる。一態様において、ユーザーによる本発明の装置との接続が可能なスクリーンは、タッチスクリーンである。
【００８１】
該部分的におよび完全に自動化した装置は、処理デバイス(例えば、マイクロプロセッサーまたはパーソナルコンピュータ)およびこの装置に対する制御論理を与えて、そのユーザーの選択に基づく、この工程の1またはそれ以上の段階を操作し、かつ自動化する、関連するソフトウエアプログラムを含むことができる。この処理デバイスは、この装置の1またはそれ以上の部品または段階と機能可能な状態で結合することができる。例として、このような自動化を可能とする段階は、該装置のポンプおよびバルブ、および処理デバイスを制御することによる、特定の管路に沿った、流体および組織の出入りの制御；起動の適当な順番および/または方向；圧力センサによる閉塞の検出；混合メカニズム、容積式メカニズムを用いた、特定の経路に沿って移動すべき組織および/または流体の量の測定；加熱制御デバイスを用いた、様々な部品の温度の測定；該細胞の洗浄および濃厚化、およびこの工程と、タイミングおよびソフトウエアメカニズムとの一体化を包含するが、これらに限定されない。この自動化した装置は、また閉塞の検出用の圧力センサおよび同様な安全およびクオリティーコントロールメカニズムを含むこともできる。一態様において、ソフトウエアは、作業者が規定したパラメータに対する、細胞集団の製造を可能とする、この方法のパラメータを制御することを可能とする。例えば、この処理デバイスは、処理すべき組織の型および/または収穫すべき細胞集団または亜集団に基いて、遠心分離速度の制御を可能とする。このように、該自動化装置(1または複数)は、該手順の性能を改善し、かつ脂肪組織の収穫および患者に投与するための該脂肪組織の処理の自動化をもたらす。該処理デバイスは、また標準的な並列または直列の口、または他のコンピュータまたはネットワークとの連絡手段を含むことも可能である。従って、この処理装置は、スタンドアロン型ユニットであり得るかまたは他のデバイスと結合することができる。
【００８２】
幾つかの態様において、この装置の1またはそれ以上の局面は、該処理デバイスに備わっている、ソフトウエアを通して、ユーザーがプログラムを組むことができることである。この処理デバイスは、読出し専用記憶素子(ROM)内に、1またはそれ以上の予めプログラムに組んだ、ソフトウエアプログラムを含むことができる。例えば、該処理デバイスは、血液処理のために作られた、予めプログラムに組んだソフトウエア、脂肪組織を処理して、小体積の再生細胞を得るための、他のプログラムおよび脂肪組織を処理して大容量の再生細胞を得るための、他のプログラムを含むことができる。この処理デバイスは、またユーザーに適当なパラメータを与えて、関連する情報、例えば必要な再生細胞の量、処理すべき組織の型、必要な処理後の操作の型、治療的用途の型等の、ユーザーによる入力に基いた、この方法の最適化をもたらす、予めプログラムに組んだソフトウエアを含むことも可能である。該ソフトウエアは、例えば使い捨て可能な部品のロット番号、温度および体積測定値、組織体積および細胞数のパラメータ、適用した酵素の用量、インキュベーション時間、作業者の識別、日付および時間、患者の識別等を包含する「ランデータ(実行データ)」の自動的な収集を可能とする。
【００８３】
このデバイスの好ましい態様においては、バーコード記録装置を組込んで、この方法の文書化の一部として、これら変数(例えば、使い捨てセットのロット番号および満了日、コラーゲナーゼのロット番号および満了日、患者/サンプル識別子等)の、該処理デバイスへのデータ入力を可能とする。これは、データ入力エラーの発生機会を減じるであろう。このようなバーコード記録装置は、当分野において公知のUSBまたは他のインターフェースポートおよび装置を用いて、容易に、この処理デバイスに組込むことができる。このようにして、該デバイスは、データ入力と該方法の文書化との総合的な制御をもたらすであろう。これらパラメータの印字出力レポートは、この装置のプログラム化された操作の、ユーザーによって規定されたパラメータの一部であろう。当然、これは、ソフトウエアに、プリンタ部品(ハードウエアおよび駆動機構)またはプリンタ駆動機構を組込み、かつ該デバイスのハードウエアに、プリンタ用のインターフェース出力コネクタ(例えば、USBポート)を組込む必要がある。
【００８４】
幾つかの態様において、この装置は、単一の一体化された装置であり、上記分離並びに濃厚化工程の様々な段階を実施するための、ユーザーまたは分離デバイス何れかの介入を必要としない。他の態様では、この装置は、ユーザーの入力無しに、完全な自動化モードで動作することもできる。この装置は、また半自動的なモードで動作させることも可能であり、その間この装置は、ユーザーの介入無しに、幾つかの段階を経るが、幾つかの工程を行う前に、ユーザーの介入を必要とする。他の態様では、この装置は単一の一体化装置であり、これは所定の時点において、ユーザーが実行すべき所定の操作の指示を表示する。例えば、この処理デバイスは、この装置の管路、チャンバーおよび他の部品の、適当な挿入を要する段階を介して、ユーザーを促すことができる。従って、ユーザーは、適当な順序の操作を、確実に実行することが可能となる。このような装置では、更に該方法の諸段階の、不注意による作動または終了を回避するために、ユーザーによる各操作段階の確認が必要となる可能性がある。更なる態様において、この装置は、管路、チャンバーの正確な挿入、閉塞の不在等を確認するための、自動的なテストを開始することができる。更に別の態様では、本発明の装置は、これを流通する組織の自動的な制御を通して、多数の分離および濃厚化を行うようにプログラムすることができる。この特徴は、例えば失われるはずであった組織が、この装置内に集められるような、患者を外科手術する際に重要であり、また該組織由来の再生細胞は、該患者から分離され、濃厚化され、かつ戻される。
【００８５】
上に示したように、この装置の部品は、使い捨て(ここでは、「使い捨てセット」と呼ぶ)であり得、従ってこの装置の部分は、一回の使用後に捨てることができる。その履行は、該患者の組織と接触するあらゆる表面を、使用後に確実に捨てるのに役立つ。使い捨てセットの例は、図13に示されている。好ましい態様において、この装置の使い捨て部品は、使用が容易であり、取付が容易であり、かつ多くの管路を接続する必要性および管路接続の複雑なルーティングの必要性を排除するような、既製品として使用できるように、予め滅菌し、かつ包装される。このような使い捨て部品は、比較的製造コストが低く、従ってその棄却による、実質的な経費増を生じない。一態様において、該使い捨てデバイス(ここでは、互換的に「使い捨てセット」と呼ぶ)は、上記採集チャンバー20、処理チャンバー30、廃液チャンバー40、産出チャンバー50、フィルタアセンブリー36、サンプルバッグ60および関連する導管12または管路を含み、これらから本質的になり、あるいはこれらからなる。この装置の該使い捨てセットの好ましい態様において、該採集チャンバー20および処理チャンバー30は、剛性のフレーム内に収容された、導管12により接続されている。処理チャンバー30の回転封止網(図7および8)も、同一の剛性のフレーム内に収容されている。別の好ましい態様では、該使い捨てセットの様々なチャンバーおよび容器は、この装置の処理デバイスとの連絡を可能とする、必要なインターフェースを備え、結果としてポンプ、バルブ、センサおよびこの装置を自動化する他のデバイスが、ユーザーの介入無しに、必要に応じて適宜動作されあるいは動作停止される。該インターフェースは、またこの装置を組み立てるのに必要な時間および熟練性を減じ、またこの装置を適切に組み立てる方法を示し、かつユーザーに組立に誤りがあった際に、警告を発することによって、誤りを減じる。
【００８６】
該使い捨てセットは、更に患者から脂肪またはその他の組織を得、該患者に再生細胞を戻すのに適した、1またはそれ以上の針またはシリンジを含むことができる。含まれる様々な針またはシリンジの型および数は、処理すべき組織の型および量に依存するであろう。該使い捨てセットは、更に洗浄液体および他のこの装置で使用する処理試薬を保持するための、1またはそれ以上の剛性または可撓性の容器を含むことができる。例えば、該使い捨てセットは、この方法にとって必要な塩水、酵素、および任意の他の処理または置換液体を保持するための容器を含むことができる。更に、適当な洗浄溶液、再懸濁流体、添加剤、薬剤または移植材料を、本発明の該装置および方法との組合せで使用する、該使い捨てセットと共に備えていても良い。
この装置の再利用できる部品は、該採集チャンバー、該ポンプおよびバルブおよびポンプ制御の作動を行う様々なセンサ、遠心機モータ、遠心機モータの回転フレーム、ユーザーのインターフェーススクリーン、およびUSBポート、および他の関連するデバイスを含み、これらから本質的になり、あるいはこれらからなる。再利用可能な部品の例を図14に示す。再利用可能なハードウエアは、様々な使い捨てセットと共に使用できる。例えば、この再利用可能なハードウエアは、ここに記載するような広範囲に及ぶ組織由来の再生細胞を分離し、かつ濃厚化するために、使い捨てセットと共に使用することができる。
【００８７】
一態様において、この装置において使用する使い捨てセットは、約800mLの組織を収容できる採集チャンバー20；採集チャンバー20において洗浄しかつ消化した組織約800ｍLにより生成された再生細胞組成物を処理することのできる、処理チャンバー30；少なくとも0.5mLの再生細胞を収容できる産出チャンバー50；および約10Lの廃液を収容できる廃液容器40を含む。この態様において、該ハードウエアデバイスは、約61.0cm×45.7cm×91.4cm(24in×18in×36in)よりも大きくはない。該使い捨てセット並びに該ハードウエアデバイスの様々な部品のこれ以外の寸法も、必要に応じて考えることができ、また制限無しに、本発明の範囲に含まれるものとする。
この装置の該使い捨て部品は、該デバイスに容易に配置することができる。対応する再利用可能な部品と共に組み立てることのできる、使用された使い捨て部品の例を、図15に示す。この装置は、好ましくは不適当に搭載された使い捨て部品を検知できるように設計されている。例えば、各使い捨てセットの部品は、この装置内の適当な位置に管路、チャンバー等を、適切に配列かつ挿入するように、色分けによる案内表示を含むことができる。付随的な態様において、ここに開示する装置は持ち運び式のユニットである。例えば、この持ち運び式のユニットは、脂肪組織の収穫を行うある位置から、脂肪組織を収穫するための別の位置に移動することができる。幾つかの実施において、該持ち運び式のユニットは、患者のベッド脇で、脂肪組織を収穫し、かつ処理するのに適している。従って、患者から患者へと移動することのできる、装置の一部であり得る。従って、この持ち運び式のユニットは、所定の位置で固定される車輪に取り付けることができ、また処理手順全体を通して、安定かつ安全な位置、便利な位置に、容易に配置し、かつ使用することができる。他の態様では、該持ち運び式のユニットは、テーブルトップ等の平坦な表面上で組立かつ動作するように設計される。該持ち運び式のユニットは、またハウジングユニット内に封入することができる。この持ち運び式のユニットは、更にハンガー、フック、ラベル、スケールおよび処理手順を補助する他のデバイスを含むこともできる。この装置の、ここに記載する再利用可能な部材、例えば遠心分離機、処理デバイス、ディスプレイスクリーンの全ては、この装置の該持ち運び式のユニットに取付けることができる。
【００８８】
再生細胞を得るための、別のマニュアル式の態様も、本発明の範囲内にある。例えば、一態様において、脂肪組織は、該装置の部品、ここに記載する機器および/または補給品の任意の組み合わせを用いて処理することができる。
上記方法により得られる再生細胞は、脂肪組織フラグメントと混合し、更に処理すること無しに、患者に投与することができ、あるいは他の組織、細胞、インプラントまたはデバイスと混合した後に、患者に投与することができる。幾つかの態様において、該再生細胞は、同様な処理に付されていない脂肪組織の、1単位またはそれ以上と混合する。このように、本発明の方法を実施することによって、脂肪組織と高濃度の再生細胞とを含む組成物を、患者に投与することができる。脂肪組織の種々の単位の体積は、異なっていても良い。例えば、ある体積は、脂肪組織の別の単位に係る体積よりも少なくとも25％大きくてもよい。更に、ある体積は、脂肪組織の別の単位に係る体積よりも少なくとも50％、例えば少なくとも100％および/または50％またはそれ以上大きくてもよい。更に所定の組成物は、第一の単位の脂肪組織と、高密度化された再生細胞集団(これは、該再生細胞を含む、細胞ペレットであり得る)、1またはそれ以上の他の単位の脂肪組織とを混合することによって得ることができる。幾つかの態様において、これら他の単位は、高濃度で再生細胞を含むものではなく、あるいは換言すれば該第一の単位の脂肪組織中に含まれる再生細胞濃度よりも低い濃度を持つであろう。他の態様では、該単位の一つは、例えば高濃度の再生細胞を含む、低温保存された材料である。
【００８９】
処理の終了時点において、該濃厚化された細胞は、排出デバイス、例えばシリンジに投入され、皮下、筋肉内、または該患者の目標サイト、例えば尿道周囲領域、皺下部の皮下空間、または胸部内部への、該細胞/組織混合物の放出を可能とする他の技術によって、そのレシピエントに配置することができる。換言すれば、当業者には公知の任意の手段によって、細胞を患者の内部に配置することができる。好ましい態様において、針またはカテーテルによる、あるいは直接外科的移植による配置を含む。外科的移植に関する態様において、該細胞および組織の混合物は、予備成形したマトリックス等の添加剤と共に適用できる。
この活性な細胞集団は単独で適用でき、または他の細胞、組織、組織フラグメント、VEGFおよび他の公知の脈管形成性または動脈形成性成長因子等の成長因子、生物学的に活性なまたは不活性な化合物、再吸収性のプラスチックスカフォールド、あるいは該集団の放出性、有効性、許容度、または機能を高めるための他の添加剤との組合せで適用できる。また、構造上または治療上の目的を導くために、該細胞の機能を変更し、増強しまたは補充すべく、DNAを挿入し、または細胞培養物中に配合することにより、該細胞集団を改良することも可能である。例えば、幹細胞に関する遺伝子導入技術は、Morizono等, 2003; Mosca等, 2000に記載されているように、当業者には公知であり、またウイルストランスフェクション技術、またより詳しくはWalther & Stein, 2000およびAthanasopoulos等, 2000に記載されているアデノ-関連遺伝子導入技術を含むことができる。ウイルス以外に基づく技術も実施でき、例えばMuramatsu等, 1998に記載されている。
【００９０】
もう一つの局面において、該細胞は、脈管形成性成長因子等の、細胞がそれ自身の成長因子の源として振舞うことを可能とする、遺伝子のコードする成長因子と組合わせることができる。該遺伝子(またはその組合わせ)の添加は、当業者において公知の任意の技術により実施でき、該技術の例は、アデノウイルス導入、「遺伝子銃」、リポソーム-媒介形質導入、およびレトロウイルスまたはレンチウイルス-媒介形質導入、プラスミド、アデノ-関連ウイルス導入技術を包含するが、これらに限定されない。細胞は、遺伝子放出ビヒクルを含む担体材料と共に移植することができ、ここで該ビヒクルは、形質導入が継続しまたはその場で開始するように、長時間に渡り該細胞に遺伝子を放出しおよび/または渡すことができる。
【００９１】
該細胞および/またはこれを含有する組織を、該細胞および/または該組織を得た患者以外の患者に投与する場合、1またはそれ以上の免疫抑制剤を、該細胞および/または該組織の投与を受ける該患者に投与して、この移植の拒絶を軽減し、および好ましくは防止することができる。ここで使用する用語「免疫抑制剤または薬物」とは、正常な免疫機能を阻害または妨害する薬剤を含むものとする。ここに記載の方法にとって適した、免疫抑制剤の例は、T-細胞/B-細胞同時刺激経路を阻害する薬剤、例えば、U.S.特許公開第2002/0182211号に記載されているように、CTLA4および/またはB7経路を介してT-細胞とB-細胞との結合を妨害する薬剤を含む。好ましい免疫抑制剤は、シクロスポリンAである。その他の例は、マイオフェニレートモフェチル(myophenylate mofetil)、ラパミシン(rapamicin)、および抗-胸腺細胞グロブリンを包含する。一態様において、該免疫抑制剤は、少なくとも1種の他の治療薬と共に投与される。該免疫抑制剤は、投与経路に対して相溶性の処方にて投与され、また所定の治療効果を達成するのに十分な用量で対象に投与される。もう一つの態様において、該免疫抑制剤は、本発明の再生細胞に対して寛容性を誘発するのに十分な期間、一時的に投与する。
【００９２】
本発明の幾つかの態様において、該細胞は、1またはそれ以上の細胞分化薬剤、例えばサイトカインおよび成長因子と共に患者に投与される。様々な細胞分化薬剤が、以下の文献に記載されている：Gimble等, 1995; Lennon等, 1995; Majumdar等, 1998; Caplan & Goldberg, 1999; Ohgushi & Caplan, 1999; Pittenger等, 1999; Caplan & Bruder, 2001; Fukuda, 2001; Worster, 2001; Zuk等, 2001。
別の局面では、該細胞集団は、該レシピエントに配置され、また再吸収性のプラスチック製鞘体または他の材料、例えばマクロポアバイオサージェリー社(MacroPore Biosurgery, Inc.) (例えば、米国特許第6,269,716号、同第5,919,234号、同第6,673,362号、同第6,635,064号、同第6,653,146号、同第6,391,059号、同第6,343,531号、同第6,280,473号)によって製造されているものにより包囲されている。このセッティングにおいて、該鞘体は、脂肪組織由来の細胞で処置した、欠陥のある領域における筋肉またはその他の柔軟な組織の脱出を防止し、該欠陥の制御された修復を促進する。この方法は、再建手術において使用でき、そこで該鞘体は、所定の最終的な形状に予備成形され、結果としてインビボにて該組織の所定形状への成形を可能とする。この局面においては、追加の成分、例えば前-脂肪形成性(pro-adipogenic)または脈管形成性タンパク成長因子または生物学的または人工のスカフォールドの補充により、上記の有益な効果が増強される。
【００９３】
ここに記載するように、多くの欠損および障害が、本発明の装置並びに方法を用いて得た、再生細胞で治療できる。例えば、豊胸乳房形成術、柔軟組織欠損修正、および/または尿失禁の治療においては、再生細胞を強化した脂肪組織は、新血管形成を改善し、かつ該インプラントにおける壊死の低減を可能とし、結果として移植の改善をもたらし、かつ脂肪壊死性の偽嚢胞形成の危険性を低下する。該再生細胞に富む脂肪組織は、上記のような柔軟組織の欠損等の修正のために利用できる。正常な脂肪組織移植片に対する、この濃厚化した再生細胞集団の付加は、支持性微細環境の提供を通して、該移植片の寿命を改善することができる。更に、ここに記載する組成物は、また、夫々胃食道の逆流疾患(GERD)および大便失禁を治療するために、下部食道括約筋並びに外部肛門括約筋に対する構造上の支持体を提供するのに利用することができる(Bernardi, Favetta等, 1998)。
【００９４】
典型的には、従来の豊胸手術の候補者と考えられるヒトは、脂肪組織由来の細胞を増加させたオートロガス脂肪導入による、豊胸手術の候補者である。従来の豊胸手術に適格であると思われるこれらの候補者に加えて、これらの方法は、乳房(1または複数)の僅かな/程々の増大、形状の変更または輪郭の変更を行いたいと考える一群の人々がいる。これらの手術は、既存のインプラント技術では、技術的に不可能であり、また審美的に許容できない可能性がある。柔軟組織の増加に対する候補者は、同様に細胞に富むオートロガス脂肪組織を用いた、オートロガス脂肪導入処置に関する候補者でもある。柔軟組織の増大処置の例は、顔面(例えば、眉間、鼻唇)の皺、口周囲の線、マリオネット(marionette)線、皮膚の窪み；臀部；脹脛；生殖器；逆眼窩、足底の脂肪パッドを含むが、これらに限定されない。尿道拡張注入に対する候補者と考えられるヒトは、ここに開示した該細胞に富む脂肪組織による、オートロガス脂肪移植に対する候補者でもある。これらの手順は、女性における経尿道並びに尿道周囲注入を含み、並びに男性における経尿道および尿道前部への注入を含む。手術前の評価は、典型的に、この処置の、あらゆる関連する危険性および利点を開示する、十分なインフォームドコンセントに加えて、型通りの病歴および肉体的な検査を包含する。
【００９５】
患者候補者の確認後、該患者は、典型的には脂肪組織採取に付される。該患者の体質を、脂肪組織採取に適したサイトに付き検査することができる。この処置は、ベッド脇で、または該患者の臨床的な状態に適した血流力学的な監視を伴う、手術室で行うことができる。幾つかの好ましい収穫サイトは、正常な解剖学的構造によって限定された、損傷の危険性のある、主な血管または内臓の無い、および利用の容易な、有力な区域によって特徴付けられる。無垢の収穫サイトが、典型的には好ましいが、以前に収穫したサイトは、付随的な脂肪組織収穫サイトとして、何等排除されるものではない。これらの好ましいサイトは、以下に列挙するものを含むが、これらに制限されない：両側の下方四肢の側部および内側大腿、前方腹部壁パンヌス、および両脇腹領域。これらの手順は、しばしば脂肪彫刻(liposculpture)に対して付随的に行うことができる。該脂肪組織収穫サイトは、また患者の審美的な期待並びに当該医師により決定された、安全性プロフィールに基いて決定することができる。
【００９６】
該収穫すべき領域には、例えば標準的な腫脹性流体の溶液が皮下注射される。該溶液は、様々な標準化された投与養生で、リドカイン、塩水、および/またはエピネフリンの組合せを含んでいても、含んでいなくても良い。11-ブレードメス(あるいは他の標準的なブレード)を用いて、該収穫領域近傍の皮膚を横切るように、小さな穿刺傷をつける。該ブレードを、例えば360度回転するように回転させて、この傷を完成させる。次に、鈍い先端を持つ14-ゲージ(または適当なサイズ)のカニューレを、皮下脂肪組織面に挿入することができる。このカニューレを、電動式吸引デバイスまたは手動での吸引用のシリンジに接続することができる。このカニューレを、次いで該面全体に渡り移動させ、結合組織構造を破壊する。得られた吸引物の体積は、約0cc〜約1500ccなる範囲であり得る。このようにして集められた脂肪組織の部分または一部を、ここに記載の方法を利用した、再生細胞の単離および高密度化のために処理できる。該脂肪組織の残りは、一般に受容れられている標準的な注意に従って、該患者内に再導入するために処理することができる。あるいは、該患者は、脂肪組織切除術によって、脂肪除去することも可能である。脂肪組織の取り出し後、標準的な外科技術によって、止血を行い、何よりもまず傷を閉じる。
【００９７】
この脂肪組織の採集は、移植処置の1-2時間前に行うことができる。しかし、採集の時期は、変えることができ、また標準的な性能管理に依存するであろう。最終的に、該患者に対する管理責任を持つ診療医が、採集の時期を決定するであろう。他の態様においては、脂肪組織由来の細胞預託設備において低温保存されていた、脂肪組織由来の細胞を使用することができる。
採集した脂肪組織の体積は、典型的には約1cc〜約1500ccなる範囲で変動するであろう。組織採集の好ましい方法は、許容された性能管理標準に従うことであろう。取出される脂肪の体積は、患者毎に異なり、また多くの因子に依存するはずであり、このような因子は、豊胸乳房形成術に必要とされる脂肪組織の量、審美的予想、年齢、身体的体質、凝血プロフィール、血流力学的安定性、同時罹患状態、および医師の好みを包含するが、これらに限定されない。
組織の処理が完了した後、該患者は、豊胸乳房形成術、柔軟組織増量、および/または尿失禁の治療と関連する、脂肪組織移植を行うために、準備することができる。移植周辺の幾つかの結果は、タイミング、細胞用量、投与経路、方法、位置、および追跡を含む。
【００９８】
本発明の幾つかの態様において、該再生細胞に富む脂肪組織は、該移植の時点において、患者に投与される。これらの方法は、長期に渡る、物質の多数回に及ぶ注入の必要性を排除するものではない。結局、使用するタイミングは、性能管理標準に従う。付随的な態様において、もう一つのタイミング養生は、適用すべき細胞が、上記のように、変性、精製、刺激、または他の処理に掛けられている場合に、存在する可能性がある。
個々の患者に放出すべき細胞の用量は、典型的に脂肪組織処理後の、該細胞の収量から決定されるであろう。収穫された細胞の全てが、上記特定の処理を必要とするわけではなく、細胞の残りの部分は、ここに記載したように、低温保存することができる。一態様において、患者に放出すべき最小数の細胞は、移植される脂肪50cc当たり、5.5×105であると予想される。しかし、この値は、所定の効果を達成するために、大きさの次数だけ変動することが予想できる。この付随的に増大された脂肪組織(補正過多)は、注入された体積の割合が、経時に伴って後退するものと予想されるので、めったに無い実務とはいえない。更に、ここに開示した方法は、一連の用量に対する必要性を排除しないので、上記した用量以上の、より多くの細胞を患者に投与することができる。
【００９９】
豊胸処置において、放出経路は、腋の下、乳輪、乳腺下In柔軟組織増量手順による、乳房組織内に挿入された、標準的な14-ゲージの鈍い先端を持つカニューレを介する、開放式放出を含み、この放出経路は、適当に配置された切開部を介して、該柔軟組織に挿入された標準的な14-ゲージの鈍い先端を持つカニューレによる、開放式放出を含むことができる。尿失禁処置において、放出経路は、膀胱鏡による可視化を介する、膀胱頚部および尿道基部への直接的注入を含むことができる。あるいは、また更に、この移植は、前方からの経路を介して放出することもできる。あるいは、また更に、該細胞に富む組織は、一般に受容れられている方法によって、使用できる静脈内経路を通して放出しても良い。この静脈内放出法において、該移植すべき物質の方向性の流れを制御することは、外科的な介入によって開始される、炎症過程由来の、内分泌およびパラクリン交換によって、達成することができる。ここで論じた経路は、所定の臨床的な効果を達成するための多数の経路の使用または腹の中心部の切開の利用を排除するものではない。あるいは、また更に、細胞に富む組織は、トランスアキシラリー(transaxillary)内視鏡式胸筋下(enndoscopic subpectoral)法によって放出することも可能である。
【０１００】
一態様において、脂肪処理によって得た再生細胞を、上記のような比率で、移植すべき脂肪と混合する。この混合は、自動化手段(例えば、デバイス-制御撹拌または遠心分離)により、あるいは手動による方法(例えば、ルエルロック式シリンジ、渦撹拌)により行うことができる。該再生細胞に富む脂肪組織は、好ましくは比：表面積/体積を最大にするために、涙状の様式で投与する。他の態様では、再生細胞を、人工的なまたは天然の媒体あるいは組織スカフォールド中に再度懸濁することもでき、次いでこれを移植領域、例えば乳房領域、および/または固有の括約筋領域に挿入して、所定の効果を得る。好ましい態様において、併合した細胞および組織を、「コールマン法(Coleman Technique)」(Coleman 1991; Coleman 1995; Coleman 2001)として一般的に知られている方法に従って注入される。
脂肪組織の採集は、任意の適当な臨床的セッティングにおいて行うことができ、例えば以下のような場所：診療所；診療オフィス；救急部門；病院の病棟；集中治療病棟；手術室；カテーテル処置室；および放射線治療室を挙げることができる。豊胸乳房形成術は、外来患者セッティングにおいて行うことができ、あるいは入院患者用環境において実施することも可能である。尿道拡張注入は、典型的に外来患者セッティングにおいて行われるが、入院患者用環境において実施することも可能である。
【０１０１】
豊胸処置において、再生細胞に富むオートロガス脂肪導入の効果は、1またはそれ以上の以下に挙げるような臨床的尺度によって表すことができる：増大した乳房のサイズ；変更された乳房の形状；変更された乳房の輪郭；持続する移植性(sustained engraftment)；脂肪性壊死嚢胞形成の低下率；改善された患者の満足度；および移植可能な外来物質の低い使用量。他の柔軟組織増加処置において、再生細胞を増大させたオートロガス脂肪導入の効果は、1またはそれ以上の以下に挙げるような臨床的尺度によって表すことができる：改善された柔軟組織の形状；改善された組織の機能；改善された柔軟組織の輪郭；持続する移植性；改善された患者の生活の質；および移植可能な外来物質の低い使用量。尿失禁処置において、括約筋の維持に関する、再生細胞を増大させたオートロガス脂肪導入の効果は、1またはそれ以上の以下に挙げるような臨床的尺度によって表すことができる：低減された失禁の頻度；持続する移植性；改善された患者の生活の質；および移植可能な外来物質の低い使用量。これら細胞療法の効果は、典型的に数日乃至数週間に渡って起こる。しかし、有利な効果は、数時間程の早さで観測され、また数年間持続するものであり得る。
【０１０２】
移植すべき脂肪組織の放出前、その最中およびその後の患者の監視は、以下のものを包含するが、これらに限定されない：凝固の研究；酸素飽和；血行力学的監視；創傷の状態。患者には、手術前の診断手順、例えばマンモグラフィーによる診断を受容れるべきであることを助言するが、その理由は、生じる石灰化が、その乳房における悪性石灰化の検出能力を歪める可能性があるという問題があるからである。しかし、この助言は、場合によるものである。というのは、磁気共鳴撮像法の利用が、この限界を克服するからである。付随的な監視は、所定の臨床的効果にとって特異的なものである。移植すべき脂肪組織の放出前、放出中および放出後の患者の監視は、以下に列挙するものを含むことができる：検尿；骨盤検査；膀胱鏡検査；および尿動態評価；凝固の研究；酸素飽和；血行力学的監視；創傷の状態。付随的な監視は、所定の臨床的効果にとって特異的なものである。
【実施例】
【０１０３】
以下の実施例は、本発明の技術を適用することのできる特定の状況およびセッティングを明らかにするために与えられるものであり、また本発明の範囲および本明細書に添付した特許請求の範囲を、何等限定するものではない。
【０１０４】
実施例1：脈管形成性成長因子、VEGFの、ADCによる発現
血管内皮成長因子（VEGF)は、脈管形成の主要な調節物質である（Nagy等, 2003; Folkman, 1995)。該VEGF群のもうひとつの構成員である、胎盤成長因子は、脈管形成並びに動脈形成両者において同様な役割を演じている。具体的には、野生型の(PIGF+/+)細胞の、PIGFノックアウトマウスへの移植は、後肢虚血からの迅速回復性誘発能力を復元する(Scholz等, 2003)。
再血管形成過程に対する、脈管形成性および動脈形成性の重要性が明らかにされたので、本発明の再生細胞によるPIGFおよびVEGF発現を、3種のドナーに由来する脂肪組織由来の再生細胞を使用して、ELISAアッセイ(MN, ミネアポリスのR&Dシステムズ(Systems)製)を利用して検討した。一名のドナーは高血糖症およびタイプ2糖尿病(微小血管系および巨大血管系の疾患と強い関連性を持った状態)の病歴を有していた。各ドナーからの再生細胞を、10％FCSおよび5％HSを補充した、DMEM/F-12培地に、1,000細胞/cm2にて播種し、密集状態となるまで成長させた。上澄みのサンプルを採取し、PIGFおよびVEGFタンパク発現についてアッセイした。図16Aおよび16Bに示したように、得られた結果は、本発明の脂肪組織由来の再生細胞による、VEGF(図16A)およびPIGF(図16B)両者の、高い発現性を明らかにしている。
【０１０５】
別の研究において、正常な成熟マウス由来の培養した再生細胞によって分泌された、脈管形成関連サイトカインの相対的な量を測定した。該再生細胞は、10％FBSを含むα-MEM中で、細胞密集状態を5日越えるまで培養し、この時点で該細胞培養培地を収穫し、抗体アレイ分析(レイバイオ(RayBioTM)マウスサイトカイン抗体アレイII (Mouse Cytokine Antibody Array II), レイバイオテック社(RayBiotech, Inc)製)により評価した。以下の様な脈管形成関連成長因子が検出された：血管内皮成長因子(VEGF)、bFGF、IGF-II、エオタキシン(Eotaxin)、G-CSF、GM-CSF、IL-12 p40/p70、IL-12p70、IL-13、IL-6、IL-9、レプチン(Leptin)、MCP-1、M-CSF、MIG、PF-4、TIMP-1、TIMP-2、TNF-αおよびスロンボポエチン(Thrombopoetin)。
これらデータは、本発明の再生細胞が、多数の脈管形成性および動脈形成性成長因子を発現することを明らかにしている。更に、糖尿病患者が、正常な患者と等価なレベルで、PIGFおよびVEGFを発現したという発見は、糖尿病患者が、オートロガス脂肪組織由来の再生細胞による脈管形成療法の、候補者であり得ることを示唆している。
【０１０６】
実施例2：ADCは、脈管形成に関与している、細胞集団を含む
内皮細胞およびそのプリカーサ、内皮前駆細胞(EPCs)は、脈管形成に関与していることが知られている。EPCsが、脂肪組織由来の再生細胞内に存在するか否かを決定するために、ヒト脂肪由来の再生細胞を、EPC細胞表面マーカー、例えばCD-34について評価した。
ADCsは、ヒトの皮下脂肪組織の、酵素消化によって単離した。ADCs(100ul)を、0.2％のウシ胎児血清(FBS)含有リン酸塩バッファー(PBS)中でインキュベートし、またヒト内皮マーカーCD-31(分化した内皮細胞マーカー)およびCD-34(EPCマーカー)、並びに多能性細胞上で選択的に発現される、ヒトABCG2(ATP結合カセット輸送体)に対する蛍光標識抗体と共に、4℃にて20〜30分間インキュベートした。洗浄後、細胞を、FACSAriaソーター(FACSAria Sorter) (ベクトンディッキンソン-イムノサイトメトリーBeckton Dickenson-Immunocytometry))によって分析した。次いで、データの取得および分析を、FACSDivaソフトウエア(BD-イムノサイトメトリー, CA)によって行った。結果(提示せず)は、健康な成人を由来とする脂肪由来の再生細胞が、EPCマーカーCD-34およびABCG2を発現するが、内皮細胞マーカーCD-31を発現しないことを示した。EPCマーカーCD-34を発現する細胞が、糖尿病の病歴を持つドナーを由来とする再生細胞と同様な頻度で検出された。
【０１０７】
内皮細胞分化培地において培養した後、ヒト脂肪組織由来の再生細胞におけるEPCsの頻度を決定するために、ADCsを、フィブロネクチン-被覆プレート上に播種し、内皮細胞培地中で3日間培養して、成熟内皮細胞を取り出した。非-接着生細胞を取り出し、再度播種した。14日後に、FITC-接合ユーレックスユーロパカスアグルチニン-1(FITC-conjugated Ulex europacus Agglutinin-1) (CA, バーリンガムのベクターラボ(Vector Labs))およびDil-標識したアセチル化LDL(OR, オイゲンのモレキュラープローブズ(Molecular Probes))で染色することにより同定した。図17に示したように、得られた結果は、EPCの頻度が、約500 EPC/106ADC細胞であることを示す。
該脂肪組織由来の再生細胞内におけるEPCsの存在は、これらの細胞が、新たな血管の生成に直接関与し、かつ脈管形成および再灌流を増強できることを示している。
【０１０８】
実施例3：ADCにおける、インビトロでの血管構造の発生
脈管形成に関する当業者において認識されているアッセイは、線維芽細胞の支持細胞層上での、内皮細胞の成長が、新生の毛細血管網の、CD31-ポジティブ管路を暗示する複雑なネットワークを発生するものである(Donovan等, 2001)。脂肪由来の再生細胞は、内皮細胞、EPCs、および他の基質細胞プリカーサを含むので、我々は、これら再生細胞の支持細胞層の無い条件下での、毛細血管-様構造を形成する能力をテストした。正常なマウスの鼠頚部脂肪パッドから得た再生細胞は、培養の2週間後に、毛細血管網を発生させた(図18A)。特に、ストレプトゾトシン(streptozotocin)(STZ)-誘発タイプ1糖尿病に罹っている高血糖症マウス由来の再生細胞は、STZ投与の8週間後に、正常なマウス由来の細胞によって形成されるものと等価な毛細血管網を生成した(図18B)。
その後の研究においては、脂肪由来の再生細胞を、追加の成長因子を含まない、完全培地(10％のFCSを補充したα-MEM)中で培養した。更に、生成した血管構造は、内皮細胞マーカーCD31、CD34、VE-カドヘリンおよびウイルブランド因子/ファクタVIII(Willebrand factor/Factor VIII)に関しては正に染色されたが、汎-リンパ細胞マーカーCD45については染色されなかった。
【０１０９】
若年および高齢マウス由来の再生細胞の、毛細血管網形成能力を比較するために、正常な若年および高齢(1、12、または18月齢)マウス由来の再生細胞を、追加の成長因子を含まない、完全培地(10％のFCSを補充したα-MEM)中で培養した。等価な毛細血管-の網状構造が、あらゆるドナー由来の再生細胞の培養物中に観測された(図示せず)。
上記データは、正常なおよび糖尿病に罹っている、並びに若年および高齢の患者に由来する、脂肪由来の再生細胞が、新生の毛細血管網形成と一致する、血管構造を生成し得ることを立証している。従って、本発明の再生細胞は、脈管形成機能不全症を治療するのに使用できる。
【０１１０】
実施例4：ADCにおける血管構造の、インビボでの発育
有望ではあるが、インビトロでの脈管形成能力は、該細胞がインビボ脈管形成能力を示さなければ、殆ど価値が無い。外科的に誘発させた後肢虚血が、所定の治療による脈管形成能力の確認を可能にするインビボモデルである。このモデルを、ヒト細胞の再灌流を作動させる能力を観測することのできる、免疫不全(NOD-SCID)マウス内で発現させた。
【０１１１】
手術前の血流値を、以下に記載するようにして、両後肢について測定した。麻酔したマウスの脈管系を、以下の部位において、4-0絹製の結サツ糸で縛った：1)分岐部近傍の腸骨動脈；2)深部大腿動脈の源の遠位部分；3)表面大腿動脈の分岐部近位部分。縛った後、該脈管系を全体として取出した。創傷を閉じる前に、該縛られた大腿動脈から分岐する、全体的に観測できる側部をも縛った。24時間後に、尾部静脈を通して、129Sマウスには、同質遺伝子的なマウス脂肪由来の再生細胞5×106個を注射し、またNOD-SCIDマウスには、ヒト脂肪由来の再生細胞注射した。レーザードップラーフローイメージャー(Laser Doppler Flow Imager)(DE、ウイルミントンのムーアインスツルメンツ社(Moor Instruments Inc.)製)を用いて、以下の手順で一定間隔で、外科手術後即剤に流れを画像化した。24日間に渡る、1週当たり3回の測定は、該四肢に対する手術前の値に規格化し、コントロール四肢(手術されていない)に相対的に提示した。
該後肢虚血モデルは、使用するマウスの系統に対して極めて敏感である。NOD-SCIDマウスは、免疫不全動物であり、急性炎症応答を開始する能力を欠いている。これらのマウスに関する、この外科的な方法は、重度の虚血を生じ、未処置の動物の2/3が、大腿切除部位下方の後肢構造を失う。細胞-処置を行わなかった動物は、足指上部のあらゆる構造を失う。しかも、免疫適格のある129Sマウスについて、未処置の動物は、指節上部のあらゆる構造を失い、また部分的に再灌流を回復する、内因性の能力を示した。これは、急性炎症応答と関連する固有の脈管形成性によるものであろう。これは、再灌流が、異なる系統の処置動物とコントロール動物とを比較した場合に、さほど極端ではないことを説明している。
【０１１２】
しかし、これらの結果は、脂肪由来の再生細胞で処置したマウスが、両系統の未処置のマウスと比較して、有意に改善された灌流を示すことを明らかにしている。12日目までに、血流は、NOD-SCIDの未処置マウスにおける値10±10％と比較して、ヒト再生細胞で処置したこの系統のマウスにおいては、50±11％まで回復した(p<0.05)。同様に、免疫適格のある129Sマウスは、未処置マウスにおける値54±4％と比較して、14日目において、80±12％までの血流の回復を示した。更に、マウスの全体的解剖は、再生細胞で処置したマウスの後肢における側部血管の出現を明らかにしたが、未処置マウスの後肢またはあらゆるマウスの健康な四肢での出現を示さなかった。
【０１１３】
実施例5：高いADC用量は、改善された移植片生存性および脈管形成性と関連する
オートロガス脂肪組織の移植は、形成術および再生外科術における比較的一般的な処置である(Fulton, 1998; Shiffman, 2001)。しかし、この処置は、該脂肪組織フラグメントが、血管供給無しに導入され、結果として移植片の生存性が、新たな血管形成に依存しているという事実によって制限される(Coleman, 1995; Eppley等, 1990)。従って、限定された方法で、該移植された組織は、虚血組織を現す。
【０１１４】
フィッシャーラットにおける研究を行ったが、そこでは脂肪組織フラグメントを、大腿外部の筋肉上の皮膚領域に移植した。その右足には、0.2gの脂肪組織フラグメントのみを、左足には、脂肪由来の再生細胞を、3種の異なる用量(1.7×105-1.3×106細胞/移植片；1用量当たり動物3匹)で添加することにより補充を行った、0.2gの脂肪組織フラグメントを移植した；このようにして、反対側の足は、コントロールとして機能した。次いで、動物を1ヶ月飼育し、その後これら動物を安楽死させ、該移植片を回収し、秤量し、ホルマリンで固定し、組織学的な分析のためにパラフィン中に包埋した。
図9Aに示したように、これらの結果は、コントロール脚中の移植組織の最小の維持率および処置した脚における移植片重み維持における容量-依存性の増加を示す。該移植片の免疫組織化学的な分析は、該脂肪由来の幹細胞処理した移植片(図20B、矢印)における、かなりの程度の脈管形成および灌流を示す。これは、また脂肪組織形態の維持とも関連している(図20B)。
従って、実施例1-5は、本発明の脂肪由来の再生細胞が、脈管形成性および動脈形成性の成長因子を分泌し、インビトロで新生の毛細血管網を生成し、脂肪移植片の生存性を高め、かつ虚血再灌流性を高めることを立証している。従って、本発明の再生細胞は、脈管形成および動脈形成を促進することができ、循環不全症状を伴う、多数の疾患の治療において機能することができる。
【０１１５】
実施例6：マウスにおける脂肪由来の再生細胞による、オートロガス脂肪導入の増進
脂肪由来の再生細胞(ADCs)の、オートロガス脂肪導入を増進する能力を、マウスにおいてテストした。ADCsはlacZ導入遺伝子を持つマウス(ローザ(Rosa) 26マウス(B6; 129S-Gt(ROSA)26Sor); 通常ローザ26マウスとして知られている)から得た。ここに記載した方法に従って、ADCsを、組織的合成のあるC57 B16/S129 F1マウスの鼠頚部脂肪パッドから得た脂肪組織と混合し、追加のF1マウスの頭蓋後部の皮下領域に移植した。
1ヵ月後に、該インプラントを回収し、かつX-gal溶液中で一夜染色した。該lacZ導入遺伝子を発現する細胞(ADCs)は、X-galに暴露した際に青く染色される。該インプラントは、該組織全体に渡る青への染色を示した。次いで、このインプラントを、パラフィン中に包埋し、切開し、マウス血管内皮成長因子1(Vascular Endothelial Growth factor 1; VEGFR1)に関するレセプタの抗体で染色した。
図19は、これら染色の結果を示し、そこで該インプラントは、青色の顆粒(矢印)を含み、またVEGFR1-正(細胞質全体に渡る暗色)の細胞で構成される、多数の円形構造を含むことが示された。これらデータは、処置された脂肪吸入体の、該インプラント内で新たな血管の形成を誘発する能力を持つことを明らかにしている。
【０１１６】
実施例7：ラット内での、脂肪由来の再生細胞による、オートロガス脂肪導入の増進
同系交配したホイスターラットから抽出した脂肪組織フラグメントを、ここに記載した方法に従って、脂肪由来の再生細胞と混合した。次いで、この組成物を、レシピエントラットの大腿部および頭皮下部に、皮下的に移植した。コントロールとして、同数の動物は、脂肪組織のみ(ADCsを含まず)を頭皮下部に受容れ、一方大腿部にインプラントを受容れた動物は、脂肪組織のみを移植した、反対側大腿を有していた。移植片は、移植の1ヵ月後に収穫した。
これらの結果(図20)は、脂肪由来の再生細胞の用量の増加に伴って、大腿部インプラントの移植片重量が増加する傾向があることを示す。これらインプラントの組織学的な検討は、ADCを補充した移植片の改善された血管分布を示す。これらラットにおける頭蓋背面の低い血管分布に基き、全体的に低い保持率を持つとはいえ、同様な修正が頭皮インプラントについても観測された。
【０１１７】
実施例8：豊胸乳房形成術におけるオートロガス脂肪導入
ヒトは、その乳房の形状を変えたいと望む。患者の手術前の評価は、この手順の関連するあらゆる危険および利点を開示する十分なインフォームドコンセントに加えて、型通りの病歴および肉体的な検討を含む。
この処置を始める前に、患者は脂肪組織の採集を受ける。該患者の体質を、脂肪組織の採集に適した部位について検討する。この処置は患者のベッド脇で行われる。脂肪組織は、該患者大腿部側部および内側部分から収穫するように選択される。該収穫すべき領域は、標準的な腫脹性液体溶液で皮下注射され、該注射溶液は、様々な標準的投与養生で、リドカイン、塩水、および/またはエピネフリンの組合せを含んでいても、あるいは含まなくても良い。
11-ブレードのメス(あるいは他の標準的なブレード)を用いて、小さな穿刺傷を、真皮を横切るように形成する。該ブレードを、360度回転させて、この傷を完成させる。次いで、鈍い先端を持つ14-ゲージ(あるいは適当なサイズ)のカニューレを、該皮下脂肪組織面に挿入する。該カニューレは、電動式の吸引デバイスまたは手動での吸引のためのシリンジに接続することができる。次いで、このカニューレを、該結合組織構造を崩壊するように、該面全体を移動させる。得られる吸引物の体積は、700cc〜1000ccなる範囲にある。このようにして集めた脂肪組織の一部を、上記の方法を用いて、脂肪組織由来の再生細胞を単離し、かつ濃厚化するために処理する。該脂肪組織の残りを、この患者の乳房に再度皮下挿入すべく処理する。あるいはまた、この患者は、脂肪除去術によって、脂肪組織の除去を受けたことになる。
【０１１８】
脂肪組織の取り出し後、該患者の止血を、標準的な外科技術によって行い、何よりもまず、該創傷を閉じる。脂肪組織の採集は、診療室において、豊胸乳房形成術の、約1-2時間前に行う。しかし、この採集のタイミングは、変動することが予想され、性能管理基準に依存するであろう。結局、この患者の管理を行う責任のある診療医が、この最終のタイミングを決定するであろう。
この脂肪組織処理により得られるこれらの再生細胞を、1単位の脂肪組織(約100-300cc)と混合して、上記の比率で移植する。組織の処理を完了した後、この患者に、豊胸乳房形成術を行うべく、準備する。この患者に加えられる細胞の用量は、脂肪組織処理後の細胞収量から決定される。オートロガス脂肪50cc当たり約5.5×105細胞を、乳房に移植する。乳輪周囲の切開によって、乳房組織内に挿入された、標準的な14-ゲージの鈍い先端部を持つカニューレによって、この組成物を加える。該再生細胞に富む脂肪組織は、涙と同様にして投与して、表面積対体積の比を増大させる。
この患者を監視して、この処置の約7日後に、該移植物は、上首尾で移植されたものと考えられ、この細胞療法の効果は、主治医にも明らかとなる。
【０１１９】
実施例9：オートロガス脂肪導入および柔軟組織欠陥
患者は、柔軟組織の増量、特に皮膚の窪みの治療を望んでいる。医師は、病歴および肉体的な評価を行って患者を評価し、またこの患者がオートロガス脂肪導入のための候補者であると決定する。
この処置を開始する前に、該患者は脂肪組織の採集に掛けられる。該患者の体質を、脂肪組織の採集に適した部位について検討する。この処置は、この患者のベッド脇で行われる。脂肪組織は、該患者の前方腹部壁のパンヌスから収穫する。該収穫すべき領域は、標準的な腫脹性液体溶液で皮下注射され、該注射液は、様々な標準的投与養生で、リドカイン、塩水、および/またはエピネフリンの組合せを含んでいても、あるいは含まなくても良い。
11-ブレードのメス(あるいは他の標準的なブレード)を用いて、小さな穿刺傷を、真皮を横切るように形成する。該ブレードを、360度回転させて、この傷を完成させる。次いで、鈍い先端を持つ14-ゲージ(あるいは適当なサイズ)のカニューレを、該皮下脂肪組織面に挿入する。該カニューレは、電動式の吸引デバイスまたは手動での吸引のためのシリンジに接続することができる。次いで、このカニューレを、該結合組織構造を崩壊するように、該面全体を移動させる。得られる吸引物の体積は、約400cc〜約800ccなる範囲にある。このようにして集めた脂肪組織の一部を、上記の方法を用いて、細胞を単離し、かつ濃厚化するために処理する。該脂肪組織の残りを、この患者の柔軟組織に再度皮下挿入すべく処理する。
【０１２０】
脂肪組織の取り出し後、該患者の止血を、標準的な外科技術によって行い、何よりもまず、該創傷を閉じる。脂肪組織の採集は、脂肪組織増量の、約1-2時間前に行うことができる。
この脂肪組織処理により得られるこれらの再生細胞を、1単位の脂肪組織と混合し、上記の方法並びに比率で移植する。組織の処理を完了した後、この患者に、柔軟組織の増量を行うべく、準備する。この患者に加えられる細胞の用量は、脂肪組織処理後の細胞収量から決定される。オートロガス脂肪50cc当たり約5.5×105細胞を、該柔軟組織に移植する。適切に位置する切開部を介して、該柔軟組織に挿入された、標準的な14-ゲージの鈍い先端部を持つカニューレによって、この組成物を加える。該再生細胞に富む脂肪組織は、涙と同様にして投与して、表面積対体積の比を増大させる。
この患者を、移植脂肪組織を加える前、その最中およびこれらを加えた後に監視を行う。2日後に、患者は、該皮膚の窪みが、ほぼ完全に排除されたことに気付く。
【０１２１】
実施例10：ストレス尿失禁に対する、オートロガス脂肪導入
尿失禁の経験のある人は、医師の治療を要する。この患者の手術前の評価は、この処置に関連するあらゆる危険および利点を開示する十分なインフォームドコンセントに加えて、型通りの病歴および肉体的な検査を含む。
この処置を開始する前に、該患者は脂肪組織の採集に掛けられる。該患者の体質を、脂肪組織の採集に適した部位について検討する。この処置は、この患者の臨床的状態に適した、血行力学的監視を備えた手術室において行うことができる。脂肪組織は、該患者の、両側下部四肢の側部および内側および前方腹部壁のパンヌスから収穫する。該収穫すべき領域は、標準的な腫脹性液体溶液で皮下注射され、該注射液は、様々な標準的投与養生で、リドカイン、塩水、および/またはエピネフリンの組合せを含んでいても、あるいは含まなくても良い。
11-ブレードのメス(あるいは他の標準的なブレード)を用いて、小さな穿刺傷を、真皮を横切るように形成する。該ブレードを、360度回転させて、この傷を完成させる。次に、鈍い先端を持つ14-ゲージ(あるいは適当なサイズ)のカニューレを、該皮下脂肪組織面に挿入する。該カニューレは、電動式の吸引デバイスまたは手動での吸引のためのシリンジに接続することができる。次いで、このカニューレを、該結合組織構造を崩壊するように、該面全体を移動させる。得られる吸引物の体積は、約1200ccである。このようにして集めた脂肪組織の一部を、上記の方法を用いて、再生細胞を単離し、かつ濃厚化するために処理する。該脂肪組織の残りを、この患者の膀胱の頚部および尿道基部近傍に再度皮下挿入すべく処理する。あるいはまた、脂肪除去処置によって、該患者から脂肪を除去することができる。脂肪組織の取り出し後、止血を、標準的な外科技術によって行い、何よりもまず、該創傷を閉じる。脂肪組織の採集は、この処置の約1-2時間前に行うことができる。
【０１２２】
この脂肪組織処理により得られるこれらの再生細胞を、1単位の脂肪組織と混合し、上記の比率で移植する。組織の処理を完了した後、この患者に、移植を行うべく、準備する。この患者に加えられる細胞の用量は、特に脂肪組織処理後の細胞収量から決定される。オートロガス脂肪50cc当たり約5.5×105細胞を、膀胱鏡による可視化を通して、膀胱の頚部および尿道基部近傍に移植する。
この患者を、この処置の後に監視を行う。この移植の約3日後に、患者は、失禁頻度における減少を経験する。この処置の約1ヵ月後に、この患者は、その生活の質が改善されたことを指摘する。医師は、この移植された組織を評価し、またこの移植が長期に渡り上首尾であったものと決定する。
多くの刊行物および特許が、以上の記載において引用されている。これら引用した刊行物および特許各々の内容全体を、本発明の参考としてここに組み入れる。
等価物
当業者は、型通りの実験程度を用いて、ここに記載した本発明の特定の態様に関する多くの等価物を認識し、あるいは確認することができるであろう。このような等価物は、ここに添付した特許請求の範囲に包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】一つのフィルタアセンブリーを含む、組織由来の再生細胞を分離するための装置を示す図である。
【図２】直列構成で、複数のフィルタアセンブリーを含む、図1の装置と類似する装置を示す図である。
【図３】並列構成で、複数のフィルタアセンブリーを含む、図1の装置と類似する装置を示す図である。
【図４】遠心分離チャンバーを含む、組織由来の再生細胞を分離するための装置を示す図である。
【図５】組織由来の再生細胞を分離するための装置において使用する、予め固定されたフィルタを含む、最終チャンバーの断面図である。
【図６】浸透式濾過装置を利用する、組織由来の再生細胞を分離するための装置の、処理チャンバーの断面図である。
【図７】該再生細胞を濃厚化するための、遠心分離デバイスを利用する、再生細胞を分離するための装置の、処理チャンバーの断面図である。
【図８】図7に示した、該処理チャンバーのもう一つの断面図である。
【図９】図9.1、9.2および9.3は本発明の該装置と共に使用する、エルトリエーション部材を示す図である。
【図１０】減圧を利用して、組織由来の再生細胞を分離するための装置を示す図である。真空系は、該装置の出口に真空ポンプまたは真空源を適用することにより組立てられ、ストップコック、ベントおよびクランプを含む系を用いて、予め定められた速度にて、組織および流体を吸引するように制御され、その流動の方向およびタイミングが調節される。
【０１２４】
【図１１】装置に流体を通すために、正の圧力を利用して、組織由来の再生細胞を分離するための装置を示す図である。正の圧力系は、機械的な手段、例えば蠕動ポンプを使用し、この蠕動ポンプは、流動の方向およびタイミングを調節するために、ストップコック、ベントおよびクランプを含む系を用いて、予め定められた速度にて、組織および流体をこの装置に押込みあるいは推進する。
【図１２】図12Aは、流体の供給流が、該フィルタの孔に対して接線方向に流れるような、濾過過程を示す。図12Bは、流体の供給流が、該フィルタの孔に対して垂直に流れるような、濾過過程を示す。
【図１３】本発明の装置において使用するための、例示的な使い捨てセットを示す図である。
【図１４】本発明の装置において使用するための、例示的な再利用可能な部品を示す図である。
【図１５】図13に示したものと類似する使い捨てセットおよび図14に示したものと類似する再利用可能な部品を用いて組み立てた、本発明の例示的なデバイスを示す図である。
【図１６】図16Aおよび16Bは、培養された脂肪由来の幹細胞による、VEGF(5A)およびPIGF(5B)タンパク質の発現を示す図である。
【図１７】脂肪由来の幹細胞集団内の、内皮前駆細胞の検出を示す図である。
【図１８】図18Aおよび18Bは、正常な(7A)およびストレプトゾトシン-処理した(7B)マウス両者における、血管構造のインビトロでの発育を示す図である。
【図１９】負のコントロールと比較した、脂肪由来の幹細胞で処置した、後肢虚血マウスにおける、血流の高い平均回復率を示す図である。
【図２０】図20Aおよび20Bは、脂肪由来の幹細胞の用量の増加が、移植片の生存率および脈管形成性を改善することを示し(20A)、また組織学的な検体における、脂肪組織構造の保持率を示す(20B)図である。
【符号の説明】
【０１２５】
10・・・本発明の装置；
11・・・真空ライン；
12・・・導管；
14・・・バルブ；
20・・・採集チャンバー；
21・・・入り口；
22・・・出口；23・・・塩水源；
24・・・組織分解剤源；
25・・・回転シャフト；
27・・・フィルタケージ；
28、36・・・フィルタ(アセンブリー)；
29・・・センサ；
30・・・処理チャンバー；
32・・・ベント；
34・・・ポンプ；
39・・・圧力センサ；
60・・・サンプルチャンバー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年6月21日(2007.6.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を含む、患者に投与するのに好適な脂肪由来再生細胞を含む脂肪組織組成物の製造方法。
患者から取出した脂肪組織を密閉経路を維持するように形成された内蔵型細胞処理ユニットに導入する工程、
取出した脂肪組織に存在する成熟脂肪細胞及び結合組織から、脂肪組織由来再生細胞を含む細胞集団を分離し、密閉経路を維持しながら、該内蔵型細胞処理ユニットに、脂肪由来再生細胞を含む実質的に分離された細胞集団を得る工程、
密閉経路を維持しながら、該内蔵型細胞処理ユニット中で、脂肪由来再生細胞を含む実質的に分離された細胞集団を濃縮し、脂肪由来再生細胞を含む濃縮された細胞集団を得る工程、及び
密閉経路を維持しながら、該内蔵型細胞処理ユニット中で、脂肪由来再生細胞を含む濃縮された細胞集団を、前記患者から得られた未処理の脂肪組織の第二の部分と混合し、脂肪由来再生細胞を含む濃縮された細胞集団と前記未処理脂肪組織の混合物を含む脂肪組織組成物を得る工程。
【請求項２】
該脂肪組織組成物が、該患者の乳房に投与するのに適している、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該脂肪組織組成物が、該患者の柔軟組織領域に投与して、柔軟組織欠陥を治療するのに適している、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
該脂肪組織組成物が、該患者の尿道領域に投与して、尿失禁を治療するのに適している、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
該脂肪由来再生細胞が幹細胞を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
該脂肪由来再生細胞が前駆細胞を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
該脂肪由来再生細胞が幹細胞と前駆細胞とを含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
該脂肪組織組成物が、多重用量で投与するのに適している、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
該脂肪組織組成物が、更に１またはそれ以上の脈管形成性因子を含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
該脂肪組織組成物が、更に１またはそれ以上の動脈形成性因子を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
該脂肪組織組成物が、更に１またはそれ以上の免疫抑制性薬物を含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
脂肪由来再生細胞を含む濃縮された細胞集団を、該患者から取り出された脂肪組織の該第二の部分と混合する前に、培養する、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
該培養工程が、内皮表現型への分化を促進する培養条件に該再生細胞を暴露する工程を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
該培養工程が、該患者の上またはその内部に配置することのできる、二次元または三次元の構築物を生成する、スカフォールド材料上で行われる、請求項１２または１３記載の方法。
【請求項１５】
該スカフォールド材料が、インビボにて再吸収性である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
該再生細胞を、遺伝子導入によって変性させて、該変性された再生細胞内の１またはそれ以上の遺伝子の発現を変更する、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
該変性が、該患者の脈管形成性レベルの変更をもたらす、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
該変性が、該患者の動脈形成性レベルの変更をもたらす、請求項１６または１７記載の方法。
【請求項１９】
該変性が、該患者のアポトーシスレベルの変更をもたらす、請求項１６または１７または１８記載の方法。
【請求項２０】
該脂肪組織組成物の投与が、新血管形成性を促進する、請求項１〜１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
該投与された脂肪組織組成物が、最早存在しなくなった後にも、該新血管形成性が、安定に維持されている、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
該脂肪組織組成物の投与が、壊死を減じる、請求項１〜２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
該患者がヒトである、請求項１〜２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
該脂肪組織組成物が、患者の口唇のインプラント、患者の鼻唇のインプラント、患者の皺のインプラント、患者の目の下部のインプラント、患者の頬のインプラント、患者の顎のインプラント、患者の側頭部のインプラント、患者の胸部のインプラント、患者の大腿部のインプラント、患者の脹脛のインプラント、患者の腕のインプラント、患者の腹部のインプラント、患者の尿道括約筋のインプラント、及び患者の直腸括約筋のインプラント、からなる群から選ばれる処置における投与に適している請求項１〜２３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
該脂肪組織組成物が、密閉経路を維持しながら該患者に再導入可能である、請求項１〜２４のいずれか1項記載の方法。
【請求項２６】
該脂肪組織組成物が、少なくとも約1×105〜約1×107細胞/mLを含む、請求項１〜２５のいずれか１項記載の方法。