(57)【要約】【解決手段】  癌や他の疾患を治療するためのミニシャペロンとそれらの使用方法が提供される。ＧＲＰ９４に選択的結合親和性を有する治療薬のスクリーニングを容易にする手段も提供される。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
切断したＧＲＰ９４ミニシャペロンタンパク質をコード化する核酸。
【請求項２】
請求項１の核酸において、
前記核酸は、配列ＩＤ番号２のアミノ酸３４〜３５５、配列ＩＤ番号２のアミノ酸３４〜２２１、及び配列ＩＤ番号２のアミノ酸７０〜２２１からなる群から選択されたＧＲＰ９４タンパク質変異体をコード化するものである。
【請求項３】
発現ベクター内に含まれる、請求項２の核酸。
【請求項４】
請求項２の核酸によってコード化されたＧＲＰ９４ミニシャペロンタンパク質。
【請求項５】
薬学的に許容可能な担体内に含まれる、請求項４のタンパク質を有する組成物。
【請求項６】
請求項５の組成物であって、さらに、
前記ＧＲＰ９４ミニシャペロンタンパク質と複合体を形成しているペプチドを有するものである組成物。
【請求項７】
請求項６の組成物において、
前記複合体内の前記ペプチドは、腫瘍特異的抗原を有するものである。
【請求項８】
請求項６の組成物において、
前記複合体内の前記ペプチドは、ウイルス抗原を有するものである。
【請求項９】
悪性度を治療するために、腫瘍組織に対する免疫反応を刺激する方法であって、
ａ）請求項４に記載された少なくとも１つのミニシャペロンと、腫瘍特異的抗原を有する少なくとも１つの腫瘍特異的ペプチドとの間で複合体を形成する工程と、
ｂ）それらを必要とする患者へ、前記複合体の有効量を投与し、腫瘍特異的細胞殺傷性Ｔ細胞（ＣＴＬ）反応を開始させ、前記ＣＴＬ反応が前記腫瘍組織内での減少を引き起こし、その結果、前記悪性度を治療する工程と
を有する方法。
【請求項１０】
請求項９の方法において、
前記少なくとも１つのペプチドは、多数の共有腫瘍抗原を有するものである。
【請求項１１】
請求項１０の方法において、
前記共有腫瘍抗原は、表３に記載されたペプチドからなる群から選択されるものである。
【請求項１２】
請求項９の方法において、
前記少なくとも１つの腫瘍特異的ペプチドは、前記患者から単離され、工程ａ）の複合体を形成するために使用されるものである。
【請求項１３】
ウイルス感染に対する免疫反応を刺激し、前記感染を治療するための方法であって、
ａ）請求項４に記載された少なくとも１つのミニシャペロンと、前記ウイルスに対する抗原特異性を有した少なくとも１つのウイルス特異的ペプチドとの間で複合体を形成する工程と、
ｂ）それらを必要とする患者へ前記複合体の有効量を投与し、ウイルス特異的細胞殺傷性Ｔ細胞（ＣＴＬ）反応を開始させ、前記ＣＴＬ反応が前記ウイルス負荷を減少し、その結果、前記感染を治療する工程と
を有する方法。
【請求項１４】
請求項１３の方法において、
前記少なくとも１つのペプチドは、多数のウイルス特異的抗原を有するものである。
【請求項１５】
ホモ接合体ヌル変異をその内在性ＧＲＰ９４遺伝子内に持つトランスジェニックマウス胚であって、
前記変異は、胚性幹細胞内の相同性組換えを介して前記マウスへ導入され、さらに前記マウスは、機能性マウスＧＲＰ９４タンパク質を発現しないものである。
【請求項１６】
請求項１５のトランスジェニックマウスにおいて、
前記ヌル変異は、マウス胚盤胞への胚性幹細胞のマイクロ注入をした後に、胚性段階の前記マウスの祖先へ導入されるものである。
【請求項１７】
請求項１５のトランスジェニックマウス胚において、
前記ヌル変異は、胚性幹細胞を受精卵或いは桑実胚と共−インキュベーションした後に、胚性段階の前記マウスの祖先へ導入されるものである。
【請求項１８】
請求項１５のトランスジェニックマウス胚由来のＧＲＰ９４欠損細胞株。
【請求項１９】
胚性幹細胞株である、請求項１８の細胞株。
【請求項２０】
細胞分化を受けるように導入された、請求項１９の細胞株。
【請求項２１】
請求項２０のＧＲＰ９４欠損細胞株であって、
ニューロン、脂肪細胞、肝細胞、及びリンパ球からなる群から選択された細胞タイプへ分化するように導入されたものである、ＧＲＰ９４欠損細胞株。
【請求項２２】
ＧＲＰ９４活性に選択的に影響する治療薬剤をスクリーニングするための方法であって、
ａ）テスト化合物を請求項１８の細胞、及び野生型マウス胚由来の細胞へ投与する工程と、
ｂ）ＧＲＰ９４関連生理学的過程の変化を、前記ＧＲＰ９４欠損細胞及び野生型細胞において評価し、それにより、ＧＲＰ９４活性を選択的に調節する薬剤を同定する工程と
を有する方法。
【請求項２３】
ＧＲＰ９４活性に選択的に影響する治療薬剤をスクリーニングするための方法であって、
ａ）テスト化合物を請求項１９の細胞、及び野生型マウス胚由来の細胞へ投与する工程と、
ｂ）ＧＲＰ９４関連生理学的過程の変化を、前記ＧＲＰ９４欠損細胞及び野生型細胞において評価し、それにより、ＧＲＰ９４活性を選択的に調節する薬剤を同定する工程と
を有する方法。
【請求項２４】
ＧＲＰ９４活性に選択的に影響する治療薬剤をスクリーニングするための方法であって、
ａ）テスト化合物を請求項２１の細胞、及び野生型マウス胚由来の細胞へ投与する工程と、
ｂ）ＧＲＰ９４関連生理学的過程の変化を、前記ＧＲＰ９４欠損細胞及び野生型細胞において評価し、それにより、ＧＲＰ９４活性を選択的に調節する薬剤を同定する工程と
を有する方法。
【請求項２５】
ＨＳＰ９０ミニシャペロンをコード化する核酸であって、
ヒトＨＳＰ９０のアミノ酸１〜２１０を有し、
少なくとも１つのアミノ酸残基は、別のアミノ酸へ置換されたＴｈｒ９０、Ｉｌｅ８１、Ｐｒｏ８２からなる群から選択されるものである核酸。
【請求項２６】
請求項２５の核酸によってコード化されたＨＳＰ９０ミニシャペロンタンパク質。
【請求項２７】
薬学的に許容可能な担体内に請求項２６のＨＳＰ９０ミニシャペロンを有する薬学的組成物。
【請求項２８】
悪性度を治療するために、腫瘍組織に対する免疫反応を刺激する方法であって、
ａ）請求項２６に記載された少なくとも１つのミニシャペロンと、腫瘍特異的抗原を有する少なくとも１つの腫瘍特異的ペプチドとの間で複合体を形成する工程と、
ｂ）それらを必要とする患者へ前記複合体の有効量を投与し、腫瘍特異的細胞殺傷性Ｔ細胞（ＣＴＬ）反応を開始させ、前記ＣＴＬ反応は前記腫瘍組織の減少を引き起こし、それにより前記悪性度を治療する工程と
を有する方法。
【請求項２９】
請求項２８の方法において、
前記少なくとも１つのペプチドは、多数の共有腫瘍抗原を有するものである。
【請求項３０】
請求項２９の方法において、
前記共有腫瘍抗原は、表３に記載された群から選択されるものである。
【請求項３１】
請求項２８の方法において、
前記少なくとも１つの腫瘍特異的ペプチドは、前記患者から単離され、工程ａ）の複合体を形成するために使用されるものである。
【請求項３２】
ウイルス感染に対する免疫反応を刺激し、前記感染を治療するための方法であって、
ａ）請求項２６に記載された少なくとも１つのミニシャペロンと、前記ウイルスに対する抗原特異性を有する少なくとも１つのウイルス特異的ペプチドとの間で複合体を形成する工程と、
ｂ）それらを必要とする患者へ前記複合体の有効量を投与し、ウイルス特異的細胞殺傷性Ｔ細胞（ＣＴＬ）反応を開始させ、前記ＣＴＬ反応は、前記ウイルス負荷の減少を引き起こし、それにより前記感染を治療する工程と
を有する方法。
【請求項３３】
請求項３２の方法において、
前記少なくとも１つのペプチドは、多数のウイルス特異的抗原を有するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本発明は、２００３年５月１２日に出願された米国仮出願番号第６０／４６９，７２３号、２００３年６月６日に出願された米国仮出願番号第６０／４７７，９９０号と第６０／４７８，１４８９号、及び２００４年４月２８日に出願された米国仮出願番号第６０／５６６，３６２号と第６０／５６６，３６３号に対して優先権を主張するものである。前述の仮出願のそれぞれに開示されたことは、この参照によって本明細書に組み込まれるものである。
【０００２】
ここに記載された本発明の一部はアメリカ国立衛生研究所からの資金で行われた（グラント番号：ＣＡ−７４１８２及びＮＩＨ／ＮＩＡＩＤ  ＲＯ１  ＡＩ３０１７８）ため、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．第２０２条（ｃ）に準じて、米国政府は特定の権利を有することは理解されるものである。
【０００３】
本発明は、免疫調節、癌治療、及び胚形成の領域に関連するものである。より詳しくは、本発明は、これらの過程に有利に及び治療的に影響を与えるための、ＧＲＰ９４ベース組成物、及びそれらの使用方法を提供するものである。
【背景技術】
【０００４】
いくつかの刊行物や特許文献は、本発明に付随する技術分野を説明するために本明細書を通じて引用される。それらの引用のそれぞれは、この参照により、完全に説明されているかのようにその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００５】
グルコース調節タンパク質９４（Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ９４；ＧＲＰ９４）は、小胞体内に存在し、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）９０ファミリーのメンバーである、分子シャペロン若しくはストレスタンパク質である。このファミリーは、細菌のｈｔｐＧ遺伝子、酵母のＨＳＰ８２、高等真核生物のＨＳＰ９０α及びβ、及びミトコンドリアのＴＲＡＰ１タンパク質を含む（Ｂｕｃｈｎｅｒ，Ｊ．１９９９．Ｈｓｐ９０&Ｃｏ．−ａ  ｈｏｌｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｆｏｌｄｉｎｇ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ２４：１３６）。ＨＳＰ９０タンパク質は、細胞シグナル伝達から細菌性認識や免疫調節にまで至る多様な細胞活性に関与する、タンパク質基質の高次構造的な成熟を制御し関与するリガンドである。細胞培養モデルにおける広範囲な研究によって、ＧＲＰ９４発現は、グルコースのレベルを減少することによって（Ｌｅｅ，Ａ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｇｅｎｅｓ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８３．２５８：ｐ．５９７〜６０３）、細胞カルシウムレベルの摂動（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ，Ｉ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｓｔｏｒｅｓ  ｂｙ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ  Ａ２３１８７  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８７．２６２（２６）：ｐ．１２８０１〜５；Ｌｉｔｔｌｅ，Ｅ．ａｎｄ  Ａ．Ｓ．Ｌｅｅ，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ  ｄｒｉｖｅｎ  ｂｙ  ａ  ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９５．２７０（１６）：ｐ．９５２６〜３４）、或いは、酸化還元ポテンシャル（Ｋｉｍ，Ｙ．Ｋ．，Ｋ．Ｓ．Ｋｉｍ，ａｎｄ  Ａ．Ｓ．Ｌｅｅ，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ｂ−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９８７．１３３（３）：ｐ．５５３〜５５９）、グリコシル化（糖修飾）の阻害、若しくは折り畳まれていないタンパク質反応の活性化（Ｇａｓｓ，Ｊ．Ｎ．，Ｎ．Ｍ．Ｇｉｆｆｏｒｄ，ａｎｄ  Ｊ．Ｗ．Ｂｒｅｗｅｒ，Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｓｅｃ��ｅｔｉｎｇ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２００２．２７７（５０）：ｐ４９０４７〜５４）などによって調節されることが示された。
【０００６】
その発現を調節する全ての要素を考えると、酵母細胞は哺乳類細胞と同様にこれらのストレス状況に反応するにも関わらず、ＧＲＰ９４が酵母ゲノムには存在しないことは興味深い。ＧＲＰ９４細胞は、本質的に多細胞性生物のタンパク質であるが、ＥＲにおける全体的なタンパク質折り畳みには明らかに必要ではなく、それ自体は分泌性過程にも必要ではない。従って、ＧＲＰ９４が重要かどうか及びどの過程にＧＲＰ９４が重要なのかという質問が生じる。
【０００７】
腫瘍は、一般的に、しばしばそれ自身の形質転換過程に関連している変異タンパク質を含む。同じ変異タンパク質は、生化学的に異なる腫瘍も生じる。それ故に、そのようなタンパク質は、外来性として認識されるべきであり、免疫システムのＴ細胞アームによる活発な免疫反応を誘発する（Ｖｅｌｄｅｒｓ，Ｍ．Ｐ．，Ｈ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，ａｎｄ  Ｗ．Ｍ．Ｋａｓｔ，Ａｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ：ｉｍｐｅｄｉｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ａｄｖａｎｃｅｓ．Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，１９９８．２５：６９）。しかし、腫瘍細胞を殺傷するＴ細胞の天然の能力にも関わらず、実際は、検出可能ではあるが、癌に対する免疫反応は弱い。これは、免疫偵察システム全体から逃れるための、若しくはＴ細胞の"炎症力（ｆｉｒｅ  ｐｏｗｅｒ）"を減少するための、腫瘍細胞内の複数のメカニズムにおける進化に起因する。
【０００８】
Ｓｒｉｖａｓｔａｖａらは、ペプチドに結合した腫瘍内のＧＲＰ９４（Ｔａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｕｍｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７．２７８：１１７〜１２０を参照のこと）は、瀕死の細胞から放出されており（Ｂａｓｕ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｒｅｌｅａｓｅｓ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｗｈｉｃｈ  ｄｅｌｉｖｅｒ  ａ  ｐａｒｔｉａｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｏ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｔｈｅ  ＮＦ−ｋａｐｐａ  Ｂ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０００．１２：１５３９〜１５４６を参照のこと）、次に、マクロファージ及び／若しくは樹状細胞によって取り込まれ（Ｂｉｎｄｅｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｄ．Ｋ．Ｈａｎ，ａｎｄ  Ｐ．Ｋ．Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，ＣＤ９１：ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｐ９６．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０００．１：１５１〜１５５；Ｂｅｒｗｉｎ，Ｂ．，Ｊ．Ｐ．Ｈａｒｔ，Ｓ．Ｒｉｃｅ，Ｃ．Ｇａｓｓ，Ｓ．Ｖ．Ｐｉｚｚｏ，Ｓ．Ｒ．Ｐｏｓｔ，ａｎｄ  Ｃ．Ｖ．Ｎｉｃｃｈｉｔｔａ．２００３．Ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ａ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｇｐ９６／ＧＲＰ９４  ａｎｄ  ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２２：６１２７を参照のこと）、ここでは、Ｔａｍｕｒａ，Ｙ．ら（図１）に記載されたように、前記ペプチドはＧＲＰ９４から解離し、クラスＩ組織適合性タンパク質へ移行される。クラスＩ分子によって提示されたペプチドは、主にＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激するので、これは"ペプチド再提示"経路と呼ばれ、本発明者らの研究室によって培養細胞において、及びＳｒｉｖａｓｔａｖａの研究室によってマウスモデルにおいて、この経路によって１０〜１００倍の増加を示すように腫瘍に対して増強されたキラー細胞活性を導く（Ｓｕｔｏ，Ｒ．ａｎｄ  Ｐ．Ｋ．Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｈａｐｅｒｏｎｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５．２６９：１５８５〜１５８８、及びＢｌａｓｈｅｒｅ，Ｎ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，ｅｌｉｃｉｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９７．１８６：１３１５〜１３２２を参照のこと）。ＧＲＰ９４は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）活性を誘発し、ＡＰＣのトール様（ＡＰＣ活性化）受容体及びエンドサイトーシス（交差提示）受容体の相互作用を解してＡＰＣの交差提示経路へペプチドを向ける（Ｖａ���ｕｌａｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｓ．  Ｂｒａｅｄｅｌ，Ｎ．Ｈｉｌｆ，Ｈ．Ｓｉｎｇｈ−Ｊａｓｕｊａ，Ｓ．Ｈｅｒｔｅｒ，Ｐ．Ａｈｍａｄ−Ｎｅｊａｄ，Ｃ．Ｊ．Ｋｉｒｓｃｈｎｉｎｇ，Ｃ．Ｄａ  Ｃｏｓｔａ，Ｈ．Ｇ．Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ，Ｈ．Ｗａｇｎｅｒ，ａｎｄ  Ｈ．Ｓｃｈｉｌｄ．２００２．Ｔｈｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍｒ−ｒｅｓｉｄｅｎｔ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｐ９６  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｔｈｅ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２／４  ｐａｔｈｗａｙ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２０８４７）。
【０００９】
分化及び器官形成の過程は、天然代謝性ストレス反応に関与するように考えられるが、哺乳類発生の間のＧＲＰ９４発現に関しては、ほとんど知られていない。ＧＲＰ９４が胚形成の間で重要であるかどうかは、まだ決定されていない。
【００１０】
前述したことに基づいて、免疫過程の調節における、ＧＲＰ９４やそれらの断片によって担われている役割のさらなる解明が必要であることは明らかである。そのような情報によって、癌、ウイルス感染及び他の代謝性障害を治療するための新規ＧＲＰ９４ベース治療法を提供する。
【発明の開示】
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、切断されたＧＲＰ９４ミニシャペロンタンパク質をコード化する核酸が提供される。好ましい実施形態において、前記核酸配列は、配列ＩＤ番号２の３４〜３５５アミノ酸、配列ＩＤ番号２の３４〜２２１アミノ酸、配列ＩＤ番号２の７０〜２２１アミノ酸からなる群から選択されたＧＲＰ９４タンパク質変異体をコード化する。
【００１２】
前述した核酸によってコード化されたＧＲＰ９４ミニシャペロンタンパク質も提供される。別の観点において、薬学的に許容可能な担体内に含まれた生物学的に関連性のあるペプチドと複合された、少なくとも１つの前記ミニシャペロンタンパク質を有する組成物が開示される。そのようなペプチドは、腫瘍特異的抗原、及びウイルス抗原を有するが、これに限定されない。
【００１３】
本発明は、悪性腫瘍を治療するために、腫瘍組織に対する免疫反応を刺激するための方法も提供する。例示的な方法は、本発明の少なくとも１つのミニシャペロンと、腫瘍特異的抗原を有する少なくとも１つの腫瘍特異的ペプチドとの間で複合体を形成する工程と、それを必要としている患者へ、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）反応が開始するような、前記複合体の有効量を投与する工程とを伴う。前記ＣＴＬ反応は、前記腫瘍組織の減少を生じ、それにより悪性腫瘍を治療する。腫瘍特異的ペプチドは、表３に記載したものを含むが、これに限定されるものではない。或いは、そのようなペプチドは、悪性腫瘍に対する治療を受けている患者から単離される。
【００１４】
別の観点において、本発明は、ウイルス感染を治療するために、ウイルス感染に対する免疫反応を刺激する方法を提供する。例示的な方法は、本発明の少なくとも１つのミニシャペロンと、前記ウイルスに特異的な抗原を有する少なくとも１つのウイルス特異的ペプチドとの間で複合体を形成する工程と、それを必要とする患者へ、ウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）反応が開始し、前記ウイルス付加の減少を生じ、それにより前記感染を治療するような、前記複合体の有効量を投与する工程とを伴う。
【００１５】
その内在性ＧＲＰ９４遺伝子においてホモ接合性無発現変異を内部に持つトランスジェニック（遺伝子組換え）マウス胚も本発明によって含まれ、ここにおいて前記変異は、胚性幹細胞における相同的な組換えを介して前記マウスへ導入され、さらに前記マウスは、機能的マウスＧＲＰ９４タンパク質を発現しない。
【００１６】
上述したトランスジェニックマウス胚に由来するＧＲＰ９４欠損細胞株も開示される。そのような細胞株は、胚性幹細胞株、細胞分化が起こるように導入された幹細胞株を含み得るが、これに限定されるものではない。本発明のＧＲＰ９４欠損細胞株を用いて得られる細胞タイプは、例えば、神経細胞（ニューロン）、脂肪細胞、肝細胞、及びリンパ球を含む。
【００１７】
本発明のＧＲＰ９４欠損細胞株を用いて、ＧＲＰ９４活性に選択的に影響する治療薬をスクリーニングする方法も、本発明の範囲内である。そのような方法の１つとして、ＧＲＰ９４欠損細胞及び野生型マウス胚に由来する細胞へテスト化合物を投与する工程と、前記ＧＲＰ９４関連性生理学的過程における変化を、前記ＧＲＰ９４欠損細胞と野生型細胞とで評価し、これにより、ＧＲｐ９４活性を選択的に修飾する薬剤を同定する工程とを伴う。
【００１８】
最終的に、本発明は、ヒトＨＳＰ９０の１〜２１０アミノ酸を有するＨＳＰ９０ミニシャペロンをコード化する核酸を開示し、ここにおいて、Ｔｈｒ９０、Ｉｌｅ８１、Ｐｒｏ８２からなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸残基は、別のアミノ酸に変更される。前記ＨＳＰ９０ミニシャペロンを用いて、腫瘍若しくはウイルス抗原に対する免疫反応を刺激する方法も提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
ストレスタンパク質ＧＲＰ９４がＴ細胞に対するペプチドの提示を増強することが可能であるので、他のＨＳＰ９０ファミリー全メンバーと同様に、どのようにペプチドに結合するのか定義することが重要である。ＧＰＲ９４の半分のＮ−末端によって、完全長のタンパク質のペプチド結合活性を説明することができると以前示されたため、本発明者らは、分子ドッキングモデルの予想をテストすることによって、この結合部位を見つけた。最善の予想部位は、ｐａｎ−ＨＳＰ９０ラディシコール結合ポケットからのβシートの対面上であり、深い疎水性ポケットと近接している。前記ペプチドとラディシコール結合部位は、ペプチドに結合するためのラディシコール−屈折変異の能力によって示されるように、区別されている。フルオロフォアａｃｒｙｌｏｄａｎが、前記疎水性ポケット内のＣｙｓ１１７へ結合した場合、２つのリガンドの隣接性と一致して、その蛍光はペプチド結合によって減少される。前記結合ペプチドと接触するＨｉｓ１２５の置換は、ペプチド結合活性に影響を及ぼす。本発明者らは、ペプチドは、Ｎ−末端ドメインのβシートの凹面と結合し、結合はシャペロンの作用サイクルの間に調節されると結論付けた。これらの研究と関連して、本発明者らは、特定の機能を保持する切断されたＧＲＰ９４ポリペプチドも設計した。そのようなペプチドは、ＧＲＰ９４仲介性生物機能のアゴニスト及びアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法において有用である。
【００２０】
ＧＰＲ９４は、偏在性に発現するが、クライアントタンパク質（これらは重要な発生チェックポイントには関わっていない）はあまり知られていない。マウスＧＲＰ９４遺伝子の標的破壊は、胚性発生において重要な機能を有していることを示した。Ｇｒｐ９４−／−胎仔は、発生の卵筒段階である妊娠期間の７日目に子宮内で死亡した。それらは、この段階で正常に起こる主な分化現象である、中胚葉、原始的ストリーク（線条）、及び原始羊膜腔を発生できず、中胚葉誘導に関連するキー遺伝子を発現しない。発生上の欠陥は、母系性ＧＲＰ９４の希釈に起因するものではなく、シャペロンの活性を反映してるように思われる。Ｇｒｐ９４−／−細胞は、その野生型対応物と同じペースで分裂する。さらに、低グルコース張力によるＧＲＰ９４の転写調節が知られているにも関わらず、変異ＥＳ細胞は、低グルコース培地において野生型細胞のように増殖した。一方、変異細胞は、カルシウム恒常性の撹乱に対して、及び血清欠乏に対して、より感受性を有していた。これらのデータにより、ＧＲＰ９４の必要条件は非常に選択的であると示唆された。本発明者らは、中胚葉に重要な分泌性若しくは細胞表面タンパク質は、それらの適切な発現はＧＲＰ９４に依存している、及びこのシャペロン非存在下では、細胞−細胞相互作用が胚性細胞の適切な運命を特定する場合、それらは効率的に提示されないと仮説を立てた。
【００２１】
ＧＲＰ９４は、腫瘍拒絶において重要な役割を担っている。この活性を増強すると、悪性腫瘍の治療に有用であると示されるであろう。従って、本発明のＧＲＰ９４ベース組成物は、腫瘍ワクチンの作成に使用され得る。
【００２２】
以下の定義は、本発明の理解を容易にするために提供される。
【００２３】
従来の特許法の慣習に従うと、"ａ"及び"ａｎ"という用語は、請求の範囲を含む本明細書において用いられた場合、"１若しくはそれ以上"という意味である。
【００２４】
ここで用いられたように、"ＧＲＰ９４タンパク質"という用語は、小胞体内に存在し、本分野ではｇｐ９６、ＥＲｐ９９及びエンドプラスミンとして知られている、分子シャペロンを言及することを意味している。ＧＲＰ９４は、高等植物及び後生動物内でのみ発見されている（Ｎｉｃｃｈｉｔｔａ（１９９８）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０：１０３〜１０９）。ＧＲＰ９４などのストレスタンパク質は、適切な折り畳み（フォールディング）や新規に合成されたタンパク質の輸送を指示すること、及び熱ショック、酸化ストレス、低酸素／無酸素条件、栄養欠乏、他の生理学的ストレス、及びそのようなストレスを促進する、例えば脳卒中や心筋梗塞などの疾患や外傷などの状態の時に細胞を保護することに関連している。
【００２５】
ここで用いられたように、"ＧＲＰ９４のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）"という用語は、ヌクレオチド、ＡＤＰ、ＡＴＰ、或いはＮＥＣＡ、若しくは真菌代謝産物であるゲルダナマイシン、１７ＡＡＧ或いはラディシコールが結合するＧＲＰ９４の領域を意味している。より好ましくは、本発明者らの研究によって、ＧＲＰ９４断片は、哺乳類（ヒト、イヌ）ＧＲＰ９４のアミノ酸３４〜３５５（配列ＩＤ番号３によってコード化された、配列ＩＤ番号４）、好ましくは残基３４〜２２１（配列ＩＤ番号５によってコード化された、配列ＩＤ番号６）、好ましくは残基７０〜２２１（配列ＩＤ番号７によってコード化された、配列ＩＤ番号８）を有していることが示された。これらは、完全長タンパク質の結合活性に対しては十分である。
【００２６】
ここで用いられたように、"ＧＲＰ９４リガンド結合ドメインの結合ポケット"、"ＧＲＰ９４リガンド結合ポケット"、及び"ＧＲＰ９４結合ポケット"という用語は、同義的に用いられており、リガンドが結合できる、ＧＲＰ９４リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）内の大きな空洞を意味している。この空洞は、空であったり、水分子や溶媒からの他の分子を含むこともできる、若しくはリガンド原子を含むこともできる。前記結合ポケットは、ＧＲＰの原子によって占められたものではなく、"主要な"結合ポケットの近く、及び前記"主要な"結合ポケットと近接した、"主要な"結合ポケット近くのスペースの領域も含む。
【００２７】
ここで用いられたように、"抗原性分子"は、外因性抗原／免疫原（すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏではＧＲＰ９４と複合体を形成しない）やそれらの誘導体と同様に、ＧＲＰ９４が内因的にｉｎ  ｖｉｖｏで（例えば、感染細胞、若しくは前癌性或いは癌性組織）関連するペプチドを意味している。
【００２８】
"共通腫瘍抗原"という用語は、同様の腫瘍タイプを患った患者に共通して見られる腫瘍特異的抗原を意味している。代表的な共通腫瘍抗原は、表３に提供されている。
【００２９】
"生物活性"という用語は、対象において生物学的若しくは生理学的効果を有している分子を言及することを意味している。アジュバンド活性は、生物活性の一例である。アジュバンド活性を有する他の生物分子の産生を活性化する若しくは誘導することも、考えられる生物活性である。
【００３０】
"アジュバンド活性"という用語は、増強する、或いは抗原に対する脊椎動物対象の免疫システムの反応を調節する能力を有している分子を言及することを意味している。
【００３１】
"免疫システム"という用語は、非特異的及び特異的カテゴリーを含み、脊椎動物対象において、潜在的病原体を含む抗原分子に対する防御を提供する、全ての細胞、組織、システム、構造、及び工程を含む。本分野ではよく知られているように、非特異的免疫システムは、好中球、単球、組織マクロファージ、クッパー細胞、肺胞マクロファージ、樹状細胞、及びミクログリアなどの食作用細胞を含む。特異的免疫システムは、宿主内で特異的な免疫を与える細胞及び他の構造を意味している。特にＢ細胞リンパ球やＴ細胞リンパ球などのリンパ球は、これらの細胞に含まれる。これらの細胞としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞も含まれる。さらに、Ｂリンパ球のような抗体産生細胞、及び抗体産生細胞から産生された抗体は、"免疫システム"という用語内に含まれる。
【００３２】
"免疫反応"という用語は、脊椎動物対象の免疫システムによる、抗原若しくは抗原決定基に対するあらゆる反応を言及することを意味している。例示的な免疫反応は、以下に定義されているように、体液性免疫反応（例えば、抗原特異的抗体の産生）や細胞仲介性免疫反応（例えば、リンパ球増殖）を含む。
【００３３】
"全身性免疫反応"という用語は、免疫システムのＢリンパ球などの細胞が発達する、リンパ節−、脾臓−、若しくは腸−関連リンパ様組織内の免疫反応を言及することを意味している。例えば、全身性免疫反応は、血清ＩｇＧの産生を有することができる。さらに、全身性免疫反応は、血流内の抗原特異的抗体の循環や、脾臓及びリンパ節などの全身性コンパートメントのリンパ様組織における抗原特異的細胞を意味している。
【００３４】
"体液性免疫"若しくは"体液性免疫反応"という用語は、抗体分子が抗原刺激に反応して分泌される、後天性免疫の形態を言及することを意味している。
【００３５】
"細胞仲介性免疫"及び"細胞仲介性免疫反応"という用語は、Ｔリンパ球がそれらの犠牲細胞の近くに来た場合、それらによって提供される防御のような、リンパ球によって提供される免疫学的な防御を言及することを意味している。細胞仲介性免疫反応は、リンパ球増殖も有する。"リンパ球増殖"が測定した場合、特異的抗原に反応して分裂するリンパ球の能力が測定される。リンパ球増殖は、Ｂ細胞、Ｔ−ヘルパー細胞、若しくはＣＴＬ細胞増殖を言及することを意味している。
【００３６】
"ＣＴＬ反応"という用語は、特異的抗原を発現している細胞を溶解し殺傷する抗原特異的細胞の能力を言及することを意味している。以下に記載されたように、標準な、当業者には認識されているＣＴＬアッセイは、ＣＴＬ活性を測定するために行われた。そのようなアッセイにおいて、殺傷される細胞は、"標的細胞"として言及される。
【００３７】
ここで用いられたように、"養子免疫治療"とは、癌に対して特定な適用性を有し、それにより、前記細胞は直接的に若しくは間接的に樹立された腫瘍の退行を仲介することを目的として、抗腫瘍反応性を有する免疫細胞が腫瘍宿主へ投与されるという、治療アプローチを意味している。
【００３８】
"免疫原性組成物"は、免疫反応を誘発することができる組成物を言及することを意味している。ワクチンは、本発明によると、"免疫原生組成物"という用語の意味においては範囲に含まれると考えられる。
【００３９】
"生物反応修飾物質"という用語は、抗原の存在などの特定の刺激に対する対象の反応を増強する、若しくは調節する能力を有する分子を言及することを意味している。
【００４０】
ここで用いられたように、"候補物質"及び"候補化合物"という用語は、同義的に用いられており、生物反応修飾物質として、別の部分と相互作用すると考えられる物質を言及している。例えば、代表的な候補化合物は、完全ＧＲＰ９４タンパク質、若しくはその断片と相互作用すると考えられており、その化合物は、その後そのような相互作用で評価され得る。本発明の方法を用いて検討され得る例示的な候補化合物は、これに限定されるものではないが、ＧＲＰ９４タンパク質のアゴニスト及びアンタゴニスト、ウイルスエピトープ、ペプチド、酵素、酵素基質、補助因子、レクチン、糖質、オリゴヌクレオチド或いは核酸、オリゴ糖、タンパク質、化学化合物、小分子、及びモノクローナル抗体を含む。
【００４１】
ここで用いられたように、"調節する"とは、任意若しくは全ての科学的及び生物学的活性、若しくは野生型或いは変異型ＧＲＰ９４ポリペプチドの特性の増加、減少、若しくは他の改変を意味している。ここで用いられたように、"調節"という用語は、反応の上方制御（すなわち、活性化若しくは刺激）及び下方制御（すなわち、阻害若しくは抑制）の両方を言及する。
【００４２】
ここで用いられたように、"アゴニスト"とは、機能的ＧＲＰ９４タンパク質の生物活性を補う或いは増強する因子を意味している。
【００４３】
ここで用いられたように、"アンタゴニスト"とは、機能的ＧＲＰ９４タンパク質の生物活性を減少する或いは阻害する因子、若しくは、天然由来或いは改変非機能的ＧＲＰ９４タンパク質の生物活性を補う或いは増強する因子を意味している。
【００４４】
ここで用いられたように、"アルファへリックス"という用語は、ポリペプチド鎖の高次構造を言及しており、ここにおいて、ポリペプチドバックボーンは、左巻き若しくは右巻き方向で、分子の長軸の回りに巻かれており、アミノ酸のＲ基がらせん状（へリックス）バックボーンから外側へ突出しているものであり、前記構造の反復ユニットは、前記へリックスの１分岐であり、前記長軸に沿って約０．５６ｎｍ伸長している。
【００４５】
ここで用いられたように、"βストランド"とは、伸長したジグザグ高次構造へ延びたポリペプチド鎖の高次構造を言及している。並列に配向したポリペプチド鎖のβストランドは、"βシート"を形成する。"並列（平行）"に走ったストランドは全て、同じ方向に走る。"逆平行"のポリペプチド鎖のストランドは、お互い反対の方向に走る。
【００４６】
ここで用いられたように、"細胞"、"宿主細胞"、若しくは"組換え宿主細胞"という用語は、同義的に用いられており、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫や潜在的な子孫も意味する。変異或いは環境的な影響に起因して、特定な修飾が後世にも生じるため、実は、そのような子孫は親細胞とは同一ではないのであるが、本明細書で用いられたようなような範囲内には含まれる。
【００４７】
"キメラタンパク質"若しくは"融合タンパク質"という用語は、ここでは同義的に用いられており、ＧＲＰ９４ポリペプチドをコード化している第１のアミノ酸配列と、ＧＲＰ９４のどのドメインとも異なり、相同性もないポリペプチドを定義している第２のアミノ酸配列との融合を意味している。例えば、キメラタンパク質は、第１のタンパク質も発現している生物体内で見出される外来性ドメインを含むことができる、若しくは、異なる種類の生物体によって発現されているタンパク質構造の"種間"或いは"遺伝子間"融合であり得る。一般的に、融合タンパク質は、一般式Ｘ−ＧＲＰ９４−Ｙで表すことができ、ここにおいてＧＲＰ９４は、ＧＲＰ９４ポリペプチドから由来したタンパク質の一部を表し、ＸとＹは独立して、生物体においてＧＲＰ９４配列と関連しておらず、天然由来の変異を含むアミノ酸配列を有する若しくは持たないものである。
【００４８】
ここで用いられたように、"検出する"という用語は、例えば、放射線学的シグナル、分光学的シグナル、若しく標的物質が存在する場合にのみ現れる別のシグナルなどの検出可能なシグナルの出現を観察することによって、標的物質の存在を確認することを意味している。
【００４９】
ここで用いられたように、"相互作用する"という用語は、例えば、酵母二重ハイブリッドアッセイなどを用いて検出され得るような、分子間の検出可能な相互作用を意味している。また、"相互作用"という用語は、分子間の"結合"相互作用も含むことを意味している。相互作用は、例えば、タンパク質−タンパク質、若しくはタンパク質−核酸間で生じ得る。
【００５０】
ここで用いられたように、"修飾された"という用語は、物質の正常な状態からの変化を意味している。物質は、別々の化学ユニットの除去によって、若しくは別々の化学ユニットを付加することによって修飾され得る。"修飾された"という用語は、検出可能な標識や、精製において補助として追加されたそれら物質を含む。
【００５１】
ここで用いられたように、"変異"という用語は、その従来の意味合いを含み、核酸或いはポリペプチド配列における改変、遺伝的、天然由来、若しくは導入を意味しており、本分野の当業者には一般的に知られているような意味で用いられる。
【００５２】
ここで用いられたように、"部分的アゴニスト"という用語は、標的に結合でき、アゴニストによって誘導された、標的における改変のごく一部を誘導できる物質を意味している。その違いは、質的である、若しくは量的であり得る。従って、部分的アゴニストは、他のものでではなくアゴニストによって誘導される立体構造改変のいくつかを誘導することができる、若しくは限定範囲で特定の変化のみを誘導することができる。
【００５３】
ここで用いられたように、"部分的アンタゴニスト"という用語は、標的に結合でき、アンタゴニストによって誘導された、標的における変化のごく一部を阻害できる物質を意味している。その違いは、質的である、若しくは量的であり得る。従って、部分的アンタゴニストは、他のものでではなくアンタゴニストによって誘導される立体構造改変のいくつかを阻害することができる、若しくは限定範囲で特定の変化を阻害することができる。
【００５４】
ここで用いられたように、"核酸"若しくは"核酸分子"は、一本鎖或いは二本鎖の、あらゆるＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子を意味しており、もし一本鎖の場合はその分子の相補的配列は直線或いは環状形態である。核酸分子の所で説明したように、特定の核酸分子の配列或いは構造は、５’から３’方向で配列を表示している従来の方法に従って、本明細書において記載されている。本発明の核酸に関して、"単離核酸"という用語は、しばしば用いられる。この用語は、ＤＮＡに適用された場合、それが由来する生体の天然由来のゲノム内におけるすぐ連続した配列から分離されたＤＮＡ分子を意味する。例えば、"単離核酸"は、プラスミド或いはウイルスベクターなどのベクターに挿入されたＤＮＡ分子、若しくは原核或いは真核細胞或いは宿主生物体のゲノムＤＮＡへ組み込まれたＤＮＡ分子を含む。
【００５５】
ＲＮＡに適用された場合、"単離核酸"という用語は、上で定義したような単離ＤＮＡ分子によってコード化された主にＲＮＡ分子を言及している。或いは、この用語は、その天然状態（すなわち、細胞或いは組織内）と関連した他の核酸から十分に分離されたＲＮＡ分子を言及している。"単離核酸"（ＤＮＡ或いはＲＮＡ）は、さらに生物学的或いは合成手段によって直接生産された分子、及びその産生の間に存在する他の化合物から分離された分子を表す。
【００５６】
"パーセント相似"、"パーセント同一"、及び"パーセント同一"、及び"パーセント相同性"という用語は、特定の配列を言及する場合、ウィスコンシン大学のＧＣＧソフトウェアプログラムに規定されているものとして使用される。
【００５７】
"実質的に純粋"という用語は、所定の物質（例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、など）の少なくとも５０〜６０重量％を有する調剤を言及している。より好ましくは、前記調剤は、所定の化合物の少なくとも７５重量％、最も好ましくは９０〜９５重量％を有するものである。純度は、所定の化合に対して適切な方法（例えば、クロマトグラフィー法、アガロース或いはポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ解析、及びそれらの同等方法など）によって測定される。
【００５８】
"レプリコン"とは、例えば、プラスミド、コスミド、バクミド、プラスチド（ｐｌａｓｔｉｄ）、ファージ、若しくはウイルスなどの、それ自身の制御下で大部分は複製できるあらゆる遺伝的要素である。
【００５９】
"ベクター"とは、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、若しくはウイルスなどの、他の遺伝配列或いは要素（ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）が結合され、その結合した配列或いはヨウ素の複製をもたらすような、レプリコンである。
【００６０】
"発現オペロン"は、例えば、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（例えばＡＴＧ或いはＡＵＧコドン）、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター（転写終結区）、及びそれらと同等物であり、宿主細胞或いは生物においてポリペプチドコード化配列の発現を促進する、転写や翻訳制御配列を持つ核酸セグメントを言及する。
【００６１】
ここで用いられたように、"オリゴヌクレオチド"という用語は、本発明の配列、プライマー、及びプローブを言及し、２若しくはそれ以上の、好ましくは３以上のリボ或いはデオキシリボヌクレオチドからなる核酸分子として定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、様々な因子、及びそのオリゴヌクレオチドの特定の適用や使用に依存するであろう。
【００６２】
"特異的なハイブリダイズ"という用語は、本分野で一般的に用いられる事前に決定された状況下で、そのようなハイブリダイゼーションを可能にするために十分に相補的な配列の２つの一本鎖核酸分子の間の結合を言及する（しばしば"実施的に相補的"と言われる）。特に、この用語は、非相補的配列の一本鎖核酸を有するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを物質的に排除する、本発明の一本鎖ＤＮＡ或いはＲＮＡ分子内に含まれる実質的に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを言及する。
【００６３】
ここで用いられたように"プローブ"という用語は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、若しくは核酸（ＲＮＡ或いはＤＮＡ）を言及しており、これらは、精製制限酵素で消化して天然に由来する、或いは合成的に生産されたものであり、前記プローブに相補的な配列を有する核酸とアニーリングする、若しくは特異的にハイブリダイズすることができるものである。プローブは、一本鎖若しくは二本鎖である。前記プローブの正確な長さは、温度、プローブの原料、及び用いる方法を含む多くの因子に依存するであろう。例えば、診断用適用に対しては、標的配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチドプローブは、少しのヌクレオチドを含んでいるが、１５〜２５或いはそれ以上のヌクレオチドを典型的に含む。ここにおいてプローブとは、特定の標的核酸配列の異なる鎖と"実質的に"相補的であるように選択される。これは、事前に決定された状況下で、前記プローブが"特異的にハイブリダイズ"できる、若しくはそれらそれぞれの標的配列とアニーリングことができるように、十分に相補的でなくてはならないことを意味している。従って、前記プローブ配列は、標的の正確に相補的な配列を反映している必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチドフラグメントは、標的鎖に相補的な前記プローブ配列の残りの部分を有し、前記プローブの５’若しくは３’末端に結合される。或いは、非相補的塩基、若しくはより長い配列は、プローブ中に散在し、それと共に特異的にアニーリングするために、前記プローブ配列が標的核酸の配列と十分な相補性を有するように提供される。
【００６４】
ここで用いられたように、"プライマー"という用語は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、一本鎖若しくは二本鎖、生体システムから由来する、制限酵素消化によって産生される、若しくは適切な環境に置かれた時、鋳型−依存性核酸合成の阻害剤として機能的に働くことができるように合成的に生産される、オリゴヌクレオチドを言及する。適切な核酸鋳型、核酸の適切なヌクレオシド三リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、適切な補助因子、及び例えば適切な温度やｐＨなどの適切な条件、と存在する場合、前記プライマーは、プライマー伸長産物を生じるために、ポリメラーゼの作用、或いは同様の活性によるヌクレオチドの付加によって、その３’終端で伸長される。前記プライマーは、特定の条件、及び適用の要求に依存して、長さが変わる。例えば、診断用適用において、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的に１５〜２５、若しくはそれ以上の長さのヌクレオチドである。前記プライマーは、望ましい伸長産物の合成を刺激するために、望ましい鋳型に対して十分に相補的でなくてはならない、つまり、ポリメラーゼ、若しくは同様な酵素による合成の開始で使用するために、適切な近位で、前記プライマーの３’ヒドロキシル部分を提供するのに十分な形で、望ましい鋳型鎖とアニーリングすることが可能である。前記プライマー配列は、望ましい鋳型の正確な相補体を表していることは必要とされていない。例えば、非相補的ヌクレオチド配列は、別の相補的プライマーの５’末端に結合される。或いは、非相補的塩基は、前記オリゴヌクレオチドプライマー配列内に散在し、これにより、前記伸長産物の合成用の鋳型プライマー複合体を機能的に提供するために、前記プライマー配列が望ましい鋳型鎖の配列と十分に相補的であることが提供される。
【００６５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、米国特許番号第４，６８３，１９５号、第４，８８０，１９５号、及び第４，９６５，１８８号に記載されており、これらの全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる。
【００６６】
ここで用いられたように、"レポーター"、"レポーターシステム"、"レポーター遺伝子"、若しくは"レポーター遺伝子産物"という用語は、発現した場合、例えば、生物アッセイ、免疫アッセイ、放射線免疫アッセイによって、若しくは比色定量的な方法、蛍光発生的な方法、化学発光的な方法、或いは他の方法によって、容易に測定可能なレポーターシグナルを産生する、産物をコード化する遺伝子を核酸が有している操作的な遺伝システムを意味している。前記核酸は、ＲＮＡ或いはＤＮＡ、直線或いは環状、一本鎖或いは二本鎖、アンチセンス或いはセンスポラリティーであり、前記レポーター遺伝子産物の発現に対して、必要な調節要素に動作可能に結合される。必要な調節要素は、レポーターシステムの性質に従って、及び前記レポーター遺伝子がＤＮＡ或いはＲＮＡの形態かどうかで変わるが、これに限定されるものではないが、そのような要素には、プロモーター、エンハンサー、翻訳調節配列、ポリＡ付加シグナル、転写終止シグナル、及びそれらと同等物を含む。
【００６７】
"形質転換"、"形質移入"、"形質導入"という用語は、核酸が細胞或いは宿主生物へ導入されることによる、あらゆる方法或いは手段を意味し、同じ意味を伝えるために同義的に用いられる。そのような方法は、これに限定されるものではないが、形質移入（トランスフェクション）、マイクロインジェクション、ＰＥＧ−融合、及びそれらの同等物を含む。
【００６８】
導入された核酸は、レシピエント細胞或いは生物体の核酸配列へ（共有結合して）組み込まれる、若しくは組み込まれない。細菌、酵母、植物、及び哺乳類細胞において、例えば、導入された核酸は、エピソーム要素、或いはプラスミドなどの独立レプリコンとして維持される。或いは、前記導入された核酸は、レシピエント細胞或いは生物体の核酸へ組み込まれ、及び細胞或いは生物体ないで安定して維持され、さらに、子孫細胞或いはレシピエント細胞の生物体へ伝えられる或いは遺伝される。最後に、前記導入された核酸は、一時的にのみ、レシピエント細胞或いは宿主生物体に存在する。
【００６９】
"選択可能なマーカー遺伝子"という用語は、発現された場合、形質転換された細胞或いは植物に、抗菌抵抗などの選択可能な表現型を与える遺伝子を言及する。
【００７０】
"動作可能に接続された"という用語は、翻訳領域配列の発現に必要である調節性配列が、領域配列の発現に影響を及ぼすように、翻訳領域配列に対して適切な位置でＤＮＡ分子に配置されていることを意味している。この同じ定義は、時々、発現ベクターにおける転写ユニット、及び他の転写調節要素（例えば、エンハンサーなど）の配列に適用される。
【００７１】
アミノ酸残基は、従来の３文字或いは１文字略語に従って本明細書中で同定される。
【００７２】
ここに記載されたアミノ酸残基は、"Ｌ"異性体型であることが好ましい。しかしながら、"Ｄ"異性体型における残基は、あらゆるＬアミノ酸残基に置換され、これにより前記ポリペプチドの望ましい特性が保持されることが提供される。ここに表された全てのアミノ酸残基配列は、従来の左から右というアミノ終端からカルボキシ終端配向に一致する。
【００７３】
"単離タンパク質"若しくは"単離及び精製タンパク質"という用語は、時々ここで用いられる。この用語は、主に、本発明の単離された核酸分子の発現によって産生されたタンパク質を意味している。或いは、この用語は、"実質的に純粋"な形態で存在するように、自然に関連した他のタンパク質から十分に分けられたタンパク質を言及している。"単離された"は、他の化合物或いは物質を有する人工的な或いは合成的な混合物、若しくは基本的な活性を阻害せず、例えば不完全な精製或いは安定剤の添加に起因して生じる不純物の存在を排除することを意味している訳ではない。
【００７４】
"成熟タンパク質"若しくは"成熟ポリペプチド"は、ポリタンパク質前駆体からのタンパク質分解プロセシングなどの、一連のその発生の間、前記ポリペプチドに正常に起こるあらゆるプロセシング現象の後で前記ポリペプチドの配列を所有するポリペプチドを意味している。成熟タンパク質の配列或いは境界（バウンダリ）を指定する際、前記成熟タンパク質配列の第１のアミノ酸は、アミノ酸残基１として指定される。ここで用いられたように、天然には発見されない成熟タンパク質と関連したあらゆるアミノ酸残基は、アミノ酸１を先行するタンパク質がアミノ酸−１、２、３、などに指定されていることに関連付けられる。組換え発現システムに対して、メチオニン開始コドンはしばしば、効率的な翻訳を目的として用いられる。ここで用いられたように、結果として生じるポリペプチドにおけるこのメチオニン残基は、成熟ＧＲＰ９４タンパク質配列に相対的な−１位に位置される。
【００７５】
低分子量"ペプチド類縁体"は、ＧＲＰ９４タンパク質の天然型若しくは変異（変異された）類縁体を意味しており、これは、そのタンパク質の断片の直線或いは不連続体を有しており、他のアミノ酸で置換された１若しくはそれ以上のアミノ酸を有し、親或いは非変異タンパク質と比較した場合、改変、増強或いは減少された生物活性を有している。
【００７６】
本発明は、ＧＲＰ９４ポリペプチド或いは本発明のタンパク質の活性部分、断片、誘導体、及び機能的或いは非機能的擬態も含む。そのようなポリペプチドの"活性部分"は、完全長ポリペプチドより短いが、測定可能な生物活性は維持しているペプチドを意味している。
【００７７】
ＧＲＰ９４ポリペプチドの"断片"若しくは"部分"は、一続きのアミノ酸残基の少なくとも約５〜７の連続アミノ酸を意味しており、しばしば、少なくとも約７から９の連続アミノ酸であり、典型的には少なくとも約９〜１３の連続アミノ酸であり、最も好ましくは、少なくとも約１２〜１３、若しくはそれ以上の連続アミノ酸である。ＧＲＰ９４ポリペプチド配列、抗原決定基、若しくはエピトープの断片は、免疫特異的抗ＧＲＰ９４抗体の有効な産生のために、ＧＲＰ９４タンパク質アミノ酸配列の一部に対する免疫反応を誘発するのに有用である。
【００７８】
ＧＲＰ９４ポリペプチドの異なる"変異体"は、天然に存在する。これらの変異体は、前記タンパク質をコード化する遺伝子のヌクレオチド配列における違いによって特徴付けられる対立遺伝子（アレル）である、若しくは異なるＲＮＡプロセシング或いは翻訳後修飾に関わるものである。当業者は、単一或いは複数アミノ酸の置換、欠損、或いは交換を有する変異体を生産することができる。これらの変異体は、これに限定されるものではないが、（ａ）１若しくはそれ以上のアミノ酸残基が、保存的或いは非保存的アミノ酸と置換されている変異体、（ｂ）１若しくはそれ以上のアミノ酸がポリペプチドに付加されている変異体、（ｃ）１若しくはそれ以上のアミノ酸が置換基を含む変異体、及び、（ｄ）前記ポリペプチドが、融合パートナー、タンパク質タグ、或いは他の化学部分などの別のペプチド或いはポリペプチドと融合されており、例えば、抗体に対するエピトープ、ポリヒスチジン配列、膜融合配列、細胞質標的配列、核標的配列、ビオチン部分、及びそれらと同等物などの、ＧＲＰ９４関連ポリペプチドに対して有用な特性を与えるものである、変異体を含む。本発明の別のＧＲＰ９４ポリペプチドは、１種からのアミノ酸残基が、保存或いは非保存位置で、別の種の対応する残基に置換されている変異体を含む。別の実施形態において、非保存位置でのアミノ酸残基は、保存或いは非保存残基と置換される。これらの変異体を得るための技術は、遺伝的（抑制、欠損、変異など）、化学的、及び酵素的技術を含み、本分野の当業者には既知である。そのような対立遺伝的変異体、類縁体、断片、誘導体、変異体、及び修飾体の範囲では、ＧＲＰ９４の生物学的特性のいくつかを保持するアポトーシス修飾因子ポリペプチドの誘導体を生じる、選択的核酸プロセシング形態と、選択的転写後修飾形態を含み、それらは本発明の観点内に含まれる。
【００７９】
ここで用いられたように、"機能的"という用語は、核酸配列或いはアミノ酸配列が、列挙されたアッセイや目的に対して機能的であることを意味している。
【００８０】
特定のヌクレオチド或いはアミノ酸を言及する場合の"基本的に〜からなる"という用語は、所定の配列ＩＤ番号の特性を有する配列を意味している。例えば、アミノ酸配列を言及する時に用いられた場合、その用語は、配列それ自体、及びその配列の基本や新規特徴に影響を与えない分子修飾を含む。
【００８１】
"タグ"、"タグ配列"、若しくは"タンパク質タグ"という用語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、或いはアミノ酸、ペプチド或いはタンパク質、若しくは他の化学物質などの化学部分を言及しており、これらが他の配列へ付加されたとき、特にその配列の欠損若しくは単離において、付加的な有用性を提供する、若しくは有用な特性を与えるものである。従って、例えば、ホモポリマー核酸配列、若しくはキャプチャー（捕獲）オリゴヌクレオチドと相補的な核酸配列は、プライマー或いはプローブ配列に付加され、その後に続く伸長産物或いはハイブリダイズされた産物の単離を容易にする。タンパク質タグの場合、ヒスチジン残基（例えば、４〜８の連続したヒスチジン残基）は、タンパク質のアミノ終端或いはカルボキシ終端に付加され、金属クロマトグラフィーのキレート化によるタンパク質単離を容易にする。代わりに、アミノ酸配列、ペプチド、タンパク質、若しくは、特異的抗体分子或いは他の分子（例えば、フラグエピトープ、ｃ  ｍｙｃエピトープ、インフルエンザＡウイルス赤血球凝集素（ｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ）タンパク質の膜貫通エピトープ、タンパク質Ａ、セルロース結合ドメイン、カルモジュリン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、キチン結合ドメイン、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、及びそれらの同等物など）に反応性を有する決定基と結合する、或いはエピトープを表す融合パートナーは、タンパク質に付加され、アフィニティー（親和性）クロマトグラフィー或いは免疫親和性クロマトグラフィーなどの手順によるタンパク質単離を容易にする。化学タグ部分は、ビオチンなどの分子を含み、核酸或いはタンパク質に付加され、アビジン試薬及びそれと同等物との相互作用による単離或いは検出を容易にする。多くの他のタグ部分は、訓練を受けた職人によっては既知で、想定され得るものであり、この定義の範囲内であると考えられる。
【００８２】
"クローン"若しくは"クローン細胞集合"は、有糸分裂による、単一細胞若しくは共通の祖先から由来した細胞の集合である。
【００８３】
"細胞株"とは、何代もの間、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで安定して成長できる第１次細胞若しくは細胞集合のクローンである。
【００８４】
"抗体"若しくは"抗体分子"は、抗体やそれらの断片を含むあらゆる免疫グロブリンであり、ＧＲＰ９４タンパク質のエピトープなどの特異的な抗原に結合するものである。この用語は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、及び二重特異性抗体を含む。ここで用いられたように、抗体若しくは抗体分子としては、無傷免疫グロブリン分子と、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦ（ｖ）として本分野では知られた免疫グロブリンの一部である免疫学的に活性な部分との両方が考えられる。
【００８５】
Ｉ．ＧＲＰ９４コード化核酸分子、ＧＲＰ９４ポリペプチド、及びその断片の調整
Ａ．核酸分子
本発明のＧＲＰ９４関連配列をコード化した核酸分子は、以下の２つの（１）適切なヌクレオチド三リン酸から合成する、若しくは（２）生物源から単離する、という一般的な方法によって調整される。用いられた両方の方法は、本分野ではよく知られた方法である。
【００８６】
例えば、配列ＩＤ番号１を有する完全長ｃＤＮＡなどのヌクレオチド配列情報の利用可能性は、オリゴヌクレオチド合成による、本発明の単離核酸分子の調整を可能にする。合成オリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３８Ａ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ若しくは同様の装置で用いられるホスホラミダイト方法によって調整される。結果生じる構成物は、本分野では既知な方法、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などに従って精製される。本発明のＤＮＡ分子などの長い二本鎖ポリヌクレオチドは、現在のオリゴヌクレオチド合成方法に固有なサイズ限定のおかげで、段階的に合成されるべきである。従って、例えば２．４ｋｂ二本鎖分子は、適切な相補性を有したいくつかの小さい断片として合成される。従って、産生された相補的断片は、各断片が隣接した断片に結合するための適切な突出末端を有するように、アニーリングされる。隣接した断片は、ＤＮＡリガーゼの存在下で、突出末端をアニーリングすることによって結合され、完全な２．４ｋｂ二本鎖分子を構成する。そのように構成された合成ＤＮＡ分子は、次にクローン化され、適切なベクター内で増幅される。
【００８７】
ＧＲＰ９４若しくはそれらの相同体をコード化する核酸配列は、本分野では既知である方法を用いて、適切な生物源から単離される。好ましい実施形態において、ｃＤＮＡクローンは、ヒトのｃＤＮＡ発現ライブラリーから単離される。別の実施形態において、ｃＤＮＡ配列によって提供された配列情報を用いて、ＧＲＰ９４をコード化したゲノムクローンが単離される。代わりに、ＧＲＰ９４との相同性を有したｃＤＮＡ若しくはゲノムクローンは、ＧＲＰ９４遺伝子内の事前に決定した配列に対応するオリグヌクレオチドプローブを用いて、マウスなどの他の種から単離される。
【００８８】
本発明に従って、配列ＩＤ番号１のタンパク質コード領域と適切なレベルの配列相同性を有した核酸は、ハイブリダイゼーションと適切に厳密な洗浄条件とを用いることによって同定される。例えば、ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ｓｕｐｒａ）の方法に従って、５Ｘ  ＳＳＣ、５Ｘ  デンハート液、０．５〜１．０％  ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ  変性断片化サケ精子ＤＮＡ、０．０５％  ピロリン酸ナトリウム、及び５０％までのホルムアミドからなるハイブリダイゼーション溶液を用いて、実行される。ハイブリダイゼーションは、３７〜４２℃で、少なくとも６時間実行された。ハイブリダイゼーションに続いて、フィルタを以下のように、（１）２Ｘ  ＳＳＣ及び０．５〜１％ＳＤＳ中で、室温で５分間、（２）２Ｘ  ＳＳＣ及び０．１％  ＳＤＳ中で、室温１５分間、（３）１Ｘ  ＳＳＣ及び１％  ＳＤＳ中で、３７℃で３０分〜１時間、（４）溶液を３０分毎に変えながら、１Ｘ  ＳＳＣ及び１％  ＳＤＳで、４２〜６５℃で２時間、洗浄した。
【００８９】
特異的配列相同性を有する核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するために必要とされる前記厳密な条件を計算するための一つの共通の公式としては（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）；
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／＃ｂｐ（二重鎖における）である。
【００９０】
上の公式に記載されたように、［Ｎａ＋］＝[０．３６８]、及び５０％ホルムアミドを用い、ＧＣ含量が４２％であり、平均プローブ細部が２００ベースである場合、Ｔｍは５７℃である。ＤＮＡ二重鎖のＴｍは、相同性が１％減る毎に１〜１．５℃ずつ減少する。従って、約７５％以上の配列同一性を有する標的は、４２℃のハイブリダイゼーション温度を用いて観察される。そのような配列は、本発明の核酸配列と実質的に相同であると考えられる。
【００９１】
ハイブリダイゼーションと洗浄の厳密さは、溶液の塩濃度と温度に第１に依存している。一般的に、プローブのその標的とのアニーリングの割合を最大限にするために、ハイブリダイゼーションは、ハイブリッドの計算されたＴｍが２０〜２５℃以下である塩及び温度条件で通常実行される。洗浄条件は、前記標的に対するプローブの同一性のためにもできる限り厳密であるべきである。一般的に、洗浄条件は、ハイブリッドのＴｍが約１２〜２０℃以下であるように選択される。本発明の核酸に関しては、中程度に厳密なハイブリダイゼーションは、６Ｘ  ＳＳＣ、５Ｘ  デンハート溶液、０．５％  ＳＤＳ、及び１００μｇ／ｍｌ  変性サーモン精子ＤＮＡ中、４２℃でのハイブリダイゼーションを行い、２Ｘ  ＳＳＣ及び０．５％  ＳＤＳ中、５５℃で１５分洗浄することとして定義される。高度に厳密なハイブリダイゼーションは、６Ｘ  ＳＳＣ、５Ｘ  デンハート溶液、０．５％  ＳＤＳ、及び１００μｇ／ｍｌ  変性サーモン精子ＤＮＡ中、４２℃でのハイブリダイゼーションを行い、１Ｘ  ＳＳＣ及び０．５％  ＳＤＳ中、６５℃で１５分洗浄することとして定義される。非常に高度に厳密なハイブリダイゼーションは、６Ｘ  ＳＳＣ、５Ｘ  デンハート溶液、０．５％  ＳＤＳ、及び１００μｇ／ｍｌ  変性サーモン精子ＤＮＡ中、４２℃でのハイブリダイゼーションを行い、０．１Ｘ  ＳＳＣ及び０．５％  ＳＤＳ中、６５℃で１５分洗浄することとして定義される。
【００９２】
本発明に用いるための核酸は、あらゆる簡便性クローニングベクターにおけるＤＮＡとして維持される。好ましい実施形態において、クローンは、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）などのプラスミドクローニング／発現ベクターにおいて維持され、適切なＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）宿主細胞において増殖される。ヒト若しくはマウスＧＲＰ９４遺伝子をコード化した、本発明のゲノムクローンは、ラムダファージＦＩＸ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において維持される。
【００９３】
本発明のＧＲＰ９４コード化核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ，及びそれらの断片を含み、一本鎖或いは二本鎖であり得る。従って、本発明は、本発明の核酸分子の少なくとも１つの配列、例えば、配列ＩＤ番号１を有するｃＤＮＡの選択断片など、とハイブリダイズ可能な配列を有するオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ或いはＲＮＡのセンス鎖或いはアンチセンス鎖）を提供する。
【００９４】
これら配列の変異体（例えば、アリル変異体など）は、ヒト集団の中に存在し、本発明のオリゴを設計及び／若しくは使用する場合、考慮に入れられるべきであることは、当業者には理解されるであろう。従って、ここに開示されたＧＲＰ９４配列、若しくはそれぞれの遺伝子或いはＲＮＡ転写物上の特異的位置を標的としたオリゴに関して、そのような変異体を含むことは本発明の範囲内である。そのような変異体を含むことに関して、"天然アリル変異体"という用語は、ヒト集団において生じる、様々な特異的ヌクレオチド配列とそれらの変異体を言及するためにここでは用いられている。コード化タンパク質における保存的若しくは中立アミノ酸置換を生じさせる遺伝子多形は、そのような変異の例である。加えて、"実質的に相補的"という用語は、標的配列と完全にマッチされていないが、そのミスマッチが、記載された条件下でその標的配列とハイブリダイズする前記オリゴの能力に実質的に影響を与えていない、オリゴ配列を言及している。
【００９５】
従って、コード配列は、配列ＩＤ番号１に示されたものである。若しくはこの配列の変異体（ｍｕｔａｎｔ）、変異形（ｖａｒｉａｎｔ）、誘導体、若しくはアリル体である。前記配列は、示した配列の１若しくはそれ以上のヌクレオチドの付加、挿入、欠損、及び置換の１若しくはそれ以上である改変によって示される配列とは異なる。ヌクレオチド配列の改変は、遺伝子コードによって決定されたようにタンパク質レベルでのアミノ酸改変を生じる、若しくは生じない。
【００９６】
従って、本発明に従った核酸は、同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化するにも関わらず、配列ＩＤ番号１に示された配列とは異なる配列を含む。
【００９７】
一方、前記コードポリペプチドは、配列ＩＤ番号２に示されたアミノ酸配列とは、１若しくはそれ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有する。配列ＩＤ番号２に示された配列のアミノ酸配列変異形、変異体、誘導体、若しくはアリル体であるポリペプチドをコード化する核酸は、本発明によってさらに提供される。そのようなポリペプチドをコード化した核酸は、配列ＩＤ番号１に示されたコード配列と６０％以上の相同性を示し、好ましくは、７０％以上の相同性、８０％以上の相同性、９０％以上の相同性、若しくは９５％以上の相同性を示す。
【００９８】
本発明は、目的の核酸を得るための方法を提供し、前記方法は、配列ＩＤ番号１に示された配列の一部若しくは全てを有する、若しくは標的核酸に対して相補的な配列を有するプローブのハイブリダイゼーションを含む。一般的に、ハイブリダイゼーションに続いて、成功したハイブリダイゼーションの同定と、前記プローブにハイブリダイズされた核酸の単離（ＰＣＲの１若しくはそれ以上の工程が関連する）がある。
【００９９】
そのようなオリゴヌクレオチドプローブ若しくはプライマー、及び完全長配列（及び変異形、変異体、アリル体、及び誘導体）は、アリル体、変異形、及び変異体、特に腫瘍抗原結合活性が増強されたそれらが存在するか、核酸を有するテストサンプルをスクリーニングする際に有用であり、前記プローブは、テストされる個人から得たサンプルからの標的配列とハイブリダイズするものである。前記ハイブリダイゼーションの条件は、非特異的結合を最小限にするために調節され、中程度に厳密なハイブリダイゼーション条件に対する好ましい厳密さが使用される。当業者は、ハイブリダイゼーション反応に対して、そのようなプローブを容易に設計し、それらを標識し、適切な条件を工夫することができ、これはＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）やＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）などの教科書によって支援されている。
【０１００】
いくつかの好ましい実施形態において、配列ＩＤ番号１に示された配列の断片、若しくはペプチド結合活性に関するあらゆるアリル体である、本発明に従ったオリゴヌクレオチドは、少なくとも約１０ヌクレオチド長であり、より好ましくは約２０ヌクレオチド長である。そのような断片事態は、それぞれ本発明の観点を表している。断片及び他のオリゴヌクレオチドは、説明されたようにプライマー若しくはプローブとして用いられるが、ＧＲＰ９４ポリペプチドをコード化する配列のテストサンプルにおける存在を決定することに関係する方法（例えば、ＰＣＲによって）でも産生される。
【０１０１】
Ｂ．タンパク質
ＧＲＰ９４タンパク質は、小胞体に存在し、他の分泌タンパク質或いは小胞体内に形成し、それらの３次元形を達成する膜受容体を助ける機能を有する分子シャペロンである。本発明の完全長ＧＲＰ９４タンパク質は、既知の方法に従った様々な方法で調整される。前記タンパク質は、例えば、形質転換細菌、若しくは動物培養細胞或いは組織などの適切な源から、免疫親和性精製によって精製される。しかしながら、これは、いかなる時点でも、所定の細胞タイプにおいて存在するであろうタンパク質が少ないため、好ましい方法ではない。ＧＲＰ９４をコード化する核酸分子の利用可能性は、当業者には既知であるｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現方法を用いた、前記タンパク質の産生を可能にする。例えば、ｃＤＮＡ若しくは遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のために適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ベクター（ｐＳＰ６４やｐＳＰ６５など）へクローン化され、その後、コムギ胚芽或いはウサギ網状赤血球可溶化液などの適切な無細胞翻訳システムにおける無細胞翻訳が続く。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写と翻訳システムは、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）或いはＢＲＬ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、メリーランド州）から商業用に利用可能である。
【０１０２】
或いは、好ましい実施形態によると、より大量なＧＲＰ９４は、適切な原核或いは真核システムにおける発現によって産生される。例えば、配列ＩＤ番号１を有するｃＤＮＡ或いはそれらの望ましい断片などの、ＤＮＡ分子の一部或いは全部は、大腸菌などの細菌性細胞内の発現に適応したプラスミドベクターへ挿入される。そのようなベクターは、宿主細胞内で前記ＤＮＡの発現を可能にするような方法で位置付けられた、宿主細胞（例えば、大腸菌）内で前記ＤＮＡを発現するために必要な調節性要素を有する。発現に必要とされるそのような調節要素は、プロモーター配列、転写開始配列、及び任意に、エンハンサー配列を含む。
【０１０３】
組換え原核或いは真核システムにおける遺伝子発現によって産生されたＧＲＰ９４は、本分野では既知である方法に従って精製される。好ましい実施形態において、商業的に利用可能な発現／分泌システムを用いることができ、これによって前記組換えタンパク質は発現され、その後宿主細胞から分泌され、周囲の培地から容易に精製される。発現／分泌ベクターを用いなかった場合、代わりのアプローチは、例えば、組換えタンパク質と特異的に結合する抗体との、若しくはそれらのＮ末端或いはＣ末端での６〜８のヒスチジン残基でタグ付けされた組換えタンパク質を単離するためのニッケルカラムとの免疫学的相互作用によってなどの、親和性分離によって組換えタンパク質を精製する工程を含む。代替タグは、ＦＬＡＧエピトープ、若しくは赤血球凝集素エピトープを有する。そのような方法は、当業者によって一般的に使用されている。
【０１０４】
本発明のＧＲＰ９４タンパク質若しくはペプチド断片は、上述した方法によって調整され、標準手順に従って解析される。例えば、そのようなタンパク質は、既知の方法に従ったアミノ酸配列解析を受ける。
【０１０５】
上述したように、本発明に従ったポリペプチドを産生するための簡便な方法は、発現システムにおける核酸の使用によって、それのコード化している核酸を発現することである。発現システムの使用は、非常に高度な精巧度まで到達している。
【０１０６】
従って、本発明は、（上述したように）ポリペプチドを産生する方法も含み、前記方法は、前記ポリペプチドをコード化する核酸（一般的には本発明に従った核酸）から発現する工程を含む。これは、ポリペプチドの産生を引き起こす若しくは可能にする適切な条件下、そのようなベクターを含む、培養中の宿主細胞を増殖することによって簡便に達成される。ポリペプチドは、網状赤血球可溶化液などのｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムにおいても産生される。
【０１０７】
アミノ酸配列の変異形、アリル体、誘導体、若しくは変異体であるポリペプチドも、本発明によって提供される。変異形、アリル体、誘導体、或いは変異体であるポリペプチドは、配列ＩＤ番号２も示された配列と、１若しくはそれ以上のアミノ酸の付加、置換、欠損、及び挿入の１若しくはそれ以上によって異なるアミノ酸配列を有する。好ましいそのようなポリペプチドは、ＧＲＰ９４機能を有する、すなわち、以下の特徴、ペプチド結合活性、ＡＤＰ、ＡＴＰ、或いはＮＥＣＡに対する結合活性、ゲルダナマイシン或いはラディシコール、若しくはそれらの合成変異体に対する結合活性、及び配列ＩＤ番号２に示された配列に対するポリペプチドとの抗体反応性を有する免疫交差反応性の１若しくはそれ以上を有するものである。配列ＩＤ番号２に示されたアミノ酸配列のアミノ酸配列変異形、アリル体、誘導体、若しくは変異体であるポリペプチドは、示された配列と約３５％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上の配列相同性を有する配列相同性を有するアミノ酸配列を有する。特定のアミノ酸配列変異形は、配列ＩＤ番号２に示されたアミノ酸配列とは、１アミノ酸、２、３、４、５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、若しくは１５０アミノ酸以上の挿入、付加、置換、或いは欠損によって、異なるものである。
【０１０８】
本発明に従ったポリペプチドは、その活性や機能に影響を与える、若しくは修飾する分子のためのスクリーニングに用いられる。そのような分子は、治療的状況（場合によっては、予防的な状況も含む）に対して有用である。
【０１０９】
ＩＩ．ＧＲＰ９４コード化核酸、ＧＲＰ９４タンパク質、及びＧＲＰ９４ペプチド断片の使用
ＧＲＰ９４タンパク質及びＧＲＰ９４ペプチド断片
ＧＲＰ９４は、抗原提示及び腫瘍拒絶に影響を及ぼす重要な免疫調節性タンパク質であることが明らかになった。本発明のＧＲＰ９４分子は、癌の治療に対する免疫反応を特に増強するための方法を促進するために用いられる。
【０１１０】
さらに、本発明に従ったＧＲＰ９４核酸、タンパク質、及びそれらに対する抗体は、抗原修復、タンパク質折り畳み、及び腫瘍拒絶反応に密接に関与する他のタンパク質を同定するための研究ツールとして使用される。これらの経路の生化学的解明は、癌及び他の免疫機能障害の治療のための新規試薬の開発を促進するであろう。
【０１１１】
Ａ．ＧＲＰ９４コード化核酸
ＧＲＰ９４コード化核酸は、本発明に従った多くの目的で用いられる。ＧＲＰ９４コード化ＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくはそれらの断片は、ＧＲＰ９４タンパク質をコード化する遺伝子の存在及び／若しくは発現を検出するためのプローブとして用いられる。ＧＲＰ９４コード化核酸がそのようなアッセイに対するプローブとして用いられる方法としては、これに限定されるものではないが、（１）ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、（２）サザンハイブリダイゼーション、（３）ノーザンハイブリダイゼーション、及び（４）ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）などの様々な増幅反応を含む。
【０１１２】
本発明のＧＲＰ９４コード化核酸は、他の動物種からの関連遺伝子を同定するためのプローブとしても有用である。本分野ではよく知られているように、ハイブリダイゼーション厳密性は、核酸プローブと、様々な程度の相同性を有する相補的配列とのハイブリダイゼーションを可能にするように調節される。従って、ＧＲＰ９４コード化核酸は、様々な程度でＧＲＰ９４と関連する他の遺伝子を同定し、特徴付けることを促進するために用いられ、それにより分子シャペロンシステムのさらなる特徴付けが可能になるものである。さらに、それらは、ＧＲＰ９４と（例えば"相互作用トラップ"技術によって）相互作用するタンパク質をコード化する遺伝子を同定するために用いられ、これはさらに、抗原提示及び腫瘍拒絶に関与する構成成分の同定を促進するべきである。
【０１１３】
ＧＰＲ９４をコード化する核酸分子、或いはそれらの断片は、ＧＲＰ９４の産生を調節し、それによって免疫調節性反応に使用できるタンパク質の量を調節するためにも有用である。ＧＲＰ９４タンパク質の生理学的な量における変化は、例えば抗原提示などに関与する他のタンパク質因子の活性に対して劇的な影響を与える。
【０１１４】
ＧＲＰ９４コード化核酸の利用可能性は、ＧＲＰ９４遺伝子の一部或いは全部、若しくはそれらの変異配列を有している実験マウスの系統の産生を可能にする。そのようなマウスは、免疫調節及び腫瘍拒絶に対するｉｎ  ｖｉｖｏモデルを提供する。代わりに、ここに提供されたＧＲＰ９４配列情報は、ＧＲＰ９４をコード化する内在性遺伝子が特異的に不活性化されているノックマウスの産生を可能にする。実施例２を参照のこと。実験マウスに導入遺伝子を導入する方法は、当業者には既知である。３つの共通する方法としては、１．初期胚への目的外来性遺伝子をコード化するレトロウイルスベクターの組込み、２．新しく受精させた卵の前核へのＤＮＡの注入、及び３．初期胚への遺伝操作された胚性幹細胞の取り込みを含む。上述したトランスジェニック（遺伝子組換え）マウスの生産は、胚発生や免疫調節におけるＧＲＰ９４の役割を分子的解明するために有用である。
【０１１５】
ヒトＧＰＲ９４遺伝子を有するトランスジェニックマウスは、マウスＧＰＲ９４遺伝子をヒトの遺伝子に直接置換することによって生成される。これらのトランスジェニック動物は、ヒトの疾患に対する、及びＧＲＰ９４によって修飾された生物活性に関連する傷害や疾患を最終的な治療に対する動物モデルとして、薬剤スクリーニング研究に有用である。ＧＲＰ９４の"ノックアウト"を有するトランスジェニック動物は、胚発生におけるＧＲＰ９４の役割を評価するのに有用である。
【０１１６】
哺乳類システムにおけるＧＲＰ９４の役割を定義する手段として、ＧＲＰ９４遺伝子の標的変異破壊が原因でＧＲＰ９４タンパク質を産生できないマウスが産生される。
【０１１７】
この項で用いられたように、"動物"という用語は、ヒトを除く全ての脊椎動物を含む。また、胚性及び胎生段階を含む全ての発生段階の個々の動物も含む。"トランスジェニック動物"は、例えば、標的組換え或いはマイクロインジェクションによって、若しくは組換えウイルスでの注入によってなどの、細胞下レベルでの計画的な遺伝子操作によって、直接的に或いは間接的に変えられた或いは有するようになった遺伝子情報を有する１若しくはそれ以上の細胞を有するあらゆる動物のことである。"トランスジェニック動物"という用語は、典型的な異種交配やｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精を含むことを意味しているものではないが、１若しくはそれ以上の細胞が組換えＤＮＡ分子によって変えられている或いはそれらを有するようになった動物を含むことを意味している。この分子は、定義された遺伝子座を特異的に標的化される、染色体内に無作為に連結される、若しくは染色体外のＤＮＡ置換されるものである。"生殖（胚）細胞系列トランスジェニック動物"という用語は、遺伝子改変若しくは遺伝子情報が生殖細胞系列に導入され、それにより遺伝子情報を子孫へ伝達する能力を持つようになったトランスジェニック動物を言及している。そのような子孫において、その改変或いは遺伝子情報のいくつかまたは全てを有する子孫もまたトランスジェニック動物である。
【０１１８】
改変或いは遺伝子情報は、レシピエントが属する動物の種とは異なっている、或いは特定の個々のレシピエントのみ異なっているものである、若しくは遺伝子情報はすでにレシピエントが有しているものである。最後のケースでは、改変或いは導入された遺伝子は、未変性遺伝子とは異なった発現をする。
【０１１９】
改変ＧＲＰ９４遺伝子は、宿主動物由来の同じＧＲＰ９４タンパク質を完全にコード化するものではなく、その発現産物は、軽微な或いは大幅な度合いで改変される、若しくは全く欠けているものである。しかしながら、より中程度に修飾されたＧＲＰ９４遺伝子は、それが特異的な改変であった場合、本発明の範囲内に含まれると考えられる。
【０１２０】
標的遺伝子を改変するために用いられたＤＮＡは、幅広い多くの技術によって得られ、その技術には、これに限定されるものではないが、ゲノム源からの単離、単離されたｍＲＮＡ鋳型からのｃＤＮＡの調整、直接的な合成、若しくはそれらの組み合わせを含む。
【０１２１】
導入遺伝子を導入するための標的細胞の種類は、胚性幹細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された移植前胚から得られる（Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４〜１５６；Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：２５５〜２５８；Ｇｏｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：９０６５〜９０６９）。導入遺伝子は、ＤＮＡ形質移入などの標準技術によって、若しくはレトロウイルス仲介性形質伝達によって、ＥＳ細胞へ効率的に導入され得る。結果生じる形質転換されたＥＳ細胞は、その後、非ヒト動物からの胚盤胞と組み合わさ得る。導入されたＥＳ細胞は、その後その胚をコロニー形成し、結果生じるキメラ動物の生殖細胞系列を与える。
【０１２２】
個々の遺伝子やそれらの発現産物の寄与を決定するための問題に対する１つのアプローチは、単離されたＧＲＰ９４遺伝子を用いて、野生型遺伝子を分化全能性ＥＳ細胞（上述したような細胞など）において選択的に不活性化し、次にトランスジェニックマウスを産生することである。遺伝子−標的トランスジェニックマウスの産生における遺伝子−標的ＥＳ細胞の使用は、他の所で記載され概説されている（Ｆｒｏｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５６：１４５〜１４７；Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：５３４〜５３９）。
【０１２３】
標的相同性組換えを用いることによって、特異的変化を染色体アリルへ挿入し、あらゆる遺伝子領域を望んだ変異を有するように不活性化する或いは改変する技術が利用可能である。しかしながら、１００％に近い頻度で生じる相同性染色体外組換えと比較して、相同性プラスミド−染色体組換えは、１０−６〜１０−３の間の頻度でのみ検出されると当初は報告されていた。非相同性プラスミド−染色体相互作用は、相同的挿入と比較して、１０５倍〜１０２倍のレベルでより頻繁に生じる。
【０１２４】
マウスＥＳ細胞における標的組換えのこの低比率を克服するために、希少な相同性組換えを検出する或いは選択するための様々な戦略が開発された。相同性改変現象を検出するための１つのアプローチは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用い、相同的挿入のために、形質転換体細胞のプールをスクリーニングし、個々のクローンをスクリーニングすることである。代わりに、ポジティブ遺伝子選択アプローチは、相同的挿入が生じる場合にのみ活性であるマーカー遺伝子が構成されるように開発され、これによりこれらの組換えの直接的な選択を可能になるものである。相同性組換えを選択するために開発された最も強力なアプローチの一つは、ポジティブ−ネガティブ選択（ＰＮＳ）方法であり、これは、改変が存在するため直接的な選択がない遺伝子のために開発された。ＰＮＳ方法は、マーカー遺伝子がそれ自身のプロモーターを有しているためん、高レベルでは発現していない遺伝子を標的にするためにはより効率的である。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子を用いることによって、及びガンシクロビル（ＧＡＮＣ）或いは１−（２−デオキシ−２−フルオロ−Ｂ−Ｄアラビノフルラノシル）−５−ヨードウラシル）（ＦＩＡＵ）などの効果的なヘルペス薬剤を有するその非相同的挿入に対して選択することによって、非相同性組換えは選択される。このカウンター選択によって、生存形質転換体における相同性組換えの数は、増加され得る。
【０１２５】
ここで用いられたように、"標的遺伝子"若しくは"ノックアウト"とは、これに限定するものではないが、ここに記載された方法などのヒトの介入によって、生殖細胞系列或いは非ヒト動物へ導入されたＤＮＡ配列である。本発明の標的遺伝子は、同族内在性アリルを特異的に改変するように設計されたＤＮＡ配列を含む。
【０１２６】
本発明のトランスジェニックマウスのために使用する方法も、本明細書で提供される。癌の治療や予防のための薬剤は、ＧＲＰ９４トランスジェニックマウスを用いた研究でスクリーニングされる。
【０１２７】
本発明の別の実施形態において、ＧＲＰ９４ノックアウトマウスは、ＧＲＰ９４タンパク質に特異的なモノクローナル抗体のアレイを産生するために用いられる。
【０１２８】
また、本発明の別の実施形態において、ＧＲＰ９４遺伝子は、ゲノムから検出され得る（すなわち、切り出される）短い配列で隣接するＧＲＰ９４遺伝子と置換される。２つの異なるバクテリオファージリコンビナーゼを用いる方法が記載され、これはゲノムへの外来性ＤＮＡの切除或いは組込みのために用いられる。いくつかの原核生物及び低等真核生物の部位特異的組換えシステムは、高等真核生物においてもうまく操作することが示された。酵母、植物、及び動物細胞において、機能的部位特異的組換えシステムは、バクテリオファージＰ１（ＣＲＥ−ｌｏｘＰ）（以下を参照）及びＭｕ（Ｇｉｎ−ｇｉｘ）から、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（出芽酵母、ＦＬＰ−ｆｒｔ）（Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９１；Ｌｙｚｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）及びＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ（Ｒ−ＲＳ）（Ｏｎｏｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９１；Ｏｎｏｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）の転化プラスミドから、報告された。このアプローチは、本分野では既知である方法によって、組織特異的方法若しくは発生的特異的方法において用いられ得る。選択された細胞においてはＧＲＰ９４が不活性で他の細胞ではそうではない、そのようなマウスは、"条件的ノックアウトマウス"と名付けられており、疾患に対する動物モデルとして役立つ。例えば、ＧＲＰ９４が筋肉発達に対して重要であるとの発見は、筋肉組織の遺伝的欠陥や、筋肉変性疾患に対する重要な動物モデルを提供する。
【０１２９】
ＧＲＰ９４欠損マウス及びＧＲＰ９４欠損ＥＳ細胞の利用可能性は、治療法を開発するために用いることができる細胞株の産生を可能にする。第１に、ＧＲＰ９４欠損細胞株は、ＧＲＰ９４の機能を哺乳類ＨＳＰ９０ファミリーの他の３つのメンバーの機能と区別するアッセイを開発するために用いられ得る。ＧＲＰ９４に優位に依存するこのストレス反応性は、これらの細胞に影響を受け、従って（本明細書のデータにおいてすでに示されたように）識別可能であるべきである。第２に、ＧＲＰ９４欠損細胞株は、ＨＳＰ９０若しくはＧＲＰ９４に対して特異的な薬剤を開発するための用いられ得、従って、このファミリーの全てのメンバーを標的とする薬剤よりもよく、望まない副作用を持たない抗腫瘍薬剤の作成を可能にする。第３に、ＧＲＰ９４欠損ＥＳ細胞株は、組織特異的或いは細胞種特異的適用に対する、培養分化細胞株を作成するために用いられ得る。例えば、肝臓細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）若しくは脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）は既にそのような細胞から産生されており、これらは、ＤＮＡアレイやタンパク質アレイなどの全ゲノム及び全プロテオーム技術を用いて、正常及び／若しくは病原性肝機能における、及び／若しくは脂肪組織生物学におけるＧＲＰ９４の役割を決定するために用いられ得る。ＧＲＰ９４は、グルコース代謝に対するセンサーであると知られているので、目的の細胞種には膵臓細胞及び筋細胞も含むことができ、ＧＲＰ９４の非存在は、ＧＲＰ９４のセンサー機能に依存した、或いはこれらの組織の生理機能に影響を与えるその非存在に依存した薬剤の研究や産生を可能にする。
【０１３０】
癌治療の状況において、ＧＲＰ９４欠損マウスとＥＳ細胞の利用可能性は、腫瘍免疫療法に対する、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａらによって促進されたモデルの遺伝子テストを可能にする。腫瘍は、ＧＲＰ９４欠損を産生し、免疫システムを刺激した場合のｉｎ  ｖｉｖｏでの役割を決定するためにマウスへ注射され得る。そのような研究室テストの有用性は、免疫調節活性も有している、ストレスタンパク質などの他のタンパク質の発見になり得、そのタンパク質の作用はＧＲＰ９４の存在によって遮蔽されるものである。
【０１３１】
Ｂ．ＧＲＰ９４タンパク質及びそれらの断片
精製ＧＲＰ９４若しくはそれらの断片は、哺乳類細胞におけるＧＲＰ９４の存在及び蓄積に対する高感度検出試薬としても作用する、ＧＲＰポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体を産生するために用いられる。組換え技術は、ＧＲＰ９４タンパク質の一部或いは全部を含む融合タンパク質の発現を可能にする。前記タンパク質の完全長タンパク質或いは断片は、前記タンパク質の様々なエピトープに特異的なモノクローナル抗体のアレイを生産を促進するために用いられ、それにより細胞内の前記タンパク質の検出に対して著しい感受性を提供する。
【０１３２】
ＧＲＰ９４に免疫学的に特異的であるポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体は、前記タンパク質を検出し定量化するように設計された様々なアッセイにおいて用いられる。そのようなアッセイには、これに限定されるものではないが、（１）フローサイトメトリー解析、（２）腫瘍細胞におけるＧＲＰ９４の免疫化学的局在、及び（３）様々な細胞からの抽出物の免疫ブロット解析（例えば、ドットブロット、ウエスタンブロットなど）を含む。さらに、上述されたように、抗ＧＲＰ９４は、ＧＲＰ９４の精製のためにも用いられ得る（例えば、親和性カラム精製、免疫沈降など）。
【０１３３】
前述に説明から、本発明のＧＲＰ９４コード化核酸、ＧＲＰ９４発現ベクター、ＧＲＰ９４タンパク質、及び抗ＧＲＰ９４抗体は、ＧＲＰ９４遺伝子発現を検出し、タンパク質折り畳み、抗原提示、及び腫瘍拒絶に関連した遺伝子及びタンパク質の相互作用を評価するために、ＧＲＰ９４タンパク質蓄積を改変するために用いられる。本発明の別の観点によると、ＧＲＰ９４産生を回復する或いは増強するのに適切な薬剤を同定するための、癌治療に対する薬剤をスクリーニングする方法が提供される。上述したＧＲＰ９４欠損細胞株は、この目的のための優れたスクリーニングツールを提供する。
【０１３４】
薬剤スクリーニングアッセイに用いられたＧＲＰ９４ポリペプチド或いは断片は、溶液中では含まれず、固体支持体へ添加される、若しくは細胞内に存在するものである。薬剤スクリーニングの１つの方法は、原核生物或いは真核生物宿主細胞を利用し、それら宿主細胞は、好ましくは競合的結合アッセイにおいて、前記ポリペプチド或いは断片を発現する組換えポリヌクレオチドで安定的に形質転換される。そのような細胞（生細胞でも固定された形態でも）は、標準結合アッセイに用いられ得る。ある人は、例えば、ＧＲＰ９４ポリペプチド或いは断片とテストされる薬剤との間の複合体の形成を決定し、ＧＲＰ９４ポリペプチド或いは断片と既知リガンドとの間の複合体の形成が、テストされる薬剤によってどの程度干渉されるかを検討する。本発明の細胞株を用いたそのようなアッセイは、ＨＳＰ９０とＧＲＰ９４の間で異なった結合を示す薬剤の同定を促進する。
【０１３５】
薬剤スクリーニングのための別の技術は、ＧＲＰ９４ポリペプチドに対して適切な結合親和性を有する化合物のための高処理スクリーニング系を提供し、Ｇｅｙｓｅｎによる１９８４年９月１３日に公開されたＰＣＴ公開公報番号ＷＯ８４／０３５６４号に詳細に記載されている。簡潔に説明すると、多くの異なる小ペプチドテスト化合物は、プラスチックピン或いは他のものの表面などの固体基質上に合成される。前記ペプチドテスト化合物は、ＧＲＰ９４ポリペプチドと反応され、洗浄される。ＧＲＰ９４ポリペプチド結合は、次に本分野ではよく知られた方法によって検出される。
【０１３６】
精製されたＧＲＰ９４は、上述した薬剤スクリーニング技術で用いるために、プレート上に直接コーティングされる。しかしながら、前記ポリペプチドに対する非中和抗体は、ＧＲＰ９４ポリペプチドを前記固体相上に固定化するための抗体を捕獲するために用いられ得る。ＧＲＰ９４をプレート或いは他の固体基質上に接着する好ましい方法は、部位特異的ビオチン付加に向いたＣ末端タグを有する、修飾ＧＲＰ９４を使用するものである。特に、著者らは、ビオチン標識化部位がＮ１−３５５、Ｎ３４−３５５、及びＮ３４−２２２のＣ末端に作成され得ることを示した。
【０１３７】
本発明は、ＧＲＰ９４ポリペプチド或いはそれらの断片と結合するためのテスト化合物と競合する、ＧＲＰ９４ポリペプチドに特異的に結合可能な抗体を中和する競合性薬剤スクリーニングアッセイの使用も考慮に入れる。これに関して、前記抗体は、ＧＲＰ９４ポリペプチドの１若しくはそれ以上の抗原性決定基を共有するあらゆるペプチドの存在を検出するために用いられ得る。
【０１３８】
薬剤スクリーニングに対するさらなる技術は、非機能性ＧＲＰ９４遺伝子を有する宿主真核生物細胞株若しくは細胞（上述したような）の使用を含む。これらの宿主細胞株若しくは細胞は、ＧＲＰ９４ポリペプチドレベルで欠損している。前記宿主細胞株若しくは細胞は、薬剤化合物の存在下で増殖する。前記宿主細胞の増殖速度は、前記化合物がＧＲＰ９４欠損細胞の増殖を調節するかどうか決定するために測定される。
【０１３９】
例えば、腫瘍細胞は、制御されない増殖によって正常細胞とは区別される。従って、多くの癌治療法は、急速に分裂する細胞を選択的に阻害するように設計される。細胞の増殖調節は、外部細胞膜における多くの受容体タンパク質、及び細胞膜内に埋め込まれた"キナーゼ"と呼ばれる酵素に依存しており、それらの機能としては、他の増殖調節タンパク質をリン酸化（リン酸基を付加する）するものである。受容体やキナーゼの多くは、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）と相互作用する細胞増殖調節に関与しており、細胞内でのそれらの適切な機能と正確な堆積のためにこの相互作用に依存している。特に、ＨＳＰ９０は、有力な抗腫瘍薬剤標的候補として考えられてきた。しかしながら、ＨＳＰ９０は、ＧＲＰ９４に非常に高い相同性を有しており、ＧＲＰ９４と構造要素を共有しており。ＧＲＰ９４が結合するものとほとんど同じリガンドに結合する。今日まで、ＨＳＰ９０活性を干渉するように設計された全ての阻害剤は、ＧＲＰ９４にも結合し、阻害する。これは、抗ＨＳＰ９０薬剤を用いた結果として望まない副作用を導く。従って、ＧＲＰ９４欠損細胞株の使用は、ＧＲＰ９４若しくはＨＳＰ９０の選択的結合を示す薬剤の同定を可能にするであろう。
【０１４０】
癌に対抗するための第２の戦略は、癌性細胞と正常細胞との間の増殖の違いではなく、それらの間の化学的な違いを目標とするものである。腫瘍細胞の特徴となるタンパク質断片における違いを検出するＴリンパ球の精巧な能力のおかげで、そのような細胞に作用し殺傷するためのＴ細胞性免疫システムの助けを得ることは可能である。ＧＲＰ９４は、始めＳｒｉｖａｓｔａｖａらによって、後に他の人によって、そのようなＴリンパ球による腫瘍細胞の認識を刺激することが示された。
【０１４１】
この技術におけるバリエーションとしては、目的の様々なストレス条件下で、ＧＲＰ９４が欠損した細胞の増殖があり、これにより前記ストレスに対処する細胞の能力を決定し、細胞性ストレス反応を修飾するための薬剤の能力を測定するものである。全ての動物に対するこの技術の重要な進展としては、特異的組織及び／若しくは細胞種においてＧＲＰ９４遺伝子が不活性化されたマウスにおけるストレス反応性の測定がある。
【０１４２】
理論的薬剤デザインのゴールは、生物学的に活性な目的のポリペプチドの構造類似体、若しくは、例えばより活性があり安定した形態のポリペプチドである薬剤或いは例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチドの機能を増殖する或いは阻害する薬剤を構築するために相互作用する（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤など）小分子の構造類似体を産生することである。例えば、Ｈｏｄｇｓｏｎ，（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１９〜２１を参照のこと。ひとつのアプローチにおいて、ある人は、まず（例えば、ＧＲＰ９４ポリペプチドなど）目的のタンパク質、若しくは例えばＧＲＰ９４ペプチド複合体の三次元構造を、Ｘ線結晶学によって、核磁気共鳴によって、コンピューターモデリング、若しくは最も一般的にはそれらアプローチの組み合わせによって決定する。頻繁ではないが、ポリペプチドの構造に関する有用な情報は、相同性タンパク質の構造に基づいたモデリングによって得られる。理論的薬剤デザインの例としては、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の開発である（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：５２７〜５３３）。加えて、ペプチド（例えば、ＧＲＰ９４ポリペプチド）は、アラニンスキャンによって解析される（Ｗｅｌｌｓ，１９９１，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３９０〜４１１）。この技術において、アミノ酸残基は、Ａｌａによって置換され、前記ペプチド活性に対するその影響が決定される。前記ペプチドの前記アミノ酸残基のそれぞれは、この方法によって解析され、前記ペプチドの重要領域を決定する。
【０１４３】
ＧＲＰ９４のペプチド結合部位の発見、及びＨＳＰ９０ファミリータンパク質の他のメンバーとの配列及び／若しくは構造の高度な相同性によって、このファミリーの他のメンバーにおける相同的部位に結合するペプチド及び同様のリガンドに関連する、本発明の別の観点が示される。例えば、細菌におけるｈｔｐＧを標的とすることによって、新規抗生物質が導かれる。別の例として、ＨＳＰ９０ペプチド結合部位を標的とすることによって、その活性の修飾が導かれる。第３に、１ペプチド結合部位についての知識を得ることによって、ストレスタンパク質であるＨＳＰ９０ファミリーの全ての他のメンバーの結合部位の理論的構造ベース遺伝子操作が導かれる。
【０１４４】
また、機能的アッセイによって選択された、標的特異的抗体を単離し、次にその結晶構造を解析することも可能である。原理としては、このアプローチは、次に続く薬剤デザインの基礎となり得る薬学的コア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）をもたらす。機能的薬理学的活性抗体に対する抗イディオタイプ固体（抗−ｉｄｓ）を産生することにより、タンパク質結晶学全体を回避することが可能である。鏡像として、前記抗−ｉｄｓの結合部位は、オリジナル分子の類似体になると予想される。次に、前記抗−ｉｄｓは、科学的或いは生物学的に産生されたペプチドのバンクからペプチドを同定し、単離するために用いられる。選択されたペプチドは、その後薬学的コアとして働く。
【０１４５】
従って、ある人は、例えば、ＧＲＰ９４ポリペプチド活性の阻害剤、アゴニスト、アンタゴニストなどとして作用する、改善されたＧＲＰ９４ポリペプチド活性或いは安定性を有する薬剤をデザインする。クローン化ＧＲＰ９４配列の利用可能性の長所によって、十分量のＧＲＰ９４ポリペプチドが、Ｘ線結晶学などの解析研究を実行する場合に利用できるようになる。さらに、ここに提供されたＧＲＰ９４タンパク質配列の知識を得ることによって、Ｘ線結晶学の変わりに、或いはそれに加えて、コンピューターモデリング技術を用いる人に対するガイドとなる。
【０１４６】
ＩＩＩ．薬剤
Ａ．薬剤とペプチド治療
本発明のＧＲＰ９４ポリペプチド／タンパク質、抗体、ペプチド、及び核酸は、薬学的組成物にも調合され得る。これらの組成物は、上述の物質の１つに加えて、本分野の当業者にはよく知られた、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝液、安定剤、若しくは他の物質を有する。そのような物質は、無毒性であるべきで、前記活性成分の有効性を阻害しないものでなくてはならない。前記担体若しくは他の物質の正確な性質は、例えば、経口、静脈内、皮膚或いは皮下、鼻腔内、筋肉内、腹腔内経路などの投与経路に依存している。
【０１４７】
個々へ与えられるものである本発明に従ったポリペプチド、抗体、ペプチド、核酸分子、小分子、若しくは他の薬学的に有用な化合物は、好ましくは、"予防的に有効な量"若しくは"治療上有効な量"（場合によっては、予防的な場合は治療であると考えられるが）であり、これは、前記個々に有益をもたらすのに十分である。
【０１４８】
Ｂ．遺伝子治療の方法
さらなる別の手段として、標準の生物学的に活性なＧＲＰ９４ポリペプチドをコード化する核酸は、免疫システムの修飾が必要とされている患者、若しくは癌を患っている患者などを治療するための遺伝子治療の方法に用いられ得る。１つのアプローチにおいて、ｐａｎ−ＨＳＰ９０薬剤に感受性を持たない、ＧＲＰ９４の修飾されたバージョンは、抗ＨＳＰ９０の特異性を増加し、ＧＲＰ９４の同時標的に起因する望まない副作用を阻害する方法で、投与され得る。別のアプローチにおいて、ＧＲＰ９４は、効率的に分泌されず、効率的な分泌にＧＲＰ９４を必要としているタンパク質（例えば、免疫グロブリン、トール様受容体など）などに関与する疾患の遺伝子治療に用いられる（Ｒａｎｄｏｗ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｂ．Ｓｅｅｄ．２００１．Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｇｐ９６  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３：８９１）。
【０１４９】
最小で十分なバージョンのＧＲＰ９４遺伝子を遺伝子治療（及び微小タンパク質をタンパク質ベース治療）に使用することの主な利益は、投与した遺伝子／タンパク質の望まない効果及び活性が最小限になるということである。他のＨＳＰ９０全ての様な、ＧＲＰ９４は、モジュラー構造を有している。それは、ユニークな活性を有する、異なるドメインから成っている。例えば、少なくとも３つのタンパク質は、ＨＳＰ９０のＣ末端ドメインに結合すると知られており、少なくとも１つは、中央ドメインに結合する（Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｃ．，Ｉ．Ｍｏａｒｅｆｉ，ａｎｄ  Ｆ．Ｕ．Ｈａｒｔｌ．２００１．Ｈｓｐ９０：ａ  ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  ｂｕｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｆｏｌｄｉｎｇ  ｔｏｏｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５４：２６７；Ｂｕｃｈｎｅｒ，Ｊ．１９９９．Ｈｓｐ９０&Ｃｏ．−ａ  ｈｏｌｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｆｏｌｄｉｎｇ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ２４：１３６）。ＧＲＰ９４のリガンド結合ドメインと荷電ドメインとからのみなる構造に対する治療に限れば、導入された遺伝子／タンパク質をより特異的な治療に用いるような、他の相互作用が起こる可能性はない。
【０１５０】
最小シャペロンモジュールを用いる第２の利点は、小タンパク質は組換え体を産生することが簡単である点である。小３５５アミノ酸タンパク質は、細菌、昆虫細胞、或いは哺乳類細胞発現システムにおいて、完全長ＧＲＰ９４と比較して、高収量とより良い活性（おそらく、正確に折り畳まれたタンパク質分子のより高いパーセンテージに起因する）が得られる。
【０１５１】
ウイルスベクターなどのベクターは、幅広い様々な異なる標的細胞へ遺伝子を導入するために先行文献において使用されてきた。典型的には、前記ベクターは、目的のポリペプチドの発現から有用な治療効果或いは予防効果を提供するのに十分な比率において、形質転換が生じることができるように標的細胞へさらされる。形質転換された核酸は、各標的腫瘍細胞のゲノムへ永久に取り込まれ持続的な効果を提供する、若しくは代わりにその治療が定期的に繰り返される。
【０１５２】
ウイルスベクターやプラスミドベクターの両方である様々なベクターは、本分野では知られており、米国特許番号第５，２５２，４７９号、及び国際特許番号ＷＯ９３／０７２８２号を参照のこと。特に多くのウイルスは、遺伝子転移ベクターとして用いられ、これらには、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、ＨＳＶやＥＢＶを含むヘルペスウイルス、及びレトロウイルスなどのパポバウイルスが含まれる。先行技術における多くの遺伝子治療プロトコールは、障害のあるマウスレトロウイルスが用いられていた。
【０１５３】
腫瘍組織に対するＧＲＰ９４核酸を選択的に標的とする遺伝子転移技術が好ましい。この例としては、受容体仲介性遺伝子転移を含み、ここにおいて核酸は、前記標的細胞の表面に存在する受容体に特異的なリガンドを有しているタンパク質リガンドにポリリシンを介して結合されているものである。
【０１５４】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を説明するために提供される。これらは、決して本発明を限定することを意図したものではない。  
【実施例１】
【０１５５】
ＧＲＰ９４のＮ末端ペプチド結合部位の同定
グルコース調節タンパク質９４（ＧＲＰ９４）（ｇｐ９６としても知られている）は、分子シャペロンのＨＳＰ９０１ファミリーのメンバーであり、２つのメカニズム：すなわち、免疫システムの適応アームに対するペプチド提示の増強［１］、及び自然免疫の刺激［２］によってＴ細胞反応を劇的に刺激することができる。これらの活性のおかげで、腫瘍由来ＧＲＰ９４は、腫瘍に対して免疫反応を誘発するために用いられ得、潜在的に強力な免疫治療ツールになる［３］。抗原提示活性は、その免疫原性を増強するＧＲＰ９４における変異に起因するものではなく、むしろペプチドと結合するその能力に起因するものであると示されている［４］。ＧＲＰ９４−ペプチド複合体は、受容体仲介性エンドサイトーシスを介して抗原提示細胞のサブセットによって取り込まれると知られており［５］、次に、細胞表面にあるＭＨＣクラスＩ分子に対して、シャペロンペプチドが内在性抗原提示細胞上に提示される。ペプチド結合は多くの分子シャペロンの通常の活性である一方で、ＧＲＰ９４は、抗原提示を増強する場合、そのようなシャペロンのなかで最も効果的であると議論されていた。その重要性にも関わらず。ＧＲＰ９４ペプチド相互作用、及びそのペプチド結合部位の同定は、詳細には特徴付けられていなかった。これらは、ＧＲＰ９４の免疫刺激作用を理解するに対して、重大な問題である。ＧＲＰ９４によるペプチド結合の機序は、２つの活性の間の連結は未だ解明されていないが、選択された膜結合のシャペロン及び分泌タンパク質としてのその活性についても伝達する［６］。同様な質問が、シグナル伝達複合体を組織化し、転写因子を調節する場合に、これらサイトゾルシャペロンの重要な役割であるにも関わらず、全ての他のＨＳＰ９０シャペロンに対して答えられていない。水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）由来のいくつかのペプチドは、ＧＲＰ９４に結合すると示されていた。ＶＳＶ８は、ＶＳＶのＮタンパク質からの八量体（ＲＧＹＶＹＱＧＬ）であり、ＭＨＣクラスＩＫｂを介して特異的Ｔ細胞に対して提示された、ウイルスの優性Ｔ細胞エピトープである［８］。ＭＨＣクラスＩを有するこのペプチドの複合体の構造は、解明されている［９］。ＶＳＶ８は、ＶＳＶ  Ｎタンパク質形質転換細胞株から精製されたＧＲＰ９４から溶出され［１０］、このペプチドは、精製されたＧＲＰ９４にｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接結合することが示された［１］。ペプチドＡは、前記ウイルスの糖タンパク質からの１５−ｍｅｒ（ＫＲＱＩＹＴＤＬＥＭＮＲＬＧＫ）であり、免疫原性であるとは知られていない［１、１１、１２］。しかしながら、このペプチドは、ＶＳＶ  Ｇタンパク質からのＬＳＳＬＦＲＰＫＲＲＰＩＹＫＳを含む、他のペプチドがするように、ＧＲＰ９４に結合する［１］。ＳｐｅｅとＮｅｅｆｊｅｓは、光反応性側鎖を有する放射性ペプチドを用い、ＧＲＰ９４のペプチド優先度を探索した［１３］。明らかなサイズ優先度は発見できず、４０ｍｅｒでさえ前記シャペロンに結合した。特異性が観られた唯一の配列は、基本的に９ｍｅｒである、若しくはＧＲＰ９４に相対的に弱く結合する２及び９位の酸性アミノ酸である。従って、ＧＲＰ９４との結合に互換性がある配列或いは構造的な特徴は、まだ知られていない。
【０１５６】
ＧＲＰ９４のペプチド結合活性に関する限られた量の情報は、低い結合の化学量論（約１％のペプチドのみがペプチドに結合すると示されている［１４］）と、遅い結合反応速度論［１５］にある程度起因している。これらの技術的障害は、前記ペプチド結合部位とその調節の構造的決定の同定も妨げている。本発明者らは、ペプチド結合構成要素を構成し、この断片に対するペプチド結合が特異的であることを示す第３のＧＲＰ９４のＮ末端は、ｐａｎ−ＨＳＰ９０阻害剤であるラディシコール及びゲルダナマイシンによって阻害され、ＧＲＰ９４の１モルに対して１モルに近い結合化学量論を有することを示した［１５］。加えて、本発明者らのデータによると、この部位の前記ペプチド特異性は、別のＥＲ常在ストレスタンパク質であるＢｉＰの特異性とは異なることが示唆された［１５］。この実施例において、本発明者らは、分子モデリング、生化学的特徴付け、及び部位特異的突然変異誘発を用い、Ｎ末端ドメイン内に位置した、或いはラディシコール結合部位の反対の表面にあるペプチド結合部位を同定し、Ｈｉｓ１２５が前記結合部位内に位置し、その結合活性に直接関連していることを示した。
【０１５７】
以下の材料及び方法は、実施例１の実施を容易にするために提供される。
【０１５８】
組換えタンパク質
Ｎ１−３５５：昆虫細胞内のＮ１−３５５の発現のための構成要素と、その精製工程は[１５]に記載されている。組換えＮ１−３５５タンパク質は、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグを含み、次にＧＲＰ９４の成熟配列の最初の３５５アミノ酸が続き、シグナルＫＤＥＬを標的にしたＣ末端ＥＲ１を含む。
【０１５９】
Ｎ３４−３５５：Ｎ１−３５５の最初の３３アミノ酸をコード化した配列は、ＰＣＲクローニングにより削除された。結果生じたＰＣＲ産物を、ＢａｍＨ１とＸｍａＩを用いて、アミノ末端の因子Ｘａ認識配列が続くＨｉｓ６タグに付加するように、ｐＱＥＸａベクター（Ｑｉａｇｅｎ）に挿入した。前記プラスミドを、Ｍ１５  Ｅ．ｃｏｌｉにおいて形質転換し、中間ログ段階まで増殖させ、次に１ｍＭ  ＩＰＴＧと共に４時間、２７℃でインキュベートし、タンパク質発現を誘導した。バクテリアを播種し、５００ｍＭ  ＮａＣｌと２０ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．２）で１％ＮＰ４０（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で溶解した。Ｎ３４−３５５を、取り扱い説明書に従って、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）の親和性クロマトグラフィーによって、界面活性剤溶解液から精製した。結合したタンパク質は、５００ｍＭイミダゾールで溶出し、透析し、濃縮した。このタンパク質は、１０〜２０％スクロースを含む２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１１０ｍＭ  ＫＯＡｃ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２（バッファーＡ）中、−８０℃で保存した。必要な場合、Ｈｉｓ６タグを含むアミノ末端伸長を、取り扱い説明書に従って、因子Ｘａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）での消化によって除去した。反応混合液は、小さいＮｉ−ＮＴＡカラムに通して再精製し、切断されたＮ３４−３５５のみを含む流出液を使用した。前記切断されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、親タンパク質よりも２〜３ｋＤａ小さく現れ、これは１７アミノ酸の除去と一致していた（図示せず）。消化後、７ｍｅｒであるＰＹＮＧＴＧＳは、Ａｌａ３４或いは成熟Ｎ３４−３５５配列の前に置かれる。
【０１６０】
ミニ−ＧＲＰ９４（例えば、アミノ酸３４〜３５５、７０〜２２１）のための、及び／若しくはミニ−ＨＳＰ９０組換えたんぱく質のための構成要素を、目的の配列のＰＣＲ増幅によって作成し、標準手順によって、発現ベクターｐＱＥ３０（Ｑｉａｆｅｎ  Ｃｏｒｐ．）のマルチプルクローニング部位へクローニングした。６−ヒスチジン部位は、発現タンパク質のＮ末端にこのベクターによって提供され、親和性精製が可能になった。
【０１６１】
アミノ酸１〜２１０からなるＨＳＰ９０断片を用い、ＧＲＰ９４で記載したように発現させた。正常ＨＳＰ９０配列を用いることに関して、本発明者らは、アミノ酸１００〜１３４の間の領域に突然変異を誘導した（実施例１の図４を参照のこと）。部位特異的突然変異は、結合ペプチドと結合するＧＲＰ９４におけるアミノ酸によって導かれ、これに限定されるものではないが、Ｔｈｒ９０、Ｉｌｅ８１、Ｐｒｏ８２、及びＧＲＰ９４配列にマッチするようなアミノ酸１３０の前の残基の挿入を含む。
【０１６２】
変異タンパク質：ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、アミン鎖置換を、Ｎ３４−３５５をコード化するベクターへ導入した。制限酵素解析によって解析する場合、変異はシークエンスによって検証した。このタンパク質は、バクテリア内で発現させ、上述したように精製した。
【０１６３】
ペプチド
ペプチドは、ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｃａｇｏの施設で合成され、質量分析法によって検証された。２つのバインダーペプチドの配列は、ＶＳＶ８としてＲＧＹＶＹＱＧＬ（ＶＳＶＮタンパク質から）、及びＰｅｐＡとしてＫＲＱＩＹＴＤＬＥＭＮＲＬＧＫ（ＶＳＶ  Ｇタンパク質から）である。水の中に保存溶液を調整し、−８０℃で保存した。ペプチド濃度は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）をもちいて決定した。指示されたように、ペプチドは、ＩｏｄｏＢｅａｄ法（Ｐｉｅｒｃｅ）によってイオジン化し、取り込まれなかったイオジンは、短いＤｏｗｅｘ  Ａｇ１Ｘ８カラムに通すことによって除去した。前記ペプチドの特異的放射線は、通常２ｘ１０１４〜１ｘ１０１５ｃｐｍ／ｍｏｌｅであった。
【０１６４】
ペプチド結合アッセイ
２種類の結合アッセイを用いた。溶液結合（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ）アッセイは、[１５]に記載されたように実行した。簡潔には、組換えタンパク質を、飽和状態下でイオジン化ペプチドと共にインキュベートし、バッファーＡ中、０．８μｌのパックＰ−３０ビーズ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を含むスピンカラムを通じて、遊離ペプチドの分離後、タンパク質−ペプチド複合体に関連する放射線を測定した。タンパク質なしのイオジン化ペプチドは、スピンカラム分離のバックグラウンド対照として使用された。
【０１６５】
固相結合アッセイ（テキスト中ではプレートアッセイとして言及されている）は、他の所で記載、検証されている（Ｂｉｓｗａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ  ｉｎ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）。簡潔には、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３５９０  Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ニューヨーク州）を、アッセイ前にペプチドでコーティングし、１００μｌのバッファーＡ中の組換えタンパク質を９０分間結合させた。結合は、ＨＲＰ−ウサギ抗Ｈｉｓ６（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって定量し、色変化は、ＢｉｏＴｅｋプレートリーダーを用いて４１５ｎｍで観察した。Ｎ１−３５５及びＮ３４−３５５は通常、０．７或いは１μｇのインプットレベルで飽和に到達するので、このレベルのＯＤ４１５値を１と定義し、全てのデータ点をそれを規準化した。３００μＭラディシコール（Ｓｉｇｍａ；ＤＭＳＯ中の保存溶液）による阻害を、特異性対照として用いた。
【０１６６】
ＧＲＰ９４に対するペプチド結合は、飽和可能で特異的であるので、オフ率はまだ非常に遅く[１５]、Ｋａ値は、分数占有曲線（Ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｏｃｃｕｐａｎｃｙ  ｃｕｒｖｅｓ）から図形的に推測した（タンパク質インプットの機能としての、飽和時のＯＤ４１５値に関連した所定のタンパク質インプットのＯＤ４１５値）。結合反応が均等でない場合、これらの値は、様々な変異の間の比較用パラメーターとして有効である。
【０１６７】
ゲル電気泳動
ブルーネガティブゲル電気泳動によるタンパク質高次構造の解析は、ＳＤＳなしのＬａｅｍｌｉゲルシステムの５〜１５％勾配アクリルアミドゲルを用いて、ネガティブバッファーに含まれたクーマシーブリリアントブルーＧ２５０（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）によって行われた[４０]。チログロブリン、フェリチン、及びＢＳＡを、分子量標準として用いた。
【０１６８】
タンパク質修飾
タンパク質への蛍光色素８−ＡＮＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，オレゴン州）の結合は、５００μｌのバッファーＡ中の０．５μＭの適切なＮ３５５構成要素を含む５μＭ  ＡＮＳとインキュベートすることによって行った。
【０１６９】
アクリロダン（ａｃｒｙｌｏｄａｎ；６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン）修飾のために、組換えタンパク質（１０μＭ）を、５０ｍＭアンモニウム酢酸バッファー（ｐＨ６．９）中の１００μＭアクリロダン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の存在下、４０℃で一晩インキュベートし、遊離アクリロダンはスピンカラムを用いて除去した。Ｎ３５５−アクリロダンに対するペプチドの効果を測定する実験のために、ペプチドを最終濃度１００μＭになるように添加し、対照サンプルには等量のバッファーを添加した。この混合液に、１０分間５０℃の熱ショックを与え、５００μｌまで希釈し、蛍光測定をＰＴＩ蛍光測定器で実行した。サンプルは、ＡＮＳに対しては３５０ｎｍ、アクリロダンに対しては３９０ｎｍで励起させ、発光スペクトルは、４００〜６００ｎｍの間で収集した。このスリット幅は、励起に対しては２ｎｍで、発光に対しては２〜６ｎｍにセットした。
【０１７０】
ＤＥＰＣでのヒスチジン修飾の前に、野生型或いはＨ１２５Ｄ  Ｎ３４−３５５（各８００μｇ）を、バッファーＡ中の２４ユニットの因子Ｘａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）と２５℃で一晩処理し、因子Ｘａを除去するためにＸａｒｅｘ  Ａｇａｒｏｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて、ペプチドを含むＨｉｓ６を除去するためにＮｉ−ＮＴＡアガロースを用いて再精製した。Ｈｉｓ−切断タンパク質は、バッファーＡ中の１２μＭのタンパク質及び２．８ｍＭのペプチドとして、２５℃で一晩、ペプチドＡ（若しくは溶液のみ）と反応させた。遊離ペプチドを除去し、バッファーを、Ｐ１０スピンカラムを用いて、５０ｍＭアンモニア酢酸（ｐＨ６．８）に代えた。遊離Ｎ３４−３５５及びタンパク質−ペプチド複合体の両方を、１ｍＭ  ＤＥＰＣ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）と２５℃で反応させる、若しくは溶液対照としてＥｔＯＨと反応させた。１５〜２０分間インキュベートし、２４０ｎｍでの反応を観察することによって決定されたように、完全なＨｉｓ修飾が得られた[２５]。指示されたように、カルベトキシヒスチジン（ｃａｒｂｅｔｈｏｘｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）は、４００ｍＭヒドロキシルアミンで１５分間、２５℃で処理することによって、ヒスチジンに戻される。
【０１７１】
質量分析法
サンプルは、アセトニトリルと１％  ＴＦＡで飽和したシナピニン酸中、２０μＭ最終濃度でまで希釈した。各サンプルの１〜２μｌを、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  ｇｏｌｄ  ｃｈｉｐに吸収させ、空気乾燥した。質量は、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ）によって測定した。
【０１７２】
結果
ＧＲＰ９４−結合ペプチドは、１８８残基断片内に含まれる
以前、本発明者らは、切り取られたバージョンのＧＲＰ９４（アミノ酸１〜３５５を含む）は、ＶＳＶ主要Ｔ細胞抗原であるＶＳＶ８などの免疫学的に関連のあるペプチドと結合するための完全長タンパク質の能力を説明するのに十分であると証明した。本発明者らはさらに、この活性は、ｐａｎ−ＨＳＰ９０阻害剤であるラディシコール及びゲルダナマイシンによって調節される対象であることを示した[１５]。このペプチド結合部位をさらに位置付けるために、成熟タンパク質の最初の３３アミノ酸を欠損した、より短いバージョンの組換えＧＲＰ９４（Ｎ３４−３５５；図１Ａ）をクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ内で過剰発現させた。この組換えタンパク質は、Ｎ１−３５５の結合曲線と非常に類似した結合曲線でＶＳＶ８と結合し（図１Ｂ）、これは、最初の３３アミノ酸が、ペプチド結合活性には重要ではないことを示している。ペプチド結合部位を含むより小さい断片を定義するために、本発明者らは、Ｎ３４−３５５の１つのトロンビン部位（Ｃ末端側Ａｒｎ２２２）を利用し、Ｎ３４−３５５とペプチドとの複合体はトロンビン切断後、無傷を維持するかどうかを検証した。消化後、２つのバンドがクーマシーブルー染色によって検出可能であり、これらは予想されたＮ末端２２．４ｋＤａ、及びＣ末端１４．６ｋＤａ断片と一致した（図１Ｃ）。断片の割り当ては、Ｎ３４−３５５のＮ末端部に対して（抗Ｈｉｓ６０）、若しくはＣ末端近くの残基２６１〜２７６（９Ｇ１９[１６]）に対して特異的な抗体によって確認した。ＧＲＰ９４−ペプチド複合体は、ＳＤＳに対して耐性であり[１]、ペプチド結合タンパク質断片は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、結合イオジン化ペプチドの放射線活性によって検出できる。トロンビンの非存在下において、非切断複合体に一致する放射線活性バンドが検出可能であった。部分的トロンビン消化の後、正確な分子量である２２．４ｋＤａの付加的な放射線標識バンドが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離後に検出でき、一方、他の１４．６ｋＤａ断片は標識されなかった（図１Ｃ）。従って、これらのデータより、ＧＲＰ９４のアミノ酸３４〜２２２は、ペプチドの結合を維持するのに十分であることが示された。
【０１７３】
ＧＲＰ９４−ペプチド複合体の分子モデリング
本発明者らは、次に以前に公開したデータを利用し[１７][１８]、潜在的ペプチド結合部位のコンピューターモデルを作成した。第１に、本発明者らは、ＨＳＰ９０のＮ末端ドメインの結晶構造（ＰＤＢ  ｆｉｌｅｓ  １ＹＥＲ  ａｎｄ  １Ａ４Ｈ）を用いて、エネルギー最小化をされた、ＧＲＰ９４の高度相同性セグメント（酵母ＨＳＰ９０とマウスＧＲＰ９４の間で５１％の相同性）の予想構造を産生した。第２に、本発明者らは、ＭＨＣクラスＩと関連して決定された（２ＭＨＣ；［９］）抗原性ペプチドＶＳＶ８の既知構造を用いた。第３に、ＧＲＰ９４に結合する場合、ＶＳＶ８の高次構造は、ＭＨＣクラスＩと結合したときのその高次構造と本質的に同様であるという仮定を単純化するために、本発明者らは、ｔｈｅ  ｄｏｃｋｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ＰａｔｃｈＤｏｃｋ[１９]を用いて、潜在的結合部位を予想した。前記アルゴリズムは、リガンド分子と高度にゲノム的形状相補性を有する位置をタンパク質表面で検査し、前記リガンドをこれらの位置にドッキングさせる。そのようなドッキング解法は通常、異なるタンパク質の溝においてクラスターを形成し、この溝における結合は高度な形状相補性を可能にする。加えて、ＶＳＶ８とＭＨＣクラスＩとの原子接触に関する統計学的データを収集し、前記ドッキング解法を評価するために用いた。形状相補性の観点から一番高い評価の解法、及び統計的評価を選択した。
【０１７４】
ペプチド結合部位はラディシコール結合ポケットとは区別される
７つの最適な解法（ソリューション）は、２つの潜在的ドッキング部位にマップされた。１つの部位は、ラディシコール結合ポケットと部分的に一致し（図２Ａ）、前記タンパク質において最大の溝であった。以前のデータによるとラディシコール及びペプチドが同時に結合できるので[１５]、この部位は考えられそうもない。従って、本発明者らは、ラディシコールには結合しない変異がまだペプチドに結合できるかどうかを検討した。酵母ＨＳＰ９０のＮ末端ドメインとラディシコールとの間の複合体の決定構造[１８]、及びＨＳＰ９０とＧＲＰ９４の間の類似性[１９]に依存して、本発明者らは、残基Ａｓｐ１２８とＧｌｙ１３２を同時に、それぞれＡｓｎとＡｌａへ変異させた。ＨＳＰ９０におけるＡｓｐ９３（ＧＲＰ９４におけるＡｓｐ１２８に対応する）は、ラディシコールと重大な水素結合をなし、Ｇｌｙ９７は阻害剤に対して固くパッキングし、前記結合ポケットの重要な位置であるヘリックス４位に対して役立つ[１７、１８、２０]。ＨＳＰ９０のＤ９３Ｎ変異体は、ＡＴＰとは結合せず[２１]、ＧＲＰ９４の二重変異体は、ラディシコールと結合できないと予想された。組換えＮ３４−３５５  Ｄ１２８Ｎ、Ｇ１３２Ａ変異体（ＲａｄＲ）は、可溶性であり、ほぼ単量体であり、野生型タンパク質のように、抗体９Ｇ１０に対する構造感受性エピトープを発現した。前記ＲａｄＲ変異体がラディシコールに結合するかテストするために、本発明者らは、２つの機能的テスト（詳細は[１５]を参照のこと）である、９Ｇ１０エピトープの欠損、及びネガティブブルーゲルにおいて移動性を増加した小型高次構造の獲得を用いた。両方の変化は、ラディシコール結合に対するタンパク質の高次構造変化に影響を及ぼすように見られた[１５]。結果生じた変異体は、９Ｇ１０エピトープの連続してさらすこと（データは示さず）、及び小型高次構造の獲得の欠損によって判断されたように、ラディシコールでの処理に屈折性を有した（図３Ａ）。ラディシコール結合の欠損にも関わらず、ＷＴタンパク質と比較して明らかな会合定数における少しの減少のみで、前記ＲａｄＲタンパク質はペプチドと効果的に結合した（図３Ｃ）。ラディシコール結合の欠損と一致して、ＲａｄＲ変異体のペプチド結合活性は、ラディシコールでの前処理によって阻害されないが、野生型Ｎ３４−３５５の活性は著しく阻害された（図３Ｂ）。本発明者らは、Ｎ３４−３５５のペプチド結合部位がラディシコール結合部位と異なる[１５]だけでなく、阻害剤結合の消滅はペプチドへ結合する能力には影響を与えないと結論付けた。
【０１７５】
ペプチド結合は２つの疎水性プローブに対する結合部位の環境に影響を及ぼす
他の潜在的ペプチドドッキング部位は、βシートの反対側にあり、ここには８つのβシートからできたサドル様表面がある。このサドルに対するサイドバリアは、２つのループ（Ａｓｐ１７０〜Ａｒｇ２２２、及びＬｙｓ１１９〜Ａｓｎ１２２）であり、モデル配列の末端であるストランドＨ（Ｖａｌ２６０〜Ｓｅｒ２６３）のプラス部分によって提供される（図２Ｂ）。４つの最高の評価解法は、ＶＳＶ８がこのサドル内にうまくはまると予想した（図２Ｂ）。ペプチドは、ストランドＥ〜Ｈを横切り、βシートの長軸に相対して約７０度の角度ではまり、表面接触のほとんどはβシートとであった。
【０１７６】
この推定上のペプチド結合部位は、深い疎水性ポケットと近接している（図４）。へリックス及びストランドＨを導いているループからと同様に、ストランドＥ、Ｆ，Ｇ、及びＨからの疎水性残基は、このポケットを形成すると予想される。βシートのエッジストランド（Ｈ）と前述のループは、このポケットへの入り口の一部を形成し（図４Ｂ）、疎水性色素ｂｉｓ−ＡＮＳの結合部位を導くと示された[２２]。従って、本発明者らは、このポケットは、ＧＲＰ９４に結合すると報告されていた[１２、２２]、例えばｂｉｓ−ＡＮＳ、ＡＮＳ、アクリロダン、及びＮｉｌｅ  Ｒｅｄなどの様々な疎水性プローブに適応できると推測した。ＡＮＳが疎水性環境において結合されると予想された[２３]ように、ＡＮＳ標識化Ｎ１−３５５の発光スペクトルは、４７４ｎｍ周辺で最大になる（図５Ａ）。ＡＮＳ標識化Ｎ１−３５５をペプチドＡとインキュベートした場合、ＡＮＳ蛍光の強度は減少し、その発光最大値はわずかにブルーシフトであった（図５Ａ）。そのような減少したＡＮＳ傾向は、直接的に若しくは構造変化を介して、フルオロフォアの環境に影響を及ぼす、ペプチドＡ結合と一致した。或いは、ＡＮＳ及びペプチドが同じ結合部位に競合した場合、ＡＮＳの放出に起因するものになるであろう。後者の説明は、ＡＮＳ発光のブルーシフトに起因して外されるので、本発明者らは、ペプチドは疎水性ポケットに近接して結合するという意見に賛成する。
【０１７７】
予想されたようにペプチドが結合した場合、他の疎水性プローブの環境にも影響を及ぼすであろう。ストランドＧは、Ｎ１−３５５中に単一のシステイン残基（Ｃｙｓ１１７）を有しており、この側鎖は前記疎水性ポケットに方向を向いているので（図４）、本発明者らは前記タンパク質をＣｙｓ−特異的ナフタレン誘導体アクリロダンで修飾した［１２］。アクリロダンは水溶性溶液中では非常に低量子収量であるので、その蛍光は、チオールとの反応によって著しく増加し［２４］、次にその蛍光は、疎水性のその環境に対して非常に感受性を有していた。図５Ｂに示されたように、３９０ｎｍで励起した場合、アクリロダン−修飾Ｎ１−３５５は、フルオロフォアが極度な疎水性の環境にいた場合に予想されたように、４７４ｎｍ周辺で最大の発光をした。遊離アクリロダンは、５２０ｎｍで最大値を示した。６Ｍグアニジン塩酸塩と共役したＮ１−３５５−アクリロダンの変性は、４７４ｎｍでの蛍光を消滅し、６Ｍグアニジン中の遊離アクリロダンと同じ発光最大値を生じ、これは観察された蛍光はタンパク質の三次構造に依存することを示している。共有結合性修飾であると予想されたように、変性Ｎ１−３５５−アクリロダン共役の蛍光強度は、遊離アクリロダンに比べて著しく高かった（図５Ｂ）。これらのスペクトル特性は、Ｃｙｓ１１７ｎｉ共有結合的に結合した場合、アクリロダンが疎水性ポケットに位置付けられるという予想を実現させる。従って、Ｎ１−３５５のアクリロダン修飾は、分子変化の検出用に定義された蛍光プローブを提供する。
【０１７８】
アクリロダンでの修飾がＮ１−３５５のペプチド結合に影響を及ぼすかどうかをテストするために、本発明者らは、アクリロダン−修飾タンパク質、及び非修飾タンパク質を、飽和量のイオジン化ＶＳＶ８と共にインキュベートし、それぞれに対するペプチド結合を測定した。アクリロダン−共役タンパク質は、前記非修飾タンパク質のように、本質的にはペプチドを結合でき（図５Ｃ）、これはアクリロダンが結合活性を干渉しないことを示している。重要なことには、アクリロダンの蛍光は、ペプチドの存在下で部分的に消光された（図５Ｄ）。これらのデータは、図２Ｂのモデルと十分一致し、ペプチド結合部位は異なってはいるが、前記疎水性ポケットと近接していると予想された。しかしながら、これらのデータは、ペプチド結合がアクリロダンと近接することに起因する消光と、より離れた部位へのペプチド結合の結果としての高次構造変化に起因する消光とを区別できない。しかしながら、本発明者らは以前、ペプチド結合は阻害剤結合と同様な構造変化を誘導せず、全体的な構造変化と相反して、Ｎ３５５のプロテアーゼ感受性も変えない（データは示さず）ことを示した［１５］。これは、以下に示したデータ（表１）と共に、Ｃｙｓ１１７に近接したペプチド結合が好ましいことを示している。
【０１７９】
ペプチド結合はヒスチジン残基の修飾に対して感受性を有している
ペプチド結合部位を定義するための第３のアプローチは、ペプチド結合がｐＨ感受性であるという観察に由来している（図６Ａ及び参考文献［１］）。結合はｐＨ７．２以上で
阻害され、ｐＨ６．０周辺で刺激される。加えて、結合は、イミダゾールに感受性を有しており、６ｍＭイミダゾールの存在下でペプチド結合が半分に減少する（図６Ｂ）両方の観察によって、ヒスチジン残基がＧＲＰ９４によるペプチド結合に関与していることを示された。ジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）は、特定の条件下、高度に特異的な方法で、ヒスチジンのイミダゾール環をＮ−カルベトシキレート化し（Ｎ−ｃａｒｂｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｓ）［２５、２６］、従って、ヒスチジンの役割を定義する場合に有用である。エタノール溶液のみは阻害作用がない一方で、Ｎ３４−３５５のＤＥＰＣ処理（Ｈｉｓ６タグの切断後）は、阻害剤であるラディシコールと同じ位効果的に、前記タンパク質のペプチド結合活性を消滅させる（図６Ｃ）。ヒドロキシルアミン（ＨＡ）処理は、ＤＥＰＣ修飾タンパク質の活性を回復し（図６Ｃ）、他のアミノ酸ではなく、修飾されたＨｉｓ残基のみが、活性の変化に重要であった。
【０１８０】
Ｈｉｓ１２５はペプチド結合に重要である
Ｎ３４−３５５タンパク質は４つのＨｉｓ残基を有しており、１２５位、１９４位、２００位、及び３５３位である。前記モデルに基づいて（図２Ｂ）、Ｈｉｓ１２５は、ペプチド結合部位に最も関与しそうなヒスチジン残基であると判断された。従って、本発明者らは、Ｈｉｓ１２５を、Ａｓｐ（電荷が変わる）に、或いはＴｙｒ（イミダゾール環がフェノール環に置換する）に変異させた。変異Ｈ１２５Ｄタンパク質は、ペプチド結合活性を有さず、Ｈ１２５Ｙタンパク質は部分的な活性のみを有していた（図７Ａ）。結合反応が非常に遅い速度［１５］であり、従って平衡ではなく、ヒルプロットはその親和性を計算するためには用いることができないが、分数占有プロットは、会合定数を測定するために用いることはできる。野生型及びＨ１２５Ｙに対して計算された分数占有は、ｓｕｐｅｒ−ｉｍｐｏｓａｂｌｅであり（図７Ｂ）、野生型とＨ１２５Ｙタンパク質の会合定数の間に著しい違いは見られなかった。Ｈ１２５Ｙ変異体の飽和レベルは野生型の飽和レベルの約０．６であるので、この解析は、Ｈ１２５Ｙ変異体が、活性割合による結合によってというよりも、前記タンパク質の活性割合に影響を及ぼすことを示唆していた。結合活性の欠損は、前記変異タンパク質の全体的な誤った折り畳みに起因するものではない。第１に、両者は可溶性タンパク質として精製され、野生型タンパク質と類似のクロマトグラフィー特性を示した。第２に、Ｈ１２５Ｄ及びＨ１２５Ｙの両方は、モノクローナル９Ｇ１０エピトープを発現した（データは示さず）。第３に、図７Ｃにおけるネガティブゲル移動テストによって示されたように、Ｈ１２５Ｄは、阻害剤であるラディシコールへ結合し、その高次構造を変えることによってそれに反応するためのその能力を保持した。同様のテストによって、Ｈ１２５Ｙ変異体の約半分はラディシコールの非存在下でさえ、速く移動する高次構造内に見出されることが示されており、これはＨ１２５Ｙ変異体は、活性タンパク質の割合を減少するという結論を支持している。しかしながら、正確な移動度（約５０％）を示すこのタンパク質の集団は、ラディシコール結合誘導性構造変化できる能力があると明らかになった（図７Ｃ）。この集団の相対的な存在量は、Ｈ１２５Ｙのペプチド飽和レベル（野生型のペプチド飽和レベルの約０．６、図７Ａ）と一致している。従って、Ｎ３４−３５５の１２５位のチロシンは、活性タンパク質の割合が減少する間、ペプチド結合それ自体は妨げない。ヒスチジン及びチロシンと対照的に、１２５位のアスパラギン酸は、ペプチド結合を消滅するので、本発明者らは、１２５位残基の性質はペプチド結合に重要であると提案し、これは構造モデルの強力な予想を確認するものである。
【０１８１】
Ｈｉｓ１２５は結合ペプチドに物理的に近い
上述したデータによると、Ｃｙｓ１１７の環境はペプチド結合に変化をもたらし、ＤＥＰＣによる若しくは電荷変化変異によるＨｉｓ１２５修飾はペプチド結合を消滅することが示されているけれども、それらは高次構造変化の伝達の観点で説明され、従って物理的関連は形式上示していない。従って、本発明者らは、ペプチド保護実験においてＤＥＰＣ修飾手順を用いた。ＤＥＰＣ修飾の程度は、ペプチド結合Ｎ３４−３５５及びペプチドなしＮ３４−３５５（Ｈｉｓ６タグが除去された所から）の間で比較され、ペプチドがモデル通りに結合された場合を推測すると、修飾からＨｉｓ１２５を保護するべきである。前記タンパク質は、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって解析された（表１）。各Ｎ−カルベトキシル化によって、修飾されたＨｉｓ残基当たり７２Ｄａが付加される。ＤＥＰＣで修飾されたＮ３４−３５５の質量は、非修飾タンパク質と比較して、２８９Ｄａに増加し、これは全てのＨｉｓ残基の修飾から予想された通りである。Ｈｉｓのみが修飾されたことは、ヒドロキシルアミンでの後処理による質量増加の可逆性によって示された［２６］。Ｎ３４−３５５は、ＤＥＰＣでの修飾前にペプチドＡｄｅ飽和され、得られた質量は、ペプチドの非存在下の場合以下の７３Ｄａであり（表１）、これは１つの残基がＤＥＰＣ修飾から保護された場合に予想された通りである。ＤＥＰＣ修飾タンパク質のタンパク質分解性断片の質量分析により、保護残基はＨｉｓ１２５であると確認された（データは示さず）。Ｈ１２５Ｄ変異体が同様な方法で用いられた場合、その質量は、ペプチドが存在の有無に関わらず、ＤＥＰＣでの修飾後２１１〜２１５Ｄａ増加し、これは３つのＨｉｓのみを有し、ペプチドに結合できないタンパク質から予想された通りである（表１）。これらの修飾実験によって、４つのヒスチジンの修飾であり、Ｈｉｓ１２５のみがペプチド結合に関与しており、これは前記ペプチドに物理的に関与していることが立証された。
【０１８２】
【表１】
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【０１８３】
議論
ＧＲＰ９４のシャペロン活性、若しくはペプチド特異的Ｔ細胞反応を刺激するその能力を理解するための骨格としては、どのようにそれがペプチドに結合するかを解析することである。我々の以前のデータ［１５］と共に、本発明者らは、シャペロンＧＲＰ９４のペプチド結合部位は、Ｎ末端ドメインの大きな溝内で、ヌクレオチド／ゲルダナマイシン／ラディシコール結合部位の反対側に位置付けられていることを示した。このペプチド結合部位は、コンピュータードッキングアルゴリズムによって予想され、以下の実験的観察はその予想からなっている。ａ）１〜３３及び２２３〜３５５の残基は、結合に使用しない場合、結合ペプチドの保持に対して不必要である、ｂ）ペプチド結合は天然では疎水性ではなく、むしろこの部位の親水性性質に一致している、ｃ）疎水性ポケットに位置付けられたＣｙｓ１１７は、ペプチド結合によって影響を受けるが、ペプチド結合を阻害することなく共有結合的に修飾され得る、ｄ）阻害剤であるラディシコールに対する結合部位の変化はペプチド結合を妨げない、ｅ）１２５位残基の性質は、ペプチド結合にとって重要であり、Ｈｉｓ−１２５は、ペプチドが結合された場合、ＤＥＰＣでの修飾から保護される、ｆ）Ｎ１−３５５における他の３つのヒスチジンは関与してないように見える。
【０１８４】
Ｈｉｓ１２５に対するＡｓｐの置換は、前記タンパク質のペプチド結合活性を消滅するには十分である。ペプチド結合を減少或いは消滅した変異体は結合ポケットの外側に位置し、タンパク質高次構造に影響を及ぼすように作用する一方、本発明者らは、ペプチドが結合した場合、小分子ＤＥＰＣによる修飾からの保護のため、Ｈｉｓ１２５及びペプチドの間の物理的関連を示した。従って、本発明者らは、Ｎ末端ドメインの湾曲したβシートが、少なくともｉｎ  ｖｉｔｒｏではこのシャペロンのペプチド結合部位であり、単なる調節部位ではないと提案する。突然変異によるアミノ酸のより広範囲な調査、及び結合部位の範囲をマップするための他の生化学的方法が進行中である。
【０１８５】
コンピュータ生成モデルがペプチド関連性のモードを予想する時も正しい場合、結合は、完全長のペプチドと接触して溝の軸に沿ったものであり、これはペプチドとＭＨＣクラスＩタンパク質の溝との相互作用を暗示するものである。提案された結合部位のサドル様配置は、ＧＲＰ９４結合ペプチドが前記溝の軸に沿って‘スライド’することを可能にし、これはＶＳＶ８は、真ん中の８アミノ酸がＶＳＶ８配列であるペプチドのＶＳＶ１９と同様の反応速度で結合するという観察を明らかにするものである。結合部位のこの観点は、同様の親和性を有して、８ｍｅｒ〜４０ｍｅｒの異なる長さのペプチドと結合するＧＲＰ９４の能力も説明する［１、１３、１５］。
【０１８６】
シャペロンは一般的に疎水性ペプチドを認識すると考えられているが（実際、ＨＳＰ７０ではそうである）、ＧＲＰ９４によって認識されるペプチドの特徴は、異なるように観られる。ここで同定されたＧＲＰ９４溝は、塩基性側鎖（リシン及びヒスチジン）、及び疎水性側鎖をほとんど持たないヒドロキシル性側鎖（例えばスレオニン）に沿っている。本発明において用いられた２つのバインダーペプチドも、完全に親水性であり、それらの結合はｐＨに対して感受性を有しており、高塩濃度で解離した［１５］。従って、少なくともこれらのペプチドの結合は、疎水性ではなく。極性及び静電気的相互作用によって決定されるようである。この観察も、Ｈｉｓ１２５変異体の性質と一致しており、これは、イミダゾール環のＴｙｒ側鎖での置換は部分的結合を可能にし、Ａｓｐでの置換は完全に結合を阻害したように、結合に影響を及ぼした。
【０１８７】
ペプチド結合部位に対する床を形成するβストランドは、ラディシコール結合ポケットとは分離している。前記ドメインの中心にあるβシートは、Ｎ末端ドメインの両方の活性において役割を果たしているように見える。これは、このβシートのストランドＦに対して、ここに明らかに示されている（図４Ａ）。これは、少なくとも１つの残基であるＡｓｐ１２８を含み、この側鎖はラディシコールに向けられており、ラディシコールへの結合に重要であり、これはＨＳＰ９０との相同性から予想された通りであり［１８］、この研究においても直接的に示されている。同じストランドＦは、Ｈｉｓ１２５も内蔵し、ペプチド結合におけるこの中心的役割は、ここに説明されている。それらは近接しているにも関わらず、阻害剤と接触するこのストランド側の残基の置換は、ペプチド結合を有する前記すとランドの別側における接触には著しく影響せず、その逆もまた同じである。本発明者らによると、ラディシコール−屈折変異体は、ペプチドと結合することができ、ペプチド結合における変異はラディシコールに対してまだ正常に反応することが示された。ペプチド結合は、ラディシコールの結合によって阻害され得るが、前記阻害剤はその結合部位を最初に占有しなくてはならない［１５］。これは、ラディシコールの結合は、βシートを横切る或いはペプチド結合溝を変えるようなより間接的な、一方向性の変化を伝達する。
【０１８８】
ＨＳＰ９０の結晶構造は、ゲルダナマイシン／ラディシコール／ＡＴＰの存在下及び非存在下の両方で解析され、構造におけるその違いは、ヌクレオチド部位の占有によって誘導された高次構造変化を定義するのを助ける［１７、１８、２０、２９］。２つの形態は、全部で約３５残基である、３つのらせん体及びループの点で異なり、これらの大部分はヌクレオチド結合ポケットの増強を可能にする若しくは抑制するものである。ＧＲＰ９４の対応する領域は、アミノ酸１３５〜１７４である（図４Ａ）。ゲルダナマイシン或いはラディシコールによるペプチド結合の阻害を説明するような、βシートにおける明らかな違いはない。従って、観察された阻害は、微妙の変化に起因する、若しくは１３５〜１７４領域から前記分子の反対側までの構造変化のより間接的な伝達に起因するものである。
【０１８９】
ＧＲＰ９４のペプチド結合部位の同定は、それらはペプチドに結合すると報告されていたので、全てのＨＳＰ９０タンパク質に直接関連しているが、それらの結合部位は未だ一つもマップされていない。Ｓｃｈｅｉｂｅｌらは、酵母ＨＳＰ９０のＮ末端２１０アミノ酸は、ゲルダナマイシン−及びＡＴＰ−感受性で［３０］、ペプチドに結合するのに十分な単量体ドメインを形成することを示し、それはここに記載されたような最小ＧＲＰ９４コンストラクトによく似ている。Ｎ末端ドメインへの負に電荷したドメインの付加は、特異性に影響を及ぼすことなく、ペプチド結合親和性を増加する［３１］。酵母ＨＳＰ９０とマウスＧＲＰ９４との間の別の類似点は、ペプチド結合の性質が明白に非平衡であることである（［１５、３１］及び本発明）。サドル様結合部位に寄与する残基の比較によって、Ｈｉｓ１２５は全てのＨＳＰ９０を欠損し、ほとんどのＨＳＰ９０配列はＴｈｒに置換されていることが示された。ＨＳＰ９０の１〜２１０ドメインは、より長いペプチドより緩くＶＳＶ８に結合するため［３１］、ＨＳＰ９０のＮ末端部位は、ペプチド結合においてＧＲＰ９４ほど効率的ではない、若しくはそのペプチド特異性が異なる可能性がある。
【０１９０】
ＧＲＰ９４によるペプチド結合を他のペプチド結合部位と比較することは有益である。ＨＳＰ７０タンパク質において、ペプチドは、βサンドイッチドメインからのループによって描かれたβシートの先端にも結合する［３２、３３］。このペプチドは、３つのβストランドに対して垂直に接触し、その結合溝は疎水性アミノ酸及び極性アミノ酸の両方を有しているが、電荷残基は有していない［３２、３３］。相対的に、ＧＲＰ９４ペプチド溝は広く、ほとんどの極性残基を作り出し、前記ペプチドは、大体３つのストランド（ストランドＧ、Ｆ、及びＨ）の軸に沿って接触している。ＧＲＰ９４のペプチドとの相互作用は、ＭＨＣタンパク質と共通したいくつかの特徴を有している。ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩの両方において、会合定数は低く、オフ率は非常に遅い。ＧＲＰ９４‐ペプチド複合体は、非常に安定で、ＳＤＳに対してさえも耐性を有し、多くのＭＨＣ−ペプチド複合体のようである［３４］。ＫｂクラスＩタンパク質との複合体の場合、この研究に用いられた同じＶＳＶ８ペプチドは、３−ストランドβシートを横切った約４５０位に位置し、ＧＲｐ９４結合溝であると提案した形態（トポロジー）と同様な形態である２つのαらせんの間に束縛された［９］。面白いことに、βシートの別面上の残基と阻害剤であるゲルダナマイシン或いはラディシコールとの重要な接触をもたらすストランドＦのように、ペプチドと相互作用するＭＨＣクラスＩの同じ３つのβストランドは、前記シートの別面上に、前記タンパク質のβ２ｍサブユニットとの重要な接触も提供する［３５］。ＭＨＣアリルに依存して［３６］、β２ｍにおける変異は、そのような接触を変え、βシートの別面上に負荷したペプチドに影響を及ぼすことができる［３７］。
【０１９１】
ＭＨＣ−ペプチド複合体は、次に続くＴ細胞受容体との接触が到達し利用できるように、結合ペプチドの１面を残すように設計される。一方、ＨＳＰ７０タンパク質において、結合ペプチドは、可逆的なラッチとして作用するαへリックスドメインによって、所定の位置に埋められ、ロックされ、その動きは、ヌクレオチド誘導性構造変化によって調節される［３３］。本発明のデータは、ＧＲＰ９４−ペプチド複合体がモデルのどちらか一方に似ているかどうかを決定するには十分でない。Ｎ末端ドメインの少なくとも１つの活性に必要とされ、Ｎ末端ドメインへの阻害剤の結合によって誘導される高次構造変化に関与するため［１５］、第２のＧＲＰ９４の酸性ドメインはペプチドのロッキングシステムを提供する可能性がある。最近公開されたＧＲＰ９４のＮ末端残基４８〜３１６の構造［３８］（その論文で用いられた命名法では残基６９〜３３７）は、結合ペプチドを束縛するように作用する明らかな部分はないと示していた。一方、酸性ドメインは、結晶構造では不規則であり、従って、ＨＳＰ７０タンパク質の長いへリックスと同様に、ペプチド結合ポケットへの接近を潜在的に制御できる［３３］。
【０１９２】
この研究で同定されたペプチド−結合部位は、ＧＲＰ９４のＴ細胞刺激活性において重要な役割を演じる。Ｎ末端ＧＲＰ９４断片は抗原提示細胞と結合し、Ｔ細胞を活性化できると示したデータと合わせて［３９］、本発明者らのデータは、免疫学的に関連するペプチドはこの部位で結合すること、及びＧＲＰ９４のＮ３４−３５５断片はＴ細胞のペプチド特異的活性の原因となるように見えると示していた。この部位はヌクレオチド部位や疎水性ポケットに結合するリガンドによって制御され得るので、この部位へのペプチドの結合は、まだ発見されていない細胞内補助因子によって制御され得る。
【０１９３】
【表２】
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【０１９４】
【表３】
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【実施例２】
【０１９５】
小胞体シャペロンＧＲＰ９４はマウス原腸形成及び中胚葉誘導に重要である
小胞体シャペロンＧＲＰ９４は、遍在的に発現されるが、クライアントタンパク質はほとんど知られておらず、それらは重要な発生チェックポイントには関与していない。マウスＧＲＰ９４遺伝子の標的破壊によって、それは胚発生において重要な機能を有していることが示された。Ｇｒｐ９４−／−胚は、発生の卵筒段階である、妊娠７日目に子宮内で死んだ。それらは、その段階で正常に生じる主な分化イベントである、中胚葉、原始線条、及び原始羊膜腔を発生することに失敗し、中胚葉誘導に関与する重要な遺伝子を発現しない。発生上の欠損は、母系ＧＲＰ９４の希釈に起因するものではなく、前記シャペロンの活性を反映しているようである。Ｇｒｐ９４−／−細胞は、それらの野生型対応物と同じペースで分裂した。さらに、低グルコース張力による既知のＧＲＰ９４の転写性制御にも関わらず、変異ＥＳ細胞は、低グルコース培地において野生型と同様に増殖した。一方、変異細胞は、血清欠乏、及びカルシウム恒常性の摂動に対してさらに感受性を有していた。これらのデータは、ＧＲＰ９４の必要条件は非常に選択的であると示している。本発明者らは、中胚葉誘導に重要であるいくつかの分泌或いは細胞表面タンパク質の適切な発現はＧＲＰ９４に依存しており、細胞−細胞相互作用が胚細胞の適切な運命を特定する場合、このシャペロンの非存在下ではこれらの提示が非効率的である。
【０１９６】
分化及び器官形成のほとんどは天然代謝性ストレス反応が関与していると考えられているけれども、哺乳類発生の間のＧＲＰ９４発現に関してほとんど知られていない。ＧＲＰ９４転写は、卵母細胞及び２細胞期胚を含んで、遍在的に見出されている［６］。タンパク質レベルで、未分化Ｆ９細胞には検出されていないが、一方、主要なＥＲストレスタンパク質であるＧＲＰ７８／ＢｉＰは、構成的に発現されていることが見出されている。しかしながら、Ｃａ＋＋イオン透過孔によって誘導されたストレスに対して、ＧＲＰ９４及びＧＲＰ７８タンパク質両方の発現は、生体分化細胞の場合と同様に誘導された［６］。ＧＲｐ９４であるように思われるが厳格には同定されていない、１００ｋＤａタンパク質は、早ければ４細胞期の発生中のマウス胚の細胞上に発現されていることが示された［７］。卵筒段階で７から８．５日胚では、発現は胚性及び胚体外外胚葉において最も高く、内臓内胚葉においてはより低くなる［８］。さらに、原始線条から現れる中胚葉細胞は、陽性であった［７］。後期（Ｅ９．５〜１３．５）では、器官形成の間、ＧＲＰ９４は、構成的に発現され、発生中の心臓、神経上皮、及び外胚葉組織の表面内に最も顕著に局在していることが見出された［９］。これらの発現パターンは、発生中の胚におけるエネルギー代謝に関連しているとしばしば考えられており、ＧＲＰ９４発現は、ストレスタンパク質と同様に、その機能を最も要求されている時期と場所で最大である。
【０１９７】
ＧＲＰ９４の重要な機能は、いくつかの遺伝的方法によって研究されていた。アンチセンス［１０］若しくはＧＲＰ９４レベルのリボザイム仲介性欠乏［８］は、ＧＲＰ９４及びＧＲＰ７８／ＢｉＰタンパク質両方に影響を及ぼし、ストレス条件によるそれらの誘導が阻害され得る場合、それらの基本的な発現は変わらず、細胞成長と増殖を支持するには十分である。ＧＲＰ９４は、多くのその転写的制御因子をＧＲＰ７９／ＢｉＰと共有している［１１］。ＧＲＰ９４欠損マウス前Ｂリンパ球株である７０Ｚ／３は、リポ多糖類（ＬＰＳ）刺激に対する感受性に基づいてＲａｎｄｏｗとＳｅｅｄによって単離され［１２］、培養で増殖可能であることが示された。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）において、ヌルｇｒｐ９４変異体は、前記タンパク質が植物発生において重要であることを示している［１３］。ナズナ（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ）変異体及び７０Ｚ／３細胞株の両方は、ＧＲＰ９４の欠損は細胞致死ではなく、むしろ選択的な過程に影響を及ぼすことを遺伝的に示した。これらの研究及び酵母からＧＲＰ９４の非存在は、ＧＲＰ９４発現と複数の細胞性（ｍｕｌｔｉ−ｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ）との間の相関に一致する。
【０１９８】
上述の結論は、ＧＲＰ９４を他のほとんどのシャペロンと区別し、そのクライアントタンパク質が少数である、といったＧＲＰ９４の別の例外的な特徴に恐らく関連している。ＧＲＰ９４欠損株において、表面発現するものであるが、インテグリン及びトール様受容体ではないタンパク質が影響を受けることが示された［１２］。同様に、本発明者らは、免疫グロブリン生合成は、ＧＲＰ９４の薬理学的な阻害に対して感受性を有しているが、ＭＨＣクラスＩの生合成ではそうではない。それらの折り畳みの間にＧＲＰ９４が関連していると知られている分泌及び膜タンパク質の間では、同定可能な共通の構造因子はない。従って、タンパク質構造に基づいてＧＲＰ９４基質を予想することは現在不可能である。ＧＲＰ９４の明らかな選択性のため、マウスにおいてＧＲＰ９４発現を除去することの影響を決定することが重要であった。
【０１９９】
本発明者らは本明細書において、マウス組織におけるその遍在性発現にも関わらず、ＧＲＰ９４に対するマウス遺伝子を標的化することは、重大な発生チェックポイント、すなわち中胚葉の誘導における特異的な欠陥を有する胚性致死な表現型を生じると報告する。
【０２００】
以下の材料及び方法は、実施例２の実施を容易にするために提供される。
【０２０１】
ｇｒｐ９４のクローニング及びマッピング
Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら［４１］は、１０番染色体に位置する１つのマウスＧＲＰ９４コード化遺伝子が存在するが、部分的なゲノム配列が利用可能であることを示した。本発明者らは、マウスｇｒｐ９４のエクソン／イントロン構造をマップするためのガイドとして、ブタｇｒｐ９４遺伝子［４２］を用いた。マウスＧＲＰ９４の重複部分をコード化する９つのファージを、Ｓｖ１２９ゲノムλファージライブラリー（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）から単離し、それらのｇｒｐ９４遺伝子含有量をエクソンＰＣＲ解析によってマッピングした。約２３ｋｂのそれぞれのゲノムＤＮＡを有するファージ（データは示さず）は、標的ベクターを構成するために用いた。
【０２０２】
標的コンストラクトは、ベクターｐＰＮＴ１内に構築した［４３］。エクソン８と４、及びエクソン８の間のイントロンから伸長する８ｋｂのＥｃｏＲＶ断片を、右腕として用いた。左腕はＰＣＲ増幅された完全な配列であった。これは、５’ＵＴＲから始まりエクソン３内部で終わる、１．５ｋｂのｇｒｐ９４を含む。この２つの腕（アーム）は、転写の方向とは逆方向に挿入されたネオマイシン耐性カセットによって分離した。これは停止コドンを形成し、成熟ＧＲＰ９４タンパク質の７８１アミノ酸の６１のみ（＋ベクター由来の付加的なアミノ酸３つ）を含むタンパク質産生が予想される。前記標的コンストラクトであるｇｒｐ９４配列の上流には、ネガティブ選択のためにチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を含有した。
【０２０３】
ｇｒｐ９４遺伝子標的化マウスの生成
前記標的コンストラクトを、Ｃ１  ＥＳ細胞（Ｄｒ．Ｂ．Ｈｅｎｄｒｉｋｓｏｎ（ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｃａｇｏ）から寄贈された）へ電気穿孔し、ガンシクロビル及びＧ４１８の両方に対して耐性なクローンを単離し、増殖させた。１２の正確に標的化したクローンを同定し、これは、非標的化ＥＳクローンの約１／４の割合に相当する。これらのクローンの６つを、さらに増殖させ、偽妊娠Ｃ５７Ｂ１／６  ＷＴ雌マウスからの胚盤胞に注入した。前記胚盤胞を移植し、その雌マウスはある期間まで成長させ、キメラ動物を作成した。次に、７５％以上の茶毛を有する７匹のオスキメラ子孫を、ＷＴ  Ｃ５７Ｂ１／６雌マウスと交配し、結果生じた子孫の遺伝子型を同定した。ヘテロ接合体を、Ｆ１世代を生むために交雑（ｉｎｔｅｒ−ｃｒｏｓｓ）した。破壊された遺伝子の生殖系列伝達を有する２つの独立マウス系統を派生させた。両系統の表現型は、区別不可能であるので、ここで報告したデータは、系統１８から得られたものである。このデータは、少なくとも６世代に亘って、Ｃ５７Ｂ１／６バックグラウンドと戻し交雑されたマウスからのものである。
【０２０４】
標的化マウスからのＥＳ細胞株の生成
ｇｒｐ９４−／−交雑からのＥＳ細胞を、３０−１／２"ゲージ針を用いてＭ２培地（Ｓｉｇｍａ）でＥ３．５妊娠雌の卵管を流すことによって単離した。胚盤胞は、完全ＥＳ培地（ＤＥＭＥ、２０％ＦＣＳ、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐグルタミン、β−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、Ｈｅｐｅｓ。１０００μ／ｍｌＥＳＧＲＯ）中でゼラチンコーティングした組織培養ディッシュに播種した。内部細胞塊を４日後に単離し、照射されたマウス胚性線維芽細胞上に増殖させた。
【０２０５】
細胞増殖及び生存アッセイ
増殖アッセイは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて実行した。増殖アッセイを実行する前に、細胞を２週間、異なるレベルのグルコースを含む培地中で増殖させた。無グルコースの培地、及び高グルコース培地（４．５ｇ／Ｌ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入した。いくつかの実験において、細胞は、１ｍＭＥＧＴＡの存在下で増殖させ、その増殖は細胞分裂の数で定量化した。血清欠乏実験として、６０％コンフルエンス或いはそれ以上で既知数の細胞をプレーティングし、前記細胞がゼラチンコーティングプレートに適切に接着したら、増殖培地を無血清培地に交換し、そのプレートを洗浄し、残った接着細胞をトリパンブルー（Ｆｉｓｈｅｒ）除去でアッセイした。剥離した細胞は、ほとんどがトリパンブルー陽性であり、再びプレーティングしても接着できなかった。タプシガルジン感受性アッセイのために、細胞培養を、０．２５〜３μＭの薬剤濃度で３〜２４時間処理した。
【０２０６】
免疫組織化学及びホールマウント原位置ハイブリッド形成
脱落膜膨張（Ｄｅｃｉｄｕａｌ  ｓｗｅｌｌｉｎｇｓ）を、子宮筋組織から単離し、４℃で一晩、４％パラホルムアルデヒド内で固定した。この組織をパラフィンに包埋し、５〜７μｍで切片化し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｎｔ  ｓｌｉｄｅｓ（Ｆｉｓｈｅｒ）上に載せた。免疫組織化学法のために、このスライドを脱蝋して、Ｈ２Ｏ２で固定し、１０ｍＭクエン酸（ｐＨ６．０）で１０分間煮沸し、９Ｇ１０（Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ）での抗体検出の前に室温に冷却した。Ｈ&Ｅ染色のために、スライドは脱蝋し、再水和し、Ｈａｒｒｉｓ’  ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ）で４分間染色し、水道水できれいになるまで洗浄し、脱色するために１％酸アルコール（７０％エタノールに１％  ＨＣｌ）に浸し、流水で洗浄し、１００％エタノールに浸した。次にスライドを３〜４回、エオシン−ｐｈｌｏｘｉｎｅ（Ｆｉｓｈｅｒ）に浸し、脱水し、キシレン（Ｆｉｓｈｅｒ）できれいにし、載せた。脾細胞のＦＡＣＳ解析を、標準的な手順を用いて、蛍光抗−ＩｇＭ及び抗−ＣＤ３モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で実行した。
【０２０７】
ホールマウント原位置ハイブリッド形成のために、胚（Ｅ６．５及びＥ７．５）を新鮮に単離された脱落膜から解体し、４５分間冷４％パラホルムアルデヒドで固定し、［４４］に記載されたように処理した。簡潔には、胚を再水和させ、Ｈ２Ｏ２で脱色し、プロテインキナーゼＫで透過性にし、再固定した。ホウ化水素ナトリウムで処理した後、胚を洗浄し、６３℃で１時間、プレハイブリダイズした。ＤＩＧ標識プローブ（２μｇ／ｍｌ）（Ｃｏｍｐａｎｙ  ｆｏｒ  ＤＩＧ）を、添加し、ハイブリダイゼーションを６３℃で２０分間、実行した。厳密性が増加した時点での洗浄後、プローブ結合をＰｕｒｐｌｅ  ＡＰ（Ｒｏｃｈｅ）で検出した。胚を、Ｔ−１００  タングステンフィルム（Ｋｏｄａｋ）を用いた精密顕微鏡を通じて写真を撮った。
【０２０８】
Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｔ）を除く全てのリボプローブは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内にクローニングされたｃＤＮＡからＴ３  ＲＮＡ  ポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて合成された。ｂｒａｃｈｙｕｒｙ鋳型コンストラクトはＤｒ．Ｈｅｒｍａｎｎ（Ｍａｘ−Ｐｌａｎｃｋ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｆｕｒ  Ｅｎｔｗｉｃｋｌｕｎｇｓｂｉｏｌｏｇｉｅ，Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））から寄贈され、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で転写された。
【０２０９】
ＬＰＳアッセイ
新鮮に単離されホモジナイズされたマウス脾臓からのＢ細胞を、取り扱い説明書に従って、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ  Ｍ（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）で精製した。細胞は、１０６細胞当たり５μｇ  ＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ血清型０１２７：Ｂ８、Ｓｉｇｍａ）の非存在或いは存在下、２００μｌ培地中に、３つ組で９６ウェルプレートに播種した。前記細胞を、７２時間、３７℃、７．５％  ＣＯ２でインキュベートし、その上清を、アルカリ性ホスファターゼ標識抗−マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）と、検出用に基質バッファー（５００ｍｌ中に０．２４ＭＭｇＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、０．９Ｍジエタノールアミン、ｐＨ９．８）中の１ｍｇ／ｍｌＰＮＰＰ基質を用いて、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって解析した。
【０２１０】
ＲＮＡ及びｃＤＮＡ調整
総ＲＮＡを調整するために、全体胚を１００μｌ  Ｔｒｉｚｏｌ（Ｓｉｇｍａ）中でピペッティングすることによってホモジナイズした。１０μｇグリコゲンを担体として添加し、ＲＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。他の胚からのＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて調整した。一般的に、各ＲＮＡサンプルの半分は、ｃＤＮＡ調整のために用いた。ランダムプライマー（Ｇｉｂｃｏ若しくはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｄＮＴＰ混合物を添加し、５分間、６５℃でインキュベートし、氷上ですぐに冷やした。反応バッファーを添加した後、Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を添加し、５０分間４２℃でＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、若しくは１時間３７℃でＳｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて第１鎖が合成された。次に、ＲＮＡ鋳型を除去するためにＲＮａｓｅ  Ｈを用い、ＰＣＲ解析の干渉を最小限にした。
【０２１１】
結果
マウスｇｒｐ９４遺伝子の標的化
ＧＲＰ９４は、多細胞生物にのみ発見され、細胞増殖には必要なく、限られた基質範囲を有するので、このシャペロンは、分泌経路においてほとんどのタンパク質の折り畳みには恐らく必要ない。従って、本発明者らは、標的化マウスｇｒｐ９４の切断は、破局的な成長欠陥というよりも定義された表現型を生むであろうと仮定した。
【０２１２】
マウスｇｒｐ９４遺伝子は、１０番染色体に位置し［１４］、１２９Ｃ１ＥＳ細胞系統内で標的化され（図８Ａ）、６つの正確に標的化されたクローン（ガンシクロビル及びＧ４１８両方に耐性）を選択し、偽妊娠Ｃ５７Ｂ１／６野生型（ＷＴ）雌マウスからの胚盤胞内に注入した。２つの独立した系統から７５％以上の表皮色キメラ化を示した７匹の雌を次に、ＷＴ  Ｃ５７Ｂ１／６雌と交配させ、結果生じた子孫の遺伝子型を同定した。ヘテロ接合体を交雑し、さらに同様に、１２世代に亘ってＷＴ  Ｃ５７Ｂ１／６バックグラウンドと戻し交雑した。
【０２１３】
この標的化コンストラクトから産生される予想されたタンパク質は、成熟ＧＲＰ９４タンパク質の６１アミノ酸（７８１の中から）、さらにベクター由来の３つの付加的アミノ酸を含む。この断片は、タンパク質−ペプチド結合及びヌクレオチド結合の既知活性に対しては不十分である［１５〜１７］。１つのＷＴ及び２つのヘテロ接合体Ｆ１マウスから単離したゲノムＤＮＡでのサザンブロット解析を、標的コンストラクト外部の３’プローブを用いて行い、この結果は図８Ｂに示した。ＲＴ−ＰＣＲ解析は、ＧＲＰ９４の非存在下での−／−胚からの転写を示すことによって、この発見の解釈を拡大した（図４Ａ）。ＧＲＰ９４タンパク質の非存在は、アミノ酸２６６位から３４７位のあいだのエピトープを認識する９Ｇ１０モノクローナル抗−ＧＲＰ９４を用いて、胚性組織と細胞の免疫ブロットによって検証した。
【０２１４】
ｇｒｐ９４のホモ接合体欠損は胚性致死表現型を有する
表２に示したように、生存可能なｇｒｐ９４−／−マウスは、ヘテロ接合体間の交雑による９００以上の子孫からは得られなかった。ヘテロ接合体生産マウスの割合は、５５．４％であり、これは−／−マウスの非存在において予想された６６．７％ではなかった。従って、ホモ接合体変異死亡率にくわえて、ノックアウトアリルであり、まだ研究されていない表現型の歪んだ遺伝が存在することを示している。
【０２１５】
胚性死亡率の段階を決定するために、本発明者らは、胚形成の異なる段階で胚をばらばらにした。Ｅ１４．５及びＥ１０．５の時点で、−／−胚は見出せず、Ｅ８．５の時点でさえ、ごく少数の変異胚が同定されたのみである（表２）。Ｅ８．５〜Ｅ９．５の間で、胚の再吸収は共通のことであった。しかしながら、本発明者らは、Ｅ５．５〜Ｅ７．５の間で、予想された１：２：１メンデル比に一致する遺伝子型分配を発見した。
【０２１６】
発生の卵筒段階まで、ｇｒｐ９４−／−胚は、ｇｒｐ９４＋／＋胚と形態学的に区別不可能である（図９Ａ〜Ｄ）。ＧＲＰ９４タンパク質発現は、ＷＴ胚を通じて容易に検出された（図９Ｃ）。１日後、ｇｒｐ９４−／−胚は、ＷＴ胚と比べてまだほぼ区別不可能であった（図９Ｅ〜Ｆ）。しかしながら、Ｅ７．０〜７．５では、ｇｒｐ９４−／−胚とｇｒｐ９４＋／＋胚の間に劇的な違いが観察された（図９Ｉ、Ｊ）。それらは適切に伸長しないので、遠位チップの周りの卵黄嚢には余分なスペースがあった。羊膜若しくは漿膜も形成されず、原始羊膜溝も明らかでなかった（図９Ｊ）。胚盤葉上層と胚外領域との間の接合部は、ＷＴ胚のものよりも明白ではなく、内胚葉細胞層は異常に現れた（図９Ｋ）この段階の正常の胚においては、内胚葉の胚外領域は、頂端空胞（ａｐｉｃａｌ  ｖａｃｕｏｌｅｓ）及び微絨毛を有する立方状／円柱状細胞で構成されており、前記接合部の下に位置する内胚葉層の胚領域は、ほとんど扁平上皮細胞からなっていた。対照的に、ｇｒｐ９４−／−胚の内胚葉は、胚領域及び胚外領域の両方が立方状細胞で構成されていた（図９Ｌ、黒矢印）。ライヘルト膜に結合した頭頂部内胚葉は、−／−胚において正常に見えた（図９Ｌ）。
【０２１７】
注目すべきこととしては、−／−胚は、中胚葉の形成を開始した時に原始外胚葉細胞の移入を時々示すのみであり、正常のものは明らかに３つの胚葉を産生したけれども、２つの胚葉のみがこれらの胚において現れた（図９Ｉ〜Ｌ）。
【０２１８】
【表４】
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【０２１９】
ｇｒｐ９４−／−発生における欠損は原腸形成の時に生じる
発生における欠損がｇｒｐ９４−／−胚において明らかになった時点で、正常胚は、原腸形成を開始していた。この過程の間、内臓内胚葉細胞は置換され、全３胚葉が胚盤葉上層から発生する。前記内臓内胚葉細胞は、卵黄嚢及び胚外領域の一部に寄与するが、それにも関わらず体軸の形成において役割を担っていることが示された［１９、２０］。ＧＲＰ９４に対する免疫化学染色によって、ＧＲＰ９４はＥ５．５（図１０Ａ）若しくはＥ６．５（図１０Ｂ）の全ての細胞において発現されていることが示された。しかしながら、染色は均一ではなく、他の内胚葉或いは外胚葉細胞よりもＧＲＰを発現した内臓内胚葉細胞のクラスターが明らかに存在した（図１０）。重要なこととしては、胚本来及び胚外組織における発現レベルが、周囲の母系組織と比較して著しく異ならないことである。
【０２２０】
原腸形成の進行は、細胞運命特定化に関連した転写因子の発現によって一般的に観察されており、従って、本発明者らは、ｇｒｐ９４−／−胚をｉｎ  ｓｉｔｕ（原位置）ハイブリダイゼーション及び半定量性ＲＴ−ＰＣＲによって解析した。正常胚においてＥ４．５の時点ですでに発現が検出される［２１］転写因子であるＯｃｔ４は、Ｅ６．５の時点で胚盤葉上層の至るところで発現されており、翌日を超えると、原条内に徐々に集結してくる（図１１Ａ）。Ｅ７．５−／−胚において、Ｏｃｔ４転写物の分配は、Ｅ６．５  ＷＴ胚のものと似ている（図１１Ａ）。Ｏｔｘ２はホメオボックス転写因子であり、原腸形成前の胚性外胚葉及び内臓内胚葉に偏在的に発現し、原条伸長［４５］のように、Ｅ６．５〜７．５の間に胚の前領域に徐々に限定されるものである。Ｅ７．５のｇｒｐ９４−／−胚において、変異胚の全外胚葉に発現したＯｔｘ２は、Ｅ６．５のＷＴ胚におけるその分配と同じである。これら両方のマーカーは、ｇｒｐ９４−／−胚はＥ６．５段階以降は進行しないという結論を分子レベルで確証させるものである。
【０２２１】
前記胚の異なる領域が特異的に影響を受けたかどうかを決定するために、本発明者らは、前内臓内胚葉（ＡＶＥ）に対する多くのマーカーの発現をテストした。Ｅ６．５〜７．５の時点でＡＶＥに限定された［２２］ｌｉｍ−１の発現は、発現のドメインが同じ齢のＷＴ胚と同じくらい近くに伸長しなかったけれども、変異胚においても適切に正常に見えた（図１１Ｇ）。同様に、第２のＡＶＥマーカーであるＨｅｘ［２３］は、変異胚において前側に発現した（データは示さず）。機能的内蔵内胚葉は、適切な原腸形成にとって重大であるため［２４］、いくつかの他のＡＶＥマーカーをＲＴ−ＰＣＲによってテストした。トランスサイレチン、トランスフェリン、αフェトプロテイン、アポリポタンパク質Ａ１及びＥ、及びレチノール結合タンパク質の転写物は、ＷＴ及び変異胚において全て同等に発現していた（図１２Ｄ）。結論としては、このマーカー解析によって、ＡＶＥ形成体の形成である少なくとも軸性分化プログラムの一部は、ＧＲＰ９４における欠損によって破壊されるものではないと示唆された。
【０２２２】
調査された別の領域は、胚外外胚葉であった。正常及び変異胚の両方は、Ｅ６．５の胚外外胚葉においてマーカーＢｍｐ４［４６］の発現を示した（図１１Ｅ）。Ｅ７．５のｇｒｐ９４−／−胚は、近接した胚外外胚葉にのみＢｍｐ４を発現したが、ＷＴ胚においては胚外溝を裏打ちする胚外中胚葉において発現していた（図１１Ｆ）。これは、胚外外胚葉に対して明らかな影響を及ぼさず、Ｅ６．５の分化停止と再び一致していた。
【０２２３】
対照的に、初期中胚葉マーカー［４７］であるｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｔ）の発現は、著しく影響を及ぼした。Ｅ７．５のｇｒｐ９４−／−胚は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、Ｔアンチセンスプローブに対してネガティブ（陰性）であったが、正常同腹仔ｂｒａｃｈｙｕｒｙは原条において発現していた（図１１Ｃ）。ｂｒａｃｈｙｕｒｙの非存在或いは低発現は、ＲＴ−ＰＣＲによっても確認された（図１２）。ｂｒａｃｈｙｕｒｙ特異的プライマーを用いた個々のＥ７．５胚からの転写物の増幅は、ｇｒｐ９４−／−サンプルにおいて限界に近いｂｒａｃｈｙｕｒｙシグナルのみを示したが、ｈｇｐｒｔ転写物は、容易に増幅された。しかしながら、第２のＴ−ボックスタンパク質であるＥｏｍｅｓは、原腸形成、及びｂｒａｃｈｙｕｒｙよりも初期段階での中胚葉誘導に関与し［２５］、−／−胚において発現していた。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの全マウントによって、ｅｏｍｅｓは、ＷＴのＥ７．５胚の原条及び胚外領域において最初に発現されている［２６］。変異胚において、ｅｏｍｅｓの発現ドメインは、原条が発達するために発現される領域を含む、卵筒の大部分を有していた（図１１Ｄ）。Ｅ７．５のｇｒｐ９４−／−胚におけるｅｏｍｅｓの発現パターンは、Ｅ６．５のＷＴ胚のものと非常に類似していた［２６］。この結果と一致して、ＲＴ−ＰＣＲ解析は、ｅｏｍｅｓ転写物は、ＷＴのＥ７．５胚で見られた範囲内の中間レベルで、変異胚において容易に検出された（図１２Ｃ）。ＷＴ胚における変異性は、Ｅ６．５〜Ｅ７．５の間のｅｏｍｅｓの徐々に限定される発現と一致していた［２６］。最後に、後期中胚葉マーカーであるｐＭｅｓｏｇｅｎｉｎ１［２７］は、ＲＴ−ＰＣＲによって検出されなかった（データは示さず、Ｎ＝２変異胚）。ＲＴ−ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション解析、及び形態学的データを総合すると、ｇｒｐ９４−／−発生における欠損は、原条が発生する初期の原腸形成段階であった。さらに、ＧＲＰ９４活性は、ｅｏｍｅｓ発現の初期ウェーブと、ｂｒａｃｈｙｕｒｙ発現の正常時間との間に必要とされるように見られた。
【０２２４】
生産へテロ接合体は正常である
生産へテロ接合体とＷＴマウスの間に表現型の違いは観察されなかった。外見、体重、寿命、及び繁殖性は、全て正常であった（データは示さず）。これが残存アリルからのＧＲＰ９４発現の上方制御に起因するかどうかを調査するために、ｇｒｐ９４＋／＋、及びｇｒｐ９４＋／−マウスの肝臓及び脾臓から総タンパク質を単離し、ＧＲＰ９４発現を免疫ブロッティングによって定量化した。図１３Ａに示したように、ヘテロ接合体組織におけるＧＲＰ９４の量は、ＷＴレベルの約５０％近くであり、これはＷＴありるからの発現の上方制御がないことを意味している。さらに、３つの異なる主要なＥＲシャペロンのレベルを定量化した。ＢｉＰ、カルネキシン、及びＥＲｐ７２のレベルは、ヘテロ接合体及びＷＴ動物において一致しており（Ｓ．Ｖｏｇｅｎ  ａｎｄ  Ｔ．Ｇｉｄａｌｅｖｉｔｚ、データは示さず）、これはこれらのＥＲシャペロンはＧＲＰ９４の発現の減少を補わなかったことを示している。本発明者らは、ＧＲＰ９４の正常の発現は、正常マウス生理機能に対しては半分で十分であると結論付けた。
【０２２５】
ＧＲＰ９４は休止Ｂリンパ球の免疫グロブリン（Ｉｇ）分泌プラズマ細胞への分化の間に上方制御されるので［２８、２９］、本発明者らは、半分の量のＧＲＰ９４がＢ細胞分化やＩｇ分泌に及ぼす影響を検討した。ＬＰＳでの刺激前後の、表面Ｉｇ発現に対するＦＡＣＳによって、及びＩｇ分泌に対するＥＬＩＳＡによって、脾臓細胞を調査した。図１３Ｂに示したように、ｅｘ  ｖｉｖｏのＬＰＳ刺激の３日前後での表面Ｉｇ発現のレベルにおける違いはなかった。Ｔ細胞及びＢ細胞の数も、両方の遺伝子型のマウスにおいて同じだった。第３に、ｇｒｐ９４＋／−、及びｇｒｐ９４＋／＋マウス脾細胞によって分泌されたＩｇＭのレベルにおいても、著しい違いを検出できなった（図１３Ｃ）。従って、正常レベルの５０％のＧＲＰ９４は、ＥＲシャペロンの強大な上方制御を伴う生理反応である、Ｉｇ分泌を補助するには十分であった。
【０２２６】
異なるストレス条件下でのＧＲＰ９４の分化要求
ｇｒｐ９４−／−胚で見られたような初期胚致死表現型は、例えば、部分的な細胞周期の阻止などの遅い増殖によって引き起こされる。別の可能性では、変異体はその細胞が母系由来ＧＲＰ９４の十分なレベルを有する限りのみ生存することである。これらの可能性を解決するために、本発明者らは、移植前Ｅ３．５胚盤胞からＥＳ細胞株を派生させた。ＥＳ細胞クローンのマッチングペアは、ｇｒｐ９４−／−及び＋／−同腹仔胚〜樹立した。ｇｒｐ９４−／−ＥＳ細胞（１４．１と呼ばれるクローン）は、＋／＋ＥＳクローン（４２．１と呼ばれる）と同様に、複数世代に亘って培養増殖可能であった（図１４Ａ）。従って、ＧＲＰ９４は、細胞増殖と分裂それ自体に対しては必須ではない。さらに、この観察によって、初期胚形成の間の母系ＧＲＰ９４の希釈が原因で、変異胚の発生停止は単純なものではないと証明された。
【０２２７】
ＧＲＰ９４はよく知られたストレスタンパク質であるので、本発明者らは、以下の３つの細胞性ストレス条件：低グルコースでの増殖、血清使用中止に対する反応、及びカルシウム恒常性の摂動、に対するＧＲＰ９４欠損細胞の感受性を検討した。驚くべくことに、ｇｒｐ９４−／−細胞は、正常グルコースレベルの２．５％まで下がったとしても、低グルコース張力下の正常細胞と同様に増殖した（図１４Ｂ）。従って、グルコース欠乏によるその転写制御にも関わらず、ＧＲＰ９４は、このストレス条件下での細胞生存には重要ではない。一方、ｇｒｐ９４−／−細胞は、血清欠乏は許容しない。血清の使用中止後３時間いないに、２５％の変異細胞は死滅し、約２０％のみが血清なしで２４時間後まで生存したが、一方、ＷＴ細胞の細胞死は４８時間後でさえさほどなかった（図１４Ｃ）。ＧＲＰ欠損細胞も、ＥＲ  Ｃａ＋＋−ＡＴＰａｓｅの阻害剤である、タプシガルジンとの処理に対して感受性を有しており［３０］、３００ｎＭタプシガルジンの存在下で７時間後に広範囲の細胞死が生じた（図１４Ｄ）。さらに、ＷＴ細胞は、１ｍＭＥＧＴＡの存在下で５日間増殖できたが、−／−細胞は、そのようなＣａ＋＋−キレート化条件下では増殖できなかった（図１４Ｅ〜Ｆ）。これらの研究によって、ＧＲＰ９４のストレスタンパク質としての要求は、ＧＲＰ９４のシャペロンとしての要求と同様に選択的であり、いくつかのストレス反応には重要であるが、全てにではなく、その限定基質特性を恐らく反映している。
【０２２８】
図１５は、ＧＲＰ９４−欠損細胞が血清使用中止に対して感受性を有していることを示したものである。ＥＳ細胞培養を、正常増殖培地から無血清培地へ移行し、生細胞を示した時間で測定した。示されたように、野生型ＥＳ細胞は、このストレスに対して少なくとも４日間生存したが、ＧＲＰ９４−／−細胞は、すぐ死滅した。図１６は、ＧＲＰ９４のＮ末端ドメインが樹状細胞によって取り込まれることを示したものである。ＧＲＰ９４のＮ末端ドメイン（Ｎ１−３５５或いはＮ３４−３５５）は、４０℃で精製マウス樹状細胞と結合し、３７℃での加熱によってエンドソーム小胞内へ内部移行した。前記タンパク質は、テキサスレッド−ストレプトアビジン（Ｔｅｘａｓ−ｒｅｄ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）のそれらのＣ末端ビオチン化Ｌｙｓ３７０への結合によって視覚化した。結合アッセイは、右の顕微鏡写真に示され、Ｎ３４−３５５の樹状細胞への結合を定量化した。前記タンパク質は、単独或いはアルファ２マクログロブリン（ＣＤ９１受容体の阻害剤）の存在下、若しくはフコイジン（スカベンジャー受容体Ａの阻害剤）の存在下で、４℃、１時間で前記細胞への結合を可能にした。インキュベーション後、前記細胞を洗浄し、溶解し、免疫ブロットによって解析した。結合度を蛍光体イメージングによって定量化した。
【０２２９】
図１７に示したように、ＧＲＰ９４ノックアウト（ＫＯ）細胞は、全ての３胚葉から細胞タイプへ分化できた。ＧＲＰ９４−／−或いはＧＲＰ９４＋／−細胞は、懸滴内に凝集され胚様体を形成し、その胚様体は、次に培地中のＤＭＳＯ或いはレチノイン酸の含有によって様々な細胞タイプへの分化が誘導される。ニューロン（神経細胞：左のパネル）は、その形態によって、及び中間体フィラメントタンパク質に対するニューロン特異的抗体で染色によって同定される。肝細胞（真ん中のパネル）は、インドシアニングリーン染色によって、及びマーカータンパク質のＰＣＲ増幅によって同定される。脂肪細胞（右のパネル）は、その脂質顆粒のオイルレッドＯ（Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ）染色によって同定される。
【０２３０】
図１８は、ＧＲＰ９４欠損細胞は、筋肉へは分化しないことを示したものである。＋／＋ＥＳ細胞はミオシン重鎖ポジティブ細胞（上パネル）へ容易に分化したが、−／−ＥＳ細胞は、骨格筋細胞を生じることはできなかった（左、下）。
【０２３１】
図１９は、ノックアウト（ＫＯ）胚はおよそＥ６．５で停止したことを示す（Ａ〜Ｈ）ＷＴ（上パネル）及び変異体（下パネル）胚の組織学的解析である。妊娠Ｅ５．５、６．５、若しくは７．５日目の胚を固定し、切片化し、ヘマトキシリンとエオシンとで染色した。Ｅ７．５の野生型胚において空洞、羊膜、及び絨毛膜の形成、及び左−右及び背−腹非対称軸の形成に着目すべきであるが、一方、変異胚ではこれらの発生特徴のどれも現れなかった。
【０２３２】
議論
多くの分子シャペロンは、豊富に且つ偏在的に発現している。従って、そのようなシャペロンの１つであるＧＲＰ９４の消失によって、母系ＧＲＰ９４が閾値レベルに到達したらすぐに細胞レベルの破局的な増殖欠損を生じる可能性は十分にある。代わりに、その機能は、重複性を有し、容易に別のシャペロンによって満たされるであろう。従って、ここに記載されたｇｒｐ９４の標的とした破壊の表現型は、驚くべくその特異性を有している。胚致死によって、ｇｒｐ９４はマウス発生にとって重要な遺伝子であることが示された。さらに、その欠損の綿密な解析によって、ＧＲＰ９４に非常に依存した第１段階としては、原腸形成と中胚葉誘導であることが示された。これは、ＧＲＰ９４のサイトゾルファミリーメンバーであるＨＳＰ９０βを必要とする第１段階よりも早く、その消失によって、胎盤発生の欠陥が原因でマウスの発生がＥ９．０〜９．５で停止する［３１］。ＧＲＰ９４の必要性は、別のＣａ＋＋−結合ＥＲシャペロンであるカルレティキュリンよりも早く、その消失によって心臓発生の欠陥を引き起こす［３２］。
【０２３３】
ｇｒｐ９４−／−胚の発生停止は、母系遺伝的タンパク質の希釈に起因するものではなく、胚に対する自律性のもののようである。ＧＲＰ９４は、その前にはないが、早ければＥ４．５から移植後胚の至る所で発現されていた（［Ｌｉ，１９９１  ＃１０３８］及び本発明者らによる研究）。さらに重要なことは、ＧＲＰ９４欠損細胞は、分裂する能力を有し、培養中で分化する能力さえも有しており、これは、ＧＲｐ９４が細胞増殖それ自体にとって重要でないことを示している。この結論は、Ｒａｎｄｏｗ  ａｎｄ  Ｓｅｅｄ（ＧＲＰ９４欠損前駆Ｂ細胞株を用いた）［１２］、及びＩｓｈｉｆｕｒｏら（天然由来シロイヌナズナヌル変異体を用いた）［１３］による観察によって拡大される。従って、発生停止の正確な段階に関する本発明者らの解釈としては、ＧＲＰ９４の活性は、胚形成の間の重要なチェックポイントのいくつかの局面の適切な実行にとって重要であるというものである。
【０２３４】
ＧＲＰ９４の非存在下で、原条の形成及びその結果生じる中胚葉の誘導なしに、胚発生は卵筒段階で停止した。いくつかの中胚葉マーカー、特に転写因子であるｂｒａｃｈｙｕｒｙ及びｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎの転写物の解析によって、分化プログラムはｅｏｍｅｓ及びｂｒａｃｈｙｕｒｙの発現の間のどこかで停止されることが示唆された。内臓内胚葉、及びＡＶＥは、Ｌｉｍ−１及びＨｅｘ転写物を局在化することによって、及びトランスフェリン受容体、レチノール結合タンパク質、及びいくつかの他のマーカーの転写物を定量化することによって判断されたように、ＧＲＰ９４欠損胚においても正常に発生した。それにも関わらず、前領域の分化は完全に正常という訳ではなかった。第１に、Ｌｉｍ−１及びＨｅｘの発現ドメインは、ＷＴ胚のものより小さく、より局在化しており、胚の全周縁を伸ばしていない。第２に、胚周辺の内胚葉細胞は、扁平上皮になるというよりも立方状を適切に維持している。主要な原条欠陥に対するこれらの欠陥の割合は、不明である。
【０２３５】
発生欠陥は、培養ｇｒｐ９４−／−ＥＳ細胞の表現型にも反映される。これらの細胞は、血清使用中止などのストレスに対して、及びカルシウム恒常性の崩壊に対してより感受性を有するが、驚くことに、ＷＴ  ＥＳ細胞よりも低グルコース張力に対する感受性は有していない。これらの生化学的表現型は、ストレスタンパク質としてその役割においてでさえ、ＧＲＰ９４の選択性を強調する。さらに、ｇｒｐ９４−／−ＥＳ細胞は、培養において分化する能力を有しており、これにより、全３胚葉に由来した多系統を生じるが、心臓細胞若しくは骨格筋細胞を生じることはできない。さらにこれにより、ＧＲＰ９４の必要性におけるいくつかの特異性が示された（Ｓ．Ｗａｎｄｅｒｌｉｎｇ，Ｏ．Ｏｓｔｒｏｖｓｋｙ  ａｎｄ  Ｙ．Ａｒｇｏｎ，ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ  ｉｎ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）。
【０２３６】
ＧＲＰ９４の非存在に起因する正確な分子欠損はまだ定義されていないが、このシャペロンの欠乏によって、発生的に重要なクライアントタンパク質の成熟に対してＧＲＰ９４が非常に必要とされることを明らかにすると容易に提案できるように思われる。ＧＲＰ９４はＥＲシャペロンであるので、推定上のクライアントは、分泌型若しくは膜結合性であってもよく、高度な誘導性過程である中胚葉形成に必要とされる細胞−細胞相互作用に関与しているようである。注目すべきこととして、ｍｅｓｄマウスにおける中胚葉誘導欠陥は、ＬＲＰ−５／６膜受容体と相互作用する能力を持ったＥＲ常在性タンパク質における欠損に起因しているものとして最近同定された［３３］。ＧＲＰ９４誘導性胚欠損は、同様なパラダイムに起因するものである。ＧＲＰ９４クライアントタンパク質を同定することは、ＧＲＰ９４の特異性に関する構造的情報がないのでより難しくなる。少数の基質のみが確実に同定されており、その中の少数が共通のモチーフの定義を妨げる。初期発生において潜在的な機能を有する唯一の既知クライアントタンパク質は、トール様受容体１、２、及び４である。注目すべきは、トールはそもそも、ショウジョウバエ胚において、軸形成において非常に重要であるものとして同定された［３４］。同様な機能は、その後アフリカツメガエル胚においても同定された［３５］。しかしながら、高等真核生物において、複数のトール様受容体が存在し、これまで初期哺乳類発生における機能を示されたことはなかった。ＧＲＰ９４が、複数トール様受容体に共通する構造的モチーフを認識するならば、全ての折り畳みはこのシャペロンの非存在下で損なわれ、軸形成における欠陥として潜在的に現れる。
【０２３７】
反対に、多くの他のタンパク質の遺伝的消失によって、原条形成及び原腸形成時のその重要性が確認された。これらは、線維芽細胞成長因子受容体、アクチビン受容体、骨形成受容体、及びそれらの各リガンドのいくつかを含む［３６］［３７〜４０］。これらのタンパク質は、膜発現或いは分泌のためのＧＲＰ９４への依存性という観点で研究されなかったが、小胞体におけるその生合成に起因して全て、潜在的なクライアントである。
【０２３８】
要約すると、本発明者らは、１若しくはそれ以上の発生的に重要なタンパク質のＥＲ成熟は、ＧＲＰ９４の活性に大きく依存していると仮定した。この分子シャペロンの非存在下で、基質は適切に折り畳まれず、細胞表面へ輸送するためのＥＲ質調節機構によって放出されなかった。言い換えると、これは重大なリガンド−受容体相互作用を阻害しており、中胚葉誘導で必要とされる特定の細胞間相互作用を妨げる。
【０２３９】
以下の、１）Ｇｒｐ９４は、中胚葉誘導に対する哺乳類発生の間必要とされる、２）Ｇｒｐ９４は、筋肉細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化に必要とされるが、他の系統の分化には必要ではない、３）Ｇｒｐ９４は、血清が欠乏した場合、生存因子の分泌を支持することによって、胚性幹細胞をアポトーシスから保護する、４）Ｇｒｐ９４のペプチド結合部位は、そのＮ末端ヌクレオチド結合ドメインに位置している、５）Ｈｉｓ１２５は、ペプチド結合にとって重要であり、結合ペプチドと接触する、及び６）ペプチド結合にとって十分な同じ断片は結合するにも十分であり、樹状細胞によって内部移行される、という結論は、前述の結果に基づいてなされたものである。
【０２４０】
【表５】
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【０２４１】
【表６】
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【０２４２】
【表７】
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【０２４３】
【表８】
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【実施例３】
【０２４４】
ペプチドを含む腫瘍保護薬剤はＧＲＰ９４タンパク質に結合できる
この実施例は、腫瘍抗原を提示するためのペプチドに結合する分子シャペロンＧＲＰ９４を用いることによって、腫瘍に反応した免疫システムの調節について説明する。本発明は、ＧＲＰ９４のペプチド特異性は、それを腫瘍保護薬剤として特に有効にするという仮説に基づいている。従って、本発明は、分子シャペロンＧＲＰ９４のペプチド結合活性に基づいた腫瘍ワクチンを提供する。１観点において、表３に提供されたようなペプチド配列は、ＧＲＰ９４或いはＨＳＰ９０ミニシャペロンと複合体を形成する。複合体形成に続いて、前記複合体を有する組成物の有効量は、癌患者へ投与され、腫瘍特異的ＣＴＬ反応を刺激する。代わりに、腫瘍関連ペプチドは、治療される患者から単離され、ここに記載されたＧＲＰ９４及びＨＳＰ９０ミニシャペロンと複合体を形成される。両方のアプローチは、免疫調節腫瘍減少若しくは拒絶を刺激しなくてはならない。同様なアプローチは、ウイルス特異的ペプチド、及び本発明のミニシャペロンからなる複合体を用いて、ウイルス生感染の治療及び根絶のために用いられ得る。
【０２４５】
組換えタンパク質（ＧＲＰ９４由来或いはＨＳＰ９０由来）は、典型的には、結合率が遅いことに起因するペプチドの膨大なモル濃度過剰で、合成ペプチドとインキュベートした。４マイクロモルのＧＲＰ９４は、８００マイクロモルの合成バインダーペプチドと飽和させた。会合は、１０分間、５０℃でのタンパク質処理によって増強され、この負荷は非常に効率的であるので、タンパク質の８５％までペプチドに負荷され得る。
【０２４６】
【表９】
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【０２４７】
新しく発明されたペプチド結合アッセイを用いて、ペプチドライブラリーを、組換えＧＲＰ９４を用いてスクリーニングし、高親和性及び低親和性結合ペプチドを同定した。バインダーペプチドの最適な長さ及び他の特性は、順序を変えられた（ｐｅｒｍｕｔａｔｅｄ）合成配列のライブラリーを用いることで推定される。次にコンセンサスバインダー配列は、大きな複雑性ファージディスプレイ（ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｐｈａｓｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）ライブラリーを選別することによって決定された。次にバインダーペプチドは、他のシャペロンによって選択されたペプチド、最も重要なのはＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ結合ペプチドと比較された。これらの実験は、ＧＲＰ９４−ペプチド提示経路の選択性を決定するのを助ける。
【０２４８】
実施例１に記載されたように、ＧＲＰ９４のペプチド結合部位は、生化学及び部位直接的変異原性の組み合わせによってマッピングされ、そのデータは、前記シャペロンのコンピュータ構造モデルに合致する。この分子をさらに特徴付けるために、本発明者らは、改変されたペプチドへの親和性及び／若しくは特異性を有するＧＲＰ９４バージョンを研究し、組織培養内で、次に特異的キラーＴ細胞反応を増強されたマウスモデルにおいて、ＧＲＰ９４の操作されたバージョンをテストした。高親和性バインダーペプチドは、それらがエンドサイトーシスの間でもＧＲＰ９４への結合を維持したため、より提示されることが可能である。代わりに、ＧＲＰ９４に対して中程度親和性を有するペプチドは、それらがＭＨＣクラスＩにより効率的に伝達されるため、選択的に提示される。
【０２４９】
抗原提示細胞によって取り込まれ、Ｔ細胞を刺激する最小ＧＲＰ９４誘導体は、ここに記載されている。様々なマクロファージ及び樹状細胞（培養株及びｅｘ  ｖｉｖｏ由来）は、ＧＲＰ９４由来のペプチド負荷組換えコンストラクトとインキュベートされ、前記ペプチドを提示するそれらの能力は、培養でのＴ細胞反応を測定することによってテストされた。そのようなミニシャペロンは、完全長シャペロンの他の活性を含まないようであり、従って、腫瘍ワクチンとしてより適している。
【０２５０】
Ｔ細胞認識を可能にし、刺激する腫瘍特異的ペプチド人工的に増加する１つの方法は、図２０に示されたように、タンパク質ＧＲＰ９４を有する複合体としてそのようなペプチドを導入することである。ＧＲＰ９４は偏在性タンパク質であり、腫瘍細胞内の変異ペプチドを含むペプチドに結合する。Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ研究室による優れた研究によって、腫瘍ペプチドに結合したＧＲＰ９４は、ワクチン接種したマウスに使用し、対照マウスと比較して、腫瘍と戦う場合に１０〜２００倍Ｔ細胞の反応が優れていた（Ｂｌａｃｈｅｒｅ，Ｎ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｓ，ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｉｎ ｖｉｔｒｏ，ｅｌｉｃｉｔ  ｐｅｐｕｔｉｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９７．１８６：１３１５〜１３２２を参照のこと）。ＧＲＰ９４注入マウスによる腫瘍拒絶の頻度は、優れていた。このアプローチは、現在臨床試験でテストされている。この大きな利点は、自己タンパク質を持ちいることであり、ペプチド抗原を運搬する手段として、著しい免疫反応もない。
【０２５１】
少なくとも２つの薬剤がＧＲＰ９４のペプチド結合活性を阻害すると以前報告された（Ｓｃｈｕｌｔｅ，Ｔ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｄｉｃｉｃｏｌ  ｗｉｔｈ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９０  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１９９９．１３：１４３５〜１４４８）。これらの研究は、タンパク質配列の最初の２００アミノ酸に結合するペプチドの部位を局在化した（Ｖｏｇｅｎ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｄｉｃｉｃｏｌ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｅｐｕｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｏｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＲＰ９４．Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２００２．２７７：４０７４２〜４０７５０を参照のこと）。組換えタンパク質を産生する能力を用いて、本発明者らは、ＧＲＰ９４における異なる部位に対するペプチド結合及び阻害剤結合マップを示し、重要なこととしては、このシャペロンのペプチド特異性は、Ｖｏｇｅｎらによって開示されたように、ＢｉＰ若しくはＨＳＰ７０などの他のものの特異性とは異なっていると示した。最後に、実施例２に記載された本発明のノックアウトマウス胚由来のＧＲＰ９４欠損細胞は、前記タンパク質の操作されたバージョンの活性をテストするための宿主として用いられ得る。
【０２５２】
図２０に記載したように、ＧＲＰ９４結合ペプチドがマクロファージ及び／若しくは樹状細胞を介して、Ｔ細胞に間接的に提示されることはすでに確認されている。これらの細胞は、注入されたＧＲＰ９４を取り込み（Ｂｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．によって記載されたようなＣＤ９１依存性エンドサイトーシス、若しくはＢｅｒｗｉｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（ＣＤ９１−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｒｏｓｓ−Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＲＰ９４（ｇｐ９４）−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００２．１６８：４２８２〜４２８６）に記載されたような別の経路を介して）、腫瘍ペプチドをＧＲＰ９４からＭＨＣクラスＩへ、いくつかのｉｌｌ定義経路によって伝達され、次に、Ｔ細胞刺激のために、前記ペプチドをクラスＩ分子との複合体で表面に提示する（Ｂｅｒｗｉｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ＧＲＰ９４（Ｇ￥ｐ９４）−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｎｔｏ  Ｅｎｄｏｃｏｍａｌ  ＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  Ｉ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｔｒａｆｆｉｃ，２００２．３：３５８〜３６６）。
【０２５３】
ＧＲＰ９４結合ペプチドのスペクトルを定義するために、本発明者らは、ライブラリーアプローチを用いることを計画した。本発明者らは、組換えＧＲＰ９４バージョンを用いた９６ウェルプレートフォーマット結合アッセイを確立し、これにより図２１に示されたように、バインダーペプチドの最適な特性を決定可能になった。本発明者らは、一番知られたバインダーペプチドの化学的に合成されたバージョンのライブラリーを選択し（ｖｓｖ８：ＲＧＹＶＹＱＧＬ；ペプチドＡ：ＫＲＱＩＹＴＤＬＥＭＮＲＬＧＫ）、ピン或いはプレートフォーマットのニロトセルロースにくっ付けた。前記ライブラリーは、２つのペプチド及び合成アミノ酸置換の各末端からの進行性切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｓ）からなる。結合の特異性は、Ｖｏｇｅｎらによって記載されたように、阻害剤であるラディシコールへの感受性によって確認された。この方法において、本発明者らは、結合するために最適であり、重要な側鎖に対して必要である長さと疎水性を決定した。このアプローチは、合成ペプチド能力及びｒｏｂｏｔｉｃアッセイシステムがこのスクリーンに利用可能になるように、さらに強化された。
【０２５４】
最適な長さが分かったので、本発明者らは、すてに保有していたライブラリーを用いてペプチドファージディスプレイライブラリーを使用した。ファージディスプレイＧＲＰ９４結合ペプチドは、コンセンサス配列を派生させるために、単離され、配列決定した。本発明者らのアッセイは定量的であるので、結果として生じたペプチドは、ランク付けされた。ヒトゲノムデータベースは、これらのペプチドがヒトタンパク質中にどのくらいの頻度で、及びどの種類のタンパク質が生じるかを解明するために使用した。このアプローチの重要な組成物は、Ｔ細胞を刺激すると知られているペプチドを有するＧＲＰ９４結合ペプチドを比較した。本発明者らは、この目的のために、そのようなペプチドのコレクション、及びそれに対応する各Ｔ細胞クローン若しくはハイブリドーマを有している。ＧＲＰ９４結合ペプチドの大部分が、Ｔ細胞によって認識されるペプチドと構造的に異なる場合、腫瘍に対して免疫化するこの方法は、広く適用可能とならないであろう。しかしながら、ＧＲＰ９４結合ペプチドとして知られた小サブセットの検討によって、これはこのケースには当てはまらず、Ｔ細胞によって認識されるペプチドと相当な同一性を有していることが示唆された。
【０２５５】
従って、ＧＲＰ９４の最小ペプチド結合ドメインは、アミノ酸３４〜２２１である。上と同様なアッセイを用いて、本発明者らは、平均ヒット率が配列当たり１〜２変異となるようにこの配列を無作為に変異させ、既知ペプチドＶＳＶ８に対する親和性が減少した組換えタンパク質を選択した。これらは、ペプチド結合に影響を及ぼす全てのアミノ酸を決定するために配列決定した。部位直接的変異原性を用いた予備データによって、Ｔｒｐ２０２及びＨｉｓ１３６はペプチド結合に関与すると示唆され、結合部位をマッピングするための本アプローチの実行可能性を検証した。
【０２５６】
平行して、本発明者らは、Ｔ細胞反応の増強においてより効果的である"設計バージョン"を産生するために、ＧＲＰ９４を、ペプチドとよく結合するように及び／若しくは天然由来タンパク質をは異なるように操作した。低レベルのペプチド−ＧＲＰ９４が投与された場合でも、ペプチド親和性が増加した変異体は、免疫システムに感作した。代わりに、より高い親和性は、マクロファージ／樹状細胞環境においてペプチドからのＧＲＰ９４の解離がより難しくなったため、有害となった。従って、本発明者らは、改変されたペプチド認識を与える変異体をスクリーニングした。
【０２５７】
これらの変異体が細胞−フリーペプチド結合アッセイで特徴付けられたので、本発明者らは、まず、（ここに記載されたように）培養抗原提示細胞を用い、次にＴａｍｕｒａら、Ｂａｓｕ  ら、Ｓｕｔｏら、及びＢｌａｃｈｅｒｅらによる引用文献に記載されたように、マウスの免疫化を用いて、これらをＴ細胞へのペプチド提示に関してテストした。
【０２５８】
図２２は、野生型ＧＲＰ９４の核酸及びアミノ酸配列を提供するものである。
【０２５９】
【表１０】
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【０２６０】
本発明は詳細に記載され、それらの特定の実施例を参照にしているが、様々な変更及び修飾が、それらの要旨や範囲から逸脱することなくなされることが、当業者には理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２６１】
【図１Ａ】図１は、ＧＲＰ９４の最小部分を示したものであり、これでペプチド結合は十分である。図１Ａは、用いられた組換えタンパク質の図式である。「１５」で用いられたタンパク質であるＮ１−３５５は、ＧＲＰ９４の最初の３５５アミノ酸を含み、成熟タンパク質のＤＤＥＶＤ  Ｎ−末端から開始している。Ｎ３４−３５５は、細菌内で発現したバージョンであり、成熟ＧＲＰ９４の最初の３３アミノ酸が欠損している。斜線部分はＮ−末端ドメインであり、ヌクレオチド／ゲルダナマイシン／ラディシコール結合部位を含む。濃い灰色の部分は、Ｎ−末端ドメインに属する少なくとも１つの活性を必要とする酸性度メインである。薄い灰色の部分は、Ｈｉｓ６タグである。Ｎ３４−３５５において、前記タグは、因子Ｘａ切断部位が続く。Ｎ１−３５５は、ＫＤＥＬ  ＥＲ回収シグナルで終結し、このシグナルはＮ３４−３５５内にはない。Ａｒｇ２２２の後の１つのトロンビン切断部位は、その領域が９Ｇ１０モノクローナル抗ＧＲＰ９４エピトープ（抗原決定基）を含むように印（＊）をつけた。
【図１Ｂ】図１は、ＧＲＰ９４の最小部分を示したものであり、これでペプチド結合は十分である。図１Ｂは、Ｎ１−３５５及びＮ３４−３５５のペプチド結合能力を示したものである。組換えシャペロンのこの２つのバージョンは、９６ウェルプレートアッセイにおいて、８−ｍｅｒのペプチドＶＳＶ８の結合に対して、示された用量でテストされた（実験手順を参照のこと）。黒塗り三角形はＮ１−３５５を示し、黒塗り四角はＮ３４−３５５を示す。白塗りの記号はラディシコールによるペプチド結合の阻害を示している。
【図１Ｃ】図１は、ＧＲＰ９４の最小部分を示したものであり、これでペプチド結合は十分である。図１Ｃは、Ｎ１−３５５−ヨウ素化ペプチド複合体のトロンビン消化を示したものである。Ｃ．Ｂ．は、トロンビンによる部分的なタンパク質分解の後のクーマシーブルー染色ゲルであり、組換えタンパク質が２つの断片に切断されていることを示している。１２５Ｉは、同じゲルのオートラジオグラフィーであり、ヨウ素化ペプチドは、より大きなトロンビン断片とともに共遊走することを示している。α−Ｈｉｓは、Ｎ−末端Ｈｉｓタグに対するウエスタンブロットであり、２２．４ｋＤａのバンドはＮ−末端断片として確認できる。９Ｇ１０は、酸性度メイン内に存在するエピトープに対するウエスタンブロットであり、１４．６ｋＤａのバンドはＣ−末端断片として確認できる。ゲルの上部にあるより大きなバンドは、未消化物質である。
【図２Ａ】図２は、分子ドッキングモデルを示したものである。マウスＧＲＰ９４の関連配列（アミノ酸４６〜２６９）は、ＢｉｏＳｙｍソフトウェアを用いて、酵母ＨＳＰ９０（ＰＤＢファイル１ＹＥＲ；［２０］）のＮ末端ドメインの解決された構造を介して構成され、エネルギーは最小化させた。前記ペプチドＶＳＶ８の構造は、ＶＳＶ８及びＭＨＣクラスＩＫｂの複合体の解決された構造［９］から選択された。次にＶＳＶ８は、ＰａｔｃｈＤｏｃｋ（Ｓｃｈｎｅｉｄｍａｎ−Ｄｕｈｏｖｎｙ，Ｄ．，Ｙ．Ｉｎｂａｒ，Ｖ．Ｐｏｌａｋ，Ｍ．Ｓｈａｔｓｋｙ，Ｉ．Ｈａｌｐｅｒｉｎ，Ｈ．Ｂｅｎｙａｍｉｎｉ，Ａ．Ｂａｒｚｉｌａｉ，Ｏ．Ｄｒｏｒ，Ｎ．Ｈａｓｐｅｌ，Ｒ．Ｎｕｓｓｉｎｏｖ，  ａｎｄ  Ｈ．Ｊ．Ｗｏｌｆｓｏｎ．２００３．Ｔａｋｉｎｇ  ｇｅｏｍｅｔｒｙ  ｔｏ  ｉｔｓ  ｄｅｇｅ：ｆａｓｔ  ｕｎｂｏｕｎｄ  ｒｉｇｉｄ（ａｎｄ  ｈｉｎｇｅ−ｂｅｎｔ）ｄｏｃｋｉｎｇ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ５２：１０７）を用いてモデル化ＧＲＰ９４構造へドッキングされ、ＭＨＣクラスＩと同様な高次構造内のＧＲＰ９４へ結合すると予想された。最高ランキングドッキング解法（ソリューション）が示された。これらは、２つの可能部位の間で分割され、それぞれパネルＡ及びＢにおいて緑色で示されている。図２Ａは、ラディシコール／ゲルダナマイシン結合部位を部分的に重複する３つのペプチドドッキング解法を示している。左のパネルは、βシートの軸に沿ったＣ末端からの側面図である。右のパネルは、底面図である。白い楕円は、ラディシコール結合部位のアウトラインである。
【図２Ｂ】図２は、分子ドッキングモデルを示したものである。マウスＧＲＰ９４の関連配列（アミノ酸４６〜２６９）は、ＢｉｏＳｙｍソフトウェアを用いて、酵母ＨＳＰ９０（ＰＤＢファイル１ＹＥＲ；［２０］）のＮ末端ドメインの解決された構造を介して構成され、エネルギーは最小化させた。前記ペプチドＶＳＶ８の構造は、ＶＳＶ８及びＭＨＣクラスＩＫｂの複合体の解決された構造［９］から選択された。次にＶＳＶ８は、ＰａｔｃｈＤｏｃｋ（Ｓｃｈｎｅｉｄｍａｎ−Ｄｕｈｏｖｎｙ，Ｄ．，Ｙ．Ｉｎｂａｒ，Ｖ．Ｐｏｌａｋ，Ｍ．Ｓｈａｔｓｋｙ，Ｉ．Ｈａｌｐｅｒｉｎ，Ｈ．Ｂｅｎｙａｍｉｎｉ，Ａ．Ｂａｒｚｉｌａｉ，Ｏ．Ｄｒｏｒ，Ｎ．Ｈａｓｐｅｌ，Ｒ．Ｎｕｓｓｉｎｏｖ，  ａｎｄ  Ｈ．Ｊ．Ｗｏｌｆｓｏｎ．２００３．Ｔａｋｉｎｇ  ｇｅｏｍｅｔｒｙ  ｔｏ  ｉｔｓ  ｄｅｇｅ：ｆａｓｔ  ｕｎｂｏｕｎｄ  ｒｉｇｉｄ（ａｎｄ  ｈｉｎｇｅ−ｂｅｎｔ）ｄｏｃｋｉｎｇ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ５２：１０７）を用いてモデル化ＧＲＰ９４構造へドッキングされ、ＭＨＣクラスＩと同様な高次構造内のＧＲＰ９４へ結合すると予想された。最高ランキングドッキング解法（ソリューション）が示された。これらは、２つの可能部位の間で分割され、それぞれパネルＡ及びＢにおいて緑色で示されている。図２Ｂは、βシートの一部の上をマッピングした４つのドッキング解法である。左のパネルは、図２Ａと同様な、βシートの軸に沿った図である。右のパネルは、上面図である。１つのシステイン及び３つのヒスチジンは、それぞれ黄色と淡い青色の円柱状の線で示されている。赤い矢印は、Ｃｙｓ１１７、赤い矢じり（ａｒｒｏｗｈｅａｄ）は、Ｈｉｓ１２５であり、Ａ〜Ｈは、βシート鎖を示している。
【図３Ａ】図３は、ラディシコール−屈折変異体Ｎ３４−３５５  Ｄ１２８Ｎ、Ｇ１３２Ａがまだペプチドに結合することを示した図である。図３Ａは、Ｎ３４−３５５（ＲａｄＲ）のＤ１２８Ｎ、Ｇ１３２Ａ変異体は、ラディシコール処理Ｎ３４−３５５（ＷＴ）に対して屈折性を有しておりＲａｄＲタンパク質は、１５分間、ＤＭＳＯ若しくはラディシコールとインキュベートされ、ブルーネガティブゲルで解析された。ラディシコール結合ＷＴタンパク質は、タンパク質内の構造変化［１５］のため、ゲルにおいて素早く移動した。ラディシコールへ結合するためのＲａｄＲタンパク質の能力は、劇的に減少した。黒矢印は、非修飾タンパク質、白矢印は、ラディシコール結合タンパク質を示している。
【図３Ｂ】図３は、ラディシコール−屈折変異Ｎ３４−３５５  Ｄ１２８Ｎ、Ｇ１３２Ａがまだペプチドに結合することを示した図である。図３Ｂは、ＲａｄＲ変異体によるペプチド結合がラディシコールによって影響を受けず、ＷＴタンパク質の飽和性と同様な飽和性を有していることを示したものである。Ｎ３４−３５５及びＲａｄＲタンパク質のＶＳＶ８への結合は、プレートアッセイ（実験手順を参照のこと）によって測定された。黒いバーは、阻害剤非存在下での結合、灰色のバーは、ラディシコール存在下での結合を示している。データは、３つ組サンプルの平均値である。
【図３Ｃ】図３は、ラディシコール−屈折変異Ｎ３４−３５５  Ｄ１２８Ｎ、Ｇ１３２Ａがまだペプチドに結合することを示した図である。図３Ｃは、Ｎ３４−３５５及びＲａｄＲタンパク質の用量結合を示したものである。ＶＳＶ８ペプチドへの結合は、プレートアッセイによって測定された。丸は、ＷＴタンパク質、四角は、ＲａｄＲ変異体を示している。データは、３つ組サンプルの平均値である。
【図４Ａ】図４は、予想されるペプチド結合部位が深い疎水性ポケットと、阻害剤結合部位とに近接していることを示したものである。図４Ａは、ＧＲＰ９４及びＨＳＰ９０のＮ末端ドメインの一部の複数配列の配列比較を示したものである。配列上の黒線は、ストランドＧ及びＦ（パネルＢを参照のこと）を示しており、それぞれＣｙｓ１１７及びＨｉｓ１２５を含むものである。配列下の赤線は、部分的配列内の阻害剤結合ポケット構成物を示している［１７、２０］。緑線は、ＨＳＰ９０における３５アミノ酸を示しており、この位置はゲルダナマイシン結合と、遊離高次構造との間で異なっている。これらは、ＨＳＰ９０残基１００〜１３４（括弧内の番号）は、ＧＲＰ９４の残基１３５〜１７４に一致する。黄色のハイライトは１２５位、灰色のハイライトはＡｓｐ１２８及びＧｌｙ１３２（ＲａｄＲ変異体において変異された残基）、緑色のハイライトはＩｌｅ１１５、Ｌｅｕ１２４、及びＶａｌ１２６（疎水性ポケットに寄与している残基）を示している。疎水性ポケットからの他の残基は、Ｌｅｕ８０、Ｉｌｅ８４、Ｌｅｕ２４０、Ｉｌｅ２４３、Ｖａｌ２４７、Ｉｌｅ２５４、Ｉｌｅ２５８、Ｐｒｏ２５９、及びＶａｌ２６０である。アミノ酸は、Ｅ或いはＤに対しては青色で、Ｋ、Ｒ或いはＨに対しては赤色、Ｎ或いはＱに対しては紫色、Ｆ或いはＹに対しては緑色、Ｃに対しては茶色、Ａ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔに対しては黒色、及びＩ、Ｌ、Ｍ、Ｖに対しては黄色で示してある。
【図４Ｂ】図４は、予想されるペプチド結合部位が深い疎水性ポケットと、阻害剤結合部位とに近接していることを示したものである。図４Ｂは、疎水性ポケットのモデルを示したものである。スペースフィル（ｓｐｅｃｅｆｉｌｌ）モデル（左のパネル）は、図２Ｂと同様な図のタンパク質を示している。ペプチドは、淡い緑で示されている。濃い緑色は、残基Ｉ、Ｌ、及びＶ、青色はＦ、紫色はＴ、茶色はＰ、黄色はＣ、淡い青色はＨを示している。赤矢印はＣｙｓ１１７、赤矢じりはＨｉｓ１２５を示している。赤の点線は、ｂｉｓ−ＡＮＳへの架橋を示す残基のおおよその位置を示している［２２］。
【図５Ａ】図５は、ペプチド結合がＣｙｓ１１７を含む疎水性ポケットの環境に影響を及ぼすことを示したものである。図５Ａは、ペプチドＡ結合がＮ１−３５５−結合ＡＮＳの発光に影響を及ぼすことを示したものである。Ｎ１−３５５は、まずＡＮＳと反応し（Ｎ１−３５５−ＡＮＳ）、次に飽和量のペプチドＡと結合した。Ｎ１−３５５−ＡＮＳの発光最大値は、４７８ｎｍであり、これは高度な疎水性環境であることを示している。ペプチドＡの付加は、Ｎ１−３５５−ＡＮＳの蛍光を部分的に消光するが、遊離ＡＮＳはしない。Ｎ１−３５５自体は、示された波長範囲においては蛍光ではない。
【図５Ｂ】図５は、ペプチド結合がＣｙｓ１１７を含む疎水性ポケットの環境に影響を及ぼすことを示したものである。図５Ｂは、アクリロダンが予想された疎水性ポケット内のＣｙｓと共有結合的に結合することを示したものである。Ｎ１−３５５及びＮ３４−３５５は、４０℃で一晩、アクリロダンと反応させた。タンパク質なしで同一量のアクリロダンを有するサンプルを、対照とした。次に各サンプルの半分量を、グアニジン塩化物に最終濃度が６Ｍとなるまで添加し、残りには当量のバッファーを添加した。非変性条件下でＮ１−３５５−結合アクリロダンの発光最大値は、約４７３ｎｍであり、これは、高度な疎水性環境であることを示している。６Ｍグアニジン塩化物において、発光最大値は、Ｎ１−３５５−結合、及び遊離アクリロダンの両方に対して約５２２ｎｍであったが、一方、タンパク質結合アクリロダンの蛍光強度は、遊離色素よりも著しく高く、これは共有結合を意味している。
【図５Ｃ】図５は、ペプチド結合がＣｙｓ１１７を含む疎水性ポケットの環境に影響を及ぼすことを示したものである。図５Ｃは、アクリロダン共役Ｎ１−３５５が非共役Ｎ１−３５５と同程度でペプチドと結合することを示したものである。遊離或いはアクリロダン−共役タンパク質（３．６μＭ）は、飽和条件下で８００ｍＭ  １２５Ｉ−ＶＳＶ８と反応させ、非結合ペプチドは、スピンカラムを用いて除去された［１５］。遊離１２５ＩＶＳＶ８は、非結合ペプチドの効率的な除去を調節するために用いられた。Ｎ１−３５５及びＮ１−３５５−ａｃｒは、それぞれ遊離及びアクリロダン共役タンパク質を意味しており、Ｎ１−３５５＋ＶＳＶ８＊及びＮ１−３５５−ａｃｒ＋ＶＳＶ８＊は、同じタンパク質が１２５Ｉ−ＶＳＶ８に結合していることを意味しており、ＶＳＶ８＊は、遊離１２５Ｉ−ＶＳＶ８ペプチドを意味している。
【図５Ｄ】図５は、ペプチド結合がＣｙｓ１１７を含む疎水性ポケットの環境に影響を及ぼすことを示したものである。図５Ｄは、Ｎ１−３５５に共有結合的に結合したアクリロダンの蛍光がペプチドの付加によって影響を受けることを示したものである。ＶＳＶ８（８００ｍＭ最終濃度）若しくは同等量のバッファーの存在下でのアクリロダン共役Ｎ１−３５５の蛍光発光スキャンは、励起波長３９０ｎｍで測定された。ＶＳＶ８単独は、測定された波長範囲内では蛍光を示さなかった。
【図６Ａ】図６は、ペプチド結合がＨｉｓ残基を必要とすることを示したものである。図６Ａは、ペプチド結合がｐＨ依存性であることを示したものである。Ｎ１−３５５のペプチドＶＳＶ８への結合は、［１５］に記載された溶液結合アッセイを用いて様々なｐＨ値で測定された。ｐＨ７．２において、Ｈｅｐｅｓ若しくはＰｉｐｅｓは、同様の結果で使用され、平均値は、１００％に設定した。ＨｅｐｅｓはｐＨ８．２で用い、ＰｉｐｅｓはｐＨ６．２で使用し、標準ｐＨの７．２で得られた値で規準化された平均結合値を有していた。
【図６Ｂ】図６は、ペプチド結合がＨｉｓ残基を必要とすることを示したものである。図６Ｂは、ペプチド結合がイミダゾールに感受性を有していることを示したものである。Ｎ３４−３５５のペプチドＡへの結合は、９６ウェルプレートアッセイ（実験手順を参照のこと）を用いて測定された。イミダゾールは、指示された最終濃度まで添加され、各濃度の結合は、イミダゾールなしのもので規準化した。ラディシコール存在下でのペプチド結合は、非特異的結合の測定値として示された。三角は阻害剤の非存在下での結合、四角はラディシコールの存在下での結合を示す。
【図６Ｃ】図６は、ペプチド結合がＨｉｓ残基を必要とすることを示したものである。図６Ｃは、結合活性がＤＥＰＣ修飾によって消滅されることを示したものである。組換えＮ３５５のＨｉｓ６タグは、取り扱い説明書（Ｎｏｖａｇｅｎ）に従って、因子Ｘａによって切断され、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを用いてタンパク質再精製を行った。タンパク質は、ここに記載されたようにＤＥＰＣで処理し、ヒスチジン選択的に修飾した。一部の修飾されたタンパク質は、０．４Ｍヒドロシキルアミン（ＨＡ）で処理され、ＤＥＰＣ作用を逆転させた。エタノールでの修飾は、溶液対照として用いられた。ラディシコール処理は、特異的ペプチド結合を測定するために用いられた。未処理及び修飾タンパク質は、ペプチドＡコーティングプレート（０．７μｇタンパク質／ウェル）に結合され、結合はＨＲＰ−ヤギ抗−ラット（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）に続いて、９Ｇ１０  Ｍａｂ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ）との間接的な反応によって定量化された。３つ組データポイントは、それぞれの実験からのものである。ＤＥＰＣは、結合をバックグラウンドレベルまで減少したが、一方ＨＡは、ＤＥＰＣ効果を完全に逆転させた。Ｈｉｓ６タグの除去は、有効性或いは結合の特異性に全く影響を及ぼさなかった。Ｒはラディシコール、Ｅｔはエタノール、ＤＥＰはＤＥＰＣでの処理、ＨＡはヒドロキシルアミンに続きＤＥＰＣでの処理を意味している。
【図７Ａ】図７は、部位直接的変異原性によってペプチド結合に対するヒスチジン１２５の重要性を明らかにされることを示しているものである。図７Ａは、Ｈｉｓ１２５の改変がペプチドＡへのＮ３４−３５５結合に影響を及ぼすことを示している。野生型Ｎ３４−３５５、Ｈ１２５Ｙ、或いはＨ１２５Ｄタンパク質は、金属キレートクロマトグラフィーによって精製され、ペプチドへ結合するその能力は、プレートアッセイ（方法を参照のこと）でテストされた。ラディシコール（３００μＭ）による阻害は、特異性対照として用いられた（Ｒａｄ）。結合は、ＷＴタンパク質に対する結合飽和のレベルに基づいて、２つのタンパク質インプット（入力）レベル（０．７或いは２μｇ）で測定された。示されたデータは平均値であり、２回の実験の３つ組ポイントの標準エラーである。黒色バーは、０．７μｇタンパク質、灰色バーは、２μｇタンパク質を示している。
【図７Ｂ】図７は、部位直接的変異原性によってペプチド結合に対するヒスチジン１２５の重要性を明らかにされることを示しているものである。図７Ｂは、野生型及びＨ１２５Ｙの分数占有曲線を示したものである。ペプチド結合タンパク質の量は、各タンパク質に対する飽和結合レベルの分数として計算され、タンパク質のインプットの機能として示された。黒色四角は、野生型タンパク質に対する３回の独立した用量結合実験からの値である。白色四角は、Ｈ１２５Ｙに対する３回の独立した実験からの値である。
【図７Ｃ】図７は、部位直接的変異原性によってペプチド結合に対するヒスチジン１２５の重要性を明らかにされることを示しているものである。図７Ｃは、Ｈ１２５Ｄ変異体がラディシコール結合に対して予想された構造変化を示すことを示したものである。Ｈ１２５Ｄ及びＨ１２５Ｙは、ブルーネガティブゲル電気泳動を用いてＷＴタンパク質と比較された。各タンパク質（１０μｇ）は、３００μＭラディシコール或いはＤＭＳＯで処理され、次に各２つの隣接するゲルレーンに添加された。電気泳動後、ゲルをクーマシーブルーで染色した。野生型及びＨ１２５Ｄタンパク質は、モノマーとしてほぼ移動し、特有のラディシコール誘導性移動度シフトは両者に見られた。Ｈ１２５Ｙタンパク質もモノマーとして移動したけれども、２つの異なる高次構造で存在した。約半分のＨ１２５Ｙは、ラディシコール非存在下でさえも移動度の増加を示したが、他の半分は予想された移動度とラディシコール誘導性高次構造変化の両方を示した。黒矢印は非結合タンパク質、白矢印はラディシコール結合タンパク質を示している。
【図８Ａ】図８は、マウスＧＲＰ９４遺伝子の標的化破壊を示したものである。図８Ａは、マウス遺伝子及び標的ベクターの模式図である。ＧＲＰ９４遺伝子の１６エクソン（黒ボックス）、及びイントロン（細い線、長さはエクソンプライマーＰＣＲ及び／若しくはシークエンス解析によって決定された）は、エクソン１１及び１８の間のギャップと共に、縮小して記載されている。標的ベクターは、ＰＣＲ増幅によって産生された１．２ｋｂの５’相同性、及びＥｃｏＲＶ断片における８．０ｋｂの３’相同性を含む。ｎｅｏ耐性カセットは、成熟タンパク質の中にエクソン３，６１アミノ酸の末端でコード領域を中断した。その転写配向は、ＧＲＰ９４の配向と反対であり、矢印によって示されている。５’相同性領域は、ｔｋと隣接しており、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子は、ネガティブ選択に対して用いた。
【図８Ｂ】図８は、マウスＧＲＰ９４遺伝子の標的化破壊を示したものである。図８Ｂには、２つのマウスにおける正確な標的化は、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）或いはＥｃｏＲＩ（Ｒ）での消化後、挿入（パネルＡの矢印を参照のこと）の５’に位置したプローブＡでのサザンブロットによって決定されたことが示されている。
【図９ａ】図９は、Ｇｒｐ９４−／−胚が原腸形成に失敗したことを示すものである。図９Ａ〜Ｈは、ＷＴ（左パネル）及び変異体（右パネル）胚の組織学的及び免疫染色解析を示したものである。Ｅ５．５胚（Ａ〜Ｄ）及びＥ６．５胚（Ｅ〜Ｈ）は、材料及び方法に記載されたように、固定され、切片化され、ヘマトキシリン及びエオシン（ＨとＥ、Ａ〜Ｂ、Ｅ〜Ｆ）或いはＭａｂ  ９Ｇ１０（αＧＲＰ９４、Ｃ〜Ｄ、Ｇ〜Ｈ）で染色された。ＶＥは内臓内胚葉、ＥＰＣは栄養膜錐体を示す。パネルＥ〜Ｆ内の＊は、前羊膜腔の発生を示している。
【図９ｂ】図９は、Ｇｒｐ９４−／−胚が原腸形成に失敗したことを示すものである。図９Ｉ〜Ｌは、Ｅ７．５胚の組織学的解析によって、ＷＴ胚（Ｉ）と比較して、変異胚（Ｊ）において、中胚葉形成の欠損、及び空洞化の欠損が見られたことを示すものである。ＰＡ  Ｃａｖは前羊膜腔、ＥＣ  Ｃａｖは胚外腔、ＰＥは頭頂内胚葉を示す。パネルＩにおける二重矢印、及びパネルＫにおける矢印は、胚性及び胚外領域の間の接合を占め得している。Ｋは、ＷＴ内胚葉のより高度な拡大率画像であり、接合部の胚外側における細胞の立方状構造、及び接合部の胚側内胚葉細胞上の扁平上皮形態を示している。Ｌは、変異体胚の同様な図であり、接合部の両側上のＶＥ細胞は立方状である。前羊膜腔に対する証拠がないことに注意する。ＰＥ細胞は変異体及びＷＴ胚において違いは見られなかった。
【図１０】図１０は、前原腸形成胚におけるＧＲＰ９４の発現を示したものである。抗−ＧＲＰ９４モノクローナル抗体である９Ｇ１０による、Ｅ５．５（Ａ）及びＥ６．５（Ｂ）ＷＴ胚の免疫組織化学を示した。示された切片は、複数サンプルの代表例であり、材料及び方法に記載されたように染色された。矢じりは、高タンパク質発現を現している内臓内胚葉細胞のクラスターを指し示している。バーは、（Ａ）では５０μｍ、及び（Ｂ）では１００μｍである。
【図１１】図１１は、ｇｒｐ９４−／−胚が原条を発生しないことを示したものである。ｇｒｐ９４変異胚における発生的マーカーの解析は、全マウントｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによってなされた。全てのペアにおいて、ＷＴ胚は左側に、変異胚は右側に示した。全ての胚は、表示されない限りＥ７．５である。示されたこれらの図は、各マーカーに対する２〜７同腹仔からの代表的な変異体及びＷＴ胚である。図１１Ａより、Ｏｃｔ４は、Ｅ６．５の胚盤葉上層に亘って正常に発現し、後半ではＷＴ胚においてＥ７．５で原条（ｐｓ）に局在化していた。変異体は、胚盤葉上層全体の発現が維持されていた。図１１Ｂより、Ｅ７．５でのＯｔｘ２発現は正常胚の前領域に局在化されていたが、変異体では胚盤葉上層全体に発現されていた。図１１Ｃより、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙは、正常胚においてＥ７．５で原条において発現されていたが、Ｅ７．５変異胚では検出できなかった。図１１Ｄより、Ｅｏｍｅｓは、Ｅ６．５で胚外外胚葉（ｅｅ）及び発生原条で発現されており、後半、ＷＴ胚においてＥ７．５で原条に局在化されていた。Ｅ７．５の変異胚はＥ６．５のＷＴ胚と共通していた。図１１Ｅは、Ｅ６．５におけるＢｍｐ４発現を示している。Ｂｍｐ４は、正常胚及び変異は位の両者の近位胚外外胚葉において正常に発現していた（矢印）。図１１Ｆより、Ｂｍｐ４発現は、ＷＴ胚の胚外（ｅｘｏｃｏｅｌｏｍｉｃ）腔（ｅｃ）を裏打ちする胚外中胚葉においてＥ７．５でも検出された。変異胚は、矢印で示されたように、近位胚外外胚葉にのみＢｍｐ４を発現した。図１１Ｇにより、Ｌｉｍ１はＷＴ  Ｅ７．５胚のＡＶＥ及び中胚葉翼において発現されていたが、変異体においては、中胚葉発現は見られなかった。
【図１２】図１２は、中胚葉性マーカーの転写の解析を示したものである。図１２Ａにおいて、ｃＤＮＡは、母系組織から注意深く切り離された完全Ｅ７．５胚から調整された。１つの野生型（ＷＴ）及び２つのｇｒｐ９４−／−胚（ＫＯ１及びＫＯ２）が示されている。インプットｃＤＮＡの量は、ＰＣＲ反応の直線範囲におけるＨＰＲＴプライマーを用いて規準化された（レーン１〜６）。レーン１〜３、７〜９は、それぞれ０．２５、０．１２５、０．０６３μｌのＷＴｃＤＮＡである。レーン４〜５、１０〜１１は、２つの分離−／−胚からの１．５μｌのｇｒｐ９４−／−ｃＤＮＡである。図１２Ｂにおいて、Ａと同様なｃＤＮＡは、基準初期中胚葉マーカーであるｂｒａｃｈｙｕｒｙの発現を推測するために用いられた。インプットｃＤＮＡの違いを調整すると、ＫＯ１からのシグナルは、ＫＯ２からのシグナルより約４倍強かったが、ＷＴｃＤＮＡより２桁小さかった。示された実験は、４分の１である。図１２Ｃは、Ｅｏｍｏｓ発現のＲＴ−ＰＣＲ定量を示したものである。ｃＤＮＡインプットは、β−チューブリンの増幅物を用いて規準化された。２つのＷＴ及び２つの変異体（ＫＯ）胚の５分の１が示されている。図１２Ｄは、ＶＥマーカー発現のＲＴ−ＰＣＲ解析を示したものである。３つのＷＴ及び３つのＫＯ胚からのｃＤＮＡを比較し、β−チューブリン発現に対して規準化された。ＴＴＲはトランスサイレチン、ＴＦＮはトランスフェリン、ＡＦＰはαフェトタンパク質、ＡｐｏＡ１はアポリポタンパク質Ａ１、ＡｐｏＥはアポリポタンパク質Ｅ、ＲＢＰはレチノール結合タンパク質を示している。
【図１３】図１３は、ヘテロ接合体マウスが正常であることを示したものである。図１３Ａより、ｇｒｐ９４−／−マウスにおいて、ＧＲＰ９４タンパク質は５０％減少した。肝臓ホモジェネート液をヘテロ接合体及びＷＴマウスから調整し、総タンパク質の等量を左から右に向かって希釈シリーズ（１００、５０、２５μｇ）で添加し、抗ＧＲＰ９４（９Ｇ１０）（上のパネル）、或いは抗βチューブリン（下のパネル）を用いた免疫ブロットによって解析した。３つのＧＲＰ９４バンドは、完全長タンパク質、及び２つの小さい消化産物であり、肝臓抽出物において共通して見られるものである。示されたブロットは、４つの反復の代表例である。基本的に同じ結果が脾臓溶解液の解析によっても得られた。図１３Ｂは、脾細胞上の表面マーカーの発現を示したものである。ヘテロ接合体（ＨＥＴ）或いはＷＴマウスからの脾臓細胞は、培養し、５０μｇ／ｍｌＬＰＳで処理し、Ｂ細胞の増殖を開始させ、Ｉｇ分泌細胞へ分化させた。３日後、Ｔ細胞に対するマーカーである抗ＣＤ３抗体（右の灰色）、或いはＢ細胞に対するマーカーである抗ＩｇＭ抗体（濃い灰色）で染色した。黒線は、非染色細胞を意味している。図１３Ｃは、脾細胞におけるＩｇ分泌の誘導を示したものである。ヘテロ接合体或いはＷＴマウスからの脾臓細胞は、上述したように５０μｇ／ｍｌＬＰＳで処理し、３日後培地中のＩｇのレベルを、抗−μ抗体或いは抗−κ抗体を用いたＥＬＩＳＡによって決定した。ＬＰＳ処理前後の培地中のＩｇの割合は、各脾臓培養に対して計算し、誘導の大きさとしてプロットした。
【図１４】図１４は、ｇｒｐ９４−／−細胞の増殖とストレス反応を示したものである。野生型及び変異ＥＳ細胞クローンは、Ｅ３．５胚盤胞から確立し、支持細胞なしで増殖するように適応させた。細胞は、高グルコース培地（４．５Ｌ）（図１４Ａ）で増殖させる、若しくは低（０．１ｇ／Ｌ）グルコース培地（図１４Ｂ）で増殖するように適応させ、次にその増殖率を１週間後に測定した（ｎ＝３）。図１４Ｃは、血清欠乏に対する変異細胞の感受性を示したものである。血清を時間０で除去し、生存接着細胞を指示された時間で計測した（ｎ＝４）。脱離した細胞の全ては、トリパンブルー陽性であり、完全な培地に取り替えた際に増殖しない。青の四角はクローン４２．１のＷＴ細胞、赤の丸はクローン１４．１の変異細胞を示している。図１４Ｄは、タプシガルジン（Ｔｇ）への異なる感受性を示したものである。ＷＴ及び変異ＥＳ細胞を、３００ｎＭタプシガルジン（＋）で処理する、若しくはニセ（ｍｏｃｋ）処理（−）し、その生存度を６時間後（ＷＴ細胞への細胞毒性が限界に近い時間）に観察した。図１４Ｅ〜Ｆより、ＷＴ及び変異ＥＳ細胞が１ｍＭＥＧＴＡの存在下或いは非存在下、指示された時間で増殖するか、その生存度を評価された。
【図１５】図１５は、ＧＲＰ９４欠損細胞が血清除去に対して感受性を有することを示したグラフである。
【図１６】図１６は、ＧＲＰ９４のＮ末端ドメインが樹状細胞によって取り込まれることを示した顕微鏡写真及び結合アッセイである。
【図１７】図１７は、ＧＲＰ９４ノックアウト（ＫＯ）細胞が全ての３胚葉から細胞タイプへ分化できることを示した一連の顕微鏡写真である。
【図１８】図１８は、ＧＲＰ９４欠損細胞が筋肉へは分化しないことを示した一連の顕微鏡写真とブロットである。
【図１９】図１９は、ノックアウト（ＫＯ）胚はＥ６．５周辺で停止することを示した一連の顕微鏡写真である。
【図２０】図２０は、Ｔ細胞へのペプチド提示に対するＳｒｉｖａｓｔａｖａモデルを示している。末期腫瘍細胞１０由来のＧＲＰ９４の分画を、腫瘍特異的ペプチドと共に添加した。これは、特定の樹状細胞及びマクロファージ（ＡＰＣ）の原形質膜上のＣＤ９１と結合し、その結果、受容体仲介性エンドサイトーシスによって内部移行された。エンドソームコンパートメントにおいて、前記ペプチドは、ＧＲＰ９４から解離され、ＡＰＣのサイトゾルへ押し出され、次に小胞体ペプチド輸送体（ＴＡＰ）を介してＥＲ内腔へ輸送され、これは、新しく合成されたクラスＩ分子２０及び２２へ含まれる。次に、含まれたクラスＩは、原形質膜へ輸送され、ここのいてＴ細胞によって認識されるように腫瘍由来ペプチドを提示する。いくつかのペプチドは、ＧＲＰ９４から放出された後及びクラスＩ分子へ含まれる前に、プロテオソーム３０によって整形される。
【図２１】図２１は、ペプチド結合アッセイを示している。複数ウェルプレート（９６）は、指示されたペプチドでコーティングし、次に阻害剤であるラディシコールの非存在下或いは存在下で、ＧＲＰ９４のアミノ酸３４〜３５５からなるＨｉｓ６タグ化Ｎ３５５とインキュベートした。各反応は、０．７μモルシャペロンを含む。ＶＳＶ８及びＰｅｐＡは、ＧＲＰ９４バインダーペプチドとして知られており、一方ＮＹＬは非バインダーである。溶解液とは、細菌溶解液中の総タンパク質量を意味しており、それぞれ０．７μモルシャペロンを含み、これは結合の部分的阻害のみを説明しているものである。ペプチドコーティングプレートへのシャペロンの結合は、ＨＲＰ共役抗−Ｈｉｓ抗体によって検出された。
【図２２Ａ】図２２Ａ及び図２２Ｂは、完全長ＧＲＰ９４に対するタンパク質及び核酸配列を示している。図２２Ａは、ＧＲＰ９４タンパク質配列（配列ＩＤ番号２）を示している。
【図２２Ｂ】図２２Ａ及び図２２Ｂは、完全長ＧＲＰ９４に対するタンパク質及び核酸配列を示している。図２２Ｂは、ＧＲＰ９４核酸（配列ＩＤ番号１）を示している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ−９Ｈ】
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【図９Ｉ−９Ｌ】
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【図１０Ａ−１０Ｂ】
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【図１１Ａ−１１Ｇ】
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【図１２Ａ−１２Ｄ】
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【図１３Ａ−１３Ｃ】
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【図１４Ａ−１４Ｆ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【国際調査報告】
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2007504840.tif 000051
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