(57)【要約】  本発明は、ウイルス性疾患に耐性があるトランスジェニック根茎及び敏感な接ぎ穂を含む接木植物に関するものであり、疾患に対する耐性は、接木植物全体がウイルス性疾患に耐性があるように、トランスジェニックウイルス耐性根茎から接ぎ穂に与えられる。本発明はさらに、接木型ウイルス耐性植物の生成法、及びそれによって生成される植物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ウイルスタンパク質の発現による以外のウイルス性疾患に耐性があるトランスジェニック根茎、及びウイルス性疾患に対して感受性がある接ぎ穂を含む植物であって、接木植物が前記ウイルス性疾患に耐性がある植物。
【請求項２】
ウイルス性疾患に耐性があるトランスジェニック根茎が、ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントと少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１に記載の植物。
【請求項３】
ウイルス性疾患に耐性があるトランスジェニック根茎が、ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントを標的とするｓｉＲＮＡを作製するために設計したＤＮＡ構築体を含む、請求項２に記載の植物。
【請求項４】
ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントが、ウイルスタンパク質又はその一部分をコードする、請求項２に記載の植物。
【請求項５】
ウイルスタンパク質がウイルスコートタンパク質、ウイルス複製タンパク質、ウイルス運動性タンパク質又はその一部分からなる群から選択される、請求項４に記載の植物。
【請求項６】
ウイルスタンパク質がウイルス複製タンパク質又はその一部分である、請求項５に記載の植物。
【請求項７】
トランスジェニック根茎が、土壌伝染性ウイルスによって引き起こされる疾患に耐性がある、請求項６に記載の植物。
【請求項８】
線虫伝播性ウイルス：ネポウイルス：アラビノモザイクウイルス、ブドウファンリーフウイルス、トマト黒色輪点ウイルス、イチゴ舌輪点ウイルス、トマト輪点ウイルス、及びタバコ輪点ウイルス；トブラウイルス：Ｐｅａ  ｅａｒｌｙ  ｂｒｏｗｎｉｎｇウイルス、タバコラットルウイルス及びコショウ輪点ウイルス；真菌伝播性ウイルス：キュウリ緑斑ウイルス、キュウリ黄化えそ病ウイルス、メロンえそ斑点ウイルス、アカクローバえそモザイク病ウイルス、カボチャえそウイルス、タバコ黄斑えそ病サテライトウイルス、レタスビッグベインウイルス、ペッパーイエローベインウイルス、ビートえそ性葉脈黄化ウイルス、ビート土壌伝染性ウイルス、オートムギ縞萎縮病ウイルス、ナンキンマメ斑紋ウイルス、ジャガイモモップトップウイルス、イネ縞葉枯病壊死ウイルス、土壌伝染性コムギ縞萎縮病ウイルス、オオムギマイルドモザイクウイルス、オオムギ黄萎ウイルス、オートムギモザイクウイルス、イネ壊死モザイクウイルス、コムギ条斑病モザイクウイルス及びコムギ黄萎モザイクウイルス；根の損傷によって伝播するウイルス：トバモウイルス属：タバコモザイクウイルス、トマトモザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクトバモウイルス、キュウリ果斑モザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクウイルス、オンドグロッサムリングスポットウイルス、パプリカ弱斑ウイルス、コショウ弱斑ウイルス、オオバコモザイクウイルス及びタバコ弱緑斑モザイクウイルス；及び未知の経路によって伝播するウイルス：オランダガラシ黄斑ウイルス、ソラマメネクロティックウイルトウイルス、ピーチロゼットモザイクウイルス及びサトウキビ退録条斑病ウイルスからなる群から選択される土壌伝染性ウイルスによって引き起こされる疾患から保護されている、請求項７に記載の植物。
【請求項９】
ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントが、キュウリ果斑モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）の複製タンパク質の断片である推定５４ｋＤａのタンパク質をコードする、請求項４に記載の植物。
【請求項１０】
推定５４ｋＤａのタンパク質をコードするウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントが配列番号１に記載の配列を有する、請求項９に記載の植物。
【請求項１１】
トバモウイルス属の土壌伝染性ウイルスによって引き起こされる疾患から保護されている、請求項１０に記載の植物。
【請求項１２】
ＣＦＭＭＶによって引き起こされる疾患から保護されている、請求項１１に記載の植物。
【請求項１３】
ウリ科である、請求項１２に記載の植物。
【請求項１４】
キュウリ属植物である、請求項１３に記載の植物。
【請求項１５】
ＤＮＡ構築体が少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ分子を形成するＲＮＡ配列をコードする核酸配列を含み、二本鎖ＲＮＡ分子がウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントの切断を仲介する、請求項３に記載の植物。
【請求項１６】
ＤＮＡ構築体が、
ａ．以下のものに動作可能に連結した少なくとも１つの植物の発現可能なプロモーター、
ｂ．少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡを形成するＲＮＡ配列をコードする核酸配列であって、二本鎖ＲＮＡ分子がウイルスゲノムの標的セグメントのセンスヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドの第１ヌクレオチド配列、及び前記ウイルスゲノムの前記標的セグメントのセンスヌクレオチド配列の相補配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドの第２ヌクレオチド配列を含む核酸配列、及び場合によっては、
ｃ．転写終了シグナル
を含む、請求項１５に記載の植物。
【請求項１７】
第１ヌクレオチド配列と第２ヌクレオチド配列がスペーサー配列によって隔てられている、請求項１６に記載の植物。
【請求項１８】
スペーサー配列がイントロンの配列を含む、請求項１７に記載の植物。
【請求項１９】
スペーサー配列が、配列番号３に記載の配列を有するヒマカタラーゼ遺伝子のイントロンを含む、請求項１８に記載の植物。
【請求項２０】
ＤＮＡ構築体が、同一プロモーターと動作可能に連結した第１及び第２ヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載の植物。
【請求項２１】
土壌伝染性ウイルス及び植物の気生部分に影響を与えるベクターによって伝播するウイルスからなる群から選択されるウイルスに耐性がある、請求項２０に記載の植物。
【請求項２２】
土壌伝染性ウイルスが線虫伝播性ウイルス：ネポウイルス：アラビノモザイクウイルス、ブドウファンリーフウイルス、トマト黒色輪点ウイルス、イチゴ舌輪点ウイルス、トマト輪点ウイルス、及びタバコ輪点ウイルス；トブラウイルス：Ｐｅａ  ｅａｒｌｙ  ｂｒｏｗｎｉｎｇウイルス、タバコラットルウイルス及びコショウ輪点ウイルス；真菌伝播性ウイルス：キュウリ緑斑ウイルス、キュウリ黄化えそ病ウイルス、メロンえそ斑点ウイルス、アカクローバえそモザイク病ウイルス、カボチャえそウイルス、タバコ黄斑えそ病サテライトウイルス、レタスビッグベインウイルス、ペッパーイエローベインウイルス、ビートえそ性葉脈黄化ウイルス、ビート土壌伝染性ウイルス、オートムギ縞萎縮病ウイルス、ナンキンマメ斑紋ウイルス、ジャガイモモップトップウイルス、イネ縞葉枯病壊死ウイルス、土壌伝染性コムギ縞萎縮病ウイルス、オオムギマイルドモザイクウイルス、オオムギ黄萎ウイルス、オートムギモザイクウイルス、イネ壊死モザイクウイルス、コムギ条斑病モザイクウイルス及びコムギ黄萎モザイクウイルス；根の損傷によって伝播するウイルス：トバモウイルス属：タバコモザイクウイルス、トマトモザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクトバモウイルス、キュウリ果斑モザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクウイルス、オンドグロッサムリングスポットウイルス、パプリカ弱斑ウイルス、コショウ弱斑ウイルス、オオバコモザイクウイルス及びタバコ弱緑斑モザイクウイルス；及び未知の経路によって伝播するウイルス：オランダガラシ黄斑ウイルス、ソラマメネクロティックウイルトウイルス、ピーチロゼットモザイクウイルス及びサトウキビ退録条斑病ウイルスからなる群から選択される、請求項２１に記載の植物。
【請求項２３】
植物の気生部分に影響を与えるベクターによって伝播するウイルスがカリモウイルス科、ジェミニウイルス科、サーコウイルス科、レオウイルス科、タルチチウイルス科、ブロモウイルス科、コモウイルス科、ポチウイルス科、トンブスウイルス科、セクイウイルス科、クロストロウイルス科及びルテオウイルス科；トバモウイルス、トブラウイルス、ポテックスウイルス、カルラウイルス、アレクシウイルス、カピロウイルス、フォベアウイルス、トリコウイルス、ブドウウイルス、フロウイルス、ペクルウイルス、ポモウイルス、ベニーウイルス、ホルデイウイルス、ソベモウイルス、マラフィウイルス、チモウイルス、イダエオウイルス、オウルミウイルス、ウンブラウイルスからなる群から選択される科である、請求項２１に記載の植物。
【請求項２４】
ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントが、ズッキーニ黄化モザイクウイルス（ＺＹＭＶ）のゲノムの３’端を含む、請求項１５に記載の植物。
【請求項２５】
ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントが配列番号２に記載の核酸配列を含む、請求項２４に記載の植物。
【請求項２６】
第１ヌクレオチド配列が、配列番号２に記載のヌクレオチド配列及びその断片と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１６に記載の植物。
【請求項２７】
第２ヌクレオチド配列が、配列番号２に記載のヌクレオチド配列の相補配列及びその断片と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項２６に記載の植物。
【請求項２８】
ポチウイルス科由来のウイルスによって引き起こされる疾患に耐性がある、請求項２７に記載の植物。
【請求項２９】
ＺＹＭＶに耐性がある、請求項２８に記載の植物。
【請求項３０】
核酸配列がプロモーター、エンハンサー、転写因子、スプライシングシグナル及び終了配列からなる群から選択される少なくとも１つの発現制御配列をさらに含む、請求項２に記載の植物。
【請求項３１】
プロモーターが構成性プロモーターである、請求項３０に記載の植物。
【請求項３２】
核酸配列が選択可能なマーカーをさらに含む、請求項３に記載の植物。
【請求項３３】
選択可能なマーカーが抗生物質耐性を与える産物をコードするポリヌクレオチド配列、及び検出可能な産物をコードするレポーター遺伝子から選択される、請求項３２に記載の植物。
【請求項３４】
転写終了シグナルがＮＯＳターミネーターである、請求項３０に記載の植物。
【請求項３５】
ウイルス性疾患に耐性がある植物を生成するための方法であって、
ａ．抗ウイルスタンパク質の発現による以外のウイルス性疾患に耐性があるトランスジェニック根茎を提供すること、
ｂ．前記ウイルス性疾患に対して感受性がある接ぎ穂を提供すること、及び
ｃ．接ぎ穂を根茎に接木させて前記ウイルス性疾患に耐性がある接木植物を得ること
を含む方法。
【請求項３６】
根茎をウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントと少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を用いて形質転換して、ウイルス性疾患に耐性があるトランスジェニック根茎を生成する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントを標的とするｓｉＲＮＡを作製するために設計したＤＮＡ構築体を用いて根茎を形質転換する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントが、ウイルスタンパク質又はその一部分をコードする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
ウイルスタンパク質がウイルスコートタンパク質、ウイルス複製タンパク質、ウイルス運動性タンパク質又はその一部分からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ウイルスタンパク質がウイルス複製タンパク質又はその一部分である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
トランスジェニック根茎が、土壌伝染性ウイルスによって引き起こされる疾患に耐性がある、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
線虫伝播性ウイルス：ネポウイルス：アラビノモザイクウイルス、ブドウファンリーフウイルス、トマト黒色輪点ウイルス、イチゴ舌輪点ウイルス、トマト輪点ウイルス、及びタバコ輪点ウイルス；トブラウイルス：Ｐｅａ  ｅａｒｌｙ  ｂｒｏｗｎｉｎｇウイルス、タバコラットルウイルス及びコショウ輪点ウイルス；真菌伝播性ウイルス：キュウリ緑斑ウイルス、キュウリ黄化えそ病ウイルス、メロンえそ斑点ウイルス、アカクローバえそモザイク病ウイルス、カボチャえそウイルス、タバコ黄斑えそ病サテライトウイルス、レタスビッグベインウイルス、ペッパーイエローベインウイルス、ビートえそ性葉脈黄化ウイルス、ビート土壌伝染性ウイルス、オートムギ縞萎縮病ウイルス、ナンキンマメ斑紋ウイルス、ジャガイモモップトップウイルス、イネ縞葉枯病壊死ウイルス、土壌伝染性コムギ縞萎縮病ウイルス、オオムギマイルドモザイクウイルス、オオムギ黄萎ウイルス、オートムギモザイクウイルス、イネ壊死モザイクウイルス、コムギ条斑病モザイクウイルス及びコムギ黄萎モザイクウイルス；根の損傷によって伝播するウイルス：トバモウイルス属：タバコモザイクウイルス、トマトモザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクトバモウイルス、キュウリ果斑モザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクウイルス、オンドグロッサムリングスポットウイルス、パプリカ弱斑ウイルス、コショウ弱斑ウイルス、オオバコモザイクウイルス及びタバコ弱緑斑モザイクウイルス；及び未知の経路によって伝播するウイルス：オランダガラシ黄斑ウイルス、ソラマメネクロティックウイルトウイルス、ピーチロゼットモザイクウイルス及びサトウキビ退録条斑病ウイルスからなる群から選択される土壌伝染性ウイルスによって引き起こされる疾患から植物を保護する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
トランスジェニック根茎が、キュウリ果斑モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）の複製タンパク質の断片である推定５４ｋＤａのタンパク質をコードする核酸配列を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
トランスジェニック根茎が、配列番号１に記載の配列を有する推定５４ｋＤａのタンパク質をコードする核酸配列を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
トバモウイルス属の土壌伝染性ウイルスによって引き起こされる疾患から植物を保護する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ＣＦＭＭＶによって引き起こされる疾患から植物を保護する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
植物がウリ科である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
植物がキュウリ属植物である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ＤＮＡ構築体が少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ分子を形成するＲＮＡ配列をコードする核酸配列を含み、二本鎖ＲＮＡ分子がウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントの切断を仲介する、請求項３７に記載の方法。
【請求項５０】
ＤＮＡ構築体が、
ａ．以下のものに動作可能に連結した少なくとも１つの植物の発現可能なプロモーター、
ｂ．少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡを形成するＲＮＡ配列をコードする核酸配列であって、二本鎖ＲＮＡ分子がウイルスゲノムの標的セグメントのセンスヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドの第１ヌクレオチド配列、及び前記ウイルスゲノムの前記標的セグメントのセンスヌクレオチド配列の相補配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドの第２ヌクレオチド配列を含む核酸配列、及び場合によっては、
ｃ．転写終了シグナル
を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
第１ヌクレオチド配列と第２ヌクレオチド配列がスペーサー配列によって隔てられている、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
スペーサー配列がイントロンの配列を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
スペーサー配列が配列番号３に記載の配列を有するヒマカタラーゼ遺伝子のイントロンを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ＤＮＡ構築体が同一プロモーターと動作可能に連結した第１及び第２ヌクレオチド配列を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
植物が土壌伝染性ウイルス及び植物の気生部分に影響を与えるベクターによって伝播するウイルスからなる群から選択されるウイルスに対して耐性がある、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
土壌伝染性ウイルスが線虫伝播性ウイルス：ネポウイルス：アラビノモザイクウイルス、ブドウファンリーフウイルス、トマト黒色輪点ウイルス、イチゴ舌輪点ウイルス、トマト輪点ウイルス、及びタバコ輪点ウイルス；トブラウイルス：Ｐｅａ  ｅａｒｌｙ  ｂｒｏｗｎｉｎｇウイルス、タバコラットルウイルス及びコショウ輪点ウイルス；真菌伝播性ウイルス：キュウリ緑斑ウイルス、キュウリ黄化えそ病ウイルス、メロンえそ斑点ウイルス、アカクローバえそモザイク病ウイルス、カボチャえそウイルス、タバコ黄斑えそ病サテライトウイルス、レタスビッグベインウイルス、ペッパーイエローベインウイルス、ビートえそ性葉脈黄化ウイルス、ビート土壌伝染性ウイルス、オートムギ縞萎縮病ウイルス、ナンキンマメ斑紋ウイルス、ジャガイモモップトップウイルス、イネ縞葉枯病壊死ウイルス、土壌伝染性コムギ縞萎縮病ウイルス、オオムギマイルドモザイクウイルス、オオムギ黄萎ウイルス、オートムギモザイクウイルス、イネ壊死モザイクウイルス、コムギ条斑病モザイクウイルス及びコムギ黄萎モザイクウイルス；根の損傷によって伝播するウイルス：トバモウイルス属：タバコモザイクウイルス、トマトモザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクトバモウイルス、キュウリ果斑モザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクウイルス、オンドグロッサムリングスポットウイルス、パプリカ弱斑ウイルス、コショウ弱斑ウイルス、オオバコモザイクウイルス及びタバコ弱緑斑モザイクウイルス；及び未知の経路によって伝播するウイルス：オランダガラシ黄斑ウイルス、ソラマメネクロティックウイルトウイルス、ピーチロゼットモザイクウイルス及びサトウキビ退録条斑病ウイルスからなる群から選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項５７】
植物の気生部分に影響を与えるベクターによって伝播するウイルスがカリモウイルス科、ジェミニウイルス科、サーコウイルス科、レオウイルス科、タルチチウイルス科、ブロモウイルス科、コモウイルス科、ポチウイルス科、トンブスウイルス科、セクイウイルス科、クロストロウイルス科及びルテオウイルス科；トバモウイルス、トブラウイルス、ポテックスウイルス、カルラウイルス、アレクシウイルス、カピロウイルス、フォベアウイルス、トリコウイルス、ブドウウイルス、フロウイルス、ペクルウイルス、ポモウイルス、ベニーウイルス、ホルデイウイルス、ソベモウイルス、マラフィウイルス、チモウイルス、イダエオウイルス、オウルミウイルス、ウンブラウイルスからなる群から選択される科である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントが、ズッキーニ黄化モザイクウイルス（ＺＹＭＶ）のゲノムの３’端を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５９】
ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントが配列番号２に記載の核酸配列を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項６０】
第１ヌクレオチド配列が、配列番号２に記載のヌクレオチド配列及びその断片と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項６１】
第２ヌクレオチド配列が、配列番号２に記載のヌクレオチド配列の相補配列及びその断片と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項６２】
植物がポチウイルス科由来のウイルスによって引き起こされる疾患に耐性がある、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
植物がＺＹＭＶに耐性がある、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
請求項３５から６３までのいずれか一項に記載の方法によって生成される接木植物。
【請求項６５】
土壌伝染性ウイルス及び植物の気生部分に影響を与えるベクターによって伝播するウイルスからなる群から選択されるウイルスに耐性がある、請求項６４に記載の植物。
【請求項６６】
線虫伝播性ウイルス：ネポウイルス：アラビノモザイクウイルス、ブドウファンリーフウイルス、トマト黒色輪点ウイルス、イチゴ舌輪点ウイルス、トマト輪点ウイルス、及びタバコ輪点ウイルス；トブラウイルス：Ｐｅａ  ｅａｒｌｙ  ｂｒｏｗｎｉｎｇウイルス、タバコラットルウイルス及びコショウ輪点ウイルス；真菌伝播性ウイルス：キュウリ緑斑ウイルス、キュウリ黄化えそ病ウイルス、メロンえそ斑点ウイルス、アカクローバえそモザイク病ウイルス、カボチャえそウイルス、タバコ黄斑えそ病サテライトウイルス、レタスビッグベインウイルス、ペッパーイエローベインウイルス、ビートえそ性葉脈黄化ウイルス、ビート土壌伝染性ウイルス、オートムギ縞萎縮病ウイルス、ナンキンマメ斑紋ウイルス、ジャガイモモップトップウイルス、イネ縞葉枯病壊死ウイルス、土壌伝染性コムギ縞萎縮病ウイルス、オオムギマイルドモザイクウイルス、オオムギ黄萎ウイルス、オートムギモザイクウイルス、イネ壊死モザイクウイルス、コムギ条斑病モザイクウイルス及びコムギ黄萎モザイクウイルス；根の損傷によって伝播するウイルス：トバモウイルス属：タバコモザイクウイルス、トマトモザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクトバモウイルス、キュウリ果斑モザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクウイルス、オンドグロッサムリングスポットウイルス、パプリカ弱斑ウイルス、コショウ弱斑ウイルス、オオバコモザイクウイルス及びタバコ弱緑斑モザイクウイルス；及び未知の経路によって伝播するウイルス：オランダガラシ黄斑ウイルス、ソラマメネクロティックウイルトウイルス、ピーチロゼットモザイクウイルス及びサトウキビ退録条斑病ウイルスからなる群から選択される土壌伝染性ウイルスに耐性がある、請求項６５に記載の植物。
【請求項６７】
カリモウイルス科、ジェミニウイルス科、サーコウイルス科、レオウイルス科、タルチチウイルス科、ブロモウイルス科、コモウイルス科、ポチウイルス科、トンブスウイルス科、セクイウイルス科、クロストロウイルス科及びルテオウイルス科；トバモウイルス、トブラウイルス、ポテックスウイルス、カルラウイルス、アレクシウイルス、カピロウイルス、フォベアウイルス、トリコウイルス、ブドウウイルス、フロウイルス、ペクルウイルス、ポモウイルス、ベニーウイルス、ホルデイウイルス、ソベモウイルス、マラフィウイルス、チモウイルス、イダエオウイルス、オウルミウイルス、ウンブラウイルスからなる群から選択される科の、植物の気生部分に影響を与えるベクターによって伝播するウイルスに耐性がある、請求項６５に記載の植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニックウイルス耐性根茎から接ぎ穂に疾患に対する耐性が与えられる、トランスジェニックウイルス耐性根茎及び接木接ぎ穂を含むウイルス性疾患に耐性がある植物、及びその生成法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物病原性ウイルスは、世界中で農業における新鮮品の生産において相当な損失を引き起こす。広い領域での１種の栽培を含めた現代の農業習慣、及び温室領域の増大をもたらす一年を通じた新鮮品に関する需要は、ウイルス伝播の問題を悪化させ、その結果生じる損害を増大させる。
【０００３】
ウイルス感染に耐性がある植物を生成するための伝統的な植物の品種改良プログラムは、過去において首尾良く使用されてきている。しかしながら、このような品種改良プログラムは、常に入手可能であるわけではない天然源の耐性に依存する。例えば、ズッキーニ黄化モザイクウイルス（ＺＹＭＶ）は、世界中で毎年ウリ科において重度の損害を引き起こす。このウイルスは葉のアブラムシによって植物から植物に移り、殺虫剤はウイルスの伝播を防ぐ際に不充分であることが分かっている。さらに、限られた耐性源が同定されている。
【０００４】
Ｐｏｗｅｌｌ−Ａｂｅｌら（Ｐｏｗｅｌｌ−Ａｂｅｌら、１９８６．「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」２３２：７３８〜７４３）は、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）遺伝子を用いて形質転換しそれを発現させた植物は、ＴＭＶに対して耐性があることを示した最初の人物であった。その時以来、アルファルファモザイクウイルス、タバコラットルウイルス、ジャガイモウイルスＸ、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）、ポチウイルスを含めた１５の分類群中の少なくとも２５のウイルス、及びにジャガイモウイルスＸとジャガイモウイルスＹコートタンパク質の両方を用いて形質転換した植物に関して、ウイルスのコートタンパク質仲介の耐性が示されてきている。
【０００５】
一般に、ＣＰ仲介の耐性は広範囲のウイルス系統に対して有効であるが、ＲＮＡ仲介の耐性、即ちタンパク質に翻訳されないウイルスＲＮＡ断片の発現がウイルス耐性を与えることより、通常は有効性が低い。例えば米国特許第６，６４９，８１３号は、ウイルスゲノムのレプリカーゼ部分の読み過ごし部分から採取したコード配列を含むトランスジェニック植物がウイルスによる後の疾患に耐性がある、１つの植物世代から他の植物世代に伝わる可能性があるウイルス誘導型耐性を開示している。タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）由来の５４ｋＤａのコード配列の使用が、具体的に記載されている。レプリカーゼ仲介の耐性は高い配列相同性を共有する系統に限られ、攻撃ウイルスの力価によって影響されず、トランス遺伝子の発現レベルとは関係がない。
【０００６】
転写後型遺伝子発現抑制（ＰＴＧＳ）は、細胞ｍＲＮＡとウイルスｍＲＮＡの両方を標的化することができる配列特異的な防御機構であり、遺伝子発現を不活性化させるために広く使用されているツールである。ＰＴＧＳは植物中で生じることが知られているが、一方で非常に関連がある現象であるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、広範囲の他の生物中で生じることが知られている（Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ、Ｄ．２０００．「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、２９０：１１０８〜１１０９）。ＲＮＡ干渉は、例えばカンセンチュウ目、アカパンカビ、キイロショウジョウバエ中、及び哺乳動物中で生じることが示されてきている。さらに、トランス遺伝子及びウイルスは植物中での遺伝子発現抑制を誘導することが示されてきており、ＰＴＧＳはウイルス蓄積に対する自然な防御機構であると現在は考えられている（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ａ．及びＢａｕｌｃｏｍｂｅ、Ｄ．１９９９．「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、２８６：９５０〜９５２；Ｍａｔｚｋｅら、２００１．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１１：２２１〜２２７）。
【０００７】
ウイルス誘導型遺伝子発現抑制（ＶＩＧＳ）は、幾つかの植物ＲＮＡウイルスに関して充分実証されている。このプロセスは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子によって開始される。ｄｓＲＮＡ分子はおそらくウイルスＲＮＡの複製中間体によって、或いは異常なトランス遺伝子コードＲＮＡによって作製され、これらはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性によってｄｓＲＮＡになる。ｄｓＲＮＡは幾つかのリボヌクレアーゼＩＩＩファミリーによって低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に切断され、それらは一般に２１〜２６ヌクレオチドの大きさの範囲である。同系ｍＲＮＡを破壊する多成分ヌクレアーゼ複合体ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導型遺伝子発現抑制複合体）を形成することによって、ｓｉＲＮＡはＲＮＡ分解を次いで促進すると考えられている。ｓｉＲＮＡの発見以来、この機構に基づく方法は、遺伝子機能を解明し望ましくない遺伝子発現を防ぐための研究ツールとして使用されて、特定の標的遺伝子が発現抑制されてきている。
【０００８】
ＷＯ９９／６１６３１は、遺伝子のセンス及びアンチセンスＲＮＡ断片を使用する、植物中の標的遺伝子の発現を改変するための方法を開示している。センス及びアンチセンスＲＮＡ断片は、二本鎖ＲＮＡ分子を対状に形成することができ、それによって遺伝子の発現を改変する。
【０００９】
ＷＯ９９／５３０５０は、センス及びアンチセンスヌクレオチド配列を有する領域間で塩基対を形成することによって二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができる、標的核酸を対象とするセンス及びアンチセンスＲＮＡ分子をコードするキメラ遺伝子を導入することによって、或いはＲＮＡ分子自体を導入することによって、真核生物細胞中、特に植物細胞中の当該の核酸の表現型発現を低下させるための方法及び手段を開示している。
【００１０】
ＷＯ００／６８３７４は、遺伝子のセンス及びアンチセンスＲＮＡ断片を使用する、細胞中のウイルス遺伝子の発現を改変するための方法に関する。センス及びアンチセンスＲＮＡ断片は、二本鎖ＲＮＡ分子を対状に形成することができ、それによって遺伝子の発現を改変する。本発明はさらに、好ましいことにウイルスに対する耐性又は抵抗力がある、本発明の方法を使用して得られる細胞、植物又は動物に関する。
【００１１】
ＷＯ２００４／００９７７９は、ＲＮＡ前駆体を発現させるための前駆体ＲＮＡ構築体を含む組成物を開示している。前駆体ＲＮＡ構築体は、ミクロＲＮＡを有する前駆体ＲＮＡの発現を誘導する植物細胞中で発現されるプロモーターを含む。ミクロＲＮＡは標的遺伝子又はヌクレオチド配列の一部分と相補的或いは部分的に相補的であり、標的配列又は遺伝子の発現を調節するために働く。このようにして、ＲＮＡ前駆体構築体を設計して、当該の任意のヌクレオチド配列、内生植物遺伝子或いは代替的にトランス遺伝子の発現を調節することができる。
【００１２】
接木は、根茎の望ましい属性と接ぎ穂の望ましい属性を組み合わせるための、農業者及び庭師によって使用される古典的技法である。過去において接木は、多年生、特に草本植物及び樹木に主に使用された。今日この技法は一年生植物にも使用されており、根茎及び接ぎ穂を含む接木植物苗木の割合は絶えず増大している。Ｓｍｉｒｎｏｖら（Ｓｍｉｒｎｏｖら、１９９７．「植物生理学（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．）」１１４：１１１３〜１１２１）は接木技法を使用して、野生型タバコ植物とヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質を発現するトランスジェニックタバコ植物を接木した。Ｓｍｉｒｎｏｖらは、接木植物のトランスジェニック根茎中での抗ウイルスタンパク質の発現は、野生型接ぎ穂におけるウイルス感染に対する耐性を誘導することを実証した。しかしながら耐性は、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質の酵素活性に依存した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
これまで、病原体感染に耐性がある植物を生成するための試みは、耐性関連形質を植物ゲノムに取り込ませるための形質転換法を使用することに主に集中していた。しかしながら、トランスジェニック植物から得られる農産物は多くの国々で望まれていない。或いは、接木技法が使用された。特定の疾患に耐性がある根茎の使用が示されてきているが、接木接ぎ穂は病原体の伝播に敏感であった。
【００１４】
したがって、認められている必要性が存在し、病原体、特にウイルスに耐性があり、農産物が遺伝的に改変されていない植物部分によって生成される、植物を有することが非常に有利であると思われる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、植物全体がウイルス性疾患に耐性がある、トランスジェニックウイルス耐性根茎及び敏感な接ぎ穂を含む接木植物を提供する。本発明の植物は、多年生又は一年生であってよい。本発明はさらに、接木型耐性植物を生成するための組成物及び方法を提供する。ウイルス耐性の性質は、個々の植物を生成するために使用する組成物の具体的な特徴に依存する。幾つかの態様によれば本発明は、土壌伝染性ウイルスから保護された接木植物を提供する。他の態様によれば、本発明の植物はウイルスによって引き起こされる葉感染に対して耐性がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の植物は、さまざまな型の接木によって生成することができる；接ぎ穂が所望の農産物を生成するとき、接木法が典型的には使用される。有利なことに、本発明の植物によって生成される農産物は遺伝的に改変されていない、何故なら根茎が植物の唯一のトランスジェニック部分だからである。
【００１７】
如何なる特定の理論又は機構に縛られることも望まずに、ウイルス性疾患に対する本発明の植物の耐性は、接木型の敏感な接ぎ穂に耐性を与えるトランスジェニック根茎に与えられた、ＲＮＡ仲介のウイルス耐性に原因がある可能性がある。
【００１８】
したがって、一態様によれば本発明は、抗ウイルスタンパク質の発現による以外のウイルス性疾患に耐性があるトランスジェニック根茎、及びウイルス性疾患に対して感受性がある接ぎ穂を含む植物であって、接木植物が前記ウイルス性疾患に耐性がある植物を提供する。
【００１９】
さまざまな実施形態によれば本発明は、ウイルスタンパク質又はその一部分及びｓｉＲＮＡをコードする配列から選択される核酸配列転写産物を発現するトランスジェニック根茎によって、接木接ぎ穂に与えられるウイルス耐性を提供する。したがって、幾つかの実施形態によれば、ウイルス感染に耐性があるトランスジェニック根茎は、ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントと少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む。他の実施形態によれば、ウイルス感染に耐性があるトランスジェニック根茎は、ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントを標的とするｓｉＲＮＡを作製するために設計したＤＮＡ構築体を含む。
【００２０】
本明細書で使用する用語「セグメント」は、ウイルスゲノムのコード領域、非コード領域、その一部分及びその組合せからなる群から選択される核酸配列を指す。
【００２１】
一実施形態によれば、ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントと少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列は、タンパク質又はその一部分をコードしている。他の実施形態によれば、核酸配列はコートタンパク質、複製タンパク質、運動性タンパク質又はその一部分からなる群から選択されるタンパク質をコードしている。一実施形態によれば、トランスジェニック根茎は、ウイルスゲノムのレプリカーゼ部分のセグメントである核酸配列を含む。
【００２２】
別の実施形態によれば、トランスジェニック根茎は、キュウリ果斑モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）の複製タンパク質の断片である推定５４ｋＤａのタンパク質をコードする核酸配列を含む。現在好ましい一実施形態によれば、トランスジェニック根茎は、配列番号１に記載の配列を有する核酸配列を含む。
【００２３】
さらに別の実施形態によれば、ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントを標的とするｓｉＲＮＡを作製するために設計したＤＮＡ構築体は、
（ａ）以下のものに動作可能に連結した少なくとも１つの植物の発現可能なプロモーター、
（ｂ）少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡを形成するＲＮＡ配列をコードする核酸配列であって、二本鎖ＲＮＡ分子がウイルスゲノムの標的セグメントのセンスヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドの第１ヌクレオチド配列、及び前記ウイルスゲノムの前記標的セグメントのセンスヌクレオチド配列の相補配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドの第２ヌクレオチド配列を含む核酸配列、及び場合によっては、
（ｃ）転写終了シグナルを含む。
【００２４】
好ましい一実施形態によれば、ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントを標的とするｓｉＲＮＡを作製するために設計したＤＮＡ構築体は、
（ａ）以下のものに動作可能に連結した少なくとも１つの植物の発現可能なプロモーター、
（ｂ）ステム−ループの形の少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡを形成するＲＮＡ配列をコードする核酸配列であって、二本鎖ＲＮＡ分子がウイルスゲノムの標的セグメントのセンスヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドの第１ヌクレオチド配列；前記ウイルスゲノムの前記標的セグメントのセンスヌクレオチド配列の相補配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドの第２ヌクレオチド配列を含む核酸配列；及びスペーサー配列；及び場合によっては、
（ｃ）転写終了シグナルを含む。
【００２５】
構築体が植物細胞内でｓｉＲＮＡの生成を誘導するように設計されており、ｓｉＲＮＡがウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントを標的化するという条件で、本発明の実施はいずれか特定のＤＮＡ構築体に限られないことは理解されよう。幾つかの実施形態によれば、構築体は少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ分子を形成するＲＮＡ配列をコードする核酸配列を含み、その二本鎖ＲＮＡ分子はウイルス標的配列の切断を仲介する。さまざまな方法でＤＮＡ構築体を設計して、二本鎖ＲＮＡを形成することができる。さらに、本発明はｓｉＲＮＡを生成する構築体を用いて実施するが、植物細胞内でｓｉＲＮＡを生成するための当分野で知られている任意の方法も、本発明の範囲内に含まれることは理解されるはずである。
【００２６】
植物細胞内のウイルスゲノムのセグメントを切断するための手段としてのｓｉＲＮＡの使用は、以前に開示されている。染色体遺伝子（内生又は異種遺伝子のいずれか）が根茎中で発現抑制されるとき、その発現抑制は発現抑制された根茎から対応する染色体遺伝子を発現する標的接ぎ穂に伝わることも示されてきている。しかしながら、本発明は驚くことに、病原性ウイルスのゲノムの少なくとも１つのセグメントを標的化するｓｉＲＮＡを生成する構築体を用いた根茎の形質転換は、他の場合はウイルスによる感染を受けやすい接木接ぎ穂に耐性を与えることを開示する。
【００２７】
幾つかの実施形態によれば、第１ヌクレオチド配列と第２ヌクレオチド配列は、同一プロモーターに動作可能に連結している。他の実施形態では、第１ヌクレオチド配列と第２ヌクレオチド配列のそれぞれが別々のプロモーターに動作可能に連結しており、その別々のプロモーターは同じであるか異なっていてよい。
【００２８】
一実施形態によれば、第１ヌクレオチド配列は、ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントのセンスヌクレオチド配列の配列と少なくとも９５％の同一性、好ましくは１００％の同一性である、少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドの配列を含む。他の実施形態によれば、第２ヌクレオチド配列は、ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントのセンスヌクレオチド配列の相補配列と少なくとも９５％の同一性、好ましくは１００％の同一性である、少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドの配列を含む。
【００２９】
使用することができる第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列の長さに対する上限は存在せず、したがって本発明の構築体は、約２０ヌクレオチド〜完全長の標的ＲＮＡの長さを含めた、さまざま長さのヌクレオチド配列を含むことができる。本発明の第１ヌクレオチド及び第２ヌクレオチドの長さは、約１，０００ヌクレオチド長であることが好ましい。別の実施形態によれば、第１ヌクレオチド及び第２ヌクレオチドの長さは、約２２ヌクレオチド長である。
【００３０】
好ましい一実施形態によれば、第１ヌクレオチド配列は、配列番号２に記載のヌクレオチド配列又はその断片と９０％の同一性、好ましくは９５％、より好ましくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。他の現在好ましい実施形態によれば、第２ヌクレオチド配列は、配列番号２に記載のヌクレオチド配列の相補配列又はその断片と９０％の同一性、好ましくは９５％、より好ましくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００３１】
一実施形態によれば、阻害ＲＮＡ分子の構造体は第１及び第２ヌクレオチド配列、スペーサー配列をさらに含み、したがって二本鎖ＲＮＡはステム−ループＲＮＡ（ヘアピンＲＮＡ、ｈｐＲＮＡ）の形である。好ましい実施形態では、スペーサー配列の長さは、第１及び第２ヌクレオチドの長さの１／５〜１／１０である。
【００３２】
幾つかの実施形態によればスペーサー配列は、ｓｉＲＮＡ生成を増大させるための遺伝子のイントロンに由来するヌクレオチド配列を含む。一実施形態によればスペーサー配列は、配列番号３に記載の配列を有するヒマカタラーゼ遺伝子由来のイントロンを含む、ヌクレオチド配列を含む。
【００３３】
場合によっては、ｓｉＲＮＡをコードする構築体は転写終了シグナルを含む。一実施形態によれば、転写終了シグナルはＮＯＳターミネーターである。
【００３４】
特定の実施形態によれば、接木接ぎ穂に耐性を与える核酸配列は、植物細胞内での核酸配列の発現に関する制御要素をさらに含む。発現制御配列は、プロモーター、エンハンサー、転写因子、スプライシングシグナル、及び終了配列からなる群から選択される。一実施形態によれば、プロモーターは構成性プロモーターである。現在好ましい一実施形態によれば、構成性プロモーターはイチゴベインバンディングウイルスのプロモーターである。別の実施形態によれば、プロモーターは組織特異的プロモーターである。
【００３５】
他の実施形態によれば、ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントと少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を用いて形質転換したトランスジェニック根茎は、土壌伝染性ウイルスによって引き起こされる疾患に耐性がある。一実施形態によれば、このようなトランスジェニック根茎を含む接木植物は、線虫伝播性ウイルス、真菌伝播性ウイルス、根の損傷によって伝播するウイルス及び未知のベクターによって伝播するウイルスからなる群から選択される土壌伝染性ウイルスから保護される。
【００３６】
一実施形態によれば、線虫伝播性ウイルスは、ネポウイルス：アラビノモザイクウイルス、ブドウファンリーフウイルス、トマト黒色輪点ウイルス、イチゴ舌輪点ウイルス、トマト輪点ウイルス、及びタバコ輪点ウイルス；トブラウイルス：Ｐｅａ  ｅａｒｌｙ  ｂｒｏｗｎｉｎｇウイルス、タバコラットルウイルス及びコショウ輪点ウイルスから選択されるが、これらだけには限られない。
【００３７】
別の実施形態によれば、真菌伝播性ウイルスは、キュウリ緑斑ウイルス、キュウリ黄化えそ病ウイルス、メロンえそ斑点ウイルス、アカクローバえそモザイク病ウイルス、カボチャえそウイルス、タバコ黄斑えそ病サテライトウイルス、レタスビッグベインウイルス、ペッパーイエローベインウイルス、ビートえそ性葉脈黄化ウイルス、ビート土壌伝染性ウイルス、オートムギ縞萎縮病ウイルス、ナンキンマメ斑紋ウイルス、ジャガイモモップトップウイルス、イネ縞葉枯病壊死ウイルス、土壌伝染性コムギ縞萎縮病ウイルス、オオムギマイルドモザイクウイルス、オオムギ黄萎ウイルス、オートムギモザイクウイルス、イネ壊死モザイクウイルス、コムギ条斑病モザイクウイルス及びコムギ黄萎モザイクウイルスからなる群から選択されるが、これらだけには限られない。
【００３８】
さらなる実施形態によれば、根の損傷によって伝播するウイルスはトバモウイルス属：タバコモザイクウイルス、トマトモザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクトバモウイルス、キュウリ果斑モザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクウイルス、オンドグロッサムリングスポットウイルス、パプリカ弱斑ウイルス、コショウ弱斑ウイルス、オオバコモザイクウイルス及びタバコ弱緑斑モザイクウイルスからなる群から選択されるが、これらだけには限られない。
【００３９】
さらに別の実施形態によれば、未知の経路によって伝播するウイルスは、オランダガラシ黄斑ウイルス、ソラマメネクロティックウイルトウイルス、ピーチロゼットモザイクウイルス及びサトウキビ退録条斑病ウイルスからなる群から選択されるが、これらだけには限られない。
【００４０】
一実施形態によれば接木植物は、トバモウイルス属の土壌伝染性ウイルスによって引き起こされる疾患から保護されている。他の実施形態によれば接木植物は、トバモウイルス属のＣＦＭＭＶによって引き起こされる疾患から保護されている。さらに別の実施形態によれば、接木植物はウリ科から選択される。
【００４１】
接木技術を使用して、敏感な植物に土壌伝染性ウイルス病原体に対する耐性を与えることができることを、本発明は初めて示す。土壌伝染性ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントと少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む耐性のある根茎と、敏感な接ぎ穂を接木することによって、接ぎ穂は土壌伝染性の病原体に対して保護されやすい逆の状態になる。
【００４２】
さらなる実施形態によれば、ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントを標的とするｓｉＲＮＡを作製するために設計したＤＮＡ構築体を含むトランスジェニックウイルス耐性根茎及び接ぎ穂を含む接木植物は、任意の種の植物を含む。さらに、ある植物を生成させて任意の選択植物ウイルスに対する耐性を示すことができ、複数の植物ウイルスに対する耐性を得ることもできる。幾つかの実施形態によれば植物は、本明細書で前に記載した群から選択される土壌伝染性ウイルスに耐性がある。他の実施形態によれば植物は、植物の気生部分に影響を与えるベクターによって伝播するウイルスに耐性がある。一実施形態によれば、植物の気生部分に影響を与えるウイルスは、カリモウイルス科、ジェミニウイルス科、サーコウイルス科、レオウイルス科、タルチチウイルス科、ブロモウイルス科、コモウイルス科、ポチウイルス科、トンブスウイルス科、セクイウイルス科、クロストロウイルス科及びルテオウイルス科からなる群から選択されるウイルス科である。他の実施形態によればウイルスは、トバモウイルス、トブラウイルス、ポテックスウイルス、カルラウイルス、アレクシウイルス、カピロウイルス、フォベアウイルス、トリコウイルス、ブドウウイルス、フロウイルス、ペクルウイルス、ポモウイルス、ベニーウイルス、ホルデイウイルス、ソベモウイルス、マラフィウイルス、チモウイルス、イダエオウイルス、オウルミウイルス、及びウンブラウイルスからなる群から選択される。
【００４３】
特定の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡを作製するために設計したＤＮＡ構築体を含む根茎を含む接木植物は、ポチウイルス科由来の植物ウイルスに耐性がある。以下の記載中には、トランスジェニックタバコ属ベンサミアナ系の根茎及びさらにタバコ属ベンサミアナ系の接ぎ穂にウイルスに対する耐性を与える、コートタンパク質遺伝子及び３’非コード領域を含めたズッキーニ黄化モザイクウイルス（ＺＹＭＶ）のゲノムの３’端を標的とするｓｉＲＮＡの使用を、本発明の広範囲の技術の具体例として記載する。
【００４４】
本発明の根茎に形質転換した核酸配列は、トランスジェニック植物のみが発芽し成長することができるように、選択可能なマーカーをさらに含むことが好ましい。追加的又は代替的に、レポーター遺伝子を構築体中に取り込ませて、そのレポーター遺伝子を発現するトランスジェニック植物の選択を可能にすることができる。一実施形態によれば、選択可能なマーカーは、植物中で抗生物質耐性を誘導する遺伝子である。
【００４５】
公の場でトランスジェニック植物の増殖に関して設けられている近年の規制は、抗生物質耐性を誘導する遺伝子を含むトランスジェニック植物の使用を除外している。したがって、トランスジェニック植物の選択は、本発明に従いウイルス耐性を与えるように設計した第１構築体と、レポーター遺伝子を含む第２構築体の同時形質転換によって行うことができる。ウイルス耐性を与える構築体の首尾良い形質転換は、レポーター遺伝子を発現し従って首尾良い形質転換を示す植物においてのみ、当業者に知られている方法によって、例えばＰＣＲによって次いで確認する。
【００４６】
当分野で知られているように本発明の核酸配列は、植物を形質転換するために使用する植物形質転換ベクターに取り込ませることができる。
【００４７】
さらなる態様によれば本発明は、ウイルスによる感染に耐性がある植物を生成するための方法であって、（ａ）抗ウイルスタンパク質の発現による以外のウイルス感染に耐性があるトランスジェニック根茎を提供するステップ、（ｂ）前記ウイルスによる感染の影響を受けやすい接ぎ穂を提供するステップ、及び（ｃ）接ぎ穂を根茎に接木させて前記ウイルス感染に耐性がある接木植物を得るステップを含む方法を提供する。
【００４８】
一実施形態によれば、ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントと少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を用いて根茎を形質転換して、ウイルス感染に耐性があるトランスジェニック根茎を生成する。他の実施形態によれば、ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントを標的とするｓｉＲＮＡを作製するために設計したＤＮＡ構築体を用いて根茎を形質転換して、ウイルス感染に耐性があるトランスジェニック根茎を生成する。本発明の好ましい実施形態によれば、影響を与えるウイルスゲノムのセグメントは植物中での感染及び／又は複製のためにウイルスに必要不可欠であり、したがってその切断はウイルス感染及び／又は複製を妨げ、それによって耐性植物を与える。
【００４９】
耐性のある根茎を生成するためのポリヌクレオチド又はＤＮＡ構築体を用いた植物の形質転換は、当業者に知られているように、さまざまな手段によって行うことができる。一般的な方法は、アグロバクテリア菌仲介形質転換、マイクロプロジェクタイル法、花粉仲介移動、リポソーム仲介形質転換、直接的な遺伝子移動（例えば、マイクロインジェクションによる）及び胚形成カルスのエレクトロポレーションだけには限られないが、これらによって例示される。一実施形態によれば、アグロバクテリア菌仲介形質転換を使用して耐性植物を生成する。
【００５０】
本発明の核酸配列を含むトランスジェニック植物は、当業者に知られている分子遺伝学の標準的方法を使用して選択することができる。一実施形態によれば、抗生物質に対するそれらの耐性に従いトランスジェニック植物を選択する。幾つかの実施形態によれば、選択可能なマーカーとして働く抗生物質は、パラモマイシン及びカナマイシンからなるアミノグリコシド群の１つである。
【００５１】
別の実施形態によれば、ウイルス感染に対するそれらの耐性に従いトランスジェニック植物を選択する。一実施形態によれば、線虫伝播性ウイルス：ネポウイルス：アラビノモザイクウイルス、ブドウファンリーフウイルス、トマト黒色輪点ウイルス、イチゴ舌輪点ウイルス、トマト輪点ウイルス、及びタバコ輪点ウイルス；トブラウイルス：Ｐｅａ  ｅａｒｌｙ  ｂｒｏｗｎｉｎｇウイルス、タバコラットルウイルス及びコショウ輪点ウイルス；真菌伝播性ウイルス：キュウリ緑斑ウイルス、キュウリ黄化えそ病ウイルス、メロンえそ斑点ウイルス、アカクローバえそモザイク病ウイルス、カボチャえそウイルス、タバコ黄斑えそ病サテライトウイルス、レタスビッグベインウイルス、ペッパーイエローベインウイルス、ビートえそ性葉脈黄化ウイルス、ビート土壌伝染性ウイルス、オートムギ縞萎縮病ウイルス、ナンキンマメ斑紋ウイルス、ジャガイモモップトップウイルス、イネ縞葉枯病壊死ウイルス、土壌伝染性コムギ縞萎縮病ウイルス、オオムギマイルドモザイクウイルス、オオムギ黄萎ウイルス、オートムギモザイクウイルス、イネ壊死モザイクウイルス、コムギ条斑病モザイクウイルス及びコムギ黄萎モザイクウイルス；根の損傷によって伝播するウイルス：トバモウイルス属：タバコモザイクウイルス、トマトモザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクトバモウイルス、キュウリ果斑モザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクウイルス、オンドグロッサムリングスポットウイルス、パプリカ弱斑ウイルス、コショウ弱斑ウイルス、オオバコモザイクウイルス及びタバコ弱緑斑モザイクウイルス；及び未知の経路によって伝播するウイルス：オランダガラシ黄斑ウイルス、ソラマメネクロティックウイルトウイルス、ピーチロゼットモザイクウイルス及びサトウキビ退録条斑病ウイルスからなる群から選択される土壌伝染性ウイルスだけには限られないが、これらを含めた土壌伝染性ウイルスに対するそれらの耐性に従いトランスジェニック植物を選択する。
【００５２】
別の実施形態によれば、ウイルス科：カリモウイルス科、ジェミニウイルス科、サーコウイルス科、レオウイルス科、タルチチウイルス科、ブロモウイルス科、コモウイルス科、ポチウイルス科、トンブスウイルス科、セクイウイルス科、クロストロウイルス科及びルテオウイルス科；トバモウイルス、トブラウイルス、ポテックスウイルス、カルラウイルス、アレクシウイルス、カピロウイルス、フォベアウイルス、トリコウイルス、ブドウウイルス、フロウイルス、ペクルウイルス、ポモウイルス、ベニーウイルス、ホルデイウイルス、ソベモウイルス、マラフィウイルス、チモウイルス、イダエオウイルス、オウルミウイルス、ウンブラウイルスからなる群から選択される、植物の気生部分に影響を与えるベクターによって伝播するウイルスに対する、それらの耐性に従いトランスジェニック植物を選択する。
【００５３】
別の態様によれば本発明は、本発明の方法によって生成する接木植物に関する。トランスジェニックウイルス耐性根茎に接木させた他の場合ウイルス感染の影響を受けやすい接ぎ穂を含む植物は、ウイルス感染に耐性がある。接木植物は、その根茎が耐性がある同じウイルス種に耐性があると思われる。根茎はそのゲノムに安定的に組み込まれた本発明の核酸配列を含み、ＤＮＡ構築体の性質は根茎が耐性があるウイルス種を決定する。
【００５４】
本発明のこれらの特徴及び他の特徴は、以下の図面、記載及び特許請求の範囲中でさらに詳細に説明する。
【００５５】
発明の詳細な説明
本発明は、根茎及び接ぎ穂を含む、ウイルス性疾患に耐性がある接木植物に関する。抗ウイルスタンパク質の発現による以外の植物ウイルスに対する耐性を与えるＤＮＡ構築体を用いて形質転換した植物は、根茎の供給源として働き、ウイルス性疾患に対して感受性がある植物は、接ぎ穂の供給源として働く。接ぎ穂を根茎に接木することによって、その植物全体がウイルス感染から保護される。
【００５６】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は本出願中の、以下の詳細な記載中で述べるか或いは図面中に示す、要素の構成及び配置の詳述に限られないことは理解されよう。本発明は他の実施形態が可能であり、或いはさまざまな方法で実施又は実行することができる。さらに、本明細書で使用する語法又は用語は記載の目的であり、制限的なものとしてみなすべきではないことは理解されよう。
【００５７】
定義
用語「植物」は、その最も広い意味で本明細書において使用する。植物は任意の種類の樹木、草本、多年生又は一年生植物を含むが、これらだけには限られない。植物はさらに、植物の分化の任意の段階に存在する構造体に大部分は分化した複数の植物細胞を指す。このような構造体には根、茎、苗条、葉、花、花弁、果実などがあるが、これらだけには限られない。
【００５８】
本明細書において使用する用語「接木植物」は、当分野で知られている任意の方法によって根茎に接ぎ穂を接木した、根茎及び接ぎ穂を含む植物を指す。
【００５９】
本明細書において使用する用語「根茎」は、植物の根の部分を含む接木用の茎を指す。用語「接ぎ穂」は、通常気生部分のみ或いは主にそれを接木に与える接木における根茎との一体化用に設計又は調製した、植物の分離済みの生きた部分を指す。
【００６０】
本明細書において使用する用語「ウイルス」は、植物ウイルス、即ち植物細胞に感染し植物細胞中で増殖することができるウイルスを指す。典型的には、ウイルスは病原性であり、したがって実質的なウイルス感染は農作物の収率低下を引き起こす。
【００６１】
本明細書において使用する用語「土壌伝染性」ウイルスは、線虫、真菌を含めた土壌中のベクター、又は未知の土壌中のベクターによって伝播するウイルス、及び植物残骸中に留まり根の損傷によって土壌中を伝播するウイルスを指す。
【００６２】
用語「耐性植物」及び「ウイルス性疾患に耐性がある植物」は、非耐性（感受性）植物と比較して、ウイルスに対して高い抵抗力を有する植物を指す。この高い抵抗力は、問題のウイルスを植物に意図的に感染させることによって調べる。それぞれのウイルスに特異的な症状規模に従い、感受性植物と比較して低い症状強度を示す植物を、ウイルスに耐性がある植物として定義する。植物は感染に抵抗することができるか（したがって耐性は免疫と呼ぶ）、或いはそれらが回復する感染の予備段階を経ることができる（したがって耐性は回復と呼ぶ）。耐性は、子孫の個体群に遺伝し得る安定した特徴である可能性がある。或いは耐性は、接木植物が根茎及び接ぎ穂を含む場合のみ存在する。後者の状況では、ウイルス性疾患に耐性がある植物は、ウイルス性疾患から保護された植物とも呼ぶ。
【００６３】
用語「遺伝子」は、ＲＮＡ又はポリペプチドの生成に必要なコード配列を含む、核酸（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）配列を指す。ポリペプチドは完全長コード配列によって、或いは任意のその一部分によってコードされ得る。用語「その一部分」は、遺伝子に関して使用するとき、その遺伝子の断片を指す。断片は、数個のヌクレオチド〜遺伝子配列全体マイナス１ヌクレオチドの大きさの範囲であってよい。したがって、「遺伝子の少なくとも一部分を含む核酸配列」は、遺伝子又は遺伝子全体の断片を含むことができる。
【００６４】
用語「遺伝子」は構造遺伝子のコード領域をさらに含み、いずれかの端で約１ｋｂの距離の５’及び３’端上のコード領域の隣に位置する配列を、遺伝子が完全長ｍＲＮＡの長さ部分に対応するように含む。コード領域の５’に位置しｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と呼ぶ。コード領域の３’又は下流に位置しｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と呼ぶ。本明細書において使用する用語「イントロン」は、遺伝子のコード領域に割り込んでいる非コード配列を指す。「イントロン」は核又は一次転写産物から除去又は「スプライシング切断」され、したがってメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物中には存在しない。
【００６５】
本明細書において使用する用語「核酸」は、直線状又は分岐状の、一本鎖又は二本鎖であるＲＮＡ又はＤＮＡ、或いはそれらのハイブリッドを指す。この用語はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドも含む。
【００６６】
本明細書において使用する用語「プロモーター要素」、「プロモーター」、又は「プロモーター配列」は、５’端に位置する（即ち、ＤＮＡポリマーのタンパク質コード領域に先行する）ＤＮＡ配列を指す。本来知られている大部分のプロモーターの位置は、転写される領域に先行する。プロモーターはスイッチとして機能し、遺伝子の発現を活性化させる。遺伝子が活性化される場合、それは転写される、或いは転写と関係があると言える。転写は、遺伝子からのｍＲＮＡの合成を含む。したがって、プロモーターは転写制御要素として働き、遺伝子のｍＲＮＡへの転写を開始するための部位をさらに与える。
【００６７】
用語「異種遺伝子」又は「キメラ遺伝子」は、その本来の環境中に存在しない因子をコードする遺伝子を指す（即ち、人間の手によって改変されている）。例えば異種遺伝子は、他種に導入された一種由来の遺伝子を含む。異種遺伝子は、（例えば、突然変異させる、多数のコピーを加える、非原型プロモーター又はエンハンサー配列と連結させてあるなどの）幾つかの方法で改変されている生物に固有の遺伝子も含む。異種遺伝子は、ｃＤＮＡ形の植物の遺伝子を含む植物の遺伝子配列を含むことができ；ｃＤＮＡ配列はセンス方向に発現させて（ｍＲＮＡを生成することができ）、或いはアンチセンス方向に発現させて（ｍＲＮＡ転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡ転写産物を生成することができる）。異種遺伝子によってコードされるタンパク質の遺伝子、又は染色体の植物遺伝子配列と自然に結合することが分かっておらず、或いは本来見られない染色体の部分（例えば、遺伝子が通常発現されない遺伝子座で発現される遺伝子）と結合する、プロモーターなどの制御要素を含むヌクレオチド配列と典型的には接合する点で、異種植物遺伝子は内生植物遺伝子と区別される。特定の植物種に内生の植物遺伝子（内生植物遺伝子）は、その植物種において本来見られる遺伝子、又は従来の品種改良法によってその植物種に導入することができる遺伝子である。
【００６８】
用語「トランスジェニック」は、植物又は果実又は種子（即ち「トランスジェニック植物」又は「トランスジェニック果実」又は「トランスジェニック種子」）に関して使用するとき、１つ又は複数のその細胞中に少なくとも１つの異種遺伝子を含む植物又は果実又は種子を指す。用語「トランスジェニック植物素材」は、少なくとも１つのその細胞中に少なくとも１つの異種遺伝子を含む植物、植物構造体、植物組織、植物種子又は植物細胞を広く指す。
【００６９】
用語「形質転換体」又は「形質転換細胞」は、継代数と無関係にその細胞に由来する一次形質転換細胞及び培養物を含む。故意又は偶然の突然変異のために、全ての子孫はＤＮＡ含有物が全く同一である可能性はない。最初に形質転換した細胞に関して調べたのと同じ機能を有する突然変異した子孫は、形質転換体の定義中に含まれる。
【００７０】
本発明は、ウイルス感染に耐性があり根茎が植物の唯一の遺伝的に改変された部分である、トランスジェニック植物を生成するために接木の技法を使用する系を開示する。したがって本発明の植物は、形質転換法を使用してウイルス感染に対する耐性を与えることができ、一方で本発明の植物によって生成される農産物は遺伝的に改変されていない点で、これまで知られている耐性植物より有利である。
【００７１】
接ぎ穂を根茎に接木することは、樹木植物の増殖において長年使用されている一般的な園芸習慣である。一度接木すると、水及び栄養が根茎から接ぎ穂に運ばれて、接ぎ穂の成長を助長する。今日現在、接木は生成する接木植物の園芸特徴を改善するために、さまざまな植物種に関して広く使用されている。農作物の収穫において使用される根茎及び接ぎ穂を含む接木した実生苗木の割合は、現在の農業習慣では絶えず増大している。例えば、ギリシャ、イタリア及びスペインで栽培されている約６０％のキュウリ及びスイカの実生苗木は、接木した実生苗木である。接木した実生苗木に関する栽培の需要を満たすために、高スループットの接木のためのさまざまな方法が開発されている。使用される全ての方法において、接ぎ穂と根茎の相補端を１つにして接木体を形成する。植物の正常な治癒プロセスの一部として接木体においてカルス組織が生成し、接ぎ穂と根茎の間の水及び栄養の導管として働く。
【００７２】
一態様によれば本発明は、抗ウイルスタンパク質の発現による以外のウイルス性疾患に耐性があるトランスジェニック根茎、及びウイルス性疾患に対して感受性がある接ぎ穂を含む植物であって、接木植物が前記ウイルス性疾患に耐性がある植物を提供する。
【００７３】
さまざまな方法を使用して、根茎として働くことができるウイルス性疾患に耐性があるトランスジェニック植物を生成することができる。本発明は特に、標的ウイルスゲノムのセグメントと相同の転写産物を発現するトランスジェニック根茎に関する。
【００７４】
特定の機構に縛られることを望まずに、耐性はＲＮＡ発現抑制と関係している可能性がある。真菌中では抑えられる植物における転写後型遺伝子発現抑制（ＰＴＧＳ）と呼ばれるＲＮＡ発現抑制、及び動物におけるＲＮＡ干渉は、特定の遺伝子転写レベルが関連ＲＮＡの存在下で低下する現象を指す。発現抑制される遺伝子は生物に内生又は外来性であってよく、染色体中に組み込まれて存在するか、或いはゲノム中に組み込まれていないトランスフェクションベクター又はウイルスなどの一時的な形で存在してよい。遺伝子の発現は完全に、或いは部分的に阻害される。ＰＴＧＳが標的ＲＮＡの機能を完全に、或いは部分的に阻害すると考えることもできる。
【００７５】
幾つかの実施形態によれば、ウイルス感染に耐性があるトランスジェニック根茎は、ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントと少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む。
【００７６】
ウイルスのゲノムの一部分を構成的に発現させるトランス遺伝子を導入することによって、ウイルスによる感染に対する植物の耐性をもたらすことが示されてきている（Ｍａｒａｔｈｅら、２０００．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４３：２９５〜３０６）。ここで本発明は、敏感な接ぎ穂を前に記載したように形質転換したトランスジェニック根茎に接木することは、根茎から接ぎ穂へのウイルス耐性の付与をもたらすことを示す。特に本発明は、このような接木植物は土壌伝染性ウイルスによって引き起こされる疾患から保護されることを示す。
【００７７】
非制限的な例として本発明は、トランスジェニック耐性キュウリ根茎への接木による、土壌伝染性のキュウリ果斑モザイクトバモウイルス（ＣＦＭＭＶ）に対する影響を受けやすいキュウリの栽培品種の保護を開示する。
【００７８】
ＣＦＭＭＶは、イスラエルで温室栽培キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）から単離された、新たに報告されたウリ科植物に感染するトバモウイルスである（Ａｎｔｉｇｎｕｓら、２００１．「植物病理学（Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）」、９１：５６５〜５７１）。キュウリ変種は、２つの亜群に属する４つの異なるトバモウイルスの影響を受けやすい。ＣＦＭＭＶはキュウリ緑斑モザイクウイルス（ＫＧＭＭＶ）及びズッキーニ緑斑モザイクウイルス（ＺＧＭＭＶ）と生物学的且つ配列に関して非常に関連性があるが、弱い血清学的親和性及びキュウリ緑斑モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ−Ｗ）と低いコートタンパク質（ＣＰ）相同性を示す。
【００７９】
ＣＦＭＭＶのＲＮＡゲノムは、３つのサブゲノムＲＮＡを有し４つのオープンリーディングフレームをコードする、６，５６２ヌクレオチド（Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＡＦ３２１０５７、配列番号４）からなる（図１）。ＣＦＭＭＶの５’隣接領域は、複製に必要不可欠な２つの同時開始タンパク質：１３２ｋＤａ及び１８９ｋＤａのタンパク質をコードする。１８９ｋＤａのタンパク質は、１３２ｋＤａのタンパク質の３’端、位置３６２９での漏出性ＵＡＧ終了コドンの読み過ごしによって作製される（Ａｎｔｉｇｎｕｓら、２００１、上記）。タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）では、Ｉ１−ＲＮＡと呼ばれるサブゲノムＲＮＡは短いレプリカーゼ遺伝子（１３２ｋＤａ）の端から始まり、レプリカーゼフレームの読み過ごし部分をコードし、トバモウイルスによって感染される植物では未だ同定されていない推定５４ｋＤａのタンパク質を生成する（Ｚａｉｔｌｉｎ、Ｍ．１９９９．Ｐｈｉｌ  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂ  ３５４：５８７〜５９１）。
【００８０】
商業用の温室条件下では、ＣＦＭＭＶの症状は、比較的進んだ成長段階で果実及び先端葉において最初に認められる。葉の症状には重度の斑紋症状、静脈縞模様及び黄斑形成がある。幾つかの場合、完全に分化した植物が、植物の衰弱をもたらす重度の萎縮症状を示す。温室内での急速なウイルスの伝播は、相当数の経済的な作物の損失をもたらす可能性がある。植物器官と接種源の機械的接触によって、ウイルスは容易に伝播する。植物残骸又は感染した温室の土壌中に、ウイルスが長期間存在し続ける可能性がある。キュウリにおける有効で自然な耐性供給源の欠如は、伝統的な品種改良プログラムによる商業品種への耐性のある遺伝子の移入を妨げる。
【００８１】
したがって一実施形態によれば、トランスジェニック根茎は、キュウリ果斑モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）の複製タンパク質の断片である推定５４ｋＤａのタンパク質をコードする核酸配列を含む。１つの現在好ましい実施形態によれば、トランスジェニック根茎は、配列番号１に記載の配列を有する核酸配列を含む。
【００８２】
本明細書で以下に例示するように、ＣＦＭＭＶの推定無構造５４ｋＤａ遺伝子を用いて形質転換した単為結実キュウリは、ＣＦＭＭＶ感染に対する高レベルの耐性（免疫）を示し、生物学的又は分子学的方法によって、接種植物においてウイルスの形跡を検出することはできなかった。
【００８３】
耐性応答と関係があった幾つかのパラメータを調べた。反復実験において、トランスジェニック系における５４ｋＤａの遺伝子転写産物の蓄積レベルは、強力な構成性プロモーターによって誘導されたにもかかわらず一貫して低かった（図６）。特定の機構に縛られることは望まずに、植物ウイルスに対する発現抑制仲介の耐性に関して以前に報告されたように、耐性はトランス遺伝子転写産物の特異的分解と関連している可能性がある。
【００８４】
興味深いことに、トランスジェニック植物にＣＦＭＭＶ又はＺＹＭＶを接種することは、５４ｋＤａのコード配列のＲＮＡ発現レベルに影響を与えなかった（図６）。対照的に、発現抑制が耐性機構において示された幾つかの試験では、トランスジェニック耐性植物に相同的なウイルスを接種することは、ウイルスＲＮＡのレベルを低下させた（Ｓａｖｅｎｋｏｖ、Ｅ．Ｉ．及びＶａｌｋｏｎｅｎ、Ｊ．Ｐ．２００２．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８３：２３２５〜２３３５）。発現抑制を抑制する遺伝子を有することが知られているウイルスによる事前感染が、攻撃的ＣＦＭＭＶ感染に対するトランスジェニック植物の耐性を妨げることはなかった。この観察結果は、それぞれジャガイモＹウイルスによる事前感染に圧倒された、ジャガイモＡウイルス又はプラムポックスウイルスに対するトランスジェニックタバコ属ベンサミアナ系の発現抑制仲介の耐性に関する報告と異なる。
【００８５】
本発明は、トランスジェニック耐性根茎に接木することによる、ＣＦＭＭＶの土壌中接種に対して敏感なキュウリの保護を示す。したがって本発明は、ウイルスゲノムのセグメントと相同性がある転写産物を発現するトランスジェニック根茎に接木することによって、敏感な接ぎ穂を土壌伝染性ウイルスに対して保護することができることを初めて実証する。本明細書で開示するトランスジェニック根茎仲介の保護には相当数の農業用途があり、非遺伝的改変型（非ＧＭＯ）産物を生成して増殖させ、土壌中の病原体に対して適切に保護することができる。
【００８６】
さらなる実施形態によれば、ウイルス感染に耐性があるトランスジェニック根茎は、ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントを標的とするｓｉＲＮＡを作製するために設計したＤＮＡ構築体を含む。
【００８７】
転写後型遺伝子発現抑制の現象は、２つの型のトランス遺伝子の遺伝子座によって誘導される可能性がある。最初の型は、本明細書で前に記載した充分に転写される１つのトランス遺伝子に対応する。ＰＴＧＳを効率良く誘導する第２の型のトランス遺伝子の遺伝子座は、逆方向反復配列（ＩＲ）として編成された２つのトランス遺伝子コピーを有し、読み過ごし転写によってｄｓＲＮＡを生成するものである。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、植物を含めた幾つかの生物において特定の遺伝子発現を抑制する際に非常に有効である。ウイルス誘導型遺伝子発現抑制（ＶＩＧＳ）は、例えば幾つかの植物ＲＮＡウイルスに関して実証されてきている（Ｖａｎｃｅ及びＶａｕｃｈｅｒｅｔ、２００１．「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、２９２：２２７７〜２２８０）。このプロセスは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子によって開始される。ｄｓＲＮＡ分子はおそらくウイルスＲＮＡの複製中間体によって、或いは異常なトランス遺伝子コードＲＮＡによって作製され、これらはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性によってｄｓＲＮＡになる（Ｄａｌｍａｙら、２０００．「セル（Ｃｅｌｌ）」、１０１：５４３〜５５３；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、２００１．「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、４１１：８３４〜８４２）。このようなｄｓＲＮＡ分子は植物細胞中に取り込まれており、ウイルスの遺伝子発現を抑制又は阻害する際に有用であることが示されてきている（例えば、米国出願Ｎｏ．２００２０１６９２９８を参照のこと）。
【００８８】
植物細胞中では、ｄｓＲＮＡはリボヌクレアーゼＩＩＩファミリーのメンバーによって低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に切断され、それらは一般に２１〜２６ヌクレオチドの大きさの範囲である。したがってｓｉＲＮＡは、同系ｍＲＮＡを破壊する多成分ヌクレアーゼ複合体ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導型抑制複合体）を形成することによって、ＲＮＡ分解を促進すると考えられている（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１．ＥＭＢＯ  Ｊ  ２０：６８７７〜６８８８；Ｚａｍｏｒｅら、２０００．Ｃｅｌｌ  １０１：２５〜３３）。近年、２１〜２６ヌクレオチドの大きさの範囲であるこのようなｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ経路の中間体は、動物及び哺乳動物系において遺伝子発現を抑制する際に同様に有効であることが示されてきている。したがってｓｉＲＮＡの使用は、遺伝子発現を下方制御するための強力なツールとなっている。
【００８９】
転写後型遺伝子発現抑制は、ウイルス伝播を連想させる非常に特徴的な形式で、個々の植物中において全体に広がる。このことは、発現抑制が開始されシグナルが配列特異的な形式で発現抑制を開始させることができる植物の遠方部分に次いで伝わる組織中で生成される、全体的な発現抑制シグナルの仮説につながる。発現抑制の配列特異性は、シグナルは核酸であるが、シグナルのアイデンティティーは依然知られていないことを示唆する（Ｋａｌａｎｔｉｄｉｓ、Ｋ．２００４．ＰＩｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：１０５９〜１０６１）。発現抑制は主として炭素供給源から炭素吸収源の方向、即ち、光合成の糖生成物を輸出する葉などの組織からこれらの生成物を輸入する根などの組織に広がり、それが植物全体中で確立するまでに、数週間までかかる可能性がある。接木植物における発現抑制シグナルの存在は示されてきており、この場合発現抑制は発現抑制された根茎から標的接ぎ穂に伝わった。しかしながら、このようなシグナル伝達は、接ぎ穂による対応するトランス遺伝子の発現に依存した。さらに、内生遺伝子又は接ぎ穂に安定的に組み込まれた外来性遺伝子であれ、染色体の対応する遺伝子の過剰発現は、シグナル伝達によって仲介されるＲＮＡ分解を誘導するための、根茎から接ぎ穂への必要不可欠な前提条件であることが実証された。
【００９０】
本発明は、ウイルスゲノム配列を発現抑制することを標的化するｄｓＲＮＡを発現するトランスジェニック根茎は、接木時に敏感な接ぎ穂にウイルス耐性を与えることを実証する。接ぎ穂に与えられるウイルス耐性は、根茎から接ぎ穂に伝わるシグナルは、ウイルスゲノム配列を切断する際に有効であることを示す。したがって本発明は、根茎から接ぎ穂に伝わるシグナルは、配列特異的な形式で植物ゲノムによって発現されない核酸配列の機能的発現に干渉することを初めて示す。この発見は、伝わるシグナルがＲＮＡであることを示唆する。Ｓｍｉｒｎｏｖら（上記）は、トランスジェニック植物中でのヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）の発現は、接木植物中でのウイルス耐性を誘導することを示した。この著者達は、接ぎ穂によって得られる耐性は、サリチル酸の蓄積及び病原関連タンパク質の合成に依存しないことをさらに実証している。しかしながら、これらの結果は本発明によって記載する現象とは実質的に異なる、何故ならＰＡＰの酵素活性は、接ぎ穂をウイルス感染に耐性がある状態にするシグナルを生成するために必要とされるからである。さらにＰＡＰ活性は、本発明の接木植物に与えられる配列特異的な耐性とは対照的に、非特異的なウイルス耐性を与える。
【００９１】
一実施形態によれば本発明は、トランスジェニック耐性タバコ根茎に接木することによる、ズッキーニ黄化モザイクウイルス（ＺＹＭＶ）に対する敏感なタバコの接ぎ穂（タバコ属ベンサミアナ系）の保護を開示し、この耐性根茎は、コートタンパク質をコードする遺伝子及びウイルスゲノムの３’非翻訳領域を含む、ＺＹＭＶゲノムのセグメントを標的とするｓｉＲＮＡを作製するために設計したＤＮＡ構築体を含む。この実施形態は、本明細書で前に記載した本発明の広範囲を示す非制限的な例として働く。
【００９２】
本発明の組成物及び方法を使用して、ウイルス感染を受けやすい任意の植物に耐性を与えることができる。非制限的な例には、ウリ科の植物、ダイズ、コムギ、オートムギ、モロコシ、コットン、トマト、ジャガイモ、タバコ、コショウ、コメ、コーン、オオムギ、アブラナ属、及びシロイヌナズナがある。一実施形態によれば、接木したウイルス耐性植物はウリ科の植物である。好ましい一実施形態によれば、トランスジェニックウイルス耐性植物はスイカ、メロン、パンプキン、カボチャ、ズッキーニ及びキュウリからなる群から選択される。ウイルス特異性は、植物に形質転換される核酸配列の型及び設計によって決定されると思われる。核酸配列は１つ又は複数のウイルスゲノムの対応するセグメントの発現抑制を標的化する転写産物をコードすることができ、さらに２個以上の核酸配列を植物に形質転換することができる。
【００９３】
特定の実施形態によれば本発明は、土壌伝染性ウイルスによって引き起こされる疾患に耐性がある、土壌伝染性ウイルスのゲノムの少なくとも１つのセグメントと少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含むトランスジェニック根茎、及び疾患に対して感受性がある接ぎ穂を含む植物を提供し、この接木植物は前記土壌伝染性ウイルスによって引き起こされる前記疾患から保護される。
【００９４】
一実施形態によれば植物は、線虫伝播性ウイルス：ネポウイルス：アラビノモザイクウイルス、ブドウファンリーフウイルス、トマト黒色輪点ウイルス、イチゴ舌輪点ウイルス、トマト輪点ウイルス、及びタバコ輪点ウイルス；トブラウイルス：Ｐｅａ  ｅａｒｌｙ  ｂｒｏｗｎｉｎｇウイルス、タバコラットルウイルス及びコショウ輪点ウイルス；真菌伝播性ウイルス：キュウリ緑斑ウイルス、キュウリ黄化えそ病ウイルス、メロンえそ斑点ウイルス、アカクローバえそモザイク病ウイルス、カボチャえそウイルス、タバコ黄斑えそ病サテライトウイルス、レタスビッグベインウイルス、ペッパーイエローベインウイルス、ビートえそ性葉脈黄化ウイルス、ビート土壌伝染性ウイルス、オートムギ縞萎縮病ウイルス、ナンキンマメ斑紋ウイルス、ジャガイモモップトップウイルス、イネ縞葉枯病壊死ウイルス、土壌伝染性コムギ縞萎縮病ウイルス、オオムギマイルドモザイクウイルス、オオムギ黄萎ウイルス、オートムギモザイクウイルス、イネ壊死モザイクウイルス、コムギ条斑病モザイクウイルス及びコムギ黄萎モザイクウイルス；根の損傷によって伝播するウイルス：トバモウイルス属：タバコモザイクウイルス、トマトモザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクトバモウイルス、キュウリ果斑モザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクウイルス、オンドグロッサムリングスポットウイルス、パプリカ弱斑ウイルス、コショウ弱斑ウイルス、オオバコモザイクウイルス及びタバコ弱緑斑モザイクウイルス；及び未知の経路によって伝播するウイルス：オランダガラシ黄斑ウイルス、ソラマメネクロティックウイルトウイルス、ピーチロゼットモザイクウイルス及びサトウキビ退録条斑病ウイルスからなる群から選択される土壌伝染性ウイルスだけには限られないが、これらを含めた土壌伝染性ウイルスによって引き起こされる疾患に耐性がある。
【００９５】
一実施形態によれば、トランスジェニック根茎は、キュウリ果斑モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）の複製タンパク質の断片である推定５４ｋＤａのタンパク質をコードする核酸配列を含む。現在好ましい一実施形態によれば、トランスジェニック根茎は、配列番号１に記載の配列を有する核酸配列を含む。
【００９６】
さらなる実施形態によれば本発明は、ウイルスによって引き起こされる疾患に耐性がある、ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントを標的とするｓｉＲＮＡを作製するために設計したＤＮＡ構築体を含むトランスジェニック根茎、及び前記ウイルスによって引き起こされる疾患に対して感受性がある接ぎ穂を含む植物を提供し、この接木植物は前記ウイルスによって引き起こされる前記感染に耐性がある。
【００９７】
ウイルスゲノムの標的セグメントに応じて植物を設計して、任意のウイルスに対して耐性があるようにすることができる。幾つかの実施形態によれば、植物は土壌伝染性ウイルス、及び本明細書で前に記載した植物の気生部分に影響を与えるベクターによって伝播するウイルスに耐性がある。
【００９８】
一実施形態によれば、ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントを標的とするｓｉＲＮＡを作製するために設計したＤＮＡ構築体は、
（ａ）以下のものに動作可能に連結した少なくとも１つの植物の発現可能なプロモーター、
（ｂ）少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡを形成するＲＮＡ配列をコードする核酸配列であって、二本鎖ＲＮＡ分子がウイルスゲノムの標的セグメントのセンスヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドの第１ヌクレオチド配列、及び前記ウイルスゲノムの前記標的セグメントのセンスヌクレオチド配列の相補配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドの第２ヌクレオチド配列を含む核酸配列、及び場合によっては、
（ｃ）転写終了シグナルを含む。
【００９９】
幾つかの実施形態によれば、本発明のＤＮＡ構築体はステム−ループＲＮＡを発現し、第１（センス）及び第２（アンチセンス）ヌクレオチド配列、第１及び第２ヌクレオチド配列をコードするＤＮＡ領域間に位置するスペーサーポリヌクレオチド配列をさらに含むように設計する。スペーサーポリヌクレオチド配列の長さは、ステム−ループＲＮＡの特異的構造に従い変わる可能性がある。典型的には、スペーサーの長さと第１及び第２ヌクレオチド配列の長さの比は、１：５〜１：１０の範囲内である。
【０１００】
好ましい一実施形態によれば、ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントを標的とするｓｉＲＮＡを作製するために設計したＤＮＡ構築体は、
（ａ）以下のものに動作可能に連結した少なくとも１つの植物の発現可能なプロモーター、
（ｂ）ステム−ループの形の少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡを形成するＲＮＡ配列をコードする核酸配列であって、二本鎖ＲＮＡ分子がウイルスゲノムの標的セグメントのセンスヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドの第１ヌクレオチド配列；前記ウイルスゲノムの前記標的セグメントのセンスヌクレオチド配列の相補配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドの第２ヌクレオチド配列を含む核酸配列；及びスペーサー配列；及び場合によっては、
（ｃ）転写終了シグナルを含む。
【０１０１】
一実施形態によればスペーサー配列は、ｓｉＲＮＡ生成を増大させることが当分野で知られている、遺伝子のイントロンに由来するヌクレオチド配列を含む。一実施形態によればスペーサー配列は、配列番号３に記載の配列を有するヒマカタラーゼ遺伝子由来のイントロンを含む、ヌクレオチド配列を含む。
【０１０２】
本明細書において使用する用語「ＤＮＡ構築体」及び「核酸配列」は、宿主細胞又は生物中で発現される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド分子を指す。典型的にはこのような発現は、構成性、誘導性又は組織特異的プロモーター、及び増大要素を含めた幾つかのシス作用性制御要素の制御下にある。当分野では一般的であるが、このようなポリヌクレオチド配列は、制御要素と「動作可能に連結している」と言える。真核生物細胞中に運ばれる核酸配列は、その核酸配列を含む真核生物細胞の選択を可能にする、真核生物又は細菌由来の選択可能なマーカーも典型的には含む。これらは、当分野でよく知られている抗生物質耐性を与えるさまざまな遺伝子、及びさまざまなレポーター遺伝子だけには限らないが、それらを含み得る。場合によっては核酸配列は、クローニング部位、１つ又は複数の原核生物の複製起点、１つ又は複数の翻訳開始部位、１つ又は複数のポリアデニル化シグナルなどをさらに含む。
【０１０３】
本明細書において使用する用語「核酸配列の発現」、又は「ポリヌクレオチドの発現」は、適切な制御領域、特にプロモーター領域と動作可能に連結したＤＮＡ領域が、生物学的に活性がある、即ち他の核酸と相互作用することができるか、或いはポリペプチド又はタンパク質に翻訳することができるＲＮＡに転写されるプロセスを指す。本発明の教示に従い、ウイルス遺伝子又はその一部分の発現抑制を得るために、タンパク質の翻訳は必ずしも必要とされないことは理解されるはずである。
【０１０４】
用語「遺伝子の発現」は、遺伝子の「転写」によって（即ち、ＲＮＡポリメラーゼの酵素作用によって）遺伝子中にコードされている遺伝情報をＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又はｓｎＲＮＡ）に、及びｍＲＮＡの「翻訳」によってタンパク質に変換するプロセスを指す。遺伝子の発現は、プロセス中の多くの段階で制御することができる。「上方制御」又は「活性化」は遺伝子の発現産物（即ち、ＲＮＡ又はタンパク質）の生成を増大させる制御を指し、一方「下方制御」又は「抑制」は生成を低下させる制御を指す。上方制御又は下方制御と関係がある分子（例えば転写因子）は、それぞれ「活性化因子」及び「抑制因子」と呼ばれることが多い。
【０１０５】
ウイルスゲノムのセグメントである本発明のヌクレオチド配列は、完全長遺伝子、又はその一部分、非コード領域又はその一部分又はこれらの組合せであってよい。本明細書において使用する用語「相同性」は、核酸配列に関して使用するとき、少なくとも２つのヌクレオチド配列間の類似性又は同一性の程度を指す。部分的な相同性又は完全な相同性（即ち同一性）が存在する可能性がある。「配列同一性」は、比較する長さ全体に関する割合として表される、２つ以上のヌクレオチド配列間の関連性の指標を指す。同一性の計算は、同一でありそのそれぞれの配列中で同一の相対的位置に存在する、ヌクレオチド残基を考慮する。ギャップ、即ち、残基が１つの配列中には存在するが他の配列中には存在しないアラインメント中の位置は、非同一残基に関する位置としてみなされる。例えばＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ系検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７．「核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）」２５：３３８９〜３４０２）及び「ＢＥＳＴＦＩＴ」を使用して、相同性が決定される。
【０１０６】
本明細書において使用する「ヌクレオチド配列の相補配列」は、そのヌクレオチド配列と二本鎖ＤＮＡ分子を形成することができると思われ、シャルガフの法則（ＡＴ；ＧＣ）に従いヌクレオチドをそれらの相補的ヌクレオチドと置換すること、及び５’〜３’方向、即ちヌクレオチド配列の反対方向に読み取ることによって、そのヌクレオチド配列から誘導することができるヌクレオチド配列である。
【０１０７】
本明細書において使用するＲＮＡ分子のヌクレオチド配列は、配列表のＤＮＡヌクレオチド配列を参照することによって同定することができる。しかしながら当業者は、文脈に応じてＲＮＡ又はＤＮＡを意味するかどうかを理解していると思われる。さらに、ＲＮＡ分子中でＴ塩基がウラシル（Ｕ）に置換されていること以外、ヌクレオチド配列は同一である。
【０１０８】
ウイルスゲノムのセグメントと相同的な核酸配列の全体長が長くなるほど、ウイルスゲノムのセグメントの配列との配列同一性に関する要件は厳しくなくなることは理解されよう。核酸配列全体は、対応するウイルスゲノムのセグメントと少なくとも約９０％の配列同一性、及び約９５％又は１００％のさらに高い配列同一性を有することができる。
【０１０９】
ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントを標的とするｓｉＲＮＡを作製するために設計したＤＮＡ構築体を根茎が含む、ある実施形態によれば、ＤＮＡ構築体の第２（アンチセンス）ヌクレオチド配列の長さは、第１（センス）ヌクレオチド配列の長さによって主に決定され、後者の配列の長さに対応し得る。しかしながら、約１０％長さが異なるアンチセンス配列を使用することができる。同様に、アンチセンス領域のヌクレオチド配列はセンス領域のヌクレオチド配列によって主に決定され、センス領域の相補配列と約９０％の配列同一性、及び約９５％又は１００％のさらに高い配列同一性を有することができる。
【０１１０】
ｓｉＲＮＡを作製するために設計したＤＮＡ構築体の第１及び第２ヌクレオチド配列は、それらの配列が少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドを含むという条件で、任意の長さであってよい。したがって、第１及び第２ヌクレオチドは、標的配列の一部分又は標的配列の完全長を含むことができる。幾つかの実施形態によれば、ヌクレオチド配列の長さは２０ヌクレオチド〜１，２００ヌクレオチドである。
【０１１１】
一実施形態によれば、本発明のＤＮＡ構築体によって作製したｓｉＲＮＡは、ウイルスコートタンパク質のコード領域を含めた、ＺＹＭＶゲノムのセグメントを発現抑制することを標的化する。
【０１１２】
好ましい一実施形態によれば、第１ヌクレオチド配列は配列番号２に記載のヌクレオチド配列又はその断片と９０％の同一性、好ましくは９５％、より好ましくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１１３】
別の好ましい実施形態によれば、第２ヌクレオチド配列は配列番号２に記載のヌクレオチド配列の相補配列又はその断片と９０％の同一性、好ましくは９５％、より好ましくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１１４】
特定の実施形態によれば、第１ヌクレオチド配列と第２ヌクレオチド配列は、同一プロモーターに動作可能に連結している。少なくとも一部分が相補的である転写される鎖は、ｄｓＲＮＡを形成することができる。他の実施形態によれば、第１ヌクレオチド配列と第２ヌクレオチド配列は、２本の別々の鎖として転写される。ｄｓＲＮＡがこのように生成されるとき、転写されるＤＮＡ配列は、１つは第１ヌクレオチド配列の転写を制御し、もう１つは第２の相補ヌクレオチド配列を制御する、２つのプロモーターの側面に位置している。この２つのプロモーターは同じであるか異なっていてよい。一実施形態によれば、第１ヌクレオチド配列と第２ヌクレオチド配列は、同一プロモーターに動作可能に連結している。
【０１１５】
植物の発現可能なプロモーターは当分野で知られている。適切なプロモーターの選択は、本発明のＤＮＡ構築体を使用することを目的とする植物種、有用性、及び必要とされる作用形態によって決定されると思われる。本発明の教示に従う好ましいプロモーターは、一般的又は組織特異的な構成性プロモーターである。用語「構成性」は、プロモーターに関して言及するとき、そのプロモーターは、刺激（例えば熱ショック、化学物質、光など）の不在下において動作可能に連結した核酸配列の転写を誘導することができることを意味する。典型的には構成性プロモーターは、実質的に任意の細胞及び任意の組織におけるトランス遺伝子の発現を誘導することができる。植物中での構成性遺伝子の発現のために使用されることが多いプロモーターには、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、強化型ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）プロモーター、マンノピン合成酵素（ｍａｓ）プロモーター、ノパリン合成酵素（ｎｏｓ）プロモーター、及びオクトピン合成酵素（ｏｃｓ）プロモーターがある。本発明の本発明者及び同僚によって単離した、イチゴベインバンディングウイルス（ＳＶＢＶ）から単離した構成性プロモーター（Ｗａｎｇら、２０００．「ウイルス遺伝子（Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ）」２０：１１〜１７）を、使用することが好ましい。
【０１１６】
特定の遺伝子を抑制するための転写後遺伝子制御の可能性のある使用は、細胞内で活性ｓｉＲＮＡを得るための、さまざまな新しい方法の開発につながっている。例えば米国出願Ｎｏ．２００４０２６２２４９は、標的遺伝子、特に植物細胞内のウイルス遺伝子を発現抑制するためのｓｉＲＮＡの直接的な導入を開示している。本発明の教示は、植物細胞内にｓｉＲＮＡを作製するため、或いは植物細胞にｓｉＲＮＡを直接導入するための、当分野で知られている任意の方法によって実施することができる。
【０１１７】
本明細書で前に記載した核酸配列、特に（ｉ）配列番号１及び配列番号２から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸、又は（ｉｉ）配列番号１及び配列番号２から選択されるヌクレオチド配列の相補配列、及びこれらの断片とクロスハイブリダイズするヌクレオチド分子も、本発明の範囲内にある。
【０１１８】
首尾良いハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件に大きく依存する。本明細書において使用する用語「緊縮条件」又は「緊縮性」は、核酸、塩、及び温度によって定義されるハイブリダイゼーションに関する条件を指す。これらの条件は当分野でよく知られており、これらを変えて同一又は関連ポリヌクレオチド配列を同定又は検出することができる。低又は高緊縮性を含む多くの均等条件は、配列の長さ及び性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）、標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）、環境（溶液中に存在するか、或いは固体支持体上に固定されている）、塩及び他の成分（例えばホルムアミド、硫酸デキストラン及び／又はポリエチレングリコール）の濃度、及び反応の温度（約５℃〜約２５℃の範囲内、プローブの融解温度未満）などの要因に依存する。１つ又は複数の要因を変えて、低又は高緊縮性の条件を作成することができる。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：研究室用マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ）」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク．１９８９、特に第１１章中に例示されている。一実施形態によれば、クロスハイブリダイゼーションは、６５℃において１．０〜２．０×ＳＳＣの適度な緊縮性の下で行う。
【０１１９】
植物細胞へのヌクレオチド配列の形質転換用に設計した構築体は、本発明の構築体を含む植物細胞の選択を可能にする選択可能なマーカーも典型的には含む。用語「選択可能なマーカー」は、その中で選択可能なマーカーが発現する細胞に抗生物質又は薬剤に対する耐性を与えるか、或いは検出することができる特徴（例えば発光性又は蛍光性）の発現を与える、活性を有する酵素をコードする遺伝子を指す。
【０１２０】
典型的には、抗生物質耐性を与え、当分野でよく知られている遺伝子を選択可能なマーカーとして使用する。しかしながら、開放耕地での抗生物質耐性を与える遺伝子を含む遺伝的に改変された植物、特に農作物の栽培は、最終産物が外来性遺伝物質を含まないときでさえ、相当数の西洋諸国において許されていない。したがって、幾つかの実施形態によれば、同時形質転換法を使用して、本発明のＤＮＡ構築体を用いて形質転換した植物を選択する。
【０１２１】
一実施形態によれば同時形質転換は、本発明のウイルス遺伝子の発現抑制をもたらすＤＮＡ構築体、及び少なくとも１つの選択可能なマーカーを含むＤＮＡ構築体を用いて行う。同時形質転換の方法は当分野で知られており、高い割合の形質転換細胞が両方のＤＮＡ構築体を有するという発見に一部分は基づく。選択可能なマーカーを発現する植物は、例えばＰＣＲ反応によって、ウイルス遺伝子の発現抑制をもたらすＤＮＡ構築体の存在に関して調べる。選択した植物は成熟状態に栽培し、自家受粉させる。生成した子孫では、２つのＤＮＡ構築体は独立に分離し、所望のＤＮＡ構築体のみを含む植物を選択することができる。
【０１２２】
場合によっては、ウイルス遺伝子の切断をもたらす核酸配列は転写終了シグナルを含む。本発明の構築体中に使用することができるさまざまなターミネーターは、当業者にはよく知られている。ターミネーターはプロモーター配列と同じ遺伝子由来、或いは異なる遺伝子由来であってよい。一実施形態によれば、転写終了シグナルはＮＯＳターミネーターである。
【０１２３】
さらなる態様によれば本発明は、ウイルスによる感染に耐性がある接木植物を生成するための方法であって、（ａ）抗ウイルスタンパク質の発現による以外のウイルス感染に耐性があるトランスジェニック根茎を提供するステップ、（ｂ）前記ウイルスによる感染の影響を受けやすい接ぎ穂を提供するステップ、及び（ｃ）接ぎ穂を根茎に接木させて前記ウイルス感染に耐性がある接木植物を得るステップを含む方法を提供する。
【０１２４】
接木は、２つの独立した植物の部分を１つの植物に組み合わせることを含む。芽条と根部の接木、添え継ぎの接木、先端と裂け目の接木、側面接木、鞍状部接木及び芽の接木だけには限られないが、これらを含めたさまざまな方法で、このような組合せを実施することができる（さらなる詳細に関しては、Ｇａｒｎｅｒ  Ｒ．Ｊ、「接木師の入門書（Ｔｈｅ  Ｇｒａｆｔｅｒ’ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）」、第５版、（１９９３年３月）Ｃａｓｓｅｌｌ  Ａｃａｄｅｍｉｃ；ＩＳＢＮ：０３０４３４２７４２を参照のこと）。
【０１２５】
一実施形態によれば、ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントと少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を用いて根茎を形質転換して、ウイルス感染に耐性があるトランスジェニック根茎を生成する。
【０１２６】
さらなる実施形態によれば、ウイルスゲノムの少なくとも１つのセグメントを標的とするｓｉＲＮＡを作製するために設計したＤＮＡ構築体を用いて根茎を形質転換して、ウイルス感染に耐性があるトランスジェニック根茎を生成する。
【０１２７】
本発明の好ましい実施形態によれば、影響を与えるウイルスゲノムのセグメントは植物中での感染及び／又は複製のためにウイルスに必要不可欠であり、したがってその切断はウイルス感染及び／又は複製を妨げ、それによって耐性植物を与える。
【０１２８】
根茎をウイルス感染に対して耐性がある状態にするために、本発明の核酸配列を用いて根茎を形質転換するための方法は当分野で知られている。本明細書において使用する用語「形質転換」又は「形質転換する」は、それによってＤＮＡ構築体などの外来性ＤＮＡがレシピエント細胞に入り、形質転換、遺伝的に改変された又はトランスジェニック細胞に変えるプロセスを記載する。形質転換は安定したものである可能性があり、核酸配列を植物のゲノムに組込み、このようにして安定した遺伝的特徴を表し、或いは一時的に、形質転換されているがゲノムに組込まれていない核酸配列を細胞によって発現させ、このようにして一時的な特徴を表す。好ましい実施形態によれば、本発明の核酸配列は植物細胞に安定的に形質転換する。
【０１２９】
単子葉植物と双子葉植物の両方に外来性遺伝子を導入する、さまざまな方法が存在する（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、Ｉ．１９９１．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ４２、２０５〜２２５；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ、Ｋら、１９８９．「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」（１９８９）３３８、２７４〜２７６）。
【０１３０】
植物のゲノムＤＮＡ中に外来性ＤＮＡを安定的に組み込む主要な方法には、２つの主な手法がある：
【０１３１】
アグロバクテリア菌仲介遺伝子移入：アグロバクテリア菌仲介系は、植物のゲノムＤＮＡ中に組み込む明確なＤＮＡセグメントを含むプラスミドベクターの使用を含む。植物組織の接種法は、植物種及びアグロバクテリア菌送達系に応じて変わる。広く使用されている手法は、植物全体の分化を開始させるのに良い供給源となる任意の組織外植変を用いて行うことができる、リーフ−ディスク手順である（Ｈｏｒｓｃｈ、Ｒ．Ｂら、１９８８．「植物の分子生物学マニュアル（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ）」Ａ５、１〜９、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ）。補足的手法は、真空浸潤と組み合わせたアグロバクテリア菌送達系を使用する。アグロバクテリア菌送達系は、トランスジェニック双子葉植物を作製する際に特に有用である。
【０１３２】
直接的なＤＮＡの取り込み。植物細胞に直接ＤＮＡを移入するさまざまな方法が存在する。エレクトロポレーションでは、プロトプラストを強い電場に一時的に曝し、小さな穴を開けてＤＮＡの進入を可能にする。マイクロインジェクションでは、マイクロピペットを使用して細胞に直接ＤＮＡを機械的に注入する。マイクロ粒子衝突法では、硫酸マグネシウム結晶又はタングステン粒子などのマイクロプロジェクタイルにＤＮＡを吸着させ、マイクロプロジェクタイルは細胞又は植物組織中に物理的に進む。
【０１３３】
安定した形質転換の後、植物の繁殖が次いで起こる。植物の繁殖の最も一般的な方法は、種子によるものである。しかしながら、種子繁殖による再生の欠点は、異型接合性による作物の均一性の欠如である、何故なら、メンデルの法則により支配される遺伝的変化に従い植物によって種子が生成されるからである。言い換えれば、それぞれの種子は遺伝的に異なり、それぞれの種子はその独自の特異的な特徴で成長すると思われる。したがって、再生植物が同一の特徴を有し親のトランスジェニック植物の特徴を有するように、再生が影響を受けることが好ましい。形質転換植物を再生する好ましい方法は微細繁殖によるものであり、これは形質転換植物の迅速な一貫した再生をもたらす。
【０１３４】
微細繁殖は、選択した親植物又は栽培品種から切除した１つの組織サンプルから、第２世代の植物を増殖させる方法である。この方法は、好ましい組織を有し融合タンパク質を発現する植物の大量再生産を可能にする。新たに生成する植物は元の植物と遺伝的に同一であり、元の植物の全ての特徴を有する。微細繁殖は元のトランスジェニック又は形質転換植物の特徴を保ちながら、短時間での高品質の植物体の大量生産を可能にし、選択した栽培品種の迅速な繁殖をもたらす。植物をクローニングするこの方法の利点には、植物繁殖のスピード、並びに生成する植物の質及び均一性がある。
【０１３５】
微細繁殖は、段階間の培養培地又は生長条件の改変を必要とする、多段階の手順である。微細繁殖法は４つの基本段階：段階１、初期組織培養；段階２、組織培養繁殖；段階３、分化及び植物体形成；及び段階４、温室培養及び無感覚化を含む。段階１中は、組織培養が確立され汚染物質を含まないことを保証する。段階２中は、充分な数の組織サンプルが生じて生成目的を満たすまで、初期組織培養物を増殖させる。段階３中は、新たに生長した組織サンプルを分類し個々の苗木に生長させる。段階４中は、形質転換させた苗木を無感覚状態にするために温室に移し、そこで自然環境において苗木が生長し続けることができるように、光に対する植物の耐性を徐々に増大させる。
【０１３６】
当業者は、本発明中に記載する核酸配列のさまざまな要素と形質転換ベクターは動作可能に連結して、前記核酸又は核酸断片の発現をもたらすことを理解していると思われる。本発明の構築体の要素とベクターを動作可能に連結させるための技法は、当業者によく知られている。このような技法には、例えば１つ又は複数の制限酵素部位を含む、合成リンカーなどのリンカーの使用がある。
【０１３７】
本明細書で以下に例示するように、本発明のトランスジェニック根茎は、外来性ＲＮＡ分子、特に標的ウイルスのゲノムの少なくとも１つのセグメントと相同性があるＲＮＡ配列を発現する。例えばトランスジェニック植物の葉のＲＮＡを単離すること、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において特異的プライマーを使用することによりウイルスＲＮＡの存在を試験することによって、当業者に知られている方法によって発現を調べることができる。
【０１３８】
本発明はさらに、根茎として働かせるための、本発明の核酸配列を用いて形質転換した植物の細胞又はその他の部分に関する。さらに、トランスジェニック植物によって生成する種子も本発明によって含まれ、この種子は植物に形質転換される核酸配列をさらに含む。
【０１３９】
トランスジェニック耐性植物は、従来の品種改良計画によって大規模な根茎の生成用に繁殖させることができる。さらに品種改良を使用して、同じ又は関連植物種の他の変種、或いはハイブリッド植物にＤＮＡ構築体を導入することができる。トランスジェニック植物から得られる種子は、安定したゲノム挿入体として核酸配列を含み、したがって、本明細書に記載するトランスジェニック植物のトランスジェニック子孫、トランスジェニック植物の種子から生長させたトランスジェニック子孫も本発明によって含まれる。任意の前に記載したトランスジェニック植物が、本発明の教示に従い接ぎ穂が接木されている根茎として働くことができる。
【０１４０】
トランスジェニック耐性根茎を与えるための、本発明の核酸配列を用いて形質転換した植物の選択は、当業者に知られている分子遺伝学の標準的な方法を使用することによって行う。一実施形態によれば核酸配列は、抗生物質に対する耐性を与える産物をコードする核酸配列をさらに含み、したがってトランスジェニック植物は、抗生物質に対するそれらの耐性に従い選択する。幾つかの実施形態によれば、選択可能なマーカーとして働く抗生物質は、パラモマイシン及びカナマイシンからなるアミノグリコシド群の１つである。他の実施形態によれば核酸配列は、検出可能な産物をコードするレポーター遺伝子をさらに含み、したがって、その産物が検出されるトランスジェニック植物を選択する。幾つかの実施形態によれば、レポーター遺伝子はＧＵＳ、ＧＦＰなどからなる群から選択される。
【０１４１】
別の実施形態によれば、耐性のある根茎を与えるために形質転換する植物は、ウイルス感染に対するそれらの耐性に従い選択する。植物を攻撃するために選択するウイルスは、その植物に形質転換された核酸配列をそのゲノム中に含む。一実施形態によれば、線虫伝播性ウイルス：ネポウイルス：アラビノモザイクウイルス、ブドウファンリーフウイルス、トマト黒色輪点ウイルス、イチゴ舌輪点ウイルス、トマト輪点ウイルス、及びタバコ輪点ウイルス；トブラウイルス：Ｐｅａ  ｅａｒｌｙ  ｂｒｏｗｎｉｎｇウイルス、タバコラットルウイルス及びコショウ輪点ウイルス；真菌伝播性ウイルス：キュウリ緑斑ウイルス、キュウリ黄化えそ病ウイルス、メロンえそ斑点ウイルス、アカクローバえそモザイク病ウイルス、カボチャえそウイルス、タバコ黄斑えそ病サテライトウイルス、レタスビッグベインウイルス、ペッパーイエローベインウイルス、ビートえそ性葉脈黄化ウイルス、ビート土壌伝染性ウイルス、オートムギ縞萎縮病ウイルス、ナンキンマメ斑紋ウイルス、ジャガイモモップトップウイルス、イネ縞葉枯病壊死ウイルス、土壌伝染性コムギ縞萎縮病ウイルス、オオムギマイルドモザイクウイルス、オオムギ黄萎ウイルス、オートムギモザイクウイルス、イネ壊死モザイクウイルス、コムギ条斑病モザイクウイルス及びコムギ黄萎モザイクウイルス；根の損傷によって伝播するウイルス：トバモウイルス属：タバコモザイクウイルス、トマトモザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクトバモウイルス、キュウリ果斑モザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクウイルス、オンドグロッサムリングスポットウイルス、パプリカ弱斑ウイルス、コショウ弱斑ウイルス、オオバコモザイクウイルス及びタバコ弱緑斑モザイクウイルス；及び未知の経路によって伝播するウイルス：オランダガラシ黄斑ウイルス、ソラマメネクロティックウイルトウイルス、ピーチロゼットモザイクウイルス及びサトウキビ退録条斑病ウイルスからなる群から選択される土壌伝染性ウイルスだけには限られないが、これらを含めた土壌伝染性ウイルスに対するそれらの耐性に従い、トランスジェニック植物を選択する。
【０１４２】
他の実施形態によれば、ウイルス科：カリモウイルス科、ジェミニウイルス科、サーコウイルス科、レオウイルス科、タルチチウイルス科、ブロモウイルス科、コモウイルス科、ポチウイルス科、トンブスウイルス科、セクイウイルス科、クロストロウイルス科及びルテオウイルス科；トバモウイルス、トブラウイルス、ポテックスウイルス、カルラウイルス、アレクシウイルス、カピロウイルス、フォベアウイルス、トリコウイルス、ブドウウイルス、フロウイルス、ペクルウイルス、ポモウイルス、ベニーウイルス、ホルデイウイルス、ソベモウイルス、マラフィウイルス、チモウイルス、イダエオウイルス、オウルミウイルス、ウンブラウイルスからなる群から選択されるウイルスだけには限られないが、これらを含めた植物の気生部分に影響を与えるベクターによって伝播するウイルスに対する、それらの耐性に従いトランスジェニック植物を選択する。
【０１４３】
他の態様によれば本発明は、本発明の方法によって生成するウイルス耐性接木植物に関する。トランスジェニック耐性根茎に接木させた他の場合ウイルス性疾患の影響を受けやすい接ぎ穂を含む植物は、ウイルス性疾患に耐性がある。その根茎は、そのゲノム中に安定的に組み込まれた本発明の核酸配列を含む。本明細書で前に記載した核酸配列、又は充分転写された１つのトランス遺伝子、又はｓｉＲＮＡを生成するトランス遺伝子の性質が、接木植物に与えられる耐性の特徴を決定する。幾つかの実施形態によれば根茎は、土壌伝染性ウイルスによって引き起こされる疾患からの保護を与える。他の実施形態によれば根茎は、植物の気生部分に影響を与えるベクターによって伝播するウイルスによって引き起こされる疾患に対する耐性を与える。
【０１４４】
本明細書の以下の非制限的実施例は、本発明の根茎及び接ぎ穂を含む耐性植物を以下に記載する。実施例中では他に述べない限り、全ての組換えＤＮＡ及びＲＮＡ技法、並びに園芸法は、当業者に知られているのと同様に標準プロトコルに従い行う。
【実施例】
【０１４５】
実験手順
バイナリーベクターｐＣＡＭＳＶ５４−ｋＤａの構築
位置３６２９のＡＵＧの上流に他の２２個のヌクレオチドを有する推定５４ｋＤａのコード配列（図１Ａ）を、Ａｎｔｉｇｎｕｓら、上記によって作製した完全長クローンを使用して、ｐＣａｍｂｉａ２３０１バイナリーベクター（受託番号ＡＦ２３４３１６；Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚら、１９９４．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５：９８９〜９９４）にクローニングした。この５４ｋＤａのコード配列は、その５’端においてＺＹＭＶの非コード領域（ＮＣＲ）と、及びその３’端（Ｔ）においてＮＯＳポリ−Ａターミネーターと融合させた（図１Ｂ）。クローン遺伝子及びＮＰＴＩＩマーカー遺伝子を、それぞれ切断型イチゴベインバンディングカリモウイルス（ＳＶＢＶ）プロモーター（したがってＳＶと表す）及び完全長ＳＶＢＶプロモーターの下流にクローニングした（Ｗａｎｇら、２０００．「ウイルス遺伝子（Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ）」２０：１１〜１７（図１Ｂ）。このＤＮＡ構築体を、Ｔ−ＤＮＡの左（ＬＢ）と右（ＲＢ）境界の間にクローニングした（図１Ｂ）。ＺＹＭＶの５’ＮＣＲと結合したＳＶプロモーターは、ＳＶセンスプライマー（配列番号５：５’ＣＧＣＴＡＧＣＴＡＴＣＡＣＴＧＡＡＡＡＧＡＣＡＧＣ３’）及びＮｃｏＩ部位（下線部）を有するＺＹＭＶ  ＮＣＲアンチセンスプライマー（配列番号６：
【化１】
2007527717.tif 000002
）を用いて、鋳型ΔＳＶＢＶｐｒ−ＺＹＭＶ−ＦＬＣクローン（Ｗａｎｇら、上記）からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ断片（４７０ｂｐ）は、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）にクローニングし、さらにｐΔＳＶＢＶｐｒ−ＮＣＲｚｙと表した。
【０１４６】
５４ｋＤａのコード配列は、以下のプライマー：
【化２】
2007527717.tif 000003
（下線を引いたＮｃｏＩ部位を有する５４ｋＤａのセンスプライマー、配列番号７）、
【化３】
2007527717.tif 000004
（下線を引いたＢｓｔＥＩＩ部位を有する５４ｋＤａのアンチセンスプライマー、配列番号８）を用いて、クローンｐＵＣ３’−３．３ｋｂからＰＣＲによって増幅させた。推定５４ｋＤａのＰＣＲ断片（１４６１ｂｐ）はＮｃｏＩ／ＢｓｔＥＩＩによって事前に消化し、ＮｃｏＩ／ＢｓｔＥＩＩによって消化したｐΔＳＶＢＶ−ＮＣＲｚｙにクローニングした。得られたクローンｐΔＳＶＢＶ−ＮＣＲ５４−ｋＤａはＥｃｏＲＩ／ＢｓｔＥＩＩによって二重消化し、生成した挿入体はバイナリーベクターｐＣＡＭＢＩＡ２３０１にクローニングし、これをクローニング前にＥｃｏＲＩ／ＢｓｔＥＩＩによって二重消化した。ｐＣＡＭ３５Ｓ−ＳＶ５４−ｋＤａ由来の３５Ｓプロモーター（ＮＰＴＩＩ遺伝子の上流に位置する）は、以下のように完全ＳＶＢＶプロモーターで置換し：以前にｐＧＥＭ−ＴにクローニングしＳＶＢＶｐｒと呼ぶ（Ｗａｎｔら、上記）ＳＶＢＶプロモーターは、ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ部位の二重消化によって切除し、ここでｐＣＡＭＳＶ５４−ｋＤａと表すバイナリーベクター中の同じ部位にクローニングした。この最終構築体（図１Ｂ）はアグロバクテリア菌ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＥＨＡ１０５菌株中に導入し、これを使用して所望の植物を形質転換した。
【０１４７】
ｓｉＲＮＡ、ｐＣｄｄＣＰ−ＺＹを作製するためのＤＮＡ構築体の構築
ウイルスコートタンパク質及び３’非コード領域（ＮＣＲ）をコードする完全遺伝子を含むＺＹＭＶゲノムの３’端（配列番号２、受託番号Ｍ３５０９５）を、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ部位を有するプライマー（センスプライマー、５’ＡＴＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＡＧＧＣＡＣＴＣＡＧＣＣＡＡＣＴＧＴＧＧＣ３’、配列番号１０）、及びＮａｒＩ及びＰｓｔＩ部位を有するアンチセンスプライマー（５’ＡＴＧＧＣＧＣＣＧＧＴＡＣＣＡＧＧＣＴＴＧＣＡＡＡＣＧＧＡＧＴＣ３’、配列番号１１）を用いてＰＣＲ増幅させた。このセグメントはＺＹＭＶイスラエル単離体から単離し、受託番号ＮＣ＿００３３２２４を有するＺＹＭＶゲノムの位置８５３８〜９５８８の核酸配列（配列番号９）と相同性がある。
【０１４８】
事前にカタラーゼイントロンを、ＫＳ  Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔのポリリンカーにクローニングした。クローニングしたカタラーゼイントロンは、５’端にＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩ部位、並びに３’端にＮａｒＩ及びＫｐｎＩを含んでいた。ＺＹＭＶゲノムの３’端のＰＣＲ産物（１０５０ｂｐ）はＫｐｎＩ及びＮａｒＩで最初に切断し、生成した産物はＫＳプラスミド中のカタラーゼイントロンの下流（３’端）にクローニングした。その後、ＰＣＲ産物はＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで切断し、産物はＫＳプラスミド中のカタラーゼイントロンの５’端にクローニングした。これによって、カタラーゼイントロンと隔てられた、ＫＳ中のＺＹＭＶゲノムの３’端の逆方向反復配列が生じた。新しいクローンはｐＫＳｄｄＣＰ−ＺＹと表した。ｐＣａｍｂｉａバイナリーベクター２３０１由来の３５ＳＣａＭＶプロモーターは、ＳＶＢＶプロモーターで置換した。前に記載した構築体、ｐＫＳｄｄＣＰ−ＺＹはＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ近辺で切断し、ＳＶＢＶプロモーターの下流、及びＮＯＳターミネーターの上流の適切な部位ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩにクローニングした。新しいクローンはｐＣｄｄＣＰ−ＺＹと表した（図２）。
【０１４９】
アグロバクテリア菌仲介形質転換
アグロバクテリア菌の培養物を、適切な選択抗生物質及び１００μＭのアセトシリンゴンを含むＬＢ培地において２８℃で一晩増殖させ、次いで抗生物質を含まない培地中で同じ条件下において４時間継代培養した。０．５ＯＤの最終濃度で３％のスクロースを含む液体ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ、Ｔ．及びＳｋｏｏｇ、Ｆ．１９６２．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ  １５：４７３〜４９７）中に、細菌を沈殿及び再懸濁させた。形質転換法は、依然に記載されたもの（Ｔａｂｅｉら、１９９８．「植物細胞の報告書（Ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｒｔ）」１７：１５９−１６４）と同様であり、幾つかの変更を行った。
【０１５０】
キュウリの形質転換
改良種「Ｉｌａｎ」（Ｚｅｒａｉｍ  Ｇｅｄｅｒａ  Ｃｏ．、イスラエル）の内果皮除去したキュウリの種子を、７０％エタノール中で１分間、次いで２％次亜塩素酸中で２０分間のインキュベーションによって表面滅菌した。充分に洗浄した後、暗所中２５℃で３％スクロース及び０．８％のＯｘｏｉｄ寒天を含むＭＳ培地において１〜２日間、種子をインキュベートした。種子胚を切り裂き、個々の子葉は、２００μＭのアセトシリンゴンを補った再生培地（ＭＳ培地、３％のスクロース、２ｍｇ／ｌのベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、１ｍｇ／ｌのアブシジン酸（ＡＢＡ）、０．８％のＯｘｏｉｄ寒天）で、暗所中２５℃において１〜２日間インキュベートした。子葉はアグロバクテリア菌の懸濁液に５分間浸し、濾紙上で乾燥させ、暗所中で２日間同時培養するために同じプレートに戻した。次いで外植片を選択培地（５００ｍｇ／ｌのセファトキシム及び１００ｍｇ／ｌのカナマイシンを補った再生培地）に移し、２週間に１回継代培養しながら１６／８時間の光周期体制でインキュベートした。再生した若枝は切除し、生長培地（ＭＳ、３％のスクロース、１ｍｇ／ｌのジベレリン酸、０．１ｍｇ／ｌのＢＡＰ、０．１ｍｇ／ｌのＡＢＡ、０．８％のＯｘｏｉｄ寒天、５００ｍｇ／ｌのセファトキシム及び１００ｍｇ／ｌのカナマイシン）に移した。若枝の発根は、ＭＳ、３％のスクロース、０．５ｍｇ／ｌのインドール酪酸、０．８％のＯｘｏｉｄ寒天、５００ｍｇ／ｌのセファトキシム及び１００ｍｇ／ｌのカナマイシン中で誘導した。発根した外植片は、さらなる増殖のために温室に移す前に、無感覚状態にするためにジフィー７ピートペレットに移植した。
【０１５１】
タバコの形質転換
無菌植物由来の葉の外植片を、２００μＭのアセトシリンゴンを補った再生培地（ＭＳ培地、３％のスクロース、１ｍｇ／ｌのベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、０．１ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、０．８％のＯｘｏｉｄ寒天）で、暗所中２５℃において１〜２日間インキュベートした。外植片はアグロバクテリア菌の懸濁液に５分間浸し、濾紙上で乾燥させ、暗所中で２日間同時培養するために同じプレートに戻した。次いで外植片を選択培地（５００ｍｇ／ｌのセファトキシム及び２５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを補った再生培地）に移し、２週間に１回継代培養しながら１６／８時間の光周期体制でインキュベートした。再生した若枝は切除し、発根用培地（ＭＳ、３％のスクロース、０．８％のＯｘｏｉｄ寒天、５００ｍｇ／ｌのセファトキシム及び２５０ｍｇ／ｌのカナマイシン）に移した。発根した外植片は、さらなる増殖のために温室に移す前に、無感覚状態にするためにジフィー７ピートペレットに移植した。
【０１５２】
Ｒ１実生苗木における分離アッセイ
個々の形質転換植物からの子孫を、以下のようにＤＮＡ構築体の分離に関してスクリーニングした：Ｒ１種子は表面滅菌し、１００ｍｇ／ｌのカナマイシンの存在下で前に記載したのと同様に発芽させた。トランスジェニック種子（ＮＰＴＩＩ遺伝子を有する）は正常な根の分化を示し、一方で非トランスジェニック子孫の植物は、それらの萎縮した無枝の根によって容易に検出した。カナマイシン耐性／感受性の比を記録し、トランスジェニック実生苗木は他の実験において使用した。
【０１５３】
耐性応答の評価
カナマイシン耐性のＲ１実生苗木を、温室条件下においてウイルス耐性に関してスクリーニングした。
【０１５４】
ＣＦＭＭＶに対する耐性
カナマイシン耐性のキュウリ植物に、５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．４）中に１ｍｇ／ｍｌの精製ＣＦＭＭＶ、又は５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ８．０）中に４００μｇ／ｍｌのウイルスＲＮＡを機械的に接種した。大部分のトランスジェニック子孫に関して、１０を超える実生苗木を接種によって最初にスクリーニングした。接種した実生苗木は、温室条件下に数週間保った。接種に対する応答性は症状を肉眼で調べることによって決定し、ＣＦＭＭＶの存在に関しては、１：１，０００の希釈で調製した特異的な抗血清を用いるＤＡＳ−ＥＬＩＳＡによって決定した（Ａｎｔｉｇｎｕｓら、上記）。他の耐性分析は、接種後３週間でのタバコ属ベンサミアナ系及びシロバナヨウシュチョウセンアサガオへの機械的な戻し接種によって行った。
【０１５５】
ＺＹＭＶに対する耐性
カナマイシン耐性のＧＵＳ発現タバコ植物に、ＺＹＭＶの全身伝播を得るためのヘルパーとして働いた、キュウリ緑斑モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）として仮に同定したトバモウイルスとＺＹＭＶを同時感染させた、タバコ植物由来の１：５の比で希釈した樹液を機械的に接種した。大部分のトランスジェニック子孫に関して、１０を超える実生苗木を接種によって最初にスクリーニングした。接種した実生苗木は、温室条件下に数週間保った。接種に対する応答性は、１：２，０００の希釈で調製した特異的なＺＹＭＶ−ＣＰ抗血清を用いるＥＬＩＳＡによって決定した。
【０１５６】
子葉段階のキュウリの実生苗木を接木用に使用した。子葉節下の茎を対角切断し、これもまた１つの子葉を保持するような方法で子葉節において対角切断した、トランスジェニック又は非形質転換根茎の実生苗木の上部に取り付けた後に、非形質転換接ぎ穂を接木する代表的な接木法を使用した（したがって接木した実生苗木は３個の子葉を含んでいた）。３週齢のタバコの実生苗木に、根茎に対角切断部を作製し同様に対角切断した接ぎ穂を取り付けることによって上部に接木した。接ぎ穂／根茎接合部は、小さなプラスチッククリップを用いて定位置に固定した。第１週中、接木植物は高い湿度中に保った。
【０１５７】
植物の接種
キュウリの実生苗木は、ＣＦＭＭＶ  ＫＧＭＭＶ、ＺＧＭＭＶ  ＣＧＭＭＶ及びキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）の培養を維持するための供給源植物として使用した。カボチャ植物は、ＺＹＭＶ及びＣＭＶ−Ｆｎｙの接種源として使用した。蒸留水中で供給源植物の若葉をすり潰すことによって、接種物を調製した。
【０１５８】
カーボランダム（商標）を散布した後、子葉（発生後３日）に機械的に接種した。ポリスチレントレイからウイルス感染させたパーライト培地を含むプラスチックポット（１０ｃｍ径）に試験する植物を移植することによって、根の接種を行った。１：１００の比で０．０１Ｍのリン酸バッファーｐＨ７中にウイルス感染させたキュウリの葉をすり潰すことによって、粗製接種原を調製した。四葉の段階でウイルス感染させた植物の茎において対角切断することによって、接木接種を行った。接種する植物の先端部分は除去し、その茎の下側部分は、感染根茎の対角切断部に挿入する前にくさび形に刈り込んだ。接ぎ穂と根茎の接触地点はパラフィルム片と結合させて、充分な融合をもたらした。第１週中、接木植物はプラスチックバッグ中に保ち高い湿度を保った。
【０１５９】
ビリオンは記載されたのと同様に（Ｃｈａｐｍａｎ  Ｓ．Ｎ．１９９８．「植物ウイルス学プロトコル（Ｐｌａｎｔ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」Ｇ．Ｄ．Ｆｏｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓ．Ｃ．Ｔａｙｌｏｒ、Ｅｄｓ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：１２３〜１２９中）、感染植物から部分的に精製した。部分的に精製したビリオンは、２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファーと１：１で混合し、５分間沸騰させた（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９．「分子クローニング−研究室用マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ）」、第２版）。沸騰させた物質（１０μｌ）は、１２．５％のポリアクリルアミドゲル上においてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画した。
【０１６０】
ＲＮＡの抽出及び分析、ノーザンブロッティング及びＲＴ−ＰＣＲ
ウイルスＲＮＡの転写を、発芽後３週間の実生苗木から抽出した全ＲＮＡのノーザンブロッティング及びＲＴ−ＰＣＲ分析によって測定した。若葉組織（３００ｍｇ）を液体窒素中に微粉状体にすり潰し、製造者の教示書に従いＴＲＩ−ＲＥＡＧＥＮＴキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ、ＵＳＡ）を用いてＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ濃度はＧｅｎｅＱｕａｕｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって測定し、異なる供給源由来の匹敵する量のＲＮＡをゲル上に載せた。約３０μｇのそれぞれのサンプルを、ホルムアルデヒドを含む変性１．５％アガロースゲルに施した。ゲル中で分離したＲＮＡは次いでＨｙｂｏｎｄ−ＮＸ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＮＪ、ＵＳＡ）にブロッティングし、８０ＷのＵＶランプ（Ｖｉｌｂｅｒ  Ｌｏｕｒｍａｔ  ＢＬＸ−２５４、フランス）に２分間曝すことによって固定した。Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂバッファー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いたプレハイブリダイゼーションを２時間行った。ＣＦＭＭＶの５４ｋＤａ遺伝子（ヌクレオチド３８２４〜４６９３）の３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブ、及びランダムにプライマー処理した３２Ｐ標識ＤＮＡプローブ（ランダムプライマーＤＮＡ標識混合キット；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ  ＨａＥｍｅｋ、イスラエル）とのハイブリダイゼーションによって、形質転換植物においてＣＦＭＭＶのＲＮＡを検出した。接種植物中のＣＦＭＭＶのＲＮＡを検出するためのＲＴ−ＰＣＲは、５４ｋＤａ遺伝子の特異的プライマー（センス：５’ＧＣＴＡＣＧＧＡＧＣＧＴＣＣＧＣＧＧ３’、配列番号１２、及びアンチセンス：５’ＣＧＣＧＧＴＣＧＡＣＴＧＴＡＴＧＴＣＡＴ３’、配列番号１３）を用いて、Ａｒａｚｉら（２００１．Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８７：６７〜８２）に従い２〜５μｇの合計ＲＮＡを用いる１−チューブ１−ステップ法で行った。ＲＴ−ＰＣＲサイクルは以下の通りであった：４６℃で３０分間；９４℃で２分間、次に９４℃、５８℃及び７２℃、それぞれ３０秒間で３５サイクル、並びに７２℃において５分間の最後の１サイクル。さまざまなトバモウイルスの感染性アッセイ（図３）のためのＲＴ−ＰＣＲは、以下のウイルスのＣＰゲノムの特異的プライマーを用いて２ステップで行った：
ＣＧＭＭＶ（５’ＴＣＴＧＡＣＣＡＧＡＣＴＡＣＣＧＡＡＡＡ３’、配列番号１４、及び５’ＡＴＧＧＣＴＴＡＣＡＡＴＣＣＧＡＴＣＡＣ３’、配列番号１５）；
ＫＧＭＭＶ（５’ＧＡＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＴＴＣＴＡＡＧＴＣＡＧＧＴＣＣＴ３’、配列番号１６、及び５’ＧＡＧＡＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＴＴＴＧＡＧＧＡＡＧＴＡＧＣＧＣＴ３’、配列番号１７）；
ＺＧＭＭＶ（５’ＴＣＴＡＴＣＧＣＴＴＡＡＣＧＣＡＧＣ３’、配列番号１８、及び５’ＡＴＧＴＣＴＴＡＣＴＣＴＡＣＴＴＣＴＧＧ３’、配列番号１９）；並びに
ＣＦＭＭＶ（５’ＣＡＡＧＡＣＧＡＧＧＴＡＧＡＣＧＡＡＣ３’、配列番号２０、及び５’ＡＴＧＣＣＴＴＡＣＴＣＴＡＣＣＡＧＣＧ３’、配列番号２１）。ＲＴ−ＰＣＲは、ｉ−サイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）においてＲＴ−ＰＣＲ  ＡｍｐＴａｑキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）によって行い、サイクリングステップは、３７℃で１時間、及び１分間９４℃の３０サイクル、５３℃（ＫＧＭＭＶ）、５２℃（ＺＧＭＭＶ、ＣＧＭＭＶ）又は４４℃（ＣＦＭＭＶ）のアニーリング温度で４０秒、１分間７２℃、及び最後に７２℃において１０分間であった。
【０１６１】
ＤＮＡ抽出及びＰＣＲ分析
全ゲノムＤＮＡを、ＣＴＡＢ法（Ｃｈｅｎ、Ｄ．Ｈ．及びＲｏｎａｌｄ、Ｐ．Ｃ．１９９９．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  １７：５３〜５７）によって（発芽後３週間で）若葉から抽出した。ＤＮＡ溶液（１μｌ）を、ＣＦＭＭＶの５４ｋＤａ遺伝子の配列（受託番号ＡＦ３２１０５７、配列番号４）に従うプライマーを含む２５μｌのＰＣＲ反応混合物に希釈した。２組のプライマー：位置３８２４及び４６９３に設定した第１プライマー（配列番号１２及び配列番号１３；図４）、及び位置３７８５及び４４７９に設定した第２プライマー（５’ＧＡＡＡＡＡＧＧＡＧＴＴＴＴＴＧＡＴＣＣＣＧＣＴ３’、配列番号２２、及び５’ＡＣＴＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣＴＴＣＴＴＡＴＧＣＣＣ３’、配列番号２３；図３）を、５４ｋＤａの遺伝子を検出するために使用した。ＰＣＲ条件は：９４℃で２分間の１サイクル、並びに９４、５８及び７２℃、それぞれ３０秒、及び最後に７２℃において５分間で３５サイクルであった。
【０１６２】
（実施例１）
耐性のあるキュウリ系の同定及び特徴付け
ｐＣＡＭＳＶの５４ｋＤａ構築体を用いたアグロバクテリア菌仲介形質転換の後に、個々のＲ０形質転換体を成熟状態まで増殖させ、自家受粉させてＲ１種子を得た。植物ゲノム内のＣＦＭＭＶの５４ｋＤａ遺伝子の存在は、表１中に示す全てのカナマイシン耐性Ｒ１系に関するＰＣＲ分析によって確認した。耐性スクリーニングの後、１４のＲ１系のうち８系が完全な耐性応答を示した（表１）。残りの系の幾つかは完全に感受性があり；他の系は部分的に耐性があるとして特徴付けた。接種した子葉中のＣＦＭＭＶのＲＮＡの蓄積を評価するための試みは一切行わなかった。しかしながら、ＥＬＩＳＡ及び戻し接種アッセイによって大部分の系において示されたように、８個の耐性レプリカーゼ系の上葉においてウイルスの蓄積は検出されなかった。同様に、高温（３０〜３５℃）で植物を栽培すると、耐性応答は変わらなかった。
【表１】
2007527717.tif 000005
【０１６３】
（実施例２）
同型Ｉ４４系における耐性の特徴付け
さらに広範囲の試験を行って、１個のＮＰＴＩＩ挿入による推定予想した分離を示す系Ｒ４４の耐性を特徴付けた（表１）。遺伝的一貫性のために、系Ｒ４４の１０個の異なるＲ１植物由来の種子を、本明細書で前に記載したのと同様にカナマイシンの存在下で発芽させ、トランスジェニック遺伝子座に関して分離しないＲ２同型系（したがって系Ｉ４４と表す）を同定し、さらなる試験用に使用した。Ｉ４４植物は、本来の栽培品種（「Ｉｌａｎ」）と区別がつかない正常な表現型及び正常な果実の分化を示した。
【０１６４】
親系（「Ｉｌａｎ」）はＣＦＭＭＶ接種の影響を非常に受けやすく（表２）、接種後１４日で強烈な斑紋症状、その後は葉の変形、植物の萎縮、及び黄斑を有する異常な果実状態を発症した（図５）。対照的にＩ４４植物は、植物抽出物（表２、図５）及び精製ＲＮＡ（データ示さず）の機械的接種に対して完全に耐性があった。温室中のＣＦＭＭＶの土壌仲介接種は、ウイルス伝染の開始の誘導要因である（Ａｎｔｉｇｎｕｓ、未発表）。したがって、ＣＦＭＭＶ接種原を故意に感染させた土壌中に植えたＩ４４実生苗木の応答性を調べた。さらに、系Ｉ４４を最も攻撃的な接種法、即ち感染させた感受性のある根茎（改良種「Ｉｌａｎ」）の上部への接木によってさらに攻撃した。使用した接種法とは無関係に、Ｉ４４植物は無症状の状態であり、ＥＬＩＳＡによって、或いは感受性のある宿主（タバコ属ベンサミアナ系及びキュウリ）への戻し接種によって、ウイルス蓄積を検出することはできなかった（表２）。
【表２】
2007527717.tif 000006
【０１６５】
（実施例３）
Ｉ４４耐性系の分子の特徴付け
系Ｉ４４のゲノム中のウイルス核酸配列の存在は、ＰＣＲ（図４Ｃ）及びサザンブロッティング（データ示さず）によって確認した。５４ｋＤａのコード配列の転写は、接種又は非接種Ｉ４４植物においてＲＴ−ＰＣＲによって検出した（図４Ａ）。反対に、Ｉ４４植物由来の全ＲＮＡ調製物に関するＰＣＲ反応は陰性であり（図４Ｃ）、図４Ａ中に示す増幅ＲＴ−ＰＣＲバンドは、ＲＮＡ調製物中の汚染したＤＮＡ残留物によるものではなかったことが示された。ＲＴ−ＰＣＲアッセイを行って、ＣＦＭＭＶを接種した系Ｉ４４における症状の欠如が、ウイルス蓄積の欠如によるものであったかどうかを評価した。「Ｉｌａｎ」接種植物における陽性ＣＰバンドの存在とは対照的に、Ｉ４４系においてＣＦＭＭＶコートタンパク質（ＣＰ）用の特異的プライマーを用いて、増幅バンドは観察されなかった（図４Ｂ）。これらの結果によって、Ｉ４４植物においてウイルス蓄積の形跡を検出することができない観察結果がさらに確かになる。
【０１６６】
（実施例４）
他のトバモウイルスに対する耐性に関するスクリーニング
レプリカーゼ仲介の耐性が高い配列特異性を示すことは、以前から示されてきている。したがって、さまざまなウリ科感染トバモウイルスの感染に対するＩ４４系の応答性を調べた。系Ｉ４４及び非形質転換「Ｉｌａｎ」栽培品種には、３つの他のトバモウイルス：ＫＧＭＭＶ、ＺＧＭＭＶ及びＣＧＭＭＶを接種した。非形質転換改良種「Ｉｌａｎ」は、接種後日数（ｄｐｉ）８日からＫＧＭＭＶ及びＺＧＭＭＶに関して症状を示し、ＣＦＭＭＶ及びＣＧＭＭＶに関しては２日遅れて症状を示した（表３）。症状出現の有意な遅れを系Ｉ４４において観察した：症状は１４ｄｐｉではＣＧＭＭＶ及びＺＧＭＭＶに関してのみ、２０ｄｐｉではＫＧＭＭＶに関して眼に見える状態であった。さらに、非形質転換植物によって示された重度の症状と対照的に、全実験中（３０ｄｐｉ）ＣＧＭＭＶを感染させたＩ４４植物において症状の顕著な低下を観察した（表３）。トバモウイルス感染に対する系Ｉ４４の応答性は、精製ビリオンを検出するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、及びウイルスＲＮＡ用のＲＴ−ＰＣＲによって確認した（図３）。ＺＧＭＭＶ、ＣＧＭＭＶ及びＫＧＭＭＶビリオンの蓄積は、Ｉ４４と対照「Ｉｌａｎ」植物の両方においてはっきりと検出した；しかしながらＣＦＭＭＶビリオンは、これらの後者の植物においてのみ検出した（図３Ａ）。さらに、Ｉ４４植物、及び非形質転換対照植物において、ＲＴ−ＰＣＲによりＣＧＭＭＶ、ＫＧＭＭＶ及びＺＧＭＭＶのウイルスＲＮＡを検出した一方で、ＣＦＭＭＶのＲＮＡは対照「Ｉｌａｎ」植物においてのみ発見した（図３Ｂ）。
【表３】
2007527717.tif 000007
【０１６７】
（実施例５）
ウイルス接種した植物における形質転換された核酸配列の転写
系Ｉ４４によって示されたＣＦＭＭＶ感染に対する特異性及び顕著な耐性は、ＲＮＡの発現抑制とおそらく関係がある、ＲＮＡ仲介の耐性機構の優勢を示す可能性がある。この仮説を試験するために、ＣＦＭＭＶ接種の前後に系Ｉ４４及び「Ｉｌａｎ」植物から全ＲＮＡを抽出した。等量の全ＲＮＡを有するサンプルを、標識５４ｋＤａプローブを用いるノーザンブロットハイブリダイゼーションによって分析した。このプローブは、ＣＦＭＭＶゲノムＲＮＡ（上側バンド）、５４ｋＤａを有する推定サブゲノムＲＮＡＩ１、及び５４ｋＤａのトランス遺伝子転写産物とハイブリダイズした。予想通り、Ｉ４４植物における転写産物は、感染状態の対照植物において検出したＩ１サブゲノムＲＮＡより短かった（図６）。５４ｋＤａの転写産物は系Ｉ４４植物においてのみ観察し、転写産物蓄積のレベルは、ＣＦＭＭＶ又はＺＹＭＶをＩ４４植物に事前接種することによって実質的に影響を受けなかった（図６）。発現抑制仲介のウイルス耐性は、ウイルスで植物を攻撃する前にポチウイルスを接種することによって（Ｓａｖｅｎｋｏｖ、Ｅ．Ｉ．及びＶａｌｋｏｎｅｎ、Ｊ．Ｐ．２００２．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ８３：２３２５〜２３３５）、或いは温度条件を変えることによって（Ｓｚｉｔｔｙａら、２００３．ＥＭＢＯ  Ｊ２２：６３３〜６４０）、抑制され得ることが示されてきている。以下のポチウイルス：ＺＹＭＶ、ズッキーニ小斑モザイクウイルス（ＺＦＭＶ）及びキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ、サツマイモウイルス属；ポチウイルス科）、又はキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の１つを事前に接種した後に、ＣＦＭＭＶに対する耐性に関して系Ｉ４４の植物を評価した（表４）。ＥＬＩＳＡ及びシロバナヨウシュチョウセンアサガオへの戻し接種によって確認したように、Ｉ４４植物は個々のポチウイルス又はＣＭＶの典型的な症状を示したが、一連の感染においてＣＦＭＭＶに対しては依然として耐性があった。さらに、ＣＦＭＭＶ感染に対する系Ｉ４４の耐性が、異なる温度（２０、２８又は３５℃）において栽培チャンバー中で接種植物を栽培することによって影響を受けることはなかった。
【表４】
2007527717.tif 000008
【０１６８】
（実施例６）
Ｉ４４根茎による感受性のある接ぎ穂の保護
トバモウイルス粒子は土壌中で長期間生存し、感染した土壌中の根を介したＣＦＭＭＶ感染は一般的な現象である。系Ｉ４４はＣＦＭＭＶの土壌接種に対して耐性を示したので（表２）、非形質転換接ぎ穂用の防御根茎として働くためのこの系の適性を試験した。
【０１６９】
対照Ｉｌａｎ植物は系Ｉ４４又はＩｌａｎ根茎と接木し、ＣＦＭＭＶに感染した土壌に植えた。非形質転換Ｉｌａｎ根茎と接木した大部分の植物（１２／１６）がＣＦＭＭＶの明らかな症状を示し、ＥＬＩＳＡによって陽性反応を示した。しかしながら、眼に見える症状、ＥＬＩＳＡ試験及びタバコ属ベンサミアナ系への戻し接種により評価して、Ｉ４４と接木した接ぎ穂はいずれも（０／１６）、実験期間中（５週間）感染状態にならなかった。平行した実験では、Ｉ４４根茎と接木した「Ｉｌａｎ」接ぎ穂は、ＣＦＭＭＶの直接的な機械的接種に対して感受性があった。
【０１７０】
（実施例７）
耐性のあるタバコ属ベンサミアナ系根茎による感受性のある接ぎ穂の保護
本明細書で前に記載したのと同様に、ｐＣｄｄＣＰ−ＺＹ構築体を有するアグロバクテリア菌ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを用いてタバコ属ベンサミアナ系の葉盤を形質転換した。再生培地での選択の後、個々の推定形質転換体をＧＵＳ発現によって同定した。確認した形質転換体は自家受粉させて、Ｒ１世代が生じた。個々の形質転換植物からの子孫を、以下のようにＤＮＡ構築体の分離に関してスクリーニングした：Ｒ１種子は表面滅菌し、２５０ｍｇ／ｌのカナマイシンの存在下で発芽させた。トランスジェニック種子（ＮＰＴＩＩ遺伝子を有する）は正常な根の分化を示し、一方で非トランスジェニック子孫の植物は、それらの萎縮した無枝の根によって容易に検出した。カナマイシン耐性／感受性の比を記録し、トランスジェニック実生苗木は接種の実験において使用した。
【０１７１】
カナマイシン耐性のＧＵＳ発現タバコＲ１実生苗木に、ＺＹＭＶの全身伝播を得るためのヘルパーとして働いた、キュウリ緑斑モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）として仮に同定したトバモウイルスとＺＹＭＶを同時感染させた、タバコ植物由来の１：５の比で希釈した樹液を機械的に接種した。大部分のトランスジェニック子孫に関して、１０を超える実生苗木を接種によって最初にスクリーニングした。接種した実生苗木は、温室条件下に数週間保った。接種に対する応答性は、１：２，０００の希釈で調製した特異的なＺＹＭＶ−コートタンパク質抗血清を用いるＥＬＩＳＡによって決定した。
【０１７２】
選択したトランスジェニック系は、その後の接木実験において根茎として使用した。３週齢のタバコの実生苗木に、根茎に対角切断部を作製し同様に対角切断した接ぎ穂を取り付けることによって上部に接木した。接ぎ穂／根茎接合部は、小さなプラスチッククリップを用いて定位置に固定した。第１週中、接木植物は高い湿度中に保った。接ぎ穂の機械的接種は、本明細書で前に記載したのと同様に、ＺＹＭＶとトバモウイルスを同時感染させたタバコ植物由来の１：５の比で希釈した樹液を用いて接木後３〜４週間行った。接種した接木植物は、温室条件下に数週間保った。接種に対する応答性は、１：２，０００の希釈で調製した特異的なＺＹＭＶ−ＣＰ抗血清を用いるＥＬＩＳＡによって決定した。幾つかの実験では、接種した接ぎ穂中のＺＹＭＶの存在は感受性のあるカボチャ植物への戻し接種によって決定した。結果は以下の表５中に要約する。
【表５】
2007527717.tif 000009
【０１７３】
非接木型タバコ対照、又は非トランスジェニック根茎と接木した接ぎ穂は、それぞれ８９％及び７０％の高い感染率を示した。トランスジェニック系と接木した接ぎ穂の応答性は２群に分けることができる：根茎系Ｚ８９、Ｚ９９又はＺ１０２と接木した接ぎ穂はＺＹＭＶの全身感染に対して完全に保護され；根茎系Ｚ９７、Ｚ１００又はＺ１０１などと接木した接ぎ穂は病状を示した。幾つかの保護された根茎において、接種した接ぎ穂中のＺＹＭＶの不在をカボチャ植物への戻し接種によって確認した。
【０１７４】
具体的な実施形態の前述の記載は、一般的な知識を適用することによって、他者は不要な実験無しで一般概念から逸脱せずに、このような具体的な実施形態をさまざまな用途のために容易に変更及び／又は適合させることができるほど、本発明の一般的性質を充分明らかにすると思われ、したがって、このような適合及び変更は開示した実施形態の均等物の意味及び範囲内に含まれるはずであり、そうであることを目的とする。本明細書で使用する語法又は用語は、制限の目的ではなく記載の目的であることは理解されよう。さまざまな開示した化学的構造化及び機能を行うための手段、物質、及びステップは、本発明から逸脱せずにさまざまな他の形をとることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】ＣＦＭＭＶゲノム編成及び５４ｋＤａのＤＮＡ構築体の概略図である。Ａ．ＣＦＭＭＶゲノムの編成の図である。ヌクレオチド番号は、推定遺伝子の位置を指す。推定５４ｋＤａをコードする３つのサブゲノムＲＮＡ（ＲＮＡ−Ｉ１）、運動性タンパク質（ＭＰ）及びコートタンパク質（ＣＰ）遺伝子を示す。Ｂ．左（ＬＢ）と右（ＲＢ）Ｔ−ＤＮＡ境界の間の、植物の形質転換において使用する構築体の組成の図である。ＣＦＭＭＶの５４ｋＤａ遺伝子は、切断型ＳＶＢＶ（ＳＶ）プロモーターとＮＯＳポリ−Ａターミネーター（Ｔ）の間のＺＹＭＶの５’非コード領域（ＮＣＲ）と融合させた。選択ＮＰＴＩＩ遺伝子は、完全長ＳＶＢＶプロモーターの制御下において挿入した。
【図２】左（ＬＢ）と右（ＲＢ）Ｔ−ＤＮＡ境界の間にｓｉＲＮＡ、ｐＣｄｄＣＰ−ＺＹを作製するためのＤＮＡ構築体の概略図である。ＺＹＭＶ遺伝子コートタンパク質（ＣＰ）及びウイルスの３’非コード領域（ＮＣＲ）を含むポリヌクレオチドの逆方向反復配列は、イントロンのそれぞれの側から、ＳＶＢＶ（ＳＶ）プロモーターとＮＯＳポリ−Ａターミネーター（Ｔｅｒ）の間で融合させた。選択ＮＰＴＩＩ及びＧＵＳ遺伝子は、３５Ｓプロモーターの制御下においてそれぞれ挿入した。
【図３】ビリオン蓄積（ａ）及びＲＴ−ＰＣＲ（ｂ）によって評価した、異なるウリ科作物感染トバモウイルス；ＣＦＭＭＶ（ＣＦ）、ＣＧＭＭＶ（ＣＧ）、ＫＧＭＭＶ（ＫＧ）及びＺＧＭＭＶ（ＺＧ）による感染に対する、Ｉ４４耐性植物及び対照植物の応答性を示す図である。
【図４】ＣＦＭＭＶによる感染を示すＲＴ−ＰＣＲ産物を示す図である。非接種（Ｈ）又はＣＦＭＭＶの接種後３週間（ｉｎｏｃｕｌ．）の、系Ｉ４４及び非形質転換「Ｉｌａｎ」植物由来の全ＲＮＡが、ＲＴ−ＰＣＲ（ａ）及び（ｂ）の鋳型として、並びに陰性対照分析としてのＰＣＲ（ｃ）の鋳型として働いた。（ａ）５４ｋＤａ遺伝子のプライマー。（ｂ）ＣＰ遺伝子のプライマー。ＭＷ：１００ｂｐステップラダーの分子量。
【図５】ＣＦＭＭＶ接種に対するキュウリ植物の応答性を示す図である。Ａ及びＣ：トランスジェニック系Ｉ４４。Ｂ及びＤ：非形質転換「Ｉｌａｎ」栽培品種。葉及び果実は、接種後３週間及び７週間で病状をそれぞれ示した。
【図６】形質転換したＩ４４植物における５４ｋＤａの転写産物の存在を示す図である。非接種或いは１８ｄｐｉでＣＦＭＭＶ（ＣＦ）又はＺＹＭＶ（ＺＹ）を接種した、形質転換した（Ｉ４４）及び非形質転換植物（「Ｉｌａｎ」）の第２及び第３の真葉から、全ＲＮＡを抽出した。変性アガロースゲル電気泳動及びノーザンブロットハイブリダイゼーションによって、ＲＮＡを分析した。レーン毎に載せたＲＮＡの量は、３μｇ（ＣＦＭＭＶを感染させた非形質転換「Ｉｌａｎ」植物由来）、又は３０μｇ（全ての他のレーン）であった。５４ｋＤａのコード配列と相補的な３２Ｐ標識ＲＮＡプローブを、トランス遺伝子及びウイルスＲＮＡを検出するために使用した。ＣＦＭＭＶのＲＮＡ及びサブゲノムＲＮＡ−Ｉ１の電気泳動の位置を図の隣に示す。トランス遺伝子の転写産物を示す（５４ｋＤａの転写産物）。レーンＩｌａｎ＋ＣＦ（ＣＦＭＭＶを感染させた非形質転換植物）は４時間露光させ、一方他のレーンは３日間露光させた。下図：膜に移す前にゲルの臭化エチジウム染色によって測定した、１８ＳＲＮＡのレベル。
【図１】
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【図２】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【配列表】
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