(57)【要約】【解決課題】  遺伝子組換微生物による発現及び収量が向上した組換ポリペプチド、並びに組換ポリペプチドの発現及び収量を向上させる方法を提供すること。【解決手段】  ポリペプチド、該ポリペプチドの末端に結合した０〜２個のアミノ酸で構成されるスペーサー・ペプチド及び該スペーサー・ペプチドに結合した４〜１２個のアミノ酸で構成されるタグ・ペプチドから成り、該タグ・ペプチドは１〜３個のＧｌｙ・Ａｒｇ・Ａｒｇ・Ａｒｇからなるペプチド単位により構成されることを特徴とする組換ポリペプチドが提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチド、該ポリペプチドの末端に結合した０〜２個のアミノ酸で構成されるスペーサー・ペプチド及び該スペーサー・ペプチドに結合した４〜１２個のアミノ酸で構成されるタグ・ペプチドから成り、該タグ・ペプチドは１〜３個のＧｌｙ・Ａｒｇ・Ａｒｇ・Ａｒｇ（配列番号：１）からなるペプチド単位により構成されることを特徴とする組換ポリペプチド。
【請求項２】
前記スペーサー・ペプチド及び該スペーサー・ペプチドに結合したタグ・ペプチドが、ポリペプチドのＣ末端に結合する、請求項１に記載の組換ポリペプチド。
【請求項３】
前記スペーサー・ペプチドのアミノ酸がＧｌｙである、請求項１又は２に記載の組換ポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、ＴＥＶ（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｄｇｅ  Ｖｉｒｕｓ）プロテアーゼ、抗ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ｓｃＦｖ抗体、抗ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ抗体、ＣＡＤ（Ｃａｓｐａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＤＮａｓｅ）及びＧＬｕｃ（Ｇａｕｓｓｉａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）からなる群から選択されるタンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換ポリペプチド。
【請求項５】
前記スペーサー・ペプチドが１個のアミノ酸で構成される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換ポリペプチド。
【請求項６】
組換ポリペプチドの生産方法であって、
（ａ）ポリペプチド、該ポリペプチドの末端に結合した０〜２個のアミノ酸で構成されるスペーサー・ペプチド及び該スペーサー・ペプチドに結合した４〜１２個のアミノ酸で構成されるタグ・ペプチドから成り、該タグ・ペプチドは１〜３個のＧｌｙ・Ａｒｇ・Ａｒｇ・Ａｒｇ（配列番号：１）からなるペプチド単位により構成されることを特徴とする組換ポリペプチドをコードする発現カセットを含むベクターを用意し、
（ｂ）上記（ａ）のベクターにより宿主細胞を形質転換し、
（ｃ）上記（ｂ）で得られた形質転換細胞を、該細胞の生育に適した条件下で培養し、及び
（ｄ）上記（ｃ）の培養物から上記（ａ）の組換ポリペプチドを回収すること、
を含む、前記方法。
【請求項７】
前記スペーサー・ペプチド及び該スペーサー・ペプチドに結合したタグ・ペプチドが、ポリペプチドのＣ末端に結合する、請求項６に記載の組換ポリペプチドの生産方法。
【請求項８】
前記スペーサー・ペプチドのアミノ酸がＧｌｙである、請求項６又は７に記載の組換ポリペプチドの生産方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、ＴＥＶ（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｄｇｅ  Ｖｉｒｕｓ）プロテアーゼ、抗ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ｓｃＦｖ抗体、抗ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ抗体、ＣＡＤ（Ｃａｓｐａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＤＮａｓｅ）及びＧＬｕｃ（Ｇａｕｓｓｉａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）からなる群から選択されるタンパク質である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の組換ポリペプチドの生産方法。
【請求項１０】
前記スペーサー・ペプチドが１個のアミノ酸で構成される、請求項６〜９のいずれか一項に記載の組換ポリペプチドの生産方法。
【請求項１１】
前記宿主が大腸菌である、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の組換ポリペプチドの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のアミノ酸配列によりタグ化されたポリペプチド及び当該タグ化によるポリペプチドの発現量及び収量の向上方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換ポリペプチドの生産において、当該組換ポリペプチドの発現量、したがってその収量を向上させることは、依然として重要な課題である。この目的のため、一般的には、発現条件（例えば、培地の種類、発現のための培養温度、発現時間、菌株等）を最適化することが行われてきた。例えば、そのように最適化された培地として、ＴＢ培地や２ｘＹＴ培地が用いられている。
【０００３】
また、別の方法として、目的タンパク質をＧＳＴやＭＢＰなどの高発現性タンパク質との融合タンパク質として発現させた後、高発現性タンパク質を切断除去することで目的タンパク質を回収することもしばしば行われている。しかしながら、これらの技術も依然として経験的要素に大きく依存するため、その成否の予測は困難であり、少なくとも、所望の発現量を実現し得る条件の検討には多大な時間と労力が必要である。
【０００４】
このような課題の解決方法として、近年、大腸菌を利用した発現系又は酵母発現系によって、ＳＫ、ＳＫＸ、ＳＫＸＸ（配列番号：２）、ＡＫＸＸ（配列番号：３）又はＫＫＸＸ（配列番号：４）のアミノ酸配列（但し、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す）からなるペプチドタグがＮ末端に連結したタグ化タンパク質として目的タンパク質を発現させることが提案されている（特許文献１）。当該特許文献には、それらのペプチドタグをＮ末端に連結することで、マウスＦａｂ抗体及びウサギｓｃＦｖ抗体の発現量が増加したことが示されている。
【０００５】
一方、本発明者らは、先に、ポリペプチドの末端に１〜２０個の親水性アミノ酸から成るタグを付与することにより当該ポリペプチドの溶解度を向上させ得ることを見出している（特許文献２）。また、本発明者らは、生体分子の末端に任意のアミノ酸配列から成るペプチドが付加されたペプチド付加生体分子の溶解度を熱力学的理論に基づき計算する方法及び当該計算方法を用いて所望の溶解度とするペプチドタグを設計する方法、並びにそのような方法を利用して封入体（大腸菌の組換細胞等内に蓄積する不活性型凝集）形成を防止する方法を見出している（特許文献３）。しかしながら、これらの特許文献のいずれにおいても、組換ポリペプチドの発現量及び収量を増加させることは意図されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１６／２０４１９８号パンフレット
【特許文献２】特開２００６−１８８５０７号公報
【特許文献３】特許第５２７３４３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明は、その発現及び収量が向上した組換ポリペプチド並びに組換ポリペプチドの発現及び収量を向上させる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者らは、末端が様々にタグ化されたポリペプチドの様々な性質に関して研究を行ってきたなかで、驚くべきことに、特定のアミノ酸から成るタグが付加されたタグ化ポリペプチドとしてポリペプチドを発現させると、当該ポリペプチドの発現量及び収量が向上することを見出した。更に、そのような発現量及び収量の向上は、アミノ酸配列が全く異なるような種々のポリペプチドに対して本発明のタグを付加した場合でさえも、達成され得ることが見出された。
【０００９】
したがって、本発明の第１の局面は、
（１）ポリペプチド、該ポリペプチドの末端に結合した０〜２個のアミノ酸で構成されるスペーサー・ペプチド及び該スペーサー・ペプチドに結合した４〜１２個のアミノ酸で構成されるタグ・ペプチドから成り、該タグ・ペプチドは１〜３個のＧｌｙ・Ａｒｇ・Ａｒｇ・Ａｒｇ（配列番号：１）からなるペプチド単位により構成されることを特徴とする組換ポリペプチドである。
【００１０】
本発明では、上記ポリペプチドのＣ末端側に、スペーサー・ペプチドが存在するときは当該スペーサー・ペプチドが結合し、該スペーサー・ペプチドに本発明のタグ・ペプチドが結合してもよい。したがって、本発明の好適な一態様は、
（２）前記スペーサー・ペプチド及び該スペーサー・ペプチドに結合したタグ・ペプチドが、ポリペプチドのＣ末端に結合する、上記（１）の組換ポリペプチドである。
【００１１】
本発明のタグ化ポリペプチドは、発現量を向上させるべきポリペプチドとタグ・ペプチドの間にスペーサーとして機能するアミノ酸、例えばＧｌｙを１個又は２個程度有してもよく、そのような場合にも組換ポリペプチドの発現及び収量が向上することが見出された。したがって、本発明の好適な１つの態様は、
（３）前記スペーサー・ペプチドのアミノ酸がＧｌｙである、上記（１）又は（２）の組換ポリペプチドである。
【００１２】
上記のとおり、本発明は、様々なポリペプチドに対して適用可能であり、例えばＴＥＶプロテアーゼ、抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ抗体、抗ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ抗体、ＣＡＤ及びＧＬｕｃに対しても好適に適用できる。したがって、本発明の１つの態様は、
（４）前記ポリペプチドが、ＴＥＶ（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｄｇｅ  Ｖｉｒｕｓ）プロテアーゼ、抗ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ｓｃＦｖ抗体、抗ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ抗体、ＣＡＤ（Ｃａｓｐａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＤＮａｓｅ）及びＧＬｕｃ（Ｇａｕｓｓｉａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）からなる群から選択されるタンパク質である、上記（１）〜（３）のいずれかの組換ポリペプチドである。
【００１３】
また、本発明の特定の一態様では、スペーサー・ペプチドが１個のアミノ酸で構成されてよい。すなわち、
（５）前記スペーサー・ペプチドが１個のアミノ酸で構成される、上記（１）〜（４）のいずれかの組換ポリペプチドである。
【００１４】
また、本発明は、本発明のタグ化ポリペプチドとしてポリペプチドを発現させることにより、当該ポリペプチドの発現量及び収量を向上させることを意図する。したがって、本発明の第２の局面は、
（６）組換ポリペプチドの生産方法であって、
（ａ）ポリペプチド、該ポリペプチドの末端に結合した０〜２個のアミノ酸で構成されるスペーサー・ペプチド及び該スペーサー・ペプチドに結合した４〜１２個のアミノ酸で構成されるタグ・ペプチドから成り、該タグ・ペプチドは１〜３個のＧｌｙ・Ａｒｇ・Ａｒｇ・Ａｒｇからなるペプチド単位により構成されることを特徴とする組換ポリペプチドをコードする発現カセットを含むベクターを用意し、
（ｂ）上記（ａ）のベクターにより宿主細胞を形質転換し、
（ｃ）上記（ｂ）で得られた形質転換細胞を、該細胞の生育に適した条件下で培養し、及び
（ｄ）上記（ｃ）の培養物から上記（ａ）の組換ポリペプチドを回収すること、
を含む、前記方法である。
【００１５】
本発明の生産方法において使用される組換ポリペプチドの態様は、上記（２）〜（５）のいずれも含み得る。したがって、本発明の生産方法の特定の態様は、
（７）前記スペーサー・ペプチド及び該スペーサー・ペプチドに結合したタグ・ペプチドが、ポリペプチドのＣ末端に結合する、上記（６）の組換ポリペプチドの生産方法、
（８）前記スペーサー・ペプチドのアミノ酸がＧｌｙである、上記（６）又は（７）の組換ポリペプチドの生産方法、
（９）前記ポリペプチドが、ＴＥＶ（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｄｇｅ  Ｖｉｒｕｓ）プロテアーゼ、抗ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ｓｃＦｖ抗体、抗ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ抗体、ＣＡＤ（Ｃａｓｐａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＤＮａｓｅ）及びＧＬｕｃ（Ｇａｕｓｓｉａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）からなる群から選択されるタンパク質である、上記（６）〜（８）のいずれかの組換ポリペプチドの生産方法、及び
（１０）前記スペーサー・ペプチドが１個のアミノ酸で構成される、上記（６）〜（９）のいずれかの組換ポリペプチドの生産方法である。
【００１６】
本発明の生産方法は、さまざまな宿主を用いた組換ポリペプチド生産に適用可能であるが、宿主が大腸菌細胞であることが好ましい。したがって、本発明の別の態様は、
（１１）前記宿主が大腸菌である、上記（６）〜（１０）のいずれかの組換ポリペプチドの生産方法である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のタグ化ポリペプチドとしてポリペプチドを発現させることにより、当該ポリペプチドの発現量及び収量を向上することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明のタグ・ペプチドによりＣ末端をタグ化したＴＥＶ（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｄｇｅ  Ｖｉｒｕｓ）プロテアーゼを示す。図中、パネルａ）は当該タグ化ＴＥＶプロテアーゼ（ＴＥＶＣ９Ｒ）の３Ｄ構造であり、太線部分がタグ・ペプチドを示す。パネルｂ）はＴＥＶＣ９Ｒ発現ベクターの模式図である。パネルｃ）はＴＥＶＣ９Ｒのアミノ酸配列である（配列番号：７）。
【図２】図２は、大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ）を宿主に用いたＴＥＶ及びＴＥＶＣ９Ｒ（Ｍ．Ｗ．≒２８Ｋｄａ）の発現量を示す。Ｍは分子量マーカー、Ｓは上清画分、Ｐは沈殿画分である。ＴＥＶ（Ｈｉｓタグのみでタグ化された対照ポリペプチド）のバンドを矢印で示している。発現誘導はＯ．Ｄ．＝０．５で１ｍＭのＩＰＴＧ添加により行った。図中、パネルａ）は５ｍＬのＬＢ培地内で２５℃、３１℃及び３７℃での発現を示し、パネルｂ）は２００ｍＬのＬＢ培地内で３１℃及び３７℃での発現を示している。
【図３】図３は、本発明のタグ・ペプチドによりＣ末端をタグ化した抗ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ｓｃＦｖ抗体を示す。図中、パネルａ）は当該タグ化抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ（抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ  Ｃ９Ｒ）の３Ｄ構造であり、「Ｄｏｍａｉｎ  １」及び「Ｄｏｍａｉｎ  ２」が各ドメインを、「Ｌｉｎｋｅｒ」がドメイン間リンカーを、そして「Ｃ９Ｒ  Ｔａｇ」がタグ・ペプチドを示す。パネルｂ）は抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ  Ｃ９Ｒ発現ベクターの模式図である。
【図４】図４は、Ｎ末端にＨｉｓタグを有するが、本発明のタグ・ペプチドによりＣ末端をタグ化されていない抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ（Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ）；及びＮ末端のＨｉｓタグに加えて本発明のタグ・ペプチドによりＣ末端をタグ化した抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ  Ｃ９Ｒ（Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ  Ｃ９Ｒ）のアミノ酸配列である（それぞれ、配列番号：８及び９）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
＜タグ化ポリペプチド＞
本発明では、遺伝子組換生物による外来ポリペプチドの発現を向上させるために、特定のアミノ酸配列を有するタグによって当該ポリペプチドが修飾される。本明細書において、そのようなタグによって修飾されたポリペプチドをタグ化ポリペプチドと称し、以下に、当該本発明のタグ化ポリペプチドの構造を説明する。なお、本明細書において、特段の断りのない場合には、アミノ酸配列はＮ末端からＣ末端に向けて記載される。
【００２０】
１．ポリペプチド
本発明において、その発現を向上させるべきポリペプチドの種類については特に制限がない。後述のように、本発明のタグ化により、その由来もアミノ酸配列も異なるポリペプチド（つまり、ＴＥＶ（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｄｇｅ  Ｖｉｒｕｓ）プロテアーゼ、抗ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ｓｃＦｖ抗体、抗ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ抗体、ＣＡＤ（Ｃａｓｐａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＤＮａｓｅ）及びＧＬｕｃ（Ｇａｕｓｓｉａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ））の遺伝子組換生物内での発現を向上させ得ることが示されている。
【００２１】
したがって、本発明のポリペプチドは、細菌、真菌、ウイルス、植物及び動物等に由来するタンパク質及びそれらの断片に相当するポリペプチドであってよいがそれらに限定されない。
【００２２】
例えば、本発明のポリペプチドの他の例として、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａプロテアーゼ、ＶＨＨシングルドメイン抗体断片、Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ等を挙げることができる。
【００２３】
なお、本明細書において、ポリペプチドの用語はタンパク質だけでなく、タンパク質の任意の断片を構成するポリペプチドを含む。
【００２４】
２．タグ・ペプチド
上記ポリペプチドの末端に結合される本発明のタグ・ペプチドは、Ｇｌｙ・Ａｒｇ・Ａｒｇ・Ａｒｇ（配列番号：１）からなるペプチド単位を少なくとも１個有する。また、本発明のタグ・ペプチドにおいては、該ペプチド単位が連続して繰り返されていてもよい。そのようなペプチド単位の連続した繰り返しの回数に特に制限はなく、例えば、ペプチド単位の繰り返しは７回以下、好ましくは５回以下、より好ましくは３回以下であってよい。
【００２５】
すなわち、本発明のタグ・ペプチドは、アミノ酸一文字表記により、一般式（ＧＲＲＲ）ｎで表され、式中、好ましくはｎが１〜７、より好ましくは１〜５、さらに好ましくは１〜３であり得る。より具体的に、本発明のもっとも好適なタグ・ペプチドの例は、ＧＲＲＲ（配列番号：１）、ＧＲＲＲＧＲＲＲ（配列番号：５）及びＧＲＲＲＧＲＲＲＧＲＲＲ（配列番号：６）である。
【００２６】
３．スペーサー・ペプチド
本発明のタグ化ポリペプチドにおいて、必ずしも必須ではないが、上記ポリペプチドとタグ・ペプチドを、スペーサー・ペプチドを介して結合させることも好適である。そのようなスペーサーとしては１〜２個程度のアミノ酸、好ましくはＧｌｙを挙げることができる。
【００２７】
４．その他のタグ・ペプチド
本発明のタグ化ポリペプチドは、本発明のタグ・ペプチドが結合した末端と反対側の末端に、本発明のタグ・ペプチド以外の公知のタグ・ペプチドを有していてもよい。例えば、本発明によって発現を上昇させるべき元のポリペプチドのＣ末端側に本発明のタグ・ペプチドを結合させた場合、本発明のタグ化ポリペプチドのＮ末端側には、種々の目的のために、本発明のタグ・ペプチド以外のタグ・ペプチドを結合させてよい。例えば、発現した組換ポリペプチドをアフィニティ・クロマトグラフィー等により分離する目的で、公知のＨｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグやｍｙｃタグをＮ末端側に結合させてもよい。
【００２８】
＜タグ化ポリペプチドの製造＞
本発明のタグ化ポリペプチドは、当業者に公知の方法により製造することができる。好ましくは、目的のタグ化ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを組込んだ発現ベクターにより適切な宿主細胞を形質転換し、当該形質転換細胞の生育に適した条件下で該細胞を生育させることにより本発明のタグ化ポリペプチドを製造することができる。そのような方法は、分子生物学のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｆ．  Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｐｕｂｌ．Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９７、またはＳａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュアル」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９、等に記載されている。
【００２９】
例えば、本発明のタグ化ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを組込んだ発現ベクターを製造するためには、タグ化前のポリペプチドのｃＤＮＡが組込まれた発現プラスミドを鋳型として用いることができる。そして、例えば部位特異的変異法により目的とするタグ・ペプチドのアミノ酸配列（又はスペーサー・ペプチド及びタグ・ペプチドのアミノ酸配列）をコードするヌクレオチド配列を、前記ポリペプチドのＯＲＦの５’末端又は３’末端側に対して付加すればよい。そのような方法を実施するためのキットはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社（米国）等から市販されている。また、所望により、上記のようにして作製した本発明のタグ化ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを別の発現ベクター内にクローニングしてもよい。
【００３０】
つまり、本発明に用いることのできる発現ベクターは、用いる宿主細胞の種類に応じて、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、コスミド、又は線状もしくは環状のＤＮＡ等から成るベクターであってよい。例えば、大腸菌のｐＥＴ１５、ｐＥＴ２６、ｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１、λｇｔ１１又はｐＢｄＣＩ；桿菌のｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４又はｐＢＤ２１４；コリネバクテリウム属のｐＳＡ７７又はｐＡＪ６６７等である。酵母細胞のための好適なベクターとしては、２μｍＤＮＡ、ＹＥｐ２、ＹＥｐ１３、ＹＲｐ７、ＹＩｐ５やｐＹＡＣ２が挙げられる。動物宿主細胞のための好適なベクターとしては、ｐＣＤＭ８及びｐＭＴ２ＰＣ、並びにアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等が挙げられる。
【００３１】
上記の発現ベクターを宿主細胞に導入（形質転換）する手法としては、共沈、ヒートショック法、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクション等の慣用のトランスフェクション法が用い得る。宿主細胞としては、大腸菌や酵母等の細菌やＣＨＯ細胞等の動物細胞が好適であり得る。好ましい宿主細胞の例は、大腸菌細胞である。
【００３２】
上記のようにして本発明のベクターにより形質転換された宿主細胞を、その細胞の至適培養条件下でインキュベーとすることにより、本発明のタグ化ポリペプチドを生産することができる。その後、培養物から、遠心分離、塩析、等電点沈殿、透析及び各種のクロマトグラフィーを組み合わせることで、本発明のタグ化ポリペプチドを精製することができる。たとえば、上記のように、本発明のタグ化ポリペプチドは、本発明のタグ・ペプチドとは反対側の末端にＨｉｓタグ等のアフィニティ・タグを付加しておき、それをアフィニティ・クロマトグラフィーにより精製してもよい。
【００３３】
具体的に、上記のようにして形質転換された細胞は、典型的には、炭素源、窒素源、無機塩、及び場合により微量元素ないしビタミン等の微量成分を含む天然、半合成又は合成培地を用いて培養することができる。例えば、大腸菌宿主のための培地としては、大腸菌が十分に生育できるものであればいずれの培地も使用でき、一般的に用いられているＬＢ培地やＴＢ培地なども使用可能である。また、形質転換に際して、例えばアンピシリンやカナマイシン等の抗生物質に対する耐性遺伝子も同時に宿主細胞に導入した場合、それらの抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３４】
培養法は、固体培養でも液体培養でも構わないが、生産されたタグ化ポリペプチドを培養物から分離する際の利便性の観点からは、液体培養が好ましい。
【００３５】
液体培養は、バッチ式であっても連続式であってもよい。また、いずれの場合にも、培養の適切な時点で追加の前記炭素源等を補給する形式であってもかまわない。更に、培養は、好適な温度、酸素濃度、ｐＨ等を維持しながら継続されるべきである。一般的な微生物宿主細胞に由来する形質転換体の好適な培養温度は、通常１５℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜３７℃の範囲である。宿主微生物が好気性の場合、発酵中の適切な酸素濃度を確保するために振盪（フラスコ培養等）、攪拌／通気（ジャー・ファーメンター培養等）を行う必要がある。それらの培養条件は、当業者にとって容易に設定可能である。
【００３６】
本発明のタグ化ポリペプチドは、上記の培養物の上清中、菌体内、及びその双方に蓄積され得る。菌体内に蓄積したタグ化ポリペプチドは、公知の方法、例えば、超音波破砕、凍結融解、圧力式ホモジナイザー（フレンチプレス）、自己溶菌（Ｔｅｔｓｕｙａ  Ｋａｍｉｏｋａ，Ｓｈｉｈｏｒｉ  Ｓｏｈｙａ，Ｎａｎ  Ｗｕ，Ｔｅｉ  Ｍａｋｉ，Ｔｏｍｏｋｉ  Ｍａｔｓｕｄａ，Ｔａｋａｈｉｓａ  Ｉｋｅｇａｍｉ，Ｈａｒｕｋｉ  Ｎａｋａｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｙｕｔａｋａ  Ｋｕｒｏｄａ；Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｂｙ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｃｅｌｌ  Ａｕｔｏｌｙｓｉｓ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＶａｎＸ；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；４３９（２）：２１２−７（２０１３））や界面活性剤による溶菌などを使用して抽出することができる。
【００３７】
培養物の上清中又は菌体から抽出した本発明のタグ化ポリペプチドの精製を行うために、上記のような公知のＨｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグやｍｙｃタグを使用することは有利であり得る。これらのタグを用いたポリペプチドの精製法も当業者によく知られており、そのためのキットも幅広く市販されている。
【００３８】
以下、本発明について実施例を用いて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
［方法］
１．培養
遺伝子組換をした大腸菌は、ＬＢ培地又はＴＢ培地のいずれかで、２５℃〜３７℃で培養した。５ｍＬの培養では、試験管を２５０ｒｐｍで振とうした。２００ｍＬの培養では、５００ｍＬ羽根つき三角フラスコを２５０ｒｐｍで振とうした。いずれの場合も、培養液のＯＤが０．５となった時点で終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加えて発現誘導を行った。サンプリングは、発現誘導から２時間目と４時間目に行った。
【００４０】
２．タグ化ポリペプチドの回収
サンプルは、培養液の一部（５００μＬ）を回収し、遠心（４℃、１４０００ｒｐｍ（２００００＊ｇ）、１５分）により大腸菌体を沈殿させ、集菌する。集菌した大腸菌体に２５０μＬのＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．７）、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を加えて超音波破砕し、懸濁状態の破砕液を全培養物Ａ：Ａｌｌとし、懸濁状態の破砕液を遠心（４℃、１４０００ｒｐｍ（２００００＊ｇ）、１５分）により上清画分Ｓ：Ｓｕｐ、沈殿画分Ｐ：Ｐｐｔに分離した。分離後に沈殿画分にはＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒを２５０μＬ加えて懸濁し、その一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥに使用した。また、上清画分からも沈殿画分と同じ量をＳＤＳ−ＰＡＧＥに使用した。
【００４１】
３．ＳＤＳ-ＰＡＧＥ
上記のサンプルのそれぞれを、１０μＬずつ１７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにアプライした。また、分子量マーカー（Ｍ）も同時にアプライした。泳動したポリペプチドを可視化するために、ＣＢＢ染色を行った。すなわち、泳動後のゲルを固定液（２０％メタノール、７．５％酢酸溶液）に５分間漬け、染色液（０．２５％ＣＢＢ−Ｒ２５０、５０％メタノール、５％酢酸）に５分漬け、脱色液（５％メタノール、７％酢酸）に５分漬けて、ＲＯ水で脱色させた。
【００４２】
４．発現ポリペプチド量の解析
上記のようにしてＣＢＢ染色したゲルを、ＵＳＢ接続したカメラを用いて撮影し、その画像データを解析用の画像データとした。その画像データを、ＩｍａｇｅＪ（ｈｔｔｐｓ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）からダウンロード可能な画像解析ソフトウェア）を用いて、各バンドの強度を数値化した。
【００４３】
［実施例１］  ＴＥＶプロテアーゼの発現向上
本発明のタグによりＣ末端をタグ化したＴｏｂａｃｃｏ  Ｅｄｇｅ  Ｖｉｒｕｓプロテアーゼ（以下、「ＴＥＶ」と略す。）を、次のようにして作製した。なお、本明細書において、「Ｃ０Ｒ」は本発明のタグ・ペプチド及びスペーサー・ペプチドのいずれも有さないポリペプチドを、「Ｃ３Ｒ」は１個のペプチド単位（ＧＲＲＲ）からなるタグ・ペプチドを有するポリペプチドを、「Ｃ６Ｒ」は２個のペプチド単位からなるタグ・ペプチドを有するポリペプチドを、また、「Ｃ９Ｒ」は３個のペプチド単位からなるタグ・ペプチドを有するポリペプチドを、それぞれ、表している。
【００４４】
ＴＥＶのｃＤＮＡは、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ０４５１７に記載されたＴＥＶ配列を基に合成ＤＮＡを作成しｐＵＣＦａに挿入したもの（ＦＡＳＭＡＣ社から入手）をテンプレートとしてＰＣＲにより増幅し、ｐＥＴ−１５ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社から入手）のＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位に挿入した。１つのＧ（スペーサーとして）及びＧＲＲＲＧＲＲＲＧＲＲＲ（配列番号：９）からなるタグ・ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ＴＥＶテンプレートのＣ末端に対応する配列に対して、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（商品名：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、米国）を用いて付加し、その配列を増幅した。プラスミド配列をＤＮＡ配列決定（ＰＲＩＳＭ  ３１３０ｘ１  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（商品名：ＡＢＩ社、米国））により確認した。なお、ｐＥＴ−１５ｂベクターは、前記ＮｄｅＩ部位の上流にＨｉｓタグを含んでおり、したがって、本実施例のタグ化ＴＥＶには、Ｎ末端側にＨｉｓタグも付加されている。この遺伝子組換により作製された発現プラスミドによりコードされるアミノ酸配列を図１のパネルｃ）に示した（配列番号：１０）。
【００４５】
上記のようにして作製した発現プラスミドを、発現ベクターの製造元の指示に準じて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに導入した。得られた遺伝子組換大腸菌は、上記の培養方法に従って、ＬＢ培地（５ｍＬ及び２００ｍＬ）並びにＴＢ培地（５ｍＬ及び２００ｍＬ）内で培養して、本発明のタグ化ＴＥＶ（ＴＥＶＣ９Ｒ）を発現させた。対照としては、Ｈｉｓタグのみでタグ化され、本発明のタグ・ペプチドでタグ化されていないＴＥＶを発現させた。
【００４６】
培養後、上記の方法に従って、発現されたポリペプチドを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って、発現ポリペプチド量を解析した。図２に、５ｍＬのＬＢ培地内で２５℃、３１℃及び３７℃で発現させた場合（図２ａ）、並びに２００ｍＬのＬＢ培地内で３１℃及び３７℃で発現させた場合（図２ｂ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した。
【００４７】
また、５ｍＬのＴＢ培地及びＬＢ培地内での発現ポリペプチド量（いずれも３１℃及び３７℃で培養）の解析結果を表１に示す。なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのＩｍａｇｅＪによる解析結果（ピクセル単位）からｍｇ単位への換算は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにはＴＥＶ１μｇを同時に流しておりそのバンド強度の数値を標準として他のバンド強度の数値を割ることでμｇを算出し、そこから５ｍＬの発現量を算出した。
【００４８】
さらに、２００ｍＬのＴＢ培地及びＬＢ培地内で、３１℃又は３７℃にて培養後、精製したポリペプチド量の解析結果を表２に示す。すなわち、２００ｍＬ培養物については、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに先立って、供給元の指示に従ったＮｉ−ＮＴＡ精製（商品名Ｎｉ−ＮＴＡ  ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を行った。具体的には、上記「２．タグ化ポリペプチドの回収」の項に記載した手法に従って大腸菌を集菌し、菌体を上記手法で破壊した後に、Ｎｉ−ＮＴＡ精製した。また、さらにその後で逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＲＰ（ＹＭＣ社製）、移動相：水／アセトニトリル、検出：２２０ｎｍ）によりポリペプチドの高純度精製収量を測定した。当該逆相ＨＰＬＣクロマトグラムからのｍｇ単位への換算は、ＨＰＬＣ精製後のサンプルを凍結乾燥し粉末にし、それを１ｍＬのミリＱ水に溶解させ、Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００を用いてＵＶ濃度測定法により濃度を決め、そこからｍｇに換算して行った。なお、表中、「Ｓｕｐ」は上清画分を表し、「Ｐｐｔ」は不溶性画分を表している。また、「Ｎｉ−ＮＴＡ」はＮｉ−ＮＴＡカラム精製後の収量を表し、「ＨＰＬＣ」は逆相ＨＰＬＣ精製後の収量を表している。
【００４９】
【表１】
2019112346.tif 000002
【００５０】
【表２】
2019112346.tif 000003
【００５１】
上記の結果から、本発明のタグ・ペプチドをＣ末端に付加したタグ化ポリペプチドとしてＴＥＶを発現させた場合、いずれの条件でも発現量の向上が認められた。なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、培養液から抽出した未精製のポリペプチド及びさらにＮｉ−ＮＴＡ精製したポリペプチドをサンプルとした場合のいずれでも同様の傾向が認められ、且つ、逆相ＨＰＬＣ精製後の収率も同様又はさらに良好であった。
【００５２】
［実施例２］  抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖの発現向上
実施例１と同様にして、本発明のタグによりＣ末端をタグ化した抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ（以下、「抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ  Ｃ９Ｒ」と略す。）のための発現プラスミドを作製した。すなわち、上記タグ化前ｓｃＦｖのｃＤＮＡとして、図４に示したアミノ酸配列の１〜２４６位をコードする合成ＤＮＡをｐＵＣＦａに挿入したプラスミド（ＦＡＳＭＡＣ社から入手した）をテンプレートとしてＰＣＲにより増幅し、ｐＥＴ−１５ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社から入手）のＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位に挿入した。１つのＧ（スペーサーとして）及びＧＲＲＲＧＲＲＲＧＲＲＲ（配列番号：６）からなるタグ・ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖテンプレートのＣ末端に対応する配列に対して、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて付加した。得られたプラスミドの配列を実施例１と同様の方法でＤＮＡ配列決定して確認した。なお、ｐＥＴ−１５ｂベクターを用いているので、このタグ化抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖにも、Ｎ末端側にＨｉｓタグが付加されている。この発現プラスミドによりコードされるアミノ酸配列を図４に示した。
【００５３】
上記のようにして作製した発現プラスミドを、発現ベクターの製造元の指示に準じて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに導入した。得られた遺伝子組換大腸菌は、上記の培養方法に従って、２００ｍＬのＬＢ培地内で培養して、本発明のタグ化抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ  Ｃ９Ｒを発現させた。なお、培養は３７℃で行った。対照としては、タグ化していない抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖを発現させた。
【００５４】
培養後、実施例１の場合に準じて、供給元の指示に従ったＮｉ−ＮＴＡ精製（商品名Ｎｉ−ＮＴＡ  ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を行ってポリペプチドを精製し、精製ポリペプチド量を解析した。結果を表３に示す。
【００５５】
【表３】
2019112346.tif 000004
【００５６】
上記の結果から、本発明のタグ・ペプチドをＣ末端に付加したタグ化ポリペプチドとして抗ＥＧＲＦ  ｓｃＦｖを発現させた場合、その収量の向上が認められた。
【００５７】
なお、実施例１において、培養液から抽出した未精製のポリペプチドをサンプルとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った場合の結果と、さらにＮｉ−ＮＴＡ精製したポリペプチドをサンプルとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った場合の結果において同一の傾向が認められたことや、実施例２においても精製したポリペプチドの収量が向上していたことから、以後の実験では培養液から抽出した未精製のポリペプチドをサンプルとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＩｍａｇｅＪにより発現量を解析した。
【００５８】
［実施例３］  抗ＯＫＴ３  ｓｃＦｖの発現向上
実施例１と同様にして、本発明によりタグ化した抗ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ（以下、「ＯＫＴ３」と略す。）のための発現プラスミドを作製した。すなわち、ＯＫＴ３のｃＤＮＡを、合成ＤＮＡとしてｐＵＣＦａに挿入したプラスミド（ＦＡＳＭＡＣ社から入手した）をテンプレートとしてＰＣＲにより増幅し、ｐＥＴ−１５ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社から入手）のＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位に挿入した。１つのＧ（スペーサーとして）及びＧＲＲＲＧＲＲＲＧＲＲＲ（配列番号：９）からなるタグ・ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ＯＫＴ３テンプレートのＣ末端に対応する配列に対して、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて付加した。得られたプラスミドの配列を実施例１と同様の方法でＤＮＡ配列決定して確認した。なお、ｐＥＴ−１５ｂベクターを用いているので、このタグ化ＯＫＴ３にも、Ｎ末端側にＨｉｓタグが付加されている。この発現プラスミドによりコードされるアミノ酸配列は以下のとおりであった。
【００５９】
【化１】
2019112346.tif 000005
【００６０】
上記のようにして作製した発現プラスミドを、発現ベクターの製造元の指示に準じて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに導入した。得られた遺伝子組換大腸菌は、上記の培養方法に従って、５ｍＬのＬＢ培地内で培養して、本発明のタグ化ＯＫＴ３を発現させた。なお、培養は３１℃で行った。対照としては、タグ化していないＯＫＴ３を発現させた。
【００６１】
培養後、上記の方法に従って発現されたポリペプチドを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って、発現ポリペプチド量を解析した。解析結果を表４に示す。なお、表中、「Ｐｐｔ」は不溶性画分を表し、「Ｓｕｐ」は上清画分を表している。
【００６２】
【表４】
2019112346.tif 000006
【００６３】
上記の結果は、タグ化ＯＫＴ３（ＯＫＴ３  Ｃ９Ｒ）とタグ化していないＯＫＴ３（ＯＫＴ３）を、それぞれ２つのゲル上で泳動させたものであるが、各サンプルと同時に分子量マーカー（ｍａｒｋｅｒ）を泳動させているので、２ゲル間をマーカーのバンド強度の数値を標準として比較することができる。つまり、マーカーに含まれるタンパク質量は常に一定であるため、この差がゲル間の差異になるから、各マーカーの強度でそれぞれのバンド強度を割り標準化している。この結果、ＯＫＴ３  Ｃ９ＲはＯＫＴ３よりもおよそ４倍の発現量を示した。
【００６４】
［実施例４］  ＣＡＤの発現向上
本発明によりタグ化したＣａｓｐａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＤＮａｓｅ（以下、「ＣＡＤ」と略す。）のための発現プラスミドを作製した。すなわち、上記実施例と同様にして、ＣＡＤのｃＤＮＡを合成ＤＮＡとして挿入したプラスミドをテンプレートとしてＰＣＲにより増幅し、ｐＡＥＤ４ベクター（“Ｍ．Ｍ．Ｉｓｌａｍ，Ｓ．Ｓｏｈｙａ，Ｋ．Ｎｏｇｕｃｈｉ，Ｍ．Ｙｏｈｄａ，Ｙ．Ｋｕｒｏｄａ；Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｉｎ  ｗｈｉｃｈ  ｏｖｅｒ  ｏｎｅ−ｔｈｉｒｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ａｒｅ  ａｌａｎｉｎｅｓ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．；１０５（２００８），１５３３４−１５３３９”及び“Ｍ．Ｍ．Ｉｓｌａｍ，Ｓ．Ｓｏｈｙａ，Ｋ．Ｎｏｇｕｃｈｉ，Ｓ．Ｋｉｄｏｋｏｒｏ，Ｍ．Ｙｏｈｄａ，Ｙ．Ｋｕｒｏｄａ；Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ＢＰＴＩｓ  ｂｙ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｎｄ  ｄｏｕｂｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ；Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；７７（２００９），９６２−９７０”に記載）のＮｄｅＩ及びＮｃｏＩ制限部位に挿入した。スペーサー・ペプチドは含めず、ＧＲＲＲ（配列番号：１）、ＧＲＲＲＧＲＲＲ（配列番号：５）又はＧＲＲＲＧＲＲＲＧＲＲＲ（配列番号：６）からなるタグ・ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ＣＡＤテンプレートのＣ末端に対応する配列に対して、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて付加し、その配列を増幅した。得られたプラスミドの配列を実施例１と同様の方法でＤＮＡ配列決定して確認した。なお、ｐＡＥＤ４ベクターにはＨｉｓタグ配列が含まれていないので、本実施例ではＮ末端側にＨｉｓタグは付加されない。配列番号：６を付加したＣＡＤ（ＣＡＤＣ９Ｒ）のための発現プラスミドによりコードされるアミノ酸配列は以下のとおりであった。
【００６５】
【化２】
2019112346.tif 000007
【００６６】
上記のようにして作製した発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換した。得られた遺伝子組換大腸菌は、上記の培養方法に従って、５ｍＬのＬＢ培地内で培養して、本発明のタグ化ＣＡＤ（ＣＡＤＣ３Ｒ、ＣＡＤＣ６Ｒ及びＣＡＤＣ９Ｒ）を発現させた。培養は２５℃で行った。対照としては、タグ化していないＣＡＤ（ＣＡＤＣ０Ｒ）を発現させた。
【００６７】
培養後、上記の方法に従って発現されたポリペプチドを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って、発現ポリペプチド量を解析した。
【００６８】
解析結果は表５のとおりであり、ＣＡＤＣ３Ｒ、ＣＡＤＣ６Ｒ及びＣＡＤＣ９Ｒは、ＣＡＤＣ０Ｒに比べて、それぞれ、およそ３．３倍、４．７倍及び３．５倍の発現量を示した。
【００６９】
【表５】
2019112346.tif 000008
【００７０】
さらに、上記の発現プラスミドを別の大腸菌株ＪＭ１０９（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに導入した際の、各タグ化ポリペプチドの発現量も確認した。培養は、５ｍＬのＬＢ培地中、２５℃、３０℃及び３７℃で行った。表６は、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ及びＪＭ１０９（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ形質転換体を同じ条件下で培養し、全培養物サンプル内のタグ化ポリペプチド発現量を、各場合のＣＡＤＣ０Ｒ(対照）のＩｍａｇｅＪ解析値を１として、それに対する相対値として示している。
【００７１】
【表６】
2019112346.tif 000009
【００７２】
上記の結果から、本発明のタグ・ペプチドをＣ末端に付加したタグ化ポリペプチドとしてＣＡＤを発現させた場合、いずれの条件及び宿主でも発現量の向上が認められた。
【００７３】
［実施例５］  ＧＬｕｃの発現向上
本発明によりタグ化したＧａｕｓｓｉａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（以下、「ＧＬｕｃ」と略す。）のための発現プラスミドを作製した。すなわち、ＧＬｕｃのｃＤＮＡを合成ＤＮＡをとしてｐＵＣ１９に挿入したプラスミドをテンプレートとしてＰＣＲにより増幅し、ｐＡＥＤ４ベクターのＮｄｅＩ及びＮｃｏＩ制限部位に挿入した。スペーサー・ペプチドは含めず、ＧＲＲＲ（配列番号：１）、ＧＲＲＲＧＲＲＲ(配列番号：５）又はＧＲＲＲＧＲＲＲＧＲＲＲ（配列番号：６）からなるタグ・ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ＧＬｕｃテンプレートのＣ末端に対応する配列に対して、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて付加し、その配列を増幅した。得られたプラスミドの配列を実施例１と同様の方法でＤＮＡ配列決定して確認した。なお、ｐＡＥＤ４ベクターにはＨｉｓタグ配列が含まれていないので、本実施例でもＮ末端側にＨｉｓタグは付加されない。配列番号：６を付加したＧＬｕｃ（ＧＬｕｃＣ９Ｒ）のための発現プラスミドによりコードされるアミノ酸配列は以下のとおりであった。
【００７４】
【化３】
2019112346.tif 000010
【００７５】
上記のようにして作製した発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに導入した。得られた遺伝子組換大腸菌は、上記の培養方法に従って、５ｍＬのＬＢ培地内で培養して、本発明のタグ化ＧＬｕｃ（ＧＬｕｃＣ３Ｒ、ＧＬｕｃＣ６Ｒ及びＧＬｕｃＣ９Ｒ）を発現させた。培養は２５℃で行った。対照としては、タグ化していないＧＬｕｃ（ＧＬｕｃＣ０Ｒ）を発現させた。
【００７６】
培養後、上記の方法に従って発現されたポリペプチドを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って、発現ポリペプチド量を解析した。
【００７７】
解析結果は表７のとおりであり、ＧＬｕｃＣ３Ｒ、ＧＬｕｃＣ６Ｒ及びＧＬｕｃＣ９Ｒは、ＧＬｕｃＣ０Ｒに対して、それぞれおよそ１．９倍、２．１倍及び２．７倍の発現量を示した。
【００７８】
【表７】
2019112346.tif 000011
【００７９】
上記の結果から、本発明のタグ・ペプチドをＣ末端に付加したタグ化ポリペプチドとしてＧＬｕｃを発現させた場合、いずれのタグ・ペプチドでも発現量の向上が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明のタグ・ペプチドにより効率的な組換タンパク質の生産が可能になるので、本発明は遺伝子組換技術関連産業分野において利用可能である。
【図１】
2019112346.tif 000012
【図２】
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【図３】
2019112346.tif 000014
【図４】
2019112346.tif 000015
【配列表】
2019112346000001.app