(57)【要約】  本発明は、ヒトＮｏｇｏＡポリペプチドまたはヒトＮｉＧまたはヒトＮｉＧ−Ｄ２０またはヒトＮｏｇｏＡ＿３４２−３５７に、解離定数＜１０００ｎＭで結合する能力のある結合分子、かかる結合分子をコードするポリヌクレオチド；該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター；結合分子を産生する能力のあるポリヌクレオチドを含む発現系；上記定義の発現系を含む単離宿主細胞；医薬としての、特に神経修復の処置における、かかる結合分子の使用；該結合分子を含む医薬組成物；および神経修復に関連する疾患の処置方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＮｏｇｏＡポリペプチド（配列番号５）またはヒトＮｉＧ（配列番号７）またはヒトＮｉＧ−Ｄ２０（配列番号２４）またはヒトＮｏｇｏＡ＿３４２−３５７（配列番号６）に、解離定数＜１０００ｎＭで結合する能力のある結合分子。
【請求項２】
ヒトＮｏｇｏＡポリペプチド（配列番号５）またはヒトＮｉＧ（配列番号７）またはヒトＮｉＧ−Ｄ２０（配列番号２４）またはヒトＮｏｇｏＡ＿３４２−３５７（配列番号６）に、解離定数＜１０００ｎＭで結合する能力のある結合分子であって、少なくとも１つの抗原結合部位を含み、該抗原結合部位が、
・配列中に高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、その高頻度可変領域の各々が、それらの等価の高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｈ１−３Ａ６（配列番号８）、ＣＤＲ−Ｈ２−３Ａ６（配列番号９）およびＣＤＲ−Ｈ３−３Ａ６（配列番号１０）に少なくとも５０％相同であるか；または、
・配列中に高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、その高頻度可変領域の各々が、それらの等価の高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｌ１−３Ａ６（配列番号１１）、ＣＤＲ−Ｌ２−３Ａ６（配列番号１２）およびＣＤＲ−Ｌ３−３Ａ６（配列番号１３）に少なくとも５０％相同である、
結合分子。
【請求項３】
ヒトＮｏｇｏＡポリペプチド（配列番号５）またはヒトＮｉＧ（配列番号７）またはヒトＮｉＧ−Ｄ２０（配列番号２４）またはヒトＮｏｇｏＡ＿３４２−３５７（配列番号６）に、解離定数＜１０００ｎＭで結合する能力のある結合分子であって、
・配列中に高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む第１抗原結合部位を含み、その高頻度可変領域の各々が、それらの等価の高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｈ１−３Ａ６（配列番号８）、ＣＤＲ−Ｈ２−３Ａ６（配列番号９）およびＣＤＲ−Ｈ３−３Ａ６（配列番号１０）に少なくとも５０％相同であり；そして、
・配列中に高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む第２抗原結合部位を含み、その高頻度可変領域の各々が、それらの等価の高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｌ１−３Ａ６（配列番号１１）、ＣＤＲ−Ｌ２−３Ａ６（配列番号１２）およびＣＤＲ−Ｌ３−３Ａ６（配列番号１３）に少なくとも５０％相同である、
結合分子。
【請求項４】
少なくとも１つの抗原結合部位を含む結合分子であって、該抗原結合部位が、
・配列中に高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｈ１−３Ａ６（配列番号８）、ＣＤＲ−Ｈ２−３Ａ６（配列番号９）およびＣＤＲ−Ｈ３−３Ａ６（配列番号１０）を含むか；または、
・配列中に高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｌ１−３Ａ６（配列番号１１）、ＣＤＲ−Ｌ２−３Ａ６（配列番号１２）およびＣＤＲ−Ｌ３−３Ａ６（配列番号１３）を含むか；または、
・それらの直接的等価物を含む、
結合分子。
【請求項５】
・高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｈ１−３Ａ６（配列番号８）、ＣＤＲ−Ｈ２−３Ａ６（配列番号９）およびＣＤＲ−Ｈ３−３Ａ６（配列番号１０）を配列中に含む第１抗原結合部位；および、
・高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｌ１−３Ａ６（配列番号１１）、ＣＤＲ−Ｌ２−３Ａ６（配列番号１２）およびＣＤＲ−Ｌ３−３Ａ６（配列番号１３）を配列中に含む第２抗原結合部位；または、
・それらの直接的等価物、
を含む結合分子。
【請求項６】
少なくとも、
・（ｉ）配列中に高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｈ１−３Ａ６（配列番号８）、ＣＤＲ−Ｈ２−３Ａ６（配列番号９）およびＣＤＲ−Ｈ３−３Ａ６（配列番号１０）を含む可変ドメイン、および、（ｉｉ）ヒト重鎖の定常部またはそのフラグメント、を含む１つの免疫グロブリン重鎖またはそのフラグメント；および、
・（ｉ）配列中に高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｌ１−３Ａ６（配列番号１１）、ＣＤＲ−Ｌ２−３Ａ６（配列番号１２）およびＣＤＲ−Ｌ３−３Ａ６（配列番号１３）を含む可変ドメイン、および、（ｉｉ）ヒト軽鎖の定常部またはそのフラグメント、を含む１つの免疫グロブリン軽鎖またはそのフラグメント；または、
・それらの直接的等価物、
を含む、請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の結合分子。
【請求項７】
ヒト重鎖の定常部またはそのフラグメントがγ４タイプのものであり、ヒト軽鎖の定常部またはそのフラグメントがκタイプのものである、請求項６に記載の結合分子。
【請求項８】
ヒトまたはキメラまたはヒト化モノクローナル抗体である、請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の結合分子。
【請求項９】
配列番号２および配列番号３で示されるポリペプチド配列を含む結合分子。
【請求項１０】
請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の結合分子をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
【請求項１１】
・配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６で示されるポリヌクレオチド配列；または、
・配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９で示されるポリヌクレオチド配列、
のいずれかを含むポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１０または請求項１１のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１０または請求項１１のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む発現系であって、該発現系またはその一部が適合する宿主細胞中に存在するときに、該発現系またはその一部が請求項１ないし請求項９のいずれかに記載のポリペプチドを産生する能力がある、発現系。
【請求項１４】
請求項１３に記載の発現系を含む、単離された宿主細胞。
【請求項１５】
医薬としての、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の結合分子の使用。
【請求項１６】
神経修復の処置における、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の結合分子の使用。
【請求項１７】
請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の結合分子を、少なくとも１種の医薬的に許容し得る担体または希釈剤と共に含む、医薬組成物。
【請求項１８】
神経修復に関連する疾患の処置方法であって、そのような処置を必要としている対象に、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の結合分子の有効量を投与することを含む、処置方法。
【請求項１９】
神経修復に関連する疾患の処置方法であって、そのような処置を必要としている対象に、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の結合分子の有効量を投与することを含む、処置方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、例えばモノクローナル抗体またはそれらのＦａｂフラグメントなどの、ＮｏｇｏＡ結合分子に関する。
【０００２】
成人の中枢神経系（ＣＮＳ）の損傷後の神経の再生は、軸索を覆う抑制性ミエリン環境の存在および瘢痕組織の形成のために限定されている。ここ数年で、ＣＮＳが損傷後にそれ自体を自然修復できない理由の分子的理解に重要な洞察が得られた。ミエリン中の抑制性分子は、特に損傷直後に、軸索再生の主要な妨害物である。今までに、ＮｏｇｏＡ、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）およびミエリン−オリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＯＭｇｐ）が、神経突起伸長の強力な抑制因子として特徴解析された。加えて、ミエリンは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン類などの他の抑制性成分も含有する。Ｎｏｇｏ−Ａは、レチキュロン（reticulon）タンパク質ファミリーのメンバーであり、アミノ−ＮｏｇｏおよびＮｏｇｏ−６６と呼ばれる少なくとも２つの生物学的に活性かつ薬理的に別個のドメインを有する。前者の受容体部位は今までに知られていないが、Ｎｏｇｏ−６６は、インビトロおよびインビボで神経受容体ＮｇＲを介して神経成長を抑制する。Ｎｏｇｏ−６６に加え、ＭＡＧおよびＯＭｇｐも、高い親和性でＮｇＲに結合し、神経突起伸長を抑制する。
【０００３】
神経修復の増強のために現在追求されている有望な新しい研究アプローチには、酵素のコンドロイチナーゼＡＢＣを使用する瘢痕組織の切断、嗅覚鞘性（Olfactory ensheathing）細胞および幹細胞を使用する架橋技法、および神経成長を押し上げるためのタンパク質成長因子が含まれる。膜結合グアノシントリホスファターゼ（ＧＴＰａｓｅ）であるＲｈｏなどの細胞内シグナル伝達媒介因子の調整による神経突起伸長抑制因子の遮断作用は、軸索成長抑制において鍵となる結びつきであると思われる。環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）は、インビトロでミエリン関連抑制を克服でき、インビボで再生を誘導できる。ＮｇＲ受容体のペプチド抑制因子（ＮＥＰ１−４０）の使用は、脊髄損傷後のラットにおいて、神経の再成長および機能的回復を誘導する。
【０００４】
上記のアプローチの使用に加えて、中枢および末梢神経系の神経突起成長抑制性分子を中和する、特にＮｏｇｏＡの神経突起成長抑制活性を中和する、ある種のモノクローナル抗体の使用も注目を集めてきた。かくして、モノクローナル抗体ＩＮ−１またはＩＮ−１のＦａｂフラグメントが、神経突起伸長をインビトロで誘導し、発芽および再生をインビボで増強することが示された（Schwab ME et al. (1996) Physiol. Rev. 76, 319-370）。ＮｏｇｏＡの異なるドメインを神経突起成長抑制活性について試験することにより、分子中のいくつかの抑制性ドメインが図表化された（Chen et al. (2000) Nature 403, 434-439; GrandPre eta l. (2000) Nature 403, 439-444; Prinjha et al. (2000) Nature 403, 383-384）。
【０００５】
天然の免疫グロブリンまたは抗体は、一般的に、抗原結合部位を各上腕の末端に有するＹ型の多量体分子を含む。構造の残りの部分、特にＹの幹状部分は、その免疫グロブリンに関連するエフェクター機能を媒介する。抗体は、２本の重鎖および２本の軽鎖からなる。重鎖と軽鎖の両方が可変ドメインおよび定常部を含む。抗原結合部位は、軽鎖の可変ドメインを伴う重鎖の可変ドメインからなる。重鎖および軽鎖の可変ドメインは、同じ一般構造を有する。より具体的には、抗体の抗原結合特性は、重鎖および軽鎖の可変ドメイン中の３個の特異的領域によって本質的に決定され、これらは、高頻度可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる。これらの３個の高頻度可変領域は、配列が比較的保存されており直接結合に関与しない４個のフレームワーク領域（ＦＲ）と交互になっている。ＣＤＲはループを形成し、主としてβ−シート立体構造をとるフレームワーク領域により近接して保持される。重鎖のＣＤＲは、随伴する軽鎖のＣＤＲと一体となって、抗体分子の抗原結合部位を本質的に構成する。何がＦＲまたはＣＤＲ領域を構成するかに関する決定は、通常、同じ種で生成される数々の抗体のアミノ酸配列を比較することにより成される。ＣＤＲおよびＦＲ領域を同定するための一般的な規則は、当業者の一般的知識であり、例えばウェブサイトで見出すことができる（http://www.bioinf.org.uk/abs/）。
【０００６】
驚くべきことに、この度、Medarex Mice（ヒト免疫グロブリン遺伝子で遺伝的に再構築されたマウス）において、ヒトＮｉＧに対して生成されたＩｇＧタイプの新規モノクローナルヒト抗体（以後、「３Ａ６」と呼ぶ）が、先行技術のＮｏｇｏＡ抗体（Schwab ME et al. (1996) Physiol. Rev. 76, 319-370）よりも良好な特性を、特に、ホモ・サピエンスを含む様々な種のＮｏｇｏＡへの結合親和性に関して、そして、所定の抗体濃度でのより高いＮｏｇｏ−Ａ神経突起伸長中和活性に関して、有することが判明した。さらに、該抗体と同じ高頻度可変性領域を有する他のＮｏｇｏＡ結合分子を構築することが今や可能である。
【０００７】
従って、本発明は、ＮｏｇｏＡの特定領域またはエピトープに対する結合分子（以後、「本発明の結合分子」、または、簡潔に「結合分子」と称する）を提供する。好ましくは、本発明の結合分子は、ヒトＮｏｇｏＡ＿３４２−３５７（ヒトＮｉＧにおける３Ａ６のエピトープ；＝配列番号６）、ヒトＮｏｇｏＡ（配列番号５）またはヒトＮｉＧ（ＮｏｇｏＡの最も強力な神経突起伸長抑制性フラグメントであり、ヒトＮｏｇｏＡのアミノ酸番号１８６で始まりアミノ酸番号１００４で終わる＝配列番号５）に、解離定数（Ｋｄ）＜１０００ｎＭ、より好ましくはＫｄ＜１００ｎＭ、最も好ましくはＫｄ＜１０ｎＭで結合する。結合反応は、例えば、実施例６に記載のＥＬＩＳＡ法および実施例７に記載のバイオセンサー親和法（biosensor affinity method）を含む、標準的方法（定性的アッセイ）により示し得る。加えて、ヒトＮｏｇｏＡへの結合および、殆どより重要なことには、その有効性を、例えば下記の通りの神経突起伸長アッセイで示し得る。
【０００８】
従って、さらに好ましい実施態様では、結合分子（１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは１.０μｇ／ｍｌ、一層より好ましくは０.１μｇ／ｍｌの濃度のもの）は、ラット小脳顆粒細胞の神経突起の数を、サルの脳タンパク質抽出物の基質上で、ヒトＮｏｇｏＡ、ヒトＮｉＧまたはＮｏｇｏＡ＿３４２−３５７ポリペプチドに結合しない（即ち、解離定数＞１０００ｎＭを有する）対照抗体で処理したラット小脳顆粒細胞の神経突起の数と比較して、少なくとも２０％、好ましくは５０％、最も好ましくは８０％増やす。
【０００９】
さらに好ましい実施態様では、本発明の結合分子は、少なくとも１つの抗原結合部位であって、該抗原結合部位は、配列中に、高頻度可変領域のＣＤＲ−Ｈ１−３Ａ６、ＣＤＲ−Ｈ２−３Ａ６およびＣＤＲ−Ｈ３−３Ａ６を含み；該ＣＤＲ−Ｈ１−３Ａ６は、配列番号８のアミノ酸配列を有し、該ＣＤＲ−Ｈ２−３Ａ６は、配列番号９のアミノ酸配列を有し、そして該ＣＤＲ−Ｈ３−３Ａ６は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するもの、およびそれらの直接的等価物を含む。
【００１０】
本発明のさらなる態様では、本発明の結合分子は、少なくとも１つの抗原結合部位を含み、該抗原結合部位は、
ａ）配列中に高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｈ１−３Ａ６、ＣＤＲ−Ｈ２−３Ａ６およびＣＤＲ−Ｈ３−３Ａ６を含み；該ＣＤＲ−Ｈ１−３Ａ６は、配列番号８のアミノ酸配列を有し、該ＣＤＲ−Ｈ２−３Ａ６は、配列番号９のアミノ酸配列を有し、該ＣＤＲ−Ｈ３−３Ａ６は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する；または、
ｂ）配列中に、高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｌ１−３Ａ６、ＣＤＲ−Ｌ２−３Ａ６およびＣＤＲ−Ｌ３−３Ａ６を含み、該ＣＤＲ−Ｌ１−３Ａ６は、配列番号１１のアミノ酸配列を有し、該ＣＤＲ−Ｌ２−３Ａ６は、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、そして該ＣＤＲ−Ｌ３−３Ａ６は、配列番号１３のアミノ酸配列を有する；または、
ｃ）それらの直接的等価物を含む。
【００１１】
本発明のさらなる態様では、本発明の結合分子は、少なくとも、
ａ）配列中に高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｈ１−３Ａ６、ＣＤＲ−Ｈ２−３Ａ６およびＣＤＲ−Ｈ３−３Ａ６を含む第１ドメインを含み；該ＣＤＲ−Ｈ１−３Ａ６は、配列番号８のアミノ酸配列を有し、該ＣＤＲ−Ｈ２−３Ａ６は、配列番号９のアミノ酸配列を有し、該ＣＤＲ−Ｈ３−３Ａ６は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する；そして、
ｂ）配列中に高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｌ１−３Ａ６、ＣＤＲ−Ｌ２−３Ａ６およびＣＤＲ−Ｌ３−３Ａ６を含む第２ドメインを含み、該ＣＤＲ−Ｌ１−３Ａ６は、配列番号１１のアミノ酸配列を有し、該ＣＤＲ−Ｌ２−３Ａ６は、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、該ＣＤＲ−Ｌ３−３Ａ６は、配列番号１３のアミノ酸配列を有する；または、
ｃ）それらの直接的等価物を含む。
【００１２】
さらに、本発明はまた、以下の本発明の結合分子を提供する。それらは、
ａ）３Ａ６の重鎖の可変部（配列番号２）；または、
ｂ）３Ａ６の軽鎖の可変部（配列番号３）、またはこれらの直接的等価物、
を含む少なくとも１つの抗原結合部位を含む。
【００１３】
抗原結合部位が第１および第２ドメインの両方を含む場合、これらは、同じポリペプチド分子に位置するか、または、好ましくは、各ドメインが異なる鎖にあってよく、第１ドメインが免疫グロブリン重鎖またはそのフラグメントの一部であり、第２ドメインが免疫グロブリン軽鎖またはそのフラグメントの一部である。
【００１４】
本発明の結合分子の例には、Ｂ細胞またはハイブリドーマにより産生されるままの抗体、およびヒトもしくはキメラもしくはヒト化抗体またはそれらの任意のフラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ'）２；およびＦａｂフラグメント、並びに一本鎖または単一ドメイン抗体が含まれる。
【００１５】
一本鎖抗体は、通常１０個ないし３０個のアミノ酸、好ましくは１５個ないし２５個のアミノ酸からなるペプチドリンカーにより共有結合した抗体重鎖および軽鎖の可変ドメインからなる。従って、そのような構造は重鎖および軽鎖の定常部を含まず、その小さいペプチドスペーサーは、定常部全体よりも抗原性が低いと考えられる。「キメラ抗体」は、重鎖または軽鎖またはその両方の定常領域がヒト起源であるが、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインが非ヒト（例えば、マウス）起源である抗体を意味する。「ヒト化抗体」は、高頻度可変領域（ＣＤＲ）が非ヒト（例えば、マウス）起源であるが、全部または実質的に全部の他の免疫グロブリン部分、例えば、定常領域および可変ドメインの保存性が高い部分、即ちフレームワーク領域が、ヒト起源である抗体を意味する。しかしながら、ヒト化抗体は、高頻度可変領域に隣接するフレームワーク領域の部分にマウス配列の数個のアミノ酸を保持し得る。
【００１６】
高頻度可変領域は、いかなる種類のフレームワーク領域を伴ってもよく、好ましくはマウスまたはヒト起源のものである。適するフレームワーク領域は、"Sequences of proteins of immunological interest", Kabat E.A. et al, US department of health and human services, Public health service, National Institute of Health に記載されている。好ましくは、本結合分子のヒト重鎖の定常部は、サブタイプを含むＩｇＧ４タイプであってよく、好ましくは、ヒト軽鎖の定常部は、κまたはλタイプ、より好ましくは、κタイプである。
【００１７】
全てのヒトに天然に見出されるタンパク質に対して産生されるモノクローナル抗体は、非ヒト系で、例えばマウスで、発現させ得る。この直接的結果として、ハイブリドーマにより産生されるような異種抗体は、ヒトに投与されると、望まざる免疫反応を誘起する。これは、主として異種免疫グロブリンの定常部により媒介される。それらを長期間投与できないので、このことは、そのような抗体の使用を明らかに限定する。従って、ヒトに投与されたときに、実質的な同種間の反応を誘起しないであろう、一本鎖、単一ドメイン、キメラまたはヒト化抗体を使用するのが特に好ましい。
【００１８】
上記に鑑み、より好ましい本発明の結合分子はキメラ抗体から選択され、それは、少なくとも、
ａ）１つの免疫グロブリン重鎖またはそのフラグメントを含み、それは、（ｉ）配列中に高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｈ１−３Ａ６、ＣＤＲ−Ｈ２−３Ａ６およびＣＤＲ−Ｈ３−３Ａ６を含む可変ドメイン、および（ｉｉ）ヒト重鎖の定常部またはそのフラグメント、を含み；該ＣＤＲ−Ｈ１−３Ａ６は、アミノ酸配列（配列番号８）を有し、該ＣＤＲ−Ｈ２−３Ａ６は、アミノ酸配列（配列番号９）を有し、該ＣＤＲ−Ｈ３−３Ａ６は、アミノ酸配列（配列番号１０）を有する、そして、
ｂ）１つの免疫グロブリン軽鎖またはそのフラグメントを含み、それは、（ｉ）配列中に高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｌ１−３Ａ６、ＣＤＲ−Ｌ２−３Ａ６およびＣＤＲ−Ｌ３−３Ａ６を含む可変ドメイン、および（ｉｉ）ヒト軽鎖の定常部またはそのフラグメント、を含み；該ＣＤＲ−Ｌ１−３Ａ６は、アミノ酸配列（配列番号１１）を有し、該ＣＤＲ−Ｌ２−３Ａ６は、アミノ酸配列（配列番号１２）を有し、該ＣＤＲ−Ｌ３−３Ａ６は、アミノ酸配列（配列番号１３）を有するか、または、
それらの直接的等価物を含む。
【００１９】
あるいは、本発明の結合分子は、
ａ）配列中に高頻度可変性ＣＤＲ−Ｈ１−３Ａ６、ＣＤＲ−Ｈ２−３Ａ６およびＣＤＲ−Ｈ３−３Ａ６を含む第１ドメイン；該ＣＤＲ−Ｈ１−３Ａ６は、アミノ酸配列（配列番号８）を有し、該ＣＤＲ−Ｈ２−３Ａ６は、アミノ酸配列（配列番号９）を有し、該ＣＤＲ−Ｈ３−３Ａ６は、アミノ酸配列（配列番号１０）を有する；および、
ｂ）配列中に高頻度可変性ＣＤＲ−Ｌ１−３Ａ６、ＣＤＲ−Ｌ２−３Ａ６およびＣＤＲ−Ｌ３−３Ａ６を含む第２ドメイン；該ＣＤＲ−Ｌ１−３Ａ６は、アミノ酸配列（配列番号１１）を有し、該ＣＤＲ−Ｌ２−３Ａ６は、アミノ酸配列（配列番号１２）を有し、該ＣＤＲ−Ｌ３−３Ａ６は、アミノ酸配列（配列番号１３）を有する；および、
ｃ）第１ドメインのＮ末端および第２ドメインのＣ末端に、または、第１ドメインのＣ末端および第２ドメインのＮ末端に結合する、ペプチドリンカー；
またはこれらの直接的等価物、
を含む抗原結合部位を含む一本鎖結合分子から選択され得る。
【００２０】
周知の通り、１個または数個のアミノ酸の欠失、付加または置換などのアミノ酸配列の小さな変化は、実質的に同一の特性を有する元のタンパク質の対立遺伝子形をもたらし得る。故に、「その直接的等価物」の用語により、本発明の任意の単一ドメイン結合分子（分子Ｘ）であって、
（ｉ）結合分子の高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の各々が、ＣＤＲ−Ｈ１−３Ａ６（配列番号８）、ＣＤＲ−Ｈ２−３Ａ６（配列番号９）およびＣＤＲ−Ｈ３−３Ａ６（配列番号１０）の等価の高頻度可変領域に、少なくとも５０または８０％相同、好ましくは少なくとも９０％相同、より好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８、９９％相同であり、他方ＣＤＲ−Ｈ１がＣＤＲ−Ｈ１−３Ａ６に等価であり、ＣＤＲ−Ｈ２がＣＤＲ−Ｈ２−３Ａ６に等価であり、ＣＤＲ−Ｈ３がＣＤＲ−Ｈ３−３Ａ６に等価であるもの；および、
（ｉｉ）好ましくは解離定数（Ｋｄ）＜１０００ｎＭ、より好ましくはＫｄ＜１００ｎＭ、最も好ましくはＫｄ＜１０ｎＭで、ヒトＮｏｇｏＡ、ヒトＮｉＧまたはヒトＮｏｇｏＡ＿３４２−３５７に結合する能力のあるもの、または、
結合部位１個につき少なくとも２個のドメインを有する任意の本発明の結合分子（分子Ｘ'）であって、
（ｉｉｉ）高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の各々が、ＣＤＲ−Ｈ１−３Ａ６（配列番号８）、ＣＤＲ−Ｈ２−３Ａ６（配列番号９）、ＣＤＲ−Ｈ３−３Ａ６（配列番号１０）、ＣＤＲ−Ｌ１−３Ａ６（配列番号１１）、ＣＤＲ−Ｌ２−３Ａ６（配列番号１２）およびＣＤＲ−Ｌ３−３Ａ６（配列番号１３）の等価の高頻度可変領域に、少なくとも５０または８０％相同、好ましくは少なくとも９０％相同、より好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８、９９％同一であり、他方ＣＤＲ−Ｈ１がＣＤＲ−Ｈ１−３Ａ６に等価であり、ＣＤＲ−Ｈ２がＣＤＲ−Ｈ２−３Ａ６に等価であり、ＣＤＲ−Ｈ３がＣＤＲ−Ｈ３−３Ａ６に等価であり、ＣＤＲ−Ｌ１がＣＤＲ−Ｌ１−３Ａ６に等価であり、ＣＤＲ−Ｌ２がＣＤＲ−Ｌ２−３Ａ６に等価であり、ＣＤＲ−Ｌ３がＣＤＲ−Ｌ３−３Ａ６に等価であるもの；および、
（ｉｖ）好ましくは解離定数（Ｋｄ）＜１０００ｎＭ、より好ましくはＫｄ＜１００ｎＭ、最も好ましくはＫｄ＜１０ｎＭで、ヒトＮｏｇｏＡ、ヒトＮｉＧまたはヒトＮｏｇｏＡ＿３４２−３５７に結合する能力のあるもの、
を意味する。
【００２１】
従って、本発明のさらなる実施態様は、例えば、解離定数＜１０００ｎＭでヒトＮｏｇｏＡ、ヒトＮｉＧまたはヒトＮｏｇｏＡ＿３４２−３５７に結合する能力があり、少なくとも１個の抗原結合部位を含む結合分子であって、該抗原結合部位は、
・配列中に高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、その高頻度可変領域の各々が、それらの等価の高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｈ１−３Ａ６（配列番号８）、ＣＤＲ−Ｈ２−３Ａ６（配列番号９）およびＣＤＲ−Ｈ３−３Ａ６（配列番号１０）に少なくとも５０％、好ましくは８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９％相同であるか；または、
・配列中に高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、その高頻度可変領域の各々が、それらの等価の高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｌ１−３Ａ６（配列番号１１）、ＣＤＲ−Ｌ２−３Ａ６（配列番号１２）およびＣＤＲ−Ｌ３−３Ａ６（配列番号１３）に少なくとも５０％、好ましくは８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９％相同である。
【００２２】
さらに、解離定数＜１０００ｎＭでヒトＮｏｇｏＡ、ヒトＮｉＧまたはヒトＮｏｇｏＡ＿３４２−３５７を結合する能力があり、
・配列中に高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む第１抗原結合部位であって、その高頻度可変領域の各々が、それらの等価の高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｈ１−３Ａ６（配列番号８）、ＣＤＲ−Ｈ２−３Ａ６（配列番号９）およびＣＤＲ−Ｈ３−３Ａ６（配列番号１０）に少なくとも５０％、好ましくは８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９％相同であるもの；および、
・配列中に高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む第２抗原結合部位であって、その高頻度可変領域の各々が、それらの等価の高頻度可変領域ＣＤＲ−Ｌ１−３Ａ６（配列番号１１）、ＣＤＲ−Ｌ２−３Ａ６（配列番号１２）およびＣＤＲ−Ｌ３−３Ａ６（配列番号１３）に少なくとも５０％、好ましくは８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９％相同であるもの、
を含む結合分子。
【００２３】
この解離定数は、例えば、実施例７に記載のバイオセンサー親和法を含む様々なアッセイで都合良く試験し得る。加えて、結合分子の結合および機能的効果を、例えば下記の通りに、バイオアッセイで示し得る。
【００２４】
ヒト重鎖の定常部は、γ１；γ２；γ３；γ４；α１；α２；δまたはεタイプのもの、好ましくはγタイプのもの、より好ましくはγ４；タイプのものであり得、一方、ヒト軽鎖の定常部は、κまたはλタイプ（λ１；λ２；およびλ３サブタイプを含む）のものであり得、しかし、好ましくはκタイプのものである。これらの全ての定常部のアミノ酸配列は、Kabat ら（前出）に示されている。
【００２５】
本発明の結合分子のコンジュゲート（conjugate）、例えば、酵素または毒素または放射性同位元素コンジュゲートも、本発明の範囲に含まれる。
【００２６】
「ポリペプチド」は、特記しない限り、ペプチド結合により相互に連結されたアミノ酸を含み、Ｎ末端で始まりＣ末端で終わるアミノ酸配列を有する任意のペプチドまたはタンパク質を含む。好ましくは、本発明のポリペプチドは、モノクローナル抗体であり、より好ましいのはキメラ（Ｖ移植とも呼ばれる）またはヒト化（ＣＤＲ移植とも呼ばれる）モノクローナル抗体である。ヒト化（ＣＤＲ移植）モノクローナル抗体は、アクセプター抗体のフレームワーク（ＦＲ）配列に導入されたさらなる突然変異を含んでも含まなくてもよい。
【００２７】
本発明で使用されるさらなるポリペプチド誘導体には、本発明のポリペプチドと共通する定性的生物学的活性を有する、即ち、ヒトＮｏｇｏＡ、ヒトＮｉＧまたはヒトＮｏｇｏＡ＿３４２−３５７に結合する能力を有する分子が含まれる。機能的誘導体には、本発明によるポリペプチドのフラグメントおよびペプチド類似体が含まれる。フラグメントは、本発明によるポリペプチドの配列中の領域、例えば特定配列のもの、を含む。用語「誘導体」は、アミノ酸配列変異体を、および本発明によるポリペプチドの、例えば特定配列の、共有結合的修飾体を定義するのに使用される。本発明によるポリペプチドの、例えば特定配列の、例えば軽鎖および重鎖の高頻度可変領域の機能的誘導体は、本発明によるポリペプチドの、例えば特定配列のアミノ酸配列と、好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％、より一層好ましくは少なくとも約８５％、最も好ましくは少なくとも約９５、９６、９７、９８、９９％の全体的配列相同性を有し、ヒトＮｏｇｏＡ、ヒトＮｉＧまたはヒトＮｏｇｏＡ＿３４２−３５７を結合する能力を実質的に保持している。
【００２８】
用語「共有結合的修飾」には、本発明によるポリペプチドの、例えば、特定配列の；または、それらのフラグメントの、有機タンパク質性または非タンパク質性誘導体化剤による修飾、異種ポリペプチド配列への融合、および翻訳後修飾が含まれる。共有的に修飾されたポリペプチド、例えば特定配列のものは、架橋によりヒトＮｏｇｏＡ、ヒトＮｉＧまたはヒトＮｏｇｏＡ＿３４２−３５７に結合する能力を依然として有する。共有結合的修飾は、標的アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応する能力のある有機誘導体化剤と反応させることにより、または、選択された組換え宿主細胞で機能する翻訳後修飾のメカニズムを活用することにより、慣習的に導入される。ある種の翻訳後修飾は、発現されたポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、頻繁に翻訳後に脱アミド化されて対応するグルタミルおよびアスパルチル残基になる。あるいは、これらの残基は、穏やかな酸性の条件下で脱アミノ化される。他の翻訳後修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル、チロシンまたはスレオニル残基の水酸基のリン酸化、リジン、アルギニンのαアミノ基およびヒスチジン側鎖のメチル化が含まれる。例えば、T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983) 参照。共有結合的修飾体には、例えば、本発明によるポリペプチド、例えば特定配列のもの、およびそれらのアミノ酸配列変異体を含む融合タンパク質、例えば、イムノアドヘシン類および異種シグナル配列へのＮ末端融合体が含まれる。
【００２９】
天然ポリペプチドおよびその機能的誘導体に関する「相同性」は、本明細書では、配列をアライニングし、必要ならばギャップを導入して最大の相同性パーセントを達成した後の、そして、保存的置換を配列同一性の一部と見なさずに、対応する天然ポリペプチドの残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。ＮもしくはＣ末端の延長または挿入はいずれも、同一性または相同性を減ずるものと解釈されない。アライメントのための方法およびコンピュータープログラムは、周知である。
【００３０】
「アミノ酸（複数も可）」は、全ての天然産生Ｌ−α−アミノ酸を表し、例えば、Ｄ−アミノ酸を含む。アミノ酸は、周知の一文字または三文字の呼称で同定される。
【００３１】
用語「アミノ酸配列変異体」は、本発明によるポリペプチド、例えば特定配列のもの、と比較して、それらのアミノ酸配列にいくつかの差異を有する分子を表す。本発明によるポリペプチド、例えば特定配列のもののアミノ酸配列変異体は、ヒトＮｏｇｏＡまたはヒトＮｉＧに、またはより好ましくはＮｏｇｏＡ＿３４２−３５７に結合する能力を依然として有する。置換変異体は、少なくとも１個のアミノ酸残基が除去され、その場所で、本発明によるポリペプチド、例えば特定配列のものと同じ位置に、異なるアミノ酸が挿入されたものである。これらの置換は、分子中の１個のみのアミノ酸が置換された単一のものでもよく、または、同じ分子中の２個またはそれ以上のアミノ酸が置換された多重のものでもよい。挿入変異体は、本発明によるポリペプチド、例えば特定配列のものの中の特定の位置で、あるアミノ酸に隣接して１個またはそれ以上のアミノ酸が挿入されたものである。あるアミノ酸に隣接して、は、そのアミノ酸のα−カルボキシまたはα−アミノ官能基のいずれかに連結されていることを意味する。欠失変異体は、本発明によるポリペプチド、例えば特定配列のもの、の１個またはそれ以上のアミノ酸が除去されたものである。普通は、欠失変異体は、分子の特定領域中に、１個または２個のアミノ酸の欠失を有する。
【００３２】
本発明の結合分子は、組換えＤＮＡ技法により産生し得る。この観点から、結合分子をコードする１種またはそれ以上のＤＮＡ分子を構築し、適切な制御配列下に置き、発現に適する宿主生物に移入しなければならない。
【００３３】
従って、非常に一般的なやり方では、
（ｉ）本発明の単一のドメインの結合分子、本発明の一本鎖の結合分子、本発明の結合分子の重鎖もしくは軽鎖またはこれらのフラグメントをコードするＤＮＡ分子；および、
（ｉｉ）本発明の結合分子を組換え手段により産生するための本発明のＤＮＡ分子の使用、
が提供される。
【００３４】
当分野の現状は、本明細書で提供される情報、即ち、高頻度可変領域のアミノ酸配列およびそれらをコードするＤＮＡ配列を与えられて、当業者が本発明のＤＮＡ分子を合成できるようなものである。可変ドメイン遺伝子を構築する方法は、例えばＥＰ２３９４００に記載されており、以下のように簡単にまとめられる：任意の特異性のモノクローナル抗体の可変ドメインをコードする遺伝子をクローン化する。フレームワークおよび高頻度可変領域をコードするＤＮＡセグメントを決定し、高頻度可変領域をコードするＤＮＡセグメントを除去して、フレームワーク領域をコードするＤＮＡセグメントを、適する制限部位とその接合部で融合するようにする。制限部位は、標準的操作によるＤＮＡ分子の突然変異導入により適切な位置で生成させ得る。上記のＣＤＲ−Ｈ１−３Ａ６、ＣＤＲ−Ｈ２−３Ａ６、ＣＤＲ−Ｈ３−３Ａ６、ＣＤＲ−Ｌ１−３Ａ６、ＣＤＲ−Ｌ２−３Ａ６およびＣＤＲ−Ｌ３−３Ａ６で与えられる配列に従い、二本鎖合成ＣＤＲカセットをＤＮＡ合成により調製する。これらのカセットに粘着末端を与え、免疫グロブリン可変ドメインをコードするＤＮＡ分子を獲得するための標準的プロトコールにより、それらが接合部でフレームワークにライゲーションできるようにする。
【００３５】
さらに、本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡコンストラクトを得るために、産生性のハイブリドーマ細胞株からのｍＲＮＡに接近する必要はない。従って、ＰＣＴ出願ＷＯ９０／０７８６１は、遺伝子のヌクレオチド配列に関する記載された情報だけがあれば、組換えＤＮＡ技法によるモノクローナル抗体の産生に詳細な指示を与える。
【００３６】
本方法は、所望のＤＮＡ配列を得るために、数々のオリゴヌクレオチドの合成、それらのＰＣＲ法による増幅、およびそれらのスプライシングを含む。
【００３７】
適するプロモーターまたは重鎖および軽鎖定常部をコードする遺伝子を含む発現ベクターは、公的に入手可能である。従って、一度本発明のＤＮＡ分子を調製したら、それを都合良く適切な発現ベクターに移入し得る。
【００３８】
一本鎖抗体をコードするＤＮＡ分子も、標準的方法により、例えばＷＯ８８／１６４９に記載の通りに、調製し得る。
【００３９】
本発明の具体的実施態様では、組換えは、本発明の結合分子のいくつかの産生が、下記の第１および第２ＤＮＡコンストラクトを含むことを意味する：
【００４０】
第１ＤＮＡコンストラクトは、重鎖またはそのフラグメントをコードし、
ａ）フレームワークと高頻度可変領域を交互に含む、可変ドメインをコードする第１部分であって、該高頻度可変領域が、配列中にＤＮＡ−ＣＤＲ−Ｈ１−３Ａ６（配列番号１４）、ＤＮＡ−ＣＤＲ−Ｈ２−３Ａ６（配列番号１５）およびＤＮＡ−ＣＤＲ−Ｈ３−３Ａ６（配列番号１６）を含み；この第１部分が、可変ドメインの最初のアミノ酸をコードするコドンで始まり、可変ドメインの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わるもの、および、
ｂ）重鎖定常部またはそのフラグメントをコードする第２部分であって、重鎖定常部の最初のアミノ酸をコードするコドンで始まり、定常部またはそのフラグメントの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わり、それにナンセンスコドンが続くもの、
を含む。
【００４１】
好ましくは、第２部分は、ヒト重鎖定常部、より好ましくは、ヒトγ４鎖の定常部をコードする。この第２部分は、ゲノムに由来する（イントロンを含む）ＤＮＡフラグメントでも、ｃＤＮＡフラグメント（イントロンなし）でもよい。
【００４２】
第２ＤＮＡコンストラクトは、軽鎖またはそのフラグメントをコードし、
ａ）フレームワークと高頻度可変領域を交互に含む、可変ドメインをコードする第１部分であって、該高頻度可変領域が、配列中にＤＮＡ−ＣＤＲ−Ｌ１−３Ａ６（配列番号１７）、ＤＮＡ−ＣＤＲ−Ｌ２−３Ａ６（配列番号１８）およびＤＮＡ−ＣＤＲ−Ｌ３−３Ａ６（配列番号１９）を含み；この第１部分が、可変ドメインの最初のアミノ酸をコードするコドンで始まり、可変ドメインの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わるもの、および、
ｂ）軽鎖定常部またはそのフラグメントをコードする第２部分であって、軽鎖定常部の最初のアミノ酸をコードするコドンで始まり、定常部またはそのフラグメントの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わり、それにナンセンスコドンが続くもの、
を含む。
【００４３】
好ましくは、第２部分はヒト軽鎖の定常部、より好ましくはヒトκ鎖の定常部をコードする。
【００４４】
第１または第２ＤＮＡコンストラクトは、有利には、第１部分の上流に位置し、リーダーペプチドの部分をコードする第３部分を含む；この第３部分は、リーダーペプチドの最初のアミノ酸をコードするコドンで始まり、最後のアミノ酸で終わる。このペプチドは、その中でそれらが発現される宿主生物による鎖の分泌に必要とされ、宿主生物により後に除去される。好ましくは、第１ＤＮＡコンストラクトの第３部分は、配列番号２１（位置−１９のアミノ酸で始まり、位置−１のアミノ酸で終わる）に示す重鎖リーダー配列のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するリーダーペプチドをコードする。また、好ましくは、第２ＤＮＡコンストラクトの第３部分は、配列番号２３（軽鎖、位置−１８のアミノ酸で始まり、位置−１のアミノ酸で終わる）に示すアミノ酸配列を有するリーダーペプチドをコードする。
【００４５】
ＤＮＡコンストラクトの各々は、適する制御配列の制御下に、特に、適するプロモーターの制御下に置かれる。発現のためにＤＮＡコンストラクトが移入される宿主生物に適合する限り、いかなる種類のプロモーターも使用し得る。しかしながら、発現を哺乳動物細胞で行おうとする場合、免疫グロブリン遺伝子のプロモーターを使用するのが特に好ましい。
【００４６】
細胞培養またはトランスジェニック動物において所望の抗体を産生し得る。適するトランスジェニック動物は、適する制御配列下に置かれた第１および第２ＤＮＡコンストラクトを卵にマイクロインジェクションし、かくして調製された卵を適切な偽妊娠の雌に移入し、所望の抗体を発現する子孫を選択することを含む、標準的方法に従って入手し得る。
【００４７】
抗体鎖を細胞培養で産生しなければならない場合、ＤＮＡコンストラクトは、最初に、単一の発現ベクター、または２種の分離しているが適合するベクターのいずれかに挿入されなければならず、後者の可能性が好ましい。
【００４８】
従って、本発明はまた、上記のＤＮＡコンストラクトの少なくとも１つを含む、原核または真核細胞株で複製できる発現ベクターを提供する。
【００４９】
ＤＮＡコンストラクトを含有する各発現ベクターを、次いで、適する宿主生物に移入する。ＤＮＡコンストラクトが２種の発現ベクターに分離して挿入されている場合、それらは、別個に、即ち、細胞ごとに１タイプのベクターで移入されても、共移入されてもよく、この後者の可能性が好ましい。適する宿主生物は、細菌、酵母または哺乳動物細胞株であり得、この後者が好ましい。より好ましくは、哺乳動物細胞株は、リンパ球起源のもの、例えばミエローマ、ハイブリドーマまたは正常不死化Ｂ細胞であるが、いかなる内在性抗体重鎖または軽鎖も発現しない。
【００５０】
宿主生物が細胞ごとに多数のベクターのコピーを含有するのも好ましい。宿主生物が哺乳動物細胞株であるならば、この望ましい目標には、標準的方法に従いコピーの数を増幅することにより到達し得る。増幅方法は、通常、薬物耐性の上昇について選択することからなり、該耐性は、発現ベクターにコードされるものである。
【００５１】
本発明の別の態様では、本発明の多鎖結合分子の産生方法が提供される。それは、（ｉ）本発明の第１および第２ＤＮＡコンストラクトを形質移入された生物を培養すること、および（ｉｉ）培養から活性な本発明の結合分子を回収すること、を含む。
【００５２】
あるいは、重鎖および軽鎖は、別個に回収され、インビトロでの再折りたたみ後に、活性な結合分子に再構成され得る。再構成の方法は、当分野で周知である；方法の例は、特にＥＰ１２０６７４またはＥＰ１２５０２３で提供されている。
【００５３】
従って、ある方法は、
（ｉ）本発明の第１ＤＮＡコンストラクトを形質移入された第１の生物を培養すること、および該重鎖またはそのフラグメントを培養から回収すること、および、
（ｉｉ）本発明の第２ＤＮＡコンストラクトを形質移入された第２の生物を培養すること、および該軽鎖またはそのフラグメントを培養から回収すること、および、
（ｉｉｉ）（ｉ）で得られる重鎖またはそのフラグメントおよび（ｉｉ）で得られる軽鎖またはそのフラグメントから、活性な本発明の結合分子をインビトロで再構成すること、
も含み得る。
【００５４】
同様に、一本鎖または単一ドメインの本発明の結合分子を産生する方法が提供され、その方法は、
（ｉ）一本鎖または単一ドメインの本発明の結合分子を各々コードするＤＮＡコンストラクトを形質移入された生物を培養すること、および、
（ｉｉ）該分子を培養から回収すること、
を含む。
【００５５】
本発明の結合分子は、例えば顆粒細胞神経突起伸長モデルで示される通り、非常に良好な神経再生活性を示す。
【００５６】
１．顆粒細胞神経突起伸長アッセイ（インビトロ）
脳組織（皮質および脳幹）を取り、以前に記載された通り、各アッセイのためにタンパク質抽出物を新鮮に調製する（Spillmann et al. 1998, Identification and characterization of a bovine neurite growth inhibitor (bNI-220), J Biol Chem. 1998 Jul 24;273(30):19283-93）。凍結組織片（例えば０.２５ｇ）を、プロテアーゼ阻害剤（１０μｇ／ｍｌアプロチニン−５μｇ／ｍｌロイペプチン−１μｇ／ｍｌペプスタチン−１ｍＭＰＭＳＦ）を含む３−４倍の体積の６０ｍＭ Ｃｈａｐｓ−２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８.０−１ｍＭ ＥＤＴＡ中、４℃でホモジナイズする。ホモジネートをローテーターに４℃で３０分間置き、１００'０００ｇで、４５分間、４℃、ＴＬＡ１００.３ローター（Beckman TL-100 超遠心機）で遠心分離する。上清から BioRad を使用してタンパク質濃度を測定する。
【００５７】
以前に記載された通りに、出生５−７日後のラットの小脳組織のトリプシン分離物から、小脳顆粒細胞を精製する（Niederost et al 1999, Bovine CNS myelin contains neurite growth-inhibitory activity associated with chondroitin sulfate proteoglycans, J Neurosci. 1999 Oct 15;19(20):8979-89）。次いで、本発明の結合分子を、試験基質上で３０分間予めインキュベートし、細胞を添加する前に取り出す。小脳顆粒細胞を添加し、２４時間インキュベートする。実験を停止するために、４％緩衝ホルムアルデヒド２ｍｌをゆっくりと培養ディッシュに添加する。上記の通りに調製したサル脳膜タンパク質抽出物を、培養ディッシュ１ｃｍ２につき１５μｇのタンパク質で、Greiner の４ウェルディッシュ（Greiner, Nuertingen, Germany）に終夜吸着させた。神経細胞を播く前に、ディッシュを温かいハンクス液で３回洗浄する。出生（５−７）日後のラットの小脳顆粒細胞を、上記の通りに調製し、５０,０００細胞／ｃｍ２で播く。細胞を２４時間無血清培地中で培養し、固定し、神経突起マーカーのＭＡＢ１ｂ（Chemicon モノクローナルＡｂ、１：２００）で免疫染色する。細胞体の染色に、ＤＡＰＩ（４',６−ジアミジノ−２−フェニル−インドール二塩酸塩、Molecular Probes より）をＭＡＢ１ｂ染色後に使用する。抗体実験のために、抗−Ｎｏｇｏ−Ａ ｍＡｂまたは対照ＩｇＧ Ａｂをディッシュ上で３０分間予めインキュベートし、その後除去する。
【００５８】
４０Ｘ対物レンズを使用して、観察野の中心を通って配置した線と神経突起との交差を全て計数することにより、ウェルの縁に対して一定の距離にある４つの視野を各ウェルにつきランダムに標本抽出する。以前に報告された通りに、その線に触れている全ての細胞体も計数し、細胞体当たりの神経突起の指数比を各ウェルについて算出する（Simonen et al, 2003, Neuron 38,201-211）。全計数を暗号化された実験で盲検法により行い、細胞体当たりの神経突起の指数として表す。結果を神経突起／細胞体の平均指数として表す。
【００５９】
本発明の結合分子と予めインキュベートすることにより、上記で調製された脊髄抽出物の非許容的（non-permissive）環境において、小脳顆粒細胞の神経突起伸長の増強を観察し得る。例えば、顆粒細胞神経突起伸長モデルにおけるヒト３Ａ６−ＩｇＧ１およびＩｇＧ４抗体の中和効果の典型的なプロフィールを下記に示す：
【表１】
2007527232.tif 000002
【００６０】
本発明の分子の中和活性は、下記に略記するインビボの脊髄損傷モデルにおいて、再生的発芽および神経突起伸長および機能的回復の測定によっても評価できる。
【００６１】
２．ラットおよびサルの脊髄損傷モデル（インビボ）
成体 Lewis ラットを、脊髄の背側半分を両側的に第８胸椎のレベルで横切（transect）することにより、顕微手術的に傷つける。椎弓切除術、麻酔および手術は、Schnell および Schwab 1993 (Eur.J. Neurosci. 5: 1156 - 1171) に記載されている。
【００６２】
神経解剖学的追跡：順行性トレーサーのビオチンデキストランアミン（ＢＤＡ）をポンプまたは移植片の反対側の皮質に注射することにより、運動および感覚皮質脊髄路を追跡する。Broesamle ら (2000 J.Neurosci. 20: 8061-8068）に記載の通り、ＢＤＡは１０−１４日の内に脊髄に輸送され、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を基質として使用して可視化される。
【００６３】
両方の主要なＣＳＴを含む、主に背側半分で脊髄節Ｔ８の約４０％を破壊する脊髄損傷の２週間後：対照動物のＣＳＴの追跡は、中程度の索の反応性発芽を示す。この現象は、文献で周知の、損傷に応答する自発的な発芽に対応する。本発明の結合分子で、または、本発明の結合分子を送達するポンプにより処置された損傷ラットは、病変部位での発芽の増強および損傷を受けた軸索の再生、損傷を受けた神経突起の神経突起伸長を示し得る。さらに、それらの動物は、感覚運動機能の回復の改善を示し得る。かかる機能試験は、以前に記載されている（Merkler et al, 2001, J. Neuroscience 21,3665-73）。
【００６４】
３．成体サルＣＮＳにおける抗体の組織分布
抗体３Ａ６をＩｇＧとして精製し、ＰＢＳ中で３ｍｇ／ｍｌに濃縮する。マウス血清由来ＩｇＧ（Chemicon Int., Temecula/CA, USA）またはコムギオーキシンに対するｍＡＢ（AMS Biotechnology, Oxon/UK）を、対照処理として使用する。２匹の雄成体マカクザル（カニクイザル）をこの研究でくも膜下注入に使用する。
【００６５】
手術操作
ケタミン（Ketalar（登録商標）; Parke-Davis, ５ｍｇ／ｋｇ、ｉ.ｍ.）の筋肉内注射により麻酔を誘導する。アトロピンをｉ.ｍ.注射（０.０５ｍｇ／ｋｇ）し、気管支分泌を低減させる。プロポフォール１％（Fresenius （登録商標））とグルコース４％溶液の混合物（プロポフォール１体積とグルコース溶液２体積）で継続的に灌流するために、静脈内カテーテルを大腿静脈に設置し、より深い麻酔を誘導する。次いで、その動物を定位固定の枠組みに置く。滅菌条件下、Ｃ２からＴｈ１まで垂直正中皮膚切開を実施する。筋膜を切り、Ｃ２からＴｈ１の脊髄の突起（spinal process）を露出させる。脊椎傍筋を牽引し、Ｃ６、Ｃ７およびＴｈ１の薄膜を剥離する。次いで、Ｃ６完全椎弓切除術および上部Ｃ７片側椎弓切除術を実施する。硬膜を露出させ、第６頸髄薄膜（cervical lamina）により覆われた脊髄の部分の吻側域に対応する、第７および第８頸髄節の上で長軸方向に切開する。ｈＮｏｇｏ−Ａ抗体を送達する浸透ポンプ（Alzet（登録商標）, 2ML1；流速：５０μｇ／時間）に連結したポリエチレンチューブ（長さ１０ｃｍ）を、硬膜下に挿入し、数ミリメートル吻側に押し、硬膜に縫合で取り付ける。浸透ポンプを、椎弓切除の数センチメートル下の左側に、背中の筋肉の塊で作られた空洞に置いて固定する。チューブをその軌道に沿って縫合で筋肉組織に固定する。それらの筋肉と皮膚を縫合する。通常プロポフォールの静脈灌流の中断の１５−３０分後に、動物は麻酔から回復する。動物を手術後に抗生物質（アンピシリン１０％、３０ｍｇ／ｋｇ、ｓ.ｃ.）で処置する。さらに、カルプロフェン（Carprofen）を１週間毎日投与する。
【００６６】
これらのサルを浸透ポンプ移植の８日後に犠牲にする。鎮静は、上記の通りに最初にケタミンで誘導し、続いて深い麻酔を致死量のペントバルビタール（９０ｍｇ／ｋｇ）のｉ.ｐ.注射により達成した。これらの動物を、０.４リットルの０.９％塩水で、続いて４リットルの固定液（０.１Ｍリン酸バッファー中の４％パラホルムアルデヒド溶液、ｐＨ＝７.６）で、経心的に灌流する。灌流を、増大する濃度の３種のスクロース溶液（固定液中１０％、リン酸バッファー中２０および３０％）で継続する。
【００６７】
組織学的操作、免疫蛍光および組織化学
サルの脳および脊髄を注意深く切り出し、３０％スクロース中で凍結保護し、クライオスタット中で４０μｍの切片に切る。注入したｍＡＢの検出のために、抗ヒト二次抗体を使用する（Jackson Laboratories）。二重標識のために、以下の抗体を使用できる：内在性Ｎｏｇｏ−Ａ用に、ウサギＡＳ４７２（親和性精製したもの）（Chen, 2000）、星状細胞用に、ＧＦＡＰに対するウサギ抗体、およびリソソーム局在用に、カテプシンＤ（DAKO）に対するウサギ抗体。全ての抗血清は、対応する二次抗体に結合したＴＲＩＴＣまたはＦＩＴＣにより、または、ＡＢＣ−ＤＡＢシステム（Vector）を使用して、可視化する。切片を Zeiss Axiophot の落射蛍光（epifluorescence）により、または、共焦点顕微鏡（ZEISS LSM 410）により、分析する。
【００６８】
注入部位およびその６ｃｍ尾側で脊髄を分析する。注入部位に高レベルの３Ａ６が存在する。より尾側の脊髄では、中心管および索表面が強く標識され、一方、灰白質および白質は、より均質的な標識を示すが、しかしながら、それはバックグラウンドより特異的かつ明確であった。同様の状況は前脳で存在し、表面および脳室の強い標識並びに実質への良好なＮｏｇｏ−Ａ抗体の浸透がある。
【００６９】
これらの実験は、ＣＮＳ細胞表面抗原に対する抗体の脊髄くも膜下腔内注入が、内側（脳室、中心管）および外側の液体空間におけるＣＳＦ循環を介して、良好な抗体分配を導くことを示す。ＩｇＧ抗体は、脳および脊髄組織に良好に浸透する。対照ＩｇＧが迅速に洗い流される一方、Ｎｏｇｏ−Ａに対する抗体は、組織に保持される。
【００７０】
４．サルの脊髄病変における神経修復および機能的改善についての試験
ケタミン（Ketalar（登録商標）; Parke-Davis、５ｍｇ／ｋｇ、ｉ.ｍ.）の筋肉内注射により、麻酔を誘導する。アトロピンをｉ.ｍ.注射（０.０５ｍｇ／ｋｇ）し、気管支分泌を低減させる。プロポフォール１％（Fresenius （登録商標））とグルコース４％溶液の混合物（プロポフォール１体積とグルコース溶液２体積）で継続的に灌流するために、静脈内カテーテルを大腿静脈に設置し、より深い麻酔を誘導する。次いで、その動物を定位固定の枠組みに置く。滅菌条件下、Ｃ２からＴｈ１まで垂直正中皮膚切開を実施する。筋膜を切り、Ｃ２からＴｈ１の脊髄の突起を露出させる。脊椎傍筋を退縮させ、Ｃ６、Ｃ７およびＴｈ１の薄膜を剥離する。次いで、完全なＣ６椎弓切除術および上部Ｃ７片側椎弓切除術を実施する。分子を病変の近傍に送達するために、ポンプに取り付けたポリエチレンチューブの空いている先端を、病変の数ミリメートル吻側の硬膜下に固定する。
【００７１】
手先運動の器用さ（behavioural manual dexterity）の試験を、公表された操作に準じて実施できる。手先運動の器用さは、霊長類用の椅子（primate chair）に座らせたサルを、ランダムに分布した５０個の孔；２５個の孔は水平に、２５個は垂直に向いている、を含む、パースペクス（Perspex）改変型「ブリンクマンボード（Brinkman board）」（１０ｃｍｘ２０ｃｍ）の前に置くことにより訓練する｛Liu, 1999 15428 /id;Rouiller, 1998 13239 /id}. 2.7。記載された通りに、再生と線維の出芽を評価できる。右半球に注射される順行性トレーサーは、ビオチン化デキストランアミン（BDA, Molecular Probe（登録商標）、塩水中１０％）である。左半球には、蛍光順行性トレーサーのフルオレセインデキストラン（Molecular Probe（登録商標）、塩水中１０％）を注射する。トレーサーを可視化するための組織学的加工は、以前に詳述された通りに実施できる {Rouiller, 1994 8322 /id}。
【００７２】
従って、本発明はまた、
（ｉ）哺乳動物神経系、特にヒト神経系の神経修復における、本発明の結合分子の使用、
（ｉｉ）有効量の本発明の結合分子を、そのような処置を必要としている患者に投与することを含む、哺乳動物神経系、特にヒト神経系の神経を修復する方法、または、
（ｉｉｉ）本発明の結合分子および医薬的に許容し得る担体または希釈剤を含む、哺乳動物神経系、特にヒト神経系の神経修復のための医薬組成物、
も提供する。
【００７３】
特に、本発明の結合分子は、神経線維損傷後の軸索再生および出芽の改善に有用である。従って、本発明の分子は、特にヒト対象のために、広範な用途を有する。例えば、本発明の結合分子は、末梢（ＰＮＳ）および中枢神経系（ＣＮＳ）の様々な疾患、即ち、より具体的には、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、レビー様の病状または他の一般的な痴呆などの神経変性疾患、頭蓋、大脳または脊髄外傷後の疾患、卒中または脱髄性疾患、の処置に有用である。かかる脱髄性疾患には、多発性硬化症、単相性脱髄、脳脊髄炎、多巣性白質脳症、全脳炎、マルキアファーバ・ビニャミ（Marchiafava-Bignami）病、橋髄鞘崩壊症（pontine myelmolysis）、副腎白質萎縮症、ペリツェウス・メルツバッハー病、海綿状変性症、アレキサンダー病、カナバン病、異染性白質ジストロフィーおよびクラッベ病が含まれるが、これらに限定されるものではない。一例では、本発明の結合分子の投与は、ＮｏｇｏＡタンパク質に関連する脱髄性疾患の処置に使用できる。別の例では、本発明の結合分子を発現する細胞を脊髄損傷部位に移植し、損傷部位全体の軸索成長を促進し得る。かかる移植細胞は、損傷または外傷後の脊髄機能復活の手段を提供するであろう。かかる細胞には、嗅覚鞘性細胞および胎児神経または組織移植片の系統の異なる幹細胞が含まれ得る。
【００７４】
卒中後の成体ラットにおける機能回復および神経解剖学的可塑性に対する、長期間遅れたＮｏｇｏ−Ａ遮断の効果は、Shih-Yen Tsai、Anay Pradham、Josh Rosales、Anis K. Mir、Martin E. Schwab、Gwendolyn L. Kartje により２００４年に公表された要旨の主題であった。中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）の８週後に、浸透ポンプを使用して、成体ラットに精製抗アミノＮｏｇｏ−Ａ抗体を投与した。熟練した前肢到達試験（forelimb reaching test）および梯子段歩行試験（ladder rung walking test）を使用して機能回復を調べた。予備的な結果は、卒中２ヶ月後に抗アミノＮｏｇｏ−Ａ阻害剤で処置したときでさえ、機能回復が改善することを示した。
【００７５】
加えて、本発明の結合分子は、一般的な虚血性網膜症、前部虚血性視神経症、全形態の視神経炎、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、網膜色素変性症、シュタルガルト病（Stargardt's disease）、ベスト卵黄状網膜変性症（Best's vitelliform retinal degeneration）、レーバー先天黒内障および他の遺伝性網膜変性症、病的近視、未熟児網膜症およびレーバー遺伝性視神経症、角膜移植または角膜屈折手術の後遺症、およびヘルペス性角膜炎を含む、直接または間接に網膜または角膜細胞の変性に関係する変性性眼障害の処置に有用である。
【００７６】
さらに、本発明の結合分子は、精神医学的症状、特に統合失調症および鬱病の処置に有用である。
【００７７】
これらの適合症のために、適切な用量は、もちろん、例えば、用いる具体的な本発明の分子、投与様式および処置しようとする症状の性質および重篤度に応じて変動するであろう。一般的に、投与量は、好ましくは、１μｇ／ｋｇ／日ないし１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあるであろう。本発明の結合分子は、都合良く、ポンプにより投与されるか、または、病変部位に治療剤として注射され、例えば、それらを頭蓋内的にＣＮＳに、または、くも膜下腔内的に脊椎に、病変部位に対して直接投与できる。
【００７８】
本発明の結合分子は、単独で、または、他の物質と組み合わせて、または連続的組合せで、提供できる。例えば、本発明の結合分子は、卒中または脊髄損傷後に、さらなる神経損傷および軸索再生の抑制を阻害する手段として、コルチコステロイド化合物などであるがこれらに限定されない抗炎症性物質と、ＮＧＦ、ＢＤＮＦなどの神経栄養因子と、または Exelon（商標）もしくはレボドパなどの神経変性疾患用の他の薬物と、組み合わせて投与できる。卒中の処置用の他の適する組合せパートナーは、アルテプラーゼおよびデスモテプラーゼ（Desmoteplase）（ＤＳＰＡ、例えばＷＯ９０／０９４３８に開示）である。ある実施態様では、本発明は、特に卒中の処置用の、本発明の結合分子およびデスモテプラーゼを含む組合せ、並びに該組合せを含む医薬組成物を提供する。本明細書で使用するとき、２つの物質が同時に投与されるか、または、その物質が同時に作用するようなやり方で独立して投与される場合に、２つの物質は、組み合わせて投与されると言われる。
【００７９】
コード番号、一般名または商品名で同定される有効成分の構造は、標準的大要「The Merck Index」の現行版から、または、データベース、例えば Patents International (例えば IMS World Publications) もしくは IMS Health により提供される他のデータベースなどから、取得し得る。これらの対応する内容を、出典明示により本明細書の一部とする。当業者は誰でも、有効成分を同定することが十分に可能であり、これらの引用文献に基づいて、インビトロおよびインビボの両方で、標準的試験モデルにおいて医薬的適応および特性を製造および試験することが同様に可能である。
【００８０】
本発明の医薬組成物は、常套のやり方で製造し得る。例えば、本発明の分子を含む本発明による組成物は、好ましくは、凍結乾燥形で提供される。即時投与のために、それを適する水性担体、例えば注射用滅菌水、または滅菌緩衝生理塩水に溶解する。
【００８１】
適する組成物の作成を補助するために、本発明の結合分子、および場合により本発明の結合分子の効果を増強する第２の薬物を、同じコンテナ内に別個に、混合または同時投与のための指示書と共に、包装してもよい。場合による第２の薬物の候補は、上記で示されている。
【００８２】
本発明の結合分子とＮＧＦなどの成長因子の組合せの相乗効果は、脊髄損傷モデルによりインビボで立証し得る。
【００８３】
本発明は、以下の実施例を参照することにより、より詳細に理解されよう。しかしながら、それらは、本発明の範囲を限定すると解釈すべきでない。
以下の実施例中、全ての温度は、摂氏の度（℃）である。
【００８４】
実施例で注目するモノクローナル抗体は、軽鎖の可変部（配列番号３）および重鎖の可変部（配列番号２）を含む、本発明による結合分子である。
【００８５】
以下の略号を使用する：
【表２】
2007527232.tif 000003
【００８６】
実施例１：方法：
ヒトＮｏｇｏ−Ａ発現コンストラクト（ｐＲＫ７−ｈＮｏｇｏ−Ａ）の生成：ラムダｇｔ１０（Clontech）で構築されたヒトｃＤＮＡライブラリーを、標準的操作を使用して、二重のフィルターのセットを用いてスクリーニングする。ヒトＮｏｇｏ−Ａのフラグメントを、ヒト全脳ｃＤＮＡ（Clontech）から、標準的プロトコールを使用して、ＰＣＲにより増幅し、その後、pBluescript にクローニングし、切断し、単離するか、または、スクリーニングのプローブとして直接使用する。４００ｂｐのＸｈｏＩ／ＳｍａＩフラグメントを５'プローブとして使用し、３'プローブは、プライマーＣＡ−ＮＡ−２Ｆ：5'-AAG CAC CAT TGA ATT CTG CAG TTC C-3'（配列番号２９）およびＣＡ−ＮＡ−３Ｒ：5'-AAC TGC AGT ACT GAG CTC CTC CAT CTG C-3'（配列番号３０）を用いて増幅する。陽性のクローンを単離し、サブクローニングし、配列を確認する。全長ヒトＮｏｇｏ−Ａ ｃＤＮＡを得るために、重なり合うクローンをヒトＮｏｇｏ−Ａ配列中の唯一のＥｃｏＲＩ制限部位を使用して組み立て、Bluescript ベクターにサブクローニングし、Pbsnogoa と名付ける。ｐＲＫ７−ｈＮｏｇｏ−Ａを得るために、全長ｃＤＮＡを真核生物発現ベクターｐＲＫ−７に定方向クローニングにより挿入した。
【００８７】
細菌による産生のための、ヒトＮｉＧ（ｈＮｉＧ）発現プラスミド（ｐＥＴ２８ａ−ｈＮｉＧ）の生成：Pbsnogoa からの各々のコード領域を、インフレームで細菌発現用のＮ末端Ｈｉｓ−およびＴ７−タグと共に、プライマーセット：フォワード 5'-GTC GCG GAT CCA TGG AGA CCC TTT TTG CTC TTC-3'（配列番号３１）；リバース 5'-GTT CTC GAG TTA TGA AGT TTT ACT CAG-3'（配列番号３２）を使用してＰＣＲで増幅した後、ｈＮｉＧをコードするＤＮＡフラグメントを、ｐＥＴ２８ａ（Novagen）のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩにサブクローニングする。最終的なプラスミドをｐＥＴ２８ａ−ｈＮｉＧと称する。次いで、１ｍＭイソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＧＴ）での誘導により、ｈＮｉＧを大腸菌 BL21 pRP に発現させた。
【００８８】
マウスＮｉＧ−エクソン３（ｍＮｉＧ−エクソン３）発現プラスミドの生成：マウスエクソン３をコードする領域を、マウスゲノムＢＡＣテンプレートから、プライマー：フォワード 5'-GTG CGG ATC CAT GGA TTT GAA GGA GCA GC-3'（配列番号３３）；リバース 5'-GTT TCT CGA GTG AAG TTT TAT TCA GCT C-3' （配列番号３４）を用いて増幅し、ｐＥＴ２８ａのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩクローニングサイトにサブクローニングする。最終的なプラスミドコンストラクトをｐＥＴ２８ａ−ｍＮｉＧ−エクソン３と名付ける。
【００８９】
サルＮｉＧのクローニング：ポリＡ ＲＮＡを、凍結サル脳組織から単離し、オリゴｄＴプライマーを使用してｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの５'および３'領域を含む２つの重なり合うフラグメントを、配列特異的プライマーおよびプルーフリーディング酵素を使用して、ＰＣＲにより増幅する。これらのプライマーは、ヒトＮｉＧ ｃＤＮＡの既知配列を使用して設計する。５'フラグメントの増幅用に、プライマーは、5'-TCCACCCCGGCCGCGCCCAA-3'（配列番号３５）および5'-AATGATGGGCAAAGCTGTGCTG-3'（配列番号３６）、３'-フラグメント用に、5'-GGTACAAAGATTGCTTATGAAACA-3'（配列番号３７）および5'-AGCAGGGCCAAGGCAATGTAGG-3'（配列番号３８）である。次いで、２つのフラグメントをサブクローニングし、各フラグメントについて、少なくとも４つの独立クローンを配列解読した。上述のプライマーを使用するオーバーラップＰＣＲにより、全長ｃＤＮＡを組み立て、得られる産物をクローニングし、再度配列解読する。
【００９０】
上記定義の組換えＮｏｇｏＮｉＧタンパク質の産生：細菌のＮｏｇｏ−Ａ−欠失ライブラリーを、大腸菌に発現させる。リゾチーム０.７５ｍｇ／ｍｌを含む超音波処理バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８.０）中での反復超音波処理により、B-Per（商標）(Pierce）または８Ｍ尿素による可溶化により、タンパク質を抽出する。ｐｅｌＢ−リーダーと共に発現されたＮｉＧを、周辺質タンパク質の精製用の Novagen のプロトコールに準じて、細胞膜周辺腔から得る。Co２＋-Talon（商標） Metal Affinity Resin (Clontech) を使用して、バッチ操作でｐＥＴ２８−コンストラクトの上清を精製する。樹脂バッチ操作中にバッファーを超音波処理バッファーにだんだんと置き換えることにより、８Ｍ尿素およびB-Per（商標）で可溶化したライセートを非変性条件にする。重力カラム (BioRad) 上、超音波処理バッファー中で、タンパク質を２５０ｍＭイミダゾールで抽出する。Superdex 200 HiLoad 16/60 上のゲル濾過により、ＮｉＧタンパク質をさらに精製する。ｐＧＥＸ−６Ｐコンストラクトの上清を、Ｇ−セファロースカラムを用いて、製造業者の指示に従うバッチ操作で精製する（Amersham Pharmacia）。ＧＳＴ−Ｎｏｇｏ−６６の切断は、可溶化したＧＳＴ−Ｎｏｇｏ−６６を PreScission プロテアーゼとインキュベートし、その後ＨＰＬＣ精製することにより行う。ＩＭＡＣ精製した組換えＮｏｇｏの分取的ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび BioRad Electro-Eluter での５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７.４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０.２％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳへの１時間２５０ｍＡでの抽出および続く３０秒間の電極反転（reversed electrode polarities）により、ゲル電気抽出を実施する。クロマトグラフィーにより精製したタンパク質のタンパク質濃度を、Pierce Coomassie Stain およびＢＳＡを標準タンパク質として使用して決定する。ゲル抽出したタンパク質のタンパク質濃度を、銀染ゲル (Merril CR, Dunau ML, Goldman D (1981) A rapid sensitive silver stain for polypeptides in polyacrylamide gels.  Analyt.Biochem. 110:201-207）のバンド強度に基づき、ＢＳＡを標準として用いて推定する。
【００９１】
実施例２：ヒト３Ａ６−ＩｇＧｍＡｂの生成
Medarex Mice（ヒト免疫グロブリン遺伝子で組み換え的に再構築されたもの）を、ヒトＮｏｇｏ−Ａの特定配列に対応するヒトＮｉＧで皮下免疫する。３Ａ６モノクローナル抗体を、マウスの脾臓細胞のハイブリドーマ細胞株との融合による標準的ハイブリドーマ技法により、生成させた。
【００９２】
Medarex マウスの免疫は、ヒトＮｉＧ７０ｕｇ／マウスを用い、首の後ろと側腹部で、TiterMax Adjuvant との Mixed V/V １.９ｍｌ中１.５ｍｇのｓ.ｃ.濃度で実行した。１８０μｌｓ.ｃ／マウスを注射し、後に数回追加免疫した。
【００９３】
ＥＬＩＳＡによる血清中の抗−Ｎｏｇｏ−Ａ Ａｂの力価決定を、８ｕｇ／ｍｌヒトＮｉＧで被覆した９６ウェルプレート中、ＰＢＳ（１００μｌ／ウェル）中で実行し、室温（ＲＴ）で４時間インキュベートした。プレートを軽くはじき（flicked）、２００μｌ／ウェルのブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋５％ＢＳＡ）を補充し、蓋をし、１時間ＲＴで、または４度で終夜インキュベートし、次いで、水道水で４回洗浄し、ＰＢＳを補充し、軽くはじいた。マウス血清をＰＢＳ＋１０％ＦＣＳ（１００μｌ／ウェル）で希釈し、２時間ＲＴで、または、終夜４度でインキュベートした。使用したマウス血清の希釈：１：１００、１：１０００、１：１００００、１：３００００。洗浄段階を繰り返した。ヤギＦ（ａｂ'）２抗−ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ＨＲＰコンジュゲートＡｂを、ＰＢＳ／０.１％ＢＳＡ／０.１％ Nonidet 40 （１００μｌ／ウェル）で希釈し、２時間ＲＴで、または終夜４度でインキュベートした。洗浄段階を繰り返した。１００μｌ／ウェルのＢＭブルーＰＯＤ基質を添加し、暗所、室温で、１５分間、そして５０μｌ／ウェルでインキュベートした。１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加してＨＰＲ基質反応を停止した。４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーを使用して、Ｏ：Ｄを決定した。ＥＬＩＳＡによるハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングは、上記の通りに実行した。ヒトＮｉＧ（８μｇ／ｍｌ、大腸菌）。ＥＬＩＳＡによるＩｇＧのアイソタイプ同定。抗体のＩｇＧサブクラスを決定するために、実験を実行した。プレートをヒトＮｉＧで被覆し、培養上清を１：１０ないし１：１００の希釈で使用した。抗体の反応性を、マウス抗−ヒトＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）ＨＲＰコンジュゲートｍＡｂのパネルを使用して、４時間インキュベートすることにより評価した。抗−ＭＣＰ１ ＩｇＧ１ ｍＡｂを正の対照として使用した。Ｅｌｉｓａを上記の通りに実行した。ハイブリドーマの生成は、ＥＬＩＳＡにおいてヒトＮｉＧに対する最高の血清力価を有するマウスから行い、融合のために選択した。マウスをＣＯ２吸入により犠牲にした。脾臓を無菌的に取り出し、単一細胞の懸濁物を作成した。カルシウム、マグネシウム不含ＰＢＳ中で洗浄する。マウスミエローマ細胞（ＰＡＩＯ）をＰＢＳ中で洗浄した。
【００９４】
等数のマウス脾臓細胞５０００個に、マウスミエローマ細胞を添加し、ＲＴで１０分間、９００ＲＰＭでスピンした。上清を注意深くかつ完全に取り除いた。１ｍｌ ＰＥＧ４０００を融合剤（ＰＢＳ中５０：５０）として、軽い振動下で、２−３分間かけて、ＲＴで滴下して添加する。水浴中、３７度で、９０秒間穏やかに震盪する。５ないし１０ｍｌの RPMI 1640 培地を５分間かけて滴下して添加し、ＰＥＧを希釈して減らし、ＲＴで１０分間置く。さらに２０ｍｌの無血清培地を添加し、遠心分離する。適量のＨＡＴ培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ＋２０ｍｌ／リットル５０ｘＨＡＴ）で再懸濁する。融合細胞を、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来腹腔細胞（１ｍｌ／ウェル）のフィーダー層を有するウェルに、１００μｌ／ウェルで播いた。
【００９５】
マウス腹膜細胞の調製は、２４時間前に実行し、Ｈａｔ培地中の培養物１ｍｌを、２４ウェルの Costar プレートで調製した。マウス１匹からの収量は、１枚の２４ウェルプレート＝約２０００細胞／ウェルに十分である。犠牲に続き、１０ｍｌシリンジおよび１８ゲージの針を使用して、腹腔を０.３４Ｍスクロース５ｍｌで洗浄する。マウス６匹の群を、１本のチューブに集め、遠心分離し、ＨＡＴ培地に再懸濁し、ウェルに分注する。
【００９６】
培養培地は、１００μＭヒポキサンチン、チミジン１.６μＭ、アミノプテリン０.４μＭ、ベータ−メルカプトエタノール５０μＭ、ゲンタマイシン５０μｇ／ｍｌ、熱非動化ＦＣＳ１０％を含有する、Glutamax を有する RPMI 1640 であった。成長速度およびハイブリドーマの出現に応じて、３日または４日毎に５０％ずつ培地を交換し、１４日後に、アミノプテリンを除外することにより、ＨＡＴ培地をＨＴ培地に交換する。ハイブリドーマのスクリーニングおよびクローンの生成。ウェルが約８０％のコンフルエントに達したら、上清を、１：３希釈で、上記の通りにＥＬＩＳＡで試験した。抗ＮｏｇｏＡｂについて陽性であるハイブリドーマからの単一の細胞のクローニングを、限界希釈により実行した。限界希釈によりクローニングを実行し、０.５細胞／１００μｌ／ウェルでプレートに播いた。４ｘ９６個の１００μｌウェルを用意した。マウスＰＥ細胞をフィーダー層に使用した。クローンの成長を顕微鏡で確認し、スクリーニングを実行する前日に、培地１００μｌを添加した。個々のハイブリドーマ成長速度は様々であるが、十分な抗体を得るのに十分な密度になるには、約１０日が必要である。
【００９７】
上清のスクリーニングは、１：１０、１：１００の希釈で行った。陽性のクローンの培養拡大を実行し、回転ビンでの産生のために、１％の低血清条件に適合させ、プロテインＡ親和性を使用して培養上清からの精製を行った。
【００９８】
実施例３：マウス３Ａ６ ｍＡｂおよびＦａｂ ３Ａ６の産生および精製：
プロテインＡ Sepharose Cl-4B カラムを使用した (Pharmacia ; ベッド高１１ｃｍ）。簡単に述べると、培養上清を、ｐＨを８.１に補正した後、４ｍｌ／分でロードし、１００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ８.１を使用して、８ｍｌ／分でカラムをベースラインまで洗浄する。５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ３.０、１４０ｍＭ ＮａＣｌを使用して、８ｍｌ／分で、結合した物質を最後に抽出し、すぐに５Ｎ ＮａＯＨで中和（ｐＨ７.０）し、濾過滅菌する。吸光度を２８０ｎｍでモニターする。精製した物質の一部を、最終的に限外濾過でさらに濃縮し、かつ／または、ＰＢＳで透析する。精製で使用する全バッファーは、あるかもしれないエンドトキシンの混入物を除去するために、１０ｋＤａ ULTRASETTE（商標）接線流（tangential flow）装置 (Filtron Technology Corporation) で濾過する。同じ理由で、プロテインＡ樹脂を２０％エタノールで何度も洗浄し、全てのチューブ類／ポンプ類を使用前に０.１Ｍ ＮａＯＨで処理する。タンパク質濃度を、分光測定により、２８０ｎｍで、１ｍｇ／ｍｌの参照吸光度１.３５を使用して測定する。還元条件下で４−２０％ Novex 勾配ゲルを使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度を型通りに評価する。製造業者の指示（Endotell AG, Allschwil, Switzerland) に従い、古典的なカブトガニ血球抽出物（Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)）反応により、エンドトキシン含量を測定する。
【００９９】
Ｆａｂフラグメントの生成：マウス３Ａ６ ｍＡｂの一部を、１００ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ５.５、２ｍＭ ＥＤＴＡで何度も透析し、６ｍｇ／ｍｌの濃度に合わせる。パパイン分解（１：２００ｗ／ｗ比）により、０.２５ｍＭシステインの存在下でＦａｂフラグメントを生成する。反応を１６時間３７℃で進行させ、次いで、大過剰（１０μＭ）の特異的パパイン阻害剤Ｅ６４（Ｎ−［Ｎ−（Ｌ−３−ｔｒａｎｓ−カルボキシオキシラン−２−カルボニル）−Ｌ−ロイシル］−アグマチン）の添加により停止させる。次いで、未処理の物質およびＦｃフラグメントを除去するために、分解した抗体をプロテインＡ Sepharose Fast Flow のカラムに通す。Ｆａｂ画分をＰＢＳで何度も透析し、約３ｍｇ／ｍｌに濃縮する。（パパインおよびＥ６４は、Roche Molecular Biochemicals のものである。)
【０１００】
実施例４：ＨＰＬＣ、質量分析並びにＶＬおよびＶＨ領域Ｎ末端アミノ酸配列解読：
ａ）還元およびアルキル化：精製し、乾燥させた３Ａ６抗体を、４０μｌの８Ｍ尿素、０.４Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３、ｐＨ８.３に溶解する。そのタンパク質と同じバッファー１０μｌに予め溶解した６０μｇＤＴＴ（Calbiochem）を添加する。５０℃で、３０分間、アルゴン下で還元を実施する（タンパク質のチオールに対して、１００倍のＤＴＴのモル過剰）。還元後、サンプルを室温に冷却する。タンパク質と同じバッファーに溶解したインドアセトアミド（Sigma Ultra, I-1149）３０４μｇを添加する。室温で１５分間、暗所で、カルボキシアミドメチル化を実行する。β−メルカプトエタノール１μｌを添加して反応をクエンチする。
【０１０１】
ｂ）重鎖および軽鎖の単離：カルボキシアミドメチル化した抗体の重鎖および軽鎖を、ＤＲ５ポンプシステムおよびダイオードアレイＵＶ検出器を有する Hewlett Packard 1090M HPLC System で、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により単離する。クロマトグラフィーの条件は：Ｒ１／Ｈ物質を詰めた PerSeptive Biosystems Poros 2.1x100 mm カラム；流速は０.５ｍｌ／分である；溶媒：（Ａ）水中０.１％ＴＦＡおよび（Ｂ）０.０９％ＴＦＡ／アセトニトリル／水９：１；８分間８０℃で勾配２５−７０％Ｂ；２１８／２８０ｎｍで検出、である。
【０１０２】
ｃ）ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ：Micromass Z-タイプエレクトロスプレーイオン化源（ＥＳＩ）を備えた Q-Tof (Micromass, Manchester, UK) 四重極型飛行時間ハイブリッドタンデム質量分析機を使用して、質量分析を実行する。取得質量範囲は、典型的にはｍ／ｚ５００−２０００である。MassLynx ソフトウェアを使用して、データを記録し、処理する。５００−２５００ｍ／ｚスケールの較正は、ウマ心臓ミオグロビン（ＭＷ１６９５１.５）の多電荷イオンピークを使用して達成する。
【０１０３】
ｄ）重鎖および軽鎖のＨＰＬＣ−ＭＳ：還元およびカルボキシアミドメチル化された重鎖および軽鎖の分離を、Perseptive Biosystems POROS R1/H を詰めた 1mmx150mm LC Packings カラムを用いる HP1100 HPLC システム (Hewlett Packard, Palo-Alto, CA, USA) で実施する。カラムを６０℃に維持する。Valco モデル C6UW HPLC バルブ (Valco, Houston, TX, USA) および１０μｌの注入ループを合わせた CTC PAL オートサンプラー (CTC, Zwingen, Switzerland）を使用して、１０μｌのサンプル量をカラムに注入する。ＨＰＬＣを MassLynx ソフトウェア (Micromass, Manchester, UK) により制御した。ＵＶ検出は２１４ｎｍである。溶離液Ａは０.０５％ＴＦＡを含有する水である。溶離液Ｂは、水：０.０４５％ＴＦＡ含有アセトニトリルの１：９混合物である。２０％Ｂから９０％Ｂの勾配を、２０分間８０℃で走らせる。流速は、典型的には６０μｌ／分である。ＬＣシステムからの全フローを、ＵＶ検出セルに導入し、次いで、ＥＳＩ源を薄めずに導入する。MassLynx ソフトウェア (Micromass, Manchester, UK) を使用して、ＨＰＬＣシステムを制御し、ＵＶ検出器からのシグナルを処理する。以下の５つのシグナルが検出される：
【０１０４】
表１：
【表３】
2007527232.tif 000004
【０１０５】
ｄ）ＶＬおよびＶＨ領域のＮ末端アミノ酸配列解読：ＨＰＬＣから集めたＨ＋Ｌ鎖のピークを、配列分析に使用する。アミノ酸配列を、Hewlett Packard G1000A N-terminal Protein Sequencing System で決定する。システムは、微小吸着性二相性カラムに保持されたタンパク質サンプルに、自動化エドマン化学で作動する。最適化された化学法 (ダブルカップル（double couple）3.0) を使用して、化学的効率を高め、遅延を最小化し、それにより配列分析を約５０残基に延長する。３成分のポンプシステムおよび口径の狭い（２．１ｍｍｘ２５ｃｍ）ＰＴＨカラムを備えたオンライン Hewlett Packard HP1090 HPLC System で、ＰＴＨ−アミノ酸の分析を実施する。
【０１０６】
結果：
質量分析から、均質なマウス３Ａ６−ＩｇＧ１の重鎖および軽鎖が測定される。Ｈ鎖は１回グリコシル化されている。重鎖および軽鎖の総合的な質量分析は、両方の鎖について単一の質量を示す。マウス３Ａ６−ＩｇＧ１のＨＰＬＣクロマトグラフィーは、単一のピークを示す。ＨＰＬＣ精製、続く還元およびアルキル化の後、純粋な重鎖および軽鎖が得られる。Ｎ末端配列分解を軽鎖および重鎖に実施する。Ｌ鎖およびＨ鎖のＮ末端配列からのアミノ酸を、配列分解により同定する。
軽鎖
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳ
重鎖
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦ
【０１０７】
実施例５：ヒト３Ａ６ｍＡｂ重鎖および軽鎖遺伝子のクローニング
TriPure 試薬（Roche diagnostics, Germany, Cat.# 1667157）を製造業者の指示に従い使用して、１０７個のハイブリドーマ細胞（クローン３Ａ６）から総ＲＮＡを調製する。ｃＤＮＡ合成のために、上記で調製した総ＲＮＡから、Oligotex Resin (Qiagen, Germany, cat. # 70022) を使用して、ｍＲＮＡを単離する。
【０１０８】
以下の条件を使用する逆転写により、ｃＤＮＡを生成させる：ｍＲＮＡ２μｌ、１０ｘ逆転写バッファー２μｌ、（ｄＴ）２０プライマー（１０μＭ）２μｌ、RNasin (Promega, 40 U/ml) ０.５μｌ、ｄＮＴＰ類（各５ｍＭ）２μｌ、Omniscript（商標）逆転写酵素 (Qiagen, Cat # 205110) １μｌ、ｄｄＨ２Ｏ１０.５μｌ、反応：３７℃で１時間。ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡのＰＣＲ増幅のために、プルーフリーディング酵素 ProofStart（商標）ＤＮＡポリメラーゼを使用する。
【０１０９】
軽鎖および重鎖のＰＣＲ：反応混合物：ｃＤＮＡ２μｌ、１０ｘ反応バッファー５μｌ、ｄＮＴＰ類（各５ｍＭ）３μｌ、５'プライマー（１０μＭ）（表２参照）２μｌ、３'プライマー（１０μＭ）（表２参照）２μｌ、ProofStart (Qiagen, Cat # 202203）１μｌ、ｄｄＨ２Ｏ３６μｌ。ＰＣＲ条件：９５℃／５分、（９５℃／４０秒、５３℃／１分、７２℃１分）ｘ３５、７２℃／１０分。得られるＰＣＲ産物を、pCRbluntTOPO (Invitrogen）に直接ライゲーションする。ライゲーション混合物を TOP 10 細胞 (Invitrogen）に形質移入し、数クローンを拾う。３Ａ６ ｍＡｂ重鎖（Ｖ−Ｈ、配列番号４３）および３Ａ６ ｍＡｂ軽鎖（Ｖ−Ｌ、配列番号４４）の可変部のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を、ＡＢＩシークエンサーで決定する。２つの独立した実験（ＲＮＡ→ｃＤＮＡ→ＲＴ−ＰＣＲ）に由来するｍＡｂ３Ａ６軽鎖ｃＤＮＡの１０個のクローンを全部一緒に配列解読し、アラインした。結果のＶ−ＨおよびＶ−Ｌのアミノ酸配列を、配列番号２（Ｖ−Ｈ）および配列番号３（Ｖ−Ｌ）に示す。ＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に使用するプライマー；全プライマーは、MWG Biotech, Germany により合成される。
【０１１０】
表２：
【表４】
2007527232.tif 000005
【０１１１】
ＩｇＧ４発現ベクターのクローニング
ＶＨ領域の分子クローニング
プライマー＃１および＃２を使用して、ＶＨｃＤＮＡを組換えｐＣＲＩＩ−プラスミドからＰＣＲにより増幅する。得られるＰＣＲ−フラグメントをＢｓｔＥＩＩで切断し、HCcassAAL のＨｉｎｃＩＩ／ＢｓｔＥＩＩ部位にサブクローニングし、中間プラスミド nogohccass を生成させる。プライマーＩｇＧ４ＨＣ５'の使用により、重鎖リーダー中の位置−２でのアミノ酸交換（アスパラギン酸の代わりにグルタミン）を達成する。自動配列解読により正しい配列であることを確認し、フラグメントＶＨｃＤＮＡをＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ切断により切り出す。ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩで切断した hcMCPfin にライゲーションし、最終的な AnogoHC3A6 発現コンストラクトを得る。
【０１１２】
ＶＬ領域の分子クローニング
プライマー＃３および＃４を使用して、ＶＬｃＤＮＡを組換えｐＣＲＩＩ−プラスミドからＰＣＲにより増幅し、それによりＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入する。ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を導入することにより、連結領域におけるアミノ酸交換（Ｒ→Ｋ）が起こる。これは、Ｊ５タイプ連結領域からＪ２タイプへの変化をもたらす。得られるＰＣＲ−フラグメントをｐＣＲＩＩ−ブラントにサブクローニングし、配列を確認する。正しいフラグメントをＭｌｕＩ／ＨｉｎｄＩＩＩにより切り出し、発現ベクター LCvec-AAL160 にライゲーションし、それにより最終的なプラスミド AnogoLC3A6 を創成する。
【０１１３】
【表５】
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【０１１４】
ヒト３Ａ６ｍＡｂの特徴解析
実施例６：ＥＬＩＳＡを使用する、３Ａ６およびＦａｂのヒトＮｏｇｏ−Ａへの結合
Greiner ９６ウェルＰＳプレート（#655161）を、ＰＢＳ（１００μｌ／ウェル）中の０.４−２μｇ／ｍｌ Ｎｏｇｏタンパク質フラグメントで被覆し、蓋をし、４時間室温でインキュベートする。プレートを軽くはじき、２００ｕｌ／ウェルのブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ）を補充し、蓋をし、１時間ＲＴで、または終夜４℃でインキュベートし、次いで３回水で、そして１回ＰＢＳで洗浄する。異なる濃度のヒト３Ａ６ＩｇＧ１、ＩｇＧ４ ｍＡｂまたは３Ａ６ ＦａｂをＰＢＳ＋２％ＢＳＡ（１００μｌ／ウェル）に希釈し、２時間ＲＴまたは終夜４℃でインキュベートする。洗浄段階を繰り返し、３Ａ６ Ｆａｂ用に、ＰＢＳ／０.１％ＢＳＡ／０.１％Nonidet 40 （１００μｌ／ウェル）中の、１：５０００希釈のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Jackson Immuno Research #109-036-098）または、１：５０００希釈のロバ抗ヒトＨＲＰ（Jackson Immuno Research  709-035-149）を添加し、２時間ＲＴまたは終夜４℃でインキュベートし、洗浄段階を繰り返す。１００μｌ／ウェルのＢＭブルーＰＯＤ（Roche #1484281）の添加によりＨＲＰ反応を開始させ、暗所で、ＲＴで１５分間インキュベートする。Ｈ２ＳＯ４ ５０μｌ／ウェル１Ｍを添加してＨＲＰ基質反応を停止させ、４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダー（Packard Spectra Count）を使用して光学密度を決定する。
【０１１５】
結果：
ヒト３Ａ６ ＩｇＧ１、ＩｇＧ４ ｍＡｂおよび３Ａ６ Ｆａｂは、０.０１−１０ｎＭの範囲に亘る非常に低い濃度でヒトＮｉＧに結合する。
【０１１６】
実施例７：マウス３Ａ６−ＩｇＧ１、３Ａ６−ＩｇＧ４および３Ａ６ Ｆａｂの、Ｎｏｇｏ−Ａドメインに対するバイオセンサー親和性測定
BIAcore 2000 光学バイオセンサー (Biacore, Uppsala, Sweden) を製造業者の指示に従って使用して、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）により、マウス３Ａ６−ＩｇＧ１ ｍＡｂ、３Ａ６−ＩｇＧ４ ｍＡｂおよび３Ａ６ Ｆａｂの親和性を測定する。組換えヒトＮＩＧを、アミンカップリング化学を使用して、ＣＭ５センサーチップのフローセルに共有結合的に固定する。簡単に述べると；カルボキシメチリル化デキストランマトリックスを、０.０２５Ｍ ＮＨＳおよび０.１Ｍ ＥＤＣを含有する溶液３５μｌの注入により活性化する。センサーチップ上での固定のために、組換えヒトＮＩＧを０.０１Ｍクエン酸バッファーｐＨ４で希釈し、流速５μｌ／分で注入して、親和性測定を可能にするカップリングレベルを達成する。残っているＮＨＳ−エステル基の非活性化は、１Ｍエタノールアミン塩酸塩（ｐＨ８.５）３５μｌの注入により実施する。センサーチップの表面を０.１ＭＨＣｌ５μｌの注入により再生する。親和性測定のために、抗体を０.５０ｎＭないし１００ｎＭの範囲の異なる濃度で、流速２００μｌ／分で注入する。各々の注入の後、センサーチップの表面を０.１Ｍ ＨＣｌ１０μｌの注入により、表面での結合活性を喪失せずに再生する。反応速度定数ｋａおよびｋｄおよび親和定数ＫＡおよびＫＤを、製造業者により供給された BIAevaluations 3.0 ソフトウェアを使用して評価する。
【０１１７】
BIAcore での親和性測定：マウス３Ａ６−ＩｇＧ１ ｍＡｂ、３Ａ６−ＩｇＧ４ ｍＡｂおよび一価Ｆａｂフラグメントに由来する３Ａ６の組換えヒトＮｏｇｏＡに対する反応速度および親和結合定数を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技法（Biacore）を使用して、リアルタイムで測定する。この分析のために、組換えヒトＮＩＧをセンサーチップ表面に結合させ、異なる濃度の抗体を注入する。結合相互作用の反応速度パラメーターは、非線形曲線フィッティングによるセンサーグラムから導かれる。これらの抗体について、平衡でのヒトＮＩＧに対する親和定数は、３Ａ６−ＩｇＧ４、３Ａ６−ＩｇＧ１、３Ａ６ Ｆａｂで０.１４ｎＭないし２.７ｎＭのＫＤ範囲にあった。
【０１１８】
実施例８：Pepspot 分析による３Ａ６ ｍＡｂエピトープの同定：
Pepspot 膜を、Jerini Peptide Technologies, Berlin, Germany から購入する。最初のインキュベーション前に、膜をエタノールで１分間、そして３回ＴＢＳで１０分間すすぐ。一次抗体による各インキュベーションの前に、膜をブロッキングバッファー中、終夜４℃でインキュベートする。１０分間ＴＢＳ−Ｔで洗浄した後、膜を一次抗体とブロッキングバッファー中３時間ＲＴでインキュベートする。抗体濃度は、ｃ（３Ａ６）＝０.６ｎＭである。ＴＢＳ−Ｔで１０分間、３回洗浄し、ブロッキングバッファー中、１：５０００００希釈の対応する二次ＨＲＰ標識抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ２、Jackson Immuno Research より) と、膜を２時間ＲＴでインキュベートする。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、膜を化学発光検出試薬（ECL Advance, Amersham Biosciences）と、製造業者の指示に従ってインキュベートし、フィルムに露光する。
【０１１９】
ヒトおよびサルＮｏｇｏ−Ａタンパク質を用いるウエスタンブロット分析：
標準法に従い、ウエスタンブロット分析を実行する。大腸菌から精製したヒトＮｉＧ１０ｎｇを、各レーンにアプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、ニトロセルロース膜に転写する。ブロッキングは、４℃で、ブロッキングバッファー中、終夜である。抗体（０.５％ブロッキングバッファー中、１ｎＭ）をペプチド（１０−、１００−および１０００−倍モル過剰のペプチド、ヒトＮｉＧペプチドエピトープＨＮＱＱＥＬＰＴＡＬＴＫＬＶＫＥＤ、スクランブル（Scrambled）ペプチドＨ−ＥＴＱＬＡＫＬＰＶＤＬＫＴＱＥ：Jerini Peptide Technologies, Berlin, Germany）と、１時間ＲＴでインキュベーションした後、膜をこの溶液に添加し、シェーカー上で１時間ＲＴでインキュベートする。３回ＴＢＳ−Ｔで１０分間洗浄した後、膜を１時間ＲＴで、ブロッキングバッファー中１：１０００００希釈の対応する二次ＨＲＰ標識抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ２、Jackson Immuno Research より）とインキュベートする。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、膜を化学発光検出試薬（ECL Advance, Amersham Biosciences）と、製造業者の指示に従ってインキュベートし、フィルムに１５秒間露光する。
【０１２０】
カニクイザルＮｉＧへのウエスタンブロット分析を、標準法に従い実行する。ＩＰＴＧによる誘導の際にサルＮｉＧを発現する大腸菌ｐＥＴ２８−サルＮｉＧ細胞溶解物のアリコートを、各レーンにアプライする。負の対照として、発現誘導のない同じ細胞の細胞溶解物をロードする。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、ニトロセルロース膜に転写する。ブロッキングは、４℃で、ブロッキングバッファー中、終夜である。抗体（０.５％ブロッキングバッファー中、１ｎＭ、Roche Applied Science）をペプチド（１０−、１００−および１０００−倍モル過剰のペプチド、配列：ＮＱＱＥＬＰＩＡＬＴＫＬＶＫＥＥＤ：Jerini Peptide Technologies, Berlin, Germany）と、１時間ＲＴでインキュベーションした後、膜をこの溶液に添加し、シェーカー上でもう１時間ＲＴでインキュベートする。３回ＴＢＳ−Ｔで１０分間洗浄した後、膜を１時間ＲＴで、ブロッキングバッファー中１：１０００００希釈の抗ヒトＨＲＰ標識二次抗体とインキュベートする。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、膜を化学発光検出試薬（ECL Advance, Amersham Biosciences）と、製造業者の指示に従ってインキュベートし、フィルムに１５秒間露光する。
【０１２１】
ＥＬＩＳＡでの３Ａ６ ｍＡｂのヒトおよびサルペプチドエピトープへの結合
Greiner ９６ウェルＰＳプレートを、ＰＢＳ（１００μｌ／ウェル）中の８μｇ／ｍｌのスクランブルペプチドＨ−ＥＴＱＬＡＫＬＰＶＤＬＫＴＱＥ、ヒトＮｉＧペプチドエピトープ３Ａ６ＩｇＧ４ Ｈ−ＮＱＱＥＬＰＴＡＬＴＫＬＶＫＥＤおよびペプチドエピトープ３Ａ６ ＩｇＧ４サルＮｉＧ、Ｈ−ＮＱＱＥＬＰＩＡＬＴＫＬＶＫＥＥＤで被覆し、蓋をし、４時間室温でインキュベートする。プレートを軽くはじき、２００ｕｌ／ウェルのブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋５％ＢＳＡ）を補充し、蓋をし、１時間ＲＴまたは終夜摂氏４度でインキュベートし、次いで４回水道水で洗浄し、ＰＢＳを補充し、軽くはじく。ｍＡｂ ３Ａ６ＩｇＧ４をＰＢＳ＋２％ＢＳＡ（１００μｌ／ウェル）で希釈し、２時間ＲＴまたは終夜４度でインキュベートする。ｍＡｂの希釈：１０ｎＭないし０.００１ｎＭ。洗浄段階を繰り返す。二次ＡｂをＰＢＳ／０.１％ＢＳＡ／０.１％ Nonidet 40 (１００μｌ／ウェル）で希釈し、２時間ＲＴまたは終夜４度でインキュベートする。洗浄段階を繰り返す。１００μｌ／ウェルＢＭブルーＰＯＤ基質を添加し、暗所、室温で１５分間、５０μｌ／ウェルでインキュベートする。１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加してＨＲＰ基質反応を停止させる。４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーを使用してＯＤを測定する。
【０１２２】
結果：
ヒト３Ａ６ ｍＡｂのエピトープマッピング：エピトープマッピングは、ヒトＮｉＧタンパク質の配列ＥＬＰＴＡＬＴＫＬＶの結果に至る。
【０１２３】
ウエスタンブロットにおける、ヒトＮｉＧに対するｍＡｂ ３Ａ６の結合の合成ペプチドとの競合：
ペプスポット（pepspot）技法により得られた結果を確認するために、ウエスタンブロット競合実験を実施する。推定エピトープ配列を含む合成１６−ｍｅｒ（ＮＱＱＥＬＰＴＡＬＴＫＬＶＫＥＤ）を、３Ａ６抗体への結合に関する全長ヒトＮｉＧとの競合に使用する。ヒトＮｉＧを結合した膜とインキュベートする前に、抗体に対する異なるモル比のペプチドを使用して、３Ａ６抗体（１ｎＭ）を１時間合成ペプチドとインキュベートする。１０倍モル過剰のペプチドは、ヒトＮｉＧ（大腸菌で産生したもの）について検出されるシグナルの有意な減少を示す。１００倍過剰は、シグナルのさらなる減少をもたらし、ペプチドの１０００倍モル過剰は、３Ａ６のヒトＮｉＧへの結合をほぼ完全に阻害する。対照的に、同じアミノ酸内容だが配列の異なる（スクランブル）１０００倍過剰のペプチドは、抗体のヒトＮｉＧへの結合に何の効果もない。
【０１２４】
サルＮｉＧに対するｍＡｂ ３Ａ６結合：合成ペプチドエピトープとの競合
エピトープ配列を含む合成１７−ｍｅｒ（ＮＱＱＥＬＰＩＡＬＴＫＬＶＫＥＥＤ）を、３Ａ６抗体への結合について、大腸菌で発現された全長カニクイサルＮｉＧとの競合に使用する。サルＮｉＧを結合した膜とインキュベートする前に、抗体に対する異なるモル比のペプチドを使用して、３Ａ６抗体（１ｎＭ）を１時間合成ペプチドとインキュベートする。１００倍過剰は、シグナルの減少をもたらし、ペプチドの１０００倍モル過剰は、３Ａ６のサルＮｉＧへの結合を実質的に阻害する。対照的に、同じアミノ酸内容だが配列の異なる（スクランブル）１０００倍過剰のペプチドは、抗体のヒトＮｉＧへの結合に何の効果もない。
【０１２５】
ＥＬＩＳＡにおける３Ａ６ ＩｇＧ４のヒトおよびサルＮｉＧペプチドエピトープへの結合
ｍＡｂのエピトープおよびスクランブル配列に対する結合の詳細な分析を、ＥＬＩＳＡを使用して実施する。結果は、明らかに、ｍＡｂが、その BIAcore におけるヒトＮｉＧついてのＫＤ０.１４ｎＭに匹敵する非常に低い濃度（０.００１ないし１.０ｎＭ）で、サルおよびヒトペプチドエピトープに濃度依存的に結合することを示す。さらに、スクランブルの対照ペプチドに結合せず、結合は特異的である。
【配列表】
2007527232000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年10月18日(2006.10.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007527232000001.app
【国際調査報告】
2007527232.tif 000083
2007527232.tif 000084
2007527232.tif 000085
2007527232.tif 000086
2007527232.tif 000087