(57)【要約】CCX CKR増殖活性を調節する物質を同定するための、物質をスクリーニングする方法を提供する。CCX CKR発現および活性レベルを活性化する段階を含む組織形成方法もまた開示し、血管新生を促進する方法も開示する。細胞増殖に関連する種々の疾患を治療する方法もまた記載する。2007527710.tif 000004
2007527710.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、細胞増殖の調節因子をスクリーニングする方法：
(a) CCXケモカイン受容体（CCX CKR）をコードする組換え構築物を含む細胞集団を被験物質と接触させる段階；および
(b) 被験物質が細胞集団の増殖に及ぼす効果を決定する段階。
【請求項２】
接触段階が、CCX CKR活性を調節するリガンドの非存在下で行われる、請求項1記載の方法。
【請求項３】
決定段階が、複数の時点で血球計を用いて細胞集団中の細胞数を計数する段階を含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
決定段階が、細胞集団の代謝活性を測定するアッセイを行う段階を含む、請求項2記載の方法。
【請求項５】
決定段階が、細胞集団におけるDNA複製を測定するアッセイを行う段階を含む、請求項2記載の方法。
【請求項６】
決定段階が、細胞集団中の、増殖細胞に特異的な細胞周期抗原の濃度を測定するアッセイを行う段階を含む、請求項2記載の方法。
【請求項７】
決定段階が、細胞集団の増殖の測定値を対照細胞集団の増殖の測定値と比較する段階を含む、請求項2記載の方法。
【請求項８】
物質が抗体である、請求項1記載の方法。
【請求項９】
以下の段階を含む、CCXケモカイン受容体（CCX CKR）の活性の調節因子をスクリーニングする方法：
(a) CCX CKRと特異的に結合するリガンドの非存在下で、CCX CKRをコードする組換え構築物を含む細胞を被験物質と接触させる段階；および
(b) 被験物質がCCX CKR活性に及ぼす効果を決定する段階。
【請求項１０】
細胞においてCCX CKRの発現および/または活性を活性化する段階を含む、細胞増殖を促進する方法。
【請求項１１】
活性化が、CCX CKRをコードする核酸構築物を細胞に導入し、それによって細胞中のCCX CKRの発現を増加させる段階を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
活性化段階が、CCX CKRと特異的に結合するリガンドの非存在下で行われる、請求項10記載の方法。
活性化
【請求項１３】
インビトロで行われる、請求項10記載の方法。
【請求項１４】
エクスビボで行われる、請求項10記載の方法。
【請求項１５】
細胞集団においてCCX CKRの発現および/または活性を活性化し、それによって組織を形成する段階を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１６】
細胞集団が骨髄細胞である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
細胞集団が内皮細胞である、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
細胞集団が心臓細胞または心筋細胞である、請求項15記載の方法。
【請求項１９】
組織を患者に移植する段階をさらに含む、請求項15記載の方法。
【請求項２０】
細胞増殖に関連する疾患を有するかまたはこのような疾患を起こしやすい患者に、CCXケモカイン受容体（CCX CKR）の細胞増殖活性またはその発現を阻害する物質を投与する段階を含む、細胞増殖に関連する疾患を治療する方法。
【請求項２１】
疾患が白血病である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
疾患が腎臓癌または肝臓癌である、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
疾患が脳腫瘍である、請求項20記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
ケモカインは、多くの相異なる多様な生物学的過程において重要な役割を果たすことが判明している、サイトカインの1つのクラスである。例えば、多くのケモカインは、単球、好中球、Tリンパ球、好塩基球、線維芽細胞を含む異なる細胞種の走化性移動を引き起こす能力を有する。いくつかのケモカインは炎症反応に関与する。特定のケモカインが関与する炎症促進活性の種類の例には以下のものが含まれる：ヒスタミン放出、リソソーム酵素およびロイコトリエン放出の促進、標的免疫細胞の内皮細胞に対する付着性の増大、補体タンパク質の結合の増強、顆粒球接着分子および補体受容体の発現の誘導、ならびに呼吸バースト。特定の他のケモカインは、造血幹細胞増殖を抑制すること、ならびに内皮細胞増殖およびケラチノサイトの増殖を抑制することが見出されている。
【０００２】
既知ケモカインは、典型的に、システインモチーフの配置に基づいて4つのサブファミリーのうちの1つに割り当てられる。いわゆるαケモカインでは、例えば、（アミノ末端から始まる）4つのシステインのうちの最初の2つが介在アミノ酸により分離されている（すなわち、C-X-Cモチーフを有する）。βケモカインは、最初の2つのシステインの間に介在アミノ酸が存在しないことにより特徴づけられる（すなわち、C-Cモチーフを含む）。より小さいγケモカインファミリーおよびδケモカインファミリーは、単一のC残基（γ）または3つの残基により分離された1対のシステイン（δ；すなわち、CX3Cモチーフを含む）によって特徴づけられる。ケモカインに関する近年の総説については、Ward et al., 1998, Immunity 9:1-11（非特許文献1）；およびBaggiolini et al., 1998, Nature 392:565-568（非特許文献2）、ならびに本明細書中で引用する参考文献を参照されたい。
【０００３】
ケモカイン活性は、受容体によって媒介され得る。例えば、C-Cケモカインに対するいくつかの7回膜貫通ドメインGタンパク質共役受容体がクローニングされており、これには以下のものが含まれる：MIP-1α、RANTES、MCP-2、MCP-3、およびMIP-5を認識するC-Cケモカイン受容体1（Neote et al., 1993, Cell, 72:415-415（非特許文献3））；MCP1、MCP2、MCP3、およびMCP4、またはMCP5の受容体であるCCR2；RANTES、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MIP-5、およびエオタキシンの受容体であるCCR3；MIP-1α、MIP-1β、およびRANTESの受容体であるCCR5；MDCまたはTARCの受容体であるCCR4；LARCの受容体であるCCR6；ならびにSLCおよびELC（MIP-3β）の受容体であるCCR7（Sallusto et al., 1998. Immunol. Today 19:568（非特許文献4）、およびWard et al., 1998, Immunity 9:1-11（非特許文献1）に概説されている）。これらのケモカイン受容体は典型的に不活性型で存在し、リガンド（すなわち、ケモカイン）が結合した時点で活性化し、シグナルを伝達する。
【０００４】
CCX-CKRという名称の別のケモカイン受容体（CCXケモカイン受容体）が近年同定され、その遺伝子配列および対応するタンパク質配列が決定された。この受容体は、ケモカインSLC（場合によっては、6-Ckineとも称される）、ELC（場合によっては、MIP-3βとも称される）、およびTECKに対して高い親和性を有する。例えば、すべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、国際公開公報第01/27146号（特許文献1）を参照されたい。
【０００５】
【特許文献１】国際公開公報第01/27146号
【非特許文献１】Ward et al., 1998, Immunity 9:1-11
【非特許文献２】Baggiolini et al., 1998, Nature 392:565-568
【非特許文献３】Neote et al., 1993, Cell, 72:415-415
【非特許文献４】Sallusto et al., 1998. Immunol. Today 19:568
【発明の開示】
【０００６】
概略
以下の特性をはじめとする本明細書に記載のケモカイン受容体、CCX CKRの固有の特性に一部基づいた、様々な方法を提供する：1) 細胞遊走に関与する細胞のみでなく、様々な組織種で受容体が発現していること、2) 大部分のケモカイン受容体の状況に共通するいくつかの活性に対して、活性が限定されていること、3) 大部分のケモカイン受容体がリガンド結合に際してのみ活性化されるのに対して、自己活性があること、および4) 単なる細胞遊走よりもむしろ細胞増殖に関与していること。
【０００７】
提供する特定の方法は、細胞増殖の調節因子をスクリーニングするように設計されている。これらの方法のいくつかは、CCX CKRをコードする組換え構築物を含む細胞集団を被験化合物と接触させる段階、および次に被験化合物が細胞集団の増殖に及ぼす効果を決定する段階を含む。いくつかの例では、接触段階は、CCX CKR活性を調節するリガンドの非存在下で行われる。被験化合物が増殖に及ぼす効果は、以下のような多くの異なる方法で決定し得る：1) 複数の時点で血球計を用いて細胞集団中の細胞数を計数する、2) 細胞集団の代謝活性を測定するアッセイを行う、3) 細胞集団におけるDNA複製を測定するアッセイを行う、および4) 細胞集団中の、増殖細胞に特異的な細胞周期抗原の濃度を測定するアッセイを行う。
【０００８】
提供する他のスクリーニング法は、CCXケモカイン受容体（CCX CKR）の活性の調節因子を同定するためのものである。これらの方法は、CCX CKRと特異的に結合するリガンドの非存在下で、CCX CKRをコードする組換え構築物を含む細胞を被験化合物と接触させる段階、および次に被験化合物がCCX CKR活性に及ぼす効果を決定する段階を含み得る。
【０００９】
本明細書に開示する別のクラスの方法は、細胞増殖を促進するためのものである。これらの方法は一般に、細胞においてCCX CKRの発現および/または活性を活性化する段階を含む。いくつかの例では、活性化は、CCX CKRをコードする核酸構築物を細胞に導入し、それによって細胞中のCCX CKRの発現を増加させることによって達成される。活性化は、CCX CKRと特異的に結合するリガンドの非存在下で行い得る。本方法は、インビボ、インビトロ、およびエクスビボで行うことができる。
【００１０】
特定の細胞増殖方法は、細胞集団においてCCX CKRの発現および/または活性を活性化し、それによって組織を形成する段階を含む。細胞集団は、例えば骨髄細胞または内皮細胞を含む、種々の種類のものであってよい。いくつかの方法は、組織を患者に移植する段階をさらに含む。
【００１１】
細胞増殖に関連する疾患を治療する方法もまた提供する。これらの方法のいくつかは、この疾患を有するかまたはこの疾患を起こしやすい患者に、CCXケモカイン受容体（CCX CKR）の細胞増殖活性を阻害する化合物を投与する段階を含む。治療し得る例示的な疾患には、白血病、腎臓癌または肝臓癌、および脳腫瘍が含まれる。
【００１２】
詳細な説明
I. 定義
本明細書で使用する「CCX CKR」という用語は、起源にも調製様式にもかかわらず、天然CCX CKRアミノ酸配列を有するタンパク質、ならびに変種、断片、および改変型を指す。したがって、この用語はCCX CKRの天然に存在する形態および組換え型の両方を包含する。この用語には、天然源から単離されたCCX CKR、当技術分野において周知である合成方法によって、および/または組換えもしくはトランスジェニック手段によって生成されたCCX CKRが含まれる。「天然に存在するCCX CKR」または単に「天然CCX CKR」とは、天然源から単離され得るCCX CKR型を指す。天然に存在するCCX CKRという用語は、具体的には、天然に存在する切断型または可溶型、天然に存在する変種型（例えば、選択的スプライシング型）、天然に存在するCCX CKRの対立遺伝子変種、および翻訳後修飾（例えば、グリコシル化およびスルホン化）を含む形態を包含する。天然に存在するCCX CKRの1つの具体的な例は、国際公開公報第01/27146号に記載されている。
【００１３】
「組換えCCX CKR」（rCCX CKR）とは、遺伝子操作、組換え、またはトランスジェニック技法を用いて生成されるCCX CKRを指す。組換えCCX CKR型は、この酵素が発現される生物に応じて、グリコシル化され得るかまたは非グリコシル化状態であり得る。CCX CKRという用語は、ヒト型CCX CKRおよび他の哺乳動物CCX CKR（例えば、サル、チンパンジー、およびゴリラなどの霊長動物、ならびにマウス、ウサギ、ウシ、およびブタなどの非霊長動物に由来するCCX CKR）の両方を含み得る。
【００１４】
「CCX CKR」変種とは、天然配列CCX CKRタンパク質と機能的に同等であるタンパク質、および同様のアミノ酸配列を有し、かつ天然に存在するCCX CKRの活性の1つまたは複数をある程度保持するタンパク質を指す。CCX CKR活性には、SLC、ELC、またはTECK、典型的には3つすべてと結合する能力が含まれるが、これに限定されない。他の例示的なCCX CKR活性には、本明細書に詳述するような、特定の細胞種において細胞増殖を促進する能力が含まれる。
【００１５】
変種にはまた、CCX CKR活性を保持する断片が含まれる。断片はCCX CKRの活性部位を含み、典型的には活性部位の両側に位置する少なくとも5〜20の隣接アミノ酸を含む。断片は、通常、少なくとも25、50、75、100、150、200、250、または300アミノ酸を含む。
【００１６】
CCX CKR変種にはまた、CCX CKRの天然配列と実質的に同一である（すなわち、実質的配列同一性を有する--以下を参照）タンパク質が含まれる。そのような変種には、欠失、挿入、および/または置換などのアミノ酸変化を有するタンパク質が含まれる。「欠失」とは、関連タンパク質における1つまたは複数のアミノ酸残基の非存在を指す。「挿入」という用語は、関連タンパク質における1つまたは複数のアミノ酸の付加を指す。「置換」とは、ポリペプチドにおける1つまたは複数のアミノ酸残基の別のアミノ酸による置き換えを指す。典型的に、そのような変化は、変種タンパク質の活性がCCX CKRの天然配列と実質的に類似するように、本来保存的である（例えば、Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company）。置換の場合、別のアミノ酸と置き換わるアミノ酸は一般に、類似の構造および/または化学的特性を有する。挿入および欠失は典型的に1〜5アミノ酸の範囲であるが、挿入の位置によって、より多くのアミノ酸が挿入または除去され得る。変種は、部位特異的突然変異誘発（Carter, et al. (1986) Nucl. Acids Res. 13:4331；Zoller et al. (1987) Nucl. Acids Res. 10:6487）、カセット突然変異誘発（Wells et al. (1985) Gene 34-315）、制限選択突然変異誘発（Wells et al. (1986) Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317:415）、およびPCR突然変異誘発（Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press）などの、当技術分野で周知の方法を用いて作製され得る。
【００１７】
CCX CKR変種にはまた、CCX CKRの改変型または誘導体型が含まれる。改変CCX CKRとは、一般に、天然配列CCX CKRの1つまたは複数のアミノ酸が天然に存在しないアミノ酸残基に改変されたタンパク質を指す。そのような改変は翻訳過程においてまたは翻訳後に起こり得り、これにはリン酸化、グリコシル化、スルホン化、架橋、アシル化、およびタンパク質分解切断が含まれるが、これらに限定されない。
【００１８】
「細胞増殖」とは、試料（例えば、培養物）中の分裂している細胞の数の測定値を指す。
【００１９】
本明細書において種々の形態で使用するケモカイン受容体活性の「調節因子」および「調節」という用語は、CCX CKRと関連した活性の拮抗作用、活性化作用、部分的拮抗作用、および/または部分的活性化作用を包含することが意図される。種々の態様において、「調節因子」はCCX CKR発現または活性を阻害または促進し得る。
【００２０】
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は互換的に用いられ、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および一本鎖または二本鎖形態のそれらのポリマーを指す。特に限定されない限り、ポリヌクレオチド配列の開示はまた、相補配列にも言及することが意図される。本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」という用語は、オリゴヌクレオチドを包含する。
【００２１】
「機能的に連結された」という用語は、2つまたはそれ以上のポリヌクレオチド（例えば、DNA）断片の間の機能的関係を指す：例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、これが適切な宿主細胞または他の発現系において配列の転写を促進する場合、コード配列に機能的に連結されている。一般に、機能的に連結されている配列は連続的であり、シグナル配列の場合には連続的でありかつ読み枠内にある。しかし、エンハンサーは、転写を増強するコード配列に近接して位置する必要はない。
【００２２】
「組換え発現カセット」、「発現カセット」、または「発現構築物」とは、そのような配列と適合する宿主において、調節エレメントに機能的に連結された遺伝子（例えば、CCX CKRをコードする遺伝子）の発現をもたらし得る調節エレメントを有する、組換えによってまたは合成によって作製された核酸構築物である。発現カセットは、少なくともプロモーター、および任意に転写終結シグナルを含む。典型的に、組換え発現カセットは、少なくとも転写されるべき核酸（例えば、所望のポリペプチドをコードする核酸）およびプロモーターを含む。発現をもたらすのに必要なまたは有益なさらなる因子もまた使用し得る。例えば、発現カセットは、転写終結シグナル、エンハンサー、および遺伝子発現に影響する他の核酸配列もまた含み得る。
【００２３】
「組換え」という用語は、インビトロで合成されるかまたは別の方法で操作されたポリヌクレオチド（例えば、「組換えポリヌクレオチド」）、組換えポリヌクレオチドを使用して細胞または他の生物系において遺伝子産物を生成する方法、または組換えポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド（「組換えタンパク質」）を指す。したがって、「組換え」ポリヌクレオチドは、その生成方法またはその構造によって定義される。その生成方法に関して、その工程は、例えばヌクレオチド配列にヒトの介入、典型的には選択または生成が関与する組換え核酸技法を使用する。または、これは、天然では相互に連続していない2つの断片の融合を含む配列を生成することによって作製されたポリヌクレオチドであってよく、天然の産物を除外することが意図される。したがって、任意の合成オリゴヌクレオチド工程を用いて導出された配列を含むポリヌクレオチドと同様に、例えば、任意の天然に存在しないベクターで細胞を形質転換することによって作製される産物も包含される。同様に、「組換え」ポリペプチドは、組換えポリヌクレオチドから発現されるものである。
【００２４】
本明細書で用いる「対立遺伝子」または「対立遺伝子配列」という用語は、CCX CKRポリペプチドをコードする遺伝子（すなわち、CCX CKRポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）の天然に存在する別の形態を指す。対立遺伝子は変異（すなわち、核酸配列の変化）によって生じ、場合によっては改変されたおよび/または異なって調節されるmRNAまたはポリペプチドを産生するが、その構造および/または機能は変化している場合もあればしていない場合もある。対立遺伝子を生じる共通の変異変化は、一般に、コードされたアミノ酸に影響し得るまたは影響し得ないヌクレオチドの天然での欠失、付加、または置換が原因とされる。これらの種類の変化はそれぞれ、所与の遺伝子、染色体、もしくは他の細胞ポリヌクレオチド内で単独で、他の変化と組み合わせて、または1回もしくは複数回起こり得る。任意の所与の遺伝子は、対立遺伝子型を有さない場合もあれば、1つまたは多くの対立遺伝子型を有する場合もある。本明細書で用いる「対立遺伝子」という用語は、遺伝子またはその遺伝子から転写されたmRNAの一方または両方を指す。
【００２５】
「調節エレメント」または「制御配列」という用語には、ポリペプチドまたは他の生体分子が相互作用して転写および翻訳を行う、エンハンサー、プロモーター、転写ターミネーター、複製開始点、染色体組み込み配列、5'および3'非翻訳領域が含まれる。真核細胞では、調節配列には、プロモーターおよび好ましくはエンハンサー（例えば、免疫ブロブリン遺伝子、SV40、サイトメガロウィルスに由来するエンハンサー）、ならびにポリアデニル化配列が含まれ、またスプライスドナー配列およびアクセプター配列も含まれ得る。使用するベクター系および宿主に応じて、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む、多くの適切な転写エレメントおよび翻訳エレメントが用いられ得る。CCX CKRに関する場合、CCX CKRコード配列と天然で結合しているプロモーター以外のプロモーターは、「異種」プロモーターと称され得る。
【００２６】
「アンチセンス配列」という用語は、RNA配列と相補的な配列を有するポリヌクレオチドを指す。この用語は、具体的には、mRNAまたはその一部に結合して、リボソームによるmRNAの転写を阻止する核酸配列を包含する。アンチセンス法は当技術分野において一般に周知である（例えば、国際公開公報第94/12633号、およびNielsen et al., 1991,Science 254:1497；OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES, A PRACTICAL APPROACH、F. Eckstein編、IRL Press at Oxford University Press (1991)；ANTISENSE RESEARCH AND APPLICATIONS (1993, CRC Press)を参照のこと）。
【００２７】
本明細書で使用する「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、およびO-ホスホセリンなどである。アミノ酸類似体とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基が結合するα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどを指す。そのような類似体は、修飾されたR基（例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する化合物を指す。
【００２８】
本明細書で使用する「実質的配列同一性」とは、以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いるかまたは目視検査による測定により、最大限の一致を得るために比較および整列させた場合に、少なくとも60%、好ましくは80%、最も好ましくは、90%、95%、98%、または99%のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する2つまたはそれ以上の配列またはサブ配列を指す。2つの配列（アミノ酸またはヌクレオチド）は、その全長にわたって（例えば、それらが実質的に異なる長さである場合は、2つのうち短い方の長さ）、あるいは少なくとも約50、約100、約200、約500、もしくは約1000個の連続したヌクレオチド、または少なくとも約10、約20、約30、約50、もしくは約100個の連続したアミノ酸残基のサブ配列にわたって比較され得る．
【００２９】
配列比較では、典型的に1つの配列が、試験配列を比較する参照配列となる。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次に、配列比較アルゴリズムにより、指定したプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性が計算される。
【００３０】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所的相同性アルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Wisconsin Genetics Software PackageのGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA、Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）によって、または目視検査によって行うことができる（例えば、一般的には、Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York（1999年まで増補）を参照のこと）。これらの参考文献およびアルゴリズムはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。前述のアルゴリズムのいずれかを使用する場合、「Window」長、ギャップペナルティーなどについてはその初期設定パラメータが用いられる。
【００３１】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの一例はBLASTアルゴリズムであり、これはAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されている。BLAST解析を行うためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通して公的に利用可能である。このアルゴリズムはまず、データベース配列中の同じ長さのワードと共にアラインメントされた場合にある正値の閾値スコアTと一致するかまたはこれを満たす問い合わせ配列中の長さWの短いワードを同定することにより、スコアの高い配列ペア（HSP）を同定する段階を含む。Tは、隣接ワードスコア閾値と称される（Altschul et al、前記）。これら最初の隣接ワードのヒットが、それらを含むより長いHSPを見出す検索を開始するための元となる。次いで、ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増大し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。各方向へのワードヒットの伸長は、以下の場合に中断される：累積アライメントスコアが、最大達成値からX量減少した場合；1つまたは複数の負のスコア残基アラインメントの累積に起因して、累積スコアがゼロ以下になった場合；またはどちらか一方の配列の末端に到達した場合。BLASTアルゴリズムパラメータ、W、T、およびXは、アラインメントの感度および速度を決定する。BLASTプログラムでは、初期設定としてワード長（W）11、BLOSUM62スコア行列（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照のこと）アラインメント（B）50、期待値（E）10、M=5、N=-4、および両鎖の比較を使用する。
【００３２】
パーセント配列同一性を計算することに加えて、BLASTアルゴリズムはまた、2つの配列間の類似性の統計解析を行う（例えば、Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)を参照のこと）。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの基準は最小総和確率（P(N)）であり、これは2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小総和確率が約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、および最も好ましくは約0.001未満である場合に、核酸は参照核酸に対して類似していると見なされる。
【００３３】
2つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることのさらなる指標は、第一ポリペプチド（例えば、第一核酸によってコードされるポリペプチド）が、第二ポリペプチド（例えば、第二核酸によってコードされるポリペプチド）と免疫学的に交差反応性があることである。したがって、例えば2つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、ポリペプチドは典型的に第二ポリペプチドと実質的に同一である。
【００３４】
2つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、2つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。実質的同一性は、典型的にはプローブヌクレオチド配列に由来する少なくとも約50個の連続したヌクレオチドの配列を用いて、断片が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で鎖またはその相補体とハイブリダイズする場合に存在する。
【００３５】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、標的配列および標的と正確なまたはほぼ正確な相補性を有するプローブの融解温度（Tm）より約5℃から約20℃ないしは25℃下回る範囲の条件を指す。本明細書で使用する融解温度とは、二本鎖核酸分子の集団が半分解離して一本鎖になる温度である。核酸のTmを計算する方法は、当技術分野において周知である（例えば、Berger and Kimmel, 1987, Methods In Enzymology, Vol. 152: Guide To Molecular Cloning Techniques, San Diego: Academic Press, Inc.、およびSambrook et al.；前記；(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratoryを参照のこと）。標準的な参考文献によって示されるように、核酸が1 M NaClの水溶液中に存在する場合、Tm値の単純な概算値は以下の式により計算することができる：Tm = 81.5 + 0.41 (% G + C)（）（例えば、Anderson and Young, 「Quantitative Filteｒ Hybridization」、Nucleic Acid Hybridization (1985)」を参照のこと）。他の参考文献は、構造および配列特性をTmの計算の考慮に入れた、より精巧なコンピュータ計算を含む。ハイブリッドの融解温度（ひいてはストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件）は、プローブの長さおよび性質（DNA、RNA、塩基組成）ならびに標的の性質（DNA、RNA、塩基組成、溶液中に存在するかまたは固定化されているか、など）、ならびに塩および他の成分の濃度（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコールの存在または非存在）などの様々な要因によって影響を受ける。これら要因の効果は周知であり、当技術分野の標準的な参考文献において考察されている（例えば、Sambrook、前記、およびAusubel、前記を参照のこと）。典型的に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件では、塩濃度はpH7.0〜8.3において約1.0M未満のナトリウムイオン、典型的には約0.01〜1.0 Mナトリウムイオンであり、温度は短いプローブ（例えば、10〜50ヌクレオチド）に関しては少なくとも約30℃、および長いプローブ（例えば、50ヌクレオチドを上回る）に関しては少なくとも約60℃である。示したように、ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成することもでき、この場合、より低い温度を使用し得る。
【００３６】
「ポリペプチド」という用語は本明細書において「タンパク質」という用語と互換的に用いられ、アミド結合によって連結されたアミノ酸残基から構成されるポリマーを指し、これには合成、天然に存在する、および天然に存在しないそれらの類似体（アミノ酸および結合）も含まれる。ペプチドはポリペプチドの例である。
【００３７】
「保存的置換」という用語は、ポリペプチドについて記載する場合、ポリペプチドの活性を実質的に変化させないポリペプチドのアミノ酸組成の変化、すなわち、重要なアミノ酸の置換でさえ実質的に活性を変化させないような、同様の性質を有する他のアミノ酸とのアミノ酸の置換を指す。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野において周知である。以下の6つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：1) アラニン（A）、セリン（S）、スレオニン（T）；2) アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；3) アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；4) アルギニン（R）、リジン（K）；5) イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；および6) フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）（Creighton, 1984, Proteins, W.H. Freeman and Companyもまた参照されたい）。
【００３８】
上記に定義した保存的置換に加えて、アミノ酸残基の他の改変も「保存的改変変種」を生じ得る。例えば、正であるか負であるかにかかわらず、すべての荷電アミノ酸は互いに置換とみなし得る。さらに、保存的改変変種はまた、コードされる配列中の単一アミノ酸または数パーセントのアミノ酸（例えば、5%未満の場合が多い）を変更、付加、または欠失する、個々の置換、欠失、または付加から生じ得る。さらに保存的改変変種は、天然または野生型の遺伝子によって使用されるアミノ酸のコドンを、同じアミノ酸に対する別のコドンと置換することによって組換えポリペプチドから生成され得る。
【００３９】
「ペプチド模倣物」および「模倣物」という用語は、本発明のCCX CKRポリペプチドと実質的に同じ構造的および機能的特徴を有する合成化合物を指す。ペプチド類似体は、鋳型ペプチドの特性と類似した特性を有する非ペプチド薬物として、製薬産業において一般に使用される。これらの種類の非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣物（peptide mimeticまたはpeptidomimetic」と称される（Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986)；Veber and Freidinger TINS p. 392 (1985)；およびEvans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987)、これらは参照により本明細書に組み入れられる）。治療上有用なペプチドと構造的に類似しているペプチド模倣物は、等価のまたは増強された治療効果または予防効果をもたらすために使用することができる。一般に、ペプチド模倣物は、例えばCCX CKRなどのパラダイムポリペプチド（すなわち、生物活性または薬理活性を有するポリペプチド）と構造的に類似しているが、以下からなる群より選択される結合によって任意に置換された1つまたは複数のペプチド結合を有する：例えば、-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH=CH-（シスおよびトランス）、-COCH2-、-CH(OH)CH2-、および-CH2SO-。模倣物は、アミノ酸の合成非天然類似体から完全に構成され得るか、または一部天然ペプチドアミノ酸および一部非天然アミノ酸類似体のキメラ分子である。模倣物はまた、任意の量の天然アミノ酸保存的置換を、このような置換が模倣物の構造および/または活性を実質的に変えない限り、取り込み得る。例えば、模倣物組成物は、それがCCX CKRの結合または酵素活性を実行し得る場合、本発明の範囲内である。
【００４０】
「薬学的に許容される」とは、担体、希釈剤、または賦形剤が、製剤の他の成分と適合しなくてはならず、かつそのレシピエントに有害であってはならないことを意味する。
【００４１】
本明細書において使用する受容体媒介性「生物学的効果」とは、天然に存在するリガンドへの受容体の結合（例えば、ELCのCCX CKR結合）によって生じる細胞機能または構造の変化を指し、これには、受容体内部移行、受容体媒介性シグナル伝達（例えば、哺乳動物Gタンパク質の活性化、細胞質ゾル遊離カルシウムの濃度の迅速かつ一過性増加の誘導）、細胞応答機能（例えば、細胞増殖の誘導、走化性の促進、または炎症性メディエータの放出）などが含まれ得る。
【００４２】
「細胞増殖性疾患」という用語には、細胞の望ましくない増殖が関与する疾患、または細胞増殖レベルの増加が望まれるような（例えば、血管新生の増強）不十分な細胞増殖と関連した疾患が含まれる。そのような疾患の非限定的な例には、腫瘍（例えば、脳、肺（小細胞、非小細胞）、卵巣、前立腺、乳房、または結腸）または他の癌腫もしくは肉腫（例えば、白血病、リンパ腫）が含まれる。
【００４３】
「血管新生」という用語は、新たな血管を形成する過程を広く指す。この過程は、既存の血管からの新たな毛細血管内皮細胞の増殖、遊走、および組織浸潤を含む。血管新生は、例えば、卵胞発育、胚発生、および創傷治癒を含む正常な生理学的過程において、ならびに腫瘍増殖および転移などの病理学的過程において重要である。血管新生の調節とは、血管の形成の増殖または減少の両方を指す。
【００４４】
薬学的組成物の「有効」量（または「治療有効」量）とは、所望の効果を提供するための、薬剤の十分であるが毒性のない量を意味する。この用語は、対象を治療するのに十分な量を指す。したがって、治療量という用語は、疾患またはどのようなものであれ任意の他の望ましくない症状の進行を阻止する、妨げる、遅延させる、または逆転させることによって、疾患の状態または症状を改善するのに十分な量をさす。予防有効量という用語は、まだ疾患を患っていない対象に投与される量を指し、したがって、疾患の発症を阻止する、妨げる、または遅延させるのに有効な量である。
【００４５】
本明細書で使用する「抗体」という用語には、ポリクローナル調製物およびモノクローナル調製物から得られた抗体、ならびに以下のものが含まれる：(i) ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば、Winter et al. (1991) Nature 349:293-299；および米国特許第4,816,567号を参照のこと）；(ii) F(ab')2およびF(ab)断片；(iii) Fv分子（非共有結合性ヘテロ二量体、例えば、Inbar, et al. (1972） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2659-2662；およびEhrlich et al. (1980) Biochem 19:4091-4096を参照のこと）；(iv) 一本鎖Fv分子（sFv）（例えば、Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照のこと）；(v) 二量体および三量体抗体断片構築物；(vi) ヒト化抗体分子（例えば、Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327；Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534-1536；および1994年9月21日に公開された英国特許公報第GB 2,276,169号を参照のこと）；(vii) ミニ抗体またはミニボディ（すなわち、C末端に、ヒンジ領域によってsFvから分離されたオリゴマー形成ドメインを含むSFvポリペプチド鎖；例えば、Pack et al. (1992) Biochem 31:1579-1584；Cumber et al. (1992) J. Immunology 149B:120-126を参照のこと）；および(vii) 親抗体分子の特異的結合特性を保持する、そのような分子から得られた任意の機能断片。
【００４６】
特定の「高親和性抗体」は、少なくとも106 M-1、好ましくは少なくとも108 M-1、より好ましくは少なくとも109 M-1またはそれ以上、例えば最大1012 M-1またはそれ以上の会合定数(Ka)を有する。
【００４７】
「アゴニスト抗体」とは、CCX CKRと結合し、その活性を活性化し得る抗体を指す（例えば、細胞増殖の促進）。いくつかのアゴニスト抗体は、CCX CKRの細胞外ドメインに結合する。アゴニスト抗体は、上記に定義した抗体クラスのいずれかに由来し得る。
【００４８】
「アンタゴニスト抗体」とは、CCX CKRとの結合に際して、この受容体の活性を阻害する抗体である（例えば、細胞増殖の抑制）。これらの抗体もまたCCX CKRの細胞外ドメインと結合し得り、上記した抗体種のいずれかであってよい。
【００４９】
II. 概要
上記の背景の項に記載したように、異なるケモカイン受容体が多様な生物活性に関与しており、そのため全体として受容体が多くの異なる生物活性に結びつけられている。本発明者らは、特定のケモカイン受容体、すなわちCCX CKRを用いて多くの研究を行い、この受容体がいくつかの際立った特徴を有することを明らかにした。
【００５０】
第一に、この受容体は様々な異なる組織種で発現される。対照的にほとんどのケモカイン受容体は、多くのケモカイン受容体が細胞遊走に関与することに起因して、主に白血球で発現される。CCX CKRが様々な他の細胞種で発現されることから、CCX CKRが単なる細胞遊走とは異なる生物活性において役割を担うことが示唆される。第二に、この受容体は、多くのケモカイン受容体に共通の活性を測定するよう設計されたアッセイにおいて、低い活性を示すか、または活性を示さなかった（例えば、リガンド依存的カルシウムシグナル伝達、リガンド依存的イノシトールリン酸代謝回転、MDCフィジオメーターを使用するリガンド依存的代謝率、およびリガンド依存的走化性）。このことからもまた、CCX CKR活性が、ケモカイン受容体と通常付随しない活性を含むことが示唆される。第三に、CCX CKRが自己活性を有することが見出され、このことは、この受容体が受容体の同族リガンド（例えば、SLC、ELC、およびTECK）の非存在下でさえも生物活性を誘発し得ることを意味する。したがって、場合によっては、この受容体の発現のみで、顕著な生物学的応答をもたらすのに十分である。このこともまた、典型的にリガンドが受容体と結合して初めて活性化される、多くのケモカイン受容体の知見と対照的である。最後に、CCX CKRは細胞増殖およびタンパク質発現の制御において重要な役割を担うことが見出された。受容体の単なる発現増加は、多くの異なるタンパク質の発現レベルに顕著な影響を及ぼし、細胞増殖の顕著な増加をもたらす。よって、主に細胞遊走に関与するいくつかの他のケモカイン受容体とは異なり、CCX CKRは細胞増殖および遺伝子発現の制御において重要な役割を果たし得る。このことは、CCX CKRが多くの細胞種で発現されるという知見と一致する。
【００５１】
これらの知見に基づき、本発明者らは、CCX CKRの活性を調節する化合物をスクリーニングするための様々な異なる方法を開発した。CCX CKRが自己活性を有するという知見により、これらのスクリーニング法のいくつかは受容体の同族リガンドを導入せずに行い得るが、多くのその他のスクリーニングアッセイではリガンドの導入が必要である。このようなアッセイ法のいくつかを用いて、CCX CKRが細胞増殖を誘導する能力に影響を及ぼす調節因子を同定することができる。他のアッセイ法は、CCX CKRと関連する他の活性の調節因子を同定するために行われる。
【００５２】
CCX CKRが細胞増殖において果たす役割を考えると、細胞増殖性疾患を治療する方法もまた提供される。細胞増殖を抑制する（例えば、特定の癌を治療する）ために特定の治療法が提供され、また他の方法を利用して所望の細胞増殖（例えば、所望の部位における血管新生および骨髄移植）を誘導することができる。細胞培養において細胞もしくは組織の細胞増殖を促進する方法、または人工組織（例えば、器官）を生成する方法もまた開示する
【００５３】
III. CCX CKR活性の調節因子のスクリーニング
A. 概括
上記のように、ならびに実施例3および4で以下に詳述するように、CCX CKRは自己活性のあるケモカイン受容体であることが見出された。したがって、この受容体は、リガンドが存在しなくても顕著な基礎活性または構成的活性を示す。得られたこの結果から、SLC、ELC、およびTECKなどのCCX CKRの同族リガンドはCCX CKRの応答を微調整する上で役割を担い、受容体活性を、細胞におけるCCX CKR発現と単に関連した基礎レベルの活性に対していくらか増減させることが示唆される。CCX CKRは自己活性があるため、CCX CKR活性を調節し得る化合物は、CCX CKRリガンドの非存在下で同定することができる。むしろ、被験化合物をCCX CKRを発現している細胞と接触させ、自己活性レベルに及ぼす影響を決定することができる。よって、SLC、ELC、およびTECKなどのCCX CKRリガンドは受容体の活性を誘発するのに必要ではないため、アッセイ組成物はこれらのリガンドを実質的に含まないかまたは完全に含まなくてよい。CCX CKRリガンド濃度に関連して使用する場合の「実質的に含まない」という用語は、一般に、対照（例えば、リガンドを除外したアッセイ）と比較してCCX CKR活性の検出可能な変化が認められないように、リガンド濃度が十分に低いこと、または慣用的な検出手段（例えば、リガンドに関する免疫学的アッセイ）によって、検出可能なレベルのリガンドが検出され得ないことを意味する。CCX CKRリガンドを実質的に含まない溶液中では、典型的に、リガンド濃度は10 pH未満、他の例では1 pH未満である。典型的にケモカイン受容体は自己活性をもたないため、この種類のアッセイ法は、これらの受容体の調製因子に関する慣用的アッセイ法とは異なる。したがって、アッセイは一般にはケモカイン受容体のリガンドの存在下で行われる。このように典型的なケモカイン受容体のアゴニストまたはアンタゴニストに関する慣用的アッセイ法と異なり、アッセイは受容体リガンドの非存在下で行うことができる。
【００５４】
CCX CKR発現レベルはいくつかの細胞種の細胞増殖において重要であるため、いくつかのスクリーニングアッセイは、細胞増殖の調節因子である化合物を同定するために行われる。そのような化合物は細胞増殖を抑制する候補化合物であって、望ましくない細胞増殖（例えば、癌または腫瘍形成）の抑制において有用である可能性がある。他のスクリーニングアッセイは、CCX CKRが細胞増殖を誘導する能力を促進する化合物を同定するために行われ得る。そのような化合物は、所望の細胞増殖（例えば、骨髄移植、血管新生、および組織または器官形成）を活性化するために利用され得る。しかし、他の活性をアッセイすることも可能である。そのような活性の例は、細胞シグナル伝達、pH変化、代謝率、キナーゼカスケード、遺伝子発現、または細胞遊走である。
【００５５】
スクリーニングアッセイで使用する細胞は、天然でCCX CKRを発現する細胞またはCCX CKRを発現するように形質転換された細胞を用いて行い得る。そのような形質転換体は、当業者に周知であり、かつ以前に考察されている慣用的な組換え技術を用いて調製することができる（例えば、国際公開公報第01/27146号を参照のこと）。形質転換細胞を利用する場合には、細胞に、CCX CKRをコードするベクターまたは発現カセットを安定にまたは一過性にトランスフェクションする。利用し得る細胞種の具体例には、HEK293細胞、CHO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、COS細胞などが含まれる。
【００５６】
細胞は、被験物質がCCX CKRに結合する条件下で、および被験物質がCCX CKRに結合するのに十分な時間、被験物質と接触させる。次いで、被験物質が細胞増殖に及ぼす影響を判定する。細胞増殖活性に及ぼす影響は、場合によっては、過去の対照であってよい対照活性レベル（すなわち、1回の測定の基づき得る、しかしより典型的には平均値または他の統計的値に基づき得る、この被験物質を用いて本アッセイよりも前に決定された活性レベル）、またはこの被験物質を用いて本アッセイと同時にかつ平行して行われる対照アッセイと比較して決定される。対照は、例えば、被験物質の非存在下で行われるおよび/またはCCX CKRを発現しない細胞を用いて行われるアッセイであってよい。
【００５７】
B. 例示的な細胞増殖アッセイ法
細胞増殖アッセイは様々な異なる方法で行うことができ、これには例えば：実際の細胞計数、コロニー形成アッセイ、代謝活性の測定、DNA合成の測定、細胞周期を制御する分子のレベルの測定（例えば、CDKキナーゼアッセイ）が含まれる。これらのアプローチの概要を以下に示す。これらアプローチのいくつかの一般的総説に関しては、例えば、すべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Roche Molecular Biochemicals, 「Apoptosis and Cell Proliferation」、2nd Revised edition, pages 66-114を参照されたい。
【００５８】
1つのアプローチでは、単純に、血球計などの細胞計数装置を用いて細胞数を計数する（例えば、実施例4を参照）。コロニー形成アッセイアプローチでは、所定数の細胞を適切な培地上にプレーティングし、所定時間後に形成されたコロニー数を決定する。コロニー形成アプローチは、多数の試料について、および2、3回分裂してその後静止状態になる細胞について行うにはいくらか厄介であると考えられる。
【００５９】
代謝活性を測定するための多くの異なる方法が利用できる。1つのアプローチでは、細胞代謝過程において切断されて、着色ホルマザン産物を形成するテトラゾリウム塩（例えば、MTT、XTT、またはWST-1）と共に細胞をインキュベートする。この種のアッセイ法に関するさらなる手引きは、Cook, J. A. and Mitchell, J. B. (1989) Anal. Biochem. 179: 1；Roehm, N.W. et al. (1991) J. Immunol. Methods 142: 257；Slater, T.F., et al. (1963) Biochem. Biophys. Acta 77: 383；Berridge, M.V. and Tan, A.S. (1993) Arch. Biochem. Biophys. 303:474；Cory, A.H., et al. (1991) Cancer Commun. 3:207；Jabbar, S.A.B., et al. (1989) Br. J. Cancer 60: 523；およびScudiero, E.A., et al. (1988) Cancer Res. 48, 4827によって提供されており、これらはそれぞれ、すべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。このようなアッセイを行うための種々のキットは、Roche Molecular Biochemicalsから入手することができる。このクラスの他のアッセイ法は、ATPの測定を含み、ルシフェラーゼ活性を介して形成される発光の形成を検出する段階を含む。このようなアッセイは、Perkin Elmerから市販されている（例えば、ATPlite（商標） Assayキットを参照のこと）。
【００６０】
細胞増殖中にはDNAが複製されるため、DNA複製の測定を提供するアッセイ法もまた細胞増殖の有用な測定を提供する。この種のアッセイ法は典型的に、標識DNA前駆物質を細胞培養液に添加する段階を含む。分裂しようとしている細胞は、そのDNA中に標識ヌクレオチドを取り込む。いくつかのアプローチでは、トリチウム標識チミジン（[3H]-TdR）を利用し、液体シンチレーション計測によって、取り込まれたトリチウム標識チミジンの量を測定する。放射性化合物の使用を避けるため、他のアッセイ法では、チミジンとまさに同様にDNAに取り込まれるチミジン類似体5-ブロモ-2'デオキシ-ウリジン（BrdU）を利用する。取り込まれたBrdUは、BrdUに対して産生されたモノクローナル抗体を利用する細胞免疫測定法により、定量的に検出することができる。このようなアッセイを行うための市販のキットは、Roche Molecular Biochemicalsを含む多くの供給源から入手することができる。
【００６１】
他のアッセイ法は、特定の細胞周期抗原が増殖細胞に特異的であるという事実を利用している。細胞周期の制御に関与する分子は、それらの活性によって、または（例えば、ウェスタンブロット法、ELISA法、または免疫組織化学法により）それらの量を定量することによって検出することができる。測定し得る、増殖細胞のみに存在する核内抗原の例には、これらに限定されるわけではないが、増殖性細胞核抗原（PCNA）、Ki-67、およびトポイソメラーゼII-α(Ki-S1)が含まれる。このようなアッセイを行うための市販のキットは、Roche Molecular Biochemicalsを含む様々な供給業者から入手することができる。
【００６２】
C. 被験物質
種々の異なる種類の物質を、CCX CKRリガンドの存在下または非存在下において、CCX CKR活性を調節する能力についてスクリーニングすることができる。物質はアゴニストであってもアンタゴニストであってもよい。物質には、例えば、抗体、ペプチドもしくは小分子、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、天然に存在する分子、または製薬産業によって合成された化合物の既存のレパートリーに由来する分子が含まれ得る。段階的な様式で合成され得る多くの種類の化合物について、コンビナトリアルライブラリーを作製することができる。このような化合物としては、ポリペプチド、βターン模倣物、多糖類、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環式化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーN置換グリシン、およびオリゴカルバメートが挙げられる。化合物の大きいコンビナトリアルライブラリーは、国際公開公報第95/12608号、国際公開公報第93/06121号、国際公開公報第94/08051号、第95/35503号、および国際公開公報第95/30642号に記載されているコード化合成ライブラリー（ESL）法によって構築され得る。ペプチドライブラリーはまた、ファージディスプレイ法によって作製され得る。例えば、Devlin、国際公開公報第91/18980号を参照されたい。スクリーニングする化合物はまた、National Cancer Institute's Natural Product Repository、メリーランド州、ベテスダから入手することができる。スクリーニングする物質はまた、アゴニスト抗体であってもアンタゴニスト抗体であってもよい。ライブラリーを調製する方法の一般的な総説は、Dolle and Nelson（J. Combinatorial Chemistry 1: 235-282 (1999)）によって提供されている。
【００６３】
スクリーニングし得る化合物の1つのクラスは、CCK CKRリガンド、SLC、ELC、およびTECKの結合ドメインの構造に基づく化合物である。例えば、これらのリガンドのN末端またはC末端に由来する合成ペプチドは、CCK CKR機能の調節因子として作用する可能性がある。
【００６４】
スクリーニングし得る化合物の別のクラスは、これらのポリペプチドリガンド、アゴニスト、およびアンタゴニストの模倣物である。「模倣物」および「ペプチド模倣物」という用語は、CCX CKRポリペプチドリガンド、アゴニスト、またはアンタゴニストと実質的に同じ構造的および/または機能的特徴を有する合成化合物を指す。模倣物は、アミノ酸の合成非天然類似体から完全に構成され得るか、または一部天然ペプチドアミノ酸および一部非天然アミノ酸類似体のキメラ分子であってよい。模倣物はまた、任意の量の天然アミノ酸保存的置換を、このような置換が模倣物の構造および/または活性を実質的に変えない限り、取り込み得る。ペプチド模倣物組成物は、典型的に以下の3つの構造群に由来する非天然構造成分の任意の組み合わせを含み得る：a) 天然アミド結合（「ペプチド結合」）連結以外の残基連結基；b) 天然に存在するアミノ酸残基の代わりの非天然残基；またはc) 二次構造模倣を誘導する、すなわち、二次構造（例えば、βターン、γターン、βシート、αヘリックス高次構造など）を誘導するかまたは安定化する残基。
【００６５】
ポリペプチドは、その残基のすべてまたはいくつかが天然のペプチド結合以外の化学的手段によって結合される場合に模倣物として特徴づけられ得る。個々のペプチド模倣物残基は、ペプチド結合、他の化学結合、またはカップリング手段（例えば、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能性マレイミド、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、またはN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）など）によって結合され得る。伝統的なアミド結合（「ペプチド結合」）連結に代わり得る結合基には、例えば、ケトメチレン（例えば、-C(=O)-NH-に対する-C(=O)-CH2-）、アミノメチレン（CH2-NH）、エチレン、オレフィン（CH=CH）、エーテル（CH2-O）、チオエーテル（CH2-S）、テトラゾール（CN4-）、チアゾール、レトロアミド、チオアミド、またはエステルが含まれる（例えば、Spatola (1983), Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, 「Peptide Backbone Modifications,」 Marcell Dekker, NYを参照されたい）。
【００６６】
ポリペプチドはまた、天然に存在するアミノ酸残基の代わりにすべてまたはいくつかの非天然残基を含むことによって、模倣物として特徴づけられ得る。非天然残基は、科学文献および特許文献において十分に記載されている。
【００６７】
模倣物はまた、構造的な模倣物残基、特に、βターン、βシート、αヘリックス構造、γターンなどのような二次構造を誘導するかまたは模倣する残基を含有する組成物を含み得る。例えば、ペプチド内での、天然アミノ酸残基の、D-アミノ酸；N-α-メチルアミノ酸；C-α-メチルアミノ酸；またはデヒドロアミノ酸による置換は、βターン、γターン、βシート、またはαヘリックス高次構造を誘導または安定化し得る。βターン模倣物構造は、例えば、Nagai (1985) Tet. Lett. 26:647-650；Feigl (1986) J. Amer. Chem. Soc. 108:181-182；Kahn (1988) J. Amer. Chem. Soc. 110:1638-1639；Kemp (1988) Tet. Lett. 29: 5057-5060；Kahn (1988) J. Molec. Recognition 1:75-79によって記載されている。βシート模倣物構造は、例えば、Smith (1992) J. Amer. Chem. Soc. 114:10672-10674によって記載されている。例えば、シスアミド代用物、1,5-二置換テトラゾールによって誘導されるVI型βターンは、Beusen (1995) Biopolymers 36:181-200によって記載されている。アミド結合の代用物としてのポリメチレン単位を生成するためのアキラルなωアミノ酸残基の取り込みは、Banerjee (1996) Biopolymers 39:769-777によって記載されている。
【００６８】
当業者は、個々の合成残基およびポリペプチド組み込み模倣物が、種々の手順および方法論を使用して合成され得ることを認識すると考えられ、これらは、科学文献および特許文献、例えば、Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman et al. (Eds) John Wiley & Sons, Inc., NYにおいて十分に記載されている。ポリペプチド組み込み模倣物はまた、例えば、Di Marchi et al.、米国特許第5,422,426号によって記載されているように、固相合成手順を使用して作製され得る。本発明の模倣物はまた、コンビナトリアル方法論を使用して合成され得る。ペプチドおよびペプチド模倣物ライブラリーを作製するための種々の技術は周知であり、これには、例えば、マルチピン、ティーバッグ、およびスプリット-カップル-ミックス技術が含まれる；例えば、al-Obeidi (1998) Mol. Biotechnol. 9:205-223；Hruby (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1:114-119；Ostergaard (1997) Mol. Divers. 3:17-27；Ostresh (1996) Methods Enzymol. 267:220-234を参照されたい。
【００６９】
他の化合物は、同定済みであり、以下に示すCCX CKRのアゴニストおよびアンタゴニストに基づく。
【００７０】
（表１）CCX CKR機能の例示的な小分子調節因子
2007527710.tif 000003
【００７１】
スクリーニングし得る化合物のさらに別のクラスは、アゴニスト抗体およびアンタゴニスト抗体を含む抗体である。そのような抗体は、多くの方法に従って調製することができる。例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を作製する方法に関しては、Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY (1991)；Stites et al. (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (7th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA、およびその中で引用されている参考文献（「Stites」）；Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2d ed.) Academic Press, New York, NY (1986)；Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495-97；ならびにHarlow and Laneを参照されたい。これらの技法は、ファージまたは同様のベクターにおける組換え抗体ライブラリーから抗体を選択することによる抗体調製を含む。Huse et al., 1989, Science 246:1275-81；およびWard et al., 1989, Nature 341:544-46を参照されたい。
【００７２】
ヒト抗体を調製する方法については、Queen, et al., 1989, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029；米国特許第5,563,762号；第5,693,761号；第5,585,089号；および第5,530,101号を参照されたい。ヒト化に用いられるヒト抗体配列は、天然に存在するヒト抗体の配列であってもよいし、またはいくつかのヒト抗体の共通配列であってもよい。Kettleborough et al., Protein Engineering 4:773 (1991)；Kolbinger et al., Protein Engineering 6:971 (1993)を参照されたい。CCK CKRに対するヒト化モノクローナル抗体はまた、ヒト免疫系の要素を有するトランスジェニック動物を用いて作製することも可能である（例えば、米国特許第5,569,825号；第5,545,806号；第5,693,762号；第5,693,761号；および第5,7124,350号を参照されたい）。
【００７３】
CCX CKRと結合する抗体はまた、ファージディスプレイ技術を用いて作製することもできる（例えば、Dower et al.、国際公開公報第91/17271号、およびMeCafferty et al.、国際公開公報第92/01047号を参照のこと）。これらの方法では、メンバーがその外表面上に異なる抗体を提示するファージのライブラリーを作製する。抗体は一般に、Fv断片またはFab断片として提示される。
【００７４】
抗体は、調製物中に存在するポリペプチド分子の少なくとも約80%、より頻繁には少なくとも約90%、さらにより頻繁には少なくとも約95%、最も頻繁には少なくとも約99%またはそれ以上が同じ抗原（例えば、CCX CKRポリペプチド）と特異的に結合する場合に、実質的に純粋である。薬学的に使用するには、少なくとも約90〜95%均一性の抗CCX CKR免疫グロブリンが好ましく、98〜99%またはそれ以上の均一性が最も好ましい。
【００７５】
IV. 細胞増殖の調節/組織形成
細胞においてCCX CKR発現を誘導し、それによって細胞増殖を促進することによって、治療で使用するために細胞または組織を形成することができる。一般に、CCX CKRを発現する細胞は、慣用的なインビトロ細胞培養法または組織工学法を用いて培養する。組織工学において利用し得る種々のバイオリアクターは、例えば、米国特許第6,642,019号；第6,218,182号；第6,080,581号；第5,888,807号；および第5,763,266号に記載されている。
【００７６】
次いで、そのようなバイオリアクターまたは細胞培養から回収した細胞を、患者に移すこと、または組織の再生が必要な部位において患者に導入することができる。その後、移植した細胞は、患者内でさらなる増殖および/または分化を起こし得る。エクスビボ細胞療法は、例えば、Mayhew et al., (1998) Tissue Eng. 4:325-344およびWakitani et al. (1998) Tissue Eng. 4:429-444 (1998)に記載されている。
【００７７】
または、細胞を組織のパッチとして培養することができ、次いでこれを患者に移すかまたは移植する。このような方法では、細胞は場合によって、組織の発達を支持する足場上で培養する。特定の用途において利用し得る例示的な足場には、例えば、米国特許第6,642,363号；第6,623,959号；第6,586,246号；第6,534,560号、第6,514,515号；第6,454,811号；および第6,306,424号に記載されるものが含まれる。
【００７８】
特定の方法は、遺伝子治療に適した核酸配列で異種細胞を形質転換する段階を含む。次いで、得られた異種細胞を患者に導入する。他の方法は、CCX CKR活性を促進するアゴニストを導入し、それによって細胞増殖を活性化させる段階を含む。
【００７９】
このような治療で使用するために培養する細胞は、種々の異なる種類の細胞であってよい。一般に、細胞は、CCX CKRを天然で発現する細胞である。以下の実施例1に記載するように、このような細胞には、これらに限定されるわけではないが、樹状細胞、脾臓細胞、リンパ球、ならびに腎臓細胞、心臓細胞、嗅上皮細胞などの様々な非リンパ球が含まれる。
【００８０】
組織形成法の有用性の1つの具体例として、CCX CKR活性および/または発現を増加させることによって、骨髄細胞の増殖を促進することができる。別の例では、CCX CKR活性および/または発現を増加させることによって、心臓細胞または心筋細胞の増殖が促進される。
【００８１】
V. 治療法
A. 概括
CCX CKRが特定の細胞種の細胞増殖において重要な役割を果たすという知見は、CCX CKR発現および/または活性を促進または阻害する治療法を用いて、所望の結果に応じて細胞増殖を制御できることを意味する。したがって、この方法は一般に、細胞増殖性疾患を有する患者に、CCX CKR発現および/または活性を促進または阻害する薬学的組成物の治療有効量または予防有効量を投与する段階を含む。
【００８２】
例えば、CCX CKRが望ましくない細胞増殖をもたらす場合（例えば、特定の癌または腫瘍において）、CCX CKRの発現または活性を阻害する物質を含む薬学的組成物を投与することができる。そのような阻害剤の例には、CCX CKR活性のアンタゴニスト（阻害剤）、アンチセンス分子、リボザイム、三重鎖ポリヌクレオチド、および低分子阻害RNA（siRNA）が含まれるが、これらについては以下に詳述する。アンタゴニストは、例えば、小分子、ポリペプチド、ポリペプチド模倣物、およびアンタゴニスト抗体であってよい。一方、所望の細胞増殖を促進するためにCCX CKR細胞増殖活性を上昇させるべき場合には（例えば、骨髄移植または血管新生において）、薬学的組成物はCCX CKRの発現または活性を促進する物質を含む。これは、例えば、遺伝子治療によってまたはアゴニストを投与することによって達成され得る。適切なアゴニストには、これらに限定されるわけではないが、小分子アゴニスト、ポリペプチドアゴニストおよびその模倣物、ならびにアゴニスト抗体が含まれる。
【００８３】
CCX CKR活性または発現が阻害されようとする疾患の具体例には、様々な種類の癌が含まれる。例えば、腎臓、心臓、肝臓、および脳でCCX CKRが発現されていることが見出されたならば、CCX CKR活性または発現を阻害する組成物を用いて、これらの部位の癌または腫瘍を治療することができる。またCCX CKRはいくつかの種類の白血球でも発現されるため、このような細胞における望ましくない細胞増殖と関連した疾患もまた治療が可能であり、このような疾患には、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、および白血病が含まれる。
【００８４】
CCX CKRが細胞増殖に関与することはまた、疾患に血管新生および新血管新生がかかわる疾患（例えば、腫瘍性疾患、網膜症、および黄斑変性病）を治療するために、阻害剤を投与できることを意味する。CCX CKRがまたマウスの心臓において高度に発現されているという証拠を考えると（Townson JR, Nibbs RJ. (2002), Eur. J. Immunol. 32:1230-41）、CCX CKRを阻害する組成物はまた、望ましくない細胞増殖と関連した種々の心疾患を治療するために使用できる。心筋梗塞などの特定の状態は、心臓組織の喪失をもたらす。CCX CKR発現または機能の促進により、心臓組織の生存および組織置換を増強することができる。
【００８５】
細胞増殖の増強が望ましい場合には、投与する組成物は、CCX CKRの発現または活性を促進する物質を含む。そのような状況の具体例には、組織修復、創傷治癒、CCX CKRが発現されている組織における血管新生の誘導、骨髄移植における骨髄の増殖が含まれる。
【００８６】
本方法は、種々の異なる動物対象/患者の治療に使用し得る。最も典型的には、対象はヒトである。しかし他の例では、対象は、非ヒト霊長動物（例えば、サル、チンパンジー、およびゴリラ）または別の哺乳動物（ウサギ、ウシ、ラット、またはマウスなど）である。そのような動物はまた、ヒト治療のモデル系としても有用であると考えられる。
【００８７】
B. CCX CKR活性または発現の阻害
種々の異なる種類の化合物を利用して、CCX CKR活性または発現を阻害することができる。これは、治療が細胞増殖の減少を必要とする場合に有用である。阻害剤の例には、CCX CKRに対して特異性を有するアンチセンスポリヌクレオチド、三重鎖オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、リボザイム、ならびにsiRNAが含まれる。これらについて、以下に、より詳細に考察する。
【００８８】
1. アンチセンスポリヌクレオチド
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを用いて、CCX CKR遺伝子の発現を阻害し、それによって細胞増殖を抑制することができる。本発明のいくつかの治療法は、インビボの生理学的な条件下でCCX CKR活性を阻害または促進するために機能し、治療効果に十分な期間、そのような条件下で比較的安定であるオリゴヌクレオチドを投与する段階を含む。ポリヌクレオチドは、そのような安定性を付与するため、および所望の組織、器官、または細胞へのオリゴヌクレオチドの標的送達を促進するために改変することができる。
【００８９】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、CCX CKRをコードするmRNAまたはCCX CKR遺伝子から転写されるmRNAの配列に特異的にハイブリダイズする、少なくとも約10塩基、典型的には少なくとも12または14塩基で、最大約3000までの連続したヌクレオチドのアンチセンス配列を含む。さらに頻繁には、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、約12〜約50ヌクレオチド長または約15〜約25ヌクレオチド長である。一般に、アンチセンスポリヌクレオチドは、安定な二重鎖を形成するのに十分長くあるべきであるが、必要に応じて、インビボで送達するのに、送達の様式に応じて十分短くあるべきである。標的配列に特異的にハイブリダイズするのに必要なポリヌクレオチドの最低の長さは、いくつかある要因の中でも特にG/C含量、ミスマッチ塩基の位置（もしあれば）、標的ポリヌクレオチドの集団に対する配列の特異性の程度、およびポリヌクレオチドの化学的性質（例えば、メチルホスホン酸骨格、ペプチド核酸、ホスホロチオエート）などのいくつかの要因に依存する。
【００９０】
一般に、特異的なハイブリダイゼーションを確実にするため、アンチセンス配列は標的CCX CKR mRNA配列と実質的に相補的である。特定の態様において、アンチセンス配列は標的配列と厳密に相補的である。しかし、アンチセンスポリヌクレオチドはまた、CCX CKR RNAまたはその遺伝子に相当する関連標的配列への特異的結合が、ポリヌクレオチドの機能特性として保持される限り、ヌクレオチド置換、付加、欠失、トランジション、転位、もしくは改変、または他の核酸配列もしくは非核酸部分を含み得る。
【００９１】
1つの態様において、アンチセンス配列は、CCX CKR mRNAの比較的接近可能な（例えば、二次構造を比較的欠く）配列と相補的である。これは、例えば、MFOLDプログラム（Genetics Computer Group、ウィスコンシン州、マディソン）を使用して推定RNA二次構造を分析すること、および当技術分野で周知のようにインビトロまたはインビボで試験することによって決定し得る。有効なアンチセンス組成物を同定するための別の有用な方法では、オリゴヌクレオチドのコンビナトリアルアレイを使用する（例えば、Milner et al., 1997, Nature Biotechnology 15:537を参照のこと）。
【００９２】
本発明はまた、アンチセンス配列のほかに（すなわち、抗CCX CKRセンス配列のほかに）さらに配列を有するアンチセンスポリヌクレオチドを提供する。この場合、アンチセンス配列は、より長い配列のポリペプチド内に含まれる。別の態様において、ポリヌクレオチドの配列は、アンチセンス配列から本質的になるかまたはアンチセンス配列である。
【００９３】
アンチセンス核酸（DNA、RNA、改変、類似体など）は、核酸を生成するための任意の適切な方法、例えば、化学合成および本明細書中に開示する組換え法を使用して作製することができる。1つの態様において、例えば、本発明のアンチセンスRNA分子は、新規な化学合成によって、またはクローニングによって調製され得る。例えば、CCX CKR mRNAにハイブリダイズするアンチセンスRNAは、プロモーターに機能的に連結された逆方向のCCX CKR DNA配列を、ベクター（例えば、プラスミド）に挿入（連結）することによって作製され得る。プロモーター、ならびに好ましくは終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルが適切に位置する場合、非コード鎖に対応する挿入配列鎖は、転写されて、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドとして作用する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、無細胞抽出物、細胞、ならびに哺乳動物およびヒトを含めた動物においてCCX CKR活性を阻害するために使用することができる。
【００９４】
アンチセンスポリヌクレオオチドに関する一般的な方法については、ANTISENSE RNA AND DNA, (1988), D.A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYを参照されたい。Dagle et al., 1991, Nucleic Acids Research, 19:1805もまた参照されたい。アンチセンス療法の総説については、例えば、Uhlmann et al., Chem. Reviews, 90:543-584 (1990)を参照されたい。
【００９５】
2. 三重鎖オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド
本発明は、（例えば、CCX CKR RNAの折りたたまれた領域またはCCX CKR遺伝子内の）二本鎖または二重鎖CCX CKR核酸と結合し、三重らせん含有核酸または「三重鎖」核酸を形成するオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド（例えば、DNA、RNA、PNAなど）を提供する。三重鎖らせんの形成は、例えば、CCX CKR遺伝子の転写を妨げ、それによって細胞中のCCX CKRを減少させるかまたは除去することにより、CCX CKR発現の阻害をもたらす。任意の特定の機構によって束縛されることを意図しないが、三重鎖らせん対形成は、二重らせんが、ポリメラーゼ、転写因子、または制御分子の結合を起こすように十分開く能力を損なうと考えられる。
【００９６】
本発明の三重鎖オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、三重らせん形成の塩基対形成法則（例えば、Cheng et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:15110；Ferrin and Camerini-Otero, 1991, Science 354:1494；Ramdas et al., 1989, J. Biol. Chem. 264:17395；Strobel et al., 1991, Science 254:1639；およびRigas et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:9591を参照のこと；それぞれ参照により本明細書に組み入れられる）ならびにCCX CKR mRNAおよび/または遺伝子配列を使用して構築される。典型的に、本発明の三重鎖形成オリゴヌクレオチドは、CCX CKR RNAまたは遺伝子の特定の配列と「相補的な」約10〜少なくとも約25のヌクレオチドまたはそれよりも長い特定の配列を含む（すなわち、安定な三重らせんを形成するのに十分長いが、必要に応じて、インビボ投与するのに、送達の様式に応じて十分短い）。この関連において、「相補性」は、安定な三重らせんを形成し得ることを意味する。1つの態様において、オリゴヌクレオチドは、CCX CKR遺伝子の制御領域（例えば、CCX CKR5'隣接配列、プロモーター、およびエンハンサー）と、または転写開始部位（例えば、転写開始部位の-10〜+10の間）と特異的に結合するように設計される。三重鎖DNAを使用する最近の治療法の進歩の総説については、いずれも参照により本明細書に組み入れられる、Gee et al., Huber and Carr, 1994, MOLECULAR AND IMMUNOLOGIC APPROACHES, Futura Publishing Co, Mt Kisco NY 、およびRininsland et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5854を参照されたい。
【００９７】
3. リボザイム
本発明はまた、CCX CKR活性の阻害に有用なリボザイムを提供する。本発明のリボザイムは、CCX CKR mRNAと結合し、これを特異的に切断して不活化する。有用なリボザイムは、CCX CKR mRNAと相補的な5'末端および3'末端配列を含み得り、本明細書中に開示するCCX CKR mRNA配列に基づいて当業者によって操作され得る（国際公開公報第93/23572、前記を参照のこと）。本発明のリボザイムには、グループIイントロンリボザイム（Cech, 1995, Biotechnology 13:323）の特徴を有するリボザイム、およびハンマーヘッドリボザイム（Edgington, 1992, Biotechnology 10:256）の特徴を有するその他のリボザイムが含まれる。
【００９８】
本発明のリボザイムには、GUA、GUU、およびGUCなどの切断部位を有するリボザイムが含まれる。本発明のCCX CKR活性のリボザイム媒介性阻害に最適な他の切断部位には、いずれも参照により本明細書に組み入れられる国際公開公報第94/02595号および国際公開公報第93/23569号に記載されている部位が含まれる。切断部位を含む、標的CCX CKR遺伝子の領域に対応する15〜20リボヌクレオオチド長の短いRNAオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドをより望ましくし得る二次構造特性について評価し得る。切断部位の適切性はまた、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへの到達性を試験することにより、または当技術分野で周知の標準的な手順に従ってインビトロリボザイム活性について試験することにより、評価することができる。
【００９９】
参照により本明細書に組み入れられるHu et al.、国際公開公報第94/03596号によって記載されているように、アンチセンス機能とリボザイムの機能は、単一のオリゴヌクレオチド中で組み合わることができる。さらに、リボザイムは、本発明の例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの説明に関連して上記したように、1つまたは複数の改変ヌクレオチドまたはヌクレオチド間の改変連結を含み得る。
【０１００】
1つの態様において、本発明のリボザイムはインビトロで作製され、細胞または患者に導入される。別の態様では、標的細胞中でリボザイムを発現させるために、エクスビボまたはインビボで遺伝子治療法が用いられる。
【０１０１】
4. 二本鎖RNA阻害/siRNA
CCX CKRの発現を阻害するには、二本鎖RNA（dsRNA）阻害法もまた使用できる。このような方法で利用されるRNAは、dsRNAの少なくとも1つの領域がCCX CKR遺伝子の領域と実質的に同一であるように設計される；場合によっては、領域はCCX CKR遺伝子と100%同一である。哺乳動物で使用するには、dsRNAは典型的に約19〜30ヌクレオチド長である（すなわち、低分子阻害RNAが利用される（siRNA））。dsRNAiおよびsiRNAを実施するのに有用な方法および組成物は、例えば、国際公開公報第98/53083号；国際公開公報第99/32619号；国際公開公報第99/53050号；国際公開公報第00/44914号；国際公開公報第01/36646号；国際公開公報第01/75164号；国際公開公報第02/44321号；および公開された米国特許出願第10/195,034号で考察されており、これらはそれぞれ、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０２】
5. アンタゴニスト抗体
CCX CKRの活性を妨害する（例えば、リガンド結合を阻害する）、CCX CKRに対する結合特異性を有する抗体もまた、遺伝子タンパク質活性を阻害するために利用することができる。そのような抗体は、以下に記載する方法に従って、全長タンパク質またはその断片化ら作製し得る。CCX CKRと特異的に結合する抗体を調製する方法は、国際公開公報第01/27146号に以前に記載されており、また以下にも記載する。
【０１０３】
C. CCX CKR活性および/または発現の促進
細胞増殖が所望の結果である場合、CCX CKRが発現されている組織においてCCX CKR活性または発現レベルを促進することにより、有益な細胞増殖をもたらすことができる。これらの目的は、例えば、CCX CKRの発現レベルまたはCCX CKRタンパク質レベルを増加させることによって達成し得る。1つのアプローチでは、以下に記載するような薬学的組成物の形態のCCX CKRタンパク質を、個体に投与する。または、CCX CKRの活性はまた、CCX CKRのアゴニストを含む薬学的組成物を導入することによって、発現レベルの増加がなくとも増加させることができる。そのようなアゴニストは、小分子、ポリペプチド、模倣物、またはアゴニスト抗体であってよい。
【０１０４】
D. 遺伝子治療
遺伝子治療は、CCX CKRは発現レベルを増加または減少させるための別の選択肢である。遺伝子治療とは、ポリヌクレオチドが伝達された（典型的に）哺乳動物細胞に対して医学的に有用な表現型効果をもたらす、通常であれば外因性のポリヌクレオチドの導入を指す。場合によって、遺伝子治療は、(i) CCX CKR活性を増加させるためにCCX CKR遺伝子産物を発現する；(ii) CCX CKR遺伝子またはmRNA配列を有する核酸（例えば、CCX CKR活性を減少させるためのアンチセンスRNAなど）を発現する、(iii) その他の方法でCCX CKR遺伝子産物の発現に影響を及ぼすポリペプチドまたはポリヌクレオチド（例えば、CCX CKR活性を減少させるための、CCX CKR mRNAに対するリボザイム）を発現する、または(iv) 内因性CCX CKR配列を置換または破壊する（例えば、それぞれ遺伝子置換および遺伝子ノックアウト）ベクターを細胞に導入する段階を含む。
【０１０５】
CCX CKR遺伝子治療に有用なベクターはウイルス性であっても非ウイルス性であってもよく、これには、本発明のCCX CKR発現系に関連して上記したベクターが含まれる。遺伝子治療ベクターがプロモーターおよび他の制御配列またはプロセシング配列を含み得ることは、当業者に理解されると考えられる（例えば、国際公開公報第01/27146号を参照）。通常、ベクターは、プロモーター、および任意にオリゴリボヌクレオチドの転写を駆動するのに役立つ（プロモーター配列内に含まれるいずれのものからも分離された）エンハンサー、ならびに必要に応じてエピソーム維持または染色体組込みおよび高レベルの転写を提供する他の制御エレメントを含む。遺伝子治療に有用なプラスミドは、選択マーカー、同定領域、および他の配列などといった他の機能的なエレメントを含み得る。さらなる配列は、細胞外および細胞内の両方で安定性を付与する上で、特定の器官、組織、または細胞集団にCCX CKRヌクレオチド配列（センスまたはアンチセンス）を標的送達する上で、細胞への侵入を媒介する上で、細胞の核への侵入を媒介する上で、および/または核DNA内での組込みを媒介する上で役割を担い得る。例えば、アプタマー様DNA構造または他のタンパク質結合部分部位を用いて、細胞表面受容体または受容体と結合する血清タンパク質に対するベクターの結合を媒介して、それによって細胞へのDNA伝達の効率を増大させることができる。他のDNA部位および構造を、核膜の受容体または核に侵入する他のタンパク質に直接的または間接的に結合し、これによってベクターの核取り込みを促進することができる。他のDNA配列は、取り込み効率に直接的または間接的に影響し得る。
【０１０６】
適切な遺伝子治療ベクターは、複製開始点を有しても有さなくてもよい。例えば、患者への投与前にベクターを増殖させるために、ベクターに複製開始点を含めることは有用である。しかし、ベクターが宿主染色体DNAに組み込まれるかまたは宿主mRNAもしくはDNAと結合するように設計される場合には、複製開始点は投与前に除去され得る場合が多い。
【０１０７】
記載のように、本発明はまた、遺伝子置換療法（すなわち、内因性CCX CKR遺伝子と組換え体遺伝子との相同組換えによる置換）のための方法および試薬を提供する。相同組換えによる組込みのために特別に設計されたベクターが使用され得る。相同組換えの最適化に重要な要因には、配列同一性の程度および染色体配列に対する相同性の長さが含まれる。組込みは転写的に活性のあるDNAにおいてより容易に起こるため、相同組換えを媒介する特定の配列もまた重要である。相同標的化構築物を構築するための方法および材料は、例えば、Mansour et al., 1988, Nature 336:348；Bradley et al., 1992, Bio/Technology 10:534に記載されている。米国特許第5,627,059号；第5,487,992号；第5,631,153号；および第5,464,764号もまた参照されたい。1つの態様において、遺伝子置換治療は、制御されるべきCCX CKR遺伝子の発現を調節する制御配列のすべてまたは一部を変更するまたは置換する段階を含む。
【０１０８】
本発明はまた、CCX CKR「遺伝子ノックアウト」（すなわち、組み換えによって作製されたベクターを使用する、内因性CCX CKR遺伝子の相同組換えによる欠失または破壊）のための方法および試薬を提供する。遺伝子ノックアウトにおいて、標的配列は、制御配列（例えば、CCX CKRプロモーター）またはRNAもしくはタンパク質コード配列であってよい。内因性遺伝子の発現を変更するための相同組換えの使用は、米国特許第5,272,071号、国際公開公報第91/09955号、国際公開公報第93/09222号、国際公開公報第96/29411号、国際公開公報第95/31560号、および国際公開公報第91/12650号に詳述されている。Moynahan et al., 1996, Hum. Mol. Genet. 5:875もまた参照されたい。
【０１０９】
遺伝子治療ベクターは、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで細胞または組織に導入することができる。エクスビボ治療では、同じ患者に自家移植するために、患者から採取され、クローンとして増殖させた細胞、例えば幹細胞にベクターを導入し得る（例えば、その開示が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,399,493号および第5,437,994号を参照されたい）。
【０１１０】
VI. 薬学的組成物
A. 組成物および投与形態
CCX CKR細胞増殖活性のアゴニストまたはアンタゴニストを含む治療組成物もまた提供する。これらは、CCX CKRと関連した細胞増殖活性を適切に調節するための、本明細書において記載する治療法で利用し得る。
【０１１１】
アゴニストまたはアンタゴニストは、無菌条件下で、治療すべき宿主に直接投与され得る。しかし、活性成分は単独で投与することが可能であるが、薬学的製剤として提示することが好ましい場合が多い。製剤は典型的に、少なくとも1つの活性成分を、1つまたは複数の許容可能なその担体と共に含む。担体はそれぞれ、他の成分と適合し、患者にとって有害でないという意味において、薬学的にも生理学的にも許容可能であるべきである。例えば、生物活性物質は、半減期などの安定性特性または薬理学的特性を増強するために、投与前にオボアルブミンまたは血清アルブミンなどの担体タンパク質と複合化し得る。さらに、本発明の治療製剤は、他の化学療法薬または化学予防薬と組み合わせること、またはそれらと共に使用することができる。
【０１１２】
治療製剤は、薬学の分野で周知の任意の方法によって調製し得る。例えば、Gilman et al (eds.) (1990) Goodman and Gilman's；The Pharmacological Bases of Therapeutics (8th eds.) Pergamon Press；および(1990) Remington's Pharmaceutical Sciences (17th eds.) Mack Publishing Co., Easton，P.a.；Avis et al (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker，N.Y.；Lieberman et al (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets Dekker, N.Y.；およびLeiberman et al (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, N.Y.を参照されたい。
【０１１３】
治療すべき疾患および対象の状態に応じて、本発明の化合物は、経口、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、ICV、嚢内注射もしくは注入、皮下注射、または移植）、吸入スプレー、経鼻、膣内、直腸、舌下、または局所投与経路により投与し得り、また各投与経路に適切である慣用的な非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバント、および媒体を含有する適切な投与単製剤として、単独でまたは共に製剤化し得る。活性成分を含有する薬学的組成物は、例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性もしくは油性懸濁液、分散性粉末もしくは顆粒、乳剤、硬カプセル剤もしくは軟カプセル剤、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤のように、経口使用に適した形態であってよい。経口使用を目的とした組成物は、薬学的組成物を製造するために、当技術分野で周知の任意の方法に従って調製され得り、そのような組成物は、薬学的に洗練されかつ口当たりのよい調製物を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤、および保存剤からなる群より選択される1つまたは複数の薬剤を含有し得る。錠剤は、錠剤の製造に適した非毒性の薬学的に許容される賦形剤との混合物中に活性成分を含有する。これらの賦形剤は、例えば、不活性な希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウム）；造粒剤および崩壊剤（例えば、コーンスターチまたはアルギン酸）；結合剤（例えば、デンプン、ゼラチン、アラビアゴム）、および潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルク）であってよい。錠剤は被覆されていなくてもよいし、または、胃腸管において崩壊および吸収を遅延させ、それにより長期にわたって持続的な作用を提供するために、周知の技法によって被覆されていてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンなどの時間遅延物質を使用することができる。錠剤はまた、米国特許第4,256,108号；第4,166,452号；および第4,265,874号に記載される技法によって被覆して、制御放出のための浸透圧治療錠剤を形成することができる。
【０１１４】
経口使用のための製剤はまた、活性成分が不活性な固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、またはカオリンと混合された硬ゼラチンカプセルとして、または活性成分が水または油性媒体、例えば、ラッカセイ油、流動パラフィン、またはオリーブ油と混合された軟ゼラチンカプセルとして提示されてもよい。
【０１１５】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤との混合物中に活性材料を含有する。このような賦形剤は、懸濁剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシ-プロピルメチル-セルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル-ピロリドン、トラガカント、およびアラビアゴム）であり；分散剤または湿潤剤は、天然に存在するホスファチド（例えば、レシチン）、または酸化アルキレンと脂肪酸との縮合生成物（例えば、ポリオキシ-エチレンステアリン酸）、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）、またはエチレンオキシドと脂肪酸および無水ヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレエート）であってよい。水性懸濁液はまた、1つまたは複数の保存剤（例えば、エチルまたはn-プロピル、p-ヒドロキシ安息香酸）、1つまたは複数の着色剤、1つまたは複数の香味剤、および1つまたは複数の甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）を含み得る。
【０１１６】
油性懸濁液は、活性成分を植物油（例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、またはココナッツ油）中、または鉱油（例えば、流動パラフィン）中に懸濁することにより製剤化され得る。油性懸濁液は、増粘剤（例えば、蜜ろう、固形パラフィン、またはセチルアルコール）を含み得る。口当たりのよい経口調製物を提供するために、上記のような甘味剤および香味剤を添加してもよい。これらの組成物は、アスコルビン酸などの酸化防止剤の添加により保存され得る。
【０１１７】
水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散性粉末または顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁剤、および1つまたは複数の保存防腐剤との混合物中に活性成分を提供する。適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤は、既に上記したものにより例証される。さらなる賦形剤、例えば、甘味剤、香味剤、および着色剤もまた存在し得る。
【０１１８】
本発明の薬学的組成物はまた、水中油型乳剤の形態であってもよい。油相は、植物油（例えば、オリーブ油またはラッカセイ油）もしくは鉱油（例えば、流動パラフィン）またはこれらの混合物であってよい。適切な乳化剤は、天然に存在するゴム（例えば、アラビアゴムまたはトラガカントゴム）、天然に存在するホスファチド（例えば、ダイズ、レシチン）、ならびに脂肪酸および無水ヘキシトールから誘導されるエステルもしくは部分エステル（例えば、ソルビタンモノオレエート）、およびそのような部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）であってよい。乳剤はまた、甘味剤および香味剤も含み得る。
【０１１９】
シロップ剤およびエリキシル剤は、甘味剤（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、またはスクロース）を用いて製剤化され得る。このような製剤はまた、粘滑剤、保存、剤ならびに香味剤および着色剤を含んでもよい。
【０１２０】
薬学的組成物は、無菌の注射用水性懸濁液または油性懸濁液の形態であってもよい。この懸濁液は、上記した適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、周知の技術に従って製剤化され得る。この無菌注射用調製物はまた、例えば1,3-ブタンジオール溶液としてなど、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の無菌注射用溶液または懸濁液であってもよい。使用し得る許容可能な媒体および溶媒には、水、リンガー溶液、および等張塩化ナトリウム溶液が含まれる。さらに、無菌不揮発性油が、溶媒または懸濁媒体として簡便に用いられる。この目的では、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無菌不揮発性油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が注射剤の調製において有用である。
【０１２１】
本発明の化合物はまた、薬剤を直腸投与するための坐剤の形態で投与され得る。これらの組成物は、通常の温度では固体であるが直腸温度では液体であり、よって直腸内で溶解して薬剤を放出する適切な非刺激性賦形剤と薬剤とを混合することによって調製され得る。このような物質は、ココアバターおよびポリエチレングリコールである。
【０１２２】
局所使用には、本発明の化合物を含有するクリーム剤、軟膏剤、ゼリー、溶液、または懸濁液などが使用され得る。本明細書で使用する局所適用はまた、洗口剤およびうがい薬の使用を含むことが意図される。
【０１２３】
本発明の薬学的組成物および方法は、上記病理学的状態の治療において通常適用される、本明細書に記載されるような治療活性のある他の化合物をさらに含み得る。
【０１２４】
血管新生を調節するには、種々の特有の送達選択肢が利用可能である。特定の適用に応じて、組成物を対象の特定の部位または組織に標的化することができる。例えばいくつかの方法において、組成物は、虚血などの種々の疾患を治療するために、心臓の特定領域に送達される。一方、他の治療は、送達を特定領域に標的化しようとしない一般的な様式で組成物を投与する段階を含む。
【０１２５】
薬剤の送達を特定領域に局在化するためには、多くのアプローチが利用され得る。これらの方法のいくつかは、身体管腔または組織への送達を含む（例えば、米国特許第5,941,868号；第6,067,988号；第6,050,986号；および第5,997,509号；ならびに国際公開公報第00/25850号；国際公開公報第00/04928号；第99/59666号；および第99/38559号を参照されたい）。送達はまた、心筋内注射または投与によって達成され得る。このようなアプローチの例には、米国特許第6,086,582号；第6,045,565号；第6,056,969号；および第5,997,525号；ならびに国際公開公報第00/16848号；国際公開公報第00/18462号；国際公開公報第00/24452号；国際公開公報第99/49773号；および国際公開公報第99/49926号で考察されているアプローチが含まれる。局所投与の他の選択肢には、心膜内注射（例えば、米国特許第5,931,810号；第5,968,010号；および第5,972,013号を参照のこと）および血管周囲送達が含まれる。同様に、様々な経心筋的血管再建（TMR）チャネル送達アプローチも利用できる。これらの方法の多くは、血管再建を行うためにレーザーを利用する。このようなアプローチの考察は、例えば、米国特許第5,925,012号；第5,976,164号；第5,993,443号；および第5,999,678号に記載されている。他の選択肢には、動脈内および/または冠動脈内送達、例えば冠動脈注射（例えば、国際公開公報第99/29251を参照のこと）および血管内投与（例えば、米国特許第6,001,350号；第6,066,123号；および第6,048,332号；ならびに国際公開公報第99/31982号；国際公開公報第99/33500号；および国際公開公報第00/15285号を参照のこと）が含まれる。したがって、例えば、本明細書に記載の組成物を心筋に直接注射することも可能である。
【０１２６】
血管新生を調節するための組成物送達のさらなる選択肢には、静脈内または皮下投与、心室アクセス（例えば、米国特許第5,924,424号を参照のこと）、および組織工学（例えば、米国特許第5,944,754号を参照のこと）を使用する全身投与が含まれる。
【０１２７】
当業者に周知の他の送達方法には、米国特許第5,698,531号；第5,893,839号；第5,797,870号；第5,693,622号；第5,674,722号；第5,328,470号；および第5,707,969号に開示されている方法が含まれる。
【０１２８】
B. 投与量
CCX CKR増殖活性の調節を必要とする状態の治療または予防において、適切な投与量レベルは、一般に約0.001〜100 mg/kg患者体重/日であり、これは単回投与または複数回投与として投与することができる。好ましくは、投与量レベルは約0.01〜約25 mg/kg/日であり；より好ましくは約0.05〜約10 mg/kg/日である。適切な投与量レベルは、約0.01〜25 mg/kg/日、約0.05〜10 mg/kg/日、または約0.1〜約5 mg/kg/日であってよい。この範囲内で、投与量は、約0.005〜約0.05、0.05〜0.5、または0.5〜5 mg/kg/日であってよい。経口投与に関しては、組成物は好ましくは、治療すべき患者に対して投与量を対症的に調節するよう、約1〜1000ミリグラムの活性成分、特に約1、5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、750、800、900、および1000ミリグラムの活性成分）を含む錠剤の形態で提供される。化合物は、1日当たり1〜4回、好ましくは1日あたり1回または2回の投与計画で投与され得る。
【０１２９】
しかし、任意の特定の患者に対する特定の用量レベルおよび投与頻度は変動し得り、使用する特定の化合物の活性、化合物の代謝安定性および作用期間、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食習慣、投与形態および投与時間、排出速度、薬剤の組み合わせ、特定の状態の重症度、ならびに宿主が受けている治療をはじめとする種々の要因に依存することは、理解されると考えられる。
【０１３０】
以下の実施例は、提供する組成物および方法の特定の局面をより詳細に説明するために提供するものである。しかし、これらの実施例は、ここで主張した本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１３１】
実施例1
白血球および種々の組織におけるCCX CKRの発現
CCX CKR mRNAの発現を、ヒトcDNAのPCR解析により、および種々の組織から単離されたRNAのRT-PCRにより決定した。まず、造血細胞および組織におけるCCX CKR発現を調べた。受容体発現は、未成熟樹状細胞（DC）（GM-CSFおよびIL-4で処理した後の単球に由来する）、3名のドナーのうち2名による初代T細胞において、ならびに脾臓およびリンパ節組織において明白であった（図1）。さらに、発現は、心臓、腎臓、胎盤、気管、および脳などの非リンパ系組織においても検出された；同じパネル上の未分画白血球もまた陽性であった（図1）。GAPDHに関する対照PCR産物によって、すべての開始RNAの完全性が確認された。
【０１３２】
CCX CKRの観察されたパターンは、NCBIデータベースにおいて見出されるヒト発現遺伝子配列断片に関して報告された分布と重複し、これを拡張する：これらのESTは、腎臓、胎児心臓、嗅上皮、および扁桃B細胞から単離されている。したがって、CCX CKRは、末梢の運動性細胞において、ならびにリンパ系組織および非リンパ系組織において発現されるようである。CCX CKRが細胞遊走に関与する細胞以外の種々の細胞で発現することから、この受容体が単なる炎症性疾患および細胞運動性とは異なる生物活性において役割を担うことが示唆される。
【０１３３】
実施例2
シグナル伝達実験
CCX CKRが、典型的にケモカイン受容体に付随する活性を示すかどうかを決定するために、一連の実験を行った。実施したアッセイには、リガンド依存的カルシウムシグナル伝達、リガンド依存的ホスファチジルイノシトール代謝回転、リガンド依存的代謝率、およびリガンド依存的走化性が含まれた。これらのアッセイの結果は陰性であるかまたは不確定であり、多くても低レベルの活性であることが示された。
【０１３４】
これらの結果から、CCX CKRの主要な活性は、典型的にケモカイン受容体に付随する活性（例えば、細胞遊走）以外の活性であることが示唆される。
【０１３５】
実施例3
タンパク質発現に及ぼすCCX CKRの影響
また、CCX CKR活性がタンパク質発現に対してどのような影響を及ぼすかを評価するために、研究を行った。これは、リガンドELS、SLC、またはTECKの存在下および非存在下で培養した、非トランスフェクションHEK293細胞およびCCX CKRをトランスフェクションしたHEK293細胞について、タンパク質レベルを決定することにより解析した。タンパク質レベルは、Beckton Dickinsonによって開発され、BD Biosciences Pharmingenから入手可能なBD PowerBlot（商標）技術を用いて決定した。一般に、この解析は、ポリアクリルアミド電気泳動により細胞溶解物中のタンパク質を分離する段階、およびその後の、特定のタンパク質に特異的な1,000を超えるモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロットを行う段階を含む。ゲル上のタンパク質バンドに結合する抗体は、結合した抗体からの化学発光を検出するデジタルカメラを用いて可視化される。シグナルの強度に基づいて、タンパク質量が決定され得る。この技術の適用に関するさらなる詳細は、Lorenz, P., et al. Proteomics (2003) 3:991-1002；Malakhov, M.P., et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:16608-13；およびYoo, G.H., et al. (2002) Clin Cancer Res. 8:3910-21によって考察されている。
【０１３６】
図2は、異なる条件セット下で増加および減少したタンパク質の数の比較を提供するチャートを提供する。左から右の順に説明すると、第一群から、非トランスフェクションHEK293細胞をCCX CKRリガンドであるELCと接触させることで、タンパク質発現レベルに比較的軽度の影響を生じることが示される。第二群から、HEK293細胞にCCX CKRを単にトランスフェクションすることによりタンパク質発現に顕著な変化が起こり、かなりの数の遺伝子の発現レベルが増加および減少することが実証される。最後の3つの群から、3つのCCX CKRリガンド（ELC、LSC、またはTECK）のうちいずれかをCCX CKRトランスフェクション細胞に添加しても、CCX CKRを単に形質転換した細胞と比較して、わずかなタンパク質発現変化が起こるのみであったことが示される。
【０１３７】
これらの結果は、ケモカイン受容体について典型的に観察される結果とは逆である。CCX CKRはそれ自体、リガンドの非存在下で、タンパク質発現の顕著な変化をもたらし得るのに対して、大部分のケモカイン受容体は、リガンド結合によって活性化された場合にのみそのような変化を起こし得る。大部分のケモカイン受容体の場合、トランスフェクション自体では遺伝子発現に限定された影響しか及ぼさない。したがって、これらの結果から、大部分のケモカイン受容体とは異なり、CCX CKRは自己活性を有し、リガンドの非存在下でさえも細胞において高レベルのタンパク質代謝回転を促進し得ることが示唆される。
【０１３８】
実施例4
細胞増殖に及ぼすCCX CKRの影響
CCX CKRが細胞増殖において役割を果たすかどうかを確認するため、別の実験セットを行った。1つの実験は、(1) 非トランスフェクションHEK293細胞（ATCC #CRL 1573）（対照）、(2) 多クローン混合物としての、CCX CKRをトランスフェクションしたHEK293細胞、および(3) CCX CKRを安定にトランスフェクションしたHEK293の3つの異なるクローンを培養し、全部で6つの異なる細胞培養物を提供する段階を含んだ。これらの培養物はそれぞれ、50,000細胞/ウェルを三つ組で播種することによって取得した。3つの異なるクローン（クローン9、12、および13）は、細胞の多クローン混合物を限界希釈することによって取得した。
【０１３９】
増殖培地（10%ウシ胎児血清を含むダルベッコ最小必須培地）中で細胞を12時間接着させ、次いでウシ胎児血清の非存在下で培養して細胞周期を同調した。次に、増殖培地を細胞に添加し直し、プレートをインキュベーターに戻した。6日間毎日、トリプシンで細胞を採取し、血球計で計数した。
【０１４０】
この実験の結果を図3に示すが、この図は、各細胞種に関する毎日の細胞数のプロットである。したがってこのプロットは、6つの細胞培養物それぞれの増殖曲線を表す。このチャートから、CCX CKR発現を増加させるためのCCX CKRの単なるトランスフェクションで、細胞増殖を顕著に増加させるのに十分であることが示される。細胞増殖の増加は、多クローン形質転換および多クローン形質転換混合物から得られた3つの個々のクローンのそれぞれの両方で観察された。これらの実験はCCX CKRリガンドを添加せずに実施したため、これらの結果からも、CCX CKRが自己活性を有し、すなわちリガンドの非存在下でさえも細胞増殖を促進し得ることが示される。
【０１４１】
以下の2つの問題に取り組むため、記載した同じ手順を用いて別の実験セットを行った：(1) 第一の実験セットで観察された自己活性応答が、単に形質転換過程の結果であるのかどうか、および(2) CCX CKRが細胞増殖を促進する能力にリガンドがどのような影響を及ぼすかを決定すること。本実験では、細胞増殖曲線を、非トランスフェクションHEK293細胞、ケモカイン受容体CCR6をトランスフェクションしたHEK293細胞、およびCCX CKRをトランスフェクションした細胞について決定した。増殖曲線は、CCX CKRリガンドTECKの存在下および非存在下で決定し、TECKは、細胞周期が同調された時点で細胞に添加し直す増殖培地中に含めるかまたは増殖培地から除外した（図4を参照）。
【０１４２】
図4に示すチャートから、いくつかの点が明らかになる。第一に、第一の実験セットの結果と一致して、HEK293細胞にCCX CKRを単にトランスフェクションすることで、顕著な細胞増殖を誘導するのに十分であった。したがって、これらの結果は、CCX CKRが自己活性を有するという結論を支持する。第二に、CCX CKRを発現している細胞へのTECKの添加は、細胞増殖活性に軽度の影響を及ぼし、これはおそらくは細胞増殖のわずかな減少であった。このこともやはり、CCX CKRが自己活性受容体であり、リガンドは活性レベルを微調整するよう作用するらしいことと一致する。第三に、この結果から、CCR6を形質転換した細胞（CCX CKR形質転換細胞と同じプラスミドで形質転換した）が細胞増殖の有意な増殖を示さなかったという理由で、CCX CKRで認められる増殖活性は、形質転換過程または細胞中のプラスミドの存在に単に起因しないことが示される。
【０１４３】
CCX CKRが自己活性を有することを示す結果が、増殖培地中に含まれる血清中にCCX CKRリガンドが存在することに単に起因しないことを確認するため、別の実験セットを行った。これらの実験では、非形質転換HEK293細胞およびCCX CKRを形質転換したHEK293細胞を、血清の非存在下で培養した。図5に示すように、非形質転換細胞は最初は増殖するが、その後、栄養素の欠如が原因で死滅し始めた。この同様の一般的傾向は形質転換細胞でも認められたが、CCX CKRが自己活性を有し、細胞増殖を誘導し得ることを示す他の結果と一致して、初期増殖速度は顕著に増大した。したがって、この実験から、CCX CKR発現と増殖活性との相関関係は、血清中のリガンドの存在に単に起因し得ないことが確認された。
【０１４４】
まとめると、この一連の実験の結果から、CCX CKRは自己活性受容体であり、その発現のみで細胞増殖を顕著に促進するのに十分であることが示される。したがって、この受容体の活性または発現レベルを増加させることにより、細胞増殖を促進することができる。リガンドの結合は、細胞増殖の促進を誘発するのに必要ではないようであるが、活性レベルを微調整する可能性がある。
【０１４５】
本明細書において引用した参考文献はすべて、個々の出版物または特許出願が詳細にかつ個別にすべての目的のためにその全体が参照により組み入れられることが示されるのと同程度に、その全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】表示の培養初代細胞および臓器に由来する全組織の細胞質RNAをRT-PCRすることにより決定された、CCX CKR RNAを発現する細胞および組織を示す。
【図２】PowerBlot（商標）解析により決定された、異なる条件下におけるタンパク質発現レベルの変化を示すチャートである。CCX CKRリガンドの存在下および非存在下の両方における、非トランスフェクションヒト胚性腎臓（HEK）293細胞およびCCX CKRを形質転換したHEK293細胞についてのタンパク質発現レベルの相違を示す。試料番号は以下の条件を表す：1) 非トランスフェクションHEK293細胞におけるタンパク質発現、2) ELCの存在下におけるHEK293細胞、3) リガンドの非存在下におけるCCX CKR形質転換細胞、4) ELCの存在下におけるCCX CKR形質転換細胞、5) SLCの存在下におけるCCX CKR形質転換細胞、および6) TECKの存在下におけるCCX CKR形質転換細胞。  チャートから、ヒト胚性腎臓（HEK）293細胞にCCX CKRを単にトランスフェクションすることにより、非トランスフェクション細胞と比較してタンパク質発現の顕著な変化が起こり、多くのタンパク質の発現が増加し、多くの他のタンパク質の発現が減少することが明らかになる。このチャートからまた、CCX CKR形質転換細胞にELC、SLC、またはTECKなどのCCX CKRリガンドを添加しても、CCX CKRを形質転換したのみでリガンドと接触させていない細胞と比較して、タンパク質発現にわずかな影響を及ぼすのみであったことが示される。
【図３】CCX CKR形質転換細胞が細胞増殖に及ぼす影響を示すチャートである。形質転換HEK293細胞の多クローン集団、および多クローン形質転換体を限界希釈することによって得られた個々のクローン（すなわち、細胞は単一の遺伝子コピーを有する）について、結果を示す。チャートから、多クローン形質転換体中の細胞および個々のクローンが、非形質転換細胞と比較して細胞増殖の顕著な増加を示すことが実証される。
【図４】ケモカインTECKの存在下および非存在下の両方における、非トランスフェクションHEK293細胞、CCR6（別のケモカイン受容体）をトランスフェクションしたHEK293細胞、およびCCX CKRをトランスフェクションしたHEK293細胞についての6日間にわたる増殖曲線のチャートである。チャートの結果から、HEK293細胞にCCR6をトランスフェクションしても、細胞増殖にほとんど影響がなかったことが示される。対照的に、同じ細胞にCCX CKRを形質転換することにより、リガンドの非存在下でさえも細胞増殖の顕著な増加が起こった。CCX CKR形質転換HEK293細胞にケモカインリガンドTECKを添加しても、CCX CKRを単に形質転換したHEK293細胞と比較して、細胞増殖にわずかな影響しか及ぼさなかった。
【図５】4日間にわたる細胞増殖曲線の別のセットを示すプロットである。チャートは、CCX CKR形質転換で認められる細胞増殖の顕著な増加が、細胞増殖培地中に含まれる血清中のCCX CKRリガンドの存在に起因する偽結果でなかったことを確認するために行った対照実験の結果を示す。非形質転換および形質転換HEK293細胞の増殖曲線を、血清の非存在下で培養した細胞培養物について示す。いずれの細胞セットにおいても、血清の欠如が原因で（すなわち、細胞は本質的に飢餓状態である）、長期にわたると細胞増殖は減少するが、それにもかかわらず初期には、CCX CKR形質転換細胞の細胞増殖は顕著に高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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