(57)【要約】本発明は、サイトカインが病因に関係している免疫疾患を治療するための物質および方法を提供する。本発明の物質および方法は、自己免疫疾患の治療に有用である。本発明の物質および方法は、ヒトＩＬ−２３および／またはヒトＩＬ−１２サイトカインに結合することができ、従ってそれらの生物活性を調節する、かつ免疫、自己免疫および癌療法における治療薬として有用である核酸リガンドに関する。１実施形態において、本発明はＩＬ−２３に特異的に結合するアプタマーを提供する。
2007527246.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−２３に特異的に結合するアプタマー。
【請求項２】
ＩＬ−２３が、ＩＬ−２３の機能と本質的に同じである生体機能を果たすＩＬ−２３の改変体である、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項３】
前記ＩＬ−２３の改変体が、ＩＬ−２３のものと実質的に同じ構造および実質的に同じ前記アプタマーへの結合能力を有する、請求項２に記載のアプタマー。
【請求項４】
ＩＬ−２３またはその改変体が、配列番号４および５を含む配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のアプタマー。
【請求項５】
ＩＬ−２３またはその改変体が、配列番号４および５を含む配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のアプタマー。
【請求項６】
ＩＬ−２３またはその改変体が、配列番号４および５を含む配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のアプタマー。
【請求項７】
ＩＬ−２３またはその改変体が、配列番号４および５を含むアミノ酸配列を有する、請求項３に記載のアプタマー。
【請求項８】
リボ核酸である、請求項７に記載のアプタマー。
【請求項９】
１本鎖リボ核酸である、請求項８に記載のアプタマー。
【請求項１０】
デオキシリボ核酸である、請求項７に記載のアプタマー。
【請求項１１】
１本鎖デオキシリボ核酸である、請求項１０に記載のアプタマー。
【請求項１２】
約１００ｎＭまたはそれ以下のＩＬ−２３またはその改変体についての解離定数を有する、請求項７に記載のアプタマー。
【請求項１３】
約５０ｎＭまたはそれ以下のＩＬ−２３またはその改変体についての解離定数を有する、請求項１２に記載のアプタマー。
【請求項１４】
約１０ｎＭまたはそれ以下のヒトＩＬ−２３またはその改変体についての解離定数を有する、請求項１３に記載のアプタマー。
【請求項１５】
約１ｎＭまたはそれ以下のヒトＩＬ−２３またはその改変体についての解離定数を有する、請求項１４に記載のアプタマー。
【請求項１６】
少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項７に記載のアプタマー。
【請求項１７】
前記修飾が、核酸の、糖位置での化学的置換、リン酸エステル位置での化学的置換および塩基位置での化学的置換から成る群より選択される、請求項１６に記載のアプタマー。
【請求項１８】
前記修飾が、修飾ヌクレオチドの組み込み；３’キャッピング；高分子量非免疫原性化合物への結合体化；親油性化合物への結合体化；およびリン酸エステル骨格修飾から成る群より選択される、請求項１６に記載のアプタマー。
【請求項１９】
前記非免疫原性高分子量化合物が、ポリアルキレングリコールである、請求項１８に記載のアプタマー。
【請求項２０】
前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコールである、請求項１９に記載のアプタマー。
【請求項２１】
前記骨格修飾が、１つまたはそれ以上のホスホロチオエートのリン酸エステル骨格への組み込みを含む、請求項１８に記載のアプタマー。
【請求項２２】
前記リン酸エステル骨格における１０より少ないホスホロチオエートの組み込みを含む、請求項２１に記載のアプタマー。
【請求項２３】
前記リン酸エステル骨格における６より少ないホスホロチオエートの組み込みを含む、請求項２２に記載のアプタマー。
【請求項２４】
前記リン酸エステル骨格における３より少ないホスホロチオエートの組み込みを含む、請求項２３に記載のアプタマー。
【請求項２５】
ＩＬ−２３またはその改変体の機能を調節する、請求項７に記載のアプタマー。
【請求項２６】
ＩＬ−２３またはその改変体の機能を阻害する、請求項２５に記載のアプタマー。
【請求項２７】
ＩＬ−２３またはその改変体の機能をインビボで阻害する、請求項２６に記載のアプタマー。
【請求項２８】
ＩＬ−２３受容体へのＩＬ−２３の結合を防止する、請求項２６に記載のアプタマー。
【請求項２９】
配列番号１３−６６、配列番号７１−８８、配列番号９１−９６、配列番号１０３−１１８、配列番号１２４−１３４、配列番号１３５−１５９、配列番号１６２、配列番号１６４−１７２、配列番号１７６−１７８、配列番号１８１−１９６、および配列番号１９９−３１４から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーのものと実質的に同じＩＬ−２３への結合能力を有する、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項３０】
配列番号１３−６６、配列番号７１−８８、配列番号９１−９６、配列番号１０３−１１８、配列番号１２４−１３４、配列番号１３５−１５９、配列番号１６２、配列番号１６４−１７２、配列番号１７６−１７８、配列番号１８１−１９６、および配列番号１９９−３１４から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーのものと実質的の同じ構造および実質的に同じＩＬ−２３への結合能力を有する、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項３１】
配列番号１３−６６、配列番号７１−８８、配列番号９１−９６、配列番号１０３−１１８、配列番号１２４−１３４、配列番号１３５−１５９、配列番号１６２、配列番号１６４−１７２、配列番号１７６−１７８、配列番号１８１−１９６、および配列番号１９９−３１４から成る群より選択される配列のうちのいずれか１つと少なくとも８０％同一の核酸配列を含む、請求項１に記載ののアプタマー。
【請求項３２】
前記アプタマー核酸配列が、配列番号１３−６６、配列番号７１−８８、配列番号９１−９６、配列番号１０３−１１８、配列番号１２４−１３４、配列番号１３５−１５９、配列番号１６２、配列番号１６４−１７２、配列番号１７６−１７８、配列番号１８１−１９６、および配列番号１９９−３１４から成る群より選択される配列のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一である、請求項３１に記載のアプタマー。
【請求項３３】
配列番号１３−６６、配列番号７１−８８、配列番号９１−９６、配列番号１０３−１１８、配列番号１２４−１３４、配列番号１３５−１５９、配列番号１６２、配列番号１６４−１７２、配列番号１７６−１７８、配列番号１８１−１９６、および配列番号１９９−３１４から成る群より選択される配列のうちのいずれか１つの固有の配列領域における２０の連続するヌクレオチド配列と同一である２０の連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項３４】
配列番号１３−６６、配列番号７１−８８、配列番号９１−９６、配列番号１０３−１１８、配列番号１２４−１３４、配列番号１３５−１５９、配列番号１６２、配列番号１６４−１７２、配列番号１７６−１７８、配列番号１８１−１９６、および配列番号１９９−３１４から成る群より選択される配列のうちのいずれか１つの固有の配列領域における８つの連続するヌクレオチド配列と同一である８つの連続するヌクレオチドを含む、請求項３３に記載のアプタマー。
【請求項３５】
配列番号１３−６６、配列番号７１−８８、配列番号９１−９６、配列番号１０３−１１８、配列番号１２４−１３４、配列番号１３５−１５９、配列番号１６２、配列番号１６４−１７２、配列番号１７６−１７８、配列番号１８１−１９６、および配列番号１９９−３１４から成る群より選択される配列のうちのいずれか１つの固有の配列領域における４つの連続するヌクレオチドの配列と同一である４つの連続するヌクレオチドを含む、請求項３４に記載のアプタマー。
【請求項３６】
配列番号１３−６６、配列番号７１−８８、配列番号９１−９６、配列番号１０３−１１８、配列番号１２４−１３４、配列番号１３５−１５９、配列番号１６２、配列番号１６４−１７２、配列番号１７６−１７８、配列番号１８１−１９６、および配列番号１９９−３１４から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む、ＩＬ−２３またはその改変体に結合し得る、アプタマー。
【請求項３７】
少なくとも１つの化学修飾をさらに含む、請求項３６に記載のアプタマー。
【請求項３８】
前記修飾が、核酸の、糖位置での化学的置換、リン酸エステル位置での化学的置換および塩基位置での化学的置換から成る群より選択される、請求項３７に記載のアプタマー。
【請求項３９】
前記修飾が、修飾ヌクレオチドの組み込み；３’キャッピング；高分子量、非免疫原性化合物への結合体化；親油性化合物への結合体化；およびリン酸エステル骨格修飾から成る群より選択される、請求項３７に記載のアプタマー。
【請求項４０】
前記高分子量非免疫原性化合物が、ポリアルキレングリコールである、請求項３９に記載のアプタマー。
【請求項４１】
前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコールである、請求項４０に記載のアプタマー。
【請求項４２】
前記骨格修飾が、１つまたはそれ以上のホスホロチオエートのリン酸エステル骨格への組み込みを含む、請求項３９に記載のアプタマー。
【請求項４３】
前記リン酸エステル骨格における１０より少ないホスホロチオエートの組み込みを含む、請求項４２に記載のアプタマー。
【請求項４４】
前記リン酸エステル骨格における６より少ないホスホロチオエートの組み込みを含む、請求項４３に記載のアプタマー。
【請求項４５】
前記リン酸エステル骨格における３より少ないホスホロチオエートの組み込みを含む、請求項４４に記載のアプタマー。
【請求項４６】
ＩＬ−１２にさらに結合し得る、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項４７】
ＩＬ−１２が、ＩＬ−１２の機能と本質的に同じ機能である生体機能を果たすＩＬ−１２の改変体である、請求項４６に記載のアプタマー。
【請求項４８】
ＩＬ−１２の改変体が、ＩＬ−１２のものと実質的に同じ構造および実質的に同じ前記アプタマーへの結合能力を有する、請求項４７に記載のアプタマー。
【請求項４９】
ＩＬ−１２またはその改変体が、配列番号４および６を含む配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４８に記載のアプタマー。
【請求項５０】
ＩＬ−１２またはその改変体が、配列番号４および６を含む配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４８に記載のアプタマー。
【請求項５１】
ＩＬ−１２またはその改変体が、配列番号４および６を含むアミノ酸配列を有する、請求項４８に記載のアプタマー。
【請求項５２】
ＩＬ−１２またはその改変体の機能を調節する、請求項５１に記載のアプタマー。
【請求項５３】
ＩＬ−１２またはその改変体の機能を阻害する、請求項５２に記載のアプタマー。
【請求項５４】
ＩＬ−１２またはその改変体の機能をインビボで阻害する、請求項５３に記載のアプタマー。
【請求項５５】
ＩＬ−１２受容体へのＩＬ−１２の結合を防止する、請求項５３に記載のアプタマー。
【請求項５６】
ＩＬ−２３またはその改変体が、マウスＩＬ−２３である、請求項４に記載のアプタマー。
【請求項５７】
マウスＩＬ−２３が、配列番号３１５および配列番号３１６を含むアミノ酸配列を有する、請求項５６に記載のアプタマー。
【請求項５８】
配列番号１３−６６、配列番号７１−８８、配列番号９１−９６、配列番号１０３−１１８、配列番号１２４−１３０、配列番号１３５−１５９、配列番号１６２、配列番号１６４−１７２、配列番号１７６−１７８、配列番号１８１−１９６、および配列番号２０３−３１４から成る群より選択される核酸配列を含むアプタマーまたはその塩の治療有効量、および薬学的に受容可能な担体または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項５９】
請求項５８に記載の組成物を脊椎動物に投与することを含む、ＩＬ−２３により媒介される疾患を治療、予防または改善する方法。
【請求項６０】
前記脊椎動物が、哺乳動物である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記疾患が、自己免疫疾患、炎症性疾患、癌、骨粗しょう症における骨吸収、およびＩ型糖尿病から成る群より選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデスおよび過敏性腸疾患から成る群より選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記癌が、結腸癌、肺癌および肺転移から成る群より選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記過敏性疾患が、クローン病および潰瘍性大腸炎から成る群より選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
配列番号１４、配列番号１７−１９、配列番号２１、配列番号２７−３２、配列番号３４−４０、配列番号４２、配列番号４９、配列番号６０−６１、配列番号９１−９２、配列番号９４、および配列番号１０３−１１８から成る群より選択される核酸配列を含むアプタマーまたはその塩の治療有効量および薬学的に受容可能な担体または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項６７】
請求項６６に記載の組成物をヒトに投与することを含む、ＩＬ−１２により媒介される疾患を治療、予防または改善する方法。
【請求項６８】
前記疾患が、自己免疫疾患、炎症性疾患、癌、骨粗しょう症における骨吸収、およびＩ型糖尿病から成る群より選択される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデスおよび過敏性腸疾患から成る群より選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記癌が、結腸癌、肺癌および肺転移から成る群より選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記過敏性疾患が、クローン病および潰瘍性大腸炎から成る群より選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
ＩＬ−２３またはその改変体含むことが推測される組成物と請求項３６に記載のアプタマーとを接触させる工程、およびＩＬ−２３またはその改変体の存在または不在を検出する工程を含む、診断方法。
【請求項７３】
インビトロ診断薬として使用するための請求項３６に記載のアプタマー。
【請求項７４】
インビボ診断薬として使用するための請求項３６に記載のアプタマー。
【請求項７５】
インビボでの疾患の治療、予防または改善において使用するための請求項３６に記載のアプタマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般には核酸の分野に関し、さらに詳細には、ヒトインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）サイトカインファミリーのメンバー、より具体的にはヒトインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、ヒトインターロイキン−２３（ＩＬ−２３）またはＩＬ−１２とＩＬ−２３の両方に、ならびに他の関連サイトカイン（例えば、ＩＬ−２７およびｐ４０二量体）に結合することができるアプタマーに関する。こうしたアプタマーは、自己免疫関連疾患、および／またはサイトカインのＩＬ−１２ファミリー、具体的にはＩＬ−２３およびＩＬ−１２が関係している他の疾患もしくは障害の治療薬および診断薬として有用である。さらに、本発明は、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合することができるアプタマーを投与するための物質および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
(発明の背景)
アプタマーは、古典的Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型塩基対合以外の相互作用による分子への特異的結合親和性を有する核酸分子である。
【０００３】
ファージディスプレイまたはモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）により作製されるペプチドのようなアプタマーは、選択された標的に特異的に結合し得、その標的の活性を調節することは（例えば、アプタマーの結合により）、それらの標的が機能する能力を阻害し得る。ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールからインビトロセレクションプロセスにより作られるアプタマーが、成長因子、転写因子、酵素、免疫グロブリンおよび受容体をはじめとする１００を超えるタンパク質のために作製されている。典型的なアプタマーは、１０−１５ｋＤａのサイズ（３０−４５ヌクレオチド）であり、ナノモル以下の親和性でその標的に結合し、ならびに密接に関連した標的を区別する（例えば、アプタマーは、代表的に同じ遺伝子ファミリーからの他のタンパク質に一般には結合しないであろう）。一連の構造研究により、アプタマーは、抗体−抗原複合体において親和性および特異性を発動するのと同じタイプの結合相互作用（例えば、水素結合、静電相補性、疎水性接触、立体的排除）を用いることができることが、明らかになった。
【０００４】
アプタマーは、高い特異性および親和性、生物学的有効度ならびに卓越した薬物動態特性をはじめとする、治療薬および診断薬としての使用に望ましい多数の特徴を有する。加えて、これらは抗体および他のタンパク質生物学的製剤に勝る特異的で競争力のある利点、例えば、次の利点をもたらす：
１）速度および制御。アプタマーは、完全なインビトロプロセスにより生産され、それにより、治療誘導をはじめとする初期誘導の迅速な生成が可能となる。インビトロセレクションにより、アプタマーの特異性および親和性を厳重に制御することができ、そして毒性標的と非免疫原性標的の両方に対する誘導をはじめとする誘導を生じさせることができる。
【０００５】
２）毒性および免疫原性。１つの類としてのアプタマーは、毒性も免疫原性もほとんどまたは全く示さなかった。高レベルのアプタマーのラットまたはウッドチャックに対する長期投薬（９０日間、毎日１０ｍｇ／ｋｇ）では、いかなる臨床測定、細胞測定または生化学的測定によっても毒性は観察されなかった。多くのモノクローナル抗体の有効度が、抗体それら自体への免疫応答により厳密に制限され得るのに対し、アプタマーに対する抗体を誘発することは極めて難しい。このことは、多分、アプタマーがＭＨＣ経由でＴ細胞により提示され得ないため、および一般に、免疫応答が、核酸フラグメントを認識しないように訓練されているためである。
【０００６】
３）投与。最近認可された抗体療法薬は、静脈内注入により（典型的には、２−４時間かけて）投与されるのに対し、アプタマーは、皮下注射により投与することができる（皮下投与によるアプタマーのバイオアベイラビリティは、サルの研究では、８０％より高い（非特許文献１）。この差は、主として、大部分の治療用ｍＡｂにとって避けがたい比較的低い溶解度およびそれ故の大きな容積に起因する。良好な溶解度（＞１５０ｍｇ／ｍＬ）および比較的低い分子量（アプタマー：１０−５０ｋＤａ；抗体：１５０ｋＤａ）のため、アプタマーの週間用量は、０．５ｍＬ未満の容量で注射により送達することができる。加えて、アプタマーの小さなサイズは、抗体または抗体フラグメントが浸透することを許容しない構造的な狭窄領域への浸透を可能にする。これは、アプタマーに基づく治療薬または予防薬のさらに別の利点をもたらす。
【０００７】
４）スケーラビリティおよびコスト。治療用アプタマーは、化学合成することができ、従って、生産需要に満たすために必要に応じて容易に規模を変更することができる。生産規模の変更の難しさにより、現在、一部の生物学的製剤の利用可能性は制限されており、大規模タンパク質生産プラントの資本経費は膨大であるのに対し、１つの大規模オリゴヌクレオチド合成装置だけで一年あたり、１００ｋｇよりも多くを生産することができ、必要とされる初期投資も比較的適度である。キログラム規模でのアプタマー合成のための現在の製品コストは、＄５００／ｇと概算され、これは、高度に最適化された抗体のためのコストに匹敵する。プロセス開発における継続的な改善により、製品コストは５年のうちに＄１００／ｇより低くなると予想される。
【０００８】
５）安定性。治療用アプタマーは、化学的に頑強である。これらは、本質的に、熱および変性剤などの因子に暴露すると活性を回復するように適合され、凍結乾燥粉末として室温で長期間にわたって（１年より長く）保管することができる。
【０００９】
（サイトカインおよび免疫応答）
哺乳動物における免疫応答は、「免疫ネットワーク」と呼ばれる一連の複雑な細胞相互作用に基づく。リンパ球、マクロファージ、顆粒球および他の細胞のネットワーク様細胞相互作用に加えて、リンフォカイン、サイトカインまたはモノカインとして知られている可溶性タンパク質は、これらの細胞相互作用の制御に重要な役割を果たす。免疫系の細胞によるサイトカイン発現は、免疫応答の調節に重要な役割を果たす。大部分のサイトカインは、多形質発現性であり、そして抗原提示；ＣＤ４＋  細胞サブセットの活性化、増殖および分化；Ｂ細胞による抗体応答；ならびに感覚過敏の発現をはじめとする多数の生物活性を有する。サイトカインは、免疫系および／または造血細胞が直接的または間接的に関与する広範な変性または異常状態に関係している。サイトカインの重要なファミリーは、ＩＬ−１２ファミリーであり、これは、例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７およびｐ４０単量体およびｐ４０二量体を含む。
【００１０】
ＩＬ−２３は、ｐ１９サブユニットおよびｐ４０サブユニット（各々、別の遺伝子によってコードされる）から成る、共有結合されたヘテロ二量体分子である。ＩＬ−１２も共有結合されたヘテロ二量体分子であり、ｐ３５サブユニットおよびｐ４０サブユニットから成る。このように、ＩＬ−２３およびＩＬ−１２の両方が、共通してｐ４０サブユニットを有する（図１）。ヒトおよびマウスｐ１９は、〜７０％アミノ酸配列同一性を共有し、ｐ３５（ＩＬ−１２に特有のサブユニット）に密接に関連している。トランスフェクションアッセイは、ｐ３５同様、ｐ１９タンパク質が、単独で発現されるときにはあまり分泌されず、より多くの発現にはそのヘテロ二量体化パートナーｐ４０の共発現を必要とすることを示している。ｐ４０とｐ１９は、協力して、ジスルフィド連結型へテロ二量体を形成する。ｐ１９成分は、活性化マクロファージ、樹状細胞（「ＤＣ」）、内皮細胞およびＴ細胞により大量に産生される。Ｔｈ１細胞は、Ｔｈ２細胞より大量のｐ１９  ｍＲＮＡを発現するが、これらの細胞タイプの中で、活性化されたマクロファージおよびＤＣのみがｐ４０（ＩＬ−２３の他方の成分）を構成的に発現する。ｐ１９の発現は、Ｔｏｌｌ様受容体−２によってシグナル伝達する細菌産物により増加される。これは、ｐ１９（そして、それゆえＩＬ−２３）が、特定の細菌感染に対する免疫応答の際に機能し得ることを示唆している。
【００１１】
ＩＬ−１２およびＩＬ−２３の共有作用の１つは、Ｔ細胞に対するそれらの増殖効果である（非特許文献２）。しかし、これらのサイトカインが作用するＴ細胞サブセットには明確な違いが存在する。マウスにおいて、ＩＬ−１２は、未処理マウスＴ細胞の増殖を誘導するが、記憶Ｔ細胞の増殖は誘導せず、これに対してＩＬ−２３の増殖効果は、記憶Ｔ細胞に限られる。ヒトにおいて、ＩＬ−１２は、ヒト未処理Ｔ細胞とヒト記憶Ｔ細胞との両方の増殖を促進するが、ＩＬ−２３の増殖効果は、やはり記憶Ｔ細胞に限られる。また、ＩＦＮ−γ産生に対するＩＬ−２３の作用は、ヒトでは主として記憶Ｔ細胞に向けられる。ＩＬ−１２は、未処理Ｔ細胞およびそれより強く記憶Ｔ細胞においてＩＦＮ−γ産生を誘導するが、ＩＬ−２３は、未処理Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ産生にはほとんど影響を及ぼさない。ＩＦＮ−γ産生の中程度の増加が、ＩＬ−２３による刺激を受けた記憶Ｔ細胞では観察されるが、この効果は、ＩＬ−１２での刺激の結果として生じるものより多少少ない。
【００１２】
このように、ＩＬ−２３は、ＩＬ−１２とは異なる生物活性を有するが、両方が、骨粗しょう症における骨吸収、Ｉ型糖尿病および癌などの疾患に加えて、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデスおよび過敏性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎を含む）などの自己免疫疾患および炎症性疾患において、一定の役割を果たすと考えられる。
【００１３】
（自己免疫疾患治療薬としてのＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２特異的アプタマー）
理論に拘束されるものではないが、ＩＬ−１２およびＩＬ−２３は、多発性硬化症（「ＭＳ」）の病因に関係していると考えられる。例えば、ｐ４０のレベルは、ＭＳ患者の脳脊髄液においてアップレギュレートされる（非特許文献３）。加えて、抗ｐ４０ｍＡｂは脳内の病巣に局在することが、明らかになった（非特許文献４）。さらに、ｐ４０  ｍＲＮＡのより低いベースラインレベルによってＩＦＮ−β治療に対する臨床応答性が予測されることが、明らかになった（Ｖａｎ−Ｂｏｘｅｌ−Ｄｅｚａｉｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。従って、ｐ４０によるＩＬ−１２とＩＬ−２３との両方のノックダウンにより、ＭＳの症状が改善する可能性がある。実際、抗ｐ４０抗体は、実験的自己免疫性脳脊髄炎（「ＥＡＥ」）の発症および重症度を有意に抑制することが、マウスにおいて（非特許文献５）およびマーモセットにおいて（非特許文献４）明らかになった。
【００１４】
ＩＬ−２３とＩＬ−１２との両方をノックアウトすることによりＭＳの発症および症状が抑制されることを示す証拠にもかかわらず、ＥＡＥマウスモデルに対するＩＬ−１２およびＩＬ−２３ノックアウトの効果によって証明されるように、マウスにおけるＭＳ／ＥＡＥの病因に関しては２つのうちＩＬ−２３のほうが重要であるという強い証拠がある（非特許文献６）。例えば、ＥＡＥは、ｐ３５ノックアウトマウスにおいて発生し得るが、ｐ１９ノックアウトマウスにおいてもｐ４０ノックアウトマウスにおいても発生しない（非特許文献６）。ｐ１９／ｐ４０ノックアウトマウスにおいて、ＣＮＳにおける（ＩＬ−１２ではなく）ＩＬ−２３の発現はＥＡＥから救うが、ＩＬ−１２の過剰発現はＥＡＥを悪化させるため、ＩＬ−１２は、一般に、ＴＨ１細胞の発達および活性化に何らかの役割を果たすように思われる（非特許文献６）。ヒトでは、ｐ３５  ｍＲＮＡではなくｐ４０  ｍＲＮＡの過剰発現が、ＭＳ患者の中枢神経系（ＣＮＳ）において観察された。
【００１５】
Ｔｈ１細胞の活性化に一般的な役割を果たすことに加えて、感染と戦うために、ＩＬ−１２のほうがＩＬ−２３より重要であり得る。マウスでは、ｐ１９のノックアウトが、古典的Ｔｈ１細胞応答（高いＩＦＮ−γ、低いＩＬ−４）を誘導するのに対し、ｐ３５とｐ４０とのノックアウトマウスにおける応答（低いＩＦＮ−ガンマ、高いＩＬ−４）は、Ｔｈ２細胞に限定される（非特許文献６）。加えて、ｐ１９ノックアウト免疫細胞は、強力な炎症性サイトカインを産生するが、ｐ４０ノックアウト免疫細胞は産生し得ない。結論として、ｐ４０、ＩＬ−１２Ｒβ１およびＩＬ−１２Ｒβ２ノックアウトマウスは、様々な感染症にかかりやすい（非特許文献７）。従ってアプタマー治療薬によって特異的にＩＬ−２３を阻害することにより、患者が感染とより戦えるようにしつつ、ＩＬ−２３媒介疾患と有効に戦うことができる。
【００１６】
ＩＬ−２３とＩＬ−１２の両方またはＩＬ−２３もしくはＩＬ−１２は、末期関節炎症の促進因子として関節リウマチに関係している。理論に拘束されるものではないが、ＩＬ−２３は、記憶Ｔ細胞および炎症性マクロファージの機能に対しこれらの細胞上のＩＬ−２３受容体（ＩＬ−２３Ｒ）の係合により影響を及ぼすと考えられる。研究は、ＩＬ−２３サブユニットｐ１９および／またはｐ４０が、マウスコラーゲン誘発関節炎（「ＣＩＡ」）、関節リウマチのマウスモデル、において一定の役割を果たすことを示している。抗ｐ４０抗体は、マウスＣＩＡにおいて症状を改善し、そして単独で、および抗腫瘍壊死因子（抗ＴＮＦ）治療と併用した場合、発現および進行を予防することが明らかになった（非特許文献８、非特許文献９および非特許文献１０）。さらに、ｐ１９とｐ４０とのノックアウトマウスは、ＣＩＡの発症に対して完全に耐性であり、一方、ｐ３５ノックアウトマウスではＣＩＡの発症および重症度が悪化することが明らかになった（非特許文献１１および非特許文献１２）。それ故、ＩＬ−２３に結合し、阻害する本発明のアプタマーおよび方法は、関節リウマチの治療薬として有用である。
【００１７】
ＩＬ−２３とＩＬ−１２の両方またはＩＬ−２３もしくはＩＬ−１２は、Ｔｈ−１媒介疾患、例えば、尋常性乾癬および過敏性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎を含むが、これらに限定されない）における炎症細胞の補充においても中心的な役割を果たすと考えられる。例えば、尋常性乾癬の患者の皮膚病変において高レベルのｐ１９およびｐ４０  ｍＲＮＡが、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検出されたのに対し、ｐ３５  ｍＲＮＡは検出されなかった（非特許文献１３）。２，４，６，トリニトロベンゼンスルホン酸（「ＴＮＢＳ」）大腸炎、マウスにおける炎症性腸疾患の実験モデル、において、抗ＩＬ−１２モノクローナル抗体での治療は、粘膜の炎症の完全な改善／予防に効力があることが証明された（非特許文献１４）。ＴＮＢＳ大腸炎モデルにおいて幾つかの異なるＩＬ−１２拮抗薬を評価した別の研究では、このようにＩＬ−１２およびＩＬ−２３の両方が関係している粘膜の炎症の予防には抗ＩＬ−１２  ｐ４０抗体が最も有効であることが証明された（非特許文献１５）。それ故、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３に結合し、阻害する本発明のアプタマーは、乾癬および炎症性腸疾患のための治療薬として有用である。
【００１８】
ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３は、全身性エリテマトーデス（「ＳＬＥ」）において一定の役割を果たすとも考えられている。例えば、ＳＬＥ患者から得た血清は、ヘテロ二量体、例えばＩＬ−１２（ｐ３５／ｐ４０）およびＩＬ−２３（ｐ１９／ｐ４０）、としてのｐ４０の血清レベルよりも有意に多い量のｐ４０を単量体として含有することが判明した。これは、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２の産生の欠損が、ＳＬＥの病因に一定の役割を果たし得ることを示唆している。それ故、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２の生体機能を強化する本発明のアプタマーは、全身性エリテマトーデスの治療における治療薬として有用である（非特許文献１６）。
【００１９】
（腫瘍学的治療薬としてのＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２特異的アプタマー）
ＩＬ−１２の抗腫瘍活性は、十分に特性付けされており、最近の研究により、ＩＬ−２３も抗腫瘍活性および抗転移活性を有することが明らかになった。例えば、レトロウイルスによりＩＬ−２３を形質導入した結腸癌細胞は、免疫応答性マウス中の細胞株により確立された結腸腫瘍の成長を、コントロール細胞株と比較して有意に低減させた。これは、腫瘍におけるＩＬ−２３の発現が、抗腫瘍効果をもたらすことを示唆している（非特許文献１７）。同様に、１本鎖ＩＬ−２３（「ｓｃＩＬ−２３」）を放出するようにレトロウイルスによって操作された肺癌細胞株は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて肺転移を有意に抑制し、その結果、ほぼ完全な腫瘍拒絶が生じた（非特許文献１８）。それ故、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合し、それらの生体機能を強化するアプタマーは、結腸癌、肺癌（特に、肺転移）ならびにＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２が抗腫瘍効果を及ぼす他の腫瘍学的疾患の治療のための腫瘍学的治療薬として有用である。
【００２０】
ヒトＩＬ−２３を特異的に標的にする治療薬は、現在、知られていない。ＩＬ−２３を標的にする入手可能な薬剤としては、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から入手できる研究用のみの抗ヒトＩＬ−２３  ｐ１９ポリクローナル抗体；ＩＬ−１２とＩＬ−２３との両方のサイトカインが、共通してｐ４０サブユニットを有するため、ＩＬ−１２とＩＬ−２３との両方を標的にする抗ヒトｐ４０モノクローナル抗体；ならびにマウスＩＬ−２３を標的にするが、ヒトＩＬ−２３は標的にしない、抗マウスＩＬ−２３  ｐ１９ポリクローナルおよびモノクローナル抗体（非特許文献１９）が挙げられる。前に説明したように、ＩＬ−２３およびＩＬ−１２両方の活性を阻害する薬剤は、患者をより感染症にかかりやすい状態にし得、そして一般に、治療薬を開発する点で、ＩＬ−２３のみを阻害する薬剤よりも多くの合併症を引き起こす。脳および関節における自己免疫炎症についてはＩＬ−２３のほうがＩＬ−１２より重要な役割を果たすという証拠があるため、ＩＬ−２３に対してのみ特異的な治療薬のほうが、抗ｐ４０ヒトｍＡｂなどの両方のサイトカインを標的にする薬剤より有利であり得る。
【００２１】
治療薬としてのアプタマーの特異性、小さなサイズおよび親和性の利点からして、ヒトサイトカイン、特にＩＬ−２３およびＩＬ−１２、が病因に一定の役割を果たす疾患を治療するアプタマー治療薬のための物質および方法を有することは、有益であり得る。本発明は、これらおよび他の要求を満たす物質および方法を提供する。
【非特許文献１】Ｔｕｃｋｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ．（１９９９）７３２：２０３−２１２
【非特許文献２】Ｂｒｏｍｂａｃｈｅｒら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎ．（２００３）
【非特許文献３】Ｆａｓｓｂｅｎｄｅｒら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（１９９８）５１：７５３
【非特許文献４】Ｂｒｏｋら、ＪＩ（２００２）１６９：６５５４
【非特許文献５】Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｅｓｃｕら、ＪＩ（１９９８）１６１：５０９７
【非特許文献６】Ｃｕａら、Ｎａｔｕｒｅ（２００３）４２１：７４４
【非特許文献７】Ａｄｏｒｉｎｉ，ｆｒｏｍ  Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００３）ｐｇ．２５３
【非特許文献８】Ｍａｌｆａｉｔら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）１１１：３７７
【非特許文献９】Ｍａｔｔｈｙｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）２８：２１４３
【非特許文献１０】Ｂｕｔｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２２０５
【非特許文献１１】ＭｃＩｎｔｙｒｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９６）２６：２９３３
【非特許文献１２】Ｍｕｒｐｈｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（２００３）１９８：１９５１
【非特許文献１３】Ｌｅｅら、Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ（２００４）１９９（１）：１２５−３０
【非特許文献１４】Ｎｅｕｒａｔｈら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ（１９９５）１８２：１２８１−１２９０
【非特許文献１５】Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００２−０３）；７０；１７７−１８３
【非特許文献１６】Ｌａｕｗｅｒｙｓら、Ｌｕｐｕｓ（２００２）１１（６）：３８４−７
【非特許文献１７】Ｗａｎｇら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（２００３）：１０５，８２０−８２４
【非特許文献１８】Ｌｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００３）１７１：６００−６０７
【非特許文献１０】Ｐｉｒｈｏｎｅｎら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００２）１６９：５６７３−５６７８
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
（発明の要旨）
本発明は、自己免疫および炎症性疾患、ならびにＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２が病因に関係している他の関連疾患／障害の治療のための物質および方法を提供する。
【００２３】
１つの実施形態において、本発明の物質は、ＩＬ−２３に特異的に結合するアプタマーを提供する。１つの実施形態において、本発明のアプタマーが結合するＩＬ−２３は、ヒトＩＬ−２３であるが、もう１つの実施形態において、ＩＬ−２３は、ヒトＩＬ−２３の改変体である。１つの実施形態において、前記ＩＬ−２３の改変体は、ヒトＩＬ−２３の機能と本質的に同じである生体機能を果たし、ヒトＩＬ−２３のものと実質的に同じ構造および実質的に同じ前記アプタマーへの結合能力を有する。
【００２４】
１つの実施形態において、ヒトＩＬ−２３またはその改変体は、配列番号４および／または５を含む配列と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、さらに好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。もう１つの実施形態において、ヒトＩＬ−２３またはその改変体は、配列番号４および５を含むアミノ酸配列を有する。
【００２５】
１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、約１００ｎＭまたはそれ以下、好ましくは５０ｎＭまたはそれ以下、さらに好ましくは１０ｎＭまたはそれ以下、さらにより好ましくは１ｎＭまたはそれ以下の、ヒトＩＬ−２３またはその改変体に対する解離定数を有する。
【００２６】
１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、ヒトＩＬ−２３またはその改変体の機能を調節する。１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、ヒトＩＬ−２３の機能を刺激する。もう１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、ヒトＩＬ−２３またはその改変体の機能を阻害する。さらにもう１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、ヒトＩＬ−２３またはその改変体の機能をインビボで阻害する。さらにもう１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、ＩＬ−２３がＩＬ−２３受容体に結合するのを防止する。幾つかの実施形態において、本発明のアプタマーによって調節されるヒトＩＬ−２３またはその改変体の機能は、自己免疫疾患（多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデスおよび過敏性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）を含むが、これらに限定されない）、炎症性疾患、癌（結腸癌、肺癌および肺転移を含むが、これらに限定されない）、骨粗しょう症における骨吸収、ならびにＩ型糖尿病などの、ヒトＩＬ−２３に関連した疾患の媒介をすることである。
【００２７】
１つの実施形態において、本発明アプタマーは、配列番号１３−６６、配列番号７１−８８、配列番号９１−９６、配列番号１０３−１１８、配列番号１２４−１３０、配列番号１３５−１５９、配列番号１６２、配列番号１６４−１７２、配列番号１７６−１７８、配列番号１８１−１９６、および配列番号２０３−３１４から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーのものと実質的に同じヒトＩＬ−２３への結合能力を有する。もう１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、配列番号１３−６６、配列番号７１−８８、配列番号９１−９６、配列番号１０３−１１８、配列番号１２４−１３０、配列番号１３５−１５９、配列番号１６２、配列番号１６４−１７２、配列番号１７６−１７８、配列番号１８１−１９６、および配列番号２０３−３１４から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーのものと実質的に同じ構造および実質的に同じヒトＩＬ−２３への結合能力を有する。
【００２８】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１３−６６、配列番号７１−８８、配列番号９１−９６、配列番号１０３−１１８、配列番号１２４−１３０、配列番号１３５−１５９、配列番号１６２、配列番号１６４−１７２、配列番号１７６−１７８、配列番号１８１−１９６、および配列番号２０３−３１４から成る群より選択される配列のうちのいずれか１つと少なくとも８０％同一、さらに好ましくは少なくとも９０％同一である核酸配列を含む、ヒトＩＬ−２３に結合するアプタマーを提供する。もう１つの実施形態において、本発明は、配列番号１３−６６、配列番号７１−８８、配列番号９１−９６、配列番号１０３−１１８、配列番号１２４−１３０、配列番号１３５−１５９、配列番号１６２、配列番号１６４−１７２、配列番号１７６−１７８、配列番号１８１−１９６、および配列番号２０３−３１４から成る群より選択される配列のうちのいずれか１つの固有の配列領域における連続する４ヌクレオチド、８ヌクレオチドまたは２０ヌクレオチドの配列と同一である、連続する４ヌクレオチド、好ましくは連続する８ヌクレオチド、さらに好ましくは連続する２０ヌクレオチドを含むアプタマーを提供する。さらにもう１つの実施形態において、本発明は、配列番号１３−６６、配列番号７１−８８、配列番号９１−９６、配列番号１０３−１１８、配列番号１２４−１３０、配列番号１３５−１５９、配列番号１６２、配列番号１６４−１７２、配列番号１７６−１７８、配列番号１８１−１９６、および配列番号２０３−３１４から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む、ヒトＩＬ−２３またはその改変体に結合することができるアプタマーを提供する。もう１つの実施形態において、本発明は、配列番号１７７、好ましくは配列番号２２４、さらに好ましくは配列番号３０９、さらに好ましくは配列番号３１０、およびさらに好ましくは配列番号３１１に記載の配列を有するアプタマーを提供する。
【００２９】
１つの実施形態において、本発明は、マウスＩＬ−２３に特異的に結合するアプタマーを提供する。もう１つの実施形態において、本発明は、マウスＩＬ−２３の機能と本質的に同じである生体機能を果たし、マウスＩＬ−２３のものと実質的に同じ構造および実質的に同じそのアプタマーへの結合能力を有するマウスＩＬ−２３の改変体に結合するアプタマーを提供する。
【００３０】
１つの実施形態において、本発明のアプタマーが結合するマウスＩＬ−２３またはその改変体は、配列番号３１５および／または３１６を含む配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。もう１つの実施形態において、マウスＩＬ−２３またはその改変体は、配列番号３１５および３１６を含むアミノ酸配列を有する。
【００３１】
１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、約１００ｎＭまたはそれ以下、好ましくは５０ｎＭまたはそれ以下、さらに好ましくは１０ｎＭまたはそれ以下のマウスＩＬ−２３またはその改変体に対する解離定数を有する。
【００３２】
１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、マウスＩＬ−２３またはその改変体の機能を調節する。１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、マウスＩＬ−２３の機能を刺激する。もう１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、マウスＩＬ−２３またはその改変体の機能を阻害する。さらにもう１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、ＩＬ−２３またはその改変体の機能をインビボで阻害する。さらにもう１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、マウスＩＬ−２３がマウスＩＬ−２３受容体に結合するのを防止する。幾つかの実施形態において、本発明のアプタマーによって調節されるマウスＩＬ−２３の機能は、実験的自己免疫性脳脊髄炎、マウスコラーゲン誘発関節炎およびＴＮＢＳ大腸炎などのＩＬ−２３に関連した疾患モデルの媒介である。
１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、配列番号１２４−１３４および配列番号１９９−２０２から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーのものと実質的に同じマウスＩＬ−２３への結合能力を有する。もう１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、配列番号１２４−１３４および配列番号１９９−２０２から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーのものと実質的に同じ構造および実質的に同じマウスＩＬ−２３への結合能力を有する。
【００３３】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１２４−１３４および配列番号１９９−２０２から成る群より選択される配列のうちのいずれか１つと少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも９０％同一の核酸配列を含む、マウスＩＬ−２３に結合するアプタマーを提供する。もう１つの実施形態において、本発明は、配列番号１２４−１３４および配列番号１９９−２０２から成る群より選択される配列のうちのいずれか１つの固有の配列領域における連続する４ヌクレオチド、連続する８ヌクレオチドまたは連続する２０ヌクレオチドと同一である、連続する４ヌクレオチド、好ましくは連続する８ヌクレオチド、さらに好ましくは連続する２０ヌクレオチドを含むアプタマーを提供する。もう１つの実施形態において、本発明は、配列番号１２４−１３４および配列番号１９９−２０２から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む、マウスＩＬ−２３またはその改変体に結合することができるアプタマーを提供する。
【００３４】
１つの実施形態において、本発明の物質は、ＩＬ−１２に特異的に結合するアプタマーを提供する。１つの実施形態において、本発明のアプタマーが結合するＩＬ−１２は、ヒトＩＬ−１２であるが、もう１つの実施形態では、ＩＬ−１２は、ヒトＩＬ−１２の改変体である。１つの実施形態において、前記ＩＬ−１２の改変体は、ヒトＩＬ−１２の機能と本質的に同じである生体機能を果たし、ならびにヒトＩＬ−１２のものと実質的に同じ構造および実質的に同じそのアプタマーに結合する能力を有する。
【００３５】
１つの実施形態において、ヒトＩＬ−１２またはその改変体は、配列番号４および／または６を含む配列と少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。もう１つの実施形態において、ヒトＩＬ−１２またはその改変体は、配列番号４および６を含むアミノ酸配列を有する。
１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、ヒトＩＬ−１２またはその改変体の機能を調節する。１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、ヒトＩＬ−２３の機能を刺激する。もう１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、ヒトＩＬ−１２またはその改変体の機能を阻害する。さらにもう１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、ヒトＩＬ−１２またはその改変体の機能をインビボで阻害する。さらにもう１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、ＩＬ−１２がＩＬ−１２受容体に結合するのを防止する。１つの実施形態において、本発明のアプタマーにより調節されるヒトＩＬ−１２またはその改変体の機能は、自己免疫疾患（多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデスおよび過敏性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）を含むが、これらに限定されない）、炎症性疾患、癌（結腸癌、肺癌および肺転移を含むが、これらに限定されない）、骨粗しょう症における骨吸収、ならびにＩ型糖尿病などの、ヒトＩＬ−１２に関連した疾患の媒介である。
【００３６】
１つの実施形態において、本発明は、リボ核酸またはデオキシリボ核酸のいずれかであるアプタマーを提供する。さらなる実施形態において、これらのリボ核酸アプタマーまたはデオキシリボ核酸アプタマーは、１本鎖である。もう１つの実施形態において、本発明は、少なくとも１つの化学修飾を含むアプタマーを提供する。１つの実施形態において、前記修飾は、核酸の、糖位置での化学的置換、リン酸位置での化学的置換および塩基位置での化学的置換；修飾ヌクレオチドの組み込み；３’キャッピング；高分子量、非免疫原性化合物への結合体化；親油性化合物への結合体化；ならびリン酸骨格修飾から成る群より選択される。１つの実施形態において、本発明のアプタマーに結合体化させる非免疫原性、高分子量化合物は、ポリアルキレングリコール、好ましくはポリエチレングリコールである。１つの実施形態において、前記骨格修飾は、１つまたはそれ以上のホスホロチオエートのリン酸エステル骨格への組み込みを含む。もう１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、リン酸エステル骨格における１０より少ない、６より少ない、または３より少ないホスホロチオエートの組み込みを含む。
【００３７】
１つの実施形態において、本発明の物質は、配列番号１３−６６、配列番号７１−８８、配列番号９１−９６、配列番号１０３−１１８、配列番号１２４−１３０、配列番号１３５−１５９、配列番号１６２、配列番号１６４−１７２、配列番号１７６−１７８、配列番号１８１−１９６、および配列番号２０３−３１４から成る群より選択される核酸配列を含むアプタマーまたはその塩の治療有効量および薬学的に受容可能な担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。もう１つの実施形態において、本発明の物質は、配列番号１４、配列番号１７−１９、配列番号２１、配列番号２７−３２、配列番号３４−４０、配列番号４２、配列番号４９、配列番号６０−６１、配列番号９１−９２、配列番号９４、および配列番号１０３−１１８から成る群より選択される核酸配列を含む、治療有効量のアプタマーまたはその塩および薬学的に受容可能な担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。好ましい実施形態において、本発明の物質は、配列番号１７７、配列番号２２４および配列番号３０９−３１２から成る群より選択される核酸配列を含むアプタマーの治療有効量を含む医薬組成物を提供する。
【００３８】
１つの実施形態において、本発明は、ＩＬ−２３によって媒介される疾患を治療、予防または改善する方法を提供し、この方法は、配列番号１３−６６、配列番号７１−８８、配列番号９１−９６、配列番号１０３−１１８、配列番号１２４−１３０、配列番号１３５−１５９、配列番号１６２、配列番号１６４−１７２、配列番号１７６−１７８、配列番号１８１−１９６、および配列番号２０３−３１４から成る群より選択される核酸配列を含むアプタマーの治療有効量を含む組成物を脊椎動物に投与することを含む。もう１つの実施形態において、本発明は、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２により媒介される疾患を治療、予防または改善する方法を提供し、この方法は、配列番号１４、配列番号１７−１９、配列番号２１、配列番号２７−３２、配列番号３４−４０、配列番号４２、配列番号４９、配列番号６０−６１、配列番号９１−９２、配列番号９４、および配列番号１０３−１１８から成る群より選択される核酸配列を含むアプタマーの治療有効量を含む組成物を脊椎動物に投与することを含む。好ましい実施形態において、脊椎動物に投与される、アプタマーの治療有効量を含む前記組成物は、配列番号１７７、配列番号２２４および配列番号３０９−３１２から成る群より選択される核酸配列を含む。１つの実施形態において、前記医薬組成物が投与される脊椎動物は、哺乳動物である。好ましい実施形態において、前記哺乳動物は、ヒトである。
【００３９】
１つの実施形態において、本発明の方法によって治療、予防または改善される疾患は、自己免疫疾患（多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデスおよび過敏性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）を含むが、これらに限定されない）、炎症性疾患、癌（結腸癌、肺癌および肺転移を含むが、これらに限定されない）、骨粗しょう症における骨吸収、ならびにＩ型糖尿病から成る群より選択される。
【００４０】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１３−６６、配列番号７１−８８、配列番号９１−９６、配列番号１０３−１１８、配列番号１２４−１３４、配列番号１３５−１５９、配列番号１６２、配列番号１６４−１７２、配列番号１７６−１７８、配列番号１８１−１９６および配列番号１９９−３１４から成る群より選択される核酸配列を有するアプタマーを、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２またはその改変体を含むと推測される組成物と接触させること、ならびにＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２またはその改変体の存在または不在を検出することを含む診断方法を提供する。
【００４１】
１つの実施形態において、本発明は、インビトロ診断薬として使用するための、配列番号１３−６６、配列番号７１−８８、配列番号９１−９６、配列番号１０３−１１８、配列番号１２４−１３４、配列番号１３５−１５９、配列番号１６２、配列番号１６４−１７２、配列番号１７６−１７８、配列番号１８１−１９６および配列番号１９９−３１４から成る群より選択される核酸配列を有するアプタマーを提供する。もう１つの実施形態において、本発明は、インビボ診断薬として使用するための、配列番号１３−６６、配列番号７１−８８、配列番号９１−９６、配列番号１０３−１１８、配列番号１２４−１３４、配列番号１３５−１５９、配列番号１６２、配列番号１６４−１７２、配列番号１７６−１７８、配列番号１８１−１９６および配列番号１９９−３１４から成る群より選択される核酸配列を有するアプタマーを提供する。さらにもう１つの実施形態において、本発明は、インビボでの疾患の治療、予防または改善において使用するための、配列番号１３−６６、配列番号７１−８８、配列番号９１−９６、配列番号１０３−１１８、配列番号１２４−１３４、配列番号１３５−１５９、配列番号１６２、配列番号１６４−１７２、配列番号１７６−１７８、配列番号１８１−１９６および配列番号１９９−３１４から成る群より選択される核酸配列を有するアプタマーを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
（発明の詳細な説明）
本発明の１つまたはそれ以上の実施形態の詳細を下に添付する説明に示す。本明細書において説明されるものに類似するか、または等価のあらゆる方法および物質を本発明の実施または検定において使用することができるが、好ましい方法および物質を今から説明する。本発明の他の特徴、目的および利点は、この説明から明らかになるであろう。本明細書において、その文脈が明確に別様に指示していない限り、単数形は、複数形も包含する。別様に定義しない限り、本明細書において用いるすべての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者が一般に理解しているものと同じ意味を有する。矛盾がある場合、本明細書が支配することとなる。
【００４３】
（ＳＥＬＥＸ（商標）法）
アプタマーの作製に適する方法は、図２に一般的に図示する「指数関数的富化によるリガンドの系統的進化（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）」（「ＳＥＬＥＸ（商標）」）と題するプロセスによる。ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスは、標的分子に非常に特異的に結合することにより核酸分子をインビトロで進化させる方法であり、例えば、１９９０年６月１１日に出願され、現在は放棄されている米国特許出願番号第０７／５３６，４２８号、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」と題する米国特許第５，４７５，０９６号、および「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」と題する米国特許第５，２７０，１６３号（国際公開第９１／１９８１３号パンフレットも参照）に記載されている。各ＳＥＬＥＸ（商標）同定核酸リガンド、すなわち各アプタマーは、所定の標的化合物または分子の特異的リガンドである。ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスは、核酸が、様々な二次元および三次元構造を形成するための十分な能力と、モノマー化合物であれポリマー化合物であれ、事実上、あらゆる化合物に対してリガンドとして作用する（すなわち、特異的結合対を形成する）ための、それらの単量体内で得ることができる十分な化学的多様性とを有するというユニークな洞察に基づく。あらゆるサイズまたは組成物の分子が標的としての役割を果たすことができる。
【００４４】
ＳＥＬＥＸ（商標）は、出発点として、ランダム化配列を含む１本鎖オリゴヌクレオチドの大きなライブラリーまたはプールに依存する。前記オリゴヌクレオチドは、修飾または非修飾ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり得る。幾つかの実施例において、前記プールは、１００％ランダムまたは部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含む。他の実施例において、前記プールは、ランダム化配列内に組み込まれた少なくとも１つの固定配列および／または保存配列を含有する、ランダムまたは部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含む。他の実施例において、前記プールは、そのオリゴヌクレオチドプールのすべての分子が共有する配列を含み得る少なくとも１つの固定配列および／または保存配列をその５’および／または３’末端に含有する、ランダムまたは部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含む。固定配列は、予備選択のために組み込まれる、そのプール内のオリゴヌクレオチドに共通の配列（例えば、以下でさらに説明するＣｐＧモチーフ、ＰＣＲプライマーのためのハイブリダイゼーション部位、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列（例えば、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ７およびＳＰ６）、制限部位、またはホモポリマー配列（例えばポリＡもしくはポリＴ鎖（ｔｒａｃｔ））、触媒コア、親和性カラムへの選択的結合のための部位、ならびに対象となるオリゴヌクレオチドのクローニングおよび／または配列決定を促進する他の配列）である。保存配列は、同じ標的に結合する多数のアプタマーによって共有される、前記固定配列以外の、配列である。
【００４５】
前記プールのオリゴヌクレオチドは、ランダム化配列部分ならびに効率的な増幅に必要な固定配列を好ましくは含む。典型的に、出発プールのオリゴヌクレオチドは、３０−５０ランダムヌクレオチドの内部領域に隣接する固定５’および３’末端配列を含有する。ランダム化ヌクレオチドは、化学合成およびランダムに切断された細胞核酸からのサイズセレクションをはじめとする多数の方法で生成することができる。試験核酸における配列改変は、セレクション／増幅の反復前またはその間の突然変異誘発によって、導入または増加することもできる。
【００４６】
オリゴヌクレオチドのランダム配列部分は、いずれの長さのものであってもよく、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含んでいてもよく、ならびに修飾ヌクレオチドもしくは修飾ヌクレオチドアナログまたは非天然ヌクレオチドもしくは非天然ヌクレオチドアナログであってもよい。例えば、米国特許第５，９５８，６９１号、同第５，６６０，９８５号、同第５，９５８，６９１号、同第５，６９８，６８７号、同第５，８１７，６３５号および同第５，６７２，６９５号、ならびにＰＣＴ国際公開パンフレット第９２／０７０６５号参照。ランダムオリゴヌクレオチドは、当該分野において周知の固相オリゴヌクレオチド合成技術を用いてホスホジエステル連結型ヌクレオチドから合成することができる。例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４６７（１９８６）およびＦｒｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：５５７５−５５７８（１９８６）参照。ランダムオリゴヌクレオチドは、トリエステル合成法などの溶液相法（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用して合成することもできる。例えば、Ｓｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．４：２５５７（１９９７）およびＨｉｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，２８：２４４９（１９７８）参照。自動ＤＮＡ合成装置で行われる代表的な合成は、１０１４−１０１６個（大部分のＳＥＬＥＸ（商標）実験にとって十分な数）の個別の分子を生じる。配列設計における十分に大きなランダム配列領域により、各合成分子が、非反復配列を示すような可能性が高くなる。
【００４７】
オリゴヌクレオチドの出発ライブラリーは、ＤＮＡ合成装置での自動化学合成により作製することができる。ランダム化配列を合成するには、ヌクレオチドをランダムに組み込むことができるように、４種すべてのヌクレオチドの混合物を合成プロセス中の各ヌクレオチド添加段階で添加する。上で述べたように、一実施形態でのランダムオリゴヌクレオチドは、完全ランダム配列を含むが、他の実施形態でのランダムオリゴヌクレオチドは、ランダムでないストレッチまたは部分的にランダムな配列を含み得る。部分的にランダムな配列は、４種のヌクレオチドを各添加段階において異なるモル比で添加することによって作ることができる。
【００４８】
オリゴヌクレオチドの出発ライブラリーは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得る。ＲＮＡライブラリーを出発ライブラリーとして使用すべき場合、典型的には、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたは修飾Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロでＤＮＡライブラリーを転写することによりそれを作製し、精製する。その後、そのＲＮＡまたはＤＮＡライブラリーを結合に好適な条件下で標的と混合し、同じ一般セレクション方式を用いる結合、分配および増幅の段階的な反復に供して、結合親和性および選択性の事実上あらゆる望ましい基準を達成する。より具体的には、核酸の出発プールを含有する混合物により開始するＳＥＬＥＸ（商標）法は、次の段階を含む：（ａ）結合に好適な条件下で前記混合物と標的を接触させる段階；（ｂ）標的分子に特異的に結合した核酸から未結合の核酸を分配する段階；（ｃ）核酸−標的複合体を解離する段階；（ｄ）その核酸−標的複合体から解離した核酸を増幅して、核酸のリガンド富化混合物を生じさせる段階；ならびに（ｅ）前記結合、分配、解離および増幅段階を、標的分子に対して特異性が高くかつ高親和性核酸リガンドを生じさせるために望まれるだけのサイクル数、繰り返す段階。ＲＮＡアプタマーを選択する場合、ＳＥＬＥＸ（商標）法は、さらに次の段階を含む：（ｉ）段階（ｄ）における増幅の前に、核酸−標的複合体から解離した核酸を逆転写する段階；および（ｉｉ）そのプロセスを再始動させる前に、段階（ｄ）からの増幅された核酸を転写する段階。
【００４９】
多数の可能な配列および構造を含む核酸混合物の中には、所定の標的に対する広範な結合親和性が存在する。例えば、２０ヌクレオチドのランダム化セグメントを含む核酸混合物は、４２０個の可能性のある候補を有し得る。標的に対する親和定数が、より高いものは、その標的に結合する可能性が最も高い。分配、解離および増幅後、より高い結合親和性候補が富化された第二の核酸混合物が作製される。追加のセレクションラウンドは、結果として生じる核酸混合物が主として１つだけまたは数個の配列から成るまで、漸進的に最良のリガンドに好都合に働く。その後、これらをクローニングし、配列決定し、純粋なリガンドまたはアプタマーとして結合親和性について個々に検定することができる。
【００５０】
セレクションおよび増幅のサイクルは、所望の目標を達成するまで繰り返す。最も一般的な場合、セレクション／増幅は、サイクルの反復により結合強度の有意な改善が達成されなくなるまで継続する。典型的にはこの方法を用いて、約１０１４個の異なる核酸種をサンプリングするが、約１０１８個もの多さの異なる核酸種をサンプリングすることもできる。一般に、核酸アプタマー分子は、５から２０サイクルの手順で選択される。１つの実施形態において、不均質性は、初期のセレクション段階でしか導入されず、反復プロセス全体にわたっては発生しない。
【００５１】
ＳＥＬＥＸ（商標）の１つの実施形態において、セレクションプロセスは、選択される標的に最も強く結合する核酸リガンドを単離するのに有効であるため、セレクションと増幅とのサイクルを１つしか必要としない。例えば、カラムが親和性が最も高い核酸リガンドの分離および単離を十分に可能ならしめる様式で、カラムに結合した標的と会合する核酸の能力が機能するクロマトグラフタイプのプロセスにおいて、こうした有効なセレクションが発生し得る。
【００５２】
多くの場合、単一の核酸リガンドが同定されるまでＳＥＬＥＸ（商標）の反復段階を行うことが必ずしも望ましいとは限らない。標的特異的核酸リガンド溶液は、多数の保存配列、および標的に対する核酸リガンドの親和性に有意な影響を及ぼすことなく置換または付加させることができる多数の配列を有する核酸構造またはモチーフのファミリーを含むことができる。完了前にＳＥＬＥＸ（商標）プロセスを停止させることにより、その核酸リガンド溶液ファミリーの多数のメンバーの配列を決定することができる。
【００５３】
様々な核酸一次構造、二次構造および三次構造が存在することは公知である。非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型相互作用に関係していることが最も一般的に証明されている構造またはモチーフは、ヘアピンループ、対称および非対称バルジ、シュードノット（ｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔｓ）およびこれらの無数の組み合わせで呼ばれる。こうしたモチーフについて知られているほぼすべての事例が、３０ヌクレオチド以下の核酸配列の中でそれらが形成され得ることを示唆している。この理由から、隣接するランダム化配列を用いるＳＥＬＥＸ（商標）手順は、約２０ヌクレオチドと約５０ヌクレオチドの間、幾つかの実施形態では約３０ヌクレオチドと約４０ヌクレオチドの間のランダム化セグメントを含有する核酸配列で出発することが、多くの場合、好ましい。一実施例では、５’固定：ランダム：３’固定配列は、約３０ヌクレオチドから約５０ヌクレオチドのランダム配列を含む。
【００５４】
中心となるＳＥＬＥＸ（商標）法は、多数の特定の目的を達成するように改変されている。例えば、米国特許第５，７０７，７９６号には、曲がった（ｂｅｎｔ）ＤＮＡなどの特定の構造的特徴を有する核酸分子を選択するためのゲル電気泳動とＳＥＬＥＸ（商標）の併用が記載されている。米国特許第５，７６３，１７７号には、標的分子に結合および／または光架橋し得る光反応性基、ならびに／または標的分子を光不活性化し得る光反応性基を含有する核酸リガンドを選択するための、ＳＥＬＥＸ（商標）をベースにした方法が記載されている。米国特許第５，５６７，５８８号および同第５，８６１，２５４号には、標的分子に対して高い親和性を有するオリゴヌクレオチドと低い親和性を有するオリゴヌクレオチドとの間の非常に有効な分配を達成する、ＳＥＬＥＸ（商標）をベースにした方法が記載されている。米国特許第５，４９６，９３８号には、ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスを行った後、改善された核酸リガンドが得るための方法が記載されている。米国特許第５，７０５，３３７号には、リガンドをその標的に共有結合させるための方法が記載されている。
【００５５】
ＳＥＬＥＸ（商標）を用いて、標的分子上の１つより多い部位に結合する核酸リガンドを得ること、および標的上の特定の部位に結合する非核酸種を含む核酸リガンドを得ることもできる。ＳＥＬＥＸ（商標）は、大きな生体分子および小さな生体分子、例えば、核酸結合タンパク質およびそれらの生体機能の一部として核酸に結合することが知られていないタンパク質ならびに補助因子および他の小分子をはじめとする想定されるあらゆる標的に結合する核酸リガンドを単離および同定するための手段を提供する。例えば、米国特許第５，５８０，７３７号には、カフェインおよび近縁のアナログ、テオフィリンに高い親和性で結合することができる、ＳＥＬＥＸ（商標）により同定された核酸配列が開示されている。
【００５６】
Ｃｏｕｎｔｅｒ−ＳＥＬＥＸ（商標）は、１つまたはそれ以上の非標的分子に対する交差反応性を有する核酸リガンド配列を除去することにより、標的分子への核酸リガンドの特異性を向上させる方法である。Ｃｏｕｎｔｅｒ−ＳＥＬＥＸ（商標）は、次の工程から成る：（ａ）核酸の候補混合物を調製する工程；（ｂ）候補混合物を標的と接触させる工程（この場合、その候補混合物を基準にしてその標的への親和性が増加した核酸と、その候補混合物の残りとを分配することができる）；（ｃ）候補混合物の残りから親和性が増加した核酸を分配する工程；（ｄ）親和性が増加した核酸を標的から解離させる工程；（ｅ）親和性が増加した核酸と１つ以上の非標的分子を接触させて、非標的分子に対して特異的親和性を有する核酸を除去する工程；ならびに（ｆ）標的分子のみに特異的な親和性を有する核酸を増幅して、標的分子に対する結合について比較的高い親和性および特異性を有する核酸配列が富化された核酸混合物を得る工程。ＳＥＬＥＸ（商標）について上で説明したように、セレクションと増幅とのサイクルは、所望の目的が達成されるまで、必要に応じて繰り返す。
【００５７】
治療薬およびワクチンとして核酸を使用する際に遭遇する１つの潜在的問題は、ホスホジエステル形態のオリゴヌクレオチドが、所望の効果が証明される前にエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼなどの細胞内および細胞外酵素により体液中で急速に分解され得ることである。それ故、ＳＥＬＥＸ（商標）法は、改善された特性（例えば、改善されたインビボ安定性または改善された送達特性）をリガンドに付与する修飾ヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンドの同定を包含する。こうした修飾の例には、リボースおよび／またはリン酸エステルおよび／または塩基位置での化学的置換が挙げられる。修飾ヌクレオチドを含有するＳＥＬＥＸ（商標）同定核酸リガンドは、例えば、米国特許第５，６６０，９８５号（リボースの２’位、ピリミジンの５位およびプリンの８位で化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドが記載されている）、同第５，７５６，７０３号（様々な２’修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドが記載されている）、および同第５，５８０，７３７号（２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）置換基で修飾された１つまたはそれ以上のヌクレオチドを含有する特異性の高い核酸リガンドが記載されている）に記載されている。
【００５８】
本発明において意図される核酸リガンドの修飾としては、核酸リガンド塩基または核酸リガンド全体に追加の電荷、分極性、疎水性、水素結合、静電相互作用および流動性を組み込む他の化学基を供給する修飾が挙げられるが、これらに限定されない。ヌクレアーゼに耐性であるオリゴヌクレオチド集団を作製する修飾としては、１つまたはそれ以上の置換ヌクレオチド間連結、糖の変更、塩基の変更またはこれらの組み合わせも挙げられ得る。こうした修飾としては、２’位糖修飾、５位ピリミジン修飾、８位プリン修飾、環外アミンでの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモもしくは５−ヨード−ウラシルの置換；骨格修飾、ホスホロチオエートもしくはアルキルリン酸エステル修飾、メチル化、およびイソ塩基イソシチジンとイソグアノシンなどの異常な塩基対の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。修飾は、キャッピングなどの３’および５’修飾も包含し得る。
【００５９】
１つの実施形態において、Ｐ（Ｏ）Ｏ基が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート）」、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）または３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）［これらの式中、ＲまたはＲ’は、独立して、Ｈまたは置換アルキルもしくは非置換アルキルである］で置換されているオリゴヌクレオチドを提供する。連結基は、−Ｏ−、−Ｎ−または−Ｓ−連結により隣接するヌクレオチドに取り付けることができる。オリゴヌクレオチド中のすべての連結が同じである必要はない。本明細書で用いる場合、用語ホスホロチオエートは、１つまたはそれ以上の硫黄原子により置換された、ホスホジエステル結合の中の１つまたはそれ以上の非架橋酸素原子を含む。
【００６０】
さらなる実施形態において、オリゴヌクレオチドは、修飾糖基を含み、例えば、ヒドロキシル基の１つまたはそれ以上が、ハロゲン、脂肪族基で置換されているか、エーテルまたはアミンとして官能化されている。１つの実施形態において、フラノース残基の２’位は、Ｏ−メチル、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリル、Ｓ−アルキル、Ｓ−アリールまたはハロ基によって置換されている。２’修飾糖の合成方法は、例えば、Ｓｐｒｏａｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：７３３−７３８（１９９１）；Ｃｏｔｔｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：２６２９−２６３５（１９９１）；およびＨｏｂｂｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：５１３８−５１４５（１９７３）に記載されている。他の修飾は、当業者に公知である。そうした修飾は、プレＳＥＬＥＸ（商標）プロセス修飾であってもよいし、ポストＳＥＬＥＸ（商標）プロセス修飾（以前に同定された未修飾リガンドの修飾）であってもよく、またはＳＥＬＥＸ（商標）プロセスへの組み込みによって行ってもよい。
【００６１】
プレＳＥＬＥＸ（商標）プロセス修飾またはＳＥＬＥＸ（商標）プロセスに組み込むことによって行われる修飾は、それらのＳＥＬＥＸ（商標）標的に対する特異性と、改善された安定性、例えばインビボ安定性、の両方を有する核酸リガンドをもたらす。核酸リガンドに対して行われるポストＳＥＬＥＸ（商標）プロセス修飾は、核酸リガンドの結合能力に有害な影響を及ぼすことなく、改善された安定性、例えばインビボ安定性をもたらすことができる。
【００６２】
米国特許第５，６３７，４５９号および同第５，６８３，８６７号に記載されているようなＳＥＬＥＸ（商標）法は、選択されたオリゴヌクレオチドと他の選択されたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド機能単位との併用を含む。例えば、米国特許第６，０１１，０２０号および同第６，０５１，６９８号ならびにＰＣＴ国際公開パンフレット第９８／１８４８０号に記載されているようなＳＥＬＥＸ（商標）法は、診断用または治療用複合体における選択された核酸リガンドと親油性または非免疫原性高分子量化合物との併用をさらに含む。これらの特許および出願は、オリゴヌクレオチドの有効な増幅および複製特性ならびに他の分子の望ましい特性と、幅広い多数の形状および他の特性との組み合わせを教示している。
【００６３】
ＳＥＬＥＸ（商標）法による小さな可撓性ペプチドへの核酸リガンドの同定も探究されている。小さなペプチドは、可撓性構造を有し、通常、多数の配座異性体が平衡している状態にある溶液で存在し、それ故、可撓性ペプチドに結合することにより喪失される配座エントロピーによって結合親和性が制限され得ると最初は考えられていた。しかし、米国特許第５，６４８，２１４号において、溶液の小さなペプチドに対する核酸リガンドの同定を実行できることが実証された。この特許では、物質Ｐ、１１アミノ酸のペプチドに対する高親和性ＲＮＡ核酸リガンドを同定した。
【００６４】
本発明の標的への特異性および結合親和性を有するアプタマーは、典型的には、本明細書に記載されるＳＥＬＥＸ（商標）プロセスによって選択する。ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスの一部として、標的に結合するために選択された配列を、その後、必要に応じて、所望の結合親和性を有する最小配列を最小限に決定する。必要に応じて、それらの選択された配列および／または最小化された配列は、結合親和性を増大させるため、あるいはその配列において、どの位置が結合活性に必須であるかを判定するために、その配列のランダム突然変異誘発または定方向突然変異誘発を行うことにより最適化される。加えて、修飾ヌクレオチドが組み込まれている配列による選択を行って、インビボでの分解に対してアプタマー分子を安定化させ得る。
【００６５】
（２’修飾ＳＥＬＥＸ（商標））
アプタマーが治療薬としての使用に適するには、合成の費用が嵩まず、安全であり、インビボで安定であることが好ましい。野生型ＲＮＡおよびＤＮＡアプタマーは、ヌクレアーゼによる分解を受けやすいため、一般にはインビボで安定ではない。ヌクレアーゼ分解に対する耐性は、２’位に修飾基を組み込むことによって大いに増大させることができる。
【００６６】
フルオロ基およびアミノ基は、後にアプタマーが選択されるオリゴヌクレオチドプールへの組み込みに成功している。しかし、これらの修飾は、結果として生じるアプタマーの合成コストを大いに上昇させ、そして場合によっては安全性の懸念を生じさせることもある。修飾オリゴヌクレオチドが分解され、その後、そのヌクレオチドがＤＮＡ合成のための基質として使用されることにより、修飾ヌクレオチドが宿主ＤＮＡに再循環され得るためである。
【００６７】
本明細書において提供するような、２’−Ｏ−メチル（「２’−ＯＭｅ」）ヌクレオチドを含有するアプタマーは、これらの欠点の多くを克服する。２’−ＯＭｅヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドは、耐ヌクレアーゼ性であり、合成の費用が嵩まない。２’−ＯＭｅヌクレオチドは、生体系のいたるところで見出せるが、天然ポリメラーゼは、生理条件下で２’−ＯＭｅ  ＮＴＰを基質として受け入れず、それ故、宿主ＤＮＡへの２’−ＯＭｅヌクレオチドの再循環に関する安全性の懸念はない。２’修飾アプタマーを作製するために用いられるＳＥＬＥＸ（商標）法は、例えば、２００２年１２月３日出願の米国仮特許出願番号第６０／４３０，７６１号、２００３年７月１５日出願の米国特許仮出願番号第６０／４８７，４７４号、２００３年１１月４日出願の米国特許仮出願番号第６０／５１７，０３９号、２００３年１２月３日出願の米国特許出願第１０／７２９，５８１号、および２００４年６月２１日出願の「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」と題する米国特許出願第１０／８７３，８５６号（各々の全体が、本明細書において参考として援用される）に記載されている。
【００６８】
本発明は、酵素的分解および化学的分解ならびに熱および物理的分解に対してオリゴヌクレオチドを未修飾オリゴヌクレオチドよりも安定にするために修飾ヌクレオチド（例えば、２’位に修飾を有するヌクレオチド）を含有する、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合し、それらの機能を調節するアプタマーを含む。２’−ＯＭｅ含有アプタマーの幾つかの例が文献にある（例えば、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２，６８３−６９５，１９９５参照）が、これらは、ＣおよびＵ残基が２’−フルオロ（２’−Ｆ）置換された修飾転写産物ならびにＡおよびＧ残基が２’−ＯＨ置換された修飾転写産物のライブラリーのインビトロセレクションによって作製された。機能的配列を同定したところ、各ＡおよびＧ残基を２’−ＯＭｅ置換に対する許容度について検定し、２’−ＯＭｅ残基として２’−ＯＭｅ置換を許容するすべてのＡおよびＧ残基を有するアプタマーを再び合成した。この二段階方式で作製されたアプタマーのＡおよびＧ残基の大部分は、２’−ＯＭｅ残基による置換を許容するが、平均して約２０％は許容しない。従って、この方法を用いて作製されるアプタマーは、２〜４個の２’−ＯＨ残基を含有する傾向があり、結果として安定性と合成コストが損なわれる。ＳＥＬＥＸ（商標）（および／または本明細書に記載のものをはじめとする、その変形および改善）によりアプタマーを選択し、富化するオリゴヌクレオチドプールにおいて使用される安定化オリゴヌクレオチドを作製する転写反応に修飾ヌクレオチドを取り入れることによって、（例えば、修飾ヌクレオチドを有するアプタマーオリゴヌクレオチドを再合成することにより）本発明の方法は、選択されたアプタマーオリゴヌクレオチドを安定化する必要をなくしている。
【００６９】
１つの実施形態において、本発明は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰおよびＵＴＰヌクレオチドの２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシおよび２’−ＯＭｅ修飾の組み合わせを含むアプタマーを提供する。もう１つの実施形態において、本発明は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰおよびＵＴＰヌクレオチドの２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシ、２’−ＯＭｅ、２’−ＮＨ２および２’−メトキシエチル修飾の組み合わせを含むアプタマーを提供する。もう１つの実施形態において、本発明は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰおよびＵＴＰヌクレオチドの２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシ、２’−ＯＭｅ、２’−ＮＨ２および２’−メトキシエチル修飾の５６通りの組み合わせを含むアプタマーを提供する。
【００７０】
本発明の２’修飾アプタマーは、野生型ポリメラーゼのものより高い、フラノースの２’位における嵩高い置換基を有する修飾ヌクレオチドの組み込み率を有する、修飾ポリメラーゼ、例えば修飾Ｔ７ポリメラーゼを使用して作ることができる。例えば、６３９位のチロシン残基をフェニルアラニンに変更した単一突然変異Ｔ７ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｆ）は、２’デオキシ、２’アミノ−および２’フルオロ−ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を基質として容易に利用し、ならびにこれは、様々な用途のための修飾ＲＮＡの合成に幅広く使用されている。しかし、報告されるところによると、この突然変異Ｔ７ポリメラーゼは、２’−ＯＭｅまたは２’−アジド（２’−Ｎ３）置換基などの嵩高い２’−置換基を有するＮＴＰを容易に利用（すなわち、組み込む）ことができない。嵩高い２’置換基の組み込みについては、Ｙ６３９Ｆ突然変異に加えて７８４位のヒスチジンをアラニン残基に変更した二重Ｔ７ポリメラーゼ突然改変体（Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ）が記載されており、修飾ピリミジンＮＴＰを組み込むための制限された環境下で使用されている。Ｐａｄｉｌｌａ，Ｒ．ａｎｄ  Ｓｏｕｓａ，Ｒ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００２，３０（２４）：１３８参照。７８４位のヒスチジンをアラニン残基に変更した単一突然変異Ｔ７ポリメラーゼ（Ｈ７８４Ａ）も記載されている。Ｐａｄｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，３０：１３８。Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ二重突然変異Ｔ７ポリメラーゼとＨ７８４Ａ単一突然変異Ｔ７ポリメラーゼの両方において、アラニンなどのより小さなアミノ酸残基への変更によって、より嵩高いヌクレオチド基質、例えば２’−ＯＭｅ置換ヌクレオチドの組み込みが可能となる。
【００７１】
一般に、本明細書において開示する条件下、Ｙ６９３Ｆ単一突然改変体は、ＧＴＰを除くすべての２’−ＯＭｅ置換ＮＴＰの組み込みに使用でき、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ二重突然改変体は、ＧＴＰを含むすべての２’−ＯＭｅ置換ＮＴＰの組み込みに使用できることが判明した。Ｈ７８４Ａ単一突然改変体は、本明細書において開示する条件下で使用される、Ｙ６３９ＦおよびＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ突然改変体に類似した特性を有すると予想される。
【００７２】
２’修飾オリゴヌクレオチドは、完全な修飾ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドのサブセットを用いて合成することができる。修飾は、同じであってもよいし、異なっていてもよい。すべてのヌクレオチドが、修飾され得、且つ、すべてが同じ修飾を含み得る。すべてのヌクレオチドが修飾され得るが、異なる修飾を含有し得る。例えば、同じ塩基を含有するすべてのヌクレオチドが、１つのタイプの修飾を有し得る一方で、他の塩基を含有するヌクレオチドが、異なるタイプの修飾を有し得る。すべてのプリンヌクレオチドが、１つのタイプの修飾を有し得る（または未修飾である）一方で、すべてのピリミジンヌクレオチドは、別の異なるタイプの修飾を有する（または未修飾である）。このように、転写産物または転写産物のプールは、例えば、リボヌクレオチド（２’−ＯＨ）、デオキシリボヌクレオチド（２’−デオキシ）、２’−Ｆおよび２’−ＯＭｅヌクレオチドをはじめとする修飾の任意の組み合わせを利用して作製される。２’−ＯＭｅ  ＣおよびＵ、ならびに２’−ＯＨ  ＡおよびＧを含有する転写混合物は、「ｒＲｍＹ」混合物と呼ばれ、それらから選択されるアプタマーは、「ｒＲｍＹ」アプタマーと呼ばれる。デオキシＡおよびＧ、ならびに２’−ＯＭｅ  ＵおよびＣを含有する転写混合物は、「ｄＲｍＹ」混合物と呼ばれ、それらから選択されるアプタマーは、「ｄＲｍＹ」アプタマーと呼ばれる。２’−ＯＭｅ  Ａ、ＣおよびＵ、ならびに２’−ＯＨ  Ｇを含有する転写混合物は、「ｒＧｍＨ」混合物と呼ばれ、それらから選択されるアプタマーは、「ｒＧｍＨ」アプタマーと呼ばれる。２’−ＯＭｅ  Ａ、Ｃ、ＵおよびＧ、ならびに２’−ＯＭｅ  Ａ、ＵおよびＣ、ならびに２’−Ｆ  Ｇを代替的に含有する転写混合物は、「代替混合物」と呼ばれ、それらから選択されるアプタマーは、「代替混合物」アプタマーと呼ばれる。２’−ＯＭｅ、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧを含有する転写混合物は、そのＧの１０％までがリボヌクレオチドである場合、「ｒ／ｍＧｍＨ」混合物と呼ばれ、それらから選択されるアプタマーは、「ｒ／ｍＧｍＨ」アプタマーと呼ばれる。２’−ＯＭｅ  Ａ、ＵおよびＣ、ならびに２’−Ｆ  Ｇを含有する転写混合物は、「ｆＧｍＨ」混合物と呼ばれ、それらから選択されるアプタマーは、「ｆＧｍＨ」アプタマーと呼ばれる。２’−ＯＭｅ  Ａ、ＵおよびＣ、ならびにデオキシＧを含有する転写混合物は、「ｄＧｍＨ」混合物と呼ばれ、それらから選択されるアプタマーは、「ｄＧｍＨ」アプタマーと呼ばれる。デオキシＡならびに２’−ＯＭｅ  Ｃ、ＧおよびＵを含有する転写混合物は、「ｄＡｍＢ」混合物と呼ばれ、それらから選択されるアプタマーは、「ｄＡｍＢ」アプタマーと呼ばれ、そしてすべての２’−ＯＨヌクレオチドを含有する転写混合物は、「ｒＮ」混合物と呼ばれ、それらから選択されるアプタマーは、「ｒＮ」または「ｒＲｒＹ」アプタマーと呼ばれる。「ｍＲｍＹ」アプタマーは、すべての２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有するアプタマーであり、可能な場合には２’−ＯＭｅ  Ｇによる任意の２’−ＯＨ  ＧのポストＳＥＬＥＸ（商標）置換によって、ｒ／ｍＧｍＨオリゴヌクレオチドから、通常、誘導される。
【００７３】
好ましい実施形態は、２’−ＯＨ、２’−デオキシおよび２’−ＯＭｅヌクレオチドの任意の組み合わせを含む。さらに好ましい実施形態は、２’−デオキシヌクレオチドと２’−ＯＭｅヌクレオチドの任意の組み合わせを含む。さらにより好ましい実施形態は、ピリミジンが２’−ＯＭｅである２’−デオキシヌクレオチドと２’−ＯＭｅヌクレオチドの任意の組み合わせ（例えば、ｄＲｍＹ、ｍＲｍＹまたはｄＧｍＨ）を有するものである。
【００７４】
本発明のアプタマーへの修飾ヌクレオチドの組み込みは、セレクションプロセスの前（プレ）に遂行される（例えば、プレＳＥＬＥＸ（商標）プロセス修飾）。場合により、修飾ヌクレオチドがプレＳＥＬＥＸ（商標）プロセス修飾により組み込まれる本発明のアプタマーは、ポストＳＥＬＥＸ（商標）プロセス修飾によりさらに修飾することができる（すなわち、プレＳＥＬＥＸ（商標）修飾後のポストＳＥＬＥＸ（商標）プロセス修飾）。プレＳＥＬＥＸ（商標）プロセス修飾は、ＳＥＬＥＸ（商標）標的に対して特異性を有し、インビボ安定性も改善された修飾核酸リガンドをもたらす。ポストＳＥＬＥＸ（商標）プロセス修飾、すなわち、修飾（例えば、プレＳＥＬＥＸ（商標）プロセス修飾によって組み込まれたヌクレオチドを有する、前に同定されたリガンドの切断、欠失、置換または追加のヌクレオチド修飾）は、プレＳＥＬＥＸ（商標）プロセス修飾によって組み込まれたヌクレオチドを有する核酸リガンドの結合能力に悪影響を及ぼすことなくインビボ安定性のさらなる改善をもたらすことができる。
【００７５】
ポリメラーゼが２’−修飾ＮＴＰを受け入れる条件下で２’−修飾（例えば、２’−ＯＭｅ）ＲＮＡ転写産物のプールを作製するために好ましいポリメラーゼは、Ｙ６９３Ｆ／Ｈ７８４Ａ二重突然改変体またはＹ６９３Ｆ単一突然改変体である。他のポリメラーゼ、特に、嵩高い２’−置換基に対して高い許容度を示すポリメラーゼも、本発明において使用することができる。こうしたポリメラーゼは、本明細書に開示する転写条件下で修飾ヌクレオチドを組み込む能力をアッセイすることにより、この能力についてスクリーニングすることができる。
【００７６】
本明細書に開示する方法において有用な転写条件にとって重要である多数の因子を決定した。例えば、結果として生じる転写産物の最初の少なくとも約６残基がすべてプリンになるように、ＤＮＡ転写テンプレートの５’末端における固定配列の５’末端にリーダー配列を組み込むと、修飾転写産物の収量増加が観察される。
【００７７】
修飾ヌクレオチドが組み込まれている転写産物を得る際のもう１つの重要な因子は、２’−ＯＨ  ＧＴＰの存在または濃度である。転写は、２つの期に分けることができる：第一の期は開始であり、この間に、ＮＴＰをＧＴＰ（または別の置換グアノシン）の３’−ヒドロキシル末端に付加させてジヌクレオチドを生じさせ、その後、それを約１０−１２ヌクレオチドまで延長し；第二の期は、伸張であり、この間に、転写を最初の約１０−１２個のヌクレオチドの付加を越えて進行させる。過剰な２’−ＯＭｅ  ＧＴＰを含有する転写混合物への少量の２’−ＯＨ  ＧＴＰの添加は、ポリメラーゼが２’−ＯＨ  ＧＴＰを使用して転写を開始できるようにするには十分であるが、転写が伸張期に入ると、２’−ＯＭｅと２’−ＯＨ  ＧＴＰの間の識別の低下および２’−ＯＨ  ＧＴＰよりも過剰な２’−ＯＭｅ  ＧＴＰにより、主として２’−ＯＭｅ  ＧＴＰの組み込みが生じ得ることが判明した。
【００７８】
転写産物に２’−ＯＭｅ置換ヌクレオチドを組み込む際のもう１つの重要な因子は、転写混合物における二価マグネシウムとマンガンの両方の使用である。塩化マグネシウムおよび塩化マンガンの濃度の組み合わせの違いが、２’−Ｏ−メチル化転写産物の収量に影響を及ぼし、塩化マグネシウムおよび塩化マンガンの最適濃度は、二価金属イオンを錯化するＮＴＰの転写反応混合物の濃度に依存することが判明した。最大限、２’置換されたＯ−メチル化転写産物（すなわち、すべてのＡ、ＣおよびＵならびに９０％のＧヌクレオチド）の最大収量を得るには、各ＮＴＰが０．５ｍＭの濃度で存在する場合、約５ｍＭの塩化マグネシウムおよび１．５ｍＭの塩化マンガンの濃度が好ましい。各ＮＴＰの濃度が１．０ｍＭである場合、約６．５ｍＭの塩化マグネシウムおよび２．０ｍＭの塩化マンガンの濃度が好ましい。各ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合、約９．６ｍＭの塩化マグネシウムおよび２．９ｍＭの塩化マンガンの濃度が好ましい。いずれの場合も、これらの濃度の２倍までの濃度から出発してもなお有意な量の修飾転写産物が得られる。
【００７９】
ＧＭＰまたはグアノシンで転写を始動させることも重要である。この作用は、開始ヌクレオチドに対するポリメラーゼの特異性に起因する。結果として、この方式で作製される一切の転写産物の５’末端ヌクレオチドは、２’−ＯＨ  Ｇになる可能性が高い。ＧＭＰ（またはグアノシン）の好ましい濃度は、０．５ｍＭであり、さらにいっそう好ましくは１ｍＭである。転写反応にＰＥＧ、好ましくはＰＥＧ−８０００を含めることが、修飾ヌクレオチドの組み込みを最大にするために有用であることも判明した。
【００８０】
転写産物への２’−ＯＭｅ  ＡＴＰ（１００％）、ＵＴＰ（１００％）、ＣＴＰ（１００％）およびＧＴＰ（〜９０％）（「ｒ／ｍＧｍＨ」）の最大限の組み込みには、以下の濃度が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝剤  ２００ｍＭ、ＤＴＴ  ４０ｍＭ、スペルミジン  ２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｗ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が１．０ｍＭである場合、６．５ｍＭ）、ＭｎＣｌ２  １．５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が１．０ｍＭである場合、２．０ｍＭ）、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各）５００μＭ（さらに好ましくは、１．０ｍＭ）、２’−ＯＨ  ＧＴＰ  ３０μＭ、２’−ＯＨ  ＧＭＰ  ５００μＭ、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  １５単位／ｍＬ、無機ピロホスファターゼ  ５単位／ｍＬ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンからなるリーダー配列。本明細書で用いる場合、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ突然変異Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（または本明細書に明記する任意の他の突然変異Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）の１単位は、ｒ／ｍＧｍＨ条件下で１ｎｍｏｌの２’−ＯＭｅ  ＮＴＰを転写産物に組み込むために必要な酵素の量と定義される。本明細書で用いる場合、無機ピロホスファターゼの１単位は、ｐＨ７．２、２５℃で１分あたり１．０ｍｏｌの無機オルトリン酸エステルを遊離するであろう酵素の量と定義される。
【００８１】
転写産物への２’−ＯＭｅ  ＡＴＰ、ＵＴＰおよびＣＴＰ（「ｒＧｍＨ」）の最大限の（１００％）組み込みには、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝剤  ２００ｍＭ、ＤＴＴ  ４０ｍＭ、スペルミジン  ２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合、９．６ｍＭ）、ＭｎＣｌ２  １．５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合、２．９ｍＭ）、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各）５００μＭ（さらに好ましくは、２．０ｍＭ）、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｆ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  １５単位／ｍＬ、無機ピロホスファターゼ  ５単位／ｍＬ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンからなるリーダー配列。
【００８２】
転写産物への２’−ＯＭｅ  ＵＴＰおよびＣＴＰ（「ｒＲｍＹ」）の最大（１００％）組み込みには、次の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝剤  ２００ｍＭ、ＤＴＴ  ４０ｍＭ、スペルミジン  ２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｗ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合、９．６ｍＭ）、ＭｎＣｌ２  １．５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合、２．９ｍＭ）、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各）５００μＭ（さらに好ましくは、２．０ｍＭ）、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  １５単位／ｍＬ、無機ピロホスファターゼ  ５単位／ｍＬ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンからなるリーダー配列。
【００８３】
転写産物へのデオキシＡＴＰおよびＧＴＰならびに２’−ＯＭｅ  ＵＴＰおよびＣＴＰ（「ｄＲｍＹ」）の最大（１００％）組み込みには、次の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝剤  ２００ｍＭ、ＤＴＴ  ４０ｍＭ、スペルミン  ２ｍＭ、スペルミジン  ２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ９．６ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．９ｍＭ、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各）２．０ｍＭ、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｆ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  １５単位／ｍＬ、無機ピロホスファターゼ  ５単位／ｍＬ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンからなるリーダー配列。
【００８４】
転写産物への２’−ＯＭｅ  ＡＴＰ、ＵＴＰおよびＣＴＰならびに２’−Ｆ  ＧＴＰ（「ｆＧｍＨ」）の最大（１００％）組み込みには、次の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝剤  ２００ｍＭ、ＤＴＴ  ４０ｍＭ、スペルミジン  ２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ９．６ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．９ｍＭ、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各）２．０ｍＭ、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｆ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  １５単位／ｍＬ、無機ピロホスファターゼ  ５単位／ｍＬ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンからなるリーダー配列。
【００８５】
転写産物へのデオキシＡＴＰならびに２’−ＯＭｅ  ＵＴＰ、ＧＴＰおよびＣＴＰ（「ｄＡｍＢ」）の最大（１００％）組み込みには、次の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝剤  ２００ｍＭ、ＤＴＴ  ４０ｍＭ、スペルミジン  ２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ９．６ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．９ｍＭ、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各）２．０ｍＭ、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｆ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  １５単位／ｍＬ、無機ピロホスファターゼ  ５単位／ｍＬ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンからなるリーダー配列。
【００８６】
上記各々について、（ａ）転写を、好ましくは、約２０℃から約５０℃、好ましくは約３０℃から４５℃、さらに好ましくは約３７℃の温度で少なくとも２時間にわたって行い、（ｂ）５０−３００ｎＭの二重鎖ＤＮＡ転写テンプレートを使用する（多様性を増大させるためにラウンド１では２００ｎＭのテンプレートを使用し（ｄＲｍＹ転写の際は、３００ｎＭのテンプレートを使用する）、後続のラウンドについては、本明細書に記載の条件を用いて、約５０ｎＭ（最適化ＰＣＲ反応の１／１０希釈）を使用する）。好ましいＤＮＡ転写テンプレートを下に記載する（ＡＲＣ２５４およびＡＲＣ２５６をすべての２’−ＯＭｅ条件で転写し、ＡＲＣ２５５をｒＲｍＹ条件下で転写する場合）。
【００８７】
【化１】
2007527246.tif 000003
本発明のｒＮ転写条件下での転写反応混合物は、２’−ＯＨアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、２’−ＯＨグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、２’−ＯＨシチジン三リン酸（ＣＴＰ）および２’−ＯＨウリジン三リン酸（ＵＴＰ）を含む。本発明のｒＮ転写混合物を使用して生成される修飾オリゴヌクレオチドは、実質的に、２’−ＯＨアデノシン、２’−ＯＨグアノシン、２’−ＯＨシチジンおよび２’−ＯＨウリジンをすべて含む。ｒＮ転写の好ましい実施形態において、結果として生じる修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−ＯＨアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−ＯＨシチジンであり、および全ウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−ＯＨウリジンである配列を含む。ｒＮ転写のさらに好ましい実施形態において、本発明の結果として生じる修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−ＯＨアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−ＯＨシチジンであり、および全ウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−ＯＨウリジンである配列を含む。ｒＮ転写の最も好ましい実施形態において、本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨシチジンであり、および全ウリジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨウリジンである配列を含む。
【００８８】
本発明のｒＲｍＹ転写条件下での転写反応混合物は、２’−ＯＨアデノシン三リン酸、２’−ＯＨグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸および２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸を含む。本発明のｒＲｍＹ転写混合物を使用して生成される修飾オリゴヌクレオチドは、実質的に、２’−ＯＨアデノシン、２’−ＯＨグアノシン、２’−Ｏ−メチルシチジンおよび２’−Ｏ−メチルウリジンをすべて含む。好ましい実施形態において、結果として生じる修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−ＯＨアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、および全ウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。さらに好ましい実施形態において、結果として生じる修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−ＯＨアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、および全ウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、結果として生じる修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、および全ウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。
【００８９】
本発明のｄＲｍＹ転写条件下での転写反応混合物は、２’−デオキシアデノシン三リン酸、２−デオキシグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸および２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸を含む。本発明のｄＲｍＹ転写条件を使用して生成される修飾オリゴヌクレオチドは、実質的に、２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシグアノシン、２’−Ｏ−メチルシチジンおよび２’−Ｏ−メチルウリジンをすべて含む。好ましい実施形態において、本発明の結果として生じる修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−デオキシアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−デオキシグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、および全ウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明の結果として生じる修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−デオキシアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−デオキシグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、および全ウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、本発明の結果として生じる修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドの１００％が２’−デオキシアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの１００％が２’−デオキシグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、および全ウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。
【００９０】
本発明のｒＧｍＨ転写条件下での転写反応混合物は、２’−ＯＨグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸および２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸を含む。本発明のｒＧｍＨ転写混合物を使用して生成される修飾オリゴヌクレオチドは、実質的に、２’−ＯＨグアノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルウリジンおよび２’−Ｏ−メチルアデノシンをすべて含む。好ましい実施形態において、結果として生じる修飾オリゴヌクレオチドは、全グアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全ウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、ならびに全アデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列を含む。さらに好ましい実施形態において、結果として生じる修飾オリゴヌクレオチドは、全グアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全ウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、ならびに全アデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、結果として生じる修飾オリゴヌクレオチドは、全グアノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全ウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、ならびに全アデノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列を含む。
【００９１】
本発明のｒ／ｍＧｍＨ転写条件下での転写反応混合物は、２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸および２’−ＯＨグアノシン三リン酸を含む。本発明のｒ／ｍＧｍＨ転写混合物を使用して生成される、結果として生じる修飾オリゴヌクレオチドは、実質的に、２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルグアノシンおよび２’−Ｏ−メチルウリジンをすべて含み、この場合、グアノシンヌクレオチド集団は、最大約１０％の２’−ＯＨグアノシンを有する。好ましい実施形態において、本発明の結果として生じるｒ／ｍＧｍＨ修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全シチジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全グアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、全ウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、ならびに全グアノシンヌクレオチドの約１０％以下が２’−ＯＨグアノシンである配列を含む。さらに好ましい実施形態において、結果として生じる修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全シチジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全グアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、全ウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、ならびに全グアノシンヌクレオチドの約１０％以下が２’−ＯＨグアノシンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、結果として生じる修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全シチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全グアノシンヌクレオチドのうちの９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、全ウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、ならびに全グアノシンヌクレオチドの約１０％以下が２’−ＯＨグアノシンである配列を含む。
【００９２】
本発明のｆＧｍＨ転写条件下での転写反応混合物は、２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、および２’−Ｆグアノシン三リン酸を含む。本発明のｆＧｍＨ転写条件を使用して生成される修飾オリゴヌクレオチドは、実質的に、２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジンおよび２’−Ｆグアノシンをすべて含む。好ましい実施形態において、結果として生じる修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全ウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全シチジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、ならびに全グアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｆグアノシンである配列を含む。さらに好ましい実施形態において、結果として生じる修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全ウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全シチジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、ならびに全グアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｆグアノシンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、結果として生じる修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全ウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全シチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、ならびに全グアノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｆグアノシンである配列を含む。
【００９３】
本発明のｄＡｍＢ転写条件下での転写反応混合物は、２’−デオキシアデノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルグアノシン三リン酸、および２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸を含む。本発明のｄＡｍＢ転写混合物を使用して生成される修飾オリゴヌクレオチドは、実質的に、２’−デオキシアデノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルグアノシンおよび２’−Ｏ−メチルウリジンをすべて含む。好ましい実施形態において、結果として生じる修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−デオキシアデノシンであり、全シチジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全グアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、ならびに全ウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。さらに好ましい実施形態において、結果として生じる修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−デオキシアデノシンであり、全シチジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全グアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、ならびに全ウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、本発明の結果として生じる修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドの１００％が２’−デオキシアデノシンであり、全シチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全グアノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、ならびに全ウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。
【００９４】
各々の場合、その後、転写産物は、アプタマーを同定するため、および／または所定の標的に対する結合特異性を有する配列の保存モチーフを決定するために、ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスにおいてライブラリーとして使用することができる。結果として生じる配列は、すでに部分的に安定化されており、そのため、最適化アプタマー配列に達するプロセスからこの段階を削除することができ、より高度に安定化されたアプタマーを結果として得ることができる。この２’−ＯＭｅＳＥＬＥＸ（商標）プロセスのもう１つの利点は、得られる配列が、配列に必要とされる２’−ＯＨヌクレオチドをほとんど、ことによると全く有さない可能性が高い点である。２’ＯＨヌクレオチドが残存する程度まで、それらをポストＳＥＬＥＸ（商標）修飾を実行することにより除去することができる。
【００９５】
下で説明するように、２’置換ヌクレオチドが完全に組み込まれている転写産物のさらに低いがそれでも有用な収量を、上で説明した最適化条件以外の条件下で得ることができる。例えば、上記転写条件の変形としては次のものが挙げられる。
【００９６】
ＨＥＰＥＳ緩衝剤濃度が、０Ｍから１Ｍの範囲にわたり得る。本発明は、例えばトリスヒドロキシメチルアミノメタンをはじめとする、５と１０との間のｐＫａを有する他の緩衝剤の使用も意図される。
【００９７】
ＤＴＴ濃度は、０ｍＭから４００ｍＭの範囲にわたり得る。本発明の方法は、例えばメルカプトエタノールをはじめとする他の還元剤の使用も提供する。
【００９８】
スペルミジンおよび／またはスペルミン濃度は、０から２０ｍＭの範囲にわたり得る。
【００９９】
ＰＥＧ−８０００濃度は、０〜５０％（ｗ／ｖ）の範囲にわたり得る。本発明の方法は、例えば他の分子量のＰＥＧまたは他のポリアルキレングリコールをはじめとする他の親水性ポリマーの使用も提供する。
【０１００】
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度は、０〜０．１％（ｗ／ｖ）の範囲にわたり得る。本発明の方法は、例えば他のＴｒｉｏｎ−Ｘ界面活性剤をはじめとする他の界面活性剤を含む、他の非イオン性界面活性剤の使用も提供する。
【０１０１】
ＭｇＣｌ２濃度は、０．５ｍＭから５０ｍＭの範囲にわたり得る。ＭｎＣｌ２濃度は、０．１５ｍＭから１５ｍＭの範囲にわたり得る。ＭｇＣｌ２およびＭｎＣｌ２は両方とも、記載した範囲内で存在しなければならず、好ましい実施形態では、約１０：約３のＭｇＣｌ２：ＭｎＣｌ２比で存在し、好ましくは、この比は、約３−５：１、さらに好ましくは、この比は、３−４：１である。
【０１０２】
２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ濃度（各ＮＴＰ）は、５μＭから５ｍＭの範囲にわたり得る。
【０１０３】
２’−ＯＨ  ＧＴＰ濃度は、０μＭから３００μＭの範囲にわたり得る。
【０１０４】
２’−ＯＨ  ＧＭＰ濃度は、０ｍＭから５ｍＭの範囲にわたり得る。
【０１０５】
ｐＨは、ｐＨ６からｐＨ９の範囲にわたり得る。本発明の方法は、修飾ヌクレオチドを組み込む大部分のポリメラーゼの活性のｐＨ範囲内で実施され得る。加えて、本発明の方法は、転写反応条件での、例えばＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびＤＴＴをはじめとするキレート化剤の任意の使用も提供する。
【０１０６】
（ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２アプタマーセレクション戦略）
本発明は、ヒトＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合する、ならびに幾つかの実施形態ではそれらの受容体への結合を阻害する、および／またはそれらの機能を別様に調節するアプタマーを提供する。ヒトＩＬ−２３およびＩＬ−１２は両方とも、共通する１つのサブユニットと１つの特有のサブユニットを有するヘテロ二量体である。共通するサブユニットは、ｐ４０サブユニットであり、これは以下のアミノ酸配列（登録番号ＡＦ１８０５６３）（配列番号４）を含有する：
【０１０７】
【化２】
2007527246.tif 000004
ｐ１９サブユニットは、ＩＬ−２３に特有であり、以下のアミノ酸配列（登録番号ＢＣ０６７５１１）（配列番号５）を含有する：
【０１０８】
【化３】
2007527246.tif 000005
ｐ３５サブユニットは、ＩＬ−１２に特有であり、以下のアミノ酸配列（登録番号ＡＦ１８０５６２）（配列番号６）を含有する：
【０１０９】
【化４】
2007527246.tif 000006
本発明は、マウスＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合する、ならびに幾つかの実施形態ではそれらの受容体への結合を阻害する、および／またはそれらの機能を別様に調節するアプタマーを提供する。ヒト同様、マウスＩＬ−２３およびＩＬ−１２は両方とも、マウスｐ４０サブユニットを共通するが、マウスｐ１９サブユニットは、マウスＩＬ−２３に特異的であり、マウスｐ３５サブユニットは、マウスＩＬ−１２に特有である。マウスｐ４０サブユニットは、以下のアミノ酸配列（登録番号Ｐ４３４３２）（配列番号３１５）を含有する：
【０１１０】
【化５】
2007527246.tif 000007
マウスｐ１９サブユニットは、以下のアミノ酸配列（登録番号ＮＰ１１２５４２）（配列番号３１６）を含有する：
【０１１１】
【化６】
2007527246.tif 000008
マウスｐ３５サブユニットは、以下のアミノ酸配列（登録番号Ｐ４３４３１）（配列番号３１７）を含有する：
【０１１２】
【化７】
2007527246.tif 000009
幾つかのＳＥＬＥＸ（商標）戦略を利用して、ＩＬ−２３およびＩＬ−１２に対して様々な特異性を有するアプタマーを作製することができる。１つのスキームは、ネガティブセレクション段階にＩＬ−１２を含めることによってＩＬ−１２よりＩＬ−２３に対して特異的なアプタマーを生成する。図３に示すように、これは、共通のサブユニット、ｐ４０（配列番号４）を認識する配列を排除し、ＩＬ−２３またはそのｐ１９サブユニット（配列番号５）に特異的なアプタマーを選択する。１つのスキームは、ネガティブセレクション段階にＩＬ−２３を含めることによって、ＩＬ−２３よりＩＬ−１２に特異的なアプタマーを生成する。これは、共通サブユニット、ｐ４０（配列番号４）を認識する配列を排除し、ＩＬ−１２またはそのｐ３５サブユニット（配列番号６）に特異的なアプタマーを選択する。ＩＬ−２３およびＩＬ−１２を１つおきのラウンドごとに交代させる別のセレクションは、共通サブユニット、ｐ４０（配列番号４）を認識するアプタマーを惹起し、その結果、両方のタンパク質を認識する。所望の結合特異性を有する配列が見つかったら、それらの配列の最小化に着手して、配列のサイズを系統的に減少させると同時に結合特性を改善することができる。
【０１１３】
下の実施例において説明するような生物学的アッセイによって実証される最高の親和性および特異的結合を有する選択されたアプタマーは、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２が病因に関係している状態の治療に適する治療薬である。
【０１１４】
（ＩＬ−２３／ＩＬ−１２特異的結合性アプタマー）
本発明の物質は、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＬ−２７をはじめとするヒトＩＬ−１２サイトカインファミリーのサイトカイン、ｐ１９、ｐ３５およびｐ４０サブユニット単量体ならびにｐ４０サブユニット二量体に特異的に結合する；ならびにインビボでおよび／または細胞ベースのアッセイにおいてＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２の活性を機能的に調節、例えば阻止する、長さが〜２５から９０ヌクレオチドの一連の核酸アプタマーを含む。
【０１１５】
ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に特異的に結合し、それらを特異的に調節することができるアプタマーを本明細書に記載する。これらのアプタマーは、自己免疫および炎症性関連疾患または障害を治療および予防する非毒性で、安全で有効なモダリティーをもたらす。１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２サイトカインによって生じることまたはそれらに別様に関連していることが各々知られている、多発性硬化症、関節リウマチ、尋常性乾癬、および過敏性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎を含むが、これらに限定されない）をはじめとする（しかし、これらに限定されない）炎症性および自己免疫疾患を治療および／または予防するために使用される。もう１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２サイトカインによって生じることまたはそれらに別様に関連していることが知られている、Ｉ型糖尿病を治療および／または予防するために使用される。もう１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、例えば全身性エリテマトーデス、結腸癌、肺癌、および骨粗しょう症における骨吸収をはじめとする、サイトカイン受容体結合の活性化が望ましい他の適応症を治療および／または予防するために使用される。
【０１１６】
治療薬および／または診断薬として使用するためのＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２特異的結合性アプタマーの例としては、下に列挙する以下の配列が挙げられる。
【０１１７】
別の注記がない限り、ＡＲＣ４８９（配列番号９１）、ＡＲＣ４９１（配列番号９４）、ＡＲＣ６２１（配列番号１０８）、ＡＲＣ６２７（配列番号１１０）、ＡＲＣ５２７（配列番号１５９）、ＡＲＣ７９２（配列番号１６２）、ＡＲＣ７９４（配列番号１６４）、ＡＲＣ７９５（配列番号１６５）、ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）、ＡＲＣ１３８６（配列番号２２４）、およびＡＲＣ１６２３−ＡＲＣ１６２５（配列番号３０９−３１１）は、プリン（ＡおよびＧ）がデオキシであり、ピリミジン（ＣおよびＵ）が２’−ＯＭｅであるＳＥＬＥＸ（商標）条件下で選択された、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合するアプタマーの配列を表す。
【０１１８】
ＡＲＣ４８９（配列番号９１）およびＡＲＣ４９１（配列番号９４）の非反復配列は、配列ＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＵＵＣＵＡＣ（配列番号６９）直後のヌクレオチド第２３で開始し、３’固定核酸配列ＧＣＵＧＵＣＧＡＵＣＧＡＵＣＧＡＵＣＧＡＵＧ（配列番号９０）に出会うまで進む。
【０１１９】
ＡＲＣ６２１（配列番号１０８）およびＡＲＣ６２７（配列番号１１０）の非反復領域は、配列ＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＵＵＣＵＡＣ（配列番号１０１）直後のヌクレオチド第２３で開始し、３’固定核酸配列ＧＵＣＧＡＵＣＧＡＵＣＧＡＵＣＡＵＣＧＡＵＧ（配列番号１０２）に会うまで進む。
【０１２０】
【化８】
2007527246.tif 000010
ＡＲＣ１６２３（配列番号３０９）、ＡＲＣ１６２４（配列番号３１０）およびＡＲＣ１６２５（配列番号３１１）は、ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）に基づく最適化配列を表し、この場合、「ｄ」は、デオキシを表し、「ｍ」は、２’−Ｏ−メチルを表し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を示し、「３Ｔ」は、３’−逆方向デオキシチミジンを表す。
【０１２１】
【化９】
2007527246.tif 000011
配列番号１３９−１４０、配列番号１４４−１４５、配列番号１４７および配列番号１５１−１５２は、プリン（ＡおよびＧ）が２’−ＯＨ（リボ）であり、ピリミジン（ＣおよびＵ）が２’−フルオロであるＳＥＬＥＸ（商標）条件下で選択された、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合するアプタマーの配列を表す。
【０１２２】
【化１０】
2007527246.tif 000012
ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合する他のアプタマーは、下の実施例１−３で説明する。
【０１２３】
これらのアプタマーは、例えば、親油性または高分子量化合物（例えばＰＥＧ）への結合体化、ＣｐＧモチーフの組み込み、キャッピング部分の組み込み、修飾ヌクレオチドの組み込みおよびリン酸エステル骨格におけるホスホロチオエートの組み込みをはじめとする、本明細書において説明するような修飾を含む。
【０１２４】
１つの実施形態において、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合する、単離された非自然発生アプタマーを提供する。幾つかの実施形態において、前記単離された非自然発生アプタマーは、１００μＭ未満、１μＭ未満、５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、５００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満および５０ｐＭ未満のＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２についての解離定数（「ＫＤ」）を有する。本発明の幾つかの実施形態において、前記解離定数は、下の実施例１において説明するようなドットブロット力価測定によって決定する。
【０１２５】
もう１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２の機能を調節する。もう１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２機能を阻害し、その一方でもう１つの実施形態では、本アプタマーは、標的の機能を刺激する。本発明のもう１つの実施形態において、本アプタマーは、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２改変体に結合し、および／またはその機能を調節する。ＩＬ−２３またはＩＬ−１２改変体は、本明細書で用いる場合、ＩＬ２３またはＩＬ−１２機能と本質的に同じ機能を果たし、好ましくは、ＩＬ−２３またはＩＬ−１２のアミノ酸配列と実質的に同じ構造を含み、幾つかの実施形態では、ＩＬ−２３またはＩＬ−１２の配列と少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、およびさらに好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を含む改変体を包含する。本発明の幾つかの実施形態において、標的改変体の配列同一性は、下で説明するようなＢＬＡＳＴを用いて判定する。
【０１２６】
２つまたはそれ以上の核酸またはタンパク質配列の文脈における用語「配列同一性」は、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを用いてまたは目視検査により測定して、最大対応に対して比較およびアラインしたとき、同じであるか、所定のパーセンテージの同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する、２つまたはそれ以上の配列または部分配列を指す。配列比較のため、一般には、１つの配列が、試験配列を比較するための参照配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを用いるときには試験および参照配列をコンピュータにインプットし、必要に応じて配列座標を設計し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを設計する。その後、設計したプログラムパラメータを基に、その配列比較アルゴリズムにより、参照配列に対する試験配列（複数を含む）の配列同一率を算出する。比較のための任意の配列アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５  ２４４４（１９８８）の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータでの実現（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）により、または目視検査（一般に、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，以下参照）により行うことができる。
【０１２７】
配列同一率の決定に適するアルゴリズムの一例は、基本ローカルアルゴリズム検索ツール（ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ）（以後「ＢＬＡＳＴ」）で使用されるアルゴリズムである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５：３３８９−３４０２（１９９７）参照。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（以後「ＮＣＢＩ」）を通して公的に利用することができる。ＮＣＢＩから入手できるソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴＩＮ（ヌクレオチド配列用）およびＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸配列用）を使用して配列同一性を判定する際に使用されるデフォルトパラメータは、ＭｃＧｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３２：Ｗ２０−Ｗ２５（２００４）に記載されている。
【０１２８】
本発明の１つの実施形態におけるアプタマーは、配列番号１３−６６、配列番号７１−８８、配列番号９１−９６、配列番号１０３−１１８、配列番号１２４−１３４、配列番号１３５−１５９、配列番号１６２、配列番号１６４−１７２、配列番号１７６−１７８、配列番号１８１−１９６、および配列番号１９９−３１４のうちのいずれか１つを含むアプタマーのものと実質的に同じＩＬ−２３への結合能力を有する。本発明のもう１つの実施形態におけるアプタマーは、配列番号１３−６６、配列番号７１−８８、配列番号９１−９６、配列番号１０３−１１８、配列番号１２４−１３４、配列番号１３５−１５９、配列番号１６２、配列番号１６４−１７２、配列番号１７６−１７８、配列番号１８１−１９６、および配列番号１９９−３１４のうちのいずれか１つを含むアプタマーのものと実質的に同じ構造およびＩＬ−２３への結合能力を有する。
【０１２９】
本発明の１つの実施形態におけるアプタマーは、配列番号１４、配列番号１７−１９、配列番号２１、配列番号２７−３２、配列番号３４−４０、配列番号４２、配列番号４９、配列番号６０−６１、配列番号９１−９２、配列番号９４、および配列番号１０３−１１８のうちのいずれか１つを含むアプタマーのものと実質的に同じＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２への結合能力を有する。本発明のもう１つの実施形態におけるアプタマーは、配列番号１４、配列番号１７−１９、配列番号２１、配列番号２７−３２、配列番号３４−４０、配列番号４２、配列番号４９、配列番号６０−６１、配列番号９１−９２、配列番号９４、および配列番号１０３−１１８のうちのいずれか１つを含むアプタマーのものと実質的に同じ構造ならびにＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２への結合能力を有する。
【０１３０】
もう１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、医薬組成物中の活性成分として使用される。もう１つの実施形態において、本発明のアプタマーまたはアプタマーを含む組成物は、炎症性および自己免疫疾患（多発性硬化症、関節リウマチ、尋常性乾癬、全身性エリテマトーデス、および過敏性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎を含むが、これらに限定されない）含むが、これらに限定されない）、Ｉ型糖尿病、結腸癌、肺癌、および骨粗しょう症における骨吸収を治療するために使用される。
【０１３１】
幾つかの実施形態において、本発明のアプタマー治療薬は、それらの標的に対して顕著な親和性および特異性を有すると同時に、それらのアプタマー治療薬が患者または被験体の体内で分解された場合には非自然発生ヌクレオチド置換からの有害な副作用を低減する。幾つかの実施形態において、本発明のアプタマー治療薬を含有する治療用組成物は、フッ素化ヌクレオチドを含まないか、低減された量のフッ素化ヌクレオチドを有する。
【０１３２】
本発明のアプタマーは、当該分野において公知の任意のオリゴヌクレオチド合成技術（固相オリゴヌクレオチド合成技術（例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４６７（１９８６）およびＦｒｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：５５７５−５５７８（１９８６）を参照のこと）および、トリエステル合成法（例えば、Ｓｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．４：２５５７（１９９７）およびＨｉｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，２８：２４４９（１９７８）を参照のこと）のような当該分野において周知の溶液相法が挙げられる）を用いて合成することができる。
【０１３３】
（免疫刺激モチーフを有するアプタマー）
本発明は、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合し、それらの生体機能を調節するアプタマーを提供する。より具体的には、本発明は、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２受容体に対するＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２の結合を増加させ、それによってＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２の生体機能を強化するアプタマーを提供する。こうしたアプタマーの作動薬的効果は、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合し、且つ、免疫刺激モチーフを含有するアプタマーを選択することにより、またはＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合するアプタマーと共に免疫刺激配列であることがわかっている標的に結合するアプタマーで治療することにより、さらに強化することができる。
【０１３４】
脊椎動物免疫系による細菌ＤＮＡの認識は、特定の配列状況での非メチル化ＣＧジヌクレオチド（「ＣｐＧモチーフ」）の認識に基づく。こうしたモチーフを認識する１つの受容体は、Ｔｏｌｌ様受容体９（「ＴＬＲ９」）であり、これは、別個の微生物成分を認識することにより先天性免疫応答に関与するＴｏｌｌ様受容体のファミリー（メンバー数  〜１０）の１メンバーである。ＴＬＲ９は、配列特異的に非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド（「ＯＤＮ」）ＣｐＧ配列に結合する。ＣｐＧモチーフの認識は、先天性および最終的には後天性免疫応答を導く防御メカニズムを誘発する。例えば、マウスにおけるＴＬＲ９の活性化は、抗原提示細胞の活性化、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子のアップレギュレーション、ならびに重要な共同刺激分子およびサイトカイン（ＩＬ−１２およびＩＬ−２３を含む）の発現を誘導する。この活性化は、ＴＨ１サイトカインＩＦＮ−ガンマの強いアップレギュレーションをはじめとする、ＢおよびＴ細胞応答を直接的にも間接的にも強化する。まとめると、ＣｐＧ配列への応答は、次のことを導く：感染性疾患に対する保護、ワクチンに対する改善された免疫応答、喘息に対する有効な反応、改善された抗体依存性細胞媒介細胞毒性。従って、ＣｐＧ  ＯＤＮは、感染性疾患に対する保護を提供することができ、免疫アジュバントまたは癌治療薬として（単独療法またはｍＡｂもしくは他の療法と併用で）機能することができ、ならびに喘息およびアレルギー反応を低減することができる。
【０１３５】
１つまたはそれ以上のＣｐＧまたは他の免疫刺激配列を含む本発明のアプタマーは、様々な戦略により、例えば、本明細書において説明するＳＥＬＥＸ（商標）プロセスを用いて、同定または作製することができる。組み込まれる免疫刺激配列は、ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよいし、および／またはＤＮＡ／ＲＮＡの組み合わせであってもよい。一般に、これらの戦略は、２つのグループに分けることができる。グループ１における戦略は、ＣｐＧモチーフまたは他の免疫刺激配列と標的に対する結合部位との両方を含むアプタマーを同定または作製することに関し、この場合、前記標的（以後、「非ＣｐＧ標的」）は、ＣｐＧモチーフまたは他の免疫刺激配列を認識することが知られているもの以外、およびＣｐＧモチーフに結合することにより免疫応答を刺激することが知られているもの以外の標的である。本発明の幾つかの実施形態において、前記非ＣｐＧ標的は、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２標的である。このグループの第一の戦略は、免疫応答の抑制が疾病発症に関係している場合、特定の非ＣｐＧ標的、好ましくは標的、例えばＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２、に対するアプタマーを得るために、オリゴヌクレオチドプールを使用してＳＥＬＥＸ（商標）を行うこと（この場合、ＣｐＧモチーフが、前記プールの各メンバーに固定領域または固定領域の一部として組み込まれており、例えば、幾つかの実施形態では、そのプールのメンバーのランダム化領域が、ＣｐＧモチーフが組み込まれた固定配列を含む）、ならびにＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定することを含む。このグループの第二の戦略は、免疫応答の抑制が疾病発症に関係している場合、特定の非ＣｐＧ標的、好ましくは標的、例えばＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２、に対するアプタマーを得るために、ＳＥＬＥＸ（商標）を行うこと、ならびにセレクション後、５’および／または３’末端にＣｐＧモチーフを追加するか、ＣｐＧモチーフを操作してアプタマーの一領域、好ましくは非必須領域にすることを含む。このグループの第三の戦略は、免疫応答の抑制が疾病発症に関係している場合、特定の非ＣｐＧ標的、好ましくは標的、例えばＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２、に対するアプタマーを得るために、ＳＥＬＥＸ（商標）を行うこと（この場合、プールの合成中、１つまたはそれ以上のヌクレオチド付加段階において、様々なヌクレオチドのモル比を、そのプールの各メンバーのランダム化領域のＣｐＧモチーフが富化されるように偏らせる）、ならびにＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定することを含む。このグループの第四の戦略は、免疫応答の抑制が疾病発症に関係している場合、特定の非ＣｐＧ標的、好ましくは標的、例えばＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２、に対するアプタマーを得るために、ＳＥＬＥＸ（商標）を行うこと、ならびにＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定することを含む。このグループの第五の戦略は、免疫応答の抑制が疾病発症に関係している場合、特定の非ＣｐＧ標的、好ましくは標的、例えばＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２、に対するアプタマーを得るために、ＳＥＬＥＸ（商標）を行うこと、ならびに結合すると免疫応答を刺激するが、ＣｐＧモチーフを含まないアプタマーを同定することを含む。
【０１３６】
グループ２における戦略は、ＣｐＧモチーフ、および／またはＣｐＧモチーフの受容体（例えば、ＴＬＲ９または他のｔｏｌｌ様受容体）により結合し、結合すると免疫応答を刺激する他の配列を含むアプタマーの同定または作製に関する。このグループの第一の戦略は、ＣｐＧモチーフまたは他の免疫刺激配列に結合し、結合すると免疫応答を刺激することが知られている標的に対するアプタマーを得るために、オリゴヌクレオチドプールを使用してＳＥＬＥＸ（商標）を行うこと（この場合、ＣｐＧモチーフは、固定領域としてまたは固定領域の一部として前記プールの各メンバーに組み込まれており、例えば、幾つかの実施形態では、前記プールのメンバーのランダム化領域が、ＣｐＧモチーフが組み込まれた固定領域を含む）、ならびにＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定することを含む。このグループの第二の戦略は、ＣｐＧモチーフまたは他の免疫刺激配列に結合し、結合すると免疫応答を刺激することが知られている標的に対するアプタマーを得るために、ＳＥＬＥＸ（商標）を行うこと、ならびにその後、５’および／または３’末端にＣｐＧモチーフを追加するか、ＣｐＧモチーフを操作してアプタマーの一領域、好ましくは非必須領域にすることを含む。このグループの第三の戦略は、ＣｐＧモチーフまたは他の免疫刺激配列に結合し、結合すると免疫応答を刺激することが知られている標的に対するアプタマーを得るために、ＳＥＬＥＸ（商標）を行うこと（この場合、プールの合成中、１つまたはそれ以上のヌクレオチド付加段階において、様々なヌクレオチドのモル比を、そのプールの各メンバーのランダム化領域のＣｐＧモチーフが富化されるように偏らせる）、ならびにＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定することを含む。このグループの第四の戦略は、ＣｐＧモチーフまたは他の免疫刺激配列に結合し、結合すると免疫応答を刺激することが知られている標的に対するアプタマーを得るために、ＳＥＬＥＸ（商標）を行うこと、ならびにＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定することを含む。このグループの第五の戦略は、ＣｐＧモチーフまたは他の免疫刺激配列に結合することが知られている標的に対するアプタマーを得るために、ＳＥＬＥＸ（商標）を行うこと、ならびに結合すると免疫応答を刺激するが、ＣｐＧモチーフを含まないアプタマーを同定することを含む。
【０１３７】
様々な異なるクラスのＣｐＧモチーフが同定されており、各々、認識され次第、異なるカスケードの事象、サイトカインおよび他の分子の放出、ならびに一定の細胞タイプの活性化を生じさせる。例えば、ＣｐＧ  Ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２，２０：７０９−７６０参照（本明細書において参考として援用される）。さらなる免疫刺激モチーフは、以下の米国特許において開示されており、これらは、各々、本明細書において参考として援用される：米国特許第６，２０７，６４６号、同第６，２３９，１１６号、同第６，４２９，１９９号、同第６，２１４，８０６号、同第６，６５３，２９２号、同第６，４２６，４３４号、同第６，５１４，９４８号および同第６，４９８，１４８号。これらのＣｐＧまたは他の免疫刺激モチーフは、いずれも、アプタマーに組み込むことができる。アプタマーの選択は、治療すべき疾患または障害に依存する。好ましい免疫刺激モチーフは、以下のとおりであり（５’から３’へ、左から右へ示す）、この場合の「ｒ」は、プリンを示し、「ｙ」は、ピリミジンを示し、「Ｘ」は、任意のヌクレオチドを示す：ＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧ（配列番号７）；ＡＡＣＧＴＴ；ＡＣＧＴ，ｒＣＧｙ；ｒｒＣＧｙｙ、ＸＣＧＸ、ＸＸＣＧＸＸ、およびＸ１Ｘ２ＣＧＹ１Ｙ２（この場合、Ｘ１は、ＧまたはＡであり、Ｘ２は、Ｃではなく、Ｙ１は、Ｇではなく、およびＹ２は、好ましくはＴである）。
【０１３８】
ＣｐＧモチーフに結合することが知られている標的以外の特定の標的（「非ＣｐＧ標的」）に結合し、結合すると免疫応答を刺激するアプタマーに、ＣｐＧモチーフが組み込まれている場合、そのＣｐＧは、好ましくは、そのアプタマーの非必須領域に局在する。アプタマーの非必須領域は、部位特異的突然変異誘発、欠失分析および／または置換分析によって同定することができる。しかし、非ＣｐＧ標的に結合するアプタマーの能力に有意には干渉しないあらゆる位置を利用することができる。アプタマー配列内に包埋することに加えて、ＣｐＧモチーフは、５’および３’末端のいずれかもしくは両方に追加することができ、または別様にアプタマーに取り付けることができる。非ＣｐＧ標的に結合するアプタマーの能力に有意に干渉しない限り、いずれの取り付け位置および手段を用いてもよい。
【０１３９】
本明細書で用いる場合、「免疫応答の刺激」は、（１）特定の応答の誘発（例えば、Ｔｈ１応答の誘発）もしくは一定の分子の産生の誘導、または（２）特定の応答の阻害もしくは抑制（例えば、Ｔｈ２応答の阻害もしくは抑制）または一定の分子の阻害もしくは抑制のいずれかを意味し得る。
【０１４０】
（医薬組成物）
本発明は、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合するアプタマー分子を含有する医薬組成物も包含する。幾つかの実施形態において、本組成物は、内服に適し、単独でか、または１つ以上の薬学的に受容可能な担体と組み合わせた、有効量の本発明の薬理活性化合物を含む。本化合物は、あったとしても非常に低い毒性を有する点で、特に有用である。
【０１４１】
本発明の組成物は、疾患もしくは障害などの病理を治療もしくは予防するために、または患者におけるそうした疾患もしくは障害の症状を緩和するために使用することができる。例えば、本発明の組成物は、炎症性および自己免疫性関連疾患、Ｉ型糖尿病、骨粗しょう症における骨吸収、および癌をはじめとする、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２サイトカインに関連した病理を治療または予防するために使用することができる。
【０１４２】
本発明の組成物は、本発明のアプタマーが特異的に結合する標的に関連または由来する疾患または障害に罹患しているか、そうした疾患または障害の素因を有する被験体への投与に有用である。本発明の組成物は、一定の病理を有する患者または被験体の治療法に使用することができる。この方法は、その病理に関係があるＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合するアプタマーまたはアプタマーを含む組成物を患者または被験体に投与して、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２へのそのアプタマーの結合により標的の生体機能を変化させ、それによってその病理を治療することを含む。
【０１４３】
一定の病理を有する患者または被験体、すなわち、本発明の方法により治療される患者または被験体は、脊椎動物、より詳細には哺乳類、またはより詳細にはヒトであり得る。
【０１４４】
実際には、本アプタマーまたはそれらの薬学的に受容可能な塩は、所望の生物活性（例えば、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２のその受容体への結合を阻害する）を発揮するのに十分な量で投与される。
【０１４５】
本発明の１つの態様は、炎症性および自己免疫疾患、癌および他の関連障害のための他の治療と併用での本発明のアプタマー組成物を含む。本発明のアプタマー組成物は、例えば、１つより多くのアプタマーを含有することができる。幾つかの例では、本発明の１つまたはそれ以上の化合物を含有する本発明のアプタマー組成物は、別の有用な組成物、例えば、抗炎症薬、免疫抑制物質または抗ウイルス薬などと併用で投与される。さらに、本発明の化合物は、上に記載したような、細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤または化学療法薬、例えばアルキル化剤、代謝拮抗物質、有糸分裂阻害剤または細胞毒性抗生物質と併用で投与することができる。一般に、こうした併用に用いるための公知治療薬の現在利用可能な剤形が適するであろう。
【０１４６】
「併用療法」（または共同療法）は、本発明のアプタマー組成物および少なくとも第二の薬剤（これらの治療薬の共同作用から有益な効果を提供することを意図した特定の治療方式の一部として）の投与を含む。併用の有益な効果としては、治療薬の併用の結果として生じる薬物動力学的共同作用または薬力学的共同作用が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、併用でのこれらの治療薬の投与は、規定された期間（選択される併用に依存して、通常は、分、時間、日または週）にわたって行われる。
【０１４７】
「併用療法」は、一般にではないが、本発明の併用を付随的および任意にもたらす別の単独療法方式の一部としてのこれらの治療薬の２つまたはそれ以上の投与を包含することが意図される。「併用療法」は、これらの治療薬を逐次的に投与すること、すなわち、各治療薬を異なる時点で投与する場合、ならびにこれらの治療薬（すなわち少なくとも２つの治療薬）を実質的に同時に投与することを包含するものと解釈する。実質的な同時の投与は、例えば、各治療薬の固定比を有する単一カプセルを被験体に投与するか、各治療薬についての単一のカプセルを複数投与することによって達成することができる。
【０１４８】
各治療薬の逐次または実質的同時投与は、局所経路、経口経路、静脈内経路、筋内経路、および粘膜組織による直接吸収をはじめとする（しかし、これらに限定されない）任意の適切な経路により達成され得る。治療薬は、同じ経路で投与することができ、または異なる経路で投与することができる。例えば、選択された併用の第一の治療薬を注射によって投与でき、その一方で、その併用の他の治療薬を局所投与することができる。
【０１４９】
あるいは、例えば、すべての治療薬を局所投与することができ、またはすべての治療薬を注射によって投与することができる。治療薬を投与する順序は、別の注記がない限り、厳密に重要なことではない。「併用療法」は、他の生物活性成分とのさらなる併用での上記治療薬の投与も包含する。併用療法が非薬物治療をさらに含む場合、この非薬物治療は、治療薬と非薬物治療の併用の共同作用による有益な効果が達成される限り、任意の適当な時に行われ得る。例えば、適切な場合、有益な効果は、非薬物治療が治療薬の投与から時間的に離れている、ことによると数日または数週間でさえ離れているときでも達成される。
【０１５０】
本発明の治療または薬理組成物は、薬学的に受容可能な媒体に溶解または分散された、その療法の活性成分（複数を含む）の有効量を、一般に含むであろう。薬学的に受容可能な媒体または担体としては、任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌薬、抗真菌薬、等張薬および吸収遅延薬などが挙げられる。薬学的活性物質のためのこうした媒体および薬剤の使用は、当該分野では周知である。本発明の治療組成物に補助活性成分を配合することもできる。
【０１５１】
医薬または薬理組成物の調製は、本開示にかんがみて当業者には判ることだろう。典型的に、こうした組成物は、溶液もしくは懸濁物のいずれかとしての注射剤として；注射前の液体における、溶液もしくは懸濁物に適する固体形態として；経口投与のための錠剤または他の固体として；持効性カプセルとして；あるいは点眼剤、クリーム、ローション、軟膏、吸入剤などをはじめとする現在使用されている他の任意の形態で調製することができる。手術現場で特定領域を治療するための外科医、内科医または健康管理者による食塩水系洗浄液などの滅菌処方物の使用も、特に有用であり得る。組成物は、マイクロデバイス、ミクロ粒子またはスポンジによって送達することもできる。
【０１５２】
処方されると、治療薬は、その投薬処方物に適合した様式で、および薬理学的に有効であるような量で投与されるであろう。これらの処方物は、上で説明したタイプの注射用溶液などの様々な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども利用することができる。
【０１５３】
この関連で、投与すべき活性成分の量および組成物の容積は、治療すべき宿主動物に依存する。投与に必要な活性化合物の正確な量は、担当医の判断に依存し、ならびに各個体に特有である。
【０１５４】
活性化合物を分散させる必要がある組成物の最小容積が一般には利用される。投与に適する方式も可変的であるが、化合物を最初に投与し、その結果をモニターし、その後、さらに間隔をおいてさらなる制御容量を与えることに代表され得る。
【０１５５】
例えば、錠剤またはカプセル（例えば、ゼラチンカプセル）の形態での経口投与については、活性薬物成分は、経口用で、非毒性で薬学的に受容可能な不活性担体、例えばエタノール、グリセロール、水などと組み合わされ得る。さらに、所望または必要とされる場合には、適切な結合剤、滑沢剤、崩壊剤および着色剤もその混合物に配合することができる。適する結合剤としては、デンプン、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプンペースト、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン、天然糖（例えば、グルコースまたはβ−ラクトース）、コーン甘味剤、天然および合成ゴム（例えば、アラビアゴム、トラガカントゴムまたはアルギン酸ナトリウム）、ポリエチレングリコール、ろうなどが挙げられる。これらの剤形に使用される滑沢剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、シリカ、滑石、ステアリン酸、そのマグネシウムもしくはカルシウム塩、および／またはポリエチレングリコールなどが挙げられる。崩壊剤としては、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムデンプン、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩、または発泡性混合物などが挙げられるが、これらに限定されない。希釈剤としては、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシンが挙げられる。
【０１５６】
本発明の化合物は、持効性および持続放出性錠剤またはカプセル、ピル、粉末、顆粒、エリキシル、チンキ剤、懸濁物、シロップおよび乳剤などの経口剤形で投与され得る。坐剤は、有利には、脂肪乳剤または懸濁物から調製される。
【０１５７】
本医薬組成物は、滅菌され得、および／またはアジュバント、例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を調節するための塩および／または緩衝剤を含有することができる。加えて、他の治療的に価値がある物質も含有することができる。本組成物は、従来どおりの混合、顆粒化またはコーティング法に従って調製され、典型的には約０．１％から７５％、好ましくは約１％から５０％の活性成分を含有する。
【０１５８】
液体組成物、特に注射用組成物は、例えば、溶解、分散などによって調製することができる。活性化合物を薬学的に純粋な溶媒、例えば水、食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール、エタノールなどに溶解するか、それらと混合して、注射用溶液または懸濁物を形成する。加えて、注射前に液体に溶解するために適する固体形態を処方することができる。
【０１５９】
本発明の化合物は、静脈内（ボーラスと注入の両方）、腹腔内、皮下または筋内用の形態（すべて薬学技術分野の当業者には周知の使用形態）で投与することができる。注射剤は、溶液または懸濁物のいずれかの従来どおりの形態で調製され得る。
【０１６０】
非経口注射剤投与は、一般に、皮下、筋内または静脈内注射および注入のために使用される。加えて、非経口投与のための１つのアプローチは、米国特許第３，７１０，７９５号（本明細書において参考として援用される）に従って、一定レベルの投薬量が維持されると想定されている遅速放出または持続放出系の移植を利用する。
【０１６１】
さらに、本発明の好ましい化合物は、適切な鼻腔内ビヒクル、吸入剤の局所使用による鼻腔内用の形態で、または当業者に周知の経皮パッチの形態を使用する経皮経路により、投与され得る。経皮送達系の形態で投与するための投薬量の投与は、勿論、その投薬計画を通して間欠的ではなく継続的であろう。他の好ましい局所調製物としては、クリーム、軟膏、ローション、エーロゾルスプレー剤およびゲルが挙げられ、この場合、活性成分の濃度は、典型的にはｗ／ｗまたはｗ／ｖで０．０１％〜１５％の範囲にわたるであろう。
【０１６２】
固体組成物のための賦形剤としては、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。上で定義した活性化合物は、例えばポリアルキレングリコール（例えば、プロピレングリコール）を担体として使用して、坐剤として処方され得る。幾つかの実施形態において、坐剤は、有利には脂肪乳剤または懸濁物から調製される。
【０１６３】
本発明の化合物は、リポソーム送達系、例えば、小型単層小胞、大型単層小胞および多層小胞の形態で投与することもできる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンを含有する様々なリン脂質から形成することができる。幾つかの実施形態では、米国特許第５，２６２，５６４号に記載されているように、脂質成分の被膜を薬物の水溶液で水和して、薬物を内包する脂質層を形成する。例えば、本明細書に記載されるアプタマー分子は、当該分野では公知の方法を使用して構成される親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物との複合体として提供することができる。核酸会合複合体の一例は、米国特許第６，０１１，０２０号に提供されている。
【０１６４】
本発明の化合物は、標的化可能な薬物担体としての可溶性ポリマーとカップリングさせることもできる。こうしたポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパナミドフェノール、またはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリシンを挙げることができる。さらに、本発明の化合物は、制御放出の達成に有用な類の生体分解性ポリマー、例えば、ポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、および架橋されたヒドロゲルまたはヒドロゲルの両親媒性ブロックコポリマーとカップリングさせることができる。
【０１６５】
所望される場合、投与される医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、ならびに例えば酢酸ナトリウムおよびオレイン酸トリエタノールアミンなどの他の物質も含有することができる。
【０１６６】
本アプタマーを利用する投薬計画は、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別および医療状態；治療すべき状態の重症度；投与経路；患者の腎および肝機能；ならびに利用される特定のアプタマーまたはその塩をはじめとする、さまざまな因子に従って選択される。通常技能の医師または獣医は、その状態の進行を予防する、その状態の進行に対抗するまたはその状態の進行を阻止するために必要な薬物の有効量を容易に決定し、処方することができる。
【０１６７】
必要とされる効果のために使用される場合、本発明の経口投薬量は、経口的に一日あたり、約０．０５ｍｇから７５００ｍｇの間の範囲にわたる。これらの組成物は、０．５ｍｇ、１．０ｍｇ、２．５ｍｇ、５．０ｍｇ、１０．０ｍｇ、１５．０ｍｇ、２５．０ｍｇ、５０．０ｍｇ、１００．０ｍｇ、２５０．０ｍｇ、５００．０ｍｇおよび１０００．０ｍｇの活性成分を含有する、印についた錠剤の形態で好ましくは提供される。注入投薬量、鼻腔内投薬量および経皮投薬量は、一日あたり、０．０５ｍｇから７５００ｍｇの間の範囲にわたる。皮下、静脈内および腹腔内投薬量は、一日あたり、０．０５ｍｇから３８００ｍｇの間の範囲にわたる。
【０１６８】
本発明の化合物の有効な血漿中レベルは、０．００２ｍｇ／ｍＬから５０ｍｇ／ｍＬの範囲にわたる。
【０１６９】
本発明の化合物は、１日１回量で投与することができ、または一日あたりの総投薬量を一日あたり２、３もしくは４回の分割量で投与することができる。
【０１７０】
（アプタマー治療薬の薬物動態および生体内分布の調節）
アプタマーを含むすべてのオリゴヌクレオチドベースの治療薬にとって、薬物動態特性を所望の医薬用途に合うように調整することは、重要である。細胞外標的に向けられたアプタマー（アンチセンスおよびＲＮＡｉに基づく治療薬の場合など）は、細胞内送達の問題点を被ることはないが、こうしたアプタマーは、依然として標的器官および標的組織に分布させることができなければならず、ならびに所望の投薬計画に一貫して、期間にわたって体内に（未改変で）留まらねばならない。
【０１７１】
従って、本発明は、アプタマー組成物の薬物動態、および特にアプタマー薬物動態を調整する能力に影響を及ぼす物質および方法を提供する。アプタマーの薬物動態の整調力（すなわち、調節能力）は、アプタマーへの修飾性部分（例えば、ＰＥＧポリマー）の結合体化、および／または核酸の化学組成を変化させるように修飾ヌクレオチド（例えば、２’−フルオロまたは２’−Ｏ−メチル）を組み込むことによって達成される。アプタマー薬物動態を整調する能力は、既存の治療用途の改善に、あるいは新規治療用途の開発に使用される。例えば、幾つかの治療用途では、例えば、抗新生物薬の場合、または急速な薬物クリアランスもしくは使用停止が望まれることがある急性疾患治療設定では、血液循環におけるアプタマーの滞留時間を減少させることが望ましい。あるいは、他の治療用途、例えば、治療薬の体循環が望まれる維持療法では、血液循環におけるアプタマーの滞留時間を増加させることが望ましいこともある。
【０１７２】
加えて、アプタマー薬物動態の整調能は、被験体におけるアプタマー治療薬の生体内分布を調節するために用いられる。例えば、幾つかの治療用途では、特定のタイプの組織または特定の器官（もしくは一対の器官）に標的を定める努力の中で、アプタマー治療薬の生体内分布の変更が望ましいことがある。これらの用途では、アプタマー治療薬が、特定の組織または器官（複数を含む）に優先的に蓄積する。他の治療用途では、所定の疾病、細胞傷害もしくは他の異常な病理に関連した細胞マーカーまたは症状を提示する組織を標的にして、アプタマーが治療上優先的にその罹患組織に蓄積するようにすることが望ましい場合がある。例えば、２００４年３月５日出願の「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」と題する米国特許同時係属仮出願番号第６０／５５０７９０号および２００５年３月７日出願の、同じく「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」と題する米国特許本出願番号第１０／−−−，−−−号に記載されているように、アプタマー治療薬のＰＥＧ化（例えば、２０ｋＤａ  ＰＥＧポリマーでのＰＥＧ化）を用いて炎症組織を標的にして、ＰＥＧ化アプタマーが治療上優先的に炎症組織に蓄積するようにする。
【０１７３】
アプタマー治療薬（例えば、アプタマー結合体、または修飾ヌクレオチドなどの化学的性質が変更されたアプタマー）の薬物動態および生体内分布プロフィールを判定するために、様々なパラメータをモニターする。そうしたパラメータとしては、例えば、アプタマー組成物の、半減期（ｔ１／２）、血漿クリアランス（Ｃ１）、分布容積（Ｖｓｓ）、濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）、最大観察血清または血漿中濃度（Ｃｍａｘ）および平均滞留時間（ＭＲＴ）が挙げられる。本明細書で用いる場合、用語「ＡＵＣ」は、アプタマー治療薬の血漿中濃度  対  アプタマー投与後の時間のプロットの下の面積を指す。ＡＵＣ値は、所定のアプタマー治療薬のバイオアベイラビリティ（すなわち、アプタマー投与後の循環血液中の投与されたアプタマー治療薬のパーセンテージ）および／または全クリアランス（Ｃ１）（すなわち、アプタマー治療薬が血液循環から除去される速度）を概算するために使用される。分布容積は、アプタマー治療薬の血漿中濃度と体内に存在するアプタマーの量とを関係付けるものである。Ｖｓｓが大きいほど、血漿以外で見出されるアプタマーの量が多い（すなわち、血管外遊出が多い）。
【０１７４】
本発明は、小分子、ペプチドもしくはポリマー末端基などの修飾性部分にアプタマーを結合体化させることにより、またはアプタマーに修飾ヌクレオチドを組み込むことにより、安定化されたアプタマー組成物の薬物動態および生体内分布をインビボで、制御された様式で調節する物質および方法を提供する。本明細書において説明するように、修飾性部分の結合体化および／またはヌクレオチド（複数を含む）の化学組成の変更は、血液循環における滞留時間および組織への分布の基本的態様を変える。
【０１７５】
ヌクレアーゼによるクリアランスに加えて、オリゴヌクレオチド治療薬は、腎臓濾過により排出される。従って、静脈内投与されたヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドは、濾過が阻止されない限り、１０分未満のインビボ半減期を一般に示す。これは、血流から組織への急速な分布を助長するか、腎糸球体を切り捨てた有効サイズより上にオリゴヌクレオチドの見掛けの分子量を増加させることによって達成することができる。下で説明するＰＥＧポリマーへの小さな治療薬の結合体化（ＰＥＧ化）により、血液循環におけるアプタマーの滞留時間を劇的に延長することができ、その結果、投薬頻度を減少させ、血管ターゲットに対する有効度を向上させることができる。
【０１７６】
アプタマーは、高分子量ポリマー、例えばＰＥＧ；ペプチド、例えばＴａｔ（ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質の１３−アミノ酸フラグメント（Ｖｉｖｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（２５）：１６０１０−７））、Ａｎｔ（ショウジョウバエアンテナペディアホメオティックタンパク質の第三ヘリックスに由来する１６−アミノ酸配列（Ｐｉｅｔｅｒｓｚ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９（１１−１２）：１３９７−４０５））およびＡｒｇ７（ポリルアルギニンから成る短い、正電荷の細胞透過性ペプチド（Ａｒｇ７）（Ｒｏｔｈｂａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６（１１）：１２５３−７；Ｒｏｔｈｂａｒｄ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５（１７）：３６１２−８））；ならびに小分子、例えば、コレステロールなどの親油性化合物などの、様々な修飾性部分に結合体化させることができる。本明細書において説明する様々な結合体の中で、アプタマーのインビボ特定は、ＰＥＧ基との複合体形成により最も大きく変更される。例えば、混合型２’Ｆ：２’−ＯＭｅ修飾アプタマー治療薬と２０ｋＤａ  ＰＥＧポリマーとの複合体形成は、腎臓濾過を妨げ、健康な組織と炎症組織、両方へのアプタマーの分布を促進する。さらに、２０ｋＤａ  ＰＥＧポリマー−アプタマー結合体は、アプタマーの腎臓濾過の防止に関して４０ｋＤａ  ＰＥＧポリマーとほぼ同じく有効であると証明される。ＰＥＧ化の１つの効果は、アプタマークリアランスに対するものであるが、２０ｋＤａ部分の存在により可能となる持続性全身暴露も、組織、特に、高潅流器官の組織および炎症部位の組織へのアプタマーの分布を助長する。アプタマー−２０ｋＤａ  ＰＥＧポリマー結合体は、そのＰＥＧ化アプタマーが優先的に炎症組織に蓄積するように、炎症部位にアプタマーを分布させる。場合によっては、２０ｋＤａ  ＰＥＧ化アプタマー結合体は、例えば腎細胞などの細胞の内部に進入することができる。
【０１７７】
修飾ヌクレオチドは、アプタマーの血漿クリアランスを調節するために使用することもできる。例えば、インビトロおよびインビボで高いヌクレアーゼ安定度を示すので現世代アプタマーの代表である、２’−Ｆと２’−ＯＭｅ両方の安定化化学作用が組み込まれた非結合体型アプタマーは、未修飾アプタマーと比較した場合、血漿からの急速な喪失（すなわち、急速な血漿クリアランス）および組織への、主として腎臓への急速な分布を示す。
【０１７８】
（ＰＥＧ誘導体化核酸）
上で説明したように、高分子量非免疫原性ポリマーでの核酸の誘導体化は、核酸の薬物動態特性および薬力学特性を変更して、より有効な治療薬にさせる可能性を有する。好適な活性変化としては、ヌクレアーゼによる分解に対する耐性増大、腎臓による濾過低減、免疫系への暴露低減、および体内の治療薬の分布変更を挙げることができる。
【０１７９】
本発明のアプタマー組成物は、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分で誘導体化することができる。ＰＡＧ誘導体化核酸の例は、２００３年１１月２１日出願の米国特許出願番号第１０／７１８，８３３号（これは、その全体が本明細書において参考として援用される）において見出される。本発明において使用される典型的なポリマーとしては、ポリエチレンオキシド（「ＰＥＯ」）としても知られているポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、およびポリプロピレングリコール（ポリイソプロピレングリコールを含む）が挙げられる。加えて、異なるアルキレンオキシド（例えば、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシド）のランダムコポリマーまたはブロックコポリマーは、多くの用途で使用することができる。最も一般的な形態のポリアルキレングリコール、例えばＰＥＧは、各末端がヒドロキシル基で終わっている線状ポリマーである：ＨＯ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ。このポリマー、α，ω−ジヒドロキシルポリエチレングリコールは、ＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨと表すこともでき、この場合、−ＰＥＧ−記号は、次の構造単位を表すと理解される：−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−（この場合、ｎは、一般に、約４〜約１０，０００の範囲にわたる）。
【０１８０】
示したようなＰＥＧ分子は、二官能性であり、「ＰＥＧジオール」と呼ばれることもある。ＰＥＧ分子の末端部分は、比較的非反応性のヒドロキシル部分、−ＯＨ基であり、これは、他の化合物上の活性化部位においてその化合物にＰＥＧを取り付けるために、活性化することができ、または官能部分に転化させることができる。こうした活性化ＰＥＧジオールは、本明細書では二活性化ＰＥＧと呼ぶ。例えば、ＰＥＧジオールの末端部分は、その比較的非反応性のヒドロキシル部分、−ＯＨをＮ−ヒドロキシスクシンイミドからのスクシンイミジル活性化エステル部分で置換することにより、アミノ部分との選択的反応のための活性炭酸エステルとして官能価されている。
【０１８１】
多くの用途において、本質的に非反応性の部分でＰＥＧ分子の一方の末端をキャップして、そのＰＥＧ分子が一官能性である（または一活性化される）ようにすることが望ましい。活性化ＰＥＧに対して多数の反応部位を一般に提示するタンパク質治療薬の場合、二官能性活性化ＰＥＧは、広範囲の架橋を導いて、低機能性凝集体を生じさせる。一活性化ＰＥＧを作製するために、ＰＥＧジオール分子の末端の一方のヒドロキシル部分は、代表的に、非反応性メトキシ末端部分、−ＯＣＨ３で置換される。そのＰＥＧ分子の他方のキャップされていない末端は、代表的に、表面またはタンパク質などの分子上の反応性部位に取り付けるために活性化することができる活性化末端部分に転化される。
【０１８２】
ＰＡＧは、水および多くの有機溶媒への可溶性、毒性の欠如および免疫原性の欠如といった特性を代表的に有するポリマーである。ＰＡＧの１つの用途は、そのポリマーを不溶性分子に共有結合させて、結果として生じるＰＡＧ分子「結合体」を可溶性にすることである。例えば、水不溶性薬物パクリタキセルは、ＰＥＧにカップリングさせると水溶性になることが証明された。Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６０：３３１−３３６（１９９５）。ＰＡＧ結合体は、多くの場合、溶解度および安定性を向上させるためばかりでなく、分子の血液循環半減期を延長するためにも使用される。
【０１８３】
本発明のポリアルキル化化合物は、一般に、５ｋＤａと８０ｋＤａの間のサイズであるが、任意のサイズを使用することができ、その選択は、そのアプタマーおよび用途次第である。本発明の他のＰＡＧ化合物は、１０ｋＤａと８０ｋＤａの間のサイズである。本発明のさらに他のＰＡＧ化合物は、１０ｋＤａと６０ｋＤａの間のサイズである。例えば、ＰＡＧポリマーは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０または８０ｋＤａのサイズであり得る。こうしたポリマーは、線状であってもよいし、または枝分れしていてもよい。幾つかの実施形態において、前記ポリマーはＰＥＧである。幾つかの実施形態において、前記ポリマーは、分枝状ＰＥＧである。さらに他の実施形態において、前記ポリマーは、図４に図示されているような４０ｋＤａ分枝ＰＥＧである。幾つかの実施形態において、前記４０ｋＤａ分枝ＰＥＧは、図５に図示されているようにアプタマーの５’末端に取り付けられている。
【０１８４】
生体発現型タンパク質治療薬とは対照的に、核酸治療薬は、代表的に、活性化モノマーヌクレオチドから化学合成される。ＰＥＧ−核酸結合体は、同一反復モノマー合成を用いてＰＥＧを組み込むことにより調製することができる。例えば、ホスホロアミダイト形態への転化により活性化されたＰＥＧを固相オリゴヌクレオチド合成に組み込むことができる。あるいは、オリゴヌクレオチド合成は、活性化ＰＥＧ取り付け部位の部位特異的組み込みで完成することができる。最も一般的には、これは、５’末端への遊離第一アミンの付加によって達成されている（固相合成の最終カップリング段階で修飾用ホスホロアミダイトを使用して組み込む）。このアプローチに使用して、活性ＰＥＧ（例えば、活性化されてアミンと反応し、結合を形成するもの）を精製オリゴヌクレオチドと併せ、そのカップリング反応を溶液状態で行う。
【０１８５】
治療薬の生体内分布を変更するＰＥＧ結合体化の能力は、その結合体の見掛けのサイズ（例えば、流体力学半径によって測定される）をはじめとする多数の因子に関係している。大きな結合体（＞１０ｋＤａ）ほど、腎臓による濾過を有効に阻止すること、およびその結果、小さな高分子（例えば、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の血清中半減期を増加させることは公知である。濾過を阻止するＰＥＧ結合体の能力が、ＰＥＧのサイズを約５０ｋＤａまで増大させることは証明されている（半減期は、腎臓による除去ではなくマクロファージ媒介代謝によって規定されるため、さらなる増加は、有益な効果をほとんど及ぼさない）。
【０１８６】
高分子量ＰＥＧ（＞１０ｋＤａ）の作製は、困難、非効率的、且つ、不経済であり得る。高分子量ＰＥＧ−核酸結合体の合成への１つの経路として、以前の研究は、高分子量活性化ＰＥＧの生成に着目していた。こうした分子を作製するための１つの方法は、２つまたはそれ以上のＰＥＧが、活性化された基を有する中心コアに取り付けられている分枝活性化ＰＥＧの形成を含む。これらの高分子量ＰＥＧ分子の末端部分、すなわち、比較的非反応性のヒドロキシル（−ＯＨ）部分は、１つまたはそれ以上のＰＥＧを活性化させて、他の化合物上の反応性部位においてその化合物に取り付け得るか、または官能部分に転化させ得る。分枝状活性化ＰＥＧは、２つより多くの末端を有するであろう。２つまたはそれ以上の末端が活性化されている場合、このように活性化されたより高分子量のＰＥＧ分子を本明細書では多活性化ＰＥＧと呼ぶ。場合によっては、分枝ＰＥＧ分子のすべての末端が活性化されているとは限らない。分枝ＰＥＧ分子のいずれか２つの末端が、活性化されている場合、このような分子ＰＥＧ分子を二活性化ＰＥＧと呼ぶ。分枝状ＰＥＧ分子の１つの末端のみが活性化される幾つかの場合、このようなＰＥＧ分子を一活性化ＰＥＧと呼ぶ。このアプローチの一例として、リシンコアに２つのモノメトキシＰＥＧを取り付け、それを、その後、反応のために活性化することにより調製される活性化ＰＥＧが記載されている（Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２：２１４−２２１，２００３）。
【０１８７】
本発明は、多重ＰＥＧ化核酸を含む高分子量ＰＥＧ−核酸（好ましくは、アプタマー）結合体の別の経済性に優れた合成経路を提供する。本発明は、ＰＥＧ連結型多量体オリゴヌクレオチド、例えば、二量体化アプタマーも包含する。本発明は、ＰＥＧ安定化部分が、１つのアプタマーの異なる部分を隔てるリンカーである、高分子量組成物にも関係する。例えば、ＰＥＧを単一のアプタマー配列内で結合体化させて、その高分子量アプタマー組成物の線状配置は、例えば、核酸−ＰＥＧ−核酸（−ＰＥＧ−核酸）ｎ（この場合、ｎは、１またはそれ以上である）である。
【０１８８】
本発明の高分子量組成物としては、少なくとも１０ｋＤａの分子量を有するものが挙げられる。組成物は、代表的には１０ｋＤａと８０ｋＤａの間のサイズの分子量を有する。本発明の高分子量組成物は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０または８０ｋＤａのサイズである。
【０１８９】
安定化部分は、本発明の高分子量アプタマー組成物の薬物動態特性および薬力学的特性を改善する分子または分子の一部である。場合によっては、安定化部分は、２つまたはそれ以上のアプタマーもしくはアプタマードメインを近接させる、または本発明の高分子量アプタマー組成物の全体的な回転自由度の低下をもたらす、分子または分子の一部である。安定化部分は、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール）であり得、これは線状であってもよいし、分枝状であってもよく、ホモポリマーであってもよいし、ヘテロポリマーであってもよい。他の安定化部分としては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などのポリマーが挙げられる。オリゴヌクレオチドが安定化部分であってもよく、このようなオリゴヌクレオチドとしては、修飾ヌクレオチド、および／または修飾されたリンカー、例えばホスホロチオエートを挙げることができる。安定化部分は、アプタマー組成物の一体部分であってもよく、すなわち、そのアプタマーに共有結合している。
【０１９０】
本発明の組成物は、２つまたはそれ以上の核酸部分が少なくとも１つのポリアルキレングリコール部分に共有結合で結合体化している高分子量アプタマー組成物を含む。このポリアルキレングリコール部分は、安定化部分としての役割を果たす。ポリアルキレングリコールが核酸と１つの分子の中で互いに一緒になるように、ポリアルキレングリコール部分がアプタマーのいずれかの末端に共有結合している組成物の場合、そのポリアルキレングリコールは、連結部分と言われる。そうした組成物おける共有結合分子の一次構造は、線状配置の核酸−ＰＡＧ−核酸を含む。一例は、一次構造の核酸−ＰＥＧ−核酸を有する組成物である。別の例は、核酸−ＰＥＧ−核酸−ＰＥＧ−核酸の線状配置である。
【０１９１】
核酸−ＰＥＧ−核酸結合体を生成するために、核酸は、元々、単一の反応性部位を有する（例えば、一活性化されている）ように合成する。好ましい実施形態において、この反応性部位は、オリゴヌクレオチドの固相合成における最終段階として修飾ホスホロアミダイトの付加により５’末端に導入されるアミノ基である。その修飾オリゴヌクレオチドの脱保護および精製後、活性化ＰＥＧの自然加水分解を最小にする高濃度溶液中で、それを再構成する。好ましい実施形態において、前記オリゴヌクレオチドの濃度は、１ｍＭであり、前記再構成溶液は、２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３−緩衝剤（ｐＨ８．３）を含有する。結合体の合成は、高度に精製された二官能性ＰＥＧの徐々の段階的な付加によって開始させる。好ましい実施形態において、前記ＰＥＧジオールは、プロピオン酸スクシンイミジルでの誘導体化により両末端が活性化されている（二活性化されている）。反応後、そのＰＥＧ−核酸結合体をゲル電気泳動または液体クロマトグラフィーによって精製して、完全に結合体化した種と部分的に結合体化した種と結合体化していない種を分離する。濃縮された多数のＰＡＧ分子（例えば、ランダムコポリマーもしくはブロックコポリマー）またはより小さなＰＡＧ鎖を連結して、様々な長さ（または分子量）を実現することができる。様々な長さのＰＡＧ鎖の間に非ＰＡＧリンカーを用いることができる。
【０１９２】
２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロおよび他の修飾ヌクレオチド修飾は、ヌクレアーゼに対してアプタマーを安定させ、インビボでのその半減期を増加させる。３’−３’−ｄＴキャップもエキソヌクレアーゼ耐性を増大させる。例えば、米国特許第５，６７４，６８５号、同第５，６６８，２６４号、同第６，２０７，８１６号および同第６，２２９，００２号参照（これらは、各々、その全体が本明細書において参考として援用される）。
【０１９３】
反応性核酸のＰＡＧ誘導体化
高分子量ＰＡＧ−核酸−ＰＡＧ結合体は、１つより多くの反応性部位を含有する核酸と一官能性活性化ＰＥＧを反応させることにより調製することができる。１つの実施形態において、前記核酸は、二反応性であるか、二活性化されており、そして２つの反応性部位：５’−アミノ基および３’−アミノ基を含有し、これらの基は、従来のホスホロアミダイト合成、例えば図６に図示されているような３’−５’−ジ−ＰＥＧ化、によってオリゴヌクレオチドに導入される。代替実施形態では、例えば、ピリミジンの５位、プリンの８位またはリボースの２’位を第一アミンの取り付け部位として用いて、反応性部位を内部の位置に導入することができる。こうした実施形態における核酸は、幾つかの活性化部または反応性部位を有することができ、多活性化されていると言われる。合成および精製後、その修飾オリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチド反応性部位との選択的な反応を促進すると同時に自然加水分解を最小にする条件下で、一活性化ＰＥＧと合される。好ましい実施形態では、モノメトキシ−ＰＥＧをプロピオン酸スクシンイミジルで活性化し、そのカップリング反応をｐＨ８．３で行う。二置換ＰＥＧを合成させるために、オリゴヌクレオチドに対して化学量論的に過剰なＰＥＧを供給する。反応後、そのＰＥＧ−核酸結合体をゲル電気泳動または液体クロマトグラフィーによって精製して、完全に結合体化した種と部分的に結合体化した種と結合体化していない種を分離する。
【０１９４】
連結ドメインは、それらに取り付けられた１つまたはそれ以上のポリアルキレングリコール部分も有することができる。このようなＰＡＧは、様々な長さのものであり得、所望の分子量の組成物を獲得するために適切な組み合わせで使用することができる。
【０１９５】
特定のリンカーの作用は、その化学組成と長さの両方による影響を受ける。長すぎるリンカー、短すぎるリンカー、またはＩＬ−２３および／もしくはＩＬ−１２と望ましくない立体性相互作用および／またはイオン性相互作用を形成するリンカーは、本アプタマーとＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２との間の複合体の形成を妨げるであろう。核酸間距離にまたがるために必要なものより長いリンカーは、そのリガンドの有効濃度を低下させることで結合安定性を低下させ得る。従って、しばしば、標的に対するアプタマーの親和性を最大にするためにリンカーの組成および長さを最適化する必要がある。
【０１９６】
本明細書に引用するすべての出版物および特許文献は、各々のこのような出版物および文献が参考として本明細書に援用されると明確に且つ個々に示されているかのうように、本明細書に援用されている。出版物および特許文献の引用は、いずれも関連の先行技術であるという明示と解釈せず、また、いずれの同じ内容および日付に関する明示とするようには意図されない。本発明をここで書面により説明してきたが、様々な実施形態で本発明を実施できること、ならびに上述の説明および以下の実施例が例証のためのものであり、後続の特許請求の範囲の限定ではないことが、当業者には理解される。
【実施例】
【０１９７】
（実施例１：アプタマーセレクションおよび配列）
（ＩＬ−２３アプタマーセレクション）
幾つかのＳＥＬＥＸ（商標）戦略を利用して、ＩＬ−２３およびＩＬ−１２に対する様々な特異性を有するリガンドを作製した。ＩＬ−１２に対してＩＬ−２３に特異的なアプタマーを生成するために設計した１つのスキームにより、ネガティブセレクション工程にＩＬ−１２を含めて、共通のサブユニットを認識するアプタマーを排除し、ＩＬ−２３に特異的なアプタマーを選択した。ＩＬ−２３およびＩＬ−１２を１ラウンドごとに交互にさせる別個のＳＥＬＥＸ（商標）スキームにより、共通のサブユニットを認識し、したがって両方のタンパク質を認識するアプタマーを惹起した。実施例１Ａおよび１Ｅにおけるセレクションは、２’−ＯＨプリンおよび２’−Ｆピリミジン（ｒＲｆＹ）含有プールで行った。これらのセレクションからのクローンを、細胞ベースのアッセイでのそれらの結合親和性およびＩＬ−２３活性の阻害に関する効力に基づき最適化した。加えて、２’−ＯＭｅヌクレオチド含有プール、すなわち、ｒＲｍＹ（２’−ＯＨ  Ａおよび２’−ＯＨ  Ｇ、ならびに２’−ＯＭｅ  Ｃおよび２’−ＯＭｅ  Ｕ）、ｒＧｍＨ（２’−ＯＨ  Ｇおよび２’−ＯＭｅ  Ｃ、２’−ＯＭｅ  Ｕ、２’−ＯＭｅ  Ａ）ならびにｄＲｍＹ（デオキシＡおよびデオキシＧ、ならびに２’−ＯＭｅ  Ｃおよび２’−ＯＭｅ  Ｕ）でのセレクションを下の実施例１Ｂ、実施例１Ｃおよび実施例１Ｄで説明する。
【０１９８】
（実施例１Ａ：  ２’−フルオロピリミジン含有プール（ｒＲｆＹ）でのヒトＩＬ−２３に対するセレクション）
２’−ＯＨプリン（リボ−プリン）ヌクレオチドおよび２’−Ｆピリミジンヌクレオチドから成るプール（ｒＲｆＹ条件）を使用して、ヒト（「ｈ」）−ＩＬ−２３に対するアプタマーを同定するために３つのセレクションを行った。第一のセレクション（ｈ−ＩＬ−２３）は、ｐ１９ドメインおよびｐ４０ドメインから成るｈ−ＩＬ−２３に対する直接セレクションであった。第二のセレクション（Ｘ−ＩＬ−２３）は、ｈ−ＩＬ−２３およびｈ−ＩＬ−１２をラウンドごとに交互に利用して、２つのタンパク質の間に共通のサブユニット（ｐ４０）に対するアプタマーのセレクションを行った。第三のセレクション（ＰＮ−ＩＬ−２３）では、ｈ−ＩＬ−１２をネガティブセレクション工程に含めて、ｈ−ＩＬ−２３に特有のサブドメイン（ｐ１９）に結合しているアプタマーを富化させた。下で説明するように、この第三セレクション、すなわち、ＰＮ−ＩＬ−２３セレクションのための出発物質は、ｈ−ＩＬ−２３タンパク質に対する２回のセレクションラウンド後のｈ−ＩＬ−２３プールの残りから分離した、ｈ−ＩＬ−２３セレクション由来のプールの一部であった。３つのセレクション戦略はすべて、ｈ−ＩＬ−２３に対するアプタマーをもたらした。ｈ−ＩＬ−２３に非常に特異的であるアプタマーもあり、ｈ−ＩＬ−２３とｈ−ＩＬ−１２との間の交差反応性を示すものもあり、そしてあるものは、ｈ−ＩＬ−２３に対してＩＬ−１２に特異的である。
【０１９９】
ｈ−ＩＬ−２３およびＰＮ−ＩＬ−２３セレクションのラウンド１は、１時間、室温、１００μＬの最終容積での、α３２Ｐ  ＡＴＰ体標識プールのスパイクを含む２’Ｆピリミジン修飾ＡＲＣ２１２プール（配列番号８）（５’ｇｇｇａａａａｇｃｇａａｕｃａｕａｃａｃａａｇａ−Ｎ４０−ｇｃｕｃｃｇｃｃａｇａｇａｃｃａａｃｃｇａｇａａ３’）の２×１０１４個の分子と、１００ｐｍｏｌのＩＬ−２３タンパク質（Ｒ＆Ｄ，Ｍｉｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）とのインキュベーションで開始した。このテンプレート（配列番号８）中のＮの連続は、ヌクレオチドの任意の組み合わせであり得、そして得られるアプタマーの固有の配列領域をもたらす。
【０２００】
ラウンド２の後、そのプールを２つの均等部分に分け、一方の部分をｈ−ＩＬ−２３セレクションの後続ラウンド（すなわち、ラウンド３−１２）に使用し、他方の部分をＰＮ−ＩＬ−２３セレクションの後続ラウンド（すなわち、ラウンド３−１１）に使用した。Ｘ−ＩＬ−２３セレクションのラウンド１は、プールＲＮＡを５０ｐｍｏｌのｈ−ＩＬ−２３および５０ｐｍｏｌのｈ−ＩＬ−１２と共にインキュベートしたこと以外、同様に行った。
【０２０１】
すべてのセレクションは、１Ｘ  ＳＨＭＣＫ緩衝剤、ｐＨ７．４（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２）中で行った。ＲＮＡ：ｈ−ＩＬ−２３複合体と遊離ＲＮＡ分子は、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ（Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）からの０．４５μｍ  ニトロセルローススピンカラムを使用して分離した。これらのカラムは、１ｍＬ  １Ｘ  ＳＨＭＣＫで予洗し、その後、ＲＮＡ：タンパク質含有溶液をそれらのカラムに添加し、１５００ｇで２分間遠心分離機中で回転させた。緩衝剤洗浄を行って、フィルターから非特異的結合因子を除去し（ラウンド１、２ｘ５００μＬ  １Ｘ  ＳＨＭＣＫ；後のラウンド、特定の結合物を富化させるために回数および容積を増加した、よりストリンジェントな洗浄）、その後、フィルターに付着したＲＮＡ：タンパク質複合体を、溶出緩衝剤（７Ｍ尿素、１００ｍＭ  酢酸ナトリウム、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、９５℃に予熱したもの）の２×２００μＬ  洗液（後のラウンドでは、２×１００μＬ  洗液）で溶出した。溶出したＲＮＡをフェノール：クロロホルム抽出し、その後、沈殿させた（４０μｇ  グリコーゲン、１容積  イソプロパノール）。３’プライマー  ５’ｔｔｃｔｃｇｇｔｔｇｇｔｃｔｃｔｇｇｃｇｇａｇｃ３’（配列番号１０）を使用し、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造業者の指示に従って使用してそのＲＮＡを逆転写し、その後、ＰＣＲにより増幅した（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ８．４、５０  ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５μＭの５’プライマー  ５’ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａａａａｇｃｇａａｔｃａｔａｃａｃａａｇａ３’（配列番号９）、０．５μＭ  の３’プライマー（配列番号１０）、０．５ｍＭ  各ｄＮＴＰ、０．０５単位／μＬ  Ｔａｑ  ポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））。ＰＣＲ反応は、以下のサイクリング条件下で行った：ａ）３０秒間９４℃；ｂ）３０秒間５５℃；ｃ）３０秒間７２℃。十分なＰＣＲ産物が産生されるまで、サイクルを繰り返した。十分なＰＣＲ産物を産生するために必要とされる最小サイクル数を、下の表１−３に「ＰＣＲ閾値」として報告する。
【０２０２】
ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、ＰＣＲテンプレートを精製した。一晩、３７℃でのα３２Ｐ  ＡＴＰ体標識化（４％  ＰＥＧ−８０００、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  スペルミジン、０．００２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、３ｍＭ  ２’ＯＨプリン、３ｍＭ  ２’Ｆピリミジン、２５ｍＭ  ＤＴＴ、０．００２５単位／μＬ  無機ピロホスファターゼ、２μｇ／ｍＬ  Ｔ７  Ｙ６３９Ｆ単一突然変異ＲＮＡポリメラーゼ、５μＣｉ  α３２Ｐ  ＡＴＰ）を用いて、テンプレートを転写した。Ｂｉｏ  Ｓｐｉｎカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）をその製造業者の指示に従って使用して、反応物を脱塩した。
【０２０３】
３つすべてのセレクションのその後のラウンドは、表１−３に示す変更を除き、ラウンド１と同じ方法を用いて繰り返した。タンパク質標的とのインキュベーション前に、プールＲＮＡを０．４５マイクロメートルニトロセルロースフィルターカラムに通してフィルターに結合する配列を除去し、その後、濾液をポジティブセレクション段階に持っていった。交代ラウンドにおいてプールＲＮＡをゲル精製した。５０ｍＭ  ＥＤＴＡで転写反応を停止させ、エタノールで沈殿させ、その後、１．５ｍｍ変性ポリアクリルアミドゲル（８Ｍ  尿素、１０％アクリルアミド、１９：１  アクリルアミド：ビスアクリルアミド）で精製した。１Ｘ  ＴＢＥ（９０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、９０ｍＭ  ホウ酸、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中、１時間、２２５ＶでＥｌｕｔｒａｐ（登録商標）装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）における電気溶出により、ゲルからプールＲＮＡを除去した。溶出物質を、３００ｍＭ  酢酸ナトリウムおよび２．５容積のエタノールの添加によって沈殿させた。
【０２０４】
ＲＮＡは、これらのセレクションを通してタンパク質過剰のままであった（約１〜２μＭ  ＲＮＡ）。タンパク質濃度は、最初の２ラウンドについては１μＭ、その後、個々のセレクションに基づいて様々な低さに低下させた。競合ｔＲＮＡを結合反応物に０．１ｍｇ／ｍＬで添加し、これは、セレクションに依存してラウンド３または４で開始した。選択したラウンドで結合アッセイを行って、合計１１−１２ラウンドを完了した。下の表１−３は、各ラウンドに用いたプールＲＮＡ濃度、タンパク質濃度およびｔＲＮＡ濃度を含む、ｈ−ＩＬ−２３セレクション戦略、Ｘ−ＩＬ−２３セレクション戦略およびＰＮ−ＩＬ−２３セレクション戦略を用いるｒＲｆＹセレクションのために利用したセレクションの詳細を含んでいる。溶出値（フィルターカラムから流出した全ＲＮＡに対するタンパク質結合ＲＮＡについてのＣＰＭ値の比）と共にドットブロット結合アッセイを用いて、セレクションの進行をモニターした。
【０２０５】
【表１】
2007527246.tif 000013
【０２０６】
【表２】
2007527246.tif 000014
【０２０７】
【表３】
2007527246.tif 000015
ｒＲｆＹセレクションの進行のモニタリング。プールのタンパク質結合親和性をモニターするために、セレクション全体をとおしてドットブロット結合アッセイを行った。極微量の３２Ｐ標識ＲＮＡをｈ−ＩＬ−２３の希釈系列と併せ、１×ＳＨＭＣＫ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）＋  ０．１ｍｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ中、２０μＬの最終容積で、３０分間、室温でインキュベートした。Ｍｉｎｉｆｏｌｄ  Ｉドットブロット、９６ウエル真空濾過マニホールド（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）を使用してニトロセルロース濾過により、結合反応を分析した。（上から下に）Ｐｒｏｔｒａｎニトロセスロース（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐナイロン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＧＢ００２ゲルブロットペーパー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）から成る三層濾過媒体を使用した。タンパク質に結合しているＲＮＡは、ニトロセルロースフィルター上に捕捉され、これに対して非タンパク質結合ＲＮＡは、ナイロンフィルター上に捕捉される。ゲルブロットペーパーは、単に他のフィルターの支持媒体として含めた。濾過後、フィルター層を分離し、乾燥させ、蛍光体スクリーン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上で露光し、Ｓｔｏｒｍ  ８６０  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（登録商標）ブロットイメージングシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して定量した。
【０２０８】
ｈ−ＩＬ−２３不在でのＲＮＡの結合に対するｈ−ＩＬ−２３存下でのＲＮＡの結合の有意な正の比率が観察された場合、このプールを、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）をその製造業者の指示に従って使用してクローニングした。ｈ−ＩＬ−２３およびＸ−ＩＬ−２３のセレクションについては、ラウンド８プールテンプレートをクローニングし、各セレクションからの３２個の個々のクローンを１点ドットブロットスクリーン（＋／−７５ｎＭ  ｈ−ＩＬ−２３、ならびに＋／−７５ｎＭ  ｈ−ＩＬ−１２での別スクリーン）でアッセイした。ＰＮ−ＩＬ−２３セレクションについては、ラウンド１０プールをクローニングおよび配列決定し、８個の特有のクローンを１点ドットブロットスクリーン（＋／−２００ｎＭ  ｈ−ＩＬ−２３、ならびに＋／−２００ｎＭ  ｈ−ＩＬ−１２での別スクリーン）でタンパク質結合についてアッセイした。その後、ラウンド１０  ＰＮ−ＩＬ−２３プールをさらなる配列決定のために再びクローニングし、ならびにＲ１２  ＰＮ−ＩＬ−２３プールおよびそれらのクローンを１点ドットブロットスクリーン（＋／−１００ｎＭ  ｈ−ＩＬ−２３、または＋／−２００ｎＭ  ｈ−ＩＬ−１２）でタンパク質結合についてアッセイした。ＫＤ決定のために、それらのクローン転写産物のをγ−３２Ｐ  ＡＴＰで５’末端標識した。ＫＤ値は、初期スクリーニングにおいて良好な＋／−  ｈ−ＩＬ−２３結合比を有したすべての非反復配列についてのドットブロットアッセイにおいてｈ−ＩＬ−２３の希釈系列（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を使用し、１：１  ＲＮＡ：タンパク質複合体を示す方程式（結合したアプタマーの比率＝振幅＊（［ＩＬ−２３］／［ＫＤ＋［ＩＬ−２３］））（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ  ｖ．３．５１、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を得られたデータに当てはめることによって決定した。タンパク質結合特性の結果を表４に作表する。ｈ−ＩＬ−２３に対して高い親和性を有するクローンを調製し、下の実施例３で説明する細胞ベースのアッセイにおいて、機能性についてスクリーニングした。
【０２０９】
【表４−１】
2007527246.tif 000016
【０２１０】
【表４−２】
2007527246.tif 000017
【０２１１】
【表４−３】
2007527246.tif 000018
Ｎ．Ｂ＝観察された有意な結合なし
特性付けしたｒＲｆＹアプタマーの核酸配列を下の表５に与える。下の各アプタマーの非反復配列は、配列ＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＡＡＵＣＡＵＡＣＡＣＡＡＧＡ（配列番号１１）の直後のヌクレオチド第２５番目で開始し、３’固定核酸配列ＧＣＵＣＣＧＣＣＡＧＡＧＡＣＣＡＡＣＣＧＡＧＡＡ（配列番号１２）に出会うまで進む。
【０２１２】
別の注記がない限り、下に列挙する個々の配列は、５’から３’への方向で表されており、ならびにプリン（ＡおよびＧ）が２’−ＯＨであり、ピリミジン（ＵおよびＣ）が２’−フルオロであるｒＲｆＹ  ＳＥＬＥＸ（商標）条件下で選択された、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合する配列を表す。表５に列挙する各配列は、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分で誘導体化することができ、そしてキャッピング（例えば、３’逆方向ｄＴ）を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【０２１３】
【表５−１】
2007527246.tif 000019
【０２１４】
【表５−２】
2007527246.tif 000020
【０２１５】
【表５−３】
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【０２１６】
【表５−４】
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【０２１７】
【表５−５】
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上で説明したドットブロットアッセイによって判定してＩＬ−２３標的タンパク質に対する結合活性を有する配列、および細胞ベースのアッセイ（下の実施例３において説明する）において機能性であった配列を最小化した（下の実施例２において説明する）。
【０２１８】
（実施例１Ｂ：リボ／２’Ｏ−Ｍｅヌクレオチド含有プールでのヒトＩＬ−２３に対するＩＬ−２３のセレクション）
リボ／２’Ｏ−メチルヌクレオチドを含有するアプタマーを同定するために、２つのセレクションを行った。一方のセレクションは、２’Ｏ−メチルＡ、２’Ｏ−メチルＣおよび２’Ｏ−メチルＵならびに２’ＯＨ  Ｇ（ｒＧｍＨ）を使用し、他方のセレクションは、２’−ＯＭｅ  Ｃ、２’−ＯＭｅ  Ｕおよび２’−ＯＨ  Ｇ、２’−ＯＨ  Ａ（ｒＲｍＹ）を使用した。両方のセレクションが、疎水性プレート上に固定化されたｈ−ＩＬ−２３に対する直接セレクションであった。ｐ１９サブドメインおよびｐ４０サブドメインに対して特異的なアプタマーについてのバイアスセレクションの段階は行わなかった。両方のセレクションが、未処理未選択プールに対してｈ−ＩＬ−２３結合が有意に富化されたプールを生じた。個々のクローン配列をここでは報告し、選択された個々のクローンについてのｈ−ＩＬ−２３結合データを提供する。
【０２１９】
プールの調製。  ＡＢＩ  ＥＸＰＥＤＩＴＥ（商標）ＤＮＡ合成装置を使用して、配列５’−ＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＴＴＣＴＡＣＮ３０ＣＧＣＴＧＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＧ−３’（ＡＲＣ２５６）（配列番号３）を有するＤＮＡテンプレートを合成し、標準的な方法により脱保護した。このＤＮＡテンプレート（配列番号３）中のＮの連続は、ヌクレオチドの任意の組み合わせであり得、そして得られるアプタマーの固有の配列領域をもたらす。
【０２２０】
このテンプレートを５’プライマー  ５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＴＴＣＴＡＣ−３’（配列番号６７）および３’プライマー  ５’−ＣＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＣＡＧＣ−３’（配列番号６８）を用いて増幅し、その後、Ｙ６３９Ｆ単一突然変異Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼでのインビトロ転写のためのテンプレートとして使用した。転写は、３７℃で一晩、２００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、４０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  スペルミジン、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％ＰＥＧ−８０００、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５００μＭ  ＮＴＰ、５００μＭ  ＧＭＰ、０．０１単位／μＬ  無機ピロホスファターゼ、および２μｇ／ｍＬ  Ｙ６３９Ｆ単一突然変異Ｔ７ポリメラーゼを使用して行った。２つの異なる組成（ｒＧｍＨおよびｒＲｍＹ）を転写した。
【０２２１】
セレクション。  セレクションの各ラウンドを、１００μＬの１×ダルベッコＰＢＳ（ＤＰＢＳ（＋Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋））中、室温で２時間、Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ疎水性プレートの表面に２０ｐｍｏｌのｈ−ＩＬ−２３を固定化することによって開始させた。その後、上清を除去し、ウエルを１２０μＬの洗浄緩衝剤（１×ＤＰＢＳ、０．２％  ＢＳＡおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で４回洗浄した。プールＲＮＡを３分間、９０℃に加熱し、１０分間、室温に冷却して、リフォールディングした。ラウンド１において、ポジティブセレクション工程を行った。簡単に言うと、プールＲＮＡの１×１０１４個の分子（０．２ｎｍｏｌ）を、固定化されたタンパク質標的を有するウエル内で、１００μＬの結合緩衝剤（１×ＤＰＢＳおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）中で１時間インキュベートした。その後、上清を除去し、ウエルを１２０μＬの洗浄緩衝剤で４回洗浄した。後続のラウンドにネガティブセレクション段階を含めた。プールＲＮＡもまた、ポジティブセレクション工程前、プールから一切のプラスチック結合配列を除去するために、室温で３０分間、空のウエル内でインキュベートした。ラウンド４の後に洗浄回数を増加して、ストリンジェンシーを増大させた。すべての場合、固定化されたｈ−ＩＬ−２３に結合しているプールＲＮＡは、ＲＴミックス（３’プライマー（配列番号６８））の添加、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、その後の６５℃での１時間のインキュベーションによって、セレクションプレート内で直接、逆転写した。
【０２２２】
結果として生じたｃＤＮＡを、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を使用するＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。６０℃のアニーリング温度でカップリングさせる「ホットスタート（Ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ）」ＰＣＲ条件を用いて、プライマー−二量体形成を最小にした。増幅されたプールテンプレートＤＮＡを、Ｃｅｎｔｒｉｓｅｐカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ａｄｅｌｐｈｉａ，ＮＪ）をその製造業者の推奨条件に従って用いて脱塩し、それを使用して次のセレクションラウンドのためのプールＲＮＡを転写した。転写されたプールは、ラウンド毎に１０％ポリアクリルアミドゲルでゲル精製した。表６は、セレクションラウンド毎に使用したＲＮＡ濃度を示すものである。
【０２２３】
【表６】
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実施例１Ａに記載したようにドットブロットサンドイッチフィルター結合アッセイを用いて、セレクションの進行をモニターした。５’−３２Ｐ標識プールＲＮＡを９０℃で３分間、リフォールディングし、１０分間、室温に冷却した。次に、プールＲＮＡ（極微量（ｔｒａｃｅ）濃度）をｈ−ＩＬ−２３  ＤＰＢＳ  ＋  ０．１ｍｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡと共に３０分間、室温でインキュベートし、その後、ドットブロット装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）内のニトロセルロースフィルターとナイロンフィルターとのサンドイッチに塗布した。そのニトロセルロースに結合したプールＲＮＡのパーセンテージを算出し、約３ランドごとに一点スクリーン（＋／−２５０ｎＭ  ｈ−ＩＬ−２３）でモニターした。プールＫＤ測定は、ｈ−ＩＬ−２３タンパク質（Ｒ＆Ｄ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の力価測定および上で説明したようなドットブロット装置を使用して測定した。
【０２２４】
ｒＲｍＹ  ｈ−ＩＬ−２３セレクションは、４セレクションラウンド後に未処理プールに対してｈ−ＩＬ−２３が富化されていた（データは示さない）。セレクションストリンジェンシーを増大させ、セレクションをさらに８ラウンド継続した。ラウンド９におけるプールＫＤは、約５００ｎＭまたはそれ以上であった。ｒＧｍＨセレクションは、ラウンド１０において未処理プール結合以上に富化された。このプールＫＤも、約５００ｎＭまたはそれ以上であった。図７は、ｈ−ＩＬ−２３に結合する、ｒＲｍＹおよびｒＧｍＨプールセレクションの結合曲線である。ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してこれらのプールをクローニングし、個々の配列を作製し、結合について検定した。１：２００希釈、＋／−２００ｎＭ  ＩＬ−２３および０．１ｍｇ／ｍＬ  競合ｔＲＮＡを使用して、すべての粗製ｒＲｍＹクローン転写に対する一点結合スクリーンを最初に行った。その後、その一点スクリーンにおいて最良の結合を示した２４個のｒＲｍＹクローンに対して１０点スクリーンを行った。１０点スクリーンは、３倍系列希釈でゼロから４８０ｎＭのＩＬ−２３を使用して行った。結合曲線を作成し（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ  ｖ．３．５１，Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）、そのデータを方程式：ＲＮＡ結合の比率＝振幅＊（［ｈ−ＩＬ−２３］／［ＫＤ＋［ｈ−ＩＬ−２３］  に当てはめることによってＫＤを概算した。下の表７は、ｈ−ＩＬ−２３に対する結合親和性を提示するｒＲｍＹ選択アプタマーについての配列データを示すものである。ｒＲｍＹクローンから１グループの６重複配列および４対の２重複配列を作製した。表８は、このように検定したｒＲｍＹクローンの結合特性を示すものである。１：２００希釈での４８の粗製ｒＧｍＨクローン転写からのクローンも検定し、０．１ｍｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡを競合物質として使用した。バックグラウンド以上の平均結合は約１４％にすぎなかったのに対し、同アッセイにおけるｒＲｍＹクローンの平均は約３０％であり、１０個のクローンは４０％より高かった。検定したｒＧｍＨクローンの配列および結合特性表示は示さない。
【０２２５】
特性付けしたｒＲｍＹアプタマーの核酸配列を下の表７に与える。表７中の各アプタマーの固有の配列は、配列ＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＵＵＣＵＡＣ（配列番号６９）の直後のヌクレオチド第２３番目で開始し、３’固定核酸配列ＧＣＵＧＵＣＧＡＵＣＧＡＵＣＧＡＵＣＧＡＵＧ（配列番号７０）に出会うまで進む。
【０２２６】
別の注記がない限り、下に列挙する個々の配列は、５’から３’への方向で表されており、そしてプリン（ＡおよびＧ）が２’−ＯＨであり、ピリミジン（ＵおよびＣ）が２’−ＯＭｅであるｒＲｍＹ  ＳＥＬＥＸ（商標）条件下で選択された、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合するアプタマーの配列を表す。表７に列挙する各配列は、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分で誘導体化することができ、そしてキャッピング（例えば、３’逆方向ｄＴ）を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【０２２７】
【表７】
2007527246.tif 000025
【０２２８】
【表８】
2007527246.tif 000026
＊＊  １×ＤＰＢＳ（＋Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋）中での３０分の室温でのインキュベーションのアッセイを行った。
＊＊  Ｒ＆Ｄ  ＩＬ−２３（担体非含有タンパク質）。
【０２２９】
（実施例１Ｃ：  デオキシ／２’Ｏ−メチルヌクレオチド含有プールでのヒトＩＬ−２３に対するセレクション）
ｈ−ＩＬ−２３戦略を使用し、デオキシプリン（ＡおよびＧ）ならびに２’−Ｏ−Ｍｅピリミジン（ＣおよびＵ）を使用して、ＩＬ−２３に対して特異的な安定化アプタマーを得るために、代替セレクションを行った。
【０２３０】
プールの調製。  ＡＢＩ  ＥＸＰＥＤＩＴＥ（商標）ＤＮＡ合成装置を使用して、配列５’−ＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＴＴＣＴＡＣＮ３０ＣＧＣＴＧＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＧ−３’（ＡＲＣ２５６、配列番号３）を有するＤＮＡテンプレートを合成し、標準的な方法により脱保護した。このＤＮＡテンプレート（配列番号３）中のＮの連続は、ヌクレオチドの任意の組み合わせであり得、ならびに得られるアプタマーの固有の配列領域をもたらす。このテンプレートを５’プライマー  ５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＴＴＣＴＡＣ−３’（配列番号６７）および３’プライマー  ５’−ＣＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＣＡＧＣ−３’（配列番号８９）で増幅し、その後、Ｙ６３９Ｆ単一突然変異Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼでのインビトロ転写のためのテンプレートとして使用した。転写は、３７℃で一晩、２００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、４０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  スペルミジン、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％ＰＥＧ−８０００、９．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．９ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２ｍＭ  ＮＴＰ、２ｍＭ  ＧＭＰ、２ｍＭ  スペルミン、０．０１単位／μＬ  無機ピロホスファターゼ、および２μｇ／ｍＬ  Ｙ６３９Ｆ単一突然変異Ｔ７ポリメラーゼを使用して行った。
【０２３１】
セレクション：１００μＬの１×ＰＢＳ中、室温で１時間、Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ疎水性プレートの表面に２０ｐｍｏｌのｈ−ＩＬ−２３を固定化することによって、各セレクションラウンドを開始させた。その後、上清を除去し、ウエルを１２０μＬの洗浄緩衝剤（１×ＰＢＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡおよび０．１ｍｇ／ｍＬ  サケ精子ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」））で５回洗浄した。ラウンド１において、ポジティブセレクション工程を行った：タンパク質標的が固定化されたウエルの内で１００μＬの結合緩衝剤（１×ＰＢＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡおよび０．１ｍｇ／ｍＬ  ｓｓＤＮＡ）中、１００ｐｍｏｌのプールＲＮＡ（６×１０１３個の固有分子）を１時間インキュベートした。その後、上清を除去し、ウエルを１２０μＬの洗浄緩衝剤で５回洗浄した。後続のラウンドにネガティブセレクション工程を含めた。プールＲＮＡもまた、ポジティブセレクション段階前、プールから一切のプラスチック結合配列を除去するために、室温で１時間、空のウエル内でインキュベートした。ラウンド３で開始する第二のネガティブセレクション工程を導入した。標的が固定化されたウエルを、ポジティブセレクション工程の前に室温で１時間、１００μＬのブロッキング緩衝剤（１×ＰＢＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ  ｓｓＤＮＡおよび０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）でブロックした。すべての場合、固定化されたｈ−ＩＬ−２３に結合しているプールＲＮＡは、ＲＴミックス（３’プライマー（配列番号８９））およびＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の添加、その後の６５℃での１時間のインキュベーションによって、セレクションプレート内で直接、逆転写した。結果として生じたｃＤＮＡを、ＰＣＲ（Ｔａｑポリメラーゼ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のためのテンプレートとして使用した。６８℃のアニーリング温度でカップリングさせる「ホットスタート」ＰＣＲ条件を用いて、プライマー−二量体形成を最小にした。増幅されたプールテンプレートＤＮＡを、Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）をその製造業者の推奨条件に従って用いて脱塩し、それを使用して、次のセレクションラウンドのためのプールＲＮＡの転写をプログラムした。転写されたプールは、ラウンドごとに１０％ポリアクリルアミドゲルでゲル精製した。
【０２３２】
タンパク質結合アッセイ。前に実施例１Ａにおいて説明したサンドイッチフィルター結合アッセイを用いて、セレクションの進行をモニターした。５’−３２Ｐ標識プールＲＮＡ（極微量濃度）をｈ−ＩＬ−２３、１×ＰＢＳ  ＋  ０．１ｍｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ  ｓｓＤＮＡおよび０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡと共に３０分間、室温でインキュベートし、その後、ドットブロット装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）内のニトロセルロースフィルターとナイロンフィルターとのサンドイッチに塗布した。そのニトロセルロースに結合したプールＲＮＡのパーセンテージを、ランド６、７および８の後、ｈ−ＩＬ−２３（０．２５ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、４ｎＭ、１６ｎＭ、６４ｎＭおよび１２８ｎＭ）での７点スクリーンで算出した。プールＫＤ測定値は、前に説明したとおり算出した。
【０２３３】
ｄＲｍＹ  ＩＬ−２３セレクションは、６セレクションラウンド後に未処理プールに対してｈ−ＩＬ−２３が富化されていた。ラウンド８でのプールＫＤは、約５４ｎＭまたはそれ以上であった。ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、ラウンド６、７および８のプールをクローニングし、個々の配列を作製した。表９は、ラウンド６、７および８のプールから作製したｄＲｍＹクローンの配列のリストである。各クローンについてタンパク質結合分析を行った。３０分間、室温でのインキュベーションについての結合アッセイを１×ＰＢＳ  ＋  ０．１ｍｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ  サケ精子ＤＮＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ中で行った。表１０は、これらの個々の配列についての結合特性表示を含む。
特性付けしたｄＲｍＹアプタマーの核酸配列を下の表９に与える。下の各アプタマーの固有の配列は、配列ＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＵＵＣＵＡＣ（配列番号６９）直後のヌクレオチド第２３番目に開始し、３’固定核酸配列ＧＣＵＧＵＣＧＡＵＣＧＡＵＣＧＡＵＣＧＡＵＧ（配列番号９０）に出会うまで進む。
【０２３４】
別の注記がない限り、下に列挙する個々の配列は、５’から３’への方向で表されており、そしてプリン（ＡおよびＧ）がデオキシであり、ピリミジン（ＵおよびＣ）が２’−ＯＭｅであるｄＲｍＹ  ＳＥＬＥＸ（商標）条件下で選択された、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合するアプタマー配列を表す。表９に列挙する各配列は、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分で誘導体化することができ、そしてキャッピング（例えば、３’逆方向ｄＴ）を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【０２３５】
【表９】
2007527246.tif 000027
【０２３６】
【表１０】
2007527246.tif 000028
＊＊  １×ＰＢＳ  ＋  ０．１ｍｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ  ｓｓＤＮＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ中でアッセイを行った、３０分の室温でのインキュベーション
＊＊  Ｒ＆Ｄ  ＩＬ−２３（担体非含有タンパク質）
Ｎ．Ｂ．＝検出可能な結合なし。
【０２３７】
（実施例１Ｄ：デオキシ／２’Ｏ−メチルヌクレオチド含有プールでのヒトＩＬ−２３に対する追加のセレクション）
序論：  デオキシ／２’Ｏ−メチルヌクレオチドを含有するプールを使用してｈ−ＩＬ−２３へのアプタマーを同定するために、３つのセレクション戦略を用いた。これらのセレクションには、２’Ｏ−Ｍｅ  Ｃおよび２’Ｏ−Ｍｅ  Ｕ、ならびにデオキシＡおよびデオキシＧを使用した。第一のセレクション戦略（ｄＲｍＹ  ｈ−ＩＬ−２３）は、ｈ−ＩＬ−２３に対する直接セレクションであった。第二のセレクション戦略（ｄＲｍＹ  ｈ−ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２ｎｅｇ）では、ｈ−ＩＬ−１２をネガティブセレクション工程に含めて、ｐ１９（ｈ−ＩＬ−２３に特有のサブドメイン）に結合するアプタマーを富化させた。第三のセレクション戦略（ｄＲｍＹ  ｈ−ＩＬ−２３−Ｓ）では、長期洗浄を含めることにより増大させたストリンジェンシーをポジティブセレクションにおいて用い、より親和性の高いアプタマーのためのセレクションのために選択した。３つすべての戦略が、ｈ−ＩＬ−２３に対するアプタマーをもたらした。ｈ−ＩＬ−２３に対して特異的なアプタマーもあり、ｈ−ＩＬ−２３とｈ−ＩＬ−１２の間の交差反応性を示すものもある。
【０２３８】
ｄＲｍＹセレクション：ｄＲｍＹ  ｈ−ＩＬ−２３セレクションのラウンド１は、ＡＢＩ  ＥＸＰＥＤＩＴＥ（商標）ＤＮＡ合成装置を使用して合成し、標準的な方法により脱保護した、配列５’−ＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＵＵＣＵＡＣ−Ｎ３０−ＧＧＵＣＧＡＵＣＧＡＵＣＧＡＵＣＡＵＣＧＡＵＧ−３’（ＡＲＣ５２０）（配列番号９８）を有する、２’−Ｏ−Ｍｅ  Ｃおよび２’−Ｏ−Ｍｅ  ＵならびにデオキシＡおよびデオキシＧ修飾ＲＮＡプールの３ｘ１０１４個の分子で開始した。このテンプレート（配列番号９８）中のＮの連続は、ヌクレオチドの任意の組み合わせであり得、ならびに得られるアプタマーの固有の配列領域をもたらす。
１００μＬの１×ＰＢＳ中、室温で１時間、Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ疎水性プレートの表面に２０ｐｍｏｌのｈ−ＩＬ−２３を固定化することによって、各セレクションラウンドを開始させた。その後、上清を除去し、ウエルを１２０μＬの洗浄緩衝剤（１×ＰＢＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡおよび０．１ｍｇ／ｍＬ  サケ精子ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」））で５回洗浄した。ラウンド１において、タンパク質標的が固定化されたウエルの内で１００μＬの結合緩衝剤（１×ＰＢＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡおよび０．１ｍｇ／ｍＬ  ｓｓＤＮＡ）中、５００ｐｍｏｌのプールＲＮＡ（３ｘ１０１４個の分子）を１時間インキュベートした。その後、上清を除去し、ウエルを１２０μＬの洗浄緩衝剤で５回洗浄した。ポジティブセレクション工程の前にプールから一切のプラスチック結合配列を除去するためにプールＲＮＡを室温で１時間、空のウエル内でもインキュベートするネガティブセレクション工程を、後続のラウンドに含めた。
ラウンド３で開始する第二のネガティブセレクション段階を導入した。ポジティブセレクション工程の前に室温で１時間、１００μＬのブロッキング緩衝剤（１Ｘ  ＰＢＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ  ｓｓＤＮＡおよび０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）でブロックした、標的が固定化されたウエル内での１時間のインキュベーションに、前記プールを付した（表１１Ａ）。ラウンド３において、そのｄＲｍＹ  ｈ−ＩＬ−２３プールは、ポジティブｈ−ＩＬ−２３ポジティブインキュベーション前に行われる、２０ｐｍｏｌのｈ−ＩＬ−１２を用いて室温で１時間ブロッキングし、１２０μＬの洗浄緩衝剤で５回洗浄したウエルにおける室温でのさらに１時間のネガティブインキュベーション工程に、そのプールを付すことによって、ｄＲｍＹ  ｈ−ＩＬ−２３／ＩＬ−１２ｎｅｇセレクションに分割した。そのプールを後のラウンドでさらなるｈ−ＩＬ−１２ブロックウエルに分割して、ストリンジェンシーを増大させた（表１１Ｂ参照）。
【０２３９】
ｈ−ＩＬ−２３結合とｈ−ＩＬ−１２結合との間の識別力を増大させるためのさらなる方法は、ｈ−ＩＬ−１２を低濃度でプールと一緒にポジティブセレクションに加える方法であり、この場合、特定のｈ−ＩＬ−２３結合因子は、固定化ｈ−ＩＬ−２３に結合することとなり、ｈ−ＩＬ−１２結合因子は、１時間のインキュベーションの後に洗浄除去されるであろう。ｄＲｍＹ  ｈ−ＩＬ−２３−Ｓセレクションは、ｈ−ＩＬ−２３との１時間のインキュベーション後にそのプールを除去し、その後、１００μＬの１Ｘ  ＰＢＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ、および０．１ｍｇ／ｍＬ  ｓｓＤＮＡを添加し、３０分間インキュベートするポジティブセレクションにおける「ストリンジェント洗浄」の追加（表１１Ｃ）により、ラウンド６においてｄＲｍＹ  ｈ−ＩＬ−２３プールから分割した。高い親和性を有する分子を選択する意図で、このストリンジェント洗浄手順を除いたり、繰り返したりした。
すべての場合、固定化されたｈ−ＩＬ−２３に結合しているプールＲＮＡは、ＲＴミックス（３’プライマー、５’−ＣＡＴＣＧＡＴＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＣ−３’（配列番号１００））およびＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の添加、その後の６５℃での１時間のインキュベーションによって、セレクションプレート内で直接、逆転写した。結果として生じたｃＤＮＡを、ＰＣＲ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．４、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５μＭの５’プライマー  ５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＴＴＣＴＡＣ−３’（配列番号９９）、０．５μＭの３’プライマー（配列番号１００）、０．５ｍＭ  各ｄＮＴＰ、０．０５単位／μＬ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））のためのテンプレートとして使用した。ＰＣＲ反応は、次のサイクリング条件下で行った：ａ）３０秒間９４℃；ｂ）３０秒間５５℃；ｃ）３０秒間７２℃。十分なＰＣＲ産物が生成されるまで、サイクルを繰り返した。十分なＰＣＲ産物を生成するために必要とされる最小サイクル数を、表１１Ａ−１１Ｃに「ＰＣＲ閾値」として報告する。
【０２４０】
ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用してＰＣＲテンプレートを精製し、それを使用して次のセレクションラウンドのためのプールＲＮＡの転写をプログラムした。一晩、３７℃で、２００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、４０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  スペルミジン、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％  ＰＥＧ−８０００、９．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．９ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２ｍＭ  ＮＴＰ、２ｍＭ  ＧＭＰ、２ｍＭ  スペルミン、０．０１単位／μＬ  無機ピロホスファターゼおよび２μｇ／ｍＬ  Ｙ６３９Ｆ単一突然変異Ｔ７ポリメラーゼを使用して、テンプレートを転写した。５０ｍＭ  ＥＤＴＡで転写反応を停止させ、エタノールで沈殿させ、その後、１．５ｍｍ変性ポリアクリルアミドゲル（８Ｍ  尿素、１０％アクリルアミド、１９：１  アクリルアミド：ビスアクリルアミド）で精製した。３００ｍＭ  ＮａＯＡｃ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ中、３７℃での受動的溶出、その後のエタノールでの沈殿により、プールＲＮＡを前記ゲルから取り出した。各ラウンドについてのセレクション条件を次の表に提供する。
【０２４１】
【表１１−１】
2007527246.tif 000029
【０２４２】
【表１１−２】
2007527246.tif 000030
タンパク質結合分析：プールのタンパク質結合親和性をモニターするために、セレクション全体を通して、前に実施例１Ａにおいて説明したようなドットブロット結合アッセイを行った。ｈ−ＩＬ−２３不在下でのＲＮＡの結合に対するｈ−ＩＬ−２３存在下でのＲＮＡの結合の有意な正の比率が見られた場合のプールを、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）をその製造業者の指示に従って用いてクローニングした。３つすべてのセレクションにおいて、６ラウンドを経たプールから同様の配列が見られ、それら３つのセレクションの中で、４５個の特有のクローンをスクリーニングのために選択した。それら４５個のクローンをＡＢＩ  ＥＸＰＥＤＩＴＥ（商標）ＤＮＡ合成装置で合成し、その後、標準的な方法により脱保護した。４５個の個々のクローンを１０％  ＰＡＧＥゲルでゲル精製し、ＲＮＡを３００ｍＭ  ＮａＯＡｃおよび２０ｍＭ  ＥＤＴＡ中で通過溶出し、その後、エタノールで沈殿させた。
【０２４３】
それらのクローンをγ−３２Ｐ  ＡＴＰで５’末端標識し、３点ドットブロットスクリーンでＩＬ−２３とＩＬ−１２の両方の結合についてアッセイした（０ｎＭ、２０ｎＭ、および１００ｎＭ  ｈ−ＩＬ−２３；０ｎＭ、２０ｎＭ、および１００ｎＭ  ｈ−ＩＬ−１２）（データは示さない）。ＩＬ−２３とＩＬ−１２の両方に対して２０ｎＭおよび１００ｎＭタンパク質条件で有意な結合を示したクローンは、前に説明したドットブロットアッセイで０ｎＭから４８０ｎＭ（３倍希釈）のタンパク質力価測定を用いて、ＫＤ決定のためにさらにアッセイした。ＫＤ値は、１：１  ＲＮＡ：タンパク質複合体を示す方程式（結合したアプタマーの比率＝振幅＊（［ＩＬ−２３］／［ＫＤ＋［ＩＬ−２３］））＋バックグラウンド結合）（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ  ｖ．３．５１、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）に得られたデータを当てはめることによって決定した。より親和性が高いクローンについてのタンパク質結合の特性付けの結果を表１３に作表し、対応するクローン配列は表１２に列挙する。
【０２４４】
特性付けしたｄＲｍＹアプタマーの核酸配列を下の表１２に与える。下の各アプタマーの固有の配列は、配列ＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＵＵＣＵＡＣ（配列番号１０１）の直後のヌクレオチド第２３番目で開始し、３’固定核酸配列ＧＵＣＧＡＵＣＧＡＵＣＧＡＵＣＡＵＣＧＡＵＧ（配列番号１０２）に出会うまで進む。
【０２４５】
別の注記がない限り、下に列挙する個々の配列は、５’から３’への方向で表されており、そしてプリン（ＡおよびＧ）がデオキシであり、ピリミジン（ＣおよびＵ）が２’−ＯＭｅであるｄＲｍＹ  ＳＥＬＥＸ（商標）条件下で選択された、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２に結合するアプタマーの配列を表す。表１２に列挙する各配列は、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分で誘導体化することができ、そしてキャッピング（例えば、３’逆方向ｄＴ）を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【０２４６】
【表１２−１】
2007527246.tif 000031
【０２４７】
【表１２−２】
2007527246.tif 000032
【０２４８】
【表１３】
2007527246.tif 000033
＊  ドットブロットアッセイにおいてＫＤを決定するための３０分の室温でのインキュベーション
＊  １×ＰＢＳ  ＋  ０．１ｍｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ、サケ精子ＤＮＡ、ＢＳＡ反応緩衝剤。
【０２４９】
（ヒトＩＬ−２３アプタマーセレクションの要約）
ＩＬ−２３  ＳＥＬＥＸ（商標）の異なるセレクション条件および戦略により、異なる結合特性を有する、安定化されたおよび／または最小化された幾つかのアプタマーを生じさせた。ｒＲｆＹ選択アプタマーは、およそ１５ｎＭから４６０ｎＭの範囲の親和性を有し、ならびに任意のポストＳＥＬＥＸ（商標）最適化前におよそ５０ｎＭから５μＭの範囲のＩＣ５０での細胞性効力を有する。これらは、結合特性の適切な増加でさらに最小化することができ、ならびに細胞ベースのアッセイにおいて効力増加を示すと予想される。これらのアプタマーは、ＩＬ−２３とＩＬ−１２の間の最も顕著な区別も示し、ＩＬ−１２よりＩＬ−２３を１００倍以上識別する。
【０２５０】
ｒＲｍＹセレクション条件下で得られるアプタマーは、約８ｎＭ〜３μＭの範囲にわたる親和性を有する。しかし、それらの細胞性効力は、ｒＲｆＹアプタマーの効力より低い。ｒＧｍＨ構築物はどうかといえば、一点スクリーンを行ったが、バックグラウンド以上のそれらの結合程度がｒＲｍＹクローンほどは良好でなかったため、それ以上は何も有さなかった。４８個の粗製ｒＧｍＨクローン転写を１：２００稀釈で用い、０．１ｍｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡを競合物質として使用した。バックグラウンド以上の平均結合はわずか約１４％にとどまり、これに対して同じアッセイでのｒＲｍＹクローンの平均は、約３０％であり、１０個のクローンは、４０％より高かった。
【０２５１】
ｄＲｍＹセレクションアプタマーは、約３ｎＭ〜約２００ｎＭの範囲の高い親和性を有し、ならびに任意のポストＳＥＬＥＸ（商標）最適化前に〜５０ｎＭから〜５００ｎＭの範囲のＩＣ５０での顕著な細胞性効力を示す（下の実施例３において説明する）。これらのアプタマーのうちの幾つかは、ＩＬ−１２より約４倍、ＩＬ−２３を区別もし、これは、さらなる最適化により向上させることができる。
【０２５２】
実施例１Ｅ：  ２’−Ｆピリミジン含有プール（ｒＲｆＹ）でのマウス（「ｍ」）−ＩＬ−２３に対するセレクション
序論：  ２’−ＯＨプリンヌクレオチドおよび２’−Ｆピリミジンヌクレオチドから成るプール（ｒＲｆＹ組成）を使用してｍＩＬ−２３に対するアプタマーを同定するために、２つのセレクション戦略を用いた。第一のセレクション戦略（ｍＩＬ−２３）は、ｍＩＬ−２３に対する直接セレクションであった。第二のセレクション戦略（ｍＩＬ−２３Ｓ）は、セレクションをより高い親和性結合因子に向かわせる試みで、初期ラウンドがＲＮＡおよびタンパク質の濃度を低下させた、よりストリンジェントなセレクションであった。両方のセレクション戦略が、ｍＩＬ−２３に対するアプタマーをもたらした。
【０２５３】
セレクション：２つの戦略（ｍＩＬ−２３およびｍＩＬ−２３Ｓ）は、γ３２Ｐ  ＡＴＰ５’末端標識プールのスパイクを含む、配列５’ＧＧＡＧＣＧＣＡＣＵＣＡＧＣＣＡＣ−Ｎ４０−ＵＵＵＣＧＡＣＣＵＣＵＣＵＧＣＵＡＧＣ  ３’（ＡＲＣ２７５）（配列番号１１９）を有する２’Ｆピリミジン修飾プールの２×１０１４個の分子とマウスＩＬ−２３（研究所内で単離したもの）とのインキュベーションで開始した。このテンプレート（配列番号１１９）中のＮの連続は、ヌクレオチドの任意の組み合わせであり得、ならびに得られるアプタマーの固有の配列領域をもたらす。
【０２５４】
ｍＩＬ−２３セレクションのラウンド１において、プールＲＮＡを５０ｐｍｏｌのタンパク質と共に、１００μＬの最終容積で、１時間、室温でインキュベートした。ｍＩＬ−２３Ｓセレクションのラウンド１では、プールＲＮＡを６５ｐｍｏｌのｍＩＬ−２３と共に、１３００μＬの最終容積で、１時間、室温でインキュベートした。セレクションは、１×ＰＢＳ緩衝剤中で行った。Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ（Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）からの０．４５μｍニトロセルローススピンカラムを使用して、ＲＮＡ：ｍＩＬ−２３複合体と遊離ＲＮＡ分子とを分離した。これらのカラムは、１ｍＬ  １Ｘ  ＰＢＳで予洗し、その後、ＲＮＡ：タンパク質含有溶液をカラムに添加し、２０００ｒｐｍで１分間、遠心分離機でスピンした。緩衝剤洗浄を行って、フィルターから非特異的結合因子を除去し（ラウンド１では、２ｘ５００μＬ  １Ｘ  ＰＢＳ；後のラウンドでは、特異的結合因子を富化させるために回数および容積を増加させた、よりストリンジェントな洗浄）、その後、フィルターに付着したＲＮＡ：タンパク質複合体を溶出緩衝剤（７Ｍ  尿素、１００ｍＭ  酢酸ナトリウム、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、９０℃に予熱）の２ｘ２００μＬの洗液（後のラウンドでは、２ｘ１００μＬの洗液）で溶出した。溶出したＲＮＡを沈殿させた（４０μｇ  グリコーゲン、１容量のイソプロパノール）。３’プライマー  ５’ＧＣＴＡＧＣＡＧＡＧＡＧＧＴＣＧＡＡＡ  ３’（配列番号１２１）を使用し、製造業者の指示に従ってＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）でＲＮＡを逆転写し、その後、ＰＣＲ増幅した（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．４、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５μＭの５’プライマー  ５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＴＣＡＧＣＣＡＣ  ３’（配列番号１２０）、０．５μＭの３’プライマー（配列番号１２１）、０．５ｍＭ  各ｄＮＴＰ、０．０５単位／μＬ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））。ＰＣＲ反応は、次のサイクリング条件下で行った：ａ）３０秒間９４℃；ｂ）３０秒間６０℃；ｃ）３０秒間７２℃。十分なＰＣＲ産物が生成されるまで、サイクルを繰り返した。十分なＰＣＲ産物を生成するために必要とされる最小サイクル数を、表１４に「ＰＣＲ閾値」として報告する。
【０２５５】
ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、ＰＣＲテンプレートを精製した。一晩、３７℃でのα３２Ｐ  ＧＴＰ体標識化（４％  ＰＥＧ−８０００、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  スペルミジン、０．００２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、３ｍＭ  ２’ＯＨプリン、３ｍＭ  ２’Ｆピリミジン、２５ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５単位／１００μＬ  無機ピロホスファターゼ、２μｇ／ｍＬ  Ｔ７  Ｙ６３９Ｆ単一突然変異ＲＮＡポリメラーゼ、５μＣｉ  α３２Ｐ  ＧＴＰ）を用いて、テンプレートを転写した。
【０２５６】
後続のラウンドは、ラウンド１と同じ方法を使用して繰り返したが、ネガティブ工程を追加した。タンパク質標的とのインキュベーション前に、プールＲＮＡを０．４５マイクロメートルニトロセルロースカラムに通して、フィルターに結合する配列を除去し、その後、濾液をポジティブセレクション工程に持っていった。交互のラウンドで、プールＲＮＡをゲル精製した。５０ｍＭ  ＥＤＴＡで転写反応を停止させ、エタノールで沈殿させ、その後、１．５ｍｍ変性ポリアクリルアミドゲル（８Ｍ  尿素、１０％アクリルアミド、１９：１  アクリルアミド：ビスアクリルアミド）で精製した。３００ｍＭ  ＮａＯＡｃ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ中で通過溶出させ、その後、３００ｍＭ  酢酸ナトリウムおよび２．５容積のエタノールの添加で沈殿させることにより、プールＲＮＡを前記ゲルから取り出した。
【０２５７】
ＲＮＡは、これらのセレクションを通してタンパク質過剰のままであった（約１μＭ  ＲＮＡ）。タンパク質濃度は、個々のセレクションに基づいて様々な低さの濃度に低下させた。競合ｔＲＮＡを結合反応物に０．１ｍｇ／ｍＬで添加し、これは、セレクションに依存してラウンド２または３で開始した。選択したラウンドで結合アッセイを行って、合計７ラウンドを完了した。表１４は、プールＲＮＡ濃度、タンパク質濃度および各ラウンドに用いたｔＲＮＡ濃度を含むセレクションの詳細を含んでいる。溶出値（フィルターカラムから流出した全ＲＮＡに対するタンパク質結合ＲＮＡについてのＣＰＭ値の比）と共に結合アッセイを用いて、セレクションの進行をモニターした。
【０２５８】
【表１４】
2007527246.tif 000034
ｒＲｆＹ  ｍＩＬ−２３タンパク質結合分析：先に説明したように、プールのタンパク質結合親和性をモニターするために、セレクション全体を通してドットブロット結合アッセイを行った。ｍＩＬ−２３存在下でＲＮＡの有意な結合レベルが観察された場合のプールを、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）をその製造業者の指示に従って使用してクローニングした。両方のｍＩＬ−２３セレクションについて、ラウンド７プールテンプレートをクローニングし、各セレクションからの１６個の個々のクローンを、８点ｍＩＬ−２３力価測定を用いてアッセイした。スクリーニングされた合計３２個のクローンのうちの７個は、特異的な結合曲線を有した。それらを表１６に列挙する。表１５は、対応する配列のリストである。他のすべては、未選択未処理プールに類似した非特異的結合曲線を示した。ｍＩＬ−２３に対して高い親和性を有するクローンを、その後、同じように、マウスＩＬ−１２、ヒトＩＬ−２３およびヒトＩＬ−１２に対するタンパク質結合についてスクリーニングした。
【０２５９】
特性付けしたｒＲｆＹアプタマーの核酸配列を下の表１５に与える。下の各アプタマーの非反復配列は、配列ＧＧＡＧＣＧＣＡＣＵＣＡＧＣＣＡＣ（配列番号１２２）の直後のヌクレオチド第１８番目で開始して、３’固定核酸配列ＵＵＵＣＧＡＣＣＵＣＵＣＵＧＣＵＡＧＣ（配列番号１２３）に出会うまで進む。
【０２６０】
別の注記がない限り、下に列挙する個々の配列は、５’から３’への方向で表されており、そしてプリン（ＡおよびＧ）が２’−ＯＨであり、ピリミジン（ＣおよびＵ）が２’−フルオロであるｒＲｆＹ  ＳＥＬＥＸ（商標）条件下で選択された、マウスＩＬ−２３に結合する配列を表す。表１５に列挙する各配列は、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分で誘導体化することができ、そしてキャッピング（例えば、３’逆方向ｄＴ）を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【０２６１】
【表１５】
2007527246.tif 000035
【０２６２】
【表１６】
2007527246.tif 000036
＊  ＫＤ決定のために３０分、室温でのインキュベーション
＊  １×ＰＢＳ  ＋  ０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ反応緩衝剤。
【０２６３】
（実施例１Ｆ：マウスＩＬ−１２に対して特異性を有するマウスＩＬ−２３アプタマーのセレクション）
序論：マウスＩＬ−１２（ｍＩＬ−１２）に対して特異性を有するマウスＩＬ−２３（ｍＩＬ−２３）に対するアプタマーを同定するために、１つのセレクションを行った。このセレクションは、ラウンド３で開始する、上のセレクションで説明したｒＲｆＹセレクションｍＩＬ−２３Ｓから分かれたものである。このセレクションは、ｍＩＬ−１２と比較して約３〜５倍の特異性を有する、ｍＩＬ−２３に対するアプタマーをもたらした。
【０２６４】
ｍＩＬ−２３Ｓ／ｍＩＬ−１２ｎｅｇ  ｒＲｆＹセレクション。  マウスＩＬ−１２に対して特性を有するマウスＩＬ−２３アプタマーを得るために、上の実施例１Ａにおいて説明したネガティブ（ＰＮ−ＩＬ−２３）セレクションにおけるタンパク質に類似したマウスＩＬ−１２をネガティブセレクションに含めた。上の実施例１Ｅにおいて説明したｍＩＬ−２３Ｓセレクションのラウンド２から得られたＲＮＡを使用して、セレクションのネガティブ段階にｍＩＬ−１２を含めるＲ３ＰＮ  ｍＩＬ−２３／１２ｎｅｇセレクションを開始した。選択したラウンドで結合アッセイを行って、９回のセレクションラウンドを行った。表１７は、プールＲＮＡ濃度、タンパク質濃度および各ラウンドに用いたｔＲＮＡ濃度を含む、セレクション条件の要約である。溶出値（フィルターカラムから流出した全ＲＮＡに対するタンパク質結合ＲＮＡについてのＣＰＭ値の比）と共に結合アッセイを用いて、セレクションの進行をモニターした。
【０２６５】
【表１７】
2007527246.tif 000037
セレクション緩衝剤：１×ＰＢＳ
＊  １時間のポジティブインキュベーション。
【０２６６】
ｒＲｆＹ  ｍＩＬ−２３Ｓ／ｍＩＬ−１２ｎｅｇタンパク質結合分析。プールのタンパク質結合親和性をモニターするために、前で説明したドットブロット結合アッセイを、セレクション全体を通して行った。極微量の３２Ｐ標識ＲＮＡをｍＩＬ−２３またはｍＩＬ−１２と併せ、１Ｘ  ＰＢＳ  ＋  ０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ中、３０μＬの最終容積で、３０分間、室温でインキュベートした。反応物をドットブロット装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ  Ｍｉｎｉｆｏｌｄ−１  Ｄｏｔ  Ｂｌｏｔ，Ａｃｒｙｌｉｃ）に添加した。前のセクションで説明したように結合曲線を作成した。ｍＩＬ−２３の存在下でＲＮＡの有意なレベルの結合が観察された場合のプールを、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）をその製造業者の指示に従って使用してクローニングした。ラウンド９プールテンプレートをクローニングし、そのセレクションからの１０個の個々のクローンを、ｍＩＬ−２３に対する８点ドットブロット力価測定でアッセイした。その後、ｍＩＬ−２３に有意に結合したクローンを、ｍＩＬ−１２への結合についてスクリーニングした。表１８は、結合性クローンのタンパク質結合特性の要約である。スクリーニングした合計１０個のクローンのうちの４個は、様々な親和性でｍＩＬ−２３およびｍＩＬ−１２に特異的な結合した。他のすべては、未選択未処理プールに類似した非特異的結合曲線を示した。その４個の結合性クローンの配列を下の表１９に列挙する。
【０２６７】
【表１８】
2007527246.tif 000038
＊  ＫＤ決定のための３０分、室温でのインキュベーション
＊  １Ｘ  ＰＢＳ  ＋  ０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ反応緩衝剤。
【０２６８】
特性付けしたｒＲｆＹアプタマーの核酸配列を下の表１９に与える。下の各アプタマーの固有の配列は、配列ＧＧＡＧＣＧＣＡＣＵＣＡＧＣＣＡＣ（配列番号１２２）の直後のヌクレオチド第１８番目で開始して、３’固定核酸配列ＵＵＵＣＧＡＣＣＵＣＵＣＵＧＣＵＡＧＣ（配列番号１２３）に出会うまで進む。
【０２６９】
別の注記がない限り、下に列挙する個々の配列は、５’から３’への方向で表されており、そしてプリン（ＡおよびＧ）が２’−ＯＨであり、ピリミジン（ＵおよびＣ）が２’−フルオロであるｒＲｆＹ  ＳＥＬＥＸ（商標）条件下で選択された、マウスＩＬ−２３に結合する配列を表す。表１９に列挙する各配列は、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分で誘導体化することができ、そしてキャッピング（例えば、３’逆方向ｄＴ）を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【０２７０】
【表１９】
2007527246.tif 000039
。
【０２７１】
（実施例２：組成およびシーケンス最適化ならびに配列）
（実施例２Ａ：最小化）
セレクション成功後、およびアプタマーの配列決定後、インビトロでの機能性の判定に加えて、それらの配列を最小化して、その所定の標的への結合特異性を保持しているが、改善された結合特性、例えば改善されたＫＤおよび／またはＩＣ５０を有する、より短いオリゴヌクレオチド配列を得た。
【０２７２】
（実施例２Ａ．１：ｒＲｆＹクローンの最小化）
実施例１Ａにおいて説明したｒＲｆＹセレクションからの結合性親クローンは、タイプ１およびタイプ２と呼ばれる、アプタマーの２つの主要ファミリーに分類される。図８Ａおよび８Ｂは、タイプ１アプタマーおよびタイプ２アプタマーの配列の例および予測的二次構造立体配置を示すものである。図９Ａおよび９Ｂは、タイプ１および２についての最小化アプタマー配列および予測的二次構造立体配置を示すものである。
【０２７３】
上の実施例１において説明したＩＬ−２３結合分析および下の実施例３で説明する細胞ベースのアッセイのデータを基に、ＡＭＸ８４−Ａ１０（配列番号４３）、ＡＭＸ８４−Ｂ１０（配列番号４４）およびＡＭＸ８４−Ｆ１１（配列番号４６）を含む、ｒＲｆＹ  ＰＮ−ＩＬ−２３セレクションから幾つかのタイプ１クローンを、さらなる特性付けのために選択した。最小化ＤＮＡ構築物オリゴヌクレオチドを転写し、ゲル精製し、ドットブロットアッセイでｈ−ＩＬ−２３への結合について検定した。
【０２７４】
最小化クローンＡ１０ｍｉｎ５（配列番号１３９）、Ａ１０ｍｉｎ６（配列番号１４０）は、ＡＭＸ８４−Ａ１０（配列番号４３）に基づくものであり、最小化クローンＢ１０ｍｉｎ４（配列番号１４４）およびＢ１０ｍｉｎ５（配列番号１４５）は、ＡＭＸ８４−Ｂ１０（配列番号４４）に基づくものであり、そして最小化クローンＦ１１ｍｉｎ２（配列番号１４７）は、ＡＭＸ８４−Ｆ１１（配列番号４６）に基づくものであった（図９Ａ）。これらのクローンをγ−３２Ｐ  ＡＴＰで５’末端標識し、親クローンについてと同じ方法を用いてＫＤ判定のためにドットブロットアッセイでアッセイした。すべてが有意なタンパク質結合を有し（表２１に要約）、そして下の実施例３において論じるような細胞ベースのアッセイで検定したとき、各々が、それらが由来するそれぞれの親クローンより効力が高かった。
【０２７５】
加えて、タイプ１アプタマーおよびタイプ２アプタマーのよい例となる最小化構築物を作製し、タイプ１アプタマー配列およびタイプ２アプタマー配列のファミリーのコンセンサス配列を基に検定した。タイプ１．４（配列番号１５１）およびタイプ１．５（配列番号１５２）は、タイプ１ファミリー配列に基づくこうした最小化構築物の２つの例であり、これらは、上で説明した他のタイプ１ミニマーと比較して、実施例３において説明する細胞ベースのアッセイにおいて高いＩＬ−２３結合親和性および最も強い活性を示した。
【０２７６】
結果として生じるｒＲｆＹミニマーの配列を下の表２０に列挙する。表２１は、表２０に列挙するミニマーについてのミニマー結合データを示すものである。
【０２７７】
下の表２０に記載する最小化ｒＲｆＹアプタマーについてのプリン（ＡおよびＧ）は、２’−ＯＨプリンであり、ピリミジン（ＣおよびＵ）は、２’−フルオロピリミジンである。別の注記がない限り、個々の配列は、５’から３’への方向で表されている。表２０に列挙する各配列は、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分で誘導体化することができ、そしてキャッピング（例えば、３’逆方向ｄＴ）を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【０２７８】
【表２０−１】
2007527246.tif 000040
【０２７９】
【表２０−２】
2007527246.tif 000041
【０２８０】
【表２０−３】
2007527246.tif 000042
【０２８１】
【表２１】
2007527246.tif 000043
＊＊  ＋０．１ｍｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ、３０分、室温でのインキュベーションでのアッセイを行った  
＊＊  Ｒ＆Ｄ  ＩＬ−２３（担体非含有タンパク質）。
【０２８２】
（実施例２Ａ．２：ｄＲｍＹセレクション１の最小化）
ＩＬ−２３に結合するアプタマーについてのｄＲｍＹセレクションプロセス（上の実施例１Ｃにおいて説明した）およびオリゴヌクレオチド配列の決定後、それらの配列を系統的に最小化して、結合特性を保持する、より短いオリゴヌクレオチド配列を得た。上の実施例１Ａにおいて説明したＩＬ−２３結合分析および下の実施例３において説明する細胞ベースのアッセイのデータを基に、さらなる特性付けのためにＡＲＣ４８９（配列番号９１）（７４マー）を選択した。クローンＡＲＣ４８９（配列番号９１）に基づく３個の最小化構築物を設計し、作製した。それらのクローンをγ−３２Ｐ  ＡＴＰで５’末端標識し、１Ｘ  ＰＢＳ  ＋  ０．１ｍｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ  サケ精子ＤＮＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ中、親クローンと同じ方法を用いて、ＫＤ決定のために、室温で３０分のインキュベーションについてドットブロットアッセイでアッセイした。表２２は、最小化ｄＲｍＹアプタマーについての配列を示すものである。表２３は、ｄＲｍＹ最小化アプタマーについての結合データを含む。１つの最小化クローン、ＡＲＣ５２７（配列番号１５９）だけが、ＩＬ−２３への結合を示した。このクローンを、下の実施例３で説明するＴｒａｎｓＡＭ（商標）ＳＴＡＴ３活性化アッセイで検定し、これは、その代表的な親、ＡＲＣ４８９（配列番号９１）と比較してアッセイ中に活性の低下を示した。
【０２８３】
下の表２２に記載する最小化ｄＲｍＹアプタマーについてのプリン（ＡおよびＧ）は、デオキシ−プリンであり、ピリミジン（ＵおよびＣ）は、２’−ＯＭｅピリジンである。別の注記がない限り、個々の配列は、５’から３’への方向で表されている。表２２に列挙する各配列は、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分で誘導体化することができ、そしてキャッピング（例えば、３’逆方向ｄＴ）を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【０２８４】
【表２２】
2007527246.tif 000044
【０２８５】
【表２３】
2007527246.tif 000045
＊＊  Ｒ＆Ｄ  ＩＬ−２３（担体非含有タンパク質）
Ｎ．Ｂ．＝検出可能な結合なし。
【０２８６】
（実施例２Ａ．３：ｄＲｍＹセレクション２の最小化）
ＩＬ−２３に結合するアプタマーについてのｄＲｍＹセレクションプロセス（上の実施例１Ｄにおいて説明した）およびオリゴヌクレオチド配列の決定後、それらの配列を系統的に最小化して、結合特性を保持する、より短いオリゴヌクレオチド配列を得た。
【０２８７】
実施例１Ｄにおいて説明した親ｄＲｍＹアプタマー配列の配列分析および目視検査を基に、ｄＲｍＹ  ｈ−ＩＬ−２３結合性クローンの活性化立体配座およびＧ−四量体構造（図１０）にホールディングされるそれらの最小化構築物についての仮説を立てた。機能的結合性配列の分析は、Ｇ四量体構成と一致するＧ二量体（Ｇ  ｄｏｕｂｌｅ）のパターンを示した（表２４）。Ｇ四量体ファミリー内の配列は、２つのサブクラス（第１ステムに３個の塩基対を有するものおよび２個の塩基対を有するもの）に分類される。二重鎖のＲＮＡおよびＤＮＡに結合するとエチジウムブロマイド蛍光が増加するのとほぼ同じように、Ｎ−メチルメソポルフィリンＩＸ（ＮＭＭ）蛍光はＧ−四量体構造に結合すると増加することが報告されている（Ａｒｔｈａｎａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６（１６）：３７２４（１９９６）；Ｍａｒａｔｈａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８（９）：１９６９（２０００）；Ｊｏｙｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，５８（７）：８３１（２００４））。故に、図１１に示すように、ＮＭＭ蛍光を用いて、ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）が実際にＧ−四量体構造をとることを確認した。これらの文献のプロトコルに従って、マグネシウムおよびカルシウムを含有するダルベッコＰＢＳ中の約１マイクロモル濃度のＮＭＭおよび約２マイクロモル濃度のアプタマーを含有する１００個のマイクロタイター反応物を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＳ蛍光プレートリーダーを使用して分析した。５５０から７５０ｎｍの蛍光発光スペクトルおよび４０５ｎｍの励起波長により採取した。抗トロンビンＤＮＡアプタマーＡＲＣ１８３のＧ−四量体構造（Ｍａｃａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：３７４５（１９９３））をこの実験でのポジティブコントロールとして使用した。ＡＲＣ１３４６は、Ｇ−四量体構造を有すると予測されないＡＲＣ９７９（配列番号１７７）と類似したサイズおよびヌクレオチド組成のアプタマーであり、これをこの実験でのネガティブコントロールとして使用した。図１１においてわかるように、ＡＲＣ１８３およびＡＲＣ９７９（配列番号１７７）は、ＮＭＭ単独と比較してＮＭＭ蛍光の有意な増加を示すが、ネガティブコントロール、ＡＲＣ１３４６は、示さない。
【０２８８】
最小化構築物をＡＢＩ  ＥＸＰＥＤＩＴＥ（商標）ＤＮＡ合成装置で合成し、その後、標準的な方法により脱保護した。それらの最小化クローンを１０％ＰＡＧＥゲルでゲル精製し、そのＲＮＡを３００ｍＭ  ＮａＯＡｃおよび２０ｍＭ  ＥＤＴＡ中で通過溶出し、その後、エタノールで沈殿させた。
【０２８９】
これらのクローンをγ−３２Ｐ  ＡＴＰで５’末端標識し、ならびにＫＤ決定のために、アプタマーを放射性標識し、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有する１Ｘ  ＰＢＳ中、極微小濃度（＜９０ｐＭ）に保つ一方で、ＩＬ−２３の濃度を変化させる直接結合アッセイを用いて、室温での３０分のインキュベーションについてドットブロットアッセイでアッセイした。結合したアプタマー  対  ［ＩＬ−２３］の比率を用いて、次の方程式をデータに当てはめることによりＫＤを算出した：
結合したアプタマーの比率＝振幅＊（［ＩＬ−２３］／（ＫＤ＋［ＩＬ−２３］））＋バックグラウンド結合。
【０２９０】
ｄＲｍＹセレクション２からの最小化構築物のうちの幾つかは、非放射性（ｃｏｌｄ）アプタマーを力価測定し、極微量の３２Ｐ  ＡＴＰ標識アプタマーと競合させる、競合形式でもアッセイした。この競合アッセイでは、［ＩＬ−２３］を一定に保ち、［極微量の標識アプタマー］を一定に保ち、［未標識アプタマー］を変化させた。次の方程式をデータに当てはめることにより、ＫＤを計算した：
結合したアプタマーの比率＝振幅＊（［アプタマー］／（ＫＤ＋［アプタマー］））＋バックグラウンド結合。
【０２９１】
Ｇ四量体に基づくミニマーが機能的結合因子であったのに対し、ステムループを予測するフォールディングアルゴリズム（ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅ；Ｄ．Ｈ．Ｍａｔｈｅｗｓ，ｅｔ  ａｌ．，「Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２８８，９１１−９４０，（１９９９））に基づき、かつＧ二量体パターンを含有しないミニマーは、機能的でなかった（ＡＲＣ７９３（配列番号１６３））。
【０２９２】
下の表２５は、最小化配列およびそれらが由来する親クローンの要約であり、表２６は、検定した最小化構築物についての直接結合アッセイ（＋／−  ｔＲＮＡ）および競合結合アッセイからの結合の特性付けの要約である。
【０２９３】
【表２４】
2007527246.tif 000046
表２４に列挙したクローンについての配列番号は、表１２において見出せる。
【０２９４】
下の表２５に記載する最小化ｄＲｍＹアプタマーについてのプリン（ＡおよびＧ）は、デオキシプリンであり、ピリミジン（ＣおよびＵ）は、２’−ＯＭｅピリミジンである。別の注記がない限り、個々の配列は、５’から３’への方向で表されている。表２５に列挙する各配列は、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分で誘導体化することができ、そしてキャッピング（例えば、３’逆方向ｄＴ）を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【０２９５】
【表２５−１】
2007527246.tif 000047
【０２９６】
【表２５−２】
2007527246.tif 000048
【０２９７】
【表２６−１】
2007527246.tif 000049
【０２９８】
【表２６−２】
2007527246.tif 000050
【０２９９】
【表２６−３】
2007527246.tif 000051
リガンド（アプタマー）の濃度を変化させ、受容体（ＩＬ−２３）の濃度を一定に保った飽和結合実験において、競合結合データを再分析し、［結合したアプタマー］を［全インプットアプタマー］に対してプロットした。ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）をこの分析に使用した。
【０３００】
結合した［ＡＲＣ９７９］は、約１．７ｎＭで飽和した（図１２）。これは、アプタマーを結合する能力があるＩＬ−２３の濃度が１ｎＭであり、すわなち、インプットＩＬ−２３の２％（１／５０）であったことを示唆している。ＫＤの計算値は８ｎＭであった。これは、競合方式で表されたデータを当てはめることによって得られた値（８．７ｎＭ）とよく一致した。
【０３０１】
ＩＬ−１２競合結合データを同じ分析に付すと（図１３）、活性ＩＬ−１２の比率は、より高く（１０％）、ＩＬ−１２に対してＩＬ−２３へのＡＲＣ９７９の特異性（３３倍）は、直接結合測定によって予測されたもの（２−５倍）より顕著であった。
【０３０２】
その後、前に説明した結合反応条件（室温で３０分のインキュベーションのために、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ）を使用して、および異なる結合反応条件（０．１ｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有する１×ダルベッコＰＢＳ（Ｍｇ＋＋およびＣａ＋＋含有）、３０分間、室温で）を使用して、ＡＲＣ９７９についての直接結合アッセイを繰り返した。両方において、新たに化学合成されたアプタマーを、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して精製し、γ−３２Ｐ  ＡＴＰで５’末端標識し、完全ヒトＩＬ−２３への直接結合について検定した。８点タンパク質力価測定をドットブロット結合アッセイにおいて用いた（｛１００ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、３００ｐＭ、１００ｐＭ、０ｐＭ｝または｛１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、３００ｐＭ、１００ｐＭ、３０ｐＭ、１０ｐＭ、０ｐＭ｝のいずれか）。ＫＤ値は、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ  ｖ．３．５１、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して方程式  ｙ＝（ｍａｘ／（１＋Ｋ／タンパク質））＋ｙｉｎｔに当てはめることにより、算出した。緩衝剤条件は、多少、結合親和性に影響を及ぼすように見えた。１×ＰＢＳ条件下でのＡＲＣ９７９についてのＫＤ値は、約１０ｎＭであると算出され、これに対して１×ダルベッコＰＢＳ条件下でのＡＲＣ９７９についてのＫＤ値は、約１ｎＭであると算出された（図１４参照）。これらのＫＤ値は、後続のアッセイで検証した（データは示さない）。これは、下の実施例３Ｄにおいて説明するＰＨＡ  ＢｌａｓｔアッセイにおいてＡＲＣ９７９がもたらす約６ｎＭのＩＣ５０値と一致する。
【０３０３】
（実施例２Ａ．４：マウスＩＬ−２３  ｒＲｆＹ最小化）
実施例１Ｅにおいて説明したマウスＩＬ−２３  ｒＲｆＹアプタマーの親クローン配列の目視検査、およびＲＮＡフォールディングプログラム（ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を使用して予測したＲＮＡ構造を基に、７個の結合性ｍＩＬ−２３クローンの各々について、最小化構築物を設計した。それらの最小化構築物オリゴのためのＰＣＲテンプレートは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｖｉｌｌｅ，ＩＡ）からオーダーされたものであった。構築物をＰＣＲ増幅し、転写し、ゲル精製し、前に説明したドットブロット結合アッセイを使用してｍＩＬ−２３への結合について検定した。極微量の３２Ｐ標識ＲＮＡをｍＩＬ−２３と併せ、室温で３０分間、１Ｘ  ＰＢＳ  ＋  ０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ中、３０μＬの最終容積でインキュベートした。その反応物をドットブロット装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ  Ｍｉｎｉｆｏｌｄ−１  Ｄｏｔ  Ｂｌｏｔ，Ａｃｒｙｌｉｃ）に添加した。前のセクションで説明したように結合曲線を作成した。表３２は、ｍＩＬ−２３結合性最小化構築物の配列のリストである。表３３は、ｍＩＬ−２３への有意な結合を有した各ｒＲｆＹ最小化構築物についてのタンパク質結合の特性付けの要約である。
【０３０４】
別の注記がない限り、下に列挙する個々の配列は、５’から３’への配向で表されており、ならびにプリン（ＡおよびＧ）が２’−ＯＨであり、ピリミジン（ＵおよびＣ）が２’−フルオロであるｒＲｆＹ  ＳＥＬＥＸ（商標）条件下で選択された、マウスＩＬ−２３に結合する配列を表す。表３２に列挙する各配列は、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分で誘導体化することができ、そしてキャッピング（例えば、３’逆方向ｄＴ）を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【０３０５】
【表３２】
2007527246.tif 000052
【０３０６】
【表３３】
2007527246.tif 000053
＊  ＫＤ決定のための、３０分、室温でのインキュベーション
＊  １×ＰＢＳ  ＋  ０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ反応緩衝剤。
【０３０７】
（実施例２Ｂ：メディシナル・ケミストリー（Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）による最適化）
アプタマー・メディシナル・ケミストリーは、変異アプタマーのセットを化学合成するアプタマー改善法である。これらの改変体セットは、代表的に、単一の置換基の導入により親アプタマーと異なっており、互いにこの置換位置で異なっている。そこで、これらの改変体を互いにおよび親と比較する。単一の置換基を含めることが特定の治療基準を達成するために必要なすべてであり得るのに十分な特性の改善は、実に重大な意味を持ち得る。
【０３０８】
あるいは、単一改変体セットから収集した情報を使用して、１つより多くの置換基が同時に導入されるさらなる改変体セットを設計することができる。１つの設計戦略は、単一置換基改変体のすべてをランク付けし、その上位４個を選択し、これら４個の単一置換基改変体についてのすべての可能な２つから成る組み合わせ（６）、３つから成る組み合わせ（４）および４つから成る組み合わせ（１）を合成し、アッセイする。第二設計戦略では、最良の単一置換基改変体を新たな親であると考え、最高ランクの単一置換改変体を含むすべての可能な２つから成る組み合わせの置換基改変体を合成し、アッセイする。他の戦略を用いることができ、またこれらの戦略は、さらに改善された改変体を同定し続けながら置換数を徐々に増加させるように、繰り返し適用することができる。
【０３０９】
アプタマー・メディシナル・ケミストリーは、全体的な置換基導入ではなく局部的な置換基導入を探査する方法として最も価値がある。アプタマーは、転写により作製されるライブラリーの中で発見されたため、ＳＥＬＥＸ（商標）プロセス中に導入される任意の置換基は、全体的に導入されるはずである。例えば、ヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を導入することを望む場合、それらをすべてのＡ（またはすべてのＧ、Ｃ、Ｔ、Ｕなど）に導入することしかできない（全体的に置換される）。幾つかのＡ（または幾つかのＧ、Ｃ、Ｔ、Ｕなど、部分的に置換されている）ではホスホロチオエートを必要とするが、他のＡではそれを許容することができないアプタマーは、このプロセスでは容易に発見することができない。
【０３１０】
アプタマー・メディシナル・ケミストリー・プロセスにより利用することができる置換基の種類は、固相合成試薬としてそれらを作製し、オリゴマー合成機構にそれらを導入する能力によってしか制限されない。間違いなく、このプロセスは、ヌクレオチドだけに限定されることはない。アプタマー・メディシナル・ケミストリー機構は、立体的な嵩、疎水性、親水性、親油性、疎油性、正電荷、負電荷、中性電荷、両性イオン、分極性、ヌクレアーゼ耐性、配座的剛性、配座的可撓性、タンパク質結合特性、質量などを導入する置換基を含むことができる。アプタマー・メディシナル・ケミストリー機構は、塩基修飾、糖修飾またはホスホジエステル結合修飾を含むことができる。
【０３１１】
治療用アプタマーに関連して有益である可能性が高い置換基の種類を考えるとき、次のカテゴリーのうちの１つまたはそれ以上に分類される置換の導入が望ましいであろう：
（１）体内に既に存在している置換基、例えば、２’−デオキシ、２’−リボ、２’−Ｏ−メチルプリンもしくはピリミジンまたは５−メチルシトシン。
【０３１２】
（２）認可されている治療薬の既に一部である置換基、例えば、ホスホロチオエート連結型オリゴヌクレオチド。
【０３１３】
（３）上の２つのカテゴリーのうちの１つに加水分解または分解する置換基、例えば、メチルホスホネート連結型オリゴヌクレオチド。
【０３１４】
（実施例２Ｂ．１：ホスホロチオエート置換によるＡＲＣ９７９の最適化）
ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）は、ｄＲｍＹ組成のＩＬ−２３に対する３４ヌクレオチドアプタマーである。各リン酸エステル結合位置で単一ホスホロチオエート置換を行ったＡＲＣ９７９の２１個のホスホロチオエート誘導体を設計し、合成した（ＡＲＣ１１４９からＡＲＣ１１６９）（配列番号２０３から配列番号２２３）（表２７参照）。これらの分子をゲル精製し、上で説明したようなドットブロットアッセイを用いてＩＬ−２３結合についてアッセイし、互いにおよびその親分子、ＡＲＣ９７９と比較した。８点ＩＬ−２３力価測定（０ｎＭから３００ｎＭ、３倍系列稀釈）を結合アッセイにおいて用いた。算出したＫＤを表２８に要約する。
【０３１５】
ＡＲＣ９７９にホスホロチオエート結合を含めたものは、ＡＲＣ９７９と比較して十分に許容された。これらの構築物の多くは、ＩＬ−２３への結合比率が増大しており、加えて、改善された（すなわち、より低い）ＫＤ値を有する（図１５）。競合アッセイにおいて同様の親和性増加が観察され（図１６）、これは、ＡＲＣ９７９のホスホロチオエート誘導体が、ＩＬ−２３に対してＡＲＣ９７９より高い親和性で競合することをさらに支持している。
【０３１６】
別の注記がない限り、下の表２７に列挙する各配列は、５’−３’方向でのものであり、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分で誘導体化することができ、そしてキャッピング（例えば、３’逆方向ｄＴ）を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【０３１７】
【表２７−１】
2007527246.tif 000054
【０３１８】
【表２７−２】
2007527246.tif 000055
【０３１９】
【表２８−１】
2007527246.tif 000056
【０３２０】
【表２８−２】
2007527246.tif 000057
。
【０３２１】
（実施例２Ｂ．２：最適化：２’−ＯＭｅ、ホスホロチオエートおよびイノシン置換）
ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）に系統的修飾を行って、全体的な安定性および血漿ヌクレアーゼ耐性を増大させた。４期のアプタマー合成、精製、および結合活性についてのアッセイを含む系統的合成アプローチにより、ＡＲＣ９７９の最も安定で効力のある改変体を同定した。このプロセスの第一段階は、ＡＲＣ１３８６（配列番号２２４）（３’−逆方向ｄＴを有するＡＲＣ９７９）の合成およびその結合活性についてのアッセイであった。ＡＲＣ１３８６（配列番号２２４）が、その親分子ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）のものに類似した親和性でＩＬ−２３に結合することが証明されたら、ＡＲＣ９７９のすべての後続誘導体を安定化３’−逆方向ｄＴで合成した。
【０３２２】
前に説明したドットブロット結合アッセイを用いて、合成した大多数のアプタマーの相対効力を特性付けした。ＫＤ決定のために、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて化学合成アプタマーを精製し、γ−３２Ｐ  ＡＴＰで５’末端標識し、完全ヒトＩＬ−２３への直接結合について検定した。０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有するダルベッコＰＢＳ（Ｍｇ＋＋およびＣａ＋＋含有）中でのドットブロット結合アッセイ（｛１００ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、３００ｐＭ、１００ｐＭ、０ｐＭ｝または｛１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、３００ｐＭ、１００ｐＭ、３０ｐＭ、１０ｐＭ、０ｐＭ｝のいずれか）で、８点タンパク質力価測定を用いた。ＫＤ値は、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ  ｖ．３．５１、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して方程式  ｙ＝（ｍａｘ／（１＋Ｋ／タンパク質））＋ｙｉｎｔに当てはめることにより算出した。合成し、精製し、ＩＬ−２３への結合についてアッセイしたＡＲＣ９７９誘導体の配列、ならびにタンパク質結合の特性付けの結果を、下の表２９および３０に作表する。表３０において判るように、および前に上の実施例２Ａ．３において説明したように、ＡＲＣ１３８６（配列番号２２４）（これは、３’逆方向ｄＴを有するＡＲＣ９７９（配列番号１７７）である）は、これらの条件下で１ｎＭのＫＤを有する。
【０３２３】
ＡＲＣ１４２７−ＡＲＣ１４７１（配列番号２２５−２６９）から成るこの最適化プロセスの１期において、ＡＲＣ１３８６（配列番号２２４）における個々のプリン残基各々を、対応する２’−Ｏ−メチル含有残基により置換した。加えて、１期において、ヌクレアーゼ安定性をもたらすことに加えて、ホスホロチオエート置換がＡＲＣ９７９の誘導体の結合親和性を強化することを示唆していた、前に生じた結果を基に、一連の個別および複合ホスホロチオエート置換を検定した。最後に、１期の終了時に、ＡＲＣ９７９／ＡＲＣ１３８６の機能に関連してステム１の役割をさらに探査する検定を一連のアプタマーに行った。表３０における結合データから判るように、多くの位置が、２’−Ｏ−メチル残基に対するデオキシ残基での置換を容易に許容した。いずれの特定のホスホロチオエートの追加も、アプタマーの親和性の有意な強化をもたらすようには見えなかった。興味深いことに、ＡＲＣ１４６５−１４７１（配列番号２６３−２６９）を比較するとわかるように、ステム１は、高親和性結合の維持に重要であったが、その役割は、構造的クランプであるよう見えた。なぜなら、アプタマーコアとステム１を含む２本の鎖との間へのＰＥＧスペーサーの導入が、アプタマーの結合特性に有意な悪影響を与えるようには見えなかったからである。
【０３２４】
最適化プロセスの１期からの構造活性関係（ＳＡＲ）の結果を基に、アプタマーの第二の系統を設計し、合成し、精製し、ＩＬ−２３への結合について検定した。ＡＲＣ１５３９−ＡＲＣ１５４５（配列番号２７０−２７６）から成る２期最適化では、１期からのデータを使用して、２’−Ｏメチル置換を排他的に用いることによりさらに高度に修飾された複合分子を生成した。これらおよびすべての後続の分子にとっての目的は、約２ｎＭまたはそれより良好な親和性（ＫＤ）、ならびに少なくとも５０％のＩＬ−２３への１００ｎＭ（または３および４期では１０ｎＭ）での結合度を保持する分子を同定することであった。単純な結合親和性という点でこれらのうち最良なものは、ＡＲＣ１５４４（配列番号２７５）であった。
【０３２５】
ＡＲＣ１５９１−ＡＲＣ１６２６（配列番号２７７−３１２）から成る最適化の３期では、ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）のＧ−四量体構造の安定性を、デオキシイノシン（ｄＩ）での（デオキシグアノシン）ｄＧの系統的置換中にＩＬ−２３結合をアッセイすることにより探査した。デオキシイノシンには、デオキシグアノシンに見られる環外アミンがないため、ｄＧからｄＩへの置換ごとに可能性のあるＧ−四量体からアミノ−Ｎ７水素結合が１つだけ除去される。データから判るように、有意な置換のみが、ＩＬ−２３に対する親和性の実質的な低下を招く。これは、そのアプタマー構造が頑丈であることを示唆している。加えて、ＡＲＣ１５４４（配列番号２７５）関連物（ＡＲＣ１６２０からＡＲＣ１６２６（配列番号３０６−３１２）を含む）へのホスホロチオエート含有残基の追加を評価した。表３０において判るように、ＡＲＣ１６２０−１６２６（配列番号３０６−３１２）の親和性は、ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）と比較して、実際に改善された。図１７は、３期最適化の努力から選択されたＡＲＣ９７９誘導体（ＡＲＣ１６２４およびＡＲＣ１６２５）についての結合曲線を図示するものであり、選択されたホスホロチオエート含有残基を含めることによってもたらされる、親分子ＡＲＣ９７９と比較して顕著に改善された結合親和性を示している。
【０３２６】
ＡＲＣ１７５５−１７５６（配列番号３１３−３１４）から成る最適化の４期は、より多くのデオキシから２’−Ｏ−メチルへの置換を導入して親和性を保持する試みのうち２つの配列だけを含む。ＡＲＣ１７５５および１７５６で判るように、これらの実験は成功した。
【０３２７】
別の注記がない限り、表２９に列挙する個々の配列は、５’から３’への方向でのものであり、そしてポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分で誘導体化することができる。
【０３２８】
【表２９−１】
2007527246.tif 000058
【０３２９】
【表２９−２】
2007527246.tif 000059
【０３３０】
【表２９−３】
2007527246.tif 000060
【０３３１】
【表２９−４】
2007527246.tif 000061
【０３３２】
【表２９−５】
2007527246.tif 000062
【０３３３】
【表２９−６】
2007527246.tif 000063
【０３３４】
【表２９−７】
2007527246.tif 000064
【０３３５】
【表３０−１】
2007527246.tif 000065
【０３３６】
【表３０−２】
2007527246.tif 000066
【０３３７】
【表３０−３】
2007527246.tif 000067
【０３３８】
【表３０−４】
2007527246.tif 000068
【０３３９】
【表３０−５】
2007527246.tif 000069
【０３４０】
【表３０−６】
2007527246.tif 000070
＊  ＫＤ決定のために３０分の室温でのインキュベーション
＊  １×ダルベッコＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋含有）＋０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ反応緩衝剤。
【０３４１】
（実施例２Ｃ：抗ＩＬ−２３アプタマーの血漿中安定性）
最適化プロセス中に同定されたアプタマーのサブセットをヒト血漿中でのヌクレアーゼ安定性についてアッセイした。血漿ヌクレアーゼ分解は、下で説明するような変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて測定した。簡単に言うと、血漿中安定性判定のために、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて化学合成アプタマーを精製し、γ−３２Ｐ  ＡＴＰで５’末端修飾し、その後、再びゲル精製した。極微量の３２Ｐ標識アプタマーを、２００マイクロリットル結合反応において、９５％ヒト血清中１００ｎＭの非標識アプタマーの存在下でインキュベートした。０時点についての反応を、ＰＢＳで血漿を置換したことを除き同じ成分で行って、ゲルに負荷された放射活性の量が実験全体を通して確実に一致するようした。反応物をサーモサイクラーにおいて３７℃で１時間、３時間、１０時間、３０時間および１００時間インキュベートした。各時点において、２０マイクロリットルの反応物を除去し、２００マイクロリットルのホルムアミド負荷色素と併せ、液体窒素で瞬間凍結し、−２０℃で保管した。最終時点を取った後、凍結サンプルを解凍し、２０マイクロリットルを各時点から除去した。その後、それらの小サンプルにＳＤＳを０．１％の最終濃度まで添加した。その後、それらのサンプルを９０℃で１０−１５分間インキュベートし、１５％変性ＰＡＧＥゲルに直接負荷させ、１２Ｗで３５分間泳動した。Ｓｔｏｒｍ  ８６０Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して、ゲル上の放射活性を定量した。各時点での完全長アプタマーのパーセンテージは、完全長アプタマーバンドを定量し、そのレーンの全カウントで割ることによって決定した。その後、各時点での完全長アプタマーの比率を、０時間時点の完全長アプタマーのパーセンテージに対して正規化した。時間の関数としての完全長アプタマーの比率を次の方程式に当てはめた：
ｍ１＊ｅ＾（−ｍ２＊ｍ０）
（式中、ｍ１は、完全長アプタマー最大％であり（ｍ１＝１００）；およびｍ２は、分解速度である）。
アプタマーの半減期（Ｔ１／２）は、（ｌｎ２）／ｍ２に等しい。
【０３４２】
サンプルデータを図１８に示し、検定したアプタマーの結果を表３１に要約する。
【０３４３】
【表３１】
2007527246.tif 000071
。
【０３４４】
（実施例３：機能的細胞アッセイ）
（活性ｒＲｆＹ  ＩＬ−２３アプタマーの細胞ベースのアッセイおよび最小化）
ＩＬ−２３は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達において一定の役割を果たし、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４およびＳＴＡＴ５をリン酸化する。ＩＬ−２３アプタマーが細胞ベースの活性を示すかどうかを検定するために、ＰＨＡ（植物性赤血球凝集素）を含有する培地中で成長させた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、すなわちＰＨＡ  Ｂｌａｓｔ、の溶解産物において、シグナル伝達をアッセイした。より具体的には、細胞ベースのアッセイにより、ＩＬ−２３アプタマーがＰＨＡ  ＢｌａｓｔにおいてＩＬ−２３誘導ＳＴＡＴ−３リン酸化を阻害できるかどうかを判定した。
【０３４５】
本質的に、ＩＬ−２３処理細胞の溶解産物は、静止状態の細胞またはアプタマーブロック細胞より活性化されたＳＴＡＴ３を含有するであろう。ＩＬ−２３誘導ＳＴＡＴ３リン酸化の阻害は、次の２つの方法によって測定した：抗ホスホＳＴＡＴ３抗体（Ｔｙｒ７０５）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を使用するウエスタンブロットによる方法；およびＴｒａｎｓＡＭ（商標）アッセイ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）による方法。ＴｒａｎｓＡＭ（商標）アッセイキットは、ＳＴＡＴコンセンサス結合部位（５’ＴＴＣＣＣＧＧＡＡ−３’）を含有するオリゴヌクレオチドが固定化されている９６ウエルプレートを提供する。ＳＴＡＴ３が活性化されているときにのみ利用できるＳＴＡＴ３上のエピトープを認識する抗ＳＴＡＴ３抗体を、ＨＲＰ結合体型二次抗体と併用して、分光光度法により定量することができる比色定量読出しを得る（図１９）。
【０３４６】
要約すると、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して全血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離することにより、細胞ベースのアッセイを行った。ＩＬ−２（１００単位／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を捕捉した、ＰＨＡを含有する末梢血（Ｓｉｇｍａ）中、３７℃／５％ＣＯ２で３〜５日間ＰＢＭＣを培養して、ＰＨＡ芽細胞（Ｂｌａｓｔ）を産生させた。ＩＬ−２３アプタマーを検定するために、ＰＨＡ芽細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、その後、ＲＰＭＩ、０．２０％ＦＢＳ中で４時間、血清飢餓させた。血清飢餓後、約２百万個の細胞を、適切に表示したエッペンドルフ型試験管に等分した。３ｎｇ／ｍＬの最終濃度のｈＩＬ−２３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を実施例１で説明したような様々なＩＬ−２３アプタマーの稀釈系列と併せ、そのサイトカイン／アプタマー混合物を前記の等分した細胞に１００μＬの最終量で添加し、３７℃で１０−１２分間インキュベートした。１．５ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４を含有する１ｍＬの氷冷ＰＢＳを添加することにより、そのインキュベーション反応を停止させた。ＴｒａｎｓＡＭ（商標）ＳＴＡＴ３アッセイにより提供された溶解緩衝剤をその製造業者の指示に従って使用して、細胞溶解産物を作製した。図２０は、この細胞ベースのアッセイのために用いたプロトコルの流れの要約を図示するものである。
【０３４７】
２’−Ｆピリミジン含有プール（ｒＲｆＹ）、リボ／２’Ｏ−Ｍｅ含有プール（ｒＲｍＹ）、デオキシ／２’Ｏ−Ｍｅ含有プール（ｄＲｍＹ）および最適化ｄＲｍＹアプタマーを用いる様々なセレクションからの親アプタマーおよび最小化ＩＬ−２３アプタマーを、ＴｒａｎｓＡＭ（商標）法を用いて検定した。
【０３４８】
（実施例３Ａ：ｒＲｆＹセレクションからの親および最小化クローンについての細胞ベースのアッセイの結果）
実施例１Ａにおいて説明したｒＲｆＹセレクションからの完全長クローンおよび実施例２Ａ．１において説明した選択された最小化ｒＲｆＹクローンを、ＴｒａｎｓＡＭ（商標）ＳＴＡＴ３活性化アッセイを用いて検定した。表３４は、実施例１Ａにおいて説明したｒＲｆＹセレクションから作製したＩＬ−２３完全長アプタマーについての細胞ベースのアッセイのデータの要約である。表３５は、それぞれの親（完全長）クローンの活性と各々比較した、実施例２Ａ．１において説明したｒＲｆＹ最小化クローンの活性化データの要約である。最小化ｒＲｆＹクローンＦ１１ｍｉｎ２（配列番号１４７）、Ａ１０ｍｉｎ５（配列番号１３９）、Ａ１０ｍｉｎ６（配列番号１４０）、Ｂ１０ｍｉｎ４（配列番号１４４）、Ｂ１０ｍｉｎ５（配列番号１４５）、タイプ１．４（配列番号１５１）およびタイプ１．５（配列番号１５２）各々は、ＴｒａｎｓＡＭ（商標）ＳＴＡＴ３活性化アッセイにおいて検定したとき、完全長ｒＲｆＹクローンのすべてに加えてそれぞれの親クローンより性能が優れていた（図２１参照）。
【０３４９】
【表３４−１】
2007527246.tif 000072
【０３５０】
【表３４−２】
2007527246.tif 000073
【０３５１】
【表３４−３】
2007527246.tif 000074
【０３５２】
【表３５】
2007527246.tif 000075
。
【０３５３】
（実施例３Ｂ：第一ｄＲｍＹセレクションからの親および最小化クローンについての細胞ベースのアッセイの結果）
実施例１Ｃにおいて説明したｄＲｍＹセレクションからの親クローンおよびこのセレクションからの最小化ｄＲｍＹクローン（実施例２Ａ．２において説明したもの）を、ＴｒａｎｓＡＭ（商標）ＳＴＡＴ３活性化アッセイを用いて活性について検定した。ＩＬ−２３に対して高い結合親和性を示した、実施例１Ｃにおいて説明した３つの完全長ｄＲｍＹクローン、ＡＲＣ４８９（配列番号９１）、ＡＲＣ４９０（配列番号９２）およびＡＲＣ４９１（配列番号９４）を検定した。ＩＬ−２３への結合を示さなかったＡＲＣ４９２（配列番号９７）をネガティブコントロールとして使用した。ＡＲＣ４８９（配列番号９１）およびＡＲＣ４９１（配列番号９４）は、ＴｒａｎｓＡＭ（商標）ＳＴＡＴ３活性化アッセイにおいて同等の細胞ベースの活性を示した。予備データは、５０ｎＭ−５００ｎＭの範囲のＩＣ５０を示している（データは示さない）。
【０３５４】
ＩＬ−２３への結合を示した、実施例２Ａ．２において説明したｄＲｍＹ最小化の努力からの唯一の最小化クローン、ＡＲＣ５２７（配列番号１５９）をＴｒａｎｓＡＭ（商標）ＳＴＡＴ３活性化アッセイにおいて検定し、これは、そのそれぞれの完全長ＡＲＣ４８９（配列番号９１）と比較してアッセイ中の活性の低下を示した（データは示さない）。
【０３５５】
（実施例３Ｃ：第二ｄＲｍＹセレクションからの親および最小化クローンについての細胞ベースのアッセイの結果）
実施例１Ｄにおいて説明したｄＲｍＹセレクションからの親クローン、およびｈＩＬ−２３への高い親和性を示したこのセレクションからの最小化クローン（実施例２Ａ．３において説明したもの）を、３ｎｇ／ｍＬの一定ＩＬ−２３濃度との組み合わせで３倍稀釈での０から３μＭの８点ＩＬ−２３力価測定を用いるＴｒａｎｓＡＭ（商標）アッセイにおいて、機能性についてスクリーニングした。完全長クローンについてのＩＣ５０は、用量反応曲線から算出した。図２２は、ＴｒａｎｓＡＭ（商標）アッセイにおいて強力な細胞ベースの活性を示した、実施例１Ｄにおいて説明したセレクションからのｄＲｍＹクローン（ＡＲＣ６１１（配列番号１０３）、ＡＲＣ６１４（配列番号１０５）、ＡＲＣ６２１（配列番号１０８）およびＡＲＣ６２７（配列番号１１０）））についての用量反応曲線の例である。
【０３５６】
ＴｒａｎｓＡＭ（商標）アッセイにおいて、最小化ｄＲｍＹクローン（実施例２Ａ．３において説明したもの）を機能性についてスクリーニングし、それぞれの親クローンと比較した。ＩＣ５０を用量反応曲線から算出した。図２３は、親完全長クローン、ＡＲＣ６２１（配列番号１０８）およびＡＲＣ６２７（配列番号１１０）と比較した、幾つかの、より強力な最小化ｄＲｍＹクローン、ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）、ＡＲＣ９８０（配列番号１７８）、ＡＲＣ９８２（配列番号１８０）についての用量反応曲線の例である。ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）は、ＴｒａｎｓＡＭ（商標）アッセイにおいて一貫して最高の動作をし、３つの実験の過程全体にわたって平均したところ４０ｎＭ＋／−１０ｎＭのＩＣ５０を有した。ＡＲＣ７９２（配列番号１６２）、ＡＲＣ７９４（配列番号１６４）、ＡＲＣ７９５（配列番号１６５）も、ＴｒａｎｓＡＭ（商標）アッセイにおいて強力な活性を示した。
【０３５７】
（実施例３Ｄ：最適化ＡＲＣ９７９誘導体についての細胞ベースのアッセイの結果）
ｈＩＬ−２３への高い親和性を示す、実施例２Ｂ．２において説明した最適化ＡＲＣ９７９誘導体のうちの幾つかを、前に説明したＰＨＡ芽細胞アッセイを用いてＩＬ−２３誘導ＳＴＡＴ３活性化を阻害するそれらの能力についてスクリーニングした。ＩＬ−２３誘導ＳＴＡＴ３リン酸化の阻害は、Ｐａｔｈｓｃａｎ（登録商標）ホスホＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）  Ｓａｎｄｗｉｔｃｈ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を使用して測定した。
【０３５８】
前に説明したＴｒａｎｓＡＭ（商標）Ａｓｓａｙに類似して、Ｐａｔｈｓｃａｎ（登録商標）Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）  Ｓａｎｄｗｉｔｃｈ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔは、９６ウエルプレートのウエルに被覆されたＳＴＡＴ３ウサギモノクローナル抗体を使用することによりＰｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ（Ｔｙｒ７０５）タンパク質の内在性レベルを検出する。細胞溶解産物とのインキュベーション後、非ホスホＳＴＡＴ３タンパク質とホスホＳＴＡＴ３タンパク質の両方が、前記被覆抗体によって捕捉される。ホスホＳＴＡＴ３マウスモノクローナル抗体を添加して、捕捉されたホスホＳＴＡＴ３タンパク質を検出し、その後、ＨＲＰ結合抗マウス抗体を使用して、結合した検出抗体を認識する。ＨＲＰ基質、ＴＭＢ、を添加して発色させる。この発色についての光学密度の大きさは、ホスホＳＴＡＴ３タンパク質の量に比例する。
【０３５９】
ＰＨＡ芽細胞は、上で説明したように単離および作製し、ならびにＴｒａｎｓＡＭ（商標）アッセイで前に説明した３ｎｇ／ｍＬを使用するのではなく６ｎｇ／ｍＬの最終一定濃度のｈＩＬ−２３（Ｒ＆Ｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で処理してＳＴＡＴ３活性化を誘導した。ＴｒａｎｓＡＭ（商標）アッセイで前に説明した３ｎｇ／ｍＬを使用するのではなく、ＳＴＡＴ３活性化を誘導するために６ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２３（Ｒ＆Ｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の一定ＩＬ−２３濃度との組み合わせで３倍稀釈での０から７００ｎＭの６点ＩＬ−２３力価測定を用いることにより、２Ｃにおいて説明したセレクションからの幾つかのクローンをスクリーニングした。Ｐａｔｈｓｃａｎキットにより提供された緩衝剤を使用して、処理細胞の溶解産物を作製し、そのアッセイをその製造業者の指示に従ってランした。完全長クローンについてのＩＣ５０は、用量反応曲線から算出した。
【０３６０】
ＴｒａｎｓＡＭ（商標）法を用いて４０＋／−１０ｎＭのＩＣ５０を示したＡＲＣ９７９は、Ｐａｔｈｓｃａｎ（登録商標）法を用いると６＋／−１ｎＭのＩＣ５０を一貫して示した。前に述べたように、このＩＣ５０値は、１ｎＭのＡＲＣ９７９についてのＫＤ値と一致する。これは、実施例２Ｂ．２において説明した直接結合アッセイ条件下で繰り返し検証した。表３６から判るように、ＡＲＣ９７９の最適化誘導体のうちの幾つかは、Ｐａｔｈｓｃａｎ（登録商標）法を用いて直接比較したとき、ＡＲＣ９７９よりなお高い効力を示し、特にＡＲＣ１６２４およびＡＲＣ１６２５は、それぞれ２ｎＭおよび４ｎＭのＩＣ５０値を示した。
【０３６１】
図２４は、Ｐａｔｈｓｃａｎ（登録商標）アッセイにおいてＩＬ−２３に対する高い親和性と強力な細胞ベースの活性の両方を示した最適化クローンの幾つかについての用量反応曲線の例である。表３６は、検定した最適化アプタマーについての用量反応曲線から導出されたＩＣ５０の要約である。
【０３６２】
【表３６】
2007527246.tif 000076
（実施例３Ｅ：マウスＩＬ−２３セレクションからの親および最小化クローンについての細胞ベースのアッセイの結果）
上で説明したＰＨＡ芽細胞アッセイおよびＴｒａｎｓＡＭ（商標）法を用いて、マウスＩＬ−２３が、ヒトＰＨＡ芽細胞においてＳＴＡＴ３を活性化することが明らかになった（図２５参照）。そのため、実施例１Ｅにおいて説明したマウスＩＬ−２３セレクションからの親クローンおよびｍＩＬ−２３への親和性を示したこのセレクションからの最小化クローン（実施例２Ａ．４において説明したもの）がヒトＰＨＡ芽細胞におけるマウスＩＬ−２３誘導ＳＴＡＴ３活性化を阻害する能力は、ＴｒａｎｓＡＭ（商標）アッセイを用いて測定した。用いたプロトコルは、ヒトＩＬ−２３を３ｎｇ／ｍＬの濃度で使用するのではなく、マウスＩＬ−２３を３０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用してＰＨＡ  ＢｌａｓｔにおけるＳＴＡＴ３活性化を誘導したことを除き、前に説明したのと同じであった。親クローンについての結果を表３７に列挙し、最小化クローンについての結果を下の表３８に列挙する。
【０３６３】
【表３７】
2007527246.tif 000077
＊  多数の実験の平均
【０３６４】
【表３８】
2007527246.tif 000078
本発明を、今、書面および実施例により説明してきたが、様々な実施形態で本発明を実施できること、および上の説明および実施例が例証のためのものであり、後続の特許請求の範囲の制限とはならないことは、当業者には理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０３６５】
【図１】図１は、サイトカインのインターロイキン−１２ファミリーの略図である。
【図２】図２は、ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールからのインビトロアプタマーセレクション（ＳＥＬＥＸ（商標））プロセスの略図である。
【図３】図３は、ネガティブセレクション段階にＩＬ−１２を含めることによりＩＬ−２３に特異的なアプタマーを選択し、それによってｐ４０（ＩＬ−１２とＩＬ−２３の両方に共通のサブユニット）を認識する配列を除去するためのインビトロセレクション機構の略図である。
【図４】図４は、４０ｋＤａ分枝ＰＥＧの図である。
【図５】図５は、アプタマーの５’末端に結合した４０ｋＤａ分枝ＰＥＧの図である。
【図６】図６は、標準的なモノＰＥＧ化、多ＰＥＧ化、およびＰＥＧ化による二量体化を表す様々なＰＥＧ化戦略を示す図である。
【図７】図７は、様々なセレクションラウンド後のＩＬ−２３へのｒＲｍＹおよびｒＧｍＨプールの結合を示すグラフである。
【図８Ａ】図８Ａは、タイプ１のＩＬ−２３アプタマーの配列および予測される二次構造立体配置の略図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、幾つかのタイプ２のＩＬ−２３アプタマーの配列および予測される二次構造立体配置の略図である。
【図９】図９Ａは、タイプ１のＩＬ−２３アプタマーについての最小化アプタマー配列および予測される二次構造立体配置の略図である。図９Ｂは、タイプ２のＩＬ−２３アプタマーについての最小化アプタマー配列および予測される二次構造立体配置の略図である。
【図１０】図１０は、ｄＲｍＹミニマー（ｍｉｎｉｍｅｒ）ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）について予測されるＧ−四量体（Ｇ−ｑｕａｒｔｅｔ）構造を図示する。
【図１１】図１１は、ＡＲＣ９７９が、Ｇ−四量体構造をとることを確認する、ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）におけるＮＭＭ蛍光の増加を示すグラフである。
【図１２】図１２は、５０ｎＭ  ＩＬ−２３を使用して結合した全［アプタマー］を基に分析したＡＲＣ９７９（配列番号１７７）競合結合曲線のグラフである。
【図１３】図１３は、２５０ｎＭ  ＩＬ−１２を使用して結合した［アプタマー］を基に分析したＡＲＣ９７９（配列番号１７７）競合結合曲線のグラフである。
【図１４】図１４は、２つの異なる結合反応条件（１×  ＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まない）または１×  ダルベッコＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋含有））下でのＡＲＣ９７９（配列番号１７７）についての直接結合曲線のグラフである。
【図１５】図１５は、単一ホスホロチオエート置換がＩＬ−２３への結合率の増加を生じさせることを図示する、ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）ホスホロチオエート誘導体についての直接結合曲線のグラフである。
【図１６】図１６は、単一ホスホロチオエート置換がＩＬ−２３に対してより高い親和性でＡＲＣ９７９と競合することを図示する、ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）ホスホロチオエート誘導体についての競合結合曲線のグラフである。
【図１７】図１７は、親ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）アプタマーと比較した、ＡＲＣ９７９最適化誘導体ＡＲＣ１６２４（配列番号３１０）およびＡＲＣ１６２５（配列番号３１１）についての直接結合曲線のグラフである（ＡＲＣ８９５は、ネガティブコントロールである）。
【図１８】図１８は、最適化ＡＲＣ９７９誘導体構築物と比較した、ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）の血漿中安定性を図示するグラフである。
【図１９】図１９は、本発明のアプタマーに暴露したＰＨＡ芽細胞の溶解物におけるＳＴＡＴ３活性を測定するために使用したＴｒａｎｓＡＭ（商標）アッセイの略図である。
【図２０】図２０は、本発明のアプタマーに暴露したＰＨＡ芽細胞におけるＩＬ−２３誘導ＳＴＡＴ３リン酸化を検出するために使用したプロトコルのフローチャートである。
【図２１】図２１は、ＴｒａｎｓＡＭ（商標）アッセイを使用してそれぞれの最適化クローンと比較した、ＰＨＡ芽細胞におけるＩＬ−２３誘導ＳＴＡＴ３リン酸化に対するｒＲｆＹ組成の親ＩＬ−２３アプタマーの阻害効果を示す代表的なグラフである。
【図２２】図２２は、ＴｒａｎｓＡＭ（商標）アッセイにおけるｄＲｍＹ組成のＩＬ−２３アプタマーによるＩＬ−２３誘導ＳＴＡＴ３リン酸化の阻害率のグラフである（ＡＲＣ７９３（配列番号１６３）は、非結合アプタマーである）。
【図２３】図２３は、ＴｒａｎｓＡＭ（商標）アッセイにおいてそれぞれの最適化クローン（ＡＲＣ９７９（配列番号１７７）、ＡＲＣ９８０（配列番号１７８）、ＡＲＣ９８２（配列番号１８０））と比較した、ｄＲｍＹ組成の親ＩＬ−２３アプタマー（ＡＲＣ６２１（配列番号１０８）、ＡＲＣ６２７（配列番号１１０））によるＩＬ−２３誘導ＳＴＡＴ３リン酸化の阻害率のグラフである。
【図２４】図２４は、Ｐａｔｈｓｃａｎ（登録商標）アッセイにおけるＡＲＣ９７９（配列番号１７７）ならびにＡＲＣ９７９の２つの最適化誘導体クローン（ＡＲＣ１６２４（配列番号３１０）およびＡＲＣ１６２５（配列番号３１１））によるＩＬ−２３誘導ＳＴＡＴ３リン酸化の阻害率グラフである。
【図２５】図２５は、ＴｒａｎｓＡＭ（商標）アッセイによって測定した、ヒトＰＨＡ芽細胞におけるヒトＩＬ−２３誘発ＳＴＡＴ３活性化とマウスＩＬ−２３誘発ＳＴＡＴ３活性化を比較するグラフである。
【図１】
2007527246.tif 000079
【図２】
2007527246.tif 000080
【図３】
2007527246.tif 000081
【図４】
2007527246.tif 000082
【図５】
2007527246.tif 000083
【図６】
2007527246.tif 000084
【図７】
2007527246.tif 000085
【図８】
2007527246.tif 000086
【図９】
2007527246.tif 000087
【図１０】
2007527246.tif 000088
【図１１】
2007527246.tif 000089
【図１２】
2007527246.tif 000090
【図１３】
2007527246.tif 000091
【図１４】
2007527246.tif 000092
【図１５】
2007527246.tif 000093
【図１６】
2007527246.tif 000094
【図１７】
2007527246.tif 000095
【図１８】
2007527246.tif 000096
【図１９】
2007527246.tif 000097
【図２０】
2007527246.tif 000098
【図２１】
2007527246.tif 000099
【図２２】
2007527246.tif 000100
【図２３】
2007527246.tif 000101
【図２４】
2007527246.tif 000102
【図２５】
2007527246.tif 000103
【配列表】
2007527246000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年11月24日(2006.11.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007527246000001.app
【国際調査報告】
2007527246.tif 000241
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2007527246.tif 000243
2007527246.tif 000244
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