(57)【要約】  本出願は、ＣＤ２０に結合する、抗体等のアンタゴニストを使用する、眼疾患の治療について記載している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼疾患の治療的有効量のＣＤ２０アンタゴニストを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の眼疾患の治療方法。
【請求項２】
アンタゴニストが抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物がヒトを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
抗体が細胞障害性剤とコンジュゲートしていない、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
抗体がリツキシマブを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
抗体がヒト化２Ｈ７を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
抗体が細胞障害性剤とコンジュゲートしている、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物にアンタゴニストを投与することから基本的になる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物が、一又は複数の眼の抗原に結合する自己抗体を産出するか、又は眼の内部に免疫複合体を有している、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
眼疾患が、ブドウ膜炎、虹彩炎、甲状腺眼病又はグレーブス眼病、ベーチェット眼病、重症眼筋無力症、眼球類天疱瘡、自己免疫性網膜症、オンコセルカ症、上強膜炎、強膜炎、再発性ステロイド依存性視神経炎、眼球が関与したヴェグナー肉芽腫症、シェーグレン眼合併症、メラノーマ関連性網膜症、及び癌関連性網膜症からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
抗体が無傷抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
抗体が、ＣＤ２０に結合する抗原結合領域を含む抗体断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)、及びダイアボディからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
抗体が静脈内投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
抗体が、眼窩内、眼内、眼周囲、硝子体内注射により投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
抗体が、ＣＤ２０に結合する抗原結合領域を含む抗体断片である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
抗体が眼に局所投与される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
これは、その全開示を出典明示によりここに援用する２００３年８月２９日出願の仮出願番号第６０／４９８７９１号に基づいて米国特許法第１１９条の優先権を主張する非仮出願である。
【０００２】
(発明の分野)
本発明は、ＣＤ２０に結合する、抗体等のアンタゴニストを使用する眼疾患の治療法に関する。
【０００３】
(発明の背景)
リンパ球は、造血過程の間に骨髄において生産される多種ある白血球のうちの１つである。リンパ球の２つの主な分類は、Ｂリンパ球(Ｂ細胞)とＴリンパ球(Ｔ細胞)である。ここで特に対象とするリンパ球はＢ細胞である。
Ｂ細胞は骨髄内で成熟して、その細胞表面上に抗原結合抗体を発現する骨髄を放出する。天然のＢ細胞がその膜結合性抗体に特異的な抗原と初めて遭遇すると、細胞は速やかに分割し始め、その子孫はメモリーＢ細胞と「プラズマ細胞」と呼ばれるエフェクター細胞に分化する。メモリーＢ細胞は長い寿命を持ち、本来の親細胞と同じ特異性を有する膜結合性抗体を発現し続ける。プラズマ細胞は、膜結合性抗体を発現する代わりに、分泌型抗体を産生する。分泌された抗体は、体液性免疫の主要なエフェクター分子である。
【０００４】
ＣＤ２０抗原(ヒトＢリンパ球制限分化抗原、Ｂｐ３５とも呼ばれる)はプレＢ及び成熟Ｂリンパ球上に位置するおよそ３５ｋＤの分子量の疎水性膜貫通型タンパク質である(Valentineら, J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989)；及びEinfeldら, EMBO J. 7(3):711-717(1988))。該抗原はまたＢ細胞非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)の９０％以上に発現されるが(Andersonら, Blood 63(6):1424-1433 (1984))、造血幹細胞、プロＢ細胞、正常なプラズマ細胞又は他の正常な組織上には見出されない(Tedderら, J. Immunol. 135(2):973-979 (1985))。ＣＤ２０は分化及び細胞周期の開始の活性化過程における初期段階を調節し(上掲のTedderら)、おそらくはカルシウムイオンチャネルとして機能する(Tedderら, J. Cell. Biochem. 14D:195 (1990))。
【０００５】
Ｂ細胞リンパ腫ではＣＤ２０が発現されるため、この抗原はこのようなリンパ腫の「標的とする(ターゲティング)」ための候補となりうる。基本的に標的とするとは一般的に以下のことを言う：Ｂ細胞のＣＤ２０表面上抗原に特異的な抗体を患者に投与する。これらの抗ＣＤ２０抗体は、正常及び悪性の何れのＢ細胞(表面上)のＣＤ２０抗原に特異的に結合する；ＣＤ２０表面上抗原に結合する抗体は、腫瘍性Ｂ細胞を破壊及び減少に至らしめることができる。さらに、腫瘍を破壊する可能性を有する化学薬品または放射性標識は抗ＣＤ２０抗体に結合させて、作用剤が腫瘍性Ｂ細胞特異的に「運ばれる」ようにすることができる。方法にかかわりなく、主たる目的は、腫瘍を破壊することである；特定の方法は、使用する特定の抗ＣＤ２０抗体により測定することができ、ゆえに、ＣＤ２０抗原を標的とする有用な方法はかなり異なる。
【０００６】
リツキシマブ(rituximab)(リツキサン(RITUXAN)(登録商標))抗体は、一般的にＣＤ２０抗原に対する遺伝子的操作を施したキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体である。リツキシマブは１９９８年４月７日に発行の米国特許第５７３６１３７号(Andersonら)において「Ｃ２Ｂ８」と呼ばれている抗体である。リツキサン(登録商標)は、再発性または低抵抗性の(refractory low-grade)または濾胞性の(follicular)、ＣＤ２０陽性、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫患者の治療のためのものである。インビトロの作用機序の研究は、リツキサン(登録商標)がヒト補体に結合し補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)を通してリンパＢ細胞系を溶解することを実証している(Reffら, Blood 83(2):435-445 (1994))。加えて、その抗体は抗体依存細胞性細胞障害(ＡＤＣＣ)のアッセイにおいて有意な活性を有している。更に近年、リツキサン(登録商標)は、他の抗ＣＤ１９抗体や抗ＣＤ２０抗体にはない、トリチウム化したチミジン取り込みアッセイにおける抗増殖性効果を持つこと及び直接的にアポトーシスを誘導することが示唆されている(Maloney等 Blood 88(10):637a (1996))。また、リツキサン(登録商標)及び化学療法及び毒素間の相乗効果は、実験的に観察された。特に、リツキサン(登録商標)は、ドキソルビシン、CDDP、VP-16、ジフテリア毒素及びリシンの細胞障害効果に対するヒトＢ細胞リンパ腫細胞系の薬物抵抗性の感度を高める(Demidem等 Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12(3):177-186 (1997))。インビボ前臨床研究では、リツキサン(登録商標)が、おそらく補足及び細胞媒介過程において、カニクイザルの末梢血、リンパ節及び骨髄からのＢ細胞を減少させることを示した (Reff 等 Blood 83(2):435-445 (1994))。
【０００７】
ＣＤ２０抗体に関する特許及び特許文献には、米国特許第５７７６４５６号、同５７３６１３７号、同６３９９０６１号、及び同５８４３４３９号、並びに米国特許出願第２００２／０１９７２５５Ａ１、同２００３／００２１７８１Ａ１号、同２００３／００８２１７２Ａ１号、同２００３／００９５９６３Ａ１号、同２００３／０１４７８８５Ａ１号(Anderson等)；米国特許第６４５５０４３Ｂ１号及び国際公開第００／０９１６０号(Grillo-Lopez, A)；国際公開第００／２７４２８号(Grillo-Lopez及びWhite)；国際公開第００／２７４３３号(Grillo-Lopez及びLeonard)；国際公開第００／４４７８８号(Braslawsky等)；国際公開第０１／１０４６２号(Rastetter, W)；国際公開第０１／１０４６１号(Rastetter及びWhite)；国際公開第０１／１０４６０号(White及びGrillo-Lopez)；米国出願第２００２／０００６４０４号及び国際公開第０２／０４０２１号(Hanna及びHariharan)；米国出願第２００２／００１２６６５Ａ１号及び国際公開第０１／７４３８８号(Hanna, N)；米国出願第２００２／００５８０２９Ａ１号(Hanna, N)；米国出願第２００３／０１０３９７１Ａ１号(Hariharan及びHanna)；米国出願第２００２／０００９４４４Ａ１号、及び国際公開第０１／８０８８４(Grillo-Lopez, A)；国際公開第０１／９７８５８(White, C)；米国出願第２００２／０１２８４８８Ａ１号及び国際公開第０２／３４７９０号(Reff, M)；国際公開第０２／０６０９５５号(Braslawsky等)；国際公開第２／０９６９４８号(Braslawsky等)；国際公開第０２／０７９２５５号(Reff及びDavies)；米国特許第６１７１５８６Ｂ１号、及び国際公開第９８／５６４１８(Lam等)；国際公開第９８／５８９６４号(Raju, S)；国際公開第９９／２２７６４号(Raju, S)；国際公開第９９／５１６４２号、米国特許第６１９４５５１Ｂ１号、米国特許第６２４２１９５Ｂ１号、米国特許第６５２８６２４Ｂ１号及び米国特許第６５３８１２４号(Idusogie等)；国際公開第００／４２０７２号(Presta, L)；国際公開第００／６７７９６号(Curd等)；国際公開第０１／０３７３４号(Grillo-Lopez等)；米国出願第２００２／０００４５８７Ａ１号及び国際公開第０１／７７３４２号(Miller及びPresta)；米国出願第２００２／０１９７２５６号(Grewal, I)；米国出願第２００３／０１５７１０８Ａ１(Presta L)；米国特許第６０９０３６５Ｂ１号、同６２８７５３７Ｂ１号、同６０１５５４２号、同５８４３３９８号、及び同５５９５７２１号(Kaminski等)；米国特許第５５００３６２号、同５６７７１８０号、同５７２１１０８号、及び同６１２０７６７号(Robinson等)；米国特許第６４１０３９１Ｂ１号(Raubitschek等)；米国特許第６２２４８６６Ｂ１号及び国際公開第００／２０８６４号(Barbera-Guillem, E)；国際公開第０１／１３９４５号(Barbera-Guillem, E)；国際公開第００／６７７９５号(Goldenberg)；米国出願第２００３／０１３３９３０Ａ１号及び国際公開第００／７４７１８号(Goldenberg及びHansen)；国際公開第００／７６５４２号(Golay等)；国際公開第０１／７２３３３号(Wolin及びRosenblatt)；米国特許第６３６８５９６Ｂ１号(Ghetie等)；米国出願第２００２／００４１８４７Ａ１(Goldenberg, D)；米国出願第２００３／００２６８０１Ａ１(Weiner及びHartmann)；国際公開第０２／１０２３１２(Engleman, E)；米国特許出願第２００３／００６８６６４号(Albitar等)；国際公開第０３／００２６０７���(Leung, S)；国際公開第０３／０４９６９４号(Wolin等)；国際公開第０３／０６１６９４号(Sing及びSiegall)が含まれ、これらのそれぞれは出典明示によりここに援用される。また、米国特許第５８４９８９８号及び欧州出願第３３０１９１号(Seed等)；米国特許第４８６１５７９号及び欧州特許第３３２８６５Ａ２号(Meyer及びWeiss)；米国特許第４８６１５７９号(Meyer等)及び国際公開第９５／０３７７０号(Bhat等)も参照される。
【０００８】
リツキシマブを用いた治療法に関する文献には：Perrotta及びAbuel 「Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to Rituximab」 Abstract # 3360 Blood 10(1)(part 1-2): p. 88B (1998)；Stasi等 「Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody treatment for adults with chronic idopathic thrombocytopenic purpura」 Blood 98(4):952-957 (2001)；Matthews, R. 「Medical Heretics」 New Scientist (7 April, 2001)；Leandro等 「Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion」 Ann Rheum Dis 61:883-888 (2002)；Leandro等 「Lymphocyte depletion in thrumatoid arthritis: early evidence for safety, efficacy and dose response.  Arthritis and Rheumatism 44(9): S370 (2001)；Leandro等 「An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus」, Arthritis & Rheumatism 46(1):2673-2677 (2002)；Edwards and Cambridge 「Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes」 Rhematology 40:205-211 (2001)；Edwards等 「B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders」 Biochem. Soc. Trans. 30(4):824-828 (2002)；Edwards等 「Efficacy and safety of Rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: A randomized, placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism 46(9): S197 (2002)；Levine and Pestronk 「IgM antibody-related polyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using Rituximab」 Neurology 52: 1701-1704 (1999)；DeVita等 「Efficacy of selective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis」 Arthritis & Rheum 46:2029-2033 (2002)；Higashida等 「Treatment of DMARD-Refractory rheumatoid arthritis with rituximab.」  Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; New Orleans, LA 2002；Tuscano, J. 「Successful treatment of Infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab」Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; New Orleans, LA 2002.が含まれる。
【０００９】
眼疾患における抗体に関する文献には、Haldar等, Invest Ophthalmol Visual Sci 29:37 (1988)；Kahaly等, Horm. Metab. Res. 21(3):137-141 (1989)；Peek等,  Investigative Ophthalmology & Visual Science 39(10):1976-1979 (1998)；Harper及びFoster, International Ophthalmology Clinics 38(1):1-19 (1998)；Bartalena等,  Bailliere's Clinical Endocrinology and Metabolism 11(3):521-536 (1997)；Seider等, British Journal of Ophthalmology 85(11):1287-1288 (2001)；Hiromatsu等, Endocrinologia Japonica 39(6):593-600 (1992)；Donnelly, J Autoimmunity 1(3):207-216 (1988)；Hollows, F, Australian Journal of Ophthalmology 9(3):239-245 (1981)；Weetman及びMcGregor Endocrine Reviews 5(2):309-355 (1984)；Waltman及びYarian American Journal of Ophthalmology 77(6):891-894 (1974)；Aronson等, JAMA 196(3):225-228 (1966)；Shields等, Arch Ophthalmol. 118(11):1497-1507 (2000)；及びBartalena等,  European Journal of Nuclear Medicine 29(Suppl. 2):S458-S465 (2002)が含まれる。
国際公開第２０００／４０２６２号には、抗-ＣＤ４単鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)断片を用いた、眼疾患の治療について記載されている。
【００１０】
(発明の概要)
本発明は、眼疾患の治療的有効量のＣＤ２０アンタゴニストを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における眼疾患の治療方法に関する。好ましくは、アンタゴニストは、無傷抗体並びに抗体断片を含む、リツキシマブ又はヒト化２Ｈ７等の抗体である。ここで治療可能な眼疾患の実施例には、ブドウ膜炎(虹彩炎を含む)、甲状腺眼病又はグレーブス眼病(Graves' ophthalmology)、ベーチェット眼病(ocular Behcet's disease)、重症眼筋無力症(ocular myasthenia gravis)、眼球類天疱瘡(ocular pemphigoid)、自己免疫性網膜症(autoimmune retinopathy)、オンコセルカ症(onchocerciasis)、上強膜炎、強膜炎、再発性ステロイド依存性視神経炎(relapsing steroid dependent optic neuritis)、眼球が関与したヴェグナー肉芽腫症(ocular involvement of Wegener's granulomatosis)、シェーグレン眼合併症(Sjogren's eye complication)、メラノーマ関連性網膜症(melanoma associated retinopathy)、及び／又は癌関連性網膜症(cancer associated retinopathy)が含まれる。
【００１１】
(好ましい実施態様の詳細な説明)
Ｉ．定義
ここで「眼疾患」とは、眼に関連する病気又は疾患のことである。ここで眼疾患を有する哺乳動物は、一般的に眼病の一又は複数の兆候を示す。ここで特に対象となる眼疾患には、限定されるものではないが、ブドウ膜炎 (虹彩炎及び急性前部ブドウ膜炎を含む)、甲状腺眼病又はグレーブス眼病、ベーチェット眼病、重症眼筋無力症、眼球類天疱瘡、自己免疫性網膜症、オンコセルカ症、上強膜炎、強膜炎、再発性ステロイド依存性視神経炎、眼球が関与したヴェグナー肉芽腫症、シェーグレン眼合併症、メラノーマ関連性網膜症、癌関連性網膜症等が含まれる。
ここで「自己抗体」とは、哺乳動物が一又は複数の自身の抗原に対して産出する抗体を意味する。自己抗体は、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、クロマトスキャニング等を使用し、哺乳動物からの生体サンプル(例えば涙、眼のバイオプシー、血清、血漿等)において検出され得る。
ここで「眼抗原」とは、眼の内部又は周囲に存在するタンパク質抗原等の抗原である。眼抗原は、眼の内部又は周囲、並びに他の組織(例えば骨格筋組織)に存在していてよく、もしくは哺乳動物の他の細胞又は組織と比較して、眼の内部又は周囲のみに、又はそこにほとんどが存在していてもよく、例えば網膜タンパク質、特にリカバリン、眼筋抗原、網膜ミュラー細胞、ブドウ膜である。
【００１２】
ここでの目的において、「免疫複合体」は、抗体(例えば自己抗体)と抗原(例えば眼の内部又は周囲に見出される抗原)との間に形成される非共有結合的に結合した複合体を含む。
「ＣＤ２０」抗原は、末梢血又はリンパ系器官の９０％以上のＢ細胞の表面にみられる〜３５ｋＤａの非グルコシル化リンタンパク質である。ＣＤ２０は初期のプレＢ細胞発育中に発現し、プラズマ細胞分化まで残る。ＣＤ２０は正常Ｂ細胞、並びに悪性のＢ細胞の双方に存在する。ＣＤ２０を指す文献中での他の名前には、「Ｂリンパ球限定抗原(B-lymphocyte-restricted antigen)」及び「Ｂｐ３５」が含まれる。ＣＤ２０抗原は、例としてClark等 PNAS (USA) 82:1766 (1985)に記載されている。
【００１３】
「アンタゴニスト」とは、Ｂ細胞上のＣＤ２０に結合する際に、哺乳動物のＢ細胞を破壊又は枯渇させる、及び／又は一以上のＢ細胞機能を妨げる、例えば、Ｂ細胞に誘導される体液性反応を低減又は阻害する分子である。好ましくは、アンタゴニストは、それによって治療する哺乳動物のＢ細胞を枯渇する(すなわち、循環中のＢ細胞レベルを下げる)ことができる。そのような枯渇は、抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)及び／又は補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)、Ｂ細胞増殖の阻害及び／又はＢ細胞死の誘導(例えば、アポトーシスを介する)等の多様な機能を介して達成されるであろう。本発明の範囲に包含されるアンタゴニストには、場合によって細胞障害性剤を抱合する又は細胞障害性剤と融合している、ＣＤ２０に結合する抗体、合成又は天然配列のペプチド及び小分子アンタゴニストが含まれる。好適なアンタゴニストは抗体を含む。
【００１４】
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃレセプター(ＦｃＲ)を発現する非特異的細胞障害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球、及びマクロファージ)が標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いて標的細胞を溶解する細胞媒介性反応を指す。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲIIIのみを発現する一方、単球はＦｃγＲI、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIを発現する。造血性細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch及びKinet, Annu.Rev.Immunol., 9:457-92(1991)の４６４頁の表３に要約されている。対象分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第５５００３６２号又は第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施されうる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー(ＮＫ)細胞を含む。あるいは、又は付加的に、対象分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等 .PNAS(USA), 95:652-656(1998)に開示されたような動物モデルにおいて、インビボで評価されてもよい。
【００１５】
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。好ましくは、その細胞が少なくともＦｃγＲIIIを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が好適である。
「Ｆｃレセプター」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するために使用される。好適なＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(γレセプター)に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIサブクラスのレセプターを含むものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲIIレセプターは、ＦｃγＲIIＡ(「活性化レセプター」)及びＦｃγＲIIＢ(「阻害レセプター」)を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲIIＡは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)を有する。阻害レセプターＦｃγＲIIＢは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース阻害モチーフ(ＩＴＩＭ)を有する(Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)参照)。ＦｃＲはRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capelら, Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Haasら, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)において概説されている。将来同定されるものも含む他のＦｃＲが、ここにおける「ＦｃＲ」なる用語によって包含される。この用語は胎児への母性ＩｇＧの移動の原因である新生児レセプター、ＦｃＲｎもまた含む(Guyerら, J. Immumol. 117:587 (1976)及びKimら, J. Immunol. 24:249 (1994))。
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解する分子の能力を称する。補体活性化経路は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した分子(例えば、抗体)に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。
【００１６】
「成長阻害」アンタゴニストは、アンタゴニストが結合する抗原を発現している細胞の増殖を阻害又は低減するものである。例えば、アンタゴニストはインビトロ及び／又はインビボでのＢ細胞の増殖を阻害又は低減しうる。
「アポトーシスを誘導する」アンタゴニストとは、標準的なアポトーシスアッセイにより測定できるようなＢ細胞などのプログラム細胞死、例えば、アネキシンＶの結合、ＤＮＡ断片化、細胞収縮、小胞体の肥大、細胞断片化、及び／又は膜小嚢の形成(アポトーシス体と呼称)を誘導するものである。
【００１７】
ここで「抗体」なる用語は、広い意味で用いられ、特にモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷抗体から形成した多特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、及び所望の生物学的活性を有する限りにおける抗体断片の範囲にわたる。
「抗体断片」は、無傷抗体の一部、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多特異性抗体が含まれる。
ここでの目的において、「無傷抗体」とは、重及び軽可変ドメイン並びにＦｃ領域を含む。
【００１８】
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
【００１９】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する、３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害(ＡＤＣＣ)への抗体の関与を示す。
【００２０】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
【００２１】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの３つの高頻度可変領域は相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つの高頻度可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つの高頻度可変領域のみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００２２】
任意の脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
抗体の重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体は異なるクラスが割り当てられる。無傷抗体には５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、さらにそれらは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２等のサブクラス(アイソタイプ)に分かれる。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られている。
【００２３】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成が可能であるリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディーは、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びHollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。
【００２４】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能性がある突然変異を除いて同一な抗体を称する。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体はハイブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリンの混入がないという利点がある。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を表すものであり、抗体が何か特定の方法による生成を必要として構築されたものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature, 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作ることができる(例えば米国特許第４８１６５６７号を参照のこと)。また「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson等, Nature, 352：624-628 (1991)およびMarks等, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００２５】
ここでモノクローナル抗体は、特に「キメラ」抗体(免疫グロブリン)を含み、その重鎖および／または軽鎖の一部は、特定の種由来または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片のように他の種由来または他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同のものである(米国特許第４８１６５６７号；Morrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。ここで対象とするキメラ抗体には、非ヒト霊長類(例えば、ヒヒ、アカゲザル又はカニクイザルなどの旧世界サル)由来の可変ドメイン抗原結合配列とヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む(米国特許第５６９３７８０号)。
【００２６】
非ヒト(例えばマウス)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、又は実質的に全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも一又は一般的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。更なる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
【００２７】
ここで使用されるところの「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合の原因である抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基(例えば、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)、及び重鎖可変ドメインの３１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)；Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))、及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基(例えば、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３)；Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここで定義するように高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００２８】
ＣＤ２０抗原に結合する抗体の例には以下のものが含まれる：現在では「リツキシマブ」(「リツキサン(登録商標)」)と呼称される「Ｃ２Ｂ８」(米国特許第５７３６１３７号、出典明示によりここに援用される)；「イブリツモマブ・チウキセタン」ゼバリン(ZEVALIN)(登録商標)、又は「Ｙ２Ｂ８」と命名されるイットリウム-[９０]-標識２Ｂ８マウス抗体(米国特許第５７３６１３７号、出典明示によりここに援用される)；場合によっては「１３１Ｉ-Ｂ１」抗体(ヨウ素Ｉ１３１トシツモマブ、BEXXARＴＭ)を生成するために１３１Ｉで標識した「トシツモマブ」と呼称されるマウスＩｇＧ２ａ「Ｂ１」(米国特許第５５９５７２１号、出典明示によりここに援用される)；マウスモノクローナル抗体「１Ｆ５」(Press等 Blood 69(2):584-591 (1987))；「フレームワークパッチ(framework patched)」又はヒト化１Ｆ５(国際公開第０３／００２６０７号、Leuug, S)；ATCC寄託HB-96450)；マウス２Ｈ７及びキメラ２Ｈ７抗体(米国特許第５６７７１８０号、出典明示によりここに援用される)；ヒト化２Ｈ７；ｈｕＭａｘ-ＣＤ２０(Genmab, Denmark)；ＡＭＥ-１３３(Applied Molecular Evolution)；及びInternational Leukocyte Typing Workshopより入手可能なモノクローナル抗体Ｌ２７、Ｇ２８-２、９３-１Ｂ３、Ｂ-Ｃ１又はＮＵ-Ｂ２(Valentine等, Leukocyte Typing III (McMichael, 編集, p440., Oxford University Press (1987))。
【００２９】
ここで「リツキシマブ」又は「リツキサン(登録商標)」なる用語は、一般的にＣＤ２０抗原に対する遺伝学的に操作したキメラのマウス／ヒトモノクローナル抗体を指し、出典明示によりここに援用される米国特許第５７３６１３７号では「Ｃ２Ｂ８」と命名されており、さらにＣＤ２０に結合する能力を保持したその断片も含む。
【００３０】
単にここでの目的のために、「ヒト化２Ｈ７」は以下に示す可変軽配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＰＬＩＹＡＰＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＷＳＦＮＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ(配列番号：１)；
及び可変重配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＳＹＮＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧＲＦＴＩＳＶＤＫＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＶＹＹＳＮＳＹＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ(配列番号：２)；
を含む、無傷抗体又は抗体断片を称する。
【００３１】
ヒト化２Ｈ７抗体が無傷抗体である場合、好ましくは以下に示す軽鎖アミノ酸配列：
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＰＬＩＹＡＰＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＷＳＦＮＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ(配列番号：３)；
及び重鎖アミノ酸配列：
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＳＹＮＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧＲＦＴＩＳＶＤＫＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＶＹＹＳＮＳＹＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ(配列番号：４)
を含む。
【００３２】
「単離された」アンタゴニストは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分は、アンタゴニストの診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様においては、アンタゴニストは、(１)ローリー(Lowry)法により定量して、アンタゴニストが９５重量％より多くなるほど、最も好ましくは９９重量％より多くなるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように充分な程度まで精製される。アンタゴニストの自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離されたアンタゴニストには、組換え細胞内のインサイツのアンタゴニストが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたアンタゴニストは少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００３３】
治療の目的とされる「哺乳動物」とは、ヒト、家庭及び農場用動物、及び動物園、スポーツ又はペット用動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を含む、哺乳動物に分類されるあらゆる動物を称する。好ましくは哺乳動物はヒトである。
「治療」とは、治療的処置及び予防又は防止手段の両方を称する。治療の必要があるものには、既に眼疾患に羅患しているもの、並びに眼疾患が予防されるべきものが含まれる。従って、哺乳動物は、眼疾患に罹患していると診断されてもよく、又は眼疾患に罹りやすい又は敏感であってもよい。
「治療的有効量」という用語は、疑われる眼疾患を予防、改善又は治療するのに効果的なアンタゴニストの量を称する。
【００３４】
ここで治療補助剤として用いる「免疫抑制剤」という用語は、ここで治療される哺乳動物の免疫系を抑制またはマスクするように働く物質を称する。これは、サイトカイン産生を抑制する、自己抗原の発現を下方制御または抑制する、ＭＨＣ抗原をマスクする物質を含む。そのような薬剤の例として、２-アミノ-６-アリル-５-置換ピリミジン(米国特許第４６６５０７７号参照、開示されていることは出典明示によりここに援用される)；非ステロイド性抗炎症剤(ＮＳＡＩＤ)；アザチオプリン；シクロホスファミド；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソーン；グルタルアルデヒド (米国特許第４１２０６４９号に記載のように、ＭＨＣ抗原をマスクする)；ＭＨＣ抗原およびＭＨＣ断片に対する抗イデオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；副腎皮質ステロイドなどのステロイド、例として、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、及びデキサメタゾン；メトトレキサート(経口又は皮下)；ヒドロキシクロロキン；スルファサラジン；レフルノミド；サイトカイン、又は抗インターフェロン-γ、-β、又は-α抗体、抗腫瘍壊死因子α抗体(インフリキシマブ又はアダリムマブ)、抗ＴＮＦαイムノアドヘシン(エタネルセプト)、抗腫瘍壊死因子β抗体、抗インターロイキン２抗体、及び抗ＩＬ-２レセプター抗体を含むサイトカインレセプターアンタゴニスト；抗ＣＤ１１ａ及び抗ＣＤ１８抗体を含む抗ＬＦＡ-１抗体；抗-Ｌ３Ｔ４抗体；異種性抗リンパ球グロブリン；ｐａｎ-Ｔ抗体、好ましくは抗-ＣＤ３または抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ-３結合ドメインを含む可溶性ペプチド(１９９０年７月２６日公開の国際公開第９０／０８１８７号)、ストレプトキナーゼ；ＴＧＦ−β；ストレプトドルナーゼ(streptodornase)；宿主由来のＲＮＡまたはＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ−６１４４３；デオキシスペルグアニン(deoxyspergualin)；ラパマイシン；Ｔ細胞レセプター (Cohen等, 米国特許第５１１４７２１号)；Ｔ細胞レセプターフラグメント(Offner ら, Science 251:430-432 (1991)；国際公開第９０／１１２９４号；Ianeway, Nature, 341: 482 (1989)；及び国際公開第 91/01133号)；及びＴ１０Ｂ９等のＴ細胞レセプター抗体 (欧州特許第３４０１０９号)を含む。
【００３５】
ここで使用する「細胞障害性剤」なる用語は、細胞の機能阻害又は阻止、及び／又は細胞破壊をもたらす物質を称する。この用語は、放射性同位体(例として、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体)、化学療法剤、及び細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素活性毒素又は小分子毒素などの毒素、またはそれらの断片を含むことを意図する。
【００３６】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXANＴＭ)のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カリケアマイシン(calicheamicin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン、マルセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)などの抗生物質；メトトレキセート及び５−フルオロウラシル(５−ＦＵ)のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似物；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)、５−ＦＵ；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢���エリプチニウム(elliptinium)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)：ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)；ラゾキサン(razoxane)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカーバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ara-C」)；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル(タキソール(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)、及びドキセタキセル(タキソテア(登録商標)、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；クロランブシル；ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ−１６)；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン(navelbine)；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＴＰ-１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸；エスペラマイシン；カペシタビン(capecitabine)；並びに製薬的に許容可能な塩類、酸類、又は上記何れかの誘導体が含まれる。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン(raloxifene)、４(５)-イミダゾール類を阻害するアロマターゼ、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びトレミフェン(Fareston)；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド(bicalutamide)、リュープリン(leuprolide)、及びゴセレリン；及び製薬的に許容可能な塩類、酸類又は上記何れかの誘導体が含まれる。
【００３７】
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。このようなサイトカインの例としては、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンを挙げることができる。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)、甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、及び黄体形成ホルモン(ＬＨ)のような糖タンパク質ホルモン；肝臓成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミュラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；ＮＧＦ−β等の神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-βのようなトランスフォーミング成長因子(ＴＧＦ)；インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ；エリスロポイエチン(ＥＰＯ)；オステオインダクティブ因子；インターフェロン-α、-β及び-γのようなインターフェロン；マクロファージＣＳＦ(Ｍ-ＣＳＦ)のようなコロニー刺激因子(ＣＳＦ)；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ(ＧＭ−ＣＳＦ)；及び顆粒球-ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)；ＩＬ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-２、ＩＬ-３、 ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、 ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２、ＩＬ-１５等のインターロイキン(ＩＬ)；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α又はＴＮＦ-β；及びＬＩＦ及びキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物を含む。
【００３８】
この出願で用いられる用語「プロドラッグ」は、親薬剤に比較して腫瘍細胞に対する細胞障害性が低く、酵素的に活性化又はより活性な親形態に変換される製薬的活性物質の前駆体又は誘導体形態を称する。例えば、Wilman, 「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, pp.375-382, 615th Meeting, Belfast (1986)、及びStella 等, 「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」、Directed Drug Delivery, Borchardt等(編), pp247-267, Humana Press (1985)参照。本発明のプロドラッグは、限定するものではないが、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ-アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β-ラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定はしないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害性剤の例には、前記の化学療法剤が含まれる。
【００３９】
「Ｂ細胞悪性腫瘍」は、Ｂ細胞に係る悪性腫瘍である。具体例には、リンパ球優位型ホジキン病(ＬＰＨＤ)を含むホジキン病；非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)；濾胞中心細胞(ＦＣＣ)リンパ腫；急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)；慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)；ヘアリー細胞白血病；形質細胞様リンパ性リンパ腫(plasmacytoid lymphocytic lymphoma)；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ又はＨＩＶ-関連リンパ腫；多発性骨髄腫；中枢神経系(ＣＮＳ)リンパ腫；移植後リンパ増殖症候群(ＰＴＬＤ)；ヴァルデンストレームマクログロブリン血症(リンパ形質細胞性リンパ腫)；粘膜関連リンパ組織(ＭＡＬＴ)リンパ腫；及び辺縁帯リンパ腫／白血病が含まれる。
【００４０】
非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)には、限定されるものではないが、下級／濾胞性ＮＨＬ、再発性又は難治性ＮＨＬ、前線下級(front line low grade)ＮＨＬ、ＩＩＩ／ＩＶ段階のＮＨＬ、化学療法耐性ＮＨＬ、小リンパ球性(ＳＬ)ＮＨＬ、中級／濾胞性ＮＨＬ、中級びまん性(intermediate grade diffuse)ＮＨＬ、びまん性大細胞型リンパ腫、攻撃型ＮＨＬ(攻撃型前線ＮＨＬ及び攻撃型再発性ＮＨＬを含む)、自家幹細胞移植後の再発性又は難治性ＮＨＬ、高級免疫芽細胞性ＮＨＬ、高級リンパ芽球ＮＨＬ、高級小型非開裂細胞性ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ等が含まれる。
【００４１】
ＩＩ．アンタゴニストの製造
本発明の方法及び製造品は、ＣＤ２０に結合するアンタゴニストを使用し又は含む。したがって、該アンタゴニストの生産方法をここに記載する。
アンタゴニストの生産又はスクリーニングのために用いるＣＤ２０抗原は、例としてＣＤ２０又はその所望のエピトープを含む一部の可溶性形態であってもよい。あるいは又は更に、それらの細胞表面にＣＤ２０を発現する細胞をアンタゴニストの生産又はスクリーニングに用いることができる。アンタゴニストの生産に有用なＣＤ２０の他の形態は当業者に明らかである。
【００４２】
好ましいアンタゴニストが抗体の場合、抗体以外のアンタゴニストが考慮される。例えば、アンタゴニストは、場合によっては細胞障害性剤(例えば、ここに記載のもの)と融合又は結合(抱合)した小分子アンタゴニストを含んでもよい。抗原に結合する小分子を同定するために、ここで対象とするＣＤ２０抗原について小分子ライブラリーをスクリーニングしてもよい。更に、小分子をその拮抗的特性及び／又は細胞障害性剤との結合についてスクリーニングしてもよい。
また、アンタゴニストは理論的な設計またはファージディスプレイにより生産したペプチドでもよい(例として１９９８年８月１３日公開の国際公開第９８／３５０３６号を参照)。一実施態様では、選択した分子が、抗体のＣＤＲに基づいて設計した「ＣＤＲ模倣体」又は抗体類似体でもよい。該ペプチドはそれ自体で拮抗作用を持つが、場合によってはペプチドはその拮抗的性質を付加又は亢進するために細胞障害性剤に融合してもよい。
以下は、本発明に従って用いた抗体アンタゴニストの製造の例示的技術として記載する。
【００４３】
(ｉ)  ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)注射することにより動物に産生される。免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに関連する抗原を、二官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基による抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基による)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲとＲ１が異なったアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲにより抱合させることが有用である。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫化する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なった架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまたタンパク融合として組換え細胞培養中で調製することもできる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【００４４】
(ｉｉ)  モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は実質的に同種の抗体の集団から得られる、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、わずかながら存在する起こりうる天然に生じる突然変異体を除いて同一である。よって、「モノクローナル」との修飾詞は、別個の抗体の混合物ではなく、抗体の特性を示すものである。
例えば、モノクローナル抗体は、Kohlerら, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作製することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記したようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp59-103(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【００４５】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫系、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡから入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックヴィル、メリーランド、ＵＳＡから入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されたものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
【００４６】
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunsonほか, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp59-103(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が包含される。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
【００４７】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から適切に分離される。
モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、常法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、そうしないと免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する概説論文には、Skerraら, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPluckthum, Immunol. Revs., 130:151-188(1992)が含まれる。
【００４８】
更なる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCaffertyら, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから単離することができる。Clacksonら, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marksら, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の単離を記述している。続く刊行物は、鎖混合による高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生産(Marksら, Bio/Technology, 10:779-783(1992))、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouseら, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266(1993))を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の単離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する実行可能な別法である。
ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を、相同的マウス配列に代えて置換することにより(米国特許第４８１６５６７号；Morrisonら, Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることで修飾できる。
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに置換され、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と、異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【００４９】
(ｉｉｉ)  ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法は当該技術に記載されている。好ましくは、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくらかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域(ＦＲ)として受け入れる(Simsほか, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothiaら, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carterほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Prestaほか, J. Immunol., 151:2623(1993))。
【００５０】
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【００５１】
(ｉｖ)ヒト抗体
ヒト化のための別法により、ヒト抗体を生産することができる。例えば、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。例えば、Jakobovitsら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovitsら, Nature 362:255-258 (1993)；Bruggermanら, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第５５９１６６９号、同５５８９３６９号及び同５５４５８０７号を参照されたい。
【００５２】
別に、ファージディスプレイ技術(McCaffertyら, Nature 348：552-553(1990))を、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させるために使用することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３の大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のいずれかにおいてイン-フレームをクローンし、ファージ粒子の表面において機能的抗体断片として表示される。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖のＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択により、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がなされる。よって、ファージはＢ細胞の特性のいくつかを模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照のこと。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源がファージディスプレイのために使用可能である。Clacksonら, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化されたマウス脾臓から得られたＶ遺伝子の小ランダム組合せライブラリーからの抗オキサゾロン抗体の異なった配列を単離した。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構成可能で、抗原(自己抗原を含む)とは異なる配列の抗体を、Marksら, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffithら, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術に本質的に従って単離することができる。また、米国特許第５５６５３３２号及び同５５７３９０５号を参照のこと。
またヒト抗体は、活性化Ｂ細胞によりインビトロで生産してもよい(例えば米国特許第５５６７６１０号及び同５２２９２７５号を参照)。
【００５３】
(ｖ)  抗体断片
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimotoら, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennanら, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片の生産のための他の技術は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。このような直鎖状抗体断片は一特異性又は二重特異性であってよい。
【００５４】
(ｖｉ)  二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＣＤ２０抗原の２つの異なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体ではＣＤ２０と、更に第２のＢ細胞表面マーカーが結合しうる。あるいは、抗-ＣＤ２０結合アームは、Ｂ細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、ＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対するＦｃレセプター、又はＴ細胞レセプター分子(例えばＣＤ２又はＣＤ３)等の白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体はＢ細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はＣＤ２０-結合アーム及び細胞障害剤(例えば、サポリン(saporin)、抗-インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
【００５５】
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millsteinら, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第９３／０８８２９号及びTrauneckerら、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、コンストラクトに使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【００５６】
このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
米国特許第５７３１１６８号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【００５７】
二特異性抗体とは架橋抗体や「ヘテロ抱合抗体」を含む。例えば、ヘテロ抱合体の一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合していても良い。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対するターゲティング(米国特許第４６７６９８０号)及びＨＩＶ感染の治療(国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／２００３７３号及び欧州特許第０３０８９号)のために提案されてる。ヘテロ抱合抗体は従来からの架橋方法を使用することによって生成できる。当技術分野においては、適切な架橋剤は周知であり、それらは複数の架橋法と共に米国特許第４６７６９８０号に記されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81 (1985) は無傷抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【００５８】
最近の進歩により、大腸菌からＦａｂ'-ＳＨ断片の直接の回収が容易になり、これは科学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby,J.Exp.Med.,175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役させて二重特異性抗体を形成する。従って、形成された二重特異性抗体は、ヒト乳腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解活性を誘発すると同時に、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞及び正常ヒトＴ細胞へ結合することが可能であった。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産された。Kostelnyら, J.Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させられた。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片製造方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
【００５９】
ＩＩＩ．アンタゴニストのコンジュゲート(結合)と他の修飾
ここでの方法に用いる又は製造品に内包されるアンタゴニストは場合によって細胞障害性剤と結合させる。
そのようなアンタゴニスト-細胞障害性剤コンジュゲートの生成に有用な化学療法剤は前述している。
また、アンタゴニストと、一又は複数の小分子毒素のコンジュゲート、例えばカリケアマイシン(calicheamicin)、マイタンシン(maytansine)(米国特許第５２０８０２０)、トリコテン(trichothene)及びＣＣ１０６５もここにおいて考慮される。本発明の一実施態様では、アンタゴニストは、一又は複数のマイタンシン(maytansine)分子(例えば、アンタゴニスト抗体分子当たり約１から約１０のマイタンシン分子)とコンジュゲートしている。マイタンシンは、例えばＭａｙ−ＳＨ３へ還元されるＭａｙ−ＳＳ−Ｍｅへ変換され、修飾アンタゴニスト(Chariら，Cancer Research 52:127-131(1992))と反応してマイタンシノイド(maytansinoids)−アンタゴニストコンジュゲートを生じる。
【００６０】
あるいは、アンタゴニストは、一又は複数のカリケアマイシン分子を包含する。抗体のカリケアマイシンファミリーは、サブピコモル濃度で、二重鎖ＤＮＡの割れ目を作ることができる。使用されるであろうカリケアマイシンの構造類似体は、限定されるものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinmanら, Cancer Research 53:3336-3342(1993)及びLodeら，Cancer Research 58:2925-2928(1998))を含む。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日に公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
【００６１】
本発明は、更に、核酸分解性活性(例えば、リボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮＡ分解酵素)を有する化合物とコンジュゲートされたアンタゴニストについて考慮する。
種々の放射性同位体が放射性コンジュゲートアンタゴニストの生成に利用できる。具体例にはＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。
アンタゴニストと細胞障害性剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシレート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビス-アジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイソシアネート類(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)がアンタゴニストに放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは、細胞内で細胞毒性薬剤を放出を容易にする「切断可能なリンカー」でもよい。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチターゼ過敏性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー(Chariら,  Cancer Research 52：127-131(1992))が使用されてもよい。
あるいは、アンタゴニスト及び細胞障害性剤を含んでなる融合タンパク質を、例えば組み換え技術又はペプチド合成で製造してもよい。
【００６２】
他の実施態様では、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)にアンタゴニストがコンジュゲートされ得、ここで、アンタゴニスト-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄化(clearing)剤を使用し、循環から未結合コンジュゲートを除去し、ついで、細胞障害性剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
また、本発明のアンタゴニストを、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、国際公開第８１／０１１４５号を参照)を活性な抗癌剤に転化させるプロドラッグ活性化酵素にコンジュゲートさせてもよい。例えば国際公開第８８／０７３７８号及び米国特許第４９７５２７８号を参照されたい。
そのようなコンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に転化するように、プロドラッグに作用し得る任意の酵素が含まれる。
【００６３】
限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗癌剤５-フルオロウラシルに転化するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なもの；Ｄ-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの転化に有用なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なノイラミニダーゼ及びβ-ガラクトシダーゼ；β-ラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化させるのに有用なβ-ラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、当該分野において「アブザイム」としてもまた公知の酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを転化させるために使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328:457-458(1987)を参照)。アンタゴニスト-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。
この発明の酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えば上で検討したヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、アンタゴニストに共有的に結合させることができる。あるいは、本発明のアンタゴニストの少なくとも抗原結合領域を本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該技術においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる(例えばNeubergerら, Nature 312:604-608(1984)参照。
【００６４】
アンタゴニストの他の修飾がここで検討される。例えば、アンタゴニストは、様々な非タンパク質性(nonproteinaceous)のポリマー、例えば、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン類、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーの1つに結合させてもよい。抗体断片、例えば一又は複数のＰＥＧ分子に結合したＦａｂ'は、本発明の特に好ましい実施態様である。
また、ここで開示するアンタゴニストはリポソームとして製剤化してもよい。アンタゴニストを含むリポソームは、Epstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985)；Hwang等, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980)；米国特許第４４８５０４５号及び同４５４４５４５号；及び１９９７年１０月２３日に公開の国際公開第９７／３８７３１号等に記載されているような当分野において公知の方法によって調製される。循環時間が長いリポソームは、米国特許第５０１３５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、フォスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導体ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって生成することができる。所望の直径を有するリポソームを産出するために、リポソームを規定のサイズの孔のフィルターに通す。本発明の抗体のＦａｂ'断片を、ジスルフィド相互反応を介してMartin等 J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載のようにリポソームとコンジュゲートさせることができる。場合によっては、化学療法剤をリポソーム内に内包させる。Gabizon等 J. National Cancer Inst.81(19)1484 (1989)を参照。
【００６５】
ここで記載のタンパク質又はペプチドアンタゴニストのアミノ酸配列の修飾を考察する。例えば、アンタゴニストの結合親和性及び／又は他の生物学的特性が改善されることが望ましい。アンタゴニストのアミノ酸配列変異体は、適当なヌクレオチド変化をアンタゴニスト核酸に導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、例えば、アンタゴニストのアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、最終構造物に達するまでなされるが、その最終構造物は所望の特徴を有する。また、アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数又は位置の変化など、アンタゴニストの翻訳後過程を変更しうる。
突然変異のための好ましい位置にあるアンタゴニストの残基又は領域の同定のために有用な方法は、Cunningham及びWells , Science 244: 1081-1085 (1989)に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基又は基が同定され(例えば、arg, asp, his, lys,及びglu等の荷電残基)、中性又は負荷電アミノ酸(最も好ましくはアラニン又はポリペプチドアニリン)に置換され、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を及ぼす。次いで置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位において又はそれに対して更に又は他の置換を導入することにより精密にされる。即ち、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における変異の性能を分析するために、ａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現されたアンタゴニスト変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
【００６６】
アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノ-及び／又はカルボキシル末端融合物、並びに一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例は、Ｎ-末端メチオニル残基を持つアンタゴニスト又は細胞障害ポリペプチドに融合したアンタゴニストを含む。アンタゴニスト分子の他の挿入変異体は、アンタゴニストの血清半減期を向上させる酵素又はポリペプチドのアンタゴニストのＮ-又はＣ-末端への融合物を含む。
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、アンタゴニスト分子において少なくとも一つのアミノ酸残基に異なる残基が挿入されている。抗体アンタゴニストの置換突然変異について最も関心ある部位は高度可変領域を含むが、ＦＲ交互変化も考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表１に示す。これらの置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表１に「例示的置換」と名前を付けた又はアミノ酸の分類を参照して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてよい。
【００６７】
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【００６８】
アンタゴニストの生物学的性質における実質的な修飾は、(ａ)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、(ｂ)標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は(ｃ)側鎖の嵩を維持するそれらの効果において実質的に異なる置換を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けられる：
(１)疎水性：ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile；
(２)中性の親水性：cys、ser、thr、
(３)酸性：asp、glu；
(４)塩基性：asn、gln、his、lys、arg；
(５)鎖配向に影響する残基：gly、pro；及び
(６)芳香族：trp、tyr、phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
アンタゴニストの適切な配置の維持に関与しない任意のシステイン残基は、一般にセリンで置換し、分子の酸化的安定性を向上させて異常な架橋を防止する。逆に、アンタゴニストにシステイン結合を付加して、その安定性を向上させてもよい(特にここでのアンタゴニストは抗体断片、例としてＦｖ断片である)。
【００６９】
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、さらなる発展のために選択され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性突然変異である。簡潔に言えば、幾つかの高頻度可変領域部位(例えば６−７部位)を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された抗体変異体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として、一価種類にディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体と抗原の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
アンタゴニストのアミノ酸変異の他の型は、アンタゴニストの元のグリコシル化パターンを変更する。変更とは、アンタゴニストに見い出される一又は複数の炭水化物部分の欠失、及び／又はアンタゴニストに存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を含む。
【００７０】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン(ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸)のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ-結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを称するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いられる。
アンタゴニストへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(Ｎ-結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化させることによって簡便に達成される。該変化は、元のアンタゴニストの配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ-結合グリコシル化部位の場合)。
【００７１】
抗体がＦｃ領域を含む場合、そこに結合する炭水化物は変更されてよい。例えば抗体のＦｃ領域に結合するフコースを欠失した成熟炭水化物構造を有する抗体が、米国特許出願第２００３／０１５７１０８Ａ１号、Preata, Lに記載されている。抗体のＦｃ領域に結合した炭水化物において、二等分されたＮ-アセチルグルコサミン(GlcNAc)を有する抗体は、国際公開第０３／０１１８７８号、Jean-Mairetら、及び米国特許第６６０２６８４号、Umanaらが参照される。抗体のＦｃ領域に結合したオリゴ糖において、少なくとも一のガラクトース残基を有する抗体は、国際公開第９７／３００８７号、Patelらに報告されている。さらに、そのＦｃ領域に結合した変性炭水化物を有する抗体に関連する国際公開第９８／５８９６４号(Raju, S)及び国際公開第９９／２２７６４号(Raju, S)を参照のこと。
【００７２】
アンタゴニストのアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではないが、天然源からの単離(天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)又は初期に調製されたアンタゴニストの変異体又は非変異体のオリゴヌクレオチド媒介(又は部位特異的)突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製を含む。
【００７３】
エフェクター機能、例えばアンタゴニストの抗原依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)及び／又は補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)を向上させるために、本発明のアンタゴニストを修飾することが望ましい。このことは、抗体アンタゴニストのＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸置換を導入することで達成される。代わりにまたは加えて、Ｆｃ領域にシステイン残基を導入することによってこの領域での鎖間のジスルフィド結合形成が起こりうる。故に、生成されたホモ二量体抗体は内部移行能を向上および／または補体媒介性細胞殺害および抗体依存性細胞障害(ＡＤＣＣ)を増強する。Caron等, J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) およびShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照。抗腫瘍活性が亢進されたホモ二量体抗体もまた、Wolff ら Cancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載されているような異種性二機能性交差結合を用いて調製されうる。または、抗体を二重のＦｃ領域を持つように操作して、それによって補体媒介性溶解およびＡＤＣＣ能を亢進させうる。StevensonらAnti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。国際公開第００／４２０７２号(Presta, L.)には、ヒトエフェクター細胞の存在下で改善されたＡＤＣＣ機能を有する抗体が記載されており、ここで抗体はそのＦｃ領域にアミノ酸置換を含む。
【００７４】
変更したＣ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)を有する抗体は、国際公開第９９／５１６４２号、米国特許第６１９４５５１Ｂ１号、米国特許第６２４２１９５Ｂ１号、米国特許第６５２８６２４Ｂ１号及び米国特許第６５３８１２４号(Idusogieら)に記載されている。抗体は、そのＦｃ領域の一又は複数のアミノ酸位置２７０、３２２、３２６、３２７、３２９、３１３、３３３及び／又は３３４でのアミノ酸置換を含む。
【００７５】
アンタゴニストの血清半減期を延長するために、例として米国特許第５７３９２７７号に記載されているようにアンタゴニスト(特に抗体断片)内にサルベージレセプター結合エピトープが組み込まれる。ここで用いる、「サルベージレセプター結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期延長に関与するＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを表す。そのＦｃ領域に置換を有し、血清半減期が延長された抗体は、国際公開第００／４２０７２号(Presta, L.)に記載されてる。
３又はそれ以上の機能的抗原結合部位を有するように設計された抗体も考慮される(米国出願第２００２／０００４５８７Ａ１号、Millerら)。
【００７６】
ＩＶ．製薬用調製物
本発明に関連して使用されるアンタゴニストの治療用調製物は、所望の純度を有するアンタゴニストを、凍結乾燥された調製物又は水性溶液の形態で、任意の製薬的に許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存される(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスファート、シタラート、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンズエトニウムクロリド；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体)；及び／又はトゥイーン(TWEEN)ＴＭ、プルロニクス(PLURONICS)ＴＭ、又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００７７】
例示的抗-ＣＤ２０抗体の調製物は国際公開第９８／５６４１８号に記載されており、特に参考としてここに援用される。この公報は、２−８℃で２年間の最小限の貯蔵期間を持つように、リツキシマブ４０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍＭ酢酸塩、１５０ｍＭトレハロース、０．９％ベンジルアルコール、ｐＨ５．０の０．０２％ポリソルベート２０を含む液状複数回用量の調製物について記載している。対象となる他の抗-ＣＤ２０調製物は、リツキシマブ１０ｍｇ／ｍＬ、９．０ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、および注入用の滅菌水を含むｐＨ  ６．５のものである。
凍結乾燥調製物は、米国特許第６２６７９５８号(Andyaら)に記載されるように、皮下的投与に適する。そのような凍結乾燥調製物は適当な希釈剤で高いタンパク質濃度に再編成されるかもしれないし、また再編成された調製物はここで治療される哺乳動物に皮下注射されうる。
【００７８】
また、ここでの調製物は治療を特異的に示すために必要な一以上の活性化合物、好ましくはお互い負に作用しない相補的活性を持つものを含みうる。例として、さらに細胞障害性剤、化学療法剤、サイトカインまたは免疫抑制剤(例として、シクロスポリンまたはＴ細胞結合抗体、例としてＬＦＡ-１に結合するもの等のＴ細胞作用性のもの)を提供することが望まれる。そのような他剤の有効量は調製物に存在するアンタゴニスト量、疾患または疾病または治療の型、および上述した他の因子に依存する。これらは一般に同じ用量およびここに示した投与経路またはここで用いられる用量の約１〜９９％量で用いられる。
また、活性成分は、例としてコアセルべーション技術または界面重合化により調製したマイクロカプセル、例として、個々のコロイド状のドラッグデリバリーシステム(例として、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)またはマクロエマルジョン中の、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ-(メチルメタサイクリン)マイクロカプセル中に包まれているかもしれない。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
【００７９】
持続性徐放剤が調製される。持続性徐放剤の好適な例は、アンタゴニストを含む固形疎水性ポリマーの準透過性基質を含むものであり、基質は、造形品、例としてフィルム、またはマイクロカプセルの形である。持続性徐放基質の例として、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール))、ポリ乳酸(米国特許第３７７３９１９号), L-グルタミン酸およびγエチル-Ｌ-グルタミン酸のコポリマー、非分解性のエチレンビニール酢酸塩、分解性の乳酸-グリコール酸コポリマー、例としてLUPRON DEPOTＴＭ(乳酸-グリコール酸コポリマーおよびロイプロリド酢酸塩で構成された注入可能ミクロスフェア)、およびポリＤ-(-)-３-ヒドロキシブチリン酸を含む。
インビボ投与に用いる調製物は無菌でなければならない。これは滅菌濾過膜を通す濾過によって容易く達成できる。
【００８０】
Ｖ．アンタゴニストを用いた治療 
本発明は、ＣＤ２０に結合するアンタゴニストを使用した眼疾患の治療に関する。好ましいアンタゴニストは、リツキシマブ又はヒト化２Ｈ７等の、ＣＤ２０に結合する抗体である。抗体は無傷抗体又は抗体断片であってよい。
ここで治療される疾患の例には、限定されるものではないが、ブドウ膜炎 (虹彩炎を含む)、甲状腺眼病又はグレーブス眼病、ベーチェット眼病、重症眼筋無力症,、眼球類天疱瘡、自己免疫性網膜症、オンコセルカ症、上強膜炎、強膜炎、再発性ステロイド依存性視神経炎、眼球が関与したヴェグナー肉芽腫症、シェーグレン眼合併症、メラノーマ関連性網膜症、及び／又は癌関連性網膜症が含まれる。一般的に、ここで治療される哺乳動物は、Ｂ細胞悪性腫瘍に罹患していない。ここで治療される哺乳動物は、視力障害、痛み、赤み等の、一又は複数の眼病の兆候を通常示す。
【００８１】
本発明の一実施態様において、哺乳動物は、眼に存在する抗原(類)を含む、一又は複数の自己抗原に結合する自己抗体を産出する。哺乳動物はこのような自己抗体を検出する予測アッセイにかけられてもよく、このようなアッセイに対してポジティブな結果を有する哺乳動物又は患者が、ここに記載される治療の候補となる。いくつかのケース、例えば重症筋無力症において、眼の内部又は周囲、さらに他の箇所に存在する抗原に対する自己抗体(例えば、特別の(extra)-眼筋を含む、骨格筋組織に対する自己抗体)は、眼の内部に存在し、予測アッセイを使用して検出される。別に又は付加的に、患者は、関節リウマチ脈管炎から生じる強膜炎等、全身性疾患プロセスの一部で、眼に堆積する免疫複合体を有し得る。さらに本発明は、このような免疫複合体の存在の検出、及びそれらを有することが見出されている患者の治療について考察している。
【００８２】
ＣＤ２０抗原に結合するアンタゴニストを含有する組成物は、良好な医学的実務に合致する方式で調製され、調薬され、そして投与される。このときに考慮する因子は、治療される特定の疾患又は病状、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床的状態、疾患又は病状の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療実務者に知られた他の因子を含む。投与されるアンタゴニストの治療的有効量は、そのような考察によって決定される。
一般的な提案として、腸管外投与されるアンタゴニストの有効量は、患者当たり約２０ｍｇ／ｍ２〜約１００００ｍｇ／ｍ２の範囲で、一又は複数回投与される。無傷抗体の例示的第ＶＩ投薬計画には、１週間に３７５ｍｇ／ｍ２を４回；１０００ｍｇを２回（例えば、１及び１５日目）；又は１グラムを３回が含まれる。局所的に投与される抗体又は抗体断片、例えば点眼薬又は軟膏、もしくは眼窩内又は眼周囲への注射において、例示的用量は、約０．００１〜約１００ｍｇの範囲、例えば約０．１〜約１０ｍｇの範囲であり、１日に１回、１日に２回、又はそれ以上の頻度で適用される。眼内(intracameral)又は硝子体内(intavitreal)注射においては、約０．０１〜約１０ｍｇの範囲、好ましくは約０．１〜約１ｍｇの範囲の用量が考察される。
【００８３】
しかしながら、上記したようなアンタゴニストの提案した量は、多くの治療的裁量による。上記のように、適切な用量及び日程計画を選択する際の鍵となる要素は、得られた結果である。例えば、相対的により高い用量は、まず最初に進行中の及び急性疾患の治療に必要とされるかもしれない。最も効果的な結果を得るために、疾病又は疾患に応じて、できるだけ疾病又は疾患の最初の徴候、診断、出現または発症に近づくように、又は疾病又は疾患の緩解期となるようにアンタゴニストを投与する。
アンタゴニストは、非経口的、硝子体内、眼内、眼窩内、眼周囲、局所的(例えば点眼剤又は眼用軟膏を介して)、皮下、腹膜内、肺内、鼻腔内、及び／又は病巣内投与を含む好適な方法で投与される。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内、皮下投与を含む。包膜内投与も考察される。加えて、アンタゴニストは、例えばアンタゴニストの用量を減少させたパルス注入によって、好適に投与してもよい。好ましくは、投薬は、注射、最も好ましくは静脈内注射により行われるか、又は眼の内部もしくは周囲に投与される。
【００８４】
他の合成物、例えばここで言うアンタゴニストを有する細胞障害性剤、化学療法剤、免疫抑制剤及び／又はサイトカイン類を投与してもよい。例えば、ＣＤ２０アンタゴニストは、グルコルチコイド類(glucorticoids)／プレドニゾン／メチルプレドニゾン(グルココルトコイド類)、静脈注射用免疫グロブリン(ガンマグロブリン)、コバルト遠隔照射療法、血漿交換法、レボチロキシン、シクロスポリンＡ、ソマタスタチン(somatastatin)類似体、サイトカインアンタゴニスト、抗-代謝産物、免疫抑制剤、細胞障害性剤(例えば、クロラムブシル、シクロホスファミド、アザチオプリン)、眼窩放射線治療、眼窩減圧法、リハビリ手術、放射性ヨウ素、甲状腺摘出手術等と組み合わせてもよい。併用投与は、別々の調製物又は単一の製薬用調製物を使用して、同時投与、及び、何れの順序での連続的な投与を含み、好ましくは、両方の(または全ての)活性剤が同時に生物学的活性を示す期間があるものである。
【００８５】
タンパク質アンタゴニストの患者への投与の他に、本出願は、遺伝子治療によるアンタゴニストの投与を熟慮する。アンタゴニストをコード化する核酸のこのような投与は、「アンタゴニストの治療上有効量を投与する」という表現に包含される。細胞内抗体を生成することを目的とした遺伝子治療の使用に関して、例えば１９９６年３月１４日公開の国際公開第９６／０７３２１号を参照。
核酸(場合によって、ベクターに含まれる)を患者の細胞に入れるには主に2つのアプローチ；インビボ及びエクスビボがある。インビボ運搬のために、通常アンタゴニストが必要である部位に、直接核酸を注入する。エクスビボ治療のために、患者の細胞を取り出し、核酸を単離した細胞に導入し、変更された細胞を直接患者に投与する、又は例えば、患者の体内に埋め込まれる多孔性の膜に被包する(例として米国特許第４８９２５３８号及び同５２８３１８７号を参照)。核酸を生きた細胞に導入するための有用な多種の技術がある。技術は、核酸がインビトロ培養された細胞に移入するか、又は意図した宿主のインビボ細胞に移入するかどうかによって異なる。インビトロの哺乳動物細胞への核酸の移入に適切な技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿方法などの使用を含む。遺伝子のエクスビボ運搬のための一般的に用いられるベクターは、レトロウイルスである。
【００８６】
現在好適なインビボでの核酸移入技術は、ウイルスベクター(例として、アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ随伴ウイルス)及び脂質ベースのシステム(遺伝子の脂質介在移入のために有用な脂質は、例えばＤＯＴＭＡ，ＤＯＰＥ及びＤＣ-Ｃｈｏｌである)による形質移入を含む。ある状況では、核酸供給源に標的細胞を標的とする薬剤、例えば細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンドなどを与えることが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスと関連している細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はその断片、循環内で内部移行を行うタンパク質に対する抗体、細胞内局在を標的として細胞内半減期を延長するタンパク質をターゲティング及び／又は取り込み促進のために用いてもよい。例として、Wu等, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)；及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414 (1990)に、レセプター媒介性エンドサイトーシスの技術が記載されている。現在知られている遺伝子作製及び遺伝子治療のプロトコールの考察には、Anderson等, Science 256:808-813 (1992)を参照。また、国際公開第９３／２５６７３号及びここに挙げた文献も参照のこと。
更に、以下の限定的でない実施例により本発明を詳述する。本明細書中のすべての引例に開示されていることは出典明示によりここに援用される。
【実施例】
【００８７】
実施例１
眼疾患の一又は複数の兆候を有すると診断された患者を、この実施例に従い治療する。ここで治療される眼疾患の例には、ブドウ膜炎 (虹彩炎を含む)、甲状腺眼病 (グレーブス眼病とも称される)、ベーチェット眼病、重症眼筋無力症、眼球類天疱瘡、自己免疫性網膜症、オンコセルカ症、上強膜炎、強膜炎、再発性ステロイド依存性視神経炎、眼球が関与したヴェグナー肉芽腫症、シェーグレン眼合併症、メラノーマ関連性網膜症、又は癌関連性網膜症が含まれる。
患者は、無傷のリツキシマブ又はヒト化２Ｈ７、もしくはリツキシマブ又はヒト化２Ｈ７の断片(例えばＦａｂ、Ｆ(ａｂ')２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又はダイアボディ)で治療される。
好ましくは、無傷抗体は、循環性のＣＤ２０ポジティブＢ細胞を消耗(少なくともある程度)させ、よって眼疾患の兆候を改善するために、１週間当たり３７５ｍｇ／ｍ２ｘ４、１０００ｍｇｘ２(例えば１及び１５日目)、又は１グラムｘ３から選択される用量で、静脈内投与(ＩＶ)される。
眼病が眼の表面にある場合、例えば強膜炎又はシェーグレン症候群の場合、抗体は全身に投与されるか(例えば上述のような静脈注射)、又は抗体は点眼剤又は軟膏による局所投与用に調製される。適切な用量は約０．１〜１０ｍｇの範囲にあり、一日１回、２回又は３回適用される。
【００８８】
眼内浸透が所望される場合、例えばブドウ膜炎の場合、抗体又は抗体断片は硝子体内又は眼内注射により投与される。この投与方式に従い、眼への取り込み度合いを改善するために、抗体は抗体断片の形態であることが好ましい。硝子体内又は眼内注射用の抗体断片の用量は、約０．１〜約１．０ｍｇの範囲である。抗体又は抗体断片は、硝子体内又は眼内注射により、例えばひと月に１回、定期的に投与される。
【００８９】
ＣＤ２０抗体を用いた治療は、眼疾患を治療するための一又は複数の他の治療、例えばグルコルチコイド類／プレドニゾン／メチルプレドニゾン(グルココルチコイド類)、静脈注射用免疫グロブリン(ガンマグロブリン)、ソマタスタチン類似体、サイトカインアンタゴニスト、血漿交換法、レボチロキシン、シクロスポリンＡ、抗-代謝産物、免疫抑制剤、細胞障害性剤(例えば、クロラムブシル、シクロホスファミド、アザチオプリン)、コバルト遠隔照射療法、眼窩放射線治療、眼窩減圧法、リハビリ手術、放射性ヨウ素、及び／又は甲状腺摘出手術等と組み合わせてもよい。
ＣＤ２０抗体で治療された患者では、眼病の兆候の改善が見られ、例えば視力の改善、不快感又は催涙性の低下、視力消失の防止又は改善がなされた。
【国際調査報告】
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