(57)【要約】  本発明は、自然界において２つ以上のサブユニットで存在するタンパク質を、組換えによる方法によって生成する改良法を対象とし；より一般的には、２つ以上の不連続のＤＮＡ断片の連結によって得られるいかなるキメラＤＮＡ分子の増幅、およびそれに続く発現にも適用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
注目している２つのヌクレオチドセグメントＸ１およびＸ２を含むポリヌクレオチド（Ｘ１Ｘ２）（但し、Ｘ１Ｘ２の中にあるＸ２は、Ｘ１のすぐ３’にある）を、Ｘ１を含む核酸分子と、Ｘ２を含む同じまたは異なる核酸分子とから作製する方法であって、Ｘ１およびＸ２が同じ分子に由来する場合にはそれらは連続しておらず、この方法は、
（ａ）（ｉ）Ｘ１のアンチセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する順方向プライマーであるＰＦＸ１と、（ｉｉ）Ｘ１のセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する逆方向プライマーであるＰＲＸ１とを含む第１のプライマーセットを用いて、センスおよびアンチセンスの核酸鎖を含む第１の二本鎖核酸セグメントＸ１を増幅するステップと；
（ｂ）（ｉ）Ｘ２のアンチセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する順方向プライマーであるＰＦＸ２と、（ｉｉ）Ｘ２のセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する逆方向プライマーであるＰＲＸ２とを含む第２のプライマーセットを用いて、センスおよびアンチセンスの核酸鎖を含む第２の二本鎖核酸セグメントＸ２を増幅するステップと；
（ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）のＸ１産物およびＸ２産物を単離するステップと；
（ｄ）化学量論量の、ステップ（ｃ）の単離されたＸ１産物およびＸ２産物、ならびにプライマーＰＦＸ１、プライマーＰＲＸ２、および融合プライマーを含む単一の反応容器中でＰＣＲを行うステップとを含み、該融合プライマーは、ＰＲＸ１のヌクレオチド配列と、その５’末端でそれに先行する、ＰＦＸ２’と名付けられたＰＦＸ２の相補体の配列とを有し、この単一容器中で行ったＰＣＲは、中間体である二本鎖ポリヌクレオチドＸ１ＵＲの増幅をもたらし、該中間体は、センスおよびアンチセンスの核酸鎖を含み、かつ、二本鎖核酸セグメントＸ１と、Ｘ２の５’二本鎖核酸セグメントとを含み、ここで、Ｘ１の３’末端は、Ｘ２の該５’セグメントに融合しており、前記反応は、Ｘ１ＵＲ中間体の増幅ももたらして、Ｘ１ＵＲおよびＸ２を変性およびアニールして、アニールされた分子種を生成し、次に、５’−３’ポリメラーゼ活性および５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の両方を有するＤＮＡポリメラーゼ、プライマーＰＦＸ１、およびプライマーＰＲＸ２を用いて前記アニールされた分子種を伸長および増幅することによってＸ１Ｘ２を作製することを特徴とする方法。
【請求項２】
注目している２つのヌクレオチドセグメントＸ１およびＸ２を含むポリヌクレオチド（Ｘ１Ｘ２）（但し、Ｘ１Ｘ２の中にあるＸ２は、Ｘ１のすぐ３’にある）を、Ｘ１を含む核酸分子と、Ｘ２を含む同じまたは異なる核酸分子とから作製する方法であって、Ｘ１およびＸ２が同じ分子に由来する場合にはそれらは連続しておらず、この方法は、
（ａ）（ｉ）Ｘ１のアンチセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する順方向プライマーであるＰＦＸ１と、（ｉｉ）Ｘ１のセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する逆方向プライマーであるＰＲＸ１とを含む第１のプライマーセットを用いて、センスおよびアンチセンスの核酸鎖を含む第１の二本鎖核酸セグメントＸ１を増幅するステップと；
（ｂ）（ｉ）Ｘ２のアンチセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する順方向プライマーであるＰＦＸ２と、（ｉｉ）Ｘ２のセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する逆方向プライマーであるＰＲＸ２とを含む第２のプライマーセットを用いて、センスおよびアンチセンスの核酸鎖を含む第２の二本鎖核酸セグメントＸ２を増幅するステップと；
（ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）のＸ１産物およびＸ２産物を単離するステップと；
（ｄ）化学量論量の、ステップ（ｃ）の単離されたＸ１産物およびＸ２産物、ならびにプライマーＰＲＸ１、プライマーＰＦＸ２、および融合プライマーを含む単一の反応容器中でＰＣＲを行うステップとを含み、該融合プライマーは、ＰＦＸ２のヌクレオチド配列と、その５’末端でそれに先行する、ＰＲＸ１’と名付けられたＰＲＸ１の相補体の配列とを有し、この単一容器中で行ったＰＣＲは、中間体である二本鎖ポリヌクレオチドＤＲＸ２の増幅をもたらし、該中間体は、センスおよびアンチセンスの核酸鎖を含み、かつ、二本鎖核酸セグメントＸ２と、Ｘ１の３’二本鎖核酸セグメントとを含み、ここで、Ｘ２の５’末端は、Ｘ１の該３’セグメントに融合しており、前記反応は、ＤＲＸ２中間体の増幅ももたらして、ＤＲＸ２およびＸ１を変性およびアニールして、アニールされた分子種を生成し、次に、５’−３’ポリメラーゼ活性および５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の両方を有するＤＮＡポリメラーゼ、プライマーＰＲＸ１、およびプライマーＰＦＸ２を用いて前記アニールされた分子種を伸長および増幅することによってＸ１Ｘ２を作製することを特徴とする方法。
【請求項３】
注目している２つのヌクレオチドセグメントＸ１およびＸ２を含むポリヌクレオチド（Ｘ１Ｘ２）（但し、Ｘ１Ｘ２の中にあるＸ２は、Ｘ１のすぐ３’にある）を、Ｘ１を含む核酸分子と、Ｘ２を含む同じまたは異なる核酸分子とから作製する方法であって、Ｘ１およびＸ２が同じ分子に由来する場合にはそれらは連続しておらず、この方法は、
（ａ）（ｉ）Ｘ１のアンチセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する順方向プライマーであるＰＦＸ１と、（ｉｉ）Ｘ１のセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する逆方向プライマーであるＰＲＸ１とを含む第１のプライマーセットを用いて、センスおよびアンチセンスの核酸鎖を含む第１の二本鎖核酸セグメントＸ１を増幅するステップと；
（ｂ）（ｉ）Ｘ２のアンチセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する順方向プライマーであるＰＦＸ２と、（ｉｉ）Ｘ２のセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する逆方向プライマーであるＰＲＸ２とを含む第２のプライマーセットを用いて、センスおよびアンチセンスの核酸鎖を含む第２の二本鎖核酸セグメントＸ２を増幅するステップと；
（ｃ）第３のプライマーセットを用いて、中間体である二本鎖ポリヌクレオチドＸ１ＵＲを増幅するステップであって、該中間体は、センスおよびアンチセンスの核酸鎖を含み、かつ、二本鎖核酸セグメントＸ１と、Ｘ２の５’二本鎖核酸セグメントとを含み、ここで、Ｘ１の３’末端は、Ｘ２の該５’セグメントに融合しており、該第３のプライマーセットは、（ｉ）ＰＦＸ１および（ｉｉ）融合プライマーを含み、該融合プライマーは、ＰＲＸ１のヌクレオチド配列と、その５’末端でそれに先行する、ＰＦＸ２’と名付けられたＰＦＸ２の相補体の配列とを有する、Ｘ１ＵＲを増幅するステップと；
（ｄ）Ｘ１ＵＲおよびＸ２を変性およびアニールして、アニールされた分子種を生成し、次に、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーＰＦＸ１、およびプライマーＰＲＸ２を用いて前記アニールされた分子種を伸長および増幅することによってＸ１Ｘ２を作製するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
注目している２つのヌクレオチドセグメントＸ１およびＸ２を含むポリヌクレオチド（Ｘ１Ｘ２）（但し、Ｘ１Ｘ２の中にあるＸ２は、Ｘ１のすぐ３’にある）を、Ｘ１を含む核酸分子と、Ｘ２を含む同じまたは異なる核酸分子とから作製する方法であって、Ｘ１およびＸ２が同じ分子に由来する場合にはそれらは連続しておらず、この方法は、
（ａ）（ｉ）Ｘ１のアンチセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する順方向プライマーであるＰＦＸ１と、（ｉｉ）Ｘ１のセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する逆方向プライマーであるＰＲＸ１とを含む第１のプライマーセットを用いて、センスおよびアンチセンスの核酸鎖を含む第１の二本鎖核酸セグメントＸ１を増幅するステップと；
（ｂ）（ｉ）Ｘ２のアンチセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する順方向プライマーであるＰＦＸ２と、（ｉｉ）Ｘ２のセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する逆方向プライマーであるＰＲＸ２とを含む第２のプライマーセットを用いて、センスおよびアンチセンスの核酸鎖を含む第２の二本鎖核酸セグメントＸ２を増幅するステップと；
（ｃ）第３のプライマーセットを用いて、中間体である二本鎖ポリヌクレオチドＤＲＸ２を増幅するステップであって、該中間体は、センスおよびアンチセンスの核酸鎖を含み、かつ、二本鎖核酸セグメントＸ２と、Ｘ１の３’二本鎖核酸セグメントとを含み、ここで、Ｘ２の５’末端は、Ｘ１の該３’セグメントに融合しており、該第３のプライマーセットは、（ｉ）ＰＲＸ２、および（ｉｉ）融合プライマーを含み、該融合プライマーは、ＰＦＸ２のヌクレオチド配列と、その５’末端でそれに先行する、ＰＲＸ１’と名付けられたＰＲＸ１の相補体の配列とを有する、ＤＲＸ２を増幅するステップと；
（ｄ）ＤＲＸ２およびＸ２を変性およびアニールして、アニールされた分子種を生成し、次に、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーＰＲＸ１、およびプライマーＰＦＸ２を用いて前記アニールされた分子種を伸長および増幅することによってＸ１Ｘ２を作製するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
注目している２つのヌクレオチドセグメントＸ１およびＸ２を含むポリヌクレオチド（Ｘ１Ｘ２）（但し、Ｘ１Ｘ２の中にあるＸ２は、Ｘ１のすぐ３’にある）を、Ｘ１を含む核酸分子と、Ｘ２を含む同じまたは異なる核酸分子とから作製する方法であって、Ｘ１およびＸ２が同じ分子に由来する場合にはそれらは連続しておらず、この方法は、
（ａ）（ｉ）Ｘ２のアンチセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する順方向プライマーであるＰＦＸ２と、（ｉｉ）Ｘ２のセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する逆方向プライマーであるＰＲＸ２とを含む第２のプライマーセットを用いて、センスおよびアンチセンスの核酸鎖を含む第１の二本鎖核酸セグメントＸ２を増幅するステップと；
（ｂ）第３のプライマーセットを用いて、中間体である二本鎖ポリヌクレオチドＸ１ＵＲを増幅するステップであって、該中間体は、センスおよびアンチセンスの核酸鎖を含み、かつ、二本鎖核酸セグメントＸ１と、Ｘ２の５’二本鎖核酸セグメントとを含み、ここで、Ｘ１の３’末端は、Ｘ２の該５’セグメントに融合しており、該第３のプライマーセットは、（ｉ）Ｘ１のアンチセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する順方向プライマーであるＰＦＸ１と、（ｉｉ）融合プライマーとを含み、該融合プライマーは、Ｘ１のセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する逆方向プライマーであるＰＲＸ１のヌクレオチド配列と、その５’末端でそれに先行する、ＰＦＸ２’と名付けられたＰＦＸ２の相補体の配列とを有する、Ｘ１ＵＲを増幅するステップと；
（ｃ）Ｘ１ＵＲおよびＸ２を変性およびアニールして、アニールされた分子種を生成し、次に、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーＰＦＸ１、およびプライマーＰＲＸ２を用いて前記アニールされた分子種を伸長および増幅することによってＸ１Ｘ２を作製するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
注目している２つのヌクレオチドセグメントＸ１およびＸ２を含むポリヌクレオチド（Ｘ１Ｘ２）（但し、Ｘ１Ｘ２の中にあるＸ２は、Ｘ１のすぐ３’にある）を、Ｘ１を含む核酸分子と、Ｘ２を含む同じまたは異なる核酸分子とから作製する方法であって、Ｘ１およびＸ２が同じ分子に由来する場合にはそれらは連続しておらず、この方法は、
（ａ）（ｉ）Ｘ１のアンチセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する順方向プライマーであるＰＦＸ１と、（ｉｉ）Ｘ１のセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する逆方向プライマーであるＰＲＸ１とを含む第１のプライマーセットを用いて、センスおよびアンチセンスの核酸鎖を含む第１の二本鎖核酸セグメントＸ１を増幅するステップと；
（ｂ）第３のプライマーセットを用いて、中間体である二本鎖ポリヌクレオチドＤＲＸ２を増幅するステップであって、該中間体は、センスおよびアンチセンスの核酸鎖を含み、かつ、二本鎖核酸セグメントＸ２と、Ｘ１の３’二本鎖核酸セグメントとを含み、ここで、Ｘ２の５’末端は、Ｘ１の該３’セグメントに融合しており、該第３のプライマーセットは、（ｉ）Ｘ２のセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する逆方向プライマーであるＰＲＸ２と、（ｉｉ）融合プライマーとを含み、該融合プライマーは、Ｘ２のアンチセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する順方向プライマーであるＰＦＸ２のヌクレオチド配列と、その５’末端でそれに先行する、ＰＲＸ１’と名付けられたＰＲＸ１の相補体の配列とを有する、ＤＲＸ２を増幅するステップと；
（ｃ）ＤＲＸ２およびＸ２を変性およびアニールして、アニールされた分子種を生成し、次に、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーＰＲＸ１、およびプライマーＰＦＸ２を用いて前記アニールされた分子種を伸長および増幅することによってＸ１Ｘ２を作製するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
セグメントＸ１およびセグメントＸ２は両方とも同じ核酸分子に含まれることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記核酸分子は哺乳類ゲノム、好ましくはヒトゲノムであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチド（Ｘ１Ｘ２）は生物学的に活性なポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチド（Ｘ１Ｘ２）は、絨毛性性腺刺激ホルモン（ＣＧ）の活性を有するポリペプチド；黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、またはＬＨおよびＦＳＨの両方の活性を有するポリペプチド；甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）；あるいは、アルファ−インターフェロン（ＩＮＦ−α）、ベータ−インターフェロン（ＩＮＦ−β）、またはＩＮＦ−αおよびＩＮＦ−βの両方の活性を有するポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
セグメントＸ１はシグナル配列をコードし、Ｘ２は生物学的に活性なポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ポリヌクレオチド（Ｘ１Ｘ２）によってコードされた組換えタンパク質を製造する方法であって、請求項１から６のいずれかに記載の方法によって得られたポリヌクレオチド（Ｘ１Ｘ２）を適当な発現ベクターに挿入することを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
配列番号２０に記載のポリヌクレオチド配列セットを含むことを特徴とする核酸分子。
【請求項１４】
請求項１３の核酸分子を含むことを特徴とするベクター。
【請求項１５】
配列番号２０のポリヌクレオチドを発現するように形質転換されることを特徴とする哺乳類宿主細胞。
【請求項１６】
配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号１１に記載の配列セットを有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
配列番号１２に記載の配列セットを有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
配列番号３０または配列番号３１に記載の配列セットを有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１９に記載のオリゴヌクレオチドの１つによってコードされていることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２１】
請求項２０に記載のポリペプチドの活性を有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項２２】
注目している２つのヌクレオチドセグメントＸ１およびＸ２を含むポリヌクレオチド（Ｘ１Ｘ２）（但し、Ｘ１Ｘ２の中にあるＸ２は、Ｘ１のすぐ３’にある）を、Ｘ１を含む核酸分子と、Ｘ２を含む同じまたは異なる核酸分子とから作製する方法であって、Ｘ１およびＸ２が同じ分子に由来する場合にはそれらは連続しておらず、この方法は、
（ａ）以下のプライマーセット（ｉ）および（ｉｉ）を用いたポリメラーゼ連鎖反応で、Ｘ１ＵＲおよびＤＲＸ２（ここでＵＲは少なくとも１２ヌクレオチドを有するＸ２の５’セグメントであり、ＤＲは少なくとも１２ヌクレオチドを有するＸ１の３’セグメントである）からなる群から選択された少なくとも１つの中間体二本鎖ポリヌクレオチドを増幅するステップであって、
プライマーセット（ｉ）は、Ｘ１ＵＲ用であり、Ｘ１のアンチセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する順方向プライマーであるＰＦＸ１、および融合プライマーであり、該融合プライマーは、Ｘ１のセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する逆方向プライマーであるＰＲＸ１のヌクレオチド配列と、その５’末端でそれに先行する、ＰＦＸ２’と名付けられたＰＦＸ２の相補体の配列とを有し、
プライマーセット（ｉｉ）は、ＤＲＸ２用であり、Ｘ２のセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する逆方向プライマーであるＰＲＸ２、および融合プライマーであり、該融合プライマーは、Ｘ２のアンチセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する順方向プライマーであるＰＦＸ２のヌクレオチド配列と、その５’末端でそれに先行する、ＰＲＸ１’と名付けられたＰＲＸ１の相補体の配列とを有する、中間体二本鎖ポリヌクレオチドを増幅するステップと；
（ｂ）（ｉ）該中間体がＸ１ＵＲである場合、Ｘ２のアンチセンス鎖にアニールされたＸ１ＵＲのセンス鎖；
（ｉｉ）該中間体がＤＲＸ２である場合、ＤＲＸ２のアンチセンス鎖にアニールされたＸ１のセンス鎖；および、
（ｉｉｉ）該中間体がＸ１ＵＲおよびＤＲＸ２である場合、ＤＲＸ２のアンチセンス鎖にアニールされたＸ１ＵＲのセンス鎖
からなる群から選択された分子種Ａを形成するステップと；
（ｃ）（ｉ）該中間体がＸ１ＵＲである場合、Ｘ２のセンス鎖にアニールされたＸ１ＵＲのアンチセンス鎖；
（ｉｉ）該中間体がＤＲＸ２である場合、ＤＲＸ２のセンス鎖にアニールされたＸ１のアンチセンス鎖；および、
（ｉｉｉ）該中間体がＸ１ＵＲおよびＤＲＸ２である場合、ＤＲＸ２のセンス鎖にアニールされたＸ１ＵＲのアンチセンス鎖
からなる群から選択された分子種Ｂを形成するステップと；
（ｄ）所定の重合条件下で行ったポリメラーゼ連鎖反応により、５’−３’ポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いて分子種Ａを伸長させてＸ１Ｘ２を形成し、さらに、プライマーＰＦＸ１およびプライマーＰＲＸ２、ならびに５’−３’ポリメラーゼ活性および５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の両方を有するポリメラーゼ酵素を用いて分子種Ｂを伸長させてＸ１Ｘ２を形成するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２３】
注目している２つのヌクレオチドセグメントＸ１およびＸ２を含むポリヌクレオチド（Ｘ１Ｘ２）（但し、Ｘ１Ｘ２の中にあるＸ２は、Ｘ１のすぐ３’にある）を、Ｘ１を含む核酸分子と、Ｘ２を含む同じまたは異なる核酸分子とから作製する方法であって、Ｘ１およびＸ２が同じ分子に由来する場合にはそれらは連続しておらず、この方法は、
（ａ）以下のプライマーセット（ｉ）および（ｉｉ）を用いたポリメラーゼ連鎖反応で、Ｘ１ＵＲおよびＤＲＸ２（但し、ＵＲは少なくとも１２ヌクレオチドを有するＸ２の５’セグメントであり、ＤＲは少なくとも１２ヌクレオチドを有するＸ１の３’セグメントである）からなる群から選択された少なくとも１つの中間体二本鎖ポリヌクレオチドを増幅するステップであって、
プライマーセット（ｉ）は、Ｘ１ＵＲ用であり、Ｘ１のアンチセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する順方向プライマーであるＰＦＸ１、および融合プライマーであり、該融合プライマーは、Ｘ１のセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する逆方向プライマーであるＰＲＸ１のヌクレオチド配列と、その５’末端でそれに先行する、ＰＦＸ２’と名付けられたＰＦＸ２の相補体の配列とを有し、
プライマーセット（ｉｉ）は、ＤＲＸ２用であり、Ｘ２のセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する逆方向プライマーであるＰＲＸ２、および融合プライマーであり、該融合プライマーは、Ｘ２のアンチセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する順方向プライマーであるＰＦＸ２のヌクレオチド配列と、その５’末端でそれに先行する、ＰＲＸ１’と名付けられたＰＲＸ１の相補体の配列とを有する、中間体二本鎖ポリヌクレオチドを増幅するステップと；
（ｂ）（ｉ）分子種Ａを形成する、Ｘ１ＵＲのセンス鎖およびＸ２のアンチセンス鎖；
（ｉｉ）分子種Ａを形成する、Ｘ１のセンス鎖およびＤＲＸ２のアンチセンス鎖；
（ｉｉｉ）分子種Ａを形成する、Ｘ１ＵＲのセンス鎖およびＤＲＸ２のアンチセンス鎖；
（ｉｖ）分子種Ｂを形成する、Ｘ１ＵＲのアンチセンス鎖およびＸ２のセンス鎖；
（ｖ）分子種Ｂを形成する、Ｘ１のアンチセンス鎖およびＤＲＸ２のセンス鎖；
（ｉｉｉ）分子種Ａを形成する、Ｘ１ＵＲのアンチセンス鎖およびＤＲＸ２のセンス鎖
のうち少なくとも１組をアニールさせるステップと；
（ｃ）所定の重合条件下で行ったポリメラーゼ連鎖反応により、５’−３’ポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いて分子種Ａを伸長させてＸ１Ｘ２を形成し、さらにプライマーＰＦＸ１およびプライマーＰＲＸ２、ならびに５’−３’ポリメラーゼ活性および５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の両方を有するポリメラーゼ酵素を用いて分子種Ｂを伸長させてＸ１Ｘ２を形成するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
セグメントＸ１およびセグメントＸ２は両方とも同じ核酸分子に含まれることを特徴とする請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸分子は哺乳類ゲノム、好ましくはヒトゲノムであることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリヌクレオチド（Ｘ１Ｘ２）は生物学的に活性なポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項２２から２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリヌクレオチド（Ｘ１Ｘ２）は、絨毛性性腺刺激ホルモン（ＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、または甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の活性を有するポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
セグメントＸ１はシグナル配列をコードし、Ｘ２は生物学的に活性なポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項２２から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
ポリヌクレオチド（Ｘ１Ｘ２）によってコードされた組換えタンパク質を製造する方法であって、請求項２２から２７のいずれかに記載の方法によって得られたポリヌクレオチド（Ｘ１Ｘ２）を適当な発現ベクターに挿入することを含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自然界において２つ以上のサブユニットで存在するタンパク質を、組換えによる方法によって生成する改良法を対象とし；より一般的には、２つ以上の不連続のＤＮＡ断片の連結によって得られるいかなるキメラＤＮＡ分子の増幅、およびそれに続く発現にも適用できる。
【背景技術】
【０００２】
融合タンパク質の発現は、当技術分野で周知であり、例えば、以下の特許刊行物、すなわち、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、および特許文献７に開示されている。
【０００３】
適当な発現システムにおける、注目している組換え体タンパク質（例えばヒトタンパク質）の製造は、組換えＤＮＡ技術の主要な産業応用の１つである。多くの場合のようにタンパク質が宿主細胞内で不安定である場合、注目しているタンパク質を、後に所定の特定部位でプロセシングされて所望のタンパク質を遊離するであろう保護的な（または安定化する）タンパク質を含む融合部分の形態で製造することが有利となることがある。
【０００４】
融合タンパク質を作製する別の理由は、適当なポリペプチド配列を選択して、１つまたは複数のそのような配列を、注目しているポリペプチドまたはタンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端に結合させることによって、発現レベルを増大させ、および／または精製過程を容易にすることである。融合タンパク質を発現するさらに別の理由は、２つ以上の異なったタンパク質またはサブユニットの特徴的な性質を単一鎖にもたせ、それによって、そのタンパク質それ自体における、より高い活性／用量比を提供し、および/または２つのサブユニットの連結を得るための余分なステップを回避することでありうる。組換えタンパク質の発現に伴う古典的な問題の１つは、発現するべき核酸の有用かつ信頼できる供給源を得ることに関するものである。
【０００５】
【特許文献１】欧州特許第６６９４号明細書
【特許文献２】欧州特許第２０２９０号明細書
【特許文献３】米国特許第４８９８８３０号明細書
【特許文献４】米国特許第５４５２１９９号明細書
【特許文献５】欧州特許第２１３４７２号明細書
【特許文献６】欧州特許第１９６８６４号明細書
【特許文献７】欧州特許第４６１１６５号明細書
【特許文献８】米国特許第５３８５８３９号明細書
【特許文献９】米国特許第５１６８０６２号明細書
【非特許文献１】Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989）Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York
【非特許文献２】DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985)
【非特許文献３】Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984)
【非特許文献４】Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)]
【非特許文献５】Transcription And Translation [B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)]
【非特許文献６】Animal Cell Culture [R. I. Freshney, ed. (1986)]
【非特許文献７】Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]
【非特許文献８】B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)
【非特許文献９】F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994); (1989); (1992)
【非特許文献１０】Saiki et al., Science 1988, 239: 487
【非特許文献１１】Benoist and Chambon, Nature 1981, 290: 304-310
【非特許文献１２】Yamamoto, et al., Cell 1980, 22: 787-797
【非特許文献１３】Wagner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1981; 82: 3567-71
【非特許文献１４】Wolfe, et al. Nature Genetics 1992; 1: 379-384
【非特許文献１５】Brinster et al., Nature 1982, 296: 39-42
【非特許文献１６】Villa-Komaroff, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1978, 75: 3727-3731
【非特許文献１７】DeBoer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1983, 80: 21-25
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【非特許文献２４】Basic Cell Culture 2nd Edition. Davis, J. M. ed. Oxford University Press (2002)
【非特許文献２５】Artificial self-assembling systems for gene delivery. Felgner, et al., eds. Oxford University Press (1996)
【非特許文献２６】Lebkowski, et al. Mol Cell Biol 1988 8(10): 3988-3996
【非特許文献２７】pTARGET（商標）Mammalian Expression System Technical Manual
【非特許文献２８】Dahl et al. Methods Enzymol 1989; 168: 414-422
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
この問題に取り組む１つの方法は、発現するべきタンパク質をコードするｍＲＮＡの使用である。しかし、ｍＲＮＡは、天然の状態で常に容易に見出されるわけではない。例えば、ベータ鎖ヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の場合には、対応するｍＲＮＡは、ヒト脳下垂体細胞にのみ見出すことができ、しかもそれは極微量でしかない。利用可能であるには、このｍＲＮＡを、死亡直後のヒト脳下垂体細胞から採取しなければならない。
【０００７】
代替の一手段は、注目しているコード配列をゲノムＤＮＡから得ることである。しかし、これは厄介で時間のかかる過程である。何故なら、しばしば、不要なＤＮＡ物質が大量に初期試料に存在し、それによって、突然変異や他の誤りの確率が増大するからである。したがって、ポリペプチドの発現に使用する核酸配列を生成するための、とりわけ、組換え異種融合ポリペプチドの発現に使用する核酸配列を生成するための改善された方法の必要性が今なお存在している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、遂に、既知の方法に伴う上述の不都合のうち少なくとも１つを伴わずに、タンパク質および融合タンパク質の発現をゲノムＤＮＡから開始することを可能にする方法を見出した。新規のこの方法は、組換えタンパク質の産生に向けた新規のアプローチを提供する。すなわち、この方法は、コードしているＤＮＡ断片を、制限酵素を使用せずに、所望の位置で連結して増幅することを可能にする。これは、所望のＤＮＡのまさにコード領域のみを（すなわちイントロンなしで）使用して、それによって、スプライシングを回避し、および／または望ましくないアンプリコンの形成を低減することが可能であることを意味する。
【０００９】
この新規な方法の利点の例は、ヒトベータＦＳＨの発現によって代表される。ヒトベータＦＳＨを発現する遺伝子は、１５００塩基を超える長さであるが、対応するコード領域は３９０塩基長にすぎない。本発明の方法論によれば、１５００塩基の遺伝子全体を用いる必要なく、３９０塩基の正しいＤＮＡ配列を含有する発現構築物を構築することが可能である。したがって、不必要でありかつ問題を起こす可能性のある１１１０塩基の余分なＤＮＡの除去を、制限酵素を使用せずに、且つ、ｍＲＮＡを単離してｃＤＮＡを生成する余分なステップを経ずに行うことが可能となる。したがって、本発明は、有用であり、安価であり、かつ間違いがより少ない。
【００１０】
本発明の方法論を用いれば、２つの異なったタンパク質またはタンパク質サブユニットの特徴を単一鎖中で発現するＤＮＡキメラ分子、あるいは特定のタンパク質のその活性をになう部分のみを発現するＤＮＡキメラ分子を設計することさえも可能であり、比較的単純である。例えば、ＬＨ活性のみでなくＦＳＨ活性をも有する新規タンパク質を発現することが可能である。換言すれば、追加されたか、増強されているか、または別の方法で修飾された活性を有する新規タンパク質を生成することが可能である。小型で正確なＤＮＡ小片を用いることによって、同一または同様の活性を有するより小さいポリペプチドを得るために、野生型タンパク質における実際の活性部位を操作することも可能となり、それによって、新規のポリペプチドは、大きさがより小さいことによって、野生型タンパク質とは異なった投与経路で（すなわち、注射によってではなく、吸入によって、あるいは経皮または経粘膜経路で）患者に投与されるか、あるいは、治療用タンパク質の組換え体生成における収率の増大など、他の利点を有するかもしれない。
【００１１】
下記の詳細な説明および実施例から明らかになるように、本発明の方法は、２つの不連続のＤＮＡセグメントＸ１およびＸ２で最初に実行され、従って、これらが１つに融合する一連のＰＣＲ増幅ステップに基づいている。そのようにして得られたポリヌクレオチド（Ｘ１Ｘ２）は、その後、所望のポリペプチドを既知の方法によって組換え細胞またはトランスジェニック動物で発現するために適当な発現ベクターに挿入される。このポリペプチドは融合ポリペプチドでもよく、あるいは、ポリヌクレオチドエレメントＸ１およびＸ２（但し、Ｘ１およびＸ２はゲノムＤＮＡ中で隣接していないエキソン配列である）からなるｃＤＮＡを翻訳することによって自然に生成されるタンパク質に同一なポリペプチドでもよい。本発明に包含されるその他のキメラポリペプチドには、黄体形成ホルモン−卵胞刺激ホルモン（ＬＨ−ＦＳＨ）などの二重活性ポリペプチド、または、その成熟タンパク質がＬＨ、ＦＳＨ、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、絨毛性性腺刺激ホルモン（ＣＧ）、もしくは任意の他の活性ポリペプチドである単一のポリペプチド、プロポリペプチド、もしくはプレプロポリペプチドが含まれる。
【００１２】
別の態様では、本発明は、ＦＳＨ活性を有するキメラ卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）ポリペプチドを対象とするが、このキメラ卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）ポリペプチドは、２本の別々のポリペプチド鎖（天然の分子ではαおよびβと名付けられている）の代わりに、α鎖の３’末端がβ鎖の５’末端に直接融合されているα鎖をコードする単一の融合ポリヌクレオチドセグメントを含む。コードされているキメラポリペプチド分子は、ＡＢ−ＦＳＨと呼ばれ、ＦＳＨ活性を有することが示されている。キメラＡＢ−ＦＳＨタンパク質を生成するこの方法は、完全長のタンパク質が単一のベクターにおいてコードされ、単一のプロモーターから発現されるので、活性な卵胞刺激ホルモンの簡便な発現を可能にする。この方法は、単離されたベータ−ＦＳＨ鎖および／またはアルファ−ＦＳＨ鎖を含まない活性で安定なＡＢ−ＦＳＨ融合タンパク質を容易に精製することを可能にする。
【００１３】
ＡＢ−ＦＳＨは、発現を行う細胞からの融合タンパク質の分泌を指示するα鎖用のシグナル配列と共に発現させて、その後の精製を容易にすることが好ましい。シグナル配列は、翻訳後修飾において切断されるであろう。別法として、β鎖のシグナル配列をα鎖の５’に用いることもでき、また、α鎖のシグナル配列をβ鎖の５’に用いることもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明によれば、当技術分野の技術の範囲内で、従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技法を用いることができる。そのような技術は文献において十分に説明されている。例えば、非特許文献１（本明細中、「Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９」と称する）；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；および非特許文献９を参照のこと。
【００１５】
定義
本明細書で使用される場合、ＤＮＡの「増幅」は、ＤＮＡ配列の混合物中にある特定のＤＮＡ配列の濃度を増大させるためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用を意味する。ＰＣＲに関する説明には、非特許文献１０を参照のこと。
【００１６】
「遺伝子」という用語は、１つまたは複数のタンパク質または酵素の全体または一部を含むアミノ酸の特定の配列をコードしているか、あるいはそれに対応しているＤＮＡ配列を意味し、このＤＮＡ配列は、調節ＤＮＡ配列（プロモーター配列など）および非翻訳配列（５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、およびイントロンなど）を含んでも、含まなくてもよい。一部の遺伝子は、構造遺伝子ではなく、ＤＮＡからＲＮＡに転写されることはあるが、アミノ酸配列には翻訳されない。
【００１７】
特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造について論じる場合、本明細書では、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、転写されたｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖であり、センス鎖または「順方向」鎖としても知られている）に沿って、５’から３’方向に配列を定義する通常の慣例に従って配列を記載することができる。特定の二本鎖ＤＮＡ分子と比較した他のＤＮＡ配列の構成は、本明細書では、通常の慣例に従って記載することができ、ここで、特定の二本鎖ＤＮＡの５’末端にある配列は、「上流」配列（ＵＲ）であり、特定の二本鎖ＤＮＡの３’末端にある配列は、「下流」（ＤＲ）配列である。しかし、本発明の方法は、参照のセンス（「順方向」）鎖、およびそれに相補的なアンチセンス（「逆方向」）鎖の両方の増幅に有効であることに留意されたい。
【００１８】
特定の一本鎖ポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマー、または二本鎖ＤＮＡ分子の分離された鎖など）の構造について論じる場合、本明細書では、配列を５’から３’方向に定義する通常の慣例に従って配列を記載し、その５’末端は、前記一本鎖ポリヌクレオチドのリン酸端末を表し、その３’末端は、前記一本鎖ポリヌクレオチドのヒドロキシ端末を表す。詳細には、「順方向」プライマーは、アンチセンス（「逆方向」）鎖の３’末端にハイブリッド形成して相補的なセンス（または「順方向」）鎖の５’−３’重合を導くオリゴヌクレオチドである。逆に、「逆方向」プライマーは、センス（「順方向」）鎖の３’末端にハイブリッド形成して相補的なアンチセンス（「逆方向」）鎖の５’−３’重合を導くオリゴヌクレオチドである。
【００１９】
「発現構築物」、「発現ベクター」、または「構築物」は、選択された宿主細胞における標的核酸配列の適切な転写および翻訳を提供する配列エレメントと作用可能（ｏｐｅｒａｂｌｙ）に連結した標的核酸配列またはその発現が望まれている配列とを含む核酸配列を意味する。そのような配列エレメントには、例えば、プロモーター、分泌のためのシグナル配列、およびポリアデニル化シグナルを含めることができる。「発現構築物」、「発現ベクター」、または「構築物」は、「ベクター配列」をさらに含む。「ベクター配列」とは、（限定されるものではないが）プラスミド、コスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、および酵母人工染色体を含めた、本発明の組換えＤＮＡ技術において、発現構築物のクローニングおよび増殖を促進する有用性を有する、当技術分野で確立されているいくつかの核酸配列の任意のものを意味する。本発明の発現構築物は、宿主を形質転換して、導入された標的核酸配列の発現（例えば転写および翻訳）を促進するように、宿主細胞内に導入することができる。
【００２０】
「プロモーター」または「プロモーター配列」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼに結合して、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的においては、プロモーター配列は、転写開始部位によってその３’末端で境界が定められ、バックグランドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するのに必要最小限の数の塩基またはエレメントを含むように上流（５’方向）に延在している。プロモーター配列中には、ＲＮＡポリメラーゼ結合の原因となるタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）に加えて、転写開始部位（好都合には、例えばヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングによって定義される）も見出されるであろう。プロモーターは、エンハンサー配列およびリプレッサー配列を含めた他の発現調節配列に作用可能に接続されていることがある。
【００２１】
ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、または酵素などの発現産物を「コードする」配列は、発現された際に、そのＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、または酵素の産生をもたらすヌクレオチド配列であり、すなわち、このヌクレオチド配列は、そのポリペプチド、タンパク質、または酵素のアミノ酸配列をコードする。タンパク質のコード配列は開始コドン（通常ＡＴＧ）および停止コドンを含むことができる。
【００２２】
「宿主細胞」とは、本発明の１つまたは複数の発現構築物で形質移入または形質転換されている細胞を意味する。そのような宿主細胞には、原核細胞および真核細胞が含まれる。本発明での使用に好ましい真核細胞は、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞など、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されている哺乳類細胞である。宿主細胞という用語は、トランスジェニック哺乳動物など、ｉｎ  ｖｉｖｏで見出される形質転換細胞も包含する。
【００２３】
「形質移入」または「形質転換」とは、（限定されるものではないが）マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介の形質移入、カルシウムリン酸媒介の形質移入、またはウイルス媒介の形質移入を含めた、当技術分野で確立されている任意の方法によって、本発明の１つまたは複数の発現構築物を宿主細胞に導入する過程を意味する。形質移入または形質転換によって本発明の発現構築物が導入されている宿主細胞は、「形質移入され」ているか、あるいは「形質転換され」ている。
【００２４】
キメラポリヌクレオチドＸ１Ｘ２の増幅
本発明者らは、注目している２つの不連続のヌクレオチドセグメントＸ１およびＸ２を含むキメラポリヌクレオチド（Ｘ１Ｘ２）を増幅する方法を発見した。一実施形態では、Ｘ１配列およびＸ２配列は、区別できるタンパク質をコードする配列に由来し、したがって、Ｘ１Ｘ２配列は融合タンパク質をコードする。別の実施形態では、Ｘ１配列およびＸ２配列は、単一タンパク質をコードする配列に由来する。例えば、Ｘ１およびＸ２は、ある遺伝子の２つのエキソン配列を表してもよく、これらのエキソン配列は、その遺伝子のゲノム配列中では隣接していない（例えばイントロン、あるいは場合によっては他のエキソンまたはエキソンの一部による分離によって）が、その遺伝子の転写されたｍＲＮＡ中では隣接している（例えば介在配列を除去するスプライシングによって）。この場合、本発明の方法は、スプライシングされたＲＮＡの単離、ｃＤＮＡの作製、またはゲノムＤＮＡ配列の複雑な制限消化および連結の実行を必要とせずに、Ｘ２がＸ１のすぐ３’にある、連結されたＸ１Ｘ２配列の直接的な生成を可能にする。
【００２５】
注目している２つのヌクレオチドセグメントＸ１およびＸ２は、Ｘ１を含む核酸分子と、Ｘ２を含む核酸分子とを含む核酸混合物から得ることができる。別法として、注目している２つのヌクレオチドセグメントＸ１およびＸ２は、同一の核酸分子に含まれるが、それらは連続していない。この核酸分子は例えばゲノムＤＮＡでよい。この核酸分子は、哺乳動物に由来するもの、中でもヒトに由来するものが好ましい。
【００２６】
本発明の一実施形態では、この方法は４回の異なったＰＣＲ反応を含む。
【００２７】
第１の反応では、第１の核酸セグメントＸ１を第１のプライマーセットで作製および増幅し、このプライマーセットは、（ｉ）Ｘ１配列の一方の鎖の３’末端にハイブリッド形成する第１のプライマーであるＰＦＸ１（これは「Ｘ１用のプライマー順方向」を意味する）と、（ｉｉ）Ｘ１配列の相補体の３’末端にハイブリッド形成する第２のプライマーであるＰＲＸ１（これは「Ｘ１用のプライマー逆方向」を意味する）とを含む（図１）。増幅されたＸ１  ＰＣＲ産物は、任意の適した方法で単離することができる（例えば、非特許文献１、非特許文献８、および非特許文献９に記載されている通りに；例えば、共にＱｉａｇｅｎ社製のＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットおよびＱＩＡＥＸ  ＩＩゲル抽出キットを含めた市販のキット）。
【００２８】
第２の反応では、第２の核酸セグメントＸ２を第２のプライマーセットで作製および増幅し、このプライマーセットは、（ｉ）Ｘ２配列の一方の鎖の３’末端にハイブリッド形成する第２の順方向プライマーであるＰＦＸ２と、（ｉｉ）Ｘ２配列の相補体の３’末端にハイブリッド形成する第２の逆方向プライマーであるＰＲＸ１とを含む。増幅されたＸ２産物は、任意の適した方法で単離または精製することができる。
【００２９】
第３のＰＣＲ反応（図２）では、中間体分子であるＸ１ＵＲまたはＤＲＸ２を作製および増幅する。Ｘ１ＵＲは、Ｘ１の第１の核酸セグメント全体と、Ｘ２の比較的小さい５’セグメントとを含み、Ｘ１の３’末端がＸ２の５’セグメントに融合している。ＤＲＸ２は、Ｘ２の第１の核酸セグメント全体と、Ｘ１の比較的小さい３’セグメントとを含み、Ｘ２の５’末端がＸ１の３’セグメントに融合している。このステップは、第３のプライマーセットを用いて実行する。Ｘ１ＵＲ用では、第３のプライマーセットは、（ｉ）ＰＦＸ１および（ｉｉ）融合プライマーＰＲＸ１−ＰＦＸ２’を含み、この融合プライマーは、ＰＲＸ１のヌクレオチド配列と、そのすぐ３’末端に続く、ＰＦＸ２の相補体の配列（ＰＦＸ２’と名付けられている）とを有する。ＤＲＸ２用では、第３のプライマーセットは、（ｉ）融合プライマーＰＲＸ１’−ＰＦＸ２と、（ｉｉ）プライマーＰＲＸ２とを含み、この融合プライマーは、順方向プライマーＰＦＸ２の５’末端と、それに結合したＰＲＸ１の相補体のヌクレオチド配列（ＰＲＸ１’と名付けられている）とを有する。いずれの中間体も、任意の適した方法を用いて単離または精製することができる。
【００３０】
第４の反応（図３）において、最後に、所望のポリヌクレオチドＸ１Ｘ２を作製および増幅する。このＰＣＲ反応は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの、市販されている多くの供給源に関して、そのＴａｑ酵素が、ある特定の温度では５’−３’ＤＮＡポリメラーゼ活性と５’−３’エキソヌクレアーゼ活性との両方を有するという事実によっている。
【００３１】
この第４の反応の一実施形態では、以下の試薬、すなわち、Ｘ１ＵＲ増幅産物、Ｘ２増幅産物、プライマーＰＦＸ１、およびプライマーＰＲＸ２を使用する。この反応では、Ｘ１ＵＲおよびＸ２の両方が、プライマーＰＦＸ１およびプライマーＰＲＸ２を用いたＰＣＲのテンプレートとして働く。これらのテンプレートは、ここで重要な２つの分子種、すなわち分子種Ａおよび分子種Ｂにアニールする。
【００３２】
分子種Ａは、Ｘ１ＵＲの順方向（５’−３’）鎖、およびＸ２の逆方向（３’−５’）鎖からなり、これら２つの鎖は、相補的な、Ｘ１ＵＲのＵＲ領域におけるＸ２由来の配列と、Ｘ２の逆方向鎖の３’末端とを介してアニールしている。いずれのプライマーも分子種Ａに結合しないが、Ｔａｑポリメラーゼは、アニールしている重複領域の３’末端を伸長して、二本鎖分子種Ｘ１Ｘ２を生成するであろう。
【００３３】
分子種Ｂは、Ｘ１ＵＲの逆方向（３’−５’）鎖、およびＸ２の順方向（５’−３’）鎖からなり、これら２つの鎖は、相補的な、Ｘ１ＵＲのＵＲ領域におけるＸ２由来の配列と、Ｘ２の順方向鎖の５’末端とを介してアニールしている。両方のプライマーとも、この分子種に結合する。アニールしたプライマーの３’末端が、その後、Ｔａｑポリメラーゼの５’−３’ポリメラーゼ活性によって伸長される。テンプレート上で各プライマーが５’−３方向に伸長し、アニールしている元の鎖（Ｘ１ＵＲの逆方向鎖またはＸ２の順方向鎖）がＴａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって除去されるため、最終産物であるＸ１Ｘ２の両鎖は完全なものとなるであろう。換言すれば、ＰＲＸ２の伸長産物がＸ１ＵＲの逆方向鎖の５’末端に「出会う」鎖には、「ニック」がないであろう。何故なら、後者はＴａｑ酵素によって除去され、一方、Ｘ１Ｘ２の（新たに合成された）順方向鎖は、ＰＲＸ２の伸長産物の残りが構築されるためのテンプレートとして働くであろうからである。同じ過程が働いて、Ｘ１Ｘ２の完全な順方向鎖をもたらす。すなわち、プライマーＰＲＸ１の伸長産物がＸ２の順方向鎖の５’末端に「出会う」と、この鎖がＴａｑ酵素によって除去され、一方、Ｘ１Ｘ２の（新たに合成された）逆方向鎖は、ＰＦＸ１の伸長産物の残りが構築されるためのテンプレートとして働くであろう。
【００３４】
この第４の反応の代替の一実施形態では、以下の試薬、すなわちＤＲＸ２増幅産物、Ｘ１増幅産物、プライマーＰＦＸ１、およびプライマーＰＲＸ２を使用する。この反応では、ＤＲＸ２およびＸ１の両方が、プライマーＰＦＸ１およびプライマーＰＲＸ２を用いたＰＣＲのテンプレートとして働く。第４のＰＣＲ反応のこのバージョンでは、分子種Ａおよび分子種Ｂを形成するためのアニーリングが、Ｘ１の相補的Ｘ１配列と、ＤＲＸ２のＤＲ領域とによって媒介されるが、これは、すぐ上に記載した実施形態に類似したものであり、本明細書によって同様に包含される。
【００３５】
この第４の反応のさらに別の実施形態では、以下の試薬、すなわち、Ｘ１ＵＲ増幅産物、ＤＲＸ２増幅産物、プライマーＰＦＸ１、およびプライマーＰＲＸ２を使用する。この反応では、Ｘ１ＵＲおよびＤＲＸ２の両方が、プライマーＰＦＸ１およびプライマーＰＲＸ２を用いたＰＣＲのテンプレートとして働く。第４のＰＣＲ反応のこのバージョンでは、分子種Ａおよび分子種Ｂを形成するためのアニーリングが、Ｘ１ＵＲのＵＲ領域の相補的Ｘ２配列およびＸ２の順方向鎖の５’末端と、Ｘ１の相補的Ｘ１配列およびＤＲＸ２のＤＲ領域との両方によって媒介されるが、これは、すぐ上に記載した実施形態に類似したものであり、本明細書によって同様に包含される。
【００３６】
分子種Ａの伸長には、いかなるオリゴヌクレオチドプライマーも必要でないことが理解されよう。したがって、エキソヌクレアーゼとしても作用するポリメラーゼを利用するという上述の指示は、分子種Ｂの増幅に関するものである。しかし実際には、効率および簡便性の理由から、分子種Ａの伸長および分子種Ｂの伸長は、両方とも同じ反応混合物中で行われ、したがって同じ酵素が両方に使用されるであろう。
【００３７】
本発明の他の実施形態では、この方法は４回未満の異なったＰＣＲ反応を含む。
【００３８】
例えば、本発明の方法では、開始ＤＮＡセグメントであるＸ１およびＸ２の両方（またはすべて）をＰＣＲ増幅または単離する必要がない。したがって、中間体Ｘ１ＵＲおよび／またはＤＲＸ２は、Ｘ１またはＸ２を生成するＰＣＲを最初に行わずに、一次テンプレート配列（例えばゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）から直接生成することができる。例えば、ゲノムＤＮＡからＸ１ＵＲを直接増幅するのに、プライマーＰＦＸ１およびハイブリッドプライマーＰＲＸ１−ＰＦＸ２’を使用することができる。同様に、ゲノムＤＮＡからＤＲＸ２を直接増幅するのに、プライマーＰＲＸ２およびハイブリッドプライマーＰＲＸ１’−ＰＦＸ２を使用することができる。しかし、増幅または単離されたＸ１配列およびＸ２配列から開始することによって、後続の増幅ステップがより効率的になる。
【００３９】
セグメントＸ２をＸ１ＵＲと結合させてキメラＤＮＡ分子Ｘ１Ｘ２を組み立てる場合には、セグメントＸ２を増幅または単離するべきである。同様に、セグメントＸ１をＤＲＸ２と結合させてキメラＤＮＡ分子Ｘ１Ｘ２を組み立てる場合には、セグメントＸ１を増幅または単離するべきである。
【００４０】
好ましい実施形態（以下、「ストラテジー＃２」と呼ぶ）によれば、本発明は、注目している２つのヌクレオチドセグメントＸ１およびＸ２を含むポリヌクレオチド（Ｘ１Ｘ２）を、Ｘ１を含む核酸分子と、Ｘ２を含む同じまたは異なる核酸分子とから作製する方法を対象とし、ここで、Ｘ１Ｘ２の中にあるＸ２は、Ｘ１のすぐ３’にあり、Ｘ１およびＸ２が同じ分子に由来する場合にはそれらは連続しておらず、この方法は、
（ａ）（ｉ）Ｘ１のアンチセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する順方向プライマーであるＰＦＸ１と、（ｉｉ）Ｘ１のセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する逆方向プライマーであるＰＲＸ１とを含む第１のプライマーセットを用いて、センスおよびアンチセンスの核酸鎖を含む第１の二本鎖核酸セグメントＸ１を増幅するステップと；
（ｂ）（ｉ）Ｘ２のアンチセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する順方向プライマーであるＰＦＸ２と、（ｉｉ）Ｘ２のセンス鎖の３’末端にハイブリッド形成する逆方向プライマーであるＰＲＸ２とを含む第２のプライマーセットを用いて、センスおよびアンチセンスの核酸鎖を含む第２の二本鎖核酸セグメントＸ２を増幅するステップと；
（ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）のＸ１産物およびＸ２産物を単離するステップと；
（ｄ）化学量論量の、ステップ（ｃ）の単離されたＸ１産物およびＸ２産物、ならびにプライマーＰＦＸ１、プライマーＰＲＸ２、および融合プライマーを含む単一の反応容器中でＰＣＲを行うステップとを含み、該融合プライマーは、ＰＲＸ１のヌクレオチド配列と、その５’末端でそれに先行する、ＰＦＸ２’と名付けられたＰＦＸ２の相補体の配列とを有し、この単一容器中で行ったＰＣＲは、中間体である二本鎖ポリヌクレオチドＸ１ＵＲの増幅をもたらし、該中間体は、センスおよびアンチセンスの核酸鎖を含み、かつ、二本鎖核酸セグメントＸ１と、Ｘ２の５’二本鎖核酸セグメントとを含み、ここで、Ｘ１の３’末端は、Ｘ２の該５’セグメントに融合しており、前記反応は、Ｘ１ＵＲ中間体の増幅ももたらして、Ｘ１ＵＲおよびＸ２を変性およびアニールして、アニールされた分子種を形成し、次に、５’−３’ポリメラーゼ活性および５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の両方を有するＤＮＡポリメラーゼ、プライマーＰＦＸ１、およびプライマーＰＲＸ２を用いて前記アニールされた分子種を伸長および増幅することによってＸ１Ｘ２を作製するステップとを含む。
【００４１】
別法では、ステップ（ｄ）は、化学量論量の、ステップ（ｃ）の単離されたＸ１産物およびＸ２産物、ならびにプライマーＰＲＸ１、プライマーＰＦＸ２、および融合プライマーを含む単一の反応容器中でＰＣＲを行うことによって実施でき、ここで、該融合プライマーは、ＰＦＸ２のヌクレオチド配列と、その５’末端でそれに先行する、ＰＲＸ１’と名付けられたＰＲＸ１の相補体の配列とを有し、この単一容器中で行ったＰＣＲは、中間体である二本鎖ポリヌクレオチドＤＲＸ２の増幅をもたらし、該中間体は、センスおよびアンチセンスの核酸鎖を含み、かつ、二本鎖核酸セグメントＸ２と、Ｘ１の３’二本鎖核酸セグメントとを含み、ここで、Ｘ２の５’末端は、Ｘ１の該３’セグメントに融合しており、前記反応は、ＤＲＸ２中間体の増幅ももたらして、ＤＲＸ２およびＸ１を変性およびアニールして、アニールされた分子種を形成し、次に、５’−３’ポリメラーゼ活性および５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の両方を有するＤＮＡポリメラーゼ、プライマーＰＲＸ１、およびプライマーＰＦＸ２を用いて前記アニールされた分子種を伸長および増幅することによってＸ１Ｘ２を作製する。
【００４２】
本発明の方法は、キメラ分子Ｘ１Ｘ２に、追加の配列（Ｘ３）をさらに連結するのにも使用できることが理解されよう。例えば、ＤＮＡ小片Ｘ１Ｘ２およびＸ３をポリヌクレオチドＸ１Ｘ２Ｘ３に組み立てる場合、ＵＲアプローチを使用するならば、セグメントＸ１Ｘ２も、同様にＸ３の５’末端に相補的な延長部を有するであろう（これと並んで、ＤＲアプローチでは、Ｘ１Ｘ２が、Ｘ１Ｘ２の３’末端に相補的な延長部を有するセグメントＸ３に連結されるであろう）。
【００４３】
上記の方法は、キメラタンパク質をコードする核酸配列を作製すること、あるいは、多重エキソンタンパク質をコードする核酸配列をゲノム由来のＤＮＡから組み立てることに限定されない。１つまたは複数のＤＮＡ分子からの制限断片を含めた、いかなる２つ以上のポリヌクレオチドセグメントも融合することができる。上記の方法は、３つ以上の不連続もしくは異種の核酸分子、またはそのような分子のセグメントを含むポリヌクレオチドを生成するように、容易に適合させることができる。
【００４４】
ポリメラーゼ／エキソヌクレアーゼ活性を併せ持つ適当なＴａｑポリメラーゼは市販されている。例えば、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（＃Ｍ７７４１または＃Ｍ７７４５）；Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（＃Ｍ２１０１または＃Ｍ２１０５）；Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ（＃Ｍ１９４５または＃Ｍ１９４５）を参照のこと。これらはすべて、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ、米国）から購入できる。
【００４５】
注目しているＸ１Ｘ２の新規に増幅されたポリヌクレオチドは、したがって、標準的な方法によって単離することができ、対応する融合ポリペプチドの発現を提供するために適当な発現系に挿入することができる。
【００４６】
発現構築物
本発明の発現構築物は、プロモーター、翻訳開始シグナル（「開始」コドン）、翻訳終結シグナル（「終止」コドン）、およびポリアデニル化シグナルを含めた、増幅された配列を選択された宿主細胞内で適切に転写および翻訳させるのに必要なエレメントと、それらに作用可能に連結された、増幅されたポリヌクレオチド配列とを含有する。発現構築物は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、エンハンサー、応答エレメント、サプレッサー、シグナル配列、および同様のものを含めた、増幅された配列の発現を修飾する追加の配列を含んでよい。
【００４７】
プロモーター配列は、宿主細胞にとって内在性のものでも、異種のものでもよく、偏在的な発現（すなわち、発現が、明らかな外部刺激の非存在下で起こり、かつ細胞型特異的でない）を提供するものでも、組織特異的な発現（細胞型特異的な発現としても知られている）を提供するものでもよい。
【００４８】
遺伝子発現を制御するのに使用できるプロモーターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（特許文献８および特許文献９）、ＳＶ４０初期プロモーター領域（非特許文献１１）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含有されるプロモーター（非特許文献１２）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼプロモーター／エンハンサー（非特許文献１３）および単純ヘルペスウイルスＬＡＴプロモーター（非特許文献１４）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（非特許文献１５）；β−ラクタマーゼプロモーター（非特許文献１６）、またはｔａｃプロモーター（非特許文献１７）などの原核細胞の発現ベクター；非特許文献１８も参照；Ｇａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリ性ホスファターゼプロモーターなどの酵母または他の真菌からのプロモーターエレメント；ヒトベータアクチンプロモータ（非特許文献１９）、マウス乳癌ウイルスの長末端反復中に存在するグルココルチコイド誘導性プロモーター（ＭＭＴＶ  ＬＴＲ；非特許文献２０）、モロニーマウス白血病ウイルスの長末端反復配列（ＭｕＬＶ  ＬＴＲ；非特許文献２１）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４９】
発現構築物は、発現構築物のクローニングおよび増殖を促進するベクター配列をさらに含む。プラスミドおよび真菌ベクターを含めた多数のベクターが、様々な真核および原核の宿主細胞内での複製および／または発現用に記載されている。本発明で有用な標準的ベクターは、当技術分野で周知であり、これらには、プラスミド、コスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、および酵母人工染色体が含まれる（しかし、これらに限定されない）。ベクター配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で増殖するための複製開始点；ＳＶ４０複製開始点；宿主細胞内での選択に用いるアンピシリン、ネオマイシン、もしくはプロマイシン耐性遺伝子；および／または優性の選択的マーカーに、注目している遺伝子を加えたものを増幅する遺伝子（例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子）を含有してよい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養における、コードされている標的−レポーター融合タンパク質の長期発現は、哺乳類宿主細胞における染色体外構築物の自律増殖を可能にするベクター配列（例えばエプスタイン−バーウイルス由来のＥＢＮＡ−１およびｏｒｉＰ）を使用することによって実現することができる。
【００５０】
例えば、プラスミドは、通常のタイプのベクターである。プラスミドは、一般的には、追加の外来性ＤＮＡを容易に受け入れることができ、かつ適当な宿主細胞に容易に導入することができる、通常は細菌起源の、二本鎖ＤＮＡの自己充足的な分子である。プラスミドベクターは、通常、外来性ＤＮＡを挿入するのに適した１つまたは複数の独特の制限部位を有する。原核細胞の発現に使用できるプラスミドの例には、ｐＢＲ３２２由来のプラスミド、ｐＥＭＢＬ由来のプラスミド、ｐＥＸ由来のプラスミド、ｐＢＴａｃ由来のプラスミド、およびｐＵＣ由来のプラスミドが含まれるが、これらに限定されない。
【００５１】
酵母での発現用のベクターが多数存在する。例えば、ＹＥＰ２４、ＹＩＰ５、ＹＥＰ５１、ＹＥＰ５２、ｐＹＥＳ２、およびＹＲＰ１７は、遺伝子構築物をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに導入するのに有用な、クローニングおよび発現の媒体である（例えば、非特許文献２２を参照）。これらのベクターは、ｐＢＲ３２２  ｏｒｉの存在によって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で複製でき、かつ、酵母２ミクロンプラスミドの複製決定部位によって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで複製できる。
【００５２】
哺乳類細胞での発現用の発現ベクターが多数存在する。これらのベクターの多くは、細菌内でのベクターの増殖を促進する原核細胞配列を含有し、かつ真核細胞での発現を引き起こす１つまたは複数の真核細胞転写調節配列を含有する。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏ、およびｐＨｙｇに由来するベクターは、真核細胞の形質移入に適した哺乳類発現ベクターの例である。これらのベクターの一部は、原核および真核の両方の細胞における複製および薬剤抵抗性選択を容易にするために、ｐＢＲ３２２などの細菌プラスミド由来の配列を付加することによって修飾されている。ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ−１）、またはエプスタイン−バーウイルスなどのウイルスの派生物（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来、およびｐ２０５）を、真核細胞におけるタンパク質の一過性発現に用いることができる。バキュロウイルス発現系（例えば、非特許文献９を参照）を用いることもできる。そのようなバキュロウイルス発現系の例には、ｐＶＬ由来のベクター（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、およびｐＶＬ９４１など）、ｐＡｃＵＷ由来のベクター（ｐＡｃＵＷ１など）、およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来のベクター（β−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃ  ＩＩＩ）が含まれる。
【００５３】
原核細胞および真核細胞の両方に適した他の発現系、および一般的な組換え操作に関しては、非特許文献１、第１６章および第１７章を参照されたい。
【００５４】
本発明の発現構築物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの真核または原核の宿主細胞に形質移入または形質転換することができる。好ましいｉｎ  ｖｉｔｒｏの宿主細胞は、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞系である。哺乳類細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養のプロトコルは、当技術分野で十分に確立されている［例えば、非特許文献２３および非特許文献２４を参照］。形質移入および形質転換の技法は、当技術分野で十分に確立されており、それらには、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム媒介性形質移入、カルシウムリン酸媒介性形質移入、またはウイルス媒介性形質移入を含めることができる［例えば、非特許文献２５；非特許文献２６；非特許文献１；および非特許文献９を参照］。
【００５５】
生物学的に活性なキメラタンパク質の生産
本発明の好ましい態様によれば、生物学的に活性なポリペプチドＥ１Ｅ２をコードするポリヌクレオチドＸ１Ｘ２を生成するのに本発明の方法が使用される。ここで、Ｅ１はＸ１によってコードされているポリペプチド配列であり、そして、Ｅ２はＸ２によってコードされているポリペプチド配列である。
【００５６】
本発明の別の態様によれば、２つのヌクレオチドセグメントＸ１およびＸ２は、２つのエキソンであって、これらは両方ともヒトゲノムに存在し、それぞれが、生物学的に活性なタンパク質の２つの断片のうちの１つをコードする。
【００５７】
一実施例では、Ｘ１およびＸ２は、ＦＳＨのベータサブユニットの２つのエキソンをコードする。
【００５８】
別の実施例では、Ｘ１およびＸ２は、多重サブユニットタンパク質の２つのサブユニット、ＦＳＨのアルファサブユニットおよびベータサブユニットをコードする。したがって、本発明のさらに別の態様によれば、ポリヌクレオチド（Ｘ１Ｘ２）は、絨毛性性腺刺激ホルモン（ＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、または甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の活性を有する単一ポリペプチドをコードするか；あるいは、これらのホルモンの複数の活性（例えばＬＨおよびＦＳＨの両方の活性）を有する単一ポリペプチドをコードする。
【００５９】
別法として、ポリヌクレオチド（Ｘ１Ｘ２）は前タンパク質Ｅ１Ｅ２をコードするものでもよく、ここで、セグメントＥ１は融合パートナー、例えばシグナル配列を表し、そして、Ｅ２は生物学的に活性な成熟ポリペプチドである。シグナル配列は、Ｅ２における天然のシグナル配列でも、異なるシグナル配列でもよい。その目的は、成熟Ｅ２の分泌を促進することであろう。
【００６０】
例えば、セグメントＸ１およびＸ２からなるＦＳＨのβサブユニットを生成することができる。別法として、１つに融合される、ＤＮＡの異種セグメントを用いることによって、いかなる他のキメラポリペプチドも生成することができる。したがって、キメラタンパク質は、構成ポリペプチドの両方の特性を有するであろう。このようにして、新規かつ独特の分子を生成することができる。
【００６１】
実施例はｈＦＳＨのベータサブユニットの発現に関するもの、ならびに、ＦＳＨのアルファおよびベータサブユニットの両方（ＡＢ−ＦＳＨと名付ける）を含有するキメラタンパク質の発現に関するものであるが、これらから明らかになるように、本発明による方法は、いかなる２つ（またはそれより多く）の不連続のＤＮＡセグメントを使用しても実行することができる。当業者ならば容易に理解するであろうように、追加のセグメントを使用する場合には、追加のＰＣＲステップが必要になるであろう。
【実施例】
【００６２】
次いで、本発明を以下の実施例によって説明する。しかし、これらの使用および明細書中のいずれの他の実施例も単なる例示にすぎず、本発明または任意の例示の形態の範囲および意味を少しも限定するものではない。同様に、本発明は本明細書に記載の特定の好ましい実施形態に限定するものではない。実際、本発明の多くの修正形態および変形形態はこの明細書を読めば直ちに当業者に明らかであろうし、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行うことができる。したがって、本発明は特許請求の範囲が権利を有するものと等価物の全容に従って、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されるべきである。
【００６３】
（実施例１）
新規なＰＣＲ手順を用いたβ−ＦＳＨ発現構築物の構築
ヒトＦＳＨのβサブユニットをコードするゲノムＤＮＡの配列はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＨ００３５９９にある。ヒトＦＳＨのβサブユニットのｃＤＮＡ配列は配列番号１である。シグナル配列は配列番号２として記述されている。エキソン１は配列番号３の配列を有し、エキソン２は配列番号４の配列を有する。ヒトβ−ＦＳＨの対応するアミノ酸配列は、配列番号５にある。β−ＦＳＨは、本実施例が製造する唯一のものの様々な多形で存在することに留意すべきである。しかし、本方法により、任意の他の多形を容易に調製することができたであろう。
【００６４】
Ａ  β−ＦＳＨをコードする配列のＰＣＲ増幅
１．β−ＦＳＨの２つのエキソンのうちの１つを各々コードする２つのＤＮＡ断片の単離および増幅
ヒトゲノムＤＮＡを、Ｎｕｃｌｅｏ  Ｓｐｉｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｑｕｉｃｋ  Ｐｕｒｅキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  ＧｍＢＨ  ＆  Ｃｏ．）を用いて５０μｌの全血から抽出した。次いで、単離したＤＮＡを１００μｌのＴＢ緩衝液（ＤＮＡ溶液）に溶解した。１０μｌのこのＤＮＡ溶液を、２つの独立したＰＣＲ反応（ＰＣＲ反応に付き５μｌゲノムＤＮＡ溶液）用の鋳型として用いた。
【００６５】
第１のＰＣＲ反応をβ−ＦＳＨのエキソン１に特異的なプライマーを用いて行った。配列（配列番号７）５’−ＡＴＧ  ＡＡＧ  ＡＣＡ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＴＴＣ  Ｃ−３’を有する順方向プライマーＰＦＸ１は、配列番号１の４０位から６４位の断片に相当する。配列（配列番号８）５’−ＣＣＴ  ＧＧＴ  ＧＴＡ  ＧＣＡ  ＧＴＡ  ＧＣＣ  ＡＧＣ−３’を有する逆方向プライマーＰＲＸ１は、配列番号１の１９８位から１７８位の断片の相補体に相当する。このＰＣＲ反応は、図１の左図に図示されているように、生成物Ｘ１を増幅する。
【００６６】
第２のＰＣＲ反応をβ−ＦＳＨのエキソン２に特異的なプライマーを用いて行った。配列（配列番号９）５’−ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＧＴＧ  ＴＡＴ  ＡＡＧ  ＧＡＣ  ＣＣＡ−３’を有する順方向プライマーＰＦＸ２は、配列番号１の１９９位から２１９位の断片に相当する。配列（配列番号１０）５’−ＴＴＡ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＣＡＴ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＡＡＡ  ＧＧ−３’を有する逆方向プライマーＰＲＸ２は、配列番号１の４２９位から４０７位の断片の相補体に相当する。このＰＣＲ反応は、図１の左図に図示されているように、生成物Ｘ２を増幅する。
【００６７】
各独立のＰＣＲ反応物は、鋳型としてのヒトゲノムＤＮＡ溶液５μｌ、および以下の追加の試薬を含んでいた：
１．１０×ＰＣＲ緩衝液（好熱性のＤＮＡポリメラーゼ１０×緩衝液、マグネシウムフリーＭ１９０Ｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ、ＵＳＡ）１０μｌ
２．２５ｍｍｏｌ  ＭｇＣｌ２  １０μｌ
３．ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰを各々１０μｍｏｌを含むｄＮＴＰストック溶液  ５μｌ
４．１００ｐｍｏｌ／μｌ順方向プライマーストック溶液１μｌ
５．１００ｐｍｏｌ／μｌ逆方向プライマーストック溶液１μｌ
６．ＴＡＱ（５Ｕ／μｌ）（貯蔵用緩衝液Ａ中のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｍｉ８６５、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ、ＵＳＡ）２μｌ
７．Ｈ２Ｏ  ６５μｌ
【００６８】
サイクリングパラメータは以下のとおりであった。９５℃で２分間最初の変性；各サイクルが、９４℃で３０秒間、次いで５０℃で３０秒間、その後７２℃で１分間からなる３０サイクルの増幅；および７２℃で５分間最後の伸長。サイクリングは、ＰＴＣ−１００（商標）ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、Ｍａｓｓ、ＵＳＡ）を用いて行った。
【００６９】
各ＰＣＲによる生成物Ｘ１およびＸ２（それぞれβ−ＦＳＨエキソン１およびエキソン２断片）の増幅は、対照分子量マーカーとしてＤＮＡ分子量マーカーφＸ／Ｈｉｎｃ  ＩＩ  ＭＫ１３ａ（ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用い、１２５ｍＡで３０分間、アガロースゲル（ＴＡＥ緩衝液中２％）電気泳動により確認した。結果を図４に示す（レーン２および３参照）。次いで、ＰＣＲ反応の生成物Ｘ１およびＸ２をＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｋｉｔ（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ。Ｃａｔ  Ｎｏ．７４０５９０．５０）を用いて精製した。
【００７０】
２．Ｘ１ＵＲ中間生成物のＰＣＲ増幅：
ＰＣＲ反応を、配列（配列番号１１）：
【００７１】
【化１】
2007506409.tif 000002
【００７２】
（ここで、ＰＲＸ１の配列は、イタリック体を使用し、ＰＦＸ２の配列の逆方向の相補体には下線をしている）を有するエキソン１の順方向プライマーＰＦＸ１（配列番号７）およびハイブリッド逆方向プライマーＰＲＸ１−ＰＦＸ２’を用い、鋳型としての生成物Ｘ１（上記のように調製）上で行った。
【００７３】
ＰＣＲ反応混合物は、鋳型としてのＰＣＲ生成物Ｘ１（β−ＦＳＨのエキソン１：配列番号３）溶液１μｌ、および上記に記載した追加の試薬を含有していた。サイクリングパラメータは以下のとおりであった。９５℃で２分間最初の変性；各サイクルが、９４℃で３０秒間、次いで５０℃で１分間、その後６８℃で２分間からなる３０サイクルの増幅；および７２℃で１０分間最後の伸長。サイクリングは、ＰＴＣ−１００（商標）ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、Ｍａｓｓ、ＵＳＡ）を用いて行った。この反応を図２の先頭の図に示す。
【００７４】
ＰＣＲによるＸ１ＵＲ中間生成物の増幅は、対照分子量マーカーとしてＤＮＡ分子量マーカーφＸ／Ｈｉｎｃ  ＩＩ  ＭＫ１３ａ（ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用い、１２５ｍＡで３０分間、アガロースゲル（ＴＡＥ緩衝液中２％）電気泳動により確認した。次いで、Ｘ１ＵＲ  ＰＣＲ生成物をＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｋｉｔ（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ。Ｃａｔ  Ｎｏ．７４０５９０．５０）を用いて精製し、純粋なＤＮＡを最終体積５０μｌで得た。ＤＮＡの純度およびサイズを、対照分子量マーカーとしてＤＮＡ分子量マーカーφＸ／Ｈｉｎｃ  ＩＩ  ＭＫ１３ａ（ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用い、１２５ｍＡで３０分間、アガロース（ＴＡＥ緩衝液中２％）電気泳動により確認した。
【００７５】
中間体Ｘ１ＵＲ  β−ＦＳＨ  ＰＣＲ生成物（配列番号１３）は、配列番号４（β−ＦＳＨエキソンＸ２配列）の最初の２１塩基対によりその３’末端で伸長されたＸ１（β−ＦＳＨエキソン１；配列番号３）配列よりなる。
【００７６】
３．生成物Ｘ１Ｘ２（エキソン１−エキソン２  β−ＦＳＨ）のＰＣＲ増幅
生成物Ｘ１Ｘ２を増幅するために、２つの異なる戦略を使用した。
【００７７】
戦略＃１：
図３に記載された最初の戦略では、ＰＣＲ反応をエキソン１の順方向プライマーＰＦＸ１（配列番号７）およびエキソン２の逆方向プライマーＰＲＸ２（配列番号１０）を用いて行った。より早期に増幅された生成物Ｘ１ＵＲおよびＸ２をこの反応の鋳型とした。このＰＣＲ反応は、以下の試薬を含んでいた：
１．１０×ＰＣＲ緩衝液（好熱性のＤＮＡポリメラーゼ１０×緩衝液、マグネシウムフリーＭ１９０Ｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ、ＵＳＡ）１０μｌ
２．２５ｍｍｏｌ  ＭｇＣｌ２  １０μｌ
３．ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰを各々１０μｍｏｌ含むｄＮＴＰストック溶液５μｌ
４．Ｘ１ＵＲ中間体ＰＣＲ生成物（配列番号１３）１μｌ
５．Ｘ２ＰＣＲ生成物（β−ＦＳＨのエキソン２：配列番号４）１μｌ
６．１００ｐｍｏｌ／μｌ  ＰＦＸ１（β−ＦＳＨエキソン１順方向プライマー（配列番号７））ストック希釈液１μｌ
７．１００ｐｍｏｌ／μｌ  ＰＲＸ２（β−ＦＳＨエキソン２逆方向プライマー（配列番号１０））ストック希釈液１μｌ
８．ＴＡＱ（５Ｕ／μｌ）（貯蔵用緩衝液Ａ中のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｍｉ８６５、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）２μｌ
９．Ｈ２Ｏ  ６５μｌ
【００７８】
サイクリングパラメータは以下のとおりであった。９５℃で２分間最初の変性；各サイクルが、９４℃で３０秒間、次いで５０℃で１分間、その後６８℃で２分間よりなる３０サイクルの増幅；および７２℃で１０分間最後の伸長。サイクリングは、ＰＴＣ−１００（商標）ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、Ｍａｓｓ、ＵＳＡ）を用いて行った。
【００７９】
このＰＣＲ反応による生成物Ｘ１Ｘ２の増幅は、上述のように行われるアガロース（ＴＡＥ緩衝液中２％）電気泳動により確認した。結果を図４に示す（レーン４参照）。次いで、このＰＣＲ反応の生成物をＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｋｉｔ（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ。Ｃａｔ  Ｎｏ．７４０５９０．５０）を用いて精製し、純粋なＤＮＡを最終体積５０μｌで得た。ＤＮＡの純度およびサイズを、上述のように行われるアガロース（ＴＡＥ緩衝液中２％）電気泳動により確認した。
【００８０】
生成物のサイズは、アガロースゲル電気泳動（上述のように行われる）により決定したところ、約３９０ｂｐであった。この生成物の配列が、プライマーＰＦＸ１（β−ＦＳＨエキソン１順方向プライマー（配列番号７））を用い、従来の配列分析によりβ−ＦＳＨのＸ１Ｘ２（配列番号６；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５１０参照）の全長をコードする配列であることを確認した。
【００８１】
戦略＃２：
代わる戦略では、最終的ＰＣＲ生成物Ｘ１Ｘ２を、鋳型として生成物Ｘ１およびＸ２を用い、一段階の３プライマーＰＣＲ法により生成した。この戦略は、１ＰＣＲステップによりクローニングプロセスを短縮させた。この戦略では、プライマーＰＲＸ２、ＰＦＸ１、およびハイブリッド逆方向プライマーＰＲＸ１−ＰＦＸ２’を鋳型としての生成物Ｘ１およびＸ２上で用い、それにより最初のＸ１ＵＲ中間体、次いでＸ１Ｘ２最終生成物を一段階のＰＣＲ反応で増幅させた。ＰＣＲ反応は、以下の試薬を含んでいた：
１．１０×ＰＣＲ緩衝液（好熱性のＤＮＡポリメラーゼ１０×緩衝液、マグネシウムフリーＭ１９０Ｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ、ＵＳＡ）１０μｌ
２．２５ｍｍｏｌ  ＭｇＣｌ２  １０μｌ
３．ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰを各々１０μｍｏｌ含むｄＮＴＰストック溶液５μｌ
４．Ｘ１  ＰＣＲ生成物（配列番号３）２μｌ
５．Ｘ２  ＰＣＲ生成物（β−ＦＳＨのエキソン２：配列番号４）２μｌ
６．１００ｐｍｏｌ／μｌ  ＰＲＸ２（β−ＦＳＨエキソン２逆方向プライマー（配列番号１０））ストック希釈液１μｌ
７．１００ｐｍｏｌ／μｌ順方向プライマーＰＦＸ１（β−ＦＳＨエキソン１順方向プライマー（配列番号７）ストック希釈液１μｌ
８．１００ｐｍｏｌ／μｌハイブリッド逆方向プライマーＰＲＸ１−ＰＦＸ２’（配列番号１１）ストック希釈液１μｌ
９．ＴＡＱ（５Ｕ／μｌ）（貯蔵用緩衝液Ａ中のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｍｉ８６５、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ、ＵＳＡ）２μｌ
１０．Ｈ２Ｏ  ６５μｌ
【００８２】
サイクリングパラメータは以下のとおりであった。９５℃で２分間最初の変性；各サイクルが、９４℃で３０秒間、次いで５０℃で１分間、その後６８℃で２分間よりなる３０サイクルの増幅；および７２℃で１０分間最後の伸長。サイクリングは、ＰＴＣ−１００（商標）ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、Ｍａｓｓ、ＵＳＡ）を用いて行った。
【００８３】
このＰＣＲ反応による生成物Ｘ１Ｘ２の増幅は、上述のように行われるアガロース（ＴＡＥ緩衝液中２％）電気泳動により確認した。次いで、このＰＣＲ反応の生成物をＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｋｉｔ（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ。Ｃａｔ  Ｎｏ．７４０５９０．５０）を用いて精製し、純粋なＤＮＡを最終体積５０μｌで得た。ＤＮＡの純度およびサイズを、上述のように行われるアガロース（ＴＡＥ緩衝液中２％）電気泳動により確認した。
【００８４】
生成物のサイズは、アガロースゲル電気泳動（上述のように行われる）により決定したところ、約３９０ｂｐであった。この生成物の配列が、プライマーＰＦＸ１（β−ＦＳＨエキソン１順方向プライマー（配列番号７））を用い、従来の配列分析によりβ−ＦＳＨのＸ１Ｘ２（配列番号６；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５１０参照）の全長をコードする配列であることを確認した。
【００８５】
両方のＰＣＲ戦略を用いた場合の結果は同じであったが、我々は、より多量で高純度の生成物ＤＮＡを生じるので、戦略＃１  ＰＣＲ反応由来の生成物Ｘ１Ｘ２を使用した。しかし、化学量論的な量の鋳型を必要とするが、２番目のアプローチも実行可能であり、非常に早く進行するという利点を有する。
【００８６】
４．生成物Ｘ１Ｘ２（エキソン１−エキソン２  β−ＦＳＨ）へのＳｈｉｎｅ−ＤｅｌｇａｒｍｏおよびＫｏｚａｋ配列の付加
発現されたＳＤＫ−Ｘ１Ｘ２転写の翻訳を指示するＳｈｉｎｅ−ＤｅｌｇａｒｎｏおよびＫｏｚａｋコンセンサス配列（ＳＤＫ）を形成するために、１７ヌクレオチド配列を、ＰＣＲ生成物Ｘ１Ｘ２（エキソン１−エキソン２  β−ＦＳＨ）（配列番号６）の５’末端に付加した。プライマーＰＲＸ２、β−ＦＳＨエキソン２逆方向プライマー（配列番号１０）；および配列
【００８７】
【化２】
2007506409.tif 000003
【００８８】
（ここでＳｈｉｎｅ−ＤｅｌｇａｒｎｏおよびＫｏｚａｋコンセンサス配列には下線をし、エキソン１順方向プライマーＰＦＸ１（配列番号７）の配列はイタリック体とし、翻訳開始のための「開始」コドンはボールド体としている）を有する新たな順方向プライマーＳＤＫ−ＰＦＸ１を用いて、ＰＣＲ生成物Ｘ１Ｘ２上でＰＣＲ反応を行うことによりこの配列を付加した。ＰＣＲ反応物は、鋳型としてのＰＣＲ生成物Ｘ１Ｘ２（エキソン１−エキソン２  β−ＦＳＨ）１μｌ、および以下の追加の試薬を含んでいた：
１．１０×ＰＣＲ緩衝液（好熱性のＤＮＡポリメラーゼ１０×緩衝液、（好熱性のＤＮＡポリメラーゼ１０×緩衝液、マグネシウムフリーＭ１９０Ｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ、ＵＳＡ）１０μｌ
２．２５ｍｍｏｌ  ＭｇＣｌ２  １０μｌ
３．ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰを各々１０μｍｏｌ含むｄＮＴＰストック溶液５μｌ
４．１００ｐｍｏｌ／μｌ  ＳＤＫ−ＰＦＸ１プライマー（配列番号１２）ストック希釈液１μｌ
５．１００ｐｍｏｌ／μｌ  ＰＲＸ２（β−ＦＳＨエキソン２逆方向プライマー（配列番号１０））ストック希釈液１μｌ
６．ＴＡＱ（５Ｕ／μｌ）（貯蔵用緩衝液Ａ中のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｍｉ８６５、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ、ＵＳＡ）２μｌ
７．Ｈ２Ｏ  ６５μｌ
【００８９】
サイクリングパラメータは以下のとおりであった。９５℃で２分間最初の変性；各サイクルが、９４℃で３０秒間、次いで５０℃で１分間、その後６８℃で２分間よりなる３０サイクルの増幅；および７２℃で１０分間最後の伸長。
【００９０】
このＰＣＲ反応による生成物ＳＤＫ−Ｘ１Ｘ２の増幅は、上述のように行われるアガロース（ＴＡＥ緩衝液中２％）電気泳動により確認した。次いで、このＰＣＲ反応の生成物を、ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｋｉｔ（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ。Ｃａｔ  Ｎｏ．７４０５９０．５０）を用いて精製し、純粋なＤＮＡを最終体積５０μｌで得た。ＤＮＡの純度およびサイズを、上述のように行われるアガロース（ＴＡＥ緩衝液中２％）電気泳動により確認した。
【００９１】
Ｂ．β−ＦＳＨ発現構築物の構築
ＰＣＲ生成物ＳＤＫ−Ｘ１Ｘ２を、製造元の指示（非特許文献２７）に従って、ｐＴＡＲＧＥＴ（商標）発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に導入してクローン化した。この系は、ＰＣＲ生成物（Ｔａｑポリメラーゼ活性の当然の結果として導入される）の各末端の３’アデニン突出を、直線化されたｐＴＡＲＧＥＴ（商標）発現ベクター上の５’チミン突出とアニーリングすることによりなされる結合に基づいている。結合したｐＴＡＲＧＥＴ（商標）ベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換させた。
【００９２】
形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを固体培地で２４時間培養し、次いで各形質転換由来の１０個の細菌コロニーを用いて個別の液体培地に接種した。プラスミドＤＮＡを、製造元の指示に従って、ＪＥＴ  Ｑｕｉｃｋ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ／５０（Ｇｅｎｏｍｅｄ  ＧｍＢＨ、Ｗｉｅｌａｍｄｓｔｒ  Ｂａｄ  Ｏｅｙｎｈｏｍｓｅｎ）を用いて培養した液体培地から抽出した。
【００９３】
次いで、単離したプラスミドＤＮＡについて、ＰＣＲによるＳＤＫ−Ｘ１Ｘ２  β−ＦＳＨインサートの導入を調べた。このＰＣＲでは、プライマーＰＦＸ１（β−ＦＳＨエキソン１順方向プライマー（配列番号７））およびＰＲＸ２（β−ＦＳＨエキソン２逆方向プライマー（配列番号１０））を、１μｌの精製したプラスミドＤＮＡ鋳型を増幅するのに用いた。Ｘ１Ｘ２断片の増幅の成功により、ｐＴＡＲＧＥＴベクターへ導入したβ−ＦＳＨ配列のクローン化の成功が確認された。得られた発現構築物を、ｐＴＰＫＢＦＳＨ（ＳＤＫ−Ｘ１Ｘ２  ＰＣＲ生成物インサート含有ｐＴＡＲＧＥＴ）と名付けた。
【００９４】
（実施例２）
哺乳類細胞培養におけるβ−ＦＳＨの発現
ｐＴＰＫＢＦＳＨ（ＳＤＫ−Ｘ１Ｘ２  β−ＦＳＨインサート含有ｐＴａｒｇｅＴ）発現構築物を、ＣＯＳ−７Ｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．１１６２２０１６）、およびＣＨＯ−Ｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．１１６１９０１２）細胞系におけるβ−ＦＳＨタンパク質の発現に用いた。ｐＴＰＫＢＦＳＨ構築物を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）トランスフェクション試薬を用い、製造元の指示に従って様々な細胞系に形質移入した。発現ベクターｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）がトランスフェクション対照物として含まれていた。
【００９５】
トランスフェクション後、細胞を１０００μｇ／ｍｌゲネチシン（ゲネチシン）を含む選択培地で７日間培養した。ゲネチシン耐性細胞を２００μｇ／ｍｌでゲネチシンを含む新たな培地に移して、細胞密度が１０６細胞／ｍｌとなるまで培養した。次いで、この培養液の上清について、β−ＦＳＨサブユニットの存在を、生理活性ヒトβ−ＦＳＨを検出するための卵胞刺激ホルモン（非特許文献２８）のための顆粒膜細胞アロマターゼバイオアッセイ（Ｇｒａｎｕｌｏｓａ  Ａｒｏｍａｔａｓｅ  Ｂｉｏａｓｓａｙ：ＧＡＢアッセイ）法を用いて試験した。このアッセイは、顆粒膜細胞のアロマターゼ活性の刺激に基づくＦＳＨ活性を定量化するが、アロマターゼ活性は、アンドロステンジオン前駆物質からのエストロゲン産生の放射性免疫定量法により測定する。したがって、このアッセイは試験試料の生物学的に活性なβ−ＦＳＨタンパク質の量を定量化する機能的アッセイである。
【００９６】
ＧＡＢアッセイにおいて顆粒膜細胞を誘導するために、無傷のメスＳｐａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２１〜２２日齢）に、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）約１０ｍｇを含むシラスチックカプセル（１０ｍｍ）を移植して、顆粒膜細胞の増殖を刺激した。４日後、動物を屠殺し、卵巣を除去し、カプセルを除去した。カプセルを除去した卵巣の卵胞を、２７ゲージの皮下注射器で穿刺し、顆粒膜細胞をペニシリン／ステレプトマイシン（各１００Ｕ／ｍＬ）および２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＭｃＣｏｙ’ｓ  ５ａ培地（Ｇｉｂｃｏ）に移動させた。細胞を５分間低速で遠心することによりペレット化し、次いで新鮮な培地で洗浄した。細胞生存率を細胞アリコートのトリパンブルー染色により評価し、次いで血球計を用いて細胞を計数した。その後、細胞を培地中で希釈して最終体積約２０００から２４００生存細胞／ｍｌとした。
【００９７】
アッセイの日に、新鮮なＧＡＢアッセイ培地を準備した。ＧＡＢアッセイ培地は、ペニシリン／ステレプトマイシン（各１００Ｕ／ｍＬ）および２ｍＭ  Ｌ−グルタミンに加えて、１．２５μＭ  アンドロステンジオン（Ｓｉｇｍａ）、０．１２５μＭ  ジエチルスチルベストロール（Ｓｉｇｍａ）；３７．５ｎｇ／ｍＬ  ヒト絨毛性ゴナドトロピン（Ｓｉｇｍａ：カタログ＃Ｃ−０４３４）、０．１５６ｍＭ  １−メチル−３−イソブチルキサンチン（Ｓｉｇｍａ）、および１．２５μｇ／ｍｌインスリン（Ｓｉｇｍａ：カタログ＃Ｉ−１５０７）を補充したＭｃＣｏｙ’ｓ  ５ａ培地（Ｇｉｂｃｏ）であった。
【００９８】
次いで、４００μｌのＧＡＢアッセイ培地および６０μＬの顆粒膜細胞懸濁液（約５０，０００から８０，０００個の生存細胞）を２４ウェルプレートの各ウェルに加えた。次に、４０μｌのｐＴＰＫＢＦＳＨ−形質移入ＣＯＳもしくはＣＨＯ細胞上清または様々な濃度の陽性対照組換えＦＳＨ（Ｏｒｇａｎｏｎ）を各ウェルに加えた。次いで、このプレートを加湿した５％  ＣＯ２インキュベーター中で、３７℃で３日間培養した。次いで、各ウェルから上清を収穫し、１０〜２０μｌの上清のエストロゲンレベルを放射性免疫測定法により測定した。エストロゲン放射性免疫測定法は、製造元の指示に従い、エストラジオール測定（Ｏｒｉｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｆｉｎｌａｎｄ）用のＳｐｅｃｔｒｉａ  ＲＩＡ  ｋｉｔを用いて行った。
【００９９】
このアッセイでは、様々な濃度の陽性対照組換えＦＳＨ（Ｏｒｇａｎｏｎ）を試験して、ＦＳＨ活性の滴定曲線を計算するのに用いた（ミリユニット／ミリリットル、ｍＵ／ｍｌの組換えＦＳＨ濃度対エストロゲン放射性免疫測定値、表１参照）。次いで、この対照曲線を用いて、ｐＴＰＫＢＦＳＨ−形質移入ＣＯＳまたはＣＨＯ細胞の上清におけるβ−ＦＳＨ活性量を内挿した。
【０１００】
ｐＴＰＫＢＦＳＨ−形質移入細胞由来の１／１０００希釈の上清を顆粒膜細胞アッセイで試験した際、３４８ｐｇ／ｍｌのエストラジオールを産生した。この値はおよそ２５ｍＵ／ｍｌの対照組換えＦＳＨで見られるものとほぼ等しい。試験した上清の希釈因子について是正した後に、この結果はｐＴＰＫＢＦＳＨ−形質移入細胞系が生理活性β−ＦＳＨを約２５ユニット／ｍｌの量で産生することを示している。
【０１０１】
【表１】
2007506409.tif 000004
【０１０２】
（実施例３）
ＡＢ  ＦＳＨにおけるキメラＤＮＡの産生および発現
ヒトＦＳＨホルモンタンパク質は、αサブユニットに加えβサブユニットからなるマルチサブユニットタンパク質である。αサブユニットの完全ｃＤＮＡ配列は、配列番号１４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００７３５）である。この実施例では、ホルモンの両サブユニットが一本鎖タンパク質に含まれている活性なヒトＦＳＨタンパク質の産生について説明する。
【０１０３】
Ａ．β−ＦＳＨサブユニットをコードする核酸配列
β−ＦＳＨサブユニットをコードする配列（Ｘ１Ｘ２；配列番号６）を、実施例１に記載したように調製した。
【０１０４】
Ｂ．α−ＦＳＨサブユニットをコードする核酸配列
ｍＲＮＡを、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｍＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．７２０２２）を用い、製造元の指示に従ってヒト胎盤組織から単離した。プライマーにＨＣＧ−ＳＥＮＴ（５’−ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＴＡＣ  ＴＡＣ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＴＡＴ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＡＴＣ−３’；配列番号１５）およびＨＣＧ−ＡＮＴＩＳＥＮＴ（５’−  ＴＴＡ  ＡＧＡ  ＴＴＴ  ＧＴＧ  ＡＴＡ  ＡＴＡ  ＡＣＡ  ＡＧＴ  ＡＣＴ  ＧＣＡ  Ｇ−３’；配列番号１６）を用い、５μｌの単離したｍＲＮＡを逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で鋳型として用いた。このＲＴ−ＰＣＲ反応を、製造元の指示に従ってＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて行った。このＲＴ−ＰＣＲの生成物をｇｌｙｃａｌＡと名付け、２％アガロースゲル電気泳動（上述のように行われる；図５、レーン３参照）およびプライマーＨＣＧ−ＳＥＮＴおよびＨＣＧ−ＡＮＴＩＳＥＮＴを用いて行われる配列決定により、ヒトα−ＦＳＨの完全なコード配列（配列番号１７）を示すことを確認した。
【０１０５】
次いで、ｇｌｙｃａｌＡ  α−ＦＳＨ  ＲＴ−ＰＣＲ生成物を、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯクローニングキットを用い、製造元（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｋ４９５５−１０）の指示に従って、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５  Ｄ−ＴＯＰＯベクターに導入してクローン化した。このクローニングを可能にするために、ヌクレオチド配列ＣＡＣＣをプライマーＨＣＧ−ＳＥＮＴＣＡＣＣ（５’−ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＴＴＡ  ＣＴＡ  ＣＡＧ  ＡＡＡ  ＡＴＡ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＴＡＴ  Ｃ−３’配列番号１８）およびＨＣＧ−ＡＮＴＩＳＥＮＴ（配列番号１６）を用いたＰＣＲを介して、ｇｌｙｃａｌＡ  ＲＴ−ＰＣＲ生成物の５’末端に付加した。このＰＣＲは、鋳型としてのｇｌｙｃａｌＡ（α−ＦＳＨ）ＲＴ−ＰＣＲ生成物１μｌ、および以下の追加の試薬を含んでいた：
１．１０×ＰＣＲ緩衝液（好熱性のＤＮＡポリメラーゼ１０×緩衝液、マグネシウムを含まないＭ１９０Ｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ、ＵＳＡ）１０μｌ
２．２５ｍｍｏｌ  ＭｇＣｌ２  １０μｌ
３．ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰを各々１０μｍｏｌ含むｄＮＴＰストック溶液５μｌ
４．１００ｐｍｏｌ／μｌプライマーＨＣＧ−ＳＥＮＴＣＡＣＣ（配列番号１８）ストック希釈液１μｌ
５．１００ｐｍｏｌ／μｌプライマーＨＣＧ−ＡＮＴＩＳＥＮＴ（配列番号１６）ストック希釈液１μｌ
６．ＴＡＱ（５Ｕ／μｌ）（ストック緩衝液Ａ中のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｍｉ８６５、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ、ＵＳＡ）２μｌ
７．Ｈ２Ｏ  ６５μｌ
【０１０６】
サイクリングパラメータは、以下のとおりであった。９５℃で２分間最初の変性；各サイクルが、９４℃で３０秒間、次いで５０℃で１分間、その後６８℃で２分間よりなる３０サイクルの増幅；および７２℃で１０分間最後の伸長。
【０１０７】
次いで、ＣＡＣＣｇｌｙｃａｌＡ（配列番号１９）と名付けられたこのＰＣＲ生成物を、製造元の指示に従ってｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５  Ｄ−ＴＯＰＯベクターに挿入した。この発現構築物をｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ｇｌｙｃａｌＡと名付けた。
【０１０８】
この構築物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養液でのα−ＦＳＨサブユニットの一過性の発現に用いることができる。代わりに、α−ＦＳＨの安定な発現が望まれる場合には、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ｇｌｙｃａｌＡが、ＶｉｒａｌＰｏｗｅｒ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｍｉｘと共に、ＶｉｒａＰｏｗｅｒ  ２９３ＦＴ−Ｐｒｏｄｕｃｅｒ  細胞系に挿入され、パッケージされたレンチウイルスを生じる（製造元の指示に従う：ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｋ４９５５−１０）。このパッケージされたウイルスは、培養液中で哺乳類細胞系を変換するのに用いられ、α−ＦＳＨサブユニットを安定に発現する哺乳類細胞系を製造する。
【０１０９】
Ｃ．α−ＦＳＨ  ＋β−ＦＳＨ（ＡＢ−ＦＳＨ）をコードする核酸配列の作成
上述したα−ＦＳＨおよびβ−ＦＳＨをコードする配列を使用してキメラ核酸分子α−β−ＦＳＨを作製したが、ここで、成熟β−ＦＳＨタンパク質（すなわち、シグナルペプチドなし）をコードする配列を、α−ＦＳＨのタンパク質（すなわち、シグナルペプチドを含む）をコードする配列の３’末端に融合させた。Ｘ１Ｘ２  βヒトＦＳＨの産生のために、α−β−ＦＳＨ（ＡＢ−ＦＳＨ；配列番号２０）のヌクレオチド配列を、上述したＰＣＲをベースにした方法を用いて作成した。このヌクレオチド配列は、ＡＢ−ＦＳＨポリペプチド（配列番号２７）をコードする。
【０１１０】
１．成熟β−ＦＳＨ
ＰＣＲ反応を行い、成熟β−ＦＳＨ（すなわち、シグナルペプチドをコードする配列を欠く）をコードする核酸配列を生成した。このＰＣＲ反応を、鋳型としての精製したＸ１Ｘ２  ＰＣＲ生成物（上記実施例１参照）溶液１μｌ上で、新たな順方向プライマーＰＦＭＸ２（５’−ＡＡＴ  ＡＧＣ  ＴＧＴ  ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＡＡ−３’；配列番号２１）および逆方向プライマーＰＲＸ２（配列番号１０）を用いて行った。この反応は、追加の試薬を含み、上記実施例１Ａ１に記載したサイクリングパラメータを用いて行った（β−ＦＳＨの２つのエキソンのうちの１つを各々コードする２つのＤＮＡ断片の単離および増幅）。得られたＰＣＲ生成物は、Ｓ−ＦＳＨ−Ｂ（配列番号２２）と名付け、２％アガロースゲル電気泳動により確認した（上述のように行う；図５のレーン２参照）。
【０１１１】
２．前駆体タンパク質α−ＦＳＨ
第２のＰＣＲ反応を行い、終止コドンを除去したα−ＦＳＨの前駆体タンパク質の核酸配列を生成した。α−ＦＳＨ終止コドンの除去は、α−β−ＦＳＨ融合タンパク質の早発性の切断を防止するために必要である。このＰＣＲ反応を、プライマーＨＣＧ−ＳＥＮＴ（配列番号１５）および新たなプライマーＨＣＧ−ＡＮＴＩＳＥＮＴ／ｗｏＴＡＡ（５’−ＡＧＡ  ＴＴＴ  ＧＴＧ  ＡＴＡ  ＡＴＡ  ＡＣＡ  ＡＧＴ  ＡＣＴ  ＧＣＡ  ＧＴＧ  Ｇ−３’；配列番号２３）を用いて鋳型としてのｇｌｙｃａｌＡ  ＰＣＲ生成物（配列番号１７）上で行った。このＰＣＲは、鋳型としてのｇｌｙｃａｌＡ（α−ＦＳＨ）ＰＣＲ生成物１μｌ、および以下の追加の試薬を含んでいた：
１．１０×ＰＣＲ緩衝液（好熱性のＤＮＡポリメラーゼ１０×緩衝液、マグネシウムフリーＭ１９０Ｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ、ＵＳＡ）１０μｌ
２．２５ｍｍｏｌ  ＭｇＣｌ２  １０μｌ
３．ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰを各々１０μｍｏｌ含むｄＮＴＰストック溶液５μｌ
４．１００ｐｍｏｌ／μｌプライマーＨＣＧ−ＳＥＮＴ（配列番号１５）ストック希釈液１μｌ
５．１００ｐｍｏｌ／μｌプライマーＨＣＧ−ＡＮＴＩＳＥＮＴ／ｗｏＴＡＡ（配列番号２３）ストック希釈液１μｌ
６．ＴＡＱ（５Ｕ／μｌ）（貯蔵用緩衝液Ａ中のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｍｉ８６５、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ、ＵＳＡ）２μｌ
７．Ｈ２Ｏ  ６５μｌ
【０１１２】
サイクリングパラメータは以下のとおりであった。９５℃で２分間最初の変性；各サイクルが、９４℃で３０秒間、次いで５０℃で１分間、その後６８℃で２分間よりなる３０サイクルの増幅；および７２℃で１０分間最後の伸長。得られたＰＣＲ生成物を、ｇｌｙｃａｌｗｏＴＡＡ（配列番号２４；ＴＡＡ終止コドンなしのα−ＦＳＨ配列）と名付けた。
【０１１３】
３．α−β−ＦＳＨ（ＡＢ−ＦＳＨ）
最初のＰＣＲを行い、５’成熟β−ＦＳＨをコードする配列（Ｓ−ＦＳＨ−Ｂ）の短い断片を終止コドンを除去したα−ＦＳＨ配列（ｇｌｙｃａｌｗｏＴＡＡ）の３’末端に結合した中間核酸分子を生成した。このＰＣＲは、鋳型としてのｇｌｙｃａｌｗｏＴＡＡ  ＰＣＲ生成物、順方向プライマーＨＣＧ−ＳＥＮＴ（配列番号１５）、およびハイブリッド逆方向プライマーＡＢＬＩＧＡＴＩＯＮ（配列番号２５）
【０１１４】
【化３】
2007506409.tif 000005
【０１１５】
（ここで、下線した配列はプライマーＰＦＭＸ２（配列番号２１）の逆相補体であり、プライマーＡＮＴＩＳＥＮＴ／ｗｏＴＡＡの配列（配列番号２３）はイタリック体としている）を用いて行った。このＰＣＲは、鋳型としてのｇｌｙｃａｌｗｏＴＡＡ  ＰＣＲ生成物１μｌ、および以下の追加の試薬を含んでいた：
１．１０×ＰＣＲ緩衝液（好熱性のＤＮＡポリメラーゼ１０×緩衝液、マグネシウムフリーＭ１９０Ｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ、ＵＳＡ）１０μｌ
２．２５ｍｍｏｌ  ＭｇＣｌ２  １０μｌ
３．ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰを各々１０μｍｏｌ含むｄＮＴＰストック溶液５μｌ
４．１００ｐｍｏｌ／μｌプライマーＨＣＧ−ＳＥＮＴ（配列番号１５）ストック希釈液１μｌ
５．１００ｐｍｏｌ／μｌプライマーＡＢＬＩＧＡＴＩＯＮ（配列番号２５）ストック希釈液１μｌ
６．ＴＡＱ（５Ｕ／μｌ）（貯蔵用緩衝液Ａ中のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｍｉ８６５、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ、ＵＳＡ）２μｌ
７．Ｈ２Ｏ  ６５μｌ
【０１１６】
サイクリングパラメータは以下のとおりであった。９５℃で２分間最初の変性；各サイクルが、９４℃で３０秒間、次いで５０℃で１分間、その後６８℃で２分間よりなる３０サイクルの増幅；および７２℃で１０分間最後の伸長。我々は、このＰＣＲ反応の生成物をｇｌｙｃａｌｗｏＴＡＡＵＲと名付けた（配列番号２６）。
【０１１７】
次いで、第２のＰＣＲ反応を行い、鋳型としてｇｌｙｃａｌｗｏＴＡＡＵＲ中間ＰＣＲ生成物（配列番号２６）およびＳ−ＦＳＨ−Ｂ  ＰＣＲ生成物（配列番号２２）を用いて最終的なα−β−ＦＳＨ配列（ＡＢ−ＦＳＨ）を生成した。ＰＣＲを順方向プライマーＨＣＧ−ＳＥＮＴ（配列番号１５）および逆方向プライマーＰＲＸ２（配列番号１０）を用いて行った。このＰＣＲ反応は、以下の試薬を含んでいた：
１．１０×ＰＣＲ緩衝液（好熱性のＤＮＡポリメラーゼ１０×緩衝液、マグネシウムフリーＭ１９０Ｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ、ＵＳＡ）１０μｌ
２．２５ｍｍｏｌ  ＭｇＣｌ２  １０μｌ
３．ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰを各々１０μｍｏｌ含むｄＮＴＰストック溶液５μｌ
４．ｇｌｙｃａｌｗｏＴＡＡＵＲ中間ＰＣＲ生成物（配列番号２６）１μｌ
５．Ｘ２  Ｓ−ＦＳＨ−Ｂ  ＰＣＲ生成物（配列番号２２）１μｌ
６．１００ｐｍｏｌ／μｌプライマーＨＣＧ−ＳＥＮＴ（配列番号１５）ストック希釈液１μｌ
７．１００ｐｍｏｌ／μｌプライマーＰＲＸ２（配列番号１０）ストック希釈液１μｌ
８．ＴＡＱ（５Ｕ／μｌ）（貯蔵用緩衝液Ａ中のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｍｉ８６５、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ、ＵＳＡ）２μｌ
９．Ｈ２Ｏ  ６５μｌ
【０１１８】
サイクリングパラメータは以下のとおりであった。９５℃で２分間最初の変性；各サイクルが、９４℃で３０秒間、次いで５０℃で１分間、その後６８℃で２分間よりなる３０サイクルの増幅；および７２℃で１０分間最後の伸長。サイクリングは、ＰＴＣ−１００（商標）ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、Ｍａｓｓ、ＵＳＡ）を用いて行った。
【０１１９】
このＰＣＲの生成物がＡＢ−ＦＳＨ（配列番号２０）であることを２％アガロースゲル電気泳動（上述のように行う；図５のレーン４参照）およびベクタープライマーを用いたｐＬｅｎｔｉ／ＡＢ−ＦＳＨ構築物（下記参照）の配列決定により確認した。
【０１２０】
次いで、ヌクレオチド配列ＣＡＣＣを付加するのに用いたＰＣＲプライマーがＨＣＧ−ＳＥＮＴＣＡＣＣ（配列番号１８）およびＰＲＸ２（配列番号１０）であった以外は上述したように（実施例３Ｂ。「α−ＦＳＨサブユニットをコードする核酸配列」）、ＡＢ−ＦＳＨ  ＰＣＲ生成物を製造元の指示に従ってｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｋ４９５５−１０）を用いてｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５  Ｄ−ＴＯＰＯベクターに導入してクローン化した。この発現構築物はｐＬｅｎｔｉ／Ａβ−ＦＳＨと名付けた。
【０１２１】
（実施例４）
哺乳動物細胞培養液でのα−ＦＳＨおよびβ−ＦＳＨの同時発現
ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ｇｌｙｃａｌＡ（ｇｌｙｃａｌＡ  α−ＦＳＨインサート含有ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−Ｄ−ＴＯＰＯベクター）およびｐＴＰＫＢＦＳＨ（ＳＤＫ−Ｘ１Ｘ２  β−ＦＳＨインサート含有ｐＴａｒｇｅＴ）発現構築物を、ＣＯＳ−７Ｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＮｏ．１１６２２０１６）の完全ヒトＦＳＨホルモンおよびＣＨＯ−Ｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＮｏ．１１６１９０１２）細胞系の発現に用いた。α−ＦＳＨおよびβ−ＦＳＨ発現構築物を、製造元の指示に従ってＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）トランスフェクション試薬を用いて様々な細胞系に同時形質移入した。発現ベクターｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）がトランスフェクション対照物として含まれていた。
【０１２２】
トランスフェクション後、細胞を１０００μｇ／ｍｌのゲネチシンおよび４００μｇ／ｍｌのブラストサイジンを含む選択培地で７日間培養した。ゲネチシン−ブラストサイジン耐性細胞をゲネチシン（２００μｇ／ｍｌ）およびブラストサイジン（２００μｇ／ｍＬ）を含む新たな培地に移して、細胞密度が１０６細胞／ｍｌとなるまで培養した。次いで、この培養液の上清について、マルチサブユニット（非共有結合したαサブユニットおよびβサブユニット）ＦＳＨ複合体の存在を試験した。
【０１２３】
αおよびβ−ＦＳＨ複合体の存在を、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の定量のための免疫放射定量測定法キットであるＢＩＯＳＯＵＲＣＥ  ＦＳＨ−ＩＲＭＡキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｓ．Ａ．、Ｃａｔ＃ＫＩＰ０８４１−ＫＩＰ０８４４）を用いて検出した。このＦＳＨ−ＩＲＭＡアッセイは、２つのモノクローナル抗体、すなわちＦＳＨのαサブユニットに特異的なものおよびＦＳＨのβサブユニットに特異的なものの使用に基づいている。したがって、このアッセイは完全なαおよびβ−ＦＳＨ複合体しか検出しない。ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ｇｌｙｃａｌＡおよびｐＴＰＫＢＦＳＨ同時形質移入細胞の上清を、製造元の指示に従ってＦＳＨ−ＩＲＭＡキットを用いて試験した。このアッセイは、この上清がαおよびβ−ＦＳＨ複合体を１１０Ｕ／ｍｌの量で含んでいることを示した。
【０１２４】
（実施例５）
哺乳動物細胞培養液中でのα−β−ＦＳＨ融合タンパク質の発現
α−β−ＦＳＨ発現構築物であるｐＬｅｎｔｉ／ＡＢ−ＦＳＨを、製造元の指示にしたがってＣＯＳ−７Ｌ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＮｏ．１１６２２０１６）にＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）トランスフェクション試薬を用いて形質移入した。発現ベクターｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）がトランスフェクション対照物として含まれていた。
【０１２５】
トランスフェクション後、細胞を４００μｇ／ｍｌのブラストサイジン（Ｇｉｂｃｏ）を含む選択培地で７日間培養した。ブラストサイジン耐性細胞を２００μｇ／ｍｌのゲネチシンを含む新たな培地に移して、細胞密度が１０６細胞／ｍｌとなるまで培養した。次いで、これらの細胞を収穫し、溶解した。細胞は、１ｍＬの培地中で凍結し、解凍することにより溶解した。次いで、溶解した細胞を遠心して細胞片をペレット化した。次いで、上清を収穫し、α−β−ＦＳＨの存在を試験した。
【０１２６】
次いで、α−β−ＦＳＨ融合タンパク質の存在を、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の定量のための免疫放射定量測定法キットであるＢＩＯＳＯＵＲＣＥ  ＦＳＨ−ＩＲＭＡキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｓ．Ａ．、Ｃａｔ＃ＫＩＰ０８４１−ＫＩＰ０８４４）を用いて検出した。このＦＳＨ−ＩＲＭＡアッセイは、２つのモノクローナル抗体、すなわちＦＳＨのαサブユニットに特異的なものおよびＦＳＨのβサブユニットに特異的なもの使用に基づいている。溶解したｐＬｅｎｔｉ／ＡＢ−ＦＳＨ−形質移入ＣＯＳ−７Ｌ細胞の上清を、製造元の指示に従ってＦＳＨ−ＩＲＭＡキットを用いて試験した。このアッセイは、キメラα−β−ＦＳＨタンパク質が３２５Ｕ／ｍｌの濃度で存在していたことを示した。このアッセイでは、この結果がα−β−ＦＳＨタンパク質の存在量を示すが、このアッセイが真の機能的アッセイではないことに留意する。
【０１２７】
産生したα−β−ＦＳＨタンパク質が生物学的に活性であることを検証するために、溶解したｐＬｅｎｔｉ／ＡＢ−ＦＳＨ−形質移入ＣＯＳ−７Ｌ細胞の上清を、上記実施例２に記載の顆粒膜アッセイで試験する。このアッセイでは、４００μｌのＧＡＢアッセイ培地および６０μＬの顆粒膜細胞懸濁液（約５０，０００から８０，０００生存細胞）を２４ウェルプレートの各ウェルに加える。次に、４０μＬの溶解したｐＬｅｎｔｉ／ＡＢ−ＦＳＨ−形質移入ＣＯＳ−７Ｌ細胞または様々な濃度の陽性対照組換えＦＳＨ（Ｏｒｇａｎｏｎ）の上清を各ウェルに加える。次いで、プレートを加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中で、３７℃で３日間培養する。次いで、各ウェルからの上清を収穫し、１０〜２０μｌの上清を放射性免疫測定法によりエストロゲンレベルを測定する。エストロゲン放射性免疫測定法は、製造元の指示に従い、エストラジオール測定（Ｏｒｉｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｆｉｎｌａｎｄ）用のＳｐｅｃｔｒｉａ  ＲＩＡ  ｋｉｔを用いて行われる。
【０１２８】
このアッセイでは、様々な濃度の陽性対照組換えＦＳＨ（Ｏｒｇａｎｏｎ）を試験して、ＦＳＨ活性の滴定曲線を計算するのに用いる（ミリユニット／ミリリットル、ｍＵ／ｍｌの組換えＦＳＨ濃度対エストロゲン放射性免疫測定値）。次いで、この対照曲線を用いて、生物学的に活性なα−β−ＦＳＨの量を内挿した。本アッセイでは、本発明のα−β−ＦＳＨは、生物学的活性のユニット／ｍｇのタンパク質で示されるように、現在利用可能な組換えＦＳＨ（Ｏｒｇａｎｏｎ）よりも実質的に高い活性プロファイルを示す。
【０１２９】
（実施例６）
ＩＮＦ−β／ＩＮＦ−α２Ｂ発現構築物の構築
ＩＮＦ−βをコードするゲノムＤＮＡの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＭ００２１６７である。ＩＮＦ−βのｃＤＮＡ配列は配列番号２８（ここより後はＴＨＩＭＩＯＳ１という）であり、それは終止コドンなしの上記配列ＮＭ００２１６７に相当する。成熟ＩＮＦ−α２Ｂの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＭ０００６０５（ここより後はＰＥＮＮＹ１という）の一部である。
【０１３０】
Ａ  β−ＦＳＨをコードする配列のＰＣＲ増幅
１．２つのインターフェロン（ＩＮＦ−βおよびＩＮＦ−α２Ｂ）のうちの１つをそれぞれコードする２つのＤＮＡ断片の単離および増幅
ヒトゲノムＤＮＡを、Ｎｕｃｌｅｏ  Ｓｐｉｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｑｕｉｃｋ  Ｐｕｒｅ  ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  ＧｍＢＨ  ＆  Ｃｏ．）を用いて５０μｌの全血から抽出した。次いで、単離したＤＮＡを１００μｌのＴＢ緩衝液に溶解した（ＤＮＡ溶液）。１０μｌのこのＤＮＡ溶液を、２つの独立のＰＣＲ反応での鋳型として用いた（５μｌゲノムＤＮＡ溶液／ＰＣＲ反応）。最初のＰＣＲ反応を、ＩＮＦ−βに特異的なプライマーを用いて行った。
【０１３１】
順方向プライマーは、配列ＡＴＧＡＣＣＡＡＣＡＡＧＴＧＴＣＴＣＣＴＣＣＡＡＡＴＴＧＣＴを有する（ここより後はＴＨＩＭＩＯＳＦという）。終止コドンなしの逆方向プライマーは、配列ＧＴＴＴＣＧＧＡＧＧＴＡＡＣＣＴＧＴＡＡＧＴＣＴＧＴＴＡＡＴを有する（ここより後はＴＨＩＭＩＯＳＲという）。このＰＣＲ反応は、ＩＮＦ−βの生成物ＣＤＳを増幅する。
【０１３２】
第２のＰＣＲ反応を、ＩＮＦ−α２Ｂの成熟鎖に特異的なプライマーを用いて行った。順方向プライマーＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＴＧＴＧＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＡＡＣＣＣＡ（ここより後はＰＥＮＮＹＦという）は、エンテロキナーゼ部位を発現する１〜５の主要なシーケンシング（ｐｒｉｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を含む；この部位は、産生後に切断されるという選択肢を発現したタンパク質分子に与えるために付加され、したがって、万一に備えて２つの異なる生成物を提供する。
【０１３３】
エンテロキナーゼ部位（ここより後はＰＥＮＮＹＦという）を含む成熟ＩＮＦ−α２Ｂ配列は、配列番号２９に対応する。
【０１３４】
逆方向プライマーは、ＴＣＡＴＴＣＣＴＴＡＣＴＴＣＴＴＡＡＡＣ（ここより後はＰＥＮＮＹＲという）である。
【０１３５】
各々独立のＰＣＲ反応は、鋳型としてのヒトゲノムＤＮＡ溶液５μｌ、および以下の追加試薬を含んでいた：
１．１０×ＰＣＲ緩衝液（好熱性のＤＮＡポリメラーゼ１０×緩衝液、マグネシウムフリーＭ１９０Ｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ、ＵＳＡ）１０μｌ
２．２５ｍｍｏｌ  ＭｇＣｌ２  １０μｌ
３．ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰを各々１０μｍｏｌ含むｄＮＴＰストック溶液５μｌ
４．１００ｐｍｏｌ／μｌ順方向プライマーストック希釈液１μｌ
５．１００ｐｍｏｌ／μｌ逆方向プライマーストック希釈液１μｌ
６．ＴＡＱ（５Ｕ／μｌ）（貯蔵用緩衝液Ａ中のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｍｉ８６５、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ、ＵＳＡ）２μｌ
７．Ｈ２Ｏ  ６５μｌ
【０１３６】
サイクリングパラメータは以下のとおりであった。９５℃で２分間最初の変性；各サイクルが、９４℃で３０秒間、次いで５０℃で３０秒間、その後７２℃で１分間よりなる３０サイクルの増幅；および７２℃で５分間最後の伸長。サイクリングは、ＰＴＣ−１００（商標）ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、Ｍａｓｓ、ＵＳＡ）を用いて行った。
【０１３７】
ＩＮＦ−βおよびＩＮＦ−α２Ｂ生成物のＰＣＲ増幅を、対照分子量マーカーとしてＤＮＡ分子量マーカーφＸ／Ｈｉｎｃ  ＩＩ  ＭＫ１３ａ（ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用い、１２５ｍＡで３０分間、アガロースゲル（ＴＡＥ緩衝液中２％）電気泳動により確認した。結果を図４に示す（レーン２および３参照）。結果を図４に示す（レーン２および３参照）。次いで、ＰＣＲ反応の生成物を、ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｋｉｔ（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ。Ｃａｔ  Ｎｏ．７４０５９０．５０）を用いて精製した。
【０１３８】
このようにして得られたエンテロキナーゼ部位を有するＩＮＦ−β／ＩＮＦ−α２Ｂは、配列番号３０に相当するが、エンテロキナーゼ部位を有しないものは、配列番号３１に相当する。
【０１３９】
代わる方法では、最終的なＰＣＲ生成物を、鋳型としてＩＮＦ−βおよびＩＮＦ−α２Ｂ生成物を、ＰＣＲプライマーとしてＴＨＩＭＩＯＳＦ、ＰＥＮＮＹＲ、およびこの下に報告される配列を有する結合プライマーＴＩＮＡＬＥＭＥを用いて、一段階の３プライマーＰＣＲ法により生成した。
【０１４０】
ＡＴＣＡＣＡＣＴＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＴＴＣＧＧＡＧＧＴＡＡＣＣＴＧＴＡＡＧＴＣＴ
１．１０×ＰＣＲ緩衝液（好熱性のＤＮＡポリメラーゼ１０×緩衝液、マグネシウムフリーＭ１９０Ｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ、ＵＳＡ）１０μｌ
２．２５ｍｍｏｌ  ＭｇＣｌ２  １０μｌ
３．ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰを各々１０μｍｏｌ含むｄＮＴＰストック溶液５μｌ
４．ＴＨＩＭＩＯＳ１  ＰＣＲ生成物２μｌ
５．ＨＥＳＥＭＥＳＡ  ＰＣＲ生成物２μｌ
６．１００ｐｍｏｌ／μｌ順方向プライマーストックＴＨＩＭＩＯＳＦ  １μｌ
７．１００ｐｍｏｌ／μｌ逆方向プライマーストックＰＥＮＮＹＲ  １μｌ
８．１００ｐｍｏｌ／μｌハイブリッドプライマーＴＩＮＡＬＥＭＥ  １μｌ
９．ＴＡＱ（５Ｕ／μｌ）（貯蔵用緩衝液Ａ中のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｍｉ８６５、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ、ＵＳＡ）２μｌ
１０．Ｈ２Ｏ  ６５μｌ
【０１４１】
サイクリングパラメータは以下のとおりであった。９５℃で２分間最初の変性；各サイクルが、９４℃で３０秒間、次いで５０℃で１分間、その後６８℃で２分間よりなる３０サイクルの増幅；および７２℃で１０分間最後の伸長。サイクリングは、ＰＴＣ−１００（商標）ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、Ｍａｓｓ、ＵＳＡ）を用いて行った。
【０１４２】
このＰＣＲ反応による生成物の増幅を、上述のように行われるアガロース（ＴＡＥ緩衝液中２％）電気泳動により確認した。次いで、このＰＣＲ反応の生成物を、ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｋｉｔ（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ。Ｃａｔ  Ｎｏ．７４０５９０．５０）を用いて精製して、純粋なＤＮＡを最終体積５０μｌで得た。ＤＮＡの純度およびサイズを、上述のように行われるアガロース（ＴＡＥ緩衝液中２％）電気泳動により確認した。生成物のサイズは、アガロースゲル電気泳動により決定した。
【０１４３】
本発明は、本明細書に記載した特定の実施形態により制限されるものではない。実際、本明細書に記載のものに加え、前述の記載および添付の図から本発明の様々な改変が当業者に明らかであろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に収まることを意図している。
【０１４４】
さらに、すべての値はおよそであり、説明のために提供されていることを理解すべきである。
【０１４５】
特許、特許出願、公報、製品説明書、および手順書は、この出願を通じて引用され、実際上、これらの開示は本明細書にそのまま援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】出発物質を増幅する最初のＰＣＲ反応に使用される２片の出発物質（二本鎖ポリヌクレオチドセグメント）と、それに結合するプライマーとの模式図である。ＰＦＸ１はエキソン１の順方向ＰＣＲプライマーであり；ＰＲＸ１はエキソン１の逆方向ＰＣＲプライマーであり；「ＯＨ」および「ＨＯ」は二本鎖ＤＮＡの３’端末のヒドロキシ基を表し；ＰＦＸ２はエキソン２の順方向ＰＣＲプライマーであり；ＰＲＸ２はエキソン２の逆方向ＰＣＲプライマーである。
【図２】中間体ＰＣＲ産物を生成するＰＣＲステップの模式図である。ここで、Ｘ１ＵＲを作製するには、Ｘ２の５’末端部分をＸ１の３’末端に付加し、あるいは、ＤＲＸ２を作製するには、Ｘ１の３’末端の部分をＸ２の５’末端に付加する。ＰＲＸ１−ＰＦＸ２’は、ＰＲＸ１プライマー配列をＰＦＸ２プライマーの相補配列（ＰＦＸ２’）と結合することによって作製された逆方向ＰＣＲプライマーであり；ＰＲＸ１’−ＰＦＸ２は、ＰＲＸ１プライマーの相補配列（ＰＲＸ１’）をＰＦＸ２プライマー配列と結合することによって作製された順方向ＰＣＲプライマーである。
【図３】第３のＰＣＲ反応ステップの模式図である。この図は、中間体生成物Ｘ１ＵＲおよびＸ２出発物質を変性するステップと、それに続く、アニーリングによって分子種Ａおよび分子種Ｂの混合物を形成するステップと、それに続く、伸長のステップであって、それにおいて、５’−３’重合によって分子種ＡがＸ１Ｘ２を形成し、さらに共時的な５’−３’重合および５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって分子種ＢがＸ１Ｘ２を形成するステップとを図示する。Ｘ１Ｘ２は、その後の、変性、アニーリング、および伸長の周回によって増幅される。プライマーＰＦＸ１およびＰＲＸ２を用いれば、同等の機構によってＸ１およびＤＲＸ２のテンプレートからのＸ１Ｘ２分子種の形成ももたらされることに留意されたい。図３において、
【表２】
2007506409.tif 000006
は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを表し；
【表３】
2007506409.tif 000007
は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ進行性の方向を示し；かつ、
【表４】
2007506409.tif 000008
および
【表５】
2007506409.tif 000009
は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって分子種Ｂから放出されたヌクレオチドを表す。
【図４】Ｘ１ベータ−ＦＳＨ  ＰＣＲ産物（レーン２）、Ｘ２ベータ−ＦＳＨ  ＰＣＲ産物（レーン３）、およびＸ１Ｘ２ベータ−ＦＳＨ  ＰＣＲ産物（レーン４）の、成功したＰＣＲ増幅を示すアガロースゲルの写真である。レーン１は、ΦＸ／Ｈｉｎｃ  ＩＩ  ＭＫ１３ａ（ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．社（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国））分子量マーカーである。
【図５】Ｓ−ＦＳＨ−Ｂ  ＰＣＲ産物（レーン２）、ｇｌｙｃａｌＡ  ＲＴ  ＰＣＲ産物（レーン３）、およびＡＢ−ＦＳＨ（アルファ−ベータ−ＦＳＨ）ＰＣＲ産物（レーン４）の、成功したＰＣＲ増幅を示すアガロースゲルの写真である。レーン１は、ΦＸ／Ｈｉｎｃ  ＩＩ  ＭＫ１３ａ（ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．社（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国））分子量マーカーである。
【図１】
2007506409.tif 000010
【図２】
2007506409.tif 000011
【図３】
2007506409.tif 000012
【図４】
2007506409.tif 000013
【図５】
2007506409.tif 000014
【配列表】
2007506409000001.xml
【国際調査報告】
2007506409.tif 000027
2007506409.tif 000028
2007506409.tif 000029
2007506409.tif 000030
2007506409.tif 000031