(57)【要約】  Ｔ抗原発現細胞における遺伝的不安定性は，Ｔ抗原を発現する遺伝子をＢｕｂ１結合を欠失するように改変することにより克服される。改変型Ｔ抗原遺伝子を，好ましくはテロメラーゼコンストラクトの触媒サブユニットとともに組み込むことにより，安定な細胞株を製造することができる。
2007527231.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂｕｂ１蛋白質に結合する能力を欠失したＳＶ４０Ｔ抗原蛋白質。
【請求項２】
配列番号１に示されるアミノ酸配列，または細胞を不死化しうる能力を保持したその機能的フラグメントを含み，ただし，蛋白質は，８９−９７位に示されるアミノ酸残基の１またはそれ以上を欠失しているか，または前記残基の１またはそれ以上が変異しているものである，請求項１記載のＳＶ４０Ｔ抗原蛋白質。
【請求項３】
蛋白質が，残基９１，９４および９５の１またはそれ以上が欠失または変異しているものである，請求項２記載のＳＶ４０Ｔ抗原蛋白質。
【請求項４】
Ｔ抗原のアミノ酸残基８９−９７が欠失または変異している，請求項２または３記載のＳＶ４０Ｔ抗原蛋白質。
【請求項５】
蛋白質がＤＮＡに結合しない，請求項１−４のいずれかに記載のＳＶ４０Ｔ抗原蛋白質。
【請求項６】
蛋白質がＵ１９変異を含む，請求項５記載のＳＶ４０Ｔ抗原蛋白質。
【請求項７】
蛋白質が温度感受性ラージＴ抗原である，請求項１−６のいずれかに記載のＳＶ４０Ｔ抗原蛋白質。
【請求項８】
請求項１−７のいずれかに記載のＳＶ４０Ｔ抗原蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたはその相補体。
【請求項９】
発現される産物が温度感受性である，請求項８記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
さらにテロメラーゼ複合体の触媒サブユニットを含む，請求項８または９記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
Ｔ抗原をコードするポリヌクレオチドを含む組換え哺乳動物細胞であって，発現されたＴ抗原はＴ抗原とＢｕｂ１との間の結合が防止されるように改変されていることを特徴とする組換え哺乳動物細胞。
【請求項１２】
ヒト細胞である，請求項１１記載の細胞。
【請求項１３】
細胞が多能性である，請求項１１または１２記載の細胞。
【請求項１４】
細胞が，感覚上皮細胞，乳房管腔細胞または乳房線維芽細胞である，請求項１１−１３のいずれかに記載の細胞。
【請求項１５】
ポリヌクレオチドがラージＴ抗原をコードする，請求項１１−１４のいずれかに記載の細胞。
【請求項１６】
オンコジンが温度感受性である，請求項１１−１５のいずれかに記載の細胞。
【請求項１７】
ヒト体細胞である，請求項１１−１５のいずれかに記載の細胞。
【請求項１８】
Ｔ抗原が，配列番号１のアミノ酸残基８９−９７の１またはそれ以上が欠失または変異しているものである，請求項１１−１６のいずれかに記載の細胞。
【請求項１９】
欠失したアミノ酸残基が，配列番号１の９１位，９４位または９５位のトリプトファン残基の１またはそれ以上である，請求項１８記載の細胞。
【請求項２０】
さらにテロメラーゼ複合体の触媒サブユニットを含む，請求項１１−１９のいずれかに記載の細胞。
【請求項２１】
サブユニットがヒトテロメラーゼ複合体のサブユニットである，請求項２０記載の細胞。
【請求項２２】
請求項８−１０のいずれかに記載のポリヌクレオチドでトランスフォームした細胞。
【請求項２３】
治療に用いるための，請求項１１−２２のいずれかに記載の細胞。
【請求項２４】
細胞喪失または傷害により特徴づけられる疾患の治療用の医薬品の製造における，請求項１１−２３のいずれかに記載の細胞の使用。
【請求項２５】
疾患が脳細胞の喪失または傷害に起因する認識疾患である，請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
疾患がアルツハイマー病およびパーキンソン病からなる群より選択される，請求項２４または２５記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，治療に用いるための細胞の製造に関する。詳細には，本発明は，治療用途のための不死化哺乳動物細胞の製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＳＶ４０は，その天然の宿主であるアカゲザル細胞において溶解性の感染を引き起こすか，または広範な種類の非許容性齧歯類細胞において新生物性トランスフォーメーションを引き起こす，小さいＤＮＡ腫瘍ウイルスである。ＳＶ４０の初期遺伝子産物の１つであるラージＴ抗原は，多様な複雑な細胞現象，例えば，核輸送，転写制御，真核生物ＤＮＡ複製および新生物性トランスフォーメーションにつながる細胞成長の脱制御を理解するためのモデル系として広範囲に研究されてきた，多機能性のリン蛋白質である（以下に概説されている；Ｆａｎｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｋｎｉｐｐｅｒｓ，１９９２；Ｍａｎｆｒｅｄｉ  ａｎｄ  Ｐｒｉｖｅｓ，１９９４；Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ａｎｄ  Ｐｉｐａｓ，２００２）。ＳＶ４０は，限定された数のヒト腫瘍，例えば，中皮腫および骨肉腫における病原体であるかもしれないことが示唆されている（Ｇａｚｄａｒ  ｅｔ  ａｌ，２００２）。
【０００３】
Ｔ抗原が細胞の増殖経路を脱制御する能力は，初代齧歯類細胞の非常に効率的な不死化（Ｊａｔ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，１９８６；Ｐｅｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３），ヒト細胞の低頻度の不死化（Ｓｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３），および樹立された齧歯類細胞株の発癌性へのトランスフォーメーション（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）に反映される。これは単独で齧歯類細胞の不死化に十分であるが（Ｊａｔ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，１９８６），ヒト細胞の完全な不死化には追加の作用，例えばテロメラーゼ活性の再構築が必要である（Ｊｈａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｏ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０００４】
Ｔ抗原が細胞増殖メカニズムを脱制御する能力は，種々の宿主細胞蛋白質とのその特異的相互作用に依存する。Ｔ抗原付随蛋白質の研究は，多くのシグナリング経路の解明および腫瘍サプレッサー遺伝子の同定につながった（Ｍａｎｆｒｅｄｉ  ａｎｄ  Ｐｒｉｖｅｓ，１９９４；Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ａｎｄ  Ｐｉｐａｓ，２００２に概説されている）。ヒト癌の大部分で変異または欠失している腫瘍サプレッサー蛋白質ｐ５３は，元々，Ｔ抗原相互作用蛋白質として発見された（Ｌａｎｅ  ａｎｄ  Ｃｒａｗｆｏｒｄ，１９７９；Ｌｉｎｚｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｅ，１９７９）。また，Ｔ抗原と網膜芽細胞腫（ｐＲＢ）ファミリーの蛋白質のメンバーとの相互作用の同定により，細胞サイクル制御蛋白質としてのこれらの正常な細胞機能の理解が実質的に進歩した（ＤｅＣａｐｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｚａｌｖｉｄｅ  ａｎｄ  ＤｅＣａｐｒｉｏ，１９９５）。別のＴ抗原結合パートナー，例えば，ｐ３００およびｐ４００もまた，Ｔ抗原機能のすべてのレパートリーに寄与しているが，これらの詳細な役割は明らかになっていない（Ｅｃｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｌｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。最近，Ｔ抗原の最もＮ−末端（アミノ酸１−７０）がｂｏｎａ  ｆｉｄｅ  ＤｎａＪドメインを構成し（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９７），これは有効なウイルス複製，ならびにある種のトランスフォーメーション機能に必要であることが見いだされた（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｓｔｕｂｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ａｎｄ  Ｐｉｐａｓ，２００２）。
【０００５】
Ｔ抗原は明らかに極めて用途の広いウイルス癌蛋白質である。ポリオーマウイルスミドルＴ抗原または活性化Ｒａｓ蛋白質とは異なり，Ｔ抗原による蛋白質のトランスフォーメーションは比較的弱い。すなわち，レトロウイルス感染によりほとんど全ての細胞でＴ抗原の発現が与えられたとしても，数個の細胞のみがトランスフォーメーションされる。このことは，完全なトランスフォーメーションには別の作用または遺伝的変更がが必要であることを示唆する（Ｊａｔ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，１９８６）。おそらくは，発癌性トランスフォーメーションのプロセスに密接な関係があるものは，ヒト細胞におけるＴ抗原の発現が染色体異常および異数性を誘導することにより遺伝的不安定性を引き起こすことが知られているという事実である（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ，１９９１；Ｗｏｏｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。この機能は，Ｔ抗原との会合によりｐ５３活性が破壊されることにより説明することができるが，ｐ５３結合配列を含まない蛋白質のＮ−末端１４７アミノ酸は，野生型蛋白質と同様にゲノム不安定化を有効に誘導することができる（Ｗｏｏｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。また，不安定化はｐＲＢファミリーメンバーへの結合に絶対に必要なわけではない（Ｗｏｏｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。Ｔ抗原がヒト細胞においてそのような核型の不安定性を引き起こす能力は，正常な有糸分裂チェックポイントの制御をはずすその能力と相関していることが見いだされている（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。Ｔ抗原が核型の不安定性を引き起こすかまたは核内倍加を誘導するメカニズムは不明である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は，Ｔ抗原がＢｕｂ１蛋白質キナーゼに結合すること，およびこの相互作用が，Ｔ抗原発現細胞に時々伴う遺伝的不安定性の原因であることを見いだしたことに基づく。相互作用は細胞の不死化には必要ではなく，したがってこの結合の破壊は，遺伝的に安定な不死化細胞株の製造に有用である。
【０００７】
本発明の第１の観点にしたがえば，Ｂｕｂ１蛋白質に結合する能力を欠失したＳＶ４０Ｔ抗原蛋白質が提供される。
【０００８】
本発明の第２の観点にしたがえば，Ｔ抗原をコードするポリヌクレオチドを含む組換え哺乳動物細胞であって，発現されたＴ抗原がＢｕｂ１への結合が防止されるように改変されている細胞が提供される。
【０００９】
本発明の第３の観点にしたがえば，上で定義される組換え細胞を治療に用いる。
【００１０】
本発明の第４の観点にしたがえば，上で定義される組換え細胞を，細胞喪失または細胞傷害に関連する疾患の治療用の医薬品の製造に用いる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
発明の説明
本発明は，酵母ツーハイブリッドスクリーニングを活用して，ＳＶ４０Ｔ抗原のアミノ末端と相互作用する細胞蛋白質を検索することにより同定された。Ｔ抗原が，有糸分裂紡錘体集合チェックポイント蛋白質であるＢｕｂ１（Ｈｏｙｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）と特異的に相互作用することが見いだされた。この相互作用は，広範な種類の細胞タイプにおける相互の共免疫沈殿分析により確認された。遺伝的分析により，Ｔ抗原のＢｕｂ１との相互作用には，Ｔ抗原上の特定のトリプトファン含有モチーフが必要であることが示された。Ｂｕｂ１との相互作用は，Ｔ抗原による不死化には必要ないが，トランスフォーメーションには必要である。Ｔ抗原が発現すると，低レベルの紡錘体の障害の存在下であっても細胞の有糸分裂が進行するように，紡錘体集合チェックポイントが部分的に破壊される。Ｂｕｂ１と相互作用できないＴ抗原変異体は，紡錘体チェックポイントを調節する能力を欠失している。
【００１２】
Ｔ抗原上のＢｕｂ１に対する結合部位は，先に報告されているＴ抗原相互作用物質に対する結合部位とは異なる。Ｂｕｂ１のＴ抗原への結合の遺伝的分析は，ヘリックス４のアミノ酸８９−９７の領域内の決定基が相互作用に重要であることを示す。Ｔ抗原のこのセグメントは，ＤｎａＪドメイン（残基１−７０）とｐＲＢファミリーメンバーへの結合に必要な"ＬＸＣＸＥ"モチーフ（残基１０３−１０７）との間に位置する。Ｔ抗原のアミノ酸配列は配列番号１に示される。８９−９７欠失変異体（ｄｌ８９−９７）はＢｕｂ１への結合に最も欠陥のある変異体であるが，"ＷＥＸＷＷ"モチーフ中の保存トリプトファンＷ９１，Ｗ９４およびＷ９５は，それぞれ有効な結合に重要であった（Ｘは任意のアミノ酸を表す）。ｄｌ８９−９７Ｔ抗原はｐ１３０のリン酸化状態を変更し，ならびに分解のためにこれを標的とすることができることが示されており，このことは，ＤｎａＪドメインおよびポケット蛋白質結合機能が完全であることを示すため，変異体ｄｌ８９−９７における欠失は，Ｔ抗原の構造を著しく動揺させることはありそうにない（Ｓｔｕｂｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。さらに，変異体ｄｌ８９−９７，ならびにそれぞれのトリプトファン置換変異体はなお，野生型Ｔ抗原と同様にまたはこれより良くラット胚線維芽（ＲＥＦ）を不死化させることができた。Ｄｌ８９−９７Ｔ抗原はまた，野生型Ｔ抗原と同様にＨｓｃ７０，ｐＲＢおよびｐ５３に結合し，Ｅ２Ｆ転写レポーターを活性化することができ，ｐ５３依存性細胞サイクル休止を首尾よく克服することができる（Ｇｊｏｅｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。最後に，本発明者らによるアクチン集合阻害剤ＤＣＢを用いる実験もまた，ｄｌ８９−９７変異体が野生型Ｔ抗原と同様に，ｐ５３依存性四倍性チェックポイントを克服するという結論を支持する（Ａｎｄｒｅａｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｌａｎｎｉ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓ，１９９８；Ｍｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。すなわち，ｄｌ８９−９７Ｔ抗原の全体的な構造一体性は保存されているようである。"ＷＥＸＷＷ"モチーフは，ＳＶ４０，ＢＫ，ＪＣ，およびウシポリオーマウイルスＴ抗原の間で保存されている。ウイルスＴ抗原の間の保存の程度は，このモチーフが，おそらくはＤｎａＪドメインの保存"ＨＰＤ（Ｋ／Ｒ）"モチーフと類似した様式で，重要な機能を有することを示唆する。
【００１３】
Ｔ抗原は，Ｂｕｂ１の自己リン酸化活性ならびにヒストンＨ１等の外部基質に対するその活性の両方を増強する。この作用モードはＴ抗原については極めて異常である。通常は，これはその標的蛋白質（しばしば腫瘍サプレッサーである）を不活性化する。この活性化は通常ではないため，測定されたキナーゼ活性が真にＢｕｂ１によるものかどうかを確認するため，多大な努力が払われた。キナーゼシグナルはＢｕｂ１に対する特異的ｓｉＲＮＡオリゴまたはＤＮＡ系ＲＮＡｉによりサイレンシングしうることが示された。
【００１４】
Ｂｕｂ１とＴ抗原との相互作用は現存する文献を説明することができる。いくつかの報告は，Ｔ抗原が異数性および遺伝的不安定性を誘導し，構造と数の両方での染色体異常を引き起こしうることを示している（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｌｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ，１９９１；Ｗｏｏｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。元々，この不安定性は，おそらくＴ抗原がｐ５３蛋白質と相互作用してこれを不活性化させる能力のためであろうと提唱されていた。しかし，その後，ｐ５３と相互作用できないＴ抗原のアミノ末端１４７アミノ酸フラグメントがなお効率的に不安定性を誘導することができること，およびｐＲＢとの相互作用も遺伝的不安定性の誘導には厳密には必要ないことが示された（Ｗｏｏｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。さらに，体細胞におけるｐ５３の喪失によっては異数性が生じないが，４倍体化の若干の傾向が認められたことが示された（Ｂｕｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。すなわち，Ｔ抗原が核型の不安定性を引き起こすかまたは核内倍加を誘導するメカニズムは不明である。
【００１５】
ゲノム不安定性を誘導するにはアミノ末端で十分であることが示されているため，Ｔ抗原のＮ末端ドメインをベイトとして，ＨｅＬａ  ｃＤＮＡライブラリをプレイとして用いて，酵母ツーハイブリッドスクリーニングを行った。このようにして同定された１つのツーハイブリッド相互作用物質は，ヒトＢｕｂ１蛋白質キナーゼ（有糸分裂紡錘体集合のモニターに関与するチェックポイント蛋白質（Ｃａｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  ＭｃＫｅｏｎ，１９９７））であった。ｂｕｂ（ベンズイミダゾールにより阻害されない発芽）およびｍａｄ（有糸分裂休止欠損）遺伝子は，最初に酵母遺伝子スクリーニングにおいて同定され（Ｈｏｙｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｌｉ  ａｎｄ  Ｍｕｒｒａｙ，１９９１），その後，哺乳動物の対応物が発見された。現在の知識は，Ｂｕｂ１はＢｕｂ３と共に，キネトコアにおける多蛋白質紡錘体チェックポイント複合体の成分であり，キネトコアにおける張力の欠失および／または微小管のキネトコアへの付着を感知することができることを示唆する（Ｍｉｌｌｂａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｓｋｏｕｆｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。単一のキネトコアが付着しない場合であってもシグナルが生成し，シグナリングカスケードにより伝達され，最後に，後期促進複合体／シクロソーム（ＡＰＣ／Ｃ）と称されるユビキチンリガーゼ複合体が阻害され，中期から後期への移行において細胞サイクルが一時的に休止する。このチェックポイントは，二価染色体が適切に有糸分裂紡錘体に付着することをモニターすることにより，有糸分裂で姉妹染色分体の正確な分離を確実にする。Ｂｕｂ１は，ある種のヒト癌，例えば結腸直腸癌において時々変異していることが見いだされており，これは染色体不安定性および増加した異数性により特徴づけられる（Ｃａｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｒｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｓｈｉｃｈｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【００１６】
本明細書に示されるＴ抗原変異体の遺伝学的分析は，Ｂｕｂ１への結合は，不死化にはなくてもよいあるが，トランスフォーメーションに必要であるかもしれないことを示す。さらに，Ｔ抗原は，紡錘体チェックポイントを無効にするが，ＴのＢｕｂ１非結合変異体はそうではない。この結果は，Ｔ抗原のトランスフォーミング活性の重要な追加のメカニズムを示唆する。
【００１７】
本発明者らは，Ｂｕｂ１と相互作用しないｄｌ８９−９７Ｔ抗原は，紡錘体傷害が存在する場合には核内倍加の誘導に欠陥があることを見いだした。
【００１８】
Ｔ抗原をコードするポリヌクレオチドを組換えＤＮＡまたはレトロウイルスベクターまたはコンストラクトに含有させて，細胞に形質導入／感染することができる。ベクターまたはコンストラクトはさらに，ＤＮＡの転写を開始するための適当なプロモーター領域および形質導入／感染を生じた細胞を同定するために用いることができる選択マーカーを含むことができる。発現の制御は，当業者に知られる方法により行うことができる。例えば，制御は，長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターを用いて行うことができる。その他のプロモーターは当業者に明らかであろう。例えば，制御は，サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを用いて行うことができる。ＣＭＶプロモーターは非常に強いプロモーターであり，細胞が神経細胞，例えば，感覚上皮幹細胞である場合に好ましい。
【００１９】
"Ｔ抗原"との用語は，ポリオーマウイルスファミリーのラージＴ抗原を表す。この用語は，天然のおよび改変されたものを含み，例えば，細胞を不死化する能力を保持した組換え型であるが，外部因子により制御しうるもの，例えば温度感受性変異体である。好ましいＴ抗原はＳＶ４０ウイルスに由来するものである。
【００２０】
好ましい態様は，ラージＴ抗原をコードする温度感受性変異体オンコジンである。ラージＴ抗原は，移植治療において用いるべき細胞にとって好ましい。野生型ラージＴ抗原は，腫瘍原性となるためには，活性化ｒａｓおよびスモールＴ抗原等の成分を必要とする。したがって，ラージＴ抗原それ自身は，制御されないトランスフォーメーションの可能性を低下させる。温度感受性変異体の使用は，抗原が制御されないトランスフォーメーションを誘導する能力をさらに低下させる。ただし，温度感受性変異体の使用は本発明において重要な限定ではない。
【００２１】
変異体は，好ましくは，Ｕ１９欠失，例えば，Ｕ１９  ｔｓＡ５８二重変異体の初期領域に対応するものを有するラージＴ抗原（配列番号１）をコードするヌクレオチド配列を含む（米国特許５２７０１９１を参照）。しかし，変異体は，配列番号１の８９−９７で示されるアミノ酸残基の１またはそれ以上が欠失しており，または前記残基の１またはそれ以上への変異を含む。この変異体の構築は以下に示される。Ｕ１９変異は，抗原がＳＶ４０複製起点に結合することを妨害し，複製起点を含むインテグレーションされたプロウイルスが安全であることを確実にする。適当なコンストラクトを細胞中に導入する方法は当業者に知られている。
【００２２】
温度感受性変異体の使用は，細胞の条件付き不死化に望ましい。これは，細胞を成長および複製に適した培養条件下に維持することができるが，移植されたときには制御されない成長が体温により阻害されるため，移植治療に有益であろう。
【００２３】
使用にあたっては，形質導入されたまたは感染した細胞が，さらにテロメラーゼ複合体（ｈＴＥＲＴ）の触媒サブユニットをコードするポリヌクレオチドを含むことが好ましい（国際出願ＷＯ−Ａ−０１／２１７９０を参照，その内容を本明細書の一部としてここに引用する）。本発明者らにより，Ｂｕｂ１欠失およびＵ１９欠失を含むＴ抗原と，ｈＴＥＲＴとを組み合わせて用いると，核型安定性および不死化が得られることが見いだされた。これらの成分を有する細胞は，不死特性を保持する二倍体細胞を生成する。
【００２４】
Ｔ抗原およびテロメラーゼをコードするポリヌクレオチドを組換えＤＮＡまたはレトロウイルスベクターまたはコンストラクトに含有させて，細胞に形質導入／感染させることができる。２つの成分を１つのベクター中に組み込んでもよく（バイシストロニック），またはそれぞれを別々のベクター中に含ませてもよい。本発明のベクターまたはコンストラクトは，さらに，形質導入／感染を生じた細胞を同定するために用いることができる，ＤＮＡの転写を開始するための適当なプロモーター領域および選択マーカーを含んでいてもよい。発現の制御は，当業者に知られる方法により行うことができる。例えば，制御は，長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター，例えば，モロニーネズミ白血病ウイルス由来のものを用いて行うことができる。当業者には別のプロモーターが明らかであろう。例えば，制御はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを用いて行うことができる。ＣＭＶプロモーターは非常に強いプロモーターであり，細胞が神経細胞，例えば感覚上皮幹細胞である場合に好ましいであろう。
【００２５】
本発明の好ましい（バイシストロニック）コンストラクトは，以下の順番の要素を有する：
ＬＴＲ−ｈＴＥＲＴ−ＣＭＶプロモーター−ＴＡｇ（Ｕ１９ｔｓＡ５８）−ＩＲＥＳ−ｎｅｏ−ＬＴＲ
上述のコンストラクトは，アミノ酸残基８９−９７の欠失のためＴ抗原中のＢｕｂ１結合部位が欠失している。このコンストラクトで用いられるＬＴＲはモロニーネズミ白血病ウイルスからのものであり，ＩＲＥＳはリボソーム内部侵入部位（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｅｎｔｒｙ  Ｓｉｔｅ）であり，ｎｅｏは遺伝子を細胞にトランスフェクションしたときにＧ４１８耐性を与える遺伝子である。
【００２６】
さらに別の好ましい態様においては，ｈＴＥＲＴは，プロモーターとしてのＬＴＲとともに別のコンストラクトとして用意し，これとは別のコンストラクトがＴ抗原を含む（Ｂｕｂ１変異を有する）。
【００２７】
いずれの哺乳動物細胞も本発明において用いることができる。例えば，細胞は内皮細胞であってもよく，脚，心臓および他の臓器の血管再生に用いることができる。好ましくは，細胞はヒト体細胞，例えば，特定の細胞タイプに分化しうるヒト上皮幹細胞である。特に好ましい細胞はヒト感覚上皮幹細胞であり，これは，神経移植において，細胞の喪失または傷害を修復するために，および行動的または心理学的欠損，例えばアルツハイマー病またはパーキンソン病を治すために用いることができる。あるいは，細胞は分化した細胞，例えばランゲルハンス島のβ細胞であってもよい。別の細胞としては，限定されないが内分泌腺から得られる細胞，網膜細胞，蝸牛細胞，肝臓細胞，骨芽細胞および破骨細胞，筋芽細胞，線維芽細胞およびケラチノサイトが挙げられる。別の細胞には，骨髄からの幹細胞または先祖細胞，例えば，中胚葉，内胚葉および外胚葉細胞タイプを有する幹細胞が含まれる。
【００２８】
さらに別の好ましい態様においては，細胞は乳房細胞，特に乳房管腔細胞または乳房線維芽細胞である。
【００２９】
形質導入されたまたは感染した細胞は，当業者に知られる条件下で培養することができる。細胞は非ストレス条件下で培養することが好ましい。当業者は，慣用の培養手法に基づいて，それぞれの特定の細胞タイプに適した条件を理解するであろう。
【００３０】
本発明にしたがうトランスフォームした／不死化した細胞は，治療に用いるための安定な細胞株を作製するために用いることができる。当業者に理解されるように，細胞は移植治療において用いることができる。
【実施例】
【００３１】
以下の実験は本発明を例示する。
酵母ツーハイブリッド分析
ヌクレオチド１−４０８を含むＴ抗原のアミノ末端フラグメントを，ＬｅｘＡ  ＤＮＡ結合ドメインとともにインフレームでｐＧｉｌｄａ（ガラクトース誘導性発現ベクター，ｐＥＧ２０２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から誘導）にクローニングした。ＭＡＴα  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＬＥＵ２選択株ＥＧＹ４８をＬｅｘＡ−Ｔ抗原ベイトおよびｐＪＫ１０３ＬａｃＺレポータープラスミドでトランスフォーメーションした。ＭＡＴａ  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＲＦＹ２０６株をＨｅＬａ  ｃＤＮＡライブラリ（ＧＡＬ１誘導性プロモーターの制御下でＢ４２アシドブロブ融合蛋白質を発現するｐＪＧ４−５ライブラリベクター）でトランスフォーメーションした。２つの株を交配させ，ロイシンを欠失した選択培地に播種し，３０℃で４日間培養して，相互作用物質を選択した。得られたコロニーを，ロイシンを欠失した培地上でガラクトース依存性成長について，およびＸ−Ｇａｌを含む培地上でガラクトース依存性の青色について分析した。最も強いポジティブコロニーからのプラスミドＤＮＡを回収し，Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＳ４にトランスフォーメーションした。ライブラリプラスミドをコロニーＰＣＲにより同定し，ＨａｅＩＩＩ制限酵素消化パターンにより分類した。ＬｅｘＡ−Ｔ抗原ベイトと特異的に相互作用したクローンを配列決定し，ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬデータベースを用いるＢＬＡＳＴ配列比較により同定した。
【００３２】
細胞および細胞培養
ｔｓａ８，ｔｓａ１４，ＳＶ４，Ｕ２ＯＳ，２９３Ｔ，Ｒａｔ−１，ＮＩＨ３Ｔ３，ＢＯＳＣ２３およびフェニックス（Ｐｈｏｅｎｉｘ）両栄養性細胞は，標準的な方法により増殖させた（Ｇｊｏｅｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｊａｔ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，１９８９）。ＮＩＨ３Ｔ３／Ｔ細胞は，ＮＩＨ３Ｔ３細胞をｐＳＥ（ＳＶ４０初期領域をコード）および選択プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏでコトランスフェクションすることにより得た。ＮＩＨ３Ｔ３／Ｖ細胞は，ＮＩＨ３Ｔ３細胞をｐＫＳ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびｐＳＶ２ｎｅｏでトランスフェクションすることにより得た。Ｕ２ＯＳ細胞の安定な細胞株は，野生型または変異体Ｔ抗原発現ベクターをピューロマイシン耐性ベクターｐＥ−ｐｕｒｏ（Ｇｊｏｅｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）とともにコトランスフェクションすることにより生成した。
【００３３】
レトロウイルス感染および不死化アッセイ
レトロウイルスは，ｐＢａｂｅ−ｐｕｒｏベクターをＰｈｏｅｎｉｘ両種性またはＢＯＳＣ２３同種指向性産生細胞にトランスフェクションすることにより作製した。トランスフェクションの４８時間後に回収したウイルス上清を用いて感染させ，次に１．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを用いて感染した培養物を選択した。不死化アッセイは，先に記載されているように，二次ＲＥＦを用いて行った。選択の１４日後に代表的な皿を染色し，コロニーの数を測定した。各変異体Ｔ抗原について少なくとも６個のコロニーを単離し，拡張して，細胞株を確立することができるか否かを判定した。
【００３４】
プラスミドおよび変異誘発
野生型Ｔまたは変異体Ｔ抗原をコードするｐＳＧ５発現ベクターは先に記載されている（Ｇｊｏｅｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｓｔｕｂｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｚａｌｖｉｄｅ  ａｎｄ  ＤｅＣａｐｒｉｏ，１９９５）。野生型Ｔ抗原またはそれぞれの変異体をコードする組換えレトロウイルスは，ｃＤＮＡをｐＢａｂｅ−ｐｕｒｏレトロウイルスベクター（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｄ，１９９０）に挿入することにより作製した。Ｔ抗原の残基８９と９７の間の領域における点突然変異体は，Ｑｕｉｋ  Ｃｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により作製した。Ｂｕｂ１発現ベクターは，ＨＡ−タグ付き全長ネズミＢｕｂ１（Ｊ．ｖａｎＤｅｕｒｓｅｎにより提供（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００１））をｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入することにより構築した。ｍＢｕｂ１のキナーゼ不活性変異体（Ｋ７９５Ａ；（Ｋａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｓｈａｒｐ−Ｂａｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，２００１））は，部位特異的変異誘発により作製した。
【００３５】
ＤＮＡに基づくＲＮＡｉベクターｐＳｕｐｅｒは先に記載されている（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ｓｉＲＮＡオリゴを用いるＢｕｂ１のサイレンシングに成功したものと同じ配列を標的とするよう設計されたデュープレックスオリゴ［５’ＧＡＴＣＣＣＣＧＡＴＧＣＡＴＴＴＧＡＡＧＣＣＣＡＧＴＴＴＣＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＧＧＣＴＴＣＡＡＡＴＧＣＡＴＣＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡ３’（配列番号２），５’ＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＧＡＴＧＣＡＴＴＴＧＡＡＧＣＣＣＡＧＴＴＣＴＣＴＴＧＡＡＡＣＴＧＧＧＣＴＴＣＡＡＡＴＧＣＡＴＣＧＧＧ３’（配列番号３］をｐＳｕｐｅｒに挿入し，２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした。
【００３６】
ｓｉＲＮＡオリゴによるサイレンシング
基本的にＥｌｂａｓｈｉｒら（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）により推奨されるような，Ｂｕｂ１を標的とするよう設計されたオリゴは，Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）から得た。デュープレックスオリゴは，"Ｂｕｂ１センス"（５’ＧＡＵＧＣＡＵＵＵＧＡＡＧＣＣＣＡＧＵｄＴｄＴ３’；配列番号４）および"Ｂｕｂ１アンチセンス"（５’ＡＣＵＧＧＧＣＵＵＣＡＡＡＵＧＣＡＵＣｄＴｄＴ３’；配列番号５），であり，ヒトＢｕｂ１ＡＴＧ出発コドンに対してヌクレオチド１４９０−１５１２の領域を標的とする。
【００３７】
顕微鏡
ＮＩＨ３Ｔ３細胞は，コンフルエンスから播種した１２時間後，２０−８０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度のノコダゾールで約１２時間，１０μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８で少なくとも２時間処理し，顕微鏡で分析した。
【００３８】
フローサイトメトリおよび細胞同期化
Ｕ２ＯＳ細胞を１００ｎｇ／ｍｌのノコダゾールで４８時間処理し，その後に細胞を培地から回収し，氷冷ＰＢＳで２回洗浄し，氷冷７０％エタノール中で固定し，ヨウ化プロピジウムで染色し，ＦＡＣＳにより分析した（Ｇｊｏｅｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ＤＣＢ実験用には，細胞をノコダゾールで処理し，有糸分裂停止した細胞をシェイクオフにより回収した。次にこれらの細胞を洗浄し，１０μＭのＤＣＢの存在下で再播種して１８時間処理し，先に概説されているようにしてＦＡＣＳにより分析した（Ａｎｄｒｅａｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【００３９】
抗体，免疫沈殿およびウエスタンブロッティング
免疫沈殿およびウエスタンブロッティングは標準的な方法により行った（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９９０）。簡単には，細胞をＴＥＢ溶解バッファ［２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌｐＨ７．５，１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，１％  ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０，１０％グリセロール，１０μｇ／ｍｌのロイペプチン，１０μｇ／ｍｌのペプスタチン，０．５ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル］で抽出した。ノコダゾール処理ＮＩＨ３Ｔ３細胞を培地中で回収して，Ｇ２／Ｍ期の細胞を廃棄しないようにした。合計２０−３０μｇの総蛋白質をＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてウエスタンブロッティングにより分析した。用いた抗体は以下のとおりである：Ｔ抗原マウスモノクローナル抗体ＰＡｂ４１６，ＰＡｂ４１９，ＰＡｂ４２３およびＰＡｂ１００；Ｂｕｂ３ウサギポリクローナル抗体（Ｐ．Ｓｏｒｇｅｒより入手）；サイクリンＢ１（ＧＮＳ１）マウスモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），セキュリンウサギポリクローナル抗体（Ｍ．Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒより贈与）。共免疫沈殿実験においては，Ｂｕｂ１蛋白質は，Ｔ抗原を最Ｃ末端を認識するモノクローナル抗体（ＰＡｂ４２３）で免疫沈殿した後においてのみ，見ることができた。これは，Ｔ抗原をモノクローナル抗体ＰＡｂ４１６，ＰＡｂ４１９またはＰＡｂ１００で免疫沈殿させたときには検出されず，これはおそらく結合部位のアクセス可能性が低下したためであろう。我々のＮ−末端およびＣ−末端Ｂｕｂ１ポリクローナル抗体は，それぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼにインフレームで融合させたｈＢｕｂ１アミノ酸１−３０３または６９１−１０８５を用いてウサギで生成させた。融合蛋白質は不溶であったため，標準的な方法によりインクルージョンボディーを精製して免疫に用いた（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９９０）。さらに，他の起源からのＢｕｂ１抗体を用いて，Ｔ抗原／Ｂｕｂ１相互作用を分析した（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｅｘｐｏｓｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【００４０】
キナーゼアッセイおよびＶ８ホスホペプチドマッピング
インビトロキナーゼアッセイ用には，アフィニティー精製Ｂｕｂ１ポリクローナル抗体（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）を用いて標準的なプロトコルにより免疫沈殿を行った。細胞抽出は，２ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＴＥＢで行った。プロテインＡセファロースビーズをＴＥＢで２回，キナーゼバッファ［５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌｐＨ７．５，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2，１ｍＭＮａＦ，１０ｍＭｂ−グリセロホスフェート，１ｍＭＤＴＴ］で２回洗浄した。５μＣｉγ−［32Ｐ］ＡＴＰおよび２０μＭコールドＡＴＰを補充した３０μｌのキナーゼバッファをビーズに加えることにより，インビトロキナーゼ反応を開始した。Ｖ８マッピングは，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄら（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７）に報告される基本的概要にしたがって行った。この目的は，異所的に発現したＨＡ−ｍＢｕｂ１ホスホペプチドパターンをＮＩＨ３Ｔ３／ＶまたはＮＩＨ３Ｔ３／Ｔ細胞の内因性ｍＢｕｂ１のものと比較することである。インビトロキナーゼ反応は，ＮＩＨ３Ｔ３／ＶまたはＮＩＨ３Ｔ３／Ｔ細胞の溶解物からの内因性Ｂｕｂ１についてＢｕｂ１抗体を用いて行い，およびこれと平行して，ＨＡ−ｍＢｕｂ１でトランスフェクションしたＵ２ＯＳ細胞溶解物についてＨＡｔａｇ（Ｃｏｖａｎｃｅ）に対するＨＡ．１１モノクローナル抗体を用いて行った。反応液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し，内因性Ｂｕｂ１または異所的に発現したＨＡ−ｍＢｕｂ１のいずれかに対応すると考えられるバンドを切り出した。第２のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーンにアクリルアミド片を注意深く置いた。スタッキングゲルの３分の２まで達したときに，ゲルスライス中の蛋白質を１０または５０ｎｇのＶ８プロテアーゼ（Ｓｉｇｍａ）で３０分間消化した。
【００４１】
フォーカス形成アッセイ
この実験は，低継代のＲａｔ−１細胞について，Ｔ抗原ｃＤＮＡ発現ベクターを用いて先に記載されているようにして行った（Ｋａｌｄｅｒｏｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９８４）。フォーカスは，トランスフェクションの約３週間後に０．５％クリスタルバイオレットで染色することにより可視化した。アッセイは４−５回繰り返し，図５に示される実験と非常に近い結果が得られた。
【００４２】
ＴＡｇ（Ｕ１９ｔｓＡ５８ｄｌ８９−９７）の三重変異体の構築
変異体は，ｄｌ８９−９７（すなわち，配列番号１のアミノ酸８９−９７を欠失）ラージＴｃＤＮＡからの前部４００ヌクレオチドを，Ｕ１９ｔｓＡ５８変異体（Ａｌｍａｚａｎ＆ＭｃＫａｙ，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，１９９２；５７９（ｓ）：２３４−２４５に記載）からの初期領域の残りに融合させることにより構築した。Ｕ１９ｔｓＡ５８は，Ｕ１９とｔｓＡ５８との融合により得られた二重変異体である。この構築は，２つのプラスミドｐＺｉｐＮｅｏＳＶＵ１９ｔｓＡ５８およびｐＢａｂｅｄｌ８９−９７を用いて行った。ｐＺｉｐＮｅｏＳＶＵ１９ｔｓＡ５８は，ＢａｍＨ１部位の間に挿入された二重変異体の全領域を有する。挿入物はＢｇｌ１（ｎｕｃ５２３５）からＨｐａ１（ｎｕｃ２６６６）に対応し，平滑化した後にＢａｍＨ１リンカーを用いてｐＺｉｐＮｅｏＳＶ（Ｘ）１のＢａｍＨ１部位に挿入された。
【００４３】
ｐＢａｂｅｄｌ８９−９７は，ＢａｍＨ１に挿入されたラージＴのｃＤＮＡを有する。この挿入物は，ＡＴＧ（ＳＶ４０中のおよそｎｕｃ５１６４）に設けられたＮｃｏ１部位からポリＡ部位の下流のＢａｍＨ１部位（ｎｕｃ２５３３）までである。
【００４４】
キメラは，ｄｌ８９−９７プラスミド（８９−９７のｃＤＮＡの前部）のＢａｍＨ１−Ｅａｒ１フラグメント（ＳＶ４０中のｎｔ４４２８）とｐＺｉｐＮｅｏＳＶＵ１９ｔｓＡ５８のＥａｒ１−ＢａｍＨ１フラグメントを融合させることにより作製した。このラージフラグメントは，ベクターの残りならびにＳＶ４０初期領域の残りを供給する。酵素部位が複数存在するため，ラージフラグメントはＥａｒＩからＤｒａＩＩＩおよびＤｒａＩＩＩからＢａｍＨ１の２つの部分から構築した。この結果，ｄｌ８９−９７からの前部，およびＵ１９（Ｕ１９変異は真中のフラグメント中の２アミノ酸変異に対応する）ｔｓＡ５８（ｃ−末端中の１個のアミノ酸の変化）からの後部を有するｃＤＮＡが構築された。これは，本質的に３つの変異，ｄｌ８９−９７，Ｕ１９およびｔｓＡ５８を有するｃＤＮＡであるｐＺｉｐＮｅｏＳＶｄｌ８９−９７Ｕ１９ｔｓＡ５８プラスミドである。
【００４５】
ｈＴＥＲＴ／Ｂｕｂ１／Ｕ１９変異体細胞株の構築
作製した細胞株の概要
６種類の異なる不死化細胞株を作製した：３株はヒト乳房線維芽から，３株はヒト乳房管腔細胞から，以下のようにして作製した。
以下のウイルスコンストラクトで感染させたヒト線維芽細胞株：
１．  ＴＡｇ（Ｕ１９ｔｓＡ５８ｄｌ８９−９７）／ｈＴＥＲＴ（ＴＡｇ三重変異体）。この細胞株をＨＭＦｔｓ４と称した。
２．  ＴＡｇ（Ｕ１９ｄｌ８９−９７）／ｈＴＥＲＴ（ＴＡｇ二重変異体，すなわち，ＴＡｇは温度感受性ではない）。この細胞株をＨＭＦＵ１９と称した。
３．  ＴＡｇ（Ｕ１９ｔｓＡ５８）／ｈＴＥＲＴ（ＴＡｇ二重変異体，すなわち，Ｂｕｂ１変異ｄｌ８９−９７がない）。この細胞株をＨＭＦ２６と称した。
【００４６】
以下のウイルスコンストラクトで感染させたヒト乳房管腔細胞：
４．  ＴＡｇ（Ｕ１９ｔｓＡ５８ｄｌ８９−９７）／ｈＴＥＲＴ（ＴＡｇ三重変異体）。この細胞株をＬＴＳ４と称した。
５．  ＴＡｇ（Ｕ１９ｄｌ８９−９７）／ｈＴＥＲＴ（ＴＡｇ二重変異体，すなわち，ＴＡｇは温度感受性ではない）。この細胞株をＬＵ１９と称した。
６．  ＴＡｇ（Ｕ１９ｔｓＡ５８）／ｈＴＥＲＴ（ＴＡｇ二重変異体，すなわち，Ｂｕｂ１変異ｄｌ８９−９７がない）。この細胞株をＬ８／１３と称した。
【００４７】
細胞株番号１および３の生成のための材料および方法
種々のコンストラクトについて同じ一般的方法論を用いて，他の細胞株を作製した。
ＴＡｇ（すなわち，ラージＴ抗原）三重変異体コンストラクトの生成は，上述したように行い，これを用いてｔｅｆｌｙａ系を利用して安定な両種産生細胞株を作製した。これらの細胞からの両種性ウイルスを用いて，ｈＴＥＲＴを発現するレトロウイルスとともに，ヒト乳房管腔細胞およびヒト乳房線維芽細胞に感染させた。細胞はＧ４１８とハイグロマイシン（三重変異体コンストラクト上のｎｅｏ遺伝子およびｈＴＥＲＴコンストラクト上のハイグロマイシン耐性遺伝子による）とで二重に選択した。薬剤選択の後，形質導入した細胞をバルクで維ＴＡｇの許容温度である３３℃で持し，ＴＲＡＰ活性についてアッセイし，ウエスタンブロットでＴＡｇ発現を調べた。
【００４８】
次に，これらの感染細胞のバルク培養物を数ラウンドのクローン密度播種を行った。これは，細胞をプレートから取り出し，ネガティブソートを行って残留する筋上皮細胞を除去し，次に細胞を再クローニングすることにより行った。初代乳管腔細胞の正常な複製能力は約２０回の個体数倍加であり，これはクローン密度で播種した後の１継代とほぼ等しい。本発明者らは先に，ＴＡｇは細胞寿命を８０回個体数倍加（４−６回の連続するクローン継代）まで延長することができることを見いだした。このことにより，ＴＡｇのみにより誘導された延長された寿命を急速に減少させることができ，ｈＴＥＲＴおよびラージＴＡｇを発現する細胞およびその変異体がこの限界を超え，不死化したか否かを判定することが可能となった。
【００４９】
クローンレベル８においては，ＴＡｇおよびテロメラーゼ活性単独の再構成はこれらのヒト細胞の不死化には不十分であることが示されたが，一方，ｈＴＥＲＴとＴＡｇとの組み合わせは容易にこれらを不死化した。これらの成分は，異なるウイルスから別々に提供してもよく，またはバイシストロニックレトロウイルスを用いて一工程で提供してもよい。ＴＡｇとＢｕｂ１との相互作用は，ｈＴＥＲＴと組み合わせた乳房管腔上皮細胞の不死化には必要ではなかった。
【００５０】
この長期間の培養の後，細胞を核型決定して，その核型安定性を判定した。すなわち，これらが二倍体であるかまたは二倍体に近いことを確認した。
【００５１】
結果
酵母ツーハイブリッド分析によりＢｕｂ１は新規のＴ抗原相互作用物質であると同定された
図１ａに示されるように，ＬｅｘＡ  ＤＮＡ結合ドメインとインフレームで融合したヌクレオチド１−４０８（Ｔ抗原のアミノ酸１−１３６をコードする）を含むラージＴ抗原のアミノ末端フラグメントをベイトとして用いた。ＬｅｘＡ−Ｔ抗原ベイトおよびＬａｃＺレポータープラスミドをＭＡＴα  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＬＥＵ２選択株にトランスフォームした。得られた株を，Ｂ４２転写アクチベータとの融合蛋白質として発現されるＨｅＬａ  ｃＤＮＡライブラリを有するＭＡＴａ株と交配させ，ロイシンを欠失した選択培地上に播種して，相互作用物質を選択した。およそ３ｘ１０5個の二倍体細胞をスクリーニングし，３０°Ｃで４日間インキュベーションした後に，１２２個のＬＥＵ＋コ
ロニーを回収した。これらのうち，７２個のコロニーは，ロイシン欠失培地上でガラクトース依存性成長を示し，Ｘ−Ｇａｌを含む培地上でガラクトース依存性の青色を示した。最も強い表現型を有する４２個のコロニーを配列決定し，ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬデータベースを用いてＢＬＡＳＴ配列比較を行った。トランスフォームし成長した４２個のコロニーのうち，３９個はｂ−チューブリンであり，２個はＣＯＰＩＩ小胞コート蛋白質であり，第３のものはＢｕｂ１の蛋白質の保存キナーゼドメインを含むカルボキシ末端（アミノ酸６００−１０８５をコード）の単一クローンであることが示された（図１ｂ）。これらの３つの相互作用物質のそれぞれを表すクローンを再トランスフォーメーションしたところ，Ｂｕｂ１のみが真の相互作用物質であることが示された。
【００５２】
Ｔ抗原およびＢｕｂ１は共免疫沈殿によって示されるように相互作用する
酵母ツーハイブリッドの結果を確認するためには，広範な種類の細胞株，例えば，ラットｔｓａ，マウスＮＩＨ３Ｔ３およびヒトＵ２ＯＳ細胞から調製した哺乳動物細胞溶解物からの全長内因性蛋白質を用いて，Ｔ抗原とＢｕｂ１との相互作用を示すことが必要であった。ｔｓａ８および１４細胞は，熱不安定性ｔｓＡ５８Ｔ抗原を有するラット胚線維芽を不死化させることにより誘導された条件的不死化細胞株である（Ｊａｔ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，１９８９）。これらの細胞株は，許容温度（３３°Ｃ）では連続的に成長するが
，ｔｓＡ５８Ｔ抗原が急速に不活性化される非許容温度（３９．５°Ｃ）にシフトすると
，細胞サイクルのＧ１およびＧ２期での不可逆的な成長休止を生ずる，（Ｊａｔ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，１９８９）（図２ａ）。Ｔ抗原およびＢｕｂ１は，許容温度においてのみｔｓａ細胞から相互的に共免疫沈殿することができた（図２ａ）。３３℃および３９．５℃における抗体の親和性および蛋白質−蛋白質相互作用の安定性の対照としてＳＶ４細胞を用いた。これはラット胚線維芽を野生型Ｔ抗原で不死化することにより誘導されたものであり，いずれの温度でも連続的に増殖することができる。Ｔ抗原およびＢｕｂ１は，ＳＶ４細胞において，３３℃および３９．５℃のいずれでも相互作用した。無関係抗体を用いた対照免疫沈殿は，共免疫沈殿が特異的であることを示した（データ示さず）。直接免疫ブロッティングから，Ｂｕｂ１はｔｓａ細胞中でいずれの温度でも発現されるが，一方，Ｔ抗原は３３℃においてのみ存在することが示された（図２ａ）。
【００５３】
Ｔ抗原は，異所的にＴ抗原を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＮＩＨ３Ｔ３／Ｔ）からもＢｕｂ１とともに共沈殿した（図２ｂ）。対照としては，親ＮＩＨ３Ｔ３および空ベクターを発現するＮＩＨ３Ｔ３（ＮＩＨ３Ｔ３／Ｖ）を用いた。また，Ｔ抗原を安定的に発現するヒトＵ２ＯＳ細胞（Ｕ２ＯＳ／Ｔ）における相互作用も調べた。最初に，これらの細胞において，ｓｉＲＮＡ技術を用いてＢｕｂ１抗体の特異性を確認した。免疫ブロッティングにより判定した内因性Ｂｕｂ１のレベルは，Ｂｕｂ１を標的とする特異的ｓｉＲＮＡデュープレックスでトランスフェクションすると有意に低下した（図２ｃ）。次に，Ｕ２ＯＳ／Ｔ細胞においてＴ抗原がＢｕｂ１と共免疫沈殿することが示された（図２ｄ）。合わせると，これらのデータは，Ｂｕｂ１またはＴ抗原抗体のいずれかを用いた共免疫沈殿によりアッセイされたように，Ｂｕｂ１およびＴが相互作用すること，およびこの相互作用は広範な種類の細胞株において検出することができることを示す。
【００５４】
Ｔ抗原とＢｕｂ１とが生物学的パートナーであれば，Ｔ抗原はＢｕｂ１と複合体を形成することが知られている他の蛋白質と共沈殿するであろう。したがって，Ｔ抗原のＢｕｂ３（紡錘体集合チェックポイントの別の成分）との相互作用も試験した。Ｂｕｂ３は，酵母，マウスおよびヒト細胞においてＢｕｂ１との複合体中に見いだされている（Ｈｏｙｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｅｘｐｏｓｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。Ｂｕｂ３のＢｕｂ１への結合は，Ｂｕｂ１が結合していない染色体のキネトコアへの局在化に，したがって，有糸分裂紡錘体の正しい集合に必須であると考えられている（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。Ｔ抗原は，ｔｓａ（図２ａ）およびＮＩＨ３Ｔ３／Ｔ細胞（図２ｂ）の両方において，Ｂｕｂ３と共沈殿したことが認められ，このことは，Ｔ抗原およびＢｕｂ１−Ｂｕｂ３は同じ蛋白質複合体の成分であることを示唆する。
【００５５】
Ｔ抗原はＢｕｂ１キナーゼ活性を増強する
さらなる実験を行って，Ｔ抗原がＢｕｂ１に何らかの生化学的影響を有しているか否かを調べた。この目的のために，Ｂｕｂ１のキナーゼ活性を調べた。おそらくはＢｕｂ１の内因性キナーゼ活性が低いため，これまでのほとんどの研究は，精製した組換えＢｕｂ１または異所的に発現させたエピトープタグ付き蛋白質に焦点をあてていた（Ｋａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｅｘｐｏｓｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。しかし，Ｂｕｂ１キナーゼ活性の生理学的レベルを調べることとした。最初に，内因性Ｂｕｂ１キナーゼ活性について，ＮＩＨ３Ｔ３／ＶとＮＩＨ３Ｔ３／Ｔ細胞を比較して調べた（図３ａ）。細胞溶解物を抗Ｂｕｂ１抗体で免疫沈殿して，インビトロキナーゼアッセイを行った。比較のために，ＨＡ−ｍＢｕｂ１発現コンストラクトで過渡的にトランスフェクトしたＵ２ＯＳ細胞から抗ＨＡ抗体で免疫沈殿させた異所性ＨＡ−ｍＢｕｂ１もアッセイした。免疫沈殿に用いた総蛋白質の量を標準化したところ，Ｂｕｂ１自己リン酸化シグナルは，ＮＩＨ３Ｔ３／ＴからのもののほうがＮＩＨ３Ｔ３／Ｖ細胞からのものより常に強かった。さらに，バンドは異所性ＨＡ−ｍＢｕｂ１とともに移動した。しかし，これまでに内因性Ｂｕｂ１キナーゼ活性を示した報告はないため，検出されたバンドが真正のＢｕｂ１であることを確認することが必要であった。このため，Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｖ８プロテアーゼホスホペプチドマッピングを行って，推定内因性ｍＢｕｂ１と異所性ＨＡ−ｍＢｕｂ１の消化パターンを比較した。Ｖ８消化パターンの類似性の程度が高いことは，このバンドが実際に内因性Ｂｕｂ１を示すことを強く示唆する（図３ｂ）。外因性基質であるヒストンＨ１に対する内因性Ｂｕｂ１のインビトロキナーゼ活性を調べると，ＮＩＨ３Ｔ３／Ｔは活性についてもＮＩＨ３Ｔ３／Ｖ細胞より高いことがわかった（データ示さず）。
【００５６】
Ｕ２ＯＳ細胞におけるＢｕｂ１自己キナーゼシグナルは，ＮＩＨ３Ｔ３におけるよりも，再現性をもってより明らかでありかつより多かったため，この細胞システムに焦点をあててさらなる分析を行った。興味深いことに，標準化した量の総蛋白質でＢｕｂ１抗体を用いて行ったインビトロキナーゼアッセイ（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）は，Ｂｕｂ１自己リン酸化活性はＵ２ＯＳ／ＴにおいてＵ２ＯＳと比較して増強されていることを示した（図３ｃ）。ウエスタンブロッティングは，Ｕ２ＯＳにおいてＵ２ＯＳ／Ｔと比較して同等のレベルのＢｕｂ１を示した（図３ｃ）。
【００５７】
シグナルが内因性Ｂｕｂ１キナーゼ活性を表すことを確認するため，ｓｉＲＮＡ技術を用いた。図３ｄに示されるように，Ｂｕｂ１特異的ｓｉＲＮＡを４８時間トランスフェクションすると，Ｕ２ＯＳまたはＵ２ＯＳ／Ｔ細胞のいずれからもＢｕｂ１自己リン酸化シグナルが事実上完全になくなったが，対照ｓｉＲＮＡは影響を及ぼさなかった。図３ｃによれば，Ｕ２ＯＳ／ＴではＵ２ＯＳと比較してＢｕｂ１自己リン酸化活性が上昇した。バンドがＢｕｂ１発現に依存するものであることをさらに確認するために，Ｂｕｂ１ｍＲＮＡの同じ領域を標的とするｓｉＲＮＡオリゴとしてＤＮＡ系ＲＮＡｉベクターであるｐＳｕｐｅｒ（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）でトランスフェクションした。これらの実験は，高度にトランスフェクション可能でありＴ抗原を発現し，したがってＢｕｂ１自己リン酸化シグナルを測定しうることが確実なヒト２９３Ｔ細胞において行った。Ｂｕｂ１自己リン酸化シグナルは，ＤＮＡ系Ｂｕｂ１ＲＮＡｉベクター（ｐＳｕｐｅｒＢｕｂ１）でトランスフェクションした細胞において，空ベクター（ｐＳｕｐｅｒ）と比較して実質的に低下していることが明らかであった（図３ｅ）。Ｂｕｂ１キナーゼ活性のサイレンシングにともなって，さらに，約１０５ｋＤａおよび３００ｋＤａの２つの別のバンドの強度が低下した。これらの２つのバンドは，Ｂｕｂ１キナーゼの細胞標的である可能性がある。
【００５８】
インビトロキナーゼアッセイにおけるＢｕｂ１のリン酸化が共沈殿したキナーゼによるものである可能性があったため，この可能性を確かめる実験を行った。ＨＡタグ付きｍＢｕｂ１発現ベクター（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１），またはＡＴＰ結合モチーフの重要なリジンに変異を有し，したがってキナーゼ欠損であると推定されるＨＡタグ付きｍＢｕｂ１をコードするベクター（ｍＢｕｂ１Ｋ７９５Ａ）のいずれかでＵ２ＯＳ細胞をトランスフェクションした。図３ｆに示されるように，ＨＡ−ｍＢｕｂ１トランスフェクタントからの抗ＨＡ免疫沈殿物は，Ｂｕｂ１インビトロキナーゼ活性が高いことを示した。これとは明らかに対照的に，ＨＡ−ｍＢｕｂ１Ｋ７９５Ａ変異体（図３ｆでは"ＫＤ"として示す）は，自己リン酸化シグナルが消失していたため，予測されたように真にキナーゼ欠損であることが証明された。抗ＨＡ抗体を用いるウエスタンブロットは，野生型およびキナーゼ欠損ｍＢｕｂ１が同様のレベルで発現されていることを示した（図３ｆ，下）。これらのことを合わせると，これらの実験は，インビトロキナーゼ反応におけるＢｕｂ１に対応するシグナルのほとんどは，関連するキナーゼによるそのリン酸化ではなく自己リン酸化に起因するものであること，およびＴ抗原発現の結果としてそのキナーゼ活性が刺激されたことを示唆する。
【００５９】
Ｔ抗原／Ｂｕｂ１複合体形成の遺伝的分析
Ｔ抗原上のＢｕｂ１結合部位を同定するために，アミノ末端側の１３６アミノ酸中で先に単離されている変異体を用いた。最初の実験は，Ｔ抗原または種々の変異体を安定に発現するＵ２ＯＳ株を用いて行った。図２ｄに示されるように，Ｔ抗原の欠失変異体であるｄｌ８９−９７（Ｓｔｕｂｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）は，共免疫沈殿アッセイにおいてＢｕｂ１に結合することができなかったが，野生型Ｔ抗原は有意な結合を示した。ｐＲＢファミリーメンバーに結合できないＴ抗原変異体であるＫ１（Ｋａｌｄｅｒｏｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９８４）は，Ｂｕｂ１への結合を保持していた（図２ｄ）。同様に，欠陥ＤｎａＪドメインを有するＤ４４Ｎ変異体（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）もＢｕｂ１への結合を保持していた（データ示さず）。
【００６０】
これらの分析は，Ｂｕｂ１とＴ抗原との結合には，Ｔ抗原の残基８９−９７中の１またはそれ以上のアミノ酸が必要であることを示す。相互作用部位をより正確にマッピングするため，点突然変異体を作製した。Ｔ抗原の変異すべき特定の残基の選択は，異なるポリオーマウイルスファミリーメンバーの間における保存を指標とした。図４ａに示されるように，マウスポリオーマウイルスＴ抗原を除くすべてのラージＴ抗原でモチーフ"ＷＥＸＷＷ"が保存されている。我々は，集中的に，部位特異的変異誘発（アラニンスキャニング変異誘発）により，保存モチーフ中のすべての残基ならびに周辺のアミノ酸をアラニンに変異させた。すなわち，結合アッセイにおいて試験するために，変異体Ｅ９０Ａ，Ｗ９１Ａ，Ｅ９２Ａ，Ｑ９３Ａ，Ｗ９４ＡおよびＷ９５Ａを作製した。変異体の発現用のｐＢａｂｅ−ｐｕｒｏベクターを調製し，レトロウイルス中にパッケージングし，これを用いてＲａｔ−１細胞を感染させ，ピューロマイシン選択後に安定な細胞株のプールを生成した。各培養物を溶解し，Ｂｕｂ１抗体で免疫沈殿させ，次にＴ抗原抗体で免疫ブロッティングを行った。平行して全細胞溶解物を分析して，免疫沈殿に用いたＴ抗原の量を評価した。図４ｂに示されるように，共免疫沈殿分析から，Ｒａｔ−１細胞Ｔ抗原もまたＢｕｂ１と会合しすること，および欠失変異体であるｄｌ８９−９７はこの相互作用に欠陥があることが明らかとなり，このことは，Ｕ２ＯＳ細胞における先のデータ（図２ｄ）と一致する。興味深いことに，それぞれのトリプトファン置換変異体（Ｗ９１Ａ，Ｗ９４Ａ，およびＷ９５Ａ）は，Ｂｕｂ１への結合が部分的に欠損しており，一方，変異体Ｅ９０Ａ，Ｅ９２ＡおよびＱ９３Ａは，Ｂｕｂ１に結合することができた。この結果は，"ＷＥＸＷＷ"モチーフ中の保存トリプトファン残基がＢｕｂ１への結合に鍵となる役割を果たすことを強調する。おそらくは驚くことではないが，単一のトリプトファン置換変異体はある程度の結合を保持していたが，一方，はるかに広い欠失変異体であるｄｌ８９−９７ではほぼ完全に欠損していた。興味深いことに，トリプトファン置換変異体，例えばｄｌ８９−９７変異体によりコードされるＴ抗原は，ＳＤＳ−ＰＡＧＥで異常な，より遅い移動度を示し，これは修飾が変化したためであろうと考えられる。
【００６１】
Ｂｕｂ１結合はＴ抗原媒介性不死化に不可欠である
二次ラット胚線維芽のレトロウイルス感染および続くピューロマイシン選択により，選択されたＴ抗原変異体の不死化の能力を調べた。ピューロマイシン選択の１４日後，代表的なディッシュを染色し，計数して各変異体の不死化効率を判定した。それぞれについて少なくとも６個のコロニーを単離し，拡大して，細胞株を樹立するか否かを判定した。図４ｃに示される２回の独立した実験のコロニー形成効率の結果は，Ｄ４４Ｎおよびｄｌ８９−９７変異体の両方が容易にコロニーを形成したことを示す。さらに，これらの変異体から単離したコロニーは，順次サブカルチャーしうる細胞株を容易に確立し，このことは，これらのいずれもラット胚線維芽を不死化しうることを示す。ｄｌ８９−９７変異体はコロニー形成において繰り返し野生型Ｔ抗原よりわずかに有効性が高かった（図４ｃ）。さらに，ラット胚線維芽の不死化について試験したところ，点突然変異体はすべて野生型Ｔ抗原と同等にまたはそれ以上に有効であった（データ示さず）。これらを合わせると，ｄｌ８９−９７変異体ならびに点突然変異体は，その構造が大きく破壊されている場合に予測されるような普遍的な欠陥を有するのではないことを示す。
【００６２】
遺伝的分析は，トランスフォーメーションにはＴ抗原とＢｕｂ１との相互作用が必要であることを示唆する
Ｂｕｂ１変異はこれまでにある種のヒト癌で同定されているため，Ｂｕｂ１とＴ抗原との相互作用がそのトランスフォーミング活性に寄与しているか否かを試験することが望ましい。Ｔ抗原トランスフォーミング活性を測定する１つのアッセイは，Ｒａｔ−１細胞において接触阻害に打ち勝って密集したフォーカスを形成するその能力に基づく（Ｋａｌｄｅｒｏｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９８４）。このため，野生型Ｔ抗原，欠失変異体ｄｌ８９−９７，またはそれぞれの点突然変異体をコードするｃＤＮＡ発現ベクターをＲａｔ−１細胞にトランスフェクションした。３週間後，クリスタルバイオレット染色により密集したフォーカスが認められた。驚くべきことに，変異体ｄｌ８９−９７ならびにトリプトファン置換変異体Ｗ９１Ａ，Ｗ９４ＡおよびＷ９５Ａのそれぞれは，フォーカス形成に重要な欠陥があったが，一方，変異体Ｅ９０ＡおよびＥ９２Ａは部分的な欠陥を示し，変異体Ｑ９３Ａは野生型Ｔ抗原と比較して影響を受けなかった。これらの結果は，ｄｌ８９−９７，Ｗ９１Ａ，Ｗ９４ＡおよびＷ９５Ａが最も重要な結合欠陥を示し，Ｑ９３Ａはあったとしても最も少なかったという，Ｂｕｂ１結合のデータと一致する。このことは，Ｒａｔ−１細胞において，有効なＴ抗原誘導性フォーカス形成にはＢｕｂ１との相互作用が必要であるかもしれないことを示唆する。
【００６３】
Ｔ抗原は紡錘体チェックポイントに影響を及ぼす
紡錘体集合チェックポイントを通った進行は，機能的有糸分裂紡錘体の存在に依存する。ノコダゾール等の微小管脱重合剤による紡錘体の破壊は，細胞を有糸分裂で休止させる（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｂｅｎｅｚｒａ，１９９６；Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  ＭｃＫｅｏｎ，１９９７）。Ｔ抗原，Ｂｕｂ１およびＢｕｂ３の間の相互作用が機能的であれば，Ｔ抗原発現はノコダゾールに対する細胞の正常な応答を変化させるであろう。実際，有糸分裂紡錘体チェックポイント欠損細胞の顕著な特徴は，微小管脱重合剤に応答した休止に欠陥があることである（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｂｅｎｅｚｒａ，１９９６；Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  ＭｃＫｅｏｎ，１９９７）。ノコダゾールに対する細胞の応答を調べるために，５０ｎｇ／ｍｌのノコダゾールで１２，１５または１９時間処理した後に，Ｕ２ＯＳ，Ｔまたはｄｌ８９−９７変異体を発現するＵ２ＯＳの分裂指数を調べた。分裂指数は，ＤＮＡをヘキスト３３３４２染色で可視化した後に，凝縮したクロマチンを有する細胞の比率を計数することにより計算した。図５ａのグラフに示されるように，Ｔ抗原発現細胞における分裂指数は，すべての時点において，Ｕ２ＯＳまたはｄｌ８９−９７変異体を発現するＵ２ＯＳより有意に低かった。これらの結果を確認するために，有糸分裂細胞のマーカーであるホスホヒストンＨ３に対する抗体で細胞を染色することによっても，分裂指数を決定した。そのＤＮＡをＤＡＰＩ染色で可視化することにより非有糸分裂細胞を計数した後，ホスホヒストンＨ３ポジティブ細胞の比率を計算した。この方法に基づいて，細胞をノコダゾールで１５時間チャレンジしたときに，４０．８％のＵ２ＯＳ／ｄｌ８９−９７およびわずか１４．６％のＵ２ＯＳ／Ｔに対して，３９．９％のＵ２ＯＳ細胞が有糸分裂した。Ｕ２ＯＳ／ＴまたはＵ２ＯＳ／ｄｌ８９−９７について，ホスホヒストンＨ３陽性細胞の代表的な視野を図５ｂに示す。分裂指数を測定する両方のアッセイ，すなわち，ヘキストによる染色またはホスホヒストンＨ３の染色から非常に類似した結果が得られ，野生型Ｔ抗原はチェックポイントを無効とすることにより分裂指数を実質的に低下させたが，Ｂｕｂ１結合変異体ｄｌ８９−９７はそうではなかったことを示した。紡錘体チェックポイントのバイパスは，ノコダゾールの存在下で，核内倍加を伴うはずである（Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  ＭｃＫｅｏｎ，１９９７）。表１に示されるように，ノコダゾール処理の後，４５．７％のＵ２ＯＳ／Ｔ細胞が核内倍加（＞４Ｎ  ＤＮＡの含有率）を示し，一方Ｕ２ＯＳおよびＵ２ＯＳ／ｄｌ８９−９７細胞においては，わずか２４．８％および２０．６％が核内倍加を示したことが認められた。
【００６４】
【表１】
2007527231.tif 000003
【００６５】
したがって，減少した分裂指数および増加傾向の核内倍加は，いずれもＴ抗原により誘導されるＢｕｂ１結合依存性の紡錘体チェックポイントの無効化と一致した。紡錘体チェックポイントの機能不全の更に別の尺度は，紡錘体チェックポイントが標的とする姉妹染色分体分離の阻害剤であるセキュリンの未熟分解である（Ｍｉｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。細胞は，ミモシン処理によりＧ１／Ｓ境界で同調させ，６時間放出させ，次に４０，５０または１００ｎｇ／ｍｌのノコダゾールに１２時間曝露して，紡錘体チェックポイントを誘発した。Ｕ２ＯＳおよびＵ２ＯＳ／ｄｌ８９−９７細胞は，ノコダゾール濃度を増加させるとセキュリンレベルが徐々に上昇し，一方，Ｕ２ＯＳ／Ｔ細胞は試験したすべてのノコダゾール濃度においてセキュリンのレベルは低かった（図５ｃ）。
【００６６】
野生型Ｔ抗原またはｄｌ８９−９７変異体のいずれかで不死化したラット胚線維芽の低レベルの紡錘体傷害に対する一時的応答を注意深く実験し比較するために，経時的干渉顕微鏡観察を行った。用量応答実験においては，２４ｎｇ／ｍｌのノコダゾールが，Ｔを発現する細胞とｄｌ８９−９７を発現する細胞に異なるように影響したことが見いだされた。この濃度のノコダゾールでは，約９０％のＴ発現細胞は最初に１つに集まり（ｒｏｕｎｄｕｐ）次に後期に進行することが観察された。残りの１０％の運命は不明である。後期に到達した細胞の大部分は次に細胞質分裂を完了せずに培養皿の底に再び接着した。これはおそらく微小管が解重合したためであろう。これに対し，９５％を越えるｄｌ８９−９７発現細胞は，最初に１つに集まったが，最終的には後期に到達せずに平らになった。代表的な野生型Ｔ発現細胞またはｄｌ８９−９７発現細胞の一時的ノコダゾール応答を図５ｄに示す。野生型Ｔ発現細胞およびｄｌ８９−９７発現細胞がこの濃度の紡錘体トキシンに対して異なるように応答したという知見は，野生型Ｔは紡錘体チェックポイントを無効とするがＢｕｂ１−結合変異体はそうではないという概念を強く支持する。
【００６７】
紡錘体チェックポイントで休止できないと，染色体が誤って分離するため，Ｕ２ＯＳ／Ｔ細胞を，ラギング染色体，後期クロマチン架橋および多核細胞（これらはすべて欠陥のあるチェックポイントを示す）の出現について調べた。Ｔを発現する細胞においてこれらの有糸分裂異常のすべてが観察された。クロマチン架橋（図６ＤおよびＥ），多核細胞（図６Ｃ）およびラギング中期染色体（図６ＡおよびＢ）の代表的な例を図６に示す。染色体ＤＮＡはＤＡＰＩ染色により可視化し，紡錘体は抗α−チューブリン免疫染色により観察した。セントロメアまたはキネトコアを可視化するために，ＡＮＡ−Ｃ抗セントロメアヒト自己免疫血清（図６Ｅ）または抗Ｂｕｂ１抗体（図６Ａ）のいずれかを用いて免疫蛍光を行った。後期ブリッジ，ラギング染色体および多核細胞の存在はすべて不完全なチェックポイントと一致した。
【００６８】
Ｔ抗原は多機能性蛋白質であるため，Ｔ抗原による紡錘体チェックポイントの破壊がＢｕｂ１結合と関連しており，Ｔの他の機能，特にｐ５３の結合とは関連していないことを示すことが必須であった。
【００６９】
ｐ５３は紡錘体集合チェックポイントそれ自体には必要ではないことが示されているが，四倍性を監視していると思われる有糸分裂後チェックポイントに必要であることが明確に示されている（Ａｎｄｒｅａｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｌａｎｎｉ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓ，１９９８；Ｍｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。細胞に紡錘体傷害を与えると，これらは中期から後期への移行において過渡的にしか休止しない。最終的に，細胞は"有糸分裂スリッページ（ｓｌｉｐｐａｇｅ）"と称されるプロセスにより休止から逃れ，次に四倍性チェックポイントに遭遇する。したがって，野生型ｐ５３を有する細胞は，長期間のノコダゾール処置後に，"Ｇ１様"期で４ＮＤＮＡ含量で休止するが，ｐ５３を有しない細胞は核内倍加を生ずる。ｄｌ８９−９７変異体が四倍性チェックポイントの克服に欠陥がある可能性を確かめるため，もっぱらｐ５３依存性四倍性チェックポイントを誘発するが，紡錘体集合チェックポイントを誘発しない細胞質分裂阻害剤であるジヒドロサイトカラシンＢ（ＤＣＢ）で細胞を処理した（Ａｎｄｒｅａｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。まず細胞をノコダゾール処理後に有糸分裂シェイクオフを用いて同期させ，次に，１０μＭＤＣＢ中に解放した。図７は，未処理ならびに有糸分裂的に同期した（有糸分裂シェークオフ）Ｕ２ＯＳ，Ｕ２ＯＳ／ｄｌ８９−９７およびＵ２ＯＳ／Ｔの細胞サイクルのプロファイルを示す。予測されたように，Ｕ２ＯＳ細胞をＤＣＢ中に解放すると，これらは野生型ｐ５３を有するため，４Ｎ  ＤＮＡ含量で休止したままであった。驚くべきことに，Ｕ２ＯＳ／ｄｌ８９−９７およびＵ２ＯＳ／Ｔ細胞の両方とも，有意かつ同等の核内倍加（Ｍ１ゲート中にそれぞれ４３．４％および４５．１％）を生じた。これらのことを合わせると，ｄｌ８９−９７変異体がｐ５３を機能的に不活性化しうること，およびその欠陥はＢｕｂ１結合の欠失と関連しているようであることが明確に示される。
【００７０】
核型安定性
細胞株Ｎｏ．１（ＨＭＦＴＳ４）
これらは２つの別々のウイルス：ＴＡｇ（Ｕ１９ｄｌ８９−９７ｔｓＡ５８）およびｈＴＥＲＴを感染させた線維芽細胞である。
染色体数は４６，すなわち二倍体であった。染色体範囲は３３−５９であった。１３個の細胞の計数は，３３，４０，４３，４４，４５，４６，４６，４６，４６，４６，４７，５９であった。１３個の細胞のうち１個で，１つの二重微小および２つの小染色体フラグメントが検出された。
【００７１】
細胞株Ｎｏ．２（ＨＭＦＵ１９）
これらは，２つの別々のウイルス，ｈＴＥＲＴおよびＴＡｇ（Ｕ１９ｄｌ８９−９７）を感染させたヒト乳房線維芽である。これは非温度感受性，非ＤＮＡ結合，非Ｂｕｂ１結合ＴＡｇである。染色体数は４４であった。染色体範囲は２９−４４であった。１０個の細胞の計数は，可変数の染色体数を有する二倍体であった。ただし，染色体調製の間にいくつかの染色体が失われたかもしれない。
【００７２】
細胞株Ｎｏ．３（ＨＭＦ２６）
このヒト乳房線維芽細胞株は，バイシストロニックウイルスを含み，中程度のレベルのＴ抗原および適当なレベルのｈＴＥＲＴを発現する。ＨＭＦ２６細胞は染色体数７１−７３の超三倍体（異数性）である。染色体の範囲は６９−７８であった。１０個の細胞の計数は，６９，７１，７１，７１，７３，７３，７３，７６，７６，７８であった。１０個の細胞のうち８個で染色体フラグメントが検出された。これらのデータは，数的および構造的な染色体異常を示す。
【００７３】
細胞株Ｎｏ．４（ＬＴＳ４）
これらは，２つの別々のウイルス，すなわち，ＴＡｇ（Ｕ１９ｄｌ８９−９７ｔｓＡ５８）およびｈＴＥＲＴを感染させた管腔細胞である。ＬＴＳ４細胞の染色体範囲は３６−５１であった。染色体数は５１である。６個の細胞の計数は３６，３７，３８，４８，５１，５１であった。染色体のフラグメントまたは狭窄は検出されなかった。細胞は二倍体（ｎ＝４６）に近い。
【００７４】
細胞株Ｎｏ．５（ＬＵ１９）
２つの別々のウイルス，すなわち，ｈＴＥＲＴおよびＴＡｇ（Ｕ１９ｄｌ８９−９７）で感染させた管腔細胞である。染色体の数は４６であり，すなわち細胞は二倍体である。ＬＵ１９細胞の染色体の範囲は４６−９３であった。１１個の細胞の計数は４６，４６，４６，４６，４８，４８，５０，５１，５５，７７，９３であった。３つの二倍体染色体ＬＵ１９細胞において染色体異常は見られなかった。
３個の細胞で染色体狭窄が検出された。１個の細胞で２つの二重微小が存在していた（画像／１２）。２つの細胞で小染色体フラグメントが検出された。１個の細胞で２つの二動原体染色体が見いだされた。
【００７５】
細胞株Ｎｏ．６（Ｌ８／１３）
２つの別々のウイルスから駆動されるＴＡｇ（Ｕ１９ｔｓＡ５８）およびｈＴＥＲＴで感染させた管腔細胞。Ｌ８／１３細胞中の染色体の数は決定できなかった。染色体範囲は４６−１２９であり，異数性を示した。７個の細胞の計数は４６，４８，６０，６２，６６，９８，１２９であった。このデータは，ほとんどの細胞で多数の染色体異常があることを示す。これらの細胞の１つでは２つの染色体フラグメントが検出された。
【００７６】
まとめると，Ｕ１９の欠失とＢｕｂ１結合部位を有するＴ抗原およびテロメラーゼ複合体（ｈＴＥＲＴ）の触媒サブユニットで一緒にトランスフォームした細胞は，安定性および不死化された特性を保持していることが見いだされた。特に，以下の順番で要素を有するコンストラクトは，発現レベル，不死化および核型安定性の間の最良のバランスを与える：
ＬＴＲ−ｈＴＥＲＴ−ＣＭＶプロモーター−ＴＡｇ（Ｕ１９ｔｓＡ５８ｄｌ８９−９７）−ＩＲＥＳ−ｎｅｏ−ＬＴＲ
【００７７】
核型安定性および不死化はＴＡｇが温度感受性であるか否か，および成分がバイシストロニックウイルスまたは別々のウイルスとして提供されるかによらない。
【００７８】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は，ツーハイブリッド分析において用いた種々の遺伝的コンストラクトを示す。
【図２】図２は，Ｔ抗原／Ｂｕｂ１結合実験の結果を示す。
【図３】図３は，Ｂｕｂ１キナーゼ活性の結果を示す。
【図４】図４は，種々のＴ抗原におけるＢｕｂ１結合ドメインの保存配列，および種々のＴ抗原変異の不死化効率を示す。
【図５】図５は，分裂指数の分析の結果を示す。
【図６】図６は，免疫染色後の染色体の可視化を示す。
【図７】図７は，ＤＣＢ処理後の細胞サイクルのプロファイルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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