(57)【要約】【課題】ＤＮＡ修復阻害剤を使用してヌクレアーゼ媒介性ゲノム修飾を増加させるための方法および組成物を提供すること。【解決手段】一局面において、細胞における標的化されたゲノム破壊のための方法が提供され、上記方法は：少なくとも１種のヌクレアーゼを上記細胞に投与するステップであって、上記ヌクレアーゼが、上記細胞における内因性ゲノム配列を開裂する、ステップと、典型的または代替的非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の少なくとも１種の阻害剤を上記細胞に投与するステップとを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１３年２月２５日に出願された米国仮出願第６１／７６９，０３８号（この開示は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
本開示は、ゲノム編集および治療学の分野に存する。
【背景技術】
【０００３】
標的ＤＮＡ部位に特異的に結合するよう設計された、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系およびホーミングエンドヌクレアーゼを含む操作されたヌクレアーゼは、ゲノム工学において有用である。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）およびＴＡＬＥＮ（Ｆｏｋ１−ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン融合体を含むＴＡＬＥＮ、メガＴＡＬおよびコンパクトＴＡＬＥＮを含む）は、ヌクレアーゼドメインに融合された操作された部位特異的ジンクフィンガーまたはＴＡＬエフェクタードメインを含むタンパク質である。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮは、種々の異なる種におけるゲノム修飾のための使用に成功している。例えば、あらゆる目的でその開示が参照によりその全体が組み込まれる、米国特許第７，８８８，１２１号、第８，４０９，８６１号、第８，５８６，５２６号、第７，９５１，９２５号、第８，１１０，３７９号、第７，９１９，３１３号、第８，５９７，９１２号、第８，１５３，３９９号、第８，３９９，２１８号ならびに米国特許出願公開第２００９０２０３１４０号、第２０１００２９１０４８号、第２０１００２１８２６４号および第２０１１００４１１９５号を参照されたい。その上、操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ  ＲＮＡ（「単一ガイドＲＮＡ」）の使用により、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を操作して、ゲノム工学を実行することができる（Ｊｉｎｅｌら（２０１２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７巻、８１６〜８２１頁）。例えば、米国特許仮出願第６１／８２３，６８９号を参照されたい。
【０００４】
このような操作されたヌクレアーゼおよび操作されたヌクレアーゼ系は、標的ヌクレオチド配列に二本鎖切断（ＤＳＢ）を作製することから、標的化された遺伝子座における相同組換えの頻度を１０００倍超増加させることができる。加えて、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および他の経路による部位特異的ＤＳＢの不正確な修復は、遺伝子破壊をもたらすこともできる。
【０００５】
哺乳動物細胞および植物細胞において、これらのＤＮＡ傷害は、広範囲の十分に特徴付けられたＤＮＡ修復経路によって修復される。例えば、ＣｉｃｃｉａおよびＥｌｌｅｄｇｅ（２０１０年）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．４０巻（２号）：１７９〜２０４頁ならびにＰｕｃｈｔａ（２００５年）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏ  ５６巻（４０９号）：１〜１４頁を参照されたい。これらの経路の選択は、ＤＮＡ傷害型および細胞周期の状態の両方に依存し、Ｇ１期では非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、Ｓ期中またはその後では相同組換え修復（ＨＤＲ：ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ）を選択する。しかし、所定の細胞周期状態における所定の傷害であっても、細胞は、修復のための様々な分子ツールから選ぶことができる。これらの経路は、第一に、誤りのない（ｅｒｒｏｒ−ｆｒｅｅ）経路を選び、第二に、最後の手段として誤りがちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）経路を選ぶ階層に従うと考えられる。
【０００６】
遺伝子療法またはゲノム工学におけるＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ等のヌクレアーゼまたはＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ等のヌクレアーゼ系の使用のために、開裂部位における所望の修復成果は、遺伝子破壊（例えば、不活性化）または遺伝子補正のいずれかである。例えば、Ｕｒｎｏｖら（２０１０年）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．１１巻（９号）：６３６〜４６頁を参照されたい。ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＦｏｋＩ開裂ドメインを含む人工ヌクレアーゼによって作製された５’側の４塩基オーバーハングの圧倒的多数は、より誤りがちな代替的ＮＨＥＪ（「Ａ−ＮＨＥＪ」）ではなく、典型的ＤＮＡ−ＰＫｃｓ依存性ＮＨＥＪ（「Ｃ−ＮＨＥＪ」とも称される）によって誤りなく修復される。一本鎖切断（ＳＳＢ）修復にも寄与する酵素であるポリ−（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ１）を含む複合体によって、Ａ−ＮＨＥＪを行うことができることが示された。あるいは、ＤＳＢは、小型のＤＮＡ配列相同性および損傷部位におけるＤＮＡ末端切除を使用することが公知のマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）等、他のさらにより誤りがちな経路によって修復することもできる（図１に示す）。ＤＳＢ修復経路は、誤りのない修復から誤りがちな修復への活性化の階層に従うため、誤りがちな修復を達成するためには、誤りのない経路を先ず阻害しなければならない。
【０００７】
哺乳動物細胞および植物細胞は、ＤＮＡ修復鋳型を利用できるのであれば、ＨＤＲを使用することもできる。この修復鋳型は、相同染色体や姉妹染色分体であっても、あるいは遺伝子療法の場合は、ドナーが標的化配列との相同性の領域を含有するのであれば、いずれかの遺伝子配列を有するトランスフェクトされた一本または二本鎖ＤＮＡドナー鋳型（例えば、導入遺伝子）であってもよい。ＨＤＲによる遺伝子補正を達成するためには、細胞は、ＮＨＥＪよりもＨＤＲが選ばれるＳ期でなくてはならないか、あるいは細胞は、ＨＤＲを頼る前に、そのＮＨＥＪ様修復という選択肢を全て使い尽くさなければならない。ＨＤＲ誘導のための別の可能なシナリオは、Ｇ１中に負ったＤＮＡ損傷をＳ期まで持続させることである。ＤＮＡ複製中にＤＮＡ複製フォークが持続的なＳＳＢおよびＤＳＢに遭遇する場合、複製フォークが崩壊してＤＳＢを形成することができ、これがその後、ＨＤＲ修復により修復される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第７，８８８，１２１号明細書
【特許文献２】米国特許第８，４０９，８６１号明細書
【特許文献３】米国特許第８，５８６，５２６号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊｉｎｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２年）３３７巻、８１６〜８２１頁
【非特許文献２】ＣｉｃｃｉａおよびＥｌｌｅｄｇｅ、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．（２０１０年）４０巻（２号）：１７９〜２０４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、ヌクレアーゼ媒介性の誤りのないＤＮＡ修復を、誤りがちなＤＮＡ修復事象およびＨＤＲ媒介性のＤＮＡ修復事象の両方にシフトさせて、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子破壊および標的化組込みを増強する方法および組成物が依然として求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本開示は、細胞における典型的および代替的ＮＨＥＪ機構による修復を阻害して、ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ）またはヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）によって媒介される遺伝子破壊を増加させるための方法および組成物に関する。例えば、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）および／またはポリ−（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１／２（ＰＡＲＰ１／２）の小分子阻害剤を使用して、これらのＮＨＥＪ  ＤＮＡ修復経路に重大な意味を持つ酵素活性を阻害することにより、ヌクレアーゼによる遺伝子破壊のレベルは、細胞に、代替ＮＨＥＪおよび／またはマイクロホモロジー媒介末端結合等、典型的ＮＨＥＪよりも誤りがちな修復経路を頼らせることにより増加される。加えて、ＮＨＥＪ経路の阻害は、適したドナーまたは修復鋳型の存在下におけるＨＤＲ標的化組込みの効率も増加させる。したがって、本明細書に記載されている方法および組成物は、宿主細胞におけるヌクレアーゼ媒介性遺伝子破壊およびヌクレアーゼ媒介性標的化遺伝子組込みの効率を有意に増加させる。
【００１２】
一態様において、細胞ゲノムのヌクレアーゼ媒介性開裂後に修復（例えば、典型的および／または代替的ＮＨＥＪ）を阻害する条件に細胞を晒すことにより、細胞における外因性ヌクレアーゼの遺伝子破壊（例えば、欠失および／または付加）を増加させるための方法が本明細書に記載されている。ある特定の実施形態において、本方法は、１種または複数のヌクレアーゼ（および／またはヌクレアーゼ（複数可）をコードしこれを発現する発現構築物もしくはｍＲＮＡ）を宿主細胞に導入するステップと、二本または一本鎖切断の修復（例えば、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ依存性の誤りのない典型的ＮＨＥＪ、またはＰＡＲＰ依存性の代替的ＮＨＥＪ）に関与するタンパク質の１種または複数の阻害剤を細胞に導入し、これにより、細胞におけるヌクレアーゼ媒介性遺伝子破壊を増加させるステップとを含む。ある特定の実施形態において、ある特定の修復経路の阻害は、修復の際により多くの誤りを細胞に導入し、これによりゲノムのヌクレアーゼ媒介性開裂後の遺伝子破壊を増加させる。図１も参照されたい。
【００１３】
別の態様において、細胞におけるヌクレアーゼ媒介性開裂後の標的化組込み（例えば、ＨＤＲによる）を増加させるための方法が本明細書に記載されている。ある特定の実施形態において、本方法は、（ｉ）１種または複数のドナー分子と共に１種または複数のヌクレアーゼ（および／または、ヌクレアーゼ（複数可）および必要に応じて１種もしくは複数の単一ガイドＲＮＡを発現するｍＲＮＡもしくは発現構築物）を宿主細胞に導入するステップと、（ｉｉ）二本または一本鎖切断の修復に関与するタンパク質の１種または複数の阻害剤を導入して、これにより、細胞におけるヌクレアーゼ開裂後に１種または複数のドナー分子（外因性配列）の標的化組込みを増加させるステップとを含む。図１も参照されたい。ある特定の実施形態において、ドナー分子は、タンパク質をコードする遺伝子（例えば、細胞もしくは個体において欠失しているタンパク質をコードするコード配列またはタンパク質をコードする遺伝子の代替型）、調節配列および／またはマイクロＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ等の構造核酸をコードする配列からなる群より選択される配列を含む。
【００１４】
本明細書に記載されている方法のいずれかにおいて、阻害剤（複数可）は、ＰＡＲＰ１、Ｋｕ７０／８０、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ、ＸＲＣＣ４／ＸＬＦ、リガーゼＩＶ、リガーゼＩＩＩ、ＸＲＣＣ１、アルテミス（Ａｒｔｅｍｉｓ）および／またはポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）のうち１種または複数を阻害することができる。本明細書に記載されている方法のいずれかにおいて、阻害剤は、小分子、例えば、ＰＡＲＰ１阻害剤オラパリブ（Ｏｌａｐａｒｉｂ）および／またはＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害剤ＮＵ７４４１であってもよい。さらに、本明細書に記載されている方法のいずれかにおいて、ヌクレアーゼは、例えば、非天然起源のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、操作されたジンクフィンガータンパク質、操作されたＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合タンパク質またはホーミングエンドヌクレアーゼ由来の操作されたＤＮＡ結合ドメイン）を含むことができる。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＺＦＮ対である。他の実施形態において、ヌクレアーゼは、ＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ（ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインといずれかのヌクレアーゼドメイン（例えば、ＦｏｋＩ等のエンドヌクレアーゼ、メガ−ＴＡＬを形成するためのメガヌクレアーゼまたはｃＴＡＬＥＮを形成するためのＴｅｖＩヌクレアーゼドメイン）との融合体を少なくとも含むＴＡＬＥＮ）融合タンパク質またはＴＡＬＥＮ対である。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、操作された単一ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系である。
【００１５】
別の態様において、本発明は、１種または複数のヌクレアーゼ（および／または１種もしくは複数のヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド）および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系ならびにＮＨＥＪ修復経路の阻害剤を含む宿主細胞を提供する。ある特定の実施形態において、細胞は、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞または植物細胞）である。一部の態様において、宿主細胞は、ドナーＤＮＡをさらに含む。一部の態様において、宿主細胞は、樹立された細胞株であり、一方、他の態様において、宿主細胞は、哺乳動物から単離された初代細胞である。一部の態様において、細胞は、生殖質または分化細胞に由来し得る植物細胞である。本明細書に記載されている方法のいずれかにおいて、植物細胞は、単子葉または双子葉植物細胞を含むことができる。ある特定の実施形態において、植物細胞は、作物植物、例えば、トウモロコシである。ヌクレアーゼ（複数可）は、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、および／または操作された単一ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを含む操作されたヌクレアーゼ系であってもよい。一部の態様において、ドナーＤＮＡは、ポリペプチド、調節領域または構造核酸をコードする。
【００１６】
別の態様において、本発明は、細胞ゲノムのヌクレアーゼ媒介性開裂後の遺伝子破壊および／または標的化組込みの増加に有用なキット（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合タンパク質または操作されたホーミングエンドヌクレアーゼまたは操作されたガイドＲＮＡとＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）を提供する。キットは、典型的に、標的部位に結合する１種または複数のヌクレアーゼと、ＮＨＥＪに関与するタンパク質の１種または複数の阻害剤と、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子破壊および／または標的化組込みが増強されるようにヌクレアーゼおよび阻害剤を細胞に導入するための説明書とを含む。任意選択で、ヌクレアーゼの標的部位（複数可）を含有する細胞も、本明細書に記載されているキットに含まれ得る。ある特定の実施形態において、キットは、標的遺伝子を有する少なくとも１種の構築物および標的遺伝子内を開裂することのできる公知のヌクレアーゼを含む。そのようなキットは、種々の変動する宿主細胞型における開裂条件の最適化に有用である。本発明によって考慮される他のキットは、ゲノム内の公知の標的遺伝子座内を開裂することができる公知のヌクレアーゼを含んでいてもよく、加えてドナー核酸を含んでいてもよい。一部の態様において、ドナーＤＮＡは、ポリペプチド、調節領域または構造核酸をコードすることができる。一部の実施形態において、ポリペプチドは、レポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰまたはＧＵＳ）である。そのようなキットは、ドナー組込みのため、または特異的に修飾された細胞、細胞株ならびに遺伝子破壊もしくは標的化挿入を含有するトランスジェニック植物および動物の構築のための条件の最適化に有用である。
【００１７】
上述および他の態様は、本開示を全体として踏まえることにより、当業者であれば容易に明らかとなる。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
細胞における標的化されたゲノム破壊のための方法であって、前記方法は：
少なくとも１種のヌクレアーゼを前記細胞に投与するステップであって、前記ヌクレアーゼが、前記細胞における内因性ゲノム配列を開裂する、ステップと、
典型的または代替的非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の少なくとも１種の阻害剤を前記細胞に投与するステップと
を含む、方法。
（項目２）
前記阻害剤が、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）、ポリ−（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１／２（ＰＡＲＰ１／２）およびこれらの組合せからなる群より選択されるタンパク質を阻害する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記タンパク質が、ＰＡＲＰ１、Ｋｕ７０／８０、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ、ＸＲＣＣ４／ＸＬＦ、リガーゼＩＶ、リガーゼＩＩＩ、ＸＲＣＣ１、アルテミス、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）およびこれらの組合せからなる群より選択される、項目２に記載の方法。（項目４）
前記標的化されたゲノム破壊が、欠失を含む、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記標的化されたゲノム破壊が、挿入を含む、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記方法が、外因性配列を前記細胞に投与するステップをさらに含み、前記外因性配列は、前記ヌクレアーゼによる開裂後に、相同組換え修復（ＨＤＲ）機構により前記ゲノムに組み込まれる、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記外因性配列が、タンパク質をコードする配列、調節配列、構造ＲＮＡをコードする配列およびこれらの組合せからなる群より選択される、項目６に記載の方法。
（項目８）
ＨＤＲまたはマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＨ）を活性化する小分子またはポリペプチドを投与するステップをさらに含む、項目１〜７のいずれかに記載の方法。
（項目９）
前記活性化因子が、Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５０、ＮＳＢ１、Ｒａｄ５２およびこれらの組合せからなる群より選択されるタンパク質を活性化する、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガータンパク質、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系およびこれらの組合せを含むヌクレアーゼからなる群より選択される、項目１〜９のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
前記ヌクレアーゼが、発現ベクターを使用して投与されるか、またはｍＲＮＡとして投与される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
項目１〜１１のいずれかに記載の方法によって作製された細胞。
（項目１３）
真核細胞である、項目１２に記載の細胞。
（項目１４）
前記真核細胞が、哺乳動物細胞または植物細胞である、項目１３に記載の細胞。
（項目１５）
項目１２に記載の細胞を産生するためのキットであって、前記キットは、前記細胞における標的部位に結合する少なくとも１種のヌクレアーゼと、典型的または代替的ＮＨＥＪに関与するタンパク質の１種または複数の阻害剤とを含み、そして任意選択で、ＨＤＲもしくはＭＭＥＪ修復経路の活性化因子および／または外因性配列をさらに含む、キット。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ＤＮＡ修復経路の階層および操作を表す模式図である。ＦｏｋＩ媒介性ＤＳＢ切断は、ＮＨＥＪまたはＨＤＲのいずれかにより修復され得る。Ｇ１期ではＮＨＥＪによるＤＮＡ修復が選ばれ、主としてＤＮＡ−ＰＫｃｓ複合体による典型的ＮＨＥＪによって誤りなく起こる。この誤りのない経路の失敗または阻害後に、ＰＡＲＰ１媒介性ＮＨＥＪまたはＭＭＥＪのようなより誤りがちな経路が細胞により引き起こされて、変異原性修復ならびに点変異、組込みおよび／または欠失（「挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）」）のいずれかが発生し、これに続いて遺伝子破壊に至る可能性がある。本図の右部分に示す通り、ＤＮＡ切断が持続し、ＤＮＡドナー鋳型が存在する場合、ＨＤＲ経路は、このＤＮＡの組込みを媒介して、例えば、遺伝子補正を達成することができる。使用されている阻害剤または過剰発現戦略それぞれのためのタンパク質標的に下線を引く。
【図２】図２のパネルＡ〜Ｅは、アルブミン特異的ＺＦＮおよびＤＮＡ修復阻害剤による処理後の、Ｈｅｐａ  １−６細胞における誤りがちな（変異原性）修復の増加を示す。図２Ａは、実験設計の略図である。図２Ｂおよび図２Ｃは、３日目（図２Ｂ）または１０日目（図２Ｃ）にＳｕｒｖｅｙｏｒ（商標）／ＣｅｌＩアッセイによる、二連で決定された変異原性修復のパーセンテージを表すゲルである。図２Ｄは、ウエスタンブロッティングによりＺＦＮ発現レベルおよびアポトーシスマーカー（ＰＡＲＰ１開裂）欠如を示す。検出された変異原性修復のパーセント（「％挿入欠失」）と同様に、使用されている阻害剤の濃度を示す。図２Ｅは、ｍＡＬＢおよびｍＣＸＣＲ４遺伝子座の両方のゲノムＰＣＲ（Ｃｅｌ１消化なし）を示す。パーセンテージは、ＤＭＳＯ対照およびＮＵ７４４１＋オラパリブで処理した細胞の間のバンド強度における差を示す。
【図３】図３のパネルＡ〜Ｃは、ヌクレアーゼ開裂を表す。図３Ａおよび図３Ｂは、ＺＦＮおよびＤＮＡ修復阻害剤によるＨｅｐａ  １−６細胞の処理後３日目に、標的遺伝子座アルブミンのＰＣＲ後にサブクローニングされたゲノムＤＮＡの配列決定によって決定される、変異原性修復のパーセンテージを示すグラフである。図３Ａは、条件毎の遺伝子型（例えば、野生型、欠失または挿入）の分布を示す。各群の左バーは、ＺＦＮおよびＤＭＳＯ処理細胞の結果を表し、中央バーは、ＺＦＮおよびＤＮＡ−ＰＫｃｓｉで処理した細胞の結果を表し、右バーは、単独でまたはＰＡＲＰ阻害剤オラパリブと組み合わせてＺＦＮ、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害剤ＮＵ７４４１で処理した細胞の結果を示す。図３Ｂは、条件毎の変異原性修復を有するクローンの総パーセンテージを示す。図３Ｃ（配列番号１、上パネル）は、ヌクレアーゼカット（ハサミで示す）を図解し、開裂部位近くのマイクロホモロジーの２領域をボックスで示す。下パネル（配列番号２）は、特異的部位における修復されたＤＳＢのパーセンテージのディープシーケンシング解析を示し、修復阻害剤の使用は、阻害剤なしの細胞における約０．３％から、修復阻害剤が使用された場合の２．１〜２．６％の間へと、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）の頻度を増加させた。
【図４−１】図４のパネルＡ〜Ｆは、ＤＮＡ修復阻害剤による処理後の、Ｋ５６２またはＣＨＯ  Ｋ１細胞における標的化組込みの増加を示す。図４Ａは、ＲＦＬＰアッセイにより二連で決定された、Ｋ５６２細胞における一本鎖オリゴ（ｓｓオリゴ）の標的化組込みのパーセンテージを示す。パネルの下部分は、４８時間後における、ウエスタンブロッティングによるＺＦＮ発現レベルおよびアポトーシスマーカー（ＰＡＲＰ１開裂）欠如を示す。図４Ｂは、標的遺伝子座ＣＣＲ５の標的化組込みのパーセンテージ（ＰＣＲ後にサブクローニングされたゲノムＤＮＡの配列決定により決定）を示すグラフである。図４Ｃは、同じ試料から得られる細胞数の相対パーセンテージを示すグラフである。図４Ｄは、配列決定によっても決定された代替的修復事象のパーセンテージを示すグラフである。
【図４−２】図４のパネルＡ〜Ｆは、ＤＮＡ修復阻害剤による処理後の、Ｋ５６２またはＣＨＯ  Ｋ１細胞における標的化組込みの増加を示す。図４Ｅおよび図４Ｅは、プラスミドにおいて（図４Ｅ）またはＰＣＲ断片として（図４Ｆ）ドナーがグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）遺伝子座に導入された、ＣＨＯ  Ｋ１細胞における標的化組込みを示す。
【図５】図５のパネルＡおよびＢは、ヒトＣＣＲ５遺伝子座におけるヌクレアーゼ媒介性開裂後の一本鎖ドナーの標的化組込みを示す。図５Ａは、ｈＣＣＲ５特異的ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮおよびＤＭＳＯまたはＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害剤ＮＵ７４４１で処理した細胞における、３日目および１０日目の標的化組込みの総パーセンテージを表す。図５Ｂは、表示条件下で処理した細胞の、それぞれ野生型、標的化組込みおよび他の挿入欠失事象の相対パーセンテージを示す円グラフである。図５Ａおよび図５Ｂのデータは、ディープシーケンシングによって作成された。
【図６Ａ】図６のパネルＡおよびＢは、ヒト細胞株における一本鎖ドナーの標的化組込みを示す。図６Ａは、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害剤ＮＵ７４４１の存在下での、ＭＣＦ１０Ａ、ＭＣＦ７またはＨＥＫ２９３細胞におけるＡＡＶＳ１遺伝子座へのドナーの組込みを示すゲルを表す。図示されているＭＣＦ１０Ａレーンのレーン指定を次に示す：レーン１：ＺＦＮ＋オリゴ＋ＤＭＳＯ；レーン２：ＺＦＮ＋オリゴ＋１５μＭ  ＮＵ７４４１；レーン３：ＺＦＮ＋オリゴ＋２０μＭ  ＮＵ７４４１；およびレーン４：オリゴ＋ＤＭＳＯ。図示されているＭＣＦ７レーンのレーン指定を次に示す：レーン１：ＺＦＮ＋オリゴ＋ＤＭＳＯ；レーン２：ＺＦＮ＋オリゴ＋１０μＭ  ＮＵ７４４１；およびレーン３：オリゴ＋ＤＭＳＯ。図示されているＨＥＫ２９３レーンのレーン指定を次に示す：レーン１：ＺＦＮ＋オリゴ＋ＤＭＳＯ；レーン２  ＺＦＮ＋オリゴ＋１０μＭ  ＮＵ７４４１；およびレーン３：オリゴ＋ＤＭＳＯ。
【図６Ｂ】図６のパネルＡおよびＢは、ヒト細胞株における一本鎖ドナーの標的化組込みを示す。図６Ｂは、ＮＵ７４４１によるＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害後のＣＤ３４＋細胞における標的化組込みの増加を示すグラフである。標的化組込みおよび５ヌクレオチド重複および欠失のパーセンテージは、標的遺伝子座ＣＣＲ５のＰＣＲ後にサブクローニングされたゲノムＤＮＡの配列決定により決定された。
【図７−１】図７のパネルＡ〜Ｃは、一本鎖「ニッカーゼ」ＺＦＮによるｓｓオリゴの標的化組込みを表す。例えば、米国特許出願公開第２０１０００４７８０５号を参照されたい。図７Ａは、実験設計の略図である。図７Ｂは、ニッカーゼ、ｓｓオリゴおよびＤＮＡ修復阻害剤で処理したＫ５６２細胞のＳｕｒｖｅｙｏｒ（商標）／ＣｅｌＩデータおよび配列決定データを示す。
【図７−２】図７のパネルＡ〜Ｃは、一本鎖「ニッカーゼ」ＺＦＮによるｓｓオリゴの標的化組込みを表す。例えば、米国特許出願公開第２０１０００４７８０５号を参照されたい。図７Ｃは、ＰＡＲＰ１阻害剤ＮＵ１０２５を使用したＫ５６２細胞におけるオリゴによるＡＡＶＳ１遺伝子座への標的化組込みを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
ヌクレアーゼによる細胞ゲノムの開裂後に、典型的ＤＮＡ−ＰＫｃｓ依存性ＮＨＥＪ（「誤りのない」）、ＰＡＲＰ１／２依存性代替的ＮＨＥＪおよびＰＡＲＰ１／２依存性ＳＳＢ修復による細胞修復を阻害することにより、ヌクレアーゼ媒介性（例えば、ＦｏｋＩ−ＴＡＬＥ融合体、メガＴＡＬまたはコンパクトＴＡＬＥＮ等、ＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮ）ゲノム修飾の有効性を増加させるための組成物および方法が、本明細書に記載されている。典型的には、典型的ＮＨＥＪおよび／または代替的（例えば、ＰＡＲＰ１／２）修復経路の阻害は、これらのＮＨＥＪ経路に関与する１種または複数の酵素を阻害することにより、例えば、小分子阻害剤により、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）およびポリ−（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１／２（ＰＡＲＰ１）を阻害することにより達成される。例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら（２００７年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２６巻（５６号）：７８１６〜２４頁を参照されたい。
【００２０】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび哺乳動物におけるＮＨＥＪの経路は、広範に特徴付けされている。哺乳動物において、典型的ＮＨＥＪに関与する保存されたタンパク質を次に挙げる：ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）、ヘテロ二量体Ｋｕ７０／８０、ＤＮＡリガーゼＩＶ（Ｌｉｇ４）、Ｘｒｃｃ４、Ｃｅｒｎｕｎｎｏｓ／ＸＬＦおよびアルテミス。例えば、図１を参照されたい。これらのタンパク質のオルソログは、酵母、真菌および植物においても同定された。但し、これらの生物における効率的ＮＨＥＪに要求されないＤＮＡ−ＰＫｃｓを除く。Ｂ細胞特異的ＶＤＪ−およびクラススイッチ組換えにおけるその役割のため、ＤＮＡ−ＰＫｃｓは、脊椎動物における獲得免疫系と共に共進化したことが示唆された。ＤＮＡ−ＰＫｃｓおよびＫｕ７０／８０は、ヒト細胞において極めて豊富にある非ヒストン核タンパク質である。しかし、Ｋｕ７０／８０は、膜および細胞質にも存在する。Ｋｕ７０／８０は、細胞周期状態ならびに放射線照射、アルキル化剤およびソマトスタチン等のホルモン等の外部刺激に依存性の様式で細胞質から核へとシャトル輸送できる。Ｋｕ７０／８０は、ＤＮＡ末端に対し極度な高親和性を有し、したがって生細胞におけるＤＳＢに迅速に結合する。
【００２１】
ＤＮＡ損傷に応答して、酵母におけるＭｒｅ１１−Ｒａｄ５０−Ｘｒｓ２（ＭＲＸ）複合体およびＭｒｅ１１−Ｒａｄ５０−Ｎｂｓ１（ＭＲＮ）と呼ばれる哺乳動物におけるその対応物は、ＨＲおよびＮＨＥＪ経路の両方のＤＮＡ損傷感知、シグナル伝達および修復機構における中心的存在として初期に機能する。しかし、おそらく、ＭＲＮ複合体との競合において、ＤＮＡ−ＰＫｃｓおよびＫｕ７０／８０ヘテロ二量体からなるＤＮＡ−ＰＫ複合体も、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による修復において初期に機能する。ＮＨＥＪは、露出されたＤＮＡ末端へのＫｕ７０およびＫｕ８０からなるＫｕヘテロ二量体の認識および結合により開始される。哺乳動物において、Ｋｕ７０／８０ヘテロ二量体は、ＤＮＡ−ＰＫｃｓを動員し、そのキナーゼ活性を活性化する。ＤＮＡ−ＰＫｃｓ：Ｋｕ７０／８０複合体が、損傷したＤＮＡ末端に結合すると、これは、ヌクレアーゼのアルテミス、ポリメラーゼ（μおよびλ）およびリガーゼ複合体（ＸＬＦ：ＸＲＣＣ４：Ｌｉｇ４）のプロセシングの結合平衡状態を改善することができる。このようにして、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ：Ｋｕ７０／８０複合体は、その後のタンパク質の組み立ての足場として機能し、ＤＮＡ末端におけるその酵素活性を安定化する。
【００２２】
次のステップは、修復接続部のライゲーションとシーリングを触媒することによりゲノムの完全性を回復させるＬｉｇ４／ＸＲＣＣ４／ＸＬＦ複合体に関与する。重要なことに、さらなる末端プロセシングやその後の挿入および／または欠失を行わなくても、（ＦｏｋＩによって作製された末端のように）損傷した塩基がない粘着ＤＮＡ末端が容易に再接続され得ることに留意されたい。したがって、ヌクレアーゼ媒介性開裂後の修復事象は、誤りのないものであってもよい。他の事例では、Ｌｉｇ４は、Ｌｉｇ４のＣ末端におけるＢＲＣＴドメインを介してＸＲＣＣ４と複合体を形成することにより、ＮＨＥＪにおける排他的機能を有する。この複合体は、ＤＮＡ末端アライメントおよびプロセシングにおいて作製された短いギャップを埋めるＰｏｌχファミリーポリメラーゼ、Ｐｏｌμ、Ｐｏｌλおよびターミナルトランスフェラーゼと会合する。Ｌｉｇ４／ＸＲＣＣ４複合体は、ミスマッチした非粘着性ＤＮＡ末端のライゲーションを促進するＣｅｒｎｕｎｎｏｓ／ＸＬＦの会合にも影響を有する。ＮＨＥＪ経路は、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ：Ｋｕ７０／８０依存性であり、典型的ＮＨＥＪ（Ｃ−ＮＨＥＪ）とも呼ばれる。
【００２３】
Ｋｕ７０／８０非依存性であり、代替的ＮＨＥＪ（Ａ−ＮＨＥＪ）と呼ばれる別のＮＨＥＪ経路がＣ−ＮＨＥＪ欠損細胞において同定された（Ｊａｉら（２０１２年）Ｊ  Ｂｏｔａｎｙ  ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１２／９８９２７２）。この経路は、細胞において近縁のＰＡＲＰ２によって置換され得る、一本鎖切断修復タンパク質ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ１）の活性に関与する。したがって、この経路の阻害剤は、ファミリーの両方のメンバー、ＰＡＲＰ１およびＰＡＲＰ２を阻害する傾向がある。ＰＡＲＰ１／２は、高親和性で一本鎖切断に結合し、ＤＮＡライゲーションにより修復を媒介するその複合体パートナーＸＲＣＣ１およびＤＮＡリガーゼＩＩＩを動員することができる。この経路における重大なステップは、ポリ（ＡＤＰ）リボシル化によるＰＡＲＰ１／２の自己修飾であり、これは、（この修飾の負電荷の結果として）ＤＮＡからの最終的な放出をもたらす。この自己修飾が遮断されると、ＰＡＲＰ１／２は、ＤＮＡと会合したままとなり、その後の修復ステップは損なわれる。近年の証拠は、また、ＤＳＢ修復に、特に、互いに密に近接した２本の一本鎖切断に似たＤＳＢ修復にＰＡＲＰ１／２を関連付けた（ＦｏｋＩ傷害等）（Ｗａｎｇら（２００６年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．；３４巻（２１号）：６１７０〜８２頁を参照）。
【００２４】
誤りのない（典型的）および／またはＰＡＲＰ１依存性（代替的）修復経路が阻害される場合、細胞は、おそらく、誤りがちなＤＳＢ修復経路（例えばＭＭＥＪ等）を使用し、これは続いて、ヌクレアーゼによって開裂された部位における遺伝子破壊（例えば、欠失および／または付加）を増加させる。したがって、遺伝子破壊が、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子療法の所望の成果である場合、変異原性修復（ゲノムのヌクレアーゼ媒介性開裂の修復後の点変異、挿入または欠失の導入）とも称される、誤りがちなＤＳＢ修復事象の比率を増加させて、所望の遺伝子修飾の量を増加させることが有利である。
【００２５】
加えて、本開示は、本明細書に記載されている誤りのない（典型的）および／またはＰＡＲＰ１依存性（代替的）経路の阻害が、ヌクレアーゼを使用した二本または一本鎖ＤＮＡ切断傷害の誘導後に、ドナーＤＮＡ分子の標的化組込みを増加させることを実証する。遺伝子補正のために、ヌクレアーゼによる傷害が、補正的一本または二本鎖ＤＮＡドナー鋳型の組込みが達成される前に完全には修復されないことが必須である。したがって、ＳＳＢおよびＤＳＢ修復経路の阻害（例えば、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害剤ＮＵ７４４１等、市販の阻害剤の使用による）は、効率的標的化組込みを可能にする。
【００２６】
加えて、本明細書に記載されている修復経路の阻害は、二本鎖切断（ＤＳＢ）（例えば、野生型Ｆｏｋ１ヌクレアーゼを使用）または一本鎖切断（ＳＳＢ）（例えば、米国特許出願公開第２０１０００４７８０５号に記載されているＤ４５０Ｎ  Ｆｏｋ１変異体「ニッカーゼ」を使用）のいずれかの誘導の後に、ドナー分子のＺＦＮ媒介性標的化組込みの比率を劇的に増加させる。
【００２７】
したがって、多くの種の細胞型において修復を阻害することが公知の小分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで容易に投与することができるため、本開示は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるヌクレアーゼ媒介性遺伝子破壊および標的化組込み戦略の効果を最大化する。さらに、本明細書に記載されているヌクレアーゼ（複数可）によるゲノム修飾の増加は、細胞におけるより少量のヌクレアーゼの使用を可能にし、これにより、全細胞型におけるゲノム編集の効率を増加させる。
【００２８】
概要
本明細書に開示されている方法の実施ならびに組成物の調製および使用は、他に断りがなければ、分子生物学、生化学、クロマチン構造および解析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡならびに関連分野における従来技法を当業者の技能範囲内で用いる。これらの技法は、文献中で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年および第３版、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７年および定期更新；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹシリーズ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ、ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ、第３版、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９８年；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、３０４巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」（Ｐ．Ｍ．  ＷａｓｓａｒｍａｎおよびＡ．  Ｐ．  Ｗｏｌｆｆｅ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９９年；ならびにＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、１１９巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｐ．Ｂ．  Ｂｅｃｋｅｒ編）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、１９９９年を参照されたい。
【００２９】
定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用されており、直鎖状または環状コンフォメーションの、一本または二本鎖型のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的に解釈するべきではない。この用語は、天然ヌクレオチドの公知のアナログと共に、塩基、糖および／またはリン酸部分で修飾されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）を包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対形成特異性を有する、即ち、Ａのアナログは、Ｔと塩基対形成する。
【００３０】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すよう互換的に使用されている。この用語は、１個または複数のアミノ酸が相当する天然起源のアミノ酸の化学的アナログまたは修飾誘導体となった、アミノ酸ポリマーにも適用される。
【００３１】
「結合」は、高分子間（例えば、タンパク質と核酸の間）の配列特異的な非共有結合相互作用を指す。全体としての相互作用が配列特異的である限り、結合相互作用のあらゆる構成成分が、配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格におけるリン酸残基との接触）。そのような相互作用は、一般に、１０−６Ｍ−１またはそれ未満の解離定数（Ｋｄ）によって特徴付けられる。「親和性」は、結合の強度を指す：結合親和性の増加は、より低いＫｄに相関する。
【００３２】
「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合的に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、これは、同じタンパク質に結合（してホモ二量体、ホモ三量体等を形成）することができる、および／または１種または複数の異なるタンパク質の１個または複数の分子に結合することができる。結合タンパク質は、２種類以上の結合活性を有することができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合およびタンパク質結合活性を有する。
【００３３】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、亜鉛イオンの配位によりその構造が安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１個または複数のジンクフィンガーを介して配列特異的様式でＤＮＡに結合する、タンパク質または大きいタンパク質内のドメインである。用語、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、多くの場合、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと省略される。
【００３４】
「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１個または複数のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、ＴＡＬＥのその同族標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的には、３３〜３５アミノ酸長であり、天然起源のＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列と少なくともある程度の配列相同性を提示する。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。
【００３５】
ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば、天然起源のジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域を操作（１個または複数のアミノ酸を変更）することにより、所定のヌクレオチド配列に結合するよう「操作」することができる。したがって、操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、非天然起源のタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が主に合理的基準に起因する、天然には発生しないタンパク質である。設計の合理的基準は、現存するＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥ設計および結合データの情報を記憶するデータベース内の情報を処理するための置換規則およびコンピュータ処理アルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号、第６，１４０，０８１号、第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号を参照されたい；ＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６も参照されたい。
【００３６】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その産生が主にファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択等の経験的プロセスに起因する、天然には存在しないタンパク質である。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号、第５，７８９，５３８号、第５，９２５，５２３号、第６，００７，９８８号、第６，０１３，４５３号、第６，２００，７５９号、ＷＯ９５／１９４３１、ＷＯ９６／０６１６６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ９８／５４３１１、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／６０９７０、ＷＯ０１／８８１９７、ＷＯ０２／０９９０８４を参照されたい。
【００３７】
「開裂」は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断を指す。開裂は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解が挙げられるがこれらに限定されない、種々の方法により開始することができる。一本鎖開裂および二本鎖開裂の両方が可能であり、二本鎖開裂は、２種の明確に異なる一本鎖開裂事象の結果として起こり得る。ＤＮＡ開裂は、平滑末端または付着末端のいずれかの産生をもたらし得る。ある特定の実施形態において、融合ポリペプチドは、標的化二本鎖ＤＮＡ開裂のために使用される。
【００３８】
「開裂ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一であっても異なっていてもよい）と併せて開裂活性（好ましくは、二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。用語「第１および第２の開裂ハーフドメイン」、「＋および−開裂ハーフドメイン」ならびに「右および左開裂ハーフドメイン」は、二量体化する開裂ハーフドメインの対を指すよう互換的に使用される。
【００３９】
「操作された開裂ハーフドメイン」は、別の開裂ハーフドメイン（例えば、別の操作された開裂ハーフドメイン）と偏性（ｏｂｌｉｇａｔｅ）ヘテロ二量体を形成するよう修飾された開裂ハーフドメインである。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，９１４，７９６号、第８，０３４，５９８号、第８，６２３，６１８号および米国特許出願公開第２０１１／０２０１０５５号も参照されたい。
【００４０】
用語「配列」は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく；直鎖状、環状または分枝状であってよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであってよい、いずれかの長さのヌクレオチド配列を指す。用語「ドナー配列」は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、いかなる長さを有していてもよく、例えば、２〜１０，０００の間のヌクレオチド長（またはその間もしくはそれを上回るいずれかの整数値）、好ましくは約１００〜１，０００の間のヌクレオチド長（またはその間のいずれかの整数）、より好ましくは、約２００〜５００の間のヌクレオチド長であってもよい。
【００４１】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含むヌクレオプロテイン構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡと、ヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質とを含む。真核細胞クロマチンの大部分は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４をそれぞれ２個ずつ含む八量体に会合したおよそ１５０塩基対のＤＮＡを含み、リンカーＤＮＡ（生物に応じた可変性の長さである）は、ヌクレオソームコア間に延在する。ヒストンＨ１分子は、一般に、リンカーＤＮＡに会合する。本開示の目的のため、用語「クロマチン」とは、原核生物および真核生物両方のあらゆる種類の細胞ヌクレオプロテインを包含することを意味する。細胞クロマチンは、染色体およびエピソームクロマチンの両方を含む。
【００４２】
「染色体」は、細胞のゲノムの全体または一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、多くの場合、細胞のゲノムを含む全染色体のコレクションであるその核型により特徴付けられる。細胞のゲノムは、１本または複数の染色体を含むことができる。
【００４３】
「エピソーム」は、複製する核酸、ヌクレオプロテイン複合体または細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む他の構造である。エピソームの例として、プラスミドおよびある特定のウイルスゲノムが挙げられる。
【００４４】
「標的部位」または「標的配列」は、結合に十分な条件が存在する場合に結合分子が結合する核酸の部分を規定する核酸配列である。例えば、配列５’−ＧＡＡＴＴＣ−３’は、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼの標的部位である。
【００４５】
「外因性」分子は、細胞に通常存在しないが、１種または複数の遺伝学的、生化学的または他の方法により細胞に導入することができる分子である。「細胞における通常の存在」は、細胞の特定の発生ステージおよび環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生においてのみ存在する分子は、成体筋肉細胞に関して外因性分子である。同様に、熱ショックにより誘導される分子は、非熱ショック細胞に関して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全内因性分子の機能化型または正常に機能する内因性分子の機能不全型を含むことができる。
【００４６】
外因性分子は、とりわけ、コンビナトリアルケミストリープロセスにより作製された小分子等の小分子、またはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖等の高分子、上述の分子のいずれかの修飾誘導体、または上述の分子のうち１種もしくは複数を含むいずれかの複合体であってもよい。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、直鎖状、分枝状または環状であってもよく、いかなる長さであってもよい。核酸は、二重鎖を形成することができる核酸と共に三重鎖形成核酸を含む。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質として、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４７】
外因性分子は、内因性分子と同じ種類の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であってもよい。例えば、外因性核酸は、感染ウイルスゲノム、細胞に導入されたプラスミドもしくはエピソームまたは細胞に通常存在しない染色体を含むことができる。細胞への外因性分子の導入のための方法は、当業者に公知のものであり、その例として、脂質媒介性移入（即ち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４８】
対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下の特定の発生ステージの特定の細胞に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体や、ミトコンドリア、葉緑体もしくは他の細胞小器官のゲノムまたは天然起源のエピソーム核酸を含むことができる。追加的な内因性分子は、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含むことができる。
【００４９】
「融合」分子は、２個またはそれ超のサブユニット分子が好ましくは共有結合により連結された分子である。サブユニット分子は、同じ化学型の分子であっても、異なる化学型の分子であってもよい。第１の型の融合分子の例として、融合タンパク質、例えば、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥおよび／またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）およびヌクレアーゼ（開裂）ドメイン（例えば、エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ等）の間の融合体ならびに融合核酸（例えば、上記参照の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるがこれらに限定されない。第２の型の融合分子の例として、三重鎖形成核酸およびポリペプチドの間の融合体、ならびに副溝結合体および核酸の間の融合体が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５０】
細胞における融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達または細胞への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達に起因することができ、そのような送達において、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて、融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド開裂およびポリペプチドライゲーションも、細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチド送達のための方法は、本開示の他の箇所に示されている。
【００５１】
本開示の目的における「遺伝子」は、遺伝子産物（下記参照）をコードするＤＮＡ領域と共に、遺伝子産物の産生を調節するあらゆるＤＮＡ領域を、そのような調節配列がコードおよび／または転写される配列に隣接するか否かにかかわらず含む。したがって、遺伝子として、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位等の翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位ならびに遺伝子座制御領域が挙げられるがこれらに必ずしも限定されない。
【００５２】
「遺伝子発現」は、遺伝子に含有される情報から遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的な転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡまたは他のいずれかの種類のＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳により産生されるタンパク質であってもよい。遺伝子産物は、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化および編集等のプロセスにより修飾されるＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）およびグリコシル化により修飾されるタンパク質も含む。
【００５３】
「遺伝子破壊」は、付加および／または欠失を指し、相同誘導型組換えまたは非相同誘導型組換え修復機構により起こり得る。
【００５４】
「植物」細胞として、単子葉植物（単子葉類）または双子葉植物（双子葉類）の細胞が挙げられるがこれらに限定されない。単子葉類の非限定的な例として、トウモロコシ、イネ、オオムギ、カラスムギ、コムギ、ソルガム、ライムギ、サトウキビ、パイナップル、タマネギ、バナナおよびココナツ等、穀類植物が挙げられる。双子葉類の非限定的な例として、タバコ、トマト、ヒマワリ、ワタ、サトウダイコン、ジャガイモ、レタス、メロン、ダイズ、キャノーラ（ナタネ）およびアルファルファが挙げられる。植物細胞は、植物のあらゆる部分に由来するものでもよいし、および／または植物発生のあらゆるステージに由来するものでもよい。
【００５５】
遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の発現レベルの変化を指す。発現の調節として、遺伝子活性化および遺伝子抑制を挙げることができるがこれらに限定されない。調節は、完全であってもよく、即ち、遺伝子発現が完全に不活性化されるまたは野生型レベルまでもしくはそれを超えて活性化される；あるいは部分的であってもよく、遺伝子発現が部分的に低下されるまたは野生型レベルのある割合まで部分的に活性化される。
【００５６】
「真核」細胞として、真菌細胞（酵母等）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５７】
用語「作動可能な連結」および「作動可能に連結された」（または「操作可能に連結された」）は、２個またはそれ超の構成成分（配列エレメント等）の並置に関連して互換的に使用され、ここでは両方の構成成分が正常通り機能しつつ、構成成分のうち少なくとも１つがそれ以外の構成成分のうち少なくとも１つに働く機能を媒介することが可能になるように構成成分が配置されていることをいう。図解として、転写調節配列が、１種または複数の転写調節因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写のレベルを制御する場合、プロモーター等、転写調節配列は、コード配列に作動可能に連結されている。転写調節配列は、一般に、コード配列とシスで作動可能に連結されるが、これと直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、近接していなくても、コード配列に作動可能に連結された転写調節配列である。
【００５８】
融合ポリペプチドに関して、用語「作動可能に連結された」は、構成成分のそれぞれが、他の構成成分と連結した状態で、このように連結されていない場合の機能と同じ機能を実行するという事実を指すことができる。例えば、ＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦＰ、ＴＡＬＥ）が開裂ドメイン（例えば、ＦｏｋＩ、メガヌクレアーゼドメイン等、エンドヌクレアーゼドメイン）に融合した融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドにおいて、開裂（ヌクレアーゼ）ドメインが、標的部位近傍のＤＮＡを開裂することができる一方で、ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位および／またはその結合部位に結合することができる場合、ＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメインは、作動可能な連結状態にある。ヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合能（例えば、ＤＮＡに結合することもできるＺＦＰまたはＴＡＬＥドメインに融合したヌクレアーゼ）を提示することもできる。同様に、ＤＮＡ結合ドメインが活性化または抑制ドメインに融合した融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドにおいて、活性化ドメインが、遺伝子発現を上方調節することができる、または抑制ドメインが、遺伝子発現を下方調節することができる一方で、ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位および／またはその結合部位に結合することができる場合、ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化または抑制ドメインは、作動可能な連結状態にある。
【００５９】
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列は全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を保持するタンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、相当する天然型分子より多い、より少ないもしくは同じ数の残基を保有することができる、および／または１個もしくは複数のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有することができる。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当該分野において周知のものである。同様に、タンパク質機能を決定するための方法は、周知のものである。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフトまたは免疫沈降アッセイにより決定することができる。ＤＮＡ開裂は、ゲル電気泳動によりアッセイすることができる。Ａｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい。別のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力は、例えば、免疫共沈降、ツーハイブリッドアッセイまたは遺伝学および生化学両方の相補性により決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０巻：２４５〜２４６頁；米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴ  ＷＯ９８／４４３５０を参照されたい。
【００６０】
「ベクター」は、標的細胞に遺伝子配列を移入することができる。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を誘導することができ、標的細胞に遺伝子配列を移入することができるいずれかの核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニングおよび発現媒体と共に組み込みベクターを含む。
【００６１】
概観
１種または複数のヌクレアーゼによる細胞ゲノムの開裂後に遺伝子破壊（例えば、欠失、付加および／または標的化組込み）を増加させるための組成物および方法が、本明細書に記載されている。記載されている組成物および方法は、ゲノム修飾が必要とされる種々の細胞型における遺伝子破壊の増加において有効である。本明細書に記載されている方法において、天然修復機構が阻害され、ヌクレアーゼに媒介される遺伝子破壊が増強されるように、ヌクレアーゼの前、後またはこれと同時発生的にＤＮＡ修復阻害剤が投与される。加えて、本明細書に記載されている方法において、ヌクレアーゼおよび／または阻害剤の複数回投与（いずれかの順序の）を使用することができる。ヌクレアーゼにより遺伝子破壊を増加させるための迅速かつ効率的な方法を使用して、ノックアウト細胞株の作製を容易にし、細胞および／またはトランスジェニック生物の作出における標的遺伝子へのドナー分子の挿入を増加させ、種々の細胞型におけるヌクレアーゼの治療適用を増加させることができる。
【００６２】
ヌクレアーゼ
本明細書に記載されている組成物および方法は、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子修飾を増加させる。したがって、本明細書において、ヌクレアーゼ、例えば、ＤＮＡに結合する結合ドメインおよび開裂（ヌクレアーゼ）ドメインを含む融合タンパク質が提供される。そのようなものとして、遺伝子修飾は、ヌクレアーゼ、例えば、操作されたヌクレアーゼを使用して達成することができる。操作されたヌクレアーゼの技術は、天然起源のＤＮＡ結合タンパク質の操作に基づく。
【００６３】
Ａ．ＤＮＡ結合ドメイン
ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ由来のＤＮＡ結合ドメインが挙げられるがこれらに限定されない、いずれかのＤＮＡ結合ドメインが、本明細書に開示されている組成物および方法において使用されるヌクレアーゼにおいて使用され得る。
【００６４】
ある特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択した標的部位に結合するよう操作されているという点において非天然起源のものである。例えば、参照によりその全体が本明細書に全て組み込まれる、Ｂｅｅｒｌｉら（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０巻：１３５〜１４１頁；Ｐａｂｏら（２００１年）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０巻：３１３〜３４０頁；Ｉｓａｌａｎら（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９巻：６５６〜６６０頁；Ｓｅｇａｌら（２００１年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２巻：６３２〜６３７頁；Ｃｈｏｏら（２０００年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．１０巻：４１１〜４１６頁；米国特許第６，４５３，２４２号、第６，５３４，２６１号、第６，５９９，６９２号、第６，５０３，７１７号、第６，６８９，５５８号、第７，０３０，２１５号、第６，７９４，１３６号、第７，０６７，３１７号、第７，２６２，０５４号、第７，０７０，９３４号、第７，３６１，６３５号、第７，２５３，２７３号および米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号、第２００７／０２１８５２８号、第２００５／０２６７０６１号を参照されたい。
【００６５】
ある特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、少なくとも１個のジンクフィンガーを典型的に含むが、複数のジンクフィンガー（例えば、２、３、４、５、６またはそれ超のフィンガー）を含み得る、操作されたジンクフィンガータンパク質である。通常、ＺＦＰは、少なくとも３個のフィンガーを含む。ある特定のＺＦＰは、４、５または６個のフィンガーを含む。３個のフィンガーを含むＺＦＰは、９または１０ヌクレオチドを含む標的部位を典型的に認識し；４個のフィンガーを含むＺＦＰは、１２〜１４ヌクレオチドを含む標的部位を典型的に認識し；一方、６個のフィンガーを有するＺＦＰは、１８〜２１ヌクレオチドを含む標的部位を認識することができる。ＺＦＰは、１個または複数の調節ドメインを含む融合タンパク質であってもよく、このような調節ドメインは、転写活性化または抑制ドメインであってもよい。
【００６６】
他の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，５８６，５２６号を参照）。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原性細菌は、重要作物植物において多くの疾患を引き起こすことが公知である。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの病原性は、２５種を超える異なるエフェクタータンパク質を植物細胞に注射する、保存されたタイプＩＩＩ分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注射されたタンパク質の中には、植物転写活性化因子を模倣し、植物トランスクリプトームを操作する、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）がある（Ｋａｙら（２００７年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８巻：６４８〜６５１頁を参照）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく特徴付けられたＴＡＬＥの１種は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓ  ｐｖ．Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ由来のＡｖｒＢｓ３である（Ｂｏｎａｓら（１９８９年）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２１８巻：１２７〜１３６頁およびＷＯ２０１００７９４３０を参照）。ＴＡＬＥは、中心に集められた縦列反復のドメインを含有し、各反復は、このタンパク質のＤＮＡ結合特異性の要となるおよそ３４アミノ酸を含有する。加えて、これは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（総説に関しては、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ  Ｓら（２００６年）Ｊ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １６３巻（３号）：２５６〜２７２頁を参照）。加えて、植物病原性細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍにおいて、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同のｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と名付けられた２種の遺伝子が、Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ次亜種１系統ＧＭＩ１０００および次亜種４系統ＲＳ１０００において見出された（Ｈｅｕｅｒら（２００７年）Ａｐｐｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒ  Ｍｉｃｒｏ  ７３巻（１３号）：４３７９〜４３８４頁を参照）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列が互いに９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメインにおける１，５７５ｂｐの欠失により異なる。しかし、両方の遺伝子産物は、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。
【００６７】
したがって、一部の実施形態において、標的遺伝子座（例えば、グロビンまたはセーフハーバー（ｓａｆｅ  ｈａｒｂｏｒ））における標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインは、植物病原体Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ（Ｂｏｃｈら（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６巻：１５０９〜１５１２頁ならびにＭｏｓｃｏｕおよびＢｏｇｄａｎｏｖｅ（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６巻：１５０１頁を参照）ならびにＲａｌｓｔｏｎｉａ（Ｈｅｕｅｒら（２００７年）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７３巻（１３号）：４３７９〜４３８４頁；米国特許第８，４２０，７８２号および第８，４４０，４３１号および米国特許第８，５８６，５２６号を参照）に由来するドメインと同様に、ＴＡＬエフェクターに由来する操作されたドメインである。
【００６８】
操作されたジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、天然起源のジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質と比較して、新規結合特異性を有することができる。操作方法として、合理的設計および様々な種類の選択が挙げられるがこれらに限定されない。合理的設計は、例えば、三つ組（または四つ組）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用を含み、データベースにおいて、各三つ組または四つ組ヌクレオチド配列は、特定の三つ組または四つ組配列に結合するジンクフィンガーの１種または複数のアミノ酸配列に関連付けられている。例えば、参照によりその全体が明細書に組み込まれる、米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号を参照されたい。
【００６９】
ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、第５，９２５，５２３号、第６，００７，９８８号、第６，０１３，４５３号、第６，４１０，２４８号、第６，１４０，４６６号、第６，２００，７５９号および第６，２４２，５６８号ならびにＷＯ９８／３７１８６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／８８１９７およびＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、ＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。
【００７０】
加えて、上述および他の参考文献に開示されている通り、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、例えば、５個またはそれ超のアミノ酸長のリンカーを含むいずれかの適したリンカー配列を使用して一緒に連結することができる。６個またはそれ超のアミノ酸長の例示的なリンカー配列に関して、米国特許第６，４７９，６２６号、第６，９０３，１８５号および第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されているタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間に適したリンカーのいずれかの組合せを含むことができる。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、ＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。
【００７１】
標的部位；ＺＦＰまたはＴＡＬＥの選択ならびに融合タンパク質（およびこれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者に公知のものであり、米国特許第６，１４０，０８１５号、第７８９，５３８号、第６，４５３，２４２号、第６，５３４，２６１号、第５，９２５，５２３号、第６，００７，９８８号、第６，０１３，４５３号、第６，２００，７５９号、ＷＯ９５／１９４３１、ＷＯ９６／０６１６６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ９８／５４３１１、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／６０９７０、ＷＯ０１／８８１９７、ＷＯ０２／０９９０８４、ＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６に詳細に記載されている。
【００７２】
加えて、上述および他の参考文献に開示されている通り、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば、５個またはそれ超のアミノ酸長のリンカーを含むいずれかの適したリンカー配列を使用して、一緒に連結することができる。６個またはそれ超のアミノ酸長の例示的なリンカー配列に関して、米国特許第６，４７９，６２６号、第６，９０３，１８５号および第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されているタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間に適したリンカーのいずれかの組合せを含むことができる。
【００７３】
あるいは、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼに由来することができる。例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩ等、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列が公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５巻：３３７９〜３３８８頁；Ｄｕｊｏｎら（１９８９年）Ｇｅｎｅ  ８２巻：１１５〜１１８頁；Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２巻、１１２５〜１１２７頁；Ｊａｓｉｎ（１９９６年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２巻：２２４〜２２８頁；Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２６３巻：１６３〜１８０頁；Ａｒｇａｓｔら（１９９８年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２８０巻：３４５〜３５３頁およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓのカタログも参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然標的部位に結合するよう操作することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２年）Ｍｏｌｅｃ．  Ｃｅｌｌ  １０巻：８９５〜９０５頁；Ｅｐｉｎａｔら（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１巻：２９５２〜２９６２頁；Ａｓｈｗｏｒｔｈら（２００６年）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１巻：６５６〜６５９頁；Ｐａｑｕｅｓら（２００７年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７巻：４９〜６６頁；米国特許出願公開第２００７０１１７１２８号を参照されたい。メガヌクレアーゼ由来のＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性を提示することもできる。
【００７４】
Ｂ．開裂ドメイン
本明細書に記載されているいずれかのＤＮＡ結合ドメインと共に、いずれかのヌクレアーゼを使用することができる。ヌクレアーゼは、異種ＤＮＡ結合および開裂ドメイン（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ；ＴＡＬＥＮおよびメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインと異種開裂ドメイン）を含むことができる、あるいは、天然起源のヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位に結合するよう変更することができる（例えば、同族結合部位とは異なる部位に結合するよう操作されたメガヌクレアーゼ）。例えば、ＤＮＡ結合特異性が調整されたホーミングエンドヌクレアーゼの操作について記載されている、Ｃｈａｍｅｓら（２００５年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３巻（２０号）：ｅ１７８頁；Ａｒｎｏｕｌｄら（２００６年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．３５５巻：４４３〜４５８頁およびＧｒｉｚｏｔら（２００９年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ７月７日電子出版を参照されたい。加えて、ＺＦＰの操作も記載されている。例えば、米国特許第６，５３４，２６１号、第６，６０７，８８２号、第６，８２４，９７８号、第６，９７９，５３９号、第６，９３３，１１３号、第７，１６３，８２４号および第７，０１３，２１９号を参照されたい。
【００７５】
ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼドメインは、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）ドメインを含む。天然起源のメガヌクレアーゼは、１５〜４０塩基対開裂部位を認識し、一般に、４種のファミリーにグループ化される：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−ＣｙｓｔボックスファミリーおよびＨＮＨファミリー。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩを含む。これらの認識配列は公知のものである。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５巻：３３７９〜３３８８頁；Ｄｕｊｏｎら（１９８９年）Ｇｅｎｅ  ８２巻：１１５〜１１８頁；Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２巻、１１２５〜１１２７頁；Ｊａｓｉｎ（１９９６年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２巻：２２４〜２２８頁；Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２６３巻：１６３〜１８０頁；Ａｒｇａｓｔら（１９９８年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２８０巻：３４５〜３５３頁およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓのカタログも参照されたい。したがって、いずれかのメガヌクレアーゼドメイン（またはその機能部分）をいずれかのＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ）と組み合わせて、ヌクレアーゼを形成することができる。さらに、ヌクレアーゼドメインが、ＤＮＡに結合することもできる。
【００７６】
主にＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー由来の天然起源のメガヌクレアーゼに由来するＤＮＡ結合ドメインを使用して、植物、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、哺乳動物細胞およびマウスにおける部位特異的ゲノム修飾を促進してきたが、このアプローチは、メガヌクレアーゼ認識配列を保存するいずれかの相同遺伝子（Ｍｏｎｅｔら（１９９９年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｏｎ．２５５巻：８８〜９３頁）の修飾または認識配列が導入された操作前ゲノム（Ｒｏｕｔｅら（１９９４年）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．１４巻：８０９６〜１０６頁；Ｃｈｉｌｔｏｎら（２００３年）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１３３巻：９５６〜６５頁；Ｐｕｃｈｔａら（１９９６年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３巻：５０５５〜６０頁；Ｒｏｎｇら（２００２年）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６巻：１５６８〜８１頁；Ｇｏｕｂｌｅら（２００６年）Ｊ．  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．８巻（５号）：６１６〜６２２頁）に限定されていた。したがって、医学的または生物工学的に関連する部位において新規結合特異性を提示するよう、メガヌクレアーゼを操作する試みが為された（Ｐｏｒｔｅｕｓら（２００５年）Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３巻：９６７〜７３頁；Ｓｕｓｓｍａｎら（２００４年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．３４２巻：３１〜４１頁；Ｅｐｉｎａｔら（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１巻：２９５２〜６２頁；Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２年）Ｍｏｌｅｃ．  Ｃｅｌｌ  １０巻：８９５〜９０５頁；Ｅｐｉｎａｔら（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１巻：２９５２〜２９６２頁；Ａｓｈｗｏｒｔｈら（２００６年）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１巻：６５６〜６５９頁；Ｐａｑｕｅｓら（２００７年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７巻：４９〜６６頁；米国特許出願公開第２００７０１１７１２８号、第２００６０２０６９４９号、第２００６０１５３８２６号、第２００６００７８５５２号および第２００４０００２０９２号）。加えて、メガヌクレアーゼ由来の天然起源のまたは操作されたＤＮＡ結合ドメインは、また、異種ヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）由来の開裂ドメインと作動可能に連結されている（メガＴＡＬとしても公知）。
【００７７】
他の実施形態において、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。ＺＦＮは、選択した遺伝子における標的部位に結合するよう操作されたジンクフィンガータンパク質と、開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインとを含む。
【００７８】
上に記す通り、ジンクフィンガー結合ドメインは、選択した配列に結合するよう操作することができる。例えば、Ｂｅｅｒｌｉら（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０巻：１３５〜１４１頁；Ｐａｂｏら（２００１年）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０巻：３１３〜３４０頁；Ｉｓａｌａｎら（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９巻：６５６〜６６０頁；Ｓｅｇａｌら（２００１年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２巻：６３２〜６３７頁；Ｃｈｏｏら（２０００年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．１０巻：４１１〜４１６頁を参照されたい。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然起源のジンクフィンガータンパク質と比較して、新規結合特異性を有することができる。操作方法として、合理的設計および様々な種類の選択が挙げられるがこれらに限定されない。合理的設計は、例えば、三つ組（または四つ組）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用を含み、データベースにおいて、各三つ組または四つ組ヌクレオチド配列は、特定の三つ組または四つ組配列に結合するジンクフィンガーの１種または複数のアミノ酸配列に関連付けられている。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号を参照されたい。
【００７９】
ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を含む例示的選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、第５，９２５，５２３号、第６，００７，９８８号、第６，０１３，４５３号、第６，４１０，２４８号、第６，１４０，４６６号、第６，２００，７５９号および第６，２４２，５６８号ならびにＷＯ９８／３７１８６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／８８１９７およびＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、ＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。
【００８０】
標的部位；ＺＦＮの選択ならびに融合タンパク質（およびこれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者に公知のものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号および第２００６０１８８９８７号に詳細に記載されている。
【００８１】
加えて、上述および他の参考文献に開示されている通り、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば、５個またはそれ超のアミノ酸長のリンカーを含むいずれかの適したリンカー配列を使用して、一緒に連結することができる。例えば、６個またはそれ超のアミノ酸長の例示的なリンカー配列に関して、米国特許第６，４７９，６２６号、第６，９０３，１８５号および第７，１５３，９４９号を参照されたい。本明細書に記載されているタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間に適したリンカーのいずれかの組合せを含むことができる。
【００８２】
本明細書に記載されているヌクレアーゼのいずれかにおいて、ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮとも称される、操作されたＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメイン（例えば、エンドヌクレアーゼおよび／またはメガヌクレアーゼドメイン）を含むことができる。ユーザーが選ぶ標的配列との頑強な部位特異的相互作用に関して、これらのＴＡＬＥＮタンパク質を操作するための方法および組成物が公開された（米国特許第８，５８６，５２６号を参照）。一部の実施形態において、ＴＡＬＥＮは、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインを含む。他の実施形態において、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼは、メガＴＡＬである。このようなメガＴＡＬヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよびメガヌクレアーゼ開裂ドメインを含む融合タンパク質である。メガヌクレアーゼ開裂ドメインは、単量体として活性を有し、活性のために二量体化を要求しない（Ｂｏｉｓｓｅｌら（２０１３年）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ：１〜１３頁，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１２２４を参照）。加えて、ヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合機能性を提示することもできる。
【００８３】
さらに別の実施形態において、ヌクレアーゼは、コンパクトＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮ）を含む。これは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインをＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに連結した単鎖融合タンパク質である。融合タンパク質は、ＴＡＬＥ領域によって局在化されたニッカーゼとして作用し得る、あるいはＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに対してＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインが位置する場所に応じて二本鎖切断を作製することができる（Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙら（２０１３年）Ｎａｔ  Ｃｏｍｍ：１〜８頁ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ２７８２を参照）。いずれかのＴＡＬＥＮを、追加的なＴＡＬＥＮ（例えば、１種または複数のメガ−ＴＡＬを有する１種または複数のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮまたはＦｏｋＩ−ＴＡＬＥＮ））と組み合わせて使用することができる。
【００８４】
したがって、本明細書に記載されているヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ（開裂ドメイン、開裂ハーフドメイン）も含む。上に記す通り、開裂ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに対し異種であってもよく、例えば、ジンクフィンガーもしくはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ由来の開裂ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼ由来の開裂ドメインであってもよい。異種開裂ドメインは、いずれかのエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。開裂ドメインを得ることができる例示的なエンドヌクレアーゼとして、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、２００２〜２００３年カタログ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ；およびＢｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５巻：３３７９〜３３８８頁を参照されたい。ＤＮＡを開裂させる追加的な酵素は、公知のものである（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅＩ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；  Ｌｉｎｎら（編）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３年も参照）。これらの酵素（またはその機能的断片）のうち１種または複数は、開裂ドメインおよび開裂ハーフドメインの供給源として使用することができる。
【００８５】
同様に、開裂ハーフドメインは、開裂活性のために二量体化を要求する、上に表記されているいずれかのヌクレアーゼまたはその部分に由来するものでもよい。一般に、融合タンパク質が、開裂ハーフドメインを含む場合、開裂のために２個の融合タンパク質が要求される。あるいは、２個の開裂ハーフドメインを含む単一のタンパク質を使用することができる。２個の開裂ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来するものでもよいし、あるいは各開裂ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来するものでもよい。加えて、２個の融合タンパク質の標的部位は、好ましくは、２個の融合タンパク質のそれぞれの標的部位への結合が、例えば二量体化により、開裂ハーフドメインに機能的開裂ドメインを形成させる空間的配向で互いに開裂ハーフドメインを置くように、互いに対して配置される。したがって、ある特定の実施形態において、標的部位の縁付近同士は、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチド離間する。しかし、いかなる整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２個の標的部位間に介在してもよい（例えば、２〜５０ヌクレオチド対またはそれ超）。一般に、開裂の部位は、標的部位間に位置する。
【００８６】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、（認識部位の）ＤＮＡに配列特異的に結合し、結合の部位またはその付近のＤＮＡを開裂することができる。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から離れた部位のＤＮＡを開裂し、分離可能な結合および開裂ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖のその認識部位から９ヌクレオチドおよび他方の鎖のその認識部位から１３ヌクレオチドにおけるＤＮＡの二本鎖開裂を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、第５，４３６，１５０号および第５，４８７，９９４号ならびにＬｉら（１９９２年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９巻：４２７５〜４２７９頁；Ｌｉら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０巻：２７６４〜２７６８頁；Ｋｉｍら（１９９４年ａ）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１巻：８８３〜８８７頁；Ｋｉｍら（１９９４年ｂ）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２６９巻：３１，９７８〜９８２頁を参照されたい。したがって、一実施形態において、融合タンパク質は、操作されていてもされていなくてもよい、少なくとも１種のＩＩＳ型制限酵素由来の開裂ドメイン（または開裂ハーフドメイン）および１種または複数のジンクフィンガー結合ドメインを含む。
【００８７】
その開裂ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性を有する。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅら（１９９８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５巻：１０，５７０〜１０，５７５頁。したがって、本開示の目的のため、開示されている融合タンパク質に使用されているＦｏｋＩ酵素の部分は、開裂ハーフドメインとみなされる。したがって、ジンクフィンガー−ＦｏｋＩまたはＴＡＬＥ−ＦｏｋＩ融合体を使用した細胞配列の標的化二本鎖開裂および／または標的化置き換えのため、それぞれＦｏｋＩ開裂ハーフドメインを含む２個の融合タンパク質を使用して、触媒的に活性な開裂ドメインを再構成することができる。あるいは、ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび２個のＦｏｋＩ開裂ハーフドメインを含有する単一のポリペプチド分子を使用することもできる。ジンクフィンガー−またはＴＡＬＥ−ＦｏｋＩ融合体を使用した標的化開裂および標的化配列変更のためのパラメータは、本開示の他の箇所に提供される。
【００８８】
開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインは、開裂活性を保持する、または多量体形成（例えば、二量体化）して機能的開裂ドメインを形成する能力を保持するタンパク質のいずれかの部分であってもよい。
【００８９】
例示的なＩＩＳ型制限酵素は、その全体が本明細書に組み込まれる国際公開ＷＯ０７／０１４２７５に記載されている。追加的な制限酵素は、分離可能な結合および開裂ドメインも含有し、これらは、本開示により企図されている。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１巻：４１８〜４２０頁を参照されたい。
【００９０】
ある特定の実施形態において、例えば、その全ての開示が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号、第２００６０１８８９８７号および第２００８０１３１９６２号に記載されている通り、開裂ドメインは、ホモ二量体化を最小化または防止する１個または複数の操作された開裂ハーフドメイン（二量体化ドメイン変異体とも称される）を含む。ＦｏｋＩの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７および５３８位におけるアミノ酸残基は全て、ＦｏｋＩ開裂ハーフドメインの二量体化に影響を与えるための標的である。
【００９１】
偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例示的な操作された開裂ハーフドメインは、第１の開裂ハーフドメインがＦｏｋＩの４９０および５３８位のアミノ酸残基に変異を含み、第２の開裂ハーフドメインがアミノ酸残基４８６および４９９に変異を含む対を含む。
【００９２】
したがって、一実施形態において、４９０位における変異は、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）に置き換え；５３８位における変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置き換え；４８６位における変異は、Ｇｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）に置き換え；４９９位における変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置き換える。特に、ある開裂ハーフドメインにおいて４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を変異させて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と名付けられた操作された開裂ハーフドメインを産生することにより、また、別の開裂ハーフドメインにおいて４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と名付けられた操作された開裂ハーフドメインを産生することにより、本明細書に記載されている操作された開裂ハーフドメインを調製した。本明細書に記載されている操作された開裂ハーフドメインは、異常な開裂が最小化または消滅した偏性ヘテロ二量体変異体である。例えば、あらゆる目的でその開示が参照によりその全体が組み込まれる、米国特許第７，９１４，７９６号および第８，０３４，５９８号を参照されたい。
【００９３】
ある特定の実施形態において、操作された開裂ハーフドメインは、４８６、４９９および４９６位（野生型ＦｏｋＩに対して番号を付ける）における変異、例えば、４８６位における野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基に、４９９位における野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基に、４９６位における野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基に置き換える変異（それぞれ「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも称される）を含む。他の実施形態において、操作された開裂ハーフドメインは、４９０、５３８および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して番号を付ける）における変異、例えば、４９０位における野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に、５３８位における野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に、５３７位における野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基に置き換える変異（それぞれ「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも称される）を含む。他の実施形態において、操作された開裂ハーフドメインは、４９０および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して番号を付ける）における変異、例えば、４９０位における野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に、５３７位における野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基に置き換える変異（それぞれ「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも称される）を含む（米国特許出願公開第２０１１０２０１０５５号を参照）。米国特許第７，９１４，７９６号、第８，０３４，５９８号および第８，６２３，６１８号ならびに米国特許出願公開第２０１１０２０１０５５号に記載されている通り、本明細書に記載されている操作された開裂ハーフドメインは、いずれかの適した方法を使用して、例えば、野生型開裂ハーフドメイン（ＦｏｋＩ）の部位特異的変異誘発により調製することができる。
【００９４】
本明細書に記載されているヌクレアーゼにおいて、いずれかのメガヌクレアーゼまたはホーミングエンドヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメインを使用することもできる（例えば、ＤＮＡ結合ドメインに作動可能に連結して）。ヌクレアーゼドメインを得ることができるホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの非限定的な例として、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。このようなヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡに結合することもできる。
【００９５】
あるいは、ヌクレアーゼは、いわゆる「分割酵素」技術（例えば、米国特許出願公開第２００９００６８１６４号を参照）を使用して、核酸標的部位にｉｎ  ｖｉｖｏで組み立てることができる。このような分割酵素の構成成分は、別々の発現構築物において発現させることができる、あるいは、例えば自己開裂性２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列により個々の構成成分を離間させて、１個のオープンリーディングフレーム内に連結することができる。構成成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであってもよい。
【００９６】
例えば、米国特許第７，９１４，７９６号、第８，０３４，５９８号および第８，６２３，６１８号ならびに米国特許出願公開第２０１１０２０１０５５号に記載されている通り、本明細書に記載されている操作された開裂ハーフドメインは、いずれかの適した方法を使用して、例えば、野生型開裂ハーフドメイン（ＦｏｋＩ）の部位特異的変異誘発により調製することができる。
【００９７】
ヌクレアーゼ発現構築物は、当該分野で公知の方法を使用して容易に設計することができる。例えば、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号、第２００５０２０８４８９号、第２００５００２６１５７号、第２００５００６４４７４号、第２００６０１８８９８７号、第２００６００６３２３１号および国際公開ＷＯ０７／０１４２７５を参照されたい。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼの発現は、誘導性プロモーター、例えば、ラフィノースおよび／またはガラクトースの存在下で活性化（抑制解除）され、グルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの制御下にある。特に、炭素源の逐次的な変化（例えば、グルコース〜ラフィノース〜ガラクトース）に応じて、ガラクトキナーゼプロモーターが誘導され、ヌクレアーゼ（複数可）が発現される。誘導性プロモーターの他の非限定的な例として、ＣＵＰ１、ＭＥＴ１５、ＰＨＯ５およびｔｅｔ応答性プロモーターが挙げられる。
【００９８】
ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む。系のＲＮＡ構成成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）遺伝子座およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Ｊａｎｓｅｎら、２００２年、Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３巻：１５６５〜１５７５頁；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００２年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０巻：４８２〜４９６頁；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００６年、Ｂｉｏｌ．  Ｄｉｒｅｃｔ  １巻：７頁；Ｈａｆｔら、２００５年、ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｂｉｏｌ．１巻：ｅ６０頁）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列を構成する。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子と共に、ＣＲＩＳＰＲ媒介性核酸開裂の特異性をプログラムすることができる非コードＲＮＡエレメントの組合せを含有する。
【００９９】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けられた系の１種であり、４つの逐次的ステップにおいて標的化ＤＮＡ二本鎖切断を行う。第１に、２種の非コードＲＮＡ、プレｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡが、プレｃｒＲＮＡの反復領域にハイブリダイズし、プレｃｒＲＮＡのプロセシングを媒介して、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡとする。第３に、標的認識のための追加的な要件である、ｃｒＲＮＡにおけるスペーサーと、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡにおけるプロトスペーサーとの間のワトソン−クリック塩基対形成により、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡに誘導する。最後に、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡの開裂を媒介して、プロトスペーサー内に二本鎖切断を作製する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３ステップからなる：（ｉ）「適応」と呼ばれるプロセスにおける、将来的な攻撃を防止するためのＣＲＩＳＰＲアレイへの異質ＤＮＡ配列の挿入、（ｉｉ）関連するタンパク質の発現ならびにアレイの発現およびプロセシングと、続く（ｉｉｉ）異質核酸でのＲＮＡ媒介性干渉。したがって、細菌細胞において、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のうちいくつかは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然機能に関与し、異質ＤＮＡの挿入等、機能における役割を果たす。
【０１００】
ある特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、天然起源のＣａｓタンパク質の「機能的誘導体」であってもよい。天然型配列のポリペプチドの「機能的誘導体」は、天然型配列のポリペプチドと共通した定性的生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」として、相当する天然型配列のポリペプチドと共通した生物学的活性を有するのであれば、天然型配列の断片ならびに天然型配列のポリペプチドおよびその断片の誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書において企図される生物学的活性は、ＤＮＡ基質を断片へと加水分解する機能的誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合修飾およびこれらの融合体の両方を包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の適した誘導体として、Ｃａｓタンパク質またはその断片の変異体、融合体、共有結合修飾が挙げられるがこれらに限定されない。Ｃａｓタンパク質またはその断片と共にＣａｓタンパク質またはその断片の誘導体を含むＣａｓタンパク質は、細胞から得ることができるまたは化学合成することができる、あるいはこれら２手順の組合せによって為され得る。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞であってもよい、あるいは、Ｃａｓタンパク質を天然に産生し、より高い発現レベルで内因性Ｃａｓタンパク質を産生するようまたは内因性Ｃａｓと同じもしくは異なるＣａｓをコードする外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するよう遺伝子操作された細胞であってもよい。場合によっては、細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然には産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するよう遺伝子操作されている。
【０１０１】
セーフハーバーおよび他の遺伝子に標的化された例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、例えば、米国特許仮出願第６１／８２３，６８９号に開示されている。
【０１０２】
したがって、ドナー（導入遺伝子）の挿入が望まれるいずれかの遺伝子における標的部位に特異的に結合するという点において、ヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合ドメインを含む。
【０１０３】
したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ゲノムにおける所望の標的にＤＳＢを作製するよう操作することができ、ＤＳＢの修復は、修復阻害剤の使用により影響されて、誤りがちな修復の増加を引き起こし得る。
【０１０４】
Ｃ．標的部位
上に詳細に記載されている通り、ヌクレアーゼ（ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓのＲＮＡ）におけるＤＮＡドメインは、遺伝子座におけるいずれかの選択した配列に結合するよう操作することができる。操作されたＤＮＡ結合ドメインは、天然起源のＤＮＡ結合ドメインと比較して、新規結合特異性を有することができる。操作方法として、合理的設計および様々な種類の選択が挙げられるがこれらに限定されない。合理的設計は、例えば、三つ組（または四つ組）ヌクレオチド配列および個々の（例えば、ジンクフィンガー）アミノ酸配列を含むデータベースの使用を含み、該データベースにおいて、各三つ組または四つ組ヌクレオチド配列は、特定の三つ組または四つ組配列に結合するＤＮＡ結合ドメインの１種または複数のアミノ酸配列に関連付けられている。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号を参照されたい。ＴＡＬエフェクタードメインの合理的設計を行うこともできる。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。
【０１０５】
ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を含む、ＤＮＡ結合ドメインに適用可能な例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、第５，９２５，５２３号、第６，００７，９８８号、第６，０１３，４５３号、第６，４１０，２４８号、第６，１４０，４６６号、第６，２００，７５９号および第６，２４２，５６８号ならびにＷＯ９８／３７１８６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／８８１９７およびＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。
【０１０６】
標的部位；ヌクレアーゼの選択ならびに融合タンパク質（およびこれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者に公知のものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号および第２００６０１８８９８７号に詳細に記載されている。
【０１０７】
加えて、上述および他の参考文献に開示されている通り、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、マルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質）は、例えば、５個またはそれ超のアミノ酸のリンカーを含むいずれかの適したリンカー配列を使用して、一緒に連結することができる。例えば、６個またはそれ超のアミノ酸長の例示的なリンカー配列に関して、米国特許第６，４７９，６２６号、第６，９０３，１８５号および第７，１５３，９４９号を参照されたい。本明細書に記載されているタンパク質は、該タンパク質の個々のＤＮＡ結合ドメインの間に適したリンカーのいずれかの組合せを含むことができる。米国特許第８，５８６，５２６号も参照されたい。
【０１０８】
その上、単一ガイドＲＮＡは、特異的ＲＮＡ配列を作製するための当該分野で公知の一般に知られた方法により、ゲノムにおける選択した標的に結合するよう操作することができる。このような単一ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９をいずれかの選ばれた標的部位へとガイドするよう設計される。
【０１０９】
ＤＮＡ修復の阻害剤
本発明の実施において、ＤＮＡ修復経路のいずれかの阻害剤を使用することができる。典型的には、阻害剤は、誤りのない典型的ＮＨＥＪおよび／またはＰＡＲＰ１媒介性代替的ＮＨＥＪ修復、または例えば、リン酸化、ユビキチン化およびＳＵＭＯ化による翻訳後修飾によるそれらの上流調節に関与する酵素に向けられる。阻害剤は、小分子であってもよく、その例として、ＤＮＡ修復に関与する１種または複数のタンパク質を阻害する市販の小分子を含む小分子が挙げられるがこれに限定されない。
【０１１０】
ＰＡＲＰ阻害剤（例えば、ＮＵ１０２５、イニパリブ、オラパリブ）の非限定的な例として、ニコチンアミド；イソキノリノンおよびジヒドロイソキノリノン；ベンズイミダゾールおよびインドール；フタラジン−１（２Ｈ）−オンおよびキナゾリノン；イソインドリノンならびにそのアナログおよび誘導体；フェナントリジンおよびフェナントリジノン；ベンゾピロンならびにそのアナログおよび誘導体；不飽和ヒドロキサム酸（ｈｙｄｒｏｘｉｍｉｃ  ａｃｉｄ）誘導体ならびにそのアナログおよび誘導体；縮合ピリダジンならびにそのアナログおよび誘導体を含むピリダジン；および／またはカフェイン、テオフィリンおよびチミジン等の他の化合物ならびにこれらのアナログおよび誘導体が挙げられる。例えば、米国特許第８，０７１，５７９号を参照されたい。ＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害剤は、当該分野で公知のものであり、その例として、ＮＵ７０２６、ＮＵ７４４１等、市販の阻害剤が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、米国特許第６，９７４，８６７号を参照されたい。
【０１１１】
本発明における使用のために阻害することができるＤＮＡ修復経路酵素の追加的な非限定的な例として、Ｋｕ７０／８０、ＸＲＣＣＲ４／ＸＬＦ、リガーゼＩＶ（例えば、ＳＣＲ７）、ＰＮＫ（例えば、Ａ１２Ｂ４Ｃ３）、ＸＲＣＣ１、ＤＮＡリガーゼＩＩＩおよび／またはヒストンＨ１が挙げられる。また、ＡＴＭ（例えば、ＫＵ５５９３３）、ＣＨＫ１／ＣＨＫ２（例えば、ＡＺＤ７７６２またはＣＨＩＲ−１２４）およびＡＴＲ（例えば、ＶＥ  ８２１）等、細胞周期チェックポイントタンパク質を標的とする阻害剤を使用して、特異的なＤＮＡ修復阻害剤の効果を相乗的に増強する、あるいは細胞周期停止および／またはアポトーシス等の意図されない副作用を防止することができる（Ｃｉｃｃｉａら（２０１０年）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ４０巻：１７９頁を参照）。
【０１１２】
ヌクレアーゼ活性の増加に有効である限り、いずれかの適した量の１種または複数のＤＮＡ阻害剤を使用することができる。使用される特定の濃度は、当業者によって容易に決定することができる。ある特定の実施形態において、０．５μＭ〜２５μＭの間の濃度が使用され、その間のいかなる量（例えば、１μＭ〜２０μＭ、３μＭ〜１０μＭ等）も含まれる。
【０１１３】
ドナー
上に記す通り、例えば、変異体遺伝子の補正のためまたは野生型遺伝子の発現増加のために、外因性配列（「ドナー配列」または「ドナー」とも呼ばれる）の挿入を行うこともできる。ドナー配列は、典型的に、該ドナー配列が配置されるゲノム配列と同一ではないことが容易に明らかとなる。ドナー配列は、相同性の２領域に隣接する非相同配列を含有して、目的の位置における効率的ＨＤＲを可能にすることができる。その上、ドナー配列は、細胞クロマチンにおける目的の領域と相同ではない配列を含有するベクター分子を含むことができる。ドナー分子は、細胞クロマチンに対し相同性のいくつかの不連続領域を含有することができる。例えば、目的の領域に通常存在しない配列の標的化挿入のため、前記配列は、ドナー核酸分子に存在し、目的の領域における配列に対し相同性の領域に隣接することができる。
【０１１４】
ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖および／または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、直鎖状または環状形態で細胞に導入することができる。例えば、米国特許出願公開第２０１０００４７８０５号、第２０１１０２８１３６１号および第２０１１０２０７２２１号を参照されたい。直鎖状形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に公知の方法により（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護することができる。例えば、１個または複数のジデオキシヌクレオチド残基を直鎖状分子の３’末端に付加したり、および／または自己相補的オリゴヌクレオチドを片方または両方の末端にライゲーションしたりする。例えば、Ｃｈａｎｇら（１９８７年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４巻：４９５９〜４９６３頁；Ｎｅｈｌｓら（１９９６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２巻：８８６〜８８９頁を参照されたい。分解から外因性ポリヌクレオチドを保護するための追加的な方法として、末端アミノ基（複数可）の付加、ならびに例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミデートおよびＯ−メチルリボースまたはデオキシリボース残基等の修飾されたヌクレオチド間連結の使用が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１５】
ドナー配列は、オリゴヌクレオチドで有り得、内因性配列の遺伝子補正または標的化変更に使用することができる。オリゴヌクレオチドは、ベクターにおいて細胞に導入することができる、細胞にエレクトロポレーションすることができる、あるいは当該分野で公知の他の方法により導入することができる。オリゴヌクレオチドは、内因性遺伝子における変異した配列を「補正」するために使用することができる（例えば、ベータグロビンにおける鎌状変異）、あるいは所望の目的で内因性遺伝子座に配列を挿入するために使用することができる。
【０１１６】
ポリヌクレオチドは、例えば、複製起点、プロモーターおよび抗生物質抵抗性をコードする遺伝子等、追加的な配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入することができる。さらに、ドナーポリヌクレオチドは、ネイキッド核酸としてまたはリポソームもしくはポロキサマー等の薬剤と複合体形成した核酸として導入することができる、あるいはウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスおよびインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））により送達することができる。
【０１１７】
組込み部位における内因性プロモーター、即ち、ドナーが挿入される内因性遺伝子の発現を駆動するプロモーターによってその発現が駆動され得るように、ドナーは、一般に挿入される。しかし、ドナーが、プロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、構成的プロモーターまたは誘導性もしくは組織特異的プロモーターを含むことができることが明らかとなる。
【０１１８】
ドナー分子は、内因性遺伝子の全てもしくは一部が発現されるまたは全く発現されないように、内因性遺伝子に挿入することができる。例えば、本明細書に記載されている導入遺伝子は、例えば導入遺伝子との融合体として、内因性配列の一部（導入遺伝子に対しＮ末端および／またはＣ末端）が発現されるまたは全く発現されないように、内因性遺伝子座に挿入することができる。他の実施形態において、導入遺伝子（例えば、内因性遺伝子等の追加的なコード配列ありまたはなしの）は、いずれかの内因性遺伝子座、例えば、セーフハーバー遺伝子座、例えば、ＣＣＲ５遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても公知）遺伝子、アルブミン遺伝子またはＲｏｓａ遺伝子に組み込まれる。例えば、米国特許第７，９５１，９２５号および第８，１１０，３７９号、米国特許出願公開第２００８０１５９９９６号、第２０１０００２１８２６４号、第２０１００２９１０４８号、第２０１２００１７２９０号、第２０１１０２６５１９８号、第２０１３０１３７１０４号、第２０１３０１２２５９１号、第２０１３０１７７９８３号および第２０１３０１７７９６０号ならびに米国特許仮出願第６１／８２３，６８９号を参照されたい。
【０１１９】
内因性配列（内因性または導入遺伝子の一部）が、導入遺伝子と共に発現される場合、内因性配列は、全長配列（野生型または変異体）または部分的配列であってもよい。好ましくは、内因性配列は、機能的である。このような全長または部分的配列の機能の非限定的な例として、導入遺伝子（例えば、治療遺伝子）により発現されるポリペプチドの血清半減期の増加および／または担体としての作用が挙げられる。
【０１２０】
さらに、発現には必須ではないが、外因性配列は、転写または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列および／またはポリアデニル化シグナルを含むこともできる。
【０１２１】
送達
本明細書で記載されているように使用されるタンパク質（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）および／またはこれをコードするポリヌクレオチド、いずれかのドナーポリヌクレオチドならびにＤＮＡ修復阻害剤（例えば、小分子）は、いずれか適した手段により標的細胞に送達することができる。
【０１２２】
小分子（例えば、ＤＮＡ修復阻害剤）は、細胞培養培地への添加（単離された細胞へ）および／または注射（静脈内、筋肉内等）、局所適用、経口による等（被験体へ）が挙げられるがこれらに限定されない、当該分野で公知のいずれかの機構により容易に送達することができる。ＤＮＡ修復阻害剤（例えば、小分子）は、ヌクレアーゼ（複数可）および／または任意選択のドナーが投与される前に、それと同時発生的におよび／またはその後に投与することができる。構成成分のうち１種または複数は、いずれかの順序で２回またはそれより多く投与することもでき、例えば、連続的および／または逐次的なヌクレアーゼおよび／または阻害剤の複数回投与が為される。
【０１２３】
本明細書に記載されているヌクレアーゼを含むタンパク質を送達する方法は、例えば、その全ての開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４５３，２４２号、第６，５０３，７１７号、第６，５３４，２６１号、第６，５９９，６９２号、第６，６０７，８８２号、第６，６８９，５５８号、第６，８２４，９７８号、第６，９３３，１１３号、第６，９７９，５３９号、第７，０１３，２１９号および第７，１６３，８２４号に記載されている。
【０１２４】
本明細書に記載されているジンクフィンガー、ＴＡＬＥまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ジンクフィンガータンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬエフェクタードメインタンパク質、ＴＡＬＥＮおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質（複数可）のうち１種または複数をコードする配列を含有するベクターを使用して送達することもできる。ドナーコードポリヌクレオチドを同様に送達することができる。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター等が挙げられるがこれらに限定されない、いずれかのベクター系を使用することができる。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号、第６，５３４，２６１号、第６，６０７，８８２号、第６，８２４，９７８号、第６，９３３，１１３号、第６，９７９，５３９号、第７，０１３，２１９号および第７，１６３，８２４号も参照されたい。さらに、これらのベクターのうちいずれかが、１種もしくは複数のジンクフィンガータンパク質コード配列、１種もしくは複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコード配列または１種もしくは複数のＴＡＬＥコード配列を含み得ることが明らかとなる。したがって、１種または複数のヌクレアーゼまたはヌクレアーゼ系および／またはドナーが、細胞に導入される場合、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼ系および／またはドナーは、同じベクターまたは異なるベクターにおいて運ばれ得る。複数のベクターが使用される場合、各ベクターは、１種または複数種のＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥを含むヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、および／またはドナーをコードする配列を含むことができる。
【０１２５】
従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子移入方法を使用して、操作されたＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥを含むヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、および／またはドナーをコードする核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織に導入することができる。このような方法を使用して、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥを含むヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、および／またはドナーをコードする核酸を細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで投与することもできる。ある特定の実施形態において、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥをコードするヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、および／またはドナーをコードする核酸は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子療法使用のために投与される。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、およびリポソームまたはポロキサマー等の送達ビヒクルと複合体形成した核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、細胞への送達後にエピソームとなるかまたは組み込まれるゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含む。遺伝子療法手順の総説に関して、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６巻：８０８〜８１３頁（１９９２年）；ＮａｂｅｌおよびＦｅｌｇｎｅｒ、ＴＩＢＴＥＣＨ  １１巻：２１１〜２１７頁（１９９３年）；ＭｉｔａｎｉおよびＣａｓｋｅｙ、ＴＩＢＴＥＣＨ  １１巻：１６２〜１６６頁（１９９３年）；Ｄｉｌｌｏｎ、ＴＩＢＴＥＣＨ  １１巻：１６７〜１７５頁（１９９３年）；Ｍｉｌｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ３５７巻：４５５〜４６０頁（１９９２年）；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
６巻（１０号）：１１４９〜１１５４頁（１９８８年）；Ｖｉｇｎｅ、Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８巻：３５〜３６頁（１９９５年）；ＫｒｅｍｅｒおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ５１巻（１号）：３１〜４４頁（１９９５年）；Ｈａｄｄａｄａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ内、ＤｏｅｒｆｌｅｒおよびＢｏｅｈｍ（編）（１９９５）；ならびにＹｕら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １巻：１３〜２６頁（１９９４年）を参照されたい。
【０１２６】
核酸の非ウイルス送達方法は、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、人工ビリオンおよび薬剤増強されたＤＮＡ取込みを含む、あるいは細菌またはウイルス（例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＮＧＲ２３４、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ、タバコモザイクウイルス、ジャガイモウイルスＸ、カリフラワーモザイクウイルスおよびキャッサバ葉脈モザイクウイルス）により植物細胞に送達することができる。例えば、Ｃｈｕｎｇら（２００６年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１１巻（１号）：１〜４頁を参照されたい。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ  ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用したソノポレーションは、核酸の送達のために使用することもできる。好まれる実施形態において、１種または複数の核酸がｍＲＮＡとして送達される。翻訳効率および／またはｍＲＮＡ安定性を増加させるためのキャッピングされたｍＲＮＡの使用も好まれる。ＡＲＣＡ（アンチリバースキャップアナログ）キャップまたはそのバリアントが特に好まれる。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０７４，５９６号および第８，１５３，７７３号を参照されたい。
【０１２７】
追加的な例示的な核酸送達系は、Ａｍａｘａ（登録商標）Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ、Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．（例えばＵＳ６００８３３６を参照）によって提供される送達系を含む。リポフェクションは、例えば、ＵＳ５，０４９，３８６、ＵＳ４，９４６，７８７およびＵＳ４，８９７，３５５に記載されており、リポフェクション試薬は、商業的に販売されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標），Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性および中性脂質は、Ｆｅｌｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４の脂質を含む。細胞（ｅｘ  ｖｉｖｏ投与）または標的組織（ｉｎ  ｖｉｖｏ投与）に送達することができる。
【０１２８】
免疫脂質（ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｉｄ）複合体等、標的化リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知のものである（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０巻：４０４〜４１０頁（１９９５年）；Ｂｌａｅｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．２巻：２９１〜２９７頁（１９９５年）；Ｂｅｈｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５巻：３８２〜３８９頁（１９９４年）；Ｒｅｍｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５巻：６４７〜６５４頁（１９９４年）；Ｇａｏら、Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ  ２巻：７１０〜７２２頁（１９９５年）；Ａｈｍａｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２巻：４８１７〜４８２０頁（１９９２年）；米国特許第４，１８６，１８３号、第４，２１７，３４４号、第４，２３５，８７１号、第４，２６１，９７５号、第４，４８５，０５４号、第４，５０１，７２８号、第４，７７４，０８５号、第４，８３７，０２８号および第４，９４６，７８７号を参照）。
【０１２９】
送達の追加的な方法は、ＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）への送達すべき核酸のパッケージングの使用を含む。このようなＥＤＶは、抗体の一方のアームが標的組織に対する特異性を有し、他方のアームがＥＤＶに対する特異性を有する二特異性抗体を使用して、標的組織へと特異的に送達される。抗体は、標的細胞表面へとＥＤＶを運び、続いてＥＤＶは、エンドサイトーシスにより細胞内に運ばれる。細胞内に入ると、内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄら（２００９年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７巻（７号）６４３頁を参照）。
【０１３０】
操作されたＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよび／またはドナーをコードする核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに基づく系の使用は、体内の特異的な細胞にウイルスを標的化し、核へとウイルスペイロードを輸送するための高度に進化したプロセスを活用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与されてもよいし（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞の処理に使用して、修飾された細胞が患者に投与されてもよい（ｅｘ  ｖｉｖｏ）。ＺＦＰの送達のための従来のウイルスに基づく系として、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴、ワクシニアおよび単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されない。宿主ゲノムにおける組込みは、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス遺伝子移入方法により可能となり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。その上、多くの異なる細胞型および標的組織において、高い形質導入効率が観察された。
【０１３１】
レトロウイルスの向性は、外来性エンベロープタンパク質を組み入れ、標的細胞の潜在的標的集団を増やすことにより変更することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染し、典型的に高ウイルス力価を産生することができるレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来性配列のパッケージング能力を有するシス作用性末端反復配列で構成される。最小シス作用性ＬＴＲは、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、これは次に、標的細胞への治療遺伝子の組み込みに使用されて、永続的導入遺伝子発現をもたらす。広く使用されるレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびこれらの組合せに基づくベクターを含む（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６６巻：２７３１〜２７３９頁（１９９２年）；Ｊｏｈａｎｎら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６６巻：１６３５〜１６４０頁（１９９２年）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら、Ｖｉｒｏｌ．１７６巻：５８〜５９頁（１９９０年）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６３巻：２３７４〜２３７８頁（１９８９年）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６５巻：２２２０〜２２２４頁（１９９１年）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照）。
【０１３２】
一過性発現が好まれる適用において、アデノウイルスに基づく系を使用することができる。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型における非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を要求しない。このようなベクターにより、高力価および高レベルの発現が得られた。このベクターは、比較的単純な系において多量に産生することができる。例えば、核酸およびペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生において、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子療法手順のために、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターも使用して標的核酸を細胞に形質導入する（例えば、Ｗｅｓｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６０巻：３８〜４７頁（１９８７年）；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４６４１；Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５巻：７９３〜８０１頁（１９９４年）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．９４巻：１３５１頁（１９９４年）を参照）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．５巻：３２５１〜３２６０頁（１９８５年）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．４巻：２０７２〜２０８１頁（１９８４年）；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ、ＰＮＡＳ  ８１巻：６４６６〜６４７０頁（１９８４年）；ならびにＳａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６３巻：０３８２２〜３８２８頁（１９８９年）を含む多数の刊行物に記載されている。
【０１３３】
臨床治験における遺伝子移入のために、少なくとも６種のウイルスベクターアプローチが現在利用でき、これらは、ヘルパー細胞株に挿入された遺伝子による欠損ベクターの相補性に関与するアプローチを利用して、形質導入媒介物（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を作製するものである。
【０１３４】
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床治験において使用されたレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒら、Ｂｌｏｏｄ  ８５巻：３０４８〜３０５頁（１９９５年）；Ｋｏｈｎら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．１巻：１０１７〜１０２頁（１９９５年）；Ｍａｌｅｃｈら、ＰＮＡＳ  ９４巻：２２号、１２１３３〜１２１３８頁（１９９７年））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子療法治験において使用された最初の治療ベクターであった（Ｂｌａｅｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０巻：４７５〜４８０頁（１９９５年））。ＭＦＧ−Ｓパッケージングベクターには、５０％またはそれ超の形質導入効率が観察された（Ｅｌｌｅｍら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４巻（１号）：１０〜２０頁（１９９７年）；Ｄｒａｎｏｆｆら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１巻：１１１−２頁（１９９７年））。
【０１３５】
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損および非病原性パルボウイルスアデノ随伴型ウイルスに基づく有望な代替的遺伝子送達系である。ベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ  １４５ｂｐ逆位末端配列のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入細胞のゲノムへの組込みによる効率的遺伝子移入および安定的導入遺伝子送達は、このベクター系の要となる特色である（Ｗａｇｎｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ  ３５１巻：９１１７号、１７０２〜３頁（１９９８年）、Ｋｅａｒｎｓら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９巻：７４８〜５５頁（１９９６年））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６およびＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９およびＡＡＶ  ｒｈ１０、ならびにＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６等の偽型ＡＡＶを含む他のＡＡＶ血清型を本発明に従って使用することもできる。
【０１３６】
複製欠損組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）を高力価で産生し、多数の異なる細胞型を容易に感染させることができる。導入遺伝子が、Ａｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂおよび／またはＥ３遺伝子を置き換え、その後、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞に複製欠損ベクターが伝播されるように、大部分のアデノウイルスベクターが操作される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓および筋肉に存在する細胞等、非分裂分化細胞を含む、複数の型の組織にｉｎ  ｖｉｖｏで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きな運搬能力を有する。臨床治験におけるＡｄベクターの使用例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド治療法に関与した（Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７巻：１０８３〜９頁（１９９８年））。臨床治験における遺伝子移入のためのアデノウイルスベクターの使用の追加的な例として、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ２４巻：１号、５〜１０頁（１９９６年）；Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９巻：７号、１０８３〜１０８９頁（１９９８年）；Ｗｅｌｓｈら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２巻：２０５〜１８頁（１９９５年）；Ａｌｖａｒｅｚら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５巻：５９７〜６１３頁（１９９７年）；Ｔｏｐｆら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５巻：５０７〜５１３頁（１９９８年）；Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７巻：１０８３〜１０８９頁（１９９８年）が挙げられる。
【０１３７】
パッケージング細胞は、宿主細胞に感染することができるウイルス粒子の形成に使用される。このような細胞は、アデノウイルス、ＡＡＶをパッケージングする２９３細胞と、レトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞とを含む。遺伝子療法において使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングする産生株の細胞株によって作製される。ベクターは、典型的に、パッケージングおよびその後の宿主への組込み（適用可能であれば）に要求される最小ウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現させようとするタンパク質をコードする発現カセットに置き換えられている。失われているウイルス機能は、パッケージング細胞株によりトランスで供給される。例えば、遺伝子療法において使用されるＡＡＶベクターは、典型的に、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組込みに要求されるＡＡＶゲノム由来の逆位末端（ＩＴＲ）配列のみを保有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、即ち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列が欠失したヘルパープラスミドを含有する細胞株にパッケージングされる。細胞株は、ヘルパーとしてのアデノウイルスにも感染される。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如により、相当量ではパッケージングされない。アデノウイルスの混入は、例えば、アデノウイルスの方がＡＡＶよりも感受性が高い熱処理により低下させることができる。その上、ＡＡＶは、バキュロウイルス系を使用して、臨床スケールで産生することができる（米国特許第７，４７９，５５４号を参照）。
【０１３８】
多くの遺伝子療法適用において、遺伝子療法ベクターが、特定の組織型へと高度な特異性で送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外表面におけるウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることにより、所定の細胞型に対する特異性を有するよう修飾することができる。リガンドは、目的の細胞型上に存在することが公知の受容体に対する親和性を有するよう選ばれる。例えば、Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２巻：９７４７〜９７５１頁（１９９５年）は、モロニーマウス白血病ウイルスを、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現するよう修飾することができ、組換えウイルスが、ヒト上皮増殖因子受容体を発現するある特定のヒト乳がん細胞に感染することを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが該細胞表面受容体のリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルス−標的細胞ペアへと拡張することができる。例えば、繊維状ファージは、実質的にいかなる選ばれた細胞受容体に対しても特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示するよう操作することができる。上述は、主にウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することができる。このようなベクターは、特異的標的細胞による取込みを好む特異的取込み配列を含有するよう操作することができる。
【０１３９】
遺伝子療法ベクターは、後述する通り、典型的には全身性投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、真皮下または頭蓋内注入）または局所適用による個々の患者への投与により、ｉｎ  ｖｉｖｏで送達することができる。あるいは、ベクターは、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）または普遍的ドナー造血幹細胞等の細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで送達し、続いて通常、該ベクターを組み入れた細胞の選択後に、該細胞を患者に再移植することができる。
【０１４０】
診断、研究または遺伝子療法（例えば、宿主生物へのトランスフェクト細胞の再注入による）のためのｅｘ  ｖｉｖｏ細胞トランスフェクションは、当業者に周知のものである。好まれる実施形態において、細胞は、対象生物から単離され、ＺＦＰ核酸（遺伝子またはｃＤＮＡ）をトランスフェクトされ、該対象生物（例えば、患者）へと再注入して戻される。ｅｘ  ｖｉｖｏトランスフェクションに適した様々な細胞型は、当業者に周知のものである（例えば、患者から細胞を単離し培養する仕方の記述に関して、Ｆｒｅｓｈｎｅｙら、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（第３版、１９９４年）およびこれに引用されている参考文献を参照）。
【０１４１】
適した細胞として、真核および原核細胞および／または細胞株が挙げられるがこれらに限定されない。このような細胞またはこのような細胞から作製された細胞株の非限定的な例として、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）およびｐｅｒＣ６細胞、いずれかの植物細胞（分化または未分化）、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）等の昆虫細胞またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ等の真菌細胞が挙げられる。ある特定の実施形態において、細胞株は、ＣＨＯ−Ｋ１、ＭＤＣＫまたはＨＥＫ２９３細胞株である。その上、初代細胞を単離し、ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ）またはヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）による処理後に、処置すべき被験体への再導入のためにｅｘ  ｖｉｖｏで使用することができる。適した初代細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞等が挙げられるがこれらに限定されない他の血液細胞サブセットを含む。適した細胞は、例として挙げる胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞（ＣＤ３４＋）、神経幹細胞および間葉系幹細胞等、幹細胞も含む。
【０１４２】
一実施形態において、幹細胞は、細胞トランスフェクションおよび遺伝子療法のためのｅｘ  ｖｉｖｏ手順において使用される。幹細胞使用の利点は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで他の細胞型へと分化させることができること、あるいは哺乳動物（細胞のドナー等）へと導入することができ、その骨髄に生着することである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α等、サイトカインを使用して、ＣＤ３４＋細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで臨床的に重要な免疫細胞型へと分化させるための方法は公知のものである（Ｉｎａｂａら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．１７６巻：１６９３〜１７０２頁（１９９２年）を参照）。
【０１４３】
幹細胞は、公知の方法を使用した形質導入および分化のために単離される。例えば、幹細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）およびＩａｄ（分化した抗原提示細胞）等、望まれない細胞に結合する抗体により骨髄細胞をパニングすることにより、骨髄細胞から単離される（Ｉｎａｂａら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．１７６巻：１６９３〜１７０２頁（１９９２年）を参照）。
【０１４４】
一部の実施形態において、修飾された幹細胞を使用することもできる。例えば、アポトーシスに対し抵抗性となるよう作製された幹細胞を治療用組成物として使用することができ、該幹細胞は、本発明のＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および／またはドナーも含有する。アポトーシスに対する抵抗性は、例えば、幹細胞においてＢＡＸまたはＢＡＫ特異的ヌクレアーゼを使用してＢＡＸおよび／またはＢＡＫをノックアウトすることにより（米国特許出願公開第２０１０／０００３７５６号を参照）、あるいは例えば、再度カスパーゼ６特異的ＺＦＮを使用したカスパーゼの破壊により生じ得る。あるいは、アポトーシスに対する抵抗性は、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（カルボベンゾキシ−バリル−アラニル−アスパルチル−［Ｏ−メチル］−フルオロメチルケトン）等、カスパーゼ阻害剤の使用により達成することもできる。
【０１４５】
治療用ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および／またはドナー核酸を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等）は、細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける形質導入のために生物に直接投与されてもよい。あるいは、ネイキッドＤＮＡまたはｍＲＮＡを投与することができる。投与は、注射、注入、局所適用およびエレクトロポレーションが挙げられるがこれらに限定されない、血液または組織細胞との最終接触へと分子を導入するために通常使用される経路のうちいずれかにより為される。このような核酸を投与する適した方法を利用することができ、これは当業者に周知のものであり、２種以上の経路を使用して、特定の組成物を投与することができるが、多くの場合、特定の経路が、別の経路よりも即時かつより有効な反応をもたらすことができる。
【０１４６】
造血幹細胞へのＤＮＡの導入のための方法は、例えば、米国特許第５，９２８，６３８号に開示されている。造血幹細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞への導入遺伝子の導入に有用なベクターは、アデノウイルス３５型を含む。
【０１４７】
免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）への導入遺伝子の導入に適したベクターは、非組み込み型レンチウイルスベクターを含む。例えば、米国特許出願公開第２００９０１１７６１７号を参照されたい。
【０１４８】
薬学的に許容される担体は、一部には、投与されている特定の組成物と、組成物の投与に使用される特定の方法により決定される。したがって、後述する通り、利用できる医薬組成物の幅広い適した製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、１９８９年を参照）。
【０１４９】
対照的に、導入遺伝子または融合タンパク質が、植物遺伝子の操作のためにｉｎ  ｖｉｖｏで投与される場合（後述する「植物細胞への核酸送達」セクションを参照）、融合タンパク質の特定の使用に応じて、構成的、調節型（例えば、発生における、組織もしくは細胞型による、または環境による）または誘導性プロモーターのいずれかが使用される。植物プロモーターの非限定的な例として、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａユビキチン−３（ｕｂｉ−３）に由来するプロモーター配列（Ｃａｌｌｉｓら（１９９０年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２６５巻−１２４８６〜１２４９３頁）；Ａ．ｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓマンノピンシンターゼ（Δｍａｓ）（Ｐｅｔｏｌｉｎｏら、米国特許第６，７３０，８２４号）；および／またはキャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）（Ｖｅｒｄａｇｕｅｒら（１９９６年）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３１巻：１１２９〜１１３９頁）が挙げられる。
【０１５０】
植物細胞への核酸送達
上に記す通り、ＤＮＡ構築物は、種々の従来技法により所望の植物宿主（例えば、そのゲノム）に導入することができる。このような技法の総説に関して、例えば、ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８８年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．）第ＶＩＩＩ節、４２１〜４６３頁；ならびにＧｒｉｅｒｓｏｎおよびＣｏｒｅｙ、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８８年、第２版）、Ｂｌａｃｋｉｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、７〜９章を参照されたい。
【０１５１】
例えば、ＤＮＡ構築物は、植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクション等の技法を使用して、植物細胞のゲノムＤＮＡ中に直接導入されてもよいし、あるいはＤＮＡ構築物は、ＤＮＡ微粒子銃等、遺伝子銃方法を使用して、植物組織に直接導入されてもよい（例えば、Ｋｌｅｉｎら（１９８７年）Ｎａｔｕｒｅ  ３２７巻：７０〜７３頁を参照）。あるいは、ＤＮＡ構築物は、ナノ粒子形質転換により植物細胞に導入することができる（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００９０１０４７００号を参照）。あるいは、ＤＮＡ構築物は、適したＴ−ＤＮＡ境界／隣接領域と組み合わせ、従来のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ宿主ベクターに導入することができる。バイナリーベクターの武装解除および使用を含む、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介性形質転換技法は、科学文献に十分に記載されている。例えば、Ｈｏｒｓｃｈら（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３巻：４９６〜４９８頁およびＦｒａｌｅｙら（１９８３年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０巻：４８０３頁を参照されたい。
【０１５２】
加えて、遺伝子移入は、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＮＧＲ２３４、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ、ジャガイモウイルスＸ、カリフラワーモザイクウイルスおよびキャッサバ葉脈モザイクウイルスおよび／またはタバコモザイクウイルス等、非Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細菌またはウイルスを使用して達成することができる。例えば、Ｃｈｕｎｇら（２００６年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１１巻（１号）：１〜４頁を参照されたい。
【０１５３】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ宿主のビルレンス機能は、バイナリーＴ  ＤＮＡベクター（Ｂｅｖａｎ（１９８４年）Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２巻：８７１１〜８７２１頁）または共培養手順（Ｈｏｒｓｃｈら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７巻：１２２９〜１２３１頁）を使用して細胞がこの細菌に感染される際に、植物細胞ＤＮＡへの構築物および隣接マーカーを含有するＴ鎖の挿入を誘導する。一般に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換系は、双子葉植物の操作に使用される（Ｂｅｖａｎら（１９８２年）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ  １６巻：３５７〜３８４頁；Ｒｏｇｅｒｓら（１９８６年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１８巻：６２７〜６４１頁）。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換系は、単子葉植物および植物細胞の形質転換およびＤＮＡ移入に使用することもできる。米国特許第５，５９１，６１６号；Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎら（１９８４年）ＥＭＢＯ  Ｊ  ３巻：３０３９〜３０４１頁；Ｈｏｏｙｋａｓｓ−Ｖａｎ  Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎら（１９８４年）Ｎａｔｕｒｅ  ３１１巻：７６３〜７６４頁；Ｇｒｉｍｓｌｅｙら（１９８７年）Ｎａｔｕｒｅ  ３２５巻：１６７７〜１７９頁；Ｂｏｕｌｔｏｎら（１９８９年）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．１２巻：３１〜４０頁；およびＧｏｕｌｄら（１９９１年）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９５巻：４２６〜４３４頁を参照されたい。
【０１５４】
代替的な遺伝子移入および形質転換方法として、ネイキッドＤＮＡのカルシウム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはエレクトロポレーション媒介性取込みによるプロトプラスト形質転換（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら（１９８４年）ＥＭＢＯ  Ｊ  ３巻：２７１７〜２７２２頁、Ｐｏｔｒｙｋｕｓら（１９８５年）Ｍｏｌｅｃ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．１９９巻：１６９〜１７７頁；Ｆｒｏｍｍら（１９８５年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２巻：５８２４〜５８２８頁；およびＳｈｉｍａｍｏｔｏ（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ  ３３８巻：２７４〜２７６頁を参照）および植物組織のエレクトロポレーション（Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら（１９９２年）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ
４巻：１４９５〜１５０５頁）が挙げられるがこれらに限定されない。植物細胞形質転換のための追加的な方法は、マイクロインジェクション、シリコンカーバイド媒介性ＤＮＡ取込み（Ｋａｅｐｐｌｅｒら（１９９０年）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ
９巻：４１５〜４１８頁）および微粒子銃（Ｋｌｅｉｎら（１９８８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５巻：４３０５〜４３０９頁；およびＧｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら（１９９０年）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２巻：６０３〜６１８頁を参照）を含む。
【０１５５】
植物細胞にヌクレアーゼコードポリヌクレオチドを導入する方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，３９９，２１８号および第８，３２９，９８６号ならびに米国特許出願公開第２０１００２５７６３８号、第２００８０１８２３３２号、第２０１１０１６７５２１号および第２０１１０１８９７７５号にも記載されている。
【０１５６】
開示されている方法および組成物を使用して、植物細胞のゲノムに挿入された複数の挿入部位に外因性配列を挿入することができる。これは、植物ゲノムに導入された導入遺伝子の発現が、その組込み部位に決定的に依存する限り有用である。したがって、例えば、除草剤耐性、昆虫抵抗性、栄養素、抗生物質または治療分子をコードする遺伝子は、その発現に都合よい植物ゲノムの領域へと標的化組換えにより挿入することができる。
【０１５７】
上述の形質転換技法のいずれかにより産生された形質転換植物細胞を培養して、形質転換された遺伝子型、したがって、所望の表現型を保有する植物全体を再生することができる。このような再生技法は、組織培養成長培地中のある特定の植物ホルモンの操作に頼り、典型的には、所望のヌクレオチド配列と共に導入された殺生物剤および／または除草剤マーカーに頼る。培養プロトプラストからの植物再生は、Ｅｖａｎｓら、「Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ
Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ内、１２４〜１７６頁、Ｍａｃｍｉｌｌｉａｎ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８３年；およびＢｉｎｄｉｎｇ、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ、２１〜７３頁、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、１９８５年に記載されている。再生は、植物カルス、外植片、器官、花粉、胚またはこれらの部分から得ることもできる。このような再生技法は、Ｋｌｅｅら（１９８７年）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．３８巻：４６７〜４８６頁に全般的に記載されている。
【０１５８】
植物細胞に導入された核酸を使用して、基本的にいかなる植物にも所望の形質を付与することができる。幅広い植物および植物細胞系は、本開示の核酸構築物および上述の様々な形質転換方法を使用して、本明細書に記載されている所望の生理学的および農学的特徴のために操作することができる。好まれる実施形態において、操作するための標的植物および植物細胞として、穀物作物（例えば、コムギ、トウモロコシ、イネ、アワ、オオムギ）、果実作物（例えば、トマト、リンゴ、セイヨウナシ、イチゴ、オレンジ）、飼料作物（例えば、アルファルファ）、根菜作物（例えば、ニンジン、ジャガイモ、サトウダイコン、ヤムイモ）、葉物野菜作物（例えば、レタス、ホウレンソウ）；観花用植物（例えば、ペチュニア、バラ、キク）、針葉樹およびマツ（例えば、マツ、モミ、エゾマツ）；ファイトレメディエーションに使用される植物（例えば、重金属蓄積植物）；油料作物（例えば、ヒマワリ、ナタネ）ならびに実験目的に使用される植物（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）を含む作物等、単子葉および双子葉植物が挙げられるがこれらに限定されない。したがって、開示されている方法および組成物は、Ａｓｐａｒａｇｕｓ、Ａｖｅｎａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｃｉｔｒｕｓ、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、Ｄａｕｃｕｓ、Ｅｒｉｇｅｒｏｎ、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ、Ｍａｌｕｓ、Ｍａｎｉｈｏｔ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｏｒｙｃｈｏｐｈｒａｇｍｕｓ、Ｏｒｙｚａ、Ｐｅｒｓｅａ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、Ｐｉｓｕｍ、Ｐｙｒｕｓ、Ｐｒｕｎｕｓ、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｖｉｔｉｓ、ＶｉｇｎａおよびＺｅａ属の種が挙げられるがこれらに限定されない、広範囲の植物にわたり使用される。
【０１５９】
当業者であれば、外因性配列がトランスジェニック植物に安定的に組み入れられ、作動可能であると確認された後に、これを有性交雑により他の植物に導入することができることを認識する。交雑される種に応じて、多数の標準育種技法のいずれを使用してもよい。
【０１６０】
形質転換ＤＮＡに存在するマーカー遺伝子にコードされる形質に関して操作された植物材料を選択またはスクリーニングすることにより、形質転換された植物細胞、カルス、組織または植物を同定および単離することができる。例えば、形質転換遺伝子構築物が抵抗性を付与する抗生物質または除草剤を阻害量含有する培地において操作された植物材料を育成することにより、選択を行うことができる。さらに、形質転換された植物および植物細胞は、組換え核酸構築物に存在し得るいずれかの可視マーカー遺伝子（例えば、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ＢまたはＣ１遺伝子）の活性をスクリーニングすることにより同定することもできる。このような選択およびスクリーニング方法論は、当業者に周知のものである。
【０１６１】
物理学的および生化学的方法を使用して、挿入された遺伝子構築物を含有する植物または植物細胞形質転換体を同定することもできる。このような方法として、１）組換えＤＮＡ挿入物の構造を検出および決定するためのサザンブロット解析またはＰＣＲ増幅；２）遺伝子構築物のＲＮＡ転写物を検出および試験するためのノーザンブロット、Ｓ１  ＲＮａｓｅ保護、プライマー伸長または逆転写酵素ＰＣＲ増幅；３）酵素またはリボザイム活性を検出するための酵素アッセイ（このような遺伝子産物が遺伝子構築物にコードされる場合）；４）タンパク質ゲル電気泳動、ウエスタンブロット技法、免疫沈降または酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）（遺伝子構築物産物がタンパク質である場合）が挙げられるがこれらに限定されない。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、酵素染色および免疫染色等、追加的な技法を使用して、特異的な植物器官および組織における組換え構築物の存在または発現を検出することもできる。これらのアッセイ全てを行うための方法は、当業者に周知のものである。
【０１６２】
本明細書に開示されている方法を使用した遺伝子操作の効果は、例えば、目的の組織から単離されたＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のノーザンブロットにより観察することができる。典型的には、ｍＲＮＡが存在する場合、またはｍＲＮＡの量が増加した場合、相当する導入遺伝子が発現されていることが仮定され得る。遺伝子および／またはコードされているポリペプチド活性を測定する他の方法を使用することができる。使用されている基質および反応産物または副産物の増加または減少を検出する方法に応じて、異なる種類の酵素アッセイを使用することができる。加えて、発現されるポリペプチドのレベルは、免疫化学的に、即ち、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡおよび電気泳動による検出アッセイ（染色またはウエスタンブロッティングのいずれかによる）等の当業者に周知の他の抗体に基づくアッセイにより測定することができる。非限定的な一例として、ＥＬＩＳＡアッセイを使用したＡＡＤ−１およびＰＡＴタンパク質の検出は、米国特許出願公開第２００９００９３３６６号に記載されており、この参考文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。導入遺伝子は、植物の一部の組織において、または一部の発生ステージにおいて選択的に発現させてもよいし、あるいは導入遺伝子は、実質的にあらゆる植物組織において、実質的にその全生活環に沿って発現させてもよい。しかし、いかなるコンビナトリアル発現モードも適用可能である。
【０１６３】
本開示は、上述のトランスジェニック植物の種子であって、導入遺伝子または遺伝子構築物を有する種子も包含する。本開示は、上述のトランスジェニック植物の後代、クローン、細胞株または細胞であって、導入遺伝子または遺伝子構築物を有する前記後代、クローン、細胞株または細胞をさらに包含する。
【０１６４】
融合タンパク質（例えば、ＺＦＮ）および融合タンパク質をコードする発現ベクターは、遺伝子調節、標的化開裂および／または組換えのために植物に直接投与してもよい。ある特定の実施形態において、植物は、複数のパラロガス標的遺伝子を含有する。したがって、１種または複数の異なる融合タンパク質または融合タンパク質をコードする発現ベクターは、植物におけるこのようなパラロガス遺伝子（例えば、Ｚｐ１５、米国特許第８，３２９，９８６号を参照）の遺伝子のうち１種または複数を標的化するために、植物に投与することができる。
【０１６５】
有効量の投与は、処理するべき植物細胞との最終接触に融合タンパク質を導入するために通常使用される経路のうちいずれかによって為される。ＺＦＰは、いずれか適した様式で、好ましくは、許容される担体と共に投与される。このようなモジュレーターを投与する適した方法を利用することができ、これは当業者に周知のものであり、２種以上の経路を使用して、特定の組成物を投与することができるが、多くの場合、特定の経路が、別の経路よりも即時かつより有効な反応をもたらすことができる。
【０１６６】
担体を使用することもでき、これは一部には、投与されている特定の組成物と共に、組成物の投与に使用されている特定の方法により決定される。したがって、利用できる担体の幅広い適した製剤が存在する。
【０１６７】
適用
開示されている組成物および方法は、臨床背景で実行可能な臨床適用のヌクレアーゼに基づく治療法および農業（植物）適用を含む、いずれかの細胞型においてヌクレアーゼ媒介性ゲノム修飾を増加させることが望まれる、いずれかの適用のために使用することができる。例えば、本明細書に記載されている方法は、次のシナリオにおけるＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の治療効果を改善する：ＣＤ３４＋細胞におけるｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子破壊（ＣＣＲ５）（例えば、米国特許第７，９５１，９２５号を参照）；ＣＤ３４＋細胞における異常ヘモグロビン症のｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子補正（例えば、米国特許出願第６１／６９４，６９３号を参照）；および／またはリソソーム蓄積症および血友病の治療法のためのアルブミン遺伝子座のｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子付加（例えば、米国特許出願公開第２０１４００１７２１２号および第２０１３０１７７９８３号を参照）。
【０１６８】
加えて、本明細書に記載されている方法および組成物を使用して、いかなる所定の生物中でも安定なノックアウト細胞の作製など、モデル生物および細胞株の作製を可能にすることができる。ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、細胞株またはモデル生物におけるいずれか所定の遺伝子をノックアウトする能力を提供するが、選択マーカーの非存在下では、このような事象は極めて稀である場合がある。したがって、標的化遺伝子破壊の比率を有意に増加させる本明細書に記載されている方法を使用して、新たな特性を有する細胞株を作製することができる。これは、ハムスター（ＣＨＯ）細胞株等の生物製剤の産生に使用される細胞株、またはヒトＨＥＫ２９３細胞等の数種類のＡＡＶ血清型の産生のための細胞株、またはＳｆ９もしくはＳｆ２１等の昆虫細胞、またはゲノム的に修飾された植物および植物系統を含む。
【０１６９】
本発明の方法および組成物は、トランスジェニック生物の産生において使用することもできる。トランスジェニック動物は、疾患モデルのために開発された動物と共に、望ましい形質を有する動物を含むことができる。本発明の方法および組成物を使用して胚を処理して、トランスジェニック動物を発生させることができる。一部の実施形態において、適した胚は、小型の哺乳動物（例えば、齧歯類、ウサギ等）、コンパニオンアニマル、家畜および霊長類由来の胚を含むことができる。齧歯類の非限定的な例として、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミおよびモルモットを挙げることができる。コンパニオンアニマルの非限定的な例として、ネコ、イヌ、ウサギ、ハリネズミおよびフェレットを挙げることができる。家畜の非限定的な例として、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ラマ、アルパカおよびウシを挙げることができる。霊長類の非限定的な例として、オマキザル、チンパンジー、キツネザル、マカク、マーモセット、タマリン、クモザル、リスザルおよびサバンナモンキーを挙げることができる。他の実施形態において、適した胚は、魚類、爬虫類、両生類または鳥類由来の胚を含むことができる。あるいは、適した胚は、昆虫胚、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ胚または蚊の胚であってもよい。
【０１７０】
本発明の方法および組成物によって企図されるトランスジェニック生物は、トランスジェニック植物および種子も含む。導入のための適した導入遺伝子の例として、１種または複数のプロモーターを有するかまたは有さない、１種または複数の機能ポリペプチドをコードする配列（例えば、ｃＤＮＡ）を含むことができる、および／または生物に望ましい形質を与える１種または複数のＲＮＡ配列を産生することができる（例えば、１種または複数のｓｈＲＮＡ発現カセットにより）外因性核酸配列が挙げられる。植物におけるこのような形質として、除草剤抵抗性または耐性；昆虫抵抗性または耐性；疾患抵抗性または耐性（ウイルス、細菌、真菌、線形動物）；乾燥、熱、低温、凍結、過湿、塩ストレス、酸化ストレスに対する抵抗性または耐性により例証されるストレス耐性および／または抵抗性；収量の増加；食物含量および構成；外見；雄性不稔；ドライダウン（ｄｒｙｄｏｗｎ）；耐倒伏性（ｓｔａｎｄａｂｉｌｉｔｙ）；多産；デンプンの量および質；油の量および質；タンパク質の質および量；アミノ酸組成；その他が挙げられるがこれらに限定されない。当然ながら、除草剤、昆虫、疾患（ウイルス、細菌、真菌、線形動物）もしくは乾燥抵抗性、雄性不稔、ドライダウン、耐倒伏性、多産、デンプン特性、油の量および質を付与する核酸、または収量もしくは栄養的な質を増加させる核酸等、いずれかの記載のいずれか２種またはそれ超の外因性核酸を所望の通り用いることができる。ある特定の実施形態において、外因性核酸配列は、除草剤抵抗性タンパク質（例えば、ＡＡＤ（アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ）遺伝子）および／またはその機能的断片をコードする配列を含む。
【０１７１】
本明細書に記載されている方法および組成物を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ検査の目的のために、高度に活性なＺＦＮ／ＴＡＬＥＮの産生のために、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて（例えば、ＡＡＶ／ウイルス）、ヌクレアーゼ活性のダイナミックレンジを拡張させることができる。詳細には、プラスミドまたはＡＡＶ送達ＺＦＮ構築物における組織特異的プロモーターの使用は、組織特異的転写マーカーを非常に低用量で発現させることしかできない伝統的細胞株におけるこれらの検査を非常に困難なものとする。ＤＮＡ修復阻害剤の使用は、ＣｅｌＩ−Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイによって検出され得るポイントまでＺＦＮ活性を増加させることにより、この限界を克服することができる。
【０１７２】
キット
上述の方法のいずれかを行うためのキットも提供される。キットは、典型的に、１種もしくは複数のヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、１種もしくは複数のＤＮＡ修復阻害剤、および／または本明細書に記載されているドナーポリヌクレオチド、ならびにヌクレアーゼおよび／またはドナーポリヌクレオチドが導入される細胞にＤＮＡ修復阻害剤を投与するための説明書を含有する。キットは、細胞、細胞の形質転換のためのバッファー、細胞のための培養培地、および／またはアッセイを行うためのバッファーを含有することもできる。典型的には、キットは、キットの他の構成成分に添付または他の仕方で付随した説明書、包装または宣伝チラシ等、いずれかの材料を含むラベルも含有する。
【０１７３】
次の実施例は、ヌクレアーゼが１種もしくは複数のＺＦＮまたは１種もしくは複数のＴＡＬＥＮを含む、本開示の例示的な実施形態に関する。これが、単なる例証目的のためのものであり、他のヌクレアーゼ、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）と操作されたＤＮＡ結合ドメイン、および／または天然起源の操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合ドメインおよび異種開裂ドメイン、メガＴＡＬ、コンパクトＴＡＬＥＮと、操作された単一ガイドＲＮＡを使用したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ等のヌクレアーゼ系との融合体を使用することができることが認められる。
【実施例】
【０１７４】
実施例１：ＤＮＡ修復阻害剤は、ヌクレアーゼ処理細胞における変異を増加させる
図２Ａに示す通り、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸにより、アルブミン特異的ＺＦＮ対（米国特許出願公開第２０１３０１７７９８３号および第２０１３０１７７９６８号を参照）をコードするｍＲＮＡをＨｅｐａ  １−６細胞にトランスフェクトし、小分子阻害剤で２回処理した。特に、ｍＲＮＡ送達の３時間後に、それぞれ５μＭおよび３〜５μＭの濃度で、阻害剤オラパリブ（ＰＡＲＰ１阻害剤）およびＮＵ７４４１（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害剤）を添加した。対照として、１０μＭの濃度のＡＴＭ阻害剤ＫＵ５５９３３を添加した（ＡＴＭは、ＤＳＢ修復における直接的な役割を持たないが、ＤＮＡ−ＰＫｃｓに関係する）。１５時間後に、新鮮な阻害剤を培地に添加して、細胞培養培地における阻害剤の減衰を相殺した。
【０１７５】
さらに５４時間後に、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）／ＣｅｌＩアッセイによる３日目解析およびＤＮＡ配列決定のために、細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを調製した。ＤＮＡ配列決定のために、ＺＦＮのゲノム標的領域をＰＣＲにより増幅し、ｔｏｐｏクローニングし、９６個の個々のクローンを配列決定した。配列を解析し、結果を使用して、ゲノム型による群にクローンを分けた（例えば、野生型ゲノム、挿入および／または欠失を有するゲノム、他の修飾を有するゲノム）。３日目の収集において、阻害剤を含まない新鮮な培地に細胞の約３分の１を再播種し、１０日目まで育成し、ここで、細胞を収集し、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）／ＣｅｌＩアッセイにより解析した。
【０１７６】
図２および図３Ｃに示す通り、ＡＴＭ阻害剤ＫＵ５５９３３の添加は、変異原性修復の僅かな減少を引き起こした。対照的に、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害剤単独（ＮＵ７４４１）またはＰＡＲＰ１／２阻害剤（オラパリブ（Ｏｌａｌｐａｒｉｂ））との組み合わせの添加後に、変異原性修復（「％挿入欠失」）の２〜３倍の増加が観察された。この効果は、１０日目に幾分低下し、変異原性修復の増加は、依然として約２倍であった。結果は、大部分の細胞が、小分子阻害剤の中止後に回復し、正常な細胞周期を再開することを示す。２８時間後のＺＦＮの発現レベルは、いずれかの阻害剤を含ませた後に有意により低く（図２Ｄ）、細胞周期停止によるより高いＺＦＮ発現が、ＮＵ７４４１＋オラパリブ処理後により高い挿入欠失パーセンテージを引き起こしている可能性を排除した。
【０１７７】
細胞死が、図２Ｂおよび図２Ｃにおける幾分より弱い親ＰＣＲバンドに寄与する可能性を除外するために、それぞれｍＡＬＢおよびｍＣＸＣＲ４遺伝子座の両方における放射性ゲノムＰＣＲを行った（図２Ｅ）。次に、ＤＭＳＯ対照と、ＮＵ７４４１およびオラパリブで処理した細胞との間のバンド強度を比較した。細胞死が、ＮＵ７４４１＋オラパリブ試料におけるバンド強度の減少を引き起こしていた場合、両方の遺伝子座が等しく影響を受け（ＤＮＡ断片化により）、より弱いＰＣＲ増幅を示す筈である。しかし、ｍＡＬＢ（ＺＦＮ標的遺伝子座）におけるバンド強度は３６％低下したが、ｍＣＸＣＲ４は、僅かにより高かった（３％）。このことは、細胞死が、観察されたバンド強度の差の原因ではないことを示す。
【０１７８】
図３に示す配列決定データ（３日目から）は、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害単独の後に変異原性修復の２倍の増加を確認した。さらに、これらの事象の大部分は、わずかな欠失であった（図３Ａ）。
【０１７９】
図３Ｃは、開裂後に細胞によって利用されるＭＭＥＪ（マイクロホモロジー媒介末端結合）のパーセントを示す。図解されている通り、ヌクレアーゼは、ゲノムをカットする（ハサミで示す）。開裂部位付近のマイクロホモロジーの２領域をボックスで示す。ＭＭＥＪにより修復が行われる場合、開裂したＤＮＡは、マイクロホモロジーのこれらの区域まで切除され、続いて連結される。次に、ディープシーケンシング解析によりこの接合部を検出した。図３Ｃに示す通り、３日目または１０日目にディープシーケンシングにより検出されたＭＭＥＪのパーセントは、典型的ＮＨＥＪおよび代替的ＮＨＥＪ阻害剤の存在下で観察されるＭＭＥＪ使用の増加がほぼ１０倍であることを示し、これは、ＤＮＡ修復経路の階層が存在することを支持する。
【０１８０】
要約すると、ＤＳＢ修復経路は、変異原性修復事象を増加させるために、特異的小分子阻害剤の使用により操作することができる。
【０１８１】
実施例２：ＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害剤を使用した、Ｋ５６２およびＣＨＯ  Ｋ１細胞におけるｓｓオリゴのヌクレアーゼ媒介性標的化組込みの増加
Ａ．ＺＦＮ
Ａｍａｘａ（登録商標）エレクトロポレーションシステムにより、ＣＣＲ５特異的ＺＦＮ対（米国特許第７，９５１，９２５号を参照）をコードするプラスミドＤＮＡと、標的領域に対し相同性を有し特有の制限部位（ＡｖｒＩＩ）を有する一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓオリゴ）（１２０ｂｐ）をＫ５６２細胞にトランスフェクトした。次に、実施例１に記載されている（図２Ａに概要を示す）小分子阻害剤で細胞を２回処理した。特に、ＺＦＮコードＤＮＡ送達の５時間後に、それぞれ５μＭおよび３μＭの濃度の阻害剤オラパリブ（ＰＡＲＰ１／２阻害剤）およびＮＵ７４４１（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害剤）を添加した。対照として、１０μＭの濃度のＡＴＭ阻害剤ＫＵ５５９３３を添加した。１５時間後に、新鮮な阻害剤を培地に添加して、細胞培養培地における阻害剤の減衰を相殺した。さらに５４時間後に、細胞を収集し、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）／ＣｅｌＩアッセイ、ＲＦＬＰ解析およびＤＮＡ配列決定による３日目の解析のためにゲノムＤＮＡを調製した。
【０１８２】
組み込まれたｓｓオリゴ内をカットする制限酵素によるＰＣＲ増幅した標的遺伝子座の消化により、ＲＦＬＰアッセイを行った。ＤＮＡ配列決定のために、ＺＦＮのゲノム標的領域をＰＣＲにより増幅し、ｔｏｐｏクローニングし、９６個の個々のクローンを配列決定した。
【０１８３】
図４（パネルＡ〜Ｃ）に示す通り、ＡＴＭ阻害剤ＫＵ５５９３３の添加は、標的化組込みに効果がなかった。対照的に、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害剤の添加後に、標的化組込みの２〜３倍の増加が観察された。この増加は、ＲＦＬＰアッセイおよび９６コロニー配列決定の両方により観察された。ＰＡＲＰ１／２阻害剤の添加が、標的組込みの効率をさらに増加させることはなかった。ＺＦＮの発現レベルは、いずれかの阻害剤を含ませた後に僅かに高くなり、これは、カットおよび標的化組込みの両方にプラスに影響を与えることができた。これは処理細胞における細胞周期停止に起因する可能性が高く、このことは、３日目における細胞数の約５０％低減からも裏付けられる（図４Ｃ）。しかし、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害剤ＮＵ７４４１（それのみまたはオラパリブと共に）の添加のみが、より高い標的化組込み率をもたらしたため、より高いＺＦＮ発現の寄与は無視できる。
【０１８４】
興味深いことに、配列決定は、標的化組込みの増加が、野生型対立遺伝子を犠牲にして成り立つだけでなく、欠失、重複および挿入ももたらす（図４Ｂと図４Ｄを比較）ことを明らかにした。このことは、修復阻害剤の使用が、標的化組込みをより特異的なものとし、意図されないＤＮＡ修復事象を回避し得ることを示唆する。
【０１８５】
１０日目の解析は、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害後の標的化組込みの増加が、３日目から実質的に変化しなかったことを実証した。この結果は、大部分の細胞が、小分子阻害剤の中止後に回復し、正常な細胞周期を再開することを示す。
【０１８６】
ＣＨＯ  Ｋ１細胞における二本鎖ドナーの挿入の間におけるＤＮＡ  ＰＫｃｓ阻害剤の使用も検査した。本実験のため、ドナーは、プラスミド（図４Ｅ）またはＰＣＲ断片（図４Ｆ）のいずれかにより送達された。簡潔に説明すると、Ａｍａｘａ（登録商標）機器においてＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットＶをＣＨＯ  Ｋ１細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション構成成分およびその投薬量を次に示す：１００μＬのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（商標）溶液Ｖに懸濁した１００万個のＣＨＯ  Ｋ１細胞；ＣＨＯ細胞におけるグルタミンシンテターゼ遺伝子座（ＧＳ）にＤＳＢを誘導するために操作された、それぞれ４μｇの２種のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＺＦＮ  ｍＲＮＡ（例えば、米国特許第８，１５３，３９９号を参照）；２μｇ（図４Ｅ）または４μｇ（図４Ｆ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＣＨＯまたはヒトＲａｄ５２  ｍＲＮＡ；１０μｇのプラスミドドナー（３．８ｋｂ）またはＰＣＲ断片ドナー（１．１ｋｂ）。プラスミドドナーおよびＰＣＲ断片ドナーは両者共に、２本の５００ｂｐ相同アーム、２個のｌｏｘＰ部位、およびマルチクローニングサイトを含有する、同じ標的組込み配列を保有した。
【０１８７】
トランスフェクトした細胞を培地に添加する前に、６ウェルプレートにおけるウェル当たり２ｍｌの予熱した培養培地に、それぞれ２０μＭまたは１６μＭの濃度で、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害剤ＮＵ７０２６またはＮＵ７４４１を添加した。阻害剤含有培地において２４時間３７℃、５％ＣＯ２で細胞を育成した。続いて、培地を、阻害剤を含まない新鮮な培地に交換した。阻害剤ブランク対照としてＤＭＳＯを使用した。ゲノムＤＮＡ調製のために、トランスフェクション３日後に細胞を収集した。組込み配列の上流および下流に位置するプライマー対を用いたＰＣＲにより、ゲノムＤＮＡを増幅した。精製ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、１％アガロースゲルで消化反応物を分離することにより、ＲＦＬＰ解析を行った。
【０１８８】
図４Ｅに示す通り、ＮＵ７０２６単独は同条件下で明らかな増加を提示しなかったにもかかわらず、Ｒａｄ５２  ｍＲＮＡの添加と併せたＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害剤ＮＵ７０２６の適用は、プラスミドドナーに基づく標的組込みの２〜４倍の増加をもたらした。結果は、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害剤およびＲａｄ５２  ｍＲＮＡが、プラスミドに基づく標的組込みの促進に相乗効果を有したことを示す。さらに、図４Ｆに示す通り、ＰＣＲ断片ドナーが、末端にクローニングベクター配列を保有したか否かにかかわらず、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害剤ＮＵ７４４１の添加は、ＰＣＲ断片ドナーに基づく標的組込みを約５倍増加させた。観察されたＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害剤ＮＵ７０２６およびＮＵ７４４１の間の差は、ＮＵ７４４１が、ＮＵ７０２６よりも特異的かつより強力であるという事実に帰することができる。
【０１８９】
Ｂ．ＴＡＬＥＮ
ＴＡＬＥＮ媒介性標的化組込みも、ＤＮＡ修復阻害剤の使用によって増強され得ることを実証するために、本発明者らは、同様にヒトＣＣＲ５遺伝子座を標的とするＴＡＬＥＮ対１０１０２８：１０１０３６を用いて同様の実験を行った。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。ＡＭＡＸＡにより、ｈＣＣＲ５  ＴＡＬＥＮまたはＺＦＮのいずれかをコードするプラスミドＤＮＡをＫ５６２細胞にトランスフェクトし、続いて細胞をＤＭＳＯまたはＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害剤ＮＵ７４４１で処理した。３日目および１０日目に細胞を収集し、ディープシーケンシングによりＰＣＲ後にゲノムＰＣＲを解析した。
【０１９０】
図５に示す通り、ＺＦＮ媒介性開裂と同様に、ＴＡＬＥＮ媒介性標的化組込みは、３日目に最大２倍（図５Ａ）であった。上述のＺＦＮデータと一致して、本発明者らは、ＴＡＬＥＮにより、ＮＵ７４４１処理後に、全ゲノム編集事象の半分超が標的化組込みとなり、望まれない変異原性事象（挿入欠失）が劇的に低下したことも観察した（図５Ｂ）。ＺＦＮ媒介性ＴＩ事象がさらに増加し、ＴＡＬＥＮ媒介性事象が減少した、１０日目の挙動の差は、さらなる最適化を未だ経ていない第一世代ＣＣＲ５  ＴＡＬＥＮとは対照的に、使用したＣＣＲ５  ＺＦＮ（例えば、高度に最適化されたＺＦＮ）のより高い特異性に帰することができる。
【０１９１】
したがって、データは、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ媒介性開裂の両方が、同じ阻害剤により操作され得ることを実証する。
【０１９２】
これらの結果は、ＤＳＢ修復経路が、標的化組込みの効率および特異性を増加させるために、特異的小分子阻害剤の使用により操作され得ることを示す。
【０１９３】
実施例３：ＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害剤を使用した、ＨＥＫ２９３またはＣＤ３４＋細胞におけるｓｓオリゴの標的化組込みの増加
次に、本発明者らは、阻害剤を使用して、一本鎖ドナーの標的化組込みに対するその効果を測定した。簡潔に説明すると、Ａｍａｘａ（登録商標）機器において、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットＶを用いてＨＥＫ２９３およびＭＣＦ７細胞にトランスフェクトし、Ｎｕｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）キットＬを用いてＭＣＦ１０Ａ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション構成成分およびその投薬量を次に示す：１００μＬのｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ溶液に懸濁した８０万個の細胞；ヒト細胞におけるＡＡＶＳ１遺伝子座にＤＳＢを誘導するために操作された、それぞれ３μｇの２種のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＺＦＮ  ｍＲＮＡ（例えば、米国特許第８，１１０，３７９号を参照）；０．３ｎｍｏｌの１００ｎｔ  ｓｓＤＮＡオリゴドナー。オリゴドナーは、ＺＦＮ開裂部位の２０ｂｐ上流の位置にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を保有し、ＲＦＬＰによる標的組込み解析のためのマーカーとしてＨｉｎｄＩＩＩ部位を使用した。
【０１９４】
トランスフェクトされた細胞を培地に添加する前に、６ウェルプレートにおけるウェル当たり２ｍｌの予熱した培養培地に、ＨＥＫ２９３およびＭＣＦ７は１０μＭ、ＭＣＦ１０Ａは１５または２０μＭの濃度で、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害剤ＮＵ７４４１を添加した。阻害剤含有培地において２４時間、３７℃、５％ＣＯ２で細胞を育成した。次に、培地を、阻害剤を含まない新鮮な培地に交換した。阻害剤ブランク対照としてＤＭＳＯを使用した。ゲノムＤＮＡ調製のために、トランスフェクション３日後にＨＥＫ２９３およびＭＣＦ１０Ａ細胞を収集し、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ５日後にＭＣＦ７細胞を収集した。ｓｓＤＮＡオリゴドナー配列の上流および下流に位置するプライマー対を用いたＰＣＲにより、ゲノムＤＮＡを増幅した。精製ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、１０％アクリルアミドゲルで消化反応物を分離することにより、ＲＦＬＰ解析を行った。
【０１９５】
図６に示す通り、結果は、ＮＵ７４４１の使用が、ＨＥＫ２９３細胞における一本鎖ドナーの標的化組込みを増加させたことを実証した（例えば、図６Ａを参照）。
【０１９６】
以前の実験は、小分子阻害剤を使用して、細胞株における二本鎖および一本鎖ドナー配列の標的化組込みの効率および特異性を増加させることができることを実証した。小分子阻害剤を使用して、初代細胞における標的化組込みの効率および特異性を増加させることもできることを実証するため、小分子阻害剤（ＮＵ７４４１）をＣＤ３４＋前駆細胞に添加した。
【０１９７】
具体的には、分化を抑制する培地における培養３日後に、ドナー由来のＣＤ３４＋細胞にトランスフェクトした。このことは、ＢＴＸエレクトロポレーションシステムにより、ＣＣＲ５特異的ＺＦＮ対をコードするｍＲＮＡ  ＤＮＡと、標的領域に対する相同性を有し、特有の制限部位（ＡｖｒＩＩ）を有するｓｓオリゴヌクレオチド（１２０ｂｐ）により行った。次に、実施例１に記載されている小分子阻害剤で細胞を２回処理した。特に、ｍＲＮＡ送達３時間後に、３μＭの濃度で、阻害剤ＮＵ７４４１（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害剤）を添加した。１５時間後に、新鮮な阻害剤を培地に添加して、細胞培養培地における阻害剤の減衰を相殺した。さらに５４時間後に、細胞を収集し、ＤＮＡ配列決定による３日目の解析のためにゲノムＤＮＡを調製した。ＤＮＡ配列決定のために、ＺＦＮのゲノム標的領域をＰＣＲにより増幅し、ｔｏｐｏクローニングし、９６個の個々のクローンを配列決定した。
【０１９８】
図６Ｂに示す通り、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害剤の添加は、５ヌクレオチド重複および欠失を犠牲にして、ＣＤ３４＋細胞における標的化組込みの僅かな増加をもたらす。
【０１９９】
したがって、ＤＳＢ修復経路は、初代細胞における標的化組込みの効率および特異性を増加させるために、特異的小分子阻害剤の使用により操作され得る。
【０２００】
実施例４：ニッカーゼおよびＤＮＡ−ＰＫｃｓ／Ｐａｒｐ阻害剤処理による、Ｋ５６２細胞におけるｓｓオリゴの標的化組込みの増加
Ａｍａｘａエレクトロポレーションシステムにより、ＣＣＲ５特異的ＺＦＮ対（米国特許第７，９５１，９２５号を参照）をコードするプラスミドＤＮＡと、標的領域に対し相同性を有し特有の制限部位（ＡｖｒＩＩ）を有する一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓオリゴ）（１２０ｂｐ）をＫ５６２細胞にトランスフェクトした。以前の実験とは対照的に、ＺＦＮ対は、野生型ＦｏｋＩ  ＺＦＮ（８１９６−ＷＴ）および変異体Ｆｏｋ１  ＺＦＮ（８２６７−Ｄ４５０Ｎ）（米国特許第７，９１４，７９６号、第８０３４，５９８号および第８，６２３，６１８号を参照）を含み、本実験において使用されているＺＦＮ対は、標的部位におけるＤＮＡの一方の鎖を開裂し、したがって、「ニッカーゼ」として機能する。米国特許出願公開第２０１０００４７８０５号を参照されたい。この種類のＤＮＡ損傷の低い有害性質のため、ｓｓＤＮＡ切断に媒介される組換え事象は、ＤＳＢよりも好ましくなり得る。しかし、ｓｓＤＮＡ切断により媒介される遺伝子修飾の頻度は非常に低い。ｓｓＤＮＡ切断（「ニック」）により媒介される遺伝子修飾の頻度を増加させる試みにおいて、ＤＮＡ−ＰＫｃｓおよびＰＡＲＰ阻害剤を使用した。
【０２０１】
簡潔に説明すると、トランスフェクション５時間および１５時間後に、トランスフェクトされたＫ５６２細胞を、ＰＡＲＰ１／２阻害剤（オラパリブ−５μＭ）またはＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害剤（ＮＵ７４４１−３μＭ）のいずれかで２回処理して、細胞培養培地における阻害剤の減衰を相殺した。さらに５４時間後に、細胞を収集し、実施例１に記載されている通り、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）／ＣｅｌＩアッセイ、ＲＦＬＰ解析およびＤＮＡ配列決定による３日目の解析のために、ゲノムＤＮＡを調製した。組み込まれたｓｓオリゴ内をカットする制限酵素によるＰＣＲ増幅した標的遺伝子座の消化により、ＲＦＬＰアッセイを行った。ＤＮＡ配列決定のために、ＺＦＮのゲノム標的領域をＰＣＲにより増幅し、ｔｏｐｏクローニングし、９６個の個々のクローンを配列決定した。
【０２０２】
図７Ａおよび図７Ｂに示す通り、ニッカーゼのみの処理は、ＤＮＡ修復阻害剤の存在下であっても、いかなる検出可能レベルのＣｅｌＩシグナルも生じなかった（挿入欠失なし）。しかし、一本鎖オリゴヌクレオチドをニッカーゼＺＦＮと共トランスフェクトした場合、未処理細胞において非常に低いＣｅｌＩシグナルが検出され、ＤＮＡ−ＰＫｃｓおよびＰＡＲＰ１／２阻害後に頑強なシグナル（７％および５％挿入欠失）が検出された。本発明者らがこれらの試料を配列決定した際に、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害剤で処理した９６クローンのうち１クローンのみが、非ＷＴ配列を生じ、ｓｓオリゴの完全な標的化組込みを表した。
【０２０３】
別の実験において、Ｋ５６２細胞をＰＡＲＰ１阻害剤ＮＵ１０２５で処理した。簡潔に説明すると、３μｌのアンチセンスＡＡＶＳ１オリゴ（１００μＭ）を有するかまたは有さない、ＡＡＶＳ１に特異的な５μｇの二本鎖開裂またはニッカーゼＺＦＮ（米国特許第８，１１０，３７９号）を２００万個のＫ５６２細胞にｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔした。２４時間または４８時間のｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ後に、細胞をＰＡＲＰ阻害剤ＮＵ１０２５で直ちに処理した。ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ４８時間後に全細胞を収集した。１．０μｇのＰＣＲ  ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ消化に付した。図７Ｃに示す通り、二本鎖開裂またはニッカーゼＺＦＮの両方により、検出可能な組込みが観察された。
【０２０４】
これらの結果は、ニッカーゼヌクレアーゼをＤＮＡ修復阻害剤と共に使用して、高い特異性で標的化組込みを行うことができることを実証する。
【０２０５】
本明細書に言及されているあらゆる特許、特許出願および刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２０６】
理解を明確にする目的のため、図解および例として本開示を詳細に示してきたが、当業者であれば、本開示の精神または範囲から逸脱することなく、様々な変更および修正を実施することができることが明らかである。したがって、先の記載および実施例は、限定的に解釈するべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年4月1日(2019.4.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞におけるマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）を介した標的化されたゲノム破壊のためのインビトロの方法であって、前記方法は：
少なくとも１種のヌクレアーゼを前記細胞に投与するステップであって、前記ヌクレアーゼが、前記細胞における内因性ゲノム配列を開裂し、前記ヌクレアーゼが、ＴＡＬＥエフェクタードメインヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）および/またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系である、ステップと、
少なくとも１つのＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）タンパク質の小分子阻害剤、および少なくとも１つのポリ−（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１／２（ＰＡＲＰ１／２）タンパク質の小分子阻害剤を含む培地中で前記細胞を増殖させるステップと
を含み、
前記ＰＡＲＰ１／２タンパク質の小分子阻害剤が、ニコチンアミド；イソキノリノン；ジヒドロイソキノリノン；ベンズイミダゾール；インドール；フタラジン−１（２Ｈ）−オン；キナゾリノン；イソインドリノン；フェナントリジン；フェナントリジノン；ベンゾピロン；不飽和ヒドロキサム酸誘導体；ピリダジン；カフェイン、テオフィリン、およびチミジンからなる群から選択され、前記ＤＮＡ−ＰＫｃｓタンパク質の小分子阻害剤が、ＮＵ７０２６およびＮＵ７４４１からなる群から選択され、
前記細胞における前記内因性ゲノム配列は、前記少なくとも１種のヌクレアーゼによる開裂の後にＭＭＥＪを介して破壊される、
方法。
【請求項２】
前記細胞が、Ｒａｄ５２  ｍＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的化されたゲノム破壊が、欠失を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記標的化されたゲノム破壊が、挿入を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が、外因性配列を前記細胞に投与するステップをさらに含み、前記外因性配列は、前記ヌクレアーゼによる開裂後に、相同組換え修復（ＨＤＲ）機構により前記ゲノムに組み込まれる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ヌクレアーゼが、発現ベクターを使用して投与されるか、またはｍＲＮＡとして投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が真核細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記真核細胞が、哺乳動物細胞または植物細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法において使用するためのキットであって、前記キットは、前記細胞における標的部位に結合する少なくとも１種のヌクレアーゼと、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）タンパク質の１種または複数の小分子阻害剤および／またはポリ−（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１／２（ＰＡＲＰ１／２）タンパク質の１種または複数の小分子阻害剤とを含み、
前記ＰＡＲＰ１／２タンパク質の小分子阻害剤が、ニコチンアミド；イソキノリノン；ジヒドロイソキノリノン；ベンズイミダゾール；インドール；フタラジン−１（２Ｈ）−オン；キナゾリノン；イソインドリノン；フェナントリジン；フェナントリジノン；ベンゾピロン；不飽和ヒドロキサム酸誘導体；ピリダジン；カフェイン、テオフィリン、およびチミジンからなる群から選択され、前記ＤＮＡ−ＰＫｃｓタンパク質の小分子阻害剤が、ＮＵ７０２６およびＮＵ７４４１からなる群から選択され、
そして任意選択で、ＭＭＥＪ修復経路の活性化因子および／または外因性配列をさらに含む、キット。
【請求項１０】
処置の方法において使用するための組成物であって、
該組成物は、標的化されたゲノム破壊を含む細胞を含み、
該方法は、
ｉ）請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法によって細胞において標的化されたゲノム破壊を導入するステップ
ｉｉ）前記組成物を個々の患者に投与するステップを含む、
組成物。
【請求項１１】
前記細胞が、前記細胞において標的化されたゲノム破壊を導入するステップの前に前記個々の患者から外植されているか、または前記細胞が幹細胞である、請求項９に記載の組成物。