(57)【要約】【課題】    本発明の課題は、新たな作用機序のミトコンドリア病の治療薬を提供することである。【解決手段】本発明により、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣ）、フェニル酪酸（ＰＢＡ）、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物を有効成分として含有する遺伝性ミトコンドリア病の治療および／または予防のための医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物は、ｍｔ−ｔＲＮＡLeu(UUR)、ｍｔ−ｔＲＮＡTrp、ｍｔ−ｔＲＮＡLys、ｍｔ−ｔＲＮＡGlu、およびｍｔ−ｔＲＮＡGlnからなる群より選ばれる少なくとも一つのｍｔ−ｔＲＮＡのタウリンの修飾の異常に起因するミトコンドリア病またはＭｏｔ１遺伝子の変異に起因するミトコンドリア病に特に有用である。【選択図】図２７
2019112338.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣ）、フェニル酪酸（ＰＢＡ）、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物を有効成分として含有する遺伝性ミトコンドリア病の治療および／または予防のための医薬組成物。
【請求項２】
タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣ）またはそれの薬学的に許容される塩を有効成分として含有する請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記遺伝性ミトコンドリア病が、ミトコンドリアｔＲＮＡ（ｍｔ−ｔＲＮＡ）のタウリン修飾の異常に起因するミトコンドリア病である請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ｍｔ−ｔＲＮＡのタウリン修飾の異常が、ｍｔ−ｔＲＮＡLeu(UUR)、ｍｔ−ｔＲＮＡTrp、ｍｔ−ｔＲＮＡLys、ｍｔ−ｔＲＮＡGlu、およびｍｔ−ｔＲＮＡGlnからなる群より選ばれる少なくとも一つのｍｔ−ｔＲＮＡのタウリンの修飾の異常である請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ミトコンドリア病が、Ｍｏｔ１遺伝子の変異に起因するミトコンドリア病である請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
タウリン修飾の異常に起因したミトコンドリア病に罹患した患者に投与されることを特徴とする請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項７】
Ｍｏｔ１遺伝子の変異に起因するミトコンドリア病に罹患した患者に投与されることを特徴とする請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項８】
他のミトコンドリア病治療薬と併用して投与されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一つに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミトコンドリア病の治療薬に関し、特には、遺伝子性変異に起因するミトコンドリア病に対する治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは、真核生物細胞の細胞小器官の１つで、電子伝達系によるＡＴＰの生産を行っており、生体内で消費するエネルギーのほとんどは、ミトコンドリアから供給されている。ミトコンドリアは、それ以外に多様な機能に関与することが報告されており、例えば、細胞のアポトーシスにおいても重要な役割を果たしている。さらに最近、ミトコンドリアの異常と多数の疾患との関連が注目されるようになっている。
【０００３】
ミトコンドリア病は、ミトコンドリアの機能低下や障害に起因する疾患の総称である。ミトコンドリア病は、脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群（ＭＥＬＡＳ）、赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん症候群（ＭＥＲＲＦ）等のミトコンドリア脳筋症のように、ミトコンドリア遺伝子（ｍｔＤＮＡ）の遺伝的変異による先天性の疾患と考えられてきた。しかし最近では、環境因子や薬剤によるミトコンドリア機能障害や、神経変性疾患によるミトコンドリア異常等の後天的なミトコンドリア病も報告されている。
【０００４】
哺乳動物のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）は、２２個のミトコンドリアトランスファーＲＮＡ（ｍｔ−ｔＲＮＡ）をエンコードしており、これらのｍｔ−ｔＲＮＡは、１３種類のミトコンドリアタンパク質を翻訳している。これらのｍｔＤＮＡ由来のタンパク質は、素早く呼吸系複合体に取り込まれ、電子伝達に関与している。ｍｔＤＮＡは、好気性呼吸において必須の役割を果たしており、ｍｔＤＮＡにおける変異は、ミトコンドリア病を含む種々の代謝疾患と関連している。ｍｔ−ｔＲＮＡをエンコードするｍｔＤＮＡにおけるいくつかの点変異をもつ患者は、重篤なミトコンドリアの機能障害を呈し、これは多臓器不全を引き起こす。しかしながら、点変異がなぜこのような重篤な症状を引き起こすかは完全には明らかになっていない。
【０００５】
細胞質ｔＲＮＡと同様に、ｍｔ−ｔＲＮＡは、種々の化学的修飾を含んでいる。ウシのｍｔ−ｔＲＮＡでは、２２のｍｔ−ｔＲＮＡにおいて１１８箇所における１５種類の修飾が同定されている。全ての修飾は、核ＤＮＡによってエンコードされるｍｔ−ｔＲＮＡ修飾酵素によって仲介されている。例えば、ｍｔ−ｔＲＮＡ修飾酵素であるＭｔｕ１、Ｐｕｓ１、およびＴｒｉｔ１は、それぞれ、ｍｔ−ｔＲＮＡの、２位におけるチオール修飾、プソイドウリジン修飾、イソペンテニル修飾を仲介している。これらの酵素を欠失したトランスジェニックマウスは、ミトコンドリア翻訳の顕著な減少を示し、ミトコンドリアの機能障害を引き起こす。さらに、これらの遺伝子の変異が、ミトコンドリア機能障害を持つ患者で同定されている。
【０００６】
哺乳動物のミトコンドリアのｔＲＮＡ（ｍｔ−ｔＲＮＡｓ）には、タウリンに由来するユニークな修飾を持つものがある。タウリン修飾はこれらｍｔ−ｔＲＮAのアンチコドンの３４番のウラシル（Ｕ）に存在する。アンチコドンの最初のヌクレオチドである３４番目のウオッブルウラシルに位置するタウリン修飾は、５−タウリノメチルウリジン（τｍ5U）を含むｍｔ−ｔＲＮＡLeu(UUR)およびｍｔ−ｔＲＮＡTrp、５−タウリノメチル−２−チオウリジン（τｍ5ｓ2U）を含むｍｔ−ｔＲＮＡLys、ｍｔ−ｔＲＮＡGluおよびｍｔ−ｔＲＮＡGlnが知られている。タウリン修飾は、コドン−アンチコド相互作用の安定化を通じて、ミトコンドリアの翻訳に関わっている。
【０００７】
これらのｍｔ−ｔＲＮＡにおけるタウリン修飾の変異は、ＭＥＬＡＳやＭＥＲＦＦなどのミトコンドリア病と関連している。ＭＥＬＡＳ患者の約８０％で、ｍｔ−ｔＲＮＡLeu(URR)においてＡ３２３４Ｇ変異を有しており、ほとんどのＭＥＲＲＦ患者で、ｍｔ−ｔＲＮＡLysにおいてＡ８３４４Ｇ変異を有していることが報告されている。このようにタウリン修飾の異常は、ミトコンドリア病の発症と関連していると報告されているが、その分子メカニズムは不明のままである。
【０００８】
また、ミトコンドリア病の患者で、mitochondrial optimization 1 （Ｍｔｏ１）およびGTP binding protein 3（ＧＴＰＢＰ３）の遺伝的変異が同定されており、これらの遺伝子がタウリン修飾に関わっていることが示唆されている。
【０００９】
そこで、いくつかのグループにより、Ｍｔｏ１のイントロン領域に遺伝子トラップコンストラクトを挿入し、Ｍｔｏ１欠損マウスを作製したことが報告されている（非特許文献１、非特許文献２）。そこでは、ミトコンドリア翻訳は正常であり、高齢のＭｔｏ１欠損マウスにおいて、僅かな呼吸機能の欠陥が観察された、と報告されている。さらに、それらのＭｔｏ１欠損マウスでは、Ｍｔｏ１タンパク質が観察され、また、ｍｔ−ｔＲＮＡの修飾も特に変化がなかった、と報告されている。
【００１０】
ミトコンドリア病の治療剤の開発は進められており、現在、α−トコトリエノールキノン、タウリン、ピルビン酸ナトリウム、L-アルギニン、５−ＡＬＡ／Ｆｅなどの化合物が、ミトコンドリア病の治療薬として臨床試験が行われている。しかしながら、現在日本国内で承認されたミトコンドリア病治療の医薬品はなく、早急な医薬品の開発が望まれている。
【００１１】
タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣ）は、ある種のタンパク質の熱凝集を阻害する化学シャペロンとして報告され（非特許文献３）、また、マウスにおいて、凝集物の蓄積を減少し、小胞体ストレス（ＵＰＲ）を抑制すると報告されている（非特許文献３、および非特許文献４）。また、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤を含む角膜内皮の小胞体関連ストレスに関連する疾患の処置または予防剤において、それにさらに添加されるＥＲストレス治療剤としてＴＵＤＣの使用が提案されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ＷＯ２０１５／０６４７６８
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Tischnerら (2015) Hum Mol Genet. 24, 2247-2266.
【非特許文献２】Beckerら(2014) PLoS One.9,e114918.
【非特許文献３】Cortezら(2014) Prion. 8, 197-202.
【非特許文献４】Sigurdssonら、Cell Stem Cell.18, 522-532.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、新たなミトコンドリア病の治療薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を続けた結果、ミトコンドリアのｔＲＮＡのタウリン修飾がＭｔｏ１によって仲介されていることをつきとめ、Ｍto１の遺伝子異常が遺伝的原因によるミトコンドリア病の原因の一つであることをつきとめた。そして、Ｍto１の遺伝子異常のよって生じるタウリン修飾の異常が、ミトコンドリアにおける翻訳と呼吸の障害を引き起こし、更には、Ｏｐａ１を含む核ＤＮＡによってエンコードされるミトコンドリアタンパク質の異常な局在化を引き起こすためにミトコンドリアの形態異常を引き起こすことをつきとめた。さらには、そのような異常な局在化を示したミトコンドリアタンパク質が細胞質内でミスフォールディングを引き起こして凝集し、細胞障害性の小胞体ストレス（ＵＰＲ）を誘導することもつきとめた。
そこで本発明者らは、引き起こされたミトコンドリアタンパク質の異常な局在化を緩和または修復することによりミトコンドリア病の治療が行えると考え、異常な局在化を緩和または修復する物質を鋭意探索した。その結果、本発明者らは、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣ）などの化学シャペロンが、遺伝子異常に起因して生じたミトコンドリア異常を修復できること見いだし本発明を完成した。
【００１６】
本発明は以下の態様を含むものである。
［１］タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣ）、フェニル酪酸（ＰＢＡ）、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物を有効成分として含有する遺伝性ミトコンドリア病の治療および／または予防のための医薬組成物。
［２］タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣ）またはそれの薬学的に許容される塩を有効成分として含有する上記［１］に記載の医薬組成物。
［３］前記遺伝性ミトコンドリア病が、ミトコンドリアｔＲＮＡ（ｍｔ−ｔＲＮＡ）のタウリン修飾の異常に起因するミトコンドリア病である上記［１］または［２］に記載の医薬組成物。
［４］前記ｍｔ−ｔＲＮＡのタウリン修飾の異常が、ｍｔ−ｔＲＮＡLeu(UUR)、ｍｔ−ｔＲＮＡTrp、ｍｔ−ｔＲＮＡLys、ｍｔ−ｔＲＮＡGlu、およびｍｔ−ｔＲＮＡGlnからなる群より選ばれる少なくとも一つのｍｔ−ｔＲＮＡのタウリン修飾の異常である上記［３］に記載の医薬組成物。
［５］前記ミトコンドリア病が、Ｍto１遺伝子の変異に起因するミトコンドリア病である上記［１］または［２］に記載の医薬組成物。
［６］タウリン修飾の異常に起因するミトコンドリア病に罹患した患者に投与されることを特徴とする上記［１］または［２］に記載の医薬組成物。
［７］Ｍto１遺伝子の変異に起因するミトコンドリア病に罹患した患者に投与されることを特徴とする上記［１］または［２］に記載の医薬組成物。
［８］他のミトコンドリア病治療薬と併用して投与されることを特徴とする上記［１］〜［７］のいずれか一つに記載の医薬組成物。
【００１７】
［９］以下の工程からなるミトコンドリア病に罹患した患者を治療する方法、
（ａ）ミトコンドリア病に罹患した患者が、ｍｔ−ｔＲＮＡのタウリン修飾の異常を有することを検出する工程、および
（ｂ）工程（ａ）により、前記タウリン修飾の異常を有すると判定された患者に、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣ）、フェニル酪酸（ＰＢＡ）、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物を、治療有効量の投与する工程。
［１０］前記ｍｔ−ｔＲＮＡのタウリン修飾の異常が、ｍｔ−ｔＲＮＡLeu(UUR)、ｍｔ−ｔＲＮＡTrp、ｍｔ−ｔＲＮＡLys、ｍｔ−ｔＲＮＡGlu、およびｍｔ−ｔＲＮＡGlnからなる群より選ばれる少なくとも一つのｍｔ−ｔＲＮＡのタウリン修飾の異常である上記［９］に記載の方法。
［１１］前記工程（ａ）における検出が、患者から単離・精製したｍｔ−ｔＲＮＡLeu(UUR)、ｍｔ−ｔＲＮＡTrp、ｍｔ−ｔＲＮＡLys、ｍｔ−ｔＲＮＡGlu、またはｍｔ−ｔＲＮＡGlnを質量分析法により検出することを含む上記［１０］に記載の方法。
［１２］前記工程（ａ）における検出が、患者から単離・精製したＲＮＡを用いて、ｍｔ−ｔＲＮＡLeu(UUR)、ｍｔ−ｔＲＮＡTrp、ｍｔ−ｔＲＮＡLys、ｍｔ−ｔＲＮＡGlu、またはｍｔ−ｔＲＮＡGlnの３４番目のウラシルのタウリン修飾を検出する方法であって、
以下の２つの工程：
A1．第１プライマーを用いて、該ＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを生成する工程、ここで、該第１プライマーは、該ＲＮＡ上のタウリン修飾を有する部位を含む領域と相補的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドである、
A2．第２プライマーを用いて、該ＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを生成する工程、ここで、該第２プライマーは、該ＲＮＡ上のタウリン修飾を有する部位より５’側の領域と相補的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドである、
をそれぞれ行い、それぞれの工程から生成されたｃＤＮＡ量の差を測定することにより該タウリン修飾を検出する方法、を含む工程である、上記［１０］に記載の方法。
［１３］以下の工程からなるミトコンドリア病に罹患した患者を治療する方法、
（ａ）ミトコンドリア病に罹患した患者が、Ｍto１遺伝子の変異を有することを検出する工程、および
（ｂ）工程（ａ）により、前記変異を有すると判定された患者に、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣ）、フェニル酪酸（ＰＢＡ）、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物を、治療有効量の投与する工程。
［１４］前記工程（ａ）における検出が、患者から単離したＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ法によりＭto１変異を検出することを含む上記［１０］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、新たなミトコンドリア病の治療薬が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Ｍｔｏ１ノックアウトマウス作成の概要を示す。
【図２】野生型およびＭｔｏ１ノックアウトマウスの交配後の胚（Ｅ８〜Ｅ９）の 形態を観察した結果である。Ａは、ＰＥＣＡＭ−１抗体およびエオシンで染色した結果である。矢印は、心臓の心室である。バーは、０．５ｍｍ（上図）および０．２ｍｍ（下図）を示す。Ｂは、Ｅ８．０およびＥ９．０における形態を示している。バーは、０．５ｍｍ。
【図３】野生型およびＭｔｏ１ノックアウトＥＳ細胞から抽出した全ＲＮＡにおけるタウリン修飾の有無の結果を示している。ウラシル（Ｕ）、５−タウリノメチルウリジン（τｍ5Ｕ）および５−タウリノメチル−２−チオウリジン（τｍ5ｓ2Ｕ）のマスクロマトグラムの結果を示している。
【図４】野生型およびＭｔｏ１ノックアウトＥＳ細胞から抽出した全ＲＮＡから精製したｍｔ−ｔＲＮＡTrpのフラグメントにおけるタウリン修飾の有無を確認したマスクロマトグラムの結果である。矢印は、τｍ5Ｕの有無が異なる対応するフラグメントのピークを示している。
【図５】マウスのｍｔ−ｔＲＮＡTrpの２次構造および３４番目のウラシルにおけるタウリン修飾を示した図である。
【図６】野生型およびＭｔｏ１ノックアウトＥＳ細胞におけるミトコンドリアの代謝標識の結果を示した図である。
【図７】Ｍｔｏ１ノックアウトのＥＳ細胞および胚（Ｅ９．０）のミトコンドリアを電子顕微鏡で観察した結果である。矢印は、広がったクリステを示す。バーは、１μｍ。
【図８】野生型およびＭｔｏ１ノックアウトＥＳ細胞（Ｅ９．０）におけるＯｐａ１の発現をblue-native PAGEを用いて確認した結果を示す。
【図９】野生型およびＭｔｏ１ノックアウトＥＳ細胞における、ミトコンドリアの外膜および内膜に局在するタンパク質のレベルを確認した結果である。外膜タンパク質としてＴｏｍｍ２０、Ｔｏｍｍ４０、Ｄｒｐ１、およびＭｆｎ２を、内膜タンパク質としてＭｉｔｏｆｉｌｉｎ、Ｏｐａ１、Ｔｉｍｍ４４、Ｔｉｍｍ５０のタンパク質レベルを確認した結果である。
【図１０】細胞内におけるタンパク質の凝集を確認した結果である。バーは１０μｍを示す。
【図１１】野生型およびＭｔｏ１ノックアウトＥＳ細胞における編集型および非編集型Ｘｂｐ１、およびＣｈｏｐの発現レベルを確認した結果である。それぞれｎ＝３。***は、ＷＴに対して、P<0.0001を示す。
【図１２】野生型およびＭｔｏ１ノックアウトＥＳ細胞の小胞体構造を透過電子顕微鏡で確認した結果である。矢印は、拡大した小胞体を示す。バーは１μｍを示す
【図１３】新生のＦｌｏｘマウスおよび心臓特異的コンディショナルＭｔｏ１ノックアウトマウス（ＨｃＫＯ）の心臓の、ミトコンドリアおよび小胞体構造を透過電子顕微鏡で確認した結果である。バーは１μｍを示す。矢印はＥＲ構造を示す。矢先は、凝集様構造を示す。
【図１４】新生マウスの心臓からのミトコンドリアにおけるＯｐａ１およびＴｉｍｍ４４の発現をウエスタンブロットにより確認した結果である。
【図１５】新生のＦｌｏｘマウスおよび心臓特異的コンディショナルＭｔｏ１ノックアウトマウス（ＨｃＫＯ）の心臓における挿入および非挿入Xbp1、およびＣｈｏｐの発現レベルを確認した結果である。Ｆｌｏｘ：ｎ＝３、ＨｃＫＯ：ｎ＝６。Ｆｌｏｘに対し、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。
【図１６】呼吸系サブユニットに関連するミトコンドリアタンパク質（ＭＴＣＯＩおよびＮｄｕｆｂ８）および内膜タンパク質（Ｏｐａ１およびＴｉｍｍ４４）の発現をウエスタンブロットにより確認した結果である。
【図１７】Ｆｌｏｘマウスおよび肝臓特異的コンディショナルＭｔｏ１ノックアウトマウス（ＬｃＫＯ）の肝臓のミトコンドリアを透過電子顕微鏡で確認した結果である。バーは１μｍを示す。矢印はクリスタの凝集様構造を示す。
【図１８】ＴＵＤＣで処理した野生型およびＭｔｏ１ノックアウトＥＳ細胞におけるタンパク質ミスフォールディングによる凝集を検出した結果である。バーは１０μｍを示す。
【図１９】細胞の可溶性および不溶性分画中のＯｐａ１をウエスタンブロットにより解析した結果である。
【図２０】ＴＵＤＣで処理した細胞のミトコンドリアを透過電子顕微鏡で確認した結果である。バーは１μｍを示す。
【図２１】ＴＵＤＣ処理した細胞の全細胞溶解物中のＣｈｏｐ遺伝子発現を解析した結果である。*P<0.05。
【図２２】ＴＵＤＣ処理した細胞の小胞体構造を透過電子顕微鏡で確認した結果である。バーは１μｍを示す。矢印はＥＲ構造を示す。ＫＯ細胞における拡大したＥＲがＴＵＤＣ処理で回復しているのが確認できる。
【図２３】ＥＲからのカルシウムの漏出を測定した結果である。カルシウムの漏出は、Ｆｌｕｏ−４を用い、Ｆｌｕｏ−４を含むタイロード液中で３０分処理した後、培地をカルシウム不含のタイロード液に換え、タルプシガルギンで刺激してＥＲからのカルシウム放出を共焦点顕微鏡にて確認した。
【図２４】ＴＵＤＣ処理における細胞増殖の影響を確認した結果である。***P<0.001。
【図２５】２５Ａは、ＰＢＡで処理した野生型およびＭｔｏ１ノックアウトＥＳ細胞におけるタンパク質ミスフォールディングによる凝集を検出した結果である。バーは５０μｍを示す。２５Ｂは、ＰＢＡで処理した細胞の全細胞溶解物中のＣｈｏｐ遺伝子発現を解析した結果である。*P<0.001。２５Ｃは、ＰＢＡ処理における細胞増殖の影響を確認した結果である。***P<0.001。
【図２６】ＴＵＤＣを１週間投与したＦｌｏｘおよびＬｃＫＯマウスから精製したミトコンドリア分画中のＯＰａ１をウエスタンブロットにより解析した結果である。
【図２７】ＴＵＤＣを投与したＦｌｏｘおよびＬｃＫＯマウスのミトコンドリアを透過電子顕微鏡で確認した結果である。バーは１μｍを示す。
【図２８】異常なクリステ凝集をもつミトコンドリアの割合を、透過電子顕微鏡を用いて測定した結果である。***P<0.001。
【図２９】ＦｌｏｘおよびＬｃＫＯマウスの肝臓から得た細胞中の集合した呼吸系複合体のblue-native PAGEの結果である。複合体ＩＩＩおよびＩＶは、それぞれ、抗ＵＱＣＲ−２およびＭＴＣＯＩ抗体を用いて免疫検出した。
【図３０】ＴＵＤＣ投与したＦｌｏｘおよびＬｃＫＯマウスの肝臓中の複合体ＩＶの相対活性を示した図である。***P<0.001。
【図３１】ＴＵＤＣ投与したＦｌｏｘおよびＬｃＫＯマウスの肝臓中のＣｈｏｐの相対的遺伝子発現レベルおよびタンパク質レベルを測定した結果である。***P<0.05。
【図３２】ＴＵＤＣ投与したＦｌｏｘおよびＬｃＫＯマウスの肝臓中のＦｇｆ２１の相対的遺伝子発現レベルを測定した結果である。***P<0.0001。
【図３３】ＢＩＸ、ＴＭＡＮＯ、またはＴＵＤＣで処理した野生型およびＭｔｏ１ノックアウトＥＳ細胞におけるＣｈｏｐの発現レベルを確認した結果である。Ｃｈｏｐ発現量は、各細胞中の１８Ｓの発現量に対する相対値で示してある。*P<0.005、**P<0.001、N.S.=Not Significant。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を、例示的な実施態様を例として、本発明の実施において使用することができる好ましい方法および材料とともに説明する。
なお、文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。また、本明細書に記載されたものと同等または同様の任意の材料および方法は、本発明の実施において同様に使用することができる。
また、本明細書に記載された発明に関連して本明細書中で引用されるすべての刊行物および特許は、例えば、本発明で使用できる方法や材料その他を示すものとして、本明細書の一部を構成するものである。
【００２１】
本明細書中で、「Ｘ〜Ｙ」という表現を用いた場合は、下限としてＸを、上限としてＹを含む意味で用いる。本明細書において「約」とは、±１０％を許容する意味で用いる。
【００２２】
本発明の医薬組成物が対象とするミトコンドリア病は、遺伝性のミトコンドリア病である。本明細書において遺伝性ミトコンドリア病とは、ミトコンドリア病の原因が核DNAあるいはミトコンドリアDNA上の遺伝子の変異の結果として生じるミトコンドリア病を意味し、これに限定されないが、赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん（ＭＥＲＲＦ）；ミトコンドリアミオパシー・脳症・ラクトアシドーシス・脳卒中（ＭＥＬＡＳ）；レーバー遺伝性視神経障害（ＬＨＯＮ）；優性視神経萎縮（ＤＯＡ）；リー症侯群；カーンズ・セイヤー症候群（ＫＳＳ）；フリードライヒ運動失調（ＦＲＤＡ）；慢性進行性外眼筋麻痺症（ＣＰＥＯ）          などをあげあることができる。本発明の医薬組成物が対象とするミトコンドリア病は、特に好ましくは、ｍｔ−ｔＲＮＡLeu(UUR)、ｍｔ−ｔＲＮＡTrp、ｍｔ−ｔＲＮＡLys、ｍｔ−ｔＲＮＡGlu、およびｍｔ−ｔＲＮＡGlnからなる群より選ばれる少なくとも一つのｍｔ−ｔＲＮＡのタウリンの修飾の異常に起因するミトコンドリア病、または、Ｍto１遺伝子の変異に起因するミトコンドリア病である。
【００２３】
本発明の医薬組成物に用いる、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣ）、フェニル酪酸（ＰＢＡ）は、購入することができ、また、低分子の化合物合成の技術分野において用いられている公知の方法を参照して合成することができる。また、それらの塩も、当該技術分野における公知の方法を参照して合成または調製することができる。
【００２４】
本発明よって提供される医薬組成物は、治療有効量の、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣ）、フェニル酪酸（ＰＢＡ）、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物（以下、単に「本発明に用いる化合物」という場合がある）を有効成分として含有する遺伝性ミトコンドリア病の治療または予防のための医薬組成物である。
「薬学的に許容されるその塩」とは、上記化合物から形成される非毒性の塩を示す。適切な塩としては、例えば、これに限定しないが、アンモニウム塩などの無機塩、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、メチルアミン、エチルアミン、シクロヘキシルアミンなどの低級アルキルアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンなどの置換低級アルキルアミンなどの有機塩基との塩、などをあげることができる。
【００２５】
本発明はまた、本発明に用いる化合物から形成される溶媒和物及び水和物を含む医薬組成物を包含する。「溶媒和物」という用語は、１種以上の溶媒分子と上記の化合物（その薬学的に許容される塩を含む）の分子複合体を指す。例えば、これに限定されないが、水、エタノールなどである。「水和物」という用語は、溶媒分子が水である複合体を指す。本発明で用いる化合物は、その塩、水和物および溶媒和物を含む。例えば、タウロウルソデオキシコール酸については、その二水和物をあげることができる
【００２６】
本発明の医薬組成物は、本発明に用いる化合物に加え、１以上の薬学的に許容される担体、及び、適宜、他のミトコンドリア病の治療薬を含むことができる。
【００２７】
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、当業者に知られているように、任意およびすべての、溶媒、分散媒体、コーティング剤、酸化防止剤、キレート剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、界面活性剤、緩衝剤、浸透圧調節剤、吸収遅延剤、塩、薬物安定剤、賦形剤、希釈剤、結合剤、崩壊剤、甘味剤、芳香剤、潤沢剤、染料など、及びそれらの組合せを含む。何れかの担体が本発明の活性成分と不適合である場合以外は、本発明の治療または医薬組成物において使用することができる。
【００２８】
本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、治療を必要とするほ乳類に投与される場合、治療効果を生じさせるのに十分な量の上記化合物をいう。治療有効量は対象および治療する疾患症状、対象の体重および年齢、疾患症状の重症度、投与方法などに依存して異なり、当該技術分野における当業者により容易に決定されることができる。
【００２９】
本明細書で使用される「対象」という用語は、動物を指す。典型的には、動物は、哺乳動物である。対象は、例えば、霊長類（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、魚類、鳥類なども指す。ある種の実施形態において、対象は霊長類、好ましくはヒトである。
【００３０】
本発明に用いる化合物を含む医薬組成物は、医薬組成物の処方のための既知の方法に準じて処方することができる。代表的な医薬組成物には、上記した薬学的に許容される担体が含まれうる。これらの担体の使用は、当該技術分野においてよく知られている。また、活性成分を含む医薬組成物を調製するための方法は、当該技術分野においてよく知られている。
【００３１】
本発明の医薬組成物は、使用目的に応じた特定の投与経路に適合するように製剤化されうる。投与経路は、これに限定されないが、例えば、経口、非経口、静脈内、皮内、皮下、経皮、吸入、局所、経粘膜的、又は直腸内投与がある。本発明の医薬組成物は、固体形態又は液体形態で製剤化されうる。固体形態は、これに限定されないが、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、散剤、又は坐剤を含む。液体形態は、これに限定されないが、例えば、溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含む。本発明の医薬組成物は、好ましくは経口により投与される。
【００３２】
本発明に用いる化合物の投与量は、疾患の種類、投与対象の症状、年齢、投与方法等により適宜選択される。例えば、これに限定されないが、経口剤であれば、通常、１日当たり１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは１０〜５０００ｍｇ、より好ましくは１００〜２０００ｍｇを、１回又は数回に分けて投与すればよい。
【００３３】
本発明に用いる化合物の投与経路としては、経口投与、非経口投与又は直腸内投与のいずれでもよく、その一日投与量は、化合物の種類、投与方法、患者の症状・年齢等により異なる。例えば、経口投与の場合は、通常、ヒト又は哺乳動物１ｋｇ体重当たり約０．０１ｍｇ〜５０００ｍｇ、好ましくは約０．１ｍｇ〜２０００ｍｇ、更に好ましくは約１ｍｇ〜２００ｍｇを１〜数回に分けて投与することができる。静注等の非経口投与の場合は、通常、例えば、ヒト又は哺乳動物１ｋｇ体重当たり約０．０１ｍｇ〜３００ｍｇ、更に好ましくは約１ｍｇ〜１００ｍｇを投与することができる。
【００３４】
本発明はまた、治療有効量の本発明に用いる化合物を、患者に投与することを含む、遺伝性ミトコンドリア病の治療のための方法を含む。本発明の方法において治療対象とする患者は、遺伝性ミトコンドリア病と判定された患者であれば特に制限がないが、好ましくは、タウリン修飾の異常に起因するミトコンドリア病の患者である。
タウリン修飾の異常に起因するミトコンドリア病の患者としては、例えば、ｍｔ−ｔＲＮＡLeu(UUR)、ｍｔ−ｔＲＮＡTrp、ｍｔ−ｔＲＮＡLys、ｍｔ−ｔＲＮＡGlu、またはｍｔ−ｔＲＮＡGlnにおけるタウリン修飾に異常をもつ患者をあげることができ、より具体的には、３４番目のウラシルにおけるタウリン修飾に異常をもつ患者である。これらのｍｔ−ｔＲＮＡのタウリン修飾に異常を有するか否かは、対象とする患者から単離および精製したｍｔ−ｔＲＮＡを質量分析法により分析することにより検出できる。より詳細には、質量分析法では、まず、組織や細胞からｔＲＮＡを精製したのち、ヌクレアーゼによりｔＲＮＡを数個のオリゴヌクレオチドまで消化する。その後、消化されたオリゴヌクレオチドを精製し、逆相液体クロマトグラフィおよび質量分析機にて分析することによりタウリン修飾を検出する。本発明の治療方法は、これらのｍｔ−ｔＲＮＡのタウリン修飾を検出する工程を含むこともできる。
【００３５】
上記ｍｔ−ｔＲＮＡ（ｍｔ−ｔＲＮＡLeu(UUR)、ｍｔ−ｔＲＮＡTrp、ｍｔ−ｔＲＮＡLys、ｍｔ−ｔＲＮＡGlu、またはｍｔ−ｔＲＮＡGln）の３４番目のウラシルがタウリン修飾されているか否かの決定はまた、本発明者らによる特許出願の国際公開公報ＷＯ２０１４／１３６８７０に記載の方法を用いて行うことができ、それは本明細書の一部を構成するものである。具体的には、患者から単離したＲＮＡを用いて、以下の２つの工程：
Ａ１．第１プライマーを用いて、ＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを生成する工程、ここで、第１プライマーは、ＲＮＡ上のタウリン修飾を有する部位を含む領域と相補的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドである、
Ａ２．第２プライマーを用いて、ＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを生成する工程、ここで、第２プライマーは、ＲＮＡ上のタウリン修飾を有する部位より５’側の領域と相補的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドである、
をそれぞれ行い、それぞれの工程から生成されたｃＤＮＡ量の差を測定することによりタウリン修飾を検出することができる。
上記方法においては、これに限定されないが、ｃＤＮＡ量の差を核酸増幅反応、例えばＲＴ−ＰＣＲ法により測定することが好ましい。
また、患者からのＲＮＡの由来は特に制限がないが、好ましくは、血液由来のＲＮＡである。
【００３６】
本発明の方法において治療対象とする好ましい患者である、タウリン修飾の異常に起因するミトコンドリア病の患者としては、また、Ｍto１遺伝子の変異を有する患者をあげることができる。Ｍto１遺伝子に変異を有するか否かは、患者から単離したＲＮＡを用いて検出できる。より具体的には、これに限定されないが、患者から単離したＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法を用いて増幅し遺伝子配列を特定することにより、変異を検出することができる。このような変異に検出は、遺伝子配列の決定における公知の方法を制限なく用いて行うことができる。
【００３７】
本発明はまた、他の既知のミトコンドリア病薬と組み合わせて患者に投与することを含む、ミトコンドリア病の治療のための方法（併用）及び２つ以上の医薬有効成分の組合せ（配合剤）を含む。他のミトコンドリア病の治療薬としては、これに限定されることはないが、例えば、タウリン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−アルギニン、５−ＡＬＡ／Ｆｅ、イデベノン、エダラボンをあげることができる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（動物）
全ての工程は、熊本大学の動物倫理委員会より承認を得た（承認ID：A27-037 R1）。Mto1ノックアウトマウスは、標準的な相同組み換えにより、Mto1遺伝子のエクソン１−２を、ネオマイシン抵抗遺伝子で置き換えることにより作成した。概要を図１に示す。LoxP配列で挟み込まれたMto1遺伝子のエクソン１−２をもったトランスジェニックマウスを、AlbCreマウス(B6.Cg-Tg（Alb-cre）21Mgn/J）またはMhcCreマウス（B6.FVB-Tg（Myh6-cre）2182Mds/J）を交配することにより、肝臓特異的Mto1ノックアウトマウスまたは心臓特異的Mto1ノックアウトマウスをそれぞれ得た。動物は、12時間毎の明暗サイクルにて25℃で飼育した。肝臓特異的Mto1ノックアウトマウスは、８〜９週齢の雄マウスを犠牲にして全ての実験に用いた。心臓特異的Mto1ノックアウトマウスは、０．５〜１日齢の新生マウスを犠牲にして全ての実験に用いた。Ｅ８．０およびＥ９．０の遺伝子型がMto1野生型およびノックアウトである胚は、Mto1ヘテロ型の雄および雌のマウスを２時間交配させることによって作成した。また、Ｅ８．０およびＥ９．０の胚を採取し、卵黄嚢から胚性ＤＮＡを抽出した。
【００３９】
実施例１：Mto1ノックアウトマウスの作製
最初に、MTO1-EGFP(緑)で形質転換したHela細胞をMitotrackＥＲ(赤)で染色し、MTO1-EGFPがMitotrackＥＲと同じ場所に位置すること、即ち、Mto1蛋白がミトコンドリアに存在することを確認した。
次いで、Mto1のミトコンドリアでの機能を確認するために、Mto1遺伝子のエクソン１−２を欠失させたMto1ノックアウトマウスを作成した。しかし、新生マウスは生まれてこなかった。そこで、交配後８および９日（E8.0およびE9.0）における胚の形態を確認した。胚を細断し、24ウェルプレートに移した。卵黄嚢を注意深く除去した後、胚を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、PECAM-1抗体（BD Bioscience）で染色した。さらに、胚をパラフィンに包埋した後、ヘマトシキン・エオシンで対比染色し、顕微鏡で観察した。結果を図２に示す。その結果、ノックアウト胚（ＫＯ胚）が致死であるここが判った。野生型では、９日（E9.0）で完全な形態変化および成熟した心臓系が観察されたのに対し、ＫＯ胚では、９日（E9.0）においても８日（E8.0）と同様の大きさおよび形態を示していた。このことは、Mto1欠失胚が、初期の発達段階で致死となっていることを示している。
【００４０】
実施例２：Mto1ノックアウトＥＳ細胞の作製
実施例１で得られMto1ＫＯ胚から繊維芽細胞を作製するのは難しいため、Mto1ノックアウトEmbryonic stem cell line（ＫＯＥＳ細胞株）を用いて以下の検討を行った。Mto1がヘテロ接合型の雄および雌のマウスを用いて、インビトロで人工授精を行い、Mto1の野生型およびＫＯのＥＳ細胞クローンを作製した。ＫＯＥＳ細胞は、野生型（ＷＴ）に比べて非常に成長が遅かった。以下のようにしてタウリン修飾を確認した。ＷＴおよびＫＯマウス細胞からTrizol（Invitrogen）を用いて全ＲＮＡを抽出した。20μgのＲＮＡを、2.5Ｕのヌクレアーゼおよび0.2Ｕのアルカリホスファターゼで消化し、サンプルをWeiらの既報（Wei, FY.ら(2015)"Cdk5rap1-mediated 2-methylthio modification of mitochondrial tRNAs governs protein translation and contributes to myopathy in mice and humans. Cell Metab. 21, 428-442）を参照して質量分析にかけた。結果を図３に示す。５−タウリノメチルウリジン（τｍ5Ｕ）および５−タウリノメチル−２−チオウリジン（τｍ5ｓ2Ｕ）の何れもＫＯ細胞の全ＲＮＡからは検出されなかった。
【００４１】
次いで、ｍｔ−ｔＲＮＡTrpにおける修飾を確認するために、ｍｔ−ｔＲＮＡTrpの配列に相同なオリゴＤＮＡプローブを用いて、全ＲＮＡからｍｔ−ｔＲＮＡTrpを精製し、質量分析により分析をおこなった。その結果、ｍｔ−ｔＲＮＡTrpの３４番目のウラシルにおける修飾がＫＯＥＳ細胞では欠失していた。結果を図４に示す。また、ｍｔ−ｔＲＮＡTrpの３４番目のウラシルにおけるタウリン修飾を図５に示す。
これらの結果は、Mto1の欠失がｍｔ−ｔＲＮＡにおけるタウリン修飾の欠失をもたらし、それが胚性致死であることを示し得いる。
【００４２】
実施例３：野生型およびMto1ＫＯにおけるミトコンドリア翻訳および代謝の検討
ミトコンドリアにおける翻訳に対するタウリン修飾の欠失の影響を、以下のようにして確認した。
（３−１）ミトコンドリアの単離
ＥＳ細胞を、４℃、680ｒｐｍにて５分間遠心して回収した。細胞を、HEPES緩衝液に懸濁し、テフロンホモジナイザーで溶解した。250mMスクロースを含有した同量のHEPES緩衝液を添加し、さらに、４℃、600ｘｇにて15分間遠心した。上清を、４℃、15,000ｘｇにて15分間遠心し、ミトコンドリアを沈殿させた。肝臓、心臓等のマウスの組織からのミトコンドリアの単離は、氷冷MOPS緩衝液中にて組織をミンチして小片にしたのち、プロテアーゼインヒビターカクテルを添加し、テフロンホモジナイザーでホモジナイズした。ホモジネートを、４℃、800ｘｇにて15分間遠心し、上清をさらに、8,000ｘｇにて15分間遠心した。ミトコンドリア沈殿物をMOPOS緩衝液に懸濁し、ＢＣＡタンパク質アッセイキットを用いて、タンパク質濃度を1mg/mLに調製した。
【００４３】
（３−２）ミトコンドリアの翻訳測定
ミトコンドリアのタンパク質合成の標識は、Weiら(2015、Cell Metab. 21, 428-442)の報告を参考にして行った。要約すれば、細胞をメチオニン／システイン不含のDMEM培地で洗浄した後、細胞質翻訳の阻害剤であるエメチンを培地に添加し、次いで、放射性標識した35Ｓ−メチオニン／システインを細胞に添加し１時間培養した。メチオニンおよびシステインを過剰に含んだ冷却リン酸緩衝液を添加して代謝標識を停止した。次いで、上記にようにしてミトコンドリアを単離した。10μgのミトコンドリアタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（15−20％勾配ゲル）にかけた。ゲルを乾燥して、標識されたバンドを確認した。
【００４４】
（３−３）呼吸系複合体アッセイ
上記のようにして抽出したミトコンドリアを用い、Trounceら（(1996). Assessment of mitochondrial oxidative phosphorylation in patients muscle biopsies, lymphoblasts, and transmitochondrial cell line. Method. Enzymol. 264, 484-509.）の方法を参考に、複合体Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，ＩＶ、およびクエン酸シンターゼの活性を測定した。
【００４５】
（３−４）測定結果
ミトコンドリアにおける翻訳は、ＫＯ細胞で顕著に減少していた。また、Blue native PAGEを用いて、ＷＴおよびＫＯ細胞から単離したミトコンドリアを確認したところ、ＫＯ細胞では、呼吸系複合体が顕著に減少していた。そして、呼吸系複合体の活性も、ＷＴに比べてＫＯでは顕著に減少していた（それぞれＷＴに比べてＫＯでは、CI：23%、CII：30%、CIII：40%、CIV：8%）。結果を図６に示す。
上記に加えて、ＫＯ細胞では、ミトコンドリア膜電位が著しく減少していた。解糖系およびアミノ酸代謝に関わる代謝は、ＫＯ細胞でアップレギュレートされていたが、クエン酸サイクルおよびピリミジンに関する代謝はＫＯ細胞で減少していた。ＫＯ細胞ではまた、乳酸およびNADHが著しく増加しており、これはミトコンドリア障害の特徴でもある。ＫＯ細胞の全ＡＴＰレベルは、ＷＴに比べて僅かしか減少しておらず、このことは、タウリン修飾の欠失がミトコンドリア翻訳を障害しているが、代謝は、ミトコンドリア依存のエネルギー供給の減少を補うために嫌気性の解糖系へシフトしていることを示している。
【００４６】
次いで、ミトコンドリア障害は、細胞のアポトーシスと関連し、障害のある胚発生を引き起こしうると報告されているので、その点を検討した。しかしながら、ＫＯ細胞において、チトクロームＣの放出は確認されず、また、カスパーゼ３／７の活性も著しくダウンレギュレートしていた。
これらのことより、アポトーシスも翻訳の変化も、Mto1ＫＯ胚の致死には直接関わっていないことが示唆された。
【００４７】
実施例４：Mto1ノックアウトにおけるミトコンドリアの形態変化
電子顕微鏡を用いて、Mto1ノックアウトのＥＳ細胞および胚のミトコンドリアを観察した。結果を図７に示す。ＷＴで観察される狭く伸びたクリスタに比べ、ＫＯ細胞では殆どのクリスタが顕著に広がっていた。ＫＯ胚では、異常なクリスタの形態が観察された。
【００４８】
実施例５：Mto1ノックアウトにおけるミトコンドリアの膜タンパク質の検討
Optic atrophy 1（Opa1）は、クリスタの形態を制御する重要なタンパク質の一つであるので、Opa1の発現を検討した。ＷＴおよびＫＯ細胞のミトコンドリ分画を精製し、膜に結合したOpa1を、blue-native PAGEを用いて確認した。結果を図８に示す。ＫＯのミトコンドリアでは、クリスタの形態変化とともに、OPa1およびオリゴマーも顕著に減少していた。しかし、ＫＯ細胞においては、オートファゴソーム膜によって囲まれたミトコンドリアは滅多に観察されなかった。
Opa1および複合体IIタンパク質を含むミトコンドリア内膜の殆どのタンパク質は、細胞質で翻訳され、内膜へと移動する。それ故、次に、ＫＯ細胞におけるミトコンドリアタンパク質のホメオスタシスを検討した。具体的には、外膜および内膜に局在するミトコンドリアタンパク質の発現レベルを確認した。外膜タンパク質であるTomm40、Drp1、Mfn2の蛋白レベルは、ＷＴとＫＯ細胞で変化がなかったが、Tomm20はＫＯ細胞で僅かに減少していた。一方、内膜タンパク質であるMitofilin、OPa1、Timm44、Timm50はKO細胞で著しく減少していた。このことは、Mto1ＫＯ細胞において、ミトコンドリアの内膜タンパク質が選択的に減少していることを示している。結果を図９に示す。
【００４９】
内膜タンパク質の減少は、タンパク質の分解の増加、または、タンパク質選別（protein trafficking）の減少の結果であると考えられる。そこで、タンパク質選別を確認するために、GFPを用いた分割レポーター（split GFP-based reportＥＲ）を作製した。２つの分割されたGFPポリペプチド（spGFP1-10およびspGFP11）が互いに接近するとそれらは、リフォールディングされて完全なGFPタンパク質となる。外膜標的シグナルをもつspGFP1-10（Mtout-spGFP1-10）およびmCherryをもつspGFP11を結合させた。mCherryは、細胞質に均質に広がるので、外膜に位置するspGFP1-10とは容易に相互作用する。外膜標的シグナルをもつｓｐＧＦＰ1-10（Ｍｔout−ｓｐＧＦＰ1-10）およびmCherryをもつｓｐＧＦＰ11を、ＷＴおよびＫＯ細胞において共発現した場合は、予想通り、ＷＴおよびＫＯ細胞の何れにおいてもGFPの蛍光が明らかに検出できた。しかしながら、spGFP1-10を内膜標的シグナルに結合させて（Mtin-spGFP1-10）、それをspGFP11-10-mCherryと共発現させても、ＷＴでは、蛍光は検出できなかった。しかし、ＫＯ細胞にてそれらを共発現させた場合は、細胞質において蛍光が検出された。
これらの結果は、タンパク質選別における障害が、Opa1を含む内膜タンパク質の減少の原因であり、結果として、膜構築の障害を引き起こしていることを示している。
【００５０】
実施例６：Mto1ノックアウト細胞におけるミスフォールディングミトコンドリアタンパク質の蓄積
ミトコンドリアの内膜に配置されなかったミトコンドリアタンパク質がどのような影響を及ぼすかを検討した。ミトコンドリアタンパク質の多くは、膜を標的とするための疎水性ドメインを有している。これらの疎水性のため、ミトコンドリアタンパク質は、素早くミトコンドリア膜中に移送されないと、ミスフォールディングまたは凝集する傾向にある。そこで、溶液中では弱い蛍光を発するが凝集タンパク質中に入り込んだ場合に強い蛍光を発する色素を用いて、ＫＯ細胞におけるタンパク質凝集を確認した。結果を図１０に示す。ＷＴ細胞に比べ、多量の凝集がＫＯ細胞において検出された。
異なる界面活性剤を用いてＷＴおよびＫＯ細胞からタンパク質を抽出し、それらを可溶性分画と不溶性分画に分け、SDS-PAGEを行い、各種のミトコンドリアタンパク質を検出することにより、ミトコンドリアタンパク質が凝集しているかを確認した。その結果、ＷＴ細胞に比べ、ＫＯ細胞では、可溶性分画でミトコンドリア内膜タンパク質であるNdufb8、SdhaおよびOpa1が減少している一方、これらのタンパク質の全てが、ＫＯ細胞の不溶性分画に蓄積していた。これに対し、ミトコンドリアの外膜タンパク質であるTomm70、Tomm40およびTomm34は、ＫＯ細胞の不溶性分画では蓄積されていなかった。加えて、細胞質タンパク質であるエロンゲーション因子2（EF2）は、ＷＴとＫＯ細胞で差がなかった。
【００５１】
一般に、ミスフォールディングしたタンパク質は、小胞体ストレス（unfolded protein response：ＵＰＲ）を活性化すると言われている。ＵＰＲは、細胞内ホメオスタシスに深刻なインパクトを与えるものである。よく知られＵＰＲの兆候は、EF2およびeukaryotic initiation factor（elF2）のリン酸化を通じたタンパク質合成の抑制である。
実施例２で作製したＫＯ細胞について、EF2およびelF2のリン酸化を確認したところ、著しく増加しており、このことは、タンパク質合成が抑制されていることを示している。また、ＫＯ細胞においては、不完全なタンパク質の蓄積が、Atf4、Chop、および挿入Xbl1（spliced Xbl1）を含むＵＰＲ特異的な翻訳ネットワークの活性化を誘導しており、ＵＰＲ関連タンパク質の一つであるChopタンパク質レベルは著しく増加していた。ＷＴとＫＯ細胞における挿入および非挿入Xbp1、およびChopの発現を図１１に示す。タンパク質合成の抑制、並びにAtf4およびChopの増加は、分化したＫＯ細胞においても確認された。また、小胞体（ＥＲ）の形態を電子顕微鏡で確認したところ、図１２に示すように、ＫＯ細胞では、拡大したＥＲ構造が確認された。これはＵＰＲの形態学的な指標でもある。
ＥＲにおける過剰なフォールドされていないタンパク質は、細胞障害性および細胞増殖阻害と関連する、異常なカルシウムハンドリングを引き起こす。ＫＯ細胞においては、ＷＴに比べこれらも著しく増加していた。
これらの結果は、Mto1のＫＯ細胞において、ミスフォールディングしたミトコンドリアタンパク質が、細胞障害性のあるＵＰＲを積極的に引き起こしていることを示している。
【００５２】
実施例７：コンディショナルMto1ノックアウトマウスにおけるＵＰＲの確認
Mto1を欠失したＥＳ細胞において確認されたミスフォールディングしたミトコンドリアタンパク質による進行性のＵＰＲが、出生後の組織でも観察されるか確認した。心筋ミオパチーは、MELASおよびMERRF患者における共通する不良な予後であるので、心臓特異的なMto1ノックアウトマウス（ＨｃＫＯ）を作製した。ＨｃＫＯマウスは、出生後は正常に見えたが、24時間以上は生存できなかった。心臓形態においては、ＨｃＫＯおよびＦｌｏｘマウス間で著しい差はなかったことより、心臓の発達障害が致死の原因ではないと言える。死亡前の新生マウスから全RNAを抽出し、遺伝子プロフェイリングおよび質量分析により解析したところ、ＨｃＫＯマウスではMto1発現が著しく減少しており、タウリン修飾も減少していた。心不全マーカーであるAnpおよびBnpのmRNAレベルはＨｃＫＯマウスの心臓で著しく増加しており、一方、mtDNAがエンコードする呼吸系サブユニットであるMTCOIおよび核DNAがエンコードする呼吸系サブユニットであるAtp5、Uqcrc2、SdhbおよびNdufb8は、ＨｃＫＯの心臓で著しく減少していた。透過電子顕微鏡により、ミトコンドリアおよびＥＲの形態を確認したところ、図１３に示すように、ＨｃＫＯマウスの心臓では、著しく拡張したミトコンドリアとともに崩壊したクリスタ構造が確認された。ＨｃＫＯマウス心臓のミトコンドリアは、非常に低い電子密度を示し、このことは、異常なミトコンドリアタンパク質ホメオスタシスを示している。図１４に示すように、ＨｃＫＯマウス心臓では、形態異常と一致して、内膜タンパク質Opa1およびTimm44も著しく減少していた。また、図１３に示すように、ＨｃＫＯマウス心臓の細胞質において、凝集様構造が確認され、このことは、ミトコンドリアタンパク質のミスフォールディングが心筋において引き起こされていることを示している。図１３に示すように、ＨｃＫＯマウス心臓では、ＥＲ構造がフラグメント化および拡大していた。さらに、図１５に示すように、ＨｃＫＯマウス心臓では、ＵＰＲ関連遺伝子である挿入Xbp1、Xbp1、およびChopの発現レベルが著しくアップレギュレートされており、Chopのレベルは、Ｆｌｏｘマウス心臓の１０倍であった。加えて、ＨｃＫＯの心臓では、elf2およびEF2のリン酸化も著しく増加しており、タンパク質合成が抑制されていることを示している。ＨｃＫＯの心臓から調製した心筋細胞を用いてカルシウム移動を確認したところ、カルシウム振幅の自然発生頻度が、ＨｃＫＯの心筋細胞では、Ｆｌｏｘの心筋細胞に比べて著しく低かった。このことが、ＨｃＫＯの心筋細胞におけるカルシウムハンドリングの異常を反映していた。
【００５３】
肝臓特異的なＫＯマウスは、致死性の欠損にも関わらす通常は生存可能であるので、肝臓特異的なMto1ノックアウト（ＬｃＫＯ）マウスを作製した。作製したＬｃＫＯマウスは生存可能であり、ＷＴと外見上は差がなかった。しかしながら、ＬｃＫＯマウス肝臓では、欠陥のあるミトコンドリアおよび細胞質タンパク質ホメオスタシスを示し、そして、Mto1のmRNAレベルは著しく減少しており、タウリン修飾は減少していた。また、図１６に示すように、mtDNA由来のMT-COIおよび核DNA由来のNDUFB8のタンパク質レベル、並びに、Opa1およびTimm44のタンパク質レベルは、ＬｃＫＯマウス肝臓のミトコンドリアで減少していた。ミトコンドリアタンパク質ホメオスタシスの機能障害と一致して、図１７に示すように、ＬｃＫＯマウス肝臓では、ミトコンドリア膜組織の異常な凝集を示していた。ＨｃＫＯマウス心臓と同様に、ＬｃＫＯマウス肝臓でも、ＥＲ構造は拡大していた。このことは、異常なタンパク質が過剰であることを示している。同様に、ＬｃＫＯマウスでは、ＵＰＲ関連タンパク質である、Chopおよびリン酸化elF2も増加していた。
これらの結果は、インビボでも、進行性のＵＰＲが、欠損したミトコンドリアタンパク質ホメオスタシスによって引き起こされた主要な細胞障害性であることを示している。
【００５４】
実施例８：Opa1を介したMto1ＫＯ細胞を用いた改善化合物の検討
上記したように、ミスフォールディングしたミトコンドリアタンパク質の蓄積は、ミトコンドリア障害を増幅し、細胞障害性を誘導する。そこで、ミトコンドリアタンパク質のミスフォールディングを抑制することにより、機能性ミトコンドリアタンパク質の供給を増加させることが、Mto1ＫＯ細胞における細胞障害性を緩和することができると考えられる。
タウリンが結合した胆汁酸である、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣ）に着目し、Mto1ＫＯ細胞におけるミトコンドリアタンパク質の凝集を抑制できるか検討した。
培地に50μMのＴＵＤＣ（シグマより購入）を添加し、ＷＴおよびＫＯ細胞を48時間処理した。その後、タンパク質の凝集を、ProteoStat（登録商標）aggresome検出キット（Enzo Life Science）を用い、製造者の指示書に従って検出した。結果を、図１８に示す。ＴＵＤＣがタンパク質凝集を効果的に防ぐことが確認できた。また、図１９に示すように、ＫＯ細胞において、ＴＵＤＣは、不溶性のOpa1を減少させ、可溶性のOpa1を増加させた。その結果、ＴＵＤＣ処理されたＫＯ細胞では、他の内膜タンパク質とともに顕著な量のOpa1がミトコンドリア内に存在した。ミトコンドリアの形態を確認したところ、図２０に示すように、ＴＵＤＣ処理により著しく改善した。
【００５５】
次に、ＫＯ細胞における細胞障害性のＵＰＲに対するＴＵＤＣの効果を確認した。図２１に示すように、ＴＵＤＣは、ＫＯ細胞におけるChopの遺伝子およびタンパク質レベルを有効に減少させた。ＴＵＤＣはまたEF2リン酸化を減少させＫＯ細胞における全体的なタンパク質合成を増加させた。ＥＲ構造を確認したところ、図２２に示すように、ＴＵＤＣ処理によりＫＯ細胞においてＥＲ構造の改善が確認できた。また、図２３に示すように、ＴＵＤＣ処理により細胞質のカルシウムの漏出も著しく減少した。ＴＤＵＣによる細胞質タンパク質ホメオスタシスの改善は、図２４に示すように、細胞増殖も改善した。
【００５６】
実施例９：他の改善化合物の検討
次いで、他のシャペロンである、フェニル酪酸（ＰＢＡ）について同様の検討を行った。ＰＢＡは、100μMの濃度にて培地に添加した。ＰＢＡも同様に、タンパク質凝集の抑制、Chop発現の減少、および細胞増殖の著しい改善を示した。それぞれの結果を、図２５Ａ〜Ｃに示す。
【００５７】
実施例１０：インビボにおけるＴＵＤＣの効果の確認
ＬｃＫＯマウスを用い、ＴＵＤＣの改善効果を以下のようにして確認した。
ＴＵＤＣを25mg/mLの濃度となるように生理食塩水に溶解した後、250mg/kg体重の投与用量となるように、８週齢のＦｌｏｚおよびＬｃＫＯマウスの腹腔内に投与した。その後１週間、１日に１回投与を行った。最終投与の24時間後に、マウスを犠牲にして実験を行った。コントロール（Vehicle）は、生理食塩水を投与した。
ミトコンドリア膜の組織構造および細胞質のＵＰＲに対するＴＵＤＣの効果を確認した。図２６に示すように、細胞モデルと同様に、ＴＵＤＣの投与により、ＬｃＫＯマウス肝臓のミトコンドリアでも、Opa1の増加が確認できた。また、図２７に示すように、ＴＵＤＣを投与したＬｃＫＯマウスでは、肝細胞中の異常なミトコンドリア膜の組織構造が著しく改善していた。クリステ凝集を示す異常なミトコンドリアの数を定量した結果を図２８に示す。ＴＵＤＣ投与したマウスの肝臓では、数の著しい減少が確認された。
ＴＵＤＣ投与したＫＯマウスの肝臓では、完全な膜の形成が改善されていることが、呼吸系のサブユニットの部分的な回復からも裏付けられた（図２９）。ＴＵＤＣ投与により、呼吸系複合体の活性は、Ｆｌｏｘマウスでは僅かに改善されていたが、ＬｃＫＯマウスでは著しい改善が見られた（図３０）。また、ＴＵＤＣ投与ＬｃＫＯマウスでは、ChopのmRNAレベルおよびタンパク質レベルの何れも著しく減少していた（図３１）。
ＬｃＫＯマウスでは、血清中のアスパラギン酸トランスフェラーゼおよびアラニンアミノトランスフェラーゼレバルは正常であったが、血清アルブミンレベルは減少し、血清アルカリホスファターゼレベルは上昇していた。血清アルブミンおよび血清アルカリホスファターゼレベルともに、ＴＵＤＣ処置により正常レベルに回復した。また、ミトコンドリア病のホールマークであるFgf21の遺伝子発現を確認したところ、図３２に示すように、ＬｃＫＯマウスではアップレギュレートされていたが、ＴＵＤＣの投与により、顕著に減少した。このことは、ＴＵＤＣがミトコンドリア病の治療に有効であることを示している。
【００５８】
実施例１１：他の化学シャペロンとの比較
ＴＵＤＣの効果について、他の化学シャペロンである、ＢＩＸ（BiP Inducer X）およびＴＭＡＮＯとの比較を行った。ＢＩＸ（１−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−２−チオシアナト−エタノン）は、小胞体分子シャペロンであるBiP mRNA1の発現を上昇させる化合物である（再表２００７／１２５７２０号公報）。ＴＭＡＮＯ（トリメチルアミン Ｎ−オキシド）は、様々なタンパク質の構造を維持するシャペロン的な効果を有すると報告されている。
実施例２で作製したＷＴ細胞およびMot1ＫＯＥＳ細胞を入れた培地に、ＢＩＸ（シグマより購入）、ＴＭＡＮＯ（シグマより購入）、およびＴＵＤＣを50μMとなるように添加し、培養を行った。48時間後に、ＵＰＲ遺伝子の一つであるChop遺伝子の発現量をqPCR法により検討した。結果図３３に示す。ＴＵＤＣ処理ではＫＯマウス細胞におけるChopの発現が抑制されたが、ＢＩＸやＴＭＡＮＯ処理では、Chop発現量を完全に抑制することはできなかった。
【００５９】
上記の詳細な記載は、本発明の目的および対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更および置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明により、新たな作用機序のミトコンドリア病治療薬を提供することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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