(57)【要約】  本発明は、ピロプラスミド（Ｐｉｒｏｐｌａｓｍｉｄ）タンパク質または該タンパク質の免疫原性断片、および該ピロプラスミドタンパク質または該免疫原性断片をコードする核酸に関する。さらに、本発明は、該核酸を含むｃＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子および生組換えキャリアーに関する。また、本発明は、該ｃＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子および生組換えキャリアーを含む宿主細胞に関する。最後に、本発明は、ピロプラスミドタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片を含むワクチン、そのようなワクチンの製造方法、ワクチン目的のそのようなタンパク質または断片の使用、および診断試験に関する。
2007527707.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２または４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の類似性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とするピロプラスミド（Ｐｉｒｏｐｌａｓｍｉｄ）タンパク質または該タンパク質の免疫原性断片。
【請求項２】
配列番号６または８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の類似性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とするピロプラスミド（Ｐｉｒｏｐｌａｓｍｉｄ）タンパク質または該タンパク質の免疫原性断片。
【請求項３】
配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の類似性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とするピロプラスミド（Ｐｉｒｏｐｌａｓｍｉｄ）タンパク質または該タンパク質の免疫原性断片。
【請求項４】
請求項１に記載のタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片をコードすることを特徴とする核酸。
【請求項５】
請求項２に記載のタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片をコードすることを特徴とする核酸。
【請求項６】
請求項３に記載のタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片をコードすることを特徴とする核酸。
【請求項７】
請求項４〜６のうち１つ以上の項に記載の核酸を含んでなるｃＤＮＡ断片。
【請求項８】
請求項４〜６のうち１つ以上の項に記載の核酸または請求項７に記載のｃＤＮＡ断片（該核酸または該ｃＤＮＡ断片は、機能的に連結されたプロモーターの制御下にある）を含んでなる組換えＤＮＡ分子。
【請求項９】
請求項４〜６のうち１つ以上の項に記載の核酸、請求項７に記載のｃＤＮＡ断片（該核酸または該ｃＤＮＡ断片は、機能的に連結されたプロモーターの制御下にある）または請求項８に記載の組換えＤＮＡ分子を含んでなる生組換えキャリアー。
【請求項１０】
請求項４〜６のうち１つ以上の項に記載の核酸、請求項７に記載のｃＤＮＡ断片（該核酸または該ｃＤＮＡ断片は、機能的に連結されたプロモーターの制御下にある）、請求項８に記載の組換えＤＮＡ分子または請求項９に記載の生組換えキャリアーを含んでなる宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１〜３のうち１つ以上の項に記載のタンパク質もしくは該タンパク質の免疫原性断片、請求項４〜６のうち１つ以上の項に記載の核酸、請求項７に記載のｃＤＮＡ断片、請求項８に記載の組換えＤＮＡ分子、請求項９に記載の生組換えキャリアーまたは請求項１０に記載の宿主細胞またはそれらの組合せと製薬上許容される担体とを含んでなるワクチン。
【請求項１２】
アジュバントを含む、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
追加的免疫活性成分または該追加的免疫活性成分をコードする核酸を含む、請求項１１〜１２のうち１つ以上の項に記載のワクチン。
【請求項１４】
請求項１〜３のうち１つ以上の項に記載のタンパク質に対する抗体もしくは該タンパク質の免疫原性断片に対する抗体またはそれらの組合せと製薬上許容される担体とを含むことを特徴とするワクチン。
【請求項１５】
請求項１〜３のうち１つ以上の項に記載のタンパク質もしくは該タンパク質の免疫原性断片、請求項４〜６のうち１つ以上の項に記載の核酸、請求項７に記載のｃＤＮＡ断片、請求項８に記載の組換えＤＮＡ分子、請求項９に記載の生組換えキャリアーまたは請求項１０に記載の宿主細胞またはそれらの組合せと製薬上許容される担体とを混合することを含んでなる請求項１１に記載のワクチンの製造方法。
【請求項１６】
ピロプラスミド（Ｐｉｒｏｐｌａｓｍｉｄ）生物により引き起こされる感染またはその臨床的徴候の予防または治療のためのワクチンの製造のための、請求項１〜３のうち１つ以上の項に記載のタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片の使用。
【請求項１７】
ピロプラスミド（Ｐｉｒｏｐｌａｓｍｉｄ）生物により引き起こされる感染またはその臨床的徴候の予防または治療のためのワクチンの製造のための、請求項４〜６のうち１つ以上の項に記載の核酸、請求項７に記載のｃＤＮＡ断片、請求項８に記載の組換えＤＮＡ分子、請求項９に記載の生組換えキャリアーまたは請求項１０に記載の宿主細胞の使用。
【請求項１８】
配列番号１、３、５、７または９に示す核酸配列に対して少なくとも７０％類似している核酸または該核酸に相補的な核酸を含んでなり、該核酸のいずれかが少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有することを特徴とする、ピロプラスミド（Ｐｉｒｏｐｌａｓｍｉｄ）生物に関連した核酸の検出のための診断試験。
【請求項１９】
請求項１〜３のうち１つ以上の項に記載のタンパク質もしくは該タンパク質の免疫原性断片またはそれらの組合せを含むことを特徴とする、ピロプラスミド（Ｐｉｒｏｐｌａｓｍｉｄ）生物に対する抗体の検出のための診断試験。
【請求項２０】
請求項１〜３のうち１つ以上の項に記載のタンパク質に対する抗体もしくは該タンパク質の免疫原性断片に対する抗体またはそれらの組合せを含むことを特徴とする、ピロプラスミド（Ｐｉｒｏｐｌａｓｍｉｄ）生物からの抗原性物質の検出のための診断試験。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピロプラスミド（Ｐｉｒｏｐｌａｓｍｉｄ）タンパク質または該タンパク質の免疫原性断片、ピロプラスミドタンパク質または該免疫原性断片をコードする核酸、該核酸を含むｃＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子および生組換えキャリアー、該ｃＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子および生組換えキャリアーを含む宿主細胞、ピロプラスミドタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片を含むワクチン、そのようなワクチンの製造方法、そのようなタンパク質または断片の使用、ならびに診断試験に関する。
【背景技術】
【０００２】
バベシア症は、地理的に集中して生じる疾患である。この理由は、その病原体が、脊椎動物集団内に存在する寄生虫の或る保有体を吸血するマダニにより伝播されることにある。マダニが存在するところでのみ、バベシア症は生じうる。結局は、特に固有動物においては、該寄生虫は、有意な疾患を引き起こすことなく宿主と共存する。多くの場合、バベシア症が問題となるのは、遺伝的形質の同系交配および／またはバベシア症が流行している不慣れな環境への動物の輸送による人間の活動によるものである（Ｃａｌｌｏｗ，Ｌ．Ｌ．およびＤａｌｇｌｉｅｓｈ，Ｒ．Ｊ．，１９８２，ｉｎ：“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐａｒａｓｉｔｉｃ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ”，Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．およびＷａｒｒｅｎ，Ｋ．Ｓ．編，ｐ．４７５−５２６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
【０００３】
また、バベシア症は、免疫無防備状態のヒトに対してだけでなく通常のヒトに対しても、動物原性感染症因子としての脅威を有する（Ｇｒａｙら，２００２，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２９１，ｐ．１０８−１１）。
【０００４】
天然において生じるバベシア症の疾患徴候は、通常、感染の７〜２１日後に現れ始める。これらの症状には、発熱、食欲不振、うつ状態、貧血、ヘモグロビン尿症および急速に生じる虚弱が含まれる。過剰な流涙、唾液分泌および筋振戦が一般に生じる。末期的感染症においては神経徴候が生じることがあり、該疾患が治療されずに放置されると死に至りうる。凝固障害は赤血球粘性の増加を招く。その結果、微小血管系を通る血行が妨げられ、内臓の充血およびパック細胞容積（ＰＣＶ）の減少が生じる。また、感染赤血球の破裂は多数の赤血球の喪失を引き起こす。これらの結果、いくつかの組織への酸素供給が妨げられ、ついで酸素欠乏による組織損傷が生じる。
【０００５】
現在までに、バベシイダエ科の種は、以下のような獣医学的に重要なほとんどの哺乳類種に感染することが認められている（Ｋｕｔｔｌｅｒ，Ｋ．Ｌ．，ｉｎ  Ｍ．Ｒｉｓｔｉｃ編：“Ｂａｂｅｓｉｏｓｉｓ  ｏｆ  ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ  ａｎｄ  ｍａｎ”．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９８８）：ウシ（Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ，Ｂ．ｂｏｖｉｓ，Ｂ．ｂｉｇｅｍｉｎａ）、ブタ（Ｂ．ｔｒａｕｔｍａｎｎｉ，Ｂ．ｐｅｒｒｏｎｃｉｔｏｉ）、ヒツジ（Ｂ．ｏｖｉｓ，Ｂ．ｍｏｔａｓｉ）、ウマ（Ｂ．ｅｑｕｉ，Ｂ．ｃａｂａｌｌｉ）、イヌ（Ｂ．ｃａｎｉｓ，Ｂ．ｒｏｓｓｉ，Ｂ．ｖｏｇｅｌｉ）およびネコ（Ｂ．ｆｅｌｉｓ，Ｂ．ｃａｔｉ）。すべてのこれらの種においては、死または多少なりとも深刻な経済的損失（肉、乳、毛糸または子孫における質または量の低下）または健康状態の著しい低下が、バベシア感染の結果として直接的に、または二次感染の促進により引き起こされる。
【０００６】
バベシアと関連深いのはタイレリア（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ）寄生虫である。これもピロプラスミダの分類群に属し、バベシアに対する多数の生物学的および疫学的関連性を示す。獣医学的に重要なよく知られているタイレリア種はＴ．ｐａｒｖａ、Ｔ．ａｎｎｕｌａｔａおよびＴ．ｓｅｒｇｅｎｔｉである。
【０００７】
確立したバベシアまたはタイレリア感染を治療するための薬は存在し、例えば、イヌ、ウマおよびウシはジプロピオン酸イミドカルブで治療されうる。しかし、そのような感染は組織刺激による痛みを与える。さらに、それは、そのような抗寄生虫剤によく見られる欠点、すなわち、免疫記憶の形成の阻害、潜在的毒性および耐性の生成の可能性を有する。
【０００８】
バベシア症およびタイレリア症は生ワクチンでのワクチン接種により抑制されうることが示されている（Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｍ．２００１，Ｖｅｔ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，ｖｏｌ．１０１，ｐ．２９１−３１０における総説）。そのようなワクチンは、感染動物の赤血球を集めることにより製造される。すべてではないが幾つかのバベシア種に関しては、寄生虫の数を増加させるためのインビトロ赤血球培養が開発されている。ついで該動物または該培養からの感染赤血球（これは「スタビレート」としても公知である）を使用して動物にワクチン接種する。
【０００９】
タイレリアのスタビレートも同様に得られる。実際には、有効なワクチンに対する需要が非常に大きいため、タイレリアスタビレートは感染マダニの唾液腺からも製造されている。
【００１０】
そのような生寄生虫ワクチンの一般的欠点は、接種材料がほとんど制御されていないこと、その組成に大きなばらつきがあること、生物学的に安全でないこと、および全体的に、多数の実験動物の使用による方法が非倫理的であることである。また、ピロプラスミド寄生虫は非常に不安定であり、遊離酸素を避けなければならず、さもなければすぐに死んでしまう。
【００１１】
あるいは、寄生虫に感染した赤血球自体をワクチン接種に使用するのではなく、感染宿主からの血清またはインビトロ培養の上清を使用する。感染赤血球のそのような包囲液体は、いわゆる可溶性寄生虫抗原（ＳＰＡ）を含有する。これらの調製物の組成に関してはほとんど知られていない。防御活性は、赤血球への侵入の過程で残存した構造体である、血清または培地内のメロゾイト表面外皮の抗原の免疫能によるものであると示唆されている（Ｒｉｓｔｉｃ，Ｍ．およびＭｏｎｔｅｎｅｇｒｏ−Ｊａｍｅｓ，Ｓ．，１９８８，ｉｎ：“Ｂａｂｅｓｉｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｏｍｅｓｔｉｃ  Ａｎｉｍａｌｓ  ａｎｄ  Ｍａｎ”，Ｒｉｓｔｉｃ，Ｍ．編，ｐ．１６３−１９０，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）。また、インビトロ培養中、多数の寄生虫が死亡し、それにより（内部）寄生虫抗原が培地内へ遊離する。
【００１２】
そのようなＳＰＡ調製物は、必ずしも寄生虫に影響を及ぼさないものの感染の臨床的症状を十分に軽減する免疫応答を誘導しうる（ＳｃｈｅｔｔｅｒｓおよびＭｏｎｔｅｎｅｇｒｏ−Ｊａｍｅｓ，Ｓ．，１９９５，Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，ｖｏｌ．１１，ｐ．４５６−４６２）。例えば、赤血球に感染したバベシア・カニス（Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ）寄生虫のインビトロ培養の培養上清からのＳＰＡ（Ｐｉｒｏｄｏｇ（登録商標））は同種チャレンジ感染に対する免疫を誘導する（が、異種チャレンジ感染に対する免疫は誘導しない）。
【００１３】
一般に、ＳＰＡに基づくワクチンは、生寄生虫ワクチンと同じ欠点を有する。すなわち、それはほとんど特徴づけられておらず、非常にばらつきがあり、生物学的安全性を確保するためには多くの注意点を要する。また、そのようなワクチンの製造は大規模化が非常に困難である。なぜなら、それは、寄生虫、赤血球および／または血清を得るために、感染、飼育および実験動物のサンプルからの回収を要するからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ピロプラスミド（Ｐｉｒｏｐｌａｓｍｉｄ）生物による感染の予防または改善のために、有効なワクチンにおいて働きうる、十分に特徴づけられており安全であり安定であるタンパク質およびその断片を、大規模化が容易な製造により提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
驚くべきことに、５つの新規ピロプラスミドタンパク質の１以上または該タンパク質の１以上の免疫原性断片を含むワクチンは全てのこれらの有利な特性を有することが、本発明において見出された。
【００１６】
そのようなピロプラスミドタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片をワクチン中で使用することにより、生寄生虫ワクチンおよびＳＰＡワクチンの多数の欠点が本発明において克服されうる。そのようなタンパク質は十分に特徴づけられており、生物学的に安全であり、該産物は全生寄生虫より遥かに安定化されることが可能であり、その製造は容易に大規模化されうる。
【００１７】
驚くべきことに、ピロプラスミドタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片に対して産生した抗体は、宿主細胞内への寄生虫の侵入を有効に抑制して寄生虫の感染サイクルを妨げることが見出された。したがって、該タンパク質は侵入抑制抗原（ＩＩＡ）と称される。
【００１８】
ピロプラスミド寄生虫によるその宿主細胞への侵入の過程は寄生虫感染の確立において決定的に重要な段階の１つである。この段階を妨げる抗体の誘導によるこの段階での阻害により、宿主細胞内への寄生虫の初期侵入が抑制される。これは宿主における感染のレベルまたは疾患の臨床的症状、したがって疾患の重症化を予防または少なくとも軽減する。また、マダニがワクチン接種宿主を吸血した場合には、キャリアーとなるマダニが減少し、したがって環境における感染圧が低下するため、環境における疾患の更なる広がりが阻止または軽減される。
【００１９】
ピロプラスミド寄生虫の侵入を抑制する抗体を与える防御免疫応答を誘導しうるピロプラスミドＩＩＡは、ピロプラスミド寄生虫、増殖中の寄生虫の培養および感染細胞において、特異的抗血清により検出されうる。これらの特異的抗血清は、寄生虫またはその培養、感染細胞のライセートの１−Ｄおよび２−Ｄ（２次元）ウエスタンブロットにおいても、これらのＩＩＡを認識する。
【００２０】
ピロプラスミドＩＩＡは発現系において発現されうる。このようにして発現されたタンパク質またはその断片は、特異的抗体または抗原特異的リンパ球の誘導によりピロプラスミド生物による感染後の疾患またはその臨床的徴候から哺乳動物を防御するワクチンを製剤化するために使用することが可能である。
【００２１】
したがって、本発明は、配列番号２または４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは７５％、より好ましくは８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％（その順で好ましくなる）の類似性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とするピロプラスミド（Ｐｉｒｏｐｌａｓｍｉｄ）タンパク質、または該タンパク質の免疫原性断片を提供する。
【００２２】
本発明はまた、配列番号６または８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは７５％、より好ましくは８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％（その順で好ましくなる）の類似性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とするピロプラスミドタンパク質、または該タンパク質の免疫原性断片を提供する。
【００２３】
本発明は更に、配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは７５％、より好ましくは８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％（その順で好ましくなる）の類似性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とするピロプラスミドタンパク質、または該タンパク質の免疫原性断片を提供する。
【００２４】
本発明のピロプラスミドタンパク質の典型例としては以下のものが挙げられる：
・配列番号２に示すアミノ酸配列を有する、バベシア・ボビス（Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ）からのピロプラスミドＩＩＡ番号１（ＢＩＩＡ１）、
・配列番号４に示すアミノ酸配列を有する、タイレリア・アヌラタ（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ａｎｎｕｌａｔａ）からのピロプラスミドＩＩＡ番号１（ＴＩＩＡ１）、
・配列番号６に示すアミノ酸配列を有する、バベシア・ボビス（Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ）からのピロプラスミドＩＩＡ番号２（ＢＩＩＡ２）、
・配列番号８に示すアミノ酸配列を有する、タイレリア・アヌラタ（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ａｎｎｕｌａｔａ）からのピロプラスミドＩＩＡ番号２（ＴＩＩＡ２）、
・配列番号１０に示すアミノ酸配列を有する、バベシア・ボビス（Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ）からのピロプラスミドＩＩＡ番号３（ＢＩＩＡ３）。
【００２５】
「タンパク質」なる語はアミノ酸の分子鎖を含むと意図される。タンパク質は、特定の長さ、構造または形状のものではなく、必要に応じて、例えばグリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化または空間的フォールディングの変化によりインビボまたはインビトロで修飾されうる。とりわけ、ペプチド、オリゴペプチドおよびポリペプチドがタンパク質の定義に含まれる。タンパク質は生物および／または合成由来でありうる。
【００２６】
本発明の「ピロプラスミドタンパク質」は、ピロプラスミド（Ｐｉｒｏｐｌａｓｍｉｄ）の生物から入手可能なタンパク質である。
【００２７】
好ましくは、ピロプラスミドタンパク質は、種バベシア・ジバージェンス（Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、バベシア・ボビス（Ｂ．ｂｏｖｉｓ）、バベシア・モタシ（Ｂ．ｍｏｔａｓｉ）、バベシア・カバリ（Ｂ．ｃａｂａｌｌｉ）、ボベシア・エクイ（Ｂ．ｅｑｕｉ）、バベシア・カニス（Ｂ．ｃａｎｉｓ）、バベシア・ロッシ（Ｂ．ｒｏｓｓｉ）、バベシア・ボゲリ（Ｂ．ｖｏｇｅｌｉ）、バベシア・フェリス（Ｂ．ｆｅｌｉｓ）、バベシア・カチ（Ｂ．ｃａｔｉ）、バベシア・オビス（Ｂ．ｏｖｉｓ）、バベシア・トラウトマンニ（Ｂ．ｔｒａｕｔｍａｎｎｉ）、バベシア・ビゲミナ（Ｂ．ｂｉｇｅｍｉｎａ）、バベシア・ミクロチ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）、タイレリア・アヌラタ（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ａｎｎｕｌａｔａ）、タイレリア・パルバ（Ｔ．ｐａｒｖａ）、タイレリア・エクイ（Ｔ．ｅｑｕｉ）、タイレリア・フェリス（Ｔ．ｆｅｌｉｓ）、タイレリア・カニス（Ｔ．ｃａｎｉｓ）およびタイレリア・セルゲンチ（Ｔ．ｓｅｒｇｅｎｔｉ）よりなる群から選ばれる生物から入手可能である。
【００２８】
より好ましくは、ピロプラスミドタンパク質は、種バベシア・ボビス（Ｂ．ｂｏｖｉｓ）、バベシア・カバリ（Ｂ．ｃａｂａｌｌｉ）、ボベシア・エクイ（Ｂ．ｅｑｕｉ）、バベシア・カニス（Ｂ．ｃａｎｉｓ）、バベシア・ロッシ（Ｂ．ｒｏｓｓｉ）、バベシア・ビゲミナ（Ｂ．ｂｉｇｅｍｉｎａ）、タイレリア・アヌラタ（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ａｎｎｕｌａｔａ）、タイレリア・パルバ（Ｔ．ｐａｒｖａ）およびタイレリア・エクイ（Ｔ．ｅｑｕｉ）よりなる群から選ばれる生物から入手可能である。
【００２９】
より一層好ましくは、ピロプラスミドタンパク質は、種バベシア・ボビス（Ｂ．ｂｏｖｉｓ）およびタイレリア・アヌラタ（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ａｎｎｕｌａｔａ）よりなる群から選ばれる生物から入手可能である。
【００３０】
最も好ましくは、ピロプラスミドタンパク質はバベシア・ボビス（Ｂ．ｂｏｖｉｓ）から入手可能である。
【００３１】
現在の系統分類に関しては、これは、新たな洞察が新たな又は他の分類群への再分類をもたらすにつれて時代と共に変化しうると当業者は認識するであろう。しかし、これは関与生物のタンパク質レパートリーを変化させるものではなく、その分類のみを変化させるものであるため、そのような再分類された生物は本発明の範囲内であるとみなされる。これは、バベシイダエ科（Ｂａｂｅｓｉｉｄａｅ）およびタイレリイダエ科（Ｔｈｅｉｌｅｒｉｉｄａｅ）のような密接に関連した科の場合に特に重要である。例えば、バベシア・エクイ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｅｑｕｉ）は最近、タイレリア・エクイ（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ｅｑｕｉ）として再分類された。
【００３２】
抗原性となるためには、タンパク質の断片は或る長さのものである必要がある。すなわち、小さすぎる断片は、抗原提示細胞により、そのようなものとしてＭＨＣ分子と会合しうる抗原へとプロセシングされないであろう（その会合はリンパ球に対する適切な抗原提示に要求される）。エピトープを含む抗原断片は、ＭＨＣ  Ｉ受容体結合の場合には少なくとも８〜１１アミノ酸、ＭＨＣ  ＩＩ受容体結合の場合には少なくとも１１〜１５アミノ酸よりなる（例えば、Ｒ．Ｎ．Ｇｅｒｍａｉｎ  ＆  Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，１９９３，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１１，ｐ．４０３−４５０，ｉｎ：“Ｔｈｅ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ”に概説されている）。これより短いタンパク質断片はそれ自体では抗原性とならないであろう。したがって、当技術分野で公知の技術を用いて、それを担体、例えばＫＬＨ、ＢＳＡなどに結合させる必要がある。そのような短い断片は、結合している場合には、本発明の範囲内の免疫応答を十分に誘導しうる。
【００３３】
本発明においては、「エピトープ」は、Ｔおよび／またはＢリンパ球の抗原受容体と反応する、抗原性分子の部分である。したがって、本発明のエピトープは特異的Ｔおよび／またはＢ細胞を誘導および／または活性化して、これらの細胞が、感染または疾患の過程を妨げる免疫応答を引き起こす。このように、そのようなエピトープを介して、タンパク質は抗体を誘導し、および／または、免疫応答を引き起こしうる。
【００３４】
「免疫原性断片」は、ピロプラスミドタンパク質に対する免疫応答を誘導する能力を有する該ピロプラスミドタンパク質のエピトープ含有抗原性断片であると理解される。ただし、そのような抗体は侵入の過程を妨げうる。そのような免疫原性断片をどのようにして見出しうるかを以下に説明する。
【００３５】
本発明のピロプラスミドタンパク質の免疫原性断片は、本発明のピロプラスミドタンパク質のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも１０アミノ酸を含む。
【００３６】
好ましくは、そのような断片は、本発明のピロプラスミドタンパク質のアミノ酸配列から選ばれる１２、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００または３００アミノ酸（その順で好ましくなる）を含む。
【００３７】
例えば、本発明のピロプラスミドタンパク質の免疫原性断片は、Ｎ末端シグナル配列および／またはＣ末端配列を欠くタンパク質の部分により形成される。他の断片は、例えば、ピロプラスミドＩＩＡタンパク質からの特異的エピトープを含むものである。そのようなエピトープは、後記で大まかに説明する方法により決定することが可能である。すべてのそのような免疫原性断片は本発明の範囲内である。
【００３８】
本発明のピロプラスミドタンパク質の免疫原性断片およびエピトープの同定は、種々の直接的な技術、例えば、いわゆるＰＥＰＳＣＡＮ法、あるいは公知断片および／またはエピトープとの比較を行うコンピューターアルゴリズムにより容易に行うことが可能である。
【００３９】
ＰＥＰＳＣＡＮ法（ＷＯ  ８４／０３５６４およびＷＯ  ８６／０６４８７およびＨ．Ｇｅｙｓｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８４，ｖｏｌ．８１，ｐ．３９９８−４００２およびＪ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．ｍｅｔｈ．１９８７，ｖｏｌ．１０２，ｐ．２５９−２７４）は、タンパク質の免疫決定基の検出のための、実施が容易で迅速で十分に確立された方法である。それは、研究中のタンパク質と進行的（ｐｒｏｇｒｅｓｉｖｅｌｙ）に重複する一連のペプチド断片の合成、およびそれに続く、該タンパク質に対する特異的抗体でのこれらのポリペプチドの試験により、これらのうちのどれがＴおよび／またはＢリンパ球の抗原受容体に結合しうるかを同定することを含む。本発明のタンパク質に対するそのような抗体は、当技術分野でよく知られた技術を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体を製造することにより得ることが可能である。
【００４０】
特定のタンパク質断片を、公知エピトープとのその配列的および／または構造的合致に基づいて、免疫学的に重要なエピトープであると特定するためのコンピューターアルゴリズムの使用も、よく知られた技術である。これらの領域の決定は、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８１，ｖｏｌ．７８，ｐ．３８２４−３８２８）による親水性基準とＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９８７，ｖｏｌ．４７，ｐ．４５−１４８および米国特許第４，５５４，１０１号）による二次構造態様との組合せに基づいて行うことが可能である。同様に、ベルゾフスキー（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ）の両親媒性基準（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８７，ｖｏｌ．２３５，ｐ．１０５９−１０６２および米国特許出願ＮＴＩＳ  ＵＳ０７／００５，８８５）を用いて、コンピューターにより、タンパク質のアミノ酸配列から免疫原性エピトープを予測することが可能である。これらの方法の使用の概要はＳｈａｎ  Ｌｕ（一般的原理：Ｔｉｂｔｅｃｈ  １９９１，ｖｏｌ．９，ｐ．２３８−２４２）、Ｌｕ（総説：Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９２，ｖｏｌ．１０，ｐ．３−７）およびＢｅｒｚｏｆｓｋｙ（ＨＩＶエピトープ；１９９１，Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ，ｖｏｌ．５，ｐ．２４１２−２４１８）に見出される。
【００４１】
これらの方法の使用の有効性の例示はＨ．Ｍａｒｇａｌｉｔら（Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８７，ｖｏｌ．１３８，ｐ．２２１３−２２２９）により公開されており、該著者は、そのような方法を用いたＴ細胞エピトープの予測における７５％の成功率を記載している。さらにもう１つの実証は、実施例１第１．１．５節に示すとおり、ＢＩＩＡ１およびＢＩＩＡ２からの６つの抗原ペプチドの予測の成功である。
【００４２】
ついで、前記方法を用いて見出されたエピトープが侵入過程を実際に妨げうるかどうかを判定しなければならない。しかし、これは、簡便なインビトロ侵入抑制実験において非常に迅速かつ容易に行うことが可能である。そのような実験は実施例１．１．１１に記載されている。
【００４３】
本発明のタンパク質に対するアミノ酸配列の類似性（％）は、配列番号２、４，６、８または１０の完全長アミノ酸配列に対するアミノ酸アライメントにより決定しなければならない。
【００４４】
本発明のタンパク質に対する類似性（％）は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌにおいて見出されうるサブプログラム「ＢｌａｓｔＰ」（Ｔ．Ｔａｔｕｓｏｖａ  ＆  Ｔ．Ｍａｄｄｅｎ，１９９９，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．１７４，ｐ．２４７−２５０）を選択することにより、コンピューターアルゴリズム「ＢＬＡＳＴ  ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」を使用して決定しなければならない。使用する比較マトリックスは「Ｂｌｏｓｕｍ６２」であり、デフォルトパラメーター：オープンギャップペナルティ：１１、伸長ギャップペナルティ：１およびギャップｘ ドロップオフ：５０を使用する。
【００４５】
このプログラムは、「同一性」と同じであるアミノ酸の割合（％）、および「陽性」と類似しているアミノ酸の割合（％）を列挙している。「類似」アミノ酸は、同一であるアミノ酸および等価であるアミノ酸であり、「等価」アミノ酸については後記で説明する。
【００４６】
特定のピロプラスミドタンパク質に関しては、ピロプラスミドの個々の株または種に関連した該タンパク質間の自然変異が存在すると理解されるであろう。これらの変異は全配列におけるアミノ酸の相違により、あるいは該配列におけるアミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位または付加により示されうる。生物学的および免疫学的活性を実質的に変化させないアミノ酸置換は、例えばＮｅｕｒａｔｈら（１９７９，ｉｎ：“Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）により記載されている。関連アミノ酸間のアミノ酸置換または進化において頻繁に生じている置換としては、とりわけ、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌが挙げられる（Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．，１９７８，“Ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ”，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３を参照されたい）。他の一般的なアミノ酸置換には、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／ｌｌｅ、Ｌｅｕ／ＶａｌおよびＡｌａ／Ｇｌｕが含まれる。そのような関連および一般的置換アミノ酸は「等価」と称される。この情報に基づき、ＬｉｐｍａｎおよびＰｅａｒｓｏｎは、迅速かつ高感度なタンパク質比較（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８５，ｖｏｌ．２２７，ｐ．１４３５−１４４１）およびタンパク質間の機能的類似性の決定のための方法を開発した。本発明の典型的な実施形態のそのようなアミノ酸置換ならびに欠失および／または挿入を有する変異は、生じるタンパク質が、ピロプラスミド寄生虫の増殖を抑制する免疫応答、例えば、ピロプラスミド寄生虫の侵入を抑制する抗体を誘導する能力を保有している限り、本発明の範囲内である。本発明の或るピロプラスミドタンパク質のアミノ酸配列内のそのような変異は「生物学的または等価ホモログ」とみなされ、すべて本発明の範囲内である。
【００４７】
これは、本発明のピロプラスミドタンパク質が、異なる種のピロプラスミド種から単離された場合に、例えば配列番号２、４、６、８または１０に示すアミノ酸配列に対して７０％まで低下する類似性を有しうる一方、示されている実施例における同じ特性（ピロプラスミド寄生虫の侵入を抑制する抗体を誘導しうる特性）を有する同じタンパク質に尚も相当することを説明するものである。
【００４８】
本発明のピロプラスミドタンパク質をそれらの間で比較すると、異なるピロプラスミド生物から得た本発明のピロプラスミドタンパク質は、典型的には、５０％を超えるアミノ酸類似性を有する。そのようなタンパク質は、異なるバベシア種から得られた場合には、典型的には８５％を超えるアミノ酸類似性を有し、そのようなタンパク質は、バベシア・ボビス（Ｂ．ｂｏｖｉｓ）からの異なる分離体から得られた場合には、典型的には、９５％を超えるアミノ酸類似性を有する。
【００４９】
本発明のピロプラスミドタンパク質の好ましい製造方法は、遺伝子操作技術および組換え発現系を用いることによるものである。これらは、核酸、ｃＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子、生組換えキャリアーおよび／または宿主細胞の使用を含みうる。
【００５０】
したがって、本発明のもう１つの態様は、本発明のピロプラスミドタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片をコードすることを特徴とする核酸に関する。
【００５１】
１つの実施形態においては、本発明の核酸は、配列番号１、３、５、７または９に示す核酸配列を含む。
【００５２】
「核酸」なる語はデオキシまたはリボ核酸の分子鎖を含むと意図される。核酸は特定の長さのものではなく、したがって、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡよりなるポリヌクレオチド、遺伝子、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、プローブ、プライマー、リンカー、スペーサーおよびアダプターは核酸の定義に含まれる。核酸は生物由来および／または合成由来でありうる。核酸は一本鎖または二本鎖形態でありうる。一本鎖はセンスまたはアンチセンス配向でありうる。また、修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡも該定義に含まれる。核酸の塩基の修飾を行うことが可能であり、イノシンのような塩基を含有させることが可能である。他の修飾は、例えばバックボーンの修飾を含みうる。
【００５３】
「コード（する）」なる語は、とりわけ、正しい環境に置かれた場合の転写および／または翻訳による、タンパク質の発現の可能性の提供を含むと意図される。
【００５４】
本発明の核酸は、本発明のピロプラスミドタンパク質をコードするか、または該タンパク質の免疫原性断片をコードする。
【００５５】
本発明の核酸は３０ヌクレオチドの最小長を有する。好ましくは、本発明の核酸は４０、５０、１００、２５０、５００、１０００または１５００ヌクレオチド（その順で好ましくなる）を含む。
【００５６】
本発明の核酸は、例えば、Ｎ末端シグナル配列および／またはＣ末端配列を欠く本発明のピロプラスミドタンパク質をコードする核酸である。他の核酸は、ピロプラスミドタンパク質の特異的エピトープをコードする配列を含みうる。そのような核酸はすべて、本発明の範囲内である。
【００５７】
以下の配列は本発明の核酸から除かれる：
・ＢＩＩＡ１（配列番号１）に関して、ＥＳＴ配列：
Ｂ ｂｏｖｉｓ−１１ｅ０５．ｐｌｃ、
Ｂ ｂｏｖｉｓ−３４４ｅ０９．ｑｌｃ、
Ｂ ｂｏｖｉｓ−３８４ｆ０６．ｑｌｃ、
Ｂ ｂｏｖｉｓ−２６１ｄ０５．ｑｌｃ、
Ｂ ｂｏｖｉｓ−５ｅ５．ｐｌｃ、
Ｂ ｂｏｖｉｓ−３７３ｇ０１．ｑｌｃ、
Ｂ ｂｏｖｉｓ−４１８ｂ０６．ｑｌｃ、
Ｂ ｂｏｖｉｓ−３７５ｄ０２．ｑｌｃ、
Ｂ ｂｏｖｉｓ−４０７ｄ０３．ｑｌｃ、
Ｂ ｂｏｖｉｓ−２８４−ｆ０７．ｑｌｃ、
・ＢＩＩＡ１（配列番号１）に関して、合体コンティグ：
Ｂｂｏｖｉｓ．ＣＯＮＴＩＧ．１０２９、
Ｂｂｏｖｉｓ．ＣＯＮＴＩＧ．２２７、
・ＢＩＩＡ２（配列番号５）に関して、ＥＳＴ配列：
Ｂ ｂｏｖｉｓ−４１７ｇ１２．ｑｌｃ、
Ｂ ｂｏｖｉｓ−３７６ａ１０．ｑｌｃ、
・ＴＩＩＡ２（配列番号７）に関して、合体コンティグ：
ｇｎｌ｜Ｓａｎｇｅｒ ５８７４｜Ｃｏｎｔｉｇ１５４８、
・ＴＩＩＡ１（配列番号３）に関して、合体コンティグ：
ｇｎｌ｜Ｓａｎｇｅｒ ５８７４｜Ｃｏｎｔｉｇ１。
【００５８】
ＢＩＩＡ１およびＢＩＩＡ２に関するＥＳＴおよびコンティグ配列はインターネットウェブページ：ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｂ  ｂｏｖｉｓ／から入手可能である。
【００５９】
ＴＩＩＡ１およびＴＩＩＡ２に関するコンティグは、インターネットページｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｕｔｉｌｓ／ｇｅｎｏｍ  ｔｒｅｅ．ｃｇｉ？ｏｒｇａｎｉｓｍ＝ｅｕｋからＡｐｉｃｏｍｐｌｅｘａを選択することによりＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴサーバーから入手可能である。
【００６０】
本発明の核酸間の同一性（％）は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ．において見出されうるサブプログラム「ＢｌａｓｔＮ」（Ｔ．Ｔａｔｕｓｏｖａ  ＆  Ｔ．Ｍａｄｄｅｎ，１９９９，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．１７４，ｐ．２４７−２５０）を選択することにより、コンピュータープログラム「ＢＬＡＳＴ  ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」を使用して決定される。使用するパラメーターはデフォルトパラメーター：マッチに関するリウォード：＋１；ミスマッチに関するペナルティ：−２；オープンギャップペナルティ：５；伸長ギャップペナルティ：２；およびギャップｘ ドロップオフ：５０である。前記のＢｌａｓｔＰプログラムの出力とは異なり、ＢｌａｘｔＮプログラムは類似性を一覧せず、同一性のみを一覧し、同一であるヌクレオチドの％が「同一性」として示される。
【００６１】
多数の異なる核酸が１つの同じタンパク質をコードしうることは当技術分野においてよく知られている。これは、分子生物学において「ゆらぎ」または「遺伝暗号の縮重」として公知のものにより生じ、この場合、ｍＲＮＡのいくつかのコドンまたはトリプレットが、翻訳中にリボソーム内で伸長しつつあるアミノ酸の鎖に同一アミノ酸を結合させる。それは、アミノ酸をコードする各トリプレットの第２塩基および特に第３塩基において最もよく見られる。この現象は、同じタンパク質を尚もコードする２つの異なる核酸に関して、約３０％の非相同性を与えうる。したがって、約７０％のヌクレオチド配列同一性を有する２つの核酸は１つの同じタンパク質を尚もコードしうる。
【００６２】
或る核酸配列が本発明の核酸配列であるか否かを判定するためのもう１つのアプローチは、その或る核酸配列が、配列番号１、３、５、７および９に記載されているヌクレオチド配列のいずれかにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするかどうかの問題に関連している。核酸配列が、配列番号１、３、５、７および９にに記載のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする場合には、それは本発明の核酸であるとみなされる。
【００６３】
ストリンジェントな条件の定義はＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１３８，ｐ．２６７−２８４）の融解温度Ｔｍに関する式：
Ｔｍ＝［８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ］−１℃／１％ミスマッチ
から導かれる。
【００６４】
この式において、Ｍは一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの割合（％）であり、Ｌは塩基対におけるハイブリッドの長さであり、ミスマッチは同一マッチの欠如である。
【００６５】
ストリンジェントな条件は、核酸配列またはその断片が、配列番号１、３、５、７および９のいずれかに記載されている核酸配列に対して３０％のミスマッチを有する（すなわち、それらが７０％同一であるに過ぎない）場合に、それらが尚もハイブリダイズする条件である。
【００６６】
本発明のピロプラスミドタンパク質をコードする核酸はピロプラスミドのメンバー種から得ることが可能である。
【００６７】
しかし、より好ましい実施形態においては、本発明のピロプラスミドタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片をコードする核酸は、それらが、種バベシア・ジバージェンス（Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、バベシア・ボビス（Ｂ．ｂｏｖｉｓ）、バベシア・モタシ（Ｂ．ｍｏｔａｓｉ）、バベシア・カバリ（Ｂ．ｃａｂａｌｌｉ）、ボベシア・エクイ（Ｂ．ｅｑｕｉ）、バベシア・カニス（Ｂ．ｃａｎｉｓ）、バベシア・ロッシ（Ｂ．ｒｏｓｓｉ）、バベシア・ボゲリ（Ｂ．ｖｏｇｅｌｉ）、バベシア・フェリス（Ｂ．ｆｅｌｉｓ）、バベシア・カチ（Ｂ．ｃａｔｉ）、バベシア・オビス（Ｂ．ｏｖｉｓ）、バベシア・トラウトマンニ（Ｂ．ｔｒａｕｔｍａｎｎｉ）、バベシア・ビゲミナ（Ｂ．ｂｉｇｅｍｉｎａ）、バベシア・ミクロチ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）、タイレリア・アヌラタ（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ａｎｎｕｌａｔａ）、タイレリア・パルバ（Ｔ．ｐａｒｖａ）、タイレリア・エクイ（Ｔ．ｅｑｕｉ）、タイレリア・フェリス（Ｔ．ｆｅｌｉｓ）、タイレリア・カニス（Ｔ．ｃａｎｉｓ）およびタイレリア・セルゲンチ（Ｔ．ｓｅｒｇｅｎｔｉ）よりなる群から選ばれる生物から入手可能であることにより特徴づけられる。
【００６８】
より好ましくは、該核酸は、種バベシア・ボビス（Ｂ．ｂｏｖｉｓ）、バベシア・カバリ（Ｂ．ｃａｂａｌｌｉ）、ボベシア・エクイ（Ｂ．ｅｑｕｉ）、バベシア・カニス（Ｂ．ｃａｎｉｓ）、バベシア・ロッシ（Ｂ．ｒｏｓｓｉ）、バベシア・ビゲミナ（Ｂ．ｂｉｇｅｍｉｎａ）、タイレリア・アヌラタ（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ａｎｎｕｌａｔａ）、タイレリア・パルバ（Ｔ．ｐａｒｖａ）およびタイレリア・エクイ（Ｔ．ｅｑｕｉ）よりなる群から選ばれる生物から入手可能である。
【００６９】
種が新たな種として分類学的に再分類または記載される可能性は前記のとおりである。これは生物のゲノムを変化させるものではないため、そのような再分類された生物も本発明の範囲内である。
【００７０】
非哺乳類ピロプラスミドからのピロプラスミドタンパク質、該タンパク質の免疫原性断片およびそのようなピロプラスミドタンパク質またはその断片をコードする核酸も、本発明のピロプラスミドタンパク質の遺伝子およびタンパク質の高い保存性のため、本発明の範囲内に含まれる。そのような関連タンパク質またはそれらの遺伝子はパラログまたはオルソログと称されうる。
【００７１】
本発明のピロプラスミドタンパク質をコードする核酸は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”（２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；ＩＳＢＮ：０８７９６９５７７３）のような標準的な参考書に詳細に記載されており当業者によく知られた標準的な分子生物学技術により入手、操作および発現されうる。１つのそのようなタイプの操作は、当技術分野で公知の技術により寄生虫または寄生虫感染細胞もしくは生物から単離されうるＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡからｃＤＮＡ断片を合成することである。
【００７２】
したがって、もう１つの態様においては、本発明は本発明のｃＤＮＡ断片に関する。
【００７３】
逆転写によりｃＤＮＡ断片を得るための好ましい方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によるものである。ＰＣＲを行うための標準的な技術およびプロトコールは、例えば、Ｃ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ＆  Ｇ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ：“ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”（１９９５，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ８７９６９４４７３）に詳細に記載されている。
【００７４】
好ましい実施形態においては、本発明は、機能的に連結されたプロモーターの制御下にある本発明の核酸または本発明のｃＤＮＡ断片を含む組換えＤＮＡ分子に関する。
【００７５】
本発明の組換えＤＮＡ分子を構築するためには、好ましくはＤＮＡプラスミドを使用する。そのようなプラスミドは、例えば、ＤＮＡインサートの量を増加させるために、およびプローブとして、および更なる操作用の手段として有用である。クローニング用のそのようなプラスミドの具体例としては、ｐＢＲ、ｐＵＣおよびｐＧＥＭ系列のプラスミドが挙げられ、これらはすべて、いくつかの商業的供給業者から入手可能である。
【００７６】
当技術分野でよく知られた技術を用いて、本発明のピロプラスミドタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片をコードする核酸を別々のプラスミド内にクローニングし、修飾して、所望のコンホメーションを得ることが可能である。しかし、改善されたクローニングまたは発現のために、それらを１つの構築物に合体させることも可能である。
【００７７】
本発明のピロプラスミドタンパク質またはその免疫原性断片をコードするコード配列に対する修飾は、例えば、制限酵素消化、部位特異的突然変異またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術により行うことが可能である。
【００７８】
タンパク質の精製もしくは検出または発現レベルの改善のために、追加的な核酸を付加することが可能である。これは、ピロプラスミドタンパク質をコードするのに要する配列より大きいｃＤＮＡ断片または組換えＤＮＡ分子内に含まれる最終的な核酸を与えうる。そのような追加的要素がインフレームで挿入された場合には、これらは、発現されるピロプラスミドタンパク質の構成部分となる。そのような融合タンパク質も本発明の範囲内である。
【００７９】
核酸、ｃＤＮＡ断片または組換えＤＮＡ分子の発現のための必須要件は、これらが転写調節配列に機能しうる形で連結されていて、これが該核酸、ｃＤＮＡまたは組換えＤＮＡの転写を制御しうることである。転写調節配列は当技術分野でよく知られており、とりわけ、プロモーターおよびエンハンサーを含む。プロモーターの選択は、使用する発現系において該プロモーターが機能的である限り、遺伝子転写を指令しうる任意の真核性、原核性またはウイルス性プロモーターに拡張されることが当業者に明らかである。
【００８０】
より好ましい実施形態においては、本発明は、本発明の核酸または本発明のｃＤＮＡ断片（該核酸または該ｃＤＮＡ断片は、機能的に連結されたプロモーターの制御下にある）または本発明の組換えＤＮＡ分子を含む生組換えキャリアーに関する。
【００８１】
そのような生組換えキャリアー（ｌｉｖｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃａｒｒｉｅｒ）（ＬＲＣ）は、例えば、追加的な遺伝情報（この場合には、本発明のピロプラスミドタンパク質またはその免疫原性断片をコードする核酸、ｃＤＮＡまたは組換えＤＮＡ分子）がクローニングされている微生物、例えば細菌、寄生虫およびウイルスである。そのようなＬＲＣを接種した標的哺乳類は、該キャリアーの免疫原に対してだけでなく異種タンパク質または免疫原性断片（それに関する遺伝暗号が該ＬＲＣ内に追加的にクローニングされているもの、例えば、本発明のピロプラスミドタンパク質またはその免疫原性断片）に対しても免疫応答を産生するであろう。
【００８２】
細菌ＬＲＣの一例として、当技術分野で公知の弱毒化サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株が魅力的に使用されうる。
【００８３】
あるいは、生組換えキャリアー寄生虫は、とりわけ、Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ，Ａ．Ｎ．（Ｉｎｔ．Ｊｏｕｒｎ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．１９９８，ｖｏｌ．２８，ｐ．１１２１−１１３０）により記載されている。
【００８４】
核酸を標的細胞内に輸送する手段として、ＬＲＣウイルスを使用することが可能である。また、生組換えキャリアーウイルスはベクターウイルスとも称される。ベクターとしてしばしば使用されるウイルスとしては、ワクシニアウイルス（Ｐａｎｉｃａｌｉら  １９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．７９，ｐ．４９２７）、ヘルペスウイルス（ＥＰ  ０４７３２１０−Ａ２）およびレトロウイルス（Ｖａｌｅｒｉｏ，Ｄ．ら  １９８９，ｉｎ：Ｂａｕｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｄｉｃｋｅ，Ｋ．Ａ．，Ｌｏｔｚｏｖａ，Ｅ．およびＰｌｕｚｎｉｋ，Ｄ．Ｈ．（編），“Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ｔｏｄａｙ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ｐｐ．９２−９９）が挙げられる。
【００８５】
本発明の挿入された核酸、ｃＤＮＡまたは組換えＤＮＡの発現を宿主動物において誘導しうる選択されたＬＲＣ細菌、寄生虫またはウイルスのゲノム内に本発明の組換え核酸分子を導入するためには、当技術分野でよく知られたインビボ相同組換えの技術を用いることが可能である。
【００８６】
発現用の宿主細胞としては、細菌、酵母、真菌、昆虫および脊椎動物細胞発現系が非常に頻繁に使用される。そのような発現系は当技術分野でよく知られており、一般に入手可能であり、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から商業的に入手可能である。
【００８７】
したがって、より一層好ましい実施形態においては、本発明は、本発明の核酸、本発明のｃＤＮＡ断片（該核酸または該ｃＤＮＡ断片は、機能的に連結されたプロモーターの制御下にある）、本発明の組換えＤＮＡ分子または本発明の生組換えキャリアーを含む宿主細胞に関する。
【００８８】
本発明のピロプラスミドタンパク質の発現に使用する宿主細胞は、ピロプラスミドタンパク質をコードする配列を発現させるための細菌由来プラスミドまたはバクテリオファージと組合された、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓ）およびラクトバシラス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）またはカウロバクター・クレセンツス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）などの細菌に由来する細胞でありうる。また、宿主細胞は、真核生物由来であることが可能であり、例えば、酵母特異的ベクター分子と組合された酵母細胞、あるいはベクターまたは組換えバキュロウイルスと組合された昆虫細胞（Ｌｕｃｋｏｗら，１９８８，Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．６，４７−５５）、例えばＴｉ−プラスミドに基づくベクターまたは植物ウイルスベクター（Ｂａｒｔｏｎ，Ｋ．Ａ．ら，１９８３，Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．３２，ｐ．１０３３）と組合された植物細胞、あるいは同様に適当なベクターまたは組換えウイルスと組合されたＨｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、クランデル・フェリン腎細胞（Ｃｒａｎｄｅｌｌ  Ｆｅｌｉｎｅ  Ｋｉｄｎｅｙ−ｃｅｌｌｓ）などの哺乳類細胞などの高等真核細胞でありうる。
【００８９】
これらの発現系についで、植物細胞または寄生虫（寄生生物）に基づく発現系が、魅力的な発現系である。寄生虫発現系は、例えばフランス国特許出願公開番号２  ７１４  ０７４およびＵＳ  ＮＴＩＳ公開番号ＵＳ０８／０４３１０９（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．  ＆  Ｒｏｇｅｒｓ，Ｗ．，１９９３）に記載されている。生物学的用途のためのポリペプチドの植物細胞発現系は、例えばＲ．Ｆｉｓｃｈｅｒら（Ｅｕｒ．Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９，ｖｏｌ．２６２，ｐ．８１０−８１６）およびＪ．Ｌａｒｒｉｃｋら（Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇｉｎ．２００１，ｖｏｌ．１８，ｐ．８７−９４）に記載されている。
【００９０】
発現は、いわゆる無細胞発現系において行うことも可能である。そのような系は、その個々の系において機能するプロモーターに機能しうる形で連結された適当な組換え核酸の発現のためのすべての必須因子を含む。具体例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ライセート系（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）またはウサギ網状赤血球ライセート系（Ｐｒｏｍｅｇａ  ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）が挙げられる。
【００９１】
本発明のピロプラスミドタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片はワクチンの製造に非常によく適している。そのようなタンパク質または断片は、寄生虫から、あるいはピロプラスミド寄生虫に感染した動物または細胞から得ることが可能である。しかし、それより遥かに簡便なのは、本発明のピロプラスミドタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片をコードする核酸を発現系において使用することである。この後、産生したタンパク質または断片を集め、本発明のピロプラスミドタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片を製薬上許容される担体と混合することにより、これらをタンパク質サブユニットワクチンに製剤化する。
【００９２】
したがって、本発明の更にもう１つの態様は、本発明のタンパク質もしくは該タンパク質の免疫原性断片、本発明の核酸、ｃＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子、生組換えキャリアーもしくは宿主細胞またはそれらの組合せと製薬上許容される担体とを含むワクチンに関する。
【００９３】
前記のとおり、ピロプラスミドタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片はワクチン接種に有利に使用されうる。それはピロプラスミド寄生虫の増殖を妨げる（例えば、宿主への侵入を抑制する）ように働き、または寄生虫の増殖もしくはそれが引き起こす臨床的徴候を妨げる防御免疫応答（例えば、特異的抗体または活性化リンパ球）を誘導するであろう。
【００９４】
そのようなタンパク質または断片がそれら自身に対する所望の応答をもたらさない場合には、当技術分野で公知の技術を用いて、それらをＫＬＨ、ＢＳＡなどのような担体に結合させることが可能である。
【００９５】
タンパク質またはその断片の結合は、誘導される免疫応答を増強または修飾するためにも行うことが可能である。例えば、Ｔ細胞の応答を増強するためにタンパク質（またはその断片）を破傷風トキソイドに結合させることが一般に行われている。また、標的細胞の細胞死を促進するために、特異的エフェクター分子、例えば毒素を付加することも可能である。
【００９６】
そのような結合は、
・直接的な又は中間的構造体を介したアミノ酸配列の脱水、エステル化などによるカップリング、コンジュゲート化または架橋により化学的に、
・巨大分子構造体内または巨大分子構造体上での捕捉によるカップリングにより物理的に、あるいは好ましくは、
・単一の連続的発現産物が最終的に産生されるようそれらの２つのそれぞれをコードしうる核酸の断片を含む組換え核酸分子の組合せによる分子生物学的融合により行うことが可能である。そのような分子操作技術が好ましい。
【００９７】
もう１つの効率的なワクチン接種方法は、関連抗原またはエピトープをコードするＤＮＡでの直接ワクチン接種である。タンパク質をコードするＤＮＡでの直接ワクチン接種は、多種多様なタンパク質に関して成功している（例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ  １９９３，ｖｏｌ．２，ｐ．２０−２６において概説されているとおりである）。抗寄生虫ワクチンの分野においては、例えばプラスモジウム・ヨエリイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ）に対する防御がプラスモジウム・ヨエリイ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）のスポロゾイト周囲（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）遺伝子でのＤＮＡワクチン接種で得られており（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．ら  １９９４，Ｖａｃｃｉｎｅ，ｖｏｌ．１２，ｐ．１５２９−１５３３）、大リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）に対する防御が大リーシュマニア（Ｌ．ｍａｊｏｒ）表面糖タンパク質ｇｐ６３遺伝子でのＤＮＡワクチン接種で得られている（Ｘｕ  ＆  Ｌｉｅｗ  １９９４，Ｖａｃｃｉｎｅ，ｖｏｌ．１２，ｐ．１５３４−１５３６）。
【００９８】
そのようなＤＮＡワクチン接種は、本発明の核酸、ｃＤＮＡ断片、または好ましくは組換えＤＮＡ分子で行うことが可能である。
【００９９】
したがって、１つの好ましい実施形態は、本発明の核酸、ｃＤＮＡ断片または組換えＤＮＡ分子を含むことを特徴とする、本発明のワクチンに関する。
【０１００】
あるいは、本発明のワクチンは、本発明のピロプラスミドタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片を発現しうる前記の生組換えキャリアーを含みうる。そのようなワクチン、例えば、細菌、寄生虫またはウイルスキャリアーもしくはベクターに基づくワクチンは、それがピロプラスミダによる感染の自然様態をよりよく模擬する点で、サブユニットワクチンに対する利点を有する。また、該キャリアーに感染した細胞による抗原の提示が、本発明のピロプラスミドタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片が自然感染において免疫系に対して提示される経路に類似している。さらに、それらの自己増殖も利点の１つである。なぜなら、免疫化には少量の組換えキャリアーが必要であるに過ぎないからである。
【０１０１】
したがって、もう１つの好ましい実施形態は、生組換えキャリアーと製薬上許容される担体とを含む本発明のワクチンに関する。
【０１０２】
本発明のピロプラスミドタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片を発現系として発現させるためには、前記の宿主細胞を使用することが可能である。発現後、タンパク質産物を回収することが可能であるが、その代わりに、培地または完全な宿主細胞自体をワクチン中で使用することも可能である。これは、精製工程を省略できる点で有利であるが、もちろん、培地成分および／または宿主細胞成分に対する標的哺乳動物による或る程度の許容性を要する。
【０１０３】
本発明のピロプラスミドタンパク質もしくは該タンパク質の免疫原性断片または本発明の核酸、ｃＤＮＡ、組換え分子、生組換えキャリアーもしくは宿主細胞からの２以上のタイプの分子の組合せを含む本発明のワクチンも本発明の範囲内である。本発明のそのようなワクチンにおいては、該成分を１回量または分割量として一緒にすることが可能であり、これらを同時または連続的に投与することが可能である。
【０１０４】
例えば、ピロプラスミドタンパク質のコード配列を含有する組換えＤＮＡプラスミドでの初回抗原刺激と、その後或る程度の間隔を置いて行う、ピロプラスミドタンパク質での追加ワクチン接種との組合せワクチン接種が、有利に用いられうる。
【０１０５】
本発明のワクチンは、哺乳動物標的当たりに０．１〜１０００μｇの本発明のピロプラスミドタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片を含有する量で投与することが可能である。原理上はそれより少量または大量の用量を使用することが可能であり、好ましくは、ピロプラスミドタンパク質またはその免疫原性断片５０〜２００μｇの用量を使用する。
【０１０６】
生ウイルスベクターワクチンの場合には、動物当たりの用量比率は１〜１０１０  ｐｆｕであることが可能であり、好ましくは、１０〜１０５  ｐｆｕを使用する。
【０１０７】
製薬上許容される担体は、ワクチン接種する動物の健康に悪影響を及ぼさない化合物であると理解され、この場合、該悪影響は、少なくとも、該動物がワクチン接種されていない場合に見られる影響より悪くない程度のものである。製薬上許容される担体は、例えば無菌水または無菌生理塩溶液でありうる。より複雑な形態においては、該担体は例えばバッファーでありうる。
【０１０８】
しばしば、例えば、易分解性成分の分解を防ぐために、またはワクチンの貯蔵寿命を延長させるために、または凍結乾燥効率を改善するために、ワクチンを安定剤と混合する。有用な安定剤としては、とりわけ、ＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋら  １９５０，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．５９，ｐ．５０９）、脱脂乳、ゼラチン、ウシ血清アルブミン、炭水化物、例えばソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、スクロース、デキストランまたはグルコース、タンパク質、例えばアルブミンまたはカゼインまたはそれらの分解産物、およびバッファー、例えばリン酸アルカリ金属が挙げられる。
【０１０９】
本発明のワクチンは更に、いわゆる「ビヒクル」を含みうる。ビヒクルは、本発明のタンパク質、タンパク質断片、核酸もしくはその一部、ｃＤＮＡ、組換え分子、生組換えキャリアーおよび／または宿主細胞が、共有結合することなく付着する化合物である。そのようなビヒクルとしては、とりわけ、バイオマイクロカプセル、微小アルギン酸、リポソーム、マクロゾル、水酸化−、リン酸−、硫酸−または酸化−アルミニウム、Ｋａｏｌｉｎ（登録商標）およびＢｅｎｔｏｎｉｔｅ（登録商標）が挙げられ、これらはすべて、当技術分野において公知である。
【０１１０】
一例として、免疫刺激性複合体（いわゆるＩＳＣＯＭ（登録商標））内に抗原を部分的に包埋するビヒクルが挙げられる（ＥＰ  １０９．９４２、ＥＰ  １８０．５６４、ＥＰ  ２４２．３８０）。
【０１１１】
また、本発明のワクチンは、１以上の適当な界面活性化合物または乳化剤、例えばＳｐａｎ（登録商標）またはＴｗｅｅｎ（登録商標）を含みうる。
【０１１２】
本発明のワクチンの標的対象は、好ましくは哺乳動物、例えばヒトまたは獣医学的に重要な哺乳動物である。該標的は健康であっても罹病していてもよく、ピロプラスミド寄生虫に関して又はピロプラスミド寄生虫に対する抗体に関して血清陽性または陰性でありうる。該標的対象は、該ワクチン接種に感受性である任意の年齢のものでありうる。
【０１１３】
本発明のワクチンの、より好ましい標的哺乳動物は、ウシ、ウマ、イヌおよびネコである。
【０１１４】
本発明のワクチンは、予防および治療に同等に使用することが可能であり、感染または疾患の臨床的症状の確立および／または進行を妨げる。
【０１１５】
したがって、本発明の１つの態様は、ピロプラスミド生物により引き起こされる感染またはその臨床的徴候の予防または治療のためのワクチンの製造のための、本発明の核酸配列、本発明のｃＤＮＡ断片、本発明の組換えＤＮＡ分子、本発明の生組換えキャリアーまたは本発明の宿主細胞の使用に関する。
【０１１６】
本発明のワクチンは、集団内の又は環境へのピロプラスミド感染の広がりを予防または軽減する。
【０１１７】
本発明のワクチンは、標的への所望の適用方法に応じて、いくつかの形態、例えば液体、ゲル剤、軟膏剤、散剤、錠剤またはカプセル剤でありうる。
【０１１８】
好ましくは、該ワクチンは、注射可能な液体の形態である。
【０１１９】
本発明のワクチンは、当技術分野で公知の方法（例えば、非経口適用、例えば皮膚内への又は皮膚を介した全ての注射経路、例えば筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内、粘膜下または皮下経路）により哺乳動物標的に投与することが可能である。実施可能なその他の適用経路としては、眼、鼻、口、肛門または膣の粘膜上皮への或いは任意の身体部分の外皮の表皮上への滴剤、噴霧剤、ゲル剤または軟膏剤としての局所適用；エアゾールまたは散剤としての噴霧によるものが挙げられる。あるいは、適用は、例えば散剤、液体または錠剤として食物、食餌または飲み水と一緒にすることによる、消化経路を介したもの、あるいは液体、ゲル剤、錠剤またはカプセル剤としての口内への又は坐剤としての肛門への直接的な投与によるものでありうる。
【０１２０】
好ましい適用経路は、筋肉内または皮下注射によるものである。
【０１２１】
言うまでもなく、最適な適用経路は、予防または改善しようとする寄生虫感染または臨床的疾患の具体的な個別性、使用するワクチン製剤の特性および標的種の個々の特性に左右されるであろう。
【０１２２】
標的哺乳動物への本発明のワクチンの適用の方式は１回量または複数回量によるものであることが可能であり、これらは、該投与量および製剤に適した方法および免疫学的に有効な量で、同時または連続的に投与することが可能である。
【０１２３】
本発明のワクチンは年１回の量で有利に適用される。
【０１２４】
好ましい実施形態においては、本発明のワクチンは、アジュバントを含むことを特徴とする。
【０１２５】
アジュバントは、一般には、標的の免疫応答を非特異的に増強する物質である。多種多様なアジュバントが当技術分野で公知である。アジュバントの具体例としては、フロイント完全および不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオンブロック重合体およびポリアミン、例えばデキストラン硫酸、カルボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）およびピランが挙げられる。サポニンも非常に適しており、好ましいアジュバントである。サポニンは、好ましくは、１０〜１０，０００μｇ／ｍｌのレベルでワクチンに加える。サポニンのなかでは、サポニンＱｕｉｌ  Ａ（登録商標）がより好ましいアジュバントである。サポニンおよびワクチン成分はＩＳＣＯＭＳ（ＥＰ  １０９，９４２、ＥＰ  １８０，５６４、ＥＰ  ２４２，３８０）において一緒にされうる。
【０１２６】
さらに、ペプチド、例えばムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、タフトシンがアジュバントとしてしばしば使用され、鉱油、例えばＢａｙｏｌ（登録商標）またはＭａｒｋｏｌ（登録商標）、植物油またはそのエマルションおよびＤｉｌｕｖａｃＦｏｒｔｅ（登録商標）が有利に使用されうる。
【０１２７】
言うまでもなく、アジュバント化、ビヒクル化合物もしくは希釈剤の添加またはワクチンの乳化もしくは安定化のための他の方法も本発明の範囲内である。そのような添加は、例えば、よく知られたハンドブック、例えば“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ”（２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ，ＵＳＡ，ＩＳＢＮ：６８３３０６４７２）および“Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ”（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｅｔら編，１９９７，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＩＳＢＮ  ０４４４８１９６８１）に記載されている。
【０１２８】
本発明のワクチンは、もう１つの抗原または免疫活性成分と有利に混合されうる。これは、そのコード化核酸の形態としても加えることが可能である。
【０１２９】
したがって、より好ましい実施形態においては、本発明のワクチンは追加的免疫活性成分、または該追加的免疫活性成分をコードする核酸を含むことを特徴とする。
【０１３０】
追加的免疫活性成分は抗原、免疫増強物質および／またはワクチンであり、これらはいずれも、アジュバントを含みうる。
【０１３１】
追加的免疫活性成分は、抗原の形態である場合には、ヒトの又は獣医学的に重要な任意の抗原性成分よりなりうる。それは、例えば、生物学的分子または合成分子、例えばタンパク質、炭水化物、リポ多糖、タンパク質性抗原をコードする核酸、または転写調節配列に機能しうる形で連結されたそのような核酸を含有する組換え核酸分子を含みうる。また、そのような核酸、組換え核酸分子またはそのような核酸を含有するＬＲＣを含む宿主細胞は、該核酸または追加的免疫活性成分を運搬するための手段となりうる。あるいは、それは、分画化または不活化微生物、例えば寄生虫、細菌またはウイルスを含みうる。
【０１３２】
追加的免疫活性成分は、免疫増強物質、例えばケモカイン、または免疫刺激性核酸、例えばＣｐＧモチーフの形態でありうる。あるいは、本発明のワクチン自体をワクチンに添加することが可能である。
【０１３３】
例えば、本発明のワクチンを、本発明のピロプラスミドタンパク質でも該タンパク質の免疫原性断片でもないバベシアサブユニットワクチンタンパク質の調製物と一緒にして、ピロプラスミド感染または関連臨床疾患徴候に対する混合サブユニットワクチンを得ることが可能である。
【０１３４】
あるいは、本発明のワクチンは、抗生物質、ホルモンまたは抗炎症薬のような医薬成分と有利に一緒にされうる。
【０１３５】
より一層好ましい実施形態においては、本発明のワクチンは、該追加的免疫活性成分または該追加的免疫活性成分をコードする核酸が、以下のものに感染性である生物から得られることを特徴とする：
イヌ：エールリキア・カニス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ）、バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉ）、バベシア・ボゲリ（Ｂ．ｖｏｇｅｌｉ）、バベシア・ロッシ（Ｂ．ｒｏｓｓｉ）、リーシュマニア・ドノバニ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ）複合体、イヌパルボウイルス、イヌジステンパーウイルス、レプトスピラ・インテルロガンス・セロバルス・キャニコラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ  ｓｅｒｏｖａｒｓ  ｃａｎｉｃｏｌａ）、イクテロヘモラジエ（ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）、ポモナ（ｐｏｍｏｎａ）、グリッポチホサ（ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）、ブラチスラバ（ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）、イヌ肝炎ウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ヘパトゾーン・カニス（Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎ  ｃａｎｉｓ）およびボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、
ウシ：ウシヘルペスウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、パラインフルエンザ３型ウイルス、ウシパラミクソウイルス、口蹄疫ウイルス、パスツレラ・ヘモリチカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、ウシＲＳウイルス、タイレリア種（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ｓｐ．）、バベシア種（Ｂａｂｅｓｉａ  ｓｐ．）、トリパノゾーマ種（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｓｐ．）、アナプラスマ種（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｓｐ．）、ネオスポラ・カニヌム（Ｎｅｏｓｐｏｒａ  ｃａｎｉｎｕｍ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびストレプトコッカス・ジスガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、ならびに
ウマ：ストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、ストレプトコッカス・ズーエピデミクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、コリネバクテリウム・シュードツベルクローシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、シュードモナス・マレイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｌｅｉ）、アクチノバシラス・エクイリ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｑｕｉｌｉ）およびパスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ポトマック熱因子（Ｐｏｔｏｍａｃ  ｆｅｖｅｒ  ａｇｅｎｔ）、クロストリジウム・テタニイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉｉ）、マイコバクテリウム・シュードマルレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、水疱性口炎ウイルス、ボルナ病ウイルス、ウマインフルエンザウイルス、アフリカ馬疫ウイルス、ウマ動脈炎ウイルス、ウマヘルペスウイルス１〜４、伝染性貧血ウイルス、ウマ脳脊髄炎ウイルスおよびＢ型日本脳炎ウイルス。
【０１３６】
本発明のピロプラスミドタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片、本発明の核酸、ｃＤＮＡ、組換え分子、生組換えキャリアーおよび／または宿主細胞は、ピロプラスミドタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片に対する特異的抗体の効率的製造を初めて可能にするものである。これは、本発明のワクチンを、マーカーワクチンとして適したものにする。なぜなら、それは、当技術分野で公知の方法により寄生虫感染哺乳動物標的と寄生虫ワクチン接種哺乳動物との間の識別を可能にするからである。
【０１３７】
あるいは、これらの特異的抗体を、いわゆる「受身ワクチン接種」のためのワクチン自体として使用することが可能である。
【０１３８】
したがって、本発明のもう１つの態様は、本発明のタンパク質に対する抗体もしくは該タンパク質の免疫原性断片に対する抗体またはそれらの組合せと製薬上許容される担体とを含むことを特徴とするワクチンに関する。
【０１３９】
該抗体は天然由来または合成由来でありうる。該抗体は抗血清または精製抗体の形態でありうる。そのような精製抗体は発現系から有利に得られうる。
【０１４０】
本発明の抗体の大規模製造のための方法も当技術分野で公知である。そのような方法は、ファージディスプレイのための線維状ファージにおける本発明のタンパク質をコードする遺伝情報の（断片の）クローニングに基づく。そのような技術は、とりわけ、ｈｔｔｐ：／／ａｘｉｍｔ１．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／〜ｒｅｋ／ａｅｐｐｈａｇｅ．ｈｔｍｌ．における“ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ”の“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐａｇｅ”、およびＣｏｒｔｅｓｅ，Ｒ．ら，（１９９４），Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．，ｖｏｌ．１２，ｐ．２６２−２６７、Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．＆  Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．（１９９４），Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．，ｖｏｌ．１２，ｐ．１７３−１８３、Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら，（１９９２），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２６７，ｐ．１６００７−１６０１０、Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ら，（１９９４），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１２，ｐ．４３３−４５５、およびＬｉｔｔｌｅ，Ｍ．ら，（１９９４），Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．Ａｄｖ．，ｖｏｌ．１２，ｐ．５３９−５５５の総説に記載されている。
【０１４１】
ついで該ファージを使用して、ラクダ科動物重鎖抗体を発現するラクダ科動物発現ライブラリーをスクリーニングする（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｓ．およびＬａｕｗｅｒｅｙｓ，Ｍ．，Ｊｏｕｒｎ．Ｍｏｌｅｃ．Ｒｅｃｏｇｎ．，ｖｏｌ．１２，１３１−１４０（１９９９）ならびにＧｈａｈｒｏｕｄｉ，Ｍ．Ａ．ら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．４１４，ｐ．５１２−５２６（１９９７））。所望の抗体を発現するライブラリーからの細胞を増殖させ、ついで抗体の大規模発現に使用することが可能である。
【０１４２】
抗原に対する抗体で「負荷（ｌｏａｄｅｄ）」された該抗原のワクチンにおける組合せは当技術分野においては「複合」ワクチンとして公知である。本発明のそのようなワクチンは有利に使用されうる。
【０１４３】
例えば安定性または経済性の理由により、本発明のピロプラスミドタンパク質もしくは該タンパク質の免疫原性断片、または本発明の核酸、ｃＤＮＡ、組換え分子、生組換えキャリアー、宿主細胞もしくはワクチンを凍結乾燥することが可能である。一般に、これは、０℃を超える温度（例えば、４℃）での貯蔵期間の延長を可能にする。
【０１４４】
凍結乾燥のための方法は当業者に公知である。種々の規模での凍結乾燥のための装置が商業的に入手可能である。
【０１４５】
したがって、最も好ましい実施形態においては、本発明のワクチンは、該ワクチンが凍結乾燥形態であることを特徴とする。
【０１４６】
凍結乾燥ワクチンを還元（再構成）するためには、それを、生理的に許容される希釈剤に懸濁させることが可能である。そのような希釈剤は、例えば、無菌水または生理塩溶液のような単純なものでありうる。より複雑な形態においては、ＰＣＴ／ＥＰ９９／１０１７８に記載されているとおり、それをエマルションとして懸濁させることが可能である。
【０１４７】
本発明の更にもう１つの態様は、本発明のタンパク質もしくは該タンパク質の免疫原性断片、本発明の核酸、ｃＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子、生組換えキャリアーもしくは宿主細胞またはそれらの組合せと製薬上許容される担体とを混合することを含む、本発明のワクチンの製造方法に関する。
【０１４８】
本発明の更にもう１つの態様は、本発明のタンパク質に対する抗体もしくは該タンパク質の免疫原性断片に対する抗体またはそれらの組合せと製薬上許容される担体とを混合することを含む、本発明のワクチンの製造方法に関する。
【０１４９】
前記のとおり、本発明の方法により入手可能なワクチンは、予防または治療に同等に使用することが可能であり、感染またはその臨床的疾患徴候の確立および／または進行を妨げる。
【０１５０】
したがって、本発明のもう１つの態様は、ピロプラスミド生物により引き起こされる感染またはその臨床的徴候の予防または治療のためのワクチンの製造のための、本発明のタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片の使用に関する。
【０１５１】
また、本発明のもう１つの態様は、配列番号１、３、５、７または９に対して少なくとも７０％、好ましくは７５％、より好ましくは８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％（その順で好ましくなる）類似している核酸または該核酸に相補的な核酸を含み、該核酸のいずれもが、少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは１７、より好ましくは１８、１９、２０、２４、２８、３２、３５または４０ヌクレオチド（その順で好ましくなる）の長さである、ピロプラスミド生物に関連した核酸の検出のための診断試験に関する。
【０１５２】
本発明の更にもう１つの態様は、本発明のタンパク質もしくは該タンパク質の免疫原性断片またはそれらの組合せを含む、ピロプラスミド生物に対する抗体の検出のための診断試験に関する。
【０１５３】
例えば、ＢＩＩＡ１もしくはＢＩＩＡ２またはそれらのいずれかの免疫原性断片を固相担体に結合させ、これを被検サンプルと共にインキュベートし、洗浄し、結合抗体の存在を検出する。好ましい診断方法はＥＬＩＳＡによるものである。
【０１５４】
本発明の更にもう１つの態様は、本発明のタンパク質に対する抗体もしくは該タンパク質の免疫原性断片に対する抗体またはそれらの組合せを含むことを特徴とする、ピロプラスミド生物からの抗原性物質の検出のための診断試験に関する。
【０１５５】
例えば、ＢＩＩＡ１もしくはＢＩＩＡ２またはそれらのいずれかの免疫原性断片に対する抗体を固相担体に結合させ、これを被検サンプルと共にインキュベートし、洗浄し、結合タンパク質の存在を検出する。好ましい診断方法はＥＬＩＳＡによるものである。
【０１５６】
以下の非限定的な実施例により、本発明を更に詳しく説明することとする。
【０１５７】
（実施例）
【実施例１】
【０１５８】
１．１  用いた技術
１．１．１．Ｂ．ｂｏｖｉｓインビトロ培養
バベシア・ボビス（Ｂ．ｂｏｖｉｓ）イスラエル分離体（クローン系Ｃ６１４１１）を、既に記載されているとおりに（Ｌｅｖｙ  ＆  Ｒｉｓｔｉｃ  １９８０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２０７，ｐ．１２１８−１２２０）インビトロで培養した。簡潔に説明すると、４０％  ウシ血清（成体ドナーウシ由来）、５０μｇｍｌ−１  ゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、２５ｍＭ  炭酸水素ナトリウムおよびウシ赤血球（５％  パック細胞容積（ＰＣＶ））と共に培地Ｍ１９９（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を含有する２４ウェルプレート（全容量１．２ｍｌ）または２５ｃｍ２  ボトル（全容量１５ｍｌ）内にバベシア・ボビス培養物を維持した。培養物を３７℃、空気中の５％  ＣＯ２中でインキュベートし、寄生虫血症を毎日の希釈により１％〜１２％に維持した。
【０１５９】
空気中の５％  ＣＯ２ではなく９０％  Ｎ２、５％  Ｏ２で培養物を維持すること以外はクローン系Ｃ６１４１１（イスラエル分離体）に用いたのと同じプロトコールで、バベシア・ボビス（Ｂ．ｂｏｖｉｓ）メキシコ分離体（クローン系Ｃ９．１）を培養した。
【０１６０】
１．１．２．Ｂ．ｂｏｖｉｓゲノムライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーの構築
λＺＡＰ−ｃＤＮＡ（登録商標）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を該製造業者の指示に従い使用して、５μｇのバベシア・ボビス（Ｂ．ｂｏｖｉｓ）ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを構築した。０．５〜４ｋｂのｃＤＮＡ断片をセファロースＣＬ４Ｂカラム上のゲル濾過により集め、λｕｎｉＺＡＰ−ＸＲ  ＥｘｐｒｅｓｓベクターのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位内に連結した。Ｇｉｇａ  ｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄを使用してファージ粒子のパッケージングを行い、ついで大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＸＬ−１  ＢｌｕｅＭＲＦ’細胞の形質転換を行った。１．２×１０６個のプラークを得、その増幅ライブラリーを作製した。
【０１６１】
ＥＳＴデータセットを確立するために、該プレート化ｃＤＮＡライブラリーから自動的にランダムに選択した１５０００個のｃＤＮＡクローンに関して、１回の配列決定を行った。このＥＳＴデータセットから、１２８９２個の高品質配列（４７６ｂｐの平均長）よりなるデータベースを構築した。
【０１６２】
該ゲノムライブラリーを構築するために、６００μｇのバベシア・ボビスＤＮＡをＥｃｏＲＩ（１５０単位または２５０単位）で３７℃で１時間部分消化した。消化されたＤＮＡをセファロースＣＬ−４Ｂカラム上でサイズ分画した。０．５ｋｂ〜８ｋｂの断片をλ−ＺＡＰＩＩ−ＥｘｐｒｅｓｓのＥｃｏＲＩ部位内に連結し、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇエクストラクトを使用してパッケージングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’コンピテント細胞内に形質転換した。２．５×１０６個のプラークを得、その増幅ライブラリーを作製した。
【０１６３】
ＢＩＩＡ１またはＢＩＩＡ２に特異的なプライマーを使用するＰＣＲにより得たプローブで、該ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
【０１６４】
１．１．３．ＢＩＩＡ１およびＢＩＩＡ２の遺伝子に関するＢ．ｂｏｖｉｓゲノムライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ＰＣＲにより作製した特異的プローブで、ＢＩＩＡ１およびＢＩＩＡ２の遺伝子のクローンを単離するために、該バベシア・ボビス（Ｂ．ｂｏｖｉｓ）ゲノムライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。使用した特異的プライマーは以下のとおりであった：
ＢＩＩＡ１遺伝子の場合：
【０１６５】
【化１】
2007527707.tif 000003
【０１６６】
ＢＩＩＡ２遺伝子の場合：
【０１６７】
【化２】
2007527707.tif 000004
【０１６８】
標準的なバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、２０ｐｍｏｌ／μｌの各プライマー、１００ｎｇのバベシア・ボビス全ゲノムＤＮＡおよび０．５Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含有する５０μｌ容量中でのＰＣＲにより、バベシア・ボビスのＥＳＴデータベースからのクローンからの断片を増幅するために、両方のプライマーペアを使用した。ＢＩＩＡ１プローブに関しては９２℃で３０秒間、５８℃で３０秒間および７２℃で３０秒間の条件、ＢＩＩＡ２プローブに関しては９５℃で１分間、５８℃で１分間および７２℃で１０分間の条件で、３０サイクルの増幅を行った。これらのサイクルの前に、９５℃で３分間の初期変性を行い、最終伸長は７２℃で１０分間行った。
【０１６９】
両方のプローブをアガロースゲルから精製し、Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ標識キット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して５０μＣｉ  ３２Ｐ−ｄＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）で標識した。ＢＩＩＡ１  ｃＤＮＡのクローニングの場合には、合計４．１０６個のｃＤＮＡおよび４．１０５個のゲノムＤＮＡライブラリープラークを標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，前掲）によりスクリーニングし、一方、ＢＩＩＡ２  ｃＤＮＡのクローニングの場合には、５．１０５個のｃＤＮＡおよび同数のゲノムＤＮＡライブラリープラークをスクリーニングした。２サイクルのプラーク精製の後、製造業者の説明書（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に記載されているとおりに、ファジミドインサートの単離のために、すべてのクローンをインビボで切り出し、ダイターミネーター法（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）ダイターミネーターキット，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と共に自動サイクルシークエンシングを用いて、両鎖上で配列決定した。
【０１７０】
完全長ＢＩＩＡ１およびＢＩＩＡ２  ｃＤＮＡを得るために、５’−ＲＡＣＥ（ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）キット，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｌ１５０２−０１）を該製造業者の指示に従い使用して非コード化５’末端を同定した。得られた完全長クローンをｐＣＲ２．１クローニングプラスミド内に挿入し、前記のとおりに両鎖上で配列決定した。得られた配列を配列番号１（ＢＩＩＡ１）および配列番号５（ＢＩＩＡ２）に示す。
【０１７１】
１．１．４．大腸菌内での組換えＢＩＩＡ１の発現
ＢＩＩＡ１およびＢＩＩＡ２のクローンをｐＣＲ２．１クローニングプラスミドからＰＣＲによりサブクローニングした。
【０１７２】
ＢＩＩＡ１のサブクローニングに使用したプライマーは以下のとおりであった。
【０１７３】
【化３】
2007527707.tif 000005
【０１７４】
ＢＩＩＡ１に関するこれらのプライマーは塩基１（開始コドンの第１塩基からの番号づけ）の前にＢａｍＨＩ制限酵素部位を導入し、塩基１５０４の後にＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入した。
【０１７５】
ＢＩＩＡ２のサブクローニングに使用したプライマーは以下のとおりであった。
【０１７６】
【化４】
2007527707.tif 000006
【０１７７】
ＢＩＩＡ２に関するこれらのプライマーはＥｃｏＲＩ部位およびＳａｌＩ部位を導入した。
【０１７８】
ＰＣＲ（９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間の３０サイクル）の後、該断片をゲル精製し、ｐＥＴ−３２ａベクターにアニールさせ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮｏｖａＢｌｕｅ（登録商標）株内への形質転換に使用した。適当なインサートを含有するプラスミドを使用して、発現宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）内に形質転換した。誘導の０時間後および４時間後の全細胞サンプルの分析により示されるとおり、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ  チオガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）での３７℃で４時間の誘導の後、チオレドキシンとの融合タンパク質が最高収率で得られた。細菌ペレットを、２％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノールを含有するＳＤＳ−ポリアクリルアミド（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）サンプルバッファー中、９５℃で煮沸し、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲル上で泳動させ、クーマシーブリリアントブルーで染色して発現を確認した（図１および２）。
【０１７９】
１．１．５．ペプチド選択および単一特異性抗血清の作製
ＢＩＩＡ１およびＢＩＩＡ２遺伝子を完全に配列決定した後、試験動物の免疫化による特異的ポリクローナル抗体の誘導のために、コンピューター翻訳配列からペプチドを選択した。
【０１８０】
良好な表面確率（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）を有し荷電α両親媒性領域を含有するペプチド領域を選択するために、ＤＮＡ  Ｓｔａｒ（登録商標）の配列解析プログラムＰｒｏｔｅａｎを使用した。
【０１８１】
ＢＩＩＡ１から選択されたペプチド（配列番号２）は以下のとおりであった。
【０１８２】
【表１】
2007527707.tif 000007
【０１８３】
ＢＩＩＡ２から選択されたペプチド（配列番号６）は以下のとおりであった。
【０１８４】
【表２】
2007527707.tif 000008
【０１８５】
該ペプチドの合成後、それらを担体タンパク質、すなわち、マレイミド活性化キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ；７７６０５）に該製造業者の指示に従い結合させた。ウサギポリクローナル抗血清を作製するために、該ペプチド−担体結合体を使用した。
【０１８６】
その目的には、３群のＮＺＷウサギ（各群は２羽のウサギを含有）の皮下に、連続的な免疫化の間に３週の間隔をあけて５回免疫化した。免疫化の前に、各ウサギの血清を集め、それを陰性対照として使用した。等容量のアジュバントＳｔｉｍｕｎｅ（登録商標）（ＩＤ−ＤＬＯ，Ｌｅｌｙｓｔａｄ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中に取り込まれたＫＬＨに結合した２５０μｇのペプチドを各ウサギに注射した。各ウサギに注射した全容量は１０００μｌであった。血清を反応性に関してＥＬＩＳＡにより定期的に試験した。最終免疫化の１週間後に血漿瀉血を行い、血清を集めた。
【０１８７】
１．１．６．ＥＬＩＳＡ
抗体応答をＥＬＩＳＡにより評価した。９６ウェルマイクロタイタープレートを１ウェル当たり１５０ｎｇのペプチド１またはペプチド２でコートし、３７℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ／ＢＳＡで１時間ブロッキングした。個々のウサギ血清の連続希釈物（１：５０〜１：５０，０００）を３７℃で１時間インキュベートした。該プレートを洗浄し、１：２０００希釈ブタ抗ウサギＨＲＰ結合二次抗体を１時間インキュベートした。該プレートを洗浄し、ＡＢＴＳ［２，２’−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸）］−ペルオキシダーゼ基質（Ｒｏｃｈｅ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で４５分間現像した。ＯＤ４０５を記録し、比較ＥＬＩＳＡ力価を計算した。
【０１８８】
１．１．７．免疫蛍光アッセイ
ＢＩＩＡ１およびＢＩＩＡ２からのペプチドに対する抗血清によるバベシア・ボビス（Ｂ．ｂｏｖｉｓ）メロゾイトの認識を間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）により試験した。薄い血液塗抹標本を冷却メタノールで固定した。ポリクローナルウサギ抗ＢＩＩＡ１（１：４０）またはポリクローナルマウス抗ＢＩＩＡ１（１：５〜１：１６０）の存在下の３０分間の一次インキュベーションの後、５分間の３回の洗浄工程を行った。スライドを１：８０ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）フルオレセインイソチオシアナート標識抗体（Ｎｏｒｄｉｃ）と共に３０分間インキュベートした。該スライドを再び洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（登録商標）溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を適用し、対象をカバーグラスで覆い、ＦＩＴＣフィルター（４５０〜４８０／５１５〜５６５ｎｍ）を伴うＵＶ蛍光顕微鏡上で可視化した。１：５に希釈された陰性免疫前血清と比較して、該寄生虫の陽性認識を伴う最終血清希釈度として、ＩＦＡ力価を測定した。
【０１８９】
１．１．８．全メロゾイトタンパク質抽出物および侵入に際して可溶化されるタンパク質の調製
インビトロ侵入のために前記のとおりに調製したメロゾイトのサンプル８００μｌを１．２μＭ  ポリプロピレンプレフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＡＮ１２０２５００）上の濾過により赤血球ゴーストから部分的に分離した。濾過されたメロゾイトをプールし、２５ｍＭ  炭酸水素ナトリウムを含有する２０容量のＰＢＳ（ｐＨ８．０）中で２回洗浄し、ついで２０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。２回目の洗浄の後、ペレットを等容量のＰＢＳ（ｐＨ８．０）に再懸濁させ、２００μｌのアリコートに分割し、これらを遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃で５分間）し、上清除去後、１００μｌの細胞ペレット（２×１０９  メロゾイト）として−２０℃で保存した。凍結したメロゾイトペレットを使用直前に解凍し、細胞溶解し、還元し、アルキル化し（Ｐｒｏｔｅｏｐｒｅｐ（登録商標）膜抽出キット（Ｓｉｇｍａ）を該製造業者の指示に従い使用することにより行った）、最終的に、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルまたは等電点電気泳動（ＩＥＦ）ストリップへの直接適用に適した１．７ｍｌのバッファー中に得た。不溶性物質を１６，０００×ｇ、４℃で３分間の遠心分離により除去した。タンパク質濃度をブラッドフォード法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７６，ｖｏｌ．７２，ｐ．２４８−２５４）により測定した。該抽出物は相当な量の赤血球タンパク質を含有していたため、未感染赤血球の培養から開始すること以外は同じ方法で対照抽出物を調製した。
【０１９０】
前記のとおりに１時間のインビトロ侵入の後に上層バッファーを穏やかに除去することにより、侵入に際して可溶化されるタンパク質を得た。該サンプルを遠心分離（２０００×ｇ、１０分間、４℃）し、ついでペレット（これは視認できない）を廃棄し、膜断片の除去のために上清を高速で再び遠心分離した（２０分間、１２，０００×ｇ、４℃）。最終上清を１０ｍＭ  ＫＨＰＯ４（ｐＨ７．５）に対して一晩透析（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｓｎａｋｅｓｋｉｎ（登録商標）襞付き透析管，６８０３５）した。透析バッファー中で平衡化された６．５ｍｌのＤＥＡＥセファロース高速流（ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に５０ｍｌの透析上清を回転プラットフォーム上で４℃で９０分間インキュベートすることにより、残留ヘモグロビンをバッチ式で除去した。該懸濁液を３０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、ついで５０ｍｌの透析バッファーの添加により該ＤＥＡＥセファロースを４回洗浄し、ついで３０００×ｇ、４℃で５分間の遠心分離を行った。結合タンパク質を６ｍｌの溶出バッファー（３５０ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  ＫＨＰＯ４，ｐＨ７．５）の添加および５分間のインキュベーションにより溶出し、ついで３０００×ｇ、４℃で５分間の遠心分離に付した。上清を濃縮し、１０ｋＤａフィルター（ＹＭ−１０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で脱塩した。
【０１９１】
１．１．９．ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動およびウエスタンブロット法
タンパク質をβ−メルカプトエタノールの存在下または非存在下で分解（ｒｅｓｏｌｖｅ）し、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（商標）−Ｐメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気泳動的にトランスファーした。該ブロットを、０．５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳＴ）中で希釈された５％  脱脂乳で３７℃で１時間ブロッキングした。ＰＢＳＴ中の２％  脱脂乳中の一次抗体の適当な希釈物（１：５００）を１時間一晩インキュベートした。該ブロットをＰＢＳＴで洗浄し、ついで抗ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体（ＤＡＫＯ）の１：１０，０００希釈物と共に３７℃で１時間インキュベートした。該ブロットを、ＰＢＳＴで洗浄した後、ＴＭＢ  ＭＢ基質キット（Ｌｕｃｒｏｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＢＶ；ＫＰＬ  ５０−７７−００）または増強化学発光（ＥＣＬ）＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ；ＲＰＮ２１３２）で現像した。
【０１９２】
１．１．１０．等電点電気泳動（等電点フォーカシング）
全メロゾイト抽出物、侵入上清およびＢＩＩＡ１タンパク質サンプルを再水和溶液（７Ｍ  尿素，２Ｍ  チオ尿素，４％  ＣＨＡＰＳ，２％  担体両性電解質混合物  ｐＨ４−７ＮＬ（ＩＰＧバッファーおよび２０ｍＭ  ＤＴＴ））に再懸濁させた。担体両性電解質混合物ｐＨ３−１０ＮＬを使用して、ＢＩＩＡ２タンパク質サンプルを一次元で分離した。特に示さない限り、使用したＩＥＦ装置、ＩＰＧゲルおよび試薬はＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのものであった。３５μｇの全メロゾイトタンパク質または３５μｇの侵入上清およびプロテアーゼインヒビター（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ，Ｒｏｃｈｅ）を７ｃｍのストリップ（ｐＨ４−７ＮＬ）上にローディングした。１３ｃｍのストリップには、１５０μｇの全メロゾイトタンパク質または１５０μｇの侵入上清をローディングした。ストリップを再水和（１０〜１４時間）させ、自動運転［３００Ｖで１分間、９０分間（この間に３５００Ｖまで電圧を上昇させる）、ついで３５００Ｖで連続的フォーカシング、合計３５〜４０ｋＶｈ、ＩＰＧＰｈｏｒ（商標）上］で一晩（１４〜１７時間）フォーカシングを行った。
【０１９３】
等電点電気泳動後、３０ｍＭ  ＤＴＴ（使用前に新たに添加する）を含有する１０ｍｌのＳＤＳ平衡化バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，６Ｍ  尿素，２％  ＳＤＳ，３０％  グリセロール，ｐＨ８．８）中で各ストリップを１５分間平衡化することにより、該タンパク質を還元しＳＤＳに結合させた。タンパク質の再酸化を防ぎシステイン残基の反応を最小にするために、ジチオトレイトールの代わりに２．５％  ヨードアセトアミド（同様に新たに添加する）を含有するＳＤＳ平衡化バッファー中での第２の平衡化工程を行った。
【０１９４】
二次元ＳＤＳゲル電気泳動をＨｏｅｆｅｒ  ＳＥ６００系において行った。二次元電気泳動後、銀染色を用いてタンパク質を可視化した。Ｕｍａｘフラットベッドスキャナー上でＬａｂＳｃａｎ（登録商標）ｖ３．０ソフトウェアを使用して、該ゲルのイメージを得、ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ（登録商標）２Ｄ  ｖ３．０１ソフトウェア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、それを解析した。免疫ブロット法のために、７ｃｍストリップ上のタンパク質を１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、または１３ｃｍストリップを二次元タンパク質ゲル上で分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（商標）−Ｐメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ＩＰＶＨ０００１０）にトランスファーした。二次元ブロットのための後続の操作は一次元ブロットの場合と同じであった。
【０１９５】
１．１．１１．Ｂ．ｂｏｖｉｓインビトロ侵入アッセイ
既に記載されている方法（Ｆｒａｎｓｅｎら  ２００３，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．ｖｏｌ．５，ｐ．３６５−３７２）に若干の変更を加えた方法により、侵襲（侵入）を行った。６〜８％  寄生虫血症のバベシア・ボビス（Ｂ．ｂｏｖｉｓ）感染赤血球を２０００×ｇ、１５℃で１０分間遠心分離し、等容量のＶｙＭｓバッファー（Ｖｅｇａ  ＆  Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｆｒａｎｓｅｎ，前掲を参照されたい）に再懸濁させた。パルスコントローラーと共にＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）を使用して、８００μｌのサンプルを、４ｍｍ  ＢｉｏＲａｄキュベット（１６５−２０８８）中、５個の間欠（パルス間に１０秒、０℃）高電圧パルス（２．５ｋＶ、２００Ω、２５μＦ）に付した。
【０１９６】
２５ｍＭ  炭酸水素ナトリウムを含有する８ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ８．０、２０℃）をそれぞれの８００μｌのサンプルに加え、ついで１５℃で１０分間遠心分離（１８００×ｇ）を行った。遠心分離を１３００×ｇで行うこと以外は同じである第２の洗浄を行い、ついでメロゾイトペレットを、２５ｍＭ  炭酸水素ナトリウムを含有する８００μｌのＰＢＳ（ｐＨ８．０、２０℃）に再懸濁させた。１容量の再懸濁メロゾイトを９容量の懸濁ウシ赤血球（空気中のＣＯ２中、３７℃で３０分間プレインキュベートした、２５ｍＭ  炭酸水素ナトリウムを含有するＰＢＳ（ｐＨ８．０）中の５．５％  ＰＣＶ）に加えることにより、侵入を開始させ、それを２４ウェルプレート（最終容量１．２ｍｌ）、２５ｃｍ２フラスコ（１５ｍｌ）または８０ｃｍ２フラスコ（５０ｍｌ）内で空気中の５％  ＣＯ２中、３７℃で行った。１時間後にギームザ染色スライドを調製し、合計５０００個の赤血球からの寄生虫感染赤血球を計数した。
【０１９７】
１．１．１２．ポリクローナルウサギ抗血清による、侵入のインビトロ抑制
前記のとおりに高電圧パルスにより放出され２５ｍＭ  炭酸水素ナトリウム含有ＰＢＳ（ｐＨ８．０）に再懸濁された２００μｌのバベシア・ボビス（Ｂ．ｂｏｖｉｓ）メロゾイトを４０μｌのウサギ抗血清と共に２０℃で１時間インキュベートした。１時間後、９６０μｌの懸濁ウシ赤血球（空気中のＣＯ２中、３７℃で３０分間プレインキュベートした、２５ｍＭ  炭酸水素ナトリウムを含有するＰＢＳ（ｐＨ８．０）中の６．２５％  ＰＣＶ）を加え、１時間のインキュベーションを行い、ついでギームザ染色スライドを調製し、計数して侵入レベルを測定した。使用したウサギ抗血清は、ＢＩＩＡ２およびＢＩＡ２アミノ酸配列に由来する合成ペプチドに対して産生させたものであり、対照血清は、無関係な対照ペプチド（ＹＡＧＲＬＦＳＫＲＴＡＡＴＡＹＫＬＱ）に対して産生させたものであった。ペプチドは、免疫化の前にキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に連結されていた。免疫前血清も該試験に含めた。
【０１９８】
１．２．実施例１の結果
１．２．１．ＢＩＩＡ１およびＢＩＩＡ２をコードする完全長ｃＤＮＡの同定およびクローニング
ＰＣＲプローブ（ＢＩＩＡ１に関しては３５０ｂｐおよびＢＩＩＡ２に関しては４５０ｂｐ）でのバベシア・ボビス（Ｂ．ｂｏｖｉｓ）ｃＤＮＡライブラリーのプロービングは、ＢＩＩＡ１に関しては２１８１ｂｐおよびＢＩＩＡ２に関しては２３８５ｂｐのｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定をもたらした。どちらもオープンリーディングフレームと、ポリＡ尾部で終結する３’非コード領域とを含有していた。完全長ｍＲＮＡの５’キャップ化末端を決定するために、全ｍＲＮＡを脱リン酸化し、ついで５’キャップ（これは無傷のまま残っている）をタバコ酸ピロホスファターゼにより除去し、ついで特異的ＲＮＡオリゴヌクレオチドの連結を行った。ついで第１鎖ｃＤＮＡ上のネスティッドＰＣＲは、ＢＩＩＡ１およびＢＩＩＡ２に関するバベシア・ボビスｍＲＮＡの５’末端に相当する断片のクローニングおよび配列決定を可能にした。
【０１９９】
ＢＩＩＡ１の１８１５ｂｐのＯＲＦのコンピューターによる翻訳は６７．２ｋＤａのタンパク質を予測し、ＢＩＩＡ２に関する１９６５ｂｐのＯＲＦの翻訳は６５．６ｋＤａのタンパク質を予測した。
【０２００】
１．２．２．導かれたペプチドに対する抗血清による組換えＢＩＩＡ１およびＢＩＩＡ２の認識
ＢＩＩＡタンパク質に関する更なる研究を可能にするために、ウサギをＫＬＨ結合合成ペプチド１−６（前掲）で免疫した。すべての抗血清は、チオレドキシンと、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１細胞内で発現されたＢＩＩＡタンパク質の部分との組換え融合産物を特異的に認識した（図１および２）。ＩＰＴＧでの誘導の前（レーン１）および後（レーン２）の全細胞ライセートのポリアクリルアミドゲル電気泳動は、ＢＩＩＡ１およびＢＩＩＡ２に関する組換え融合産物を同定した。Ｒｅｃ  ＢＩＩＡ１およびＢＩＩＡ２は共に、免疫ブロット上で全３個の免疫血清によっては認識されるが（レーン、５、８、１１）、免疫前血清（レーン６，９，１２）によっては認識されない。免疫認識は対照タンパク質としての該融合産物のＢＩＩＡ部分には特異的であった。ＰＥＴ３２ａにおいて発現されたバベシア・ボビスｒａｂ５（レーン３、Ａｓｐ−５〜Ｌｙｓ−２０８，ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号３２４１３７．１）の組換え融合産物はこれらの血清によっては認識されなかった（レーン７、１０、１３）。また、免疫認識はペプチド特異的であり、ＢＩＩＡ１にもＢＩＩＡ２にも無関係なＫＬＨ結合合成ペプチドに対して産生した抗血清としての免疫化に使用したＫＬＨ担体タンパク質により誘導された抗体はＢＩＩＡ１組換え融合産物を認識しなかった（レーン１３）。
【０２０１】
１．２．３．免疫蛍光顕微鏡検査
寄生虫内のＢＩＩＡタンパク質を局在化するために、ＢＩＩＡ１およびＢＩＩＡ２の６個のＫＬＨ結合ペプチドに対するウサギ抗血清を使用する免疫蛍光研究を、メタノール固定によりガラススライドに付着したバベシア・ボビス（Ｂ．ｂｏｖｉｓ）インビトロ培養上で行った（図３および４）。免疫前血清（パネルＡ、Ｃ、Ｅ）の存在下のインキュベーションは、感染赤血球および未感染赤血球に由来するかすかな蛍光のバックグラウンドシグナルを超えるいずれの特異的寄生虫染色をも与えなかった。これとは対照的に、免疫血清は、検査したいずれの顕微鏡視野においても、寄生虫の特異的染色を与えた（パネルＢ、Ｄ、Ｆ）。蛍光寄生虫は１：５の希釈度の全３個のペプチドに対する抗血清で検出可能であった。赤血球内バベシア・ボビス寄生虫および遊離メロゾイトは小さい（±１×２μｍ）が、最大倍率は染色パターンの明瞭な可視化を可能にした。
【０２０２】
１．２．４．ペプチド特異的抗血清によるインビトロ侵入の抑制
１時間の時間範囲内の無タンパク質バッファー中の遊離メロゾイトによる赤血球への侵入の研究を可能にするバベシア・ボビス（Ｂ．ｂｏｖｉｓ）インビトロ侵入アッセイを用いて、ＢＩＩＡ１およびＢＩＩＡ２の異なるドメインに由来する６個のペプチドに対する抗血清の効果を評価した。抗ペプチド抗血清と共に、および無関係なペプチドに対する対照血清と共に、遊離メロゾイトを２０℃で１時間プレインキュベートし、ついで赤血球の添加により侵入を開始させた。ＢＩＩＡペプチドに対するすべての抗血清は侵入の有意な抑制を引き起こしたが、免疫前血清および対照抗血清は侵入効率に対する有意な効果を示さなかった（図５および６）。ＢＩＩＡ１に関しては、ペプチド１に対する抗血清により、最強の効果（６５±１０％の侵入抑制）が観察された。ＢＩＩＡ２に関しては、ペプチド４に対する抗血清により、最強の効果（７０±１０％の侵入抑制）が観察された。
【０２０３】
１．２．５．二次元ゲル上でのＢＩＩＡタンパク質のマッピング
ＢＩＩＡ１およびＢＩＩＡ２が赤血球への侵入中に可溶性タンパク質として媒体内に露出されるようになり、したがって、前記のＳＰＡの一部を構成するのかどうかを判定するために、侵入上清の免疫ブロット法を行った。ＢＩＩＡ１およびＢＩＩＡ２を二次元免疫ブロット上で局在化した。５０μｇの濃縮侵入上清を等電点電気泳動およびそれに続くＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。タンパク質をＰＶＤＦメンブレン上にブロットした。切り出したメンブレン部分（４５〜９０ｋＤａ）をペプチド１または３に対する抗ＢＩＩＡ１ペプチド抗血清と共に（図７、それぞれパネルＡおよびＣ）、およびペプチド４および６に対する抗ＢＩＩＡペプチド抗血清と共に（図８、それぞれパネルＡおよびＣ）インキュベートした。どちらのタンパク質に関しても、ペプチド１および４に対する抗体は同一特異的スポットに結合し（矢印）、それに加えて、対照ブロット上にも存在するタンパク質の特異的染色に結合した。これらは、同一条件下であるがメロゾイトの非存在下で調製した未感染赤血球（ＲＢＣ）の上清から調製されたものであった（図７および８、パネルＢおよびＤ）。ついで、免疫ブロット法により局在化されたスポットを、侵入前に３５Ｓ−Ｍｅｔで代謝標識した寄生虫を使用する平行実験から得た類似サンプルの銀染色二次元タンパク質ゲルと符合させた。図９は、赤血球タンパク質としてバベシア・ボビスのタンパク質のみを示すフィルムへの露出後に得たパターンが標識を含んでいないことを示す。イメージングソフトウェアを使用することにより、抗ＢＩＩＡ１ペプチド抗血清での免疫ブロット法により検出されたスポットを、オートラジオグラフ上および銀染色ゲル上の±７０ｋＤａのスポットの列に符合させることが可能であった（図９の矢印を参照されたい）。ＢＩＩＡ２は、弱い強度のスポットにより表され、このことは、該天然タンパク質の存在量がより少ないことを示している。
【実施例２】
【０２０４】
ＢＩＩＡ３のクローニング、発現および特徴づけ
第１．１．２節に記載されているバベシア・ボビス（Ｂ．ｂｏｖｉｓ）からの全増幅ＤＮＡをＢＩＩＡ３遺伝子に関して以下のプライマーでスクリーニングした。
【０２０５】
【化５】
2007527707.tif 000009
【０２０６】
ＰＣＲは、第１．１．３節に記載されているとおりに行った。
【０２０７】
該ＰＣＲ断片を直接的に配列決定し、得られた配列を配列番号９（ＢＩＩＡ３）に示す。
【０２０８】
第１．１．４節に記載されているとおりにＢＩＩＡ３  ｃＤＮＡのＰＣＲ断片を発現ベクターｐＥＴ−３２ａ内にクローニングした。プライマー９および１０はＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ制限部位を与えた。
【０２０９】
ＢＩＩＡ３タンパク質のコンピューター翻訳配列を配列番号１０に示す。ＢＩＩＡ３  ｃＤＮＡ中の１６３５ヌクレオチドのＯＲＦは６１．０ｋＤａのタンパク質をコードする。
【０２１０】
第１．１．５節に記載されているとおり、試験動物における特異的抗体の誘導のために、このタンパク質からペプチドを予測した。
【０２１１】
ＢＩＩＡ３タンパク質から選択したペプチドは以下のとおりである。
【０２１２】
【表３】
2007527707.tif 000010
【０２１３】
第１．１．５節に記載されているとおり、該ペプチドをＫＬＨに結合させ、それを使用してウサギポリクローナル抗体を産生させた。第１．１．６節に記載されているとおり、ウサギ血清をＥＬＩＳＡにより評価した。
【０２１４】
該ウサギポリクローナル抗ペプチド抗血清は、一次元（１−Ｄ）ウエスタンブロットにおいてｒｅｃＢＩＩＡ３（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）により発現されたチオレドキシン融合ＢＩＩＡ３タンパク質）を検出するためのものであった。結果を図１０、パネルＡに示す。Ｒｅｃ  ＢＩＩＡ３はペプチド７および８の両方に対する抗血清により認識され、一方、免疫前血清はＲｅｃ  ＢＩＩＡ３を認識しなかった。
【０２１５】
実施例３に記載されているとおり、ＢＩＩＡ３に対する（ならびにＢＩＩＡ１およびＢＩＩＡ２に対する）ポリクローナル抗血清をウシにおいて産生させた。
【０２１６】
このウシ抗血清もｒｅｃＢＩＩＡ３に関する一次元ウエスタンブロットにおいて使用した。結果を図１０、パネルＢに示す。２頭の動物からの血清はｒｅｃＢＩＩＡ３を認識したが、免疫前ウシ血清はそれを認識しなかった。
【０２１７】
また、第１．１．８節および第１．１．９節に記載されているとおり、ｒｅｃＢＩＩＡ３に対するウシ抗血清を天然バベシア・ボビス（Ｂ．ｂｏｖｉｓ）タンパク質の二次元（２−Ｄ）ゲル上で使用した。結果を図１１に示す。
【０２１８】
免疫前ウシ血清は赤血球由来のいくつかのスポットと反応した（パネルＡ）。パネルＢにおいては、セファロースカラムにより精製されたｒｅｃＢＩＩＡ３−免疫ＩｇＧを使用した。これは〜９５ｋＤａ、〜７５ｋＤａおよび〜３０ｋＤａのスポット（の群）を特異的に認識した（矢印を参照されたい）。見掛け上は、天然ＢＩＩＡ３のプロセシング形態および多量体形態も認識されている。
【０２１９】
ペプチド７に対するウサギポリクローナル抗血清は侵入抑制特性を有することが示された。図１２を参照されたい。セファロースＧにより精製されたＩｇＧを３つの異なる濃度で使用して、６５％の最大抑制を得た。非免疫ＩｇＧおよびＰＢＳは抑制をもたらさなかった（対照カラム）。
【０２２０】
また、間接免疫蛍光により感染赤血球内のバベシア・ボビス（Ｂ．ｂｏｖｉｓ）メロゾイトのＢＩＩＡ３の細胞下局在を決定するために、ペプチド７に対するウサギポリクローナル抗血清を使用した。検出は多光子顕微鏡検査により行った。
【０２２１】
薄い血液塗抹標本をアセトン中で１０分間固定し、風乾させた。抗ペプチド７ウサギ血清（１：２０）の存在下の３０分間の一次インキュベーションの後、ＰＢＳでの５分間の３回の洗浄工程を行った。ついでスライドを、Ａｌｅｘａ  ４８８（２０μｇ／ｍｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＵＳＡ）に結合したヤギ抗ウサギＩｇＧと共に３０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄した。ついで、二重標識のために、該スライドをＤＡＰＩ（０．５μＭ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．）と共に２０分間インキュベートし、洗浄した。ＦｌｕｏｒＳａｖｅ（登録商標）溶液を適用し、該スライドを、覆われた状態で水平位置で室温で一晩放置した。
【０２２２】
Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ３００倒立顕微鏡を備えたＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｒａｄｉａｎｃｅ  ２１００ＭＰ共焦点多光子系を使用して、蛍光シグナルを可視化した。ＤＡＰＩプローブの励起は、１０Ｗ固体レーザー（Ｍｉｌｅｎｎｉａ  Ｘｓ，Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ）によりポンピングされるモード固定（ｍｏｄｅ−ｌｏｃｋｅｄ）Ｔｉｔａｎｉｕｍ−Ｓａｐｐｈｉｒｅレーザー（Ｔｓｕｎａｍｉ，Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ）を使用して７８０ｎｍでの多光子励起により達成され、一方、Ａｌｅｘａ  ４８８プローブは４８８ｎｍでアルゴンレーザーにより励起された。
【０２２３】
多光子ＩＦＴの結果は、バベシア寄生虫の先端領域にＢＩＩＡ３特異的染色が存在することを示した。
【実施例３】
【０２２４】
組換えＢＩＩＡ１、ＢＩＩＡ２およびＢＩＩＡ３に対するウシ抗血清の作製および使用
第１．１．４節に記載されているとおりに、ＢＩＩＡ１、ＢＩＩＡ２およびＢＩＩＡ３の組換え発現産物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で作製した。細菌をペレット化し、６M  グアニジニウムＨＣｌ中で可溶化した。全細胞ライセートを９０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、可溶性ライセートをＧｕＨＣＬ中のＮｉ−ＮＴＡアガロースの懸濁物に結合させた。ビーズを８Ｍ  尿素で３回洗浄し、ついで特異的抗原を３Ｍ  尿素中の２５０ｍＭ  イミダゾールで溶出した。
【０２２５】
各ワクチン用量は１００μｇの精製ｒｅｃＢＩＩＡ抗原を含有し、サポニンアジュバントと共に２ｍｌの最終用量で製剤化された。各群５頭の免疫学的に適格なウシの頚部の筋肉内にワクチンを投与した。該初回投与の５週間後、同じ製剤で追加ワクチン接種を行った。該追加接種の３週間後に採血し、分析のために血清を調製した。
【０２２６】
結合バッファー（０．０１Ｍ  リン酸ナトリウム  ｐＨ７．４，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０１Ｍ  ＥＤＴＡ）中、５ｍｌの抗血清を２ｍｌのＧａｍｍａＢｉｎｄ  Ｐｌｕｓ（登録商標）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に２０℃で１時間インキュベートすることにより、ウシ特異的ＩｇＧの精製を行った。カラムを結合バッファーで洗浄し、ＩｇＧを５ｍｌの０．５Ｍ  ＮａＡｃ（ｐＨ３．０）で溶出し、直ちにＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ９．０）で中和した。ＩｇＧを濃縮し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して透析した。
【０２２７】
組換えＢＩＩＡ、ＢＩＩＡおよびＢＩＩＡ３（イスラエル株からクローニングされたもの）に対するウシ抗血清から精製された全ＩｇＧによるインビトロ侵入抑制を、プレインキュベーション中に最終濃度０．１５μｇ／μｌまたは０．７５μｇ／μｌのウシＩｇＧを使用して、ポリクローナルウサギ抗血清に関して記載されているとおりに（第１．１．１１節および第１．２．４節）行った。すべての試験は、各抗原について２つの異なる動物の抗体を使用して２回行った。図１３に示す結果は、抗原ごとの個々の抗血清の、合わせたデータを示す。標準偏差が示されている。該抑制が異種バベシア株の侵入に対しても効果的であることを示すために、バベシア・ボビスのメキシコ分離体（ＭＯ７）に由来するクローン系（Ｃ９．１）を試験した。
【０２２８】
両方のバベシア株による赤血球への侵入の抑制の有効性は比較しうるものである。ＢＩＩＡ１およびＢＩＩＡ２の有効性（３〜１２％）は、ＢＩＩＡ３の有効性（２３〜２５％）より更に高いようであった。
【図面の簡単な説明】
【０２２９】
【図１】レーン１：ＩＰＴＧでの誘導の前のｐＥＴ−ＢＩＩＡ１。レーン２：ＩＰＴＧでの誘導の４時間後のｐＥＴ−ＢＩＩＡ１。レーン３：誘導の４時間後のｐＥＴ−Ｒａｂ５。レーン４、５、６：抗ペプチド１と共にインキュベート。レーン７、８、９：抗ペプチド２と共にインキュベート。レーン１０、１１、１２：抗ペプチド３と共にインキュベート。レーン４、７、１０は、免疫前血清と共にインキュベートされた、誘導の４時間後のｐＥＴ−ＢＩＩＡ１を含有する。レーン５、８、１１：免疫血清と共にインキュベートされたこと以外はレーン４、７および１０と同じ。レーン６、９、１２は、免疫血清と共にインキュベートされた、誘導の４時間後のｐＥＴ−Ｒａｂ５を含有する。レーン１３：バベシア・ボビスに無関係なＫＬＨ結合ペプチドに対する抗血清と共にインキュベートされた、誘導の４時間後のｐＥＴ−ＢＩＩＡ１。
【図２】レーン２：ＩＰＴＧでの誘導の前のｐＥＴ−ＢＩＩＡ２。レーン２：ＩＰＴＧでの誘導の４時間後のｐＥＴ−ＢＩＩＡ２。レーン３：誘導の４時間後のｐＥＴ−Ｒａｂ５。レーン４、５、６：抗ペプチド４と共にインキュベート。レーン７、８、９：抗ペプチド５と共にインキュベート。レーン１０、１１、１２：抗ペプチド６と共にインキュベート。レーン４、７、１０は、ウサギの免疫前血清と共にインキュベートされた、誘導の４時間後のｐＥＴ−ＢＩＩＡ２を含有する。レーン５、８、１１：免疫血清と共にインキュベートされたこと以外はレーン４、７および１０と同じ。レーン６、９、１２は、免疫血清と共にインキュベートされた、誘導の４時間後のｐＥＴ−Ｒａｂ５を含有する。レーン１３は、バベシア・ボビスに無関係なＫＬＨ結合ペプチドに対する抗血清と共にインキュベートされた、誘導の４時間後のｐＥＴ−ＢＩＩＡ２を含有する。
【図３】パネルＡ、ＣおよびＥは、それぞれＢＩＩＡ１のペプチド１、２および３に対する免疫前ウサギ抗血清と共にインキュベートされたバベシア・ボビスのメタノール固定インビトロ培養を示す。パネルＢ、Ｄ、Ｆは、対応する免疫血清と共にインキュベートされたこと以外はＡ、ＣおよびＥと同様である。再現目的のために、色が逆転している。
【図４】パネルＡ、ＣおよびＥは、それぞれＢＩＩＡ２のペプチド４、５および６に対する免疫前ウサギ抗血清と共にインキュベートされたバベシア・ボビスのメタノール固定インビトロ培養を示す。パネルＢ、Ｄ、Ｆは、対応する免疫血清と共にインキュベートされたこと以外はＡ、ＣおよびＥと同様である。再現目的のために、色が逆転している。
【図５】対照カラムは、抑制を示さない無関係なペプチドに対する抗血清の存在下のプレインキュベーションを表す。ＢＩＩＡ１のペプチド１、２および３に対する抗血清（中空棒線）および免疫前ウサギ血清（黒棒線）を３重に２回試験した。
【図６】対照カラムは、抑制を示さない無関係なペプチドに対する抗血清の存在下のプレインキュベーションを表す。ＢＩＩＡ２のペプチド４、５および６に対する抗血清（中空棒線）および免疫前ウサギ血清（黒棒線）を３重に２回試験した。
【図７】パネルＡおよびＣ：それぞれＢＩＩＡ１ペプチド１および３に対する免疫血清での二次元（２−Ｄ）免疫ブロット。パネルＢおよびＤ：それぞれＢＩＩＡ１のペプチド１および３で免疫されたウサギの免疫前血清での二次元（２−Ｄ）免疫ブロット。矢印は、ペプチド１およびペプチド３に対する抗血清に特異的なスポットを示す。
【図８】パネルＡおよびＣ：それぞれＢＩＩＡ２ペプチド４および６に対する免疫血清での二次元（２−Ｄ）免疫ブロット。パネルＢおよびＤ：それぞれＢＩＩＡ２のペプチド４および６で免疫されたウサギの免疫前血清での二次元（２−Ｄ）免疫ブロット。矢印は、ペプチド４およびペプチド６に対する抗血清に特異的なスポットを示す。
【図９】図７および８に示す免疫ブロットに使用した二次元（２−Ｄ）ゲルのオートラジオグラフであり、侵入前に代謝標識により３５Ｓ−Ｍｅｔで標識されたバベシア・ボビス由来タンパク質のみを示している。矢印は、イメージングソフトウェアを使用して図７に示す免疫ブロットと符合させることによりＢＩＩＡ１として同定されたスポットを示す。
【図１０】ペプチド７および８に対して産生されたポリクローナルウサギ抗血清により認識される、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ｒｅｃＢＩＩＡ３の一次元（１−Ｄ）ウエスタンブロット。パネルＡ：ウサギ抗ペプチド抗血清：レーン１：抗ペプチド７；レーン３：抗ペプチド８；共に血清希釈１：２０００。レーン２および４：両方のペプチド−抗血清ウサギドナーの免疫前血清。パネルＢ：ウサギ抗ｒｅｃＢＩＩＡ３抗血清：レーン１および２：２羽の動物からの１：２００，０００での精製免疫ＩｇＧ；レーン３；免疫前ウシ血清。
【図１１】ｒｅｃＢＩＩＡ３に対するウシポリクローナル抗血清により認識される天然バベシア・ボビスタンパク質の二次元（２−Ｄ）ウエスタンブロット。パネルＡ：免疫前ウシ血清。パネルＢ：セファロースＧ精製免疫ＩｇＧ（０．８μｇ／ｍｌ）。矢印はＢＩＩＡ３特異的抗体認識を示す。
【図１２】ウシ赤血球内へのバベシア・ボビス  イスラエル分離体の侵入を抑制する、ウサギポリクローナル抗ペプチド７免疫ＩｇＧの侵入抑制アッセイ。対照（免疫前血清）による抑制を１００％に設定した。横軸：精製免疫ＩｇＧの濃度；縦軸：侵入抑制効力の相対％および標準偏差（ｎ＝３）。
【図１３】ウシ赤血球内へのバベシア・ボビス  イスラエルおよびメキシコ分離体の侵入を抑制する、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ｒｅｃＢＩＩＡ１、ｒｅｃＢＩＩＡ２およびｒｅｃＢＩＩＡ３に対するウシポリクローナル免疫ＩｇＧの侵入抑制アッセイ。対照（免疫前血清）による抑制を１００％に設定した。横軸：最終ＩｇＧの濃度（μｇ／μｌ）；縦軸：侵入抑制効力の相対％および標準偏差（ｎ＝２×２）。
【図１】
2007527707.tif 000011
【図２】
2007527707.tif 000012
【図３】
2007527707.tif 000013
【図４】
2007527707.tif 000014
【図５】
2007527707.tif 000015
【図６】
2007527707.tif 000016
【図７】
2007527707.tif 000017
【図８】
2007527707.tif 000018
【図９】
2007527707.tif 000019
【図１０】
2007527707.tif 000020
【図１１】
2007527707.tif 000021
【図１２】
2007527707.tif 000022
【図１３】
2007527707.tif 000023
【配列表】
2007527707000001.xml
【国際調査報告】
2007527707.tif 000053
2007527707.tif 000054
2007527707.tif 000055
2007527707.tif 000056
2007527707.tif 000057