(57)【要約】  本発明は、植物における発現のために最適化されたプロセシング酵素をコードするポリヌクレオチド、好ましくは合成ポリヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチドは、所望の基質に対して作用する適切な活性化条件下で活性される、中温性、好熱性、超好熱性のプロセシング酵素をコードする。これらの酵素の１つ以上を発現し、かつ植物および穀粒のプロセシングを容易にする組成の変化を有する、「自己プロセシング」トランスジェニック植物、および植物の部分、例えば、穀粒もまた提供される。例えば、改善された味を有する食品を製造するため、ならびにエタノールおよび発酵飲料の製造のための発酵可能基質を産生するための、これらの植物を製造するため、および使用するための方法もまた、提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号２、４、６、９、１９、２１、２５、３７、３９、４１、４３、４６、４８、５０、５２、５９、６１、６３、６５、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９４、９５、９６、９７、９９、１０８、および１１０もしくはその相補体、または配列番号２、４、６、９、１９、２１、２５、３７、３９、４１、４３、４６、４８、５０、５２、５９、６１、６３、６５、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９４、９５、９６、９７、９９、１０８、および１１０のいずれか１つの相補体に低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつα−アミラーゼ、プルラナーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ベータグルコシダーゼもしくはフィターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、あるいはｂ）配列番号１０、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３３、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４５、４７、４９、５１、６２、６４、６６、７０、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、１０９、もしくは１１１、またはその酵素的に活性なフラグメントを含むポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
ポリヌクレオチドが第１のポリペプチドおよび第２のペプチドを含む融合ポリペプチドをコードし、前記第１のポリペプチドがα−アミラーゼ、プルラナーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、またはグルコアミラーゼ活性を有する、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
第２のペプチドがシグナル配列ペプチドを含む、請求項２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
シグナル配列ペプチドが、第１のポリペプチドを、植物の液胞、小胞体、葉緑体、デンプン顆粒、種子または細胞壁に標的化する、請求項３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
シグナル配列がｗａｘｙからのＮ末端シグナル配列、γ−ゼインからのＮ末端シグナル配列、デンプン結合ドメイン、またはＣ末端デンプン結合ドメインである、請求項３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
ポリヌクレオチドが、配列番号２、９、または５２のいずれか１つの相補体に、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつα−アミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
ポリヌクレオチドが、配列番号４または２５のいずれか１つの相補体に、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつプルラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
ポリヌクレオチドが、配列番号６の相補体にハイブリダイズし、かつα−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
ポリヌクレオチドが、配列番号１９、２１、３７、３９、４１、または４３のいずれか１つの相補体に、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつグルコースイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドが、配列番号４６、４８、５０、または５９のいずれか１つの相補体に、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号２または９、またはその相補体のいずれか１つを含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号４または２５、またはその相補体のいずれか１つを含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号６またはその相補体を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
配列番号１９、２１、３７、３９、４１、または４３、またはその相補体のいずれか１つを含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号４６、４８、５０、または５９、またはその相補体のいずれか１つを含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１６】
ａ）配列番号２、４、６、９、１９、２１、２５、３７、３９、４１、４３、４６、４８、５０、５２、５９、６１、６３、６５、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９４、９５、９６、９７、９９、１０８、もしくは１１０もしくはその相補体、または配列番号２、４、６、９、１９、２１、２５、３７、３９、４１、４３、４６、４８、５０、５２、５９、６１、６３、６５、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９４、９５、９６、９７、９９、１０８、もしくは１１０のいずれか１つの相補体に低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつα−アミラーゼ、プルラナーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ベータグルコシダーゼもしくはフィターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有し、あるいはｂ）配列番号１０、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３３、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４５、４７、４９、５１、６２、６４、６６、７０、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、１０９、もしくは１１１、またはその酵素的に活性なフラグメントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、発現カセット。
【請求項１７】
プロモーターに作用可能に連結されている、請求項１６に記載の発現カセット。
【請求項１８】
プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項１７に記載の発現カセット。
【請求項１９】
プロモーターが組織特異的プロモーターである、請求項１７に記載の発現カセット。
【請求項２０】
プロモーターが胚乳特異的プロモーターである、請求項１９に記載の発現カセット。
【請求項２１】
胚乳特異的プロモーターがトウモロコシγ−ゼインプロモーターまたはトウモロコシＡＤＰ−ｇｐｐプロモーターである、請求項２０に記載の発現カセット。
【請求項２２】
プロモーターが配列番号１１または配列番号１２を含む、請求項２１に記載の発現カセット。
【請求項２３】
ポリヌクレオチドが、プロモーターに対してセンス方向に方向付けられる、請求項１６に記載の発現カセット。
【請求項２４】
ａ）のポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに作用可能に連結されているシグナル配列をさらにコードする、請求項１６に記載の発現カセット。
【請求項２５】
シグナル配列が、作用可能に連結されているポリペプチドを、植物の液胞、小胞体、葉緑体、デンプン顆粒、種子または細胞壁に標的化する、請求項２４に記載の発現カセット。
【請求項２６】
シグナル配列がｗａｘｙからのＮ末端シグナル配列またはγ−ゼインからのＮ末端シグナル配列である、請求項２５に記載の発現カセット。
【請求項２７】
シグナル配列がデンプン結合ドメインである、請求項２５に記載の発現カセット。
【請求項２８】
ｂ）のポリヌクレオチドが組織特異的プロモーターに作用可能に連結されている、請求項１６に記載の発現カセット。
【請求項２９】
組織特異的プロモーターがＺｅａ  ｍａｙｓ  γ−ゼインプロモーターまたはＺｅａ  ｍａｙｓ  ＡＤＰ−ｇｐｐプロモーターである、請求項２８に記載の発現カセット。
【請求項３０】
配列番号２または９、またはその相補体のいずれかを含むポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項３１】
配列番号６またはその相補体を含むポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項３２】
配列番号１９、２１、３７、３９、４１または４３、またはその相補体のいずれか１つを含むポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項３３】
配列番号４６、４８、５０、または５９、またはその相補体のいずれか１つを含むポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項３４】
配列番号４または２５、またはその相補体のいずれか１つを含むポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項３５】
配列番号１０、１３、１４、１５、１６、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３３、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４５、４７、４９、５１、６１、６３、６５、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９４、９５、９６、９７、９９、１０８、もしくは１１０、またはその酵素的に活性なフラグメントのいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項３６】
配列番号１０、１３、１４、１５、１６、３３、３５、もしくは５１、またはα−アミラーゼ活性を有するその活性なフラグメントのいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項３７】
配列番号３、２４、もしくは３４、またはプルラナーゼ活性を有するその活性なフラグメントのいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項３８】
配列番号５、２６、もしくは２７、またはα−グルコシダーゼ活性を有するその活性なフラグメントのいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項３９】
配列番号１８、２０、２８、２９、３０、３８、４０、４２、もしくは４４、またはグルコースイソメラーゼ活性を有するその活性なフラグメントのいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項４０】
配列番号４５、４７、もしくは４９、またはグルコアミラーゼ活性を有するその活性なフラグメントのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項４１】
請求項１６に記載の発現カセットを含むベクター。
【請求項４２】
請求項３０〜４０のいずれか一項に記載の発現カセットを含むベクター。
【請求項４３】
請求項１６に記載の発現カセットを含む細胞。
【請求項４４】
請求項３０〜４０のいずれか一項に記載の発現カセットを含む細胞。
【請求項４５】
アグロバクテリウム、単子葉植物細胞、双子葉植物細胞、Ｌｉｌｉｏｐｓｉｄａ細胞、Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ細胞、トウモロコシ細胞、および穀物細胞からなる群より選択される、請求項４４に記載の細胞。
【請求項４６】
トウモロコシ細胞またはイネ細胞である、請求項４５に記載の細胞。
【請求項４７】
アグロバクテリウム、単子葉植物細胞、双子葉植物細胞、Ｌｉｌｉｏｐｓｉｄａ細胞、Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ細胞、トウモロコシ細胞、および穀物細胞からなる群より選択される、請求項４５に記載の細胞。
【請求項４８】
トウモロコシ細胞である、請求項４７に記載の細胞。
【請求項４９】
請求項４１に記載のベクターで安定に形質転換された植物。
【請求項５０】
請求項４２に記載のベクターで安定に形質転換された植物。
【請求項５１】
配列番号１、１０、１３、１４、１５、１６、３３、もしくは３５のいずれかのアミノ酸配列を有するか、または配列番号２もしくは９のいずれかを含むポリヌクレオチドによってコードされるα−アミラーゼを含むベクターで安定に形質転換された植物。
【請求項５２】
α−アミラーゼが超好熱性である、請求項５１に記載の植物。
【請求項５３】
配列番号２４もしくは３４のいずれかのアミノ酸配列を有するか、または配列番号４もしくは２５のいずれかを含むポリヌクレオチドによってコードされるプルラナーゼを含むベクターで安定に形質転換された植物。
【請求項５４】
配列番号２６もしくは２７のいずれかのアミノ酸配列を有するか、または配列番号６を含むポリヌクレオチドによってコードされるα−グルコシダーゼを含むベクターで安定に形質転換された植物。
【請求項５５】
α−グルコシダーゼが超好熱性である、請求項５４に記載の植物。
【請求項５６】
配列番号１８、２０、２８、２９、３０、３８、４０、４２、もしくは４４のいずれかのアミノ酸配列を有するか、または配列番号１９、２１、３７、３９、４１、もしくは４３のいずれかを含むポリヌクレオチドによってコードされるグルコースイソメラーゼを含むベクターで安定に形質転換された植物。
【請求項５７】
α−グルコシダーゼが超好熱性である、請求項５６に記載の植物。
【請求項５８】
配列番号４５、４７、もしくは４９のいずれかのアミノ酸配列を有するか、または配列番号４６、４８、５０、もしくは５９のいずれかを含むポリヌクレオチドによってコードされるグルコースアミラーゼを含むベクターで安定に形質転換された植物。
【請求項５９】
グルコースアミラーゼが超好熱性である、請求項５８に記載の植物。
【請求項６０】
請求項４９に記載の植物由来の種子、果実、または穀粒。
【請求項６１】
請求項５０に記載の植物由来の種子、果実、または穀粒。
【請求項６２】
請求項５１に記載の植物由来の種子、果実、または穀粒。
【請求項６３】
請求項５３に記載の植物由来の種子、果実、または穀粒。
【請求項６４】
請求項５４に記載の植物由来の種子、果実、または穀粒。
【請求項６５】
請求項５６に記載の植物由来の種子、果実、または穀粒。
【請求項６６】
請求項５８に記載の植物由来の種子、果実、または穀粒。
【請求項６７】
そのゲノムが、プロモーター配列に作用可能に連結されている少なくとも１つのプロセシング酵素をコードする組換えポリヌクレオチドで増強されている、形質転換植物。
【請求項６８】
単子葉植物である、請求項６７に記載の植物。
【請求項６９】
単子葉植物がトウモロコシまたはイネである、請求項６８に記載の植物。
【請求項７０】
双子葉植物である、請求項６７に記載の植物。
【請求項７１】
穀物植物または商業的に栽培される植物である、請求項６７に記載の植物。
【請求項７２】
プロセシング酵素が、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルカナーゼ、β−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、ネオ−プルラナーゼ、イソ−プルラナーゼ、アミロプルラナーゼ、セルラーゼ、エキソ−１，４−β−セロビオヒドロラーゼ、エキソ−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ、Ｌ−アラビナーゼ、α−アラビノシダーゼ、ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、マンナーゼ、マンノシダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、プロテアーゼ、グルカナーゼ、エステラーゼ、フィターゼ、およびリパーゼからなる群より選択される、請求項６７に記載の植物。
【請求項７３】
プロセシング酵素が、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースイソメラーゼ、β−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、ネオ−プルラナーゼ、イソ−プルラナーゼ、およびアミロプルラナーゼからなる群より選択されるデンプンプロセシング酵素である、請求項７２に記載の植物。
【請求項７４】
酵素が、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコースイソメラーゼ、α−グルコシダーゼ、およびプルラナーゼから選択される、請求項７３に記載の植物。
【請求項７５】
酵素が超好熱性である、請求項７４に記載の植物。
【請求項７６】
酵素が、プロテアーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、エステラーゼ、フィターゼ、およびリパーゼからなる群より選択される非デンプン分解酵素である、請求項７２に記載の植物。
【請求項７７】
酵素が超好熱性である、請求項７６に記載の植物。
【請求項７８】
酵素が、植物の液胞、小胞体、葉緑体、デンプン顆粒、種子または細胞壁に蓄積する、請求項６７に記載の植物。
【請求項７９】
酵素が小胞体に蓄積する、請求項７８に記載の植物。
【請求項８０】
酵素がデンプン顆粒に蓄積する、請求項７８に記載の植物。
【請求項８１】
そのゲノムが、非超好熱性酵素を含む第２の組換えポリヌクレオチドでさらに増強される、請求項６７に記載の植物。
【請求項８２】
そのゲノムが、プロモーター配列に作用可能に連結した、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースイソメラーゼ、α−グルコシダーゼ、およびプルラナーゼからなる群より選択される少なくとも１つのプロセシング酵素をコードする組換えポリヌクレオチドで増強されている、形質転換植物。
【請求項８３】
プロセシング酵素が超好熱性である、請求項８２に記載の形質転換植物。
【請求項８４】
トウモロコシまたはイネである、請求項８２に記載の形質転換植物。
【請求項８５】
そのゲノムが、プロモーター配列に作用可能に連結した、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースイソメラーゼ、α−グルコシダーゼ、およびプルラナーゼからなる群より選択される少なくとも１つのプロセシング酵素をコードする組換えポリヌクレオチドで増強されている、形質転換トウモロコシ植物。
【請求項８６】
プロセシング酵素が超好熱性である、請求項８５に記載の形質転換トウモロコシ植物。
【請求項８７】
そのゲノムが、プロモーターおよびシグナル配列に作用可能に連結した、配列番号２、９、または５２を有する組換えポリヌクレオチドで増強されている、形質転換植物。
【請求項８８】
そのゲノムが、プロモーターおよびシグナル配列に作用可能に連結した、配列番号４または２５を有する組換えポリヌクレオチドで増強されている、形質転換植物。
【請求項８９】
そのゲノムが、プロモーターおよびシグナル配列に作用可能に連結した、配列番号６を有する組換えポリヌクレオチドで増強されている、形質転換植物。
【請求項９０】
そのゲノムが、配列番号１９、２１、３７、３９、４１、または４３を有する組換えポリヌクレオチドで増強されている、形質転換植物。
【請求項９１】
そのゲノムが、配列番号４６、４８、５０、または５９を有する組換えポリヌクレオチドで増強されている、形質転換植物。
【請求項９２】
請求項８２に記載の形質転換植物の生成物。
【請求項９３】
請求項８５に記載の形質転換植物の生成物。
【請求項９４】
請求項８７〜９１のいずれか一項に記載の形質転換植物の生成物。
【請求項９５】
種子、果実、または穀粒である、請求項９２に記載の生成物。
【請求項９６】
プロセシング酵素、デンプン、または糖(sugar)である、請求項９２に記載の生成物。
【請求項９７】
請求項８２に記載の植物から得られる植物。
【請求項９８】
請求項８５に記載の植物から得られる植物。
【請求項９９】
請求項８７〜９１のいずれか一項に記載の植物から得られる植物。
【請求項１００】
雑種植物である、請求項９７に記載の植物。
【請求項１０１】
雑種植物である、請求項９８に記載の植物。
【請求項１０２】
雑種植物である、請求項９９に記載の植物。
【請求項１０３】
同系植物である、請求項９７に記載の植物。
【請求項１０４】
同系植物である、請求項９８に記載の植物。
【請求項１０５】
同系植物である、請求項９９に記載の植物。
【請求項１０６】
プロテアーゼ、グルカナーゼ、フィターゼ、リパーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼまたはエステラーゼである、少なくとも１つのプロセシング酵素を含むデンプン組成物。
【請求項１０７】
酵素が超好熱性である、請求項１０６に記載のデンプン組成物。
【請求項１０８】
α−アミラーゼ、プルラナーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、またはグルコースイソメラーゼである、少なくとも１つのプロセシング酵素を含む穀粒。
【請求項１０９】
酵素が超好熱性である、請求項１０８に記載の穀粒。
【請求項１１０】
ａ）少なくとも１つの酵素を活性化する条件下で、少なくとも１つの非デンプンプロセシング酵素を含む穀粒を処理して、デンプン顆粒および非デンプン顆粒生成物を含む混合物を生じさせる工程、ここで、前記穀粒は形質転換植物から得られ、そのゲノムが、少なくとも１つの酵素をコードする発現カセットで増強されている；および
ｂ）前記混合物からデンプン顆粒を分離する工程、
を含む、デンプン顆粒を調製する方法。
【請求項１１１】
酵素がプロテアーゼ、グルカナーゼ、フィターゼ、リパーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼまたはエステラーゼである、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
酵素が超好熱性である、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
穀粒が破砕した穀粒である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１４】
穀粒が低湿度条件下で処理される、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１５】
穀粒が高湿度条件下で処理される、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１６】
穀粒が二酸化硫黄で処理される、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１７】
混合物から非デンプン生成物を分離する工程をさらに含む、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１８】
請求項１１０に記載の方法によって得られるデンプン。
【請求項１１９】
請求項１１２に記載の方法によって得られるデンプン。
【請求項１２０】
請求項１１０に記載の方法によって得られる非デンプン生成物。
【請求項１２１】
請求項１１２に記載の方法によって得られる非デンプン生成物。
【請求項１２２】
形質転換トウモロコシまたはその部分を処理する工程を含むハイパースイートコーンを産生するための方法であって、そのゲノムが、少なくとも１つのデンプン分解酵素またはデンプン異性化酵素をコードする発現カセットで増強され、かつこの発現カセットを、トウモロコシ中のポリサッカライドを糖に変換するために少なくとも１つの酵素を活性化する条件下で、胚乳中で発現して、ハイパースイートコーンを生じる、方法。
【請求項１２３】
発現カセットが、酵素をコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結したプロモーターをさらに含む、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
プロモーターが構成的プロモーターである、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
プロモーターが種子特異的プロモーターである、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２６】
プロモーターが胚乳特異的プロモーターである、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２７】
酵素が超好熱性である、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２８】
酵素がα−アミラーゼである、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
発現カセットが、少なくとも１つの酵素に作用可能に連結したシグナル配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１３０】
シグナル配列が、超好熱性酵素をアポプラストに方向付ける、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
シグナル配列が、超好熱性酵素を小胞体に方向付ける、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３２】
酵素が配列番号１３、１４、１５、１６、３３、または３５のいずれか１つを含む、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１３３】
形質転換トウモロコシまたはその部分を処理する工程を含むハイパースイートコーンを産生する方法であって、そのゲノムが、α−アミラーゼをコードする発現カセットで増強され、かつこの発現カセットを、トウモロコシ中のポリサッカライドを糖に変換するために少なくとも１つの酵素を活性化する条件下で、胚乳中で発現して、ハイパースイートコーンを生じる、方法。
【請求項１３４】
酵素が超好熱性である、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
超好熱性α−アミラーゼが、配列番号１０、１３、１４、１５、１６、３３、もしくは３５、またはα−アミラーゼ活性を有するその酵素的に活性なフラグメントのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
発現カセットが、配列番号２、９、もしくは５２、その相補体、または配列番号２、９、もしくは５２のいずれかに低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつα−アミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのいずれかから選択されるポリヌクレオチドを含む、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３７】
ａ）デンプン顆粒および少なくとも１つのプロセシング酵素を含む植物部分を、少なくとも１つの酵素を活性化する条件下で処理し、それによって、デンプン顆粒をプロセスして加水分解デンプン生成物を含む水溶液を形成し、植物部分は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素をコードする発現カセットで増強されている工程；ならびに
ｂ）前記加水分解デンプン生成物を含む水溶液を収集する工程を含む、加水分解デンプン生成物の溶液を調製するための方法。
【請求項１３８】
加水分解デンプン生成物がデキストリン、マルトオリゴサッカライド、糖、および／またはそれらの混合物を含む、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
酵素がα−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、アミロプルラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、ネオプルラナーゼ、イソ−プルラナーゼ、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４０】
少なくとも１つのプロセシング酵素が超好熱性である、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４１】
少なくとも１つのプロセシング酵素が超好熱性である、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４２】
植物部分のゲノムが、非超好熱性デンプンプロセシング酵素をコードする発現カセットでさらに増強される、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４３】
非超好熱性デンプンプロセシング酵素が、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、プルラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
少なくとも１つのプロセシング酵素が胚乳で発現される、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４５】
植物部分が穀粒である、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４６】
植物部分がトウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、サトウキビまたはイネ由来である、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４７】
少なくとも１つのプロセシング酵素が、プロモーター、およびデンプン顆粒または小胞体、または細胞壁に酵素を標的化するシグナル配列に作用可能に連結されている、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４８】
加水分解デンプン生成物を単離する工程をさらに含む、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４９】
加水分解デンプン生成物を発酵させる工程をさらに含む、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１５０】
ａ）デンプン顆粒および少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素を含む植物部分を、少なくとも１つの酵素を活性化する条件下で処理し、それによって、デンプン顆粒をプロセスして加水分解デンプン生成物を含む水溶液を形成し、植物部分は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つのα−アミラーゼをコードする発現カセットで増強されている工程；ならびに
ｂ）前記加水分解デンプン生成物を含む水溶液を収集する工程を含む、加水分解デンプン生成物を調製する方法。
【請求項１５１】
α−アミラーゼが超好熱性である、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
超好熱性α−アミラーゼが、配列番号１、１０、１３、１４、１５、１６、３３、もしくは３５、またはα−アミラーゼ活性を有するその活性なフラグメントのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
発現カセットが、配列番号２、９、４６、もしくは５２、その相補体、または低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で配列番号２、９、４６、もしくは５２のいずれかにハイブリダイズし、かつα−アミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのいずれかから選択されるポリヌクレオチドを含む、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５４】
形質転換植物のゲノムが、非超好熱性デンプンプロセシング酵素をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５５】
植物部分を、非超好熱性デンプンプロセシング酵素で処理する工程をさらに含む、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５６】
植物の細胞中に存在する少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素を含み、形質転換植物から得られ、そのゲノムが少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素をコードする発現カセットで増強されている、形質転換植物部分。
【請求項１５７】
酵素が、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースイソメラーゼ、β−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、ネオ−プルラナーゼ、イソ−プルラナーゼ、およびアミノプルラナーゼからなる群より選択されるデンプンプロセシング酵素である、請求項１５６に記載の植物部分。
【請求項１５８】
酵素が超好熱性である、請求項１５６に記載の植物部分。
【請求項１５９】
植物がトウモロコシである、請求項１５６に記載の植物部分。
【請求項１６０】
植物の細胞壁または細胞中に存在する少なくとも１つの非デンプンプロセシング酵素を含み、形質転換植物から得られ、そのゲノムが少なくとも１つの非デンプンプロセシング酵素または少なくとも１つの非デンプンポリサッカライドプロセシング酵素をコードする発現カセットで増強されている、形質転換植物部分。
【請求項１６１】
酵素が超好熱性である、請求項１６０に記載の植物部分。
【請求項１６２】
非デンプンプロセシング酵素が、プロテアーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、エステラーゼ、フィターゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、またはリパーゼからなる群より選択される、請求項１６０に記載の植物部分。
【請求項１６３】
穂、種子、果実、穀粒、飼い葉、もみ殻、またはバガスである、請求項１５６または１６０に記載の植物部分。
【請求項１６４】
配列番号１、１０、１３、１４、１５、１６、３３、もしくは３５のいずれかのアミノ酸配列を有するか、または配列番号２、９、４６、もしくは５２のいずれかを含むポリヌクレオチドによってコードされるα−アミラーゼを含む、形質転換植物部分。
【請求項１６５】
配列番号５、２６もしくは２７のいずれかのアミノ酸配列を有するか、または配列番号６を含むポリヌクレオチドによってコードされるα−グルコシダーゼを含む、形質転換植物部分。
【請求項１６６】
配列番号２８、２９、３０、３８、４０、４２、もしくは４４のいずれかの１つのアミノ酸配列を有するか、または配列番号１９、２１、３７、３９、４１、もしくは４３のいずれか１つを含むポリヌクレオチドによってコードされるグルコースイソメラーゼを含む、形質転換植物部分。
【請求項１６７】
配列番号４５、もしくは配列番号４７、もしくは配列番号４９のアミノ酸配列を有するか、または配列番号４６、４８、５０、もしくは５９のいずれかを含むポリヌクレオチドによってコードされるグルコアミラーゼを含む、形質転換植物部分。
【請求項１６８】
配列番号４または２５のいずれかを含むポリヌクレオチドによってコードされるプルラナーゼを含む形質転換植物部分。
【請求項１６９】
そこに含まれるデンプンプロセシング酵素を活性化する工程を含む、請求項１５６に記載の形質転換植物部分中でデンプンを転換する方法。
【請求項１７０】
そこに含まれる酵素を活性化する工程を含む、請求項１６４〜１６８のいずれか一項に記載の形質転換植物部分中で、デンプンをデンプン由来生成物に転換する方法。
【請求項１７１】
請求項１６９に記載の方法に従って産生される、デンプン、デキストリン、マルトオリゴサッカライドまたは糖。
【請求項１７２】
請求項１７０に記載の方法に従って産生される、デンプン、デキストリン、マルトオリゴサッカライドまたは糖。
【請求項１７３】
植物部分の細胞壁または細胞中に少なくとも１つの非デンプンプロセシング酵素を含む形質転換植物部分を使用する方法であって、
ａ）少なくとも１つの非デンプンポリサッカライドプロセシング酵素を含む形質転換植物部分を、少なくとも１つの酵素を活性化するための条件下で処理し、それによって、非デンプンポリサッカライドを消化して、オリゴサッカライドおよび／または糖を含む水溶液を形成し、植物部分は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つの非デンプンポリサッカライドプロセシング酵素をコードする発現カセットで増強されている工程；ならびに
ｂ）前記オリゴサッカライドおよび／または糖を含む水溶液を収集する工程を含む、方法。
【請求項１７４】
非デンプンポリサッカライドプロセシング酵素が、プロテアーゼ、グルカナーゼ、フィターゼ、リパーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、またはエステラーゼである、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７５】
少なくとも１つのプロセシング酵素を含む形質転換種子を使用する方法であって、
ａ）少なくとも１つのプロテアーゼまたはリパーゼを含む形質転換種子を、少なくとも１つの酵素を活性化するための条件下で処理して、アミノ酸および脂肪酸を含む水性混合物を生じ、前記種子は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つの酵素をコードする発現カセットで増強されている工程；ならびに
ｂ）前記水性混合物を収集する工程を含む、方法。
【請求項１７６】
アミノ酸、脂肪酸または両方が単離される、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７７】
少なくとも１つのプロテアーゼまたはリパーゼが超好熱性である、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７８】
ａ）少なくとも１つの酵素を活性化するための条件下で、少なくとも１つのポリサッカライドプロセシング酵素を含む植物部分を処理し、それによってポリサッカライドを消化してオリゴサッカライドまたは発酵可能な糖を形成し、植物部分は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つのポリサッカライドプロセシング酵素をコードする発現カセットで増強されている工程；および
ｂ）発酵可能な糖またはオリゴサッカライドのエタノールへの転換を促進する条件下で、前記発酵可能な糖をインキュベートする工程を含む、エタノールを調製するための方法。
【請求項１７９】
植物部分が穀粒、果実、種子、茎、木部、野菜または根である、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８０】
植物部分が、オートムギ、オオムギ、コムギ、ベリー、グレープ、ライムギ、トウモロコシ、イネ、ジャガイモ、テンサイ、サトウキビ、パイナップル、草および木からなる群より選択される植物から得られる、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８１】
ポリサッカライドプロセシング酵素が、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、プルラナーゼ、またはそれらの組み合わせである、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８２】
ポリサッカライドプロセシング酵素が超好熱性である、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８３】
ポリサッカライドプロセシング酵素が中温性である、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８４】
ポリサッカライドプロセシング酵素が超好熱性である、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８５】
ａ）一定時間熱を用いて、かつ少なくとも１つの酵素を活性化するための条件下で、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、またはプルラナーゼ、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの酵素を含む植物部分を処理し、それによってポリサッカライドを消化して発酵可能な糖を形成し、植物部分は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つの酵素をコードする発現カセットで増強されている工程；および
ｂ）発酵可能な糖のエタノールへの転換を促進する条件下で、前記発酵可能な糖をインキュベートする工程を含む、エタノールを調製するための方法。
【請求項１８６】
少なくとも１つの酵素が超好熱性である、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１８７】
少なくとも１つの酵素が中温性である、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１８８】
α−アミラーゼが配列番号１、１０、１３、１４、１５、１６、３３、もしくは３５のいずれかのアミノ酸配列を有するか、または配列番号２もしくは９のいずれかを含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１８９】
α−グルコシダーゼが配列番号５、２６もしくは２７のいずれかのアミノ酸配列を有するか、または配列番号６を含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１９０】
グルコースイソメラーゼが配列番号２８、２９、３０、３８、４０、４２、もしくは４４のいずれか１つのアミノ酸配列を有するか、または配列番号１９、２１、３７、３９、４１、もしくは４３のいずれか１つを含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１９１】
グルコアミラーゼが配列番号４５のアミノ酸配列を有するか、または配列番号４６、４８、もしくは５０のいずれかを含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１９２】
プルラナーゼが配列番号２４もしくは３４のアミノ酸配列を有するか、または配列番号４もしくは２５のいずれかを含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１９３】
ａ）少なくとも１つの酵素を活性化するための条件下で、少なくとも１つの非デンプンプロセシング酵素を含む植物部分を処理し、それによって非デンプンポリサッカライドをオリゴサッカライドおよび発酵可能な糖まで消化し、植物部分は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つの酵素をコードする発現カセットで増強されている工程；ならびに
ｂ）発酵可能な糖のエタノールへの転換を促進する条件下で、前記発酵可能な糖をインキュベートする工程を含む、エタノールを調製するための方法。
【請求項１９４】
非デンプンプロセシング酵素が、プロテアーゼ、グルカナーゼ、フィターゼ、リパーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼまたはエステラーゼである、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９５】
ａ）少なくとも１つの酵素を活性化するための条件下で、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、プルラナーゼ、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの酵素を含む植物部分を処理し、それによってポリサッカライドを消化して発酵可能な糖を形成し、植物部分は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つの酵素をコードする発現カセットで増強されている工程；および
ｂ）発酵可能な糖のエタノールへの転換を促進する条件下で、前記発酵可能な糖をインキュベートする工程を含む、エタノールを調製するための方法。
【請求項１９６】
少なくとも１つの酵素が超好熱性である、請求項１９５に記載の方法。
【請求項１９７】
さらなる甘味料を加えることなく甘みのあるデンプン質食品を製造するための方法であって、
ａ）少なくとも１つの酵素を活性化する条件下で、少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素を含む植物部分を処理し、それによって、甘みのある製品を形成するために、前記植物部分中のデンプン顆粒を糖にプロセスし、前記植物部分は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つの酵素をコードする発現カセットで増強されている工程；および
ｂ）前記甘みのある製品をデンプン質食品に加工する工程を含む、方法。
【請求項１９８】
デンプン質食品が甘みのある製品および水から形成される、請求項１９７に記載の方法。
【請求項１９９】
デンプン質食品が、麦芽、香料、ビタミン、ミネラル、着色料またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１９７に記載の方法。
【請求項２００】
少なくとも１つの酵素が超好熱性である、請求項１９７に記載の方法。
【請求項２０１】
酵素が、α−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、グルコースイソメラーゼまたはそれらの任意の組み合わせである、請求項１９７に記載の方法。
【請求項２０２】
植物が、ダイズ、ライムギ、オートムギ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、イネおよびサトウキビからなる群より選択される、請求項１９７に記載の方法。
【請求項２０３】
デンプン質食品がシリアル食品である、請求項１９７に記載の方法。
【請求項２０４】
デンプン質食品が朝食用食品である、請求項１９７に記載の方法。
【請求項２０５】
デンプン質食品がインスタント食品である、請求項１９７に記載の方法。
【請求項２０６】
デンプン質食品が焼いた食品である、請求項１９７に記載の方法。
【請求項２０７】
加工がベーキング、煮沸、加熱、蒸気処理、放電またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１９７に記載の方法。
【請求項２０８】
甘味料を加えることなくデンプン含有製品を甘くする方法であって、
ａ）少なくとも１つの酵素を活性化するための条件下で、少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素を含むデンプンを処理し、それによって、甘みのあるデンプンを形成するためにデンプンを消化して糖を形成し、前記デンプンは形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つの酵素をコードする発現カセットで増強されている工程；および
ｂ）甘みのあるデンプンを製品に加えて、甘みのあるデンプン含有食品を製造する工程を含む、方法。
【請求項２０９】
形質転換植物が、トウモロコシ、ダイズ、ライムギ、オートムギ、オオムギ、コムギ、イネおよびサトウキビからなる群より選択される、請求項２０８に記載の方法。
【請求項２１０】
少なくとも１つの酵素が超好熱性である、請求項２０８に記載の方法。
【請求項２１１】
少なくとも１つの酵素が、α−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、グルコースイソメラーゼまたはそれらの任意の組み合わせである、請求項２０８に記載の方法。
【請求項２１２】
請求項１９７に記載の方法によって得られるデンプン質食品。
【請求項２１３】
請求項２０８に記載の方法によって得られる、甘みのあるデンプン含有製品。
【請求項２１４】
ポリサッカライド含有果実または野菜を甘くするための方法であって、少なくとも１つの酵素を活性化する条件下で、少なくとも１つのポリサッカライドプロセシング酵素を含む果実または野菜を処理し、それによって、前記果実または野菜中のポリサッカライドをプロセスして糖を形成し、甘みのある果実または野菜を生じ、前記果実または野菜は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つのポリサッカライドプロセシング酵素をコードする発現カセットで増強されている工程を含む、方法。
【請求項２１５】
果実または野菜が、ジャガイモ、トマト、バナナ、カボチャ、エンドウマメ、およびマメからなる群より選択される、請求項２１４に記載の方法。
【請求項２１６】
少なくとも１つの酵素が超好熱性である、請求項２１４に記載の方法。
【請求項２１７】
酵素が、α−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、グルコースイソメラーゼまたはそれらの任意の組み合わせである、請求項２１４に記載の方法。
【請求項２１８】
請求項１５６に記載の植物部分から得られるデンプン顆粒を、少なくとも１つの酵素を活性化する条件下で処理し、それによって糖を含む水溶液を生じる工程を含む、糖を含む水溶液を調製する方法。
【請求項２１９】
デンプン由来製品の回収の前に穀粒をウェットまたはドライ製粉することを含まない、穀粒からデンプン由来生成物を調製する方法であって、
ａ）少なくとも１つの酵素を活性化する条件下で、デンプン顆粒および少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素を含む植物部分を処理し、それによって、デンプン顆粒をプロセスしてデキストリンまたは糖を含む水溶液を形成し、前記植物部分は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素をコードする発現カセットで増強されている工程；ならびに
ｂ）デンプン由来生成物を含む水溶液を収集する工程を含む、方法。
【請求項２２０】
少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素が超好熱性である、請求項２１９に記載の方法。
【請求項２２１】
請求項８２に記載の形質転換植物を栽培する工程、ならびにそこからα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースイソメラーゼ、α−グルコシダーゼ、およびプルラナーゼを単離する工程を含む、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースイソメラーゼ、α−グルコシダーゼ、およびプルラナーゼを単離する方法。
【請求項２２２】
α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースイソメラーゼ、α−グルコシダーゼ、およびプルラナーゼが超好熱性である、請求項２２１に記載の方法。
【請求項２２３】
ａ）トランスジェニック穀粒を水と混合する工程；
ｂ）前記混合物を加熱する工程；
ｃ）（ｂ）において生成したデキストリンシロップから固形物を分離する工程；および
ｄ）マルトデキストリンを収集する工程を含む、マルトデキストリンを調製する方法。
【請求項２２４】
トランスジェニック穀粒が少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素を含む、請求項２２３に記載の方法。
【請求項２２５】
デンプンプロセシング酵素がα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、およびグルコースイソメラーゼである、請求項２２４に記載の方法。
【請求項２２６】
少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素が超好熱性である、請求項２２５に記載の方法。
【請求項２２７】
請求項２２３〜２２６のいずれか一項に記載の方法によって産生されるマルトデキストリン。
【請求項２２８】
請求項２２３〜２２６のいずれか一項に記載の方法によって産生されるマルトデキストリン組成物。
【請求項２２９】
デンプン由来生成物の回収の前に穀粒の機械的破壊を含まない、穀粒からデキストリンまたは糖を調製する方法であって、
ａ）少なくとも１つの酵素を活性化する条件下で、デンプン顆粒および少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素を含む植物部分を処理し、それによって、デンプン顆粒をプロセスしてデキストリンまたは糖を含む水溶液を形成し、前記植物部分は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素をコードする発現カセットで増強されている工程；ならびに
ｂ）糖および／またはデキストリンを含む水溶液を収集する工程を含む、方法。
【請求項２３０】
デンプンプロセシング酵素がα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、およびグルコースイソメラーゼである、請求項２２９に記載の方法。
【請求項２３１】
ａ）少なくとも１つの酵素を活性化する条件下で、デンプン顆粒および少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素を含む植物部分を処理し、それによって、デンプン顆粒をプロセスしてデキストリンまたは糖を含む水溶液を形成し、前記植物部分は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つのプロセシング酵素をコードする発現カセットで増強されている工程；ならびに
ｂ）発酵可能な糖を含む水溶液を収集する工程を含む、発酵可能な糖を製造する方法。
【請求項２３２】
デンプンプロセシング酵素がα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、およびグルコースイソメラーゼである、請求項２３１に記載の方法。
【請求項２３３】
超好熱性α−アミラーゼを含むベクターで安定に形質転換されたトウモロコシ植物。
【請求項２３４】
配列番号１または配列番号５１に対して６０％より多く同一であるα−アミラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターで安定に形質転換されたトウモロコシ植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００１年８月２７日に出願された、出願番号第６０／３１５，２８１号に対する優先権を主張する、２００２年８月２７日に出願された、米国特許出願番号第１０／２２８，０６３号の一部継続出願であり、これらの各々はそれらの全体が本明細書に参照として組み込まれる。
【０００２】
本発明は、一般的には、植物分子生物学の分野に関し、およびより詳細には、植物またはその生成物に所望の特徴を提供するプロセシング酵素を発現する植物の作製に関する。
【背景技術】
【０００３】
酵素は、例えば、木部、果実および野菜、デンプン、ジュースなどの種々の農業製品をプロセスするために使用される。典型的には、プロセシング酵素は、種々の供給源、例えば、微生物発酵（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）α−アミラーゼ）または植物からの単離（コーヒーβ−ガラクトシダーゼまたは植物部分からのパパイン）などから、産業上の規模で製造および回収される。酵素調製物は、酵素反応が商業的に実行可能な様式で達成されるように、湿度、温度、時間、および機械的混合の適切な条件下で酵素および基質を混合することによって、異なるプロセシング適用において使用される。これらの方法は、酵素産生、酵素調製物の製造、酵素および基質を混合すること、および酵素反応を容易にするための適切な条件に混合物を供することの別々の工程を含む。時間、エネルギー、混合、資本支出、および／もしくは酵素製造コストを減少もしくは除去し、または改善されもしくは新規な生成物を生じる方法は、有用でありかつ有益である。このような改善が必要とされる１つの例は、トウモロコシの製粉の領域にある。
【０００４】
今日では、トウモロコシは、トウモロコシデンプンおよび他のトウモロコシ製粉副産物、例えば、トウモロコシグルテン飼料、トウモロコシグルテン粗びき粉、およびトウモロコシ油を得るために製粉される。このプロセスから得られるデンプンは、しばしば、さらに、誘導体化デンプンおよび糖などの他の生成物にプロセスされ、またはアルコールもしくは乳酸を含む種々の生成物を作製するために発酵される。トウモロコシデンプンのプロセスは、しばしば、酵素、特に、デンプンを発酵可能な糖またはフルクトースに加水分解および転換する酵素（α−およびグルコ−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼなど）の使用を含む。今日商業的に使用されるプロセスは、非常に大きなミルの構築が、合理的なコスト効果のために必要とされるスケールでトウモロコシを加工するために必要とされるので、資本集約的である。加えて、これらのプロセスは、デンプンを加水分解または修飾する酵素の別々の製造、次いで、加水分解されたデンプン生成物を産生するために酵素および基質を混合するための機構を必要とする。
【０００５】
トウモロコシ穀粒からのデンプンの回収のプロセスは周知であり、ウェット製粉プロセスを含む。トウモロコシウェット製粉は、トウモロコシ穀粒を浸漬する工程、トウモロコシ穀粒を粉砕する工程、およびこの穀粒の成分を分離する工程を含む。この穀粒は、浸漬タンク中で、約１２０°Ｆの水の向流とともに浸漬し、この穀粒は、２４〜４８時間の間、浸漬タンク中に残る。この浸漬水は、典型的には、重量で約０．２％の濃度の二酸化硫黄を含む。二酸化硫黄は、微生物増殖を減少させることを補助するため、およびまた、より効率的なデンプン−タンパク質分離を容易にするために胚乳タンパク質中のジスルフィド結合を減少するためにプロセスにおいて利用される。通常、約０．５９ガロンの浸漬水が、１ブッシェルのトウモロコシあたりに使用される。この浸漬水は廃棄物と見なされ、しばしば、望ましくないレベルの残渣の二酸化硫黄を含む。
【０００６】
次いで、浸漬された穀粒は脱水され、アトリション型ミルのセットに供される。アトリション型ミルの第１のセットは、穀粒を破砕し、穀粒の残りから胚芽を遊離する。ウェット製粉分野のために適切である市販のアトリション型ミルは、商標名Ｂａｕｅｒの下で販売されている。遠心分離が、穀粒の残りから胚芽を分離するために使用される。典型的な市販の遠心分離機は、Ｍｅｒｃｏ遠心分離機である。アトリションミルおよび遠心分離機は、操作するためにエネルギーを使用する、大きな高価な物品である。
【０００７】
プロセスの次の工程において、デンプン、殻、繊維、およびグルテンを含む残りの穀粒成分は、別のアトリションミルのセットに供され、デンプンおよびグルテン（胚乳タンパク質）から繊維成分を分離するために洗浄ふるいのセットを通過される。デンプンおよびグルテンはふるいを通過するのに対して、繊維は追加しない。遠心分離または第３の製粉、その後の遠心分離が、胚乳タンパク質からデンプンを分離するために使用される。遠心分離はデンプンスラリーを生じ、これは脱水され、次いで新鮮な水で洗浄され、および約１２％湿度まで乾燥される。実質的に純粋なデンプンは、典型的には、酵素の使用によってさらにプロセスされる。
【０００８】
種皮、胚および胚乳タンパク質を除去することが、プロセシング酵素とデンプンを効率的に接触させることを可能にし、および得られる加水分解生成物は、他の穀粒成分からの夾雑物を比較的含まないので、穀粒の他の成分からのデンプンの分離が実行される。分離はまた、穀粒の他の成分が効率的に回収され、およびミルからの収入を増加させるために同時生成物として実質的に販売され得ることを確実にする。
【０００９】
デンプンがウェット製粉プロセスから回収された後で、これは、典型的には、マルトデキストリン産生のためのゼラチン化、液化およびデキストリン化のプロセシング工程、ならびにグルコース、マルトースおよびフルクトースの産生のための糖化、異性化および精製の引き続く工程を受ける。
【００１０】
現在利用可能な酵素は結晶デンプンを迅速に加水分解できないので、ゼラチン化がデンプンの加水分解において利用される。デンプンを加水分解酵素に対して利用可能にするために、デンプンは、典型的には、水を用いてスラリーにされ（２０〜４０％乾燥固体）、および適切なゲル化温度で加熱される。トウモロコシデンプンについては、この温度は１０５〜１１０℃の間である。ゼラチン化デンプンは、典型的には非常に粘性であり、それゆえに、液化と呼ばれる次の工程において薄層化される。液化は、デンプンのグルコース分子の間の結合のいくつかを破壊し、酵素的にまたは酸の使用を通して達成される。熱安定性エンドα−アミラーゼ酵素は、この工程において、および引き続くデキストリン化の工程において使用される。加水分解の程度は、デキストリン化工程において制御され、所望のデキストロースのパーセンテージの加水分解生成物を生じる。
【００１１】
液化工程からのデキストリン生成物のさらなる加水分解は、所望される生成物に依存して、多数の異なるエキソ−アミラーゼおよび脱分岐酵素によって実行される。そして最後に、フルクトースが所望されるならば、固定化グルコースイソメラーゼ酵素が、典型的には、グルコースをフルクトースに転換するために利用される。
【００１２】
トウモロコシデンプンから発酵可能な糖（次いで、例えば、エタノール）を作製するドライミルプロセスは、外因性酵素をデンプンと効率的に接触させることを容易にする。これらのプロセスは、ウェット製粉よりも資本集約的ではないが、しばしばあるように、これらのプロセスに由来する副産物は、ウェット製粉に由来するものと同程度に価値はないので、有意なコストの利点がなお所望される。例えば、トウモロコシをドライ製粉する際に、穀粒は、分解酵素による効率的なデンプンの接触を容易にするために、粉末に粉砕される。トウモロコシ粉の酵素加水分解後、残渣の固体は、これらがタンパク質およびいくつかの他の成分を含むので、ある程度の食料としての価値を有する。Ｅｃｋｈｏｆｆは、最近、「Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｓｔｓ  ｏｆ  ｆｕｅｌ  ｅｔｈａｎｏｌ  ｆｒｏｍ  ｃｏｒｎ  ｗｉｔｈ  ｑｕｉｃｋ−ｇｅｒｍ  ｐｒｏｃｅｓｓ」（Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９４：４１（２００１））という表題の論文において、ドライ製粉に関連する改善および関連する問題についての潜在性を記載した。「迅速胚芽」法は、浸漬時間の減少を使用して、デンプンからオイルが豊富な胚芽の分離を可能にする。
【００１３】
植物中の内因性プロセシング酵素の調節および／またはレベルが所望の生成物を生じることができる１つの例は、スイートコーンである。典型的なスイートコーンの変種は、スイートコーンが通常レベルのデンプン生合成が可能ではないという事実によって、農作物トウモロコシの変種から区別される。デンプン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子における遺伝的変異は、典型的には、デンプン生合成を制限するためにスイートコーンの変種において利用される。このような変異は、デンプンシンターゼおよびＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼをコードする遺伝子においてである（例えば、甘みおよび超甘み変異）。可食性の新鮮なトウモロコシの消費者が望む、口当たりのよい甘みを生じるために必要である単純な糖である、フルクトース、グルコースおよびスクロースは、このような変異体の胚乳を発生させる際に蓄積する。しかし、デンプンの蓄積のレベルがあまりに高いならば、例えば、トウモロコシがあまりに長く成熟するために放置され（遅い収穫）、またはトウモロコシが、それが消費される前に過度の期間保存される場合に、生成物は甘みを失い、デンプンの味および食感を呈する。それゆえに、甘いトウモロコシのための収穫時期は非常に狭く、有効期間は限られている。
【００１４】
スイートコーンの変種を栽培する農業従事者に対する別の顕著な欠点は、これらの変種の有用性が可食性食品に独占的に限られていることである。農業従事者が種子の発生の間に可食性食品としての使用のために彼のスイートコーンを収穫することを控えたいならば、農作物は本質的に損失である。穀粒の収量およびスイートコーンの品質は２つの基本的な理由のために乏しい。第１の理由は、デンプン生合成経路における変異が、デンプン生合成機構を損なっており、穀粒は完全に膨らまず、収率および品質が損なわれることを引き起こす。第２に、穀粒中に存在する高レベルの糖およびこれらの糖をデンプンとして隔離することの不可能性のために、種子の全体のシンク強度が減少され、このことが穀粒中の栄養の貯蔵の減少を悪化させる。スイートコーン変種種子の胚乳は縮みかつつぶれ、適切な乾燥を受けず、および病気にかかりやすい。スイートコーン穀粒の乏しい品質は、さらに農学的な意味合いを有する；乏しい種子の生存可能性、乏しい発芽、芽生えの病気のかかりやすさ、および乏しい初期の芽生えの活力が、不適切なデンプンの蓄積によって引き起こされる要因の組み合わせから生じるからである。従って、スイートコーンの乏しい品質の問題は、消費者、農業従事者／栽培者、供給業者、および採種業者に影響を与えている。
【００１５】
従って、ドライ製粉については、プロセスの効率を改善し、および／または副産物の価値を増加する方法についての必要性が存在する。ウェット製粉については、穀粒の成分をより長く浸漬、粉砕、製粉、および／または分離するために必要である装置を要求しない、デンプンをプロセスする方法についての必要性が存在する。例えば、これが廃棄を必要とする廃液の量を減少し、それによってエネルギーおよび時間を節約し、ならびにミルの能力を増加する（穀粒は浸漬タンク中でより短い時間過ごす）ような、ウェット製粉における浸漬工程を修飾または除外することの必要性が存在する。胚からデンプン含有胚乳を分離するプロセスを除外または改善することの必要性もまた存在する。
【発明の開示】
【００１６】
本発明は、自己プロセシングする植物および植物部分、ならびにそれらを使用する方法に向けられる。本発明の自己プロセシングする植物および植物部分は、酵素（中温性、好熱性、および／または超好熱性）を発現および活性化することが可能である。酵素（中温性、好熱性、または超好熱性）の活性化の際に、植物または植物部分は、所望の結果を得るためにそれが作用する基質を自己プロセシングすることが可能である。
【００１７】
本発明は、ａ）配列番号２、４、６、９、１９、２１、２５、３７、３９、４１、４３、４６、４８、５０、５２、もしくは５９もしくはその相補体、または配列番号２、４、６、９、１９、２１、２５、３７、３９、４１、４３、４６、４８、５０、５２、もしくは５９のいずれか１つの相補体に低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつα−アミラーゼ、プルラナーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、もしくはグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、あるいはｂ）配列番号１０、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３３、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４５、４７、４９、もしくは５１、またはその酵素的に活性なフラグメントを含むポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドに向けられる。好ましくは、この単離されたポリヌクレオチドは第１のポリペプチドおよび第２のペプチドを含む融合ポリペプチドをコードし、この第１のポリペプチドはα−アミラーゼ、プルラナーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、またはグルコアミラーゼ活性を有する。最も好ましくは、第２のペプチドはシグナル配列ペプチドを含み、これは、第１のポリペプチドを、植物の液胞、小胞体、葉緑体、デンプン顆粒、種子または細胞壁に標的化してもよい。例えば、このシグナル配列は、ｗａｘｙからのＮ末端シグナル配列、γ−ゼインからのＮ末端シグナル配列、デンプン結合ドメイン、またはＣ末端デンプン結合ドメインであってもよい。配列番号２、９、または５２のいずれか１つの相補体に、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつα−アミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；配列番号４または２５の相補体に、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつプルラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；配列番号６の相補体にハイブリダイズし、かつα−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；配列番号１９、２１、３７、３９、４１、または４３のいずれか１つの相補体に、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつグルコースイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；配列番号４６、４８、５０、または５９のいずれか１つの相補体に、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがさらに含まれる。
【００１８】
本発明はまた、ａ）配列番号６１、６３、６５、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９４、９５、９６、９７、９９、１０８、および１１０もしくはその相補体、または配列番号６１、６３、６５、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９４、９５、９６、９７、９９、１０８、もしくは１１０のいずれか１つの相補体に低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつキシラナーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ベータグルコシダーゼ、エステラーゼもしくはフィターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、あるいはｂ）配列番号６２、６４、６６、７０、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、１０９、もしくは１１１、またはその酵素的に活性なフラグメントを含むポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドに向けられる。この単離されたポリヌクレオチドは第１のポリペプチドおよび第２のペプチドを含む融合ポリペプチドをコードしてもよく、この第１のポリペプチドは、キシラナーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ベータグルコシダーゼ、プロテアーゼ、またはフィターゼ活性を有する。第２のペプチドはシグナル配列ペプチドを含んでもよく、これは、第１のポリペプチドを、植物の液胞、小胞体、葉緑体、デンプン顆粒、種子または細胞壁に標的化してもよい。例えば、このシグナル配列は、ｗａｘｙからのＮ末端シグナル配列、γ−ゼインからのＮ末端シグナル配列、デンプン結合ドメイン、またはＣ末端デンプン結合ドメインであってもよい。
【００１９】
本発明において提供されかつ有用である例示的なキシラナーゼには、配列番号６１、６３、または６５によってコードされるものが含まれる。配列番号６９によってコードされる例示的なプロテアーゼ、すなわちブロメラインもまた提供される。例示的なセルラーゼには、本明細書で提供され、かつ配列番号７９、８１、９３、および９４によってコードされるようなセロビオヒドロラーゼＩおよびＩＩが含まれる。例示的なグルカナーゼは、本明細書で記載される６ＧＰ１として提供され、配列番号８５によってコードされる。例示的なベータグルコシダーゼには、本明細書に記載されかつ配列番号９６および９７によってコードされるようなベータグルコシダーゼ２およびＤが含まれる。例示的なエステラーゼ、すなわち、配列番号９９によってコードされるようなフェルラ酸エステラーゼもまた提供される。そして、配列番号１０９〜１１２によってコードされるような例示的なフィターゼ、Ｎｏｖ９Ｘもまた提供される。
【００２０】
ａ）配列番号２、４、６、９、１９、２１、２５、３７、３９、４１、４３、４６、４８、５０、５２、もしくは５９、もしくはその相補体、または配列番号２、４、６、９、１９、２１、２５、３７、３９、４１、４３、４６、４８、５０、５２、もしくは５９のいずれか１つの相補体に低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつα−アミラーゼ、プルラナーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、もしくはグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有し、あるいはｂ）配列番号１０、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３３、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４５、４７、４９、もしくは５１、またはその酵素的に活性なフラグメントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、発現カセットもまた含まれる。この発現カセットは、ポリヌクレオチドに作用可能に連結されているプロモーター、例えば、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、または好ましくは胚乳特異的プロモーターなどをさらに含む。好ましくは、胚乳特異的プロモーターはトウモロコシγ−ゼインプロモーター、またはトウモロコシＡＤＰ−ｇｐｐプロモーター、またはトウモロコシＱプロモータープロモーター、またはイネグルテリン−１プロモーターである。好ましい実施形態において、このプロモーターは、配列番号１１または配列番号１２または配列番号６７または配列番号９８を含む。さらに、別の好ましい実施形態において、このポリヌクレオチドは、プロモーターに対してセンス方向に方向付けられる。本発明の発現カセットは、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに作用可能に連結されているシグナル配列をさらにコードしてもよい。このシグナル配列は、好ましくは、作用可能に連結されているポリペプチドを、植物の液胞、小胞体、葉緑体、デンプン顆粒、種子または細胞壁に標的化する。このシグナル配列は、ｗａｘｙからのＮ末端シグナル配列、γ−ゼインからのＮ末端シグナル配列、またはデンプン結合ドメインを含む。
【００２１】
さらに、ａ）配列番号６１、６３、６５、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９４、９５、９６、９７、９９、１０８、および１１０もしくはその相補体、または配列番号６１、６３、６５、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９４、９５、９６、９７、９９、１０８、および１１０のいずれか１つの相補体に低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつキシラナーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ベータグルコシダーゼ、エステラーゼもしくはフィターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有し、あるいはｂ）配列番号６２、６４、６６、７０、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、１０９、もしくは１１１、またはその酵素的に活性なフラグメントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、発現カセットである。この発現カセットは、ポリヌクレオチドに作用可能に連結されているプロモーター、例えば、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、または好ましくは胚乳特異的プロモーターをさらに含む。胚乳特異的プロモーターはトウモロコシγ−ゼインプロモーター、またはトウモロコシＡＤＰ−ｇｐｐプロモーター、またはトウモロコシＱプロモータープロモーター、またはイネグルテリン−１プロモーターであってもよい。１つの実施形態において、このプロモーターは、配列番号１１または配列番号１２または配列番号６７または配列番号９８を含む。さらに、別の好ましい実施形態において、このポリヌクレオチドは、プロモーターに対してセンス方向に方向付けられる。本発明の発現カセットは、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに作用可能に連結されているシグナル配列をさらにコードしてもよい。このシグナル配列は、好ましくは、作用可能に連結されているポリペプチドを、植物の液胞、小胞体、葉緑体、デンプン顆粒、種子または細胞壁に標的化する。このシグナル配列は、ｗａｘｙからのＮ末端シグナル配列、γ−ゼインからのＮ末端シグナル配列、またはデンプン結合ドメインを含む。
【００２２】
本発明はさらに、本発明の発現カセットを含むベクターまたは細胞に向けられる。この細胞は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、単子葉植物細胞、双子葉植物細胞、Ｌｉｌｉｏｐｓｉｄａ細胞、Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ細胞、トウモロコシ細胞、および穀物細胞、例えば、イネ細胞からなる群より選択されてもよい。
【００２３】
さらに、本発明は、本発明のベクターで安定に形質転換された植物を含む。配列番号１、１０、１３、１４、１５、１６、３３、３５もしくは８８のいずれかのアミノ酸配列を有するか、または配列番号２、９もしくは８７のいずれかを含むポリヌクレオチドによってコードされるα−アミラーゼを含むベクターで安定に形質転換された植物が提供される。
【００２４】
別の実施形態において、配列番号２４もしくは３４のいずれかのアミノ酸配列を有するか、または配列番号４もしくは２５のいずれかを含むポリヌクレオチドによってコードされるプルラナーゼを含むベクターで安定に形質転換された植物が提供される。配列番号２６もしくは２７のいずれかのアミノ酸配列を有するか、または配列番号６を含むポリヌクレオチドによってコードされるα−グルコシダーゼを含むベクターで安定に形質転換された植物がさらに提供される。配列番号１８、２０、２８、２９、３０、３８、４０、４２、もしくは４４のいずれかのアミノ酸配列を有するか、または配列番号１９、２１、３７、３９、４１、もしくは４３のいずれかを含むポリヌクレオチドによってコードされるグルコースイソメラーゼを含むベクターで安定に形質転換された植物がさらに本明細書に記載される。別の実施形態において、配列番号４５、４７、もしくは４９のいずれかのアミノ酸配列を有するか、または配列番号４６、４８、５０、もしくは５９のいずれかを含むポリヌクレオチドによってコードされるグルコースアミラーゼを含むベクターで安定に形質転換された植物が記載される。
【００２５】
さらなる実施形態は、配列番号６２、６４、もしくは６６のいずれかのアミノ酸配列を有するか、または配列番号６１、６３、もしくは６５のいずれかを含むポリヌクレオチドによってコードされるキシラナーゼを含むベクターで安定に形質転換された植物を提供する。プロテアーゼを含むベクターで安定に形質転換された植物もまた提供される。このプロテアーゼは、配列番号７０に示されるようなアミノ酸配列を有するか、または配列番号６９を有するポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有するブロメラインであってもよい。別の実施形態において、セルラーゼを含むベクターで安定に形質転換された植物が提供される。このセルラーゼは、配列番号７９、８０、８１、８２、９３または９４のいずれかを含むポリヌクレオチドによってコードされるセロビオヒドロラーゼであってもよい。
【００２６】
さらなる実施形態は、エンドグルカナーゼなどのグルカナーゼを含むベクターで安定に形質転換された植物を提供する。このエンドグルカナーゼは、配列番号８４におけるようなアミノ酸配列を有するか、または配列番号８３を含むポリヌクレオチドによってコードされるエンドグルカナーゼＩであってもよい。ベータグルコシダーゼを含むベクターで安定に形質転換された植物もまた提供される。このベータグルコシダーゼは、配列番号９０もしくは９２に示されるアミノ酸配列を有するか、または配列番号８９もしくは９１を有するポリヌクレオチドによってコードされるベータグルコシダーゼ２またはベータグルコシダーゼＤであってもよい。別の実施形態において、エステラーゼを含むベクターで安定に形質転換された植物が提供される。このエステラーゼは、配列番号９９を含むポリヌクレオチドによってコードされるフェルラ酸エステラーゼであってもよい。
【００２７】
本発明の安定に形質転換された植物からの植物生成物、例えば、種子、果実、または穀粒などがさらに提供される。
【００２８】
別の実施形態において、本発明は、そのゲノムが、プロモーター配列に作用可能に連結されている少なくとも１つのプロセシング酵素をコードする組換えポリヌクレオチドで増強されており、そのポリヌクレオチドの配列が植物における発現のために最適化されている形質転換植物に向けられる。その植物は、単子葉植物、例えば、トウモロコシもしくはイネ、または双子葉植物であってもよい。その植物は、穀物植物または商業的に栽培される植物であってもよい。このプロセシング酵素は、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルカナーゼ、β−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、ネオ−プルラナーゼ、イソ−プルラナーゼ、アミロプルラナーゼ、セルラーゼ、エキソ−１，４−β−セロビオヒドロラーゼ、エキソ−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ、Ｌ−アラビナーゼ、α−アラビノシダーゼ、ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、マンナーゼ、マンノシダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、プロテアーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、エステラーゼ、フィターゼ、およびリパーゼからなる群より選択される。このプロセシング酵素は、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースイソメラーゼ、β−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、ネオ−プルラナーゼ、イソ−プルラナーゼ、およびアミロプルラナーゼからなる群より選択されるデンプンプロセシング酵素である。この酵素は、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコースイソメラーゼ、α−グルコシダーゼ、およびプルラナーゼから選択されてもよい。このプロセシング酵素は超好熱性由来であってもよい。本発明のこの態様に従って、この酵素は、プロテアーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、エステラーゼ、フィターゼ、セルラーゼ、ベータグルコシダーゼ、およびリパーゼからなる群より選択される非デンプン分解酵素であってもよい。このような酵素は超好熱性由来であってもよい。１つの実施形態において、この酵素は、植物の液胞、小胞体、葉緑体、デンプン顆粒、種子または細胞壁に蓄積する。さらに、別の実施形態において、植物のゲノムは、非超好熱性酵素を含む第２の組換えポリヌクレオチドでさらに増強されてもよい。
【００２９】
本発明の別の態様において、そのゲノムが、プロモーター配列に作用可能に連結した、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースイソメラーゼ、α−グルコシダーゼ、プルラナーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、グルカナーゼ、ベータグルコシダーゼ、エステラーゼ、フィターゼまたはリパーゼからなる群より選択される少なくとも１つのプロセシング酵素をコードする組換えポリヌクレオチドで増強され、そのポリヌクレオチドの配列が植物における発現のために最適化されている、形質転換植物が提供される。
【００３０】
別の実施形態は、そのゲノムが、プロモーター配列に作用可能に連結した、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースイソメラーゼ、α−グルコシダーゼ、プルラナーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、グルカナーゼ、フィターゼ、ベータグルコシダーゼ、エステラーゼ、またはリパーゼからなる群より選択される少なくとも１つのプロセシング酵素をコードする組換えポリヌクレオチドで増強され、そのポリヌクレオチドの配列がトウモロコシ植物における発現のために最適化されている、形質転換トウモロコシ植物に向けられる。
【００３１】
そのゲノムが、プロモーターおよびシグナル配列に作用可能に連結した、配列番号８３を有する組換えポリヌクレオチドで増強されている、形質転換植物が提供される。加えて、そのゲノムが、プロモーターおよびシグナル配列に作用可能に連結した、配列番号９３または９４を有する組換えポリヌクレオチドで増強されている、形質転換植物が記載される。別の実施形態において、そのゲノムが、プロモーターおよびシグナル配列に作用可能に連結した、配列番号９５を有する組換えポリヌクレオチドで増強されている、形質転換植物である。さらに、そのゲノムが、配列番号９６を有する組換えポリヌクレオチドで増強されている、形質転換植物が記載される。そのゲノムが、配列番号９７を有する組換えポリヌクレオチドで増強されている、形質転換植物もまた記載される。そのゲノムが、配列番号９９を有する組換えポリペプチドで増強されている、形質転換植物もまた記載される。
【００３２】
形質転換植物の生成物は、本明細書でさらに想定される。この生成物は、例えば、種子、果実、または穀粒を含む。この生成物は、代替的には、プロセシング酵素、デンプンまたは糖であってもよい。
【００３３】
本発明の安定に形質転換された植物から得られる植物がさらに記載される。この局面において、この植物は、雑種植物または同系植物であり得る。
【００３４】
デンプン組成物は、プロテアーゼ、グルカナーゼ、またはエステラーゼである少なくとも１つのプロセシング酵素を含む本発明のさらなる実施形態である。
【００３５】
穀粒は、本発明の別の実施形態であり、これは、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースイソメラーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ベータグルコシダーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼまたはフィターゼである、少なくとも１つのプロセシング酵素を含む。
【００３６】
別の実施形態において、デンプン顆粒を調製する方法が提供され、この方法は以下の工程を含む。少なくとも１つの酵素を活性化する条件下で、少なくとも１つの非デンプンプロセシング酵素を含む穀粒を処理して、デンプン顆粒および非デンプン分解生成物を含む混合物を産生し、この穀粒は形質転換植物から得られ、そのゲノムが、少なくとも１つの酵素をコードする発現カセットで増強されている工程；およびこの混合物からデンプン顆粒を分離する工程。その中で、この酵素は、プロテアーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、フィターゼ、リパーゼ、ベータグルコシダーゼ、セルラーゼまたはエステラーゼであってもよい。さらに、この酵素は好ましくは超好熱性由来である。この穀粒は破砕した穀粒であってもよく、および／または低湿度もしくは高湿度条件下で処理されてもよい。代替的には、穀粒は二酸化硫黄で処理されてもよい。本発明は、混合物から非デンプン生成物を分離する工程をさらに含んでもよい。この方法によって得られるデンプン生成物および非デンプン生成物がさらに記載される。
【００３７】
なお別の実施形態において、形質転換トウモロコシまたはその部分を処理する工程を含む、ハイパースイートコーンを産生するための方法が提供され、そのゲノムは、少なくとも１つのデンプン分解酵素またはデンプン異性化酵素をコードする発現カセットで増強され、かつこの発現カセットを、トウモロコシ中のポリサッカライドを糖に変換するために少なくとも１つの酵素を活性化する条件下で、胚乳中で発現して、ハイパースイートコーンを生じる。この発現カセットは、酵素をコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結したプロモーターをさらに含んでもよい。このプロモーターは、例えば、構成的プロモーター、種子特異的プロモーター、または胚乳特異的プロモーターであってもよい。この酵素は超好熱性由来であってもよく、およびα−アミラーゼであってもよい。本明細書で使用される発現カセットは、少なくとも１つの酵素に作用可能に連結したシグナル配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含んでもよい。このシグナル配列は、例えば、この酵素をアポプラストまたは小胞体に方向付けてもよい。この酵素は、配列番号１３、１４、１５、１６、３３、または３５のいずれか１つを含む。この酵素はまた、配列番号８７を含んでもよい。
【００３８】
最も好ましい実施形態において、形質転換トウモロコシまたはその部分を処理する工程を含む、ハイパースイートコーンを産生する方法が記載され、そのゲノムは、α−アミラーゼをコードする発現カセットで増強され、かつこの発現カセットを、トウモロコシ中のポリサッカライドを糖に変換するために少なくとも１つの酵素を活性化する条件下で、胚乳中で発現して、ハイパースイートコーンを生じる。この酵素は超好熱性由来であってもよく、および超好熱性α−アミラーゼは、配列番号１０、１３、１４、１５、１６、３３、もしくは３５、またはα−アミラーゼ活性を有するその酵素的に活性なフラグメントのいずれかのアミノ酸配列を含んでもよい。この酵素は配列番号８７を含む。
【００３９】
加水分解デンプン生成物の溶液を調製するための方法が本明細書に記載され、この方法は以下の工程を含む。デンプン顆粒および少なくとも１つのプロセシング酵素を含む植物部分を、少なくとも１つの酵素を活性化する条件下で処理し、それによって、デンプン顆粒をプロセスして加水分解デンプン生成物を含む水溶液を形成し、植物部分は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素をコードする発現カセットで増強されている工程；ならびにこの加水分解デンプン生成物を含む水溶液を収集する工程。この加水分解デンプン生成物は、デキストリン、マルトオリゴサッカライド、糖、および／またはそれらの混合物を含んでもよい。この酵素は、α−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、アミロプルラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。さらに、この酵素は超好熱性であってもよい。別の局面において、植物部分のゲノムが、非超好熱性デンプンプロセシング酵素をコードする発現カセットでさらに増強されてもよい。非超好熱性デンプンプロセシング酵素は、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、プルラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、またはそれらの組み合わせからなる群より選択されてもよい。さらに別の局面において、このプロセシング酵素は、好ましくは胚乳で発現される。この植物部分は穀粒であり、およびトウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、サトウキビまたはイネ由来であってもよい。少なくとも１つのプロセシング酵素は、プロモーター、およびデンプン顆粒または小胞体、または細胞壁に酵素を標的化するシグナル配列に作用可能に連結されている。この方法は、加水分解デンプン生成物を単離する工程、および／または加水分解デンプン生成物を発酵させる工程をさらに含んでもよい。
【００４０】
本発明の別の態様において、加水分解デンプン生成物を調製するための方法が記載され、この方法は以下の工程を含む。デンプン顆粒および少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素を含む植物部分を、少なくとも１つの酵素を活性化する条件下で処理し、それによって、デンプン顆粒をプロセスして加水分解デンプン生成物を含む水溶液を形成し、植物部分は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つのα−アミラーゼをコードする発現カセットで増強されている工程；ならびに加水分解デンプン生成物を含む水溶液を収集する工程。α−アミラーゼは超好熱性であってもよく、この超好熱性α−アミラーゼは、配列番号１、１０、１３、１４、１５、１６、３３、もしくは３５、またはα−アミラーゼ活性を有するその活性なフラグメントのいずれかのアミノ酸配列を含む。発現カセットは、配列番号２、９、４６、もしくは５２、その相補体、または低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で配列番号２、９、４６、もしくは５２のいずれかにハイブリダイズし、かつα−アミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのいずれかから選択されるポリヌクレオチドを含んでもよい。さらに、本発明は、非超好熱性デンプンプロセシング酵素をコードするポリヌクレオチドをさらに含む形質転換植物のゲノムをさらに提供する。代替的には、この植物部分は、非超好熱性デンプンプロセシング酵素で処理されてもよい。
【００４１】
本発明はさらに、植物の細胞中に存在する少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素を含み、形質転換植物から得られ、そのゲノムが少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素をコードする発現カセットで増強されている、形質転換植物部分に向けられる。好ましくは、この酵素は、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースイソメラーゼ、β−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、ネオ−プルラナーゼ、イソ−プルラナーゼ、およびアミノプルラナーゼからなる群より選択されるデンプンプロセシング酵素である。さらに、この酵素は超好熱性であってもよい。この植物は、例えば、トウモロコシまたはイネなどの任意の植物であってもよい。
【００４２】
本発明の別の実施形態は、植物の細胞壁または細胞中に存在する少なくとも１つの非デンプンプロセシング酵素を含み、形質転換植物から得られ、そのゲノムが少なくとも１つの非デンプンプロセシング酵素または非デンプンポリサッカライドプロセシング酵素をコードする発現カセットで増強されている、形質転換植物部分である。この酵素は超好熱性であってもよい。さらに、この非デンプンプロセシング酵素は、プロテアーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、エステラーゼ、フィターゼ、ベータグルコシダーゼ、セルラーゼ、またはリパーゼであってもよい。この植物部分は任意の植物部分であり得るが、好ましくは、穂、種子、果実、穀粒、飼い葉、もみ殻、またはバガスである。
【００４３】
本発明はまた、形質転換植物部分に向けられる。例えば、配列番号１、１０、１３、１４、１５、１６、３３、もしくは３５のいずれかのアミノ酸配列を有するか、または配列番号２、９、４６、もしくは５２のいずれかを含むポリヌクレオチドによってコードされるα−アミラーゼを含む形質転換植物部分、配列番号５、２６もしくは２７のいずれかのアミノ酸配列を有するか、または配列番号６を含むポリヌクレオチドによってコードされるα−グルコシダーゼを含む形質転換植物部分、配列番号２８、２９、３０、３８、４０、４２、もしくは４４のいずれかの１つのアミノ酸配列を有するか、または配列番号１９、２１、３７、３９、４１、もしくは４３のいずれか１つを含むポリヌクレオチドによってコードされるグルコースイソメラーゼを含む形質転換植物部分、配列番号４５、もしくは配列番号４７、もしくは配列番号４９のアミノ酸配列を有するか、または配列番号４６、４８、５０、もしくは５９のいずれかを含むポリヌクレオチドによってコードされるグルコアミラーゼを含む形質転換植物部分、および配列番号４または２５のいずれかを含むポリヌクレオチドによってコードされるプルラナーゼを含む形質転換植物部分が記載される。
【００４４】
本発明はまた、形質転換植物部分に向けられる。例えば、配列番号６２、６４もしくは６６のいずれかのアミノ酸配列を有するか、または配列番号６１、６３、もしくは６５のいずれかを含むポリヌクレオチドによってコードされるキシラナーゼを含む形質転換植物部分である。プロテアーゼを含む形質転換植物部分もまた提供される。このプロテアーゼは、配列番号７０に示されるようなアミノ酸配列を有するか、または配列番号６９を有するポリヌクレオチドによってコードされるブロメラインであってもよい。別の実施形態において、セルラーゼを含む形質転換植物部分が提供される。このセルラーゼは、配列番号７９、８０、８１、８２、９３または９４のいずれかを含むポリヌクレオチドによってコードされるセロビオヒドロラーゼであってもよい。
【００４５】
さらなる実施形態は、形質転換植物部分に、エンドグルカナーゼなどのグルカナーゼを提供する。このエンドグルカナーゼは、配列番号８４に示されるようなアミノ酸配列を有するか、または配列番号８３を含むポリヌクレオチドによってコードされるエンドグルカナーゼＩであってもよい。ベータグルコシダーゼを含む形質転換植物部分もまた提供される。このベータグルコシダーゼは、ベータグルコシダーゼ２またはベータグルコシダーゼＤであってもよく、これは、配列番号９０もしくは９２に示されるアミノ酸配列を有するか、または配列番号８９もしくは９１を有するポリヌクレオチドによってコードされる。別の実施形態において、エステラーゼを含む形質転換植物部分が提供される。このエステラーゼは、配列番号９９を含むポリヌクレオチドによってコードされるフェルラ酸エステラーゼであってもよい。
【００４６】
別の実施形態は、そこに含まれるデンプンプロセシング酵素を活性化する工程を含む、形質転換植物部分中でデンプンを転換する方法である。この方法に従って産生されるデンプン、デキストリン、マルトオリゴサッカライドまたは糖がさらに記載される。
【００４７】
本発明はさらに、植物部分の細胞壁または細胞中に少なくとも１つの非デンプンプロセシング酵素を含む形質転換植物部分を使用する方法を記載し、この方法は、以下の工程を含む。少なくとも１つの非デンプンポリサッカライドプロセシング酵素を含む形質転換植物部分を、少なくとも１つの酵素を活性化するための条件下で処理し、それによって、非デンプンポリサッカライドを消化して、オリゴサッカライドおよび／または糖を含む水溶液を形成し、植物部分は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つの非デンプンポリサッカライドプロセシング酵素をコードする発現カセットで増強されている工程；ならびにオリゴサッカライドおよび／または糖を含む水溶液を収集する工程。この非デンプンポリサッカライドプロセシング酵素は超好熱性であってもよい。
【００４８】
少なくとも１つのプロセシング酵素を含む形質転換種子を使用する方法は、以下の工程を含む。少なくとも１つのプロテアーゼまたはリパーゼを含む形質転換種子を、少なくとも１つの酵素を活性化するための条件下で処理して、アミノ酸および脂肪酸を含む水性混合物を生じ、この種子は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つの酵素をコードする発現カセットで増強されている工程；ならびに、水性混合物を収集する工程。アミノ酸、脂肪酸または両方が好ましく単離される。少なくとも１つのプロテアーゼまたはリパーゼが超好熱性であってもよい。
【００４９】
エタノールを調製するための方法は以下の工程を含む。少なくとも１つの酵素を活性化するための条件下で、少なくとも１つのポリサッカライドプロセシング酵素を含む植物部分を処理し、それによってポリサッカライドを消化してオリゴサッカライドまたは発酵可能な糖を形成し、植物部分は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つのポリサッカライドプロセシング酵素をコードする発現カセットで増強されている工程；および、発酵可能な糖またはオリゴサッカライドのエタノールへの転換を促進する条件下で、この発酵可能な糖をインキュベートする工程。この植物部分は、穀粒、果実、種子、茎、木部、野菜または根であってもよい。この植物部分は、オートムギ、オオムギ、コムギ、ベリー、ブドウ、ライムギ、トウモロコシ、イネ、ジャガイモ、テンサイ、サトウキビ、パイナップル、草および木からなる群より選択される植物から得られてもよい。別の好ましい実施形態において、ポリサッカライドプロセシング酵素は、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、プルラナーゼ、またはそれらの組み合わせである。
【００５０】
エタノールを調製するための方法が提供され、この方法は以下の工程を含む。一定時間の間、熱を用いて、かつ少なくとも１つの酵素を活性化するための条件下で、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、またはプルラナーゼ、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの酵素を含む植物部分を処理し、それによってポリサッカライドを消化して発酵可能な糖を形成し、植物部分は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つの酵素をコードする発現カセットで増強されている工程；および発酵可能な糖のエタノールへの転換を促進する条件下で、この発酵可能な糖をインキュベートする工程。少なくとも１つの酵素が超好熱性または中温性であってもよい。
【００５１】
別の実施形態において、エタノールを調製するための方法が提供され、この方法は以下の工程を含む。少なくとも１つの酵素を活性化するための条件下で、少なくとも１つの非デンプンプロセシング酵素を含む植物部分を処理し、それによって非デンプンポリサッカライドをオリゴサッカライドおよび発酵可能な糖まで消化し、植物部分は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つの酵素をコードする発現カセットで増強されている工程；ならびに、発酵可能な糖のエタノールへの転換を促進する条件下で、該発酵可能な糖をインキュベートする工程。非デンプンプロセシング酵素は、キシラナーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ベータグルコシダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、リパーゼまたはフィターゼであってもよい。
【００５２】
エタノールを調製するための方法がさらに提供され、この方法は以下の工程を含む。少なくとも１つの酵素を活性化するための条件下で、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、またはプルラナーゼ、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの酵素を含む植物部分を処理し、それによってポリサッカライドを消化して発酵可能な糖を形成し、植物部分は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つの酵素をコードする発現カセットで増強されている工程；および、発酵可能な糖のエタノールへの転換を促進する条件下で、この発酵可能な糖をインキュベートする工程。この酵素は超好熱性であってもよい。
【００５３】
さらに、さらなる甘味料を加えることを伴わずに甘みのあるデンプン質食品を製造するための方法が記載され、この方法は以下の工程を含む。少なくとも１つの酵素を活性化するための条件下で、少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素を含む植物部分を処理し、それによって、甘みのある製品を形成するために、この植物部分中のデンプン顆粒を糖にプロセスし、植物部分は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つの酵素をコードする発現カセットで増強されている工程；および、この甘みのある製品をデンプン質食品にプロセスする工程。このデンプン質食品は甘みのある製品および水から形成されてもよい。さらに、デンプン質食品は、麦芽、香料、ビタミン、ミネラル、着色料またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。少なくとも１つの酵素は超好熱性であってもよい。この酵素は、α−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、グルコースイソメラーゼまたはそれらの任意の組み合わせから選択されてもよい。この植物はさらに、ダイズ、ライムギ、オートムギ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、イネおよびサトウキビからなる群より選択されてもよい。デンプン質食品は、シリアル食品、朝食用食品、インスタント食品、または焼いた食品であってもよい。加工は、ベーキング、煮沸、加熱、蒸気処理、放電またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。
【００５４】
本発明はさらに、さらなる甘味料を加えることなくデンプン含有製品を甘くする方法に向けられ、この方法は以下の工程を含む。少なくとも１つの酵素を活性化するための条件下で、少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素を含むデンプンを処理し、それによって、甘みのあるデンプンを形成するためにデンプンを消化して糖を形成し、デンプンは形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つの酵素をコードする発現カセットで増強されている工程；および、甘みのあるデンプンを製品に加えて、甘みのあるデンプン含有食品を製造する工程。この形質転換植物は、トウモロコシ、ダイズ、ライムギ、オートムギ、オオムギ、コムギ、イネおよびサトウキビからなる群より選択されてもよい。この少なくとも１つの酵素は超好熱性であってもよい。この少なくとも１つの酵素は、α−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、グルコースイソメラーゼまたはそれらの任意の組み合わせであってもよい。
【００５５】
デンプン質食品および甘みのあるデンプン含有製品が本明細書で提供される。
【００５６】
本発明はまた、ポリサッカライド含有果実または野菜を甘くするための方法に向けられ、この方法は以下の工程を含む。少なくとも１つの酵素を活性化するための条件下で、少なくとも１つのポリサッカライドプロセシング酵素を含む果実または野菜を処理し、それによって、この果実または野菜中のポリサッカライドをプロセスして糖を形成し、甘みのある果実または野菜を生じ、果実または野菜は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つのポリサッカライドプロセシング酵素をコードする発現カセットで増強されている工程。果実または野菜は、ジャガイモ、トマト、バナナ、カボチャ、エンドウマメ、およびマメからなる群より選択される。この少なくとも１つの酵素が超好熱性由来であってもよい。
【００５７】
本発明はさらに、糖を含む水溶液を調製する方法に向けられ、この方法は、植物部分から得られるデンプン顆粒を、少なくとも１つの酵素を活性化する条件下で処理し、それによって糖を含む水溶液を生じる工程を含む。
【００５８】
別の実施形態は、デンプン由来製品の回収の前に穀粒をウェットまたはドライ製粉することを含まない、穀粒からデンプン由来生成物を調製する方法に向けられ、この方法は以下の工程を含む。少なくとも１つの酵素を活性化する条件下で、デンプン顆粒および少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素を含む植物部分を処理し、それによって、デンプン顆粒をプロセスしてデキストリンまたは糖を含む水溶液を形成し、この植物部分は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素をコードする発現カセットで増強されている工程；ならびに、デンプン由来生成物を含む水溶液を収集する工程。この少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素は超好熱性であってもよい。
【００５９】
α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースイソメラーゼ、α−グルコシダーゼ、およびプルラナーゼを単離する方法がさらに提供され、この方法は、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースイソメラーゼ、α−グルコシダーゼ、またはプルラナーゼを含む形質転換植物を栽培する工程、ならびにそこからα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースイソメラーゼ、α−グルコシダーゼ、またはプルラナーゼを単離する工程を含む。キシラナーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ベータグルコシダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、フィターゼまたはリパーゼを単離する方法もまた提供され、この方法は、キシラナーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ベータグルコシダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、フィターゼまたはリパーゼを含む形質転換植物を栽培する工程、ならびにそこからキシラナーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、エステラーゼ、ベータグルコシダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、フィターゼまたはリパーゼを単離する工程を含む。
【００６０】
マルトデキストリンを調製する方法は以下の工程を含む。トランスジェニック穀粒を水と混合する工程；この混合物を加熱する工程；生成したデキストリンシロップから固形物を分離する工程；およびマルトデキストリンを収集する工程。トランスジェニック穀粒は、少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素を含む。このデンプンプロセシング酵素は、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、およびグルコースイソメラーゼであってもよい。さらに、この方法によって産生したマルトデキストリンは、この方法によって産生した組成物と同様に提供される。
【００６１】
デンプン由来生成物の回収の前に穀粒の機械的破壊を含まない、穀粒からデキストリンまたは糖を調製する方法が提供され、この方法は以下の工程を含む。少なくとも１つの酵素を活性化する条件下で、デンプン顆粒および少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素を含む植物部分を処理し、それによって、デンプン顆粒をプロセスしてデキストリンまたは糖を含む水溶液を形成し、この植物部分は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素をコードする発現カセットで増強されている工程；ならびに、糖および／またはデキストリンを含む水溶液を収集する工程。
【００６２】
本発明はさらに、発酵可能な糖を製造する方法に向けられ、この方法は以下の工程を含む。少なくとも１つの酵素を活性化する条件下で、デンプン顆粒および少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素を含む植物部分を処理し、それによって、デンプン顆粒をプロセスしてデキストリンまたは糖を含む水溶液を形成し、この植物部分は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つのプロセシング酵素をコードする発現カセットで増強されている工程；ならびに、発酵可能な糖を含む水溶液を収集する工程。
【００６３】
さらに、超好熱性α−アミラーゼを含むベクターで安定に形質転換されたトウモロコシ植物が本明細書で提供される。例えば、好ましくは、配列番号１または配列番号５１に対して６０％より多く同一であるα−アミラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターで安定に形質転換されたトウモロコシ植物が含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６４】
本発明に従って、「自己プロセシング」植物または植物部分は、プロセシング、例えば、植物中のデンプン、ポリサッカライド、脂質、タンパク質などを修飾することが可能であるプロセシング酵素をコードする単離されたポリヌクレオチドをそこに組み込んでおり、このプロセシング酵素は、中温性、好熱性、または超好熱性であり得、および粉砕、水の添加、加熱、またはさもなくば酵素の機能のために好ましい条件を提供することによって活性化されてもよい。プロセシング酵素をコードする単離されたポリヌクレオチドは、そこでの発現のために植物または植物部分に組み込まれる。プロセシング酵素の発現および活性化の際に、本発明の植物または植物部分は、プロセシング酵素が作用する基質をプロセスする。それゆえに、本発明の植物または植物部分は、これらの基質をプロセスするために通常必要とされる外部の供給源の非存在下で、または減少したその外部の供給源を用いて、そこに含まれるプロセシング酵素の活性化の際に酵素の基質を自己プロセシングすることが可能である。このようなものとして、形質転換植物、形質転換植物細胞、および形質転換植物部分は、本発明に従ってそこに組み込まれた酵素を介して、所望の基質をプロセスする「ビルト−イン」プロセシング能力を有する。好ましくは、このプロセシング酵素をコードするポリヌクレオチドは「遺伝的に安定」であり、すなわち、このポリヌクレオチドは、本発明の形質転換植物または植物部分中で安定に維持され、かつ後に続く世代を通して子孫によって安定に遺伝される。
【００６５】
本発明に従って、このような植物および植物部分を利用する方法は、デンプンに由来する生成物の回収の前に、植物部分の完全性を製粉するか、またはさもなくば物理的に破壊する必要性を除外することができる。例えば、本発明は、デンプンに由来する生成物を回収するために、トウモロコシおよび他の穀粒をプロセスするための改善された方法を提供する。本発明はまた、外因性に産生されたデンプン加水分解酵素を加えることの必要性なしで、デンプン内での特異的結合の加水分解のために適切である、顆粒中または顆粒上のデンプン分解酵素のレベルを含むデンプン顆粒の回収を可能にする方法を提供する。本発明はまた、本発明の方法によって得られる、自己プロセシング植物または植物部分からの改善された生成物を提供する。
【００６６】
加えて、「自己プロセシング」形質転換植物部分、例えば、穀粒、および形質転換植物は、既存の技術に伴う主要な問題点を回避する。すなわち、プロセシング酵素は、典型的には、費用がかかる培養上清から酵素を単離することを必要とする、微生物の発酵によって産生され；単離された酵素は、特定の応用のために製剤化される必要があり、その基質と酵素を加え、混合し、および反応させるためのプロセスおよび機構が開発されなければならない。本発明の形質転換植物またはその部分はまた、プロセシング酵素それ自体、ならびにその酵素の基質および生成物、例えば、糖、アミノ酸、脂肪酸およびデンプンおよび非デンプンポリサッカライドの供給源である。本発明の植物はまた、雑種および同系などの子孫植物を調製するために利用されてもよい。
【００６７】
プロセシング酵素およびそれらをコードするポリヌクレオチド
プロセシング酵素（中温性、好熱性、または超好熱性）をコードするポリヌクレオチドは、植物または植物部分に導入される。このプロセシング酵素は、植物またはトランスジェニック植物中で見い出されるような、それが機能する所望の基質に基づいて、および／または所望の最終生成物に基づいて選択される。例えば、このプロセシング酵素は、デンプンプロセシング酵素、例えば、デンプン分解酵素もしくはデンプン異性化酵素、または非デンプンプロセシング酵素であってもよい。適切なプロセシング酵素には以下が含まれるがこれらに限定されない：例えば、α−アミラーゼ、エンドもしくはエキソ−１，４、または１，６−α−Ｄ、グルコアミラーゼ、グルコースイソメラーゼ、β−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、および他のエキソ−アミラーゼ；ならびにデンプン脱分岐酵素、例えば、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、ネオ−プルラナーゼ、イソ−プルラナーゼ、アミロプルラナーゼなど、グルコシルトランスフェラーゼ、例えば、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼなど、セルラーゼ、例えば、エキソ−１，４−β−セロビオヒドロラーゼ、エキソ−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、β−グルコシダーゼなど；エンドグルカナーゼ、例えば、エンド−１，３−β−グルカナーゼおよびエンド−１，４−β−グルカナーゼなど；Ｌ−アラビナーゼ、例えば、エンド−１，５−α−Ｌ−アラビナーゼ、α−アラビノシダーゼなど；ガラクタナーゼ、例えば、エンド−１，４−β−Ｄ−ガラクタナーゼ、エンド−１，３−β−Ｄ−ガラクタナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼなど；マンナーゼ、例えば、エンド−１，４−β−Ｄ−マンナーゼ、β−マンノシダーゼ、α−マンノシダーゼなど；キシラナーゼ、例えば、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、β−Ｄ−キシロシダーゼ、１，３−β−Ｄ−キシラナーゼなど；ならびにペクチナーゼ；ならびに、プロテアーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、チオレドキシン／チオレドキシン還元酵素、エステラーゼ、フィターゼ、およびリパーゼを含む非デンプンプロセシング酵素。
【００６８】
１つの実施形態において、プロセシング酵素は、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、アミロプルラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、またはそれらの組み合わせの群から選択されるデンプン分解酵素である。この実施形態に従って、デンプン分解酵素は、本明細書にさらに記載されるように、植物または植物部分に含まれる酵素の活性化の際に、自己プロセシング植物または植物部分がデンプンを分解することを許容することを可能にする。このデンプン分解酵素は、所望の最終生成物に基づいて選択される。例えば、グルコースイソメラーゼは、グルコース（ヘキソース）をフルクトースに転換するために選択され得る。代替的には、酵素は、例えば、プロセシングの程度の関数に基づく種々の鎖の長さを有するか、または所望の種々の分枝パターンを有する、所望されるデンプン由来の最終生成物に基づいて選択されてもよい。例えば、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、またはアミロプルラナーゼは、デキストリン生成物を産生するための短いインキュベーション時間の下で、およびより短い鎖の生成物または糖を産生するためのより長いインキュベーション時間の下で使用することができる。プルラナーゼは、高アミロースデンプンを生じるデンプン中の分枝の点を特異的に加水分解するために使用することができ、またはネオプルラナーゼは、散在するα１，６結合を有するα１，４結合のストレッチを有するデンプンを産生するために使用することができる。グルコシダーゼは、限界デキストリンを産生するために使用することができ、または異なる酵素の組み合わせが、他のデンプン誘導体を製造するために使用することができる。
【００６９】
別の実施形態において、プロセシング酵素は、プロテアーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、フィターゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ベータグルコシダーゼおよびエステラーゼから選択される非デンプンプロセシング酵素である。これらの非デンプン分解酵素は、本発明の自己プロセシング植物または植物部分が、植物の標的化された領域中に組み込むことを可能にし、活性化の際に、その中のデンプン顆粒をインタクトにしたままで、植物を破壊する。例えば、好ましい実施形態において、非デンプン分解酵素は、植物細胞の胚乳マトリックスを標的とし、活性化の際に、その中のデンプン顆粒をインタクトにしたままで、かつ得られる材料からより容易に回収可能にしながら、胚乳マトリックスを破壊する。
【００７０】
プロセシング酵素の組み合わせが、本発明によってさらに想定される。例えば、デンプンプロセシング酵素および非デンプンプロセシング酵素が組み合わせて使用されてもよい。プロセシング酵素の組み合わせが、各々の酵素をコードする複数の遺伝子構築物の使用を利用することによって得てもよい。代替的には、酵素で安定して形質転換された個々のトランスジェニック植物が、両方の酵素を含む植物を得るための公知の方法によって交雑されてもよい。別の方法は、トランスジェニック植物とともに外因性酵素の使用を含む。
【００７１】
プロセシング酵素は、任意の供給源から単離または誘導されてもよく、およびそれに対応するポリヌクレオチドは、当業者によって確認されることが可能である。例えば、α−アミラーゼなどのプロセシング酵素は、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ（例えば、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｈｉｒｏｕｓａｍｉおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ（例えば、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅａｌｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、ならびにトウモロコシ、オオムギ、およびイネなどの植物に由来する。
【００７２】
本発明のプロセシング酵素は、植物のゲノム中に導入され、かつ発現された後で活性化されることが可能である。酵素を活性化するための条件は各個々の酵素について決定され、温度、ｐＨ、水和、金属の存在、化合物を活性化すること、化合物を不活性化することなどの様々な条件を含み得る。例えば、温度依存的な酵素には、中温性、好熱性、および超好熱性の酵素が含まれ得る。中温性酵素は、典型的には、２０℃〜６５℃の間の温度で最大活性を有し、７０℃よりも高い温度で不活性化される。中温性酵素は、３０〜３７℃で顕著な活性を有し、３０℃における活性は、好ましくは、最大活性の少なくとも１０％であり、より好ましくは、最大活性の少なくとも２０％である。
【００７３】
好熱性酵素は、５０℃〜８０℃の間の温度で最大活性を有し、８０℃よりも高い温度で不活性化される。好熱性酵素は、好ましくは、３０℃で最大活性の２０％未満、より好ましくは、最大活性の１０％未満を有する。
【００７４】
「超好熱性」酵素は、さらにより高い温度において活性を有する。超好熱性酵素は、８０℃よりも高い温度で最大活性を有し、少なくとも８０℃の温度で活性を保持し、より好ましくは少なくとも９０℃の温度で活性を保持し、最も好ましくは少なくとも９５℃の温度で活性を保持する。超好熱性酵素はまた、低い温度で減少した活性を有する。超好熱性酵素は、３０℃において活性を有してもよく、これは最大活性の１０％未満であり、好ましくは最大活性の５％未満である。
【００７５】
プロセシング酵素をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、植物のような選択された生物中の発現のために最適化されているコドンを含むように修飾される（例えば、Ｗａｄａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：２３６７（１９９０）、Ｍｕｒｒａｙら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７：４７７（１９８９）、米国特許第５，０９６，８２５号、同第５，６２５，１３６号、同第５，６７０，３５６号および同第５，８７４，３０４号を参照のこと）。コドンが最適化された配列は合成配列であり、すなわち、それらは天然には存在せず、好ましくは、プロセシング酵素をコードする、コドン最適化されていない親のポリヌクレオチドによってコードされる、同一のポリペプチド（または全長ポリペプチドと実質的に同じ活性を有する、全長ポリペプチドの酵素的に活性なフラグメント）をコードする。プロセス適用におけるその性能が改善されるように、例えば、特定のプロセシング酵素をコードするＤＮＡの再帰的変異誘発を介して、親の供給源のポリペプチドから、ポリペプチドが生化学的に区別できるか、または改善されることが好ましい。好ましいポリヌクレオチドは、標的宿主植物における発現のために最適化され、かつプロセシング酵素をコードする。これらの酵素を調製するための方法には、変異誘発、例えば、再帰的変異誘発および選択が含まれる。変異誘発およびヌクレオチド配列変化のための方法は当分野において周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４８８（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：３６７（１９８７）；米国特許第４，８７３，１９２号；ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ編（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびそこに引用されている参考文献、ならびにＡｒｎｏｌｄら、Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｓｃｉ．，５１：５０９１（１９９６）を参照のこと。標的植物または生物中の核酸セグメントの発現を最適化するための方法は当分野において周知である。手短に述べると、標的生物によって使用される最適コドンを示すコドン使用頻度表が得られ、最適なコドンが標的ポリヌクレオチド中のコドンを置き換えるために選択され、次いで、最適化配列が化学的に合成される。トウモロコシにとって好ましいコドンは、米国特許第５，６２５，１３６号に記載される。
【００７６】
本発明のポリヌクレオチドの相補的核酸がさらに想定される。サザンブロットまたはノーザンブロットにおけるフィルター上の１００個よりも多くの相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションのための低ストリンジェンシー条件の例は、５０％ホルムアミド、例えば、３７℃における５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳ中のハイブリダイゼーション、および６０〜６５℃における０．１×ＳＳＣでの洗浄である。例示的な低ストリンジェンシー条件には、３７℃の３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液によるハイブリダイゼーション、および５０〜５５℃の１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍ  クエン酸酸ナトリウム）の洗浄が含まれる。例示的な中程度のストリンジェンシー条件には、３７℃の４０〜４５％ホルムアミド、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳ中のハイブリダイゼーション、および５５〜６０℃の０．５×〜１×ＳＳＣの洗浄が含まれる。
【００７７】
さらに、プロセシング酵素の「酵素的に活性な」フラグメントをコードするポリヌクレオチドがさらに想定される。本明細書で使用されるように、「酵素的に活性な」は、プロセシング酵素が適切な条件下で通常作用する基質を修飾するためのプロセシング酵素と実質的に同じ生物学的活性を有する、プロセシング酵素のポリペプチドフラグメントを意味する。
【００７８】
好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２、９、４６、および５２において提供されるようなα−アミラーゼをコードする、トウモロコシに最適化されたポリヌクレオチドである。別の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号４および２５に提供されるような、プルラナーゼをコードする、トウモロコシに最適化されたポリヌクレオチドである。さらに別の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号６に提供されるような、α−グルコシダーゼをコードする、トウモロコシに最適化されたポリヌクレオチドである。別の好ましいポリヌクレオチドは、配列番号１９、２１、３７、３９、４１、または４３を有する、グルコースイソメラーゼをコードする、トウモロコシに最適化されたポリヌクレオチドである。別の実施形態において、配列番号４６、４８、または５０に示されるような、グルコアミラーゼをコードする、トウモロコシに最適化されたポリヌクレオチドが好ましい。さらに、グルカナーゼ／マンナーゼ融合ポリペプチドについてのトウモロコシに最適化されたポリヌクレオチドが配列番号５７に提供される。本発明はさらに、場合によって、中程度の、または好ましくは低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつα−アミラーゼ、プルラナーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコアミラーゼ、グルカナーゼ、またはマンナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするようなポリヌクレオチドの相補体を提供する。
【００７９】
ポリヌクレオチドは、「核酸」または「ポリ核酸」と交換可能に使用されてもよく、糖、リン酸、およびプリンまたはピリミジンのいずれかである塩基を含むモノマー（ヌクレオチド）から構成される、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および一本鎖または二本鎖の形態のいずれかであるそのポリマーをいう。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、かつ天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される天然のヌクレオチドの既知のアナログを含む核酸を含む。他に示されない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に修飾されたその改変体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列ならびに明示的に示される配列を黙示的に含む。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（または全ての）第３の位置のコドンが、混合された塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成され得る。
【００８０】
「改変体」または実質的に同様の配列がさらに本発明に含まれる。ヌクレオチド配列については、改変体は、遺伝コードの縮重のために、ネイティブタンパク質の同一なアミノ酸配列をコードする配列を含む。これらのような天然に存在する対立遺伝子改変体は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ハイブリダイゼーション技術、およびライゲーション再アセンブリー技術のような周知の分子生物学技術の使用で同定することができる。改変体ヌクレオチド配列はまた、例えば、部位特異的変異誘発によって生成される、ネイティブタンパク質をコードするもの、ならびにアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードするものなどの、合成的に誘導されるヌクレオチド配列を含む。一般的に、本発明のヌクレオチド配列改変体は、少なくとも４０％、５０％、６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、最も好ましくは９９％でありかつこれらのクラスに基づくネイティブヌクレオチド配列と同一性の単一単位のパーセンテージを有する。例えば、７１％、７２％、７３％など、少なくとも９０％クラスまでである。改変体はまた、同定された遺伝子フラグメントに対応する全長遺伝子を含んでもよい。
【００８１】
調節配列：プロモーター／シグナル配列／選択マーカー
本発明のプロセシング酵素をコードするポリヌクレオチド配列は、例えば、植物内の特定の区画に超好熱性酵素を標的化するために、局在化シグナルまたはシグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列（ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端において）に作用可能に連結されてもよい。このような標的の例には、液胞、小胞体、葉緑体、アミロプラスト、デンプン顆粒、または細胞壁、または特定の組織、例えば、種子が含まれるがこれらに限定されない。特に、組織特異的プロモーターまたは誘導性プロモーターと併せた、植物中のシグナル配列を有するプロセシング酵素をコードするポリヌクレオチドの発現は、植物中で局在化した高レベルのプロセシング酵素を生じ得る。多数のシグナル配列が、特定の区画または特定の区画の外側へのポリヌクレオチドの発現または標的化に影響を与えることが知られている。適切なシグナル配列および標的化プロモーターは当分野において公知であり、これには本明細書に提供されるものが含まれるがこれらに限定されない。
【００８２】
例えば、特定の組織または器官中での発現が所望される場合、組織特異的プロモーターが使用されてもよい。対照的に、刺激に応答した遺伝子発現が所望される場合、誘導性プロモーターは選択の調節エレメントである。連続的発現が植物の細胞全体を通して所望される場合、構成的プロモーターが利用される。コアプロモーター配列から上流および／または下流のさらなる調節配列が、トランスジェニック植物中の異種ヌクレオチド配列の様々なレベルの発現をもたらすために、形質転換ベクターの発現構築物中に含まれてもよい。
【００８３】
種々の発現特性を有する多数の植物プロモーターが記載されている。記載されてきたいくつかの構成的プロモーターの例には、イネアクチン１（Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２：３３９９（１９９２）；米国特許第５，６４１，８７６号）、ＣａＭＶ  ３５Ｓ（Ｏｄｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８１０（１９８５））、ＣａＭＶ  １９Ｓ（Ｌａｗｔｏｎら、１９８７）、ｎｏｓ（Ｅｂｅｒｔら、１９８７）、Ａｄｈ（Ｗａｌｋｅｒら、１９８７）、スクロースシンターゼ（ＹａｎｇおよびＲｕｓｓｅｌｌ、１９９０）、およびユビキチンプロモーターが含まれる。
【００８４】
トランスジェニック植物中の遺伝子の組織特異的標的化における使用のためのベクターは、典型的には、組織特異的プロモーターを含み、また、エンハンサー配列などの他の組織特異的制御エレメントを含んでもよい。特定の植物組織における特異的または増強された発現を指向するプロモーターは、本発明の開示に鑑みて当業者には公知である。これらには、例えば、緑色組織に特異的であるｒｂｃＳプロモーター；根または損傷した葉組織においてより高い活性を有するｏｃｓ、ｎｏｓおよびｍａｓプロモーター；根における増強された発現を指向する短縮型（−９０〜＋８）３５Ｓプロモーター、根における発現を指向するα−チューブリン遺伝子、および胚乳における発現を指向するゼイン貯蔵タンパク質遺伝子に由来するプロモーターが含まれる。
【００８５】
組織特異的発現は、遺伝子産物が所望されない組織においてのみ発現されるアンチセンス遺伝子と組み合わせて、構成的に発現される遺伝子を導入すること（全ての組織）によって機能的に達成されてもよい。例えば、リパーゼをコードする遺伝子は、カリフラワーモザイクウイルスからの３５Ｓプロモーターを使用して、それが全ての組織において発現されるように、導入されてもよい。例えば、ゼインプロモーターを使用する、トウモロコシ穀粒中でリパーゼ遺伝子のアンチセンス転写物の発現は、種子中でのリパーゼタンパク質の蓄積を妨害する。従って、導入された遺伝子によってコードされるタンパク質は、穀粒以外の全ての組織に存在する。
【００８６】
さらに、いくつかの組織特異的調節遺伝子および／またはプロモーターが、植物において報告されている。いくつかの報告されている組織特異的遺伝子には、種子貯蔵タンパク質（例えば、ナピン、クルシフェリン、ベータ−コングリシニン、およびファセオリン）、ゼインまたはオイルボディータンパク質（例えば、オレオシン）をコードする遺伝子、脂肪酸生合成に関与する遺伝子（アシルキャリアタンパク質、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ、および脂肪酸デサチュラーゼ（ｆａｄ  ２−１））、および胚発生の間に発現される他の遺伝子（Ｂｃｅ４など、例えば、ＥＰ  ２５５３７８およびＫｒｉｄｌら、Ｓｅｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１：２０９（１９９１）を参照のこと）が含まれる。記載されている組織特異的プロモーターの例には以下が含まれる。レクチン（Ｖｏｄｋｉｎ、Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．，１３８；８７（１９８３）；Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍら、Ｄｅｒ．Ｇｅｎｅｔ．，１１：１６０（１９９０））、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ１（Ｖｏｇｅｌら、１９８９；Ｄｅｎｎｉｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：３９８３（１９８４））、トウモロコシ集光複合体（Ｓｉｍｐｓｏｎ、１９８６；Ｂａｎｓａｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：３６５４（１９９２））、トウモロコシ熱ショックタンパク質（Ｏｄｅｌｌら、１９８５；Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒら、１９８６）、エンドウマメスモールサブユニットＲｕＢＰカルボキシラーゼ（Ｐｏｕｌｓｅｎら、１９８６；Ｃａｓｈｍｏｒｅら、１９８３）、Ｔｉプラスミドマンノピンシンターゼ（Ｌａｎｇｒｉｄｇｅら、１９８９）、Ｔｉプラスミドノパリンシンターゼ（Ｌａｎｇｒｉｄｇｅら、１９８９）、ペチュニアカルコンイソメラーゼ（ｖａｎＴｕｎｅｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，７；１２５７（１９８８））、マメグリシンリッチタンパク質１（Ｋｅｌｌｅｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，３：１６３９（１９８９））、短縮型ＣａＭＶ  ３５ｓ（Ｏｄｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８１０（１９８５））、ジャガイモパタチン（Ｗｅｎｚｌｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１３：３４７（１９８９））、根細胞（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：７４４９（１９９０））、トウモロコシゼイン（Ｒｅｉｎａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：６４２５（１９９０）；Ｋｒｉｚら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０７：９０（１９８７）；Ｗａｎｄｅｌｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７：２３５４（１９８９）；Ｌａｎｇｒｉｄｇｅら、Ｃｅｌｌ，３４：１０１５（１９８３）；Ｒｅｉｎａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：７４４９（１９９０））、グロブリン−１（Ｂｅｌａｎｇｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２９：８６３（１９９１））、α−チューブリン、ｃａｂ（Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１５：４３１（１９８９））、ＰＥＰＣａｓｅ（ＨｕｄｓｐｅｔｈおよびＧｒｕｌａ、１９８９）、Ｒ遺伝子複合体関連プロモーター（Ｃｈａｎｄｌｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１：１１７５（１９８９））、およびカルコ��シンターゼプロモーター（Ｆｒａｎｋｅｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：２６０５（１９９１））。エンドウマメビシリンプロモーター（Ｃｚａｋｏら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２３５：３３（１９９２））は、種子特異的発現のために特に有用である（参照として本明細書に組み込まれる米国特許第５，６２５，１３６号もまた参照のこと）。成熟葉における発現のための他の有用なプロモーターは、老化の発生に際してスイッチが入るもの、例えば、シロイヌナズナからのＳＡＧプロモーターである（Ｇａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０：１９８６（１９９５））。
【００８７】
開花の際、またはその間に、果実発生を通して、少なくとも成熟の開始までに発現される果実特異的プロモーターのクラスは、米国特許第４，９４３，６７４号において議論され、この開示は参照として本明細書によって組み込まれる。綿繊維中で優先的に発現されるｃＤＮＡクローンは単離されている（Ｊｏｈｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５７６９（１９９２））。果実発生の間のディファレンシャル発現を示すトマトからのｃＤＮＡクローンは単離され、特徴付けされている（Ｍａｎｓｓｏｎら、Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２００：３５６（１９８５）、Ｓｌａｔｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１３７（１９８５））。ポリガラクツロナーゼ遺伝子についてのプロモーターは、果実成熟において活性である。ポリガラクツロナーゼ遺伝子は、米国特許第４，５３５，０６０号、同第４，７６９，０６１号、同第４，８０１，５９０号、および同第５，１０７，０６５号に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００８８】
組織特異的プロモーターの他の例には、葉への損傷後に（例えば、噛み付く昆虫から）葉細胞において、塊茎において（例えば、パタチン遺伝子プロモーター）、および繊維細胞において（例えば、発生的に調節される繊維細胞タンパク質の例はＥ６である）（Ｊｏｈｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５７６９（１９９２））発現を指向するものが含まれる。Ｅ６遺伝子は繊維中で最も活性であるが、低レベルの転写物は、葉、胚珠、および花卉において見い出される。
【００８９】
いくつかの「組織特異的」プロモーターの組織特異性は絶対的なものではないかもしれず、ジフテリア毒素配列を使用して、当業者によって試験されてもよい。異なる組織特異的プロモーターの組み合わせによって、「漏出性」発現を有する組織特異的発現を達成することができる（Ｂｅａｌｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，９：１５２７（１９９７））。他の組織特異的プロモーターは当業者によって単離されることができる（米国特許第５，５８９，３７９号を参照のこと）。
【００９０】
１つの実施形態において、α−アミラーゼなどのポリサッカライド加水分解遺伝子からの生成物の方向は、細胞質にではなく、アポプラストなどの特定のオルガネラに標的化されてもよい。このことは、タンパク質のアポプラスト特異的標的化を付与する、トウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナル配列（配列番号１７）の使用によって例示される。特定の区画にタンパク質または酵素を方向付けることは、それが基質と接触されない様式で酵素を局在化させることを可能にする。この様式で、酵素の酵素的作用は、酵素がその基質と接触するまで起こらない。この酵素は、酵素を含む植物の細胞または器官の物理的完全性を破壊するために細胞または植物の組織を製粉（細胞の完全性の物理的破壊）または加熱するプロセスによって、その基質と接触させることができる。例えば、中温性デンプン加水分解酵素は、アミロプラスト中のデンプン顆粒と接触させないために、アポプラストまたは小胞体に標的化することができる。穀粒の製粉は、穀粒の完全性を破壊し、次いでデンプン加水分解酵素がデンプン顆粒と接触する。この様式において、酵素およびその基質の同時局在化の潜在的にネガティブな効果を回避することができる。
【００９１】
別の実施形態において、組織特異的プロモーターには、トウモロコシγ−ゼインプロモーター（配列番号１２によって例示される）、またはトウモロコシＡＤＰ−ｇｐｐプロモーター（配列番号１１によって例示され、これは５’非翻訳配列およびイントロン配列を含む）、またはＱタンパク質プロモーター（配列番号９８によって例示される）、またはイネグルテリン１プロモーター（配列番号６７によって例示される）などの胚乳特異的プロモーターが含まれる。従って、本発明には、配列番号１１、１２、６７、もしくは９８を含むプロモーターを含む単離されたポリヌクレオチド、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でその相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチド、または配列番号１１、１２、６７、もしくは９８を有するプロモーターの活性の、例えば、少なくとも１０％、および好ましくは少なくとも５０％のプロモーター活性を有するそのフラグメントが含まれる。
【００９２】
本発明の別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、例えば、ｗａｘｙ遺伝子からの、クロロプラスト（アミロプラスト）輸送ペプチド（ＣＴＰ）およびデンプン結合ドメインに作用可能に連結されている、超好熱性プロセシング酵素をコードする。この実施形態における例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１０（ｗａｘｙからのデンプン結合ドメインに連結されたα−アミラーゼ）をコードする。他の例示的なポリヌクレオチドは以下をコードする。小胞体に酵素を標的化し、かつアポプラストに分泌するシグナル配列に連結された超好熱性プロセシング酵素（配列番号１３、２７、または３０をコードするポリヌクレオチドによって例示され、これは、それぞれ、α−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼに作用可能に連結したトウモロコシγ−ゼインからのＮ末端配列を含む）、小胞体中に酵素を保持するシグナル配列に連結された超好熱性プロセシング酵素（配列番号１４、２６、２８、２９、３３、３４、３５、または３６をコードするポリヌクレオチドによって例示され、これは、ＳＥＫＤＥＬに作用可能に連結した、超好熱性酵素に作用可能に連結されているトウモロコシγ−ゼインからのＮ末端配列を含み、この酵素は、α−アミラーゼ、ｍａｌＡ  α−グルコシダーゼ、Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａグルコースイソメラーゼ、Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａグルコースイソメラーゼである）、アミロプラストに酵素を標的化するＮ末端配列に連結された超好熱性プロセシング酵素（配列番号１５をコードするポリヌクレオチドによって例示され、これは、α−アミラーゼに作用可能に連結されている、ｗａｘｙからのＮ末端アミロプラスト標的化配列を含む）、デンプン顆粒に酵素を標的化する超好熱性融合ポリペプチド（配列番号１６をコードするポリヌクレオチドによって例示され、これは、ｗａｘｙデンプン結合ドメインを含む、α−アミラーゼ／ｗａｘｙ融合ポリペプチドに作用可能に連結されている、ｗａｘｙからのＮ末端アミロプラスト標的化配列を含む）、ＥＲ保持シグナルに連結された超好熱性プロセシング酵素（配列番号３８および３９をコードするポリヌクレオチドによって例示される）。さらに、超好熱性プロセシング酵素は、アミノ酸配列（配列番号５３）を有する生のデンプン結合部位に連結されてもよく、ここで、プロセシング酵素をコードするポリヌクレオチドは、この結合部位をコードする、トウモロコシに最適化された核酸配列（配列番号５４）に連結されている。
【００９３】
いくつかの誘導性プロモーターが報告されている。多くは、Ｇａｔｚ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７：１６８（１９９６）およびＧａｔｚ，Ｃ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：８９（１９９７）による概説に記載されている。例には、テトラサイクリンリプレッサー系、Ｌａｃリプレッサー系、銅誘導系、サリチル酸誘導系（例えば、ＰＲ１ ａ系）、糖質コルチコイド誘導系（Ａｏｙａｍａ  Ｔ．ら、Ｎ−Ｈ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１１：６０５（１９９７））およびエクジソン誘導系が含まれる。他の誘導性プロモーターには、ＡＢＡ−および膨圧−誘導性プロモーター、オーキシン結合タンパク質遺伝子のプロモーター（Ｓｃｈｗｏｂら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，４：４２３（１９９３））、ＵＤＰグルコースフラボノイドグリコシル−トランスフェラーゼ遺伝子プロモーター（Ｒａｌｓｔｏｎら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１９：１８５（１９８８））、ＭＰＩプロテイナーゼインヒビタープロモーター（Ｃｏｒｄｅｒｏら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，６：１４１（１９９４））、ならびにグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９；１２９３（１９９５）；Ｑｕｉｇｌｅｙら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，２９：４１２（１９８９）；Ｍａｒｔｉｎｅｚら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０８：５５１（１９８９））が含まれる。ベンゼンスルホンアミド−誘導系プロモーター（米国特許第５３６４，７８０号）およびアルコール誘導系プロモーター（ＷＯ  ９７／０６２６９およびＷＯ  ９７／０６２６８）およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼプロモーターもまた含まれる。
【００９４】
他の研究は、塩分の増加、乾燥、病原体、および損傷などの環境ストレスまたは刺激に応答して誘導性に調節される遺伝子に焦点を当てている（Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：６５５５（１９８５）；Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：６５５５（１９８５）、Ｓｍｉｔｈら、Ｐｌａｎｔａ，１６８：９４（１９８６））。メタロカルボキシペプチダーゼ−インヒビタータンパク質の蓄積は、損傷したジャガイモ植物の葉において報告されてきた（Ｇｒａｈａｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１０１：１１６４（１９８１））。他の植物遺伝子は、メチルジャスモン酸、エリシター、熱ショック、嫌気性ストレス、または除草剤セーフナーによって誘導されることが報告されている。
【００９５】
キメラトランス作用性ウイルス複製タンパク質の発現の調節は、例えば、Ｃｒｅ−媒介性遺伝子活性化などの、他の遺伝的ストラテジーによってさらに調節できる（Ｏｄｅｌｌら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１１３：３６９（１９９０））。従って、プロモーターからのキメラ複製遺伝子の発現をブロックする、プロモーターと複製タンパク質コード配列の間のｌｏｘ部位によって結合される３’調節配列を含むＤＮＡフラグメントは、Ｃｒｅ媒介性切除によって取り除くことができ、トランス作用性複製遺伝子の発現を生じる。この場合、キメラＣｒｅ遺伝子、キメラトランス作用性複製遺伝子、または両方は、組織−および発生−特異的または誘導性プロモーターの制御下にあり得る。代替的な遺伝子ストラテジーは、ｔＲＮＡサプレッサー遺伝子の使用である。例えば、ｔＲＮＡサプレッサー遺伝子の発現の調節は、適切な終止コドンを含む、トランス作用性複製タンパク質コード配列の発現を条件付きで制御することができる（Ｕｌｍａｓｏｖら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３５：４１７（１９９７））。再度、キメラｔＲＮＡサプレッサー遺伝子、キメラトランス作用性複製遺伝子、または両方が、組織−および発生−特異的または誘導性プロモーターの制御下にあり得る。
【００９６】
好ましくは、多細胞生物の場合には、プロモーターはまた、特定の組織、器官または発生の段階に特異的であり得る。このようなプロモーターの例には、Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ＡＤＰ−ｇｐｐおよびＺｅａ  ｍａｙｓ  γ−ゼインプロモーターおよびＺｅａ  ｍａｙｓグロブリンプロモーターが含まれるがこれらに限定されない。
【００９７】
トランスジェニック植物における遺伝子の発現は、植物の発生の間の特定の時間の期間のみに所望される可能性がある。発生のタイミングは、しばしば、組織特異的遺伝子発現と相関する。例えば、ゼイン貯蔵タンパク質の発現は、受粉の約１５日後に胚乳中で開始される。
【００９８】
加えて、ベクターは、トランスジェニック植物の細胞中での特定の遺伝子産物の細胞内標的化において、または細胞外環境にタンパク質を方向付ける際に、構築および利用されてもよい。これは、一般的には、特定の遺伝子のコード配列に、輸送ペプチド配列またはシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を結合することによって達成される。この得られる輸送ペプチドまたはシグナルペプチドは、それぞれ、特定の細胞内または細胞外の目的の場所にタンパク質を輸送し、次いで、翻訳後に除去される。輸送ペプチドまたはシグナルペプチドは、細胞内の膜、例えば、液胞、ベシクル、プラスチドおよびミトコンドリアの膜を通してのタンパク質の輸送を容易にすることによって作用するのに対して、シグナルペプチドは、タンパク質を細胞外の膜を通してタンパク質を方向付ける。
【００９９】
小胞体に標的化するため、およびアポプラストへの分泌のための、トウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナル配列などのシグナル配列は、本発明に従う超好熱性プロセシング酵素をコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結されてもよい（Ｔｏｒｒｅｎｔら、１９９７）。例えば、配列番号１３、２７、および３０は、トウモロコシγ−ゼインタンパク質からのＮ末端配列に作用可能に連結した超好熱性酵素をコードするポリヌクレオチドを提供する。別のシグナル配列は、小胞体中にポリペプチドを保持するためのアミノ酸配列ＳＥＫＤＥＬである（ＭｕｎｒｏおよびＰｅｌｈａｍ、１９８７）。例えば、配列番号１４、２６、２８、２９、３３、３４、３５、または３６をコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＫＤＥＬに作用可能に連結したプロセシング酵素に作用可能に連結したトウモロコシγ−ゼインからのＮ末端配列を含む。ポリペプチドはまた、ｗａｘｙアミロプラスト標的化ペプチド（Ｋｌｏｓｇｅｎら、１９８６）またはデンプン顆粒への融合によって、アミロプラストに標的化されてもよい。例えば、超好熱性プロセシング酵素をコードするポリヌクレオチドは、葉緑体（アミロプラスト）輸送ペプチド（ＣＴＰ）および、例えば、ｗａｘｙ遺伝子からのデンプン結合ドメインに作用可能に連結されてもよい。配列番号１０は、ｗａｘｙからのデンプン結合ドメインに連結されたα−アミラーゼを例示する。配列番号１５は、α−アミラーゼに作用可能に連結したｗａｘｙからのＮ末端配列アミロプラスト標的化配列を例示する。さらに、プロセシング酵素をコードするポリヌクレオチドは、ｗａｘｙデンプン結合ドメインを使用して、デンプン顆粒を標的化するために融合されてもよい。例えば、配列番号１６は、ｗａｘｙデンプン結合ドメインを含む、α−アミラーゼ／ｗａｘｙ融合ポリペプチドに作用可能に連結した、ｗａｘｙからのＮ末端アミロプラスト標的化配列を含む融合ポリペプチドを例示する。
【０１００】
本発明のポリヌクレオチドは、当分野において公知であるように、プロセシングシグナルに加えて、他の調節配列をさらに含んでもよい。「調節配列」および「適切な調節配列」は、各々、コード配列の上流（５’非コード配列）、その中、またはその下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列をいい、これらは、関連するコード配列の転写、ＲＮＡのプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響を与える。調節配列には、エンハンサー、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化シグナル配列が含まれる。これらには、天然および合成の配列、ならびに天然および合成の配列の組み合わせであり得る配列が含まれる。
【０１０１】
選択マーカーもまた、当分野において公知であるように、形質転換植物および植物組織の選択を可能にするために、本発明において使用されてもよい。関心対象の発現可能遺伝子として、またはそれに加えて、選択可能な、またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を利用することが所望され得る。「マーカー遺伝子」は、マーカー遺伝子を発現する細胞に対して識別可能な表現型を付与する遺伝子であり、従って、マーカーを有さない細胞から、このような形質転換された細胞を区別することを可能にする。このような遺伝子は、化学的手段によって、すなわち、選択剤（例えば、除草剤、抗生物質など）の使用を通して選択することができる形質をマーカーが付与するか否か、またはそれが単に観察もしくは試験を通して、すなわち、スクリーニングによって（例えば、Ｒ遺伝子座形質）同定することができる形質であるか否かに依存して、選択可能であるか、またはスクリーニング可能であるかのいずれかであるマーカーをコードしてもよい。当然、適切なマーカー遺伝子の多くの例は当分野において公知であり、本発明の実施において利用され得る。
【０１０２】
形質転換細胞を同定または選択する手段として、その分泌が検出され得る「選択マーカー」をコードする遺伝子もまた、選択可能な、またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子という用語に含まれる。例には、抗体相互作用によって同定され得る分泌可能な抗原をコードするマーカー、またはそれらの触媒活性によって検出され得る分泌可能な酵素でさえもが含まれる。分泌可能なタンパク質は多数のクラスに分類され、これには、例えば、ＥＬＩＳＡによって検出可能である小さな拡散可能なタンパク質；細胞外溶液中で検出可能である小さな活性酵素（例えば、α−アミラーゼ、β−ラクタマーゼ、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ）；および細胞壁に挿入またはトラップされるタンパク質（例えば、エクステンシンまたはタバコＰＲ−Ｓの発現単位中に見い出されるものなどのリーダー配列を含むタンパク質）が含まれる。
【０１０３】
選択可能な分泌可能なマーカーに関しては、細胞壁中に隔離されるタンパク質をコードし、かつそのタンパク質が独特なエピトープを含む遺伝子の使用は、特に有用であると見なされる。このような分泌された抗原マーカーは、理想的には、植物組織中で低いバックグラウンドを提供するエピトープ配列、効率的な発現および原形質膜を横切った標的化を付与し、ならびに細胞壁中に結合し、なお抗体に対して接近可能であるタンパク質を産生するプロモーター−リーダー配列を利用する。独特なエピトープを含むように修飾された、正常に分泌された壁タンパク質は、このような要求を全て満たす。
【０１０４】
この様式での修飾のために適切であるタンパク質の１つの例は、エクステンシン、またはヒドロキシプロリンリッチ糖タンパク質（ＨＰＲＧ）である。例えば、トウモロコシＨＰＲＧ（Ｓｔｅｉｆｅｌら、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２：７８５（１９９０））分子は、分子生物学、発現、およびタンパク質構造によって十分に特徴付けされている。しかし、様々なエクステンシンおよび／またはグリシンリッチ壁タンパク質（Ｋｅｌｌｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，８：１３０９（１９８９））の任意の１つは、スクリーニング可能なマーカーを作製するために抗原性部位の付加によって修飾することができる。
【０１０５】
ａ．選択マーカー
本発明との関連での使用のための可能な選択マーカーには、以下が含まれるがこれらに限定されない：カナマイシン耐性をコードし、カナマイシン、Ｇ４１８などを使用するために選択することができるｎｅｏもしくはｎｐｔＩＩ遺伝子（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９：１８３（１９８５））；除草剤ホスフィノスリシンに対する耐性を付与するｂａｒ遺伝子；変化したＥＰＳＰシンターゼタンパク質（Ｈｉｎｃｈｅｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．，６：９１５（１９８８））をコードし、従ってグリフォセート耐性を付与する遺伝子；ブロモキシニルに対する耐性を付与する、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｚａｅｎａｅからのｂｘｎなどのニトリラーゼ遺伝子（Ｓｔａｌｋｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４１９（１９８８））；イミダゾリノン、スルホニルウレア、または他のＡＬＳ−阻害化学物質に対する耐性を付与する変異型アセト乳酸ンシンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）（欧州特許出願１５４，２０４、１９８５）；メトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子（Ｔｈｉｌｌｅｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１２５００（１９８８））；除草剤ダラポンに対する耐性を付与するダラポンデハロゲナーゼ遺伝子；ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）遺伝子；５−メチルトリプトファンに対する耐性を付与する変異型アントラニル酸シンターゼ遺伝子；抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｐｈ遺伝子；またはマンノースを代謝する能力を提供する、マンノース−６−リン酸イソメラーゼ遺伝子（本明細書では、ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子とも呼ばれる）（米国特許第５，７６７，３７８号および同第５，９９４，６２９号）。当業者は、本発明における使用のために、適切な選択マーカー遺伝子を選択することが可能である。変異型ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子が利用される場合、さらなる利点は、適切な葉緑体輸送ペプチド、ＣＴＰの組み込みを通して現実化されてもよい（欧州特許出願０，２１８，５７１、１９８７）。
【０１０６】
形質転換体を選択するための系において使用されることが可能である選択マーカー遺伝子の例示的な実施形態は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓからのｂａｒ遺伝子またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓからのｐａｔ遺伝子のような酵素ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。酵素ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）は、除草剤ビアラフォス、ホスフィノスリシン（ＰＰＴ）中の活性成分を不活性化する。ＰＰＴはグルタミンシンターゼを阻害し（Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０５：４２（１９８６）；Ｔｗｅｌｌら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９１：１２７０（１９８９））、迅速なアンモニアの蓄積および細胞死を引き起こす。単子葉植物とともにこの選択系を使用することの成功は、穀物の形質転換において報告された主要な困難のために、特に驚くべきものであった（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７：２６９（１９８９））。
【０１０７】
本発明の実施においてビアラフォス耐性を利用することが望まれる場合、この目的のために特に有用な遺伝子は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの種（例えば、ＡＴＣＣ番号２１，７０５）から入手可能であるｂａｒ遺伝子またはｐａｔ遺伝子である。ｂａｒ遺伝子のクローニングは記載されており（Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０５：４２（１９８６）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ．，６：２５１９（１９８７））、単子葉植物以外の植物の状況におけるｂａｒ遺伝子の使用を有する（Ｄｅ  Ｂｌｏｃｋら、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ．，６：２５１３（１９８７）；Ｄｅ  Ｂｌｏｃｋら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９１：６９４（１９８９））。
【０１０８】
ｂ．スクリーニング可能なマーカー
利用されてもよいスクリーニング可能なマーカーには以下が含まれるがこれらに限定されない：そのための種々の色素原性基質が公知である酵素をコードするβ−グルクロニダーゼもしくはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）；植物組織中でアントシアニン色素（赤色）の産生を調節する産物をコードする、Ｒ−遺伝子座遺伝子（Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａら、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，２６３〜２８２頁（１９８８））；そのための種々の色素原性基質（例えば、ＰＡＤＡＣ、色素原性セファロスポリン）が公知である酵素をコードするβ−ラクタマーゼ遺伝子（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，７５：３７３７（１９７８））；色素原性カテコールを転換することができるカテコールジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子（Ｚｕｋｏｗｓｋｙら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８０：１１０１（１９８３））；α−アミラーゼ遺伝子（Ｉｋｕｔａら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．，８：２４１（１９９０））；ＤＯＰＡおよびドーパキノンへのチロシンの酸化が可能である酵素をコードし、これらは次には容易に検出可能な化合物であるメラニンを形成する、チロシナーゼ遺伝子（Ｋａｔｚら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１２９：２７０３（１９８３））；そのための色素原性基質が存在する酵素をコードするβ−ガラクトシダーゼ遺伝子；生物発光検出を可能にするルシフェラーゼ（ｌｕｘ）遺伝子（Ｏｗら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４：８５６（１９８６））；またはカルシウム感受性生物発光検出において利用されるエクオリン遺伝子（Ｐｒａｓｈｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１２６：１２５９（１９８５））、または緑色蛍光タンパク質遺伝子（Ｎｉｅｄｚら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，１４：４０３（１９９５））。
【０１０９】
トウモロコシＲ遺伝子複合体からの遺伝子は、スクリーニング可能なマーカーとして特に有用であることが意図される。トウモロコシ中のＲ遺伝子複合体は、大部分の種子および植物組織中のアントシアニン色素の産生を調節するように作用するタンパク質をコードしている。Ｒ遺伝子複合体からの遺伝子は、トウモロコシ形質転換のために適切である。なぜなら、形質転換細胞におけるこの遺伝子の発現は、細胞に害を与えないからである。従って、このような細胞に導入されたＲ遺伝子は赤色色素の発現を引き起こし、そして安定に組み込まれた場合、赤色の領域として視覚的に点数付けすることができる。トウモロコシ系統が、アントシアニン生合成経路における酵素的中間体をコードする遺伝子についての優性対立遺伝子を有し（Ｃ２、Ａ１、Ａ２、Ｂｚ１およびＢｚ２）、しかしＲ遺伝子座に劣性対立遺伝子を有する場合、Ｒを有する細胞株からの任意の細胞の形質転換は赤色色素形成を生じる。例示的な系統には、ｒｇ−Ｓｔａｄｌｅｒ対立遺伝子を含むＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  ２２、およびｒ−ｇ、ｂ、Ｐ１であるＫ５５誘導体であるＴＲ１１２が含まれる。代替的には、Ｃ１およびＲ対立遺伝子が一緒に導入される場合、トウモロコシの任意の遺伝子型が利用され得る。本発明における使用のために意図されるさらなるスクリーニング可能なマーカーは、ｌｕｘ遺伝子によってコードされるホタルルシフェラーゼである。形質転換細胞中のｌｕｘ遺伝子の存在は、例えば、Ｘ線フィルム、シンチレーション計数、蛍光分光分析、低光量ビデオカメラ、光子計数カメラまたはマルチウェルルミノメトリーを使用して検出されてもよい。この系は、例えば、組織培養プレート上、または全体の植物のスクリーニングについてさえの、生物発光のための手段スクリーニングのために展開されてもよいこともまた想定される。
【０１１０】
植物を形質転換するために使用されるポリヌクレオチドには、植物遺伝子および非植物遺伝子、例えば、細菌、酵母、動物またはウイルスからの遺伝子からのＤＮＡが含まれてもよいがこれらに限定されない。導入されたＤＮＡは、修飾された遺伝子、遺伝子の部分、またはキメラ遺伝子を含むことができ、これらには、同じかまたは異なるトウモロコシ遺伝子型からの遺伝子が含まれる。「キメラ遺伝子」または「キメラＤＮＡ」という用語は、天然の条件下でＤＮＡを合わせない種からの少なくとも２つのＤＮＡ配列もしくはセグメントを含む、遺伝子もしくはＤＮＡ配列もしくはセグメントとして定義されるか、またはそのＤＮＡ配列またはセグメントは、形質転換されていない植物のネイティブなゲノム中に通常存在しない様式で配置もしくは連結される。
【０１１１】
超好熱性プロセシング酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、および好ましくは、コドンが最適化されたポリヌクレオチドがさらに提供される。発現カセット中のポリヌクレオチド（第１のポリヌクレオチド）が、調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、末端配列、またはそれらの任意の組み合わせに、および任意に、第１のポリヌクレオチドによってコードされる酵素を特定の細胞または細胞下の位置に方向付けるシグナル配列（Ｎ末端またはＣ末端）をコードする第２のポリヌクレオチドに作用可能に連結されることが好ましい。従って、プロモーターおよび１つ以上のシグナル配列は、植物、植物組織、または植物細胞中の特定の位置における酵素の高レベルの発現を提供することができる。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性（条件付き）プロモーターまたは組織特異的プロモーター、例えば、トウモロコシγ−ゼインプロモーター（配列番号１２によって例示される）またはトウモロコシＡＤＰ−ｇｐｐプロモーター（配列番号１１によって例示され、これは５’非翻訳配列およびイントロン配列を含む）などの胚乳特異的プロモーターであり得る。本発明はまた、配列番号１１もしくは１２を含むプロモーターを含む単離されたポリヌクレオチド、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でその相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチド、または、プロモーター活性、例えば、配列番号１１もしくは１２を有するプロモーターの活性の少なくとも１０％、および好ましくは少なくとも５０％を有するそのフラグメントを提供する。本発明の発現カセットまたはポリヌクレオチドを含むベクター、および本発明のポリヌクレオチド、発現カセットまたはベクターを含む形質転換細胞もまた提供される。本発明のベクターは、本発明の１つより多くの超好熱性プロセシング酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含むことができ、その配列は、センス方向またはアンチセンス方向であることが可能であり、そして形質転換細胞は本発明の１つ以上のベクターを含んでもよい。好ましいベクターは、核酸を植物細胞に導入するために有用なものである。
【０１１２】
形質転換
発現カセット、または発現カセットを含むベクター構築物が細胞に挿入されてもよい。発現カセットまたはベクター構築物は、エピソームとして保有されるか、または細胞のゲノムに組み込まれてもよい。次いで、形質転換された細胞はトランスジェニック植物に生長されてもよい。従って、本発明は、トランスジェニック植物の生成物を提供する。このような生成物には、種子、果実、子孫、およびトランスジェニック植物の子孫の生成物が含まれてもよいがこれらに限定されない。
【０１１３】
種々の技術が利用され、細胞宿主への構築物の導入のための当業者に公知である。細菌および多くの真核生物細胞の形質転換は、ポリエチレングリコール、塩化カルシウム、ウイルス感染、ファージ感染、エレクトロポレーションおよび当分野において公知である他の方法の使用を通して達成されてもよい。植物細胞または組織を形質転換するための技術には、形質転換因子としてＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたはＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを利用するＤＮＡを用いる形質転換、エレクトロポレーション、ＤＮＡ注入、微粒子射撃．粒子加速などが含まれる（例えば、ＥＰ  ２９５９５９およびＥＰ  １３８３４１を参照されたい）。
【０１１４】
１つの実施形態において、アグロバクテリウム種Ｔｉ−由来ベクターのＴｉプラスミドおよびＲｉプラスミドのバイナリ型ベクターが、ダイズ、ワタ、アブラナ、タバコ、およびイネなどの単子葉植物および双子葉植物を含む広範な種々の高等植物を形質転換するために使用される（Ｐａｃｃｉｏｔｔｉら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：２４１（１９８５）；Ｂｙｒｎｅら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，８：３（１９８７）；Ｓｕｋｈａｐｉｎｄａら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，８：２０９（１９８７）；Ｌｏｒｚら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９：１７８（１９８５）；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９：１８３（１９８５）；Ｐａｒｋら、Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．，３８：３６５（１９８５）；Ｈｉｅｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，６：２７１（１９９４））。形質転換植物細胞へのＴ−ＤＮＡの使用は広範に研究されており、十分に記載されている（ＥＰ  １２０５１６；Ｈｏｅｋｅｍａ，Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｂｉｎａｒｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ．Ｏｆｆｓｅｔ−ｄｒｕｋｋｅｒｉｊ  Ｋａｎｔｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．；Ａｌｂｌａｓｓｅｒｄａｍ（１９８５），第Ｖ章；Ｋｎａｕｆら、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｏｓｔ  Ｒａｎｇｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ−Ｐｌａｎｔ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，Ｐｕｈｌｅｒ，Ａ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８３，２４５頁；およびＡｎ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：２７７（１９８５））。
【０１１５】
外来性ＤＮＡ構築物の直接的取り込み（ＥＰ  ２９５９５９を参照のこと）、エレクトロポレーションの技術（Ｆｒｏｍｍら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），３１９：７９１（１９８６））、または核酸構築物でコートされた金属粒子を用いる高速弾丸射撃（Ｋｌｉｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０（１９８７）、および米国特許第４，９４５，０５０号）などの他の形質転換方法は当業者に利用可能である。一旦形質転換されると、細胞は、当業者によって再生されることができる。特に関連性のあるものは、アブラナ（Ｄｅ  Ｂｌｏｃｋら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：６９４−７０１（１９８９））、ヒマワリ（Ｅｖｅｒｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５：１２０１（１９８７））、ダイズ（ＭｃＣａｂｅら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：９２３（１９８８）；Ｈｉｎｃｈｅｅら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：９１５（１９８８）；Ｃｈｅｅら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９１：１２１２（１９８９）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８６：７５００（１９８９）ＥＰ  ３０１７４９）、イネ（Ｈｉｅｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，６：２７１（１９９４））、およびトウモロコシ（Ｇｏｒｄｏｎ  Ｋａｍｍら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２：６０３（１９９０）；Ｆｒｏｍｍら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：８３３，（１９９０））などの商業的に重要な穀物に外来性遺伝子を形質転換するための最近記載された方法である。
【０１１６】
ゲノムまたは合成のフラグメントを含む発現ベクターは、プロトプラストに、またはインタクトな組織もしくは単離された細胞に導入され得る。好ましくは、発現ベクターは、インタクトな組織に導入される。植物組織を培養する一般的な方法が、例えば、Ｍａｋｉら、「Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ」ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｌｉｃｈら（編），６７〜８８頁  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）によって；およびＰｈｉｌｌｉｐｓら「Ｃｅｌｌ−Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｉｎ−Ｖｉｔｒｏ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ」ｉｎ  Ｃｏｒｎ  ＆  Ｃｏｒｎ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，第３版  １０，Ｓｐｒａｇｕｅら（編）３４５〜３８７頁，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ  Ｉｎｃ．（１９８８）によって提供される。
【０１１７】
１つの実施形態において、発現ベクターは、微粒子弾丸媒介送達、ＤＮＡ注入、エレクトロポレーションなどのような直接的な遺伝子移入方法を使用して、トウモロコシまたは他の植物組織に導入されてもよい。発現ベクターは、微粒子銃デバイスを用いる微粒子弾丸媒体を使用して植物組織に導入される。例えば、Ｔｏｍｅｓら、「Ｄｉｒｅｃｔ  ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｉｎｔａｃｔ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ」ｉｎ  Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（編）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９５）を参照のこと。それにも関わらず、本発明は、公知の形質転換方法に従って超好熱性プロセシング酵素を用いる植物の形質転換を意図する。Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２２：４２１（１９８８）；Ｓａｎｆｏｒｄら、Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５：２７（１９８７）（タマネギ）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，８７：６７１（１９８８）（ダイズ）；ＭｃＣａｂｅら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：９２３（１９８８）（ダイズ）；Ｄａｔｔａら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：７３６（１９９０）（イネ）；Ｋｌｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：４３０５（１９８８  ）（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：５５９（１９８８）（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９１：４４０（１９８８）（トウモロコシ）；Ｆｒｏｍｍら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：８３３（１９９０）（トウモロコシ）；およびＧｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２，６０３（１９９０）（トウモロコシ）；Ｓｖａｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：８５２６（１９９０）（タバコ葉緑体）；Ｋｏｚｉｅｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１９４（１９９３）（トウモロコシ）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ，３３８：２７４（１９８９）（イネ）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９５７（１９９１）（イネ）；欧州特許出願ＥＰ  ０  ３３２  ５８１（オーチャードグラスおよび他のＰｏｏｉｄｅａｅ）；Ｖａｓｉｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１５５３（１９９３）（コムギ）；Ｗｅｅｋｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０２：１０７７（１９９３）（コムギ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，８２．シロイヌナズナプロトコール、Ｅｄ．Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｚａｐａｔｅｒおよび  Ｓａｌｉｎａｓ編、１９９８  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（シロイヌナズナ）もまた参照のこと。
【０１１８】
植物の形質転換は、単一のＤＮＡ分子または複数のＤＮＡ分子（すなわち、同時形質転換）を用いて行うことができ、両方のこれらの技術は、本発明の発現カセットおよび構築物を用いる使用のために適切である。多数の形質転換ベクターが植物形質転換のために利用可能であり、本発明の発現カセットは、任意のこのようなベクターとともに使用することができる。ベクターの選択は、好ましい形質転換技術および形質転換のための標的種に依存する。
【０１１９】
最終的には、単子葉植物ゲノムへの導入のために最も望ましいＤＮＡセグメントは、所望の形質（例えば、タンパク質、脂質またはポリサッカライドの加水分解）をコードし、および新規なプロモーターもしくはエンハンサーなどの下で導入され、またはおそらく、相同もしくは組織特異的（例えば、根−、頸領／葉鞘−、輪生−、茎−、穂の輪−、穀粒−、または葉−特異的）プロモーターまたは制御エレメントでさえある、相同遺伝子または遺伝子ファミリーであってもよい。確かに、本発明の特定の使用は、構成的様式または誘導性様式である遺伝子の標的化であることが想定される。
【０１２０】
適切な形質転換ベクターの例
植物形質転換のための利用可能である多数の形質転換ベクターが、植物形質転換の分野における当業者に公知であり、本発明に関連のある遺伝子は、当分野で公知である任意のこのようなベクターとともに使用することができる。ベクターの選択は、好ましい形質転換技術および形質転換のための標的種に依存する。
【０１２１】
ａ．アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）形質転換のために適切なベクター
多くのベクターが、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを使用する形質転換のために利用可能である。これらは、典型的には、少なくとも１つのＴ−ＤＮＡボーダー配列を有し、ｐＢＩＮ１９（Ｂｅｖａｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８４））などのベクターを含む。以下に、アグロバクテリウム形質転換のために適切である２つの代表的なベクターの構築が記載される。
【０１２２】
ｐＣＩＢ２００およびｐＣＩＢ２００１
バイナリベクターｐｃＩＢ２００およびｐＣＩＢ２００１は、アグロバクテリウムを用いる使用のための組換えベクターの構築のために使用され、以下の様式で構築される。ｐＴＪＳ７５ｋａｎは、ｐＴＪＳ７５のＮａｒＩ消化によって作製され（Ｓｃｈｍｉｄｈａｕｓｅｒ＆Ｈｅｌｉｎｓｋｉ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６４：４４６（１９８５））、テトラサイクリン耐性遺伝子の切除、続いてＮＰＴＩＩを有するｐＵＣ４ＫからのＡｃｃＩフラグメントの挿入を可能にする（Ｍｅｓｓｉｎｇ＆Ｖｉｅｒｒａ、Ｇｅｎｅ，１９：２５９（１９８２）：Ｂｅｖａｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３０４：１８４（１９８３）：ＭｃＢｒｉｄｅら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１４：２６６（１９９０））。ＸｈｏＩリンカーは、左側および右側Ｔ−ＤＮＡボーダー、植物の選択可能ｎｏｓ／ｎｐｔＩＩキメラ遺伝子ならびにｐＵＣポリリンカーを含む、ＰＣＩＢ７のＥｃｏＲＶフラグメントにライゲーションされ（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎら、Ｇｅｎｅ，５３：１５３（１９８７））、ＸｈｏＩ−消化フラグメントは、ＳａｌＩ−消化ｐＴＪＳ７５ｋａｎにクローニングされ、ｐＣＩＢ２００を作製する（ＥＰ  ０  ３３２  １０４、実施例１９もまた参照のこと）。ｐＣＩＢ２００は以下の独特なポリリンカー制限部位：ＥｃｏＲＩ、ＳｓｔＩ、ＫｐｎＩ、ＢｇｌＩＩ、ＸｂａＩ、およびＳａｌＩを含む。ｐＣＩＢ２００１は、さらなる制限部位のポリリンカーへの挿入により作際されたｐＣＩＢ２００の誘導体である。ｐＣＩＢ２００１のポリリンカー中の独特な制限部位は、ＥｃｏＲＩ、ＳｓｔＩ、ＫｐｎＩ、ＢｇｌＩＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、ＭｌｕＩ、ＢｃｌＩ、ＡｖｒＩＩ、ＡｐａＩ、ＨｐａＩ、およびＳｔｕＩである。ｐＣＩＢ２００１はまた、これらの独特な制限部位を含むことに加えて、植物および細菌のカナマイシン選択、アグロバクテリウム−媒介性形質転換のための左側および右側Ｔ−ＤＮＡボーダー、大腸菌と他の宿主の間の可動化のためＲＫ２−由来ｔｒｆＡ機能、ならびにこれもまたＲＫ２からであるＯｒｉＴおよびＯｒｉＶ機能を有する。ｐＣＩＢ２００１ポリリンカーは、それら自体の調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニングのために適切である。
【０１２３】
ｐＣＩＢ１０およびそのハイグロマイシン選択誘導体
バイナリベクターｐＣＩＢ１０は、植物における選択のためのカナマイシン耐性をコードする遺伝子、ならびにＴ−ＤＮＡ右側および左側ボーダー配列を含み、そして広範な宿主範囲のプラスミドｐＲＫ２５２からの配列を取り込み、大腸菌とアグロバクテリウムの両方においてそれを複製することを可能にする。その構築は、Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎら（Ｇｅｎｅ，５３：１５３（１９８７））によって記載されている。Ｇｒｉｔｚら（Ｇｅｎｅ，２５：１７９（１９８３））によって記載されたハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼについての遺伝子を組み込む、ｐＣＩＢ１０の種々の誘導体が構築される。これらの誘導体は、ハイグロマイシンのみ（ｐＣＩＢ７４３）、またはハイグロマイシンおよびカナマイシン（ｐＣＩＢ７１５、ｐＣＩＢ７１７）に対するトランスジェニック植物細胞の選択を可能にする。
【０１２４】
ｂ．非アグロバクテリウム形質転換のために適切であるベクター
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの使用を伴わない形質転換は、選択された形質転換ベクター中のＴ−ＤＮＡ配列の必要性を回避し、結果的に、これらの配列を欠くベクターは、Ｔ−ＤＮＡ配列を含む、上記に記載したものなどのベクターに加えて、利用することができる。アグロバクテリウムに依存しない形質転換技術には、粒子射撃を介する形質転換、プロトプラスト取り込み（例えば、ＰＥＧおよびエレクトロポレーション）、およびマイクロインジェクションが含まれる。ベクターの選択は、大部分は、形質転換される種のために好ましい選択に依存する。非アグロバクテリウム形質転換のために適切である代表的なベクターの非限定的な例の構築がさらに記載される。
【０１２５】
ｐＣＩＢ３０６４
ｐＣＩＢ３０６４は、除草剤バスタ（またはホスフィノスリシン）による選択と組み合わせた、直接的な遺伝子移入技術のために適切であるｐＵＣ−由来ベクターである。プラスミドｐＣＩＢ２４６は、大腸菌ＧＵＳ遺伝子およびＣａＭＶ  ３５Ｓ転写ターミネーターに操作的に融合されているＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターを含み、ＰＣＴ出願公開ＷＯ  ９３／０７２７８に記載されている。このベクターの３５Ｓプロモーターは、開始部位の５’に２つのＡＴＧ配列を含む。これらの部位は、ＡＴＧを除去し、ならびに制限部位ＳｓｐＩおよびＰｖｕＩＩを生成するような方法で、標準的なＰＣＲ技術を使用して変異される。新たな制限部位は、独特なＳａｌＩ部位から９６ｂｐおよび３７ｂｐ離れており、実際の開始部位から１０１ｂｐおよび４２ｂｐ離れている。ｐＣＩＢ２４６の得られる誘導体はｐＣＩＢ３０２５と称する。次いで、ＧＵＳ遺伝子は、ＳａｌＩおよびＳａｃＩを用いる消化によってｐＣＩＢ３０２５から切除され、末端が平滑にされ、そして再ライゲーションしてプラスミドｐＣＩＢ３０６０を生成する。プラスミドｐＪＩＴ８２は、ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｎｏｒｗｉｃｈから入手され得、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓからのｂａｒ遺伝子を含む４００ｂｐ  ＳｍａＩフラグメントが切除され、ｐＣＩＢ３０６０のＨｐａＩ部位に挿入される（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ，６：２５１９（１９８７））。これはｐＣＩＢ３０６４を生成し、これは、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターおよびターミネーターの制御下にある、除草剤選択のための、アンピシリン耐性（大腸菌における選択のため）のための遺伝子であるｂａｒ遺伝子、ならびに独特の部位であるＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＢａｍＨＩを有するポリリンカーを含む。このベクターは、それら自体の調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニングのために適切である。
【０１２６】
ｐＳＯＧ１９およびｐＳＯＧ３５：
プラスミドｐＳＯＧ３５は、メトトレキサートに耐性を付与する選択マーカーとして、大腸菌遺伝子ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を利用する形質転換ベクターである。ＰＣＲは、３５Ｓプロモーター（−８００ｂｐ）、トウモロコシＡｄｈＩ遺伝子からのイントロン６（−５５０ｂｐ）、およびｐＳＯＧ１０からの１８ｂｐのＧＵＳ非翻訳リーダー配列を増幅するために使用される。大腸菌ジヒドロ葉酸還元酵素ＩＩ型遺伝子をコードする２５０ｂｐフラグメントもまた、ＰＣＲによって増幅され、これらの２つのＰＣＲフラグメントは、ｐＵＣ１９ベクターバックボーンおよびノパリンシンターゼターミネーターを含む、ｐＢ１２２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からのＳａｃＩ−ＰｓｔＩフラグメントとアセンブルされる。これらのフラグメントのアセンブリーは、イントロン６配列、ＧＵＳリーダー、ＤＨＦＲ遺伝子およびノパリンシンターゼターミネーターを融合されている３５Ｓプロモーターを含むｐＳＯＧ１９を生成する。トウモロコシＣｈｌｏｒｏｔｉｃ  Ｍｏｔｔｌｅウイルス（ＭＣＭＶ）からのリーダー配列でのｐＳＯＧ１９のＧＵＳリーダーの置換は、ベクターｐＳＯＧ３５を生成する。ｐＳＯＧ１９およびｐＳＯＧ３５は、アンピシリン耐性のためのｐＵＣ遺伝子を有し、外来性基質のクローニングのために利用可能であるＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ部位を有する。
【０１２７】
ｃ．葉緑体形質転換のために適切であるベクター
植物プラスチド中の本発明のヌクレオチド配列の発現のために、プラスチド形質転換ベクターｐＰＨ１４３（ＷＯ  ９７／３２０１１、実施例３６）が使用される。ヌクレオチド配列はｐＰＨ１４３に挿入され、それによって、ＰＲＯＴＯＸコード配列を置き換える。次いで、このベクターは、プラスチド形質転換およびスペクチノマイシン耐性についての形質転換体の選択のために使用される。代替的には、ヌクレオチド配列は、それがａａｄＨ遺伝子を置き換えるように、ｐＰＨ１４３中に挿入される。この場合において、形質転換体は、ＰＲＯＴＯＸインヒビターに対する耐性について選択される。
【０１２８】
形質転換法に供される植物宿主
引き続くクローン増殖が可能である任意の植物組織は、器官形成または胚形成によるかに関わらず、本発明の構築物を用いて形質転換され得る。器官形成という用語は、シュートおよび根が、それによって成長点中心から連続して発生されるプロセスを意味するのに対して、胚形成という用語は、体細胞からまたは配偶子からに関わらず、それによって協奏的な様式で（連続的ではなく）、シュートおよび根が一緒に発生するプロセスを意味する。選択される特定の組織は、形質転換される特定の種のために利用可能である、およびそれに最も良好に適している、クローン性増殖系に依存して変化する。例示的な組織標的には、分化した、および分化していない組織または植物が含まれ、これには、葉ディスク、根、茎、シュート、葉、花粉、種子、胚、子葉、胚軸、大配偶体、カルス組織、既存の生長点組織（例えば、頂端分裂組織、腋芽、および根の分裂組織）、および誘導された分裂組織（例えば、子葉分裂組織および胚軸分裂組織）、腫瘍組織、および種々の形態の細胞および培養、例えば、単一の細胞、プロトプラスト、胚、およびカルス組織が含まれるがこれらに限定されない。この植物組織は、植物または器官、組織または細胞培養中にあってもよい。
【０１２９】
本発明の植物は、種々の形態を取り得る。この植物は、形質転換細胞および非形質転換細胞のキメラであってもよい；この植物は、クローン性形質転換体（例えば、発現カセットを含むように形質転換されている全ての細胞）であってもよい；この植物は、形質転換されたか、または形質転換されていない組織の移植片を含んでもよい（例えば、カンキツ類種中での形質転換されていない接ぎ穂に移植された形質転換根ストック）。この形質転換植物は、種々の手段によって、例えば、クローン性増殖または古典的な育種技術によって増殖されてもよい。例えば、第１世代（またはＴ１）の形質転換植物は、ホモ接合性の第２世代（またはＴ２）の形質転換植物を与えるように自己増殖されてもよく、Ｔ２植物はさらに、古典的な育種技術を通して増殖される。優性選択マーカー（例えば、ｎｐｔ  ＩＩ）は、育種を補助するために発現カセットに付随させることができる。
【０１３０】
本発明は、単子葉植物および双子葉植物を含む任意の植物種の形質転換のために使用されてもよく、この植物種には以下が含まれるがこれらには限定されない：トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、アブラナ種（例えば、Ｂ．ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｒａｐａ、Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、特に、種油の供給源として有用であるアブラナ種、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、アワ（ｍｉｌｌｅｔ）（例えば、パールミレット（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ））、プロソミレット（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、アワ（ｆｏｘｔａｉｌ  ｍｉｌｌｅｔ）（Ｓｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ）、フィンガーミレット（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｅａ種）、ココナツ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）、柑橘類の木（Ｃｉｔｒｕｓ種）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ種）、アボガド（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、テンサイ（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ種）、オートムギ、オオムギ、野菜、観賞用植物、木本植物、例えば、針葉樹および落葉樹、カボチャ（ｓｑｕａｓｈ）、カボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ）、アサ、ズッキーニ、リンゴ、西洋ナシ、マルメロ、メロン、プラム、チェリー、ピーチ、ネクタリン、アプリコット、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、ダイズ、ソルガム、サトウキビ、アブラナ、クローバー、ニンジン、およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ。
【０１３１】
野菜には以下が含まれる。トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、レタス（例えば、Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）、グリーンビーンズ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｌｉｍｅｎｓｉｓ）、エンドウマメ（Ｌａｔｈｙｒｕｓ種）、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、コショウ、セロリ、およびＣｕｃｕｍｉｓ属のメンバー、例えば、キュウリ（Ｃ．ｓａｔｉｖｕｓ）、カンタロープメロン（Ｃ．ｃａｎｔａｌｕｐｅｎｓｉｓ）、およびマスクメロン（Ｃ．ｍｅｌｏ）。観賞用植物には以下が含まれる。ツツジ（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ種）、アジサイ（Ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ  ｈｙｄｒａｎｇｅａ）、ハイビスカス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｒｏｓａｓａｎｅｎｓｉｓ）、バラ（Ｒｏｓａ種）、チューリップ（Ｔｕｌｉｐａ種）、ラッパズイセン（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ種）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ポインセチア（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、およびキク。本発明を実施する際に利用されてもよい針葉樹には以下が含まれる。例えば、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）、スラッシュパイン（Ｐｉｎｕｓ  ｅｌｌｉｏｔｉｉ）、ポンデローサマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｐｏｎｄｅｒｏｓａ）、ロッジポールパイン（Ｐｉｎｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔａ）、およびモンテレーパイン（Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ）などのマツ、ダグラスモミ（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ  ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ）；ウェスタンヘムロック（Ｔｓｕｇａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）；ベイトウヒ（Ｐｉｃｅａ  ｇｌａｕｃａ）；アメリカスギ（Ｓｅｑｕｏｉａ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）；エゾマツ（Ａｂｉｅｓ  ａｍａｂｉｌｉｓ）およびバルサムモミ（Ａｂｉｅｓ  ｂａｌｓａｍｅａ）などの純粋なモミ；ならびに欧州アカスギ（Ｔｈｕｊａ  ｐｌｉｃａｔａ）およびアラスカイエローシーダー（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ）などのシーダー。マメ植物には、マメおよびエンドウマメが含まれる。マメには、グアル、ローカストビーン、コロハ、ダイズ、ガーデンビーン、ササゲ、ムングビーン、ライマメ、ソラマメ、レンズマメ、ヒヨコマメなどが含まれる。マメ科植物には以下が含まれるがこれらに限定されない：Ａｒａｃｈｉｓ、例えば、ピーナッツ、Ｖｉｃｉａ、例えば、クラウンベッチ、ヘアリーベッチ、アズキベッチ、ムングビーン、およびヒヨコマメ、Ｌｕｐｉｎｕｓ、例えば、ルピナス、トリフォリウム、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、例えば、インゲンマメおよびライマメ、Ｐｉｓｕｍ、例えば、フィールドビーン、Ｍｅｌｉｌｏｔｕｓ、例えば、クローバー、Ｍｅｄｉｃａｇｏ、例えば、アルファルファ、Ｌｏｔｕｓ、例えば、トレフォイル、ｌｅｎｓ、例えば、レンズマメ、およびフォルスインジゴ（ｆａｌｓｅ  ｉｎｄｉｇｏ）。本発明の方法における使用のための好ましい飼い葉および芝草には、アルファルファ、カモガヤ、ヒロハノウシノケグサ、多年生ライグラス、コヌカグサ（ｃｒｅｅｐｉｎｇ  ｂｅｎｔ  ｇｒａｓｓ）、およびコヌカグサ（ｒｅｄｔｏｐ）が���まれる。
【０１３２】
好ましくは、本発明の植物は、穀物植物、例えば、トウモロコシ、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ、ダイズ、ワタ、ベニバナ、ピーナッツ、ソルガム、コムギ、ミレット、タバコ、オオムギ、イネ、トマト、ジャガイモ、カボチャ、メロン、マメ科作物などを含む。他の好ましい植物には、ＬｉｌｉｏｐｓｉｄａおよびＰａｎｉｃｏｉｄｅａｅが含まれる。
【０１３３】
一旦所望のＤＮＡが特定の植物種に形質転換されると、これは、伝統的な育種技術を使用して、その種の中で増殖されるか、または特に、商業的な変種を含む同じ種の他の変種に移動されてもよい。
【０１３４】
以下は、双子葉植物と単子葉植物の両方を形質転換するための代表的な方法、ならびに代表的なプラスチド形質転換技術の記載である。
【０１３５】
ａ．双子葉植物の形質転換
双子葉植物のための形質転換技術は当分野において周知であり、これは、アグロバクテリウムベースの技術およびアグロバクテリウムを必要としない技術を含む。非アグロバクテリウム技術には、プロトプラストまたは細胞による、直接的な外因性遺伝物質の取り込みを含む。これは、ＰＥＧもしくはエレクトロポレーション媒介性の取り込み、粒子射撃媒介送達、またはマイクロインジェクションによって達成することができる。これらの技術の例は、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ，３：２７１７（１９８４）、Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９：１６９（１９８５）、Ｒｅｉｃｈら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４：１００１（１９８６）、およびＫｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３２７：７０（１９８７）によって記載されている。各々の場合において、形質転換細胞は、当分野において公知である標準的な技術を使用して、全体の植物に再生される。
【０１３６】
アグロバクテリウム媒介形質転換は、多くの異なる種を用いての、形質転換のその高い効率およびその広い有用性ゆえに、双子葉植物の形質転換のための好ましい技術である。アグロバクテリウム形質転換は、典型的には、適切なアグロバクテリウム株への、関心対象の外来性ＤＮＡを有するバイナリベクター（例えば、ｐＣＩＢ２００またはｐＣＩＢ２００１）の移入を含み、このアグロバクテリウム株は、同時存在性のＴｉプラスミド上または染色体へのいずれかで、宿主アグロバクテリウム株によって保有されるｖｉｒ遺伝子の相補体に依存し得る（ｐＣＩＢ２００またはｐＣＩＢ２００１については、ＣＩＢ５４２株（Ｕｋｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，５：１５９（１９９３）））。アグロバクテリウムへの組換えバイナリベクターの移入は、組換えバイナリベクターを保有する大腸菌、ｐＲＫ２０１３などのプラスミドを保有しかつ標的アグロバクテリウム株に組換えバイナリベクターを可動化可能であるヘルパー大腸菌株を使用する、トリペアレント接合手順（ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ  ｍａｔｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）によって達成される。代替的には、組換えバイナリベクターは、ＤＮＡ形質転換によって、アグロバクテリウムに移入することができる（Ｈｏｅｆｇｅｎ＆Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：９８７７（１９８８））。
【０１３７】
組換えアグロバクテリウムによる標的植物種の形質転換は、通常、植物からの外植片とともにアグロバクテリウムの同時培養を含み、当分野において周知であるプロトコールに従う。バイナリプラスミドのＴ−ＤＮＡボーダー間に存在する、抗生物質または除草剤耐性マーカーを有する形質転換された組織が、選択培地上で再生される。
【０１３８】
ベクターは、公知の方法において植物細胞に導入されてもよい。形質転換のために好ましい細胞には、アグロバクテリウム、Ｌｉｌｉｏｐｓｉｄａ細胞およびＰａｎｉｃｏｉｄｅａｅ細胞を含む単子葉植物および双子葉植物が含まれる。好ましい単子葉植物細胞は穀物細胞、例えば、トウモロコシ（コーン）、オオムギ、およびコムギ、ならびにデンプンを蓄積する双子葉植物細胞、例えば、ジャガイモである。
【０１３９】
遺伝子で植物細胞を形質転換するための別のアプローチは、植物組織および細胞において、不活性または生物学的に活性な粒子を発射することを含む。この技術は、米国特許第４，９４５，０５０号、同第５，０３６，００６号、および同第５，１００，７９２号に開示されている。一般的に、この手順は、細胞の外部表面を貫通し、かつその内部への取り込みを可能にするために有効である条件下で、細胞において、不活性または生物学的に活性な粒子を発射することを含む。不活性粒子が使用される場合、ベクターは、所望の遺伝子を含むベクターで粒子をコートすることによって、細胞に導入することができる。代替的には、標的細胞は、ベクターが粒子の後を追って細胞に運ばれるように、ベクターによって取り囲まれることができる。生物学的に活性な粒子（例えば、乾燥酵母細胞、乾燥細菌、またはバクテリオファージ、各々が導入されることが求められているＤＮＡを含む）もまた、植物細胞組織に発射することができる。
【０１４０】
ｂ．単子葉植物の形質転換
大部分の単子葉植物種の形質転換もまた、今や日常的になってきている。好ましい技術には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはエレクトロポレーション技術を使用する、プロトプラストへの直接的遺伝子移入、およびカルス組織への粒子射撃が含まれる。形質転換は、単一のＤＮＡ種または複数のＤＮＡ種（すなわち、同時形質転換）を用いて行うことができ、両方のこれらの技術は、本発明による使用のために適切である。同時形質転換は、完全なベクター構築を回避すること、ならびに関心対象の遺伝子について連鎖していない遺伝子座および選択マーカーを有するトランスジェニック植物を生成することの利点を有する可能性があり、次の世代における選択マーカーの除去を可能にし、このことは望ましいと見なされるはずである。しかし、同時形質転換の使用の不利な点は、別々のＤＮＡ種がゲノムに組み込まれる頻度が１００％未満であることである（Ｓｃｈｏｃｈｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４：１０９３  １９８６））。
【０１４１】
特許出願ＥＰ  ０  ２９２  ４３５、ＥＰ  ０  ３９２  ２２５、およびＷＯ  ９３／０７２７８は、トウモロコシの選り抜きの同系系統からのカルスおよびプロトプラストの調製、ＰＥＧまたはエレクトロポレーションを使用するプロトプラストの形質転換、および形質転換されたプロトプラストからのトウモロコシ植物の再生のための技術を記載する。Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２：６０３（１９９０））およびＦｒｏｍｍら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：８３３（１９９０））は、粒子射撃を使用するＡ１８８由来トウモロコシ系統の形質転換のために技術を公開している。さらに、ＷＯ  ９３／０７２７８およびＫｏｚｉｅｌら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１９４（１９９３））は、粒子射撃による、トウモロコシの選り抜きの同系系統の形質転換のための技術を記載している。この技術は、受粉の１４〜１５日後のトウモロコシ穂から切除した１．５〜２．５ｍｍの長さの未成熟トウモロコシ胚、および射撃のためのＰＤＳ−１０００Ｈｅ微粒子銃デバイスを利用する。
【０１４２】
イネの形質転換もまた、プロトプラストまたは粒子射撃を利用する直接的遺伝子移入技術によって行われ得る。プロトプラスト媒介形質転換は、ジャポニカ型およびインディカ型について記載されてきた（Ｚｈａｎｇら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ，７：３７９（１９８８）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ，３３８：２７４（１９８９）；Ｄａｔｔａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：７３６（１９９０））。両方の型はまた、粒子射撃を使用して日常的に形質転換可能である（Ｃｈｒｉｓｔｏｕら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９５７（１９９１））。さらに、ＷＯ  ９３／２１３３５は、エレクトロポレーションを介する、イネの形質転換のための技術を記載している。特許出願ＥＰ  ０  ３３２  ５８１は、Ｐｏｏｉｄｅａｅプロトプラストの生成、形質転換、および再生のための技術を記載している。これらの技術は、Ｄａｃｔｙｌｉｓおよびコムギの形質転換を可能にする。さらに、コムギの形質転換は、Ｖａｓｉｌら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：６６７（１９９２））によって、Ｃ型長期再生可能カルスの細胞への粒子射撃を使用して、ならびにまたＶａｓｉｌら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１５５３（１９９３））およびＷｅｅｋｓら（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０２：１０７７（１９９３））によって、未成熟胚および未成熟胚誘導カルスの粒子射撃を使用して記載されている。しかし、コムギ形質転換のための好ましい技術は、未成熟胚の粒子射撃によるコムギの形質転換を含み、遺伝子送達の前に高スクロースまたは高マルトースのいずれかを含む。射撃の前に、任意の数の胚（０．７５〜１ｍｍの長さ）が、３％スクロースおよび体細胞胚の誘導のための３ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄを含むＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇａおよびＳｋｏｏｇ、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，１５：４７３（１９６２））上にプレートされ、これは暗所で進行される。選択された射撃の日に、胚は誘導培地から取り出され、浸透圧調節物質上に配置される（すなわち、所望の濃度、典型的には、１５％で加えたスクロースまたはマルトースを有する誘導培地）。胚は２〜３時間原形質分離され、次いで射撃される。標的プレートあたり２０個の胚が典型的であるが、これは決定的ではない。適切な遺伝子保有プラスミド（例えば、ｐＣＩＢ３０６４またはｐＳＧ３５）は、標準的な技術を使用して、マイクロメートルサイズの金粒子に沈着される。胚の各プレートが、標準的な８０メッシュスクリーンを使用する約１０００ｐｓｉのバースト圧を使用するＤｕＰｏｎｔ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ（登録商標）ヘリウムデバイスを用いて射撃される。射撃後、回収のために、胚は、約２４時間、暗所に再度配置される（浸透圧調節物質上のまま）。２４時間後、胚は浸透圧調節物質から取り出され、再生の前約１ヶ月の間そこに留まる導入培地に再度配置される。約１ヶ月後、発生している胚形成カルスを有する胚外植片が、適切な選択剤（ｐＣＩＢ３０６４の場合には１０ｍｇ／ｌ  バスタ、およびｐＳＯＧ３５の場合には２ｍｇ／ｌ  メトトレキサート）をさらに含む、再生培地（ＭＳ＋１ｍｇ／リットル  ＮＡＡ、５ｍｇ／リットル  ＧＡ）に移される。約１ヶ月後、��生したシュートは、半分の強度のＭＳ、２％スクロース、および同じ濃度の選択剤を含む、「ＧＡ７」として知られるより大きな滅菌容器に移される。
【０１４３】
アグロバクテリウムを使用しての単子葉植物の形質転換もまた、記載されている。ＷＯ  ９４／００９７７および米国特許第５，５９１，６１６号を参照のこと。これらの両方は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４４】
ｃ．プラスチドの形質転換
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃ．ｖ．「Ｘａｎｔｈｉ  ｎｃ」の種子は、Ｔ寒天培地上の１’’環状アレイ中にプレートあたり７個で発芽させ、および本質的に記載されたように（ＳｖａｂおよびＭａｌｉｇａ，ＰＮＡＳ，  ９０：９１３（１９９３））、プラスミドｐＰＨ１４３およびｐＰＨ１４５からのＤＮＡでコートした１μｍタングステン粒子（Ｍ１０，Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いるソーイングの１２〜１４日後に射撃する。射撃された芽生えは、葉が切除される後２日間Ｔ培地上でインキュベートし、５００μｇ／ｍｌスペクチノマイシン二塩酸塩（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むＲＭＯＰ培地（Ｓｖａｂ、ＨａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚおよびＭａｌｉｇａ，ＰＮＡＳ，８７：８５２６（１９９０））のプレート上で、明光中で（３５０〜５００μｍｏｌ光子／ｍ2／ｓ）、背軸面を上にして配置される。射撃の３〜８週後に漂白した葉の下部に出現する耐性シュートは同じ選択培地上でサブクローニングされ、カルスが形成することを可能にし、二次シュートが単離されかつサブクローニングされる。独立したサブクローン中での形質転換されたプラスチドゲノムコピー（同種原形質性）の完全な分離が、サザンブロッティングの標準的な技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９））によって評価される。ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲｌ消化した全細胞ＤＮＡ（Ｍｅｔｔｌｅｒ，Ｉ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ，５：３４６（１９８７））は、１％  Ｔｒｉｓ−ホウ酸（ＴＢＥ）アガロースゲル上で分離され、ナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転写され、そしてｒｐｓ７／１２プラスチド標的化配列の一部を含むｐＣ８からの０．７  ｋｂ  ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡフラグメントに対応する、32Ｐ−標識されたランダムプライムされたＤＮＡ配列でプローブされる。同種原形質性シュートは、スペクチノマイシン含有ＭＳ／ＩＢＡ培地上で無菌的に発根され（ＭｃＢｒｉｄｅら、ＰＮＡＳ，９１：７３０１（１９９４））、温室に移される。
【０１４５】
安定に形質転換された植物の産生および特徴付け
次いで、形質転換された植物細胞は、次にはカルスに生長されるトランスジェニック細胞の選択のために、適切な選択培地中に配置される。シュートはカルスから生長され、小植物が、発根培地中での生長によってシュートから生成される。種々の構築物が、通常、植物細胞中での選択のためのマーカーに結合される。便利には、マーカーは、殺生物剤（特に、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、クロラムフェニコール、などの抗生物質、除草剤など）に対して耐性であってもよい。使用される特定のマーカーは、導入されたＤＮＡを欠く細胞と比較して、形質転換細胞の選択を可能にする。本発明の転写／発現カセットを含むＤＮＡ構築物の成分は、宿主に対してネイティブ（内因性）または外来性（外因性）である配列から調製されてもよい。「外来性」によって、配列は、構築物が導入される野生型宿主においては見い出されないことが意味される。異種構築物は、転写開始領域がそこから誘導される、遺伝子に対してネイティブではない、少なくとも１つの領域を含む。
【０１４６】
トランスジェニック細胞および植物における導入遺伝子の存在を確認するために、サザンブロット分析が、当業者に公知である方法を使用して実行され得る。ゲノムへのポリ核酸セグメントの組み込みは、サザンブロットによって検出および定量することができる。なぜなら、これらは、適切な制限酵素の使用を通して、セグメントを含む構築物から容易に区別することができるからである。導入遺伝子の発現産物は、その産物の性質に依存して、種々の方法のいずれかにおいて検出することができ、これには、ウェスタンブロットおよび酵素アッセイが含まれる。異なる植物組織中でタンパク質発現を定量し、および複製を検出するための１つの特に有用な方法は、ＧＵＳなどのレポーター遺伝子を使用することである。一旦トランスジェニック植物が得られると、それらは、所望の表現型を有する植物組織または部分を生じるように生長する可能性がある。これらの植物組織または植物部分は収集されてもよく、および／または種子が収集されてもよい。この種子は、所望の特性を有する組織または部分を伴うさらなる植物を生長させるための供給源として働き得る。
【０１４７】
従って、本発明は、本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチド、発現カセット、またはベクターを含む穂、種子、果実、穀粒、飼い葉、もみ殻、またはバガスなどの、形質転換された植物または植物部分、このような植物を作製する方法、およびこのような植物またはその部分を使用する方法を提供する。この形質転換された植物または植物部分は、特定の組織の特定の細胞もしくは細胞下区画、または発生している穀粒に任意に局在化されるプロセシング酵素を発現する。例えば、本発明は、植物の細胞中に存在する少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素を含む形質転換植物部分を提供し、ここでこの植物部分は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素をコードする発現カセットで増強されている。このプロセシング酵素は、酵素が活性である条件下で酵素を基質に接触させることを可能にする、加熱、粉砕、または他の方法などの方法によって活性化されない限り、標的基質に対して作用しない。
【０１４８】
本発明の例示的な方法
本発明の自己プロセシング植物および植物部分は、そこで発現されかつ活性化されるプロセシング酵素（中温性、好熱性、または超好熱性）を利用する種々の方法において使用されてもよい。本発明に従って、トランスジェニック植物から得られ、そのゲノムが、少なくとも１つのプロセシング酵素で増強されている、トランスジェニック植物部分は、そのプロセシング酵素が発現されかつ活性化される条件下に配置される。活性化の際に、プロセシング酵素は活性化され、それが所望の結果を得るように通常作用する基質に対して作用するように機能する。例えば、デンプンプロセシング酵素は、活性化の際に所望の結果を得るために、分解、加水分解、異性化、またはさもなくば修飾するようにデンプンに対して作用する。非デンプンプロセシング酵素は、植物からのデンプン、脂質、アミノ酸、または他の生成物の抽出を容易にするために、植物細胞膜を破壊するように使用されてもよい。さらに、非超好熱性および超好熱性の酵素は、本発明の自己プロセシング植物または植物部分と組み合わせて使用されてもよい。例えば、中温性非デンプン分解酵素は、デンプン抽出のために植物細胞膜を破壊するために活性化されてもよく、引き続いて、次に超好熱性デンプン分解酵素が、デンプンを分解するために、自己プロセシング植物において活性化されてもよい。
【０１４９】
穀粒中で発現される酵素は、それらの活性が促進される条件に、それらを含む植物または植物部分を配置することによって活性化させることができる。例えば、以下の１つ以上の技術が使用されてもよい。植物部分は水と接触されてもよく、これは、加水分解酵素のための基質を提供し、従って、この酵素を活性化する。植物部分は、植物部分の発生の間に沈着した区画から酵素を移動させ、従って、この基質と結合することを可能にする水と接触されてもよい。酵素の移動は、区画化が成熟、穀粒の乾燥、および再水和の間に破られるので、可能である。インタクトな、または破壊された穀粒は、植物部分の発生の間に沈着した区画から酵素を移動させ、従って、この基質と結合することを可能にする水と接触されてもよい。酵素はまた、活性化化合物の添加によって活性化され得る。例えば、カルシウム依存性酵素は、カルシウムの添加によって活性化され得る。他の活性化化合物は、当業者によって決定されてもよい。酵素は、不活性化因子の除去によって活性化され得る。例えば、アミラーゼ酵素の既知のペプチド阻害剤が存在し、アミラーゼは、アミラーゼ阻害剤と同時発現することが可能であり、次いで、プロテアーゼの添加によって活性化される。酵素は、酵素が最も活性であるｐＨへのｐＨの変化によって活性化され得る。酵素はまた、温度の上昇によって活性化され得る。酵素は、一般的に、その酵素についての最大温度まで活性が増加する。中温性酵素は、大気温度の活性レベルから、典型的には７０℃以下である、それが活性を喪失する温度まで、活性が増加する。同様に、好熱性および超好熱性の酵素もまた、温度の上昇によって活性化され得る。好熱性酵素は、活性または安定性の最大温度まで、温度を加熱することによって活性化され得る。超好熱性酵素については、安定性および活性の最大温度は、一般的には７０℃から８５℃までの間である。超好熱性酵素は、２５℃から８５℃まで、９５℃まで、または１００℃までさえのより大きな潜在的な温度の変化のために、中温性または好熱性よりも、さらに大きな相対的活性化を有する。温度の増加は、任意の方法によって、例えば、ベーキング、煮沸、加熱、蒸気処理、放電またはそれらの任意の組み合わせによってなどの加熱によって、達成されてもよい。さらに、中温性または好熱性酵素を発現する植物において、酵素の活性化は、粉砕によって達成されてもよく、それによって、酵素を基質と接触させることを可能にする。
【０１５０】
最適条件、例えば、温度、水和、ｐＨなどは、当業者によって決定されてもよく、これは、利用される個々の酵素および酵素の所望される適用に依存してもよい。
【０１５１】
本発明はさらに、特定のプロセスにおいて補助し得る外因性酵素の使用を提供する。例えば、本発明の自己プロセシング植物または植物部分の使用は、反応を容易にするための外因性に提供される酵素と組み合わせて使用されてもよい。例として、トランスジェニックα−アミラーゼトウモロコシは、デンプンを加水分解するため、またはエタノールを産生するための自己プロセシング酵素、例えば、プルラナーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、マンナーゼ、ヘミセルラーゼなどと組み合わせて使用されてもよい。実際、このような酵素とのトランスジェニックα−アミラーゼの組み合わせは、予想外に、トランスジェニックα−アミラーゼトウモロコシ単独の使用と比較して、優れた程度のデンプン転換を提供することが見い出された。
【０１５２】
本明細書で意図される適切な方法の例が提供される。
【０１５３】
ａ．植物からのデンプン抽出
本発明は、植物からのデンプンの抽出を容易にする方法を提供する。特に、胚乳の物理的に制限されたマトリックス（細胞壁、非デンプンポリサッカライド、およびタンパク質マトリックス）を破壊するプロセシング酵素をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドが、その酵素が、好ましくは植物中のデンプン顆粒に対して物理的に近接にあるように導入される。本発明のこの実施形態において、形質転換植物は、プロテアーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、チオレドキシン／チオレドキシン還元酵素、セルラーゼ、フィターゼ、リパーゼ、ベータグルコシダーゼ、エステラーゼなどの１つ以上を発現し、しかし、デンプン顆粒の完全性を維持するために、デンプン分解活性を有する酵素は発現しない。従って、穀粒などの植物部分におけるこれらの酵素の発現は、穀粒のプロセス特性を改善する。このプロセシング酵素は、中温性、好熱性、または超好熱性であってもよい。１つの例において、本発明の形質転換植物からの穀粒は熱乾燥され、おそらく非超好熱性プロセシング酵素を不活性化し、種子の完全性を改善する。穀粒（または破砕された穀粒）は、低温または高温で（時間が最も重要な場合）、高いまたは低い湿度の含量または条件で（Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｇｏｒｄｏｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｍ編，３１９〜３３７頁（１９９４）を参照のこと、これらの開示は本明細書に組み込まれる）、二酸化硫黄ありまたはなしで浸漬される。上昇した温度に達した際に、任意に特定の湿度条件において、胚乳マトリックスの完全性は、胚乳中に存在するタンパク質および非デンプンポリサッカライドを分解する酵素、例えば、プロテアーゼ、キシラナーゼ、フィターゼまたはグルカナーゼを活性化することによって破壊され、そこに存在するデンプン顆粒をインタクトなままにし、得られる物質からより容易に回収可能にする。さらに、流出液中のタンパク質および非デンプンポリサッカライドは、少なくとも部分的に分解されかつ高度に濃縮され、それゆえに、改善された動物の飼料、食品、または微生物の発酵のための培地成分のために使用されてもよい。この流出液は、改善された組成を有するトウモロコシ浸漬液と見なされる。
【０１５４】
従って、本発明は、デンプン顆粒を調製するための方法を提供する。この方法は、少なくとも１つの非デンプンプロセシング酵素を含む穀粒、例えば、破砕した穀粒を、少なくとも１つの酵素を活性化する条件下で処理し、デンプン顆粒および非デンプン分解生成物、例えば、胚乳マトリックス生成物を生じる工程を含む。この非デンプンプロセシング酵素は、中温性、好熱性、または超好熱性であってもよい。酵素の活性化後に、デンプン顆粒は、混合物から分離される。穀粒は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つのプロセシング酵素をコードする発現カセットを含む（この発現カセットで増強されている）。例えば、このプロセシング酵素は、プロテアーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、フィターゼ、チオレドキシン／チオレドキシン還元酵素、エステラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、またはベータグルコシダーゼであってもよい。このプロセシング酵素は超好熱性であってもよい。この穀粒は、高いかまたは低い湿度条件下で、二酸化硫黄の存在下または非存在下で処理され得る。トランスジェニック植物からの穀粒中のプロセシング酵素の活性および発現レベルに依存して、トランスジェニック穀粒は、プロセシングの前またはその間に、商品穀粒と混合されてもよい。少なくとも１つのさらなる成分を含む、デンプン、非デンプン生成物、および改善された浸漬水などの方法によって得られる生成物もまた提供される。
【０１５５】
ｂ．デンプンプロセシング方法
本発明の形質転換植物または植物部分は、デンプン顆粒を、デキストリン、他の修飾デンプン、またはヘキソースに分解する本明細書に開示されるデンプン分解酵素（例えば、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、アミロプルラナーゼ）、またはグルコースをフルクトースに転換する酵素（例えば、グルコースイソメラーゼ）を含んでもよい。好ましくは、デンプン分解酵素は、α−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、ネオプルラナーゼ、アミロプルラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、およびこれらの組み合わせから選択され、穀粒を形質転換するために使用される。さらに、好ましくは、この酵素は、プロモーター、およびこの酵素をデンプン顆粒、アミロプラスト、アポプラスト、または小胞体に標的化するシグナル配列に作用可能に連結される。最も好ましくは、この酵素は、胚乳において、および特に、トウモロコシ胚乳において発現され、１つ以上の細胞区画、またはデンプン顆粒自体の中に局在化される。好ましい植物部分は穀粒である。好ましい植物部分は、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、サトウキビ、またはイネに由来するものである。
【０１５６】
本発明の１つのデンプン分解方法に従って、形質転換穀粒は、デンプン顆粒中にデンプン分解酵素を蓄積し、５０℃〜６０℃の従来的な温度で浸漬され、および当分野において公知であるようにウェット製粉される。好ましくは、デンプン分解酵素は超好熱性由来である。デンプン顆粒への酵素の細胞下標的化のために、またはデンプン顆粒との酵素の結合によって、従来的な温度におけるウェット製粉プロセスの間に酵素およびデンプンを接触させることによって、プロセシング酵素は、デンプン顆粒とともに同時精製され、デンプン顆粒／酵素混合物を得る。デンプン顆粒／酵素混合物の回収に続いて、次に、酵素は、酵素の活性のための好ましい条件を提供することによって活性化される。例えば、プロセシングは、ヘキソースへのデンプンの部分的（誘導体化デンプンまたはデキストリンを作製するため）または完全な加水分解を容易にするための、湿度および／または温度の様々な条件で実行されてもよい。高いデキストロースまたはフルクトース等価物を含むシロップが、この様式で得られる。この方法は、デンプンが対応するヘキソースに転換される時間、エネルギー、ならびに酵素のコストおよび効率を減少し、生成物の産生の効率を、高い糖浸漬液およびより高いデキストロース等価物シロップと同様に増加する。
【０１５７】
別の実施形態において、酵素を発現する穀粒から作製した、植物、あるいは、果実もしくは穀粒、または粉などの植物の生成物は、酵素を活性化し、および植物内で発現されかつそこに含まれるポリサッカライドを糖に転換するために処理される。好ましくは、この酵素は、本明細書に開示されるような、この酵素をデンプン顆粒、アミロプラスト、アポプラスト、または小胞体に標的化するシグナル配列に融合される。次いで、産生された糖は、植物または植物の生成物から、単離または回収されてもよい。別の実施形態において、ポリサッカライドを糖に転換することが可能であるプロセシング酵素は、当分野において公知であり、かつ本明細書に開示される方法に従って、誘導性プロモーターの制御下に配置される。このプロセシング酵素は、中温性、好熱性、または超好熱性であってもよい。植物は所望される段階まで生長され、酵素の発現、および植物または植物の生成物中のポリサッカライドの糖への転換を引き起こすプロモーターが誘導される。好ましくは、この酵素は、酵素をデンプン顆粒、アミロプラスト、アポプラスト、または小胞体に標的化するシグナル配列に作用可能に連結される。別の実施形態において、デンプンを糖に転換することが可能であるプロセシング酵素を発現する形質転換植物が産生される。この酵素は、植物中のデンプン顆粒に酵素を標的化するシグナル配列に融合される。次いで、デンプンが、形質転換植物によって発現される酵素を含む形質転換植物から単離される。次いで、単離されたデンプンに含まれる酵素が、デンプンを糖に転換するために活性化されてもよい。この酵素は、中温性、好熱性、または超好熱性であってもよい。デンプンを糖に転換することが可能である超好熱性酵素の例は、本明細書に提供される。本方法は、ポリサッカライドを産生し、かつポリサッカライドを糖または加水分解デンプン生成物、例えば、デキストリン、マルトオリゴサッカライド、グルコースおよび／もしくはそれらの混合物に転換することが可能である酵素を発現することができる任意の植物とともに使用されてもよい。
【０１５８】
本発明は、ポリサッカライドの特定の共有結合を加水分解して、ポリサッカライド誘導体を形成するプロセシング酵素で形質転換された、植物または植物からの生成物から、デキストリンおよび変化されたデンプンを産生する方法を提供する。１つの実施形態において、植物、または植物の生成物、例えば、酵素を発現する穀粒からの作製された、果実もしくは穀粒、または粉は、酵素を活性化し、かつ植物中に含まれるポリサッカライドを、分子量が減少したポリサッカライドに転換するために十分な条件下に配置する。好ましくは、この酵素は、本明細書に開示されるように、酵素をデンプン顆粒、アミロプラスト、アポプラスト、または小胞体に標的化するシグナル配列に融合される。次いで、生成されたデキストリンまたは誘導体デンプンが、植物または植物の生成物から、単離または回収されてもよい。別の実施形態において、ポリサッカライドをデキストリンまたは変化したデンプンに転換することが可能であるプロセシング酵素は、当分野において公知であり、かつ本明細書に開示される方法に従って、誘導性プロモーターの制御下に配置される。植物は所望される段階まで生長され、酵素の発現、および植物または植物の生成物中のポリサッカライドの、デキストリンまたは変化したデンプンへの転換を引き起こすプロモーターが誘導される。好ましくは、この酵素は、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、イソまたはネオ−プルラナーゼであり、酵素をデンプン顆粒、アミロプラスト、アポプラスト、または小胞体に標的化するシグナル配列に作用可能に連結される。１つの実施形態において、この酵素は、アポプラストまたは小胞体（ｅｎｄｏｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）に標的化される。なお別の実施形態において、形質転換植物は、デンプンをデキストリンまたは変化したデンプンに転換することが可能である酵素を発現するように産生される。この酵素は、植物中のデンプン顆粒に酵素を標的化するシグナル配列に融合される。次いで、デンプンが、形質転換植物によって発現される酵素を含む形質転換植物から単離される。次いで、単離されたデンプンに含まれる酵素は、デンプンをデキストリンまたは変化したデンプンに転換するための活性化のために十分な条件下で活性化されてもよい。例えばデンプンを加水分解デンプン生成物に転換することが可能である超好熱性酵素の例は、本明細書に提供される。本方法は、ポリサッカライドを産生し、かつポリサッカライドを糖に転換することが可能である酵素を発現することができる任意の植物とともに使用されてもよい。
【０１５９】
別の実施形態において、デンプン顆粒中の結合を、デキストリン、修飾デンプン、またはヘキソースに分解するデンプン分解酵素（例えば、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、アミロプルラナーゼ）を蓄積する本発明の形質転換植物からの穀粒は、様々な時間の間、デンプン分解酵素の活性のために好ましい条件下で浸漬される。得られる混合物は、高レベルのデンプン誘導生成物を含み得る。このような穀粒の使用は、１）穀粒を製粉するか、またはさもなくば穀粒をプロセスして、最初にデンプン顆粒を得る必要性を除去し、２）穀粒の胚乳組織中に酵素を直接的に配置することによって、デンプンを酵素に対してより接近可能にし、そして３）微生物によって産生されたデンプン加水分解酵素の必要性を除去する。従って、ヘキソース回収の前に、酵素をデンプンに対して作用させるための水の存在下で、穀粒、好ましくはトウモロコシ穀粒を単に加熱することによって、ウェット製粉の全体のプロセスが除去される。
【０１６０】
このプロセスはまた、エタノールの製造、高フルクトースシロップ、ヘキソース（グルコース）含有発酵培地、または穀粒成分の生成を必要としないデンプンの任意の他の使用のために利用することができる。
【０１６１】
本発明はさらに、デキストリン、マルトオリゴサッカライド、および／または糖を調製する方法を提供し、この方法は、少なくとも１つの酵素を活性化するための条件下で、デンプン顆粒および少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素を含む植物部分を処理し、それによってデンプン顆粒を消化して、糖を含む水溶液を形成する工程を含む。この植物部分は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つのプロセシング酵素をコードする発現カセットで増強されている。次いで、デキストリン、マルトオリゴサッカライド、および／または糖を含む水溶液が収集される。１つの実施形態において、このプロセシング酵素は、α−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、プルラナーゼ、グルコアミラーゼ、アミロプルラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、またはそれらの任意の組み合わせである。好ましくは、この酵素は超好熱性由来である。別の実施形態において、この方法は、デキストリン、マルトオリゴサッカライド、および／または糖を単離する工程をさらに含む。
【０１６２】
ｃ．改善されたトウモロコシ変種
本発明はまた、通常レベルのデンプンの蓄積を有し、かつ、例えば、超好熱性酵素の場合においては、植物または植物部分を煮沸または加熱することによる、そこに含まれる酵素の活性化の際に、酵素が活性化されかつ単純な糖へのデンプンの迅速な転換を容易にするように、それらの胚乳またはデンプン蓄積器官に十分なレベルのアミロース分解酵素を蓄積する、改善されたトウモロコシの変種（および他の穀物の変種）を提供する。これらの単純な糖（主としてグルコース）は、処理されたトウモロコシに甘みを与える。この得られるトウモロコシ植物は、穀粒産生雑種として、およびスイートコーンとしての二重の使用のための改善された変種である。従って、本発明は、ハイパースイートコーンを産生する方法を提供し、この方法は、形質転換トウモロコシまたはその部分を処理する工程を含み、そのゲノムは、少なくとも１つのアミロース分解酵素をコードする第１のポリヌクレオチドに作用可能に連結したプロモーターを含む発現カセットで増強され、およびその発現カセットを、コーン中のポリサッカライドを糖に転換するために少なくとも１つの酵素を活性化する条件で胚乳で発現し、ハイパースイートコーンを生じる。このプロモーターは、α−アミラーゼ、例えば、配列番号１３、１４、または１６を含むものなどのプロセシング酵素をコードするポリヌクレオチド配列に連結されている、構成的プロモーター、種子特異的プロモーター、または胚乳特異的プロモーターであってもよい。好ましくは、この酵素は、超好熱性である。１つの実施形態において、この発現カセットは、第１のポリヌクレオチドによってコードされる酵素に作用可能に連結されているシグナル配列をコードする、第２のポリヌクレオチドをさらに含む。本発明のこの実施形態における例示的なシグナル配列は、アポプラスト、小胞体、デンプン顆粒、またはアミロプラストに方向付けられる。トウモロコシ植物は、穀粒を有する穂が形成され、次いで、プロモーターが、酵素が発現されかつ植物中に含まれるポリサッカライドを糖に転換することを引き起こすために誘導されるように、生長される。
【０１６３】
ｄ．自己発酵植物
本発明の別の実施形態において、トウモロコシ、イネ、コムギ、またはサトウキビなどの植物は、それらの細胞壁中に大量のプロセシング酵素、例えば、キシラナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、グルカナーゼ、ペクチナーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、ベータグルコシダーゼ、フィターゼ、プロテアーゼなど（非デンプンポリサッカライド分解酵素）を蓄積するように操作される。穀粒成分（またはサトウキビの場合には糖）の収穫後、飼い葉、もみ殻、またはバガスが、細胞壁における発現および蓄積のため、ならびにバイオマスの供給源として標的化された、酵素の供給源として使用される。飼い葉（または他の取り残しの組織）が、発酵可能な糖を回収するためのプロセスにおいて、原料として使用される。発酵可能な糖を得るプロセスは、非デンプンポリサッカライド分解酵素を活性化する工程からなる。例えば、活性化は、非デンプンポリサッカライドの、得られる糖への加水分解のために十分な時間の間、水の存在下で植物組織を加熱することを含んでもよい。従って、この自己プロセシング飼い葉は、それらが原料の成分であるので、本質的に追加のコストなしで、モノサッカライドへのポリサッカライドの転換のために必要とされる酵素を産生する。さらに、温度依存的な酵素は、植物の生長および発生、ならびに、細胞壁標的化、タンパク質に融合されたセルロース／キシロース結合ドメインによるポリサッカライドミクロフィブリルへの標的化にさえ、有害な効果を有さず、酵素への基質の接近可能性を改善する。
【０１６４】
従って、本発明はまた、植物部分の細胞の細胞壁中の少なくとも１つの非デンプンポリサッカライドプロセシング酵素を含む、形質転換植物部分を使用する方法を提供する。この方法は、少なくとも１つの酵素を活性化する条件下で、少なくとも１つの非デンプンポリサッカライドプロセシング酵素を含む形質転換植物部分を処理し、それによってデンプン顆粒を消化して、糖を含む水溶液を形成し、ここで、この植物部分は、形質転換植物から得られ、そのゲノムは少なくとも１つの非デンプンポリサッカライドプロセシング酵素をコードする発現カセットで増強されている工程；および、糖を含む水溶液を収集する工程を含む。本発明はまた、植物または植物部分の細胞、または細胞の細胞壁に存在する少なくとも１つの非デンプンポリサッカライドプロセシング酵素を含む、形質転換された植物または植物部分を含む。この植物部分は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つの非デンプンプロセシング酵素、例えば、キシラナーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ペクチナーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、ベータグルコシダーゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせをコードする発現カセットで増強されている。
【０１６５】
ｅ．タンパク質および糖含量が高い水相
さらに別の実施形態において、プロテアーゼおよびリパーゼは、種子、例えば、ダイズ種子中に蓄積するように操作される。例えば、加熱によるなどの、プロテアーゼまたはリパーゼの活性化後、種子の中のこれらの酵素は、プロセシングの間に、ダイズ中に存在する脂質および貯蔵タンパク質を加水分解する。従って、飼料、食料、または発酵培地として使用され得るアミノ酸、および脂肪酸を含む可溶性生成物が入手され得る。ポリサッカライドは、典型的には、プロセスされた穀粒の不溶性画分において見い出される。しかし、種子においてポリサッカライド分解酵素の発現および蓄積を組み合わせることによって、タンパク質およびポリサッカライドは加水分解され得、水相において見い出される。例えば、トウモロコシからのゼイン、ならびにダイズからの貯蔵タンパク質および非デンプンポリサッカライドは、この様式で可溶化され得る。水相および疎水性相の成分は、有機溶媒または超臨界二酸化炭素を用いる抽出によって容易に分離することができる。従って、提供されるものは、より高いレベルのタンパク質、アミノ酸、糖、またはサッカライドを含む、穀粒の水性抽出物を生成するための方法である。
【０１６６】
ｆ．自己プロセシング発酵
本発明は、エタノール、発酵飲料、または他の発酵由来製品を製造するための方法を提供する。この方法は、植物、または植物の生成物もしくはその部分、または植物の派生物、例えば、穀粒粉を得、ここで、ポリサッカライドを糖に転換するプロセシング酵素が発現される工程を含む。植物、またはその生成物は、糖が上記のようなポリサッカライドの転換によって産生されるように処理される。次いで、糖および植物の他の成分が、当分野において公知である方法に従って、発酵されて、エタノールまたは発酵飲料、または他の発酵由来製品を形成する。例えば、米国特許第４，９２９，４５２号を参照のこと。手短に述べると、ポリサッカライドの転換によって産生される糖は、エタノールへの糖の転換を促進する条件化で、酵母とともにインキュベートされる。適切な酵母には、高アルコール許容性かつ高糖許容性である酵母の株、例えば、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２０８６７などが含まれる。この株は、１９８７年９月１７日にｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤに寄託され、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２０８６７を割り当てられた。次いで、発酵製品または発酵飲料は、エタノールもしくは蒸留された飲料を単離するために蒸留され、またはさもなくば発酵製品が回収されてもよい。この方法において使用される植物は、ポリサッカライドを含む任意の植物であってもよく、本発明の酵素を発現することが可能である。多くのこのような植物が本明細書に開示される。好ましくは、この植物は、商業的に栽培されているものである。より好ましくは、この植物は、エタノールもしくは発酵飲料、または発酵製品を製造するために通常使用されるもの、例えば、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、ライムギ、トマト、ブドウまたはイネなどである。
【０１６７】
この方法は、少なくとも１つの酵素を活性化するための条件下で、少なくとも１つのポリサッカライドプロセシング酵素を含む植物部分を処理し、それによって植物部分中のポリサッカライドを消化して、発酵可能な糖を形成する工程を含む。このポリサッカライドプロセシング酵素は、中温性、好熱性、または超好熱性であってもよい。この植物部分は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つのポリサッカライドプロセシング酵素をコードする発現カセットで増強されている。本発明のこの実施形態のための植物部分には、穀粒、果実、種子、茎、木部、野菜または根が含まれるがこれらに限定されない。植物には、オートムギ、オオムギ、コムギ、ベリー、ブドウ、ライムギ、トウモロコシ、イネ、ジャガイモ、テンサイ、サトウキビ、パイナップル、草および木が含まれるがこれらに限定されない。この植物部分は、商品穀粒または他の市販の基材と組み合わせてもよい；プロセシングのための基材の供給源は、自己プロセシング植物以外の供給源であってもよい。次いで、発酵可能な糖が、エタノールへの発酵可能な糖の転換を促進する条件化で、例えば、酵母および／または他の微生物とともに、インキュベートされる。１つの実施形態において、この植物部分は、α−アミラーゼで形質転換されたトウモロコシに由来し、これは、時間の長さおよび発酵のコストを減少することが見い出されている。
【０１６８】
残渣のデンプンの量は、本発明に従って作製された、熱安定性α−アミラーゼを発現するトランスジェニックトウモロコシが、例えば、発酵において使用されるときに、減少することが見い出された。このことは、より多くのデンプンが発酵の間に可溶化されることを示す。残渣のデンプンの量の減少は、重量でより多くのタンパク質含量およびより高い価値を有する醸造かすを生じる。さらに、本発明のトランスジェニックトウモロコシの発酵は、液化プロセスがより低いｐＨで実行されることを可能にし、これは、より高い温度、例えば、８５℃よりも高い、好ましくは、９０℃よりも高い、より好ましくは、９５℃以上の温度で、ｐＨを調整するために使用される化学物質のコストの節約を生じ、より短い液化時間およびより完全なデンプンの可溶化、ならびに液化の回数の減少を生じ、全てがエタノールの高収率を伴う効率的な発酵反応を生じる。
【０１６９】
さらに、本発明に従って作製されたトランスジェニック植物の小さな部分でさえ、これとともに従来的な植物部分を接触させることは、発酵時間およびそれに伴うコストを減少し得ることが見い出された。このようなものとして、本発明は、ポリサッカライドプロセシング酵素を含まない植物部分の使用と比較して、ポリサッカライドを糖に転換するポリサッカライドプロセシング酵素を含む植物からのトランスジェニック植物部分を用いること（ｓｕｂｊｅｃｔｉｎｇ）を含む植物についての発酵時間の減少に関する。
【０１７０】
ｇ．生のデンプンプロセシング酵素およびそれらをコードするポリヌクレオチド
中温性プロセシング酵素をコードするポリヌクレオチドは、植物または植物部分に導入される。１つの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号４７および４９に提供されるようなグルコアミラーゼをコードする、配列番号４８、５０、および５９に提供されるような、トウモロコシに最適化されたポリヌクレオチドである。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号５１に提供されるような、アルファ−アミラーゼをコードする、配列番号５２に提供されるような、トウモロコシに最適化されたポリヌクレオチドである。さらに、プロセシング酵素の融合生成物がさらに意図される。１つの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号４５に提供されるような、アルファ−アミラーゼおよびグルコアミラーゼの融合物をコードする、配列番号４６に提供されるような、トウモロコシに最適化されたポリヌクレオチドである。プロセシング酵素の組み合わせが、本発明によってさらに想定される。例えば、デンプンプロセシング酵素および非デンプンプロセシング酵素の組み合わせが本明細書で意図される。プロセシング酵素のこのような組み合わせは、各々の酵素をコードする複数の遺伝子構築物の使用を利用することによって得られ得る。代替的には、酵素で安定に形質転換された個々のトランスジェニック植物は、両方の酵素を含む植物を得るために公知の方法によって交雑されてもよい。別の方法には、トランスジェニック植物を伴う外因性酵素の使用が含まれる。
【０１７１】
デンプンプロセシング酵素および非デンプンプロセシング酵素の供給源は、単離され、または任意の供給源に由来してもよく、それに対応するポリヌクレオチドが、当業者によって確認されてもよい。α−アミラーゼは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｈｉｒｏｕｓａｍｉおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ（例えば、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ならびにトウモロコシ、オオムギ、およびイネなどの植物に由来してもよい。グルコアミラーゼは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｈｉｒｏｕｓａｍｉおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ（例えば、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ（例えば、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）に由来してもよい。
【０１７２】
本発明の別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号５３に提供されるような、生のデンプンの結合ドメインをコードする、配列番号５４に提供されるような、トウモロコシに最適化されたポリヌクレオチドに作用可能に連結される中温性デンプンプロセシング酵素酵素をコードする。
【０１７３】
別の実施形態において、組織特異的プロモーターには、トウモロコシγ−ゼインプロモーターなどの胚乳特異的プロモーター（配列番号１２によって例示される）、またはトウモロコシＡＤＰ−ｇｐｐプロモーター（配列番号１１によって例示され、これは５’非翻訳配列およびイントロン配列を含む）、またはＱタンパク質プロモーター（配列番号９８によって例示される）、イネグルテリンプロモーター（配列番号６７によって例示される）が含まれる。従って、本発明は、配列番号１１、１２、６７、もしくは９８を含むプロモーターを含む単離されたポリヌクレオチド、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でその相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチド、または配列番号１１、１２、６７、もしくは９８を有するプロモーターの活性の、例えば、少なくとも１０％、および好ましくは少なくとも５０％のプロモーター活性を有するそのフラグメントを含む。
【０１７４】
１つの実施形態において、デンプン加水分解遺伝子からの生成物、例えば、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、またはα−アミラーゼ／グルコアミラーゼ融合物は、細胞質よりはむしろ、小胞体またはアポプラストなどの特定のオルガネラまたは位置に標的化されてもよい。これは、タンパク質のアポプラスト特異的標的化を付与するトウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナル配列（配列番号１７）の使用、ならびに小胞体中での保持のための配列ＳＥＫＤＥＬに作用可能に連結したプロセシング酵素に作用可能に連結したγ−ゼインＮ末端シグナル配列（配列番号１７）の使用によって例示される。特定の区画にタンパク質または酵素を方向付けることは、それが基質と接触されない様式で、酵素を局在化させることを可能にする。この様式において、酵素の作用は、酵素がその基質と接触されるまで起こらない。酵素は、製粉（細胞の完全性の物理的破壊）および水和のプロセスによって、その基質と接触させることができる。例えば、中温性デンプン加水分解酵素は、アポプラストまたは小胞体に標的化することができ、それゆえに、アミロプラスト中のデンプン顆粒とは接触されない。穀粒の製粉は、穀粒の完全性を破壊し、次いで、デンプン加水分解酵素は、デンプン顆粒と接触する。この様式において、酵素および基質の同時局在化の潜在的にネガティブな効果が回避され得る。
【０１７５】
ｈ．甘味料の添加を伴わない食品
さらなる甘味料を添加を伴わない、甘みのあるデンプン質食品を製造するための方法もまた提供される。デンプン質食品の例には、朝食用食品、インスタント食品、焼いた食品、パスタ、およびシリアル食品、例えば、朝食用シリアルが含まれるがこれらに限定されない。この方法は、デンプンプロセシング酵素を活性化する条件下で、少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素を含む植物部分を処理し、それによって、例えば、超好熱性酵素を含まない植物部分からのデンプン顆粒をプロセスすることによって産生された生成物と比較して甘みのある生成物を形成するために、植物部分中のデンプン顆粒を糖にプロセスする工程を含む。好ましくは、デンプンプロセシング酵素は超好熱性由来であり、加熱によって、例えば、ベーキング、煮沸、加熱、蒸気処理、放電またはそれらの任意の組み合わせによって活性化される。植物部分は、形質転換植物、例えば、形質転換されたダイズ、ライムギ、オートムギ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、イネ、またはサトウキビから得られ、そのゲノムは、少なくとも１つの超好熱性デンプンプロセシング酵素、例えば、α−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、またはそれらの任意の組み合わせをコードする発現カセットで増強されている。次いで、甘みを有する生成物が、デンプン質食品にプロセスされる。本発明はまた、この方法によって製造される、デンプン質食品、例えば、シリアル食品、朝食用食品、インスタント食品、または焼いた食品を提供する。デンプン質食品は、甘みのある生成物および水から形成されてもよく、麦芽、香料、ビタミン、ミネラル、着色料、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。
【０１７６】
酵素は、シリアル生成物に植物材料を含める前に、またはシリアル生成物のプロセシングの間に、植物材料中に含まれるポリサッカライドを糖に転換するために活性化されてもよい。従って、酵素材料中に含まれるポリサッカライドは、材料を活性化することによって、例えば、超好熱性酵素の場合においては、デンプン質生成物に含める前に加熱することによって、糖に転換されてもよい。次いで、ポリサッカライドの転換によって産生される糖を含む植物材料は、甘みのある生成物を産生するために生成物に添加される。代替的には、ポリサッカライドは、デンプン質生成物のプロセシングの間に、酵素によって糖に転換されてもよい。シリアル生成物を作製するために使用されるプロセスの例は当分野において周知であり、これには、米国特許第６，１８３，７８８号；同第６，１５９，５３０号；同第６，１４９，９６５号；同第４，９８８，５２１号および同第５，３６８，８７０号に記載されるように、加熱、ベーキング、煮沸などが含まれる。
【０１７７】
手短に述べると、練り粉は、水とともに種々の乾燥成分をブレンドすること、およびデンプン性成分をゼラチン化し、かつ調理した香りを発生するように調理することによって調製されてもよい。次いで、調理した材料は、シリアルの練り粉などの調理した練り粉を形成するように機械的に働かせることができる。乾燥成分は、種々の添加物、例えば、糖、デンプン、塩、ビタミン、ミネラル、着色料、香料、塩などを含んでもよい。水に加えて、種々の液体成分、例えば、コーン（トウモロコシ）または麦芽のシロップが添加され得る。デンプン質材料は、本発明の形質転換植物からの、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、オートムギ、オオムギ、ライムギ、または他の穀物穀粒およびその混合物からの、穀物穀粒、カット穀粒、グリットまた粉を含んでもよい。次いで、練り粉が、押し出しまたはスタンプなどのプロセスを通して所望の形状にプロセスされ、さらにＪａｍｅｓ調理装置、オーブンまたは放電デバイスなどの手段を使用して調理されてもよい。
【０１７８】
甘味料を加えることなく、デンプン含有生成物を甘くするための方法がさらに提供される。この方法は、少なくとも１つの酵素を活性化するための条件で、少なくとも１つのデンプンプロセシング酵素を含むデンプンを処理し、それによってデンプンを消化して糖を形成し、それによって、例えば、超好熱性酵素を含まないデンプンを処理することによって生成された生成物と比較して、処理された（甘くされた）デンプンを形成する。本発明のデンプンは、形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つのプロセシング酵素をコードする発現カセットで増強されている。この酵素には、α−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。この酵素は超好熱性由来であり、熱で活性化される。好ましい形質転換植物には、トウモロコシ、ダイズ、ライムギ、オートムギ、オオムギ、コムギ、イネおよびサトウキビが含まれる。次いで、処理されたデンプンが、甘くされたデンプン含有生成物、例えば、デンプン質食品を生成するために生成物に加えられる。この方法によって生成される生成物を含む甘くされたデンプンもまた、提供される。
【０１７９】
本発明はさらに、果実または野菜を含むポリサッカライドを甘くするための方法をさらに提供し、この方法は以下の工程を含む。少なくとも１つの酵素を活性化する条件下で、少なくとも１つのポリサッカライドプロセシング酵素を含む果実または野菜を処理し、それによって、果実または野菜中のポリサッカライドをプロセスして糖を形成し、例えば、ポリサッカライドプロセシング酵素を含まない植物からの果実または野菜と比較して、甘くされた果実または野菜を生じる工程。本発明の果実または野菜は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つのポリサッカライドプロセシング酵素をコードする発現カセットで増強されている。果実および野菜には、ジャガイモ、トマト、バナナ、カボチャ、エンドウマメ、およびマメが含まれる。酵素には、α−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。この酵素は超好熱性であってもよい。
【０１８０】
ｉ．ポリサッカライドを含む植物または植物生成物を甘くすること
本発明の方法は、上記のような、ポリサッカライドを糖に転換するポリサッカライドプロセシング酵素を発現する植物を得る工程を含む。従って、この酵素は、植物および植物の生成物の中で、例えば、果実または野菜の中で発現される。１つの実施形態において、この酵素は、この酵素の発現が外部刺激によって誘導され得るように、誘導性プロモーターの制御下に配置される。このような誘導性プロモーターおよび構築物は当分野において周知であり、本明細書に記載される。植物またはその生成物中での酵素の発現は、植物またはその生成物中に含まれるポリサッカライドが糖に転換され、および植物またはその生成物を甘くすることを引き起こす。別の実施形態において、ポリサッカライドプロセシング酵素は、構成的に発現される。従って、植物またはその生成物は、ポリサッカライドを糖に転換する酵素を活性化するために十分な条件下で、植物またはその生成物を甘くする酵素の作用を通して、活性化されてもよい。結果として、糖を形成するための果実または野菜におけるポリサッカライドの自己プロセシングは、例えば、ポリサッカライドプロセシング酵素を含まない植物からの果実または野菜と比較して、甘くされた果実または野菜を生じる。本発明の果実または野菜は形質転換植物から得られ、そのゲノムは、少なくとも１つのポリサッカライドプロセシング酵素をコードする発現カセットで増強されている。果実および野菜には、ジャガイモ、トマト、バナナ、カボチャ、エンドウマメ、およびマメが含まれる。酵素には、α−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。ポリサッカライドプロセシング酵素は超好熱性であってもよい。
【０１８１】
ｊ．胚乳マトリックスを破壊する酵素を含む、形質転換穀粒からのデンプンの単離
本発明は、胚乳マトリックスを破壊する酵素が発現される形質転換穀粒からデンプンを単離するための方法を提供する。この方法は、例えば、細胞壁の、非デンプンポリサッカライドおよび／またはタンパク質の修飾によって、胚乳マトリックスを破壊する酵素を発現する植物を得る工程を含む。このような酵素の例には、プロテアーゼ、グルカナーゼ、チオレドキシン、チオレドキシン還元酵素、フィターゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ベータグルコシダーゼ、キシラナーゼおよびエステラーゼが含まれるがこれらに限定されない。このような酵素は、デンプン顆粒の完全性を維持するために、デンプン分解活性を示すいかなる酵素も含まない。この酵素は、この酵素をデンプン顆粒に標的化するシグナル配列に融合されてもよい。１つの実施形態において、穀粒は、酵素を活性化するため、および穀粒中に含まれる内因性酵素を不活性化するために熱乾燥される。熱処理は、胚乳マトリックスを破壊するように作用する酵素の活性化を引き起こし、次いでこれは、デンプン顆粒から容易に分離される。別の実施形態において、穀粒は、低温または高温において、高いまたは低い湿度含量で、二酸化硫黄のあるなしで、浸漬される。次いで、穀粒は、胚乳マトリックスを破壊するために熱処理され、デンプン顆粒の容易な分離を可能にする。別の実施形態において、適切な温度および湿度の条件は、プロテアーゼをデンプン顆粒に入れ、かつ顆粒中に含まれるタンパク質を分解することを可能にするように設定される。このような処理は、高収率および夾雑タンパク質がほとんどないことを伴う、デンプン顆粒を生成する。
【０１８２】
ｋ．高糖等価物を有するシロップ、およびエタノールまたは発酵飲料を製造するためのそのシロップの使用
本方法は、上記のような、ポリサッカライドを糖に転換するポリサッカライドプロセシング酵素を発現する植物を得る工程を含む。植物またはその生成物は、発現された酵素が植物またはその生成物中に含まれるポリサッカライドを、デキストリン、マルトオリゴサッカライド、および／または糖に転換する条件下で、水性の流れに浸漬させる。次いで、ポリサッカライドの転換を通して生成された、デキストリン、マルトオリゴサッカライド、および／または糖を含む水性の流れが分離されて、高糖等価物を有するシロップを生成する。この方法は、デンプン顆粒を得るために、植物またはその生成物をウェット製粉するさらなる工程を含んでもよいし、または含まなくてもよい。この方法で使用されてもよい酵素の例には、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、およびα−グルコシダーゼが含まれるがこれらに限定されない。この酵素は超好熱性であってもよい。本発明に従って生成される糖には、ヘキソース、グルコースおよびフルクトースが含まれるがこれらに限定されない。本発明とともに使用されてもよい植物の例には、トウモロコシ、コムギまたはオオムギが含まれるがこれらに限定されない。使用されてもよい植物の生成物の例には、果実、穀粒および野菜が含まれるがこれらに限定されない。１つの実施形態において、ポリサッカライドプロセシング酵素は、誘導性プロモーターの制御下に配置される。従って、浸漬プロセスの前またはその間に、プロモーターは、酵素の発現を引き起こすために誘導され、次いでこれは、ポリサッカライドの糖への転換を提供する。誘導性プロモーターおよびそれらを含む構築物の例は、当分野において周知であり、本明細書に提供される。従って、ポリサッカライドプロセシングが超好熱性である場合、浸漬は、超好熱性酵素を活性化するため、および植物またはその生成物中に見い出される内因性酵素を不活性化するために高温で実行される。別の実施形態において、ポリサッカライドを糖に転換することが可能である超好熱性酵素は構成的に発現される。この酵素は、シグナル配列の使用を通して、植物中の区画に標的化されてもよいし、またはされなくてもよい。植物またはその生成物は、高温条件下で浸漬され、植物中に含まれるポリサッカライドの糖への転換を引き起こす。
【０１８３】
高糖等価物を有するシロップから、エタノールまたは発酵飲料を製造するための方法もまた提供される。本方法は、シロップに含まれる糖の、エタノールまたは発酵飲料への転換を可能にする条件下で、酵母とともにシロップをインキュベートする工程を含む。このような発酵飲料の例には、ビールおよびワインが含まれるがこれらに限定されない。発酵条件は当分野において周知であり、米国特許第４，９２９，４５２号および本明細書に記載される。好ましくは、この酵母は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２０８６７などの酵母の高アルコール許容性かつ高糖許容性株である。発酵製品または発酵飲料は、エタノールまたは蒸留した飲料を単離するために蒸留されてもよい。
【０１８４】
ｌ．植物の細胞壁中での超好熱性酵素の蓄積
本発明は、植物の細胞壁中に超好熱性酵素を蓄積するための方法を提供する。この方法は、標的化された酵素が細胞壁中に蓄積するように、細胞壁標的化シグナルに融合されている超好熱性酵素を、植物中で発現する工程を含む。好ましくは、この酵素は、ポリサッカライドをモノサッカライドに転換することが可能である。標的化配列の例には、セルロースまたはキシロース結合ドメインが含まれるがこれらに限定されない。超好熱性酵素の例には、配列番号１、３、５、１０、１３、１４、１５または１６に列挙されるものが含まれる。細胞壁を含む植物材料は、原料から糖を回収するためのプロセスにおける所望の酵素の供給源として、または他の供給源から生じるポリサッカライドの、モノサッカライドへの転換のための酵素の供給源として加えられてもよい。加えて、細胞壁は、酵素がそこから精製されてもよい、供給源として働き得る。酵素を精製するための方法は当分野において周知であり、これには、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、等電点電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ、塩析沈殿、透析などが含まれるがこれらに限定されない。従って、本発明はまた、植物の細胞壁から単離された精製された酵素を提供する。
【０１８５】
ｍ．プロセシング酵素を調製および単離する方法
本発明に従って、本発明の組換え的に産生されるプロセシング酵素は、形質転換植物組織または細胞のために選択された、植物中で活性化可能である本発明のプロセシング酵素を含む植物組織または植物細胞を形質転換すること、形質転換植物組織または細胞を形質転換植物に生長させること、および形質転換植物またはその部分からプロセシング酵素を単離することによって調製されてもよい。この組換え的に産生される酵素は、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースイソメラーゼ、α−グルコシダーゼ、プルラナーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、グルカナーゼ、ベータグルコシダーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、またはフィターゼであってもよい。この酵素は、配列番号２、４、６、９、１９、２１、２５、３７、３９、４１、４３、４６、４８、５０、５２、５９、６１、６３、６５、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９４、９５、９６、９７、または９９のいずれかから選択されるポリヌクレオチドによってコードされてもよい。
【０１８６】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明され、これは、いかなる方法によっても本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【０１８７】
実施例１
超好熱性デンプン−プロセシング／異性化酵素についてのトウモロコシに最適化された遺伝子の構築
デンプン分解またはグルコース異性化に関与する、酵素、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、α−グルコシダーゼ、およびグルコースイソメラーゼを、それらの所望の活性プロフィールのために選択した。これらには、例えば、大気温度における最小活性、高温活性／安定性、および低ｐＨにおける活性が含まれる。次いで、対応する遺伝子を、米国特許第５，６２５，１３６号に記載されるようなトウモロコシで好ましいコドンを使用することによって設計し、そしてこれはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって合成された。
【０１８８】
アミノ酸配列、配列番号１を有する７９７ＧＬ３  α−アミラーゼを、その超好熱性活性のために選択した。この酵素の核酸配列を推定し、配列番号２に表されるようにトウモロコシに最適化した。同様に、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する６ｇｐ３プルラナーゼを選択した。６ｇｐ３プルラナーゼについての核酸配列を推定し、配列番号４に表されるようにトウモロコシに最適化した。
【０１８９】
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓからのｍａｌＡ  α−グルコシダーゼについてのアミノ酸配列を、文献、Ｊ．Ｂａｃｔ．１７７：４８２−４８５（１９９５）；Ｊ．Ｂａｃｔ．１８０：１２８７−１２９５（１９９８）から得た。このタンパク質の公開されたアミノ酸配列（配列番号５）に基づいて、ｍａｌＡ  α−グルコシダーゼをコードする、トウモロコシに最適化された合成遺伝子（配列番号６）を設計した。
【０１９０】
いくつかのグルコースイソメラーゼ酵素を選択した。Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来のグルコースイソメラーゼについてのアミノ酸配列（配列番号１８）を、アクセッション番号ＮＣ＿０００８５３を有する公開されたＤＮＡに基づいて予測し、トウモロコシに最適化された合成遺伝子（配列番号１９）を設計した。同様に、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ由来のグルコースイソメラーゼについてのアミノ酸配列（配列番号２０）を、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１（５）：１８６７−１８７５  １９９５、アクセッション番号Ｌ３８９９４からの公開されたＤＮＡ配列に基づいて予測した。Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａグルコースイソメラーゼをコードする、トウモロコシに最適化された合成遺伝子（配列番号２１）を設計した。
【０１９１】
実施例２
大腸菌における７９７ＧＬ３  α−アミラーゼおよびデンプンカプセル化領域の融合物の発現
トウモロコシ顆粒結合デンプンシンターゼ（ｗａｘｙ）からのデンプンカプセル化領域（ＳＥＲ）に融合された超好熱性７９７ＧＬ３  α−アミラーゼをコードする構築物を、大腸菌に導入しかつそこで発現させた。アミノ酸配列（配列番号８）をコードするトウモロコシ顆粒結合デンプンシンターゼｃＤＮＡ（配列番号７）（Ｋｌｏｓｇｅｎ  ＲＢら、１９８６）を、デンプン結合ドメイン、またはデンプンカプセル化領域（ＳＥＲ）の供給源としてクローニングした。全長ｃＤＮＡを、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｘ０３９３５から設計したプライマーＳＶ５７（５’ＡＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＣＡＣＧＴ  ３’）（配列番号２２）およびＳＶ５８（５’ＡＧＣＴＡＡＧＣＴＴＣＡＧＧＧＣＧＣＧＧＣＣＡＣＧＴＴＣＴ  ３’）（配列番号２３）を使用して、トウモロコシ種子から調製したＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。完全なｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングし、このプラスミドをｐＮＯＶ４０２２と名付けた。
【０１９２】
デンプン結合ドメインを含む、ｗａｘｙ  ｃＤＮＡのＣ末端部分（９１９〜１８１８ｂｐによってコードされる）を、ｐＮＯＶ４０２２から増幅し、全長のトウモロコシに最適化された７９７ＧＬ３遺伝子（配列番号２）の３’末端にインフレームで融合させた。核酸配列、配列番号９を有し、アミノ酸配列、配列番号１０をコードする、融合遺伝子産物７９７ＧＬ３／Ｗａｘｙを、ＮｃｏＩ／ＮｈｅＩで切断したｐＥＴ２８ｂ（ＮＯＶＡＧＥＮ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に、ＮｃｏＩ／ＸｂａＩフラグメントとしてクローニングした。７９７ＧＬ３遺伝子は、単独で、ＮｃｏＩ／ＸｂａＩフラグメントとして、ｐＥＴ２８ｂベクターにクローニングした。
【０１９３】
ｐＥＴ２８／７９７ＧＬ３ベクターおよびｐＥＴ２８／７９７ＧＬ３／Ｗａｘｙベクターを、ＢＬ２１／ＤＥ３  大腸菌細胞（ＮＯＶＡＧＥＮ）に形質転換し、製造業者の指示に従って増殖および誘導した。ＰＡＧＥ／Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色による分析は、それぞれ、融合アミラーゼおよび非融合アミラーゼの予測サイズに対応する、両方の抽出物中の誘導タンパク質を示した。
【０１９４】
全細胞抽出物を、以下のようにして、超好熱性アミラーゼ活性について分析した：５ｍｇのデンプンを２０μｌの水に懸濁し、次いで、２５μｌのエタノールで希釈した。アミラーゼ活性について試験される標準アミラーゼポジティブコントロールまたはサンプルをこの混合物に加え、水を５００μｌの最終反応量まで加えた。反応を８０℃にて１５〜４５分間実行した。次いで、反応を室温まで冷却し、５００μｌのｏ−ジアニシジンおよびグルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ混合物（Ｓｉｇｍａ）を加えた。この混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。５００μｌの１２Ｎ  硫酸を、反応を停止するために加えた。５４０ｎｍにおける吸収を、アミラーゼ／サンプルによって遊離されたグルコースの量を定量するために測定した。融合アミラーゼと非融合アミラーゼの両方の抽出物のアッセイは、同様のレベルの超好熱性アミラーゼ活性を与えたのに対して、コントロール抽出物はネガティブであった。このことは、７９７ＧＬ３アミラーゼが、ｗａｘｙタンパク質のＣ末端部分に融合されたときに、なお活性であること（高温において）を示した。
【０１９５】
実施例３
トウモロコシにおける胚乳特異的発現のためのプロモーターフラグメントの単離
Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ＡＤＰ−ｇｐｐ（ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ）のラージサブユニットからのプロモーターおよび５’非翻訳領域Ｉ（第１イントロンを含む）を、ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＭ８１６０３から設計したプライマーを使用して、トウモロコシゲノムＤＮＡから、１５１５塩基対フラグメント（配列番号１１）として増幅した。ＡＤＰ−ｇｐｐプロモーターは、胚乳特異的であることが示された（ＳｈａｗおよびＨａｎｎａｈ，１９９２）。
【０１９６】
Ｚｅａ  ｍａｙｓ  γ−ゼイン遺伝子からのプロモーターを、プラスミドｐＧＺ２７．３（Ｄｒ．Ｂｒｉａｎ  Ｌａｒｋｉｎｓから入手した）から、６７３ｂｐフラグメント（配列番号１２）として増幅した。γ−ゼインプロモーターは、胚乳特異的であることが示された（Ｔｏｒｒｅｎｔら、１９９７）。
【０１９７】
実施例４
７９７ＧＬ３超好熱性α−アミラーゼについての形質転換ベクターの構築
発現カセットを、種々の標的化シグナルを用いてトウモロコシ胚乳中で７９７ＧＬ３超好熱性アミラーゼを発現するために、以下のように構築した：
【０１９８】
ｐＮＯＶ６２００（配列番号１３）は、小胞体に標的化するため、およびアポプラストへの分泌のために、実施例１において上記に記載したように、合成７９７ＧＬ３アミラーゼに融合されたγ−ゼインＮ末端シグナル配列（ＭＲＶＬＬＶＡＬＡＬＬＡＬＡＡＳＡＴＳ）（配列番号１７）を含む（Ｔｏｒｒｅｎｔら、１９９７）。この融合物は、胚乳における特異的な発現のために、トウモロコシＡＤＰ−ｇｐｐプロモーターの後ろにクローニングした。
【０１９９】
ｐＮＯＶ６２０１（配列番号１４）は、小胞体（ＥＲ）への標的化、およびそこでの保持のための配列ＳＥＫＤＥＬのＣ末端付加を有する、合成７９７ＧＬ３アミラーゼに融合されているγ−ゼインＮ末端シグナル配列を含む（ＭｕｎｒｏおよびＰｅｌｈａｍ，１９８７）。この融合物は、胚乳における特異的な発現のために、トウモロコシＡＤＰ−ｇｐｐプロモーターの後ろにクローニングした。
【０２００】
ｐＮＯＶ７０１３は、小胞体（ＥＲ）への標的化、およびそこでの保持のための配列ＳＥＫＤＥＬのＣ末端付加を有する、合成７９７ＧＬ３アミラーゼに融合されているγ−ゼインＮ末端シグナル配列を含む。ＰＮＯＶ７０１３は、胚乳中でこの融合物を発現させるために、トウモロコシＡＤＰ−ｓｐｐプロモーターの代わりに、トウモロコシγ−ゼインプロモーター（配列番号１２）が使用される以外は、ｐＮＯＶ６２０１と同じである。
【０２０１】
ｐＮＯＶ４０２９（配列番号１５）は、アミロプラストへの標的化のために、合成７９７ＧＬ３アミラーゼに融合された、ｗａｘｙアミロプラスト標的化ペプチド（Ｋｌｏｓｇｅｎら、１９８６）を含む。この融合物は、胚乳における特異的な発現のために、トウモロコシＡＤＰ−ｇｐｐプロモーターの後ろにクローニングした。
【０２０２】
ｐＮＯＶ４０３１（配列番号１６）は、デンプン顆粒への標的化のために、合成７９７ＧＬ３／ｗａｘｙ融合タンパク質に融合された、ｗａｘｙアミロプラスト標的化ペプチドを含む。この融合物は、胚乳における特異的な発現のために、トウモロコシＡＤＰ−ｇｐｐプロモーターの後ろにクローニングした。
【０２０３】
さらなる構築物を、より高いレベルの酵素発現を得るために、トウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングされたこれらの融合物を用いて作製した。全ての発現カセットは、アグロバクテリウム感染を介する、トウモロコシへの形質転換のために、バイナリベクターに移動させた。このバイナリベクターはホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）遺伝子を含んだ。これは、マンノースを用いるトランスジェニック細胞の選択を可能にする。形質転換トウモロコシ植物は、自家受粉または外部交配のいずれかを行い、種子は分析のために収集した。
【０２０４】
さらなる構築物を、α−アミラーゼについて記載されたものと正確に同じ様式で、６ｇｐ３プルラナーゼまたは３４０ｇ１２  α−グルコシダーゼのいずれかに融合された、上記の標的化シグナルを用いて作製した。これらの融合物を、上記のように、トウモロコシＡＤＰ−ｇｐｐプロモーターおよび／またはγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングし、トウモロコシに形質転換した。形質転換トウモロコシ植物は、自家受粉または外部交配のいずれかを行い、種子は分析のために収集した。
【０２０５】
酵素の組み合わせを、個々の酵素を発現する植物を交配させることによって、または同時形質転換を可能にするために同じバイナリベクターにいくつかの発現カセットをクローニングすることによってのいずれかで、生成することができる。
【０２０６】
実施例５
６ＧＰ３好熱性プルラナーゼについての植物形質転換ベクターの構築
発現カセットを、トウモロコシ胚乳の小胞体中で６ＧＰ３好熱性プルラナーゼを発現するために、以下のように構築した：
【０２０７】
ｐＮＯＶ７００５（配列番号２４および２５）は、ＥＲへの標的化およびそこへの保持のために、配列ＳＥＫＤＥＬのＣ末端付加を有する、合成６ＧＰ３プルラナーゼに融合された、トウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナル配列を含む。アミノ酸ペプチドＳＥＫＤＥＬは、合成遺伝子を増幅し、かつ同時にタンパク質のＣ末端の６アミノ酸を付加するように設計されたプライマーによるＰＣＲを使用して、酵素のＣ末端に融合される。この融合物は、胚乳における特異的な発現のために、トウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０２０８】
実施例６
ｍａｌＡについての植物形質転換ベクターの構築
超好熱性α−グルコシダーゼ
発現カセットを、種々の標的化シグナルを用いて、トウモロコシ胚乳中でＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ｍａｌＡ超好熱性α−グルコシダーゼを発現するように、以下のように構築した：
【０２０９】
ｐＮＯＶ４８３１（配列番号２６）は、小胞体（ＥＲ）への標的化およびそこでの保持のために、配列ＳＥＫＤＥＬのＣ末端付加を有する、合成ｍａｌＡ  α−グルコシダーゼに融合された、トウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナル配列（ＭＲＶＬＬＶＡＬＡＬＬＡＬＡＡＳＡＴＳ）（配列番号１７）を含む（ＭｕｎｒｏおよびＰｅｌｈａｍ、１９８７）。この融合物は、胚乳における特異的な発現のために、トウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０２１０】
ｐＮＯＶ４８３９（配列番号２７）は、小胞体への標的化およびアポプラストへの分泌のために、合成ｍａｌＡ  α−グルコシダーゼに融合された、トウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナル配列（ＭＲＶＬＬＶＡＬＡＬＬＡＬＡＡＳＡＴＳ）（配列番号１７）を含む（Ｔｏｒｒｅｎｔら、１９９７）。この融合物は、胚乳における特異的な発現のために、トウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０２１１】
ｐＮＯＶ４８３７は、小胞体への標的化およびそこでの保持のために、配列ＳＥＫＤＥＬのＣ末端付加を有する、合成ｍａｌＡ  α−グルコシダーゼに融合された、トウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナル配列（ＭＲＶＬＬＶＡＬＡＬＬＡＬＡＡＳＡＴＳ）（配列番号１７）を含む。この融合物は、胚乳における特異的な発現のために、トウモロコシＡＤＰｇｐｐプロモーターの後ろにクローニングした。このクローンのアミノ酸配列は、ｐＮＯＶ４８３１（配列番号２６）のそれと同一である。
【０２１２】
実施例７
超好熱性Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａグルコースイソメラーゼのための植物形質転換ベクターの構築
発現カセットを、種々の標的化シグナルを用いて、トウモロコシ胚乳中でＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ超好熱性グルコースイソメラーゼを発現するために、以下のように構築した：
【０２１３】
ｐＮＯＶ４８３２（配列番号２８）は、ＥＲへの標的化およびそこでの保持のために、配列ＳＥＫＤＥＬのＣ末端付加を有する、合成Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａグルコースイソメラーゼに融合された、トウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナル配列（ＭＲＶＬＬＶＡＬＡＬＬＡＬＡＡＳＡＴＳ）（配列番号１７）を含む。この融合物は、胚乳における特異的な発現のために、トウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０２１４】
ｐＮＯＶ４８３３（配列番号２９）は、ＥＲへの標的化およびそこでの保持のために、配列ＳＥＫＤＥＬのＣ末端付加を有する、合成Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａグルコースイソメラーゼに融合された、トウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナル配列（ＭＲＶＬＬＶＡＬＡＬＬＡＬＡＡＳＡＴＳ）（配列番号１７）を含む。この融合物は、胚乳における特異的な発現のために、トウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０２１５】
ｐＮＯＶ４８４０（配列番号３０）は、小胞体への標的化およびアポプラストへの分泌のために、合成Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａグルコースイソメラーゼに融合された、トウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナル配列（ＭＲＶＬＬＶＡＬＡＬＬＡＬＡＡＳＡＴＳ）（配列番号１７）を含む（Ｔｏｒｒｅｎｔら、１９９７）。この融合物は、胚乳における特異的な発現のために、トウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０２１６】
ｐＮＯＶ４８３８は、ＥＲへの標的化およびそこでの保持のために、配列ＳＥＫＤＥＬのＣ末端付加を有する、合成Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａグルコースイソメラーゼに融合された、トウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナル配列（ＭＲＶＬＬＶＡＬＡＬＬＡＬＡＡＳＡＴＳ）（配列番号１７）を含む。この融合物は、胚乳における特異的な発現のために、トウモロコシＡＤＰｇｐｐプロモーターの後ろにクローニングした。このクローンのアミノ酸配列は、ｐＮＯＶ４８３３（配列番号２９）のそれと同一である。
【０２１７】
実施例８
超好熱性グルカナーゼＥｇｌＡの発現のための植物形質転換ベクターの構築
ｐＮＯＶ４８００（配列番号５８）は、アポプラストへの局在化のために、ＥｇｌＡ成熟タンパク質配列と融合された、オオムギアルファアミラーゼＡＭＹ３２ｂシグナル配列（ＭＧＫＮＧＮＬＣＣＦＳＬＬＬＬＬＬＡＧＬＡＳＧＨＱ）（配列番号３１）を含む。この融合物は、胚乳における特異的な発現のために、トウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０２１８】
実施例９
複数の超好熱性酵素の発現のための植物形質転換ベクターの構築
ｐＮＯＶ４８４１は、７９７ＧＬ３  α−アミラーゼ融合物および６ＧＰ３プルラナーゼ融合物の二重遺伝子構築物を含む。７９７ＧＬ３融合物（配列番号３３）と６ＧＰ３融合物（配列番号３４）の両方は、ＥＲへの標的化およびそこでの保持のために、トウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナル配列およびＳＥＫＤＥＬ配列を有した。各融合物は、胚乳における特異的な発現のために、別々のトウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０２１９】
ｐＮＯＶ４８４２は、７９７ＧＬ３  α−アミラーゼ融合物およびｍａｌＡ  α−グルコシダーゼ融合物の二重遺伝子構築物を含む。７９７ＧＬ３融合物（配列番号３５）とｍａｌＡ  α−グルコシダーゼ融合ポリペプチド（配列番号３６）の両方は、ＥＲへの標的化およびそこでの保持のために、トウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナル配列およびＳＥＫＤＥＬ配列を有した。各融合物は、胚乳における特異的な発現のために、別々のトウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０２２０】
ｐＮＯＶ４８４３は、７９７ＧＬ３  α−アミラーゼ融合物およびｍａｌＡ  α−グルコシダーゼ融合物の二重遺伝子構築物を含む。７９７ＧＬ３融合物とｍａｌＡ  α−グルコシダーゼ融合物の両方は、ＥＲへの標的化およびそこでの保持のために、トウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナル配列およびＳＥＫＤＥＬ配列を有する。胚乳における特異的な発現のために、７９７ＧＬ３融合物はトウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングし、ｍａｌＡ融合物は、トウモロコシＡＤＰｇｐｐプロモーターの後ろにクローニングした。この７９７ＧＬ３融合物およびｍａｌＡ融合物のアミノ酸配列は、ｐＮＯＶ４８４２のそれと同一である（それぞれ、配列番号３５および３６）。
【０２２１】
ｐＮＯＶ４８４４は、７９７ＧＬ３α−アミラーゼ融合物、６ＧＰ３プルラナーゼ融合物、およびｍａｌＡ  α−グルコシダーゼ融合物の三重遺伝子構築物を含む。７９７ＧＬ３、ｍａｌＡ、および６ＧＰ３は、全て、ＥＲへの標的化およびそこでの保持のために、トウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナル配列およびＳＥＫＤＥＬ配列を有する。胚乳における特異的な発現のために、７９７ＧＬ３融合物およびｍａｌＡ融合物は、２つの別々のトウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングし、６ＧＰ３融合物は、トウモロコシＡＤＰｇｐｐプロモーターの後ろにクローニングした。この７９７ＧＬ３融合物およびｍａｌＡ融合物のアミノ酸配列は、ｐＮＯＶ４８４２のそれと同一である（それぞれ、配列番号３５および３６）。６ＧＰ３融合物のアミノ酸配列は、ｐＮＯＶ４８４１（配列番号３４）のそれと同一である。
【０２２２】
本実施例において、ならびに以下の実施例において示される全ての発現カセットを、アグロバクテリウム感染を介して、トウモロコシへの形質転換のために、バイナリベクターｐＮＯＶ２１１７に移動させた。ｐＮＯＶ２１１７は、マンノースを用いてトランスジェニック細胞の選択を可能にする、ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）遺伝子を含む。ｐＮＯＶ２１１７は、ｐＶＳ１とＣｏｌＥ１の両方の複製起点を有するバイナリベクターである。このベクターは、ｐＡＤ１２８９からの構成的ＶｉｒＧ遺伝子（Ｈａｎｓｅｎ，Ｇ．，ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９１：７６０３−７６０７（１９９４）、参照により本明細書に組み込まれる）およびＴｎ７からのスペクチノマイシン耐性遺伝子を含む。トウモロコシユビキチンプロモーター、ＰＭＩコード領域、およびｐＮＯＶ１１７のノパリンシンターゼターミネーターが、右側と左側のボーダー間のポリリンカーにクローニングされる（Ｎｅｇｒｏｔｔｏ，Ｄ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １９：７９８−８０３（２０００）、参照により本明細書に組み込まれる）。形質転換トウモロコシ植物は、自家受粉または外部交配のいずれかを行い、種子は分析のために収集する。異なる酵素の組み合わせは、個々の酵素を発現する植物を交雑させることによって、または複数の遺伝子カセットの１つを用いて植物を形質転換することによってのいずれかで生成され得る。
【０２２３】
実施例１０
細菌およびＰｉｃｈｉａ発現ベクターの構築
Ｐｉｃｈｉａまたは細菌において超好熱性α−グルコシダーゼおよびグルコースイソメラーゼを発現するための発現カセットを、以下のように構築した：
【０２２４】
ｐＮＯＶ４８２９（配列番号３７および３８）は、細菌発現ベクターｐＥＴ２９ａ中のＥＲ保持シグナルを有する、合成Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａグルコースイソメラーゼを含む。このグルコースイソメラーゼ融合遺伝子を、ｐＥＴ２９ａのＮｃｏＩ部位およびＳａｃＩ部位にクローニングし、これはタンパク質精製のためのＮ末端Ｓ−タグの付加を生じる。
【０２２５】
ｐＮＯＶ４８３０（配列番号３９および４０）は、細菌発現ベクターｐＥＴ２９ａ中のＥＲ保持シグナルを有する、合成Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａグルコースイソメラーゼを含む。このグルコースイソメラーゼ融合遺伝子を、ｐＥＴ２９ａのＮｃｏＩ部位およびＳａｃＩ部位にクローニングし、これはタンパク質精製のためのＮ末端Ｓ−タグの付加を生じる。
【０２２６】
ｐＮＯＶ４８３５（配列番号４１および４２）は、細菌発現ベクターｐＥＴ２８Ｃ中のＢａｍＨＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位にクローニングされた合成Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａグルコースイソメラーゼ遺伝子を含む。これは、グルコースイソメラーゼのＮ末端へのＨｉｓ−タグの融合物（タンパク質精製用）を生じる。
【０２２７】
ｐＮＯＶ４８３６（配列番号４３および４４）は、細菌発現ベクターｐＥＴ２８Ｃ中のＢａｍＨＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位にクローニングされた合成Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａグルコースイソメラーゼ遺伝子を含む。これは、グルコースイソメラーゼのＮ末端へのＨｉｓ−タグの融合物（タンパク質精製用）を生じる。
【０２２８】
実施例１１
未成熟トウモロコシ胚の形質転換を、本質的に、Ｎｅｇｒｏｔｔｏら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １９：７９８−８０３に記載されているように実行した。本実施例については、全ての培地成分は、Ｎｅｇｒｏｔｔｏら、前出に記載されている通りである。しかし、この文献に記載されている種々の培地成分が置換されてもよい。
【０２２９】
Ａ．形質転換プラスミドおよび選択マーカー
形質転換のために使用される遺伝子を、トウモロコシ形質転換のために適切なベクターにクローニングした。本実施例において使用されるベクターは、トランスジェニック株の選択のためにホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）遺伝子を含んだ（Ｎｅｇｒｏｔｔｏら、（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １９：７９８−８０３）。
【０２３０】
Ｂ．Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの調製
植物形質転換プラスミドを含むアグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢｌ）を、ＹＥＰ（酵母抽出物（５ｇ／Ｌ）、ペプトン（ｌ０ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（５ｇ／Ｌ）、１５ｇ／ｌ  寒天、ｐＨ  ６．８）固形培地上で、２〜４日間、２８℃で増殖させた。約０．８×１０9アグロバクテリウムを、１００μＭ  Ａｓで補充したＬｓ−ｉｎｆ培地中に懸濁した（Ｎｅｇｒｏｔｔｏら、（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  １９：７９８−８０３）。細菌を、この培地中で、３０〜６０分間、プレ誘導した。
【０２３１】
Ｃ．接種
Ａ１８８または他の適切な遺伝子型からの未成熟胚を、８〜１２日齢の穂から、液体ＬＳ−ｉｎｆ＋１００μＭ  Ａｓに切除した。胚を新鮮な感染培地で１回洗浄した。次いで、アグロバクテリウム溶液を加え、３０秒間ボルテックスし、５分間、細菌で定着させた。次いで、胚盤側を上にして胚をＬＳＡ培地に移し、暗所で２〜３日間培養した。引き続いて、ペトリプレートあたり、２０から２５個の間の胚を、セフォタキシム（２５０ｍｇ／ｌ）および硝酸銀（１．６ｍｇ／ｌ）で補充したＬＳＤｃ培地に移し、暗所にて２８℃で１０日間培養した。
【０２３２】
Ｄ．形質転換細胞の選択および形質転換植物の再生
胚形成カルスを生成する未成熟胚を、ＬＳＤＩＭ０．５Ｓ培地に移した。培養を、この培地上で６週間選択し、３週間で継代培養工程を行った。生存しているカルスを、マンノースを補充したＲｅｇ１培地に移した。明所での培養後（１６時間明／８時間暗のレジメント（ｒｅｇｉｍｅｎｔ））、次いで、緑色組織を、成長調節剤を含まないＲｅｇ２培地に移し、１〜２週間インキュベートした。小植物を、Ｒｅｇ３培地を含むＭａｇｅｎｔａ  ＧＡ−７ボックス（Ｍａｇｅｎｔａ  Ｃｏｒｐ，Ｃｈｉｃａｇｏ  Ｉｌｌ．）に移し、明所で増殖させた。２〜３週間後、植物を、ＰＣＲによって、ＰＭＩ遺伝子および他の関心対象の遺伝子の存在について試験した。ＰＣＲアッセイからのポジティブ植物を、温室に移した。
【０２３３】
実施例１２
アポプラストまたはＥＲに標的化された、α−アミラーゼを発現するトウモロコシ植物からのＴ１種子の分析
実施例４に記載したように、ｐＮＯＶ６２００またはｐＮＯＶ６２０１のいずれかで形質転換された自家受粉したトウモロコシ植物からのＴ１種子を得た。これらの穀粒中でのデンプンの蓄積は、高温への任意の曝露の前に、目視検査およびヨウ素溶液を用いるデンプンの通常の染色に基づいて、正常なようであった。未成熟穀粒を切り裂き、精製した胚乳を個別に微量遠心チューブに配置し、２００μｌの５０  ｍＭ  ＮａＰ０4緩衝液中に浸漬した。このチューブを、８５℃のウォーターバス中に２０分間配置し、次いで、氷上で冷却した。２０マイクロリットルの１％ヨウ素溶液を各チューブに加え、混合した。約２５％の分離された穀粒は、デンプンについて通常染色した。残りの７５％は染色に失敗し、このことは、デンプンが、ヨウ素で染色されない低分子量糖に分解されたことを示す。ｐＮＯＶ６２００およびｐＮＯＶ６２０１のＴ１のＴ１穀粒は、トウモロコシデンプンを自己加水分解していたことが見い出された。３７℃でのインキュベーション後には、検出可能なデンプンの減少は存在しなかった。
【０２３４】
アミラーゼの発現は、胚乳からの超好熱性タンパク質画分の単離、その後のＰＡＧＥ／Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色によってさらに分析した。適切な分子量（５０  ｋＤ）の分離しているタンパク質バンドを観察した。これらのサンプルは、市販の染色されたアミロース（ＡＭＹＬＡＺＹＭＥ、Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｒｅｌａｎｄより）を使用するα−アミラーゼアッセイに供する。高レベルの超好熱性アミラーゼ活性が、５０  ｋＤタンパク質の存在と相関した。
【０２３５】
超好熱性α−アミラーゼを発現し、アミロプラストに標的化された、トランスジェニックトウモロコシの大部分からの穀粒中のデンプンは、酵素がデンプン顆粒と直接的に接触されるならば、大気温度において、デンプンの大部分を加水分解するために十分に活性であることがさらに見い出された。アミロプラストに標的化された超好熱性α−アミラーゼを有する８０の系統のうち、穀粒中にデンプンを蓄積する４系統を同定した。これらの系統のうちの３つを、比色分析用アミラザイム（ａｍｙｌａｚｙｍｅ）アッセイ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を使用して熱安定性α−アミラーゼ活性について分析した。このアミラーゼ酵素アッセイは、これらの系統が、低レベルの熱安定性アミラーゼ活性を有することを示した。これらの３つの系統から精製したデンプンが、適切な湿度および熱の条件で処理されたとき、デンプンは加水分解された。このことは、これらの系統から調製されたデンプンの自己加水分解を容易にするために十分なレベルのα−アミラーゼの存在を示す。
【０２３６】
ｐＮＯＶ６２００とｐＮＯＶ６２０１の両方の形質転換体の複数の独立した系統からのＴ１種子を得た。各系統からの個々の穀粒(kernel)を切り裂き、精製した胚乳を、個別に、３００μｌの５０  ｍＭ  ＮａＰ０4緩衝液中でホモジナイズした。胚乳懸濁液のアリコートを、８５℃でのα−アミラーゼ活性について分析した。約８０％の系統が、超好熱性活性について分離する（図１Ａ、１Ｂ、および２を参照のこと）。
【０２３７】
野生型植物またはｐＮＯＶ６２０１で形質転換された植物からの穀粒を、１００℃で、１、２、３、または６時間加熱し、次いで、ヨウ素溶液でデンプンについて染色した。３または６時間後に、成熟穀粒中で、それぞれ、デンプンがほとんど検出されなかったか、または全く検出されなかった。従って、小胞体に標的化される超好熱性アミラーゼを発現するトランスジェニックトウモロコシからの成熟穀粒中のデンプンは、高温でインキュベートされたときに、加水分解された。
【０２３８】
別の実験において、５０℃で１６時間浸漬されたｐＮＯＶ６２０１植物からの成熟Ｔ１穀粒からの部分精製したデンプンは、８５℃で５分間の加熱後に加水分解された。このことは、小胞体に標的化されたα−アミラーゼが、穀粒の粉砕後にデンプンに結合し、および加熱の際にデンプンを加水分解可能であることを例証した。ヨウ素染色は、デンプンが、５０℃で１６時間の浸漬後に、成熟種子中でインタクトなままであることを示した。
【０２３９】
別の実験において、分離している、ｐＮＯＶ６２０１で形質転換された植物からの成熟穀粒を、９５℃で１６時間加熱し、次いで乾燥した。超好熱性α−アミラーゼを発現している種子中で、糖へのデンプンの加水分解は、乾燥後に皺がある外見を生じた。
【０２４０】
実施例１３
アミロプラストに標的化されたα−アミラーゼを発現するトウモロコシ植物からのＴ１種子の分析
実施例４に記載したように、ｐＮＯＶ４０２９またはｐＮＯＶ４０３１のいずれかで形質転換した自家受粉したトウモロコシ植物からのＴ１種子を得た。これらの系統由来の穀粒中でのデンプンの蓄積は、明確に正常ではなかった。全ての系統を、デンプンが非常に低いか、またはデンプンがない表現型について、重篤度のある程度のバリエーションを伴って分離した。未成熟穀粒から精製された胚乳は、高温への曝露の前には、ヨウ素で弱くのみ染色した。８５℃で２０分後、染色は存在しなかった。穂を乾燥させたとき、穀粒は収縮した。この特定のアミラーゼは、穀粒と直接的に接触されたときに、デンプンを加水分解するために、温室の温度において十分な活性を明確に有した。
【０２４１】
実施例１４
α−アミラーゼを発現するトウモロコシ植物からの穀粒の発酵
１００％トランスジェニック穀粒は、８５℃対９５℃で、液化時間を変化させた。外因性α−アミラーゼの添加なしでの発酵において十分な性能を発揮する、熱安定性α−アミラーゼを含むトランスジェニックトウモロコシ（ｐＮＯＶ６２０１）は、液化のためにはるかにより少ない時間を必要とし、より完全なデンプンの可溶化を生じる。実験室スケールの発酵は、以下の工程（以下に詳述する）を用いるプロトコールによって実行した：１）粉砕、２）湿度分析、３）グラウンドコーン（ｇｒｏｕｎｄ  ｃｏｒｎ）、水、バックセット（ｂａｃｋｓｅｔ）およびα−アミラーゼを含むスラリーの調製、４）液化ならびに５）同時の糖化および発酵（ＳＳＦ）。本実施例において、液化工程の温度および時間は、以下に記載するように変化させた。加えて、トランスジェニックトウモロコシを、外因性α−アミラーゼのあるなしで液化し、エタノール産生の性能を、市販のα−アミラーゼで処理されたコントロールトウモロコシと比較した。
【０２４２】
本実施例において使用されるトランスジェニックトウモロコシを、実施例４において示される手順に従って、α−アミラーゼ遺伝子およびＰＭＩ選択マーカーを含むベクター、すなわち、ｐＮＯＶ６２０１を使用して作製した。トランスジェニックトウモロコシを、高レベルの熱安定性α−アミラーゼを発現するトランスジェニック系統からの花粉を用いて、市販の雑種（Ｎ３０３０ＢＴ）を受粉させることによって生成した。このトウモロコシを、１１％湿度まで乾燥させ、室温で保存した。トランスジェニックトウモロコシ粉のα−アミラーゼ含量は、９５単位／ｇであり、ここで、１単位の酵素は、ｐＨ  ６．０  ＭＥＳ緩衝液中で、８５℃にて、トウモロコシ粉から、１分間あたり１マイクロモルの還元末端を生じる。使用したコントロールトウモロコシは、エタノール産生において十分な性能を有することが知られている黄色のデントコーンであった。
【０２４３】
１）粉砕：トランスジェニックトウモロコシ（１１８０ｇ）を、２．０ｍｍふるいを備えたＰｅｒｔｅｎ  ３１００ハンマーミル中で粉砕し、従って、トランスジェニックトウモロコシ粉を生成した。コントロールトウモロコシを、トランスジェニックトウモロコシによる夾雑を妨害するための徹底的な洗浄後に、同じミル中で製粉した。
【０２４４】
２）湿度分析：トランスジェニックおよびコントロールトウモロコシのサンプル（２０  ｇ）をアルミニウム秤量ボートで秤量し、１００℃で４時間加熱した。サンプルを再度秤量し、重量の減少から湿度含量を計算した。トランスジェニック粉の湿度含量は９．２６％であり；コントロール粉のそれは１２．５４％であった。
【０２４５】
３）スラリーの調製：スラリーの組成を、ＳＳＦの開始時において、３６％固体を有するマッシュを生じるように設計した。コントロールサンプルを、１００ｍｌプラスチックボトル中で調製し、これは、２１．５０ｇのコントロールトウモロコシ粉、２３ｍｌの脱イオン水、６．０ｍｌのバックセット（８％固体重量）、および水で１／５０希釈した０．３０ｍｌの市販のα−アミラーゼを含んだ。α−アミラーゼ用量を、産業上での使用にとって代表的なように選択した。トランスジェニックα−アミラーゼのアッセイのために、上記の条件下でアッセイされるときに、コントロールα−アミラーゼ用量は、２Ｕ／ｇトウモロコシ粉であった。ｐＨを、水酸化アルミニウムの添加によって、６．０まで調整した。トランスジェニックサンプルを同じ様式で調整したが、トランスジェニック粉のより低い湿度含量のために、２０ｇのトウモロコシ粉を含んだ。トランスジェニック粉のスラリーを、コントロールサンプルと同じ用量のα−アミラーゼを用いて、または外因性α−アミラーゼなしのいずれかで調製した。
【０２４６】
４）液化：トランスジェニックトウモロコシ粉のスラリーを含むボトルを、８５℃または９５℃のいずれかで、５、１５、３０、４５、または６０分の時間、ウォーターバス中に浸漬した。コントロールスラリーを、８５℃で６０分間インキュベートした。高温インキュベーションの間、スラリーを、５分毎に手動で激しく混合した。高温工程の後で、スラリーを氷上で冷却した。
【０２４７】
５）同時の糖化および発酵：液化によって生成したマッシュを、グルコアミラーゼ（市販のＬ−４００グルコアミラーゼの１／５０希釈の０．６５ｍｌ）、プロテアーゼ（市販のプロテアーゼの１，０００倍希釈の０．６０ｍｌ）、０．２ｍｇ  Ｌａｃｔｏｃｉｄｅおよび尿素（５０％尿素液の１０倍希釈の０．８５ｍｌ）と混合した。マッシュを含む１００ｍｌボトルのキャップに穴を空けて、ＣＯ2を放出させた。次いで、マッシュに酵母（１．４４ｍｌ）を接種し、９０Ｆに設定したウォーターバス中でインキュベートした。発酵の２４時間後、温度を８６Ｆまで低下させ；４８時間において、温度を８２Ｆに設定した。
【０２４８】
接種のための酵母を、７０グラムのマルトデキストリン、２３０ｍｌの水、１００ｍｌのバックセット、グルコアミラーゼ（市販のグルコアミラーゼの１０倍希釈の０．８８ｍｌ）、プロテアーゼ（市販の酵素の１００倍希釈の１．７６ｍｌ）、尿素（１．０７グラム）、ペニシリン（０．６７ｍｇ）、および硫酸亜鉛（０．１３ｇ）とともに酵母（０．１２ｇ）を含んだ混合物を調製することによって増殖した。増殖培養を、それが必要とされる日の前に開始し、９０°Ｆで混合しながらインキュベートした。
【０２４９】
２４時間、４８時間および７２時間でサンプルを各発酵ベッセルから取り、０．２μｍフィルターを通して濾過し、そしてエタノールおよび糖についてＨＰＬＣによって分析した。７２時間で、全体の溶解した固体および残渣のデンプンについて、サンプルを分析した。
【０２５０】
ＨＰＬＣ分析を、屈折率検出器、カラムヒーター、およびＢｉｏ−Ｒａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラムを備えたバイナリグラジエントシステム上で実行した。このシステムは、１ｍｌ／分で、水中の０．００５  Ｍ  Ｈ2Ｓ０4で平衡化した。カラム温度は５０℃であった。サンプル注入量は５μｌであった；溶出は同じ溶媒中であった。ＲＩ応答は、既知の標準の注入によって較正した。エタノールとグルコースの両方を、各注入において測定した。
【０２５１】
残渣のデンプンを以下のように測定した。サンプルおよび標準を、オーブン中で５０℃に加熱し、次いでサンプルミル中で粉末に粉砕した。粉末（０．２ｇ）を１５ｍｌ目盛りの遠心チューブ中で秤量した。この粉末を、１０ｍｌ水性エタノール（８０％  ｖ／ｖ）を用いて、ボルテックス、続いて遠心分離および上清の廃棄によって、３回洗浄した。ＤＭＳＯ（２．０ｍｌ）、続いてＭＯＰＳ緩衝液中の３．０ｍｌの熱安定性アルファ−アミラーゼ（３００単位）をペレットに加えた。激しい混合の後、チューブを、ウォーターバス中で、８５℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションの間、チューブを４回混合した。サンプルを冷却し、４．０ｍｌの酢酸ナトリウム緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ  ４．５）を加え、続いて０．１ｍｌのグルコアミラーゼ（２０Ｕ）を加えた。サンプルを５０℃で２時間インキュベートし、混合し、次いで５分間、３，５００ｒｐｍで遠心分離した。上清を０．２μｍフィルターを通して濾過し、上記のＨＰＬＣ法によってグルコースについて分析した。５０μｌの注入サイズをサンプルについて使用し、低い残渣のデンプンを有した（固形物の＜２０％）。
【０２５２】
結果  トランスジェニックトウモロコシは、α−アミラーゼを加えることなしで発酵において十分な性能であった。７２時間におけるエタノールの収量は、表１に示されるように、外因性α−アミラーゼのあるなしで本質的に同じであった。これらのデータはまた、液化温度がより高い場合、より高い収量のエタノールが達成されること；トランスジェニックトウモロコシ中で発現される本酵素が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  α−アミラーゼなどの商業的に使用される他の酵素よりも、より高い温度で活性を有することを示す。
【０２５３】
【表１】
2007527726.tif 000002
【０２５４】
液化時間が変化されたとき、効率的なエタノール産生のために必要とされる液化時間は、従来的なプロセスによって必要とされる時間よりもはるかに少なかったことが見い出された。図３は、７２時間の発酵におけるエタノール収量が、１５分間〜６０分間の液化でほぼ変化されなかったことを示す。加えて、９５℃における液化は、８５℃における液化よりも、各時点においてより多くのエタノールを与えた。この観察は、超好熱性酵素の使用によって達成される、プロセスの改善を実証する。
【０２５５】
コントロールトウモロコシは、トランスジェニックトウモロコシよりも高い最終エタノール収量を与えたが、しかし、コントロールは、それが発酵において非常に良好な性能であるために選択した。対照的に、トランスジェニックトウモロコシは、形質転換を容易にするために選択された遺伝的バックグラウンドを有する。周知の育種技術によって、選り抜きのトウモロコシの遺伝資源にα−アミラーゼ形質を導入することは、この違いを取り除くはずである。
【０２５６】
７２時間において生成された残渣のデンプンレベルの試験（図４）は、トランスジェニックα−アミラーゼが、発酵のために利用可能であるデンプンを作製する際に顕著な改善を生じること；はるかに少ないデンプンが発酵後に残ることを示す。
【０２５７】
エタノールレベルと残渣のデンプンレベル両方を使用して、最適液化時間は、９５℃において１５分間、および８５℃において３０分間であった。本実験において、これらの時間は、発酵容器がウォーターバス中にあった全体の時間であった。従って、これらの時間は、サンプルの温度が室温から８５℃または９５℃まで上昇した間の時間を含む。より短い液化時間は、ジェットクッカーなどの装置の使用によって、迅速にマッシュを加熱する大スケールの産業プロセスにおいて最適であるかもしれない。従来的な産業用液化プロセスは、マッシュが、１時間以上の間、高温でインキュベートされることを可能にする保持タンクを必要とする。本発明は、このような保持タンクの必要性を除外し、液化装置の生産性を増加する。
【０２５８】
発酵プロセスにおけるα−アミラーゼの１つの重要な機能は、マッシュの粘性を減少させることである。多くの時点において、トランスジェニックトウモロコシ粉を含むサンプルは、コントロールサンプルよりも顕著に粘性が低かった。加えて、トランスジェニックサンプルは、全てのコントロールサンプルで観察されたゼラチン相を経由しないようであった；ゼラチン化は、通常、トウモロコシスラリーが調理されるときに起こる。従って、胚乳のフラグメントを通して分布するα−アミラーゼを有することは、分散を遅延させ、かつマッシュの混合およびポンピングのエネルギーコストを増加させる大きなゲルの形成を妨害することによって、調理の間のマッシュの有利な物理特性を与える。
【０２５９】
トランスジェニックトウモロコシ中の高用量のα−アミラーゼはまた、トランスジェニックマッシュの好ましい特性に寄与する可能性がある。８５℃においては、トランスジェニックトウモロコシのα−アミラーゼ活性は、コントロールにおいて使用される外因性α−アミラーゼの用量のそれよりも、何倍も高い活性であった。この後者は、商業的使用の速度の代表的なものとして選択した。
【０２６０】
実施例１５
コントロールトウモロコシと混合したときのトランスジェニックトウモロコシの効果的な機能
トランスジェニックトウモロコシ粉を、５％から１００％トランスジェニックトウモロコシ粉までの様々なレベルで、コントロールトウモロコシ粉と混合した。これらを、実施例１４に記載されるように処理した。トランスジェニック的に発現されたα−アミラーゼを含むマッシュを、８５℃で３０分間、または９５℃で１５分間液化した；コントロールマッシュを、実施例１４に記載されるように調製し、８５℃で３０もしくは６０分間（各１）または９５℃で１５もしくは６０分間（各１）液化した。
【０２６１】
エタノールについて４８および７２時間、ならびに残渣のデンプンについてのデータを表２に与える。４８時間におけるエタノールレベルを、図５においてグラフにしている；残渣のデンプンの決定は表６に示す。これらのデータは、トランスジェニック的に発現された熱安定性α−アミラーゼが、トランスジェニック穀粒が、マッシュ中で全体の穀粒の小さな割合（５％まで低い）であるときでさえ、非常に良好なエタノール生成の性能を与えることを示す。データはまた、トランスジェニック穀粒が全体の穀粒の少なくとも４０％を含むときに、残渣のデンプンが、コントロールマッシュにおいて顕著により低いことを示す。
【０２６２】
【表２】
2007527726.tif 000003
【０２６３】
実施例１６
全体のトウモロコシの１．５〜１２％の割合でトランスジェニックトウモロコシを使用する、液化ｐＨの関数としてのエタノール生成
トランスジェニックトウモロコシは、１回の発酵において全体のトウモロコシの５〜１０％のレベルで十分な性能を示したので、更なるの一連の発酵（ここで、トランスジェニックトウモロコシは全体のトウモロコシの１．５〜１２％を含む）を実行した。ｐＨを６．４〜５．２まで変化させ、トランスジェニックトウモロコシ中で発現されたα−アミラーゼ酵素を、産業上常用のものよりも低いｐＨで、活性について最適化した。
【０２６４】
実験を、以下の例外を伴って、実施例１５に記載されるように実行した：
１）．トランスジェニック粉を、全体の乾燥重量のパーセントとして１．５％〜１２．０％の範囲のレベルでコントロール粉と混合した。
２）．コントロールトウモロコシは、実施例１４および１５において使用されるコントロールよりもトランスジェニックトウモロコシにより類似している、Ｎ３０３０ＢＴであった。
３）．外因性α−アミラーゼを、トランスジェニック粉を含むサンプルに加えなかった。
４）．サンプルを、液化の前に、ｐＨ  ５．２、５．６、６．０または６．４に調整した。０％トランスジェニックトウモロコシ粉から１２％トランスジェニックトウモロコシ粉の範囲にわたる少なくとも５つのサンプルを、各ｐＨについて調製した。
５）．全サンプルについての液化を、８５℃で６０分間実行した。
【０２６５】
発酵時間の関数としてのエタノール含量の変化を図７に示す。この図は、３％トランスジェニックトウモロコシを含んだサンプルから得られたデータを示す。より低いｐＨにおいて、発酵は、ｐＨ  ６．０およびそれ以上よりもより迅速に進行する；同様の挙動を、トランスジェニック穀粒の他の用量を有するサンプルにおいて観察した。高レベルの発現と組み合わせた、トランスジェニック酵素の活性のｐＨプロフィールは、より低いｐＨの液化が、従来的なｐＨ  ６．０プロセスにおいて可能であるよりも、より迅速な発酵、従って、より高いスループットを生じることを可能にする。
【０２６６】
７２時間におけるエタノール収量を図８に示す。見られ得るように、エタノール収量に基づくと、結果は、サンプル中に含まれるトランスジェニック穀粒の量にほとんど依存しないことを示した。従って、穀粒は、エタノールの発酵的生成を容易にするために、豊富なアミラーゼを含んでいる。より低いｐＨの液化が、より高いエタノール収量を生じることもまた実証される。
【０２６７】
液化後のサンプルの粘性をモニターし、ｐＨ  ６．０において、６％トランスジェニック穀粒が、粘性の適切な減少のために十分であることを観察した。ｐＨ  ５．２および５．６においては、粘性は、１２％トランスジェニック穀粒において、コントロールのそれと等価であるが、より低いパーセンテージのトランスジェニック穀粒ではない。
【０２６８】
実施例１７
好熱性酵素を使用する、トウモロコシ粉からのフルクトースの生成
超好熱性α−アミラーゼ、７９７ＧＬ３を発現するトウモロコシは、α−グルコシダーゼ（ＭａｌＡ）およびキシロースイソメラーゼ（ＸｙｌＡ）と混合したときに、フルクトースの生成を容易にすることが示された。
【０２６９】
７９７ＧＬ３を発現するｐＮＯＶ６２０１トランスジェニック植物からの種子を、Ｋｌｅｃｏセル中で粉まで粉砕し、従って、アミラーゼ粉を作製した。非トランスジェニックトウモロコシ穀粒を、コントロール粉を生成するために、同じ様式で粉砕した。
【０２７０】
α−グルコシダーゼ、ＭａｌＡ（Ｓ．ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来）を、大腸菌中で発現させた。収集した細菌を、１  ｍＭ  ４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリドを含む、５０  ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液  ｐＨ  ７．０中に懸濁し、次いで、フレンチプレッシャーセル（Ｆｒｅｎｃｈ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｃｅｌｌ）で溶解した。この溶解物を、２３，０００×ｇで、１５分間、４℃で遠心分離した。上清溶液を取り出し、７０℃に１０分間加熱し、氷上で１０分間冷却し、次いで３４，０００×ｇで３０分間、４℃で遠心分離した。上清溶液を取り出し、ＭａｌＡを、セントリコン１０デバイスで２倍濃縮した。セントリコン１０工程の濾液を、ＭａｌＡについてのネガティブコントロールとしての使用のために保持した。
【０２７１】
キシロース（グルコース）イソメラーゼを、大腸菌中で、Ｔ．  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａのｘｙｌＡ遺伝子を発現することによって調製した。細菌を１００  ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ  ７．０中に懸濁し、フレンチプレッシャーセルを通過させることによって溶解した。細胞細片の沈殿後、抽出物を８０℃に１０分間加熱し、次いで遠心分離した。上清溶液は、ＸｙｌＡ酵素活性を含んだ。空のベクターコントロール抽出物を、ＸｙｌＡ抽出物と並行して調製した。
【０２７２】
トウモロコシ粉（サンプルあたり６０ｍｇ）を緩衝液およびＥ  ｃｏｌｉからの抽出物と混合した。表３に示されるように、サンプルは、アミラーゼトウモロコシ粉（アミラーゼ）またはコントロールトウモロコシ粉（コントロール）、５０μｌのＭａｌＡ抽出物（＋）または濾液（−）のいずれか、および２０μｌのＸｙｌＡ抽出物（＋）または空のベクターコントロール（−）のいずれかを含んだ。全てのサンプルはまた、２３０μｌの５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、１０ｍＭ  ＭｇＳ０４、および１  ｍＭ  ＣｏＣｌ２を含んだ；緩衝液のｐＨは室温で７．０であった。
【０２７３】
サンプルを８５℃で１８時間インキュベートした。インキュベーション時間の最後に、サンプルを、０．９ｍｌの８５℃の水で希釈し、不溶性物質を除去するために遠心分離した。次いで、上清画分を、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）３限外濾過デバイスを通して濾過し、ＥＬＳＤ検出を用いてＨＰＬＣによって分析した。
【０２７４】
グラジエントＨＰＬＣシステムは、Ａｓｔｅｃ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ａｍｉｎｏカラム、５ミクロン粒子サイズ、２５０×４．６ｍｍおよびＡｌｌｔｅｃｈ  ＥＬＳＤ  ２０００検出器を備えた。このシステムは、水：アセトニトリルの１５：８５混合物でプレ平衡化した。流速は１ｍｌ／分であった。初期条件は、注入後５分間維持され、次に、５０：５０  水：アセトニトリルまでの２０分間グラジエント、続いて１０分間同じ溶媒であった。このシステムは、２０分間の８０：２０  水：アセトニトリルで洗浄し、次いで、出発溶媒で再平衡化した。フルクトースは、５．８分で、グルコースは８．７分で溶出した。
【０２７５】
【表３】
2007527726.tif 000004
【０２７６】
ＨＰＬＣの結果はまた、α―アミラーゼを含む全てのサンプルにおいて、より大きなマルトオリゴサッカライドの存在を示した。これらの結果は、３つの好熱性酵素が、より高い温度でトウモロコシ粉からフルクトースを生成するように、一緒に機能することができることを実証する。
【０２７７】
実施例１８
イソメラーゼを伴うアミラーゼ粉
別の例において、アミラーゼ粉は、精製したＭａｌＡ、ならびに２つの細菌のキシロースイソメラーゼの各々：Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａのＸｙｌＡ、およびＤｉｖｅｒｓａから得られるＢＤ８０３７と名付けられた酵素と混合した。アミラーゼ粉は、実施例１８に記載されるように調製した。
【０２７８】
６Ｈｉｓ精製タグを有するＳ．ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＭａｌＡを、大腸菌中で発現させた。細胞溶解物を実施例１８に記載されるように調製し、次いで、ニッケルアフィニティーレジン（Ｐｒｏｂｏｎｄ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、かつネイティブタンパク質精製のための製造業者の指示に従って、見かけの均一性まで精製した。
【０２７９】
ＳタグおよびＥＲ保持シグナルの付加を有するＴ．ｍａｒｉｔｉｍａ  ＸｙｌＡを大腸菌中で発現し、実施例１８に記載されるように、Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ  ＸｙｌＡと同様の様式で調製した。
【０２８０】
キシロースイソメラーゼＢＤ８０３７を、凍結乾燥粉末として入手し、０．４×元の量の水中に再懸濁した。
【０２８１】
アミローストウモロコシ粉を、酵素溶液プラス水または緩衝液とともに混合した。全ての反応は、６０ｍｇアミロース粉および総計６００μｌの液体を含んだ。１セットの反応は、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、室温にてｐＨ  ７．０、プラス１０ｍＭ  ＭｇＳ０４および１ｍＭ  ＣｏＣ１２で緩衝化され；第２のセットの反応においては、金属含有緩衝溶液が、水によって置き換えられた。イソメラーゼ酵素の量は、表４において示されるように変化させた。全ての反応は、９０℃で２時間インキュベートした。反応上清画分を遠心分離によって調製した。ペレットを、さらなる６００μｌ  Ｈ2Ｏで洗浄し、再遠心分離した。各反応からの上清画分を合わせ、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  １０を通して濾過し、および実施例１７に記載されるように、ＥＬＳＤ検出を伴うＨＰＬＣによって分析した。観察されたグルコースおよびフルクトースの量を、図１５においてグラフで表す。
【０２８２】
【表４】
2007527726.tif 000005
【０２８３】
各々のイソメラーゼを用いると、α−アミラーゼおよびα−グルコシダーゼが反応中に存在したときには、用量依存的な様式で、フルクトースがトウモロコシ粉から生成した。これらの結果は、穀粒発現されるアミラーゼ７９７ＧＬ３は、添加される金属イオンのあるなしで、ＭａｌＡおよび種々の異なる好熱性イソメラーゼとともに作用して、高温にてトウモロコシ粉からフルクトースを生成することを実証する。添加される金属イオンの存在下で、イソメラーゼは、約５５％フルクトースの、予測されたフルクトース：グルコース平衡を９０℃において達成し得る。これは、フルクトース濃度を増加させるためにクロマトグラフィー分離を必要とする、中温性イソメラーゼを使用する現在のプロセスを超えた改善である。
【０２８４】
実施例１９
トウモロコシ中のプルラナーゼの発現
ｐＮＯＶ７０１３またはｐＮＯＶ７００５のいずれかについてホモ接合性であったトランスジェニック植物を、７９７ＧＬ３  α−アミラーゼと６ＧＰ３  プルラナーゼの両方を発現するトランスジェニックトウモロコシ種子を生成するように交雑させた。
【０２８５】
ｐＮＯＶ  ７００５またはｐＮＯＶ  ４０９３のいずれかで形質転換された、自家受粉したトウモロコシ植物からのＴ１またはＴ２種子を得た。ｐＮＯＶ４０９３は、６ＧＰ３についてのトウモロコシに最適化された合成遺伝子の融合物であり（配列番号３、４）、アミロプラストへの融合タンパク質の局在化のための、アミロプラスト標的化配列（配列番号７、８）を有する。この融合タンパク質は、胚乳における特異的な発現のために、ＡＤＰｇｐｐプロモーター（配列番号１１）の制御下にある。ｐＮＯＶ７００５構築物は、プルラナーゼの発現を、胚乳の小胞体中に標的化する。ＥＲにおけるこの酵素の局在化は、穀粒中のデンプンの正常な蓄積を可能にする。高温への任意の曝露の前に、ヨウ素溶液を用いて、デンプンについての通常の染色もまた観察した。
【０２８６】
α−アミラーゼの場合において記載したように、アミロプラストに標的化されたプルラナーゼ（ｐＮＯＶ４０９３）の発現は、穀粒中での異常なデンプンの蓄積を生じた。トウモロコシの穂が乾燥されるとき、穀粒は収縮する。明白に、この好熱性プルラナーゼは、それが種子の胚乳中のデンプン顆粒とともに直接的に接触されるときに、低温において十分に活性であり、およびデンプンを加水分解する。
【０２８７】
酵素の調製またはトウモロコシ粉からの酵素の抽出：プルラナーゼ酵素を、Ｋｌｅｃｏグラインダー中でそれらを粉砕すること、続いて、連続して攪拌しながら、５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ５．５緩衝液中での、室温で１時間の粉のインキュベーションによって、トランスジェニック種子から抽出した。次いで、インキュベートした混合物を、１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を、酵素の供給源として使用した。
【０２８８】
プルラナーゼアッセイ：アッセイ反応を９６ウェルプレート中で実行した。トウモロコシ粉から抽出した酵素（１００μｌ）を、４０ｍＭ  ＣａＣ１2を含む、９００μｌの  ５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ５．５緩衝液で１０倍希釈した。この混合物をボルテックスし、１タブレットのＬｉｍｉｔ−Ｄｅｘｔｒｉｚｙｍｅ（アズリン架橋プルラン、Ｍｅｇａｚｙｍｅより）を各反応混合物に加え、７５℃で３０分間（または示されるように）インキュベートした。インキュベーションの最後に、反応混合物を３５００  ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を５倍希釈し、５９０ｎｍにおける吸光度測定のために９６ウェル平底プレートに移した。プルラナーゼによる、アズリン架橋プルラン基質の加水分解は、水溶性色素フラグメントを生じ、これらの遊離の速度（５９０ｎｍにおける吸光度の増加として測定される）は、酵素活性に直接的に比例する。
【０２８９】
図９は、ｐＮＯＶ  ７００５で形質転換した異なるイベントからのＴ２種子の分析を示す。非トランスジェニックコントロールと比較した、プルラナーゼ活性の高発現を、多数のイベントにおいて検出することができる。
【０２９０】
トランスジェニック（プルラナーゼまたはアミラーゼ、または両方の酵素を発現する）および／またはコントロール（非トランスジェニック）からの測定した量（〜１００μｇ）の乾燥トウモロコシ粉に、４０ｍＭ  ＣａＣｌ2を含む１０００μｌの５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ  ５．５緩衝液を加えた。この反応混液をボルテックスし、シェーカー上で１時間インキュベートした。酵素反応を、図において示されるような時間の間、インキュベーション混液を高温（プルラナーゼにとっての最適反応温度である７５℃、または図において言及されるように）に移すことによって開始した。反応を、それらを氷上に下ろして冷却することによって停止した。次いで、反応混液を１０分間、１４０００ｒｐｍで遠心分離した。上清のアリコート（１００μｌ）を３倍希釈し、ＨＰＬＣ分析のために０．２ミクロンフィルターを通して濾過した。
【０２９１】
サンプルを、以下の条件を使用してＨＰＬＣによって分析した：
カラム：Ａｌｌｔｅｃｈ  Ｐｒｅｖａｉｌ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ＥＳ  ５ミクロン  ２５０×４．６ｍｍ
検出器：Ａｌｌｔｅｃｈ  ＥＬＳＤ  ２０００
ポンプ：Ｇｉｌｓｏｎ  ３２２
インジェクター：Ｇｉｌｓｏｎ  ２１５インジェクター／ダイルーター
溶媒：ＨＰＬＣグレードアセトニトリル（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および水（Ｗａｔｅｒｓ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍにより精製）。
【０２９２】
低度の重合のオリゴサッカライド（ＤＰ  １〜１５）のために使用したグラジエント。
時間  水％  アセトニトリル％
０    １５    ８５  
５    １５    ８５
２５    ５０    ５０
３５    ５０    ５０
３６    ８０    ２０
５５    ８０    ２０
５６    １５    ８５
７６    １５    ８５
【０２９３】
高度の重合のサッカライド（ＤＰ  ２０〜１００以上）のために使用したグラジエント。
時間  水％  アセトニトリル％
０    ３５    ６５
６０    ８５    １５
７０    ８５    １５
８５    ３５    ６５
１００    ３５    ６５
データ分析のために使用したシステム：Ｇｉｌｓｏｎ  Ｕｎｉｐｏｉｎｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍバージョン３．２。
【０２９４】
図１０Ａおよび１０Ｂは、トランスジェニックトウモロコシ粉中のデンプンから発現したプルラナーゼによって生じた加水分解生成物のＨＰＬＣ分析を示す。プルラナーゼ発現トウモロコシの粉の、反応緩衝液中、７５℃で３０分間でのインキュベーションは、トウモロコシデンプンからの中程度の鎖のオリゴサッカライド（ＤＰ約１０〜３０）および短いアミロース鎖（ＤＰ約１００〜２００）の産生を生じる。この図はまた、プルラナーゼ活性の、カルシウムイオンの存在への依存性を示す。
【０２９５】
プルラナーゼを発現するトランスジェニックトウモロコシは、脱分枝されており（α１−６結合が切断されている）それゆえに高レベルのアミロース／直鎖デキストリンを有する修飾デンプン／デキストリンを生成するために使用することができる。プルラナーゼによって生成されるアミロース／デキストリンの鎖長分布はまた、使用されるデンプンの種類（例えば、ｗａｘｙ、高アミロースなど）に依存して、それゆえに修飾デンプン／デキストリンの特性に依存して変化する。
【０２９６】
α１−６結合の加水分解はまた、基質としてプルランを使用して実証した。トウモロコシ粉から単離したプルラナーゼは、プルランを効率的に加水分解した。インキュベーションの最後に生成した生成物のＨＰＬＣ分析は（記載されるように）、トウモロコシからの酵素による、プルラン分子中のα１−６結合の加水分解に起因して、予測されるように、マルトトリオースの生成を示した。
【０２９７】
実施例２０
トウモロコシ中でのプルラナーゼの発現
６ｇｐ３プルラナーゼの発現を、トウモロコシ粉からの抽出、続いてＰＡＧＥおよびＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色によってさらに分析した。トウモロコシ粉を、Ｋｌｅｃｏグラインダー中で種子を、３０秒間粉砕することによって作製した。酵素を、約１５０ｍｇの粉から、１ｍｌの５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ  ５．５緩衝液で抽出した。この混合物をボルテックスし、シェーカーで室温にて１時間インキュベートし、続いて７０℃で別の１５分間のインキュベーションを行った。次いで、この混合物を遠心分離し（１５分間、室温において１４０００ｒｐｍ）、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に使用した。適切な分子量（９５  ｋＤａｌ）のタンパク質バンドを観察した。これらのサンプルを、市販の色素結合体化限界デキストリン（ＬＩＭＩＴ−  ＤＥＸＴＲＩＺＹＭＥ、Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｒｅｌａｎｄより）を使用するプルラナーゼアッセイに供する。高レベルの好熱性プルラナーゼ活性が、９５ｋＤタンパク質の存在と相関した。
【０２９８】
トランスジェニックトウモロコシ種子のウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡ分析もまた、プルラナーゼ（大腸菌中で発現）に対して産生された抗体と反応する約９５ｋＤタンパク質の発現を実証した。
【０２９９】
実施例２１
プルラナーゼ発現トウモロコシの付加による、デンプン加水分解の速度の増大および短い鎖の（発酵可能な）オリゴサッカライドの収量の改善
図１１Ａおよび１１Ｂに示されるデータは、２つの反応混液からのデンプン加水分解生成物の、上記のようなＨＰＬＣ分析から生じた。「アミラーゼ」として示される第１の反応は、例えば、実施例４において記載される方法に従って作製した、α−アミラーゼを発現するトランスジェニックトウモロコシのトウモロコシ粉サンプル、および非トランスジェニックトウモロコシＡ１８８のトウモロコシ粉サンプルの混合物［１：１（ｗ／ｗ）］を含み；そして「アミラーゼ＋プルラナーゼ」として示される第２の反応混合物は、α−アミラーゼを発現するトランスジェニックトウモロコシのトウモロコシ粉サンプル、および実施例１９において記載される方法に従って作製した、プルラナーゼを発現するトランスジェニックトウモロコシのトウモロコシ粉サンプルの混合物［１：１（ｗ／ｗ）］を含む。得られた結果は、デンプン加水分解プロセスの間に、α−アミラーゼと組み合わせたプルラナーゼの使用の利点を支持する。この利点は、デンプン加水分解の速度の増加（図１１Ａ）および低ＤＰを有する発酵可能なオリゴサッカライドの収量の増加（図１１Ｂ）からである。
【０３００】
トウモロコシ中で発現される、α−アミラーゼ単独、またはα−アミラーゼおよびプルラナーゼ（またはデンプン加水分解酵素の任意の他の組み合わせ）が、マルトデキストリン（直鎖または分枝鎖オリゴサッカライド）を生成するために使用可能であることが見い出された（図１１Ａ、１１Ｂ、１２、および１３Ａ）。反応条件に依存して、加水分解酵素の型およびそれらの組み合わせ、ならびに使用されるデンプンの型に依存して、生成されるマルトデキストリンの組成、およびそれらの特性は変化する。
【０３０１】
図１２は、図１１において記載されるのと同様の様式で実行された実験の結果を示す。反応のインキュベーションの間に従う異なる温度および時間のスキームをこの図に示す。プルラナーゼについての最適反応温度は７５℃であり、α−アミラーゼについてはそれは＞９５℃である。従って、示されたスキームは、それらのそれぞれの最適な反応温度における、プルラナーゼおよび／またはα−アミラーゼによる触媒を実行するための範囲を提供することが理解される。このことは、６０分間のインキュベーション時間の最後に、α−アミラーゼおよびプルラナーゼの組み合わせがトウモロコシデンプンを加水分解する際により良好な性能であったことを示す結果から、明確に導き出され得る。
【０３０２】
３０分間のインキュベーションの最後での、２つのセットの反応混合物からのデンプン加水分解生成物の、上記のような（約１５０ｍｇのトウモロコシ粉をこれらの反応において使用したことを例外とする）ＨＰＬＣ分析を、図１３Ａおよび１３Ｂに示す。第１のセットの反応は８５℃でインキュベートし、第２のセットは９５℃でインキュベートした。各セットについて、２つの反応混合物が存在する；「アミラーゼＸプルラナーゼ」と示される第１の反応は、α−アミラーゼとプルラナーゼの両方を発現するトランスジェニックトウモロコシ（異花受粉によって生成した）からの粉を含み、「アミラーゼ」と示される第２の反応は、交雑によって観察されるα−アミラーゼ活性（アミラーゼＸプルラナーゼ）の同じ量を得るような比率である、α−アミラーゼ発現トランスジェニックトウモロコシのトウモロコシ粉サンプルおよび非トランスジェニックトウモロコシＡ１８８のトウモロコシ粉サンプルの混合物である。低ＤＰオリゴサッカライドの全体の収量は、トウモロコシ粉サンプルが８５℃でインキュベートされたときに、α−アミラーゼ単独を発現するトウモロコシと比較して、α−アミラーゼおよびプルラナーゼの交雑の場合により高かった。９５℃のインキュベーション温度は、プルラナーゼ酵素を（少なくとも部分的に）不活性化し、それゆえに、「アミラーゼＸプルラナーゼ」と「アミラーゼ」の間でわずかな違いが観察可能である。しかし、両方のインキュベーション温度についてのデータは、α−アミラーゼおよびプルラナーゼの交雑のトウモロコシ粉が、α−アミラーゼ単独を発現するトウモロコシと比較されたときに、インキュベーション時間の最後において、生成するグルコースの量の顕著な改善を示す（図１３Ｂ）。それゆえに、α−アミラーゼとプルラナーゼの両方を発現するトウモロコシの使用は、グルコースへのデンプンの完全な加水分解が重要であるプロセスのために本質的に有益であり得る。
【０３０３】
上記の例は、α−アミラーゼと組み合わせて使用したときに、トウモロコシ種子中で発現されるプルラナーゼが、デンプン加水分解プロセスを改善することの十分な支持を提供する。プルラナーゼ酵素活性は、α１−６結合特異的であり、α−アミラーゼ（α１−４結合特異的酵素）よりもはるかにより効率的にデンプンを脱分枝化し、それによって、分枝オリゴサッカライドの量を減少し（例えば、限界デキストリン、パノース；これらは通常発酵可能でない）、および直鎖の短いオリゴサッカライド（エタノールなどに容易に発酵可能である）の量を増加する。第２に、プルラナーゼによって触媒された脱分枝化によるデンプン分子の断片化は、α−アミラーゼについての基質の接近可能性を増加し、それゆえに、α−アミラーゼによって触媒される反応の効率の増加を生じる。
【０３０４】
実施例２２
７９７ＧＬ３アルファアミラーゼおよびｍａｌＡアルファ−グルコシダーゼが、同様なｐＨおよび温度条件下で、いずれかの酵素単独によって生成されるものよりも、増加したグルコースの量を生じるように機能するか否かを決定するために、約０．３５μｇのｍａｌＡアルファグルコシダーゼ酵素（細菌中で産生）を、１％デンプン、および、非トランスジェニックトウモロコシ種子（コントロール）または７９７ＧＬ３トランスジェニックトウモロコシ種子（７９７ＧＬ３トウモロコシ種子中で、アルファアミラーゼはデンプンと同時精製される）のいずれかから精製したデンプンを含む溶液に加えた。さらに、非トランスジェニックトウモロコシ種子および７９７ＧＬ３トランスジェニックトウモロコシ種子からの精製デンプンを、いかなるｍａｌＡ酵素も非存在下で１％トウモロコシデンプンに加えた。この混合物を、９０℃、ｐＨ  ６．０で１時間インキュベートし、いかなる不溶性画分も除去するために遠心分離し、そしてグルコースレベルについて可溶性画分をＨＰＬＣによって分析した。図１４において示されるように、７９７ＧＬ３アルファ−アミラーゼおよびｍａｌＡアルファ−グルコシダーゼは、同様のｐＨおよび温度において、デンプンをグルコースに分解するように機能する。生成したグルコースの量は、いずれかの酵素単独によって生成するものよりも有意に高い。
【０３０５】
実施例２３
生のデンプンの加水分解のためのＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍグルコアミラーゼの有用性を決定した。図１５に示されるように、生のデンプンの加水分解転換を、水、オオムギα−アミラーゼ（Ｓｉｇｍａからの市販の調製物）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｕｍグルコアミラーゼ、およびこれらの組み合わせを用いて試験し、室温でおよび３０℃で確認した。示されるように、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｕｍグルコアミラーゼとのオオムギα−アミラーゼの組み合わせは、生のデンプンをグルコースに加水分解可能であった。さらに、オオムギアミラーゼおよび好熱嫌気性菌ＧＡによって生成されたグルコースの量は、いずれかの酵素単独によって生成されたものよりも有意に高い。
【０３０６】
実施例２４
生のデンプンの加水分解のため、および植物形質転換のための、ベクタートウモロコシに最適化された遺伝子および配列
酵素は、約２０〜５０℃の範囲の温度で、生のデンプンを加水分解するそれらの能力に基づいて選択した。次いで、対応する遺伝子または遺伝子フラグメントを、実施例１に示されるように、合成遺伝子の構築のためにトウモロコシに好ましいコドンを使用することによって設計した。
【０３０７】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｈｉｒｏｕｓａｍｉ  α−アミラーゼ／グルコアミラーゼ融合ポリペプチド（シグナル配列なし）を選択し、これは、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６：８８４−８８９（１９９２）；Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５４５：１９０５−１４（１９９０）；Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：１７４−７９（１９９２）において同定されるように、配列番号４５に示されるようなアミノ酸配列を有する。トウモロコシに最適化された核酸を設計し、これは配列番号４６に表される。
【０３０８】
同様に、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６２：３０２−３０８（１９９８）に公開されるようなアミノ酸配列を有するＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍグルコアミラーゼを選択し、これを選択した。トウモロコシに最適化された核酸を設計した（配列番号４８）。
【０３０９】
文献（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８６）５０，９５７−９６４頁）に記載されるようなアミノ酸配列（シグナル配列なし）（配列番号５０）を有するＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼを選択した。トウモロコシに最適化された核酸を設計し、これは配列番号５１に表される。
【０３１０】
さらに、トウモロコシα−アミラーゼを選択し、そのアミノ酸配列（配列番号５１）および核酸配列（配列番号５２）は文献から得た。例えば、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０５：７５９−７６０（１９９４）を参照のこと。
【０３１１】
発現カセットを、配列番号４６に表されるにように設計された、トウモロコシに最適化された核酸から、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｈｉｒｏｕｓａｍｉα−アミラーゼ／グルコアミラーゼ融合ポリペプチドを発現するために構築し、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍグルコアミラーゼを、トウモロコシに最適化された核酸から、配列番号４８に表されるように設計し、トウモロコシに最適化された核酸からのアミノ酸配列（シグナル配列なし）（配列番号４９）を有するＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼを選択し、トウモロコシα−アミラーゼを設計し、配列番号５０に表す。
【０３１２】
トウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナル配列（ＭＲＶＬＬＶＡＬＡＬＬＡＬＡＡＳＡＴＳ）（配列番号１７）を含むプラスミドを、酵素をコードする合成遺伝子と融合させる。任意に、配列ＳＥＫＤＥＬを、ＥＲへの標的化およびそこでの保持のために合成遺伝子のＣ末端に融合させる。この融合物を、植物形質転換プラスミド中で、胚乳における特異的発現のために、トウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングする。この融合物を、アグロバクテリウム形質移入を介してトウモロコシ組織に送達させる。
【０３１３】
実施例２５
選択した酵素を含む発現カセットを、酵素を発現させるために構築する。生のデンプン結合部位についての配列を含むプラスミドを、酵素をコードする合成遺伝子に融合させる。生のデンプン結合部位は、非ゼラチン化デンプンに結合するための酵素融合物を可能にする。生のデンプン結合部位のアミノ酸配列（配列番号５３）を、文献に基づいて決定し、核酸配列を、トウモロコシに最適化させて配列番号５４を得た。トウモロコシに最適化させた核酸配列は、植物中での発現のために、プラスミド中で酵素をコードする合成遺伝子に融合させる。
【０３１４】
実施例２６
植物形質転換のための、トウモロコシに最適化された遺伝子およびベクターの構築
遺伝子または遺伝子フラグメントを、実施例１に示されるように、合成遺伝子の構築のためにトウモロコシに好ましいコドンを使用することによって設計した。
【０３１５】
超好熱性エンドグルカナーゼアミノ酸配列（シグナル配列なし）であるＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ  ＥＧＬＡを選択した。これは、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９９９）１８１，２８４−２９０頁において同定されるように、配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有する。トウモロコシに最適化された核酸を設計した。これを配列番号５６に表す。
【０３１６】
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓキシロースイソメラーゼを選択した。これは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６２：１５−２７（１９９７）に記載されるように、配列番号５７に示されるアミノ酸配列を有する。
【０３１７】
発現カセットを、トウモロコシに最適化された核酸（配列番号５６）からＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ  ＥＧＬＡ（エンドクルカナーゼ）を発現するため、およびアミノ酸配列配列番号５７をコードする、トウモロコシに最適化された核酸からＴｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓキシロースイソメラーゼを発現するために構築した。トウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナル配列（ＭＲＶＬＬＶＡＬＡＬＬＡＬＡＡＳＡＴＳ）（配列番号１７）を含むプラスミドを、酵素をコードする、合成のトウモロコシに最適化された遺伝子に融合させた。任意に、配列ＳＥＫＤＥＬを、ＥＲへの標的化およびそこでの保持のために合成遺伝子のＣ末端に融合させる。この融合物を、植物形質転換プラスミド中で、胚乳における特異的発現のために、トウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングする。この融合物を、アグロバクテリウム形質移入を介してトウモロコシ組織に送達させる。
【０３１８】
実施例２７
トウモロコシで発現された好熱性酵素を使用する、トウモロコシ粉からのグルコースの生成
超好熱性α−アミラーゼ、７９７ＧＬ３およびα−グルコシダーゼ（ＭａｌＡ）の発現は、水溶液と混合され、および９０℃でインキュベートされたときに、グルコースの産生を生じることを示した。
【０３１９】
ＭａｌＡ酵素を発現するトランスジェニックトウモロコシ系統（系統１６８Ａ１０Ｂ、ｐＮＯＶ４８３１）を、ｐ−ニトロフェニル−α−グルコシドの加水分解によって示されるように、α−グルコシダーゼ活性を測定することによって同定した。
【０３２０】
７９７ＧＬ３を発現するトランスジェニック植物からのトウモロコシ穀粒を、Ｋｌｅｃｏセル中で粉まで粉砕し、従ってアミラーゼ粉を作製した。ＭａｌＡを発現するトランスジェニック植物からのトウモロコシ穀粒を、Ｋｌｅｃｏセル中で粉まで粉砕し、従ってＭａｌＡ粉を作製する。非トランスジェニックトウモロコシ穀粒を同じ様式で粉砕し、コントロール粉を生成した。
【０３２１】
緩衝液は５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液ｐＨ  ６．０であった。
【０３２２】
トウモロコシ粉加水分解反応：サンプルを、以下の表５に示すように調製した。トウモロコシ粉（サンプルあたり約６０ｍｇ）を、４０ｍｌの５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ  ６．０と混合した。サンプルを、９０℃に設定したウォーターバス中で、２．５および１４時間インキュベートした。示されたインキュベーション時間において、サンプルを取り出し、グルコース含量について分析した。
【０３２３】
サンプルを、グルコースオキシダーゼ／西洋ワサビペルオキシダーゼベースのアッセイによってグルコースについてアッセイした。ＧＯＰＯＤ試薬は、０．２ｍｇ／ｍｌ  ｏ−ジアニシジン、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．５、１００Ｕ／ｍｌ  グルコースオキシダーゼ、および１０Ｕ／ｍｌ西洋ワサビペルオキシダーゼを含んだ。２０μｌのサンプルまたは希釈サンプルを、グルコース標準（これは０〜０．２２ｍｇ／ｍｌで変化する）とともに９６ウェルプレート中で整列させた。１００μｌのＧＯＰＯＤ試薬を、混合しながら各ウェルに加え、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。１００μｌの硫酸（９Ｍ）を加え、５４０ｎｍにおける吸光度を読み取った。サンプルのグルコース濃度を、標準曲線を参照することによって決定した。各サンプル中で観察されたグルコースの量を表５に示す。
【０３２４】
【表５】
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【０３２５】
これらのデータは、トウモロコシ中の超好熱性α−アミラーゼおよびα−グルコシダーゼの発現が、適切な条件下で水和および加熱されたときに、グルコースを生じることを実証する。
【０３２６】
実施例２８
マルトデキストリンの生成
好熱性α−アミラーゼを発現する穀粒を、マルトデキストリンを調製するために使用した。例示されたプロセスは、事前のデンプンの単離を必要とせず、外因性酵素の付加も必要としない。
【０３２７】
７９７ＧＬ３を発現するトランスジェニック植物からのトウモロコシ穀粒を、Ｋｌｅｃｏセル中で粉まで粉砕し、「アミロース粉」を作製した。１０％トランスジェニック／９０％非トランスジェニック穀粒の混合物を、同じ様式で粉砕して、「１０％アミラーゼ粉」を作製した。
【０３２８】
アミラーゼ粉および１０％アミラーゼ粉（約６０ｍｇ／サンプル）を、粉ｍｇあたり５μｌの水の割合で、水と混合した。得られるスラリーを、表６に示されるように、９０℃にて２０時間までインキュベートした。反応を、８５℃で０．９ｍｌの５０ｍＭ  ＥＤＴＡの付加によって停止し、ピペッティングによって混合した。０．２ｍｌのスラリーのサンプルを取り出し、遠心分離して不溶性物質を除去し、そして水中で３×希釈した。
【０３２９】
糖およびマルトデキストリンについて、ＥＬＳＤ検出を用いるＨＰＬＣによってサンプルを分析した。グラジエントＨＰＬＣシステムは、Ａｓｔｅｃポリマーアミノカラム、５ミクロン粒子サイズ、２５０×４．６ｍｍおよびＡｌｌｔｅｃｈ  ＥＬＳＤ  ２０００検出器を備えた。このシステムを、水：アセトニトリルの１５：８５混合物プレ平衡化した。流速は１ｍｌ／分であった。初期条件は、注入後５分間維持され、次に、５０：５０  水：アセトニトリルまでの２０分間グラジエント、続いて１０分間同じ溶媒であった。このシステムは、２０分間の８０：２０  水：アセトニトリルで洗浄し、次いで、出発溶媒で再平衡化した。
【０３３０】
得られるピーク面積を、粉の体積および重量について標準化した。炭水化物のμｇあたりのＥＬＳＤの応答因子はＤＰの増加とともに減少し、従って、より高いＤＰのマルトデキストリンは、ピーク面積によって示されるよりも、より高い全体のパーセンテージを表す。
【０３３１】
１００％アミラーゼ粉を用いる反応の生成物の相対的ピーク面積を図１７に示す。１０％アミラーゼ粉を用いる反応の生成物の相対的ピーク面積を図１８に示す。
【０３３２】
これらのデータは、加熱の時間を変化させることによって、種々のマルトデキストリン混合物が生成され得ることを実証する。α−アミラーゼ活性のレベルは、マルトデキストリンプロフィールを変化させるために、野生型トウモロコシと、トランスジェニックα−アミラーゼ発現トウモロコシを混合することによって変化させることができる。
【０３３３】
本実施例に記載された加水分解反応の生成物は、遠心分離、濾過、イオン交換、ゲル浸透、限外濾過、ナノ濾過、逆浸透、炭素粒子を用いる脱色、スプレードライ、および当分野において公知である他の標準的な技術を含む、十分に定義された種々の方法の使用によって、食品および他の応用のために、濃縮および精製することができる。
【０３３４】
実施例２９
マルトデキストリン生成に対する時間および温度の効果
好熱性α−アミラーゼを含む穀粒の自己加水分解のマルトデキストリン生成物の組成は、反応の時間および温度を変化させることによって変えられる可能性がある。
【０３３５】
別の実験において、アミラーゼ粉は、上記の実施例２８に記載されるように生成し、６０ｍｇ粉あたり３００μｌ水の比率で混合した。サンプルを、７０℃、８０℃、９０℃、または１００℃において、９０分間までインキュベートした。反応を、９０℃での９００ｍｌの５０ｍＭ  ＥＤＴＡの付加によって停止し、遠心分離して不溶性物質を除去し、および０．４５μｍナイロンフィルターを通して濾過した。濾過物を、実施例２８に記載されるように、ＨＰＬＣによって分析した。
【０３３６】
この分析の結果を図１９に示す。ＤＰ数の命名法は、重合の程度をいう。ＤＰ２はマルトース、ＤＰ３はマルトトリオースなどである。より大きなＤＰマルトデキストリンは、溶出の最後近くの単一ピークで溶出した。これに「＞ＤＰ１２」と標識する。この凝集物は、０．４５μｍフィルターおよびガードカラムを通過したデキストリン含み、フィルターまたはガードカラムによってトラップされる任意の非常に大きなデンプン断片は含まない。
【０３３７】
この実験は、生成物のマルトデキストリン組成が、所望のマルトオリゴサッカライドまたはマルトデキストリン生成物を得るために、温度とインキュベーション時間の両方を変化させることによって、変化させることができることを実証する。
【０３３８】
実施例３０
マルトデキストリン生成
好熱性α−アミラーゼを含むトランスジェニックトウモロコシからのマルトデキストリン生成物の組成はまた、α−グルコシダーゼおよびキシロースイソメラーゼなどの他の酵素の付加によって、ならびに熱で処理する前に、水性粉混合物中に塩を含めることによって変化させることができる。
【０３３９】
別の例において、上記のように調製されたアミラーゼ粉を、精製ＭａｌＡおよび／またはＢＤ８０３７と称する細菌キシロースイソメラーゼと混合した。６Ｈｉｓ精製タグを有するＳ．ｓｕｌｆｏｔａｒｉｃｕｓ  ＭａｌＡを、大腸菌中で発現させた。細胞溶解物を、実施例２８に記載されるように調製し、次いで、ニッケルアフィニティーレジン（Ｐｒｏｂｏｎｄ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、かつネイティブタンパク質精製のための製造業者の指示に従って、見かけの均一性まで精製した。キシロースイソメラーゼＢＤ８０３７をＤｉｖｅｒｓａから凍結乾燥粉末として入手し、０．４×元の体積の水に再懸濁した。
【０３４０】
アミラーゼトウモロコシ粉を、酵素溶液プラス水または緩衝液と混合した。全ての反応は、６０ｍｇアミロース粉および総計６００μｌの液体を含んだ。１つのセットの反応は、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、室温にてｐＨ  ７．０、プラス１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４および１ｍＭ  ＣｏＣｌ2で緩衝化され；第２のセットの反応においては、金属含有緩衝溶液が、水によって置き換えられた。全ての反応は９０℃で２時間インキュベートされた。反応上清画分を遠心分離によって調製した。ペレットを、さらなる６００μｌ  Ｈ2Ｏで洗浄し、再遠心分離した。各反応からの上清画分を合わせ、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  １０を通して濾過し、および上記のようにＥＬＳＤ検出を用いるＨＰＬＣによって分析した。
【０３４１】
結果を図２０においてグラフに示す。これらは、穀粒で発現されるアミラーゼ７９７ＧＬ３が、添加される金属イオンのあるなしで、他の好熱性酵素とともに作用して、高温にてトウモロコシ粉から種々のマルトデキストリン混合物を生成することを実証する。特に、グルコアミラーゼまたはα−グルコシダーゼを含めることは、より多くのグルコースを有する生成物および他の少ないＤＰ生成物を生じる可能性がある。グルコースイソメラーゼ活性を有する酵素を含めることは、フルクトースを有する生成物を生じ、従って、アミラーゼ単独によって、またはα−グルコシダーゼを伴うアミラーゼによって生成されるものよりも甘い。加えて、このデータは、ＤＰ５、ＤＰ６、およびＤＰ７マルトオリゴサッカライドの割合が、二価カチオン性の塩、例えば、ＣｏＣｌ2およびＭｇＳ０4を含めることによって増加可能であることを示す。
【０３４２】
本発明に記載されるものなどの反応によって産生されるマルトデキストリン組成物を変化させる他の手段には以下が含まれる：反応ｐＨを変化させること、トランスジェニック穀粒または非トランスジェニック穀粒におけるデンプン型を変化させること、固形物の比率を変化させること、または有機溶媒の付加による。
【０３４３】
実施例３１
デンプン由来生成物の回収の前に穀粒の機械的破壊を伴わない、穀粒からのデキストリンまたは糖の調製
糖およびマルトデキストリンを、α−アミラーゼ、７９７ＧＬ３を発現するトランスジェニック穀粒を水と接触させ、および９０℃で一晩（＞１４時間）加熱することによって調製した。次いで、液体を、濾過により穀粒から分離した。液体生成物を、実施例１５に記載される方法によってＨＰＬＣによって分析した。表６は、検出される生成物のプロフィールを示す。
【０３４４】
【表６】
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＊ＤＰ３の量にはマルトトリオースが含まれ、α（１→４）結合の代わりにα（１→６）結合を有するマルトトリオースの異性体を含み得る。同様に、ＤＰ４〜ＤＰ７の量は、所与の鎖の長さの線状マルトオリゴサッカライド、ならびに、１つ以上のα（１→４）結合の代わりに１つ以上のα（１→６）結合を有する異性体を含む。
【０３４５】
これらのデータは、糖およびマルトデキストリンが、インタクトなα−アミラーゼ発現穀粒を水と接触させること、および加熱することによって調製できることを実証する。次いで、この生成物は、濾過もしくは遠心分離によって、または重力静置によって、インタクトな穀粒から分離できる。
【０３４６】
実施例３２
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼを発現するトウモロコシにおける生のデンプンの発酵
トランスジェニックトウモロコシ穀粒を、実施例２９に記載されるように作製されたトランスジェニック植物から収穫する。穀粒を粉まで粉砕する。このトウモロコシ穀粒は、小胞体に標的化された、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅのグルコアミラーゼ（配列番号４９）の活性フラグメントを含むタンパク質を発現する。
【０３４７】
トウモロコシ穀粒を、実施例１５に記載されるように、粉まで粉砕する。次いで、２０ｇのトウモロコシ粉、２３ｍｌの脱イオン水、６．０ｍｌのバックセット（重量で８％固形物）を含むマッシュを調製する。ｐＨを、水酸化アンモニウムの付加により６．０に調整する。以下の成分をマッシュに加える：プロテアーゼ（市販のプロテアーゼの１，０００希釈の０．６０ｍｌ）、０．２ｍｇ  Ｌａｃｔｏｃｉｄｅおよび尿素（５０％尿素液体の１０倍希釈の０．８５ｍｌ）。マッシュを含む１００ｍｌボトルのキャップに穴を空けて、ＣＯ2を放出させるた。次いで、マッシュに酵母（１．４４ｍｌ）を接種し、９０℃に設定したウォーターバス中でインキュベートする。発酵の２４時間後、温度を８６℃まで低下させ；４８時間において、温度を８２℃に設定する。
【０３４８】
接種のための酵母は、実施例１４に記載されるように増殖させる。
【０３４９】
サンプルを実施例１４に記載されるように取り出し、次いで、実施例１４に記載される方法によって分析する。
【０３５０】
実施例３３
トランスジェニックトウモロコシ穀粒を、実施例２８に記載されるように作製したトランスジェニック植物から収穫する。このトウモロコシ穀粒は、小胞体に標的化された、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅのグルコアミラーゼ（配列番号４９）の活性フラグメントを含むタンパク質を発現する。
【０３５１】
トウモロコシ穀粒を、実施例１５に記載されるように、粉まで粉砕する。次いで、２０ｇのトウモロコシ粉、２３ｍｌの脱イオン水、６．０ｍｌのバックセット（重量で８％固形物）を含むマッシュを調製する。ｐＨを、水酸化アンモニウムの付加により６．０に調整する。以下の成分をマッシュに加える：プロテアーゼ（市販のプロテアーゼの１，０００希釈の０．６０ｍｌ）、０．２ｍｇ  Ｌａｃｔｏｃｉｄｅおよび尿素（５０％尿素液体の１０倍希釈の０．８５ｍｌ）。マッシュを含む１００ｍｌボトルのキャップに穴を空けて、ＣＯ2を放出させる。次いで、マッシュに酵母（１．４４ｍｌ）を接種し、９０℃に設定したウォーターバス中でインキュベートする。発酵の２４時間後、温度を８６℃まで低下させ；４８時間において、温度を８２℃に設定する。
【０３５２】
接種のための酵母は、実施例１４に記載されるように増殖させる。
【０３５３】
サンプルを実施例１４に記載されるように取り出し、次いで、実施例１４に記載される方法によって分析する。
【０３５４】
実施例３４
外因性α−アミラーゼの付加を伴う、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼを発現するトウモロコシの全体の穀粒中での生のデンプンの発酵の例
トランスジェニックトウモロコシ穀粒を、実施例２８に記載されるように作製したトランスジェニック植物から収穫する。このトウモロコシ穀粒は、小胞体に標的化された、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅのグルコアミラーゼ（配列番号４９）の活性フラグメントを含むタンパク質を発現する。
【０３５５】
トウモロコシ穀粒に、２０ｇのトウモロコシ粉、２３ｍｌの脱イオン水、６．０ｍｌのバックセット（重量で８％固形物）を含める。ｐＨを、水酸化アンモニウムの付加により６．０に調整する。以下の成分を加える：Ｓｉｇｍａから購入したオオムギα−アミラーゼ（２ｍｇ）、プロテアーゼ（市販のプロテアーゼの１，０００希釈の０．６０ｍｌ）、０．２ｍｇ  Ｌａｃｔｏｃｉｄｅおよび尿素（５０％尿素液体の１０倍希釈の０．８５ｍｌ）。混合物を含む１００ｍｌボトルのキャップに穴を空けて、ＣＯ2を放出させる。次いで、この混合物に酵母（１．４４ｍｌ）を接種し、９０℃に設定したウォーターバス中でインキュベートする。発酵の２４時間後、温度を８６℃まで低下させ；４８時間において、温度を８２℃に設定する。
【０３５６】
接種のための酵母は、実施例１４に記載されるように増殖させる。
【０３５７】
サンプルを実施例１４に記載されるように取り出し、次いで、実施例１４に記載される方法によって分析する。
【０３５８】
実施例３５
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼおよびＺｅａ  ｍａｙｓアミラーゼを発現するトウモロコシにおける生のデンプンの発酵
トランスジェニックトウモロコシ穀粒を、実施例２８に記載されるように作製したトランスジェニック植物から収穫する。このトウモロコシ穀粒は、小胞体に標的化された、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅのグルコアミラーゼ（配列番号４９）の活性フラグメントを含むタンパク質を発現する。このトウモロコシ穀粒はまた、実施例２８に記載されるような、生のデンプン結合ドメインを有するトウモロコシアミラーゼを発現する。
【０３５９】
トウモロコシ穀粒を、実施例１４に記載されるように、粉まで粉砕する。次いで、２０ｇのトウモロコシ粉、２３ｍｌの脱イオン水、６．０ｍｌのバックセット（重量で８％固形物）を含むマッシュを調製する。ｐＨを、水酸化アンモニウムの付加により６．０に調整する。以下の成分をマッシュに加える：プロテアーゼ（市販のプロテアーゼの１，０００希釈の０．６０ｍｌ）、０．２ｍｇ  Ｌａｃｔｏｃｉｄｅおよび尿素（５０％尿素液体の１０倍希釈の０．８５ｍｌ）。マッシュを含む１００ｍｌボトルのキャップに穴を空けて、ＣＯ2を放出させる。次いで、マッシュに酵母（１．４４ｍｌ）を接種し、９０Ｆに設定したウォーターバス中でインキュベートする。発酵の２４時間後、温度を８６Ｆまで低下させ；４８時間において、温度を８２Ｆに設定する。
【０３６０】
接種のための酵母は、実施例１４に記載されるように増殖させる。
【０３６１】
サンプルを実施例１４に記載されるように取り出し、次いで、実施例１４に記載される方法によって分析する。
【０３６２】
実施例３６
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍグルコアミラーゼを発現するトウモロコシにおける生のデンプンの発酵の例
トランスジェニックトウモロコシ穀粒を、実施例２８に記載されるように作製したトランスジェニック植物から収穫する。このトウモロコシ穀粒は、小胞体に標的化された、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのグルコアミラーゼ（配列番号４７）の活性フラグメントを含むタンパク質を発現する。
【０３６３】
トウモロコシ穀粒を、実施例１５に記載されるように、粉まで粉砕する。次いで、２０ｇのトウモロコシ粉、２３ｍｌの脱イオン水、６．０ｍｌのバックセット（重量で８％固形物）を含むマッシュを調製する。ｐＨを、水酸化アンモニウムの付加により６．０に調整する。以下の成分をマッシュに加える：プロテアーゼ（市販のプロテアーゼの１，０００希釈の０．６０ｍｌ）、０．２ｍｇ  Ｌａｃｔｏｃｉｄｅおよび尿素（５０％尿素液体の１０倍希釈の０．８５ｍｌ）。マッシュを含む１００ｍｌボトルのキャップに穴を空けて、ＣＯ2を放出させる。次いで、マッシュに酵母（１．４４ｍｌ）を接種し、９０℃に設定したウォーターバス中でインキュベートする。発酵の２４時間後、温度を８６℃まで低下させ；４８時間において、温度を８２℃に設定する。
【０３６４】
接種のための酵母は、実施例１４に記載されるように増殖させる。
【０３６５】
サンプルを実施例１４に記載されるように取り出し、次いで、実施例１４に記載される方法によって分析する。
【０３６６】
実施例３７
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼを発現するトウモロコシにおける生のデンプンの発酵の例
トランスジェニックトウモロコシ穀粒を、実施例２８に記載されるように作製したトランスジェニック植物から収穫する。このトウモロコシ穀粒は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼの活性フラグメントを含むタンパク質を発現する（Ｆｉｉｌ，Ｎ．Ｐ．「Ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅｓ  Ｇｌ  ａｎｄ  Ｇ２  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ａｒｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｂｕｔ  ｃｌｏｓｅｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍＲＮＡｓ」  ＥＭＢＯ  Ｊ．３（５），１０９７−１１０２（１９８４）、アクセッション番号Ｐ０４０６４）。このグルコアミラーゼをコードするトウモロコシに最適化された核酸は配列番号５９を有し、小胞体に標的化される。
【０３６７】
トウモロコシ穀粒を、実施例１４に記載されるように、粉まで粉砕する。次いで、２０ｇのトウモロコシ粉、２３ｍｌの脱イオン水、６．０ｍｌのバックセット（重量で８％固形物）を含むマッシュを調製する。ｐＨを、水酸化アンモニウムの付加により６．０に調整する。以下の成分をマッシュに加える：プロテアーゼ（市販のプロテアーゼの１，０００希釈の０．６０ｍｌ）、０．２ｍｇ  Ｌａｃｔｏｃｉｄｅおよび尿素（５０％尿素液体の１０倍希釈の０．８５ｍｌ）。マッシュを含む１００ｍｌボトルのキャップに穴を空けて、ＣＯ2を放出させる。次いで、マッシュに酵母（１．４４ｍｌ）を接種し、９０℃に設定したウォーターバス中でインキュベートする。発酵の２４時間後、温度を８６℃まで低下させ；４８時間において、温度を８２℃に設定する。
【０３６８】
接種のための酵母は、実施例１４に記載されるように増殖させる。
【０３６９】
サンプルを実施例１４に記載されるように取り出し、次いで、実施例１４に記載される方法によって分析する。
【０３７０】
実施例３８
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼおよびＺｅａ  ｍａｙｓアミラーゼを発現するトウモロコシにおける生のデンプンの発酵の例
トランスジェニックトウモロコシ穀粒を、実施例２８に記載されるように作製したトランスジェニック植物から収穫する。このトウモロコシ穀粒は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼの活性フラグメントを含むタンパク質を発現し（Ｆｉｉｌ，Ｎ．Ｐ．「Ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅｓ  Ｇｌ  ａｎｄ  Ｇ２  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ａｒｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｂｕｔ  ｃｌｏｓｅｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍＲＮＡｓ」  ＥＭＢＯ  Ｊ．３（５），１０９７−１１０２（１９８４）、アクセッション番号Ｐ０４０６４）（配列番号５９、トウモロコシに最適化された核酸）、小胞体に標的化される。この穀粒はまた、実施例２８に記載されるように、生のデンプン結合ドメインを有するトウモロコシアミラーゼを発現する。
【０３７１】
トウモロコシ穀粒を、実施例１４に記載されるように、粉まで粉砕する。次いで、２０ｇのトウモロコシ粉、２３ｍｌの脱イオン水、６．０ｍｌのバックセット（重量で８％固形物）を含むマッシュを調製する。ｐＨを、水酸化アンモニウムの付加により６．０に調整する。以下の成分をマッシュに加える：プロテアーゼ（市販のプロテアーゼの１，０００希釈の０．６０ｍｌ）、０．２ｍｇ  Ｌａｃｔｏｃｉｄｅおよび尿素（５０％尿素液体の１０倍希釈の０．８５ｍｌ）。マッシュを含む１００ｍｌボトルのキャップに穴を空けて、ＣＯ2を放出させる。次いで、マッシュに酵母（１．４４ｍｌ）を接種し、９０℃に設定したウォーターバス中でインキュベートする。発酵の２４時間後、温度を８６℃まで低下させ；４８時間において、温度を８２℃に設定する。
【０３７２】
接種のための酵母は、実施例１４に記載されるように増殖させる。
【０３７３】
サンプルを実施例１４に記載されるように取り出し、次いで、実施例１４に記載される方法によって分析する。
【０３７４】
実施例３９
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍグルコアミラーゼおよびオオムギアミラーゼを発現するトウモロコシにおける生のデンプンの発酵の例
トランスジェニックトウモロコシ穀粒を、実施例２８に記載されるように作製したトランスジェニック植物から収穫する。このトウモロコシ穀粒は、小胞体に標的化されたＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのグルコアミラーゼの活性フラグメントを含むタンパク質を発現する（配列番号４７）。この穀粒はまた、タンパク質の発現を小胞体に標的化するように修飾された、低ｐＩオオムギアミラーゼａｍｙＩ遺伝子（Ｒｏｇｅｒｓ，Ｊ．Ｃ．およびＭｉｌｌｉｍａｎ，Ｃ．「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｂａｒｌｅｙ  ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８（１３），８１６９−８１７４（１９８３））を発現する。
【０３７５】
トウモロコシ穀粒を、実施例１４に記載されるように、粉まで粉砕する。次いで、２０ｇのトウモロコシ粉、２３ｍｌの脱イオン水、６．０ｍｌのバックセット（重量で８％固形物）を含むマッシュを調製する。ｐＨを、水酸化アンモニウムの付加により６．０に調整する。以下の成分をマッシュに加える：プロテアーゼ（市販のプロテアーゼの１，０００希釈の０．６０ｍｌ）、０．２ｍｇ  Ｌａｃｔｏｃｉｄｅおよび尿素（５０％尿素液体の１０倍希釈の０．８５ｍｌ）。マッシュを含む１００ｍｌボトルのキャップに穴を空けて、ＣＯ2を放出させる。次いで、マッシュに酵母（１．４４ｍｌ）を接種し、９０℃に設定したウォーターバス中でインキュベートする。発酵の２４時間後、温度を８６℃まで低下させ；４８時間において、温度を８２℃に設定する。
【０３７６】
接種のための酵母は、実施例１４に記載されるように増殖させる。
【０３７７】
サンプルを実施例１４に記載されるように取り出し、次いで、実施例１４に記載される方法によって分析する。
【０３７８】
実施例４０
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍグルコアミラーゼおよびオオムギアミラーゼを発現するトウモロコシの全体の穀粒における生のデンプンの発酵の例
トランスジェニックトウモロコシ穀粒を、実施例２８に記載されるように作製したトランスジェニック植物から収穫する。このトウモロコシ穀粒は、小胞体に標的化されたＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのグルコアミラーゼの活性フラグメントを含むタンパク質を発現する（配列番号４７）。この穀粒はまた、タンパク質の発現を小胞体に標的化するように修飾された、低ｐＩオオムギアミラーゼａｍｙＩ遺伝子（Ｒｏｇｅｒｓ，Ｊ．Ｃ．およびＭｉｌｌｉｍａｎ，Ｃ．「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｂａｒｌｅｙ  ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８（１３），８１６９−８１７４（１９８３））を発現する。
【０３７９】
トウモロコシ穀粒を、２０ｇのトウモロコシ粉、２３ｍｌの脱イオン水、６．０ｍｌのバックセット（重量で８％固形物）と接触させる。ｐＨを、水酸化アンモニウムの付加により６．０に調整する。以下の成分を混合物に加える：プロテアーゼ（市販のプロテアーゼの１，０００希釈の０．６０ｍｌ）、０．２ｍｇ  Ｌａｃｔｏｃｉｄｅおよび尿素（５０％尿素液体の１０倍希釈の０．８５ｍｌ）。マッシュを含む１００ｍｌボトルのキャップに穴を空けて、ＣＯ2を放出させる。次いで、混合物に酵母（１．４４ｍｌ）を接種し、９０℃に設定したウォーターバス中でインキュベートする。発酵の２４時間後、温度を８６℃まで低下させ；４８時間において、温度を８２℃に設定する。
【０３８０】
接種のための酵母は、実施例１４に記載されるように増殖させる。
【０３８１】
サンプルを実施例１４に記載されるように取り出し、次いで、実施例１４に記載される方法によって分析する。
【０３８２】
実施例４１
アルファ−アミラーゼおよびグルコアミラーゼ融合物を発現するトウモロコシにおける生のデンプンの発酵の例
トランスジェニックトウモロコシ穀粒を、実施例２８に記載されるように作製したトランスジェニック植物から収穫する。このトウモロコシ穀粒は、小胞体に標的化される、配列番号４５に提供されるようなアルファ−アミラーゼおよびグルコアミラーゼ融合物をコードする、配列番号４６に提供されるような、トウモロコシに最適化されたポリヌクレオチドを発現する。
【０３８３】
トウモロコシ穀粒を、実施例１４に記載されるように、粉まで粉砕する。次いで、２０ｇのトウモロコシ粉、２３ｍｌの脱イオン水、６．０ｍｌのバックセット（重量で８％固形物）を含むマッシュを調製する。ｐＨを、水酸化アンモニウムの付加により６．０に調整する。以下の成分をマッシュに加える：プロテアーゼ（市販のプロテアーゼの１，０００希釈の０．６０ｍｌ）、０．２ｍｇ  Ｌａｃｔｏｃｉｄｅおよび尿素（５０％尿素液体の１０倍希釈の０．８５ｍｌ）。マッシュを含む１００ｍｌボトルのキャップに穴を空けて、ＣＯ2を放出させる。次いで、マッシュに酵母（１．４４ｍｌ）を接種し、９０℃に設定したウォーターバス中でインキュベートする。発酵の２４時間後、温度を８６℃まで低下させ；４８時間において、温度を８２℃に設定する。
【０３８４】
接種のための酵母は、実施例１４に記載されるように増殖させる。
【０３８５】
サンプルを実施例１４に記載されるように取り出し、次いで、実施例１４に記載される方法によって分析する。
【０３８６】
実施例４２
形質転換ベクターの構築
トウモロコシ中で超好熱性ベータ−グルカナーゼＥｇｌＡを発現するための発現カセットを以下のように構築した：
【０３８７】
ｐＮＯＶ４８００は、小胞体への標的化およびアポプラストへの分泌のために、ＥｇｌＡベータ−グルカナーゼについての合成遺伝子に融合された、オオムギＡｍｙ３２ｂシグナルペプチド（ＭＧＫＮＧＮＬＣＣＦＳＬＬＬＬＬＬＡＧＬＡＳＧＨＱ）を含む。この融合物は、胚乳における特異的な発現のために、トウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０３８８】
ｐＮＯＶ４８０３は、小胞体への標的化およびアポプラストへの分泌のために、ＥｇｌＡベータ−グルカナーゼについての合成遺伝子に融合された、オオムギＡｍｙ３２ｂシグナルペプチドを含む。この融合物は、植物全体での発現のために、トウモロコシユビキチンプロモーターの後ろにクローニングした。
【０３８９】
トウモロコシ中で超好熱性ベータ−グルカナーゼ／マンナナーゼ６ＧＰ１（配列番号８５）を発現するための発現カセットを以下のように構築した：
【０３９０】
ｐＮＯＶ４８１９は、小胞体への標的化およびアポプラストへの分泌のために、６ＧＰ１ベータ−グルカナーゼ／マンナナーゼについての合成遺伝子に融合された、タバコＰＲ１ａシグナルペプチド（ＭＧＦＶＬＦＳＱＬＰＳＦＬＬＶＳＴＬＬＬＦＬＶＩＳＨＳＣＲＡ）を含む。この融合物は、胚乳における特異的な発現のために、トウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０３９１】
ｐＮＯＶ４８２０は、細胞質局在化および胚乳における特異的発現のためのトウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングされた、６ＧＰ１についての合成遺伝子を含む。
【０３９２】
ｐＮＯＶ４８２３は、小胞体への標的化およびそこでの保持のために、配列ＫＤＥＬのＣ末端付加を伴う、６ＧＰ１ベータ−グルカナーゼ／マンナナーゼについての合成遺伝子に融合された、タバコＰＲ１ａシグナルペプチドを含む。この融合物は、胚乳における特異的な発現のために、トウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０３９３】
ｐＮＯＶ４８２５は、小胞体への標的化およびそこでの保持のために、配列ＫＤＥＬのＣ末端付加を伴う、６ＧＰ１ベータ−グルカナーゼ／マンナナーゼについての合成遺伝子に融合された、タバコＰＲ１ａシグナルペプチドを含む。この融合物は、植物全体での発現のために、トウモロコシユビキチンプロモーターの後ろにクローニングした。
【０３９４】
トウモロコシ中でオオムギＡｍｙｌ  アルファ−アミラーゼ（配列番号８７）を発現するための発現カセットを以下のように構築した：
【０３９５】
ｐＮＯＶ４８６７は、小胞体への標的化およびそこでの保持のために、配列ＳＥＫＤＥＬのＣ末端付加を伴う、オオムギＡｍｙＩアルファ−アミラーゼに融合された、トウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナル配列を含む。この融合物は、胚乳における特異的な発現のために、トウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０３９６】
ｐＮＯＶ４８７９は、小胞体への標的化およびそこでの保持のために、配列ＳＥＫＤＥＬのＣ末端付加を伴う、オオムギＡｍｙＩ  アルファ−アミラーゼに融合された、トウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナル配列を含む。この融合物は、胚における特異的な発現のために、トウモロコシグロブリンプロモーターの後ろにクローニングした。
【０３９７】
ｐＮＯＶ４８９７は、小胞体への標的化およびアポプラストでの分泌のために、オオムギＡｍｙＩ  アルファ−アミラーゼに融合された、トウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナル配列を含む。この融合物は、胚における特異的な発現のために、トウモロコシグロブリンプロモーターの後ろにクローニングした。
【０３９８】
ｐＮＯＶ４８９５は、小胞体への標的化およびアポプラストでの分泌のために、オオムギＡｍｙＩ  アルファ−アミラーゼに融合された、トウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナル配列を含む。この融合物は、胚乳における特異的な発現のために、トウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０３９９】
ｐＮＯＶ４９０１は、細胞質局在化および胚における特異的発現のために、トウモロコシグロブリンプロモーターの後ろにクローニングされたオオムギＡｍｙＩ  アルファ−アミラーゼについての遺伝子を含む。
【０４００】
トウモロコシ中でＲｈｉｚｏｐｕｓグルコアミラーゼ（配列番号５０）を発現するための発現カセットを以下のように構築した：
【０４０１】
ｐＮＯＶ４８７２は、小胞体への標的化およびそこでの保持のために、配列ＳＥＫＤＥＬのＣ末端付加を伴う、Ｒｈｉｚｏｐｕｓグルコアミラーゼについての合成遺伝子に融合された、トウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナル配列を含む。この融合物は、胚乳における特異的な発現のために、トウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０４０２】
ｐＮＯＶ４８８０は、小胞体への標的化およびそこでの保持のために、配列ＳＥＫＤＥＬのＣ末端付加を伴う、Ｒｈｉｚｏｐｕｓグルコアミラーゼについての合成遺伝子に融合された、トウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナル配列を含む。この融合物は、胚における特異的な発現のために、トウモロコシグロブリンプロモーターの後ろにクローニングした。
【０４０３】
ｐＮＯＶ４８８９は、小胞体への標的化およびアポプラストへの分泌のために、Ｒｈｉｚｏｐｕｓグルコアミラーゼについての合成遺伝子に融合された、トウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナル配列を含む。この融合物は、胚における特異的な発現のために、トウモロコシグロブリンプロモーターの後ろにクローニングした。
【０４０４】
ｐＮＯＶ４８９０は、小胞体への標的化およびアポプラストへの分泌のために、Ｒｈｉｚｏｐｕｓグルコアミラーゼについての合成遺伝子に融合された、トウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナル配列を含む。この融合物は、胚乳における特異的な発現のために、トウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０４０５】
ｐＮＯＶ４８９１は、細胞質局在化および胚乳における特異的な発現のためにトウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングされた、Ｒｈｉｚｏｐｕｓグルコアミラーゼについての合成遺伝子を含む。
【０４０６】
実施例４３
トウモロコシにおける中温性Ｒｈｉｚｏｐｕｓグルコアミラーゼの発現
トウモロコシにおけるＲｈｉｚｏｐｕｓグルコアミラーゼの発現のための種々の構築物を生成した。トウモロコシγ−ゼインプロモーターおよびグロブリンプロモーターを、胚乳または胚においてそれぞれ特異的にグルコアミラーゼを発現させるために使用した。さらに、トウモロコシγ−ゼインシグナル配列および合成ＥＲ保持シグナルを、グルコアミラーゼタンパク質の細胞下局在を調節するために使用した。５つ全ての構築物（ｐＮＯＶ４８７２、ｐＮＯＶ４８８０、ｐＮＯＶ４８８９、ｐＮＯＶ４８９０、およびｐＮＯＶ４８９１）が、種子中で検出されるグルコアミラーゼ活性を有するトランスジェニック植物を生じた。表７および８は、個々のトランスジェニック種子（構築物ｐＮＯＶ４８７２）およびプールした種子（構築物ｐＮＯＶ４８８９）それぞれについての結果を示す。このＲｈｉｚｏｐｕｓグルコアミラーゼを発現する任意のトランスジェニック植物について、有害な表現型は観察されなかった。
【０４０７】
グルコアミラーゼアッセイ：種子を粉まで粉砕し、粉を水中に懸濁した。サンプルを３０℃で５０分間インキュベートし、グルコアミラーゼをデンプンと反応させた。不溶性物質をペレット化し、上清についてのグルコース濃度を決定した。各サンプル中で遊離したグルコースの量を、存在するグルコアミラーゼのレベルの表示として得た。グルコース濃度を、ＧＯＨＯＤ試薬（３００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／Ｃｌ  ｐＨ７．５、グルコースオキシダーゼ（２０Ｕ／ｍｌ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（２０Ｕ／ｍｌ）、ｏ−ジアニシジン  ０．１  ｍｇ／ｍｌ）とサンプルを、３０分間、３７℃でインキュベートすること、０．５体積の１２Ｎ  Ｈ２Ｓ０４を付加すること、およびＯＤ５４０を測定することによって決定した。
【０４０８】
表７は、個々のトランスジェニックトウモロコシ種子中のＲｈｉｚｏｐｕｓグルコアミラーゼの活性を示す（構築物ｐＮＯＶ４８７２）。
【０４０９】
【表７】
2007527726.tif 000008
【０４１０】
表８は、プールしたトランスジェニックトウモロコシ種子中のＲｈｉｚｏｐｕｓグルコアミラーゼの活性を示す（構築物ｐＮＯＶ４８８９）。
【０４１１】
【表８】
2007527726.tif 000009
【０４１２】
全ての発現カセットを、アグロバクテリウム感染を介するトウモロコシへの形質転換のためのバイナリベクターｐＮＯＶ２１１７に挿入した。このバイナリベクターは、マンノースを用いてトランスジェニック細胞の選択を可能にする、ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）遺伝子を含んだ。形質転換トウモロコシ植物は、自家受粉または外部交配のいずれかを行い、種子は分析のために収集した。
【０４１３】
実施例４４
トウモロコシ中での超好熱性ベータ−グルカナーゼＥｇｌＡの発現
トウモロコシ中での超好熱性ベータ−グルカナーゼＥｇｌＡの発現のために、本発明者らは、植物全体を通しての発現のためのユビキチンプロモーター、およびトウモロコシ種子の胚乳中での特異的発現のためのγ−ゼインプロモーターを利用した。オオムギＡｍｙ３２ｂシグナルペプチドを、アポプラスト中での局在化のためにＥｇｌＡに融合させた。
【０４１４】
トウモロコシの種子および葉における超好熱性ベータ−グルカナーゼＥｇｌＡの発現を、酵素アッセイおよびウェスタンブロッティングを使用して分析した。
【０４１５】
構築物ｐＮＯＶ４８００またはｐＮＯＶ４８０３について分けたトランスジェニック種子を、ベータ−グルカナーゼについて、ウェスタンブロッティングと酵素アッセイの両方を使用して分析した。胚乳を、個々の種子を４８時間水に浸漬した後で単離した。タンパク質を、５０ｍＭ  ＮａＰＯ４緩衝液（ｐＨ  ６．０）中で胚乳を粉砕することによって抽出した。熱安定性タンパク質を、抽出物を１００℃で１５分間加熱すること、続いて不溶性物質をペレット化することによって単離した。熱安定性タンパク質を含む上清を、アゾ−オオムギグルカン法（ｍｅｇａｚｙｍｅ）を使用してベータグルカナーゼ活性について分析した。サンプルを、１００℃で１０分間プレインキュベートし、アゾ−オオムギグルカン基質を使用して、１００℃で１０分間アッセイした。インキュベーション後、３容量の沈殿溶液を各サンプルに加え、サンプルを１分間遠心分離し、そして各上清のＯＤ５９０を決定した。加えて、５μｇのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＥｇｌＡタンパク質に対する抗体を使用するウェスタンブロット分析のために、ニトロセルロースにブロットした。ウェスタンブロット分析は、ＥｇｌＡポジティブ胚乳抽出物中で特異的な熱安定性タンパク質を検出し、ネガティブ抽出物では検出しなかった。ウェスタンブロットシグナルは、酵素的に検出されたＥｇｌＡ活性のレベルと相関する。
【０４１６】
ＥｇｌＡ活性を、トランスジェニック構築物ｐＮＯＶ４８０３およびｐＮＯＶ４８００をそれぞれ含む植物の葉および種子において分析した。このアッセイは（上記のように実行される）、熱安定性ベータ−グルカナーゼＥｇｌＡが、トランスジェニック植物の葉（表９）および種子（表１０）において様々なレベルで発現されたのに対し、非トランスジェニックコントロール植物では活性が検出されなかったことを示した。構築物ｐＮＯＶ４８００およびｐＮＯＶ４８０３を利用する、トウモロコシ中でのＥｇｌＡの発現は、いかなる検出可能なネガティブ表現型も生じなかった。
【０４１７】
表９は、トランスジェニックトウモロコシ植物の葉における超好熱性ベータ−グルカナーゼＥｇｌＡの活性を示す。酵素アッセイを、ｐＮＯＶ４８０３トランスジェニック植物の葉からの抽出物に対して、超好熱性ベータ−グルカナーゼ活性を検出するために実行した。アッセイは、アゾ−オオムギグルカン法（ｍｅｇａｚｙｍｅ）を使用して、１００℃で実行した。結果は、トランスジェニック葉が様々なレベルの超好熱性ベータ−グルカナーゼ活性を有することを示す。
【０４１８】
【表９】
2007527726.tif 000010
【０４１９】
表１０は、トランスジェニックトウモロコシ植物の種子における超好熱性ベータ−グルカナーゼＥｇｌＡの活性を示す。酵素アッセイを、ｐＮＯＶ４８００トランスジェニック植物の個々の分離した種子からの抽出物に対して、超好熱性ベータ−グルカナーゼ活性を検出するために実行した。アッセイは、アゾ−オオムギグルカン法（ｍｅｇａｚｙｍｅ）を使用して、１００℃で実行した。結果は、トランスジェニック種子が様々なレベルの超好熱性ベータ−グルカナーゼ活性を有することを示す。
【０４２０】
【表１０】
2007527726.tif 000011
【０４２１】
細胞壁組成およびインビトロ消化性分析に対する、エンドグルカナーゼＥｇｌＡのトランスジェニック発現の効果
それぞれ、Ｅｇｌａ（ｐＮＯＶ４８０３）を発現しないか、または発現する、２つの系統、＃２６３および＃２６６からの５つの個々の種子を温室で生長させた。未成熟植物からの小さな葉のサンプルから作製したタンパク質抽出物を、トランスジェニックエンドグルカナーゼ活性が＃２６６植物に存在したが、＃２６３植物には存在しなかったことを確認するために使用した。十分に成熟した植物では、受粉の３０日後、地上部の全体の植物を収穫し、おおまかに刻み、およびオーブンで７２時間乾燥させた。各サンプルを２連のサンプルに分け（それぞれＡおよびＢとラベルを付けた）、インビトロ消化の前に４０℃または９０℃のいずれかでのプレインキュベーションによって材料を処理した以外は、一般的な手順を使用して、濾過ルーメン液（ｓｔｒａｉｎｅｄ  ｒｕｍｅｎ  ｆｌｕｉｄ）を使用するインビトロ消化性分析に供した（Ｆｏｒａｇｅ  ｆｉｂｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｐｐａｒａｔｕｓ，ｒｅａｇｅｎｔｓ，ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，ａｎｄ  ｓｏｍｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｂｙ  Ｈ．Ｋ．Ｇｏｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐ．Ｊ．Ｖａｎ  Ｓｏｅｓｔ，Ｇｏｅｒｉｎｇ，Ｈ．Ｋｅｉｔｈ  １９４１（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）：Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，１９７０．ｉｖ，２０  ｐ．：ｉｌｌ．−−  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ｈａｎｄｂｏｏｋ  ；ｎｏ．３７９）。インビトロ消化性分析は以下のように実行した：
【０４２２】
サンプルを、ｗｉｌｅｙミルで約１ｍｍに刻み、次いで、分析のために１６の秤量したアリコートに小分けした。材料を緩衝液中に懸濁し、４０℃または９０℃のいずれかで２時間インキュベートし、次いで、一晩冷却した。微量栄養素、トリプターゼおよびカゼインおよび亜硫酸ナトリウムを加え、濾過ルーメン液を加え、および３７℃で３０時間インキュベートした。中性デタージェントファイバー（ＮＤＦ）、酸性デタージェントファーバー（ＡＤＦ）および酸性デタージェントリグニン（ＡＤ−Ｌ）の分析を、標準的な重量測定法を使用して実行した（Ｖａｎ  ＳｏｅｓｔおよびＷｉｎｅ，Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｕｓ  Ｆｅｅｄｓ．ＩＶ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌ−ｗａｌｌ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ．Ｐ．Ｊ．Ｖａｎ  ＳｏｅｓｔおよびＲ．Ｈ．Ｗｉｎｅ．（１９６７）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｅ  ＡＯＡＣ，５０：５０−５５；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｉｅｔｒｙ  ｆｉｂｅｒ，ｎｅｕｔｒａｌ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｆｉｂｅｒ  ａｎｄ  ｎｏｎｓｔａｒｃｈ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ａｎｉｍａｌ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ（１９９１）．Ｐ．Ｊ．Ｖａｎ  Ｓｏｅｓｔ，Ｊ．Ｂ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ＆  Ｂ．Ａ．Ｌｅｗｉｓ．Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，７４：３５８３−３５９７もまた参照のこと）。
【０４２３】
データは、ＥｇｌＡを発現するトランスジェニック植物（＃２６６）は、コントロール植物（＃２３３）よりも多くのＮＤＦを含むのに対して、ＡＤＦおよびリグニンは比較的変化しないことを示す。トランスジェニック植物のＮＤＦ画分は、非トランスジェニック植物のそれよりも容易に消化され、このことは、セルロースの消化性の増加（ＮＤＦ−ＡＤＦ−ＡＤ−Ｌ）に起因し、トランスジェニック的に発現されたエンドグルカナーゼ酵素による細胞壁セルロースの「自己消化」と一致している。
【０４２４】
実施例４５
トウモロコシにおける好熱性ベータ−グルカナーゼ／マンナーゼ（６ＧＰ１）の発現
ｐＮＯＶ４８２０およびｐＮＯＶ４８２３についての形質転換種子を、アゾ−オオムギグルカン法（ｍｅｇａｚｙｍｅ）を使用して、６ＧＰ１ベータグルカナーゼ活性について分析した。５０℃において実行した酵素アッセイは、トランスジェニック種子が好熱性６ＧＰ１ベータ−グルカナーゼ活性を有するのに対して、非トランスジェニック種子中では活性が検出されなかった（ポジティブシグナルはこのアッセイに伴うバックグラウンドノイズを表す）ことを示す。
【０４２５】
表１１は、トランスジェニックトウモロコシ種子における好熱性ベータ−グルカナーゼ／マンナナーゼ６ＧＰ１の活性を示す。ｐＮＯＶ４８２０（イベント１〜６）およびｐＮＯＶ４８２３（イベント７〜９）についてのトランスジェニック種子を、アゾ−オオムギグルカン法（ｍｅｇａｚｙｍｅ）を使用して、６ＧＰ１ベータグルカナーゼ活性について分析した。酵素アッセイは５０℃において実行し、その結果は、トランスジェニック種子が好熱性６ＧＰ１ベータ−グルカナーゼ活性を有するのに対して、非トランスジェニック種子中では活性が検出されなかったことを示す。
【０４２６】
【表１１】
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【０４２７】
実施例４６
トウモロコシ中での中温性オオムギＡｍｙＩアミラーゼの発現
種々の構築物を、トウモロコシ中でのオオムギＡｍｙＩアルファ−アミラーゼの発現のために生成した。トウモロコシγ−ゼインプロモーターおよびグロブリンプロモーターを、それぞれ胚乳または胚において特異的にアミラーゼを発現させるために使用した。加えて、γ−ゼインシグナル配列および合成ＥＲ保持シグナルを、アミラーゼタンパク質の細胞下局在を調節するために使用した。５つ全ての構築物（ｐＮＯＶ４８６７、ｐＮＯＶ４８７９、ｐＮＯＶ４８９７、ｐＮＯＶ４８９５、ｐＮＯＶ４９０１）は、種子において検出されるアルファ−アミラーゼ活性を有するトランスジェニック植物を生じた。表１２は、５つの独立した分離したイベント（構築物ｐＮＯＶ４８７９およびｐＮＯＶ４８９７）についての個々の種子における活性を示す。全ての構築物は、収縮した種子表現型を有するいくつかのトランスジェニックイベントを生じ、これは、オオムギＡｍｙＩアミラーゼの合成が、デンプンの形成、蓄積、または分解に影響を与え得ることを示す。
【０４２８】
図１２は、個々のトウモロコシ種子中でのオオムギＡｍｙＩアルファ−アミラーゼの活性を示す（構築物ｐＮＯＶ４８７９およびｐＮＯＶ４８９７）。構築物ｐＮＯＶ４８７９（種子サンプル１および２）およびｐＮＯＶ４８９７（種子サンプル３〜５）についての個々の分離した種子を、以前に記載したように、アルファ−アミラーゼ活性について分析した。
【０４２９】
【表１２】
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【０４３０】
実施例４７
キシラナーゼ構築物の調製
表１３は、独特なキシラナーゼ発現カセットを各々含む９個のバイナリベクターを列挙する。これらのキシラナーゼ発現カセットは、プロモーター、合成キシラナーゼ遺伝子（コード配列）、イントロン（ＰＥＰＣ、逆方向）およびターミネーター（３５Ｓ）を含む。
【０４３１】
２つの合成のトウモロコシに最適化されたエンド−キシラナーゼ遺伝子を、バイナリベクターｐＮＯＶ２１１７にクローニングした。これらの２つのキシラナーゼ遺伝子は、ＢＤ７４３６（配列番号６１）およびＢＤ６００２Ａ（配列番号６３）と称した。第３のトウモロコシに最適化された配列、ＢＤ６００２Ｂ（配列番号６５）を含むさらなるバイナリベクターを作製することができる。
【０４３２】
２つのプロモーターを使用した：トウモロコシグルテリン−２プロモーター（２７ｋＤガンマ−ゼインプロモーター（配列番号１２））およびイネグルテリン−１（Ｏｓｇｔ１）プロモーター（配列番号６７）である。表１に列挙される最初の６個のベクターを、トランスジェニック植物を生成するために使用した。最後の３個のベクターもまた、作製およびトランスジェニック植物を生成するために使用することができる。
【０４３３】
ベクター１１５６０および１１５６２は、配列番号６２に示されるポリペプチド（ＢＤ７４３６）をコードする。構築物１１５５９および１１５６１は、配列番号６２のＮ末端に融合された配列番号１７からなるポリペプチドをコードする。配列番号１７は、２７ｋＤガンマ−ゼインタンパク質からの１９アミノ酸シグナル配列である。
【０４３４】
ベクター１２１７５は、配列番号６４に示されるポリペプチド（ＢＤ６００２Ａ）をコードする。ベクター１２１７４は、配列番号６４のＮ末端に融合されたガンマ−ゼインシグナル配列（配列番号１７）からなる融合タンパク質をコードする。
【０４３５】
ベクターｐＷＩＮ０６２およびｐＷＩＮ０６４は、配列番号６６に示されるポリペプチド（ＢＤ６００２Ｂ）をコードする。ベクターｐＷＩＮ０５８は、配列番号６６のＮ末端に融合されたトウモロコシｗａｘｙタンパク質（配列番号６８）の葉緑体通過ペプチドからなる融合タンパク質をコードする。
【０４３６】
【表１３】
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【０４３７】
全ての構築物は、マンノース含有培地上で再生されたトランスジェニック組織のポジティブ選択を可能にするために、ＰＭＩについての発現カセットを含む。
【０４３８】
実施例４８
キシラナーゼ活性アッセイの結果
表１４および１５に示される結果は、キシラナーゼ活性が、キシラナーゼ遺伝子ＢＤ７４３６（実施例４７における配列番号６１）およびＢＤ６００２Ａ（実施例４７における配列番号６３）を含むバイナリベクターで安定に形質転換された、再生（Ｔ０）トウモロコシ植物から収穫したＴ１世代に蓄積することを実証する。Ａｚｏ−ＷＡＸＹアッセイ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を使用して、活性を、プールした（分離した）トランスジェニック種子と単一のトランスジェニック種子の両方からの抽出物中で検出した。
【０４３９】
Ｔ１種子を粉砕し、可溶性タンパク質を、クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ  ５．４）を使用して粉サンプルから抽出した。粉懸濁液を室温で６０分間攪拌し、不溶性物質を遠心分離によって除去した。上清画分のキシラナーゼ活性を、Ａｚｏ−ＷＡＸＹアッセイを使用して測定した（ＭｃＣｌｅａｒｙ，Ｂ．Ｖ．「Ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｘｙｌａｎａｓｅ，ｂｅｔａ−ｇｌｕｃａｎａｓｅ  ａｎｄ  ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ  ｉｎ  ｆｅｅｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  ａｎｉｍａｌ  ｆｅｅｄｓ」．Ｉｎ  ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｆｅｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ）（Ｗ．ｖａｎ  Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ，Ｍ．Ｈｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．Ｐ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｊｕｇｔ，ａｎｄ  Ｗ．Ａ．Ｃ  Ｓｏｍｅｒｓ編），Ｎｏｏｒｄｗｉｉｊｋｅｒｈｏｕｔ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，２５−２７  Ｏｃｔｏｂｅｒ，１９９５）。抽出物および基質を３７℃でプレインキュベートした。１体積の１×抽出上清に、１体積の基質（１％  Ａｚｏ−コムギアラビノキシラン  Ｓ−  ＡＷＡＸＰ）を加え、次いで、３７℃で５分間インキュベートした。トウモロコシ粉抽出物中のキシラナーゼ活性は、エンド−メカニズムによってＡｚｏ−コムギアラビノキシランを脱重合し、キシロオリゴマーの型で低分子量の着色したフラグメントを生成する。５分間のインキュベーション後、反応を、５体積の９５％  ＥｔＯＨの付加によって終結した。アルコールの付加は、より低分子量のキシロオリゴマーのみが溶液に残存するように脱重合していない着色した基質が沈殿することを引き起こす。不溶性物質を遠心分離によって除去した。上清画分の吸光度を５９０ｎｍで測定し、粉のグラムあたりのキシラナーゼの単位を、既知のキシラナーゼ標準の活性を使用する同一のアッセイからの吸光度の値に対する比較によって決定した。この標準の活性を、ＢＣＡアッセイによって決定した。標準の酵素アッセイを、基質としてコムギアラビノキシランを使用して、および２，２’−ビシコニン酸（ＢＣＡ）との還元末端の反応によって決定した。基質を、０．０２％アジ化ナトリウムを含む、１００ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ  ５．３０中のコムギアラビノキシランの１．４％  ｗ／ｗ溶液（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｐ−ＷＡＸＹＭ）として調製した。ＢＣＡ試薬を、５０部の試薬Ａと１部の試薬Ｂを合わせることによって調製した（試薬ＡおよびＢはＰｉｅｒｃｅより、それぞれ製品番号２３２２３および２３２２４）。これらの試薬を、使用前４時間以内に合わせた。アッセイを、２００マイクロリットルの基質を８０マイクロリットルの酵素サンプルと合わせることによって実行した。所望の温度で所望の長さの時間のインキュベーションの後、２．８０ミリリットルのＢＣＡ試薬を加えた。内容物を混合し、８０℃に３０〜４５分間配置した。内容物を冷却させ、次いでキュベットに移し、５６０ｎｍにおける吸光度を、既知の濃度のキシロースと比較して測定した。酵素の希釈、インキュベーション時間、およびインキュベーション温度の選択は、当業者によって変更することができる。
【０４４０】
表１４に示される実験結果は、Ｔ１世代トウモロコシ種子から調製された粉中の組換えキシラナーゼ活性の存在を実証する。１２のＴ０植物（独立したＴ−ＤＮＡ組み込みイベントに由来する）からの種子を分析した。１２のトランスジェニックイベントを、示されるように６つの異なるベクターから誘導した（ベクターの説明については、実施例４７における表１３を参照のこと）。非トランスジェニック（ネガティブコントロール）トウモロコシ粉の抽出物は、測定可能なキシラナーゼ活性を含まない（表１５を参照のこと）。これらの１２個のサンプル中のキシラナーゼ活性は、１０〜８７単位／グラム粉の範囲であった。
【０４４１】
【表１４】
2007527726.tif 000015
【０４４２】
表１５における結果は、単一の穀粒に由来するトウモロコシ粉中のキシラナーゼ活性の存在を実証する。ベクター１１５６１および１１５５９を含む２つのＴ０植物からのＴ１種子を分析した。これらのベクターは実施例４７に説明されている。２つの植物の各々からの８個の種子を粉砕し、各種子からの粉サンプルを抽出した。この表は、各抽出物の単独のアッセイの結果を示す。キシラナーゼ活性は、両方のトランスジェニックイベントについて、種子１、５、および８の抽出物のアッセイにおいて見い出されなかった。これらの種子はヌル分離個体を表す。種子２、３、４、６、および７は、両方のトランスジェニックイベントについて、組換えＢＤ７４３６遺伝子の発現に起因する測定可能なキシラナーゼ活性を蓄積した。キシラナーゼ活性についてポジティブであると試験された（＞１０単位／グラム粉）１０個全ての種子は、明白に収縮または縮小した外見を有した。対照的に、キシラナーゼ活性についてネガティブであると試験された（≦１単位／グラム粉）６個全ての種子は、正常な外見を有した。この結果は、組換えキシラナーゼが、発生および／または成熟の間に、内因性の（アラビノ）キシラン基質を脱重合したことを示す。
【０４４３】
【表１５】
2007527726.tif 000016
【０４４４】
実施例４９
酵素を使用する、トウモロコシ種子からのデンプンの回収の増強
トウモロコシのウェット製粉は、トウモロコシ穀粒を浸漬する工程、トウモロコシ穀粒を粉砕する工程、および穀粒の成分を分離する工程を含む。ウェット製粉プロセスを模倣するために、ベンチトップアッセイ（破砕トウモロコシアッセイ）を開発した。
【０４４５】
この「破砕トウモロコシアッセイ」を、トウモロコシのウェット製粉プロセスの効率の改善を生じる、トウモロコシ種子からのデンプン収量を増強する酵素を同定するために使用した。酵素送達は、外因性付加、トランスジェニックトウモロコシ種子、または両方の組み合わせによってのいずれかであった。トウモロコシ成分の分離を容易にする酵素の使用に加えて、プロセスからのＳＯ2の除去もまた示される。
【０４４６】
破砕トウモロコシアッセイ
１グラムの種子を、４０００、２０００、１０００、５００、４００、４０、または０ｐｐｍ  ＳＯ2中で、５０℃または３７℃で一晩浸漬した。種子を半分に切断し、胚を除去した。各々の半分の種子を再度半分に切断した。各々の浸漬した種子サンプルからの浸漬水を保持し、４００ｐｐｍ〜０ｐｐｍ  ＳＯ2の範囲の最終濃度まで希釈した。酵素を有するかまたは有さない、２ｍｌの浸漬水を、胚を除いた種子に加え、サンプルを５０℃または３７℃に、２〜３時間配置した。各酵素をサンプルあたり１０単位加えた。全てのサンプルを、ほぼ１５分毎にボルテックスした。２〜３時間後、サンプルをミラクロス（ｍｉｒａ  ｃｌｏｔｈ）を通して、５０ｍｌ遠心管に濾過した。種子を２ｍｌの水で洗浄し、第１の上清を有するサンプルをプールした。サンプルを１５分間、３０００ｒｐｍで遠心分離した。遠心分離後、上清を注ぎ出し、ペレットを３７℃に配置して乾燥させた。全てのペレットの重量を記録した。デンプンおよびタンパク質の定量をまた、処理の間に遊離したデンプン：タンパク質の比率を決定するために、サンプル上で実行した（データ示さず）。
【０４４７】
破砕トウモロコシアッセイにおける、６ＧＰ１エンドグルカナーゼを発現するトウモロコシ植物からのＴ１種子およびＴ２種子の分析
熱安定性エンドグルカナーゼを含むトランスジェニックトウモロコシ（ｐＮＯＶ４８１９およびｐＮＯＶ４８２３）は、破砕トウモロコシアッセイにおいて分析したときに、十分な性能であった。ｐＮＯＶ４８１９系統からのデンプンの回収は、２０００ｐｐｍ  ＳＯ2中に浸漬させたときに、エンドグルカナーゼを発現する種子において、２倍高いことが見い出された。エンドグルカナーゼ種子へのプロテアーゼおよびセロビオヒドロラーゼの付加は、コントロール種子よりも、デンプンの回収を約７倍増加した。表１６を参照のこと。
【０４４８】
【表１６】
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【０４４９】
同様の結果が、胚乳のＥＲに標的化されるエンドグルカナーゼを含むトランスジェニック種子中で観察され（ｐＮＯＶ４８２３）、これは、再度、コントロール種子と比較したときに、２〜７倍のデンプンの回収の増加を生じた。表１７を参照のこと。
【０４５０】
【表１７】
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【０４５１】
これらの結果は、エンドグルカナーゼの発現が、デンプンの分離およびトウモロコシ種子のタンパク質成分を増強することを確認する。さらに、浸漬工程の間でのＳＯ２の減少または除去は、通常に浸漬したコントロール種子と比較し得るか、またはより良好なデンプンの回収を生じたことが示され得る。表１８を参照のこと。ウェット製粉プロセスからの高レベルのＳＯ２の除去は、付加価値のある利点を提供し得る。
【０４５２】
【表１８】
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【０４５３】
実施例５０
トウモロコシに最適化されたブロメラインについての形質転換ベクターの構築
種々の標的化シグナルを用いてトウモロコシ胚乳中でトウモロコシに最適化されたブロメラインを発現するための発現カセットを以下のように構築した：
【０４５４】
ｐＳＹＮ１１０００（配列番号７３）は、ＰＶＳへの標的化およびそこでの保持のために、ブロメラインシグナル配列（ＭＡＷＫＶＱＶＶＦＬＦＬＦＬＣＶＭＷＡＳＰＳＡＡＳＡ）（配列番号７２）、および配列ＶＦＡＥＡＩＡＡＮＳＴＬＶＡＥのＣ末端付加物と融合された合成ブロメラインを含む（ＶｉｔａｌｅおよびＲａｉｋｈｅｌ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ  ４  ｎｏ．４  １４９−１５５頁）。この融合物は、胚乳での特異的発現のためにトウモロコシガンマゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０４５５】
ｐＳＹＮ１１５８７（配列番号７５）は、小胞体（ＥＲ）への標的化およびそこでの保持のために、ブロメラインＮ末端シグナル配列（ＭＡＷＫＶＱＶＶＦＬＦＬＦＬＣＶＭＷＡＳＰＳＡＡＳＡ）、および配列ＳＥＫＤＥＬのＣ末端付加を伴う合成ブロメラインを含む（ＭｕｎｒｏおよびＰｅｌｈａｍ，１９８７）。この融合物は、胚乳での特異的発現のためにトウモロコシガンマゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０４５６】
ｐＳＹＮ１１５８９（配列番号７４）は、溶解性液胞への標的化のために、溶解性液胞標的化配列ＳＳＳＳＦＡＤＳＮＰＩＲＶＴＤＲＡＡＳＴ（ＮｅｕｈａｕｓおよびＲｏｇｅｒｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３８：１２７−１４４，１９９８）に融合されたブロメラインシグナル配列（ＭＡＷＫＶＱＶＶＦＬＦＬＦＬＣＶＭＷＡＳＰＳＡＡＳＡ）（配列番号７２）、および合成ブロメラインを含む。この融合物は、胚乳での特異的発現のためにトウモロコシガンマゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０４５７】
ｐＳＹＮ１２１６９（配列番号７６）は、小胞体への標的化およびアポプラストへの分泌のために合成ブロメラインに融合されたトウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナル配列（ＭＲＶＬＬＶＡＬＡＬＬＡＬＡＡＳＡＴＳ）（配列番号１７）を含む（Ｔｏｒｒｅｎｔら、１９９７）。この融合物は、胚乳での特異的発現のためにトウモロコシガンマゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０４５８】
ｐＳＹＮ１２５７５（配列番号７７）は、アミロプラストへの標的化のために、合成ブロメラインに融合されたｗａｘｙアミロプラスト標的化ペプチド（Ｋｌｏｓｇｅｎら、１９８６）を含む。この融合物は、胚乳での特異的発現のためにトウモロコシガンマゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０４５９】
ｐＳＭ２７０（配列番号７８）は、溶解性液胞への標的化のために、溶解性液胞標的化配列ＳＳＳＳＦＡＤＳＮＰＩＲＶＴＤＲＡＡＳＴ（ＮｅｕｈａｕｓおよびＲｏｇｅｒｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３８：１２７−１４４，１９９８）に融合されたブロメラインＮ末端シグナル配列、および合成ブロメラインを含む。この融合物は、アリューロンでの特異的発現のためにアリューロン特異的プロモーターＰ１９（米国特許第６３９２１２３号）の後ろにクローニングした。
【０４６０】
実施例５１
トウモロコシ中でのブロメラインの発現
種子の様々な細胞下局在における発現のために、標的化配列を有する合成ブロメライン遺伝子を含むベクターで形質転換されたＴ１トランスジェニック系統からの種子を、プロテアーゼ活性について分析した。トウモロコシ粉を、Ｋｌｅｃｏグラインダー中で種子を３０秒間粉砕することによって作製した。酵素を、１００ｍｇの粉から、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび５  ｍＭ  ＤＴＴを含む１  ｍｌの５０  ｍＭ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ４．８または５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．０緩衝液を用いて抽出した。サンプルをボルテックスし、次いで４℃に配置し、３０分間連続的な振盪を行った。各トランスジェニック系統からの抽出物を、製品カタログに概説されるように、レゾルフィン標識カゼイン（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号  １  ０８０  ７３３）を使用してアッセイした。Ｔ２種子からの粉を、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２４４：５５７−５５８頁に概説されるように、以下の修飾を伴って、ブロメライン特異的アッセイを使用してアッセイした。１００ｍｇのトウモロコシ種子粉を、１ｍｌの５０ｍＭＮａ2ＨＰＯ4／５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ  ７．０、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ  ＋／−  １μＭ  ロイペプチンを用いて、１５分間、４℃で抽出した。抽出物を、５分間、１４，０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離した。抽出を２連で行った。Ｔ２トランスジェニック系統からの粉を、Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨＭｅｃ（Ｓｉｇｍａ）を基質として使用して、ブロメライン活性についてアッセイした。１００μｌ／トウモロコシ種子抽出物の４つのアリコートを、５０μｌ  １００ｍＭＮａ2ＨＰＯ4／１００ｍＭ  ＮａＨ2Ｐ０4、ｐＨ  ７．０、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、８ｍＭ  ＤＴＴ／ウェルを含む９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に加えた。反応を、５０μｌの２０μＭ  Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨＭｅｃの添加によって開始した。反応速度を、３６０ｎｍ励起フィルターおよび４６５ｎｍ発酵フィルターを装着したＳｐｅｃｔｒａＦｌｕｏｒＰｌｕｓ（Ｔｅｃａｎ）を使用して、４０℃で、２．５分の間隔でモニターした。
【０４６１】
表１９は、異なるＴ１ブロメラインイベントからの種子の分析を示す。ブロメライン発現は、Ａ１８８およびＪＨＡＦコントロール系統よりも、２〜７倍高いことが見い出された。Ｔ１トランスジェニック系統は再び栽培され、Ｔ２種子を得た。Ｔ２種子の分析は、ブロメラインの発現を示した。図２１は、ＥＲに標的化された（１１５８７）および溶解性液胞に標的化された（１１５８９）ブロメラインについて、Ｔ２種子中でのＺ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨＭｅｃを使用するブロメライン活性アッセイを示す。
【０４６２】
ブロメラインを発現するトウモロコシ植物からのＴ２種子の分析
Ｔ２トランスジェニックブロメライン系統、１１５８７−２からの種子を、デンプン回収の増強について、破砕トウモロコシアッセイにおいて分析した。外因性に加えたブロメラインを使用する以前の実験は、単独で、および他の酵素、特にセルラーゼと組み合わせて試験したときに、デンプン回収の増加を示した。系統１１５８７−２からのＴ２種子は、３７℃／２０００  ｐｐｍ  ＳＯ２で一晩浸漬したときに、コントロール種子よりも、回収されたデンプンの１．３倍の増加を示した。より重要なことには、セルラーゼ（Ｃ８５４６）を加えたときに、種子を３７℃／２０００  ｐｐｍ  ＳＯ２で浸漬したときに、Ｔ２ブロメライン系統から、２倍のデンプンの増加が存在した。
【０４６３】
トランスジェニック系統は、種子を３７℃／２０００  ｐｐｍ  ＳＯ２で浸漬したときに、コントロール種子よりも、デンプンが増加する同様の傾向を示した。コントロールよりも回収されたデンプンの１．６倍の増加がトランスジェニック種子において見られ、セルラーゼ（Ｃ８５４６）の添加を用いると２．１倍のデンプンの増加が見られた。表２０を参照のこと。
【０４６４】
これらの結果は、ブロメラインを発現するトランスジェニック種子が使用されるときに、ウェット製粉プロセスの間に、デンプンの回収をまた増強しながら、温度およびＳＯ２レベルを減少させることが可能であることを顕著に示す。
【０４６５】
【表１９】
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【０４６６】
【表２０】
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【０４６７】
実施例５２
トウモロコシに最適化されたフェルラ酸エステラーゼについての形質転換ベクターの構築
種々の標的化シグナルのあるなしで、トウモロコシ胚乳中でトウモロコシに最適化されたフェルラ酸を発現するために発現カセットを以下のように構築した：
【０４６８】
プラスミド１３０３６（配列番号１０１）は、トウモロコシに最適化されたフェルラ酸エステラーゼ（ＦＡＥ）配列（配列番号９９）を含む。この配列は、胚乳の細胞質中での特異的な発現のために、任意の標的化配列なしで、トウモロコシガンマゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０４６９】
プラスミド１３０３８（配列番号１０３）は、小胞体への標的化およびアポプラストへの分泌のために、合成ＦＡＥに融合されたトウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナル配列（ＭＲＶＬＬＶＡＬＡＬＬＡＬＡＡＳＡＴＳ）（配列番号１７）を含む（Ｔｏｒｒｅｎｔら、１９９７）。この融合物は、胚乳での特異的な発現のために、トウモロコシガンマゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０４７０】
プラスミド１３０３９（配列番号１０５）は、アミロプラストへの標的化のために、合成ＦＡＥに融合されたｗａｘｙアミロプラスト標的化ペプチド（ＭＬＡＡＬＡＴＳＱＬＶＡＴＲＡＧＬＧＶＰＤＡＳＴＦＲＲＧＡＡＱＧＬＲＧＡＲＡＳＡＡＡＤＴＬＳＭＲＴＳＡＲＡＡＰＲＨＱＨＱＱＡＲＲＧＡＲＦＰＳＬＶＶＣＡＳＡＧＡ）（Ｋｌｏｓｇｅｎら、１９８６）を含む。この融合物は、胚乳での特異的な発現のために、ガンマゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０４７１】
プラスミド１３３４７（配列番号１０７）は、小胞体（ＥＲ）への標的化およびそこへの保持のために、配列ＳＥＫＤＥＬのＣ末端付加を有する合成ＦＡＥに融合されたトウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナル配列（ＭＲＶＬＬＶＡＬＡＬＬＡＬＡＡＳＡＴＳ）（配列番号１７）を含む（ＭｕｎｒｏおよびＰｅｌｈａｍ，１９８７）。この融合物は、胚乳での特異的な発現のために、トウモロコシガンマゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０４７２】
全ての発現カセットを、アグロバクテリウム感染を介するトウモロコシへの形質転換のために、バイナリベクターｐＮＯＶ２１１７に移動させた。このバイナリベクターは、マンノースを用いてトランスジェニック細胞の選択を可能にする、ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）遺伝子を含んだ。形質転換したトウモロコシ植物は、自家受粉または外部交配のいずれかを行い、種子は分析のために収集した。
【０４７３】
酵素の組み合わせは、個々の酵素を発現する植物を交雑させることによって、または同時発現を可能にするためにいくつかの発現カセットを同じバイナリベクターにクローニングすることによってのいずれかで生成され得る。
【０４７４】
【化１】
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【０４７５】
【化２】
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【０４７６】
【化３】
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【０４７７】
【化４】
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【０４７８】
【化５】
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【０４７９】
【化６】
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【０４８０】
【化７】
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【０４８１】
【化８】
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【０４８２】
【化９】
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【０４８３】
【化１０】
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【０４８４】
実施例５３
フェルラ酸エステラーゼによるトウモロコシ繊維の加水分解的分解
トウモロコシ繊維は、トウモロコシのウェット製粉およびドライ製粉の主要な副産物である。繊維成分は、主として、種子の皮（殻）およびアリューロンから生じる粗い（ｃｏｕｒｓｅ）繊維から構成され、胚乳細胞壁から生じる細かい繊維の画分を伴う。フェルラ酸、ヒドロキシケイ皮酸は、細胞壁のリグニン、ヘミセルロース、およびセルロース成分の架橋を生じる穀物の穀粒の細胞壁中に高濃度で見い出される。フェルラ酸架橋の酵素的分解は、トウモロコシ繊維の加水分解における重要な工程であり、他の加水分解酵素によるさらなる酵素的分解の接近可能性を生じ得る。
【０４８５】
フェルラ酸エステラーゼ活性アッセイ
フェルラ酸エステラーゼ、ＦＡＥ−１（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍからのトウモロコシに最適化された合成遺伝子）を、大腸菌中で発現した。細胞を収穫し、−８０℃で一晩保存した。収穫した細菌を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液  ｐＨ７．５中に懸濁した。リゾチームを、２００μｇ／ｍＬの最終濃度で加え、サンプルを、穏やかに攪拌しながら室温で１０分間インキュベートした。サンプルを、４℃にて１５分間、４０００ｒｐｍで遠心分離した。遠心分離後、上清を５０ｍＬコニカルチューブに移し、７０℃のウォーターバスに３０分間配置した。次いで、サンプルを、１５分間４０００ｒｐｍで遠心分離し、清澄化した上清をコニカルチューブに移した（Ｂｌｕｍら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｒ  ２０００，１３４６−１３５１頁）。
【０４８６】
組換えＦＡＥ−１を、Ｍａｓｔｉｈｕｂｏｖａら、（２００２）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０９  ９６−１０１に記載されるように、４−メチルウンベリフェリルフェルラ酸を使用して、活性について試験した。組換えタンパク質ＦＡＥ−１（１０４−３）を、１０、１００、および１０００倍希釈し、そしてアッセイした。活性アッセイの結果を図２２に示す。
【０４８７】
トウモロコシ種子繊維の調製
トウモロコシ果皮の粗い繊維を、イエローデント＃２穀粒を、４８時間、５０℃で、２０００ｐｐｍのメタ重亜硫酸ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ）中に浸漬することによって単離した。穀粒を、等量部の水と混合し、逆方向の刃を備えるＷａｒｉｎｇ実験用ヘビーデューティーブレンダーでブレンドした。ブレンダーを、５０％電圧出力で、２分間、可変自動変圧器（Ｓｔａｃｏ  Ｅｎｅｒｇｙ）を用いて制御した。ブレンドした材料を、標準試験ふるい＃７（Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で水道水で洗浄し、デンプン画分から粗い繊維を分離した。粗い繊維および胚を、４Ｌビーカー（Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で熱い水道水を用いて、胚から離れて繊維を浮遊させることによって分離した。次いで、繊維をエタノールに浸漬し、その後、真空オーブン（  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）中、６０℃で一晩乾燥させた。トウモロコシ穀粒の皮に由来するトウモロコシの粗い繊維を、ミルフィーダー３１７０（Ｐｅｒｔｅｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に装着した実験用ミル３１００を用いて、０．５ｍｍ粒子サイズまで製粉した。
【０４８８】
トウモロコシ繊維加水分解アッセイ
粗い繊維（ＣＦ）を、５０  ｍＭ  クエン酸−リン酸緩衝液、ｐＨ  ５．２中で、３０  ｍｇ／５  ｍｌ  緩衝液で懸濁した。ＣＦストックをボルテックスし、４０ｍｌモジュラーリザーバー（Ｂｅｃｋｍａｎ、カタログ番号３７２７９０）に移した。この溶液を十分に混合し、次いで、１００μｌを９６ウェルプレート（Ｃｏｍｉｎｇ  Ｉｎｃ．，カタログ番号９０１７、ポリスチレン、平底）に移した。酵素を１〜１０μｌ／ウェルで加え、緩衝液で最終量を１１０μｌに調整した。ＣＦバックグラウンドコントロールは、１０μｌの緩衝液のみを含んだ。プレートをアルミニウムホイルでシールし、定常的に振盪しながら１８時間、３７℃でインキュベートした。プレートを、１５分間、４０００ｒｐｍで遠心分離した。１〜１０μｌのＣＦ上清を、１００μｌのＢＣＡ試薬（ＢＣＡ試薬：試薬Ａ（Ｐｉｅｒｃｅ、製品番号２３２２３）、試薬Ｂ（Ｐｉｅｒｃｅ、製品番号２３２２４））をプレロードした９６ウェルプレートに移した。最終量を１１０μｌに調整した。プレートをアルミニウムホイルでシールし、８５℃に３０分間配置した。８５℃でのインキュベーション後、プレートを５分間、２５００ｒｐｍで遠心分離した。吸光度の値を５６２ｎｍで読み取った（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｐｌｕｓ）。サンプルを、Ｄ−グルコースおよびＤ−キシロース（Ｓｉｇｍａ）の検量線を用いて定量した。アッセイの結果を、遊離した全体の糖として報告する。
【０４８９】
トウモロコシ種子繊維加水分解アッセイにおけるフェルラ酸エステラーゼによって遊離された全体の糖の測定
組換えＦＡＥ−１繊維加水分解アッセイからの結果は、全体の還元糖の増加を示さなかった（データ示さず）。これらの結果は予測されないことではなかった。なぜなら、文献において、全体の還元糖の増加は、他の加水分解酵素がＦＡＥと組み合わせて使用されるときのみに検出可能であると報告されていたからである（Ｙｕら、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２００３，５１，２１８−  ２２３）。図２３は、トウモロコシ繊維上で増殖した真菌上清へのＦＡＥ−２の添加が、全体の還元糖の増加を示すことを示す。これは、ＦＡＥがトウモロコシ繊維の加水分解において重要な役割を果たすことを示唆する。
【０４９０】
図２３は、真菌上清（ＦＳ９）へのＦＡＥ−２の添加に伴う、トウモロコシ繊維からの全体の還元糖の遊離の増加を示す、トウモロコシ繊維加水分解アッセイの結果を示す。
【０４９１】
ＦＡＥ−１によってトウモロコシ種子繊維から遊離されたフェルラ酸の分析
トウモロコシ繊維に対するＦＡＥ活性を、わずかな修飾を伴って、ＷａｌｆｒｏｎおよびＰａｒｒ（１９９６）（Ｗａｌｄｒｏｎ．ＫＷ．Ｐａｒｒ  ＡＪ  １９９６  Ｖｏｌ  ７  ３０５−３１２頁  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ  Ａｎａｌ）に記載されるように、フェルラ酸の遊離を追跡することによって試験した。トウモロコシ穀粒の皮に由来するトウモロコシの粗い繊維を、ミルフィーダー３１７０（Ｐｅｒｔｅｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に装着した実験用ミル３１００を用いて、０．５ｍｍ粒子サイズまで製粉し、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、基質として使用した。１ｍｌのアッセイを、２４ウェルのＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ（商標）中で実行した。基質を、５０ｍＭクエン酸リン酸  ｐＨ  ５．４中で、５０℃、１１０ｒｐｍにて、１８時間、組換えＦＡＥの存在下および非存在下でインキュベートした。インキュベート時間の後、サンプルを１０分間、１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、その後酢酸エチル抽出を行った。使用した全ての溶媒は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからであった。０．８ｍｌの上清を０．５ｍｌ氷酢酸で酸性化し、等量の酢酸エチルで３回抽出した。有機画分を合わせて、ｓｐｅｅｄ  ｖａｃ（Ｓａｖａｎｔ）で４０℃にて乾燥させた。次いで、サンプルを１００μｌのメタノールで懸濁し、ＨＰＬＣ分析のために使用した。
【０４９２】
ＨＰＬＣクロマトグラフィーを以下のように実行した。フェルラ酸（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を、ＨＰＬＣ分析における標準として使用した（データ示さず）。ＨＰＬＣ分析を、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄシリーズ１１００ＨＰＬＣシステムを用いて行った。その手順は、Ｃ18完全キャップ逆相カラム（ＸｔｅｒｒａＲｐ18、１５０ｍｍ×３．９ｍｍ  ｉ．ｄ．５μｍ  粒子サイズ）を利用し、４０℃にて１．０  ｍｌ  分-1で操作した。フェルラ酸が、３２分間で２５〜７０％Ｂのグラジエント（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．０１％ｂ  ＴＦＡ；溶媒Ｂ：ＭｅＣＮ、０．００７５％）で溶出した。
【０４９３】
図２４に示されるように、トウモロコシ繊維から遊離したＦＡは、１０または１００μｌのＦＡＥ−１で処理したときに、コントロールよりも２〜３倍高かった。これらの結果は、ＦＡＥ−１が、トウモロコシ繊維を加水分解可能であることを明確に示す。
【０４９４】
実施例５４
トウモロコシで発現されたグルコアミラーゼおよびアミラーゼの発酵における機能性
本実施例は、トウモロコシで発現された酵素が、加える酵素の非存在下で、かつコーンスラリーを調理することなく、コーンスラリー中のデンプンの発酵を補助することを実証する。Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｚｙｚａｅグルコアミラーゼ（ＲＯＧＡ）（配列番号４９）を含むトウモロコシ穀粒は、実施例３２に記載されるように生成した。オオムギ低ｐＩ  α−アミラーゼ（ＡＭＹＩ）（配列番号８８）を含むトウモロコシ穀粒は、実施例４６に記載されるように生成する。以下の材料を本実施例において使用する：
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ（ＡＮＧＡ）はＳｉｇｍａから購入した。
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ種グルコアミラーゼ（ＲｘＧＡ）はＷａｋｏから乾燥結晶粉末として購入し、１０  ｍＭ  酢酸ナトリウム  ｐＨ  ５．２、５  ｍＭ  ＣａＣｌ2中で１０  ｍｇ／ｍｌで作製した。
ＭＡＭＹＩ  微生物によって産生したＡＭＹＩを、１０  ｍＭ  酢酸ナトリウム  ｐＨ  ５．２、５  ｍＭ  ＣａＣｌ2中で約０．２５ｍｇ／ｍｌに調製した。
酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｃｅａｅであった。
ＹＥは水中の酵母抽出液の滅菌５％溶液であった。
酵母スターターは、総量３００ｍｌの水中に、５０ｇ  マルトデキストリン、１．５ｇ  酵母抽出物、０．２ｍｇ  ＺｎＳＯ4を含んだ。培地は、調製後にオートクレーブによって滅菌した。室温まで冷却した後、１ｍｌのテトラサイクリン（エタノール中１０ｍｇ／ｍｌ）、１００μｌ  ＡＭＧ３００グルコアミラーゼおよび１５５ｍｇ活性ドライイーストを加えた。次いで、この混合物を３０℃で２２時間振盪させた。一晩の酵母培養物を水で１／１０希釈し、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されているように、Ａ６００を測定して酵母の数を決定した。
ＲＯＧＡ粉  穀粒を、活性なグルコアミラーゼを有することが知られているいくつかのＴ０株からプールした、種子をＫｌｅｃｏ中で粉砕し、全ての粉をプールした。
ＡＭＹＩ粉  ＡＭＹＩを発現するＴ０トウモロコシからの穀粒をプールし、上記のように粉砕した。
コントロール粉  同様の遺伝子バックグラウンドからの穀粒を、ＲＯＧＡ発現トウモロコシと同じ様式で粉砕した。
全ての接種混合物を滅菌チューブ中で調製した；これは１．６５ｍｌあたり以下を含んだ：酵母細胞（１×１０7）、酵母抽出物（８．６ｍｇ）、テトラサイクリン（５５μｇ）。１．６５ｍｌを、ｇ粉あたり、各発酵チューブに加えた。
【０４９５】
発酵調製：粉を、風袋を計った１７×１００ｍｍ滅菌ポリプロピレンに、１．８ｇ／チューブで秤量した。５０μｌの０．９  Ｍ  Ｈ2Ｓ０4を加えて、発酵前の最終ｐＨを５に調整した。接種混合物（２．１ｍｌ）を、以下に示すように、ＲＸＧＡ、ＡＭＹＩ−Ｐ、およびアミラーゼ脱塩緩衝液とともに、チューブあたりに加えた。緩衝液の量は、全体の固形物含量が各チューブ中で一定であるように、各粉の湿度含量に基づいて調整した。チューブを徹底的に混合し、秤量し、プラスチックバッグ中に配置し、そして３０℃でインキュベートした。
【０４９６】
【表２１】
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【０４９７】
発酵チューブを、６７時間の時間経過にわたって間隔をあけて秤量した。重量の喪失は、発酵の間のＣＯ2の発生に対応する。サンプルのエタノール含量を、ＤＣＬエタノールアッセイ法によって、発酵の６７時間後に決定した。キット（カタログ番号２２９−２９）を、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｔｏｗｎ，ＰＥ，Ｃａｎａｄａ，ＤＩＥ  １Ｂ０から購入した。サンプル（１０μｌ）を、各発酵チューブから３連で取り、９９０μｌの水に希釈した。１０μｌの希釈サンプルを、１．２５ｍｌのアッセイ緩衝液／ＡＤＨ−ＮＡＤ試薬の１２．５／１混合物と混合した。標準（０、５、１０および２０％  ｖ／ｖ  ＥｔＯＨ）を希釈し、並行してアッセイした。反応を、３７℃で１０分間インキュベートし、次いでＡ３４０を読み取った。標準を２連で調製し、各発酵からのサンプルを３連で調製した（最初の希釈を含む）。サンプルの重量は、以下の表に詳述されるように時間とともに変化した。重量の喪失は、時間０における最初のサンプル重量のパーセンテージとして表現する。
【０４９８】
【表２２】
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【０４９９】
これらのデータは、トウモロコシ中で発現されるＲＯＧＡ酵素が、基質がないコントロールと比較した場合に、発酵速度を増加させることを示す。これはまた、トウモロコシ穀粒で発現されるＡＭＹＩ酵素が、トウモロコシ中のデンプンの発酵の強力な活性化因子であることを示す以前のデータを確認する。エタノール含量を以下に詳述する。
【０５００】
【表２３】
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【０５０１】
これらのデータもまた、トウモロコシ中でＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼを発現することが、トウモロコシ中のデンプンの発酵の増加を容易にすることを実証する。同様に、トウモロコシ中でのオオムギアミラーゼの発現は、外因性酵素を加えることなく、トウモロコシデンプンをより発酵可能にする。
【０５０２】
実施例５５
セロビオヒドロラーゼＩ
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉセロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨ  Ｉ）遺伝子を、公開されたデータベース配列（アクセッション番号Ｅ００３８９）に基づくＲＴ−ＰＣＲによって増幅およびクローニングした。ｃＤＮＡ配列を、ＳｉｇｎａｌＰプログラムを使用して、シグナル配列の存在について分析し、これは１７アミノ酸シグナル配列を予測した。配列（配列番号７９）に示されるように、シグナル配列をコードするＤＮＡ配列を、ＰＣＲによってＡＴＧで置き換えた。このｃＤＮＡ配列を使用して、その後の構築物を作製した。さらなる構築物を、トウモロコシに最適化された遺伝子のバージョン（配列番号９３）に置換することによって作製する。
【０５０３】
実施例５６
セロビオヒドロラーゼＩＩ
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉセロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ  ＩＩ）遺伝子を、公開されたデータベース配列（アクセッション番号Ｍ５５０８０）に基づくＲＴ−ＰＣＲによって増幅およびクローニングした。ｃＤＮＡ配列を、ＳｉｇｎａｌＰプログラムを使用して、シグナル配列の存在について分析し、これは１８アミノ酸シグナル配列を予測した。配列（配列番号８１）に示されるように、シグナル配列をコードするＤＮＡ配列を、ＰＣＲによってＡＴＧで置き換えた。このｃＤＮＡ配列を使用して、その後の構築物を作製した。さらなる構築物を、トウモロコシに最適化された遺伝子のバージョン（配列番号９４）に置換することによって作製する。
【０５０４】
実施例５７
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  セロビオヒドロラーゼＩおよびセロビオヒドロラーゼＩＩについての形質転換ベクターの構築
ネイティブなＮ末端シグナル配列を含まないＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  セロビオヒドロラーゼＩ（ｃｂｈｉ）ｃＤＮＡは実施例５５に記載されている。種々の標的化シグナルを用いて、トウモロコシ胚乳においてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉｉセロビオヒドロラーゼＩ  ｃＤＮＡを発現するために、発現カセットを以下のように構築した：
【０５０５】
プラスミド１２３９２は、細胞質における発現のために、胚乳における特異的な発現のために、γゼインプロモーターの後ろにクローニングされたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉｉ  ｃｂｈｉ  ｃＤＮＡを含む。
【０５０６】
プラスミド１２３９１は、小胞体における標的化およびアポプラストへの分泌のために、実施例１において上記のようにＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉｉ  ｃｂｈｉ  ｃＤＮＡに融合されたトウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナル配列（ＭＲＶＬＬＶＡＬＡＬＬＡＬＡＡＳＡＴＳ）（配列番号１７）を含む（Ｔｏｒｒｅｎｔら、１９９７）。この融合物は、胚乳における特異的な発現のために、γゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０５０７】
プラスミド１２３９２は、小胞体（ＥＲ）における標的化およびそこでの保持のために、配列ＫＤＥＬのＣ末端付加を伴う、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉｉ  ｃｂｈｉ  ｃＤＮＡに融合されたγ−ゼインＮ末端シグナル配列を含む（ＭｕｎｒｏおよびＰｅｌｈａｍ、１９８７）。この融合物は、胚乳における特異的な発現のために、トウモロコシγゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０５０８】
プラスミド１２６５６は、アミロプラストへの標的化のために、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉｉ  ｃｂｈｉ  ｃＤＮＡに融合されたｗａｘｙアミロプラスト標的化ペプチド（Ｋｌｏｓｇｅｎら、１９８６）を含む。この融合物は、胚乳における特異的な発現のために、トウモロコシγゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０５０９】
全ての発現カセットを、アグロバクテリウム感染を介するトウモロコシへの形質転換のために、バイナリベクター（ｐＮＯＶ２１１７）に移動させた。このバイナリベクターは、マンノースを用いてトランスジェニック細胞の選択を可能にするホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）遺伝子を含んだ。形質転換トウモロコシ植物は、自家受粉または外部交配のいずれかを行い、種子は分析のために収集した。
【０５１０】
さらなる構築物（プラスミド１２６５２、１２６５３、１２６５４および１２６５５）を、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉｉ  ｃｂｈｉ  ｃＤＮＡについて記載されているものと正確に同じ様式で、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉｉ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅＩＩ（ｃｂｈｉｉ）ｃＤＮＡに融合された、標的化シグナルを用いて作製した。これらの融合物は、胚乳における特異的発現のために、トウモロコシＱタンパク質プロモーター（５０Ｋｄ  γゼイン）（配列番号９８）の後ろにクローニングし、上記のようにトウモロコシに形質転換した。形質転換トウモロコシ植物は、自家受粉または外部交配のいずれかを行い、種子は分析のために収集した。
【０５１１】
酵素の組み合わせは、個々の酵素を発現する植物を交雑させることによって、または同時形質転換を可能にするために同じバイナリベクターにいくつかの発現カセットをクローニングすることによってのいずれかで生成させることができる。
【０５１２】
実施例５８
トウモロコシ中でのＣｂｈｉの発現
プラスミド１２３９０、１２３９１または１２３９２のいずれかで形質転換した自家受粉したトウモロコシ植物からのＴ１種子を得た。１２３９０構築物は、胚乳の小胞体中でのＣｂｈＩの発現を標的とし。１２３９１構築物は、胚乳のアポプラスト中でのＣｂｈＩの発現を標的とし、そして１２３９２構築物は胚乳の細胞質中でのＣｂｈＩの発現を標的とする。
【０５１３】
トウモロコシ粉からのＣｂｈＩの抽出および検出：ＣｂｈＩおよびＣｂｈＩＩに対するポリクローナル抗体を、確立された方法に従ってヤギにおいて産生した。ＣｂｈＩトランスジェニック種子からの粉を、Ａｕｔｏｇｉｚｅｒグラインダー中でそれらを粉砕することによって得た。約５０ｍｇの粉を、０．５ｍｌの２０ｍＭ  ＮａＰ０4緩衝液（ｐＨ  ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中に再懸濁し、続いて連続的に振盪しながら、室温で１５分間のインキュベーションを行った。次いで、インキュベートした混合物を、１０分間、１０，０００×ｇで遠心分離した。上清を酵素の供給源として使用した。３０μｌのこの抽出物を４〜１２％  ＮｕＰＡＧＥゲル（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にロードし、ＮｕＰＡＧＥ  ＭＥＳ泳動緩衝液（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で分離した、タンパク質をニトロセルロースメンブレンにブロットし、ウェスタンブロット分析を、上記の特異的抗体、続いてアルカリホスファターゼ結合体化ウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）して、確立されたプロトコールに従って行った。アルカリホスファターゼ活性を、Ｍｏｓｓ  Ｉｎｃ．からのｒｅａｄｙ  ｔｏ  ｕｓｅＢＣＩＰ／ＭＢＴ（ｐｌｕｓ）基質とのメンブレンのインキュベーションによって検出した。
【０５１４】
プラスミド１２３９０で形質転換した異なるイベントからのＴ１種子のウェスタンブロット分析を行った。ＣｂｈＩタンパク質の発現を非トランスジェニックコントロールと比較し、多数のイベントにおいて検出した。
【０５１５】
破砕トウモロコシアッセイを、ＣｂｈＩを発現するトランスジェニック種子を使用して、本質的に実施例４９に記載されるように実行した。トランスジェニック種子からのデンプンの回収を測定し、その結果を表２４に示す。
【０５１６】
【表２４】
2007527726.tif 000035
【０５１７】
実施例５９
エンドグルカナーゼＩ構築物の調製
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉエンドグルカナーゼＩ（ＥＧＬＩ）遺伝子を増幅し、公開されたデータベース配列（アクセッション番号Ｍ１５６６５；Ｐｅｎｔｔｉｌａら、１９８６）に基づいてＰＣＲによってクローニングした。ゲノム配列のみを得ることができるので、オーバーラップＰＣＲを使用して２つのイントロンを除去することによってゲノム配列からｃＤＮＡ配列を生成した。得られるｃＤＮＡ配列を、ＳｉｇｎａｌＰプログラムを使用してシグナル配列の存在について分析し、これは、２２アミノ酸のシグナル配列を予測した。このシグナル配列をコードするＤＮＡ配列を、配列中に示されるように（配列番号８３）、ＰＣＲによってＡＴＧで置き換えた。このｃＤＮＡ配列を使用して、以下に示すような次の構築物を作製した。
【０５１８】
オーバーラップＰＣＲ
オーバーラップＰＣＲは、２つ以上のＰＣＲ産物の相補的末端を融合するために使用される技術であり（Ｈｏら、１９８９）、塩基対（ｂｐ）の変化を作製し、ｂｐを加え、またはｂｐを欠失させるために使用することができる。意図したｂｐの変化の部位において、意図する変化および変化のいずれかの側の１５ｂｐの配列を含む、フォワードまたはリバースの変異誘発プライマー（Ｍｕｔ−ＦおよびＭｕｔ−Ｒ）を作製する。例えば、イントロンを除去するために、プライマーは、エキソン２の最初の１５ｂｐに融合されたエキソン１の最後の１５ｂｐからなる。増幅される配列の末端にアニールするプライマー、例えば、ＡＴＧおよび終止コドンプライマーもまた、調製される。産物のＰＣＲ増幅は、独立した反応において、ＡＴＧ／Ｍｕｔ−ＲプライマーおよびＭｕｔ−Ｆ／終止プライマーの対を用いて進行する。この産物をゲル精製し、プライマーを加えることなくＰＣＲで一緒に融合させる。融合反応物をゲル上で分離し、正確なサイズのバンドをゲル精製し、クローニングする。複数の変化は、さらなる変異誘発プライマー対の追加を通して、同時に達成可能である。
【０５１９】
ＥＧＬＩ植物発現構築物
トウモロコシの胚乳中でＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＥＧＬＩ  ｃＤＮＡを発現するために、発現カセットを以下のように作製した：
【０５２０】
１３０２５は、細胞質局在化および胚乳における特異的発現のために、トウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングされたＴ．ｒｅｅｓｅｉ  ＥＧＬＩ遺伝子を含む。
【０５２１】
１３０２６は、小胞体への標的化およびアポプラストへの分泌のために、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ  ＥＧＬＩ遺伝子に融合されたトウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナルペプチド（ＭＲＶＬＬＶＡＬＡＬＬＡＬＡＡＳＡＴＳ）を含む。この融合物は、胚乳における特異的発現のためにトウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０５２２】
１３０２７は、小胞体への標的化およびそこでの保持のために、配列ＫＤＥＬのＣ末端付加を伴う、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ  ＥＧＬＩ遺伝子に融合されたトウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナルペプチドを含む。この融合物は、胚乳における特異的発現のためにトウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０５２３】
１３０２８は、アミロプラストのルーメンへの標的化のために、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ  ＥＧＬＩ遺伝子に融合されたトウモロコシ顆粒結合デンプンシンターゼＩ（ＧＢＳＳＩ）Ｎ末端シグナルペプチド（Ｎ末端７７アミノ酸）を含む。この融合物は、胚乳における特異的発現のためにトウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０５２４】
１３０２９は、デンプン顆粒への標的化のために、トウモロコシＧＢＳＳＩ遺伝子のデンプン結合ドメイン（Ｃ末端３０１アミノ酸）のＣ末端付加を伴う、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ  ＥＧＬＩ遺伝子に融合されたトウモロコシＧＢＳＳＩ  Ｎ末端シグナルペプチドを含む。この融合物は、胚乳における特異的発現のためにトウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０５２５】
さらなる発現カセットは、ＥＧＬＩのトウモロコシに最適化されたバージョン（配列番号９５）を使用して生成する。
【０５２６】
ＥＧＬ１酵素アッセイ
ＥＧＬ酵素活性を、Ｍａｌｔ  Ｂｅｔａ−Ｇｌｕｃａｎａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（カタログ番号＃  Ｋ−ＭＢＧＬ）（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｒｅｌａｎｄ  Ｌｔｄ．）を使用して、トウモロコシ形質転換体において測定する。ＥＧＬ  Ｉ発現体の酵素アッセイは、実施例５３に記載されるように、トウモロコシ繊維加水分解アッセイにおいて試験する。
【０５２７】
実施例６０
β−グルコシダーゼ２
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉβ−グルコシダーゼ２（ＢＧＬ２）遺伝子を、配列アクセッション番号ＡＢ００３１１０（Ｔａｋａｓｈｉｍａら、１９９９）に基づいて、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅およびクローニングした。
【０５２８】
ＢＧＬ２植物発現構築物
トウモロコシ胚乳においてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＢＧＬ２  ｃＤＮＡ（配列番号８９）を発現するために、発現構築物を以下のように作製した：
【０５２９】
１３０３０は、細胞質局在化および胚乳における特異的発現のために、トウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０５３０】
１３０３１は、小胞体への標的化およびアポプラストへの分泌のために、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ  ＢＧＬ２遺伝子に融合されたトウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナルペプチド（ＭＲＶＬＬＶＡＬＡＬＬＡＬＡＡＳＡＴＳ）を含む。この融合物は、胚乳における特異的発現のためにトウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０５３１】
１３０３２は、小胞体への標的化およびそこでの保持のために、配列ＫＤＥＬのＣ末端付加を伴う、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ  ＢＧＬ２遺伝子に融合されたトウモロコシγ−ゼインＮ末端シグナルペプチドを含む。この融合物は、胚乳における特異的発現のためにトウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０５３２】
１３０３３は、アミロプラストのルーメンへの標的化のために、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ  ＢＧＬ２遺伝子に融合されたトウモロコシ顆粒結合デンプンシンターゼＩ（ＧＢＳＳＩ）Ｎ末端シグナルペプチド（Ｎ末端７７アミノ酸）を含む。この融合物は、胚乳における特異的発現のためにトウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０５３３】
１３０３４は、デンプン顆粒への標的化のために、トウモロコシＧＢＳＳＩ遺伝子のデンプン結合ドメイン（Ｃ末端３０１アミノ酸）のＣ末端付加を伴う、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ  ＢＧＬ２遺伝子に融合されたトウモロコシＧＢＳＳＩ  Ｎ末端シグナルペプチドを含む。この融合物は、胚乳における特異的発現のためにトウモロコシγ−ゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０５３４】
さらなる発現カセットは、ＢＧＬ２のトウモロコシに最適化されたバージョン（配列番号９６）で置換することによって生成する。
【０５３５】
全ての発現カセットを、アグロバクテリウム感染を介するトウモロコシへの形質転換のためのバイナリベクターｐＮＯＶ２１１７に挿入する。このバイナリベクターは、マンノースを用いてトランスジェニック細胞の選択を可能にする、ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）遺伝子を含んだ。形質転換トウモロコシ細胞は、自家受粉または外部交配のいずれかを行い、種子は分析のために収集した。
【０５３６】
ＢＧＬ２酵素アッセイ
ＢＧＬ２酵素アッセイを、ＢａｕｅｒおよびＫｅｌｌｙ（Ｂａｕｅｒ，Ｍ．Ｗ．およびＫｅｌｌｙ，Ｒ．Ｍ．１９９８．Ｔｈｅ  ｆａｍｉｌｙ  １  β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ  ａｎｄ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ｓｈａｒｅ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：１７１７０−１７１７８）から修飾したプロトコールを使用して、トランスジェニックトウモロコシにおいて測定する。プロトコールは、１００℃の代わりに３７℃でサンプルをインキュベートするように修飾することができる。ＢＧＬ２−発現体の酵素活性を、繊維加水分解アッセイにおいて試験する。
【０５３７】
実施例６１
β−グルコシダーゼＤ
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  β−グルコシダーゼＤ（ＣＥＬ３Ｄ）遺伝子を、公開されたデータベース配列（アクセッション番号ＡＹ２８１３７８；Ｆｏｒｅｍａｎら、２００３）に基づくＲＴ−ＰＣＲによって増幅およびクローニングした。実施例５８に記載されるように、ゲノム配列のみを得ることができるので、オーバーラップＰＣＲを使用してイントロンを除去することによってゲノム配列からｃＤＮＡ配列を生成した。得られるｃＤＮＡ配列（配列番号９１）を次の構築物のために使用し得る。得られるｃＤＮＡのトウモロコシに最適化されたバージョン（配列番号９７）もまた、構築物のために使用してもよい。
【０５３８】
植物構築物を生成することができ、β−グルコシダーゼアッセイは、実施例６０においてＢＧＬ２について記載されるのと同様に、ＢＧＬ２をＣＥＬ３Ｄで置き換えて実行することができる。
【０５３９】
実施例６２
リパーゼ
リパーゼをコードするｃＤＮＡは、アクセッション番号Ｄ８５８９５、ＡＦ０４４８８、およびＡＦ０４４８９（Ｔｓｕｃｈｉｙａら、１９９６；Ｙｕら、２００３）からの配列、および実施例５９〜６０に示される方法論を使用して生成される。
【０５４０】
リパーゼ酵素活性は、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｌｉｐａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（カタログ番号Ｍ０６１２）（Ｍａｒｋｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、トランスジェニックトウモロコシにおいて測定することができる。リパーゼ活性はまた、これもＭａｒｋｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．からの蛍光基質１，２−ジオレオイル−３−（ピラン−１−イル）デカノイル−ｒａｃグリセロール（Ｍ０２５８）を使用してインビトロで測定することができる。
【０５４１】
実施例６３
イネにおけるフィターゼの発現
ベクター１１２６７および１１２６８は、Ｎｏｖ９ｘフィターゼをコードするバイナリベクターを含む。両方のベクター中でのＮｏｖ９ｘフィターゼの発現は、イネグルテリン−１プロモーター（配列番号６７）の制御下にある。ベクター１１２６７および１１２６８は、ｐＮＯＶ２１１７に由来する。
【０５４２】
ベクター１１２６７中のＮｏｖ９ｘフィターゼ発現カセットは、イネグルテリン−１プロモーター、アポプラスト標的化シグナルを伴うＮｏｖ９ｘフィターゼ遺伝子、ＰＥＰＣイントロン、および３５Ｓターミネーターを含む。ベクター１１２６７中のＮｏｖ９ｘフィターゼコード配列の生成物を配列番号１１０に示す。
【０５４３】
ベクター１１２６８中のＮｏｖ９ｘフィターゼ発現カセットは、イネグルテリン−１プロモーター、ＥＲ保持を伴うＮｏｖ９ｘフィターゼ遺伝子（配列番号１１１）、ＰＥＰＣイントロン、および３５Ｓターミネーターを含む。ベクター１１２６８中のＮｏｖ９ｘフィターゼコード配列の生成物を配列番号１１２に示す。
【０５４４】
アポプラスト標的化を伴う１１２６７  Ｎｏｖ９ｘフィターゼＤＮＡ配列（配列番号１０９）。翻訳開始コドンおよび終止コドンに下線を付す。２７ｋＤ  ガンマ−ゼインタンパク質のシグナル配列をコードする配列は太字である。
【化１１】
2007527726.tif 000036
【０５４５】
アポプラスト標的化遺伝子産物を伴う１１２６７  Ｎｏｖ９ｘフィターゼ（配列番号１１０）。２７ｋＤ  ガンマ−ゼインタンパク質のシグナル配列は太字である。
【化１２】
2007527726.tif 000037
【０５４６】
ＥＲ保持を伴う１１２６８  Ｎｏｖ９ｘフィターゼＤＮＡ配列（配列番号１１１）。２７ｋＤ  ガンマ−ゼインタンパク質のシグナル配列をコードする配列は太字である。ＳＥＫＤＥＬヘキサヘプチドＥＲ保持シグナルをコードする配列に下線を付す。
【化１３】
2007527726.tif 000038
【０５４７】
ＥＲ保持を伴う１１２６８  Ｎｏｖ９ｘフィターゼ、遺伝子産物（配列番号１１２）。２７ｋＤ  ガンマ−ゼインタンパク質のシグナル配列は太字である。ＥＲ保持シグナルに下線を付す。
【化１４】
2007527726.tif 000039
【０５４８】
トランスジェニックイネ植物の生成
イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）を、形質転換植物を生成するために使用する。種々のイネ品種を使用することができる（Ｈｉｅｉら、１９９４，Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：２７１−２８２；Ｄｏｎｇら、１９９６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ２：２６７−  ２７６；Ｈｉｅｉら、１９９７，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３５：２０５−２１８）。以下に記載する種々の培地成分もまた、濃度を変化させるか、または置換してもよい。ＭＳ−ＣＩＭ培地（ＭＳ基礎塩、４．３  ｇ／リットル；Ｂ５  ビタミン（２００  ｘ）、５  ｍｌ／リットル；スクロース、３０  ｇ／リットル；プロリン、５００  ｍｇ／リットル；グルタミン、５００  ｍｇ／リットル；カゼイン塩酸塩、３００  ｍｇ／リットル；２，４−Ｄ（１  ｍｇ／ｍｌ）、２  ｍｌ／リットル；１  Ｎ  ＫＯＨでｐＨを５．８に調整；Ｐｈｙｔａｇｅｌ、３  ｇ／リットル）上で培養することによって、胚形成応答が開始し、および／または培養が成成熟胚から樹立される。培養応答の初期段階にある成熟胚、または樹立された培養系統のいずれかを接種し、所望のベクター構築物を含むアグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４とともに同時培養する。アグロバクテリウムは、グリセロールストックから、固形ＹＰＣ培地上で（１００  ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンおよび任意の他の適切な抗生物質）、〜２日間、２８℃で培養した。アグロバクテリウムを、液体ＭＳ−ＣＩＭ培地に再懸濁する。アグロバクテリウム培養を、０．２〜０．３のＯＤ６００まで希釈し、アセトシリンゴンを２００μＭの最終濃度まで加える。アグロバクテリウムをアセトシリンゴンで誘導し、その後イネ培養物を有する溶液を混合する。接種のために、培養物を細菌懸濁液に浸漬する。液体細菌懸濁液を取り出し、接種した培養物を同時培養培地上に配置し、２２℃で２日間インキュベートする。次いで、培養物を、チカルシリン（４００ｍｇ／リットル）を有するＭＳ−ＣＩＭ培地に移し、アグロバクテリウムの増殖を阻害する。ＰＭＩ選択マーカー遺伝子を利用する構築物については（Ｒｅｅｄら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．−Ｐｌａｎｔ  ３７：１２７−１３２）、培養を、７日後に、炭水化物源としてマンノースを含む選択培地（２％マンノース、３００ｍｇ／リットル  チカルシリンを有するＭＳ）に移し、暗所で３〜４週間培養する。次いで、耐性コロニーを再生誘導培地（２，４−Ｄを含まず、０．５ｍｇ／ＩＡＡ、１ｍｇ／リットル  ゼアチン、２００ｍｇ／リットル  チカルシリン、２％マンノースおよび３％ソルビトールを含むＭＳ）に移し、暗所で１４日間生長させる。次いで、増殖コロニーを別のラウンドの誘導培地に移し、明所栽培室に移す。再生したシュートをＧＡ７−１培地（ホルモンを含まず、２％ソルビトールを含むＭＳ）に移し、次いで、温室に移し、そこでそれらは十分に大きく、かつ適切な根を有する。植物を温室中の土壌に移植し、成熟するまで生長させる。
【０５４９】
実施例６４
Ｎｏｖ９Ｘフィターゼを発現するトランスジェニックイネ種子の分析
イネ種子からのＮｏｖ９Ｘフィターゼの定量のためのＥＬＩＳＡ
トランスジェニックイネ種子において発現したフィターゼの量を、ＥＬＩＳＡによってアッセイした。１つ（１ｇ）のイネ種子を、Ｋｌｅｃｏグラインダー中で粉まで粉砕した。５０ｍｇの粉を、Ｎｏｖ９Ｘフィターゼ活性アッセイのために、実施例−に記載する酢酸ナトリウム緩衝液中に再懸濁し、イムノアッセイのために、必要に応じて希釈した。Ｎｏｖ９Ｘイムノアッセイは、２つのポリクローナル抗体を利用する、フィターゼの検出のための定量サンドイッチアッセイである。ウサギ抗体をプロテインＡを使用して精製し、ヤギ抗体を、大腸菌封入体中で生成される組換えフィターゼ（Ｎｏｖ９Ｘ）に対してイムノアフィニティー精製した。これらの高度に特異的な抗体を使用して、このアッセイは、トランスジェニック植物中のピコグラムレベルのフィターゼを測定することができる。このアッセイに対して３つの基本部分がある。サンプル中のフィターゼタンパク質は、ウサギ抗体を使用して、固相マイクロタイターウェルに捕捉される。次いで、「サンドイッチ」が、固相抗体、フィターゼタンパク質と、ウェルに加えられた二次抗体の間で形成される。未結合二次抗体が除去された洗浄工程後、結合抗体は、アルカリホスファターゼ標識抗体を使用して検出される。酵素のための基質が加えられ、発色が各ウェルの吸光度を読み取ることによって測定される。標準曲線は、濃度対吸光度をプロットするために、４つのパラメーターの曲線のフィットを使用する。
【０５５０】
フィターゼ活性アッセイ
フィチン酸の加水分解に際して遊離する無機リン酸の見積もりに基づく、フィターゼ活性の決定は、Ｅｎｇｅｌｅｎ，Ａ．Ｊ．ら、Ｊ．ＡＯＡＣ，Ｉｎｔｅｒ．，８４，６２９（２００１）の方法に従って、３７℃で実行することができる。１単位の酵素活性は、アッセイ条件下で、１分間あたりに１μｍｏｌの無機リン酸を遊離する酵素の量として定義される。例えば、フィターゼ活性は、１ｍＭ  ＣａＣｌ２を補充した２５０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ  ５．５中で、２．０ｍｌの酵素調製物を、４．０ｍｌの９．１ｍＭ  フィチン酸ナトリウムとともに、３７℃で６０分間インキュベートすることによって測定してもよい。インキュベーション後、１０％（ｖ／ｖ）モリブデン酸アンモニウムおよび０．２３５％（ｗ／ｖ）バナジン酸アンモニウムストック溶液からなる等量部の４．０ｍｌの着色停止試薬を加えることによって反応を停止する。沈殿を遠心分離によって除去し、遊離したリン酸を、リン酸標準のセットに対して、４１５ｎｍで分光光度法的に測定する。フィターゼ活性を、生じたリン酸標準曲線を使用して、フィターゼ含有サンプルについて得られたＡ４１５ｎｍの吸光度の値を内挿することによって計算する。
【０５５１】
この手順は、より小さな体積に適合させるためにスケールダウンしてもよく、好ましい容器に適合させてもよい。好ましい容器には、ガラス製試験管およびプラスチック製マイクロプレートが含まれる。ウォーターバス中に反応容器を部分的に沈めることは、酵素反応の間に定常的な温度を維持するために必須である。
【０５５２】
【表２５】
2007527726.tif 000040
＊μｇフィターゼはサンドイッチＥＬＩＳＡによってアッセイした
＊＊フィターゼ活性は、上記のフィターゼ活性アッセイによってアッセイした
【０５５３】
フィターゼを発現するトランスジェニックイネの調理の間に遊離する無機リン酸のアッセイ
選択されたトランスジェニック系統およびコントロール野生型系統からの１ｇ種子の２つのサンプルは、卓上Ｋｅｔｔ  ＴＲ２００自動ライスハスカーを使用して皮を取った。次いで、１つのサンプルを、Ｋｅｔｔライスポリッシャー中で３０秒間磨いた。２倍量のＨ２Ｏを各サンプルに加え、チューブを水のビーカー中に浸漬することによって、コメを調理した。水を沸騰させ、１０分間、沸騰状態を保持した。次いで、「調理した」コメをペースト状に砕き、総量６ｍｌのスラリーにした。このスラリーを１５，０００×ｇで１０分間遠心分離し、清澄な上清を、遊離した内因性無機リン酸についてアッセイした。遊離した無機リン酸のアッセイは、無機リン酸とのモリブデン酸イオンおよびバナジン酸イオンの錯体形成の結果としての色形成に基づき、実施例に記載されるように、フィターゼ酵素活性について、４１５ｎｍにおいて分光光度法的に測定される。結果を表２４に示す。
【０５５４】
全ての刊行物、特許、および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。前述の明細書において、本発明はその特定の好ましい態様に関して記載されてきたが、多くの詳細は例示目的のために示され、本発明がさらなる態様を受け入れ可能であること、および本明細書に記載される特定の詳細は、本発明の基本的な原理から逸脱することなく、著しく変化され得ることが当業者には明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０５５５】
【図１Ａ】図１Ａは、ｐＮＯＶ６２０１植物からの分離Ｔ１穀粒および６つのｐＮＯＶ６２００系統からのトウモロコシ穀粒および胚乳において発現されたα−アミラーゼの活性を図示する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ｐＮＯＶ６２０１植物からの分離Ｔ１穀粒および６つのｐＮＯＶ６２００系統からのトウモロコシ穀粒および胚乳において発現されたα−アミラーゼの活性を図示する。
【図２】ｐＮＯＶ６２０１系統からの分離Ｔ１穀粒におけるα−アミラーゼの活性を図示する。
【図３】８５℃および９５℃で６０分間までの液化時間に供された熱安定性７９７ＧＬ３αアミラーゼを含むトランスジェニックトウモロコシのマッシュの発酵の際に産生されるエタノールの量を示す。この図は、７２時間の発酵におけるエタノール収量が１５分間から６０分間までの液化でほぼ変化しなかったことを図示する。さらに、この図は、９５℃における液化によって産生されたマッシュが、８５℃における液化によって産生されたマッシュよりも、各時点においてより多くのエタノールを産生したことを示す。
【図４】８５℃および９５℃で６０分間までの液化時間に供された熱安定性αアミラーゼを含むトランスジェニックトウモロコシのマッシュの発酵の後で残存する残渣のデンプンの量（％）を示す。この図は、７２時間の発酵におけるエタノール収量が１５分間から６０分間までの液化でほぼ変化しなかったことを図示する。さらに、この図は、９５℃における液化によって産生されたマッシュが、８５℃における液化によって産生されたマッシュよりも、各時点においてより多くのエタノールを産生したことを示す。
【図５】８５℃および９５℃において調製された、トランスジェニックトウモロコシ、コントロールトウモロコシ、および種々のそれらの混合物のマッシュについてのエタノール収量を示す。この図は、発酵後に残っているデンプンの減少が存在したので、α−アミラーゼを含むトランスジェニックトウモロコシが、発酵のために利用可能であるデンプンの製造の顕著な改善を生じることを図示する。
【図６】８５℃および９５℃において調製された、トランスジェニック穀粒、コントロールトウモロコシ、および種々のそれらの混合物のマッシュについての、発酵後に乾燥した台で測定した残渣のデンプンの量を示す。
【図７】５．２〜６．４の間の種々のｐＨ範囲において２０〜８０時間の期間にわたって、３％トランスジェニックトウモロコシを含むサンプルの発酵時間の関数としてエタノールが生じることを示す。この図は、より低いｐＨで行った発酵が、６．０以上のｐＨにおいてよりもより迅速に進行することを図示する。
【図８】５．２〜６．４の間の種々のｐＨ範囲において０〜１２重量％の種々の重量パーセンテージを含むトランスジェニックトウモロコシを含むマッシュの発酵の間にエタノールが生じることを示す。この図は、エタノール収量が、サンプル中に含まれるトランスジェニック穀粒の量とは独立していたことを図示する。
【図９】ｐＮＯＶ７００５で形質転換した異なるイベントからのＴ２種子の分析を示す。非トランスジェニックコントロールと比較して、プルラナーゼ活性の高い発現が、多数のイベントにおいて検出することができる。
【図１０Ａ】図１０Ａは、トランスジェニックトウモロコシ粉中のデンプンから発現されたプルラナーゼによって生成された加水分解生成物のＨＰＬＣ分析の結果を示す。７５℃において３０分間の、反応緩衝液中でのプルラナーゼ発現トウモロコシの粉のインキュベーションは、トウモロコシデンプンから、中程度の鎖のオリゴサッカライド（重合の程度（ＤＰ）、約１０〜３０）および短いアミロース鎖（ＤＰ約１００〜２００）の産生を生じる。図１０Ａはまた、プルラナーゼの活性に対する、加えられたカルシウムイオンの効果を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、トランスジェニックトウモロコシ粉中のデンプンから発現されたプルラナーゼによって生成された加水分解生成物のＨＰＬＣ分析の結果を示す。７５℃において３０分間の、反応緩衝液中でのプルラナーゼ発現トウモロコシの粉のインキュベーションは、トウモロコシデンプンから、中程度の鎖のオリゴサッカライド（重合の程度（ＤＰ）、約１０〜３０）および短いアミロース鎖（ＤＰ約１００〜２００）の産生を生じる。図１０Ｂはまた、プルラナーゼの活性に対する、加えられたカルシウムイオンの効果を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、２つの反応混合物からのデンプン加水分解生成物のＨＰＬＣ分析から生じた結果を示す。「アミラーゼ」と示された第１の反応は、α−アミラーゼ発現トランスジェニックトウモロコシおよび非トランスジェニックトウモロコシＡ１８８のトウモロコシ粉サンプルの混合物［１：１（ｗ／ｗ）］を含み；ならびに第２の反応混合物「アミラーゼ＋プルラナーゼ」は、α−アミラーゼ発現トランスジェニックトウモロコシおよびプルラナーゼ発現トランスジェニックトウモロコシのトウモロコシ粉サンプルの混合物［１：１（ｗ／ｗ）］を含む。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、２つの反応混合物からのデンプン加水分解生成物のＨＰＬＣ分析から生じた結果を示す。「アミラーゼ」と示された第１の反応は、α−アミラーゼ発現トランスジェニックトウモロコシおよび非トランスジェニックトウモロコシＡ１８８のトウモロコシ粉サンプルの混合物［１：１（ｗ／ｗ）］を含み；ならびに第２の反応混合物「アミラーゼ＋プルラナーゼ」は、α−アミラーゼ発現トランスジェニックトウモロコシおよびプルラナーゼ発現トランスジェニックトウモロコシのトウモロコシ粉サンプルの混合物［１：１（ｗ／ｗ）］を含む。
【図１２】２つの反応混合物について、２５μｌの反応混合物中の、μｇでの糖生成物の量を示す。「アミラーゼ」と示された第１の反応は、α−アミラーゼ発現トランスジェニックトウモロコシおよび非トランスジェニックトウモロコシＡ１８８のトウモロコシ粉サンプルの混合物［１：１（ｗ／ｗ）］を含み；ならびに第２の反応混合物「アミラーゼ＋プルラナーゼ」は、α−アミラーゼ発現トランスジェニックトウモロコシおよびプルラナーゼ発現トランスジェニックトウモロコシのトウモロコシ粉サンプルの混合物［１：１（ｗ／ｗ）］を含む。
【図１３Ａ】図１３Ａは、８５℃および９５℃における３０分間のインキュベーションの最後における、２つのセットの反応混合物からのデンプン加水分解生成物を示す。各セットについて、２つの反応混合物が存在する；「アミラーゼＸプルラナーゼ」と示される第１の反応は、α−アミラーゼとプルラナーゼの両方を発現するトランスジェニックトウモロコシ（他花受粉によって生成する）からの粉を含み、そして「アミラーゼ」と示される第２の反応は、交雑において観察される（アミラーゼＸプルラナーゼ）のと同じ量のα−アミラーゼ活性を得るような比率の、α−アミラーゼ発現トランスジェニックトウモロコシおよび非トランスジェニックトウモロコシＡ１８８のトウモロコシ粉サンプルの混合物を含む。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、８５℃および９５℃における３０分間のインキュベーションの最後における、２つのセットの反応混合物からのデンプン加水分解生成物を示す。各セットについて、２つの反応混合物が存在する；「アミラーゼＸプルラナーゼ」と示される第１の反応は、α−アミラーゼとプルラナーゼの両方を発現するトランスジェニックトウモロコシ（他花受粉によって生成する）からの粉を含み、そして「アミラーゼ」と示される第２の反応は、交雑において観察される（アミラーゼＸプルラナーゼ）のと同じ量のα−アミラーゼ活性を得るような比率の、α−アミラーゼ発現トランスジェニックトウモロコシおよび非トランスジェニックトウモロコシＡ１８８のトウモロコシ粉サンプルの混合物を含む。
【図１４】非トランスジェニックトウモロコシ種子（コントロール）、７９７ＧＬ３  α−アミラーゼを含むトランスジェニックトウモロコシ種子、およびＭａｌ  Ａ  α−グルコシダーゼとの７９７ＧＬ３トランスジェニックトウモロコシ種子の組み合わせを使用する、グルコースへのデンプンの分解を示す。
【図１５】室温または３０℃における生のデンプンの転換を示す。この図において、反応混合物１および２は、それぞれ、室温および３０℃における、水およびデンプンの組み合わせである。反応混合物３および４は、それぞれ、室温および３０℃における、オオムギα−アミラーゼおよびデンプンの組み合わせである。反応混合物５および６は、それぞれ、室温および３０℃における、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍグルコアミラーゼおよびデンプンの組み合わせである。反応混合物７および８は、それぞれ、室温および３０℃における、オオムギα−アミラーゼ（ｓｉｇｍａ）およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍグルコアミラーゼおよびデンプンの組み合わせである。反応混合物９および１０は、それぞれ、室温および３０℃における、オオムギα−アミラーゼ（ｓｉｇｍａ）コントロールおよびデンプンの組み合わせである。Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍグルコアミラーゼの生成物の重合の程度（ＤＰ）が示される。
【図１６】実施例１９に示されるような、アルファアミラーゼ、アルファグルコシダーゼ、およびグルコースイソメラーゼの組み合わせを使用する、アミラーゼトランスジェニックトウモロコシ粉からのフルクトースの産生を示す。アミラーゼトウモロコシ粉は、酵素溶液プラス水または緩衝液と混合された。全ての反応は、６０ｍｇアミラーゼ粉および全体で６００μｌの液体を含み、９０℃で２時間インキュベートされた。
【図１７】９０℃における０〜１２００分間のインキュベーション時間の関数としての、自己プロセシング穀粒からの１００％アミラーゼ粉を用いる反応の生成物のピーク面積を示す。
【図１８】９０℃における０〜１２００分間のインキュベーション時間の関数としての、自己プロセシング穀粒からの１０％トランスジェニックアミラーゼ粉および９０％コントロールトウモロコシ粉を用いる反応の生成物のピーク面積を示す。
【図１９】デンプン加水分解に対する温度の効果を評価するために、７０℃、８０℃、９０℃、または１００℃において、９０分間までインキュベートしたトランスジェニックアミラーゼ粉のＨＰＬＣ分析の結果を提供する。
【図２０】種々の反応条件下で、酵素溶液プラス水または緩衝液と混合した６０ｍｇトランスジェニックアミラーゼ粉を含むサンプルについてのＥＬＳＤピーク面積を示す。１つの反応のセットは、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、室温にてｐＨ  ７．０、プラス１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4および１ｍＭ  ＣｏＣｌ2で緩衝化され；第２の反応のセットにおいては、金属含有緩衝溶液が、水によって置き換えられた。全ての反応は９０℃で２時間インキュベートされた。
【図２１】図２１は、ＥＲに標的化された（１１５８７）および溶解性液胞に標的化された（１１５８９）ブロメラインについて、Ｔ２種子中でのＺ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨＭｅｃを使用するブロメライン活性アッセイを示す。
【図２２】図２２は、組換えＦＡＥ−１を、Ｍａｓｔｉｈｕｂｏｖａら、（２００２）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０９  ９６−１０１に記載されるように、４−メチルウンベリフェリルフェルラ酸を使用して、組換えタンパク質ＦＡＥ−１（１０４−３）をアッセイした結果を示す。
【図２３】図２３は、真菌上清（ＦＳ９）へのＦＡＥ−２の添加に伴う、トウモロコシ繊維からの全体の還元糖の遊離の増加を示す、トウモロコシ繊維加水分解アッセイの結果を示す。
【図２４】図２４は、１０または１００μｌのＦＡＥ−１で処理した場合のトウモロコシ繊維から遊離したＦＡについて示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年11月16日(2006.11.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号６１、６３、６５、６９、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９４、９５、９６、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、もしくは１１１またはその相補体、あるいは配列番号６１、６３、６５、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９４、９５、９６、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、もしくは１１１のいずれか１つの相補体に低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、エキソ−１，４−β−セロビオヒドロラーゼ、エキソ−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ、Ｌ−アラビナーゼ、α−アラビノシダーゼ、ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、マンナナーゼ、マンノシダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、プロテアーゼ、グルカナーゼ、またはエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、あるいはｂ）配列番号６２、６４、６６、７０、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、もしくは１１２、またはその酵素的に活性なフラグメントを含むポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
ポリヌクレオチドが第１のポリペプチドおよび第２のペプチドを含む融合ポリペプチドをコードし、前記第１のポリペプチドがセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、エキソ−１，４−β−セロビオヒドロラーゼ、エキソ−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ、Ｌ−アラビナーゼ、α−アラビノシダーゼ、ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、マンナナーゼ、マンノシダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、プロテアーゼ、グルカナーゼ、またはエステラーゼ活性を有する、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
第２のペプチドが標的化配列ペプチドを含む、請求項２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
標的化配列ペプチドが、第１のポリペプチドを、植物の液胞、小胞体、葉緑体、デンプン顆粒、または細胞壁に標的化する、請求項３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
標的化配列がｗａｘｙからのＮ末端シグナル配列、γ−ゼインからのＮ末端シグナル配列、デンプン結合ドメイン、またはＣ末端デンプン結合ドメインである、請求項３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、発現カセット。
【請求項７】
プロモーターに作用可能に連結されている、請求項６に記載の発現カセット。
【請求項８】
プロモーターが誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、構成的プロモーター又は胚乳特異的プロモーターである、請求項７に記載の発現カセット。
【請求項９】
胚乳特異的プロモーターがトウモロコシγ−ゼインプロモーター、イネグルテリン−１プロモーターまたはトウモロコシＡＤＰ−ｇｐｐプロモーターである、請求項８に記載の発現カセット。
【請求項１０】
γ−ゼインプロモーターが２７ｋＤ又は５５ｋＤのガンマゼインプロモーターである、請求項９に記載の発現カセット。
【請求項１１】
プロモーターが配列番号１１または配列番号１２を含む、請求項９に記載の発現カセット。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドが、プロモーターに対してセンス方向に方向付けられる、請求項６に記載の発現カセット。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに作用可能に連結されている標的化配列をさらにコードする、請求項６に記載の発現カセット。
【請求項１４】
標的化配列が、作用可能に連結されているポリペプチドを、植物の液胞、小胞体、葉緑体、デンプン顆粒、または細胞壁に標的化する、請求項１３に記載の発現カセット。
【請求項１５】
標的化配列がｗａｘｙからのＮ末端シグナル配列、γ−ゼインからのＮ末端シグナル配列またはデンプン結合ドメインである、請求項１４に記載の発現カセット。
【請求項１６】
請求項６に記載の発現カセットを含む細胞。
【請求項１７】
請求項１６に記載の細胞を含む植物、またはその一部。
【請求項１８】
アグロバクテリウム、単子葉植物細胞、双子葉植物細胞、Ｌｉｌｉｏｐｓｉｄａ細胞、Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ細胞、トウモロコシ細胞、および穀物細胞からなる群より選択される、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１９】
請求項１７に記載の植物由来の種子、果実、茎(stem)、葉、茎(stalk)または穀粒。
【請求項２０】
テンサイ、サトウキビ、オートムギ、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、またはイネである、請求項１に記載の植物。
【請求項２１】
発酵可能な糖、モノサッカライド、又はオリゴサッカライドを調製する方法であって、
酵素である、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、エキソ−１，４−β−セロビオヒドロラーゼ、エキソ−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ、Ｌ−アラビナーゼ、α−アラビノシダーゼ、ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、マンナナーゼ、マンノシダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、プロテアーゼ、グルカナーゼ、またはエステラーゼを含むトランスジェニック単子葉植物部分を、当該酵素を活性化する条件下で処理する工程、それによってポリサッカライドを消化してオリゴサッカライドまたは発酵可能な糖を形成する工程を含んで成り、ここで、前記植物部分は形質転換単子葉植物から得られ、そのゲノムは、前記酵素をコードするポリヌクレオチド及び標的化配列と作用可能に連結したプロモーターを含む発現カセットで増強されている、方法。
【請求項２２】
プロモーターが誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、胚乳特異的プロモーター又は構成的プロモーターである、請求項２１に記載の発酵可能な糖、モノサッカライド、又はオリゴサッカライドを調製する方法。
【請求項２３】
胚乳特異的プロモーターがトウモロコシγ−ゼインプロモーター、イネグルテリン−１プロモーターまたはトウモロコシＡＤＰ−ｇｐｐプロモーターである、請求項２２に記載の発酵可能な糖、モノサッカライド、又はオリゴサッカライドを調製する方法。
【請求項２４】
トウモロコシγ−ゼインプロモーターが２７ｋＤ又は５５ｋＤのガンマゼインプロモーターである、請求項２３に記載の発酵可能な糖、モノサッカライド、又はオリゴサッカライドを調製する方法。
【請求項２５】
プロモーターが配列番号１１または配列番号１２を含む、請求項２３に記載の発酵可能な糖、モノサッカライド、又はオリゴサッカライドを調製する方法。
【請求項２６】
植物部分が種子、果実、茎(stem)、葉、茎(stalk)または穀粒である、請求項２１に記載の発酵可能な糖、モノサッカライド、又はオリゴサッカライドを調製する方法。
【請求項２７】
植物部分がテンサイ、サトウキビ、オートムギ、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、またはイネから得られる、請求項２１に記載の発酵可能な糖、モノサッカライド、又はオリゴサッカライドを調製する方法。
【請求項２８】
処理が、一定時間の間、且つ酵素を活性化させる条件下で植物部分を加熱し、それによりポリサッカライドを消化してオリゴサッカライドまたは発酵可能な糖を形成させることを含んで成る、請求項２１に記載の発酵可能な糖、モノサッカライド、又はオリゴサッカライドを調製する方法。
【請求項２９】
前記酵素が配列番号６１、６３、６５、６９、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９４、９５、９６、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、もしくは１１１を含むポリヌクレオチド配列でコードされている、請求項２１に記載の発酵可能な糖、モノサッカライド、又はオリゴサッカライドを調製する方法。
【請求項３０】
前記ポリヌクレオチド配列が配列番号６２、６４、６６、７０、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、もしくは１１２含むポリヌクレオチド配列をコードしている、請求項２１に記載の発酵可能な糖、モノサッカライド、又はオリゴサッカライドを調製する方法。
【請求項３１】
オリゴサッカライドまたは発酵可能な糖をエタノールに転換するのを促進する条件下で、モノサッカライド、オリゴサッカライド、または発酵可能な糖をインキュベートする工程を含む、請求項２１に記載の発酵可能な糖、モノサッカライド、又はオリゴサッカライドを調製する方法。
【国際調査報告】
2007527726.tif 000204
2007527726.tif 000205
2007527726.tif 000206
2007527726.tif 000207
2007527726.tif 000208
2007527726.tif 000209