(57)【要約】  本発明は、ワタアブラムシおよび／または前記アブラムシによるウイルス伝搬に対する耐性に関与するＶａｔ遺伝子のクローニング、並びにその遺伝子の新しいマーカーの識別に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下から選択された単離したポリヌクレオチド：
ａ）ワタアブラムシおよび／または前記アブラムシによるウイルス伝搬に対する耐性に関与するポリペプチドであり、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％そして更に好ましくは少なくとも９５％がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のポリペプチドと一致しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ｂ）ポリヌクレオチドａ）に相補的なポリヌクレオチド、
ｃ）ポリヌクレオチドａ）またはポリヌクレオチドｂ）と、ストリンジェントな条件の下で、選択的にハイブリダイズする能力のあるポリヌクレオチド。
【請求項２】
ａ）配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のポリヌクレオチド、
ｂ）配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリヌクレオチド、
ｃ）ポリヌクレオチドａ）またはポリヌクレオチドｂ）の相補的ポリヌクレオチド、
ｄ）ポリヌクレオチドａ）、ｂ）またはｃ）のいずれか一つと、ストリンジェントな条件の下で、選択的にハイブリダイズする能力のあるポリヌクレオチド、
のいずれかから選択されることを特徴とする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
少なくとも１０ｂｐのポリヌクレオチド断片で構成されることを特徴とする、請求項１または２のいずれかに記載されているポリヌクレオチド。
【請求項４】
ワタアブラムシおよび／または前記アブラムシによるウイルス伝搬に対する耐性に関与するポリペプチドであって、少なくとも一つの核酸プローブおよび／または請求項１から３のいずれか一つのポリヌクレオチドから得られる少なくとも一対の増幅プライマーを用いて、植物のゲノムＤＮＡバンクまたはｃＤＮＡバンクをスクリーニングすることによって得ることができるポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項５】
それぞれが以下のプライマー、即ち
Ｌ２７３：
Ｆ２−Ｂ２：ＧＧＡＧＡＧＡＧＡＡＴＣＣＧＧＧＡＣＴＡＡＧＴＧＡＣＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）
Ｆ２−Ｂｒ：ＴＡＡＣＣＡＣＣＴＴＴＴＣＣＧＡＴＣＡＡＡＴＴＴＣＧＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）
Ｌ２４６：
Ｆ２−Ｂ２  Ｅｃｏ：ＡＴＴＧＡＴＧＡＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＣＴＣＧＡＴＣＴＣＴＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）
Ｆ２  Ｅｃｏ：ＧＡＧＴＴＣＡＡＴＣＣＡＴＴＴＣＡＡＴＧＡＴＴＴＡＡＧＡＴＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）
Ｖ６８１：
Ｖ６８１：ＧＧＡＡＴＣＴＴＧＴＴＧＡＧＧＣＣＧＡＧＡＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）
Ｖ６８１Ｒ：ＧＴＴＧＴＡＴＡＴＧＧＣＴＴＣＣＣＴＧＴＡＧＣＣ（ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：１２）
Ｖ１６８４：
Ｖ５８８：ＣＡＡＣＡＧＧＣＴＣＡＡＣＡＧＴＧＴＡＴＴＣＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）
Ｖ５５１Ｒ：ＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡＣＧＡＧＡＧＡＧＡＴＧＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）
Ｖ４３２：
Ｖ４３２：ＡＡＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣＴＣＣＣＴＣＣＡＣＴＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）
Ｖ４３２Ｒ：ＴＴＡＧＡＧＴＧＧＣＡＡＡＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）
ＧＲＰ８０５：
ＧＲＰ８０５：ＡＴＣＣＣＣＴＧＴＴＴＣＣＴＴＣＡＡＣＡＡＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）
ＧＲＰ８０５Ｒ：ＡＡＣＣＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＡＡＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）
Ｍ８：
Ｍ８：ＣＣＧＡＣＧＣＡＴＣＴＣＣＣＧＡＣＧＣＧＴＴＧＴＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）
Ｍ８Ｒ：ＴＣＧＴＧＡＡＧＧＧＴＴＴＴＧＧＡＧＡＧＴＧＡＧＡＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）
マーカーＥ：
ＬＲＲ１：ＣＣＴＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＴＣＴＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）
ＬＲＲ８４２Ｒ：ＣＴＣＣＡＣＴＣＡＧＡＡＴＴＧＧＴＡＧＧＴＧＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）
マーカーＤ：
ＬＲＲ９１５：ＡＡＣＡＡＣＴＴＡＧＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＡＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）
ＬＲＲ１Ｒ：ＧＴＴＧＴＴＧＡＧＡＧＣＡＡＴＡＧＴＧＴＡＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、
によって規定されるマーカー、Ｌ２７３、Ｌ２４６、Ｖ６８１、Ｖ１６８４、Ｖ４３２、ＧＲＰ８０５、Ｍ８、マーカーＥあるいはマーカーＤのうちから選択されることを特徴とする、ワタアブラムシに対する耐性および／または前記アブラムシによるウイルス伝搬に対する耐性に有利なＶａｔ遺伝子の対立遺伝子の存在の有無を検出することのできる、遺伝子マーカー。
【請求項６】
・ポリヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で構成される一対のプライマー、
・ポリヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０で構成される一対のプライマー、
・ポリヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２で構成される一対のプライマー、
・ポリヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４で構成される一対のプライマー、
・ポリヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６で構成される一対のプライマー、
・ポリヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８で構成される一対のプライマー、
・ポリヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０で構成される一対のプライマー、
・ポリヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２で構成される一対のプライマー、そして
・ポリヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４で構成される一対のプライマー、
の中から選ばれることを特徴とする、請求項５において規定されるようなマーカーのうちの一つの増幅を可能にする一対のプライマー。
【請求項７】
請求項６で規定されているようなプライマーを少なくとも一対含むことを特徴とする、ワタアブラムシに対する耐性および／または前記アブラムシによるウイルス伝搬に対する耐性に有利なＶａｔ遺伝子の対立遺伝子が植物に存在することを検出するためのキット。
【請求項８】
ワタアブラムシに対する耐性および／または前記アブラムシによるウイルス伝搬に対する耐性に有利なＶａｔ遺伝子の対立遺伝子が植物に存在することを検出するための、請求項１から３のいずれか一つに記載の少なくとも一つのポリヌクレオチドの使用法。
【請求項９】
ワタアブラムシに対する耐性および／または前記アブラムシによるウイルス伝搬に対する耐性に有利なＶａｔ遺伝子の対立遺伝子が植物に存在することを検出するための、請求項５に記載の少なくとも一つの遺伝子マーカーの使用法。
【請求項１０】
前記植物が瓜科植物であることを特徴とする、請求項８または９のいずれかに記載の使用法。
【請求項１１】
植物に存在するＶａｔ遺伝子の対立遺伝子型を決定することを含むことを特徴とする、植物のワタアブラムシに対する耐性および／または前記アブラムシによるウイルス伝搬に対する耐性もしくは感受性を検出する方法。
【請求項１２】
適切なプロモーターの転写制御の下に置かれた状態の、請求項１から３のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項１３】
請求項１から３のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドまたは請求項１２に記載の発現カセットを含む、組換えベクター。
【請求項１４】
請求項１から３のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドによって遺伝的に形質転換された細胞。
【請求項１５】
ワタアブラムシに対する耐性および／または前記アブラムシによるウイルス伝搬に対する耐性を有するトランスジェニック植物を作成するための、請求項１または２に記載のポリヌクレオチドの使用法。
【請求項１６】
請求項１または２のいずれかに記載のポリヌクレオチドによって遺伝的に形質転換されたトランスジェニック植物。
【請求項１７】
瓜科、アオイ科そしてナス科のうちから選択される、請求項１６に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１８】
ポリペプチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と８０％一致することを特徴とする、ワタアブラムシおよび／または前記アブラムシによるウイルス伝搬に対する耐性に関与するポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は害虫、そして特にアブラムシに対する新しい対抗手段に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
害虫は農業における主な心配事のうちの一つとなるものである。虫自体によって発生する被害の他に、これらの虫の攻撃により、細菌、ウイルスまたは菌類による病気の、植物への伝搬や感染がしばしば助長されている。
【０００３】
害虫の中でも、（アリマキとも呼ばれる）アブラムシが最もよく知られている。それは４０００種を越え、中でも最も広く分布しているのがモモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ）とワタアブラムシ（Ａｐｈｉｓ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）である。
【０００４】
それぞれの種は、独自の生活環と、特に有利な宿主の集合とを持つ。アリマキは極めて活動的な生物であり、環境条件に迅速に適応する。この迅速な適応の本質は、アリマキによって展開されている多様な生殖戦略によるものである。気候条件により、アリマキは有性生殖または無性生殖によって生殖し、卵生または胎生となる。それらは、植物から植物への移動を容易にする翅を持つこともあれば、持たないときもある。このような高度な適応能力と生殖能力により、屋外栽培、そして温室栽培であればなおのこと、全体への蔓延は極めて早い。一つの個体からは４０と１００の間に含まれる数の幼虫が生み出される。
【０００５】
綿花やメロンにつくワタアブラムシは、北方を除き世界の多くの地域に見られる。アブラムシは成長過程を経て、一週間ほどで生殖を行うことが可能である。適応能力と生殖能力により、気象条件に関係なく、ワンシーズンで多くの子孫が生まれる可能性がある。メロンにつくアブラムシの宿主は広範なものである（約７００種の栽培されたまたは野性植物であり、そのうちの五十程がフランス国内にある）。これらの宿主の中でも、最も感受性が高いのは、例えばメロン、ズッキーニ、胡瓜を含むウリ科、綿花やハイビスカスのようなアオイ科の植物、そして割合は低いがナス科と柑橘類のようなミカン科である。
【０００６】
メロンにつくアブラムシは主に葉の裏側、芽や新梢につく。師管の中の栄養分を吸い取ることで、アブラムシはその植物の資源を奪い取り弱らせてしまう。コロニーを形成された組織は退緑し、葉は巻き込まれて光合成の効率が下がる。アブラムシは非常に糖分に富んだ甘露を分泌し、それは煤病菌のような腐生菌の栄養素となり、該煤病菌は、葉の表面を黒い膜で覆い、それがまた植物の光合成能力を減退させ、被害を受けた野菜や果物の市場価値を大きく下落させる。その上、アブラムシは数多くのウイルスを媒介し、管を刺したときに、植物の師管にそのようなウイルスを直接導き入れる。
【０００７】
化学的対抗法が、現状では依然として最も広く行われている。しかしながら、それには多くの欠点がある。使用する薬剤の作用はしばしば広範囲に及ぶものであり、アブラムシと同時に益虫も駆除してしまう。環境汚染の危険もまた大きい：殺虫剤は、実際のところ、ヒト、益獣および環境にとって最も有毒な薬剤の中に数えられるものである（Ｒｅｃｕｅｉｌ  ｄｅｓ  ｅｆｆｅｔｓ  ｎｏｎ  ｉｎｔｅｎｔｉｏｎｎｅｌｓ  ｄｅｓ  ｐｒｏｄｕｉｔｓ  ｐｈｙｔｏｓａｎｉｔａｉｒｅｓ，Ａｃｔａ  １９９８，２５６ｐ，ＢＥＲＧＥＲ  ｅｔ  ＶＡＮ  ＨＯＬＳＴ，２００１，ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｌｕｔ．Ｒｅｓ．Ｉｎｔ．，８，１０９−１１２）。また、ワタアブラムシが有機リン酸系、カーバメイト系、ピレスロイド系および有機塩素系として用いられる化合物に対する耐性を発達させてしまった地域もある（ＬＡＲＲＹ  ｅｔ  ａｌ．ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｔｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，５，２２−２９，２００１；ＤＥＬＯＲＭＥ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４９，９０−９６，１９９７）。
【０００８】
生物学的対抗法は、要するに、例えばテントウムシ、幾つかの半翅目あるいは病原菌のような、ワタアブラムシの野生の補食動物や寄生生物を用いることである。しかしながら、これは温室栽培でしか用いることができない。
【０００９】
もう一つのアプローチは、元からアブラムシに耐性のある品種を研究することや、そのような品種を用いた品種改良や雑種の作成に基づくものである。
【００１０】
このようにして、アブラムシに耐性のある品種が、特に小麦、林檎木、エンドウ、レタス、トマト等で見いだされた。
【００１１】
メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ）においては、ワタアブラムシに対する耐性を与える優性な遺伝子座が存在することが、極東やインド原産のメロンの系統で発見された。この遺伝子座は、Ａｇ（ワタアブラムシ耐性のもの）またはＶａｔ（アブラムシ伝搬ウイルス耐性のもの）と呼ばれており、ワタアブラムシが植物につくことに対する耐性と、媒介動物であるところのこのアブラムシがウイルスを伝搬することに対して抵抗するものという、二つの耐性表現型を与えるものである（ＫＩＳＨＡＢＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．，６４，９３５−９３７，１９７１；ＢＯＨＮ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，９８，３７−４０，１９７３；ＬＥＣＯＱ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，６９，１２２３−１２２５，１９７９；ＰＩＴＲＡＴ  ｅｔ  ＬＥＣＯＱ，Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，７０，９５８−９６１，１９８０）。
【非特許文献１】ＫＩＳＨＡＢＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．，６４，９３５−９３７，１９７１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
耐性に望ましいＶａｔ遺伝子座を、交配により、市販されている様々な品種のメロンに導入した。しかしながら、通常の品種改良の技術でアブラムシに耐性のある品種のメロンを作成することは依然として時間も費用もかかる。
【００１３】
それゆえ、望ましく思われるのは、Ｖａｔ遺伝子を精確に識別し、そしてクローニングすることにより、特に、つぎのようなことを可能ならしめることである：
・耐性に望ましいＶａｔ対立遺伝子を、遺伝子導入により、ワタアブラムシへの感受性が高い品種のメロンに、そして同様に、このアブラムシへの感受性が高く、元からの耐性がみられたことのない他の種、例えば、ズッキーニ、キュウリまたは綿花に、導入すること。耐性に望ましいＶａｔ遺伝子の対立遺伝子を、例えばナス科の植物、特にトマトのような、アブラムシによるウイルス伝搬への感受性が高い植物種に導入してもよい；
・Ｖａｔ遺伝子のオーソログをメロン以外の種で探求すること；
・特に従来の品種選択技法の枠内で使用可能な、新たなマーカーを明らかにし、それにより、耐性のある品種の識別を容易にし、および／または農学的に利点のある品種のその耐性特性の遺伝子移入の検査をやりやすくすること。
【００１４】
Ｖａｔ遺伝子は、メロンの第五染色体のサブテロメア領域にあることがつきとめられた（ＰＥＲＩＮ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ，１０４，１０１７−１０３４，２００２）。耐性遺伝子と相同の配列がこの領域にいくつもマッピングされており（ＫＬＩＮＧＥＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．，１２６，５６−６３，２００１；ＢＲＯＴＭＡＮ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１０４，１０５５−１０６３，２００２）、Ｖａｔ遺伝子はＮＢＳ−ＬＲＲのスーパーファミリーに属しており、そのうちの多数の耐性遺伝子が現にクローニングされているのではないかということが考えられる。
【００１５】
このスーパーファミリーに分類される遺伝子には、ヌクレオチドと結合する部位（ＮＢＳ：ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）が一つとロイシンに富んだ反復配列（ＬＲＲ：ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔｓ）が含まれている。ＮＢＳ−ＬＲＲと相同の配列がＶａｔ遺伝子座に結合しているのが観察された（ＫＬＩＮＧＥＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．，１２６，５６−６３，２００１）。そのような耐性遺伝子のホモログの中でも、ＮＢＳ−２、ＮＢＳ４６−７、ＮＢＳ５ａおよびＮＢＳ５ｂの位置がそれぞれＶａｔの４．７５、７．５、１０および１１ｃＭであることがつきとめられた。しかしながら、それら相互の間でＶａｔ遺伝子座と共分離しているものはない（ＢＲＯＴＭＡＮ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１０４，１０５５−１０６３，２００２）。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、ワタアブラムシに対する耐性とそれに媒介されるウイルス伝搬に対して耐性に有利に働くＶａｔ対立遺伝子についてホモ接合体であるメロンのゲノムＤＮＡに基づき、ＢＡＣ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）バンクを構築した。本発明者らは、それと並行して、先行技術において知られているマーカーよりも高い精度でＶａｔ遺伝子座を囲むマーカーを明らかにした。そのようなマーカーを用いてＢＡＣバンクをスクリーニングすると、そのＶａｔ遺伝子座全体を完全な形で保有するクローンを識別することができた。
【００１７】
そのようなクローンのうちの一つをサブクローニングすると、Ｖａｔ遺伝子を含む約１１０００ｂｐのゲノムＤＮＡ断片が一つ得られた。この断片の配列は（４つのエクソンは灰色で上線を付け、３つのイントロンは下線を付けて）図１に示しており、それと並んで、添付の配列表にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１という番号を付けて示している。対応するｃＤＮＡ配列も得られ、対応するポリペプチド配列も決定された。ｃＤＮＡ配列とポリペプチド配列は、それぞれ添付の配列表にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３という番号で示されている。
【００１８】
Ｖａｔ遺伝子のパラログを、以後、Ｖａｔ−ｌｉｋｅと呼ぶことにするが、それもまた、ＢＡＣバンクから単離された。この得られたＶａｔ−ｌｉｋｅ遺伝子の配列は、添付の配列表にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４という番号で示されている。ｃＤＮＡ配列と推定されるポリペプチド配列はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６という番号で示されている。
【００１９】
図２は、ＶａｔのｃＤＮＡとＶａｔ−ｌｉｋｅのｃＤＮＡとの間の配列のアラインメントを示している。ＶａｔのｃＤＮＡは４４２２ｂｐからなるが、一方、Ｖａｔ−ｌｉｋｅのｃＤＮＡが４２３３ｂｐしか含まないのは、Ｖａｔの配列の３０１４位と３２１０位との間に位置する１９５ｂｐが欠失し、Ｖａｔ−ｌｉｋｅの配列の３６４９位と３６５６位との間に位置する６ｂｐが付加されているからである。ＶａｔとＶａｔ−ｌｉｋｅの配列の間で９２．４％が一致していることが示されている。
【００２０】
図３は、それぞれ１４７３個のアミノ酸と１４１０個のアミノ酸からなる、得られたＶＡＴタンパク質配列とＶＡＴ−ｌｉｋｅタンパク質配列のアラインメントを示している。ＶＡＴとＶＡＴ−ｌｉｋｅの配列の間の９０％が一致していることが示されている。
【００２１】
Ｖａｔ遺伝子とＶａｔ−ｌｉｋｅ遺伝子は遺伝的にも物理的にも（１７ｋｂの隔たりはあるが）つながりがある。遺伝子組換え植物を、ＶａｔとＶａｔ−ｌｉｋｅとの間で遺伝子解析により識別した。Ｖａｔ−ｌｉｋｅ遺伝子のみを有する植物はワタアブラムシにコロニー形成されたり、それによりウイルスを伝搬されたりすることに感受性がある。逆にＶａｔ遺伝子のみを有する植物はワタアブラムシにコロニー形成されたり、それによりウイルスを伝搬されたりすることに耐性を有する。それゆえ、Ｖａｔ遺伝子は前述の二つの表現型を与えるのに必要かつ十分である。
【００２２】
本発明が対象とする単離したポリヌクレオチドは以下のいずれかから選択されたものである：
ａ）ワタアブラムシおよび／または前記アブラムシによるウイルス伝搬に対する耐性に関与するポリペプチドであり、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％そして更に好ましくは少なくとも９５％がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のポリペプチドと一致しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ｂ）ポリヌクレオチドａ）に相補的なポリヌクレオチド、
ｃ）ポリヌクレオチドａ）またはポリヌクレオチドｂ）と、ストリンジェントな条件の下で、選択的にハイブリダイズする能力のあるポリヌクレオチド。
【００２３】
そうでないと断っている場合は別としてヌクレオチド配列またはペプチド配列についてここで示されている同一配列の割合は、基準配列の全体で構成される比較ウィンドウについて得られた値に関連するものであり、該値は、ソフトウエアＢＬＡＳＴシリーズ（ＡＬＴＳＣＨＵＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５，３３８９−３４０２，１９９７）によって、基準配列の全体で構成されている比較ウィンドウについての初期設定のパラメーターを用いることで得られる。
【００２４】
前記ポリペプチドの合成を可能にするゲノム情報を含む一切のポリヌクレオチドを、所定のポリペプチドを「コードする」ポリヌクレオチドとして定義する。
【００２５】
このように、ワタアブラムシおよび／または前記アブラムシによるウイルス伝搬に対する耐性に関与するポリペプチドをコードする本発明にかなうポリヌクレオチドは、特に、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のポリヌクレオチドおよび配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリヌクレオチドを含む。
【００２６】
本発明はまた、少なくとも１０ｂｐ、好ましくは少なくとも２０ｂｐそしてさらに好ましい仕方では少なくとも５０ｂｐの上記ポリヌクレオチドａ）またはｂ）の断片、あるいは上記ポリヌクレオチドａ）またはｂ）とストリンジェントな条件の下で選択的にハイブリダイズすることのできるあらゆる断片を含む。好ましい断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の配列のヌクレオチドのうちのいずれか一つ、あるいはこれらのポリヌクレオチドまたはそれに相補的なもののいずれか一つとストリンジェントな条件の下で選択的にハイブリダイズすることのできる断片である。他の好ましい断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のポリヌクレオチドに存在しない、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１かＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリヌクレオチドのいずれか一つの断片、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることなく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１かＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリヌクレオチドのうちのいずれか一つと選択的にハイブリダイズすることのできる断片である。
【００２７】
所定のポリヌクレオチドについての、ストリンジェントなハイブリダイズ条件は、ポリヌクレオチドの大きさと塩基組成、並びにハイブリダイゼーションの混合物の組成（特にｐＨとイオン強度）に応じて、当業者によって識別される。一般的には、所定の大きさと配列のポリヌクレオチドについては、ストリンジェントな条件は、同一の反応混合物におけるポリヌクレオチドとその相補配列によって形成されたハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）よりも、約５℃から１０℃低い温度で作業することによって得られる。
【００２８】
これにおいて、本発明にかなうポリヌクレオチドａ）またはポリヌクレオチドｂ）と選択的にハイブリダイズすることのできるあらゆるポリヌクレオチドを規定するが、該ポリヌクレオチドは、メロンの核酸バンク（特にゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのバンク）とストリンジェントな条件でハイブリダイズする際に、前記ポリヌクレオチドとの検出可能な（つまりバックグラウンドノイズの少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍大きな）ハイブリダイゼーションシグナルを生成するが、前記バンクの他の配列とは、そして特にＮＢＳ−ＬＲＲファミリーの他のタンパク質をコードする配列とは、検出可能なシグナルを全く生成しない。
【００２９】
本発明はまた、本発明にかなうポリヌクレオチドａ）もしくはｂ）またはそれらのポリヌクレオチドの断片から得られるポリヌクレオチドプローブまたは増幅プライマーも対象としている。
【００３０】
本発明はまた、ワタアブラムシおよび／または前記アブラムシによるウイルス伝搬に対する耐性に関与するポリペプチドであって、本発明のプローブかプライマーを用いて前記バンクをスクリーニングすることによって、植物のゲノムＤＮＡバンクまたはｃＤＮＡバンクから得ることができるポリペプチドをコードする、あらゆるポリヌクレオチドも含む。
【００３１】
これにおいて、特にメロンのＶＡＴ遺伝子とは別の対立遺伝子、そして特にワタアブラムシおよび／または前記アブラムシによるウイルス伝搬に対する耐性を与える能力のある他の対立遺伝子、並びにメロン以外の植物、特にズッキーニやキュウリのような他の瓜科植物、そして更に一般的には（例えば綿花などのアオイ科のような）ワタアブラムシがつきやすく、および／または（例えばトマトのようなナス科の）前記アブラムシによるウイルス伝搬に感受性のある植物におけるＶａｔ遺伝子のオルトログが含まれる。
【００３２】
本発明はまた、植物、そして特にメロンに、ワタアブラムシによるコロニー形成に対する耐性および／または前記アブラムシによるウイルス伝搬に対する耐性に有利なＶａｔ遺伝子の対立遺伝子の有無を検出することのできる遺伝子マーカーも含む。
【００３３】
本発明にかなう遺伝子マーカーは、特に以下のマーカーを含む：Ｌ２７３、Ｌ２４６、Ｖ６８１、Ｖ１６８４、Ｖ４３２、ＧＲＰ８０５、Ｍ８、マーカーＥ、マーカーＤ。
【００３４】
マーカーＥおよびＤは、特にＰＩ１６１３７５におけるＶａｔ遺伝子とＶａｔ−ｌｉｋｅ遺伝子を判別するために使用可能なものである。
【００３５】
これらのマーカーは、瓜科植物、とりわけメロンにおいて使用可能である。該マーカーＥおよびＤは、他の植物、例えば綿花のようなアオイ科、またはハイビスカスやトマトのようなナス科植物においても使用可能である。
【００３６】
本発明のマーカーはそれぞれ以下のようなプライマーによって規定される。
Ｌ２７３：
Ｆ２−Ｂ２：ＧＧＡＧＡＧＡＧＡＡＴＣＣＧＧＧＡＣＴＡＡＧＴＧＡＣＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）
Ｆ２−Ｂｒ：ＴＡＡＣＣＡＣＣＴＴＴＴＣＣＧＡＴＣＡＡＡＴＴＴＣＧＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）
Ｌ２４６：
Ｆ２−Ｂ２  Ｅｃｏ：ＡＴＴＧＡＴＧＡＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＣＴＣＧＡＴＣＴＣＴＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）
Ｆ２  Ｅｃｏ：ＧＡＧＴＴＣＡＡＴＣＣＡＴＴＴＣＡＡＴＧＡＴＴＴＡＡＧＡＴＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）
Ｖ６８１：
Ｖ６８１：ＧＧＡＡＴＣＴＴＧＴＴＧＡＧＧＣＣＧＡＧＡＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）
Ｖ６８１Ｒ：ＧＴＴＧＴＡＴＡＴＧＧＣＴＴＣＣＣＴＧＴＡＧＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）
Ｖ１６８４：
Ｖ５８８：ＣＡＡＣＡＧＧＣＴＣＡＡＣＡＧＴＧＴＡＴＴＣＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）
Ｖ５５１Ｒ：ＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡＣＧＡＧＡＧＡＧＡＴＧＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）
Ｖ４３２：
Ｖ４３２：ＡＡＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣＴＣＣＣＴＣＣＡＣＴＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）
Ｖ４３２Ｒ：ＴＴＡＧＡＧＴＧＧＣＡＡＡＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）
ＧＲＰ８０５：
ＧＲＰ８０５：ＡＴＣＣＣＣＴＧＴＴＴＣＣＴＴＣＡＡＣＡＡＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）
ＧＲＰ８０５Ｒ：ＡＡＣＣＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＡＡＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）
Ｍ８：
Ｍ８：ＣＣＧＡＣＧＣＡＴＣＴＣＣＣＧＡＣＧＣＧＴＴＧＴＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）
Ｍ８Ｒ：ＴＣＧＴＧＡＡＧＧＧＴＴＴＴＧＧＡＧＡＧＴＧＡＧＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）
マーカーＥ：
ＬＲＲ１：ＣＣＴＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＴＣＴＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）
ＬＲＲ８４２Ｒ：ＣＴＣＣＡＣＴＣＡＧＡＡＴＴＧＧＴＡＧＧＴＧＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）
マーカーＤ：
ＬＲＲ９１５：ＡＡＣＡＡＣＴＴＡＧＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＡＧＣ（ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：２３）
ＬＲＲ１Ｒ：ＧＴＴＧＴＴＧＡＧＡＧＣＡＡＴＡＧＴＧＴＡＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）
【００３７】
ワタアブラムシおよび／または前記アブラムシによるウイルス伝搬に対する耐性を有する他の遺伝子マーカーもまた、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と、ワタアブラムシおよび／またはこのアブラムシによるウイルス伝搬に感受性のある植物から得られたそれらの相同配列とを比較することにより、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で規定することができ、それにより、これらの配列の間に存在する多型性を検出し、耐性に関連する型と感受性に関連する型とを決定することができる。
【００３８】
そのような多型性は、Ｖａｔ遺伝子のコード領域内に位置し、ＶＡＴタンパク質のペプチド配列が改変したものとして翻訳される可能性がある。それはまた、Ｖａｔ遺伝子のコードしない５’領域またはイントロンに位置する多型性である可能性もあり、または、コードは行うがＶＡＴタンパク質の配列が改変されたものとしては翻訳されな領域に位置する多型性である可能性もある。
【００３９】
このように多型性が識別された場合、それを耐性または感受性の遺伝子マーカーとして用い、そしてこれらの様々な型を判別することができる（核酸プローブ、増幅プライマー、制限酵素のような）手段を規定することも可能である。
【００４０】
本発明はまた、本発明にかなう少なくとも一つのポリヌクレオチドまたは少なくとも一つの遺伝子マーカーの利用をも含むものであり、これは、植物にワタアブラムシに対する耐性および／または前記アブラムシによるウイルス伝搬に対する耐性に有利なＶａｔ遺伝子の対立遺伝子の存在を検出するものである。
【００４１】
本発明は特に、植物のワタアブラムシおよび／または前記アブラムシによるウイルス伝搬に対する耐性または感受性の評価方法を対象とするものであり、該方法は前記植物に存在するＶａｔ遺伝子の対立遺伝子型を決定することが含まれていることを特徴とする。
【００４２】
本発明はまた上記に規定された検出方法の実施に使用可能なオリゴヌクレオチドプライマーをも対象とするものである。
【００４３】
特に本発明は以下のことを対象とする：
・ワタアブラムシおよび／または前記アブラムシによるウイルス伝搬に対する耐性または感受性に関連する少なくとも一つの多型性を含むＶａｔ遺伝子の領域を増幅することのできる、一対のあらゆるプライマー、
・上記のマーカーＬ２７３、Ｌ２４６、Ｖ６８１、Ｖ１６８４、Ｖ４３２、ＧＲＰ８０５、Ｍ８、マーカーＥ、あるいはマーカーＤのうちの一つを増幅できるような一対のあらゆるプライマー。
【００４４】
本発明はまた、本発明の方法を実施するためのキットも対象としている。これらのキットは、場合によっては、増幅反応を行うことのできる試薬に、増幅産物を検出する手段に、一つまたは複数の制限酵素に、および／または増幅のポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロールに関連する、本発明にかなう少なくとも一対のプライマーを含む。
【００４５】
本発明はまた、以下も対象とするものである：
・本発明にかなうポリヌクレオチド、そして特に、適切なプロモーターの転写制御の下に置かれた状態で、ワタアブラムシおよび／または前記アブラムシによるウイルス伝搬に対する耐性に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、一つの発現カセット、
・本発明にかなう一つのポリヌクレオチドまたは一つの発現カセットを、適切な宿主ベクターに導入することから生じる組換えベクター。
【００４６】
本発明はまた、組換えポリペプチドの製造方法をも含んでおり、該方法は、原核細胞または真核細胞である宿主細胞を、ワタアブラムシおよび／または前記アブラムシによるウイルス伝搬に対する耐性に関与するポリペプチドをコードする本発明にかなうポリヌクレオチドによって形質転換することと、前記細胞によって産生された前記ポリペプチドを回収することを含むことを特徴とする。
【００４７】
本発明はまたワタアブラムシおよび／または前記アブラムシによるウイルス伝搬に対する耐性に関与するポリペプチドを対象としており、該ポリペプチドは、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％そして更に好ましくは少なくとも９５％がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のポリペプチドと一致しており、且つ、前記ポリペプチドの少なくとも５個、好ましくは少なくとも１０個、そして更に好ましくは少なくとも１５個の連続するアミノ酸断片を有している。
【００４８】
本発明はまた、本発明にかなうポリヌクレオチドまたは発現カセットによって遺伝的形質転換された宿主細胞をも含むものである。
【００４９】
そのような宿主細胞は、真核細胞でも原核細胞でもよい。例として挙げれば、細菌、特に大腸菌またはアグロバクテリウム、例えばサッカロマイセスなどの酵母、動物細胞または、好ましくは、植物細胞である。
【００５０】
本発明はまた、本発明にかなうポリヌクレオチドで遺伝的形質転換されたトランスジェニック植物をも含むものである。
【００５１】
組換えベクターを構築し、宿主となる細胞または生物を形質転換し、そして組換えタンパク質を産生する従来の技術は、本発明を実施するためにも使用可能である。
【００５２】
宿主ベクターと発現を調節する配列の選択は、選択された宿主細胞または宿主生物、そして目的の用途に応じて行われる。
【００５３】
本発明にかなうポリヌクレオチドで植物を遺伝的に形質転換することにより、ワタアブラムシおよび／または前記アブラムシによるウイルス伝搬に対する耐性を有するトランスジェニック植物を得ることができる。
【００５４】
そういうわけで、本発明は、本発明にかなうポリヌクレオチドを用いて植物のワタアブラムシに対する耐性を増強することをも対象とする。
【００５５】
そういうわけで、本発明は更にとりわけワタアブラムシおよび／または前記アブラムシによるウイルス伝搬に対する耐性を有するトランスジェニック植物の作成方法をも対象とするものであり、該方法は、前記植物を本発明にかなうポリヌクレオチドで遺伝的形質転換することを含むことを特徴とする。
【００５６】
前記植物は、ワタアブラムシに弱い種、特にメロン、胡瓜またはズッキーニのような瓜科植物、または綿花やハイビスカスのようなアオイ科の植物、あるいはワタアブラムシが伝搬するウイルスに感受性が高い種、特にトマトやトウガラシのようなナス科の植物から、有利には選択される。
【００５７】
更に、Ｖａｔ遺伝子の高いレベルでの過剰発現は、メロンあるいは（瓜科、ナス科またはアオイ科の）他の植物種において、更に多様な病原体に対する、植物の構成的な耐性を生じさせることができる。例えば、この過剰発現により、植物は、ワタアブラムシから系統発生的に離れたアブラムシを認識できるようになり、または、一般的な病原体の感染周期を遅らせることのできる弱い構成的な耐性をもたらすことができる。そのために、作成可能なトランスジェニック植物は、Ｖａｔ遺伝子を強いプロモーター（３５Ｓ）の制御の下で発現させることができ、そしてそれゆえに、それ自身のプロモーターの制御の下にある場合よりも高いレベルでそれを発現することができる。しかしながら、（例えば細胞死のような）植物の生命活動に有害な影響を避けるために、必然的に遺伝子の発現をそれ自身の最も妥当なレベルに制御する必要がある。
【００５８】
植物の遺伝的形質転換は、それ自体、業界では周知の従来の方法によって行うことができる。
【００５９】
非制限的な例として、瓜科植物、特にメロンの形質転換についてはＧＵＩＳ  ｅｔ  ａｌ．が説明している技術を用いることができる（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１５，２８９−３１１，１９９８；Ｓｃｉｅｎｔｉａ  ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ，８４，９１−９９，２０００）。綿花の形質転換については、ＰＡＮＮＥＴＩＥＲ  ｅｔ  ａｌ．が説明している技術を用いることができる（Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，９６，１６３−１６６，１９９７）。トマトの形質転換については、ＨＡＭＺＡおよびＣＨＵＰＥＡＵが説明している手順を用いることが可能である（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．，４４，１８３７−１８４５，１９９３）。
【００６０】
他の方法としては、ワタアブラムシおよび／または前記アブラムシによるウイルス伝搬に対する増強された耐性を有する植物は、突然変異誘発して、このような耐性をもたらすために必要な改変を前記植物に存在するＶａｔ遺伝子の対立遺伝子内に導入することにより、得ることができる。
【００６１】
本発明の範囲内で使用可能な突然変異誘発方法は、それ自体、業界では知られている。例えば、Ｄ．ＴＡＧＵ（ｅｄｓ  ＩＮＲＡ  １９９９）の著作によって説明されている。
【００６２】
本発明はまた、本発明にかなう遺伝子導入方法または突然変異誘発方法により得られた形質転換植物、並びにこれらの植物の子孫に関するものである。本発明はまた、これらの植物から得られるもの、例えば植物の器官または組織、細胞、種子などをも含む。
【００６３】
本発明は、Ｖａｔ遺伝子に関連するマーカーの定義、この遺伝子のクローニング、そして前記遺伝子を用いることによってワタアブラムシおよび／または前記アブラムシによるウイルス伝搬に対する耐性を有する植物が得られることを示す非制限的な例を参照しつつ、以下の補足説明を読むことにより、更によく理解される。
【実施例１】
【００６４】
遺伝的アプローチによるＶＡＴ遺伝子の識別：
【００６５】
・ＢＡＣバンクの作成
【００６６】
約２９個のゲノム相当物を有するメロン（ワタアブラムシおよび／またはこのアブラムシによるウイルス伝搬に対する耐性を有する品種ＰＩ１６１３７５）のゲノムＤＮＡのＢＡＣバンクを構築した。ＢＡＣバンクの第一の部分は６６０４８個のクローン（ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化されるＤＮＡ）を、第二の部分は５６４４８個のクローン（ＥｃｏＲＩで消化されるＤＮＡ）を有する。
【００６７】
・ＢＡＣバンクのスクリーニングとＶａｔ遺伝子座を有するＢＡＣクローンの選択
【００６８】
Ｖａｔ遺伝子を有するクローンを識別するために、バンクを、Ｖａｔ遺伝子座の両脇にあるマーカーを用いてスクリーニングした。Ｖａｔ遺伝子座をカバーする複数のＢＡＣクローンを識別してアラインした。これらのＢＡＣクローンから新しいマーカーを作成した。Ｖａｔ遺伝子座を含む１７０ｋｂのインサートを有するＢＡＣクローン３．１８．９を、Ｖａｔ遺伝子の識別のために選択し、ついで配列決定した。このクローンは、Ｖａｔ遺伝子座を囲むマーカーＬ２７３およびＬ２４６を含む。戻し交配の個体群〔（Ｖｅｄｒａｎｔａｉｓ（感受性あり）×ＰＩ１６１３７５（耐性あり））×Ｖｅｄｒａｎｔａｉｓ〕から得られた６０００の植物のうち、マーカーＬ２７３とＶａｔ遺伝子の間では十本の組換え植物が識別されたのに対し、マーカーＬ２４６とＶａｔ遺伝子の間では一つの組換え植物だけが識別された。
【００６９】
マーカーＬ２７３は、以下のプライマーによって規定される：
Ｆ２−Ｂ２：ＧＧＡＧＡＧＡＧＡＡＴＣＣＧＧＧＡＣＴＡＡＧＴＧＡＣＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）およびＦ２−Ｂｒ：ＴＡＡＣＣＡＣＣＴＴＴＴＣＣＧＡＴＣＡＡＡＴＴＴＣＧＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）。
【００７０】
（ワタアブラムシに感受性がある）品種Ｖｅｄｒａｎｔａｉｓ（Ｖｉｌｍｏｒｉｎ）または（ワタアブラムシに耐性がある）品種ＰＩ１６１３７５（ＩＮＲＡが増殖した韓国のアクセッション）番号のゲノムＤＮＡから得られた増幅産物の長さは、２１０ｂｐである。増幅産物は、品種ＰＩ１６１３７５に制限部位ＢｓｉＷＩを有し、それにより、１８１ｂｐと２９ｂｐの二つの断片が得られる。他方、酵素ＢｓｒＧＩによる消化は、Ｖｅｄｒａｎｔａｉｓの増幅産物を三つの断片、即ち１５３ｂｐ、２８ｂｐおよび２９ｂｐに小さくし、ＰＩ１６１３７５の増幅産物を、二つの断片、即ち１８２ｂｐと２８ｂｐに小さくする。
【００７１】
マーカーＬ２４６は、以下のプライマーによって規定される：
Ｆ２−Ｂ２  Ｅｃｏ：ＡＴＴＧＡＴＧＡＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＣＴＣＧＡＴＣＴＣＴＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）およびＦ２  Ｅｃｏ：ＧＡＧＴＴＣＡＡＴＣＣＡＴＴＴＣＡＡＴＧＡＴＴＴＡＡＧＡＴＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）。
【００７２】
品種Ｖｅｄｒａｎｔａｉｓまたは品種ＰＩ１６１３７５のゲノムＤＮＡから得られた増幅産物の長さは、１７３ｂｐである。品種ＰＩ１６１３７５の増幅産物は、それぞれ１４４ｂｐと２９ｂｐの二つの断片を得ることを可能にする酵素ＥｃｏＲＶの制限部位を有する。
【００７３】
間隔を狭め、Ｖａｔ遺伝子の範囲を精確に限定するために、二つのマーカーＬ２７３とＬ２４６を有するＢＡＣクローン３−１８−９から、これらの二つのマーカーの間に含まれる領域内のオリゴヌクレオチド（表１）を指定した。
【００７４】
マーカーＶ４３２は、以下のプライマーによって規定される：
Ｖ４３２：ＡＡＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣＴＣＣＣＴＣＣＡＣＴＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）およびＶ４３２Ｒ：ＴＴＡＧＡＧＴＧＧＣＡＡＡＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）。
【００７５】
品種Ｖｅｄｒａｎｔａｉｓまたは品種ＰＩ１６１３７５のゲノムＤＮＡから得られた増幅産物の長さは、４３２ｂｐである。品種ＰＩ１６１３７５の増幅産物は、それぞれ２２３ｂｐと２０９ｂｐの二つの断片を得ることを可能にする酵素ＨａｅＩＩの制限部位を有する。
【００７６】
この制限部位は品種Ｖｅｄｒａｎｔａｉｓにはないものである。
【００７７】
マーカーＶ６８１は、以下のプライマーによって規定される：
Ｖ６８１：ＧＧＡＡＴＣＴＴＧＴＴＧＡＧＧＣＣＧＡＧＡＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）およびＶ６８１Ｒ：ＧＴＴＧＴＡＴＡＴＧＧＣＴＴＣＣＣＴＧＴＡＧＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）。
【００７８】
品種Ｖｅｄｒａｎｔａｉｓまたは品種ＰＩ１６１３７５のゲノムＤＮＡから得られた増幅産物の長さは、６８１ｂｐである。品種ＰＩ１６１３７５の増幅産物は、それぞれ４３５ｂｐ、２２１ｂｐおよび２５ｂｐの三つの断片を得ることを可能にする、二つの酵素ＲｓａＩ制限部位を有する。これらの制限部位は品種Ｖｅｄｒａｎｔａｉｓにはないものである。
【００７９】
マーカーＶ１６８４は、以下のプライマーによって規定される：
Ｖ５８８：ＣＡＡＣＡＧＧＣＴＣＡＡＣＡＧＴＧＴＡＴＴＣＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）およびＶ５５１Ｒ：ＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡＣＧＡＧＡＧＡＧＡＴＧＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）。
【００８０】
品種Ｖｅｄｒａｎｔａｉｓで増幅された断片の長さは約１３００ｂｐであるのに対し、品種ＰＩ１６１３７５では増幅産物の長さは１６８４ｂｐである。この場合、大きさに多型性があることが問題である。
【００８１】
そのようなマーカー並びにマーカーＤ、Ｅ、およびＭ８（以下の実施例４参照）とそれらを規定するオリゴヌクレオチドは、以下の表１に示されている。
【００８２】
【表１】
2007527694.tif 000002
【００８３】
これらのオリゴヌクレオチドの組み合わせ（表２）を、交配〔Ｆ１（Ｖｅｄｒａｎｔａｉｓ×ＰＩ１６１３７５）×Ｖｅｄｒａｎｔａｉｓ〕により生じ、Ｖａｔ遺伝子座（ｌｏｃｕｓ  Ｖａｔ）の近傍で組換えが発生する、戻し交配した植物のＤＮＡを増幅するために用いた。
【００８４】
その結果を以下の表２と図４に示す。
【００８５】
【表２】
2007527694.tif 000003
【００８６】
このような結果により以下のことが明らかになる。
植物Ｐ２６  ６４は、マーカーＶ４３２とＶａｔ遺伝子との間に組換えが発生していることを示す。
植物Ｐ４９  ４０では、マーカーＬ２４６とＶａｔ遺伝子との間に組換えが発生していることを示す。
植物Ｐ１０  ３５は、マーカーＶ１６８４とＶａｔ遺伝子との間に組換えが発生していることを示す。マーカーＶ１６８４にＶａｔ遺伝子のＡＴＧが含まれているため、この植物は、遺伝子の機能を無効にする遺伝子内組換えを示す。
マーカーＶ６８１はＶａｔ遺伝子と共分離する。
【００８７】
それゆえ、これらのデータは、Ｖａｔ遺伝子を遺伝的に識別することを可能にする。
【実施例２】
【００８８】
Ｖａｔ遺伝子配列のサブクローニングと検証
【００８９】
Ｖａｔ遺伝子のサブクローニングをベクターｐＧＥＭ（登録商標）３Ｚｆ＋（Ｐｒｏｍｅｇａ）内で行った。このために、ＢＡＣクローン３−１８−９を制限酵素ＭｓｃＩによって消化した。それにより生じたそれぞれの断片をベクターｐＧＥＭ（登録商標）３Ｚｆ＋（Ｐｒｏｍｅｇａ）内に連結させ、つぎにＶａｔ遺伝子を囲むまたはこの遺伝子の内部にあるマーカーでスクリーニングした。
【００９０】
Ｖａｔ遺伝子を含む１８１８５ｂｐのクローンが識別された（クローンＣ７．１）。酵素による切断のクローンＣ７．１の末端の配列決定、並びに表１のオリゴヌクレオチドによるＶａｔ遺伝子の配列決定によって、それが確かにＶａｔ遺伝子についてのものであることの検証が可能となった。このクローンの１１０９７ｂｐの部分の配列を、図１並びに添付の配列表に示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）。
【実施例３】
【００９１】
Ｖａｔ遺伝子のｃＤＮＡを得る
【００９２】
ｃＤＮＡをＭａｒａｔｈｏｎ（登録商標）ｃＤＮＡクローン・キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）で得た。このｃＤＮＡを添付の配列表に、番号ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で示した。
【００９３】
Ｖａｔ遺伝子は４個のエクソンと３個のイントロンを有する。
第一のエクソンは２３６７ｂｐであり、（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の２３４４位に対応する）開始コドンＡＴＧの１番目の塩基から（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の４７１０位に対応する）２３６７番目の塩基にまで伸びている。
第一のイントロンは、２３６８番目の塩基から２９２１番目の塩基（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１では４７１１から５２６４）まで伸びている。
第二のエクソンは、２９２２番目の塩基から４０５５番目の塩基（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１では５２６５から６３９８）まで伸びている。
第二のイントロンは、４０５６番目の塩基から４８７６番目の塩基（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１では６３９９から７２１９）まで伸びている。
第三のエクソンは、４８７７番目の塩基から５７３４番目の塩基（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１では７２２０から８０７７）まで伸びている。
第三のイントロンは、５７３５番目の塩基から５８３３番目の塩基（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１では８０７８から８１７６）まで伸びている。
第四のエクソンは、５８３４番目の塩基から５８９６番目の塩基（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１では８１７７から８２３９）まで伸びている。
【実施例４】
【００９４】
Ｖａｔ遺伝子とＶａｔ−ｌｉｋｅ遺伝子の間の判別
【００９５】
前述のスクリーニングの際に、Ｖａｔ遺伝子のホモログ（Ｖａｔ−ｌｉｋｅ）を有するクローンを識別した（核レベルで９３．８％、そしてタンパク質レベルで８９．９％が一致する）。Ｖａｔ−ｌｉｋｅの配列を添付の配列表に番号ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で示す。
【００９６】
Ｖａｔ遺伝子とＶａｔ−ｌｉｋｅ遺伝子は距離が１７ｋｂなので、遺伝的にも物理的にも結びついている。
【００９７】
二つのマーカー（マーカーＤおよびマーカーＥ）により、ＰＩ１６１３７５におけるＶａｔ−ｌｉｋｅ遺伝子からＶａｔ遺伝子を判別することができる。
【００９８】
マーカーＥは、以下のプライマーによって規定される：
ＬＲＲ１：ＣＣＴＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＴＣＴＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）およびＬＲＲ８４２Ｒ：ＣＴＣＣＡＣＴＣＡＧＡＡＴＴＧＧＴＡＧＧＴＧＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）。
【００９９】
このマーカーは、ＰＩ１６１３７５において、Ｖａｔ遺伝子に対応する１７２２ｂｐの断片とＶａｔ−ｌｉｋｅ遺伝子に対応する１５２７ｂｐの断片の増幅を可能にする。
【０１００】
品種ＶｅｄｒａｎｔａｉｓのゲノムＤＮＡから得られる増幅産物の長さは、アガロースゲル上で約１．３ｋｂである。
【０１０１】
マーカーＤは以下のプライマーによって規定される：
ＬＲＲ９１５：ＡＡＣＡＡＣＴＴＡＧＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＡＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）およびＬＲＲ１Ｒ：ＧＴＴＧＴＴＧＡＧＡＧＣＡＡＴＡ                            ＧＴＧＴＡＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）。
【０１０２】
このマーカーは、ＰＩ１６１３７５において、Ｖａｔ遺伝子に対応する１５４９ｂｐの断片とＶａｔ−ｌｉｋｅ遺伝子に対応する１３７２ｂｐの断片を増幅することを可能にする。Ｖｅｄｒａｎｔａｉｓにおいては、このマーカーは、約７５０ｂｐ、９００ｂｐ、１１００ｂｐ、１３００ｂｐの４つのＤＮＡ断片の増幅を可能にする。
【０１０３】
マーカーＬ２４６およびＭ８は、Ｖａｔ遺伝子とＶａｔ−ｌｉｋｅ遺伝子との間の組換え体を解析し、そしてそれら二つの遺伝子を遺伝的に判別することを可能にする。
【０１０４】
マーカーＭ８は、以下のプライマーによって規定される：
Ｍ８：ＣＣＧＡＣＧＣＡＴＣＴＣＣＣＧＡＣＧＣＧＴＴＧＴＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）およびＭ８Ｒ：ＴＣＧＴＧＡＡＧＧＧＴＴＴＴＧＧＡＧＡＧＴＧＡＧＡＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）。
【０１０５】
品種ＶｅｄｒａｎｔａｉｓとＰＩ１６１３７５のゲノムＤＮＡから得られた増幅産物の長さは、２２８ｂｐである。品種ＰＩ１６１３７５の増幅産物は、それぞれ１９５ｂｐと３３ｂｐの二つの断片を得ることを可能にする酵素ＡａｔＩＩの制限部位を有する。
【０１０６】
実際、Ｖａｔ遺伝子とＶａｔ−ｌｉｋｅ遺伝子との間の組換え植物を、戻し交配による個体群〔Ｆ１（Ｖｅｄｒａｎｔａｉｓ×ＰＩ１６１３７５）×Ｖｅｄｒａｎｔａｉｓ〕の中で識別した。Ｖａｔ−ｌｉｋｅ遺伝子だけを有する植物はワタアブラムシに感受性が高く、それは例えば（表２の）植物８４８である。逆に、Ｖａｔ−ｌｉｋｅ遺伝子を有さない植物はワタアブラムシに耐性があり、それは例えば（表２の）植物Ｐ４９４０である。
【実施例５】
【０１０７】
Ｖａｔ遺伝子を含む発現ベクターの構成
【０１０８】
特にキメラＮＯＳ／ＮＰＴＩＩ遺伝子、カナマイシン耐性を選択するマーカー、およびプロモーターｐ３５Ｓを含む、バイナリーベクターｐＢｉｎ６１（ＢＥＮＤＡＨＭＡＮＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３２，１９５−２０４，２００２；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｉｎｓｂｕｒｙ−ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．ａｃ．ｕｋ／ｄａｖｉｄｂａｕｌｃｏｍｂｅ／Ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｐＢｉｎ６１．ｄｏｃでも配列が入手可能）に、自身のプロモーターがないＶａｔ遺伝子のゲノムＤＮＡを導入する。センス方向のＶａｔ遺伝子はｐ３５Ｓプロモーターの後に導入する。ベクターｐＢｉｎ６１は、根頭癌腫病菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の様々な株（ＬＢＡ４４０４，Ｃ５８Ｃ１−ｐｃｈ３２）に導入する。
【０１０９】
他の方法としては、Ｖａｔ遺伝子の上流と下流を含んだ約２．５ｋｂの長さの完全なゲノムＤＮＡを、プロモーターと調節配列の存在を確実に存在させるために、ベクターＳＬＪ７２９２（ＪＯＮＥＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１，２８５−３０２９７，１９９２）とｐＢｉｎ  １９（ＢＥＶＡＮ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ１２：８７１１‐８７２１，１９８４）の平滑末端に導入する。Ｖａｔ遺伝子を含むバイナリーベクターＳＬＪ７２９２とｐＢｉｎ  １９を、根頭癌腫病菌の様々な株（ＬＢＡ４４０４、Ｃ５８Ｃ１‐ｐｃｈ３２、Ｃ５８Ｃ１‐ｐＭＰ９０）（ＳＣＨＷＥＩＴＺＥＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ，４（２），１９６−２０４，１９８０；ＧＯＯＤＮＥＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４（５５５０），２３２３−２３２８，２００１）、またはＣ５８ｐＧＶ２２６０（ＤＥＢＬＡＥＲＥ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３，４７７７−４７８８，１９８５）に導入する。
【０１１０】
表３は植物に応じて用いる構成を示す。
【０１１１】
【表３】
2007527694.tif 000004
【実施例６】
【０１１２】
メロンにおける機能的有効性の検証
【０１１３】
・遺伝子的形質転換したメロンの植物体を得る
【０１１４】
一連の手順は、ＧＵＩＳ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｔｉａ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ，８４，９１−９９，２０００）のものを用いた。
【０１１５】
品種Ｖｅｄｒａｎｔａｉｓ（ＶＩＬＭＯＲＩＮ）の感受性のあるメロンの葉の若い外植体を、根頭癌腫病菌（１０6から１０8細胞／ｍＬ）の懸濁液の中で３０分間、攪拌しながらインキュベートする。例５で説明した構成で形質転換を行う。
【０１１６】
それから、形質転換されている可能性のある外植体を、続いてワットマン紙Ｎｏ．１の上に１０分間移し、つぎに、１μＭの６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、１μＭの６−（ｇ，ｇ−ジメチルアリルアミノ）−プリン（２ｉＰ）、０．２ｍＭのアセトシリンゴン、そして０．７ｇ・Ｌ-1の寒天を含む共培養培地で、２７℃の暗所で２日間インキュベートする。
【０１１７】
いくつかの修正を加え、ＫＡＴＨＡＬ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，７，４４９−４５１，１９８８）が説明する条件を用いて葉の植体を再生させる。葉の外植体は、１μＭの６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、１μＭの６−（ｇ，ｇ−ジメチルアリルアミノ）−プリン（２ｉＰ）を加え、１００ｍｇ・Ｌ-1のカナマイシンと２２５ｍｇ・Ｌ-1のｔｉｍｅｎｔｉｎを含む、寒天０．７ｇ・Ｌ-1の中で固化させた、ＭＵＲＡＳＨＩＧＥ＆ＳＫＯＯＧ（ＭＳ）培地（Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ，１５，４７３−４９７，１９６２）で構成される再生培地の上に移す。
【０１１８】
３週間の培養の後、葉状の外植体に形成された芽を切除し、１μＭのＢＡＰと０．３μＭのジベレリン酸（ＧＡ３）を加え、１００ｍｇ・Ｌ-1のカナマイシンと２２５ｍｇ・Ｌ-1のｔｉｍｅｎｔｉｎを含む、寒天０．７ｇ・Ｌ-1の中で固化させた、ＭＳ培地で構成される成長培地の上でインキュベートする。
【０１１９】
それから、芽を、成長調整剤を含まず、同量の抗生物質と寒天を含むＭＳ培地で構成される発根培地の中に置く。
【０１２０】
発根が現れるとすぐに、それらの幼植物をＧＵＩＳ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｔｉａ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ，６９，１９９−２０６，１９９７）に従って順化させ、ＡＹＵＢ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４，８６２−８６６，１９９６）が説明している培養手順により温室に移す。
【０１２１】
再生し発根した植物体をフローサイトメトリーによって分析する。二倍体の植物体だけを保存し、導入遺伝子の存在を検証するためにＰＣＲにより分子レベルで研究する。
【０１２２】
Ｖａｔ遺伝子の存在を明らかにするために、実施例１で説明したような、Ｖａｔのプロモーターのところに位置する一対のＶ１６８４プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３および１４）とＶａｔ遺伝子の中央に位置する一対のプライマーＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２３および２４）を用いる。
【０１２３】
ＰＣＲの条件は以下の通りである：
反応混合物：ｑｓｐ水１０μＬ；１０×緩衝剤１μＬ；ｄＮＴＰ’ｓ（４ｍＭ）０．６μＬ；プライマー１（１０ｐＭ）０．４μＬおよびプライマー２（１０ｐＭ）０．４μＬ；Ｔａｋａｒａ  Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．０８μＬ；ＤＮＡ１．２μＬ。
・用いたＰＣＲ条件：
手順１：９４℃で２分
手順２変性：９４℃で３０秒
手順３対合：６０℃で４５秒
手順４伸長：７２℃で２分
手順５：手順２から手順４までを３０回繰り返す
手順６：７２℃で１０分
【０１２４】
ｂ−カナマイシン耐性遺伝子ｎｐｔＩＩの存在を明らかにするために、プライマー
Ｋａｎａ  ＩＩ：５’−ＣＣＧＧＣＴＡＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）および
Ｋａｎａ  ＩＩＩ：５’−ＧＣＧＡＴＡＧＡＡＧＧＣＧＡＴＧＣＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）
を、以下の条件で用いた。
反応混合物：ｑｓｐ水１０μＬ；１０×緩衝剤１μＬ；ＭｇＣｌ2（２５ｍＭ）０．６μＬ；ｄＮＴＰ’ｓ（４ｍＭ）０．２μＬ；プライマー１（１０ｐＭ）０．４μＬおよびプライマー２（１０ｐＭ）０．４μＬ；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．０４μＬ；ＤＮＡ１．２μＬ。
・用いたＰＣＲ条件：
手順１：９４℃で２分
手順２変性：９４℃で３０秒
手順３対合：５３℃で１分
手順４伸長：７２℃で１分
手順５：手順２から手順４までを３０回繰り返す
手順６：７２℃で１０分
【０１２５】
ｃ−研究対象の組織中に残った細菌の存在による増幅は一切発生していないことを検証するために、根頭癌腫病菌のＣ５８株の染色体ＤＮＡに特有のＰｉｃＡ+プライマー（ＡＴＧＣＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＧＴＣＴＴＣＧＡＧ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）およびＰｉｃＡ-プライマー（ＧＡＣＧＣＡＡＣＧＣＡＴＣＣＴＣＧＡＴＣＡＧＣＴ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）を用いてＰＣＲで植物体も試験する。反応混合物とＰＣＲ条件は、ｎｐｔＩＩ遺伝子に対して使用したものと同一である。
【０１２６】
例５に示した様々な構成から、メロンでいく通りもの形質転換を行う。そのような形質転換の結果を表４に示す。
【０１２７】
【表４】
2007527694.tif 000005
【０１２８】
遺伝子型ＶｅｄｒａｎｔａｉｓのＶａｔ遺伝子をもつ二つの形質転換体は、最初の手順によって得られた。
【０１２９】
発根した二倍体の植物体を抗生物質を除いた培地の上でｉｎ  ｖｉｔｒｏで発根させ、つぎに分離して、環境制御した部屋（１８℃で８時間の夜‐２４℃で１６時間の昼）で４週間、生物学的試験の前に順化させる。
【０１３０】
他の方法として、欧州特許第０４１２９１２号明細書（ＬＩＭＡＧＲＡＩＮ）に記載されている子葉を有する外植体の遺伝的形質転換方法にも従った。Ｃ１Ｔｚ１のメロン遺伝子型の約１００００の外植体を、構成ｐＶａｔ−Ｖａｔ遺伝子の構成を有する細菌Ｃ５８Ｃ１ｐｍｐ９０で感染させた。１００ｍｇ・Ｌ-1のカナマイシンを与えた培地上で再生し発根した植物体をＰＣＲで分析して、導入遺伝子ｎｐｔＩＩおよびＶａｔの存在を検証した。用いたプライマーとＰＣＲ条件は上記に説明した通りのものである。２７の形質転換の事象を、ｎｐｔＩＩ遺伝子をもつものとして識別した。
【０１３１】
結局のところ、遺伝子型ＶｅｄｒａｎｔａｉｓのＶａｔ遺伝子をもつ２つの形質転換体が最初の手順により得られ、２７の形質転換体がその第二の手順により得られた。
【０１３２】
・ワタアブラムシによるコロニー形成に対する耐性の測定
【０１３３】
メロンの上で収集され（Ｇ．ＬＡＢＯＮＮＥ，ＩＮＲＡ，Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ）、クローン１３と記載された（ＬＵＰＯＬＩ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｉａ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ  ｅｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔａ，６５，２９１−３００，１９９２）、Ｎｍｌクローンを用いる。ワタアブラムシを培養室（２４℃で１６時間の昼そして１８℃で８時間の夜）内のメロンＶｅｄｒａｎｔａｉｓの上で育てる。
【０１３４】
遺伝的形質転換の実験により、および比較対照用の植物体をｉｎ  ｖｉｔｒｏで発芽させることにより生じた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの植物体を、ｉｎ  ｖｉｖｏで１０日間、順化させた。
【０１３５】
ワタアブラムシによるコロニー形成に対する耐性の試験を、ＰＩＴＲＡＴおよびＬＥＣＯＱに適応させた（Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，７０，９５８−９６１，１９８０）。無翅成虫を細いピンセットで採取し、ペトリ皿の中で１時間絶食させる。試験対象のそれぞれの植物体の広げた二枚の葉の上に十匹のアブラムシを置く。置いてから４８時間後に、葉の上に定着したアブラムシの数を適合できるようにする。４８時間目で、感受性のある植物の上に置かれた１０匹のアブラムシが定着しているのに対し、耐性のある植物の上には、（一般的には５を下回る数の）数匹しか葉の上に残っていない。つぎに蔓延させてから７日後に、成虫と幼虫のアブラムシの数、並びにそれらの成育段階を観察する。感受性のある植物では、この期間が経過した後、新しい世代のアブラムシが（平均して１００匹を越える数）発生し、数多くの幼虫が（同じく１００を越える数）存在している。耐性のある植物では、（一般的には５未満の数の）数匹の成虫が葉の上に残っており、余り成長していない幼虫が（３０を下回る数の）数匹だけ存在している。それぞれの試験において、感受性のあるものとして比較対照に用いるのは品種Ｖｅｄｒａｎｔａｉｓであり、耐性のあるものとして比較対照用に用いるのは、Ｖａｔ遺伝子座についてのホモ接合体である品種Ｍａｒｇｏｔである。
【０１３６】
得られた結果を表５と６に示す。
【０１３７】
【表５】
2007527694.tif 000006
【０１３８】
【表６】
2007527694.tif 000007
【０１３９】
他の方法として、試験対象の各植物の葉に１０匹ではなく３匹のアブラムシを置いてもよい。それらのアブラムシはケージに入れてもいれなくてもよい。アブラムシを置いてから七日後に、植物の上にいるアブラムシの成虫と幼虫の数を数える。
【０１４０】
そうして得られた結果を表７に示す。
【０１４１】
【表７】
2007527694.tif 000008
【０１４２】
これらの結果により明らかなように、クローンＭ１、Ｍ４、Ｖ２．１５、Ｖ３．１、Ｖ３．６、Ｖ４．１８およびＶ７．１９は、アブラムシに対して耐性がある。
【０１４３】
・ワタアブラムシによるウイルス感染に対する耐性の測定
【０１４４】
ウイルス感染の試験は、主にＰＩＴＲＡＴとＬＥＣＯＱが説明しているように行う（Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，７０，９５８−９６１，１９８０）。ＣＭＶ（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ）のＩ１７Ｆ株を、形質転換植物ならびに比較対照用のＶｅｄｒａｎｔａｉｓ系統およびＭａｒｇｏｔ系統におけるワタアブラムシによる伝搬の試験に用いてもよい。ウイルスを機械的に接種することにより、メロンＶｅｄｒａｎｔａｉｓで増殖させる。１時間の絶食の後に、ウイルスに感染させてペトリ皿に置いた葉の上にアブラムの成虫を５分間置いて、ウイルスを付着させる。それからそれらのアブラムシを試験対象の植物の上に移す。病原体を有するアブラムシを置いて約１５分経過後に、そのアブラムシ達をピンセットで取り除き、植物を殺虫剤で処理して、培養室（２４℃で１２時間の昼そして１８℃で１２時間の夜）に置く。接種から十五日後、ワタアブラムシによるＣＭＶの感染に感受性のある植物は重篤なモザイク症状を進行している。耐性のある植物は何の症状も示しておらず、そのような植物でＥＬＩＳＡを行ってもウイルスは検出されない。ＥＬＩＳＡ試験は、ＣＬＡＲＫおよびＡＤＡＭＳが記述した手順（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，３４，４７５−４８３，１９７７）に従って、ＣＭＶのキャプシドタンパク質に対する抗体（フランス、ボルドーのＬＣＡ社提供のＡＤＧＥＮ）を用いて行う。
【実施例７】
【０１４５】
トマトにおける機能的有効性の確認
【０１４６】
トマトの形質転換
【０１４７】
形質転換の手順は、Ｆｅｒｕｍ（ＩＮＲＡ系統）およびＭｏｎｔｆａｖｅｔ  ６３．５（Ｆ１雑種）の複数の遺伝子型の子葉に基づき、Ｐ．Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ（ＩＮＲＡ，Ｍｏｎｔｆａｖｅｔ，Ｆｒａｎｃｅ）がＨＡＭＺＡおよびＣＨＵＰＥＡＵ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．，４４，１８３７−１８４５，１９９３）のものを適合させたものである。
【０１４８】
形質転換のために用いる株は例５で説明されているものである。再生させて発根させた植物体をフローサイトメトリーで分析し、二倍体の植物体だけを保存する。
【０１４９】
ｎｐｔＩＩ遺伝子とＶａｔ遺伝子を含むインサートが存在すること、並びに再生した植物体のゲノムの中でそれが発現していることを検証するための分子分析を、ＰＣＲとＲＴ−ＰＣＲで行う。用いたＰＣＲ条件は例６で説明されているものと同様である。四対のプライマーを用いた：Ｖａｔプロモーターのところに位置するＶ１６８４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４）、Ｖａｔ遺伝子の中央に位置するマーカーＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３とＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４）およびマーカーＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１とＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２）のプライマー対、およびその遺伝子の３’に位置する断片を増幅するプライマーＶ６３２。プライマーＶ６３２の配列は以下の通りである：
Ｖａｔ６３２Ｒ：ＣＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＡＴＴＣＡＴＡＴＣＴＴＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）
Ｖａｔ６３２Ｆ：ＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＴＡＣＴＧＡＴＴＣＣＡＡＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）。
【０１５０】
トマトについて、（表８のような）様々な構成に基づいて、そして二つの異なる遺伝子型ＦｅｒｕｍおよびＭｏｎｔｆａｖｅｔ（ＩＮＲＡ）について、複数の形質転換を行う。
【０１５１】
【表８】
2007527694.tif 000009
【０１５２】
（例６で説明した条件で）マーカーＤのプライマー対を用いてＴ７植物体と比較対照用のＦｅｒｕｍについてＲＴ−ＰＣＲにより分子分析を行うことにより、形質転換をした植物体（Ｔ７）におけるＶａｔ遺伝子の発現を明らかにすることができた。
【０１５３】
遺伝子型Ｍｏｎｔｆａｖｅｔの形質転換をした植物体について用いた全てのプライマーにより、その導入遺伝子の全体が組み込まれた様々な外植体から生じる１４の植物体を決定することができる。
【０１５４】
結局のところ、遺伝子型Ｆｅｒｕｍの植物体２つと遺伝子型Ｍｏｎｔｆａｖｅｔ６３．５の植物体１４個にＶａｔ遺伝子が組み込まれた。
【０１５５】
形質転換をした植物体のみを発根させ、分離して、環境制御した部屋（夜は１８℃で８時間−昼は２４℃で１６時間）で４週間、生物学的試験の前に順化する。今日までのところ分析したのはＦｅｒｕｍの植物体二つのみである。
【０１５６】
・ウイルス感染の測定
【０１５７】
ワタアブラムシの系統（Ｎｍｌ）とワタアブラムシによる感染の手順は、メロンでのウイルス感染に対する耐性の試験と同一のものを用いる。選択したウイルスは、メロンとトマトに感染するＩ１７Ｆ株であるＣＭＶ（キュウリモザイクウイルス）である。この株は、機械的に接種するか、モモアカアブラムシによって媒介される場合に（ＪＡＣＱＵＥＭＯＮＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，８（１），８５−９４，２００１）、効率的にトマトに感染させることができる。このウイルスをメロンＶｅｄｒａｎｔａｉｓの幼植物の上で増殖させる。ワタアブラムシによるＣＭＶの付着を、感染したメロンの幼植物の上で行う。伝搬は病原体を有する１０匹のアブラムシを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られた５葉期のトマトの幼植物の上に、または苗床から得られた２葉期の幼植物（播種の約５週間後）の上に置くことで行われる。それぞれの遺伝子型（比較対照用トマトと形質転換トマト）についての伝搬率は、２０の植物体に少なくとも２回繰り返すことで評価する。感受性のある比較対照用の品種は、品種Ｆｅｒｕｍである。
【０１５８】
ＥＬＩＳＡテストは、ＣＬＡＲＫおよびＡＤＡＭＳが記述した手順（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３４，４７５−４８３，１９７７）に従って、ＣＭＶのキャプシドタンパク質に対する抗体（フランス、ボルドーのＬＣＡ社提供のＡＤＧＥＮ）を用いて行う。
【０１５９】
少数の植物体について得られた最初の結果を表９に示す。
【０１６０】
【表９】
2007527694.tif 000010
【０１６１】
一部が欠けたＶａｔ遺伝子を有する符号Ｔ１の植物体と感受性のある比較対照用の植物体は、１００％感染した。符号Ｔ２およびＴ７の形質転換した幾つかの植物体でウイルスは伝搬されておらず、このことは、Ｖａｔを組み込んだトランスジェニックトマトにおいて、Ｖａｔ遺伝子がワタアブラムシによるウイルス伝搬に対する耐性の効果を有すること暗示する。
【実施例８】
【０１６２】
綿花における機能的有効性の確認
【０１６３】
綿花の形質転換
【０１６４】
綿花（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ  Ｌ．）の遺伝的形質転換は、ＳＨＯＥＭＡＫＥＲ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，３，１７８−１８１，１９８６）およびＴＲＯＬＩＮＤＥＲおよびＧＯＯＤＩＮ（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，６，２３１−２３４，１９８７）によって発表された体細胞胚形成法による形質転換体の再生に基づいて行う。この形質転換方法で形質転換ベクターとして用いる根頭癌腫病菌は、ＵＭＢＥＣＫ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５，２６３−２６６，１９８７）およびＦＩＲＯＯＺＡＢＡＤＹ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０，１０５−１１６，１９８７）によるものに、上記の出版物との関係で幾つかの修正を加えて適合させたものである。その形質転換に用いるアグロバクテリアの株は、例５で説明したものと同様であり、そして特にＬＢＡ４４０４株、Ｃ５８Ｃ１ｐＧＶ２２６０株およびＣ５８Ｃ１ｐＭＰ９０株である。最初の株は、Ｎｏｓプロモーターの制御下にあるカナマイシン耐性遺伝子および自身のプロモーターの制御下にあるＶａｔ遺伝子でとりわけ構成されたｐＳＬＪ７２９２プラスミド、あるいは３５Ｓプロモーターの制御下にあるＶａｔ遺伝子を含むｐＢｉｎ６１プラスミドを含む。他の二つの株は、Ｎｏｓプロモーターの制御下にあるカナマイシン耐性遺伝子および自身のプロモーターの制御下にあるＶａｔ遺伝子でとりわけ構成されたｐＢｉｎ１９プラスミドを有する。
【０１６５】
・綿花の再生
【０１６６】
無菌状態で栽培された若い植物体から採取した胚軸（品種Ｃｏｋｅｒ  ３１０）の外植体を用いる。それらをアグロバクテリアの存在の下に２０分間置き、つぎにＭＵＲＡＳＨＩＧＥ＆ＳＫＯＯＧ（ＭＳ）の無機元素、３０ｇＬ-1のグルコース、ＭＯＲＥＬ＆ＷＥＴＭＯＲＥ（Ａｍ．Ｊ．Ｂｏｔ．３８，１４１−１４３，１９５１）のビタミン、０．１から０．０５ｍｇＬ-1の２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、そして０．１から０．０１ｍｇＬ-1のカイネチンから構成される培養培地（基礎培地）で、４８時間培養する。この培地は、細菌の成育を止めるための選択剤も抗生物質も含まない。この共培養期間の後、同一の培地に濃度が２５ｍｇＬ-1のカナマイシンと濃度が５００ｍｇＬ-1のセフォタキシムを加えたものに、外植体を移植する。続いて、１５日ごとに同様の培地に外植体を移植する。３から５週間培養した後、形質転換細胞の増殖に由来するカルスが現れる。それらの大きさが直径約０．５ｃｍに達すると、それらを単離して、セフォタキシムの濃度を半分にし、成長物質（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸およびカイネチン）の濃度も減らした同様の培地に移植する。それからそのような移植を、胚組織が現れるまで、２週間毎に行う。カルスの状態に応じて、成長物質の濃度が変わる一続きの培地を用いてもよい。胚組織を、成長物質を加えない基礎培地で単離する。この培地で、一定割合の前胚を幼植物に成長させる。このような幼植物を、成長物質を除いてグルコースの代わりにショ糖を入れた、液状の基礎培地によって「湿らせた」バーミキュライトの担体の上に移す。それらが約４−６ｃｍに達すると、それらをＳ２型の温室に直接移す。
【０１６７】
再生した植物体のゲノムにおいてＶａｔ遺伝子が存在し、またそれが発現していることを検証するために、ＰＣＲによって分子解析を行う。ｎｐｔＩＩ遺伝子を増幅するために、一対のプライマーを用いる。Ｖａｔ遺伝子には二対のプライマーを用いた：遺伝子の３’に位置するＶａｔ断片を増幅する第一の対は６３２と呼ばれ、遺伝子の中央に位置する断片を増幅する第二の対はＬＲＲと呼ばれる。
【０１６８】
ｎｐｔＩＩ遺伝子を増幅するために用いるプライマー対の配列は、以下の通りである：
Ｋａｎａ  ＩＩＩ：ＧＣＧＡＴＡＧＡＡＧＧＣＧＡＴＧＣＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）
ｋａｎａ  Ｒ：ＣＣＧＧＣＴＡＣＣＴＧＣＣＡＴＴＣＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）
【０１６９】
プライマー対６３２の配列は以下の通りである：
Ｖａｔ６３２Ｆ：ＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＴＡＣＴＧＡＴＴＣＣＡＡＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）
Ｖａｔ６３２Ｒ：ＣＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＡＴＴＣＡＴＡＴＣＴＴＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）
【０１７０】
プライマー対ＬＲＲの配列は以下の通りである：
ＬＲＲＦ：ＧＴＴＧＴＴＧＡＧＡＧＣＡＡＴＡＧＴＧＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）
ＬＲＲＲ：ＣＣＴＴＡＧＡＧＡＡＧＡＡＴＧＡＡＧＴＣＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）
【０１７１】
どのようなプライマーを用いるにせよ、ＰＣＲの条件は以下の通りである：
２５μＬの反応培地に、
水９．５μＬ
１０×緩衝剤：２．５μＬ
ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）：２μＬ
オリゴ１（１０μＭ）：２．５μＬ
オリゴ２（１０μＭ）２．５μＬ
Ｔａｑ（５ｕ／μＬ）：０．２５μＬ
ＤＮＡ：５μＬ
スケジュール：
９４℃で３分
つぎに、９４℃で３０秒−５９℃で４５秒−７２℃で４５秒を３５回繰り返す。
【０１７２】
最終的には８カ月後、形質転換された１２本の植物体を温室に移した：それらの植物体は、５つの異なる胚形成系統に由来するものである。それらのうちの２本は、上記に示したＰＣＲ条件でＶａｔ遺伝子の増幅が得られた２つの異なる系統に由来するものである。他のものは、遺伝子ｎｐｔＩＩの増幅が得られた系統に由来するものではあるが、Ｖａｔ遺伝子の増幅が得られた系統に由来するものではない。基質の量を変化させることで、前もって陰性であることが判明している抽出物によって適度な大きさの増幅を実現することが可能であったという限りにおいて、それらが偽陰性を示しているということはあり得ないことではない。
【０１７３】
ワタアブラムシによる感染に対する耐性の測定
【０１７４】
（レユニオン島原産の）綿花で採取したワタアブラムシのクローンを用いて、綿花の上に維持する。実際、明らかになっているところによると、ワタアブラムシの個体群は、宿主となる植物に応じて遺伝的な構造が強化されるということである（ＶＡＮＬＥＲＢＥＲＧＨＥ−ＭＡＳＵＴＴＩ  ｅｔ  ＣＨＡＶＩＧＮＹ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｃｏｌｏｇｙ，７，９０５−９１４，１９９８）。試験はメロンについてのものと同様の手順に従って行うが、植物体の培養条件は綿花のものに適合させる。綿花を維持する温室のタイプは、２８℃から３０℃の温度であるＳ２であり、補助照明の強度と継続時間は１２−１２の光周期に合わせる。
【０１７５】
メロンの試験と同じように行った耐性の評価に加え、形質転換した植物体における（幼虫の様々な段階の長さ、成虫の生存期間、本来の成長率などの）アブラムシの一生にわたる記録（ＸＩＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｉａ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ  ｅｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔａ，９０，２５−３５，１９９９）の更なる精確な評価も、ヘテロログの状態の、ワタアブラムシに対するＶａｔ遺伝子の、場合によっては弱い効果を検出するために、行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】クローンＣ７．１の配列。
【図２】ＶａｔのｃＤＮＡとＶａｔ−ｌｉｋｅのｃＤＮＡとの間の配列のアラインメント。
【図３】Ｖａｔタンパク質配列とＶａｔ−ｌｉｋｅタンパク質配列のアラインメント。
【図４】各植物体で生じた組換えの位置を示した図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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