(57)【要約】【課題】  本発明の目的はエンドセリン−１の過剰産生を抑制し皮膚の美白剤、高血圧症、急性心筋梗塞、肺高血圧症、レイノー症候群又はアテローム性動脈硬化症、虚血性腎疾患の予防・治療剤に有効な製剤を得ることにある。【解決手段】  出芽酵母の抽出物、アヤメ科アヤメ属の植物の根の抽出物、生姜の抽出物、菖蒲の抽出物、ウスベニアオイ抽出物、クマザサ抽出物より選ばれる１種又は２種以上の植物抽出物を有効成分として含有することにより目的を達することがわかった。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
出芽酵母の抽出物、アヤメ科アヤメ属の植物の根の抽出物、生姜の抽出物、菖蒲の抽出物、ウスベニアオイ抽出物、クマザサ抽出物より選ばれる１種又は２種以上の植物抽出物を有効成分として含有することを特徴とするエンドセリン−１抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドセリン−１の過剰産生を抑制し、皮膚の美白剤、高血圧症、急性心筋梗塞、肺高血圧症、レイノー症候群又はアテローム性動脈硬化症、虚血性腎疾患の予防・治療剤として利用できるな製剤を得ることにある。
【背景技術】
【０００２】
エンドセリン−１は血管内皮細胞の産生する強力な血管収縮ペプチドで２１残基のアミノ酸からなる。エンドセリン−１は血管内皮細胞に存在するエンドセリン変換酵素の働きでビッグエンドセリンから生成する。エンドセリン−１は標的細胞のエンドセリン受容体を介してホスホリパーゼＣの活性化、カルシウムチャンネルの開口など多様な細胞内シグナル伝達系を活性化する。その結果、ホルモン・神経伝達物質分泌調節、細胞増殖・分化作用などさまざまな作用が奏される。一般的に、エンドセリン−１の濃度上昇は高血圧症や心疾患などの原因となる。
また、エンドセリンの増大する放出又は異常な放出は、末梢、腎臓及び脳の血管における持続的な血管収縮を引き起こし、病理学的状態につながることがある。高められたエンドセリン血中濃度が高血圧症、急性心筋梗塞、肺高血圧症、レイノー症候群又はアテローム性動脈硬化症の患者において及び喘息症の気道において見られることが文献に報告されている。
また、虚血性腎疾患の予防・治療剤としても利用されている。（特許文献１〜４参照
【０００３】
また、エンドセリン−１は、紫外線が肌にあたると、表皮角化細胞（ケラチノサイトとも言う）でエンドセリン−１が産生され（非特許文献１参照）、産生されたエンドセリン−１は、表皮メラニン細胞（メラノサイトとも言う）を刺激して、シミ、ソバカスの原因となるメラニンを盛んに合成させる。したがって、表皮角化細胞のエンドセリン−１の合成を抑制することができればシミ、ソバカスを治療または予防することができる
以上のように高血圧症、急性心筋梗塞、肺高血圧症、レイノー症候群又はアテローム性動脈硬化症、虚血性腎疾患の予防・治療剤として利用されている。
【０００４】
このようにエンドセリン−１の過剰産生は、色素細胞の過剰増殖につながり、メラニン産生を亢進させ、シミ、ソバカス、くすみ等の原因となると考えられる。したがって、これらの発現を抑制することは、色素細胞の増殖を抑制し、皮膚におけるメラニンの過剰産生を抑制し、日焼け後の色素沈着、シミ、ソバカス等の予防又は抑制に有用である。
【０００５】
出芽酵母は出芽によって増える酵母の総称であるが、Saccharomyces cerevisiaeが代表的なものである。
パンや酒（ビール、ワイン、清酒など）を作る際に用いられており、人類にとって最も馴染みの深い有用微生物の一つである。出芽酵母の抽出物は健康食品の原料としても注目されている。
また、メラニン生成抑制外用剤、角質層のターンオーバー速度改善剤、ペルオキシナイトライト阻害剤等の用途が知られ、（特許文献５〜７参照）化粧料の原料として抽出物が市販されている。
【０００６】
アヤメ科アヤメ属の根は、歯磨きなどの香料や健胃剤等の薬用として用いられている。
さらに発毛抑制剤、メラニン生成抑制剤、キネシン抑制剤等の用途が知られ、（特許文献８〜１０参照）化粧料の原料として抽出物が市販されている。
なお、アヤメ科アヤメ属の植物としては以下の植物が例示できる。
シロバナイリス(Iris florentina) 、ドイツアヤメ(I. germanica)、ハナショウブ(I. ensata)、ヒオウギアヤメ(I. setosa)、I. pallida、I. versicolor
【０００７】
生姜は、ショウガ(Zingiber officinale)の根のことで、料理、菓子、飲み物等々広く利用されている。生薬としては、発散作用、健胃作用、鎮吐作用が知られている。
また、美白化粧料、育毛剤、エラスターゼ阻害剤等の用途が知られ、（特許文献１１〜１３参照）化粧料の原料として抽出物が市販されている。
【０００８】
菖蒲はショウブ（Acorus calamus）の根の乾燥したのもので、生薬として、鎮痛・血行促進の用途で用いられる。
また、養毛・育毛料、ニキビ予防治療剤、アロマターゼ活性化剤等の用途が知られ、（特許文献１４〜１６参照）化粧料の原料として抽出物が市販されている。
【０００９】
ウスベニアオイ（学名: Malva sylvestris、又はMalva mauritiana L.）は、アオイ科ゼニアオイ属の多年草で、マロウとも呼ばれている。
若葉と花はサラダやハーブティに、葉と根は茹でて、野菜としても利用できる。民間薬として、咳や胃炎に効果があるとされている。
また、保湿性化粧料、抗男性ホルモン剤、ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、メイラード反応阻害剤、及び該メイラード反応阻害剤等の用途が知られ、（特許文献１７〜２０参照）化粧料の原料として抽出物が市販されている。
【００１０】
クマザサ（学名：Sasa veitchii）は、イネ科ササ属の植物で、乾燥した葉は煎じて茶にされたり、エキスが健康食品として市販されている。これは高血圧、糖尿病などに効果があるとされる。
また、アンドロゲン受容体結合阻害剤、痒み及び／又は痛み抑制剤、肌の保湿効果及び肌の細胞間脂質であるセラミドの合成促進作用の用途等が知られ、（特許文献２１〜２３参照）化粧料の原料として抽出物が市販されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開平０３−１２８３３０号公報
【特許文献２】特開２００８−０９４７３７号公報
【特許文献３】特開２００７−２２３９６５号公報
【特許文献４】特開２００７−１３１６４５号公報
【特許文献１】特開平０６−２１１６３９号公報
【特許文献２】特開平０６−２５６１５５号公報
【特許文献３】特開２００２−３２６９２２号公報
【特許文献４】特開平１１−３２２５４８号公報
【特許文献５】特開平１１−３３５２３３号公報
【特許文献６】特開２０１５−０３０７２０号公報
【特許文献７】特開平０８−０９２０５６号公報
【特許文献８】特開平１０−２１８７３７号公報
【特許文献９】特開２０００−１１９１８９号公報
【特許文献１０】特開平０８−０７３３２４公報
【特許文献１１】特開２００１−３２２９４３公報
【特許文献１２】特開２００５−３４３８７３公報
【特許文献１３】特開昭６０−２５８１０４号公報
【特許文献１４】特開平０５−０７０３６０号公報
【特許文献１５】特開２０１１−００１３２８号公報
【特許文献１６】特開２０１２−０６７０６１号公報
【特許文献１７】特開平０１−００３１２６号公報
【特許文献１８】特開平１０−１５８１７７号公報
【特許文献１９】特開平１１−１９９４６７号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ［１９９５，  ３７１（２）：１８８−１９０］
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、エンドセリン−１の過剰産生を抑制し、皮膚の美白剤、高血圧症、急性心筋梗塞、肺高血圧症、レイノー症候群又はアテローム性動脈硬化症、虚血性腎疾患の予防・治療剤として利用できるな製剤を得ることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らが鋭意検討した結果、出芽酵母の抽出物、アヤメ科アヤメ属の植物の根の抽出物、生姜の抽出物、菖蒲の抽出物、ウスベニアオイ抽出物、クマザサ抽出物より選ばれる１種又は２種以上の植物抽出物が本発明の課題を解決する手段として有効なことがわかった。
用いる部位は特に限定はないが、ウスベニアオイは花、クマザサは葉、がよく用いられる。
出芽酵母、アヤメ科アヤメ属の植物の根、生姜、菖蒲、ウスベニアオイ、クマザサを、抽出効率を考え、細切、乾燥、粉砕等の処理を行った後に抽出を行うことが好ましい。
乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。
前記抽出に用いる溶媒としては、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合液を用いる。
前記抽出溶媒として使用し得る水としては、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。従って、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
前記親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられ、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。
なお、前記水と親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜２０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１〜１５質量部添加することが好ましい。多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜２０質量部添加することが好ましい。
抽出に使用する溶媒の量は、原料となる植物に対して望ましくは５〜３００倍量程度、さらに望ましくは１０〜１００倍量程度が良い。さらに抽出効率を上げるため、抽出溶媒中で撹拌やホモジナイズしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが適切である。
尚、抽出操作は１回のみの操作に限定されるものではない。抽出後の残渣に再度新鮮な溶媒を添加し、抽出操作を施すこともできるし、抽出溶媒を複数回抽出原料に接触させることも可能である。
必要ならば、その効果に影響のない範囲で更に脱臭、脱色等の精製処理を加えても良く、エバポレーターのような減圧濃縮装置や加熱による溶媒除去などにより、濃縮することができる。
また、この抽出物を合成吸着剤（ダイアイオンＨＰ２０やセファビースＳＰ８２５、アンバーライトＸＡＤ４、ＭＣＩｇｅｌＣＨＰ２０Ｐ等）やデキストラン樹脂（セファデックスＬＨ−２０など）、限外濾過等を用いてさらに精製することも可能である。
【００１５】
本発明の製剤は、経口、注射、外用のいずれでも薬効を発現するが、皮膚外用剤として用いるのが好ましい。皮膚外用剤には、皮膚化粧料、外用医薬部外品、医療用皮膚外用剤が含まれる。
上記の抽出物を製剤に固形分として０．００００１〜５０重量％、好ましくは０．０００１〜１０重量％配合する。
【００１６】
また、本発明の製剤には、上記成分の他に医薬品や化粧品の各種製剤において使用されている界面活性剤、油性成分、保湿剤、高分子化合物、紫外線吸収剤、抗炎症剤、殺菌剤、酸化防止剤、金属イオン封鎖剤、防腐剤、ビタミン類、色素、香料、水等を配合することができる。
【００１７】
上記界面活性剤としては、アニオン性、カチオン性、非イオン性、天然、合成のいずれの界面活性剤も使用できるが、皮膚に対する刺激性を考慮すると非イオン性のものを使用することが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えばグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、アルキルグリコシド等が挙げられる。
【００１８】
油性成分としては、油脂類、ロウ類、炭化水素類、高級脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、精油類、シリコーン油類などを挙げることができる。油脂類としては、例えば大豆油、ヌカ油、ホホバ油、アボガド油、アーモンド油、オリーブ油、カカオ油、ゴマ油、パーシック油、ヒマシ油、ヤシ油、ミンク油、牛脂、豚脂等の天然油脂、これらの天然油脂を水素添加して得られる硬化油及びミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド等の合成トリグリセリド等が；ロウ類としては、例えばカルナバロウ、鯨ロウ、ミツロウ、ラノリン等が；炭化水素類としては、例えば流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、セレシン、スクワラン、ブリスタン等が；高級脂肪酸類としては、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ラノリン酸、イソステアリン酸等が；高級アルコール類としては、例えばラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、２−ヘキシルデカノール等が；エステル類としては、例えばオクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、アジピン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、オレイン酸デシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル等が；精油類としては、例えばハッカ油、ジャスミン油、ショウ脳油、ヒノキ油、トウヒ油、リュウ油、テレピン油、ケイ皮油、ベルガモット油、ミカン油、ショウブ油、パイン油、ラベンダー油、ベイ油、クローブ油、ヒバ油、バラ油、ユーカリ油、レモン油、タイム油、ペパーミント油、ローズ油、セージ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ボルネオール、リナロール、ゲラニオール、カンファー、チモール、スピラントール、ピネン、リモネン、テルペン系化合物等が；シリコーン油類としては、例えばジメチルポリシロキサン等が挙げられる。これら上述の油性成分は一種又は二種以上を組み合わせて使用することができる。本発明においては、このうち特にミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド、ラノリン、流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、スクワラン、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、イソステアリン酸、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、コレステロール、オクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、ミリスチレン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル、ハッカ油、トウヒ油、ケイ皮油、ローズ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ゲラニオール、ピネン、リモネン、ジメチルポリシロキサンを使用することが好ましい。
【００１９】
本発明の製剤には、さらに下記のような成分を配合することができるが、その成分もこれらに限定されるものではない。
色素類；黄色４号、青色１号、黄色２０２号等の厚生省令に定められたタール色素別表Ｉ及びIIの色素、クロロフィル、リボフラビン、クロシン、紅花、アントラキノン等の食品添加物として認められている天然色素等。
ビタミン類；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ等。
その他；殺菌剤、防腐剤、その他製剤上必要な成分等。
【実施例】
【００２０】
以下に実施例を記載するが、なんら限定されるものではない。
【００２１】
実施例１（出芽酵母の抽出物）
サッカロミセスセレビシアエ（乾燥、粉砕品）２０ｇに、５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、エバポレートしたのち、これを凍結乾燥した。
【００２２】
実施例２（アヤメ科アヤメ属の植物の根の抽出物）
シロバナイリス(Iris florentina)（部位＝根、乾燥品）３０ｇに、４０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、エバポレートしたのち、これを凍結乾燥した。
これをエバポレートしたのち、凍結乾燥した。
【００２３】
実施例３（生姜の抽出物）
生姜（大生姜、根生姜、刻み）３０ｇに、３０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、エバポレートしたのち、これを凍結乾燥した。
【００２４】
実施例４（菖蒲の抽出物）
菖蒲（刻み、乾燥品）２０ｇに、３０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、エバポレートしたのち、これを凍結乾燥した。
【００２５】
実施例５（ウスベニアオイ抽出物）
ウスベニアオイ（部位＝花、ルーマニア産、乾燥品）１０ｇに、エタノール３００ｇ、精製水７００ｇを加え、撹拌しつつ５日間抽出した。
これをエバポレートしたのち、凍結乾燥した。
【００２６】
実施例６（クマザサ抽出物）
クマザサ（部位＝葉、栃本天海堂、刻み、乾燥品）２０ｇに、エタノール３００ｇ、精製水７００ｇを加え、撹拌しつつ５日間抽出した。
これをエバポレートしたのち、凍結乾燥した。
【００２７】
確認試験  エンドセリン−１発現抑制試験
２継代目のヒト包皮由来表皮細胞（クラボウ）を５０−７０％コンフルエントとなるようＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（フェノールレッド不含）で培養後、前日にカルシウム濃度を１．８ｍＭに変更したＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地に、実施例を添加し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ中で２日間培養した。
【００２８】
＜ＲＮＡの抽出＞
細胞からの Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出は、トリプシン／ＥＤＴＡで剥離後、ＳＶ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用い、プロメガ社の添付マニュアル（日本語プロトコールＮｏＴＭ０４８Ｊ２００１年６月作成）に従い調製した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用い算出した。
【００２９】
＜ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲ＞
２．５μｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡを使い、ＭＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＲＮａｓｅＨ−（東洋紡社）を用い、東洋紡社推奨プロトコール（ＴＯＹＯＢＯ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＦＯＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ２００８／２００９のページ１−４２）に従いＲＴ反応を行なった。
リアルタイムＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用い、以下のように実施した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法を用い（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ，東洋紡社）、７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍの操作マニュアル（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ＣＴ（△△ＣＴ）法（ｎ＝３）により遺伝子発現比較を実施した。内部標準としてＧＡＰＤＨを使用した。
【００３０】
＜使用プライマー＞
エンドセリン−１：フォワードプライマーがＴＣＣＴＣＴＧＣＴＧＧＴＴＣＣＴＧＡＣＴ（配列番号１）の塩基配列と、リバースプライマーがＣＡＧＡＡＡＣＴＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＧＴ（配列番号２）の塩基配列とのセット
ＧＡＰＤＨ：フォワードプライマーがＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴ（配列番号３）の塩基配列と、リバースプライマーがＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧ（配列番号４）の塩基配列とのセット
【００３１】
終濃度を実施例１〜３は０．０５％で、実施例４は０．１％で、実施例５〜６は０．２％で行った。確認試験の結果を図１に示す。
結果を見ると、実施例はいずれもエンドセリン−１の遺伝子発現を強く抑制することがわかった。
【００３２】
また実施例を配合した外用剤を作成し実際に使用してみた結果、エンドセリン−１の産生を抑制し、美白に有効なことがわかった。
また、内服剤として高血圧症、急性心筋梗塞、肺高血圧症、レイノー症候群又はアテローム性動脈硬化症、虚血性腎疾患の予防・治療剤に有効であった。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】終濃度を実施例１〜３は０．０５％で、実施例４は０．１％で、実施例５〜６は０．２％で行った確認試験の結果で、エンドセリン−１の遺伝子発現量変化を示す図である。  縦軸は実施例を添加していないコントロールの遺伝子発現量を１としてときの遺伝子発現量である。
【図１】
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【配列表】
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