(57)【要約】  本発明は、リガンドを検出するための方法、装置、及びキットを提供する。当該方法は、リガンドに対する受容体を含むアフィニティー基板にサンプル由来のリガンドを捕捉し、検出表面に当該捕捉リガンドを転写し、そして液晶を用いて当該検出表面上のリガンドを検出することを含む。従って、当該捕捉ステップは、検出ステップから切り離されている。
2007506982.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ: 
(a)  リガンドを有するか又は有すると思われるサンプルを、該リガンドと特異的に結合できる受容体を含むアフィニティー基板に接触させ(インキ付け); 
(b)  上記アフィニティー基板を検出表面に接触させ(スタンピング)、ここで受容体に結合されるリガンドの少なくとも一部が、当該検出表面に転写され； そして
(c)  上記検出表面上のリガンドの存在を検出する、
を含むリガンド検出方法であって、当該検出表面がさらに液晶を含む、前記方法。
【請求項２】
以下のステップ：
(d)  ステップ(a)の後にアフィニティー基板を洗浄し;
(e)  ステップ(b)の後に検出基板を洗浄し;又は
(f)  (d)と(e)の両ステップ
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記受容体又はリガンドが、生体分子、生体分子認識物質、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、毒素、金属、重金属、キレート剤、病原体、ウイルス、細菌、哺乳動物細胞又はその一部、核酸、核酸アナログ又はミミック、糖、抗体又はその機能断片、有機分子、脂質、リン脂質、薬物、化学薬品、殺虫剤、除草剤、又はそれらの断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アフィニティー基板が、ポリマー、シリカ物質、金属又は金属酸化物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記アフィニティー基板が、ポリジメチルシロキサン(ＰＤＭＳ)を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＰＤＭＳがさらにペプチド末端化している、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ペプチド末端化ＰＤＭＳが、リン酸化ペプチドを検出できる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＰＤＭＳがさらに抗体末端化している、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体末端化ＰＤＭＳが、タンパク質を検出できる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記受容体が、１以上の結合性部分を介してアフィニティー基板に結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプル中に存在するリガンドの量が定量される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記アフィニティー基板が、相異なる位置に配置される受容体のアレイを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アレイ内の受容体が、１以上のリガンドに対して特異性を有し、またここで前記液晶が、１以上のリガンドの存在を検出できる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アレイ内の受容体が、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の様々な残基におけるタンパク質リン酸化の存在を検出することができる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出表面が自己組織化単分子膜を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記自己組織化単分子膜が、アミン、アルカンチオール又は有機硫黄化合物を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記自己組織化単分子膜がステップ（ｂ）の前に酸で前処理される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記アフィニティー基板を検出表面に接触させるステップが、少なくとも部分的に湾曲したアフィニティー基板上で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記検出表面が、被捕捉リガンドの不存在下でホメオトロピック・アンカリングを引き起こす、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記液晶が、ネマティック液晶、スメクティック液晶、高分子液晶、リオトロピック液晶、クロモニック液晶、フラストレート液晶、サーモトロピック液晶、カラムナー液晶、ディスコティック・ネマティック液晶、カラミティック・ネマティック液晶、強誘電性液晶、ディスコイド液晶、又はコレステリック液晶を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記液晶が、ＵＶ光照射により前処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記液晶が、４−シアノ−４’−ペンチルビフェニル（５ＣＢ）又はドーピングされたその塩を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記液晶の配向が、光学的又は電気的に検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
支持体と該支持体上の第１層と該第１層上の自己組織化単分子膜とを含む検出表面。
【請求項２５】
前記自己組織化単分子膜が、アミン、アルカンチオール、又は有機硫黄化合物を含む請求項２４に記載の検出表面。
【請求項２６】
前記第１層が、金属層、ポリマー層、又はシラン層を含む、請求項２４に記載の検出表面。
【請求項２７】
前記金属層が、金、銀、銅、プラチナ、パラジウム、クロム、チタン、又はそれらの酸化物を含む、請求項２６に記載の検出表面。
【請求項２８】
前記検出表面上に液晶をさらに含む、請求項２４に記載の検出表面。
【請求項２９】
前記液晶が検出基板に熱でアニールされる、請求項２８に記載の検出表面。
【請求項３０】
以下の：
（ａ）  アフィニティー基板；
（ｂ）  アフィニティー基板から分離されている検出基板；  及び
（ｃ）  液晶
を含む、リガンド検出用キット。
【請求項３１】
リガンドに対して特異的である１以上の受容体をさらに含む、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
前記検出表面を化学修飾できる化合物をさらに含む、請求項３０に記載のキット。
【請求項３３】
前記化学修飾がアミンを含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記アフィニティー基板が１以上のリガンドを含む、請求項３０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リガンドをアフィニティー・マイクロコンタクトプリンティングし、そして液晶を用いてリガンドの有無を可視化することを使用して、関心のリガンド又は被分析物を検出する方法に関する。
【０００２】
関連文献
本発明は、2003年9月23日出願の米国仮特許出願第60/505,114号の優先権を主張する。当該出願は本明細書中に援用される。
【０００３】
米国政府の権利
本発明は次の米国政府機関の支援の下に実現した: Office of Naval Research(海軍研究局)、N00014-99-1-0250; NSF(全米科学財団)、DMR-0079983; NSF、ECS-0086902;及びNIH(国立衛生研究所)、5 T32 GM08349。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
背景
サンプル中の生体物質/化学物質の存在を検出する方法は分析化学や生化学の分野で絶えず発展してきた領域である。環境や生命体などを由来源とするサンプル中の様々な標的種の検出を可能にする様々な方法が開発されてきた。臨床場面では疾患の診断や治療法の処方前に標的種の検出がしばしば必要となる。
【０００５】
今日、サンプル中の標的種の存在を検出するための検査法にはいくつかのタイプがある。アッセイの通常のタイプはラジオイムノアッセイ(RIA)である。RIAはサンプル中のごく低濃度の抗体又は抗原を検出することができる高感度の方法である。RIAの原理は高アフィニティー抗体に対する放射性標識抗原と無標識抗原の競合結合である。一般に、抗体分子の抗原結合部位をちょうど飽和させるような濃度で標識抗原を抗体と混合する。次に未知濃度の無標識抗原を逓増量加える。抗体は標識抗原と無標識抗原とを区別しないため、両タイプの抗原は抗体上の空いている結合部位を求めて競合する。溶液中の遊離標識抗原の量を計測すれば、無標識抗原の濃度を求めることができる。Kuby J, Immunology, W.H. Freeman and Company, New York, NY (1991), pp. 147-150.
【０００６】
もう1つのタイプの検査法は酵素結合免疫吸着アッセイ、つまりＥＬＩＳＡであり、病原体の存在を検出する方法として普及してきた。このタイプの検査法は、タンパク質、ウイルス及び細菌に結合したエピトープを認識できる生体化学種を使用して病原体を検出する。一般にELISA法では、サンプル中に標的種が存在すると、抗体に結合された酵素が無色の基質と反応して有色の反応生成物を生じる。Kuby J, Immunology, W.H. Freeman and Company, New York, NY (1991), pp. 147-150. この種の様々な検査法では物理的に吸着させたウシ血清アルブミンが、ブロッキング層として使用されてきた。なぜならウシ血清アルブミンは、検査結果を妨げるか又は狂わせるおそれのある生体化学種の非特異的吸着を防ぐことが判明したからである。
【０００７】
ＥＬＩＳＡなどの免疫吸着アッセイは広く普及した簡易な方法であるが、難点もいくつかある。Tizard IR, Veterinary Immunology: An Introduction, W.B. Saunders Company, Philadelphia, Pennsylvania (1996); Harlow, Ed.: Lane D, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, New York (1988); Van Oss CJ, van Regenmortel MHV, Immunochemistry, Dekker, New York, New York (1994). 標識抗体は、特に放射性標識を必要とする検査法では、高く付くことがある。また、放射性標識は、放射性物質が有害でもあることから、特別の取り扱いを必要とする。この方法の最大の難点である化合物の標識は、分析物に対する抗体の結合親和力を変化させるおそれがある。酵素は大きな分子であるため、抗体活性を立体的に阻害するおそれがあるか、又は抗体に結合した後に酵素活性を失うおそれがある。免疫吸着アッセイに付随するもう1つの懸念は、固相支持体/抗原/抗体複合体に対するタンパク質の非特異的結合である。これはバックグラウンドノイズの増加、感受性の低下、そして偽陽性判定へとつながりかねない。加えて、固相支持体上へのタンパク質の固定化は結合部位のコンフォメーションに影響し、感受性を低下させ、そして非特異的結合の増加を招きかねない。たとえばタンパク質と固相支持体の疎水性相互作用のためにポリスチレンウェルへのタンパク質の物理的吸着が起こる。これらの相互作用はポリスチレン表面を覆うためのアミノ酸分子鎖のアンフォールディングを促進するおそれもある。これは結合部位の不活性化を招きかねない。
【０００８】
タンパク質被覆ビーズの集塊形成を原理とする定量的診断検査法もまた、タンパク質及びウイルスの検出に使用可能である。Tizard IR, Veterinary Immunology: An Introduction, W.B. Saunders Company, Philadelphia, Pennsylvania (1996); Cocchi JM, Trabaud MA, Grange J, Serres PF, Desgranges CJ, Immunological Meth., 160 (1993), pp. 1; Starkey CA, Yen-Lieberman B, Proffitt MR, J. Clin. Microbiol. 28 (1990), pp. 819; Van Oss CJ, van Regenmortel MHV, Immunochemistry, Dekker, New York, New York (1994). 抗体の直接検出では、抗原を直径数ミクロンのラテックスビーズ表面に非特異的に吸着させる。このタンパク質被覆ビーズはわずかな電荷をもち、それが集塊形成を防いでいる。吸着タンパク質に対して特異的な抗体の導入はビーズの結合を可能にし、凝集を招く。この凝集は目視で、又は準弾性光散乱などのような方法で、検出しうる。しかし、目視による凝集検査法は感受性が低いし、また準弾性光散乱法による計測は複雑な装置を必要とし、中央検査施設から遠く離れた場所での使用には向かない。さらに、この種の検査法はバルク溶液方式なのでマイクロアレイの使用による高多重処理が不可能である。
【０００９】
標識タンパク質の必要性を克服するために、タンパク質/リガンド結合の直接検出を原理とする方法が研究されてきた。Schmitt F-J, Haussling L, Ringsdorf H, Knoll W, Thin Solid Films, 210/211, (1992), pp.815; Hausiling L, Ringsdorf H, Langmuir 7 (1991), pp. 1837. 表面プラスモン反射率測定法(SPR)はそうした方法の1つである。SPRは、エバネッセント電磁波で励起させた金属薄膜表面付近の流体の屈折率の変化に対して感度が高い。リガンドへのタンパク質の結合は、共鳴角又はシグナル強度の増大を調べることにより検出することができる。この方法での一般的な角分解能は0.005°であり、ＳＰＲで吸着膜厚のオングストローム以下の変化を検出可能にする。しかし、共鳴角の変化は単なるバルク溶液の屈折率の変化にではなく結合に起因することを確実にするための配慮が必要である。共鳴角は流体の屈折率に依存するため熱安定環境が求められる。水温の25℃から26℃への上昇は屈折率の0.0001の変化に相当する。この増大の結果として共鳴角の約0.015°の、又は実測タンパク質層厚の約0.2nmの、変化が起こるであろう。こうした温度安定性という要求条件のため、SPRは多くの野外での適用に不向きとなる。加えて、センサー表面又はその近傍への分子の非特異的吸着は偽のシグナル変化を生じさせるおそれがあるため、非特異的相互作用を最小限に抑えるような表面が必要になる。従って、表面プラスモン反射率測定法はELISAよりも複雑であり、検査施設備え付けの装置及び洗練された表面の調製が必要となる。
【００１０】
生体特異的な相互作用の検出へのイオンチャンネルスイッチの使用が報告されている。Cornell BA, Braach-Maksvytis VLB, King LG, Osman PDJ, Raguse B, Wieczorek L, Pace RJ, Nature 387 (1998), pp. 580. イオンチャンネルスイッチを使用する装置では、可動性イオンチャンネルを組み込んだ繋留脂質膜がイオンリザーバーによって金電極表面から切り離されている。この金表面は脂質膜繋留用のアンカーとして役立ち、また電極として機能する。脂質膜内には上及び下イオンチャンネルが存在する。導電性になるためには、この外側及び内側イオンチャンネルが整列し、二量体を形成しなければならない。膜貫通脂質は脂質膜の安定化を手助けするが、一端が電極表面に付着し、また終端は膜の外へ伸びるリガンドである。外層のイオンチャンネルはリガンドを有する。外側イオンチャンネルは固定されていないため自由に動き、ときには内側チャンネルと二量体を形成し、導電を可能にする。この外側イオンチャンネルと膜貫通脂質の両方に二価分子が結合すると、外側イオンチャンネルの可動性は制約され導電性の測定可能な低下が起こる。しかし、多量のタンパク質がこの外層に吸着すると、イオンチャンネルの可動性はおそらく制約され、非特異的相互作用に起因する偽の導電性低下が観測されよう。加えて、この方法は導電性の変化を検出するための高感度装置を必要とする。脂質膜の作製には数時間を要するし、また膜安定性も限られている(溶液に浸さなければならない)。さらに重要なことに、特異的抗体を脂質膜/イオンチャンネルに結合させなければならず、検出対象の分析物ごとに別個のタンパク質化学反応を必要とする。
【００１１】
特異的タンパク質のリガンドへの結合の光学的検出を可能にする多孔質シリコン支持体に基づく方法が報告されている。Lin V, Motesharei K, Dancil KS, Sailor MJ, Ghadiri MR, Science 278 (1997), pp. 840; Dancil KS, Greiner DP, Sailor MJ, J. Am. Chem. Soc. 121 (1999), pp. 7925. 多孔質部分は一般に厚さが1〜5m、面積が数μm2〜mm2である。一般的な結合所要時間は約30分であり、結合後は表面をすすぎ洗いする。この分野の当初の研究では極端に低い濃度の分析物の検出が誤って報告された。ビオチン化表面へのストレプトアビジンの結合は当初、多孔質支持体の屈折率を低下させると判明したが、これは後に誤って表面酸化によるものとされた。加えて、該薄膜の有効光学的厚さの変化はストレプトアビジンの導入後に観測されると報告されたが、特異的相互作用と非特異的吸着の区別はできなかった。この方法では標識分子は不要であるが、多孔質シリコン表面は酸化と非特異的吸着が起きやすい。
【００１２】
受容体-リガンド相互作用の検出への重合多層膜の使用もまた報告されている。Charych DH, Nagy JO, Spevak W, Bednarski MD, Science 261 (1993), pp. 585; Pan JJ, Charych D, Langmuir 13 (1997), pp. 1365. ラングミュア-ブロジット（Langmuir-Blodgett）法で作製したポリジアセチレン多層膜はポリマー骨格のコンフォメーション変化に伴い青から赤へと色を変える。色の変化を引き起こしうるのはたとえば温度又はpHの変化である。多層膜にリガンドを結合させることにより、この反応を制御しタンパク質の検出に使用することができる。リガンドに多価高分子が結合すると多層膜への圧力が誘導される。十分なタンパク質が結合すれば多層膜系に色の変化が見られる。結合所要時間は一般に約30分のオーダーである。この系は受容体-リガンド相互作用の検出を可能にし、また該事象を、容易に計測、定量しうる光シグナルへと変換する。この光出力を目視で解釈するか、又は定量的な結論を導き出すために分光光度計で分析することができる。インフルエンザウイルス検出への重合多層膜の使用はすでに実証されている。しかし、この方法の著しい難点は多価分析物を必要とすることである。重合多層膜に結合した多数のリガンドは同じ高分子に結合しなければならない。これは一価分子へのこの方法の使用を妨げる(ビーズに基づいた検査法でさえ多価分子を必要とせず、競争的に実行することができる)。IgGなどの二価分子の結合は実証されていない。さらに、ラングミュア-ブロジット法は実験室規模から商業規模への実用化が困難である。ラングミュア-ブロジット法に代わる方法として、これらの原理の、小胞の使用による実証もすでになされている。しかし、0.1mg/mlを下回る濃度の分析物に対して非感受性であるため、その有用性は限られることが小胞に基づいた研究で判明している。
【００１３】
最近、液晶を使用する検査装置が開示されるに至った。たとえば、ガラス上に斜め蒸着した異方性金薄膜を支持体とするオクタンチオールとビオチンを含む混合自己組織化単分子膜(SAM)を使用した液晶使用の検査装置が最近報告されている。Gupta VK, Skaife JJ, Dubrovsky TB, Abbott NL, Science 279 (March 27, 1998), pp. 2077-2079. また、1999年12月9日公開のPCT公開第WO 99/63329号明細書では、基板に付着させたSAMとSAMによってアンカリングされた液晶層とを使用する検査装置が開示されている。開示の、異方性金薄膜を使用する液晶検査装置はサンプル中の標的タンパク質の有無の判定への使用には適するが、斜め蒸着法による異方性金薄膜の作製は難しい。斜め蒸着金薄膜の作製にはたとえば面倒な洗浄ステップや高真空蒸着などが必要である。さらに、そうした検査装置は標的の捕捉と検出の両方に同じ表面を使用する。捕捉と検出の両方に単一表面を使用するため、該表面は両機能を果たすように最適化するのが不可能である。
【００１４】
従来の研究で、マイクロコンタクトプリント法は表面にアルカンチオールの組織化された単分子膜パターンを形成する大いに有用な方法であることが証明された。マイクロコンタクトプリント法や他の密接に関連した「ソフトリトグラフ」法3はコロイド、金属錯体、ポリマー、タンパク質、金属イオンなどのパターン形成にまで適用されるようになってきた。マイクロコンタクトプリント法は最も単純な形ではポリジメチルシロキサン(ＰＤＭＳ)スタンプ表面への、パターン形成しようとする化学種の溶液による「インキ付け」ステップ及びインキ付けしたＰＤＭＳスタンプの第2表面への密着ステップを含む。ＰＤＭＳスタンプ表面と第2表面の物理化学的特性を適正に設計すれば、「インキ付け」化学種はＰＤＭＳから第2表面へと転写される。たとえばＰＤＭＳ表面に吸着させたタンパク質は、第2表面の表面エネルギーがＰＤＭＳのそれを上回る場合には、第2表面へと転写されよう。この方法は表面へのタンパク質パターンの形成を可能にするものであり、生体分子検査用及びパターン化細胞培養用の表面の作製にすでに利用されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
前述のような従来の検査法には標的種の存在を検出する機能に優れたものも多いが、従来の検査法は高コストで、またしばしば機器類と専門家を必要とするため、野外での日常的な使用が困難であるもの多い。従って、より使いやすく、遠隔地でのサンプル評価を可能にするような検査装置及びシステムが必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の要約
本発明の一実施態様は、リガンドを検出するための、次のステップを含む方法を提供する: (a)リガンドを有する又は有すると思われるサンプルを、アフィニティー基板に接触させる(インキ付け)ステップ、ここで当該アフィニティー基盤は、該リガンドと特異的に結合しうる受容体を含む; (b)該アフィニティー基板を検出表面に接触させるステップ(スタンピング)、ここで受容体に結合したリガンドの少なくとも一部分が該検出表面に転写される; 及び(c)該検出表面上の該リガンドの存在を検出するステップ、ここで当該検出表面は液晶をさらに含む。この方法はさらに、ステップ(a)に続きアフィニティー基板を洗浄するステップ(d)を、ステップ(b)に続き検出基板を洗浄するステップ(e)を、又は(d)及び(e)の両ステップを含む。
【００１７】
この方法では、受容体又はリガンドは生体分子、生体分子認識物質、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、毒素、金属、重金属、キレート剤、病原体、ウイルス、細菌、哺乳動物細胞又はその部分、核酸、核酸アナログ又はミミック、糖、抗体又はその機能断片、有機分子、脂質、リン脂質、薬物、化学薬品、殺虫剤、除草剤、或いはそれらの断片を含んでもよい。
【００１８】
開示の方法では、アフィニティー基板はポリマー、シリカ物質、金属又は金属酸化物を含む。アフィニティー基板はポリジメチルシロキサン(ＰＤＭＳ)を含むのが好ましい。好ましい実施態様では、ＰＤＭＳスタンプはさらにペプチド末端化している。このペプチド末端化ＰＤＭＳスタンプはリン酸化ペプチドを検出することができる。別の好ましい実施態様では、ＰＤＭＳスタンプはさらに抗体末端化している。抗体末端化ＰＤＭＳスタンプはタンパク質を検出することができる。
【００１９】
該方法では、受容体は１以上の結合性部分を介してアフィニティー基板に結合する。さらに、該方法はサンプル中のリガンドの存在量の定量を可能にする。
【００２０】
別の実施態様では、該方法は相異なる位置に配置される受容体のアレイを含むアフィニティー基板を提供する。一般に、アレイ内の受容体は複数のリガンドに対して特異性を有するため、液晶は複数のリガンドの存在を検出することができる。好ましくは、アレイ内の受容体は上皮増殖因子受容体(EGFR)の様々な残基におけるタンパク質リン酸化の存在を検出することができる。
【００２１】
さらに該方法では、検出表面は自己組織化単分子膜を含む。自己組織化単分子膜はアミン、アルカンチオール又は有機硫黄化合物を含むのが好ましい。また、自己組織化単分子膜はステップ(b)の前に酸で前処理するのが好ましい。
【００２２】
該方法の別の実施態様では、アフィニティー基板を検出表面に接触させるステップは、少なくとも部分的に湾曲したアフィニティー基板上で行う。最も好ましい実施態様では、該検出表面は捕捉されたリガンドが存在しない場合、ホメオトロピック・アンカリングを引き起こす。
【００２３】
該方法では、液晶はネマティック液晶、スメクティック液晶、高分子液晶、リオトロピック液晶、クロモニック液晶、フラストレート液晶、サーモトロピック液晶、カラムナー液晶、ディスコティック・ネマティック液晶、カラミティック・ネマティック液晶、強誘電性液晶、ディスコイド(discoid)液晶、又はコレステリック液晶を含む。好ましい実施態様では、液晶をUV照射により前処理する。好ましい実施態様では、液晶は4-シアノ-4'-ペンチルビフェニル(5CB)又はドーピング処理されたその塩を含む。さらに、液晶の配向は光学的又は電気的に検出してもよい。
【００２４】
本発明の別の態様は、支持体、当該支持体上の第1層、及び当該第1層上の自己組織化単分子膜を含む検出表面を提供する。自己組織化単分子膜は一般に、アミン、アルカンチオール又は有機硫黄化合物を含む。さらに、第1層は金属層、ポリマー層又はシラン層を含む。金属層は金、銀、銅、プラチナ、パラジウム、クロム又はチタン、又はそれらの酸化物を含むのが好ましい。検出表面はまた液晶を含む。一実施態様では液晶を検出基板に熱アニールする。
【００２５】
本発明のさらに別の態様は、(a)アフィニティー基板、(b)アフィニティー基板から分離されている検出基板、及び(c)液晶を含む、リガンド検出用キットを提供する。該キットはリガンドに対して特異的である１以上の受容体をさらに含む。該キットはまた、検出表面を化学修飾できる化合物を含む。化学修飾はアミンを含むのが好ましい。キット内では、アフィニティー基板は１以上のリガンドを含む。
【００２６】
本発明の他の目的及び利点は発明の詳細な説明、図面及び明細書に添付した特許請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明は関心リガンド又は分析物を、該リガンドのアフィニティー・マイクロコンタクトプリント法によるプリンティングと液晶によるリガンドの有無の視覚化とを用いて、検出するための方法を提供する。アフィニティー・マイクロコンタクトプリント法はサンプルからリガンドを特異的に捕捉し検出表面に「スタンプする」ために使用する。本発明の方法はリガンドを有する又は有すると思われるサンプルをアフィニティー基板に接触させるステップを伴う。アフィニティー基板は、該リガンドに対して特異的である受容体を、又は関心分析物に対して特異的であるアフィニティー分子を、含む。サンプル中にリガンドが存在すれば、リガンドの一部は受容体に結合しうるので、サンプルから取り出して単離又は検出に回すことができる。このステップはスタンプの「インク付け」ともいう。一般に、アフィニティー基板は所望の時間、例えば数時間にわたりサンプルとインキュベートすることになろう。このインキュベーション時間は検査するサンプルの性質に応じて異なることがある。リガンドが受容体によってサンプルから捕捉された後に、アフィニティー基板を、別の基板上に設けた検出表面に密着させ、以って結合リガンドを検出表面に転写するようにする。このステップはリガンドを「スタンプする」又は「プリントする」ステップともいう。当業者には自明であろうが、アフィニティー基板を検出表面に密着させるステップは手動、自動のいずれでも行える。検出表面上の転写リガンドの有無は液晶を使用して視覚化することができる。一般に液晶は、アフィニティー基板との密着後の検出表面に配置され、視覚化される。液晶がこのステップにおいて等方相へと加熱される場合には、該等方相を冷却して液晶相を形成させてから画像化するのがよい。液晶は蒸着により液晶相とすることもできる。液晶の無秩序化又は乱れは一般に、検出表面にリガンドが存在することを示唆する。しかし、検出表面のリガンドによる液晶の秩序化によってサンプル中のリガンドの存在を検出することも可能である。液晶の一様なアンカリングが乱された場合には、サンプル中にリガンドが存在することになる。液晶の一様なアンカリングが乱されたかどうかの判定には種々の方法を用いてよい。そうした方法の1つは偏光子を介した基板の観察である。これはプレートリーダーなどのような自動化装置によって行うことができる。電気法(たとえば薄膜の電気インピーダンスの計測)を使用してもよい。本発明の他の実施態様では、捕捉表面上のリガンドの存在は、リガンドの不存在下にとる配向とは識別可能な明確な配向をとる液晶によって報告されよう。液晶の配向はたとえばリガンドの存在下では表面に対して平行であり、リガンドの不存在下では表面に対して垂直である。他の実施態様では、表面にリガンドが存在すると液晶の面内配向が変化する。
【００２８】
この方法の図解が図1.1である。図で明らかなように、アフィニティースタンプはリガンド溶液中でインク付けされる。インク付けしたスタンプは斜め蒸着金薄膜上のSAMにアフィニティー・マイクロコンタクトプリント法でプリントされる。液晶の配向の差異がスタンプされたタンパク質の存在を報告する。液晶をもちいて、アフィニティー・コンタクトプリントされたタンパク質を画像化するために使用されるより具体的方法が、図１.２に示される。この図では、金薄膜基板上のアミン末端化ＳＡＭ(自己組織化単分子膜)はプリンティングの前に0.1M HClで10秒間処理される(これは好ましい基板の例である)。金薄膜基板の作製では、清浄な顕微鏡用スライドガラス上に45°の角度で金を蒸着する。この金薄膜基板上のアミン末端化ＳＡＭにアフィニティースタンプを30秒間密着させ、次いではがす。ＰＤＭＳスタンプはシリコンマスターから成形して、256μm角のPEGを与えるようにした。次に液晶を2枚の基板の間に挟んで液晶セルを組み立てる。第1基板はタンパク質をプリントした金薄膜である。第2基板はOTS(オクタデシルトリクロロシラン)官能化スライドガラスである。この基板は液晶をホメオトロピック配向方向にアンカリングする。サンプルは37℃から室温へと40分以上で徐冷する。
【００２９】
図1.1から明らかなように、検出表面の視覚化を容易にするには、検出表面を、2枚の基板で液晶を挟んだ形の液晶セルの一部とすることができる。一般に、セルの第1基板は検出表面となり、第2基板の素材は光学的に透明な材料、好ましくは液晶をホメオトロピック配向方向にアンカリングしうる材料である。第2基板の好適な例はOTS(オクチルトリクロロシラン)である。本発明の他の実施態様では、第2表面は液晶と空気の界面であろう。すなわち捕捉表面上に液晶の薄膜を広げて、捕捉されたタンパク質を画像化することになろう。
【００３０】
当業者には自明であろうが、アフィニティー基板上に何らかのリガンド-受容体相互作用が起きても検出可能量のリガンドが検出表面に転写できるように検出表面と結合リガンドの間の分子的相互作用は十分に強くあるべきである。一般に、アフィニティー基板から検出表面へのリガンドの転写に必要なのは通常、両基板表面の密着だけである。両基板の一方又は両方に圧力をかけてリガンドの転写を促してもよい。当業者には自明であろうが、アフィニティー基板からのリガンドの脱離は、リガンドと受容体の間の相互作用を乱し又は妨げてリガンドを切り離すことにより起こる。リガンドの転写はリガンド、受容体及び検出表面の性質に依存するため、加熱、冷却、アフィニティー基板と検出表面の間の反復接触、洗浄などによって転写を増進又は促進することができる。転写はまた、アフィニティー基板又は検出表面の転写剤による前処理によって増進することもできる。転写剤の一例は酸である。本発明の方法は、サンプルとの接触後にアフィニティー基板を洗浄することにより、切り離されたリガンドの収率又は精製の向上につながる非特異的結合不純物の除去をしやすくしてもよい。
【００３１】
一般に、検出表面に転写されるリガンドは検出表面と非特異的に結合する。従って検出表面は、任意のリガンドと非特異的に結合しうるように、またリガンドと特異的に結合するような一切の構造又は分子を欠くように、処理することができる。従って、特定のリガンドに対して特異的であるアフィニティー基板と違って、検出表面はリガンド特異的ではない。
【００３２】
検出表面から分離されているアフィニティー基板を使用することにより、リガンド捕捉ステップを検出ステップから切り離すことができる。この切り離しは、単一表面を使用してリガンドの捕捉と検出の両方を行うシステムと比べた場合の利点を多数もたらす。たとえば感受性及び/又は選択性を高めるためにアフィニティー基板と検出表面を別々に最適化することができる。またアフィニティー基板と検出表面を、所期の環境に特に適した別々の材料でつくることもできる。たとえば関心リガンド又は分析物が一般に、高酸性、高塩基性、高温又は低温などのような極端な環境に存在する場合には、アフィニティー基板を、そうした環境での物理化学的劣化に耐えるような材料でつくることができる。実施態様によっては、スタンプ表面でのリガンド捕捉量を極大化するために、種々の方法を使用してスタンプ表面に受容体を固定化することができる。これらの方法は、表面に受容体を固定化することが技術上周知であるポリマーブラシ、ヒドロゲル、タンパク質多層膜、高分子電解質膜、プロテインA、ストレプトアビジン及び他分子層の使用を伴ってもよい。それに対して検出表面は、リガンドを検出しやすくするもののリガンドが存在するような環境に耐えうる必要は必ずしもない比較的デリケートな材料でつくることができる。多様な基板が使用可能であり、その非限定的な例はラビング処理した高分子膜（rubbed polymer films)、凹凸のある表面、ナノ成形及びマイクロ成形で作製した表面、液晶の配向を目的にUV処理により作製した表面(光配向膜)、ポリマーブラシで処理した表面、液晶配向用の延伸表面、ラビング処理したタンパク質膜、斜め蒸着有機及び無機物質、機械研磨表面、有機単分子膜又は多層膜を支持する無機薄膜、高分子又は高分子電解質を吸着させた表面、ガラス表面、シラン系単分子膜で処理したガラス表面、表面に有機硫黄化合物を吸着させた金及び銀薄膜などである。さらに、アフィニティー基板も検出表面も再使用が可能であり、コストダウンにつながる。サンプルと接触させた後のアフィニティー基板を検出基板と1回又は複数回接触させて検出表面上のリガンドを濃縮し、比較的低レベルのリガンドでも検出可能にすることもできる。処理後のアフィニティー基板を複数の検出表面と接触させて、単一サンプルから複数の検出作業が行えるようにすることも可能である。また、サンプル中の標的分子の位置に関する空間情報を保存することも可能であるが、そうした情報は組織切片からのタンパク質の検出(画像化)又は空間分解した分子パターンからの化学種の検出に際して、大いに有用であるかもしれない。
【００３３】
リガンド又は分析物と受容体又はアフィニティー分子
当業者には自明であろうが、アフィニティー基板は関心分析物に対して特異的であるアフィニティー分子を受容体の代りに含んでもよい。受容体のなかには関心クラスに属する一連の分子を捕捉するものもあろう。従って、関心リガンド又は分析物が何であるかは、該リガンド又は分析物を特異的に捕捉しうる受容体又はアフィニティー分子が存在する限り、特に限定されない。受容体は種々の好適な生体分子又は生体分子認識物質、たとえばペプチド及びポリペプチド; 炭水化物; 毒素; 重金属などのような金属; キレート剤; ウイルスや細菌などのような病原体; RNA及びDNAなどの核酸、そのアナログ及びミミック; ビオチン; アビジン; 糖; 抗体; IgGなどを非限定的に含む免疫グロブリンなどのような抗体のFab、Fab’又は他の活性断片; 薬物、化学物質、殺虫剤、除草剤などのような有機小分子を含んでもよい。IgG、IgA、IgM、IgD及びIgEなどの免疫グロブリン、及び免疫グロブリンの断片は特に好ましい受容体である。本発明に使用しうる生体分子及びリガンドの例は、米国特許第6,171,802号及び第6,284,197号の各明細書でも論じられている。これらの文献は本明細書中に援用される。
【００３４】
受容体はアフィニティー基板表面に均一に分布させてもよい。実施態様によっては、受容体のほぼすべては凹凸のある表面の凸部に位置させることになろう。これはアフィニティー基板をBSAなどのようなブロッキング化合物で被覆し、次いで凸部からブロッキング化合物を拭き取る又は擦り取り、そして表面を受容体で処理することによって行われよう。
【００３５】
リガンドの場合と同様に、アフィニティー基板の受容体部分もまた特に限定されない。受容体がリガンドとなり、リガンドが受容体となる限りで、前述のうち任意のリガンドは受容体としても使用可能である。
【００３６】
アフィニティー基板
前述のように、アフィニティー基板は関心リガンド又は分析物を捕捉し、補足したリガンドを検出表面に転写するために使用する。これらの機能を果たすために、アフィニティー基板はリガンド又はアフィニティー分子を支持体に結合させて含む。好ましい実施態様では、アフィニティー分子は支持体に、直接又は１以上の結合性部分を介して、共有結合させる。ただし、アフィニティー基板がリガンドを効果的に捕捉し転写しうる限りで、共有結合させる必要はない。アフィニティー分子を共有結合させない場合には、リガンドの存在を検出するためにアフィニティー分子とリガンドを検出表面に転写してもよい。アフィニティー基板の支持体には多様な材料が使用可能であり、使用材料は、該基板に特定受容体又はアフィニティー分子が結合しうる限りで、特に限定されない。好ましい支持体の例は、表面修飾用の化合物又は薬剤と反応しうる表面を備えた高分子及び含シリカ材料である。
【００３７】
アフィニティー基板は、サンプリング条件下で、たとえば水性溶媒中で、安定である任意の高分子を含めた多様な材料から成形してよい。非限定的な例はポリジメチルシロキサン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリシアノアクリレート、ポリオレフィン、ポリイミドである。一群の好ましい基板はポリウレタン、ポリシアノアクリレート又はポリスチレンから成形される。ポリスチレンは本発明への使用に適した特に好ましい基板である。代替基板はスピンオンガラス(SOG)たとえば湿式のゾルゲル法によって成形されるシリカ材のテトラエトキシシラン(TEOS)などである。この無機材料は鋳型成形してもよい。SOGはヒドロキシル基を提示するガラスであるため、シラン化学(たとえば3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APES))の使用により表面を処理することができよう。SOGは剛体であるため、たとえばエラストマーなどよりも溝が「面取り」されにくい。シリコーンエラストマーを使用することもできる。スタンプとしての使用に好適なシリコーンエラストマーの例は、メチルクロロシラン、エチルクロロシラン、フェニルクロロシランなどのようなクロロシランを含む前駆体から形成されるものである。好ましいシリコーンエラストマーはポリジメチルシロキサン(ＰＤＭＳ)である。
【００３８】
開示のアフィニティー基板は特徴のない平坦な材料でつくることもできるが、うね又は高台といった位相的特徴をもつのが好ましい。位相的特徴は必要に応じて正方形、長方形、三角形、円形、半円形又はそれらの組み合せなど多様な幾何形状をとりうるし、また一般にナノスケールでやや丸型又はくさび形に形成されよう。これらの立体的特徴は任意の所望寸法をとってよいし、また顕微鏡で容易に観察しうるサイズにしてもよい。一般的な特徴はマイクロスケールであろうが、1〜100μmの範囲内とすることができる。たとえば立体的特徴は辺の長さが10〜20μmの四角形であろう。複数領域を採用するアフィニティー基板を使用して、あるサンプルに対して、同じ又は多様な特異性をもちうる受容体を提示するようにしてもよい。受容体が多様な特異性をもつ場合には、各々の立体的特徴は単一リガンドに対して特異的である受容体をもつであろうし、またリガンドの識別を容易にするために立体的特徴が多様な形状をもつようにすることができる。たとえば特定のDNAリガンドに対応する受容体は円形の立体的特徴と結合させ、またタンパク質リガンドに対応する受容体は四角形の立体的特徴の上に存在させることができるが、その場合には検出表面上の液晶の円形乱れはDNAリガンドの存在を示し、また四角形乱れの存在はタンパク質の存在を示すことになろう。
【００３９】
アフィニティー基板の少なくとも一部分をシリコン酸化物、金属酸化物、金属及びそれらの組み合せを非限定的に含む無機材料で被覆することにより、該基板と検出装置の検出領域の立体形状を改変してもよい。これは真空蒸着法で行うのが好ましい。金と銀はこうした立体形状改変用の無機材料として特に好ましく、金が特に好ましい。検出領域の少なくとも一部分を金又は銀で被覆するときは、被覆面を有機硫黄化合物たとえばメルカプタン又は二硫化物などで処理してもよい。この有機硫黄化合物は該金属表面に結合することになろう。
【００４０】
微細構造を作り込んだ基板は種々の製造方法で作製することができる。好適な一方法では、通常の微細加工法でたとえばシリコン材料で鋳型を形成し、次いで鋳型に液体高分子を塗って凝固させる。コンパクトディスクやホログラフィック格子の生産に使用されるものと類似した、高分子の機械的エンボス加工法を用いてもよい。熱した硬質のマスター型をほぼガラス転移温度に加熱した高分子シートにプレスして、マスター型の浮き彫りを高分子に転写し、次いで高分子をガラス転移点下に冷却してからマスター型を取り除く。光重合法、リトグラフ法などで基板を作製してもよい。
【００４１】
好ましい1つの基板作製方法では、シリコン製又は他材料製のマスター型を使用してＰＤＭＳ製又は他エラストマー製のレプリカを成形する。シリコンマスターの表面に含フッ素化合物を塗布してからエラストマーレプリカを作製するのが、レプリカの型抜きがやり易くなり、好ましい。次にこのエラストマーレプリカをマスター型として使用して、好ましくはエポキシドなどを非限定的に含む熱硬化性材料から、より好ましくはポリウレタン、ポリシアノアクリレート、ポリスチレンなどを非限定的に含む紫外線硬化性材料から、レプリカを成形する。こうした高分子レプリカの成形に使用するには、ポリスチレンが特に好ましい材料である。
【００４２】
以下、液晶検査装置用の支持体表面に生化学的ブロッキング層を化学的に固定化するための方法に使用するのが好ましいステップからなる反応スキームを開示する。一般に、支持体はまず表面修飾剤で処理するが、該表面修飾剤は支持体表面の官能基と反応しうる反応性基を一端に有し、二官能性スペーサー化合物の一端の反応性基と反応しうる反応性基を他端に有する。好ましい表面修飾化合物では、支持体の官能基と反応しうる反応性基の非限定的な例はハロゲン-ケイ素結合又はアルコキシ-ケイ素結合などのような官能基である。これらの官能基はシリカウェーハ又はガラスなどのような支持体表面の化学基と反応して共有結合を形成し、以って該ケイ素化合物を支持体表面に繋留する。表面修飾化合物はまた、二官能性スペーサー化合物の一端の反応性基と反応しうる反応性基を一端に含む。表面修飾化合物のそうした反応性基として好ましい非限定的な例はアルキルアミンである。こうして、好ましい表面修飾剤は、ケイ素原子; 該ケイ素原子に酸素-ケイ素結合を介して結合した少なくとも1つのアルコキシ基; 及び該ケイ素原子に炭素-ケイ素結合を介して結合したアミノアルキル基を含むケイ素化合物である。より好ましい表面修飾化合物の例は炭素原子数2〜8のアミノアルキル基をもつアミノアルキルトリアルコキシシランである。なかでも特に好ましいのはアミノプロピルトリエトキシシラン(APTS)である。
【００４３】
当業者には自明であろうが、エトキシ基の代りにメトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペントキシなどのアルコキシ基を使用してもよい。やはり当業者には自明であろうが、アミノアルキルジアルキルクロロシラン、スルフヒドリル末端化シラン(例えば、3-メルカプトプロピルトリメトキシシランなど)、それに二重結合をもつシラン(例えばアリルトリクロロシラン及びアリルトリアルコキシシランなど)を非限定的に含む他のシランを表面修飾剤として使用してもよい。当業者には自明であろうが、3-メルカプトプロピルトリメトキシシランなどのようなスルフヒドリル基をもつシランは支持体上の表面化学基と生化学ブロッキング化合物の両方と、該シラン上のスルフヒドリル基と該タンパク質上のスルフヒドリル基の間のジスルフィド結合の形成を通じて、反応するであろう。従って、そうした表面修飾化合物を使用する場合には二官能性スペーサー化合物は必要でないかもしれない。しかし望むなら、n-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート(SPDP)又はスクシンイミジルオキシカルボニル-メチル-(2-ピリジルジチオ)トルエン(SMPT)又はスクシンイミジル-4-(N-マレイミド-メチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC)又はマレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)などのようなヘテロ二官能性架橋剤を、そうした含スルフヒドリル基表面修飾ケイ素化合物と併用することもできる。
【００４４】
表面修飾化合物と支持体の反応は、二官能性スペーサー化合物との反応により活性化することができる修飾表面をもつ支持体を生成する。反応混合物中の水は表面修飾剤と望ましくない反応を引き起こす結果となりかねないので、表面修飾化合物と支持体の反応は無水溶媒及び条件を使用して行うのが好ましい。ただし当業者には自明であろうが、若干の水が存在してもかまわない。
【００４５】
支持体表面に受容体を化学的に固定化するための方法では、二官能性スペーサー化合物又は二官能性活性化剤の一端の反応性基は一般に、支持体の修飾表面と反応して該表面を活性化し活性化修飾表面を形成する。好ましい二官能性スペーサー化合物の2つの末端は、類似の又は異なる官能基をもつ。そうした二官能性スペーサー化合物は好ましくは2つの末端の各々に脱離基をもち、一端は生化学ブロッキング化合物上のアミンなどのような基と反応し、他端は繋留された表面修飾化合物上のアミンなどのような基と反応することになろう。好ましい二官能性スペーサー化合物又は活性化剤は次式:
【化１】
2007506982.tif 000003
[式中、nは1〜20の、好ましくは2〜10の、さらになお好ましくは5〜8の、整数である。二官能性スペーサー化合物又は活性化剤はnの値が6であるスベリン酸ジスクシンイミジルであるのが最も好ましい。]
で示される構造を含む。
【００４６】
当業者には自明であろうが、前記のジスクシンイミジル類の代りに多様な二官能性スペーサー化合物が使用可能であり、それらも支持体表面に生化学ブロッキング化合物を固定化する効果があろう。表面修飾化合物上のアミン基及び生化学ブロッキング層の生化学化合物上のアミン基と反応するようなホモ二官能性スペーサー化合物の非限定的な例はスベリン酸ジスクシンイミジル; スベリン酸ビス(スルホスクシンイミジル); グルタル酸ジスクシンイミジル; アジポイミド酸ジメチル; スベルイミド酸ジメチル; ピメルイミド酸ジメチル; 3,3-ジチオビスプロピオンイミド酸; アジピン酸メチルN-スクシンイミジル; 及び1,5-ジフルオロ-2,4-ニトロベンゼンなどである。表面修飾化合物上のスルフヒドリル基及び生化学ブロッキング層の生化学化合物上のスルフヒドリル基と反応するようなホモ二官能性スペーサー化合物の非限定的な例は1,11-ビス-マレイミドテトラエチレングリコール; ビスマレイミドヘキサン; 1,6-ヘキサン-ビス-ビニルスルホン; 1,8-ビス-マレイミドトリエチレングリコール; 1,4-ビス-マレイミドブタン; 及びビスマレイミドエタンなどである。
【００４７】
本発明には前記のホモ二官能性スペーサー化合物に加えて、ヘテロ二官能性スペーサー化合物を使用することもできる。一端はアミン基と反応し、もう一端はスルフヒドリル基と反応しうるような二官能性スペーサー化合物の非限定的な例はN-(-マレイミドウンデカノイルオキシ)スルホスクシンイミドエステル; スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシ-(6-アミド-カプロン酸); N-(-マレイミドウンデカン酸); 4-[p-マレイミドフェニル]酪酸スクシンイミジル; スクシンイミジル-6[(-マレイミドプロピオンアミド)ヘキサン酸]; スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸; N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノ安息香酸; N-[-マレイミドブチリルオキシ]スクシンイミドエステル; m-マレイミドベンゾイル-Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド・エステル；Ｎ-マレイミドカプロン酸; N-[-マレイミドカプロイルオキシ]スクシンイミドエステル; N-スクシンイミジル-[4-ビニルスルホニル]安息香酸; N-[-マレイミドプロピルオキシ]スクシンイミドエステル; 3-[ブロモアセトアミド]プロピオン酸スクシンイミジル; N-マレイミドプロピオン酸; N-[-マレイミドアセトキシ]スクシンイミドエステル; S-アセチルチオプロピオン酸N-スクシンイミジル; 及びヨード酢酸N-スクシンイミジルである。一端はアミン基と反応し、もう一端はカルボキシル基と反応できるような二官能性スペーサー化合物の例は塩酸1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドである。一端はスルフヒドリル基と反応し、もう一端はヒドロキシル基と反応しうるようなヘテロ二官能性スペーサー化合物の一例はN-[p-マレイミドフェニル]イソシアネートである。
【００４８】
受容体化合物は、二官能性スペーサー化合物との反応によって生成される支持体の活性化修飾表面と反応するのが好ましい。たとえばアミン基のうちの1つ、好ましくはリシン残基上の-アミノ基などのようなアミンは、二官能性スペーサー化合物の未反応末端と反応して共有アミド結合を形成し、生化学ブロッキング化合物を支持体表面に固定化するであろう。
【００４９】
一実施態様では、アフィニティー基板は通常のガラス用架橋法を用いて高分子(捕捉タンパク質)をＰＤＭＳスタンプ上に共有結合させて作製する。すなわち該高分子(捕捉タンパク質)上の第1級アミンが支持体表面上のスルホ-NHSエステルと反応してアフィニティースタンプに共有結合するようにする。たとえば、図21に示すように、まずO2プラズマを使用して表面を酸化させることによりＰＤＭＳ支持体を官能化する(ステップ1)。酸化させた表面を次に、アミノプロピルトリエトキシシラン(APTS)と反応させて、第1級アミンを提示する表面とする(ステップ2)。次に二官能性架橋剤(BS3)を使用して支持体表面上の第1級アミンを高分子(捕捉タンパク質)上の第1級アミンと架橋結合する(ステップ3及び4)。
【００５０】
アフィニティー基板はアフィニティースタンプともいう。アフィニティー基板、その構造及び作製方法の例は米国特許出願公開第US2002/0028451号、第US2001/0013294号、第US 2002/0098364号、及び米国特許第6,096,386号、第6,537,499号及び6,596,346号の各明細書にも記載されている。それらの明細書は参照により開示される。
【００５１】
ＰＤＭＳに代わるスタンプ作製材料の非限定的な例はハイドロゲル(Langmuir 2000, 16, 9944-9946; Langmuir 1998, 14 (15) 3971-3975を参照)、エラストマー(シロキサン(ＰＤＭＳ)、シリコーン、ポリオレフィン、炭化水素ゴム、クロロスルホン化ポリエチレン、ポリクロロプレン、塩化ポリエチレン)(www.dupont-dow.comを参照)、ゴム、他の高分子(ポリアニリン、ポリピロール)(Synthetic Metals 1997, 84 (1-3), 27-34を参照)である。
【００５２】
別の好ましい実施態様では、円筒型スタンプを使用してタンパク質、ペプチド、抗体及び他のマイクロコンタクトプリント化学種などのような生体分子を検出表面にプリントする。円筒型スタンプの例示的な支持体は20ml液体シンチレーションバイアルであるが、多数の好適な代替支持体が存在することは当業者には自明であろう。円筒型スタンプは過去に広い面積にわたり連続的に処理しスタンプできるようにするために使用された(参考文献21、26)。アフィニティー・マイクロコンタクトプリント法はＰＤＭＳスタンプの表面を化学的に官能化し、特異的生体分子(タンパク質など)を結合する受容体を提示するようにしたマイクロコンタクトプリント法の変法である。表面との接着及び剥離に際してスタンプの接触線近傍に作用する力はタンパク質(及び他のマイクロコンタクトプリント化学種)の、好ましい方位角配向での付着をもたらすであろう。好ましい実施態様では、プリントされたタンパク質の方位角対称は液晶を使用して判定する。液晶が合成高分子及びタンパク質などのような生体高分子で装飾した表面の面内構造の高感度プローブとして役立ちうることは技術上周知である。実施態様によっては、マイクロコンタクトプリント法とアフィニティー・マイクロコンタクトプリント法のどちらでプリントしたタンパク質も液晶を好ましい方位角配向で配向させるが、該配向は円筒型スタンプと被スタンプ表面の接触の方位角方向を調節して決めることができる。ある種の特に好ましい実施態様では、本発明の方法は、生体分子事象を液晶の配向転移と共役させる界面を含めた界面で生体分子を組織化する方法を提供する。
【００５３】
検出表面
本方法に使用する検出表面は、アフィニティー基板からリガンド又は分析物を転写するための表面であり、かつ該リガンドの液晶による視覚化と検出を可能にする表面である。従って検出表面はリガンドの不存在下に液晶をアンカリングするような任意の表面でありうる。検出表面は支持体上に、金属薄膜などのようなたとえば斜め蒸着した金薄膜を介して堆積させた自己組織化単分子膜であるのが好ましい。一般に金属薄膜は支持体上に蒸着する。あるいは、検出表面はアミノプロピルトリエトキシシランで被覆したスライドガラスでもよい。アフィニティー基板と同様に検出表面にもまたパターン形成をしてもよい。本発明はまた、自己組織化単分子膜以外の、やはり液晶を一様にアンカリングしうるような表面の使用を見込む。そうした表面の例はラビング処理した基板などであり、米国特許出願公開第US2002/0055093号明細書でも扱われており、本発明の方法と併用するときは結合剤を欠くことができる。同公開文献は参照により開示される。検出表面の作成に使用してもよい他の方法は光重合、機械研磨、有機及び無機材料の斜め蒸着、変形可能な支持体の延伸、マイクロ/ナノ成形などである。液晶にホメオトロピック配向又は方位角方向に変化させた配向をもたらすような表面もまた使用可能である。
【００５４】
捕捉表面用の代替材料には金に加えて、銀、銅、貴金属及び貨幣金属、チタンなどの金属酸化物、高分子、ケイ素、及び多様なガラス類を非限定的に含む他の代替表面被覆材料もある。多様な基板が、次のものを非限定的に含めて、使用可能である: ラビング処理したポリイミドなどの高分子膜、凹凸をもつ表面、ナノ成形/マイクロ成形で作成した表面、液晶を配向させるためのUV処理で作製した表面(光配向膜)、ポリマーブラシで処理した表面、液晶配向用の延伸表面、ラビング処理したタンパク質膜、斜め蒸着有機及び無機薄膜、機械研磨表面、有機単分子膜又は多層膜を支持する無機薄膜、高分子又は高分子電解質を吸着させた表面、ガラス表面、シラン系単分子膜で処理したガラス表面、表面に有機硫黄化合物を吸着させた金及び銀薄膜。カルボキシル基、金属カルボキシレート、エチレングリコール、ニトリル基、フェロセニウム、4級アンモニウム、スルホネート及びアミン基を提示する単分子膜の形成を導く有機硫黄化合物も使用可能である。本発明の検出表面用の支持体は、該支持体が液晶を一様にアンカリングしうる又は一様にアンカリングするよう処理されうる限りで、特に限定されない。好ましい支持体の例は、表面修飾化合物及び薬剤と反応するためのヒドロキシル基を含むような高分子及び含シリカ材料である。高分子支持体の非限定的な例はポリスチレン、ポリカーボネート、及びポリメチルメタクリレートなどであるが、それらはプラズマ処理してヒドロキシル又はカルボキシル官能基を提示させるようにするのが好ましい。シリコーンエラストマーもまた使用可能である。支持体用として好適な他の材料はインジウム酸化物、スズ酸化物、マグネシウム酸化物を非限定的に含む金属酸化物であり、またヒドロキシル又はカルボキシル基などの反応性官能基をもつ含硫黄化合物と反応させるのが好ましい金、銀、プラチナを非限定的に含む金属である。支持体として使用してもよいさらに別の材料はセルロース系材料たとえばニトロセルロース、木材、紙、板紙、ゾルゲル材料などである。特に好ましい支持体はガラス、石英、シリカなどであり、最も好ましい支持体はスライドガラスとシリカウェーハである。そうした支持体は使用前に清浄化するのが好ましい。当業者には自明であろうが、本発明に使用する表面は前述のものに限定されない。検出表面として自己組織化単分子膜(SAM)を使用するときは、該SAMは次の特性を1つ又は複数有してもよい:
(1)親水性;
(2)液晶を一様に配向させる; 及び
(3)特に液晶又は水性緩衝液と接触させたときに、リガンドがSAMから脱着しない。
【００５５】
第1に、親水性SAMはスタンプから基板へのタンパク質転写を増進するために使用することができる。マイクロコンタクトプリント法のタンパク質固定化機構は物理吸着によるタンパク質固定化機構とは異なる。親水性表面へのタンパク質転写の増進は、空気と接触する親水性表面の高表面エネルギーの結果と考えられる。第2に、斜め蒸着金薄膜上に液晶を一様に配向させるSAMは結合タンパク質の検出の改善に使用することができる。第3に、液晶又は水性緩衝液と接触させたときにタンパク質の脱着を許容しないようなSAMは、検出には液晶中への無脱着が重要なので、使用可能である。スタンプされたタンパク質の活性の、溶液由来の第2タンパク質の結合による試験が可能になるかもしれないという意味で、水性緩衝液中への無脱着が望ましい。好ましいSAMは、以上の基準をすべて満たすアミン末端化ＳＡＭである。例示のSAMはリガンドが親水性なので親水性であるが、特にリガンドが疎水性ならば、疎水性分子をSAMに使用することも可能である。
【００５６】
検出表面用の支持体にも多様な材料が使用可能である。本発明の検出表面用の支持体は、該支持体が液晶を一様にアンカリングしうる又は一様にアンカリングするよう処理されうる限りで、特に限定されない。好ましい支持体の例は、表面修飾化合物及び薬剤と反応するためのヒドロキシル基を含むような高分子及び含シリカ材料である。高分子支持体の非限定的な例は、プラズマ処理してヒドロキシル又はカルボキシル官能基を提示させるようにするのが好ましいポリスチレン、ポリカーボネート、及びポリメチルメタクリレートなどである。シリコーンエラストマーもまた使用可能である。支持体用として好適な他の材料はインジウム酸化物、スズ酸化物、マグネシウム酸化物を非限定的に含む金属酸化物であり、またヒドロキシル又はカルボキシル基などの反応性官能基をもつ含硫黄化合物と反応させるのが好ましい金、銀、プラチナを非限定的に含む金属である。支持体として使用してもよいさらに別の材料はセルロース系材料たとえばニトロセルロース、木材、紙、板紙、ゾルゲル材料などである。特に好ましい支持体はガラス、石英、シリカなどであり、最も好ましい支持体はスライドガラスとシリカウェーハである。そうした支持体は使用前に清浄化するのが好ましい。たとえばスライドガラスは「ピラニア溶液」(70%H2SO4/30%H2O2)による1時間の処理で清浄化し、次いで脱イオン水ですすぎ洗いしてから、窒素ガス流下で乾燥させるのが好ましい。「ピラニア溶液」は有機化合物と激しく反応するため取り扱いに注意を要するし、また密閉容器中に保存してはならない。
【００５７】
本発明に従う好ましい支持体は上面とその上に斜め蒸着した金属の薄膜を含む。使用してもよい金属の非限定的な例は金、銀、銅、プラチナ、パラジウムなどである。随意に、支持体上面に予め堆積した接着促進用のチタン(又は他金属)薄膜に金又は銀薄膜などの斜め蒸着金属薄膜を被せてもよい。こうした形でのチタンの使用は、銀又はより好ましくは金など斜め蒸着金属の接着性を向上させる。本発明では、クロム及び有機接着促進材料たとえばアミノプロピルトリメトキシシランを使用してもよい。好適な検出表面はそうした材料を使用しなくても作製しうるので、チタン又は他の接着促進用材料の使用は必須ではない。接着促進材料を使用する場合には、種々の厚さの膜を支持体上に堆積することができる。実施態様によっては、約10ÅのTiをスライドガラス又はガラス板などの支持体上に堆積する。別の実施態様では、接着促進材料の厚さが(約)5Å(0.5nm)〜(約)20Å(2.0nm)であり、また別の実施態様では厚さが(約)8Å(0.8nm)〜(約)15Å(1.5nm)である。実施態様によっては、約10Å(1.0nm)のアミノプロピルトリアルコキシシランを接着促進材料として堆積する。別の実施態様では、この接着促進材料の厚さは(約)5Å(0.5nm)〜(約)50Å(5nm)である。実施態様によっては接着促進材料の厚さは増してもよく、Tiなどの接着促進材料の厚さは(約)5Å(0.5nm)〜(約)100Å(10nm)である。
【００５８】
実施態様によっては、斜め蒸着金属好ましくは金の薄膜を支持体の清浄化表面に蒸着するが、これは5×10-6トル（torr）未満又は同程度の圧力により約0.2Å/s(0.02nm/s)の速度で金を気化させ、金粒子の入射束に対してサンプルを相対的に回転させずに行う。Gupta VK et al. Chemistry of Materials 8 (1996), p.1366を参照。他の実施態様では、チタンなどの接着促進材料を含む支持体上面に金などのような金属を前述の要領で蒸着する。支持体の金属蒸着表面上の金などの金属の膜厚は一般に(約)50Å(5nm)〜(約)300Å(30nm)である。他の実施態様では、支持体表面に蒸着した金などの金属の膜厚は(約)80Å(8nm)〜(約)250Å(25nm)、あるいは(約)90Å(9nm)〜(約)200Å(20nm)である。さらに他の実施態様では、支持体上に蒸着した金などの金属の膜厚は(約)100Å(10nm)〜(約)200Å(20nm)である。実施態様によっては、金などの金属は (約)30゜〜（約)60゜の角度で蒸着する。他の好ましい実施態様では、(約)50゜の角度で金などの金属を蒸着する。金を支持体表面に蒸着する角度は検出表面の感度に影響を及ぼすことが判明している。従って当業者には自明であろうが、用途次第では別の蒸着角度が好ましい場合もある。金属蒸着後に得られる金属蒸着表面は一般に異方的に粗い、半透明な表面である。
【００５９】
次いで、一般に支持体上に自己組織化単分子膜(SAM)を堆積させて検出表面を作製する。一般にSAMは支持体上で自然に自己組織化するアルカンチオール分子又は有機硫黄化合物からなる。アルカンチオールはアルカンチオールを含む溶液から支持体表面に容易に吸着させることができる。アルカンチオールはエタノール又はメタノールなどのようなアルコール中に存在させるような実施態様もあるが、本発明では他の溶媒を使用することもできる。
【００６０】
SAMの作製には種々のアルカンチオールを使用してよい。好適なアルカンチオールの非限定的な例はC4〜C20アルカンチオールたとえばブタンチオール、ペンタンチオール、ヘキサンチオール、ヘプタンチオール、オクタンチオール、ノナンチオール、デカンチオール、ウンデカンチオール、ドデカンチオール、トリデカンチオール、テトラデカンチオール、ペンタデカンチオール、ヘキサデカンチオール、ヘプタデカンチオール、オクタデカンチオール、ノナデカンチオール、エイコサンチオールなどである。種々の実施態様では、アルカンチオールはC5〜C12アルカンチオール、C5〜C10アルカンチオール、C5〜C8アルカンチオール、又はヘキサンチオールなどである。当業者には自明であろうが、ジアルキルジスルヒド(R-S-S-R)もまた検出表面の作製に使用可能である。アミン末端化アルカンチオールなどのような官能化アルカンチオールもまた使用可能であり、アルカンチオール類の化合物群に包含される。たとえば一実施態様では、1-アミノアルカンチオールなどのようなアミノアルカンチオール類をエタンチオールの代りに、又はエタンチオールと共に、使用して、自己組織化単分子膜を作製する。
【００６１】
アルカンチオールの吸着に使用する溶液のアルカンチオール濃度は一般に1μM〜10mMである。1μM溶液を使用する場合の好ましい浸漬時間は10秒間〜24時間である。特に好ましい浸漬時間は1分間〜6時間である。他の好ましい浸漬時間は30分間〜2時間である。検出表面は一般に、支持体の金属蒸着表面に1mMアルカンチオール/エタノール溶液を少なくとも1時間にわたり接触させて作製する。当業者には自明であろうが、高密度の単分子膜が得られる限り、接触時間はもっと長くても短くてもよい。一般に、アルカンチオール溶液の濃度が低ければ低いほど、金属蒸着表面とアルカンチオール溶液との接触時間は長くなり、逆に、アルカンチオール溶液の濃度が高ければ高いほど、金属蒸着表面とアルカンチオール溶液との接触時間は短くなろう。
【００６２】
アルカンチオールは一般に、約15℃〜約60℃、約20℃〜約40℃、約22℃〜約40℃、又は約25℃〜約37℃の範囲内の溶液中で支持体の金属蒸着表面に吸着させる。温度は実施態様により約22℃〜約28℃であり、また約25℃である。アルカンチオール吸着時には定常温度である必要はなく、温度が上下してもよい。一般にアルカンチオール溶液の温度は検出表面の作製には決定的に重要ではない。支持体の金属蒸着表面にDNA認識断片を事前に吸着させてある場合には、アルカンチオール吸着温度は一般に約20℃〜約60℃、約22℃〜約38℃、約22℃〜約28℃、又は約25℃〜約26℃の範囲である。アルカンチオールの吸着には25℃(程度)の温度が特に好適である。
【００６３】
支持体の金属蒸着表面にアルカンチオールを吸着させたら、次に支持体表面をエタノールで洗浄するのが一般的である。通常は次にN2等の不活性ガス流を洗浄済み表面に吹き込んでエタノールを飛ばす。
【００６４】
実施態様によっては、検出表面は、斜め蒸着金薄膜上に堆積させたアミン末端化自己組織化単分子膜(SAM)たとえば1-アミノエタノールチオールを含む。ただしSAMは任意好適な表面上に堆積させることができる。実施態様によっては、アミン末端化ＳＡＭは、たとえば0.1M HClで10秒間、酸処理して、タンパク質の転写と液晶画像化の改善を図る。アミン末端化ＳＡＭが使用可能なのは、いくつかの実施態様では重要となりうる3つの特性を有するためである。すなわち該SAMは(i)親水性であり、(ii)液晶を一様に配向させ、そして(iii)液晶又は水性緩衝液と接触させたときに、タンパク質がSAMから脱着しない。他の検出表面もこれらの特性をいくつか又は全部備えていれば、使用可能である。
【００６５】
様々なタイプの液晶が、ラビング処理した基板表面と併せて使用することができる。使用可能な液晶の例にはネマティック液晶とスメクティック液晶の両方が含まれる。本発明に使用してもよい他タイプの液晶の非限定的な例は高分子液晶、リオトロピック液晶、クロモグリク酸二ナトリウムを含むクロモニック液晶、フラストレート液晶、サーモトロピック液晶、カラムナー液晶、ディスコティック・ネマティック液晶、カラミティック・ネマティック液晶、強誘電性液晶、ディスコイド液晶又はコレステリック液晶である。使用可能な液晶の一例を表1に示す。
【００６６】
【表１】
2007506982.tif 000004
【００６７】
液晶を本発明に使用する理由はその特性にある。特に本発明の検出系は液晶の4大特性を利用する。第1に、液晶内の分子(メソゲン)はその配向を、場合によっては最大100μmも離れたバルク液晶の領域に伝えることができる。こうしたメソゲン間の長距離伝達は表面内の変化を、該表面にアンカリングした液晶薄膜の配向の変化へと増幅することを可能にする。第2に、液晶は液体であるため、表面へのタンパク質の結合に関する情報は液晶の体積へと即座に変換される(増幅と変換は数秒で起こりうる)。第3に、液晶内のメソゲンの選択配向に起因する光学異方性のために、バルク液晶の配向は偏光顕微鏡法により容易に画像化できる。第4に、液晶は表面の分子レベル及びメソスケール構造に対して敏感であるため、高分子及び小分子の結合を報告するように表面を設計することができる。こうして、本発明の表面検出系は特異的なリガンド-受容体相互作用を検出するための一般的で手軽な手段となる。
【００６８】
好ましい液晶は検出表面上でプラナーからホメオトロピックへの配向転移を起こしうるが、該転移は液晶中の電気二重層の形成により引き起こすことがきる。この転移を起こしうる液晶の例は4-シアノ-4'-ペンチルビフェニル(5CB)である。液晶を用いた表面の検出は、斜め蒸着金薄膜に限らず、等方性金薄膜及びガラスなどの他表面にも拡大することができる。特に好ましい液晶組成物は、塩類、例えばテトラブチルアンモニウムテトラフルオロボレート(TBAF)をドーピングした5CBである。いくつかの好ましい方法では、5CBはUV照射してから検出表面に堆積する。UV照射が液晶中のイオン濃度上昇を招きうることは過去の研究報告で示されている。
【００６９】
実施例で示すように、これらの特性を備える検出表面は溶液からの抗体の特異的捕捉、該抗体のアミン末端化ＳＡＭへのプリンティング、及び液晶を用いた該抗体の存在の検出を可能にした。アフィニティー・マイクロコンタクトプリント法と液晶を用いた検出とを組み合せることにより、捕捉ステップを検出ステップから切り離すことができる。さらに、アミン末端化ＳＡＭで装飾した表面は液晶配列のプラナーからホメオトロピックへの転移をもたらした。本発明の範囲を制限することなく、この転移は液晶5CB中の電気二重層の形成に起因すると考えられている。この転移を利用することにより、液晶を用いた表面上のタンパク質の検出は、斜め蒸着金薄膜に限らず、他の表面たとえば斜め入射角で蒸着していない金薄膜表面及びガラスなどにも拡大することができる。本発明はまた、開示の検出表面又は基板をも包含する。特に、アミン末端化ＳＡＭを具備する検出表面がカバーされる。検出表面は、一般に厚さが1μm〜100μmの液晶で被覆することもできる。この液晶は、検出表面に堆積させることができ、また第2基板を使用することなく使用することができる。実施態様によっては、基板表面のリガンドの存在に対する該液晶の応答を極大化するために、該液晶を検出表面と接触させた後に熱アニールすることができる。
【００７０】
本発明への使用に好適な検出表面の例は米国特許出願公開第US2002/0004216号、第US2002/0055093号及び第US 2003/0099993号の各明細書で開示されている。これらの明細書は本明細書中に援用される。
【００７１】
キット
本発明はまた、特に開示の検出方法を実行するためのキットを提供する。液晶検査に使用されるキットは、１以上の受容体、アフィニティー基板、検出表面、スペーシング材料好ましくフィルム、及び液晶化合物を含む。好ましい液晶検査に使用されるキットでは、液晶を一様にアンカリングする表面は別のラビング処理した基板構造である。そうしたキットはリガンド検出のための説明書を含んでもよい。そうした説明書は一般に、アフィニティー基板を検出対象の標的リガンドを含む可能性のあるサンプルとインキュベートし、またアフィニティー基板を検出表面と接触させて、捕捉したリガンドを転写するための説明を含むであろう。キットはまた、標的種の存在を確認する方法やサンプル中の標的種の濃度を求めるためのステップに関する説明書を含むのが好ましい。例示的なキット構成要素は、特に後の実施例で開示する。
【００７２】
検出表面上のリガンドを検出するための好ましいキットは、金属蒸着表面、液晶、液晶を一様にアンカリングする表面、及び適応されているフィルムなどのスペーシング材料を含む。本発明のキットはいずれも、有機硫黄化合物か又は好適な有機硫黄化合物をすでに吸着させた金属蒸着表面を提供するのが好ましい。金属蒸着表面に吸着させるためのアルカンチオールを別個に提供する場合には、エタノール溶液などのような溶液の形で、又はアルカンチオール溶液の調製用の液体に添加する形態で、提供してもよい。好ましいキットの構成要素として提供される、液晶を一様にアンカリングする表面は、前述の構成要素のうちのいずれを含んでもよい。本発明の好適なキットはまた、アルカンチオール吸着後又はサンプル溶液への浸漬後に使用する、１以上の洗浄用溶液を含んでもよい。そうしたキットは検出に関する説明書及び/又は検出表面又は光学セルの作製に関する説明書を含んでもよい。
【００７３】
以下の実施例では本発明の好ましい実施態様で使用される方法、技法及び装置を示す。これらの実施例は説明目的には役立つが、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００７４】
材料と方法
材料  チタン(99.999%)と金(99.999%)はInternational Advanced Materials(New York, NY)から入手した。顕微鏡用スライドガラスはFisher Scientific (Pittsburgh, PA)から入手したプレミアムグレードのFisher’s Finestである。ネマティック液晶の4-シアノ-4'-ペンチルビフェニル(5CB)はBDH製であり、EM Industries (Hawthorne, NY)から購入した。オクチルトリクロロシラン(OTS)と3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APES)、それに液晶N-(4-メトキシベンジリデン)-4-ブチルアニリン(MBBA)はAldrich (Milwaukee, WI)から購入した。水溶液はすべて、Milli-Q純水システム(Millipore, Bedford, MA)を使用して高純度の脱イオン水(18 MΩ cm)で調製した。タンパク質溶液はすべてリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.4 (Sigma, St. Lois, MO)を使用して調製した。2-メルカプトエチルアミンと抗ビオチンIgGもまたSigmaから購入した。ＰＤＭＳスタンプはSylgard 184 (Dow Corning, Midland, MI)から作製した。液晶セルは小型バインダークリップ(Acco, Lincolnshire, IL)でまとめた。BS3(スベリン酸ビス[スルホスクシンイミジル])とビオチン化BSAはPierce (Rockford, IL)から購入した。
【００７５】
基板の洗浄
スライドガラスをピラニア溶液(70% H2SO4、30%H2O2)と塩基溶液(70%KOH、30%H2O2)で順次、窒素ガスを吹き込んで撹拌しながら、洗浄した(約80℃で1時間)。警告: ピラニア溶液の取り扱いには細心の注意を払う; 場合によっては、特に相当な量の酸化性有機物と混合したりすると、思いがけず爆発することがある。次いでスライドガラスを脱イオン水(18 MΩ cm)、エタノール、及びメタノールで十分にすすぎ洗いし、窒素ガス流の下で乾燥した。清浄化したスライドは真空オーブン、110℃で保存した。
【００７６】
オクチルトリクロロシラン(OTS)処理スライドガラスの作製
OTS処理スライドガラスはBrake JM, Abbott NL, Langmuir 2002, 18, 6101-6109に開示の方法で作製した。要するに、10mM OTS/n-ヘプタン溶液を酸化アルミニウムのカラムに通して残留水を完全に除去した。次に、このOTS/n-ヘプタン溶液にピラニア溶液で清浄化したスライドガラスを30分間浸漬した。スライドガラスを塩化メチレンですすぎ洗いし、窒素ガス流の下で乾燥した。このOTS処理スライガラスのホメオトロピック配向誘導能を、2枚のOTS処理スライドガラスの間に挟んだ5CBの配向を観察することにより、検査した。ホメオトロピック配列を誘導しないスライドガラスを全て廃棄した。
【００７７】
捕捉表面用の代替材料
金に代わる他の表面被覆材料の非限定的な例は銀、金属、金属酸化物、高分子、ケイ素、ガラスなどである。金に代わる他の表面被覆材料の非限定的な例は銀、銅、高価な及び貨幣の金属、酸化チタンを含む金属酸化物、高分子、ケイ素、及び各種ガラスである。多様な基板が使用可能であり、その非限定的な例はラビング処理したポリイミドなどの高分子膜、凹凸のある表面、ナノ成形及びマイクロ成形で作製した表面、液晶の配向を目的にUV処理により作製した表面(光配向膜)、ポリマーブラシで処理した表面、液晶配向用の延伸表面、ラビング処理したタンパク質膜、斜め蒸着有機及び無機物質、機械研磨表面、有機単分子膜又は多層膜を支持する無機薄膜、高分子又は高分子電解質を吸着させた表面、ガラス表面、シラン系単分子膜で処理したガラス表面、表面に有機硫黄化合物を吸着させた金及び銀薄膜などである。本発明の検出表面用の支持体は、該支持体が液晶を一様にアンカリングしうる又は一様にアンカリングするよう処理されうる限りで、特に限定されない。好ましい支持体の例は、表面修飾化合物及び薬剤と反応するためのヒドロキシル基を含むような高分子及び含シリカ材料である。高分子支持体の非限定的な例はポリスチレン、ポリカーボネート、及びポリメチルメタクリレートなどであるが、それらはプラズマ処理してヒドロキシル又はカルボキシル官能基を提示させるようにするのが好ましい。シリコーンエラストマーもまた使用可能である。支持体用として好適な他の材料は酸化インジウム、酸化スズ、酸化マグネシウムを非限定的に含む金属酸化物であり、またヒドロキシル又はカルボキシル基などの反応性官能基をもつ含硫黄化合物と反応させるのが好ましい金、銀、プラチナを非限定的に含む金属である。支持体として使用してもよいさらに別の材料はセルロース系材料たとえばニトロセルロース、木材、紙、板紙、ゾルゲル材料などである。特に好ましい支持体はガラス、石英、シリカなどであり、最も好ましい支持体はスライドガラスとシリカウェーハである。そうした支持体は使用前に清浄化するのが好ましい。当業者には自明であろうが、本発明に使用する表面は前述のものに限定されない。
【００７８】
捕捉表面の化学官能化
金又は銀表面の官能化の代替物は、非限定的にアミン、アルコール、アルデヒド、メチル、アリル、カルボニル、カルボキシル、二トリル、ニトロ、チオール、エチレングリコール、アミノ-エチレングリコール又はフェロセニルで末端化されたジスルフィド又はチオールを含む。実施態様によっては、前述の官能基を反応性部分たとえばNHS、SPDP又はマレイミドなどにより活性化するのが望ましい(www.dojindo.com)。
【００７９】
同様に、ケイ素系又はガラス質の基板を化学修飾するために利用できるいくつかの代替物が存在し、非限定的に、アミン、アルコール、アルデヒド、メチル、アリル、カルボニル、カルボキシル、二トリル、ニトロ、チオール、エチレングリコール又はアミノ-エチレングリコール末端化されたシランを含む。実施態様によっては、前述の官能基を反応性部分たとえばNHS、SPDP又はマレイミドなどにより活性化するのが望ましい(www.dojindo.com)。
【００８０】
いくつかの好ましい実施態様では、化学官能基化表面の選択は表面に接着させるべきリガンドの性質次第である。次表は種々の生体分子の接着に使用される若干の例示的な官能基又は化学修飾表面への接着に使用可能な特定の官能基をもつ化合物を示す。
【００８１】
【表２】
2007506982.tif 000005
【００８２】
チオールカップリングの選択はリガンド上のチオール基の利用可能性次第である。チオールカップリングは強還元性条件には不向きであろう(そうした条件の下ではジスルヒド結合が不安定になる)。多糖や複合糖質は、容易に酸化してアルデヒドになるcisジオール及びシアル酸をもつ。それゆえ、いくつかの実施態様では、アルデヒド・カップリングがこれらのケースに使用する事ができる。他の実施態様では、特にアミンカップリングもチオールカップリングも不安定であるときに、ストレプトアビジン-ビオチンが好ましいカップリング対である。
【００８３】
一般的なNHS-EDC法
(1)NHS(0.1M)とEDC(0.4M)の蒸留脱イオン水溶液を調製する。
(2)末端カルボン酸基を有する固定化表面をPBSで平衡化する。
(3)表面にNHS(0.05M)とEDC(0.20M)の混合H2O溶液を7分間通すことにより、表面カルボン酸基をNHSエステルへと変換させる。
(4)表面をPBSで2分間すすぎ洗いする。
(5)固定化しようとするタンパク質又はリガンドの溶液を表面上に7分間注ぎ、その結果としてNHSエステルの置換によるアミド結合を形成させる。
(6)表面をPBSですすぎ洗いし、そしてpH 8.6リン酸ナトリウム緩衝液(25mM)で洗浄して(5〜20分間)、過剰NHSエステルを不活性化する。
【００８４】
3-グリシドキシプロピルトリメトキシシランの使用によるＰＤＭＳへのタンパク質の固定化
アミン-開始親水性開環反応を介して、ＰＤＭＳスタンプ上にアミン・末端化受容体を共有結合で固定する方法において好適に使用されるステップを記載する反応スキームが、以下に開示される。まずO2プラズマを使用してＰＤＭＳスタンプ表面を酸化させる。次に、この酸化表面を3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン(GPS)の0.1%v/v無水トルエン溶液40℃に30分間浸漬することでGPSと反応させる。次に該表面を無水トルエンで数回洗浄し、オーブンに入れ110℃で20分間加熱処理する。次いでタンパク質のPBS溶液を1滴垂らして該表面のエポキシ基にタンパク質を共有結合させる。該表面を、一定の保湿環境を保つために水で湿らせた綿と共にペトリ皿に入れ、蓋をして1〜2時間インキュベートする。
【００８５】
3-(トリエトキシシリル)プロピル-イソシアネートの使用によるＰＤＭＳへのタンパク質の固定化
【００８６】
まずO2プラズマを使用してＰＤＭＳスタンプ表面を酸化させる。次に、この酸化表面を3-(トリエトキシシリル)プロピル-イソシアネート3%w/vトルエン溶液中、40℃で2時間インキュベートする。次に該表面をトルエン、ヘキサン及びエーテルですすぎ洗いしてから、窒素ガス流の下で乾燥させる。次いでイソシアネート誘導体化表面にタンパク質のPBS溶液を1滴垂らす。該表面を、一定の保湿環境を保つために水で湿らせた綿と共にペトリ皿に入れ、蓋をして1〜2時間インキュベートする。
【００８７】
塩化チオニル活性化ガラス又はＰＤＭＳ表面へのタンパク質の固定化
(1)ピラニア溶液又は濃硝酸で洗浄した清浄なスライドガラスを準備する。又はO2プラズマで表面を処理してシリコン酸化物膜で覆われたＰＤＭＳを作製する。
(2)該スライドガラス又はＰＤＭＳを3-アミノプロピルトリエトキシシラン10%水溶液80℃に1時間浸漬して、第1級アミン表面を作製する。
(3)該表面を水ですすぎ洗いし、オーブンで乾燥させ、アセトンですすぎ洗いする。
(4)該表面を1%(v/v)トリエチルアミン及び10%(v/)無水コハク酸のアセトン溶液に浸漬する。
(5)反応完了(室温で10〜20分)後、スクシンアミドプロピルガラス又はＰＤＭＳをアセトンと塩化メチレンで十分にすすぎ洗いする。
(6)該表面を塩化チオニルに浸漬し、両者を加熱用マントル上で反応させる(60℃、1時間)。
(7)反応後、活性化表面を塩化メチレン、アセトン及び水ですすぎ洗いする。
(8)該表面を110℃で乾燥させ、固定化に必要とされるときまで室温で乾燥保存する。
(9)塩化チオニル活性化表面をPBS中で平衡化する。
(10)抗体を1滴垂らし4℃で一晩置く。
(11)固定化の後、該表面を1.0Mグリシンメチルエステル/PBS溶液に2時間浸漬して、未反応塩化チオニル活性化部位をブロッキングする。
(12)該表面をPBSで洗浄し、使用時までPBS中に保存する。
【００８８】
ニトリロ三酢酸(NTA)末端化表面へのヒスチジン標識タンパク質の固定化
実施態様によっては、1mM混合アルカンチオール(NTA末端化アルカンチオール及びエチレングリコール末端化アルカンチオール)/エタノール溶液に金薄膜表面を12時間以上浸漬することにより、金薄膜表面上にSAMを形成する。
(1)SAMはエタノールですすぎ洗いし、窒素ガス流の下で乾燥した後、40mM NiSO4水溶液(pH 7.2)に1時間浸漬する。
(2)次いでSAMをPBS溶液(pH 8.2)で10秒間すすぎ洗いし、窒素ガス流の下で乾燥する。
(3)0.1μMヒスチジン標識タンパク質/PBS溶液中でSAMをインキュベーションすることによりタンパク質を結合させる。
(4)基板をPBS(pH 8.2)ですすぎ洗いし、窒素ガス流の下で乾燥するか、又は使用時までPBS(pH 7.4)中に保存する。
【００８９】
反応性マレイミド基の導入によるタンパク質の固定
(1)10mM Hepes, pH 7.4、150mM NaCl及び3.4mM EDTA (HBS)でカルボキシメチル化マトリックスを平衡化する。
(2)該表面を、0.05M NHS/0.2M EDC混合Mill-Q水溶液の流量5μl/分で7分間に注入することにより、活性化する。
(3)NHS/EDCによる該表面の活性化の後、1.0Mエチレンジアミン(pH 6.0)の5μl/分での10分間注入することにより、アミノ基を生成させる。
(4)マレイミド基を導入するために、該表面を15mM N-(4-マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミドHBS/エタノール(1:1)溶液に5μl/分で30分間接触させる。
(5)フローセル上の緩衝液を10mM酢酸ナトリウム(pH 6.0)及び0.1M NaCl (ABS)に交換した後、タンパク質/ABSを2μl/分で25分間注入する。
(6)10mMジチオスレイトール(DTT)を5μl/分で2分間注入して、未反応マレイミド基をブロッキングする。
(7)固定化の仕上げに、40μlの20mM Tris-HCl, pH 7.5 、1M KCl、1mM EDTA及び1mM DTTを5μl/分で注入して表面を洗浄する。
【００９０】
金薄膜の一様な堆積
エリプソメトリーと併用するための膜厚約500Åの金薄膜は、電子線蒸着装置(VES-3000-C; Tek-Vac Industries, Brentwood, NY)を使用して、回転している遊星型装置に取り付けたシリコンウェーハ(Silicon Sense, Nashua, NH)上に(非選択的な入射方向又は角度で)蒸着させた。遊星型装置上の基板の回転は、金が確実に非選択的入射方向で蒸着されるようにした。スライドガラスと金薄膜の接着の促進にはチタン薄膜(厚さ約100Å)を使用した。金とチタンの蒸着速度は約0.1Å/sであった。蒸着時の蒸着装置内圧力はそれぞれ5×10-7トル以下とした。
【００９１】
半透明金薄膜
液晶と併用するための膜厚約140Åの半透明金薄膜は、前述の電子線蒸着装置を使用して固定式ホルダー上に取り付けた清浄スライドガラス上で蒸着された。異方性金薄膜(斜め蒸着金薄膜)は固定入射角(表面に対する法線との角度)45°で蒸着した。等方性金薄膜は固定入射角(表面に対する法線との角度)0°で蒸着した。スライドガラスと金薄膜の接着の促進にはチタン薄膜(厚さ約55Å)を使用した。
【００９２】
アミン末端化ＳＡＭ
1mM 2-メルカプトエチルアミン(NH2(CH2)2SH; Sigma)のエタノール溶液への浸漬により金薄膜表面に自己組織化単分子膜(SAM)を形成した。室温で6時間浸漬した後、スライドガラスを取り出し、エタノールで洗浄し、窒素ガス流の下で乾燥した。若干のアミン末端化ＳＡＭは、基板を0.1N又は1N HCl溶液に15秒間浸漬し、次いで取り出し、窒素ガス流の下で乾燥するという方法でHClにより前処理した。
【００９３】
アフィニティースタンプの作製
ＰＤＭＳスタンプは光リトグラフ法で作製したシリコンマスター上に、Sylgard 184 (Dow Corning, Midland, MI)を注型して作製した。ＰＤＭＳの離型を容易にするため、該マスターを(トリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル)-1-トリクロロシラン蒸気で一晩、減圧下でシラン処理した。ＰＤＭＳを一晩、80℃で硬化した。このエラストマースタンプを剥がすとシリコンマスターのネガ・パターンが得られた。このＰＤＭＳを1cm角のスタンプに切り、次いでPlasmaTherm 1441 RIE (流量8 sccm、20秒、100W)を使用して酸化し、表面に薄いシリコン酸化物皮膜を形成させた。この酸化ＰＤＭＳを第1級アミンで官能化した。10% 3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APES; Aldrich)水溶液、80℃に1時間浸漬するというのがその方法であった。処理後の表面を1mM BS3(スベリン酸ビス[スルホスクシンイミジル]; Pierce)に15分間接触させることにより、NHSエステルで活性化した。ビオチン化BSA(Pierce)をアフィニティースタンプ上に共有結合により固定化した。これには2mg/mlのビオチン化BSA/PBSで活性化スタンプを2〜8時間覆うという方法を用いた。
【００９４】
ＰＤＭＳに代わるスタンプ作製材料の非限定的な例はハイドロゲル(Langmuir 2000, 16, 9944-9946; Langmuir 1998, 14 (15) 3971-3975を参照)、エラストマー(シロキサン(ＰＤＭＳ)、シリコーン、ポリオレフィン、ゴム炭化水素、クロロスルホン化ポリエチレン、ポリクロロプレン、塩化ポリエチレン)(www.dupont-dow.comを参照)、ゴム、他の高分子(ポリアニリン、ポリピロール)(Synthetic Metals 1997, 84 (1-3), 27-34を参照)である。
【００９５】
スタンプ法
スタンプ全体を抗体/PBS溶液(1mg/ml)で5時間覆うことによりスタンプにインク付けした。インク付けしたスタンプを15秒間水洗いしてから窒素ガス流の下で乾燥した。該スタンプを、HClで30秒間前処理したアミン末端化ＳＡＭに３０秒間接触させ、始めの3秒間軽く圧力をかけた。次いでスタンプをはがした。円筒支持体に取り付けたスタンプでプリントするときは、インク付けしたスタンプを20mlシンチレーションバイアルに粘着テープで貼り付け、基板上を約30秒かけてゆっくりと転がした。
【００９６】
直接吸着
一様に蒸着した金薄膜をアミン末端化ＳＡＭで装飾し、次いで0.1M HClで前処理した。次いで、この金薄膜表面を抗ビオチンIgG/PBS溶液(1mg/ml)で5又は24時間覆った。
【００９７】
光学セル
光学セルはタンパク質をスタンプしたスライドガラスとOTS処理スライドガラスを組み合せて作製した。スライドガラスを互いに向き合わせて重ね、Saran Wrap(約12μm)又はMylar(約13μm)をスライドガラスの端部に挿入して、隙間を設けた。光学セルはブルドッグ・クリップで固定し、ホットプレート上に置いて約40℃に加熱した。注射筒内で等方相へと加熱(>35℃) しておいた5CBをホットプレート上の各セルの端部に分注した。液晶の膜厚(13μm±2μm)を参考文献(37)に開示の要領で測定した。5CBは両表面間の隙間に毛管力により引き込まれた。次に光学セルをオーブン中で36℃から33℃へと1時間かけて徐冷した。この冷却により5CBは等方相からネマティック相へと転移した。
【００９８】
画像キャプチャー
液晶画像はCCDカメラ(DXC-151A; Sony, Park Ridge, NJ)又はデジタルカメラ(Olympus C-2020 Zoom)と偏光顕微鏡(BX60; Olympus, Tokyo, Japan)付属のフレームグラブ・ソフトウェア(Mediagrabber; Rasterops Inc., Santa Clara, CA)とを使用してキャプチャーした。顕微鏡光源の設定(最大強度の50%、開口絞り50%、倍率4X又は10X、コンデンサーなし)と、CCDカメラ又はデジタルカメラ(絞り値11)の設定(自動色補正なし、10×の場合のシャッター速度1/100秒)を一定にした。
【００９９】
エリプソメトリー
SAMとタンパク質膜の光学膜厚を求めるためにエリプソメトリー法による測定を行った。各サンプルに関する光学膜厚の報告値は3基板の平均であり、各基板は位置を変えて3回測定した。測定はRudolph Auto ELエリプソメーター(Flanders, NJ)を使用して、波長6320Å、入射角70°で行った。エリプソメトリー法による測定に使用した金薄膜基板は一様に蒸着した金薄膜である。SAMと固定化タンパク質の光学膜厚は3層モデルを使用し、SAM、タンパク質の両方について屈折率を1.45と仮定して、推定した。
【０１００】
実験結果
実施例1  アフィニティー・マイクロコンタクトプリント法用の表面の設計
この実施例で使用した検出表面上のSAMは次の特性を有した: (i)親水性である、(ii)液晶を一様に配向させる、(iii)液晶又は水性緩衝液と接触させたときに、タンパク質がSAMから脱着しない。アミン末端化ＳＡＭは親水性である。Harnett et al. Appl Phys Lett 2000, 76, 2466-2468; Dulcey et al. Science 1991, 252, 55-554. 過去の研究では、第1級アミンで被覆した表面は溶液から生体物質を非特異的に吸着することも示されている。そこで、この実施例ではアミン末端化ＳＡＭを使用した。検出表面に求められた最終的な特性は液晶の一様配向であった。アミン末端化ＳＡＭが液晶5CBを一様に配向するかどうかを調べるために、2枚の基板の間に液晶5CBを挟んだサンドイッチセル(液晶の厚さ:約12μm)を作製した。下基板は斜め蒸着金薄膜上に設けたアミン末端化ＳＡＭであった。上基板はOTSで官能化したスライドガラスであった。
【０１０１】
OTS処理スライドガラスを上基板に使用したのは、OTSはビフェニル系液晶特に5CBのホメオトロピック配列を引き起こすとの報告があったためである。Cognard J, Molecular Crystals and Liquid Crystals 1982, 1-77及びYang et al. Microchemistry Proceedings 1994, 41-454. ホメオトロピック配列では5CBの長軸の平均的な配向は表面の法線方向である。液晶中を通過する偏光には屈折率異方性は存在しない。従って、OTS処理表面は光学像には影響しないので、液晶の光学像は金薄膜基板上の表面相互作用だけを伝えることになろう。
【０１０２】
図2Aは一方の基板上にアミン末端化ＳＡＭを設け他方の基板上にOTSを設けたサンドイッチセルの、36℃オーブンで1時間処理した後の光学像を示す。顕微鏡ステージ上のサンプル配向が0°では、直交偏光子を通過する最小量の光が観測された。ステージ上のサンプル配向は斜め蒸着金薄膜の入射(最大金薄膜表面粗さ)方向と偏光顕微鏡の下方偏光子の間の角度である。これは、5CBの平均配向がサンプル配向0°での一方の偏光子と同じ方向であることを示唆する。というのは、該偏光は複屈折量が0であり、従って直交偏光子によってさえぎられるからである。サンプル配向45°では該偏光は複屈折量が最大となり、最大量の光が直交偏光子を通過する。この観測結果から、アミン末端化ＳＡＭ表面は該液晶を一様に配向したとの結論に達した。
【０１０３】
両表面上でおいてアミン末端化ＳＡＭを用いてくさび形セル（１の末端でスペーサーを有するが、もう一方でスペーサーを有さない）を作成し、そして４分の１波長板を挿入した際の干渉色の変化を観察することにより、アミン末端化ＳＡＭ上の液晶の方位角配向は、金表面の粗さを最小とする方向であること（粗さを最大にする方向と直交する方向であること）が判定された。液晶の方位角配向の判定に関するさらに詳しい説明はLuk et al. Langmuir 2003, 19, 1671-1680で開示されている。
【０１０４】
図2Aでは、液晶配向における多くの線欠陥（選択配向を示さない(等方性の)液晶領域）もまた見られた。該欠陥の除去が可能かどうかを見るために液晶セルを加熱した。図2Aのサンプルをオーブンで36℃に18時間加熱し、次いで室温に冷ますと、両表面とも液晶配向はホメオトロピックになった(図2B)。36℃は5CBの透明化温度(〜35℃)を超える。透明化温度(clearing temperature)はメソゲンが液晶から等方相に転移する温度である。ホメオトロピック配向はコノスコピーによって検出する。ホメオトロピック配向のコノスコピーによる検出に関するさらに詳細な説明はBrake JM, Abbott NL, Langmuir 2002, 18, 6101-6109に掲載されている。36℃に加熱したほとんどのサンプルでは、プラナーからホメオトロピック配向への転移は加熱の約8時間後に起こる。たとえば室温に放置した場合にはプラナーからホメオトロピック配向への転移は約6日後に起こる。従って、透明化温度を超える液晶の加熱はプラナーからホメオトロピック配向への転移の所要時間を短縮すると結論付けられた。
【０１０５】
過去の研究報告によれば、液晶と接触する表面での電気二重層の形成はホメオトロピック配向を誘導する可能性がある。たとえば5CBとカルボン酸ナトリウムを提示している表面との接触は5CBのプラナーからホメオトロピック配向への転移を招く。電気二重層を形成する5CB中のイオン種はその合成終結時に、液晶内分子の化学的分解によって形成されるか、又は混入した水のイオン化(H+及びOH-)のいずれかによって形成されて存在する。Shah RR, Abbott NL, J Phys Chem B 2001, 105, 4936-4950. 過去の研究報告によれば、電気二重層によって誘導される電界は、その正の誘電異方性(長軸-短軸間の誘電定数の差)のために、5CBをホメオトロピック配向に配列させることができるとされる。この結論は、負の誘電異方性を有する液晶(MBBA)がホメオトロピック配向への転移を示さないという観測結果によって裏付けられた。MBBA液晶セルはアミン末端化ＳＡＭとOTSで作製した。サンプルを、透明化温度を超えて21日間加熱し、次いで室温に冷ました後でも、MBBA液晶はプラナーアンカリングを示した。これは、プラナーからホメオトロピック配向への転移が電気二重層の形成に起因するとの仮説と整合する。
【０１０６】
電気二重層の形成は表面上のアンモニウム種の存在に関連するとの仮説がある。そこで、酸で表面を処理することによりアンモニウム基の役割を調べてみた。表面上のNH3+基の増加は液晶のアンカリングエネルギーを低下させよう。図2Cは、アミン末端化ＳＡＭを0.1N HClで前処理したときの液晶の光学像を示す。図2A及び2Bと比較すると、アミン末端化ＳＡＭの0.1N HClによる前処理は液晶中の欠陥数を減少させる結果となった。アミン末端化ＳＡＭを0.1N HClで前処理することによる液晶中の欠陥数の減少は、固定化された欠陥線(pinned defect lines)の減少を招く液晶のプラナーアンカリングエネルギーの低下と整合する。非前処理表面と比較した場合の前処理表面のプラナーアンカリングエネルギーの低下は、一段と高荷電になった表面の存在と整合する。従って、アミン末端化ＳＡＭを酸で処理すると液晶の一様配向が改善することになる。図2Dでは、前処理されていないアミン末端化ＳＡＭの場合(図2B)と同様に、0.1N HClで前処理したアミン末端化ＳＡＭでもプラナーからホメオトロピック配向への転移が見られた。
【０１０７】
HCl処理アミン末端化ＳＡＭの膜厚はアフィニティー・マイクロコンタクトプリントプリンティングの前にも測定した。0、0.1及び1N HClで処理したアミン末端化ＳＡＭは、エリプソメトリーによる実測膜厚がそれぞれ1.3、1.3及び1.0±0.2nmであった。HClは室温では気体であり、またエリプソメトリーで測定したアミン末端化ＳＡＭの膜厚は酸処理濃度の違いによる変化がないので、酸処理の結果としての表面への塩の有意の蓄積は起きないという結論になる。
【０１０８】
実施例2  タンパク質のアフィニティー・マイクロコンタクトプリンティングを確認するためのエリプソメトリーの使用
アフィニティースタンプから0.1N HCl前処理アミン末端化ＳＡＭへのタンパク質の転写をエリプソメトリーによって確認した。エリプソメトリーには平坦なＰＤＭＳスタンプを使用した。該スタンプはまずO2プラズマで酸化させ、次いでシラン化学(アミノプロピルトリエトキシシラン)を使用して第1級アミンで官能化した。次にスベリン酸ビス[スルホスクシンイミジル](BS3)を介してビオチン化BSAをアフィニティースタンプ上に共有結合で固定化した。スタンプ表面に抗ビオチンIgG/PBS(1mg/ml)を1滴垂らし5時間置いてから15秒間水洗いするという方法で、スタンプにインク付けした。次にスタンプをアミン末端化ＳＡＭに30秒間接触させた。抗ビオチンIgGをインク付けしたアフィニティースタンプからのスタンピングでは10.8±0.4nmの膜厚変化がエリプソメトリーにより測定された。過去の研究でも抗ビオチンIgGの固定化ビオチン化BSAへの結合で同様の膜厚変化(10nm)が報告されている。Kim SR, Abbott NL, Langmuir 2002, 18, 5269-5276. 対照実験では、ビオチン化BSAアフィニティースタンプの表面に非特異的抗体(抗ヤギIgG)/PBS (1mg/ml)を1滴垂らし5時間置くという方法でインク付けした。抗ヤギIgGをインク付けしたスタンプを次に、抗ビオチンIgGをインク付けしたスタンプの場合と同様に、プリンティングした。対照実験の場合のエリプソメトリーで測定した膜厚変化は2.3±0.2nmであった。これらの結果は、アフィニティースタンプから0.1N HCl前処理アミン末端化ＳＡＭへのタンパク質の特異的捕捉及び転写を裏付ける。
【０１０９】
同じ濃度と浸漬時間(1mg/ml、5時間)を使用して、アフィニティー・マイクロコンタクトプリント法と直接吸着プリント法によるタンパク質転写量を比較した。抗ビオチンIgGの場合、溶液からの直接吸着によるエリプソメトリーで測定した膜厚変化は6.7±0.2nmである。24時間浸漬したサンプルでも、エリプソメトリーで測定した膜厚変化は6.7nm以下であった。アフィニティー・マイクロコンタクトプリント法のほうがエリプソメトリーで測定した膜厚変化は大きい。おそらく、直接吸着法と比べてアフィニティースタンプ上の抗ビオチンIgG密度が高いためと考えられるが、それは本発明の範囲を限定するものではない。
【０１１０】
アフィニティースタンプからのタンパク質の転写に対する酸処理の効果を試験するために、酸処理濃度を変化させ、エリプソメトリーで膜厚を測定した。0、0.1及び1N HClで前処理したアミン末端化ＳＡＭに抗ビオチンIgGをアフィニティー・マイクロコンタクトプリント法でプリントしたときの、エリプソメトリーによる実測膜厚はそれぞれ7.4、10.8及び13.4±0.4nmであった。アミン末端化ＳＡＭの酸処理濃度を高めると基板に転写されるタンパク質の量が増大するとの結論になった。
【０１１１】
実施例3  アフィニティー・マイクロコンタクトプリントされたタンパク質上の液晶の配向
次に、アフィニティー・マイクロコンタクトプリント法でアミン末端化ＳＡＭ上にプリントしたタンパク質について液晶の配向を調べた。この液晶実験に使用したＰＤＭＳスタンプは300×300μmの正方形のPEGのアレイを有した。前述と同じ要領で、スタンプを酸化させ、次に第1級アミンで官能化した。次いでビオチン化BSAをアフィニティースタンプ上に共有結合させた。次に、スタンプ表面に抗ビオチンIgG/PBS(1mg/ml)を1滴垂らし5時間置いてから15秒間水洗いするという方法で、スタンプにインク付けした。次にスタンプをアミン末端化ＳＡＭに30秒間接触させた。次いでタンパク質の検出のために液晶5CBを2表面間に挟んで液晶セルとした。該液晶セルの下表面は、抗体をアフィニティー・マイクロコンタクトプリント法でプリントした0.1N HCl前処理アミン末端化ＳＡＭであった。上表面は5CBのホメオトロピック配列を実現させるOTSであった。
【０１１２】
図4.1Ａは、抗ビオチンIgGでスタンプされた表面を支持体とし36℃から33℃へと1時間かけて徐冷された液晶の光学像である。サンプルを徐冷したのは、室温への急冷は欠陥線を多発させる結果となるからである。顕微鏡ステージ上のサンプル配向が0°では、緑色四角形のアレイが見えた。顕微鏡ステージ上のサンプル配向は斜め蒸着金薄膜の入射(最大金薄膜表面粗さ)方向と偏光顕微鏡の下方偏光子の間の角度である。サンプル配向0°でのバックグラウンドは黒である。サンプル配向45°では、緑色四角形のアレイにいくつかの暗い領域ができ、またバックグラウンドは緑一色である。四角形はアフィニティースタンプ上のPEGと同じサイズであるため、これらの領域は抗ビオチンIgGが固定化されていると見られる。暗領域は、一の偏光子と同じ方向において、アミン処理されたＳＡＭ上で液晶が一様に配向されることを指し示すと解釈される。干渉色図表(Michel-Levy chart)を使用すれば、緑色から該液晶の有効複屈折量(Δneff)を求めることができる。サンプルの膜厚は約12μmなので、干渉色図表からサンプルの有効複屈折量を求めると約0.065となった。アミン末端化ＳＡＭ上の5CBの傾斜角を、傾斜複屈折材料の有効複屈折量(Δneff)の式から出発して求めた(Van Doorn et al. Influence of Device Parameters on the Performance of Twisted-Nematic Liquid-Crystal Matrix Displays in the Physics and Chemistry of Liquid Crystal Devices「液晶装置の物理学及び化学におけるねじれネマティック液晶マトリックスディスプレーに対する装置パラメーターの影響」; Plenum Press: New York, 1980) :
【数１】
2007506982.tif 000006
[式中、n‖=1.7110及びn⊥=1.5296は5CBの光軸に対してそれぞれ平行及び垂直方向の、23℃での屈折率である。θは表面法線に対する5CBの傾斜角である。
【０１１３】
式2は、5CBの傾斜角がOTS表面(θ1〜0°)からアミン末端化ＳＡＭで修飾した金薄膜表面(θ2)へと線形に変化するとの仮定にしたがっている。式2中、dは5CB薄膜の厚さ(約12μm)であり、zは5CB内の位置であって、z=0はOTS-5CB界面を表す。
【数２】
2007506982.tif 000007
【０１１４】
式2を式1に代入し、式1を該薄膜の厚さ分だけ積分することにより、以下の：
【数３】
2007506982.tif 000008
を使用して5CBの有効複屈折量を見積もることができる。
【０１１５】
〜0.065の有効複屈折量では、アミン末端化ＳＡＭ上の5CBの傾斜角は表面法線に対して約〜70°と計算される。
【０１１６】
図4.1Bは、36℃のオーブンで8時間加熱した後の図4.1Aのサンプルの光学像である。図4.1Bでは、アミン末端化ＳＡＭ上の、タンパク質で覆われていない液晶の、近プラナー配向(〜70°)からホメオトロピック配向(〜0°)への変化が観測された。顕微鏡ステージ上の諸々のサンプル配向での連続的に黒色のバックグラウンドは、ホメオトロピック配向を示す。このホメオトロピック配向はコノスコピーによっても確認された。
【０１１７】
この実施例では、液晶アンカリングの経時的な変化の仕方も探っている。図3は、抗ビオチンIgGをアフィニティー・マイクロコンタクトプリント法でプリントしたサンプルの時間発展を示す。オーブン内の時間が長くなると(5及び7時間)、バックグラウンド(0.1N HClで前処理したアミン末端化ＳＡＭ)色の、緑色から黄色への変化が見られた。この緑色から黄色への変化は干渉色図表上の低次の干渉色への変化に対応する。サンプルの厚さ(スペーサーの厚さ〜12μm)に変化はないので、色の変化は有効複屈折量の〜0.065から〜0.02への変化に起因した。これはアミン末端化ＳＡＭの表面法線に対する傾斜角の〜70°から〜35°への変化に対応する。36℃オーブン内の時間が10時間以上では、タンパク質で覆われていない領域の液晶配向はホメオトロピック(傾斜角0°)である。図3.2は、37℃での10時間にわる液晶加熱の、液晶配向の一様性に対する影響を示す比較図である。A)の光学像は液晶セル作製の1時間後であり、B)の光学像は同じ液晶セルの、37℃で10時間加熱後である。前述のように、アミン末端化ＳＡＭ上のこのプラナーからホメオトロピック配向への転移は電気二重層の形成に起因すると考えられる。
【０１１８】
図3に見られる光学コントラストがビオチン化BSAに特異的に結合し金薄膜基板に転写される抗ビオチンIgGに起因することを確認するために、対照実験を行った。対照実験では、ビオチン化BSAアフィニティースタンプ表面に非特異的抗体(抗ヤギIgG)/PBS(1mg/ml)を1滴垂らし5時間置いて、該スタンプにインク付けした。抗ヤギIgGをインク付けしたスタンプを次に、抗ビオチンIgGをインク付けしたスタンプと同じ要領で、プリントした。図4.1Cは対照実験の光学像を示す。サンプル配向0°では光学像全体が暗い。サンプル配向45°では光学像全体が緑色である。スタンプが接触した領域は、スタンプが接触しなかった領域と同じ液晶配向を示している。この結果は、図3に見られるコントラストは表面にプリントされた抗ビオチンIgGに起因するとの結論への裏付けとなる。
【０１１９】
図4.1Dは図4.1のサンプルの、36℃のオーブンで8時間加熱した後の光学像である。やはりプラナーからホメオトロピック配向への転移が観測された。これはコノスコピーによって確認された。
【０１２０】
図4の結果から、抗体を特異的に捕捉し、0.1N HCl処理アミン末端化ＳＡＭで装飾した金薄膜基板上にプリントし、特異的抗体の存在を、液晶を使用して検出することが可能であるとの結論に至った。図4.2は特異的捕捉の、対照との比較である。
【０１２１】
実施例4  マイクロコンタクトプリント法でプリントしたタンパク質に対する液晶の配向応答
図3及び4を詳しく観察すると、アフィニティー・マイクロコンタクトプリント法でプリントしたタンパク質の領域内には液晶応答のある種の一様性が認められる。アフィニティー・マイクロコンタクトプリント法はタンパク質配向をもたらすと仮定した。タンパク質配向の可能性を調べるために、アフィニティー・マイクロコンタクトプリント法とマイクロコンタクトプリント法でプリントしたタンパク質に対する液晶の応答を比較した。マイクロコンタクトプリント法でプリントしたタンパク質に対する液晶の応答は該タンパク質の配向度の低さを反映して一様性も低くなる考えられた。図5.1から液晶応答の点ではアフィニティー・マイクロコンタクトプリント法もマイクロコンタクトプリント法もほぼ同じであることが分かる。サンプル配向0°と90°では、バックグラウンドは黒、四角形は緑である。顕微鏡ステージ上でサンプルを回転させると、緑色の四角形は暗くなり、サンプル配向約60°で最も暗くなった。バックグラウンドはサンプル配向約45°で最も明るくなった。要するに、スタンプした(すなわちアフィニティー・マイクロコンタクトプリント法又はマイクロコンタクトプリント法でプリントした)タンパク質は液晶に若干の配向をもたらすし、またアフィニティー・マイクロコンタクトプリント法とマイクロコンタクトプリント法でプリントしたタンパク質に対する液晶の応答はどちらもほぼ同じであるということになる。図5.2はアフィニティー・マイクロコンタクトプリント法とマイクロコンタクトプリント法でプリントしたIgGの液晶像の比較である。図5.2Aではアフィニティー・マイクロコンタクトプリント法でタンパク質をプリントした領域の方位角配向がかなり一様である。図5.2Bではマイクロコンタクトプリント法でタンパク質をプリントした領域の方位角配向がかなりランダムである。
【０１２２】
実施例5  等方性金薄膜及びガラス上へのタンパク質のアフィニティー・マイクロコンタクトプリンティング
異方性金薄膜は液晶の一様配向に影響を及ぼすと仮定した。タンパク質スタンプ領域内の液晶の配向に対する異方性金薄膜の影響を除去し、以ってスタンプされたタンパク質が液晶を配向させうるかどうかを調べるために、等方性金薄膜及びガラス上へのマイクロコンタクトプリンティングを行った。等方性金薄膜は法線からの入射角0°で蒸着するが、それは異方性をもたらすことがなく、従って液晶に一様配向をもたらすこともない。この等方性金薄膜は同じアミン末端化ＳＡＭで官能化し、次いで0.1N HClで前処理した。この表面に抗ビオチンIgGをマイクロコンタクトプリント法でプリントし、液晶で画像化した。液晶の応答は図3、4A及び5に示す応答とよく似ていた。アミノプロピルトリエトキシシランを使用して表面を官能化したガラスにもIgGをマイクロコンタクトプリント法でプリントした。短時間(<20時間)では、タンパク質スタンプ領域での液晶の応答はタンパク質非スタンプ領域と同様であった(非一様、プラナー配向)。長時間では(>20時間)、タンパク質スタンプ領域は、バックグラウンドが(図3のように)ホメオトロピック配向へと転移していくため、一段と明白になった。ホメオトロピック配向への完全転移は金薄膜よりもガラスのほうがずっと遅かった(約8時間対約80日間)。従って、スタンプされたタンパク質が液晶に何らかの配向をもたらすとの証拠はないが、アミン末端化単分子膜上のホメオトロピック配向への転移を利用することにより、液晶の使用によるタンパク質検出は斜め蒸着金薄膜に限定されず、第1級アミンで官能化した等方性金薄膜やガラスの表面でも実行可能であるとの結論になる。
【０１２３】
実施例6  アフィニティースタンプの再使用
過去の研究報告で示されているように、アフィニティースタンプは再使用が可能である。Bernard et al. Nat Biotechnol 2001, 19, 866-869. ビオチン化BSAアフィニティースタンプの再使用可能性を試験するために、該スタンプに抗ビオチンIgGをさらに2回、再補充(再インク付け)した。図6は該アフィニティースタンプの第1回、第2回及び第3回使用に対する液晶の応答を示す。色の違いを別にすれば、第1回、第2回及び第3回使用に関する画像はよく似ている。色の違いについては、セルの厚さの違い、酸前処理の違い、タンパク質の表面付着量の違いなど、いくつかの理由が考えられた。(図6の場合のように>10時間ではなく)1時間後に撮影した画像では、所与のサンプルによればバックグラウンドの色は四角内の色と同じであった。これは色の変化が領域内のタンパク質の有無とは無関係であることを示す。また、タンパク質がアミン末端化ＳＡＭを液晶からマスクするために、タンパク質スタンプ領域でプラナーからホメオトロピック配向への転移が生じないという可能性もある。従って、色の違いはセルの厚さのわずかな違いの結果であると考えられる。有効複屈折量を0.065で一定と仮定すると、干渉色図表からセルの厚さの違いは12±1 μmと計算された。従って、図6はビオチン化BSAアフィニティースタンプが再使用可能であることを示している。
【０１２４】
ビオチン化BSAアフィニティースタンプの再使用可能性はエリプソメトリーでも裏付けられた。該スタンプの第1回、第2回、第3回使用に関する、エリプソメトリー法で測定した膜厚変化はそれぞれ10.8、8.5及び8.3±0.4 μmであった。それを並べて比較したのが図6Bである。抗ヤギIgGをスタンプした対照実験では、第1回、第2回、第3回使用に関する、エリプソメトリー法で測定した膜厚変化はそれぞれ2.3、1.5及び1.2±0.2 μmであった。これらの結果はアフィニティースタンプの再使用可能性を裏付ける。エリプソメトリーの結果はまた、以前にも観測されたように、非特異的転写タンパク質量が第1回のスタンプ使用後に減少することも示している。
【０１２５】
図7では、0.1N HCl処理アミン末端化ＳＡＭの、タンパク質で覆われていない領域で、液晶のプラナーからホメオトロピック配向への転移が見られる。該転移は通常、液晶セル作製の約2日後に起きる。
【０１２６】
実施例7  アフィニティー・マイクロコンタクトプリント法によるタンパク質のパターン形成に使用される通常手順の実験
ＰＤＭＳスタンプ(「材料と方法」を参照)表面にビオチン化ウシ血清アルブミン(BSA)を共有結合させることにより、アフィニティースタンプを作製した。該スタンプの表面の抗ビオチンIgG水溶液への浸漬後に、スタンプ表面を水性緩衝液で洗浄し、次いでNH2(CH2)2SHで官能化した金薄膜と接触させた。該金薄膜は斜め入射角物理蒸着法で作製した。この金薄膜斜め蒸着は、前述のような液晶の一様方位角配向を引き起こす面内構造の金薄膜への導入につながる。該スタンプと金薄膜表面との接触は、スタンプの一端を該表面と接触させ、次いでスタンプの残りの部分を押し下げて該表面と接触させるという順序で行った。接触後、スタンプを該表面から、接触時の方向とは反対の方向に、剥がした。タンパク質転写後、被スタンプ表面を(厚さ約13μmの帯状のMylarフィルムを使用して)オクチルトリクロロシラン処理[液晶の垂直(又はホメオトロピック)アンカリングが目的]スライドガラスから隔てて、被スタンプ表面とスライドガラス表面の間に形成された隙間にネマティック液晶5CBを導入した。
【０１２７】
図8Aは、直交偏光子に対するサンプル配向の関数としての、アフィニティー・マイクロコンタクトプリント法でプリントした抗ビオチンIgGと接触させたネマティック液晶(LC)4-シアノ-4'-ペンチルビフェニル(5CB)の一連の偏光顕微鏡像(透過モード)である。アミン末端化表面に転写された抗ビオチンIgGのエリプソメトリー法での厚さは、〜10nmである。図8Aをよく見ると、直交偏光子に対するサンプルの方位角配向が0°か又は90°のとき(直交偏光の検光子又は偏光子のいずれかと、金蒸着の方位角方向との配向に対応)は、LCの見かけ上の色は抗体を欠く領域では黒でありパターン化した抗体で覆われた四角の領域では緑であることが分かる。この結果は、抗体をプリントした表面領域上の液晶の方位角配向が抗体を欠く表面領域上の方位角配向とは異なることを示唆する。図8Aはまた、0°及び90°から離れていく方向へとサンプルが回転すると抗体プリント領域上のLCは見かけ上暗くなり、サンプル配向約45°で最も暗くなることを示す。この結果は、抗体プリント領域上のLCの方位角配向はランダムではなく、金の蒸着方向に対して〜45°の方位角のあたりに分布することを示唆する。この結論は、抗体プリント表面領域内と抗体を欠く表明領域内の液晶透過光の強さの測定によって裏付けられる(図8C)。本発明者らは、液晶の好ましい方位角配向がスタンプと表面との接触方向の±20°以内にあることを割り出した。本発明者らはまた、ＰＤＭＳスタンプからの抗体のマイクロコンタクトプリンティングがプリントされた抗体と接触するLCの好ましい配向につながることを見出した(図8B及び8D)。本発明者らにより、斜め蒸着金薄膜上に(アフィニティー・マイクロコンタクトプリント法又はマイクロコンタクトプリント法で)プリントされたタンパク質が局所的に好ましい方位角配向を液晶にもららすということ、並びにアフィニティー・マイクロコンタクトプリント法でプリントしたタンパク質及びマイクロコンタクトプリント法でプリントしたタンパク質に対する液晶の応答は同じようであるということを結論付けられた。
【０１２８】
実施例8  スタンプと表面との間の接触方向を制御するための円筒型スタンプの使用
実施例7の結果はアフィニティー・マイクロコンタクトプリント法とマイクロコンタクトプリント法のどちらも好ましい方位角配向でのタンパク質の付着をもたらすことを示唆するものの、本発明者らはスタンプと表面との見かけ接触方向と、LCの方位角配向との間に±20°の差を観測した。スタンプと表面の接触方向の制御を改善し、以ってLCの実測方位角配向を決定づけるうえでの該接触方向の役割を調べるために、本発明者らは円筒型スタンプを採用することにした(図9)。円筒型スタンプは従来、連続的に処理し、そして広い領域にスタンプすることを可能にするために使用されてきた。本実施例では、円筒型スタンプは化学種パターンの方位角方向の分子レベル組織化を規定するために用いた。
【０１２９】
図10は円筒型スタンプでIgGを表面にマイクロコンタクトプリントしたアミン官能化(斜め蒸着)金薄膜上に支持されるネマティック5CBの光学図を示す。図10A及びBを調べると、液晶の方位角配向は被スタンプ表面への抗体転写時の円筒型スタンプの運動の方位角方向にきっちりと従うことが明らかになる。パターン化した抗体を欠く場合には、LCの方位角配向は斜め蒸着金薄膜の構造を鋳型とする方向に従う。これらの結論は、プリントされたタンパク質の存在及び不存在下でのLC透過光の強さの測定によって裏付けられる(図3C)。図10Cを図8C及び8Dと比較すると、サンプル回転時のLC透過光の強さの変調度合いを特徴とするようなLCの一様配向は、円筒型スタンプからタンパク質を被スタンプ表面に転写するとき(図10C)のほうが通常の方法(図8C及び8D)と比べて明らかに良好である。これらの結果は、総合すると、抗体の方位角配向は被スタンプ表面への抗体の転写に円筒型スタンプを使用することによって制御するとこができることを示す。
【０１３０】
前述の実験に使用した金薄膜は斜め蒸着法によったが、本発明者らはIgGのマイクロコンタクトプリンティングが基層異方性をもたない表面上でのIgGの好ましい方位角配向を誘発するはずだと仮定した。本発明者らはこの点を調べるために、シリカ基板に法線入射蒸着した金薄膜上に抗体をマイクロコンタクトプリントした。図11A及びBを調べると、ＬＣは、抗体を有さない領域の表面ではランダムな方位配向をとるということが確認される。
対照的に、IgGプリント領域のLCは円筒型スタンプと金薄膜の接触方向によって規定される好ましい方向に配向する。LC透過偏光の定量的測定から裏付けられるが、金薄膜上のプリントされたIgGを欠く表面領域ではLCに選択配向はないが、プリントされたIgGで装飾された表面領域では選択配向が存在する(図11B)。これらの測定ではまた、法線入射と斜め入射で蒸着した金薄膜上にプリントされた抗体上でのLCの一様配列は同じようであることも示される(それぞれ図11Bと図10Cを参照)。最後に、本発明者らは、マイクロコンタクトプリント法でプリントしたIgG以外のタンパク質上でLCの選択方位角配向を観測したことも指摘する。たとえばマイクロコンタクトプリント法でプリントしたBSAは5CBのネマティック相に一様方位角配向をとらせる。
【０１３１】
実施例9  アフィニティー・マイクロコンタクトプリント法でプリントしたマイクロアレイを使用した多重/定量的タンパク質検出
アフィニティー・マイクロコンタクトプリント法用のマイクロアレイを作るために、(トリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル)-1-トリクロロシランでシラン化した平坦シリコンマスター上でSylgard 184を成形することにより、ＰＤＭＳスタンプを作製する。
【０１３２】
80℃での一晩硬化の後、酸素プラズマ(Plasma Etch PE-200, 8sccm, 20秒、100W)を使用してＰＤＭＳを酸化させる。酸化ＰＤＭＳを、10% APES水溶液80℃に1時間浸漬することにより、第1級アミンで官能化する。その表面を、0.1M無水コハク酸/DMFへの浸漬(10分間)により、カルボン酸で官能化し、次いでDMFで洗い、PBS中に保存する。該スタンプをNHS/EDCで活性化し、PBSで洗う。該スタンプを顕微鏡スライドガラスにテープで貼り付け、GeneMachines OmniGrid Microarrayerに取り付ける。このMicroarrayerは25スポット(抗体あたり5スポット)×4アレイの作製に使用する。たとえば異なる残基がリン酸化されているタンパク質を検出するには、次の抗体をアレイに使用することができる: 汎反応性(pan-reactive)である111.6 Ab (Lab Vision)、並びにリン酸化位置特異的な抗体である抗pY1068(Biosource)、抗pY1086 (Biosource)、抗pY1148(Biosource)及び抗pY1173 (Upstate) 。小液滴の蒸発を抑えるためにグリセロール(40%)を抗体溶液に加える。ＰＤＭＳは1%BSA/PBSで10分間不活性化する。細胞膜抽出物WT(EGF処理+及び)及びPAR(EGF処理+及び)の小液滴を、シリコンガスケット又は疎水性ペンで仕切られた4つの抗体アレイ上に垂らし、4℃で6時間インキュベートする。スタンプをPBS+0.01%Triton X-100、PBS及び水で順次洗う。スタンプを、アミン末端化単分子膜で官能化した30°斜め蒸着金薄膜に、前の実施例で述べた要領で、ローラープリントする。スタンプされたタンパク質を、斜め蒸着金薄膜基板とOTS処理スライドガラスの間に5CBを挟んで、画像化する。画像を偏光顕微鏡に取り付けたデジタルカメラで撮影する。5スポットの光度を平均して、各膜抽出物の全EGFR及びリン酸化EGFRの定量的解析とする。
【０１３３】
実施例10  アフィニティー・マイクロコンタクトプリント法と液晶シグナル増幅による上皮増殖因子受容体(EGFR)の画像化
方法: EGFRはEGF刺激を受けたタンパク質チロシンキナーゼの活性を処理する膜貫通型糖タンパク質である。その過剰発現と突然変異は多数の癌に関連付けられてきた。以下の実験では、アフィニティー・マイクロコンタクトプリント法(aCP)と液晶(LC)を土台とする無標識分析法により、細胞膜抽出物又は細胞溶解液に由来するEGFRを少量のサンプルから検出しうることを実証する。ＰＤＭＳスタンプの官能化は、パターン形成したスタンプ表面をプラズマエッチング(8sccm、20秒、100W)で酸化させて薄いシリコン酸化膜を形成させることから始まる。次に、酸化ＰＤＭＳを10% 3-アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液80℃に1時間浸漬して第1級アミン末端化表面を創出した。表面アミンと0.1M 無水コハク酸/N,N-ジメチルホルムアミドの間の、室温での10分間にわたる求核開環反応でカルボキシル基末端化表面を生成させる。次に標準NHS-EDCプロトコールに従い汎反応性(pan-reactive)抗EGFR 111.6 (1mg/ml, Lab Vision)をカルボキシル基末端化表面に固定化した。次に、ヒト上皮癌細胞(A431)、EGFRを欠くマウス線維芽細胞(B82L-親（parental）)又は野生型ヒトEGFRを安定的に発現するマウス線維芽細胞(B82L-WT)のいずれかから精製した細胞膜抽出物の小液滴(約1μL)を1つ抗体修飾表面に垂らし、室温で3〜5時間インキュベートすることにより、EGFRをアフィニティー捕捉させた。A431とB82L-WTはそれぞれ約100万EGFR/細胞、10万EGFR/細胞を含む。スタンプ表面を界面活性剤溶液(0.01% Triton X-100/PBS)、PBS及びMilli-Q水で十分にすすぎ洗いし、窒素ガス流の下で乾燥する。次に、該スタンプの、基板へのコンタクトプリンティングにより、アフィニティー捕捉EGFRを、アミン末端化単分子膜を提示する表面に転写する。アミン末端化型の自己組織化単分子膜(SAM)はスタンピングの前にHClで処理するが、これは基板を1N HCl水溶液に15秒間浸漬し、窒素ガス流の下で乾燥するという方法で行う。被スタンプ表面を直交偏光顕微鏡でLCセル越しに観測する。このLCセルはタンパク質をスタンプしたアミン末端化ＳＡＭとOTS処理スライドガラスの間にLCを挟んで作製する。図12Aは以上の方法の図解である。
【０１３４】
代替方法: 以下は、アミン開始求核開環反応を介してＰＤＭＳスタンプへアミン末端化受容体を共有結合で固定化する方法に使用するのが好ましいステップを説明した反応スキームである。ＰＤＭＳスタンプ表面をまずO2プラズマで酸化する。次に酸化表面を、3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン(GPS)の0.1%v/v無水トルエン溶液、40℃、に30分間浸漬して、GPSと反応させる。次いで該表面を無水トルエンで数回洗浄し、110℃のオーブンで20分間、加熱処理する。次いで該表面に抗EGFR/PBSを1滴垂らして、該表面のエポキシ基に該タンパク質を共有結合させる。該表面を、一定の保湿環境を保つために水で湿らせた綿を入れペトリ皿に入れ、蓋をして1〜2時間インキュベートする。次いで細胞膜抽出物の小液滴(〜1μL)を1つ垂らしてEGFRをアフィニティー捕捉させる。図12Bは以上の方法の図解である。
【０１３５】
追加の代替方法: 
ＰＤＭＳスタンプ表面をまずO2プラズマで酸化する。次に酸化表面をプロピル-イソシアン酸3-(トリエトキシシリル)の3%w/vトルエン溶液40℃中で2時間インキュベートする。次いで該表面をトルエン、ヘキサン及びエーテルで洗浄し、窒素流で完全に乾燥する。イソシアン酸誘導体化表面に受容体タンパク質/PBSを1滴垂らす。該表面を、一定の保湿環境を保つために水で湿らせた綿を入れペトリ皿に入れ、蓋をして1〜2時間インキュベートする。次いで細胞膜抽出物の小液滴(〜1μL)を1つ垂らしてEGFRをアフィニティー捕捉させる。図12Cは以上の方法の図解である。
【０１３６】
汎反応性抗EGFR(111.6 Ab)からのLC結果:
図13は、EGFRを含む細胞膜抽出物(B82L-WT)とEGFRを含まない細胞膜抽出物(B82L-親（parental）)からアフィニティー捕捉され、プリントされたＥＧＦＲを提示するアミン末端化ＳＡＭ上に支持されるネマティック5CBの光学像(直交ポーラー)を示す。該アミン末端化ＳＡＭ(下基板)は斜め蒸着金薄膜を支持体とし、また第2表面(上基板)はOTS処理スライドガラスであった。プリンティング後、両基板を36℃でアニールしてから、室温で画像化した。プリンティング直後、A431サンプルは被プリント領域内でLC配向の乱れを示したが、それは対照サンプル(B82L-親（parental）)では見られなかった。36℃で1日アニールした後は、A431サンプルのバックグラウンド領域内に限りLC配向がホメオトロピックに変化した。このLCパターンは1週間あまり持続した。対照サンプルでは全表面が次第にホメオトロピックに変化したが、これはスタンピングによる表面へのタンパク質転写量がごくわずかであったことを意味する。B82L-親（parental）サンプル上のLCのホメオトロピック配向はコノスコピーによって確認された。
【０１３７】
エリプソメトリー:
アフィニティースタンプからアミン末端化ＳＡＭへのEGFRの転写はエリプソメトリーによって確認された。A431由来のアフィニティー捕捉タンパク質層のエリプソメトリーによる膜厚はB82L-親（parental）由来の膜厚を〜3nm上回った。LCパターンが表面結合EGFRによって生成されたことを確認するために、第2抗体(Clone 199.12, Lab Vision)を使用するサンドイッチ検査法を実行した。199.12 Abと111.6 AbはEGFRの異なるリガンド結合部位に結合する。A431由来の表面結合EGFRによって捕捉された199.12 Abの膜厚は〜1.1nmであった。B82L-親（parental）による対照実験では、199.12 Abによる処理後の膜厚の増大が見られなかった。平坦金薄膜基板を支持体とするアミン末端化ＳＡＭ上のプリントされたタンパク質層のエリプソメトリーによる膜厚もまた測定した。全タンパク質濃度1μg/μlのWT(野生型)サンプルに由来する、プリントされたタンパク質層はPAR(B82L-親（parental）)サンプルに由来するものよりも〜1nm厚かった。
【０１３８】
スタンプされたタンパク質の定量:
被スタンプ表面に転写されたタンパク質を、各々の場合についてパターン化領域の内側のLCの平均的な見かけを、Adobe Photoshopソフトウェアを使用して測定することにより、定量化した。図14は、WTサンプルは高光出力を提示するが、PARサンプルの被プリント領域内の光度はごく低いことを示す。また、LCシグナルが全細胞タンパク質濃度の低下に伴い次第に低減していくことも示している。LCシグナルのこうした低減は、LCパターンが表面にプリントされたアフィニティー捕捉EGFRによるという仮設を支持する。
【０１３９】
リン酸化位置特異的な抗EGFR(1068 Ab)からの結果:
EGFRチロシンリン酸化は受容体の活性化と密接に関連する。EGF刺激は受容体チロシンキナーゼドメインの自己リン酸化を引き起こす。受容体の多様なチロシンリン酸化体と排他的に反応する抗体が得られれば、活性化された受容体の検出は可能である。図15は次の4種類の細胞膜抽出物からアフィニティー捕捉した被プリントEGFRを提示するアミン末端化ＳＡＭを支持体とするネマティック5CBの光学像を示す: 1. EGF処理(5分間)したB82L-WT; 2. EGF処理しないB82L-WT; 3. EGF処理(5分間)したB82L-親（parental）; 4. EGF処理しないB82L-親（parental）。汎反応性(pan-reactive)抗EGFR(111.6 Ab)はリン酸化EGFRと非リン酸化EGFRの違いを区別できないため、どちらのタイプのサンプルでもLC配向の乱れを示す。しかし、リン酸化位置特異的な抗EGFR(1068 Ab)はリン酸化した野生型サンプルの場合に限りＬＣ配向の乱れを示す。図16はそれぞれの場合について、タンパク質被プリント領域における5CBの平均光学応答を示す。
【０１４０】
リン酸化の阻害:
生体シグナル伝達過程の研究はしばしば特異的阻害薬を使用してシグナル伝達ネットワークを選択的に混乱させることによって行われる。今日のEGFR関連癌関係の創薬研究はほとんどがチロシンキナーゼ活性の阻害を中心としている。しかし、そうした研究は既存スクリーニング方法の欠点によって妨げられてきた。本分析方法をこの目的に阻害薬と共に使用しうるかどうかを調べるために、細胞膜抽出物を種々用意し、チロシンキナーゼ阻害薬(AG1478)とEGFで別々に処理した(表1)。
【０１４１】
【表３】
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【０１４２】
阻害薬からのLC結果:
図17は、リン酸化位置特異的な抗EGFR 1068 Abを使用して8種類の細胞膜抽出物からアフィニティー捕捉した被プリントEGFRを提示するアミン末端化ＳＡＭを支持体とするネマティック5CBの光学像を示す。野生型(EGF+)サンプルだけがLC配向の乱れを示すが、それはAG1478阻害薬による処理がEGFのEGFRへの結合を首尾よく阻止することを意味する。これらの結果は、この方法が抗癌(チロシンキナーゼ標的)薬のEGFR機能を特異的に弱める能力の解析に使用されうるとの展望をもたらす。
【０１４３】
実施例11  システイン末端化ペプチドによりＰＤＭＳスタンプを官能化する方法
今日までのところ、ＰＤＭＳスタンプをペプチドで官能化する方法は報告されていない。そうしたスタンプは既知ペプチド配列に対しアフィニティーをもつタンパク質の、複雑な混合物(細胞溶解液など)からの捕捉などに応用されるかもしれない。作製されるスタンプはまた、スタンプから所望表面への効率的なタンパク質転写が起こりうるような表面特性をもたなければならない。本実施例ではスタンプ表面にペプチドを共有結合させるための好適な化学反応を説明する。図18に反応スキームを示す。
【０１４４】
ＰＤＭＳスタンプはSylgard 184 Silicone Elastomer Kitを使用して作製し、60℃で少なくとも12時間硬化させた。スタンプを酸素プラズマチャンバーに内で20秒間酸化させ、次いでただちに10%アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)/希酢酸(pH 6.0)溶液に浸漬した。これを80℃に加熱し1時間維持した。スタンプを水洗いし、窒素ガス流の下で乾燥した。次に、スタンプ表面をBS3の1mM水溶液で15分間、次いで2mg/ml BSA/PBS緩衝溶液で30分間、順次処理した。
【０１４５】
共有結合したBSAはリジン残基にスタンプと接触していない遊離アミン基を有する。従って、これらの遊離アミンはヘテロ二官能性架橋剤を介したペプチド分子結合に使用することができる。スタンプを2mM SSMCC/TEA(pH 7.0)溶液で45分間処理した。スタンプを水で洗い、250μMシステイン含有ペプチド/TEA(pH 7.0)溶液で3時間処理した。スタンプを水洗いし、次いで後続のタンパク質捕捉ステップに使用した。
【０１４６】
実施例12：ペプチド修飾スタンプの使用による標的抗pY抗体の捕捉と解放
スタンプ表面におけるリン酸化ペプチドの存在を告げるために、リン酸化チロシン残基を含むペプチド[たとえばアミノ酸配列IYGEFKKKC(配列番号１)を含みかつ既知のSrcプロテインキナーゼ基質であるp-Src-tideなど]に対してだけアフィニティーをもつリン酸化位置特異的な抗体を使用した。Houseman BT et al., Langmuir 19, 1522-1531 (3003)を参照。(p) Src-tideという翻訳後修飾ペプチドIIは、Srcプロテインキナーゼ修飾を模倣するリン酸化チロシン(pY)残基を含む合成分子IpYGEFKKKC(配列番号２)である。これらの分子の配列はMALDI-TOF質量分析法で確認した。逆相C-18 HPLC分析により各分子の純度は98%超であることが示された。
【０１４７】
本実施例は、この抗体タンパク質がp-Src-tideで修飾されたスタンプへ選択的に結合することを明らかにする。Src-tideで修飾されたスタンプは抗体をまったく補足しないことが観測されている。
【０１４８】
この選択的結合のモニターするために、蛍光標識モノクローナル抗リン酸化チロシン(Sigma)を使用した。図19に示すように、Src-tide修飾及びp-Src-tide修飾の両スタンプ(前記の要領で作製)をFITC-抗pY/(PBS+0.1%Triton X-100)希釈溶液(10μg/mL)に3時間接触させた。次に両スタンプをPBS+0.1%Titon X-100で10秒間洗浄し、ついで水で1秒間洗い、次いで窒素ガス流の下で乾燥した。
【０１４９】
結合抗体がSAM表面に転写され、液晶による検出が可能になるかどうかを試験するために実験を設計した。斜め蒸着金薄膜表面を2メルカプト-アミンの2mMエタノール溶液に4時間浸漬してアミン末端化単分子膜を作製した。当該金表面を多量のエタノールと水で洗浄し、乾燥した。次いで、当該SAM表面を1N HClに15秒間浸し、窒素ガスで風乾した。
【０１５０】
FITC-抗pY処理後の乾燥させたスタンプをSAM表面に30秒間接触させた。図20Aに図解するように、1)スタンプによるタンパク質の当初捕捉量と2)SAM表面へのタンパク質転写量の両方を観測するために、スタンプ表面の蛍光強度を分析した。
【０１５１】
図20Bはペプチド修飾スタンプを使用したときの2つの重要な結果を示す。第1に、p-Src-tideへのタンパク質(リン酸化部位特異的な抗体)の当初結合量はSrc-tide修飾スタンプ表面のタンパク質吸着量をかなり上回る(矢印で示す領域を参照)。第2に、スタンプを検出表面と接触させた後のスタンプから検出表面へのタンパク質転写量はモニターすることが可能である。金-SAMのサイズはスタンプのサイズの約1/3であった。暗くなった部分は蛍光標識タンパク質が転写された部分である。
【０１５２】
実施例13：液晶UV前処理によるアミン末端化ＳＡＭ上へのホメオトロピック配向の作成
液晶作製の前処理によるアミン末端化ＳＡＭ上へのホメオトロピック配向の創出が可能かどうかを調べる実験をした。
【０１５３】
先行実施例の場合同様の要領で、新鮮なバッチの5CBをOTS処理スライドガラスと金薄膜上のアミン末端化ＳＡＭの間に挟んだとき、新鮮ではないバッチの場合ほどホメオトロピック配向への転移は観測されなかった(例えば新鮮なバッチは使用期限まで5か月あったが、新鮮でないバッチは使用期限まで1か月を切っていた)。一般に、液晶の前処理は液晶の一様挙動の期間を長くする。従って、前処理後の液晶はより長期にわたりホメオトロピック配向を持続する。従って、ホメオトロピック配向の、より長期にわたる持続が望ましい場合には液晶を前処理してもよい。
【０１５４】
図22Aは、2週間後でもホメオトロピック配向に転移しなかった新鮮な5CBの一様プラナー配向を示す。該新鮮な5CBは、OTS処理スライドガラスと1M HClで前処理した(入射角30°での斜め蒸着)金薄膜上のアミン末端化ＳＡＭの間に挟んだ。
【０１５５】
該新鮮な5CBはガラスバイアルに入れフィルターを備えるSpectroline E-seriesランプ(model EN280L, Westbury, NY)を使用して4時間にわたりUV前処理した。該ランプはUV強度が1.09mW/cm2、UV波長域が300〜450nm(ピーク365nm)である。UV前処理5CBを次にOTS処理スライドガラスと1M HCl前処理金薄膜上のアミン末端化ＳＡＭの間に挟んだ。UV前処理5CBの配向は2日後、部分的にホメオトロピック配向に変わる(図22B参照)。
【０１５６】
該新鮮な5CBはまた、ガラスバイアルに入れフィルターを備えるSpectroline E-seriesランプを使用して24時間にわたりUV前処理した。この(24時間UV前処理)5CBもまたOTS処理スライドガラスと1M HCl前処理金薄膜上のアミン末端化ＳＡＭの間に挟んだ。該24時間UV前処理5CBの配向は液晶セル作製の10分後、ホメオトロピック配向となった(図22C参照)。
【０１５７】
本発明の構成物及びキットは開示の構成要素のうちのいずれか又はすべてを備えることができる。また本発明の方法は開示のステップのうちのいずれかを単独で又は多様に組み合せて実行することにより、行うことができる。当業者には自明であろうが、本発明の諸々の実施態様は本明細書で開示したたの諸々の好適な実施態様と併用することができる。また、やはり当業者には自明であろうが、本発明は、本発明の構成物、キット及び方法の変形であって、開示の１以上の構成要素又はステップを明確に除外するような変形をも包含する。
【０１５８】
当業者には自明であろうが、開示の範囲はいかなる目的でも、特に明細書の提出という点で、可能な諸々の部分的範囲及びその組み合せを包含する。記載の範囲は、同じ範囲を明示するものとして、また少なくとも二等分、三等分、四等分、五等分、十等分などへと分割しうるものとして、容易に認識されうる。非限定的な例として、開示の各範囲は下部３分の1、中部３分の1及び上部３分の1などへと容易に分割することができる。当業者には自明であろうが、「まで」、「少なくとも」、「超」、「未満」などの用語は記載の数字を含み、また後に前述のように部分範囲へと分割しうる範囲をいう。同様にして、開示の比はいずれもその中に包含される諸々の部分比を含む。
【０１５９】
当業者には自明であろうが、成員を通常の方法で、たとえばマーカッシュ方式などへと群化する場合には、本発明はその群全体だけでなくその主群の個別成員及び諸々の可能な下位群をも包含する。従って本発明は、一切の目的のために、主群だけでなく単数又は複数の成員を欠く該主群をも包含する。本発明はまた、本発明において任意の単数又は複数の群成員の明示的除外を見込む。
【０１６０】
本明細書で開示した参考文献、特許明細書及び刊行物はすべて、明確に本明細書に援用される。特に断らない限り、「単数形」の名詞、「少なくとも１」の名詞は、「１以上」の名詞を意味する。
【０１６１】
以上、好ましい実施態様を例示し説明したが、開示した本発明の最広義の態様から逸脱することなく当技術分野の通常の技術に従って種々の変化や変更を例示の実施態様に加えうることは言うまでもない。
【０１６２】
追加の参考文献は以下のとおりである：
【化２】
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【化３】
2007506982.tif 000011
【化４】
2007506982.tif 000012
【化５】
2007506982.tif 000013
【０１６３】
全ての刊行物は、一切の目的のために、本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１．１】図1.1及び1.2は、アフィニティー・マイクロコンタクトプリント法でプリントしたタンパク質の、液晶の使用による検出のための実験ステップの図解である。ビオチン化BSAアフィニティースタンプに抗ビオチンIgG溶液中でインク付けする。インク付けしたスタンプを斜め蒸着金薄膜上のSAMにアフィニティー・マイクロコンタクトプリント法でプリントする。液晶配向の差異がスタンプされたタンパク質の存在を報告する。
【図１．２】図1.1及び1.2は、アフィニティー・マイクロコンタクトプリント法でプリントしたタンパク質の、液晶の使用による検出のための実験ステップの図解である。ビオチン化BSAアフィニティースタンプに抗ビオチンIgG溶液中でインク付けする。インク付けしたスタンプを斜め蒸着金薄膜上のSAMにアフィニティー・マイクロコンタクトプリント法でプリントする。液晶配向の差異がスタンプされたタンパク質の存在を報告する。
【図２】図2: アミン末端化ＳＡＭとOTS処理スライドガラスの間に挟まれた5CBの光学像。A)アミン末端化ＳＡＭ、36℃オーブンで1時間; B) アミン末端化ＳＡＭ、36℃で18時間; C)0.1N HClで前処理したアミン末端化ＳＡＭ、36℃で1時間; D) 0.1N HClで前処理したアミン末端化ＳＡＭ、36℃で18時間。
【図３．１】図3.1: 0.1N HClで前処理したアミン末端化ＳＡＭ上にスタンプされた抗ビオチンIgGの液晶像の時間変化。画像化の合間はサンプルを36℃で加熱した。
【図３．２】図3.2: 液晶配向の一様性に対する時間/加熱の影響。A)液晶セル作製1時間後の光学像; B)同じ液晶セルの、サンプルを37℃に10時間加熱した後の光学像。
【図４】図4: ビオチン化BSAアフィニティースタンプを使用してアフィニティー・マイクロコンタクトプリント法でプリントしたIgGに対する液晶応答の光学像。このアフィニティースタンプは300μm2 PEGのアレイである。A)抗ビオチンIgG、1時間冷却。B) 36℃に8時間加熱後のAのサンプル。プリントされたタンパク質を欠く領域では液晶がプラナー配向からホメオトロピック配向へと変化する。C) 抗ヤギIgG(対照)、1時間冷却。D) 36℃に8時間加熱後のCのサンプル。液晶がプラナー配向からホメオトロピック配向へと転移する。
【図４．１】図4.1: マイクロコンタクトプリント法でプリントした抗ビオチンIgGに対する液晶応答の光学像。A)0°で蒸着した(等方性)金薄膜上のアミン末端化ＳＡＭへのマイクロコンタクトプリンティング; B)アミノプロピルトリエトキシシランで官能化したガラスへのマイクロコンタクトプリンティング。
【図４．２】図4.2: 当該図は、ビオチン化BSAアフィニティースタンプに抗ビオチンIgG及び抗ヤギIgG(対照)を付着させたときの液晶像を示す。図4.2Aでは、液晶はビオチン化BSAアフィニティースタンプへの抗ビオチンIgGの結合とその後のアミン末端化ＳＡＭ基板へ転写する。図4.2Aを図4.2Bの対照実験と比較すると、該アフィニティースタンプは抗ビオチンIgGを特異的に捕捉し、該基質に転写し、それは液晶を使用して検出しうるとの結論が得られる。
【図５．１】図5.1: アフィニティー・マイクロコンタクトプリンティングされたＩｇＧとマイクロコンタクトプリンティングされたIgGについての液晶応答の比較。A)抗ビオチンIgGのアフィニティー・マイクロコンタクトプリンティング; B) 抗ビオチンIgGのマイクロコンタクトプリンティング。
【図５．２】図5.2: アフィニティー・コンタクトプリント法とマイクロコンタクトプリント法に関するIgGプリント領域内の液晶の一様性の比較。A)抗ビオチンIgGのアフィニティー・コンタクトプリンティング; B) 抗ストレプトアビジンIgGのマイクロコンタクトプリンティング。
【図６．１】図6.1: ビオチン化BSAアフィニティースタンプを再使用して抗ビオチンIgGをプリントしたときに得られた光学像。A)1回目のスタンプ使用; B)2回目のスタンプ使用; C)3回目のスタンプ使用。
【図６．２】図6.2: 図6.1で取り上げた光学像の並列比較。
【図７】図7: A)3回目のスタンプ使用後の、アフィニティー・コンタクトプリント法でプリントした抗ビオチンIgGの光学像。これらの光学像は液晶セル作製の1時間後に撮影した。B)これらの光学像は同じサンプルについて、液晶セルを37℃に32時間加熱後に撮影した。0.1M HClで処理したアミン末端化ＳＡＭ上の、タンパク質を欠く領域が今度はホメオトロピック配向となっている。
【図８】図8: アミン末端化ＳＡＭと接触している5CBの光学像(交差分極): アミン末端化ＳＡＭの水平寸法300μm×300μm領域に抗ビオチンIgGをアフィニティー・マイクロコンタクトプリント法でプリントした場合 (A)とマイクロコンタクトプリント法でプリントした場合 (B)。顕微鏡ステージ上のサンプル配向の関数として計測した四角形模様の内側と外側の光度を、アフィニティー・マイクロコンタクトプリント法(C)とマイクロコンタクトプリント法(D)について、グラフ化している。
【図９】図9: 円筒支持体上に取り付けたＰＤＭＳスタンプの使用によるタンパク質のマイクロコンタクトプリンティングの図解(R1=14mm、t1=4mm)。
【図１０】図10: 円筒支持体上に取り付けたＰＤＭＳスタンプを使用してIgGを表面にマイクロコンタクトプリント法でプリントしたアミン末端化ＳＡＭ と接触している5CBの光学像(直交偏光子)。(A)0°サンプル配向; (B)45°サンプル配向; (C) IgGをマイクロコンタクトプリント法でプリントした表面領域と被プリントIgGを欠く表面領域の液晶の輝度を示すグラフ。
【図１１】図11: 円筒支持体上に取り付けたＰＤＭＳスタンプを使用してIgGを表面にマイクロコンタクトプリント法でプリントしたアミン末端化ＳＡＭ と接触している5CBの光学像(直交偏光子)。アミン末端化ＳＡＭは、法線入射で蒸着した金薄膜で支持されている。(A)0°サンプル配向; (B) IgGをマイクロコンタクトプリント法でプリントした表面領域と被プリントIgGを欠く表面領域の液晶の輝度を示すグラフ。
【図１２】図12A-C: ＰＤＭＳスタンプへの生体高分子の共有結合固定化のための反応スキームの図解。
【図１３】図13: アミン末端化ＳＡＭを支持体とするネマティック5CBの光学像と図解。光学像はEGFR(上皮増殖因子受容体)を含む細胞膜抽出物(B82L-WT)又はEGFRを含まない細胞膜抽出物(B82L-親（parental）)からアフィニティー捕捉したEGFRのプリンティングを示す。
【図１４】図14: スタンプされたタンパク質の定量を実証する代表的な結果。WT及び親（parental）サンプルの説明は図13の場合と同じである。
【図１５】図15: アミン末端化ＳＡＭを支持体とするネマティック5CBの光学像。次の4種類の細胞膜抽出物からアフィニティー捕捉したEGFRのプリンティングを示す: 1. EGF処理(5分)したB82L-WT; 2. EGF処理しないB82L-WT; 3. EGF処理(5分)したB82L-親（parental）; 4. EGF処理しないB82L-親（parental）。
【図１６】図16: 被プリントEGFRの領域での5CBの平均光学応答の定量的分析。
【図１７】図17: リン特異的抗EGFR 1068Abを使用して8種類の細胞膜抽出物からアフィニティー捕捉したEGFRのプリンティングを示す、アミン末端化ＳＡＭを支持体とするネマティック5CBの光学像。
【図１８】図18: BSA被覆ＰＤＭＳスタンプのペプチド修飾のためのスキーム。
【図１９】図19: 抗体の特異的捕捉のためのスキーム。
【図２０】図20: A 標識タンパク質の転写の図解。B タンパク質の転写を示すローラー法でプリントした表面の光学像。
【図２１】図21: アフィニティースタンプ作成方法の図解。
【図２２】図22: オクチルトリクロロシラン(OTS)処理スライドガラスと1N HClで前処理したアミン末端化ＳＡＭで官能化した半透明金薄膜(入射角30°)との間に挟まれた液晶(5CB)の光学像。A) 5CB; B) UVで4時間前処理した5CB; C) UVで24時間前処理した5CB。24時間UV前処理した5CBの配向は、液晶形成10分後にはホメオトロピックであった(図22Cを参照)。
【図１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図３】
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【図４】
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【図４】
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【図４】
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【図５】
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【図５】
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【図６】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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