(57)【要約】【課題】  末梢性及び／または冠動脈虚血症候群の患者を治療する新規な方法を提供し、骨格筋及び心筋において血管新生及び動脈形成を促進するべく相乗的に作用する能力がある生成物も提供する。【解決手段】  上記課題を解決するため、ヘパリン化合物と、血管新生増殖因子の発現を促進するかまたは生じさせる能力がある任意の薬剤またはベクターとを併用する。【選択図】  図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生増殖因子をコードする有効量の発現ベクターと、ヘパリン化合物とを含むことを特徴とする生成物。
【請求項２】
前記ヘパリン化合物が、低分子量ヘパリンまたは標準ヘパリンであることを特徴とする請求項１に記載の生成物。
【請求項３】
前記血管新生増殖因子が、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）であることを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載の生成物。
【請求項４】
前記血管新生増殖因子が、酸性ＦＧＦまたはＦＧＦ−１であることを特徴とする請求項３に記載の生成物。
【請求項５】
前記血管新生増殖因子が、ＦＧＦ−２、またはｂＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、またはＦＧＦ１−２２のいずれかであることを特徴とする請求項３に記載の生成物。
【請求項６】
前記血管新生増殖因子が、ＶＥＧＦであることを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載の生成物。
【請求項７】
前記ベクターが、プラスミドベクターであることを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載の生成物。
【請求項８】
前記プラスミドベクターが、条件複製プラスミドであることを特徴とする請求項７に記載の生成物。
【請求項９】
前記ベクターが、ｐＣＯＲプラスミドであることを特徴とする請求項８に記載の生成物。
【請求項１０】
前記ＦＧＦ−１またはＦＧＦａが発現され、前記発現ベクターがＮＶ１ＦＧＦであることを特徴とする請求項１ないし９のいずれかに記載の生成物。
【請求項１１】
前記低分子量ヘパリンが、エノキサパリン、フラキシパリン、ダルテパリン、アルデパリン、チンザパリン、レビパリンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１ないし１０のいずれかに記載の生成物。
【請求項１２】
虚血の治療において、同時に、別々に、または連続的に使用するための請求項１ないし１１のいずれかに記載の生成物。
【請求項１３】
末梢性虚血または心虚血を治療するための薬物を製造するための請求項１ないし１２のいずれかに記載の生成物の使用方法。
【請求項１４】
虚血を治療するための薬物を製造する際の、血管新生増殖因子をコードする発現ベクターの使用方法であって、
前記血管新生増殖因子をコードする発現ベクターが、ヘパリン化合物と併用して投与されることを特徴とする使用方法。
【請求項１５】
虚血を治療するための薬物を製造する際のヘパリン化合物の使用方法であって、
前記ヘパリンが、血管新生増殖因子をコードする発現ベクターと併用して投与されることを特徴とする使用方法。
【請求項１６】
前記ヘパリン化合物が、標準ヘパリンまたは低分子量ヘパリンであることを特徴とする請求項１４または１５のいずれかに記載の使用方法。
【請求項１７】
前記発現ベクターが、ＦＧＦ−１またはＦＧＦａをコードし、かつプラスミドであることを特徴とする請求項１３ないし１６のいずれかに記載の使用方法。
【請求項１８】
前記低分子量ヘパリンが、エノキサパリン、フラキシパリン、ダルテパリン、アルデパリン、チンザパリン、レビパリンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１３ないし１７のいずれかに記載の使用方法。
【請求項１９】
虚血性患者の骨格筋または心筋組織において成熟側副血管を促進することによって作用する薬物を製造するための請求項１３ないし１８のいずれかに記載の使用方法。
【請求項２０】
虚血性患者の骨格筋または心筋組織において成熟側副血管及び細動脈の両方を促進することによって作用する薬物を製造するための請求項１３ないし１９のいずれかに記載の使用方法。
【請求項２１】
虚血性患者の骨格筋または心筋組織において大きな成熟伝導血管（１５０μｍ超の側副血管）及び小さな抵抗動脈（５０μｍ未満の細動脈）の形成を促進することによって作用する薬物を製造するための請求項１３ないし２０のいずれかに記載の使用方法。
【請求項２２】
前記虚血性患者が、末梢性虚血または冠動脈虚血を起こしやすいかまたは虚血の危険性があり、
前記患者が、４５才またはそれ以上であり、過体重であり、及び／またはアルコールまたはタバコの消費量が多く、及び／またはアテローム性動脈硬化症及び／または糖尿病であり、及び／または動けない状態であることを特徴とする請求項１３ないし２１のいずれかに記載の使用方法。
【請求項２３】
前記虚血性患者が、最後の２４時間から６ヵ月まで、または最大で１年、２年、または３年前までの期間、虚血性心発作を起こしやすい患者であり、
血管新生因子をコードする発現ベクターと低分子量ヘパリンの組合せ物を投与する過程を含むことを特徴とする請求項１３ないし２２のいずれかに記載の使用方法。
【請求項２４】
前記低分子量ヘパリンが、１日当たり０．２〜０．４ｍｇ／ｋｇの用量で皮下に投与されることを特徴とする請求項１３ないし２３のいずれかに記載の使用方法。
【請求項２５】
前記低分子量ヘパリンが、１日当たり約０．３ｍｇ／ｋｇの用量で皮下に投与されることを特徴とする請求項２４に記載の使用方法。
【請求項２６】
前記低分子量ヘパリンの最初の投与と最後の投与の間が少なくとも２０日間または３０日間は離されるように、前記低分子量ヘパリンが、少なくとも２０日間または少なくとも３０日間にわたり投与され、１回、２回、３回、またはそれ以上の間、前記血管新生増殖因子をコードするＤＮＡが投与されることを特徴とする請求項１３ないし２５のいずれかに記載の使用方法。
【請求項２７】
血管新生増殖因子をコードする発現ベクターと、ヘパリン化合物とを含む医薬組成物であって、
前記ベクターまたは前記ヘパリン化合物のいずれか単独の場合よりも、これらを併用する方が骨格筋及び心筋において血管新生をさらに促進することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２８】
血管新生増殖因子をコードする発現ベクターと、ヘパリン化合物とを含む医薬組成物であって、
前記ベクターまたは前記ヘパリン化合物のいずれか単独の場合よりも、これらを併用する方が骨格筋及び心筋において動脈形成をさらに促進することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２９】
前記ヘパリン化合物が、標準ヘパリンまたは低分子量ヘパリンであることを特徴とする請求項２７または２８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記血管新生増殖因子が、ＦＧＦ−１であることを特徴とする請求項２７または２８のいずれかの医薬組合せ物。
【請求項３１】
前記血管新生増殖因子が、ＦＧＦ−２、またはｂＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、またはＦＧＦ１−２２のいずれかであることを特徴とする請求項２７または２８のいずれかの医薬組成物。
【請求項３２】
前記発現ベクターが、ウイルス性ベクターであることを特徴とする請求項２７または２８のいずれかの医薬組成物。
【請求項３３】
前記発現ベクターが、非ウイルス性ベクターであることを特徴とする請求項２７または２８のいずれかの医薬組成物。
【請求項３４】
前記発現ベクターが、プラスミドであることを特徴とする請求項２７または２８のいずれかの医薬組成物。
【請求項３５】
前記発現ベクターが、ｐＣＯＲであることを特徴とする請求項２７または２８のいずれかの医薬組成物。
【請求項３６】
前記発現ベクターが、ＮＶ１ＦＧＦであることを特徴とする請求項２７または２８のいずれかの医薬組成物。
【請求項３７】
前記低分子量ヘパリンが、エノキサパリン、ナドロパリン、ダルテパリン、アルデパリン、チンザパリン、またはレビパリンであることを特徴とする請求項２７または２８のいずれかの医薬組成物。
【請求項３８】
末梢性虚血を治療する方法であって、
血管新生因子をコードする発現ベクターとヘパリン化合物との組合せ物を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３９】
冠動脈虚血を治療する方法であって、
血管新生因子をコードする発現ベクターとヘパリン化合物との組合せ物を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
末梢性虚血または冠動脈虚血を起こしやすいかまたは虚血の危険性がある患者を治療する方法であって、
前記患者が、４５才またはそれ以上であり、過体重であり、及び／またはアルコールまたはタバコの消費量が多く、及び／またはアテローム性動脈硬化症及び／または糖尿病であり、及び／または動けない状態であり、
そのような治療が、血管新生因子をコードする発現ベクターとヘパリン化合物との組合せ物を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項４１】
最後の２４時間から６ヵ月まで、または最大で１、２、または３年前までの期間、虚血性心発作を起こしやすい患者を治療する方法であって、
血管新生因子をコードする発現ベクターとヘパリン化合物との組合せ物を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項４２】
前記ヘパリン化合物が、標準ヘパリンまたは低分子量ヘパリンであることを特徴とする請求項３８ないし４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
骨格筋または心筋組織において成熟側副血管を促進する必要がある哺乳動物被検対象にそのような治療を施す方法であって、
前記被検対象の前記組織に請求項１ないし１１のいずれか１つに記載の前記生成物を、成熟側副血管を促進する有効量注入する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項４４】
骨格筋または心筋組織において側副血管及び細動脈の両方を促進する必要がある哺乳動物被検対象にそのような治療を施す方法であって、
前記被検対象の前記組織に請求項１ないし１１のいずれか１つに記載の前記生成物を、側副血管及び細動脈の両方を促進する有効量注入する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項４５】
骨格筋または心筋組織において大きな成熟伝導血管（１５０μｍ超の側副血管）及び小さな抵抗動脈（５０μｍ未満の細動脈）の形成を促進する必要がある哺乳動物被検対象にそのような治療を施す方法であって、
前記被検対象の前記組織に請求項１ないし１１のいずれか１つに記載の前記生成物を有効量注入する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
前記血管新生増殖因子が、ＦＧＦａまたはＦＧＦ１であることを特徴とする請求項３８ないし４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記ヘパリン化合物と、前記ＦＧＦ−１をコードする発現ベクターとが、別々にまたは同時に投与されることを特徴とする請求項３８ないし４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記ＦＧＦ−１をコードする発現ベクターが、骨格筋または心筋組織において注入され、
前記ヘパリン化合物が、全身的に投与されることを特徴とする請求項３８ないし４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記ヘパリン化合物が、腹腔内にまたは皮下に投与されることを特徴とする請求項３８ないし４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
前記低分子量ヘパリンが、１日当たり０．２〜０．４ｍｇ／ｋｇの用量で皮下に投与されることを特徴とする請求項３８ないし４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記低分子量ヘパリンが、１日当たり約０．３ｍｇ／ｋｇの用量で皮下に投与されることを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記低分子量ヘパリンの最初の投与と最後の投与の間が少なくとも２０日間または３０日間は離されるように、前記低分子量ヘパリンが、少なくとも２０日間または少なくとも３０日間にわたり投与され、１回、２回、３回、またはそれ以上の間、前記血管新生増殖因子をコードするＤＮＡが投与されることを特徴とする請求項３８ないし５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
前記血管新生増殖因子をコードする遺伝子またはＤＮＡが、大腿及びふくらはぎの後部に投与されることを特徴とする請求項３８ないし５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
前記血管新生増殖因子をコードする遺伝子またはＤＮＡが、前記骨格筋または心筋の虚血性部位の周辺に頻回注射により投与されることを特徴とする請求項３８ないし５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
前記低分子量ヘパリンが、エノキサパリン、フラキシパリン、ダルテパリン、アルデパリン、チンザパリン、レビパリンからなる群から選択されることを特徴とする請求項３８ないし５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
前記低分子量ヘパリンが、前記血管新生因子をコードする遺伝子より前に投与されることを特徴とする請求項３８ないし５５のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
ＦＧＦａまたはＦＧＦ−１遺伝子またはＤＮＡ配列が、非ウイルス性ベクターによって、好適にはプラスミドベクターによって、保有されることを特徴とする請求項３８ないし５６のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
前記プラスミドベクターが、ｐＣＯＲなどの条件複製ベクターであることを特徴とする請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記プラスミドベクターが、ＮＶ１ＦＧＦと呼ばれることを特徴とする請求項５７または５８のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
末梢性虚血を治療する方法であって、
血管新生増殖因子をコードする発現ベクターと、ヘパリン化合物との医薬組合せ物を、そのような治療が必要な哺乳動物被検対象に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項６１】
冠動脈虚血を治療する方法であって、
血管新生増殖因子をコードする発現ベクターと、ヘパリン化合物との医薬組合せ物を、そのような治療が必要な哺乳動物被検対象に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項６２】
虚血性骨格筋または心筋組織において１５０μｍ以上の側副血管の形成を促進する方法であって、
血管新生増殖因子をコードする発現ベクターと、ヘパリン化合物との医薬組合せ物を、そのような治療が必要な哺乳動物被検対象に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項６３】
虚血性骨格筋または心筋組織において５０μｍ以下の細動脈の形成を促進する方法であって、
血管新生増殖因子をコードする発現ベクターと、ヘパリン化合物との医薬組合せ物を、そのような治療が必要な哺乳動物被検対象に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項６４】
前記血管新生増殖因子が、酸性ＦＧＦまたはＦＧＦ−１であることを特徴とする請求項６０ないし６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
前記血管新生増殖因子が、ＦＧＦ−２、または塩基性ＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、またはＦＧＦ１−２２のいずれかであることを特徴とする請求項６０ないし６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
前記発現ベクターが、ウイルス性ベクターであることを特徴とする請求項６０ないし６５のいずれかに記載の方法。
【請求項６７】
前記発現ベクターが、非ウイルス性ベクターであることを特徴とする請求項６０ないし６６のいずれかに記載の方法。
【請求項６８】
前記発現ベクターが、プラスミドベクターであることを特徴とする請求項６０ないし６７のいずれかに記載の方法。
【請求項６９】
前記発現ベクターが、ｐＣＯＲであることを特徴とする請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記発現ベクターが、ＮＶ１ＦＧＦであることを特徴とする請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記ヘパリン化合物が、標準ヘパリンまたは低分子量ヘパリンであることを特徴とする請求項６０ないし７０のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
前記低分子量ヘパリンが、エノキサパリン、ナドロパリン、ダルテパリン、アルデパリン、チンザパリン、またはレビパリンであることを特徴とする請求項６０ないし７１のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、末梢性及び／または冠動脈虚血症候群の患者を治療する新規な方法に関し、血管新生増殖因子をコードする発現ベクターと、ヘパリン化合物または低分子量ヘパリン化合物とを含む生成物であって、骨格筋及び心筋において血管新生及び動脈形成を促進するべく効果的に作用可能な生成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
骨格及び心臓の虚血性組織における血液灌流の回復は、血管新生の複雑なプロセスを伴う。複雑なプロセスとは、内皮細胞の増殖、基底膜の分解、周囲のマトリクスを通過しての移行、アライメント、血管壁を形成して毛細血管網を新たに形成するための管状構造体への分化等からなる。動脈形成は、側副細動脈の成長を指すが、このような血管が有する能力は、毛細血管網のそれに比べて高いので、血液灌流の回復のための効率的なプロセスであると考えられている（Carmeliet et al., Nat. Med., 2000; 6: 389-395、Van Royen et al., Cardiovasc. Res., 2001; 49: 543-553）。
【０００３】
血液灌流を回復させる様々な戦略が存在する。血管新生遺伝子治療は、側副発達の向上及び灌流異常並びに関係する虚血の克服を目標とする可能な選択肢である（６〜８）。血管新生タンパク質を発現する能力がある核酸を、裸の形で投与するか、或いはリポソームまたはウイルス性ベクターにより投与するかいずれかでの治療的血管新生について調査が行われてきた。
【０００４】
直接虚血性組織における増殖因子の搬送を含むタンパク質治療は、治療的血管新生の別の選択肢を構成する。例えば、側副血管を促進するために幾つかの組換え型タンパク質、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ、及びＴＧＦ−ｐを投与することが提唱されている。
【０００５】
幾つかの異なる血管新生タンパク質、例えば、組換え型ヒトＶＥＧＦタンパク質、組換え型ヒト塩基性ＦＧＦタンパク質（ｂＦＧＦ）、組換え型ＴＧＦ−８またはＰＤＧＦタンパク質を含むタンパク質の局所投与が側副血管を促進することが動物実験により実証された。そのような組換え型血管新生タンパク質が、虚血性心血管疾患、即ち末梢血管疾患または冠状動脈疾患の治療に対して提唱されてきた。
【０００６】
ヘパリンは、天然源から抽出されるグリコサミノグリカンファミリーの生物学的に活性な物質であり、価値ある抗凝血性及び抗血栓の性質を有する。ヘパリンは、特に、手術後の静脈血栓症の治療に有用である。ヘパリン化合物は、種々の分子量で調製されることがある。
【０００７】
標準ヘパリンは、６０００〜４００００Ｄａの分子量を有する。最も流通しているヘパリン調製物の平均分子量は、１２０００〜１５０００Ｄａの範囲にある。標準ヘパリンは、ブタの腸管粘液またはウシの肺から大規模に単離される。
【０００８】
ヘパリンは、２０００〜１００００Ｄａの範囲の平均分子量を有する硫酸多糖の混合物の調製物を含む平均分子量がより低い分子に断片化されることがある。これらの混合物は、ヘパリンエステルの解重合及びけん化によって産出される。これらは、抗血栓活性が高く、全抗凝血活性がヘパリンよりも低い。
【０００９】
血液凝固は、多くのタンパク質分解酵素が一定配列において相互に活性化し、最後の段階でフィブリノゲンがタンパク質分解酵素トロンビンの作用下で不溶性フィブリンに変えられるようなカスケード様プロセスに基づく。凝固プロセスには、実のところ、複雑に相互関係を有しても連続的なものとして一般的に説明される３つの期が含まれる。第１期は、トロンボプラスチン形成からなる、プロトロンビナーゼ（または活性トロンボプラスチン形成）期である。第２期はトロンビン形成からなり、この期は、要約すると、イオン化カルシウムの存在下で、プロトロンビナーゼの影響下での、プロトロンビンのトロンビンへの変換である。最後に、第３期はフィブリン形成からなり、ここでは血液フィブリノゲンは、不溶性になるフィブリンへ変えられるトロンビンの影響下にある。
【００１０】
プロトロンビナーゼの形成は、トロンボプラスチン形成過程の間に、本質的に２つの異なる経路、即ち内因性経路と外因性経路に基づいて起こるが、これらは、プロトロンビンを活性化して活性トロンビンにすることができるような、それぞれ血漿及び組織起源のプロトロンビナーゼの形成に終わる。
【００１１】
内因性経路は、連続的に活性化される能力がある多数の因子または血漿プロ酵素（因子ＸＩＩ、ＸＩ，ＩＸ、ＶＩＩＩ、Ｘ）を伴い、ここで、各活性化された産物（因子ＸＩＩａ、ＸＩａ，ＩＸａ、ＶＩＩＩａ、Ｘａ）は、次のプロ酵素を活性化する能力がある酵素のように作用し、活性化されたＸ因子（Ｘａ）は、特に血小板起源のリン脂質及びＶ因子との反応によって、活性内因性血漿プロトロンビナーゼの産出に関与する。外因系は、特に組織病変部に直接依存することができるが、より限られた数の因子を求めるものであり、ＶＩＩ因子と共に、因子ＶＩＩＩａのように、不活性Ｘ因子をＸａ因子に変えることができる組織トロンボプラスチンの産出物を特に含む。トロンビンへのプロトロンビンの活性化配列は、このとき、内因系に対するものと実質的に同じであるが、ここには血漿起源のではなく組織のリン脂質がある。
【００１２】
凝固プロセスの結果、このプロセスの始動の起点で、例えば血管のレベルで、病変部を埋めることを特に目的とする、不溶性のフィブリン血餅が形成される。
【００１３】
これらの凝固プロセスは通常、特にプラスミンの影響下で、血餅を溶解させるように意図された線維素溶解と呼ばれるプロセスを生じさせ、ここで、酵素は普通は循環血液中に不活性前駆体プラスミノゲンの形でしか存在せず、フィブリン自体はそれにもかかわらず不活性プラスミノゲンの線維素溶解性活性プラスミンへの変換を開始する能力がある因子の１つを構成する。実のところ、非常に複雑なプロセスに基づき、対立する活性化因子及び阻害因子に依存して、均衡機序がある。これらの機序の不均衡は、凝固性亢進の点では、その後、血栓症に羅患させることができる。他方では、凝固性亢進は、宿主を出血の危険にさらす。
【００１４】
ヘパリンの抗凝固活性の詳細な機序は、今では基本的に知られている。ヘパリンは、連続酵素反応のカスケードにおける幾つかのレベルで作用し、血液の凝固性亢進をもたらすことができる状況において生理的止血の経過に関与している。ヘパリンは、詳細には、異なる形の凝固性亢進を作り出しかつ維持することに関与する多数の凝固因子を同時に抑制する能力がある。もっと正確に言えば、ヘパリンは、抗トロンビンとの高親和性複合体を形成する。抗トロンビン‐ヘパリン複合体の形成によって、２つの成分凝血原プロテアーゼ、即ち因子Ｘａ及びトロンビンの阻害速度が大いに増す。抗トロンビン単独によるこれらの両酵素の阻害速度は、従って、ヘパリンによって約１０００倍に増加する。両活性型プロテアーゼの促進された不活性化は、血餅形成に不可欠なフィブリノゲンのフィブリンへの変換が引き続き起こることを防止する。
【非特許文献１】Ouriel K. Peripheral arterial disease. Lancet. 2001; 358: 1257-1264.
【非特許文献２】Soubrier F, Cameron B, Manse B, Somarriba S, Dubertret C, Jaslin G, Jung G, Le Caer C, Dang D, Mouvault JM, Scherman D, Mayaux JF, Crouzet J. pCOR : a new design of plasmid vectors fornonviral gene therapy. Gene Ther. 1999; 6: 1482-1488.
【非特許文献３】Dart AM, Chin-Dusting JPF. Lipids and the endothelium. Cardiovasc. Res. 1999; 43: 308-322.
【非特許文献４】Takeshita S, Isshiki T. , Sato T. Increased expression of direct gene transfer into skeletal muscles observed after acute ischemic injury in rats. Lab. Invest. 1996; 74: 1061-1065.
【非特許文献５】Silvestre JS, Mallat Z, Duriez M, Tamarat R, Bureau MF, Scherman D, Duverger N,Branellec D, Tedgui A, LevyBi. Antiangiogenic effect of interleukin-10 in ischemia-induced angiogenesis in mice hindlimb. Circ. Res. 2000; 87: 448-452.
【非特許文献６】Yla-Herttuala S, Martin JF.Cardiovascular gene therapy. Lancet. 2000; 355: 213-222.
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
ヘパリンはこのようにして、著しい妨害を受けているとき、例えば外科手術の場合に、凝固性亢進の緩和効果を許容し、凝固‐線維素溶解機序を均衡する。しかし、再平衡でのこれらの試みが非常に細心の注意を要すること、その結果として、過凝固の危険、例えば術後血栓症の出現を防止するための高用量の抗凝血の投与‐または後者の不十分な選択性‐が最終的に大出血をもたらすことがあることは、よく知られている。
【発明を解決するための手段】
【００１６】
出願人は、低分子量ヘパリン（ＬＭＨＷ）または標準ヘパリンなどのヘパリン化合物を、血管新生増殖因子をコードする発現ベクターと併用すると、強力な血管新生及び動脈形成の相乗反応を誘発し得ることを発見した。出願人はまた、標準ヘパリンと線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）をコードする発現ベクターとの組成物が強力な血管新生及び動脈形成効果を生じさせることを示した。ヘパリンがポリメラーゼを強力に阻害するという一般知識に反して、ポリメラーゼとの結合において二重鎖のＤＮＡと競合することによって、出願人は、これが、例えば骨格筋及び／または心筋において血管新生増殖因子をコードするＤＮＡの活性を高めかつ強力な相乗的な血管新生の反応を生じさせるような、ＬＭＨＷまたは標準ヘパリンと組み合わせて発現ベクターまたはプラスミドの形での裸のＤＮＡ注入を伴うケースではないことを実証した。本発明のそのような組合せは、先行技術には決して開示されていなかった。
【００１７】
その上、驚くべきことに、ＬＭＨＷと共に血管新生増殖因子をコードするＤＮＡを投与すると、高コレステロール血症または糖尿病環境における血管新生異常を逆にすることができることが発見された。高レベルの脂質は、血管拡張、白血球‐内皮相互作用、血栓症、線維素溶解、内皮細胞増殖などの内皮機能をひどく損なうことがあり得る（３）。特に、酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）系は、高レベルの酸化低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ‐Ｃ）を含むこれらの生理病理学的条件に影響される。糖尿病の実験モデル及びＩ型及びＩＩ型糖尿病の患者における血管機能は、著しく損なわれている血管新生機能によって特徴付けられる。
【００１８】
出願人は、酸性線維芽細胞増殖因子などの血管新生増殖因子をコードする発現ベクターが、標準ヘパリンまたはＬＭＨＷなどのヘパリン化合物との併用で、虚血性骨格筋または心筋に投与されたときに、高コレステロール血症または糖尿病を罹患している哺乳動物被検対象において、側副血管における異常を効率的に逆行させ、細動脈などの成熟血管の形成を促進する能力があることを既に示した。
【００１９】
出願人は、標準ヘパリンまたはＬＭＨＷなどのヘパリン化合物と共に酸性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１）をコードする発現ベクターを含む生成物を有効量用いて、特に高コレステロール血症または糖尿病などの悪質な病気において、虚血性骨格筋または心筋の血管新生異常を救うことができることを発見した。本発明は、強力な血管新生効果を有する組成物に関し、具体的には、骨格筋及び心筋に選択的なもの関する。本発明は、血管新生増殖因子をコードするＤＮＡが低分子量ヘパリンまたは標準ヘパリンなどのヘパリン化合物との併用で強力な相乗効果を有し、骨格筋及び心筋に強力な血管新生反応を誘発するという事実に部分的に基づく。
【００２０】
しかしながら、本発明は、ヘパリン化合物との併用でＤＮＡ発現ベクターまたは裸のＤＮＡの使用に限定されるものではない。その代わりに、細胞または生物における血管新生増殖因子の発現を促進するかまたは生じさせる能力がある任意の薬剤またはベクターを選択して用いることができる。当業者は、これらの薬剤またはベクターの多数の例に精通しており、そのようなものには、プラスミド、ウイルス、レトロウイルス、核酸、コスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣ、ウイルス性ゲノム、組換え型アデノウイルス性ベクター、細胞と一体にされるかまたは細胞内に存在する他の核酸、アデノウイルス性ベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レンチウイルス性、またはレトロウイルス性ベクターなどのベクターが含まれる。それ故に、「ベクター」は、核酸を宿主細胞内に導入するために利用することができる任意の核酸または核酸を有する粒子、細胞、または生物を意味する。「ベクター」なる語は、核酸を細胞に導入及び／または、少なくとも１つの血管新生増殖因子の発現を生じさせるかまたは促進する化合物を導入するためのウイルス性及び非ウイルス性の両方の生成物及び系を含む。「ベクター」は、in vitro、ex vivo、またはin vivoで用いられることができる。非ウイルス性ベクターは、プラスミド、コスミドを含み、例えば、リポソーム、サイトフェクチン（cytofectin）、ＤＮＡ‐タンパク質複合体、生体高分子を含めることができる。ウイルス性ベクターには、例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ関連ウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、レオウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタイン‐バーウイルス、組換え欠陥アデノウイルスベクターが含まれる。ベクターには、ウイルスの組換え型ゲノム配列またはゲノム配列全体を含めることもできる。ベクターはまた、細胞に感染し、細胞に入り、または細胞に導入されてその中に核酸を搬送する能力があるウイルスを産出するための機能的配列を含むゲノムの一部を含むこともできる。
【００２１】
本発明は、血管新生増殖因子をコードする有効量の薬剤または発現ベクターまたはプラスミドと、標準ヘパリンまたはＬＭＨＷなどのヘパリン化合物を含む生成物に関し、末梢性または心虚血を治療する薬物を製造するためのそのような生成物の使用方法に関する。
【００２２】
本発明はまた、ベクターまたはヘパリン化合物のいずれか単独よりもこれらを併用する方が骨格筋及び心筋において血管新生をさらに促進するような発現ベクターを含む医薬組成物に関する。
【００２３】
本発明はまた、心筋及び骨格筋において血管新生及び動脈形成を促進する新規な方法に関し、血管新生増殖因子をコードする発現ベクターと低分子量ヘパリンまたは標準ヘパリンとの、相乗的に作用する能力がある新規な組合せに関する。
【００２４】
本発明は更に、末梢性虚血または冠動脈虚血を起こしやすいかまたは虚血の危険性がある患者であって、４５才またはそれ以上であり、過体重であり、及び／またはアルコールまたはタバコの消費量が多く、及び／またはアテローム性動脈硬化症及び／または糖尿病であり、及び／または動けない状態である患者を治療する新規な方法であって、血管新生因子をコードするＤＮＡ配列とヘパリン化合物の組合せ物を投与する過程を含む方法に関する。本発明はまた、最後の２４時間から６ヵ月まで、または最大で１、２、または３年前までの期間、虚血性心発作を起こしやすかった患者を治療するのに有用であり、血管新生因子をコードする発現ベクターとヘパリン化合物の組合せ物を投与する過程を含む。
【００２５】
本発明は更に、哺乳動物被検対象の虚血性骨格筋または心筋組織において側副血管と細動脈の両方を促進する新たな方法であって、被検対象に本発明の生成物を有効量注入する過程を含む方法を提供する。
【００２６】
本発明は更に、哺乳動物被検対象に本発明の生成物を有効量注入することによって被検対象の虚血骨格筋または心筋組織において大きな成熟伝導血管（１５０μｍ超の側副血管）及び小さな抵抗動脈（５０μｍ未満の細動脈）の形成を促進する方法を提供する。
【００２７】
本発明の更なる目的は、特に内皮機能が損なわれているときに、虚血性組織において側副血管成長と細動脈成長の両方を促進する方法を提供することである。
【００２８】
高コレステロール血症または糖尿病環境の虚血性筋肉において血管再生を刺激及び／または促進する方法と、血管新生異常を逆行させる必要がある、高コレステロール血症または糖尿病を患っている哺乳動物被検対象にそのような治療を施す方法を提供することも本発明の目的である。
【００２９】
本発明の別の目的は、末梢性または心筋虚血、創傷治癒、または新血管新生または組織再生を必要とする他の状態など虚血状態を治療するための血管新生治療を提供することである。
【００３０】
さらに、本発明の別の目的は、血管形成術、バイパス移植術または他の血管再生手順の対象である患者において治療的血管新生を増強する方法を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明は、冠動脈または末梢性虚血の患者を治療するための、血管新生因子をコードする発現ベクターと、低分子量ヘパリンまたは標準ヘパリンとを含む組成物を提供する。そのような組合せ物の使用は、期せずして、哺乳動物被検対象の虚血性骨格筋または心筋組織の至る所で血管新生または動脈形成を促進することによって血管再生と灌流を増強する相乗効果を与える。
【００３２】
本発明は、心筋及び骨格筋において血管新生及び動脈形成を促進する新規な方法にも関する。
【００３３】
「被検対象」なる語には、限定されるものではないが、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ラット、ネズミ、サル、ヒトなどの哺乳動物が含まれる。
【００３４】
血管新生増殖因子をコードするベクターは、通常はＤＮＡ分子であり、一般的に、治療される個々の細胞において血管新生増殖因子発現する能力がある。血管新生増殖因子をコードする発現ベクターには、例えば、ＦＧＦ−１または酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ）、ＦＧＦ−２、または塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、またはＦＧＦ１−２３のいずれかなどの線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）をコードするＤＮＡが含まれることがある。そのような血管新生増殖因子のコード配列は、当該分野で既知である。例えば、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、及びＦＧＦ−７のＤＮＡコード配列は、それぞれ配列番号（SEQ ID NO）１〜６に設定される。本発明の組合せ物において有用な他の遺伝子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）をコードする遺伝子であり、例えば、ＶＥＧＦ−Ａ（成熟アイソフォーム２０６、１８９、１６５、１４５、及び１２１アミノ酸残基）、ＶＥＧＦ２０６、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１２０や、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄを含むＶＥＧＦ同族体や、ＶＥＧＦヘテロ二量体などをコードする遺伝子である。他の有用な遺伝子には、血小板由来の増殖因子（ＰＤＧＦ ＡＡ、ＡＢ、またはＢＢ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、またはインシュリン増殖因子（ＩＧＦ‐ＩまたはＩＩ）が含まれる。本発明の好適な組成物には、酸性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１またはａＦＧＦ）をコードするＤＮＡが含まれる。
【００３５】
血管新生因子コード配列は、ウイルス性または非ウイルス性発現ベクターによって保有されることがある。「ベクター」なる語は、好適にはＤＮＡまたは核酸分子である賦形剤を指し、これは、核酸分子を輸送しかつ自身が保有する血管新生因子を発現することができる。ベクターが核酸分子であるとき、核酸分子はベクター核酸に共有結合的に結合される。血管新生因子を発現するために種々の発現ベクターを用いることができる。そのようなベクターには、染色体のベクターと、エピソームのベクターと、ウイルス由来のベクター、例えば、細菌性プラスミドに由来するベクターと、バクテリオファージに由来するベクターと、酵母エピソームに由来するベクターと、酵母人工染色体を含む酵母染色体要素に由来するベクターと、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルスなどのウイルスに由来するベクターとが含まれる。ベクターは、例えばコスミド及びファージミドなどのプラスミド及びバクテリオファージ遺伝因子に由来するものなど、これらの源の組合せに由来することもある。原核及び真核宿主に対する適切なクローニングベクター及び発現ベクターについては、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd. ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , (1989) に記載されている。
【００３６】
血管新生因子は、プラスミドによって保有及び発現されるのが最も好ましい。発現プラスミドは、当該分野で既知である。ｐＢＲ３２２などのＣｏｌＥ１プラスミド、プラスミドｐＭＢ１、またはプラスミドｐＭＫ１６に由来する発現プラスミドを用いることができるので（Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, JohnWiley and Sons, New York (1988)§11: 1.5.2）、血管新生因子コード配列は、従来の方法に従って大腸菌を形質転換し、挿入断片を有する形質転換体をスクリーニングすることによって、クローン化されることがある。哺乳動物発現ベクターは、用いられ、ｐＣＤＭ８（Seed, B. Nature 329: 840 (1987)）及びｐＭＴ２ＰＣ（Kaufman et al., EMBO J. 6: 187- 195 (1987)）を含むことがある。他の適切な遺伝子作成物には、この作成物を染色体外に維持し、細胞中に作成物の多コピーを産出するために、哺乳動物複製起点が与えらされることができる。インビトロゲン社（Invitrogen, San Diego Calif.）から得たプラスミドｐＣＥＰ４及びｐＲＥＰ４は、エプスタイン‐バーウイルス複製起点と、一体化なしに高コピーエピソームの複製を産出する核抗原ＥＢＮＡ‐１コード化領域を含む。血管新生因子を発現するのに有用であるであろう当業者に利用可能な既知のベクターのほんの一例として、ここに挙げた発現ベクターがprovideされる。これらは、例えば、Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989に見つけることができる。発現ベクターまたはプラスミドは、血管新生因子の発現に必要な、ベクターにおいて血管新生因子コード配列に機能的に結合された調節領域を含み、プロモーター、開始コドン、停止コドン及びポリアデニル化シグナルを含む。
【００３７】
開始及び停止コドンは、一般的に血管新生因子のコード配列を有するフレームにあり、所望の血管新生因子をコードするヌクレオチド配列の一部であると考えられる。
【００３８】
本発明を実施するのに有用なプロモーターの例には、限定されるものではないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーターと、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターと、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、例えばＨＩＶ末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターと、モロニーウイルス、ＡＬＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、例えばＣＭＶ前初期プロモーターと、エプスタイン‐バーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）と、そして、ヒトαアクチン、ヒトのミオシン、ヒトのヘモグロビン、ヒトの筋肉クレアチン、ヒトのメタロチオネインなどヒト遺伝子由来のプロモーターとが含まれる。調節配列は、温度、栄養素添加物、またはホルモンまたは他のリガンドなどの外因性因子によるなどして、１若しくは複数の宿主細胞（即ち組織特異）において構成的発現を与えることがあるか或いは１若しくは複数の細胞型において誘発性発現を与えることがある。原核及び真核宿主において構成的及び誘発性発現を与える種々のベクターは、当業者に公知である。例えば、筋肉特異プロモーターは、血管新生因子の発現を推進するために用いられることがあり、米国特許公開公報２００３／００３９９８４に記載されているネズミまたはヒトのＣＡＲＰ遺伝子の上流配列または国際公開ＷＯ０１／１１０６４に記載の心筋αアクチンプロモーター配列を含む。
【００３９】
特にヒトに対する遺伝子ワクチンの産出において、本発明を実行するのに有用なポリアデニル化シグナルの例には、限定されるものではないが、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ウシまたはヒトの成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナルが含まれる。特に、ｐＣＥＰ４プラスミド（Invitrogen, San Diego Calif.）においてＳＶ４０ポリアデニル化シグナルと呼ばれるＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが用いられる。
【００４０】
ＤＮＡ発現に必要な調節要素に加えて、他の要素がＤＮＡ分子に含まれることもある。そのような追加要素には、エンハンサーが含まれる。エンハンサーは、限定されるものではないが、ヒトのアクチン、ヒトのミオシン、ヒトのヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンと、ＳＶ４０、ＲＳＶ、及びＥＢＶエンハンサーなどからのウイルス性エンハンサー、サイトメガロウイルス前初期エンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー、レトロウイルスＬＴＲエンハンサー、を含む群から選択されることができる。
【００４１】
転写の開始及び制御のための部位を含めることに加えて、発現ベクターは、転写の終了に必要な配列と、転写された領域において翻訳のためのリボソーム結合部位とを含むこともできる。当業者は、発現ベクターにおいて有用である調節配列が多数あることに気付くことになるであろう。そのような調節配列については、例えば、Sambrook et al, Molecular Cloning. A LaboratoryManual. 2nd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , (1989) に記載されている。
【００４２】
公知の手順により、血管新生因子コード配列をベクター核酸に挿入することができる。一般的に、最終的に発現することになるＤＮＡ配列は、１若しくは複数の制限酵素によりＤＮＡ配列及び発現ベクターを切断してその後フラグメント（断片）群を結合することによって、発現ベクターに結合される。制限酵素の消化及び結合の手順は、当業者に既知である。
【００４３】
発現ベクターには、一般的に、組換え型ベクター作成物を含む細胞の亜集団の選択を可能にする選択可能なマーカが含まれる。マーカは、本明細書中で説明した核酸分子を含む同じベクター内に含有されることができるか、或いは別々のベクター上にあることがある。表現型形質のための選択を与えるマーカは効果的であろう。
【００４４】
血管新生因子の分泌が望ましい場合、適切な分泌シグナルが発現ベクターに組み込まれる。シグナル配列は、ペプチドに対し内生的であるかまたはこれらのペプチドに非相同的であることが可能である。
【００４５】
最も好適な実施形態に基づけば、発現ベクターは、ＦＧＦ−１を発現するプラスミドであり、ＮＶ１ＦＧＦと呼ばれる。ＮＶ１ＦＧＦは、ｐＣＯＲプラスミドと呼ばれる、条件付きの複製開始点を想定してデザインされた元の骨格に挿入された分泌型ヒトＦＧＦ−１（ｓｐｈＦＧＦ−１）をコードするような最適化された発現カセットを持つプラスミドである（２）。結果として生じるプラスミドは、好都合なことに２．４ｋｂの小さなサイズであり、配列は、配列番号７に記載されているような配列である。ｓｐｈＦＧＦ−１をコードする配列は、ヒト線維芽細胞インターフェロン由来の分泌シグナルペプチド（ｓｐ）をコードする配列と、アミノ酸２１〜１５４由来の天然の切断型ヒトＦＧＦ−１との融合である（米国特許第４，６８６，１１３号、第５，８４９，５３８号）。ｓｐｈＦＧＦ−１の発現は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー／プロモーター（ヌクレオチド‐５２２〜＋７２から）によって推進された。適切かつ効率的な転写終結及びそれに続くｓｐｈＦＧＦ−１転写物のポリアデニル化を確実にするために、ｓｐｈＦＧＦ−１融合の下流にシミアンウイルス４０（ＳＶ４０ゲノムからのヌクレオチド２５３８〜２７５９, GenBank locus SV4CG；米国特許第５，１６８，０６２号）からの後期ポリアデニル化シグナルを挿入した。国際公開ＷＯ９７／１０３４３及びSoubrier et al.（２）に記載の好適なｐＣＯＲプラスミドは、抗生物質抵抗性遺伝子のいずれをも欠いている。プラスミドの選択は、独立栄養受容株中の抑制因子転移ＲＮＡ遺伝子に依存する。高コピー数でかつ厳しく制限された宿主範囲のプラスミドの維持は、Ｒ６Ｋ γ複製起点により得られる。このタンパク質に対する配列コード化は、細菌に常に見られる訳ではないが、選択された宿主株のゲノムに人工的に挿入される。従って、所望されていない播種の可能性は非常に限られている。
【００４６】
本発明に基づいて血管新生遺伝子を保有及び発現するベクターまたはプラスミドは、当業者に既知または利用可能な何らかの適切な手段により投与されることがある。
【００４７】
本発明に基づけば、血管新生因子をコードする発現ベクターは、ヘパリン化合物と併用されて骨格筋及び心筋における毛細血管の成長を促進するべく相乗的に作用することがある。ヘパリン化合物は、標準ヘパリンまたは低分子量ヘパリンであることがある。
【００４８】
標準的なまたは未分画ヘパリンは、分子量６０００〜４００００Ｄａのムコ多糖である。最も流通しているヘパリン調製物の平均分子量は、１２０００〜１５０００Ｄａの範囲にある。標準ヘパリンは、ブタの腸管粘液またはウシの肺から大規模に単離される。
【００４９】
以下に示すように、ポリマー鎖は、１−４グリコシド間（interglycoside）結合により結合されたＤ−グルコサミンとウロン酸の繰り返し二糖単位で構成される。ウロン酸残基は、グルクロン酸またはＬ‐イズロン酸のいずれかであることができる。より正確に言えば、ヘパリンは、３つのＤ−グルコサミン及び２つのウロン酸残基の独特の五糖配列からなる、鍵となる構造単位を含む。これらの単糖残基の各々におけるほんの少しのヒドロキシル基は、高度に負に帯電したポリマーを生じさせる硫酸である。特に、中心のＤ−グルコサミン残基は、独特の３‐Ｏ‐硫酸部分を含み、五糖の第１及び第５Ｄ‐グルコサミドは、高い抗凝血活性を保持するために重大な意味を持つことが分かった４つの硫酸基を含む。これらのどれか１つが除かれると、抗凝血活性が劇的に低下する。
【００５０】
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【００５１】
ヘパリンは、高度に酸性の硫酸基を有するので、生理ｐＨでアニオンとして存在し、通常はナトリウム塩として投与される。２０〜５０％がそのまま排出される。ヘパリン多糖鎖は、胃酸中で分解され、従って、一般的に静脈内または皮下に投与される。一般的には、ヘパリンは、血腫形成の危険があるので筋肉内に投与されない。
【００５２】
低分子量ヘパリンは、本発明に基づく組合せ物において用いられるが、当該分野で既知である。ＬＭＨＷ及び調製方法については、米国特許第５，３８９，６１８号、第４，６９２，４３５号、第４，３０３，６５１号、欧州特許ＥＰ０ ０４０ １４４、及びNenci GG（Vasc. Med, 2000; 5: 251-258）に記載されており、これらの文献は引用を以って本明細書の一部となす。
【００５３】
低分子量ヘパリンは、ヘパリンからまたは特に分子量約２０００〜５００００のヘパリン成分を含む画分から得られたムコ多糖画分に対応する。
【００５４】
ヘパリンの断片化のためのプロセスは、当該分野で既知である。例えば、欧州特許ＥＰ４０，１４４には、そのポリマー鎖の一端にエチレン二重結合を含み、２，０００〜１０，０００ダルトンの重量平均分子量を有するような、ヘパリンから構成される硫酸多糖の混合物の調製について記載されている。これらの混合物は、ヘパリンエステルの解重合及びけん化によって産出される。他のプロセスについても、Johnson et al, Thrombos.Haemostas.Stuttg., 35,586 (1976)、Lane et al, Thrombosis Research, 16,651、米国特許第３，７６６，１６７号に記載されている。
【００５５】
高分子量ヘパリンと低分子量ヘパリンの両方の混合物もまた、本発明において用いられることがある。この関連で、米国特許第５，３８９，６１８号には、ヘパリンの重量平均分子量より低い重量平均分子量を有し、９％〜２０％の分子量２，０００ダルトン以下のポリマー鎖と、５％〜２０％の分子量８，０００ダルトン以上のポリマー鎖とを含み、重量平均分子量／数平均分子量の比が１．３〜１．６であるような多糖類の混合物の調製について記載されている。そのように記載されているプロセスには、先ず、長鎖四級アンモニウム塩により水溶性媒体中に出発材料ヘパリンを塩化する過程と、次にこのようにして産出された塩をエステル化して９．５％〜１４％の範囲のエステル化度を有するエステルを形成する過程と、その後９．５％〜１４％の範囲のエステル化度を有するそのようなエステルを解重合する過程とが含まれる。解重合のレベルと、最終製品の分子特性は、ヘパリン塩出発材料のエステル化度を変えることによって制御されることがある。
【００５６】
出発材料は、そこからムコ多糖が抽出されることがあるが、従来の注射可能な製剤品質のヘパリンより構成されるか、または、哺乳動物の組織または器官から、特に例えば豚または牛の腸管粘液からまたは肺から、この有効成分に対して抽出操作の最後に得られるような粗製ヘパリンにより構成される。ヘパリン出発材料は、ブタのヘパリン、特にブタの粘膜のヘパリンであるのが好ましい。その塩化の上流のアルコールによってこれを予備的に沈殿させることがある。
【００５７】
一例として、低分子量ヘパリンを調製するプロセスには、以下の過程が含まれることがある。予備的過程は、デルマタン硫酸含有量が２％以下のヘパリンの調製を可能にする。その後、出発ヘパリンの塩化の過程を行う。ヘパリン塩は、温度約２０℃、水溶性媒体中で、化学量論的に過剰な対応する塩のヘパリンナトリウムとの相互作用によって調製されることがある。例えば、用いられる四級アンモニウム塩は、塩化ベンゼトニウムなどのベンゼトニウム塩である。第２の過程として、エステル化を行う。エステル化度が９．５％〜１４％の範囲である塩の形をしたヘパリンの部分エステルは、塩素派生物の存在下で、塩化有機溶剤中でヘパリンの長鎖四級アンモニウム塩のエステル化によって調製されることがある。その上、反応の効率は、種々の反応物の比率と反応温度及び時間を制御することによって増加する。ヘパリンの部分エステルは、芳香族エステルであることがある。塩素派生物は塩化ベンジルであることがあり、塩化溶剤はクロロホルムまたは塩化メチルのいずれかである。９．５％〜１４％の範囲のエステル化度は、３〜５体積部の塩化有機溶剤中で１重量部のヘパリン塩当たり約１体積部の塩素派生物を用いることによって達成され、２５〜４５℃の温度で１５〜４８時間の期間、反応を実施することがある。
【００５８】
或いは、ヘパリンの部分エステルは、ナトリウム塩の形であることがある。そのようにして得られたエステルは、酢酸ナトリウムの存在下で、特にメタノールなどのアルコールにより沈殿により回収されることがある。反応媒体１容積当たり１〜１．２容積のアルコールが用いられる。エステルのエステル化度は、その後、高速液体クロマトグラフィーにより決定されることがある。具体的には、ベンジルエステルの場合には、ベンジルエステルのけん化によって産出されるベンジルアルコールの量が測定されることがある。
【００５９】
最後の過程として、塩基／エステルの重量比が０．０５〜０．２の範囲である水溶液中で水酸化ナトリウムなどの強塩基にエステルを接触させることによって解重合を実施する。反応媒体の温度を５０〜７０℃の範囲の値、好適には５５〜６５℃に調整し、３０分間ないし３時間の範囲の期間、反応を行う。水／エステルの重量比が１５〜３０の範囲である媒体において反応を行うことも好ましい。
【００６０】
或いは、エステル化過程において調製されたような１重量部のヘパリンの芳香族エステルであって、エステル化度が９．５％〜１４％の範囲である塩の形をしたエステルにより解重合を行う。０．０８〜０．１５重量部の水酸化ナトリウムと混合し、２０〜３０重量部の水とも混合し、結果として生じる混合物をその後５５〜６５℃の温度で１〜２時間維持する。生成物は、その後、希無機酸、好適には塩酸による反応媒体の中和と、メタノールなどのアルコールの存在下での沈殿によって、回収されることがある。
【００６１】
所定の力価の水性アルコール媒体中で、これまた所定の割合の塩化ナトリウムなどの無機塩の存在下で、選択的沈殿やゲル濾過などの種々の技術によって、上記したプロセスの最後に得られたムコ多糖画分の追加分画を進めることができる。
【００６２】
追加分画は、前もって水に再溶解させた各ムコ多糖画分に適用される追加過程によって達成されることがあり、この過程は、この水溶液に１〜２容積のエタノールと１０〜１００ｇ／ｌの塩化ナトリウムを加える過程と、一方では、形成された等しく活性の沈殿物と、他方では、上澄み液に溶解したままの内容物を、特に更なるアルコール沈殿によって、回収する過程とからなり、それが分画産物を構成する。
【００６３】
イン−ウエスラー（Yin-Wessler）力価／ＵＳＰ力価の比がより高いムコ多糖画分を最初の抽出の画分からゲル濾過によって得ることもできる。そのような溶液は、その有効分画ゾーンが有効分子量４，０００から６０，０００Ｄａの間にあるビーズ形態のポリアクリルアミドとアガロースのゲルＵＬＴＲＯＧＥＬ ＡｃＡ ４４を通過することがある。
【００６４】
治療される画分が、どのような精製度に到達しようと、ナトリウム塩などの生理的に許容される金属塩の状態であるという範囲で、治療される画分は、ヘパリンの塩に適用可能な何らかのプロセスによってカルシウムなどの別の生理的に許容される金属を含む混合塩または単一塩に変えられることがある。好都合なことに、１９７３年４月１３日に出願されたフランス特許第７３ １３５８０号に記載されたプロセスを使うことができる。このプロセスは、基本的に、例えばヘパリンのナトリウム塩から開始して、溶液中で後者を別の生理的に許容される金属、例えば塩化カルシウム、の異なる塩に接触させる過程と、その後にヘパリンに非結合の金属イオンの分離を（例えばアルコール沈殿または透析によって）進める過程と、到達した置換率が十分でない限りにおいて、所望の最終置換率に基づき、更なる量の別の塩、特に塩化カルシウムに、最初の接触の最後に得られた混合ヘパリン塩を溶液中で再度接触させる過程とから構成されることが想起されることになる。
【００６５】
画分は、一方では、特に０．２ＭのＮａＣｌ、０．０５Ｍのトリス‐ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中でアガロースなどの支持体上に固定された抗トロンビンＩＩＩに画分を接触させることを含むシステムにおいて、後者上に固定される自身の能力によって明らかにされる抗トロンビンＩＩＩに関する特定の親和性によって、他方では、比で表されるイン−ウエスラー力価及びＵＳＰ力価（ＹＷ／ＵＳＰ比）によって、特徴付けられることがある。
【００６６】
ヘパリンは、核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）によって特徴付けられることがある。本発明に基づき実施される、２７０メガヘルツ（ＭＨｚ）の放射線による３５℃で重水に溶解させたこれらの化合物の溶液におけるプロトン（１Ｈ）に対する化合物のＮＭＲスペクトルをより詳しく参照すると、スペクトルの特性要素として、５．４ｐｐｍのオーダーの化学変位に対して観察される共鳴信号より実質的に弱い共鳴信号が４．８及び５．２ｐｐｍのオーダーの化学変位に対して観察される（変位の測定のための基準：ＴＳＰ（Ｓｏｄｉｕｍ３−Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ−２，２，３，３−ｄ４）。
【００６７】
本発明に基づく組合せ物において用いられることがある標準的なまたは未分画ヘパリンまたはＬＭＨＷは、一方では、上記のＬＭＨＷとしての一般的性質と抗トロンビンＩＩＩへの親和性を有し、他方では、これらの画分はより高い分子量を有するのみならず、その構造中に上述の構造を有するオリゴ糖部分を含むことがある。先に述べたか或いは引用文献に記載されているような上述のＬＭＨＷ化合物のいずれかを選択して、個々に用いるか、または他のＬＭＨＷ化合物または他の治療学的または医薬化合物と併用することができる。
【００６８】
ＬＭＨＷが、標準的なまたは未分画ヘパリンと同様に安全かつ有効であり、心筋梗塞、心臓手術、血管手術、冠動脈及び末梢性経皮的血管再生、急性卒中を含む急性冠動脈症候群などの異なる臨床状況で用いられることがあることは、幾つかの研究により示されている（Nenci GG et al., Vasc Med, 2000; 5: 251-258）。
【００６９】
好適実施形態に基づけば、本発明の組合せ物は、急性深部静脈血栓症の予防及び治療のため、危険性が中程度または高い手術における静脈血栓塞栓症の予防的治療、血液透析中の体外循環系における凝固の予防のため、アスピリンとの併用で不安定狭心症と急性非Ｑ波心筋梗塞の治療のための、アベンティス・ファーマ社（Aventis Pharma SA）からＣｌｅｘａｎｅ（登録商標）／Ｌｏｖｅｎｏｘ（登録商標）の名称で現在市販されているＬＭＨＷを含む。
【００７０】
フラグミン（Fragmin）（登録商標）は、１９８５年以来市場に出ている、ファルマシア・アップジョン社（Pharmacia & Upjohn）が製造している低分子量ヘパリンである。これは、平均分子量５０００Ｄａのダルテパリンナトリウムを含む、血栓症の治療及び予防に有用な抗血栓剤である。ダルテパリンナトリウムは、ブタの腸管粘液からのナトリウムヘパリンの亜硝酸解重合により産出される。これは、平均分子量４０００〜６０００Ｄａの強い酸性の硫酸化多糖鎖と、２０００〜９０００Ｄａの範囲内の物質約９０％で構成される。
【００７１】
市場に出ている他の低分子量ヘパリンは、サノフィ社（Sanofi）が商品化したフラキシパリン（Fraxiparin）（登録商標）（ナドロパリン）、デュポン社（Dupont）が商品化したＣｌｉｖａｒｉｎ（登録商標）（レビパリン）及びＩｎｎｏｈｅｌｐ（登録商標）（チンザパリン）であり、本発明に基づきＮＶ１ＦＧＦと併用されることがある。
【００７２】
最も好適な実施形態において、プラスミドＮＶ１ＦＧＦは、エノキサパリン、例えばエノキサパリン（Ｌｏｖｅｎｏｘ（登録商標）、Ｃｌｅｘａｎｅ（登録商標））、フラグミン（登録商標）、またはフラキシパリン（登録商標）と併用される。
【００７３】
この実施形態に基づけば、エノキサパリンは、血管新生増殖因子をコードする因子と併用されるが、そのような因子は通常はＤＮＡ分子であり、治療される個々の細胞において血管新生増殖因子を発現する能力がある。血管新生増殖因子をコードするＤＮＡには、例えば、ＦＧＦ−１または酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ）、ＦＧＦ−２または塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ‐５、ＦＧＦ‐６、及びＦＧＦ‐７またはＦＧＦ１−２２のいずれかなどの線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）をコードするＤＮＡが含まれることがある。
【００７４】
別の実施形態に基づけば、エノキサパリンは、細動脈などの成熟血管及び／または毛細血管の形成によって示されるように、相乗的な血管新生の反応を促進するのに十分な濃度でプラスミドＮＶ１ＦＧＦと併用される。その上、ＮＶ１ＦＧＦとエノキサパリンの組合せ物は、治療された筋肉において検出不能の濃度で治療的血管新生を効率的に促進する能力があるので、特に強力である。エノキサパリンと併用するとき、ＮＶ１ＦＧＦは治療濃度域内の濃度で投与され、それによって、周囲の組織または器官への播種または不規則な血管新生に起因するネガティブな副作用を回避する。
【００７５】
エノキサパリンは、不活性または生理的に活性であることがある薬剤学的に適合性の製剤において組成物の形で用いられることがある。静脈内または皮下経路により用いられることが好ましい。静脈内または皮下投与のための無菌組成物は、一般的には水溶液である。これらの組成物には、湿潤剤、等張化剤、乳化剤、分散剤、安定剤から選択されるのが好ましいアジュバントが含まれることもある。無菌化は、幾つかの方法で、例えば無菌濾過、組成物への安定剤の組み入れ、または照射により行うことができる。これらは、使用時に滅菌水または任意の他の注射可能な無菌媒体に溶解し得る無菌固形組成物の形で調製されるうこともある。適切な組成物の一例として、２０ｍｇのエノキサパリンを十分な量の蒸留水に溶解させて０．２ｍｌの溶液を調製する。用量は、所望の効果、治療期間、用いる投与経路に依存し、一般的には、皮下経路により、１日当たり０．２ｍｇから４ｍｇ／ｋｇ、好適には１．５ｍｇ／ｋｇを毎日または０．７５ｍｇ／ｋｇを１日２回、即ち成人に１日当たり１４〜２８０ｍｇである。
【００７６】
ダルテパリンまたはファルマシア・アップジョン社により商品化されているフラグミン（登録商標）が本発明の相乗的な組合せ物に用いられることもある。フラグミン（登録商標）またはダルテパリンの構造及び調製方法は、米国特許第４，３０３，６５１号に記載されている。ダルテパリンまたはフラグミン（登録商標）は、幾つかの異なる方法で調製されることがある。そのような方法の１つは、（ａ）上記したようなジメトキシエタン中で亜硝酸を加えた標準ヘパリンの治療を含む。上記の方法は、この型のフラグメントを一連の不活性フラグメントと共に与える。活性フラグメントは、マトリクスに結合した抗トロンビンＩＩＩを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどにより、不活性要素から解放されることがある（Hook et al., FEBS Lett. 66,90 (1976); Hopwood et al., FEBS Lett. 63,51 (1976); L. -O. Andersson et al., Thromb. Res. 9,575 (1976)）。フラグメントを作成する他の方法は、（ｂ）低いｐＨ及び低い温度での過ヨウ素酸酸化による方法、（ｃ）ヘパリナーゼによる部分解重合による方法、（ｄ）カルボキシ基のエステル化及びそれに続くアルカリ条件下でのβ脱離によるヘパリンの部分解重合による方法、（ｅ）部分Ｎ脱硫酸化及びそれに続くｐＨ３．９での亜硝酸による脱アミノによるヘパリンの部分解重合による方法である。方法（ａ）及び（ｂ）については、例に記載されている。
【００７７】
活性フラグメントには、１４〜１８の糖単位が含まれることがある。構造解析は、標準ヘパリンにおけるものと同じ主要構造構成要素、即ちＬ‐イズロノシル（iduronosyl）‐２‐Ｏ‐サルフェート（１α−４）‐Ｎ‐スルホ‐Ｄ‐グルコサミン‐６‐Ｏ‐サルフェートを支配的な糖単位として示す。しかし、硫酸化されていないイズロン酸の量は、出発材料中の量よりかなり多いことがある。
【００７８】
活性フラグメントは、構造（Ｕ−Ｇ）ｎ−Ｉ−Ｇ−（Ｕ−Ｇ）ｍを有し得る。ここで、ｎは１または２、ｍは５または６、Ｉは硫酸化されていないＬ‐イズロン酸、ＵはＬ‐イズロン酸−２‐Ｏ‐サルフェート、ＧはＮ‐スルホ‐Ｄ−グルコサミン‐６‐Ｏ‐サルフェートである。数個のＵ基は、Ｏ‐サルフェートを欠いているかまたはＤ‐グルクロン酸に置換されていることがあり、同様に、数個のＧ基は、Ｏ‐サルフェートを欠いているかまたはＮ‐アセチル‐Ｄ−グルコサミン基に置換されていることがある。還元または非還元還元末端基は用いられる調製方法の種類によって変わることがあり、それ故に例えばヘパリンの脱アミノ化分解は還元末端位置における２，５‐無水‐Ｄ‐マンノースの形成をもたらす。活性フラグメントは、ＵＶ、ＩＲ、及びＮＭＲスペクトル及び電界におけるい移動度の決定など物理化学的方法によって特徴付けられることがある。しかし、得られた数値は完全な情報を与えるわけではなく、また、凝固‐不活性フラグメントは類似の特性を実質的に示す。このことは、生物活性が、硫酸化されていないウロン酸の位置が特に重要であるような糖残基の特異配列から派生するという事実に依存する。
【００７９】
治療される個体は、通常、ヒトなどの哺乳動物である。個体は、例えば遺伝因子または環境因子に起因して、虚血（上述の虚血状態のいずれかなど）になる危険がある個体であることがある。それ故にこの個体は、虚血の家族歴を有することがある。個体は、以下の危険因子、即ち、４５才またはそれ以上（５０、５５、または６０才以上、またはそれ以上）である、喫煙者である、アルコール消費量が多い、過体重である、アテローム性動脈硬化症または糖尿病である、または動けない状態である、のうちの１若しくは複数を有することがある。個体は、心虚血または末梢性虚血を有することがある。
【００８０】
治療される個体、特に心疾患を有する個体は、最後の２４時間に虚血性発作を有していたことがあることがある。個体は、特に末梢性虚血を有する個体は、１年、２年、３年、またはそれ以上前など、６ヵ月以上前に虚血性発作を有していたことがある者であることがある。
【００８１】
個体は、集中治療を受けていることがあり（通常は最後の２４時間に虚血性発作を治療されている）、例えば呼吸のために酸素（または酸素濃度を高めた空気）を与えられていることがある。
【００８２】
相乗作用及び効力に関してそのような優れた特性のおかげで、ＮＶ１ＦＧＦとＬＭＨＷの組合せは、高コレステロール血症または糖尿病によって引き起こされる悪質な病気における治療的血管新生として特に有用であったことが実証されている。
【００８３】
従って、本発明は、その起源に拘らず高コレステロール血症または糖尿病などの病気において悪化した、弱くなった血液供給によって引き起こされる血管新生異常の逆行に関する。
【００８４】
本発明の文脈内では、標的組織は、上に述べたように、高コレステロール血症または糖尿病環境において更に悪化した、酸素を含ませた血液の十分な供給が組織から奪われるときに生じる虚血性障害を患っているかまたは患う危険がある骨格筋または心筋組織を含む。例に実証されているように、ＬＭＨＷまたは標準ヘパリンと共にプラスミドＮＶ１ＦＧＦを筋肉内または心筋内に注入することは、遺伝子治療における必要な安全基準に適合し、損なわれている内皮機能を更に呈する虚血性組織において血管新生を誘発する能力があるような治療濃度域において効果的に用いられることがある。
【００８５】
本発明はまた、虚血（上述の虚血状態のいずれかなど）の治療において、同時に、別々に、または連続的に使用するための、血管新生増殖因子をコードする遺伝子を発現するための薬剤またはベクターと、低分子量ヘパリンまたは標準ヘパリンとを含む生成物を提供する。更に、本発明は、血管新生増殖因子発現薬剤と低分子量ヘパリンの組合せ物を投与することによって、虚血（上述の虚血状態のいずれかなど）を治療するための薬物を製造する際の血管新生増殖因子をコードする薬剤または発現ベクターの使用方法を提供する。本発明はまた、血管新生増殖因子をコードする薬剤または発現ベクターと低分子量ヘパリンの組合せ物を投与することによって、虚血（上述の虚血状態のいずれかなど）を治療するための薬物を製造する際の低分子量ヘパリンを提供する。
【００８６】
血管新生増殖因子をコードするＤＮＡまたはベクター及び低分子量ヘパリンは、別々に（即ちその両方を含む組成物の形でではなく）投与されることがあり、或いはその両方を含む組成物の形で投与されることがある。別々の投与の場合には、血管新生増殖因子をコードする遺伝子を発現するための薬剤またはベクターの少なくとも１、２、３、またはそれ以上の投与が、１週間以内（１または２日間以内など）の低分子量ヘパリンの投与になることになる。一実施形態において、血管新生増殖因子をコードする遺伝子を発現するための薬剤またはベクターと低分子量ヘパリンとが少なくとも１、２、３、４、５、またはそれ以上の機会に同時（例えば互いに２時間以内など）に投与される。
【００８７】
ＮＶ１ＦＧＦプラスミドとの関連で開示されている投与の１回量、部位またはタイミングなどの投与の特徴は、任意の血管新生増殖因子をコードする因子の投与に適用できることが分かる。
【００８８】
本発明の一実施形態に基づけば、ＮＶ１ＦＧＦプラスミドは、標的骨格筋または心筋組織に局所的な様式で投与される。本発明の枠内でＮＶ１ＦＧＦプラスミドを標的組織に投与する任意の適切な手段を用いることができるが、針またはカテーテルを用いて筋肉へＮＶ１ＦＧＦを直接注入することによって標的筋肉組織への局所的注射が達成されることが好ましい。
【００８９】
「注射／注入（する）」なる語は、ＮＶ１ＦＧＦが標的骨格筋または心筋組織に力強く導入されることを意味する。本発明に基づき、任意の適切なまたは利用可能な注射装置、方法、またはシステムを用いることができる。
【００９０】
ＮＶ１ＦＧＦプラスミド１回分の投与は標的組織への単回注射によって達成可能であるが、ＮＶ１ＦＧＦの頻回注射による用量の投与が好ましい。頻回注射は、２、３、４、５、またはそれ以上の反復注射であることができるが、高コレステロール血症または糖尿病に罹患している哺乳動物被検対象の虚血性筋肉への５回またはそれ以上の注射であるのが好ましい。頻回注射は、各注射がなされる標的組織上の位置によって画定される特定の幾何学的配置などのパラメータによって処理されることができる点で、単回注射に優る利点を示す。頻回注射によるＮＶ１ＦＧＦの単回投与の注入はより良好に制御されることができ、任意の投与量を投与する際の効果が最大になることがある。
【００９１】
通常は、血管新生増殖因子をコードする薬剤またはベクターを、１２〜１６日毎などの１０〜１８日毎の間隔で少なくとも３回を超える回数を投与する。
【００９２】
頻回注射の特定の幾何学的配置は、ＮＶ１ＦＧＦの各適用が行われる２次元空間のいずれかにおいて画定されることがある。頻回注射は、虚血性組織の内部または周辺において実施されることがあり、注射点が２ｃｍまたは３ｃｍ離れるように間隔を空けるのが好ましい。
【００９３】
本発明の別の実施形態に基づけば、頻回注射の各々は互いに約５〜１０分以内に行われる。
【００９４】
血管新生異常に影響されかつ内皮機能がひどく損なわれているような標的組織にＮＶ１ＦＧＦを投与するとき、ＮＶ１ＦＧＦが、側副血管形成のための末端と源に適度に隣接する領域とその間の区域とに接触できるような投与であることが望ましい。
【００９５】
ＮＶ１ＦＧＦの筋肉内注射は、遠位大腿及び遠位脚筋肉へ、虚血性部位に近接しかつ囲繞する領域において実施されるのが最も好ましい。
【００９６】
本発明の１つの有利な側面において、高コレステロール血症または糖尿病環境における血管新生の異常を逆行させるために、治療学的に有効量のＮＶ１ＦＧＦがＬＭＨＷと共に投与される。高コレステロール血症または糖尿病の被検対象に加えて血管新生異常に罹患している所与の被検対象の体重及び状態により有効量が変わることになるが、所与の被検対象及び状態に対する適切な１回量を決定することは、当業者の考えの範囲内である。
【００９７】
この側面の好適実施形態に基づけば、ＮＶ１ＦＧＦの筋肉内注射の用量を５００μｇ、１０００μｇ、２０００μｇから１６０００μｇへと増加させて治療を行う。最も好ましいのは、２×５００μｇと２×１０００μｇの用量の反復注射である。ＮＶ１ＦＧＦの高い安全性を考慮して、大投与量が用いられることがあり、例えば、４０００μｇ、８０００、１６０００または２×２０００μｇ、２×４０００μｇ、２×８０００μｇなどが、側副毛細血管と細動脈の両方の持続形成を促進するために血管新生異常の過酷な条件に投与されることがあり、それによって、高コレステロール血症または糖尿病に罹患している哺乳動物被検対象における虚血に起因する血管新生異常の逆行が見込まれる。
【００９８】
ＮＶ１ＦＧＦは、薬学的に許容される担体及びＮＶ１ＦＧＦプラスミドを含む医薬組成物中で標的虚血性心筋または骨格筋に投与されるのが望ましい。
【００９９】
本発明の一実施形態に基づけば、例えばエノキサパリンまたはフラキシパリンなどのＬＭＨＷは、不活性または生理的に活性であることがある薬剤学的に適合性の製剤において組成物の形で用いられることがある。これらは、静脈内または皮下経路により用いられることが好ましい。静脈内または皮下投与のための無菌組成物は、一般的には水溶液である。これらの組成物には、湿潤剤、等張化剤、乳化剤、分散剤、安定剤から選択されるのが好ましいアジュバントが含まれることもある。無菌化は、幾つかの方法で、例えば無菌濾過、組成物への安定剤の組み入れ、または照射により行うことができる。これらは、使用時に滅菌水または他の何らかの注射可能な無菌媒体中に溶解させ得る無菌固形組成物の形で調製されることもある。適切な組成物の一例として、２０ｍｇのＬＭＨＷを十分な量の蒸留水に溶解させて０．２ｍｌの溶液を調製する。
【０１００】
用量は、所望の効果、治療期間、用いる投与経路に依存し、一般的には、皮下経路により、１日当たり０．２ｍｇから４ｍｇ／ｋｇ、即ち５〜２８０ｍｇの単位用量で、成人１人に１日当たり１４〜２８０ｍｇである。用量は、１日当たり０．２〜０．３ｍｇ／ｋｇであるのが好ましい。一実施形態において、例えばヘパリン（ＬＭＨＷまたは標準ヘパリン）の最初の投与と最後の投与が少なくとも２０日間または少なくとも３０日間は離されるように、ＬＭＨＷが少なくとも２０日間または少なくとも３０日間にわたり投与される（この日数の間、血管新生増殖因子をコードする因子も、１回、２回、３回、またはそれ以上投与される）。
【０１０１】
任意の適切な薬学的に許容される担体は、本発明の枠内で用いられることができ、そのような担体は当該分野で公知である。担体の選択は、組成物が投与される特定の部位と、組成物を投与するのに用いられる特定の方法とによって部分的に決定されることになる。注入に適した製剤には、水溶液及び非水溶液と、製剤を目的とするレシピエントの血液と等張にするような酸化防止剤、緩衝剤、静菌薬、溶質を含むことができる等張性無菌注射溶液と、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び保存剤を含む水性及び非水性無菌懸濁剤とが含まれる。この製剤をアンプルやバイアルなどの単位用量または複単位用量密封容器中に存在させ、使用の直前に無菌液体担体、例えば水を加えることしか必要としないフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。先に記載したような無菌の粉末、顆粒、錠剤から即時注射溶液及び懸濁剤を調製することができる。薬学的に許容される担体は緩衝生理食塩水溶液であるのが好ましい。医薬組成物が塩化ナトリウム溶液を含むのが最も好ましい。
【０１０２】
本発明は更に、末梢性及び／または冠動脈虚血症候群の患者に有効量のＬＭＨＷと有効量の血管新生増殖因子をコードするＤＮＡ、好適にはＮＶ１ＦＧＦプラスミドを投与することによって患者を治療する新規な方法に関する。危険性がある患者には、初期の冠動脈または末梢性虚血症候群の症状を罹患する患者と、従ってそのような症状を罹患したことがない他者よりも虚血性の骨格または心筋の組織損傷を経験しやすい患者とが含まれる。
【０１０３】
本発明はまた、末梢性または心筋虚血、創傷治癒、または新血管新生または組織再生を必要とする他の状態などの虚血状態を治療するための血管新生治療を提供する。本発明は、ＰＡＯＤ（末梢血管閉塞疾患）病態、ＩＣ（間欠性跛行）またはＣＡＤ（冠状動脈疾患）とも呼ばれるＰＡＤ（末梢血管疾患）を治療するために有用であることがある。
【０１０４】
本発明の別の目的は、上述したように、血管形成術、バイパス移植術または他の血管再生手順の対象である患者において、ＬＭＨＷまたは標準ヘパリンとＮＶ１ＦＧＦの組合せ物を投与することにより治療的血管新生を増強する方法を提供することである。
【０１０５】
本発明の更に別の目的は、本発明の組合せ物を、虚血性骨格筋または心筋において側副血管と細動脈の両方を促進するのに十分な量投与することによって、損なわれている内皮機能を患っている哺乳動物の虚血性心筋または骨格筋の血管再生を刺激及び／または促進する新たな方法を提供することである。より詳細には、本発明は、高コレステロール血症または糖尿病環境の虚血性筋肉において血管再生を刺激及び／または促進する方法と、血管新生異常を逆行させる必要がある、高コレステロール血症または糖尿病を患っている哺乳動物被検対象にそのような治療を施す方法とに関する。
【０１０６】
単独または複数の大血管閉塞に起因する後肢中の障害性灌流が、末梢血管疾患（ＰＡＤ）の原因である。初期段階では、これは移所運動を伴う筋肉の不快感を引き起こし、後の段階で潰瘍形成及び壊疽に至る（１）。慢性心血管疾患は、内皮機能障害に関係する機序を通して、既にＰＡＤなどの虚血状態に罹患している患者における悪質な因子である（２、３）。高コレステロール血症、高血圧症、糖尿病などの病態は、ＰＡＤの実験モデルを開発するための可能な標的として調査されてきた（４〜７）。にもかかわらず、後肢虚血のそのようなモデルにおいて、クリティカルな点は、自発的な血管新生反応を打ち消して何らかの血管再生治療の効力を与えることである。
【０１０７】
本発明に基づけば、ＮＶ１ＦＧＦとＬＭＨＷまたは標準ヘパリンの組合せは、側副血管と細動脈の両方の成長を促進することによって、ＰＡＤまたは冠状動脈疾患を罹患している患者において血管新生のコレステロール誘発性障害を救うために特に効力があることが実証されてきた。
【０１０８】
以下の例に示すように、ＮＶ１ＦＧＦをＬＭＨＷまたは標準ヘパリンと組み合わせると、血液を組織へ運搬及び搬送するのに必要な、大腿の後部の虚血損傷した筋肉における大きな成熟伝導血管（１５０μｍ超の側副血管）及び小さな抵抗動脈（５０μｍ未満の細動脈）の形成を効果的に誘発することが可能である。細動脈などのそのような成熟血管の誘発は、高コレステロール血症または糖尿病により有害な血管新生異常が誘発される最も重度の患者において貴重な治療であることが証明されてきた。
【０１０９】
細動脈は、内皮細胞層と、周細胞から形成された壁細胞とを含む成熟血管として知られ、これらの血管の能力が毛細血管網に比べて高いので（Carmeliet et al., Nat. Med., 2000; 6:389-395、Van Royen et al., Cardiovasc. Res., 2001; 49: 543-553）、側副細動脈の成長は、特に効率的かつ優れた治療的血管新生である。
【０１１０】
本発明の更なる目的は、治療された細胞においてＶＥＧＦが上方制御されないという条件付きでＮＶ１ＦＧＦとＬＭＨＷまたは標準ヘパリンの組合せ物を投与することによって血管新生を促進する方法を提供することである。
【０１１１】
この出願を通して、種々の出版物、特許及び特許出願を参照してきた。これらの出版物、特許及び特許出願の教示及び開示はそっくりそのまま、引用を以ってこの出願の一部となし、この出願に関連する最先端技術をより詳細に記述している。
【０１１２】
当業者が本明細書において実施形態で開示された発明の原理を変え得ることも理解及び期待され、そのような改変、変更及び置換は、この出願の範囲内に含まれることが意図されている。
【０１１３】
例
【０１１４】
例１：動物及び食餌
【０１１５】
実験には１１〜１２週齢のシリアンゴールデンハムスター（CERJ, Le Genest St Isle, France）を用いた。動物は、研究プロトコルの開始から少なくとも７日前に標準状態において平均することができるようにした。全ての動物は、実験の全期間にわたり、自由に水を飲むことができた。全ての動物手順は動物使用委員会（Animal Use Committee）の承認を受けたものであり、米国立衛生研究所（National Institute of Health）発行の指針（NIH publication No. 85-23, revised 1985）に適合している。
【０１１６】
１匹当たり２０ｇの、標準的な食事に３％コレステロールと１５％ココアバターを補充したものからできたコレステロールを強化した食餌（ref. 1414C, UAR, Epinay-sur-Orge, France）を高コレステロール食餌下のハムスターに毎日与え、ハムスターを無作為に４つの群、即ち（ｉ）生理食塩水群、（ｉｉ）ＮＶ１ＦＧＦ群、（ｉｉｉ）ＮＶ１ＦＧＦ及びエノキサパリン、（ｉｖ）エノキサパリン及び生理食塩水、に割り当てた。
【０１１７】
例２：後肢虚血の誘発
【０１１８】
ＬＣまたはＨＣ食餌から３５日後、以下の外科手順に従って動物に後肢虚血を作成した。他の動物種に関して記載された手順（１９、２０）に従って、Ｎ２Ｏ（毎分０．８リットル）、Ｏ２（毎分０．４リットル）、及びイソフルラン（２％）によるガス麻酔下で後肢虚血を誘発した。無菌外科条件下で、右後肢の内側大腿上で鼠径靭帯から膝蓋の近位にある点まで縦方向の切開を行った。この切開を通して、外科ループ（surgical loop）を用いて、大腿動脈を解体し、その主要側枝を凝固させた。外腸骨動脈の分枝としてのその近位起源から、伏在枝と膝窩枝とに二股に分かれる遠位点まで、大腿動脈を完全に切除した（４）。切開を４．０シルクワイヤにより１つの層で閉じた。
【０１１９】
例３：後肢骨格筋における遺伝子移入
【０１２０】
生理食塩水と、エノキサパリンの有無を問わずＮＶ１ＦＧＦをコードするプラスミドと、生理食塩水を有するエノキサパリンとを、虚血の誘発から１４日後に、それぞれを虚血性肢の前脛骨筋、内転筋、大腿四頭筋に、合計３回の６０‐ｕＬ注射によって盲検化して投与した。
【０１２１】
例４：血清中の総コレステロール、脂質及びトリグリセリドレベルの測定
【０１２２】
手術の日から−３５、−７、及び＋２１または＋２８日目に、ＨＣ／２１群、ＨＣ／２８群、生理食塩水群、ＮＶ１ＦＧＦ群、エノキサパリン群、またはエノキサパリンを有するＮＶ１ＦＧＦ群のハムスターからＮ２Ｏ（毎分０．８リットル）、Ｏ２（毎分０．４リットル）、及びイソフルラン（２％）によるガス麻酔下で後眼窩穿刺により血液を得た。市販のキット（Olympus Diagnostica GmbH, Hamburg, Germany）により、血清中の総コレステロール及びトリグリセリドレベルを酵素学的に決定した。コレステロールに富む食餌は、総コレステロールとトリグリセリド血清レベルの両方を時間依存的に増加させた。実験の最後（即ち虚血後２８日目）に全ての群において血清脂質を測定した。
【０１２３】
例５：血管造影による側副血管形成の定量化
【０１２４】
虚血の誘発後２１日目（ＨＣ／２１群）または２８日目（ＬＣ群、ＨＣ／２８群、生理食塩水群、ＮＶ１ＦＧＦ群）に血管造影手順を以下のように実行した。
【０１２５】
腹大動脈内に挿入したカテーテルを介して〜３００μｌの造影剤（水に溶かした０．５ｇ．ｍｏｌ‐１の硫酸バリウム溶液）を注入した直後に、ハムスターを過量のペントバルビタールナトリウムにより屠殺した。ハムスターをＸ線標本撮影装置（ファキシトロンＸレイ社（Faxitron X-ray Corp., Wheeling, IL, USA）製モデルＭＸ−２０）内へ背面位で載置し、両肢から脈管構造の検死写真を回収してデジタル化した（software Specimen, DALSA MedOptics, Tucson, AZ, USA）。このＸ線撮影装置は、直径１５０μｍ以上の血管の可視化を可能にする。治療の内容を知らされていない（盲検化された）調査者が、既述したような専用ソフトウェア（５）を用いて、写真をオフラインで分析した。
【０１２６】
手短かに言えば、虚血性・非虚血性肢の両方に対して、大体の後部側における側副血管の範囲を分析領域の百分率として決定した。血管造影スコアを虚血性／非虚血性の比（百分率）として計算した。方法の妥当性を調べるために、後肢虚血を作成していない６匹の別々の週齢をマッチさせたハムスターにおいて血管造影スコアを評価した。予想通り、右肢／左肢の比（百分率）として計算された血管造影スコアは１．０４±０．１８であった。
【０１２７】
例６：免疫組織化学による細動脈形成の定量化及び高コレステロール血症ハムスターの大腿動脈の切除によって後肢虚血により誘発された典型的な筋肉病変部
【０１２８】
虚血の誘発後２８日目に虚血性後肢からの骨格筋を収集し、ＰＢＳ‐３．７％ホルマリン溶液中に固定した。非虚血性後肢からの筋肉を同様に試料採取し、対照筋肉として供した。異なる筋肉（薄筋、半膜様筋、内転筋、半腱様筋、大腿二頭筋）からなる２つの横断スライスを各大腿の後部から処理した。スライスを脱水し、パラフィンに埋め込み、免疫組織化学のために５μｍ厚の切片を作成した。平滑筋αアクチンに対するマウスのモノクローナル抗体（ＳＭＡ；clone 1A4, ２００倍希釈, Dako, Carpinteria, CA, USA）は、成熟血管において構成的に発現されるので、ＳＭＡ抗体を血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）に対するマーカとして用いた。市販のキット（Envision（登録商標）＋System/Horse Radish Peroxidase, Dako, Carpinteria, CA, USA）を用いてアビジン‐ビオチン‐ペルオキシダーゼ法によりＳＭＡ抗体を検出した。ＳＭＡ陽性（ＳＭＡ＋）血管をサイズ（外径）によって並べ、内転筋及び薄筋の両方で直径５０μｍ未満の細動脈を数えた。
【０１２９】
これらの筋肉は、後肢虚血ハムスターモデルにおける組織病理学的な病変部に対する感受性、逆に、大腿の後部側からの他の筋肉（半腱様筋、半膜様筋、大腿二頭筋）に対する感受性で選択されてきた。
【０１３０】
大腿動脈の切除により誘発される典型的な病変部を図２に示す。虚血の誘発後２８日目に大腿の後部からの筋肉即ち薄筋及び内転筋を収集し、ＨＥＳ染色後に５μｍ厚の筋肉切片を観察した。虚血性筋肉における軽度の壊死（破線）及び中心核形成（矢印）の存在をそれぞれ図２Ｂ及び２Ｃに示す。対照として、病変部を有しない非虚血性対側筋肉を１００倍に拡大した断面を図２Ａに示す。筋肉量への虚血の影響を調べるために内転筋及び薄筋の総面積を決定した。総筋肉面積に対してＳＭＡ＋細動脈の数を決定した。その後、両パラメータに対して虚血性／非虚血性の比の値を計算した。全ての手順は、治療の内容を知らされていない調査者によって実施された。
【０１３１】
例７：虚血性筋肉におけるＮＶ１ＦＧＦ遺伝子移入後のＦＧＦ−１の発現
【０１３２】
非虚血性及び虚血性肢からの前脛骨筋における生理食塩水注入、ＮＶ１ＦＧＦ遺伝子移入、及びＮＶ１ＦＧＦとエノキサパリンの組合せ物の注入から１４日目（即ち虚血の誘発から２８日目）に、以下の処理を行った。古典的ストレプトアビジン‐ビオチンアッセイを用いてＦＧＦ−１の免疫組織化学を行い、ＦＧＦ−１発現を検出した。一次ポリクローナル抗ＦＧＦ−１ウサギ抗体（reference AB-32-NA、３０倍希釈、R & D Systems, Abingdon, UK）によるインキュベーションに続き、ビオチン化したロバ抗ウサギ免疫グロブリン（２００倍希釈、Amersham, Buckinghamshire, UK）によるインキュベーションを行った。ストレプトアビジンに結合されたペルオキシダーゼを加えた後で、色で見分けられるジアミノベンジジン基質を用いて免疫複合体を局在化させた。５μｍ厚の切片をヘマトキシリンにより対比染色し、脱水して、永久封入媒体にマウントした。顕微鏡（Axioplan 2, Zeiss, Hallbergmoos, Germany）下で免疫反応性線維を同定（ブラウン染色）した。
【０１３３】
ＶＥＧＦやＦＧＦ−２などの他の血管新生因子に関与する遺伝子治療とは対照的に、ＦＧＦ−１の発現が、ＮＶ１ＦＧＦにより治療された動物の虚血性筋肉に有利に制限されることを、発明者は証明した。
【０１３４】
さらに、非虚血性（対側）の非注射肢及び生理食塩水またはＮＶ１ＦＧＦを注入された虚血性肢から得られた大腿の後部からの筋肉（前脛骨筋、薄筋及び内転筋）における抗ＦＧＦ−１ポリクローナル抗体による免疫組織化学染色の代表的な写真（１００倍拡大）によって示されるように、ＦＧＦ−１の発現は、驚くべきことに、生理食塩水により治療された動物の虚血性筋肉にも、生理食塩水及びＮＶ１ＦＧＦにより治療された動物の非虚血性（対側）筋肉にも、いずれにおいても検出されないことが可能である。これは、成熟血管の形成による持続した血管新生反応に影響を与えるのに十分な治療濃度域内で、しかし播種及び不規則な血管新生またはネガティブな副作用を許容しない濃度で、コードされたＦＧＦ−１タンパク質の徐放を可能にするプラスミドＮＶ１ＦＧＦの優れた性質をはっきりと示す。ＮＶ１ＦＧＦは、それ故に、治療された筋肉において検出不能の濃度で血管新生を効率的に促進する能力があり、従って、治療濃度域内に含まれるＮＶ１ＦＧＦの濃度の使用を可能にし、悪質な内皮機能障害によって特徴付けられる状態にあるので、特に強力であることが立証された。安全性及び効力の点でそのような優れた特性を有するので、ＮＶ１ＦＧＦは、高コレステロール血症または糖尿病によって引き起こされる悪質な病気において血管新生治療として有利に用いられることがある。
【０１３５】
これらの結果は、ＮＶ１ＦＧＦ遺伝子治療が、細動脈の増加により障害性側副形成を救う能力があることをはっきり実証している。実質的に、１５０μｍ超の側副血管の成長は、大腿二頭筋、内転筋、薄筋、半膜様筋、半腱様筋を含む大腿の後部において血管造影的に立証されている。期せずして、本願出願人は、血管造影スコアにより強調されたように、ＮＶ１ＦＧＦ遺伝子移入から１４日後に側副血管の形成がこの領域内に著しく刺激されることを実証した。
【０１３６】
大腿動脈切除後にその領域に虚血が生じたことを強く主張するために組織酸素化のin situ測定が行われてはいないが、中心核形成、ジストロフィー、壊死、炎症などの組織学的病変部の存在が明らかになった。より正確に言えば、これらの病変部は内転筋及び薄筋に限定されたが、大腿二頭筋、半膜様筋、及び半腱様筋は病変部を生じ易くはなかった。専ら、内転筋管の真上で内転筋及び薄筋において５０μｍ未満の細動脈の定量化を行った。ＮＶ１ＦＧＦ遺伝子移入は、虚血性肢のこれらの筋肉への細動脈の絶対数を増加させた。
【０１３７】
これらのデータは、従って、組織への血液の運搬及び搬送に必要な、大腿の後部の虚血損傷した筋肉において大きな成熟伝導血管（１５０μｍ超の側副血管）及び小さな抵抗動脈（５０μｍ未満の細動脈）の形成を誘発するＮＶ１ＦＧＦの能力を明白に実証する。
【０１３８】
例８：高コレステロール血症のハムスターにおける筋肉内投与後１４日目（即ち後肢虚血後２８日目）に側副発達及び細動脈密度に対するエノキサパリンと組み合わせたＮＶ１ＦＧＦとＮＶ１ＦＧＦ遺伝子移入の比較実験
【０１３９】
後肢虚血の誘発後１４日目に筋肉内ＮＶ１ＦＧＦ遺伝子移入とエノキサパリンの皮下投与との組合せは、生理食塩水で治療したハムスター、エノキサパリン、またはＮＶ１ＦＧＦ遺伝子移入と比べたとき、虚血性肢における側副形成を大いに向上させる。また、ＮＶ１ＦＧＦ及びエノキサパリンを投与した後の血管造影スコアは、生理食塩水で治療したハムスターまたはＮＶ１ＦＧＦで治療したハムスター、またはエノキサパリンで治療したハムスターのものより確かに著しく高い。
【０１４０】
エノキサパリンの有無を問わず生理食塩水及びＮＶ１ＦＧＦで治療したハムスターの虚血性筋肉から平滑筋αアクチン（ＳＭＡ）免疫組織化学によって成熟血管を標識し、筋肉面積及び５０μｍ未満のＳＭＡ陽性細動脈を定量化する。
【０１４１】
ＮＶ１ＦＧＦ及びエノキサパリン群において、虚血性肢における前脛骨筋、内転筋及び薄筋の面積減少が観察される。
【０１４２】
例９：ＮＶ１ＦＧＦ及びエノキサパリンまたは標準ヘパリンを用いた糖尿病のネズミにおける後肢虚血の治療
【０１４３】
側副血管の発達における血管新生及び動脈形成の重要性は、十分に証明されている。それ故に、側副血管の外見上機能不全の患者を治療するアプローチとして血管新生サイトカインによる血管新生治療が提唱されてきた。糖尿病は、側副形成における顕著な障害に関連している。従って、抗炎症薬または抗凝固薬、エノキサパリンなどの低分子量ヘパリンとＮＶ１ＦＧＦ血管新生遺伝子治療との組合せを支持するために、糖尿病の環境において後肢虚血の実験モデルを用いる。
【０１４４】
糖尿病の誘発：
【０１４５】
ストレプトゾトシンは、Ｉ型糖尿病のモデルを与える膵臓のインシュリン産出β島細胞を選択的に破壊する。０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中にストレプトゾトシンを１０ｍｇ／ｍｌで溶解させたものを８〜１０週齢のオスのＣ５７ＢＩ／６マウスに８０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内に注入する。マウスは、糖尿病であると考えられ、それ故に、７２時間時点での血漿グルコースレベルが２５０ｍｇ／ｄｌ以上でありかつ高いままであれば、研究に含められる。
【０１４６】
後肢虚血：
【０１４７】
糖尿病の誘発から４週間後に外科手順を実行し、顕微鏡下で行う。腸骨動脈の上に位置する右後肢の鼠径で下方に皮膚の切開を行う。その後、４−０シルク結紮糸により腸骨動脈を近位及び遠位に結紮し、切除する。全ての副動脈を結紮し、切断する。
【０１４８】
プラスミド溶液の注入：
【０１４９】
手術後７日間以内に、右後肢の大腿四頭筋及び／または前脛骨筋において（注入量：４０μｇ／筋肉）、単回投与として、体重１ｋｇ当たり０．４〜４．０ｍｇ（即ち１０〜１００μｇ／マウスまたは５〜５０μｇ／筋肉）の範囲でＮＶ１ＦＧＦプラスミド溶液を注入した。
【０１５０】
低分子量ヘパリン（エノキサパリン）の注入：
【０１５１】
手術の数時間前に始めて、または手術と同時に、または手術の翌日に、エノキサパリンを１日１回１．０〜１．５ｍｇ／ｋｇの用量で１〜２週間皮下に注射する。皮下治療の開始前に静脈内注射によって０．５〜０．７５ｍｇ／ｋｇの１回投与量のエノキサパリンを投与することもある。
【０１５２】
治療学的効力をモニタする評価項目：
【０１５３】
−手術前、手術直後、及び手術後毎週連続した４週間に、後肢の灌流をレーザドップラ・イメージングにより非観血的に評価する。虚血性（右）／正常（左）肢の血液流の比を測定し、治療群間で再灌流の動態と灌流状態を比較する。
【０１５４】
−筋肉抽出物上のＥＬＩＳＡ（タンパク質）またはＲＴ−ＰＣＲ（ｍＲＮＡ）または筋肉切片上の免疫組織化学（タンパク質）など半定量的な方法により、ＣＤ３１などの血管新生のマーカを評価することもある。
【０１５５】
相乗効果をモニタする評価項目：
【０１５６】
−単剤のいずれかと比べて、ＮＶ１ＦＧＦ+エノキサパリンにより治療されたマウスにおける後肢再灌流の、より速い動態の証拠を示す比較、または
【０１５７】
−単剤に対し、併用療法による治療に続く任意の所与の時点での、より高レベルの灌流の証拠を示す比較、及び／または
【０１５８】
−単剤としての所与用量のＮＶ１ＦＧＦと比べて、エノキサパリンと併用したときの、より低用量のＮＶ１ＦＧＦによる類似レベルの灌流の証拠を示す比較。
【０１５９】
非特許文献１〜８の各々を全体的または部分的に用いるかまたは依存するかして本発明の側面を作り出し、使用することができる。これら非特許文献は、特に、引用を以って本明細書の一部をなす。その上、上記の例及び説明を本発明の範囲の制限と受け止めるべきではない。当業者は、特許請求の範囲及び本発明の意図から逸脱することなく、記載されている方法及び化合物及び化合物の多様な組合せを考案及び製作することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】（ａ）Ｄ０からＤ６の間、１日１回、生理食塩水溶液の皮下注射、（ｂ）Ｄ０からＤ６の間、１日１回、１．５ｍｇ／ｋｇでエノキサパリンの皮下注射、及び（ｃ）Ｄ１からＤ６の間、１日１回、１．５ｍｇ／ｋｇでエノキサパリンの皮下注射と組み合わせて、３つのハムスター筋肉、即ち、前脛骨筋、大腿四頭筋、内転筋／薄筋においてルシフェラーゼ遺伝子を保有するｐＣＯＲなどのプラスミドを６０μｇ注入した後のルシフェラーゼ発現の測定に対応するグラフである。このデータは、そのタンパク質が発現されることを証明し、血管新生増殖因子をコードする核酸なしの対照プラスミドを用いてエノキサパリン治療に対するベースラインを確立する。
【図１】
2007536909.tif 000003
【配列表】
2007536909000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年9月26日(2007.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生増殖因子をコードする有効量の発現ベクターと、ヘパリン化合物とを含むことを特徴とする生成物。
【請求項２】
前記ヘパリン化合物が、低分子量ヘパリンまたは標準ヘパリンであることを特徴とする請求項１に記載の生成物。
【請求項３】
前記血管新生増殖因子が、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）であることを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載の生成物。
【請求項４】
前記血管新生増殖因子が、酸性ＦＧＦまたはＦＧＦ−１であることを特徴とする請求項３に記載の生成物。
【請求項５】
前記血管新生増殖因子が、ＦＧＦ−２、またはｂＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、またはＦＧＦ１−２２のいずれかであることを特徴とする請求項３に記載の生成物。
【請求項６】
前記血管新生増殖因子が、ＶＥＧＦであることを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載の生成物。
【請求項７】
前記ベクターが、プラスミドベクターであることを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載の生成物。
【請求項８】
前記プラスミドベクターが、条件複製プラスミドであることを特徴とする請求項７に記載の生成物。
【請求項９】
前記ベクターが、ｐＣＯＲプラスミドであることを特徴とする請求項８に記載の生成物。
【請求項１０】
前記ＦＧＦ−１またはＦＧＦａが発現され、前記発現ベクターがＮＶ１ＦＧＦであることを特徴とする請求項１ないし９のいずれかに記載の生成物。
【請求項１１】
前記低分子量ヘパリンが、エノキサパリン、フラキシパリン、ダルテパリン、アルデパリン、チンザパリン、レビパリンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１ないし１０のいずれかに記載の生成物。
【請求項１２】
虚血の治療において、同時に、別々に、または連続的に使用するための請求項１ないし１１のいずれかに記載の生成物。
【請求項１３】
末梢性虚血または心虚血を治療するための薬物を製造するための請求項１ないし１２のいずれかに記載の生成物の使用方法。
【請求項１４】
虚血を治療するための薬物を製造する際の、血管新生増殖因子をコードする発現ベクターの使用方法であって、
前記血管新生増殖因子をコードする発現ベクターが、ヘパリン化合物と併用して投与されることを特徴とする使用方法。
【請求項１５】
虚血を治療するための薬物を製造する際のヘパリン化合物の使用方法であって、
前記ヘパリンが、血管新生増殖因子をコードする発現ベクターと併用して投与されることを特徴とする使用方法。
【請求項１６】
前記ヘパリン化合物が、標準ヘパリンまたは低分子量ヘパリンであることを特徴とする請求項１４または１５のいずれかに記載の使用方法。
【請求項１７】
前記発現ベクターが、ＦＧＦ−１またはＦＧＦａをコードし、かつプラスミドであることを特徴とする請求項１３ないし１６のいずれかに記載の使用方法。
【請求項１８】
前記低分子量ヘパリンが、エノキサパリン、フラキシパリン、ダルテパリン、アルデパリン、チンザパリン、レビパリンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１３ないし１７のいずれかに記載の使用方法。
【請求項１９】
虚血性患者の骨格筋または心筋組織において成熟側副血管を促進することによって作用する薬物を製造するための請求項１３ないし１８のいずれかに記載の使用方法。
【請求項２０】
虚血性患者の骨格筋または心筋組織において成熟側副血管及び細動脈の両方を促進することによって作用する薬物を製造するための請求項１３ないし１９のいずれかに記載の使用方法。
【請求項２１】
虚血性患者の骨格筋または心筋組織において大きな成熟伝導血管（１５０μｍ超の側副血管）及び小さな抵抗動脈（５０μｍ未満の細動脈）の形成を促進することによって作用する薬物を製造するための請求項１３ないし２０のいずれかに記載の使用方法。
【請求項２２】
前記虚血性患者が、末梢性虚血または冠動脈虚血を起こしやすいかまたは虚血の危険性があり、
前記患者が、４５才またはそれ以上であり、過体重であり、及び／またはアルコールまたはタバコの消費量が多く、及び／またはアテローム性動脈硬化症及び／または糖尿病であり、及び／または動けない状態であることを特徴とする請求項１３ないし２１のいずれかに記載の使用方法。
【請求項２３】
前記虚血性患者が、最後の２４時間から６ヵ月まで、または最大で１年、２年、または３年前までの期間、虚血性心発作を起こしやすい患者であり、
血管新生因子をコードする発現ベクターと低分子量ヘパリンの組合せ物を投与する過程を含むことを特徴とする請求項１３ないし２２のいずれかに記載の使用方法。
【請求項２４】
前記低分子量ヘパリンが、１日当たり０．２〜０．４ｍｇ／ｋｇの用量で皮下に投与されることを特徴とする請求項１３ないし２３のいずれかに記載の使用方法。
【請求項２５】
前記低分子量ヘパリンが、１日当たり約０．３ｍｇ／ｋｇの用量で皮下に投与されることを特徴とする請求項２４に記載の使用方法。
【請求項２６】
前記低分子量ヘパリンの最初の投与と最後の投与の間が少なくとも２０日間または３０日間は離されるように、前記低分子量ヘパリンが、少なくとも２０日間または少なくとも３０日間にわたり投与され、１回、２回、３回、またはそれ以上の間、前記血管新生増殖因子をコードするＤＮＡが投与されることを特徴とする請求項１３ないし２５のいずれかに記載の使用方法。
【請求項２７】
血管新生増殖因子をコードする発現ベクターと、ヘパリン化合物とを含む医薬組成物であって、
前記ベクターまたは前記ヘパリン化合物のいずれか単独の場合よりも、これらを併用する方が骨格筋及び心筋において血管新生をさらに促進することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２８】
血管新生増殖因子をコードする発現ベクターと、ヘパリン化合物とを含む医薬組成物であって、
前記ベクターまたは前記ヘパリン化合物のいずれか単独の場合よりも、これらを併用する方が骨格筋及び心筋において動脈形成をさらに促進することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２９】
前記ヘパリン化合物が、標準ヘパリンまたは低分子量ヘパリンであることを特徴とする請求項２７または２８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記血管新生増殖因子が、ＦＧＦ−１であることを特徴とする請求項２７または２８のいずれかの医薬組合せ物。
【請求項３１】
前記血管新生増殖因子が、ＦＧＦ−２、またはｂＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、またはＦＧＦ１−２２のいずれかであることを特徴とする請求項２７または２８のいずれかの医薬組成物。
【請求項３２】
前記発現ベクターが、ウイルス性ベクターであることを特徴とする請求項２７または２８のいずれかの医薬組成物。
【請求項３３】
前記発現ベクターが、非ウイルス性ベクターであることを特徴とする請求項２７または２８のいずれかの医薬組成物。
【請求項３４】
前記発現ベクターが、プラスミドであることを特徴とする請求項２７または２８のいずれかの医薬組成物。
【請求項３５】
前記発現ベクターが、ｐＣＯＲであることを特徴とする請求項２７または２８のいずれかの医薬組成物。
【請求項３６】
前記発現ベクターが、ＮＶ１ＦＧＦであることを特徴とする請求項２７または２８のいずれかの医薬組成物。
【請求項３７】
前記低分子量ヘパリンが、エノキサパリン、ナドロパリン、ダルテパリン、アルデパリン、チンザパリン、またはレビパリンであることを特徴とする請求項２７または２８のいずれかの医薬組成物。
【国際調査報告】
2007536909.tif 000004
2007536909.tif 000005
2007536909.tif 000006
2007536909.tif 000007