(57)【要約】【課題】ユビキチンリガーゼシステムの制御を利用した、膜蛋白質の制御剤等を提供すること。【解決手段】ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を制御する物質を含むことを特徴とする、細胞内輸送を介した膜蛋白質の分解又はリサイクリングの制御剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を制御する物質を含むことを特徴とする、細胞内輸送を介した膜蛋白質の分解又はリサイクリングの制御剤。
【請求項２】
膜蛋白質が、下記の（ｉ）又は（ii）であることを特徴とする、請求項１記載の制御剤。
（ｉ）血管内皮細胞発現接着系膜蛋白質
（ii）血管内皮細胞発現細胞間接着膜蛋白質
【請求項３】
ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質が、ユビキチンリガーゼ複合体を構成する蛋白質、又はユビキチンリガーゼの基質であることを特徴とする、請求項１又は２記載の制御剤。
【請求項４】
ユビキチンリガーゼ複合体を構成する蛋白質が、CUL3蛋白質、ユビキチンリガーゼのアダプター蛋白質、Rbx1、Nedd8、又はARIH1からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする、請求項３に記載の制御剤。
【請求項５】
膜蛋白質（ｉ）がIntegrin蛋白質であり、ユビキチンリガーゼ関連蛋白質のうち、アダプター蛋白質が、以下の（Ａ−ｉ）であり、基質が（Ｂ−ｉ）であることを特徴とする、請求項４に記載の制御剤。
（Ａ−ｉ）ANKFY1、KCTD18、BTBD7、CCIN、KCTD2、KLHL18、KLHL34、ZBTB6からなる群から選択される少なくとも一種のBTB蛋白質
（Ｂ−ｉ）SNX9、SNX11、SNX17からなる群から選択される少なくとも一種の蛋白質
【請求項６】
膜蛋白質（ii）がVE-Cadherin蛋白質であり、ユビキチンリガーゼ関連蛋白質のうち、アダプター蛋白質が、以下の（Ａ−ii）であることを特徴とする、請求項４に記載の制御剤。
（Ａ−ii）ABTB1、BACH1、KBTBD11、KLHL12、KLHL34、KCTD18、RHOBTB3、ZBTB42からなる群から選択される少なくとも一種のBTB蛋白質
【請求項７】
下記（１）乃至(３)の工程を含むことを特徴とする、ユビキチンリガーゼシステムがその細胞内輸送を介した分解又はリサイクリングのいずれに関与しているかによって、膜蛋白質を分類する方法。
（１）ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子の発現を制御する工程。
（２）（１）の制御前後の、リサイクリングエンドソーム、後期エンドソーム、又はリソソームから選択される細胞内構造物の一種に特異的に発現する蛋白質と、膜蛋白質との共局在を確認する工程。
（３）リサイクリングエンドソームに特異的に発現する蛋白質と共局在し得る膜蛋白質を、ユビキチンリガーゼシステムがそのリサイクリングに関与している膜蛋白質とし、後期エンドソーム又はリソソームに特異的に発現する蛋白質と共局在し得る膜蛋白質を、ユビキチンリガーゼシステムがその細胞内輸送を介した分解に関与している膜蛋白質として同定する工程。
【請求項８】
下記（Ｉ）乃至(IV)の工程を含むことを特徴とする、細胞内輸送を介した膜蛋白質の分解又はリサイクリングの制御剤の、スクリーニング方法。
（Ｉ）ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を制御し得る物質を選択する工程。
（II）（Ｉ）で選択した候補物質を、細胞に添加する工程。
（III）（II）の前後での当該膜蛋白質の細胞内局在位置を確認する工程。
（IV）（III）の細胞内局在位置に変化が見られたものを、当該膜蛋白質の分解又はリサイクリングの制御剤として抽出する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ユビキチンリガーゼシステムによって細胞内挙動が制御される膜蛋白質に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞表面には、細胞膜に発現する、いわゆる膜蛋白質というものが数多く存在する。
【０００３】
この膜蛋白質とは、細胞外ドメイン、細胞膜貫通ドメイン、細胞内ドメインを有する蛋白質であり、細胞外ドメインで受け取った何らかのシグナルを、細胞内ドメインを介して細胞内に伝達する働きを有するものである。
【０００４】
そしてこの膜蛋白質には、細胞膜上に表出後、エンドサイトーシスによる細胞内取り込み（初期エンドソームへの輸送）の後、主にリサイクルエンドソームを経て細胞膜に輸送され、そのまま再利用（リサイクリング）されるものと、主に後期エンドソームを経て、リソソームに移送され、分解を受けるものとに大別される。
【０００５】
このような膜蛋白質の細胞内での挙動には、種々の因子が関与していることが予想され、その一部は明らかにされつつあるが、全貌が解明された分けでは無い。
【０００６】
一方、ユビキチンリガーゼは、細胞内において、そのアダプター部位を変更することによって、様々な基質蛋白質をユビキチン化し、その分解や機能変化等に関わっていることが知られているが（非特許文献１、２）、膜蛋白質の細胞内輸送を介した分解やリサイクリングとの関わりについては、報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Natural Cell Biology vol.5 No.11, P.950-951, November 2003
【非特許文献２】Current Biology, vol.14, R59-R61, January 20, 2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者等はこの度、細胞内輸送を介した膜蛋白質の分解又はリサイクリング等（以下、まとめて「細胞内挙動」と記載することがある。）に注目し、鋭意研究を行った結果、膜蛋白質の細胞内挙動が、ユビキチンリガーゼシステムによって制御されていることを見出し、本発明に到達したものであって、その目的とするところは、ユビキチンリガーゼシステムの制御を利用した、膜蛋白質の細胞内挙動の制御剤等を提供するにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述の目的は、下記第一の発明から第八の発明によって、達成される。
【００１０】
＜第一の発明＞
ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を制御する物質を含むことを特徴とする、細胞内輸送を介した膜蛋白質の分解又はリサイクリングの制御剤。
【００１１】
＜第二の発明＞
膜蛋白質が、下記の（ｉ）又は（ii）であることを特徴とする、第一の発明に記載の制御剤。
（ｉ）血管内皮細胞発現接着系膜蛋白質
（ii）血管内皮細胞発現細胞間接着膜蛋白質
【００１２】
＜第三の発明＞
ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質が、ユビキチンリガーゼ複合体を構成する蛋白質、又はユビキチンリガーゼの基質であることを特徴とする、第一又は第二の発明に記載の制御剤。
【００１３】
＜第四の発明＞
ユビキチンリガーゼ複合体を構成する蛋白質が、CUL3蛋白質、ユビキチンリガーゼのアダプター蛋白質、Rbx1、Nedd8、又はARIH1からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする、第三の発明に記載の制御剤。
【００１４】
＜第五の発明＞
膜蛋白質（ｉ）がIntegrin蛋白質であり、ユビキチンリガーゼ関連蛋白質のうち、アダプター蛋白質が、以下の（Ａ−ｉ）であり、基質が（Ｂ−ｉ）であることを特徴とする、第四の発明に記載の制御剤。
（Ａ−ｉ）ANKFY1、KCTD18、BTBD7、CCIN、KCTD2、KLHL18、KLHL34、ZBTB6からなる群から選択される少なくとも一種のBTB蛋白質
（Ｂ−ｉ）SNX9、SNX11、SNX17からなる群から選択される少なくとも一種の蛋白質
【００１５】
＜第六の発明＞
膜蛋白質（ii）がVE-Cadherin蛋白質であり、ユビキチンリガーゼ関連蛋白質のうち、アダプター蛋白質が、以下の（Ａ−ii）であることを特徴とする、第四の発明に記載の制御剤。
（Ａ−ii）ABTB1、BACH1、KBTBD11、KLHL12、KLHL34、KCTD18、RHOBTB3、ZBTB42からなる群から選択される少なくとも一種のBTB蛋白質
【００１６】
＜第七の発明＞
下記（１）乃至(３)の工程を含むことを特徴とする、ユビキチンリガーゼシステムがその細胞内輸送を介した分解又はリサイクリングのいずれに関与しているかによって、膜蛋白質を分類する方法。
（１）ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子の発現を制御する工程。
（２）（１）の制御前後の、リサイクリングエンドソーム、後期エンドソーム、又はリソソームから選択される細胞内構造物の一種に特異的に発現する蛋白質と、膜蛋白質との共局在を確認する工程。
（３）リサイクリングエンドソームに特異的に発現する蛋白質と共局在し得る膜蛋白質を、ユビキチンリガーゼシステムがそのリサイクリングに関与している膜蛋白質とし、後期エンドソーム又はリソソームに特異的に発現する蛋白質と共局在し得る膜蛋白質を、ユビキチンリガーゼシステムがその細胞内輸送を介した分解に関与している膜蛋白質として同定する工程。
【００１７】
＜第八の発明＞
下記（Ｉ）乃至(IV)の工程を含むことを特徴とする、細胞内輸送を介した膜蛋白質の分解又はリサイクリングの制御剤の、スクリーニング方法。
（Ｉ）ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を制御し得る物質を選択する工程。
（II）（Ｉ）で選択した候補物質を、細胞に添加する工程。
（III）（II）の前後での当該膜蛋白質の細胞内局在位置を確認する工程。
（IV）（III）の細胞内局在位置に変化が見られたものを、当該膜蛋白質の分解又はリサイクリングの制御剤として抽出する工程。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の「細胞内輸送を介した膜蛋白質の分解又はリサイクリングの制御剤」は、各種の実験・研究試薬として用いうるほか、ユビキチンリガーゼシグナリングのコントロールによって、膜蛋白質の細胞内挙動を制御し、当該膜蛋白質本来の機能の制御を通じて、各種の疾患の予防又は治療にも利用可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１−１Ａ】siCUL3（＃１、＃２）処理によって、Integrinβ１の発現量に変化が無いことを、Western Blottingによって確認した結果を示す図である。
【図１−１Ｂ】siCUL3（＃１、＃２）処理によって、Integrinβ１が細胞内に局在していることを、膜透過剤（Triton）処理後の免疫染色によって確認した結果を示す図である。
【図１−１Ｃ】siCUL3（＃１、＃２）処理によって、細胞表面のIntegrinβ１量が減少することを、膜透過剤（Triton）未処理での免疫染色によって確認した結果を示す図である。
【図１−１Ｄ】図１−１ＣのIntegrinβ１の検出量を、免疫染色で使用した標識の発光の数値化によって示した図である。
【図１−１Ｅ】siCUL3（＃１、＃２）処理によって、細胞表面Integrinβ１が減少することを、細胞表面Integrinβ１のビオチン化とストレプトアビジンを用いたPull-down処理を用い、Western Blottingによって確認した結果を示す図である。
【図１−２Ａ】siCUL3（＃１）処理のレスキューによって、細胞内でのCUL3の発現量が回復することを、Western Blottingによって確認した結果を示す図である。
【図１−２Ｂ】siCUL3（＃１）処理のレスキューによって、細胞内でのIntegrinβ１陽性の細胞内斑点構造が縮小することを示す図である。
【図１−３Ａ】siCUL3（＃１）処理によって、Integrinβ１が、初期エンドソームマーカー蛋白質であるRab5と共局在している（ピアソン相関係数（Pearson co-efficient）＞０．５）ことを示す図である。
【図１−３Ｂ】siCUL3（＃１）処理によって、Integrinβ１が、リサイクリングエンドソームマーカー蛋白質であるRab11と共局在している（ピアソン相関係数＞０．５）ことを示す図である。
【図１−３Ｃ】siCUL3（＃１）処理によっても、Integrinβ１は、後期エンドソームマーカー蛋白質であるRab7とは共局在していない（ピアソン相関係数＜０．５）ことを示す図である。
【図１−３Ｄ】siCUL3（＃１）処理によっても、Integrinβ１は、リソソームマーカー蛋白質であるLAMP1とは共局在していない（ピアソン相関係数＜０．５）ことを示す図である。
【図１−４Ａ】siCUL3（＃１）処理によって、細胞内に留まっているIntegrinβ１の量の減少が抑制（リサイクリングに回るIntegrinβ１量の増加が抑制）される、つまりリサイクリングが阻害されることを示す図である。
【図１−４Ｂ】siCUL3（＃１）処理によっても、処理後10分でのIntegrinβ１の細胞内への取り込み量には、siCONT（＃１）処理の場合と、差が無いことを示す図である。
【図１−５Ａ】siCUL3（＃１）処理によって、Integrinα２及びIntegrinβ１共に、細胞内に局在していることを示す図である。
【図１−５Ｂ】siCUL3（＃１）処理によっても、Integrinα２の細胞における総発現量に変化が無いことを示す図である。
【図１−６Ａ】siANKFY1（＃１、＃２）処理によって、細胞において発現しているIntegrinα２及びIntegrinβ１の総発現量に変化が無いことを、Western Blottingによって確認した結果を示す図である。
【図１−６Ｂ】siANKFY1（＃１、＃２）処理によって、Integrinα２及びIntegrinβ１が細胞内に局在していることを、膜透過剤（Triton）処理後の免疫染色によって確認した結果を示す図である。
【図１−６Ｃ】siANKFY1（＃１、＃２）処理によって、細胞表面のIntegrinβ１量が減少することを、膜透過剤（Triton）未処理での免疫染色によって確認した結果を示す図である。
【図１−６Ｄ】図１−６ＣのIntegrinβ１の検出量を、免疫染色で使用した標識の発光の数値化によって示した図である。
【図１−７Ａ】siANKFY1（＃３）処理と、そのレスキュー処理（siRNA耐性ANKFY1との同時投与）によっても、Integrinβ１の細胞における総発現量に変化が無いことを、Western Blottingによって確認した結果を示す図である。
【図１−７Ｂ】siANKFY1（＃３）処理によって、Integrinβ１が細胞内に局在するが、そのレスキュー処理（siRNA耐性ANKFY1との同時投与）によって、Integrinβ１の細胞膜への局在が回復することを、免疫染色によって確認した結果を示す図である。
【図１−８】siRNAを用いた他の各種BTB蛋白質の阻害による、HUVEC中のIntegrinβ１の局在位置への影響を、Integrinβ１の抗体染色により確認した結果を示す図である。
【図１−９Ａ】３種のsiKCTD18（＃１、＃２、＃３）を用いたKCTD18遺伝子の阻害の、HUVEC中のIntegrinβ１及びSNX9蛋白質の、総発現量に与える影響を、Western Blottingにより確認した結果を示す図である。
【図１−９Ｂ】３種のsiKCTD18（＃１、＃２、＃３）を用いたKCTD18遺伝子の阻害による、HUVEC中のIntegrinβ１の局在位置への影響を、Integrinβ１の抗体染色により確認した結果を示す図である。
【図１−１０】３種のsiKCTD18（＃１、＃２、＃３）を用いたKCTD18遺伝子の阻害による、基底膜上でのHUVECの細胞伸展及び細胞面積への影響を、Integrinβ１の抗体染色により示した図である。
【図１−１１Ａ】３種のsiSNX9（＃１、＃２、＃３）を用いたSNX9遺伝子の阻害による、HUVEC中のIntegrinβ１及びSNX9蛋白質の、総発現量への影響を、Western Blottingにより確認した結果を示す図である。
【図１−１１Ｂ】３種のsiSNX9（＃１、＃２、＃３）を用いたSNX9遺伝子の阻害による、HUVEC中のIntegrinβ１の局在位置への影響を、Integrinβ１の抗体染色により確認した結果を示す図である。
【図１−１２】３種のsiSNX9（＃１、＃２、＃３）を用いたSNX9遺伝子の阻害による、基底膜上のHUVECの細胞伸展及び細胞面積への影響を、蛍光標識ファロイジンによるF-actinの染色により示した図である。
【図１−１３】SNX9以外の各種SNX蛋白質の阻害による、HUVEC中のIntegrinβ１の局在位置への影響を、Integrinβ１の抗体染色により確認した結果を示す図である。
【図１−１４】siCUL3（＃１）及びsiANKFY1（＃１）を用いた各遺伝子の阻害による血管新生への影響を、蛍光標識ファロイジンによるF-actinの染色により示した図である。
【図２−１Ａ】siRNAを用いた他の各種BTB蛋白質の阻害による、HUVEC中のVE-Cadherinの膜局在の消失を、VE-Cadherinの抗体染色により確認した結果を示す図である。
【図２−１Ｂ】siRNAを用いた他の各種BTB蛋白質の阻害による、HUVEC中のVE-Cadherinの膜局在の消失を、VE-Cadherinの抗体染色により確認した結果を示す図である。
【図３−１】ANKFY1とCUL3が、Nedd8の存在下で相互作用することを、ANKFY1の標識（HA）に対する抗体を用いた、免疫沈降（IP）及びWestern Blottingにより確認した結果を示す図である。
【図３−２】AlphaScreenTMシステムによって得られた発光シグナルの値によって、CUL3と他のBTB蛋白質が相互作用することを示す図である。
【図３−３】AlphaScreenTMシステムによって得られた発光シグナルの値によって、KCTD18とSNX9とが相互作用することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２１】
［本発明の制御剤］
本発明の「細胞内輸送を介した膜蛋白質の分解又はリサイクリングの制御剤」は、「ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を制御する物質」を含むことを特徴とするものである。
【００２２】
≪膜蛋白質≫
本発明で言う「膜蛋白質」としては、例えば下記（ｉ）乃至（viii）のいずれかに属する膜蛋白質等が挙げられる。
【００２３】
＜（ｉ）：血管内皮細胞発現接着系膜蛋白質＞
（ｉ）に属する膜蛋白質（以下、「膜蛋白質（ｉ）」と記載することがある。）としては、具体的には、Integrin蛋白質等が挙げられる。
Integrin蛋白質とは、細胞接着分子の働きを有する膜蛋白質の一種であり、その構造は、「α鎖」と「β鎖」の2種のサブユニットから成るヘテロダイマーである。α鎖とβ鎖のそれぞれが複数の種類を有するため、これらサブユニットを多様に組み合わせることによって、様々な種類の細胞外マトリックス（Extracellular Matrix：以下「ECM」と記載することがある。）への接着が可能となる。
【００２４】
尚、Integrin蛋白質としては、より具体的には例えば下記のものが挙げられる。
【００２５】
Integrinα１
Integrinα２
Integrinα３
Integrinα６
Integrinβ１
【００２６】
＜（ii）：血管内皮細胞発現細胞間接着膜蛋白質＞
（ii）に属する膜蛋白質（以下、「膜蛋白質（ii）」と記載することがある。）としては、具体的には、例えば下記のものが挙げられる。
VE-Cadherin 
Beta-catenin
P120 catenin
【００２７】
＜（iii）：血管内皮細胞発現白血球遊走膜蛋白質＞
（iii）に属する膜蛋白質（以下、「膜蛋白質（iii）」と記載することがある。）としては、具体的には、例えば下記のものが挙げられる。
VCAM-1
MAC-1
【００２８】
＜（iv）：血管内皮細胞発現細胞増殖シグナリング膜蛋白質＞
（iv）に属する膜蛋白質（以下、「膜蛋白質（iv）」と記載することがある。）としては、具体的には、例えば下記のものが挙げられる。
HER1
FGFR1
アドレナリン受容体β１
VEGFR2
Neuropilin1
Neuropilin2
Sema3A
Notch1
DLL4
Tie1
Tie2
ephrinB2
EphB4
ALK1
ALK5
【００２９】
＜（ｖ）：血管内皮細胞発現酸化LDL受容体型膜蛋白質＞
（ｖ）に属する膜蛋白質（以下、「膜蛋白質（ｖ）」と記載することがある。）としては、具体的には、例えば下記のものが挙げられる。
LOX-1
【００３０】
（vi）：血管内皮細胞発現免疫反応抑制性膜蛋白質
（vi）に属する膜蛋白質（以下、「膜蛋白質（vi）」と記載することがある。）としては、具体的には、例えば下記のものが挙げられる。
PD-L1
CD44
【００３１】
＜（vii）：癌細胞発現膜蛋白質＞
（vii）に属する膜蛋白質（以下、「膜蛋白質（vii）」と記載することがある。）としては、具体的には、例えば下記のものが挙げられる。
JA（各種癌関連膜蛋白質）
PD-L1（各種癌関連膜蛋白質）
VEGFR1（胃癌、大腸癌関連膜蛋白質）
VEGFR2（胃癌、大腸癌関連膜蛋白質）
Tie2（間葉系腫瘍関連膜蛋白質）
CD44（胃癌関連膜蛋白質）
HER2（胃癌、乳癌関連膜蛋白質）
FGFR2（胃癌関連膜蛋白質）
FGFR4（胃癌、肝胆癌、横紋筋肉腫関連膜蛋白質）
c-MET（胃癌関連膜蛋白質）
c-kit（間葉系腫瘍関連膜蛋白質）
Fas（間葉系腫瘍関連膜蛋白質）
CTLA-4（各種癌の免疫療法関連膜蛋白質）
CCR4（各種癌の免疫療法関連膜蛋白質）
【００３２】
＜（viii）：腸炎症細胞発現膜蛋白質＞
（viii）に属する膜蛋白質（以下、「膜蛋白質（viii）」と記載することがある。）としては、具体的には、例えば下記のものが挙げられる。
Integrin beta7
Integrin alpha4
MAｄCAM-1
フラクタルカイン
IL-6受容体
IL-8受容体
IL-12受容体
IL-23受容体
TNFα受容体
【００３３】
尚、上記の膜蛋白質は、いずれも公知の蛋白質であり、その遺伝子及びアミノ酸の配列は、下記のデータベース等に記載されている。
「NCBI CCDS database 」
（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/CCDS/CcdsBrowse.cgi）
【００３４】
≪ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質≫
本発明で言う「ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質」としては、
「ユビキチンリガーゼ複合体を構成する蛋白質」
又は
「ユビキチンリガーゼの基質蛋白質」
等が主なものとして挙げられるが、そのほか「基質蛋白質」の更に先の、膜蛋白質が細胞内輸送を介した分解やリサイクリングを受けるまでの「シグナル伝達カスケード上にある蛋白質」等が挙げられる。
【００３５】
＜ユビキチンリガーゼ複合体を構成する蛋白質＞
「ユビキチンリガーゼ」とは、下記のユビキチンシステム関連酵素のうちのE3を意味する。
【００３６】
E1：ユビキチン活性化酵素
E2：ユビキチン結合酵素
E3：ユビキチン転移酵素（ユビキチンリガーゼ）
【００３７】
そして、ユビキチン化（以下「Ub化」と記載する。）の最終段階で作用するE3は、下記の各種の役割を有する複数のコンポーネントからなる複合体であることが知られている。
【００３８】
{１}リガーゼ活性を有するとともに他のコンポーネントをつなぐプラットフォームの役割をも担っている本体部位（[Cullin1(CUL1)、Cullin2(CUL2)、Cullin3(CUL3)]等のCullin(CUL)蛋白質）
{２}基質（Ub化の対象となる蛋白質）を認識するアダプター部位（アダプター蛋白質）
{３}その他の部位（Rbx1、Nedd8 (N8, Neural Precursor Cell Expressed, Developmentally Down-Regulated 8)、ARIH1（ariadne RBR E3 ubiquitin protein ligase 1） 等）
【００３９】
そして、{２}の、基質特異性のあるアダプター部位を変更することで、種々の蛋白質に対するUb化を実現し得るものである。
【００４０】
従って本発明で言う「ユビキチンリガーゼ複合体を構成する蛋白質」としては、「CUL3蛋白質」、「アダプター蛋白質」、「Rbx1」、「Nedd8」、又は「ARIH1」等が挙げられる。
【００４１】
（アダプター蛋白質）
「アダプター蛋白質」としては、上記「CUL3蛋白質」との結合部位の異なる、「F-box含有蛋白質」、「BC-box含有蛋白質」、「BTBドメイン含有蛋白質（以下「BTB蛋白質」と記載することがある。））等が挙げられるが、これらの中で、本発明で制御する対象としては、CUL3と共に、複数の細胞内膜輸送経路で機能する事が報告されているという理由から、「BTB蛋白質」が好ましい。
【００４２】
「BTB蛋白質」のうち、BTBドメインを有するヒト蛋白質としては、既に遺伝子レベルから、183種類が知られている。
【００４３】
具体的な「BTB蛋白質」としては、例えば下記（Ａ−ｉ）や（Ａ−ii）のような「（Ａ）BTB蛋白質」が挙げられる。
【００４４】
（Ａ−ｉ）：上述の膜蛋白質（ｉ）の細胞内挙動に関連するBTB蛋白質
膜蛋白質（ｉ）が「Integrin蛋白質」である場合：
ANKFY1、KCTD18、BTBD7、CCIN、KCTD2、KLHL18、KLHL34、又はZBTB6等
【００４５】
これらの蛋白質は、下記に示す通り、公知の蛋白質である。
【００４６】
ANKFY1：Ankyrin repeat and FYVE domain containing 1、あるいは別名: Rabankyrin-5, ANKHZN, BTBD23, ZFYVE14等とも呼ばれる約1200個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC02023」等として、市場から入手可能である。
【００４７】
KCTD18：potassium channel tetramerization domain containing 18、あるいは別名: 6530404F10Rik等とも呼ばれる約400個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC21268E」等として、市場から入手可能である。
【００４８】
BTBD7：BTB (POZ) domain containing 7、あるいは別名: FUP1等とも呼ばれる約1100個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC01173」等として、市場から入手可能である。
【００４９】
CCIN：calicin、あるいは別名: BTBD20, KBTBD14等とも呼ばれる約600個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC08991」等として、市場から入手可能である。
【００５０】
KCTD2：potassium channel tetramerization domain containing 2と呼ばれる約250個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC11364」等として、市場から入手可能である。
【００５１】
KLHL18：kelch like family member 18と呼ばれる約600個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC05762」等として、市場から入手可能である。
【００５２】
KLHL34：kelch like family member 34と呼ばれる約650個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC27326」等として、市場から入手可能である。
【００５３】
ZBTB6：zinc finger and BTB domain containing 6、あるいは別名: ZID, ZNF482等とも呼ばれる約400個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC03234」等として、市場から入手可能である。
【００５４】
（Ａ−ii）：上述の膜蛋白質（ii）の細胞内挙動に関連するBTB蛋白質
膜蛋白質（ii）が「VE-Cadherin蛋白質」である場合：
ABTB1、BACH1、KBTBD11、KLHL12、KLHL34、KCTD18、RHOBTB3、又はZBTB42等
【００５５】
これらの蛋白質も、下記に示す通り、公知の蛋白質である。
【００５６】
（Ａ−ii）の蛋白質
【００５７】
ABTB1：Ankyrin repeat and BTB/POZdomain-containing protein 1あるいは別名: BPOZ, BTB3, BTBD21, EF1ABP, PP2259等とも呼ばれる約478個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC11239」等として、市場から入手可能である。
【００５８】
BACH1：BTB AND CNC HOMOLOGY 1あるいは別名: BASIC LEUCINE ZIPPER TRANSCRIPTION FACTOR 1, BTBD24等とも呼ばれる約736個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC01715」等として、市場から入手可能である。
【００５９】
KBTBD11：kelch repeat and BTB domain containing 11あるいは別名:KLHDC7C等とも呼ばれる約623個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC16551」等として、市場から入手可能である。
【００６０】
KLHL12：kelch Like Family Member 12あるいは別名:DKIR, C3IP1等とも呼ばれる約568個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC03452」等として、市場から入手可能である。
【００６１】
KLHL34：kelch like family member 34と呼ばれる約650個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC27326」等として、市場から入手可能である。
【００６２】
KCTD18：potassium channel tetramerization domain containing 18、あるいは別名: 6530404F10Rik等とも呼ばれる約400個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC21268E」等として、市場から入手可能である。
【００６３】
RHOBTB3：Rho-related BTB domain-containing protein 3と呼ばれる約611個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC00141」等として、市場から入手可能である。
【００６４】
ZBTB42：Zinc Finger And BTB Domain Containing 42あるいは別名:LCCS6, ZNF925等とも呼ばれる約422個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC30602M」等として、市場から入手可能である。
【００６５】
ここで、（Ａ−ｉ）や（Ａ−ii）は、BTB構造を有することや、（Ａ−ｉ）や（Ａ−ii）の一部がCUL3と相互作用することが下記試験例３−１、３−２等で確認されたこと、更にはそれら（Ａ−ｉ）や（Ａ−ii）の阻害が、CUL3阻害時と同等の表現型（図１−８、図１−９Ｂ、図２−１Ａ及びＢ）を示すこと等からも、E3のアダプター蛋白質としての役割を担う蛋白質であることが分かる。
【００６６】
＜ユビキチンリガーゼの基質蛋白質＞
本発明で言う「ユビキチンリガーゼの基質蛋白質」としては、例えば下記（Ｂ−ｉ）のような「（Ｂ）基質蛋白質」が挙げられる。
【００６７】
（Ｂ−ｉ）：（Ａ−ｉ）に対応する「基質蛋白質」
膜蛋白質（ｉ）が「Integrin蛋白質」である場合：
SNX9、SNX11、又はSNX17 等
【００６８】
これらの蛋白質も、下記に示す通り、公知の蛋白質である。
【００６９】
SNX9：sorting nexin 9、あるいは別名: SDP1, SH3PX1, SH3PXD3A, WISP等とも呼ばれる約600個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC03587」等として、市場から入手可能である。
【００７０】
SNX11：sorting nexin 11と呼ばれる約250個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC26087M」等として、市場から入手可能である。
【００７１】
SNX17：sorting nexin 17と呼ばれる約500個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC00391」等として、市場から入手可能である。
【００７２】
尚、（Ｂ−ｉ）は、その一種であるSNX9が、（Ａ−ｉ）のE3アダプター蛋白質（KCTD18）と相互作用する（試験例３−３）こと等からも、E3のUb化基質としての役割を担う蛋白質であると考えられる。
【００７３】
（Ａ）の蛋白質を含む「BTB蛋白質」、及び（Ｂ）の蛋白質を含む基質蛋白質の、遺伝子及びアミノ酸の配列は、下記のデータベースや文献等に記載されている。
【００７４】
「NCBI CCDS database 」
（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/CCDS/CcdsBrowse.cgi）
【００７５】
Stogios et al. Sequence and structural analysis of BTB domain proteins.
（Genome Biol. 2005;6(10):R82. Epub 2005 Sep 15.）
【００７６】
≪細胞内輸送を介した膜蛋白質の分解又はリサイクリング≫
＜細胞内輸送＞
本発明で言う「細胞内輸送」とは、膜蛋白質の「分解やリサイクリングに至るまでの細胞内の移動」等を言う。
【００７７】
＜細胞内輸送を介した膜蛋白質の分解＞
本発明で言う「細胞内輸送を介した膜蛋白質の分解（以下、単に「膜蛋白質の分解」と言うことがある。）とは、膜蛋白質が、「エンドサイトーシス」を経て、「初期エンドソーム」、「後期エンドソーム」、「リソソーム」の順に移動した後に分解されること、又は分解へ至るまでの細胞内挙動の各々を言う。
【００７８】
＜細胞内輸送を介した膜蛋白質のリサイクリング＞
本発明で言う「細胞内輸送を介した膜蛋白質のリサイクリング（以下、単に「膜蛋白質のリサイクリング」と言うことがある。）」とは、膜蛋白質が、「エンドサイトーシス」を経て、「初期エンドソーム」、「リサイクリングエンドソーム」の順に移動した後に「細胞膜」へとリサイクリングされること、又はリサイクリングに至るまでの細胞内挙動の各々を言う。
【００７９】
尚、リサイクリング経路の制御のうち、例えば「阻害」処理を施すと、多くの場合、膜蛋白質は細胞膜に移送されず細胞内に局在し続けるため、細胞全体での当該膜蛋白質の総発現量に変化が無いことが多いが、稀に、阻害処理によって制御機構全体のバランスが崩れ、イレギュラーに分解経路に回ってしまい、細胞全体での当該膜蛋白質の総発現量が減少してしまう場合もある。
【００８０】
≪制御≫
本発明で言う「制御」には、“「量や機能」の「阻害（抑制）」又は「促進（増加）」”が含まれる。
【００８１】
すなわち本発明において、「蛋白質又はその遺伝子の制御」とは、
「投与対象（生体や細胞や実験試料等）における、当該蛋白質又はその遺伝子の、量の抑制（減少）又は促進（増加）」
又は
「投与対象における、当該蛋白質又はその遺伝子の、機能の阻害又は促進」
を意味している。
【００８２】
≪ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を制御する物質≫
「ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を制御する物質」としては、投与対象における当該蛋白質又はその遺伝子の「量や機能」を、「阻害（抑制）又は促進（増加）する物質」が挙げられる。
【００８３】
＜ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子の量や機能を、阻害（抑制）する物質＞
「ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子の量や機能を、阻害（抑制）する物質」としては、
「ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子の発現量を、抑制する物質」
「ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を分解する物質」
「ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子の機能を阻害する物質」
等が挙げられる。
【００８４】
具体的には、下記のようなものが挙げられるが、必ずしもこれらに限られるものでは無い。
【００８５】
（ｘ）ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質の遺伝子に対するsiRNA遺伝子、shRNA遺伝子、miRNA遺伝子、アンチセンスRNA、核酸アプタマー、又はリボザイム等を含む、遺伝子発現制御等に用いられる各種の核酸物質、各種の核酸分解酵素、及び各種の低分子性化合物等。
（ｙ）ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質に対する抗体、ペプチドアプタマー、サイクリックマクロペプチド、又は各種のプロテアーゼ等を含む、蛋白質を制御するのに用いられる各種のペプチド或いは蛋白質類、及び各種の低分子性化合物等。
【００８６】
（ｘ）のユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質の遺伝子に対するsiRNA遺伝子、shRNA遺伝子、miRNA遺伝子、アンチセンスRNA、核酸アプタマー、リボザイム等は、公知の知見に基づいて適宜設計することが可能であるが、siRNA遺伝子としては、例えば後述する表１に記載したようなものを購入することができるほか、Sigma社等に設計依頼することも可能である。
尚、核酸アプタマーは、ランダム配列からなる公知の巨大ライブラリー等からのスクリーニングによって得ることが一般的である。
【００８７】
（ｙ）のユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質に対する抗体は、公知の方法に従い、当該蛋白質を抗原として、適当な宿主に免疫することや、常法に従った人工的な合成等によって作製することができるが、公知の抗体として表２記載のようなものを購入することもできる。
【００８８】
本発明において抗体とは、モノクローナル抗体（mAb）、ポリクローナル抗体（pAb）、もしくはキメラ抗体やヒト化抗体のいずれであっても良く、ファージ抗体であっても良い。
【００８９】
本発明において、抗体を各種の「制御剤」に用いる場合には、制御ターゲットが明確なため、モノクローナル抗体が好ましい。
但し、後述する本発明の「分類方法」や「スクリーニング方法」に使用する際には、ポリクローナル抗体でも良い。
【００９０】
尚、ペプチドアプタマーも、上述の核酸アプタマー同様、公知の巨大ライブラリー等からのスクリーニングによって得ることが一般的である。
【００９１】
＜ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子の量や機能を、促進（増加）する物質＞
「ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子の量や機能を、促進する物質」としては、
「ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子の発現量を増加させる物質」
「ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子」そのもの
「ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子の機能を促進する物質」
等が挙げられる。
【００９２】
具体的には、下記のようなものが挙げられるが、必ずしもこれらに限られるものでは無い。
【００９３】
（ｚ）ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質の遺伝子又はその改変体
（ｗ）ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその改変体、或いはそれらの誘導体
【００９４】
本発明において（ｚ）の「遺伝子」とは、アデニン（A）、グアニン（G）等のプリン塩基や、チミン（T）、ウラシル（U）、シトシン（C）等のピリミジン塩基やそれらの修飾塩基を構成要素として含むポリヌクレオチドであり、一本鎖又は二本鎖のDNA、cDNA、一本鎖又は二本鎖のRNA、一本鎖DNAと一本鎖RNAからなるハイブリッド体、RNAとDNAが結合して一本鎖となったキメラ体をも含むものである。
【００９５】
（ｚ）の「改変体」には、当該遺伝子としての機能を損なわない範囲で、１乃至数個の核酸を「欠失」、「置換」、「付加」、又は「挿入」した、核酸配列自体の改変体の他、「メチル化」、「リン酸化」、「アミノ基修飾」その他の、核酸医薬等に用いられる公知の修飾を施したもの等が含まれる。
【００９６】
本発明において、遺伝子は、プラスミド、ウイルスベクター等の形態で用いることができ、その際には、一本鎖であっても二本鎖であっても構わない。
【００９７】
これらの遺伝子は、常法に従い、DNA合成装置や形質転換細胞等を用いて人工的に合成する、天然に存在するポリヌクレオチドを抽出する、天然からの抽出ポリヌクレオチドの塩基の一部を欠失、置換、付加、挿入する、目的とする配列と相補的な配列を用い、逆転写酵素やDNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ等によって目的の配列のものを合成させる、これらの方法で得られたポリヌクレオチドの塩基を修飾する等の方法によって製造することができる。
【００９８】
また、（ｗ）の「改変体」とは、各蛋白質の機能を阻害しない範囲で、１乃至数個のアミノ酸を欠失、置換、付加、挿入したものを意味し、「誘導体」としては、各蛋白質やその「改変体」の、前駆体や、反応性官能基を保護したもの、側鎖を各種の置換基や糖鎖等で修飾したもの等が含まれる。
【００９９】
ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質の遺伝子及びアミノ酸の配列も、上述の（Ａ）や（Ｂ）と同じ、上述のデータベース等に記載されている。
【０１００】
≪本発明の制御剤の応用≫
本発明の制御剤は、医薬等の他、実験室内における実験・研究試薬として、例えば本発明のスクリーニング方法等に用いる試薬の一部としても、非常に利用価値の高いものである。
【０１０１】
尚、実験・研究試薬としては、上記の成分の他、一般に実験・研究試薬に用いられている溶媒その他の各種添加剤等を含有させることができる。
【０１０２】
［本発明の膜蛋白質の分類方法］
本発明の「ユビキチンリガーゼシステムがその細胞内輸送を介した分解又はリサイクリングのいずれに関与しているかによって、膜蛋白質を分類する方法」は、下記（１）乃至(３)の工程を含むことを特徴とするものである。
【０１０３】
（１）ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子の発現を制御する工程。
（２）（１）の制御前後の、リサイクリングエンドソーム、後期エンドソーム、又はリソソームから選択される細胞内構造物（オルガネラ）の一種に特異的に発現する蛋白質（オルガネラマーカー）と、膜蛋白質との共局在を確認する工程。
（３）リサイクリングエンドソームに特異的に発現する蛋白質と共局在し得る膜蛋白質を、ユビキチンリガーゼシステムがそのリサイクリングに関与している膜蛋白質とし、後期エンドソーム又はリソソームに特異的に発現する蛋白質と共局在し得る膜蛋白質を、ユビキチンリガーゼシステムがその細胞内輸送を介した分解に関与している膜蛋白質として同定する工程。
【０１０４】
≪制御対象物質≫
（１）で制御される対象となる「ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質」としては、「ユビキチンリガーゼ複合体を構成する蛋白質」、「ユビキチンリガーゼの基質蛋白質」、「基質蛋白質」又はその先の、膜蛋白質が細胞内輸送を介した分解やリサイクリングを受けるまでの「シグナル伝達カスケード上にある蛋白質」等が挙げられる。
【０１０５】
尚、多数の膜蛋白質を一度に分類にかけるような場合には、シグナル伝達カスケード上流での制御ができるほど、確実に制御できるため、「ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質」としては、「ユビキチンリガーゼ複合体を構成する蛋白質」や「ユビキチンリガーゼの基質蛋白質」が好ましく、また基質を特定しなくとも制御可能という点で、「ユビキチンリガーゼ複合体を構成する蛋白質」が更に好ましく、その中でも、E3機能の根幹であり、アダプターが未特定の状況下でも分類に用い得るという点で、CUL3が特に好ましい。
【０１０６】
≪オルガネラマーカー≫
尚、（２）に先立って、細胞内輸送の過程で蛋白質が通過すると予測される、各オルガネラの可視化のために、（１）の制御と並行して、下記の様な、GFP等で標識した各種オルガネラマーカーをコードする遺伝子等を、被験細胞に導入することが好ましい。
【０１０７】
GFP-Rab5 (初期エンドソームマーカー)
GFP-Rab11 (リサイクリングエンドソームマーカー)
GFP-Rab7 (後期エンドソームマーカー)
LAMP1-GFP (リソソームマーカー)
【０１０８】
≪制御方法≫
上述の本発明の「制御剤」に用いられる「ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を制御する物質」を用いて、常法に従って、制御することができる。
【０１０９】
≪共局在の確認方法≫
共局在は、例えば以下の方法によって確認することができる。
＜膜蛋白質の局在位置の確認＞
被験細胞について、膜蛋白質の細胞内局在位置を、表２記載の抗体等を用いた免疫染色により、上述の検出機器を用いて確認する。
【０１１０】
＜各種オルガネラマーカーの局在位置の確認＞
被験細胞について、各種オルガネラマーカーの細胞内局在位置を、各マーカーに結合させたGFP等の標識に対する抗体（表２参照）等を用いた免疫染色により、上述の検出機器を用いて確認する。
【０１１１】
膜蛋白質と各種オルガネラマーカーの検出結果写真を「マージ」し、下記の方法にて共局在を確認する。
【０１１２】
＜ピアソン相関係数の算出＞
膜蛋白質と各種オルガネラマーカーとの共局在を定量化するために、FIJI (NIH)ソフトウェアを用いて、ピアソン相関係数の値を算出する。
一般的に0.5を超えると、２つの分子は共局在していると言える。
【０１１３】
［本発明の膜蛋白質の分解又はリサイクリングの制御剤の、スクリーニング方法］
本発明の、「細胞内輸送を介した膜蛋白質の分解又はリサイクリングの制御剤」のスクリーニング方法は、下記（Ｉ）乃至(IV)の工程を含むことを特徴とするものである。
【０１１４】
（Ｉ）ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を制御し得る物質を選択する工程。
（II）（Ｉ）で選択した候補物質を、細胞に添加する工程。
（III）（II）の前後での当該膜蛋白質の細胞内局在位置を確認する工程。
（IV）（III）の細胞内局在位置に変化が見られたものを、当該膜蛋白質の分解又はリサイクリングの制御剤として抽出する工程。
【０１１５】
（II）の「制御」や（III）の「確認」は、上述の「膜蛋白質の分類方法」で用いた方法によって実施することが可能である。
【実施例】
【０１１６】
［実施例１：細胞内輸送を介した膜蛋白質の分解又はリサイクリングの制御剤］
蛋白質製剤や核酸医薬等を製造する常法を使用し、
下記の制御対象蛋白質又はその誘導体自体、それら蛋白質又はその誘導体の、遺伝子又はその改変体自体、それらの各遺伝子に対するsiRNA分子、shRNA遺伝子、miRNA遺伝子、アンチセンスRNA、核酸アプタマー、リボザイム、各種の核酸分解酵素、或いは、公知の免疫方法等によって得られる下記の制御対象の蛋白質に対する抗体、ペプチドアプタマー、サイクリックマクロペプチド、又は各種のプロテアーゼ
等を含む、本発明の各種制御剤を製造する。
【０１１７】
≪制御対象蛋白質≫
下記の蛋白質又はその改変体、或いはそれらの誘導体。
「CUL3蛋白質」
「（Ａ）BTB蛋白質」
「（Ｂ）基質蛋白質」
「Rbx1」
「Nedd8」
「ARIH1」
【０１１８】
≪制御剤≫
上記の制御対象蛋白質、それらの遺伝子、表１記載の各種のsiRNA遺伝子、又は表２記載の各種の抗体等を含む本発明の制御剤を作製する。
【０１１９】
これらの各種制御剤によって、Integrin蛋白質やVE-Cadherin等を含む膜蛋白質の、細胞内輸送を介した分解又はリサイクリングを制御し得ると考えられる。
【０１２０】
［試験例］
以下の試験例によって、本発明の各種の制御剤等の効果を確認した。
【０１２１】
尚、各試験例において用いたsiRNA、蛋白質の分離・検出方法、検出用抗体等は下記の通りである。
【０１２２】
≪材料及び方法：Material and method≫
（siRNA試薬）
各試験例で使用したsiRNA試薬の配列は、表１及び配列表に示した通りである。
【０１２３】
（レンチウイルスを用いた外来遺伝子発現系）
細胞で発現させたい蛋白質の遺伝子を、下記の「組込ベクター」に組み込んだ。
この「組込ベクター」を、下記の２種類の「パッケージングベクターＩ，II」と共に、HEK293T細胞にトランスフェクトすることによって、自己複製可能なレンチウイルスを作製させた。トランスフェクトの４８時間後に、培地中からこのレンチウイルスを回収した。
【０１２４】
「組込ベクター」：CSII-CMV-MCS-IRES2-Bsd ベクター（理研、三好浩之博士より取得)
「パッケージングベクターＩ」：pCAG-HIVgp ベクター（理研、三好浩之博士より取得)
「パッケージングベクターII」：pCMV-VSVG-RSV-Rev ベクター（理研、三好浩之博士より取得)
【０１２５】
（蛋白質の分離）
７．５％、１５％ゲルまたは、１０−２０％グラジエントゲルによる、SDS-PAGE電気泳動によって、被験試料中の蛋白質を分離し、下記方法による蛋白質の検出に用いた。
【０１２６】
（蛋白質の検出：Western Blotting）
SDS-PAGE電気泳動で用いたゲルから、PVDF膜（Bio-Rad社製）に蛋白質を転写した後、表２記載の一次抗体、二次抗体、二次抗体の標識等を用いて、Western Blottingによる蛋白質検出を行った。
二次抗体標識の発光基質としては、ECL Prime Western Blotting Detection Reagent （GEヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いた。
【０１２７】
（Western Blottingにおける検出機器）
CCDカメラタイプ画像解析装置：
Image Quant LAS-4000（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）
【０１２８】
（蛋白質の検出：細胞中の免疫染色）
4 % PFA（パラホルムアルデヒド）-PBSで細胞を固定し、0.1 % Triton-PBSで膜透過し、3 % BSA-PBSでブロッキングした後、表２記載の一次抗体、二次抗体、二次抗体の標識を用いて、免疫染色法によるタンパク質の細胞内における可視化を行った。
【０１２９】
（免疫染色における検出機器）
顕微鏡は、A1R共焦点顕微鏡 (Nikon社製)を用いた。
【０１３０】
（蛋白質間相互作用の確認方法）
各種の蛋白質が、「ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質」であることを確認するための手段として、「CUL3」と「アダプター蛋白質」との相互作用、「アダプター蛋白質」と「基質蛋白質」との相互作用等を調べる必要があるが、その際には、蛋白質相互作用を確認できる常法によって確認することができ、例えば、酵母ツーハイブリッド法や、共免疫沈降法、プルダウンアッセイ法のほか、下記試験例等でも用いているAlphaScreenTMシステム等が挙げられる。
【０１３１】
（AlphaScreenTMシステム）
AlphaScreenTMシステムとは、PerkinElmer社の公知のシステムであって、主に次のような原理・手法を用いるものである。
（詳細は、"http://www.perkinelmer.com/category/alpha-kits"等参照）
【０１３２】
（原理）
相互作用を確認したい2つの蛋白質を、それぞれ下記（１）、（２）のビーズに結合させる。
2つの蛋白質が相互作用（結合）し、（１）、（２）のビーズが200nm以内の範囲内に近接した時に初めて、（２）内部のチオキシン誘導体の発光が生じる。
この発光シグナルを検出することによって、蛋白質の相互作用を確認することができる。
【０１３３】
（使用ビーズ）
（１）Donor Beads（PerkinElmer社製）：フタロシアニン（680nmの光を受けることで周囲の酸素を励起させ、一重項酸素に変換する、フォトセンシタイザー）を内部に含むビーズ。
（２）Acceptor Beads（PerkinElmer社製）：チオキシン誘導体（一重項酸素から受け取ったエネルギーによって520〜620nmの光を発する）を内部に含むビーズ。
【０１３４】
（各被験蛋白質とビーズの結合）
例えば、下記の関係を利用することができる。
「ストレプトアビジン」−「ビオチン」
「抗原」−「抗体」（例：（「FLAGタグ」及び「抗FLAG抗体」）
【０１３５】
（発光シグナルの検出）
EnVision Reader （PerkinElmer社製）等を用いて検出できる。
尚、AlphaScreenTMシステムによれば、発光シグナルの値が、バックグラウンドの値の10倍を超えている場合に、直接結合していると判断できる。
【０１３６】
【表１】
2019112320.tif 000002
【０１３７】
（上記配列中、小文字はRNA、大文字はDNAを表す。）
【０１３８】
【表２】
2019112320.tif 000003
【０１３９】
［試験例１：（ｉ）血管内皮細胞発現接着系膜蛋白質の制御］
（ｉ）の膜蛋白質（Integrin蛋白質）の制御が、各種の「ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を制御する物質」によって可能となることを、以下の試験例１−１〜１４によって示す。
【０１４０】
「ユビキチンリガーゼ（E3）シグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を制御する物質」としては、以下の物質を用いた。
【０１４１】
試験例１−１〜５： CUL3に対するsiRNA遺伝子（E3プラットフォーム阻害剤）
試験例１−２：CUL3遺伝子（E3プラットフォーム生成促進剤）
試験例１−６〜７： ANKFY1に対するsiRNA遺伝子（E3アダプター阻害剤）
試験例１−７：ANKFY1遺伝子（E3アダプター生成促進剤）
試験例１−８：その他のBTB蛋白質に対するsiRNA遺伝子（E3アダプター阻害剤）
試験例１−９〜１０：KCTD18に対するsiRNA遺伝子（E3アダプター阻害剤）
試験例１−１１〜１２：SNX9に対するsiRNA遺伝子（E3基質阻害剤）
試験例１−１３：その他のSNX蛋白質に対するsiRNA遺伝子（E3基質阻害剤）
【０１４２】
尚、試験例１−１４においては、siCUL3又はsiANKFY1によるIntegrin蛋白質のリサイクリング阻害の結果、Integrin蛋白質本来の機能であるECMへの接着性が消失することを通じた、血管新生の阻害が起こっていることが確認された。
【０１４３】
｛試験例１−１〜５：CUL3制御による、膜蛋白質（ｉ）（Integrinα２、β１）の細胞内挙動変化の確認｝
【０１４４】
≪試験例１−１：siCUL3による、Integrinβ１の細胞内局在≫
〈実験手順：Protocol〉
（CUL3、integrinβ１、GAPDHの細胞内発現量）
表１記載のコントロールsiRNA（siCONT＃１）、siCUL3＃１、又はsiCUL3＃２を、各々リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）にトランスフェクションし、表２の一次抗体、二次抗体等を用いて、上述のSDS-PAGE（７．５％ゲル使用）、Western Blottingによって、Integrinβ１及びCUL3の検出を行った結果を、図１−１Ａに示す。
尚、コントロールとしてGAPDHを用いた。
【０１４５】
（Integrinβ１の細胞内局在）
上記トランスフェクション細胞内のIntegrinβ１を、表２に記載の抗Integrinβ１抗体等を用い、上述のTriton-PBSによる膜透過を利用した免疫染色方法及び検出機器によって検出した（図１−１Ｂ／バー：20μm）。
【０１４６】
（Integrinβ１の細胞膜局在）
上記トランスフェクション細胞膜上のIntegrinβ１を、表２に記載の「Alexa488標識抗Integrinβ１抗体（TS2/16）」を用いた免疫染色により、上述の検出機器で検出した（図１−１Ｃ／バー：20μm）。
尚、図１−１Ｂの場合と異なり、Triton-PBSによる膜透過を利用していないため、細胞膜上にあるIntegrinβ１のみが検出された。
各細胞のAlexa488の蛍光強度を測定し、コントロールを100%として定量した（図１−１Ｄ）（***：p＜０．００１）。
【０１４７】
（Integrinβ１の細胞膜における存在量）
上記トランスフェクション細胞の一部を「Input試料」とし、残りを次の「Pull-down試料」の調製に用いた。
【０１４８】
細胞表面上のIntegrinβ１を、氷上にてビオチンラベルし、細胞を破砕後、ビオチン化タンパク質をストレプトアビジンビーズで回収し、「Pull-down試料」とした。
【０１４９】
「Input試料」及び「Pull-down試料」について、表２の一次抗体、二次抗体等を用いて、上述のSDS-PAGE（７．５％ゲル使用）、Western Blottingによって、細胞膜表面のIntegrinβ１の検出を行った結果を、図１−１Ｅに示す。
図中の数値は、Surface/Totalのバンド強度をコントロールを１として、算出したものである。
【０１５０】
〈結果〉
結果を、図１−１Ａ〜図１−１Ｅに示す。
siCUL3（＃１、＃２）処理によって、Integrinβ１の総発現量に変化は無いものの（図１−１Ａ、１−１Ｅ（Input））、Integrinβ１が細胞内に局在し（図１−１Ｂ）、細胞膜上のIntegrinβ１は減少した（図１−１Ｃ、図１−１Ｄ、図１−１Ｅの（Pull-down））していた。
【０１５１】
〈考察〉
Integrinβ１の大部分が、分解されずにリサイクリングされることが知られていること、及び上述の結果を考え合わせることによって、CUL3がIntegrinβ１の細胞膜から細胞内への取り込みと細胞内から細胞膜への輸送のリサイクリング経路を制御している事、すなわちCUL3遺伝子の発現を制御する核酸物質が、細胞内輸送を介したIntegrinβ１のリサイクリングの制御剤となることが分かった。
【０１５２】
≪試験例１−２：si CUL3のレスキューによる、Integrinβ１のリサイクリングの回復≫
〈実験手順：Protocol〉
（CUL3のノックダウン）
表１記載のコントロールsiRNA（siCONT＃１）又はsiCUL3＃１を、各々リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）にトランスフェクションし、表２の一次抗体、二次抗体等を用いて、上述のSDS-PAGE（７．５％ゲル使用）、Western Blottingによって、FLAG、及びCUL3の検出を行い、その結果を図１−２Ａに示す。
【０１５３】
尚、CUL3のノックダウンのレスキュー試験として、siCUL3＃１と共に、siCUL3＃１耐性としたFLAG-CUL3遺伝子を、上述のレンチウイルスを用いた発現系によって導入したものについても、同様に蛋白質の検出を行った（図１−２Ａ：右端のレーン）。
「siCUL3＃１耐性FLAG-CUL3」は、siCUL3＃１のノックダウン標的部位（CUL3のORFの mRNA）に対してサイレント変異を導入したCUL3 cDNAを用い、レンチウイルスによって、HUVECに導入した。
コントロールとしては、GAPDH（SDS-PAGEでは、７．５％ゲル使用）を用いた。
【０１５４】
（Integrinβ１の細胞内局在）
上述の通り、CUL3の「ノックダウン」処理又は「ノックダウンとレスキュー」処理を施したHUVECについて、Integrinβ１の細胞内局在を、表２の一次抗体等を用いた免疫染色により、上述の検出機器で確認した結果を図１−２Ｂに示す（バー：20μm）。
尚、図１−２Ｂの右の列の写真は、左の写真内の枠で囲った部分の拡大図である。
【０１５５】
〈結果〉
結果を、図１−２Ａ〜図１−２Ｂに示す。
CUL3の発現量は、ノックダウン処理によって減少するものの、レスキュー処理によって回復するとともに（図１−２Ａ）、Integrinβ１の細胞内局在も回復した（図１−２Ｂ）。
【０１５６】
〈考察〉
上述の結果から、CUL3がIntegrinβ１のリサイクリングに必須であることが示唆される。
また、上記により、siCUL3によるIntegrinβ１の細胞内局在が、単にsiRNA導入によるサイドエフェクトではないことが証明された。
つまり、これらの結果は、CUL3遺伝子の発現を抑制する核酸物質（siCUL3遺伝子）及び、CUL3の発現量を増加させる遺伝子（siCUL3＃１耐性FLAG-CUL3遺伝子）が、各々「細胞内輸送を介したIntegrinβ１の分解又はリサイクリング」の制御剤となり得ることも分かった。
【０１５７】
≪試験例１−３：siCUL3による、Integrinβ１の細胞内局在変化時のIntegrinβ１の局在オルガネラの同定≫
〈実験手順：Protocol〉
（CUL3のノックダウン）
表１記載のコントロールsiRNA（siCONT＃１）又はsiCUL3＃１を、各々リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）にトランスフェクションした。
【０１５８】
尚、細胞内オルガネラの可視化のために、siCUL3のトランスフェクションの２４時間後に、GFP-Rab5 (初期エンドソームマーカー)、GFP-Rab11 (リサイクリングエンドソームマーカー)、GFP-Rab7 (後期エンドソームマーカー),又はLAMP1-GFP (リソソームマーカー)の各々の遺伝子を、上述のレンチウイルスを用いた発現系によってHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）に導入した。
Integrinβ１及びオルガネラマーカーの検出は、レンチウイルスの感染の４８時間後に行った。
【０１５９】
（Integrinβ１の細胞内局在）
上述の通り、CUL3をノックダウンしたHUVECについて、Integrinβ１の細胞内局在を、表２記載の一次抗体、二次抗体等を用いた免疫染色によって確認し、各種オルガネラマーカーとの共局在を上述の検出機器で観察した結果を図１−３Ａ〜Ｄに示す（バー：20μm）。
【０１６０】
尚、図１−３Ａ〜Ｄの左から３列目は、左の２列の写真（「Integrinβ１」と「各種オルガネラマーカー」の検出結果）を「マージ」したものであり、一番右の列は、「マージ」写真内の枠で囲った部分の拡大図である。
【０１６１】
（ピアソン相関係数の算出）
上述の方法でピアソン相関係数を算出することによって、Integrinβ１と各種オルガネラマーカーとの共局在を定量化し、その値を、各マージ画像に記載した。
【０１６２】
〈結果〉
結果を、図１−３Ａ〜図１−３Ｄに示す。
試験例１−３の結果、siCUL3によって、膜蛋白質であるIntegrinβ１は、初期エンドソームマーカー及びリサイクリングエンドソームマーカーとの間のピアソン相関係数値がいずれも、共局在を示す0.5を超えていることから、Integrinβ１が、これらの細胞内構造物に局在していることが確認された（図１−３Ａ下段、Ｂ下段）。
【０１６３】
しかし、後期エンドソームマーカー（図１−３Ｃ下段）やリソソームマーカー（図１−３Ｄ下段）との共局在は示しておらず、Integrinβ１のこれらの細胞内構造物への局在が見られなかった。
【０１６４】
一方、siCONT＃１では、細胞内の各エンドソームやリソソームへのIntegrinβ１の局在は、いずれも見られなかった（図１−３Ａ〜Ｄ上段）。
【０１６５】
〈考察〉
Integrinβ１が、細胞内でリサイクリングを受けることは知られているが、
上述の結果、Integrinβ１が、エンドサイトーシスによって細胞内の初期エンドソームに取り込まれた後、後期エンドソームを経てリソソームへ至るいわゆる「分解経路」では無く、「リサイクリングエンドソーム」を介した「リサイクリング経路」を辿っていることが確認され、更にそのリサイクリングは、E3の構成成分（CUL3）の発現抑制によって、阻害されていることが判明した。
【０１６６】
≪試験例１−４：siCUL3による、Integrinβ１のリサイクリング量低下≫
【０１６７】
〈実験手順：Protocol〉
（CUL3のノックダウン）
上記と同様に表１記載のコントロールsiRNA（siCONT＃１）又はsiCUL3＃１を、各々リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）にトランスフェクションした。
【０１６８】
（Integrinβ１のリサイクリングアッセイ）
上記トランスフェクション細胞を、氷上にて表２記載の「Alexa488標識抗Integrinβ１抗体」で処理し、細胞膜上のIntegrinβ１を標識後、PBSで1回洗った後、通常の培養条件で1時間培養する。次に、細胞膜上の「Alexa488標識抗Integrinβ１抗体」を、表２記載の「抗Alexa488抗体」で1時間処理する事で、蛍光をクエンチする。この時点を0分として、PBSで1回洗った後、通常の培養条件で経時的に培養する。各時間でさらに細胞膜上の「Alexa488標識抗Integrinβ１抗体」を「抗Alexa488抗体」で1時間処理し、蛍光をクエンチする。各時間における、細胞内の蛍光強度を測定する事で、リサイクリングされなかったIntegrinβ１量を測定した（図１−４Ａ）。（*：p＜０．０５）。
【０１６９】
（Integrinβ１の取り込みアッセイ）
上記トランスフェクション細胞を、氷上にて表２記載の「Alexa488標識抗Integrinβ１抗体」で処理し、細胞膜上のIntegrinβ１を標識後、PBSで1回洗った。この時点を0分として、通常の培養条件で10分間培養した。次に、細胞膜上の「Alexa488標識抗Integrinβ１抗体」を、表２記載の「抗Alexa488抗体」で1時間処理する事で、蛍光をクエンチする。その後、細胞内の蛍光強度を測定する事で、10分間で取り込まれたintegrinβ１量を測定した（図１−４Ｂ）。（n.s.：有意差無し）。
【０１７０】
〈結果〉
結果を、図１−４Ａ〜図１−４Ｂに示す。
10分後のIntegrinβ１の細胞内取り込み量には差が無いものの（図１−４Ｂ）、60分後には、siCONT＃１では細胞内Integrinβ１量（リサイクリングされなかったIntegrinβ１量）の低下が進む（約40％減）のに対し、siCUL3＃１では減少は約20％程度に止まり、リサイクリングされた量が減少していた（図１−４Ａ）。
【０１７１】
〈考察〉
上述の結果から、CUL3は、Integrinβ１の細胞内への正常な取り込み経路には影響を与えず、リサイクリング経路のみを特異的に制御していることが示唆された。
【０１７２】
≪試験例１−５：siCUL3による、Integrinα２、及びIntegrinβ１の細胞内局在変化≫
〈実験手順：Protocol〉
（CUL3のノックダウン）
上記と同様に表１記載のコントロールsiRNA（siCONT＃１）又はsiCUL3＃１を、各々リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）にトランスフェクションした。
【０１７３】
（Integrinα２及びIntegrinβ１の細胞内局在）
上記トランスフェクション細胞内の、Integrinα２、Integrinβ１を、表２に記載の抗Integrinα２抗体、及び抗Integrinβ１抗体等を用いた免疫染色により、上述の検出機器で検出した（図１−５Ａ／バー：20μm）。
【０１７４】
尚、図１−５Ａの左から３列目は、左の２列の写真（「Integrinα２」と「Integrinβ１」の検出結果）を「マージ」したものであり、一番右の列は、「マージ」写真内の枠で囲った部分の拡大図である。
【０１７５】
（Integrinα２の細胞内発現量）
表１記載のコントロールsiRNA（siCONT＃１）又はsiCUL3＃１を、各々リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）にトランスフェクションし、表２の一次抗体、二次抗体等を用いて、上述のSDS-PAGE（７．５％ゲル使用）、Western Blottingによって、Integrinα２及びCUL3の検出を行った結果を、図１−５Ｂに示す。
【０１７６】
尚、コントロールとしてGAPDHを用いた。
【０１７７】
〈結果〉
結果を、図１−５Ａ及び図１−５Ｂに示す。
siCUL3＃１処理によって、Integrinα２の総発現量に変化は無かった（図１−５Ｂ）。
【０１７８】
尚、siCUL3＃１処理によって、Integrinβ１の総発現量に変化が無いことは、試験例１−１（図１−１Ａ）で確認されている。
【０１７９】
一方、siCUL3＃１処理によって、Integrinβ１及びIntegrinα２は、細胞内に局在した（図１−５Ａ）。
【０１８０】
〈考察〉
上述の結果から、CUL3を制御する物質（siCUL3）は、Integrinα２やIntegrinβ１等のIntegrin蛋白質の細胞内局在を制御することが判明した。
【０１８１】
≪試験例１−１〜５のまとめ≫
つまり、「ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を制御する物質」の一種である「E3プラットフォーム（CUL3）の遺伝子」又は「この遺伝子を制御する物質（siCUL3）」が、Integrinβ１の細胞膜上へのリサイクリングを制御していることが確認された。
【０１８２】
｛試験例１−６〜７：アダプター（ANKFY1）制御によるIntegrin蛋白質（α２、β１）の細胞内挙動変化の確認｝
【０１８３】
≪試験例１−６：siANKFY1による、Integrinα２、及びIntegrinβ１の細胞内局在≫
〈実験手順：Protocol〉
（ANKFY1のノックダウン）
上記と同様に表１記載のコントロールsiRNA（siCONT＃２）、siANKFY1＃１、又はsiANKFY1＃２を、各々リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）にトランスフェクションした。
【０１８４】
（Integrinα２及びIntegrinβ１の細胞内発現量）
表１記載のコントロールsiRNA（siCONT＃２）、siANKFY1＃１、又はsiANKFY1＃２を、各々リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）にトランスフェクションし、表２の一次抗体、二次抗体等を用いて、上述のSDS-PAGE（７．５％ゲル使用）、Western Blottingによって、Integrinα２及びIntegrinβ１の検出を行った結果を、図１−６Ａに示す。
【０１８５】
尚、コントロールとしてGAPDHを用いた。
【０１８６】
（Integrinα２及びIntegrinβ１の細胞内局在）
上記トランスフェクション細胞内の、Integrinα２、Integrinβ１を、表２に記載の抗Integrinα２抗体、及び抗Integrinβ１抗体等を用い、上述のTriton-PBSによる膜透過を利用した免疫染色方法によって、上述の検出機器で検出した（図１−６Ｂ／バー：20μm）。
【０１８７】
尚、図１−６Ｂの左から３列目は、左の２列の写真（「Integrinα２」と「Integrinβ１」の検出結果）を「マージ」したものであり、一番右の列は、「マージ」写真内の枠で囲った部分の拡大図である。
【０１８８】
（Integrinβ１の細胞膜局在）
上記トランスフェクション細胞膜上のIntegrinβ１を、表２に記載の「Alexa488標識抗Integrinβ１抗体（TS2/16）」を用いた免疫染色により、上述の検出機器で検出した（図１−６Ｃ／バー：20μm）。
【０１８９】
尚、図１−６Ｂの場合と異なり、Triton-PBSによる膜透過を利用していないため、細胞膜上にあるIntegrinβ１のみが検出された。
【０１９０】
各細胞のAlexa488の蛍光強度を測定し、コントロールを100%として定量した（図１−６Ｄ）（***：p＜０．００１）。
【０１９１】
〈結果〉
結果を、図１−６Ａ〜図１−６Ｄに示す。
ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質であるアダプターの一種（ANKFY1）の阻害（＃１〜３）によっても、Integrinα２、Integrinβ１の総発現量には差が無かった（図１−６Ａ）。
一方、siANKFY1＃１、siANKFY1＃２によって、Integrinα２もIntegrinβ１も細胞内に局在した（図１−６Ｂ）。
尚、細胞膜上のIntegrinβ１量は減少した（図１−６Ｃ、Ｄ）。
【０１９２】
〈考察〉
上述の結果から、ANKFY1は、Integrinα２やIntegrinβ１の両方、つまりヘテロダイマーであるIntegrin蛋白質の、「α鎖」と「β鎖」の両方のサブユニットのリサイクリングを制御していることが分かった。
「α鎖」と「β鎖」には上述したように、それぞれ複数の種類が存在するが、「α鎖」同士又は「β鎖」同士は構造上・機能上の類似性が高いことから、Integrin蛋白質のサブユニット全般が、E3によって細胞内挙動を制御されており、「ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を制御する物質」が、Integrin蛋白質のサブユニット全般のリサイクリングの制御剤となり得ることが分かった。
【０１９３】
≪試験例１−７：siANKFY1のレスキューによる、Integrinβ１のリサイクリングの回復≫
〈実験手順：Protocol〉
（ANKFY1のノックダウン）
表１記載のコントロールsiRNA（siCONT＃２）又はsiANKFY1＃３を、各々リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）にトランスフェクションし、表２の一次抗体、二次抗体等を用いて、上述のSDS-PAGE（１０−２０％グラジエントゲル使用）、Western Blottingによって、Integrinβ１、ＨＡ、及びANKFY1の検出を行い、その結果を図１−７Ａに示す。
【０１９４】
尚、ANKFY1の「ノックダウン」の「レスキュー」試験として、siANKFY1と共に、siANKFY1 耐性としたANKFY1-HAを、上述のレンチウイルスを用いた発現系によってHUVECに導入したものについても、同様に蛋白質の検出を行った（図１−７Ａ：右端のレーン）。
【０１９５】
「siANKFY1＃３耐性のANKFY1-HA」は、siANKFY1＃３のノックダウン標的部位（ANKFY1 mRNAの3'末端非翻訳領域）に対応する配列を含まないANKFY1 cDNAを用いた。
【０１９６】
コントロールとしては、GAPDH（SDS-PAGEでは、１５％ゲル使用）を用いた。
【０１９７】
（Integrinβ１とANKFY1-HAの細胞内局在）
上述の通り、ANKFY1の「ノックダウン」処理と「レスキュー」処理を施したHUVECについて、Integrinβ１とANKFY1-HAの細胞内局在を、免疫染色によって確認した結果を図１−７Ｂに示す（バー：20μm）。
【０１９８】
尚、図１−７Ｂの左から３列目は、左の２列の写真（「ANKFY1-HA」と「Integrinβ１」の検出結果）を「マージ」したものであり、一番右の列は、「マージ」写真内の枠で囲った部分の拡大図である。
【０１９９】
〈結果〉
結果を、図１−７Ａ〜図１−７Ｂに示す。
「レスキュー」処理によって、ANKFY1の発現量がsiCONT＃２並に回復したことが確認できた（図１−７Ａ）。
「ノックダウン」処理によって、Integrinβ１が細胞内に局在したが、「レスキュー」処理によって、Integrinβ１の細胞膜へのリサイクリングがsiCONT＃２並に回復した（図１−７Ｂ）。
【０２００】
〈考察〉
上述の結果から、siANKFY1によるIntegrinβ１の細胞内局在、つまりIntegrinβ１のリサイクリング阻害が、単にsiRNA導入によるサイドエフェクトではないことが証明された。
また、これらの結果は、ユビキチンリガーゼシグナリング関連物質（アダプター）であるANKFY1に関して、下記の２点を示している。
【０２０１】
「ANKFY1遺伝子の発現を抑制する核酸物質（siANKFY1）」が、「細胞内輸送を介したIntegrinβ１のリサイクリングの抑制剤」であること
【０２０２】
「ANKFY1の発現量を増加させる物質（siANKFY1＃３耐性ANKFY1-HA遺伝子、即ちANKFY1遺伝子）」が、「細胞内輸送を介したIntegrinβ１のリサイクリングの促進剤」であること
【０２０３】
≪試験例１−６〜７のまとめ≫
つまり、「ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を制御する物質」の一種である「E3アダプター（ANKFY1）の遺伝子」、又は「この遺伝子を制御する物質（siANKFY1）」が、Integrinβ１の細胞膜上へのリサイクリングを制御していることが確認された。
【０２０４】
｛試験例１−８：その他のBTB蛋白質遺伝子制御物質の利用｝
各種BTB蛋白質遺伝子の制御物質の一種であるBTB蛋白質siRNAを用いた「本発明の制御剤」の、効果を確認した。
〈実験手順：Protocol〉
（各種BTB蛋白質のノックダウン）
コントロールsiRNA（siCONT＃１）又は175種類のBTB蛋白質を標的とするsiRNA（siRNA Libraries（Thermo Fisher Scientific社製）を、各々リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）にトランスフェクションした。
【０２０５】
（Integrinβ１の細胞内局在）
上記トランスフェクション細胞内のIntegrinβ１を、表２に記載の抗Integrinβ１抗体等を用いた免疫染色により、上述の検出機器で検出した主な結果を図１−８に示す（バー： 20μm）。
【０２０６】
〈結果〉
結果を、図１−８に示す。
図１−８から分かるように、試験した175種類のうち、６種のBTB蛋白質（BTBD7、CCIN、KCTD2、KLHL18、KLHL34、ZBTB6）についてのsiRNAが、siCUL3やsiANKFY1＃２と同様に、Integrinβ１の細胞内局在を示した。
一方、同じBTB蛋白質であっても、例えば、HUVECにおいて、Notchシグナルを制御することが知られているE3アダプター「BAZF」や、VEGFR２（VEGFレセプター２）シグナルを制御することが知られているE3アダプター「SPOP」の発現抑制等によっては、integrin β１の細胞内における局在は見られなかった（比較対照例）。
【０２０７】
〈考察〉
上述の結果から、「ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を制御する物質」の一種である「E3アダプター（BTB蛋白質）の遺伝子を制御する物質（siBTBD7、 siCCIN、siKCTD2、siKLHL18、siKLHL34、siZBTB6）」もまた、Integrinβ１の細胞膜上へのリサイクリングを制御していることが判明した。
【０２０８】
｛試験例１−９〜１０：KCTD18制御による、膜蛋白質（Integrinβ１）の細胞内挙動変化の確認｝
≪試験例１−９：siKCTD18によるIntegrinβ１の細胞内局在≫
〈実験手順：Protocol〉
（KCTD18のノックダウン）
表１記載のコントロールsiRNA（siCONT＃１）、siCUL3＃１、又はsiKCTD18（＃１〜＃３）を、各々リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）にトランスフェクションした。
【０２０９】
（Integrinβ１及びSNX9の細胞内発現量）
上記トランスフェクション細胞について、表２の一次抗体、二次抗体等を用いて、上述のSDS-PAGE（７．５％ゲル使用）、Western Blottingによって、Integrinβ１及びSNX9の検出を行った結果を、図１−９Ａに示す。
尚、コントロールとしてGAPDH（SDS-PAGEでは、１５％ゲル使用）を用いた。
【０２１０】
（Integrinβ１の細胞内局在）
上記トランスフェクション細胞内のIntegrinβ１を、表２に記載の抗Integrinβ１抗体等を用いて検出した。結果を図１−９Ｂに示す。
【０２１１】
〈結果〉
KCTD18がノックダウンされた細胞では、いずれもIntegrinβ１は、細胞内に局在化されていることが判明した（図１−９Ｂ）。
【０２１２】
〈考察〉
上記により、KCTD18の遺伝子制御物質（siKCTD18）が、細胞内輸送を介したIntegrinβ１のリサイクリングを制御していることが判明した。
【０２１３】
≪試験例１−１０：siKCTD18による基底膜上での細胞伸展の制御≫
〈実験手順：Protocol〉
（KCTD18のノックダウン）
上述の様に表１記載のsiCONT＃１、又はsiKCTD18（＃１〜＃３）をトランスフェクションした細胞を、細胞外マトリックスタンパク質を含む基底膜（BD Matrigel登録商標）の上に播種した。
細胞の基底膜への接着１時間後、細胞を4 % PFA-PBSで固定し、細胞の伸展の状況を、細胞膜蛋白質であるIntegrinβ１を指標に観察した。
Integrinβ１は、表２記載の抗Integrinβ１抗体を用いた免疫染色により、上述の検出機器で検出した。結果を図１−１０に示す。
【０２１４】
〈結果〉
siKCTD18処理によって、HUVECの基底膜上での伸展（Integrinβ１のECMへの接着性）が阻害されていた（図１−１０）。
【０２１５】
〈考察〉
上記により、KCTD18の遺伝子阻害物質（siKCTD18）が、Integrinβ１のリサイクリングを阻害した結果、Integrinβ１本来の機能（ECMへの接着性）が低下し、基底膜上での細胞伸展をも阻害していることが分かった。
【０２１６】
≪試験例１−９〜１０のまとめ≫
この様に、KCTD18の制御が、CUL3の制御と同様の表現型を示すことに加え、KCTD18がBTB蛋白質であること、及び後述する試験例３−２（図３−２）で、KCTD18が現にCUL3と相互作用することが確認されていること等と考え合わせると、KCTD18が、E3のアダプターであることが判明した。
つまり、「ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を制御する物質」の一種である「E3アダプター（KCTD18）の遺伝子を制御する物質（siKCTD18）」が、Integrinβ１の細胞膜上へのリサイクリングを制御していることが確認された。
【０２１７】
尚、siKCTD18（＃１〜＃３）によるリサイクリング阻害の結果、図１−１０の基底膜への細胞伸展の阻害に続いて、血管新生が阻害されていることも確認されている（図示せず。）。
【０２１８】
｛試験例１−１１〜１２：SNX9制御による、膜蛋白質（Integrinβ１）の細胞内挙動変化の確認｝
≪試験例１−１１：siSNX9によるIntegrinβ１の細胞内局在≫
〈実験手順：Protocol〉
（SNX9のノックダウン）
表１記載のコントロールsiRNA（siCONT＃１）又はsiSNX9（＃１〜＃３）を、各々リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）にトランスフェクションした。
【０２１９】
（Integrinβ１及びSNX9の細胞内発現量）
Integrinβ１、SNX9を、上記のSDS-PAGE（７．５％ゲル使用）、及び表２に記載の抗Integrinβ１抗体等を用いたWestern Blottingによって検出した。結果を図１−１１Ａに示す。
尚、コントロールとしてGAPDH（SDS-PAGEは、１５％ゲルを使用）を用いた。
【０２２０】
（Integrinβ１の細胞内局在）
また、上記と同様のトランスフェクションを行い、トランスフェクション細胞内のIntegrinβ１を、表２記載の抗体等を用いて検出した。結果を図１−１１Ｂに示す。
【０２２１】
〈結果〉
図１−１１Ａ及び図１−１１Ｂから分かる通り、SNX9がノックダウンされた細胞では、いずれもIntegrinβ１の総発現量には特段の変化は無いものの、Integrinβ１が細胞内に局在化されていることが判明した。
【０２２２】
〈考察〉
上記により、SNX9の遺伝子阻害物質（siSNX９）もまた、Integrinβ１のリサイクリングを阻害していることが判明した。
【０２２３】
≪試験例１−１２：siSNX9による、基底膜上での細胞伸展の制御≫
〈実験手順：Protocol〉
（SNX9のノックダウン）
上述の様に、表１記載のコントロールsiRNA（siCONT＃１）、又はsiSNX9（＃１〜＃３）を、各々リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）にトランスフェクションし、細胞外マトリックスタンパク質を含む基底膜（BD Matrigel登録商標）の上に播種した。
【０２２４】
（細胞伸展の確認）
細胞の基底膜への接着１時間後の伸展の状況を、血管の細胞内骨格を形成するF-actinを指標に観察した。
細胞伸展の有無は、細胞を播種した基底膜に、F-actinに特異的に結合するRhodamine-phalloidin (Thermo Fisher Scientific社製)の1000倍希釈液を添加して染色した（血管内に存在する）F-actinを、上述の検出機器で検出することによって確認した。結果を図１−１２に示す。
【０２２５】
〈結果〉
SNX9遺伝子の発現を阻害することによって、HUVECの基底膜上での伸展（ECMへの接着性）が阻害されていた（図１−１２）。
【０２２６】
〈考察〉
上記により、SNX9遺伝子阻害物質が、Integrinβ１のリサイクリングを阻害した結果、Integrinβ１本来の機能（ECMへの接着性）が低下し、基底膜上での細胞伸展を阻害していることが分かった。
【０２２７】
≪試験例１−１１〜１２のまとめ≫
SNX9は、後述する試験例３−３（図３−３）で、KCTD18と相互作用することが確認されており、またSNX9の制御が、CUL3やKCTD18の制御（試験例１−９〜１０）と同様の表現型（試験例１−１１〜１２）を示すこと等から、SNX9は、KCTD18をアダプターとするE3のUb化基質である蓋然性が極めて高いことが確認された。
つまり、「ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を制御する物質」の一種である「Ub化基質（SNX9）の遺伝子を制御する物質（siSNX9）」が、Integrinβ１の細胞膜上へのリサイクリングを制御していることが確認された。
【０２２８】
尚、siSNX9（＃１〜＃３）によるリサイクリング阻害の結果、図１−１２の基底膜への細胞伸展の阻害に続いて、血管新生が阻害されていることも確認されている（図示せず。）。
【０２２９】
｛試験例１−１３：その他のSNX蛋白質の制御による、Integrinβ１の細胞内挙動変化の確認｝
SNX9以外の各種SNX蛋白質遺伝子の、制御物質の一種であるsiSNXを用いた本発明の各種制御剤の、効果を確認した。
【０２３０】
〈実験手順：Protocol〉
（各種SNX蛋白質のノックダウン）
表１記載のコントロールsiRNA（siCONT＃１）又は各種SNX蛋白質のsiRNA（siSNX1, siSNX5, siSNX6, siSNX10, siSNX11, siSNX16, siSNX17, siSNX20, siSNX33）を、各々リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）にトランスフェクションした。
【０２３１】
（各SNX蛋白質の細胞内局在）
上記トランスフェクション細胞内のIntegrinβ１を、表２に記載の抗Integrinβ１抗体等を用いて検出した。結果を図１−１３に示す。
【０２３２】
〈結果〉
試験した9種類のSNX蛋白質のうち、SNX11、SNX17でも、SNX9と同様にIntegrinβ１の細胞内局在が見られた（図１−１３）。
【０２３３】
〈考察〉
上記の結果から、SNX11、SNX17も、SNX9と同様に何らかのBTB蛋白質をアダプターとするE3の、基質であると考えられる。
但し、SNX9が、E3アダプターであるKCTD18と相互作用する（試験例３−３、図３−３）のに対し、SNX11、SNX17は、KCTD18とは相互作用しないことが判明した(図示せず）。
従って、SNX11、SNX17のアダプターとしては、上述の試験例１−８において、175種類のBTB蛋白質のうち、Integrinβ１の細胞内局在に関与していることが判明した他の６種類のBTB蛋白質が、有力な候補として考えられる。
というのも、上述の試験例１−８においてIntegrinβ１の細胞内局在の確認のために用いた175種類のBTB蛋白質は、現在遺伝子レベルで知られている183種類のBTB蛋白質のうち、基質が既に知られているもの等を除く殆どを網羅していることから、その中で、「siRNA処理によって、siCUL3、siSNX11、siSNX 17等と同様のIntegrinβ１の細胞内局在を示すもの」として抽出された、試験例１−８の６種類のBTB蛋白質のいずれかが、SNX11、SNX17を基質とするE3アダプターであると考えるのが、妥当だからである。
つまり、「ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を制御する物質」の一種である「E3アダプター（SNX11, SNX17）の遺伝子を制御する物質（siSNX11, siSNX17）」が、Integrinβ１の細胞膜上へのリサイクリングを制御していることが確認された。
【０２３４】
｛試験例１−１４：CUL3又はANKFY1の発現制御による血管新生阻害の確認｝
上記の方法に準じてsiCUL3＃１やsiANKFY1＃１処理を行い、各種の確認を行った。
【０２３５】
その結果、これらの処理によっても、Integrinα２及びIntegrinβ１の総発現量には変化が無いことが既出の試験例で確認されている一方で（図１−１Ａ、１−５Ｂ、１−６Ａ等）、これらの細胞内への局在が見られ（図１−１Ｂ、１−２Ｂ、１−６Ｂ等）、その結果、細胞の基底膜での伸展が阻害されて細胞面積の縮小していること（図示せず）、更には血管新生が阻害されていることが判明した（図１−１４）。
【０２３６】
尚、上記において、細胞内の局在はIntegrinα２やIntegrinβ１の免疫染色により、また細胞の基底膜での伸展は、細胞接着斑（Focal adhesion）マーカーである「パキシリン（paxillin）」及び「ビンキュリン（vinculin）」の免疫染色によって、血管新生阻害は、蛍光標識ファロイジンによるF-actinの染色により確認した。
【０２３７】
つまり、「CUL3やE3アダプターであるANKFY1（ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質）やその遺伝子の制御剤（siRNA等）」によって、Integrinα２やIntegrinβ１等の膜蛋白質のリサイクリングが制御を受ける結果、Integrin蛋白質本来の機能が失われ、血管新生が制御されていることが分かった。
また、リサイクリングの制御剤が、血管新生の制御にも役立つことが判明した。
【０２３８】
［試験例２：（ii）血管内皮細胞発現細胞間接着膜蛋白質の制御］
（ii）の膜蛋白質（VE-Cadherin蛋白質）の制御が、各種の「ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を制御する物質」によって可能となることを、以下の試験例２−１によって示す。
【０２３９】
「ユビキチンリガーゼ（E3）シグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を制御する物質」としては、各種BTB蛋白質に対するsiRNA遺伝子（E3アダプター阻害剤）を用いた。
【０２４０】
｛試験例２−１：各種BTB蛋白質制御による、膜蛋白質（ii）（VE-Cadherin蛋白質）の細胞内挙動変化の確認｝
各種BTB蛋白質遺伝子の制御物質の一種であるBTB蛋白質siRNAを用いた「本発明の制御剤」の、効果を確認した。
【０２４１】
〈実験手順：Protocol〉
（各種BTB蛋白質のノックダウン）
表１記載の、コントロールsiRNA（siCONT＃１）、siCUL3（＃１）、又は８種のBTB蛋白質（ABTB1、BACH1、KBTBD11、KLHL12、KLHL34、KCTD18、RHOBTB3、ZBTB42）を標的とするsiRNA（siRNA Libraries（Thermo Fisher Scientific社製）を、各々リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）にトランスフェクションした。
尚、KCTD18のsiRNAとしては、表１記載のsiKCTD18＃４を用いた。
【０２４２】
（VE-Cadherinの細胞膜における局在の消失）
上記トランスフェクション細胞内のVE-Cadherinを、表２に記載の抗VE-Cadherin抗体等を用いた免疫染色により、ImageXpress Micro（Molecular Device社製）で検出した結果を図２−１Ａ及びＢに示す（バー： 20μm）。
【０２４３】
〈結果〉
結果を、図２−１Ａ及び図２−１Ｂに示す。
図２−１Ａ及び図２−１Ｂから分かるように、これら８種のBTB蛋白質（ABTB1、BACH1、KBTBD11、KLHL12、KLHL34、KCTD18、RHOBTB3、ZBTB42）についてのsiRNAが、siCUL3と同様に、VE-Cadherinの細胞膜における局在を消失させた。
【０２４４】
これら８種のBTB蛋白質のうち、後述する試験例３−２で示したものについては、CUL3との相互作用が確認されており（図３−２）、更に上記結果の通り、これらのsiRNAがsiCUL3と同様の表現型を示すことから、これらのBTB蛋白質は、E3のアダプターである蓋然性が高いことが判明した。
つまり、「ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を制御する物質」の一種である、「E3プラットフォーム（CUL3）やE3アダプター（上記８種のBTB蛋白質）の遺伝子を制御する物質（siCUL3、siABTB1、siBACH1、siKBTBD11、siKLHL12、siKLHL34、siKCTD18、siRHOBTB3、siZBTB42）」によって、VE-Cadherin蛋白質の、細胞膜上へのリサイクリングが制御されることが分かった。
【０２４５】
［試験例３：ユビキチンリガーゼ関連蛋白質相互間の相互作用の確認］
【０２４６】
｛試験例３−１：CUL3 とANKFY1の相互作用の確認｝
【０２４７】
〈実験手順：Protocol〉
（トランスフェクション）
ANKFY1とCUL3が、実際に細胞内で相互作用していることを確認するため、遺伝子導入効率が良く扱いやすい、ヒト胎児由来腎臓上皮細胞HEK293T細胞（DMEM培地、 Wako株式会社製）に、リポフェクション試薬「GeneJuice」(Millipore社製)を用いて、図３−１に示したような組み合わせで、FLAG標識CUL3、HA標識ANKFY1（ANKFY1-HA又はHA-ANKFY1）又はMyc標識Nedd8をトランスフェクションし、強制発現させた。
【０２４８】
（細胞溶解液の回収）
上記の培養細胞を、Buffer （1% NP40(Nonidet p-40)、150 mM NaCl、25 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、5 % glycerol、pH 7.4）にて処理し、細胞溶解液を回収した。
【０２４９】
（Input試料）
10000 gで遠心分離し、上清を回収後、一部を「Input」試料とした。
【０２５０】
（IP（HA）試料）
「Input」試料を回収した後の残った上清に、表２記載の抗HA抗体（ラビット抗HA pAb）を添加し、HA標識ANKFY1を免疫沈降させ、「IP（HA）」試料とした。
【０２５１】
（蛋白質の分離・検出）
「Input」試料及び「IP（HA）」試料について、表２の一次抗体、二次抗体等を用いて、上述のSDS-PAGE（１０−２０％グラジエントゲル使用）、Western Blottingによって、蛋白質の検出を行った結果を、図３−１に示す。
「＊」で示されているものが、Nedd8化CUL3である。
【０２５２】
尚、「＊」と共に「抗CUL3抗体」で検出された真下のバンドは、Nedd8化CUL3（単体）と共に、Nedd8化CUL3とのヘテロダイマーその他の多量体として共に免疫沈降されたフリーのCUL3が、SDS-PAGE処理等によって分離したものや、Nedd8化CUL3の一部のNedd8が脱落したもの等であると思われる。
【０２５３】
また、図中の「heavy chain」、「light chain」とは、Western Blottingの際に用いた変性剤等によって立体構造が破壊された、上記の抗HA抗体（ラビット抗HA pAb）のものと考えられる。
「ラビット抗HA pAb」の「heavy chain」や「light chain」が、Myc標識Nedd8検出用ゲル上で同時に検出されたのは、マウスIgGとラビットIgGの配列が非常に似ていることによって、表２記載のMyc検出用二次抗体（ヤギ抗マウスIgG mAb）が「ラビット抗HA pAb」（「heavy chain」、「light chain」）に反応してしまったためであると思われる。
【０２５４】
更に、免疫沈降前の「Input」試料の検出結果で、Myc-Nedd8無添加の左側の３レーンでも、Nedd8化CUL3（＊印）が検出されているのは、内在性のNedd8によるものと考えられる。
尚、内因性Nedd8によるCUL3の割合が、フリーのCUL3に対して少ないことからも分かる通り、細胞内において、Nedd8化と脱Nedd8のバランスは既知の酵素群によって厳密に制限され、常にNedd8化CUL3の量は低く維持されていることが知られている。
【０２５５】
〈結果〉
図が示す通り、「IP（HA）」試料においては、FLAG標識CUL3、HA標識ANKFY1に加えて、Nedd8を強制発現させた場合に限り、CUL3が明瞭に検出された（図３−１、「IP（HA）」の右端の２レーン）。
【０２５６】
尚、Nedd8阻害剤（MLN-4924、Boston Biochem社製）を添加して同様の実験を行った場合には、Myc標識Nedd8を強制発現させても、CUL3が検出されなかった（図示せず）。
【０２５７】
〈考察〉
上記により、ANKFY1はCUL3と相互作用することが確認された。
つまり、ANKFY1が、基質をUb化するためのアダプター、つまり「ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質」の一種であることが確認された。
【０２５８】
一方、ANKFY1とCUL3の相互作用には、Nedd8のようなE3用補助因子が必須であることも、同時に判明した。
【０２５９】
尚、HA標識をN末端に付加したANKFY1-HAも、Ｃ末端に付加したHA-ANKFY1も、共にCUL3と相互することが分かったが、細胞内での発現効率は、ANKFY1-HAの方が高かったため、相互作用の確認試薬としては、ANKFY1-HAが適していることが分かった。
【０２６０】
｛試験例３−２：CUL3とその他のBTB蛋白質との相互作用の確認｝
【０２６１】
〈実験手順：Protocol〉
上述のAlphaScreenTMシステムによって、CUL3と各種BTB蛋白質との相互作用を確認した。
【０２６２】
〈結果〉
各々の発光シグナルの値が、相互作用の一つの判断基準であるバックグラウンドの値の10倍をはるかに超えていることから、CUL3と各種BTB蛋白質との間に相互作用があることが確認された。結果を図３―２に示す。
【０２６３】
尚、図３−２に示した以外のBTB蛋白質についても、試験例３−１に示したANKFY1の場合と同様、Nedd8等の因子を更に追加することによって、CUL3との相互作用が確認できると考えられる。
【０２６４】
〈考察〉
図３−２からも分かる通り、これらのBTB蛋白質は、ユビキチンリガーゼのアダプター、つまり「ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質」の一種である蓋然性が極めて高いことが分かった。
【０２６５】
｛試験例３−３：KCTD18（アダプター）とSNX9（基質）の相互作用の確認｝
〈実験手順：Protocol〉
上述のAlphaScreenTMシステムによって、SNX9とKCTD18との相互作用を確認した。
【０２６６】
〈結果〉
発光シグナルの値が、相互作用の一つの判断基準であるバックグラウンドの値の10倍をはるかに超えていることから、KCTD18はSNX9との相互作用があることが確認された。結果を図３−３に示す。
【０２６７】
〈考察〉
図３−３からも分かる通り、KCTD18は、SNX9をUb化基質とするE3のアダプター、つまり「ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質」である蓋然性が極めて高いことが分かった。
【０２６８】
［まとめ］
試験例１〜３の結果を総合することによって、「ユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を制御する物質」が、「細胞内輸送を介した、下記（ｉ）や（ii）を初めとする膜蛋白質の分解又はリサイクリングの制御剤」となり得ることが判明した。
（ｉ）血管内皮細胞発現接着系膜蛋白質
（ii）血管内皮細胞発現細胞間接着膜蛋白質
【０２６９】
また、これらの結果から、本発明の方法によって、「ユビキチンリガーゼシステムがその細胞内輸送を介した分解又はリサイクリングのいずれに関与しているかによって、膜蛋白質を分類すること」や「細胞内輸送を介した膜蛋白質の分解又はリサイクリングの制御剤をスクリーニングすること」ができることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０２７０】
上記試験例等の結果から分かる通り、本発明の「細胞内輸送を介した膜蛋白質の分解又はリサイクリングの制御剤」は、各種の実験・研究試薬として用いうるほか、ユビキチンリガーゼシグナリングのコントロールによって、膜蛋白質の細胞内挙動を制御し、当該膜蛋白質本来の機能の制御を通じて、各種の疾患の予防又は治療にも利用可能なものである。
【図１−１Ａ】
2019112320.tif 000004
【図１−１Ｂ】
2019112320.tif 000005
【図１−１Ｃ】
2019112320.tif 000006
【図１−１Ｄ】
2019112320.tif 000007
【図１−１Ｅ】
2019112320.tif 000008
【図１−２Ａ】
2019112320.tif 000009
【図１−２Ｂ】
2019112320.tif 000010
【図１−３Ａ】
2019112320.tif 000011
【図１−３Ｂ】
2019112320.tif 000012
【図１−３Ｃ】
2019112320.tif 000013
【図１−３Ｄ】
2019112320.tif 000014
【図１−４Ａ】
2019112320.tif 000015
【図１−４Ｂ】
2019112320.tif 000016
【図１−５Ａ】
2019112320.tif 000017
【図１−５Ｂ】
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【図１−６Ａ】
2019112320.tif 000019
【図１−６Ｂ】
2019112320.tif 000020
【図１−６Ｃ】
2019112320.tif 000021
【図１−６Ｄ】
2019112320.tif 000022
【図１−７Ａ】
2019112320.tif 000023
【図１−７Ｂ】
2019112320.tif 000024
【図１−８】
2019112320.tif 000025
【図１−９Ａ】
2019112320.tif 000026
【図１−９Ｂ】
2019112320.tif 000027
【図１−１０】
2019112320.tif 000028
【図１−１１Ａ】
2019112320.tif 000029
【図１−１１Ｂ】
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【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図１−１４】
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【図２−１Ａ】
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【図２−１Ｂ】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【配列表】
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