(57)【要約】結合組織成長因子活性を回復するための、グルココルチコイド誘導性キナーゼの調節。線維増殖性障害の検出および処置に有用な方法および化合物も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＧＫ１、ＳＧＫ２、ＳＧＫ３を発現する細胞を、グルココルチコイド誘導性キナーゼ
を調節する物質と接触させることを含む、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）活性および発現
を変更するための方法。
【請求項２】
ＣＴＧＦの上方制御または下方制御により引き起こされる線維増殖性障害の処置のため
の薬物を調製するための、請求項１に記載の方法の使用。
【請求項３】
疾患が、線維増殖性障害：放射線により引き起こされる疾患、腫瘍、血管新生、肉芽腫
性疾患、臓器および移植片の拒絶反応、紅斑性狼瘡、アテローム性動脈硬化、低酸素症、
酸化ストレス、心筋の梗塞および虚血、心臓の肥大および線維症、糸球体腎炎および糸球
体硬化症、腎線維症、真性糖尿病、線維性膵炎、肝硬変、脂肪性肝炎および胆管線維症、
線維化および炎症性の腸疾患、消化性潰瘍、腹腔内癒着、腹膜透析における腹膜線維症、
肺線維症、線維性肺胞炎、肺サルコイドーシスおよび／または喘息、卵巣機能不全、子宮
筋腫、関節炎、筋肉の痛み／筋肉痛および筋膜炎、硬皮症、ケロイド、歯肉肥大；角膜、
眼液、および網膜を含む様々な臓器における瘢痕または結合組織の形成；緑内障、脳梗塞
を含む脳の病変、アルツハイマー病、傷の治癒、抜歯後の治癒、骨の治癒および成長、骨
折の修復の群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
組織サンプルおよび組織標本におけるＳＧＫ１、ＳＧＫ２またはＳＧＫ３の発現の上方
制御を測定することによる、線維増殖性障害の進行、退行または発症を判断するための方
法。
【請求項５】
ＳＧＫ１が選択された一塩基多型変異を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
放射線により引き起こされる疾患、腫瘍、血管新生、肉芽腫性疾患、臓器および移植片
の拒絶反応、紅斑性狼瘡、アテローム性動脈硬化、低酸素症、酸化ストレス、心筋の梗塞
および虚血、心臓の肥大および線維症、糸球体腎炎および糸球体硬化症、腎線維症、真性
糖尿病、線維性膵炎、肝硬変、脂肪性肝炎および胆管線維症、線維化および炎症性の腸疾
患、消化性潰瘍、腹腔内癒着、腹膜透析における腹膜線維症、肺線維症、線維性肺胞炎、
肺サルコイドーシスおよび／または喘息、卵巣機能不全、子宮筋腫、関節炎、筋肉の痛み
／筋肉痛および筋膜炎、硬皮症、ケロイド、歯肉肥大；角膜、眼液、および網膜を含む様
々な臓器における瘢痕または結合組織の形成；緑内障、脳梗塞を含む脳の病変、アルツハ
イマー病、傷の治癒、抜歯後の治癒、骨の治癒および成長、骨折の修復の群から選択され
る疾患を診断するための、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
結合組織成長因子の調節不全により引き起こされる障害の処置のための薬物を製造する
ための、一般式ＩまたはＩＩを有する列挙された化合物から選択されるＳＧＫ１阻害剤の
使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、血清・グルココルチコイド誘導性キナーゼＳＧＫ１を発現する細胞を、前記
グルココルチコイド誘導性キナーゼを調節する物質と接触させることを含む、結合組織増
殖因子（ＣＴＧＦ）活性を変更する方法に関する。さらに、本発明は線維性疾患の診断お
よび処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
線維症は、正常な傷の治癒プロセスのバランスが崩れ、結果として、正常な組織機能を
妨げ広範囲の線維性障害において臓器不全をもたらすことがある、瘢痕組織の持続的な形
成をもたらす病的状態である。
【０００３】
線維症では、線維芽細胞により発現されるＣＴＧＦが重要な役割を果たし、したがって
ＣＴＧＦは抗線維化療法の興味を引く標的であることが知られている。ますます多くの臨
床上の証拠が、線維性障害におけるＣＴＧＦの役割を支持している。多くの発表された研
究では、肺、皮膚、腎臓、肝臓、心臓、および眼を含む主要な臓器および組織の線維増殖
性障害を有する患者から得られたサンプルに、ＣＴＧＦが異常に高い量で存在することが
示されている（Ｉｈｎ、２００２年）。ＣＴＧＦの産生の変更は、本明細書においてこれ
以降「線維増殖性障害」と呼ぶ、放射線治療、腫瘍、血管新生、肉芽腫性疾患、臓器およ
び移植片の拒絶反応、紅斑性狼瘡、アテローム性動脈硬化、低酸素症、酸化ストレス、心
筋の梗塞および虚血、心臓の肥大および線維症、糸球体腎炎および糸球体硬化症、腎線維
症、真性糖尿病、線維性膵炎、肝硬変、脂肪性肝炎および胆管線維症、線維化および炎症
性の腸疾患、消化性潰瘍、腹腔内癒着、腹膜透析における腹膜線維症、肺線維症、線維性
肺胞炎、肺サルコイドーシスおよび／または喘息、卵巣機能不全、子宮筋腫、関節炎、筋
肉の痛み／筋肉痛および筋膜炎、硬皮症、ケロイド、歯肉肥大；角膜、眼液、および網膜
を含む様々な臓器における瘢痕または結合組織の形成；緑内障、脳梗塞を含む脳の病変、
アルツハイマー病、傷の治癒、抜歯後の治癒、骨の治癒および成長、骨折の修復などの多
くの疾患で観察されている。
【０００４】
ＣＴＧＦは、傷の瘢痕プロセスにおけるＣＴＧＦの誘導および後に続く事象の誘導をも
たらす一連の事象を引き起こす上での中心的な役割を有するため、抗線維化療法の標的と
して提唱されている。しかし、このような取組みは、未だ研究および開発の初期段階にあ
り、結果は不確かである。本出願は、ＣＴＧＦ活性の妨害をもたらす別のアプローチを提
供し、はるかにより早い段階でＣＴＧＦの調節を妨害し、したがってＣＴＧＦ発現を防止
する。その結果、本発明は、広範な副作用なしに重大な臨床上の利益をもたらす利点のあ
る治療法を提供することが期待される。
【０００５】
ＳＧＫ１は、初めは、グルココルチコイド誘導性遺伝子としてクローニングされ、鉱質
コルチコイドにより強力に上方制御されることが引き続き示された。ＳＧＫ１は、インス
リン様増殖因子ＩＧＦ１、インスリンにより、ならびにホスホイノシトール−３−キナー
ゼ（ＰＩ３キナーゼ）およびホスホイノシトール依存性キナーゼＰＤＫ１を伴うシグナル
カスケードを介した酸化ストレスにより調節されることが示されている（Ｋｏｂａｙａｓ
ｈｉ＆Ｃｏｈｅｎ、１９９９年、Ｐａｒｋら、１９９９年、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、１９
９９年）。ＰＤＫ１によるＳＧＫ１の活性化は、セリン４２２のリン酸化を伴う。セリン
４２２のアスパラギン酸への変異（S422DＳＧＫ１）はキナーゼの継続的な活性化をもた
らすことが、さらに示されている（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、１９９９年）。
【０００６】
グルココルチコイド誘導性キナーゼＳＧＫ１活性を測定するために、様々なアッセイ系
が使用可能である。シンチレーション近接アッセイ（Ｓｏｒｇら、Ｊ．ｏｆ．Ｂｉｏｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、２００２年、７巻、１１〜１９頁）およびフラッ
シュプレートアッセイでは、基質としてのタンパク質またはペプチドのγＡＴＰによる放
射性リン酸化を測定する。阻害性の化合物の存在下で、放射性シグナルがないこと、また
はその減少が検出可能である。さらに、均一な時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＨＴＲ
−ＦＲＥＴ）技術および蛍光偏光（ＦＰ）技術が、アッセイ方法として有用である（Ｓｉ
ｌｌｓら、Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、２００２年、１
９１〜２１４頁）。他の非放射性のＥＬＩＳＡベースのアッセイ方法は、特異的なリン−
抗体（ＡＢ）を使用する。リン−ＡＢは、リン酸化した基質にのみ結合する。この結合は
、ペルオキシダーゼが結合した抗ヒツジ二次抗体を用いて化学発光により検出することが
できる（Ｒｏｓｓら、２００２年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、直接発表、原稿ＢＪ２００２
０７８６）。
【０００７】
以前の結果では、ＳＧＫ１は腎上皮のＮａ+チャンネルの強力な刺激物質であることが
示された（Ｄｅ  ｌａ  Ｒｏｓａら、１９９９年、Ｂｏｅｈｍｅｒら、２０００年、Ｃｈ
ｅｎら、１９９９年、Ｎａｒａｙ−Ｆｅｊｅｓ−Ｔｏｔｈら、１９９９年、Ｌａｎｇら、
２０００年、Ｓｈｉｇａｅｖら、２０００年、Ｗａｇｎｅｒら、２００１年）。
【０００８】
ＳＧＫ１に関する別の発見は、（ＣＣ／ＣＴ）のヌクレオチドの組合せを有するエキソ
ン８における一塩基多型（ＳＮＰ）、およびイントロン６（ＣＣ）におけるさらなる多型
が、血圧の上昇に関連するということであり（Ｂｕｓｊａｈｎら、２００２年）、これよ
りＳＧＫ１は血圧調節および高血圧に重要であり得ると結論が下された。
【０００９】
ＳＧＫ１の活性の上昇が、腎臓のナトリウムの再吸収の増加により高血圧をもたらす腎
上皮のＮａ+チャンネルの活性と相関するので（Ｌｉｆｔｏｎ、１９９６年；Ｓｔａｅｓ
ｓｅｎら、２００３年；Ｗａｒｎｏｃｋ、２００１年）、ＳＧＫ１の対立遺伝子の変異の
組合せに依存して、血圧を上昇させる腎臓のＮａ+再吸収の増加が生じることがあること
は決定的であった（Ｂｕｓｊａｈｎら、２００２年）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明の概要
線維芽細胞における結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）の発現は、広範囲の疾患に関連する
線維症を引き起こす中心である。本発明は、意外にも、ＣＴＧＦの発現の増加が、血清・
グルココルチコイド誘導性キナーゼＳＧＫ１の存在および上方制御に強力に相関すること
を説明するものである。
【００１１】
より詳しくは、ＳＧＫ１には２つの新規の重要な機能（ｉ）鉱質コルチコイドの塩欲求
に対するシグナリング、および（ｉｉ）鉱質コルチコイドが誘導するＣＴＧＦおよび心線
維症の形成の媒介、があることを、本発明は開示している。
【００１２】
データにより、一般に線維性疾患でＳＧＫ１キナーゼが決定的な役割を果たす心線維症
の例が説明される。ＳＧＫ１の過剰転写が、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、クローン病、肺
線維症、肝硬変、および線維性膵炎に観察されている。心線維症における過剰のＳＧＫ１
転写の機能上の重要性は探究されており、当技術分野の経験者であれば、示された所見を
この研究を通じて未だに探究されていない他の線維性疾患に容易に拡張することができる
が、ＳＧＫ１は前記の疾患の病態生理学に積極的に関係することを強力に提唱することが
できる。
【００１３】
ＳＧＫ１ノックアウトマウス由来の線維芽細胞におけるＣＴＧＦの生成は、線維症を引
き起こすことでよく知られている物質であるデオキシコルチコステロンが誘導することが
できない。一方、このホルモンは、ＳＧＫ１の機能を完全に有する正常マウス由来の線維
芽細胞でＣＴＧＦの著しい発現を誘導する。したがって、ＳＧＫ１は、ＣＴＧＦが主導す
る線維症の強力な調節物質である。
【００１４】
線維芽細胞で発現されるＣＴＧＦは、線維症を引き起こす最も重要なメディエータであ
るので、ＳＧＫ１を阻害するとＣＴＧＦの発現が妨害され、線維症が抑制される。ＳＧＫ
１には疾患を助長するプロセスでこの中心的役割を有し、したがって天然の生来の機能の
他に、線維症をもたらす疾患に関連するいくつかの予期しない新規の機能がある。
【００１５】
本発明は、線維性疾患の疾病素因、進行、退行、または発症を決定するための方法も提
供し、これはＣＴＧＦの状態と組み合わせて、組織サンプルおよび組織標本におけるＳＧ
Ｋ１の発現の上方制御または下方制御を測定することにより行われる。疾患の個体から採
取したサンプルは、そのようなサンプルにおける選択されたＳＧＫ１の一塩基発現多型変
異の分析、および疾患に対する疾病素因との相関の分析がさらに可能となりうる。
【００１６】
別の一態様は、ＳＧＫ１に関連する疾患を調節する新しい薬物候補を同定するスクリー
ニング方法に関する。本発明による特に有用なモジュレーターは、ＳＧＫ１の機能を妨害
し、したがってＣＴＧＦ発現および活性の上方制御を防止する化合物である。ＳＧＫ１の
阻害物質は、「線維増殖性障害」の群：放射線により引き起こされる線維症、腫瘍、血管
新生、肉芽腫性疾患、臓器および移植片の拒絶反応、紅斑性狼瘡、アテローム性動脈硬化
、低酸素症、酸化ストレス、心筋の梗塞および虚血、心臓の肥大および線維症、糸球体腎
炎および糸球体硬化症、腎線維症、真性糖尿病、線維性膵炎、肝硬変、脂肪性肝炎および
胆管線維症、線維化および炎症性の腸疾患、消化性潰瘍、腹腔内癒着、腹膜透析における
腹膜線維症、肺線維症、線維性肺胞炎、肺サルコイドーシスおよび／または喘息、卵巣機
能不全、子宮筋腫、関節炎、筋肉の痛み／筋肉痛および筋膜炎、硬皮症、ケロイド、歯肉
肥大、瘢痕形成；角膜、眼液、および網膜における瘢痕または結合組織の形成の抑制；緑
内障、脳梗塞を含む脳の病変、アルツハイマー病、傷の治癒、抜歯後の治癒、骨の治癒お
よび成長、骨折後の骨の治癒から選択される疾患の症状を患う対象を処置するのに特に有
用である。
【００１７】
本発明により行われる薬物スクリーニングのアプローチは、ＳＧＫ１を標的とする治療
用化合物の発見をもたらした。１つはアシルヒドラゾン誘導体のクラスに属し、他方はピ
リドピリミジン誘導体に属する、２つの異なるクラスの化合物が同定されている。選択さ
れたＳＧＫ１阻害性化合物は、薬学的に有効な担体、賦形剤または希釈剤を含む薬剤組成
物において、線維症をもたらす様々な疾患の処置に有用である。望ましい治療プロファイ
ルを有する新しい薬物を同定するのに用いられるスクリーニング方法は、本出願に開示さ
れる化合物に制限されるものではないことが、本発明にとって重要である。さらに、ＳＧ
Ｋ１調節性の化合物をスクリーニングするための１ステップのアプローチまたは２ステッ
プのアプローチが、適用に役立ち得ることは、専門家には明らかである。このようなスク
リーニングの第１のステップは、ＳＧＫ１キナーゼ活性を妨害する化合物の同定を含む。
様々なアッセイ形式が利用可能であり、好ましいアッセイは、γＡＴＰとともに基質とし
てのタンパク質またはペプチドのＳＧＫ１が触媒する放射性のリン酸化の測定を使用して
いる。ＳＧＫ１阻害性の化合物の存在下で放射性シグナルが検出されないか、または減少
したシグナルが検出できる。第２の読出し装置では、ＳＧＫ１阻害性の化合物は、ＣＴＧ
Ｆ発現を妨害するその可能性がモニターされるが、他の読出し活性の測定も同様に有用で
あり得る。ＣＴＧＦを測定することの他に、または測定する代わりに、プロコラーゲン、
インテグリンα５、またはプロテオグリカンを測定することも考慮することができる。
発明の詳細な説明
ＳＧＫ１が心線維症のシグナリングに関与することがあるか否かを探究するために、Ｄ
ＯＣＡを連続的に放出する（２．４ｍｇ／日）ペレットを、ｓｇｋ１＋／＋マウスおよび
ｓｇｋ１−／−マウスの両者に埋め込み、飲料水中１％ＮａＣｌとともに与えた。
【００１８】
処置前では、ｓｇｋ１−／−マウスおよびｓｇｋ１＋／＋マウスの血圧は同様であり、
血漿Ｎａ+、Ｃｌ-、Ｃａ2+、およびリン酸塩濃度、糸球体ろ過速度、尿流量、および腎臓
の電解質排出も同様であった。
【００１９】
ｓｇｋ１−／−マウスおよびｓｇｋ１＋／＋マウスの両者に１８日間のＤＯＣＡ／高塩
分処置を行ったところ、血圧、ならびにＮａＣｌおよび水分の尿排出量に統計上有意な増
加がもたらされた。この結果は、Ｃａ2+、およびリン酸塩の尿排出における有意な増加と
対応し、細胞外体積１２、１３の増大の典型的な結果であった、。ＤＯＣＡは、ｓｇｋ１
＋／＋に顕著な低カリウム血症を引き起こしたが、ｓｇｋ１−／−マウスには引き起こさ
ず、鉱質コルチコイドが調節する腎臓のＫ+排泄におけるＳＧＫ１の役割を含意する。
【００２０】
ｓｇｋ１−／−マウスにおける血圧の上昇は、腎臓のＮａ+再吸収の顕著な上方制御と
一致し、ここに示すように、ＤＯＣＡが媒介する鉱質コルチコイド受容体の活性化による
腎臓の塩の再吸収のこのＳＧＫ１非依存性の上方制御は、明らかに、最終的な腎臓のＮａ
Ｃｌ貯留を引き起こし、したがって血圧を上昇させるのに十分である。
【００２１】
しかし、ＤＯＣＡ／高塩分が引き起こす血漿Ｎａ+濃度、尿流量、絶対および分画のＮ
ａＣｌ排泄の上昇は、ｓｇｋ１＋／＋マウスに比べてｓｇｋ１−／−マウスで著しく鈍く
なった。ｓｇｋ１−／−マウスでは腎臓のＮａ+再吸収の刺激が不完全であることを考慮
すると、反対に、すなわちこれらのマウスにおける尿中ＮａＣｌの排出量の減少ではなく
増加が期待された。
【００２２】
したがって、新しい発見は、ＳＧＫ１が鉱質コルチコイドが誘導する塩欲求に寄与し得
るということであった。この可能性を検証するために、マウスを、ボトル１が常時水道水
を含む２本の飲料ボトルに手が届くメタボリックケージに入れた。ｓｇｋ１＋／＋マウス
では、ボトル２を水道水から１％ＮａＣｌに切替えても、ボトル１からの水分摂取を有意
に変更せず、ＤＯＣＡペレットを埋め込んだ後のみボトル２からの塩分摂取の顕著な上昇
を引き起こし、ＤＯＣＡが誘導する塩欲求と一致した（図１）。しかし、この反応は、ｓ
ｇｋ−／−マウスでは有意に減少した。ボトル２からの液体摂取量の有意差は、ボトル２
に水道水を提供した後でもｓｇｋ１＋／＋マウスとｓｇｋ１−／−マウスとの間に存続し
、ｓｇｋ１＋／＋マウスはｓｇｋ１−／−マウスよりも塩を強く探索し続けたことを示し
ていた。これらのデータは、ＳＧＫ１は、腎臓のＮａ+再吸収の刺激による排出量の阻害
にだけではなく、鉱質コルチコイドが誘導する塩欲求による取込みの刺激にも関与する、
鉱質コルチコイドが調節するＮａ+ホメオスタシスで二重の役割を演じることの第１の証
拠を提供する（６、７）。ＳＧＫ１は、グルココルチコイドによる塩欲求の調節に同様に
関係することがあり（２）、塩の取込みのＳＧＫ１依存性の増加はストレス状態の間中、
細胞外液体体積および血圧を上昇させる一因となることがある（１５）。さらに、塩欲求
が増加し、引き続き塩の取込みが増加し細胞外の液体が増大すると、ＳＧＫ１遺伝子内に
通常の多型を有する個体の血圧値が高くなる一因となることがあり、非選択の白人の５％
程度に影響を及ぼす（１６）。
【００２３】
血圧は等しく上昇したが、ＤＯＣＡ／高塩分の腎臓の増殖およびタンパク尿に対する効
果は、ｓｇｋ１−／−マウスで著しく鈍くなった。さらに、心臓の形態は、ｓｇｋ１−／
−マウスとｓｇｋ１＋／＋マウスとでは劇的に異なった。ＤＯＣＡ／高塩分処置を１８日
間行うと、ｓｇｋ１＋／＋マウスでは心臓に明らかな線維症がもたらされたが、ｓｇｋ１
−／−マウスでは心臓にいかなる認め得る効果もないままであった（図２ａ）。線維症の
重症度の定量分析は、線維症の面積を測定し、次いで全体の面積のパーセント値で表すこ
とにより評価され、ＤＯＣＡ／高塩分処置のｓｇｋ１＋／＋マウスとｓｇｋ１−／−マウ
スとの間に線維症の度合いの間に統計学的な有意差が表れた（図２ｂ）。ＤＯＣＡ／高塩
分処置の前では、ｓｇｋ１＋／＋マウスとｓｇｋ１−／−マウスとには顕著な線維症は観
察されなかった（図２ｂ）。
【００２４】
ＤＯＣＡ／高塩分処置のｓｇｋ１＋／＋マウスに観察された心線維症の増強は、マイク
ロアレイ分析で決定したいくつかの遺伝子の転写調節の変更と対応した。ｓｇｋ１＋／＋
マウスでは、４８時間のＤＯＣＡ／高塩分処置により、プロコラーゲン、インテグリンα
５、プロテオグリカン４、および結合組織成長因子ＣＴＧＦなど、線維症の病因に関わる
いくつかの遺伝子が誘導され（図２ｃ）、ＳＧＫ１転写の増加と対応した（リアルタイム
ＰＣＲにより分析して、ＤＯＣＡ／高塩分処置のｓｇｋ１＋／＋マウスにおけるＳＧＫ１
／ＧＡＰＤＨコピー数は非処置のｓｇｋ１＋／＋マウスに比べて２．１０±０．１４倍に
増加）。これとは対照的に、ｓｇｋ１−／−マウスではこれらの遺伝子のどれも、ＤＯＣ
Ａ／高塩分により誘導されなかった。
【００２５】
ＤＯＣＡ／高塩分処置のｓｇｋ１＋／＋マウスは、ｓｇｋ１−／−マウスに比べてより
大量の塩の取込みを示し（図１）、鉱質コルチコイドの非存在下で心線維症を刺激するた
めに長時間の塩の摂取の増加が以前に報告されているので（１７）、我々は、ｓｇｋ１＋
／＋マウスとｓｇｋ１−／−マウスとの間の心線維症の度合いの違いはｓｇｋ１＋／＋マ
ウスの塩の取込みがより多いことに対する二次的なものであるか否かを決定するために、
ｓｇｋ１＋／＋マウスにＤＯＣＡ＋１％食塩水を、ｓｇｋ１−／−マウスにＤＯＣＡ＋２
％食塩水を提供するさらなる一連の実験を行った。これらの条件下でも、ｓｇｋ１−／−
マウス（ｎ＝５）の液体の取込みは、２．２±０．４倍高く、Ｎａ+取込みはしたがって
ｓｇｋ１＋／＋マウス（ｎ＝５）よりもｓｇｋ１−／−マウスで４倍を超えて高く、（こ
の場合は心線維症のマーカーとして用いた）心臓のＣＴＧＦ発現は、ウェスタンブロッテ
ィングで分析してｓｇｋ１＋／＋マウスからの心組織でのみ有意に増加し（非処置：０．
９±０．２対ＤＯＣＡ／１％塩：４．７±１．０、ＣＴＧＦ／β−チューブリンのデンシ
トメトリー分析の任意の単位（Ｐ＜０．０１））、ｓｇｋ１−／−マウスでは増加しなか
った（非処置：１．５±１．０対ＤＯＣＡ／２％塩：１．７±０．７、ＣＴＧＦ／β−チ
ューブリンのデンシトメトリー分析の任意の単位）。
【００２６】
上記に記載した低カリウム血症は心毒性であることがあり、したがって修復性の線維症
をもたらすことがある（１８）。したがって、ＤＯＣＡ／高塩分処置のｓｇｋ１＋／＋マ
ウスにおける過度の低カリウム血症は、心線維症が観察される一因となる可能性があった
。しかし、鉱質コルチコイド／ＫＣｌでの高塩分処置を行ったラットの補足では、心臓の
線維症の度合いおよびコラーゲン含量には作用がなかったことが以前に報告されている（
１９）。
【００２７】
ＣＣＮ（ｃｔｇｆ／ｃｙｒ６１／ｎｏｖ）遺伝子ファミリー（２０）の１メンバーであ
るＣＴＧＦは、マトリックスタンパク質形成の重要なメディエータであることが知られて
おり（２１，２２）、コラーゲンおよびインテグリンα５転写の上方制御はＣＴＧＦ発現
に派生的である可能性がある（２３、２４）。したがって、我々は、ＣＴＧＦタンパク質
レベルの調節におけるＤＯＣＡの役割をさらに探究した。ウェスタンブロット分析による
と、ＤＯＣＡ／高塩分で（１８日間）処置すると、ｓｇｋ１＋／＋マウスからの心臓組織
におけるＣＴＧＦ発現が明らかに上方制御されたが、ｓｇｋ１−／−マウスでは変更され
なかった（図３ａ、ｂ）。同様に、ｓｇｋ１＋／＋マウスおよびｓｇｋ１−／−マウスか
ら分離したマウス肺線維症の初代培養物を刺激すると、ＤＯＣＡ（１０μＭ、２４時間）
で刺激後ｓｇｋ１＋／＋細胞においてのみＣＴＧＦレベルの上昇が示された（図３ｃ、ｄ
）。培養した線維芽細胞におけるＣＴＧＦ発現のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激にＳＧＫ１が必要
であることから示唆されるのは、鉱質コルチコイドが誘導するＣＴＧＦの形成における違
いは、ｓｇｋ１−／−マウスとｓｇｋ１＋／＋マウスの間の血圧、電解質代謝、または血
漿濃度の違いを要求しないことであり、一方で鉱質コルチコイドが過剰である間中、これ
らの、および、さらなる機能上のパラメータは当然、心機能および線維症の変更の一因に
なる。ＣＴＧＦ発現のＳＧＫ１依存性の上方制御により、このキナーゼがマトリックス堆
積を増強するシグナリングで決定的な役割を果たすことに対する説明が提供される。しか
し、この観察は、ＳＧＫ１に関わり、心線維症をもたらすさらなるシグナリング経路を除
外しない。
【００２８】
図面の簡単な説明
図１：ＳＧＫ１はＤＯＣＡによるＮａＣｌ取込みの刺激に必要とされる。
【００２９】
ＤＯＣＡ処置前および処置中の、ＳＧＫ１ノックアウトマウス（ｓｇｋ１−／−、白抜
き記号）またはその野生型同腹仔（ｓｇｋ１＋／＋、塗りつぶし記号）による、ボトル１
（水道水、左パネル）、またはボトル２（水道水または食塩水、右パネル）からの毎日の
水の摂取容積。
図２：ＳＧＫ１は、ＤＯＣＡが誘導する心線維症の発症および遺伝子発現の変更に必要と
される。
【００３０】
ａ：１８日間ＤＯＣＡ／高塩分食餌処置後の野生型マウス（ｓｇｋ１＋／＋、左）、お
よびＳＧＫ１ノックアウトマウス（ｓｇｋ１−／−、右）からの心臓組織のＨ＆Ｅおよび
Ｍａｓｓｏｒｉのトリクローム染色（×１５０倍率）。ｂ：ＤＯＣＡ／高塩分処置のｓｇ
ｋ１＋／＋、およびｓｇｋ１−／−に観察される線維症の度合いを説明するグラフ（線維
性の面積は全体の面積のパーセント値として表される）（平均±ＳＥＭ、ｎ＝６、*有意
差（Ｐ＜０．０５））。ｃ：ＳＧＫ１ノックアウトマウス（ｓｇｋ１−／−、白抜きコラ
ム）、および野生型同腹仔（ｓｇｋ１＋／＋、塗りつぶしコラム）をＤＯＣＡ／高塩分食
餌処置２日後、非処置のマウスと比べた、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、プロコラーゲ
ンＩ、ＩＶ、およびＶＩＩＩ型、プロテオグリカン４、およびインテグリンα５転写物の
レベルにおけるフォールド変化の算術平均±ＳＥＭ（２動物における４比較）を示すマイ
クロアレイ分析。
図３：ＤＯＣＡは、ｓｇｋ１＋／＋マウスからの心臓および初代培養マウス肺線維芽細胞
におけるＣＴＧＦ発現を増強するが、ｓｇｋ１−／−マウスでは増強しない。
【００３１】
ａ：対照、およびＤＯＣＡ／高塩分処置（１８日間）ＳＧＫ１ノックアウトマウス（ｓ
ｇｋ１−／−）および野生型同腹仔（ｓｇｋ１＋／＋）からの心臓におけるＣＴＧＦおよ
びβ−チューブリンレベルの代表的なウェスタンブロット。ｂ：β−チューブリンの比で
表された、ＣＴＧＦウェスタンブロットのデンシトメトリー分析（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３
〜５、*ｓｇｋ１＋／＋偽とｓｇｋ１＋／＋ＤＯＣＡの間で有意差、＃ｓｇｋ１＋／＋Ｄ
ＯＣＡとｓｇｋ１−／−ＤＯＣＡの間で有意差（Ｐ＜０．０５））。ｃ：ＤＯＣＡ処置マ
ウスの肺線維症における、ＣＴＧＦおよびβ−チューブリン発現の代表的なウェスタンブ
ロット。ｄ：ＳＧＫ１ノックアウト動物（ｓｇｋ１−／−、白抜きコラム）および野生型
同腹仔（ｓｇｋ１＋／＋、塗りつぶしコラム）由来の線維芽細胞におけるＣＴＧＦタンパ
ク質存在量（β−チューブリン発現の関数として）の算術平均±ＳＥＭ（下パネル、ｎ＝
６、*有意差、Ｐ＜０．０５）。
【００３２】
さらなる方法と材料
【００３３】
実施例１
動物実験
ＳＧＫ１を欠くマウス（ｓｇｋ１−／−）を、先に記載したように生成した９。野生型
（ｓｇｋ１＋／＋）マウスおよびＳＧＫ１ノックアウト（ｓｇｋ１−／−）マウスに、麻
酔中（腹腔内のメデトミジン０．５ｍｇ／ｋｇ＋ミダゾラム５ｍｇ／ｋｇ＋フェンタニル
０．０５ｍｇ／ｋｇ、これらは皮下のアチパメゾール２．５ｍｇ／ｋｇ＋フルマゼニル０
．５ｍｇ／ｋｇ＋ナロキソン１．２ｍｇ／ｋｇにより覆された）に首領域（２８）に２１
日放出の５０ｍｇＤＯＣＡペレット（フロリダ州、Ｓａｒａｓｏｔａ、Ｉｎｎｏｖａｔｉ
ｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を埋め込んだ。ＤＯＣＡペレットを埋
め込む１日前に、ベースの２４時間尿を採集するために、ｓｇｋ１−／−マウスおよびｓ
ｇｋ１＋／＋マウスの体重を測定し、個別にメタボリックケージ（ドイツ、Ｔｅｃｎｉｐ
ｌａｓｔ  Ｈｏｈｅｎｐｅｉｓｓｅｎｂｅｒｇ）に入れた。マウスは、標準マウス食餌（
ドイツ、Ｈｅｉｄｅｎａｕ、Ａｌｔｒｏｍｉｎ）および水道水、および／または１％もし
くは２％ＮａＣｌに自由に手が届いた。メタボリックケージの内壁はシリコーン処理して
あり、尿は水を飽和させた油の下で採集した。ＤＯＣＡ／１％ＮａＣｌ処置２９の前、な
らびに１、２、４、６、１０および１４日目に、テールカフ法により収縮期動脈血圧を測
定した。ＤＯＣＡ／高塩分処置の１８日目に、２４時間尿および体重を再び測定し、動物
を麻酔し（腹腔内ケタミンおよびキシラジン）、眼窩後部叢に穿刺して血液２００μｌを
ヘパリン添加キャピラリー中に採取した。Ｎａ+およびＫ+の血漿中および尿中濃度を炎光
光度計（ＥＬＥＸ６３６１、ドイツ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）により、Ｃｌ-濃度を電気滴
定（Ｃｈｌｏｒｉｄｏｍｅｔｅｒ６６１０、ドイツ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）により測定し
、Ｃａ2+、リン酸塩、およびクレアチニンを市販の診断キット（ドイツ、Ｍｕｎｉｃｈ、
Ｓｉｇｍａ）で評価した。
【００３４】
実施例２
顕微鏡
非処理またはＤＯＣＡ／高塩分処理（１８日間）のｓｇｋ１＋／＋マウスおよびｓｇｋ
１−／−マウスからの心臓を、麻酔下で速やかに取り出し、重量を測定し、４％パラホル
ムアルデヒド／０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２）中一夜固定し、パラ
フィンに包埋した。脱ろうした５μｍの厚い心筋切片を、Ｈ＆ＥおよびＭａｓｓｏｎのト
リクロームで染色した（３０）。染色したパラフィン切片を、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌ
ａｎ顕微鏡（ドイツ、Ｊｅｎａ、Ｚｅｉｓｓ）で分析した。Ａｘｉｏｃａｍビデオカメラ
（ドイツ、Ｊｅｎａ、Ｚｅｉｓｓ）を用い、製造元のソフトウェア（Ａｘｉｏｖｉｓｉｏ
ｎ、ドイツ、Ｊｅｎａ、Ｚｅｉｓｓ）を用いて、デジタル化画像上で面積を測定した。全
組織面積を４×対物レンズで測定し、線維性の面積を２０×対物レンズを用いて同定し定
量した。次いで線維症の度合いを全組織面積のパーセント値として計算した。
【００３５】
実施例３
マイクロアレイ分析
Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｆｉｂｒｏｕｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔを用
い、製造元の指示（ドイツ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｑｉａｇｅｎ）にしたがい、非処置またはＤ
ＯＣＡ／高塩分（４８時間）処置ｓｇｋ１＋／＋マウスおよびｓｇｋ１−／−マウスから
得た心臓から、全ＲＮＡを分離した。ＤＯＣＡ／高塩分または偽処置のｓｇｋ１−／−マ
ウスおよびｓｇｋ１＋／＋マウスの心臓からの全ＲＮＡを用い、市販のキット（メリーラ
ンド州、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ）およびオリゴｄ（Ｔ）２４  Ｔ７プライマーを用いてセカンドストランド合成を生
成した。テンプレートとしてＴ７プロモーターと結合した二重鎖ｃＤＮＡおよびＴ７ＲＮ
Ａ転写物ラベリングキット（ニューヨーク州、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＥＮＺＯ  Ｄｉ
ａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により、ビオチンラベルしたＣＴ
ＰおよびＵＴＰを用いてｃＲＮＡを生成した。ｃＲＮＡをフラグメント化し、マウスゲノ
ムＭＯＥ４３０Ａオリゴヌクレオチドアレイチップ（カリフォルニア州、Ｓａｎｔａ  Ｃ
ｌａｒａ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）にハイブリダイズした。次いで、アレイチップを、フ
ィコエリスリンと結合したストレプトアビジン（メリーランド州、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐ
ｒｏｂｅｓ）を用いて染色し、レーザー共焦点スキャナー（カリフォルニア州、Ｓａｎｔ
ａ  Ｃｌａｒａ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて蛍光強度を測定した
。スキャンした画像の強度を、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ５（
カリフォルニア州、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて分析した
。各アレイの平均強度が等しくなるように、全体的なスケーリングを全てのアレイに適用
した。全体的なスケーリングでは、各プローブ細胞の生のシグナル値に、スケーリングフ
ァクターを掛けた。その発現が０．５というシグナルのログ比で大幅に変わる遺伝子を、
Ｄａｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ  Ｔｏｏｌ（カリフォルニア州、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ａｆ
ｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて同定した。
【００３６】
実施例４
ＳＧＫ１を調節する化合物
４．１．一般式Ｉの化合物、薬学的に有用なそれらの誘導体、塩、溶液および立体異性体
、ならびにそれらの混合物。
【００３７】
【化１】
2007527875.tif 000002
【００３８】
［式中、
Ｒ1、Ｒ5は、Ｈ、ＯＨ、ＯＡ、ＯＡｃ、またはメチルのいずれかであり、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10は、Ｈ、ＯＨ、ＯＡ、ＯＡｃ、ＯＣＦ3、Ｈａ
ｌ、ＮＯ2、ＣＦ3、Ａ、ＣＮ、ＯＳＯ2ＣＨ3、ＳＯ2ＣＨ3、ＮＨ2、またはＣＯＯＨのい
ずれかであり、
Ｒ11は、ＨまたはＣＨ3であり、
Ａは、炭素原子が１、２、３、または４個のアルキルであり、
Ｘは、ＣＨ2、ＣＨ2ＣＨ2、ＯＣＨ2、または−ＣＨ（ＯＨ）−であり、
Ｈａｌは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである］
以下の化合物の群から選択される式Ｉによる化合物：
（３−ヒドロキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデ
ン）−ヒドラジド、
（３−ヒドロキシ−フェニル）−酸性酸−［１−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−フェ
ニル）−エチリデン］−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン
）−ヒドラジド、
フェニル酸性酸−（３−フルオロ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（４−ヒドロキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデ
ン）−ヒドラジド、
（３，４−ジクロロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリ
デン）−ヒドラジド、
ｍ−トリル−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
ｏ−トリル−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（２−クロロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）
−ヒドラジド、
（３−クロロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）
−ヒドラジド、
（４−フルオロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン
）−ヒドラジド、
（２−クロロ−４−フルオロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−
ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−フルオロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン
）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド
、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２，６−ジメチル−ベンジリ
デン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（３−フルオロ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン
）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−［１−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−フェニ
ル）−エチリデン］−ヒドラジド、
（３−メチルスルホニルオキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ
−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３，５−ジヒドロキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベン
ジリデン）−ヒドラジド、
（３−フルオロ−フェニル）−酸性酸−（３−フルオロ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン
）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（４−アセトキシ−２−メトキシ−ベンジリデン
）−ヒドラジド、
（３−トリフルオロメチル−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベ
ンジリデン）−ヒドラジド、
３−（３−メトキシ−フェニル）−プロピオン酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベ
ンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（２，４−ジヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒド
ラジド、
（３−メトキシ−フェノキシ）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデ
ン）−ヒドラジド、
（３−ニトロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）
−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（５−クロロ−２−ヒドロキシ−ベンジリデン）
−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（２−ヒドロキシ−５−ニトロ−ベンジリデン）
−ヒドラジド、
２−ヒドロキシ−２−フェニル−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデ
ン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（２−エトキシ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン
）−ヒドラジド、
（３−ブロモ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）
−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−［１−（４−ヒドロキシ−フェニル）−エチリデ
ン］−ヒドラジド、
（３，５−ジフルオロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジ
リデン）−ヒドラジド、
（３−ヒドロキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メチル−ベンジリデン
）−ヒドラジド、
（３−ヒドロキシ−フェニル）−酸性酸−（２−エトキシ−４−ヒドロキシ−ベンジリデ
ン）−ヒドラジド、
（３−ヒドロキシ−フェニル）−酸性酸−（２−メトキシ−４−ヒドロキシ−６−メチル
−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（２−フルオロ−フェニル）−酸性酸−（２−メトキシ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン
）−ヒドラジド
４．２．一般式ＩＩの化合物、薬学的に有用なそれらの誘導体、塩、溶液、および立体異
性体、ならびにそれらの混合物
【００３９】
【化２】
2007527875.tif 000003
【００４０】
［式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5は、Ｈ、Ａ、ＯＨ、ＯＡ、アルケニル、アルキニル、ＮＯ2、Ｎ
Ｈ2、ＮＨＡ、ＮＡ2、Ｈａｌ、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＡ、−ＯＨｅｔ、−Ｏ−アルキレ
ン−Ｈｅｔ、−Ｏ−アルキレン−ＮＲ8Ｒ9、またはＣＯＮＲ8Ｒ9、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5から選択された２つの基、
あるいは−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−、−Ｏ−ＣＨ2−Ｏ−、または−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−
であり、
Ｒ6、Ｒ7は、Ｈ、Ａ、Ｈａｌ、ＯＨ、ＯＡ、またはＣＮのいずれかであり、
Ｒ8、Ｒ9は、ＨまたはＡのいずれかであり、
Ｈｅｔは、１個または数個のＨａｌ、Ａ、ＯＡ、ＣＯＯＡ、ＣＮ、またはカルボニル酸素
（＝Ｏ）により置換されている１から４個のＮ−、Ｏ−、および／またはＳ−原子を有す
る飽和のまたは不飽和の複素環であり、
Ａは、炭素原子１から１０個のアルキルであり、この場合１〜７個のＨ原子はＦおよび／
または塩素で置換されていてよく、
Ｘ、Ｘ’は、ＮＨであるか、欠如しており、
Ｈａｌは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである］
式ＩＩによる化合物は、以下の化合物の群から選択される：
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−（２−フルオロ−５−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−（４−クロロ−５−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−（２，４−ジフルオロフェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−（２，６−ジフルオロフェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−（３−フルオロ−５−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−（４−フルオロ−５−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−（４−メチル−５−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−（２，４−ジブロモ−６−フルオロ−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−（２−フルオロ−６−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−（２−フルオロ−５−メチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−（２，３，４−トリフルオロ−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−（４−ブロモ−２，６−ジフルオロ−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−（２−フルオロ−３−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−［２−（１−ｔｅｒｔ．−ブチルオキシカルボニル−ピペリジン
−４−イル）−フェニル］−尿素、
Ｎ−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−２，４−ジクロロ−ベンズアミド、
Ｎ−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−４−クロロ−５−トリフルオロメチル−ベンズアミド、
Ｎ−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−２−フルオロ−５−トリフルオロメチル−ベンズアミド、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−［３−クロロ−５−トリフルオロメチル−２−（ピペリジン−４
−イルオキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−［（２−フルオロ−５−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−フ
ェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−［５−フルオロ−２−（ピペリジン−４−イルオキシ）−フェニ
ル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−［４−クロロ−５−トリフルオロメチル−２−（ピペリジン−４
−イルオキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−［２−（ピペリジン−４−イルオキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−［２−フルオロ−５−（２−ジエチルアミノ−エトキシ）−フェ
ニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−［２−フルオロ−５−［２−（ピペリジン−１−イル）−エトキ
シ］−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−［４−フルオロ−２−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−フェ
ニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−［４−フルオロ−２−（２−ジエチルアミノ−エトキシ）−フェ
ニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−［３−クロロ−４−［２−（モルホリン−４−イル）−エトキシ
］−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−［４−フルオロ−２−［２−（モルホリン−４−イル）−エトキ
シ］−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−［３−クロロ−４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−フェニ
ル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−［３−クロロ−４−（２−ジエチルアミノ−エトキシ）−フェニ
ル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−［４−クロロ−２−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−フェニ
ル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イ
ル）−フェニル］−３−［２−クロロ−５−（２−ジエチルアミノ−エトキシ）−フェニ
ル］−尿素、
【００４１】
実施例５
ＳＧＫ１ヌクレオチド多型
任意の高血圧患者のイントロン６を規定するヌクレオチド配列は、．．．．ａａｔｔａ
ｃａｔｔＣｇｃａａｃｃｃａｇ．．．．であり、健常集団を代表するヌクレオチド配列は
、．．．．ａａｔｔａｃａｔｔＴｇｃａａｃｃｃａｇ．．．．である。配列は、受入番号
ＧＩ２４６３２００位置２０７１により入手可能である。任意の高血圧患者のエキソン８
配列は、ホモ接合体の．．．．ｔａｃｔｇａＣｔｔｃｇｇａｃｔ．．．．、もしくは．．
．．ｔａｃｔｇａＴｔｔｃｇｇａｃｔ．．．．、またはヘテロ接合体の．．．．ｔａｃｔ
ｇａＣｔｔｃｇｇａｃｔ．．．．および．．．．ｔａｃｔｇａＴｔｔｃｇｇａｃｔ．．．
．である。配列は、受入番号ＮＭ＿００５６２７．２、位置７７７により入手可能である
。ＴＴヌクレオチドの組合せを有するホモ接合体の個体は、同時にイントロン６にＣＣ一
塩基多型が表されている場合でも保護される。
【００４２】
実施例６
細胞培養物
ｓｇｋ１＋／＋マウスおよびｓｇｋ１−／−マウス（８〜１４週齢）から肺線維芽細胞
を回収するために、肺全体を取り出し、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン
、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ドイツ、Ｋａ
ｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を追加したＤＭＥＭ２ｍＭを含む
９０ｍｍ細胞培養ディッシュに移した。組織を細切し、標準の細胞培養条件下（３７℃、
５％ＣＯ2）で培養した。最初の接種後２〜４日で、細胞の増殖が観察された。線維芽細
胞は、フィブロネクチンをポジティブ染色することにより同定し、２〜６継代の間で実験
に使用した。ＤＯＣＡ処置によるＳＧＫ１ｍＲＮＡの増加、およびｓｇｋ１−／−マウス
の肺線維芽細胞におけるＳＧＫ１の欠如を、リアルタイムＰＣＲにより確認した（データ
は示さず）。
【００４３】
実施例７
ウェスタンブロット分析
非処置およびＤＯＣＡ／高塩分処置（１８日間）のｓｇｋ１＋／＋マウスおよびｓｇｋ
１−／−マウスからの心臓全体を取り出し、直ちに液体窒素中で冷凍し、次いで、５０ｍ
Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ
ＥＧＴＡ、５０ｍＭフッ化ナトリウム、５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭオルトバ
ナジン酸ナトリウム、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、
１％ドデシル硫酸ナトリウム、およびプロテアーゼカクテル阻害剤（スイス、Ｂａｓｅｌ
、Ｒｏｃｈｅ）、を含む溶解バッファー中ガラスホモジナイザーを用いて組織をホモジナ
イズし、ホモジネートを１００００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を取り出し
、ウェスタンブロッティングに使用した。６０ｍｍ培養ディッシュ中のｓｇｋ１＋／＋マ
ウスおよびｓｇｋ１−／−マウスの肺線維芽細胞から１８時間血清を除き、その後ＤＯＣ
Ａ（１０μＭ）を加え、２４時間後に細胞を溶解した。細胞溶解物全体（５０μｇ）およ
び心臓ホモジネート（７０μｇ）を、ＳＤＳ−ｐａｇｅ（１０％Ｔｒｉｓ−グリシン）に
より分離し、ニトロセルロース膜に移し、ブロッキングバッファー（０．１％Ｔｗｅｅｎ
含有ＰＢＳ中５％脱脂ミルク）で１時間ブロックし、ヤギポリクローナルＣＴＧＦ一次抗
体（ブロッキングバッファー中１：４００に希釈、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ドイツ、Ｈｅ
ｉｄｅｌｂｅｒｇ）とともに４℃で一夜インキュベートした。ＨＲＰ−結合した抗ヤギ二
次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ドイツ、Ｈｅｉｄｅｒｂｅｒｇ）とともにインキュベー
トした後、製造元の指示（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ドイツ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）にしたがい、
ＥＣＬで可視化を行った。ローディングコントロールとして一次β−チューブリン（Ｓａ
ｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ドイツ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）抗体でも膜を検出した。Ｓｃｉｏｎ
Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ、米国、Ｍａｒｙｌａｎｄ）を用いてＣＴＧＦのデンシトメト
リー分析を行い、β−チューブリンを用いて標準化した。
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【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ＤＯＣＡ処置前および処置中の、ＳＧＫ１ノックアウトマウスまたはその野生型同腹仔による、ボトルからの毎日の水の摂取容積を示すグラフである。
【図２】ＤＯＣＡ／高塩分食餌処置による繊維症への影響を示す図である。（ａ）ＤＯＣＡ／高塩分食餌処置後の野生型マウスおよびＳＧＫ１ノックアウトマウスからの心臓組織のＨ＆ＥおよびＭａｓｓｏｒｉのトリクローム染色（×１５０倍率）。（ｂ）ＤＯＣＡ／高塩分処置のｓｇｋ１＋／＋、およびｓｇｋ１−／−に観察される線維症の度合いを説明するグラフ。（ｃ）ＳＧＫ１ノックアウトマウスおよび野生型同腹仔をＤＯＣＡ／高塩分食餌処置２日後、非処置のマウスと比べた、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、プロコラーゲンＩ、ＩＶ、およびＶＩＩＩ型、プロテオグリカン４、およびインテグリンα５転写物のレベルにおけるフォールド変化の算術平均±ＳＥＭ（２動物における４比較）を示すマイクロアレイ分析。
【図３】ＤＯＣＡはｓｇｋ１＋／＋マウスからの心臓および初代培養マウス肺線維芽細胞におけるＣＴＧＦ発現を増強するが、ｓｇｋ１−／−マウスでは増強しないことを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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