(57)【要約】      （修正有）【課題】標的細胞における活動電位の光遺伝学的調節のための装置、システム及び方法の提供。【解決手段】細胞の膜電位の調節のためのシステムであって、光に応答して第１のイオンが細胞膜を通過することを可能にするように適合された光活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第１の核酸と；第２のイオンが細胞膜を通過することを可能にすることによって第１のイオンの細胞膜の通過に応答する応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第２の核酸と；光により標的場所を照射するように構成された装置とを含むシステム。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の膜電位の調節のためのシステムであって、
光に応答して第１のイオンが細胞膜を通過することを可能にするように適合された光活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第１の核酸と；
第２のイオンが細胞膜を通過することを可能にすることによって第１のイオンの細胞膜の通過に応答する応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第２の核酸と；
光により標的場所を照射するように構成された装置と
を含む、該システム。
【請求項２】
前記光活性化タンパク質がイオンポンプである、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記イオンポンプが、水素イオンポンプ、ナトリウムイオンポンプ、カリウムイオンポンプ、クロライドイオンポンプまたはカルシウムイオンポンプである、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記光活性化タンパク質がイオンチャンネルである、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記イオンチャンネルが、水素イオンチャンネル、ナトリウムイオンチャンネル、カリウムイオンチャンネル、クロライドイオンチャンネルまたはカルシウムイオンチャンネルである、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
前記応答タンパク質がイオンポンプである、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記イオンポンプが、水素イオンポンプ、ナトリウムイオンポンプ、カリウムイオンポンプ、クロライドイオンポンプまたはカルシウムイオンポンプである、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
前記応答タンパク質が、イオンチャンネル、イオン交換タンパク質またはイオンコトランスポーターである、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記イオンチャンネルが、水素イオンチャンネル、ナトリウムイオンチャンネル、カリウムイオンチャンネル、クロライドイオンチャンネル、カルシウムイオンチャンネルまたはカチオンチャンネルである、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記装置が、約３５０〜約７５０ｎｍの範囲の波長を有する光により標的場所を照射するように構成される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記装置が、約５３０〜最大約５６０ｎｍの範囲の波長を有する光により標的場所を照射するように構成される、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
前記装置が光により標的場所を一定して照射するように構成される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記装置が光のパルスにより標的場所を照射するように構成される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記装置が光の波長及び／または強度を調節するように構成される、請求項１２または１３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記装置が光のパルスの周波数及び／または継続期間を調節するように構成される、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１６】
前記装置が使用者インプットに応答して標的場所を照射するように構成される、請求項１２または１３に記載のシステム。
【請求項１７】
前記使用者インプットが、光の波長、光の強度、光パルスの継続期間、光パルスの周波数、及び／または標的場所を含む、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
前記装置が対象中に埋込まれるように適合される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１９】
前記標的場所が、細胞、細胞の部分、複数の細胞、神経線維の束、神経筋接合部、中枢神経系（ＣＮＳ）組織、末梢神経系（ＰＮＳ）組織または解剖学的領域である、請求項１に記載のシステム。
【請求項２０】
前記第１の核酸及び前記第２の核酸が単一の発現ベクター内に存在する、請求項１に記載のシステム。
【請求項２１】
光に応答して第１のイオンが細胞膜を通過することを可能にするように適合された光活性化タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、ニューロン特異的転写制御エレメントへ機能的に連結される、請求項１に記載のシステム。
【請求項２２】
第２のイオンが細胞膜を通過することを可能にすることによって第１のイオンの細胞膜の通過に応答する応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む前記第２の核酸が、ニューロン特異的転写制御エレメントへ機能的に連結される、請求項１に記載のシステム。
【請求項２３】
光に応答して第１のイオンが細胞膜を通過することを可能にするように適合された光活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第１の核酸と；
第２のイオンが細胞膜を通過することを可能にすることによって第１のイオンの細胞膜の通過に応答する応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第２の核酸と
を含む、医薬組成物。
【請求項２４】
前記光活性化タンパク質がイオンポンプである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記イオンポンプが、水素イオンポンプ、ナトリウムイオンポンプ、カリウムイオンポンプ、クロライドイオンポンプまたはカルシウムイオンポンプである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記光活性化タンパク質がイオンチャンネルである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記イオンチャンネルが、水素イオンチャンネル、ナトリウムイオンチャンネル、カリウムイオンチャンネル、クロライドイオンチャンネルまたはカルシウムイオンチャンネルである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記応答タンパク質がイオンポンプである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２９】
前記イオンポンプが、水素イオンポンプ、ナトリウムイオンポンプ、カリウムイオンポンプ、クロライドイオンポンプまたはカルシウムイオンポンプである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記応答タンパク質が、イオンチャンネル、イオン交換タンパク質またはイオンコトランスポーターである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３１】
前記イオンチャンネルが、水素イオンチャンネル、ナトリウムイオンチャンネル、カリウムイオンチャンネル、クロライドイオンチャンネル、カルシウムイオンチャンネルまたはカチオンチャンネルである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記第１の核酸及び前記第２の核酸が単一の発現ベクター内に存在する、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３３】
光に応答して第１のイオンが細胞膜を通過することを可能にするように適合された光活性化タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、ニューロン特異的転写制御エレメントへ機能的に連結される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３４】
第２のイオンが細胞膜を通過することを可能にすることによって第１のイオンの細胞膜の通過に応答する応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む前記第２の核酸が、ニューロン特異的転写制御エレメントへ機能的に連結される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３５】
光に応答して第１のイオンが細胞膜を通過することを可能にするように適合された光活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第１の核酸と；
第２のイオンが細胞膜を通過することを可能にすることによって第１のイオンの細胞膜の通過に応答する応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第２の核酸と
を含む、細胞。
【請求項３６】
前記光活性化タンパク質がイオンポンプである、請求項３５に記載の細胞。
【請求項３７】
前記イオンポンプが、水素イオンポンプ、ナトリウムイオンポンプ、カリウムイオンポンプ、クロライドイオンポンプまたはカルシウムイオンポンプである、請求項３６に記載の細胞。
【請求項３８】
前記光活性化タンパク質がイオンチャンネルである、請求項３５に記載の細胞。
【請求項３９】
前記イオンチャンネルが、水素イオンチャンネル、ナトリウムイオンチャンネル、カリウムイオンチャンネル、クロライドイオンチャンネルまたはカルシウムイオンチャンネルである、請求項３８に記載の細胞。
【請求項４０】
前記応答タンパク質がイオンポンプである、請求項３５に記載の細胞。
【請求項４１】
前記イオンポンプが、水素イオンポンプ、ナトリウムイオンポンプ、カリウムイオンポンプ、クロライドイオンポンプまたはカルシウムイオンポンプである、請求項４０に記載の細胞。
【請求項４２】
前記応答タンパク質が、イオンチャンネル、イオン交換タンパク質またはイオンコトランスポーターである、請求項３５に記載の細胞。
【請求項４３】
前記イオンチャンネルが、水素イオンチャンネル、ナトリウムイオンチャンネル、カリウムイオンチャンネル、クロライドイオンチャンネル、カルシウムイオンチャンネルまたはカチオンチャンネルである、請求項４２に記載の細胞。
【請求項４４】
前記第１の核酸及び前記第２の核酸が単一の発現ベクター内に存在する、請求項３５に記載の細胞。
【請求項４５】
光に応答して第１のイオンが細胞膜を通過することを可能にするように適合された光活性化タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、ニューロン特異的転写制御エレメントへ機能的に連結される、請求項３５に記載の細胞。
【請求項４６】
第２のイオンが細胞膜を通過することを可能にすることによって第１のイオンの細胞膜の通過に応答する応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む前記第２の核酸が、ニューロン特異的転写制御エレメントへ機能的に連結される、請求項３５に記載の細胞。
【請求項４７】
光に応答して細胞の膜電位を調節する方法であって、活性化用の波長の光に細胞を曝露する段階を含み、細胞が、
ａ）光に応答して第１のイオンが細胞膜を通過することを可能にするように適合された光活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第１の核酸と；
ｂ）第２のイオンが細胞膜を通過することを可能にすることによって第１のイオンの細胞膜の通過に応答する応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第２の核酸と
により遺伝学的に改変される、該方法。
【請求項４８】
前記光活性化タンパク質がイオンポンプである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記イオンポンプが、水素イオンポンプ、ナトリウムイオンポンプ、カリウムイオンポンプ、クロライドイオンポンプまたはカルシウムイオンポンプである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記光活性化タンパク質がイオンチャンネルである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記イオンチャンネルが、水素イオンチャンネル、ナトリウムイオンチャンネル、カリウムイオンチャンネル、クロライドイオンチャンネルまたはカルシウムイオンチャンネルである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記応答タンパク質がイオンポンプである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
前記イオンポンプが、水素イオンポンプ、ナトリウムイオンポンプ、カリウムイオンポンプ、クロライドイオンポンプまたはカルシウムイオンポンプである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記応答タンパク質が、イオンチャンネル、イオン交換タンパク質またはイオンコトランスポーターである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５５】
前記イオンチャンネルが、水素イオンチャンネル、ナトリウムイオンチャンネル、カリウムイオンチャンネル、クロライドイオンチャンネル、カルシウムイオンチャンネルまたはカチオンチャンネルである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
活性化用の波長の光に前記細胞を曝露する段階が、細胞内で、逆行性で伝導される活動電位を阻害する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５７】
光に応答して細胞中の電圧ゲート型ナトリウムチャンネルの活性を阻害する方法であって、活性化用の波長の光に細胞を曝露する段階を含み、細胞が、
ａ）光に応答して複数の水素イオンが細胞膜を外向きの方向で通過することを可能にするように適合された光活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第１の核酸と；
ｂ）複数のナトリウムイオンが細胞膜を内向きの方向で通過することを可能にし、細胞膜の持続的脱分極を引き起こし、それによって電圧ゲート型ナトリウムイオンチャンネルを不活性化し、その活性を阻害することによって、細胞膜の外部表面上またはその付近での水素イオンの存在に応答する応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第２の核酸と
により遺伝学的に改変される、該方法。
【請求項５８】
前記光活性化タンパク質がイオンポンプである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記イオンポンプが、水素イオンポンプ、ナトリウムイオンポンプ、カリウムイオンポンプ、クロライドイオンポンプまたはカルシウムイオンポンプである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記光活性化タンパク質がイオンチャンネルである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記イオンチャンネルが、水素イオンチャンネル、ナトリウムイオンチャンネル、カリウムイオンチャンネル、クロライドイオンチャンネルまたはカルシウムイオンチャンネルである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記応答タンパク質がイオンポンプである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
前記イオンポンプが、水素イオンポンプ、ナトリウムイオンポンプ、カリウムイオンポンプ、クロライドイオンポンプまたはカルシウムイオンポンプである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記応答タンパク質が、イオンチャンネル、イオン交換タンパク質またはイオンコトランスポーターである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６５】
前記イオンチャンネルが、水素イオンチャンネル、ナトリウムイオンチャンネル、カリウムイオンチャンネル、クロライドイオンチャンネル、カルシウムイオンチャンネルまたはカチオンチャンネルである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
活性化用の波長の光に前記細胞を曝露する段階が、細胞内で逆行性または順行性で伝導される活動電位を阻害する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６７】
対象における病態を治療する方法であって、
ａ）光に応答して第１のイオンが標的細胞の膜を通過することを可能にするように適合された光活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第１の核酸；及び
ｂ）第２のイオンが標的細胞の膜を通過しここで該膜を通る第２のイオンの通過が病態を治療することを可能にすることによって、第１のイオンの該膜の通過に応答する応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第２の核酸
により対象の標的細胞を遺伝学的に改変する段階と；
病態について対象を治療するために、活性化用の波長の光に標的細胞を曝露する段階と
を含む、該方法。
【請求項６８】
前記光活性化タンパク質がイオンポンプである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記イオンポンプが、水素イオンポンプ、ナトリウムイオンポンプ、カリウムイオンポンプ、クロライドイオンポンプまたはカルシウムイオンポンプである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記光活性化タンパク質がイオンチャンネルである、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
前記イオンチャンネルが、水素イオンチャンネル、ナトリウムイオンチャンネル、カリウムイオンチャンネル、クロライドイオンチャンネルまたはカルシウムイオンチャンネルである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記応答タンパク質がイオンポンプである、請求項６７に記載の方法。
【請求項７３】
前記イオンポンプが、水素イオンポンプ、ナトリウムイオンポンプ、カリウムイオンポンプ、クロライドイオンポンプまたはカルシウムイオンポンプである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記応答タンパク質が、イオンチャンネル、イオン交換タンパク質またはイオンコトランスポーターである、請求項６７に記載の方法。
【請求項７５】
前記イオンチャンネルが、水素イオンチャンネル、ナトリウムイオンチャンネル、カリウムイオンチャンネル、クロライドイオンチャンネル、カルシウムイオンチャンネルまたはカチオンチャンネルである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
活性化用の波長の光に前記細胞を曝露する段階が、細胞内で逆行性または順行性で伝導される活動電位を阻害する、請求項６７に記載の方法。
【請求項７７】
前記病態が、心臓の病態、胃腸の病態、内分泌腺の病態、神経学的病態または精神病態である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７８】
対象における病態を治療する方法であって、
ａ）光に応答して複数の水素イオンが神経細胞の膜を外向きの方向で通過することを可能にするように適合された光活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第１の核酸；及び
ｂ）複数のナトリウムイオンが膜を内向きの方向で通過し、ここで膜を通る複数のナトリウムイオンの通過が膜を脱分極させ、神経細胞の膜中の電圧ゲート型ナトリウムチャンネルを不活性化し、それによって神経学的病態を治療することを可能にすることによって、神経細胞の膜を通る複数の水素イオンの通過に応答する応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第２の核酸
により対象の神経細胞を遺伝学的に改変する段階と；
病態について対象を治療するために、活性化用の波長の光に神経細胞を曝露する段階と
を含む、該方法。
【請求項７９】
前記光活性化タンパク質が水素イオンポンプである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記光活性化タンパク質が水素イオンチャンネルである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記応答タンパク質がナトリウムイオンポンプである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
前記応答タンパク質が、ナトリウムイオンチャンネル、ナトリウムイオン交換タンパク質またはナトリウムイオンコトランスポーターである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８３】
活性化用の波長の光に前記細胞を曝露する段階が、細胞内で逆行性または順行性で伝導される活動電位を阻害する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８４】
前記病態が、心臓の病態、胃腸の病態または神経学的病態である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８５】
神経細胞またはその部分内で逆行性で伝導される活動電位を選択的に阻害する方法であって、
ａ）光に応答して複数の水素イオンが神経細胞の膜を通過することを可能にするように適合された光活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第１の核酸；及び
ｂ）複数のナトリウムイオンが膜を通過し、ここで膜を通るナトリウムイオンの通過が膜を脱分極させ、逆行性で伝導される活動電位を引き起こす神経細胞の膜中の複数の電圧ゲート型ナトリウムチャンネルを不活性化することを可能にすることによって、水素イオンの神経細胞の膜の通過に応答する応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第２の核酸
により神経細胞を遺伝学的に改変する段階と；
その中の逆行性で伝導される活動電位を阻害するために、活性化用の波長の光に神経細胞またはその部分を曝露する段階と
を含む、該方法。
【請求項８６】
前記光活性化タンパク質が水素イオンポンプである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記光活性化タンパク質が水素イオンチャンネルである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記応答タンパク質がナトリウムイオンポンプである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
前記応答タンパク質が、ナトリウムイオンチャンネル、ナトリウムイオン交換タンパク質またはナトリウムイオンコトランスポーターである、請求項８５に記載の方法。
【請求項９０】
光に応答して第１のイオンが細胞膜を通過することを可能にするように適合された光活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第１の核酸と；
第２のイオンが細胞膜を通過することを可能にすることによって第１のイオンの細胞膜の通過に応答する応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第２の核酸と
を含む、キット。
【請求項９１】
前記光活性化タンパク質がイオンポンプである、請求項９０に記載のキット。
【請求項９２】
前記イオンポンプが、水素イオンポンプ、ナトリウムイオンポンプ、カリウムイオンポンプ、クロライドイオンポンプまたはカルシウムイオンポンプである、請求項９１に記載のキット。
【請求項９３】
前記光活性化タンパク質が、イオンチャンネル、イオン交換タンパク質またはイオンコトランスポーターである、請求項９０に記載のキット。
【請求項９４】
前記イオンチャンネルが、水素イオンチャンネル、ナトリウムイオンチャンネル、カリウムイオンチャンネル、クロライドイオンチャンネル、カルシウムイオンチャンネルまたはカチオンチャンネルである、請求項９３に記載のキット。
【請求項９５】
前記応答タンパク質がイオンポンプである、請求項９０に記載のキット。
【請求項９６】
前記イオンポンプが、水素イオンポンプ、ナトリウムイオンポンプ、カリウムイオンポンプ、クロライドイオンポンプまたはカルシウムイオンポンプである、請求項９５に記載のキット。
【請求項９７】
前記応答タンパク質がイオンチャンネルである、請求項９０に記載のキット。
【請求項９８】
前記イオンチャンネルが、水素イオンチャンネル、ナトリウムイオンチャンネル、カリウムイオンチャンネル、クロライドイオンチャンネルまたはカルシウムイオンチャンネルである、請求項９７に記載のキット。
【請求項９９】
光により標的場所を照射するように構成された装置をさらに含む、請求項９０に記載のキット。
【請求項１００】
前記装置が、約３５０〜約７５０ｎｍの範囲の波長を有する光により標的場所を照射するように構成される、請求項９９に記載のキット。
【請求項１０１】
前記装置が、約５３０〜最大約５６０ｎｍの範囲の波長を有する光により標的場所を照射するように構成される、請求項９９に記載のキット。
【請求項１０２】
前記装置が光により標的場所を一定して照射するように構成される、請求項９９に記載のキット。
【請求項１０３】
前記装置が光のパルスにより標的場所を照射するように構成される、請求項９９に記載のキット。
【請求項１０４】
前記装置が光の波長及び／または強度を調節するように構成される、請求項１０２または１０３に記載のキット。
【請求項１０５】
前記装置が光のパルスの周波数及び／または継続期間を調節するように構成される、請求項１０３に記載のキット。
【請求項１０６】
前記装置が使用者インプットに応答して標的場所を照射するように構成される、請求項１０２または１０３に記載のキット。
【請求項１０７】
前記使用者インプットが、光の波長、光の強度、光パルスの継続期間、光パルスの周波数、及び／または標的場所を含む、請求項１０６に記載のキット。
【請求項１０８】
前記装置が対象中に埋込まれるように適合される、請求項９０に記載のキット。
【請求項１０９】
前記標的場所が、細胞、細胞の部分、複数の細胞、神経線維の束、神経筋接合部、中枢神経系（ＣＮＳ）組織、末梢神経系（ＰＮＳ）組織または解剖学的領域である、請求項９０に記載のキット。
【請求項１１０】
ａ）光に応答して第１のイオンが細胞膜を通過することを可能にするように適合された光応答性タンパク質と；
ｂ）第２のイオンが細胞膜を通過することを可能にすることによって第１のイオンの細胞膜の通過に応答する応答タンパク質と
を含む、融合ポリペプチド。
【請求項１１１】
アミノ末端からカルボキシル末端の順序で、
ａ）光に応答して第１のイオンが細胞膜を通過することを可能にするように適合された光応答性タンパク質と；
ｂ）膜トラフィッキングシグナルと；
ｃ）第２のイオンが細胞膜を通過することを可能にすることによって第１のイオンの細胞膜の通過に応答する応答タンパク質と；
ｄ）膜トラフィッキングシグナルと
を含む、請求項１１０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１２】
前記応答タンパク質が、配列番号：１９中で記載されるＡＳＩＣ２ａポリペプチドアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１０または１１１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１３】
前記膜トラフィッキングシグナルがアミノ酸配列
2019194225.tif 000045
を含む、請求項１１１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１４】
小胞体（ＥＲ）搬出シグナルをさらに含む、請求項１１０〜１１３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１５】
前記ＥＲ搬出シグナルがアミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号：４７）を含む、請求項１１４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１６】
前記融合ポリペプチドが、光応答性ポリペプチドと応答タンパク質との間に挿入された、自己切断ポリペプチドを含む、請求項１１０〜１１５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１７】
前記自己切断ポリペプチドがアミノ酸配列
2019194225.tif 000046
を含む、請求項１１６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１８】
請求項１１０〜１１７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項１１９】
請求項１１８に記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。
【請求項１２０】
前記融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、ニューロン特異的転写制御エレメントへ機能的に連結される、請求項１１９に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１２１】
請求項１１９に記載の組換え発現ベクターにより遺伝学的に改変された細胞。
【請求項１２２】
前記細胞がニューロンである、請求項１２１に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年４月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／８１７，２２１号の利益を主張し、その全体は参照として本明細書に援用される。
【０００２】
テキストファイルとして提供される配列リストの参照としての援用
配列リストは、２０１４年４月２９日に生成され、２０８ＫＢのサイズを有する「ＳＴＡＮ−１０３０ＷＯ  ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」テキストファイルとして本明細書に提供される。テキストファイルの内容は、それらの全体が参照として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
緒論
光遺伝学は、機能的でインタクトな生物学的システムと同じペースに保つのに必要な時間的な正確さ（ミリセカンドの時間スケール）による標的細胞における特異的事象の制御に使用される、遺伝学的方法と光学的方法の組み合わせを指す。光遺伝学は、標的細胞の原形質膜の中へ、迅速な光応答性のイオンチャンネルまたはポンプタンパク質を導入して、特異的標的化メカニズム（組織特異的プロモーター等）の使用を介して細胞タイプの解像度を維持しながら、膜電位の時間的に正確な操作を可能にすることを含む。
【０００４】
光遺伝学的な電気的阻害における主な制限となる工程は、既存のツールがインプット抵抗変化を引き起こさないこと、および既存のイオンポンプタンパク質は１つの光子あたり１つのイオンのみを移動させるので、比較的弱い光電流しか生成しないということである。反対に、光遺伝学的な興奮における主な制限となる工程は、標的細胞の突起（軸索等）を興奮させる場合、逆行性で伝導される活動電位が細胞体へ戻り得、また、側枝の細胞突起に下り得、それによって特異性が低下することである。それゆえ、標的細胞における活動電位の阻害及び／または遮断に使用され、それによって光遺伝学的技術の使用の可能性を広げることができる装置、システム及び方法についての必要性がある。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本開示の態様には、標的細胞における活動電位の光遺伝学的調節のための装置、システム及び方法が含まれる。発明対象の装置は、光生成装置、制御装置、及び標的細胞へベクターを送達するための送達装置を含む。発明対象のシステムは、光活性化タンパク質、応答タンパク質、これらのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に加えて、標的細胞におけるこれらのタンパク質の発現を促進する発現システムを含む。発明対象の装置及びシステムを使用して、標的細胞における活動電位を光遺伝学的に阻害及び遮断する（例えば、ヒトまたは非ヒト動物対象における神経または精神の病態を治療する）方法も提供される。
[本発明1001]
細胞の膜電位の調節のためのシステムであって、
光に応答して第1のイオンが細胞膜を通過することを可能にするように適合された光活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第1の核酸と；
第2のイオンが細胞膜を通過することを可能にすることによって第1のイオンの細胞膜の通過に応答する応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第2の核酸と；
光により標的場所を照射するように構成された装置と
を含む、該システム。
[本発明1002]
前記光活性化タンパク質がイオンポンプである、本発明1001のシステム。
[本発明1003]
前記イオンポンプが、水素イオンポンプ、ナトリウムイオンポンプ、カリウムイオンポンプ、クロライドイオンポンプまたはカルシウムイオンポンプである、本発明1002のシステム。
[本発明1004]
前記光活性化タンパク質がイオンチャンネルである、本発明1001のシステム。
[本発明1005]
前記イオンチャンネルが、水素イオンチャンネル、ナトリウムイオンチャンネル、カリウムイオンチャンネル、クロライドイオンチャンネルまたはカルシウムイオンチャンネルである、本発明1004のシステム。
[本発明1006]
前記応答タンパク質がイオンポンプである、本発明1001のシステム。
[本発明1007]
前記イオンポンプが、水素イオンポンプ、ナトリウムイオンポンプ、カリウムイオンポンプ、クロライドイオンポンプまたはカルシウムイオンポンプである、本発明1006のシステム。
[本発明1008]
前記応答タンパク質が、イオンチャンネル、イオン交換タンパク質またはイオンコトランスポーターである、本発明1001のシステム。
[本発明1009]
前記イオンチャンネルが、水素イオンチャンネル、ナトリウムイオンチャンネル、カリウムイオンチャンネル、クロライドイオンチャンネル、カルシウムイオンチャンネルまたはカチオンチャンネルである、本発明1008のシステム。
[本発明1010]
前記装置が、約350〜約750ｎｍの範囲の波長を有する光により標的場所を照射するように構成される、本発明1001のシステム。
[本発明1011]
前記装置が、約530〜最大約560ｎｍの範囲の波長を有する光により標的場所を照射するように構成される、本発明1010のシステム。
[本発明1012]
前記装置が光により標的場所を一定して照射するように構成される、本発明1001のシステム。
[本発明1013]
前記装置が光のパルスにより標的場所を照射するように構成される、本発明1001のシステム。
[本発明1014]
前記装置が光の波長及び／または強度を調節するように構成される、本発明1012または1013のシステム。
[本発明1015]
前記装置が光のパルスの周波数及び／または継続期間を調節するように構成される、本発明1013のシステム。
[本発明1016]
前記装置が使用者インプットに応答して標的場所を照射するように構成される、本発明1012または1013のシステム。
[本発明1017]
前記使用者インプットが、光の波長、光の強度、光パルスの継続期間、光パルスの周波数、及び／または標的場所を含む、本発明1016のシステム。
[本発明1018]
前記装置が対象中に埋込まれるように適合される、本発明1001のシステム。
[本発明1019]
前記標的場所が、細胞、細胞の部分、複数の細胞、神経線維の束、神経筋接合部、中枢神経系（ＣＮＳ）組織、末梢神経系（ＰＮＳ）組織または解剖学的領域である、本発明1001のシステム。
[本発明1020]
前記第1の核酸及び前記第2の核酸が単一の発現ベクター内に存在する、本発明1001のシステム。
[本発明1021]
光に応答して第1のイオンが細胞膜を通過することを可能にするように適合された光活性化タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、ニューロン特異的転写制御エレメントへ機能的に連結される、本発明1001のシステム。
[本発明1022]
第2のイオンが細胞膜を通過することを可能にすることによって第1のイオンの細胞膜の通過に応答する応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む前記第2の核酸が、ニューロン特異的転写制御エレメントへ機能的に連結される、本発明1001のシステム。
[本発明1023]
光に応答して第1のイオンが細胞膜を通過することを可能にするように適合された光活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第1の核酸と；
第2のイオンが細胞膜を通過することを可能にすることによって第1のイオンの細胞膜の通過に応答する応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第2の核酸と
を含む、医薬組成物。
[本発明1024]
前記光活性化タンパク質がイオンポンプである、本発明1023の組成物。
[本発明1025]
前記イオンポンプが、水素イオンポンプ、ナトリウムイオンポンプ、カリウムイオンポンプ、クロライドイオンポンプまたはカルシウムイオンポンプである、本発明1024の組成物。
[本発明1026]
前記光活性化タンパク質がイオンチャンネルである、本発明1021の組成物。
[本発明1027]
前記イオンチャンネルが、水素イオンチャンネル、ナトリウムイオンチャンネル、カリウムイオンチャンネル、クロライドイオンチャンネルまたはカルシウムイオンチャンネルである、本発明1026の組成物。
[本発明1028]
前記応答タンパク質がイオンポンプである、本発明1023の組成物。
[本発明1029]
前記イオンポンプが、水素イオンポンプ、ナトリウムイオンポンプ、カリウムイオンポンプ、クロライドイオンポンプまたはカルシウムイオンポンプである、本発明1028の組成物。
[本発明1030]
前記応答タンパク質が、イオンチャンネル、イオン交換タンパク質またはイオンコトランスポーターである、本発明1023の組成物。
[本発明1031]
前記イオンチャンネルが、水素イオンチャンネル、ナトリウムイオンチャンネル、カリウムイオンチャンネル、クロライドイオンチャンネル、カルシウムイオンチャンネルまたはカチオンチャンネルである、本発明1030の組成物。
[本発明1032]
前記第1の核酸及び前記第2の核酸が単一の発現ベクター内に存在する、本発明1023の組成物。
[本発明1033]
光に応答して第1のイオンが細胞膜を通過することを可能にするように適合された光活性化タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、ニューロン特異的転写制御エレメントへ機能的に連結される、本発明1023の組成物。
[本発明1034]
第2のイオンが細胞膜を通過することを可能にすることによって第1のイオンの細胞膜の通過に応答する応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む前記第2の核酸が、ニューロン特異的転写制御エレメントへ機能的に連結される、本発明1023の組成物。
[本発明1035]
光に応答して第1のイオンが細胞膜を通過することを可能にするように適合された光活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第1の核酸と；
第2のイオンが細胞膜を通過することを可能にすることによって第1のイオンの細胞膜の通過に応答する応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第2の核酸と
を含む、細胞。
[本発明1036]
前記光活性化タンパク質がイオンポンプである、本発明1035の細胞。
[本発明1037]
前記イオンポンプが、水素イオンポンプ、ナトリウムイオンポンプ、カリウムイオンポンプ、クロライドイオンポンプまたはカルシウムイオンポンプである、本発明1036の細胞。
[本発明1038]
前記光活性化タンパク質がイオンチャンネルである、本発明1035の細胞。
[本発明1039]
前記イオンチャンネルが、水素イオンチャンネル、ナトリウムイオンチャンネル、カリウムイオンチャンネル、クロライドイオンチャンネルまたはカルシウムイオンチャンネルである、本発明1038の細胞。
[本発明1040]
前記応答タンパク質がイオンポンプである、本発明1035の細胞。
[本発明1041]
前記イオンポンプが、水素イオンポンプ、ナトリウムイオンポンプ、カリウムイオンポンプ、クロライドイオンポンプまたはカルシウムイオンポンプである、本発明1040の細胞。
[本発明1042]
前記応答タンパク質が、イオンチャンネル、イオン交換タンパク質またはイオンコトランスポーターである、本発明1035の細胞。
[本発明1043]
前記イオンチャンネルが、水素イオンチャンネル、ナトリウムイオンチャンネル、カリウムイオンチャンネル、クロライドイオンチャンネル、カルシウムイオンチャンネルまたはカチオンチャンネルである、本発明1042の細胞。
[本発明1044]
前記第1の核酸及び前記第2の核酸が単一の発現ベクター内に存在する、本発明1035の細胞。
[本発明1045]
光に応答して第1のイオンが細胞膜を通過することを可能にするように適合された光活性化タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、ニューロン特異的転写制御エレメントへ機能的に連結される、本発明1035の細胞。
[本発明1046]
第2のイオンが細胞膜を通過することを可能にすることによって第1のイオンの細胞膜の通過に応答する応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む前記第2の核酸が、ニューロン特異的転写制御エレメントへ機能的に連結される、本発明1035の細胞。
[本発明1047]
光に応答して細胞の膜電位を調節する方法であって、活性化用の波長の光に細胞を曝露する段階を含み、細胞が、
ａ）光に応答して第1のイオンが細胞膜を通過することを可能にするように適合された光活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第1の核酸と；
ｂ）第2のイオンが細胞膜を通過することを可能にすることによって第1のイオンの細胞膜の通過に応答する応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第2の核酸と
により遺伝学的に改変される、該方法。
[本発明1048]
前記光活性化タンパク質がイオンポンプである、本発明1047の方法。
[本発明1049]
前記イオンポンプが、水素イオンポンプ、ナトリウムイオンポンプ、カリウムイオンポンプ、クロライドイオンポンプまたはカルシウムイオンポンプである、本発明1048の方法。
[本発明1050]
前記光活性化タンパク質がイオンチャンネルである、本発明1047の方法。
[本発明1051]
前記イオンチャンネルが、水素イオンチャンネル、ナトリウムイオンチャンネル、カリウムイオンチャンネル、クロライドイオンチャンネルまたはカルシウムイオンチャンネルである、本発明1050の方法。
[本発明1052]
前記応答タンパク質がイオンポンプである、本発明1047の方法。
[本発明1053]
前記イオンポンプが、水素イオンポンプ、ナトリウムイオンポンプ、カリウムイオンポンプ、クロライドイオンポンプまたはカルシウムイオンポンプである、本発明1052の方法。
[本発明1054]
前記応答タンパク質が、イオンチャンネル、イオン交換タンパク質またはイオンコトランスポーターである、本発明1047の方法。
[本発明1055]
前記イオンチャンネルが、水素イオンチャンネル、ナトリウムイオンチャンネル、カリウムイオンチャンネル、クロライドイオンチャンネル、カルシウムイオンチャンネルまたはカチオンチャンネルである、本発明1054の方法。
[本発明1056]
活性化用の波長の光に前記細胞を曝露する段階が、細胞内で、逆行性で伝導される活動電位を阻害する、本発明1047の方法。
[本発明1057]
光に応答して細胞中の電圧ゲート型ナトリウムチャンネルの活性を阻害する方法であって、活性化用の波長の光に細胞を曝露する段階を含み、細胞が、
ａ）光に応答して複数の水素イオンが細胞膜を外向きの方向で通過することを可能にするように適合された光活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第1の核酸と；
ｂ）複数のナトリウムイオンが細胞膜を内向きの方向で通過することを可能にし、細胞膜の持続的脱分極を引き起こし、それによって電圧ゲート型ナトリウムイオンチャンネルを不活性化し、その活性を阻害することによって、細胞膜の外部表面上またはその付近での水素イオンの存在に応答する応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第2の核酸と
により遺伝学的に改変される、該方法。
[本発明1058]
前記光活性化タンパク質がイオンポンプである、本発明1057の方法。
[本発明1059]
前記イオンポンプが、水素イオンポンプ、ナトリウムイオンポンプ、カリウムイオンポンプ、クロライドイオンポンプまたはカルシウムイオンポンプである、本発明1058の方法。
[本発明1060]
前記光活性化タンパク質がイオンチャンネルである、本発明1057の方法。
[本発明1061]
前記イオンチャンネルが、水素イオンチャンネル、ナトリウムイオンチャンネル、カリウムイオンチャンネル、クロライドイオンチャンネルまたはカルシウムイオンチャンネルである、本発明1060の方法。
[本発明1062]
前記応答タンパク質がイオンポンプである、本発明1057の方法。
[本発明1063]
前記イオンポンプが、水素イオンポンプ、ナトリウムイオンポンプ、カリウムイオンポンプ、クロライドイオンポンプまたはカルシウムイオンポンプである、本発明1062の方法。
[本発明1064]
前記応答タンパク質が、イオンチャンネル、イオン交換タンパク質またはイオンコトランスポーターである、本発明1057の方法。
[本発明1065]
前記イオンチャンネルが、水素イオンチャンネル、ナトリウムイオンチャンネル、カリウムイオンチャンネル、クロライドイオンチャンネル、カルシウムイオンチャンネルまたはカチオンチャンネルである、本発明1064の方法。
[本発明1066]
活性化用の波長の光に前記細胞を曝露する段階が、細胞内で逆行性または順行性で伝導される活動電位を阻害する、本発明1057の方法。
[本発明1067]
対象における病態を治療する方法であって、
ａ）光に応答して第1のイオンが標的細胞の膜を通過することを可能にするように適合された光活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第1の核酸；及び
ｂ）第2のイオンが標的細胞の膜を通過しここで該膜を通る第2のイオンの通過が病態を治療することを可能にすることによって、第1のイオンの該膜の通過に応答する応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第2の核酸
により対象の標的細胞を遺伝学的に改変する段階と；
病態について対象を治療するために、活性化用の波長の光に標的細胞を曝露する段階と
を含む、該方法。
[本発明1068]
前記光活性化タンパク質がイオンポンプである、本発明1067の方法。
[本発明1069]
前記イオンポンプが、水素イオンポンプ、ナトリウムイオンポンプ、カリウムイオンポンプ、クロライドイオンポンプまたはカルシウムイオンポンプである、本発明1068の方法。
[本発明1070]
前記光活性化タンパク質がイオンチャンネルである、本発明1067の方法。
[本発明1071]
前記イオンチャンネルが、水素イオンチャンネル、ナトリウムイオンチャンネル、カリウムイオンチャンネル、クロライドイオンチャンネルまたはカルシウムイオンチャンネルである、本発明1070の方法。
[本発明1072]
前記応答タンパク質がイオンポンプである、本発明1067の方法。
[本発明1073]
前記イオンポンプが、水素イオンポンプ、ナトリウムイオンポンプ、カリウムイオンポンプ、クロライドイオンポンプまたはカルシウムイオンポンプである、本発明1072の方法。
[本発明1074]
前記応答タンパク質が、イオンチャンネル、イオン交換タンパク質またはイオンコトランスポーターである、本発明1067の方法。
[本発明1075]
前記イオンチャンネルが、水素イオンチャンネル、ナトリウムイオンチャンネル、カリウムイオンチャンネル、クロライドイオンチャンネル、カルシウムイオンチャンネルまたはカチオンチャンネルである、本発明1074の方法。
[本発明1076]
活性化用の波長の光に前記細胞を曝露する段階が、細胞内で逆行性または順行性で伝導される活動電位を阻害する、本発明1067の方法。
[本発明1077]
前記病態が、心臓の病態、胃腸の病態、内分泌腺の病態、神経学的病態または精神病態である、本発明1067の方法。
[本発明1078]
対象における病態を治療する方法であって、
ａ）光に応答して複数の水素イオンが神経細胞の膜を外向きの方向で通過することを可能にするように適合された光活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第1の核酸；及び
ｂ）複数のナトリウムイオンが膜を内向きの方向で通過し、ここで膜を通る複数のナトリウムイオンの通過が膜を脱分極させ、神経細胞の膜中の電圧ゲート型ナトリウムチャンネルを不活性化し、それによって神経学的病態を治療することを可能にすることによって、神経細胞の膜を通る複数の水素イオンの通過に応答する応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第2の核酸
により対象の神経細胞を遺伝学的に改変する段階と；
病態について対象を治療するために、活性化用の波長の光に神経細胞を曝露する段階と
を含む、該方法。
[本発明1079]
前記光活性化タンパク質が水素イオンポンプである、本発明1078の方法。
[本発明1080]
前記光活性化タンパク質が水素イオンチャンネルである、本発明1078の方法。
[本発明1081]
前記応答タンパク質がナトリウムイオンポンプである、本発明1078の方法。
[本発明1082]
前記応答タンパク質が、ナトリウムイオンチャンネル、ナトリウムイオン交換タンパク質またはナトリウムイオンコトランスポーターである、本発明1078の方法。
[本発明1083]
活性化用の波長の光に前記細胞を曝露する段階が、細胞内で逆行性または順行性で伝導される活動電位を阻害する、本発明1078の方法。
[本発明1084]
前記病態が、心臓の病態、胃腸の病態または神経学的病態である、本発明1078の方法。
[本発明1085]
神経細胞またはその部分内で逆行性で伝導される活動電位を選択的に阻害する方法であって、
ａ）光に応答して複数の水素イオンが神経細胞の膜を通過することを可能にするように適合された光活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第1の核酸；及び
ｂ）複数のナトリウムイオンが膜を通過し、ここで膜を通るナトリウムイオンの通過が膜を脱分極させ、逆行性で伝導される活動電位を引き起こす神経細胞の膜中の複数の電圧ゲート型ナトリウムチャンネルを不活性化することを可能にすることによって、水素イオンの神経細胞の膜の通過に応答する応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第2の核酸
により神経細胞を遺伝学的に改変する段階と；
その中の逆行性で伝導される活動電位を阻害するために、活性化用の波長の光に神経細胞またはその部分を曝露する段階と
を含む、該方法。
[本発明1086]
前記光活性化タンパク質が水素イオンポンプである、本発明1085の方法。
[本発明1087]
前記光活性化タンパク質が水素イオンチャンネルである、本発明1085の方法。
[本発明1088]
前記応答タンパク質がナトリウムイオンポンプである、本発明1085の方法。
[本発明1089]
前記応答タンパク質が、ナトリウムイオンチャンネル、ナトリウムイオン交換タンパク質またはナトリウムイオンコトランスポーターである、本発明1085の方法。
[本発明1090]
光に応答して第1のイオンが細胞膜を通過することを可能にするように適合された光活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第1の核酸と；
第2のイオンが細胞膜を通過することを可能にすることによって第1のイオンの細胞膜の通過に応答する応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第2の核酸と
を含む、キット。
[本発明1091]
前記光活性化タンパク質がイオンポンプである、本発明1090のキット。
[本発明1092]
前記イオンポンプが、水素イオンポンプ、ナトリウムイオンポンプ、カリウムイオンポンプ、クロライドイオンポンプまたはカルシウムイオンポンプである、本発明1091のキット。
[本発明1093]
前記光活性化タンパク質が、イオンチャンネル、イオン交換タンパク質またはイオンコトランスポーターである、本発明1090のキット。
[本発明1094]
前記イオンチャンネルが、水素イオンチャンネル、ナトリウムイオンチャンネル、カリウムイオンチャンネル、クロライドイオンチャンネル、カルシウムイオンチャンネルまたはカチオンチャンネルである、本発明1093のキット。
[本発明1095]
前記応答タンパク質がイオンポンプである、本発明1090のキット。
[本発明1096]
前記イオンポンプが、水素イオンポンプ、ナトリウムイオンポンプ、カリウムイオンポンプ、クロライドイオンポンプまたはカルシウムイオンポンプである、本発明1095のキット。
[本発明1097]
前記応答タンパク質がイオンチャンネルである、本発明1090のキット。
[本発明1098]
前記イオンチャンネルが、水素イオンチャンネル、ナトリウムイオンチャンネル、カリウムイオンチャンネル、クロライドイオンチャンネルまたはカルシウムイオンチャンネルである、本発明1097のキット。
[本発明1099]
光により標的場所を照射するように構成された装置をさらに含む、本発明1090のキット。
[本発明1100]
前記装置が、約350〜約750ｎｍの範囲の波長を有する光により標的場所を照射するように構成される、本発明1099のキット。
[本発明1101]
前記装置が、約530〜最大約560ｎｍの範囲の波長を有する光により標的場所を照射するように構成される、本発明1099のキット。
[本発明1102]
前記装置が光により標的場所を一定して照射するように構成される、本発明1099のキット。
[本発明1103]
前記装置が光のパルスにより標的場所を照射するように構成される、本発明1099のキット。
[本発明1104]
前記装置が光の波長及び／または強度を調節するように構成される、本発明1102または1103のキット。
[本発明1105]
前記装置が光のパルスの周波数及び／または継続期間を調節するように構成される、本発明1103のキット。
[本発明1106]
前記装置が使用者インプットに応答して標的場所を照射するように構成される、本発明1102または1103のキット。
[本発明1107]
前記使用者インプットが、光の波長、光の強度、光パルスの継続期間、光パルスの周波数、及び／または標的場所を含む、本発明1106のキット。
[本発明1108]
前記装置が対象中に埋込まれるように適合される、本発明1090のキット。
[本発明1109]
前記標的場所が、細胞、細胞の部分、複数の細胞、神経線維の束、神経筋接合部、中枢神経系（ＣＮＳ）組織、末梢神経系（ＰＮＳ）組織または解剖学的領域である、本発明1090のキット。
[本発明1110]
ａ）光に応答して第1のイオンが細胞膜を通過することを可能にするように適合された光応答性タンパク質と；
ｂ）第2のイオンが細胞膜を通過することを可能にすることによって第1のイオンの細胞膜の通過に応答する応答タンパク質と
を含む、融合ポリペプチド。
[本発明1111]
アミノ末端からカルボキシル末端の順序で、
ａ）光に応答して第1のイオンが細胞膜を通過することを可能にするように適合された光応答性タンパク質と；
ｂ）膜トラフィッキングシグナルと；
ｃ）第2のイオンが細胞膜を通過することを可能にすることによって第1のイオンの細胞膜の通過に応答する応答タンパク質と；
ｄ）膜トラフィッキングシグナルと
を含む、本発明1110の融合ポリペプチド。
[本発明1112]
前記応答タンパク質が、配列番号：19中で記載されるＡＳＩＣ2ａポリペプチドアミノ酸配列と、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1110または1111の融合ポリペプチド。
[本発明1113]
前記膜トラフィッキングシグナルがアミノ酸配列
2019194225.tif 000002
を含む、本発明1111の融合ポリペプチド。
[本発明1114]
小胞体（ＥＲ）搬出シグナルをさらに含む、本発明1110〜1113のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1115]
前記ＥＲ搬出シグナルがアミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号：47）を含む、本発明1114の融合ポリペプチド。
[本発明1116]
前記融合ポリペプチドが、光応答性ポリペプチドと応答タンパク質との間に挿入された、自己切断ポリペプチドを含む、本発明1110〜1115のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1117]
前記自己切断ポリペプチドがアミノ酸配列
2019194225.tif 000003
を含む、本発明1116の融合ポリペプチド。
[本発明1118]
本発明1110〜1117のいずれかの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
[本発明1119]
本発明1118の核酸を含む、組換え発現ベクター。
[本発明1120]
前記融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、ニューロン特異的転写制御エレメントへ機能的に連結される、本発明1119の組換え発現ベクター。
[本発明1121]
本発明1119の組換え発現ベクターにより遺伝学的に改変された細胞。
[本発明1122]
前記細胞がニューロンである、本発明1121の細胞。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】発明対象の光遺伝学的システムの図式的な表現であり、神経細胞の膜中に存在する光活性化タンパク質（ｅＡｒｃｈ３．０）及び応答タンパク質（ｅＡＳＩＣ２ａまたはＡＳＩＣ２ａ）を示す。細胞が示された波長の光により照射された後の時間の関数としての膜電流、及び時間の関数としての誘発活動電位スパイキング（膜電圧）に対する光の影響も図示される。
【図２】ＡＳＩＣ２ａ電流が大きい場合の誘発活動電位発火に対する光の影響を図示する複数のグラフを示す。グラフは、電気的誘発活動電位スパイキングの間の、神経細胞が示された波長の光により照射される時間の関数としての、ｅＡｒｃｈ−ＡＳＩＣ２ａ発現神経細胞の膜電圧の事例を示す。
【図３】ＡＳＩＣ２ａ電流が大きい場合の誘発活動電位発火に対する光の影響を図示する複数のグラフを示す。グラフは、電気的誘発活動電位スパイキングの間の、神経細胞が示された波長の光により照射される時間の関数としての、ｅＡｒｃｈ−ｅＡＳＩＣ２ａ発現神経細胞の膜電圧の事例を示す。
【図４】ＡＳＩＣ２ａ電流が小さい場合の誘発活動電位発火に対する光の影響を図示する複数のグラフを示す。グラフは、電気的誘発活動電位スパイキングの間の、神経細胞が示された波長の光により照射される時間の関数としての、ｅＡｒｃｈ−ｅＡＳＩＣ２ａ発現神経細胞の膜電圧の事例を示す。
【図５】Ａｒｃｈ配列（Ａｒｃｈ）、トラフィッキング配列（ＴＳ）、リボソームスキップ配列（ｐ２Ａ）、ＡＳＩＣ２ａ配列（ＡＳＩＣ２ａ）、黄色蛍光タンパク質配列（ＥＹＦＰ）を含有する事例のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
【図６】Ａｒｃｈ配列（Ａｒｃｈ）、トラフィッキング配列（ＴＳ）、リボソームスキップ配列（ｐ２Ａ）、ＡＳＩＣ２ａ配列（ＡＳＩＣ２ａ）、トラフィッキング配列（ＴＳ）、黄色蛍光タンパク質配列（ＥＹＦＰ）、小胞体搬出配列（ＥＲ）を含有する事例のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
【図７】Ａｒｃｈ配列、ＡＳＩＣ２ａ配列に加えて、追加の構成要素（ＣａＭＫＩＩａプロモーター等）を含有する事例のベクターのマップを示す。
【図８】Ａｒｃｈ配列、ＡＳＩＣ２ａ配列に加えて、追加の構成要素（ｈＳｙｎプロモーター等）を含有する事例のベクターのマップを示す。
【図９】本開示の実施形態に従う光学的刺激システムの第１の事例を示す。
【図１０】本開示の実施形態に従う光学的刺激システムの第２の事例を示す。
【図１１】本開示の実施形態に従う光学的刺激システムの第３の事例を示す。
【図１２】本開示の実施形態に従う事例の方法の工程を図示するフローチャートを示す。
【図１３−１】図１３Ａ〜Ｋは、様々な光応答性タンパク質のアミノ酸配列を提供する。
【図１３−２】図１３−１に記載の通り。
【図１３−３】図１３−１に記載の通り。
【図１３−４】図１３−１に記載の通り。
【図１３−５】図１３−１に記載の通り。
【図１３−６】図１３−１に記載の通り。
【図１３−７】図１３−１に記載の通り。
【図１３−８】図１３−１に記載の通り。
【図１３−９】図１３−１に記載の通り。
【図１４−１】図１４Ａ〜Ｈは、例示的な応答タンパク質のアミノ酸配列を提供する。
【図１４−２】図１４−１に記載の通り。
【図１４−３】図１４−１に記載の通り。
【図１４−４】図１４−１に記載の通り。
【図１４−５】図１４−１に記載の通り。
【図１４−６】図１４−１に記載の通り。
【図１４−７】図１４−１に記載の通り。
【図１５−１】図１５Ａ〜Ｌは、バイスタンダー効果の同定及び説明を図示する。
【図１５−２】図１５−１に記載の通り。
【図１５−３】図１５−１に記載の通り。
【図１５−４】図１５−１に記載の通り。
【図１５−５】図１５−１に記載の通り。
【図１５−６】図１５−１に記載の通り。
【図１６】ＣｈＲ２発現細胞の光電流とＣｈＲ２バイスタンダーの電流との間の速度論的差異を示すトレースを図示する（破線のボックスは、両方のトレースの最初の０．５秒に関する拡大図を示す）。
【図１７Ａ】オプシン発現ニューロンについての光電流の大きさ及びトレースを図示する。
【図１７Ｂ】オプシン発現ニューロンについての光電流の大きさ及びトレースを図示する。
【図１８−１】図１８Ａ〜Ｄは、反復する光のオフと光のオンの時期の間に成功して誘発されたスパイクのパーセンテージとして測定された活動電位発火に対するバイスタンダー電流の機能的影響を図示する。
【図１８−２】図１８−１に記載の通り。
【図１９−１】図１９Ａ〜Ｇは、電気刺激誘発性のバイスタンダー効果及びＡＳＩＣアンタゴニストのアミロライド投与の効果を図示する。
【図１９−２】図１９−１に記載の通り。
【図１９−３】図１９−１に記載の通り。
【図２０】タングステン同心双極電極を使用する、Ｓｃｈａｆｆｅｒ側枝から海馬のＣＡ１領域への電気刺激に応答する例示的なバイスタンダー電流を図示する。
【図２１】図２１Ａ〜Ｃは、アミロライド投与に関する対照実験を図示する。
【図２２】図２２Ａ〜Ｃは、バイスタンダーニューロンについての細胞健全性の測定値を図示する。
【図２３−１】図２３Ａ〜Ｄは、２構成要素の光遺伝学的（ＴＣＯ）アプローチを使用する、３つの酸感受性イオンチャンネルの光学的活性化を図示する。
【図２３−２】図２３−１に記載の通り。
【図２４−１】図２４Ａ〜Ｅは、クロレラロドプシン（ＣｓＲ）の光電流及び関連する電流の定量化を図示する。
【図２４−２】図２４−１に記載の通り。
【図２５−１】図２５Ａ〜Ｅはアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞における永続的潅流の有無によるＣｓＲ−ＡＳＩＣ１ａ光電流及び関連する定量化を図示する。
【図２５−２】図２５−１に記載の通り。
【図２５−３】図２５−１に記載の通り。
【図２６−１】図２６Ａ〜Ｅは、卵母細胞において２電極電圧クランプ（ＴＥＶＣ）によって測定されたＣｓＲ−ＡＳＩＣ２ａ光電流に対する様々なパラメーター（ｐＨ、緩衝液、光強度など）の効果を図示する。
【図２６−２】図２６−１に記載の通り。
【図２６−３】図２６−１に記載の通り。
【図２７−１】図２７Ａ〜Ｈは、海馬ニューロン中のｅＡｒｃｈ３．０−ＡＳＩＣ２ａ（Ｃｈａｍｐ）の発現、かかるニューロン中の光電流、及び関連する定量化を図示する。
【図２７−２】図２７−１に記載の通り。
【図２７−３】図２７−１に記載の通り。
【図２７−４】図２７−１に記載の通り。
【図２８−１】図２８Ａ〜Ｆは、培養された海馬ニューロンにおけるＡＳＩＣ２ａ構成要素の可変的な存在の様々な測定値を図示する。
【図２８−２】図２８−１に記載の通り。
【図２８−３】図２８−１に記載の通り。
【図２９】図２９Ａ〜Ｂは、Ｃｈａｍｐ電流及び速度に対する光パルス継続期間の効果を図示する。
【図３０−１】図３０Ａ〜Ｆは、Ｃｈａｍｐ光電流に対するタイロード液中のＨＥＰＥＳ濃度の効果を図示する。
【図３０−２】図３０−１に記載の通り。
【図３０−３】図３０−１に記載の通り。
【図３１】図３１Ａ〜Ｂは、継続期間を増加させた光パルスに応答したＣｈａｍｐ媒介性の膜の過分極及び脱分極を図示する。
【図３２−１】図３２Ａ〜Ｄは、４つのＣｈａｍｐ構成の一対一の比較において構成要素の間の分子的距離を増加させる効果を図示する。
【図３２−２】図３２−１に記載の通り。
【図３２−３】図３２−１に記載の通り。
【図３３−１】図３３Ａ〜Ｄは、プロトンポンプとＡＳＩＣとの間の分子的分離を増加させた４つの異なるＣｈａｍｐ構成にわたる細胞健全性の様々な測定値を図示する。
【図３３−２】図３３−１に記載の通り。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
定義
本明細書において使用される時、「個体」、「対象」または「患者」は、ヒトを含む哺乳類であり得る。哺乳類には、有蹄動物、イヌ科の動物、ネコ科の動物、ウシ属の動物、ヒツジ属の動物、非ヒトの霊長目の動物、ウサギ目の動物（例えばウサギ）、齧歯目の動物（例えばマウス及びラット）が含まれるが、これらに限定されない。一態様において、個体はヒトである。別の態様において、個体は非ヒト哺乳類である。
【０００８】
生来のタンパク質配列におけるアミノ酸置換は「保存的」または「非保存的」であり、かかる置換アミノ酸残基は遺伝コードによってコードされたものであってもなくてもよい。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が化学的に類似する側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられることである（すなわち塩基性側鎖を持つアミノ酸を、塩基性側鎖を備えた別のアミノ酸に置き換えること）。「非保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が化学的に異なる側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられることである（すなわち塩基性側鎖を有するアミノ酸を、芳香族側鎖を有するアミノ酸に置き換えること）。基準の２０アミノ酸の「アルファベット」は、それらの側鎖の化学的特性に基づいた化学的ファミリーへと分けられる。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族基を有する側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を備えたアミノ酸が含まれる。
【０００９】
本明細書において使用される時、薬物、化合物または医薬組成物の「効果的な投薬量」または「効果的な量」とは、有益な効果または所望される結果に対して十分な量である。予防的使用のために、有益であるかまたは所望される結果には、疾患（疾患の生化学的、組織学的及び／または行動的症状、その合併症、ならびに疾患の発症の間に提示される中間の病理学的表現型を含む）のリスクを消失もしくは低下させること、重症度を軽減させること、または発症を遅延させること等の結果が含まれる。治療法的使用のために、有益であるかまたは所望される結果には、疾患からもたらされる１つまたは複数の症状を減少させること、疾患を患う者のＱＯＬを増加させること、疾患を治療するのに要求される他の医薬物の用量を減少させること、標的化等によって別の医薬物の効果を促進すること、疾患の進行を遅延させること、及び／または生存を延長すること等の臨床結果が含まれる。効果的な投薬量は１つまたは複数の投与で投与することができる。本開示の目的のために、薬物、化合物または医薬組成物の効果的な投薬量は、予防的または治療法的な治療を直接または間接的に遂行するのに十分な量である。臨床的な文脈において理解されるように、薬物、化合物または医薬組成物の効果的な投薬量は、別の薬物、化合物または医薬組成物と併用して達成されるかまたは達成されなくてもよい。したがって、「効果的な投薬量」は１つまたは複数の治療法用の薬剤を投与する文脈において判断することができ、単一の薬剤は、１つまたは複数の他の薬剤と併用して、所望される結果が達成され得るかまたは達成されるならば、効果的な量で与えられていると判断することができる。
【００１０】
本明細書において使用される時、「治療」または「治療すること」は、臨床結果を含む、有益または所望される結果を得るためのアプローチである。本開示の目的のために、有益または所望される臨床結果には、以下の、疾患からもたらされる症状を減少させること、疾患を患う者のＱＯＬを増加させること、疾患を治療するのに要求される他の医薬物の用量を減少させること、疾患の進行を遅延させること、及び／または個体の生存を延長させることのうちの１つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない。
【００１１】
本発明がより詳しく記述される前に、記述される特定の実施形態は当然変動し得るので、本発明はかかるものに限定されないことを理解すべきである。本発明の範囲は添付の請求項によってのみ限定されるので、本明細書において使用される用語は特定の実施形態を記述するのみの目的のためのものであり、限定することを意図しないことも理解すべきである。
【００１２】
値の範囲が提供される場合、間に入る各々の値は、文脈が明確に指示しない限り下限の単位の１０分の１まで、その範囲の上限及び下限とその明示された範囲内の任意の他の明示された値または間に入る値との間で、本発明内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、より小さい範囲で独立して含まれてもよく、本発明内に包含されるが、但し明示された範囲における限界が具体的に除外される場合もある。明示された範囲に限界の１つまたは両方が含まれる場合には、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除外した範囲も本発明中に含まれる。
【００１３】
特定の範囲は、用語「約」が先行している数値により本明細書において提示される。「約」という用語は、本明細書において、それが先行する正確な数についての文字どおりの支持に加えて、その用語が先行する数の近くまたは近似する数を提供するように使用される。ある数が具体的に列挙された数の近くまたは近似するかどうかの決定において、近いかまたは近似する列挙されていない数は、それが提示される文脈において、具体的に列挙された数の実質的な均等物を提供する数であり得る。
【００１４】
特別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実践または試験において、本明細書において記述されたものに類似または同等の任意の方法及び材料を使用することができるが、代表的な例示的な方法及び材料がここで記述される。
【００１５】
本明細書において引用されるすべての出版物及び特許は、あたかも各々の個別の出版物または特許が参照として援用されることが具体的に個別に示されたかのように、参照として本明細書に援用され、引用された出版物に関連した方法及び／または材料を開示及び記述するために参照として本明細書に援用される。任意の出版物の引用は申請日の前に開示されているものについてであり、本発明が、従来の発明のおかげでかかる出版物に先行する権利がないことの承認として解釈されるべきではない。さらに、提供される出版物の日付は実際の出版日とは異なってもよく、それは独立して確認される必要があるだろう。
【００１６】
本明細書及び添付の請求項において使用される時、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」には、文脈が明確に指示しない限り、複数の指示物が含まれることが指摘される。任意のオプションの要素を除外するように請求項を書くことができることが、さらに指摘される。それゆえ、この表現法は、請求項の要素の列挙に関連する「もっぱら」、「のみ」及び同種のものといった排他的な用語の使用、または「否定的な」限定の使用のための先行詞として役立つことを意図する。
【００１７】
本開示の読了に際して当業者に明らかになるように、本明細書において記述及び図示される各々の個別の実施形態は別々の構成要素及び特色を有し、それは本発明の範囲または趣旨から逸脱せずに、他の複数の実施形態のいずれかの特色と容易に分離または組み合わせることができる。任意の列挙された方法は、列挙された事象の順序または論理上可能な他の順序で実行することができる。
【００１８】
本発明の実施形態の様々な態様のさらに詳しい記述において、様々な実施形態のシステム及び装置の態様を最初により詳しく概説し、続いて本発明の特定の実施形態に記載の方法及びキットを考察する。
【００１９】
詳細な説明
本開示の態様には、標的細胞における活動電位の光遺伝学的調節のための装置、システム及び方法が含まれる。発明対象の装置は、光生成装置、制御装置、及び標的細胞へベクターを送達するための送達装置を含む。発明対象のシステムは、光活性化タンパク質、応答タンパク質、これらのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に加えて、標的細胞におけるこれらのタンパク質の発現を促進する発現システムを含む。発明対象の装置及びシステムを使用して、標的細胞における活動電位を光遺伝学的に阻害及び遮断する（例えば、ヒトまたは動物対象における神経または精神の病態を治療する）方法も提供される。
【００２０】
システム及び装置
本開示の態様には、標的細胞における活動電位を光遺伝学的に調節するために構成されたシステム及び装置が含まれる。発明対象のシステムは、概して、光活性化タンパク質、応答タンパク質、及び標的細胞へ活性化用の波長の光を送達するための１つまたは複数の装置を含む。発明対象のシステムは、発明対象のタンパク質をコードするヌクレオチド配列に加えて、追加の構成要素（転写制御エレメント（例えば組織特異的プロモーター配列または細胞タイプ特異的プロモーター配列等のプロモーター配列）、トラフィッキング配列、シグナル配列、小胞体搬出配列及び同種のもの等）を含む核酸を、さらに含む。標的細胞へ発明対象の核酸を送達するための装置及び標的細胞への光の送達を制御するための装置も提供される。これらの各々の構成要素をここでさらにより詳しく記述する。
【００２１】
光活性化タンパク質
上で要約されるように、本開示の態様には、活性化用の波長の光によりタンパク質が照射される場合に、１つまたは複数のイオンが標的細胞の原形質膜を通過することを可能にする、光活性化タンパク質が含まれる。光活性化タンパク質は、イオンポンプタンパク質（光の１つの光子あたり、少数のイオンの、原形質膜の通過を促進する）またはイオンチャンネルタンパク質（チャンネルが開口している場合にイオンの流れが原形質膜を通って自由に流れることを可能にする）として特徴づけることができる。発明対象の光活性化タンパク質は、いくつかの実施形態において特定の種のイオンに特異的であり、特定の種のイオンのみの膜の通過を、発明対象の光活性化タンパク質が可能にすることを意味する。
【００２２】
適切な光応答性ポリペプチドの事例には、例えば光応答性クロライドポンプのハロロドプシンファミリー（例えばＮｐＨＲ、ＮｐＨＲ２．０、ＮｐＨＲ３．０、ＮｐＨＲ３．１）が含まれる。別の事例として、ＧｔＲ３プロトンポンプを使用して光に応答して神経細胞膜の過分極を促進することができる。別の事例として、ｅＡｒｃｈ（プロトンポンプ）を使用して光に応答して神経細胞膜の過分極を促進することができる。別の事例として、ＡｒｃｈＴオプシンタンパク質またはＭａｃオプシンタンパク質を使用して光に応答して神経細胞膜の過分極を促進することができる。
【００２３】
適切な光応答性ポリペプチドの事例には、例えば光応答性カチオンチャンネルタンパク質のチャンネルロドプシンファミリーのメンバー（例えばＣｈＲ２、ＳＦＯ、ＳＳＦＯ、Ｃ１Ｖ１）が含まれ、それらを使用して、光刺激に応答して神経細胞膜の脱分極または脱分極誘導性のシナプスの枯渇を促進することができる。
【００２４】
促進された細胞内輸送アミノ酸モチーフ
本開示は、哺乳類細胞の原形質膜への輸送を促進する１つまたは複数のアミノ酸配列モチーフの添加による、細胞中で発現する光応答性オプシンタンパク質の修飾を提供する。進化的により単純な生物に由来する構成要素を有する光応答性オプシンタンパク質は、哺乳類細胞によって発現もしくは耐容されないか、または哺乳類細胞中で高レベルで発現した場合に異常な細胞内局在を示し得る。したがって、いくつかの実施形態において、細胞中で発現する光応答性オプシンタンパク質は、シグナルペプチド、小胞体（ＥＲ）搬出シグナル、膜トラフィッキングシグナル、及び／またはＮ末端のゴルジ搬出シグナルからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸配列モチーフへ融合することができる。哺乳類細胞の原形質膜への光応答性タンパク質の輸送を促進する１つまたは複数のアミノ酸配列モチーフは、光応答性タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方へ融合することができる。任意で、光応答性タンパク質及び１つまたは複数のアミノ酸配列モチーフは、リンカーによって分離することができる。いくつかの実施形態において、光応答性タンパク質は、細胞原形質膜へのタンパク質の輸送を促進するトラフィッキングシグナル（ｔｓ）の添加によって修飾することができる。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャンネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来し得る。他の実施形態において、トラフィッキングシグナルはアミノ酸配列
2019194225.tif 000004
を含むことができる。
【００２５】
使用のために好適なトラフィッキング配列は、ヒト内向き整流カリウムチャンネルＫｉｒ２．１のトラフィッキング配列
2019194225.tif 000005
等のアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【００２６】
トラフィッキング配列は、約１０アミノ酸〜約５０アミノ酸（例えば約１０アミノ酸〜約２０アミノ酸、約２０アミノ酸〜約３０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約４０アミノ酸、または約４０アミノ酸〜約５０アミノ酸）の長さを有することができる。
【００２７】
使用のために好適なシグナル配列は、以下のもののうちの１つ等のアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
１）ｈＣｈＲ２のシグナルペプチド
2019194225.tif 000006
；
２）ニューロンのニコチン性アセチルコリン受容体のβ２サブユニットシグナルペプチド
2019194225.tif 000007
；
３）ニコチン性アセチルコリン受容体シグナル配列
2019194225.tif 000008
；及び
４）ニコチン性アセチルコリン受容体シグナル配列
2019194225.tif 000009
。
【００２８】
シグナル配列は、約１０アミノ酸〜約５０アミノ酸（例えば約１０アミノ酸〜約２０アミノ酸、約２０アミノ酸〜約３０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約４０アミノ酸、または約４０アミノ酸〜約５０アミノ酸）の長さを有することができる。
【００２９】
本開示の修飾されたオプシンにおける使用のために好適な小胞体（ＥＲ）搬出配列には、例えばＶＸＸＳＬ（配列中、Ｘは任意のアミノ酸である）（配列番号：４２）（例えばＶＫＥＳＬ（配列番号：４３）；ＶＬＧＳＬ（配列番号：４４）；など）；
2019194225.tif 000010
（配列中、Ｘは任意のアミノ酸である）（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号：４７））；及び同種のものが含まれる。ＥＲ搬出配列は、約５アミノ酸〜約２５アミノ酸（例えば約５アミノ酸〜約１０アミノ酸、約１０アミノ酸〜約１５アミノ酸、約１５アミノ酸〜約２０アミノ酸、または約２０アミノ酸〜約２５アミノ酸）の長さを有することができる。
【００３０】
いくつかの実施形態において、タンパク質中のシグナルペプチド配列は、削除することができるかまたは異なるタンパク質からのシグナルペプチド配列に置換することができる。
【００３１】
プロトンポンプタンパク質
いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、細胞が光により照射される場合に、細胞の原形質膜を横切って１つまたは複数のプロトンを輸送することができるアーキロドプシン（Ａｒｃｈ）プロトンポンプである。光は約５３０〜約５９５ｎｍの間の波長を有することができるかまたは約５６０ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態において、Ａｒｃｈタンパク質は、配列番号：１（Ａｒｃｈ）中で示される配列と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができる。Ａｒｃｈタンパク質は、生来のアミノ酸配列の中へ導入された置換、欠失及び／または挿入を加えて含んで、光への感受性を増加もしくは減少、光の特定の波長への感受性を増加もしくは減少、及び／またはＡｒｃｈタンパク質が標的細胞の原形質膜を横切ってイオンを輸送する能力を増加もしくは減少させることができる。加えて、Ａｒｃｈタンパク質は１つまたは複数の保存的アミノ酸置換及び／または１つまたは複数の非保存的アミノ酸置換を含有することができる。生来のアミノ酸配列の中へ導入された置換、欠失及び／または挿入を含むＡｒｃｈタンパク質は、光に応答して標的細胞の原形質膜を横切ってイオンを輸送する能力を適切に保持する。
【００３２】
いくつかの実施形態において、Ａｒｃｈタンパク質は、シグナルペプチド、ＥＲ搬出シグナル及び膜トラフィッキングシグナルからなる群から選択される標的細胞の原形質膜への輸送を促進する少なくとも１つ（１、２、３またはそれ以上等）のアミノ酸配列モチーフを含む。いくつかの実施形態において、Ａｒｃｈタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ａｒｃｈタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ａｒｃｈタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド、Ｃ末端のＥＲ搬出シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ａｒｃｈタンパク質は、Ｃ末端のＥＲ搬出シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端のＥＲ搬出シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルは、リンカーによって連結される。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００または５００アミノ酸長のいずれかを含むことができる。リンカーは、蛍光タンパク質（例えば黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質またはシアン蛍光タンパク質であるがこれらに限定されない）をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、ＥＲ搬出シグナルは、トラフィッキングシグナルよりもＣ末端に配置される。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ＥＲ搬出シグナルよりもＣ末端に配置される。
【００３３】
いくつかの実施形態において、光応答性プロトンポンプタンパク質は青色光へ応答することができ、グィラルディア・セータ（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ  ｔｈｅｔａ）に由来することができ、細胞が青色光により照射される場合に、プロトンポンプタンパク質は細胞中で過分極電流を媒介することができる。光は約４５０〜約４９５ｎｍの間の波長を有することができるかまたは約４９０ｎｍの波長を有することができる。別の実施形態において、光応答性プロトンポンプタンパク質は、配列番号：４（ＧｔＲ３）中で示される配列と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができる。光応答性プロトンポンプタンパク質は、生来のアミノ酸配列の中へ導入された置換、欠失及び／または挿入を加えて含んで、光への感受性を増加もしくは減少、光の特定の波長への感受性を増加もしくは減少、及び／または光応答性プロトンポンプタンパク質が細胞の原形質膜の分極状態を調節する能力を増加もしくは減少させることができる。加えて、光応答性プロトンポンプタンパク質は１つまたは複数の保存的アミノ酸置換及び／または１つまたは複数の非保存的アミノ酸置換を含有することができる。生来のアミノ酸配列の中へ導入された置換、欠失及び／または挿入を含む光応答性プロトンポンプタンパク質は、光に応答してニューロン細胞の原形質膜を過分極する能力を適切に保持する。
【００３４】
本明細書において開示される方法の他の態様において、光応答性プロトンポンプタンパク質は、配列番号：４中で示される配列と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のコアアミノ酸配列、ならびにシグナルペプチド、ＥＲ搬出シグナル及び膜トラフィッキングシグナルからなる群から選択される哺乳類細胞の原形質膜への輸送を促進する少なくとも１つ（１、２、３またはそれ以上等）のアミノ酸配列モチーフを含むことができる。いくつかの実施形態において、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態において、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド、Ｃ末端のＥＲ搬出シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｃ末端のＥＲ搬出シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端のＥＲ搬出シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルは、リンカーによって連結される。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００または５００アミノ酸長のいずれかを含むことができる。リンカーは、蛍光タンパク質（例えば黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質またはシアン蛍光タンパク質であるがこれらに限定されない）をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、ＥＲ搬出シグナルは、トラフィッキングシグナルよりもＣ末端に配置される。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ＥＲ搬出シグナルよりもＣ末端に配置される。
【００３５】
本明細書において記述される光応答性プロトンポンプタンパク質（配列番号：４中で示される配列と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のコアアミノ酸配列を含む光応答性プロトンポンプタンパク質等）のいずれかをコードする、単離されたポリヌクレオチドも本明細書において提供される。本明細書において記述されるタンパク質（配列番号：４中で示される配列と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のコアアミノ酸配列を含む光応答性プロトンポンプタンパク質等）をコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクター（本明細書において記述されるウイルスベクター等）も本明細書において提供される。
【００３６】
いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、細胞が光により照射される場合に細胞の原形質膜を横切って１つまたは複数のプロトンを輸送することができるＯｘｙｒｒｈｉｓ  ｍａｒｉｎａ(渦鞭毛虫)（Ｏｘｙ）プロトンポンプである。光は約５００〜約５６０ｎｍの間の波長を有することができるかまたは約５３０ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態において、Ｏｘｙタンパク質は、配列番号：５中で示される配列と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができる。Ｏｘｙタンパク質は、生来のアミノ酸配列の中へ導入された置換、欠失及び／または挿入を加えて含んで、光への感受性を増加もしくは減少、光の特定の波長への感受性を増加もしくは減少、及び／またはＯｘｙタンパク質が標的細胞の原形質膜を横切ってイオンを輸送する能力を増加もしくは減少させることができる。加えて、Ｏｘｙタンパク質は１つまたは複数の保存的アミノ酸置換及び／または１つまたは複数の非保存的アミノ酸置換を含有することができる。生来のアミノ酸配列の中へ導入された置換、欠失及び／または挿入を含むＯｘｙタンパク質は、光に応答して標的細胞の原形質膜を横切ってイオンを輸送する能力を適切に保持する。
【００３７】
いくつかの実施形態において、Ｏｘｙタンパク質は、シグナルペプチド、ＥＲ搬出シグナル及び膜トラフィッキングシグナルからなる群から選択される標的細胞の原形質膜への輸送を促進する少なくとも１つ（１、２、３またはそれ以上等）のアミノ酸配列モチーフを含む。いくつかの実施形態において、Ｏｘｙタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｏｘｙタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｏｘｙタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド、Ｃ末端のＥＲ搬出シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｏｘｙタンパク質は、Ｃ末端のＥＲ搬出シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端のＥＲ搬出シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルは、リンカーによって連結される。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００または５００アミノ酸長のいずれかを含むことができる。リンカーは、蛍光タンパク質（例えば黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質またはシアン蛍光タンパク質であるがこれらに限定されない）をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、ＥＲ搬出シグナルは、トラフィッキングシグナルよりもＣ末端に配置される。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ＥＲ搬出シグナルよりもＣ末端に配置される。
【００３８】
いくつかの実施形態において、光応答性プロトンポンプタンパク質は光へ応答することができ、レプトスファエリア・マクランス（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍａｃｕｌａｎｓ）に由来することができ、細胞が５２０ｎｍ〜５６０ｎｍの光により照射される場合に、プロトンポンプタンパク質は細胞の膜を横切ってプロトンをポンプで輸送することができる。光は約５２０〜約５６０ｎｍの間の波長を有することができる。別の実施形態において、光応答性プロトンポンプタンパク質は、配列番号：６または配列番号：７（Ｍａｃ；Ｍａｃ３．０）中で示される配列と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができる。光応答性プロトンポンプタンパク質は、生来のアミノ酸配列の中へ導入された置換、欠失及び／または挿入を加えて含んで、光への感受性を増加もしくは減少、光の特定の波長への感受性を増加もしくは減少、及び／または光応答性プロトンポンプタンパク質が細胞の原形質膜の分極状態を調節する能力を増加もしくは減少させることができる。加えて、光応答性プロトンポンプタンパク質は１つまたは複数の保存的アミノ酸置換及び／または１つまたは複数の非保存的アミノ酸置換を含有することができる。生来のアミノ酸配列の中へ導入された置換、欠失及び／または挿入を含む光応答性プロトンポンプタンパク質は、光に応答してニューロン細胞の原形質膜を横切ってプロトンをポンプで輸送する能力を適切に保持する。
【００３９】
本明細書において開示される方法の他の態様において、光応答性プロトンポンプタンパク質は、配列番号：６中で示される配列と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のコアアミノ酸配列、ならびにシグナルペプチド、ＥＲ搬出シグナル及び膜トラフィッキングシグナルからなる群から選択される哺乳類細胞の原形質膜への輸送を促進する少なくとも１つ（１、２、３またはそれ以上等）のアミノ酸配列モチーフを含むことができる。いくつかの実施形態において、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態において、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド、Ｃ末端のＥＲ搬出シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｃ末端のＥＲ搬出シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端のＥＲ搬出シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルは、リンカーによって連結される。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００または５００アミノ酸長のいずれかを含むことができる。リンカーは、蛍光タンパク質（例えば黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質またはシアン蛍光タンパク質であるがこれらに限定されない）をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、ＥＲ搬出シグナルは、トラフィッキングシグナルよりもＣ末端に配置される。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ＥＲ搬出シグナルよりもＣ末端に配置される。
【００４０】
本明細書において記述される光応答性プロトンポンプタンパク質（配列番号：６中で示される配列と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のコアアミノ酸配列を含む光応答性プロトンポンプタンパク質等）のいずれかをコードする、単離されたポリヌクレオチドも本明細書において提供される。本明細書において記述されるタンパク質（配列番号：６中で示される配列へ、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のコアアミノ酸配列を含む光応答性プロトンポンプタンパク質等）をコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクター（本明細書において記述されるウイルスベクター等）も本明細書において提供される。
【００４１】
光活性化プロトンポンプタンパク質に関連するさらなる開示は、国際特許第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２８８９３号中で見出すことができ、この開示はその全体を参照として本明細書に援用される。
【００４２】
カチオンチャンネルタンパク質
いくつかの態様において、光応答性カチオンチャンネルタンパク質はコナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）に由来することができ、細胞が光により照射される場合に、カチオンチャンネルタンパク質は細胞膜を横切ってカチオンを輸送することができる。別の実施形態において、光応答性カチオンチャンネルタンパク質は、配列番号：８中で示される配列と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができる。コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）に由来する光応答性カチオンチャンネルタンパク質の活性化に使用される光は、約４６０〜約４９５ｎｍの間の波長を有することができるかまたは約４８０ｎｍの波長を有することができる。加えて、約１００Ｈｚの時間周波数を有する光パルスを使用して、光応答性タンパク質を活性化することができる。いくつかの実施形態において、約１００Ｈｚの時間周波数を有する光パルスによるコナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）に由来する光応答性カチオンチャンネルの活性化は、光応答性カチオンチャンネルを発現するニューロンの脱分極誘導性のシナプスの枯渇を引き起こすことができる。光応答性カチオンチャンネルタンパク質は、生来のアミノ酸配列の中へ導入された置換、欠失及び／または挿入を加えて含んで、光への感受性を増加もしくは減少、光の特定の波長への感受性を増加もしくは減少、及び／または光応答性カチオンチャンネルタンパク質が細胞の原形質膜の分極状態を調節する能力を増加もしくは減少させることができる。加えて、光応答性カチオンチャンネルタンパク質は１つまたは複数の保存的アミノ酸置換及び／または１つまたは複数の非保存的アミノ酸置換を含有することができる。生来のアミノ酸配列の中へ導入された置換、欠失及び／または挿入を含む光応答性プロトンポンプタンパク質は、細胞膜を横切ってカチオンを輸送する能力を適切に保持する。別の実施形態において、光応答性カチオンチャンネルタンパク質は、図１３Ｅ中で示され、配列番号：２９中で記載されるＣ１Ｃ２アミノ酸配列と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができる。Ｃ１Ｃ２の結晶構造はＫａｔｏら（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ  ４８２：３６９中で提示される。別の実施形態において、光応答性カチオンチャンネルタンパク質は、図１３Ｆ中で示され、配列番号：３０中で記載されるＲｅａＣｈＲアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができる。
【００４３】
いくつかの実施形態において、光応答性カチオンチャンネルは、配列番号：８中で記載されるアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換を含む。いくつかの実施形態において、光応答性カチオンチャンネルは、配列番号：８中で記載されるアミノ酸配列のＬ１３２Ｃ置換を含む。いくつかの実施形態において、光応答性カチオンチャンネルは、配列番号：８中で記載されるアミノ酸配列のＥ１２３Ｔ置換を含む。いくつかの実施形態において、光応答性カチオンチャンネルは、配列番号：８中で記載されるアミノ酸配列のＥ１２３Ａ置換を含む。いくつかの実施形態において、光応答性カチオンチャンネルは、配列番号：８中で記載されるアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換及びＥ１２３Ｔ置換を含む。いくつかの実施形態において、光応答性カチオンチャンネルは、配列番号：８中で記載されるアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換及びＥ１２３Ａ置換を含む。いくつかの実施形態において、光応答性カチオンチャンネルは、配列番号：８中で記載されるアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換、Ｌ１３２Ｃ置換及びＥ１２３Ｔ置換を含む。いくつかの実施形態において、光応答性カチオンチャンネルは、配列番号：８中で記載されるアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換、Ｌ１３２Ｃ置換及びＥ１２３Ａ置換を含む。いくつかの実施形態において、光応答性カチオンチャンネルは、配列番号：８中で記載されるアミノ酸配列のＬ１３２Ｃ置換及びＥ１２３Ｔ置換を含む。いくつかの実施形態において、光応答性カチオンチャンネルは、配列番号：８中で記載されるアミノ酸配列のＬ１３２Ｃ置換及びＥ１２３Ａ置換を含む。いくつかの実施形態において、光応答性カチオンチャンネルは、配列番号：８中で記載されるアミノ酸配列のＨ１４３Ｒアミノ酸配列置換を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態において、ＣｈＲ２タンパク質は、シグナルペプチド、ＥＲ搬出シグナル及び膜トラフィッキングシグナルからなる群から選択される標的細胞の原形質膜への輸送を促進する少なくとも１つ（１、２、３またはそれ以上等）のアミノ酸配列モチーフを含む。いくつかの実施形態において、ＣｈＲ２タンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態において、ＣｈＲ２タンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、ＣｈＲ２タンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド、Ｃ末端のＥＲ搬出シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、ＣｈＲ２タンパク質は、Ｃ末端のＥＲ搬出シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端のＥＲ搬出シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルは、リンカーによって連結される。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００または５００アミノ酸長のいずれかを含むことができる。リンカーは、蛍光タンパク質（例えば黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質またはシアン蛍光タンパク質であるがこれらに限定されない）をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、ＥＲ搬出シグナルは、トラフィッキングシグナルよりもＣ末端に配置される。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ＥＲ搬出シグナルよりもＣ末端に配置される。
【００４５】
ステップ関数型オプシン及び安定化ステップ関数型オプシン
他の実施形態において、光応答性カチオンチャンネルタンパク質は、ステップ関数型オプシン（ＳＦＯ）タンパク質または安定化ステップ関数型オプシン（ＳＳＦＯ）タンパク質であり得、それらはタンパク質のレチナール結合ポケットの全体にわたる重要な位置で特異的アミノ酸置換を有することができる。いくつかの実施形態において、ＳＦＯタンパク質は配列番号：８のアミノ酸残基Ｃ１２８で変異を有することができる。他の実施形態において、ＳＦＯタンパク質は配列番号：５中でＣ１２８Ａ変異を有する。他の実施形態において、ＳＦＯタンパク質は配列番号：８中でＣ１２８Ｓ変異を有する。別の実施形態において、ＳＦＯタンパク質は配列番号：８中でＣ１２８Ｔ変異を有する。いくつかの実施形態において、ＳＦＯタンパク質は、配列番号：９中で示される配列へ、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができる。
【００４６】
いくつかの実施形態において、ＳＳＦＯタンパク質は配列番号：８のアミノ酸残基Ｄ１５６で変異を有することができる。他の実施形態において、ＳＳＦＯタンパク質は、配列番号：８のアミノ酸残基Ｃ１２８及びＤ１５６の両方で変異を有することができる。一実施形態において、ＳＳＦＯタンパク質は配列番号：８中でＣ１２８Ｓ及びＤ１５６Ａ変異を有する。別の実施形態において、ＳＳＦＯタンパク質は、配列番号：１０中で示される配列と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができる。別の実施形態において、ＳＳＦＯタンパク質は配列番号：８中でＣ１２８Ｔ変異を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＳＳＦＯタンパク質は配列番号：８中でＣ１２８Ｔ及びＤ１５６Ａの変異を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態において、細胞が青色光により照射される場合に、本明細書において提供されるＳＦＯまたはＳＳＦＯのタンパク質は細胞中で脱分極電流を媒介することができる。他の実施形態において、光は約４４５ｎｍの波長を有することができる。加えて、いくつかの実施形態において、ＳＦＯ及びＳＳＦＯの光電流の延長された安定性に起因して、光の単一パルスまたは間隔を置いた光のパルスとして光を送達することができる。いくつかの実施形態において、単一パルスまたは間隔を置いた光のパルスによるＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質の活性化は、ＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質を発現するニューロンの脱分極誘導性のシナプスの枯渇を引き起こすことができる。いくつかの実施形態において、開示したステップ関数型オプシンタンパク質及び安定化ステップ関数型オプシンタンパク質の各々は、光に応答してニューロン細胞の膜の脱分極における使用のための特異的な特性及び特徴を有することができる。
【００４８】
ＳＦＯまたはＳＳＦＯのタンパク質に関連するさらなる開示は、国際特許出願第ＷＯ２０１０／０５６９７０号中で見出すことができ、この開示はその全体を参照として本明細書に援用される。
【００４９】
Ｃ１Ｖ１キメラカチオンチャンネル
他の実施形態において、光応答性カチオンチャンネルタンパク質は、ボルボックス・カルテリ（Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ）のＶＣｈＲ１タンパク質及びコナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉ）からのＣｈＲ１タンパク質に由来したＣ１Ｖ１キメラタンパク質であり得、タンパク質は、ＣｈＲ１の第１及び第２の膜貫通らせんによって置き換えられた少なくとも第１及び第２の膜貫通らせんを有するＶＣｈＲ１のアミノ酸配列を含み；光に応答性であり；細胞が光により照射される場合に、細胞中で脱分極電流を媒介することができる。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、キメラ光応答性タンパク質の第２の膜貫通らせんと第３の膜貫通らせんとの間に位置する細胞内ループドメイン内の置き換えをさらに含むことができ、少なくとも細胞内ループドメインの部分はＣｈＲ１からの対応する部分によって置き換えられる。別の実施形態において、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質の細胞内ループドメインの部分は、ＣｈＲ１のアミノ酸残基Ａ１４５まで延長するＣｈＲ１からの対応する部分により置き換えることができる。他の実施形態において、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質は、キメラ光応答性タンパク質の第３の膜貫通らせん内の置き換えをさらに含むことができ、少なくとも第３の膜貫通らせんの部分はＣｈＲ１の対応する配列によって置き換えられる。さらに別の実施形態において、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質の細胞内ループドメインの部分は、ＣｈＲ１のアミノ酸残基Ｗ１６３まで延長するＣｈＲ１からの対応する部分により置き換えることができる。他の実施形態において、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質は、配列番号：１１中で示される配列と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができる。
【００５０】
いくつかの実施形態において、細胞が緑色光により照射される場合に、Ｃ１Ｖ１タンパク質は細胞中で脱分極電流を媒介することができる。他の実施形態において、光は約５４０〜約５６０ｎｍの間の波長を有することができる。いくつかの実施形態において、光は約５４２ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態において、細胞が紫色光により照射される場合に、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質は細胞中で脱分極電流を媒介することができない。いくつかの実施形態において、細胞が約４０５ｎｍの波長を有する光により照射される場合に、キメラタンパク質は細胞中で脱分極電流を媒介することができない。加えて、いくつかの実施形態において、約１００Ｈｚの時間周波数を有する光パルスを使用して、Ｃ１Ｖ１タンパク質を活性化することができる。
【００５１】
Ｃ１Ｖ１キメラ変異体バリアント
いくつかの態様において、本開示は、置換されたアミノ酸配列または変異されたアミノ配列を含むポリペプチドを提供し、変異体ポリペプチドは、前駆体Ｃ１Ｖ１キメラポリペプチドの特徴的な光活性化可能な性質を保持するが、いくつかの特異的な態様において、変更された特性も保持することができる。例えば、本明細書において記述される変異体光応答性Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質は、動物細胞内または動物細胞原形質膜上の両方で増加したレベルの発現；異なる光の波長（特に赤色光）に曝露された場合に変更された反応性；及び／または特性の組み合わせを示すことができ、それによって、キメラＣ１Ｖ１ポリペプチドは、低い感度、速い不活性化、他の光応答性カチオンチャンネルとの最小の交差活性化のための低い紫色光活性化、及び／または動物細胞中の強い発現の特性を保持する。
【００５２】
したがって、キメラポリペプチドのＶＣｈＲ１部分のレチナール結合ポケットの全体にわたる重要な位置で特異的なアミノ酸置換を有することができるＣ１Ｖ１のキメラ光応答性オプシンタンパク質が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質は配列番号：１１のアミノ酸残基Ｅ１２２で変異を有することができる。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質は配列番号：１１のアミノ酸残基Ｅ１６２で変異を有することができる。他の実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、配列番号：１１のアミノ酸残基Ｅ１６２及びＥ１２２の両方で変異を有することができる。他の実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、配列番号：１２、配列番号：１３または配列番号：１４中で示される配列と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができる。
【００５３】
いくつかの態様において、細胞が光により照射される場合に、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２変異体キメラタンパク質は細胞中で脱分極電流を媒介することができる。いくつかの実施形態において、光は緑色光であり得る。他の実施形態において、光は約５４０ｎｍ〜約５６０ｎｍの間の波長を有することができる。いくつかの実施形態において、光は約５４６ｎｍの波長を有することができる。他の実施形態において、細胞が赤色光により照射される場合に、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２変異体キメラタンパク質は細胞中で脱分極電流を媒介することができる。いくつかの実施形態において、赤色光は約６３０ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態において、細胞が紫色光により照射される場合に、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２変異体キメラタンパク質は細胞中で脱分極電流を媒介しない。いくつかの実施形態において、細胞が約４０５ｎｍの波長を有する光により照射される場合に、キメラタンパク質は細胞中で脱分極電流を媒介しない。加えて、いくつかの実施形態において、約１００Ｈｚの時間周波数を有する光パルスを使用して、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２変異体キメラタンパク質を活性化することができる。いくつかの実施形態において、１００Ｈｚの周波数を有する光パルスによるＣ１Ｖ１−Ｅ１２２変異体キメラタンパク質の活性化は、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２変異体キメラタンパク質を発現するニューロンの脱分極誘導性のシナプスの枯渇を引き起こすことができる。
【００５４】
他の態様において、細胞が光により照射される場合に、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２変異体キメラタンパク質は細胞中で脱分極電流を媒介することができる。いくつかの実施形態において、光は緑色光であり得る。他の実施形態において、光は約５３５ｎｍ〜約５４０ｎｍの間の波長を有することができる。いくつかの実施形態において、光は約５４２ｎｍの波長を有することができる。他の実施形態において、光は約５３０ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態において、細胞が紫色光により照射される場合に、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２変異体キメラタンパク質は細胞中で脱分極電流を媒介しない。いくつかの実施形態において、細胞が約４０５ｎｍの波長を有する光により照射される場合に、キメラタンパク質は細胞中で脱分極電流を媒介しない。加えて、いくつかの実施形態において、約１００Ｈｚの時間周波数を有する光パルスを使用して、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２変異体キメラタンパク質を活性化することができる。いくつかの実施形態において、１００Ｈｚの周波数を有する光パルスによるＣ１Ｖ１−Ｅ１６２変異体キメラタンパク質の活性化は、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２変異体キメラタンパク質を発現するニューロンの脱分極誘導性のシナプスの枯渇を引き起こすことができる。
【００５５】
さらに他の態様において、細胞が光により照射される場合に、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異体キメラタンパク質は細胞中で脱分極電流を媒介することができる。いくつかの実施形態において、光は緑色光であり得る。他の実施形態において、光は約５４０ｎｍ〜約５６０ｎｍの間の波長を有することができる。いくつかの実施形態において、光は約５４６ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態において、細胞が紫色光により照射される場合に、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異体キメラタンパク質は細胞中で脱分極電流を媒介しない。いくつかの実施形態において、細胞が約４０５ｎｍの波長を有する光により照射される場合に、キメラタンパク質は細胞中で脱分極電流を媒介しない。いくつかの実施形態において、紫色光に曝露された場合に、Ｅ１２２／Ｅ１６２での変異を欠損するＣ１Ｖ１キメラタンパク質と比較してまたは他の光応答性カチオンチャンネルタンパク質と比較して、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異体キメラタンパク質はより低い活性化を示し得る。加えて、いくつかの実施形態において、約１００Ｈｚの時間周波数を有する光パルスを使用して、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異体キメラタンパク質を活性化することができる。いくつかの実施形態において、１００Ｈｚの周波数を有する光パルスによるＣ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異体キメラタンパク質の活性化は、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異体キメラタンパク質を発現するニューロンの脱分極誘導性のシナプスの枯渇を引き起こすことができる。
【００５６】
シオヒゲムシ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ）光応答性タンパク質
いくつかの実施形態において、光応答性イオンチャンネルタンパク質は４７０ｎｍ〜５１０ｎｍの光に応答することができ、シオヒゲムシ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ）に由来することができ、細胞が光により照射される場合にイオンチャンネルタンパク質は細胞中で過分極電流を媒介することができる。光は約４７０ｎｍ〜約５１０ｎｍの間の波長を有することができるかまたは約４９０ｎｍの波長を有することができる。別の実施形態において、光応答性イオンチャンネルタンパク質は、配列番号：１５中で示される配列へ、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができる。光応答性イオンチャンネルタンパク質は、生来のアミノ酸配列の中へ導入された置換、欠失及び／または挿入を加えて含んで、光への感受性を増加もしくは減少、光の特定の波長への感受性を増加もしくは減少、及び／または光応答性イオンチャンネルタンパク質が細胞の原形質膜の分極状態を調節する能力を増加もしくは減少させることができる。加えて、光応答性イオンチャンネルタンパク質は１つまたは複数の保存的アミノ酸置換及び／または１つまたは複数の非保存的アミノ酸置換を含有することができる。生来のアミノ酸配列の中へ導入された置換、欠失及び／または挿入を含む光応答性イオンチャンネルタンパク質は、光に応答してニューロン細胞の原形質膜を横切ってイオンを輸送する能力を適切に保持する。
【００５７】
本明細書において開示される方法の他の態様において、光応答性イオンチャンネルタンパク質は、配列番号：１５中で示される配列と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のコアアミノ酸配列、ならびにシグナルペプチド、ＥＲ搬出シグナル及び膜トラフィッキングシグナルからなる群から選択される哺乳類細胞の原形質膜への輸送を促進する少なくとも１つ（１、２、３またはそれ以上等）のアミノ酸配列モチーフを含むことができる。いくつかの実施形態において、光応答性プロトンイオンチャンネルは、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態において、光応答性イオンチャンネルタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、光応答性イオンチャンネルタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド、Ｃ末端のＥＲ搬出シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、光応答性イオンチャンネルタンパク質は、Ｃ末端のＥＲ搬出シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端のＥＲ搬出シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルは、リンカーによって連結される。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００または５００アミノ酸長のいずれかを含むことができる。リンカーは、蛍光タンパク質（例えば黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質またはシアン蛍光タンパク質であるがこれらに限定されない）をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、ＥＲ搬出シグナルは、トラフィッキングシグナルよりもＣ末端に配置される。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ＥＲ搬出シグナルよりもＣ末端に配置される。
【００５８】
本明細書において記述される光応答性チャンネルタンパク質（配列番号：１５中で示される配列と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のコアアミノ酸配列を含む光応答性イオンチャンネルタンパク質等）のいずれかをコードする、単離されたポリヌクレオチドも本明細書において提供される。本明細書において記述されるタンパク質（配列番号：１５中で示される配列と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のコアアミノ酸配列を含む光応答性チャンネルタンパク質等）をコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクター（本明細書において記述されるウイルスベクター等）も本明細書において提供される。
【００５９】
クロライドイオンポンプ
いくつかの態様において、上記のニューロンの原形質膜上で発現する前記１つまたは複数の光応答性クロライドポンプタンパク質は、ナトロノモナス・ファラオニス（Ｎａｔｒｏｎｏｍｏｎａｓ  ｐｈａｒａｏｎｉｓ）に由来し得る。いくつかの実施形態において、光応答性クロライドポンプタンパク質は赤色光に加えてアンバー光に応答することができ、光応答性クロライドポンプタンパク質がアンバー光または赤色光により照射される場合に、ニューロン中の過分極電流を媒介することができる。光応答性クロライドポンプを活性化することができる光の波長は約５８０〜６３０ｎｍの間であり得る。いくつかの実施形態において、光は約５８９ｎｍの波長であり得るか、または光は約６３０ｎｍを超える（例えば約７４０ｎｍ未満）波長を有することができる。別の実施形態において、光は約６３０ｎｍの波長を有する。いくつかの実施形態において、連続的な光のパルスに曝露された場合に、光応答性クロライドポンプタンパク質は少なくとも約９０分間神経細胞膜を過分極させることができる。いくつかの実施形態において、光応答性クロライドポンプタンパク質は、配列番号：１６中で示される配列と、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができる。加えて、光応答性クロライドポンプタンパク質は、生来のアミノ酸配列の中へ導入された置換、欠失及び／または挿入を含んで、光への感受性を増加もしくは減少、光の特定の波長への感受性を増加もしくは減少、及び／または光応答性タンパク質が細胞の原形質膜の分極状態を調節する能力を増加もしくは減少させることができる。いくつかの実施形態において、光応答性クロライドポンプタンパク質は１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含有する。いくつかの実施形態において、光応答性タンパク質は１つまたは複数の非保存的アミノ酸置換を含有する。生来のアミノ酸配列の中へ導入された置換、欠失及び／または挿入を含む光応答性タンパク質は、光に応答してニューロン細胞の原形質膜を過分極する能力を適切に保持する。
【００６０】
加えて、他の態様において、光応答性クロライドポンプタンパク質は、配列番号：１６中で示される配列と、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のコアアミノ酸配列、及び小胞体（ＥＲ）搬出シグナルを含むことができる。このＥＲ搬出シグナルは、コアアミノ酸配列のＣ末端に融合することができるか、またはコアアミノ酸配列のＮ末端に融合することができる。いくつかの実施形態において、ＥＲ搬出シグナルはリンカーによってコアアミノ酸配列に連結される。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００または５００アミノ酸長のいずれかを含むことができる。リンカーは、蛍光タンパク質（例えば黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質またはシアン蛍光タンパク質であるがこれらに限定されない）をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、ＥＲ搬出シグナルはアミノ酸配列ＦＸＹＥＮＥ（配列番号：４６）を含むことができ、配列中、Ｘは任意のアミノ酸であり得る。別の実施形態において、ＥＲ搬出シグナルはアミノ酸配列ＶＸＸＳＬ（配列番号：４２）を含むことができ、配列中、Ｘは任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ搬出シグナルは、アミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号：４７）を含むことができる。
【００６１】
本開示の修飾されたオプシンにおける使用のために好適な小胞体（ＥＲ）搬出配列には、例えばＶＸＸＳＬ（配列中、Ｘは任意のアミノ酸である）（配列番号：４２）（例えばＶＫＥＳＬ（配列番号：４３）；ＶＬＧＳＬ（配列番号：４４）；など）；
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；ＦＸＹＥＮＥ（配列中、Ｘは任意のアミノ酸である）（配列番号：４６）（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号：４７））；及び同種のものが含まれる。ＥＲ搬出配列は、約５アミノ酸〜約２５アミノ酸（例えば約５アミノ酸〜約１０アミノ酸、約１０アミノ酸〜約１５アミノ酸、約１５アミノ酸〜約２０アミノ酸、または約２０アミノ酸〜約２５アミノ酸）の長さを有することができる。
【００６２】
他の態様において、本明細書において記述される光応答性クロライドポンプタンパク質は、細胞膜上で発現する光応答性タンパク質を含むことができ、タンパク質は、配列番号：１６中で示される配列と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のコアアミノ酸配列、及びトラフィッキングシグナル（例えば、光応答性クロライドポンプタンパク質の原形質膜への輸送を促進することができる）を含む。トラフィッキングシグナルは、コアアミノ酸配列のＣ末端に融合することができるか、またはコアアミノ酸配列のＮ末端に融合することができる。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルはリンカーによってコアアミノ酸配列に連結することができ、リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００または５００アミノ酸長のいずれかを含むことができる。リンカーは、蛍光タンパク質（例えば黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質またはシアン蛍光タンパク質であるがこれらに限定されない）をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャンネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来し得る。他の実施形態において、トラフィッキングシグナルはアミノ酸配列
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を含むことができる。
【００６３】
いくつかの態様において、光応答性クロライドポンプタンパク質は、配列番号：１６中で示される配列と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のコアアミノ酸配列、ならびにＥＲ搬出シグナル、シグナルペプチド及び膜トラフィッキングシグナルからなる群から選択される哺乳類細胞の原形質膜への輸送を促進する少なくとも１つ（１、２、３またはそれ以上等）のアミノ酸配列モチーフを含むことができる。いくつかの実施形態において、光応答性クロライドポンプタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド、Ｃ末端のＥＲ搬出シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端のＥＲ搬出シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルは、リンカーによって連結することができる。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００または５００アミノ酸長のいずれかを含むことができる。リンカーは、蛍光タンパク質（例えば黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質またはシアン蛍光タンパク質であるがこれらに限定されない）も含むことができる。いくつかの実施形態において、ＥＲ搬出シグナルは、トラフィッキングシグナルよりもＣ末端に配置され得る。他の実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ＥＲ搬出シグナルよりもＣ末端に配置される。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはアミノ酸配列
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を含む。別の実施形態において、光応答性クロライドポンプタンパク質は配列番号：１７と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。
【００６４】
さらに、他の態様において、光応答性クロライドポンプタンパク質は、配列番号：１６中で示される配列と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のコアアミノ酸配列を含むことができ、配列番号：１６のＮ末端のシグナルペプチドは欠失または置換される。いくつかの実施形態において、他のシグナルペプチド（他のオプシンからのシグナルペプチド等）を使用することができる。光応答性タンパク質は、本明細書において記述されるＥＲ輸送シグナル及び／または膜トラフィッキングシグナルをさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、光応答性クロライドポンプタンパク質は配列番号：１８と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態において、光応答性オプシンタンパク質は、配列番号：１６中で示される配列と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むＮｐＨＲオプシンタンパク質である。いくつかの実施形態において、ＮｐＨＲオプシンタンパク質は、小胞体（ＥＲ）搬出シグナル及び／または膜トラフィッキングシグナルをさらに含む。例えば、ＮｐＨＲオプシンタンパク質は、配列番号：１６中で示される配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列及び小胞体（ＥＲ）搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態において、配列番号：１６中で示される配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列は、リンカーを介してＥＲ搬出シグナルへ連結される。いくつかの実施形態において、ＥＲ搬出シグナルはアミノ酸配列ＦＸＹＥＮＥ（配列番号：４６）を含み、配列中、Ｘは任意のアミノ酸であり得る。別の実施形態において、ＥＲ搬出シグナルはアミノ酸配列ＶＸＸＳＬ（配列番号：４２）を含み、配列中、Ｘは任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ搬出シグナルはアミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号：４７）を含む。いくつかの実施形態において、ＮｐＨＲオプシンタンパク質は、配列番号：１６中で示される配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、ＥＲ搬出シグナル、及び膜トラフィッキングシグナルを含む。他の実施形態において、ＮｐＨＲオプシンタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、配列番号：１６中で示される配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、ＥＲ搬出シグナル及び膜トラフィッキングシグナルを含む。他の実施形態において、ＮｐＨＲオプシンタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、配列番号：１６中で示される配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、膜トラフィッキングシグナル及びＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態において、膜トラフィッキングシグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャンネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。いくつかの実施形態において、膜トラフィッキングシグナルはアミノ酸配列
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を含む。いくつかの実施形態において、膜トラフィッキングシグナルは、リンカーによって配列番号：１６中で示される配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列に連結される。いくつかの実施形態において、膜トラフィッキングシグナルは、リンカーを介してＥＲ搬出シグナルに連結される。リンカーは、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００または５００アミノ酸長のいずれかを含むことができる。リンカーは、蛍光タンパク質（例えば黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質またはシアン蛍光タンパク質であるがこれらに限定されない）をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、光応答性オプシンタンパク質はＮ末端のシグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、光応答性オプシンタンパク質は配列番号：１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、光応答性オプシンタンパク質は配列番号：１８のアミノ酸配列を含む。
【００６６】
本明細書において記述される光応答性クロライドポンプタンパク質（配列番号：１６中で示される配列と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のコアアミノ酸配列を含む光応答性タンパク質等）のいずれか、ＥＲ搬出シグナル及び膜トラフィッキングシグナルをコードする、ポリヌクレオチドも本明細書において提供される。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号：１７及び配列番号：１８と少なくとも９５％同一のアミノ酸をコードする配列を含む。ポリヌクレオチドは、発現ベクター（本明細書において記述されるウイルスベクター等であるがこれらに限定されない）中に存在することができる。ポリヌクレオチドを光応答性クロライドイオンポンプタンパク質の発現のために使用することができる。
【００６７】
光応答性クロライドポンプタンパク質に関連するさらなる開示は、米国特許出願第２００９／００９３４０３号及び第２０１０／０１４５４１８号に加えて、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２８８９３号中で見出すことができ、それらの各々の開示はそれらの全体が参照として本明細書に援用される。
【００６８】
クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）のタイプ１ロドプシン
いくつかの実施形態において、適切な光応答性ポリペプチドは、コッコミクサ・サブエリプソイディア（Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ  ｓｕｂｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）（クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ））からのロドプシンである。いくつかの実施形態において、適切な光応答性ポリペプチドタンパク質は、配列番号：６２中で示される配列と、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。加えて、光応答性ポリペプチドは、生来のアミノ酸配列の中へ導入された置換、欠失及び／または挿入を含んで、光への感受性を増加もしくは減少、光の特定の波長への感受性を増加もしくは減少、及び／または光応答性タンパク質が細胞の原形質膜の分極状態を調節する能力を増加もしくは減少させることができる。いくつかの実施形態において、光応答性ポリペプチドは１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含有する。いくつかの実施形態において、光応答性ポリペプチドは１つまたは複数の非保存的アミノ酸置換を含有する。生来のアミノ酸配列の中へ導入された置換、欠失及び／または挿入を含む光応答性ポリペプチドは、光に応答してニューロン細胞の原形質膜を過分極する能力を適切に保持する。
【００６９】
いくつかの事例において、適切な光応答性ポリペプチドタンパク質は、配列番号：６２中で示される配列と、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含み；ＥＲ搬出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号：４７））を含む。いくつかの事例において、適切な光応答性ポリペプチドタンパク質は、配列番号：６２中で示される配列と、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含み；膜トラフィッキングシグナル
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を含む。いくつかの事例において、適切な光応答性ポリペプチドタンパク質は、配列番号：６２中で示される配列と、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含み；膜トラフィッキングシグナル
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及びＥＲ搬出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号：４７））を含む。
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【００７０】
応答タンパク質
上で要約されるように、本開示の態様には、応答タンパク質が発明対象の光活性化タンパク質を介して通過した１つまたは複数のイオンの存在を検出する場合に、１つまたは複数のイオンが膜を通過することを可能にする、応答タンパク質が含まれる。応答タンパク質は、イオンポンプタンパク質（光の１つの動作サイクルあたり少数のイオンの、膜の通過を促進する）またはイオンチャンネルタンパク質（イオンの流れが膜を通って自由に流れることを可能にする）として特徴づけることができる。発明対象の応答タンパク質は、特定の種のイオンまたは特定の群のイオン（例えばカチオン）に特異的であり、特定の種または群のイオンのみの膜の通過を、発明対象の応答タンパク質が可能にすることを意味する。いくつかの事例において、応答タンパク質は与えられた細胞について異種タンパク質である（例えば、応答タンパク質は細胞中で通常は発現しないものである）。他の事例において、応答タンパク質は、与えられた細胞に生来のものである（例えば、応答タンパク質は細胞中で通常は発現するものである）。応答タンパク質は、哺乳類タンパク質（例えばヒトタンパク質、非ヒトタンパク質）、細菌タンパク質、古細菌タンパク質などであり得る。
【００７１】
いくつかの実施形態において、応答タンパク質はイオンチャンネルである。いくつかの事例において、応答タンパク質は、カチオンチャンネル（例えばカリウムチャンネル、カルシウムチャンネル）である。いくつかの事例において、応答タンパク質は、アニオンチャンネル（例えばクロライドイオンチャンネル、ナトリウムチャンネル）である。他の実例において、応答タンパク質はプロトンポンプである。応答タンパク質は電圧ゲート型またはリガンドゲート型であり得る。
【００７２】
適切な応答タンパク質の非限定的事例には、例えば電圧ゲート型カリウムチャンネル（例えばＫＶＬＱＴ１）；カリウムチャンネル（例えばＨＥＲＧ）；内向き整流Ｋ＋チャンネル（例えばＫｉｒ２．１）；酸感受性ナトリウムイオンチャンネル；及び同種のものが含まれる。いくつかの事例において、応答タンパク質は、イオン交換輸送体（アンチポーター）（例えばナトリウム−カルシウム交換輸送体（ＮＣＸ）、カリウム依存性ナトリウム−カルシウム交換輸送体（ＳＬＣ２４）またはナトリウム−水素交換輸送体（ＮｈａＡ））である。いくつかの事例において、応答タンパク質は、シンポート種のイオンコトランスポーター（例えばナトリウム−カリウム−クロライド コトランスポーター（ＮＫＣＣ１及びＮＫＣＣ２）またはナトリウム−リン酸 コトランスポーター（ＳＬＣ３４Ａ１））である。
【００７３】
例えば、適切な応答タンパク質は、図１４Ａ〜Ｈのうちの１つ中で示されるアミノ酸配列（配列番号：１９〜２８）の約１００アミノ酸（ａａ）〜約２００ａａ、約２００ａａ〜約３００ａａ、約３００ａａ〜約４００ａａ、約４００ａａ〜約５００ａａ、約５００ａａ〜約６００ａａ、約６００ａａ〜約７００ａａ、約７００ａａ〜約８００ａａ、約８００ａａ〜約９００ａａ、９００ａａ〜約１０００ａａ、約１０００ａａ〜約１１００ａａ、最大で全長の連続したストレッチと、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【００７４】
酸感受性イオンチャンネルバリアント２ａ（ＡＳＩＣ２ａ）
いくつかの実施形態において、応答タンパク質は、ＡＳＩＣ２ａタンパク質が酸性条件（原形質膜の外部表面上またはその付近での複数の水素イオンの存在等）を検出する場合に、複数のナトリウムイオンが標的細胞の原形質膜を横切って流れることを可能にする、酸感受性イオンチャンネルバリアント２ａ（ＡＳＩＣ２ａ）ナトリウムイオンチャンネルタンパク質である。いくつかの実施形態において、ＡＳＩＣ２ａタンパク質は、配列番号：１９中で示される配列と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができる。ＡＳＩＣ２ａタンパク質は、生来のアミノ酸配列の中へ導入された置換、欠失及び／または挿入を加えて含んで、酸性条件への感受性を増加もしくは減少、及び／またはＡＳＩＣ２ａタンパク質が標的細胞の原形質膜を横切ってナトリウムイオンの流れを調節する能力を増加もしくは減少させることができる。加えて、ＡＳＩＣ２ａタンパク質は１つまたは複数の保存的アミノ酸置換及び／または１つまたは複数の非保存的アミノ酸置換を含有することができる。生来のアミノ酸配列の中へ導入された置換、欠失及び／または挿入を含むＡＳＩＣ２ａタンパク質は、ＡＳＩＣ２ａタンパク質の機能性を適切に保持する。
【００７５】
いくつかの実施形態において、ＡＳＩＣ２ａタンパク質は、シグナルペプチド、ＥＲ搬出シグナル及び膜トラフィッキングシグナルからなる群から選択される標的細胞の原形質膜への輸送を促進する少なくとも１つ（１、２、３またはそれ以上等）のアミノ酸配列モチーフを含む。いくつかの実施形態において、ＡＳＩＣ２ａタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態において、ＡＳＩＣ２ａタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、ＡＳＩＣ２ａタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド、Ｃ末端のＥＲ搬出シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、ＡＳＩＣ２ａタンパク質は、Ｃ末端のＥＲ搬出シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端のＥＲ搬出シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルは、リンカーによって連結される。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００または５００アミノ酸長のいずれかを含むことができる。リンカーは、蛍光タンパク質（例えば黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質またはシアン蛍光タンパク質であるがこれらに限定されない）をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、ＥＲ搬出シグナルは、トラフィッキングシグナルよりもＣ末端に配置される。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ＥＲ搬出シグナルよりもＣ末端に配置される。
【００７６】
ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）カリウムチャンネル（ＨｐＫｃｈＡ）
いくつかの実施形態において、応答タンパク質は、ＨｐＫｃｈＡタンパク質が酸性条件（原形質膜の外部表面上またはその付近での複数の水素イオンの存在等）を検出する場合に、複数のカリウムイオンが標的細胞の原形質膜を横切って流れることを可能にする、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）カリウムイオンチャンネルタンパク質（ＨｐＫｃｈＡ）である。いくつかの実施形態において、ＨｐＫｃｈＡタンパク質は、配列番号：２０中で示される配列と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができる。ＨｐＫｃｈＡタンパク質は、生来のアミノ酸配列の中へ導入された置換、欠失及び／または挿入を加えて含んで、酸性条件への感受性を増加もしくは減少、及び／またはＨｐＫｃｈＡタンパク質が標的細胞の原形質膜を横切ってカリウムイオンの流れを調節する能力を増加もしくは減少させることができる。加えて、ＨｐＫｃｈＡタンパク質は１つまたは複数の保存的アミノ酸置換及び／または１つまたは複数の非保存的アミノ酸置換を含有することができる。生来のアミノ酸配列の中へ導入された置換、欠失及び／または挿入を含むＨｐＫｃｈＡタンパク質は、ＨｐＫｃｈＡタンパク質の機能性を適切に保持する。
【００７７】
いくつかの実施形態において、ＨｐＫｃｈＡタンパク質は、シグナルペプチド、ＥＲ搬出シグナル及び膜トラフィッキングシグナルからなる群から選択される標的細胞の原形質膜への輸送を促進する少なくとも１つ（１、２、３またはそれ以上等）のアミノ酸配列モチーフを含む。いくつかの実施形態において、ＨｐＫｃｈＡタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態において、ＨｐＫｃｈＡタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、ＨｐＫｃｈＡタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド、Ｃ末端のＥＲ搬出シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、ＨｐＫｃｈＡタンパク質は、Ｃ末端のＥＲ搬出シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端のＥＲ搬出シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルは、リンカーによって連結される。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００または５００アミノ酸長のいずれかを含むことができる。リンカーは、蛍光タンパク質（例えば黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質またはシアン蛍光タンパク質であるがこれらに限定されない）をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、ＥＲ搬出シグナルは、トラフィッキングシグナルよりもＣ末端に配置される。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ＥＲ搬出シグナルよりもＣ末端に配置される。
【００７８】
融合タンパク質
いくつかの事例において、光応答性タンパク質及び応答タンパク質は単一のポリペプチド鎖中で一緒に存在する（例えば光応答性タンパク質及び応答タンパク質は融合タンパク質である）。本開示は、光応答性ポリペプチド及び応答ポリペプチドを含む、２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドを提供する。
【００７９】
いくつかの実施形態において、発明対象の２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端の順序で、ａ）光応答性ポリペプチド（上述の通り）と；ｂ）応答タンパク質（上述の通り）とを含む。いくつかの実施形態において、発明対象の２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端の順序で、ａ）応答タンパク質と；ｂ）光応答性ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態において、発明対象の２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端の順序で、ａ）光応答性ポリペプチドと；ｂ）リンカーペプチドと；ｃ）応答タンパク質とを含む。いくつかの実施形態において、発明対象の２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端の順序で、ａ）光応答性ポリペプチドと；ｂ）膜トラフィッキングシグナルと；ｃ）応答タンパク質とを含む。いくつかの実施形態において、発明対象の２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端の順序で、ａ）光応答性ポリペプチドと；ｂ）膜トラフィッキングシグナルと；ｃ）応答タンパク質と；ｄ）膜トラフィッキングシグナルとを含む。いくつかの実施形態において、発明対象の２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端の順序で、ａ）光応答性ポリペプチドと；ｂ）膜トラフィッキングシグナルと；ｃ）自己切断ポリペプチドと；ｄ）応答タンパク質と；ｅ）膜トラフィッキングシグナルとを含む。
【００８０】
いくつかの実施形態において、発明対象の２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端の順序で、ａ）光応答性ポリペプチドと；ｂ）膜トラフィッキングシグナルと；ｃ）スペーサーポリペプチドと；ｄ）応答タンパク質と；ｄ）ＥＲ搬出シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、発明対象の２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端の順序で、ａ）光応答性ポリペプチドと；ｂ）膜トラフィッキングシグナルと；ｃ）スペーサーポリペプチドと；ｄ）応答タンパク質と；ｅ）膜トラフィッキングシグナルと；ｆ）ＥＲ搬出シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、発明対象の２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端の順序で、ａ）光応答性ポリペプチドと；ｂ）膜トラフィッキングシグナルと；ｃ）応答タンパク質と；ｄ）膜トラフィッキングシグナルと；ｅ）ＥＲ搬出シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、発明対象の２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端の順序で、ａ）光応答性ポリペプチドと；ｂ）膜トラフィッキングシグナルと；ｃ）自己切断ポリペプチドと；ｄ）応答タンパク質と；ｅ）膜トラフィッキングシグナルと；ｆ）ＥＲ搬出シグナルとを含む。
【００８１】
適切な自己切断ポリペプチドには、例えばＰ２Ａペプチドのような２Ａペプチド：
2019194225.tif 000018
；Ｔ２Ａペプチド：
2019194225.tif 000019
；Ｅ２Ａペプチド：
2019194225.tif 000020
；Ｆ２Ａペプチド：
2019194225.tif 000021
；及び同種のもの等）が含まれる。いくつかの事例において、自己切断ペプチドは、Ｐ２Ａペプチド：
2019194225.tif 000022
である。いくつかの事例において、Ｐ２Ａペプチドは、アミノ酸配列：
2019194225.tif 000023
を含む。
【００８２】
いくつかの実施形態において、発明対象の２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端の順序で、ａ）配列番号：１中で記載されるｅＡｒｃｈポリペプチドアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｅＡｒｃｈポリペプチドと；ｂ）膜トラフィッキングシグナルと；ｃ）配列番号：１９中で記載されるＡＳＩＣ２ａポリペプチドアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＡＳＩＣ２ａポリペプチドと；ｄ）膜トラフィッキングシグナルとを含む。いくつかの事例において、膜トラフィッキングシグナルは、
2019194225.tif 000024
である。これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、ＥＲ搬出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号：４７））をさらに含む。
【００８３】
いくつかの実施形態において、発明対象の２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端の順序で、ａ）配列番号：１中で記載されるｅＡｒｃｈポリペプチドアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｅＡｒｃｈポリペプチドと；ｂ）膜トラフィッキングシグナル
2019194225.tif 000025
と；ｃ）約５アミノ酸〜約１００アミノ酸のポリペプチドリンカー（例えば約２０アミノ酸〜約２５アミノ酸長のポリペプチドリンカー）と；ｄ）配列番号：１９中で記載されるＡＳＩＣ２ａポリペプチドアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＡＳＩＣ２ａポリペプチドと；ｅ）膜トラフィッキングシグナル
2019194225.tif 000026
とを含む。これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、ＥＲ搬出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号：４７））をさらに含む。
【００８４】
いくつかの実施形態において、発明対象の２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端の順序で、ａ）配列番号：１中で記載されるｅＡｒｃｈポリペプチドアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｅＡｒｃｈポリペプチドと；ｂ）膜トラフィッキングシグナル
2019194225.tif 000027
と；ｃ）約５アミノ酸〜約１００アミノ酸のポリペプチドリンカー（例えば約４０アミノ酸〜約４５アミノ酸長のポリペプチドリンカー）と；ｄ）配列番号：１９中で記載されるＡＳＩＣ２ａポリペプチドアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＡＳＩＣ２ａポリペプチドと；ｅ）膜トラフィッキングシグナル
2019194225.tif 000028
とを含む。これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、ＥＲ搬出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号：４７））をさらに含む。
【００８５】
いくつかの実施形態において、発明対象の２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端の順序で、ａ）配列番号：１中で記載されるｅＡｒｃｈポリペプチドアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｅＡｒｃｈポリペプチドと；ｂ）膜トラフィッキングシグナルと；ｃ）自己切断ペプチド
2019194225.tif 000029
と；ｄ）配列番号：１９中で記載されるＡＳＩＣ２ａポリペプチドアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＡＳＩＣ２ａポリペプチドと；ｅ）膜トラフィッキングシグナルとを含む。いくつかの事例において、膜トラフィッキングシグナルは、
2019194225.tif 000030
である。これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、ＥＲ搬出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号：４７））をさらに含む。
【００８６】
適切なリンカーには「柔軟なリンカー」が含まれる。存在するならば、リンカーポリペプチドは、一般的には、リンカーによって接続されるポリペプチドの間でのある程度の柔軟な移動を可能にするのに十分な長さである。適切なリンカーは容易に選択することができ、任意の適切な異なる長さ（５アミノ酸〜１００アミノ酸、例えば５アミノ酸（ａａ）〜１０ａａ、１０ａａ〜１５ａａ、１５ａａ〜２５ａａ、２５ａａ〜４０ａａ、４０ａａ〜６０ａａ、６０ａａ〜８０ａａまたは８０ａａ〜１００ａａ等）であり得る。いくつかの事例において、ポリペプチドリンカーは、存在するならば、２０ａａ〜２５ａａ長である。いくつかの事例において、ポリペプチドリンカーは、存在するならば、４０ａａ〜４５ａａ長である。
【００８７】
例示的なポリペプチドリンカーには、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号：５３）及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号：５４）、配列中、ｎは少なくとも１の整数、例えば１、２、３、４、５または５〜１０が含まれる）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー及び当技術分野において公知の他のポリペプチドリンカーが含まれる。例示的な柔軟なリンカーには、
2019194225.tif 000031
及び同種のものが含まれるが、限定されない。当業者は、リンカーが柔軟なリンカーに加えて、より柔軟でない構造を付与する１つまたは複数の部分を含むことができるように、リンカーポリペプチドのデザインが、リンカーが柔軟なリンカーをすべてまたは部分的に含むことができることを認識するだろう。
【００８８】
いくつかの事例において、発明対象の２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、配列番号：３１（Ｃｈａｍｐ１．０）中で記載されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの事例において、発明対象の２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、配列番号：３２（Ｃｈａｍｐ２．０）中で記載されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの事例において、発明対象の２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、配列番号：３３（Ｃｈａｍｐ３．０）中で記載されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの事例において、発明対象の２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、配列番号：３４（Ｃｈａｍｐ４．０）中で記載されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８９】
いくつかの事例において、発明対象の２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、配列番号：３１（Ｃｈａｍｐ１．０）中で記載されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を、黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）配列なしに含む。いくつかの事例において、発明対象の２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、配列番号：３２（Ｃｈａｍｐ２．０）中で記載されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を、黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）配列なしに含む。いくつかの事例において、発明対象の２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、配列番号：３３（Ｃｈａｍｐ３．０）中で記載されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を、黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）配列なしに含む。いくつかの事例において、発明対象の２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、配列番号：３４（Ｃｈａｍｐ４．０）中で記載されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を、黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）配列なしに含む。
【００９０】
本開示は、上述のような融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本開示は、上述のような融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。いくつかの事例において、融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ニューロン特異的転写制御エレメントへ機能的に連結される。適切な発現ベクター及びニューロン特異的転写制御エレメントは本明細書において記述される。本開示は、上述のような融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む組換え発現ベクターにより遺伝学的に改変された細胞を提供する。いくつかの実施形態において、細胞はニューロンである。
【００９１】
例示的なシステム
本開示は様々な組成物を提供し、それらには以下のものが含まれるが、これらに限定されない。
【００９２】
ａ）ｉ）光応答性ポリペプチドがプロトンポンプである、光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と；ｉｉ）応答タンパク質がイオンチャンネル（例えばアニオンチャンネル）である、応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組成物。
【００９３】
ｂ）ｉ）光応答性ポリペプチドがプロトンポンプである、光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と；ｉｉ）応答タンパク質がクロライドイオンチャンネルである、応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組成物。
【００９４】
ｃ）ｉ）光応答性ポリペプチドがプロトンポンプである、光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と；ｉｉ）応答タンパク質がイオンチャンネル（例えばカチオンチャンネル）である、応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組成物。
【００９５】
ｄ）ｉ）光応答性ポリペプチドがプロトンポンプである、光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と；ｉｉ）応答タンパク質がカリウムイオンチャンネルである、応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組成物。
【００９６】
ｅ）ｉ）光応答性ポリペプチドがプロトンポンプである、光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と；ｉｉ）応答タンパク質がナトリウムイオンチャンネルである、応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組成物。
【００９７】
ｆ）ｉ）光応答性ポリペプチドがチャンネルロドプシンである、光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と；ｉｉ）応答タンパク質がイオンチャンネル（例えばアニオンチャンネル）である、応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組成物。
【００９８】
ｇ）ｉ）光応答性ポリペプチドがチャンネルロドプシンである、光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と；ｉｉ）応答タンパク質がクロライドイオンチャンネルである、応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組成物。
【００９９】
ｈ）ｉ）光応答性ポリペプチドがチャンネルロドプシンである、光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と；ｉｉ）応答タンパク質がイオンチャンネル（例えばカチオンチャンネル）である、応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組成物。
【０１００】
ｉ）ｉ）光応答性ポリペプチドがチャンネルロドプシンである、光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と；ｉｉ）応答タンパク質がカリウムチャンネルである、応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組成物。
【０１０１】
ｊ）ｉ）光応答性ポリペプチドがチャンネルロドプシンである、光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と；ｉｉ）応答タンパク質がナトリウムチャンネルである、応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組成物。
【０１０２】
ｋ）ｉ）光応答性ポリペプチドがチャンネルロドプシンである、光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と；ｉｉ）応答タンパク質がプロトンポンプである、応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組成物。
【０１０３】
ｌ）ｉ）光応答性ポリペプチドがプロトンポンプである、光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と；ｉｉ）応答タンパク質がプロトンポンプである、応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組成物。
【０１０４】
ｍ）ｉ）光応答性ポリペプチドがクロライドイオンポンプである、光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と；ｉｉ）応答タンパク質がアニオンチャンネルである、応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組成物。
【０１０５】
ｎ）ｉ）光応答性ポリペプチドがクロライドイオンポンプである、光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と；ｉｉ）応答タンパク質がカチオンチャンネルである、応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組成物。
【０１０６】
ｏ）ｉ）光応答性ポリペプチドがクロライドイオンポンプである、光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と；ｉｉ）応答タンパク質がカリウムチャンネルである、応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組成物。
【０１０７】
ｐ）ｉ）光応答性ポリペプチドがクロライドイオンポンプである、光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と；ｉｉ）応答タンパク質がナトリウムチャンネルである、応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組成物。
【０１０８】
ｑ）ｉ）光応答性ポリペプチドがクロライドイオンポンプである、光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と；ｉｉ）応答タンパク質がプロトンポンプである、応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組成物。
【０１０９】
本開示は様々な組成物を提供し、それらには以下のものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１０】
ａ）ｉ）光応答性ポリペプチドがイオンポンプまたはイオンチャンネルである、光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と；ｉｉ）応答タンパク質が、イオン交換輸送体、イオントランスポーター、イオンアンチポーターまたはイオンシンポートコトランスポーターである、応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組成物。
【０１１１】
ｂ）ｉ）光応答性ポリペプチドがプロトンポンプである、光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と；ｉｉ）応答タンパク質がナトリウム−リン酸 コトランスポーターである、応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組成物。
【０１１２】
ｃ）ｉ）光応答性ポリペプチドがプロトンポンプである、光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と；ｉｉ）応答タンパク質がナトリウム−カリウム−クロライド コトランスポーターである、応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組成物。
【０１１３】
ｄ）ｉ）光応答性ポリペプチドがプロトンポンプである、光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と；ｉｉ）応答タンパク質が、イオン交換輸送体（アンチポーター）、例えばナトリウム−カルシウム交換輸送体、カリウム依存性ナトリウム−カルシウム交換輸送体またはナトリウム−水素交換輸送体である、応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組成物。
【０１１４】
ｅ）ｉ）光応答性ポリペプチドがチャンネルロドプシンである、光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と；ｉｉ）応答タンパク質がナトリウム−リン酸 コトランスポーターである、応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組成物。
【０１１５】
ｆ）ｉ）光応答性ポリペプチドがチャンネルロドプシンである、光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と；ｉｉ）応答タンパク質がナトリウム−カリウム−クロライド コトランスポーターである、応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組成物。
【０１１６】
ｇ）ｉ）光応答性ポリペプチドがチャンネルロドプシンである、光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と；ｉｉ）応答タンパク質が、イオン交換輸送体（アンチポーター）、例えばナトリウム−カルシウム交換輸送体、カリウム依存性ナトリウム−カルシウム交換輸送体またはナトリウム−水素交換輸送体である、応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組成物。
【０１１７】
本開示は様々な組成物を提供し、それらには以下のものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１８】
ａ）上述のような、２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む組成物。
【０１１９】
ｂ）アミノ末端からカルボキシル末端の順序で、ｉ）光応答性ポリペプチド（上述の通り）と；ｉｉ）応答タンパク質（上述の通り）とを含む、２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドを含む核酸を含む組成物。
【０１２０】
ｃ）アミノ末端からカルボキシル末端の順序で、ｉ）応答タンパク質と；ｉｉ）光応答性ポリペプチドとを含む、２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドを含む核酸を含む組成物。
【０１２１】
ｄ）アミノ末端からカルボキシル末端の順序で、ｉ）光応答性ポリペプチドと；ｉｉ）リンカーペプチドと；ｉｉｉ）応答タンパク質とを含む、２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドを含む核酸を含む組成物。
【０１２２】
ｅ）アミノ末端からカルボキシル末端の順序で、ｉ）光応答性ポリペプチドと；ｉｉ）膜トラフィッキングシグナルと；ｉｉｉ）応答タンパク質とを含む、２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドを含む核酸を含む組成物。
【０１２３】
ｆ）アミノ末端からカルボキシル末端の順序で、ｉ）光応答性ポリペプチドと；ｉｉ）膜トラフィッキングシグナルと；ｉｉｉ）応答タンパク質と；ｉｖ）膜トラフィッキングシグナルとを含む、２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドを含む核酸を含む組成物。
【０１２４】
ｇ）アミノ末端からカルボキシル末端の順序で、ｉ）光応答性ポリペプチドと；ｉｉ）膜トラフィッキングシグナルと；ｉｉｉ）自己切断ポリペプチドと；ｉｖ）応答タンパク質と；ｖ）膜トラフィッキングシグナルとを含む、２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドを含む核酸を含む組成物。
【０１２５】
ｈ）アミノ末端からカルボキシル末端の順序で、ｉ）配列番号：１中で記載されるｅＡｒｃｈポリペプチドアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｅＡｒｃｈポリペプチドと；ｉｉ）膜トラフィッキングシグナルと；ｉｉｉ）配列番号：１９中で記載されるＡＳＩＣ２ａポリペプチドアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＡＳＩＣ２ａポリペプチドと；ｉｖ）膜トラフィッキングシグナルとを含む、２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドを含む核酸を含む組成物。いくつかの事例において、膜トラフィッキングシグナルは、
2019194225.tif 000032
である。これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、ＥＲ搬出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号：４７））をさらに含む。
【０１２６】
ｉ）アミノ末端からカルボキシル末端の順序で、ｉ）配列番号：１中で記載されるｅＡｒｃｈポリペプチドアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｅＡｒｃｈポリペプチドと；ｉｉ）膜トラフィッキングシグナル
2019194225.tif 000033
と；ｉｉｉ）約５アミノ酸〜約１００アミノ酸のポリペプチドリンカー（例えば約２０アミノ酸〜約２５アミノ酸長のポリペプチドリンカー）と；ｉｖ）配列番号：１９中で記載されるＡＳＩＣ２ａポリペプチドアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＡＳＩＣ２ａポリペプチドと；ｖ）膜トラフィッキングシグナル
2019194225.tif 000034
とを含む、２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドを含む核酸を含む組成物。これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、ＥＲ搬出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号：４７））をさらに含む。
【０１２７】
ｊ）アミノ末端からカルボキシル末端の順序で、ｉ）配列番号：１中で記載されるｅＡｒｃｈポリペプチドアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｅＡｒｃｈポリペプチドと；ｉｉ）膜トラフィッキングシグナル
2019194225.tif 000035
と；ｉｉｉ）約５アミノ酸〜約１００アミノ酸のポリペプチドリンカー（例えば約４０アミノ酸〜約４５アミノ酸長のポリペプチドリンカー）と；ｉｖ）配列番号：１９中で記載されるＡＳＩＣ２ａポリペプチドアミノ酸配列へ、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＡＳＩＣ２ａポリペプチドと；ｖ）膜トラフィッキングシグナル
2019194225.tif 000036
とを含む、２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドを含む核酸を含む組成物。これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、ＥＲ搬出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号：４７））をさらに含む。
【０１２８】
ｋ）アミノ末端からカルボキシル末端の順序で、ｉ）配列番号：１中で記載されるｅＡｒｃｈポリペプチドアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｅＡｒｃｈポリペプチドと；ｉｉ）膜トラフィッキングシグナルと；ｉｉｉ）自己切断ペプチド
2019194225.tif 000037
と；ｉｖ）配列番号：１９中で記載されるＡＳＩＣ２ａポリペプチドアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＡＳＩＣ２ａポリペプチドと；ｖ）膜トラフィッキングシグナルとを含む、２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドを含む核酸を含む組成物。いくつかの事例において、膜トラフィッキングシグナルは、
2019194225.tif 000038
である。これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、２構成要素の光遺伝学的融合ポリペプチドは、ＥＲ搬出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号：４７））をさらに含む。
【０１２９】
いくつかの事例において、上記の核酸は、光応答性タンパク質及び／または応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクターである。いくつかの事例において、発明対象の組成物は、光応答性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現ベクターと；応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクターとを含む。いくつかの事例において、発明対象の組成物は、光応答性タンパク質をコードするヌクレオチド配列及び応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単一の発現ベクターを含む。組成物が単一の発現ベクターを含む場合に、いくつかの事例において、光応答性タンパク質をコードするヌクレオチド配列及び応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、同じ転写制御エレメント（例えばプロモーター）の転写制御（機能的に連結された）下である。組成物が単一の発現ベクターを含む場合に、いくつかの事例において、光応答性タンパク質をコードするヌクレオチド配列及び応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、２つの異なるプロモーターの転写制御（機能的に連結された）下である。
【０１３０】
本開示は、細胞の膜電位の調節のためのシステムであって、ｉ）光に応答して第１のイオンが細胞膜を通過することを可能にするように適合された光活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第１の核酸と；ｉｉ）第２のイオンが細胞膜を通過することを可能にすることによって、第１のイオンの細胞膜の通過に応答する応答タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第２の核酸と；ｉｉｉ）光により標的場所を照射するように構成された装置とを含む、該システムを提供する。核酸の上記の組み合わせのいずれかは、発明対象のシステム中で含まれ得る。
【０１３１】
ポリヌクレオチド及びベクター
本開示の態様には、本明細書において記述される発明対象のタンパク質のうちの１つまたは複数（例えば上述のような１つまたは複数の光活性化タンパク質または応答タンパク質）をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸（ポリヌクレオチド等）が含まれる。いくつかの実施形態において、発明対象のポリヌクレオチドは発現カセットを含み、発現カセットは、ポリヌクレオチドによってコードされた１つまたは複数のタンパク質の標的細胞中での発現に利用される複数の構成要素（例えば複数のコード配列）を含有する。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、発明対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの部分はプロモーター配列へ機能的に連結される。標的細胞中で機能する任意の適切なプロモーターを発明対象のポリヌクレオチドの発現のために使用することができる。特定の実施形態において、プロモーター配列は、特定の標的細胞タイプまたは特定の組織タイプに特異的なプロモーター（特定のニューロンプロモーターまたは汎ニューロンプロモーター等）であり得る。プロモーターの開始調節領域（特定の動物細胞中でポリヌクレオチドの発現を駆動するのに有用である）は多数あり、当業者は精通している。発明対象のポリヌクレオチドの発現を駆動できる実質的に任意のプロモーターを使用することができる。いくつかの実施形態において、発明対象のタンパク質の発現の駆動に使用されるプロモーターはＴｈｙ１プロモーターであり得る（例えばＬｌｅｗｅｌｌｙｎら，２０１０，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１６（１０）：１１６１−１１６６を参照）。いくつかの実施形態において、発明対象のタンパク質の発現の駆動に使用されるプロモーターは、ヒトシナプシン（ｈＳｙｎ）プロモーター、ヒト伸長因子１−α（ＥＦ１α）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーター、シナプシン−Ｉプロモーター（例えばヒトシナプシン−Ｉプロモーター）、ヒトシヌクレイン１プロモーター、ヒトＴｈｙ１プロモーター、カルシウム／カルモジュリン依存性のキナーゼＩＩα（ＣＡＭＫＩＩα）プロモーター、または標的細胞中での発明対象の核酸配列の発現の駆動を可能にする任意の他のプロモーターであり得る。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、プロモーターは誘導可能プロモーターであり得る。例えば、プロモーターは、外来的に投与された薬物へ反応するトランス作用因子によって誘導することができる。誘導可能プロモーターの事例には、テトラサイクリンオンプロモーターもしくはテトラサイクリンオフプロモーター、またはタモキシフェン誘導可能ＣｒｅＥＲが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、発明対象のポリヌクレオチドは、同じ転写からの２つの別々のタンパク質の生成に使用することができるリボソームスキップ配列を含むことができる。かかる実施形態において、発明対象のポリヌクレオチドは、典型的には応答タンパク質に加えて光活性化タンパク質をコードするコード配列を含むだろう。これらの実施形態において、リボソームスキップ配列を２つのコード配列の間に配置して、同じ転写物から２つの別個のタンパク質（すなわち光活性化タンパク質及び応答タンパク質）を生産することができる。
【０１３５】
発明対象のポリヌクレオチドまたは本明細書において記述されるようなその任意のバリアントを含むベクターも本明細書において提供される。本開示に記載のベクターには、ベクターのポリヌクレオチドから転写された場合に標的細胞の原形質膜上で発明対象のタンパク質の蓄積を生じるＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含むベクターも含まれる。使用することができるベクターには、レンチウイルスベクター、ＨＳＶベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが限定されずに含まれる。レンチウイルスには、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ及びＥＩＡＶが含まれるが、これらに限定されない。レンチウイルスには、ＶＳＶ、狂犬病ウイルス、Ｍｏ−ＭＬＶ、バキュロウイルス及びエボラウイルスが含まれるが、これらに限定されない他のウイルスのエンベロープタンパク質によりシュードタイプ化することができる。かかるベクターは当技術分野において標準的な方法を使用して調製することができる。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、ベクターは組換えＡＡＶベクターであり得る。ＡＡＶベクターは、それらが感染する細胞のゲノムの中へ、安定的かつ部位特異的な様式で組み込むことができる比較的小さいサイズのＤＮＡウイルスである。それらは、細胞の増殖、形態または分化に対する任意の効果を誘導せずに幅広い範囲の細胞に感染することができ、ヒト病理に関与するようには思われない。ＡＡＶゲノムをクローン化、配列決定及び特徴づけた。それはおよそ４７００塩基を包含し、各々の末端でおよそ１４５塩基の逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域（ウイルスのための複製起点として役立つ）を含有する。ゲノムの残りは、カプシド形成機能を保有する２つの必須領域（ウイルス複製及びウイルス遺伝子の発現に関与するｒｅｐ遺伝子を含有するゲノムの左側パート；ならびにウイルスのカプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含有するゲノムの右側パート）に分けられる。
【０１３７】
ＡＡＶベクターは当技術分野において標準的な方法を使用して調製することができる。任意のセロタイプのアデノ随伴ウイルスが適切である（例えばＢｌａｃｋｌｏｗ、「Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ編（１９８８）の１６５〜１７４ページ；Ｒｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３：１，１９７４；Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ（ＪＲ  Ｋｅｒｒ、ＳＦ  Ｃｏｔｍｏｒｅ、ＭＥ  Ｂｌｏｏｍ、ＲＭ  Ｌｉｎｄｅｎ、ＣＲ  Ｐａｒｒｉｓｈ編）５〜１４ページ、Ｈｕｄｄｅｒ  Ａｒｎｏｌｄ、Ｌｏｎｄｏｎ、イギリス（２００６）中のＰ．Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ「Ｔｈｅ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ」；及びＤＥ  Ｂｏｗｌｅｓ、ＪＥ  Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ、ＲＪ  Ｓａｍｕｌｓｋｉ「Ｔｈｅ  Ｇｅｎｕｓ  Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ」（ＪＲ  Ｋｅｒｒ、ＳＦ  Ｃｏｔｍｏｒｅ、ＭＥ  Ｂｌｏｏｍ、ＲＭ  Ｌｉｎｄｅｎ、ＣＲ  Ｐａｒｒｉｓｈ編）ｐ１５〜２３ページ、Ｈｕｄｄｅｒ  Ａｒｎｏｌｄ、Ｌｏｎｄｏｎ、イギリス（２００６）を参照、それらの各々の開示はそれらの全体が参照として本明細書に援用される）。ベクターのための精製方法は、例えば「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｈｉｇｈ  Ｔｉｔｅｒ  Ｈｅｌｐｅｒ−ｆｒｅｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＡＡＶ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」というタイトルの米国特許第６，５６６，１１８号、第６，９８９，２６４号及び第６，９９５，００６号ならびにＷＯ／１９９９／０１１７６４中で見出すことができ、それらの開示はそれらの全体が参照として本明細書に援用される。バキュロウイルスシステムにおいてＡＡＶベクターを調製する方法は、例えばＷＯ２００８／０２４９９８中で記述される。ＡＡＶベクターは自己相補的または一本鎖であり得る。ハイブリッドベクターの調製は例えばＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２７０９１号中で記述され、この開示はその全体を参照として本明細書に援用される。インビトロ及びインビボでの遺伝子の移入のためのＡＡＶに由来するベクターの使用が記述された（例えば国際特許出願第９１／１８０８８号及び第９３／０９２３９号；米国特許第４，７９７，３６８号、第６，５９６，５３５号及び第５，１３９，９４１号；ならびに欧州特許第０４８８５２８号を参照、そのすべてはそれらの全体が参照として本明細書に援用される）。これらの出版物は、ｒｅｐ遺伝子及び／またはｃａｐ遺伝子を欠失させ、興味ある遺伝子によって置き換えられた様々なＡＡＶ由来コンストラクト、ならびにインビトロで（培養細胞の中へ）またはインビボで（直接生物の中へ）興味ある遺伝子を移入するためのこれらのコンストラクトの使用を記述する。本開示に記載の複製欠損組換えＡＡＶは、２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域が隣接した興味ある核酸配列を含有するプラスミド及びＡＡＶカプシド形成遺伝子（ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子）を保有するプラスミドを、ヒトヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス）により感染した細胞株の中へコトランスフェクションすることによって調製することができる。次いで産生されたＡＡＶ組換え体は標準的な技法によって精製される。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、本開示の方法で使用されるベクターは、ウイルス粒子（例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５及びＡＡＶ１６が含まれるが、これらに限定されないＡＡＶウイルス粒子）の中でキャプシド形成される。したがって、本開示には、本明細書において記述されるベクターのいずれかを含む組換えウイルス粒子（それが組換えポリヌクレオチドを含有するので組換え体である）が含まれる。かかる粒子を生産する方法は当技術分野において公知であり、米国特許第６，５９６，５３５号中で記述され、この開示はその全体を参照として本明細書に援用される。
【０１３９】
図５は発明対象のポリヌクレオチドの事例を提供する。図示されたポリヌクレオチドは、５'から３'で、光活性化タンパク質配列（Ａｒｃｈ）、トラフィッキング配列（ｔｓ）、リボソームスキップ配列（ｐ２Ａ）、応答タンパク質配列（ＡＳＩＣ２ａ）及び黄色蛍光タンパク質配列（ＥＹＦＰ）を含む。図６は発明対象のポリヌクレオチドの異なる事例を提供する。図示されたポリヌクレオチドは、５'から３'で、光活性化タンパク質配列（Ａｒｃｈ）、トラフィッキング配列（ｔｓ）、リボソームスキップ配列（ｐ２Ａ）、応答タンパク質配列（ＡＳＩＣ２ａ）、トラフィッキング配列（ｔｓ）、黄色蛍光タンパク質配列（ＥＹＦＰ）及び小胞体搬出配列（ＥＲ）を含む。
【０１４０】
図７は発明対象のベクターの事例を提供する。図示されたベクターは、５'から３'で、ＣａｍＫＩＩプロモーター配列、Ａｒｃｈコード配列、トラフィッキング配列（ｔｓ）、リボソームスキップ配列（ｐ２Ａ）、ＡＳＩＣ２ａコード配列、トラフィッキング配列（ｔｓ）、黄色蛍光タンパク質配列（ＥＹＦＰ）及び小胞体搬出配列（ＥＲ）を含む。図８は発明対象のベクターの別の事例を提供する。図示されたベクターは、５'から３'で、ｈＳｙｎプロモーター配列、Ａｒｃｈコード配列、トラフィッキング配列（ｔｓ）、リボソームスキップ配列（ｐ２Ａ）、ＡＳＩＣ２ａコード配列及び黄色蛍光タンパク質配列（ＥＹＦＰ）を含む。
【０１４１】
医薬組成物
本開示の態様には、発明対象のポリヌクレオチド、ベクターまたはその構成要素を含む医薬組成物が含まれる。発明対象の医薬組成物を、標的細胞が１つまたは複数の発明対象のタンパク質を発現するように標的細胞を遺伝学的に改変する目的のために、対象へ投与することができる。発明対象の医薬組成物は、いくつかの実施形態において、薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、標的細胞への発明対象のポリヌクレオチドまたはベクターの送達を促進する構成要素を含むことができ、トランスフェクション試薬またはその構成要素（脂質、ポリマー及び同種のもの等）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、発明対象の医薬組成物は対象への注射に好適であり、例えば滅菌済みであろう。例えば、いくつかの実施形態において、発明対象の医薬組成物は対象への注射に好適であり、例えば、組成物は滅菌済みであり、検出可能なパイロジェン及び／または他の毒素がない。
【０１４３】
薬学的に許容される賦形剤（賦形剤、アジュバント、担体または希釈剤等）は、公に容易に利用可能である。さらに、薬学的に許容される補助物質（ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張性調整剤、安定剤、湿潤剤ならびに同種のもの等）は、同様に公に容易に利用可能であり、本開示の医薬組成物の中へ限定されずに取り込むことができる。
【０１４４】
標的の細胞及び組織
上で要約されるように、本開示の態様には、発明対象のポリヌクレオチドまたはその構成要素の標的細胞への送達が含まれる。標的細胞は一般的には電気的インパルスを運搬または伝達する細胞（神経細胞等）である。いくつかの実施形態において、標的細胞は、例えば感覚ニューロン、運動ニューロンまたは介在ニューロンであり得る。本開示の標的細胞には、中枢神経系の細胞及び／または末梢神経系の細胞が含まれ得る。いくつかの実施形態において、標的組織には、複数の神経線維、神経、神経細胞ガングリオン、神経筋接合部、神経によって支配される組織（筋肉、皮膚または内分泌組織が含まれるが、これらに限定されない）または解剖学的領域（脳または脊髄の部分または下位部分等）が含まれる。いくつかの実施形態において、標的組織は個別の細胞の部分（神経細胞の特異的軸索等）であり得る。
【０１４５】
一旦発明対象のポリヌクレオチドが標的の細胞または組織に送達されたならば、ポリヌクレオチドは標的細胞に入り発現される。いくつかの実施形態において、組織特異的プロモーターについての活性のある標的細胞中でのみ発現が起こるように、発明対象のポリヌクレオチドは組織特異的プロモーターを含むことができる。この手法において、発明対象のポリヌクレオチドが標的細胞以外の細胞に送達されれば、組織特異的プロモーターはそれらの細胞中で不活性であるので、ポリヌクレオチドは非標的細胞中で発現しないだろう。いくつかの実施形態において、外来的に投与された薬物がプロモーターを活性化する細胞内で十分な濃度である場合にのみポリヌクレオチドの発現が起こるように、発明対象のポリヌクレオチドは誘導可能プロモーターを含有することができる。
【０１４６】
いくつかの事例において、本開示は、上述のような光応答性タンパク質及び応答タンパク質を発現する標的細胞の活性の調節のための方法を提供し、方法は光による光応答性タンパク質の活性化を含む。いくつかの事例において、本開示は、上述のような光応答性タンパク質及び応答タンパク質を発現する細胞に近位の標的細胞の活性の調節のための方法を提供し、方法は光による光応答性タンパク質の活性化を含む。したがって、標的細胞は光応答性タンパク質及び応答タンパク質を発現しなくてもよいが、標的細胞の活性は、標的細胞に近位の細胞中の光応答性タンパク質の光による活性化に際して調節される。上述のような光応答性タンパク質及び応答タンパク質を発現する細胞に「近位の」標的細胞には、上述のような光応答性タンパク質及び応答タンパク質を発現する細胞と直接物理的に接触する細胞が含まれる。上述のような光応答性タンパク質及び応答タンパク質を発現する細胞に「近位の」標的細胞には、上述のような光応答性タンパク質及び応答タンパク質を発現する細胞と直接物理的に接触しない細胞が含まれるが、その活性は、上述のような光応答性タンパク質及び応答タンパク質を発現する細胞によって調節される（例えば上述のような光応答性タンパク質及び応答タンパク質を発現する細胞によって産生される神経伝達物質によって調節される；など）。
【０１４７】
装置
上で要約されるように、本開示の態様には、発明対象の方法の態様の実行に使用することができる様々な装置が含まれる。発明対象の方法における使用を見出される装置には、標的の細胞及び組織への発明対象のポリヌクレオチドの送達に使用できる送達装置、発明対象の光活性化タンパク質を発現する標的細胞の照射に使用できる光生成装置、ならびに特異的な標的の細胞または組織への光の送達の制御に使用できる制御装置が含まれる。これらの装置の各々はさらに以下に記述される。
【０１４８】
送達装置
本開示の態様には、標的細胞への発明対象の医薬組成物の送達に使用できる送達装置が含まれる。発明対象の送達装置は、発明対象の医薬組成物の規則的な用量、非規則的な用量、プログラムされた用量、または臨床医もしくは患者により活性化された用量を１つまたは複数の標的細胞へ提供して、標的細胞が発明対象のタンパク質を発現し続けることを保証することができる。
【０１４９】
発明対象の送達装置は、一般的には様々な構成要素（リザーバー、ポンプ、アクチュエーター、チューブ構成要素、針、カテーテル、及び患者の標的の細胞または組織への発明対象の医薬組成物の送達に好適な他の構成要素等）を含むことができる。送達装置は、コンピューターでの操作を促進する構成要素（電力源、メモリーを含むプロセッサー、ユーザインプット装置、及び／またはグラフィカルユーザーインターフェース等）も含むことができる。いくつかの実施形態において、送達装置は患者内に完全にまたは部分的に埋込み可能であり得る。いくつかの実施形態において、送達装置は介護者によって操作することができ、装置は患者の身体の部分の中へ（例えば患者の脳の中へ）導入され、発明対象の医薬組成物は標的組織（例えば患者の脳の部分）に送達される。いくつかの実施形態において、医薬組成物の送達に続いて、装置を除去することができる。他の実施形態において、装置は、追加の医薬組成物の後の送達のためにその場に維持することができる。
【０１５０】
光生成装置
本開示の態様には、発明対象のタンパク質の１つまたは複数を発現する標的細胞への光の送達に使用できる光生成装置が含まれる。本開示の実施形態に従う光生成装置は、一般的には装置上の１つまたは複数の光源から多様な異なる波長の光を生産することができる。いくつかの実施形態において、光生成装置は、１つまたは複数の発明対象のタンパク質を発現する標的細胞の周囲または近くに配置できる光カフまたは光スリーブを含むことができる。いくつかの実施形態において、光源の部分または光源全体は埋込み可能であり得る。発明対象の光生成装置は、本明細書において開示される光活性化タンパク質の刺激のために有用な任意の構成であり得る。いくつかの実施形態において、例えば、光生成装置は、標的の細胞または組織の排他的な照射を促進する構成要素を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態において、光生成装置は、標的細胞、標的細胞の部分（例えば神経細胞の特定の軸索）、または特定の解剖学的構造（例えば神経線維の束、標的組織または脊髄の部分等）へ排他的に光を方向付けることができる。「排他的に光を方向付ける」によって、光生成装置は特異的な標的構造のみへ光を送達し、他の構造を照射しないことが意味される。例えば、いくつかの実施形態において、光生成装置は、神経細胞の軸索を照射するように構成されてもよいが、神経細胞の他の部分を照射しなくてもよい。この手法において、光生成装置からの光は、照射される特異的な標的構造中の光活性化タンパク質のみに影響する。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、光生成装置は、光活性化タンパク質を発現する標的細胞を含有する領域を完全には囲まず、むしろＵ字形を有し得る。いくつかの実施形態において、光生成装置は、特定の領域または標的構造（例えば特異的なニューロン領域）への光生成装置のガイドに使用できるアタッチメントアームを有することができる。アタッチメントアームは光生成装置の埋込みに続いて除去することができるか、または興味ある標的細胞に近傍の光生成装置の位置を固定するようにその場に残すことができる。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、発明対象の光生成装置は内側ボディを含むことができ、内側ボディは光の生成のための少なくとも１つの手段（それは電力源に接続される）を有する。いくつかの実施形態において、電力源は、光生成装置に電力を供給するための内蔵電池であり得る。いくつかの実施形態において、埋込み可能な光生成装置は、電力を供給する装置のための外部源から無線で送信された電磁エネルギーを受信するための外部アンテナを含むことができる。無線で送信された電磁エネルギーは、電波、マイクロ波、または光生成装置に電力を供給する外部源から送信できる任意の他の電磁エネルギー源であり得る。いくつかの実施形態において、光生成装置は、例えば半導体または当技術分野において公知の他のプロセスを使用して製造された集積回路によって制御される。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、光生成装置は発光ダイオード（ＬＥＤ）を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＬＥＤは青色光及び／または緑色光を生成することができる。他の実施形態において、ＬＥＤはアンバー光及び／または黄色光を生成することができる。いくつかの実施形態において、複数のマイクロＬＥＤは光生成装置の内側ボディの中へ包埋される。他の実施形態において、光生成装置は、固体レーザーダイオードまたは光を生成できる他の手段である。光生成装置は、発明対象の光活性化タンパク質を活性化するのに十分な波長及び強度を有する光を生成することができる。いくつかの実施形態において、光生成装置は、包括的に、約０．０５ｍＷ／ｍｍ２、０．１ｍＷ／ｍｍ２、０．２ｍＷ／ｍｍ２、０．３ｍＷ／ｍｍ２、０．４ｍＷ／ｍｍ２、０．５ｍＷ／ｍｍ２、約０．６ｍＷ／ｍｍ２、約０．７ｍＷ／ｍｍ２、約０．８ｍＷ／ｍｍ２、約０．９ｍＷ／ｍｍ２、約１．０ｍＷ／ｍｍ２、約１．１ｍＷ／ｍｍ２、約１．２ｍＷ／ｍｍ２約１．３ｍＷ／ｍｍ２約１．４ｍＷ／ｍｍ２約１．５ｍＷ／ｍｍ２約１．６ｍＷ／ｍｍ２、約１．７ｍＷ／ｍｍ２、約１．８ｍＷ／ｍｍ２、約１．９ｍＷ／ｍｍ２、約２．０ｍＷ／ｍｍ２、約２．１ｍＷ／ｍｍ２、約２．２ｍＷ／ｍｍ２、約２．３ｍＷ／ｍｍ２、約２．４ｍＷ／ｍｍ２、約２．５ｍＷ／ｍｍ２、約３ｍＷ／ｍｍ２、約３．５ｍＷ／ｍｍ２、約４ｍＷ／ｍｍ２、約４．５ｍＷ／ｍｍ２、約５ｍＷ／ｍｍ２、約５．５ｍＷ／ｍｍ２、約６ｍＷ／ｍｍ２、約７ｍＷ／ｍｍ２、約８ｍＷ／ｍｍ２、約９ｍＷ／ｍｍ２、または約１０ｍＷ／ｍｍ２のうちのいずれかの強度を有する光を、これらの数の間の値を含んで生産する。いくつかの実施形態において、光生成装置は、少なくとも約１０Ｈｚ（約２５Ｈｚまで等、約５０Ｈｚまで等、約７５Ｈｚまで等、約１００Ｈｚまで等）の強度を有する光を生産する。
【０１５４】
発明対象の光生成装置は、一般的には、約３５０ｎｍから、約３６０ｎｍまで、約３７０ｎｍまで、約３８０ｎｍまで、約３９０ｎｍまで、約４００ｎｍまで、約４１０ｎｍまで、約４２０ｎｍまで、約４３０ｎｍまで、約４４０ｎｍまで、約４５０ｎｍまで、約４６０ｎｍまで、約４７０ｎｍまで、約４８０ｎｍまで、約４９０ｎｍまで、約５００ｎｍまで、約５１０ｎｍまで、約５２０ｎｍまで、約５３０ｎｍまで、約５４０ｎｍまで、約５５０ｎｍまで、約５６０ｎｍまで、約５７０ｎｍまで、約５８０ｎｍまで、約５９０ｎｍまで、約６００ｎｍまで、約６１０ｎｍまで、約６２０ｎｍまで、約６３０ｎｍまで、約６４０ｎｍまで、約６５０ｎｍまで、約６６０ｎｍまで、約６７０ｎｍまで、約６８０ｎｍまで、約６９０ｎｍまで、約７００ｎｍまで、約７１０ｎｍまで、約７２０ｎｍまで、約７３０ｎｍまで、約７４０ｎｍまで、及び／または約７５０ｎｍまでの範囲の波長を有する光を生成することができる。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、発明対象の光生成装置は、光源から光を送ることができ、標的構造へ光を送達することができる、１つまたは複数の光ファイバーを含むことができる。光ファイバーはプラスチック材料またはガラス材料を含むことができ、いくつかの実施形態において、剛性構造によって収容することができなかった場所中への光生成装置の設置を促進するように適切に柔軟であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、光生成装置は、光を生成する光源に加えて、患者の身体上またはその中の様々な場所中に配置することができる１つまたは複数の光ファイバーを含むことができる。光源からの光は、光ファイバーを介して通過することができ、角のまわりを通過し、光ファイバー中で曲がり、光ファイバーの端部で出現して、標的構造へ光を送達する。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、発明対象の光生成装置は、光の異なる波長による標的組織の照射に使用することができる複数の光源を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態において、光生成装置は、第１の波長（例えば赤色光）の光を生成する第１の光源、及び第２の波長（例えば緑色光）の光を生成する第２の光源を含むことができる。かかる光生成装置は、両方の波長の光による同じ標的組織の同時照射に使用することができるか、または第１の波長の光及び第２の波長の光により標的組織を交互に照射することができる。いくつかの実施形態において、かかる光生成装置は、同じ光源からの光の異なる標的組織への送達に使用することができる。例えば、いくつかの実施形態において、光生成装置は、第１の標的組織への第１の波長の光を送達し、異なる標的組織への第２の波長の光を送達することができる。
【０１５７】
制御装置
本開示の態様には、発明対象の光生成装置から放射される光の量を制御または調節することができる制御装置が含まれる。いくつかの実施形態において、制御装置は、光生成装置から標的組織に送られる光の波長及び／または強度を調節するように構成することができる。いくつかの実施形態において、制御装置は、光生成装置から標的組織に送られる光の周波数及び／または継続期間を調節するように構成することができる。例えば、いくつかの実施形態において、制御装置は光生成装置から光のパルスを標的組織へ送達するように構成することができる。標的組織が、使用者インプットなどに従って、例えば規則的または不規則な率で光生成装置からの光により照射されるように、制御装置は光パルスの周波数及び／または継続期間を調節することができる。いくつかの実施形態において、制御装置は、約１ミリ秒以下から約１秒まで、約１０秒まで、約２０秒まで、約３０秒まで、約４０秒まで、約５０秒まで、約６０秒以上までの範囲の継続期間を有する、光生成装置から光のパルスを生産することができる。いくつかの実施形態において、制御装置は、１ミリ秒あたり１パルスから１秒あたり約１パルスまで、１分あたり約１パルスまで、１０分あたり約１パルスまで、２０分あたり約１パルスまで、３０分あたり約１パルスまでの周波数を有する、光生成装置から光のパルスを生産することができる。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、発明対象の制御装置は、送信コイルへ取り付けできる電力源を含むことができる。いくつかの実施形態において、電池は、電力をそれに提供するために電力源に接続することができる。スイッチを電力源に接続することができ、操作者（例えば患者または介護者）が手動で電力源を作動または停止することを可能にする。いくつかの実施形態において、スイッチの作動に際して、電力源は、制御装置上の送信コイルと埋込み可能な光生成装置（光カフまたは光スリーブ等）の外部アンテナとの間の電磁結合を介して光生成装置へ電力を提供することができる。送信コイルは、光生成装置へ電力を供給するために、及び光生成装置へ１つまたは複数の制御信号を送信するために、その近傍である場合に、埋込み可能な光生成装置の外部アンテナと電磁結合を確立することができる。いくつかの実施形態において、制御装置の送信コイルと埋込み可能な光生成装置の外部アンテナとの間の電磁結合は、高周波磁気インダクタンス結合であり得る。高周波磁気インダクタンス結合が使用される場合、電波の操作上の周波数は、包括的に、約１〜２０ＭＨｚの間であり得、これらの数の間の任意の値（例えば約１ＭＨｚ、約２ＭＨｚ、約３ＭＨｚ、約４ＭＨｚ、約５ＭＨｚ、約６ＭＨｚ、約７ＭＨｚ、約８ＭＨｚ、約９ＭＨｚ、約１０ＭＨｚ、約１１ＭＨｚ、約１２ＭＨｚ、約１３ＭＨｚ、約１４ＭＨｚ、約１５ＭＨｚ、約１６ＭＨｚ、約１７ＭＨｚ、約１８ＭＨｚ、約１９ＭＨｚまたは約２０ＭＨｚ）を含む。しかしながら、他の結合技法（受光器、赤外線または生物医学的遠隔測定システム等）を使用することができる（例えばＫｉｏｕｒｔｉ、「Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｌｅｍｅｔｒｙ：Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｉｍｐｌａｎｔｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｅｘｔｅｒｎａｌ  Ｗｏｒｌｄ」、Ｏｐｔｉｃｏｎ１８２６，（８）：Ｓｐｒｉｎｇ，２０１０を参照）。
【０１５９】
ここで図９へ移って、光学的刺激システム１００の第１の事例を図示する。光学的刺激システム１００は、標的組織（例えば患者の脳組織１０７）への発明対象のポリヌクレオチドの送達のための送達装置１０１を含む。光生成装置１０２、制御装置１０３、及び光生成装置１０２によって生成した光を光カフ１０６上に配置された光アレイ１０５へ運搬するための光ファイバー１０４も提供される。
【０１６０】
ここで図１０へ移って、光学的刺激システム１１０の第２の事例を図示する。光学的刺激システム１１０は、標的組織（例えば患者の脳組織１０７）への発明対象のポリヌクレオチドの送達のためのカテーテル１１２を含む。光生成装置１０２、制御装置１０３、及び光生成装置１０２によって生成した光を光ファイバー１０４の端部へ運搬するための光ファイバー１０４も提供される。
【０１６１】
ここで図１１へ移って、光学的刺激システム１２０の第３の事例を図示する。光学的刺激システム１２０は、光生成装置１０２、制御装置１０３、及び光生成装置１０２によって生成した光を患者の脊髄１２１に沿った様々な位置へ運搬するための光ファイバー１０４を含む。
【０１６２】
方法
本開示の態様には、標的細胞中の活動電位の光遺伝学的調節のための方法が含まれる。発明対象の方法は、概して、標的細胞の中への光活性化タンパク質及び応答タンパク質の導入ならびに活性化波長の光による標的細胞の照射を含む。活性化波長の光による標的細胞の照射により、光活性化タンパク質は、第１のイオンの種のうちの１つまたは複数を、標的細胞の原形質膜を通過させることを可能にする。光活性化タンパク質を介して通過した第１のイオンの種の存在により、応答タンパク質は、第２のイオンの種を、標的細胞の原形質膜を通過させることを可能にする。第２のイオンの種の、標的細胞の原形質膜の通過は、所望される効果（例えば原形質膜の膜電位の調節、イオンチャンネルの活性化または不活性化など等）を有する。いくつかの実施形態において、第２のイオン種の、原形質膜の通過は、患者における１つまたは複数の神経学的応答またはプロセスの調節に使用することができ、したがって患者における疾患または病態の治療に使用することができる。それゆえ、いくつかの実施形態において、発明対象の方法は、病態（神経学的病態等）について本明細書において提供されるシステム及び装置を使用して患者を治療することを含む。発明対象の方法をここで以下により詳細に記述する。
【０１６３】
上で論じられるように、いくつかの事例において、標的細胞は光応答性タンパク質及び応答タンパク質を発現しないが、標的細胞の活性は、標的細胞に近位の細胞中の光応答性タンパク質の光による活性化に際して調節される。上述のような光応答性タンパク質及び応答タンパク質を発現する細胞に「近位の」標的細胞には、上述のような光応答性タンパク質及び応答タンパク質を発現する細胞と直接物理的に接触する細胞が含まれる。上述のような光応答性タンパク質及び応答タンパク質を発現する細胞に「近位の」標的細胞には、上述のような光応答性タンパク質及び応答タンパク質を発現する細胞と直接物理的に接触しない細胞が含まれるが、その活性は、上述のような光応答性タンパク質及び応答タンパク質を発現する細胞によって調節される（例えば上述のような光応答性タンパク質及び応答タンパク質を発現する細胞によって産生される神経伝達物質によって調節される；など）。
【０１６４】
標的細胞中の膜電位の調節
いくつかの実施形態において、発明対象の方法は、発明対象のシステム及び装置を使用して標的細胞中の膜電位を調節することを含む。いくつかの実施形態において、標的細胞が光活性化タンパク質及び応答タンパク質の両方を発現するように、発明対象の光活性化タンパク質及び発明対象の応答タンパク質をコードする核酸を標的細胞の中へ導入する。次いで標的細胞は、光生成装置を使用して活性化波長の光により照射される。光活性化タンパク質の照射は、光に応答して１つまたは複数の第１のイオンの種の、細胞の原形質膜を通る移動を生じる。いくつかの実施形態において、例えば、光活性化タンパク質はプロトンポンプであり、光に応答して原形質膜の内側から原形質膜の外側へタンパク質を移動させる。
【０１６５】
一旦、第１のイオン種が標的細胞の原形質膜を横切って移動されたならば、応答タンパク質は、標的細胞の原形質膜を横切って第２のイオン種を輸送することによって、第１のイオン種の存在に応答する。いくつかの実施形態において、例えば、応答タンパク質は酸感受性イオンチャンネル（例えばＡＳＩＣ２ａ等）であり、それは、酸性条件の存在（原形質膜の外側上のプロトンの存在等）を検出し、第２のイオンの種の、原形質膜の通過を可能にするイオンチャンネル（ナトリウムイオンチャンネル等）の開口によって応答する。第２のイオンの種の、原形質膜の通過は、原形質膜を横切って電荷分布を変化させることによって細胞の膜電位を調節する。例えば、いくつかの実施形態において、第２のイオンの種の、原形質膜の通過は、細胞の内側に正電荷の蓄積を生じ、それは細胞の膜電位を調節する。それゆえ、発明対象の応答タンパク質と組み合わせて発明対象の光活性化タンパク質を使用すると、本開示の方法は活性化波長の光に応答して標的細胞の膜電位を調節することに使用することができる。
【０１６６】
電圧ゲート型イオンチャンネルの阻害活性
いくつかの実施形態において、発明対象の方法は神経細胞中に存在し得る電圧ゲート型ナトリウムチャンネル（ＶＧＳＣ）の活性を阻害することを含む。ＶＧＳＣは、神経細胞の膜電位中の変化によって活性化され、一般的には与えられた刺激に応答して神経細胞膜の迅速で協調した脱分極に関与するイオンチャンネルのクラスである。例えば、ＶＧＳＣは神経細胞の軸索に沿ってしばしば見出され、軸索に沿った活動電位の伝導を一般的には促進する。
【０１６７】
ＶＧＳＣは、ナトリウムイオンが原形質膜の外側から神経細胞の中へ流れ込むことを可能にすることによって機能する。神経細胞の中への正に荷電したナトリウムイオンの流れは、膜電位を変化させ、それによって神経細胞の長さに沿って活動電位を伝導する。活性化に続いて、ＶＧＳＣは時間依存的様式で不活性化される。一旦不活性化されたならば、細胞膜電位が再分極するまで、ＶＧＳＣは不応性の不活性化状態のままである。それゆえ、一旦不活性化されたならば、神経細胞が再分極するまでＶＧＳＣが活性を取り戻すことができないので、ＶＧＳＣの不活性化は神経細胞活性の制御のための強力な技法である。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、発明対象の方法は、神経細胞の中へ光活性化タンパク質（光活性化プロトンポンプ（例えばＡｒｃｈ）等）及び応答タンパク質（酸感受性ナトリウムイオンチャンネル（例えばＡＳＩＣ２ａ）等）を導入することによって、ＶＧＳＣの活性を阻害することを含む。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは神経細胞の中へ導入され、タンパク質は神経細胞によって発現し神経細胞の原形質膜の中へ挿入される。次いで、神経細胞は光生成装置からの活性化波長の光により照射されて、光活性化プロトンポンプによる、細胞の内側から細胞の外側への原形質膜を通るプロトンの輸送を引き起こす。プロトンが原形質膜の外部表面上またはその近くに存在する場合、応答タンパク質はプロトンの存在を検出し、ナトリウムイオンチャンネルの開口によって応答する。ナトリウムイオンチャンネルは、ナトリウムイオンが細胞の外側から細胞の内側へ原形質膜を通過することを可能にする。
【０１６９】
一旦神経細胞の内側にあれば、ナトリウムイオンは膜を十分に脱分極させて原形質膜中の１つまたは複数のＶＧＳＣを不活性化する。ＶＧＳＣの不活性化は、膜が再分極し（それは光の中断及び応答タンパク質電流の減衰によって促進される）、不応期が終了するまで、ＶＧＳＣが神経細胞中でさらなる活動電位を生成することを防止する。それゆえ、神経細胞に沿った活動電位の伝導は、光パルスの継続期間、応答タンパク質電流減衰及び不応期の間ブロックされる。神経細胞原形質膜の中へ発明対象のタンパク質を導入すること及び神経細胞中の１つまたは複数のＶＧＳＣを不活性化する光生成装置からの活性化波長の光により細胞を照射することによって、神経細胞に沿った活動電位の伝導をブロックすることに、発明対象の方法を使用することができる。活動電位遮断の継続期間が光パルスの継続期間より長続きするので、活動電位の阻害は連続的な光送達ではなく、パルス光送達を使用して達成することができる。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、発明対象の方法は、標的組織中に存在し得る１つまたは複数の電圧ゲート型カルシウムチャンネル（ＶＧＣＣ）の活性を阻害することを含む。例えば、いくつかの細胞及び組織中で、電圧ゲート型カルシウムチャンネル（ＶＧＣＣ）は、電圧ゲート型ナトリウムチャンネル（ＶＧＳＣ）に関して上記のものに類似した役割を果たし、電圧依存性不活性化も示す。さらに、ＶＧＣＣは神経伝達物質放出、調節物質及びホルモン放出、ならびに筋収縮も媒介する。したがって、いくつかの実施形態において、発明対象の方法は、標的細胞の中へ光活性化タンパク質（光活性化プロトンポンプ（例えばＡｒｃｈ）等）及び応答タンパク質（酸感受性ナトリウムイオンチャンネル（例えばＡＳＩＣ２ａ）等）を導入することによって、ＶＧＣＣの活性を阻害することを含む。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは標的細胞の中へ導入され、タンパク質は標的細胞によって発現されて標的細胞の原形質膜の中へ挿入される。次いで、標的細胞は光生成装置からの活性化波長の光により照射されて、光活性化プロトンポンプによる細胞の内側から細胞の外側への、原形質膜を通るプロトンの輸送を引き起こす。プロトンが原形質膜の外部表面上またはその近くに存在する場合、応答タンパク質はプロトンの存在を検出し、ナトリウムイオンチャンネルの開口によって応答する。ナトリウムイオンチャンネルは、ナトリウムイオンが細胞の外側から細胞の内側へ、原形質膜を通過することを可能にする。
【０１７１】
一旦標的細胞の内側にあれば、ナトリウムイオンは膜を十分に脱分極させて原形質膜中の１つまたは複数のＶＧＣＣを不活性化する。ＶＧＣＣの不活性化は、膜が再分極し（それは光の中断及び応答タンパク質電流の減衰によって促進される）、不応期が終了するまで、例えばＶＧＣＣが標的細胞中でさらなる活動電位を生成すること；神経伝達物質、調節物質またはホルモンの放出を媒介すること；筋収縮を媒介すること；及び同種のことを防止する。それゆえ、標的細胞中のＶＧＣＣの様々な機能は、光パルスの継続期間、応答タンパク質電流減衰及び不応期の間ブロックされる。したがって、標的細胞原形質膜の中へ発明対象のタンパク質を導入すること及び標的細胞中の１つまたは複数のＶＧＣＣを不活性化する光生成装置からの活性化波長の光により細胞を照射することによって、標的細胞中でＶＧＣＣの様々な機能をブロックすることに、発明対象の方法は使用することができる。ＶＧＣＣ遮断の継続期間が光パルスの継続期間より長続きするので、ＶＧＣＣの阻害は連続的な光送達ではなく、パルス光送達を使用して達成することができる。
【０１７２】
神経細胞中の逆行性活動電位の阻害及び／またはブロック
いくつかの実施形態において、発明対象の方法は、発明対象のシステム及び装置を使用して、神経細胞の部分に沿った（例えば神経細胞の軸索に沿った）逆行性活動電位の伝導をブロック及び／または阻害することを含む。例えば、いくつかの実施形態において、発明対象の方法は、神経細胞の中へ光活性化タンパク質（光活性化プロトンポンプ（例えばＡｒｃｈ）等）及び応答タンパク質（酸感受性ナトリウムイオンチャンネル（例えばＡＳＩＣ２ａ）等）を導入することを含む。タンパク質をコードするポリヌクレオチドは神経細胞の中へ導入され、タンパク質は神経細胞によって発現されて神経細胞の原形質膜の中へ挿入される。
【０１７３】
次いで、光生成装置が活性化される場合に、神経細胞の標的部分のみ（例えば神経細胞の軸索のみまたは軸索の部分のみ）が、活性化波長の光により照射されるように、光生成装置は配置される。次いで、光生成装置を活性化して神経細胞の所望される部分へ光を送達して、光活性化プロトンポンプによる細胞の内側から細胞の外側への、原形質膜を通るプロトンの輸送を引き起こす。プロトンが原形質膜の外部表面上またはその近くに存在する場合、応答タンパク質はプロトンの存在を検出し、ナトリウムイオンチャンネルの開口によって応答する。ナトリウムイオンチャンネルは、ナトリウムイオンが細胞の外側から細胞の内側へ、原形質膜を通過することを可能にする。
【０１７４】
一旦細胞の内側にあれば、ナトリウムイオンは、光生成装置からの光により照射される細胞の部分において膜を十分に脱分極させて原形質膜中の１つまたは複数のＶＧＳＣを不活性化する。神経細胞の指定された領域におけるＶＧＳＣの不活性化は、膜が再分極し（それは光の中断及び応答タンパク質電流の減衰によって促進される）、不応期が終了するまで、ＶＧＳＣが神経細胞中でさらなる活動電位を生成することを防止する。それゆえ、照射された領域における神経細胞に沿った活動電位の伝導は、光パルスの継続期間、応答タンパク質電流減衰及び不応期の間ブロックされる。したがって、神経細胞原形質膜の中へ発明対象のタンパク質を導入すること及び神経細胞または軸索の照射された部分中の１つまたは複数のＶＧＳＣを不活性化する光生成装置からの活性化波長の光により神経細胞の特異的部分のみを照射することによって、神経細胞の特定の部分に沿った活動電位の伝導をブロックすることに、発明対象の方法を使用することができる。活性遮断の継続期間が光パルスの継続期間より長続きするので、活動電位の阻害は連続的な光送達ではなく、パルス光送達を使用して達成することができる。したがって、発明対象の方法は、神経細胞の特異的部分への活性化波長の光の送達によって、神経細胞または軸索の特定の部分に沿った活動電位の伝導をブロックまたは阻害することに使用することができる。重要なことには、活動電位は、それにもかかわらず、発明対象の光活性化タンパク質を活性化用の波長の光により照射されない神経細胞または軸索の他の部分を介して伝導され得る。本手法において、活動電位の伝導（順行性及び／または直行性（ｏｒｔｈｏｇｒａｄｅ）のもの、ならびに天然、光学的または電気的に誘発されたもの）を軸索分岐または細胞のサブドメインへ限定することにより、特異性が達成される。
【０１７５】
治療の方法
いくつかの実施形態において、発明対象の方法は、患者内の標的細胞の活動電位を光遺伝学的に調節することによって、病態または障害（神経学的病態または障害）について患者を治療することに使用することができる。いくつかの実施形態において、発明対象の方法は、患者内の標的組織中へ光活性化タンパク質（光活性化プロトンポンプ（例えばＡｒｃｈ）等）及び応答タンパク質（酸感受性ナトリウムイオンチャンネル（例えばＡＳＩＣ２ａ）等）を導入することを含む。いくつかの実施形態において、標的組織の中への発明対象のタンパク質の導入は発明対象の送達装置を使用して遂行される。発明対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは標的組織の中へ導入され、タンパク質は標的組織中の神経細胞によって発現されて神経細胞の原形質膜の中へ挿入される。
【０１７６】
次いで、光生成装置が活性化された場合に、活性化波長の光により標的組織を照射するように光生成装置を配置する。光生成装置を活性化して（患者または介護者のいずれかによって）標的組織へ光を送達して、光活性化プロトンポンプによる標的組織中の細胞の内側から細胞の外側への、原形質膜を通るプロトンの輸送を引き起こす。プロトンが原形質膜の外部表面上またはその近くに存在する場合、応答タンパク質はプロトンの存在を検出し、ナトリウムイオンチャンネルの開口によって応答する。ナトリウムイオンチャンネルは、ナトリウムイオンが細胞の外側から細胞の内側へ、原形質膜を通過することを可能にする。
【０１７７】
一旦細胞の内側にあれば、ナトリウムイオンは、光生成装置からの光により照射される細胞の部分において膜を十分に脱分極させて原形質膜中の１つまたは複数のＶＧＳＣを不活性化する。神経細胞の指定された領域におけるＶＧＳＣの不活性化は、膜が再分極し（それは光の中断及び応答タンパク質電流の減衰によって促進される）、不応期が終了するまで、ＶＧＳＣが神経細胞中でさらなる活動電位を生成することを防止する。それゆえ、神経細胞に沿った活動電位の伝導は、光パルスの継続期間、応答タンパク質電流減衰及び不応期の間ブロックされる。したがって、神経細胞原形質膜の中へ発明対象のタンパク質を導入すること及び神経細胞の照射された部分中の１つまたは複数のＶＧＳＣを不活性化する光生成装置からの活性化波長の光により神経細胞を照射することによって、神経細胞中の活動電位の伝導をブロックすることに、発明対象の方法を使用することができる。活性遮断の継続期間が光パルスの継続期間より長続きするので、活動電位の阻害は連続的な光送達ではなく、パルス光送達を使用して達成することができる。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、発明対象の方法は、標的組織中に存在し得る１つまたは複数の電圧ゲート型カルシウムチャンネル（ＶＧＣＣ）の活性を阻害することによって、障害について対象を治療することを含む。例えば、いくつかの細胞及び組織中で、電圧ゲート型カルシウムチャンネル（ＶＧＣＣ）は、電圧ゲート型ナトリウムチャンネル（ＶＧＳＣ）に関して上記のものに類似した役割を果たし、電圧依存性不活性化も示す。さらに、ＶＧＣＣは神経伝達物質放出、調節物質及びホルモン放出、ならびに筋収縮も媒介する。したがって、いくつかの実施形態において、発明対象の方法は、標的細胞の中へ光活性化タンパク質（光活性化プロトンポンプ（例えばＡｒｃｈ）等）及び応答タンパク質（酸感受性ナトリウムイオンチャンネル（例えばＡＳＩＣ２ａ）等）を導入することによりＶＧＣＣの活性を阻害することによって、対象を治療することを含む。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは標的細胞の中へ導入され、タンパク質は標的細胞によって発現されて標的細胞の原形質膜の中へ挿入される。次いで、標的細胞は光生成装置からの活性化波長の光により照射されて、光活性化プロトンポンプによる細胞の内側から細胞の外側への、原形質膜を通るプロトンの輸送を引き起こす。プロトンが原形質膜の外部表面上またはその近くに存在する場合、応答タンパク質はプロトンの存在を検出し、ナトリウムイオンチャンネルの開口によって応答する。ナトリウムイオンチャンネルは、ナトリウムイオンが細胞の外側から細胞の内側へ、原形質膜を通過することを可能にする。
【０１７９】
一旦標的細胞の内側にあれば、ナトリウムイオンは膜を十分に脱分極させて原形質膜中の１つまたは複数のＶＧＣＣを不活性化する。ＶＧＣＣの不活性化は、膜が再分極し（それは光の中断及び応答タンパク質電流の減衰によって促進される）、不応期が終了するまで、例えばＶＧＣＣが標的細胞中でさらなる活動電位を生成すること；神経伝達物質、調節物質またはホルモンの放出を媒介すること；筋収縮を媒介すること；及び同種のことを防止する。それゆえ、標的細胞中のＶＧＣＣの様々な機能は、光パルスの継続期間、応答タンパク質電流減衰及び不応期の間ブロックされる。したがって、標的細胞原形質膜の中へ発明対象のタンパク質を導入すること及び標的細胞中の１つまたは複数のＶＧＣＣを不活性化する光生成装置からの活性化波長の光により細胞を照射することにより標的細胞中でＶＧＣＣの様々な機能をブロックすることによって、障害について対象を治療することに、発明対象の方法は使用することができる。ＶＧＣＣ遮断の継続期間が光パルスの継続期間より長続きするので、ＶＧＣＣの阻害は連続的な光送達ではなく、パルス光送達を使用して達成することができる。
【０１８０】
したがって、発明対象の方法は任意の疾患または病態の治療に使用することができ、興奮性細胞もしくは神経細胞に沿ったまたは興奮性細胞もしくは神経細胞の特定の部分に沿った活動電位の伝導のブロックまたは阻害は、患者のための治療法上の効果を有するか、またはＶＧＣＣの機能のブロックは、患者のための治療法上の効果を有するだろう。発明対象の方法の治療法上の適用の例は、心調律障害のための治療法（ペーシング、カルディオバージョン、除細動、再同期または心臓に関連する他の病態等）；胃腸の治療法（肥満、消化管運動異常（例えば胃不全麻痺）、消化不良に対処する治療法、または他の治療法等）、骨盤底治療法を支援する骨盤底組織（例えば仙骨組織または陰部神経組織）のための治療法（疼痛治療法、泌尿器治療法または便失禁治療法、性機能障害または他の治療法等）；脳神経治療法（後頭神経痛、三叉神経痛、顔面痛、片頭痛を和らげる治療法等）；疼痛（侵害受容性疼痛または神経障害性疼痛等）の治療のための治療法；神経病態及び／または精神病態のための治療法；内分泌腺病態のための治療法；または同種のものを限定されずに含む。
【０１８１】
活動電位の伝導（順行性及び／または直行性のもの、ならびに天然、光学的または電気的に誘発されたもの）を軸索分岐または細胞のサブドメインへ限定することにより、上述のように特異性が達成され得る。
【０１８２】
併用療法の方法
いくつかの実施形態において、発明対象の方法は、第１の組織中の活動電位の活性化または開始を含み、第２の組織内の活動電位の伝導のブロックまたは阻害も含む、併用療法を含む。例えば、いくつかの実施形態において、発明対象の方法は、細胞の中へ第１の光活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入することによって、第１の組織（神経細胞等）の中へ第１の光活性化タンパク質を導入することを含む。第１の光活性化タンパク質は標的組織中の細胞の原形質膜を横切って１つまたは複数のイオンを輸送して、活性化波長の光に応答して第１の組織中で活動電位をトリガーすることができる。
【０１８３】
同時に、第２の光活性化タンパク質（光活性化プロトンポンプ（例えばＡｒｃｈ）等）及び応答タンパク質（酸感受性ナトリウムイオンチャンネル（例えばＡＳＩＣ２ａ）等）も、組織の中へ導入する。次いで、光生成装置を標的組織の付近で配置して標的組織を照射する。標的組織またはその部分を異なる波長の光により照射できるように、光生成装置は複数の光源を含む。光生成装置の部分は、活動電位をブロックまたは阻害することが所望される標的組織の部分を排他的に照射するように配置される。例えば、光生成装置の部分（特定の光カフまたは光スリーブ等）は、光の特定の波長により例えば神経細胞の特定の部分（神経細胞の軸索等）を排他的に照射するように配置され得る。
【０１８４】
次いで、光生成装置を活性化して、標的組織中の第１の光活性化タンパク質を活性化用の波長の光を送達する。この照射は標的組織中で活動電位を生成し、これは標的組織中の神経細胞を介して伝導される。同時に、光生成装置を活性化して、活動電位をブロックまたは阻害することが所望される標的組織の特定の部分へ第２の光活性化タンパク質を活性化用の波長の光を送達する。この照射は、光活性化プロトンポンプによる細胞の内側から細胞の外側への、原形質膜を通るプロトンの輸送を引き起こす。プロトンが原形質膜の外部表面上またはその近くに存在する場合、応答タンパク質はプロトンの存在を検出し、ナトリウムイオンチャンネルの開口によって応答する。ナトリウムイオンチャンネルは、ナトリウムイオンが細胞の外側から細胞の内側へ、原形質膜を通過することを可能にし、生来の電圧ゲート型ナトリウムチャンネルを不活性にするように細胞を十分に脱分極する（脱分極ブロックとして公知の現象）。
【０１８５】
標的組織の指定された部分におけるＶＧＳＣの電圧依存性不活性化は、膜が再分極し（それは光の中断及び応答タンパク質電流の減衰によって促進される）、不応期が終了するまで、ＶＧＳＣが神経細胞中でさらなる活動電位を生成することを防止する。それゆえ、規定の領域における神経細胞に沿った活動電位の伝導は、光パルスの継続期間、応答タンパク質電流の減衰及び不応期の間深くブロックされる。したがって、発明対象の方法は、第１の活性化波長の光を使用して標的組織中で活動電位を開始すること、及び標的組織の特異的部分中でのＶＧＳＣの不活性化により標的組織の特異的部分を介する活動電位の伝導を同時にブロックまたは阻害することによって、標的組織を介する活動電位の流れを制御することに使用することができる。加えて、活性遮断の継続期間が光パルスの継続期間より長続きするので、活動電位の阻害は連続的な光送達ではなく、パルス光送達を使用して達成することができる。本手法において、発明対象の方法は、発明対象のシステム及び装置を使用して、標的組織を介する活動電位の流れの方向付け及び制御を提供する。図１２は発明対象の方法の事例の工程を図示するフローチャートを提供する。
【０１８６】
キット
例えば上述のような発明対象のシステム及び装置またはその構成要素、ならびに標的組織中で活動電位を光遺伝学的に調節するために発明対象のシステム及び／または装置をどのように使用するかについてのインストラクションを少なくとも含むキットも提供される。いくつかの実施形態において、キットは、発明対象のポリヌクレオチド、ベクターまたは医薬組成物のうちの１つまたは複数を含むことができる。本開示の実施形態に従うキットは、１つまたは複数の装置（１つもしくは複数の送達装置、１つもしくは複数の光生成装置及び／または１つもしくは複数の制御装置等）も含むことができる。
【０１８７】
上で論じられるようなシステム及び装置を使用するためのインストラクションは、一般的には適切な記録媒体上に記録される。例えば、インストラクションは基材（紙またはプラスチックなど等）上に印刷することができる。それゆえ、インストラクションは、パッケージ挿入物としてキット中に、キットまたはその構成要素の容器のラベル中に（すなわち、パッケージングまたはサブパッケージングに伴って）などで存在することができる。他の実施形態において、インストラクションは、適切なコンピューター読み取り可能な記憶媒体、例えばデジタル記憶媒体、例えばＣＤ−ＲＯＭ、ディスケットなど上に存在する電子記憶データファイルとして存在する。インストラクションは、システム及び装置をどのように使用するかについての完全なインストラクションが含まれるか、またはインターネット上に転記されたインストラクションにアクセスできるウェブサイトアドレスとして、任意の形状をとることができる。
【実施例】
【０１８８】
実施例１：神経細胞中でｅＡｒｃｈ３．０及びＡＳＩＣ２ａを使用する活動電位の阻害
神経細胞に、光活性化プロトンポンプタンパク質（ｅＡｒｃｈ３．０）及び酸感受性ナトリウムイオンチャンネル応答タンパク質（ＡＳＩＣ２ａ）をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクションした。タンパク質は神経細胞中で発現し、神経細胞の原形質膜中に存在した。５６０ｎｍの光のパルスはｅＡｒｃｈ３．０を活性化し、速い外向きプロトン電流を引き起こし、原形質膜の早期過分極をもたらした。次いで、細胞外プロトンは、ＡＳＩＣ２ａによって運搬された内向きカチオン電流を活性化し、持続的膜脱分極及び後続する生来の電圧ゲート型ナトリウムチャンネルの不活性化をもたらし、脱分極ブロック及び誘発されたスパイキングの抑制を引き起こした。結果を図１中で示す。
【０１８９】
実施例２：ＡＳＩＣ２ａを使用する活動電位の強い阻害
海馬の培養ニューロンに、酸感受性ナトリウムイオンチャンネル応答タンパク質（ＡＳＩＣ２ａ）をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクションした。タンパク質は神経細胞中で発現し、神経細胞の原形質膜中に存在した。１０００ｐＡ電流を１０Ｈｚで細胞の中へ注入し、ホールセルパッチクランプ記録を収集した。１０００ｐＡ電流パルス注入に応答して、外向き電流成分はスパイキングを阻害した。しかしながら、２０００ｐＡ電流パルス注入の間に、ＡＳＩＣ構成要素によって引き起こされた脱分極ブロックのみがスパイキングを阻害するのに十分であった。結果を図２中で示す。挿入図は、１秒の緑色光パルスに応答した各々の細胞の電圧クランプトレースを示す。
【０１９０】
実施例３：活動電位の、ＡＳＩＣ２ａ媒介性阻害
神経細胞に、光活性化プロトンポンプタンパク質（ｅＡｒｃｈ３．０）及び酸感受性ナトリウムイオンチャンネル応答タンパク質（ＡＳＩＣ２ａ）をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクションした。タンパク質は神経細胞中で発現し、神経細胞の原形質膜中に存在した。スパイクは、１０Ｈｚで閾上（高信頼性スパイキング）電流パルス注入を使用して、ベースラインで誘発された。光が適用された場合、ｅＡｒｃｈ３．０媒介性過分極はスパイキングを阻害するのに不十分であったが、ＡＳＩＣ２ａ媒介性脱分極は、脱分極ブロックに起因して、光パルスの残りを通してスパイキングを強く抑制した。右側の挿入図は、提供された外向き電流及び内向き電流の振幅により、５６０ｎｍの光の１秒のパルスに対する同じニューロンの電圧クランプ応答を示す。結果を図３中で示す。
【０１９１】
実施例４：活動電位の、弱いＡＳＩＣ２ａ媒介性阻害
神経細胞に、光活性化プロトンポンプタンパク質（ｅＡｒｃｈ３．０）及び酸感受性ナトリウムイオンチャンネル応答タンパク質（ＡＳＩＣ２ａ）をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクションした。タンパク質は神経細胞中で発現し、神経細胞の原形質膜中に存在した。この実施例において、内向き電流：外向き電流の比は小さく（約１）、したがって、ＡＳＩＣ構成要素によって引き起こされた脱分極は、脱分極ブロックを引き起こすこと及び誘発されたスパイキングに打ち勝つことには不十分であった。結果を図４中で示す。
【０１９２】
実施例５：細胞外プロトンによる興奮性の容積調節
この実施例において、細胞外イオン（特にプロトン）が、酸感受性膜タンパク質の活性化を介して細胞非自律的様式でどのように局所的な神経活性に影響を及ぼし得るかが記述される。細胞機能の操作のためのアプローチが記述され、それは酸感受性イオンチャンネルと光感受性プロトンポンプをカップリングし、融通性のある神経制御のために、多くの可能な順列で、膜貫通電流のより長く存続するイオン特異的な調節を可能にするものである。
【０１９３】
方法
バイスタンダー実験
すべての実験は、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅによって承認されたプロトコル下で行われた。
【０１９４】
定位の注入：ＣａｍＫＩＩ陽性ニューロン中でのＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）、ｅＡｒｃｈ３．０またはｅＮｐＨＲ３．０の発現のために、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）セロタイプ２／５を、約４〜１６×１０１２ｐｆｕ／ｍＬ−１のゲノム力価で、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌベクターコアによって産生した。１μＬのウイルスを、３〜４週齢のマウスの海馬のＣＡ１領域の中へ２つの部位で片側に定位で注入した。すべての動物についての座標は、注入部位＃１で、前後で−２．２、中外側で１．５（左側）及び背腹で−１．３（前頂部からのｍｍで）、ならびに注入部位＃２で、前後で−１．７、中外側で１．２５（左側）及び背腹で−１．５（前頂部からのｍｍで）であった。皮質のバイスタンダー実験のために、Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２（１８系統）マウス（Ａｒｅｎｋｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ，２００７）を使用した（施設内で交配）。
【０１９５】
急性スライス電気生理学的記録：急性脳スライスを、ウイルス注入後４〜８週、または遺伝子導入マウスについては４週齢のマウスから調製した。致死性の麻酔後に、経心臓的潅流を行い、断頭し、続いて迅速に脳を抽出し、氷冷したショ糖ベースのスライス溶液（２３４ｍＭショ糖、１１ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．５  ＫＣｌ、１．２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）中に脳を浸した。海馬の３００μｍ厚のスライスをＬｅｉｃａビブラトーム（Ｌｅｉｃａ  ＶＴ１０００Ｓ）で切断した。切断後に、スライスを、高張性回復溶液（８％増加した濃度の人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ））中に、３３℃で１５分間浸し、その後標準的なＡＣＳＦ（１２３ｍＭ  ＮａＣｌ、２６ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１１ｍＭグルコース、３ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１．２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）へ移し、３３℃でさらに４５分間経ったら、その時点でそれらを室温へ移した。
【０１９６】
皮質ニューロン及び海馬ニューロン上のホールセルパッチクランプ記録を正立のＬｅｉｃａ  ＤＭ−ＬＦＳＡ顕微鏡上で行った。スライスを、暖めた（３３℃）ＡＣＳＦ中で７ｍｌ／分−１の速度で継続的に潅流した。パッチングは、電気的に誘発されたシナプス反応の試験の間以外は、シナプス伝達ブロッカーの６−シアノ−７−ニトロキノキサリン−２，３−ジオン（ＣＮＱＸ、５０μＭ）及びＤ（−）−２−アミノ−５−ホスホノ吉草酸（ＡＰＶ、２５μＭ）及びガバジン（２５μＭ）（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の存在下において行った。アミロライド実験については、アミロライドを５００μＭ（Ｔｏｃｒｉｓ）の濃度でＡＣＳＦへ添加した。硼珪酸ガラス（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）ピペットを抵抗値３〜６ＭΩへ引き、グルコン酸カリウム細胞内液（１３０ｍＭ  グルコン酸カリウム、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨを７．３へＫＯＨにより調整した）により充填した。電圧及び電流クランプ電気生理学的な記録及び操作はｐＣｌａｍｐ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して行った。細胞はすべての実験について−７０ｍＶで保持された。−３００ｐＡより大きい漏れ電流のある細胞または３０ＭΩより大きいピペット抵抗は除外した。光（全視野照射）は、異なる波長のフィルターのための１０ポジションホイールを備えたＬａｍｂｄａ  １０−３フィルターホイール（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または外部のフィルター（ｎｍでの波長／ｎｍでの帯域幅：４７０／２０；５６０／２５；５９０／２０）を取り付けた、３００Ｗ  ＤＧ−４ランプ（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ、米国）から放射された。光パルスは、４０倍の０．８のＮＡの水浸対物レンズを介して４〜７ｍＷ／ｍｍ２の光出力密度で送達した。細胞外電気刺激は、プラチナ−イリジウム（ＦＨＣ、Ｂｏｗｄｏｉｎ、ＭＥ、米国）またはタングステン（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＬ、米国）の同心双極電極を使用して行った。電気的パルスは、５００μＡ〜２．５ｍＡの範囲の強度及び５〜１０Ｈｚの周波数で２００μ秒の矩形パルスを送達するように、ｐＣｌａｍｐによって制御された刺激アイソレータ（ＩＳＯ−Ｆｌｅｘ、Ａ．Ｍ．Ｐ．Ｉ）を使用して送達された。
【０１９７】
免疫組織化学：スライス調製物におけるバイスタンダーの同定のために、０．３％ビオシチンを細胞内ピペット溶液へ添加し、記録に続いて、スライスを４％パラホルムアルデヒド潅流固定溶液（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ、米国）中で２４時間固定し、次いで１Xリン酸緩衝生理食塩水（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）へ移した。ビオシチンを、蛍光ストレプトアビジン（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６コンジュゲート、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により３時間にわたって染色した。ＹＦＰ染色のために、スライスを抗ＧＦＰ一次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：５００希釈）中で２４時間インキュベーションした。Ｃｙ５二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、１：５００希釈）を２％ＮＤＳ中で１時間、室温で３時間、続いてＤＡＰＩ（１：５０，０００）を３０分間適用し、次いでマウントし、ＰＶＡ−ＤＡＢＣＯ（Ｓｉｇｍａ）によりカバーグラスをかけた。イメージは、５倍及び１０倍の乾燥対物レンズならびに２０倍、４０倍及び６３倍の油浸対物レンズを使用して、１０２４×１０２４ピクセルの解像度で、Ｌｅｉｃａ共焦点顕微鏡（ＤＭ６００Ｂ）上で得た。
【０１９８】
データ解析：すべての生理学的結果の分析はＣｌａｍｐｆｉｔソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して行った。ピペット（アクセス）抵抗（Ｒａ）及び膜抵抗（Ｒｍ）を５分間の間隔でモニターして記録の安定性を保証し、漏れ電流が３００ｐＡ未満及びＲａが３０ＭΩ未満で、薬物適用の継続期間及び連続的な膜試験の間でＲａの変化が２５％未満である場合のみ、データを組み入れた。逆転電位を１４ｍＶの推測液間電位について補正した。統計解析はＭａｃ  ＯＳ  ＸのためのＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０を使用して行った。ＹＦＰ対照とオプシン群または電気刺激群との間の比較のために、ノンパラメトリックな対応のない両側Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を行って群間の平均順位を比較し、ガウス分布は推測しなかった。バイスタンダーニューロンのスパイキングに対する光の機能的影響の比較のために、ノンパラメトリックな対応のあるＷｉｌｃｏｘｉｎ符号付き順位検定を使用して、各々のオプシンについての逐次的な光のオン 対 光のオフのエポックを比較し、再びガウス分布は推測しなかった。有意性閾値は、ｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、ｐ＜０．００１（＊＊＊）及びｐ＜０．０００１（＊＊＊＊）で設定された。
【０１９９】
２構成要素の光遺伝学実験。コンストラクトデザイン及びアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞中での発現：ラットＡＳＩＣについてのコード配列（ｐＲＳＳＰ６００９中の）はＳｔｅｆａｎ  Ｇｒuｎｄｅｒ（Ａａｃｈｅｎ）によって提供された。ＡＳＩＣをコードするｐＲＳＳＰ６００９プラスミド、及びコッコミクサ・サブエリプソイディア（Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ  ｓｕｂｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）Ｃ−１６９ロドプシンＣｓＲＴ４６ＮをコードするｐＧＥＭプラスミドを、ｐＲＳＳＰ６００９中のＭｕｌＩ部位及びｐＧＥＭ中のＮｈｅＩ部位で直線化した。Ｔ７（ｐＧＥＭ）またはＳＰ６（ｐＲＳＳＰ６００９）ｍＭｅｓｓａｇｅ  ｍＭａｃｈｉｎｅキット（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ、Ｔｅｘａｓ、米国）を使用してＲＮＡへと転写した後に、ＣｓＲポンプ及び１つのタイプのＡＳＩＣをコードする３２ｎｇのキャッピングしたＲＮＡを、ＡＳＩＣ１及びＡＳＩＣ２ａについては１：１のポンプ：チャンネルのモル比ならびにＡＳＩＣ３については１：２のモル比により、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞の中へ共注入した。卵母細胞は、１μＭオールトランスレチナールを含むＯＲＩ溶液中で、１８℃で３日間インキュベーションした（Ｔｓｕｎｏｄａ＆Ｈｅｇｅｍａｎｎ，２００９）。
【０２００】
２電極電圧クランプ測定：ＴＥＶＣ測定は、ＧｅｎｅＣｌａｍｐ  ５００増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ）を使用し、アフリカツメガエル（Ｘ．ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞上で行った。データ収集、緩衝液交換及び光トリガリングは、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １３２２Ａインターフェース（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）経由でｐＣｌａｍｐソフトウェアにより制御した。７５Ｗキセノンランプ（Ｊｅｎａ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｊｅｎａ、ドイツ）によって提供された光を、Ｋ５５フィルター（Ｂａｌｚｅｒｓ、リヒテンシュタイン）を介して通過させ、光ガイド（２ｍｍの直径）を使用して卵母細胞へ適用した。光強度は、卵母細胞の表面で８．５×１０２０光子／秒-1／ｍ-２であった。バルク緩衝液（チャンバー体積３００μｌ）を、１．８±０．２ｍｌ／分の流速で連続的に潅流した。データを１ｋＨｚで捕捉し、０．５ｋＨｚでフィルタリングした。特別に規定されないならば、細胞外緩衝液は、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２及び０．１〜５ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５で）からなっていた。ｐＨ滴定のために、緩衝溶液を、ｐＨ８．０〜４．０の範囲にわたって５ｍＭ  ＭＯＰＳ／ＭＥＳ／クエン酸により調整し、続いて０．１ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）で測定した光電流と比較した。
【０２０１】
海馬ニューロンのためのコンストラクトデザイン：ラットＡＳＩＣ２ａのタンパク質配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１０３４０１４．１）はＧｅｎｓｃｒｉｐｔによってヒトコドンに至適化され合成された。ｅＡｒｃｈ３．０及びＡＳＩＣ−ＹＦＰ融合物を、ＣａＭＫＩＩαまたはヒトのシナプシンプロモーター下でＡＡＶ２骨格の中へクローン化した。トラフィッキングシグナル（ＴＳ）及び小胞体搬出シグナル（ＥＲ）配列を適切に添加して、膜トラフィッキングを促進した。すべてのマップ及び配列の詳細は、ウェブサイトｗｗｗ．ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｏｒｇ上にある。
【０２０２】
海馬ニューロン培養及びリン酸カルシウムトランスフェクション（Ｍａｔｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１１；９：１５９−７２）に従って）。初代培養海馬ニューロンは、Ｐ０  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ仔ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）から調製した。ＣＡ１及びＣＡ３を単離し、０．４ｍｇ／ｍｌパパイン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）により消化し、１：３０マトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ）によりプレコートしたガラスカバーグラスの上へプレーティングした。培養は、１．２５％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、４％Ｂ−２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）及び２ｍｇ／ｍｌフルオロデオキシウリジン（ＦＵＤＲ）（Ｓｉｇｍａ）を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、５％ＣＯ２の高湿度のインキュベーター中で維持し、１ウェルあたり６５，０００細胞の密度で２４ウェルプレート中のカバーグラス上で増殖させた。各々のウェルについて、ＤＮＡ−ＣａＣｌ２混合物は、１５μｌのＨ２Ｏ中で２μｇ  ＤＮＡ（Ｑｉａｇｅｎエンドトキシン不含有調製物）及び１．８７５μｌの２Ｍ  ＣａＣｌ２（最終的なＣａ２＋濃度２５０ｍＭ）により調製した。ＤＮＡ−ＣａＣｌ２へ、ＨＥＰＥＳで緩衝した２×食塩水（ｐＨ７．０５）の１５μｌを添加した。室温（２０〜２２℃）で２０分後に、混合物を各々のウェル（ウェルから増殖培地を除去し、あらかじめ温めた最小必須培地（ＭＥＭ）で置き換えておいた）の中へ１滴ずつ添加し、トランスフェクションを３７℃で４５〜６０分間進め、その後、もとの増殖培地を戻す前に、各々のウェルを１ｍｌの暖かいＭＥＭにより３回洗浄した。
【０２０３】
培養した海馬ニューロンにおける電気生理学的記録：ホールセルパッチクランプ記録は、培養された海馬ニューロンに対してトランスフェクション４〜８日後に正立Ｌｅｉｃａ  ＤＭ−ＬＦＳＡ顕微鏡上で行った（Ｍａｔｔｉｓら，２０１１）。細胞は、シナプス伝達ブロッカーの６−シアノ−７−ニトロキノキサリン−２，３−ジオン（ＣＮＱＸ）、Ｄ（−）−２−アミノ−５−ホスホノ吉草酸（ＡＰＶ）及びガバジン（２５μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の存在下において、標準的な細胞外タイロード液（ＮａＣｌ：１２５ｍＭ、ＫＣｌ  ２ｍＭ、ＣａＣｌ２  ２ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、グルコース３０ｍＭ、ＨＥＰＥＳ  ２５ｍＭ（ＮａＯＨによりｐＨ７．３〜７．４へ滴定）、３２０ｍＯｓｍ）または低ＨＥＰＥＳタイロード液（ＮａＣｌ：１２５ｍＭ、ＫＣｌ  ２ｍＭ、ＣａＣｌ２  ２ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、グルコース５５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ  ０．１ｍＭ（ｐＨ７．３〜７．４へ滴定）、３２０ｍＯｓｍ）中で、１〜２ｍｌ／分の率で連続的に潅流した。３〜６ＭΩの先端抵抗を備えたパッチピペット硼珪酸ガラス電極（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を、グルコン酸カリウム細胞内液（グルコン酸カリウム１３０ｍＭ、ＫＣｌ  １０ｍＭ、ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ、ＥＧＴＡ  １０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ（ＫＯＨによりｐＨ７．３へ滴定）、３００ｍＯｓｍ）により充填した。Ｄｉｇｉｄａｔａ  １４４０Ａインターフェース経由でｐＣｌａｍｐ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、データ収集、電流及び光の操作を制御し、ＣｌａｍｐＦｉｔソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して分析した。細胞はすべての電圧クランプ実験について−７０ｍＶで保持された。静止膜電位を１６ｍＶの推測液間電位について補正した。光遺伝学的ツールの活性化のための全視野照射は、４０倍の０．８の開口数（ＮＡ）の水浸対物レンズ経由で、３００ＷのＤＧ−４ランプ（Ｓｕｔｔｅｒ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって送達した。光は、最初にλ１０−３フィルターホイール（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）内の５６０／２５ｎｍのフィルターを介して通過された。光出力密度はすべての実験について約５ｍＷ／ｍｍ−２であった。すべての実験を室温（２４〜２５℃）で行った。
【０２０４】
培養ニューロンの共焦点イメージ：共焦点イメージは、トランスフェクションしたニューロンのガラスカバーグラスをＤＡＰＩ（１：５０，０００）により染色し、次いで、それを４０倍の拡大の１．２５のＮＡ（油浸）で１，０２５×１，０２４ピクセル解像度としてＬｅｉｃａ共焦点顕微鏡（ＤＭ６００Ｂ）を使用してイメージングすることによって得られた。ｅＹＦＰについては励起／放射波長は４８８ｎｍ／５００〜５４５ｎｍであった。
【０２０５】
結果
バイスタンダー効果の電気生理学的特性
神経活性における、「バイスタンダーニューロン」（本明細書において、間接的に曝露されているが、直接は発現してはいないニューロンとして定義される）による光遺伝学媒介性変化の存在が試験された。２つの光遺伝学的標的化戦略を用いた。第一に、ＣＨＲ２（Ｈ１３４Ｒ）、ｅＡｒｃｈ３．０、ｅＮｐＨＲ３．０またはカルモジュリンキナーゼＩＩαプロモーターによって駆動されるＹＦＰ対照（ＡＡＶ５−ＣａｍＫＩＩ−（オプシン）−ｅＹＦＰ）のうちの１つを含有する光遺伝学的コンストラクトを、海馬のＣＡ１領域中の片側に注入した。これらのニューロンの対側への軸索投射に起因して、次いで、対側のＣＡ１中のオプシン発現軸索によって囲まれた、非発現ニューロン（バイスタンダーニューロン）から記録することができた（図１５Ａ及び１５Ｃ）。脱分極オプシンＣＨＲ２（Ｈ１３４Ｒ）（今後ＣｈＲ２と称される）、２つの過分極オプシン（膜標的化発現について促進された）（プロトンポンプのアーキロドプシン（ｅＡｒｃｈ３．０）及びクロライドポンプのハロロドプシン（ｅＮｐＨＲ３．０））、及びＹＦＰ対照へのバイスタンダー応答を、一致した実験条件下で海馬の調製物において比較した。第２のカテゴリーのバイスタンダーニューロンは遺伝子導入マウス系統Ｔｈｙ１−ＣｈＲ２（１８系統）を使用して同定し、その場合、ＣｈＲ２は層Ｖ皮質ニューロン中で発現し、バイスタンダーニューロンは表面的な皮質中に位置し、それらはＣｈＲ２を発現する膜突起によって囲まれるが、ＣｈＲ２を自らは発現していない（図１５Ｂ及び１５Ｄ）。
【０２０６】
イオンチャンネル性シナプス伝達ブロッカーの存在下においてバイスタンダーニューロンからのホールセル記録を、急性脳スライス中で行った。１５秒の青色光パルスに応答して、海馬のＣｈＲ２バイスタンダーニューロンは、直接的なＣｈＲ２光電流よりも数桁の大きさで遅い開始速度（約２秒）で脱分極する膜電流（平均＝−１５５ｐＡ）（図１５Ｅ）を示した（図１５Ｊ及び図１６）。皮質のＴｈｙ１−ＣｈＲ２バイスタンダーニューロンは、Ｔｈｙ１−ＣｈＲ２発現ニューロンにおける、より小さい直接的なＣｈＲ２光電流の大きさと矛盾しない、より小さい内向き電流（平均＝−２７ｐＡ）を示した（図１７）。これらの内向き電流は、海馬のＣｈＲ２バイスタンダーについて６．１ｍＶ及び皮質のＴｈｙ１−ＣｈＲ２バイスタンダーについて２．７ｍＶの平均膜脱分極に対応した（図１５Ｆ）。ＡＡＶ５−ＹＦＰ対照バイスタンダーは、膜電流または電圧の変化を示さなかった。パルス光パラダイムが光遺伝学的適用の脱分極のために一般的に使用されるとすれば、２０Ｈｚ及び１０Ｈｚの光パルストレインに対するバイスタンダー応答を検査した場合、再び類似する遅い内向き電流（２０Ｈｚについて平均＝−７３ｐＡ及び１０Ｈｚについて−２９ｐＡ）が観察された（図１５Ｇ）。
【０２０７】
次いで海馬のバイスタンダーニューロンに対する過分極化光遺伝学的ツールの影響について考察した。３０秒の光パルスの間に、ＡＡＶ５−ｅＡｒｃｈ３．０バイスタンダーは、直接的なｅＡｒｃｈ３．０光電流よりも数桁の大きさで遅い、遅い（約５秒）過分極電流（平均＝２１ｐＡ）を示し、ＡＡＶ５−ｅＮｐＨＲ３．０バイスタンダーは、より小さく（平均＝１０ｐＡ）、さらにより遅い（約８秒）過分極電流を示した（図１５Ｈ及び１５Ｊ）。これらの外向き電流はｅＡｒｃｈ３．０について−３．３ｍＶ及びｅＮｐＨＲ３．０について−１．１ｍＶの小さい平均膜過分極に対応したが、膜電流または電圧における変化は一致した実験条件下でＡＡＶ５−ＹＦＰ対照バイスタンダーについて観察されなかった（図１５Ｉ）。
【０２０８】
光の適用の間に、ＣｈＲ２バイスタンダーニューロンは膜抵抗の平均２４％の減少を示したが、ｅＡｒｃｈ３．０バイスタンダーニューロンは膜抵抗の９％の増加及びｅＮｐＨＲ３．０バイスタンダーニューロンは２％の増加を示した。ＹＦＰ対照は膜抵抗の３％の減少を示した（図１５Ｌ）。電流−電圧の関係性は、バイスタンダーの脱分極について有意に右上がりの勾配及びバイスタンダーの過分極について有意に右下がりの勾配を実証し、−１０〜−４０ｍＶの間の逆転電位で収束した（図１５Ｋ）。バイスタンダー効果の機能的及び機構的な調査。
【０２０９】
図１５Ａ〜Ｌ。バイスタンダー効果の識別及び説明。Ａ  海馬のＣＡ１へのＡＡＶ５−ＣａｍＫＩＩ−（オプシン）−ｅＹＦＰの片側への注入は、対側の海馬において非発現バイスタンダーニューロンをもたらした。バイスタンダーニューロン（星）のＹＦＰ発現及び場所を示す共焦点イメージ（５倍、スケールバー１ｍｍ）。Ｂ  Ｔｈｙ１−ＣｈＲ２（１８系統）遺伝子導入マウスの皮質の表層中の皮質のバイスタンダーニューロン。バイスタンダーニューロン（星）のＹＦＰ発現及び場所を示す共焦点イメージ（１０倍、スケールバー１００μｍ）。Ｃ  ＣＡ１中のストレプトアビジンで標識されたビオシチン充填海馬のバイスタンダーニューロン（スケールバーは１００μｍ及び２０μｍ）。Ｄ  ストレプトアビジンで標識されたビオシチン充填皮質のバイスタンダーニューロンであり、ＹＦＰ蛍光によって囲まれるが重複してないことが抗ＹＦＰ抗体染色によって確認された（スケールバーは５０μｍ及び２０μｍ）。Ｅ  ＡＡＶ５−ＣｈＲ２海馬のバイスタンダー（平均±ＳＥＭ＝−１５５±３２ｐＡ、ｎ＝１１、ｐ＜０．０００１、ＹＦＰへ比較した）、Ｔｈｙ１−ＣｈＲ２皮質のバイスタンダー（−２７±６ｐＡ、ｎ＝６、ｐ＜０．００１、ＡＡＶ５−ＹＦＰへ比較した）及びＡＡＶ５−ＹＦＰ対照（０．７±０．７ｐＡ、ｎ＝１０）についての、１５秒の４７０ｎｍの光パルスに応答した脱分極バイスタンダー電流であり、例示的電圧クランプトレースは下の要約プロットで示される。Ｆ  ＡＡＶ５−ＣｈＲ２海馬のバイスタンダー（６．１±１．４ｍＶ、ｎ＝１１、ｐ＜０．０００１）、Ｔｈｙ１−ＣｈＲ２バイスタンダー（２．７±０．６ｍＶ、ｎ＝３、ｐ＜０．０１）及びＡＡＶ５−ＹＦＰ対照（０．０２±０．０７ｍＶ、ｎ＝９）についての、脱分極バイスタンダー電位である。例示的電流クランプトレースは下の要約プロットで示される。Ｇ  ２０Ｈｚ（−７３±１８ｐＡ、ｎ＝１２）及び１０Ｈｚ（−２９±６ｐＡ、ｎ＝１１）での４７０ｎｍの光パルストレインに応答したバイスタンダー電流である。例示的電圧クランプトレースは下の要約プロットで示される。Ｈ  ＡＡＶ５−ｅＡｒｃｈ３．０（２１±４ｐＡ、ｎ＝１２、ｐ＜０．０００１）については５６０ｎｍ、ＡＡＶ５−ｅＮｐＨＲ３．０（１０±２ｐＡ、ｎ＝１４、ｐ＜０．０００１）については５９０ｎｍ、及びＡＡＶ５−ＹＦＰ対照（１．３±０．８ｐＡ、ｎ＝１０、５６０ｎｍ光）の３０秒の光に応答した過分極バイスタンダー電流である。例示的電圧クランプトレースは下の要約プロットで示される。Ｉ  ＡＡＶ５−ｅＡｒｃｈ３．０（−３．３±１．１ｍＶ、ｎ＝１２、ｐ＜０．０００１）、ＡＡＶ５−ｅＮｐＨＲ３．０（−１．１±０．２ｍＶ、ｎ＝１２、ｐ＜０．００１）及びＡＡＶ５−ＹＦＰ対照（−０．１±０．２ｍＶ、ｎ＝９）についての過分極バイスタンダー電位である。例示的電流クランプトレースは下の要約プロットで示される。Ｊ  バイスタンダーの脱分極（ＣｈＲ２：１８００±２００ミリ秒、ｎ＝８）及び過分極（ｅＡｒｃｈ３．０：４８００±７１０ミリ秒、ｎ＝１０、ｅＮｐＨＲ３．０：８３００±８５０ミリ秒、ｎ＝７）についての開始速度（τオン）。Ｋ  脱分極ＣｈＲ２バイスタンダー電流（勾配についてのＲ２（０��の差異）＝０．７１、ｐ＜０．０００１）及び過分極バイスタンダー電流（ｅＡｒｃｈ３．０：勾配についてのＲ２＝０．４３、ｐ＜０．０００１、ｅＮｐＨＲ３．０：勾配についてのＲ２＝０．２６、ｐ＝０．０００１）についての電流−電圧の関係性（ｎ＝５〜１２）。Ｌ  ＣｈＲ２（４７０ｎｍ、膜抵抗の２４％の減少、ｎ＝８、ｐ＜０．００１）、ｅＡｒｃｈ３．０（５６０ｎｍ、膜抵抗の９％の増加、ｎ＝１２、ｐ＜０．０００１）、ｅＮｐＨＲ３．０（５９０ｎｍ、膜抵抗の２％の増加、ｎ＝１１、ｐ＜０．０１）及びＹＦＰ対照バイスタンダー（５６０ｎｍ、膜抵抗の３％の減少、ｎ＝１１）についての光の３０秒パルスに応答したベースラインからの膜抵抗における変化。棒グラフはすべて平均値を示し、エラーバーは平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表わす。個別のデーターポイントは、単一の細胞からの結果を示す。すべての統計比較はＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ（ノンパラメトリック）の対応のあるｔ検定を使用して、試験（オプシン）群とＹＦＰ対照との間で行う。
【０２１０】
図１６：光電流の速度及びバイスタンダー。４７０ｎｍの光パルス（それぞれ０．５秒及び１５秒）に応答した、ＣｈＲ２発現細胞の光電流とＣｈＲ２バイスタンダーの電流との間のオン速度における差異を図示する事例のトレース。破線のボックスは、両方のトレースの最初の０．５秒に関する拡大図を示す。
【０２１１】
図１７Ａ及び１７Ｂ：光電流の大きさ。Ａ  バイスタンダーニューロンと同じ調製物中に存在するオプシン発現ニューロンについての定常状態の光電流の大きさ（１秒の光に応答した）。ＡＡＶ−ＣｈＲ２（ｎ＝２０、４７０ｎｍ）、Ｔｈｙ１−ＣｈＲ２（ｎ＝６、４７０ｎｍ）、ＡＡＶ−ｅＡｒｃｈ３．０（ｎ＝１４、５６０ｎｍ）、ＡＡＶ−ｅＮｐＨＲ３．０（ｎ＝１６、５９０ｎｍ）。バーは平均及びＳＥＭを示し、塗りつぶされた円は個別の細胞の光電流を示す。Ｂ  ＡＡＶ５−ＣｈＲ２（青）、ＡＡＶ−ｅＡｒｃｈ３．０（緑）及びＡＡＶ−ｅＮｐＨＲ３．０（アンバー）を発現するニューロンについての事例の光電流トレース。
【０２１２】
誘発活動電位の発火に対するバイスタンダー効果の影響が調べられた（図１８）。照射（４７０ｎｍ、５６０ｎｍまたは５９０ｎｍ）のエポックの間に、バイスタンダーニューロンにおいて誘発された活動電位の比率は双方向様式で調節され、ＡＡＶ５−ＣｈＲ２バイスタンダーの事例においておよそ２倍になり、ＡＡＶ５−ｅＡｒｃｈ３．０バイスタンダーの事例において半分になった（図１８Ａ及び１８Ｂ）。ＡＡＶ５−ｅＮｐＨＲ３．０バイスタンダーは、照射の間のスパイキング成功の中等度であるが有意な低下も示したが、光エポックによる調節はＡＡＶ５−ＹＦＰ対照において観察されなかった（図１８Ｃ及び１８Ｄ）。
【０２１３】
図１８Ａ〜Ｄ。活動電位発火に対するバイスタンダー電流の機能的影響。スパイクは、ベースラインでの約５０％成功率を達成するようにタイトレーションされた１０Ｈｚの電流パルスの細胞内注入によってバイスタンダーニューロン中で誘発された。光パルスを適用し、誘発されたスパイキングにおける変化を記録した。プロットは、Ａ  ＡＡＶ−ＣｈＲ２（ｎ＝４〜１０）、Ｂ  ＡＡＶ−ｅＡｒｃｈ３．０（ｎ＝１３〜１４）、Ｃ  ＡＡＶ−ｅＮｐＨＲ３．０（ｎ＝９〜１４）及びＤ  ＡＡＶ−ＹＦＰ対照のバイスタンダーニューロンについて反復した光のオフ及び光のオンのエポックの間に成功して誘発されたスパイクのパーセンテージを示す。要約プロット及び個別の細胞データを事例トレースにより示す。破線のボックスは、中央の光のオフ／光のオンのエポックに関する拡大図を示す。棒グラフは平均値を示す。エラーバーはＳＥＭを表わす。すべての統計比較（Ｗｉｌｃｏｘｏｎマッチドペア符号付き順位検定）は、光のオンエポック及び先行する光のオフエポックの間で行う。
【０２１４】
バイスタンダー効果が局所的な神経活性における変化の方向を追うことが観察されたので、電気刺激を使用する神経活性の操作の間の効果を観察することができるかどうかが疑問視された。電気刺激は遺伝学的に規定された細胞のタイプまたは投射に拘束されないが、海馬のＣＡ１領域への軸索インプット（Ｓｃｈａｆｆｅｒ側枝）を刺激することによって、「電気的バイスタンダー」を生成しようとした（図１９Ａ）。刺激パラダイムがシナプス放出を誘導する能力（図１９Ｂ）が確認され、次いでイオンチャンネル性シナプス伝達ブロッカーを適用して細胞外環境に対する電気的軸索刺激の影響を単離した。光遺伝学的操作の強度を模倣するために、１０Ｈｚの周波数で高い振幅（０．５〜２．５ｍＡ）の細胞外電流パルスを２０秒の期間使用した（図１９Ｃ）。電気的アーティファクトから、刺激の間のホールセルの電流応答の評価に異議が唱えられたが、ベースラインと比較した刺激直後の保持電流の平均変化は、ＹＦＰ対照群（−１１ｐＡ）よりも有意にネガティブであり（図１９Ｄ）、ＣｈＲ２光遺伝学的バイスタンダー電流に同等の遅い回復が示された。電極金属と細胞外液との間のユニークな電気化学反応の可能性は、タングステン電極及びプラチナ−イリジウム電極の両方を使用して、実験を行うことによって制御され；類似の効果は両方の電極タイプで見出された（図２０）。
【０２１５】
局所的な細胞外ｐＨの変化によってバイスタンダー効果を起こすことができるという仮説が立てられた。神経活性及びシナプスの放出は細胞外ｐＨを調節することができ、多くの膜タンパク質（酸感受性イオンチャンネル（ＡＳＩＣ）等、これらは静止時に部分的に開口し、脳中に豊富にある）が、細胞外プロトンによって修飾される。ＣｈＲ２バイスタンダー電流へのＡＳＩＣの寄与は、ＡＳＩＣ阻害剤のアミロライドによる薬理学的遮断を使用することによって試験された。バイスタンダー電流（１５秒の光パルス）は５分間ごとに７５分間までの間海馬のＣｈＲ２バイスタンダーニューロンにおいて誘発された。２つのベースライン測定に続いて、５００μＭアミロライドを２０分間の間適用し、次いで「ウォッシュアウト」期間の間にＡＣＳＦ単独に戻した。アミロライド適用の間に、膜抵抗の増加（任意の照射の非存在下において）（図１５Ｅ）が観察され、光に誘発されたバイスタンダー電流の大きさはベースライン値の約５０％へ同時に低下し、それはウォッシュアウト期間の間に緩慢に回復した（図１５Ｆ及び１５Ｇ）。ホールセルパッチクランプ構成において細胞を長期間保持する効果を制御するために、実験をアミロライド適用の非存在下において反復し、バイスタンダー電流の大きさの一貫した低下は経時的に観察されなかった（図２１Ｃ）。細胞健全性の測定値は、記録の継続期間でピペットアクセス及び細胞膜の完全性を確認した（図２２Ａ及び２２Ｂ）。
【０２１６】
酸感受性イオンチャンネルへのプロトンポンプのカップリング
酸感受性イオンチャンネルの細胞外プロトンへの応答は、「２構成要素の光遺伝学」（ＴＣＯ）と称される概念を利用した。モジュラーシステムが考案され、そのシステムでは、図２３Ａ中で図示されるように、光感受性タンパク質（プロトンポンプ（例えばコッコミクサ・サブエリプソイディア（Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ  ｓｕｂｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）Ｃ−１６９（ＣｓＲ）またはアーキロドプシン（Ａｒｃｈ））等）を、二次カップリングされたイオンチャンネル（酸感受性イオンチャンネル（ＡＳＩＣ）等）と共発現して、特異的イオン種によって運搬される、光でトリガーされた二次電流を誘発する。
【０２１７】
卵母細胞：Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ（和名：アフリカツメガエル）卵母細胞においてこのアプローチを試験するために、北極の緑藻コッコミクサ・サブエリプソイディア（Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ  ｓｕｂｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）Ｃ−１６９の光駆動性プロトンポンプ（ＣｓＲ）（Ｂｌａｎｃら，２０１２）を選択し（これは、よく特徴づけられているバクテリオロドプシンまたはアーキロドプシンに比較して卵母細胞中での発現が改善されている）、ニューロンの過分極のために使用した。ＣｓＲ変異体Ｔ４６Ｎ（野生型よりも低い電圧依存性を示し、負電圧の大きな光電流を有する）を使用した（図２４）。
【０２１８】
Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ（和名：アフリカツメガエル）卵母細胞中で、ＣｓＲを、各々の３つの異なるラット酸感受性イオンチャンネルのＡＳＩＣ１ａ、ＡＳＩＣ２ａまたはＡＳＩＣ３と共発現させた。これらのチャンネルは、多かれ少なかれ生理的ｐＨより下で、プロトン活性化電流の急なｐＨ依存性を特徴づける。光の開始直後に、ＣｓＲのプロトンポンピングによって運搬された小さい外向き電流、続いて共発現した酸感受性イオンチャンネルによって運搬された大きな内向き電流が観察された（図２３Ｂ〜Ｄ）。ＡＳＩＣ１ａ及びＡＳＩＣ３の両方について、二次的に活性化された内向き電流は光開始後１〜２秒内にピークに達し、次いで、ＡＳＩＣ１ａ及びＡＳＩＣ３の高いプロトン感受性及び速い感度に起因して、今までに記述されるような初期ポンプ電流へ急速に減衰した（Ｚｈａｎｇ＆Ｃａｎｅｓｓａ，２００２）（図２３Ｂ及び２３Ｄ）。これとは対照的に、ＡＳＩＣ２ａは長く存続する光活性化内向き電流を媒介した（図２３Ｃ）。ＡＳＩＣ２ａ電流の上昇はすべての電圧で多相的であり、従来の研究（チャンネルがバルク溶液の酸性化によって直接活性化される）において観察されない特性である。これは、恐らくプロトンポンプによるチャンネルの間接的活性化のためである。５という低いｐＨ５０及びＡＳＩＣ２ａの報告された遅く不完全な感度に一致して（Ｚｈａｎｇ＆Ｃａｎｅｓｓａ  ２００２）、光誘導電流は照射の間に非常に緩慢にのみ減衰した。光オフセットに続いて、電流は約２０秒内で０へ減衰し、照射によって常に再活性化することができた（図２５Ａ）。
【０２１９】
図２３Ａ〜Ｄ。３つの酸感受性イオンチャンネルの光学的活性化。Ａ  ２構成要素の光遺伝学的（ＴＣＯ）アプローチの原理。照射に際して、光活性化プロトンポンプは局所的な細胞外培地を中程度に酸性化し、それらのプロトン感知ドメイン経由で酸感受性イオンチャンネル（ＡＳＩＣ）を活性化することができる。これは、中等度の光強度で持続的細胞脱分極のために使用することができる遠隔性の大きなナトリウム流入を生じる。ゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞中で、コッコミクサ・サブエリプソイディア（Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ  ｓｕｂｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）の光駆動性プロトンポンプ（ＣｓＲ）を使用した。Ｂ〜Ｄ  ラットＡＳＩＣ１ａ、ラットＡＳＩＣ２ａまたはラットＡＳＩＣ３と１：１のモルＲＮＡ比で（ＡＳＩＣ３については２：１）卵母細胞中で共発現させたＣｓＲＴ４６Ｎの巨視的電流。細胞は、一定の潅流下で０．１ｍＭ  ＭＯＰＳ及びｐＨ７．５で異なる保持電圧で５６０ｎｍの光により照射された。小さい外向きに方向付けられたポンプ電流（ＣｓＲ）は、大きな内向きナトリウム電流（ＡＳＩＣ）をトリガーする。挿入図は、ＣｓＲＴ４６Ｎ−ＡＳＩＣ１ａの緑色光による照射の開始直後の初期ポンプ活性へズームしたものである。ＡＳＩＣ１ａ及びＡＳＩＣ３は持続的光で強い不活性化を示すが、ＡＳＩＣ２ａが中等度から全く不活性化がないことを示すことに注目されたい。
【０２２０】
図２４Ａ〜Ｅ。クロレラロドプシン（ＣｓＲ）の光電流。Ａ、Ｂ  ゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞中のＣｓＲ野生型（Ａ）及びＴ４６Ｎ（Ｂ）の光誘導ポンプ電流。Ｔ４６Ｎ変異体は、野生型に比較して負の膜電圧でより大きな電流を示す。Ｃ  電流−電圧関係性、Ｉ（Ｅ）。Ｄ  ５４５ｎｍで最大値の作用スペクトル。Ｅ  同一の条件下で発現したバクテリオロドプシンの光電流（ＢＲ、５７０ｎｍ励起）とＣｓＲ光電流（５４５ｎｍ励起）の比較。ＣｓＲの電流振幅はＢＲの電流振幅よりも平均で１０倍大きい。
【０２２１】
図２５Ａ〜Ｄ。Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ（和名：アフリカツメガエル）卵母細胞中での永続的潅流の有無によるＣｓＲ−ＡＳＩＣ１ａの特徴づけ。「潅流」条件において、３００μｌの計測チャンバーは、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）を含有する標準的な計測緩衝液により１．８±０．２ｍｌ／分で連続的に潅流された。「潅流のない」測定において、緩衝液供給を切り離し、ペリスタポンプのスイッチを切った。Ａ  異なる電圧での「潅流のない」、連続的な「潅流」、及び「潅流のない」の一連の条件における、５６０ｎｍの４０秒の光パルスでの代表的なＣｓＲＴ４６Ｎ−ＡＳＩＣ２ａ光電流。挿入図：−４０ｍＶでの「潅流のない」及び「連続的な潅流」の反復的な光電流。Ｂ  正規化された「潅流」（白丸）と「潅流のない」（正方形）ピーク光電流の比較。空いている正方形は第１の光パルスへの応答及び塗りつぶされた正方形は第３の光パルスへの応答を記述する（Ａを参照）。Ｃ  「潅流」及び第１の光パルス（空いている）と３番目の光パルスについての「潅流のない」条件の初期ＣｓＲＴ４６Ｎポンプ電流に依存する−４０ｍＶで正規化されたピーク光電流（Ａ及びＢを参照）。すべての電流をｐＨ４及び−４０ｍＶでＡＳＩＣ２ａ電流に対して正規化した（図５を参照）。Ｄ  潅流あり（円）及び潅流なし（塗りつぶされた正方形及び空いている正方形、Ｂ及びＣを参照）で、最大半量光電流を達成する時間ｔ１／２、オンによって定量化された、ＣｓＲＴ４６Ｎ−ＡＳＩＣ２ａオン速度。Ｅ  潅流あり（円）及び潅流なし（塗りつぶされた正方形及び空いている正方形、Ｂ及びＣを参照）で、光をスイッチオフした後の半分まで光電流を低下させる時間ｔ１／２、オフによって定量化された、ＣｓＲＴ４６Ｎ−ＡＳＩＣ２ａオフ速度。挿入図：−４０ｍＶでの代表的な光電流についてのｔ１／２、オン及びｔ１／２、オフ（赤色）の記述。
【０２２２】
観察された光活性化内向き電流は、負の電圧でのＮａ＋についての駆動力の増加ならびにＡＳＩＣ２ａの電圧非依存性のゲーティング及び透過性に起因して、膜電圧に反比例した（Ｚｈａｎｇ＆Ｃａｎｅｓｓａ，２００２）（図２３Ａ；図２６Ａ）。Ｎａ＋からＫ＋またはコリンへの主な細胞外カチオンの濃度の変化は、逆転電位をシフトし、内向き電流成分の大きさを大幅に減少させ、ＴＣＯペアの主な特色としてＡＳＩＣ２ａ応答のＮａ＋選択性が確認された（図２６Ａ）。
【０２２３】
光によって活性化されるＡＳＩＣ２ａチャンネルの割合を決定するために、迅速な緩衝液交換によってＡＳＩＣ２ａ電流をタイトレーションした。最大電流（−６０ｍＶで膜電位を保持する場合）はｐＨ４でのみ達成されたことが見出された（図２６Ｂ）。この値への光活性化電流の正規化から、ＡＳＩＣのおよそ２５％がＣｓＲ媒介性酸性化によって活性化されることが明らかにされ（図２６Ｂ〜Ｄ）、細胞表面でＡＳＩＣによって感知される酸性化の近似が可能にされた（図２６Ｂ緑色バー）。５．５以下のｐＨ値で、ＡＳＩＣ２ａがｐＨ６でよりも著しく不活性化されることも指摘された。したがって、ニューロン適用のために、不活性化の程度は達成できる外部ｐＨ値についての有用な指標として役立つことができる。
【０２２４】
ＡＳＩＣ活性化は、異なる強度での光の適用によって調査されるように、活性のあるプロトンポンプの数に強く依存した（図２６Ｅ）。さらに、効果的な活性化がプロトンについての外部緩衝能力（すなわち緩衝液強度及び細胞外体積）に依存することが期待された。実際、０．１ｍＭから５ｍＭへ緩衝液の強度を増加させることはＡＳＩＣ２ａ媒介性内向き電流を強く減少させ（図２６Ｃ）、対応して、光活性化ＡＳＩＣ２ａチャンネルの割合は０．１ｍＭ  ＭＯＰＳで約２５％から５ｍＭ  ＭＯＰＳで約２％になった（図２６Ｄ）。これとは対照的に、細胞外バルク体積は重要性が低いようであった。連続的な潅流による照射の間のバルク培地の一貫した交換は、一定のバルク相による条件と比較して、光活性化ＡＳＩＣ２ａ電流をわずかにだけ減少させた（図２５）。
【０２２５】
図２６Ａ〜Ｅ。卵母細胞中の２電極電圧クランプ（ＴＥＶＣ）によるＣｓＲ−ＡＳＩＣ２ａの特徴づけ。Ａ  １００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＫＣｌまたは１００ｍＭ塩化コリンの細胞外培地中の正規化された光電流の電流−電圧依存性（すべての培地は１ｍＭ  ＮａＣｌ／ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２及び０．１ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）を加えて含有し、ｎ＝５であり、ｐＨ４によって活性化されたＡＳＩＣ２ａ電流へ正規化された）。Ｂ  暗黒中でのｐＨ滴定の間に測定したＡＳＩＣ２ａ電流及びｐＨ７．５で測定した光電流との比較。四角で囲った領域は、０．１ｍＭ  ＭＯＰＳで緑色光による照射によるＡＳＩＣ２ａのパーセント活性化を強調する（図５Ｂ中で示されるデータ）。挿入図：−４０ｍＶでのＡＳＩＣ２ａの代表的なｐＨ活性化電流のトレース。Ｃ  異なる緩衝液濃度でｐＨ４または緑色光によって活性化されたＣｓＲＴ４６Ｎ−ＡＳＩＣ２ａの巨視的電流（５ｍＭ  ＭＯＰＳ、１ｍＭ  ＭＯＰＳ及び０．１ｍＭ  ＭＯＰＳ、−４０ｍＶ、一定の潅流）。Ｄ  異なる緩衝液濃度中で光に駆動されるプロトンポンプＣｓＲＴ４６ＮによるＡＳＩＣ２ａのパーセント活性化（５ｍＭ  ＭＯＰＳ、１ｍＭ  ＭＯＰＳ及び０．１ｍＭ  ＭＯＰＳ、−４０ｍＶ、ｎ＝９であり、１００％活性化をｐＨ４によって産生されたピークＡＳＩＣ電流とした）。Ｅ  異なる光強度で測定した正規化されたＡＳＩＣ２ａ及びＣｓＲＴ４６Ｎの光電流（０．１ｍＭ  ＭＯＰＳ、−４０ｍＶ、ｎ＝５であり、ｐＨ４によって活性化されたＡＳＩＣ２ａ電流へ正規化した）。挿入図：−４０ｍＶでの代表的な電流トレース。
【０２２６】
ニューロン：神経科学への適用のために、ＡＳＩＣ２ａを培養した海馬ニューロン中で試験した。チャンネルを、光駆動性プロトンポンプｅＡｒｃｈ３．０（ニューロン中で高い発現するポンプのうちの１つ）と共発現した（Ｃｈｏｗら，２０１０、Ｍａｔｔｉｓら，２０１１）。単一のｅＡｒｃｈ３．０−ＡＳＩＣ２ａコンストラクトを開発し、それは、Ｃｈａｍｐ（チャンネル／ポンプ）と称され、ＤＮＡレベルでプロトンポンプとＡＳＩＣ２ａチャンネルを融合させ、リンカー配列のみによって２つの遺伝子を分離するものであった（図２７Ａ）。ｅＡｒｃｈ３．０−ＡＳＩＣ２ａ（Ｃｈａｍｐ１．０）の組み合わせは、トラフィッキングシグナル（ＴＳ）及び小胞体（ＥＲ）搬出モチーフを介してより良好な膜局所化（Ｃｈａｍｐ２．０）について促進された（Ｇｒａｄｉｎａｒｕら，２０１０）（図２７Ａ及び２７Ｂ）。ヒトシナプシン（ｈＳｙｎ）またはカルモジュリンキナーゼＩＩα（ＣａｍＫＩＩα）プロモーター下でコンストラクトを発現する培養した海馬錐体ニューロンから、ホールセルパッチクランプ記録を行い、電圧クランプ記録において５６０ｎｍの光に応答する特徴的な二相性膜電流を観察した（図２７Ｃ）。平均の電流の大きさは、外向きプロトンポンプ媒介性成分について２４６ｐＡ、及び内向きＡＳＩＣ媒介性成分について−９５０ｐＡであった（図２７Ｄ）。二相性電流はＹＦＰ陽性ニューロンの４８％において観察され（図２８Ａ及び２８Ｂ）、二種の構成要素コンストラクトを発現するニューロンにおける細胞健全性に対する有害効果の証拠はなかった（図２８Ｃ〜Ｆ）。内向き電流の大きさは外向きプロトンポンプ電流の大きさに直線的に相関した（図２７Ｅ）。ピークの内向き及び外向きの電流の大きさは、ＨＥＰＥＳ緩衝溶液中で、光パルスの継続期間（１秒〜１５秒）により有意に変動せず（図２９Ａ及び２９Ｂ）、最大電流が１秒内に達成可能だったことを示唆するが、光パルス継続期間の増加と共に、二項指数関数によってフィッティングしたオフ速度は増加した（図２９Ｃ及び２９Ｄ）。より長い光パルス（１５秒）については、光パルスの経過にわたって、内向き電流の大きさが初期値のおよそ８０％へ明らかに減衰することが観察され（図２７Ｃ及び図３０Ｂ）、それは持続的光条件下での細胞外酸性度の増加によって説明することができる。
【０２２７】
別個の実験において、電流の大きさに対する細胞外タイロード液中のＨＥＰＥＳ緩衝剤の濃度を減少させる効果（２５ｍＭから０．１ｍＭへ）を試験した（図３０）。低（０．１ｍＭ）ＨＥＰＥＳ溶液において、７／１１のニューロン（約６０％）が特徴的な二相性膜反応を示した（他の点では一致した条件下で標準（２５ｍＭ）タイロード液における５／１０のニューロン（５０％）と比較）。特により長い光パルス（１５秒）の間に低ＨＥＰＥＳ溶液における電流の大きさが増加する傾向がある（図３０Ｄ〜Ｆ）が、これには、光パルスの継続期間にわたってピーク内向き電流のより大きな減衰による応答の安定性の減少が同時に起こり（図３０Ａ及び３０Ｂ）、緩衝の弱い溶液中の細胞外ｐＨのより大きな低下に起因する可能性が高い。
【０２２８】
ＴＣＯを発現するニューロンの膜電位応答の電流クランプ記録から、５６０ｎｍの光が膜電位の初期過分極（−３３ｍＶ）、続いて後続する脱分極（８７ｍＶ）を誘発し（図２７Ｆ及び２７Ｇ）、それは活動電位（約９スパイク）を生成するのに十分であり、光パルスの終了を超えて存続することが明らかにされた（図２７Ｆ及び２７Ｈ）。ＡＳＩＣ媒介性脱分極の程度は初期ポンプ媒介性過分極に比例し（図３１Ｂ）、電圧クランプ記録において観察された内向き及び外向きの電流成分間の直線状の関係性を反映する。光パルス継続期間は、１秒光を超えても膜電位変化の大きさを有意に変更しなかった（図３１）。
【０２２９】
図２７Ａ〜Ｈ。海馬ニューロン中のｅＡｒｃｈ３．０−ＡＳＩＣ２ａ（Ｃｈａｍｐ）の発現。Ａ  促進された光駆動性プロトンポンプＡｒｃｈ３．０と組み合わせたＹＦＰにより標識したＡＳＩＣ２ａを発現する、培養した海馬ニューロンからの黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）蛍光の４０倍拡大での共焦点イメージ。スケールバーは３０μｍを表わす。コンストラクトはＣａｍＫＩＩα及びヒトシナプシン（ｈＳｙｎ）プロモーターの両方下で良好に発現した。Ｂ  ｅＡｒｃｈ（トラフィッキング配列（ＴＳ）によって促進された）及びＡＳＩＣ２ａを含有し、リンカー配列によって分離され、ＹＦＰにより標識された２構成要素のコンストラクトの線画イラスト。Ｃ  Ｃｈａｍｐ電流の代表的な電圧クランプトレース（５６０ｎｍの光の１秒、５秒及び１５秒のパルス（光パルスのタイミングは横線によって示される）に応答したｅＡｒｃｈ３．０−ＡＳＩＣ２ａ電流）。外向き及び内向きの電流成分を測定するのに使用されたトレースの領域ならびにオフ速度は、破線及び矢印によって示される。Ｄ  ５６０ｎｍの光の１秒のパルスに応答したＣｈａｍｐ電流の外向き（平均±ＳＥＭ＝２４６±２７ｐＡ）及び内向き（−９５０±１７２ｐＡ）成分の大きさ（ｎ＝２１）。Ｅ  ５６０ｎｍの光の１秒のパルスへの電流応答の内向き成分と外向き成分との間の関係性（ｎ＝２１）。線形回帰分析は、０からの勾配の差についてＲ２＝０．３３（ｐ＜０．０１）をもたらす。Ｆ  電流クランプにおいて記録された、４つの異なるｅＡｒｃｈ−ＡＳＩＣ２ａ（Ｃｈａｍｐ）を発現する細胞からの５６０ｎｍの光の１秒のパルス（光パルスのタイミングは横線によって示される）への多様な膜電位応答の事例。応答の過分極成分及び脱分極化成分を測定するのに使用されたトレースの領域が示される。Ｇ  光応答の過分極成分（ｅＡｒｃｈ３．０−媒介性、−３３±３ｍＶ）及び脱分極成分（ＡＳＩＣ２ａ媒介性、８７±６ｍＶ）の大きさ（ｎ＝１３）Ｈ  １秒（ｎ＝１７）、５秒（ｎ＝１５）及び１５秒（ｎ＝４）の光パルスに応答して誘発されたスパイクの数。
【０２３０】
図２８Ａ〜Ｆ。培養海馬ニューロン中のＡＳＩＣ２ａ構成要素の可変性の存在。Ａ  ＡＳＩＣ２ａ構成要素が小さい場合の、ｅＡｒｃｈ３．０−ＡＳＩＣ２ａ電流の事例（上部トレース）、及びｅＡｒｃｈ３．０（外向き）構成要素のみが内向きのＡＳＩＣ２ａ構成要素なしで存在するＡＳＩＣの、負電流の事例（下部トレース）。Ｂ  ＡＳＩＣ陰性細胞（ｅＡｒｃｈ３．０構成要素のみが存在、ｎ＝２３）及びＡＳＩＣ陽性細胞（外向き構成要素（ｅＡｒｃｈ３．０）及び内向き構成要素（ＡＳＩＣ２ａ）が存在、ｎ＝２１）についての外向き電流成分の大きさ。Ｃ  すべてのＡＳＩＣ陰性細胞（ｎ＝２３）及びＡＳＩＣ陽性細胞（ｎ＝２１）についての漏れ電流。Ｄ  すべてのＡＳＩＣ陰性細胞（ｎ＝１１）及びＡＳＩＣ陽性細胞（ｎ＝１３）についての静止膜電位。Ｅ  すべてのＡＳＩＣ陰性細胞（ｎ＝２３）及びＡＳＩＣ陽性細胞（ｎ＝２１）についてのピペット（アクセス）抵抗。Ｆ  すべてのＡＳＩＣ陰性細胞（ｎ＝２３）及びＡＳＩＣ陽性細胞（ｎ＝２１）についての膜抵抗。
【０２３１】
図２９Ａ及び２９Ｂ。継続期間を増加させた光パルスに応答するＣｈａｍｐ電流及び速度。Ａ  １秒（ｎ＝２１）、５秒（ｎ＝１４）及び１５秒（ｎ＝１０）の光パルスに応答する外向き及び内向き電流成分の大きさ。Ｂ  １秒（ｎ＝１８）、５秒（ｎ＝９）及び１５秒（ｎ＝７）の光パルスに応答するＣｈａｍｐ電流のオフ速度。オフ応答は、速い期間及び遅い期間で指数関数によってフィッティングされる。
【０２３２】
図３０Ａ〜Ｆ。低ＨＥＰＥＳタイロード液中のＣｈａｍｐ電流。０．１ｍＭ  ＨＥＰＥＳのｅＡｒｃｈ３．０−ＡＳＩＣ２ａ（Ｃｈａｍｐ）光電流の事例であり、１５秒の光パルスの継続期間にわたるピーク電流の迅速な減衰を図示する。ピーク電流及び最終電流の測定のために使用されたトレースの領域が示される。Ｂ  １５秒の光パルスに応答する、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｎ＝５）及び０．１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｎ＝６）中でパッチした細胞についてのピーク電流：最終電流の比。Ｃ  ０．１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｎ＝６）の１５秒の光パルスに応答する内向き電流成分及び外向き電流成分の大きさ。Ｄ  他の点では一致した条件下での、１秒及び１５秒の光パルス（ｎ＝５〜７）の間の２５ｍＭ及び０．１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中の内向き電流の大きさ。Ｅ及びＦ  ０．１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中の１秒及び１５秒の光パルスの間の外向き膜電流及び内向き膜電流。
【０２３３】
図３１Ａ及び３１Ｂ。継続期間を増加させた光パルスに応答するＣｈａｍｐ電位及びＣｈａｍｐ媒介性の過分極と脱分極との間の関係性。Ａ  １秒（ｎ＝１３）、５秒（ｎ＝１０）及び１５秒（ｎ＝４）の光パルスに応答した膜の過分極及び脱分極の大きさ。Ｂ  Ｃｈａｍｐ媒介性の膜の過分極と脱分極との間の関係性についての線形回帰分析は、０からの勾配の差についてＲ２＝０．４７（ｐ＜０．０１）をもたらす。
【０２３４】
特徴的な二相性ＴＣＯ応答の生成においてプロトンポンプ構成要素及びＡＳＩＣ構成要素の近接の影響が調査された。２構成要素の分子的分離は、２つの遺伝子の間の長さを増加させるＤＮＡのリンカー配列を埋め込むことによって系統的に増加させた。第一に、接近して２つのタンパク質を融合する６９塩基対トラフィッキング配列からなる短いリンカー（Ｃｈａｍｐ３．０）、第二に、２つのタンパク質をさらにつなぐがより長い介在ペプチド鎖を備えた長い（１２３塩基対）リンカー配列（Ｃｈａｍｐ２．０）、第三に、翻訳の間に２つのタンパク質を切断するリボソームｐ２ａスキップ配列（Ｓｚｙｍｃｚａｋ−Ｗｏｒｋｍａｎら（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２０１２；２０１２：１９９−２０４）；Ｐｒａｋａｓｈら（Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１２；９：１１７１−１１７９））。最終的に、共発現させるが融合物コンストラクトの生成のない２つの別々のコンストラクト（ＣａｍＫＩＩ−Ａｒｃｈ３．０−ｍＣｈｅｒｒｙ及びＣａｍＫＩＩ−ＡＳＩＣ２ａ−ＹＦＰ）を同時に使用して、ニューロンにトランスフェクションした。４つのコンストラクト及び１つのＣａｍＫＩＩ−ｅＡｒｃｈ３．０−ＹＦＰ対照を、一致した実験条件下で一対一の比較で試験した（図３２）。
【０２３５】
４つのすべてのアプローチが良好なＹＦＰ発現を生じたことが見出され、ＡＳＩＣコンストラクトの成功した発現が示された。共発現の実験において、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の良好な共局所化が観察され、単一の細胞内の両方のコンストラクトの発現が確認された（図３２Ａ〜Ｄ）。コンストラクト間の分子的分離を増加させることは、ＴＣＯ応答の内向き電流成分が観察される可能性を低くすることが見出され、短いリンカー配列（ＴＳ）コンストラクト（Ｃｈａｍｐ３．０）は０．１ｍＭ緩衝液で最も信頼できる最大の内向きＡＳＩＣ媒介性電流を示す（平均内向き電流＝−５９９ｐＡ、平均外向き電流＝１５０ｐＡ）（図３２Ａ）。分離された（ｐ２ａスプリット）コンストラクトにより大きなＡＳＩＣ電流が時々観察されたが、これらはよりあまり確実に起こらなかった（図３２Ｄ）。共発現したコンストラクトはｅＡｒｃｈ３．０光電流のみ（外向き成分）を生成し、それは大きさ（平均＝３７７ｐＡ）で、融合物またはｐ２ａスプリットコンストラクトよりもＡｒｃｈ３．０対照（平均＝５７５ｐＡ）により近かった。プロトンポンプ及びＡＳＩＣチャンネルの物理的な近接へのＴＣＯ機能の観察された依存性は、膜の２つの構成要素の間の相互作用におけるナノ環境のイオンセンシングの重要性を強調する。
【０２３６】
図３２Ａ〜Ｄ。４つのＣｈａｍｐコンストラクトの一対一の比較：分子的距離を増加させる効果。電気生理学的記録はすべて低ＨＥＰＥＳ（０．１ｍＭ）タイロード液中で行われた。各々のコンストラクトについて：線画は２構成要素のコンストラクトの構造を図示し、共焦点イメージは培養における蛍光発現を実証し、グラフはピーク外向き電流の相対的な大きさ及び光パルスの終了時の電流を示す。光パルスの終了時でより負の電流はより大きなＡＳＩＣ構成要素を示す。挿入図：各々の２構成要素コンストラクトについての５６０ｎｍの光の１秒のパルス（光パルスのタイミングは横線によって示される）への電流応答の代表的なトレース。Ａ  Ｃｈａｍｐ３．０：ｅＡｒｃｈ３．０及びＡＳＩＣ２ａは６９塩基対の膜トラフィッキングシグナル（ＴＳ）からなる短いリンカー配列によって融合される（ｎ＝１６）。Ｂ  Ｃｈａｍｐ２．０：ｅＡｒｃｈ３．０及びＡＳＩＣ２ａはより長い（１２３塩基対）配列によって融合される（ｎ＝１７）。Ｃ  Ｃｈａｍｐ４．０：ｅＡｒｃｈ３．０及びＡＳＩＣ２ａはリボソームスキップ配列（ｐ２Ａ）によってタンパク質翻訳の間に分けられる（ｎ＝１４）。Ｄ  ｅＡｒｃｈ３．０及びＡＳＩＣ２ａのコトランスフェクション：ｅＡｒｃｈ３．０をｍＣｈｅｒｒｙにより標識し、ＡＳＩＣ２ａをＹＦＰにより標識して、単一の細胞中で両方の構成要素の同定を可能にする。コトランスフェクションされたコンストラクト及びｅＡｒｃｈ３．０のみの対照についての外向き電流及び光パルスの終了時の電流の電気生理学的特性（それぞれ、ｎ＝９及びｎ＝９）。
【０２３７】
図３３Ａ〜Ｄ。プロトンポンプとＡＳＩＣとの間で増加させた分子的分離を備えた４つの異なるＣｈａｍｐコンストラクトにわたる細胞健全性の測定。５つの群（Ｃｈａｍｐ３．０、Ｃｈａｍｐ２．０、Ｃｈａｍｐ４．０、ｅＡｒｃｈ３．０及びＡＳＩＣ２ａのコトランスフェクション、ならびにｅＡｒｃｈ３．０のみ）にわたる任意の細胞健全性の測定値において有意な差はなかった（一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｆ＝１．５６〜２．２７、ｐ＞０．０５、ｎ＝９〜１７）。Ａ 漏れ電流、Ｂ 膜抵抗、Ｃ ピペット抵抗、Ｄ 静止膜電位。
【０２３８】
参照文献：
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2019194225.tif 000040
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【０２３９】
前述の発明は、理解の明瞭性の目的のための図示及び実施例によってかなり詳細に記述されてきたが、添付の請求項の趣旨または範囲から逸脱せずに、特定の変化及び修飾を本発明へ行なえることは、本発明の教示を考慮して当業者に容易に明らかである。
【０２４０】
したがって、先行するものは本発明の原理を単に説明するものである。当業者が、本明細書において明確に記述されないかまたは示されないが、本発明の原理を具体化し、その趣旨及び範囲内に含まれる様々なアレンジを考案することができるであろうことが認識されるだろう。さらに、本明細書において列挙されたすべての事例及び条件付きの文言は、主として、読者が、本発明の原理及び当該技術分野の促進に対して本発明者によって寄与された概念を理解するのを支援することが意図され、かかる具体的に列挙された事例及び条件に限定されないと解釈されるべきである。さらに、本発明の原理、態様及び実施形態に加えて、その具体的な事例を列挙する本明細書におけるすべての記述は、構造的及び機能的なその均等物を包含することが意図される。加えて、かかる相当物は、現在公知の均等物、及び将来開発される均等物（すなわち、構造にかかわらず、同じ機能を行う開発された任意の要素）の両方を含むことが意図される。本発明の範囲は、したがって、本明細書において示され記述された例示的な実施形態へ限定されるとは意図されない。むしろ、本発明の範囲及び趣旨は添付の請求項によって具現される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【図１３−７】
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【図１３−８】
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【図１３−９】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１４−６】
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【図１４−７】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１５−５】
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【図１５−６】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【図２６−１】
2019194225.tif 000099
【図２６−２】
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【図２６−３】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【図２７−４】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２８−３】
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【図２９】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３０−３】
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【図３１】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３２−３】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年7月29日(2019.7.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の膜電位の調節のためのシステムであって、
ａ）配列番号：１、４、５、および６の１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む光応答性プロトンポンプタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、第１の核酸と；
ｂ）配列番号：１９に記載されるＡＳＩＣ２ａポリペプチドアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む酸感受性イオンチャンネルをコードするヌクレオチド配列を含む、第２の核酸と；
ｃ）光により標的場所を照射するように構成された装置と
を含む、該システム。
【請求項２】
前記光応答性プロトンポンプタンパク質が、配列番号：１、４、５、および６のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記酸感受性イオンチャンネルが、配列番号：１９に記載されるＡＳＩＣ２ａポリペプチドアミノ酸配列と、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のシステム。
【請求項４】
前記光応答性プロトンポンプタンパク質が、膜トラフィッキングシグナルを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５】
前記酸感受性イオンチャンネルが、膜トラフィッキングシグナルを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項６】
前記膜トラフィッキングシグナルが、アミノ酸配列
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を含む、請求項４または５に記載のシステム。
【請求項７】
前記光応答性プロトンポンプタンパク質が、小胞体（ＥＲ）搬出シグナルを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項８】
前記酸感受性イオンチャンネルが、小胞体（ＥＲ）搬出シグナルを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項９】
前記ＥＲ搬出シグナルが、アミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号：４７）を含む、請求項７または８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記装置が、３５０〜７５０ｎｍまたは５３０ｎｍ〜５６０ｎｍの範囲の波長を有する光により標的場所を照射するように構成される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１１】
前記装置が以下の1つまたは複数を行うように構成される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のシステム：
ａ）光により標的場所を一定して照射する；
ｂ）光のパルスにより標的場所を照射する；
ｃ）光の波長及び／または強度を調節する； 
ｄ）光のパルスの周波数及び／または継続期間を調節する；ならびに
ｅ）使用者インプットに応答して標的場所を照射する。
【請求項１２】
前記使用者インプットが、光の波長、光の強度、光パルスの継続期間、光パルスの周波数、及び／または標的場所を含む、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記装置が対象中に埋込まれるように適合されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１４】
前記第１の核酸及び前記第２の核酸が単一の発現ベクター内に存在する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１５】
光応答性プロトンポンプタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、ニューロン特異的転写制御エレメントへ機能的に連結されている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１６】
酸感受性イオンチャンネルをコードする前記ヌクレオチド配列が、ニューロン特異的転写制御エレメントへ機能的に連結されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１７】
光応答性プロトンポンプタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列と酸感受性イオンチャンネルをコードする前記ヌクレオチド配列が、２つの異なるプロモーターに機能的に連結されている、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のシステム。