(57)【要約】IL-21の投与は自己免疫反応の低減をもたらし、それによって自己免疫疾患の有益な治療となる。治療できる具体的な自己免疫疾患としては、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬、強直性脊椎炎、強皮症、I型糖尿病、乾癬性関節炎、変形性関節炎、炎症性腸疾患、アトピー性皮膚炎、および喘息が挙げられる。薬学的組成物はIL-21ポリペプチドおよびその活性断片を含みうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的に許容される媒体中にアミノ酸残基番号30から162までのSEQ ID NO:2に記載のIL-21ポリペプチドを含んだ薬学的組成物の治療的に有効な量を投与する段階を含む、哺乳類において自己免疫反応を低減する方法。
【請求項２】
薬学的に許容される媒体中にアミノ酸残基番号30から162までのSEQ ID NO:2に記載のIL-21ポリペプチドを含んだ薬学的組成物の治療的に有効な量を投与する段階を含む、自己免疫疾患を有する哺乳類を治療する方法。
【請求項３】
自己免疫疾患が、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬、強直性脊椎炎、強皮症、I型糖尿病、乾癬性関節炎、変形性関節炎、炎症性腸疾患、アトピー性皮膚炎、および喘息からなる群より選択される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
治療が疾患の発症遅延をもたらす、請求項2記載の方法。
【請求項５】
治療が疾患の重症度の低下をもたらす、請求項2記載の方法。
【請求項６】
哺乳類がヒトである、請求項1または2記載の方法。
【請求項７】
薬学的に許容される媒体中にアミノ酸残基番号30から162までのSEQ ID NO:2に記載の配列の少なくとも14個の連続アミノ酸残基であるポリペプチドを含んだ薬学的組成物の治療的に有効な量を投与する段階を含む、哺乳類において自己免疫反応を低減する方法。
【請求項８】
薬学的に許容される媒体中にアミノ酸残基番号30から162までのSEQ ID NO:2に記載の配列の少なくとも15個の連続アミノ酸残基であるポリペプチドを含んだ薬学的組成物の治療的に有効な量を投与する段階を含む、自己免疫疾患を有する哺乳類を治療する方法。
【請求項９】
自己免疫疾患が、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬、強直性脊椎炎、強皮症、I型糖尿病、乾癬性関節炎、変形性関節炎、炎症性腸疾患、アトピー性皮膚炎、および喘息からなる群より選択される、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
治療が疾患の発症遅延をもたらす、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
治療が疾患の重症度の低下をもたらす、請求項8記載の方法。
【請求項１２】
哺乳類がヒトである、請求項7または8記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
サイトカインは一般に、造血系の細胞の増殖もしくは分化を刺激するかまたは身体の免疫および炎症反応機構に関与している。インターロイキンは免疫反応を媒介するサイトカインのファミリーである。免疫反応の中心となるのはT細胞であり、これは多くのサイトカインを産生し、抗原に対する適応免疫を与える。T細胞により産生されるサイトカインは1型と2型に分類されている(Kelso, A. Immun. Cell Biol. 76:300-317, 1998)。1型サイトカインはIL-2、IFN-γ、LT-αを含み、炎症反応、ウイルス免疫、細胞内寄生体免疫および同種移植の拒絶反応に関与する。2型サイトカインはIL-4、IL-5、IL-6、IL-10およびIL-13を含み、液性反応、蠕虫免疫およびアレルギー反応に関与する。1型と2型との間の共有のサイトカインはIL-3、GM-CSFおよびTNF-αを含む。1型および2型産生T細胞集団は異なるタイプの炎症組織の中に選択的に遊走することを示唆するいくつかの証拠がある。
【０００２】
成熟T細胞は活性化、すなわち抗原またはその他の刺激物により活性化されて、例えば、サイトカイン、生化学的なシグナル伝達物質、またはさらにT細胞集団の運命に影響を与える受容体を産生することができる。
【０００３】
B細胞は、B細胞抗原受容体およびその他のアクセサリー分子を含むその細胞表面の受容体を介して活性化され、サイトカインの産生および抗原特異的な免疫グロブリンの分泌などのアクセサリー細胞機能を果たすことができる。
【０００４】
ナチュラルキラー(NK)細胞はT細胞およびB細胞と共通の神経前駆細胞を有し、免疫学的監視に影響を与える。血中リンパ球の15%までを占めるNK細胞は、B細胞のようには抗原特異的受容体を発現しないが、標的細胞の融解に自己MHCの欠如を必要とする。NK細胞はある種の腫瘍細胞およびウイルス感染細胞の認識と殺処理に関与する。NK細胞はインビボでは活性化を必要とすると考えられるが、インビトロでは活性化なしにある種の腫瘍細胞を殺傷することが示されている。
【０００５】
免疫系は病原体、すなわち細菌、ウイルス、真菌などにより引き起こされる疾患に対する、ならびに身体の自己の細胞および組織の異常増殖により引き起こされる疾患(すなわち、癌性の腫瘍)に対する身体の主要な防御である。通常、免疫系は身体の正常細胞、すなわち「自己」細胞と、外来性病原体または異常細胞、すなわち「非自己」細胞とを識別することができる。免疫系が自身の身体に反応することを抑制するプロセスは寛容と呼ばれる。免疫系が「自己」を正常と認識する能力およびその組織または細胞に向けたそれに続く反応を失い、寛容の喪失、つまり自己免疫の状態になることがある。自己免疫から起こる病態は多くの場合深刻な臨床的帰結を有し、世界中で、とりわけ先進国で主要な健康問題の一つである。
【０００６】
そのような自己免疫疾患の一例は、多発性硬化症(MS)、つまり中枢神経系(CNS)の進行性疾患である。MS患者では、患者自身の免疫系がミエリン、つまり脳および脊椎中の神経線維を取り囲み隔離する保護層を破壊する。ミエリン鞘の破壊は神経伝達の混乱および神経線維に対する瘢痕性損傷を引き起こす。この結末が刺痛または知覚麻痺、不明瞭な発語、視覚障害、眩暈などを含む、罹患患者における多数の症状の発現である。疾患の間に、運動の障害につながる四肢の強度喪失が起こり、最も深刻な場合には、手足の麻痺状態にいたる。臨床診断に基づくと、脳または脊椎のどの部分が影響を受けているか、重症度、発病の頻度などに基づき、現在4つのタイプのMS分類が存在している。
【０００７】
MSに対する現在の治療法としては、コルチコステロイド薬(急性発症の症状を軽減するため)、ならびにIFN-βおよびノバントロン(Novantrone)(登録商標)のようなその他の薬物が挙げられる。ノバントロン(登録商標)は後期MS患者に対し、とりわけその他の治療法が効かなかった患者に対して承認されている。ノバントロン(登録商標)は大部分の細胞にとって細胞傷害性であり、したがって予測されるように多くの副作用を有し、最大の治療効果に必要とされる用量では有毒である。IFN-βも同様に有毒であり、MS患者における薬物用量は限定的である。さらに、これらの薬物の連続使用はその同一薬物のさらなる使用に対して患者を鈍感にすることが示されており、したがってこれらの薬物を長期治療法として使用するには限界がある。本発明はIL-21の投与による自己免疫疾患の治療方法を提供する。MSなどの自己免疫疾患の患者はとりわけIL-21による治療から恩恵を享受するはずである。IL-21には現在用いられている治療法と関連する有害な副作用がないからである。これらのおよびその他の用途は本明細書の教示から当業者には明らかなはずである。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
一つの局面のなかで、本発明はIL-21の機能活性を有するポリペプチドの治療的に有効な量をその必要性のある被験体に投与する段階を含む、自己免疫疾患の治療方法を提供する。一つの態様において、IL-21ポリペプチドは残基番号30から残基番号162までのSEQ ID NO:2に示されるアミノ酸残基の配列を含む。
【０００９】
他の局面において、本発明はIL-21の機能活性を有するポリペプチドの治療的に有効な量を被験体に投与する段階を含む、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬、強直性脊椎炎、強皮症、I型糖尿病、乾癬性関節炎、変形性関節炎、炎症性腸疾患、アトピー性皮膚炎、および喘息からなる群より選択される自己免疫疾患の治療方法を提供する。一つの態様において、IL-21ポリペプチドは残基番号30から残基番号162までのSEQ ID NO:2に示されるアミノ酸残基の配列を含む。
【００１０】
他の局面において、本発明はIL-21ポリペプチドの投与による哺乳類における自己免疫反応の低減方法を提供する。ある種の態様では、反応の低減は疾患の発症遅延または疾患の重症度の低下として判定することができる。本発明の任意の局面において、哺乳類はヒトとすることができる。
【００１１】
本発明の説明
本発明を詳細に説明する前に、本発明の理解を助けるため、次の用語を定義する：
【００１２】
用語「親和性タグ」とは、第2のポリペプチドの精製または検出を提供し、または基質への第2のポリペプチドの結合のための部位を供給するための、第2のポリペプチドに結合され得るポリペプチド断片を示すために本明細書において使用される。主に、それに対して抗体もしくは他の特異的結合剤が利用可能な任意のペプチドまたはタンパク質が親和性タグとして使用され得る。親和性タグには、ポリヒスチジン領域、プロテインA (Nilssonら、EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilssonら、Methods Enzymol. 198: 3, 1991)、グルタチオンSトランスフェラーゼ(SmithおよびJohnson, Gene 67; 31, 1988)、Glu-Glu親和性タグ(Grussenmeyerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952〜4, 1985)、サブスタンスP、Flag(商標)ペプチド(Hoppら、Biotechnology 6: 1204〜1210, 1988)、ストレプトアビジン結合ペプチド、またはその他の抗原性エピトープもしくは結合ドメインが含まれる。全般的には、Fordら、Protein Expression and Purification 2: 95〜107, 1991を参照されたい。親和性タグをコードするDNAは、商業的供給元(例えばPharmacia Biotech, Piscataway, NJ)から入手できる。
【００１３】
用語「対立遺伝子変異体」とは、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の二つまたはそれ以上の別の形態(alternative form)のいずれかを示すために本明細書において使用される。対立遺伝子変異は、突然変異によって自然に生じ、集団内の表現型多型現象をもたらしうる。遺伝子突然変異は、サイレント(コードされたポリペプチドにおいて変化がない)であることもあり、あるいは変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることもある。対立遺伝子変異体という用語はまた、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書において使用される。
【００１４】
用語「アミノ末端」および「カルボキシル末端」とは、ポリペプチド内の位置を示すために本明細書において使用される。その情況が可能である場合、これらの用語は、接近性または相対的位置を示すためにポリペプチドの特定の配列または一部に関して使用される。例えば、ポリペプチド内の対象配列のカルボキシル末端側に位置する一定の配列は、その対象配列のカルボキシル末端に隣接して位置するが、必ずしも完全なポリペプチドのカルボキシル末端であるわけではない。
【００１５】
用語「ガン」または「ガン細胞」とは、正常な組織または組織細胞とは異なる特徴を有する新生物のなかに見られる組織または細胞を示すために本明細書において使用される。そのような特徴のなかには、以下に限定されることはないが、退形成の程度、形状の不規則性、細胞の輪郭の不明瞭さ、核のサイズ、核または細胞質の構造の変化、その他の表現型の変化、ガン状態または前ガン状態を示す細胞内タンパク質の存在、細胞分裂数の増加、および転移能が含まれる。「ガン」に関する単語には、ガン腫、肉腫、腫瘍、上皮腫、白血病、リンパ腫、ポリープ、および硬性ガン(scirrus)、悪性転換、新生物などが含まれる。
【００１６】
用語「相補体／抗相補体対」とは、適切な条件下で、非共有的に会合して安定した対を形成する非同一性成分を示す。例えば、ビオチンおよびアビジン(またはストレプトアビジン)は、相補体/抗相補体対の基本型メンバーである。他の典型的な相補体/抗相補体対には、受容体/リガンド対、抗体/抗原(またはハプテンもしくはエピトープ)対、センス/アンチセンスポリヌクレオチド対、および同様のものが含まれる。相補体/抗相補体対の続く解離が所望される場合、その相補体/抗相補体対は109 M-1未満(<109 M-1)の結合親和性を有することが好ましい。
【００１７】
用語「ポリヌクレオチド分子の相補体」とは、相補的塩基配列および対照配列に比較して逆の配向を有するポリヌクレオチド分子を示す。
【００１８】
用語「縮重ヌクレオチド配列」とは、一つまたは複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列(ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチド分子に比較して)を示す。縮重コドンは、ヌクレオチドの異なったトリプレットを含むが、同じアミノ酸残基をコードする(すなわち、GAUおよびGACトリプレットはそれぞれAspをコードする)。
【００１９】
用語「発現ベクター」とは、転写を提供するための追加断片に操作可能に連結された関心あるポリペプチドをコードする部分を含む、線状または環状DNA分子を示すために使用される。そのような追加断片には、プロモーターおよびターミネーター配列が含まれ、一つまたは複数の複製起点、一つまたは複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなども含みうる。発現ベクターは一般に、プラスミドもしくはウイルスDNAから誘導され、または両者の要素を含むことができる。
【００２０】
用語「単離された」とは、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドがその天然の遺伝的環境から除去され、他の無関係なまたは所望でないコード配列を有さず、遺伝子組み換えタンパク質の産生系内での使用に適切な形で存在することを示す。そのような単離された分子は、それらの天然の環境から分離された分子であって、cDNAおよびゲノムクローンを含む。本発明の単離されたDNA分子は通常は関係する他の遺伝子を含まないが、天然に存在する5'および3'非翻訳領域、例えばプロモーターおよびターミネーターを含むことができる。関連する領域の同定は、当業者には明らかであろう(例えば、DynanおよびTijan, Nature 316: 774〜78, 1985を参照をされたい)。
【００２１】
「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その生来の環境以外の条件、例えば血液および動物組織とは別の条件下で見出されるポリペプチドまたはタンパク質である。好ましい形態として、単離されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。高精製された形態、すなわち95%を超える純度、より好ましくは99%を超える純度でポリペプチドを供給することが好ましい。この情況下で使用される場合、用語「単離された」とは、他の物理的な形、例えばダイマー形または他のグリコシル化されたもしくは誘導体化された形での同ポリペプチドの存在を排除しない。
【００２２】
用語「レベル」とは、免疫細胞、例えばNK細胞、T細胞、特に細胞傷害性T細胞、B細胞および同様のものを言及する場合、増加したレベルとは、細胞数の増加または細胞機能の活性亢進のどちらかである。
【００２３】
用語「レベル」とは、ウイルス感染を言及する場合、ウイルス感染レベルの変化を示し、以下に限定されることはないが、CTLもしくはNK細胞(前述)のレベルの変化、ウイルス量の減少、抗ウイルス抗体価の増加、アラニンアミノトランスフェラーゼの血清学的レベルの減少、または標的組織もしくは臓器の組織学的検査により決定されるような改善が含まれる。これらのレベル変化が有意な相違であるかまたは変化であるかの決定は、十分に当業者の技術範囲内である。
【００２４】
用語「新生物(の)」とは、細胞を言及する場合、新しい異常な増殖を経験する細胞、特に増殖において、制御できない進行性の結果的に新生物をもたらす組織におけるものを示す。新生物細胞は、悪性、すなわち侵襲性で且つ転移性であるか、または良性であり得る。
【００２５】
用語「操作可能に連結された」とは、DNA断片を言及する場合、断片が、その意図された目的、例えば転写がプロモーターにおいて開始し、コード部分を経由してターミネーターまで進行するよう、協働するように配列されることを示す。
【００２６】
「ポリヌクレオチド」は、5'末端から3'末端に読み取られるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーである。ポリヌクレオチドはRNAおよびDNAを包含し、天然源から単離され、インビトロで合成され、または天然および合成分子の組み合わせから調製され得る。ポリヌクレオチドのサイズは、塩基対(略語「bp」)、ヌクレオチド(「nt」)、またはキロベース(「kb」)として表される。その情況が可能である場合、後者の二つの用語は、一本鎖または二本鎖であるポリヌクレオチドを記述しうる。この用語が二本鎖分子に適用される場合、それは全体の長さを示すために使用され、用語「塩基対」に等しいことが理解されるであろう。二本鎖ポリヌクレオチドの二本の鎖は長さがわずかに異なっていてもよく、その末端は酵素切断の結果として段差がつき得ることが当業者により理解される；従って、二本鎖ポリヌクレオチド分子内の全てのヌクレオチドは対になっていないこともある。
【００２７】
「ポリペプチド」は、天然において生成されてもまたは合成的に生成されてもいずれにせよ、ペプチド結合により連結されるアミノ酸残基のポリマーである。約10個未満のアミノ酸残基のポリペプチドは通常、「ペプチド」と呼ばれる。
【００２８】
用語「プロモーター」とは、当該技術分野において認識されている意味で本明細書において使用され、RNAポリメラーゼの結合および転写の開始を与えるDNA配列を含む遺伝子の部分を示す。プロモーター配列は通常は遺伝子の5'非コード領域に見出されるが、必ずそうであるわけではない。
【００２９】
「タンパク質」は、一つまたは複数のポリペプチド鎖を含む高分子である。タンパク質はまた、非ペプチド成分、例えば糖鎖基を含むことができる。糖鎖および他の非ペプチド置換基は、タンパク質を産生する細胞によってタンパク質に付加され、細胞型により変化する。タンパク質は、それらのアミノ酸主鎖の点から本明細書において定義され；置換基、例えば糖鎖基は一般に特定されないが、存在する可能性がある。
【００３０】
用語「受容体」は、生物活性分子(すなわちリガンド)に結合し、細胞上でリガンドの効果を仲介する細胞関連タンパク質を示す。膜結合受容体は、細胞外リガンド結合ドメインと、典型的にはシグナル伝達に関与する細胞内エフェクタードメインとを含む、多ペプチド構造を特徴とする。受容体へのリガンドの結合は、細胞中のエフェクタードメインと他の分子との間の相互作用を引き起こす受容体の立体構造変化をもたらす。この相互作用は次に、細胞の代謝に変化を引き起こす。受容体-リガンド相互作用に関連した代謝事象には、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、サイクリックAMP産生の増加、細胞内カルシウムの移行、膜脂質の移行、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解、およびリン脂質の加水分解が含まれる。一般に受容体は、膜結合受容体、細胞質受容体、または核受容体; 単量体(例えば、チロイド刺激性ホルモン受容体、β-アドレナリン受容体)または多量体(例えば、PDGF受容体、成長ホルモン受容体、IL-3受容体、GM-CSF受容体、G-CSF受容体、エリトロポエチン受容体およびIL-6受容体)であり得る。
【００３１】
用語「分泌シグナル配列」とは、その配列よりも大きなポリペプチドの構成要素として、より大きなポリペプチドを、そのポリペプチドを合成する細胞の分泌経路を介して方向づけるポリペプチド(「分泌ペプチド」)をコードするDNA配列を示す。分泌経路を介した移動の間に、前記のより大きなポリペプチドは通常切断されて、分泌ペプチドは除かれる。
【００３２】
不正確な分析方法(例えば、ゲル電気泳動法)により決定されるポリマーの分子量および長さは、おおよその値であることが理解されるであろう。そのような値が「約」Xまたは「おおよそ」Xとして表される場合、その言及されたXの値は、正確には±10%であることが理解されるであろう。
【００３３】
本明細書に引用される全ての文献は、その全体が参照として組み入れられる。
【００３４】
本発明は一つには、IL-21の投与がインビトロおよびインビボにおいてある種の免疫細胞反応の阻害を引き起こすという発見に基づいている。IL-21処理樹状細胞はインビトロにおいて不十分な抗原提示細胞である(Brandt K et. al., Blood, 102 (12):4090-8, 2003)。さらに、IL-21が抗原投与段階で遅延型過敏症(DTH)反応を抑制するが、感作段階では抑制しないことから、IL-21は抗原特異的T細胞の初回抗原刺激を阻害しないが、継続的な免疫反応を阻害できることが示唆される。実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)、つまりヒトMSのマウスモデルにおいて、阻害するためにIL-21が同様に使用される。続く実施例において、動物モデルおよびインビトロアッセイが、生体試料に対するIL-21の活性を実証することによって自己免疫の阻害におけるIL-21の役割を証明する。
【００３５】
A. IL-21およびその受容体の説明
ヒトIL-21(配列番号:1および配列番号:2)はIL-21と名付けられた。ヒトIL-21は、共通して所有される米国特許第6,307,024号および米国特許第6,686,178号(これは参照として本明細書に組み入れられる)に報告されている。現在IL-21Rと呼ばれる(以前はzalpha11と呼ばれた)IL-21受容体(配列番号:9および配列番号:10)、およびヘテロ二量体性受容体IL-21R/IL-21Rγは、共通して所有される国際公開公報第0/17235号、国際公開公報第01/77171号、および米国特許第6,692,924号(これらは参照として本明細書に組み入れられる)に報告されている。これらの公報に報告されているように、IL-21は、CD3に対して選択を行った、活性化ヒト末梢血単核細胞(hPBMC)から作製したcDNAライブラリーより単離された。CD3は、リンパ系起源の細胞、特にT細胞に固有の細胞表面マーカーである。
【００３６】
IL-21Rのアミノ酸配列から、コードされる受容体は、IL-2、IL-4、IL-7、IL-15、EPO、TPO、GM-CSFおよびG-CSFに対する受容体を含むがこれらに限定されることはない、クラスIサイトカイン受容体サブファミリー(概説については、Cosman、「The Hematopoietin Receptor Superfamily」 Cytokine 5(2): 95〜106, 1993を参照されたい)に属することが示された。その受容体の組織分布から、IL-21に対する標的は、造血系細胞、特にリンパ系前駆細胞およびリンパ系細胞であることが示唆される。リンパ系細胞に作用する、その他周知の4-ヘリックス・バンドル型のサイトカインには、IL-2、IL-4、IL-7、およびIL-15が含まれる。4-ヘリックス・バンドル型のサイトカインの概説については、Nicolaら、Advances in Protein Chemistry 52: 1〜65, 1999およびKelso, A., Immunol. Cell Biol. 76: 300〜317,1998を参照されたい。
【００３７】
IL-21の場合、分泌シグナル配列はアミノ酸残基1(Met)〜29(Ser)からなり、成熟型ポリペプチドはアミノ酸残基30(Gln)〜162(Ser)からなる(配列番号:2に示される)。一般にサイトカインは4-αヘリックス構造を有すると予想され、ヘリックスA、CおよびDがリガンド-受容体相互作用に最も重要であり、そのファミリーのメンバー間でより高度に保存されている。配列番号:2に示されるヒトIL-21のアミノ酸配列を参照し、ヒトIL-21、ヒトIL-15、ヒトIL-4、およびヒトGM-CSFのアミノ酸配列の整列から、IL-21のヘリックスAは、配列番号:2に示されるアミノ酸残基41〜56により定義され; ヘリックスBはアミノ酸残基69〜84により定義され; ヘリックスCはアミノ酸残基92〜105により定義され; ヘリックスDはアミノ酸残基135〜148により定義されることが予想された。構造解析から、A/Bループは長く、B/Cループは短く、そしてC/Dループは平行して長いことが示されている。このループ構造は、アップ-アップ-ダウン-ダウンヘリカル構成をもたらす。システイン残基は、IL-21とIL-15との間で絶対的に保存されている。IL-15とIL-21との間で保存されるシステイン残基は、配列番号:2のアミノ酸残基71、78、122および125に対応する。システイン残基のいくつかの保存はまた、配列番号:2のアミノ酸残基78および125に対応する、IL-2、IL-4、GM-CSFおよびIL-21に見出される。システイン配置の一致は、4-ヘリックス・バンドル構造のさらなる確認となる。同様に、IL-15、IL-2、IL-4、GM-CSFおよびIL-21を含むファミリーにおいて高度に保存されるのは、配列番号:2の中の残基136〜138に示されるGlu-Phe-Leu配列である。多重整列に基づくIL-21のさらなる解析により、アミノ酸残基44、47および135(配列番号:2に示される)は、IL-21がその同族受容体と結合する際に重要な役割を果たすと予想される。さらに、マウスIL-21(配列番号:4)の予測されるアミノ酸配列は、予測されるヒトタンパク質に対して57%の同一性を示す。ヒトおよびマウスIL-21の配列間の比較に基づいて、良く保存された残基が、αヘリックスAおよびDをコードすることが予測される領域に見出された。
【００３８】
本明細書に記載されるIL-21のポリペプチド領域、ドメイン、モチーフ、残基および配列をコードするその対応ポリヌクレオチドは、配列番号:1に示される通りである。IL-21、IL-2、IL-4、IL-15およびGM-CSFに対するヘリックスA、B、C、およびD、ならびにループA/B、B/CおよびC/Dを含むアミノ酸残基は、表1に示される。
【００３９】
（表１）
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【００４０】
当業者は、配列番号:1に開示される配列がヒトIL-21の単一の対立遺伝子を表しており、対立遺伝子のばらつきおよび選択的スプライシングが起こると予測されることを認識するであろう。この配列の対立遺伝子変異体は、標準的な方法に従い、異なる個体由来のcDNAまたはゲノムライブラリーを探索することによりクローニングすることができる。サイレント突然変異を含む対立遺伝子変異体および変異によりアミノ酸配列を変化させる対立遺伝子変異体を含む、配列番号:1に示されるDNA配列の対立遺伝子変異体は、配列番号:2の対立遺伝子変異体であるタンパク質と同様に本発明の範囲内である。IL-21ポリペプチドの特性を保持する、選択的スプライスを受けたmRNAから生成されるcDNAは、そのようなcDNAおよびmRNAによりコードされるポリペプチドと同様に本発明の範囲内に含まれる。これらの配列の対立遺伝子変異体およびスプライス変異体は、当技術分野において周知の標準的な方法に従い、異なる個体または組織由来のcDNAまたはゲノムライブラリーを探索することによりクローニングすることができる。
【００４１】
本発明によりまた、配列番号:2のポリペプチドまたはその相同分子種に対して実質的に類似する配列同一性を有する単離されたIL-21ポリペプチドが提供される。用語「実質的に類似する配列同一性」とは、配列番号:2に示される配列またはその相同分子種に対して少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%の、または95%を超える配列同一性を含むポリペプチドを示すために本明細書において使用される。本発明には同様に、配列番号:2のアミノ酸残基1〜162または33〜162の配列に対して少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または95%を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドも含まれる。本発明には、そのようなポリペプチドをコードする核酸分子もさらに含まれる。同一性の割合を決定するための方法を、以下に記載する。
【００４２】
同一性の割合は、従来の方法により決定される。例えば、Altschulら、Bull. Math. Bio. 48:603 (1986)や、HenikoffおよびHenikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)を参照されたい。簡単に言えば、二つのアミノ酸配列が、ギャップ開始ペナルティー10、ギャップ拡張ペナルティー1、および表2（アミノ酸は標準的な1文字表記により示される）に示されるようなHenikoffおよびHenikoff(前掲)の「BLOSUM62」スコアリングマトリックスを用いて、整列スコアを最適化するように整列される。
2007506789.tif 000003
【００４３】
（表２）
2007506789.tif 000004
【００４４】
当業者は、二つのアミノ酸配列を整列させるために利用できる多くの確立されたアルゴリズムが存在することを理解している。PearsonおよびLipmanの「FASTA」類似性検索アルゴリズムは、本明細書に開示されるアミノ酸配列と推定上のIL-21変異体のアミノ酸配列により共有される同一性のレベルを試験するための適当なタンパク質整列法である。FASTAアルゴリズムは、PearsonおよびLipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)、およびPearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)に記述されている。
【００４５】
IL-21変異体のポリペプチドまたは実質的に類似する配列同一性を有するポリペプチドは、一つまたは複数のアミノ酸置換、欠失または付加を有するものとして特徴付けられる。これらの変化は好ましくは主要でない性質のもの、すなわち保存性アミノ酸置換(表3を参照されたい)およびポリペプチドの折りたたみまたは活性に顕著な影響を及ぼさない他の置換; 小さな欠失、典型的には1個〜約30個のアミノ酸の欠失；およびアミノ末端またはカルボキシル末端の伸長、例えばアミノ末端メチオニン残基による伸長、約20〜25残基までの小さなリンカーペプチドによる伸長、または親和性タグによる伸長である。従って、本発明には、配列番号:2の対応領域に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の同一性の配列を含む、約108〜216個のアミノ酸残基のポリペプチドが含まれる。親和性タグを含むポリペプチドは、IL-21ポリペプチドと親和性タグとの間にタンパク質分解的切断部位をさらに含むことができる。好ましいそのような部位にはトロンビン切断部位および第Xa因子切断部位が含まれる。
【００４６】
（表３）保存性アミノ酸置換
塩基性:          アルギニン
リジン
ヒスチジン
酸性:            グルタミン酸
アスパラギン酸
極性:            グルタミン
アスパラギン
疎水性:          ロイシン
イソロイシン
バリン
芳香族:          フェニルアラニン
トリプトファン
チロシン
小さな:          グリシン
アラニン
セリン
トレオニン
メチオニン
【００４７】
構造の完全性を維持するのに重要な領域またはドメインを含む、アミノ酸残基の決定を行うことができる。これらの領域のなかで、程度の差こそあるものの、変化に寛容であって、分子の全体的な三次構造を維持すると思われる特定の残基を決定することができる。配列の構造を分析するための方法には、アミノ酸またはヌクレオチドの同一性が高い複数配列の整列、二次構造的性質、二元パターン、相補的パッキングおよび埋没した極性相互作用が含まれるが、これらに限定されることはない(Barton, Current Opin. Struct. Biol. 5:372〜376, 1995およびCordesら、Current Opin. Struct. Biol. 6:3〜10, 1996)。一般に、分子に対する改変を設計するかまたは特定の断片を同定する場合、構造の決定には、改変した分子の活性の評価が伴う。
【００４８】
生物活性に対して必須な高次構造の破壊を最小限に抑えるようにIL-21ポリペプチドのアミノ酸配列を変更する。例えば、IL-21ポリペプチドが一つまたは複数のヘリックスを含む場合、アミノ酸残基の変更は、分子のヘリックス構造を破壊しないよう、ならびに立体構造の変化が、ある重要な機能、例えば、結合相手、例えばAおよびDヘリックス、配列番号:2の残基44、47および135との結合を弱めてしまう、分子の他の構成要素を破壊しないように行われるであろう。アミノ酸配列の変更による効果は、例えば、上記に開示されるようなコンピュータモデリングにより予測することができ、または結晶構造の解析により決定することができる(例えば、Lapthornら、Nat. Struct. Biol. 2:266-268, 1995を参照のこと)。当技術分野においてよく知られている他の技法では、変異タンパク質の折りたたみを標準分子(例えば、野生型タンパク質)の折りたたみと比較する。例えば、変異体および標準分子のシステインパターンの比較を行うことができる。質量分析ならびに還元およびアルキル化を利用した化学修飾により、ジスルフィド結合と関連性のあるまたはそのような関連性のないシステイン残基を決定するための方法が提供される(Beanら、Anal. Biochem. 201:216〜226, 1992; Gray, Protein Sci. 2:1732〜1748, 1993; およびPattersonら、Anal. Chem. 66:3727〜3732, 1994)。一般に、修飾された分子が標準分子と同じシステインパターンを有さない場合、折りたたみに影響が及ぶと考えられる。折りたたみを測定するためのもう一つの周知で認められている方法は、円二色性(CD)である。修飾分子および標準分子により生成されるCDスペクトルの測定および比較は、日常業務である(Johnson, Proteins 7:205〜214, 1990)。結晶構造解析は、折りたたみおよび構造を解析するためのもう一つのよく知られた方法である。核磁気共鳴(NMR)、消化ペプチドマッピングおよびエピトープマッピングはまた、タンパク質とポリペプチドとの間の折りたたみおよび構造的類似性を解析するための周知の方法である(Schaananら、Science 257:961〜964, 1992)。
【００４９】
配列番号:2に示されるようなIL-21タンパク質の配列のHopp/Woods親水性プロファイルを作成することができる(Hoppら、Proc. Natl. Acad. Sci. 78:3824〜3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88:1〜18, 1986およびTriquierら、Protein Engineering 11:153〜169, 1998)。このプロファイルは、スライドする6-残基窓(sliding six-residue window)に基づく。埋没したG、S、およびT残基ならびに露出したH、Y、およびW残基は無視した。例えば、IL-21では、親水性領域には、配列番号:2のアミノ酸残基114〜119、配列番号:2のアミノ酸残基101〜105、配列番号:2のアミノ酸残基126〜131、配列番号:2のアミノ酸残基113〜118および配列番号:2のアミノ酸残基158〜162が含まれる。
【００５０】
当業者は、IL-21ポリペプチドのアミノ酸配列の変更を設計する際、親水性または疎水性が全体的な構造および生物学的プロファイルを破壊しないように考慮されることを認識するであろう。置換に対し特に関心があるのは、Val、LeuおよびIleからなる群またはMet、Gly、Ser、Ala、TyrおよびTrpからなる群より選択される疎水性残基である。例えば、置換に寛容な残基のなかには、配列番号:2に示される残基100および103を含めることができるであろう。配列番号:2の71、78、122および125位のシステイン残基は、相対的に置換に寛容ではないと考えられる。
【００５１】
必須アミノ酸の同一性はまた、IL-21とのIL-15、IL-2、IL-4およびGM-CSFの間の配列類似性の解析から推定することができる。前述の「FASTA」解析のような方法を用いて、類似性の高い領域をタンパク質ファミリーのなかで同定し、保存領域に対するアミノ酸配列を解析するために使用する。構造に基づき、IL-21変異体のポリヌクレオチドを同定するための別のアプローチは、IL-21変異体と考えられる遺伝子をコードする核酸分子が、上述の、配列番号:1のヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズできるかどうかを決定することである。
【００５２】
本発明のポリペプチド中の必須アミノ酸を同定する他の方法は、部位特異的突然変異誘発法またはアラニンスキャニング突然変異誘発法のような、当技術分野において周知の方法である(CunninghamおよびWells, Science 244:1081 (1989), Bassら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4498 (1991), CoombsおよびCorey、「Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering」、Proteins: Analysis and Design, Angeletti (編)中、259〜311頁(Academic Press社、1998))。後者の方法では、単一のアラニン突然変異を分子中のすべての残基に導入し、得られた変異体分子について、その分子の活性に重要なアミノ酸残基を同定するため、以下に開示されるように、生物活性または生化学活性を試験する。Hiltonら、J. Biol. Chem. 271:4699 (1996)も参照されたい。
【００５３】
本発明にはまた、IL-21の機能活性を有する分子の投与が含まれる。従って、IL-21ポリペプチドの機能的な断片および機能的な改変型ポリペプチド、ならびにそのような機能的な断片および改変型ポリペプチドをコードする核酸分子の投与が含まれる。本明細書に定義される「機能的な」IL-21またはその断片は、その増殖活性もしくは分化活性によるか、特に、NK細胞、T細胞、B細胞および樹状細胞のような免疫エフェクター細胞に対し、特殊化した細胞機能を誘導するもしくは阻害する能力によるか、または抗IL-21抗体もしくはIL-21受容体(可溶性であるかまたは固定化された)に特異的に結合するその能力により特徴付けられる。機能的なIL-21にはまた、インビトロでまたはインビボで抗ガン作用および抗ウイルス作用を示す能力が含まれる。本明細書で前述したとおり、IL-21は、配列番号:2に示される、ヘリックスA(アミノ酸残基41〜56)、ヘリックスB(アミノ酸残基69〜84)、ヘリックスC(アミノ酸92〜105)およびヘリックスD(アミノ酸残基135〜148)を含む4-ヘリックス・バンドル構造により特徴付けられる。従って、本発明により、(a) 上記のヘリックスの一つまたは複数を含むポリペプチド分子; および(b) これらのヘリックスの一つまたは複数を含む機能的な断片を包含する融合タンパク質がさらに提供される。融合タンパク質の他のポリペプチド部分には、IL-15、IL-2、IL-4およびGM-CSFのようなもう一つの4-ヘリックス・バンドル型サイトカインを、または融合タンパク質の分泌を促進する外来のおよび/もしくは無関連の分泌シグナルペプチドを与えることができる。
【００５４】
核酸分子の日常的な欠失解析を行い、IL-21ポリペプチドをコードする核酸分子の機能的な断片を得ることができる。例として、配列番号:1のヌクレオチド配列またはその断片を有するDNA分子をBal31ヌクレアーゼで消化して、一連のネスト型欠失を得ることができる。次に、これらのDNA断片を発現ベクター中へ正しい読み枠で挿入し、発現したそのポリペプチドを単離し、IL-21活性について、または抗IL-21抗体もしくはzalpha11受容体を結合する能力について試験する。エキソヌクレアーゼ消化に対する一つの別の方法は、所望のIL-21断片の産生を特定するため、欠失または停止コドンを導入するオリゴヌクレオチド指定変異導入法を利用することである。または、IL-21遺伝子の特定断片をポリメラーゼ鎖反応により合成することができる。
【００５５】
機能的ドメインを同定するための標準的な方法は、当業者によく知られている。例えば、インターフェロンの片端または両端でのトランケーションに関する研究が、HorisbergerおよびDi Marco, Pharmac. Ther. 66:507 (1995)によりまとめられている。さらに、タンパク質の機能解析のための標準的な方法は、例えば、Treuterら、Molec. Gen. Genet. 240:113 (1993); Contentら、「Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon」、Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (編)中、65〜72頁 (Nijhoff 1987); Herschman、「The EGF Receptor」、Control of Animal Cell Proliferation 1, Boyntonら(編)中、169〜199頁 (Academic Press 1985); Coumailleauら、J. Biol. Chem. 270:29270 (1995); Fukunagaら、J. Biol. Chem. 270:25291 (1995); Yamaguchiら、Biochem. Pharmacol. 50:1295 (1995); およびMeiselら、Plant Molec. Biol. 30:1 (1996)に記述されている。
【００５６】
複数のアミノ酸置換は、突然変異誘発およびスクリーニングの周知の方法、例えばReidhaar-OlsonおよびSauer (Science 241:53 (1988))またはBowieおよびSauer (Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86:2152 (1989))に開示される方法を用いて行い、試験することができる。簡単に言えば、これらの著者により、ポリペプチド中の二つまたはそれ以上の位置を同時に任意抽出し、機能的なポリペプチドを選択し、それから各位置で許容される置換の範囲を決定するため、突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定するための方法が開示される。使用できる他の方法には、ファージ・ディスプレイ法(例えば、Lowmanら、Biochem. 30 :10832 (1991); Ladnerら、米国特許第5,223,409号、Huse, 国際公開公報第92/06204号)、および領域指定変異導入法(Derbyshireら、Gene 46:145 (1986); およびNerら、DNA 7:127, (1988))が含まれる。
【００５７】
開示したIL-21のヌクレオチドおよびポリペプチド配列の変異体はまた、Stemmer, Nature 370:389 (1994), Stemmer, Proc. Natl Acad. Sci. USA 91:10747 (1994)、および国際公開公報第97/20078に開示されるようなDNAシャフリング法により作製することができる。簡単に言えば、変異体DNA分子は、親DNAの無作為な断片化に続くPCRを用いた再構築によるインビトロ相同組換えにより作製され、結果として無作為に導入された点突然変異体が得られる。この方法は、その工程中にさらなるばらつきを導入するため、異なる種由来の対立遺伝子変異体またはDNA分子のような親DNAのファミリーを利用することにより、改良することができる。所望の活性の選択またはスクリーニング、その後さらに変異導入および測定を繰り返し行うことで、有害な変化を同時に選択しながら所望の突然変異を選択することによる、配列の迅速な「進化」を実現する。
【００５８】
本明細書に開示される突然変異導入法は、高速大量処理の自動化スクリーニング法と組み合わせて、宿主細胞中で、クローニングされ変異導入されたポリペプチドの活性を検出することができる。生物学的に活性なポリペプチドを、または抗IL-21抗体もしくは可溶性zalpha11受容体と結合するポリペプチドをコードする変異導入DNA分子は、最新機器を用いて、宿主細胞から回収し迅速に配列決定することができる。これらの方法は、関心のあるポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の重要性を迅速に決定することを可能とし、構造未知のポリペプチドに適用することができる。
【００５９】
さらに、本発明のタンパク質(またはそのポリペプチド断片)を他の生物活性分子、特に他のサイトカインに連結して、多機能分子を得ることできる。例えば、IL-21由来の一つまたは複数のヘリックスを他のサイトカインに連結して、その生物学的特性または産生効率を高めることができる。
【００６０】
従って、本発明により、IL-21のヘリックスの一つまたは複数を含む断片が別のポリペプチドに融合された一連の新規ハイブリッド分子が提供される。融合は、組み換え産生系でキメラ分子の発現を可能とするため、DNAレベルでのスプライシングにより行われることが好ましい。次いで、得られた分子を、溶解性の向上、安定性の向上、長時間のクリアランス半減期、発現および分泌レベルの向上、ならびに薬物力学のような特性について測定する。そのようなハイブリッド分子は、その構成要素のタンパク質またはポリペプチドの間に付加的なアミノ酸残基(例えば、ポリペプチドリンカー)をさらに含んでもよい。
【００６１】
天然に存在しないアミノ酸には、以下に限定されることはないが、トランス-3-メチルプロリン、2,4-メタノプロリン(2,4-methanoproline)、シス-4-ヒドロキシプロリン、トランス-4-ヒドロキシプロリン、N-メチルグリシン、アロ-トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、3-および4-メチルプロリン、3,3-ジメチルプロリン、tert-ロイシン、ノルバリン、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン、ならびに4-フルオロフェニルアラニンが含まれる。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質中に導入するためのいくつかの方法が当技術分野において知られている。例えば、ナンセンス突然変異が化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAを用いて抑制されるインビトロ系を使用することができる。アミノ酸を合成するための方法およびtRNAをアミノアシル化するための方法は、当技術分野において周知である。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写および翻訳は、通常、大腸菌(E. coli) S30の抽出物ならびに市販の酵素および他の試薬を含む無細胞系で行われる。タンパク質はクロマトグラフィーにより精製される。例えば、Robertsonら、J. Am. Chem. Soc. 113:2722 (1991)、Ellmanら、Methods Enzymol. 202:301 (1991)、Chungら、Science 259:806 (1993)、およびChungら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:10145 (1993)を参照されたい。
【００６２】
第二の方法では、突然変異したmRNAおよび化学的にアミノアシル化したサプレッサーtRNAのマイクロインジェクションにより、アフリカツメガエル卵母細胞中で翻訳が行われる(Turcattiら、J. Biol. Chem. 271:19991 (1996))。第三の方法のなかでは、置換されることになる天然型アミノ酸(例えば、フェニルアラニン)の非存在下で、所望の非天然型アミノ酸 (例えば、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン、または4-フルオロフェニルアラニン)の存在下で大腸菌(E. coli)細胞を培養する。非天然型アミノ酸は、その天然型アミノ酸の代わりにタンパク質中に導入される。Koideら、Biochem. 33:7470 (1994)を参照されたい。天然に存在するアミノ酸残基は、インビトロでの化学修飾法により天然に存在しない種に変換することができる。化学修飾法を部位特異的突然変異誘発法と組み合わせて、置換の範囲をさらに拡げることができる(WynnおよびRichards, Protein Sci. 2:395 (1993))。IL-21を安定化させることは、その分子の半減期を延ばすのに、特に活性状態での代謝持続性を延ばすのに有利となる可能性がある。半減期の延長を達成するため、本明細書に記載の方法を用いてIL-21分子を化学的に修飾することができる。PEG化は、血漿半減期を増加させること、可溶性の増大、ならびに抗原性および免疫原性の低下が実証された一般に利用される方法の一つである(Nucciら、Advanced Drug Delivery Reviews 6:133〜155, 1991およびLuら、Int. J. Peptide Protein Res. 43:127〜138, 1994)。
【００６３】
限定数の、非保存性アミノ酸、遺伝コードによりコードされないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、および異常アミノ酸を、IL-21のアミノ酸残基と置換することができる。
【００６４】
本発明によりまた、本明細書に記載のIL-21ポリペプチドのエピトープを持つ部分を含むポリペプチド断片またはペプチドが提供される。そのような断片またはペプチドには、タンパク質全体を免疫原として使用する場合に抗体応答を誘発するタンパク質の一部である「免疫原性エピトープ」が含まれ得る。免疫原性エピトープを持つペプチドは標準的な方法を用いて同定することができる(例えば、Geysenら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:3998 (1983)を参照されたい)。当業者であれば、抗原性のエピトープを持ったポリペプチドはIL-21ポリペプチド(例えば、SEQ ID NO:2)の少なくとも6個、好ましくは少なくとも9個、およびより好ましくは少なくとも15個から約30個の連続アミノ酸残基の配列を含むことを認識するであろう。IL-21ポリペプチドのさらに大きな部分、すなわち、そのアミノ酸配列の最大で全長までの30から100残基を含んだポリペプチドが含まれる。すなわち、組成物はSEQ ID NO:2によりコードされるアミノ酸番号32からアミノ酸番号162までのIL-21ポリペプチド、またはその連続的な9から131アミノ酸の断片を含んだポリペプチドを含むことができる。
【００６５】
対照的に、ポリペプチド断片またはペプチドには、抗体が特異的に結合できるタンパク質分子の領域である「抗原性エピトープ」が含まれ得る。ある種のエピトープは、直線的なまたは連続的なアミノ酸ストレッチからなり、そのようなエピトープの抗原性は変性剤によって破壊されることはない。タンパク質のエピトープを模倣し得る比較的短い合成ペプチドを使用して、そのタンパク質に対する抗体の産生を刺激できることが当技術分野において知られている(例えば、Sutcliffeら、Science 219:660 (1983)を参照されたい)。従って、本発明の抗原性エピトープを持つペプチドおよびポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドと結合する抗体を産生させるのに有用である。Hopp/Woods親水性プロファイルを使用して、最も抗原性が高い可能性がある領域を決定することができる(Hoppら、1981(前掲)およびHopp、1986(前掲))。IL-21の場合、これらの領域には配列番号:2のアミノ酸残基114〜119、101〜105、126〜131、113〜118、および158〜162が含まれる。
【００６６】
抗原性エピトープを持つペプチドおよびポリペプチドには、配列番号:2または配列番号:4の少なくとも4〜10個のアミノ酸、少なくとも10〜14個のアミノ酸、または約14〜約30個のアミノ酸が含まれることが好ましい。そのようなエピトープを持つペプチドおよびポリペプチドは、本明細書に記載されるように、IL-21ポリペプチドを断片化することにより、または化学的ペプチド合成により産生することができる。さらにエピトープは、ランダムペプチドライブラリーのファージ・ディスプレイ法により選択することができる(例えば、LaneおよびStephen, Curr. Opin. Immunol. 5:268 (1993);およびCorteseら、Curr. Opin. Biotechnol. 7:616 (1996)を参照されたい)。エピトープを同定するための標準的な方法およびエピトープを含む小さなペプチドから抗体を産生するための標準的な方法は、例えば、Mole,「Epitope Mapping」、Methods in Molecular Biology, Vol. 10, Manson (編)中, 105〜116頁(The Humana Press社 1992); Price,「Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies」、Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, RitterおよびLadyman(編)中、60〜84頁 (Cambridge University Press 1995),ならびにColiganら(編), Current Protocols in Immunology, 9.3.1〜9.3.5頁および9.4.1〜9.4.11 (John Wiley & Sons 1997)に記述されている。
【００６７】
IL-21変異体のポリヌクレオチドの特定のヌクレオチド配列に関係なく、そのポリヌクレオチドは、その増殖活性もしくは分化活性、特殊化した細胞機能を誘導するもしくは阻害する能力により、または抗IL-21抗体もしくはzalpha11受容体に特異的に結合する能力により特徴付けられるポリペプチドをコードする。より具体的には、IL-21変異体のポリヌクレオチドは、配列番号:2に示されるポリペプチドの活性の、少なくとも50%、および好ましくは、70%、80%または90%を超える活性を示すポリペプチドをコードする。
【００６８】
変異体および融合タンパク質を含む任意のIL-21ポリペプチドに対し、当業者は、当技術分野において周知の遺伝コードおよび方法を用いて、その変異体をコードする完全に縮重したポリヌクレオチド配列を容易に創出することができる。
【００６９】
本発明により、種々の他のポリペプチド融合体(および一つまたは複数のポリペプチド融合体を含む、関連する多量体タンパク質)がさらに提供される。例えば、IL-21ポリペプチドは、米国特許第5,155,027号および米国特許第5,567,584号に開示されるような二量体化タンパク質との融合体として調製することができる。この点に関して好ましい二量体化タンパク質には、免疫グロブリン定常領域ドメインが含まれる。免疫グロブリン-IL-21ポリペプチド融合体は、(さまざまな多量体のIL-21類似体を産生させるため)遺伝子組み換え細胞中で発現させることができる。補助ドメインをIL-21ポリペプチドに融合して、それらを特定の細胞、組織、または高分子へ標的化することができる。例えば、IL-21のポリペプチドまたはタンパク質は、所定の細胞型に向けて、その標的細胞の表面上の受容体に特異的に結合するリガンドにIL-21ポリペプチドを融合させることにより標的化することができる。このような方法で、ポリペプチドおよびタンパク質を治療または診断を目的に標的化することができる。IL-21ポリペプチドは、精製のための親和性タグおよび標的化ドメインのような二つまたはそれ以上の成分に融合することができる。ポリペプチド融合はまた、特にドメイン間に、一つまたは複数の切断部位を含むこともできる。Tuanら、Connective Tissue Research 34:1〜9, 1996を参照されたい。
【００７０】
本明細書に記述される方法を用いて、当業者は、配列番号:2の残基1〜162もしくは33〜162に対して実質的に類似する配列同一性を有する種々のポリペプチド、またはその機能断片および融合体を同定および/または調製することができ、その際に、そのようなポリペプチドまたは断片もしくは融合体は、増殖、分化を刺激する能力、特殊化した細胞機能を誘導する能力またはIL-21受容体もしくはIL-21抗体を結合する能力のような野生型タンパク質の特性を保持している。
【００７１】
本発明のなかで使用されるIL-21ポリペプチドは、従来の方法に従って遺伝子組み換え宿主細胞中で産生させることができる。適当な宿主細胞は、外来DNAで形質転換または形質導入させることができ且つ培養で増殖させることができる細胞型であり、これらのなかには、細菌細胞、真菌細胞、および培養高等真核細胞が含まれる。真核細胞、特に多細胞生物の培養細胞が好ましい。クローニングしたDNA分子を操作するための技術および種々の宿主細胞中に外来DNAを導入するための技術は、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989、およびAusubelら(編)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons社、NY, 1987により開示されている。
【００７２】
一般に、IL-21ポリペプチドをコードするDNA配列は、発現ベクター内の、その発現に必要とされる他の遺伝因子(転写プロモーターおよびターミネーターを通常含む)に操作可能に連結される。ベクターにはまた、一つまたは複数の選択マーカーおよび一つまたは複数の複製起点が含まれることが多いが、当業者であれば、ある系内で、選択マーカーは他のベクター上に与えられてもよく、外来DNAの複製は宿主細胞のゲノム中への組み込みにより実現されてもよいことを認識するであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクターおよび他の因子の選択は、当技術分野における通常の技術の程度内の日常設計である。そのような多くの因子は文献に記述されており、商業的供給者を通して入手可能である。
【００７３】
IL-21ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路中へ向けるため、分泌シグナル配列(リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても知られる)が発現ベクターに供与される。分泌シグナル配列は、IL-21のものであっても別の分泌タンパク質(例えば、t-PA)由来であっても、新たに合成されてもよい。分泌シグナル配列はIL-21のDNA配列に操作可能に連結される、すなわちその二つの配列が正しい読み枠で連結され、新たに合成されたポリヌクレオチドを宿主細胞の分泌経路中へ向けるように配置される。分泌シグナル配列は、関心のあるポリペプチドをコードするDNA配列の5'側に位置付けられることが多いが、ある種の分泌シグナル配列は、関心のあるDNA配列の他の場所に位置付けられることもある(例えば、Welchら、米国特許第5,037,743号; Hollandら、米国特許第5,143,830号を参照されたい)。
【００７４】
哺乳類培養細胞は、本発明のなかで適当な宿主である。外来DNAを哺乳類宿主細胞中へ導入するための方法には、リン酸カルシウムによるトランスフェクション(形質導入)法 (Wiglerら、Cell 14:725,1978; CorsaroおよびPearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981 : GrahamおよびVan der Eb, Virology 52:456, 1973)、エレクトロポレーション法(Neumannら、EMBO J. 1: 841〜5, 1982)、DEAE-デキストランによるトランスフェクション法(Ausubelら、前掲)、およびリポソームによるトランスフェクション法(Hawley-Nelsonら、Focus 15:73, 1993; Ciccaroneら、Focus 15:80, 1993)、ならびにウイルスベクター(MillerおよびRosman, BioTechniques 7:980〜90, 1989; WangおよびFiner, Nature Med. 2:714〜6, 1996)が含まれる。
【００７５】
多岐にわたる適した組み換え宿主細胞のなかには、グラム陰性の宿主原核生物が含まれるが、これに限定されることはない。大腸菌(E. coli)の適当な菌株には、W3110株、K12株由来の菌株MM294株、TG-1株、JM-107株、BL21株、およびUT5600株が含まれる。その他の適当な菌株には: BL21(DE3)株、BL21(DE3)pLysS株、BL21(DE3)pLysE株、DH1株、DH4I株、DH5株、DH5I株、DH5IF'株、DH5IMCR株、DH10B株、DH10B/p3株、DH11S株、C600株、HB101株、JM101株、JM105株、JM109株、JM110株、K38株、RR1株、Y1088株、Y1089株、CSH18株、ER1451株、ER1647株、大腸菌(E. coli) K12株、大腸菌(E. coli) K12株RV308、大腸菌(E. coli) K12株C600、大腸菌(E. coli) HB101株、大腸菌(E. coli) K12株C600 Rk-Mk-、大腸菌(E. coli) K12株RR1(例えば、Brown(編)、Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)を参照されたい)が含まれる。その他のグラム陰性の宿主原核生物のなかには、セラチア属(Serratia)、シュードモナス属(Pseudomonas)、カウロバクター属(Caulobacter)を含めることができる。宿主原核生物のなかには、バチルス属(Bacillus)、例えば、枯草菌(B. subtilis)およびバチルス・チューリンゲンシス菌(B. thuringienesis)、ならびにバチルス・チューリンゲンシス変種イスラエレンシス株(B. thuringienesis var. israelensis)のほか、ストレプトマイセス属(Streptomyces)、例えば、ストレプトマイセス・リビダンス(S.lividans)、ストレプトマイセス・アンボファシエンス菌(S. ambofaciens)、ストレプトマイセス・フラジアエ菌(S. fradiae)、およびストレプトマイセス・グリセオフスカス菌(S. griseofuscus)のようなグラム陽性生物を含めることができる。枯草菌(Bacillus subtilus)の適当な菌株には、BR151株、YB886株、MI119株、MI120株、およびB170株が含まれる(例えば、Hardy、「Bacillus Cloning Methods」、DNA Cloning: A Practical Approach, Glover(編)中、(IRL Press 1985)を参照されたい)。宿主原核生物中でベクターを増殖させるための標準的な方法は当業者によく知られている(例えば、Ausubelら(編)、Short Protocols in Molecular Biology、第3版 (John Wiley & Sons 1995); Wuら、Methods in Gene Biotechnology (CRC Press社 1997)を参照されたい)。一つの態様として、本発明の方法では、American Type Culture Collection (ATCC)にATCC＃27325として寄託されたW3110株で発現させたIL-21を使用する。
【００７６】
本発明の発現系を用いたIL-21の大量産生が必要とされる場合、バッチ発酵を使用することができる。一般にバッチ発酵には、600 nmでの吸光度(OD)5〜20まで増殖可能とする振盪フラスコ培養にてIL-21を発現する大腸菌(E. coli)株を適当な培地中で増殖させることにより、初期種培養フラスコを調製することが含まれる。適当な培地には、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酵母抽出物、加水分解された動物タンパク質、加水分解された植物タンパク質または加水分解されたカゼインのような供給源由来の窒素が含まれる。リン酸塩は、リン酸カリウム、リン酸アンモニウム、リン酸またはリン酸ナトリウムから供給される。その他の成分は、塩化マグネシウムまたは硫酸マグネシウム、硫酸鉄または塩化第一鉄、および他の微量元素が考えられる。増殖培地には、増殖を高めるため、糖質、例えば、フルクトース、グルコース、ガラクトース、ラクトース、およびグリセロールを添加することができる。または、給餌バッチ培養を使用して大量のIL-21タンパク質を産生する。IL-21を産生する大腸菌(E. coli)株は、バッチ発酵に植菌するため使用した初期容器に対して記述されている条件に類似の条件下で増殖させる。
【００７７】
発酵後、細胞を遠心により集菌し、ホモジナイゼーション用緩衝液に再懸濁し、例えば、APV-Gaulinホモジナイザー(Invensys APV, Tonawanda, New York)またはその他の種類の細胞破壊装置、例えばビーズミルもしくは超音波処理器でホモジナイズする。または細胞を発酵槽から直接採取し、APV-Gaulinホモジナイザーでホモジナイズする。洗浄した封入体の沈殿物は、βメルカプトエタノール(10〜100 mM)またはジチオスレイトール(5〜50 mM)のような還元剤を含有する塩酸グアニジン溶液(5〜8 M)または尿素溶液(7〜8 M)を用いて可溶化することができる。この溶液は、Tris緩衝溶液、リン酸緩衝溶液、HEPES緩衝溶液または他の適用な緩衝溶液として調製することができる。封入体は、ラウリル硫酸ナトリウム(0.1〜2%)を含有する尿素溶液(2〜4 M)で可溶化することもできる。溶解しにくい(refractile)封入体としてIL-21が蓄積される形質転換済みの宿主大腸菌(E. coli)から精製IL-21を回収する工程では、細胞を破壊して封入体を遠心により回収する。次いで封入体を、還元剤を含有する6 M塩酸グアニジン溶液中で可溶化および変性させる。次いで還元されたIL-21を制御された復元工程で酸化する。再び折りたたまれたIL-21は、清浄化および不溶性タンパク質の除去を目的としてろ過器を通過させることができる。IL-21タンパク質を再び折りたたみ、濃縮した後、その再び折りたたまれたタンパク質を希釈緩衝溶液に入れて陽イオン交換カラム上に捕捉させ、疎水性相互作用クロマトグラフィーを利用して精製する。
【００７８】
本発明のポリペプチドを純度80%以上まで、より好ましくは純度90%以上まで、さらにより好ましくは純度95%以上まで精製することが好ましく、とりわけ好ましいのは薬剤的に精製された状態であり、その状態は、コンタミしている高分子、特に他のタンパク質および核酸に関して純度が99.9%を超え、感染物質および発熱物質がない状態である。精製ポリペプチドには実質的に、他のポリペプチド、特に他の動物起源ポリペプチドがないことが好ましい。
【００７９】
当業者に周知のさまざまな測定法を利用して、IL-21タンパク質またはポリペプチドに結合する抗体を検出することができる。典型的な測定法は、Antibodies: A Laboratory Manual, HarlowおよびLane (編), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988に詳述されている。そのような測定法の代表例には、同時並行的(concurrent)な免疫電気泳動法、放射免疫測定法、放射免疫沈降法、酵素結合免疫吸着測定(ELISA)法、ドットブロットまたはウエスタンブロット法、阻害または競合測定法、およびサンドイッチ測定法が含まれる。さらに抗体は、変異型IL-21タンパク質またはポリペプチドと対比して、野生型IL-21タンパク質またはポリペプチドとの結合についてスクリーニングすることができる。
【００８０】
本発明の方法はまた、IL-21ポリペプチドをポリマーと結合させた化学修飾型IL-21組成物の使用をも意図する。実例となるIL-21ポリペプチドは、成熟型IL-21ポリペプチドのような機能的な膜貫通ドメインがない可溶性ポリペプチドである。通常ポリマーは水溶性であり、IL-21複合体は生理的環境のような水性環境中で沈殿しない。適当なポリマーの一例は、アシル化のための活性エステル、またはアルキル化のためのアルデヒドのような単一の反応基を有するように改変されたものである。この方法では、重合度を制御することができる。反応性アルデヒドの一例は、ポリエチレングリコール・プロピオンアルデヒド、またはモノ-(C1-C10)アルコキシ、もしくはそのアリールオキシ誘導体である(例えば、Harrisら、米国特許第5,252,714号を参照されたい)。ポリマーは分枝していても分枝していなくてもよい。さらに、ポリマー混合物を使用してIL-21複合体を生成することができる。
【００８１】
治療に使用するIL-21複合体には、薬学的に許容される水溶性ポリマー成分を含めることができる。適当な水溶性ポリマーには、ポリエチレングリコール(PEG)、モノメトキシPEG、モノ-(C1-C10)アルコキシ-PEG、アリロキシ-PEG、ポリ-(N-ビニルピロリドン)PEG、トレシルモノメトキシPEG、PEGプロピオンアルデヒド、ビス-スクシンイミジルカーボネートPEG、プロピレングリコール・ホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシド・コポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマーが含まれる。適当なPEGは、分子量約600〜約60,000(例えば、5,000、12,000、20,000および25,000)を有しうる。IL-21複合体にはまた、そのような水溶性ポリマーの混合物が含まれてもよい。
【００８２】
B. 自己免疫疾患を治療するためのIL-21の使用
IL-21は重要な免疫学的機能を有することが知られている組織であって、免疫系に関与している細胞を含む組織から単離された。IL-21はCD3+選択された活性化末梢血液細胞により発現されており、IL-21の発現はT細胞活性化後に増加することが示されている。実験により、IL-21ポリペプチドはNK細胞またはNK前駆細胞の増殖(growth)/増殖(expansion)および/または分化状態に影響を与えることが実証されている。(Toomey JA et al., J. Leukoc. Biol., 74:233-242, 2003; Strengell M et al., J. Immunol., 170:5464-5469, 2003; Parrish-Novak J et. al., Nature, 408:57-63, 2000)。IL-21およびIL-15を含む組成物はNK前駆細胞およびNK細胞を刺激することが示されており、以前に報告されている因子および因子の組み合わせよりも強力であった。(Toomey JA et al., 前記, 2003; Strengell M 前記, 2003)。さらに、IL-21はNK細胞の増殖(expansion)を促進し、IL-21はおおむねNK細胞の増殖(growth)に対するIL-4の阻害効果を克服し、IL-2と相乗作用してNK細胞の増殖(growth)を促進し、IFN-γの発現を選択的に促進し、IL-13発現を抑制した。(Toomey JA et al., J. Leukoc. Biol. 前記, 2003; Strengell M et al., 前記, 2003: Parrish-Novak et. al., 前記, 2002)。
【００８３】
樹状細胞は病原体および腫瘍に対する適応免疫の開始および制御、ならびに自己免疫の誘発に重要な抗原提示細胞(APC)のサブクラスである。(Guermonprez P et al., Ann. Rev. Immunol., 20:621-667, 2002; Heath WR and Carbone FR, Ann. Rev. Immunol., 19:47-64, 2001に概説されている)。T細胞に対し抗原を提示する細胞の主要源として、DCは寛容の樹立および維持ならびに自己免疫の回避に重要な役割を果たすことがより明確である。DCは胸腺および末梢中において自己抗原に対する寛容を与えることが示されている。さらに、DCをインビトロでおよびインビボで産生させることができ、これはマウスで特異的に寛容を誘発し、インビボで自己免疫を阻害することができる。(Wakkach A et al., Immunity 18:605-617, 2003: Sato K et al., Immunity 18:367-379, 2003)。これらの結果は、DC機能の制御がインビボで免疫反応を調節するのにおよびそのバランスを自己免疫から自己抗原の寛容へ移行させるのに重要であることを示唆している。(Mehling A and Beissert S, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 38:1-21, 2003:Steinman RM et al., Ann. N Y Acad. Sci., 987:15-25, 2003:Steinman RM et al., Ann. Rev. Immunol., 21:685-711, 2003)。サイトカインは樹状細胞機能のモジュレーターとしての機能を果たし、それによって自己免疫を阻害することができる。本発明は、IL-21組成物の投与によって哺乳類において自己免疫反応を低減させる方法を提供する。本発明はまた、罹患した哺乳類、具体的にはヒトにIL-21組成物を投与することによって、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬、強直性脊椎炎、強皮症、I型糖尿病、乾癬性関節炎、変形性関節炎、炎症性腸疾患、アトピー性皮膚炎および喘息などの自己免疫疾患を治療する方法を提供する。IL-21による処置は被験体に何らかの有益な効果をもたらし、さまざまな方法で測定することができる。特定の測定結果が、IL-21の投与が特定の自己免疫疾患の発症遅延または疾患の重症度の軽減をもたらすことを実証しうる。被験体に対し有益な効果を実証するために使われるパラメータは、疾患の診断、患者の根本的な健康状態に依存するが、疾患の重症度、毒性により引き起こされる副作用などの合併症、費用を減らし、およびまたはより好都合な治療計画を提供することができるであろう。処置によって肝臓、肺、心臓、中枢神経系、および胃腸系などの臓器に対する損傷の低下をもたらすことができるであろう。患者に対する治療効果を判定できるものを決めることは十分に臨床医の技術の範囲内である。
【００８４】
1. IL-21で処理した樹状細胞はインビトロで抗原特異的なCD4 T細胞の増殖を阻害する
本発明では、免疫反応を阻害するIL-21の能力は樹状細胞(DC)をIL-21とともに培養することおよび培養したDCを抗原提示細胞(APC)として用いることによって評価される。DCはBALB/c(H-2d)マウス骨髄から、骨髄細胞を抽出することおよびその細胞を顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)とともにまたはGM-CSF + IL-21もしくはGM-CSF +IL-15とともに10日間培養することによって作製される。次いでDCを洗浄し、ニワトリオボアルブミンのペプチド(OVA323-334)などの抗原とともにインキュベートする。抗原パルスDCを洗浄し、その後さまざまな濃度のDO11.10系形質転換マウス由来CD4+ T細胞を用いて培養する。DO11.10系形質転換マウス由来CD4+ T細胞は全て、I-Adとの関連でOVA323-334ペプチドに特異的である形質転換T細胞受容体(TCR)を発現する。OVA323-334ペプチドでパルスしたDCと接触しているCD4+ T細胞は活性化されて増殖する。分裂細胞における3Hチミジンの取込みにより分裂を測定することができる。GM-CSFまたはGM-CSF + IL-15中で培養したDCと共培養したDO11.10系T細胞は急速に増殖し、3H-チミジンの取込みの増加を示す。対照的に、GM-CSF + IL-21で得られたDCと共培養したDO11.10系T細胞は3H-チミジンの取込みの低下により示されるように十分には増殖しない。すなわち、GM-CSFに加えてIL-21に曝露されたDCはインビトロにおいて不十分な抗原提示細胞である。
【００８５】
樹状細胞はflt3Lを用いて培養することにより、マウス骨髄から得ることもできる。flt3L + IL-21を用いて培養することによって得られたDCはまた、flt3L単独を用いて培養することによって得られたDCと比べて不十分な抗原提示細胞である。したがって、樹状細胞培養物にIL-21を添加することで、同系T細胞を刺激して増殖させることができる効果的なAPCの発生が抑制される。
【００８６】
2. IL-21由来樹状細胞はインビボで不十分な抗原提示細胞である
本発明では、IL-21の存在下で骨髄細胞から得られたDCは不十分な抗原提示細胞であることが実証される。GM-CSFまたはGM-CSF + IL-21とともに10日間培養したDCをフルオレセインイソチオシアネート(FITC)でパルスし、洗浄し、その後、マウスの足蹠中に注射する。6日後、マウスの耳の厚さを測定する。FITC-DC免疫マウスを、その左耳に対照PBSを注射することによって、およびその右耳にFITCのPBS液を注射することによってアレルギー誘発させる。耳の厚さを24時間後に測定する。GM-CSF(+FITC)中の培養物から得られたDCで免疫したマウスは24時間以内に耳の厚さの増大、つまりFITCに対する免疫反応の証しを示す。対照的に、GM-CSF + IL-21 (+FITC)中で培養することによって得られたDCで免疫したマウスは耳厚の増加を示さないことから、GM-CSF + IL-21培養DCによってもたらされる免疫反応がないことが示唆される。(Brandt K et. al., Blood (in press), 2003)。本発明はIL-21中で培養したDCがインビボで不十分な抗原提示細胞であることを示す。
【００８７】
3. IL-21中で培養した樹状細胞はより低いレベルのMHCクラスIIを発現し、より高いレベルのMHCクラスIを発現する
上に明記したように、DCをマウス骨髄から得てGM-CSFまたはGM-CSF + IL-21を用いて培養する。DCを洗浄し、マウス樹状細胞に対するマーカーCD11bおよびCD11cとともに、MHCクラスII(I-Ad)に対するFITC結合抗体およびMHCクラスI (H-2Kd)に対するPE結合抗体で染色する。GM-CSFを用いて培養したDCは高いレベルのMHCクラスIIおよびMHCクラスI分子を発現する。GM-CSF + IL-21を用いて培養して得られるDCはGM-CSF単独を用いて培養したDCに比べて、より低いレベルのMHCクラスII分子およびより高いレベルのMHCクラスI分子を発現する。より低いレベルのMHCクラスIIの発現はインビトロにおいてCD4+ T細胞の刺激と増殖の低下をもたらしうる。
【００８８】
さらなる証拠から、IL-21がインビボでT細胞およびB細胞の増殖および/または分化に影響を及ぼすことが示される。IL-21は、正常B細胞の増殖を、その細胞に供与される共刺激因子の性質に応じて阻害または促進できることが示されている。IL-21はいくつかのB細胞系の増殖を阻害するが、それ以外のものを阻害することはなく、この現象は、大部分の阻害されない細胞系は特異的IL-21結合によって測定するとIL-21Rを発現しているにも関わらず起こる。多くのヒトB細胞系はSCIDマウスで増殖し、SCIDマウスを殺傷する(Bonnefoixら、Leukemia and Lymphoma 25:169〜178, 1997)。本明細書の実施例には、IL-21により阻害される三つのB細胞系およびIL-21に応答しなかった三つのB細胞系について記述する。リンパ腫細胞系は全てIL-21R陽性であった。これらリンパ腫細胞をSCIDマウスに移植して、IL-21がリンパ腫を持つ動物の生存を引き延ばすことができるか決定した。IL-21は、増殖がインビトロで阻害された三つの細胞系に対して顕著な効果を示した。別の実験において、SCIDマウスのNK細胞の枯渇によってはIM-9モデルでのIL-21の効果を抑制できなかったことから、NK細胞がこのモデルにおけるIL-21の効果に必要とされないことが示唆される。詳細な論議については、参照により本明細書に組み入れられる、共通して所有する国際公開公報第03/103589号を参照されたい。
【００８９】
（表４）
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【００９０】
4. IL-21処置はDTHを抗原投与の段階で抑制するが、感作の段階では抑制しない
DTH反応は、CD4+T細胞により誘導され、T細胞、好中球、マクロファージにより媒介される典型的な免疫反応である。DTH反応は、CD4+T細胞が媒介する反応についての一つの有用な指標となる。CD4+ T細胞反応を調べるために使われる一つのモデルでは、アジュバントとしてRIBIまたはCFAのどちらかとともに、マウスにニワトリオボアルブミンタンパク質(OVA)を皮下投与し免疫化する。この段階を感作段階と呼ぶ(0日目〜6日目)。7日後、耳測定を行う。次いで、マウスの耳に対照PBS (左耳)またはOVA (右耳)を注射する。この段階を抗原投与段階と呼ぶ(7日目〜8日目)。OVAに対して生じた免疫反応により耳に炎症が起こり、24時間後に耳厚が増大する。これをカリパスにより測定する。前述したようにDTH試験を行う(例えば、Oura et al., Blood 101:560-567, 2003; Zaloom et al., Immunology 72:584-587, 1991.を参照されたい)。IL-21の投与がCD4+ T細胞反応をもたらすことを実証するため、マウスの群に対して0日目〜6日目(感作段階)から、または7日目〜8日目(抗原投与段階)からPBSかIL-21を1日1回腹腔内注射する。0日目〜6日目からIL-21で処置したマウスには、PBSで処置したマウスと同様に、OVAで処置した耳の耳厚の類似的増加にみられる通り、正常な免疫反応が認められる。これとは対照的に、7日目〜8日目からIL-21で処置したマウスはPBSで処置したマウスのものと比べて、OVAで処置した耳の厚さの減少を示す。これによりIL-21が抗原投与段階でDTHを阻害し、継続的な免疫反応を阻害できることが実証される。これにより同様に、IL-21が免疫反応の誘発を阻害しないことが実証される。IL-21を感作段階で投与した場合、それはDTHを阻害しないからである。
【００９１】
（表５）
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【００９２】
5. 抗原投与段階でのDTHのIL-21媒介性阻害は用量依存的である
上に明記したように、7日目〜8日目よりPBSまたはさまざまな用量のIL-21のいずれかでマウスを処置することによって、DTH反応をマウスモデルで試験する。このデータによって、IL-21の用量増加が抗原投与段階で投与した場合にマウスの耳厚の阻害増大をもたらすことが示される。これにより、IL-21による炎症の阻害が用量依存的であることが実証される。
【００９３】
（表６）
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【００９４】
6. IL-21はマウス関節リウマチモデル(コラーゲン誘発関節炎モデル)において足部スコアと腫脹を抑制する
関節リウマチは一種の自己免疫疾患であり、その発生部位では体の免疫反応が、自己タンパク、特にコラーゲンを標的とする。コラーゲンはタンパクの一つであり、多くの組織の、とりわけ関節の基盤である。こうして生じたコラーゲンに対する免疫反応は関節破壊の原因となり、長期にわたると患者は手足を動かすことができなくなり、関節や膝に激痛を覚える。関節炎患者の血清中にはTNFα(腫瘍壊死因子)の量とコラーゲンに対する抗体量が増加するが、この二つの量は慢性疾患の指標というだけでなく病態にも関与する(Smolen and Stein+er G, Nat. Rev. Drug Discov., 2:473-488, 2003; Firestein, Nature 423:356-361, 2003.)。さらに関節リウマチは、CD4+T細胞によって惹起される。樹状細胞(DC)はCD4+T細胞に対しコラーゲンを抗原として示す。コラーゲン誘発関節炎(CIA)モデルはマウス関節リウマチモデルであり、ヒト関節リウマチをほぼ反映するモデルである(Moore, Methods Mol. Biol. 225:175-179, 2003: Waksman, Scand. J. Immunol., 56:12-34, 2002)。完全フロイントアジュバント(CFA)に乳化させたコラーゲンを尾根部に2回投与してマウスを免疫化した。この結果、足に腫脹が生じ、この腫脹は一定期間にわたって増大し、目視評価とカリパスによる測定が可能である。IL-21中で培養したDCがインビトロでCD4+T細胞反応を抑制するというデータに基づき、IL-21をコラーゲン免疫化マウス群に投与し、疾患スコアに対する効果を評価した。IL-21による足部スコアと足部腫脹の抑制は、進行中の自己免疫反応に対する抑制効果を示すものである。
【００９５】
7. IL-21処置はマウス多発性硬化症モデルにおいて疾患の発症を遅らせる
実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、マウスヒトMSモデルである(Gold et al., Mol. Med. Today, 6:88-91, 2000; Anderton et al., Immunol. Rev., 169:123-137, 1999)。マウスを用いて疾患を誘発するには多数の方法がある。このような方法の一つにミエリンタンパクMOG(ミエリン希突起膠細胞糖タンパク)由来ペプチドでマウスを免疫化するものがある。ミエリンタンパクは髄鞘の外側に存在し、髄鞘の保護層として作用する。0日目、マウスにRIBIアジュバントに乳化させたMOGペプチド(MOG35-55)を皮下投与し免疫化した。続いて2日目、百日咳毒素(PT)を静注した。マウスは跛行、振戦に続いて前肢および後肢の麻痺に始まる麻痺症状を示し始めた。この徴候を疾患の発症時期、範囲、重症度を測定する様々な指標によりスコア化した。発症遅延は、その薬物によってマウスの疾患過程が変化していることを示す。発症率の低下は、その薬物が発病中のマウス数に作用を持つことを示す。臨床スコアの低下は、その薬物が疾病の重症度に作用を持つことを示す。マウス群に1日目から15日目までPBSあるいはIL-21を投与した。本モデルではIL-21投与群における症状の発現、疾患スコアの出現率、疾患スコアの重症度を指標としてIL-21の効果を示す。マウス(n=13/群)に0日目、RIBIアジュバント中100μgのMOG35-55ペプチドを皮下投与し免疫化した。全マウスに投与2日目、200 ng PTを静注した。マウス群にPBS、100μg BSA、10μg IL-21、または100μg IL-21を0日目から20日目まで静注した。前述した通り、マウスを0日目から30日目まで毎日、臨床徴候と体重減についてスコア化した。10μg IL-21投与群、100μg IL-21投与群は、PBS投与群やBSA投与群に比し、発症遅延を示している。100μg投与群で認められる遅延が10μg投与群の遅延より大きいことはIL-21の効果が用量依存性であることを示唆している。
【００９６】
（表７）
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【００９７】
8. IL-21由来樹状細胞は自己免疫反応をインビボで抑制できる
前述した通り、IL-21中で培養した樹状細胞は、インビトロのCD4+T細胞増殖刺激能の欠如、インビボの抗原に対する反応刺激能の欠如から明らかなようにインビトロ、インビボともに不十分な抗原提示細胞である。インビボで自己免疫疾患の抑制にIL-21由来DCが使用可能か否かを調べるため、0日目、マウスにRIBIアジュバント中のMOG35-55ペプチドを投与し免疫化した。GM-CSF + IL-21中で培養した樹状細胞にMOG35-55ペプチドを添加し、マウスの足蹠に注入した。2日目、マウスに百日咳毒素を静注した。IL-21中で培養したDCの自己免疫疾患抑制能は、マウスにおける疾患スコアの低下、発症遅延、疾患の発症率の減少で示される。
【００９８】
A. 過敏症
過敏症は種別に分類される：即時型でIgE関連のI型過敏症；細胞障害性関連の抗体と補体が存在するII型過敏症；抗原抗体複合体が介するIII型過敏症；遅延型過敏症(DTH)であるIV型過敏症。
【００９９】
IV型過敏症反応は、T細胞の主としてTh1細胞とCD8+T細胞が介して起こるが、マクロファージと好中球が著しく関与している。IV型反応で研究が進んだ3例は、DTH、接触過敏症(CH)、セリアック病(グルテン過敏性腸疾患)である。接触過敏症は、金属やツタウルシなど経皮吸収される抗原に対する反応である。アトピー性皮膚炎(AD)をCHの一形態として分類するよう支持する動きがあるが、その分類については未だ意見の一致をみない。IL-21は抗原投与の段階(急性期、過渡期)の反応でDTHを抑制すること、IL-21に刺激されたDCは、弱いDTH反応とCH反応を伝達することが判っているので、CHに関連する他の疾患同様ADの治療に有用であると考えられる。
【０１００】
ADのための試験には主にトランスジェニックモデルを必要とするが、AD患者から採取した細胞が、ADにおけるIL-21の効果を評価するためのインビトロ系として使用可能である。さらにT細胞反応の評価、抗原提示細胞(APC)の反応、CHモデルにおける免疫組織化学から、IL-21を用いたAD患者の治療に対する貴重な情報が得られる(Leung and Bieber, The Lancet, 361:151-160, 2003: Maurer, Curr. Problems Dermatol., l22:38-43, 1995; Akhavan and Cohen, Clin. Dermatol., 21:158-162, 2003; Herrick et al., J. Immunol., 170:2488-2495, 2003; Marsella and Olivry, Clin. Dermatol.,21:122-133, 2003)。
【０１０１】
B. 炎症性腸疾患
炎症性腸疾患(IBD)として知られる、免疫調節不全に起因する腸内の炎症は、二つの大きな疾患定義(クローン病(CD)、潰瘍性大腸炎(UC))を特徴とする。一般的に、CDはTh1反応の調節不全により、UCはTh2反応の調節不全によると考えられている。多くのサイトカイン、ケモカイン、マトリックスメタロプロテアーゼが、IBD患者の炎症を起こした病変部で亢進されていないことが判明している。これらには、IL-1、IL-12、IL-18、IL-15、TNF-α、IFN-γ、MIP1α、MIP1β、MIP2が含まれる。他の治療が概して患者の生活の質を改善するものであるのに対して、REMICADE(登録商標) (Centocor, Malvern, PA)は、CD患者に投与しクローン病そのものを標的にするのに成功した、現在唯一の薬である。IBDに関連する自己免疫反応について、IL-21の抑制作用は以下のIBDモデルで明らかである。IBDモデル: マウスDSSモデル、マウスTNBSモデル、マウスCD4+CD45Rbhiモデル、マウスmdr 1a-/-モデル、マウス移植片対宿主病(GVHD)腸炎症モデル(Stadnicki A and Colman RW, Arch Immunol Ther Exp 51:149-155, 2003; Pizarro TT et al., Trends in Mol Med 9:218-222, 2003)。ヒトIBDの実験モデルの一つに、げっ歯類へのデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)の経口投与がある。DSSは、ある程度ヒトの組織学的所見に似た特徴がある急性および慢性の潰瘍性大腸炎を誘発する。DSS誘発大腸炎は、腸内細菌、マクロファージ、好中球と深く関与し、T細胞、B細胞に果たす役割は小さい(Mahler et al., Am. J. Physiol. 274:G544-G551, 1998; Egger et al., Digestion 62:240-248, 2000)。TNBS誘発大腸炎はTh1介在性疾患と考えられているので、ヒトUCよりもヒトCDと共通点がある。トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)を様々な用量(株によって異なる)でマウスに直腸注入し、抗原特異的(TNBS)T細胞反応を誘発する。この抗原特異的(TNBS)T細胞反応には、Th1様サイトカインIL-12、IL-18、IFNγの分泌が含まれる。大腸炎には、炎症部位への抗原特異的T細胞、マクロファージ、好中球の漸増が必要となる(Neurath et a1., Int. Rev. Immunol., 19:51-62, 2000; Dohi T et al., J. Exp. Med. 189:1169-1179, 1999)。大腸炎の他の比較的新しいモデルとしては、SCIDマウスにCD4+CD45RBhiを移入したモデルがある。CD4+T細胞は、CD45Rbの発現に基づく二つのカテゴリーに大きく分けられる。CD4+CD45RBhi細胞は未感作T細胞、CD4+CD45Rbloは調節性T細胞と考えられる。同系SCIDマウスへの全細胞(CD4+T)移入では大腸炎症状を誘発しない。しかしCD4+CD45RBhi T細胞のみをSCIDマウスに注入すると、マウスは3〜6週間の一定期間にわたって大腸炎を発症する。未感作T細胞とCD4+CD45Rblo調節性T細胞の同時移入が大腸炎を抑制するということは、調節性T細胞が免疫反応の調節に重要な役割を果たしていることを示唆している(Leach et al., Am. J. Pathol., 148:1503-1515, 1996; Powrie et al., J. Exp. Med., 179:589-600, 1999)。本モデルにより、マウスの免疫寛容を生じるDC産生能によるT細胞の調節機能を亢進させることでIL-21が大腸炎を抑制することが明らかとなる。骨髄移植に関連する大腸炎の臨床上関連のあるモデルとしては、GVHD誘発大腸炎がある。移植片対宿主病(GVHD)は、免疫不全で組織適合性のあるレシピエントのエフェクター細胞中で発症し、それらが増殖して宿主細胞を攻撃する。異質遺伝子型の骨髄移植を受けた患者や重症の再生不良性貧血患者にはGVHDのリスクがある。マウスでもヒトでも、下痢は本症候群の共通した重篤な症状である。ヒトでは結腸および小腸の疾患が認められている。マウスGVHD誘発大腸炎モデルでも、ヒトと同様の組織学的疾患を示す。したがって、これらのマウスモデルは、GVHDでの大腸炎抑制薬の有効性を評価するのに使用できる(Eigenbrodt et al., Am. J. Pathol., 137:1065-1076, 1990; Thiele et al., J. Clin. Invest., 84:1947-1956, 1989)。
【０１０２】
C. 全身性エリテマトーデス
全身性エリテマトーデス(SLE)は、遍在性の自己抗原(抗dsDNA)に対する慢性的なIgG抗体産生を特徴とする免疫複合体関連の疾患である。SLEの作用は特定臓器に局在化するのではなく全身性である。多数の染色体座がSLEに関連しており、抗dsDNA抗体や糸球体腎炎など疾患の様々な局面を助長すると考えられる。CD4+T細胞は、マウスSLEモデルにおいて積極的役割を果たすことが判明している(Horwitz, Lupus 10:319-320, 2001; Yellin and Thienel, Curr. Rheumatol. Rep., 2:24-37, 2000)。CD8+T細胞の役割は明確に定義されてはいないが、「サプレッサー」CD8+Tの機能はループス患者を障害することを示唆する証拠がある(Filaci et al., J. Immunol.,166:6452-6457, 2001; Sakane et al., J. Immunol., 137:3809-3813, 1986)。
【０１０３】
IL-21は、B細胞に直接働くことで抗体反応を調節することが知られている(Mehta et al., J. Immunol., 170:4111-4118, 2003; Ozaki et al., Science, 298:1630-1634, 2002; Suto et al., Blood, 100:4565-4573, 2002)。さらにIL-21はCD8 T細胞の活性を高めるので、IL-21を投与することで機能不全のループス患者にさらに強力なサプレッサーT細胞機能がもたらされる。
【０１０４】
ヒトSLE患者とマウスモデルの血清からIL-21活性を検定した。IL-21を用いて培養後、ヒトSLE患者の末梢血リンパ球(PBL)におけるCD8+T細胞のサプレッサー活性をインビトロで評価した。SLE患者のCD8+T細胞のサプレッサー活性について、抗CD3によって誘導された自己末梢血単核球(PBMC)の増殖を阻害する能力で評価した。抑制機能は、培養中のIFNγおよびIL-6の分泌と相関している。IL-21投与患者由来の培養物でIFNγおよびIL-6が上昇したことは一段と高いサプレッサー活性の指標と考えられる(Filaci et al., J. Immunol. 166:6452-6457, 2001)。
【０１０５】
D. 乾癬
乾癬は慢性の炎症性皮膚疾患であり、表皮角化細胞の増殖およびCD4+メモリーT細胞、好中球、マクロファージなどの単核球浸潤にも関連している(Christophers, Int. Arch. Allergy Immunol., 110:199, 1996)。最近、環境抗原が疾患病理の始まりであると同時に一因として重要な役割を果たすと考えられている。しかし、乾癬の病理に介在すると考えられるのは自己抗原に対する許容性の消失である。樹状細胞とCD4+T細胞はその病理に至る免疫反応に必要な抗原の提示と認知において重要な役割を演じると考えられる。最近、我々はCD4+CD45RB移入モデルに基づく一つの乾癬モデルを開発した(Davenport et al., Internet. Immunopharmacol., 2:653-672)。乾癬を誘発する細胞を注入したマウスにIL-21を投与し、臨床スコア(皮膚疾患)に対するその効果を評価し、IL-21の有用性を示すものである。
【０１０６】
IL-21は免疫調節薬を含む自己免疫病で既に使用されている他剤との併用投与が可能である。免疫調節薬としては、インターフェロンα(IFN-α)、IFNγ、NOVANTRONE(登録商標)、ENBREL(登録商標)、REMICADE(登録商標)、LEUKINE(登録商標)、IL-2が挙げられる。IL-21に関する至適用量の確立と投与計画は以下の様々な方法で行われる: IL-21の薬物動態研究と薬力学研究、動物モデルにおける有効用量の決定、IL-21の毒性評価。その後、霊長類で行った直接薬物動態測定と臨床試験を患者での理論量予測に利用できる。患者での理論量とは、患者で生体反応に達するのに十分な規模と持続時間を持つ血漿IL-21値に達する用量のことである。さらにIL-21は正常樹状細胞の多様な反応を刺激するので、患者のエフェクター細胞におけるIL-21の生体活性を測定するのに代理マーカーを利用することができる。
【０１０７】
IL-21-サポリン融合毒素または他のIL-21-毒素融合物は、自己免疫疾患に対して利用でき、IL-21で処置できる疾患範囲を拡げる。さらにこのようなIL-21-毒素融合物は、IL-21が自己免疫B細胞、CD8+、その受容体に結合しているその他の自己免疫疾患に対しても利用できる。融合毒素により媒介されるこのIL-21受容体の活性化は、標的細胞の増殖を阻害する、それぞれ独立した二つの方法を提供する。一つは、リガンド単独で認められるのと同等の効果であり、もう一つは、受容体の内在化を介した毒素の送達によるものである。IL-21受容体のリンパに限局した発現パターンは、患者がリガンド-サポリン結合体を許容しうることを示唆する。
【０１０８】
IL-21は活性化CD4+「ヘルパー」T細胞の産物である。活性化CD4+ヘルパーT細胞は体液性免疫と細胞性免疫の両方に必要であり、抗原が再び侵入してきた場合に備えて長期記憶を持続するのにも必要である(米国特許第6,307,024号; Parrish-Novak et al., Nature 408:57-63, 2000)。IL-21受容体は抗癌反応と免疫反応を媒介する細胞で発現するが、IL-21は先の実験によりインビトロでこれらの細胞種の増殖を刺激できることが判明している(同一所有者のWIPO公開国際公開公報第0/17235号および国際公開公報第01/77171号)。免疫反応の抑制は、少なくとも、抗原提示期間もしくは既存の反応を抑制するエフェクター反応の期間の二つの段階において立証されている。前述の通り、IL-21はCD4+T細胞への抗原提示を特異的に抑制することができる。多くの自己免疫反応はCD4+T細胞の活性化を通して指示されている。抗原提示期間にCD4+T細胞に対する抗原提示をIL-21曝露によって抑制すると免疫反応抑制を持続することになり、それによって自己免疫を抑制することになる。このエフェクター期間に、IL-21はCD8＋細胞およびNK細胞の活性を高める。CD8＋T細胞とNK細胞は自己免疫を助長すると一般的に考えられているが、これらの細胞は自己免疫中に調節機能を果たすことと、CD8＋細胞および/またはNK細胞の減少は自己免疫反応の重症度を高めることをいくつかの証拠が示唆している。自己免疫反応の亢進はマウスMSモデルで明らかである。マウスMSモデルでは、パーフォリンを発現する細胞(CD8＋細胞、NK細胞)の減少によりマウスのEAEが悪化した(Malipiero U et.al., Eur J Immunol. 27:3151-3160, 1997)。さらに、NK細胞の減少が疾患重症度を増大し、NK細胞の活性化によりEAEからマウスを保護した(Singh AK et al. J Exp Med. 194:1801-1811, 2001)。これらの実験が示唆しているのは、CD8＋T細胞およびNK細胞に対するIL-21の活性増強能は、抑制することで自己免疫反応の調節に一つの役割を果たすということである。したがって、IL-21は抗原提示細胞に対して作用するとともに、CD8＋T細胞とNK細胞のようなエフェクター細胞にも作用することで進行中の免疫反応を抑制することができる。
【０１０９】
本発明を、以下の限定しない実施例によりさらに詳しく述べる。
【０１１０】
実施例
実施例1
IL-21を用いて培養した樹状細胞は、インビトロでは弱い抗原提示細胞である
BALB/c骨髄細胞培養株を顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)またはGM-CSF + IL-15 またはGM-CSF + IL-21中で培養することによって、マウス樹状細胞を得る。これら樹状細胞はフローサイトメトリーによって表現型で分類し、MHCクラスIおよびMHCクラスIIの分子発現を調べる。さらにこれら樹状細胞をOVA323-334ペプチドで刺激し、DO11.10トランスジェニックT細胞に対する抗原提示細胞として利用する。
【０１１１】
GM-CSF + IL-21中で培養した樹状細胞は、GM-CSF単独を用いて培養したDCに比し、MHCクラスII分子をより低レベルで、MHCクラスI分子をより高レベルで発現する。GM-CSF単独またはGM-CSF + IL-15を用いて培養した樹状細胞は、インビトロで抗原特異的DO11.10 T細胞の効率的な増殖を誘発する。これとは対照的に、GM-CSF + IL-21中で培養したDCは、前述の培養に比べ、増殖の誘発ははるかに小さい。同様に、flt3L単独を用いて培養したDCもトランスジェニックDO11.10 T細胞の効率的な増殖を誘発する。flt3L+ IL-21を用いて培養したDCは、効率よく増殖を誘発することができなかった。
【０１１２】
B. 試験計画
およそ8〜10週齢のBALB/c雌性マウスを安楽死させる。これらのマウスから大腿骨を単離し、乳鉢と乳棒を用いて粉砕し、骨髄細胞を抽出する。ACK溶解緩衝液(0.15 M NH4Cl、1 mM KHCo3、0.1 mM EDTA)で2分間細胞をインキュベートして赤血球を溶解し、RPMI-10培地(10% FBSを含むRPMI)で中和する。細胞を一度RPMI-10培地で洗浄し、24ウェルプレートにて完全DMEM培地中、示したサイトカインを添加して総量3 ml/ウェルとし、細胞200万個/mlで培養する。細胞培養に用いたのは、20 ng/ml組換えマウスGM-CSF (rmGM-CSF、R & D systems)、またはrmGM-CSF + 30 ng/ml組換えマウスIL-15 (rmIL-15、R & D systems)、またはrmGM-CSF + 30 ng/ml)組換えマウスIL-21(rmIL-21、Zymogenetics)である。細胞には新鮮培地とサイトカインを4日ごとに再補給する。培養開始から10日目、細胞を回収し、フローサイトメトリー解析または腫瘍抗原提示細胞(APC)分析のどちらかに用いる。
【０１１３】
DCのフローサイトメトリー解析では、細胞表面のマーカー発現をBecton Dickinson (BD) FACs Caliburにて標準的な3色フローサイトメトリーにより解析した。抗体は全てBD Pharmingen (San Diego, CA)から入手した。フルオレッセインイソチオシアネート(FITC)結合CD80、CD86、Kd、I-Ad、フィコエリスリン(PE)結合CD11c、およびAPC結合CD11bを細胞の染色に用いる。各染色には1〜3×106細胞を用いる。ブロッキングバッファー(PBS、10% FBS、20μg/ml 2.4G2)で細胞をインキュベートすることで非特異的結合を阻害する。ブロッキングした後、第1抗体を加えて20分間、細胞をインキュベートする。特に断りのない限り、抗体は全て1μg/mlとし、総量100μlで用いる。細胞を一度PBSで洗浄し、PBSに再縣濁してからフローサイトメーターによってデータを得る。データをCellquest Software (BD biosciences)により解析する。
【０１１４】
APC分析にあたって、雌性DO11.10トランスジェニックマウスを安楽死させる。マウスから脾臓を単離し、前述の通りACK溶解緩衝液で赤血球を溶解する。細胞をDMEM培地に再縣濁して、総量100μl/ウェルで96ウェルプレートに指定濃度(図面参照)にて3反復でプレーティングする。単離したDCはDMEM培地で一度洗浄し、インキュベーターあるいはウォーターバス内で37℃にて1時間、1μM OVA323-334ペプチドで刺激する。1時間後、細胞を完全DMEM培地で二度洗浄する。その後細胞を、既にプレーティングしたDC11.10脾臓細胞に加え、総量100μl、濃度0.25および106細胞/ウェルでプレーティングする。96ウェルプレートをインキュベーターで37℃、5% CO2の環境で培養する。培養を開始して3日目に、1マイクロキュリーの3H-チミジンを各ウェル(25μl/ウェル)に添加する。3H-チミジンの添加16時間後、プレートから標準セルハーベスターにて細胞を回収し、回収量をシンチレーションカウンターにより計測する。データを分析し、エクセルソフト(Microsoft Corporation, Seattle, WA)によりグラフを描く。
【０１１５】
C. 試験結果
前述の通り、GM-CSF単独またはGM-CSF + IL-15を用いて培養したDCは、抗原特異的DO11.10T細胞の効率的な増殖を誘発した。これとは対照的に、GM-CSF + IL-21を用いて培養したDCは、DC11.10T細胞の効率的な増殖を誘発することができなかった。このデータと一致して、flt3L単独を用いて培養したDCでは効率的な増殖が見られたのに対し、flt3L + IL-21を用いて培養したDCもDO11.10細胞の効率的増殖を誘発することができなかった。GM-CSF + IL-21で培養した樹状細胞は、GM-CSF単独で培養したDCに比し、MHCクラスII分子をより低レベルで、MHCクラスI分子はより高レベルで発現したが、このことはIL-21がDC媒介性のT細胞機能を阻害するメカニズムとなっていることを示唆している。
【０１１６】
実施例2
IL-21は遅延型過敏症(DTH)を抗原投与の段階で抑制するが、感作の段階では抑制しない
A. 要約
DTH反応はCD4+T細胞により誘導され、T細胞、好中球、マクロファージにより媒介される典型的な免疫反応である。DTH反応は、CD4+T細胞が媒介する反応について一つの有用な指標となる。アジュバントとしてRIBIまたはCFAのどちらかとともに、マウスにニワトリオボアルブミンタンパク質(OVA)を皮下投与し免疫化する。この段階を感作段階と呼ぶ(0日目〜6日目)。7日後、耳測定を行う。続いてマウスの左耳にPBS(対照群)、あるいは右耳にOVAを注射する。この段階を抗原投与段階と呼ぶ(7日目〜8日目)。OVAに対して生じた免疫反応により耳に炎症が起こり、OVA投与の24時間後に耳厚が増大したが、PBSを投与した耳では炎症が起こらなかった。これはカリパスにより測定する。前述した通り、DTH試験を行う。マウス群に対して0日目〜6日目(感作段階)から、または7日目〜8日目(抗原投与段階)からPBSかIL-21を1日1回腹腔内注入する。PBSを投与したマウスに対して、0日目〜6日目からIL-21を投与したマウスには、耳厚の増大にみられる通り、正常な免疫反応が認められる。これとは対照的に、7日目〜8日目からIL-21を投与したマウスには、OVAを投与して24時間後に耳厚の減少が認められたが、PBSを投与した場合の耳厚は減少しなかった。
【０１１７】
B. 試験計画
C57BL/6マウス(n=8/群)に対し、RIBIアジュバント(Corixa, Seattle, WA)に乳化させたニワトリオボアルブミン(OVA) 100μg (総量200μl)を背部に投与し免疫化する。オボアルブミン0.5 mg/mlをRIBIバイアルに添加し、2分間十分に撹拌し、マウスに注入使用する乳剤を作製する。免疫化の7日後、マウスの左耳にPBS 10μl(対照群)を、また、右耳にPBS中OVA10μg (10μl)を注射する。全マウスの耳厚を測定してから耳に注射する(0時点測定)。耳厚は、抗原投与24時間後に測定する。耳厚については0時点測定と24時間時点測定の相違を算出するが、これは耳の炎症を反映する。マウス群には0日目〜6日目(感作段階)から、または7日目〜8日目(抗原投与段階)からPBSかIL-21の様々な濃度(図に示す通り)を腹腔内注入する。7日目、8日目の注入投与は、耳厚測定0時点と24時点の2時間前に行う。24時間終了時に耳厚を測定し、耳を切断して組織分析用にホルマリンに浸漬する。
【０１１８】
C. 試験結果と結論
抗原投与後24時間で、対照群マウスと、0日目〜6日目からIL-21を投与したマウスには、耳厚の著しい増大が認められた。これらとは対照的に、7日目〜8日目にIL-21を投与したマウスには対照群にみられた肥厚より少なくとも50％少ない増大を認めた。この相違は統計学的に有意であった(p=0.0164)。これはIL-21が抗原投与段階でT細胞反応とDTHに重要な役割を果たしていることを示唆している。追跡試験で、少量のIL-21 (5μg/マウス)についてはDTHに著しい効果はなかったが、用量が25μg〜200μg/マウスでは耳厚ひいてはDTHについて統計的に有意な阻害効果があった。これらのデータから、IL-21の作用は用量依存性であり、IL-21には進行中の免疫反応に対する阻害能があることが明らかである。
【０１１９】
実施例3
IL-21は多発性硬化症のマウスモデルで疾患の発症を遅延する
A. 要約
IL-21が多発性硬化症に何らかの作用を及ぼすかどうか、また実験的自己免疫脳脊髄炎(EAE)に対してIL-21に阻害能があるかどうかを調べるため、マウスMSモデルを用いて試験を行った。十分定義されているC57BL/6マウスのミエリン希突起膠細胞糖タンパク(MOG)35-55ペプチド免疫化モデルを用いた。本試験は、DCを介する抗原提示(前述参照)阻害するか、CD8 T細胞応答を促進するかのいずれかによってEAEにおいてIL-21が疾患スコアを遅延させるおよび/または阻害することを決定するために行った。本モデルにおいては効率的なCD8 T細胞応答の欠如がEAEを増悪させる(Malipiero et al., Eur. J. Immunol., 27:3151-3160, 1997)。IL-21が用量依存的にEAEモデルにおいて疾患の発症を遅延させることは、IL-21の使用がMSにおいて有益であることを示唆している。
【０１２０】
B. 試験計画
実験的自己免疫性脳炎(EAE)はMSのマウスモデルである。その一つのモデルでは、RIBIアジュバント中で乳化したMOGペプチド(MOG35-55)100μgで、C57BL/6マウスを免疫する。PBSに溶解したMOG35-55の0.5 mg/ml調製物2ミリリットルをRIBIバイアルに加え、十分に撹拌して溶液を乳化する。マウスの背中の毛を剃り、MOG/RIBI 100μgをマウスの背中に皮下注射する。免疫化2日前および免疫化後毎日、マウスの体重を量る。次いで、マウスに百日咳毒素(PT)200μl、終濃度200 ng/マウスを2日目に静脈注射する。臨床スコアを目的にマウスを毎日モニターする。0日目から20日目までマウスの群にPBS 200μl、100μg BSA、10μgまたは100μg IL-21を容量200μlで腹腔内注射する。マウスの体重、臨床スコアおよび罹患率を評価し解析用にプロットする。
【０１２１】
C. 結果と結論
0日目から20日目までのIL-21の投与によって、このモデルで疾患の発症が用量依存的に遅延した。100μg IL-21の用量では10μg用量よりも反応がより遅延したことから、IL-21が自己免疫を阻害できるという証拠が得られた。
【０１２２】
実施例4
EAEにおけるIL-21培養DC
A. 要約
実施例1に明記されているように、IL-21の存在下で産生された樹状細胞はインビトロおよびインビボで不十分な抗原提示細胞であることから、IL-21はDCの寛容誘導能を促進できることが示唆される。本発明者らはこれらのIL-21 DCが上記のMOG35-55モデルにおいてEAEを阻害できるかどうかを調べようと考えた。GM-CSF単独またはGM-CSF + IL-21を用いて培養したDCにMOG35-55ペプチドをパルスし、これをC57BL/6マウスに皮下注射する。臨床スコアおよび体重減をモニターして、IL-21 DCの効果を対照DCと比較して調べる。発症の遅延または臨床スコアの減少によって、対照DCと比べたIL-21 DCの寛容誘導能が示唆される。
【０１２３】
B. 試験計画
およそ8〜10週齢の雌性C57BL/6マウスを安楽死させる。これらのマウスから大腿骨を単離し、乳鉢と乳棒を用いて粉砕し、骨髄細胞を抽出する。ACK溶解緩衝液(0.15 M NH4Cl、1 mM KHCO3、0.1 mM EDTA)で2分間細胞をインキュベートして赤血球を溶解し、RPMI-10培地(10% FBSを含むRPMI)で中和する。細胞を一度RPMI-10培地で洗浄し、24ウェルプレートにて完全DMEM培地中、示したサイトカインを添加して総量3 ml/ウェルとし、細胞200万個/mlで培養する。細胞培養に用いたのは、20 ng/ml組換えマウスGM-CSF (rmGM-CSF, R & D systems)またはrmGM-CSF + 30 ng/ml組換えマウスIL-15 (rmIL-15, R & D systems)またはrmGM-CSF + 30 ng/ml組換えマウスIL-21である。細胞には新鮮培地とサイトカインを4日ごとに再補給する。培養開始から10日目に細胞を回収し、これに1μM MOG35-55ペプチドを37℃で1時間パルスする。細胞をPBSで2度洗浄し、PBS中に再懸濁し、C57BL/6マウスの足蹠中に皮下注射する(細胞1×106個/マウス)。免疫化の2日前および免疫化後の毎日、マウスの体重を量る。次いで、マウスに百日咳毒素(PT) 200μl、終濃度200 ng/マウスを2日目に静脈注射する。臨床スコアを目的にマウスを毎日モニターする。マウスの体重、臨床スコアおよび罹患率を評価し解析用にプロットする。
【０１２４】
C. 結果と結論
疾患の発症を遅延させるおよび/または罹患率もしくは臨床的重症度を低下させるIL-21 DCの能力から、IL21 DCが寛容誘導能を誘発し自己免疫疾患を阻害することを示すことができる。
【０１２５】
実施例5
DSS大腸炎におけるIL-21
A. 要約
DSS大腸炎はヒトIBDに対する多くのマウスモデルの一つである。マウスに硫酸デキストランナトリウム(DSS)を経口投与することで、5〜8日間にわたって体重減および下痢が起こる。7日後にDSSを除去することで、体重減のゆっくりとした回復および大腸の再上皮化が起こる。DSS処理と同時にIL-21をマウスに投与し、0日目〜13日目まで体重減および疾患活動係数(DAI)スコアに対するIL-21の効果を追跡する。体重減およびDAIスコアの抑制によって、IL-21が大腸炎を阻害することが示唆される。
【０１２６】
B. 試験計画
0日目〜7日目までC57BL/6マウスの群(n=6/群)に2%または3% DSS水を与え、続けて8日目〜13日目まで水を与える。IL-21を0日目〜8日目まで10μg〜100μg/マウスに及ぶ用量で腹腔内投与する。DSS投与の経過中に、マウスを体重減およびDAIスコアについてモニターする。DAIスコアには3つのパラメータ、つまり糞便一貫性スコア、糞便中の潜血スコアおよび殺処理時の大腸の組織学的スコアの合計が含まれる。マウスを8日目および13日目に殺処理する。大腸の長さおよび組織学的スコアを評価する。
【０１２７】
C. 結果と結論
IL-21の体重減の阻害能および/またはDAIスコアはIL-21がこのモデルにおいて大腸炎を阻害する能力を反映することから、IL-21がヒトIBDの治療に有用であることが示唆される。
【０１２８】
実施例6
TNBS大腸炎におけるIL-21
A. 要約
TNBS大腸炎はヒトIBDに対する多くのマウスモデルの一つである。マウスに2-4-6トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)を直腸投与することで、10〜14日間にわたって下痢および腸炎が起こる。TNBS処理と同時にIL-21をマウスに投与し、腸炎に対するIL-21の効果を評価する。炎症の阻害によってIL-21が大腸炎を阻害することが示唆される。
【０１２９】
B. 試験計画
BALB/c系またはSJLマウスの群(n=6/群)を0日目および7日目に、1〜2% TNBSの30〜50%エタノールまたはエタノール単独(媒体対照)の直腸内浣腸で処置する。IL-21を0日目〜8日目まで10μg〜100μg/マウスに及ぶ用量で腹腔内投与する。マウスを10日目および13日目に殺処理する。大腸の長さおよび組織学的スコアを評価する。
【０１３０】
C. 結果と結論
IL-21の腸炎阻害能はIL-21がこのモデルにおいて大腸炎を阻害する能力を実証するものであることから、IL-21がヒトIBDの治療に有用であることが示唆される。
【０１３１】
実施例7
CD4+CD45RBhi (CD25-)大腸炎および乾癬におけるIL-21
A. 要約
CD4+CD45RbhiまたはCD4+CD25- T細胞を同系SCIDマウスに移入することで、マウスに大腸炎が起こる。調節性T細胞(CD4+CD25+またはCD4+CD45RBlo)の同時移入によって、この大腸炎が阻害される。CD4+CD25- T細胞をマウスに移入後、マウスにさらに黄色ブドウ球菌毒素(staphylococcal enterotoxin)B (SEB)を注射すれば、マウスは大腸炎だけでなく乾癬も発現する。細胞移入後の0日目〜21日目までIL-21を投与し、大腸炎および乾癬の症状をモニターする。乾癬スコアの抑制または大腸炎(組織像)によって、IL-21がこれらの自己免疫疾患を阻害できることが示唆される。
【０１３２】
B. 試験計画
脾臓および鼠径リンパ節をB10.D2マウスから単離する。単一の細胞懸濁液を形成させてカウントする。Miltenyiビーズシステムを用いて、CD25+細胞を正の選択により選別する。細胞を100分の1希釈のCD25-PE (BD Pharmingen)で染色し、15分間インキュベートする。過剰な抗体を洗い流し、細胞を抗PE-ビーズ10μl/細胞106個とともに20分間インキュベートする。細胞をPBSで洗浄し、LSカラム(Miltenyi Biotech)に通す。カラムを素通りする細胞(CD25-)をさらに分析するために保持する。CD4濃縮カクテル(Stem Cell technologies)をこれらのCD25-細胞に添加(100分の1希釈)し、15分間インキュベートする。細胞をPBSで洗浄する。10分の1希釈の抗ビオチン四量体を細胞に15分間添加し、続けて磁性コロイド(60μl/細胞106個)を15分間添加する(全てStem Cell Technologiesより)。細胞を負の選択カラム(0.5", Stem cell Technologies)に通す。素通りする細胞がCD4+CD25-細胞である。フローサイトメトリーを用いて純度を分析する。細胞0.4×106個を総量200μlとして未処置CB-17 SCIDマウスに静脈注射する。翌日(d1)、マウスに10μg SEBを腹腔内注射する。乾癬および大腸炎の症状を2〜5週まで追跡する。1日目から20日目までマウスの群にPBS、100μg BSAまたは10〜100μg IL-21を腹腔内注射する。
【０１３３】
C. 結果と結論
IL-21処置マウスにおける乾癬および大腸炎症状の抑制によって、IL-21がこのモデルにおいて乾癬および大腸炎の自己免疫症状を阻害できることが示唆される。
【０１３４】
実施例8
接触過敏症におけるIL-21
A. 要約
ジニトロフルオロベンゼン(DNFB)およびオキサゾロンを含むさまざまな接触アレルゲンを用いて、接触過敏症をマウスに誘発させることができる。マウスをアセトンおよびオリーブ油の媒体に入れたアレルゲンで局所的に感作し、その後、オリーブ油単独に入れたアレルゲンでその耳にアレルギー誘発させる。耳の厚さの変化はアレルゲンに対する免疫反応の指標である。IL-21を感作段階(d0〜5)または抗原投与段階(d5〜6)の間のいずれかに投与する。IL-21による耳の厚さの抑制によって、接触過敏症を阻害するうえでのIL-21の役割が示唆される。
【０１３５】
B. 試験計画
d0に、C57Bl/6マウスの背中に0.5% DNFBのアセトン:オリーブ油(4:1)またはアセトン:オリーブ油のみを塗布する。d5に、マウスの耳の厚さをキャリパーにより測定し、溶液25μlを耳に滴下することによってオリーブ油単独(対照)または0.25% DNFBのオリーブ油でマウスの耳にアレルギーを誘発させる。耳の厚さの変化をd6に測定し、炎症をd5とd6との間の耳の厚さの相違として算出する。0日目〜5日目または5日目〜6日目のいずれかに、マウスの群にPBSまたは10〜100μg IL-21を腹腔内注射する。
【０１３６】
C. 結果と結論
IL-21による耳の厚さの抑制によって、IL-21が接触過敏症を阻害するうえで有用となりうることが実証される。
【０１３７】
実施例9
全身性エリテマトーデスを治療するためのIL-21の使用
A. 要約
ループスのマウスモデルは雌性NZBWF1マウスにおける自然発症モデルである。このマウスは、約20〜25週齢から始まるタンパク尿、続けて抗dsDNA抗体を発現し、この両者は自己免疫の徴候である。IL-21を20週目から始めて5週間、1週につき3回投与する。タンパク尿および抗dsDNA抗体をさまざまな時点でマウスの尿および血液から検出する。IL-21処置マウスでのタンパク尿および抗dsDNA抗体の減少はマウスループスモデルにおけるIL-21の阻害効果を示す(Gross et.al., Nature 404:995-999, 2000)。
【０１３８】
B. 試験計画
15週目から始めて(1週間に1回)、雌性NZBWF1マウス(n=15/群)を尿および血液中のそれぞれタンパク尿および抗dsDNA抗体について試験する。20週目から始めて5週間、マウスの群を1週につき3度PBS単独または10〜100μg IL-21で処置する。1週間に1回、標準的アッセイによりタンパク尿および血液中抗dsDNA抗体の力価を測定する。
【０１３９】
C. 結果と結論:
IL-21処置マウスにおけるタンパク尿および抗dsDNA抗体の減少は、IL-21がマウスループスモデルにおいて阻害効果を有することを示唆するものである。
【０１４０】
本発明の特定の態様を説明のために本明細書に記述してきたが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなくさまざまな変更をなすことができることが、前述から理解されよう。したがって、本発明は添付の特許請求の範囲による以外には、限定されることはない。
【配列表】
2007506789000001.app
【国際調査報告】
2007506789.tif 000009
2007506789.tif 000010
2007506789.tif 000011
2007506789.tif 000012