(57)【要約】【課題】デオキシ糖及びグリコシドをを含むバイオマスから誘導された溶液から該デオキシ糖及びグリコシドを分離し及び回収する方法の提供。【解決手段】本発明は、パルプ化プロセスから得られたパルプ廃液のようなバイオマスから誘導された溶液からのフコースのようなデオキシ糖の回収に関する。本発明はまた、バイオマスからのグリコシドの回収に関する。本発明は、溶離剤として水を使用した特定のカラム充填材及びその組み合わせによるクロマトグラフィー分画の使用に基づく。クロマトグラフィー分画から得られたデオキシ糖生成物は、結晶化によりさらに精製され得る。本発明はまた、新規結晶Ｌ−フコース生成物及びフコースの結晶化のための新規方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種以上のデオキシ糖及び所望によりグリコシドを含むバイオマスから誘導された溶液から１種以上のデオキシ糖及び所望によりグリコシドを分離し及び回収する方法であって、
前記溶液を、溶離剤として水を使用して、１つ以上のクロマトグラフィー分画（１）段階、（２）段階及び（３）段階：
（１）強酸性カチオン交換樹脂から選択されるカラム充填材を使用した少なくとも１つのクロマトグラフィー分画、
（２）弱酸性カチオン交換樹脂及び弱塩基性アニオン交換樹脂から選択されるカラム充填材を使用した少なくとも１つのクロマトグラフィー分画、
（３）強塩基性アニオン交換樹脂から選択されるカラム充填材を使用した少なくとも１つのクロマトグラフィー分画、
にかけ、続いて分画（１）及び／又は（２）及び／又は（３）から少なくとも１種のデオキシ糖及び所望によりグリコシドに富む１つ以上の画分を回収する、
ことからなる方法。
【請求項２】
前記デオキシ糖はフコース及びラムノースから選択され、及び前記グリコシドはメチル−α−Ｄ−キシロピラノシドから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶液を、（１）段階、（２）段階及び／又は（３）段階の２つ以上にかけることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記溶液を、（１）段階、（２）段階及び／又は（３）段階から選択される段階に２回以上かけることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記方法は、（１）段階からラムノースに富む画分を回収することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記方法は、（２）段階からメチル−α−Ｄ−キシロピラノシドに富む画分を回収することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記方法は、（３）段階からフコースに富む画分を回収することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記方法は、（１）段階、（２）段階又は（３）段階の１つにおいてラムノース、フコース又はメチル−α−Ｄ−キシロピラノシドに富む画分を回収することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記方法は、前記バイオマスから誘導された溶液を、強塩基性アニオン交換樹脂から選択されるカラム充填材を使用したクロマトグラフィー分画にかけ、そしてフコースに富む画分を回収することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法は、以下の逐次段階：
（１）前記バイオマスから誘導された溶液を、強酸性カチオン交換樹脂から選択されるカラム充填材を使用したクロマトグラフィー分画にかけ、そしてラムノースに富む画分及び／又はフコースから選択されるデオキシ糖及びメチル−α−Ｄ−キシロピラノシドから選択されるグリコシドを含む１つ以上の画分を回収する段階、及び
（２）前記メチル−α−Ｄ−キシロピラノシド及びフコースを含む１つ以上の画分を、弱酸性カチオン交換樹脂から選択されるカラム充填材を使用したクロマトグラフィー分画にかけ、そしてメチル−α−Ｄ−キシロピラノシドに富む画分及びフコースを含む画分を
回収する段階、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法は、前記フコースを含む画分を、強塩基性アニオン交換樹脂から選択されるカラム充填材を使用したクロマトグラフィー分画にかけ、そしてフコースに富む画分を回収することを含む（３）段階をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記強酸性カチオン交換樹脂は、Ｎａ+形態にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記強酸性カチオン交換樹脂は、Ｚｎ2+形態にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記弱酸性カチオン交換樹脂は、Ｎａ+形態にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記強塩基性アニオン交換樹脂は、ＨＳＯ3-形態にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記クロマトグラフィー分画は、ＳＭＢ分離を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記バイオマスから誘導された溶液は、植物ベースのバイオマスから誘導されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記バイオマスから誘導された溶液は、１種以上のデオキシ糖及びグリコシドを含むバイオマス加水分解物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記１種以上のデオキシ糖及びグリコシドを含むバイオマス加水分解物は、パルプ化プロセスから得られたパルプ廃液である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記パルプ廃液は、堅木のパルプ化から得られる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記１種以上のデオキシ糖及びグリコシドを含むバイオマス加水分解物は、甜菜から誘導された溶液及びサトウキビから誘導された溶液から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法は、前記少なくとも１種のデオキシ糖及び所望によりグリコシドに富む１種以上の画分を結晶化にかけることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記結晶化は、蒸発及び冷却結晶化を用いて行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記１種以上のデオキシ糖は、フコースから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
フコースは、水、アルコール、好ましくはエタノール、及び水とアルコールとの混合物から選択される溶媒、好ましくは水とアルコールとの混合物から結晶化される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記結晶化の溶媒は、水である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記フコースの結晶化は、ＤＳとして４５％を超えるフコースを含む溶液から行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記フコースの結晶化は、ＤＳとして８０％を超えるフコースを含む溶液から行われる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記フコースの結晶化は、ＤＳとして、２０％未満のラムノース、１５％未満のキシロース、３％未満のアラビノース及び１％未満のガラクトースを含む溶液から行われる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記フコースの結晶化は、ＤＳとして、４５％を超えるフコース、２０％未満のラムノース、１５％未満のキシロース、３％未満のアラビノース及び１％未満のガラクトースを含む溶液から行われる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
フコースの結晶化が、４５％を超えるフコース、２０％未満のラムノース、１５％未満のキシロース、３％未満のアラビノース及び１％未満のガラクトースを含むバイオマスから誘導された溶液から行われる、フコースの結晶化のための方法。
【請求項３２】
前記結晶化は、０ないし１００℃の範囲の温度にて行われる、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
生じた結晶塊の粘度は、５ないし５００Ｐａｓの範囲にある、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記結晶化は、溶媒として水とエタノールとの混合物を使用して行われる、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記結晶化は、０．５ないし１０日間の滞留時間により行われる、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記フコースの結晶化は、ＤＳとして、８０％を超えるフコース、２０％未満のラムノース、１５％未満のキシロース、３％未満のアラビノース及び１％未満のガラクトースを含むバイオマスから誘導された溶液から行われる、請求項３１に記載のフコースの結晶化のための方法。
【請求項３７】
前記フコースの結晶化は、０ないし１００℃の範囲の温度において行われる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記フコースの結晶化は、６ないし８０時間の滞留時間により行われる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記フコースの結晶化は、分別結晶化により行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項４０】
前記方法は、ＤＳとして６０％を超える純度を有する結晶フコースを与える、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記結晶フコースの純度は、ＤＳとして９０％を超える、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記結晶フコースの純度は、ＤＳとして９９％を超える、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記方法は、前記結晶化から得られた結晶を洗浄することを含む、請求項２２又は３１に記載の方法。
【請求項４４】
洗浄剤は、水、有機溶媒又はそれらの混合物から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記フコースは、Ｌ−フコースである、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
前記ラムノースは、Ｌ−ラムノースである、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
１４４℃よりも高い融点及びＤＳとして９９％を超える純度を有する、バイオマスをベースとした結晶Ｌ−フコース。
【請求項４８】
１４５℃よりも高い融点及びＤＳとして９９．５％を超える純度を有する、請求項４７に記載のバイオマスをベースとした結晶Ｌ−フコース。
【請求項４９】
植物ベースのバイオマスをベースとした、請求項４７に記載の結晶Ｌ−フコース。
【請求項５０】
請求項２４及び３１に従う方法により得られ得る、請求項４７に記載の結晶Ｌ−フコース。
【請求項５１】
水からの結晶化により得られ得、続いて洗浄される、請求項５０に記載の結晶Ｌ−フコース。
【請求項５２】
栄養補助食品中の成分としての、請求項４７ないし５１のうちいずれか１項に記載の結晶Ｌ−フコースの使用。
【請求項５３】
医薬品中の成分としての、請求項４７ないし５１のうちいずれか１項に記載の結晶Ｌ−フコースの使用。
【請求項５４】
化粧品中の成分としての、請求項４７ないし５１のうちいずれか１項に記載の結晶Ｌ−フコースの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、糖分離技術の分野に関する。とりわけ、本発明は、デオキシ糖及びグリコシドをを含むバイオマスから誘導される溶液から該デオキシ糖及びグリコシドを分離し及び回収する方法に関する。とりわけ、本発明は、フコース及び特にＬ−フコースの分離に関する。本発明はまた、新規な結晶Ｌ−フコース生成物及びフコースの結晶化のための方法に関する。さらに、本発明は、こうして得られた結晶Ｌ−フコースの栄養補助食品としての並びに薬物的及び化粧品的用途のための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
デオキシ糖は、木材資源、海藻、並びに甜菜及びサトウキビのような植物ベースの材料中に少量見られる、いわゆる希少な糖の例である。特定のデオキシ糖は、例えば甘味料用途のために並びに医薬品及び化粧品用途のために有益であることが判っている。
グリコシド、とりわけアルキルグリコシドは、上述のデオキシ糖と同様の植物ベースの材料中に頻繁に見られる糖誘導体である。
デオキシ糖は、Ｌ−体で及びＤ−体で存在することが既知である。例えば、フコースは、Ｌ−フコース及びＤ−フコースとして存在している。
特に興味あるデオキシ糖の一例は、フコース、またの名を６−デオキシガラクトースである。フコースは、Ｄ−体及びＬ−体の両方で、多くの異なった原料からの広く種々の天然物中に見られる。Ｌ−フコースに対する興味が、腫瘍、炎症状態及びヒト免疫系に関連した病気のような種々の病気状態を治療する医療分野におけるその可能性のため、最近増加している。Ｌ−フコースはまた、化粧品分野における、例えば皮膚保湿剤としての用途を有する。
【０００３】
非特許文献１に従うと、結晶Ｌ−フコースは、１４０℃の融点及び−７５．６°の旋光度を有する。Ｌ−フコースは例えば、幾つかのヒト母乳オリゴ糖中に生じる。
植物材料中において、フコースは典型的に、多糖類鎖の末端に又は該多糖類鎖中のどちらかにおいてＬ−フコピラノシル単位を有するしばしば非常に枝分れした構造となっている植物多糖類に結合している。幾つかの場合、メチル化されたフコピラノシル単位が植物多糖類中に生じる。
Ｌ−フコース又はメチル化されたＬ−フコピラノシル単位は、例えば、ジャガイモ、キャッサバ塊茎及びキウイフルーツの細胞壁中に、大豆の種子の多糖類中に、及びシカクマメ類及びセイヨウカブラナ中に生じる。
細胞間粘液中に見られる海藻多糖類は複雑な構造を形成し、及びフコイダンと呼ばれる硫酸化Ｌ−フコースポリマーからしばしば成る。フコイダンの抽出のために特に重要な海藻は、Ｅｃｋｌｏｎｉａ  ｋｕｒｏｍｅ，Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ａｎｇｕｓｔａｔａ  ｖａｒ  ｌｏｎｇｉｓｓｉｍａ，Ｆｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ，Ｋｊｅｌｌｍａｎｉｅｌｌａ  ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ，Ｐｅｌｖｅｔｉａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌａｔａ  及び  Ｆｕｃｕｓ  ｓｅｒｒａｔｕｓ  Ｌ  である。
さらには、種々のバクテリア、真菌類及びミクロ藻類からの細胞外多糖類がＬ−フコースを含む。
Ｌ−フコースは、種々の抽出法により藻類のような天然原料から得られ得る。これらのフコースの回収のために使用される天然由来の原料は、典型的に多成分混合物である。十分な純度を有するフコースの分離は、従来では問題を有していた。
【０００４】
Ｌ−フコースは、Ｐｈａｅｏｐｈｙｃｅａｅ藻類中に生じたフコイダンの加水分解により得られている。ブラック（Ｂｌａｃｋ），Ｗ．Ａ．Ｐ．他は、非特許文献２中において
、最適化されたフコイダン抽出法を開示している。最高の収率は、７０℃の温度にて１時間、塩酸を用いた抽出（ｐＨ２．０ないし２．５）により得られた。１単位の藻類と１０単位の液体の比（ｗ／ｖ）が最適であると示された。この手順は、およそ５０％の総フコースを得た。３つのその後に行われた酸抽出で８０％を超えるＬ−フコースを得た。粗フコイダンは、中和により酸抽出液から単離され、そして蒸発されて乾燥される。
特許文献１、ケルコ社（Ｋｅｌｃｏ  Ｃｏ．）（１９６６年３月１５日発行）は、フコイダン、濃塩酸及びメタノールの混合物を、フコイダンが実質的に分解されそして脱硫酸化されるまで加熱する段階、そしてその後の、前記混合物からメチルα−Ｌ−フコシドからなる分解生成物を及び続く加水分解の後にＬ−フコースを回収する段階からなる、α−Ｌ−フコシド及びＬ−フコースの結晶を調製する方法を開示している。
上記引用文献の実施例ＶＩＩＩは、フコイダン分解生成物を含む前記混合物からα−Ｌ−フコシド（メチルα−Ｌ−フコシド）を除去し、こうして得られた混合物を１Ｎ硫酸を用いて処理し、Ｂａ（ＯＨ）2を用いて硫酸を沈澱させ、カチオン交換樹脂（Ｈ+形態のアンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）  ＩＲ−１２０）及び活性炭素を用いて該溶液を処理し、真空下に該無色の溶液をシロップ状まで濃縮し、及び熱メタノールを用いて該シロップを希釈することにより、結晶Ｌ−フコースを得る方法を開示している。前記希釈溶液にエーテルが添加され、そしてＬ−フコースを用いてシーディングした後、該混合物は８ないし１２日間冷凍し続けられた。１３６ないし１３８℃の融点を有する結晶Ｌ−フコースが得られた。実施例ＩＸに従うと、同様の手順が１３６ないし１３９℃の融点を有する結晶Ｌ−フコースを与えた。
【０００５】
日本国特許出願公開の特許文献２（竹村，Ｍ他．，Ｔｏｗａ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄ．）は、コルダリアセアエ（Ｃｈｏｒｄａｒｉａｃｅａｅ）又はスペルマトクナセアエ（Ｓｐｅｒｍａｔｏｃｈｎａｃｅａｅ）の科に属する海藻からのＬ−フコースの直接抽出を記載している。海藻は、水中で分散され、そして濃硫酸を用いて処理された。得られた加水分解物は冷却され、そして海藻残留物は濾過により除去された。濾過物のｐＨは５に調節され、濾過物は木炭を用いて処理されそして濾過された。Ｌ−フコース以外の糖類を消化するために酵母が濾過物に添加された。混合物は、木炭を用いて処理されそして濾過された。濾過物は、カチオン及びアニオン交換樹脂を用いた脱イオン処理にかけられ、そして濃縮された。濃縮された糖溶液がエタノールと混合され、そして結晶化された。この方法において、９８．７％の純度を有するＬ−フコースが得られた（分析方法に言及することなしに）。Ｌ−フコース生成物に対する溶融点データは与えられなかった。
【０００６】
Ｆ．Ｍ．Ｒｏｍｂｏｕｔｓ及びＪ．Ｆ．Ｔｈｉｂａｕｌｔは、非特許文献３において、甜菜パルプのエタノール不溶性残留物からのペクチンの単離を記載している。単離されたペクチンは、ＤＥＡＥ−セルロース上のクロマトグラフィーにより、又はＣｕＳＯ4を用
いた沈澱により精製された。ペクチンは、比較的高い含量の中性糖を有していた。各々のペクチン中の主とした中性糖はアラビノース及びガラクトースであり；他の存在する糖はラムノース、フコース、キシロース、マンノース及びグルコースであった。フコースは糖／ペクチン混合物から分離されなかった。
【０００７】
Ｖ．Ａ．Ｄｅｒｅｖｉｔｓｋａｙａ他（非特許文献４）は、アニオン交換クロマトグラフィーによるオリゴ糖の複雑な混合物の分離を記載している。その開示に従うと、２−アミノ−２−デオキシグルシトール、グルコサミン、ガラクトース及びフコースが、アニオン交換クロマトグラフィーにより、０．２Ｍボレートにより緩衝されたオリゴ糖混合物からうまく分離された。
【０００８】
Ｍ．Ｈ．Ｓｉｍａｔｕｐａｎｇは、非特許文献５において、幾つかの中性単糖類及びウロン酸のイオン交換クロマトグラフィーを記載している。該引用文献は、ボレート緩衝液系を利用した、ウロン酸及びフコースを含む単糖類及びマンヌロン酸及びグルロン酸の複
雑な混合物のイオン交換クロマトグラフィーを開示している。前記クロマトグラフィー系は、ＨＡ−Ｘ４又はＢＡ−Ｘ４（ボレート形態）アニオン交換体を含むスチール製カラム及び種々のｐＨ値における種々のボレート濃度の緩衝液系を使用した。分離プロファイルは、デオキシ糖と他の単糖類との間でオーバーラップし、それにより分離結果が満足いくものではないことを示している。
【０００９】
Ｓ．Ｈｏｎｄａ他（非特許文献６）は、溶離剤としてアセトニトリルを使用した、ナトリウム及びカルシウムの形態にあるカチオン交換樹脂を用いた糖（アルドース）アノマーの分離を記載している。該引用文献は、各々の糖の互いからのアノマーの分離を開示するのみであり、他の糖からの１種の糖の分離を開示していない。デオキシ糖は他の糖と同時に溶離された。
【００１０】
ＭｃＧｕｉｒｅ他は、非特許文献７において、単糖類の高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィー溶離へのｐＨの影響を研究した。分離における溶離剤は水酸化ナトリウム溶液であった。結果は、フコースが他の単糖類から分離されたことを示している。しかしながら、他のデオキシ糖は言及されていない。
【００１１】
日本国特許出願公開の特許文献３は、クラドシフォン  オカムラナス  トキダ（Ｃｌａｄｏｓｉｐｈｏｎ  ｏｋａｍｕｒａｎｕｓ  Ｔｏｋｉｄａ）又はフコイダンを含む抽出物から調製されたフコイダンからＬ−フコースを製造するための方法を開示している。該方法は、例えば水及び／又は酸を用いた処理、中和、透析及び電気透析処理及び溶離剤としてアルカリを使用したイオン交換処理からなる多段階方法である。Ｌ−フコースは、最終的にアルコールから結晶化される。
【００１２】
Ｄ．Ｂａｌａｇｈｏｖａ他は、非特許文献８において、前加水分解過程におけるカエデの木の糖部分の変化を研究した。カエデの木に見られる主たる単糖類は、Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−フコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−マンノース及びＤ−ガラクトースであった。Ｌ−フコースは糖混合物から分離されなかった。
【００１３】
Ｌ−フコースはまた、Ｌ−アラビノースから（非特許文献９）、Ｄ−グルコースから（非特許文献１０）、メチル−Ｌ−ラムノースから（非特許文献１１）、Ｄ−マンノースから（非特許文献１２）及びＤ−ガラクトースから（非特許文献１３）、化学合成により得られ得る。
【００１４】
酵素的及び微生物的合成がまた、Ｌ−フコースの製造のために使用されてきた。
Ｃ．Ｗｏｎｇ他は、非特許文献１６において、Ｌ−フコース及びその類似体の酵素的合成を開示している。Ｌ−フコースは、Ｌ−フクロース−１−ホスフェートアルドラーゼにより触媒されるジヒドロキシアセトンホスフェート（ＤＨＡＰ）及びＤＬ−ラクトアルデヒドからの酵素的合成、続く酸ホスファターゼ及びＬ−フコースイソメラーゼとの反応により生成される。Ｌ−フコース生成物は、ダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）  ５０Ｗ−Ｘ８（Ｂａ2+形態）クロマトグラフィーにより、所望によりシリカゲルによる分離と組み合わせて単離された。
【００１５】
特許文献４，ヘキストアーゲー（Ｈｏｅｃｓｔ  ＡＧ）（１９８４年３月１４日発行）は、１０％を超えるフコース及び／又はラムノースを含む細胞外の多糖類を生成する、アルカリジーンズ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プソイドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）又はエンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）を使用した発酵によるフコース及びラムノースから選択されるデオキシ糖の生成のための方法を開示している。フコース及び／又はラムノースは、クロマトグラフィー、イオン交換又は吸着（例えばゼオライトを用いた）により、或いは更なる発酵処理により
、発酵生成物の加水分解物から回収され得ると記載されている。欧州特許の実施例において、ラムノース及びフコースは、更なる発酵処理により回収されている。該引用文献は、デオキシ糖の分離又はフコース及びラムノースのクロマトグラフィーによる互いからの分離を開示していない。
【００１６】
特許文献５，呉羽化学工業株式会社（１９８８年９月２０日発行）は、アラビアガムから高い純度のラムノースを生成するための方法を開示している。該方法は、アラビアガムの加水分解により形成された単糖類を含む水性溶液を得るために鉱酸の水性溶液中でのアラビアガムの部分加水分解、中和及び極性有機溶媒を用いた処理をし、及びこうして得られた該水性溶液を強酸性カチオン交換クロマトグラフィーに、及びその後に活性炭素を使用した吸着及び分離の方法にかけることからなる。
【００１７】
特許文献６，キシロフィン  オイ（Ｘｙｒｏｆｉｎ  Ｏｙ）（２００２年４月４日発行）は、炭水化物の互いからのクロマトグラフィー分離のための弱酸性カチオン交換樹脂の使用を開示している。好ましくは、弱酸性カチオン交換樹脂は、デオキシ、メチル及び無水糖のような疎水性単糖類及び糖アルコールのより親水性の糖からの分離のために使用される。
【００１８】
特許文献７，キシロフィン  オイ（２００２年４月４日発行）は、弱酸性カチオン交換樹脂がクロマトグラフィー分離のために使用される少なくとも１段階からなる多段階方法により、ラムノース、アラビノース及びそれらの混合物を含む溶液から、該ラムノース、アラビノース及びそれらの混合物からなる群より選択される単糖類を回収するための方法を開示している。
【００１９】
グリコシドの回収は、例えば特許文献８，Ａ．Ｅ．スターレー  マニュファクチャリング  カンパニー（Ａ．Ｅ．Ｓｔａｌｅｙ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ），１９８２年５月１１日発行，において議論されている。この引用文献は、澱粉から得られた粗グリコシド混合物からのメチル−α−Ｄ−グルコピラノシドの回収を記載している。該引用文献の実施例においては、メチル−α−Ｄ−グルコピラノシドは、メタノールからの結晶化によりグリコシド混合物から回収されている。
【００２０】
Ｉ．Ａｕｇｅｓｔａｄ他は、非特許文献１７において、アノマーグリコシド、とりわけＬ−フコース、Ｄ−リボース及びＬ−ラムノースの結晶メチルフラノシドのクロマトグラフィー分離を、及び、非特許文献１８において、ガラクトース、アラビノース及びキシロースの新規結晶メチルフラノシドの分離を議論している。アノマー体のクロマトグラフィー分離は、溶離剤として有機溶媒を使用したセルロースカラムを用いて行われている。
【非特許文献１】メルク  インデックス（Ｍｅｒｋ  Ｉｎｄｅｘ），第１２版，１９９６
【非特許文献２】“Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｌｇａｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ．ＩＶ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−ｓｃａｌｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｃｏｉｄａｎ  ｆｒｏｍ  ｂｒｏｗｎ  ｍａｒｉｎｅ  ａｌｇａｅ”，Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．３：１２２−１２９（１９５２）
【特許文献１】米国特許第３，２４０，７７５号明細書
【特許文献２】特開昭６３−０２７４９６号公報
【非特許文献３】Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９８６，第１７７頁ないし第１８７頁
【非特許文献４】Ｄｏｋｌ．Ａｋａｄ．Ｎａｕｋ．ＳＳＳＲ（１９７５），２２３（５）１１３７−９
【非特許文献５】Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｅｒ．（１９７９），１７８（２），５８８−９１
【非特許文献６】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，２９１（１９８４）３１７−３２５
【非特許文献７】Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ，第４９巻，１１／１２番，１９９９年６月
【特許文献３】特開平１１−０３５５９１号公報（１９９９年２月９日発行）
【非特許文献８】Ｖｙｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｃｅｓｙ  Ｃｈｅｍ．Ｓｐｒａｃｏｖａｎｉ  Ｄｒｅｖａ（１９９６），１８７−１９２（出版者：テクニカ  ユニバージタ  ズボレン（Ｔｅｃｈｎｉｃｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｚｉｔａ  Ｚｖｏｌｅｎ），ズボレン，スロバキア）
【非特許文献９】Ｔａｎｉｍｕｒａ，Ａ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ，Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ．５５：１２３０６（１９６１）
【非特許文献１０】Ｃｈｉｂａ，Ｔ．＆Ｔｅｊｉｍａ，Ｓ．，Ａ  ｎｅｗ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  α−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２７：２８３８−２８４０（１９７９）
【非特許文献１１】Ｄｅｆａｙｅ，Ｊ．，他．，Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  Ｌ−（４−2Ｈ）ｆｕｃｏｓｅ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．１２６：１６５−１６９（１９８４）
【非特許文献１２】Ｇｅｓｓｏｎ，Ｊ−Ｐ他．，Ａ  ｓｈｏｒｔ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  ａｎａｌｏｇｓ  ｆｒｏｍ  Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３３：３６３７−３６４０（１９９２）
【非特許文献１３】Ｄｅｊｔｅｒ−Ｊｕｓｚｙｎｓｋｉ，Ｍ＆Ｆｌｏｗｅｒｓ，Ｈ−Ｍ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．２８：１４４−１４６（１９７３）
【非特許文献１４】Ｋｒｉｓｔｅｎ，Ｈ．，他．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｉｎｔｏ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ  ｉｎｔｏ  Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ，Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．７：２７７−２８１（１９８８）
【非特許文献１５】Ｓａｒｂａｊｎａ，Ｓ．他．，Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２７０：９３−９６（１９６５）
【非特許文献１６】Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６０：７３６０−７３６３（１９９５）
【特許文献４】欧州特許第１０２５３５号明細書
【特許文献５】米国特許第４，７７２，３４４号明細書
【特許文献６】国際公開第０２／２７０３８号パンフレット
【特許文献７】国際公開第０２／２７０３９号パンフレット
【特許文献８】米国特許第４３２９４４９号明細書
【非特許文献１７】Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ（１９５６），１０，９１１−１６
【非特許文献１８】Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ（１９５４），８，２５１−６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
既知の方法に関連した問題の１つは、それら方法は、所望のデオキシ糖を他の非常に類似した糖と一緒の混合物として提供するということであるか、又は、それら方法は、フコースのようなデオキシ糖を十分な純度では提供しないということである。褐藻類からの直接的な抽出はコスト高であり、及び量及び質の点で季節的な変化を受ける。一方、例えば他の糖からの化学合成を介してのＬ−フコースの生成はコスト高であり、及び低収率とな
る。さらには、９９％を超える純度を有する結晶フコース生成物を得るために、フコースの結晶化のための適する出発フコース溶液を調製することに問題がある。
さらに、デオキシ糖の互いからの回収は、その非常に類似した構造のため現在の技術においては問題を生じている。多くの分離方法において、デオキシ糖は、同様に挙動し、それゆえこれら非常に類似した糖の間では実質的な分離が起きない。むしろ、それらデオキシ糖はしばしば同一の画分中で混合物として回収される。
高純度を有するフコース及び他のデオキシ糖並びにグリコシドは、デオキシ糖及び例えばアルドース及びペントース糖を含むバイオマスから誘導される溶液から、新規なクロマトグラフィー分離法を用いて効率的に回収され得ることが今や見出された。とりわけ重大な不純物の含量が特定の限界値よりも低い範囲内にあるとき、１４１℃よりも高い、好ましくは１４５℃よりも高い融点を有する高純度のフコース結晶が、ＤＳとして４５％を超えるフコース含量を有する非純粋シロップから得られ得ることも見出された。フコースがアラビノース及びラムノースのような他の糖に対して非常に強い塩析効果を有することが判った。この理由のため、現在の技術においては高純度を有するフコース結晶を調製することが非常に困難である。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明の簡単な説明
本発明の目的は、フコースのようなデオキシ糖、並びにグリコシドを含むバイオマスから誘導される溶液から該フコースのようなデオキシ糖、並びにグリコシドを分離し及び回収する方法を提供することである。本発明のもう１つの目的は、デオキシ糖を互いから、及び他の単糖類から分離する方法を提供することである。本発明の他の目的は、デオキシ糖及び単糖類からグリコシドを分離する方法を提供することである。本発明の方法によると、既知の方法に関連した不利さが軽減され得る。本発明の目的は、独立請求項の記載事項により特徴付けられる方法により達成される。本発明の好ましい態様は、従属請求項に開示される。
本発明に従うと、上記目的はバイオマスから誘導される材料から、１種以上のデオキシ糖及び所望によりグリコシドを分離し及び回収する新規で多用途の方法を提供することにより達成される。本発明において有益なバイオマスから誘導される材料は、典型的に植物ベースのバイオマスから誘導される。それは例えば、ヘミセルロースからの、デオキシ糖及び例えばアルドース及びペントース糖及びグリコシド、とりわけアルキルグリコシドを含むヘミセルロース加水分解物である。例えばシラカバの木から誘導されるヘミセルロース加水分解物中において、フコース及びラムノースはＬ−形態で存在する。
本発明の方法は、クロマトグラフィー分離における唯一の溶離剤として水を使用して、強酸性カチオン交換樹脂、弱酸性カチオン交換樹脂、強塩基性アニオン交換樹脂及び弱塩基性アニオン交換樹脂から選択されるカラム充填材を用いた１種以上のクロマトグラフィー分画の使用をベースとする。驚くべきことに、溶離剤としての水の使用がデオキシ糖及びグリコシドの効率的な分離を与えることが判った。クロマトグラフィー分離後、所望のデオキシ糖又はグリコシドに富む画分は、高純度を有する所望のデオキシ糖又はグリコシドを得るためにさらに結晶化され得る。
本発明のクロマトグラフィー法によると、例えば１０ないし９０％、典型的に４０ないし８０％又はそれ以上の純度を有するフコース画分が得られ得る。クロマトグラフィー分離から得られたフコース画分は、結晶化によりさらに精製され得る。該結晶化は、９９％まで又は９９％を超える純度及び１４４℃以上の融点を有するフコース生成物を提供する。本発明の典型的な態様において、フコースの結晶化は、不純物として、ＤＳとして、２０％未満のラムノース、１５％未満のキシロース、３％未満のアラビノース及び１％未満のガラクトースを含む溶液から行われる。結晶フコースは典型的に、ＤＳとして、０．０１ないし０．１％の範囲の量でラムノース、アラビノース、ガラクトース及びマンノースを含む。
本発明の方法は、従って、フコースのような所望のデオキシ糖が例えば医薬品用途のた
めの十分な純度で得られ得るという利点を提供する。
【００２３】
本発明に関する定義
明細書並びに実施例及び請求項全体において、以下の定義が使用される：
“デオキシ糖”は、アルドース又はケトース中の単糖類のヒドロキシル基の脱酸素により形成された単糖類誘導体を指す。本発明に関するデオキシ糖の典型的な例は、ラムノース及びフコースである。
グリコシドは、グリコシドエーテル結合を含む糖誘導体である。本発明に関するグリコシド、とりわけアルキルグリコシドの一例は、メチル−α−Ｄ−キシロピラノシド（ＭＡＸ）である。
ＭＡＸは、メチル−α−Ｄ−キシロピラノシドを指す。
ＳＡＣは、強酸性カチオン交換樹脂を指す。
ＷＡＣは、弱酸性カチオン交換樹脂を指す。
ＳＢＡは、強塩基性アニオン交換樹脂を指す。
ＷＢＡは、弱塩基性アニオン交換樹脂を指す。
ＤＶＢは、ジビニルベンゼンを指す。
ＡＣＮは、アセトニトリルを指す。
ＤＳは、質量％として表されるカールフィッシャー（Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ）測定により測定された乾燥物含量を指す。
ＲＤＳは、質量％として表される、屈折率による乾燥物含量を指す。
純度は、乾燥物に対して％として表された化合物の含量を指す。
ＳＭＢは、擬似移動床プロセスを指す。
本発明に関連する融点は、示されていない限り、欧州薬局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅａ）の方法により測定される。
【００２４】
図面の簡単な説明
以下の図面は、本発明の例示的な態様であり、及びいかなる場合においても本発明の範囲を限定することを意味していない。
図１は、実施例１（Ｎａ+形態にある強酸性カチオン交換樹脂を使用した、デオキシ糖
を含む溶液のクロマトグラフィー分画）から得られた分離プロファイルのグラフである。
図２は、実施例２（Ｚｎ2+形態にある強酸性カチオン交換樹脂を用いた、デオキシ糖を含む溶液のクロマトグラフィー分画）から得られた分離プロファイルのグラフである。
図３は、実施例３（Ｎａ+形態にある弱酸性カチオン交換樹脂を用いた、デオキシ糖を
含む溶液のクロマトグラフィー分画）から得られた分離プロファイルのグラフである。
図４は、実施例５（ＨＳＯ3-形態にある強塩基性アニオン交換樹脂を用いた、デオキシ糖を含む溶液のクロマトグラフィー分画）から得られた分離プロファイルのグラフである。
図５は、フコースの融点とフコースの純度との間の関係を示すグラフである。
図６は、実施例１１（ＨＳＯ3-形態にある強塩基性アニオン交換樹脂を用いた、デオキシ糖を含む溶液のクロマトグラフィー分画）から得られた分離プロファイルのグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明の詳細な説明
本発明は、デオキシ糖と、ペントース及びヘキソース糖のような通常の糖、及びグリコシドとを含むバイオマスから誘導された溶液から、１種以上のデオキシ糖及び所望によりグリコシドを分離し及び回収する方法に関する。本発明の方法は、前記バイオマスから誘導された溶液を、溶離剤として水を使用して、１つ以上のクロマトグラフィー分画（１）段階、（２）段階及び（３）段階：
（１）強酸性カチオン交換樹脂から選択されるカラム充填材を使用した少なくとも１つ
のクロマトグラフィー分画、
（２）弱酸性カチオン交換樹脂及び弱塩基性アニオン交換樹脂から選択されるカラム充填材を使用した少なくとも１つのクロマトグラフィー分画、
（３）強塩基性アニオン交換樹脂から選択されるカラム充填材を使用した少なくとも１つのクロマトグラフィー分画、
にかけ、及び（１）段階、（２）段階及び／又は（３）段階から少なくとも１種のデオキシ糖及び所望によりグリコシドに富む１つ以上の画分を回収する、
ことを特徴とする。
本発明の典型的な態様において、本発明の方法は、フコース及びラムノースから選択されるデオキシ糖、及びメチル−α−Ｄ−キシロピラノシドから選択されるグリコシドの互いからの、及び他の糖からの分離を含む。
本発明の一態様において、本発明の方法は、前記溶液を、（１）段階、（２）段階及び／又は（３）段階の２つ以上にかけることを含む。本発明のもう１つの態様において、本発明の方法は、前記溶液を、（１）段階、（２）段階及び／又は（３）段階から選択される段階に２回以上かけることを含む。
本発明の方法の他の態様において、該方法は、（１）段階からラムノースに富む画分を回収することを含む。
本発明の方法のさらに他の態様において、該方法は、（２）段階からメチル−α−Ｄ−キシロピラノシドに富む画分を回収することを含む。
本発明の方法のさらに他の態様において、該方法は、（３）段階からフコースに富む画分を回収することを含む。
本発明の方法のさらなる態様において、該方法は、（３）段階、すなわち、バイオマスから誘導された前記溶液を、強塩基性アニオン交換樹脂から選択されるカラム充填材を使用したクロマトグラフィー分画にかけ、そしてフコースに富む画分を回収することを含む。
本発明の（２）段階において、弱塩基性アニオン交換樹脂の使用は典型的に、弱酸性カチオン交換樹脂と同様の分離結果を与える。本発明において有益な弱塩基性アニオン交換樹脂は、未発行のフィンランド国特許出願第２００２０５９２号明細書（国際公開第０３／０８０８７２号パンフレット）に開示されている。
【００２６】
本発明の方法のさらに他の態様において、該方法は、以下の逐次段階：
（１）前記バイオマスから誘導された溶液を、強酸性カチオン交換樹脂から選択されるカラム充填材を使用したクロマトグラフィー分画にかけ、そしてラムノースに富む画分及び／又はフコースから選択されるデオキシ糖及びメチル−α−Ｄ−キシロピラノシドから選択されるグリコシドを含む１つ以上の画分を回収する段階、及び
（２）前記メチル−α−Ｄ−キシロピラノシド及びフコースを含む１つ以上の画分を、弱酸性カチオン交換樹脂から選択されるカラム充填材を使用したクロマトグラフィー分画にかけ、そしてメチル−α−Ｄ−キシロピラノシドに富む画分及びフコースを含む画分を回収する段階、
を含む。
上述の方法の一態様において、該方法は、前記フコースを含む画分を、強塩基性アニオン交換樹脂から選択されるカラム充填材を使用したクロマトグラフィー分画にかけ、そしてフコースに富む画分を回収することを含む（３）段階をさらに含む。
本発明の一態様において、本発明はまた、以下の分離順序：ＷＡＣ（１）＋ＷＡＣ（２）＋ＳＡＣ（３）（ここで、ＷＡＣ（１）はアルドース糖の回収のためであり、ＷＡＣ（２）はＭＡＸの回収のためであり、及びＳＡＣ（３）はラムノース及びフコースの回収のためである）を用いた方法にも関する。
本発明のもう１つの態様において、本発明はまた、以下の分離順序：ＷＡＣ（１）＋ＳＡＣ（２）＋ＷＡＣ（３）（ここで、ＷＡＣ（１）はアルドース糖の回収のためであり、ＳＡＣ（２）はラムノースの回収のためであり、及びＷＡＣ（３）はＭＡＸ及びフコース
の回収のためである。）を用いた方法にも関する。
本発明の他の態様において、本発明はまた、以下の分離順序：ＷＡＣ（１）＋ＳＢＡ（２）（ここで、ＷＡＣ（１）はアルドース糖の回収のためであり、及びＳＢＡ（２）はＭＡＸ、ラムノース及びフコースの回収のためである。）を用いた方法にも関する。
【００２７】
本発明の方法の（１）段階においてカラム充填材として使用される前記強酸性カチオン交換樹脂は、１価カチオン形態又は２価カチオン形態にあり得る。本発明の好ましい態様において、前記強酸性カチオン交換樹脂はＮａ+形態にある。前記樹脂はまた、例えばＨ+、Ｍｇ2+又はＣａ2+又はＺｎ2+形態であり得る。
前記強酸性カチオン交換樹脂は、スチレン又はアクリル骨格を有し得る。本発明の好ましい態様において、前記樹脂は、スルホン化されたポリスチレン−コ−ジビニルベンゼン樹脂である。アルキル−置換されたスチレンのようなモノマーをベースとしたもののような他のアルケニル芳香族ポリマー樹脂又はその混合物も適用され得る。前記樹脂はまた、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルナフタレン、ジビニルベンゼンのような他の適する芳香族架橋性モノマーを用いて、又はイソプレン、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、Ｎ，Ｎ’−メチレンビス−アクリルアミド又はそれらの混合物のような脂肪族架橋性モノマーを用いて架橋され得る。前記樹脂の架橋度は、典型的にジビニルベンゼンのような架橋剤のおよそ１ないしおよそ２０％、好ましくはおよそ３ないし８％である。前記樹脂の平均粒径は通常、１０ないし２０００μｍ、好ましくは１００ないし４００μｍである。
【００２８】
本発明の（２）段階においてカラム充填材として使用される前記弱酸性カチオン交換樹脂は、１価又は２価カチオン形態、好ましくはＮａ+形態にあり得る。前記樹脂はまた、
例えばＨ+、Ｍｇ2+又はＣａ2+形態にあり得る。
弱酸性カチオン交換樹脂は、好ましくはカルボキシル官能基を有するアクリル系カチオン交換樹脂である。しかしながら、前記樹脂は、アクリル系樹脂以外、例えばスチレン樹脂であり得、及び官能基はカルボキシル基以外、例えば他の弱酸であり得る。そのようなアクリル系樹脂は好ましくは、メチルアクリレート、エチルアクリレート、ブチルアクリレート、メチルメタクリレート又はアクリロニトリル又はアクリル酸又はそれらの混合物から誘導される。前記樹脂は、架橋剤、例えばジビニルベンゼンを用いて、又は上述の他の架橋剤を用いて架橋され得る。適する架橋度は、１ないし２０質量％、好ましくは３ないし８％質量％である。前記樹脂の平均粒径は通常、１０ないし２０００μｍ、好ましくは１００ないし４００μｍである。
【００２９】
本発明の（２）段階において択一的に使用され得る前記弱塩基性アニオン交換樹脂は好ましくは、アクリル骨格を有する弱塩基性アニオン交換樹脂である。弱塩基性アニオン交換樹脂は好ましくは、メチルアクリレート、エチルアクリレート、ブチルアクリレート、メチルメタクリレート、アクリロニトリルのような、アクリルエステル（Ｈ2＝ＣＲ−Ｃ
ＯＯＲ’（式中、ＲはＨ又はＣＨ3を表し、及びＲ’はメチル基、エチル基、イソプロピ
ル基、ブチル基等のようなアルキル基を表す。））又はアクリル酸又はそれらの混合物から誘導される。アクリルマトリックスは、例えばジビニルベンゼン（ＤＶＢ）のような芳香族型の、又はイソプレン、１，７−オクタジエン、トリビニルシクロヘキサン、ジエチレングリコールジビニルエーテル、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−アルキレンビスアクリルアミド、エチレングリコールジメタクリレート並びに他のジ−、トリ−、テトラ−、ペンタアクリレート及びペンタメタクリレートのような脂肪族型のものであり得る適する架橋剤により架橋される。ジビニルベンゼンによる適する架橋度は、１ないし１０質量％ＤＶＢ、好ましくは３ないし８質量％である。弱塩基性アニオン交換樹脂は、架橋されたポリアクリルポリマーの、モノ−、ジ−、トリ−、テトラ−、ペンタ−又はヘキサミン或いは他のポリアミンのような適するアミンによるアミン化により、製造される。例えば、ジメチルアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、
テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン及びジメチルアミノプロピルアミンが適するアミンである。
【００３０】
他の弱塩基性アニオン交換樹脂構造は、エピクロロヒドリン−ベースの重縮合アニオン交換体である。エピクロロヒドリンのクロロメチル基及びエポキシ基は、ポリアミンと反応して、架橋されたゲル型のアニオン交換体を形成する。例えば、エピクロロヒドリンとトリエチレンテトラミンとの縮合反応は、以下のアニオン樹脂構造を生じる。この型のアニオン樹脂は、弱塩基性（三級アミン）と強塩基性（四級アンモニウム）官能基の両方を含む。
弱塩基性アニオン交換樹脂の他の類は、フェノールとホルムアルデヒドのアミン化された重縮合生成物である。
弱塩基性アニオン交換樹脂を生成するための他の良く知られた方法は、脂肪族アミンとアンモニアの重縮合樹脂である。モノマーアミン又はアンモニアが例えばホルムアルデヒドと反応される場合に、架橋された樹脂構造が形成される。アミンとホルムアルデヒドとの間の反応は、重縮合物を形成するためにさらに反応し得るメチロール及び／又はアゾメチン基を形成する。この型の良く知られた構造は、ホルムアルデヒド、アセトン及びテトラエチレンペンタミンの反応樹脂である。芳香族アミンはまた、ホルムアルデヒドにより架橋されて、弱塩基性アニオン交換体を生じる。
官能基としてピリジン基を有する架橋されたポリビニルピリジン−ベースのイオン交換体の異なる型もまた、弱塩基性アニオン交換体として有益である。
樹脂の平均粒径は通常、１０ないし２０００マイクロメーター、好ましくは１００ないし４００マイクロメーターである。
【００３１】
本発明の方法の（３）段階におけるカラム充填材として使用される前記強塩基性アニオン樹脂は典型的に、ＨＳＯ3-形態にある。前記強塩基性アニオン交換樹脂は、スチレン又はアクリル骨格を有し得る。樹脂はジビニルベンゼンにより架橋され得る。アルキル−置換されたスチレン又はその混合物のようなモノマーをベースとしたもののような他のアルケニル芳香族ポリマー樹脂がまた適用され得る。前記樹脂はまた、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルナフタレン、ジビニルベンゼンのような他の適する芳香族架橋モノマーにより、又はイソプレン、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドのような脂肪族架橋モノマー又はその混合物により、架橋され得る。樹脂の架橋度は典型的に、ジビニルベンゼンのような架橋剤のおよそ１ないしおよそ２０％、好ましくはおよそ３ないしおよそ８％である。樹脂の平均粒径は通常、１０ないし２０００μｍ、好ましくは１００ないし４００μｍである。
【００３２】
本発明の好ましい態様において、（１）段階、（２）段階及び（３）段階において使用される樹脂はゲル型樹脂である。
樹脂の製造業者は例えば、ファイネックス社（Ｆｉｎｅｘ  Ｌｔｄ．）、ダウケミカルズ社（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、バイエルケミカルズ社（Ｂａｙｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、プロライト社（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ  Ｃｏ．）及びロームアンドハース社（Ｒｏｈｍ＆Ｈａｓｓ  Ｃｏ．）である。
本発明の一態様において、各々の樹脂は、別々のカラム内に存在する。本発明のもう一つの態様において、二つ以上の異なった樹脂（ＳＡＣ、ＷＡＣ、ＳＢＡ及びＷＢＡ）が部分的な充填材床として１つのカラム内に含まれ得、それによりカラムは各々異なった樹脂を含む一つ以上の部分的なカラムを含む。
クロマトグラフィー分画操作において、前記樹脂のカチオン性／アニオン性は好ましくは、系の供給溶液のカチオン性／アニオン性と実質的に平衡である。
本発明の方法のクロマトグラフィー分画において使用される溶離剤は水である。
クロマトグラフィー分画の温度は典型的に、２０ないし９０℃、好ましくは４０ないし
６５℃の範囲にある。分画される溶液のｐＨは典型的に２ないし９の範囲にある。
クロマトグラフィー分画は、バッチ式プロセス又は擬似移動床（ＳＭＢ）プロセスとして行われ得る。ＳＭＢプロセスは好ましくは、逐次又は連続プロセスとして行われる。
擬似移動床プロセスにおいて、クロマトグラフィー分画は典型的に、一連に接続され及び少なくとも１つのループを形成した３ないし１４個のカラムを使用して行われる。カラムはパイプラインにより接続されている。カラムの流速は典型的に、該カラムの断面積の０．５ないし１０ｍ3／（ｈｍ2）である。カラムは、上述の樹脂から選択されたカラム充填材により充填される。カラムは、供給溶液及び溶離剤がカラムに供給され得、そして生成物がカラムから収集され得るように、供給ライン及び生成物ラインを備えている。生成物ラインは、生成物流の質／量が操作中に監視され得るように、オンライン装置を備えている。
クロマトグラフィーＳＭＢ分離の間、供給溶液はポンプによりループ内のカラムを通して循環される。溶離剤が添加され、そして所望のデオキシ糖、他の付加的な生成物画分及び残留画分を含む生成物画分がカラムから収集される。カラム内の溶離剤の流れは、カラムの頂上から又はカラムの底からもたらされ得る。
クロマトグラフィー分画前に、供給溶液は、例えば、イオン交換処理又は希釈による軟化、例えば蒸発による濃縮、ｐＨ調節、濾過及びメンブレン濾過から選択される１つ以上の前処理段階にかけられ得る。カラム内に供給する前に、供給溶液及び溶離剤は上述の分画温度（例えば５０ないし８５℃の範囲）まで加熱される。
クロマトグラフィー分画は、少なくとも１種のデオキシ糖及び所望によりグリコシドに富む１つ以上の画分を与える。
クロマトグラフィー分画の収率を改善するために、クロマトグラフィー分画の再循環画分がまた使用され得る。
本発明のクロマトグラフィー分画方法はさらに、メンブレン濾過、イオン交換、蒸発及び濾過から選択される１つ以上の精製段階を含み得る。これら精製段階は、前記クロマトグラフィー分画段階の前後又は間に行なわれ得る。
クロマトグラフィー分画から得られた所望のデオキシ糖に富む画分はさらに、結晶デオキシ糖生成物を得るために結晶化によりさらに精製され得る。
結晶化は典型的に、蒸発及び冷却結晶化を使用して行われる。結晶化溶媒は、水、アルコールのような有機溶媒から選択され得、好ましくはエタノール、及びそれらの混合物である。
【００３３】
続いて、デオキシ糖の結晶化がフコースの結晶化に関してより詳細に記載される。
フコースの結晶化は典型的に、水、アルコールのような有機溶媒から選択される溶媒、好ましくはエタノール、及び水とエタノールとの混合物のようなそれらの混合物を使用して行われる。本発明の好ましい態様において、結晶化は、水により又は水とエタノールとの混合物により行われる。
結晶化は典型的に、クロマトグラフィー分画から得られるフコースに富む溶液を、適切な乾燥物含量まで（例えば、液体の溶解度及び組成によっておよそ７０％ないし９０％のＲＤＳまで）蒸発することにより行われる。溶液は、フコースのシード結晶によりシード添加され得る。シードが使用される場合、乾燥形態における微粉砕結晶であるか、又は水、エタノールのようなアルコール、又はそれらの混合物であり得る結晶化溶媒中に懸濁される。典型的な結晶化溶媒は水である。結晶の生長可能性及び粘度が許容する場合は、シーディング後に蒸発が続けられ得る。蒸発後、結晶塊は、その結晶含量又は粘度が十分に高くなるまで同時に混合しながら冷却にかけられ得る。その後、さらなる冷却が収率を高めるために必要とされるか又は低粘度が結晶化の分離のために必要とされる場合に、結晶化溶媒が添加され得る。結晶塊は典型的に、１０ないし４０℃の温度まで冷却される。結晶塊はその後、最大の結晶化収率に到達するために、一定期間、好ましくは０．５時間ないし６日間、最終温度にて混合され得、そしてその後、結晶は例えば濾過により分離される。濾過は慣用の遠心分離又はフィルタにより行なわれ得る。濾過ケークは結晶化溶媒に
より洗浄され、そして乾燥される。乾燥は、例えば慣用の方法により、３０ないし９０℃の温度にて行なわれ得る。高純度を有するフコースの結晶が得られる。結晶化は典型的に、ＤＳとして９９％を超える純度、及び１４２．５℃よりも高い、好ましくは１４４℃よりも高い融点を有する結晶フコースを与える。
フコースの分別結晶化において、結晶化は、６０％を超える、好ましくは９０％を超える、及び最も好ましくは９９％を超える純度を有する結晶フコースを与える。
【００３４】
本発明の一態様において、フコースの結晶化は、ＤＳとして４５％を超えるフコースを含む溶液から行われる。本発明のもう１つの態様において、フコースの結晶化は、ＤＳとして８０％を超えるフコースを含む溶液から行われる。本発明の好ましい態様において、フコースの結晶化は、以下の不純物プロファイル：ＤＳとして、２０％未満のラムノース、１５％未満のキシロース、３％未満のアラビノース及び１％未満のガラクトースをさらに含む溶液から行われる。
本発明の一態様において、フコースの結晶化は、以下の不純物プロファイル：ＤＳとして、２０％未満のラムノース、１５％未満のキシロース、３％未満のアラビノース及び１％未満のガラクトースの存在下に４５％を超えるフコースを含む溶液から行われる。結晶化は典型的に、水とエタノールとの混合物から行われ、塊の粘度は典型的に５ないし５００Ｐａｓの範囲にあり、及び滞留時間は０．５ないし１０日間であり、及び温度は０ないし１００℃、好ましくは２０ないし７０℃の範囲内にある。
本発明のもう１つの態様において、フコースの結晶化は、上述の不純物プロファイルの存在下に８０％を超えるフコースを含む溶液から行われる。結晶化は、結晶化は、０ないし１００℃、好ましくは２０ないし７０℃の範囲の温度において６ないし８０時間の期間で行われ、及び有機溶媒なしに行なわれ得る。
本発明のさらなる局面において、本発明はまた、フコースの結晶化が、ＤＳとして、２０％未満のラムノース、１５％未満のキシロース、３％未満のアラビノース及び１％未満のガラクトースを含む不純物プロファイルの存在下に４５％を超えるフコースを含むバイオマスから誘導された溶液から行われるところの、フコースの結晶化のための方法を提供する。
本発明のまたさらなる局面において、本発明はまた、フコースの結晶化が、ＤＳとして、２０％未満のラムノース、１５％未満のキシロース、３％未満のアラビノース及び１％未満のガラクトースを含む不純物プロファイルの存在下に８０％を超えるフコースを含むバイオマスから誘導された溶液から行われるところの、フコースの結晶化のための方法を提供する。
上述の結晶化供給物の所望の不純物プロファイルは、例えばクロマトグラフィー分画、バイオマス加水分解物の分別結晶化により又は好ましくは上述の（１）段階ないし（３）段階により調製された異なった組成を有する液の混合により達成され得る。
【００３５】
本発明の方法は典型的に、結晶化から得られた結晶を洗浄するさらなる段階を含む。洗浄剤は典型的に、水及びエタノールのような有機溶媒、又はそれらの混合物から選択される。
結晶化供給物の典型的な乾燥物含量は、３０ないし７０質量％の範囲にある。フコース結晶化塊の適する粘度は５０ないし３００Ｐａｓである。
本発明のさらに他の局面において、本発明はまた、１４４℃よりも高い及び最も好ましくは１４５℃よりも高い融点、並びに、ＤＳとして９９％を超える純度を有する新規な結晶フコース生成物を提供する。前記新規結晶フコース生成物は、４５％を超えるフコース、典型的に８０％を超えるフコースを含む溶液から、及び上述の不純物プロファイルの存在下に、上述された方法により、とりわけフコースを結晶化することにより得られ得る。
デオキシ糖の回収のための出発物質は典型的に、前記デオキシ糖、グリコシド、他の単糖類及び他の炭水化物を含む混合物である。本発明の典型的な態様において、前記デオキシ糖はラムノース及びフコースを含み、及びグリコシドはメチル−α−Ｄ−キシロピラノ
シドを含む。混合物はまた、二糖類及びそれ以上の多糖類を含み得る。
【００３６】
デオキシ糖の回収のための出発物質は、バイオマスから、好ましくは植物ベースのバイオマスから、及び典型的には、軟木又は堅木、籾わら又は籾殻、トウモロコシの皮、トウモロコシの穂軸、トウモロコシ繊維、バガス及び甜菜のような、ヘミセルロース含有の植物ベースの材料から誘導される。シラカバ又はブナのような堅木から誘導されたヘミセルロース含有のバイオマスが、本発明における出発物質としての使用のためにとりわけ好ましい。
上述の出発物質中のデオキシ糖の含量は典型的に非常に低い。例えば、フコースの含量は０．０１質量％位であり得る。
デオキシ糖の回収のための出発物質は典型的に、上述のヘミセルロース含有のバイオマスの加水分解物である。該加水分解物は典型的に、バイオマスの弱酸加水分解又は酵素的加水分解から得られる。本発明の好ましい態様において、出発物質は、ヘミセルロース加水分解物又はヘミセルロース加水分解物から誘導された溶液である。
本発明に従うデオキシ糖の回収のためのバイオマス加水分解物は典型的に、パルプ化プロセスから得られたパルプ廃液である。パルプ廃液はとりわけ、酸性、塩基性又は中性亜硫酸パルプ化、好ましくは酸性亜硫酸パルプ化により得られ得る、亜硫酸パルプ廃液である。パルプ廃液は、０．０１ないし０．０５質量％の典型的なフコース含量を有する。クロマトグライー分画段階におけるパルプ廃液画分の典型的なフコース含量は、４ないし６質量％の範囲にある。フコースの前濃縮は、パルプ廃液からのキシロースのクロマトグラフィー分離により及び／又は結晶化により行なわれ得る。
本発明において有益な典型的なパルプ廃液は、好ましくは酸性亜硫酸パルプ化から得られたパルプ廃液である。パルプ廃液は亜硫酸パルプ化から直接的に得られ得る。パルプ廃液はまた、濃縮された亜硫酸パルプ廃液又は亜硫酸蒸解から得られた副生成物であり得る。パルプ廃液はまた、亜硫酸パルプ廃液からクロマトグラフィー的に得られ及びデオキシ糖を含む画分であり得る。
デオキシ糖を含む出発溶液は例えば、キシロース、ラムノース及び／又はマンノースの大部分が分離された、例えば亜硫酸パルプ廃液、例えば国際公開第０２／２７０３９号パンフレット（米国特許出願公開第０２／０１２０１３５号明細書）に開示される液である。
【００３７】
本発明の１つの典型的な態様において、出発溶液は、デオキシ糖の他に、典型的にバイオマスのヘミセルロースから誘導されたアルドース糖のような普通の糖を含む。
本発明のもう１つの典型的な態様において、出発溶液は、キシロースの回収後のキシロース回収プロセス、或いは、ラムノースの回収後のラムノース回収プロセスから分離されるところの、及びデオキシ糖に富むところの側流である。そのような側流は例えば、結晶化プロセス段階からの母液又はクロマトグラフィー分離プロセス段階等からの副生成物画分であり得る。上述のラムノース回収プロセスは、例えばキシロースの回収後の亜硫酸パルプ廃液からラムノースを回収する方法を指す（国際公開第０２／２７００３９号パンフレット）。カラム充填材として弱酸性カチオン交換樹脂を使用して、ラムノースのようなデオキシ糖がヘキソース及びペントース糖から分離され得る。上昇されたｐＨにおいてＮａ+形態にある弱酸性カチオン交換樹脂を使用することにより、ラムノースはヘキソース
及びペントース糖の前に溶離される。
出発物質はまた、甜菜又はサトウキビから誘導された溶液であり得る。
デオキシ糖及びグリコシドの回収のための他の原料としては、海藻中に見られるフコイダン並びにジャガイモ、キャッサバ塊茎、キウイフルーツ、シカクマメ類及びセイヨウカブラナ等の細胞壁中に見られる植物性多糖類が言及され得る。
本発明はまた、１４４℃よりも高い融点、ＤＳとして９９％を超える純度を有するバイオマスをベースとした結晶Ｌ−フコースに関する。本発明のＬ−フコース結晶は典型的に、５０μｍの最小長及び２０μｍの最小幅を有する１００ないし２５０μｍの平均粒径を
有する。本発明の好ましい態様において、本発明は、植物ベースのバイオマスをベースとした結晶Ｌ−フコースに関する。本発明のさらに好ましい態様において、結晶Ｌ−フコースは１４５℃よりも高い融点及びＤＳとして９９．５％を超える純度を有する。
本発明のさらに他の態様において、本発明は、上述の結晶化方法により、とりわけ水からの結晶化、続く洗浄により、得られ得る結晶Ｌ−フコースに関する。
本発明はまた、栄養補助食品、医薬品及び化粧品のための成分としての本発明の結晶Ｌ−フコースの使用に関する。
【００３８】
以下の実施例は、いかなる場合であっても本発明を限定することなしに本発明の例示的な態様を示す。
以下の実施例において、ラムノース及びフコースはＬ−形態にある。
【実施例】
【００３９】
実施例１
Ｎａ+形態にある強酸性カチオン交換樹脂を用いたデオキシ糖を含む溶液のクロマトグ
ラフィー分画
クロマトグラフィー分画のための供給物として使用したデオキシ糖を含む溶液は、キシロースの大部分の回収後に、Ｃａ2+をベースとした亜硫酸パルプ廃液から分離された側流であった（国際公開第０２／２７０３９号パンフレット；米国特許出願公開第０２／０１２０１３５号明細書）。亜硫酸蒸解のための原料としてシラカバを使用した。供給溶液は以下の組成を有していた：
【表１】
2007506711.tif 000002
クロマトグラフィー分画を、バッチ式プロセスとして試験的規模のクロマトグラフィー分離カラム内で行った。１ｍの径を有するカラムを、ファイネックス社製のスチレン骨格を有する強酸性カチオン交換樹脂（Ｆｉｎｅｘ  ＣＳ１１ＧＣ）により充填した。該樹脂はＮａ+形態であった。樹脂床の高さはおよそ４．８ｍであった。該樹脂のＤＶＢ含量は
５．５質量％であり、及び該樹脂の平均粒径は０．３１ｍｍであった。カラム、供給溶液及び溶離剤の温度は６５℃であった。カラム内の流速は５５０Ｌ／時間に調節した。
クロマトグラフィー分画を以下のとおりに行った：
１段階：供給溶液の乾燥物を、溶液の屈折率（ＲＩ）に従い、溶液１００ｇ中の乾燥物３７ｇに調節した。
２段階：前加熱した溶液６０Ｌを樹脂床の頂上にポンプ供給した。
３段階：前加熱したイオン交換水をカラムの頂上に供給することにより、供給溶液をカラムの下流に溶離した。
４段階：流出溶液の５０ｍＬ試料を５分間隔にて収集した。試料の組成を、屈折率検出器及び２倍のアミノカラム（７５％ＡＣＮを溶離剤として使用した。）付きＨＰＬＣ装置を用いて解析した。
ラムノースがフコース及びＭＡＸの前にカラムから溶離され、そしてフコース及びＭＡＸは殆ど同時に溶離された。ラムノースに富む画分並びにフコース及びＭＡＸに富む画分が、以下の表に示された純度及び収率で分離され得た。画分中の成分の収率は、再循環画
分及び残留画分をまた含むすべての流出画分中の該成分の総量に関して与えられる。
【表２】
2007506711.tif 000003
ラムノースに富む画分は、ラムノースの更なる加工に添加され得る。
流出物（流出溶液）のｐＨは４ないし６であった。分離プロファイルを図１に示す。
【００４０】
実施例２
Ｚｎ2+形態にある強酸性カチオン交換樹脂を用いたデオキシ糖を含む溶液のクロマトグラフィー分画
クロマトグラフィー分画のために使用した供給溶液は、国際公開第０２／０１２０１３５号パンフレット（米国特許出願公開第０２／０１２０１３５号明細書）に開示されたラムノース回収プロセスから得た。供給溶液は以下の組成を有していた：
【表３】
2007506711.tif 000004
クロマトグラフィー分画を、バッチ式プロセスとして実験室用のクロマトグラフィー分離カラム内で行った。０．０９ｍの径を有するカラムを、ファイネックス社製のスチレン骨格を有する強酸性カチオン交換樹脂（Ｆｉｎｅｘ  ＣＳ１１ＧＣ）により充填した。樹脂床の高さはおよそ１．５ｍであった。該樹脂のＤＶＢ含量は５．５質量％であり、及び該樹脂の平均粒径は０．３１ｍｍであった。該樹脂をＺｎ2+形態に再生した。カラム及び供給溶液及び溶離水の温度は６５℃であった。カラム内の流速は５０ｍＬ／分に調節した。
クロマトグラフィー分画を以下のとおりに行った：
１段階：供給溶液の乾燥物を、溶液の屈折率（ＲＩ）に従い、溶液１００ｇ中の乾燥物２５ｇに調節した。
２段階：前加熱した溶液８００ｍＬを樹脂床の頂上にポンプ供給した。
３段階：前加熱したイオン交換水をカラムの頂上に供給することにより、供給溶液をカラムの下流に溶離した。
４段階：流出溶液の１０ｍＬ試料を３分間隔にて収集した。試料の組成を、パルス電気化学検出器及びカルボパックＰＡ１（ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１）（登録商標）アニオン交換カラム（水及び０．２Ｍ  ＮａＯＨを溶離剤として使用した。）付きダイオネックス（Ｄｉｏｎｅｘ）ＨＰＬＣ装置を用いて解析した。
ラムノースがフコース及びＭＡＸの前に溶離され、そしてフコース及びＭＡＸは殆ど同時に溶離された。ラムノースに富む画分並びにフコース及びＭＡＸに富む画分が、以下の表に示された純度及び収率で分離され得た。
【表４】
2007506711.tif 000005
流出物（例えば、流出溶液）のｐＨは３ないし４であった。分離プロファイルを図２に示す。
【００４１】
実施例３
Ｎａ+形態にある弱酸性カチオン交換樹脂を用いたデオキシ糖を含む溶液のクロマトグ
ラフィー分画
クロマトグラフィー分画のための供給物は、実施例１（Ｎａ+形態にあるＳＡＣにより
分離）に従い得られたフコース、ＭＡＸ、ラムノース及びその他の単糖類を含む画分であった。供給溶液は以下の組成を有していた：
【表５】
2007506711.tif 000006
クロマトグラフィー分画を、バッチ式プロセスとして試験的規模のクロマトグラフィー分離カラム内で行った。０．６０ｍの径を有するカラムを、ファイネックス社製のアクリ
ル骨格を有する弱酸性カチオン交換樹脂（Ｆｉｎｅｘ  ＣＳ１６ＧＣ）により充填した。該樹脂はＮａ+形態に再生された。樹脂床の高さはおよそ５．２ｍであった。該樹脂のＤ
ＶＢ含量は８質量％であり、及び該樹脂の平均粒径は０．３３ｍｍであった。カラム、供給溶液及び溶離剤の温度は６５℃であった。カラム内の流速は１５０Ｌ／時間に調節した。
クロマトグラフィー分画を以下のとおりに行った：
１段階：供給溶液の乾燥物を、溶液の屈折率（ＲＩ）に従い、溶液１００ｇ中の乾燥物３３ｇに調節した。
２段階：前加熱した溶液１５０Ｌを樹脂床の頂上にポンプ供給した。
３段階：前加熱したイオン交換水をカラムの頂上に供給することにより、供給溶液をカラムの下流に溶離した。
４段階：流出溶液の画分試料を８分間隔にて収集した。試料の組成を、屈折率検出器及び２倍のアミノカラム（７５％ＡＣＮを溶離剤として使用した。）付きＨＰＬＣ装置を用いて解析した。
溶出の順序は、メチル−α−Ｄ−キシロース（ＭＡＸ）、ラムノース及びフコースであり、そしてそれらは部分的に重複した。他の単糖類の幾分かが、フコースの後に別のピークとして溶出された。Ｎａ+形態にあるＷＡＣ樹脂により、上述の成分の各々に富む画分
が、下記の表に与えたとおりに分離され得た。
【表６】
2007506711.tif 000007
流出物のｐＨは９．２ないし９．７であった。分離プロファイルを図３に示す
【００４２】
実施例４
ＨＳＯ3-形態にある強塩基性アニオン交換樹脂を用いたデオキシ糖を含む溶液の前処理
前処理段階は、バッチ式プロセスとして試験的規模のクロマトグラフィー分離カラム内で行った。０．２２５ｍの径を有するカラムを、アクリル骨格を有する強塩基性アニオン交換樹脂（デュオライト（Ｄｕｏｌｉｔｅ）Ａ１０１Ｄ）により充填した。平均ビーズ径は０．３５ｍｍであった。樹脂床の高さはおよそ３．５ｍであった。該樹脂を亜硫酸水素（ＨＳＯ3-）形態に再生し、そして供給装置を樹脂床の頂上に設置した。カラム及び供給溶液の温度は２５℃であった。カラム内の流速は最大２０Ｌ／時間となるように調節した。供給溶液のｐＨは４ないし４．５の範囲であった。
供給物として、実施例３からのシロップ（ＷＡＣ（Ｎａ+））を使用し、そしてこの前
処理の目的は、クロマログラフィー分離樹脂からＨＳＯ3-イオンを置換し得る化合物を取り除くことであった。
前処理段階を以下のとおりに行った：
１段階：水の薄層が樹脂表面上に見られ得るまでの溶離水の量を滴下した。
２段階：供給溶液の１５００ないし２０００リットルをカラムに通した。
３段階：供給溶液の薄層が樹脂表面上に見られ得るまで該供給溶液の量を滴下した。
４段階：乾燥物が流出物中に測定され得なくなるまで溶離水を流した。
前処理段階は、デオキシ糖の純度を高めなかった上に、いずれの分解も見られなかった。続く分離におけるフコース画分からの脱色及び安定効果は大きかった。流出溶液のｐＨはおよそ４であった。
【００４３】
実施例５
ＨＳＯ3-形態にある強塩基性アニオン交換樹脂を用いたデオキシ糖を含む溶液のクロマトグラフィー分画
クロマトグラフィー分画のために使用した供給溶液は、実施例３（Ｎａ+形態にあるＷ
ＡＣによる分離）に従い得られたデオキシ糖を含む画分であった。供給溶液は以下の組成を有していた：
【表７】
2007506711.tif 000008
クロマトグラフィー分画を、バッチ式プロセスとして試験的規模のクロマトグラフィー分離カラム内で行った。０．６ｍの径を有するカラムを、アクリル骨格を有する強塩基性アニオン交換樹脂（Ｆｉｎｅｘ  Ａｓ５３２ＧＣ、３．５％ＤＶＢ）により充填した。樹脂床の高さはおよそ４．８ｍであった。該樹脂の平均粒径は０．３５ｍｍであった。該樹脂を亜硫酸水素（ＨＳＯ3-）形態に再生した。カラム、供給溶液及び溶離水の温度は４０℃であった。カラム内の流速は２８３Ｌ／時間に調節した。
クロマトグラフィー分画を以下のとおりに行った：
１段階：供給溶液の乾燥物を、溶液の屈折率（ＲＩ）に従い、溶液１００ｇ中の乾燥物３７ｇに調節した。
２段階：前加熱した溶液８００ｍＬを樹脂床の頂上にポンプ供給した。
３段階：前加熱したイオン交換水をカラムの頂上に供給することにより、供給溶液をカラムの下流に溶離した。
４段階：流出した溶液の５０ｍＬ試料を１０分間隔にて収集した。試料の組成を、ＡＣＮ（７９％）を溶離剤として使用したアミノカラム付きＨＰＬＣ装置を用いて解析した。
フコース及びラムノースの前に、ＭＡＸを含む他の単糖類の殆どが別のピークとしてカラムから溶離された。ラムノースがフコースの後に溶離されたが、それらは部分的に重複した。亜硫酸形態の強塩基性アニオン交換樹脂によって、フコース及びラムノースに富む画分が、以下の表に与えられたとおりに分離され得た。
【表８】
2007506711.tif 000009
流出物（例えば、流出溶液）のｐＨは４．０ないし４．３であった。分離プロファイルを図４に示す。
【００４４】
実施例６
フコースの冷却結晶化
（ＥｔＯＨと水の混合物中での結晶化により続いた水性結晶化）
冷却結晶化を、ＤＳとして、７１．８％フコース、１．４％キシロース。０．９％アラビノース、５．３％ラムノース及び０．２％未満のガラクトースを含む、クロマトグラフィーにより富んだフコースシロップから行った。供給シロップの総量５５ｋｇの乾燥物を、減圧下にて蒸発させることにより濃縮し、そして１００リットルの冷却結晶化器内に移した。８９．３質量％乾燥物含量を有するシロップを５０℃にて混合した。混合の間にシーディングが自発的に生じた。５０℃におけるおよそ２０時間の混合後、母液は、２９％のフコース結晶化率に対応する８５．３質量％の乾燥物濃度を有していた。その後、粘度を低下させるために２５リットルのエタノールを添加し、そして塊を４０時間で２０℃まで冷却した。結晶化塊を、最大のフコース結晶化率を得るためにおよそ２０℃にて３日間混合した。結晶をその後、慣用のバスケット式遠心器を使用して母液から分離した。総量２６．５ｋｇの湿った結晶を得た。該結晶を、２０リットルのエタノールと混合することにより洗浄し、遠心分離しそして乾燥した。９９％を超える純度を有する総量２４．５ｋｇのフコース結晶を得た。フコースの収率は、供給シロップ中のフコースの６２％であった。フコース生成物は１４５．１℃の融点を有していた。
３つの融点測定値を、粉砕の前後に欧州薬局方の方法により行った。乾燥した結晶から得られた融点は、１４５．０、１４５．０及び１４４．６℃であり、そして微粉砕した試料から得られた融点は、１４５．２、１４５．４及び１４５．４℃であった。すべての測定値の平均は１４５．１℃であった。さらに、熱的挙動を、示差走査熱量計（Ｍｅｔｔｌｅｒ  ＦＰ８４ＨＴ）により、２℃／分の加熱速度を使用して、４０℃ないし１６０℃まで測定した。サーモグラム中に１つのピークがあり、そして該ピークの温度は１４３．５℃であった。
【００４５】
実施例７
溶媒としての水による結晶化
（水性煮沸結晶化（Ａｑｕｅｏｕｓ  ｂｏｉｌｉｎｇ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ）と、続く水中での冷却結晶化）
結晶化のための出発物質は、実施例５に従い、すなわち３つの逐次クロマトグラフィー分画（Ｎａ+形態にあるＳＡＣ、Ｎａ+形態にあるＷＡＣ及びＨＳＯ3-形態にあるＳＢＡ）から得られたフコースに富む画分であった。出発フコース溶液は、ＤＳとして、８６．３％のフコース、０．８％のキシロース、０．３％のアラビノース、４．５％のラムノース
及び０．２％未満のガラクトースを含んでいた。先の結晶化からの幾分かの低純度の中間フコース結晶を溶解し、そして前記出発溶液と混合して、結晶化供給液を得た。こうして得られた供給液の組成は、ＨＰＬＣ（アミノ形態にある樹脂、＋５５℃、５０％Ｈ3ＰＯ4６ｍＬ／Ｌを有する７９％ＡＣＮ）により測定した、ＤＳとして、８８．３％のフコース、１．１％のキシロース、０．３％のアラビノース及び４．１％のラムノース、０．２％のガラクトース及び０．５％未満のＭＡＸであった。供給溶液のｐＨは４．３であり、及び乾燥物含量（ＤＳ）は３４．１質量％であった。供給シロップの総量２８０ｋｇＤＳを、減圧下にて蒸発結晶器により濃縮した。シーディングは、乾燥した微粉砕フコースのシード結晶の４０グラムを用いて、５４．５℃にて行った。シード結晶は、先の結晶化の生成物から粉砕により調製した。シーディング後、煮沸結晶化塊は、シロップの残りを供給することにより、及び該結晶化塊を減圧下にて濃縮することにより、調製した。煮沸結晶化塊の総量２４０リットルを、慣用の冷却結晶化器内に移した。該塊を４０時間にて５５ないし２３．５℃まで段階的に冷却した。２３．５℃におけるおよそ９時間の混合後、結晶化率は、フコースのおよそ５９％であった。結晶化の手順は以下のとおりであった：
Ｔｉｍｅ    Ｔ        ＤＳ，ｍＬ
時間        ℃        質量％
０      ５４．５    ８０．４    ４０ｇのシード結晶を用いて蒸発結晶化器内にシ
ーディング
２      ５５．０    ８２．１    冷却結晶化の開始（ＤＳ，塊８３．０）
２２      ４０．７    ７５．３
４２      ２３．０    ７０．８    冷却終了
５１      ２３．５    ７０．７    遠心分離、結晶の洗浄及び乾燥試験
１回の遠心分離試験を、実験室用のバスケット式遠心器  ロト  サイレンタ（Ｒｏｔｏ
Ｓｉｌｅｎｔａ）ＩＩ（７分／３３５０ｒｐｍ、５０ｍＬの洗浄水）を用いて行った。湿った結晶の総量４８３グラムが、結晶化塊の１１５５グラムから得られた。遠心分離の結果は以下のとおりである：
総量          ＤＳ        フコース％      ＤＳ
グラム        ％          ＤＳとして      グラム
結晶化塊              １１５５      ８３．０      ８６．３      ９５８．７
遠心分離された結晶      ４８３      ９７．６      ９８          ４７１．４
乾燥（４０℃にておよそ６時間）は、乾燥の２．４％損失を生じた。結晶純度はＤＳとして９８％あり、及び融点は１３６．６℃であった。フコース収率は、入手可能なフコース量に基づき５４．６％であった。遠心分離された結晶の幾分かを、９９．５％エタノールと混合することにより洗浄し、遠心分離しそして乾燥した。結果として、９９％よりも高い純度、１４６．１℃の融点及び長さ５０μｍを超え且つ幅２０μｍを超える粒径を有する結晶生成物が得られた。９９％を超える純度を有するフコース結晶の生成率は、およそ５０％であった。本実施例は、高純度のフコース結晶が、供給液の組成が特定範囲にあり、及び不純物は沈澱しないが母液を用いて該結晶から洗浄除去され得る場合に、水溶液からの結晶化により得られ得ることを示している。
【００４６】
実施例８
溶媒として水とエタノールの混合物を用いたフコースの結晶化
（水性煮沸結晶化と、続くＥｔＯＨと水の混合物中での冷却結晶化）
結晶化のための供給シロップは、実施例７と同様のフコース溶液であった。結晶化の開始は実施例７と同様の方法により行った。実施例６に記載された煮沸結晶化を、結晶含量が粘度を高くするまで水溶媒中の冷却結晶化により続けた。その後、９９．５％エタノー
ルの３０リットルを、粘度を低下させるために結晶化塊に混合し、そして、結晶化を、１５時間で２３．５から１５．５℃への冷却により続けた。その後、結晶を、慣用のバスケット式遠心器を使用することにより、母液から分離した。総量１５４．５ｋｇの湿った結晶が得られた。該結晶を９９．５％エタノールの１００リットルと混合することにより洗浄し、遠心分離しそして乾燥した。９９％を超える純度及び１４５．５℃の融点を有する結晶生成物の総量１２１．５ｋｇが得られた。特定旋光度は、［α］D20−７４．７°で
あった。フコース生成物の収率はおよそ５０％であった。本実施例は、高いフコース結晶が、供給液の組成が特定範囲にある場合に、ＥｔＯＨと水の混合物からの結晶化により得られ得ることを示している。
【００４７】
実施例９
溶媒として水とエタノールの混合物を用いたフコースの結晶化
（水性煮沸結晶化と、続くＥｔＯＨと水の混合物中での冷却結晶化）
結晶化のための出発材料は、実施例７及び８の結晶化からの母液と洗浄液を組み合わせることにより得た。供給溶液は、ＤＳとして、７８％のフコース、１．８％のキシロース、０．６％のアラビノース、７．８％のラムノース、０．５％のガラクトース及び０．５％未満のＭＡＸを含んでいた（ＨＰＬＣにより測定：アミノ形態にある樹脂、＋５５℃、５０％Ｈ3ＰＯ4６ｍＬ／Ｌによる７９％ＡＣＮ）。４３質量％のＤＳ含量を有する供給シロップの総量１３８ｋｇＤＳを、減圧下にて慣用の蒸発結晶器により濃縮した。シーディングは、フコースのシード結晶の４０グラムを用いて、５４．６℃にて行った。シーディング後、煮沸結晶化塊は、シロップの残りを供給することにより、及び該結晶化塊を減圧下にて濃縮することにより、調製した。煮沸結晶化塊の総量１１５リットルを、慣用の冷却結晶化器内に移した。該塊を４８時間にて５６から３６℃に段階的に冷却し、それにより粘度が高まり、そして該塊は水溶媒からの結晶分離に適していた。この段階において、結晶化率は５０％フコースであった。しかしながら、粘度を低下させるために９９．５％エタノールの２７リットルを添加することにより、及び２０時間で３６から１５．５℃に冷却することにより、結晶化を続けた。その後、結晶を分離し及び乾燥した。結晶化の手順は以下のとおりであった：
Ｔｉｍｅ    Ｔ        ＤＳ，ｍＬ
時間        ℃        質量％
０      ５４．６    ８３．３    ４０ｇのシード結晶を用いて蒸発結晶化器内にシ
ーディング
１      ５６．０    ８２．１    冷却結晶化の開始，ＤＳ，塊８５．０
２０      ５１．３    ７９．６
４８      ３６．０    ７７．８    該塊は厚く、そしてＥｔＯＨ添加を開始
６７      １５．５      −        遠心分離、結晶の洗浄及び乾燥
結晶は、慣用のバスケット式遠心器を使用することにより、母液から分離した。総量５９．９ｋｇの湿った結晶が得られた。結晶を、９９．５％エタノール３０Ｌと混合することにより洗浄し、遠心分離しそして乾燥した。９９％を超える純度及び１４３．７℃の融点を有する結晶生成物４８．４ｋｇが得られた。特定旋光度は、［α］D20−７２．２°
であった。フコース生成物の収率はおよそ４８％であった。本実施例は、高純度のフコース結晶が、供給液の組成が特定範囲にある場合に、水とエタノールの混合物から、及び比較的低純度を有する供給シロップ（最初の結晶化の母液）から直接に結晶化することにより得られ得ることを示している。
【００４８】
実施例１０
フコース結晶化試験の結果の結論
融点がフコース結晶の純度の良好な指標であることが判った。結果を以下の表に示す。
結果の直線状の適合性（図５を参照のこと。）は、以下の式：結晶の純度（ＤＳ％）＝０．１７７×ｍｐ（℃）＋７３．７１（Ｒ2＝０．９７８）  を与える。
【表９】
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上記表中の試験試料２７０５２及び１７０５２は、本発明に従い調製された他のＬ−フコース試料を指す。
さらに、本発明のＬ−フコース試料と市販のＬ−フコース試料（シグマ  ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．））との間の対比試験は、以下の結果を与えた。
【表１０】
2007506711.tif 000011
【００４９】
実施例１１
ＨＳＯ3-形態にある強塩基性アニオン交換樹脂を用いたデオキシ糖を含む溶液のクロマトグラフィー分画
クロマトグラフィー分画のための供給物として使用したデオキシ糖を含む溶液は、キシロースの殆どの回収後にＣａ2+ベースの亜硫酸パルプ廃液から分離された側流であった。シラカバが亜硫酸蒸解のための原料として使用された。供給溶液は以下の組成を有していた：
【表１１】
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クロマトグラフィー分画を、バッチ式プロセスとして試験的規模のクロマトグラフィー分離カラム内で行った。０．１ｍの径を有するカラムを、アクリル骨格を有する強塩基性アニオン交換樹脂（Ｆｉｎｅｘ  Ａｓ５３２ＧＣ、３．５％ＤＶＢ）により充填した。樹脂床の高さはおよそ１．２ｍであった。該樹脂の平均粒径は０．３５ｍｍであった。該樹脂を亜硫酸水素（ＨＳＯ3-）形態に再生した。カラム、供給溶液及び溶離水の温度は４０℃であった。カラム内の流速は１００ｍＬ／分に調節した。供給液のｐＨは６．０であった。
クロマトグラフィー分画を以下のとおりに行った：
１段階：供給溶液の乾燥物を、溶液の屈折率（ＲＩ）に従い、溶液１００ｇ中の乾燥物３１．５ｇに調節した。
２段階：前加熱した溶液８００ｍＬを樹脂床の頂上にポンプ供給した。
３段階：前加熱したイオン交換水をカラムの頂上に供給することにより、供給溶液をカラムの下流に溶離した。
４段階：流出した溶液の５ｍＬ試料を５分間隔にて収集した。試料の組成を、水及びＡＣＮ（７９％）を溶離剤として使用したアミノカラム付きＨＰＬＣ装置を用いて解析した。
フコース及びラムノースの前に、ＭＡＸを含む他の単糖類の殆どが分離ピークとしてカラムから溶出された。ラムノースがフコースの後に部分的に溶出された。こうして亜硫酸水素形態の強塩基性アニオン交換樹脂によって、フコースに富む画分が、他の単糖類及び他の成分から良好に分離され得た。流出物（例えば、流出溶液）のｐＨは１．９ないし３．８であった。分離プロファイルを図６に示す。
【００５０】
実施例１２
ＳＭＢプロセスを用いたフコースを含むシロップのクロマトグラフィー分画
クロマトグラフィー分画のためのＳＭＢ試験装置は、直列に接続された６つのカラム、供給ポンプ、再生ポンプ、溶離水ポンプ並びに種々のプロセス流のための流入及び生成物バルブを含んでいた。各々のカラムの高さは３．４ｍであり、及び各々のカラムは０．２ｍの径を有していた。カラムを、Ｎａ+形態にある強酸性ゲル型のカチオン交換樹脂（フ
ァイネックスＣＳ１１ＧＣ）により充填した。平均ビーズ径は０．３３ｍｍであり、及びジビニルベンゼン含量は５．５％であった。
クロマトグラフィー分画のための供給物は、国際公開第０２／２７０３９号パンフレット（＝米国特許出願公開第２００２／１２０１３５号明細書）に開示されるラムノース回収プロセスからのシロップであった。クロマトグラフィー分画の目的は、該シロップ中に含まれるフコース及びラムノースを分離することであった。
供給物のｐＨを、５０質量％ＮａＯＨ溶液を用いて６．２に調節した。溶液をその後、濾過の補助剤としてのケナイト（Ｋｅｎｉｔｅ）３００（プレコート１ｋｇ／ｍ2、ＤＳ
ベースで正味０．５％）を使用したサイツ（Ｓｅｉｔｚ）圧力フィルタにより濾過し、そして供給物濃度を５５ｇ／１００ｍＬに調節した。供給物の組成は以下の表に記載するが
、パーセンテージは乾燥物質量に基づき与えられる。
【表１２】
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分画を、以下の記載のとおりに９段階のＳＭＢ順序により行った。供給物及び溶離剤の温度は６５℃であった。水を溶離剤として使用した。
１段階：供給溶液の１６Ｌを、８０Ｌ／時間の流速にて第一カラムにポンプ供給し、そして残留画分を該カラムから収集した。同時に水２７Ｌを１３５Ｌ／時間の流速にて第二カラムに押出し、そして残留画分をカラム４から収集した。同時にまた、水１６Ｌを８０Ｌ／時間の流速にてカラム５に押出し、そしてフコースを含む画分を最後のカラムから収集した。
２段階：供給溶液の１０Ｌを、８０Ｌ／時間の流速にて第一カラムにポンプ供給し、そしてラムノースを含む画分を該カラムから収集した。同時に水１９Ｌを１５０Ｌ／時間の流速にて第二カラムに押出し、そしてもう１つのラムノースを含む画分をカラム４から収集した。同時にまた、水１６Ｌを８０Ｌ／時間の流速にてカラム５に押出し、そしてフコースを含む画分を最後のカラムから収集した。
３段階：供給物の３０Ｌを、８０Ｌ／時間の流速にて第一カラムにポンプ供給し、そしてフコースを含む画分を最後のカラムから収集した。
４段階：水２７Ｌを、８０Ｌ／時間の流速にて最後のカラムにポンプ供給し、そして残留画分を第二カラムから収集した。同時に水２７Ｌを８０Ｌ／時間の流速にて第三カラムに押出し、そして残留画分をカラム５から収集した。
５段階：水２０Ｌを、８０Ｌ／時間の流速にて最後のカラムにポンプ供給し、そしてラムノースを含む画分を第二カラムから収集した。同時に水２０Ｌを８０Ｌ／時間の流速にて第三カラムに押出し、そしてもう１つのラムノースを含む画分をカラム５から収集した。
６段階：２９Ｌを、８０Ｌ／時間の流速にてすべてのカラムで形成したカラムセットのループに循環させた。
７段階：水２８Ｌを、８０Ｌ／時間の流速にて最後のカラムにポンプ供給し、そして残留画分を第三カラムから収集した。同時に水２８Ｌを８０Ｌ／時間の流速にてカラム４に押出し、そして残留画分を最後のカラムから収集した。
８段階：水２０Ｌを、８０Ｌ／時間の流速にて第一カラムにポンプ供給し、そしてラムノースを含む画分を第三カラムから収集した。同時に水２０Ｌを８０Ｌ／時間の流速にてカラム４に押出し、そしてもう１つのラムノースを含む画分を最後のカラムから収集した。
９段階：２９Ｌを、８０Ｌ／時間の流速にてすべてのカラムで形成したカラムセットのループに循環させた。
系の平衡化後、以下の画分：すべてのカラムから１つの残留画分、すべてのカラムから１つのラムノースを含む画分及び最後のカラムから３つのフコースを含む画分を、系から引出した。組み合わせた画分に対するＨＰＬＣ解析を含む結果を以下の表に記載する。
【表１３】
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生成物画分から計算された総収率は、フコースに対して９４．４％であり、そしてラムノースに対して７６％であった。
【００５１】
技術的な進歩につれ、本発明の概念が種々の方法にて改良され得ることが当業者に明らかである。本発明及びその態様は、上述の実施例に限定されず、請求項の範囲内で変化し得る。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】実施例１（Ｎａ+形態にある強酸性カチオン交換樹脂を使用した、デオキシ糖を含む溶液のクロマトグラフィー分画）から得られた分離プロファイルのグラフである。
【図２】実施例２（Ｚｎ2+形態にある強酸性カチオン交換樹脂を用いた、デオキシ糖を含む溶液のクロマトグラフィー分画）から得られた分離プロファイルのグラフである。
【図３】実施例３（Ｎａ+形態にある弱酸性カチオン交換樹脂を用いた、デオキシ糖を含む溶液のクロマトグラフィー分画）から得られた分離プロファイルのグラフである。
【図４】実施例５（ＨＳＯ3-形態にある強塩基性アニオン交換樹脂を用いた、デオキシ糖を含む溶液のクロマトグラフィー分画）から得られた分離プロファイルのグラフである。
【図５】フコースの融点とフコースの純度との間の関係を示すグラフである。
【図６】実施例１１（ＨＳＯ3-形態にある強塩基性アニオン交換樹脂を用いた、デオキシ糖を含む溶液のクロマトグラフィー分画）から得られた分離プロファイルのグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年5月25日(2006.5.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
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【国際調査報告】
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