(57)【要約】【課題】本発明は、共役多価電解質（conjugated polyelectrolyte）を用いて、タンパク質のコンホメーション変化及び自己集合／凝集、特にアミロイド原線維の形成を測定するための方法に関する。【解決手段】共役多価電解質をタンパク質に曝露して、それにより共役多価電解質及び関心対象のタンパク質が相互作用し、そして前記タンパク質のコンホメーション変化に反応した、前記多価電解質の特性変化を観察する。検出された変化を用いて、前記タンパク質の異なるコンホメーション、特にアミロイド原線維の形成を決定する。【選択図】図１
2007536555.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
直接プローブとして、共役多価電解質（conjugated polyelectrolyte）を用いて、タンパク質におけるコンホメーション変化及び／又は自己集合／凝集を検出するための方法。
【請求項２】
コンホメーション変化又は自己集合／凝集が、アミロイド原線維又はプロトフィブリルの形成である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ｉ）共役多価電解質をタンパク質に曝露し；
ｉｉ）共役多価電解質の少なくとも１つの特性における変化を検出し；
ｉｉｉ）前記変化を用いて、前記タンパク質におけるコンホメーション変化又は自己集合／凝集を決定する
工程を含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記特性が、蛍光、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、放出光の消光、吸収、インピーダンス、屈折率、質量、粘弾特性、厚さ又は他の物理特性からなる群より選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
多価電解質が、チオフェン、ピロール、アニリン、フラン、フェニレン、ビニレン、フルオレン又はその置換型のコポリマー又はホモポリマーを含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記共役多価電解質が、１又はそれ以上の陰イオン性、陽イオン性及び／又は双性イオン性側鎖官能基を有する、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記イオン性側鎖官能基が、アミノ酸、アミノ酸誘導体、神経伝達物質、単糖、核酸、及びその組み合わせ並びに化学的に修飾された誘導体を含む群より選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
共役多価電解質及び前記タンパク質が、例えば水素結合、若しくは静電相互作用のような非共有結合又は非極性相互作用により相互作用する、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
共役多価電解質が、固体支持体に結合しており、好ましくは前記固体支持体に吸着されているか又は共有結合する、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
固体支持体がマイクロタイタープレート又はフローセルである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
共役多価電解質が溶液中にある、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
共役多価電解質が、ポリマー・マトリックス中に捕捉されている、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
共役多価電解質の少なくとも１つの特性における変化の検出が、水性溶液、有機溶媒、体液、又は組織試料中で行われる、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
請求項９記載の方法を行うための、共役多価電解質が固定されている表面、及び共役多価電解質の少なくとも１つの特性を測定する手段を含む、装置の使用。
【請求項１５】
測定手段が、蛍光、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、放出光の消光、吸収、インピーダンス、屈折率、質量、粘弾特性、厚さ又は他の物理特性からなる群より選択される、少なくとも１つの特性を測定することができる、請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
多価電解質が、少なくとも２点のアレイにおいて固定されている、請求項１４記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、共役多価電解質（conjugated polyelectrolyte）（ＣＰ）を用いて、タンパク質のコンホメーション変化及び自己集合／凝集、特にアミロイド原線維の形成を検出するための方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質におけるコンホメーション変化、特にアミロイド原線維の形成を選択的に検出することが可能な物質は、臨床化学における分析ツールとして使用される可能性が高いため、こうした物質の開発が、ますます注目されてきている。アミロイド原線維は、通常、コンゴーレッド及びチオフラビンＴ等の小分子色素で染色される。
【０００３】
ＣＰに基づくセンサーは、集団系反応による増幅のため、非常に軽微な撹乱にも感受性であり、そのため、小分子に基づくセンサーに比較して、重要な優位性をもたらす。生物学的分子に関する検出要素としてのＣＰの使用を実現するには、ポリマーが水性環境に適合する必要がある。これは、最近、共役（そしてときに発光性）多価電解質が、光誘起電荷又は励起移動のための条件に対する生体分子の影響を介して、生体分子を検出するのに用いられたように、こうした多価電解質を作製することにより達成されている。
【０００４】
ＣＰは、以前、多価電解質鎖のコンホメーション改変を介した、受容体／分析物相互作用等の生体特異的相互作用を検出するために用いられていた［Nilsson, K. P. R.; Inganaes, O. Nature Materials 2003, 2, 419-424.;Ho, H-A.ら Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 1548.;Ho, H-A.; Leclerc, M. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 1384.; Dore, K.; Dubus, S.; Ho, H-A.; Levesque, I.; Brunette, M.; Corbeil, G.; Boissinot, M.; Boivin, G.; Bergeron, M.G.; Boudreau, D.; Leclerc, M. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 4240.; WO02/081735、WO03/096016］。
【０００５】
しかし、タンパク質のコンホメーション変化及び自己集合／凝集、特にアミロイド原線維の形成を記録するための直接プローブとしてのＣＰの使用は、報告されてない。
タンパク質のコンホメーション変化及び自己集合／凝集、特にアミロイド原線維の形成を検出するためのより単純でより感受性が高い方法が必要とされている。したがって、タンパク質と直接相互作用でき、タンパク質のコンホメーション改変を光学シグナルに変換できる、ＣＰに基づく方法が望ましいであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の概要
タンパク質等の天然バイオポリマーは、バイオポリマーの規則正しい三次元構造及び特定の機能を導くアルファ・へリックス及びベータ・シート等の、規則正しいコンホメーションを高頻度に有する。生体分子のコンホメーション変化は、細胞シグナル伝達経路及び酵素反応の一環として生物学的系で非常に重要である。
【０００７】
同様に、ＣＰのコンホメーションが改変されると、鎖の配置、並びに生じた電子構造及び光学プロセスの間を直接相関させることが可能になる。ＣＰのコンホメーションの柔軟性のため、鎖の配置、並びに生じた電子構造及びプロセスの間を直接相関させることができる。これには、ＣＰ鎖配置がタンパク質のコンホメーション変化に管理される必要がある。タンパク質のコンホメーションが変化することにより、多価電解質主鎖の異なるコンホメーションを導くことができれば、多価電解質からの吸収及び発光特性の改変が見られるであろう。そのため、新規センサーを作成するプラットホームとして使用できる。多くの疾患が、アルファ・へリックス構造をベータ・シートが豊富な構造に変換するアミロイド原線維が形成されるようなタンパク質の構造異常に関連するため、タンパク質のコンホメーション変化及び自己集合／凝集を記録可能な蛍光プローブを用いる方法は関心が高まる。こうした疾患の例は、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、続発性アミロイドーシス、２型糖尿病及びウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）である。アミロイド原線維の形成は、疾患の特徴であり、そしてバイオテクノロジー的なタンパク質精製を妨害するため、こうしたプロセスの単純な検出ツールは非常に重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明の目的は、上記及び他の需要を満たす手段及び方法を提供することである。この目的は、第一の様相において、共役多価電解質を直接プローブとして用いる、タンパク質のコンホメーション変化及び／又は自己集合／凝集を検出するための方法により達成される。
【０００９】
現在、好ましい態様において、タンパク質のコンホメーション変化又は自己集合／凝集は、アミロイド原線維又はプロトフィブリルの形成である。
概要として、本発明記載の方法は：
ｉ）共役多価電解質をタンパク質に曝露し；
ｉｉ）共役多価電解質の少なくとも１つの特性における変化を検出し；
ｉｉｉ）前記変化を用いて、前記タンパク質におけるコンホメーション変化又は自己集合／凝集を決定する
工程を含む。
【００１０】
この方法は、当業者により、例えば、変化を、工程ｉ）の前に検出すべきである少なくとも１つの特性に関する値を測定する他の工程を用いて、さらに精緻化されてもよい。
好ましくは、共役多価電解質は、チオフェン、ピロール、アニリン、フラン、フェニレン、ビニレン、フルオレン又はその置換型のコポリマー又はホモポリマーを含み、好ましくは、共役多価電解質は１又はそれ以上のイオン性側鎖官能基を有する。側鎖官能基は、陰イオン性、陽イオン性又は双性イオン性であってもよく、そしてアミノ酸、アミノ酸誘導体、神経伝達物質、単糖、核酸、並びにその組み合わせ及び化学的に修飾された誘導体で構成される群より選択することができる。
【００１１】
本発明の好ましい態様において、変化を検出すべき少なくとも１つの特性は、蛍光、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、放出光の消光、吸収、インピーダンス、屈折率、質量、粘弾特性及び厚さからなる群より選択される。
【００１２】
本発明の他の態様において、共役多価電解質若しくはコンホメーション変化及び／又は自己集合／凝集を検出すべきタンパク質のいずれかが、マイクロタイタープレート又はフローセル等の固体支持体に結合しており、好ましくは前記固体支持体に吸着されているか又は共有結合している。しかし、共役多価電解質及びタンパク質はまた、溶液中にあってもよく、若しくはポリマー・マトリックス中に捕捉されていてもよく、また、検出を組織試料中で行うこともできる。
【００１３】
本発明の他の側面は、タンパク質のコンホメーション変化及び自己集合／凝集を決定するためのバイオセンサー装置の使用であって、上で同定される種類の共役多価電解質、及び前記多価電解質を前記ターゲット・タンパク質に曝露することができる前記共役多価電解質の支持体、及び少なくとも１つの特性における変化を検出するための手段が含まれる。前記バイオセンサー装置の使用を請求項１４で特定する。
【発明の効果】
【００１４】
同定を望むタンパク質のコンホメーション変化の多様性はまた、さらなる側面において、本発明がマイクロアレイの形で実施することができ、検出系が表面上で係留しかつパターン化される必要があることも示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
概括的には、本発明は、共役多価電解質を用いた、タンパク質のコンホメーション変化及び自己集合／凝集、特にアミロイド原線維の形成を記録するための新規な方法に関する。共役多価電解質をタンパク質に曝露すると、多価電解質及び関心対象のタンパク質が相互作用し、前記タンパク質におけるコンホメーション変化に応じた前記多価電解質の特性変化を観察する。検出された変化は、前記タンパク質のコンホメーションを決定することに用いる。
【００１６】
本発明はまた、タンパク質のコンホメーション変化及び自己集合／凝集、特にアミロイド原線維の形成を検出するための前記方法を含む、バイオセンサー装置にも関する。
本発明は、前記タンパク質と直接相互作用する共役多価電解質に基づく。相互作用は共有結合なしに起こり、そして共役多価電解質及び生体分子の間の水素結合、静電相互作用及び非極性相互作用に基づき、これらは本明細書において、非共有結合と称されるが、これにはさらに、共有性でない、いかなる種類の結合も含まれる。
【００１７】
本出願で用いられる「直接プローブ」という用語は、他の巨大分子化合物を必要とせずに、タンパク質と直接相互作用して、コンホメーション変化を検出することが可能なプローブを意味する。
【００１８】
本発明は、タンパク質のコンホメーションにおける変化、特にアミロイド原線維の形成が、共役多価電解質の主鎖のコンホメーション遷移、共役多価電解質鎖の分離又は凝集を誘導することを利用する。さらに、共役多価電解質の主鎖のコンホメーション遷移、共役多価電解質鎖の分離又は凝集は、共役多価電解質の鎖内プロセス及び鎖間プロセスを変化させる。これらの変化は、溶液中又は表面上で検出することができる。特に、本発明により、タンパク質のコンホメーション変化及び自己集合／凝集、特にアミロイド原線維の検出をすることができる。
【００１９】
共役多価電解質は、例えば、バイオセンサー・セル中の支持体上に共役多価電解質を固定することにより、バイオセンサー装置の活性部分として適切に提供される。適切には、バイオセンサー装置は前記支持体の適切な容器（receptable）を含み、そして共役多価電解質及びタンパク質間の複合体が支持体上に形成される。
【００２０】
しかしながら、例えば、共役多価電解質を溶液中で提供してタンパク質溶液を複合体溶液流と混合しながらフローセルを通過させるといった、他の形態でもよい。相互作用は多様な分析技術により監視することもできる。
【００２１】
バイオセンサー組立品は、タンパク質におけるコンホメーション変化による、多価電解質特性の変化を検出するための適切な手段を有するべきである。
上に論じる特性を示す共役多価電解質の例として、ポリ（３−［（Ｓ）−５−アミノ−５−カルボキシル−３−オキサペンチル］−２，５−チオフェニレン塩酸）（ＰＯＷＴ）、ポリチオフェン酢酸（ＰＴＡＡ）、ポリ（３−［（Ｓ）−５−アミノ−５−メトキシカルボキシル−３−オキサペンチル］−２，５−チオフェニレン塩酸）（ＰＯＭＴ）、ポリ（（３，３”−ジ［（Ｓ）−５−アミノ−５−カルボニル−３−オキサペンチル］−［２，２’；５’，２”］）−５，５”−テルチオフェニレン塩酸）（ＰＯＮＴ）、及びポリ（（１，４−ジ（３−［（Ｓ）−５アミノ−５−カルボニル−３−オキサペンチル］−チオフェン−２−イル）−ベンゼン）塩酸）（ｆ−ＰＯＮＴ）（図１を参照されたい）をあげることができる。これらの多価電解質の研究（Andersson, M.;Ekeblad, P.O.; Hjertberg, T.; Wennerstroem, O.; Inganas, O. Polymer Commun. 1991, 32, 546-548.; Berggren, M.; Bergman, P.; Fagerstroem, J.; Inganas, O.; Andersson, M.; Weman, H.; Granstroem, M.; Stafstroem, S.; Wennerstroem, O.; Hjertberg, T. Chem. Phys. Lett. 1999, 304, 84-90.; Ding, L.; Jonforsen, M.; Roman, L.S.; Andersson, M.R.; Inganas, O. 2000, Synth. Met., 110, 133-140.; Nilsson, K.P.R.; Andersson, M.R.; Inganas, O. Journal of Physics: Condensed Matter 2002, 14, 10011-10020.; Nilsson, K.P.R.; Inganaes, O. Nature Materials 2003, 2, 419-424.; Nilsson, K.P.R.; Rydberg, J.; Baltzer, L.; Inganaes, O. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100, 10170-10174. Nilsson, K.P.R.; Rydberg, J.; Baltzer, L.; Inganaes, O. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 11197-11202を参照されたい）により、単一の多価電解質鎖内及び隣接する多価電解質鎖間での異なる静電相互作用及び水素結合パターンにより、興味深い光学プロセス及び電子プロセスが示されている。イオン性側鎖による相互作用により、多価電解質主鎖は別のコンホメーションを取らざるを得ないか、又は、多価電解質鎖の分離又は凝集せざるを得なくなる。特に、多価電解質鎖の分離及び凝集により新規な鎖内プロセス及び鎖間プロセスが誘導される。鎖内プロセスは多価電解質鎖内の光学プロセス及び電子プロセスに関与し、そして鎖間プロセスは隣接する多価電解質鎖間の光学プロセス及び電子プロセスに関与する。このため、新規な鎖内プロセス及び鎖間プロセスにより新規光学吸収及び発光特性が起こる。
【００２２】
異なるｐＨで荷電される陰イオン性又は陽イオン性のイオン性側鎖の官能基により、これらのポリチオフェン誘導体は負又は正に荷電されたオリゴマー及びポリマーとの多価電解質複合体を形成するのに適するものとなる。さらに、イオン性基は異なる分子と多様な水素結合パターンを生成する。
【００２３】
以下の本発明の詳細な説明は、共役多価電解質、タンパク質、検出方法、共役多価電解質及びタンパク質の固定、並びにアレイ及びラインを別個に取り扱うであろう。最後に、本発明の有用性を立証するいくつかの実験で本発明を例示する。
【００２４】
Ｉ  共役多価電解質
本発明は、最低限５量体であり、単量体のチオフェン、ピロール、アニリン、フラン、フェニレン、ビニレン、フルオレン又はその置換型由来の何量体かからなり、そのホモポリマー又はコポリマーを形成する多様な共役多価電解質に関する。共役多価電解質は、単分散であり、特定の鎖長を持つ多価電解質鎖からなることも可能であり、また多分散であり、異なる鎖長を持つ多価電解質からなっていてもよい。さらに、陰イオン性、陽イオン性又は双性イオン性側鎖官能基を持つ単量体が本発明の範囲内に含まれる。側鎖官能基は限定されるわけではないが、アミノ酸、アミノ酸誘導体、神経伝達物質、単糖、核酸、又はその組み合わせ及び化学的に修飾された誘導体に由来する。本発明の共役多価電解質は１本鎖官能基を含有してもよく、また２以上の異なる側鎖官能基を含んでもよい。異なるｐＨで荷電される陰イオン性又は陽イオン性の共役多価電解質の官能基は、これらの多価電解質誘導体を負又は正に荷電されたオリゴマー及びポリマーとの強力な多価電解質複合体を形成するのに適したものにする。さらに、イオン性基は異なる分子との多様な水素結合パターンを生成する。
【００２５】
ＩＩ  タンパク質
本発明の共役多価電解質は関心対象のタンパク質と相互作用する。これらの相互作用は共有結合なしに形成され、共役多価電解質及びタンパク質間の水素結合、静電相互作用及び非極性相互作用に基づく。前記タンパク質には、そのコンホメーション及び／又は自己集合／凝集を変化させる能力、特にアミロイド原線維を形成する能力があるであろう。タンパク質コンホメーションの改変は、共役多価電解質及びタンパク質の複合体化の前に起こってもよく、また共役多価電解質−タンパク質複合体内で起こってもよい。非常に多様なタンパク質が使用でき、タンパク質の選択は共役多価電解質の親和性によってのみ制限をうける。タンパク質は、関心対象の共役多価電解質と相互作用できるように化学的に修飾することもできる。多様な範囲のタンパク質を誘導体化する方法が周知である。例えば、極性基及び非極性基、又は水素結合する能力を有する基を含有するように、アミノ酸側鎖を容易に修飾することができる。タンパク質は、溶液中（実施例１〜４を参照されたい）、又は組織試料中（実施例５〜１３を参照されたい）にあってもよい。タンパク質のコンホメーション変化又は自己集合／凝集の検出を、水溶液中（実施例１〜４を参照されたい）、有機溶媒中、体液中、又は組織試料中（組織学的染色、実施例５〜１３を参照されたい）で行うこともできる。
【００２６】
ＩＩＩ  検出法
上記のように、本発明は、タンパク質のコンホメーション変化、特にアミロイド原線維の形成による、共役多価電解質の鎖内プロセス及び鎖間プロセスの改変の利用に基づく。これらの改変は、蛍光、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、放出光の消光、吸収、インピーダンス、屈折率、質量変化、粘弾特性、厚さの変化又は他の物理特性により観察することができる。共役多価電解質の主鎖のコンホメーション遷移、多価電解質鎖の分離及び凝集は、共役多価電解質の鎖内プロセス及び鎖間プロセスを改変するであろうし、例えば、２以上の異なる波長での放出光の強度比の変化として検出できる（実施例２〜４を参照されたい）。発光強度は蛍光光度計により記録でき、そして検出装置中の光子流が増すと、感度が高まりうる。これは、励起源としてレーザーを用いて達成できる。
【００２７】
蛍光変化はまた、蛍光顕微鏡又は共焦点顕微鏡を用いて検出することができる。励起フィルター又は発光フィルターの組み合わせを用いてもよく、ＣＣＤカメラ（実施例５〜１４を参照されたい）、ビデオカメラ、通常のカメラ又はポラロイドカメラにより、画像を記録することができる。次いで、画像は、コンピュータ上の画像プロセシングソフトウェア、画像相関分光（ＩＣＳ）又は他の手段により分析することができる。
【００２８】
インピーダンス分光法を用いて、インピーダンスの変化を検出することができる。本発明により、共役多価電解質を、導電性ポリマー・ヒドロゲル・マトリックス、例えば［ポリ［３，４−（エチレンジオキシ）チオフェン］／ポリ（スチレンスルホン酸）（ＰＥＤＯＴ／ＰＳＳ）］の内部に固定することができる。
【００２９】
次いで、抵抗、静電容量及びインダクタンスの変化を、共役多価電解質、又は水性環境中のタンパク質分子を用いて追跡することもできる。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により屈折率の微小な変化を検出することができる。屈折率の変化は、共役多価電解質の鎖内プロセス及び鎖間プロセスが、タンパク質のコンホメーション変化により改変された際に起こる。これらの改変により、多価電解質鎖の凝集も導くことができ、その改変は屈折率の変化として検出される。
【００３０】
水晶振動子マイクロバランス及び散逸（ＱＣＭ−Ｄ）は、感受性が高くて多用途の技術であり、液体中の分子の吸着層の吸着質量及び粘弾特性両方を測定する。タンパク質のコンホメーション変化による、共役多価電解質の鎖内プロセス及び鎖間プロセスの改変は、質量及び粘弾特性の変化を起こすこともできるため、ＱＣＭ−Ｄ又は他の技術により検出することができる。エリプソメトリー、画像化又は消光型（null）エリプソメトリーは、偏光した光を用いて試料の誘電特性を感知する光学技術であり、オングストローム・レベル未満で、厚さにおけるこれらの変化を検出するために用いられる。それゆえ、共役多価電解質の鎖内プロセス及び鎖間プロセスの改変を測定するために、これらの技術を用いることができる。
【００３１】
共役多価電解質を用いるタンパク質のコンホメーション変化の検出はまた、電気的方法及び電気化学的方法によってもできる。共役多価電解質のゲル又はネットワークは形成することができ、それゆえ、各ポリマー鎖がネットワークのすべての鎖と（間接的に）接触している三次元の物体が得られる。例えば発光特性が用いられる場合など、共役多価電解質が半導体状態にある場合は前記多価電解質の伝導率はかなり低く、これはゲル周囲の水性媒体のイオン伝導率と容易に区別することが多少困難である。したがって、ネットワークにおいて電気伝導を可能にする、感受性巨大分子の伝導性が極めて高いゲルを形成することが望ましい。金属製ポリマー及び高伝導率もたらす共役鎖のドーピングは、伝導率を高めるだけでなく、鎖の力学的特性及び配置も変化させ、それにより発光検出の場合には作用している機構が妨害される点が問題である。この問題の解決法は、１つの構成要素Ａが高い伝導率を提供し、そして別の構成要素Ｂがタンパク質相互作用を提供するような２構成要素のポリマーゲルを使用することである。これらの２つの化合物を適切な態様で化合すると、タンパク質の前記コンホメーション変化によるゲルの配置の変化を用いて、タンパク質のコンホメーション変化を検出することができる。構成要素Ａは、高度にドーピングされたポリマーの水性分散物であってもよく、共役多価電解質である構成要素Ｂを化合させてゲルを作製することもできる。２点又は４点プローブ法を用いて、これらのゲルのＤＣ又はＡＣ伝導率を測定することにより、若しくはインピーダンス分光により、タンパク質のコンホメーション変化におけるコンダクタンスの変化を追跡することができる。
【００３２】
共役多価電解質の鎖内プロセス及び鎖間プロセスは、タンパク質のコンホメーション変化により改変され、そして共役多価電解質の電気化学特性を変化させ、次いで、これを用いて、タンパク質のコンホメーション変化に関する電気化学検出装置を構築することができる。タンパク質の存在下で形成されるヒドロゲルの酸化還元電位の変化を用いて、タンパク質のコンホメーション変化を検出することができる。
【００３３】
上記方法はまた、マイクロアレイの形で実行して生物学的試料の組成物の「画像」を得ることもできる。
【００３４】
ＩＶ  共役ポリマー及びタンパク質の固定
共役多価電解質又はタンパク質を、シリコンウエハー、ガラス（例えばスライドガラス、ガラス・ビーズ、ガラス（ウエハー等）、シリコン・ゴム、ポリスチレン、ポリエチレン、テフロン（登録商標）、シリカゲル・ビーズ）、金、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯコーティング物質、例えばガラス又はプラスチック）、ろ紙（例えばナイロン、セルロース及びニトロセルロース）、標準的コピー紙又はその変型及び分離媒体又は他のクロマトグラフィー媒体を含むがこれらに限定されない、多様な固体支持体上に固定することもできる。共役多価電解質の固体支持体へのトランスファーは、以下に限定されるわけではないが、例えば、浸漬被覆、スピン・コーティング、密着焼付け、スクリーンプリンティング、インクジェット技術、吹き付け、ディスペンシング、及びソフト・リソグラフィー又はＢＩＡＣＯＲＥＴＭ（Biacore、スウェーデン・ウプサラ）系の使用によるマイクロ流体プリンティングを用いて達成することができる。
【００３５】
共役多価電解質の固定は、高温で固体支持体に物理的に接着させることにより、又はヒドロゲル・マトリックス中に捕捉することにより達成される。
本発明の共役多価電解質の固定は、使用容易性、装置（例えばアレイ又は平行ライン）への組立て、安定性、堅牢性、蛍光反応を改善すること、マイクロタイタープレートを用いたハイスループット・スクリーニング（ＨＴＳ）プロセス及び他の所望の特性へ適合させることが望まれる場合もある。
【００３６】
本発明のタンパク質を、共役多価電解質と共に（すなわち多価電解質溶液と混合して）固定することもできる。
タンパク質を固定する他の方法は、共役多価電解質の下又は上に前記タンパク質を配置することである。
【００３７】
共役多価電解質と共に混合したタンパク質の固体支持体へのトランスファーは、限定されるわけではないが、浸漬被覆、スピン・コーティング、密着焼付け、スクリーンプリンティング、インクジェット技術、吹き付け、ディスペンシング、及びソフト・リソグラフィーの使用によるマイクロ流体プリンティングにより達成することができる（実施例１４を参照されたい）。共役多価電解質の下にタンパク質を配置しようとする場合、上記のように多価電解質と共に混合する態様と同様、前記タンパク質を固体支持体にトランスファーする必要がある。共役多価電解質上へのタンパク質の配置は同じ態様であるが、多価電解質が固体支持体に固定した後に行う。
【００３８】
固体支持体への固定中の、本発明の共役多価電解質及びタンパク質の溶媒は、水、緩衝水溶液、メタノール、エタノール及びその組み合わせであってもよいがこれらに限定されない。この工程において他の種類の支持ポリマーを添加することもできる。
【００３９】
共役多価電解質及びタンパク質は、固体支持体上のポリマー・マトリックス内に捕捉することもでき、又は溶液中に浮遊させることもできる。共役多価電解質のゲル又はネットワークを形成することもできるが、この場合は、本発明の各共役多価電解質鎖は、ネットワーク中のすべての鎖と（間接的に）接触している。限定されるわけではないが、ポリ［３，４−（エチレンジオキシ）［チオフェン］／ポリ］（スチレンスルホン酸）（ＰＥＤＯＴ／ＰＳＳ）、ポリ（塩化ジアリルジメチルアンモニウム）（ＰＤＡＤＭＡＣ）、ポリ−４−ビニルピリジン（ＰＶＰｙ）、ポリ（ピロール）（ＰＰｙ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（アニリン）（ＰＡＮＩ）又はその組み合わせ等の他のポリマーと共役多価電解質を混合することにより、これらのポリマー・マトリックスを実現することができる。これらのポリマー・ブレンドを水中で膨張させることにより、生物学的起源のタンパク質を用いる際に関心がもたれうるヒドロゲルが実現する。本発明の共役多価電解質を、固体支持体に固定する前に、これらのポリマーと混合することもでき、またその後、トランスファーすることもできる。関心対象のタンパク質を、共役多価電解質と共に、又は次の工程でトランスファーすることもできる。所望の場合、必要な場合、又は他の理由がある場合には、マイクロアレイ又は平行ライン形式を用いることもできる。本発明の特定の態様において、このネットワーク又はヒドロゲル・アプローチを用いて、タンパク質のコンホメーション改変による、共役多価電解質鎖のコンホメーション変化及び凝集を検出することもできる。これらの改変はその後、吸収、蛍光、電気特性、インピーダンスを測定することにより、又は他の手段により検出することもできる。
【００４０】
Ｖ  アレイ又はライン
本発明によれば、各点又はラインで同じ又は異なる共役多価電解質の多数のアレイ又は平行ラインを生成することにより、単一のセンサー又は溶液に基づくアプローチの欠点を克服することもできる。アレイ又は平行ライン・アプローチにより、容易な態様で、１つ又は異なる共役多価電解質に対する１つ又は異なるタンパク質の平行分析を行うことができる。アレイ又はラインを用いる主な目的は、他の性質及び特性の中でも、使用容易性、携帯性、定量化、選択性を高めることである。このアプローチを用いて、多構成要素試料を測定し、そして部分的に選択的なセンサースポットを用いる能力を探究することもできる。これにより、同時に２以上の関心対象の試料を分析し、チップ上で濃度決定を行い、バックグラウンドを研究する機会が得られる。共役多価電解質及び／又はタンパク質を、任意の大きさの固体支持体上に、及び選択された任意のパターン（例えばアレイ、ライン、点、ポスト）中に固定することにより、小型で、携帯可能で、読取容易で、かつ解析可能な装置を構築することもできる。
【００４１】
多数のアレイを使用するには、程度の差はあれ、非常に多数のタンパク質を同時に検出することができなければならない。これはしばしば、マイクロアレイの形で行われ、この場合、多くの個々の検出装置要素（又はプローブ）が狭い表面積に統合されて、検出を大規模で並行に処理できるようになる。我々は、エラストマー刻印を用いた微小密着焼付けにより、共役多価電解質及び共役多価電解質／タンパク質複合体をプリントできることを示した（図２０）。共役多価電解質溶液をスポットすることにより、又は多価電解質溶液をインクジェット処理することにより、又は上記他の方法により、マイクロアレイ表面上へトランスファーを行うこともできる。これらの工程は、マルチピクセルのマイクロアレイを調製するのに必須である。
実験
【実施例１】
【００４２】
ＰＴＡＡを用いた、溶液中のウシ・インスリンのアミロイド形成の光学的検出
脱イオン水中に１．０ｍｇ  ＰＴＡＡ／ｍｌを含有するストック溶液を調製した。２５ｍＭ  ＨＣｌ中に３２０μＭウシ・インスリンを含有するストック溶液を水槽（６５℃）に入れて、アミロイド形成を誘導した。吸収測定のため、１０μｌのポリマー・ストック溶液を２５μｌのインスリン・ストック溶液と混合して２０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ７．０を用いて、最終体積１５００μｌに希釈した。５分間インキュベーションした後、吸収スペクトルを記録した。吸収スペクトル（図３）をＵＶ／ＶＩＳに関して、Perkin-Elmerラムダ９  ＵＶ／ＶＩＳ／ＮＩＲ分光光度計上で記録し、そして２日の期間中、試料を分析した。
【実施例２】
【００４３】
ＰＴＡＡを用いた、溶液中のウシ・インスリンのアミロイド形成の蛍光検出
脱イオン水中に１．０ｍｇ  ＰＴＡＡ／ｍｌを含有するストック溶液を調製した。２５ｍＭ  ＨＣｌ中に３２０μＭウシ・インスリンを含有するストック溶液を水槽（６５℃）に入れて、アミロイド形成を誘導した。発光測定のため、１０μｌのポリマー・ストック溶液を２５μｌのインスリン・ストック溶液と混合して２０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ７．０を用いて、最終体積１５００μｌに希釈した。５分間インキュベーションした後、発光スペクトルを記録した。ISA Jobin-Yvon spex FluoroMax-2装置上で発光スペクトルを記録し、そして１０時間の期間中、試料を分析した。４００ｎｍの励起で、すべてのスペクトルを記録した。アミロイド形成は、発光の減少、及びより長い波長への発光最大値のシフトにより検出する（図５）。５５０ｎｍ及び５８０ｎｍでの放出光の強度比をウシ・インスリンのアミロイド形成を検出に用いることもできる（図６）。
【実施例３】
【００４４】
ＰＯＮＴを用いた、溶液中のウシ・インスリンのアミロイド形成の蛍光検出
脱イオン水中に１．５ｍｇ  ＰＯＮＴ／ｍｌを含有するストック溶液を調製した。２５ｍＭ  ＨＣｌ中に３２０μＭウシ・インスリンを含有するストック溶液を水槽（６５℃）に入れて、アミロイド形成を誘導した。発光測定のため、１０μｌのポリマー・ストック溶液を２５μｌのインスリン・ストック溶液と混合して２５ｍＭ  ＨＣｌを用いて、最終体積１５００μｌに希釈した。５分間インキュベーションした後、発光スペクトルを記録した。発光スペクトルをISA Jobin-Yvon spex FluoroMax-2装置上で記録して１０時間の期間中試料を分析した。すべてのスペクトルは４００ｎｍの励起で記録した。アミロイド形成は、発光の増加、及びより短い波長への発光最大値のシフトにより検出する（図７）。５６０ｎｍ（鎖内プロセス）及び６００ｎｍ（鎖間プロセス）での放出光の強度比を用いて、ウシ・インスリンのアミロイド形成を検出することもできる（図８）。
【実施例４】
【００４５】
ＰＯＷＴを用いた、溶液中のウシ・インスリンのアミロイド形成の蛍光検出
脱イオン水中に１．０ｍｇ  ＰＯＷＴ／ｍｌを含有するストック溶液を調製した。２５ｍＭ  ＨＣｌ中に３２０μＭウシ・インスリンを含有するストック溶液を水槽（６５℃）に入れて、アミロイド形成を誘導した。発光測定のため、１０μｌのポリマー・ストック溶液を２５μｌのインスリン・ストック溶液と混合して２５ｍＭ  ＨＣｌを用いて、最終体積１５００μｌに希釈した。５分間インキュベーションした後、発光スペクトルを記録した。発光スペクトルは、ISA Jobin-Yvon spex FluoroMax-2装置上で記録して１０時間の期間中試料を分析した。すべてのスペクトルは、４００ｎｍの励起で記録した。アミロイド形成は、５４０ｎｍ（鎖内プロセス）及び６７０ｎｍ（鎖間プロセス）での放出光の強度比を取得することにより検出する（図９）。
【実施例５】
【００４６】
ＰＯＭＴでの膵臓組織の組織学的染色
膵臓由来の凍結切片を氷冷アセトン又はエタノール中で１０分間固定し、そして０．１５Ｍ  ＴＢＳ緩衝液で洗浄した。切片を、インキュベーション緩衝溶液、１００ｍＭ炭酸Ｎａ、ｐＨ１０中で１０分間平衡化した。平衡化に用いたのと同じ緩衝液とＰＯＭＴを混合して（１００μｌ中、０．２５μｇプローブ）切片に加えた。加湿チャンバー中でインキュベーションを２時間行い、そしてインキュベーション緩衝液を用いて、過剰なプローブ溶液を洗い流した。組織試料からの蛍光は、４０５／３０ｎｍバンドパス・フィルター（ＬＰ４５０）、４７０／４０ｎｍバンドパス・フィルター（ＬＰ５１５）及び５４６／１２ｎｍバンドパス・フィルター（ＬＰ５９０）を用いて、ＣＣＤカメラ（Axiocam ＨＲ）を装備したエピ蛍光顕微鏡（Zeiss Axiovert倒立顕微鏡Ａ２００ Mot）を用いて記録した。ＡＩＡＰＰ（アミロイド膵島アミロイドポリペプチド）との相互作用による、ＰＯＭＴの鎖内プロセス及び鎖間プロセスの改変は、ＰＯＭＴからの放出光の色及び強度の変化として見られる（図１０）。ＡＩＡＰＰは、２型糖尿病及び膵島細胞腺腫等の疾患と関連する。膵臓組織のあるものは多量の脂肪を含有した。クロロホルム：メタノール２：１混合物中でインキュベーションすることにより、これを除去した。
【実施例６】
【００４７】
ＰＯＮＴでの膵臓組織の組織学的染色
膵臓由来の凍結切片を氷冷アセトン又はエタノール中で１０分間固定して０．１５Ｍ  ＴＢＳ緩衝液で洗浄した。切片を、インキュベーション緩衝溶液、１００ｍＭグリシン、ｐＨ１．８中で１０分間平衡化した。平衡化に用いたのと同じ緩衝液とＰＯＮＴを混合して（１００μｌ中、０．２５μｇプローブ）、切片に加えた。加湿チャンバー中でインキュベーションを２時間行い、そしてインキュベーション緩衝液を用いて、過剰なプローブ溶液を洗い流した。組織試料からの蛍光は、４０５／３０ｎｍバンドパス・フィルター（ＬＰ４５０）、４７０／４０ｎｍバンドパス・フィルター（ＬＰ５１５）及び５４６／１２ｎｍバンドパス・フィルター（ＬＰ５９０）を用いて、ＣＣＤカメラ（Axiocam ＨＲ）を装備したエピ蛍光顕微鏡（Zeiss Axiovert倒立顕微鏡Ａ２００ Mot）を用いて記録した。ＡＩＡＰＰ（アミロイド膵島アミロイドポリペプチド）との相互作用による、ＰＯＮＴの鎖内プロセス及び鎖間プロセスの改変は、ＰＯＮＴからの放出光の色及び強度の変化として見られる（図１１）。ＡＩＡＰＰは、２型糖尿病及び膵島細胞腺腫等の疾患と関連する。膵臓組織のあるものは多量の脂肪を含有した。クロロホルム：メタノール２：１混合物中でインキュベーションすることにより、これを除去した。
【実施例７】
【００４８】
ＰＴＡＡでの膵臓組織の組織学的染色
膵臓由来の凍結切片を氷冷アセトン又はエタノール中で１０分間固定して０．１５Ｍ  ＴＢＳ緩衝液で洗浄した。切片を、インキュベーション緩衝溶液、１００ｍＭ炭酸Ｎａ、ｐＨ１０中で１０分間平衡化した。平衡化に用いたのと同じ緩衝液とＰＴＡＡを混合して（１００μｌ中、０．２５μｇプローブ）切片に加えた。加湿チャンバー中でインキュベーションを２時間行い、そしてインキュベーション緩衝液を用いて、過剰なプローブ溶液を洗い流した。組織試料からの蛍光は、４０５／３０ｎｍバンドパス・フィルター（ＬＰ４５０）、４７０／４０ｎｍバンドパス・フィルター（ＬＰ５１５）及び５４６／１２ｎｍバンドパス・フィルター（ＬＰ５９０）を用いて、ＣＣＤカメラ（Axiocam ＨＲ）を装備したエピ蛍光顕微鏡（Zeiss Axiovert倒立顕微鏡Ａ２００ Mot）を用いて記録した。ＡＩＡＰＰ（アミロイド膵島アミロイドポリペプチド）との相互作用による、ＰＴＡＡの鎖内プロセス及び鎖間プロセスの改変は、ＰＴＡＡからの放出光の色及び強度の変化として見られる（図１２）。ＡＩＡＰＰは、２型糖尿病及び膵島細胞腺腫等の疾患と関連する。膵臓組織のあるものは多量の脂肪を含有した。クロロホルム：メタノール２：１混合物中でインキュベーションすることにより、これを除去した。
【実施例８】
【００４９】
ＰＴＡＡでの副腎組織の組織学的染色
ホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋したアミロイド含有組織由来の切片（５μｍ）を、プラス・スライド（Histolab、スウェーデン・ヨーテボリ）上に設置してキシレン（２ｘ３０分間）、無水アルコール（２ｘ１０分間）、９５％アルコール（１０分間）及び７０％アルコール（１０分間）で脱パラフィン処理し、そして最後に２〜３分間、再蒸留水中でリンスした。切片を、インキュベーション緩衝溶液、１００ｍＭ炭酸Ｎａ、ｐＨ１０中で１０分間平衡化した。平衡化に用いたのと同じ緩衝液とＰＴＡＡを混合して（１００μｌ中、０．２５μｇプローブ）、切片に加えた。加湿チャンバー中でインキュベーションを２時間行い、そしてインキュベーション緩衝液を用いて、過剰なプローブ溶液を洗い流した。組織試料からの蛍光は、４０５／３０ｎｍバンドパス・フィルター（ＬＰ４５０）、４７０／４０ｎｍバンドパス・フィルター（ＬＰ５１５）及び５４６／１２ｎｍバンドパス・フィルター（ＬＰ５９０）を用いて、ＣＣＤカメラ（Axiocam ＨＲ）を装備したエピ蛍光顕微鏡（Zeiss Axiovert倒立顕微鏡Ａ２００ Mot）を用いて記録した。ＡＡ（アミロイドＡ）との相互作用による、ＰＴＡＡの鎖内プロセス及び鎖間プロセスの改変は、ＰＴＡＡからの放出光の色及び強度の変化として見られる（図１３）。ＡＡは、続発性アミロイドーシス及び家族性地中海熱等の疾患と関連する。
【実施例９】
【００５０】
ＰＴＡＡでの腎臓組織の組織学的染色
ホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋したアミロイド含有組織由来の切片（５μｍ）を、プラス・スライド（Histolab、スウェーデン・ヨーテボリ）上に設置してキシレン（２ｘ３０分間）、無水アルコール（２ｘ１０分間）、９５％アルコール（１０分間）及び７０％アルコール（１０分間）で脱パラフィン処理し、そして最後に２〜３分間、再蒸留水中でリンスした。切片を、インキュベーション緩衝溶液、１００ｍＭ炭酸Ｎａ、ｐＨ１０中で１０分間平衡化した。平衡化に用いたのと同じ緩衝液とＰＴＡＡを混合して（１００μｌ中、０．２５μｇプローブ）、切片に加えた。加湿チャンバー中でインキュベーションを２時間行い、そしてインキュベーション緩衝液を用いて、過剰なプローブ溶液を洗い流した。組織試料からの蛍光は、４０５／３０ｎｍバンドパス・フィルター（ＬＰ４５０）、４７０／４０ｎｍバンドパス・フィルター（ＬＰ５１５）及び５４６／１２ｎｍバンドパス・フィルター（ＬＰ５９０）を用いて、ＣＣＤカメラ（Axiocam ＨＲ）を装備したエピ蛍光顕微鏡（Zeiss Axiovert倒立顕微鏡Ａ２００ Mot）を用いて記録した。ＡＡ（アミロイドＡ）との相互作用による、ＰＴＡＡの鎖内プロセス及び鎖間プロセスの改変は、ＰＴＡＡからの放出光の色及び強度の変化として見られる（図１４）。ＡＡは、続発性アミロイドーシス及び家族性地中海熱等の疾患と関連する。
【実施例１０】
【００５１】
ＰＴＡＡでの肝臓組織の組織学的染色
ホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋したアミロイド含有組織由来の切片（５μｍ）を、プラス・スライド（Histolab、スウェーデン・ヨーテボリ）上に設置してキシレン（２ｘ３０分間）、無水アルコール（２ｘ１０分間）、９５％アルコール（１０分間）及び７０％アルコール（１０分間）で脱パラフィン処理し、そして最後に２〜３分間、再蒸留水中でリンスした。切片を、インキュベーション緩衝溶液、１００ｍＭ炭酸Ｎａ、ｐＨ１０中で１０分間平衡化した。平衡化に用いたのと同じ緩衝液とＰＴＡＡを混合して（１００μｌ中、０．２５μｇプローブ）切片に加えた。加湿チャンバー中でインキュベーションを２時間行い、そしてインキュベーション緩衝液を用いて過剰なプローブ溶液を洗い流した。組織試料からの蛍光は、４０５／３０ｎｍバンドパス・フィルター（ＬＰ４５０）、４７０／４０ｎｍバンドパス・フィルター（ＬＰ５１５）及び５４６／１２ｎｍバンドパス・フィルター（ＬＰ５９０）を用いて、ＣＣＤカメラ（Axiocam ＨＲ）を装備したエピ蛍光顕微鏡（Zeiss Axiovert倒立顕微鏡Ａ２００ Mot）を用いて記録した。ＡＬ（免疫グロブリン軽鎖アミロイド）との相互作用による、ＰＴＡＡの鎖内プロセス及び鎖間プロセスの改変は、ＰＴＡＡからの放出光の色及び強度の変化として見られる（図１５）。ＡＬは、骨髄腫関連又はマクログロブリン血症関連の原発性ＡＬアミロイドーシス等の疾患と関連する。
【実施例１１】
【００５２】
ＰＴＡＡでの腎臓組織の組織学的染色
ホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋したアミロイド含有組織由来の切片（５μｍ）を、プラス・スライド（Histolab、スウェーデン・ヨーテボリ）上に設置してキシレン（２ｘ３０分間）、無水アルコール（２ｘ１０分間）、９５％アルコール（１０分間）及び７０％アルコール（１０分間）で脱パラフィン処理し、そして最後に２〜３分間、再蒸留水中でリンスした。切片を、インキュベーション緩衝溶液、１００ｍＭ炭酸Ｎａ、ｐＨ１０中で１０分間平衡化した。平衡化に用いたのと同じ緩衝液とＰＴＡＡを混合して（１００μｌ中、０．２５μｇプローブ）、切片に加えた。加湿チャンバー中でインキュベーションを２時間行い、そしてインキュベーション緩衝液を用いて過剰なプローブ溶液を洗い流した。組織試料からの蛍光は、４０５／３０ｎｍバンドパス・フィルター（ＬＰ４５０）、４７０／４０ｎｍバンドパス・フィルター（ＬＰ５１５）及び５４６／１２ｎｍバンドパス・フィルター（ＬＰ５９０）を用いて、ＣＣＤカメラ（Axiocam ＨＲ）を装備したエピ蛍光顕微鏡（Zeiss Axiovert倒立顕微鏡Ａ２００ Mot）を用いて記録した。ＡＬ（免疫グロブリン軽鎖アミロイド）との相互作用によるＰＴＡＡの鎖内プロセス及び鎖間プロセスの改変は、ＰＴＡＡからの放出光の色及び強度の変化として見られる（図１６）。ＡＬは、骨髄腫関連又はマクログロブリン血症関連の原発性ＡＬアミロイドーシス等の疾患と関連する。
【実施例１２】
【００５３】
ＰＴＡＡでの腸内筋層の組織学的染色
ホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋したアミロイド含有組織由来の切片（５μｍ）を、プラス・スライド（Histolab、スウェーデン・ヨーテボリ）上に設置してキシレン（２ｘ３０分間）、無水アルコール（２ｘ１０分間）、９５％アルコール（１０分間）及び７０％アルコール（１０分間）で脱パラフィン処理し、そして最後に２〜３分間、再蒸留水中でリンスした。切片を、インキュベーション緩衝溶液、１００ｍＭ炭酸Ｎａ、ｐＨ１０中で１０分間平衡化した。平衡化に用いたのと同じ緩衝液とＰＴＡＡを混合して（１００μｌ中、０．２５μｇプローブ）、切片に加えた。加湿チャンバー中でインキュベーションを２時間行い、そしてインキュベーション緩衝液を用いて過剰なプローブ溶液を洗い流した。組織試料からの蛍光は、４０５／３０ｎｍバンドパス・フィルター（ＬＰ４５０）、４７０／４０ｎｍバンドパス・フィルター（ＬＰ５１５）及び５４６／１２ｎｍバンドパス・フィルター（ＬＰ５９０）を用いて、ＣＣＤカメラ（Axiocam ＨＲ）を装備したエピ蛍光顕微鏡（Zeiss Axiovert倒立顕微鏡Ａ２００ Mot）を用いて記録した。ＡＬ（免疫グロブリン軽鎖アミロイド）との相互作用によるＰＴＡＡの鎖内プロセス及び鎖間プロセスの改変は、ＰＴＡＡからの放出光の色及び強度の変化として見られる（図１７）。ＡＬは、骨髄腫関連又はマクログロブリン血症関連の原発性ＡＬアミロイドーシス等の疾患と関連する。
【実施例１３】
【００５４】
ＰＴＡＡでの脳組織の組織学的染色
ホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋したアミロイド含有組織由来の切片（５μｍ）を、プラス・スライド（Histolab、スウェーデン・ヨーテボリ）上に設置してキシレン（２ｘ３０分間）、無水アルコール（２ｘ１０分間）、９５％アルコール（１０分間）及び７０％アルコール（１０分間）で脱パラフィン処理し、そして最後に２〜３分間、再蒸留水中でリンスした。切片を、インキュベーション緩衝溶液、１００ｍＭ炭酸Ｎａ、ｐＨ１０中で１０分間平衡化した。平衡化に用いたのと同じ緩衝液とＰＴＡＡを混合して（１００μｌ中、０．２５μｇプローブ）、切片に加えた。加湿チャンバー中でインキュベーションを２時間行い、そしてインキュベーション緩衝液を用いて過剰なプローブ溶液を洗い流した。組織試料からの蛍光は、４０５／３０ｎｍバンドパス・フィルター（ＬＰ４５０）、４７０／４０ｎｍバンドパス・フィルター（ＬＰ５１５）及び５４６／１２ｎｍバンドパス・フィルター（ＬＰ５９０）を用いて、ＣＣＤカメラ（Axiocam ＨＲ）を装備したエピ蛍光顕微鏡（Zeiss Axiovert倒立顕微鏡Ａ２００ Mot）を用いて記録した。Ａ−ベータ斑との相互作用によるＰＴＡＡの鎖内プロセス及び鎖間プロセスの改変は、ＰＴＡＡからの放出光の色及び強度の変化として見られる（図１８）。Ａ−ベータ斑はアルツハイマー病等の疾患と関連する。
【実施例１４】
【００５５】
ＰＯＮＴを用いた、コラーゲン及びアミロイド・インスリン原線維の混合物の染色
Ｉ型コラーゲン（シロウサギ皮膚由来；Sigma）を、０．５Ｍ  ＨＡｃ中に溶解して最終濃度３２０μＭにした。この溶液２０μｌを２μｌのｆＢＩ溶液（３２０μＭ）と混合し、そして脱イオン水で、最終体積１００μｌに希釈した。混合物の小滴、２μｌを、顕微鏡スライド上に置き、そして乾燥させた後、スポットをＰＯＮＴ溶液（１．０ｍｇ  ｍｌ−１）の小滴（１μｌ）で１分間染色した。脱イオン水中で徹底的にリンスすることにより、過剰な未結合ＰＯＮＴを取り除いた。顕微鏡スライド上のＰＯＮＴ／タンパク質複合体からの蛍光は、４０５／３０ｎｍフィルター（ＬＰ４５０、曝露時間：１５００ｍｓ）を用いて、ＣＣＤカメラ（Axiocam ＨＲ）を装備したエピ蛍光顕微鏡（Zeiss Axiovert倒立顕微鏡Ａ２００  Mot）を用いて記録した。ＰＯＮＴ／コラーゲン複合体及びＰＯＮＴ／アミロイド・インスリン原線維複合体間の色の相違を図１９に示す。コラーゲンは、巨大分子らせん構造及び内在性らせん構造を有する線維性タンパク質であり、ＰＯＮＴとの相互作用により、前記多価電解質鎖が赤色を放出する配置を採るようになるであろう。アミロイド・インスリン原線維もまた巨大分子らせん構造を有するが、原線維は内在性βシート構造を有し、ＰＯＮＴとの相互作用により、前記多価電解質が緑色／黄色の光を放出する配置を採るようになるであろう。ＰＯＮＴから放出される色の相違は、２つのタンパク質の内在性コンホメーションであるヘリックス及びβシートの相違によるものである。
【実施例１５】
【００５６】
ＰＯＷＴのマイクロ密着焼付け
２構成要素のシリコン・ゴム（ポリ（ジメチルシロキサン）、ＰＤＭＳ）であるSylgard 184（Dow Corning、英国）は、ＰＯＷＴを固体表面にトランスファーするのに用いるエラストマー・スタンプを調製するために用いた。プレポリマー及び硬化剤を、製造者に提供される指示に従い混合する。次いで、これを、シリコンウエハー上で、ネガティブ・フォトレジストＳＵ−８（Micro Chem Inc.、米国マサチューセッツ州ニュートン）を構造要素として用いたフォトリソグラフィーにより調製したテンプレート上に注ぐ。硬化は、少なくとも２０分間１３０℃に加熱することにより達成される。構造物の高さは１８マイクロメートルであり、支持体は、各５％のアンモニア及びＨ２０２を含有する沸騰水性溶液（ＴＬ−１洗浄液）中で清浄化したＳｉウエハーであった。CleWinバージョン２．５１（WieWeb Software）中でテンプレートの配置を設計し、そしてＣｒマスクにトランスファーし、これをフォトリソグラフィー工程に用いた。テンプレートである、シリコンウエハー上のＳＵ−８構造を作製した後、シラン化（silanization）（ジメチル−ジクロロシラン）を行って、ＳＵ−８テンプレートの適切な表面エネルギーを得た。ＰＤＭＳスタンプを、水に基づくＰＯＷＴ溶液（５ｍｇ  ｍｌ−１）中で浸漬被覆する前に１０秒間、プラズマ処理した。Ｎ２を用いて、スタンプ上でポリマーを乾燥させた。ＴＬ−１洗浄液であらかじめ清浄化したガラス支持体上に、又は１０秒間酸素プラズマ処理により修飾したポリスチレン表面上に、２０〜２５分間、スタンプを下向きに置いた。スタンプを接触させる前に両方の支持体を湿らせた。スタンプを除去した後、ＰＯＷＴを部分的にガラスにトランスファーした（図２０）。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、双性イオン性ポリチオフェン誘導体である、ポリ（３−［（Ｓ）−５−アミノ−５−カルボキシル−３−オキサペンチル］−２，５−チオフェニレン塩酸）（ＰＯＷＴ）、陰イオン性ポリチオフェン誘導体である、ポリチオフェン酢酸（ＰＴＡＡ）、陽イオン性ポリチオフェン誘導体である、ポリ（３−［（Ｓ）−５−アミノ−５−メトキシカルボキシル−３−オキサペンチル］−２，５−チオフェニレン塩酸）（ＰＯＭＴ）、特定の鎖長を持つ双性イオン性ポリチオフェン誘導体である、ポリ（（３，３”−ジ［（Ｓ）−５−アミノ−５−カルボニル−３−オキサペンチル］−［２，２’；５’，２”］）−５，５”−テルチオフェニレン塩酸）（ＰＯＮＴ）、並びに特定の鎖長を持つチオフェン及びフェニレンの双性イオン性ココポリマー（cocopolymer）である、ポリ（（１，４−ジ（３−［（Ｓ）−５−アミノ−５−カルボニル−３−オキサペンチル］−チオフェン−２−イル）−ベンゼン）塩酸）（ｆ−ＰＯＮＴ）の化学構造を示す。
【図２】図２は、本発明の計画図を示す。
【図３】図３は、０μＭインスリン、５μＭ未変性ウシ・インスリン、又は５μＭアミロイド・ウシ・インスリンと８０μＭ  ＰＴＡＡ（単量体に基づく）を、各々２０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液ｐＨ７．０中で５分間インキュベーションした後の吸収スペクトルを示す。挿入図は、ＰＴＡＡ／未変性ウシ・インスリン（左）及びＰＴＡＡ／アミロイド・ウシ・インスリン（右）を含有するマイクロタイタープレート・ウェルを示す。
【図４】図４は、ウシ・インスリン（０．３ｍＭ、ｐＨ１．６、６５℃）においてアミロイドが形成される間の、２０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液、ｐＨ７．０中の５μＭウシ・インスリンのアリコットを用いた、８０μＭ  ＰＴＡＡ（単量体に基づく）の４３４ｎｍ及び４６３ｎｍの吸光強度の変化を示す。
【図５】図５は、０μＭタンパク質、５μＭ未変性ウシ・インスリン、５μＭアミロイド・ウシ・インスリン、５μＭ未変性ニワトリ・リゾチーム、又は５μＭアミロイド・ニワトリ・リゾチームと８０μＭ  ＰＴＡＡ（単量体に基づく）を、各々、２０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液ｐＨ７．０中で５分間インキュベーションした後の発光スペクトルを示す。すべての発光スペクトルを、４００ｎｍの励起で記録した。
【図６】図６は、ウシ・インスリン（０．３ｍＭ、ｐＨ１．６、６５℃）においてアミロイドが形成される間の、２０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液、ｐＨ７．０中の５μＭウシ・インスリンのアリコットを用いた、８０μＭ  ＰＴＡＡ（単量体に基づく）の５５０ｎｍ及び５８０ｎｍで放出される光の強度比の変化を示す。
【図７】図７は、０μＭインスリン、５μＭ未変性ウシ・インスリン、又は５μＭアミロイド・ウシ・インスリンと６．２μＭ  ＰＯＮＴを、各々、２０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液ｐＨ７．０中で５分間インキュベーションした後の発光スペクトルを示す。すべての発光スペクトルを、４００ｎｍの励起で記録した。
【図８】図８は、ウシ・インスリン（０．３ｍＭ、ｐＨ１．６、６５℃）においてアミロイドが形成される間の、２０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液、ｐＨ１．６中の５μＭインスリンのアリコットを用いた、６．２μＭ  ＰＯＮＴの５６０ｎｍ及び６００ｎｍでの放出光の強度比の変化を示す。
【図９】図９は、ウシ・インスリン（０．３ｍＭ、ｐＨ１．６、６５℃）においてアミロイドが形成される間の、２０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液、ｐＨ１．６中の５μＭインスリンのアリコットを用いた、３０μＭ  ＰＯＷＴ（単量体に基づく）の５４０ｎｍ及び６７０ｎｍでの放出光の強度比の変化を示す。
【図１０】図１０は、ＰＯＭＴで染色した膵臓組織の蛍光画像を示す。ＣＣＤカメラ（Axiocam ＨＲ）を装備したエピ蛍光顕微鏡（Zeiss Axiovert倒立顕微鏡Ａ２００ Mot）で蛍光を記録した。フィルター４０５／４７０／５４６ｎｍ（上部）及びフィルター５４６ｎｍ（下部）。ＡＩＡＰＰは、各々、桃色及び赤色である。
【図１１】図１１は、ＰＯＮＴで染色した膵臓組織の蛍光画像を示す。ＣＣＤカメラ（Axiocam ＨＲ）を装備したエピ蛍光顕微鏡（Zeiss Axiovert倒立顕微鏡Ａ２００ Mot）で蛍光を記録した。フィルター４０５／４７０／５４６ｎｍ（上部）及びフィルター５４６ｎｍ（下部）。ＡＩＡＰＰは、各々、桃色及び赤色である。
【図１２】図１２は、ＰＴＡＡで染色した膵臓組織の蛍光画像を示す。ＣＣＤカメラ（Axiocam ＨＲ）を装備したエピ蛍光顕微鏡（Zeiss Axiovert倒立顕微鏡Ａ２００ Mot）で蛍光を記録した。フィルター４０５／４７０／５４６ｎｍ（上部）及びフィルター５４６ｎｍ（下部）。ＡＩＡＰＰは、各々、桃色及び赤色である。
【図１３】図１３は、ＰＴＡＡで染色した副腎組織の蛍光画像を示す。ＣＣＤカメラ（Axiocam ＨＲ）を装備したエピ蛍光顕微鏡（Zeiss Axiovert倒立顕微鏡Ａ２００ Mot）で蛍光を記録した。発光フィルター５４６ｎｍは、ＡＡを赤色で示す。
【図１４】図１４は、ＰＴＡＡで染色した腎臓組織の蛍光画像を示す。ＣＣＤカメラ（Axiocam ＨＲ）を装備したエピ蛍光顕微鏡（Zeiss Axiovert倒立顕微鏡Ａ２００ Mot）で蛍光を記録した。発光フィルター５４６ｎｍは、ＡＡを赤色で示す。
【図１５】図１５は、ＰＴＡＡで染色した肝臓組織の蛍光画像を示す。ＣＣＤカメラ（Axiocam ＨＲ）を装備したエピ蛍光顕微鏡（Zeiss Axiovert倒立顕微鏡Ａ２００ Mot）で蛍光を記録した。フィルター４０５／４７０／５４６ｎｍ（上部）及びフィルター５４６ｎｍ（下部）。ＡＬは、各々、黄色／赤色及び赤色で示される。
【図１６】図１６は、ＰＴＡＡで染色した腎臓組織の蛍光画像を示す。ＣＣＤカメラ（Axiocam ＨＲ）を装備したエピ蛍光顕微鏡（Zeiss Axiovert倒立顕微鏡Ａ２００ Mot）で蛍光を記録した。フィルター４０５／４７０／５４６ｎｍ（上部）及びフィルター５４６ｎｍ（下部）。ＡＬは、各々、黄色／赤色及び赤色で示される。
【図１７】図１７は、ＰＴＡＡで染色した腸の筋層の蛍光画像を示す。ＣＣＤカメラ（Axiocam ＨＲ）を装備したエピ蛍光顕微鏡（Zeiss Axiovert倒立顕微鏡Ａ２００ Mot）で蛍光を記録した。フィルター４０５／４７０／５４６ｎｍ（上部）及びフィルター５４６ｎｍ（下部）。ＡＬは、各々、黄色及び赤色で示される。
【図１８】図１８は、ＰＴＡＡで染色した脳組織の蛍光画像を示す。ＣＣＤカメラ（Axiocam ＨＲ）を装備したエピ蛍光顕微鏡（Zeiss Axiovert倒立顕微鏡Ａ２００ Mot）で蛍光を記録した。発光フィルター５４６ｎｍは、Ａ−ベータ斑を赤色で示す。
【図１９】図１９は、ＰＯＮＴで染色したコラーゲン及びアミロイド・インスリン原線維の混合物の蛍光画像を示す。ＣＣＤカメラ（Axiocam ＨＲ）を装備したエピ蛍光顕微鏡（Zeiss Axiovert倒立顕微鏡Ａ２００ Mot）で蛍光を記録した。発光フィルター４７０ｎｍは、コラーゲン／ＰＯＮＴを赤色で、そしてアミロイド・インスリン原線維／ＰＯＮＴを黄色／緑色で示す。ＰＯＮＴから放出される色の相違は、２つのタンパク質の内因性のコンホメーション、らせん状及びβシートが相違するためである。
【図２０】図２０は、ＰＯＷＴのマイクロ密着焼付けを示す。１００ｘ１００μｍのポリスチレン正方形周囲２５μｍ幅の線を伴う、プラズマ・エッチングしたポリスチレン上の正方形ネット。反射光の光学顕微鏡。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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