(57)【要約】【課題】新たな抗酸化用組成物を提供することを課題とする。【解決手段】アスコルビン酸とアンペロプシンを含有する抗酸化用組成物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスコルビン酸とアンペロプシンを含有する抗酸化用組成物。
【請求項２】
アスコルビン酸９０質量部に対しアンペロプシンを０．５〜１０質量部含有する請求項１に記載の抗酸化用組成物。
【請求項３】
アンペロプシンが藤茶抽出物由来であることを特徴とする請求項１または２に記載の抗酸化用組成物。
【請求項４】
抗酸化作用が一重項酸素消去作用である請求項１〜３のいずれかに記載の抗酸化用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗酸化用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アンペロプシンは、藤茶に含有されるフラボノール化合物であり、ジヒドロミリセチンともよばれている。
アンペロプシンを含む植物である藤茶は、中国を主産地とするブドウ科蛇葡萄属に分類され、中国名を顕歯蛇葡萄という。学名は、Ampelopsis grossedentataである。この植物は、主には中国の広西、広東、雲南、貴州、湖南、湖北、江西、福建などの省並びに自治区に分布している。中国の広西、湖南などの省や自治区の壮族や瑶族の人々がこの茎および葉から作った飲料をお茶として常用しており（これを「藤茶」と呼んでいる）、また風邪、のどの痛みなどにも利用されている。アンペロプシンは、藤茶の示す各種生理活性や薬理活性、例えば肝臓疾患の治療作用（特許文献１）、リパーゼ阻害作用（特許文献２）、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用（特許文献３）、抗菌作用（特許文献４）、香料の劣化防止作用（特許文献５）、色素の褪色防止作用（特許文献６）等の作用や活性の本体として特定されている。
【０００３】
精製したアンペロプシンには強い抗酸化作用があることが知られている。非特許文献１には、純度が９８％であるジヒドロミリセチンはラットの心筋・肝・脳組織ホモジネートの中のマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の生成を抑制し、精製純度が高いほど、実験系統の中のＤＰＰＨフリーラジカルを減少させ、さらに、ジヒドロミルセチンは油脂のＭＤＡの生成を抑制し、純度（６０％〜９０％）の増加につれ抗酸化作用は強くなり、動物油と植物油には強い抗酸化作用があることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−０２６５８４号公報
【特許文献２】特開２００３−０１２５３６号公報
【特許文献３】特開２００２−１７３４２４号公報
【特許文献４】特開２００２−１５９５６６号公報
【特許文献５】特開２００４−０１８７５６号公報
【特許文献６】特開２００２−０６５２０１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】http://saitouboueki.com/new/fujicha/characteristic.html
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、アンペロプシンがアスコルビン酸の示す一重項酸素消去能を相乗的に増強することを見いだした。
本発明は、この知見に基づきなされたものであって、アスコルビン酸とアンペロプシンを含有する新たな抗酸化用組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の主な構成は以下の通りである。
（１）アスコルビン酸とアンペロプシンを含有する抗酸化用組成物。
（２）アスコルビン酸９０質量部に対しアンペロプシンを０．５〜１０質量部含有する（１）に記載の抗酸化用組成物。
（３）アンペロプシンが藤茶抽出物由来であることを特徴とする（１）または（２）に記載の抗酸化用組成物。
（４）抗酸化作用が一重項酸素消去作用である（１）〜（３）のいずれかに記載の抗酸化用組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、新たな抗酸化用組成物が提供される。この抗酸化用組成物は、アスコルビン酸の示す一重項酸素消去作用を増強し、抗酸化作用を発揮する。またアンペロプシンを含有することで抗酸化効果が増強されるため、アスコルビン酸の使用量を低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＥＳＲ測定結果から、一重項酸素消去有効濃度を求める近似式を得るためのプロットの模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、アスコルビン酸とアンペロプシンを含有する抗酸化用組成物に係る発明である。
【００１１】
アンペロプシンは、下記の式で表される。
【００１２】
【化１】
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【００１３】
本発明に用いるアンペロプシンは、例えば、藤茶（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ  ｇｒｏｓｓｅｄｅｎｔａｔａ）、大叶蛇葡萄（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ  ｍｅｇａｌｏｐｈｙｌｌａ）、広東蛇葡萄（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ  ｃａｎｔｏｎｉｅｎｓｉｓ）、ケンポナシ（Ｈｏｖｅｎｉａ  ｄｕｌｃｉｓ）、オノエヤナギ（Ｓａｌｉｘ  ｓａｃｈａｌｉｎｅｎｓｉｓ）、ヨレハマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔａ）、Ｅｒｙｔｈｒｏｐｈｌｅｕｍ  ａｆｒｉｃａｎｕｍ及びカツラ（Ｃｅｒｃｉｄｉｐｈｙｌｌｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）から選ばれる植物の抽出物から単離精製することができる。これらの中でも、藤茶が好ましい。
【００１４】
具体的には、Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ属植物である藤茶（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ  ｇｒｏｓｓｅｄｅｎｔａｔａ）から、下記のようにしてアンペロプシンを得ることができる。
すなわち、乾燥させた藤茶の枝葉部を含水エタノールで抽出した抽出物を濃縮し、例えば多孔性樹脂（ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ−２０）を用いたカラムクロマトグラフィーにかけ、８０容量％含水メタノールで溶出される分画にアンペロプシンが得られる。これを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーや再結晶により、更に精製することができる。精製されたアンペロプシンは、試薬としても販売されており、これを用いることもできる。
【００１５】
藤茶からアンペロプシンを得るためには以下のような操作を行う。
乾燥した藤茶の葉又は茎の粉砕物又は粉末を抽出原料とし、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合溶媒に投入し、室温乃至溶媒の沸点以下の温度で任意の装置を用いて抽出することにより得ることができる。
【００１６】
抽出に用いる有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、イソプロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられる。
また、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。なお、水と親水性有機溶媒との混合系溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して３０〜９０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１０〜４０質量部、多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１０〜９０質量部添加することが好ましい。
【００１７】
抽出溶媒を満たした処理槽に、藤茶の乾燥・粉砕物を投入し、必要に応じて時々撹拌しながら、３０分〜２時間静置して可溶性成分を溶出した後、ろ過して固形物を除去し、この抽出液から抽出溶媒を留去し、乾燥することにより抽出物が得られる。抽出溶媒量は、抽出原料の通常５〜１５倍量（質量比）であることが好ましく、抽出条件は、抽出溶媒として水を用いた場合には、通常５０〜９５℃で１〜４時間程度である。また、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いる場合には、通常４０〜８０℃で３０分〜４時間程度である。
【００１８】
得られた抽出液から抽出溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られる。更に乾燥すれば、固形の抽出物が得られる。本発明においては、アンペロプシンの含有量が１０質量％以上、好ましくは２０質量％以上であれば、上記抽出液又はその濃縮液の状態であっても良い。これらは、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂、液―液向流分配などの方法により精製してから用いても構わない。
したがって、上記の藤茶から抽出しアンペロプシンの濃度を高めた抽出物も本発明の組成物として使用可能である。
【００１９】
組成物中のアンペロプシンの含有量は、ＨＰＬＣなど公知の分析方法で分析することができる。定量方法の概略は次のとおりである。
・試料溶液の調整
ＨＰＬＣ法で調整したメンブランフィルターでのろ過前に試料溶液（２４μｇ／ｍｌ）を３０％メタノール（０．５％アスコルビン酸含有）にて正確に５倍希釈し、０．２μｍのメンブランフィルターでろ過したものを標準溶液とする。
【００２０】
・ＨＰＬＣ法試料調整
試料約３０ｍｇを精秤し、３０％メタノール（０．５％アスコルビン酸含有）を加えて超音波にて溶解し、正確に５０ｍＬとする。この溶液１ｍＬを３０％メタノール（０．５％アスコルビン酸含有）にて２５ｍＬに正確に希釈し、０．４５μｍのメンブランフィルターでろ過したものを試料溶液とする（２４μｇ／ｍｌ）。
【００２１】
・ 標準溶液の調整
ＨＰＬＣ法で調整した８μｇ／ｍｌ標準溶液を３０％メタノール（０．５％アスコルビン酸含有）にて正確に５倍希釈し、１．６μｇ／ｍｌ標準溶液を調整する。これを３０％メタノール（０．５％アスコルビン酸含有）にて正確に５倍希釈し、０．３２μｇ／ｍｌ標準溶液を調整する。８μｇ／ｍｌ標準溶液、１．６μｇ／ｍｌ標準溶液、０．３２μｇ／ｍｌ標準溶液を０．２μｍのメンブランフィルターでろ過し、標準溶液とする。
【００２２】
・ＨＰＬＣ法標準液の調整
標準品１０．００ｍｇを精秤し、メタノール（０．５％アスコルビン酸含有）を適量加えて超音波処理して溶解し、メタノール（０．５％アスコルビン酸含有）を加えて正確に２５ｍＬとする。その溶液を５ｍｌとり１２．５％メタノール（０．５％アスコルビン酸含有）を加えて正確に２５ｍｌとする。その溶液を４ｍｌとり３０％メタノール（０．５％アスコルビン酸含有）を加えて正確に２０ｍｌとし、１６μｇ／ｍＬ標準溶液を調整する。これを正確に２倍希釈し、８μｇ／ｍｌ標準溶液とする。これを正確に２倍希釈し、４μｇ／ｍｌ標準溶液とした。０．４５μｍのメンブランフィルターでろ過したものを標準溶液とする。
【００２３】
・測定条件
LC装置：ACQUITY UPLC (Waters)
MS装置：TOD(Waters)
カラム：ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm, 100x2.1 mm i.d., Waters)
カラム温度：40 ℃
移動相：A) 0.1% formic acid/Ultra Pure Water,
B) 0.1% formicacid/MeCN
10％B溶液で、7分間イソクラティック分析。その後カラム洗浄のため、2分間かけてリニアで90%B溶液まで上げ、0.5分で10%B溶液にリニアで戻し、4分間10%B溶液で再安定化させてから次の分析を実施する。
流速：0.4 mL/min
注入量：2.0 μL
検出器：UV 290 nm, MS(M.w. 319.0434)
MS条件：Polarity ES-(capillary voltage 1.8 kV, sampling cone 40 V, extraction cone 4.0 kV, cone Voltage: 20 V, source temp. 150℃, desolvation temp. 400℃, cone gas flow 50 L/h, desolvation gas flow 1000 L/h, Mass scan range: 100-1000 Da, Scan time: 0.2 sec-1.
MRM condition：precursor ion>production：318.83>192.90
検出感度の点からPolarity ES-を使用した。
オートサンプラー：5℃
【００２４】
・算出方法
標準品成績書に記載の純度（HPLC純度・水分値）で補正し算出する。
【００２５】
本発明の抗酸化用組成物は、アンペロプシンとアスコルビン酸を必須の構成成分とする。アスコルビン酸は、Ｌ−アスコルビン酸が好ましい。Ｌ−アスコルビン酸の塩や誘導体であっても良い。本発明の組成物は、賦形剤やその他成分を添加して錠剤、カプセル剤、液剤、あるいは粉末の製剤とすることができる。このように製剤化した組成物は、生体内に発生する一重項酸素消去効果を有するサプリメント剤や健康食品として利用することができる。
【００２６】
本発明の組成物にあっては、Ｌ−アスコルビン酸９０質量部に対してアンペロプシンを０．５〜１０質量部配合するが、好ましくは、Ｌ−アスコルビン酸９０質量部に対してアンペロプシンを１質量部配合すると、効率的にアスコルビン酸の示す一重項酸素消去能を増強する。
【００２７】
一重項酸素は励起状態の酸素であって、生体内においては、紫外線を浴びたりすることにより体内の色素が増感剤の役目をして一重項酸素が発生する。このため効率よく一重項酸素を消去することが重要である。
【実施例】
【００２８】
以下に試験例を示し、本発明を説明する。
１．試験方法
評価は、ＥＳＲ（電子スピン共鳴）測定によって行った。試験対象物はアスコルビン酸及び藤茶より精製したアンペロプシンである。
【００２９】
（１）使用装置
＜ＥＳＲ測定条件＞
ＥＳＲ−ＪＥＳ−ＲＥ１Ｘ：日本電子製を用いた。
ＥＳＲスペクトルは、試料中の有機ラジカルを示している。
使用したＥＳＲの測定条件を示す。
共鳴周波数：９．４０ＧＨ
出力：４．０ｍＷ
磁場変調：１００ｋＨ
観測磁場：３３５．５±５ｍＴ
測定時間：１．０ｍｉｎ
変調幅：０．１ｍＴ
増幅率：５００
応答時間：０．１ｓｅｃ
【００３０】
＜ＬＥＤ光発生装置＞
ＳＬＬ−４１００Ｓ  ＲＧＢ（（有）シマテック製）を用いた。
【００３１】
（２）一重項酸素消去能の測定手順
一検体における試薬の添加量を以下に示す。各評価検体は適宜、４０％（ｖ／ｖ）ＤＭＦ溶媒で希釈して評価検体とした。
下記に示す１）〜４）の順番で試薬溶液を加えていった。
１）評価検体  溶媒：４０％（ｖ／ｖ）Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１００μＬ
２）生理食塩水  ２０μＬ
３）４−ＯＨ  ＴＥＭＰ  溶媒：４０％（ｖ／ｖ）ＤＭＦ１００ｍＭ、４０μＬ（終濃度２０ｍＭ）
４）ローズベンガル溶媒：４０％（ｖ／ｖ）ＤＭＦ１００μＭ、４０μＬ（終濃度２０μＭ）
評価濃度１点につき、ｎ＝３を設定した。全量２００μｌを９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに滴下し、緑色光（λｍａｘ：５２５ｎｍ）照射によるローズベンガルの光増感反応によって反応する一重項酸素と、溶液中に存在している４−ＯＨ  ＴＥＭＰ（２，２，６，６−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｏｌ）とのａｄｄｕｃｔ（≒付加体）［２，２，６，６−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−４−ｈｙｄｏｘｙ−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌｏｘｙ（４−ＯＨ  ＴＥＭＰＯ）ｒａｄｉｃａｌ］についてＥＳＲ（電子スピン共鳴）測定をおこなった。光照射装置はＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ  Ｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｄｉｏｄｅ  Ｇｒｅｅｎ（ΙＭＡＸ＝５３０ｎｍ）光源のＳＬＬ−４１００Ｓ  ＲＧＢ（（有）シマテック製）を用い、照射時間２０ｍｉｎのＥＳＲシグナル強度（Ｓｎ）から次の計算式で一重項酸素消去率を求めた。
一重項酸素消去率（％）＝１００−１００×（Ｓｎ（検体濃度Ｘ）／Ｓｎ（コントロール）
【００３２】
（３）データ数値化
フリーラジカル解析システム  Ｗｉｎ−ＲＡＤ（ラジカルリサーチ製）を用いてＥＳＲスペクトルのデータ取り込みとシグナル比Ｓｎ（有機ラジカル／Ｍｎマーカーのシグナル比）の数値化を行った。
【００３３】
（４）データの解析方法
各検体の各濃度における消去能％に基づき、ＩＣ５０（５０％消去濃度）およびＩＣ３０（３０％消去濃度）を算出した。
［各検体における抗酸化成分濃度］  ｖｓ  ［Ｆ／１−Ｆ］  
＊Ｆ／（１−Ｆ）・・・（Ｆ＝（１／１００）×Ｑ、Ｑは一重項酸素消去率）
ｘ軸→［抗酸化成分濃度］  ｙ軸→［Ｆ／１−Ｆ］をプロットして、ｙ＝１に対するｘ値（濃度）からＩＣ５０（５０％消去）濃度を、ｙ＝０．４２９に対するｘ値（濃度）からＩＣ３０（３０％消去）濃度を求めた。１点の濃度についてｎ＝３で測定し、最低３点の濃度における結果から導かれた近似式に基づいて５０％消去濃度や３０％消去濃度を算出した。図１にアスコルビン酸の一重項酸素消去能を求めるための検量線を図示する。
【００３４】
２．測定結果
（１）ＩＣ３０値
アンペロプシン及びアスコルビン酸のＩＣ３０（３０％消去濃度）は下記の表１の値を示した。
【００３５】
【表１】
2019112379.tif 000004
【００３６】
アンペロプシン及びアスコルビン酸は、いずれも強い一重項酸素消去作用を示した。
【００３７】
（２）アスコルビン酸とアンペロプシン併用による一重項酸素消去能
アスコルビン酸０．００１４７質量％に対して、アンペロプシンを１／９０の濃度（０．００００１６３質量％）になるように添加した場合の一重項酸素消去能を測定した結果を下記の表２に示す。
【００３８】
【表２】
2019112379.tif 000005
【００３９】
表２に示すように、アンペロプシン単独では一重項酸素消去能を示さない濃度である０．００００１６３質量％の添加で、アンペロプシン/アスコルビン酸併用は６８．４０％という高い一重項酸素消去能を示した。これはアンペロプシンの添加に由来する効果であるものと考えられた。すなわち、アンペロプシンとアスコルビン酸は共存することで、単独で用いる場合から予測できない高い抗酸化能を示すことが明らかである。したがってアスコルビン酸に微量のアンペロプシンを併用した場合、抗酸化剤としてのアスコルビン酸配合量を大幅に減量することが可能となる。
【図１】
2019112379.tif 000006