(57)【要約】      （修正有）【課題】イチゴの病原ウイルスの検定方法としてより感度の高い方法の提供を可能とする、イチゴの病原ウイルス由来の核酸をＬＡＭＰ法により特異的に増幅するためのプライマーセットを提供する。【解決手段】ＬＡＭＰ法により、ＳＭＹＥＶ、ＳＭｏＶ及びＳＶＢＶから選択される１つ以上のイチゴの病原ウイルス由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットであって、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマーが夫々特定の配列により示されるポリヌクレオチド等であるセットのいずれか１つ以上を含むプライマーセット、並びに上記プライマーセットを用いて、検体から抽出された核酸を鋳型にＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行うことを含むイチゴの病原ウイルスの検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＡＭＰ法により、イチゴマイルドイエローエッジウイルス（ＳＭＹＥＶ）、イチゴモットルウイルス（ＳＭｏＶ）およびイチゴベインバンディングウイルス（ＳＶＢＶ）からなる群より選択される１つ以上のイチゴの病原ウイルス由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットであって、以下の（１）〜（３）からなる群より選択される１つ以上を含むプライマーセット：
（１）配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭＹＥＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチド、もしくは配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭＹＥＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭＹＥＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチド、もしくは配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭＹＥＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー、または、
前記のＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、およびＢ３プライマーをそれぞれ構成するポリヌクレオチドの配列の相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、およびＢ３プライマー；
（２）配列番号７の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号７の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭｏＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号８の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは、配列番号８の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭｏＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号９の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号９の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭｏＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号１０の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは、配列番号１０の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭｏＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー、または、
前記のＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、およびＢ３プライマーをそれぞれ構成するポリヌクレオチドの配列の相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、およびＢ３プライマー；
（３）配列番号１３の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号１３の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＶＢＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号１４の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号１４の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＶＢＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号１５の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは、配列番号１５の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＶＢＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号１６の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号１６の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＶＢＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー、または、
前記のＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、およびＢ３プライマーをそれぞれ構成するポリヌクレオチドの配列の相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、およびＢ３プライマー。
【請求項２】
前記（１）がさらに、
配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭＹＥＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、および
配列番号６の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは、配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭＹＥＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＬＢプライマーから選択される１つ以上、または、
前記のＬＦプライマーおよびＬＢプライマーをそれぞれ構成するポリヌクレオチドの配列の相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマーおよびＬＢプライマーから選択される１つ以上を含み、
前記（２）がさらに、
配列番号１１の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは、配列番号１１の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭｏＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、および
配列番号１２の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは、配列番号１２の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭｏＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＬＢプライマー
から選択される１つ以上、または、
前記のＬＦプライマーおよびＬＢプライマーをそれぞれ構成するポリヌクレオチドの配列の相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマーおよびＬＢプライマーから選択される１つ以上を含み、ならびに
前記（３）がさらに、
配列番号１７の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは、配列番号１７の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＶＢＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、および
配列番号１８の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは、配列番号１８の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＶＢＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＬＢプライマー
から選択される１つ以上、または、
前記のＬＦプライマーおよびＬＢプライマーをそれぞれ構成するポリヌクレオチドの配列の相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマーおよびＬＢプライマーから選択される１つ以上を含む請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
前記（１）〜（３）がいずれもＬＦプライマーおよびＬＢプライマーの双方を含む請求項２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
イチゴマイルドイエローエッジウイルス（ＳＭＹＥＶ）由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットであり、前記プライマーセットが前記（１）を含む請求項１〜３のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項５】
イチゴモットルウイルス（ＳＭｏＶ）由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットであり、前記プライマーセットが前記（２）を含む請求項１〜３のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項６】
イチゴベインバンディングウイルス（ＳＶＢＶ）由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットであり、前記プライマーセットが前記（３）を含む請求項１〜３のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項７】
前記（１）〜（３）をいずれも含む請求項１〜３のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項８】
イチゴの病原ウイルスの検出方法であって、
検体から核酸を抽出すること、
請求項１〜７のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて、前記核酸を鋳型にＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行うこと、
増幅産物があると判断された場合に検体にイチゴの病原ウイルスが存在すると判断することを含む、検出方法。
【請求項９】
イチゴの病原ウイルスの検出方法であって、
検体から核酸を抽出すること、
請求項７に記載のプライマーセットを用いて、前記核酸を鋳型にＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行うこと、
前記増幅反応後のＤＮＡの二本鎖への会合曲線解析により、検体におけるイチゴの病原ウイルスの存在の有無および存在するイチゴの病原ウイルスの種類の数を判断することを含む、検出方法。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のプライマーセット、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、ｄＮＴＰｓ、および緩衝液を含む、イチゴの病原ウイルスの検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イチゴの病原ウイルス由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットおよびイチゴの病原ウイルスの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イチゴの病原ウイルスとしては国内において、イチゴマイルドイエローエッジウイルス（ＳＭＹＥＶ）、イチゴモットルウイルス（ＳＭｏＶ）、およびイチゴベインバンディングウイルス（ＳＶＢＶ）が確認されている。これらウイルスそれぞれが単独感染しても、苗の草勢は健全苗と変わらず、病徴は明確に現れない。しかし、重複感染すると草丈が低くなり、株が矮化する。さらにイチゴ果実が肥大せず小さくなり、くず果が多くなるので、果実の価値が著しく低下する。親株が感染した場合、ランナーの発生が少なくなり、生産性に悪影響を及ぼす。ウイルスフリーのイチゴ苗の作製が茎頂培養技術によって既に確立されているが、培養後の検定が求められる。
【０００３】
イチゴの病原ウイルスの検定方法としては、従来から小葉接ぎ木法が知られているが、検定に長期間を要するという問題があった。
非特許文献１においては、イチゴの病原ウイルスの検定方法としてＰＣＲ法を利用した遺伝子診断方法が報告されている。この方法は、接ぎ木作業のような熟練を要せず、検出時間も大幅に短縮されるため、実用化されている。さらに近年、別の遺伝子診断方法として、ＬＡＭＰ法を利用した方法も報告されている（非特許文献２および３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  Ｖｏｌｕｍｅ  １１１，  Ｉｓｓｕｅ  ２，  Ａｕｇｕｓｔ ２００３, Ｐａｇｅｓ ８５-９３
【非特許文献２】平成２０年度北海道農業研究成果情報(http://www.naro.affrc.go.jp/org/harc/seika/h20/09.06/0105/main.htm)
【非特許文献３】Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ Ｓｉｎｉｃａ, ２０１５, ４８(３), ６１３-６２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、イチゴの病原ウイルスの検定方法としてより感度の高い方法の提供を課題とするものである。より具体的には、本発明は、上記の方法に利用できるイチゴの病原ウイルス由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ＬＡＭＰ法はＰＣＲ法において必要とされる高額機器が不要であり、処理時間も短いという利点がある。本発明者らは、ＬＡＭＰ法に用いるプライマーを種々検討していたところ、既知のＬＡＭＰ法に基づく方法と比較してイチゴの病原ウイルスの感度を向上させることができるプライマーセットを見出した。
本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００７】
即ち、本発明は以下＜１＞〜＜１０＞を提供するものである。
＜１＞ＬＡＭＰ法により、イチゴマイルドイエローエッジウイルス（ＳＭＹＥＶ）、イチゴモットルウイルス（ＳＭｏＶ）およびイチゴベインバンディングウイルス（ＳＶＢＶ）からなる群より選択される１つ以上のイチゴの病原ウイルス由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットであって、以下の（１）〜（３）からなる群より選択される１つ以上を含むプライマーセット：
（１）配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭＹＥＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチド、もしくは配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭＹＥＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭＹＥＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチド、もしくは配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭＹＥＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー、または、
上記のＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、およびＢ３プライマーをそれぞれ構成するポリヌクレオチドの配列の相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、およびＢ３プライマー；
（２）配列番号７の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号７の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭｏＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号８の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは、配列番号８の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭｏＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号９の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号９の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭｏＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号１０の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは、配列番号１０の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭｏＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー、または、
上記のＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、およびＢ３プライマーをそれぞれ構成するポリヌクレオチドの配列の相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、およびＢ３プライマー；
（３）配列番号１３の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号１３の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＶＢＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号１４の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号１４の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＶＢＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号１５の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは、配列番号１５の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＶＢＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号１６の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号１６の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＶＢＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー、または、
上記のＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、およびＢ３プライマーをそれぞれ構成するポリヌクレオチドの配列の相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、およびＢ３プライマー。
【０００８】
＜２＞上記（１）がさらに、
配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭＹＥＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、および
配列番号６の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは、配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭＹＥＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＬＢプライマーから選択される１つ以上、または、
上記のＬＦプライマーおよびＬＢプライマーをそれぞれ構成するポリヌクレオチドの配列の相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマーおよびＬＢプライマーから選択される１つ以上を含み、
上記（２）がさらに、
配列番号１１の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは、配列番号１１の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭｏＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、および
配列番号１２の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは、配列番号１２の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭｏＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＬＢプライマー
から選択される１つ以上、または、
上記のＬＦプライマーおよびＬＢプライマーをそれぞれ構成するポリヌクレオチドの配列の相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマーおよびＬＢプライマーから選択される１つ以上を含み、ならびに
上記（３）がさらに、
配列番号１７の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは、配列番号１７の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＶＢＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、および
配列番号１８の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは、配列番号１８の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＶＢＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＬＢプライマー
から選択される１つ以上、または、
上記のＬＦプライマーおよびＬＢプライマーをそれぞれ構成するポリヌクレオチドの配列の相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマーおよびＬＢプライマーから選択される１つ以上を含む＜１＞に記載のプライマーセット。
【０００９】
＜３＞上記（１）〜（３）がいずれもＬＦプライマーおよびＬＢプライマーの双方を含む＜２＞に記載のプライマーセット。
＜４＞イチゴマイルドイエローエッジウイルス（ＳＭＹＥＶ）由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットであり、上記プライマーセットが上記（１）を含む＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載のプライマーセット。
＜５＞イチゴモットルウイルス（ＳＭｏＶ）由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットであり、上記プライマーセットが上記（２）を含む＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載のプライマーセット。
＜６＞イチゴベインバンディングウイルス（ＳＶＢＶ）由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットであり、上記プライマーセットが上記（３）を含む＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載のプライマーセット。
＜７＞上記（１）〜（３）をいずれも含む＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載のプライマーセット。
【００１０】
＜８＞イチゴの病原ウイルスの検出方法であって、
検体から核酸を抽出すること、
＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載のプライマーセットを用いて、上記核酸を鋳型にＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行うこと、
増幅産物があると判断された場合に検体にイチゴの病原ウイルスが存在すると判断することを含む、検出方法。
＜９＞イチゴの病原ウイルスの検出方法であって、
検体から核酸を抽出すること、
＜７＞に記載のプライマーセットを用いて、上記核酸を鋳型にＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行うこと、
上記増幅反応後のＤＮＡの二本鎖への会合曲線解析により、検体におけるイチゴの病原ウイルスの存在の有無および存在するイチゴの病原ウイルスの種類の数を判断することを含む、検出方法。
＜１０＞＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載のプライマーセット、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、ｄＮＴＰｓ、および緩衝液を含む、イチゴの病原ウイルスの検出用キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、ＬＡＭＰ法によりイチゴの病原ウイルス由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットが提供される。このプライマーセットを用いて、イチゴの病原ウイルスをより高い感度で検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーと標的領域（ゲノムＲＮＡの例）との位置関係を示す図である。
【図２】ＳＭＹＥＶ、ＳＭｏＶ、およびＳＶＢＶ由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットを用いてウイルスの同時検出を行った例を示す写真である。
【図３】ＳＭＹＥＶ、ＳＭｏＶ、およびＳＶＢＶ由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法による増幅を行った増幅産物の会合曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について更に詳しく述べる。
本明細書中において、核酸の塩基配列中のＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃは、デオキシリボヌクレオチド中のアデニン塩基、グアニン塩基、チミン塩基、シトシン塩基を示す。また、本明細書中で、「／」を用いて複数の塩基が記載されているときは、記載されているいずれの塩基でもよいことを示し、例えば「Ｃ／Ｔ」と記載されているときは、シトシン塩基であってもチミン塩基であってもよいことを示す。
【００１４】
ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ-Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ)法は、Ｎｏｔｏｍｉらによって開発され、日本特許第３３１３３５８号公報、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, ２８, ｅ６３, ２０００、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ, ２９０, １１９５-１１９８, ２００２、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, ４７, Ｎｏ.９, １７４２-１７４３,２００１に報告されている核酸の増幅方法である。一般的に、ＬＡＭＰ法は、ＰＣＲを用いた方法に比べ増幅効率が優れていると共に、サンプル中の不純物の影響も受けにくい。そのため、簡便なサンプルの前処理で目的の核酸の増幅を行うことが可能である。
【００１５】
本明細書において「ＬＡＭＰ法」は、ＲＴ−ＬＡＭＰ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を含む意味で用いられる。ＲＴ−ＬＡＭＰ法においては、逆転写反応とＬＡＭＰ反応を同時に行うことによってＲＮＡを鋳型に核酸の増幅を行う。
【００１６】
＜ＬＡＭＰ法に用いるプライマー＞
ＬＡＭＰ法におけるプライマーおよびプライマー設計について、以下説明する。
ＬＡＭＰ法に用いられるプライマーセットは、少なくとも、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーを含む。図１は、ＲＴ−ＬＡＭＰを行う場合の、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーとウイルスのゲノムＲＮＡの標的領域との位置関係を示した図である。
ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーは、各々二つの領域を含む。即ち、ＦＩＰはＦ１ｃとＦ２を含み、ＢＩＰはＢ２とＢ１ｃを含む。Ｆ３プライマーはＦ３領域を含んでいる。Ｂ３プライマーはＢ３領域を含む。各プライマーはそれぞれ以下のように設計する。
【００１７】
（１）ＦＩＰプライマー：標的核酸のＦ２領域を３'端に持ち、５'末端側に標的核酸のＦ１ｃと同じ配列を持つように設計する。
（２）Ｆ３プライマー：標的核酸のＦ３領域を持つように設計する。
（３）ＢＩＰプライマー：標的核酸のＢ２領域を３'端に持ち、５'末端側に標的核酸のＢ１ｃと同じ配列を持つように設計する。
（４）Ｂ３プライマー：標的核酸のＢ３領域を持つように設計する。
【００１８】
ここで、Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃ領域は、ＲＮＡの５'末端側から３'末端側方向にかけてこの順で設定された領域である。またＢ３、Ｂ２、Ｂ１、Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃ領域は、その相補鎖のｃＤＮＡの５'末端側から３'末端側方向にかけてこの順で設定された領域である。このときＢ３とＢ３ｃ、Ｂ２とＢ２ｃ、Ｂ１とＢ１ｃ、Ｆ１ｃとＦ１、Ｆ２ｃとＦ２、Ｆ３ｃとＦ３は相補鎖である。
【００１９】
このようなＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマーおよびＢ３プライマーを用いてＬＡＭＰ増幅を行なうと、図１のｃＤＮＡから、ダンベル型のステム・アンド・ループ構造の増幅産物が得られる。その増幅機構については、例えば、Ｗｅｂサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｉｋｅｎ．ｃｏ．ｊｐ／、または特開２００２−１８６７８１号公報を参照することが可能である。
【００２０】
プライマーセットは、上記４種のプライマーのほかにループプライマーを含むことが好ましい。ループプライマーとしては、ＬＦプライマー、ＬＢプライマー、またはＬＦプライマーおよびＬＢプライマーを用いることが好ましい。ＬＦプライマーおよびＬＢプライマーは、増幅反応の起点となるダンベル構造の５'末端側のループの１本鎖部分に相補的な配列を持つループプライマーである。ＬＦプライマーは、図１中のＦ１領域とＦ２領域の間の配列に相補的な配列を持つようにすれば設計でき、ＬＢプライマーは、図１中のＢ１領域とＢ２領域の間の配列に相補的な配列を持つように設計できる。ＬＦプライマーおよびＬＢプライマーを用いることにより、ＤＮＡ合成の起点を増やすことが可能となり、増幅効率が上がり、増幅に要する時間を１／３〜１／２に短縮することが可能となる。
【００２１】
＜プライマーセット＞
本発明のプライマーセットはＬＡＭＰ法によりイチゴの病原ウイルス由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットである。イチゴの病原ウイルスはイチゴマイルドイエローエッジウイルス（ＳＭＹＥＶ）、イチゴモットルウイルス（ＳＭｏＶ）およびイチゴベインバンディングウイルス（ＳＶＢＶ）からなる群より選択される１つ以上である。
本発明のプライマーセットは、下記の（１）〜（３）からなる群より選択される１つ以上を含み、含まれるプライマーセットに応じたイチゴの病原ウイルスを検出することができる。
（１）イチゴマイルドイエローエッジウイルス（ＳＭＹＥＶ）由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセット、
（２）イチゴモットルウイルス（ＳＭｏＶ）由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセット、
（３）イチゴベインバンディングウイルス（ＳＶＢＶ）由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセット。
【００２２】
上記（１）、（２）、および（３）は、それぞれ単独で用いてもよく、いずれか２つ以上を組み合わせて用いてもよい。上記プライマーセット３つを組み合わせて用いることも好ましい。後述の実施例で示すように、上記プライマーセット３つを組み合わせて用いても、偽陽性は確認されない。３種のウイルスの核酸をそれぞれ特異的に増幅するために用いられるプライマーセットを組み合わせて用いることにより、イチゴのいずれか１つ以上のウイルスへの感染を容易、迅速に低コストで検出することができる。
【００２３】
上述のように、イチゴは重複感染することにより病徴が明確に現れるため、イチゴ栽培においては、重複感染を判別することが特に求められる。異なるウイルス由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットの複数を組み合わせて用いた測定においては、増幅産物であるＤＮＡの二本鎖への会合曲線解析により、検出されているイチゴの病原ウイルスの種類の数を判断することが可能であり、単独感染であるかまたは重複感染であるかを判別することができる。
【００２４】
プライマーセットにおける各プライマーは、それぞれの塩基配列情報をもとに、一般的なＤＮＡ合成機で合成することができる。
【００２５】
また、プライマーセットにおけるプライマー量比は特に限定されず、ＬＡＭＰ法において一般的である量比で用いればよい。例えば、反応液１２．５マイクロリットルで目視判定する場合、１サンプル当たり、Ｆ３プライマーとＢ３プライマーはそれぞれ２．５ピコモル、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーはそれぞれ２０ピコモル、ＬＦプライマーとＬＢプライマーはそれぞれ１０ピコモルとすることができる。反応液２５マイクロリットルで目視判定もしくはカネカ温調機能付き吸光度計ＭｙＡｂｓｃｏｐｅ（登録商標）、エンドポイント濁度測定装置ＬＴ−１６（ニッポンジーン）、ＬＡＭＰ法用測定装置ＬＦ−８ Ｐｌｕｓ（ニッポンジーン）を使用する場合、１サンプル当たり、Ｆ３プライマーとＢ３プライマーはそれぞれ５ピコモル、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーはそれぞれ４０ピコモル、ＬＦプライマーとＬＢプライマーはそれぞれ２０ピコモルで用いることができる。またＧｅｎｅｌｙｚｅｒ Ｆ(ＴＯＳＨＩＢＡ ＭＥＤＩＣＡＬ)及び等温増幅蛍光測定装置Genie（登録商標）III（ニッポンジーン）を用いたモニタリングを行う場合、反応液２５マイクロリットルで１サンプル当たり、Ｆ３プライマーとＢ３プライマーはそれぞれ５ピコモル、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーはそれぞれ２０ピコモル、ＬＦプライマーとＬＢプライマーはそれぞれ１０ピコモルで用いることができる。
以下、（１）〜（３）の各プライマーセットの設計について説明する。
【００２６】
［（１）イチゴマイルドイエローエッジウイルス（ＳＭＹＥＶ）由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセット］
本発明において、ＳＭＹＥＶ由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットは、複数のＳＭＹＥＶ株のゲノムについてのアライメントを行い、保存性の高い領域において、Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１ｃ、Ｂ１ｃ、Ｂ２、Ｂ３領域を選択して設計された。
表１に、複数のＳＭＹＥＶ株のゲノム（コートタンパク質遺伝子）についてのアライメントを示す。
【００２７】
【表１】
2019110810.tif 000002
2019110810.tif 000003
2019110810.tif 000004
2019110810.tif 000005
2019110810.tif 000006
2019110810.tif 000007
2019110810.tif 000008
2019110810.tif 000009
2019110810.tif 000010
【００２８】
表１のＭＹＥＶＦ３、ＭＹＥＶＦＩＰ(Ｆ２)、ＭＹＥＶＦＩＰ(Ｆ１)、ＭＹＥＶＢＩＰ(Ｂ１)、ＭＹＥＶＢＩＰ(Ｂ２)、ＭＹＥＶＢ３で示される領域は、本発明におけるＳＭＹＥＶ由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットの設計において、それぞれＦ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃ領域とされた領域である。各領域の特定の配列を、表１で、特にｓｙ０３株(Ｂｈａｇｗａｔ ｅｔ ａｌ., ２０１６ｂ)の配列および表１に示していない未公開の株の配列に基づいて決定し、それらの配列に基づいて、ＳＭＹＥＶ由来の核酸を特異的に増幅するためのＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、およびＢ３プライマーとして、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４でそれぞれ示されるポリヌクレオチドを設計した。
対応するＦ２、Ｆ１ｃ、Ｂ２、Ｂ１ｃ領域の配列は表２のとおりである。
【００２９】
【表２】
2019110810.tif 000011
【００３０】
さらに、表１のＭＹＥＶＬＦ２、ＭＹＥＶＬＢ２で示される領域を選択し、それぞれ配列番号５および配列番号６でそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、ＬＦプライマーおよびＬＢプライマーを設計した。
【００３１】
なお、表１においては、後述の実施例で示す、別のプライマーセットの設計に用いられたＦ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃ、ＬＦ、ＬＢ領域も示されている。これらの領域に基づいて同様にプライマーセットを設計して作製したが、後述の実施例で示すように、特異性が十分ではないと考えられる結果であった。
また、表１においては、先行文献で用いられているプライマーセットの各領域も示されている。本発明で用いられるプライマーセットの設計に用いられた領域の位置は先行文献で用いられているプライマーセットの各領域の位置と大きく異なっていることがわかる。
【００３２】
上記ＦＩＰプライマーは、ＳＭＹＥＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含んでいてもよい。
具体的には、上記ＦＩＰプライマーは、配列番号１で示されるポリヌクレオチドの何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換しているかまたは、欠失および／もしくは挿入を有していてもよい。特に１〜数個のヌクレオチドが置換していてもよい。
【００３３】
そのようなポリヌクレオチドの例としては以下が挙げられる：
Ｆ２領域（配列番号６１）について、５’側から１番目はＣの代わりにＡ／Ｔであってもよく、５番目はＡの代わりにＣ／Ｔ／Ｇであってもよく、７番目はＣの代わりにＡ／Ｔ／Ｇであってもよく、１０番目はＡの代わりにＧ／Ｃ／Ｔであってもよく、１１番目はＣの代わりにＴであってもよく、１３番目はＴの代わりにＣであってもよく、１６番目はＣの代わりにＴであってもよい；
Ｆ１ｃ領域（配列番号６２）について、５’側から５番目はＴの代わりにＣ／Ａ／Ｇであってもよく、８番目はＡの代わりにＣ／Ｔであってもよく、１１番目はＧの代わりにＡであってもよく、１４番目はＡの代わりにＣ／Ｔであってもよく、１７番目はＧの代わりにＣ／Ａ／Ｔであってもよく、２０番目はＧの代わりにＡであってもよい。
【００３４】
また、配列番号１で示されるポリヌクレオチドは配列番号６１で表されるＦ２領域と配列番号６１で表されるＦ１ｃ領域とが直接結合したものであるが、ＦＩＰプライマーは、配列番号１の配列で示されるポリヌクレオチドのＦ２領域とＦ１ｃ領域との間に、１〜６ヌクレオチドの配列（例えば、スペーサーとして使用される配列、一例としてＡ、Ｔ、ＴＴ、ＴＴＴ、ＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＡ、ＴＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＴＴもしくは制限酵素認識配列（ＧＡＡＴＴＣ；制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位、ＧＧＡＴＴＣ；制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位、ＣＴＧＣＡＣ；制限酵素ＰｓｔＩ認識部位、ＧＡＴＡＴＣ；制限酵素ＥｃｏＲＶ認識部位）が含まれていている配列を有していてもよい。ただし、ＦＩＰプライマーにおいて、Ｆ２領域とＦ１ｃ領域は直接結合していることが好ましい。
さらに、変異は上記ＦＩＰプライマー中のＧＣ含量が５０〜６０％になるような範囲の変異であることが好ましい。
プライマーは上記の範囲のポリヌクレオチドが、混合プライマーとして調製されたものであってもよい。
【００３５】
上記ＢＩＰプライマーは、ＳＭＹＥＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含んでいてもよい。
具体的には、上記ＢＩＰプライマーは、配列番号２の配列で示されるポリヌクレオチドの何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換しているかまたは、欠失および／もしくは挿入を有していてもよい。特に１〜数個のヌクレオチドが置換していてもよい。
【００３６】
そのようなポリヌクレオチドの例としては以下が挙げられる：
Ｂ２領域（配列番号６３）について、
５’側から１番目はＣの代わりにＡ／Ｇであってもよく、４番目はＡの代わりにＧであってもよく、７番目はＧの代わりにＴ／Ａであってもよく、１０番目はＴの代わりにＧ／Ａ／Ｃであってもよく、１３番目はＡの代わりにＧであってもよい；
Ｂ１ｃ領域（配列番号６４）について、５’側から３番目はＣの代わりにＴであってもよく、６番目はＣの代わりにＴであってもよく、７番目はＧの代わりにＡであってもよく、９番目はＣの代わりにＴであってもよく、１１番目はＴの代わりにＣであってもよく、７番目はＧの代わりにＡであってもよく、１２、１３番目はＧＡの代わりに、ＣＣ、ＴＡ、ＴＣであってもよく、１５番目はＡの代わりにＧであってもよい。
【００３７】
また、配列番号２で示されるポリヌクレオチドは、配列番号６３で表されるＢ２領域と配列番号６４で表されるＢ１ｃ領域とが直接結合したものであるが、ＢＩＰプライマーは、Ｂ２領域の配列とＢ１ｃ領域の配列との間に、１〜６ヌクレオチドの配列（例えば、スペーサーとして使用される配列、一例としてＡ、Ｔ、ＴＴ、ＴＴＴ、ＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＡ、ＴＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＴＴもしくは制限酵素認識配列（ＧＡＡＴＴＣ；制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位、ＧＧＡＴＴＣ；制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位、ＣＴＧＣＡＣ；制限酵素ＰｓｔＩ認識部位、ＧＡＴＡＴＣ；制限酵素ＥｃｏＲＶ認識部位）を含んでいてもよい。ただし、ＢＩＰプライマーにおいて、Ｂ２領域とＢ１ｃ領域は直接結合していることが好ましい。
【００３８】
さらに、変異は上記ＢＩＰプライマー中のＧＣ含量が５０〜６０％になるような範囲の変異であることが好ましい。
プライマーは上記の範囲のポリヌクレオチドが、混合プライマーとして調製されたものであってもよい。
【００３９】
上記Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＬＦプライマー、およびＬＢプライマーは、それぞれＳＭＹＥＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含んでいてもよい。
具体的には、それぞれ配列番号３から６それぞれの配列で示されるポリヌクレオチドの何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換しているかまたは、欠失および／もしくは挿入を有していてもよい。特に１〜数個のヌクレオチドが置換していてもよい。
【００４０】
そのようなポリヌクレオチドの例としては以下が挙げられる：
Ｆ３プライマー（配列番号３）について、５’側から２番目はＴの代わりにＧ／Ａでもよく、８番目はＣの代わりにＴでもよく、１１番目はＴの代わりにＣでもよく、１４番目はＡの代わりにＧでもよく、１７番目はＴの代わりにＣでもよい；
Ｂ３プライマー（配列番号４）について、５’側から３番目はＣの代わりにＴでもよく、４番目はＣの代わりにＴでもよく、５番目はＧの代わりにＴでもよく、６番目はＧの代わりにＡでもよく、９番目はＴの代わりにＡでもよく、１２番目はＣの代わりにＴでもよい；
ＬＦプライマー（配列番号５）について、５’側から３番目はＧの代わりにＡであってもよく、６番目はＧの代わりにＡであってもよく、９番目はＧの代わりにＡであってもよく、１８番目はＴの代わりにＣであってもよく、２０番目はＡの代わりにＧであってもよい；
ＬＢプライマー（配列番号６）について、５’端から４番目はＡの代わりにＧ／Ｔでもよく、７番目はＴの代わりにＣでもよく、１９番目はＴの代わりにＣでもよい。
【００４１】
さらに、変異は上記のそれぞれのプライマー中のＧＣ含量が５０〜６０％になるような範囲の変異であることが好ましい。
プライマーは上記の範囲のポリヌクレオチドが、それぞれ混合プライマーとして調製されたものであってもよい。
【００４２】
ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＬＦプライマー、およびＬＢプライマーは、それぞれについて上述されるポリヌクレオチドを、全て同時に相補配列としたものによりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなっていてもよい。
【００４３】
［（２）イチゴモットルウイルス（ＳＭｏＶ）由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセット］
本発明において、ＳＭｏＶ由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットは、複数のＳＭｏＶ株のゲノムについてのアライメントを行い、保存性の高い領域において、Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１ｃ、Ｂ１ｃ、Ｂ２、Ｂ３領域を選択して設計された。
表３に複数のＳＭｏＶ株のゲノムのアライメントを示す。
【００４４】
【表３】
2019110810.tif 000012
2019110810.tif 000013
2019110810.tif 000014
2019110810.tif 000015
【００４５】
表３のＳＭｏＶＦ３ＧＣ、ＳＭｏＶＦＩＰＧＣ(Ｆ２)、ＳＭｏＶＦＩＰＧＣ(Ｆ１)、ＳＭｏＶＢＩＰＧＣ(Ｂ１)、ＳＭｏＶＢＩＰＧＣ(Ｂ２)、ＳＭｏＶＢ３ＧＣで示される領域は、本発明におけるＳＭｏＶ由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットの設計において、それぞれＦ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃ領域とされた領域である。各領域の特定の配列を、表３のＮＳｐｅｒ５１株のＲＮＡ２遺伝子の塩基配列(Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. ＫＵ２００４６１、Ｂｈａｇｗａｔ ｅｔ ａｌ., ２０１６ａ)の配列に基づいて決定し、それらの配列に基づいて、ＳＭｏＶ由来の核酸を特異的に増幅するためのＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、およびＢ３プライマーとして、それぞれ配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０でそれぞれ示されるポリヌクレオチドを設計した。
対応するＦ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ領域の配列は表４のとおりである。
【００４６】
【表４】
2019110810.tif 000016
【００４７】
さらに、表３において、ＳＭｏＶＬＦＧＣ、ＳＭｏＶＬＢＧＣで示される領域を選択し、それぞれ、配列番号１１および配列番号１２でそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、ＬＦプライマー、およびＬＢプライマーを含むプライマーを設計した。
【００４８】
なお、表３においては、後述の実施例で示す、別のプライマーセットの設計に用いられたＦ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃ、ＬＦ、ＬＢ領域も示されている。これらの領域に基づいて同様にプライマーセットを設計して作製したが、後述の実施例で示すように、特異性が十分ではないと考えられる結果であった。
また、表３においては、先行文献で用いられているプライマーセットの各領域も示されている。本発明で用いられるプライマーセットの設計に用いられた領域の位置は先行文献で用いられているプライマーセットの各領域の位置と大きく異なっていることがわかる。
【００４９】
上記ＦＩＰプライマーは、ＳＭｏＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含んでいてもよい。
具体的には、上記ＦＩＰプライマーは、配列番号７の配列で示されるポリヌクレオチドの何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換しているかまたは、欠失および／もしくは挿入を有していてもよい。特に１〜数個のヌクレオチドが置換していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例はＦ２領域（配列番号６５）において、５’側から１５番目のＴがＡであるものが挙げられる。
【００５０】
また、配列番号７で示されるポリヌクレオチドは配列番号６５で表されるＦ２領域と配列番号６６で表されるＦ１ｃ領域とが直接結合したものであるが、ＦＩＰプライマーは、Ｆ２領域とＦ１ｃ領域との間に、好ましくは１〜６ヌクレオチドの配列（例えば、スペーサーとして使用される配列、一例としてＡ、Ｔ、ＴＴ、ＴＴＴ、ＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＡ、ＴＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＴＴもしくは制限酵素認識配列（ＧＡＡＴＴＣ；制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位、ＧＧＡＴＴＣ；制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位、ＣＴＧＣＡＣ；制限酵素ＰｓｔＩ認識部位、ＧＡＴＡＴＣ；制限酵素ＥｃｏＲＶ認識部位）を含んでいてもよい。ただし、ＦＩＰプライマーにおいて、Ｆ２領域とＦ１ｃ領域は直接結合していることが好ましい。
【００５１】
さらに、変異は上記ＦＩＰプライマー中のＧＣ含量が５０〜６０％になるような範囲の変異であることが好ましい。
プライマーは上記の範囲のポリヌクレオチドが、混合プライマーとして調製されたものであってもよい。
【００５２】
上記ＢＩＰプライマーは、ＳＭｏＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含んでいてもよい。
具体的には、上記ＢＩＰプライマーは、配列番号８の配列で示されるポリヌクレオチドの何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換しているかまたは、欠失および／もしくは挿入を有していてもよい。特に１〜数個のヌクレオチドが置換していてもよい。
【００５３】
そのようなポリヌクレオチドの例としては以下が挙げられる：
Ｂ２領域（配列番号６７）について、５’側から２番目はＡの代わりにＴであってもよく、４番目はＣの代わりにＴであってもよく、５番目はＡの代わりにＧであってもよく、６番目はＴの代わりにＣであってもよく、１９番目はＧの代わりにＡであってもよく、２０番目はＡの代わりにＧであってもよい；
Ｂ１ｃ領域（配列番号６８）について、５’側から４番目はＧの代わりにＡであってもよく、９番目はＣの代わりにＡ／Ｔであってもよく、１０番目はＴの代わりにＣであってもよく、１１番目はＴの代わりにＡ／Ｇ／Ｃであってもよく、１２番目はＧの代わりにＡであってもよく、２０番目はＣの代わりにＴであってもよく、２１番目はＣの代わりにＴであってもよく、２２番目はＡの代わりにＧであってもよい。
さらに、変異はいずれの領域についてもＧＣ含量が５０〜６０％になるような範囲の変異であることが好ましい。
【００５４】
また、配列番号８で示されるポリヌクレオチドは、配列番号６７で表されるＢ２領域と配列番号６８で表されるＢ１ｃ領域とが直接結合したものであるが、ＢＩＰプライマーは、Ｂ２領域に対応する配列とＢ１ｃ領域に対応する配列との間に、１〜６ヌクレオチドの配列（例えば、スペーサーとして使用される配列の一例としてＡ、Ｔ、ＴＴ、ＴＴＴ、ＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＡ、ＴＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＴＴもしくは制限酵素認識配列（ＧＡＡＴＴＣ；制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位、ＧＧＡＴＴＣ；制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位、ＣＴＧＣＡＣ；制限酵素ＰｓｔＩ認識部位、ＧＡＴＡＴＣ；制限酵素ＥｃｏＲＶ認識部位）を含んでいてもよい。ただし、ＢＩＰプライマーにおいて、Ｂ２領域とＢ１ｃ領域は直接結合していることが好ましい。
プライマーは上記の範囲のポリヌクレオチドが、混合プライマーとして調製されたものであってもよい。
【００５５】
上記Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＬＦプライマー、およびＬＢプライマーは、ＳＭｏＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含んでいてもよい。
具体的には、それぞれ配列番号９から１２それぞれの配列で示されるポリヌクレオチドの何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換しているかまたは、欠失および／もしくは挿入を有していてもよい。特に１〜数個のヌクレオチドが置換していてもよい。
【００５６】
そのようなポリヌクレオチドの例としては以下が挙げられる：
Ｆ３プライマー（配列番号９）について、５’側から４番目はＧの代わりにＴであってもよく、９番目はＧの代わりにＡであってもよく、１３番目はＡの代わりにＧであってもよい；
Ｂ３プライマー（配列番号１０）について、５’側から６番目はＴの代わりにＣであってもよく、８番目はＡの代わりにＧであってもよく、１０番目はＧの代わりにＡであってもよく、１３番目はＡの代わりにＴであってもよい；
ＬＦプライマー（配列番号１１）について、５’側から１４番目はＴの代わりにＡであってもよい；
ＬＢプライマー（配列番号１２）について、５’側から１２番目はＧの代わりにＡであってもよく、１３番目のＡの代わりにＧであってもよく、２２番目のＡの代わりにＧであってもよい。
【００５７】
さらに、変異はいずれのプライマーについてもＧＣ含量が５０〜６０％になるような範囲の変異であることが好ましい。
プライマーは上記の範囲のポリヌクレオチドが、それぞれ混合プライマーとして調製されたものであってもよい。
【００５８】
ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＬＦプライマー、およびＬＢプライマーは、それぞれについて上述されるポリヌクレオチドを全て同時に相補配列としたものによりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなっていてもよい。
【００５９】
［（３）イチゴベインバンディングウイルス（ＳＶＢＶ）由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセット］
本発明において、ＳＶＢＶ由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットは、複数のＳＶＢＶ株のゲノムについてのアライメントを行い、保存性の高い領域において、Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１ｃ、Ｂ１ｃ、Ｂ２、Ｂ３領域を選択して設計された。
表５に複数のＳＶＢＶ株のゲノム（コートタンパク質遺伝子）のアライメントを示す。
【００６０】
【表５】
2019110810.tif 000017
【００６１】
表５に示すようにＦ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃ領域を選択した。各領域の特定の配列を、ＳＶＢＶチュウゴク株の部分配列(Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ.  ＡＹ８６２３８９, Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ., ２００５)の配列に基づいて決定し、それらの配列に基づいて、ＳＶＢＶ由来の核酸を特異的に増幅するためのＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、およびＢ３プライマーとして、それぞれ配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６でそれぞれ示されるポリヌクレオチドを設計した。
【００６２】
Ｆ２、Ｆ１ｃ、Ｂ１ｃ、Ｂ２領域の配列は下記のとおりである。
【００６３】
【表６】
2019110810.tif 000018
【００６４】
さらに、表５に示すようにＬＦ、ＬＢ領域を選択し、それぞれ、配列番号１７および配列番号１８でそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、ＬＦプライマー、およびＬＢプライマーを含むプライマーを設計した。
【００６５】
表７に先行文献（非特許文献２）で用いられているプライマーセットの各領域を示す。本発明で用いられるプライマーセットの設計に用いられた領域の位置は先行文献で用いられているプライマーセットの各領域の位置と大きく異なっていることがわかる。
【００６６】
【表７】
2019110810.tif 000019
2019110810.tif 000020
【００６７】
上記ＦＩＰプライマーは、ＳＶＢＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含んでいてもよい。
具体的には、上記ＦＩＰプライマーは、配列番号１３の配列で示されるポリヌクレオチドの何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換しているかまたは、欠失および／もしくは挿入を有していてもよい。特に１〜数個のヌクレオチドが置換していてもよい。
【００６８】
そのようなポリヌクレオチドの例としては以下が挙げられる：
Ｆ２領域（配列番号６９）について、５’側から２番目はＡの代わりにＴであってもよく、５番目はＡの代わりにＧであってもよく、１７番目はＴの代わりにＣであってもよく、１８番目はＴの代わりにＣであってもよく、２０番目はＧの代わりにＡであってもよい；
Ｆ１ｃ領域（配列番号７０）について、５’側から７番目はＴの代わりにＣであってもよく１０番目はＡの代わりにＣであってもよく、１２番目はＧの代わりにＡであってもよく、１３番目はＡの代わりにＧであってもよく、２２番目はＡの代わりにＴであってもよい。
【００６９】
また、配列番号１３で示されるポリヌクレオチドは配列番号６９で表されるＦ２領域と配列番号７０で表されるＦ１ｃ領域とが直接結合したものであるが、ＦＩＰプライマーは、ポリヌクレオチドのＦ２領域とＦ１ｃ領域との間に、１〜６ヌクレオチドの配列（例えば、スペーサーとして使用される配列、一例としてＡ、Ｔ、ＴＴ、ＴＴＴ、ＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＡ、ＴＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＴＴもしくは制限酵素認識配列（ＧＡＡＴＴＣ；制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位、ＧＧＡＴＴＣ；制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位、ＣＴＧＣＡＣ；制限酵素ＰｓｔＩ認識部位、ＧＡＴＡＴＣ；制限酵素ＥｃｏＲＶ認識部位）を含んでいてもよい。ただし、ＦＩＰプライマーにおいて、Ｆ２領域とＦ１ｃ領域は直接結合していることが好ましい。
【００７０】
さらに、変異は、上記ＦＩＰプライマーのＧＣ含量が４０〜６５％程度となる範囲の変異であることが好ましい。
プライマーは上記の範囲のポリヌクレオチドが、混合プライマーとして調製されたものであってもよい。
【００７１】
上記ＢＩＰプライマーは、ＳＶＢＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含んでいてもよい。
具体的には、上記ＢＩＰプライマーは、配列番号１４の配列で示されるポリヌクレオチドの何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換しているかまたは、欠失および／もしくは挿入を有していてもよい。特に１〜数個のヌクレオチドが置換していてもよい。
【００７２】
そのようなポリヌクレオチドの例としては以下が挙げられる：
Ｂ２ｃ領域（配列番号７１）について、５’側から１８番目はＡの代わりにＧであってもよく、１６番目はＴの代わりにＧであってもよく、１３番目はＡの代わりにＧであってもよく、９番目はＧの代わりにＡであってもよい；
Ｂ１領域（配列番号７２）について、５’側から２番目はＴの代わりにＣであってもよく、５番目はＴの代わりにＡであってもよく、１１番目はＧの代わりにＡであってもよく、３’末端はＧの代わりにＴであってもよい。
【００７３】
また、配列番号１４で示されるポリヌクレオチドは、配列番号７１で表されるＢ２領域の配列と配列番号７２で表されるＢ１ｃ領域の配列が直接結合したものであるが、ＢＩＰプライマーは、配列番号１４の配列で示されるポリヌクレオチドのＢ２領域とＢ１ｃ領域に対応する配列との間に、１〜６ヌクレオチドの配列（例えば、スペーサーとして使用される配列、一例としてＡ、Ｔ、ＴＴ、ＴＴＴ、ＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＡ、ＴＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＴＴもしくは制限酵素認識配列（ＧＡＡＴＴＣ；制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位、ＧＧＡＴＴＣ；制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位、ＣＴＧＣＡＣ；制限酵素ＰｓｔＩ認識部位、ＧＡＴＡＴＣ；制限酵素ＥｃｏＲＶ認識部位）を含んでいてもよい。ただし、ＢＩＰプライマーにおいて、Ｂ２領域とＢ１ｃ領域は直接結合していることが好ましい。
【００７４】
さらに、変異は、上記ＢＩＰプライマーのＧＣ含量が４０〜６５％程度となる範囲の変異であることが好ましい。
プライマーは上記の範囲のポリヌクレオチドが、混合プライマーとして調製されたものであってもよい。
【００７５】
上記Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＬＦプライマー、およびＬＢプライマーは、ＳＶＢＶ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含んでいてもよい。具体的には、それぞれ配列番号１５から１８それぞれの配列で示されるポリヌクレオチドの何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換しているかまたは、欠失および／もしくは挿入を有していてもよい。特に１〜数個のヌクレオチドが置換していてもよい。
【００７６】
そのようなポリヌクレオチドの例としては以下が挙げられる：
Ｆ３プライマー（配列番号１５）について５’側から６番目はＴの代わりにＡ／Ｃであってもよく、９番目はＣの代わりにＴであってもよく、１２番目はＣの代わりにＴであってもよい；
Ｂ３プライマー（配列番号１６）について、５’側から７番目はＴの代わりにＡであってもよく、１４番目はＧの代わりにＡであってもよい；
ＬＦ領域（配列番号１７）について、５’側から５番目はＧの代わりにＡであってもよく、７番目はＧの代わりにＡであってもよく、１６番目はＴの代わりにＣであってもよく、２５番目はＣの代わりにＴであってもよい；
ＬＢプライマー（配列番号１８）について、５’側から９番目はＴの代わりにＡであってもよく、２２番目はＧの代わりにＡであってもよい。
【００７７】
さらに、変異は、上記それぞれのプライマーのＧＣ含量が４０〜６５％程度となる範囲の変異であることが好ましい。
プライマーは上記の範囲のポリヌクレオチドが、それぞれ混合プライマーとして調製されたものであってもよい。
【００７８】
ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＬＦプライマー、およびＬＢプライマーは、それぞれについて上述されるポリヌクレオチドを全て同時に相補配列としたものでそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなっていてもよい。
【００７９】
＜ＬＡＭＰ法：核酸の増幅＞
ＬＡＭＰ法によるＤＮＡの増幅反応においては、検体から抽出された核酸と、プライマーセットと、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素と、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）と、緩衝液とを含む反応液を、等温で一定時間静置すればよい。ＲＴ−ＬＡＭＰ法によるｃＤＮＡの増幅反応においては、上記反応液にさらに逆転写酵素を加えればよい。
【００８０】
温度は、５０℃以上７５℃以下が好ましく、６０℃以上６５℃以下がより好ましく、６３℃がさらに好ましい。静置時間は、１５分以上であればｃＤＮＡの増幅を検出できるが、１５分以上１時間以内が好ましく、２０分以上４０分以内がより好ましい。
【００８１】
逆転写酵素、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、ｄＮＴＰｓおよび緩衝液としては、例えば、Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標）ＲＮＡ増幅試薬キット（栄研化学社製）に含まれる各試薬を使用できる。また植物病検査用LAMPプライマーセット専用RNA増幅試薬(ニッポンジーン)も使用可能である。
【００８２】
＜ウイルスの検出＞
上記のプライマーセットを用いて核酸の増幅を行うことにより、簡便、安価、高速に、特異的なウイルスの検出が可能である。具体的には、検体に含まれる核酸をＬＡＭＰ増幅反応に供し、増幅反応の結果生じた増幅産物の有無を判定することにより、検体中のウイルスを特異的に検出することができる。
【００８３】
ここで「検体」であるイチゴとしては、葉、実、茎、根等、いずれの部位を用いてもよいが、葉を用いることが好ましい。
検体から、核酸を抽出し、抽出した核酸を鋳型としてＬＡＭＰ法による増幅反応を行う。例えば、ＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡを鋳型としてＬＡＭＰ法によるＤＮＡの増幅反応を行うことができ、一方、ＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＬＡＭＰ法によるｃＤＮＡの増幅反応を行うことができる。
核酸の抽出は、公知の方法で行えばよく、一例として以下の手順で行うことができる。
採取したイチゴ苗の葉をチューブにいれ、抽出緩衝液を加えてこの緩衝液中で葉を潰す。任意で熱処理を行い、その後チューブを遠心しその上澄みを使用することができる。ＲＮＡの抽出の際は抽出緩衝液がメルカプトエタノールを含むことが好ましい。
【００８４】
増幅産物の有無の判断は、例えば、ＲＴ−ＬＡＭＰ法によるｃＤＮＡの増幅反応を行った後の反応液を肉眼で観察し、反応液の白濁が確認された場合にウイルスが存在すると判断できる。また、この反応液にＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ等の蛍光インターカレーターを加え、ＵＶ照射下でｃＤＮＡの増幅を示す発光が確認された場合にウイルスが存在すると判断できる。この判断は目視で行うことも可能である。
【００８５】
カネカ社製の温調機能付き吸光度計（ＭｙＡｂｓｃｏｐｅ（登録商標））、ニッポンジーン社製のエンドポイント濁度測定装置ＬＴ−１６（登録商標）、ニッポンジーン社製のＬＡＭＰ法用測定装置ＬＦ−８ Ｐｌｕｓ（登録商標）を用いて増幅産物量に応じた吸光度の変化を測定してもよい。増幅産物の有無に加えて、増幅産物の量を判断することが可能である。
【００８６】
また、ＬＡＭＰ反応で得られる一本鎖核酸の二本鎖への会合をモニタリングして会合曲線解析を行うことにより、増幅された核酸の検出が可能である。このような会合の解析は、例えば、東芝メディカルシステムズ株式会社の等温増幅蛍光測定装置Ｇｅｎｅｌｙｚｅｒ Ｆ、及び等温増幅蛍光測定装置Ｇｅｎｉｅ（登録商標）III（ニッポンジーン）を用いて行うことができる。測定の際は、上記測定装置の専用試薬を用いればよい。
【００８７】
＜ウイルス検出用キット＞
また、本発明のウイルスの検出方法を使用するために必要な各種の試薬類は、予めパッケージングしてキット化することができる。具体的には、上記プライマーセット、核酸合成の基質となる４種類のｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、鎖置換活性を有する鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、補助因子としての塩類（マグネシウム塩又はマンガン塩等）、酵素や鋳型を安定化する保護剤、さらに必要に応じてＲＮＡからｃＤＮＡを合成する逆転写酵素、反応生成物の検出に必要な試薬類を組み合わせてキットとして提供できる。
【００８８】
キットは、本発明のプライマーセットによってＬＡＭＰ反応が正常に進行することを確認するための陽性対照（ポジティブコントロール）を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明のプライマーセットにより増幅される領域を含んだＤＮＡが挙げられる。
【実施例】
【００８９】
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
なお、実施例において、塩基配列の記載は全て、５’−３’である。
【００９０】
＜プライマーセットの設計＞
イチゴマイルドイエローエッジウイルス（ＳＭＹＥＶ）、イチゴモットルウイルス（ＳＭｏＶ）、およびイチゴベインバンディングウイルス（ＳＶＢＶ）それぞれについて、プライマーセットを設計し、下記表に示すプライマーセットを用意した。
各ウイルスについて公知の配列情報をもとに、ＤＮＡ解析ソフトウエアであるＭＥＧＡ６を用いてアライメント解析を行い、保存性が高い領域を探索した。探索された領域において、上述のようにＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３領域を選択し、（上記表１、表３、表５参照）各プライマーセットを設計した。設計の際、適宜Primer Explorer V.5も用いて、下記のように複数のプライマーセットを設計した。
SMoVプライマーセットは、ＧＣ含量が高くなるようループプライマーを含むプライマーセットを設計した。設計されたプライマーセット（プライマー）を化学合成した。脱塩グレードで精製し１０ｎｍｏｌで合成後、滅菌蒸留水で１００μＭに濃度調整した。これを原液として−２０℃で冷凍保存した。夫々のプライマーについて、所定の濃度に希釈して一定量確保した。希釈したプライマーも−２０℃で冷凍保存した。
【００９１】
【表８】
2019110810.tif 000021
【００９２】
【表９】
2019110810.tif 000022
2019110810.tif 000023
【００９３】
【表１０】
2019110810.tif 000024
【００９４】
＜核酸抽出＞
１．５ｍｌチューブとその蓋で挟んで、イチゴ苗の葉を採取した。１．５ｍｌチューブに試料と抽出バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ５００μＬ＋メルカプトエタノール １０μＬ）５００μＬを入れ、ピペットチップ先端で潰した。チューブを遠心（５，０００ｒｐｍ×１ｍｉｎ）し、上澄みを新しい１．５ｍｌチューブに入れ、ポリクラールＶＴを耳かき一杯添加し、ボルテックスで撹拌した。インキュベート（１００℃・１０分）後、氷水で急冷し、遠心（１５，０００ｒｐｍ×５分）した。上澄みを新しいチューブに移し、抽出サンプルとした。
【００９５】
＜ウイルス検出試験（単独検出）＞
１)目視判定
（手順）
各ウイルス用プライマーセットとともに、Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標）RNA増幅試薬キット（ＲＴ−ＬＡＭＰ)(栄研化学ｈｔｔｐｓ://ｇｅｎｏｍｅ.ｅ-ｍｐ.ｊｐ/ｐｒｏｄｕｃｔｓ/ｒｎａ.ｈｔｍｌ)とLoopamp 蛍光・目視検出試薬 (栄研化学ｈｔｔｐｓ://ｇｅｎｏｍｅ.ｅ-ｍｐ.ｊｐ/ｐｒｏｄｕｃｔｓ/ｍｏｋｕｓｉ.ｈｔｍｌ)を使用した。１サンプル当たり、１．５μＬの上記抽出サンプルと６．２５μＬの２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ、０．５μＬのＥｎｚｙｍｅ ｍｉｘ、０．５μＬの蛍光試薬、０．５μＬのＦ３プライマー（５μＭ）、０．５μＬのＢ３プライマー（５μＭ）、０．５μＬのＦＩＰプライマー（４０μＭ）、０．５μＬのＢＩＰプライマー（４０μＭ）、０．５μＬのＬＦプライマー（２０μＭ）、０．５μＬのＬＢプライマー（２０μＭ）、０．７５μＬの滅菌蒸留水を加えることで計１２．５μＬに調製した。もしくは３．０μＬの上記抽出サンプルと１２．５μＬの２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ、１．０μＬのＥｎｚｙｍｅ ｍｉｘ、１．０μＬの蛍光試薬、１．０μＬのＦ３プライマー（５μＭ）、１．０μＬのＢ３プライマー（５μＭ）、１．０μＬのＦＩＰプライマー（４０μＭ）、１．０μＬのＢＩＰプライマー（４０μＭ）、１．０μＬのＬＦプライマー（２０μＭ）、１．０μＬのＬＢプライマー（２０μＭ）、１．５μＬの滅菌蒸留水を加えることで計２５．０μＬに調製した。これらの調製は氷上で行った。ＬｉｆｅＥＣＯサーマルサイクラー（Ｂｉｏｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ., Ｌｔｄ.）で６３℃１時間反応させ、９５℃２分間処理で反応停止させた後、目視判定した。ネガティブコントロールとしてRNAではなく滅菌蒸留水１．５μＬを添加した。
【００９６】
（プライマーセットの機能の確認）
上記の各ウイルスに対するプライマーセットにつき、まず、ＳＭＹＥＶ、ＳＭｏＶ、ＳＶＢＶ重複感染苗、健全苗、水の３検体を用いた上記目視判定を行った。ただし、ＬｉｆｅＥＣＯサーマルサイクラーでの反応は６３℃で９０分行った。
ＳＭＹＥＶ感染株を含む検体について、ＳＭＹＥＶプライマーセット１〜５をそれぞれ用いて上記目視判定を行った。結果は以下のとおりである、
ＳＭＹＥＶプライマーセット１は、感染苗のみに明確に陽性を示した。
ＳＭＹＥＶプライマーセット２、４、５は、いずれも偽陽性（健全苗または水の検体でも陽性を示す）が確認された。
ＳＭＹＥＶプライマーセット３は、検出感度が不良であった。
【００９７】
ＳＭｏＶ感染株を含む検体について、ＳＭｏＶプライマーセット１〜７をそれぞれ用いて同様に目視判定を行った。結果は以下のとおりである、
ＳＭｏＶプライマーセット１は、感染苗のみに明確に陽性を示した。
ＳＭｏＶプライマーセット２、４は、感染苗に対しても陰性であった。
ＳＭｏＶプライマーセット３、５、７は、いずれも偽陽性が確認された。
ＳＭｏＶプライマーセット６は、検出感度が不良であった。
【００９８】
ＳＶＢＶ感染株を含む検体について、ＳＶＢＶプライマーセット１を用いて上記検出試験を行った結果、ＳＶＢＶプライマーセットは、感染苗のみに明確に陽性を示した。
【００９９】
以上の結果に基づき、ＳＭＹＥＶプライマーセット１、ＳＭｏＶプライマーセット１、およびＳＶＢＶプライマーセット１をさらなる試験に用いた。
【０１００】
（ＲＴ−ＰＣＲおよび既報のプライマーセットを用いたＲＴ−ＬＡＭＰ法との比較）
それぞれのウイルスの感染苗から発生したランナーの苗９検体および健全（非感染）苗１検体につき、ＲＴ−ＰＣＲおよび各種プライマーセットを用いたＲＴ−ＬＡＭＰ法による検出試験を行い、結果を比較した。
ＲＴ−ＰＣＲはＴｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ,.２００３ (Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ, Ｖｏｌ. １１１, Ｉｓｓｕｅ ２, ２００３, Ｐａｇｅ ８５-９３)に記載の方法で行った。
ＳＭＹＥＶ検出試験においては、プライマーセットとしてＳＭＹＥＶプライマーセット１、非特許文献２（平成２０年度北海道農業研究成果情報）の表３に記載のＳＭＹＥＶ用の４つのプライマーのセット、および非特許文献３（Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ Ｓｉｎｉｃａ, ２０１５, ４８(３), ６１３-６２０）のＴａｂｌｅ １に記載の４プライマー（ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、）を用いた。結果を表１１に示す
【０１０１】
【表１１】
2019110810.tif 000025
【０１０２】
ＲＴ−ＰＣＲや既報のＲＴ−ＬＡＭＰ法で検出されない感染苗についてもＳＭＹＥＶプライマーセット１で陽性反応を示した。
ＳＭｏＶ検出試験においては、プライマーセットとしてＳＭｏＶプライマーセット１、非特許文献２（平成２０年度北海道農業研究成果情報）の表３に記載のＳＭｏＶ用の４つのプライマーのセットを用いた。結果を表１２に示す
【０１０３】
【表１２】
2019110810.tif 000026
【０１０４】
ＲＴ−ＰＣＲや既報のＲＴ−ＬＡＭＰ法で検出されない感染苗についてもＳＭＹＥＶプライマーセット１で陽性反応を示した。
ＳＶＢＶ検出試験においては、プライマーセットとしてＳＶＢＶプライマーセット１、非特許文献２（平成２０年度北海道農業研究成果情報）の表３に記載のＳＶＢＶ用の４つのプライマーのセットを用いた。結果を表１３に示す
【０１０５】
【表１３】
2019110810.tif 000027
【０１０６】
ＳＶＢＶプライマーセット１を用いた検出は、既報のＬＡＭＰ法と異なってＰＣＲで得られた検出と同じ結果を示した。
【０１０７】
ＳＭＹＥＶとＳＭｏＶはＲＮＡウイルスである一方、ＳＶＢＶはＤＮＡウイルスである。しかし、Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標）ＲＮＡ増幅試薬キットを利用した上述の方法で、明確な結果が得られた。ＳＶＢＶ検出については、Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ増幅試薬キット（栄研化学）を用いても同様に行ったが、ＲＮＡ増幅試薬キットを用いた例のように明確な検出結果は得られなかった。抽出過程で用いたメルカプトエタノールが影響していると考えられる。
【０１０８】
２）吸光度計を用いた判定
上記の各ウイルスに対するプライマーセットを用いた各ウイルスの検出として吸光度計を用いた判定も行った。一定の反応時間の経過後吸光度の増加が見られたときに陽性であると判断することができる。
Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標）ＲＮＡ増幅試薬キット（ＲＴ−ＬＡＭＰ）（栄研化学）とプライマーセットを使用する。１サンプル当たり、３．０μＬの核酸抽出サンプルと１２．５μＬの２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ、１．０μＬのＥｎｚｙｍｅ ｍｉｘ、１．０μＬの蛍光試薬、１．０μＬのＦ３プライマー（５μＭ）、１．０μＬのＢ３プライマー（５μＭ）、１．０μＬのＦＩＰプライマー（４０μＭ）、１．０μＬのＢＩＰプライマー（４０μＭ）、１．０μＬのＬＦプライマー（２０μＭ）、１．０μＬのＬＢプライマー（２０μＭ）、２．５μＬの滅菌蒸留水を加えることで計２５μＬに調製した（Ｄ−ＱＵＩＣＫ入りチューブ（ＫＡＮＥＫＡ）もしくは通常のチューブを使用）。これらの調整は氷上で行った。ＭｙＡｂｓｃｏｐｅ（登録商標）（温調機能付き吸光度計、カネカ社）にセットし、６３℃１時間処理で増幅反応し、８５℃１０分で反応停止させた。Ｇセンサで吸光度変化をリアルタイム測定し、一定の反応時間の経過後吸光度の増加が見られたときに陽性であると判断した。ＳＭＹＥＶプライマーセット１、およびＳＭｏＶプライマーセット１、ＳＶＢＶプライマーセット１を用いて、上記と同じ感染苗９検体および健全（非感染）苗１検体について、判定を行ったところ、目視判定と同様の結果が得られた。
【０１０９】
３）会合曲線解析による判定
３．０μＬの核酸抽出サンプル、１．０μＬのＦ３プライマー（５μＭ）、１．０μＬのＢ３プライマー（５μＭ）、０．５μＬのＦＩＰプライマー（４０μＭ）、０．５μＬのＢＩＰプライマー（４０μＭ）、０．５μＬのＬＦプライマー（２０μＭ）、０．５μＬのＬＢプライマー（２０μＭ）、１５μＬのＩＳＯ−００４、０．２５μＬのＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＲＴ−００１）、２．７５μＬの滅菌蒸留水を加えることで計２５μＬに調製した。これらの調整は氷上で行った。Ｇｅｎｅｌｙｚｅｒ Ｆ（ＴＯＳＨＩＢＡ ＭＥＤＩＣＡＬ）にセットし、６３℃１時間処理後、９５℃２分間処理でＬＡＭＰ反応を停止させた後、徐々に８０℃まで下げた。ＳＭＹＥＶプライマーセット１，およびＳＭｏＶプライマーセット１，ＳＶＢＶプライマーセット１を用いて、それぞれについて上記と同じ感染苗９検体および健全（非感染）苗１検体について、判定を行った。いずれも目視判定で陽性であった例において会合による蛍光値のピークが確認された。
【０１１０】
＜ウイルス検出試験（複数同時検出）＞
１）目視判定
Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標）ＲＮＡ増幅試薬キット（ＲＴ−ＬＡＭＰ）（栄研化学）、Ｌｏｏｐａｍｐ蛍光・目視検出試薬（栄研化学）を使用した。１．５μｌの核酸抽出サンプル、６．２５μＬの２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ、０．５μＬのＬｏｏｐａｍｐ蛍光・目視検出試薬、０．５μＬのＥｎｚｙｍｅ ｍｉｘ、０．１２５μＬのＭＹＥＶＦ３プライマー（２０μＭ、Ｆ３プライマー）、０．１２５μＬのＭＹＥＶＢ３プライマー（２０μＭ、Ｂ３プライマー）、０．２５μＬのＭＹＥＶＦＩＰプライマー（８０μＭ、ＦＩＰプライマー）、０．２５μＬのＭＹＥＶＢＩＰプライマー（８０μＭ、ＢＩＰプライマー）、０．２５μＬのＭＹＥＶＬＦプライマー（４０μＭ、ＬＦプライマー）、０．２５μＬのＭＹＥＶＬＢプライマー（４０μＭ、ＬＢプライマー）、０．１２５μＬのＳＭｏＶＦ３ＧＣプライマー（２０μＭ、Ｆ３プライマー）、０．１２５μＬのＳＭｏＶＢ３ＧＣプライマー（２０μＭ、Ｂ３プライマー）、０．２５μＬのＳＭｏＶＦＩＰＧＣプライマー（８０μＭ、ＦＩＰプライマー）、０．２５μＬのＳＭｏＶＢＩＰＧＣプライマー（８０μＭ、ＢＩＰプライマー）、０．２５μＬのＳＭｏＶＬＦＧＣプライマー（４０μＭ、ＬＦプライマー）、０．２５μＬのＳＭｏＶＬＢＧＣプライマー（４０μＭ、ＬＢプライマー）、０．１２５μＬのＳＶＢＶＦ３プライマー（２０μＭ、Ｆ３プライマー）、０．１２５μＬのＳＶＢＶＢ３プライマー（２０μＭ、Ｂ３プライマー）、０．２５μＬのＳＶＢＶＦＩＰＧＣプライマー（８０μＭ、ＦＩＰプライマー）、０．２５μＬのＳＶＢＶＢＩＰＧＣプライマー（８０μＭ、ＢＩＰプライマー）、０．２５μＬのＳＶＢＶＬＦＧＣプライマー（４０μＭ、ＬＦプライマー）、０．２５μＬのＳＶＢＶＬＢＧＣプライマー（４０μＭ、ＬＢプライマー）、そして０．５５μＬの滅菌蒸留水を加えることで計１２．５μＬに調製した。これらの調整は氷上で行った。偽陽性の確認のため６３℃９０分処理後、９５℃２分処理で反応停止させた。目視判別してポジティブコントロールのみに陽性反応を示し、ネガティブコントロールは陰性反応であることを確認した。別に、６３℃６０分処理後、９５℃２分処理で反応停止させた例を、図２に示す。図２に示される結果（同時検出）をＳＭＹＥＶプライマーセット１、ＳＭｏＶプライマーセット１、およびＳＶＢＶプライマーセット１をそれぞれ単独で用いた場合の結果とともに表１４に示す。
【０１１１】
【表１４】
2019110810.tif 000028
【０１１２】
図２および表１４に示される結果から複数のイチゴの病原ウイルス由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットを合わせて用いても偽陽性なく感染苗の検出が可能であることがわかる。プライマーセットを合わせて使用することにより、いずれかのウイルスに感染した検体を、迅速に安価に検出することができる。
【０１１３】
２）会合曲線解析による判定
３．０μＬの核酸抽出サンプル、１５μＬのＩＳＯ−００４、０．２５μＬのＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＲＴ−００１）、０．２５μＬのＭＹＥＶＦ３プライマー（２０μＭ、Ｆ３プライマー）、０．２５μＬのＭＹＥＶＢ３プライマー（２０μＭ、Ｂ３プライマー）、０．５μＬのＭＹＥＶＦＩＰプライマー（４０μＭ、ＦＩＰプライマー）、０．５μＬのＭＹＥＶＢＩＰプライマー（４０μＭ、ＢＩＰプライマー）、０．２５μＬのＭＹＥＶＬＦプライマー（４０μＭ、ＬＦプライマー）、０．２５μＬのＭＹＥＶＬＢプライマー（４０μＭ、ＬＢプライマー）、０．２５μＬのＳＭｏＶＦ３ＧＣプライマー（２０μＭ、Ｆ３プライマー）、０．２５μＬのＳＭｏＶＢ３ＧＣプライマー（２０μＭ、Ｂ３プライマー）、０．５μＬのＳＭｏＶＦＩＰＧＣプライマー（４０μＭ、ＦＩＰプライマー）、０．５μＬのＳＭｏＶＢＩＰＧＣプライマー（４０μＭ、ＢＩＰプライマー）、０．２５μＬのＳＭｏＶＬＦＧＣプライマー（４０μＭ、ＬＦプライマー）、０．２５μＬのＳＭｏＶＬＢＧＣプライマー（４０μＭ、ＬＢプライマー）、０．２５μＬのＳＶＢＶＦ３プライマー（２０μＭ、Ｆ３プライマー）、０．２５μＬのＳＶＢＶＢ３プライマー（２０μＭ、Ｂ３プライマー）、０．２５μＬのＳＶＢＶＦＩＰＧＣプライマー（４０μＭ、ＦＩＰプライマー）、０．２５μＬのＳＶＢＶＢＩＰＧＣプライマー（４０μＭ、ＢＩＰプライマー）、０．２５μＬのＳＶＢＶＬＦＧＣプライマー（４０μＭ、ＬＦプライマー）、０．２５μＬのＳＶＢＶＬＢＧＣプライマー（４０μＭ、ＬＢプライマー）、０．７５μＬの滅菌蒸留水を加えることで計２５μＬに調製した。これらの調整は氷上で行った。Ｇｅｎｅｌｙｚｅｒ Ｆにセットし、６３℃１時間処理後、９５℃２分間処理でＬＡＭＰ反応を停止させた後、徐々に８０℃まで下げた。その間に会合曲線解析を行った。結果を図３に示す。単独感染株では１つのピークを示した一方で、重複感染株は２つのピークを示した。
【０１１４】
引用文献
Bhagwat,B., Dickison,V., Ding,X., Walker,M., Bernardy,M., Bouthillier,M., Creelman,A., DeYoung,R., Li,Y., Nie,X., Wang,A.,Xiang,Y. and Sanfacon,H."Genome sequence analysis of five Canadian isolates of strawberry mottle virus reveals extensive intra-species diversity and a longer RNA2 with increased coding capacity compared to a previously characterized European isolate." Archives of virology 161.6 (2016a): 1657-1663.
Bhagwat, B., Dickison, V., Su, L., Bernardy, M., Wiersma, P. A., Nie, X., & Xiang, Y. Molecular characterization of divergent strawberry mild yellow edge virus isolates from eastern Canada. Journal of Phytopathology,164.9, (2016b): 691-696.
ZHOU, H. C., LI, S. Y., HE, S. T., GUO, A. G., ZHAO, X., & HAO, S. H. (2005). Detection of strawberry vein banding virus by PCR and sequence analysis of specific fragment [J]. Journal of Fruit Science,3, 024.
【図１】
2019110810.tif 000029
【図２】
2019110810.tif 000030
【図３】
2019110810.tif 000031
【配列表】
2019110810000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年4月27日(2018.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＡＭＰ法により、イチゴマイルドイエローエッジウイルス（ＳＭＹＥＶ）、イチゴモットルウイルス（ＳＭｏＶ）およびイチゴベインバンディングウイルス（ＳＶＢＶ）からなる群より選択される１つ以上のイチゴの病原ウイルス由来の核酸を増幅するためのプライマーセットであって、以下の（１）〜（３）からなる群より選択される１つ以上を含むプライマーセット：
（１）配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭＹＥＶ由来の核酸を増幅可能な範囲で下記のＦＩＰプライマーの変異を含むポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭＹＥＶ由来の核酸を増幅可能な範囲で下記のＢＩＰプライマーの変異を含むポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭＹＥＶ由来の核酸を増幅可能な範囲で下記のＦ３プライマーの変異を含むポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭＹＥＶ由来の核酸を増幅可能な範囲で下記のＢ３プライマーの変異を含むポリヌクレオチドからなるＢ３プライマーを含むプライマーセット；
ＦＩＰプライマーの変異：
Ｆ２領域（配列番号６１）について、５’側から１番目のＣがＡ／Ｔとなる置換、５番目のＡがＣ／Ｔ／Ｇとなる置換、７番目のＣがＡ／Ｔ／Ｇとなる置換、１０番目のＡがＧ／Ｃ／Ｔとなる置換、１１番目のＣがＴとなる置換、１３番目のＴがＣとなる置換、および１６番目のＣがＴとなる置換、ならびにＦ１ｃ領域（配列番号６２）について、５’側から５番目のＴがＣ／Ａ／Ｇとなる置換、８番目のＡがＣ／Ｔとなる置換、１１番目のＧがＡとなる置換、１４番目のＡがＣ／Ｔとなる置換、１７番目のＧがＣ／Ａ／Ｔとなる置換、および２０番目のＧがＡとなる置換からなる群から選択される１〜５個、または、Ｆ２領域（配列番号６１）とＦ１ｃ領域（配列番号６２）との間への１〜６ヌクレオチドの配列の挿入；
ＢＩＰプライマーの変異：
Ｂ２領域（配列番号６３）について、５’側から１番目のＣがＡ／Ｇとなる置換、４番目のＡがＧとなる置換、７番目のＧがＴ／Ａとなる置換、１０番目のＴがＧ／Ａ／Ｃとなる置換、および１３番目のＡがＧとなる置換、ならびにＢ１ｃ領域（配列番号６４）について、５’側から３番目のＣがＴとなる置換、６番目のＣがＴとなる置換、７番目のＧがＡとなる置換、９番目のＣがＴとなる置換、１１番目のＴがＣとなる置換、１２、１３番目のＧＡがＣＣ／ＴＡ／ＴＣとなる置換、および１５番目のＡがＧとなる置換からなる群から選択される１〜５個（ヌクレオチド置換数として）、または、Ｂ２領域（配列番号６３）とＢ１ｃ領域（配列番号６４）との間への１〜６ヌクレオチドの配列の挿入；
Ｆ３プライマーの変異：
配列番号３で示される配列の５’側から２番目のＴがＧ／Ａとなる置換、８番目のＣがＴとなる置換、１１番目のＴがＣとなる置換、１４番目のＡがＧとなる置換、および１７番目のＴがＣとなる置換からなる群から選択される１〜５個；
Ｂ３プライマーの変異：
配列番号４で示される配列の５’側から３番目のＣがＴとなる置換、４番目のＣがＴとなる置換、５番目のＧがＴとなる置換、６番目のＧがＡとなる置換、９番目のＴがＡとなる置換、および１２番目のＣがＴとなる置換からなる群から選択される１〜５個、
（２）配列番号７の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号７の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭｏＶ由来の核酸を増幅可能な範囲で下記のＦＩＰプライマーの変異を含むポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号８の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号８の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭｏＶ由来の核酸を増幅可能な範囲で下記のＢＩＰプライマーの変異を含むポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号９の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号９の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭｏＶ由来の核酸を増幅可能な範囲で下記のＦ３プライマーの変異を含むポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号１０の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号１０の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭｏＶ由来の核酸を増幅可能な範囲で下記のＢ３プライマーの変異を含むポリヌクレオチドからなるＢ３プライマーを含むプライマーセット；
ＦＩＰプライマーの変異：
Ｆ２領域（配列番号６５）において、５’側から１５番目のＴがＡとなる置換、または、Ｆ２領域（配列番号６５）とＦ１ｃ領域（配列番号６６）との間への１〜６ヌクレオチドの配列の挿入；
ＢＩＰプライマーの変異：
Ｂ２領域（配列番号６７）について、５’側から２番目のＡがＴとなる置換、４番目のＣがＴとなる置換、５番目のＡがＧとなる置換、６番目のＴがＣとなる置換、１９番目のＧがＡとなる置換、および２０番目のＡがＧとなる置換、ならびに、Ｂ１ｃ領域（配列番号６８）について、５’側から４番目のＧがＡとなる置換、９番目のＣがＡ／Ｔとなる置換、１０番目のＴがＣとなる置換、１１番目のＴがＡ／Ｇ／Ｃとなる置換、１２番目のＧがＡとなる置換、２０番目のＣがＴとなる置換、２１番目のＣがＴとなる置換、および２２番目のＡがＧとなる置換からなる群から選択される１〜５個、またはＢ２領域（配列番号６７）とＢ１ｃ領域（配列番号６８）との間への１〜６ヌクレオチドの配列の挿入；
Ｆ３プライマーの変異：
配列番号９で示される配列の５’側から４番目のＧがＴとなる置換、９番目のＧがＡとなる置換、および１３番目のＡがＧとなる置換からなる群から選択される１〜３個；
Ｂ３プライマーの変異：
配列番号１０で示される配列の５’側から６番目のＴがＣとなる置換、８番目のＡがＧとなる置換、１０番目のＧがＡとなる置換、および１３番目のＡがＴとなる置換からなる群から選択される１〜４個、
（３）配列番号１３の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号１３の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＶＢＶ由来の核酸を増幅可能な範囲で下記のＦＩＰプライマーの変異を含むポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号１４の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号１４の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＶＢＶ由来の核酸を増幅可能な範囲で下記のＢＩＰプライマーの変異を含むポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号１５の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号１５の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＶＢＶ由来の核酸を増幅可能な範囲で下記のＦ３プライマーの変異を含むポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号１６の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号１６の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＶＢＶ由来の核酸を増幅可能な範囲で下記のＢ３プライマーの変異を含むポリヌクレオチドからなるＢ３プライマーを含むプライマーセット、
ＦＩＰプライマーの変異：
Ｆ２領域（配列番号６９）について、５’側から２番目のＡがＴとなる置換、５番目のＡがＧとなる置換、１７番目のＴがＣとなる置換、１８番目のＴがＣとなる置換、および２０番目のＧがＡとなる置換、ならびにＦ１ｃ領域（配列番号７０）について、５’側から７番目のＴがＣとなる置換、１０番目のＡがＣとなる置換、１２番目のＧがＡとなる置換、１３番目のＡがＧとなる置換、および２２番目のＡがＴとなる置換からなる群から選択される１〜５個、または、Ｆ２領域（配列番号６９）とＦ１ｃ領域（配列番号７０）との間への１〜６ヌクレオチドの配列の挿入；
ＢＩＰプライマーの変異：
Ｂ２ｃ領域（配列番号７１）について、５’側から１８番目のＡがＧとなる置換、１６番目のＴがＧとなる置換、１３番目のＡがＧとなる置換、および９番目のＧがＡとなる置換、ならびにＢ１領域（配列番号７２）について、５’側から２番目のＴがＣとなる置換、５番目のＴがＡとなる置換、１１番目のＧがＡとなる置換、および３’末端のＧがＴとなる置換からなる群から選択される１〜５個、または、Ｂ２領域（配列番号７１）とＢ１ｃ領域（配列番号７２）との間への１〜６ヌクレオチドの配列の挿入；
Ｆ３プライマーの変異：
配列番号１５で示される配列の５’側から６番目のＴがＡ／Ｃとなる置換、９番目のＣがＴとなる置換、および１２番目のＣがＴとなる置換からなる群から選択される１〜３個；
Ｂ３プライマーの変異：
配列番号１６で示される配列の５’側から７番目のＴがＡとなる置換および１４番目のＧがＡとなる置換からなる群から選択される１〜２個。
【請求項２】
前記（１）が、配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマーを含むプライマーセットであり、
前記（２）が、配列番号７の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号８の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号９の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号１０の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマーを含むプライマーセットであり、
前記（３）が、配列番号１３の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号１４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号１５の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号１６の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマーを含むプライマーセットである請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
前記（１）〜（３）が、それぞれさらに以下（１’）〜（３’）を含む請求項１または２に記載のプライマーセット；
（１’）配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭＹＥＶ由来の核酸を増幅可能な範囲で下記のＬＦプライマーの変異を含むポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、および
配列番号６の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号６の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭＹＥＶ由来の核酸を増幅可能な範囲で下記のＬＢプライマーの変異を含むポリヌクレオチドからなるＬＢプライマーから選択される１つ以上、
ＬＦプライマーの変異：
配列番号５で示される配列の５’側から３番目のＧがＡとなる置換、６番目のＧがＡとなる置換、９番目のＧがＡとなる置換、１８番目のＴがＣとなる置換、および２０番目のＡがＧとなる置換からなる群から選択される１〜５個；
ＬＢプライマーの変異：
配列番号６で示される配列の５’ 側から４番目のＡがＧ／Ｔとなる置換、７番目のＴがＣとなる置換、１９番目のＴがＣとなる置換からなる群から選択される１〜３個；
（２’）配列番号１１の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号１１の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭｏＶ由来の核酸を増幅可能な範囲で下記のＬＦプライマーの変異を含むポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、および
配列番号１２の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号１２の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭｏＶ由来の核酸を増幅可能な範囲で下記のＬＢプライマーの変異を含むポリヌクレオチドからなるＬＢプライマーから選択される１つ以上、
ＬＦプライマーの変異：
配列番号１１で示される配列の５’側から１４番目のＴがＡとなる置換；
ＬＢプライマーの変異：
配列番号１２で示される配列の５’側から１２番目のＧがＡとなる置換、１３番目のＡがＧとなる置換、および２２番目のＡがＧとなる置換からなる群から選択される１〜３個；
ならびに
（３’）配列番号１７の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号１７の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＶＢＶ由来の核酸を増幅可能な範囲で下記のＬＦプライマーの変異を含むポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、および
配列番号１８の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号１８の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＶＢＶ由来の核酸を増幅可能な範囲で下記のＬＢプライマーの変異を含むポリヌクレオチドからなるＬＢプライマー
から選択される１つ以上、
ＬＦプライマーの変異：
配列番号１７で示される配列の５’側から５番目のＧがＡとなる置換、７番目のＧがＡとなる置換、１６番目のＴがＣとなる置換、および２５番目のＣがＴとなる置換からなる群から選択される１〜４個；
ＬＢプライマーの変異：
配列番号１８で示される配列の５’側から９番目のＴがＡとなる置換および２２番目のＧがＡとなる置換からなる群から選択される１〜２個。
【請求項４】
前記（１’）が、配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマーおよび配列番号６の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＢプライマーから選択される１つ以上であり、
前記（２’）が、配列番号１１の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマーおよび配列番号１２の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＢプライマーから選択される１つ以上であり、ならびに
前記（３’）が、配列番号１７の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマーおよび配列番号１８の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＢプライマーから選択される１つ以上
である請求項３に記載のプライマーセット。
【請求項５】
前記（１）〜（３）がいずれもＬＦプライマーおよびＬＢプライマーの双方を含む請求項３または４に記載のプライマーセット。
【請求項６】
イチゴマイルドイエローエッジウイルス（ＳＭＹＥＶ）由来の核酸を増幅するためのプライマーセットであり、前記プライマーセットが前記（１）を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項７】
イチゴモットルウイルス（ＳＭｏＶ）由来の核酸を増幅するためのプライマーセットであり、前記プライマーセットが前記（２）を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項８】
イチゴベインバンディングウイルス（ＳＶＢＶ）由来の核酸を増幅するためのプライマーセットであり、前記プライマーセットが前記（３）を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項９】
前記（１）〜（３）をいずれも含む請求項１〜５のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項１０】
イチゴの病原ウイルスの検出方法であって、
検体から核酸を抽出すること、
請求項１〜９のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて、前記核酸を鋳型にＬＡＭＰ法によってＤＮＡまたはｃＤＮＡの増幅反応を行うこと、
増幅産物があると判断された場合に検体にイチゴの病原ウイルスが存在すると判断することを含む、検出方法。
【請求項１１】
イチゴの病原ウイルスの検出方法であって、
検体から核酸を抽出すること、
請求項９に記載のプライマーセットを用いて、前記核酸を鋳型にＬＡＭＰ法によってＤＮＡまたはｃＤＮＡの増幅反応を行うこと、
前記増幅反応後のＤＮＡまたはｃＤＮＡの二本鎖への会合曲線解析により、検体におけるイチゴの病原ウイルスの存在の有無および存在するイチゴの病原ウイルスの種類の数を判断することを含む、検出方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のプライマーセット、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、ｄＮＴＰｓ、および緩衝液を含む、イチゴの病原ウイルスの検出用キット。
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月25日(2018.9.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＡＭＰ法により、イチゴマイルドイエローエッジウイルス（ＳＭＹＥＶ）、イチゴモットルウイルス（ＳＭｏＶ）およびイチゴベインバンディングウイルス（ＳＶＢＶ）からなる群より選択される１つ以上のイチゴの病原ウイルス由来の核酸を増幅するためのプライマーセットであって、以下の（１）〜（３）からなる群より選択される１つ以上を含むプライマーセット：
（１）配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭＹＥＶ由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含み、該変異がＦ２領域（配列番号６１）とＦ１ｃ領域（配列番号６２）との間への１〜６ヌクレオチドの配列の挿入であるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭＹＥＶ由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含み、該変異がＢ２領域（配列番号６３）とＢ１ｃ領域（配列番号６４）との間への１〜６ヌクレオチドの配列の挿入であるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー、
配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、および
配列番号６の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＢプライマーを含むプライマーセット、
（２）配列番号７の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号７の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭｏＶ由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含み、該変異がＦ２領域（配列番号６５）とＦ１ｃ領域（配列番号６６）との間への１〜６ヌクレオチドの配列の挿入であるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号８の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号８の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＭｏＶ由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含み、該変異がＢ２領域（配列番号６７）とＢ１ｃ領域（配列番号６８）との間への１〜６ヌクレオチドの配列の挿入であるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号９の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、
配列番号１０の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー、
配列番号１１の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、および
配列番号１２の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＢプライマー
を含むプライマーセット、
（３）配列番号１３の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号１３の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＶＢＶ由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含み、該変異がＦ２領域（配列番号６９）とＦ１ｃ領域（配列番号７０）との間への１〜６ヌクレオチドの配列の挿入であるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号１４の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号１４の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、ＳＶＢＶ由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含み、該変異がＢ２領域（配列番号７１）とＢ１ｃ領域（配列番号７２）との間への１〜６ヌクレオチドの配列の挿入であるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号１５の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、
配列番号１６の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー、
配列番号１７の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、および
配列番号１８の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＢプライマーを含むプライマーセット。
【請求項２】
前記（１）が、配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、および配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマーを含むプライマーセットであり、
前記（２）が、配列番号７の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、および配列番号８の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマーを含むプライマーセットであり、
前記（３）が、配列番号１３の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、および配列番号１４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマーを含むプライマーセットである請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
イチゴマイルドイエローエッジウイルス（ＳＭＹＥＶ）由来の核酸を増幅するためのプライマーセットであり、前記プライマーセットが前記（１）を含む請求項１または２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
イチゴモットルウイルス（ＳＭｏＶ）由来の核酸を増幅するためのプライマーセットであり、前記プライマーセットが前記（２）を含む請求項１または２に記載のプライマーセット。
【請求項５】
イチゴベインバンディングウイルス（ＳＶＢＶ）由来の核酸を増幅するためのプライマーセットであり、前記プライマーセットが前記（３）を含む請求項１または２に記載のプライマーセット。
【請求項６】
前記（１）〜（３）をいずれも含む請求項１または２に記載のプライマーセット。
【請求項７】
イチゴの病原ウイルスの検出方法であって、
検体から核酸を抽出すること、
前記核酸および請求項１〜６のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行うこと、
増幅産物があると判断された場合に前記検体にイチゴの病原ウイルスが存在すると判断することを含む、検出方法。
【請求項８】
イチゴの病原ウイルスの検出方法であって、
検体から核酸を抽出すること、
前記核酸および請求項６に記載のプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行うこと、
前記増幅反応後のＤＮＡの二本鎖への会合曲線解析により、前記検体におけるイチゴの病原ウイルスの存在の有無および存在するイチゴの病原ウイルスの種類の数を判断することを含む、検出方法。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のプライマーセット、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、ｄＮＴＰｓ、および緩衝液を含む、イチゴの病原ウイルスの検出用キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本明細書において「ＬＡＭＰ法」は、ＲＴ−ＬＡＭＰ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を含む意味で用いられる。ＲＴ−ＬＡＭＰ法においては、逆転写反応とＬＡＭＰ反応を同時に行うことによって核酸の増幅を行う。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
ここで「検体」であるイチゴとしては、葉、実、茎、根等、いずれの部位を用いてもよいが、葉を用いることが好ましい。
検体から、核酸を抽出し、ＬＡＭＰ法による増幅反応を行う。例えば、ＤＮＡを抽出し、ＬＡＭＰ法によるＤＮＡの増幅反応を行うことができ、一方、ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＬＡＭＰ法によるＤＮＡの増幅反応を行うことができる。
核酸の抽出は、公知の方法で行えばよく、一例として以下の手順で行うことができる。
採取したイチゴ苗の葉をチューブにいれ、抽出緩衝液を加えてこの緩衝液中で葉を潰す。任意で熱処理を行い、その後チューブを遠心しその上澄みを使用することができる。ＲＮＡの抽出の際は抽出緩衝液がメルカプトエタノールを含むことが好ましい。