(57)【要約】【課題】生体のＤＤＲ２産生を促進する組成物を提供することを課題とする。【解決手段】メマツヨイグサ種子エキス又はクダモノトケイソウ果実エキスを有効成分として含有するＤＤＲ２産生促進用組成物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
メマツヨイグサ種子エキス又はクダモノトケイソウ果実エキスを有効成分として含有するＤＤＲ２産生促進用組成物。
【請求項２】
メマツヨイグサ種子エキスを０．００００５質量％〜０．０５質量％含有する請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
クダモノトケイソウ果実エキスを０．００１質量％〜０．０５質量％含有する請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
皮膚に塗布する外用の形態である請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体のＤＤＲ２産生促進用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体の総タンパク質のうち約３０％がコラーゲンであると言われており、コラーゲンが細胞外マトリックスの重要な構成要素であると考えられている。コラーゲンは、細胞接着のための物理的な足場となり、さらに、細胞へ情報を伝えるシグナル伝達物質としても働き、細胞の増殖や分化など様々なイベントに関与している。
細胞膜上にはコラーゲンを認識する受容体膜タンパク質が存在している。代表的な受容体として、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ、Ｄｉｓｃｏｉｄｉｎ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ディスコイディン・ドメイン・レセプター以下、「ＤＤＲ」）、ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＶ、ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１が挙げられる（非特許文献１）。
【０００３】
これらの受容体の中でＤＤＲが近年注目されている。ＤＤＲは、受容体型チロシンキナーゼファミリーに属するコラーゲン受容体タンパク質である（非特許文献２）。ＤＤＲには、ＤＤＲ１とＤＤＲ２の２つのアイソフォームが存在し、それぞれ上皮系細胞と間葉系細胞に特異的な発現がみられる。ＤＤＲ２は、コラーゲンやＭＭＰ（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）の発現にかかわっており、皮膚の創傷治癒に重要な役割を担っていることが、非特許文献３に記載されている。特許文献１にはＤＤＲ２のキナーゼ活性によって仲介される増殖性障害治療に用いる化合物が提案されている。
【０００４】
またＤＤＲ２は、３重らせん構造をもったコラーゲン分子によって刺激され、リン酸化シグナルを伝達することが知られている。ＤＤＲ２がダメージを受けた軟骨組織を認識して結合し、より活性化されることから、ＤＤＲ２はメカニカルストレスを細胞内に伝達するメカノセンサーとして機能することが示唆されている（非特許文献４）。
このようにＤＤＲ２は、組織に発生した傷を修復するために重要な機能を果たしていると考えられている。真皮線維芽細胞のＤＤＲ２は、ダメージを受けた真皮コラーゲンを認識して、損傷部分を修復・再生する重要な働きを担っているものと考えられる。しかし真皮線維芽細胞ＤＤＲ２の発現量を維持あるいは増加させる物質や組成物は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１３−５０８３９３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Leitinger, B. (2011) Transmembrane collagen receptors. Annual Rev. Cell Develop. Biol., 27, 2.1-2.26.
【非特許文献２】Leitinger, B. (2014) Discoidin domain receptor functions in physiological and pathological conditions. Int. Rev. Cell Mol. Biol., 310, 39-87.
【非特許文献３】Olaso, E. at al. (2011) Impaired dermal wound healing in discoidin domain receptor 2-deficient mice associated with defective extracellular matrix remodeling. Fibrosis Tissue Repair, 4, 5-14.
【非特許文献４】Majkowska, I. et al. (2017) Discoidin domain receptor 2 mediates Collagen-induced activation of membrane-type 1 matrix metalloproteinase in human fibroblasts. J. Biol. Chem., 292, 16, 6633-6643.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、多数の天然物質について探索を行い、ＤＤＲ２の産生を促進する物質を見出し、本発明をなした。
本発明は、生体のＤＤＲ２産生を促進する組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（１）メマツヨイグサ種子エキス又はクダモノトケイソウ果実エキスを有効成分として含有するＤＤＲ２産生促進用組成物。
（２）メマツヨイグサ種子エキスを０．００００５質量％〜０．０５質量％含有する（１）に記載の組成物。
（３）クダモノトケイソウ果実エキスを０．００１質量％〜０．０５質量％含有する（１）に記載の組成物。
（４）皮膚に塗布する外用の形態である（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、ＤＤＲ２産生を促進する組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】紫外線を照射したコラーゲンによるＤＤＲ２のｍＲＮＡ増加を確認した試験結果を示すグラフである。図中の「Ｃｏｌｌ−」はコラーゲン処理なし、「ＵＶＡ  Ｃｏｌｌ＋」は紫外線照射したコラーゲンを意味している。
【図２】メマツヨイグサ種子エキス（ルナホワイトＢ）によるヒト線維芽細胞へのＤＤＲ２産生促進効果を確認する試験の結果を示すグラフである。
【図３】クダモノトケイソウ果実エキス（キュアパッション）によるヒト線維芽細胞へのＤＤＲ２産生促進効果を確認する試験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、メマツヨイグサ種子エキス又はクダモノトケイソウ果実エキスを有効成分として含有するＤＤＲ２産生促進用組成物に関する。
本発明の有効成分であるメマツヨイグサ種子エキス及びクダモノトケイソウ果実エキスについて説明する。
【００１２】
メマツヨイグサ種子エキスは、イブニングプリムローズという別名で知られるメマツヨイグサ（Ｏｅｎｏｔｈｅｒａ  ｂｉｅｎｎｉｓ）の種子から抽出されたエキスである。メマツヨイグサ種子エキスは、メマツヨイグサの種子を適当な溶媒で抽出することによって得られる。抽出は、種子を低温ないし加温下で溶媒中に所定の時間浸漬することによって実施できる。具体的には、特開２００４−１３７２３３号公報に開示された方法を採用して抽出することができる。
抽出溶媒としては特に限定されないが、例えば、水；メチルアルコール、エチルアルコール等の低級一価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコール、アセトン等のケトン類、エチルエーテル等のエーテル類、酢酸エチル等のエステル類等の一種又は二種以上を用いることができる。
【００１３】
メマツヨイグサ種子エキスは、そのままあるいは、一定期間放置し熟成させた後に用いることもできる。必要に応じて、本発明の効果に影響のない範囲で、更に、濾過又はイオン交換樹脂等により、脱臭、脱色等の精製処理を施して用いることもできる。さらに液体クロマトグラフィー等の分離手段を用い、活性の高い画分を取り出して用いることもできる。
【００１４】
メマツヨイグサの種子エキスの好ましい抽出方法の例としては、濃度０〜１００ｖｏｌ％の含水エチルアルコール、１，３−ブチレングリコール又はアセトンを用い、室温で、又は加温して１〜５日間抽出を行った後、濾過し、得られた濾液を更に一週間程放置して熟成させ、再び濾過を行う方法が挙げられる。但し、抽出法はこれに限定されるものではない。
【００１５】
本発明の組成物は、メマツヨイグサ種子エキスを有効成分として含む外用剤である限りその形態については特に制限はない。液状、ペースト状、ゲル状等いずれの形態で用いることもできる。又は液状等のエキスを、乾固させて固体状とする、あるいはスプレードライ等により乾燥させて粉末として用いることもできる。
メマツヨイグサ種子エキスは、市販されているものを使用しても良い。本発明に適する市販品としては、メマツヨイグサ種子エキス１．０質量％を含有する一丸ファルコス株式会社製「ルナホワイトＢ」を例示できる。ルナホワイトＢは、メマツヨイグサ種子エキスを１．０質量％、１，３−ブチレングリコールを４９．５質量％と水を４９．５質量％から成る。
【００１６】
本発明で使用するクダモノトケイソウ果実エキスは、クダモノトケイソウ（別名：パッションフルーツ）」とは、トケイソウ科（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａｃｅａｅ）、トケイソウ属（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ）の植物：パッションフルーツ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ  ｅｄｕｌｉｓ  Ｓｉｍｓ．）の果皮、果実、果実(種子を含む)から抽出されたエキスである。クダモノトケイソウ果実エキスは、クダモノトケイソウ果実を適当な溶媒で抽出することによって得られる。抽出は、種子を低温ないし加温下で溶媒中に所定の時間浸漬することによって実施できる。具体的には、特開２０１３−６０４０４号公報に開示された方法を採用して抽出することができる。
【００１７】
本発明で用いるクダモノトケイソウ果実エキスを得るための抽出溶媒としては、水、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブタノール、イソブタノール等の低級アルコール或いは含水低級アルコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、１，２−ブチレングリコール、１，４−ブチレングリコール、１，５−ペンタンジオール、１，２−ペンタンジオール、１，３−ペンタンジオール、１，４−ペンタンジオール、１，３，５−ペンタントリオール、グリセリン、ポリエチレングリコール（分子量１００〜１０万）等の多価アルコール或いは含水多価アルコール、アセトン、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、エチルメチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、キシレン、ベンゼン、クロロホルム、四塩化炭素、フェノール、トルエン等の各種有機溶媒や、適宜規定度を調製した酸（塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、ギ酸、酢酸等）やアルカリ（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、アンモニア等）の中から選ばれる１種もしくは２種以上の混液が挙げられ、特に水、エタノール及び１，３−ブチレングリコールから選ばれる１種又は２種以上を選択することが好ましい。
【００１８】
抽出方法については、その溶媒の温度や原料に対する溶媒の重量比率、又は抽出時間についても、種々の原料及び使用する溶媒に対しそれぞれを任意に設定することができる。溶媒の温度としては−４℃から１００℃の範囲で任意に設定できるが、原料中に含まれる成分の安定性の点から、１０〜４０℃付近が好ましい。又、原料に対する溶媒の重量比率も、例えば原料：溶媒が、４：１〜１：１００の範囲内で任意に設定することができ、特に１：１〜１：２０の重量比率が好ましい。
【００１９】
本発明で用いるクダモノトケイソウ果実エキスは、溶媒抽出後、更に適宜精製操作を行っても良い。精製操作としては、酸（塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、有機酸等）又はアルカリ（水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、アンモニア等）添加による分解、微生物による発酵又は代謝変換、イオン交換樹脂や活性炭、ケイ藻土等による成分吸着、種々の分離モード（イオン交換、親水性吸着、疎水性吸着、サイズ排除、配位子交換、アフィニティー等）を有するクロマトグラフィーを用いた分画、濾紙やメンブランフィルター、限外濾過膜等を用いた濾過、加圧又は減圧、加温又は冷却、乾燥、ｐＨ調整、脱臭、脱色、長時間の静置保管等が例示でき、これらを任意に選択し組み合わせ処理を行うことが可能である。
クダモノトケイソウ果実エキスは、市販されているものを使用しても良い。本発明に適する市販品としては、クダモノトケイソウ果実エキス１．０質量％を含有する「キュアパッション」を例示できる。キュアパッションは、クダモノトケイソウ果実エキスを１．０質量％、１，３−ブチレングリコールを３０．０質量％と水を６９．０質量％から成る。
【００２０】
本発明の組成物には、メマツヨイグサ種子エキスを０．００００５質量％以上含有する。好ましくは０．００００５〜０．０５質量％含有する。さらに好ましくは０．００００８〜０．０３質量％、特に好ましくは、０．００００８〜０．０１質量％含有する。
また、本発明の組成物には、クダモノトケイソウ果実エキスを０．００１質量％以上含有する。好ましくは０．００１〜０．０５質量％含有する。さらに好ましくは０．００３〜０．０３質量％、特に好ましくは、０．００３〜０．０２質量％である。
【００２１】
本発明のＤＤＲ２産生促進用組成物は、食品、医薬品・医薬部外品、化粧料として使用可能である。
なお製剤化に当たっては、賦形剤やその他の有効成分を本発明の組成物の目的を阻害しない範囲で使用することができる。具体的には、シクロデキストリン、へミセルロース、リグニン、グアーガム、コンニャクマンナン、イサゴール、アルギン酸、寒天、カラギーナン、キチン、カルボキシメチルセルロース、ポリデキストロースなどの食物繊維や増粘剤、食用油、カルシウム、鉄、ナトリウム、亜鉛、銅、カリウム、リン、マグネシウム、ヨウ素、マンガン、セレンなどのミネラル；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ナイアシン、葉酸、パントテン酸などの脂溶性又は水溶性のビタミン群、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、リン脂質、アラビアガム、キサンタンガム、トラガカントガム、ローカストビーンガムなどの乳化剤や分散剤、増量剤、賦形剤、保存料・酸化防止剤、風味調整剤や香料、塩化ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、グリシン、コハク酸、乳酸ナトリウムなどの呈味料、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、アジピン酸、フマル酸、リンゴ酸などの酸味料、マルチトール、アスパルテームなどの低カロリー甘味料、着色剤などである。
本発明の組成物は、試験例に示すとおり、線維芽細胞に直接作用して、線維芽細胞におけるＤＤＲ２産生促進作用を発揮する。したがって化粧品のような、外用剤として使用することが作用機構上好ましい。化粧料とする場合は、皮膚マッサージ用化粧料に配合して、マッサージと併用することが好適である。
食品とする場合は、チューインガムやキャンディー、チュアブル錠などの形態を例示できる。
化粧料は、上記のとおりＤＤＲ２産生促進作用を発揮できる組成であれば、配合成分には特に大きな制限はない。また形態も、液状、クリーム状、ゼリー状など様々な形態であっても問題はない。また水中油型或いは油中水型のいずれの乳化組成物であっても良い。
【実施例】
【００２２】
以下に試験例、実施例を示し、本発明をさらに説明する。
＜試験例：ＤＤＲ２産生促進試験＞
予備試験により選抜された２種類のエキス、メマツヨイグサ種子エキス及びクダモノトケイソウ果実エキスの紫外線傷害を与えたコラーゲン誘発性ＤＤＲ２産生の促進作用を確認した。
１．試験方法
（１）試験試料
１）メマツヨイグサ種子エキス：一丸ファルコス株式会社製「ルナホワイトＢ」メマツヨイグサ種子エキス１．０質量％含有品。
２）クダモノトケイソウ果実エキス：一丸ファルコス株式会社製「キュアパッション」クダモノトケイソウ果実エキス１．０質量％含有品。
【００２３】
（２）試験用細胞
新生児由来正常ヒト線維芽細胞  （Ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ以下「ＮＨＤＦ」、ＬＯＮＺＡ）を用いた。
【００２４】
（３）細胞培養条件
１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清（ＦＢＳ）ＳＡ（ＳＩＧＭＡ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）及び１％（ｖ／ｖ）Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）含有ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地（ＧＩＢＣＯ）を用いて、３７°Ｃ、５％ＣＯ２存在下のインキュベーターで培養した。
【００２５】
（４）紫外線によるコラーゲンへの傷害負荷
あらかじめＮＨＤＦ細胞を６−ｗｅｌｌプレートに１６０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種して、２４時間培養した。
ついで１％（ｖ／ｖ）Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含む氷冷ＤＭＥＭ培地を用いて、コラーゲン溶液（５ｍｇ／ｍｌコラーゲン酸性溶液  Ｉ−ＡＣ、ＩＡＣ−５０、高研）を１００μｇ／ｍｌに希釈した。この希釈液を氷上におき、照射量７．５Ｊ／ｃｍ２のＵＶＡを照射した。
【００２６】
（５）ＵＶＡを照射のコラーゲンによるＤＤＲ２産生促進試験
このＵＶＡを照射したコラーゲン溶液を氷冷ＤＭＥＭで２０μｇ／ｍｌに希釈し、細胞に添加して３７°Ｃ、５％ＣＯ２存在下のインキュベーターで２４時間培養した。
なおＤＤＲ２のリン酸化を阻害する場合は、阻害剤であるＤＤＲ１−ＩＮ−１（ナミキ商事）を終濃度５μＭとなるように添加して使用した。
２４時間培養後、培地を除去してＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ、富士フイルム和光純薬）で洗浄し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＴｏｔａｌ  ＲＮＡを調製し、定量した。
ｃＤＮＡの合成は、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ：タカラバイオ株式会社）を用い、定量ＰＣＲはＰｏｗｅｒＵｐ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。
測定に用いたＤＤＲ２のプライマー配列は次のとおりである。
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ: ＣＣＣＡＧＣＴＧＴＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＧＴＴＡ
（配列表配列番号１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ: ＴＣＡＧＧＡＣＡＡＡＴＧＧＣＴＧＧＴＴＧＡＧ
（配列表配列番号２）
【００２７】
（６）メマツヨイグサ種子エキス又はクダモノトケイソウ果実エキスによるＤＤＲ２産生促進試験
メマツヨイグサ種子エキスとして「ルナホワイトＢ」(一丸ファルコス株式会社)、クダモノトケイソウ果実エキスとして「キュアパッション」(一丸ファルコス株式会社)を用いた。
ＮＨＤＦ細胞は、６−ｗｅｌｌプレートに１６０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種して、２４時間培養した。培養後、培地を除去して、ルナホワイトＢ（一丸ファルコス）又はキュアパッション（一丸ファルコス）を添加した。
まずルナホワイトＢは、ＤＭＥＭ培地（血清なし）で２００倍に希釈した。この希釈溶液は０．２５質量％ブチレングリコール（以下「ＢＧ」、富士フイルム和光純薬）を含有する。２００倍希釈したルナホワイトＢを０．２５質量％ ＢＧ含有ＤＭＥＭ培地で段階希釈して、０．００８、０．０１６、０．０３２、０．０６４質量％のルナホワイトＢ含有培地を調製した。
また、キュアパッションは、ＤＭＥＭ培地（血清なし）で６倍に希釈した。この希釈溶液は０．５質量％ＢＧ（富士フイルム和光純薬）を含有する。６倍希釈したキュアパッションを０．５質量％ＢＧ含有ＤＭＥＭ培地で段階希釈して、０．４１７、１．６６質量％に調製して使用した。
ＤＤＲ２のタンパク質量産生促進効果を有するポジティブコントロールとして、１、１．５、２ｍＭ  Ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ（以下「ＰＦ」、東京化成工業株式会社）を用いた。
【００２８】
サンプル添加処理から４８時間培養した後、培地を除去して、細胞を２ｍｌのＰＢＳで洗浄した。細胞は２００μｌ  Ｌａｅｍｍｌｉ  ｂｕｆｆｅｒ（０．０９Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、３％  ＳＤＳ、１０．３％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に溶解し、エッペンドルフチューブに回収して、超音波破砕（１０秒処理、５秒氷上静置を３回）にかけて細胞を溶解させた。
次いで、４°Ｃで１５，０００×ｇの条件で１０分間遠心分離した。上清を４×ＳＤＳ−ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒと混合し、９５°Ｃで３分間熱処理した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけてタンパク質を分離した。ゲル内のタンパク質は、電気的にＰＶＤＦ膜に転写した。
転写後、膜をＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に浸し、約１５分間ブロッキングした。
次に、ＰＶＤＦ膜をＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋで１，０００倍希釈した一次抗体（Ａｎｔｉ−ＤＤＲ２、ＡＦ２５３８、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ又は  Ａｎｔｉ−βＡｃｔｉｎ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に浸し、４°Ｃで一晩反応させた。次いで、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）を用いて４回洗浄後、１０，０００倍希釈した二次抗体（Ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−Ｇｏａｔ  ＩｇＧ  （Ｈ＋Ｌ）  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＨＲＰ、Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  又は  Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｃｒｏｓｓ−Ａｄｓｏｒｂｅｄ，ＨＲＰ，  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ，Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に浸し、室温で１時間反応させた。
ＰＢＳＴで４回洗浄した後、ＥＣＬ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、化学発光検出装置（ＬＡＳ−４０００  ｍｉｎｉ、Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ）でシグナルを検出した。
検出されたバンドのシグナル強度を解析（Ｍｕｌｔｉ  Ｇａｕｇｅ，フジフィルム株式会社）し、ＢＧコントロールに対する相対値を算出しＤＤＲ２の増加量を評価した。
また、ＤＤＲ２のｍＲＮＡ量を上記と同様に測定した。
【００２９】
２．試験結果
（１）ＵＶＡ曝露コラーゲンによるＤＤＲ２産生促進試験の結果
ダメージコラーゲンによるＤＤＲ２産生促進試験におけるＤＤＲ２測定結果を図１に示す。なおＤＤＲ２の産生がリン酸化シグナル依存的かどうかを知るために、阻害剤であるＤＤＲ１−ＩＮ−１の存在下でも測定した。
図１に示すとおり、ＵＶＡ処理により、コラーゲンはＤＤＲ２のｍＲＮＡレベルが、無処理のコントロールに比べて、１．３倍に増加した。さらに、ＤＤＲ１−ＩＮ−１阻害剤により、ＤＤＲ２のｍＲＮＡレベルは無処理のコントロールに比べて、それぞれ１．１５倍になっていた。これは、細胞がダメージコラーゲンを認識し、ＤＤＲ２のｍＲＮＡ発現レベルが増加したことを表している。またこの効果は、リン酸化阻害剤によって抑制された。
【００３０】
（２）メマツヨイグサ種子エキス又はクダモノトケイソウ果実エキスによるＤＤＲ２産生促進試験の結果
１）ルナホワイトＢ（メマツヨイグサ種子エキス）
ＮＨＤＦ細胞をルナホワイトＢで処理した結果を図２に示す。
図２に示すとおり、ルナホワイトＢでＮＨＤＦ細胞を処理すると、０．００８〜０．０６４質量％の濃度でコントロールに比較して約１．３〜１．４倍にＤＤＲ２タンパク質量が増加した。このとき、ＤＤＲ２タンパク質量とｍＲＮＡの変動との相関性は見られなかった。したがって、メマツヨイグサ種子エキスはＤＤＲ２タンパク質の産生機構に直接作用するものと考えられた。
【００３１】
２）キュアパッション（クダモノトケイソウ果実エキス）
ＮＨＤＦ細胞をキュアパッションで処理した結果を図３に示す。
図３に示すとおり、キュアパッションでＮＨＤＦ細胞を処理すると、０．４１７質量％の濃度でコントロールに比較して約１．２倍に、０．１６６質量％の濃度で約１．１１倍にＤＤＲ２タンパク質量が増加した。このとき、ＤＤＲ２のタンパク質量とｍＲＮＡの変動との相関性は見られなかった。したがって、クダモノトケイソウ果実エキスは、ＤＤＲ２タンパク質の産生機構に直接作用するものと考えられた。
【００３２】
以上の試験からメマツヨイグサ種子エキス又はクダモノトケイソウ果実エキスは、ＤＤＲ２産生に有効であることが確認できた。
【００３３】
＜製造例＞
下記の処方によりマッサージ用化粧料を調製した。
ジェル状マッサージ用化粧料                                  （質量％）
グリセリン                                                    ５ 
エタノール                                                    ３
（アクリレーツ／アクリル酸アルキル（Ｃ１０−３０））クロスポリマー
０．３
ＰＥＧ−８０水添ヒマシ油                                      ０．３
水酸化カリウム                                                ０．１１
メマツヨイグサ種子エキス                                      ０．０００１  
水                                                            残余
水、グリセリン、（アクリレーツ／アクリル酸アルキル（Ｃ１０−３０））クロスポリマー、ＰＥＧ−８０水添ヒマシ油  を加熱溶解させる。冷却後、水酸化カリウムで中和し、あらかじめメマツヨイグサ種子エキスとエタノールを分散していたものをさらに投入し、混合してジェル状マッサージ化粧料を得た。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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