(57)【要約】  本発明は、ファミリーのメンバーとして、上皮成長因子(EGF)フォールド含有ドメインを含み、長さが125〜153アミノ酸であって、８つの保存されたシステイン残基を含む分泌タンパク質として本発明で同定された新規なタンパク質INSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117が挙げられる、SECFAM1ファミリーと名付けられた新規な分泌タンパク質のファミリーに関しており、また疾患の診断、予防及び治療における前記タンパク質及びそのコード遺伝子由来の核酸配列の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
SECFAM1ファミリーのメンバーの同定方法であって、
翻訳された核酸配列又はポリペプチド配列のデータベースを検索して、以下の配列プロファイルにマッチングするポリペプチドを同定することを含む前記方法：
A  R  N  D  C  Q  E  G  H  I  L  K  M  F  P  S  T  W  Y  V
1 M   -1 -1 -2 -3 -1  0 -2 -3 -2  0  1 -1  7  0 -2 -1 -1 -1 -1  0 
2 N    1  2  2 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1  0  3 -2 -2  1  0 -3 -2 -1 
3 K    0  0 -1  0 -2  1  2 -2 -1  0 -1  1 -1 -3  2 -1 -1 -3 -2  1 
4 R    0  3 -1 -2  4  0 -1 -2 -1  0  0  0  0 -2 -2  1 -1 -3 -2 -1 
5 Y    1  0 -2 -2 -2 -1 -1 -2 -1  0  0 -1  0 -1  3  0 -1 -2  2  0 
6 L   -1  2 -1 -1 -2  0  0 -2 -1 -1  0  3  2 -2 -2  0  1 -2 -2 -1 
7 Q    1  0  0 -1 -1  1  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  2  2  3 -1 -1 
8 K   -1 -1  2 -1 -2 -1 -1  0 -1  0  0  1  2 -1 -2  0  0 -3 -2  2 
9 A    0  0 -2 -2 -1 -1 -2 -2 -2  0  0 -1  0 -1 -2  0 -1  7  0  0 
10 T    0  1  0 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1  0  0  0 -2  1  2  1 -3 -2 -1 
11 Q    1  0  0 -1 -1  2  0 -1 -1 -1  0  0  0 -2  0  2  0 -3 -2 -1 
12 G    0  0  0  2 -2 -1  0  3  4 -2 -2 -1  2 -2 -2  0 -1 -2 -1 -2 
13 K    1 -1 -1 -1 -2 -1 -1  2 -2 -3 -2  0 -1 -1 -2  2 -1  7 -1 -2 
14 L    0 -2 -2 -3 -1 -2 -2  1 -2 -1  0 -2  0  0 -2 -1  1  8  0 -1 
15 L    2 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -3  1  3 -2  0 -1 -2 -1  0 -3 -1  2 
16 I   -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  2  4 -2  1  1 -3 -2 -1 -2  0  1 
17 I    1 -2 -2 -2 -1 -2 -2 -2 -1  1  1 -2  0  0  3 -1 -1 -1  2  0 
18 I    0 -2 -1 -2 -1 -1 -2 -2 -2  1  3 -1  0 -1 -2  1  0 -2 -1  0 
19 F   -1 -2 -3 -3  6 -2 -3 -3 -1 -1  0 -2  3  2 -3 -2 -1  6  3 -1 
20 I    0 -2 -1 -2 -1 -2 -2 -2 -2  3  1 -2  0 -1 -2  1  1 -3 -1  2 
21 V    2 -2 -1 -2  3 -1 -1 -1 -2  0  0 -1  0 -2 -2  2  0 -3 -2  0 
22 T    1 -2 -2 -2  3 -1 -2 -2 -2 -1  0 -2  2 -1 -2  0  2  6 -1  0 
23 L   -1 -3 -3 -3  4 -3 -3 -3 -2  0  2 -3  0  4 -3 -2 -1 -1  0  1 
24 W    0 -3 -3 -3  5 -2 -3 -2 -2 -1  0 -3 -1  0 -3 -1 -1  9  0 -1 
25 G    1 -2 -1 -2  4 -1 -2  1 -2  0  0 -1  2 -2 -2  0  1 -2 -2  0 
26 K   -1  0 -1 -2  1  1  0 -3  1  0  1  2  0  2 -2 -1 -1 -2  0 -1 
27 A    0 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  1  3 -2  3  0  0 -2 -1 -2 -1  1 
28 V    0 -2 -2 -3  4 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  3 -1 -2 -1  0 -2 -1  2 
29 S    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1  5 -1  1 -1  0 -1 -2  2  0 -3  0 -1 
30 S    4 -1 -1 -2 -1 -1 -1  2 -2 -2 -2 -1 -1 -2 -1  1  1 -3 -2 -1 
31 A    1 -1  0  0 -1  1  0  1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -2 
32 N   -1 -1  2 -1 -2 -1 -2 -2 -1  0  3 -1  0  1 -3  1 -1 -2 -1  0 
33 H   -1  0  0 -1 -2  5  0 -3  3 -1  1  0  0 -2 -2 -1 -1 -2 -1 -1 
34 H   -1  0  0 -1 -2  0  0 -2  6  0 -1  0 -1 -2  2  0 -1 -3  0 -1 
35 K   -1  0  0 -1 -3  3  0 -2  4 -3 -2  1 -1 -3  3  0 -1 -2  0 -2 
36 A    2  1  0 -1 -1  0 -1 -1  4 -1 -1  0 -1 -2 -1  0  2 -2  0 -1 
37 H    0 -1  0 -1 -2 -1 -1  3  6 -3 -3 -1 -2 -2 -2  1 -1 -2  0 -2 
38 H    0 -1  0 -2  5 -1 -1 -2  5 -1  0 -1 -1 -1 -2  0  1 -2  0 -1 
39 V   -1 -2 -2 -2 -2 -1  0 -3 -2  2  2 -2  0 -1  2 -2 -1 -3 -1  2 
40 R    1  2 -1 -1 -2  1  1 -1 -1 -2 -2  3 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
41 T    2 -1 -1 -1 -2  3  0  1 -1 -2 -2  0 -1 -3  0  0  2 -2 -2 -1 
42 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
43 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
44 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
45 E   -1  0  0  1 -4  1  6 -2  0 -3 -3  0 -2 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
46 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
47 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  4  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
48 A    4 -1 -1 -2  0 -1 -1 -1 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  2 -3 -2  0 
49 L    3 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -3  0  2 -2  0 -1 -2  0  0 -3 -1  1 
50 H   -2 -1  0  3 -3  0  0 -2  8 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -1 -2 -3  0 -3 
51 R   -1  6  0 -2 -3  0  0 -2  0 -3 -2  1 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 
52 C   -1 -3 -1  3  8 -2 -1 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -1 -1 -3 -2 -2 
53 C    0 -2 -1 -2  8 -2 -2 -2 -2 -1 -1 -2 -1 -2 -2  2  0 -2 -2 -1 
54 N   -1  0  6  0 -2  0  0  0  0 -3 -3  0 -2 -3 -2  2  0 -4 -2 -3 
55 K   -1  2  0 -1 -3  3  0 -2 -1 -3 -2  4 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
56 N   -2 -1  6  0 -3  0  0 -1  0 -3 -3  0 -2 -3  3  0  0 -4 -2 -3 
57 K   -1  5  0 -2 -3  0  0 -2  0 -3 -2  3 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 
58 I   -1  2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 -2  4  0 -1  0 -1 -3 -2 -1 -3 -1  1 
59 E   -1  0  0  0 -3  0  5 -2 -1 -2 -2  0 -2 -3 -1  0  2 -3 -2 -1 
60 E   -1 -1 -1  0 -3  0  5 -3 -1  2 -1  0 -1 -2 -2 -1 -1 -3 -2  0 
61 R    1  5 -1 -2 -2  0  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -3 -2  0 -1 -3 -2 -2 
62 S    0  2  0 -1 -2  0  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -2 
63 Q   -1  0  0  0 -3  6  1 -2  0 -3 -2  0  0 -3 -1  0 -1 -2 -1 -2 
64 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
65 V    2 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -3  1  0 -2  0 -1 -2 -1  0 -3 -1  4 
66 K   -1  3  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  5 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
67 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
68 S    2 -1  0 -1 -1  0  0  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -1 
69 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
70 F   -2  2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 -1  0  1 -1  0  4 -3 -2 -2 -1  0 -1 
71 P   -1  0 -1 -1 -3  0  0 -2 -2 -3 -3  2 -2 -3  5  1 -1 -4 -3 -2 
72 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
73 Q   -1  0  0  0 -3  6  1 -2  0 -3 -2  2  0 -3 -1  0 -1 -2 -1 -2 
74 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
75 A    5 -1 -2 -2  0 -1 -1  0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  0 -3 -2  0 
76 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
77 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
78 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
79 R   -1  6  0 -2 -3  0  0 -2  0 -3 -2  1 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 
80 A    4 -1  1 -1  0 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  0 -3 -2  0 
81 A    0  4  0 -2 -2  2  0 -2 -1 -2  0  2  0 -3 -2  0 -1 -3 -2 -2 
82 P   -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4  7 -1 -1 -4 -3 -2 
83 S    2 -1  0 -1 -1  0  0  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -1 
84 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
85 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  2  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  5 
86 D   -2 -2  0  6 -3  0  2 -1 -1 -3 -4 -1 -3 -3 -1  0 -1 -4 -3 -3 
87 A    5 -1 -2 -2  0 -1 -1  0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  0 -3 -2  0 
88 S    0  2  0 -1 -1  0  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -2 
89 I   -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3  5  1 -3  0  0 -3 -2 -1 -3 -1  2 
90 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
91 E   -1  1 -1 -1 -2  0  1 -3 -2  2  1  2  0 -1 -2 -1 -1 -3 -2  0 
92 Q   -1  0  0  0 -2  4  1  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  0  2  2 -1 -2 
93 K   -1  2  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  6 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
94 W   -2 -1 -2 -2 -2  2 -1 -2 -1 -3 -2 -1 -1  0 -3 -2 -2 10  0 -3 
95 W   -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1  0 -4 -3 -2 11  1 -3 
96 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
97 H   -2  0  1  3 -3  2  2 -2  5 -3 -3  0 -2 -2 -1  0 -1 -3  0 -3 
98 M   -1 -1 -2 -3 -1  0 -2 -3 -2  0  1 -1  7  0 -2 -1 -1 -1 -1  0 
99 Q   -1  0  2  0 -3  2  3 -2  0 -1  1  0  0 -2 -2  0 -1 -3 -2 -1 
100 P   -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4  7 -1 -1 -4 -3 -2 
101 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
102 L   -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  1  4 -2  1  0 -3 -2 -1 -2 -1  1 
103 E   -1 -1 -1  0 -3  0  5 -2 -1 -1  0  0 -1 -2  0  0 -1 -3 -2  0 
104 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
105 E   -1  0  0  1 -4  1  6 -2  0 -3 -3  0 -2 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
106 E   -1 -1  0  2 -4  0  4  2 -1 -3 -4  0 -3 -3 -1  0 -1 -3 -3 -3 
107 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
108 K   -1  1  0  3 -3  0  0 -2 -1 -3 -3  4 -2 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
109 V    0 -2 -2 -3 -1 -2 -2 -3 -3  1  2 -2  0 -1 -2 -1  1 -3 -1  4 
110 L   -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  1  4 -2  1  0 -3 -2 -1 -2 -1  0 
111 P   -1 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -3 -2  2 -1 -2 -1 -2  6 -1 -1 -4 -2  0 
112 D   -2 -1  3  6 -3  0  1 -1  0 -3 -4 -1 -3 -3 -1  0 -1 -4 -3 -3 
113 R   -1  3  2 -2 -2  0 -1 -2  0 -1  1  0  0 -1 -2  0 -1 -2  1 -1 
114 K    0 -1  0  0 -1  0  0  0 -1 -2 -2  1 -1 -2 -1  4  1 -3 -2 -2 
115 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
116 W   -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1  0 -4 -3 -2 11  1 -3 
117 S    0 -1  0 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1  0  2 -2 -1  3  3 -2 -2 -1 
118 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
119 S    1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1 -2  0 -1 -1 -1 -2 -1  3  3 -3 -2  0 
120 S    0  0  0  0 -2  3  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  3  1 -3 -2 -2 
121 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
122 N   -1 -1  5  0 -3 -1 -1  3  4 -3 -3 -1 -2 -3 -2  0 -1 -3 -1 -3 
123 K   -1  3  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  5 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
124 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -4 -3  4  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
125 K   -1  1  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  6 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
126 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
127 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
128 R   -1  3  0 -1 -2  0  0 -2 -1 -2 -2  4 -1 -3 -1  0  2 -3 -2 -2 
129 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  2  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  5 
130 T    0 -1  0 -1 -1  0 -1 -1  2 -1  0 -1 -1 -2 -1  3  3 -3 -1 -1 
131 H   -1  4  0 -1 -3  0  0 -2  4 -3 -2  0 -1 -3  3 -1 -1 -3 -1 -3
（ここで、NCBIが指定するデフォルトパラメーター[Blosum 62 マトリックス；ギャップオープンペナルティー＝11及びギャップ伸長ペナルティー＝１]を用いて、前記プロファイルを検索プログラムBLASTにクエリー配列として入力した場合、SECFAM1ファミリーのメンバーは10-2以下のE-valueを有する）。
【請求項２】
E-valueが10-5以下、10-10以下、10-50以下、最も好ましくは10-70以下である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
翻訳された核酸配列のデータベースが、cDNA、EST、mRNA、全体的ゲノム又は部分的ゲノムのデータベースから派生する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
データベースがESTデータベースである、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
データベースが、ヒト配列データベースである、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
以下の(i)〜(iii)のいずれかの単離ポリペプチド：
(i)NCBIが指定するBlosum 62 マトリックス；ギャップオープンペナルティー＝11及びギャップ伸長ペナルティー＝１を有するデフォルトパラメーターを用いて、下記プロファイルを検索プログラムBLASTにクエリー配列として入力した場合、10-2以下のE-valueを有するポリペプチド配列を含む単離ポリペプチド：
A  R  N  D  C  Q  E  G  H  I  L  K  M  F  P  S  T  W  Y  V
1 M   -1 -1 -2 -3 -1  0 -2 -3 -2  0  1 -1  7  0 -2 -1 -1 -1 -1  0 
2 N    1  2  2 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1  0  3 -2 -2  1  0 -3 -2 -1 
3 K    0  0 -1  0 -2  1  2 -2 -1  0 -1  1 -1 -3  2 -1 -1 -3 -2  1 
4 R    0  3 -1 -2  4  0 -1 -2 -1  0  0  0  0 -2 -2  1 -1 -3 -2 -1 
5 Y    1  0 -2 -2 -2 -1 -1 -2 -1  0  0 -1  0 -1  3  0 -1 -2  2  0 
6 L   -1  2 -1 -1 -2  0  0 -2 -1 -1  0  3  2 -2 -2  0  1 -2 -2 -1 
7 Q    1  0  0 -1 -1  1  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  2  2  3 -1 -1 
8 K   -1 -1  2 -1 -2 -1 -1  0 -1  0  0  1  2 -1 -2  0  0 -3 -2  2 
9 A    0  0 -2 -2 -1 -1 -2 -2 -2  0  0 -1  0 -1 -2  0 -1  7  0  0 
10 T    0  1  0 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1  0  0  0 -2  1  2  1 -3 -2 -1 
11 Q    1  0  0 -1 -1  2  0 -1 -1 -1  0  0  0 -2  0  2  0 -3 -2 -1 
12 G    0  0  0  2 -2 -1  0  3  4 -2 -2 -1  2 -2 -2  0 -1 -2 -1 -2 
13 K    1 -1 -1 -1 -2 -1 -1  2 -2 -3 -2  0 -1 -1 -2  2 -1  7 -1 -2 
14 L    0 -2 -2 -3 -1 -2 -2  1 -2 -1  0 -2  0  0 -2 -1  1  8  0 -1 
15 L    2 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -3  1  3 -2  0 -1 -2 -1  0 -3 -1  2 
16 I   -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  2  4 -2  1  1 -3 -2 -1 -2  0  1 
17 I    1 -2 -2 -2 -1 -2 -2 -2 -1  1  1 -2  0  0  3 -1 -1 -1  2  0 
18 I    0 -2 -1 -2 -1 -1 -2 -2 -2  1  3 -1  0 -1 -2  1  0 -2 -1  0 
19 F   -1 -2 -3 -3  6 -2 -3 -3 -1 -1  0 -2  3  2 -3 -2 -1  6  3 -1 
20 I    0 -2 -1 -2 -1 -2 -2 -2 -2  3  1 -2  0 -1 -2  1  1 -3 -1  2 
21 V    2 -2 -1 -2  3 -1 -1 -1 -2  0  0 -1  0 -2 -2  2  0 -3 -2  0 
22 T    1 -2 -2 -2  3 -1 -2 -2 -2 -1  0 -2  2 -1 -2  0  2  6 -1  0 
23 L   -1 -3 -3 -3  4 -3 -3 -3 -2  0  2 -3  0  4 -3 -2 -1 -1  0  1 
24 W    0 -3 -3 -3  5 -2 -3 -2 -2 -1  0 -3 -1  0 -3 -1 -1  9  0 -1 
25 G    1 -2 -1 -2  4 -1 -2  1 -2  0  0 -1  2 -2 -2  0  1 -2 -2  0 
26 K   -1  0 -1 -2  1  1  0 -3  1  0  1  2  0  2 -2 -1 -1 -2  0 -1 
27 A    0 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  1  3 -2  3  0  0 -2 -1 -2 -1  1 
28 V    0 -2 -2 -3  4 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  3 -1 -2 -1  0 -2 -1  2 
29 S    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1  5 -1  1 -1  0 -1 -2  2  0 -3  0 -1 
30 S    4 -1 -1 -2 -1 -1 -1  2 -2 -2 -2 -1 -1 -2 -1  1  1 -3 -2 -1 
31 A    1 -1  0  0 -1  1  0  1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -2 
32 N   -1 -1  2 -1 -2 -1 -2 -2 -1  0  3 -1  0  1 -3  1 -1 -2 -1  0 
33 H   -1  0  0 -1 -2  5  0 -3  3 -1  1  0  0 -2 -2 -1 -1 -2 -1 -1 
34 H   -1  0  0 -1 -2  0  0 -2  6  0 -1  0 -1 -2  2  0 -1 -3  0 -1 
35 K   -1  0  0 -1 -3  3  0 -2  4 -3 -2  1 -1 -3  3  0 -1 -2  0 -2 
36 A    2  1  0 -1 -1  0 -1 -1  4 -1 -1  0 -1 -2 -1  0  2 -2  0 -1 
37 H    0 -1  0 -1 -2 -1 -1  3  6 -3 -3 -1 -2 -2 -2  1 -1 -2  0 -2 
38 H    0 -1  0 -2  5 -1 -1 -2  5 -1  0 -1 -1 -1 -2  0  1 -2  0 -1 
39 V   -1 -2 -2 -2 -2 -1  0 -3 -2  2  2 -2  0 -1  2 -2 -1 -3 -1  2 
40 R    1  2 -1 -1 -2  1  1 -1 -1 -2 -2  3 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
41 T    2 -1 -1 -1 -2  3  0  1 -1 -2 -2  0 -1 -3  0  0  2 -2 -2 -1 
42 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
43 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
44 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
45 E   -1  0  0  1 -4  1  6 -2  0 -3 -3  0 -2 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
46 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
47 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  4  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
48 A    4 -1 -1 -2  0 -1 -1 -1 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  2 -3 -2  0 
49 L    3 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -3  0  2 -2  0 -1 -2  0  0 -3 -1  1 
50 H   -2 -1  0  3 -3  0  0 -2  8 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -1 -2 -3  0 -3 
51 R   -1  6  0 -2 -3  0  0 -2  0 -3 -2  1 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 
52 C   -1 -3 -1  3  8 -2 -1 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -1 -1 -3 -2 -2 
53 C    0 -2 -1 -2  8 -2 -2 -2 -2 -1 -1 -2 -1 -2 -2  2  0 -2 -2 -1 
54 N   -1  0  6  0 -2  0  0  0  0 -3 -3  0 -2 -3 -2  2  0 -4 -2 -3 
55 K   -1  2  0 -1 -3  3  0 -2 -1 -3 -2  4 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
56 N   -2 -1  6  0 -3  0  0 -1  0 -3 -3  0 -2 -3  3  0  0 -4 -2 -3 
57 K   -1  5  0 -2 -3  0  0 -2  0 -3 -2  3 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 
58 I   -1  2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 -2  4  0 -1  0 -1 -3 -2 -1 -3 -1  1 
59 E   -1  0  0  0 -3  0  5 -2 -1 -2 -2  0 -2 -3 -1  0  2 -3 -2 -1 
60 E   -1 -1 -1  0 -3  0  5 -3 -1  2 -1  0 -1 -2 -2 -1 -1 -3 -2  0 
61 R    1  5 -1 -2 -2  0  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -3 -2  0 -1 -3 -2 -2 
62 S    0  2  0 -1 -2  0  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -2 
63 Q   -1  0  0  0 -3  6  1 -2  0 -3 -2  0  0 -3 -1  0 -1 -2 -1 -2 
64 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
65 V    2 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -3  1  0 -2  0 -1 -2 -1  0 -3 -1  4 
66 K   -1  3  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  5 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
67 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
68 S    2 -1  0 -1 -1  0  0  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -1 
69 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
70 F   -2  2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 -1  0  1 -1  0  4 -3 -2 -2 -1  0 -1 
71 P   -1  0 -1 -1 -3  0  0 -2 -2 -3 -3  2 -2 -3  5  1 -1 -4 -3 -2 
72 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
73 Q   -1  0  0  0 -3  6  1 -2  0 -3 -2  2  0 -3 -1  0 -1 -2 -1 -2 
74 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
75 A    5 -1 -2 -2  0 -1 -1  0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  0 -3 -2  0 
76 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
77 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
78 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
79 R   -1  6  0 -2 -3  0  0 -2  0 -3 -2  1 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 
80 A    4 -1  1 -1  0 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  0 -3 -2  0 
81 A    0  4  0 -2 -2  2  0 -2 -1 -2  0  2  0 -3 -2  0 -1 -3 -2 -2 
82 P   -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4  7 -1 -1 -4 -3 -2 
83 S    2 -1  0 -1 -1  0  0  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -1 
84 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
85 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  2  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  5 
86 D   -2 -2  0  6 -3  0  2 -1 -1 -3 -4 -1 -3 -3 -1  0 -1 -4 -3 -3 
87 A    5 -1 -2 -2  0 -1 -1  0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  0 -3 -2  0 
88 S    0  2  0 -1 -1  0  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -2 
89 I   -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3  5  1 -3  0  0 -3 -2 -1 -3 -1  2 
90 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
91 E   -1  1 -1 -1 -2  0  1 -3 -2  2  1  2  0 -1 -2 -1 -1 -3 -2  0 
92 Q   -1  0  0  0 -2  4  1  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  0  2  2 -1 -2 
93 K   -1  2  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  6 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
94 W   -2 -1 -2 -2 -2  2 -1 -2 -1 -3 -2 -1 -1  0 -3 -2 -2 10  0 -3 
95 W   -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1  0 -4 -3 -2 11  1 -3 
96 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
97 H   -2  0  1  3 -3  2  2 -2  5 -3 -3  0 -2 -2 -1  0 -1 -3  0 -3 
98 M   -1 -1 -2 -3 -1  0 -2 -3 -2  0  1 -1  7  0 -2 -1 -1 -1 -1  0 
99 Q   -1  0  2  0 -3  2  3 -2  0 -1  1  0  0 -2 -2  0 -1 -3 -2 -1 
100 P   -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4  7 -1 -1 -4 -3 -2 
101 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
102 L   -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  1  4 -2  1  0 -3 -2 -1 -2 -1  1 
103 E   -1 -1 -1  0 -3  0  5 -2 -1 -1  0  0 -1 -2  0  0 -1 -3 -2  0 
104 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
105 E   -1  0  0  1 -4  1  6 -2  0 -3 -3  0 -2 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
106 E   -1 -1  0  2 -4  0  4  2 -1 -3 -4  0 -3 -3 -1  0 -1 -3 -3 -3 
107 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
108 K   -1  1  0  3 -3  0  0 -2 -1 -3 -3  4 -2 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
109 V    0 -2 -2 -3 -1 -2 -2 -3 -3  1  2 -2  0 -1 -2 -1  1 -3 -1  4 
110 L   -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  1  4 -2  1  0 -3 -2 -1 -2 -1  0 
111 P   -1 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -3 -2  2 -1 -2 -1 -2  6 -1 -1 -4 -2  0 
112 D   -2 -1  3  6 -3  0  1 -1  0 -3 -4 -1 -3 -3 -1  0 -1 -4 -3 -3 
113 R   -1  3  2 -2 -2  0 -1 -2  0 -1  1  0  0 -1 -2  0 -1 -2  1 -1 
114 K    0 -1  0  0 -1  0  0  0 -1 -2 -2  1 -1 -2 -1  4  1 -3 -2 -2 
115 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
116 W   -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1  0 -4 -3 -2 11  1 -3 
117 S    0 -1  0 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1  0  2 -2 -1  3  3 -2 -2 -1 
118 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
119 S    1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1 -2  0 -1 -1 -1 -2 -1  3  3 -3 -2  0 
120 S    0  0  0  0 -2  3  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  3  1 -3 -2 -2 
121 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
122 N   -1 -1  5  0 -3 -1 -1  3  4 -3 -3 -1 -2 -3 -2  0 -1 -3 -1 -3 
123 K   -1  3  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  5 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
124 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -4 -3  4  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
125 K   -1  1  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  6 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
126 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
127 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
128 R   -1  3  0 -1 -2  0  0 -2 -1 -2 -2  4 -1 -3 -1  0  2 -3 -2 -2 
129 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  2  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  5 
130 T    0 -1  0 -1 -1  0 -1 -1  2 -1  0 -1 -1 -2 -1  3  3 -3 -1 -1 
131 H   -1  4  0 -1 -3  0  0 -2  4 -3 -2  0 -1 -3  3 -1 -1 -3 -1 -3；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであるか又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
【請求項７】
NCBIが指定するBlosum 62 マトリックス；ギャップオープンペナルティー＝11及びギャップ伸長ペナルティー＝１を有するデフォルトパラメーターを用いて、下記プロファイルを検索プログラムBLASTにクエリー配列として入力した場合、10-2以下のE-valueを有するポリペプチドからなる、請求項６記載のポリペプチド。
A  R  N  D  C  Q  E  G  H  I  L  K  M  F  P  S  T  W  Y  V
1 M   -1 -1 -2 -3 -1  0 -2 -3 -2  0  1 -1  7  0 -2 -1 -1 -1 -1  0 
2 N    1  2  2 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1  0  3 -2 -2  1  0 -3 -2 -1 
3 K    0  0 -1  0 -2  1  2 -2 -1  0 -1  1 -1 -3  2 -1 -1 -3 -2  1 
4 R    0  3 -1 -2  4  0 -1 -2 -1  0  0  0  0 -2 -2  1 -1 -3 -2 -1 
5 Y    1  0 -2 -2 -2 -1 -1 -2 -1  0  0 -1  0 -1  3  0 -1 -2  2  0 
6 L   -1  2 -1 -1 -2  0  0 -2 -1 -1  0  3  2 -2 -2  0  1 -2 -2 -1 
7 Q    1  0  0 -1 -1  1  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  2  2  3 -1 -1 
8 K   -1 -1  2 -1 -2 -1 -1  0 -1  0  0  1  2 -1 -2  0  0 -3 -2  2 
9 A    0  0 -2 -2 -1 -1 -2 -2 -2  0  0 -1  0 -1 -2  0 -1  7  0  0 
10 T    0  1  0 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1  0  0  0 -2  1  2  1 -3 -2 -1 
11 Q    1  0  0 -1 -1  2  0 -1 -1 -1  0  0  0 -2  0  2  0 -3 -2 -1 
12 G    0  0  0  2 -2 -1  0  3  4 -2 -2 -1  2 -2 -2  0 -1 -2 -1 -2 
13 K    1 -1 -1 -1 -2 -1 -1  2 -2 -3 -2  0 -1 -1 -2  2 -1  7 -1 -2 
14 L    0 -2 -2 -3 -1 -2 -2  1 -2 -1  0 -2  0  0 -2 -1  1  8  0 -1 
15 L    2 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -3  1  3 -2  0 -1 -2 -1  0 -3 -1  2 
16 I   -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  2  4 -2  1  1 -3 -2 -1 -2  0  1 
17 I    1 -2 -2 -2 -1 -2 -2 -2 -1  1  1 -2  0  0  3 -1 -1 -1  2  0 
18 I    0 -2 -1 -2 -1 -1 -2 -2 -2  1  3 -1  0 -1 -2  1  0 -2 -1  0 
19 F   -1 -2 -3 -3  6 -2 -3 -3 -1 -1  0 -2  3  2 -3 -2 -1  6  3 -1 
20 I    0 -2 -1 -2 -1 -2 -2 -2 -2  3  1 -2  0 -1 -2  1  1 -3 -1  2 
21 V    2 -2 -1 -2  3 -1 -1 -1 -2  0  0 -1  0 -2 -2  2  0 -3 -2  0 
22 T    1 -2 -2 -2  3 -1 -2 -2 -2 -1  0 -2  2 -1 -2  0  2  6 -1  0 
23 L   -1 -3 -3 -3  4 -3 -3 -3 -2  0  2 -3  0  4 -3 -2 -1 -1  0  1 
24 W    0 -3 -3 -3  5 -2 -3 -2 -2 -1  0 -3 -1  0 -3 -1 -1  9  0 -1 
25 G    1 -2 -1 -2  4 -1 -2  1 -2  0  0 -1  2 -2 -2  0  1 -2 -2  0 
26 K   -1  0 -1 -2  1  1  0 -3  1  0  1  2  0  2 -2 -1 -1 -2  0 -1 
27 A    0 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  1  3 -2  3  0  0 -2 -1 -2 -1  1 
28 V    0 -2 -2 -3  4 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  3 -1 -2 -1  0 -2 -1  2 
29 S    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1  5 -1  1 -1  0 -1 -2  2  0 -3  0 -1 
30 S    4 -1 -1 -2 -1 -1 -1  2 -2 -2 -2 -1 -1 -2 -1  1  1 -3 -2 -1 
31 A    1 -1  0  0 -1  1  0  1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -2 
32 N   -1 -1  2 -1 -2 -1 -2 -2 -1  0  3 -1  0  1 -3  1 -1 -2 -1  0 
33 H   -1  0  0 -1 -2  5  0 -3  3 -1  1  0  0 -2 -2 -1 -1 -2 -1 -1 
34 H   -1  0  0 -1 -2  0  0 -2  6  0 -1  0 -1 -2  2  0 -1 -3  0 -1 
35 K   -1  0  0 -1 -3  3  0 -2  4 -3 -2  1 -1 -3  3  0 -1 -2  0 -2 
36 A    2  1  0 -1 -1  0 -1 -1  4 -1 -1  0 -1 -2 -1  0  2 -2  0 -1 
37 H    0 -1  0 -1 -2 -1 -1  3  6 -3 -3 -1 -2 -2 -2  1 -1 -2  0 -2 
38 H    0 -1  0 -2  5 -1 -1 -2  5 -1  0 -1 -1 -1 -2  0  1 -2  0 -1 
39 V   -1 -2 -2 -2 -2 -1  0 -3 -2  2  2 -2  0 -1  2 -2 -1 -3 -1  2 
40 R    1  2 -1 -1 -2  1  1 -1 -1 -2 -2  3 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
41 T    2 -1 -1 -1 -2  3  0  1 -1 -2 -2  0 -1 -3  0  0  2 -2 -2 -1 
42 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
43 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
44 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
45 E   -1  0  0  1 -4  1  6 -2  0 -3 -3  0 -2 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
46 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
47 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  4  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
48 A    4 -1 -1 -2  0 -1 -1 -1 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  2 -3 -2  0 
49 L    3 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -3  0  2 -2  0 -1 -2  0  0 -3 -1  1 
50 H   -2 -1  0  3 -3  0  0 -2  8 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -1 -2 -3  0 -3 
51 R   -1  6  0 -2 -3  0  0 -2  0 -3 -2  1 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 
52 C   -1 -3 -1  3  8 -2 -1 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -1 -1 -3 -2 -2 
53 C    0 -2 -1 -2  8 -2 -2 -2 -2 -1 -1 -2 -1 -2 -2  2  0 -2 -2 -1 
54 N   -1  0  6  0 -2  0  0  0  0 -3 -3  0 -2 -3 -2  2  0 -4 -2 -3 
55 K   -1  2  0 -1 -3  3  0 -2 -1 -3 -2  4 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
56 N   -2 -1  6  0 -3  0  0 -1  0 -3 -3  0 -2 -3  3  0  0 -4 -2 -3 
57 K   -1  5  0 -2 -3  0  0 -2  0 -3 -2  3 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 
58 I   -1  2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 -2  4  0 -1  0 -1 -3 -2 -1 -3 -1  1 
59 E   -1  0  0  0 -3  0  5 -2 -1 -2 -2  0 -2 -3 -1  0  2 -3 -2 -1 
60 E   -1 -1 -1  0 -3  0  5 -3 -1  2 -1  0 -1 -2 -2 -1 -1 -3 -2  0 
61 R    1  5 -1 -2 -2  0  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -3 -2  0 -1 -3 -2 -2 
62 S    0  2  0 -1 -2  0  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -2 
63 Q   -1  0  0  0 -3  6  1 -2  0 -3 -2  0  0 -3 -1  0 -1 -2 -1 -2 
64 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
65 V    2 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -3  1  0 -2  0 -1 -2 -1  0 -3 -1  4 
66 K   -1  3  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  5 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
67 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
68 S    2 -1  0 -1 -1  0  0  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -1 
69 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
70 F   -2  2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 -1  0  1 -1  0  4 -3 -2 -2 -1  0 -1 
71 P   -1  0 -1 -1 -3  0  0 -2 -2 -3 -3  2 -2 -3  5  1 -1 -4 -3 -2 
72 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
73 Q   -1  0  0  0 -3  6  1 -2  0 -3 -2  2  0 -3 -1  0 -1 -2 -1 -2 
74 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
75 A    5 -1 -2 -2  0 -1 -1  0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  0 -3 -2  0 
76 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
77 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
78 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
79 R   -1  6  0 -2 -3  0  0 -2  0 -3 -2  1 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 
80 A    4 -1  1 -1  0 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  0 -3 -2  0 
81 A    0  4  0 -2 -2  2  0 -2 -1 -2  0  2  0 -3 -2  0 -1 -3 -2 -2 
82 P   -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4  7 -1 -1 -4 -3 -2 
83 S    2 -1  0 -1 -1  0  0  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -1 
84 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
85 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  2  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  5 
86 D   -2 -2  0  6 -3  0  2 -1 -1 -3 -4 -1 -3 -3 -1  0 -1 -4 -3 -3 
87 A    5 -1 -2 -2  0 -1 -1  0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  0 -3 -2  0 
88 S    0  2  0 -1 -1  0  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -2 
89 I   -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3  5  1 -3  0  0 -3 -2 -1 -3 -1  2 
90 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
91 E   -1  1 -1 -1 -2  0  1 -3 -2  2  1  2  0 -1 -2 -1 -1 -3 -2  0 
92 Q   -1  0  0  0 -2  4  1  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  0  2  2 -1 -2 
93 K   -1  2  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  6 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
94 W   -2 -1 -2 -2 -2  2 -1 -2 -1 -3 -2 -1 -1  0 -3 -2 -2 10  0 -3 
95 W   -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1  0 -4 -3 -2 11  1 -3 
96 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
97 H   -2  0  1  3 -3  2  2 -2  5 -3 -3  0 -2 -2 -1  0 -1 -3  0 -3 
98 M   -1 -1 -2 -3 -1  0 -2 -3 -2  0  1 -1  7  0 -2 -1 -1 -1 -1  0 
99 Q   -1  0  2  0 -3  2  3 -2  0 -1  1  0  0 -2 -2  0 -1 -3 -2 -1 
100 P   -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4  7 -1 -1 -4 -3 -2 
101 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
102 L   -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  1  4 -2  1  0 -3 -2 -1 -2 -1  1 
103 E   -1 -1 -1  0 -3  0  5 -2 -1 -1  0  0 -1 -2  0  0 -1 -3 -2  0 
104 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
105 E   -1  0  0  1 -4  1  6 -2  0 -3 -3  0 -2 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
106 E   -1 -1  0  2 -4  0  4  2 -1 -3 -4  0 -3 -3 -1  0 -1 -3 -3 -3 
107 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
108 K   -1  1  0  3 -3  0  0 -2 -1 -3 -3  4 -2 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
109 V    0 -2 -2 -3 -1 -2 -2 -3 -3  1  2 -2  0 -1 -2 -1  1 -3 -1  4 
110 L   -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  1  4 -2  1  0 -3 -2 -1 -2 -1  0 
111 P   -1 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -3 -2  2 -1 -2 -1 -2  6 -1 -1 -4 -2  0 
112 D   -2 -1  3  6 -3  0  1 -1  0 -3 -4 -1 -3 -3 -1  0 -1 -4 -3 -3 
113 R   -1  3  2 -2 -2  0 -1 -2  0 -1  1  0  0 -1 -2  0 -1 -2  1 -1 
114 K    0 -1  0  0 -1  0  0  0 -1 -2 -2  1 -1 -2 -1  4  1 -3 -2 -2 
115 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
116 W   -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1  0 -4 -3 -2 11  1 -3 
117 S    0 -1  0 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1  0  2 -2 -1  3  3 -2 -2 -1 
118 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
119 S    1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1 -2  0 -1 -1 -1 -2 -1  3  3 -3 -2  0 
120 S    0  0  0  0 -2  3  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  3  1 -3 -2 -2 
121 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
122 N   -1 -1  5  0 -3 -1 -1  3  4 -3 -3 -1 -2 -3 -2  0 -1 -3 -1 -3 
123 K   -1  3  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  5 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
124 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -4 -3  4  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
125 K   -1  1  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  6 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
126 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
127 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
128 R   -1  3  0 -1 -2  0  0 -2 -1 -2 -2  4 -1 -3 -1  0  2 -3 -2 -2 
129 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  2  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  5 
130 T    0 -1  0 -1 -1  0 -1 -1  2 -1  0 -1 -1 -2 -1  3  3 -3 -1 -1 
131 H   -1  4  0 -1 -3  0  0 -2  4 -3 -2  0 -1 -3  3 -1 -1 -3 -1 -3
【請求項８】
ポリペプチドが、10-2の最大しきい値E-value、より好ましくは10-5以下、10-10以下、10-50以下の最小しきい値E-value、最も好ましくは10-70以下の最小しきい値E-valueを有する、請求項６又は７記載のポリペプチド。
【請求項９】
以下の(i)〜(iii)のいずれかの単離ポリペプチド：
(i)コンセンサスアミノ酸配列
G-T-C-E-[VI]-[VI]-[AT]-[AVL]-[HD]-R-[CD]-[CS]-[NS]-[KRQ]-[NP]-[RK]-[IR]-[ET]-[EI]-[RA]-[SR]-Q-T-[VA]-[KR]-C-[SA]-C-[LFR]-[PSK]-G-[KQ]-[VI]-A-G-T-T-R-[NA]-[RQLAK]-P-[SA]-C-V-[DE]-A-[SAR]-I-[VI]-[IELKR]-[WGQET]-[KR]-[WQ]-W-C-[EHNQD]-M-[ENQL]-P-C-[LV]-[EVLP]-G-E-[DEG]-C-[KRD]-[TVL]-L-[PI]-[DN]-[NYSLR]-[STK]-G-W-[MST]-C-[ASIT]-[TSRQ]-P(0,1)-G-[NHG]-[KR]-[IV]-K-T-T
を満足するポリペプチドを含む単離ポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであるか又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
【請求項１０】
コンセンサスアミノ酸配列
G-T-C-E-[VI]-[VI]-[AT]-[AVL]-[HD]-R-[CD]-[CS]-[NS]-[KRQ]-[NP]-[RK]-[IR]-[ET]-[EI]-[RA]-[SR]-Q-T-[VA]-[KR]-C-[SA]-C-[LFR]-[PSK]-G-[KQ]-[VI]-A-G-T-T-R-[NA]-[RQLAK]-P-[SA]-C-V-[DE]-A-[SAR]-I-[VI]-[IELKR]-[WGQET]-[KR]-[WQ]-W-C-[EHNQD]-M-[ENQL]-P-C-[LV]-[EVLP]-G-E-[DEG]-C-[KRD]-[TVL]-L-[PI]-[DN]-[NYSLR]-[STK]-G-W-[MST]-C-[ASIT]-[TSRQ]-P(0,1)-G-[NHG]-[KR]-[IV]-K-T-T
を満足するポリペプチドから成る請求項９記載の単離ポリペプチド。
【請求項１１】
以下の(i)〜(iii)のいずれかのポリペプチド：
(i)配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28及び／又は配列番号30で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであるか又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
【請求項１２】
以下の(i)〜(iii)のいずれかである、請求項１１記載のポリペプチド：
(i)配列番号26及び／又は配列番号30で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであるか又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
【請求項１３】
以下の(i)〜(iii)のいずれかである、請求項１１又は１２記載のポリペプチド：
(i)配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28及び／又は配列番号30で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであるか又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
【請求項１４】
以下の(i)〜(iii)のいずれかのポリペプチド：
(i)配列番号２、配列番号４、配列番号37及び／又は配列番号39で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであるか又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
【請求項１５】
以下の(i)〜(iii)のいずれかである、請求項１４記載のポリペプチド：
(i)配列番号２、配列番号４、配列番号37及び／又は配列番号39で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであるか又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
【請求項１６】
以下の(i)〜(iii)のいずれかのポリペプチド：
(i)配列番号６、配列番号８、配列番号41、配列番号43、配列番号53及び／又は配列番号55で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであるか又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
【請求項１７】
以下の(i)〜(iii)のいずれかである、請求項１６記載のポリペプチド：
(i)配列番号６、配列番号８、配列番号41、配列番号43、配列番号53及び／又は配列番号55で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであるか又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
【請求項１８】
以下の(i)〜(iii)のいずれかのポリペプチド：
(i)配列番号10、配列番号12、配列番号45及び／又は配列番号47で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであるか又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
【請求項１９】
以下の(i)〜(iii)のいずれかである、請求項１８記載のポリペプチド：
(i)配列番号10、配列番号12、配列番号45及び／又は配列番号47で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであるか又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
【請求項２０】
以下の(i)〜(iii)のいずれかのポリペプチド：
(i)配列番号14、配列番号16、配列番号49及び／又は配列番号51で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであるか又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
【請求項２１】
以下の(i)〜(iii)のいずれかである、請求項２０記載のポリペプチド：
(i)配列番号14、配列番号16、配列番号49及び／又は配列番号51で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであるか、又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
【請求項２２】
請求項６〜２１のいずれか１項の(iii)に記載の機能的等価物であるポリペプチドであって、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53及び／又は配列番号55で示されるアミノ酸配列に相同的であり且つEGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであることを特徴とする、前記ポリペプチド。
【請求項２３】
請求項６〜２２のいずれか１項に記載のフラグメント又は機能的等価物であるポリペプチドであって、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53及び／又は配列番号55で示されるアミノ酸配列と80％を超える配列同一性を有するか、又はそれらの活性なフラグメントと好ましくは85％、90％、95％、98％若しくは99％の配列同一性を有する、前記ポリペプチド。
【請求項２４】
請求項６〜２３のいずれか１項に記載の機能的等価物であるポリペプチドであって、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53及び／又は配列番号55で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと有意な構造相同性を示す、前記ポリペプチド。
【請求項２５】
請求項６〜２１及び請求項２３のいずれか１項に記載のフラグメントであるポリペプチドであって、
請求項６〜２１のいずれか１項に記載の(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有し、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53及び／又は配列番号55で示されるアミノ酸配列に由来する７以上のアミノ酸残基から成る、前記ポリペプチド。
【請求項２６】
凝固因子Ｘと同様の生物学的活性を有する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードしている、精製核酸分子。
【請求項２８】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52及び配列番号54で示される核酸配列を含むか、又は前記核酸配列の余剰的等価物若しくはフラグメントである、請求項２７記載の精製核酸分子。
【請求項２９】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52及び／又は配列番号54で示される核酸配列から成るか、又は前記核酸配列の余剰的等価物若しくはフラグメントである、請求項２７記載の精製核酸分子。
【請求項３０】
高ストリンジェンシー条件下で、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子とハイブリダイズする、精製核酸分子。
【請求項３１】
請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項３２】
請求項３１に記載のベクターで形質転換されている、宿主細胞。
【請求項３３】
EGFドメイン含有タンパク質ファミリーである請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチドに特異的に結合する、リガンド。
【請求項３４】
抗体である、請求項３３記載のリガンド。
【請求項３５】
請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチドの発現レベル又は活性レベルを増加又は減少させる化合物。
【請求項３６】
請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチドに、前記ポリペプチドの生物学的作用のいずれをも誘導することなく結合する、請求項３５記載の化合物。
【請求項３７】
天然の又は改変されている、基質、リガンド、酵素、受容体、構造的模倣体又は機能的模倣体である、請求項３６記載の化合物。
【請求項３８】
疾患の治療又は診断に使用するための、請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項３１記載のベクター、請求項３２記載の宿主細胞、請求項３３若しくは３４記載のリガンド、又は請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３９】
患者の疾患を診断する方法であって、
前記患者由来の組織において、請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする天然遺伝子の発現レベルを評価するか又は請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチドの活性を評価すること；及び
前記発現又は活性のレベルをコントロールレベルと比較すること；
を含み、このとき前記コントロールレベルと異なるレベルが疾患を示唆している、前記方法。
【請求項４０】
in vitroで実施される、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
（ａ）請求項３３又は３４記載のリガンドを、リガンド-ポリペプチド複合体の形成に適する条件下で、生物学的サンプルと接触させる工程；及び
（ｂ）前記複合体を検出する工程；
を含む請求項３９又は４０記載の方法。
【請求項４２】
（ａ）患者由来の組織サンプルと核酸プローブとを、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子と前記プローブとの間でハイブリッド複合体の形成を可能にするストリンジェントな条件下で接触させる工程；
（ｂ）コントロールサンプルを、工程（ａ）で用いるのと同じ条件下で前記プローブと接触させる工程；及び
（ｃ）前記サンプルのハイブリッド複合体の存在を検出する工程；
を含み、このときコントロールサンプルのハイブリッド複合体のレベルと異なる患者サンプルのハイブリッド複合体のレベルの検出が疾患を示唆している、請求項３９又は４０記載の方法。
【請求項４３】
（ａ）患者の組織由来の核酸サンプルと核酸プライマーとを、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子と前記プライマーとの間でハイブリッド複合体の形成を可能にするストリンジェントな条件下で接触させる工程；
（ｂ）コントロールサンプルを、工程（ａ）で用いられるのと同じ条件下で前記プライマーと接触させる工程；
（ｃ）前記サンプルの核酸を増幅させる工程；及び、
（ｄ）患者サンプル及びコントロールサンプルの両サンプルから、増幅核酸レベルを検出する工程；
を含み、このときコントロールサンプルの増幅核酸レベルと有意に異なる患者サンプルの増幅核酸レベルの検出が疾患を示唆している、請求項３９又は４０記載の方法。
【請求項４４】
（ａ）疾患について検査される患者から、組織サンプルを入手する工程；
（ｂ）前記組織サンプルから、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子を単離する工程；及び、
（ｃ）疾患に附随する変異の存在を、前記疾患の指標として前記核酸分子中で検出することによって、前記疾患について患者を診断する工程；
を含む請求項３９又は４０記載の方法。
【請求項４５】
核酸分子を増幅させて増幅産物を生成すること及び前記増幅産物中の変異の有無を検出することをさらに含む、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
核酸分子をその核酸分子にハイブリダイズする核酸プローブとストリンジェントな条件下で接触させて、前記核酸プローブ鎖の疾患に附随する変異に対応する任意の部分でハイブリダイズしていない部分を有するハイブリッド二本鎖分子を形成させること；及び
疾患に附随する変異の有無の指標として、前記プローブ鎖のハイブリダイズしていない部分の有無を検出すること；
によって、前記患者における変異の有無を検出する、請求項４４又は４５記載の方法。
【請求項４７】
疾患としては、不妊症を含む生殖に関する障害；新生物、メラノーマ、肺腫瘍、結腸直腸腫瘍、乳房腫瘍、膵臓腫瘍、頭頚部腫瘍及び他の固形腫瘍を含む細胞増殖性疾患；白血病、非ホジキンリンパ腫、白血球減少症、血小板減少症、脈管形成障害、カポジ肉腫のような骨髄増殖性疾患；アレルギー、炎症性腸疾患、関節炎、乾癬及び呼吸器管炎症、喘息、及び臓器移植拒絶反応を含む自己免疫／炎症性疾患；高血圧症、浮腫、狭心症、アテローム性動脈硬化症、血栓症、敗血症、ショック、再潅流傷害、及び虚血症を含む心臓血管障害；中枢神経系疾患、アルツハイマー病、脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、及び疼痛を含む神経障害；発達障害；糖尿病、骨粗しょう症、及び肥満症を含む代謝障害；AIDS及び腎疾患；ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症及び寄生虫感染症を含む感染症；
が挙げられるが、これらに限定されるものではない、請求項３９〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
疾患が、リンパ球抗原が関与する疾患である、請求項３９〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
EGFドメイン含有タンパク質としての、請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項５０】
請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項３１記載のベクター、請求項３２記載の宿主細胞、請求項３３若しくは３４記載のリガンド、又は請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の化合物を含む、医薬組成物。
【請求項５１】
請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド又は請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、ワクチン組成物。
【請求項５２】
不妊症を含む繁殖障害；新生物、メラノーマ、肺腫瘍、結腸直腸腫瘍、乳房腫瘍、膵臓腫瘍、頭頚部腫瘍及び他の固形腫瘍を含む細胞増殖性疾患；白血病、非ホジキンリンパ腫、白血球減少症、血小板減少症、脈管形成障害、カポジ肉腫のような骨髄増殖性疾患；アレルギー、炎症性腸疾患、関節炎、乾癬及び呼吸器管炎症、喘息、及び臓器移植拒絶反応を含む自己免疫／炎症性疾患；高血圧症、浮腫、狭心症、アテローム性動脈硬化症、血栓症、敗血症、ショック、再潅流傷害、及び虚血症を含む心臓血管障害；中枢神経系疾患、アルツハイマー病、脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、及び疼痛を含む神経障害；発達障害；糖尿病、骨粗しょう症、及び肥満症を含む代謝障害；AIDS及び腎疾患；ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症及び寄生虫感染症を含む感染症及び他の病的状態の治療用医薬品の製造に使用するための、請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項３１記載のベクター、請求項３２記載の宿主細胞、請求項３３若しくは３４記載のリガンド、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の化合物、又は請求項５０記載の医薬組成物。
【請求項５３】
リンパ球抗原が関与する疾患の治療用医薬品の製造に使用するための、請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項３１記載のベクター、請求項３２記載の宿主細胞、請求項３３若しくは３４記載のリガンド、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の化合物、又は請求項５０記載の医薬組成物。
【請求項５４】
請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項３１記載のベクター、請求項３２記載の宿主細胞、請求項３３若しくは３４記載のリガンド、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の化合物、又は請求項５０記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、患者の疾患を治療する方法。
【請求項５５】
罹病患者における天然遺伝子の発現又はポリペプチドの活性が健常な対象者における発現又は活性のレベルと比較した場合に低い疾患に対し、前記患者に投与されるポリペプチド、核酸分子、ベクター、リガンド、化合物又は組成物がアゴニストである、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
罹病患者における天然遺伝子の発現又はポリペプチドの活性が健常な対象者における発現又は活性のレベルと比較した場合に高い疾患に対し、前記患者に投与されるポリペプチド、核酸分子、ベクター、リガンド、化合物又は組成物がアンタゴニストである、請求項５４記載の方法。
【請求項５７】
患者において疾患の治療をモニターする方法であって、
請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチドの発現若しくは活性のレベル又は請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子の発現レベルを、ある期間にわたって前記患者に由来する組織でモニターすることを含み、
前記期間にわたる発現又は活性のレベルがコントロールレベルに対して変化することは、前記疾患の後退の指標である、前記方法。
【請求項５８】
疾患の治療及び／又は診断に有効な化合物を同定する方法であって、
請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド又は請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子を、前記ポリペプチド又は前記核酸分子に対し結合親和性を有すると疑われる１又は２以上の化合物と接触させること；及び
前記ポリペプチド又は前記核酸分子と特異的に結合する化合物を選択すること；
を含む前記方法。
【請求項５９】
ストリンジェントな条件下で、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子とハイブリダイズする核酸プローブを含む、第１の容器；
前記核酸分子を増幅するのに有用なプライマーを含む、第２の容器；及び、
疾患の診断を容易にするための、前記プローブ及びプライマーの使用説明書；
を含む、疾患の診断に有用なキット。
【請求項６０】
ハイブリダイズしないRNAを消化するための薬剤を保有する第３の容器をさらに含む、請求項５９記載のキット。
【請求項６１】
核酸分子のアレイを含むキットであって、
前記核酸分子の少なくとも１つが請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子である前記キット。
【請求項６２】
請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチドと結合する、１又は２以上の抗体；及び
前記抗体と前記ポリペプチドとの間の結合反応を検出するのに有用な試薬；
を含むキット。
【請求項６３】
請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチドを、より高いレベル若しくはより低いレベルで発現するように又は発現しないように形質転換されている、非ヒトトランスジェニック動物又は非ヒトノックアウト動物。
【請求項６４】
請求項６３記載の非ヒトトランスジェニック動物を候補化合物と接触させること、及び前記動物の疾患に対する前記化合物の作用を決定することによる、疾患の治療に有効な化合物をスクリーニングする方法。
【請求項６５】
IVFで使用するため又は避妊薬として使用するための、請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項３１記載のベクター、請求項３２記載の宿主細胞、請求項３３若しくは３４記載のリガンド、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の化合物又は請求項５０記載の医薬組成物。
【請求項６６】
避妊薬の製造で使用するための、請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項３１記載のベクター、請求項３２記載の宿主細胞、請求項３３若しくは３４記載のリガンド、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の化合物又は請求項５０記載の医薬組成物。
【請求項６７】
関節炎、リウマチ性関節炎(RA)、乾癬性関節炎、変形性関節症、全身性エリテマトーデス(SLE)、全身性硬化症、強皮症、多発性筋炎、糸球体腎炎、線維症、肺線維症及び肺炎、アレルギー疾患又は過敏性疾患、皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、炎症性腸疾患(IBD)、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、敗血症性ショック、HIV感染、移植拒絶反応、創傷治癒、転移、子宮内膜症、肝炎、肝臓線維症、癌、無痛覚症、並びに、アテローム性動脈硬化症、クローン病、アトピー性の皮膚炎及び乾癬のような炎症性皮膚疾患、シェーグレン症候群及び／又は重症筋無力症に関連している脈管炎症の治療用医薬品の製造で使用するための、請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項３１記載のベクター、請求項３２記載の宿主細胞、請求項３３若しくは３４記載のリガンド、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の化合物又は請求項５０記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ファミリーのメンバーとしては、上皮成長因子(EGF)フォールド(fold)含有ドメインを含み、長さが125〜153アミノ酸で且つ８つの保存されたシステイン残基を含む分泌タンパク質として本発明で同定された新規なタンパク質INSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117が挙げられる、SECFAM1ファミリーと名付けられた新規なタンパク質のファミリーに関しており、また疾患の診断、予防及び治療における前記タンパク質及びそのコード遺伝子由来の核酸配列の使用に関する。
本明細書で引用される全ての刊行物、特許文献及び特許出願文献は、参照により完全に本明細書に含まれるものとする。
【背景技術】
【０００２】
薬剤の発見プロセスにおいて、機能ゲノム学の時代の到来にあわせて根幹的な革命が現在進行している。“機能ゲノム学”という用語は、対象のタンパク質配列に機能を帰属させるためにバイオインフォマティクスツールを利用するアプローチに用いられる。そのようなツールは、配列データの生成速度が前記タンパク質配列に機能を割り当てる研究室の能力をはるかに超えることから、ますます必要性を増している。
バイオインフォマティクスツールの潜在能力及び精度が高まっているために、前記ツールは通常の生化学的特徴付け技術と急速に置き換えられつつある。実際、本発明の同定に用いた高度なバイオインフォマティクスツールは、今や、高い信頼性をもった結果を出力する能力を有する。
配列データが利用可能になるにつれ、種々の研究機関及び企業組織がそれらを調査し、重要な発見が絶え間なく達成され続けている。しかしながら、研究及び薬剤発見のための標的として、更なる遺伝子及びそれらがコードするポリペプチドを同定し特徴付ける必要性は引き続き存在している。
【０００３】
（序論）
（分泌タンパク質）
細胞が細胞外タンパク質を作って分泌する能力は、多くの生物学的過程の中心である。酵素、増殖因子、細胞外基質タンパク質及びシグナル伝達分子は、全て細胞によって分泌されている。このような分泌は、分泌小胞と形質膜との融合を介している。全部ではないが、ほとんどの場合、タンパク質は、シグナルペプチドによって、小胞体に方向付けられて分泌小胞内へと移動させられる。シグナルペプチドは、細胞質から分泌小胞のような膜結合区画へのペプチド鎖輸送に影響を与える、シス作用性配列である。分泌小胞を標的とするポリペプチドは、細胞外基質へと分泌されるか、又は形質膜に保持される。形質膜に保持されているポリペプチドは、１又は２以上の膜貫通ドメインを有するであろう。細胞の機能において中心的な役割を果たしている分泌タンパク質の例は、サイトカイン、ホルモン、細胞外基質タンパク質（接着分子）、プロテアーゼ、増殖因子及び分化因子である。
【０００４】
（EGFドメイン含有タンパク質）
上皮増殖因子(EGF)様タンパク質は、EGF受容体(EGF-R)ファミリーのメンバーを活性化することによって、細胞を刺激して分割する(Yarden et al., Eur J Cancer. 2001 Sep; 37 Suppl 4:S3-81)。EGFは、全てがジスルフィド結合の形成に関与する６つの保存されているシステインという特有のモチーフを有する短いペプチドである。実際、前記モチーフは、数多くの機能が多様な異なるタンパク質において見出される(Davis et al., New Biol. 1990 May; 2(5): 410-9)。このようなドメインは、機能上あまりに多様な種類のタンパク質の範囲にまたがって見いだされるため、どのような決定的に有効な結論も引き出すことはできないが、全てのEGFドメイン(プロスタグランジンG/Hシンターゼを除く)は、膜結合タンパク質の細胞外ドメイン内か、又は細胞外基質中に分泌されることが知られているタンパク質内で見出されることに気づくだろう。EGFドメインは、タンパク質間の相互作用に関与しており、またそれ自体で、非結合タンパク質の表面上に露出している疎水性残基の大部分を有することが知られている。EGFドメインは、その高度に保存されているシステインパターンを有し、線虫からヒトまで幅広い生物にわたりシグナル伝達及び調節事象において重要な役割を果たす。EGFドメインは、組織修復及び血液因子凝固の調節から、数多くの種類のヒト腫瘍の成長及び発生に関与するプロセスまでといった広範なプロセスの一断面に関係している。後者の場合、EGF様タンパク質は、EGFシグナル伝達経路のメンバーを活性化することによって、細胞を刺激して分割する(Yarden et al., Eur J Cancer, 2001 Sep; 37 Suppl 4: S3-81)。このような知見から、腫瘍進行におけるEGF様タンパク質の役割は、抗癌治療戦略の追求において非常に興味が持たれており、本分野の最近の新規な治療薬は、EGFシグナル伝達経路の妨害に基づいて開発されている(Waksal et al., Cancer Metastasis Rev. 1999; 18(4): 427-36)。
【０００５】
従って、これらドメインの知識を増やすことは、上述するような病的状態及び関連する病的状態につながる根本的経路の理解を高めるうえで、またそのような疾患を治療するためのより効率的な遺伝子及び／又は薬物療法を開発するうえで、非常に重要である。
本明細書では、分泌タンパク質リガンドの全く新規なファミリーの同定について詳述する。分泌タンパク質リガンドの定義は、特定の細胞から分泌されて、コグネイト(cognate)受容体及び下流のシグナル伝達経路の活性を変調することによって（Danファミリーで例示されるようなリガンド拮抗作用を含む）、同じ細胞又は別の細胞に表現型の応答を誘導するタンパク質である。既知の分泌タンパク質リガンドファミリーの例は、糖タンパクホルモンファミリーである。
卵胞刺激ホルモン(FSH)は、糖タンパクホルモンファミリーのメンバーである。男性では、FSHは、下垂体前葉の細胞によって分泌され、血流に入って、次に精巣のセルトリ細胞上のコグネイト受容体に結合して、精子形成プロセスを調節する。女性では、FSHが卵巣の莢膜細胞上、ストローマ細胞上及び顆粒膜細胞上の受容体に結合して排卵を調節する。FSH欠損症は、男性と女性の両者の不妊症問題につながり得る。タンパク質治療薬の形態でFSHを投与することでFSHのレベルを回復する方法は、FSHが引き起こす不妊症と闘うのに使用できる。FSHは、GONAL-fTM(Serono)として入手可能である。
この例に対する類推によって、新規な分泌型リガンドタンパク質ファミリーの同定が、新規なリガンド-受容体経路の描写を可能にし、また決定的には、リガンド結合の表現型結末を解明することを可能にすると思われ得る。ヒト疾患が前記新規な分泌型リガンドタンパク質ファミリーのいずれかのメンバーの機能不全の結末であると同定される場合は、当該メンバーをタンパク質治療薬として投与して、前記疾患と闘うことができる。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、INSP113ポリペプチド、INSP114ポリペプチド、1NSP115ポリペプチド、INSP116ポリペプチド及びINSP117ポリペプチドが分泌タンパク質、さらに詳細には、EGF様ドメイン含有分泌タンパク質であり、またさらに好ましくは凝固因子Ｘに類似する生物活性を有するという発見に基づく。INSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117は、全体として、本発明においてタンパク質のSECFAM1ファミリーとして同定されたタンパク質ファミリーの一部を形成する。
【０００７】
（タンパク質のSECFAM1ファミリーのアノテーション）
本発明のタンパク質群は、公的に入手可能な関連するアノテーションを持たず、シグナルペプチドの形態で分泌タンパク質の強いしるし(signature)を含み、また、他の動物種由来のオーソログ(orthologues)によって支持される類似のタンパク質と共にクラスタリングされ得る。さらなる検討により、５つのヒト遺伝子(INSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117)からなる今まで特徴付けられていないタンパク質ファミリーの構成が可能となり、そのファミリーは、哺乳類及び魚類のオーソログを含めて、全部で15個の配列を含む。それらの配列は全て、可変的構成(variable composition)の強いシグナルペプチド領域を示し、配列の残りの部分は高度の類似性を示している。全体として、ヒト配列内では、配列同一性が49％以上であり、保存された残基の強いプロフィールを有する（図１）。本明細書では、この関連配列のクラスター(cluster)を“SECFAM1ファミリー”と呼ぶ。
【０００８】
本発明の第１局面の一態様では、SECFAM1ファミリーのメンバーの同定方法が提供され、その方法は、翻訳された核酸配列又はポリペプチド配列のデータベースを検索して、以下の配列プロファイルにマッチングするポリペプチド配列を同定することを含む。
A  R  N  D  C  Q  E  G  H  I  L  K  M  F  P  S  T  W  Y  V
1 M   -1 -1 -2 -3 -1  0 -2 -3 -2  0  1 -1  7  0 -2 -1 -1 -1 -1  0 
2 N    1  2  2 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1  0  3 -2 -2  1  0 -3 -2 -1 
3 K    0  0 -1  0 -2  1  2 -2 -1  0 -1  1 -1 -3  2 -1 -1 -3 -2  1 
4 R    0  3 -1 -2  4  0 -1 -2 -1  0  0  0  0 -2 -2  1 -1 -3 -2 -1 
5 Y    1  0 -2 -2 -2 -1 -1 -2 -1  0  0 -1  0 -1  3  0 -1 -2  2  0 
6 L   -1  2 -1 -1 -2  0  0 -2 -1 -1  0  3  2 -2 -2  0  1 -2 -2 -1 
7 Q    1  0  0 -1 -1  1  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  2  2  3 -1 -1 
8 K   -1 -1  2 -1 -2 -1 -1  0 -1  0  0  1  2 -1 -2  0  0 -3 -2  2 
9 A    0  0 -2 -2 -1 -1 -2 -2 -2  0  0 -1  0 -1 -2  0 -1  7  0  0 
10 T    0  1  0 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1  0  0  0 -2  1  2  1 -3 -2 -1 
11 Q    1  0  0 -1 -1  2  0 -1 -1 -1  0  0  0 -2  0  2  0 -3 -2 -1 
12 G    0  0  0  2 -2 -1  0  3  4 -2 -2 -1  2 -2 -2  0 -1 -2 -1 -2 
13 K    1 -1 -1 -1 -2 -1 -1  2 -2 -3 -2  0 -1 -1 -2  2 -1  7 -1 -2 
14 L    0 -2 -2 -3 -1 -2 -2  1 -2 -1  0 -2  0  0 -2 -1  1  8  0 -1 
15 L    2 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -3  1  3 -2  0 -1 -2 -1  0 -3 -1  2 
16 I   -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  2  4 -2  1  1 -3 -2 -1 -2  0  1 
17 I    1 -2 -2 -2 -1 -2 -2 -2 -1  1  1 -2  0  0  3 -1 -1 -1  2  0 
18 I    0 -2 -1 -2 -1 -1 -2 -2 -2  1  3 -1  0 -1 -2  1  0 -2 -1  0 
19 F   -1 -2 -3 -3  6 -2 -3 -3 -1 -1  0 -2  3  2 -3 -2 -1  6  3 -1 
20 I    0 -2 -1 -2 -1 -2 -2 -2 -2  3  1 -2  0 -1 -2  1  1 -3 -1  2 
21 V    2 -2 -1 -2  3 -1 -1 -1 -2  0  0 -1  0 -2 -2  2  0 -3 -2  0 
22 T    1 -2 -2 -2  3 -1 -2 -2 -2 -1  0 -2  2 -1 -2  0  2  6 -1  0 
23 L   -1 -3 -3 -3  4 -3 -3 -3 -2  0  2 -3  0  4 -3 -2 -1 -1  0  1 
24 W    0 -3 -3 -3  5 -2 -3 -2 -2 -1  0 -3 -1  0 -3 -1 -1  9  0 -1 
25 G    1 -2 -1 -2  4 -1 -2  1 -2  0  0 -1  2 -2 -2  0  1 -2 -2  0 
26 K   -1  0 -1 -2  1  1  0 -3  1  0  1  2  0  2 -2 -1 -1 -2  0 -1 
27 A    0 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  1  3 -2  3  0  0 -2 -1 -2 -1  1 
28 V    0 -2 -2 -3  4 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  3 -1 -2 -1  0 -2 -1  2 
29 S    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1  5 -1  1 -1  0 -1 -2  2  0 -3  0 -1 
30 S    4 -1 -1 -2 -1 -1 -1  2 -2 -2 -2 -1 -1 -2 -1  1  1 -3 -2 -1 
31 A    1 -1  0  0 -1  1  0  1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -2 
32 N   -1 -1  2 -1 -2 -1 -2 -2 -1  0  3 -1  0  1 -3  1 -1 -2 -1  0 
33 H   -1  0  0 -1 -2  5  0 -3  3 -1  1  0  0 -2 -2 -1 -1 -2 -1 -1 
34 H   -1  0  0 -1 -2  0  0 -2  6  0 -1  0 -1 -2  2  0 -1 -3  0 -1 
35 K   -1  0  0 -1 -3  3  0 -2  4 -3 -2  1 -1 -3  3  0 -1 -2  0 -2 
36 A    2  1  0 -1 -1  0 -1 -1  4 -1 -1  0 -1 -2 -1  0  2 -2  0 -1 
37 H    0 -1  0 -1 -2 -1 -1  3  6 -3 -3 -1 -2 -2 -2  1 -1 -2  0 -2 
38 H    0 -1  0 -2  5 -1 -1 -2  5 -1  0 -1 -1 -1 -2  0  1 -2  0 -1 
39 V   -1 -2 -2 -2 -2 -1  0 -3 -2  2  2 -2  0 -1  2 -2 -1 -3 -1  2 
40 R    1  2 -1 -1 -2  1  1 -1 -1 -2 -2  3 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
41 T    2 -1 -1 -1 -2  3  0  1 -1 -2 -2  0 -1 -3  0  0  2 -2 -2 -1 
42 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
43 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
44 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
45 E   -1  0  0  1 -4  1  6 -2  0 -3 -3  0 -2 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
46 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
47 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  4  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
48 A    4 -1 -1 -2  0 -1 -1 -1 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  2 -3 -2  0 
49 L    3 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -3  0  2 -2  0 -1 -2  0  0 -3 -1  1 
50 H   -2 -1  0  3 -3  0  0 -2  8 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -1 -2 -3  0 -3 
51 R   -1  6  0 -2 -3  0  0 -2  0 -3 -2  1 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 
52 C   -1 -3 -1  3  8 -2 -1 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -1 -1 -3 -2 -2 
53 C    0 -2 -1 -2  8 -2 -2 -2 -2 -1 -1 -2 -1 -2 -2  2  0 -2 -2 -1 
54 N   -1  0  6  0 -2  0  0  0  0 -3 -3  0 -2 -3 -2  2  0 -4 -2 -3 
55 K   -1  2  0 -1 -3  3  0 -2 -1 -3 -2  4 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
56 N   -2 -1  6  0 -3  0  0 -1  0 -3 -3  0 -2 -3  3  0  0 -4 -2 -3 
57 K   -1  5  0 -2 -3  0  0 -2  0 -3 -2  3 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 
58 I   -1  2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 -2  4  0 -1  0 -1 -3 -2 -1 -3 -1  1 
59 E   -1  0  0  0 -3  0  5 -2 -1 -2 -2  0 -2 -3 -1  0  2 -3 -2 -1 
60 E   -1 -1 -1  0 -3  0  5 -3 -1  2 -1  0 -1 -2 -2 -1 -1 -3 -2  0 
61 R    1  5 -1 -2 -2  0  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -3 -2  0 -1 -3 -2 -2 
62 S    0  2  0 -1 -2  0  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -2 
63 Q   -1  0  0  0 -3  6  1 -2  0 -3 -2  0  0 -3 -1  0 -1 -2 -1 -2 
64 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
65 V    2 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -3  1  0 -2  0 -1 -2 -1  0 -3 -1  4 
66 K   -1  3  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  5 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
67 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
68 S    2 -1  0 -1 -1  0  0  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -1 
69 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
70 F   -2  2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 -1  0  1 -1  0  4 -3 -2 -2 -1  0 -1 
71 P   -1  0 -1 -1 -3  0  0 -2 -2 -3 -3  2 -2 -3  5  1 -1 -4 -3 -2 
72 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
73 Q   -1  0  0  0 -3  6  1 -2  0 -3 -2  2  0 -3 -1  0 -1 -2 -1 -2 
74 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
75 A    5 -1 -2 -2  0 -1 -1  0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  0 -3 -2  0 
76 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
77 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
78 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
79 R   -1  6  0 -2 -3  0  0 -2  0 -3 -2  1 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 
80 A    4 -1  1 -1  0 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  0 -3 -2  0 
81 A    0  4  0 -2 -2  2  0 -2 -1 -2  0  2  0 -3 -2  0 -1 -3 -2 -2 
82 P   -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4  7 -1 -1 -4 -3 -2 
83 S    2 -1  0 -1 -1  0  0  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -1 
84 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
85 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  2  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  5 
86 D   -2 -2  0  6 -3  0  2 -1 -1 -3 -4 -1 -3 -3 -1  0 -1 -4 -3 -3 
87 A    5 -1 -2 -2  0 -1 -1  0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  0 -3 -2  0 
88 S    0  2  0 -1 -1  0  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -2 
89 I   -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3  5  1 -3  0  0 -3 -2 -1 -3 -1  2 
90 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
91 E   -1  1 -1 -1 -2  0  1 -3 -2  2  1  2  0 -1 -2 -1 -1 -3 -2  0 
92 Q   -1  0  0  0 -2  4  1  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  0  2  2 -1 -2 
93 K   -1  2  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  6 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
94 W   -2 -1 -2 -2 -2  2 -1 -2 -1 -3 -2 -1 -1  0 -3 -2 -2 10  0 -3 
95 W   -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1  0 -4 -3 -2 11  1 -3 
96 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
97 H   -2  0  1  3 -3  2  2 -2  5 -3 -3  0 -2 -2 -1  0 -1 -3  0 -3 
98 M   -1 -1 -2 -3 -1  0 -2 -3 -2  0  1 -1  7  0 -2 -1 -1 -1 -1  0 
99 Q   -1  0  2  0 -3  2  3 -2  0 -1  1  0  0 -2 -2  0 -1 -3 -2 -1 
100 P   -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4  7 -1 -1 -4 -3 -2 
101 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
102 L   -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  1  4 -2  1  0 -3 -2 -1 -2 -1  1 
103 E   -1 -1 -1  0 -3  0  5 -2 -1 -1  0  0 -1 -2  0  0 -1 -3 -2  0 
104 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
105 E   -1  0  0  1 -4  1  6 -2  0 -3 -3  0 -2 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
106 E   -1 -1  0  2 -4  0  4  2 -1 -3 -4  0 -3 -3 -1  0 -1 -3 -3 -3 
107 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
108 K   -1  1  0  3 -3  0  0 -2 -1 -3 -3  4 -2 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
109 V    0 -2 -2 -3 -1 -2 -2 -3 -3  1  2 -2  0 -1 -2 -1  1 -3 -1  4 
110 L   -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  1  4 -2  1  0 -3 -2 -1 -2 -1  0 
111 P   -1 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -3 -2  2 -1 -2 -1 -2  6 -1 -1 -4 -2  0 
112 D   -2 -1  3  6 -3  0  1 -1  0 -3 -4 -1 -3 -3 -1  0 -1 -4 -3 -3 
113 R   -1  3  2 -2 -2  0 -1 -2  0 -1  1  0  0 -1 -2  0 -1 -2  1 -1 
114 K    0 -1  0  0 -1  0  0  0 -1 -2 -2  1 -1 -2 -1  4  1 -3 -2 -2 
115 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
116 W   -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1  0 -4 -3 -2 11  1 -3 
117 S    0 -1  0 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1  0  2 -2 -1  3  3 -2 -2 -1 
118 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
119 S    1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1 -2  0 -1 -1 -1 -2 -1  3  3 -3 -2  0 
120 S    0  0  0  0 -2  3  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  3  1 -3 -2 -2 
121 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
122 N   -1 -1  5  0 -3 -1 -1  3  4 -3 -3 -1 -2 -3 -2  0 -1 -3 -1 -3 
123 K   -1  3  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  5 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
124 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -4 -3  4  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
125 K   -1  1  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  6 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
126 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
127 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
128 R   -1  3  0 -1 -2  0  0 -2 -1 -2 -2  4 -1 -3 -1  0  2 -3 -2 -2 
129 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  2  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  5 
130 T    0 -1  0 -1 -1  0 -1 -1  2 -1  0 -1 -1 -2 -1  3  3 -3 -1 -1 
131 H   -1  4  0 -1 -3  0  0 -2  4 -3 -2  0 -1 -3  3 -1 -1 -3 -1 -3
（ここで、NCBI(国立生物工学情報センター(the National Center for Biotechnology Information); http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)によって指定されたデフォルトパラメーター[Blosum 62 マトリックス;ギャップオープンペナルティ=11及びギャップ伸長ペナルティ=1]を用い、このプロファイルを検索プログラムBLASTにクエリー配列として入力した場合、SECFAM1ファミリーのメンバーは、10-2以下のE-valueを有するものである。）
【０００９】
従って、“SECFAM1ファミリーのメンバー”は、上記パラメーターを用い、BLASTでクエリー配列として使用した場合、10-2という最大しきい値(threshold)E-valueを有する上記プロファイルを満足するポリペプチド配列と解釈すべきである。好ましくは、そのようなポリペプチド配列は、10-5以下、10-10以下、10-50以下、最も好ましくは10-70以下の最小しきい値E-valueを有する。例えば、このファミリーのメンバーINSP113は、本発明の第１局面のプロファイルと比較して、生成するE-valueが4e-80である。E-valueは、ランダムにデータベース内で見出される、より良いか又は同等に良いマッチングの予測数を表し、或いはマッチングがランダムに起こる可能性と説明することもできる。従って、全てのヒットは、そのE-valueによって格付けされ、そのようなE-valueは、順に、各配列位置に利用できる候補の数（アミノ酸の場合は20）、配列又はマッチング領域の長さ、及び検索するデータベースの大きさに依存する。従って、SECFAM1ファミリーのメンバーのような短い配列は、２つのより長い配列間の比較可能なマッチングよりも大きいE-valueを有する傾向がある。
【００１０】
上記プロファイルは、シグナル配列及びEGF様ドメインの存在を考慮している。このプロファイルは、EGF様ドメインに比べてシグナルペプチド領域（アミノ酸１〜30）のアミノ酸配列のより高度な可変性を許容する。この文脈における“可変性”は、アミノ酸配列間の類似性及び同一性の度合いに関係する。この可変性は、本発明で同定されるSECFAM1ファミリーの15個のメンバーで見い出だされる状況を反映している。15個のメンバー間のEGF様ドメイン内で共有される高度の類似性は、EGF様ドメインがおそらく分子の重要な機能に関与していることをも示唆している。このドメインがあまり重要でない場合、そのメンバー間の保存の度合いはそれほど高くないだろう。
翻訳された核酸配列を検索するデータベースとして、限定するものではないが、cDNAs、ESTs、mRNAs、全体的ゲノム又は部分的ゲノムのデータベースから派生している、翻訳された核酸配列データベースが挙げられる。
【００１１】
本発明の第２局面では以下の(i)〜(iii)のいずれかの単離ポリペプチドが提供される：
(i)NCBI(the National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)によって指定されたデフォルトパラメーター[Blosum 62 マトリックス；ギャップオープンペナルティー＝11及びギャップ伸長ペナルティー＝１]を用い、以下のプロファイルを検索プログラムBLASTにクエリー配列として入力した場合、10-2以下のE-valueを有するポリペプチド配列を含み、又は該配列から成る単離ポリペプチド：
A  R  N  D  C  Q  E  G  H  I  L  K  M  F  P  S  T  W  Y  V
1 M   -1 -1 -2 -3 -1  0 -2 -3 -2  0  1 -1  7  0 -2 -1 -1 -1 -1  0 
2 N    1  2  2 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1  0  3 -2 -2  1  0 -3 -2 -1 
3 K    0  0 -1  0 -2  1  2 -2 -1  0 -1  1 -1 -3  2 -1 -1 -3 -2  1 
4 R    0  3 -1 -2  4  0 -1 -2 -1  0  0  0  0 -2 -2  1 -1 -3 -2 -1 
5 Y    1  0 -2 -2 -2 -1 -1 -2 -1  0  0 -1  0 -1  3  0 -1 -2  2  0 
6 L   -1  2 -1 -1 -2  0  0 -2 -1 -1  0  3  2 -2 -2  0  1 -2 -2 -1 
7 Q    1  0  0 -1 -1  1  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  2  2  3 -1 -1 
8 K   -1 -1  2 -1 -2 -1 -1  0 -1  0  0  1  2 -1 -2  0  0 -3 -2  2 
9 A    0  0 -2 -2 -1 -1 -2 -2 -2  0  0 -1  0 -1 -2  0 -1  7  0  0 
10 T    0  1  0 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1  0  0  0 -2  1  2  1 -3 -2 -1 
11 Q    1  0  0 -1 -1  2  0 -1 -1 -1  0  0  0 -2  0  2  0 -3 -2 -1 
12 G    0  0  0  2 -2 -1  0  3  4 -2 -2 -1  2 -2 -2  0 -1 -2 -1 -2 
13 K    1 -1 -1 -1 -2 -1 -1  2 -2 -3 -2  0 -1 -1 -2  2 -1  7 -1 -2 
14 L    0 -2 -2 -3 -1 -2 -2  1 -2 -1  0 -2  0  0 -2 -1  1  8  0 -1 
15 L    2 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -3  1  3 -2  0 -1 -2 -1  0 -3 -1  2 
16 I   -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  2  4 -2  1  1 -3 -2 -1 -2  0  1 
17 I    1 -2 -2 -2 -1 -2 -2 -2 -1  1  1 -2  0  0  3 -1 -1 -1  2  0 
18 I    0 -2 -1 -2 -1 -1 -2 -2 -2  1  3 -1  0 -1 -2  1  0 -2 -1  0 
19 F   -1 -2 -3 -3  6 -2 -3 -3 -1 -1  0 -2  3  2 -3 -2 -1  6  3 -1 
20 I    0 -2 -1 -2 -1 -2 -2 -2 -2  3  1 -2  0 -1 -2  1  1 -3 -1  2 
21 V    2 -2 -1 -2  3 -1 -1 -1 -2  0  0 -1  0 -2 -2  2  0 -3 -2  0 
22 T    1 -2 -2 -2  3 -1 -2 -2 -2 -1  0 -2  2 -1 -2  0  2  6 -1  0 
23 L   -1 -3 -3 -3  4 -3 -3 -3 -2  0  2 -3  0  4 -3 -2 -1 -1  0  1 
24 W    0 -3 -3 -3  5 -2 -3 -2 -2 -1  0 -3 -1  0 -3 -1 -1  9  0 -1 
25 G    1 -2 -1 -2  4 -1 -2  1 -2  0  0 -1  2 -2 -2  0  1 -2 -2  0 
26 K   -1  0 -1 -2  1  1  0 -3  1  0  1  2  0  2 -2 -1 -1 -2  0 -1 
27 A    0 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  1  3 -2  3  0  0 -2 -1 -2 -1  1 
28 V    0 -2 -2 -3  4 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  3 -1 -2 -1  0 -2 -1  2 
29 S    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1  5 -1  1 -1  0 -1 -2  2  0 -3  0 -1 
30 S    4 -1 -1 -2 -1 -1 -1  2 -2 -2 -2 -1 -1 -2 -1  1  1 -3 -2 -1 
31 A    1 -1  0  0 -1  1  0  1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -2 
32 N   -1 -1  2 -1 -2 -1 -2 -2 -1  0  3 -1  0  1 -3  1 -1 -2 -1  0 
33 H   -1  0  0 -1 -2  5  0 -3  3 -1  1  0  0 -2 -2 -1 -1 -2 -1 -1 
34 H   -1  0  0 -1 -2  0  0 -2  6  0 -1  0 -1 -2  2  0 -1 -3  0 -1 
35 K   -1  0  0 -1 -3  3  0 -2  4 -3 -2  1 -1 -3  3  0 -1 -2  0 -2 
36 A    2  1  0 -1 -1  0 -1 -1  4 -1 -1  0 -1 -2 -1  0  2 -2  0 -1 
37 H    0 -1  0 -1 -2 -1 -1  3  6 -3 -3 -1 -2 -2 -2  1 -1 -2  0 -2 
38 H    0 -1  0 -2  5 -1 -1 -2  5 -1  0 -1 -1 -1 -2  0  1 -2  0 -1 
39 V   -1 -2 -2 -2 -2 -1  0 -3 -2  2  2 -2  0 -1  2 -2 -1 -3 -1  2 
40 R    1  2 -1 -1 -2  1  1 -1 -1 -2 -2  3 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
41 T    2 -1 -1 -1 -2  3  0  1 -1 -2 -2  0 -1 -3  0  0  2 -2 -2 -1 
42 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
43 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
44 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
45 E   -1  0  0  1 -4  1  6 -2  0 -3 -3  0 -2 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
46 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
47 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  4  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
48 A    4 -1 -1 -2  0 -1 -1 -1 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  2 -3 -2  0 
49 L    3 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -3  0  2 -2  0 -1 -2  0  0 -3 -1  1 
50 H   -2 -1  0  3 -3  0  0 -2  8 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -1 -2 -3  0 -3 
51 R   -1  6  0 -2 -3  0  0 -2  0 -3 -2  1 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 
52 C   -1 -3 -1  3  8 -2 -1 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -1 -1 -3 -2 -2 
53 C    0 -2 -1 -2  8 -2 -2 -2 -2 -1 -1 -2 -1 -2 -2  2  0 -2 -2 -1 
54 N   -1  0  6  0 -2  0  0  0  0 -3 -3  0 -2 -3 -2  2  0 -4 -2 -3 
55 K   -1  2  0 -1 -3  3  0 -2 -1 -3 -2  4 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
56 N   -2 -1  6  0 -3  0  0 -1  0 -3 -3  0 -2 -3  3  0  0 -4 -2 -3 
57 K   -1  5  0 -2 -3  0  0 -2  0 -3 -2  3 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 
58 I   -1  2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 -2  4  0 -1  0 -1 -3 -2 -1 -3 -1  1 
59 E   -1  0  0  0 -3  0  5 -2 -1 -2 -2  0 -2 -3 -1  0  2 -3 -2 -1 
60 E   -1 -1 -1  0 -3  0  5 -3 -1  2 -1  0 -1 -2 -2 -1 -1 -3 -2  0 
61 R    1  5 -1 -2 -2  0  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -3 -2  0 -1 -3 -2 -2 
62 S    0  2  0 -1 -2  0  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -2 
63 Q   -1  0  0  0 -3  6  1 -2  0 -3 -2  0  0 -3 -1  0 -1 -2 -1 -2 
64 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
65 V    2 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -3  1  0 -2  0 -1 -2 -1  0 -3 -1  4 
66 K   -1  3  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  5 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
67 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
68 S    2 -1  0 -1 -1  0  0  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -1 
69 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
70 F   -2  2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 -1  0  1 -1  0  4 -3 -2 -2 -1  0 -1 
71 P   -1  0 -1 -1 -3  0  0 -2 -2 -3 -3  2 -2 -3  5  1 -1 -4 -3 -2 
72 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
73 Q   -1  0  0  0 -3  6  1 -2  0 -3 -2  2  0 -3 -1  0 -1 -2 -1 -2 
74 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
75 A    5 -1 -2 -2  0 -1 -1  0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  0 -3 -2  0 
76 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
77 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
78 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
79 R   -1  6  0 -2 -3  0  0 -2  0 -3 -2  1 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 
80 A    4 -1  1 -1  0 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  0 -3 -2  0 
81 A    0  4  0 -2 -2  2  0 -2 -1 -2  0  2  0 -3 -2  0 -1 -3 -2 -2 
82 P   -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4  7 -1 -1 -4 -3 -2 
83 S    2 -1  0 -1 -1  0  0  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -1 
84 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
85 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  2  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  5 
86 D   -2 -2  0  6 -3  0  2 -1 -1 -3 -4 -1 -3 -3 -1  0 -1 -4 -3 -3 
87 A    5 -1 -2 -2  0 -1 -1  0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  0 -3 -2  0 
88 S    0  2  0 -1 -1  0  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -2 
89 I   -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3  5  1 -3  0  0 -3 -2 -1 -3 -1  2 
90 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
91 E   -1  1 -1 -1 -2  0  1 -3 -2  2  1  2  0 -1 -2 -1 -1 -3 -2  0 
92 Q   -1  0  0  0 -2  4  1  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  0  2  2 -1 -2 
93 K   -1  2  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  6 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
94 W   -2 -1 -2 -2 -2  2 -1 -2 -1 -3 -2 -1 -1  0 -3 -2 -2 10  0 -3 
95 W   -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1  0 -4 -3 -2 11  1 -3 
96 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
97 H   -2  0  1  3 -3  2  2 -2  5 -3 -3  0 -2 -2 -1  0 -1 -3  0 -3 
98 M   -1 -1 -2 -3 -1  0 -2 -3 -2  0  1 -1  7  0 -2 -1 -1 -1 -1  0 
99 Q   -1  0  2  0 -3  2  3 -2  0 -1  1  0  0 -2 -2  0 -1 -3 -2 -1 
100 P   -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4  7 -1 -1 -4 -3 -2 
101 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
102 L   -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  1  4 -2  1  0 -3 -2 -1 -2 -1  1 
103 E   -1 -1 -1  0 -3  0  5 -2 -1 -1  0  0 -1 -2  0  0 -1 -3 -2  0 
104 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
105 E   -1  0  0  1 -4  1  6 -2  0 -3 -3  0 -2 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
106 E   -1 -1  0  2 -4  0  4  2 -1 -3 -4  0 -3 -3 -1  0 -1 -3 -3 -3 
107 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
108 K   -1  1  0  3 -3  0  0 -2 -1 -3 -3  4 -2 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
109 V    0 -2 -2 -3 -1 -2 -2 -3 -3  1  2 -2  0 -1 -2 -1  1 -3 -1  4 
110 L   -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  1  4 -2  1  0 -3 -2 -1 -2 -1  0 
111 P   -1 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -3 -2  2 -1 -2 -1 -2  6 -1 -1 -4 -2  0 
112 D   -2 -1  3  6 -3  0  1 -1  0 -3 -4 -1 -3 -3 -1  0 -1 -4 -3 -3 
113 R   -1  3  2 -2 -2  0 -1 -2  0 -1  1  0  0 -1 -2  0 -1 -2  1 -1 
114 K    0 -1  0  0 -1  0  0  0 -1 -2 -2  1 -1 -2 -1  4  1 -3 -2 -2 
115 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
116 W   -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1  0 -4 -3 -2 11  1 -3 
117 S    0 -1  0 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1  0  2 -2 -1  3  3 -2 -2 -1 
118 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
119 S    1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1 -2  0 -1 -1 -1 -2 -1  3  3 -3 -2  0 
120 S    0  0  0  0 -2  3  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  3  1 -3 -2 -2 
121 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
122 N   -1 -1  5  0 -3 -1 -1  3  4 -3 -3 -1 -2 -3 -2  0 -1 -3 -1 -3 
123 K   -1  3  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  5 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
124 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -4 -3  4  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
125 K   -1  1  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  6 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
126 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
127 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
128 R   -1  3  0 -1 -2  0  0 -2 -1 -2 -2  4 -1 -3 -1  0  2 -3 -2 -2 
129 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  2  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  5 
130 T    0 -1  0 -1 -1  0 -1 -1  2 -1  0 -1 -1 -2 -1  3  3 -3 -1 -1 
131 H   -1  4  0 -1 -3  0  0 -2  4 -3 -2  0 -1 -3  3 -1 -1 -3 -1 3；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであり、好ましくは凝固因子Ｘと同様の生物活性を有する、又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
【００１２】
好ましくは、上記検査において、ポリペプチドは10-2の最大しきい値E-valueを与える。さらに好ましくは、ポリペプチド配列は10-5以下、10-10以下、10-50以下、最も好ましくは10-70以下の最小しきい値E-valueを有する。しきい値を下げると、よりストリンジェントなフィルターとして作用して、一般的なバックグラウンドポリペプチド配列からシグナルペプチドとEGF様ドメインとを含むポリペプチドを分離する。
【００１３】
本発明の第２局面の第３態様では、以下の(i)〜(iii)のいずれかの単離ポリペプチドが提供される：
(i)以下のコンセンサスアミノ酸配列：
G-T-C-E-[VI]-[VI]-[AT]-[AVL]-[HD]-R-[CD]-[CS]-[NS]-[KRQ]-[NP]-[RK]-[IR]-[ET]-[EI]-[RA]-[SR]-Q-T-[VA]-[KR]-C-[SA]-C-[LFR]-[PSK]-G-[KQ]-[VI]-A-G-T-T-R-[NA]-[RQLAK]-P-[SA]-C-V-[DE]-A-[SAR]-I-[VI]-[IELKR]-[WGQET]-[KR]-[WQ]-W-C-[EHNQD]-M-[ENQL]-P-C-[LV]-[EVLP]-G-E-[DEG]-C-[KRD]-[TVL]-L-[PI]-[DN]-[NYSLR]-[STK]-G-W-[MST]-C-[ASIT]-[TSRQ]-P(0,1)-G-[NHG]-[KR]-[IV]-K-T-T
を満足するポリペプチドを含む単離ポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであり、好ましくは凝固因子Ｘと同様の生物活性を有する、又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
【００１４】
本発明の第２局面の第４態様では、以下のコンセンサスアミノ酸配列：
G-T-C-E-[VI]-[VI]-[AT]-[AVL]-[HD]-R-[CD]-[CS]-[NS]-[KRQ]-[NP]-[RK]-[IR]-[ET]-[EI]-[RA]-[SR]-Q-T-[VA]-[KR]-C-[SA]-C-[LFR]-[PSK]-G-[KQ]-[VI]-A-G-T-T-R-[NA]-[RQLAK]-P-[SA]-C-V-[DE]-A-[SAR]-I-[VI]-[IELKR]-[WGQET]-[KR]-[WQ]-W-C-[EHNQD]-M-[ENQL]-P-C-[LV]-[EVLP]-G-E-[DEG]-C-[KRD]-[TVL]-L-[PI]-[DN]-[NYSLR]-[STK]-G-W-[MST]-C-[ASIT]-[TSRQ]-P(0,1)-G-[NHG]-[KR]-[IV]-K-T-T
を満足するポリペプチドから成る単離ポリペプチドが提供される。
【００１５】
本発明の第２局面の第５態様では、本発明の第２局面の第３態様の単離ポリペプチドであって、コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸位置55、60、66、及び77に４つのシステイン残基の１個以上、好ましくは全てを含む単離ポリペプチドが提供される。本発明の第３及び第４態様のアミノ酸配列は、PROSITE（タンパク質部位及びパターン）表記法で書かれ、アミノ酸はその１文字コードで表される(Bairoch, A., Bucher, P., and Hofmann, K., (1997). "PROSITEデータベース：Its statut in 1997." Nucl. Acids Res. 25, 217-221)。簡単には、下記式：
A(1)-x(i1,j1)-A2-x(i2,j2)-....A{p-1}-x(i{p-1},j{p-1})-Ap
を含むペプチドは以下のように解釈される。
A(K)は、１個のアミノ酸、例えばＣ、又は１セットの可能なアミノ酸、例えば[ILVF]のいずれかを特定している成分である。成分A(K)は、完全に１個のアミノ酸（例えばＣ又はＬ）を特定する場合、同一(identity)成分であり、或いはそれが１個より多くを特定する場合（例えば、[ILVF]又は[FWY])、あいまい(ambiguous)成分である。i(k)、j(k)は、全てのkについてi(k)≦j(k)であるような整数である。部分x(ik,jk)は、任意のアミノ酸ikとjkとの間のパターンマッチングのワイルドカード領域を特定する。ワイルドカード領域x(ik,jk)は、jkがikより大きい場合（例えばx(2,3)）、“フレキシブル(flexible)”である。このような領域のフレキシビリティー(flexibility)は、jk-ik.br>である。例えば、x(2,3)のフレキシビリティーは１である。j(k)がi(k)に等しい場合、例えばx(2,2)（x(2)と書ける）の場合、ワイルドカード領域は固定される。もしあれば、あるパターンのフレキシビリティーという結果は、そうでなければ１つであると定義される該パターンにおけるフレキシブルなワイルドカードのフレキシビリティーの結果である。例えば、C-x(2)-Hは２成分(CとH)と１の固定ワイルドカード領域とを有するパターンである。それは、Cの後いずれかの２個の任意アミノ酸、次いでHを含有するいずれかの配列にマッチングする。アミノ酸配列ChgHyw及びliChgHlywは、該式内に含まれるだろう。C-x(2,3)-Hは、２成分(CとH)及び１個のフレキシブルなワイルドカード領域を有するパターンである。それは、aaChgHywk及びliChgaHlywのようなCの後いずれかの２又は３個の任意アミノ酸、次いでHを含有するいずれかの配列にマッチングする。C-x(2,3)-[ILV]は、２成分(Cと[ILV])及び１個のフレキシブルなワイルドカード領域を有するパターンである。それは、Cの後いずれかの２又は３個の任意アミノ酸、次いでI、L又はVを含有するいずれかの配列にマッチングする。
本発明のこの態様で引用した配列は、INSP117(配列番号26)のアミノ酸位置44〜129由来の高い同一性領域を包含する（該アラインメントのアミノ酸52〜138、図１参照）。
【００１６】
出願人はこの理論によって拘泥されたくないが、本発明の上述した態様のポリペプチドは、全てシグナルペプチド配列を所有する。従って、シグナルペプチドを欠いている上記ポリペプチドの成熟型は、本発明のさらなる局面を形成する。
本発明の第３局面の一態様では、以下の(i)〜(iii)のいずれかのポリペプチドが提供される：
(i)配列番号２、配列番号４、配列番号37及び／又は配列番号39で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであり、好ましくは凝固因子Ｘと同様の生物活性を有し、又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
本発明のこの第３局面の第２態様によって、
(i)配列番号２、配列番号４、配列番号37及び／又は配列番号39で示されるアミノ酸配列から成る、
ポリペプチドが提供される。
【００１７】
以後、配列番号２(アクセッション番号CAD28501.1)で示される配列を有するポリペプチドを“INSP113ポリペプチド”と呼ぶ。
出願人はこの理論に拘泥されたくないが、INSP113ポリペプチドの最初の25個のアミノ酸がシグナルペプチドを形成すると想定される。シグナル配列を有するINSP113全長ポリペプチド配列とシグナル配列のないINSP113全長ポリペプチド配列がそれぞれ配列番号２と配列番号４で示される。以後、配列番号４で示される配列を有するポリペプチドを“INSP113成熟ポリペプチド”と呼ぶ。
配列番号37で示される配列を有するポリペプチドは、INSP113ポリペプチドのスプライス変種であり、以後“INSP113svポリペプチド”と呼ぶ。
出願人はこの理論に拘泥されたくないが、INSP113svポリペプチドの最初の25個のアミノ酸がシグナルペプチドを形成すると想定される。シグナル配列のないINSP113sv全長ポリペプチドの配列は配列番号39で示される。以後、配列番号39で示される配列を有するポリペプチドを“INSP113sv成熟ポリペプチド”と呼ぶ。
好ましくは、本発明の第３局面の第２態様の抗原決定基、フラグメント又は機能的等価物は、配列番号２のアミノ酸位置96、101、107及び118に４つのシステイン残基の１個以上を含む。さらに好ましくは、これらシステイン残基の１個以上が生理的条件下でジスルフィド結合形成に関与する。本発明のこの局面では、“生理的条件”は、ポリペプチドの天然又は野生型が見つかるであろう天然の環境を意味する。ジスルフィド結合形成は、多くの場合タンパク質の正確なコンホメーション、ひいてはその機能に欠くことができない。従って、このようなシステイン残基が保存されることが重要である。
【００１８】
本発明の第３局面の第３態様では、以下の(i)〜(iii)のいずれかのポリペプチドが提供される：
(i)配列番号６、配列番号８、配列番号41、配列番号43、配列番号35及び／又は配列番号55で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであり、好ましくは凝固因子Ｘと同様の生物活性を有し、又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
【００１９】
本発明の第３局面の第４態様では、
(i)配列番号６、配列番号８、配列番号41、配列番号43、配列番号35及び／又は配列番号55で示されるアミノ酸配列から成る、
ポリペプチドが提供される。
以後、配列番号６（アクセッション番号CAD38865.1）で示される配列を有するポリペプチドを“INSP114ポリペプチド”と呼ぶ。
出願人はこの理論に拘泥されたくないが、INSP114ポリペプチドの最初の30個のアミノ酸がシグナルペプチドを形成すると想定される。シグナル配列のないINSP114全長ポリペプチド配列は配列番号８で示される。以後、配列番号８で示される配列を有するポリペプチドを“INSP114成熟ポリペプチド”と呼ぶ。
配列番号41で示される配列を有するポリペプチドは、INSP114ポリペプチドのスプライス変種であり、以後“INSP114-SV2ポリペプチド”と呼ぶ。
出願人はこの理論に拘泥されたくないが、INSP114-SV2ポリペプチドの最初の30個のアミノ酸がシグナルペプチドを形成すると想定される。シグナル配列のないINSP114-SV2ポリペプチドの配列は配列番号43で示される。以後、配列番号43で示される配列を有するポリペプチドを“INSP114-SV2成熟ポリペプチド”と呼ぶ。
配列番号53で示される配列を有するポリペプチドは、INSP114ポリペプチドのスプライス変種であり、以後“INSP114-SV1ポリペプチド”と呼ぶ。
出願人はこの理論に拘泥されたくないが、INSP114-SV1ポリペプチドの最初の30個のアミノ酸がシグナルペプチドを形成すると想定される。シグナル配列のないINSP114-SV1ポリペプチドの配列は配列番号55で示される。以後、配列番号55で示される配列を有するポリペプチドを“INSP114-SV1成熟ポリペプチド”と呼ぶ。
【００２０】
好ましくは、本発明の第３局面の第４態様の抗原決定基、フラグメント又は機能的等価物は、配列番号６、配列番号41又は配列番号53のアミノ酸位置96、101、107及び118に４つのシステイン残基の１個以上を含む。さらに好ましくは、これらシステイン残基の１個以上が生理的条件下でジスルフィド結合形成に関与する。ジスルフィド結合形成は、多くの場合タンパク質の正確なコンホメーション、ひいてはその機能に欠くことができない。従って、このようなシステイン残基が保存されることが重要である。
【００２１】
本発明の第３局面の第５態様では、以下の(i)〜(iii)のいずれかのポリペプチドが提供される：
(i)配列番号10、配列番号12、配列番号45及び／又は配列番号47で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであり、好ましくは凝固因子Ｘと同様の生物活性を有し、又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
本発明の第３局面の第６態様によって、
(i)配列番号10、配列番号12、配列番号45及び／又は配列番号47で示されるアミノ酸配列から成る、
ポリペプチドが提供される。
以後、配列番号10（アクセッション番号AAY53016）で示される配列を有するポリペプチドを“INSP115ポリペプチド”と呼ぶ。
出願人はこの理論に拘泥されたくないが、INSP115ポリペプチドの最初の42個のアミノ酸がシグナルペプチドを形成すると想定される。シグナル配列のないINSP115全長ポリペプチド配列は配列番号12で示される。以後、配列番号12で示される配列を有するポリペプチドを“INSP115成熟ポリペプチド”と呼ぶ。
以後、配列番号45で示される配列を有するポリペプチドを“INSP115クローン化ポリペプチド“と呼ぶ。
出願人はこの理論に拘泥されたくないが、INSP115クローン化ポリペプチドの最初の45個のアミノ酸がシグナルペプチドを形成すると想定される。シグナル配列のないINSP115クローン化ポリペプチドの配列は配列番号47で示される。以後、配列番号47で示される配列を有するポリペプチドを“INSP115クローン化成熟ポリペプチド”と呼ぶ。
好ましくは、本発明の第３局面の第６態様の抗原決定基、フラグメント又は機能的等価物は、配列番号10又は配列番号45のアミノ酸位置97、102、108及び119に４つのシステイン残基の１個以上を含む。さらに好ましくは、これらシステイン残基の１個以上が生理的条件下でジスルフィド結合形成に関与する。ジスルフィド結合形成は、多くの場合タンパク質の正確なコンホメーション、ひいてはその機能に欠くことができない。従って、このようなシステイン残基が保存されることが重要である。
【００２２】
本発明の第３局面の第７態様では、以下の(i)〜(iii)のいずれかのポリペプチドが提供される：
(i)配列番号14、配列番号16、配列番号49及び／又は配列番号51で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであり、好ましくは凝固因子Ｘと同様の生物活性を有し、又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
本発明の第３局面の第８態様によって、
(i)配列番号14、配列番号16、配列番号49及び／又は配列番号51で示されるアミノ酸配列から成る、
ポリペプチドが提供される。
以後、配列番号14（アクセッション番号XP_087261.1）で示される配列を有するポリペプチドを“INSP116ポリペプチド”と呼ぶ。
出願人はこの理論に拘泥されたくないが、INSP116ポリペプチドの最初の34個のアミノ酸がシグナルペプチドを形成すると想定される。シグナル配列のないINSP116全長ポリペプチド配列は配列番号16で示される。以後、配列番号16で示される配列を有するポリペプチドを“INSP116成熟ポリペプチド”と呼ぶ。
以後、配列番号49で示される配列を有するポリペプチドを“INSP116クローン化ポリペプチド“と呼ぶ。
出願人はこの理論に拘泥されたくないが、INSP116クローン化ポリペプチドの最初の36個のアミノ酸がシグナルペプチドを形成すると想定される。シグナル配列のないINSP116クローン化ポリペプチドの配列は配列番号51で示される。以後、配列番号51で示される配列を有するポリペプチドを“INSP116クローン化成熟ポリペプチド”と呼ぶ。
好ましくは、本発明の第３局面の第８態様の抗原決定基、フラグメント又は機能的等価物は、配列番号14又は配列番号49のアミノ酸位置105、110、116、127に４つのシステイン残基の１個以上を含む。さらに好ましくは、これらシステイン残基の１個以上が生理的条件下でジスルフィド結合形成に関与する。ジスルフィド結合形成は、多くの場合タンパク質の正確なコンホメーション、ひいてはその機能に欠くことができない。従って、このようなシステイン残基が保存されることが重要である。
【００２３】
本発明の第３局面の第９態様では、以下の(i)〜(iii)のいずれかのポリペプチドが提供される：
(i)配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28及び／又は配列番号30で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであり、好ましくは凝固因子Ｘと同様の生物活性を有し、又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
好ましくは、本発明のこの第３局面のポリペプチドは、以下の(i)〜(iii)のいずれかのポリペプチドである：
(i)配列番号26及び／又は配列番号30で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであり、好ましくは凝固因子Ｘと同様の生物活性を有し、又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
本発明の第３局面の第10態様によって、
(i)配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28及び／又は配列番号30で示されるアミノ酸配列から成る、
ポリペプチドが提供される。
好ましくは、本発明の第３局面の第９態様の抗原決定基、フラグメント又は機能的等価物は、配列番号26のアミノ酸位置98、103、109及び120に４つのシステイン残基の１個以上を含む。さらに好ましくは、アミノ酸位置98及び109のシステイン残基が生理的条件下でジスルフィド対を形成する。従って、このようなシステイン残基が保存されることが重要である。本発明のこの態様の４つのシステイン残基は、1WHEの同様の配列を有する配列番号26と比較することによって同定された。
【００２４】
以後、配列番号18で示される配列を有するポリペプチドを“INSP117エクソン１ポリペプチド”と呼ぶ。以後、配列番号20で示される配列を有するポリペプチドを“INSP117エクソン２ポリペプチド”と呼ぶ。以後、配列番号22で示される配列を有するポリペプチドを“INSP117エクソン３ポリペプチド”と呼ぶ。以後、配列番号24で示される配列を有するポリペプチドを“INSP117エクソン４ポリペプチド”と呼ぶ。
以後、配列番号26で示される配列を有するポリペプチドを“INSP117ポリペプチド”と呼ぶ。
出願人はこの理論に拘泥されたくないが、INSP117エクソン１ポリペプチドの最初の30個のアミノ酸がシグナルポリペプチドを形成すると想定される。シグナルペプチドのないINSP117エクソン１及び全長ポリペプチド配列はそれぞれ配列番号28及び配列番号30で示される。以後、配列番号28で示される配列を有するポリペプチドを“INSP117エクソン１成熟ポリペプチド”と呼ぶ。以後、配列番号30で示される配列を有するポリペプチドを“INSP117成熟ポリペプチド”と呼ぶ。
本明細書では、用語“INSP117エクソンポリペプチド”は、INSP117エクソン１ポリペプチド、INSP117エクソン２ポリペプチド、INSP117エクソン１成熟ポリペプチド、INSP117エクソン３ポリペプチド、INSP117エクソン４ポリペプチド、INSP117ポリペプチド又はINSP117成熟ポリペプチド含むポリペプチド、並びにINSP117エクソン１ポリペプチド、INSP117エクソン２ポリペプチド、INSP117エクソン１成熟ポリペプチド、INSP117エクソン３ポリペプチド、INSP117エクソン４ポリペプチド、INSP117ポリペプチド又はINSP117成熟ポリペプチド含むポリペプチドから成るポリペプチドを包含する。
本明細書では、用語“INSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117ポリペプチド”及び“INSP113、INSP114、INSP115、INSP116又はINSP117ポリペプチド”は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53及び／又は配列番号55で示される配列を含むポリペプチドを包含する。
【００２５】
本発明の第１局面で既に説明したように、EGF様ドメインは多くのタイプの腫瘍、特にヒトの病気と腫瘍の成長と発生を含む広断面の病気で重要な役割を果たすことが分かっているので、該ドメインを含む新規タンパク質の同定は有用である。
好ましくは、本発明の第２又は第３局面のポリペプチドはEGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであり、好ましくは凝固因子Ｘと同様の生物活性を有する。“凝固因子Ｘと同様の生物活性を有する”とは、該ポリペプチドが凝固因子Ｘと同様の生物活性を有し、順次、CC-ケモカインと同様であるTAFAファミリーと同様の生物活性を有することを意味する（Tang, Y.T. et al., ‘TAFA：CC-ケモカインに相同的な新規分泌ファミリー’Genbank記録AAP92046、http://harvester.embl.de/harvester/Q7Z5/Q7Z5A7.htm参照；またTang et al.,‘TAFA：保存されたシステイン残基を有する新規分泌ファミリー及び脳内での制限された発現’Genomics. 2004 Apr;83(4):727-34参照）。ポリペプチドが凝固因子Ｘと同様の生物活性を有するかを決定するためのアッセイは、実施例17及び18で与えられる。
【００２６】
第４局面では、本発明は本発明の第２又は第３局面のポリペプチドをコードする精製核酸分子を提供する。
好ましくは、精製核酸分子は、配列番号１(INSP113ポリペプチドをコードする)、配列番号３(INSP113成熟ポリペプチドをコードする)、配列番号５(INSP114ポリペプチドをコードする)、配列番号7(INSP114成熟ポリペプチドをコードする)、配列番号９(INSP115ポリペプチドをコードする)、配列番号11(INSP115成熟ポリペプチドをコードする)、配列番号13(INSP116ポリペプチドをコードする)、配列番号15(INSP116成熟ポリペプチドをコードする)、配列番号17(INSP117エクソン１ポリペプチドをコードする)、配列番号19(INSP117エクソン２ポリペプチドをコードする)、配列番号21(INSP117エクソン３ポリペプチドをコードする)、配列番号23(INSP117エクソン４ポリペプチドをコードする)、配列番号25(INSP117ポリペプチドをコードする)、配列番号27(INSP117成熟エクソン１ポリペプチドをコードする)、配列番号29(INSP117成熟ポリペプチドをコードする)、配列番号36(INSP113svポリペプチドをコードする)、配列番号38(INSP113sv成熟ポリペプチドをコードする)、配列番号40(INSP114-SV2ポリペプチドをコードする)、配列番号42(INSP114-SV2成熟ポリペプチドをコードする)、配列番号44(INSP115クローン化ポリペプチドをコードする)、配列番号46(INSP115クローン化成熟ポリペプチドをコードする)、配列番号48(INSP116クローン化ポリペプチドをコードする)、配列番号50(INSP116クローン化成熟ポリペプチドをコードする)、配列番号52(INSP114-SV1ポリペプチドをコードする)及び／又は配列番号54(INSP114-SV1成熟ポリペプチドをコードする)で示される核酸分子を含み、或いはこれら配列のいずれか１つの余剰的(redundant)等価物又はフラグメントである。
【００２７】
本発明は、さらに配列番号１(INSP113ポリペプチドをコードする)、配列番号３(INSP113成熟ポリペプチドをコードする)、配列番号５(INSP114ポリペプチドをコードする)、配列番号7(INSP114成熟ポリペプチドをコードする)、配列番号９(INSP115ポリペプチドをコードする)、配列番号11(INSP115成熟ポリペプチドをコードする)、配列番号13(INSP116ポリペプチドをコードする)、配列番号15(INSP116成熟ポリペプチドをコードする)、配列番号17(INSP117エクソン１ポリペプチドをコードする)、配列番号19(INSP117エクソン２ポリペプチドをコードする)、配列番号21(INSP117エクソン３ポリペプチドをコードする)、配列番号23(INSP117エクソン４ポリペプチドをコードする)、配列番号25(INSP117ポリペプチドをコードする)、配列番号27(INSP117成熟エクソン１ポリペプチドをコードする)、配列番号29(INSP117成熟ポリペプチドをコードする)、配列番号36(INSP113svポリペプチドをコードする)、配列番号38(INSP113sv成熟ポリペプチドをコードする)、配列番号40(INSP114-SV2ポリペプチドをコードする)、配列番号42(INSP114-SV2成熟ポリペプチドをコードする)、配列番号44(INSP115クローン化ポリペプチドをコードする)、配列番号46(INSP115クローン化成熟ポリペプチドをコードする)、配列番号48(INSP116クローン化ポリペプチドをコードする)、配列番号50(INSP116クローン化成熟ポリペプチドをコードする)、配列番号52(INSP114-SV1ポリペプチドをコードする)及び／又は配列番号54(INSP114-SV1成熟ポリペプチドをコードする)で示される核酸分子から成り、或いはこれら配列のいずれか１つの余剰的等価物又はフラグメントである精製核酸分子を提供する。
【００２８】
この出願で示される配列番号52及び配列番号54の配列は終止コドンを含まないが、本明細書では、配列番号52及び配列番号54の列挙は、終止コドンをも含む配列番号52及び配列番号54についてこの出願で示される配列を有するヌクレオチド配列をも包含する。同様に、この出願で示される終止コドンを含まない他の配列番号についても、その配列番号の列挙は、終止コドンを含む当該配列の列挙をも包含する。
本発明のこの局面の一態様によれば、精製核酸分子はINSP117エクソン１ポリペプチドの開始位置(配列番号18のアミノ酸１〜30)にあるシグナルペプチドを除外する。この態様によれば、精製核酸分子は、好ましくは配列番号17のヌクレオチド91〜115(配列番号27で示され、INSP117エクソン１成熟ポリペプチドをコードする)又は配列番号25のヌクレオチド91〜402(配列番号29で示され、INSP117成熟ポリペプチドをコードする)を含む。本発明は、さらに配列番号17のヌクレオチド91〜115(配列番号27で示され、INSP117エクソン１成熟ポリペプチドをコードする)又は配列番号25のヌクレオチド91〜402(配列番号29で示され、INSP117成熟ポリペプチドをコードする)から成る精製核酸分子を提供する。
【００２９】
第５局面では、本発明は、高ストリンジェンシー条件下、本発明の第４局面の核酸分子とハイブリダイズする精製核酸分子を提供する。
第６局面では、本発明は、本発明の第４又は第５局面の核酸分子を含む、発現ベクターのようなベクターを提供する。好ましいベクターとして、pCR4-TOPO-INSP113(図18)、pCR4-TOPO-INSP113sv(図19)、pDONR(図20)、pEAK12d(図21)、pDEST12.2(図22)、pENTR-INSP113-6HIS(図23)、pENTR-INSP113sv-6HIS(図24)、pEAK12d-INSP113-6HIS(図25)、pEAK12d-INSP113sv-6HIS(図26)、pDEST12.2-INSP113-6HIS(図27)、pDEST12.2-INSP113sv-6HIS(図28)、pCR4-TOPO-INSP114(図31)、pCR4-TOPO-INSP114-GR1(図35)、pCR4-TOPO-INSP114-SV2(図36)、pDONR 221(図38)、pEAK12d(図39)、pDEST12.2(図40)、pENTR_INSP114-6HIS(図41)、pEAK12d_INSP114-6HIS(図42)、pDEST12.2_INSP114-6HIS(図43)、pENTR_INSP114-SV1-6HIS(図44)、pEAK12d_INSP114-SV1-6HIS(図45)、pDEST12.2_INSP114-SV1-6HIS(図46)、pENTR_INSP114-SV2-6HIS(図47)、pEAK12d_INSP114-SV2-6HIS(図48)、pDEST12.2_INSP114-SV2-6HIS(図49)、pDONR 221(図51)、pEAK12d(図52)、pDEST12.2(図53)、pENTR_INSP115-6HIS(図54)、pEAK12d_INSP115-6HIS(図55)、pDEST12.2_INSP115-6HIS(図56)、pDONR 221(図58)、pEAK12d(図59)、pDEST12.2(図60)、pENTR_INSP116-6HIS(図61)、pEAK12d_INSP116-6HIS(図62)、pDEST12.2_INSP116-6HIS(図63)、pCRII-TOPO-INSP117(図66)、pDONR 221(図67)、pEAK12d(図68)、pDEST12.2(図69)、pENTR_INSP117-6HIS(図70)、pEAK12d_INSP117-6HIS(図71)及びpDEST12.2_INSP117-6HIS(図72)が挙げられる。
【００３０】
第７局面では、本発明は、本発明の第６局面のベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
第８局面では、本発明は、本発明の第２又は第３局面のEGF含有タンパク質ファミリーのメンバーに特異的に結合するリガンドを提供する。好ましくは、このリガンドは、タンパク質のEGF含有ファミリーのメンバーである本発明の第５局面のポリペプチドの機能を阻害する。本発明のポリペプチドに対するリガンドは、天然の又は修飾された基質、酵素、受容体、2000Daまで、好ましくは800Da以下の小さい天然若しくは合成有機分子のような小さい有機分子、ペプチド模倣物質、無機分子、ペプチド、ポリペプチド、抗体、上記のものの構造的若しくは機能的模倣物質を含む種々の形態があり得る。
第９局面では、本発明は、本発明の第２又は第３局面のポリペプチドをコードする天然遺伝子の発現を変え、或いは本発明の第２又は第３局面のポリペプチドの活性を調節するために有効な化合物を提供する。
本発明の第９局面の化合物は、遺伝子の発現レベル又はポリペプチドの活性を高め（アゴニスト作用）或いは低減（アンタゴニスト作用）し得る。
重要なことに、INSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117ポリペプチドの機能を同定することによって、疾患の治療及び／又は診断に有効な化合物を同定し得るスクリーニング方法の設計が可能となる。本発明の第８及び第９局面のリガンド及び化合物は、該方法を用いて同定され得る。これらの方法は、本発明の局面として包含される。
【００３１】
第10局面では、本発明は、EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーが関係している疾患の治療又は診断で使用するため、本発明の第２若しくは第３局面のポリペプチド、又は本発明の第４若しくは第５局面の核酸分子、又は本発明の第６局面のベクター、又は本発明の第７局面の宿主細胞、又は本発明の第８局面のリガンド、又は本発明の第９局面の化合物を提供する。このような疾患には、新生物、メラノーマ、肺腫瘍、結腸直腸腫瘍、乳房腫瘍、膵臓腫瘍、頭頚部腫瘍及び他の固形腫瘍を含む細胞増殖性疾患；白血病、非ホジキンリンパ腫、白血球減少症、血小板減少症、脈管形成障害、カポジ肉腫のような骨髄増殖性疾患；アレルギー、炎症性腸疾患、関節炎、乾癬及び呼吸器管炎症、喘息、及び臓器移植拒絶反応を含む自己免疫／炎症性疾患；高血圧症、浮腫、狭心症、アテローム性動脈硬化症、血栓症、敗血症、ショック、再潅流傷害、及び虚血症を含む心臓血管障害；中枢神経系疾患、アルツハイマー病、脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、及び疼痛を含む神経障害；発達障害；糖尿病、骨粗しょう症、及び肥満症を含む代謝障害；AIDS及び腎疾患；ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症及び寄生虫感染症を含む感染症及び他の病的状態が挙げられる。好ましくは、これら疾患はEGFドメイン含有タンパク質が関係している疾患である。これら分子は、このような疾患の治療用薬物の製造でも使用し得る。これら分子は、避妊又は不妊症を含む生殖障害の治療のためも使用することができる。
【００３２】
本発明の第11局面では、本発明は、患者の疾患を診断する方法であって、前記患者由来の組織で、本発明の第２若しくは第３局面のポリペプチドをコードする天然遺伝子の発現レベル又は本発明の第２若しくは第３局面のポリペプチドの活性レベルを評価する工程、及び前記発現又は活性のレベルをコントロールレベルと比較する工程を含む方法を提供し、この場合前記コントロールレベルと異なるレベルは疾患の指標である。このような方法は、好ましくはin vitroで実施されるであろう。同様な方法は、患者における疾患の治療上の処置のモニタリングに使用され得る。この場合、時間の経過にしたがってポリペプチド又は核酸分子の発現若しくは活性のレベルがコントロールレベルに向かって変化することは、疾患の緩解を示している。
本発明の第２若しくは第３局面のポリペプチドを検出する好ましい方法は、以下の工程を含む：（ａ）本発明の第８局面のリガンド（例えば抗体）と生物学的サンプルとを、リガンド-ポリペプチド複合体の形成に適した条件下で接触させる工程；及び（ｂ）前記複合体を検出する工程。
当業者には明らかなように、短いプローブによる核酸ハイブリダイゼーション法、点変異分析、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅、及び抗体を用いて異常なタンパク質レベルを検出する方法のような、本発明の第11局面の該方法のいくつかの異なる方法がある。同様な方法を短期又は長期ベースで用いて、患者における疾患の治療上の処置をモニターすることを可能にすることができる。本発明は、これら疾患の診断方法に有用なキットをも提供する。
【００３３】
第12局面では、本発明は、EGFドメイン含有タンパク質としての本発明の第２又は第３局面のポリペプチドの使用を提供する。EGFドメイン含有タンパク質としての本発明のポリペプチドの好適な使用として、細胞の成長、代謝若しくは分化のレギュレーターとしての使用、受容体／リガンド対の一部としての使用及び生理的若しくは病的状態の診断マーカーとしての使用が挙げられる。
第13局面では、本発明は、薬学的に許容し得る担体と共に、本発明の第２若しくは第３局面のポリペプチド、又は本発明の第４若しくは第５局面の核酸分子、又は本発明の第６局面のベクター、又は本発明の第７局面の宿主細胞、又は本発明の第８局面のリガンド、又は本発明の第９局面の化合物を含む医薬組成物を提供する。
第14局面では、本発明は、診断又は治療用薬物の製造で使用するための、本発明の第２若しくは第３局面のポリペプチド、又は本発明の第４若しくは第５局面の核酸分子、又は本発明の第６局面のベクター、又は本発明の第７局面の宿主細胞、又は本発明の第８局面のリガンド、又は本発明の第９局面の化合物を提供する。
第15局面では、本発明は、患者の疾患の治療方法であって、前記患者に、本発明の第２若しくは第３局面のポリペプチド、又は本発明の第４若しくは第５局面の核酸分子、又は本発明の第６局面のベクター、又は本発明の第７局面の宿主細胞、又は本発明の第８局面のリガンド、又は本発明の第９局面の化合物を投与することを含む方法を提供する。
【００３４】
本発明の第２若しくは第３局面のポリペプチドをコードする天然遺伝子の発現、又は本発明の第２若しくは第３局面のポリペプチドの活性が、健常な対象者の発現又は活性レベルと比較したとき罹患対象者で低い疾患については、患者に投与されるポリペプチド、核酸分子、リガンド又は化合物がアゴニストであるべきである。逆に、天然遺伝子の発現又はポリペプチドの活性が、健常な対象者の発現又は活性レベルと比較したとき罹患対象者で高い疾患については、患者に投与されるポリペプチド、核酸分子、リガンド又は化合物がアンタゴニストであるべきである。このようなアンタゴニストの例として、アンチセンス核酸分子、リボザイム及びリガンド（例えば抗体）が挙げられる。
第16局面では、本発明は、本発明の第２若しくは第３局面のポリペプチドを高レベルで、又は低レベルで発現させるために、又は全く発現させないように形質転換したトランスジェニック又は遺伝子ノックアウト非ヒト動物を提供する。このようなトランスジェニック動物は、疾患の研究用モデルとして非常に有用であり、このような疾患の治療又は診断に有効な化合物の同定用スクリーニング方法で用いることもできる。
【００３５】
本発明を利用するために用いることができる標準的な技術及び方法の要旨については後述する。この発明は、記載される特定の方法論、プロトコル、細胞株、ベクター及び試薬に限定されないことは理解されるだろう。本明細書で用いられる専門用語は単に特定の態様を説明するためのものであり、この用語によって本発明の範囲を限定しようとするものではないことも理解されるだろう。本発明の範囲は添付の請求の範囲の用語によってのみ限定される。
この明細書では、ヌクレオチド及びアミノ酸についての標準的な略語が用いられる。
本発明の実施は、別に指定しない限り、分子生物学、微生物学、組換えDNA技術及び免疫学の通常の技術を利用する。このような技術は当業者の理解範囲内である。
【００３６】
このような技術は文献で完全に説明されている。特に適切な解説書の例として以下のものが挙げられる：Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especially volumes 154 & 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds. 1987, Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer Verlag, N.Y.); and Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C. C. Blackwell eds. 1986)。
【００３７】
本明細書において用いる“ポリペプチド”という用語は、ペプチド結合又は改変ペプチド結合によって互いに結合した２個又は３個以上のアミノ酸を含むいずれかのペプチド又はタンパク質を包含する。前記改変ペプチド結合によるものは、すなわちペプチドイソスターである。この用語は、短鎖（ペプチド及びオリゴペプチド）及び長鎖（タンパク質）の両方を指す。
本発明のポリペプチドは成熟タンパク質の形態を有するものでもよく、またプレ-、プロ-又はプレプロ-タンパク質であってプレ-、プロ-又はプレプロ-部分の切断によって活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生じるタンパク質でもよい。そのようなポリペプチドでは、プレ-、プロ-又はプレプロ-配列がリーダー配列若しくは分泌配列であっても、又は成熟ポリペプチド配列の精製のために用いられる配列であってもよい。
本発明の第２若しくは第３局面のポリペプチドは、融合タンパク質の一部分を形成することができる。例えば、１個又は２個以上の付加アミノ酸配列を含むことが有利なことが多い。前記付加アミノ酸配列は、分泌若しくはリーダー配列、プロ-配列、精製に役立つ配列、又は例えば組換え生産の間により高いタンパク質安定性を付与する配列を含んでもよい。代わりに、又は前記に加えて、前記成熟ポリペプチドを別の化合物、例えば前記ポリペプチドの半減期を増加させるような化合物（例えばポリエチレングリコール）と融合させることができる。
【００３８】
ポリペプチドは、天然のプロセス（例えば翻訳後プロセッシング）によって、又は本技術分野で周知の化学的改変技術によって改変された、20個の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含んでいてもよい。本発明のポリペプチドに一般的に存在する公知の改変には、グリコシル化、脂質付加、硫化、γ-カルボキシル化（例えばグルタミン酸残基の）、ヒドロキシル化及びADP-リボシル化がある。他の可能な改変には、アセチル化、アシル化、アミド化、フラビンの共有結合付加、ヘム部分の共有結合付加、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合付加、脂質誘導体の共有結合付加、ホスファチジルイノシトールの共有結合付加、架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、GPIアンカー形成、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解性プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、タンパク質へのトランスファーRNA媒介性アミノ酸付加（例えばアルギニル化）、及びユビキチン結合が含まれる。
改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノ末端又はカルボキシ末端を含むポリペプチド内のいずれの場所に存在してもよい。実際、共有結合改変によるポリペプチドのアミノ末端若しくはカルボキシ末端又はその両端の閉塞(blockage)は、天然に存在するポリペプチド及び合成ポリペプチドで一般的であり、そのような改変は本発明のポリペプチドにも存在し得る。
【００３９】
ポリペプチド内に生じる改変は、多くの場合ポリペプチドが生成される方法の関数であろう。組換えによって生成されるポリペプチドについて、改変の性質及び程度は大部分が、特定の宿主細胞の翻訳後改変能力及び問題のポリペプチドのアミノ酸配列に存在している改変シグナルによって決定されるであろう。例えば、グリコシル化パターンは、異なる種類の宿主細胞間で変動する。
本発明のポリペプチドは、任意の適切な様式で調製することができる。そのようなポリペプチドには、単離された天然に存在するポリペプチド（例えば、細胞培養物から精製される）、組換え的に生成されたポリペプチド（融合タンパク質を含む）、合成的に生成されたポリペプチド又はこれら方法の組合せによって生成されたポリペプチドが含まれる。
本発明の第３局面の機能的に等価なポリペプチドは、INSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117ポリペプチドと相同なポリペプチドであり得る。本明細書で用いる用語として、２個のポリペプチドは、前記ポリペプチドの一方の配列が他方のポリペプチドの配列に対して充分に高度の同一性又は類似性を有する場合、“相同である”と言われる。“同一性”とは、アラインメントを施した配列のどの特定の場所においても、アミノ酸残基が前記配列間で同一であることを示す。“類似性”は、アラインメントを施した配列のいずれの特定の場所においても、アミノ酸残基が前記配列間で類似の種類であることを示す。同一性及び類似性の度合いは、容易に計算できる（Computational Molecular Biology, A.M. Lesk ed., Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing. Informatics and Genome Projects, D.W. Smith ed., Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, A.M. Griffin and H.G. Griffin eds., Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, G. von Heinje, Academic Press, 1987；及びSequence Analysis Primer, M. Gribskov and J. Devereux eds., M. Stockton Press, New York, 1991）。
【００４０】
従って、相同なポリペプチドには、INSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117ポリペプチドの天然の生物学的変種（例えば前記ポリペプチドが由来した種における対立形質変種又は地理的変種）及び変異体（例えばアミノ酸置換、挿入又は欠失を含む変異体）が含まれる。前記変異体は、１個又は２個以上のアミノ酸残基が保存的又は非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）で置換されているポリペプチドを含んでもよく、さらにそのような置換アミノ酸残基は遺伝コードでコードされたものでもそうでなくてもよい。典型的な前記の置換は、Ala、Val、Leu及びIle間で；SerとThr間で；酸性残基AspとGlu間で；AsnとGln間で；塩基性残基LysとArg間で；又は芳香族残基PheとTyr間で生じる。特に好ましいものは、いくつか（すなわち5から10、1から5、1から3、1から2、又は単に1個）のアミノ酸が任意の組合せで置換、欠失又は付加された変種である。とりわけ好ましいものは、タンパク質の特性及び活性を変化させないサイレント置換、付加及び欠失である。また、その際とりわけ好ましいものは、保存的置換である。前記変異体にはまた、１個又は２個以上のアミノ酸残基が置換基を含むポリペプチドも含まれる。
【００４１】
典型的には、２個のポリペプチド間で30％を超える同一性が、機能的等価物の指標であると考えられる。好ましくは、本発明の第２若しくは第３局面の機能的に等価なポリペプチドは、INSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117ポリペプチド又はそれらの活性なフラグメントと、80％を超える配列同一性の度合いを有する。より好ましいポリペプチドは、それぞれ85％、90％、95％、98％又は99％を超える同一性の度合いを有する。
本発明の第２若しくは第３局面の機能的に等価なポリペプチドはまた、構造的アラインメントの１又は２以上の技術を用いて同定されたポリペプチドであってもよい。例えば、バイオペンジウム(BiopediumTM)検索データベースの作製に用いられる検索ツールの一角を構成するインファーマティカ=ゲノムスレッダー（Inpharmatica Genome Threader）技術を用いて（PCT特許出願WO 01/69507参照）、INSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117ポリペプチドと比較して低い配列同一性しかもたないが、INSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117ポリペプチド配列と有意な構造的相同性を共有するという理由からEGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであると予測される、現在のところ機能が未知なポリペプチドを同定することができる。“有意な構造的相同性”とは、インファーマティカ=ゲノムスレッダーが、２つのタンパク質は少なくとも10％以上の確実性を有して構造的相同性を共有すると予測することを意味する。
本発明の第２若しくは第３局面のポリペプチドはまた、INSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117ポリペプチドのフラグメント並びにINSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117ポリペプチドの機能的等価物のフラグメントを含むが、ただし、これらフラグメントがEGF含有タンパク質ファミリーのメンバーであるか、又はINSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117ポリペプチドと共通の抗原決定基を有することを条件とする。
【００４２】
本明細書において用いる、“フラグメント”という用語は、INSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117ポリペプチド又はその機能的等価物の１つのいずれかのアミノ酸配列の一部（全体ではないが）と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。前記フラグメントは、前記配列に由来する少なくともｎ個の連続するアミノ酸を含むべきであり、さらに個々の配列に応じてｎは、好ましくは７又はそれより大きい（例えば8、10、12、14、16、18、20又はそれより大きい）。小さなフラグメントは、抗原決定基を構成することができる。
全長INSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117ポリペプチドのフラグメントは、INSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117ポリペプチド配列内のそれぞれ２、３又は４個の隣接するエクソン配列の組合せから成り得る。
このようなフラグメントは、“独立的存在(free-standing)”（すなわち、他のアミノ酸若しくはポリペプチドの一部でもなく、他のアミノ酸若しくはポリペプチドの一部に融合されているのでもない）であってもよく、又はより大きなポリペプチドに含まれて、前記ポリペプチドの一部分又は領域を形成してもよい。より大きなポリペプチド内に含まれている場合、本発明のフラグメントは、最も好ましくは連続するただ１つの領域を形成する。例えばある種の好ましい態様は、前記フラグメントのアミノ末端に融合したプレ−及び／又はプロ−ポリペプチド領域を有するフラグメント、及び／又は前記フラグメントのカルボキシ末端に融合した付加的領域を有するフラグメントに関する。しかし、いくつかのフラグメントがただ１つのより大きなポリペプチド内に含まれていてもよい。
本発明のポリペプチド又はその免疫原性フラグメント（少なくとも１つの抗原決定基を含む）を用いて、例えばポリクローナル又はモノクローナル抗体といった、前記ポリペプチドに免疫特異的なリガンドを作製することができる。そのような抗体を用いて、本発明のポリペプチドを発現しているクローンを単離若しくは同定するか、又はアフィニティークロマトグラフィーで本発明のポリペプチドを精製することができる。前記抗体はまた、当業者には明らかなように、他の用途のうち診断的又は治療的補助としても用いることができる。
【００４３】
“タンパク質”という用語は、限定するものではないが、酵素として作用する当該ポリペプチドを含むタイプのポリペプチドを意味する。好ましくは、本発明のタンパク質又はポリペプチドはリガンドとして作用する。この文脈におけるリガンドは、受容体のような別の分子に結合する分子を意味する。リガンドは酵素の補足因子であり得る。
“免疫特異的”という用語は、抗体が、従来技術における他の関連ポリペプチドに対する親和性よりも、本発明のポリペプチドに対して実質的に強い親和性を有することを意味する。本明細書で用いる“抗体”という用語は、完全な分子だけでなく問題の抗原決定基と結合することができるそのフラグメント、例えばFab、F(ab’)2及びFvも指す。従って、そのような抗体は、本発明の第２又は第３局面のポリペプチドと結合する。
“実質的に強い親和性”という表現によって、本発明のポリペプチドに対する親和性が、既知の分泌タンパク質に対する親和性と比較して、測定可能に増加することを意味している。
好ましくは、本発明のポリペプチドに対する親和性が、既知の分泌タンパク質（例えばタンパク質のEGFドメイン含有ファミリーのメンバー）に対する親和性よりも、少なくとも1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、106倍強い。
【００４４】
ポリクローナル抗体が所望される場合、選択される哺乳類（例えばマウス、ウサギ、ヤギ又はウマ）を本発明の第２又は第３局面のポリペプチドで免疫し得る。動物を免疫するために用いられるポリペプチドは、組換えDNA技術によって誘導してもよく、又は化学的に合成してもよい。所望する場合には、前記ポリペプチドを担体タンパク質と結合させることができる。前記ポリペプチドと化学的に結合させ得る一般的に用いられる担体として、ウシ血清アルブミン、チログロブリン及びキーホールリンペットヘモシアニンが挙げられる。次に、前記担体結合ポリペプチドを用いて動物を免疫する。免疫した動物から血清を採集し、既知手順（例えばイムノアフィニティークロマトグラフィー）で処理する。
当業者は、本発明の第２又は第３局面のポリペプチドに対するモノクローナル抗体も容易に生成できる。ハイブリドーマ技術を用いてモノクローナル抗体を作製する一般的な方法論は周知である（例えば以下を参照されたい：G. Kohler & C. Milstein, Nature 256：495−497(1975)； Kozbor et al., Immunology Today 4：72(1983)； Cole et al., 77−96 “Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”, Alan R. Liss, Inc. (1985)）。
【００４５】
本発明の第２又は第３局面のポリペプチドに対して産生されたモノクローナル抗体のパネル(panels)を種々の特性、すなわちアイソタイプ、エピトープ、親和性などについてスクリーニングすることができる。モノクローナル抗体は、それらを産生させる個々のポリペプチドの精製に特に有用である。あるいは、問題のモノクローナル抗体をコードする遺伝子を、例えば当該技術分野で知られるPCR技術によってハイブリドーマから単離し、さらにクローン化し、適切なベクターで発現させることができる。
また、非ヒト可変領域がヒト定常領域と結合又は融合されているキメラ抗体（例えば以下を参照されたい：Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84：3439(1987)）も有用であり得る。
抗体は、例えばヒト化により、改変して個体での免疫原性を減少させることができる（例えば以下を参照されたい：Jones et al., Nature,321：522(1986)； Verhoeyen et al., Science, 239：1534(1988)； Kabat et al., J. Immunol., 147：1709(1991)； Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86：10029(1989)； Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88：34181(1991)； Hodgson et al., Bio/Technology 9：421(1991)）。本明細書で用いられる“ヒト化抗体”という用語は、非ヒトドナー抗体の重鎖及び／又は軽鎖の可変ドメイン中のCDRアミノ酸及び選択した他のアミノ酸がヒト抗体の等価なアミノ酸に代えて置換されている抗体分子を指す。従って、ヒト化抗体はヒトの抗体とよく似ているが、ドナー抗体の結合能力を有する。
【００４６】
また別の選択肢では、前記抗体が、２つの異なる抗原結合ドメインを有し、その各ドメインは異なるエピトープに向けられている“二重特異性”抗体であってもよい。
ファージディスプレー技術を用いて、本発明のポリペプチドに対する結合活性を有する抗体をコードしている遺伝子を、関連する抗体の保有についてスクリーニングされたヒト由来のリンパ球のPCR増幅V-遺伝子レパートリー、又は未感作ライブラリーのいずれかから選択することができる（J. McCafferty et al., (1990) Nature 348：552−554； J. Marks et al., (1992) Biotechnology 10：779-783）。これら抗体の親和性は、鎖のシャッフリングによって改善することもできる（T. Clackson et al., (1991) Nature 352：624-628）。
上記技術によって生成された抗体は、ポリクローナルであれモノクローナルであれ、免疫アッセイ、ラジオイムノアッセイ（RIA）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）で試薬として用いることができるという点で、更なる有用性を有する。これらの用途では、これら抗体を、分析的に検出可能な試薬（例えば放射性同位元素、蛍光分子又は酵素）で標識することができる。
本発明の第４及び第５局面の好ましい核酸分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、及び/又は配列番号55に記載のポリペプチド配列並びに機能的に等価なポリペプチドをコードするものである。これら核酸分子は、本明細書に記載される方法及び用途で用いることができる。本発明の核酸分子は、好ましくは本明細書で開示される配列に由来する少なくともｎ個の連続するヌクレオチドを含み、この場合、前記個々の配列に応じてｎは10又はそれより大きい（例えば12、14、15、18、20、25、30、35、40又はそれより大きい）。
【００４７】
本発明の核酸分子は、上述した核酸分子に相補的な配列も含む（例えばアンチセンス又はプローブとしての目的のため）。
本発明の核酸分子は、RNA（例えばmRNA）、又はDNA（例えばcDNA、合成DNA又はゲノムDNAを含む）の形態でよい。そのような核酸分子は、クローニングによって、化学合成によって、又はそれらの組合せによって得ることができる。前記核酸分子は、固相ホスホルアミダイト化学合成のような技術を用いる化学合成によって、ゲノム若しくはcDNAライブラリーから、又は生物体からの分離によって調製することができる。RNA分子は、一般的にはDNA配列のin vitro又はin vivo転写によって生成し得る。
核酸分子は、二本鎖でも一本鎖でもよい。一本鎖DNAは、コード鎖（センス鎖としても知られる）でも、非コード鎖（アンチセンス鎖とも称される）でもよい。
“核酸分子”という用語には、DNA及びRNAの類似体（例えば改変骨格を含むもの）、並びにペプチド核酸（PNA）も含まれる。本明細書で用いられる“PNA”という用語は、アンチセンス分子又は抗遺伝子作用因子を指し、長さが少なくとも５ヌクレオチドであってアミノ酸残基のペプチド骨格に結合されたオリゴヌクレオチドを含む。前記ペプチド骨格は好ましくはリジンで終わり、前記末端リジンは当該組成物に可溶性を付与する。PNAは、PEG化されて細胞内での寿命が延長されてもよい｛細胞内では、PNAは優先的に相補性一本鎖DNA及びRNAと結合して転写物の伸長を停止させる（P.E. Nielsen et al. (1993) Anticancer Drug Des. 8：53-63）｝。
【００４８】
この発明のポリペプチドをコードする核酸分子は、本明細書で開示される１又は２以上の核酸分子のコード配列と同一であり得る。
これらの分子はまた、遺伝コードの縮退の結果として、ポリペプチド配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、及び/又は配列番号55をコードする配列と異なる配列を有してもよい。そのような核酸分子には、限定するものではないが、それ自体で成熟なポリペプチドのコード配列；成熟ポリペプチドのコード配列及び付加的コード配列（例えばリーダー配列又は分泌配列をコードするもの）、例えばプロ-、プレ-又はプレプロ-ポリペプチド配列をコードするもの；前述の付加的コード配列を伴って、又は伴わないで、さらに付加的な非コード配列（非コード5’及び3’配列を含む）を伴う成熟ポリペプチドのコード配列が含まれる。前記の非コード5’及び3’配列は、例えば転写された非翻訳配列で、転写（終止シグナルを含む）、リボソーム結合及びmRNA安定性において役割を果たすものである。前記核酸分子は、更なる機能性を提供するアミノ酸のような付加アミノ酸をコードする付加配列を含むこともできる。
【００４９】
本発明の第４及び第５局面の核酸分子は、本発明の第２又は第３局面のポリペプチド及びフラグメントのフラグメント又は機能的等価物をもコードし得る。そのような核酸分子は、天然に存在する変種（例えば天然に存在する対立形質変種）であっても、又は前記分子は天然に存在することが知られていない変種であってもよい。このような天然に存在しない核酸分子の変種は、突然変異誘導技術（核酸分子、細胞又は生物に対して適用される技術を含む）によって生じさせ得る。
このような変種の中では、特にヌクレオチドの置換、欠失又は挿入によって前述の核酸分子と異なる変種が挙げられる。置換、欠失又は挿入には、１又は２以上のヌクレオチドが関与し得る。変種は、コード領域若しくは非コード領域又はその両方において変化していてもよい。コード領域における変化は、保存的又は非保存的なアミノ酸置換、欠失又は挿入を引き起こし得る。
本発明の核酸分子はまた、多様な理由で、当技術分野で一般的に知られている方法を用いて操作することができ、前記方法としては、遺伝子産物（ポリペプチド）のクローニング、プロセッシング及び／又は発現の改変が挙げられる。ランダムフラグメント化によるDNAシャッフリング並びに遺伝子フラグメント及び合成オリゴヌクレオチドのPCRリアッセンブリーは、ヌクレオチド配列の操作で使用し得る技術に含まれる。部位特異的突然変異誘導を用いて、新規な制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変更、コドンの優先性の変化、スプライシング変種の生成、変異の導入などを行うことができる。
【００５０】
本発明の第２又は第３局面のポリペプチドをコードする核酸分子は、結合核酸分子が融合タンパク質をコードするように、異種配列に連結されてもよい。このような結合核酸分子は本発明の第４又は第５局面に包含される。例えば、本発明のポリペプチドの活性の阻害物質についてペプチドライブラリーをスクリーニングするために、前記のような結合核酸分子を用いて、市販の抗体により認識され得る融合タンパク質を発現させることは有用だろう。融合タンパク質はまた、本発明のポリペプチド配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含むように操作し、それによって前記ポリペプチドを異種タンパク質から切り離して精製することができるようにしてもよい。
本発明の核酸分子には、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子と部分的に相補的であり、従ってそのコード核酸分子とハイブリダイズする（ハイブリダイゼーション）アンチセンス分子も含まれる。そのようなアンチセンス分子（例えばオリゴヌクレオチド）は、当業者にはよく知られるように、本発明のポリペプチドをコードする標的核酸を認識し、その標的核酸と特異的に結合してその転写を妨げるように設計することができる（例えば以下の文献を参照されたい：J.S. Cohen, Trends in Pharm. Sci., 10：435(1989)； J. Okano, Neurochem. 56：560(1991)； J. O’ Connor, Neurochem. 56：560(1991)； Lee et al., Nucleic Acids Res. 6：3073(1979)； Cooney et al., Science 241：456(1988)； Dervan et al., Science 251：1360(1991)）。
【００５１】
本明細書で用いられる“ハイブリダイゼーション”という用語は、２つの核酸分子が水素結合によって互いに会合することを指す。典型的には、１つの分子が固形支持体に固定され、他方は溶液中で遊離しているであろう。次に、水素結合に適した条件下、２つの分子を互いに接触して置くことができる。この結合に影響する因子には以下が含まれる：溶媒の種類及び体積；反応温度；ハイブリダイゼーションの時間；撹拌；液相分子の固形支持体への非特異的結合を妨害する薬剤（デンハルト試薬、又はBLOTTO）；分子の濃度；分子の結合速度を増加させる化合物の使用（硫酸デキストラン又はポリエチレングリコール）；及びハイブリダイゼーションに続く洗滌条件のストリンジェンシー（Sambrook et al.（上掲書）を参照されたい）。
完全に相補的な分子と標的分子とのハイブリダイゼーションの阻害は、当業者に知られるハイブリダイゼーションアッセイを用いて調べることができる（例えばSambrook et al.（上掲書）を参照されたい）。従って、文献（G.M. Wahl and S.L. Berger, 1987, Methods Enzymol. 152：399−407； A.R. Kimmel, 1987, Methods Enzymol. 152：507−511）で教示されるように、実質的に相同な分子は、種々のストリンジェンシー条件下、完全に相同な分子の標的分子への結合で競合し、かつその結合を阻害するだろう。
“ストリンジェンシー”とは、異なる分子の会合よりも非常に類似した分子の会合に適したハイブリダイゼーション反応の条件を指す。高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、以下を含む溶液（50％のホルムアミド、5倍のSSC（150mM NaCl、15mMクエン酸三ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム（pH7.6）、5倍のデンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、及び20μg/mLの変性せん断サケ精子DNA）中で42℃にて一晩インキュベーションし、続いてフィルターを約65℃にて0.1倍のSSC中で洗滌すると定義される。低ストリンジェンシー条件は、35℃にて実施されるハイブリダイゼーション反応を含む（Sambrook et al.（上掲書）を参照されたい）。好ましくは、ハイブリダイゼーションに用いられる条件が高ストリンジェンシー条件である。
【００５２】
本発明のこの局面の好ましい態様は、INSP113、INSP114、INSP115、INSP116又はINSP117ポリペプチドをコードする核酸分子の全長にわたって少なくとも70％同一である核酸分子、並びにそのような核酸分子と実質的に相補的な核酸分子である。好ましくは、本発明のこの局面の核酸分子は、このようなコード配列の全長にわたって少なくとも80％同一の領域を含むか、又はそれらと相補的な核酸分子である。これに関しては、そのような核酸配列の全長にわたって少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％、さらに好ましくは少なくとも98％、99％又はそれ以上の同一の核酸分子が特に好ましい。この局面の好ましい態様は、INSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117ポリペプチドと同じ生物学的機能又は活性を実質的に保持するポリペプチドをコードしている核酸分子である。
本発明はまた、以下の工程を含む、本発明の核酸分子を検出する方法を提供する：（ａ）二重鎖を形成するハイブリダイゼーション条件下で、本発明の核酸プローブを生物学的サンプルと接触させる工程；及び（ｂ）形成された前記の二重鎖を全て検出する工程。
【００５３】
本発明に従って利用し得るアッセイに関連して下記でさらに考察するように、上述の核酸分子をRNA、cDNA又はゲノムDNAに対するハイブリダイゼーションプローブとして用いてINSP113、INSP114、INSP115、INSP116又はINSP117ポリペプチドをコードする完全長cDNA及びゲノムクローンを単離し、さらにこのポリペプチドをコードする遺伝子と高い配列類似性を有する相同遺伝子又はオーソログ遺伝子のcDNA又はゲノムクローンを単離することができる。
これに関しては、当技術分野で既知の他の技術のうち、特に以下の技術を利用することができる。これらの技術は、例示として下記で考察される。DNAのシークエンシング及び解析の方法は周知であって、当技術分野では一般的に利用可能であり、本明細書で考察される本発明の態様の多くを実施するために実際に用いることができる。そのような方法では、DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、シークエナーゼ（US Biochemical Corp., Cleaveland, OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）、耐熱性T7ポリメラーゼ（Amersham, Chicago, IL）、又はポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼの組合せ（例えば市販（Gibco/BRL, Gaithersburg, MD）のELONGASE増幅システムで見出されるようなもの）のような酵素を利用することができる。好ましくは、シークエンシング過程は、例えばハミルトンマイクロラブ（Hamilton Micro Lab）2200（Hamilton, Reno, NV）、ペルティエサーマルサイクラー（Peltier Thermal Cycler）PTC200（MJ Research, Watertown, MA）、ABIカタリスト並びに373及び377DNAシークエンサー（Perkin Elmer）のような機器を用いて自動化することができる。
【００５４】
INSP113、INSP114、INSP115、INSP116又はINSP117ポリペプチドの機能と等価な機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子を単離する方法の１つは、当技術分野で知られている標準的な手法を用い、天然のプローブ又は人工的に設計したプローブによりゲノムライブラリー又はcDNAライブラリーを探索することである（例えば以下の文献を参照されたい：“Current Protocols in Molecular Biology”, Ausubel et al.(eds). Greene Publishing Association and John Wiley Interscience, New York, 1989, 1992）。特に有用なプローブは、適切なコード遺伝子（配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52及び配列番号54）に由来する核酸配列にマッチングするか、又は前記配列と相補的であって、少なくとも15、好ましくは少なくとも30、さらに好ましくは少なくとも50個の連続する塩基を含むプローブである。このようなプローブは、分析的に検出可能な試薬で標識して、前記プローブの識別を容易にすることができる。有用な試薬には、放射性同位元素、蛍光色素、及び検出可能な生成物の形成を触媒し得る酵素が含まれるが、ただしこれらに限定されない。これらプローブを用いて、当業者は、ヒト、哺乳類又は他の動物供給源から対象のタンパク質をコードするゲノムDNA、cDNA又はRNAポリヌクレオチドの相補的なコピーを単離し、関連配列、例えば前記のファミリー、タイプ及び／又はサブタイプに属するまた別のメンバーについて、前記供給源をスクリーニングすることができるであろう。
【００５５】
多くの場合、単離されるcDNA配列は不完全で、ポリペプチドをコードする領域は短く（通常は5’末端で）切断されているであろう。完全長cDNAを得るために、又は短いcDNAを伸長させるために、いくつかの方法が利用可能である。そのような配列は、部分的なヌクレオチド配列を用い、かつ上流の配列（例えばプロモーター及び調節エレメント）を検出するための当技術分野で公知の種々の方法を利用して伸長させることができる。例えば、使用しる１つの方法は、cDNA末端迅速増幅法（RACE；例えば以下を参照されたい：Frohman et al., PNAS USA 85, 8998-9002, 1988）に基づく。この技術の最近の改変（例えばマラソン（Marathon）（商標）技術（Clontech Laboratories Inc.）により例示される）は、より長いcDNAの検索を顕著に単純化した。“制限部位”PCRと称されるわずかに異なる技術では、普遍的プライマーを用いて、既知の遺伝子座に近接する未知の核酸配列が検索される（G. Sarkar (1993) PCR Methods Applic. 2：318−322）。既知の領域に基づく多様なプライマーを用いて配列を増幅又は伸長するため、逆PCRも使用し得る（T. Triglia et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16：8186）。使用し得る別の方法は捕捉PCRで、この方法は、ヒト及び酵母の人工染色体DNAにおける既知配列に近接しているDNAフラグメントのPCR増幅を含む（M. Lagerstrom et al. (1991) PCR Methods Applic. 1：111−119）。未知配列を検索するために使用し得る別の方法は、パーカーの方法である（J.D. Parker et al.(1991) Nucleic Acids Res. 19：3055−3060）。さらに、ゲノムDNAを少しずつ移動して調べるためにPCR、入れ子（nested）プライマー、及びプロモーターファインダー（PromoterFinderTM）ライブラリー（Clontech, Palo Alto, CA）を使用し得る。この方法ではライブラリーのスクリーニングが不要で、イントロン／エクソン結合部の発見に有用である。
【００５６】
完全長cDNAをスクリーニングする場合、より大きなcDNAを包含するようにサイズ選択したライブラリーを用いることが好ましい。さらにまた、遺伝子の5’領域を含む配列をより多く含むという点で、ランダムプライムド(random-primed)ライブラリーが好ましい。ランダムプライムドライブラリーの使用は、オリゴd(T)ライブラリーが完全長cDNAを生成しない状況で特に好ましいだろう。ゲノムライブラリーは、5’非転写調節領域に配列を伸長させるために有用だろう。
本発明のある態様では、染色体上の位置特定のために、本発明の核酸分子を用いることができる。この技術では、核酸分子は個々のヒト染色体上の特定の位置に対して特異的に標的化され、個々のヒト染色体上の特定の位置とハイブリダイズすることができる。本発明の関連配列の染色体上へのマッピングは、遺伝子関連疾患に関する当該配列の相関性確認において重要な工程である。いったん染色体の正確な位置に配列がマッピングされたら、前記配列の染色体上の物理的な位置を遺伝子地図データと相関させることができる。そのようなデータは、例えば以下で見出すことができる：V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man（ジョーンズホプキンス大学、ウェルチ医学図書館を通じてオンラインで利用可能である）。同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との関係を、次に連鎖解析（物理的に近接する遺伝子の同時遺伝(coinheritance)）によって同定する。これにより、ポジショナルクローニング又は他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を検索する研究者に貴重な情報が提供される。いったん疾患又は症候群の位置が遺伝連鎖によって特定のゲノム領域で大まかに限局されたら、前記領域にマッピングされるいずれの配列も、更なる解析のための関連遺伝子又は調節遺伝子となることができる。前記核酸分子はまた、正常な個体、キャリア個体又は罹患個体間で転座、逆位などによる染色体位置上の相違を検出するために用いることができる。
【００５７】
本発明の核酸分子はまた、組織分布同定(tissue localisation)のために貴重である。そのような技術は、ポリペプチドをコードするmRNAの検出によって、組織中の前記ポリペプチドの発現パターンの決定を可能にする。これらの技術には、in situハイブリダイゼーション技術及びヌクレオチド増幅技術（例えばPCR）が含まれる。これらの研究から得られる結果は、生物内での前記ポリペプチドの正常な機能を示唆する。さらに、変異遺伝子によってコードされるmRNAの発現パターンと正常mRNA発現パターンとの比較研究によって、変異ポリペプチドの疾患における役割に対する貴重な洞察が提供される。そのような不適切な発現は時間的、位置的又は量的性質を有する場合もある。
遺伝子サイレンシングアプローチを実施して、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の内在性発現をダウンレギュレートすることもできる。RNA干渉（RNAi）（S.M. Elbashir et al. Nature 2001, 411, 494-498）は、使用可能な配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのための１つの方法である。短いdsRNAオリゴヌクレオチドをin vitro合成して細胞内に導入する。これらdsRNAの配列特異的結合によって標的mRNAの分解が開始され、標的タンパク質の発現が減少又は阻害される。
上述した遺伝子サイレンシングアプローチの有効性は、ポリペプチド発現の測定により（例えばウェスタンブロッティングによる）、またタックマン(TaqMan)に基づく方法を用いるRNAレベルで評価することができる。
【００５８】
本発明のベクターは本発明の核酸分子を含み、クローニングベクターでも発現ベクターでもよい。本発明のベクターで形質転換、トランスフェクト又は形質導入し得る本発明の宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよい。
本発明のポリペプチドは、宿主細胞内に含まれるベクター中の前記ポリペプチドをコードする核酸分子の発現によって、組換え形態で調製することができる。このような発現方法は当業者によく知られており、多くは以下の文献でより詳細に記述されている：Sambrook et al.（上掲書）及びFernandez & Hoeffler（1998, eds. “Gene expression systems. Using nature for the art of expression”, Academic Press, San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokyo, Toronto）。
【００５９】
一般的には、要求される宿主でポリペプチドを生成させるために、核酸分子の維持、増殖又は発現に適したいずれの系又はベクターも用いることができる。周知であり日常的である種々の技術のいずれによっても（例えば前掲書（Sambrook et al.）に記載されたようなもの）、適切なヌクレオチド配列を発現系に挿入することができる。一般的には、コード遺伝子は制御エレメント（例えばプロモーター、リボソーム結合部位（細菌での発現の場合）、及び場合によってオペレーター）の制御下に置かれ、それによって所望のポリペプチドをコードするDNA配列を形質転換宿主細胞でRNAに転写させることができる。
適切な発現系の例には、例えば染色体系、エピソーム系及びウイルス由来系、例えば以下に由来するベクターが含まれる：細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、ウイルス、例えばバキュロウイルス、パポーバウイルス（例えばSV40）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス及びレトロウイルス、又は上記の組合せ、例えばプラスミドとバクテリオファージの遺伝子エレメントに由来するもの（例えばコスミド及びファージミドを含む）。ヒト人工染色体（HAC）もまた、プラスミドに包含させ発現させるよりも大きいDNAフラグメントを搬送するのに用いることができる。
ベクターpCR4-TOPO-INSP113(図18)、pCR4-TOPO-INSP113sv(図19)、pDONR(図20)、pEAK12d(図21)、pDEST12.2(図22)、pENTR-INSP113-6HIS(図23)、pENTR-INSP113sv-6HIS(図24)、pEAK12d-INSP113-6HIS(図25)、pEAK12d-INSP113sv-6HIS(図26)、pDEST12.2-INSP113-6HIS(図27)、pDEST12.2-INSP113sv-6HIS(図28)、pCR4-TOPO-INSP114(図31)、pCR4-TOPO-INSP114-GR1(図35)、pCR4-TOPO-INSP114-SV2(図36)、pDONR 221(図38)、pEAK12d(図39)、pDEST12.2(図40)、pENTR_INSP114-6HIS(図41)、pEAK12d_INSP114-6HIS(図42)、pDEST12.2_INSP114-6HIS(図43)、pENTR_INSP114-SV1-6HIS(図44)、pEAK12d_INSP114-SV1-6HIS(図45)、pDEST12.2_INSP114-SV1-6HIS(図46)、pENTR_INSP114-SV2-6HIS(図47)、pEAK12d_INSP114-SV2-6HIS(図48)、pDEST12.2_INSP114-SV2-6HIS(図49)、pDONR 221(図51)、pEAK12d(図52)、pDEST12.2(図53)、pENTR_INSP115-6HIS(図54)、pEAK12d_INSP115-6HIS(図55)、pDEST12.2_INSP115-6HIS(図56)、pDONR 221(図58)、pEAK12d(図59)、pDEST12.2(図60)、pENTR_INSP116-6HIS(図61)、pEAK12d_INSP116-6HIS(図62)、pDEST12.2_INSP116-6HIS(図63)、pCRII-TOPO-INSP117(図66)、pDONR 221(図67)、pEAK12d(図68)、pDEST12.2(図69)、pENTR_INSP117-6HIS(図70)、pEAK12d_INSP117-6HIS(図71)及びpDEST12.2_INSP117-6HIS(図72)は、本発明で使用するために適したベクターの好ましい例である。
【００６０】
特に適切な発現系には、組換えバクテリオファージ、プラスミド又はコスミドDNA発現ベクターで形質転換された微生物（例えば細菌）；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV）又は細菌発現ベクター（例えばTi又はpBR322プラスミド）で形質転換された植物細胞系；又は動物細胞系が含まれる。無細胞翻訳系もまた、本発明のポリペプチドの生成に用いることができる。
本発明のポリペプチドをコードする核酸分子の宿主細胞への導入は、多くの標準的な実験室マニュアル（例えば、Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986)及び上掲書（Sambrook et al.））に記載された方法によって達成できる。特に適切な方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、擦過ローディング（scrape loading）、弾道導入又は感染が含まれる（以下を参照されたい：Sambrook et al.（1989）上掲書；Ausubel et al.（1991）上掲書；Spector, Goldman & Leinwald,（1998））。真核細胞では、発現系は、その系の要求に応じて一過性（例えば、エピソーム性）又は永続的（染色体組込み）であり得る。
【００６１】
コード核酸分子は、所望であれば、例えば翻訳ポリペプチドの小胞体内腔、細胞膜周辺腔又は細胞外環境への分泌のために、シグナルペプチド又はリーダー配列のような制御配列をコードする配列を含んでいても、又は含んでいなくてもよい。これらのシグナルは前記ポリペプチドにとって内因性であってもよく、又は異種シグナルであってもよい。リーダー配列は、翻訳後プロセッシングで細菌宿主によって取り除くことができる。
制御配列に加え、宿主細胞の増殖に関連して前記ポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を付加することが望ましい場合がある。調節配列の例は、化学的又は物理的刺激（調節化合物の存在を含む）又は種々の温度若しくは代謝条件に応答して遺伝子の発現を増加させたり低下させたりする配列である。調節配列は、ベクターの非翻訳領域、例えばエンハンサー、プロモーター並びに5’及び3’非翻訳領域である。これらは、宿主細胞タンパク質と相互作用して、転写及び翻訳を実行する。そのような調節配列は、その強度及び特異性を変化させることができる。利用するベクター系及び宿主によって、いずれかの数の適切な転写及び翻訳エレメント（構成性及び誘導性プロモーターを含む）を用いることができる。例えば、細菌系でクローニングするときは、誘導性プロモーター、例えばBluescriptファージミド（Stratagene, La Jolla, CA）又はpSportl（商標）プラスミド（Gibco BRL）などのハイブリッドlacZプロモーターを用いることができる。バキュロウイルスポリヘドリン(polyhedrin)プロモーターは、昆虫細胞で用いることができる。植物細胞ゲノムに由来するプロモーター若しくはエンハンサー（例えば熱ショック、RUBISCO及び貯蔵タンパク質遺伝子）又は植物ウイルスに由来するプロモーター若しくはエンハンサー（例えばウイルスプロモーター又はリーダー配列）をベクターにクローニングすることができる。哺乳類細胞系では、哺乳類遺伝子由来又は哺乳類ウイルス由来のプロモーターが好ましい。配列の複数のコピーを含む細胞株の作製が必要な場合、適切な選択可能マーカーとともに、SV40又はEBVをベースとするベクターを使用することができる。
【００６２】
発現ベクターは、特定の核酸コード配列が適切な調節配列とともにベクター内に配置されるように構築される。前記コード配列の調節配列に関する位置及び向きは、前記コード配列が調節配列の“制御”下で転写されるような位置及び向きである（すなわち制御配列にてDNA分子と結合するRNAポリメラーゼは、前記コード配列を転写する）。前記配列を適切な向きで制御配列に付属させることができるように（すなわちリーディングフレームを維持するために）、前記配列を改変する必要がある場合もある。
制御配列及び他の調節配列は、ベクターへの挿入の前に核酸コード配列に連結させることができる。あるいは、制御配列及び適切な制限部位を既に含む発現ベクターへ、コード配列を直接クローニングすることができる。
組換えポリペプチドの長期的かつ高収量の生成のためには、安定な発現が好ましい。例えば、対象のポリペプチドを安定して発現する細胞株は、ウイルスの複製起点及び／又は内因性発現エレメント並びに選択可能マーカー遺伝子を同じ又は別個のベクター上に含み得る発現ベクターを用いて形質転換させることができる。ベクターの導入に続き、選択培地に切り替える前に細胞を栄養(enriched)培地で１〜２日間増殖させることができる。選択可能マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することで、選択可能マーカーの存在によって、導入された配列をうまく発現する細胞の増殖及び回収が可能になる。安定して形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞の種類に適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。
【００６３】
発現のための宿主として利用可能な哺乳類細胞株は当技術分野で公知であり、米国菌培養収集所（American Type Culture Collection, ATCC）から入手可能な多くの不死化細胞株が含まれる。そのような細胞株には、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、ベイビーハムスター腎（BHK）細胞、サル腎（COS）細胞、C127細胞、3T3細胞、BHK細胞、HEK293細胞、ボウズ（Bowes）メラノーマ細胞及びヒト肝細胞癌（例えばHepG2）細胞及び他の多数の細胞株が挙げられるが、これだけに限られない。
バキュロウイルス系では、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料は、特にインビトロジェン（Invitrogen, San Diego, CA）からキットの形態で（“MaxBac”キット）商業的に入手可能である。これら技術は一般的に当業者に知られており、文献に完全に記載されている（Summers & Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)）。この系での使用に特に適切な宿主細胞には、昆虫細胞、例えばドロソフィラ(Drosophila)S2細胞及びスポドプテラ(Spodoptera)Sf9細胞が含まれる。
当技術分野で公知である多くの植物細胞培養及び完全植物(whole plant)遺伝子発現系が存在する。適切な植物細胞遺伝子発現系の例には、米国特許第5,693,506号、5,659,122号及び5,608,143号に記載されるものが含まれる。植物細胞培養における遺伝子発現の更なる例は、文献に記載されている（Zenk (1991) Phytochemistry 30：3861−3863）。
特に、プロトプラストを単離し、これを培養して完全再生植物を形成することが可能な植物は全て利用することができ、それによって移入遺伝子を含む完全植物が回収できる。特に、サトウキビ、サトウダイコン、綿花、果実及び他の樹木、マメ類及び野菜の主要な種の全てを含む（ただしこれらに限定されない）全ての植物は、培養細胞又は培養組織から再生させることができる。
【００６４】
特に好ましい細菌宿主細胞の例には、連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌（E. coli）、ストレプトマイセス及びバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）細胞が含まれる。
真菌での発現に特に適切な宿主細胞の例には、酵母細胞（例えばS.セレビシエ(cerevisiae)）及びアスペルギルス細胞が含まれる。
形質転換細胞株の回収に使用し得る多くの選択系が当技術分野で公知である。そのような例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（M. Wigler et al.(1977) Cell 11：223−32）及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（I. Lowy et al.(1980) Cell 22：817−23）の遺伝子が挙げられ、これらはそれぞれtk−又はaprt±細胞で用いることができる。
さらにまた、抗代謝物質耐性、抗生物質耐性又は除草剤耐性を選択基準として用いてもよい。例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）はメトトレキセートに対する耐性を付与し（M. Wigler et al.(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77：3567−70）、nptはアミノグリコシド系ネオマイシン及びG-418に対する耐性を付与し（F. Colbere−Garapin et al.(1981) J. Mol. Biol. 150：1−14）、さらにals又はpatはそれぞれクロロスルフロン(chlorsulfuron)及びホスフィノトリシン(phosphinotricin)アセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与する。さらに別の選択可能遺伝子が報告されており、それらの例は当業者には明白であろう。
【００６５】
マーカー遺伝子発現の有無は対象の遺伝子も存在することを示唆するが、対象の遺伝子の存在及び発現を確認する必要があり得る。例えば、関連配列がマーカー遺伝子配列内に挿入されている場合、マーカー遺伝子機能が存在しないことによって、適切な配列を含む形質転換細胞を識別することができる。あるいは、マーカー遺伝子は、単一のプロモーターの制御下で、本発明のポリペプチドをコードする配列とともに直列に配置され得る。通常、誘導又は選択に応答するマーカー遺伝子の発現は、直列遺伝子の発現も示している。
あるいは、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含み、前記ポリペプチドを発現する宿主細胞は、当業者に知られている多様な手法で同定することができる。前記手法には、DNA-DNA又はDNA-RNAハイブリダイゼーション及びタンパク質バイオアッセイ、例えば蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）又はイムノアッセイ技術（例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）及び放射性イムノアッセイ（RIA））が含まれ（ただしこれらに限定されない）、核酸又はタンパク質の検出及び／又は定量のためにメンブレン、溶液又はチップをベースとする技術が含まれる（例えば以下を参照されたい：R. Hampton et al.(1990) Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St Paul, MN；及びD.E. Maddox et al.(1983) J. Exp. Med. 158：1211-1216）。
【００６６】
多種多様な標識及び結合技術が当業者に知られており、種々の核酸及びアミノ酸アッセイで用いることができる。本発明のポリペプチドをコードする核酸分子に関連する配列を検出するための標識ハイブリダイゼーションプローブ又はPCRプローブの作製手段には、標識したポリヌクレオチドを用いるオリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識又はPCR増幅が含まれる。あるいは、本発明のポリペプチドをコードする配列をベクターにクローニングしてmRNAプローブを作製することができる。そのようなベクターは当技術分野で公知であって、商業的に入手可能であり、適切なRNAポリメラーゼ（例えばT7、T3又はSP6）及び標識ヌクレオチドを添加することによりin vitroでRNAプローブを合成するために使用し得る。これら手法は、商業的に入手可能な種々のキット（Pharmacia & Upjohn (Kalamazoo, MI)； Promega (Madison, WI)； U.S. Biochemical Corp., (Cleaveland, OH)）を用いて実施することができる。
検出を容易にするために使用し得る適切なレポーター分子又は標識には、放射性核種、酵素及び蛍光、化学発光又は色素生産性物質、並びに基質、コファクター、阻害剤、磁性粒子などが挙げられる。
【００６７】
本発明の核酸分子は、トランスジェニック動物（特にげっ歯類動物）の作製にも用いることができる。そのようなトランスジェニック動物は、本発明の別のさらなる局面を構成する。そのような作製は、体細胞の改変によって局部的に、又は遺伝性改変を導入する生殖細胞系列療法によって実施することができる。前記のようなトランスジェニック動物は、本発明のポリペプチドのモジュレーターとして有効な薬剤分子のための動物モデルを作製するために特に有用であり得る。
ポリペプチドは、周知の方法によって組換え細胞培養物から回収し精製することができる。前記周知の方法には、硫安又はエタノール沈澱、酸性抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーが含まれる。高性能液体クロマトグラフィーは、精製に特に有用である。単離及び又は精製の間にポリペプチドが変性した場合には、タンパク質のリフォールディングの周知の技術を用いて活性な高次構造を再生することができる。
【００６８】
所望の場合には、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に本発明のポリペプチドをコードする配列を連結させることにより特殊化したベクター構築物も、タンパク質の精製を容易にするために用いることができる。そのような精製促進ドメインの例には、金属キレートペプチド（例えば固定化金属上での精製を可能にするヒスチジン-トリプトファンモジュール、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、及びFLAGS伸長／アフィニティー精製システム（Immunex Corp., Seattle, WA）で用いられるドメイン）が含まれる。切断可能なリンカー配列（例えばXA因子又はエンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego, CA）に特異的なもの）を精製ドメインと本発明のポリペプチドとの間に包含させて、精製を容易にすることに用いてもよい。そのような発現ベクターの１つは、チオレドキシン又はエンテロキナーゼ切断部位に先行するいくつかのヒスチジン残基と融合させた本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質の発現を提供する。ヒスチジン残基は、IMAC（固定金属イオンアフィニティークロマトグラフィー；J. Porath et al.(1992) Prot. Exp. Purif. 3：263-281）により精製を容易にし、一方、チオレドキシン又はエンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質からポリペプチドを精製するための手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターについての考察は以下で提供される：D.J. Kroll et al.(1993; DNA Cell Biol. 12：441-453）。
【００６９】
スクリーニングアッセイで使用するためにポリペプチドを発現させる場合は、前記ポリペプチドを発現する宿主細胞の表面で前記ポリペプチドを生成させることが一般には好ましい。この場合、スクリーニングアッセイで使用する前に、例えば蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）又はイムノアフィニティー技術のような技術を用いて宿主細胞を収穫することができる。ポリペプチドが培養液中に分泌される場合は、前記培養液を回収して発現されたポリペプチドを回収及び精製することができる。ポリペプチドが細胞内で生成される場合、ポリペプチドを回収する前に、先ず初めに細胞を溶解させねばならない。
本発明のポリペプチドを用いて、種々の薬剤スクリーニング技術のいずれかで化合物ライブラリーをスクリーニングすることができる。そのような化合物は、本発明のポリペプチドの遺伝子発現レベル又は活性レベルを活性化させる（アゴニスト作用）か、又は阻害する（アンタゴニスト作用）ことができ、本発明のさらなる局面を形成し得る。好ましい化合物は、本発明の第２又は第３局面のポリペプチドをコードする天然遺伝子の発現を変化させるために有効であるか、又は本発明の第２又は第３局面のポリペプチドの活性を調節するために有効である。
アゴニスト化合物又はアンタゴニスト化合物は、例えば細胞、無細胞調製物、化学物質ライブラリー又は天然産物混合物から単離することができる。これらのアゴニスト又はアンタゴニストは、天然の又は改変された、基質、リガンド、酵素、受容体、構造的模倣物質若しくは機能的模倣物質であってよい。このようなスクリーニング技術の適切な精査のため、以下を参照されたい：Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2)：Chapter 5 (1991)。
【００７０】
良好なアンタゴニストである可能性が高い化合物は、本発明のポリペプチドと結合し、結合しているときに前記ポリペプチドの生物学的作用を誘導しない分子である。強力なアンタゴニストには、本発明のポリペプチドと結合し、それによって本発明のポリペプチドの活性を阻害又は消滅させる小型有機分子、ペプチド、ポリペプチド及び抗体が含まれる。このようなやり方で、前記ポリペプチドと正常な細胞の結合分子との結合が阻害され、その結果前記ポリペプチドの正常な生物学的活性が阻害され得る。
このようなスクリーニング技術で用いられる本発明のポリペプチドは、溶液中で遊離していても、固形支持体に固定されていても、細胞表面上に保持されていても、又は細胞内に位置していてもよい。一般に、このようなスクリーニング手順は、前記のポリペプチドを発現している適切な細胞又は細胞膜を用いることを含み、前記細胞又は細胞膜をテスト化合物と接触させて、結合又は機能的応答の刺激若しくは阻害を観察する。続いて前記テスト化合物と接触させた細胞の機能的応答を、前記テスト化合物と接触させなかったコントロール細胞と比較する。このようなアッセイによって、前記ポリペプチドの活性化によって生じるシグナルをテスト化合物がもたらすか否かを、適切な検出系を用いて評価することができる。活性化の阻害剤は、一般的には既知のアゴニストの存在下でアッセイされ、テスト化合物の存在下でのアゴニストによる活性化の影響が観察される。
【００７１】
本発明のポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト化合物を同定する好ましい方法は、以下の工程を含む：
（ａ）本発明の第２又は第３局面のポリペプチドをその表面に発現している細胞を、前記ポリペプチドとの結合を許容する条件下で被検化合物と接触させる工程であって、前記ポリペプチドは、前記化合物とポリペプチドとの結合に応答して検出可能なシグナルを提供することができる第２成分と結合されており；さらに
（ｂ）前記化合物と前記ポリペプチドとの相互作用によって生じるシグナルのレベルを測定することにより、前記化合物が前記ポリペプチドと結合しこれを活性化するか又は阻害するかを決定する工程。
本発明のポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定するさらに好ましい方法は、以下の工程を含む：
（ａ）前記ポリペプチドをその表面に発現している細胞を、前記ポリペプチドとの結合を許容する条件下で被検化合物と接触させる工程であって、前記ポリペプチドは、前記化合物とポリペプチドとの結合に応答して検出可能なシグナルを提供することができる第２成分と結合されており；さらに
（ｂ）前記化合物と前記ポリペプチドとの相互作用によって生じるシグナルレベルを前記化合物が存在しないときのシグナルレベルと比較することにより、前記化合物が前記ポリペプチドと結合しこれを活性化するか又は阻害するかを決定する工程。
さらに好ましい態様では、上述の一般的な方法が、前記ポリペプチドに対する標識又は非標識リガンドの存在下でアゴニスト又はアンタゴニストの同定を行う工程をさらに含み得る。
【００７２】
本発明のポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法の別の態様は、以下の工程を含む：
本発明のポリペプチドをその表面に有する細胞とリガンド（受容体のような）との結合又は前記ポリペプチドを含む細胞膜とリガンドとの結合の阻害を、前記ポリペプチドとの結合を許容する条件下で候補化合物を存在させて決定する工程、及び前記ポリペプチドに結合したリガンドの量を決定する工程。リガンドの結合の減少をひき起こし得る化合物は、アゴニスト又はアンタゴニストであるとみなされる。好ましくは、前記リガンドが標識されている。
より詳しくは、アンタゴニスト又はアゴニスト化合物をポリペプチドについてスクリーニングする方法は以下の工程を含む：
（ａ）本発明のポリペプチドをその表面に発現している全細胞又は本発明のポリペプチドを含む細胞膜と、標識リガンドとをインキュベートする工程；
（ｂ）前記全細胞又は細胞膜と結合した標識リガンドの量を測定する工程；
（ｃ）工程（ａ）の標識リガンド及び前記全細胞又は細胞膜の混合物に候補化合物を添加し、前記混合物を平衡化させる工程；
（ｄ）前記全細胞又は細胞膜と結合した標識リガンドの量を工程（ｃ）の後で測定する工程；さらに
（ｅ）工程（ｂ）及び工程（ｄ）で結合した標識リガンドの相違を比較する工程であって、それにより工程（ｄ）で結合の減少をひき起こす化合物はアゴニスト又はアンタゴニストであるとみなす前記工程。
【００７３】
本発明のINSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117ポリペプチドは、細胞の成長と分化を調節しうる。従って、器官培養アッセイのような細胞の成長と分化の研究を可能にするシステムで、又はアガロース培養内のコロニーアッセイシステムで、INSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117ポリペプチドの生物学的活性を調べることができる。種々のアッセイで細胞増殖の刺激又は阻害を測定することができる。
例えば、細胞成長阻害を観察するため、固体又は液体培地を使用することができる。固体培地では、形成されるコロニーの大きさを比較することによって、成長阻害を受けている細胞を容易に対象細胞群から選択することができる。液体培地では、培養液の濁度(turbity)又はDNA内の標識チミジンの取込みを測定することによって成長阻害をスクリーニングすることができる。典型的に、新しく合成されたDNA中へのヌクレオシド類似体の取込みを用いて細胞集団内の増殖（すなわち、活発な細胞成長）を測定しうる。例えば、ブロモデオキシウリジン(BrdU)をDNA標識試薬として用い、かつ抗-BrdUマウスモノクロナール抗体を検出試薬として利用することができる。この抗体は、ブロモデオキシウリジンを取り込んだDNAを含有する細胞とだけ結合する。このアッセイとともに、免疫蛍光法、免疫組織化学的方法、ELISA及び比色法を含む多くの検出法を使用することができる。ブロモデオキシウリジン(BrdU)と抗-BrdUマウスモノクロナール抗体を含むキットはBoehringer Mannheim (Indianapolis, IN)から商業的に入手可能である。
【００７４】
細胞分化に及ぼすINSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117ポリペプチドの作用は、幹細胞又は胚細胞を種々の量のINSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117ポリペプチドと接触させ、かつ幹細胞又は胚細胞の分化に及ぼす作用を観察することによって測定することができる。組織特異的抗体及び顕微鏡検査法を用いて、その結果の細胞を同定することができる。
上述したアッセイにおいてINSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117ポリペプチドが用量依存様式で免疫及び／又は神経系細胞の増殖と分化を調節することも分かりうる。従って、INSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117ポリペプチドの“機能的等価物”は、上述したアッセイにおいて、用量依存様式で、活性を調節する同じ成長と分化のいずれかを示すポリペプチドを含む。用量依存的活性の度合いは、INSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117ポリペプチドの度合いと同一である必要はないが、好ましくは、“機能的等価物”は、与えられた活性アッセイにおいて、INSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117ポリペプチドと比べて実質的に同様の用量依存性を示す。
上述のある態様では、単純な結合アッセイを用いてもよく、この場合、テスト化合物のポリペプチド保持表面への付着を、直接的又は間接的にテスト化合物と結合させた標識手段によって検出するか、又は標識競合物質との競合を含むアッセイで検出する。別の態様では、競合薬剤スクリーニングアッセイを用いることができ、この場合、ポリペプチドと特異的に結合しうる中和抗体が、結合についてテスト化合物と競合する。この様式では、前記抗体を用いて、前記ポリペプチドに対し特異的な結合親和性を保有するいずれのテスト化合物の存在も検出することができる。
前記ポリペプチドをコードするmRNAの細胞内産生に及ぼす添加したテスト化合物の作用を検出するアッセイを設計することもできる。例えば、当技術分野で公知の標準的な方法によりモノクローナル又はポリクローナル抗体を用いてポリペプチドの分泌レベル又は細胞結合レベルを測定するELISAを構築することができ、このELISAを用いて、適切に操作した細胞又は組織からのポリペプチド生成を阻害又は増強し得る化合物について検索することができる。次いで、前記ポリペプチドと被検化合物との結合複合体の形成を測定することができる。
【００７５】
使用し得る別の薬剤スクリーニング技術は、対象のポリペプチドに対して適切な結合親和性を有する化合物の高速大量処理スクリーニングを提供する（国際特許出願WO84/03564を参照されたい）。この方法では、多数の異なる小型のテスト化合物を固体基質上で合成し、次に本発明のポリペプチドと反応させて洗浄しうる。ポリペプチドを固定する１つの方法は、非中和抗体を使用することである。そして、当技術分野で周知の方法を用いて、結合したポリペプチドを検出することができる。前述の薬剤スクリーニング技術で使用するため、精製ポリペプチドをプレート上に直接塗布することもできる。
本発明のポリペプチドを用いて、当技術分野で公知の標準的な受容体結合技術により膜結合受容体又は可溶性受容体を同定しうる。前記標準的な技術は、例えばリガンド結合アッセイ及び架橋アッセイであり、そのようなアッセイでは、ポリペプチドが放射性同位体で標識されているか、化学的に改変されているか、又はその検出若しくは精製を容易にするペプチド配列と融合されており、推定上の受容体供給源（例えば細胞の組成物、細胞膜、細胞上清、組織抽出物又は体液）とインキュベートされる。結合の有効性は、生物物理的技術、例えば表面プラズモン共鳴及び分光法を用いて測定することができる。結合アッセイは、受容体の精製及びクローニングのために用いることができるが、ポリペプチドとその受容体との結合と競合する前記ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストを同定するためにも用いることができる。スクリーニングアッセイを実施する標準的方法は、当技術分野ではよく理解されている。
【００７６】
本発明は、上述したアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素を同定するための方法で有用なスクリーニングキットをも包含する。本発明は、上述した方法で発見されたアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質及び酵素、並びに本発明のポリペプチドの活性又は抗原性を調節する他の化合物を包含する。
本発明は、本発明のポリペプチド、核酸、リガンド又は化合物を適切な医薬担体と組合せて含む医薬組成物を提供する。これら組成物は、詳細に後述するように、治療用若しくは診断用試薬として、ワクチンとして、又は他の免疫原性組成物として適切であり得る。
本明細書で使用する用語法により、ポリペプチド、核酸、リガンド又は化合物[Ｘ]を含む組成物は、組成物中のＸ＋Ｙの合計の少なくとも85質量％がＸである場合に不純物（ここではＹ）が“実質的にない”。好ましくは、Ｘが組成物中のＸ＋Ｙの合計の少なくとも約90質量％、より好ましくは少なくとも約95質量％、98質量％又は99質量％を構成する。
【００７７】
本医薬組成物は、好ましくは治療的に有効な量の本発明のポリペプチド、核酸分子、リガンド、又は化合物を含むべきである。本明細書で用いられる“治療的に有効な量”という用語は、標的疾患又は症状を治療、緩和若しくは予防するために、又は検出可能な治療効果若しくは予防効果を示すために必要な治療薬剤の量を指す。いずれの化合物についても、治療的に有効な用量は、最初に細胞培養アッセイ（例えば新生物細胞培養アッセイ）又は動物モデル（通常はマウス、ウサギ、イヌ又はブタ）のどちらかで見積もることができる。動物モデルは、適切な濃度範囲及び投与経路の決定にも用いることができる。次にそのような情報を用いて、ヒトで有用な投与用量及び投与経路を決定することができる。
ヒト対象者に対する正確な有効量は、疾患状態の重篤度、対象者の全身の健康状態、対象者の年齢、体重及び性別、食事、投与時間及び投与回数、併用薬剤、反応感受性及び治療に対する許容性／応答性によって決まるだろう。この量は、日常的検査により決定することができ、それは臨床医の判断の範囲内である。一般には、有効用量は、0.01mg/kgから50mg/kg、好ましくは0.05mg/kgから10mg/kgであろう。本組成物は、患者に個別に投与してもよく、又は他の薬剤、医薬品又はホルモンと一緒に投与してもよい。
【００７８】
医薬組成物は、治療薬の投与のために医薬的に許容できる担体を含むこともできる。そのような担体には、抗体及び他のポリペプチド、遺伝子並びに他の治療薬剤（例えばリポソーム）が含まれるが、ただし担体がそれ自体で前記組成物を受ける個体に有害な抗体の産生を誘導せず、かつ不都合な毒性をもたらすことなく投与しうることを条件とする。適切な担体は、大型でゆっくりと代謝される巨大分子、例えばタンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー及び不活性ウイルス粒子であり得る。
医薬組成物に、医薬的に許容できる塩、例えば鉱酸塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などのような）；及び有機酸の塩（酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような）を用いることができる。医薬的に許容できる担体についての綿密な考察は以下のテキストで入手可能である：Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)。
治療用組成物中の医薬的に許容できる担体は、さらに液体、例えば水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールを含むことができる。さらに、湿潤剤、乳化剤、pH緩衝物質などのような助剤が、前記組成物中に存在していてもよい。そのような担体は、患者が摂取できるように、前記医薬組成物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして製剤化することを可能にする。
【００７９】
いったん製剤化したら、本発明の組成物を直接対象者に投与することができる。治療される対象者は動物で、特にヒト対象者を治療することができる。
この発明で用いられる医薬組成物は、多数の経路（経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜下腔内、心室内、経皮的アプリケーション（例えばWO98/20734を参照）、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所、舌下、膣内又は直腸的手段が挙げられるが、ただしこれらに限定されない）によって投与できる。遺伝子銃又はハイポスプレーもまた、本発明の医薬組成物の投与に用いることができる。典型的には、本治療用組成物は、注射用物質（液体溶液又は懸濁液のいずれか）として調製できる。注射に先立ち液体ビヒクルで溶液又は懸濁液とするのに適する固体を調製することもできる。
本組成物の直接送達は、一般に、皮下、腹腔内、静脈内又は筋肉内注射することによって達成され、或いは組織の間隙腔に送達されるであろう。前記組成物はまた、病巣に投与してもよい。投薬治療は、単回投与スケジュールでも複数回投与スケジュールでもよい。
本発明のポリペプチドの活性が特定の疾患状態において過剰である場合には、いくつかのアプローチが利用可能である。あるアプローチは、医薬的に許容できる担体とともに上記のような阻害化合物（アンタゴニスト）を、前記ポリペプチドの機能を阻害するのに有効な量で対象者に投与することを含む。前記ポリペプチドの機能の阻害は、例えばリガンド、基質、酵素、受容体の結合を遮断することによって、又は第二のシグナルを阻害することによって成され、それによって異常な症状が緩和される。好ましくは、前記アンタゴニストが抗体である。最も好ましくは、前述したように、そのような抗体が、その免疫原性を最少にするキメラ抗体及び／又はヒト化抗体である。
【００８０】
別のアプローチでは、問題のリガンド、基質、酵素、受容体に対する結合親和性を保持する該ポリペプチドの可溶形態を投与することができる。典型的には、前記ポリペプチドは、関連部分を保持するフラグメントの形態で投与することができる。
また別のアプローチでは、前記ポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、内部で生成される又は別々に投与されるアンチセンス核酸分子（上述したような）の使用といった発現遮断技術を用いて阻害することができる。遺伝子発現の改変は、ポリペプチドをコードする遺伝子の制御領域、5’領域又は調節領域（シグナル配列、プロモーター、エンハンサー及びイントロン）に対して相補的な配列又はアンチセンス分子（DNA、RNA又はPNA）を設計することによって達成できる。同様に、阻害は“三重らせん”塩基対方法論を用いて達成することができる。三重らせん対形成は、ポリメラーゼ、転写因子又は調節分子の結合のために二重らせんが充分に開く能力を阻害することから有用である。三重らせんDNAを用いる近年の治療上の進歩は文献に記載されている（J.E. Gee et al.(1994) In：B.E. Huber & B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY）。相補的配列又はアンチセンス分子を設計し、転写物がリボソームと結合するのを妨げてmRNAの翻訳を遮断することもできる。そのようなオリゴヌクレオチドを投与してもよく、又は該オリゴヌクレオチドはin vivo発現によりin situ生成しうる。
【００８１】
さらに、本発明のポリペプチドの発現は、そのコードmRNA配列に特異的なリボザイムを用いることによって妨げることができる。リボザイムは、天然又は合成であり得る触媒的活性型のRNAである（例えば以下を参照されたい：N. Usman et al., Curr. Opin. Struct. Biol.(1996) 6(4)：527−533）。合成リボザイムを設計して、選択した位置でmRNAを特異的に切断し、それによってmRNAの機能的ポリペプチドへの翻訳を妨げることができる。リボザイムは、通常RNA分子で見出されるような、天然のリボースリン酸骨格及び天然の塩基を用いて合成され得る。或いは、リボザイムは、非天然の骨格（例えば2’-O-メチルRNA）を用いて合成されて、リボヌクレアーゼ分解から保護されてもよく、また改変塩基を含んでいてもよい。
RNA分子は、細胞内安定性及び半減期を増加させるように改変されてもよい。可能な改変には、RNA分子の5’及び／又は3’末端へのフランキング配列の付加、又は分子の骨格内でホスホジエステル結合に代わるホスホロチオエート若しくは2’-O-メチルの使用が含まれるが、ただしこれらに限られない。この概念は、PNAの生成にも受け継がれ、内因性エンドヌクレアーゼによって同様に容易には認識されないイノシン、ケオシン(gueosine)及びブトシン(butosine)のような非慣用塩基、並びにアセチル-、メチル-、チオ-及び同様な改変形態のアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンの包含によってPNA分子の全てに広げられ得る。
【００８２】
本発明のポリペプチド及びその活性の過小発現に関連する異常な状態を治療するためには、いくつかのアプローチも利用可能である。あるアプローチは、前記ポリペプチドを活性化する化合物（すなわち上述したようなアゴニスト）の治療的に有効な量を対象者に投与し、異常な状態を緩和することを含む。あるいは、本ポリペプチドの治療量を適切な医薬担体と組合せて投与し、関連性のあるポリペプチド生理学的バランスを回復させることができる。
遺伝子治療を用い、対象者の関連細胞によって本ポリペプチドの内因性産生を行わせることができる。遺伝子治療は、欠陥のある遺伝子を、修正した治療用遺伝子と置き換えることによって、前記ポリペプチドの不適切な生成を永久的に治療することに用いられる。
本発明の遺伝子治療は、in vivo又はex vivoで実施することができる。ex vivo遺伝子治療は、患者の細胞の単離と精製、治療用遺伝子の導入、及び遺伝的に改変した細胞を患者に戻して導入することを必要とする。対照的に、in vivo遺伝子治療は、患者の細胞の単離と精製を必要としない。
【００８３】
治療用遺伝子は、患者に投与するために、典型的には“パッケージング”されている。遺伝子デリバリービヒクルは、リポソームのような非ウイルス性、又は、例えばK.L. Berkner (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158：39−66に記載されているアデノウイルスのような複製欠損ウイルス若しくはN. Muzyczka (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158：97−129及び米国特許第5,252,479号に記載されているアデノ付随ウイルス（AAV）ベクターであり得る。例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子は、複製欠損レトロウイルスベクターで発現させるために操作することができる。次に、この発現構築物を単離し、前記ポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入したパッケージ細胞に導入し得る。その結果、前記パッケージ細胞は、対象の遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を産生しうるようになる。これらのプロデューサー細胞は、細胞をin vivo操作するため及びポリペプチドをin vivo発現させるために、対象者に投与することができる（以下を参照されたい：Gene Therapy and Other Molecular Genetic−based Therapeutic Approaches, Chapter 20（及びその中で引用された文献）, “Human Molecular Genetics” (1996) T. Strachan & A.P. Read, BIOS Scientific Publishers Ltd.）。
【００８４】
別のアプローチは“裸のDNA”の投与であり、この場合、治療用遺伝子が血流又は筋肉組織内に直接注射される。
本発明のポリペプチド又は核酸分子が疾患をひき起こす原因物質である場合には、本発明は、前記疾患をひき起こす原因物質に対する抗体を生成するワクチンとして用いることができる前記ポリペプチド又は核酸分子を提供する。
本発明のワクチンは、予防的（すなわち、感染を防ぐ）であっても治療的（すなわち、感染後の疾患を治療する）であってもよい。そのようなワクチンは、免疫性を付与する抗原、免疫原、ポリペプチド、タンパク質又は核酸を、通常は上述した医薬的に許容できる担体と組合せて含む。前記担体には、組成物を投与される個体に対して有害な抗体の産生をそれ自体で誘導しない担体のいずれもが含まれる。さらに、これらの担体は免疫刺激剤（“アジュバント”）として機能してもよい。さらにまた、前記抗原又は免疫原は、細菌の類毒素（例えばジフテリア、破傷風、コレラ、H.ピロリ菌（pyroli）由来の類毒素）及び他の病原体と結合されてもよい。
ポリペプチドは胃で分解されるので、ポリペプチドを含むワクチンは、好ましくは非経口的に（例えば皮下、筋肉内、静脈内又は皮内注射）投与される。非経口投与に適した製剤として、水性及び非水性の無菌注射溶液、並びに水性及び非水性の無菌懸濁液が挙げられる。前記無菌注射溶液は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤をレシピエントの血液に対して等張にする溶質を含んでいてもよく、前記無菌懸濁液は、懸濁剤又は増粘剤を含んでもよい。
【００８５】
本発明のワクチン製剤は、単位用量又は複数単位用量の容器で提供されてもよい。例えば、密封されたアンプル及びバイアルでの提供は、使用直前に無菌液状担体を添加することのみを必要とする凍結乾燥状態で保存することができる。投与量はワクチンの比活性に依存し、日常的な検査によって容易に決定することができる。
本発明のポリペプチドに結合する抗体の遺伝子デリバリーは、例えば国際特許出願WO98/55607に記載されているように行われてもよい。
ジェット式注射(jet injection)と呼ばれている技術（例えば、www.powderject.comを参照）が、ワクチン組成物の処方に有用であり得る。
ワクチン接種及びワクチンデリバリーシステムに適切な多数の方法が、国際特許出願WO 00/29428に記載されている。
【００８６】
本発明はまた、診断薬としての本発明の核酸分子の使用に関する。本発明の核酸分子により特徴付けられ、機能不全に付随する遺伝子の変異型の検出は、前記遺伝子の過小発現、過剰発現又は位置的若しくは時間的発現の変化から生じる疾患の診断、又はそのような疾患に対する感受性の診断を規定するか又はそれら診断に付け加えることができる診断ツールを提供する。前記遺伝子に変異を保有する個体は、種々の技術によってDNAレベルで検出することができる。
診断のための核酸分子は、対象者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織生検又は剖検材料から入手できる。ゲノムDNAを直接検出に用いてもよいし、又はPCR、リガーゼ連鎖反応（LCR）、鎖置換増幅（SDA）若しくは他の増幅技術を分析に先立って用いることによって、ゲノムDNAを酵素的に増幅してもよい（以下の文献を参照されたい：Saiki et al., Nature 324：163−166(1986)； Bej et al., Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol., 26：301−334(1991)； Birkenmeyer et al., J. Virol. Meth., 35：117−126(1991)； Van Brunt, J., Bio/Technology, 8：291−294(1990)）。
【００８７】
ある態様では、本発明のこの局面は、本発明のポリペプチドをコードする天然遺伝子の発現レベルを評価すること、及び前記発現レベルをコントロールのレベルと比較することを含む、患者における疾患を診断する方法を提供する。この場合、前記コントロールレベルと異なるレベルは疾患を示唆する。前記方法は、以下の工程を含み得る：
ａ）本発明の核酸分子と核酸プローブとの間でハイブリッド複合体の形成を可能にするストリンジェントな条件下で、患者由来の組織サンプルを前記核酸プローブと接触させる工程；
ｂ）工程ａ）で用いた条件と同じ条件下で、コントロールサンプルを前記プローブと接触させる工程；及び、
ｃ）前記サンプル中のハイブリッド複合体の存在を検出する工程；
この場合、コントロールサンプル中のハイブリッド複合体レベルと異なるハイブリッド複合体レベルが患者サンプルで検出されることは、疾患を示唆する。
本発明のさらなる局面は、以下の工程を含む診断方法を含む：
ａ）疾患について検査される患者から、組織サンプルを入手する工程；
ｂ）前記組織サンプルから、本発明の核酸分子を単離する工程；及び、
ｃ）疾患に付随する前記核酸分子における変異の存在を検出することによって、患者を疾患について診断する工程。
【００８８】
上記方法における核酸分子の検出を補助するため、増幅工程、例えばPCRの使用を含み得る。
正常な遺伝子型と比較して、増幅産物におけるサイズの変化によって、欠失及び挿入を検出することができる。点変異は、増幅DNAを本発明の標識RNAとハイブリダイズさせるか、或いは本発明の標識アンチセンスDNA配列とハイブリダイズさせることによって同定することができる。完全にマッチングした配列は、RNase消化によって、又は溶融温度における差異を評価することによって、ミスマッチを有する二重鎖と区別することができる。DNAを、ストリンジェントな条件下で前記DNAとハイブリダイズする核酸プローブと接触させてハイブリッド二本鎖分子を形成させること（前記ハイブリッド二本鎖は、疾患に付随する変異に対応するいずれかの部分で前記核酸プローブ鎖のハイブリダイズしていない部分を有する）、及び、前記プローブ鎖のハイブリダイズしていない部分の有無を前記DNA鎖の対応部分における疾患付随変異の有無を示すものとして検出することによって、患者における変異の有無を検出することができる。
このような診断は特に出生前検査で有用であり、新生児検査でもなお有用である。
【００８９】
参照遺伝子と“変異”遺伝子との間の点変異及び他の配列的相違は、他の周知の技術、例えば直接DNAシークエンシング又は一本鎖構造多型性（Orita et al., Genomics, 5：874−879(1989)）によって同定できる。例えば、シークエンシングプライマーは二本鎖PCR産物又は改変PCRによって作製された一本鎖テンプレート分子とともに用いることができる。配列決定は、放射能標識ヌクレオチドを用いる通常の方法によって、又は蛍光タグを用いる自動シークエンシング法によって実施される。クローン化DNAセグメントを、特異的DNAセグメントを検出するためのプローブとして用いることもできる。この方法の感受性は、PCRと併用したとき極めて増強される。さらに、点変異及び他の配列の変動（例えば多型性）は、例えば対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドをただ１つのヌクレオチドが異なる配列のPCR増幅に用いることによって、上記のように検出することができる。
DNA配列の相違はまた、変性剤の存在下又は非存在下でのゲル内のDNAフラグメントの電気泳動移動度における変化によって、又は直接DNAシークエンシング（例えば、Myers et al., Science (1985) 230：1242）によっても検出することができる。特定の位置における配列の変化はまた、RNase及びS1保護のようなヌクレアーゼ保護アッセイによって、又は化学的切断法（Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 85：4397-4401を参照）によっても明らかにすることができる。
【００９０】
ミクロ欠失、異数性、転座、逆位のような変異は、通常のゲル電気泳動及びDNAシークエンシングに加え、in situ分析によっても検出できる（例えば以下を参照されたい：Keller et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, New York, N.Y., USA(1993)）。
すなわち、細胞内のDNA又はRNA配列は、それらを単離及び／又はメンブレン上に固定する必要なしに、変異について分析することができる。蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）は、現在のところ最も一般的に用いられている方法で、FISHに関する多数の概論が存在する（例えば以下を参照されたい：Trachuck et al., Science, 250, 559-562(1990)；及びTrask et al., Trends, Genet., 7, 149-154(1991)）。
本発明の別の態様では、本発明の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築して、遺伝的変種、変異及び多型性の効率的スクリーニングを実施することができる。アレイ技術方法はよく知られていて一般的な応用性を有しており、遺伝子発現、遺伝連鎖及び遺伝的可変性を含む分子遺伝学における種々の疑問に取り組むのに用いることができる（例えば以下を参照されたい：M. Chee et al., Science (1996) , Vol 274, pp610-613）。
【００９１】
ある態様では、以下の文献に記載されている方法に従ってアレイを調製かつ使用する（PCT出願WO95/11995（Chee et al.）；D.J. Lockhart et al.(1996) Nat. Biotech. 14：1675−1680；M. Schena et al.(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93：10614−10619）。オリゴヌクレオチド対は、２から100万個を超える範囲にわたり得る。前記オリゴマーは、光誘導化学法を用いて基板上の指定領域で合成される。基板は、紙、ナイロン又は他の種類のメンブレン、フィルター、チップ、ガラススライド若しくは他の適切な固形支持体のいずれであってもよい。別の局面では、オリゴヌクレオチドは、PCT特許出願WO95/25116（Baldeschweiler et al.）に記載されているように、化学的結合方法及びインクジェット適用装置を用いることによって基板表面上で合成することができる。別の局面では、ドット（又はスロット）ブロットに類似する“格子化（gridded）”アレイを、真空系、熱結合方法、ＵＶ結合方法、機械的又は化学的結合方法を用いて基板表面にcDNAフラグメント又はオリゴヌクレオチドを配置すること及び連結させることに使用し得る。上述したようなアレイは、手動で、又は利用可能な装置（スロットブロット又はドットブロット装置）、材料（適切な固形支持体すべて）及び機械（ロボット機器を含む）を用いて作製することができ、8、24、96、384、1536又は6144個のオリゴヌクレオチド、又は２から100万個を超える範囲の他のいずれの数をも含むことができる（このことは、アレイ自体を商業的に入手可能な計測器の有効利用に向くものとしている）。
【００９２】
上記で考察した方法に加え、対象者に由来するサンプルから、ポリペプチド又はmRNAの異常な増加又は低下のレベルを決定することを含む方法によって、疾患を診断することができる。発現低下又は発現増加は、例えば、核酸増幅、一例を挙げるとPCR、RT-PCR、RNase保護、ノーザンブロット法及び他のハイブリダイゼーション方法のようなポリヌクレオチドの定量のために当技術分野で周知の方法のいずれかを用いて、RNAレベルで測定することができる。
宿主に由来するサンプルで本発明のポリペプチドレベルを決定することに使用しうるアッセイ技術は当業者によく知られており、また上記でいくらか詳細に考察されている（ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析及びELISAアッセイを含む）。本発明のこの局面では、以下の工程を含む診断方法が提供される：（ａ）上記のようなリガンドを、リガンド-ポリペプチド複合体の形成に適する条件下で、生物学的サンプルと接触させる工程；及び（ｂ）前記複合体を検出する工程。
ELISA、RIA及びFACSのようなポリペプチドレベルを測定するためのプロトコルは、ポリペプチド発現の変化レベル又は異常レベルを診断するための基礎をさらに提供することができる。ポリペプチド発現の正常値又は標準値は、正常な哺乳類対象体（好ましくはヒト）から得られた体液又は細胞抽出物を、複合体形成に適した条件下で、前記ポリペプチドに対する抗体と混合することによって確立される。標準的な複合体形成量は、種々の方法、例えば分光測定法によって定量することができる。
【００９３】
本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体は、前記ポリペプチドの発現によって特徴付けられる症状又は疾患の診断のために、又は本発明のポリペプチド、核酸分子、リガンド及び他の化合物を用いて治療されている患者をモニターするアッセイにおいて用いることができる。診断目的に有用な抗体は、治療薬として上述したのと同じ様式で調製することができる。前記ポリペプチドについての診断アッセイは、前記抗体及び標識を用いてヒトの体液又は細胞若しくは組織の抽出物中のポリペプチドを検出する方法を含む。前記抗体は改変して、又は改変せずに用いることができ、さらにそれらをレポーター分子と共有結合又は非共有結合によって結合させることによって標識することができる。当技術分野で公知の多種多様なレポーター分子を用いることができ、それらのいくつかは上述されている。
生検組織由来の、対象者、コントロール及び疾患サンプルで発現されているポリペプチドの量を標準値と比較する。標準値と対象者の値との間の偏差は疾患診断のためのパラメーターを確立する。診断アッセイを用いて、ポリペプチド発現の有無及び過剰を識別し、治療上の処置の間のポリペプチドレベルの調節をモニターすることができる。そのようなアッセイはまた、動物実験、臨床試験又は個々の患者の治療モニタリングにおける特定の治療上の処置方法の有効性を評価することに用いることができる。
【００９４】
本発明の診断キットは、以下を含み得る：
（ａ）本発明の核酸分子；
（ｂ）本発明のポリペプチド；又は
（ｃ）本発明のリガンド。
本発明のある局面では、診断キットが、ストリンジェントな条件下で本発明の核酸分子とハイブリダイズする核酸プローブを含む第１容器；前記核酸分子を増幅させるために有用なプライマーを含む第２容器；及び、疾患の診断を容易にするための前記プローブ及びプライマーの使用説明書を含み得る。前記キットは、ハイブリダイズしていないRNAを消化するための薬剤を保持している第３容器をさらに含みうる。
本発明の別の局面では、診断キットが核酸分子のアレイを含んでもよく、前記核酸分子の少なくとも１つが本発明の核酸分子であってもよい。
本発明のポリペプチドを検出するために、診断キットは、本発明のポリペプチドと結合する１又は２以上の抗体；及び、前記抗体と前記ポリペプチドとの間の結合反応の検出に有用な試薬；を含み得る。
【００９５】
そのようなキットは、EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーが関係している疾患又は疾患に対する感受性の診断に役立つであろう。そのような疾患には、新生物、メラノーマ、肺腫瘍、結腸直腸腫瘍、乳房腫瘍、膵臓腫瘍、頭頚部腫瘍及び他の固形腫瘍を含む細胞増殖性疾患；白血病、非ホジキンリンパ腫、白血球減少症、血小板減少症、脈管形成障害、カポジ肉腫のような骨髄増殖性疾患；アレルギー、炎症性腸疾患、関節炎、乾癬及び呼吸器管炎症、喘息、及び臓器移植拒絶反応を含む自己免疫／炎症性疾患；高血圧症、浮腫、狭心症、アテローム性動脈硬化症、血栓症、敗血症、ショック、再潅流傷害、及び虚血症を含む心臓血管障害；中枢神経系疾患、アルツハイマー病、脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、及び疼痛を含む神経障害；発達障害；糖尿病、骨粗しょう症、及び肥満症を含む代謝障害；AIDS及び腎疾患；ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症及び寄生虫感染症を含む感染症及び他の病的状態が挙げられる。好ましくは、これら疾患はリンパ球抗原が関係している。このようなキットは、不妊症を含む生殖障害の検出のためも使用することができる。
【００９６】
以下、本発明の種々の局面及び態様について、特にINSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117ポリペプチドに関連する実施例によってさらに詳述する。
本発明の範囲を逸脱することなく細部の改変を為しうることは、理解されるだろう。
【実施例】
【００９７】
〔実施例１−SECFAM1ファミリーメンバーの選択及びアラインメント〕
INSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117は公的に入手可能なアノテーションを持たず、シグナルペプチドの形態の分泌タンパク質の強いしるしを含み、かつ他の動物種由来のオーソログによって支持されている同様のタンパク質とクラスタリングされ得る。
さらなる検討が、５個のヒト遺伝子(INSP113〜INSP117)と、哺乳類及び魚類のオーソログを有し、全部で15個の配列から成るこれまで特徴付けされていないタンパク質のファミリーの構築を可能にした。これら配列は、ClustalWツール(Thompson, J.D., Higgins, D.G., Gibson T.J. Nucleic Acids Res 1994 Nov 11;22(22):4673-80)を用いてアラインメントした(図１)。このアラインメントから、配列の類似性と差異を明らかにすることができる。
SignalPプログラム(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)を用いて潜在的シグナルペプチド領域と、INSP113〜117ポリペプチドの切断部位を同定した。INSP113(配列番号２)のSignalP結果は、その切断部位が配列番号２の位置25と26の間に最もあり得ることを示す(図２)。INSP114(配列番号６)のSignalP結果は、その切断部位が配列番号６の位置30と31の間に最もあり得ることを示す(図３)。INSP115(配列番号10)のSignalP結果は、その切断部位が配列番号10の位置42と43の間に最もあり得ることを示す(図４)。INSP116のSignalP結果は、その切断部位が配列番号14の位置34と35の間に最もあり得ることを示す(図５)。INSP117(配列番号26)のSignalP結果は、その切断部位が配列番号26の位置30と31の間に最もあり得ることを示す。
シグナルペプチド領域は、高度な類似性を示すポリペプチドの残りの部分と比較して、より可変性であることが分かった。全体的に、ヒト配列内では、保存された残基の強いプロフィールを維持しながら、同一性は49％に低下することが観察された(図１)。関連配列のこのクラスターを“SECFAM1ファミリー”と称する。
【００９８】
〔実施例２−INSP115〕
“ゲノムスレッダー(Genome Threader)”と称する独自のバイオインファマティクスプログラムを用いたAAY53016(INSP115)についてのクエリーでは何の結果も得られなかった。しかし、AAY53016(INSP115)のホモサピエンスパラログは同定されており、本明細書ではCAD38865.1(INSP114)と呼ぶ。CAD38865.1(INSP114)の残基42〜130は、SECFAM1ファミリーに対するINSP115のBLASTPクエリーで、AAY53016(INSP115)の残基43〜132と51％の配列同一性と同定される(図11)。CAD38865.1(INSP114)の残基42〜130は、EGF様ドメインの構造を採択すると予測される領域(残基67〜121)を含む。AAY53016(INSP115)が、EGF様ドメインの構造を採択すると予測されるCAD38865.1(INSP114)の領域と共有するという高い配列同一性に基づき、AAY53016(INSP115)もEGF様ドメインの構造を採択すると予測する。Chothia及びLesk, 1986 (EMBO Journal vol.5 pp823)は、まず50％を超える配列同一性を有するタンパク質は、構成している残基の85％が同一の高次構造を採択することを示した。他のグループ(Sander, C. and Schneider, R. (1991) Proteins vol.9 pp56; Hubbard, T.J.P. and Blundell, T.L. (1987) Protein Engineering vol.1 pp159; Flores, T.P., Orengo, C.A., Moss, D.M. and Thornton, J.M. (1993) Protein Science vol.2 pp1811; and Hilbert, M., Bohm, G. and Jaenicke, R. (1993) Proteins vol.17 pp138)は、実質的にこの研究を拡張し、配列同一性が30％と低い場合さえフォールドは同じ状態のままであることを示した。
【００９９】
〔実施例３−INSP117遺伝子モデルの証拠の支持〕
INSP117遺伝子モデル予測をEST(BM94096)で検証した。このESTは、100％の同一性でINSP117の残基7〜120(全部では134)をカバーする３つのスプライシングエクソンに及んだ。このESTをヒトゲノムのBuild31のchr1:112149567-112151424(＋鎖)にマッピングした。さらに、その翻訳された遺伝子モデルは他のSECFAM1ファミリーメンバーと非常に強く整列する(図１参照)。
【０１００】
〔実施例４−SECFAM1タンパク質内にEGFドメインが存在することの証拠〕
BLAST、CDD、インタープロ(InterPro)スキャン又はインファーマティカドメインプロフェッサー(Inpharmatica Domain Professor)のような配列プロファイル又はドメインプロファイルをベースとするアプローチを用いては、SECFAM1ファミリーのタンパク質を分泌タンパク質として特徴づけすること以上には、該タンパク質ファミリーのアノテーションを定めることはできなかった。配列レベルで全く遠い関係の配列間で構造上のフォールドが維持されることを考慮して、独自のインファーマティカ=ゲノムスレッダープログラムを用いて既知の構造に対する構造上の関係を探した。
15個の各ファミリー配列によるゲノムスレッダークエリーの結果は、構造が戻る(beingreturned)傾向を明らかにした。1WHE、2PF2、2SPT及び1URKは全て、SECFAM1配列クエリーの間に複数の機会でヒットした。さらに、それらは、クエリー配列の同じ領域と一致して、構造の同じ領域にわたって折りたたまれた（ファミリーアラインメントで決定されたように）。データセットのいずれか１つのフォールド予測の割合確実性を70％台又は80％台に置くと、これらエントリーは通常最も有意な結果を構成した(ヒト配列結果については図７〜10(INSP115はいずれの結果も返答しなかった))。単独で解釈すると、これらヒットの有意性は何らかの決定的結論を引き出すには低すぎたかもしれない。しかし、いくつかの配列は配列同一性でかなり有意に外れる配列(例えば、INSP113とINSP114の間では68％のID)の全体にわたってこれらの同一構造が一貫してヒットされるという事実は、非常に強固な関係を与える。全ての場合に、ファミリー配列が折りたたまれる該構造の領域は、EGF様ドメインに関連していた。
アラインメントの結果から、４つの一貫して保存されるシステインがあることが分かった(例えば、図12参照)。これらシステイン残基は、SECFAM1ファミリーアラインメントの位置106、111、117及び128に相当する(図１参照)。さらに、これら保存残基は既知構造内のジスルフィドブリッジの形成に関与する。
図８は、SECFAM1ファミリーの残基頻度のプロファイルを示す。これは、このファミリーのユニークな特色を表す。新規配列INSP117をテンプレートとして用いてこのプロファイルを構築し、前記テンプレートから、アラインメント内においてINSP117の個々の残基によって占有される各位置でいずれか１つのアミノ酸残基が見つかる可能性を計算した。次にこれら計算結果を、INSP117の残基で区切ったアラインメントの各位置における20個の各アミノ酸残基の確率スコアの表として示した。
【０１０１】
〔実施例５−組織分布〕
３以上のエクソンにわたってスプライスすることが分かった発現配列タグ(Expressed sequence tag(EST))は、５つ全ての配列を支持した。各ESTマッチングの情報を下表１に示す。この情報は、中枢神経系の組織内でのINSP113〜117遺伝子発現のアップレギュレーションを示した。
【０１０２】
【表１】
2007527203.tif 000002
【０１０３】
〔実施例６−SECFAM1ファミリープロファイル〕
図13は、SECFAM1ファミリーの位置特異的スコアマトリックス、すなわちプロファイルを示す。これはこのファミリーのユニークな特色を表す。まず配列の複数のアラインメントを作り出すことによってプロファイルを生成した。このINSP117の場合、テンプレート配列を選択し、それに基づいてプロファイルを構築した。ファミリーアラインメント内の各位置における各アミノ酸残基タイプのスコアを、BLOSUM62位置依存性バックグラウンドマトリックス(Henikoff & Henikoff, 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-9)を基に、頻度スコアと、その残基タイプでの優性残基の置換がみとめられる可能性とに基づいて計算した。このマトリックスはファミリーアラインメントブロックの大きいデータベース(BLOcks SUbstitution Matrix)に基づき、このデータベースではアミノ酸置換頻度を62％以上の同一性でクラスタリングしているアラインメントに基づいて評価した。この場合、これら因子をプールして、SECFAM1アラインメント内の各位置における各アミノ酸タイプの対数ベースのスコアを与えた。最高の正のスコアは、当該位置で最も見出される可能性のある当該アミノ酸を示す。このプロファイルを用いてクエリー配列のアラインメントスコアを見出すことができる。各位置において、当該アミノ酸に対応する値が抽出され、該クエリー配列の各アミノ酸の該スコア全ての合計が当該配列のアラインメントスコアを構成する。この値が特定のしきい値を超える場合、そのクエリー配列はこのファミリーに有意に関連しうる。従って、このプロファイルはファミリーの高感度な統計的基準を形成する。
【０１０４】
〔実施例７−INSP113のクローニング〕
〔7.1  ヒトcDNAテンプレートの調製〕
製造業者のプロトコルに従い、Superscript II RNase H-逆転写酵素(Invitrogen)を用いて種々の正常なヒト組織全RNAサンプルから第１鎖cDNAを調製した。オリゴ(dT)15プライマー(1μl、500μg/mlで)(Promega)、2μgのヒト全RNA、1μlの10mM dNTPミックス(dATP、dGTP、dCTP及びdTTPそれぞれ10mM、中性pHで)と無菌蒸留水で最終体積12μlを、65℃で５分間加熱してから氷上で冷却した1.5mlのエッペンドルフ管内で混ぜ合わせた。内容物を簡単な遠心分離で収集し、4μlの5×第１鎖緩衝液(First-Strand Buffer)、2μlの0.1M DTT、及び1μlのRnaseOUT組換えリボヌクレアーゼインヒビター(40ユニット/μl,Invitrogen)を加えた。管の内容物を穏やかに混合し、42℃で2分間インキュベートし；次に1μl(200ユニット)のSuperscript II酵素を添加し、ピペット操作で穏やかに混ぜた。混合物を42℃で50分間インキュベートしてから70℃で15分間加熱して不活化した。該cDNAに相補的なRNAを除去するため1μl(2ユニット)の大腸菌RNase H(Invitrogen)を加え、反応混合物を37℃で20分間インキュベートした。最後の21μlの反応混合物に179μlの無菌水を添加して希釈し、総体積200μlを得た。INSP113の増幅用テンプレートとして用いたヒトcDNAサンプルは大腸、脳及び腎臓から誘導した。
〔7.2  cDNAライブラリー〕
ヒトcDNAライブラリー(バクテリオファージラムダ(λ)ベクター)をClontechから購入し、或いはλGT10ベクターでインハウス調製した。バクテリオファージλDNAは、Wizard Lambda Preps DNA精製システム(Promega, Corporation, Madison WI)を用い、製造業者の説明書に従って感染大腸菌宿主株の小規模培養から調製した。INSP113の増幅用テンプレートとして用いたヒトcDNAライブラリーサンプルは成人の大脳皮質、胎児の脳及び胎児の腎臓から誘導した。
〔7.3  PCR用の遺伝子特異的クローニングプライマー〕
プライマーデザイナーソフトウェア(Primer Designer Software)(Scientific & Educational Software, PO Box 72045, Durham, NC 27722-2045, USA)を用いて仮想のcDNAの完全コード配列を増幅するための18〜25塩基の長さを有する１対のPCRプライマーを設計した。55±10℃に近いＴmと40〜60％のGC含量を有するようにPCRプライマーを最適化した。ほとんど又は全く特異的プライミングのない標的配列(INSP113)に対して高い選択性を有するプライマーを選んだ。
〔7.4  種々のヒトcDNAテンプレート及びファージライブラリーcDNAからのINSP113のPCR増幅〕
遺伝子特異的クローニングプライマー(INSP113-CP1及びINSP113-CP2、図15〜17及び表２)を設計して、INSP113予測の全399bpコード配列をカバーする420bpのcDNAフラグメントを増幅した。INSP113予測による公共EST配列データベースの質問は、該配列が成人と胎児の脳、成人と胎児の腎臓、及び大腸cDNAテンプレート内で発現されうることを示唆した。そこで、PCRテンプレートとしてセクション7.1で列挙したヒトcDNAサンプル及びセクション7.2で列挙したファージライブラリーcDNAサンプルと共に遺伝子特異的クローニングプライマーINSP113-CP1及びINSP113-CP2を使用した。1×AmpliTaqTM緩衝液、200μMのdNTPs、50pmolesの各クローニングプライマー、2.5ユニットのAmpliTaqTM(Perkin Elmer)及び100ngのヒトcDNAテンプレートを含有する最終体積50μlで、MJ Research DNA Engineを用い、以下のようにプログラムしてPCRを行った：94℃で2分；40サイクル（94℃で1分、51℃で1分、及び72℃で1分）；次いで72℃で7分を1サイクル及び4℃で保持サイクル。
全ての50μlの各増幅産物を1×TAE緩衝液(Invitrogen)中0.8％アガロースゲル上で可視化した。単一のPCR産物では、成人の脳の第１鎖cDNAテンプレートに対応するサンプル内のほぼ予測分子集団で移動することが分かった。第２PCR産物では、胎児の脳のcDNAライブラリーテンプレートに対応するサンプル内の約500bpで移動することが分かった。Wizard PCR Preps DNA精製システム(Promega)を用いて、この２つのPCR産物をゲルから精製した。各PCR産物を50μlの無菌水で溶出させ、直接サブクローニングした。
【０１０５】
【表２】
2007527203.tif 000003
【０１０６】
〔7.5  PCR産物のサブクローニング〕
Invitrogen社から購入したTAクローニングキットを用い、製造業者が指定した条件で、PCR産物をトポイソメラーゼＩ改変クローニングベクター(pCR4-TOPO)にサブクローニングした。要するに、4μlのゲル精製PCR産物を15分間室温で1μlのTOPOベクター及び1μlの塩溶液とインキュベートした。反応混合物で以下のように大腸菌株TOP10(Invitrogen)を形質転換させた：50μl分量のOne Shot TOP10細胞を氷上で解凍し、2μlのTOPO反応混合物を添加した。混合物を15分間氷上でインキュベートしてから正確に30分間42℃でインキュベートして熱ショックを与えた。サンプルを氷上に戻し、250μlの温かい(室温)SOC培地を加えた。サンプルを1時間37℃で振とうさせながら(220rpm)インキュベートした。この形質転換混合物(300μl)をアンピシリン(100μg/ml)を含有するL-ブロス(LB)プレート上に塗布し、37℃で一晩インキュベートした。
〔7.6  コロニーPCR〕
無菌つまようじを用いて50μlの無菌水中にコロニーを接種した。10μl分量の接種材料を、1×AmpliTaqTM緩衝液、200μM dNTPs、20pmolesのT7プライマー、20pmolesのT3プライマー、1ユニットのAmpliTaqTM(Perkin Elmer)を含有する総反応体積20μlでMJ Research DNA Engineを用いてPCRに供した。サイクル条件は以下のとおりだった：94℃で2分；30サイクル（94℃で30秒、48℃で30秒及び72℃で1分）。サンプルを4℃で維持(保持サイクル)後さらに解析した。
PCR産物を1×TAE緩衝液中1％アガロースゲル上で解析した。予想したPCR産物の大きさ(420bp又は約500bpのcDNA＋105bp(複数のクローニング部位若しくはMCSのため))を得たコロニーを、アンピシリン(100μg/ml)を含有する5mlのL-ブロス(LB)内、220rpmで振とうさせながら37℃で一晩増殖させた。
【０１０７】
〔7.7  プラスミドDNA調製及びシークエンシング〕
Qiaprep Turbo 9600ロボットシステム(Qiagen)又はWizard Plus SVミニプレップキット(Promegaカタログ番号1460)を用い、製造業者の説明書に従って5mlの培養物からミニプレッププラスミドDNAを調製した。100μlの無菌水にプラスミドDNAを溶出させた。DNA濃度をエッペンドルフBO光度計又はSpectramax 190光度計(Molecular Devices)で測定した。BigDye Terminatorシステム(Applied Biosystemsカタログ番号4390246)を用い、製造業者の説明書に従ってT7プライマーによるDNAシークエンシングにプラスミドDNA(200〜500ng)を供した。プライマー配列は表２に示される。Dye-Exカラム(Qiagen)又はMontage SEQ 96クリーアッププレート(Milliporeカタログ番号LSKS09624)でシークエンシング反応を精製してからApplied Biosystems 3700シークエンサーで解析した。
配列解析によって、予測したINSP113に100％マッチングしている成人の脳のcDNAから増幅されたクローンが同定された。このクローン化cDNAフラグメントの配列は図16に示される。クローン化PCR産物(pCR4-TOPO-INSP113)(プラスミドID 13887)のプラスミドマップは図18に示される。
INSP113予測のスプライス変種を含有する第２クローンを同定した。この産物は胎児の脳のcDNAライブラリーから増幅した。第２クローンは予測したエクソン１とエクソン２の間に追加エクソンを含んでおり、この追加エクソンは終止コドンを含み、216bpのORFにつながていた。このクローン化フラグメントの配列は図17に示される。クローン化PCR産物(pCR4-TOPO-INSP113sv)(プラスミドID 13888)のプラスミドマップは図19に示される。
【０１０８】
〔実施例８−HEK293/EBNA細胞内でのINSP113及びINSP113の発現用プラスミドの構築〕
DNAシークエンシング(pCR4-TOPO-INSP113、プラスミドID 13887(図18)、又はpCR4-TOPO-INSP113sv、プラスミドID 13888(図19))で同定されたINSP113又はINSP113svの完全コード配列(ORF)を含有するpCR4-TOPOクローンを用い、GatewayTMクローニング方法論(Invitrogen)によって、哺乳類細胞発現ベクターpEAK12d(図21)及びpDEST12.2(図22)に各挿入断片をサブクローニングした。
【０１０９】
〔8.1  インフレーム6HISタグ配列に融合したゲートウェイ(Gateway)適合性INSP113 ORF及びINSP113sv ORFの生成〕
ゲートウェイクローニングプロセスの第１段階は２工程PCR反応を含み、このPCR反応は、attB1組換え部位とコザック配列によって5’末端で隣接し、かつインフレーム6ヒスチジン(6HIS)タグ、終止コドン及びattB2組換え部位をコードする配列によって3’末端で隣接するINSP0113又はINSP113sv(ゲートウェイ適合性cDNA)を生成する。第１PCR反応(50μlの最終体積)は以下を含む：1.5μlのpCR4-TOPO-INSP113(プラスミドID 13887)又は1.5μlのpCR4-TOPO-INSP113sv(プラスミドID 13888)、1.5μlのdNTPs(10mM)、5μlの10×Pfxポリメラーゼ緩衝液、1μlのMgSO4(50mM)、0.5μlの各遺伝子特異的プライマー(100μM)(INSP113-EX1及びINSP113-EX2、又はINSP113sv-EX1及びINSP113sv-EX2)、2.5μlの10×EnhancerTM溶液(Invitrogen)及び1μlのPlatinum Pfx DNAポリメラーゼ(Invitrogen)。95℃で2分の最初の変性工程後、15サイクル(94℃で15分；55℃で30秒及び68℃で2分)；及び4℃の保持サイクルによってPCR反応を行った。Wizard PCRプレップDNA精製システム(Promega)を用い、製造業者の説明書に従って増幅反応から直接産物を精製した。
第２PCR反応(50μlの最終体積)は10μlの精製PCR1産物、1.5μlのdNTPs(10mM)、5μlの10×Pfxポリメラーゼ緩衝液、1μlのMgSO4(50mM)、0.5μlの各ゲートウェイ転換プライマー(100μM)(GCPフォワード及びGCPリバース)及び0.5μlのPlatinum Pfx DNAポリメラーゼを含有した。第２PCR反応の条件は以下のとおりだった：95℃で1分；4サイクル(94℃で15秒；50℃で30秒及び68℃で3分)；19サイクル(94℃で15秒；55℃で30秒及び68℃で3分)；次いで4℃の保持サイクル。Wizard PCRプレップDNA精製システム(Promega)を用い、製造業者の説明書に従って産物をゲル精製した。
【０１１０】
〔8.2  ゲートウェイエントリーベクターpDONR221と発現ベクターpEAK12d及びpDEST12.2へのゲートウェイ適合性INSP113 ORF及びINSP113sv ORFのサブクローニング〕
ゲートウェイクローニングプロセスへの第２段階は、以下のようにPCR産物をゲートウェイエントリーベクターpDONR221(Invitrogen,図20)に改変した：PCR2からの5μの精製産物を、室温で1時間10μlの最終体積で1μlのpDONR221ベクター(0.15μg/μl)、2μlのBP緩衝液及び1.5μlのBPクロナーゼ(clonase)酵素混合物(Invitrogen)とインキュベートした。プロテイナーゼK(2μg)を添加して反応を終わらせ、37℃でさらに10分間インキュベートした。この反応の一定分量(2μl)を用いて大腸菌DH10B細胞を以下のようにエレクトロポレーションで形質転換させた：30μl分量のDH10Bエレクトロコンピテント細胞(Invitrogen)を氷上で解凍し、2μlのBP反応混合物を加えた。冷却した0.1cmのエレクトロポレーションキュベットに混合物を移し、BioRad Gene-PulserTMを用い、製造業者が推奨するプロトコロルに従って細胞をエレクトロポレートした。エレクトロポレーション直後、予め室温に温めたSOC培地(0.5ml)を加えた。混合物を15mlのスナップ-キャップ管に移し、振とうさせながら(220rpm)37℃で1時間インキュベートした。カナマイシン(40μg/ml)を含むL-ブロス(LB)プレート上に、形質転換混合物の一定分量(10μ及び50μl)を塗布し、37℃で一晩インキュベートした。
結果の２つのコロニー由来の5mlの培養物からQiaprep Turbo 9600ロボットシステム(Qiagen)を用いてプラスミドミニプレップDNAを調製した。BigDyeTerminatorシステム(Applied Biosystemsカタログ番号4390246)を用い、製造業者の説明書に従ってプラスミドDNA(200〜500ng)を21M13及びM13RevプライマーによるDNAシークエンシングに供した。プライマー配列は表２に示される。シークエンシング反応をDye-Exカラム(Qiagen)又はMontage SEQ 96クリーンアッププレート(Milliporeカタログ番号LSKS09624)で精製してからApplied Biosystems 3700シークエンサーで解析した。
【０１１１】
正確な配列(pENTR-INSP113-6HIS、プラスミドID 14216、図23、及びpENTR-INSP113sv-6HIS、プラスミドID 14223、図24)を含む１つのクローンからのプラスミド溶出液(2μl)を、最終体積10μlで1.5μlのpEAK12dベクター又はpDEST12.2ベクターのどちらか(図21及び22)(0.1μg/μl)、2μlのLR緩衝液及び1.5μlのLRクロナーゼ(Invitrogen)を含む組換え反応で用いた。混合物をRTで1時間インキュベートし、プロテイナーゼK(2μg)を添加して反応を終わらせ、37℃さらに10分間インキュベートした。この反応の一定分量(1ul)を用いて大腸菌DH10B細胞をエレクトロポレーションで以下のように形質転換させた：30μl分量のDH10Bエレクトロコンピテント細胞(Invitrogen)を氷上で解凍し、1μlのLR反応混合物を加えた。冷却した0.1cmのエレクトロポレーションキュベットに混合物を移し、BioRad Gene-PulserTMを用い、製造業者が推奨するプロトコルに従って細胞をエレクトロポレートした。エレクトロポレーション直後、予め室温に温めたSOC培地(0.5ml)を添加した。混合物を15mlのスナップ-キャップ管に移し、振とうさせながら(220rpm)37℃で1時間インキュベートした。アンピシリン(100μg/ml)を含むL-ブロス(LB)プレート上に、形質転換混合物の一定分量(10μ及び50μl)を塗布し、37℃で一晩インキュベートした。
Qiaprep Turbo 9600ロボットシステム(Qiagen)で各ベクター内でサブクローニングされたした結果の６つのコロニー由来の5mlの培養物からプラスミドミニプレップDNAを調製した。pEAK12dベクター内のプラスミドDNA(200〜500ng)を上述したようなpEAK12F及びpEAK12RプライマーによるDNAシークエンシングに供した。pDEST12.2ベクター内のプラスミドDNA(200〜500ng)を上述したような21M13及びM13RevプライマーによるDNAシークエンシングに供した。プライマー配列は表２に示される。
配列検証した各クローン(pEAK12d-INSP113-6HIS、プラスミドID番号14225(図25)、pEAK12d-INSP113sv-6HIS、plasmidID番号14227(図26)、pDEST12.2-INSP113-6HIS、プラスミドID14226(図27)、pDEST12.2-INSP113sv-6HIS、プラスミドID 14260(図28))の１つの500mlの培養物から、Sambrook J.ら(1989)によって記載された方法(Molecular Cloning,  a Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press)でCsCl勾配精製マキシ-プレップ(maxi-prep)DNAを調製し、プラスミドDNAを無菌水中1μg/μlの濃度で再懸濁させ、-20℃で貯蔵した。
【０１１２】
〔実施例９−INSP114のクローニング〕
〔9.1  ヒトcDNAテンプレートの調製〕
Superscript II RNase H-逆転写酵素(Invitrogen)を用い、製造業者の推奨するプロトコロルに従ってヒトの正常な脳の全RNAサンプル(Clontech)から第１鎖cDNAを調製した。オリゴ(dT)15プライマー(1μl、500μg/mlで)(Promega)、2μgのヒト脳の全RNA、1μlの10mM dNTP混合物(10mMの各dATP、dGTP、dCTP及びdTTP、中性pHで)及び最終体積12μlになる量の無蒸留水を1.5mlのエッペンドルフ管内で混ぜ合わせ、65℃で5分間加熱してから氷上で冷却した。内容物を簡単な遠心分離で収集し、4μlの5×第１鎖緩衝液、2μlの0.1M DTT、及び1μlのRnaseOUT組換えリボヌクレアーゼインヒビター(40ユニット/μl,Invitrogen)を加えた。管の内容物を穏やかに混合し、42℃で2分間インキュベートし；次に1μl(200ユニット)のSuperscript II酵素を加え、ピペット操作で穏やかに混ぜた。混合物を42℃で50分間インキュベートしてから70℃で15分間加熱して不活化した。このcDNAに相補的なRNAを除去するため、1μl(2ユニット)の大腸菌RNase H(Invitrogen)を加え、反応混合物を37℃で20分間インキュベートした。最終21μlの反応混合物に179μlの無菌水を加えて総体積200μlを得た。
〔9.2  cDNAライブラリー〕
ヒトcDNAライブラリー(バクテリオファージラムダ(λ)ベクター)をClontechから購入し、或いはλGT10ベクターでインハウス調製した。バクテリオファージλDNAは、Wizard Lambda Preps DNA精製システム(Promega, Corporation, Madison WI)を用い、製造業者の説明書に従って感染大腸菌宿主株の小規模培養物から調製した。INSP114の増幅用テンプレートとして用いたヒトcDNAライブラリーサンプルは成人及び胎児の脳から誘導した。
【０１１３】
〔9.3  PCR用の遺伝子特異的クローニングプライマー〕
プライマーデザイナーソフトウェア(Scientific & Educational Software, PO Box 72045, Durham, NC 27722-2045, USA)を用いて仮想のcDNAの完全コード配列を増幅するための18〜25塩基の長さを有する１対のPCRプライマーを設計した。55±10℃に近いＴmと40〜60％のGC含量を有するようにPCRプライマーを最適化した。ほとんど又は全く特異的プライミングのない標的配列(INSP114)に対して高い選択性を有するプライマーを選んだ。
〔9.4  種々のヒトcDNAテンプレート及びファージライブラリーcDNAからのINSP114のPCR増幅〕
遺伝子特異的クローニングプライマー(INSP114-CP1及びINSP114-CP2、図29、図30及び表３)を設計して、INSP114予測の全393bpコード配列をカバーする439bpのcDNAフラグメントを増幅した。INSP114予測による公共のEST配列データベースの質問は、該配列が脳cDNAテンプレート内で発現されるだろうことを示唆した。そこで、PCRテンプレートとしてセクション8.1で列挙したヒトcDNAサンプル及びセクション8.2で列挙したファージライブラリーcDNAサンプルと共に遺伝子特異的クローニングプライマーINSP114-CP1及びINSP114-CP2を使用した。1×AmpliTaqTM緩衝液、200μMのdNTPs、50pmolesの各クローニングプライマー、2.5ユニットのAmpliTaqTM(Perkin Elmer)及び100ngのヒトcDNAテンプレートを含有する最終体積50μlで、MJ Research DNA Engineを用い、以下のようにプログラムしてPCRを行った：94℃で2分；40サイクル（94℃で30秒、55℃で30秒、及び72℃で1分）；次いで72℃で7分を1サイクル及び4℃で保持サイクル。
【０１１４】
【表３】
2007527203.tif 000004
【０１１５】
全ての50μlの各増幅産物を1×TAE緩衝液(Invitrogen)中0.8％アガロースゲル上で可視化した。単一のPCR産物では、脳の第１鎖cDNAテンプレートに対応するサンプル内のほぼ予測分子集団で移動することが分かった。Qiagen MinElute DNA精製システム(Qiagen)を用いてこのPCR産物を精製した。PCR産物を10μlのEB緩衝液(10mM Tris.Cl, pH8.5)内で溶出させ、直接サブクローニングした。
〔9.5  PCR産物のサブクローニング〕
Invitrogen社から購入したTAクローニングキットを用いて、製造業者が指定した条件でPCR産物をトポイソメラーゼＩ改変クローニングベクター(pCR4-TOPO)にサブクローニングした。要するに、ヒト脳cDNA増幅からの4μlのゲル精製PCR産物を室温で15分間1μlのTOPOベクター及び1μlの塩溶液とインキュベートした。反応混合物で大腸菌株TOP10(Invitrogen)を以下のように形質転換させた：50μl分量のOne Shot TOP10細胞を氷上で解凍し、2μlのTOPO反応を加えた。混合物を15分間氷上でインキュベートしてから42℃で正確に30分間インキュベートして熱ショックを与えた。サンプルを氷上に戻し、250μlの温かい(室温)SOC培地を加えた。サンプルを振とうさせながら(220rpm)1時間37℃でインキュベートした。アンピシリン(100μg/ml)を含むL-ブロス(LB)プレート上に形質転換混合物を塗布し、37℃一晩インキュベートした。
〔9.6  コロニーPCR〕
無菌つまようじを用いて50μlの無菌水中にコロニーを接種した。10μl分量の接種材料を、1×AmpliTaqTM緩衝液、200μM dNTPs、20pmolesのT7プライマー、20pmolesのT3プライマー、1ユニットのAmpliTaqTM(Perkin Elmer)を含有する総反応体積20μlでMJ Research DNA Engineを用いてPCRに供した。サイクル条件は以下のとおりだった：94℃で2分；30サイクル（94℃で30秒、48℃で30秒及び72℃で1分）。サンプルを4℃で維持(保持サイクル)後さらに解析した。
PCR産物を1×TAE緩衝液中1％アガロースゲル上で解析した。予想したPCR産物の大きさ(439bpのcDNA＋105bp(複数のクローニング部位若しくはMCSのため))を得たコロニーを、アンピシリン(100μg/ml)を含有する5mlのL-ブロス(LB)内、220rpmで振とうさせながら37℃で一晩増殖させた。
【０１１６】
〔9.7  プラスミドDNA調製及びシークエンシング〕
Qiaprep Turbo 9600ロボットシステム(Qiagen)又はWizard Plus SVミニプレップキット(Promegaカタログ番号1460)を用い、製造業者の説明書に従って5mlの培養物からミニプレッププラスミドDNAを調製した。100μlの無菌水にプラスミドDNAを溶出させた。DNA濃度をエッペンドルフBO光度計又はSpectramax 190光度計(Molecular Devices)で測定した。BigDye Terminatorシステム(Applied Biosystemsカタログ番号4390246)を用い、製造業者の説明書に従ってT7プライマー及びT3プライマーによるDNAシークエンシングにプラスミドDNA(200〜500ng)を供した。プライマー配列は表３に示される。Dye-Exカラム(Qiagen)又はMontage SEQ 96クリーアッププレート(Milliporeカタログ番号LSKS09624)でシークエンシング反応を精製してからApplied Biosystems 3700シークエンサーで解析した。
配列解析は、予測したINSP114に100％マッチングしているクローンが同定した。このクローン化cDNAフラグメントの配列は図29に示される。クローン化PCR産物(pCR4-TOPO-INSP114)(プラスミドID 14213)のプラスミドマップは図31に示される。
〔9.8  IMAGE cDNAクローンの同定及びシークエンシング〕
公共のEST配列データベースのINSP114予測による質問は、INSP配列の部分に対応する多数のヒトESTsを同定した。これらESTsは脳及び精巣テンプレートから誘導した。あるEST、GenBankアクセッション番号AA984082が同定され、INSP114コード配列の最初の385bpに100％のマッチングを示した。対応するクローン、IMAGE ID 1616371をATCCから購入した。T7及びT3シークエンシングプライマー、及び増幅プライマーINSP114-CP1とINSP114-CP2も用いてIMAGEクローンの挿入断片を配列決定した(上記参照)。IMAGEクローン挿入断片はINSP114配列の最初の３個のエクソンに正確に対応することが分かった。最後のエクソンはたった３個のアミノ酸、次いで１個の終止コドンから成っていた。このINSP114配列では、これらアミノ酸はVTH(Val-Thr-His)だった。IMAGEクローンでは、これら３個のアミノ酸はANV(Ala-Asn-Val)、次いで終止コドンであることが分かった。IMAGEクローン1616371はINSP114-SV1に対応し、かつプラスミドID 14211である。INSP114 cdsのアラインメント及びIMAGEクローン1616371の対応領域は図32及び33に示される。
【０１１７】
〔9.9  3’RACE(cDNA末端の迅速増幅(Rapid Amplification of cDNA Ends))〕
IMAGEクローン1616371は予想した配列とは異なるエクソン４を含むことが分かったので、INSP114予測から3’RACEを行って、いずれかのさらなるエクソン４配列が見つかるかどうか同定することを決めた。公共のEST配列データベースのINSP114による質問は、脳及び精巣テンプレート由来の多数の対応するヒトESTsを同定した。そこで、3’RACE反応用テンプレートとして脳及び精巣cDNAサンプルを使用することを決定した。
〔9.10  3’RACE増幅反応〕
GeneRacerTMシステム(Invitrogen)を用い、製造業者の説明書に従って3’RACEを行った。RNAテンプレートを除く全ての反応成分を該システムで供給した。GeneRacerTMオリゴdTプライマー(表３)及びSuperScript II RNase H-逆転写酵素(Invitrogen)を用い、製造業者のプロトコロルに従って脳及び精巣RNA(Clontech, Ambion)を3’RACE-レディ(ready)第１鎖cDNAに変換した。要するに、1μlのGeneRacerTMオリゴdTプライマー(50μM)、1μlのdNTPミックス(10mM)、5μgの全RNAサンプル及びDEPC-処理した無菌水を最終体積12μlになるように1.5mlのエッペンドルフ管内で混ぜ合わせ、65℃で5分加熱してから氷上で2分間冷却した。内容物を簡単な遠心分離で収集し、4μlの5×第１鎖緩衝液、2μlの0.1M DTT、1μlのRnaseOUT組換えリボヌクレアーゼインヒビター(40ユニット/μl)及び1μlのSuperScript II RT(200U/μl)を加えた。内容物を穏やかに混合し、簡単な遠心分離で収集し、42℃で50分間インキュベートしてから70℃で15分間加熱して不活化した。混合物を氷上で2分間冷却し、簡単な遠心分離で内容物を再収集し、かつ1μl(2ユニット)の大腸菌RNase Hを加えて該cDNAに相補的なRNAを除去した。混合物を37℃で20分間インキュベートしてから氷上で冷却した。第１鎖cDNAを-20℃で貯蔵後、RACE反応で用いた。
１対の遺伝子特異的入れ子(nested)3’RACEプライマー(INSP114-GR1-3’及びINSP114-GR1nest-3’、表３)を、INSP114配列のそれぞれエクソン２及びエクソン３内で設計した。これらプライマーをそれぞれGeneRacerTM3’プライマー及びGeneRacerTM3’入れ子プライマーと共に連続したRACE PCRs内で用いた。第１増幅反応では、1×Platinum(登録商標)Taq High Fidelity PCR緩衝液、2mM MgSO4、200μM dNTPs、0.2μMのINSP114-GR1-3’プライマー、0.6μMのGeneRacerTM3’プライマー、2.5ユニットのPlatinum(登録商標)Taq High Fidelity DNAポリメラーゼ(Invitrogen)、2μlの3’GeneRacerTM-レディ脳第１鎖cDNA又は3’GeneRacerTM-レディ精巣第１鎖cDNAテンプレートのどちらかを最終体積50μlで混ぜ合わせた。以下のようにプログラムしたMJ Research DNA Engineを用いて熱サイクリングを行った：94℃で2分；5サイクル(94℃で30秒、72℃で3分)；5サイクル(94℃で30秒、70℃で3分)；25サイクル(94℃で30秒、60℃で30秒、68℃で3分)；次に68℃で10分を1サイクル及び4℃で保持サイクル。
第２PCRでは、1μlのPCR1産物を1×Platinum(登録商標)Taq High Fidelity PCR緩衝液、2mM MgSO4、200μM dNTPs、0.2μMのINSP114-GR1nest-3’プライマー、0.2μMのGeneRacerTM入れ子3’プライマー、及び2.5ユニットのPlatinum(登録商標)Taq High Fidelity DNAポリメラーゼ(Invitrogen)を最終体積50μlで混ぜ合わせた。以下のようにプログラムしたMJ Research DNA Engineを用いて熱サイクリングを行った：94℃で2分；25サイクル(94℃で30秒、60℃で30秒、68℃で3分)；次に68℃で10分の1サイクル及び4℃で保持サイクル。
1×TAE緩衝液(Invitrogen)中0.8％アガロースゲル上で全ての50μlの各増幅産物を可視化した。ゲル上の各レーンにいくつかのバンドが観察された。脳cDNA PCR1から１つのバンド、脳cDNA PCR2から１つのバンド、かつ精巣PCR2から３つのバンドが消えた。Qiagen MinElute DNA精製システム(Qiagen)でこれらPCR産物を精製した。各産物を10μlのEB緩衝液(10mM Tris.Cl, pH8.5)に溶出させ、直接クローニングした。
【０１１８】
〔9.11  3’RACE PCR産物のサブクローニング〕
Invitrogen社から購入したTAクローニングキットを用い、製造業者が指定した条件で各RACE PCR産物をトポイソメラーゼＩ改変クローニングベクター(pCR4-TOPO)にサブクローニングした。要するに、ヒトの脳cDNA増幅からゲル精製した4μlのPCR産物を1μlのTOPOベクター及び1μlの塩溶液と共に室温で15分間インキュベートした。以下のように反応混合物で大腸菌株TOP10(Invitrogen)を形質転換させた：50μl分量のOne Shot TOP10細胞を氷上で解凍し、2μlのTOPO反応を加えた。混合物を15分間氷上でインキュベートしてから42℃で正確に30分間加熱して熱ショックを与えた。サンプルを氷上に戻し、250μlの温かい(室温)SOC培地を添加した。サンプルを振とうさせながら(220rpm)37℃で1時間インキュベートした。アンピシリン(100μg/ml)を含むL-ブロス(LB)プレート上にこの形質転換混合物を塗布し、37℃で一晩インキュベートした。
〔9.12  コロニーPCR〕
無菌のつまようじでコロニーを50μlの無菌水中に接種した。次いで、MJ Research DNA Engineを用い、10μl分量の接種材料を、1×AmpliTaqTM緩衝液、200μM dNTPs、20pmolesのT7プライマー、20pmolesのT3プライマー、1ユニットのAmpliTaqTM(Perkin Elmer)を含む総反応体積20μlでPCRに供した。サイクリング条件は以下のとおりだった：94℃で2分；30サイクル(94℃で30秒、48℃で30秒及び72℃で1分30秒又は3分(予想される挿入断片に依存する))。サンプルを4℃で維持(保持サイクル)後、さらに解析した。
PCR反応産物を1×TAE緩衝液中1％アガロースゲル上で解析した。挿入断片を含むと思われるコロニー、すなわち複数のクローニング部位のため105bpより大きいPCR産物サイズを与えたコロニーを、アンピシリン(100μg/ml)を含む5mlのL-ブロス(LB)内、220rpmで振とうさせながら37℃で一晩増殖させた。
〔9.13  プラスミドDNA調製及びシークエンシング〕
Qiaprep Turbo 9600ロボットシステム(Qiagen)又はWizard Plus SVミニプレップキット(Promegaカタログ番号1460)を用い、製造業者の説明書に従って5mlの培養物からミニプレッププラスミドDNAを調製した。プラスミドDNAを100μlの無菌水に溶出させた。エッペンドルフBO光度計又はSpectramax 190光度計(Molecular Devices)でDNA濃度を測定した。BigDye Terminatorシステム(Applied Biosystemsカタログ番号4390246)を用い、製造業者の説明書に従ってプラスミドDNA(200〜500ng)をT7プライマー及びT3プライマーによるDNAシークエンシングに供した。プライマー配列は表３に示される。Dye-Exカラム(Qiagen)又はMontage SEQ 96クリーアッププレート(Milliporeカタログ番号LSKS09624)でシークエンシング反応を精製してからApplied Biosystems 3700シークエンサーで解析した。
配列解析は、pCR4-TOPO-INSP114クローン(プラスミドID 14213)又はIMAGEクローン1616371(プラスミドID 14211)のどちらかにおけるのと同じエクソン４配列を含むいくつかのクローンを同定した。しかし、第３異形のエクソン４を含むクローンも同定された。この場合、エクソン４はただ１個だけのアミノ酸W(Trp)、次に終止コドンで構成されていた。これはスプライスされたエクソン４を表し、イントロン配列へのエクソン３の継続ではない。RACE反応の産物の配列は図34に示される。クローニング産物、pCR4-TOPO-INSP114-GR1のマップは図35に示される。このクローンはプラスミドID 15939である。
【０１１９】
〔9.14  INSP114予測エクソン１〜３及びRACE-同定エクソン４を含むクローンの生成〕
RACE増幅及びクローニング反応は新規なINSP114エクソン４を同定したが、生成する必要のある、この新規エクソン４配列を有する全長INSP114配列を含むクローンは同定されなかった。pCR-TOPO-INSP114クローン由来のINSP114-SV2と称するINSP配列のこの異形、プラスミドID 14213を、元のエクソン４を新規異形と置き換えるであろう１対のPCRプライマーを用いて操作することを決めた。これらプライマーはcDNAテンプレートについては試験しなかった。エクソン１〜３の配列を含むいずれのcDNAテンプレートにも該PCRプライマーによって付加されるであろうエクソン４配列の長さが非常に短いからである。
１対の遺伝子特異的クローニングプライマー、INSP114-CP3及びINSP114-CP4を設計して(表３)INSP114配列を増幅し、かつ同時にエクソン４配列を置換した。1×Platinum(登録商標)Taq High Fidelity PCR緩衝液、2mM MgSO4、200μM dNTPs、10pmolesの各クローニングプライマー、2.5ユニットのPlatinum(登録商標)Taq High Fidelity DNAポリメラーゼ(Invitrogen)、及び1μlのプラスミドID 14213を含む最終体積50μlでPCRを行った。以下のようにプログラムしたMJ Research DNA Engineを用いて熱サイクリングを行った：94℃で2分；30サイクル(94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で30秒)；次いで68℃で7分1サイクル及び4℃で保持サイクル。
1×TAE緩衝液(Invitrogen)中0.8％アガロースゲル上で全ての50μlの各増幅産物を可視化すると、１つのPCR産物だけが、ほぼ予測した分子集団で移動することが分かった。このPCR産物をWizard PCR Preps DNA精製システム(Promega)で精製した。PCR産物を50μlの水中に溶出させ、直接サブクローニングした。
〔9.15  PCR産物のサブクローニング〕
Invitrogen社から購入したTAクローニングキッを用い、製造業者が指定した条件で、このPCR産物をトポイソメラーゼＩ改変クローニングベクター(pCR4-TOPO)にサブクローニングした。要するに、ヒト脳cDNA増幅からゲル精製した4μlのPCR産物を1μlのTOPOベクター及び1μlの塩溶液と室温で15分間インキュベートした。次に、この反応混合物で大腸菌株TOP10(Invitrogen)を以下のように形質転換させた：50μl分量のOne Shot TOP10細胞を氷上解凍し、2μlのTOPO反応を加えた。混合物を15分間氷上でインキュベートし、42℃で正確に30秒間加熱して熱ショックを与えた。サンプルを氷上に戻し、250μlの温かい(室温)SOC培地を添加した。サンプルを振とうさせながら(220rpm)37℃で1時間インキュベートした。アンピシリン(100μg/ml)を含むL-ブロス(LB)プレート上に前記形質転換混合物を塗布し、37℃で一晩インキュベートした。
【０１２０】
〔9.16  コロニーPCR〕
無菌のつまようじを用いて50μlの無菌水中にコロニーを接種した。次に、MJ Research DNA Engineを用い、10μl分量の接種材料を1×AmpliTaqTM緩衝液、200μM dNTPs、20pmolesのT7プライマー、20pmolesのT3プライマー、1ユニットのAmpliTaqTM(Perkin Elmer)を含む総反応体積20μlでPCRに供した。サイクリング条件は以下のとおりだった：94℃で2分；30サイクル(94℃で30秒、48℃で30秒及び72℃で30秒。サンプルを4℃で維持(保持サイクル)後、さらに解析した。
1×TAE緩衝液中1％アガロースゲル上でPCR反応産物を解析した。予想したPCR産物サイズ(390bpのcDNA＋105bp(複数のクローニング部位又はMCSのための))を与えたコロニーを、アンピシリン(100μg/ml)を含む5mlのL-ブロス(LB)内、220rpmで振とうさせながら37℃で一晩増殖させた。
【０１２１】
〔9.17  プラスミドDNA調製及びシークエンシング〕
Qiaprep Turbo 9600ロボットシステム(Qiagen)又はWizard Plus SVミニプレップキット(Promegaカタログ番号1460)を用い、製造業者の説明書に従って5mlの培養物からミニプレッププラスミドDNAを調製した。プラスミドDNAを100μlの無菌水に溶出させた。エッペンドルフBO光度計又はSpectramax 190光度計(Molecular Devices)を用いてDNA濃度を測定した。BigDye Terminatorシステム(Applied Biosystemsカタログ番号4390246)を用い、製造業者の説明書に従ってT7プライマー及びT3プライマーによるDNAシークエンシングにプラスミドDNA(200〜500ng)を供した。プライマー配列は表３に示される。シークエンシング反応をDye-Exカラム(Qiagen)又はMontage SEQ 96クリーアッププレート(Milliporeカタログ番号LSKS09624)で精製してからApplied Biosystems 3700シークエンサーで解析した。
配列解析は、前記代替エクソン４配列を有する予測したINSP114-SV2に100％マッチングしているクローンを同定した。このクローン化cDNAフラグメントの配列は図36に示される。クローン化産物(pCR4-TOPO-INSP114-SV2)(プラスミドID.14426)のプラスミドマップは図37に示される。
【０１２２】
〔実施例10−INSP114、INSP114-SV1、INSP114-SV2用の哺乳類細胞発現ベクターの構築〕
GatewayTMクローニング方法論(Invitrogen)で、プラスミド14213、14211及び14426をPCRテンプレートとして用いて、6HISタグをコードする3’配列を有するそれぞれINSP114、INSP114-SV1又はINSP114-SV2 ORF配列を含むpEAK12d(図42、45＆48)及びpDEST12.2(図43、46＆49)発現クローンを生成した。
〔10.1  インフレーム6HISタグ配列に融合したゲートウェイ(Gateway)適合性INSP114、INSP114-SV1及びINSP114-SV2 ORFの生成〕
ゲートウェイクローニングプロセスの第１段階は２工程PCR反応を含み、この２工程PCR反応が、attB1組換え部位とコザック配列で5’末端と隣接し、かつインフレーム6ヒスチジン(6HIS)タグ、終止コドン及びattB2組換え部位をコードする配列で3’末端と隣接しているINSP114、INSP114-SV1及びINSP114-SV2のORFsを生成する(ゲートウェイ適合性cDNA)。第１PCR反応(最終体積50μl中)は以下の成分を含む：1μl(40ng)のプラスミド14213、14211又は14426、1.5μlのdNTPs(10mM)、10μlの10×Pfxポリメラーゼ緩衝液、1μlのMgSO4(50mM)、0.5μlの各遺伝子特異的プライマー(100μM)(INSP114用のINSP114-EX1とINSP114-EX2、INSP114-SV1用のINSP114-EX1とINSP114-EX3、及びINSP114-SV2用のINSP114-EX1とINSP114-EX4)、及び0.5μlのPlatinum Pfx DNAポリメラーゼ(Invitrogen)。PCR反応は、95℃で2分の最初の変性工程、次いで12サイクル(94℃で15秒；55℃で30秒及び68℃で2分)；及び4℃の保持サイクルを用いて行った。増幅産物を1×TAE緩衝液(Invitrogen)中0.8％アガロースゲル上で可視化し、予測した分子集団で移動する産物を、Wizard PCR Preps DNA精製システム(Promega)を用い、製造業者の説明書に従ってゲルから精製し、50μlの無菌水中に回収した。
第２PCR反応(最終体積50μl中)は10μlの精製PCR1産物、1.5μlのdNTPs(10mM)、5μlの10×Pfxポリメラーゼ緩衝液、1μlのMgSO4(50mM)、0.5μlの各ゲートウェイ転換プライマー(100μM)(GCPフォワード及びGCPリバース)及び0.5μlのPlatinum Pfx DNAポリメラーゼを含んでいた。第２PCR反応の条件は以下のとおりだった：95℃で1分；4サイクル(94℃で15秒；50℃で30秒及び68℃で2分)；25サイクル(94℃で15秒；55℃で30秒及び68℃で2分)；次いで4℃で保持サイクル。Wizard PCRプレップDNA精製システム(Promega)を用い、製造業者の説明書に従ってPCR産物をゲル精製した。
【０１２３】
〔10.2  ゲートウェイ適合性INSP114、INSP114-SV1及びINSP114-SV2 ORFsのゲートウェイエントリーベクターpDONR221並びに発現ベクターpEAK12d及びpDEST12.2へのサブクローニング〕
ゲートウェイクローニングプロセスの第２段階は、以下のようにゲートウェイ改変PCR産物のゲートウェイエントリーベクターpDONR221(Invitrogen、図38)へのサブクローニングを含む：PCR2からの5μlの精製産物を最終体積10μlで1.5μlのpDONR221ベクター(0.1μg/μl)、2μlのBP緩衝液及び1.5μlのBPクロナーゼ酵素ミックス(Invitrogen)と室温で1時間インキュベートした。プロテイナーゼKを1μl(2μg/μl)添加して反応を終わらせ、37℃でさらに10分間インキュベートした。この反応の一定分量(1μl)を用いて以下のようにエレクトロポレーションで大腸菌DH10B細胞を形質転換させた：25μl分量のDH10Bエレクトロコンピテント細胞(Invitrogen)を氷上で解凍し、1μlのBP反応ミックスを加えた。冷却した0.1cmのエレクトロポレーションキュベットに混合物を移して、BioRad Gene-PulserTMを用い、製造業者が推奨するプロトコロルに従って細胞をエレクトロポレートした。エレクトロポレーション直後、室温に予め温めたSOC培地(0.5ml)を添加した。混合物を15mlのスナップ-キャップ管に移し、振とうさせながら(220rpm)1時間37℃でインキュベートした。この形質転換混合物の一定分量(10μl及び50μl)を、カナマイシン(40μg/ml)を含むL-ブロス(LB)プレート上に塗布し、37℃で一晩インキュベートした。
結果の６つのコロニーの5mlの培養物からQiaprep Turbo 9600ロボットシステム(Qiagen)を用いてプラスミドミニプレップDNAを調製した。BigDyeTerminatorシステム(Applied Biosystemsカタログ番号4390246)を用い、製造業者の説明書に従ってプラスミドDNA(150〜200ng)を21M13及びM13RevプライマーによるDNAシークエンシングに供した。プライマー配列は表３に示される。シークエンシング反応をDye-Exカラム(Qiagen)又はMontage SEQ 96クリーンアッププレート(Milliporeカタログ番号LSKS09624)で精製してからApplied Biosystems 3700シークエンサーで解析した。
【０１２４】
次に、正しい配列(pENTR_INSP114-6HIS, プラスミドID 14391, 図41、pENTR_INSP114-SV1-6HIS, プラスミドID 14392, 図44、又はpENTR_INSP114-SV2-6HIS, プラスミドID 14689, 図47)を含むクローンの１つからのプラスミド溶出液(2μl又は約150ng)を最終体積10μl中1.5μlのpEAK12dベクター又はpDEST12.2ベクターのどちらか(図39＆40)(0.1μg/μl)、2μlのLR緩衝液及び1.5μlのLRクロナーゼ(Invitrogen)を含む組換え反応で用いた。混合物をRTで1時間インキュベートし、プロテイナーゼK(2μg)を添加して反応を終わらせ、37℃でさらに10分間インキュベートした。この反応の一定分量(1ul)を用いて以下のようにエレクトロポレーションで大腸菌DH10B細胞を形質転換させた：25μl分量のDH10Bエレクトロコンピテント細胞(Invitrogen)を氷上で解凍し、1μlのLR反応ミックスを添加した。冷却した0.1cmのエレクトロポレーションキュベットに混合物を移して、BioRad Gene-PulserTMを用い、製造業者が推奨するプロトコロルに従って細胞をエレクトロポレートした。エレクトロポレーション直後、予め室温に温めたSOC培地(0.5ml)を添加した。混合物を15mlのスナップ-キャップ管に移し、振とうさせながら(220rpm)37℃で1時間インキュベートした。アンピシリン(100μg/ml)を含むL-ブロス(LB)プレート上に前記形質転換混合物の一定分量(10μl及び50μl)を塗布し、37℃で一晩インキュベートした。
その結果各ベクターでサブクローニングされた６つのコロニーの5mlの培養物から、Qiaprep Turbo 9600ロボットシステム(Qiagen)を用いてプラスミドミニプレップDNAを調製した。pEAK12dベクター中のプラスミドDNA(200〜500ng)を上述したようなpEAK12F及びpEAK12RプライマーによるDNAシークエンシングに供した。pDEST12.2ベクター中のプラスミドDNA(200〜500ng)を上述したような21M13及びM13RevプライマーによるDNAシークエンシングに供した。プライマー配列は表３に示される。
配列検証した各クローン(pEAK12d_INSP114-6HIS、pEAK12d_INSP114-SV1-6HIS及びpEAK12d_INSP114-SV2-6HIS、プラスミドID番号14396、14397及び14695、それぞれ図42、45及び48、並びにpDEST12.2_INSP114-6HIS、pDEST12.2_INSP114-SV1-6HIS及びpDEST12.2_INSP114-SV2-6HIS、プラスミドID番号14408、14409及び14696、それぞれ図43、46及び49)の１つの500mlの培養物から、Sambrook J.ら(1989)によって記載された方法(Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press)を用いてCsCl勾配精製マキシ-プレップDNAを調製し、プラスミドDNAを無菌水(又は10mM Tris-HCl pH8.5)に1μg/μlの濃度で再懸濁させ、-20℃で貯蔵した。
【０１２５】
〔実施例11−INSP115のクローニング〕
INSP115は、４つのエクソンでコードされる132アミノ酸タンパク質(396bp)の予測だった。この全長cdsを用いて公共のESTデータベースを検索し、INSP115配列にマッチングするいくつかの配列を同定した。IMAGE cDNAクローン5299791に対応する１つの配列、GenBankアクセッション番号BI599742を選択し、該クローンをATCCから購入した。シークエンシングプライマーT7及びT3(表４)を用いてIMAGEクローンの挿入断片配列を決定した。挿入断片配列はINSP115 cdsを含むことが分かった。IMAGEクローン5299791はプラスミドデータベースID14210である。INSP115に対応する領域を同定した後、IMAGEクローン挿入断片の全長は配列決定しなかった。
【０１２６】
【表４】
2007527203.tif 000005
【０１２７】
INSP115予測の配列は図50に示される。IMAGEクローン5299791の対応する領域はヌクレオチドレベルでINSP115 cdsと同一だった。
〔実施例12−INSP115用の哺乳類細胞発現ベクターの構築〕
GatewayTMクローニング方法論(Invitrogen)で、プラスミド14210をPCRテンプレートとして用いて、6HISタグをコードする3’配列を有するINSP115 ORF配列を含むpEAK12d(図55)及びpDEST12.2(図56)発現クローンを生成した。
〔12.1  インフレーム6HISタグ配列に融合したゲートウェイ(Gateway)適合性INSP115 ORFの生成〕
ゲートウェイクローニングプロセスの第１段階は２工程PCR反応を含み、この２工程PCR反応は、attB1組換え部位とコザック配列によって5’末端で隣接し、かつインフレーム6ヒスチジン(6HIS)タグ、終止コドン及びattB2組換え部位をコードする配列によって3’末端で隣接するINSP115のORFを生成する(ゲートウェイ適合性cDNA)。第１PCR反応(最終体積50μ中)は以下の成分を含む：1μl(40ng)のプラスミド14210、1.5μlのdNTPs(10mM)、10μlの10×Pfxポリメラーゼ緩衝液、1μlのMgSO4(50mM)、0.5μlの各遺伝子特異的プライマー(100μM)(INSP115-EX1とINSP115-EX2)、及び0.5μlのPlatinum Pfx DNAポリメラーゼ(Invitrogen)。PCR反応は、95℃で2分間の最初の変性工程、次いで12サイクル(94℃で15秒；55℃で30秒及び68℃で2分)；及び4℃の保持サイクル。1×TAE緩衝液(Invitrogen)中8％アガロースゲル上で増幅産物を可視化し、Wizard PCRプレップDNA精製システム(Promega)を用い、予測した分子集団で移動する産物を製造業者の説明書に従ってゲルから精製し、かつ50μlの無菌水中に回収した。
第２PCR反応(最終体積50μl中)は10μlの精製PCR1産物、1.5μlのdNTPs(10mM)、5μlの10×Pfxポリメラーゼ緩衝液、1μlのMgSO4(50mM)、0.5μlの各ゲートウェイ転換プライマー(100μM)(GCPフォワードとGCPリバース)及び0.5μlのPlatinum Pfx DNAポリメラーゼを含んでいた。第２PCR反応の条件は以下のとおりだった：95℃で1分間；4サイクル(94℃で15秒；50℃で30秒及び68℃で2分)；25サイクル(94℃で15秒；55℃で30秒及び68℃で2分)；次いで4℃で保持サイクル。Wizard PCRプレップDNA精製システム(Promega)を用い、製造業者の説明書に従ってPCR産物をゲル精製した。
【０１２８】
〔12.2  ゲートウェイ適合性INSP115 ORFのゲートウェイエントリーベクターpDONR221並びに発現ベクターpEAK12d及びpDEST12.2へのサブクローニング〕
ゲートウェイクローニングプロセスの第２段階は以下のとおりのゲートウェイ改変PCR産物のゲートウェイエントリーベクターpDONR221(Invitrogen、図51)へのサブクローニングを含む：PCR2からの5μlの精製産物を1.5μlのpDONR221ベクター(0.1μg/μl)、2μlのBP緩衝液及び1.5μlのBPクロナーゼミックス(Invitrogen)と最終体積10μlでRTにて1時間インキュベートした。プロテイナーゼKを1μl(2μg/μl)を添加して反応を終わらせ、かつ37℃でさらに10分間インキュベートした。この反応の一定分量(1μl)を用いてエレクトロポレーションで以下のように大腸菌DH10B細胞を形質転換させた：25μl分量のDH10Bエレクトロコンピテント細胞(Invitrogen)を氷上で解凍し、1μlのBP反応ミックスを添加した。冷却した0.1cmのエレクトロポレーションキュベットに混合物を移して、BioRad Gene-PulserTMを用い、製造業者が推奨するプロトコロルに従って細胞をエレクトロポレートした。エレクトロポレーション直後、予め室温に温めたSOC培地(0.5ml)を加えた。混合物を15mlのスナップ-キャップ管に移し、振とうさせながら(220rpm)37℃で1時間インキュベートした。この形質転換混合物の一定分量(10μl及び50μl)を、カナマイシン(40μg/ml)を含むL-ブロス(LB)プレート上に塗布し、37℃で一晩インキュベートした。
その結果の６つのコロニーの5mlの培養物からQiaprep Turbo 9600ロボットシステム(Qiagen)でプラスミドミニプレップDNAを調製した。BigDyeTerminatorシステム(Applied Biosystemsカタログ番号4390246)を用い、製造業者の説明書に従ってプラスミドDNA(150〜200ng)を21M13及びM13RevプライマーによるDNAシークエンシングに供した。プライマー配列は表４に示される。シークエンシング反応をDye-Exカラム(Qiagen)又はMontage SEQ 96クリーンアッププレート(Milliporeカタログ番号LSKS09624)で精製してからApplied Biosystems 3700シークエンサーで解析した。
【０１２９】
次に、正しい配列(pENTR_INSP115-6HIS、プラスミドID 14393、図54)を含むクローンの１つのプライマー溶出液(2μl又は約150ng)を、最終体積10μl中1.5μlのpEAK12dベクター又はpDEST12.2ベクターのどちらか(図52＆53)(0.1μg/μl)、2μlのLR緩衝液及び1.5μlのLRクロナーゼ(Invitrogen)を含む組換え反応で用いた。混合物をRTで1時間インキュベートし、プロテイナーゼK(2μg)を添加して反応を終わらせ、37℃でさらに10分間インキュベートした。この反応の一定分量(1ul)を用いて以下のように大腸菌DH10B細胞を形質転換させた：25μl分量のDH10Bエレクトロコンピテント細胞(Invitrogen)を氷上で解凍し、1μlのLR反応ミックスを添加した。冷却した0.1cmのエレクトロポレーションキュベットに混合物を移し、BioRad Gene-PulserTMを用い、製造業者が推奨するプロトコロルに従って細胞をエレクトロポレートした。エレクトロポレーション直後、予め室温に温めたSOC培地(0.5ml)を加えた。混合物を15mlのスナップ-キャップ管に移し、振とうさせながら(220rpm)37℃で1時間インキュベートした。この形質転換混合物の一定分量(10μl及び50μl)を、アンピシリン(100μg/ml)を含むL-ブロス(LB)プレート上に塗布し、37℃で一晩インキュベートした。
その結果各ベクターでサブクローニングされた６つのコロニーの5mlの培養物から、Qiaprep Turbo 9600ロボットシステム(Qiagen)でプラスミドミニプレップDNAを調製した。pEAK12dベクター中のプラスミドDNA(200〜500ng)を上述したようなpEAK12F及びpEAK12RプライマーによるDNAシークエンシングシークエンシングに供した。pDEST12.2ベクター中のプラスミドDNA(200〜500ng)を上述したような21M13及びM13RevプライマーによるDNAシークエンシングに供した。プライマー配列は表４に示される。
配列検証した各クローン(pEAK12d_INSP115-6HIS, プラスミドID番号14398, 図55、及びpDEST12.2_INSP115-6HIS, プラスミドID 14410, 図56)の１つの500mlの培養物から、Sambrook J.ら(1989)に記載されている方法(Molecular Cloning,  a Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press)を用いてCsCl勾配精製マキシ-プレップDNAを調製し、プラスミドDNAを無菌水(又は10mM Tris-HCl pH8.5)中1μg/μlの濃度で再懸濁させ、-20℃で貯蔵した。
【０１３０】
〔実施例13−INSP116のクローニング〕
INSP116は、５つのコーディングエクソン内にコードされる140アミノ酸タンパク質(420bp)の予測だった。この全長cdsを用いて公共のESTデータベースを検索して、INSP116配列にマッチングするいくつかの配列を同定した。IMAGE cDNAクローン5302753に対応する１つの配列、GenBank受入BI599941を選んでATCCから購入した。シークエンシングプライマーT7及びT3(表５)を用いて該IMAGEクローンの挿入断片配列を決定した。該挿入断片配列はINSP116 cdsを含むことが分かった。IMAGEクローン5302753はプラスミドデータベースID 14206である。INSP116に対応する領域を同定した後、該IMAGEクローン挿入断片の全長は配列決定しなかった。
INSP116予測の配列は図57に示される。IMAGEクローン5302753に対応する領域は、ヌクレオチドレベルでINSP116 cdsと同一だった。
【０１３１】
【表５】
2007527203.tif 000006
【０１３２】
〔実施例14−INSP116用の哺乳類細胞発現ベクターの構築〕
GatewayTMクローニング方法論(Invitrogen)により、プラスミド14206をPCRテンプレートとして用いて、6HISタグをコードする3’配列を有するINSP116 ORF配列を含むpEAK12d(図62)及びpDEST12.2(図63)発現クローンを生成した。
〔14.1  インフレーム6HISタグ配列に融合したゲートウェイ適合性INSP116 ORFの生成〕
ゲートウェイクローニングプロセスの第１段階は、２工程PCR反応を含み、該２工程PCR反応が、attB1組換え部位とコザック配列によって5’末端で隣接し、かつインフレーム6ヒスチジン(6HIS)タグ、終止コドン及びattB2組換え部位によって3’末端で隣接するINSP116のORFを生成する(ゲートウェイ適合性cDNA)。第１PCR反応(最終体積50μl)は以下の成分を含む：1μl(40ng)のプラスミド14206、1.5μlのdNTPs(10mM)、10μlの10×Pfxポリメラーゼ緩衝液、1μlのMgSO4(50mM)、0.5μlの各遺伝子特異的プライマー(100μM)(INSP116-EX1及びINSP116-EX2)、及び0.5μlのPlatinum Pfx DNAポリメラーゼ(Invitrogen)。PCR反応は、95℃で2分の最初の変性工程、次いで12サイクル(94℃で15秒；55℃で30秒及び68℃で2分)；及び4℃の保持サイクルによって行った。1×TAE緩衝液(Invitrogen)中0.8％アガロースゲル上で増幅産物を可視化し、Wizard PCRプレップDNA精製システム(Promega)を用い、製造業者の説明書に従って、予測した分子集団で移動する産物をゲルから精製して50μlの無菌水に回収した。第２PCR反応(最終体積50μl)は、10μlの精製PCR1産物、1.5μlのdNTPs(10mM)、5μlの10×Pfxポリメラーゼ緩衝液、1μlのMgSO4(50mM)、0.5μlの各ゲートウェイ転換プライマー(100μM)(GCPフォワード及びGCPリバース)及び0.5μlのPlatinum Pfx DNAポリメラーゼを含んでいた。第２PCR反応の条件は以下のとおりだった：95℃で1分間；4サイクル(94℃で15秒；50℃で30秒及び68℃で2分)；25サイクル(94℃で15秒；55℃で30秒及び68℃で2分)；次いで4℃で保持サイクル。izard PCRプレップDNA精製システム(Promega)を用い、製造業者の説明書に従ってPCR産物をゲル精製した。
【０１３３】
〔14.2  ゲートウェイ適合性INSP116 ORFのゲートウェイエントリーベクターpDONR221並びに発現ベクターpEAK12d及びpDEST12.2へのサブクローニング〕
ゲートウェイクローニングプロセスの第２段階は、以下のとおりのゲートウェイ改変PCR産物のゲートウェイエントリーベクターpDONR221(Invitrogen、図58)へのサブクローニングを含む：PCR2からの5μlの精製産物を1.5μlのpDONR221ベクター(0.1μg/μl)、2μlのBP緩衝液及び1.5μlのBPクロナーゼ酵素ミックス(Invitrogen)と最終体積10μlでRTにて1時間インキュベートした。プロテイナーゼKを1μl(2μg/μl)を添加して反応を終わらせ、37℃でさらに10分間インキュベートした。この反応の一定分量(1μl)を用いて以下のようにエレクトロポレーションで大腸菌DH10B細胞を形質転換させた：25μl分量のDH10Bエレクトロコンピテント細胞(Invitrogen)を氷上で解凍し、1μlのBP反応ミックスを添加した。冷却した0.1cmのエレクトロポレーションキュベットに混合物を移して、BioRad Gene-PulserTMを用い、製造業者が推奨するプロトコロルに従って細胞をエレクトロポレートした。エレクトロポレーション直後、予め室温に温めたSOC培地(0.5ml)を添加した。混合物を15mlのスナップ-キャップ管に移し、振とうさせながら(220rpm)37℃で1時間インキュベートした。カナマイシン(40μg/ml)を含むL-ブロス(LB)プレート上に該形質転換混合物の一定分量(10μl及び50μl)を塗布し、37℃で一晩インキュベートした。
その結果の６つのコロニーの5mlの培養物から、Qiaprep Turbo 9600ロボットシステム(Qiagen)を用いてプラスミドミニプレップDNAを調製した。BigDyeTerminatorシステム(Applied Biosystemsカタログ番号4390246)を用い、製造業者の説明書に従ってプラスミドDNA(150〜200ng)を21M13及びM13RevプライマーによるDNAシークエンシングに供した。プライマー配列は表５に示される。シークエンシング反応をDye-Exカラム(Qiagen)又はMontage SEQ 96クリーンアッププレート(Milliporeカタログ番号LSKS09624)で精製してからApplied Biosystems 3700シークエンサーで解析した。
【０１３４】
正しい配列(pENTR_INSP116-6HIS、プラスミドID 14394、図61)を含むクローンの１つのプラスミド溶出液(2μl又は約150ng)を、最終体積10μl中1.5μlのpEAK12dベクター又はpDEST12.2ベクターのどちらか(図59＆60)(0.1μg/μl)、2μlのLR緩衝液及び1.5μlのLRクロナーゼ(Invitrogen)を含む組換え反応で用いた。混合物をRTで1時間インキュベートし、プロテイナーゼK(2μg)を加えた反応を終わらせ、37℃でさらに10分インキュベートした。この反応の一定分量(1ul)を用いて大腸菌DH10B細胞を以下のようにエレクトロポレーションで形質転換させた：25μl分量のDH10Bエレクトロコンピテント細胞(Invitrogen)を氷上で解凍し、1μlのLR反応ミックスを添加した。冷却した0.1cmのエレクトロポレーションキュベットに混合物を移して、BioRad Gene-PulserTMを用い、製造業者が推奨するプロトコロルに従って細胞をエレクトロポレートした。エレクトロポレーション直後、予め室温に温めたSOC培地(0.5ml)を加えた。混合物を15mlのスナップ-キャップ管に移して、振とうさせながら(220rpm)37℃で1時間インキュベートした。この形質転換混合物の一定分量(10μl及び50μl)を、アンピシリン(100μg/ml)を含むL-ブロス(LB)プレート上に塗布し、37℃で一晩インキュベートした。
その結果各ベクターでサブクローニングされた６つのコロニーの5mlの培養物から、Qiaprep Turbo 9600ロボットシステム(Qiagen)を用いてプラスミドミニプレップDNAを調製した。pEAK12dベクター中のプラスミドDNA(200〜500ng)を上述したようなpEAK12F及びpEAK12RプライマーによるDNAシークエンシングに供した。pDEST12.2ベクター中のプラスミドDNA(200〜500ng)は、上述したような21M13及びM13RevプライマーによるDNAシークエンシングに供した。プライマー配列は表５に示される。
配列検証した各クローン(pEAK12d_INSP116-6HIS、プラスミドID番号14399、図62、及びpDEST12.2_INSP116-6HIS、プラスミドID 14411、図63)の１つの500mlの培養物からSambrook J.ら(1989)によって記載されている方法(Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press)でCsCl勾配精製マキシ-プレップDNAを調製し、プラスミドDNAを無菌水(又は10mM Tris-HCl pH8.5)中1μg/μlの濃度で再懸濁させて-20℃で貯蔵した。
【０１３５】
〔実施例15−INSP117のクローニング〕
〔15.1  ヒトcDNAテンプレートの調製〕
Superscript II RNase H-逆転写酵素(Invitrogen)を用い、製造業者が推奨するプロトコロルに従って種々の正常なヒト組織の全RNAサンプル(Clontech, Ambion, 及びインハウスサンプル)から第１鎖cDNAを調製した。オリゴ(dT)15プライマー(1μl、500μg/mlで)(Promega)、2μgのヒトの全RNA、1μlの10mM dNTPミックス(10mMの各dATP、dGTP、dCTP及びdTTP、中性pHで)及び無菌蒸留水で最終体積12μlにして1.5mlのエッペンドルフ管内で混ぜ合わせ、65℃で5分加熱してから氷上で冷却した。内容物を簡単な遠心分離で収集し、4μlの5×第１鎖緩衝液、2μlの0.1M DTT、及び1μlのRnaseOUT組換えリボヌクレアーゼインヒビター(40ユニット/μl、Invitrogen)を加えた。管の内容物を穏やかに混合し、42℃で2分間インキュベートしてから1μl(200ユニット)のSuperScript II酵素を加え、ピペット操作で穏やかに混した。混合物を42℃で50分間インキュベートしてから70℃で15分間加熱して不活化した。このcDNAに相補的なRNAを除去するため、1μl(2ユニット)の大腸菌RNase H(Invitrogen)を添加し、反応混合物を37℃で20分間インキュベートした。最終21μlの反応混合物に179μlの無菌水を加えて希釈し、200μlの総体積を得た。INSP117の増幅用テンプレートとして用いたヒトcDNAサンプルは胎盤、目及び網膜から誘導した。普遍的標準細胞系ミックスcDNAサンプル(Stratagene)も試験した。
〔15.2  cDNAライブラリー〕
ヒトcDNAライブラリー(バクテリオファージラムダ(λ)ベクター内)をClontechから購入し、或いはλGT10ベクターでインハウス製造した。バクテリオファージλDNAは、Wizard Lambda Preps DNA精製システムを用い(Promega, Corporation, Madison WI)、製造業者の説明書に従って大腸菌宿主株の小規模培養物から調製した。INSP117の増幅用テンプレートとして用いたヒトcDNAライブラリーサンプルは胎盤及び網膜から誘導した。
〔15.3  PCR用の遺伝子特異的クローニングプライマー〕
仮想のcDNAの完全コード配列を増幅するため、プライマーデザイナーソフトウェア(Scientific & Educational Software, PO Box 72045, Durham, NC 27722-2045, USA)を用いて18〜25塩基の長さを有する１対のPCRプライマーを設計した。55±10℃に近いＴmと40〜60％のGC含量を有するようにPCRプライマーを最適化した。ほとんど又は全く特異的プライミングなしで標的配列(INSP117)に対して高い選択性を有するプライマーを選択した。  〔15.4  種々のヒトcDNAテンプレート及びファージライブラリーcDNAからのINSP117のPCR増幅〕
遺伝子特異的クローニングプライマー(INSP117-CP1及びINSP117-CP2、図64、図65及び表６)を設計してINSP117予測の完全な399bpコード配列をカバーする412bpのcDNAフラグメントを増幅した。INSP117予測による公共のEST配列データベースの質問は、この配列が胎盤、目及び網膜のcDNAテンプレート内で発現されうることを示唆した。そこで、この遺伝子特異的クローニングプライマーINSP117-CP1及びINSP117-CP2を、セクション1.1で列挙したヒトcDNAサンプル及びセクション1.2でPCRテンプレートとして列挙したファージライブラリーcDNAサンプルと共に使用した。PCR反応は、1×Platinum(登録商標)Taq High Fidelity PCR緩衝液、2mM MgSO4、200μM dNTPs、0.2μMの各クローニングプライマー、2.5ユニットのPlatinum(登録商標)Taq High Fidelity DNAポリメラーゼ(Invitrogen)、100ngのヒトcDNAテンプレート、及び最終濃度の0倍、1倍、又は2倍のどれかのPCRxエンハンサー溶液(Invitrogen)を含む最終体積50μlで行った。熱サイクリングは、以下のようにプログラムしたMJ Research DNA Engineを用いて行った：94℃で2分；40サイクル(94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で1分)後、68℃で7分の1サイクル及び4℃で保持サイクル。
50μlの各増幅産物を全て1×TAE緩衝液(Invitrogen)中0.8％アガロースゲル上で可視化すると、１つのPCR集団だけが、網膜の第１鎖cDNAテンプレートに相当するサンプル内でほぼ予測した分子集団で移動することが分かった。このPCR産物をQiagen MinElute DNA精製システム(Qiagen)で精製した。このPCR産物を10μlのEB緩衝液(10mM Tris.Cl, pH8.5)に溶出させて直接サブクローニングした。
【０１３６】
【表６】
2007527203.tif 000007
【０１３７】
〔15.5  PCR産物のサブクローニング〕
Invitrogen社から購入したTAクローニングキットを用いて製造業者が指定する条件で、PCR産物をトポイソメラーゼI改変クローニングベクター(pCRII-TOPO)にサブクローニングした。要するに、ヒト網膜cDNA増幅からゲル精製した4μlのPCR産物を1μlのTOPOベクター及び1μlの塩溶液と室温で15分間インキュベートした。次に、以下のように反応混合物で大腸菌株TOP10(Invitrogen)を形質転換させた：50μl分量のOne Shot TOP10細胞を氷上で解凍し、2μlのTOPO反応を添加した。混合物を氷上で15分間インキュベートしてから42℃で正確に30秒間インキュベートして熱ショックを与えた。サンプルを氷上に戻し、250μlの温かい(室温)SOC培地を添加した。サンプルを振とうさせながら(220rpm)37℃で1時間インキュベートした。この形質転換混合物を、アンピシリン(100μg/ml)を含むL-ブロス(LB)プレート上に塗布し、37℃で一晩インキュベートした。
〔15.6  コロニーPCR〕
無菌つまようじでコロニーを50μlの無菌水中に接種した。MJ Research DNA Engineを用いて1×AmpliTaqTM緩衝液、200μM dNTPs、20pmolesのT7プライマー、20pmolesのSP6プライマー、1ユニットのAmpliTaqTM(Perkin Elmer)を含む総反応体積20μlのPCRに10μl分量の接種材料を供した。サイクリング条件は以下のとおりだった：94℃で2分；30サイクル(94℃で30秒、48℃で30秒及び72℃で1分)。サンプルを4℃で維持(保持サイクル)した後、さらに解析した。
PCR反応産物を1×TAE緩衝液中1％アガロースゲル上で可視化した。予想したPCR産物サイズ(412bpのcDNA＋187bp(複数のクローニング部位又はMCSのため))を与えたコロニーを、アンピシリン(100μg/ml)を含む5mlのL-ブロス(LB)内、220rpmで振とうさせながら37℃にて一晩増殖させた。
〔15.7  プラスミドDNA調製及びシークエンシング〕
Qiaprep Turbo 9600ロボットシステム(Qiagen)又はWizard Plus SV Miniprepsキット(Promegaカタログ番号1460)を用い、製造業者の説明書に従って5mlの培養物からミニプレッププラスミドDNAを調製した。プラスミドDNAを100μlの無菌水に溶出させた。エッペンドルフBO光度計でDNA濃度を測定した。BigDye Terminatorシステム(Applied Biosystemsカタログ番号4390246)を用い、製造業者の説明書に従ってプラスミドDNA(200〜500ng)をT7プライマー及びSP6プライマーによるDNAシークエンシングに供した。プライマー配列は表６に示される。シークエンシング反応をDye-Exカラム(Qiagen)又はMontage SEQ 96クリーンアッププレート(Milliporeカタログ番号LSKS09624)で精製してからApplied Biosystems 3700シークエンサーで解析した。
配列解析は、予測したINSP117配列に100％マッチングするクローンを同定した。このクローン化cDNAフラグメントの配列は図65に示される。このクローン化PCR産物のプラスミドマップ(pCRII-TOPO-INSP117)(プラスミドID.14417)は図66に示される。
【０１３８】
〔実施例16−INSP117用の哺乳類細胞発現ベクターの構築〕
GatewayTMクローニング方法論(Invitrogen)により、プラスミド14417をPCRテンプレートとして用いて、6HISタグをコードする3’配列を有するINSP117 ORF配列を含むpEAK12d(図71)及びpDEST12.2(図72)発現クローンを生成した。
〔16.1  インフレーム6HISタグ配列に融合したゲートウェイ適合性INSP117 ORFの生成〕
ゲートウェイクローニングプロセスの第１段階は２工程PCR反応を含み、この２工程PCR反応が、attB1組換え部位とコザック配列によって5’末端で隣接し、かつインフレーム6ヒスチジン(6HIS)タグ、終止コドン及びattB2組換え部位をコードする配列によって3’末端で隣接しているINSP117のORFを生成する(ゲートウェイ適合性cDNA)。第１PCR反応(最終体積50μl)は以下の成分を含む：1μl(40ng)のプラスミド14417、1.5μlのdNTPs(10mM)、10μlの10×Pfxポリメラーゼ緩衝液、1μlのMgSO4(50mM)、0.5μlの各遺伝子特異的プライマー(100μM)(INSP117-EX1及びINSP117-EX2)、及び0.5μlのPlatinum Pfx DNAポリメラーゼ(Invitrogen)。PCR反応は、95℃で2分の最初の変性工程後、12サイクル(94℃で15秒；55℃で30秒及び68℃で2分)；及び4℃の保持サイクル。1×TAE緩衝液(Invitrogen)中0.8％アガロースゲル上で増幅産物を可視化し、予測した分子集団で移動する産物をWizard PCR Preps DNA精製システム(Promega)で製造業者の説明書に従ってゲルから精製し、50μlの無菌水に回収した。
第２PCR反応(最終体積50μl)は10μlの精製PCR1産物、1.5μlのdNTPs(10mM)、5μlの10×Pfxポリメラーゼ緩衝液、1μlのMgSO4(50mM)、0.5μlの各ゲートウェイ転換プライマー(100μM)(GCPフォワード及びGCPリバース)及び0.5μlのPlatinum Pfx DNAポリメラーゼを含んでいた。第２PCR反応の条件は以下のとおりだった：95℃で1分；4サイクル(94℃で15秒；50℃で30秒及び68℃で2分)；25サイクル(94℃で15秒)；55℃で30秒及び68℃で2分）；次いで4℃の保持サイクル。Wizard PCRプレップDNA精製システム(Promega)を用い、製造業者の説明書に従ってPCR産物をゲル精製した。
【０１３９】
〔16.2  ゲートウェイ適合性INSP117 ORFのゲートウェイエントリーベクターpDONR221並びに発現ベクターpEAK12d及びpDEST12.2へのサブクローニング〕
ゲートウェイクローニングプロセスの第２段階は、以下のようなゲートウェイ改変PCR産物のゲートウェイエントリーベクターpDONR221(Invitrogen、図67)へのサブクローニングを含む：PCR2から精製した5μlの産物を、最終体積10μl中1.5μlのpDONR221ベクター(0.1μg/μl)、2μlのBP緩衝液及び1.5μlのBPクロナーゼ酵素ミックス(Invitrogen)とRTで1時間インキュベートした。プロテイナーゼKを1μl(2μg/μl)を添加して反応を終わらせ、37℃でさらに10分間インキュベートした。この反応の一定分量(1μl)を用いて以下のようにエレクトロポレーションで大腸菌DH10B細胞を形質転換させた：25μl分量のDH10Bエレクトロコンピテント細胞(Invitrogen)を氷上で解凍し、1μlのBP反応ミックスを加えた。冷却した0.1cmのエレクトロポレーションキュベットに混合物を移して、BioRad Gene-PulserTMを用い、製造業者が推奨するプロトコロルに従って細胞をエレクトロポレートした。エレクトロポレーション直後、予め室温に温めたSOC培地(0.5ml)を添加した。混合物を15mlのスナップ-キャップ管に移し、振とうさせながら(220rpm)37℃で1時間インキュベートした。この形質転換混合物の一定分量(10μl及び50μl)を、カナマイシン(40μg/ml)を含むL-ブロス(LB)プレート上に塗布し、37℃で一晩インキュベートした。
結果の６つのコロニーの5mlの培養物からQiaprep Turbo 9600ロボットシステム(Qiagen)を用いてプラスミドミニプレップDNAを調製した。BigDyeTerminator システム(Applied Biosystemsカタログ番号4390246)を用い、製造業者の説明書に従ってプラスミドDNA(150〜200ng)を21M13及びM13RevプライマーによるDNAシークエンシングに供した。プライマー配列は表６に示される。シークエンシング反応をDye-Exカラム(Qiagen)又はMontage SEQ 96クリーンアッププレート(Milliporeカタログ番号LSKS09624)で精製してからApplied Biosystems 3700シークエンサーで解析した。
【０１４０】
正しい配列(pENTR_INSP117-6HIS、プラスミドID 14594、図70)を含むクローンの１つのプラスミド溶出液(2μl又は約150ng)を、最終体積10μl中1.5μlのpEAK12dベクター又はpDEST12.2ベクターのどちらか(図68＆69)(0.1μg/μl)、2μlのLR緩衝液及び1.5μlのLRクロナーゼ(Invitrogen)を含む組換え反応で用いた。この混合物をRTで1時間インキュベートし、プロテイナーゼK(2μg)を添加して反応を終わらせ、37℃でさらに10分間インキュベートした。この反応の一定分量(1ul)を用いて以下のようなエレクトロポレーションで大腸菌DH10B細胞を形質転換させた：25μl分量のDH10Bエレクトロコンピテント細胞(Invitrogen)を氷上で解凍し、1μlのLR反応ミックスを添加した。冷却した0.1cmのエレクトロポレーションキュベットに混合物を移して、BioRad Gene-PulserTMを用い、製造業者が推奨するプロトコロルに従って細胞をエレクトロポレートした。エレクトロポレーション直後、予め室温に温めたSOC培地 (0.5ml)を添加した。混合物を15mlのスナップ-キャップ管に移し、振とうさせながら(220rpm)37℃で1時間インキュベートした。この形質転換混合物の一定分量(10μl及び50μl)を、アンピシリン(100μg/ml)を含むL-ブロス(LB)プレート上に塗布し、37℃で一晩インキュベートした。
その結果各ベクターでサブクローニングされた６つのコロニーの5mlの培養物から、Qiaprep Turbo 9600ロボットシステム(Qiagen)を用いてプラスミドミニプレップDNAを調製した。pEAK12dベクター中のプラスミドDNA(200〜500ng)を上述したようなpEAK12F及びpEAK12RプライマーによるDNAシークエンシングに供した。pDEST12.2ベクター中のプラスミドDNA(200〜500ng)は、上述したような21M13及びM13RevプライマーによるDNAシークエンシングに供した。プライマー配列は表６に示される。
配列検証した各クローン(pEAK12d_INSP117-6HIS、プラスミドID番号14601、図71、及びpDEST12.2_INSP117-6HIS、プラスミドID 14605、図72)の１つの500mlの培養物から、Sambrook J.ら(1989)によって記載されている方法(Molecular Cloning,  a Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press)で、CsCl勾配精製マキシ-プレップDNAを調製し、プラスミドDNAを無菌水(又は10mM Tris-HCl pH8.5)中1μg/μlの濃度で再懸濁させて-20℃で貯蔵した。
【０１４１】
〔実施例17：INSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117の発現及び精製〕
さらに実験を行い、本明細書で開示したヌクレオチド及びアミノ酸配列に基づいてINSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117ポリペプチドのin vivo組織分布及び発現レベルを決定した。
INSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117の転写物の存在は、種々のヒト組織由来cDNAのPCRで調査しうる。INSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117転写物は、試験するサンプル内で非常に低レベルで存在するかもしれない。それゆえに、RNA調製品中の小量のゲノムコンタミネーションが誤った正の結果を与えるので、種々のヒト組織内における転写部物の存在を確立するための実験の設計には極度な注意が必要である。従って、全てのRNAは、逆転写用に使う前にDNAseで処理すべきである。さらに、各組織では、逆転写が行われなかったコントロール反応（-ve RTコントロール）を設定しうる。
例えば、各組織由来の1μgの全RNAを用いてMultiscript逆転写酵素(ABI)及びランダムヘキサマープライマー(random hexamer primers)でcDNAを生成しうる。各組織について、逆転写酵素を除き全ての成分が添加されるコントロール反応(-ve RTコントロール)を設定する。各組織について、逆転写されたRNAサンプルとマイナスRTコントロールについてPCR反応を設定する。本明細書で提供される配列情報に基づき、INSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117-特異的プライマーを容易に設計することができる。逆転写されたサンプル中に正確な分子量の産物が存在することと共にマイナスRTコントロール中に産物が存在しないことは、当該組織中に転写物が存在することの証拠と解釈しうる。上述したように生成されるもののみならず、いずれの適切なcDNAライブラリーもINSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117転写物のスクリーニングのために使用しうる。
INSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117ポリペプチドの組織分布パターンは、さらにそれらポリペプチドの機能に関係する有用な情報を提供するだろう。
【０１４２】
さらに、pCR4-TOPO-INSP113(図18)、pCR4-TOPO-INSP113sv(図19)、pDONR(図20)、pEAK12d(図21)、pDEST12.2(図22)、pENTR-INSP113-6HIS(図23)、pENTR-INSP113sv-6HIS(図24)、pEAK12d-INSP113-6HIS(図25)、pEAK12d-INSP113sv-6HIS(図26)、pDEST12.2-INSP113-6HIS(図27)、pDEST12.2-INSP113sv-6HIS(図28)、pCR4-TOPO-INSP114(図31)、pCR4-TOPO-INSP114-GR1(図35)、pCR4-TOPO-INSP114-SV2(図36)、pDONR 221(図38)、pEAK12d(図39)、pDEST12.2(図40)、pENTR_INSP114-6HIS(図41)、pEAK12d_INSP114-6HIS(図42)、pDEST12.2_INSP114-6HIS(図43)、pENTR_INSP114-SV1-6HIS(図44)、pEAK12d_INSP114-SV1-6HIS(図45)、pDEST12.2_INSP114-SV1-6HIS(図46)、pENTR_INSP114-SV2-6HIS(図47)、pEAK12d_INSP114-SV2-6HIS(図48)、pDEST12.2_INSP114-SV2-6HIS(図49)、pDONR 221(図51)、pEAK12d(図52)、pDEST12.2(図 53)、pENTR_INSP115-6HIS(図54)、pEAK12d_INSP115-6HIS(図55)、pDEST12.2_INSP115-6HIS(図56)、pDONR 221(図58)、pEAK12d(図59)、pDEST12.2(図60)、pENTR_INSP116-6HIS(図61)、pEAK12d_INSP116-6HIS(図62)、pDEST12.2_INSP116-6HIS(図63)、pCRII-TOPO-INSP117(図66)、pDONR 221(図67)、pEAK12d(図68)、pDEST12.2(図69)、pENTR_INSP117-6HIS(図70)、pEAK12d_INSP117-6HIS(図71)及びpDEST12.2_INSP117-6HIS(図72)発現ベクターを用いてさらなる実験を行うことができる。これらベクターによる哺乳類細胞系のトランスフェクションはINSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117タンパク質の高レベル発現を可能にしうるので、INSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117ポリペプチドの機能特性の継続した調査を可能にする。以下の材料及び方法は、このような実験で好適なものの一例である。
【０１４３】
（細胞培養）
エプスタイン-バーウイルス(Epstein-Barr virus)核抗原を発現するヒト胎児腎臓293細胞(HEK293-EBNA,Invitrogen)をEx-細胞VPRO血清-フリー培地(シードストック、維持培地、JRH)中懸濁状態で維持する。トランスフェクションの16〜20時間前（-1日目）に、細胞を２つのT225フラスコに接種する(１つのフラスコにつき50ml、DMEM/F12(1:1)、2％FBS接種培地(JRH)を2×105細胞/mlの密度で含有)。次の日(トランスフェクション0日目)、JetPEITM試薬(2μl/μgのプラスミドDNA、ポリプラス(PolyPlus)-トランスフェクション)を用いてトランスフェクションを行う。各フラスコで、プラスミドDNAがGFP(蛍光レポーター遺伝子)DNAと共-トランスフェクトされる。次に、トランスフェクション混合物を２つのT225フラスコに加え、37℃(5％CO2)で6日間インキュベートする。陽性トランスフェクションの確認は1日目と6日目での定性蛍光試験で実施しうる(Axiovert 10 Zeiss)。
6日目(収穫日)に２つのフラスコの上清をプールし、遠心分離し(例えば4℃で400g)、一意の識別子を付けたポットに入れる。１分量(500μl)を6His-タグ付きタンパク質のQC用に保持する(内部バイオプロセッシングQC)。
トランスフェクション薬としてPolysciencesのポリエチレンイミン(PolyEthyleneImine)を用いる照合番号BP/PEI/HH/02/04、名称“懸濁細胞のPEIトランスフェクション”のプロトコロルに従うことで、スケールアップバッチを実現しうる。
（精製プロセス）
C-末端6Hisタグを有する組換えタンパク質を含有する培養基サンプルを冷緩衝液A(50mM NaH2PO4；600mM NaCl；8.7%(w/v)グリセロール,pH7.5)で希釈する。このサンプルを無菌フィルター(Millipore)でろ過し、4℃で無菌の四角培地ボトル(Nalgene)内で維持する。   自動サンプル装填装置(Labomatic)に連結したVISIONワークステーション(Applied Biosystems)で4℃にて精製を行う。精製手順は以下の２つの連続工程を含む：Niイオンで荷電されているPoros 20MC(Applied Biosystems)カラム(4.6×50mm，0.83mL）上の金属アフィニティークロマトグラフィー、次いでSephadex G-25ミデイアム(Amersham Pharmacia)カラム(1.0×10cm)上のゲルろ過。
最初のクロマトグラフィー工程では、金属アフィニティーカラムを30カラム容積のEDTA溶液(100mMのEDTA；1MのNaCl；pH8.0)で再生させ、15カラム容積の100mMのNiSO4溶液で洗浄してNiイオンを再荷電し、10カラム容積の緩衝液Aで洗浄し後、7カラム容積の緩衝液B(50mMのNaH2PO4；600mMのNaCl；8.7％(w/v)グリセロール；400mMのイミダゾール；pH7.5)で洗浄し、最後に15mMのイミダゾールを含む15カラム容積の緩衝液Aで平衡化する。Labomaticサンプル装填装置でサンプルを200mlのサンプルループに移し、引き続きNi金属アフィニティーカラム上に流速10ml/分で充填する。カラムを12カラム容積の緩衝液Aで洗浄後、20mMイミダゾールを含む28カラム容積の緩衝液Aで洗浄する。20mMイミダゾール洗浄の間に、ルーズに付着していた混入タンパク質がカラムから溶出する。組換えHisタグ付きタンパク質は流速2ml/分で10カラム容積の緩衝液Bで最後に溶出し、この溶出タンパク質を収集する。
【０１４４】
第２クロマトグラフィー工程では、Sephadex G-25ゲルろ過カラムを2mlの緩衝液D(1.137MのNaCl；2.7mMのKCl；1.5mMのKH2PO4；8mMのNa2HPO4；pH7.2)で再生し、引き続き4カラム容積の緩衝液C(137mMのNaCl；2.7mMのKCl；1.5mMのKH2PO4；8mMのNa2HPO4；20％(w/v)グリセロール；pH7.4)で平衡化する。Niカラムから溶出したピーク画分は、VISIONに組み込まれたサンプル装填装置で自動的にSephadex G-25カラム上に装填され、2ml/分の流速の緩衝液Cでタンパク質が溶出される。この画分を無菌遠心分離フィルター(Millipore)でろ過し、凍結して-80℃で保存した。一定分量のサンプルを抗His抗体でSDS-PAGE(4〜12％NuPAGEゲル；Novex)ウェスタンブロットによって分析する。NuPAGEゲルは、0.1％のクーマシーブルーR250染色液(30％メタノール、10％酢酸)中、室温で1時間染色し、引き続きバックグラウンドが除かれてタンパク質のバンドが鮮明に見えるようになるまで、20％メタノール、7.5%酢酸中で脱染しうる。
電気泳動後、タンパク質をゲルからニトロセルロース膜へ電気的に移動させる。この膜を緩衝液E(137mMのNaCl；2.7mMのKCl；1.5mMのKH2PO4；8mMのNa2HPO4；0.1％Tween20、pH7.4)中の5％粉乳で室温にて1時間遮断し、引き続き緩衝液E中の2.5％粉乳中で２種のウサギポリクローナル抗-His抗体の混合物(G-18及びH-15、各々0.2μg/ml；Santa Cruz)と4℃で一晩インキュベートする。室温でさらに1時間インキュベーション後、膜を緩衝液Eで洗浄してから(３×10分)、2.5％粉乳を含む緩衝液Eで1/3000に希釈したHRP結合抗ウサギ二次抗体(DAKO,HRP0399)と室温で2時間インキュベートする。緩衝液Eで洗浄(３×10分)後、膜をECLキット(Amersham Pharmacia)で1分処理する。引き続き膜をハイパーフィルム(Hyperfilm)(Amersham Pharmacia)に露出し、このフィルムを現像してウェスタンブロット画像を視覚的に分析する。
クーマシー染色で検出可能なタンパク質バンドを示したサンプルでは、標準物質としてウシ血清アルブミンを用いてBCAタンパク質アッセイキット(Pierce)でタンパク質濃度を決定することができる。
さらに、細胞系内におけるポリペプチドの過剰発現又は発現のノック-ダウンを利用して宿主細胞ゲノムの転写活性化に及ぼす効果を決定することができる。ウエスタンブロット法と組み合わせた免疫沈降法及び質量分析と組み合わせた免疫沈降法でINSP113、INSP114、INSP115、INSP116及びINSP117ポリペプチドの二量体化パートナー、コアクチベーター及びコリプレッサーを同定することができる。
【０１４５】
〔実施例18−凝固因子Ｘと同様の生物学的活性の検出のためのアッセイ〕
〔１．Ｔリンパ球の反応を標的にするアッセイ〕
（Fas-リガンド-誘導Ｔ細胞死）
このアッセイは、受容体媒介細胞死の新しいモジュレーターを明らかにするだろう。
このアッセイでは、抗6-hisモノクロナール抗体と結合した組換え体6ヒスチジン-タグ付きFasリガンドでジャーカット細胞(ヒトＴ細胞株)を刺激することによって、Ｔ細胞アポトーシスを誘導する。細胞が死ぬときに培養基内で放出される細胞質酵素、LDHの放出によって死を数量化する。その読み出しは490nmで解読される比色分析である。Ｔ細胞は多くの自己免疫疾患で病原性であることが分かっており、抗原特異的Ｔ細胞死を制御できることは治療戦略である(例えば、クローン病の患者における抗-TNFα治療)。
（ヒト-MLR：増殖及びサイトカイン分泌）
この細胞ベースアッセイは、別のドナー由来のPBMCによる刺激に対して、リンパ球の増殖及びサイトカインの分泌又は阻害に及ぼす新規タンパク質の効果を測定する(アロ反応性)。これらアッセイは、抗原特異的Ｔ細胞機能及び抗原提示細胞機能に焦点を当て、これらはいずれの自己免疫疾患でも重大な細胞の反応である。分泌されるサイトカイン(IL-2、4、5、10、TNF-α及びIFN-γ)をCBAで数量化する。
注意：増殖とサイトカイン分泌は無関係の反応である。
【０１４６】
（マウス-MLR：増殖）
この細胞ベースアッセイは、別のドナー(マウス株)由来の脾臓細胞で刺激後にマウス脾臓細胞のリンパ球の増殖又は阻害に及ぼす新規タンパク質の効果を測定する。この細胞ベースアッセイは、Ｔリンパ球と抗原提示細胞の反応に及ぼす新規タンパク質の効果を測定し、これを用いてh-MLRアッセイで同定する陽性のものとヒットするものの活性を確認する。このアッセイは、ヒト疾患のマウスモデルで試験するタンパク質を選択するために役立つだろう。
（スーパー抗原、TSSTで刺激されるヒトPBMC）
スーパー抗原は、Ｔ細胞に作用する免疫系の強力なモジュレーターである。スーパー抗原は、IBD、炎症性皮膚疾患(アトピー皮膚炎のような)及び乾癬のような免疫学的に媒介される障害に影響を与える。この細胞アッセイでは、TCRによってＴリンパ球活性化を特異的に標的にするが、古典的な抗原に対するＴ細胞の反応とは異なった、特に共-刺激性分子に関して異なった要件で行う。
（ConA又はPHAで刺激されるヒトPBMC）
この細胞ベースアッセイは、サイトカインビーズアレイ(CBA)アッセイ(IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-5、IL-4及びIL-10)で測定されるような種々の細胞に作用する２つの異なった刺激によって誘導されるサイトカイン分泌に及ぼす新規タンパク質の効果を測定する.
ほとんどのサイトカインは、二重作用、すなわち炎症誘導作用又は抗-炎症作用を有することがあり、損傷、環境及び細胞標的によって決まる。サイトカインの分泌を調節する能力のあるいずれのタンパク質も治療薬としての可能性がある(例えばIFN-γ及びTNF-αの低減はTh1-媒介自己免疫疾患で有益であり、一方IL-4、IL-5の低減は、Th2-媒介疾患で有益であり、IL-10の誘導はMS及びSLEで興味深いだろう)。
【０１４７】
〔２．単球/マクロファージ及び顆粒球の反応を標的にするアッセイ〕
（LPSで刺激されたヒトPBMC）
この細胞ベースアッセイは、単球/マクロファージ及び顆粒球に作用するLPSによって誘導されるサイトカイン分泌(IFN-γ、TNF-α)に及ぼす新規タンパク質の効果を測定する。  IFN-γ及びTNF-α分泌を調節する能力のあるいずれのタンパク質もTh1-媒介自己免疫疾患で有益だろう。
〔３．好中球の反応を標的にするアッセイ〕
好中球は、リウマチ性関節炎のような炎症疾患及び自己免疫疾患で重要である。IL-8のような白血球化学誘引物質は、細胞と微小血管内皮との一連の付着相互作用を惹起し、好中球の活性化、付着及び最終的には移動(migration)という結果になる。好中球の組織浸潤はこれら細胞の細胞形態における特異的変化に伴う細胞骨格要素の再編成に依存する。
この細胞ベースアッセイは、ヒト好中球の細胞骨格の再編成に及ぼす新規タンパク質の効果を測定する。
〔４．Ｂリンパ球の反応を標的にするアッセイ〕
自己抗体及び浸潤性Ｂ細胞は、全身性エリテマトーデス(SLE)、リウマチ性関節炎(RA)、シェーグレン症候群(Sjogren’s syndrome)及び重症筋無力症のような種々の自己免疫疾患の病原で重要であると考えられる。強引な証拠は、Ｂ細胞ホメオスタシスを調節しないと、病原性抗体や持続性炎症を引き起こす自己反応性Ｂ細胞の不適切な生存につながる免疫耐性を発症しうることを示す。Ｂ細胞受容体誘導後のＢ細胞の増殖、生存及び分化の調節で重要な役割を果たす新規な因子の同定は、新規療法の開発で重大な関わりがある。
（Ｂ細胞の増殖）
この細胞ベースアッセイは、Ｂ細胞の生存に及ぼす新規タンパク質の効果を測定する。  （Ｂ細胞の共-刺激）
この細胞ベースアッセイは、Ｂ細胞の共-SG液に及ぼす新規タンパク質の効果を測定する。
〔５．単球及びミクログリアの反応を標的にするアッセイ〕
（THP-1カルシウム流量）
THP1-細胞アッセイにおけるCa+-流量は、小胞体からの細胞内カルシウム放出(一般的第２メッセンジャー事象)を誘導するタンパク質の能力に及ぼす新規タンパク質の効果を測定する。
〔６．ミクログリア細胞の増殖(次のIACに提供されるだろう)〕
ミクログリア前駆体の増殖の際、いくつかのサイトカインを含む多くのコロニー刺激因子が重要な役割を果たすことが分かっている。その中で、M-CSFはマクロファージ/ミクログリアの成熟の最終段階で非常に重要であり、他のいずれの因子によっても置き換えることができない。この生物反応を評価すると、ミクログリア活性に影響を与える方法、ひいてはMS治療の可能性のある分子を同定するための機会を提供することができる。
細胞ベースアッセイを開発してM-CSFに対するミクログリア細胞系の増殖反応を測定した。その実行可能性及び頑丈さのフェーズは最適な結果を示した。このアッセイは96ウェルプレート内であり；放射性基質は必要なく、容易に自動化される。
【０１４８】
〔７．ケモカイン様活性を検出するためのアッセイ〕
構造-活性の関係についての研究は、アミノ末端領域を利用してケモカインが受容体と結合して活性化することを示す。この領域内のアミノ酸に向けられたタンパク質分解的消化、突然変異誘導、又は化学的改変はアンタゴニスト活性を有する化合物を生じさせうる(Loetscher P and Clark-Lewis I, J Leukoc Biol, 69: 881-884, 2001 Lambeir A, et al. J Biol Chem, 276: 29839-29845, 2001, Proost P, et al. Blood, 98 (13):3554-3561, 2001)。従って、対応するケモカインのアミノ末端領域又は他の領域中の１又は２以上の残基の特異的改変(欠失、非保存的置換)から生じたアンタゴニスト分子は、炎症性疾患及び自己免疫疾患治療の可能性があると考えられる(WO 02/28419; WO 00/27880; WO 99/33989; Schwarz MK and Wells TN, Curr Opin Chem Biol, 3: 407-17, 1999)。従って、本特許出願のさらなる目的は、本発明のポリペプチドを改変することによって生成されるこのような種類のアンタゴニストで表される。
本発明のポリペプチド及び関連試薬の治療における適用は、薬物発見及び前臨床開発の際にケモカイン又は他の生物学的産物のバリデーションで知られている動物の細胞、組織及びモデルを利用するin vivo/in vitroアッセイの手段によって(Coleman RA et al., Drug Discov Today, 6: 1116-1126, 2001; Li AP, Drug Discov Today, 6: 357-366, 2001; Methods Mol. Biol vol. 138, “Chemokines Protocols”, edited by Proudfoot AI et al., Humana Press Inc., 2000; Methods Enzymol, vol. 287 and 288, Academic Press, 1997)、又はin silico/コンピューターアプローチの手段(Johnson DE and Wolfgang GH, Drug Discov Today, 5: 445-454, 2000)によって評価することができる(安全性、薬物速度論及び効力に関して)。
本特許出願は、細胞増殖性疾患、自己免疫／炎症性障害、心臓血管障害、神経障害、発達障害、代謝障害、感染症及び他の病的状態のような疾患の治療又は予防で適宜処方される医薬組成物中の活性成分として有用でありうる新規なケモカイン様ポリペプチド及び一連の関連試薬を開示する。特に、ケモカインの既知の特性を考慮すると、開示されるポリペプチド及び試薬は、異常又は不完全な細胞移動を含む状態を取り扱うべきである。このような状態の非限定例は以下のとおりである：関節炎、リウマチ性関節炎(RA)、乾癬性関節炎、骨粗しょう症、全身性エリテマトーデス(SLE)、全身性硬化症、強皮症、多発性筋炎、糸球体腎炎、線維症、肺線維症及び肺炎、アレルギー又は過敏性疾患、皮膚炎、喘息、慢性閉塞性呼吸器疾患(COPD)、炎症性腸疾患(IBD)、クローン病、潰瘍性結腸炎、多発性硬化症、敗血症性ショック、HIV感染、移植片拒絶反応、創傷治癒、転移、子宮内膜症、肝炎、肝臓線維症、癌、無痛覚症、及びアテローム性動脈硬化症関連血管炎症。
【０１４９】
ケモカイン様ポリペプチドバリデーション及び特徴づけのための細胞ベースアッセイ及び動物ベースアッセイ
細胞培養又は動物モデルを用いてケモカインの特異性、力価、及び効力を試験するためのいくつかのアッセイ、例えば、in vitro化学走性アッセイ(Proudfoot A, et al. J Biol Chem 276: 10620-10626, 2001; Lusti-Narasimhan M et al., J Biol Chem, 270: 2716-21, 1995)、又はマウス耳膨潤(Garrigue JL et al., Contact Dermatitis, 30: 231-7, 1994)が開発されている。有用なツールや産物(抗体、トランスジェニック動物、放射標識タンパク質など)を生成するための多くの他のアッセイ及び技術がケモカインに専念した総説及び書籍に記載されており(Methods Mol. Biol vol. 138, “Chemokines Protocols”, edited by Proudfoot AI et al., Humana Press Inc., 2000; Methods Enzymol, vol. 287 and 288, Academic Press, 1997)、かつこれらをより正確な様式で用いて、可能な治療又は診断法及び用途とからめて本発明のケモカイン様ポリペプチド及び関連試薬の生物学的活性を検証することができる。
【０１５０】
（サイトカイン発現調節アッセイ）
１．序論
以下のin vitro細胞ベースのトリ-レプリカアッセイは、IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-5、IL-4及びIL-10のサイトカインビーズアレイ(CBA)アッセイで測定されるような、異なったヒト末梢血液単核細胞(hPBMC)に作用するConcanavalin A(Con A)によって誘導されたサイトカイン分泌に及ぼす本発明のタンパク質の効果を測定する。
最適条件は、96-ウェルプレート中、100,000細胞/ウェルで、最後は２％グリセロール中100μlである。
ミトゲン(ConA)の最適濃度は5ng/mlである。
アッセイの最適時間は48時間である。
読み出し選択はCBAである。
【０１５１】
２．設備及びソフトウェア
・96ウェル微量定量プレート光度計EX(Labsystem)
・Graph Pad Prismソフトウェア
・Excelソフトウェア
・フローサイトメーターBecton-Dickinson
・CBA解析ソフトウェア
・細胞培養用フード
・細胞培養用インキュベーター
・遠心分離機
・ピペット
３．材料及び試薬
・バフィーコート(Buffy coat)
・DMEM GIBCO 
・ヒト血清型 AB SIGMA 
・L-グルタミン GIBCO 
・ペニシリン-ストレプトマイシン GIBCO 
・フィコール(Ficoll) PHARMACIA 
・細胞培養用96ウェル微量定量プレート COSTAR 
・Concanavalin A SIGMA 
・ヒトTh1/Th2サイトカイン CBA キット Becton-Dickinson 
・PBS GIBCO 
・FALCON 50ml無菌Becton-Dickinson 
・BSA SIGMA 
・グリセロール MERCK 
・DMSO SIGMA 
・96ウェル微量定量プレート円錐底 NUNC 
【０１５２】
４．方法
4.1  バフィーコートからヒトPBMCの精製
バフィーコート１〜２をDMEMで希釈した。その後、25mlの希釈血液を50mlのFalcon管中の15mlのフィコール層上にゆっくり添加し、管を遠心分離した(2000rpm、20分、RTで、ブレーキなし)。間期細胞(リング)を収集し、細胞を25mlのDMEMで洗浄後遠心分離工程(1200rpm、5分)。この手順を３回繰り返した。バフィーコートは総計約600×106個の細胞を与えた。
4.2  スクリーニング
80μlの1.25×106細胞/mlをDMEM＋2.5％ヒト血清＋1％L-ブルタミン＋1％ペニシリン-ストレプトマイシンに希釈した後、96ウェル微量定量プレートに加えた。
１ウェル当たり10μlを加えた(ウェル毎に１条件)：タンパク質をPBS＋20％グリセロールに希釈した(タンパク質の最終希釈度は1/10)。
次にウェル毎に10μlのConA刺激を加えた(ウェル毎に１条件)：
−ConA 50μg/ml(ConAの最終濃度は5μg/mlである)
48時間後、細胞上清を集め、ヒトTh1/Th2サイトカインCBAキットBecton-Dickinsonでヒトサイトカインを測定した。
【０１５３】
4.3  CBA分析
(より詳細はCBAキットのパンフレットを参照されたい)
ｉ）混合したヒトTh1/Th2捕獲ビーズの調製
実験に必要なアッセイ管の数を決定した。
ミキシングの前に数秒間各捕獲ビーズ懸濁液を激しくボルテックスした。分析する各アッセイでは、10μl分量の各捕獲ビーズを“混合捕獲ビーズ”のラベルを付した単一の管に加えた。ビーズ混合物を徹底的にボルテックスした。
ii）試験サンプルの調製
上清をアッセイ希釈剤で希釈した(1:4)(20μlの上清＋60μlのアッセイ希釈剤)。サンプル希釈液を混合後、サンプルを96ウェル微量定量プレートの円錐底(Nunc)に移した。
iii）ヒトTh1/Th2サイトカインCBAアッセイ手順
希釈した50μlの上清を96ウェル微量定量プレート円錐底(Nunc)に加えた。50μlの混合捕獲ビーズを添加後、50μlのヒトTh1/Th2 PE 検出試薬を添加した。プレートをRTで3時間インキュベートし、直接露光しないように保護し、1500rpmで5分間遠心分離した。上清を慎重に捨てた。次の工程で、各ウェルに200μlの洗浄緩衝液を２回加え、1500rpmで5分間遠心分離し、上清を慎重に捨てた。その後、各ウェルに130μlの洗浄緩衝液を加えてビーズペレットを再懸濁させた。最後にサンプルをフローサイトメーターで分析した。CBAアプリケーションソフトウェア、Activity BaseとMicrosoft Excelソフトウェアでデータを解析した。
このアッセイの出力から、本発明のタンパク質がin-vitroで、試験した全てのサイトカインに(IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10)一貫した阻害効果を有するかを評価することができる。
さらに、EC50値に基づいて容易に、最もよく阻害されるサイトカインを評価してから、該サイトカインに特に関連することが分かっている特異的な自己免疫／炎症性疾患に到達することができる。
【０１５４】
（配列）
配列番号１：（INSP113完全ヌクレオチド配列）
2007527203.tif 000008
配列番号２：（INSP113完全FASTA配列；INSP113[ヒト]CAD28501.1仮想タンパク質）
2007527203.tif 000009
配列番号３：（INSP113成熟ヌクレオチド配列）
2007527203.tif 000010
配列番号４：（INSP113成熟ポリペプチド配列）
2007527203.tif 000011
配列番号５：（INSP114完全ヌクレオチド配列）
2007527203.tif 000012
2007527203.tif 000013
配列番号６：（INSP114完全FASTA配列；INSP114[ヒト]CAD38865.1ヒトポリペプチド）
2007527203.tif 000014
配列番号７：（INSP114成熟ヌクレオチド配列）
2007527203.tif 000015
配列番号８：（INSP114成熟ポリペプチド配列）
2007527203.tif 000016
配列番号９：（INSP115完全ヌクレオチド配列）
2007527203.tif 000017
2007527203.tif 000018
配列番号10：（INSP115完全FASTA配列；INSP115[ヒト]AAY53016ヒト分泌タンパク質クローン）
2007527203.tif 000019
配列番号11：（INSP115成熟ヌクレオチド配列）
2007527203.tif 000020
配列番号12：（INSP115成熟ポリペプチド配列）
2007527203.tif 000021
配列番号13：（INSP116完全ヌクレオチド配列）
2007527203.tif 000022
配列番号14：（INSP115完全FASTA配列；INSP116[ヒト]XP_087261.1仮想タンパク質）
2007527203.tif 000023
配列番号15：（INSP116成熟ヌクレオチド配列）
2007527203.tif 000024
配列番号16：（INSP116成熟ポリペプチド配列）
2007527203.tif 000025
配列番号17：（INSP117ヌクレオチド配列：エクソン１）
2007527203.tif 000026
配列番号18：（INSP117タンパク質配列：エクソン１）
2007527203.tif 000027
配列番号19：（INSP117ヌクレオチド配列：エクソン２）
2007527203.tif 000028
配列番号20：（INSP117タンパク質配列：エクソン２）
2007527203.tif 000029
配列番号21：（INSP117ヌクレオチド配列：エクソン３）
2007527203.tif 000030
配列番号22：（INSP117タンパク質配列：エクソン３）
2007527203.tif 000031
配列番号23：（INSP117ヌクレオチド配列：エクソン４）
2007527203.tif 000032
配列番号24：（INSP117タンパク質配列：エクソン４）
2007527203.tif 000033
配列番号25：（INSP117完全CDS）
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配列番号26：（INSP117完全タンパク質配列）
2007527203.tif 000035
2007527203.tif 000036
配列番号27：（INSP117成熟ヌクレオチド配列：エクソン１）
2007527203.tif 000037
配列番号28：（INSP117成熟ポリペプチド配列：エクソン１）
2007527203.tif 000038
配列番号29：（INSP117成熟ヌクレオチド配列）
2007527203.tif 000039
配列番号30：（INSP117成熟ポリペプチド配列）
2007527203.tif 000040
配列番号31：（染色体６についてのマウスオーソログのInpharmatica予測配列）
2007527203.tif 000041
配列番号32：（染色体10についてのマウスオーソログのInpharmatica予測配列）
2007527203.tif 000042
配列番号33：（染色体２についてのラットオーソログのInpharmatica予測配列）
2007527203.tif 000043
配列番号34：（染色体４についてのラットオーソログのInpharmatica予測配列）
2007527203.tif 000044
配列番号35：（ゲノムDNA骨格_3581についてのフグ科魚類オーソログのInpharmatica予測配列）
2007527203.tif 000045
配列番号36：（INSP113svヌクレオチド配列）
2007527203.tif 000046
配列番号37：（INSP113svポリペプチド配列）
2007527203.tif 000047
配列番号38：（INSP113sv成熟ヌクレオチド配列）
2007527203.tif 000048
配列番号39：（INSP113sv成熟ポリペプチド配列）
2007527203.tif 000049
配列番号40：（INSP114-SV2ヌクレオチド配列）
2007527203.tif 000050
配列番号41：（INSP114-SV2ポリペプチド配列）
2007527203.tif 000051
配列番号42：（INSP114-SV2成熟ヌクレオチド配列）
2007527203.tif 000052
配列番号43：（INSP114-SV2成熟ポリペプチド配列）
2007527203.tif 000053
配列番号44：（INSP115クローン化ヌクレオチド配列）
2007527203.tif 000054
2007527203.tif 000055
配列番号45：（INSP115クローン化ポリペプチド配列）
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配列番号46：（INSP115クローン化成熟ヌクレオチド配列）
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配列番号47：（INSP115クローン化成熟ポリペプチド配列）
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配列番号48：（INSP116クローン化ヌクレオチド配列）
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配列番号49：（INSP116クローン化ポリペプチド配列）
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配列番号50：（INSP116クローン化成熟ヌクレオチド配列）
2007527203.tif 000061
配列番号51：（INSP116クローン化成熟ポリペプチド配列）
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配列番号52：（INSP114-SV1ヌクレオチド配列）
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配列番号53：（INSP114-SV1ポリペプチド配列）
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配列番号54：（INSP114-SV1成熟ヌクレオチド配列）
2007527203.tif 000065
2007527203.tif 000066
配列番号55：（INSP114-SV1成熟ポリペプチド配列）
2007527203.tif 000067
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】INSP113ポリペプチド(配列番号2)、INSP114ポリペプチド(配列番号6)、INSP115ポリペプチド(配列番号10)、INSP116ポリペプチド(配列番号14)、INSP117ポリペプチド(配列番号26)、並びにそれらのマウス由来のオーソログ(AK049880.1、chr6_予測配列−配列番号31、chr10_予測配列−配列番号32、AK078681、BAC41130.1及びAAH15306.1)、ラット由来のオーソログ(chr2_予測配列−配列番号33、chr4_予測配列−配列番号34)、オナガザル(macaque)由来のオーソログ(BAB60784.1)及びフグ科魚類(pufferfish)由来のオーソログ(骨格_3581_予測配列−配列番号35)を含むSECFAM1ファミリー内の全ての15個のポリペプチド配列のClustalWアラインメントを示す。
【図２】INSP113(配列番号2)のSignalPシグナルペプチド予測を示し、シグナルペプチド確率：0.994、最大切断部位確率：0.400（位置25及び26間）である。
【図３】INSP114(配列番号6)のSignalPシグナルペプチド予測を示し、シグナルペプチド確率：0.969、最大切断部位確率：0.713（位置30及び31間）である。
【図４】INSP115(配列番号10)のSignalPシグナルペプチド予測を示し、シグナルペプチド確率：0.931、最大切断部位確率：0.274（位置42及び43間）である。
【図５】INSP116(配列番号14)のSignalPシグナルペプチド予測を示し、シグナルペプチド確率：0.908、最大切断部位確率：0.374（位置34及び35間）である。
【図６】INSP117(配列番号26)のSignalPシグナルペプチド予測を示し、シグナルペプチド確率：0.989、最大切断部位確率：0.748（位置30及び31間）である。
【図７】CAD28501.1(INSP113ポリペプチド；配列番号2)でクエリー後のゲノムスレッダー出力を示す。
【図８】CAD38865.1(INSP114ポリペプチド；配列番号6)でクエリー後のゲノムスレッダー出力を示す。
【図９】XP_08726.1(INSP116ポリペプチド；配列番号14)でクエリー後のゲノムスレッダー出力を示す。
【図１０】INSP117(配列番号26)でクエリー後のゲノムスレッダー出力を示す。
【図１１】AAY53016(INSP115；配列番号10)によりファミリーデータベースに対してBLASTPから得られたトップ15の結果と、AAY53016(INSP115；配列番号10)及びINSP114(配列番号6)間でBLASTPによって生成されたアラインメントを示す。
【図１２】INSP113(配列番号2)及びトップヒット構造1WHE間のゲノムスレッダーアラインメントを示し、クエリー配列の位置96、101、107及び118に４個の保存されたジスルフィド結合形成システインが見え(下の列)、システイン98及び109は、構造1WHEで定義されるように、保存されたジスルフィド対を表す。
【図１３】INSP117(配列番号26)に基づいて構成されるSECFAM1ファミリーのタンパク質のプロファイルを示す。
【図１４】INSP117の位置44〜129のアミノ酸(アラインメントの52〜138アミノ酸(図１))から解釈されるPROSITEフォーマットのファミリーコンセンサス配列を示し、キー：-＝各アラインメント位置間のスペーサー；Ｇ＝100％保存されたＧ残基；[VI]＝当該アラインメント位置でＶ又はＩのどちらか；P(0,1)＝このアラインメント位置で一度見つかり或いは全く見つからないＰ残基を表す。
【図１５】翻訳によるINSP113予測のヌクレオチド配列を示す。
【図１６】プライマーINSP113-CP1及びINSP113-CP2を用いてクローニングされたINSP113 PCR産物の翻訳によるヌクレオチド配列を示す。
【図１７】プライマーINSP113-CP1及びINSP113-CP2を用いてクローニングされたINSP113sv PCR産物の翻訳によるヌクレオチド配列を示す。
【図１８】pCR4-TOPO-INSP113のマップを示す。
【図１９】pCR4-TOPO-INSP113svのマップを示す。
【図２０】pDONR 221のマップを示す。
【図２１】発現ベクターpEAK12dのマップを示す。
【図２２】発現ベクターpDEST12.2のマップを示す。
【図２３】pENTR-INSP113-6HISのマップを示す。
【図２４】pENTR-INSP113sv-6HISのマップを示す。
【図２５】pEAK12d-INSP113-6HISのマップを示す。
【図２６】pEAK12d-INSP113sv-6HISのマップを示す。
【図２７】pDEST12.2-INSP113-6HISのマップを示す。
【図２８】pDEST12.2-INSP113sv-6HISのマップを示す。
【図２９】PCRプライマーの位置を示すコード配列の翻訳によるINSP114配列を示す。
【図３０】プライマーINSP114-CP1及びINSP114-CP2を用いてクローニングされたINSP114 PCR産物の翻訳によるヌクレオチド配列
【図３１】pCR4-TOPO-INSP114のマップを示す。
【図３２】INSP114cdsと、IMAGEクローン1616371(終止コドンを含む)の対応する領域のヌクレオチドアラインメントを示す。
【図３３】INSP114cdsと、IMAGEクローン1616371の対応する領域のアミノ酸アラインメントを示す。
【図３４】RACE反応で用いたプライマー対の位置を示すクローニングされたNSP114-GR1 PCR産物の翻訳によるヌクレオチド配列を示す。
【図３５】pCR4-TOPO-INSP114-GR1のマップを示す。
【図３６】プライマーINSP114-CP3及びINSP114-CP4を用いてクローニングされたINSP114-SV2 PCR産物の翻訳によるヌクレオチド配列を示す。
【図３７】pCR4-TOPO-INSP114-SV2のマップを示す。
【図３８】pDONR 221のマップを示す。
【図３９】発現ベクターpEAK12dのマップを示す。
【図４０】発現ベクターpDEST12.2のマップを示す。
【図４１】pENTR_INSP114-6HISのマップを示す。
【図４２】pEAK12d_INSP114-6HISのマップを示す。
【図４３】pDEST12.2_INSP114-6HISのマップを示す。
【図４４】pENTR_INSP114-SV1-6HISのマップを示す。
【図４５】pEAK12d_INSP114-SV1-6HISのマップを示す。
【図４６】pDEST12.2_INSP114-SV1-6HISのマップを示す。
【図４７】pENTR_INSP114-SV2-6HISのマップを示す。
【図４８】pEAK12d_INSP114-SV2-6HISのマップを示す。
【図４９】pDEST12.2_INSP114-SV2-6HISのマップを示す。
【図５０】cdsの翻訳によるINSP115配列を示す。
【図５１】pDONR 221のマップを示す。
【図５２】発現ベクターpEAK12dのマップを示す。
【図５３】発現ベクターpDEST12.2のマップを示す。
【図５４】pENTR_INSP115-6HISのマップを示す。
【図５５】pEAK12d_INSP115-6HISのマップを示す。
【図５６】pDEST12.2_INSP115-6HISのマップを示す。
【図５７】cdsの翻訳によるINSP116配列を示す。
【図５８】pDONR 221のマップを示す。
【図５９】発現ベクターpEAK12dのマップを示す。
【図６０】発現ベクターpDEST12.2のマップを示す。
【図６１】pENTR_INSP116-6HISのマップを示す。
【図６２】pEAK12d_INSP116-6HISのマップを示す。
【図６３】pDEST12.2_INSP116-6HISのマップを示す。
【図６４】翻訳によるINSP117予測のヌクレオチド配列を示す。
【図６５】プライマーINSP117-CP1及びINSP117-CP2を用いてクローニングされたINSP117 PCR産物の翻訳によるヌクレオチド配列を示す。
【図６６】pCRII-TOPO-INSP117のマップを示す。
【図６７】pDONR 221のマップを示す。
【図６８】発現ベクターpEAK12dのマップを示す。
【図６９】発現ベクターpDEST12.2のマップを示す。
【図７０】pENTR_INSP117-6HISのマップを示す。
【図７１】pEAK12d_INSP117-6HISのマップを示す。
【図７２】pDEST12.2_INSP117-6HISのマップを示す。
【図１】
2007527203.tif 000068
【図２】
2007527203.tif 000069
【図３】
2007527203.tif 000070
【図４】
2007527203.tif 000071
【図５】
2007527203.tif 000072
【図６】
2007527203.tif 000073
【図１４】
2007527203.tif 000074
【図７】
2007527203.tif 000075
【図８】
2007527203.tif 000076
【図９】
2007527203.tif 000077
【図１０】
2007527203.tif 000078
【図１１】
2007527203.tif 000079
【図１２】
2007527203.tif 000080
【図１３】
2007527203.tif 000081
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【図１５】
2007527203.tif 000084
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
2007527203.tif 000087
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【図１９】
2007527203.tif 000089
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【図２０】
2007527203.tif 000091
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【図２１】
2007527203.tif 000093
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【図２２】
2007527203.tif 000095
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
2007527203.tif 000101
2007527203.tif 000102
【図２８】
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2007527203.tif 000104
【図２９】
2007527203.tif 000105
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【図３０】
2007527203.tif 000107
【図３１】
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【図３２】
2007527203.tif 000109
【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
2007527203.tif 000114
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【図３８】
2007527203.tif 000116
【図３９】
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2007527203.tif 000118
【図４０】
2007527203.tif 000119
2007527203.tif 000120
【図４１】
2007527203.tif 000121
【図４２】
2007527203.tif 000122
2007527203.tif 000123
【図４３】
2007527203.tif 000124
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【図４４】
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【図４５】
2007527203.tif 000127
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【図４６】
2007527203.tif 000129
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【図４７】
2007527203.tif 000131
【図４８】
2007527203.tif 000132
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【図４９】
2007527203.tif 000134
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【図５０】
2007527203.tif 000136
【図５１】
2007527203.tif 000137
2007527203.tif 000138
【図５２】
2007527203.tif 000139
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【図５３】
2007527203.tif 000141
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【図５４】
2007527203.tif 000143
【図５５】
2007527203.tif 000144
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【図５６】
2007527203.tif 000146
2007527203.tif 000147
【図５７】
2007527203.tif 000148
【図５８】
2007527203.tif 000149
【図５９】
2007527203.tif 000150
2007527203.tif 000151
【図６０】
2007527203.tif 000152
2007527203.tif 000153
【図６１】
2007527203.tif 000154
【図６２】
2007527203.tif 000155
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【図６３】
2007527203.tif 000157
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【図６４】
2007527203.tif 000159
【図６５】
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【図６６】
2007527203.tif 000161
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【図６７】
2007527203.tif 000163
【図６８】
2007527203.tif 000164
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【図６９】
2007527203.tif 000166
2007527203.tif 000167
【図７０】
2007527203.tif 000168
2007527203.tif 000169
【図７１】
2007527203.tif 000170
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【図７２】
2007527203.tif 000172
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【配列表】
2007527203000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年3月23日(2007.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
SECFAM1ファミリーのメンバーの同定方法であって、
翻訳された核酸配列又はポリペプチド配列のデータベースを検索して、以下の配列プロファイルにマッチングするポリペプチドを同定することを含む前記方法：
A  R  N  D  C  Q  E  G  H  I  L  K  M  F  P  S  T  W  Y  V
1 M   -1 -1 -2 -3 -1  0 -2 -3 -2  0  1 -1  7  0 -2 -1 -1 -1 -1  0 
2 N    1  2  2 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1  0  3 -2 -2  1  0 -3 -2 -1 
3 K    0  0 -1  0 -2  1  2 -2 -1  0 -1  1 -1 -3  2 -1 -1 -3 -2  1 
4 R    0  3 -1 -2  4  0 -1 -2 -1  0  0  0  0 -2 -2  1 -1 -3 -2 -1 
5 Y    1  0 -2 -2 -2 -1 -1 -2 -1  0  0 -1  0 -1  3  0 -1 -2  2  0 
6 L   -1  2 -1 -1 -2  0  0 -2 -1 -1  0  3  2 -2 -2  0  1 -2 -2 -1 
7 Q    1  0  0 -1 -1  1  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  2  2  3 -1 -1 
8 K   -1 -1  2 -1 -2 -1 -1  0 -1  0  0  1  2 -1 -2  0  0 -3 -2  2 
9 A    0  0 -2 -2 -1 -1 -2 -2 -2  0  0 -1  0 -1 -2  0 -1  7  0  0 
10 T    0  1  0 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1  0  0  0 -2  1  2  1 -3 -2 -1 
11 Q    1  0  0 -1 -1  2  0 -1 -1 -1  0  0  0 -2  0  2  0 -3 -2 -1 
12 G    0  0  0  2 -2 -1  0  3  4 -2 -2 -1  2 -2 -2  0 -1 -2 -1 -2 
13 K    1 -1 -1 -1 -2 -1 -1  2 -2 -3 -2  0 -1 -1 -2  2 -1  7 -1 -2 
14 L    0 -2 -2 -3 -1 -2 -2  1 -2 -1  0 -2  0  0 -2 -1  1  8  0 -1 
15 L    2 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -3  1  3 -2  0 -1 -2 -1  0 -3 -1  2 
16 I   -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  2  4 -2  1  1 -3 -2 -1 -2  0  1 
17 I    1 -2 -2 -2 -1 -2 -2 -2 -1  1  1 -2  0  0  3 -1 -1 -1  2  0 
18 I    0 -2 -1 -2 -1 -1 -2 -2 -2  1  3 -1  0 -1 -2  1  0 -2 -1  0 
19 F   -1 -2 -3 -3  6 -2 -3 -3 -1 -1  0 -2  3  2 -3 -2 -1  6  3 -1 
20 I    0 -2 -1 -2 -1 -2 -2 -2 -2  3  1 -2  0 -1 -2  1  1 -3 -1  2 
21 V    2 -2 -1 -2  3 -1 -1 -1 -2  0  0 -1  0 -2 -2  2  0 -3 -2  0 
22 T    1 -2 -2 -2  3 -1 -2 -2 -2 -1  0 -2  2 -1 -2  0  2  6 -1  0 
23 L   -1 -3 -3 -3  4 -3 -3 -3 -2  0  2 -3  0  4 -3 -2 -1 -1  0  1 
24 W    0 -3 -3 -3  5 -2 -3 -2 -2 -1  0 -3 -1  0 -3 -1 -1  9  0 -1 
25 G    1 -2 -1 -2  4 -1 -2  1 -2  0  0 -1  2 -2 -2  0  1 -2 -2  0 
26 K   -1  0 -1 -2  1  1  0 -3  1  0  1  2  0  2 -2 -1 -1 -2  0 -1 
27 A    0 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  1  3 -2  3  0  0 -2 -1 -2 -1  1 
28 V    0 -2 -2 -3  4 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  3 -1 -2 -1  0 -2 -1  2 
29 S    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1  5 -1  1 -1  0 -1 -2  2  0 -3  0 -1 
30 S    4 -1 -1 -2 -1 -1 -1  2 -2 -2 -2 -1 -1 -2 -1  1  1 -3 -2 -1 
31 A    1 -1  0  0 -1  1  0  1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -2 
32 N   -1 -1  2 -1 -2 -1 -2 -2 -1  0  3 -1  0  1 -3  1 -1 -2 -1  0 
33 H   -1  0  0 -1 -2  5  0 -3  3 -1  1  0  0 -2 -2 -1 -1 -2 -1 -1 
34 H   -1  0  0 -1 -2  0  0 -2  6  0 -1  0 -1 -2  2  0 -1 -3  0 -1 
35 K   -1  0  0 -1 -3  3  0 -2  4 -3 -2  1 -1 -3  3  0 -1 -2  0 -2 
36 A    2  1  0 -1 -1  0 -1 -1  4 -1 -1  0 -1 -2 -1  0  2 -2  0 -1 
37 H    0 -1  0 -1 -2 -1 -1  3  6 -3 -3 -1 -2 -2 -2  1 -1 -2  0 -2 
38 H    0 -1  0 -2  5 -1 -1 -2  5 -1  0 -1 -1 -1 -2  0  1 -2  0 -1 
39 V   -1 -2 -2 -2 -2 -1  0 -3 -2  2  2 -2  0 -1  2 -2 -1 -3 -1  2 
40 R    1  2 -1 -1 -2  1  1 -1 -1 -2 -2  3 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
41 T    2 -1 -1 -1 -2  3  0  1 -1 -2 -2  0 -1 -3  0  0  2 -2 -2 -1 
42 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
43 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
44 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
45 E   -1  0  0  1 -4  1  6 -2  0 -3 -3  0 -2 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
46 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
47 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  4  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
48 A    4 -1 -1 -2  0 -1 -1 -1 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  2 -3 -2  0 
49 L    3 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -3  0  2 -2  0 -1 -2  0  0 -3 -1  1 
50 H   -2 -1  0  3 -3  0  0 -2  8 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -1 -2 -3  0 -3 
51 R   -1  6  0 -2 -3  0  0 -2  0 -3 -2  1 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 
52 C   -1 -3 -1  3  8 -2 -1 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -1 -1 -3 -2 -2 
53 C    0 -2 -1 -2  8 -2 -2 -2 -2 -1 -1 -2 -1 -2 -2  2  0 -2 -2 -1 
54 N   -1  0  6  0 -2  0  0  0  0 -3 -3  0 -2 -3 -2  2  0 -4 -2 -3 
55 K   -1  2  0 -1 -3  3  0 -2 -1 -3 -2  4 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
56 N   -2 -1  6  0 -3  0  0 -1  0 -3 -3  0 -2 -3  3  0  0 -4 -2 -3 
57 K   -1  5  0 -2 -3  0  0 -2  0 -3 -2  3 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 
58 I   -1  2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 -2  4  0 -1  0 -1 -3 -2 -1 -3 -1  1 
59 E   -1  0  0  0 -3  0  5 -2 -1 -2 -2  0 -2 -3 -1  0  2 -3 -2 -1 
60 E   -1 -1 -1  0 -3  0  5 -3 -1  2 -1  0 -1 -2 -2 -1 -1 -3 -2  0 
61 R    1  5 -1 -2 -2  0  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -3 -2  0 -1 -3 -2 -2 
62 S    0  2  0 -1 -2  0  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -2 
63 Q   -1  0  0  0 -3  6  1 -2  0 -3 -2  0  0 -3 -1  0 -1 -2 -1 -2 
64 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
65 V    2 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -3  1  0 -2  0 -1 -2 -1  0 -3 -1  4 
66 K   -1  3  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  5 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
67 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
68 S    2 -1  0 -1 -1  0  0  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -1 
69 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
70 F   -2  2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 -1  0  1 -1  0  4 -3 -2 -2 -1  0 -1 
71 P   -1  0 -1 -1 -3  0  0 -2 -2 -3 -3  2 -2 -3  5  1 -1 -4 -3 -2 
72 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
73 Q   -1  0  0  0 -3  6  1 -2  0 -3 -2  2  0 -3 -1  0 -1 -2 -1 -2 
74 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
75 A    5 -1 -2 -2  0 -1 -1  0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  0 -3 -2  0 
76 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
77 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
78 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
79 R   -1  6  0 -2 -3  0  0 -2  0 -3 -2  1 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 
80 A    4 -1  1 -1  0 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  0 -3 -2  0 
81 A    0  4  0 -2 -2  2  0 -2 -1 -2  0  2  0 -3 -2  0 -1 -3 -2 -2 
82 P   -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4  7 -1 -1 -4 -3 -2 
83 S    2 -1  0 -1 -1  0  0  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -1 
84 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
85 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  2  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  5 
86 D   -2 -2  0  6 -3  0  2 -1 -1 -3 -4 -1 -3 -3 -1  0 -1 -4 -3 -3 
87 A    5 -1 -2 -2  0 -1 -1  0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  0 -3 -2  0 
88 S    0  2  0 -1 -1  0  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -2 
89 I   -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3  5  1 -3  0  0 -3 -2 -1 -3 -1  2 
90 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
91 E   -1  1 -1 -1 -2  0  1 -3 -2  2  1  2  0 -1 -2 -1 -1 -3 -2  0 
92 Q   -1  0  0  0 -2  4  1  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  0  2  2 -1 -2 
93 K   -1  2  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  6 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
94 W   -2 -1 -2 -2 -2  2 -1 -2 -1 -3 -2 -1 -1  0 -3 -2 -2 10  0 -3 
95 W   -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1  0 -4 -3 -2 11  1 -3 
96 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
97 H   -2  0  1  3 -3  2  2 -2  5 -3 -3  0 -2 -2 -1  0 -1 -3  0 -3 
98 M   -1 -1 -2 -3 -1  0 -2 -3 -2  0  1 -1  7  0 -2 -1 -1 -1 -1  0 
99 Q   -1  0  2  0 -3  2  3 -2  0 -1  1  0  0 -2 -2  0 -1 -3 -2 -1 
100 P   -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4  7 -1 -1 -4 -3 -2 
101 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
102 L   -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  1  4 -2  1  0 -3 -2 -1 -2 -1  1 
103 E   -1 -1 -1  0 -3  0  5 -2 -1 -1  0  0 -1 -2  0  0 -1 -3 -2  0 
104 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
105 E   -1  0  0  1 -4  1  6 -2  0 -3 -3  0 -2 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
106 E   -1 -1  0  2 -4  0  4  2 -1 -3 -4  0 -3 -3 -1  0 -1 -3 -3 -3 
107 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
108 K   -1  1  0  3 -3  0  0 -2 -1 -3 -3  4 -2 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
109 V    0 -2 -2 -3 -1 -2 -2 -3 -3  1  2 -2  0 -1 -2 -1  1 -3 -1  4 
110 L   -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  1  4 -2  1  0 -3 -2 -1 -2 -1  0 
111 P   -1 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -3 -2  2 -1 -2 -1 -2  6 -1 -1 -4 -2  0 
112 D   -2 -1  3  6 -3  0  1 -1  0 -3 -4 -1 -3 -3 -1  0 -1 -4 -3 -3 
113 R   -1  3  2 -2 -2  0 -1 -2  0 -1  1  0  0 -1 -2  0 -1 -2  1 -1 
114 K    0 -1  0  0 -1  0  0  0 -1 -2 -2  1 -1 -2 -1  4  1 -3 -2 -2 
115 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
116 W   -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1  0 -4 -3 -2 11  1 -3 
117 S    0 -1  0 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1  0  2 -2 -1  3  3 -2 -2 -1 
118 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
119 S    1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1 -2  0 -1 -1 -1 -2 -1  3  3 -3 -2  0 
120 S    0  0  0  0 -2  3  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  3  1 -3 -2 -2 
121 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
122 N   -1 -1  5  0 -3 -1 -1  3  4 -3 -3 -1 -2 -3 -2  0 -1 -3 -1 -3 
123 K   -1  3  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  5 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
124 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -4 -3  4  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
125 K   -1  1  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  6 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
126 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
127 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
128 R   -1  3  0 -1 -2  0  0 -2 -1 -2 -2  4 -1 -3 -1  0  2 -3 -2 -2 
129 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  2  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  5 
130 T    0 -1  0 -1 -1  0 -1 -1  2 -1  0 -1 -1 -2 -1  3  3 -3 -1 -1 
131 H   -1  4  0 -1 -3  0  0 -2  4 -3 -2  0 -1 -3  3 -1 -1 -3 -1 -3
（ここで、NCBIが指定するデフォルトパラメーター[Blosum 62 マトリックス；ギャップオープンペナルティー＝11及びギャップ伸長ペナルティー＝１]を用いて、前記プロファイルを検索プログラムBLASTにクエリー配列として入力した場合、SECFAM1ファミリーのメンバーは10-2以下のE-valueを有する）。
【請求項２】
E-valueが10-5以下、10-10以下、10-50以下、又は10-70以下である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
翻訳された核酸配列のデータベースが、cDNA、EST、mRNA、全体的ゲノム又は部分的ゲノムのデータベースから派生する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
データベースがESTデータベースである、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
データベースが、ヒト配列データベースである、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
以下の(i)〜(iii)のいずれかの単離ポリペプチド：
(i)NCBIが指定するBlosum 62 マトリックス；ギャップオープンペナルティー＝11及びギャップ伸長ペナルティー＝１を有するデフォルトパラメーターを用いて、下記プロファイルを検索プログラムBLASTにクエリー配列として入力した場合、10-2以下のE-valueを有するポリペプチド配列を含む単離ポリペプチド：
A  R  N  D  C  Q  E  G  H  I  L  K  M  F  P  S  T  W  Y  V
1 M   -1 -1 -2 -3 -1  0 -2 -3 -2  0  1 -1  7  0 -2 -1 -1 -1 -1  0 
2 N    1  2  2 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1  0  3 -2 -2  1  0 -3 -2 -1 
3 K    0  0 -1  0 -2  1  2 -2 -1  0 -1  1 -1 -3  2 -1 -1 -3 -2  1 
4 R    0  3 -1 -2  4  0 -1 -2 -1  0  0  0  0 -2 -2  1 -1 -3 -2 -1 
5 Y    1  0 -2 -2 -2 -1 -1 -2 -1  0  0 -1  0 -1  3  0 -1 -2  2  0 
6 L   -1  2 -1 -1 -2  0  0 -2 -1 -1  0  3  2 -2 -2  0  1 -2 -2 -1 
7 Q    1  0  0 -1 -1  1  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  2  2  3 -1 -1 
8 K   -1 -1  2 -1 -2 -1 -1  0 -1  0  0  1  2 -1 -2  0  0 -3 -2  2 
9 A    0  0 -2 -2 -1 -1 -2 -2 -2  0  0 -1  0 -1 -2  0 -1  7  0  0 
10 T    0  1  0 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1  0  0  0 -2  1  2  1 -3 -2 -1 
11 Q    1  0  0 -1 -1  2  0 -1 -1 -1  0  0  0 -2  0  2  0 -3 -2 -1 
12 G    0  0  0  2 -2 -1  0  3  4 -2 -2 -1  2 -2 -2  0 -1 -2 -1 -2 
13 K    1 -1 -1 -1 -2 -1 -1  2 -2 -3 -2  0 -1 -1 -2  2 -1  7 -1 -2 
14 L    0 -2 -2 -3 -1 -2 -2  1 -2 -1  0 -2  0  0 -2 -1  1  8  0 -1 
15 L    2 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -3  1  3 -2  0 -1 -2 -1  0 -3 -1  2 
16 I   -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  2  4 -2  1  1 -3 -2 -1 -2  0  1 
17 I    1 -2 -2 -2 -1 -2 -2 -2 -1  1  1 -2  0  0  3 -1 -1 -1  2  0 
18 I    0 -2 -1 -2 -1 -1 -2 -2 -2  1  3 -1  0 -1 -2  1  0 -2 -1  0 
19 F   -1 -2 -3 -3  6 -2 -3 -3 -1 -1  0 -2  3  2 -3 -2 -1  6  3 -1 
20 I    0 -2 -1 -2 -1 -2 -2 -2 -2  3  1 -2  0 -1 -2  1  1 -3 -1  2 
21 V    2 -2 -1 -2  3 -1 -1 -1 -2  0  0 -1  0 -2 -2  2  0 -3 -2  0 
22 T    1 -2 -2 -2  3 -1 -2 -2 -2 -1  0 -2  2 -1 -2  0  2  6 -1  0 
23 L   -1 -3 -3 -3  4 -3 -3 -3 -2  0  2 -3  0  4 -3 -2 -1 -1  0  1 
24 W    0 -3 -3 -3  5 -2 -3 -2 -2 -1  0 -3 -1  0 -3 -1 -1  9  0 -1 
25 G    1 -2 -1 -2  4 -1 -2  1 -2  0  0 -1  2 -2 -2  0  1 -2 -2  0 
26 K   -1  0 -1 -2  1  1  0 -3  1  0  1  2  0  2 -2 -1 -1 -2  0 -1 
27 A    0 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  1  3 -2  3  0  0 -2 -1 -2 -1  1 
28 V    0 -2 -2 -3  4 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  3 -1 -2 -1  0 -2 -1  2 
29 S    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1  5 -1  1 -1  0 -1 -2  2  0 -3  0 -1 
30 S    4 -1 -1 -2 -1 -1 -1  2 -2 -2 -2 -1 -1 -2 -1  1  1 -3 -2 -1 
31 A    1 -1  0  0 -1  1  0  1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -2 
32 N   -1 -1  2 -1 -2 -1 -2 -2 -1  0  3 -1  0  1 -3  1 -1 -2 -1  0 
33 H   -1  0  0 -1 -2  5  0 -3  3 -1  1  0  0 -2 -2 -1 -1 -2 -1 -1 
34 H   -1  0  0 -1 -2  0  0 -2  6  0 -1  0 -1 -2  2  0 -1 -3  0 -1 
35 K   -1  0  0 -1 -3  3  0 -2  4 -3 -2  1 -1 -3  3  0 -1 -2  0 -2 
36 A    2  1  0 -1 -1  0 -1 -1  4 -1 -1  0 -1 -2 -1  0  2 -2  0 -1 
37 H    0 -1  0 -1 -2 -1 -1  3  6 -3 -3 -1 -2 -2 -2  1 -1 -2  0 -2 
38 H    0 -1  0 -2  5 -1 -1 -2  5 -1  0 -1 -1 -1 -2  0  1 -2  0 -1 
39 V   -1 -2 -2 -2 -2 -1  0 -3 -2  2  2 -2  0 -1  2 -2 -1 -3 -1  2 
40 R    1  2 -1 -1 -2  1  1 -1 -1 -2 -2  3 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
41 T    2 -1 -1 -1 -2  3  0  1 -1 -2 -2  0 -1 -3  0  0  2 -2 -2 -1 
42 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
43 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
44 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
45 E   -1  0  0  1 -4  1  6 -2  0 -3 -3  0 -2 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
46 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
47 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  4  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
48 A    4 -1 -1 -2  0 -1 -1 -1 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  2 -3 -2  0 
49 L    3 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -3  0  2 -2  0 -1 -2  0  0 -3 -1  1 
50 H   -2 -1  0  3 -3  0  0 -2  8 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -1 -2 -3  0 -3 
51 R   -1  6  0 -2 -3  0  0 -2  0 -3 -2  1 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 
52 C   -1 -3 -1  3  8 -2 -1 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -1 -1 -3 -2 -2 
53 C    0 -2 -1 -2  8 -2 -2 -2 -2 -1 -1 -2 -1 -2 -2  2  0 -2 -2 -1 
54 N   -1  0  6  0 -2  0  0  0  0 -3 -3  0 -2 -3 -2  2  0 -4 -2 -3 
55 K   -1  2  0 -1 -3  3  0 -2 -1 -3 -2  4 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
56 N   -2 -1  6  0 -3  0  0 -1  0 -3 -3  0 -2 -3  3  0  0 -4 -2 -3 
57 K   -1  5  0 -2 -3  0  0 -2  0 -3 -2  3 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 
58 I   -1  2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 -2  4  0 -1  0 -1 -3 -2 -1 -3 -1  1 
59 E   -1  0  0  0 -3  0  5 -2 -1 -2 -2  0 -2 -3 -1  0  2 -3 -2 -1 
60 E   -1 -1 -1  0 -3  0  5 -3 -1  2 -1  0 -1 -2 -2 -1 -1 -3 -2  0 
61 R    1  5 -1 -2 -2  0  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -3 -2  0 -1 -3 -2 -2 
62 S    0  2  0 -1 -2  0  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -2 
63 Q   -1  0  0  0 -3  6  1 -2  0 -3 -2  0  0 -3 -1  0 -1 -2 -1 -2 
64 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
65 V    2 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -3  1  0 -2  0 -1 -2 -1  0 -3 -1  4 
66 K   -1  3  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  5 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
67 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
68 S    2 -1  0 -1 -1  0  0  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -1 
69 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
70 F   -2  2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 -1  0  1 -1  0  4 -3 -2 -2 -1  0 -1 
71 P   -1  0 -1 -1 -3  0  0 -2 -2 -3 -3  2 -2 -3  5  1 -1 -4 -3 -2 
72 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
73 Q   -1  0  0  0 -3  6  1 -2  0 -3 -2  2  0 -3 -1  0 -1 -2 -1 -2 
74 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
75 A    5 -1 -2 -2  0 -1 -1  0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  0 -3 -2  0 
76 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
77 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
78 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
79 R   -1  6  0 -2 -3  0  0 -2  0 -3 -2  1 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 
80 A    4 -1  1 -1  0 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  0 -3 -2  0 
81 A    0  4  0 -2 -2  2  0 -2 -1 -2  0  2  0 -3 -2  0 -1 -3 -2 -2 
82 P   -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4  7 -1 -1 -4 -3 -2 
83 S    2 -1  0 -1 -1  0  0  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -1 
84 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
85 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  2  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  5 
86 D   -2 -2  0  6 -3  0  2 -1 -1 -3 -4 -1 -3 -3 -1  0 -1 -4 -3 -3 
87 A    5 -1 -2 -2  0 -1 -1  0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  0 -3 -2  0 
88 S    0  2  0 -1 -1  0  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -2 
89 I   -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3  5  1 -3  0  0 -3 -2 -1 -3 -1  2 
90 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
91 E   -1  1 -1 -1 -2  0  1 -3 -2  2  1  2  0 -1 -2 -1 -1 -3 -2  0 
92 Q   -1  0  0  0 -2  4  1  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  0  2  2 -1 -2 
93 K   -1  2  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  6 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
94 W   -2 -1 -2 -2 -2  2 -1 -2 -1 -3 -2 -1 -1  0 -3 -2 -2 10  0 -3 
95 W   -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1  0 -4 -3 -2 11  1 -3 
96 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
97 H   -2  0  1  3 -3  2  2 -2  5 -3 -3  0 -2 -2 -1  0 -1 -3  0 -3 
98 M   -1 -1 -2 -3 -1  0 -2 -3 -2  0  1 -1  7  0 -2 -1 -1 -1 -1  0 
99 Q   -1  0  2  0 -3  2  3 -2  0 -1  1  0  0 -2 -2  0 -1 -3 -2 -1 
100 P   -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4  7 -1 -1 -4 -3 -2 
101 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
102 L   -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  1  4 -2  1  0 -3 -2 -1 -2 -1  1 
103 E   -1 -1 -1  0 -3  0  5 -2 -1 -1  0  0 -1 -2  0  0 -1 -3 -2  0 
104 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
105 E   -1  0  0  1 -4  1  6 -2  0 -3 -3  0 -2 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
106 E   -1 -1  0  2 -4  0  4  2 -1 -3 -4  0 -3 -3 -1  0 -1 -3 -3 -3 
107 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
108 K   -1  1  0  3 -3  0  0 -2 -1 -3 -3  4 -2 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
109 V    0 -2 -2 -3 -1 -2 -2 -3 -3  1  2 -2  0 -1 -2 -1  1 -3 -1  4 
110 L   -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  1  4 -2  1  0 -3 -2 -1 -2 -1  0 
111 P   -1 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -3 -2  2 -1 -2 -1 -2  6 -1 -1 -4 -2  0 
112 D   -2 -1  3  6 -3  0  1 -1  0 -3 -4 -1 -3 -3 -1  0 -1 -4 -3 -3 
113 R   -1  3  2 -2 -2  0 -1 -2  0 -1  1  0  0 -1 -2  0 -1 -2  1 -1 
114 K    0 -1  0  0 -1  0  0  0 -1 -2 -2  1 -1 -2 -1  4  1 -3 -2 -2 
115 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
116 W   -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1  0 -4 -3 -2 11  1 -3 
117 S    0 -1  0 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1  0  2 -2 -1  3  3 -2 -2 -1 
118 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
119 S    1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1 -2  0 -1 -1 -1 -2 -1  3  3 -3 -2  0 
120 S    0  0  0  0 -2  3  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  3  1 -3 -2 -2 
121 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
122 N   -1 -1  5  0 -3 -1 -1  3  4 -3 -3 -1 -2 -3 -2  0 -1 -3 -1 -3 
123 K   -1  3  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  5 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
124 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -4 -3  4  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
125 K   -1  1  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  6 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
126 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
127 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
128 R   -1  3  0 -1 -2  0  0 -2 -1 -2 -2  4 -1 -3 -1  0  2 -3 -2 -2 
129 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  2  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  5 
130 T    0 -1  0 -1 -1  0 -1 -1  2 -1  0 -1 -1 -2 -1  3  3 -3 -1 -1 
131 H   -1  4  0 -1 -3  0  0 -2  4 -3 -2  0 -1 -3  3 -1 -1 -3 -1 -3；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであるか又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
【請求項７】
NCBIが指定するBlosum 62 マトリックス；ギャップオープンペナルティー＝11及びギャップ伸長ペナルティー＝１を有するデフォルトパラメーターを用いて、下記プロファイルを検索プログラムBLASTにクエリー配列として入力した場合、10-2以下のE-valueを有するポリペプチドからなる、請求項６記載のポリペプチド。
A  R  N  D  C  Q  E  G  H  I  L  K  M  F  P  S  T  W  Y  V
1 M   -1 -1 -2 -3 -1  0 -2 -3 -2  0  1 -1  7  0 -2 -1 -1 -1 -1  0 
2 N    1  2  2 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1  0  3 -2 -2  1  0 -3 -2 -1 
3 K    0  0 -1  0 -2  1  2 -2 -1  0 -1  1 -1 -3  2 -1 -1 -3 -2  1 
4 R    0  3 -1 -2  4  0 -1 -2 -1  0  0  0  0 -2 -2  1 -1 -3 -2 -1 
5 Y    1  0 -2 -2 -2 -1 -1 -2 -1  0  0 -1  0 -1  3  0 -1 -2  2  0 
6 L   -1  2 -1 -1 -2  0  0 -2 -1 -1  0  3  2 -2 -2  0  1 -2 -2 -1 
7 Q    1  0  0 -1 -1  1  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  2  2  3 -1 -1 
8 K   -1 -1  2 -1 -2 -1 -1  0 -1  0  0  1  2 -1 -2  0  0 -3 -2  2 
9 A    0  0 -2 -2 -1 -1 -2 -2 -2  0  0 -1  0 -1 -2  0 -1  7  0  0 
10 T    0  1  0 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1  0  0  0 -2  1  2  1 -3 -2 -1 
11 Q    1  0  0 -1 -1  2  0 -1 -1 -1  0  0  0 -2  0  2  0 -3 -2 -1 
12 G    0  0  0  2 -2 -1  0  3  4 -2 -2 -1  2 -2 -2  0 -1 -2 -1 -2 
13 K    1 -1 -1 -1 -2 -1 -1  2 -2 -3 -2  0 -1 -1 -2  2 -1  7 -1 -2 
14 L    0 -2 -2 -3 -1 -2 -2  1 -2 -1  0 -2  0  0 -2 -1  1  8  0 -1 
15 L    2 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -3  1  3 -2  0 -1 -2 -1  0 -3 -1  2 
16 I   -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  2  4 -2  1  1 -3 -2 -1 -2  0  1 
17 I    1 -2 -2 -2 -1 -2 -2 -2 -1  1  1 -2  0  0  3 -1 -1 -1  2  0 
18 I    0 -2 -1 -2 -1 -1 -2 -2 -2  1  3 -1  0 -1 -2  1  0 -2 -1  0 
19 F   -1 -2 -3 -3  6 -2 -3 -3 -1 -1  0 -2  3  2 -3 -2 -1  6  3 -1 
20 I    0 -2 -1 -2 -1 -2 -2 -2 -2  3  1 -2  0 -1 -2  1  1 -3 -1  2 
21 V    2 -2 -1 -2  3 -1 -1 -1 -2  0  0 -1  0 -2 -2  2  0 -3 -2  0 
22 T    1 -2 -2 -2  3 -1 -2 -2 -2 -1  0 -2  2 -1 -2  0  2  6 -1  0 
23 L   -1 -3 -3 -3  4 -3 -3 -3 -2  0  2 -3  0  4 -3 -2 -1 -1  0  1 
24 W    0 -3 -3 -3  5 -2 -3 -2 -2 -1  0 -3 -1  0 -3 -1 -1  9  0 -1 
25 G    1 -2 -1 -2  4 -1 -2  1 -2  0  0 -1  2 -2 -2  0  1 -2 -2  0 
26 K   -1  0 -1 -2  1  1  0 -3  1  0  1  2  0  2 -2 -1 -1 -2  0 -1 
27 A    0 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  1  3 -2  3  0  0 -2 -1 -2 -1  1 
28 V    0 -2 -2 -3  4 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  3 -1 -2 -1  0 -2 -1  2 
29 S    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1  5 -1  1 -1  0 -1 -2  2  0 -3  0 -1 
30 S    4 -1 -1 -2 -1 -1 -1  2 -2 -2 -2 -1 -1 -2 -1  1  1 -3 -2 -1 
31 A    1 -1  0  0 -1  1  0  1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -2 
32 N   -1 -1  2 -1 -2 -1 -2 -2 -1  0  3 -1  0  1 -3  1 -1 -2 -1  0 
33 H   -1  0  0 -1 -2  5  0 -3  3 -1  1  0  0 -2 -2 -1 -1 -2 -1 -1 
34 H   -1  0  0 -1 -2  0  0 -2  6  0 -1  0 -1 -2  2  0 -1 -3  0 -1 
35 K   -1  0  0 -1 -3  3  0 -2  4 -3 -2  1 -1 -3  3  0 -1 -2  0 -2 
36 A    2  1  0 -1 -1  0 -1 -1  4 -1 -1  0 -1 -2 -1  0  2 -2  0 -1 
37 H    0 -1  0 -1 -2 -1 -1  3  6 -3 -3 -1 -2 -2 -2  1 -1 -2  0 -2 
38 H    0 -1  0 -2  5 -1 -1 -2  5 -1  0 -1 -1 -1 -2  0  1 -2  0 -1 
39 V   -1 -2 -2 -2 -2 -1  0 -3 -2  2  2 -2  0 -1  2 -2 -1 -3 -1  2 
40 R    1  2 -1 -1 -2  1  1 -1 -1 -2 -2  3 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
41 T    2 -1 -1 -1 -2  3  0  1 -1 -2 -2  0 -1 -3  0  0  2 -2 -2 -1 
42 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
43 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
44 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
45 E   -1  0  0  1 -4  1  6 -2  0 -3 -3  0 -2 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
46 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
47 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  4  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
48 A    4 -1 -1 -2  0 -1 -1 -1 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  2 -3 -2  0 
49 L    3 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -3  0  2 -2  0 -1 -2  0  0 -3 -1  1 
50 H   -2 -1  0  3 -3  0  0 -2  8 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -1 -2 -3  0 -3 
51 R   -1  6  0 -2 -3  0  0 -2  0 -3 -2  1 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 
52 C   -1 -3 -1  3  8 -2 -1 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -1 -1 -3 -2 -2 
53 C    0 -2 -1 -2  8 -2 -2 -2 -2 -1 -1 -2 -1 -2 -2  2  0 -2 -2 -1 
54 N   -1  0  6  0 -2  0  0  0  0 -3 -3  0 -2 -3 -2  2  0 -4 -2 -3 
55 K   -1  2  0 -1 -3  3  0 -2 -1 -3 -2  4 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
56 N   -2 -1  6  0 -3  0  0 -1  0 -3 -3  0 -2 -3  3  0  0 -4 -2 -3 
57 K   -1  5  0 -2 -3  0  0 -2  0 -3 -2  3 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 
58 I   -1  2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 -2  4  0 -1  0 -1 -3 -2 -1 -3 -1  1 
59 E   -1  0  0  0 -3  0  5 -2 -1 -2 -2  0 -2 -3 -1  0  2 -3 -2 -1 
60 E   -1 -1 -1  0 -3  0  5 -3 -1  2 -1  0 -1 -2 -2 -1 -1 -3 -2  0 
61 R    1  5 -1 -2 -2  0  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -3 -2  0 -1 -3 -2 -2 
62 S    0  2  0 -1 -2  0  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -2 
63 Q   -1  0  0  0 -3  6  1 -2  0 -3 -2  0  0 -3 -1  0 -1 -2 -1 -2 
64 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
65 V    2 -2 -3 -3 -1 -2 -2 -2 -3  1  0 -2  0 -1 -2 -1  0 -3 -1  4 
66 K   -1  3  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  5 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
67 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
68 S    2 -1  0 -1 -1  0  0  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -1 
69 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
70 F   -2  2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 -1  0  1 -1  0  4 -3 -2 -2 -1  0 -1 
71 P   -1  0 -1 -1 -3  0  0 -2 -2 -3 -3  2 -2 -3  5  1 -1 -4 -3 -2 
72 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
73 Q   -1  0  0  0 -3  6  1 -2  0 -3 -2  2  0 -3 -1  0 -1 -2 -1 -2 
74 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
75 A    5 -1 -2 -2  0 -1 -1  0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  0 -3 -2  0 
76 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
77 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
78 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
79 R   -1  6  0 -2 -3  0  0 -2  0 -3 -2  1 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 
80 A    4 -1  1 -1  0 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  0 -3 -2  0 
81 A    0  4  0 -2 -2  2  0 -2 -1 -2  0  2  0 -3 -2  0 -1 -3 -2 -2 
82 P   -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4  7 -1 -1 -4 -3 -2 
83 S    2 -1  0 -1 -1  0  0  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -1 
84 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
85 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  2  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  5 
86 D   -2 -2  0  6 -3  0  2 -1 -1 -3 -4 -1 -3 -3 -1  0 -1 -4 -3 -3 
87 A    5 -1 -2 -2  0 -1 -1  0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  0 -3 -2  0 
88 S    0  2  0 -1 -1  0  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  0 -3 -2 -2 
89 I   -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3  5  1 -3  0  0 -3 -2 -1 -3 -1  2 
90 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
91 E   -1  1 -1 -1 -2  0  1 -3 -2  2  1  2  0 -1 -2 -1 -1 -3 -2  0 
92 Q   -1  0  0  0 -2  4  1  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  0  2  2 -1 -2 
93 K   -1  2  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  6 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
94 W   -2 -1 -2 -2 -2  2 -1 -2 -1 -3 -2 -1 -1  0 -3 -2 -2 10  0 -3 
95 W   -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1  0 -4 -3 -2 11  1 -3 
96 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
97 H   -2  0  1  3 -3  2  2 -2  5 -3 -3  0 -2 -2 -1  0 -1 -3  0 -3 
98 M   -1 -1 -2 -3 -1  0 -2 -3 -2  0  1 -1  7  0 -2 -1 -1 -1 -1  0 
99 Q   -1  0  2  0 -3  2  3 -2  0 -1  1  0  0 -2 -2  0 -1 -3 -2 -1 
100 P   -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4  7 -1 -1 -4 -3 -2 
101 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
102 L   -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  1  4 -2  1  0 -3 -2 -1 -2 -1  1 
103 E   -1 -1 -1  0 -3  0  5 -2 -1 -1  0  0 -1 -2  0  0 -1 -3 -2  0 
104 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
105 E   -1  0  0  1 -4  1  6 -2  0 -3 -3  0 -2 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
106 E   -1 -1  0  2 -4  0  4  2 -1 -3 -4  0 -3 -3 -1  0 -1 -3 -3 -3 
107 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
108 K   -1  1  0  3 -3  0  0 -2 -1 -3 -3  4 -2 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
109 V    0 -2 -2 -3 -1 -2 -2 -3 -3  1  2 -2  0 -1 -2 -1  1 -3 -1  4 
110 L   -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  1  4 -2  1  0 -3 -2 -1 -2 -1  0 
111 P   -1 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -3 -2  2 -1 -2 -1 -2  6 -1 -1 -4 -2  0 
112 D   -2 -1  3  6 -3  0  1 -1  0 -3 -4 -1 -3 -3 -1  0 -1 -4 -3 -3 
113 R   -1  3  2 -2 -2  0 -1 -2  0 -1  1  0  0 -1 -2  0 -1 -2  1 -1 
114 K    0 -1  0  0 -1  0  0  0 -1 -2 -2  1 -1 -2 -1  4  1 -3 -2 -2 
115 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
116 W   -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1  0 -4 -3 -2 11  1 -3 
117 S    0 -1  0 -1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1  0  2 -2 -1  3  3 -2 -2 -1 
118 C    0 -3 -3 -3 10 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 
119 S    1 -1  0 -1 -1 -1 -1 -1 -2  0 -1 -1 -1 -2 -1  3  3 -3 -2  0 
120 S    0  0  0  0 -2  3  0 -1 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  3  1 -3 -2 -2 
121 G    0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 
122 N   -1 -1  5  0 -3 -1 -1  3  4 -3 -3 -1 -2 -3 -2  0 -1 -3 -1 -3 
123 K   -1  3  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  5 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
124 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -4 -3  4  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 
125 K   -1  1  0 -1 -3  0  0 -2 -1 -3 -2  6 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2 
126 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
127 T    0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0  6 -2 -2  0 
128 R   -1  3  0 -1 -2  0  0 -2 -1 -2 -2  4 -1 -3 -1  0  2 -3 -2 -2 
129 V    0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  2  0 -2  0 -1 -2 -2  0 -3 -1  5 
130 T    0 -1  0 -1 -1  0 -1 -1  2 -1  0 -1 -1 -2 -1  3  3 -3 -1 -1 
131 H   -1  4  0 -1 -3  0  0 -2  4 -3 -2  0 -1 -3  3 -1 -1 -3 -1 -3
【請求項８】
ポリペプチドが、10-2の最大しきい値E-value、又は10-5以下、10-10以下、10-50以下の最小しきい値E-value、又は10-70以下の最小しきい値E-valueを有する、請求項６又は７記載のポリペプチド。
【請求項９】
以下の(i)〜(iii)のいずれかの単離ポリペプチド：
(i)コンセンサスアミノ酸配列
G-T-C-E-[VI]-[VI]-[AT]-[AVL]-[HD]-R-[CD]-[CS]-[NS]-[KRQ]-[NP]-[RK]-[IR]-[ET]-[EI]-[RA]-[SR]-Q-T-[VA]-[KR]-C-[SA]-C-[LFR]-[PSK]-G-[KQ]-[VI]-A-G-T-T-R-[NA]-[RQLAK]-P-[SA]-C-V-[DE]-A-[SAR]-I-[VI]-[IELKR]-[WGQET]-[KR]-[WQ]-W-C-[EHNQD]-M-[ENQL]-P-C-[LV]-[EVLP]-G-E-[DEG]-C-[KRD]-[TVL]-L-[PI]-[DN]-[NYSLR]-[STK]-G-W-[MST]-C-[ASIT]-[TSRQ]-P(0,1)-G-[NHG]-[KR]-[IV]-K-T-T
を満足するポリペプチドを含む単離ポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであるか又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
【請求項１０】
コンセンサスアミノ酸配列
G-T-C-E-[VI]-[VI]-[AT]-[AVL]-[HD]-R-[CD]-[CS]-[NS]-[KRQ]-[NP]-[RK]-[IR]-[ET]-[EI]-[RA]-[SR]-Q-T-[VA]-[KR]-C-[SA]-C-[LFR]-[PSK]-G-[KQ]-[VI]-A-G-T-T-R-[NA]-[RQLAK]-P-[SA]-C-V-[DE]-A-[SAR]-I-[VI]-[IELKR]-[WGQET]-[KR]-[WQ]-W-C-[EHNQD]-M-[ENQL]-P-C-[LV]-[EVLP]-G-E-[DEG]-C-[KRD]-[TVL]-L-[PI]-[DN]-[NYSLR]-[STK]-G-W-[MST]-C-[ASIT]-[TSRQ]-P(0,1)-G-[NHG]-[KR]-[IV]-K-T-T
を満足するポリペプチドから成る請求項９記載の単離ポリペプチド。
【請求項１１】
以下の(i)〜(iii)のいずれかのポリペプチド：
(i)配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28及び／又は配列番号30で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであるか又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
【請求項１２】
以下の(i)〜(iii)のいずれかである、請求項１１記載のポリペプチド：
(i)配列番号26及び／又は配列番号30で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであるか又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
【請求項１３】
以下の(i)〜(iii)のいずれかである、請求項１１又は１２記載のポリペプチド：
(i)配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28及び／又は配列番号30で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであるか又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
【請求項１４】
以下の(i)〜(iii)のいずれかのポリペプチド：
(i)配列番号２、配列番号４、配列番号37及び／又は配列番号39で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであるか又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
【請求項１５】
以下の(i)〜(iii)のいずれかである、請求項１４記載のポリペプチド：
(i)配列番号２、配列番号４、配列番号37及び／又は配列番号39で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであるか又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
【請求項１６】
以下の(i)〜(iii)のいずれかのポリペプチド：
(i)配列番号６、配列番号８、配列番号41、配列番号43、配列番号53及び／又は配列番号55で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであるか又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
【請求項１７】
以下の(i)〜(iii)のいずれかである、請求項１６記載のポリペプチド：
(i)配列番号６、配列番号８、配列番号41、配列番号43、配列番号53及び／又は配列番号55で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであるか又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
【請求項１８】
以下の(i)〜(iii)のいずれかのポリペプチド：
(i)配列番号10、配列番号12、配列番号45及び／又は配列番号47で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであるか又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
【請求項１９】
以下の(i)〜(iii)のいずれかである、請求項１８記載のポリペプチド：
(i)配列番号10、配列番号12、配列番号45及び／又は配列番号47で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであるか又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
【請求項２０】
以下の(i)〜(iii)のいずれかのポリペプチド：
(i)配列番号14、配列番号16、配列番号49及び／又は配列番号51で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであるか又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
【請求項２１】
以下の(i)〜(iii)のいずれかである、請求項２０記載のポリペプチド：
(i)配列番号14、配列番号16、配列番号49及び／又は配列番号51で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド；
(ii)EGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであるか、又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント；又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。
【請求項２２】
請求項６〜２１のいずれか１項の(iii)に記載の機能的等価物であるポリペプチドであって、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53及び／又は配列番号55で示されるアミノ酸配列に相同的であり且つEGFドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであることを特徴とする、前記ポリペプチド。
【請求項２３】
請求項６〜２２のいずれか１項に記載のフラグメント又は機能的等価物であるポリペプチドであって、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53及び／又は配列番号55で示されるアミノ酸配列又はそれらの活性なフラグメントと80％を超える配列同一性を有する、前記ポリペプチド。
【請求項２４】
請求項６〜２３のいずれか１項に記載の機能的等価物であるポリペプチドであって、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53及び／又は配列番号55で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと有意な構造相同性を示す、前記ポリペプチド。
【請求項２５】
請求項６〜２１及び請求項２３のいずれか１項に記載のフラグメントであるポリペプチドであって、
請求項６〜２１のいずれか１項に記載の(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有し、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53及び／又は配列番号55で示されるアミノ酸配列に由来する７以上のアミノ酸残基から成る、前記ポリペプチド。
【請求項２６】
凝固因子Ｘと同様の生物学的活性を有する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードしている、精製核酸分子。
【請求項２８】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52及び配列番号54で示される核酸配列を含むか、又は前記核酸配列の余剰的等価物若しくはフラグメントである、請求項２７記載の精製核酸分子。
【請求項２９】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52及び／又は配列番号54で示される核酸配列から成るか、又は前記核酸配列の余剰的等価物若しくはフラグメントである、請求項２７記載の精製核酸分子。
【請求項３０】
高ストリンジェンシー条件下で、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子とハイブリダイズする、精製核酸分子。
【請求項３１】
請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項３２】
請求項３１に記載のベクターで形質転換されている、宿主細胞。
【請求項３３】
EGFドメイン含有タンパク質ファミリーである請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチドに特異的に結合する、リガンド。
【請求項３４】
抗体である、請求項３３記載のリガンド。
【請求項３５】
請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチドの発現レベル又は活性レベルを増加又は減少させる化合物。
【請求項３６】
請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチドに、前記ポリペプチドの生物学的作用のいずれをも誘導することなく結合する、請求項３５記載の化合物。
【請求項３７】
天然の又は改変されている、基質、リガンド、酵素、受容体、構造的模倣体又は機能的模倣体である、請求項３６記載の化合物。
【請求項３８】
疾患の治療又は診断に使用するための、請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項３１記載のベクター、請求項３２記載の宿主細胞、請求項３３若しくは３４記載のリガンド、又は請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３９】
患者の疾患を診断する方法であって、
前記患者由来の組織において、請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする天然遺伝子の発現レベルを評価するか又は請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチドの活性を評価すること；及び
前記発現又は活性のレベルをコントロールレベルと比較すること；
を含み、このとき前記コントロールレベルと異なるレベルが疾患を示唆している、前記方法。
【請求項４０】
in vitroで実施される、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
（ａ）請求項３３又は３４記載のリガンドを、リガンド-ポリペプチド複合体の形成に適する条件下で、生物学的サンプルと接触させる工程；及び
（ｂ）前記複合体を検出する工程；
を含む請求項３９又は４０記載の方法。
【請求項４２】
（ａ）患者由来の組織サンプルと核酸プローブとを、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子と前記プローブとの間でハイブリッド複合体の形成を可能にするストリンジェントな条件下で接触させる工程；
（ｂ）コントロールサンプルを、工程（ａ）で用いるのと同じ条件下で前記プローブと接触させる工程；及び
（ｃ）前記サンプルのハイブリッド複合体の存在を検出する工程；
を含み、このときコントロールサンプルのハイブリッド複合体のレベルと異なる患者サンプルのハイブリッド複合体のレベルの検出が疾患を示唆している、請求項３９又は４０記載の方法。
【請求項４３】
（ａ）患者の組織由来の核酸サンプルと核酸プライマーとを、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子と前記プライマーとの間でハイブリッド複合体の形成を可能にするストリンジェントな条件下で接触させる工程；
（ｂ）コントロールサンプルを、工程（ａ）で用いられるのと同じ条件下で前記プライマーと接触させる工程；
（ｃ）前記サンプルの核酸を増幅させる工程；及び、
（ｄ）患者サンプル及びコントロールサンプルの両サンプルから、増幅核酸レベルを検出する工程；
を含み、このときコントロールサンプルの増幅核酸レベルと有意に異なる患者サンプルの増幅核酸レベルの検出が疾患を示唆している、請求項３９又は４０記載の方法。
【請求項４４】
（ａ）疾患について検査される患者から、組織サンプルを入手する工程；
（ｂ）前記組織サンプルから、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子を単離する工程；及び、
（ｃ）疾患に附随する変異の存在を、前記疾患の指標として前記核酸分子中で検出することによって、前記疾患について患者を診断する工程；
を含む請求項３９又は４０記載の方法。
【請求項４５】
核酸分子を増幅させて増幅産物を生成すること及び前記増幅産物中の変異の有無を検出することをさらに含む、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
核酸分子をその核酸分子にハイブリダイズする核酸プローブとストリンジェントな条件下で接触させて、前記核酸プローブ鎖の疾患に附随する変異に対応する任意の部分でハイブリダイズしていない部分を有するハイブリッド二本鎖分子を形成させること；及び
疾患に附随する変異の有無の指標として、前記プローブ鎖のハイブリダイズしていない部分の有無を検出すること；
によって、前記患者における変異の有無を検出する、請求項４４又は４５記載の方法。
【請求項４７】
疾患としては、不妊症を含む生殖に関する障害；新生物、メラノーマ、肺腫瘍、結腸直腸腫瘍、乳房腫瘍、膵臓腫瘍、頭頚部腫瘍及び他の固形腫瘍を含む細胞増殖性疾患；白血病、非ホジキンリンパ腫、白血球減少症、血小板減少症、脈管形成障害、カポジ肉腫のような骨髄増殖性疾患；アレルギー、炎症性腸疾患、関節炎、乾癬及び呼吸器管炎症、喘息、及び臓器移植拒絶反応を含む自己免疫／炎症性疾患；高血圧症、浮腫、狭心症、アテローム性動脈硬化症、血栓症、敗血症、ショック、再潅流傷害、及び虚血症を含む心臓血管障害；中枢神経系疾患、アルツハイマー病、脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、及び疼痛を含む神経障害；発達障害；糖尿病、骨粗しょう症、及び肥満症を含む代謝障害；AIDS及び腎疾患；ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症及び寄生虫感染症を含む感染症；
が挙げられるが、これらに限定されるものではない、請求項３９〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
疾患が、リンパ球抗原が関与する疾患である、請求項３９〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
EGFドメイン含有タンパク質としての、請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項５０】
請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項３１記載のベクター、請求項３２記載の宿主細胞、請求項３３若しくは３４記載のリガンド、又は請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の化合物を含む、医薬組成物。
【請求項５１】
請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド又は請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、ワクチン組成物。
【請求項５２】
不妊症を含む繁殖障害；新生物、メラノーマ、肺腫瘍、結腸直腸腫瘍、乳房腫瘍、膵臓腫瘍、頭頚部腫瘍及び他の固形腫瘍を含む細胞増殖性疾患；白血病、非ホジキンリンパ腫、白血球減少症、血小板減少症、脈管形成障害、カポジ肉腫のような骨髄増殖性疾患；アレルギー、炎症性腸疾患、関節炎、乾癬及び呼吸器管炎症、喘息、及び臓器移植拒絶反応を含む自己免疫／炎症性疾患；高血圧症、浮腫、狭心症、アテローム性動脈硬化症、血栓症、敗血症、ショック、再潅流傷害、及び虚血症を含む心臓血管障害；中枢神経系疾患、アルツハイマー病、脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、及び疼痛を含む神経障害；発達障害；糖尿病、骨粗しょう症、及び肥満症を含む代謝障害；AIDS及び腎疾患；ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症及び寄生虫感染症を含む感染症及び他の病的状態の治療用医薬品の製造に使用するための、請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項３１記載のベクター、請求項３２記載の宿主細胞、請求項３３若しくは３４記載のリガンド、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の化合物、又は請求項５０記載の医薬組成物。
【請求項５３】
リンパ球抗原が関与する疾患の治療用医薬品の製造に使用するための、請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項３１記載のベクター、請求項３２記載の宿主細胞、請求項３３若しくは３４記載のリガンド、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の化合物、又は請求項５０記載の医薬組成物。
【請求項５４】
請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項３１記載のベクター、請求項３２記載の宿主細胞、請求項３３若しくは３４記載のリガンド、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の化合物、又は請求項５０記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、患者の疾患を治療する方法。
【請求項５５】
罹病患者における天然遺伝子の発現又はポリペプチドの活性が健常な対象者における発現又は活性のレベルと比較した場合に低い疾患に対し、前記患者に投与されるポリペプチド、核酸分子、ベクター、リガンド、化合物又は組成物がアゴニストである、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
罹病患者における天然遺伝子の発現又はポリペプチドの活性が健常な対象者における発現又は活性のレベルと比較した場合に高い疾患に対し、前記患者に投与されるポリペプチド、核酸分子、ベクター、リガンド、化合物又は組成物がアンタゴニストである、請求項５４記載の方法。
【請求項５７】
患者において疾患の治療をモニターする方法であって、
請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチドの発現若しくは活性のレベル又は請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子の発現レベルを、ある期間にわたって前記患者に由来する組織でモニターすることを含み、
前記期間にわたる発現又は活性のレベルがコントロールレベルに対して変化することは、前記疾患の後退の指標である、前記方法。
【請求項５８】
疾患の治療及び／又は診断に有効な化合物を同定する方法であって、
請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド又は請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子を、前記ポリペプチド又は前記核酸分子に対し結合親和性を有すると疑われる１又は２以上の化合物と接触させること；及び
前記ポリペプチド又は前記核酸分子と特異的に結合する化合物を選択すること；
を含む前記方法。
【請求項５９】
ストリンジェントな条件下で、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子とハイブリダイズする核酸プローブを含む、第１の容器；
前記核酸分子を増幅するのに有用なプライマーを含む、第２の容器；及び、
疾患の診断を容易にするための、前記プローブ及びプライマーの使用説明書；
を含む、疾患の診断に有用なキット。
【請求項６０】
ハイブリダイズしないRNAを消化するための薬剤を保有する第３の容器をさらに含む、請求項５９記載のキット。
【請求項６１】
核酸分子のアレイを含むキットであって、
前記核酸分子の少なくとも１つが請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子である前記キット。
【請求項６２】
請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチドと結合する、１又は２以上の抗体；及び
前記抗体と前記ポリペプチドとの間の結合反応を検出するのに有用な試薬；
を含むキット。
【請求項６３】
請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチドを、より高いレベル若しくはより低いレベルで発現するように又は発現しないように形質転換されている、非ヒトトランスジェニック動物又は非ヒトノックアウト動物。
【請求項６４】
請求項６３記載の非ヒトトランスジェニック動物を候補化合物と接触させること、及び前記動物の疾患に対する前記化合物の作用を決定することによる、疾患の治療に有効な化合物をスクリーニングする方法。
【請求項６５】
IVFで使用するため又は避妊薬として使用するための、請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項３１記載のベクター、請求項３２記載の宿主細胞、請求項３３若しくは３４記載のリガンド、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の化合物又は請求項５０記載の医薬組成物。
【請求項６６】
避妊薬の製造で使用するための、請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項３１記載のベクター、請求項３２記載の宿主細胞、請求項３３若しくは３４記載のリガンド、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の化合物又は請求項５０記載の医薬組成物。
【請求項６７】
関節炎、リウマチ性関節炎(RA)、乾癬性関節炎、変形性関節症、全身性エリテマトーデス(SLE)、全身性硬化症、強皮症、多発性筋炎、糸球体腎炎、線維症、肺線維症及び肺炎、アレルギー疾患又は過敏性疾患、皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、炎症性腸疾患(IBD)、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、敗血症性ショック、HIV感染、移植拒絶反応、創傷治癒、転移、子宮内膜症、肝炎、肝臓線維症、癌、無痛覚症、並びに、アテローム性動脈硬化症、クローン病、アトピー性の皮膚炎及び乾癬のような炎症性皮膚疾患、シェーグレン症候群及び／又は重症筋無力症に関連している脈管炎症の治療用医薬品の製造で使用するための、請求項６〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項３１記載のベクター、請求項３２記載の宿主細胞、請求項３３若しくは３４記載のリガンド、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の化合物又は請求項５０記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2007527203.tif 000185
2007527203.tif 000186
2007527203.tif 000187
2007527203.tif 000188
2007527203.tif 000189
2007527203.tif 000190
2007527203.tif 000191