(57)【要約】本発明は、第ＩＸ因子／第ＩＸａ因子に結合可能で第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）の凝血促進活性を増大させることが可能な抗体のようなリガンド、そのようなリガンドを含む薬学的組成物、そのようなリガンドを用いた血液凝固を患う患者を処置する方法、ならびにそのようなリガンドをコードする核酸、もしくはそのようなリガンドを発現する細胞を提供する。あるリガンドでは、第ＶＩＩＩ因子を抑制しない抗体が第ＩＸａ因子の凝血促進活性を打ち消さずに、第ＩＸａ因子に結合可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第ＩＸ因子／第ＩＸａ因子に結合可能であってＦＩＸａの凝血促進活性を増大させることが可能な、配列番号：１〜８に挙げられる少なくとも一種のアミノ酸配列を含む、抗体。
【請求項２】
前記抗体が少なくとも一種の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、その少なくとも一種のＣＤＲが配列番号：３〜８に挙げられる少なくとも一種のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体が４種のフレームワーク領域内に組込まれた少なくとも３種のＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を含み、該少なくとも３種のＣＤＲのうちの一種以上が配列番号：３〜８に挙げられるようなアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が１個以上のＣＤＲ３を含み、各ＣＤＲ３が配列番号：５〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の各々が、配列番号：３〜５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項６】
前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の各々が、配列番号：６〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体が配列番号：１〜２に挙げられる少なくとも一種のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が配列番号：１〜２に挙げられる両方のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体がＩｇＧ抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体が抗体フラグメントである、請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体が組換え抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体が単鎖抗体である、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗体が標識されている、請求項１に記載の抗体。
【請求項１６】
請求項１に記載の抗体を発現する細胞。
【請求項１７】
前記抗体が少なくとも１種の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、該少なくとも１種のＣＤＲが配列番号：３〜８に挙げられる少なくとも１種のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
請求項１に記載の抗体をコードする核酸。
【請求項１９】
前記抗体が少なくとも１種の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、該少なくとも１種のＣＤＲが配列番号：３〜８に挙げられる少なくとも１種のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の核酸。
【請求項２０】
請求項１６に記載の細胞を培養する工程を包含する、第ＩＸ／ＩＸａ因子に結合可能な抗体を作製する方法。
【請求項２１】
請求項１８に記載の核酸を細胞内で発現させる工程を包含する、第ＩＸ／ＩＸａ因子に結合可能な抗体を作製する方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の抗体ならびに薬学的に受容可能なキャリアおよび／または希釈剤を含む、薬学的組成物。
【請求項２３】
前記抗体が少なくとも一種の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、該少なくとも一種のＣＤＲが配列番号：３〜８に挙げられる少なくとも一種のアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
前記薬学的組成物が、さらに第ＩＸ因子、第ＩＸａα因子、第ＩＸａβ因子および／または第ＩＸα因子を含む、請求項２３に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
薬学的に有効な量の請求項１に記載の抗体を患者に投与する工程を包含する、血液凝固障害を罹患する患者を処置する方法。
【請求項２６】
前記抗体が少なくとも一種の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、該少なくとも一種のＣＤＲが配列番号：３〜８に挙げられる少なくとも一種のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記血液凝固障害が、血友病Ａまたは出血性体質である、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、第ＩＸ因子／第ＩＸａ因子に結合可能で第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）の凝血促進活性を活性化することが可能なリガンド、それらリガンドの誘導体、そのようなリガンドを含む薬学的組成物、そのようなリガンドの投与することを含み血液凝固疾患を患う患者を治療する方法、タンパク質である特定のリガンドをコードする核酸、およびそのようなリガンドを発現する細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
正常な止血過程における鍵となる事象の一つに、第Ｘ因子（ＦＸ）不活型前駆体の酵素活性型ＦＸａへの変換、それに続くプロトロンビンの活性化プロセスおよび凝血塊の形成がある。インビボでのＦＸ活性化は、組織因子／第ＶＩＩａ因子経路から始まる。組織因子／第ＶＩＩａ因子複合体は、組織因子経路の抑制物質によって容易に抑制される。引き続いて内在性凝固経路を介してＦＸの主要部分の活性化が起こる。それには内在性第Ｘ因子を活性化する複合体の形成が欠かせない。この複合体は、Ｃａ２＋イオンの存在下でリン脂質表面に結合した第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）と第ＶＩＩＩａ因子（ＦＶＩＩＩａ）との凝固因子から成る。その内在性の第Ｘ因子を活性化するこの複合体は、安定的な凝血塊の形成を可能にするレベルのＦＸａを生じさせる。
【０００３】
ＦＶＩＩＩａは、第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）のアクチベータとして機能し、ＦＸａの形成速度を約２０００００倍も上げる（非特許文献１）。ＦＸＩＩＩａがＦＩＸａのＦＸに対する触媒活性を増大させる厳密な機序は、既に知られている。自然に生じる変異体および部位特異的突然変異、さらにプロトロンビナーゼ複合体のような補因子／酵素複合体の解析から、ＦＶＩＩＩａとＦＩＸａとの間に少なくとも二個の接触領域が存在することが示唆された。そのいずれの領域とも、ＦＩＸａの酵素活性を増大するのに重要な役割を担う。ＦＶＩＩＩは、内在性第Ｘ因子を活性化する複合体内において三つの機能を持つと一般的に考えられている。即ち、（ｉ）ＦＶＩＩＩが、ＦＸに対するプロテアーゼ活性を増大したＦＩＸａの高次構造を安定化し、（ｉｉ）ＦＶＩＩＩａが、インビボで凝血促進性リン脂質表面を提供する活性化血小板上でのＦＩＸａ受容体として機能し、（ｉｉｉ）最近のデータが示すところではＦＶＩＩＩａが、ＦＸ内の開裂部位をＦＩＸａの活性部位に合わせる。
【０００４】
止血におけるＦＶＩＩＩの重要な役割は、Ｘ染色体に関連した劣性の重篤な出血性疾患であって血液凝固第ＶＩＩＩ因子活性の欠如を特徴とする血友病Ａで明らかになっている。血友病Ａの患者は、血漿由来または組換え体のＦＶＩＩＩの静脈内注射によるＦＶＩＩＩ投与によって治療を受ける。そのような治療法は有効ではあるが、いくつかの欠点を有する。第一に、ＦＶＩＩＩの半減期が比較的短いために、一週間に２〜３回、高用量のＦＶＩＩＩを投与する必要がある。第二に、ＦＶＩＩＩの製造コストが極めて高く、その結果、主として先進工業国でしか入手することができない。最後に、重篤な患者のおよそ３０％において、ＦＶＩＩＩ活性を抑制する抗体が出現し（「インヒビタ−をもつ血友病患者」または単に「インヒビタ−をもつ患者」と呼ばれる）、そのことは重篤で生命を脅かす合併症である。
【０００５】
ＦＶＩＩＩが、止血時に果たす鍵となるその役割を、血液凝固疾患患者に投薬したときの前述の短所に結び付けて鑑みると、ＦＶＩＩＩと同様な活性を持つが、その限界をいくつか克服した化合物が強く求められている。
【非特許文献１】ｖａｎ  Ｄｉｅｉｊｅｎら  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．（１９８１）２５６：  ３４３３−３４４２
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（要旨）
本発明は、血液凝固疾患（たとえば血友病および出血性体質）の治療において第ＶＩＩＩａ因子の代替品として機能するリガンドの一部を提供する。従って、それらのリガンドは第ＩＸａ因子に結合して第ＩＸａ因子の凝血促進活性を刺激することができる。あるリガンドでは、第ＶＩＩＩ因子を抑制しない抗体が第ＩＸａ因子の凝血促進活性を打ち消さずに、第ＩＸａ因子に結合可能である。以下に述べるある特定のリガンドグループが提供される。即ち、（ｉ）第ＩＸ因子／第ＩＸａ因子に結合してＦＩＸａの凝血促進活性を上昇させるグループ、および（ｉｉ）配列番号：１〜８に記載される少なくとも一種のアミノ酸配列を含むグループ。このほかのリガンドは、それらリガンドの誘導体である。いくつかのリガンドは、配列番号：１〜８に記載された少なくとも一種のアミノ酸配列を含み、第ＩＸ／ＩＸａ因子結合性の対照抗体の結合を競合的に抑制する抗体である。従って、ある抗体は配列番号：１〜８に記載される少なくとも一種のアミノ酸配列を含み、ＦＩＸａの凝血促進活性を上昇させる。
【０００７】
そのようなリガンドを発現する細胞およびそれらリガンドをコードする核酸も本発明において提供され、さらにそのようなリガンドの製法およびそれらの細胞または核酸の使用法も提供される。
【０００８】
血友病Ａおよび出血性体質のような血液凝固疾患（たとえばヒトにおいて）の治療用の薬学的組成物も本発明で述べられる。ある薬学的組成物はたとえば、本発明で開示される一種またはそれ以上のリガンドと薬学的に受容可能なキャリアおよび／または希釈剤とを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（詳細な記載）
（Ｉ．  定義）
本明細書に記載の第ＶＩＩＩ因子は、当該技術における一般的な意味を持ち、単独の遺伝子産物から生じる種々のポリペプチド（たとえばＡｎｄｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８３，  ２９７９−２９８３，  Ｍａｙ  １９８６；    Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，  ３２６−３３０；    Ｗｏｏｄ，  Ｗ．  Ｉ．  ｅｔａｌ．  （１９８４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，  ３３０−３３７；    Ｖｅｈａｒ，  Ｇ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，  ３３７−３４２；  およびＴｏｏｌｅ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，  ３４２−３４７参照）を指し、血漿から得られるもの、あるいは合成または組換えＤＮＡ技法を用いて製造されるものである。第ＶＩＩＩ因子は自然には、全長タンパク質およびその開裂によって形成された短い形など、いくつかの形態で存在している。全長第ＶＩＩＩ因子については、たとえば米国特許第５６３３１５０号および同第４７５７００６号に記載されている。第ＶＩＩＩ因子のｍＲＮＡは、１９アミノ酸長のシグナルペプチドを含む２３５１個のアミノ酸から成る前駆体タンパク質をコードし、成熟型の第ＶＩＩＩ因子タンパク質は従って２３３２アミノ酸長を持つ。そのアミノ酸配列は、三組のＡドメイン、単一のＢドメインと二組のＣドメインとからなる、Ａ１  ：  Ａ２  ：  Ｂ  ：  Ａ３  ：  Ｃ１  ：  Ｃ２の配列順のドメイン構造を持つことが予測された。血液凝固過程でＢドメインは、その分子へのトロンビン作用によって取り除かれる。組換え第ＶＩＩＩ因子を含有し、市販されている治療用製剤の例としては、ＨＥＭＯＦＩＬ  Ｍ（登録商標）、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＥ（登録商標）  （Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，  ＩＩＩ．，  Ｕ．Ｓ．Ａ．から入手可）、ならびにＫＯＧＥＮＡＴＥ（Ｂａｙｅｒ，  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａから入手可）の商品名で販売されているものが挙げられる。
【００１０】
第ＶＩＩＩ因子という用語は、凝血促進活性を保持していて、置換、付加または欠失を伴うタンパク質を含めたその変異型も含むものである。この第ＶＩＩＩ因子という用語の中に含まれるある分子では、全長第ＶＩＩＩ因子からひとつのドメインが失われている。たとえばＢドメインが失われた第ＶＩＩＩ因子（ｒ−ＶＩＩＩ  ＳＱ）は、Ｗｙｅｔｈ社、マサシューセッツ州、によって製造されている（たとえば、Ｂｅｒｎｔｏｒｐ，  Ｅ．  （１９９７）  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ７８，  ２５６−２６０参照；さらに欧州特許出願公開第０５０６７５７号も参照）。この特別なタンパク質は、９０ｋＤａの重鎖（Ａ１：Ａ２のドメイン）と８０ｋＤａの軽鎖（Ａ３：Ｃ１：Ｃ２のドメイン）とから成り、両鎖はリンカーペプチドで連結されている。第ＶＩＩＩ因子という用語は、第ＶＩＩＩ因子活性を持つ天然に生じる第ＶＩＩＩ因子と本質的に同一の配列を持つ分子種を含むものである。
【００１１】
本明細書に記載の第ＩＸ因子は、当該技術における一般的な意味を待ち、自然に生じる形態のもの、および第ＩＸ／ＩＸａ因子活性を保持し合成、組換えまたはそのほかの手段で製造されるその変異体も含むものである。ヒト第ＩＸ因子をコードするｃＤＮＡは、種々のグループが記載（たとえば、Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２９９：  １７８−１８０  （１９８２）；    Ｆａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ６４：  １９４−２０４  （１９８４）；  およびＫｕｒａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ７９：  ６４６１−６４６４  （１９８２）を参照）してきた。組換えＤＮＡ技法による第ＩＸ因子の製法は、米国特許第４７７０９９９号中に記載されている。この用語は、第Ｘ因子活性化能を保持する天然に生じる第ＩＸ因子に置換、付加または欠失を伴うタンパク質も含めるものである。たとえば、置換基を持つ第ＩＸ因子タンパク質は、米国特許第６５９９７２４号中に記載されている。この用語には、第ＩＸａαおよび第ＩＸａβなどプロセシングを受けた種々の形態も含めることが可能である。第ＩＸ因子の概略については、Ｌｉｍｅｎｔａｎｉ，  Ｓ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ”，  ｉｎ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ：  Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  ３ｒｄ  ｅｄ．  （Ｃｏｌｍａｎ，  Ｒ．Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ）  ｄｈａｐ．  ５．，  Ｊ．Ｂ．  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  １９９４  を参照のこと。
【００１２】
本明細書に記載の凝血促進活性は、当該技術における一般的な意味を持ち、凝血塊形成を促進する活性を一般的に指す。この活性は、血液試料を用いるかあるいは当該技術で既知のほかのアッセイ（たとえば、本明細書の実施例中に記載されるアッセイを参照）を用いてモニタリングすることが可能である。本発明において開示される抗体は、それらが第ＩＸａ因子と相互作用することが可能であって、第Ｘ因子を第Ｘａ因子に変換する第ＩＸａ因子の反応速度を上げるという凝血促進活性を有する。凝血促進活性の上昇は、本明細書の実施例中の記載にあるようなアッセイを用いて計測することが可能である。活性上昇に関するアッセイは、対照あるいはベースラインレベル（たとえば、第ＶＩＩＩ因子欠乏性血友病患者からの試料）に対して一般的に比較して行われる。
【００１３】
本明細書に記載の「抗体」とは、特定の抗原に免疫学的に活性を有する免疫グロブリンを一般的に指すように意味付けられており、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体との両方を含めるものである。この用語は、キメラ抗体（たとえば、ヒト化ネズミ抗体）およびヘテロコンジュゲート抗体（たとえば二特異的抗体）のような遺伝子工学的に得られる形態のものも含める。「抗体」という用語は、抗原結合能を持つフラグメントを含めた、抗体の抗原結合性形態（たとえば、Ｆａｂ’，  Ｆ（ａｂ’）２，  Ｆａｂ，  ＦｖおよびｒＩｇＧ  尚、たとえばＰｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  １９９４−１９９５  （Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）；    Ｋｕｂｙ，  Ｊ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ３ｒｄ  Ｅｄ．，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８８）  を参照のこと）を含めるものである。この用語は、組換え単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントも包含する。さらにこの用語は、二価性または二特異的分子、二量化抗体、三量化抗体および四量化抗体も含める。二価性または二特異的分子についてはたとえば、Ｋｏｓｔｅｉｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８：  １５４７，    Ｐａｃｋ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  （１９９２）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：  １５７９，    Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  ｓｕｐｒａ，    Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５６：  ３０５５，    Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５３：  ４０２６およびＭｃＣａｒｔｎｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ８：  ３０１に記載されている。
【００１４】
特定の抗原と免疫学的に反応性を有する抗体は、ファージベクターまたは同様のベクターにおける組換え抗体のライブラリーを選択するなどの組換え方法（たとえば、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：  １２７５−１２８１  （１９８９）；    Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：  ５４４−５４６（１９８９）；  およびＶａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １４：  ３０９−３１４  （１９９６）参照）によるか、あるいは抗原または抗原をコードするＤＮＡで動物を免疫化することによって生成させることができる。
【００１５】
典型的には、免疫グロブリンは重鎖と軽鎖とを持つ。重鎖および軽鎖は各々、定常領域と可変領域（両領域は「ドメイン」としても知られる）とを含む。軽鎖および重鎖の可変領域は、３個の超可変領域によって隔てられた４個の「フレームワーク」領域を含み、「相補性決定領域」あるいは「ＣＤＲ」とも呼ばれる。このフレームワークおよびＣＤＲの範囲は、既に規定されている。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、一つの種の中でも比較的変化する。軽鎖および重鎖の構成部分を組合わせたフレームワーク領域である、抗体フレームワーク領域は、３次元空間でのＣＤＲの配置および位置調整に役立っている。
【００１６】
ＣＤＲは、抗原エピトープへの一義的な結合を受持つ。各鎖のＣＤＲは典型的な場合、Ｎ−末端側から順に数えてＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれ、また典型的には、内部に特定ＣＤＲが配置されている鎖によって同定される。たとえばＶＨＣＤＲ３は、本発明における抗体の重鎖の可変ドメイン内に配置されており、これに対してＶＬＣＤＲ１は、本発明における抗体の軽鎖の可変ドメイン由来のＣＤＲ１である。
【００１７】
「ＶＨ」または「ＶＨ」の表記は、ある抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域を指し、Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはＦａｂの重鎖も含める。「ＶＬ」または「ＶＬ」の表記は、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指し、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂの軽鎖も含める。
【００１８】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」の用語は、本来ならば２本鎖である抗体の重鎖および軽鎖の両可変ドメインが連結して単鎖を形成した場合の抗体を指す。典型的には、その２本の鎖の間にリンカーペプチドが挿入されていて固有のフォールディングをとり、活性結合部位が形成されている。
【００１９】
「キメラ抗体」とは、（ａ）定常領域またはその一部分が変更、置換えまたは交換された免疫グロブリン分子のことであって、その抗体結合部位（可変領域）が、異なるか変更されたクラス、エフェクター機能および／または種の定常領域に連結しているか、あるいはそのキメラ抗体に新たな特性を付与する全く異なる分子、たとえば酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物など、に連結しているもの、または（ｂ）可変領域またはその一部分が変更、置換え、あるいは異なるか変更された抗原特異性を持つ可変領域と交換された免疫グロブリンのことである。
【００２０】
「ヒト化抗体」とは、ヒト以外の免疫グロブリンから導かれる最小限の配列を含む免疫グロブリン分子のことである。ヒト化抗体は、受入れ側のヒト免疫グロブリンの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、所望の特異性、親和性および受容性を持つマウス、ラットまたはウサギのようなヒト以外の種由来の残基（ドナー抗体）で置き換わったヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含めるものである。いくつかの場合では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、ヒト以外の相当する残基で置き換わっている。ヒト化抗体は、レシピエントの抗体中にも、移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列中にも見出されない残基を含むことも可能である。一般的にヒト化抗体は、少なくとも１個、典型的には２個の可変ドメインのほぼ全体を含み、ヒト化抗体ＣＤＲ領域の全体またはほぼ全体は、ヒト以外の免疫グロブリンのＣＤＲ領域に相当し、フレームワーク（ＦＲ）領域の全体またはほぼ全体が、ヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列そのものである。最も好ましくはヒト化抗体は、免疫グロブリン、典型的にはヒト免疫グロブリン、の定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含む（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：  ５２２−５２５  （１９８６）；    Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：  ３２３−３２９  （１９８８）；  およびＰｒｅｓｔａ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ２：  ５９３−５９６  （１９９２））。抗体のヒト化ついてはたとえば、Ｗｉｎｔｅｒと共同研究者との方法（たとえば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：  ５２２−５２５  （１９８６）；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：  ３２３−３２７  （１９８８）；  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：  １５３４−１５３６  （１９８８）参照）に従って実施することができ、ネズミのＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の相当する配列の代わりに置換えることによっても実施することができる。従ってそのようなヒト化抗体は、ヒトのインタクトの可変ドメインよりも実質的に小さい可変ドメイン部分が、ヒト以外の動物種由来の相当配列で置換わっているキメラ抗体（米国特許第４８１６５６７号）でもある。
【００２１】
「エピトープ」または「抗原決定部位」とは、抗体が結合する抗原表面部位を指す。エピトープは、連続したアミノ酸、あるいはタンパク質の３次フォールディングによって並列した非連続のアミノ酸の両方から形成され得る。連続したアミノ酸から形成されたエピトープは典型的には、タンパク質変性溶媒に曝されても維持されるが、３次フォールディングによって形成されたエピトープは典型的には、タンパク質変性溶媒で処理されると失われる。１個のエピトープには少なくとも３個、通常それ以上、少なくとも５個、あるいは８−１０個のアミノ酸が、特有の空間高次構造で含まれている。エピトープの空間高次構造の測定方法にはたとえば、Ｘ線結晶解析および２次元核磁気共鳴法が挙げられる。たとえばＥｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ６６，  Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．  Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｅｄ  （１９９６）を参照のこと。
【００２２】
２個またはそれ以上の核酸あるいはポリペプチド配列に関しての「同一の」または何パーセントの「同一性」という用語は、アミノ酸残基またはヌクレオチドが同じか、あるいは後述の初期パラメータを伴うＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ  ２．０配列比較アルゴリズムを用いて計測されるか、あるいはマニュアルでの整列化と視覚認識とによって計測されたアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定の配列一致率％（即ち、比較領域または指定領域に関して最大限一致するように比較、整列化した時の、特定の領域に関する約６０％の同一性、好ましくは７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいはそれ以上の同一性）を持つ２個またはそれ以上の配列またはサブ配列のことを指す。そのような配列を、今後は「ほぼ同一の」と言うことにする。この定義は、分析対象配列の相補体をも指すか、あるいは適用される場合がある。またこの定義には、欠失および／または付加がある配列、それらに加えて置換基を持つ配列、さらに天然に生じるたとえば多型性または対立遺伝子性のような変異体、および人為的変異体も含まれる。後述するように、好ましいアルゴリズムでは、ギャップを考慮することができる。同一性については、アミノ酸長またはヌクレオチド長が少なくとも約５、６、７、８または９個である領域に関して言及するのが好ましく、さらには１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００個のアミノ酸長またはヌクレオチド長に関して言及するのが良い。
【００２３】
配列の比較については典型的な場合、一つの配列は、分析対象配列が比較される１種の参照配列としての役割を果たす。ある配列比較アルゴリズムを用いる際には、分析対象および参照の配列をコンピュータに入力し、サブ配列の座標を指定し、さらに必要であれば配列アルゴリズムプログラムのパラメータも指定する。また初期設定プログラムパラメータが使用出来るのが好ましく、あるいは代わりのパラメータを指定できるのが好ましい。次にその配列比較アルゴリズムによって、そのプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する分析対象配列に関する配列一致率％が計算される。
【００２４】
比較のための最適な配列整列処理についてはたとえば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズム、Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：  ４８２  （１９８１）；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈの相同性整列処理アルゴリズム、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：  ４４３  （１９７０）；Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎの同一性探査法、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：  ２４４４  （１９８８）；各種アルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ中のＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータによる実行、あるいはマニュアルによる整列化と視覚認識とによる方法（たとえば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  １９９５  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照）で実施可能である。
【００２５】
配列一致率％および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの例には、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：  ３３８９−３４０２  （１９７７）およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：  ４０３−４１０  （１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムが挙げられる。尚、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０は、本発明において記載されたパラメータと共に、本発明の核酸およびタンパク質に関する配列一致率％の決定に用いられる。ＢＬＡＳＴ解析実行用ソフトウエアは、米国立バイオテクノロジー情報センターを通して公に入手可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータであるＷ、ＴおよびＸは、整列処理の感度と速度とを決定するものである。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、初期設定としてワード長（Ｗ）１１、予測数量（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および２本鎖の両方の比較の実施を用いる。アミノ酸配列用には、初期設定としてワード長３および予測数量（Ｅ）１０を用いるＢＬＡＳＴＰプログラム、および整列数（Ｂ）５０、予測数量（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および２本鎖の両方の比較の実施を初期設定として用いるＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，    Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：  １０９１５  （１９８９）参照）が適用される。
【００２６】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２種類の配列間の類似性の統計的解析（たとえば、Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｔｓｃｈｕｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：  ５８７３−５８８７  （１９９３）参照）も実施する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される一つの類似性算定値は、最小合計確率数（Ｐ（Ｎ））であって、それは２個のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列間のマッチングが偶然起こるであろう確率を示すものである。たとえば、参照核酸との解析対象核酸の比較においての最小合計確率数が約０．２未満の場合、より好ましくは約０．０１未満の場合、最も好ましくは約０．００１未満の場合、その核酸は参照核酸に類似しているとみなされる。対数値では負の大きな数、たとえば５、１０、２０、３０、４０、７０、９０、１１０、１５０または１７０、になると言える。
【００２７】
「宿主細胞」とは天然に生じる細胞、または発現ベクターを含んでその複製または発現を継続させる形質転換細胞のことである。宿主細胞の例としては、培養細胞、外植片および生体内細胞が挙げられる。宿主細胞は、大腸菌のような原核細胞、あるいは酵母、昆虫、両生類、またはＣＨＯおよびＨｅＬａ等の哺乳類の細胞のような真核細胞であり得る。
【００２８】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本発明においてアミノ酸残基の重合体を指すものとして互換的に用いられる。これらの用語は、天然に生じるアミノ酸重合体、修飾残基を含むそれら重合体、および非天然化で生じるアミノ酸重合体はもちろんのこと、１個またはそれ以上のアミノ酸残基が、対応する天然由来アミノ酸の人工キメラ擬似体であるアミノ酸重合体にも適用される。
【００２９】
「アミノ酸」という用語は、天然に生じるアミノ酸および合成アミノ酸を指し、また天然に生じるアミノ酸に類似した機能を有するアミノ酸類似体およびアミノ酸擬似体も指す。天然に生じるアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされているものであり、後で修飾を受けるそれらのアミノ酸、たとえばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸およびＯ−ホスホセリン、も同様である。アミノ酸類似体とは、天然に生じるアミノ酸と同じ基本的化学構造を持つ化合物、たとえばＨ、カルボキシル基、アミノ基とＲ基とが結合したα炭素を持つ、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム等、を指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基を持つ場合（たとえばノルロイシン）、あるいは修飾されたペプチド主鎖を持つ場合があるが、いずれも天然に生じるアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。アミノ酸擬似体とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を持つがその機能は天然に生じるアミノ酸に類似する化合物を指す。
【００３０】
本発明ではアミノ酸は、それらの一般的に知られた３文字表記法、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨する１文字表記法のいずれかで言及される場合がある。ヌクレオチドでもまた、それらの一般的に受け入れられる１文字コードによって言及される場合がある。
【００３１】
「保存的修飾変異体」とは、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用されるものである。特別の核酸配列に関して、保存的修飾変異体は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードするそれらの核酸のこと、あるいはあるアミノ酸をコードしなくても本質的に同一のものか、または連結したもの、たとえば天然の連続的配列、を指す。遺伝子コードの縮重のために、多数の機能的同一性核酸によってほとんどのタンパク質がコードされる。たとえば、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵのコドンは、すべてアミノ酸のアラニンをコードする。従って、あるコドンによって特定されるアラニンの各位置において、そのコードされるポリペプチドを改変しない前述の別の対応するコドンにコドン変更することが可能である。そのような核酸変異は、保存的修飾変異の一種である「沈黙変異」である。本発明において、あるポリペプチドをコードする各核酸配列は、核酸の沈黙変異のことも述べているものとする。スキルの一つとして、ある核酸中の各コドン（但し、メチオニンに対する通常唯一のコドンであるＡＵＧ、およびトリプトファンに対する通常唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を、機能的に同一の分子を得るためにある状況下で変更できることがわかるであろう。従って、一つのポリペプチドをコードするある核酸の沈黙変異がしばしば、実用プローブ配列以外の発現産物に関する前述の配列中に暗示されている。
【００３２】
アミノ酸配列の場合ではスキルの一つとして、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列に対する置換、欠失または付加の個々については、コードされるアミノ酸配列中の単一アミノ酸または全体に比べて僅かな数の複数個のアミノ酸の変更、追加または欠失が存在するものであって、その変更はあるアミノ酸が化学的に類似したアミノ酸で置換えられた結果生じる「保存的修飾変異体」であることが認識される。類似するアミノ酸を機能的に提供する保存的置換テーブルは、本技術分野においてよく知られている。このような保存的修飾変異体には、本発明の多型変異体、種間類似体および対立遺伝子もさらに加わり、それらは不可欠のものである。典型的な場合、保存的置換は１）アラニン（Ａ）とグリシン（Ｇ）との、２）アスパラギン酸（Ｄ）とグルタミン酸（Ｅ）との、３）アスパラギン（Ｎ）とグルタミン（Ｑ）との、４）アルギニン（Ｒ）とリシン（Ｋ）との、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）とバリン（Ｖ）との、６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）とトリプトファン（Ｗ）との、７）セリン（Ｓ）とスレオニン（Ｔ）との、および８）システイン（Ｃ）とメチオニン（Ｍ）との、各々についてである（たとえば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  （１９８４）参照）。
【００３３】
ある抗体に「特異的に（または選択的に）結合する」という用語句、あるいはタンパク質またはペプチドを参照する場合の「〜に対して特異的に（または選択的に）免疫活性を有する」という用語句は、タンパク質とその他の生物由来物質との不均質集団中の特定タンパク質の存在を検出する結合反応のことを指す。従って、指定されたイムノアッセイ条件下で、特異化された抗体は、バックグランドの少なくとも２倍、さらに典型的な場合、１０〜１００倍、ある特定タンパク質配列に結合する。あるタンパク質に特異的に結合するリガンド（たとえば、抗体）は一般的には、少なくとも１０３Ｍ−１または１０４Ｍ−１、時には１０５Ｍ−１または１０６Ｍ−１、別の場合では１０６Ｍ−１または１０７Ｍ−１、好ましくは１０８Ｍ−１〜１０９Ｍ−１、さらに好ましくは約１０１０Ｍ−１〜１０１１Ｍ−１あるいはそれ以上、の会合定数を示す。イムノアッセイのフォーマットを変えることは、特定のタンパク質との特異的免疫反応性を持つ抗体の選択に用いることができる。たとえば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、あるタンパク質と特異的な免疫反応性を有するモノクローナル抗体の選択に日常的に使用されている。尚、特異的な免疫反応性の測定に使用可能なイムノアッセイのフォーマットおよび条件についての記載に関しては、たとえばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  （１９８８）    Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  を参照のこと。
【００３４】
「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」という用語は、本来の状態で見出されるような通常では付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない物質（たとえば、抗体）のことを指す。純度および均質性は典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーのような分析化学的技術を用いて測定される。ある調製物中に存在する主要分子種であるタンパク質または核酸は、実質的に精製されているものである。特に単離核酸は、天然状態で遺伝子に隣接していて、その遺伝子によってコードされるタンパク質以外のタンパク質をエンコードするいくつかの転写解読枠から選択される。いくつかの実施形態の中で用いられる「精製された」という用語は、一種の核酸またはタンパク質が電気泳動ゲル中で本質的に１本のバンドを形成することを意味するものである。その核酸またはタンパク質が少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに最も好ましくは少なくとも９９％、純粋であるとの意味を持つのが好ましい。別の実施形態で用いられる「精製する」または「精製」とは、精製されるべき組成物から少なくとも一種の汚染物質を除去することを意味する。この意味では、精製とはその精製化合物が均質、たとえば１００％純粋、であることまでは必要としていない。
【００３５】
「標識」または「検出可能部分」とは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、またはそのほかの物理的手段によって検出可能な組成物のことである。有用な標識の例としては、蛍光色素、電子密集性試薬、酵素（たとえばＥＬＩＳＡにおいて一般的に用いられるもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、あるいはハプテンおよび検出を可能にするそのほかのタンパク質または実在物質、たとえばペプチド内への放射性標識の取込みによるもの、またはペプチドと特異的に反応する抗体の検出で用いられるもの、が挙げられる。放射性同位元素には、たとえば３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉの場合がある。
【００３６】
（ＩＩ．  抗体を含めたリガンド）
（Ａ．  構造および活性）
本発明において、ＦＩＸａの活性化の際にＦＶＩＩＩａの代替物または補足物として機能するリガンドが開示される。そのようなリガンドは多くの有用性を持ち、その中には種々の血液凝固疾患患者を治療するための直接的または薬学的組成物の一部としての使用、およびＦＩＸ／ＦＩＸａの精製および検出における使用も含まれる。提供されるリガンドのある種のものでは、驚くべきことに他の抗体と比較してＦＩＸ／ＦＩＸａに結合するＦＩＸ／ＦＩＸａ親和性を増大させ（たとえば、後述の実施例４および５参照）、ＦＩＸａの凝血促進活性を増大させる（たとえば、後述の実施例６および７参照）ことが見出された。
【００３７】
本発明において用いられるものとしての「リガンド」という用語は一般に、
１）ａ）インビトロおよび／またはインビボで第ＩＸ因子／第ＩＸａ因子（好ましくはヒト起源のもの）に結合する化合物、ｂ）ＦＩＸａとの複合体形成によってＦＩＸａの凝血促進活性を活性化する化合物、およびｃ）配列番号：１〜８に挙げられるようなアミノ酸配列の少なくとも一種を含む化合物、ならびに
２）そのような化合物の誘導体、
を指す。
【００３８】
配列番号：１および２は各々、抗体２２４Ｆ３のＶＨおよびＶＬ領域由来のペプチド配列（図６および７参照）である。配列番号：３〜８は各々、抗体２２４Ｆ３の軽鎖Ｌ１−Ｌ３、および重鎖Ｈ１−Ｈ３のＣＤＲ配列由来のペプチド配列（図８参照）である。
【００３９】
本発明において用いられるものとしての「誘導体」という用語は、上記（ａ）および（ｂ）の特徴を持つ化合物のことを一般に指し、さらに（ｉ）配列番号：１〜８のアミノ酸配列の少なくとも一種を含む化合物、その対応する配列のアミノ酸残基数の最大２５％が置換または欠失されたいずれかの場合の配列を含む化合物、対応する配列の前記以外のアミノ酸残基数が置換または欠失された場合の配列を含む化合物、あるいは配列番号：１〜８の配列のいずれかの中に１個またはそれ以上のアミノ酸が挿入された場合の配列を含む化合物であって、いずれの場合もそのリガンドの機能は保持されているか、または機能が向上さえしたもの、あるいは（ｉｉ）  前項（ｉ）の定義を満たさなくともリガンドの特異的機能を示す化合物（たとえば、タンパク質性または非タンパク質性起源の擬似ペプチド性化合物；Ｋｅｍｐ  ＤＳ，    Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １９９０，  ｐｐ．  ２４９−２５５参照）、のいずれかも指す。タンパク質（たとえば、抗体）であるある種の誘導体は、配列番号：１〜８に挙げられたアミノ酸配列の一種またはそれ以上と実質的に同一のアミノ酸配列を持つタンパク質セグメントを含む。
【００４０】
リガンドの「特異的機能」という用語は、リガンドおよびそのほかのエフェクター（詳細は後述）が存在しない場合に対する、リガンド存在時におけるミカエリス−メンテン反応速度論の項の中の触媒効率比（ｋｃａｔ／ＫＭ）が５：１より大、好ましくは６：１より大、さらに好ましくは６．５：１より大、または最も好ましくは６．８：１より大であることで規定される。
【００４１】
あるリガンドは抗体のようなポリペプチドである。本発明で提供される抗体は一般的、配列番号：３〜８中に挙げられる相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）と同じエピトープを認識する。特別の抗体が別の抗体と同じエピトープを認識する能力については、第二の抗体（たとえば、対照抗体）の抗原（たとえば、第ＩＸ因子または第ＩＸａ因子）への結合を競合的に抑制する抗体の能力によって測定することができる。いくつかの競合的結合アッセイは、同一抗原に対する２種の抗体間の競合性の計測に用いることができる。そのようなアッセイには、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ（たとえば、実施例５を参照）がある。本技術領域において知られた種々のイムノアッセイも用いることができる。たとえば、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用いる場合、抗体が結合するエピトープによってその抗体を区別することができる。このことは、ウエル表面を被覆する捕捉抗体を用いて実施される。次に飽和量近い濃度の標識化抗原が加えられる。このタンパク質は、ある特異的抗体とエピトープとの相互作用を介してその抗体に結合するであろうものである。洗浄後、検出性部分（たとえば、検出抗体として規定される標識化抗体を伴うＨＲＰ）が予め共有結合した第二の抗体がそのＥＬＩＳＡに加えられる。この抗体は、もしそれが捕捉抗体と同じエピトープを認識するならば、その特定のエピトープにはもはや結合不能となるため、標的タンパク質に結合することはできないであろう。しかしながら、もしこの第二の抗体が標的タンパク質表面の異なるエピトープを認識するのならば、その抗体は結合可能であろうし、その結合は適切な基質を用いる、活性レベル（およびそのため結合した抗体）の定量によって検出することができる。尚、バックグランドは、単一抗体を用い、捕捉抗体と検出抗体との両方で規定されるが、その最大シグナルは、抗原特異的抗体による捕捉およびその抗原表面の標識に対する抗体による検出によって確定することができる。比較対照としてこのバックグランドおよび最大シグナルを用いることによって、抗体は一対一式のエピトープ特異性測定手法で評価することができる。
【００４２】
前述のアッセイのいずれかを用い、第一の抗体の存在下で抗原への第二の抗体の結合が、少なくとも３０％、通常は少なくとも約４０％、５０％、６０％または７５％、および場合によっては少なくとも約９０％低下するのならば、一般的に第一の抗体は、第二の抗体の結合を競合的に抑制すると考えられる。
【００４３】
本発明で提供されるある種の抗体は、１本またはそれ以上のポリペプチド鎖を持ち、そのうちの少なくとも１本のポリペプチド鎖は、少なくとも３個のループまたは相補性決定領域（即ち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を含んでいる。それらＣＤＲの一種またはそれ以上もまた、配列番号：３〜８に挙げられるような配列を含んでいる。いくつかの抗体では、そのＣＤＲは４個のフレームワーク領域内に包埋されている。ＣＤＲの定義は、Ｃｈｏｔｈｉａの計数スキーム（たとえば、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  Ｂ．，  Ｌｅｓｋ  Ａ．  Ｍ．およびＣｈｏｔｈｉａ  Ｃ．  １９９７．  ”Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎｓ”，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２７３：  ９２７−９４８を参照、尚、その開示内容は、すべての目的に対してそのまま参照することで本発明に組入れられるものである）に従う。それ以外のリガンドは、このようなリガンドの誘導体である。それらの誘導体中の一種またはそれ以上（場合によると全部）のＣＤＲは、配列番号：１〜８に挙げられた配列とアミノ酸配列において実質的に同一である。
【００４４】
従って、本発明で提供されるいくつかの抗体は、４個のフレームワーク領域内に包埋されている少なくとも３種のＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を含み、その少なくとも３種のＣＤＲのうちの１種またはそれ以上は、配列番号：３〜８に挙げられるようなアミノ酸配列を含有する。別の抗体は１個またはそれ以上のＣＤＲ３セグメントを含み、そのＣＤＲ３セグメントの各々は、配列番号：５〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。さらにそれら以外の抗体では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は各々、配列番号：３〜５からなる群から選択されるアミノ酸配列、あるいは配列番号：６〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。それ以外のある抗体では、配列番号：１〜２に挙げられるようなＶＨ領域およびＶＬ領域の一方または両方を含む。さらに配列番号：１〜８と実質的配列同一性を持つこれらの特定の抗体の誘導体も含まれる。
【００４５】
本発明で提供される抗体のいくつかのものはポリクローナル抗体であるが、別のものではモノクローナル抗体である。提供される別のポリペプチドは、組換え遺伝子工学によって得られる（「組換え抗体」）。従っていくつかのリガンドには、ヒトおよび動物のモノクローナル抗体、またはそれらのフラグメント、あるいは単鎖抗体およびそれらのフラグメント（それらにはミニ抗体、二特異性抗体、二量化抗体、三量化抗体、あるいはそれらの二量体、オリゴマーまたはマルチマーも含まれる）が含まれる。
【００４６】
いくつかのリガンドは、宿主細胞における免疫グロブリン−コード領域の改変体の発現によって生成されたタンパク質を含む。このタイプのリガンドの一例としては、「技術的修飾抗体」がある。このクラスの抗体にはたとえば、合成抗体、キメラまたはヒト化抗体、あるいはそれらの混合物、さらに恒常領域が部分的または完全に失われた抗体フラグメント（たとえば、ＦＶ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ）’２）も含まれる。技術的修飾抗体では、軽鎖および／または重鎖の一箇所または複数箇所が置換えられ得る。そのような分子には、ヒト化重鎖と非修飾軽鎖（またはキメラ軽鎖）とから成る抗体、あるいはその反対の構成の抗体を含めることができる（「ヒト化」という用語に関しては以下を参照）。Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ）２という用語は、本技術におけるそれらの通常の意味を持つものとする（たとえば、Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ．  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ｄ．，  ｉｎ  ”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  １９８８参照）。
【００４７】
あるリガンドは、第ＩＸ因子／第ＩＸａ因子に対して指向するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）から生じるものであって、ＩＸａの凝血促進活性を上昇させるＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ）２フラグメントを含む。
【００４８】
いくつかのリガンドは、選択されたヒト抗体配列の非相同性フレームワーク領域内に予め挿入されたネズミのモノクローナル抗体を由来とするＣＤＲを含むヒト化抗体である。そのフレームワーク領域は、ＣＤＲディスプレーに必要とされる領域を含んでいる。
【００４９】
定常領域は、リガンド内に存在する場合、ＩｇＧ（サブタイプ１−４）、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥのようなヒト免疫グロブリンのクラスまたはアイソタイプから典型的には選択される。免疫反応の過程で、免疫グロブリンのクラススイッチ（たとえば、ＩｇＭからＩｇＧへのスイッチでは、その定常領域はμからγに変換される）が起こる可能性がある。クラススイッチは、遺伝子工学的手法による定方向化（「定方向性クラススイッチ組換え」）においても起こる可能性があり、その場合のクラススイッチは、従来技術からも知られているようなもの（たとえば、Ｅｓｓｅｒ  Ｃ．  ａｎｄ  Ｒａｄｂｒｕｃｈ  Ａ．，    Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １９９０，  Ｖｏｌ．  ８，  ｐｐ．  ７１７−７３５参照）である。もちろんヒト化抗体では、他の細胞分子への抗体の結合に必要とされる、定常領域のようなそのほかの配列もまた、通常はヒトのものである。
【００５０】
あるリガンドでは、ＣＤＲ１，  ２，  ３，  ４，  ５または６をネズミ起源のＣＤＲ、特に配列番号：３〜８またはそれらの誘導体、と入れ替えることによってヒトの軽鎖および重鎖内の可変領域が技術的に変更されている。この６種のＣＤＲの全て、または６種未満のＣＤＲの組み合わせを変えたものも用いることができる。
【００５１】
完全なヒト化抗体はヒト抗体のフレームワーク領域とネズミ起源のＣＤＲとを持つ。この抗体は、ヒト抗体としての抗原反応性に特有の挙動を示し、医療への適用、たとえば第ＶＩＩＩ因子抑制性患者のような血液凝固疾患患者の治療、に必要な構造と諸特性とを備える。ヒト化抗体の一つの利点は、ヒト患者への投与の際、ネズミ抗体の投与の際に生じる抗原抗体反応と比較してその反応が概して低減することである。
【００５２】
本発明で提供されるいくつかのリガンドは、ネズミとヒトとの配列とからなるキメラ抗体である。それらのキメラ抗体は、ヒト免疫グロブリン由来の両方の鎖の定常領域を組合わせた、配列番号：１および／または２に挙げられるような全可変領域を含む完全ヒト化抗体とは異なるものである。
【００５３】
ほかのリガンドには、抗体のＶＬとＶＨとの領域を橋かけする人工のリンカー配列を含み、それによってＶＬとＶＨとの両領域を含むアミノ酸残基の単鎖が形成されている単鎖抗体がある。従ってこのタイプのリガンドには、（１）ミニ抗体（即ち、ｓｃＦｖフラグメントであって、たとえばプロリンを多く含む配列およびオリゴマー化ドメインに結合したものである；たとえばＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ  Ａ．  ａｎｄ  Ｐａｃｋ  Ｐ．，  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １９９７，  Ｖｏｌ．  ３，  ｐｐ．  ８３−１０５参照、尚、その開示情報は本発明において参照文献中に入れられている）を含めた単鎖抗体、ならびに（２）単一ポリペプチド鎖内の全抗体結合領域を取り込んだ単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、が含まれる。
【００５４】
たとえば単鎖抗体は、第一のＶ領域のＣ末端を第二のＶ領域のＮ末端に接続するリンカー配列として予め構成されたオリゴヌクレオチドに、Ｖ遺伝子を連結させて形成することができる。その一つの配置形態としては、ＶＨ−リンカー−ＶＬの配列で示されるものが可能である。また別のものではＶＬ−リンカー−ＶＨの配列で示されるのも可能である。従って、ＶＨとＶＬとは両方ともＮ末端ドメインに存在することが可能である（Ｈｕｓｔｏｎ  ＪＳ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １９９３，  Ｖｏｌ．  １０，  ｐｐ．  １９５−２１７；    Ｒａａｇ  Ｒ．  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｌｏｗ  Ｍ．，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，  １９９５，  Ｖｏｌ．  ９，  ｐｐ．  ７３−８０）。リンカー配列として用いられる配列は、たとえば１５０Aまでの長さ、より好ましくは４０Aまでの長さ（伸張状態での測定値）を持つことができる。
【００５５】
ペプチドリンカーおよびそれらの使用は、本技術領域ではよく知られている。たとえばＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８：  ５８７９  （１９８８）；    Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：  ４２３６  （１９８８）；    Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：  １３６２  （１９９０）；  米国特許第４９４６７７８号、米国特許第５１３２４０５号およびＳｔｅｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：  ２５６−２６５  （１９９３）を参照のこと。いくつかの例では、ペプチドリンカーは、複数の領域を合わせること以外、あるいはＶＨとＶＬとの間の最小距離またはそれ以外の空間的関係を保つこと以外には特異的な生物学的活性を持たないものである。しかしながら、ペプチドリンカーのアミノ酸置換は、分子のフォールディング、ネットチャージまたは疎水性のようないくつかの特性に影響するように選択することも可能である。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体は、アミノ酸長が５０以下、一般的には４０以下、好ましくは３０以下、より好ましくは２０以下のペプチドリンカーを所望により含む。いくつかの実施形態ではペプチドリンカーは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ配列、好ましくはその２、３、４、５または６個の繰り返し配列、のコンカテマーである。しかしながら、リンカー内のいくつかのアミノ酸置換が行われ得ることも考えられる。たとえば、グリシンをバリンに替えることも可能である。
【００５６】
グリシンとセリンとを含むリンカー配列は、その柔軟性のために有用である。グルタミンとリシンとは水溶液中でのそれらの溶解性のために有用である。単鎖抗体は、凝集体（たとえば、トリマー、オリゴマーまたはマルチマー）としても存在し得る。しかしながらいくつかの抗体では、ＶＨ鎖とＶＬ鎖とが直接接続している場合に、リンカー配列は省略される。二特異性抗体は、単一分子内に２種の異なる結合特異性を持つ高分子の複素二官能性クロスリンカー〔このグループに属するものとしては、二特異性（ｂｓ）ＩｇＧ、ｂｓＩｇＭ−ＩｇＡ、ｂｓＩｇＡダイマー、ｂｓ（Ｆａｂ’）２、ｂｓ（ｓｃＦｖ）２、二量化抗体およびｂｓビスＦａｂＦｃが挙げられる。（たとえば、Ｃａｏ  Ｙ．  ａｎｄ  Ｓｕｒｅｓｈ  Ｍ．Ｒ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，  １９９８，  Ｖｏｌ．  ９，  ｐｐ．  ６３５−６４４参照、尚、その開示情報は本発明において参照文献に入れられている）〕のことである。本発明で提供される抗体リガンドは典型的な場合、インビボでのそれらの半減期が少なくとも５日、より好ましくは少なくとも１０日、さらに最も好ましくは少なくとも２０日である。
【００５７】
（Ｂ．  リガンド活性の測定）
前述で示したように、本発明で開示されるリガンドは、第ＶＩＩＩａ補因子活性または第ＩＸａ因子活性化活性を持つ。そのためそれらは、第ＩＸａ因子の凝血促進活性を促進する。そのリガンドの機能は、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩａ因子の存在を必要としない。従ってそのリガンドの機能は、第ＶＩＩＩ因子／第ＶＩＩＩａ因子に対抗する抑制物質の存在によって負の影響を受けることはない。そのかわりそれらのリガンドは、そのような抑制物質が存在しても第ＩＸａ因子の凝血促進活性を促進することができる。
【００５８】
リガンド活性、即ちＦＩＸａの凝血促進活性を上げる能力、は以下のＦＶＩＩＩアッセイによって計測可能である。
【００５９】
アッセイ反応は、リガンドの試験機能に従い、３７℃の湯浴中でＰＰＮチューブ（Ｍｉｃｒｏｎｉｃ社製、オランダ）内で実施される。即ち、１３．６μＭのリン脂質（小胞体；１，２−ジオレオリル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン６０％、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン４０％）と６．８ｍＭ  Ｃａ２＋とを含むＨＮａＢＳＡ５−緩衝液（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、ｐＨ７．３５）２２０μｌを、予め３７℃に加温する。ＦＸ  ２０μｌ、ＦＩＸａ  ２０μｌおよび各々の補因子４０μｌを加えてリン脂質１０μＭとＣａＣｌ２  ５ｍＭとを含む反応混合物を得る。０．５、１、２、４、６、８、１０、１５、２０、２５および３０分後に、その反応混合物から２０μｌを分取し、氷冷したＥＤＴＡ−緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．３、９ｍＭ  ＥＤＴＡ、４２８ｍＭ  ＮａＣｌ）５００μｌ中に移してそのＦＸａ形成を停止させる。生成したＦＸａの量は、その反応停止混合液の２１０μｌ分を、９６穴マイクロプレート中、基質としてのαＮＡＰＡＰ混合液（５ｍＭ  Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ  ＦＸａ  （Ｐｅｆａ−５５２３）  ＋  ６μＭ  αＮＡＰＡＰ；  Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ）４０μｌと混合し、マイクロプレートリーダーで３７℃、波長４０５ｎｍにおける色素生成性基質の開裂速度（ＯＤ／〔分〕）を計測して測定される。ＦＸａ濃度は、既知量のＦＸａで作成された標準較正曲線から、各時間点で計算される。この実験は、種々の異なるＦＸ（基質）濃度（０，１０，２０，３０，４０，５０，６０，８０，１００，１２５，１５０，２００，２５０ｎＭ  ＦＸ）を組合わせて、１１ｎＭ（反応混合物中の最終濃度）のＦＩＸａおよび最適濃度（通常は２５ｎＭ）の抗体を用いて行われる。得られたＦＸａ形成速度は、ＦＸ濃度の関数としてプロットされ、ミカエリス−メンテン定数（ＶｍａｘおよびＫＭ）は、Ｗｉｎｄｏｗｓ  Ｅｘｅｌ（登録商標）の関数機能を用いて双曲線への曲線当てはめを行い計算される。ＫｃａｔはＶｍａｘ＝ｋｃａｔ〔ＦＩＸａ〕に従い計算され、触媒効率はｃａｔ．ｅｆｆ．＝ｋｃａｔ／ＫＭに従い計算される。
【００６０】
第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）を活性化する抗体１９８Ｂ１（国際公開第０１／１９９９２号にて開示）および抗体２２４Ｆ３は、ＦＩＸａ−抗体複合体による第Ｘ因子（”ＦＸ”）活性化の速度論的パラメータを測定することで特徴づけられた。ＦＸ活性化速度は、１１ｎＭのＦＩＸａ、２５ｎＭの各抗体、および濃度が０〜１５０ｎＭのＦＸを含む反応混合液中、異なる基質（即ち、ヒトＦＸ濃縮物）で計測された。ＦＸの活性化速度（ｎＭ／分）は、ＦＸ濃度の関数としてプロットされ、ミカエリス−メンテン定数（ＫｍおよびＶｍａｘ）は、Ｗｉｎｄｏｗｓ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）の関数機能を用いて双曲線への曲線当てはめを行い得られた（図３）。代謝回転数ｋｃａｔは、Ｖｍａｘを酵素−複合体濃度で除して計算した。抗体１９８Ｂ１および２２４Ｆ３は、ＦＩＸａによる場合の約１０倍もＦＸ活性化のｋｃａｔ値を上げた（表１および以後の本文参照）。補因子を伴わないＦＩＸａでは、２５ｎＭの非特異的なポリクローナルマウスＩｇＧが存在する場合と同じく、同一の双曲線が得られ、エフェクターを伴わないＦＩＸａの速度論的パラメータを計算することができた。比較のため、ミカエリス−メンテンの双曲線を異なる数点の第ＶＩＩＩａ因子（”ＦＶＩＩＩａ”）濃度でも計算した。抗体１９８Ｂ１および２２４Ｆ３で得られたＶｍａｘは、５ｐＭの第ＶＩＩＩ因子（”ＦＶＩＩＩ”）、即ち、１６ｍＵ／ｍｌ活性相当のＦＶＩＩＩ量または１．６％の血漿中濃度に相当する、の存在下で測定された値と類似していた。そのうえさらにＦＶＩＩＩはＦＩＸａのＫｍ値を（実際のＦＶＩＩＩａ濃度から影響を受けずに）約２．５倍も減少させた。抗体２２４Ｆ３では、ＦＸのＫｍ値はＦＩＸａに対して有意な影響を受けなかったが、抗体１９８Ｂ１ではＫｍ値が２倍に増大した。しかしながら全ての場合でＫｍ値は、ヒト血漿中のＦＸ濃度（１３６ｎＭ）よりはるかに低かった。さらにＫｍでは起こらなかったがＫｃａｔでのみ、抗体濃度に影響を受けた。結論として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １および２、ならびに従ってＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：  ３−８も、に挙げられた全ての配列を含む抗体２２４Ｆ３は、最大の触媒効率（ｋｃａｔ／ＫＭ）、つまり最も効率的な抗体であることを示した（本明細書の以下の表１参照）。ミカエリス−メンテン反応速度論での用語としてのその触媒効率（ｋｃａｔ／ＫＭ）は、エフェクターを伴わないＦＩＸａと比較して６８８％も上昇している。
【００６１】
エフェクターを伴わないＦＩＸａおよびＦＩＸａ−抗体複合体によるＦＸ活性化の速度論的パラメータを表１に示す。
【００６２】
【表１】
2007504812.tif 000002
本発明において提供されるリガンド（たとえば抗体および抗体誘導体）が、ヒト血漿中でのトロンビン生成実験においてＦＶＩＩＩ様活性も示すことを、ＦＶＩＩＩ不足状態の血漿中で証明した。このアッセイ系には、ＦＸＩＩａからトロンビンの形成に至るまでの内在性の全血液凝固カスケード、ならびに血漿中プロテアーゼ阻害物質、抗トロンビンおよびａ２−マクログロブリン、による凝固因子の不活化、が必要とされた。トロンビン生成の時間推移は、トロンビンのバースト形成前の凝固開始を反映する対数相の特徴を示した。トロンビンはそれ以外のセリンプロテアーゼと同様に、抗トロンビンおよびａ２−マクログロブリンによって実質的に阻害された。最初に行った試験は、ＦＶＩＩＩに対する抗体で正常血漿を免疫除去処理して得られたＦＶＩＩＩ欠乏血漿中における、ＦＩＸａを活性化する抗体の、トロンビン生成に対する効果についてであった。比較のためにＦＶＩＩＩを用いた実験も行った（図４）。ＦＶＩＩＩの添加には、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿中で次の二つの効果、即ち、（ｉ）凝固時間が短くなることを示す、トロンビンのバースト生成の早期化、および（ｉｉ）生成トロンビン量の増大の効果、が認められた。抗体１９８Ｂ１および２２４Ｆ３では、同じ全般的効果を示した（図４）が、その大きさは異なる。この点においても抗体２２４Ｆ３（△）では、ほかの抗体よりも高い効率が証明された。またいくつかのモデル実験系でも、トロンビン生成に対する両抗体の効果は、抗体濃度に依存することが認められた。この両抗体に関しては、そのトロンビン生成に対する血漿中示適効果濃度は４０−６０ｐｍｏｌ／ｍｌ血漿であって、この値は定量的ＥＬＩＳＡでのＦＶＩＩＩ枯渇化血漿で測定されたＦＩＸ濃度（４０ｐｍｏｌ／ｍｌ）に等しかった。
【００６３】
免疫除去処理したＦＶＩＩＩ欠乏血漿には、ＦＶＩＩＩ活性が残存する。これに対して、力価が１０ＢＵ超のＦＶＩＩＩインヒビタ−血漿には、抗体中和性のＦＶＩＩＩのみばかりでなく、ＦＶＩＩＩ活性も失われている。凝血促進性抗体の活性がＦＶＩＩＩ抑制物質の存在によって影響を受けるかどうかを研究するために、ＦＶＩＩＩインヒビタ−血漿中で繰返してトロンビン生成実験を行った。抑制物質の存在によって、凝血促進性抗体の活性をＦＶＩＩＩと比較することができなくなった。従って、その抗体の凝血促進活性は、ＦＥＩＢＡ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐ．  製またはＢａｘｔｅｒ  ＡＧ製）、即ち、インヒビタ−をもつ患者における出血性症状の発現を治療するのに頻繁に用いられる活性化プロトロンビン複合体、と比較することにした。インヒビタ−をもつ患者から得られた血漿では、ＦＥＩＢＡ（登録商標）に量を増やすと、トロンビン生成に対するその効果は、ＦＶＩＩＩ除去血漿中でのＦＶＩＩＩの効果と同じである（図５）。凝血促進性抗体がＦＩＸａ刺激物質として適用された場合、それらの効果はＦＶＩＩＩ除去血漿中よりもインヒビタ−血漿中でいっそう大きいと判断された。図５は、抗体２２４Ｆ３の存在下で得られたトロンビン生成の時間推移を示すものである。最適条件でのトロンビン形成は、抗体不含の場合よりも１０分早く起こった。そのうえ、血漿中ＦＩＸ濃度に等しい抗体のモル濃度では、最高のトロンビン形成能を示す。
【００６４】
（Ｃ．  リガンドの製造）
抗体リガンドは、本技術分野から導かれる既知の方法、たとえば従来のハイブリドーマ技術、あるいはファージディスプレイ遺伝子ライブラリー、免疫グロブリン鎖シャッフリング技術またはそのヒト化技術を用いるもの（たとえばＨａｒｌｏｗ  Ｅ．  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ｄ．，：  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  １９８８参照）、によって調製することができる。
【００６５】
たとえばポリクローナル抗体については、たとえば免疫化物質および必要ならばアジュバントも共に１回またはそれ以上の回数注射することによって、哺乳動物内で増やすことができる。典型的には、その免疫化物質および／またはアジュバントは、哺乳動物に皮下または腹腔内に多重回、注射されることになる。免疫化物質には、本明細書の図に示される核酸によってエンコードされるタンパク質、あるいはそのフラグメントまたは融合タンパク質を挙げることができる。哺乳動物を免疫化する際には、免疫原性であることが知られているタンパク質に免疫化物質をコンジュゲートすることが有用である場合がある。そのような免疫原性タンパク質の例としては、スカシガイのヘモシアニン、血清アルブミン、牛チログロブリンおよび大豆トリプシンインヒビターが挙げられるが、それらに限定されない。用いられる可能性のあるアジュバントの例としては、フロイントの完全アジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル−リピトＡ、合成トレハロース−ジコリノミコール酸エステル）が挙げられる。その免疫処置のプロトコールは、不適当な実験法を除き、本技術分野の当業者によって選択されるものといえる。
【００６６】
モノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ法（たとえば、Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：  ４９５  （１９７５）；  およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  １９８８，  Ｅｄｓ．  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  ｐｐ．  １４８−２４２参照）を用いて調製することができる。ハイブリドーマ法では典型的な場合、マウス、ハムスターまたは適当な宿主動物を、使用する免疫化物質に特異的に結合するであろう抗体を産生するかまたは産生可能であるリンパ球を誘発する免疫化物質で免疫化する。免疫化はたとえば、第ＩＸ因子、第ＩＸａα因子または完全活性化第ＩＸａβ因子、あるいはそれらのフラグメントを用いて実施できる。ハイブリドーマは、そのハイブリドーマ細胞の上清中のリガンドが、第ＩＸ因子／第ＩＸａ因子に結合して第ＩＸａ因子の凝血促進活性を増大させることを期待して選択される。凝血促進活性の上昇はたとえば、第ＶＩＩＩ因子様活性の計測に関する本技術領域で既知のアッセイ方法、たとえば色素原アッセイ（たとえば後述の実施例２参照）、によって証明することができる。代替法としては、インビトロでリンパ球を免疫化する場合がある。その場合一般的には、ヒト起源の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球（”ＰＢＬｓ”）が用いられ、ヒト以外の哺乳類種起源の細胞が望まれる場合には脾臓細胞またはリンパ節細胞が用いられる。次にリンパ球はポリエチレングリコールのような適当な細胞融合剤を用いて不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｃｉｐｌｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  ｐｐ．  ５９−１０３  （１９８６））。
【００６７】
不死化株化細胞は通常、形質転換した哺乳類細胞、特にげっ歯類、牛およびヒト起源のミエローマ細胞、である。通常はラットまたはマウスの株化ミエローマ細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、融合していない不死化細胞の増殖または生存を抑制する一種またはそれ以上の物質を好ましくは含む培地中で培養する場合もある。たとえば、親細胞がヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルートランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）酵素を持たない場合、そのハイブリドーマ用培地は典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリンとチミジンとを含むであろう（「ＨＡＴ培地」）。
【００６８】
代替的なものとして、本発明で開示されるリガンドのうちのタンパク質性リガンドは、組換え法でも製造可能である。この実施形態では、リガンドのＤＮＡ配列は、既知の技術によって決定でき、その全抗体ＤＮＡまたはその部分的ＤＮＡは、適当な系で発現させることができる。組換えによる製法は、ファージディスプレイ、合成および天然のライブラリー、既知の発現系での抗体タンパク質の発現、またはトランスジェニック動物での発現を含めた方法（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  １９８６，  Ｖｏｌ．  ３２１，  ｐｐ．  ５２２−５２５；    Ｐｈａｒｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  １９９６，  Ｅｄｓ．  Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ｐｐ．  １２７−１３９；    米国特許第４８７３３１６号；Ｖａｕｇｈａｎ  Ｔ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １９９８，  ｐｐ．  ５３５−５３９；    Ｐｅｒｓｉｃ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  １９９７，  ｐｐ．  ９−１８；    Ａｍｅｓ  Ｒ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １９９５，  ｐｐ．  １７７−１８６）と同様に用いることができる。
【００６９】
組換え法によって製造されるリガンドとしての抗体は、細菌用ベクター（たとえば、ｐＢｒ３２２およびその誘導体）または真核細胞用ベクター（たとえば、ｐＭＳＧおよびＳＶ４０のようなベクター）のような従来の発現ベクターを用いて製造することができる。抗体をコードするそれらの核酸配列は、複製、発現および／または宿主細胞からの分泌を制御する調節性配列と共に提供され得る。それらの調節性配列は、たとえばプロモーター（たとえばＣＭＶまたはＳＶ４０）およびシグナル配列を含む。発現ベクターは、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ＤＨＦＲ）、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子およびチミジン・キナーゼ遺伝子のような選択および増幅マーカーも含むことができる。使用されるベクターの、選択マーカー、レプリコン、エンハンサーのような構成成分は、商業的な入手あるいは従来方法での調製のいずれかが可能である。そのベクターは、種々の細胞培養体、たとえばＣＨＯ、ＣＯＳ、繊維芽細胞のような哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母、または大腸菌のような細菌、内で発現するように構成することができる。いくつかの場合では細胞は、発現されたタンパク質の最適な糖鎖形成が可能なように用いられる。
【００７０】
リガンドとしてのＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ）２フラグメントは、従来技術から導かれる既知の方法、たとえばパパインおよび／またはペプシンのようなタンパク質分解酵素類を用いる抗体開裂による方法、または組換え法、に従って製造することができる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２フラグメント類は、ファージディスプレイ遺伝子ライブラリー法類（Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １２：  ４３３−４５５）によっても調製可能である。
【００７１】
ｓｃＦｖ抗体の製法はすでに開示されている。Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  前述文献；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  前述文献；およびＶａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  前述文献を参照のこと。簡単に述べると、まず免疫化した動物由来のＢ細胞からｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを調製する。そのｃＤＮＡを、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域に特異的なプライマーを用いて増幅する。そのＰＣＲ産物を精製し、核酸配列を結合する。リンカーペプチドが望まれる場合では、そのペプチドをコードする核酸配列が、重鎖と軽鎖との核酸配列の間に挿入される。ｓｃＦｖをコードする核酸をベクター内に挿入し、適当な宿主細胞内で発現させる。希望する抗原に特異的に結合するｓｃＦｖは典型的な場合、ファージディスプレイライブラリーをバイオパンニングすることで見出される。バイオパンニングは、いくつかの方法のどれかで行うことが可能である。バイオパンニングは便宜上、表面に希望する抗原を発現する細胞を用いるか、または希望する抗原で被覆された固体表面を用いて行うことができる。その表面は便宜上、磁性ビーズであり得る。非結合ファージを固体表面の洗浄で除去し、結合ファージを溶離する。
【００７２】
ヒト抗体は、本技術領域で知られた、ファージディスプレイライブラリーを含めた種々の技術を用いて製造することができる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７：  ３８１  （１９９１）；    Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：  ５８１  （１９９１））。ヒトモノクローナル抗体の調製のためには、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の技法（ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ｐ．７７  （１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７（１）：  ８６−９５  （１９９１））も利用することができる。同様にヒト抗体も、トランスジェニック動物、たとえば内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活化されているマウス、にヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入して製造することができる。それらを吟味すると、ヒト抗体の製造は遺伝子再構成、アセンブリングおよび抗体レパートリーを含めた全ての点で人体内で見られるものによく似ていることに気付く。このアプローチは、たとえば米国特許第５５４５８０７号、第５５４５８０６号、第５５６９８２５号、第５６２５１２６号、第５６３３４２５号および第５６６１０１６号に開示されており、以下の科学出版物にも開示されている。即ち、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：  ７７９−７８３  （１９９２）；    Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：  ８５６−８５９  （１９９４）；    Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：  ８１２−８１３  （１９９４）；    Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：  ８４５−８５１  （１９９６）；    Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：  ８２６  （１９９６）；  およびＬｏｎｂｅｒｇ  ＆  Ｈｕｓｚａｒ，  Ｉｎｔｅｍ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３：  ６５−９３  （１９９５）。
【００７３】
それ以外のタンパク質リガンドは、本技術分野で知られた諸方法、たとえば分子モデリング（たとえばＧｒａｓｓｙ  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １９９８，  Ｖｏｌ．  １６，  ｐｐ．７４８−７５２；    Ｇｒｅｅｒ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  Ｖｏｌ．  ３７，  ｐｐ．１０３５−１０５４；  またはＲｅｅｓ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ：  Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ”，  （Ｓｔｅｒｍｂｅｒｇ  Ｍ．  Ｊ．  Ｅ．，  ｅｄ．）  ＩＲＬ  ｐｒｅｓｓ，  １９９６，  ｃｈａｐ．  ７−１０，  ｐｐ．１４１−２６１参照）を用いて調製することができる。
【００７４】
リガンドは、本技術分野で開示された種々の方法、たとえば硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティー精製（たとえばプロテインＧ−セファロース）、イオン交換クロマトグラフィーまたはゲルクロマトグラフィー、によって精製することができる。いくつかの方法は、本発明で開示されたリガンドが第ＩＸ因子／第ＩＸａ因子に結合し、および／または第ＩＸａ因子の凝血促進活性を増大させ、および／または第ＶＩＩＩ因子様活性を持つことを示すのに用いることができ、その方法の例としてはワンステップ血液凝固試験（たとえばＭｉｋａｅｌｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｓｗａｌｄｓｏｎ，  Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｈａｅｍａｔｏｌ．，  Ｓｕｐｐｌ．，  ３３，  ｐｐ．７９−８６，  １９８４参照）、あるいはＣＯＡＴＥＳＴ  ＶＩＩＩ：  Ｃ（登録商標）（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ社製）またはＩｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍ（ＩＭＭＵＮＯ社製）のような色素形成性試験が挙げられる。第ＶＩＩＩ因子活性の測定に用いられる全ての方法は、原則として使用可能である。計測用の対照ブランク値としては、たとえば非特異的なマウスＩｇＧ抗体を用いることができる。
【００７５】
（ＩＩＩ．  核酸および形質転換細胞）
本発明において開示されるリガンドをコードする核酸（たとえばＤＮＡまたはＲＮＡ）も本発明で提供される。たとえばある核酸は、図６および７で開示されたＤＮＡ配列の片方または両方を含んでいる。
【００７６】
そのような核酸を含み、本発明において開示されるようなリガンドを発現する宿主細胞も本発明で提供される。尚、そのような細胞は不死化されているものが好ましい。通常それらの細胞は、均質な株化細胞を形成する。またその細胞はハイブリドーマ細胞でもあり得る。
【００７７】
前述のような細胞および／または核酸を用いての抗体または抗体誘導体のようなリガンドの製法も、本発明で提供される。それらの製法には一般的に、リガンドをコードする核酸を発現ベクター内に挿入して発現構成体を形成することが含まれている。その得られた発現構成体は続いて、従来のタンパク質リガンド発現方法を用いて宿主細胞内に導入される。次にそのタンパク質リガンドは、宿主細胞の少なくとも一種の他成分から分離される。典型的には、そのリガンドが前述規定のように生物学的に純粋になるようにそのタンパク質の精製が行われる。
【００７８】
（ＩＶ．  具体的な有益性）
（Ａ．  諸治療法／薬学的組成物）
本発明において提供されるリガンドは、血液凝固疾患の治療、たとえば血友病Ａおよび第ＶＩＩＩ因子インヒビタ−をもつ患者の治療、における医療上の使用に適している。このリガンドは、患者に治療薬として有効量投与するのに適した何らかの方法、たとえば経口、皮下、筋肉内、静脈内または鼻内投与、によって投与することができる。
【００７９】
「患者」とは典型的には、ヒトの患者を指すが、ほかの哺乳類である場合も含む可能性がある。従ってこの治療法は、ヒトの医療および獣医学的適用の両方に用いることができる。好ましい実施形態において、患者は哺乳類、好ましくは霊長類、であり、さらに最も好ましい実施形態においては、患者はヒトである。
【００８０】
治療薬剤は、薬学的に受容可能なキャリアおよび／または希釈剤中に、活性物質として医薬有効量の前述規定のリガンドを含有する組成物として製造することができる。そのため、前述規定のようなリガンドと薬学的に受容可能なキャリアおよび／または希釈剤とを含有する薬学的組成物も、本発明で提供される。そのような薬学的組成物は、液体または粉末状のいずれかの形態で存在することができる。その上さらに、その薬学的組成物は、異なるリガンドまたはそれらの誘導体の混合物を含有することも可能である。また第ＩＸ因子および／または第ＩＸａ因子を含有することも可能である。尚、第ＩＸａ因子は、第ＩＸａα因子および／または第ＩＸａβ因子および／または第ＩＸα因子として存在することも可能である。キャリアまたは希釈剤用液体の例には生理食塩水がある。溶液の場合、それらは従来の諸方法で滅菌処理された滅菌物である。
本発明には、血液凝固疾患をわずらう患者の治療用医薬品を製造するための前述規定のようなリガンドの使用も含まれる。
【００８１】
本発明において記載されるリガンドは、血友病Ａに対する医薬品を開発する様々な手段において利用することができる。ひとつのアプローチとしては、ある抗体をＦｃ領域がない形式のもの（たとえばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２型）に縮小することおよびその抗体をヒト化することがあげられる。キメラまたは完全ヒト化抗体のフラグメントのいずれかは、臨床試験段階へ移るために用いられる可能性がある。別の選択肢としては、抗体の結合部位をもとにして小分子を設計することである。抗体のエフェクター機能は、ＦＩＸａにおける高次構造の変換を誘発する抗体の結合によって達成される。いくつかのそのようなエフェクトは、抗体パラトープに相当する小さな擬似タンパク質体または擬似ペプチド体によっても達成することができる。抗体は本質的には、三次元空間でペプチドエレメントの組合わせ配列を呈する生物学的分子であるため、ＦＶＩＩＩ様活性を持つ化合物（即ち、ＦＩＸａアクチベーター）は、経口投与が可能になるように、およびＦＶＩＩＩ抑制物質の存在下でも活性を示すように開発することが可能である。このタイプの化合物は、特に小児にとって厄介な静脈内注射のような投与経路での現行の治療にまつわる多くの欠点を回避するため、血友病Ａの治療に有益的に用いることが可能である。
【００８２】
そのリガンドまたは薬学的組成物は、保存のために凍結乾燥された形態で存在することが可能であり、続いて患者への投与前に適当な溶媒中に懸濁することが可能である。この方法については、従来の免疫グロブリンに対するその有益性が一般的に証明されており、この場合には既知の凍結乾燥方法および復元方法を適用することができる。
【００８３】
本発明で提供される組成物のいくつかは、薬学的に受容可能な、酸付加塩と塩基付加塩との両方を含めた意味の塩として存在するような水溶性の状態のものである。「薬学的に受容可能な酸付加塩」とは、遊離塩基のその生物学的有効性を維持し、生物学的にまたはそのほかの点で好ましくないものではない付加塩のことを指し、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、および類似酸のような無機酸、ならびに酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、リンゴ酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルフォン酸、エタンスルフォン酸、ｐ−トルエンスルフォン酸、サリチル酸、および類似酸のような有機酸と共に形成される塩類である。「薬学的に受容可能な塩基付加塩」には、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルムニウムの塩および類似塩のような無機塩基から生じる塩類が挙げられる。ある組成物では、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウムおよびマグネシウムの塩類が含まれる。薬学的に受容可能な非毒性の有機塩基から生じる塩類には、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、およびエタノールアミンのような第一級、第二級および第三級のアミン類の塩類、天然に生じる置換化アミン類を含めた置換化アミン類の塩類、環状アミン類の塩類、および塩基性イオン交換樹脂類の塩類が挙げられる。
【００８４】
その薬学的組成物は、一種またはそれ以上の次の成分も含むことができる。即ち、血清アルブミンのようなキャリアタンパク質；緩衝剤；微結晶セルロース、乳糖、トウモロコシ澱粉およびそのほかの澱粉のような充填剤；結合剤；甘味剤およびその他香味剤；着色剤；およびポリエチレングリコール。
【００８５】
その薬学的組成物は、投与法に依存する多様な単位投与剤形で投与することができる。たとえば、経口投与に適した単位投与剤形には、粉剤、錠剤、丸剤、カプセル剤およびドロップ剤が挙げられるが、それらに限定されない。経口投与される場合、タンパク質リガンド（たとえば抗体）は、消化から保護されなければならないことが分かる。このことは典型的には、酸および酵素による加水分解に対する抵抗性を付与する組成物とタンパク質リガンドとの複合体の形成、あるいはリポソームまたは保護バリアのような適当な抵抗性キャリア内への被包化、のいずれかによって成される。消化から保護する保護剤の使用法は、本技術領域においてよく知られている。
【００８６】
投与用の組成物には、薬学的に受容可能なキャリア中、好ましくは水性キャリア中、に溶解したリガンド（たとえば抗体）を挙げることができる。多様な水性キャリア、たとえば緩衝化生理食塩水および類似物、を用いることができる。これらの溶液は、滅菌されており、一般に好ましくない物質を含まない。それらの組成物は、従来の、よく知られた滅菌技術によって滅菌される場合がある。その組成物は、ｐＨ調整剤、緩衝化剤、毒性調整剤および類似薬剤のような、生理学的条件に近づけるのに必要とされるような薬学的に受容可能な医薬品添加物、たとえば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムおよび類似物、を含有する場合がある。これらの製剤中の活性物質の濃度は、大きく変わり得るものであり、選択した特定の投与法および患者の要求に従って液用量、粘性、体重および類似案件に基づき主として選択されるであろう（たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１５  ｅｄ．，  １９８０）およびＧｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｌｍａｎ，  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  （Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １９９６））。
【００８７】
その薬学的組成物を製剤化するのに用いる成分は、高純度のものが好ましく、有害性を示し得る汚染物質を実質的に含まないもの（たとえば、少なくとも米国食品添加物規格（ＮＦ）適合グレードのもの、一般的には少なくとも分析グレードのもの、さらに典型的には少なくとも医薬グレードのもの）である。さらにインビボで用いる予定の組成物は通常、滅菌されている。供用化合物が用時合成を要するものまでも、その由来産物は典型的な場合、毒性を示し得るいかなるもの、特に、合成プロセスまたは精製プロセスで存在する場合があるエンドトキシン、も実質的に含まない。非経口投与用組成物においても、滅菌されていて、実質的に等張であってＧＭＰの諸条件下で製造される。
【００８８】
本発明で提供されるリガンドを含有する組成物は、治療または予報的治療に投与することができる。その組成物は治療に用いる場合、血液凝固疾患に罹患している患者に対し、疾患とその合併症との治療あるいは少なくとも部分的なそれらの抑制に充分な量でもって投与される。このことを成し遂げるのに充分な量は、「治療上の有効投与量」として規定される。このような使用の有効量は、疾患の重篤度およびその患者の健康の全般的状態に依存することであろう。この組成物の単回または多回投与は、患者の要求度および忍容度に合うようなその投与量および投与頻度に依存して行われる場合がある。いずれにしてもその組成物は当然、患者を有効治療するのに充分な量の本発明薬剤を提供するものである。患者の血液疾患の進行の防止または遅延化を可能にするモジュレータの量は、「予防的有効投与量」と呼ばれている。予防的治療に求められるこの特別な投与量は、患者の年齢、体重、性別、投与経路、有効性、その他のような因子と同様に、患者の医学上の体調および疾病履歴に依存するであろう。
【００８９】
適切な投与量は、本技術領域の当業者によって既知技法を用いて定めることができる（たとえば、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ；    Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  （ｖｏｌｓ．  １−３，  １９９２），  Ｄｅｋｋｅｒ，  ＩＳＢＮ  ０８２４７７０８４６，  ０８２４７６９１８Ｘ，  ０８２４７１２６９２，  ０８２４７１６９８１；    Ｌｌｏｙｄ，  Ｔｈｅ  Ａｒｔ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ  （１９９９）；  およびＰｉｃｋａｒ，  Ｄｏｓａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ  （１９９９）参照）。
【００９０】
ある方法では一般的に、前述規定されたような一種またはそれ以上のリガンドを医学的有効量、患者に投与することが含まれる。リガンドの医学上の有効量とは典型的な場合、体重１ｋｇ当り、０．００５〜５０ｍｇの範囲にある。治療可能な血液凝固疾患には、血友病Ａおよび出血性体質が挙げられるが、それらに限定されない。治療される患者群には、血友病の抑制性患者が含まれ得るか、またはそれに限られ得る。
【００９１】
（Ｂ．  医療以外の有益性）
前述の諸適用に加えて、このリガンドはいくつかの産業上の応用、たとえばアフィニティークロマトグラフィー法による第ＩＸ因子／第ＩＸａ因子の精製用、検出法（たとえばＥＬＩＳＡアッセイ法）の成分として、あるいは標的タンパク質の機能的ドメインとの相互作用を同定するための薬剤として、用いることができる。
【００９２】
このリガンドは、同定法において用いられる場合、典型的には標識化されている。タンパク質リガンドを標識にコンジュゲートする多様な方法（たとえばＨｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  １４４：  ９４５  （１９６２）；    Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １３：  １０１４  （１９７４）；    Ｐａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．，  ４０：  ２１９  （１９８１）；  およびＮｙｇｒｅｎ，  Ｊ．  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，  ３０：  ４０７  （１９８２）参照）が知られている。放射性標識化ペプチドまたは放射性標識化抗体組成物のライフタイムは、それらを安定化し分解から防ぐ物質の添加によって延長することが可能である。放射性標識化ペプチドまたは抗体を安定化するどの物質またはそれらの組合わせも使用可能であり、それらの物質は米国特許第５９６１９５５号に開示されている。
【００９３】
以下の実施例は、本発明で提供されるリガンド、組成物および方法のある状況を説明するために提供されるものである。しかしながらこれらの実施例は、決して本発明請求項の領域を限定する意味のものではない。
【実施例】
【００９４】
（実施例１：ハイブリドーマ株化細胞の生成）
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ヒトＦＩＸａを用い１週間間隔で４回、免疫化した。尚、１回の免疫化ごとに１００μｇの抗原を、アジュバントとしてＡｌ（ＯＨ）３を用いて注射した。最終免疫化の３日後に脾臓細胞を得て、標準的な手法（Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：  ４９５  （１９７５））に従いハイブリドーマ株化細胞を樹立した。各マウスについて、８８０個のハイブリドーマ株化細胞を９６穴プレート内で最初はＨＡＴ選択培地中、次に通常の増殖用培地（ＲＰＭＩ−１６４０）中で、増殖させた。４〜５週間後、細胞上清をスクリーニングアッセイ（以下参照）でＦＶＩＩＩ様活性についてスクリーニングした。ＦＶＩＩＩ様活性を示すと同定された抗体を発現する株化細胞を、４〜６回サブクローニングしてその株化細胞がモノクローナルで安定であることを確かめた。
【００９５】
（ＦＶＩＩＩ様活性を呈するＦＩＸａ特異的抗体の単離。）
ＦＩＸａでＢａｌｂ／ｃマウスを免疫化し、脾臓細胞を不死化後にハイブリドーマ株化細胞を得るスクリ−ニング手順を用い、ＦＶＩＩＩａ様活性を呈示したものを、ヒトＦＩＸａに特異的な一連の抗体として単離した。
【００９６】
（実施例２：スクリーニングアッセイ）
ＦＶＩＩＩ様活性を呈する抗体を対象としたハイブリドーマ上清のスクリーニングに、市販されているＦＶＩＩＩ活性用試験キットであるＣＯＡＴＥＳＴ  ＶＩＩＩ：Ｃ／４（登録商標）（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ社製）を用いた。そのアッセイは、試料および試薬の容量を９６穴フォーマットにあわせて減量し、５分後に反応を停止せず、３時間続けて行うこと以外は、キット製造業者の仕様記載に本質的に従って実施した。そのうえさらに２０ｎｇのヒトＦＩＸａをウエルごとに加えてそのアッセイの感度を上げた。ＣＯＡＴＥＳＴ  ＶＩＩＩ：  Ｃ／４（登録商標）は、オールインワン型のアッセイであって、ＦＩＸａによってＦＸをＦＸａに分解し、同じ反応ウエル中でＦＸａ特異的な色素原性基質Ｂｚ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（Ｓ−２２２２）の開裂も同時に起こるものであった。ＦＩＸａの補因子として機能する特異的抗体によってＦＩＸａの触媒活性を刺激することで、結果としてＦＸａの生成および従って色素原性基質の開裂が起こった。解離したｐ−ニトロアニリンを、９６穴マイクロプレートリーダー（ｉＥＭＳ−Ｒｅａｄｅｒ，  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社製、フィンランド）内で波長４５０ｎｍで計測した。
【００９７】
ハイブリドーマ細胞から得られた個々の上清について、ＦＶＩＩＩ様活性に関してスクリーニングを行った。概略を述べると、酵素であるＦＩＸａ、基質であるＦＸ、リン脂質とＣａ２＋との混合物を、ハイブリドーマ上清と共に温置した。ＦＩＸａのプロテアーゼ活性を増大させることが可能である作動性抗体、即ち、ＦＩＸａ結合性抗体は、ＦＩＸａが介在したＦＸａの形成を加速した。ＦＸａの生成、つまり作動性抗体の存在の明示は、ＦＸａ特異的基質を用いてモニターされ、ｐ−ニトロアニリンの遊離をモニターした。非特異的マウスＩｇＧを発現するハイブリドーマ株化細胞の上清は、陰性対照として用いた。並行してハイブリドーマ上清も、ＥＬＩＳＡによってＦＩＸａ結合性抗体に対する試験を行った。このスクリーニング手順によって、試験した全５２８０種のハイブリドーマ上清の中から、異なる程度のＦＩＸａ作動性活性を示す８８種の抗体を発見することができたが、そのハイブリドーマ株化細胞のおよそ６０％がＦＩＸａ結合性抗体を産生していた。
【００９８】
（実施例３：凝血促進性抗体の製造および精製）
モノクローナルのハイブリドーマ株化細胞は、標準的な増殖用培地（たとえばＲＰＭＩ−１６４０）中で２〜３週間増殖させた。ＩｇＧは、標準的な手順（たとえば、Ｊｕｎｇｂａｕｅｒ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  ４７６：  ２５７−２６８参照）に従ってＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を通過させて精製した。
【００９９】
（実施例４：凝血促進性抗体の機能）
ＦＶＩＩＩ様の活性を示すすべてのモノクローナル抗体は精製され、さらにＦＸａ生成アッセイでそれらの特性解析が行われた。２種のモノクローナル抗体、１９８Ｂ１および２２４Ｆ３と称する、は、最も著しいＦＶＩＩＩ活性を示すものと同定された。これら２種の抗体の詳細な特性に関しては、さらに以下に述べることとした。抗体１９８Ｂ１は、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット解析でウシまたはネズミのＦＩＸへのいかなる結合も認められなかったため、ヒトＦＩＸおよびＦＩＸａに厳密な意味で特異的であることが判明した。その上、ウシＦＩＸａと共に温置してもＦＸａの生成が生じなかった。しかしながら抗体２２４Ｆ３は、ヒトおよびウシのＦＩＸおよびＦＩＸａに結合し、ネズミのものには結合しなかった。競合的ＥＬＩＳＡによって、この２種の抗体がＦＩＸ上の同じ結合部位と相互作用することが明らかになった。これに対してそれらの抗体は、ＦＩＸａへの結合に関してＦＶＩＩＩａと競合しなかった。
【０１００】
（ある種の抗体の活性を誘導する第Ｘａ因子形成の検出）
ＦＸをタンパク質加水分解してその酵素活性型であるＦＸａに変換することは、ＦＸを内在性の第Ｘ因子活性化複合体と接触させて行われた。この複合体は、Ｃａ２＋イオンの存在下で負に荷電したリン脂質表面の、補因子であるＦＶＩＩＩａに結合したプロテアーゼＦＩＸａから成るもの（ｖａｎ  Ｄｉｅｉｊｅｎ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ５３：  ３９６−４００；  およびＲｏｓｉｎｇ，  ｅｔａｌ．  （１９８５）  Ｂｌｏｏｄ  ６５：  ３１９−３２２）とした。ＦＸをＦＸａに変換する凝血促進性抗体の能力を定量的に測定するために、以下のアッセイが実施された。
【０１０１】
反応は、３７℃の湯浴中のＰＰＮチューブ（Ｍｉｃｒｏｎｉｃ社製、オランダ）内で行われ、予め以下の組成の反応用溶液、即ち、リン脂質１２．８μＭとＣａ２＋  ５．９ｍＭとを含有するＨＮａＢＳＡ５−緩衝液（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、ｐＨ７．３５）２２０μｌを３７℃に加温した。次に２０μｌのＦＸ、２０μｌのＦＩＸａおよび４０μｌの各補因子（抗体、または対照としてトロンビンで活性化したｒＦＶＩＩＩ）を加えてリン脂質１０μＭ、ＣａＣｌ２  ５ｍＭおよびＢＳＡ  ０．５ｍｇ／ｍｌを含有する反応混合物を得た。分析の種類によってＦＩＸａ、ｒＦＶＩＩＩ、ＦＸおよび抗体の最終濃度は調整された。反応後に時間間隔を変えてその反応混合物中から一部（２０μｌ）を分取し、それを氷冷したＥＤＴＡ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．３、９ｍＭ  ＥＤＴＡ、４２８ｍＭ  ＮａＣｌ）５００μｌ中に移してＦＸａ形成を停止させた。生成したＦＸａの量については、前述の希釈液の一部２１０μｌを９６穴マイクロプレート内で基質−αＮＡＰＡＰ混合液（５ｍＭ  Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ  ＦＸａ  （Ｐｅｆａ−５５２３）  ＋  ６μＭ  αＮＡＰＡＰ；  Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ）４０μｌと混合して測定し、色素原性基質の開裂速度（ΔＯＤ／分）をマイクロプレートリーダー中、３７℃、波長４０５ｎｍの吸光度で計測した。ＦＸａ濃度は、ＦＸａの既知量で作成した標準較正曲線から、各時点について計算して求めた。
【０１０２】
第一組の実験では、１１ｎＭ  ＦＩＸａ、１５０ｎＭ  ＦＸおよび１０μＭ  リン脂質小胞体を、５ｍＭ  Ｃａ２＋−イオン含有反応混合液中で、量を変えた抗体（５−２００ｎＭ）と共に温置し、ＦＸａの生成をＦＸａ特異的色素原性基質を用いて追跡した。抗体２２４Ｆ３では、抗体１９８Ｂ１よりも著しい結果となった。抗体２２４Ｆ３で得られたＦＸａ生成曲線を図２ａに示した。抗体が介在したＦＸａの形成速度（ｎＭ  ＦＸａ／分）の上昇は濃度に依存し、その最適抗体濃度では緩衝液での対照試験例と比較して形成速度は１０倍上昇した。陰性対照として緩衝液または非特異的ポリクローナルマウス抗体での試験を行ったが、いすれも同じバックグランド活性を示した。比較試験として、天然の補因子であるＦＶＩＩＩａ  １７．５ｐＭの存在下でＦＸａ生成アッセイも実施した。そのＦＶＩＩＩａで得られた曲線は、ほぼ５分間直線となり、その後ＦＸａ生成は止まった。これはおそらくＦＶＩＩＩａのＡ２ドメインの解離によって不活性化したためと思われる。抗体によるＦＸａの生成曲線は、少なくとも３０分直線であった。さらにその抗体滴定値は、ＦＸａの形成速度に対して用量依存的効果を示した（図２ｂ）。ＦＩＸａ濃度１１ｎＭにおいては、直線状の用量反応性は、約５ｎＭのｍＡｂ濃度まで（即ち、ＦＩＸａ分子当り１個の結合部位の存在に至るまで）得られた。抗体濃度が１０〜３０ｎＭの間である時、ＦＸの活性化速度は最大に達し、それより高い抗体濃度では減少した（図２ｂ）。ＦＩＸａ濃度５０ｎＭの場合では、抗体濃度２５ｎＭまで直線性が得られた（データは示さず）。従って、直線的な用量反応性は、ＦＩＸａが抗体で飽和されるまで観察することができた。
【０１０３】
反応混合物からＦＩＸａ、ＦＸ、リン脂質またはＣａ２＋イオンが省かれると、検出可能な量のＦＸａは形成されなかった。基質であるＦＸが僅かな量のＦＸａによってその自動触媒的活性で開裂する可能性を排除するために、ＦＸａ生成アッセイは６０μＭのＰｅｆａｂｌｏｃｋ  Ｘａ（登録商標）（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ社製）の存在下で行った。Ｐｅｆａｂｌｏｃｋは、この濃度ではＦＸａの活性を完全に抑制する競合的ＦＸａ阻害剤となった。ＥＤＴＡ緩衝液中へのサブサンプリング後にＰｅｆａｂｌｏｃｋは、ＦＸａの定量を可能にする濃度である２μＭまで希釈された。尚、Ｐｅｆａｂｌｏｃｋ  Ｘａ（登録商標）が存在する時と存在しない時とも、同じＦＸａ生成速度が得られた。これらの結果から、反応混合物中に存在するかまたは生成するＦＸａが抑制される時にＦＸａ形成が起こり、抗体介在性ＦＸａ生成への自動触媒反応の関与の可能性が排除されることが示された。要約すると、この段落で述べられた実験によって、これらの抗体がバイパス反応を触媒したり誘発することはなく、そのかわりにＦＩＸａによるＦＸのタンパク質加水分解活性化に対する特異的補因子として機能することが示された。
【０１０４】
（実施例５：ＳＰＲ−測定）
ＦＩＸａの抗体との相互作用については、ＢＩＡＣＯＲＥ  ３００  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｂｉａｃｏｒｅ社製、Ｕｐｐｓａｌａ、スェーデン）を用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技法によって研究した。ポリクローナル抗マウスＦｃ抗体をＣＭ５センサーチップ表面に固定化し、各々のモノクローナル抗体で飽和させた。対照としては、非特異的なマウスＩｇＧを用いた。異なる数種の濃度のＦＩＸａをそのチップに適用して流通させ、その親和性定数は、ＢＩＡＣＯＲＥ内蔵プログラムを用いる定常状態解析によって計算された。定常状態の結合から計算された解離速度定数（Ｋｄ）、即ち、抗体２２４Ｆ３では４．７７×１０−１０Ｍ、および抗体１９８Ｂ１では３．５５×１０−９Ｍ、は、速度論的曲線によく一致していた。抗体２２４Ｆ３は、ＦＩＸａに対して最大の親和性を示し、全ての場合でその結合は５ｍＭ  ＣａＣｌ２の存在下で抗体１９８Ｂ１のそれより強かった。
【０１０５】
図１は、５ｍＭ  ＣａＣｌ２の存在下で、抗マウスＦｃγ（ＲＡＭＦｃ）によって捕捉された２種の異なるモノクローナル抗体への、５．５６ｎＭ  ＦＩＸａの結合を示したものである。ＦＩＸａは、３ｍＭ  ＥＤＴＡの存在下では抗体への親和性が弱まり、非特異的マウスＩｇＧには結合しなかった。
【０１０６】
（実施例６：トロンビン生成）
ＦＶＩＩＩ除去血漿またはＦＶＩＩＩインヒビタ−血漿は、アンクロッド１Ｕ／ｍｌを用いてプラスチック攪拌棒で線維素除去された。線維素除去された血漿２００μｌおよび予め希釈された抗体溶液１０μｌを、マイクロチューブ内で混合した（図４および５参照）。対照として、ＦＶＩＩＩ除去血漿の代わりにｒＦＶＩＩＩを、インヒビタ−血漿の代わりにＦＥＩＢＡ（登録商標）を用いて行った。ｍＡｂ、ｒＦＶＩＩＩおよびＦＥＩＢＡ（登録商標）の各濃度については、「図面の簡単な説明」の関連項に記載されているものとした。その混合液は予め５分間、３７℃に加温され、そのうちの１０μｌ分を、氷冷したキュベット内緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，、１７５ｍＭ  ＮａＣｌ，、０．５ｍｇ／ｍｌ  オボアルブミン、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．９）７４０μｌ中に移してそのゼロ点を測定した。その後でＰａｔｈｒｏｍｔｉｎ  ＳＬ（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ社製；３７℃に予備加熱したもの）８７．５μｌおよび１６２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２含有ＨＮＢＳＡ５（３７℃に予備加熱したもの）２５μｌを加えて内在性血液凝固経路を介するトロンビン形成を開始させた。反応後に異なる時間間隔で、反応混合物からその一部分（１０μｌ）を、氷冷したキュベット内緩衝液７４０μｌ中に移してトロンビンの形成を停止させた。その希釈部分中に存在するトロンビン量を、トロンビン特異的色素原性基質Ｓ２２３８（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ社製）を用いてマイクロプレートリーダー内で測定した。トロンビンの濃度は、既知量のトロンビンで作成した標準較正曲線から、各時点に対して計算した。
【０１０７】
実験の試薬の詳細を以下に述べる。ヒト凝固因子ＦＩＸ、ＦＩＸａ、ＦＸ、ＦＸａおよびα−トロンビンは、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＵＳＡ）から購入した。組換えヒト第ＶＩＩＩ凝固因子（ｒＦＶＩＩＩ）（ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＥ（登録商標））は、Ｂａｘｔｅｒ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ）によって製造されたものである。ＢＳＡは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ＵＳＡ）から購入した。ヒトＦＶＩＩＩ枯渇化血漿は、Ｂａｘｔｅｒ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（オーストリア）によって免疫除去処理で製造されたものであり、ヒトＦＶＩＩＩインヒビタ−血漿は、Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎ（オーストリア）によって患者血漿から製造されたものである。非特異的ポリクローナルマウスＩｇＧはＳｉｇｍａ（ＵＳＡ）から購入した。リン脂質小胞体（ＤＯＰＣ：ＰＯＰＳ    ６０：４０）は、合成リン脂質（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社製、ＵＳＡ）からＢａｘｔｅｒ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ（オーストリア）によって製造されたものである。Ｐａｔｈｒｏｍｔｉｎ  ＳＬはＤａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ（ＵＳＡ）から購入し、アンクロッドはＮＩＢＳＣ（英国）から購入した。ＦＥＩＢＡ（登録商標）およびＤＡＰＰＴＩＮは、Ｂａｘｔｅｒ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ（オーストリア）から入手した。
【０１０８】
ＦＶＩＩＩａとセリンプロテアーゼであるＦＩＸａとの相互作用は、エフェクター機能の突出した例であった。補因子であるＦＶＩＩＩａがＦＩＸａへ結合することで、ＦＩＸａのＦＸ開裂活性が増大するようなＦＩＸａの高次構造の変化が特に起こって、ＦＩＸａ酵素のプロテアーゼ活性が低活性型から高活性型に変換する結果となった。プロテアーゼＦＩＸａにおける同様な高次構造の変化を引き起こす特異的抗体のスクリーニングのために、市販されている第ＦＶＩＩＩ因子用測光アッセイを、血漿中のＦＶＩＩＩ活性測定に広く使用されるように適合させた。スクリーニングした株化細胞の６０％がＦＩＸ結合性抗体を発現したが、我々のスクリーニングではそのハイブリドーマ上清のわずか１．６％のみがＦＶＩＩＩ様活性を示した。我々の仮定ではこのことは、ＦＩＸａの活性化が稀に見られることを指すものであった。速度論的な諸実験によって、その抗体がＦＩＸａの触媒活性（ｋｃａｔ）を約１０倍上昇させる一方、ＦＩＸａに対するＦＸのＫｍ値にはほとんど影響を及ぼさないことが示された。ＦＶＩＩＩは主としてＦＩＸａのｋｃａｔ値を上昇させ、その抗体−ＦＩＸａ複合体を伴うことでＦＶＩＩＩのＦＩＸａに対する効果は、Ｃａ２＋イオンおよびリン脂質の存在に厳密に依存した。従って、ＦＶＩＩＩによって起こる高次構造変化と本発明の抗体によるものとは同じであるとの結論を得ることができた。分析された凝血促進性抗体は、ＦＩＸａ結合に関してＦＶＩＩＩと競合しなかったが、互いに競合した。このことから「ホットスポット」は、相応な高次構造変化の原因にはほとんどならないことが示された。
【０１０９】
この抗体のエフェクター機能は、血漿アッセイで確認された。ＦＸａ生成アッセイとは対照的に、精製タンパク質を含有するモデル系を用いる血漿アッセイでは、ＦＸＩＩａからトロンビン形成までの厳密な全凝固経路が探究され、抗トロンビンおよびａ２−マクログロブリンで活性化した凝固因子の不活化も探究された。血漿アッセイにおいてこの抗体は、それによってＦＩＸが飽和されるまで用量依存的な有効性を示した。この有効性はＦＶＩＩＩの場合よりも低く、それはモデル系で得られた速度論的データと一致していた。その抗体は、ほかの凝固反応に影響を及ぼさず、しかも血漿中のプロテアーゼ阻害物質による活性化凝固因子の不活化にも影響を及ぼさなかった。この結論は、トロンビン生成曲線がその抗体とＦＶＩＩＩとの両方でトロンビンの同一のバーストと不活化とを示すという所見に基づくものであった。ＦＶＩＩＩ除去血漿中およびＦＶＩＩＩ抑制性血漿中には、ＦＶＩＩＩ様活性も検出され、ＦＶＩＩＩに対して指向する抑制性抗体が凝血促進性抗体の活性には影響しないという証拠が得られた。
【０１１０】
（実施例７：インビボでのマウスモデルにおける抗体２２４Ｆ３の凝血促進活性の試験）
（実験用材料：）
第ＩＸ因子ノックアウトマウスは、体重２５ｇ超のオスおよびメスを用いた。ヒトＦＩＸはＥｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＵＳＡ）から購入した。モノクローナル抗体２２４Ｆ３（サブクローン２２４  ＡＥ３）は、実施例１、２および３で述べたように調製した。非特異的ポリクローナルマウスＩｇＧは、Ｓｉｇｍａ（ＵＳＡ）から購入した。ＦＩＸ、抗体２２４Ｆ３および非特異的マウスＩｇＧは、適用緩衝液（６８ｍＭ  ＮａＣｌ，、１００ｍＭ  グリシン、２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、ｐＨ７．２  ＋  ０．１％  ＢＳＡ）で希望する濃度に希釈した。ＦＶＩＩＩ抑制性血漿は、ヤギにヒトＦＶＩＩＩを多回注射して作らせ、血漿交換法によって採取し、５６℃で２時間加熱して不活化させた。このインヒビタ−血漿の力価は２０００ＢＵを示した。正常なヤギ血漿は、非免疫化ヤギから採取し、同様に処理した。
【０１１１】
（方法：）
２０匹のＦＩＸノックアウトマウスは、ＦＶＩＩＩインヒビタ−血漿（ヤギ体内産生、２０ｍｌ／ｋｇ）で処置してさらにＦＶＩＩＩの免疫除去も行った。１時間後にヒトＦＩＸをそのマウスに注射（３００Ｕ／ｋｇ＝１５００μｇ／ｋｇ）してＦＩＸ欠乏状態を打破した。従ってそれらのマウスは、ＦＶＩＩＩインヒビタ−をもつ患者に相当する動物モデルとなった。１０分後にそれらのマウスを抗体２２４Ｆ３で処置（２０００μｇ／ｋｇ）した。さらにその１０分後に尾を（末端から１ｃｍの位置で）切り取り、ＴｕｒｅｃｅｋらがＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ７７  （３），  ５９１−５９９  （１９９７）で述べたような方法によって出血特性を測定した。
【０１１２】
２０匹のマウスには、正常なヤギ血漿で処置（２０ｍｌ／ｋｇ）した。１時間後にそのマウスにヒトＦＩＸを注射（３００Ｕ／ｋｇ＝１５００μｇ／ｋｇ）した。１０分後にそれらのマウスを抗体不含の緩衝液で処置（１０ｍｌ／ｋｇ）した。さらにその１０分後に尾を（末端から１ｃｍの位置で）切り取り、出血特性を測定した。これらのマウスは、ＦＩＸ活性およびＦＶＩＩＩ活性を提示するような陽性対照群として役立ち、ゆえにそれらは正常な出血特性を示した。
【０１１３】
２０匹のＦＩＸノックアウトマウスには、ＦＶＩＩＩインヒビタ−血漿（ヤギ体内産生、２０ｍｌ／ｋｇ）で処置してさらにＦＶＩＩＩ免疫除去処置を行った。１時間後にそれらのマウスにヒトＦＩＸを注射（３００Ｕ／ｋｇ＝１５００μｇ／ｋｇ）してＦＩＸ欠乏状態を打破した。従ってそれらのマウスは、ＦＶＩＩＩインヒビタ−をもつ患者に相当する動物モデルとなった。１０分後にそれらのマウスを、非特異的マウスＩｇＧで処置（２０００μｇ／ｋｇ）した。さらにその１０分後に尾を（末端から１ｃｍの位置で）切り取り、出血特性を測定した。これらのマウスは、ＦＶＩＩＩインヒビタ−をもつ患者に相当する動物モデルとなり、さらに非活性抗体で処置されたうえ、陰性対照群として従って提供された。
【０１１４】
（結果：）
血液損失量は、マウス各個体について２分ごとに測定した。各群２０匹のマウスの結果を平均し、それらを図９に示した。図９には、各時間間隔での最初の１６分間に観察された血液損失量を示した。ＦＶＩＩＩ活性が完全に保持されている対照群（ＦＶＩＩＩ免疫除去処理していない群）では、尾を切り取ってからの最初の２分間で血液損失量は約６０μｌであった。この対照群では、血液損失量は尾を切り取ってから１４−１６分後の時間間隔で約１５μｌにまで連続的に減少していった。ＦＶＩＩＩの免疫除去および抗体２２４Ｆ３での処置の後では、血液損失量は同様の特性、即ち、最初の２分間での血液損失量が５０μｌであり、時間間隔（２分間）当り約２０μｌずつ減少した、を示した。このことは、血液凝固が起こって血液損失がゆっくりになることを示したものである。第二の対照群の場合では、そのマウス血液損失特性は、ＦＶＩＩＩ活性が全くないことを示した。即ち、最初の血液損失量の測定値は同じく５０μｌであったが、血液損失量の減少は認められず、８分後には逆に増加した。
【０１１５】
図１０は同じデータを示すものだが、全血液損失量で表示した。非特異的マウスＩｇＧで処置された群の血液損失量は、それ以外の二つの群におけるものよりも大きく、１６分後の全血液損失量は３５０μｌに達した。抗体２２４Ｆ３で処置されたマウスまたはＦＶＩＩＩ免疫除去されていないマウスでは、最初の１６分間で同様の血液損失特性を示し、最初の１６分間での全血液損失量は約２２０μｌであった。抗体２２４Ｆ３で処置した２０匹のマウスおよび非特異的マウスＩｇＧで処置した２０匹のマウス（陰性対照群）の、最初の１６分以内の血液損失速度は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を適用して比較した。両群の差は統計学的に有意（ｐ＜０．０２）であることが判明された。
【０１１６】
（実施例８：抗体２２４Ｆ３の誘導体の開発）
（基本方針：）
凝血促進性抗体２２４Ｆ３の凝血促進活性能がさらに高められたその誘導体は、たとえばそのＶＬおよび／またはＶＨをエンコードする配列内に変異を導入することによって、開発することができた。そのような変異は、本技術分野におけるクローニング技法および細菌用発現ベクターを用い、ｓｃＦｖのフォーマットにＶＨとＶＬとの遺伝子を収容して行うのが好ましいものであった（たとえば、本明細書の第ＩＩ節のパートＣに挙げた方法を参照）。導入可能な変異例のリストとしては、（ｉ）  ＶＨおよび／またはＶＬ内への特異的な変異、（ｉｉ）  ＶＨおよび／またはＶＬの全配列を通して分布したランダム変異（たとえば誤り傾向ＰＣＲによるもの）または（ｉｉｉ）特異的ＣＤＲ内でのランダム変異、が挙げられる。これらの変異型誘導体は、ファージディスプレイ技術で予備選択することができ、それによってヒトＦＩＸａに結合可能なｓｃＦｖ変異体の存在率を高めることができた。その変異体は、標準的な発現技法を用いて上清中に発現させることができ、たとえば以下のアッセイを用いてＦＶＩＩＩ様活性に関するスクリーニングを行うことができた。
【０１１７】
（ヘキサ−ヒスチジン−タグを含む抗体フラグメントのＦＩＸａ活性化能を測定するための蛍光アッセイ：）
（材料：）
緩衝液：
・ＴＢＳ：    ２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５
・ＴＢＳ／２％ＢＳＡ：    ２ｇ  ＢＳＡ／１００ｍｌ  ＴＢＳ
・ＨＮａ：    ２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，  １７５ｍＭ  ＮａＣｌ，  ｐＨ７．３５
・ＨＮａＢＳＡ５：    ５ｍｇ  ＢＳＡ／ｍｌ  ＨＮａ−緩衝液
試薬：
・Ｐｅｎｔａ−ＨＩＳ抗体、ＢＳＡ不含（Ｑｉａｇｅｎ社製）
・ｈＦＩＸａβ（ＥＲＬ）
・ｈＦＸ（ＥＲＬ）
・リン脂質：
・蛍光原性基質Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ  ＦＸａ：  ＣＨ３ＳＯ２−Ｄ−ＣＨＡ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ．ＡｃＯＨ（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ  ＬＴＤ製）
・ＰＬ／Ｃａ＋＋／ｈＦＸ／蛍光原性基質−ミックス：  最終濃度：４．３ｍＭ  ＣａＣｌ２；  ９．４μＭ  ＰＬ；  ２９．３ｎＭ  ｈＦＸ；  １６７μＭ  蛍光原性基質
（方法：）
マイクロプレートのウエルを２μｇ／ｍｌのＰｅｎｔａ−ＨＩＳ抗体で被覆後、ＴＢＳ／２％  ＢＳＡでブロッキングした。発現された２２４Ｆ３変異体（たとえば、ｓｃＦｖフォーマット）を含有する細菌上清をＴＢＳ／２％  ＢＳＡで希釈し、ウエル内で温置した。そのプレートを洗浄し、ヒトＦＩＸａ（１μｇ／ｍｌ、ＨＮａＢＳＡ５での希釈溶液）とともに温置した。洗浄後、ＰＬ／Ｃａ＋＋／ｈＦＸ／蛍光原性基質−ミックスを注加した。蛍光シクナルの生成を蛍光リーダー内で計測した。ＦＶＩＩＩ様活性を有するｓｃＦｖがウエル表面に固定化されと、ＦＸａ生成の増大および蛍光シグナル生成の促進を観測することができた。
【０１１８】
（抗体２２４Ｆ３の誘導体の例：）
前述の方法を用いて抗体２２４Ｆ３の数種の変異バージョンを構築し、ＦＩＸａβへの結合性についてはＥＬＩＳＡによって分析し、ＦＶＩＩＩ様活性については蛍光アッセイによって分析した。表２には、構築された点変異種、およびその変異が抗体の結合能および／またはＦＩＸａ活性化能に影響するか否かを示した。特にこの表には、２２４Ｆ３抗体−ｓｃＦｖ内の特異的変異、ならびにそれに引き続いてのＦＩＸａβ結合能に関する試験（ＥＬＩＳＡ）およびＦＩＸａ活性化能に関する試験（蛍光アッセイ）の結果を示した。野生型ｓｃＦｖに類似した活性は（＋）で示され、野生型の活性よりも有意に低い活性は（−）で示された。名称に関しては、たとえばＳ３１Ｉとは、重鎖（Ｈ１−ループ内の）３１番目のアミノ酸（セリン、Ｓ）がＩ（イソロイシン）に置き換わっていることを意味するものとした。
【０１１９】
【表２】
2007504812.tif 000003
尚、本明細書の中で引用されたすべての刊行物、配列の受け入れ番号、および出願特許は、参照によって本発明に受け入れられるものであって、その個々の刊行物または出願特許は参照によって受け入れられるように特定的および個別に示されるようなものである。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】図１は、ＢＩＡＣＯＲＥ  ３００  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  （Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＧ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法により計測された、５ｍＭのＣａＣｌ２存在下での抗体１９８Ｂ１（国際公開第０１／１９９９２号）および抗体２２４Ｆ３とＦＩＸａとの相互作用の反応速度を示す。さらに具体的にはこの図は、５ｍＭ  ＣａＣｌ２の存在下、抗マウスＦｃγ（ＲＡＭＦｃ）によって捕捉された前述２種の異なるモノクローナル抗体（Ｍａｂｓ）への５．５６ｎＭのＦＩＸａの結合性を示す。分析中に５．５６ｎＭのＦＩＸａを注入し、５分間会合させ、解離を１２分間モニターした。横軸に時間を秒で示し、縦軸に任意の単位での相対反応を示す。
【図２−１】図２は、ＦＩＸａで触媒されるＦＸの活性化に対する凝血促進性抗体２２４Ｆ３の効果を示す。図２Ａは、種々の抗体濃度でのＦＸａ生成の時間推移（横軸：ｔ（分）；縦軸：ＦＸａ  （ｎＭ）；    ＊：１５ｐＭ  ＦＶＩＩＩａ；    黒菱形：１０ｎＭ  ２２４Ｆ３；    白四角：５ｎＭ；    黒四角：４ｎＭ；    白三角：３ｎＭ；    黒三角：２ｎＭ；    白丸：１ｎＭ    黒丸：緩衝液）である。図２Ｂは、抗体の滴定曲線（横軸：２２４Ｆ３（ｎＭ）；  縦軸：ＦＸａ形成速度（ｎＭ／ｍｉｎ））である。
【図２−２】図２は、ＦＩＸａで触媒されるＦＸの活性化に対する凝血促進性抗体２２４Ｆ３の効果を示す。図２Ａは、種々の抗体濃度でのＦＸａ生成の時間推移（横軸：ｔ（分）；縦軸：ＦＸａ  （ｎＭ）；    ＊：１５ｐＭ  ＦＶＩＩＩａ；    黒菱形：１０ｎＭ  ２２４Ｆ３；    白四角：５ｎＭ；    黒四角：４ｎＭ；    白三角：３ｎＭ；    黒三角：２ｎＭ；    白丸：１ｎＭ    黒丸：緩衝液）である。図２Ｂは、抗体の滴定曲線（横軸：２２４Ｆ３（ｎＭ）；  縦軸：ＦＸａ形成速度（ｎＭ／ｍｉｎ））である。
【図３】図３は、抗体−ＦＩＸａ複合体、ＦＶＩＩＩａ−ＦＩＸａ複合体、およびエフェクターを伴わないＦＸによる、ＦＩＸａで触媒されるＦＸの活性化の速度論的解析を示す。速度論的パラメータは、表１下方にまとめている（横軸：ＦＸ（ｎＭ）；    縦軸：ＦＸａ形成速度（ｎＭ／ｍｉｎ）；    黒丸：２５ｎＭマウスＩｇＧ；    黒三角：２５ｎＭ抗体１９８Ｂ１；    白三角：２５ｎＭ抗体２２４Ｆ３；    黒四角：５ｐＭ  ＦＶＩＩＩａ）。
【図４】図４は、ＦＶＩＩＩ除去血漿中でのトロンビン生成の時間推移を示す。グラフは、抗体の存在および非存在でのＦＶＩＩＩ除去血漿中でのトロンビン生成を示す（実線：ＦＶＩＩＩ除去血漿；  黒丸：４０ｎＭ抗体１９８Ｂ１；    白三角：４０ｎＭ抗体２２４Ｆ３；    黒三角：２０ｍＵ／ｍｌ  ＦＶＩＩＩ、横軸：ｔ（ｍｉｎ）、縦軸：トロンビン（ｎＭ））。
【図５】図５は、ＦＶＩＩＩインヒビタ−血漿中でのトロンビン生成の時間推移を示す。グラフは、異なる濃度のＦＥＩＢＡ（登録商標）または凝血促進性抗体２２４Ｆ３の存在下でのＦＶＩＩＩインヒビタ−血漿中でのトロンビン生成を示す。陰性対照としては、非特異的マウスＩｇＧ抗体存在下および補充物質を加えない条件でのＦＶＩＩＩインヒビタ−血漿中におけるトロンビン生成を示す。上側のグラフ：横軸ｔ（ｍｉｎ）；    縦軸：トロンビン（ｎＭ）；    白四角：０．５Ｕ／ｍｌ  ＦＥＩＢＡ（登録商標）；  黒四角：０．３Ｕ／ｍｌ  ＦＥＩＢＡ（登録商標）；  白三角：０．２Ｕ／ｍｌ  ＦＥＩＢＡ（登録商標）；  黒四角：０．１Ｕ／ｍｌ  ＦＥＩＢＡ（登録商標）；  実線：０ｎＭ  ＦＥＩＢＡ（登録商標）。下側のグラフ：横軸：  ｔ（ｍｉｎ）；    縦軸：  トロンビン（ｎＭ）；    白四角：２５０ｎＭ抗体２２４Ｆ３；  黒四角：６０ｎＭ抗体２２４Ｆ３；  白三角：２５ｎＭ抗体２２４Ｆ３；  黒三角：６．２５ｎＭ抗体２２４Ｆ３；  実線：１００ｎＭ非特異的マウスＩｇＧ。
【図６】図６および図７は、抗体２２４Ｆ３の可変部重鎖ＶＨの配列（配列番号：１）および可変部軽鎖ＶＬの配列（配列番号：２）を示す。
【図７】図６および図７は、抗体２２４Ｆ３の可変部重鎖ＶＨの配列（配列番号：１）および可変部軽鎖ＶＬの配列（配列番号：２）を示す。
【図８】図８は、抗体２２４Ｆ３のＣＤＲ（相補性決定領域）のＬ１−Ｌ３配列（配列番号：３〜５）およびＨ１−Ｈ３配列（配列番号：６〜８）を示す。各アミノ酸残基の表示は、抗体２２４Ｆ３の各々のポリペプチド鎖内のそれぞれのアミノ酸残基の位置に一致する。その残基数は、Ｌ１−Ｌ３およびＨ１−Ｈ３の配列、即ち配列番号：３〜８、が導入されるフレームワークで変動するであろう。従ってそれらの表示は、配列番号：３〜８による配列の一部を形成するものではない。そのためそれらの表示は、それらの配列を限定するものとはみなされないであろう。
【図９】図９は、正常なヤギ血漿とヒトＦＩＸとによる処置（免疫除去を伴わないもの、黒色の棒部分）；インヒビタ−血漿と、ヒトＦＩＸとリガンドとしての抗体２２４Ｆ３とによる処置（灰色の棒部分）；およびインヒビタ−血漿と、ヒトＦＩＸと非特異的ＩｇＧ抗体とによる処置（細平行線のある棒部分）がなされたＦＩＸノックアウトマウスについて、表示された時間間隔（横軸）の関数として血液損失量μｌ（縦軸）を示す。
【図１０】図１０は、正常なヤギ血漿とヒトＦＩＸとによる処置（免疫除去を伴わないもの、丸印）；  インヒビタ−血漿、ヒトＦＩＸとリガンドとしての抗体２２４Ｆ３とによる処置（黒三角印）；  およびインヒビタ−血漿、ヒトＦＩＸと非特異的ＩｇＧ抗体とによる処置（黒四角印）がなされたＦＩＸノックアウトマウスに関する、時間の関数としての全血液損失量μｌ（縦軸）を示す。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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