(57)【要約】  本発明は、生体内持続性および安定性が向上した蛋白質結合体に係り、具体的には、生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体および免疫グロブリンＦｃ領域がお互い共有結合によって連結されているため、前記生理活性ポリペプチドの生体内持続性および安定性が向上した蛋白質結合体およびその利用に関するものである。本発明の蛋白質結合体は、生理活性ポリペプチドの生体内活性が比較的高く維持され、血中半減期が著しく増加し、免疫反応誘発の危険が少ないため、多様なポリペプチド薬物の持続型製剤の開発に有用に利用できる。
2007536211.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体および免疫グロブリンＦｃ領域がお互い共有結合によって連結された蛋白質結合体。
【請求項２】
非ペプチド性重合体が、両末端の反応基を介して生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンＦｃ領域とそれぞれ共有結合によって連結される請求項１に記載の蛋白質結合体。
【請求項３】
一つの免疫グロブリンＦｃ領域に生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体の連結体が１つ以上共有結合によって連結される請求項２に記載の蛋白質結合体。
【請求項４】
免疫グロブリンＦｃ領域が非糖鎖化されることを特徴とする請求項１に記載の蛋白質結合体。
【請求項５】
免疫グロブリンＦｃ領域が、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインよりなる群から選択される１〜４個のドメインから構成される請求項１に記載の蛋白質結合体。
【請求項６】
免疫グロブリンＦｃ領域がヒンジ領域をさらに含む請求項５に記載の蛋白質結合体。
【請求項７】
免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、これらの組み合わせまたはこれらのハイブリッドのＦｃ領域よりなる群から選択される請求項１に記載の蛋白質結合体。
【請求項８】
免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、これらの組み合わせまたはこれらのハイブリッドのＦｃ領域よりなる群より選択される請求項７に記載の蛋白質結合体。
【請求項９】
免疫グロブリンＦｃ領域がＩｇＧ４ Ｆｃ領域である請求項８に記載の蛋白質結合体。
【請求項１０】
免疫グロブリンＦｃ領域が、ヒト非糖鎖化ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である請求項９に記載の蛋白質結合体。
【請求項１１】
非ペプチド性重合体の反応基が、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基およびスクシンイミド誘導体よりなる群から選択される請求項２に記載の蛋白質結合体。
【請求項１２】
スクシンイミド誘導体が、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチル、ヒドロキシスクシンイミジルまたはスクシンイミジルカーボネートである請求項１１に記載の蛋白質結合体。
【請求項１３】
非ペプチド性重合体が両末端に反応アルデヒド基の反応基を持つ請求項１２に記載の蛋白質結合体。
【請求項１４】
非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域と生理活性ポリペプチドのアミノ末端、リジン残基、ヒスチジン残基またはシステイン残基の遊離反応基に結合している請求項１記載の蛋白質結合体。
【請求項１５】
非ペプチド性重合体が、ポリエチレングリコール単独重合体、ポリプロピレングリコール単独重合体、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸およびこれらの組み合わせよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の蛋白質結合体。
【請求項１６】
非ペプチド性重合体がポリエチレングリコールである請求項１５に記載の蛋白質結合体。
【請求項１７】
生理活性ポリペプチドが、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造蛋白質、リガンド蛋白質および受容体よりなる群から選択される請求項１に記載の蛋白質結合体。
【請求項１８】
生理活性ポリペプチドが、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類、インターフェロン受容体類、コロニー刺激因子類、グルカコン様ペプチド類、Ｇプロテイン関連受容体、インターロイキン類、インターロイキン受容体類、酵素類、インターロイキン結合蛋白質類、サイトカイン結合蛋白質類、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、プロテインＡ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖蛋白質、免疫毒素、リンポ毒素、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ−１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポ蛋白質−Ｅ、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成因子、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、プラズミノゲン活性因子、フィブリン−結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、プロテインＣ、Ｃ−反応性蛋白質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンギオスタチン、アンギオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進蛋白質、カルシトニン、インスリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路抑制剤、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類、副甲状腺ホルモン、レラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体類、受容体拮抗物質、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体よび抗体断片類よりなる群から選択される請求項１７に記載の蛋白質結合体。
【請求項１９】
生理活性ポリペプチドが、ヒト成長ホルモン、インターフェロン−アルファ、顆粒球コロニー刺激因子、赤血球生成因子およびＦａｂ’抗体断片である請求項１８に記載の蛋白質結合体。
【請求項２０】
（ａ）両末端に反応基を持つ一つ以上の非ペプチド性重合体、一つ以上の生理活性ポリペプチド、および一つ以上の免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合によって連結する段階と、
（ｂ）共有結合によって連結された生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体および免疫グロブリンＦｃ領域を必須的に含む蛋白質結合体を分離する段階とを含む、請求項１の蛋白質結合体の製造方法。
【請求項２１】
段階（ａ）は、
（ａ１）活性化された非ペプチド性重合体の一方の末端に免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドを共有結合によって連結する段階と、
（ａ２）反応混合物から非ペプチド性重合体と連結された免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドを含む連結体を分離する段階と、
（ａ３）分離された連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端に免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドを共有結合によって連結し、非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域および生理活性ポリペプチドと結合した蛋白質結合体を生成する段階とを含む請求項２０に記載の製造方法。
【請求項２２】
段階（ａ１）において、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体の反応モル比が１：２．５〜１：５である請求項２１に記載の製造方法。
【請求項２３】
段階（ａ１）において、免疫グロブリンＦｃ領域と非ペプチド性重合体の反応モル比が１：５〜１：１０である請求項２１に記載の製造方法。
【請求項２４】
段階（ａ３）において、段階（ａ２）で収得された連結体：免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの反応モル比が１：０．５〜１：２０である請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
段階（ａ１）および段階（ａ３）の反応が還元剤の存在下で行われる請求項２１に記載の製造方法。
【請求項２６】
前記還元剤が、ナトリウムシアノボロハイドライド（ＮａＣＮＢＨ３）、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミン硼酸塩またはピリジン硼酸塩よりなる群から選択される請求項２５に記載の製造方法。
【請求項２７】
請求項１の蛋白質結合体およびこの薬剤学的に許容可能な担体を含む、生理活性ポリペプチドの生体内持続性および安定性増加用薬剤学的組成物。
【請求項２８】
非ペプチド性重合体が、両末端の反応基を介して生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンＦｃ領域とそれぞれ共有結合によって連結される請求項２７に記載の薬剤学的組成物。
【請求項２９】
一つの免疫グロブリンＦｃ領域に生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体の連結体が１つ以上共有結合によって連結される請求項２８に記載の薬剤学的組成物。
【請求項３０】
免疫グロブリンＦｃ領域が非糖鎖化されることを特徴とする請求項２７に記載の薬剤学的組成物。
【請求項３１】
免疫グロブリンＦｃ領域が、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインよりなる群から選択される１〜４個のドメインから構成される請求項２７に記載の薬剤学的組成物。
【請求項３２】
免疫グロブリンＦｃ領域がヒンジ領域をさらに含む請求項３１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項３３】
免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、これらの組み合わせまたはこれらのハイブリッドのＦｃ領域よりなる群から選択される請求項２７に記載の薬剤学的組成物。
【請求項３４】
免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、これらの組み合わせまたはこれらのハイブリッドのＦｃ領域よりなる群より選択される請求項３３に記載の薬剤学的組成物。
【請求項３５】
免疫グロブリンＦｃ領域がＩｇＧ４ Ｆｃ領域である請求項３４に記載の薬剤学的組成物。
【請求項３６】
免疫グロブリンＦｃ領域がヒト非糖鎖化ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である請求項３５に記載の薬剤学的組成物。
【請求項３７】
非ペプチド性重合体の反応基が、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基およびスクシンイミド誘導体よりなる群から選択される請求項２８に記載の薬剤学的組成物。
【請求項３８】
スクシンイミド誘導体が、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチル、ヒドロキシスクシンイミジルまたはスクシンイミジルカーボネートである請求項３７に記載の薬剤学的組成物。
【請求項３９】
非ペプチド性重合体が両末端に反応アルデヒド基の反応基を持つ請求項３８に記載の薬剤学的組成物。
【請求項４０】
非ペプチド性重合体の両末端が、それぞれ免疫グロブリンＦｃ領域と生理活性ポリペプチドのアミノ末端、リジン残基、ヒスチジン残基またはシステイン残基の遊離反応基に結合している請求項２７に記載の薬剤学的組成物。
【請求項４１】
非ペプチド性重合体が、ポリエチレングリコール単独重合体、ポリプロピレングリコール単独重合体、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸およびこれらの組み合わせよりなる群から選択されることを特徴とする請求項２７に記載の薬剤学的組成物。
【請求項４２】
非ペプチド性重合体がポリエチレングリコールである請求項４１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項４３】
生理活性ポリペプチドが、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造蛋白質、リガンド蛋白質および受容体よりなる群から選択される請求項２７に記載の薬剤学的組成物。
【請求項４４】
生理活性ポリペプチドが、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類、インターフェロン受容体類、コロニー刺激因子類、グルカコン様ペプチド類（ＧＬＰ−１など）、Ｇプロテイン関連受容体、インターロイキン類、インターロイキン受容体類、酵素類、インターロイキン結合蛋白質類、サイトカイン結合蛋白質類、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、プロテインＡ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖蛋白質、免疫毒素、リンポ毒素、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ−１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポ蛋白質−Ｅ、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成因子、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、プラズミノゲン活性因子、フィブリン−結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、プロテインＣ、Ｃ−反応性蛋白質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンギオスタチン、アンギオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進蛋白質、カルシトニン、インスリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路抑制剤、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類、副甲状腺ホルモン、レラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体類、受容体拮抗物質、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体よび抗体断片類よりなる群から選択される請求項４３に記載の薬剤学的組成物。
【請求項４５】
生理活性ポリペプチドが、ヒト成長ホルモン、インターフェロン−アルファ、顆粒球コロニー刺激因子、赤血球生成因子およびＦａｂ’抗体断片である請求項４４に記載の薬剤学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体および免疫グロブリンＦｃ領域がお互い共有結合によって連結され、生理活性持続期間が天然型に比べて延長された蛋白質結合体およびその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般に、ポリペプチドは、安定性が低くて変性し易く、血液内蛋白質加水分解酵素によって分解されて腎臓または肝臓を介して容易に除去されるため、薬理成分としてポリペプチドを含む蛋白質医薬品の血中濃度および力価を保つためには、蛋白質薬物を患者に頻繁に投与する必要がある。ところが、大部分注射剤の形態で患者に投与される蛋白質医薬品の場合、活性ポリペプチドの血中濃度を保つために頻繁に注射を打つことは、患者に夥しい苦痛を引き起こす。
【０００３】
このような問題点を解決するために、蛋白質薬物の血中安定性を増加させ、血中薬物濃度を長期間高く持続させて薬効を最大化しようという努力が続けられてきた。このような蛋白質薬物の持続性製剤は、蛋白質薬物の安定性を高めると同時に薬物自体の力価が十分高く維持されなければならず、患者に免疫反応を誘発してはならない。
【０００４】
蛋白質を安定化させ、蛋白質加水分解酵素との接触および腎臓による消失を抑制するための方法として、従来では、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol：以下「ＰＥＧ」という）のように溶解度の高い高分子を蛋白質薬物の表面に化学的に付加させる方法が使用された。ＰＥＧは、目的蛋白質の特定の部位または様々な部位に非特異的に結合して溶解度を高めることにより、蛋白質を安定化させ且つ蛋白質の加水分解を防止するのに効果があり、しかも、深刻な副作用も起こさないものと知られている（Sada et al., J. Fermentation Bioengineering 71: 137-139, 1991）。ところが、ＰＥＧの結合により、蛋白質の安定性は増加できるが、生理活性蛋白質の力価が著しく低くなるという問題を生じる。さらに、ＰＥＧの分子量が増加するほど蛋白質との反応性が低くなり、その結果、収率が減少するという問題を生じる。
【０００５】
最近は、ＰＥＧの両末端に同一の蛋白質薬物を結合させた二重体を作って活性の増加を図り（米国特許第５，７３８，８４６号）、あるいはお互い異なる種類の蛋白質薬物をＰＥＧの両末端に結合させて同時に２種の活性を示す蛋白質（国際出願公開第ＷＯ９２／１６２２１号）も開発されたが、これらは蛋白質薬物の活性を持続させる面では明確な効果を示していない。
【０００６】
一方、Ｋｉｎｓｔｌｅｒ等は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）とヒトアルブミンをＰＥＧに結合させた融合蛋白質が増加した安定性を示すと報告した（Kinstler et al., Pharmaceutical Research 12(12): 1883-1888, 1995）。ところが、Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−アルブミン構造を有する前記文献の修飾された薬物は、体内残留時間が天然型薬物を単独で投与した場合に比べて約４倍増加するに止まり、血中半減期の増加が微々であって、蛋白質薬物の効果的な持続性製剤として実用化されていない。
【０００７】
生理活性蛋白質の生体内安定性を高める別の方法として、遺伝子組み換えにより血中安定性の高い蛋白質遺伝子と生理活性蛋白質遺伝子を連結した後、前記組み換え遺伝子で形質転換された動物細胞などを培養して融合蛋白質を生産する方法が開発されている。例えば、現在まで蛋白質の安定性の増加に最も効果が高いものと知られているアルブミンまたはその断片を遺伝子組み換えによって目的の生理活性蛋白質に結合させて生産した融合蛋白質が報告されている（国際出願公開第ＷＯ９３／１５１９９号および第ＷＯ９３／１５２００号、ヨーロッパ特許公開第ＥＰ４１３，６２２号）。また、ヒューマンゲノムサイエンス(Human Genome Science)社が酵母で生産したインターフェロンアルファとアルブミンの融合蛋白質（製品名：AlbuferonTM）は、猿でインターフェロンの半減期を５時間から９３時間に増加させたが、修飾していないインターフェロンに比べて生体活性度が５％未満に著しく減少するという問題がある（Osborn et al., J. Phar. Exp. Ther. 303(2): 540-548, 2002）。
【０００８】
一方、免疫グロブリン(immunoglobulin、Ｉｇ)は、大きく抗原結合部位を有するＦａｂ領域と、補体結合部位を有するＦｃ領域とに区分されるが、遺伝子組み換え法によってインターフェロン（大韓民国特許公開第２００３−９４６４号）、インターロイキン−４受容体、インターロイキン−７受容体または赤血球生成因子受容体（大韓民国特許登録第２４９５７２号）を免疫グロブリンのＦｃ領域と融合している形態で哺乳動物で発現させることが知られており、国際特許公開第ＷＯ０１／０３７３７号には、サイトカインまたは成長因子をオリゴペプチドリンカー(linker)によって免疫グロブリンのＦｃ断片に結合させた融合蛋白質が開示されている。
【０００９】
また、米国特許第５，１１６，９６４号では、ＬＨＲ(lymphocyte cell surface glycoprotein)またはＣＤ４蛋白質を免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ末端またはカルボキシ末端に遺伝子組み換え法によって融合させた蛋白質を開示しており、米国特許第５，３４９，０５３号では、ＩＬ−２を免疫グロブリンＦｃ領域に融合させた融合蛋白質を開示している。その他にも、遺伝子組み換えによって製造されたＦｃ融合蛋白質の例として、インターフェロン−βまたはその誘導体と免疫グロブリンＦｃ領域の融合蛋白質（国際特許公開第ＷＯ００／２３４７２号）、ＩＬ−５受容体と免疫グロブリンＦｃ領域の融合蛋白質（米国特許第５，７１２，１２１号）およびＣＤ４蛋白質と免疫グロブリンＧ２のＦｃ領域の融合蛋白質（米国特許第６，４５１，３１３号）が開示されている。また、免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ酸を変形させた米国特許第５，６０５，６９０号には、免疫グロブリンＦｃ領域で特に補体結合部位または受容体結合部位のアミノ酸を変形させたＦｃを用いて遺伝子組み換え法によって製造されたＴＮＦＲ−ＩｇＧ１ Ｆｃ融合蛋白質が開示されている。このように変形された免疫グロブリンのＦｃ領域を用いた遺伝子組み換え方式の融合蛋白質の製造方法は、米国特許第６，２７７，３７５号、第６，４１０，００８号および第６，４４４，７９２号にも開示されている。
【００１０】
米国特許第６，６６０，８４３号は、免疫グロブリンＦｃ領域と目的蛋白質とをリンカーを用いて融合させた結合体を大腸菌から遺伝子組み換え法によって生産する方法を開示している。前記方法は、哺乳動物細胞を用いる方法よりも低いコストで生産することができ、糖鎖が除去された形態で結合体を得ることができる。ところが、目的蛋白質と免疫グロブリンＦｃ領域を大腸菌で同時に生産するため、糖鎖がある天然型の目的蛋白質には適用することが難しいうえ、封入体(inclusion body)を用いるため、ミスフォールディング(misfolding)の確率が非常に高いという問題点がある。
【００１１】
このような遺伝子組み換え法によって生産されたＦｃ融合蛋白質は、免疫グロブリンＦｃ領域の特定の部位、すなわちアミノ末端またはカルボキシル末端でのみ蛋白質融合が可能であり同種二量体の形態でのみ発現されるため、単量体の形態では生産が不可能であり、糖鎖化蛋白質間の融合または非糖鎖化蛋白質間の融合のみが可能であるため、糖鎖化蛋白質と非糖鎖化蛋白質の融合は不可能であるという欠点がある。また、融合によって新たに発生したアミノ酸配列により免疫反応が誘発されるおそれがあるだけでなく、リンカー部位に対する蛋白質加水分解酵素の敏感性が増加するおそれがある。
【００１２】
一方、免疫グロブリンＦｃ領域を用いた融合蛋白質の開発において、天然型ヒト由来Ｆｃおよび架橋剤を用いて目的蛋白質との結合体を得ようとする試みは未だ報告されていない。リンカーを用いた結合体の製造は、結合部位および結合する２つの蛋白質の方向性を選択して調節することができ、単量体、二量体または多量体の製造が可能であり、同種または異種の形態を全て製造することができるという長所がある。免疫グロブリンＦｃ領域は、哺乳動物細胞または大腸菌を用いた組み換え方法によって生産可能であるが、目的蛋白質を含んでいない天然型免疫グロブリンＦｃ領域のみを大腸菌から高収率で量産して持続型剤形に使用した例は現在まで報告されたことがない。それだけでなく、このような組み換え法によって生産された大腸菌由来免疫グロブリンＦｃ領域を用いて架橋剤を媒介として目的蛋白質との結合体を生産した試みも未だ報告されたことがない。
【００１３】
一方、免疫グロブリンは、抗体依存性細胞毒性(antibody-dependent cell cytotoxicity、ＡＤＣＣ)または補体依存性細胞毒性(complement dependent cytotoxicity、ＣＤＣ)効果などの抗体としての機能を持っており、免疫グロブリンＦｃ領域に存在する糖鎖はＡＤＣＣおよびＣＤＣ効果に重要な役割をすると報告された（Burton D., Molec. Immun. 22, 161-206, 1985）。糖鎖がない場合には、免疫グロブリン自体の血中半減期は糖鎖のある免疫グロブリンと類似であるが、補体結合力および受容体結合力は１０〜１０００倍減少すると知られている（Waldmann H., Eur. J. Immunol. 23, 403-411, 1993; Morrison S., J. Immunol. 143, 2595-2601, 1989）。
【００１４】
このように生理活性蛋白質に高分子を結合させる様々な方法が試みられてきたが、既存の方法は、ポリペプチドの安定性を高めると、活性が著しく減少し、あるいは安定性とは関係なく活性のみを増加させる方法であって、修飾による蛋白質薬物の活性減少を最小化し且つ安定性の向上を達成する方法の開発が依然として要求されている。
【００１５】
そこで、本発明者は、従来では同時に達成し難いものと思われてきた活性減少の最小化と安定性の増加を同時に成し遂げる持続性蛋白質薬物製剤を開発するために研究を行い続けた結果、免疫グロブリンＦｃ領域、非ペプチド性重合体および生理活性ポリペプチドを互いに共有結合によって連結させて製造した蛋白質結合体が、生理活性蛋白質の血中半減期を画期的に増加させ、公知の蛋白質薬物に比べて高い力価を維持することを確認することにより、本発明を完成した。
【発明の開示】
【００１６】
したがって、本発明の目的は、免疫反応を誘発することなく、生理活性ポリペプチドの活性減少を最小化し且つ血中半減期を延長させる蛋白質結合体およびその製造方法を提供することにある。
【００１７】
また、本発明の他の目的は、血中半減期が延長された前記蛋白質結合体を有効成分とする持続性蛋白質薬物製剤を提供することにある。
【００１８】
また、本発明の別の目的は、生理活性ポリペプチドの活性減少を最小化し且つ血中半減期を増加させ、安全性および生理活性の持続性を増進させる方法を提供することにある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明において、「蛋白質結合体(complex)」または「結合体」とは、一つ以上の生理活性ポリペプチド、両末端に反応基を有する一つ以上の非ペプチド性重合体および一つ以上の免疫グロブリンＦｃ領域を含み、これらの構成要素が共有結合でお互い連結されていることを示す。また、前記「結合体」と区別するために、生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体および免疫グロブリンＦｃ領域から選択された２種類の物質分子のみが共有結合で連結された構造物は「連結体(conjugate)」で表示する。
【００２０】
本発明の蛋白質結合体は、蛋白質薬物の生理活性減少を最小化しかつ生体内持続性を最大限増進させるための蛋白質薬物の変形体であって、本発明では、免疫グロブリンＦｃ領域を結合させることを特徴とする。
【００２１】
免疫グロブリンＦｃ領域は、生体内で代謝される生分解性のポリペプチドなので、薬物のキャリアとして使用するには安全である。また、免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリン全体分子に比べて相対的に分子量が少ないため、結合体の製造、精製および収率の面で有利であるうえ、アミノ酸配列が抗体ごとに異なるため、高い非均質性を示すＦａｂ部分が除去されるから、物質の同質性が大きく増加し、血中抗原性の誘発可能性も低くなる効果も期待することができる。
【００２２】
本発明において、「免疫グロブリンＦｃ領域」は、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域、重鎖不変領域１（ＣＨ１）と軽鎖不変領域１（ＣＬ１）を除いた、重鎖不変領域２（ＣＨ２）および重鎖不変領域３（ＣＨ３）部分を意味し、重鎖不変領域にヒンジ(hinge)部分を含むこともある。また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型と実質的に同等あるいはより向上した効果を持つ限り、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域のみを除き、一部または全体重鎖不変領域１（ＣＨ１）および／または軽鎖不変領域１（ＣＬ１）を含んだ、拡張されたＦｃ領域であり、あるいはＣＨ２および／またはＣＨ３に該当する相当長い一部のアミノ酸配列が除去された領域である。すなわち、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、５）１つまたは２つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（またはヒンジ領域の一部）との組み合わせ、６）重鎖不変領域の各ドメインと軽鎖不変領域の二量体であってもよい。
【００２３】
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型アミノ酸配列だけでなく、この配列誘導体(mutant)も含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列中の一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保全的または保全的置換、またはこれらの組み合わせによって相異なる配列を持つものを意味する。例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であると知られている２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２または３２７〜３３１番のアミノ酸残基が変形のために適当な部位として利用できる。また、ジスルフィド結合を形成することが可能な部位が除去されるか、あるいは天然型ＦｃからＮ末端の幾つかのアミノ酸が除去されるか、あるいは天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されることもあるなど様々な種類の誘導体が可能である。また、エフェクター機能を無くすために、補体結合部位、例えばＣｌｑ結合部位またはＡＤＣＣ部位が除去されることがある。このような免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体を製造する技術は、国際特許公開第ＷＯ９７／３４６３１号、国際特許公開第ＷＯ９６／３２４７８号などに開示されている。
【００２４】
分子の活性を全体的に変更させない蛋白質およびペプチドにおけるアミノ酸交換は、当該分野に公知となっている（H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979）。最も通常的に起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。
【００２５】
場合によっては、リン酸化(phosphorylation)、硫化(sulfation)、アクリル化(acrylation)、糖化(glycosylation)、メチル化(methylation)、ファルネシル化(farnesylation)、アセチル化(acetylation)、アミド化(amidation)などで修飾(modification)されることもできる。
【００２６】
前述したＦｃ誘導体は、本発明のＦｃ領域と同一の生物学的活性を示すが、熱やｐＨなどに対するＦｃ領域の構造的安定性を増大させた誘導体である。
【００２７】
また、このようなＦｃ領域は、ヒトおよび牛、山羊、豚、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物の生体内から分離して得られた天然型であり、あるいは形質転換された動物細胞または微生物から得られた組み換え型またはその誘導体である。ここで、天然型から得る方法では、全体免疫グロブリンをヒトまたは動物の生体から分離した後、蛋白質分解酵素を処理して得ることができる。パパインを処理する場合にはＦａｂおよびＦｃに切断され、ペプシンを処理する場合にはｐＦ’ｃおよびＦ（ａｂ’）２に切断される。これらの断片からサイズ排除クロマトグラフィ(size-exclusion chromatography)などを用いてＦｃまたはｐＦ’ｃを分離することができる。
【００２８】
好ましくは、ヒト由来のＦｃ領域は微生物から収得した組み換え型免疫グロブリンＦｃ領域である。
【００２９】
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖、または糖鎖が除去された形態である。このような免疫グロブリンＦｃの糖鎖の増減または除去には、化学的方法、酵素学的方法および微生物を用いた遺伝工学的方法などの通常の方法が利用できる。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、補体（Ｃｌｑ）の結合力が著しく低下し、抗体依存性細胞毒性または補体依存性細胞毒性が減少または除去されるので、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このような点において、薬物のキャリアとしての本来の目的にさらに符合する形態は、脱糖鎖化免疫グロブリンＦｃ領域、または非糖鎖化免疫グロブリンＦｃ領域である。
【００３０】
本発明において、「脱糖鎖化(Deglycosylation)」はＦｃ領域から酵素によって糖を除去することを意味し、「非糖鎖化(Aglycosylation)」はＦｃ領域を糖鎖化されていない形態で原核細胞、好ましくは大腸菌で生産することを意味する。
【００３１】
一方、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒト起源または牛、山羊、豚、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であり、好ましくはヒト起源である。また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来またはこれらの組み合わせ(combination)またはこれらの混成(hybrid)によるＦｃ領域である。好ましくは、ヒトの血液に最も豊富なＩｇＧまたはＩｇＭ由来であり、最も好ましくは、リガンド結合蛋白質の半減期を向上させるものと公知になっているＩｇＧ由来である。
【００３２】
一方、本発明において、「組み合わせ(combination)」とは、二量体または多量体を形成するとき、同一起源の単鎖免疫グロブリンＦｃ領域を暗号化するポリペプチドが相異なる起源の単鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ ＦｃおよびＩｇＥ Ｆｃ断片よりなる群から選択された２つ以上の断片から二量体または多量体の製造が可能である。
【００３３】
本発明において、「ハイブリッド(hybrid)」とは、単鎖の免疫グロブリンＦｃ領域内に、２つ以上の相異なる起源の免疫グロブリンＦｃ断片に該当する配列が存在することを意味する用語である。本発明の場合、様々な形態のハイブリッドが可能である。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＥ ＦｃおよびＩｇＤ ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４よりなる群から選択された１〜４つのドメインからなるドメインのハイブリッドが可能であり、ヒンジを含むことができる。
【００３４】
一方、ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のサブクラスに分けられるが、本発明では、これらの組み合わせおよびこれらの混成化も可能である。好ましくは、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４サブクラスであり、最も好ましくは、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ、Complement-dependent cytotoxicity）のようなエフェクター機能が殆どないＩｇＧ４のＦｃ領域である（図１４および図１５参照）。
【００３５】
すなわち、最も好ましい本発明の薬物のキャリア用免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４由来の非糖鎖化Ｆｃ領域である。ヒト由来のＦｃ領域は、ヒトの生体で抗原として作用し、これに対する新しい抗体を生成するなどの好ましくない免疫反応を起こすおそれのある非ヒト由来のＦｃ領域に比べて好ましい。
【００３６】
本発明において、免疫グロブリンＦｃ領域と蛋白質薬物は、非ペプチド性重合体で連結されることを特徴とする。
【００３７】
本発明において、「非ペプチド性重合体」とは、反復単位が２つ以上結合した生体適合性重合体を意味し、前記反復単位は、ペプチド結合でない任意の共有結合によってお互い連結される。
【００３８】
本発明に使用可能な「非ペプチド性重合体」は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸、poly(lactic acid)）およびＰＬＧＡ（ポリ乳酸−グリコール酸、poly(lactic-glycolic acid)）のような生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸およびこれらの組み合わせよりなる群から選択でき、好ましくはポリエチレングリコールである。当該分野に既に知られているこれらの誘導体および当該分野の技術水準で容易に製造することが可能な誘導体も、本発明の範囲に含まれる。非ペプチド性重合体は、分子量１〜１００ｋＤａ範囲、好ましくは１〜２０ｋＤａ範囲であることが好ましい。また、前記免疫グロブリンＦｃ領域と結合する本発明の非ペプチド性重合体は、１種類の重合体だけでなく、相異なる種類の重合体の組み換えを使用してもよい。
【００３９】
本発明に使用される非ペプチド性重合体は、免疫グロブリンＦｃ領域および蛋白質薬物と結合できる反応基を持つ。
【００４０】
前記非ペプチド性重合体の両末端反応基の種類は、反応アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基およびスクシンイミド誘導体(succinimide derivative)よりなる群から選択されることが好ましい。前記において、スクシンイミド誘導体としては、スクシンイミジルプロピオネート、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチルまたはスクシンイミジルカーボネートが利用できる。特に、前記非ペプチド性重合体が両末端に反応アルデヒド基の反応基を持つ場合、非特異的反応を最小化しながら非ペプチド性重合体の両末端で生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンＦｃ領域とそれぞれ結合するのに効果的である。アルデヒド結合による還元性アルキル化で生成された最終産物は、アミド結合で連結されたものより一層安定的である。
【００４１】
前記非ペプチド性重合体の両末端の反応基はお互い同一または異なる。例えば、一方の末端にはマレイミド基を、他方の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基またはブチルアルデヒド基を持つことができる。両末端にヒドロキシ反応基を持つポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）を非ペプチド性重合体として用いる場合には、公知の化学反応によって前記ヒドロキシを前記様々な反応基に活性化し、あるいは商業的に入手可能な変形反応基を持つポリエチレングリコールを用いて本発明の蛋白質結合体を製造することができる。
【００４２】
一方、本発明において、前記免疫グロブリンＦｃ領域と非ペプチド性重合体の連結体は、生理活性ポリペプチドに結合して蛋白質結合体を形成する。
【００４３】
本発明において、「生理活性ポリペプチド」、「生理活性蛋白質」、「活性蛋白質」または「蛋白質薬物」とは、生体内で生理的現象に拮抗作用を示すポリペプチドまたは蛋白質を意味する用語であって、相互交換的に使用できる。
【００４４】
このような蛋白質薬物は、変性し易い、あるいは生体内に存在する蛋白質分解酵素によってよく分解されるといった理由で長時間にわたって生理学的活性を持続することができないという欠点がある。しかし、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域とポリペプチドを結合させた結合体の場合、薬物の構造的安定性が増加し、分解半減期が増加する。ところが、Ｆｃ領域の結合によるポリペプチドの生理学的活性の減少は、その他公知となっている他のポリペプチド薬物製剤に比べて非常に軽微であるといえる。したがって、既存のポリペプチド薬物の生体内利用率に比べて本発明のポリペプチドおよび免疫グロブリンＦｃ領域の結合体は、生体内利用率が著しく増加したことを特徴とする。これは、下記本発明の実施例によっても開示されているところ、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域が結合したＩＦＮα、Ｇ−ＣＳＦ、ｈＧＨなどが、ＰＥＧのみが結合しあるいはＰＥＧとアルブミンが結合した既存の製剤に比べて約２〜６倍程度増加したことを確認することができる（表８、表９および表１０）。
【００４５】
一方、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域と蛋白質の結合は、従来の組み換え的な方法による融合ではないことを特徴とする。免疫グロブリンＦｃ領域と薬物として用いられる活性ポリペプチドが組み換え的な方法によって融合している形態は、Ｆｃ領域のＮ末端またはＣ末端にポリペプチドがペプチド結合で連結された形態であって、これをコードする核酸配列において一つのポリペプチドとして発現されて折りたたまれる。
【００４６】
蛋白質の生理学的機能体としての活性が構造によって決定されるという点に基づくとき、これは融合蛋白質活性の急激な減少をもたらす。したがって、ポリペプチド薬物がＦｃと組み換え的な方法によって融合する場合、構造的安定性が増加したとしても、生体内利用率の面で効果がない。また、このような融合蛋白質は、誤って折りたたまれ(misfolding)て凝集体の形態で発現される傾向があるので、蛋白質の製造、分離の収率面で不経済である。また、活性型ポリペプチドが糖鎖化された形態の場合、真核細胞で発現させなければならず、このような場合、Ｆｃも糖鎖化されるので、生体内で不適切な免疫反応を引き起こすおそれもある。
【００４７】
すなわち、本発明によってこそ始めて、糖鎖化された活性型ポリペプチドを非糖鎖化された免疫グロブリンＦｃ領域に連結させた結合体を製造することが可能となり、最上のシステムでそれぞれが製造、分離されるので、蛋白質獲得の収率を高めることができるなど、前記の問題点を全て克服することができる。
【００４８】
一方、本発明の蛋白質結合体に適用できる生理活性ポリペプチドとしては、ホルモン、サイトカイン、インターロイキン、インターロイキン結合蛋白質、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造蛋白質、リガンド蛋白質または受容体、細胞表面抗原、受容体拮抗物質などの様々な生理活性ポリペプチド、およびこれらの誘導体および類似体を例示することができる。
【００４９】
具体的に、生理活性ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類とインターフェロン受容体類（例えば、インターフェロン−α、−βおよび−γ、水溶性タイプＩインターフェロン受容体など）、コロニー刺激因子、インターロイキン類（例えば、インターロイキン−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２、−１３、−１４、−１５、−１６、−１７、−１８、−１９、−２０、−２１、−２２、−２３、−２４、−２５、−２６、−２７、−２８、−２９、−３０など）とインターロイキン受容体類（例えば、ＩＬ−１受容体、ＩＬ−４受容体など）、酵素類（例えば、グルコセレブロシダーゼ(glucocerebrosidase)、イズロネート−２−スルファターゼ(iduronate-2-sulfatase)、α−ガラクトシダーゼ−Ａ(alpha-galactosidase-A)、α−Ｌ−イズロニダーゼ(alpha-L-iduronidase)、ブチリルコリンエステラーゼ(butyrylcholinesterase)、キチナーゼ(chitinase)、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(glutamate decarboxylase)、イミグルセラーゼ(imiglucerase)、リパーゼ(lipase)、 ウリカーゼ(uricase)、血小板−活性因子アセチルハイドロラーゼ(platelet-activating factor acetylhydrolase)、中性エンドペプチダーゼ(neutral endopeptidase)、ミエロペルオキシダーゼ(myeloperoxidase)など）、インターロイキンおよびサイトカイン結合蛋白質類（例えば、ＩＬ−１８ｂｐ、ＴＮＦ−結合蛋白質など）、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、プロテインＡ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖蛋白質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ−１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポ蛋白質−Ｅ、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成因子、アンジオポエチン(angiopoietin)類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド(thrombin receptor activating peptide)、トロンボモジュリン(thrombomodulin)、血液因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、プラズミノゲン活性因子、フィブリン−結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン(hirudin)、プロテインＣ、Ｃ−反応性蛋白質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンギオスタチン(angiostatin)、アンギオテンシン(angiotensin)、骨形成成長因子、骨形成促進蛋白質、カルシトニン、インスリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン(elcatonin)、結合組織活性因子、組織因子経路抑制剤(tissue factor pathway inhibitor)、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類（例えば、神経成長因子(Nerve growth factor)、毛様体神経栄養因子(cilliary neurotrophic factor)、アキソジェネシス因子−１(axogenesis factor-1）、グルカコン様ペプチド類（ＧＬＰ−１）、脳−ナトリウム利尿ペプチド(brain-natriuretic peptide)、神経膠由来神経栄養因子(glial derived neurotrophic factor)、ネトリン(netrin)、好中球抑制因子(neurophil inhibitor factor)、神経因子、ニューチュリン(neuturin)など)、 副甲状腺ホルモン、レラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレ���ストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン(autotaxin)、ラクトフェリン(lactoferrin)、ミオスタチン(myostatin)、受容体類（例えば、ＴＮＦＲ（Ｐ７５）、ＴＮＦＲ（Ｐ５５）、ＩＬ−１受容体、ＶＥＧＦ受容体、Ｂ細胞活性因子受容体など）、受容体拮抗物質（例えば、ＩＬ１−Ｒａなど）、細胞表面抗原（例えば、ＣＤ２、３、４、５、７、１１ａ、１１ｂ、１８、１９、２０、２３、２５、３３、４０、４５、６９など）、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片類（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｄ）、ウイルス由来ワクチン抗原など様々な種類を含む。
【００５０】
特に好ましい生理活性ポリペプチドは、疾病の治療または予防の目的で人体に投与されるとき、投与頻度の高いヒト成長ホルモン、インターフェロン類（インターフェロン−α、−β、−γなど）、顆粒球コロニー刺激因子、赤血球生成因子および抗体断片類などであり、最も好ましくはインターフェロン−αである。また、前記生理活性ポリペプチドの天然型と実質的に同等或いはより増加した機能、構造、活性または安定性を有する限り、任意の誘導体または誘導体も本発明の生理活性ポリペプチドの範囲に含まれる。
【００５１】
本発明において、抗体断片は、特定の抗原に結合することが可能な能力を持ったＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｄまたはｓｃＦｖであり、好ましくはＦａｂ’である。Ｆａｂ断片は、軽鎖の可変ドメイン（Ｖ-Ｌ）および不変ドメイン（ＣＬ-）と重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）および第１不変ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片は、ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端にヒンジ(hinge)領域からの一つ以上のシステインを含む数個のアミノ酸残基が付加されている点でＦａｂ断片とは区別される。Ｆｄ断片は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインのみから構成された断片であり、Ｆ（ａｂ’）２は、２分子のＦａｂ’断片がジスルフィド結合あるいは化学的反応によって結合したものである。ｓｃＦｖは、ＶＬおよびＶＨドメインのみがペプチドリンカーで連結された単一ポリペプチド鎖である。
【００５２】
一方、非ペプチド性重合体を媒介として免疫グロブリンＦｃ領域と蛋白質薬物が結合する場合、免疫グロブリンＦｃ領域の結合部位は、ヒンジ部位または不変領域に存在するアミノ酸残基の遊離反応基の一つ以上を含む。好ましくは、免疫グロブリンＦｃ不変領域および蛋白質薬物のアミノ末端、リジンのアミノ残基、ヒスチジンのアミノ残基または遊離システイン残基が非ペプチド性重合体の末端反応基と共有結合によって連結されることが好ましい。
【００５３】
本発明の蛋白質結合体は、［生理活性ポリペプチド−非ペプチド性重合体−免疫グロブリンＦｃ領域］の単位構造を一つ以上含むことができる。ここで、全ての構成要素は共有結合によって線状に連結されている。非ペプチド性重合体は、両末端に反応基を持つことができるので、これを介して生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンＦｃ領域とそれぞれ共有結合で連結される。すなわち、一つの免疫グロブリンＦｃ領域に、生理活性ポリペプチドと結合した非ペプチド性重合体の１つ以上の連結体が共有結合で連結されることにより、免疫グロブリンＦｃ領域を媒介体として生理活性ポリペプチド単量体、二量体あるいは多量体を形成することができ、これにより生体内活性および安全性の増加をより効果的に達成することができる。
【００５４】
本発明の蛋白質結合体において、生理活性ポリペプチドと免疫グロブリンＦｃ領域は様々なモル比で結合できる。
【００５５】
また、従来から知られているように、２つの蛋白質がオリゴペプチドを媒介として連結される場合、その連結部位によって新しく形成される蛋白質配列が免疫反応を誘発させるおそれがあり、連結される蛋白質の結合部位がＮ末端とＣ末端にのみ制限されていた反面、本発明の蛋白質結合体は、生体適合性を有する非ペプチド性重合体によって媒介されるため、毒性または免疫反応の誘発といった副作用がなく、結合部位の多様性により様々な蛋白質結合体を提供することができるという利点がある。
【００５６】
また、従来の遺伝子組み換えによる免疫グロブリンＦｃ領域と活性蛋白質を直接融合させる方法は、融合パートナーとして用いられる免疫グロブリンＦｃ領域の末端配列でのみ融合が可能であり、動物細胞の培養に依存するので、その生産量が制限的であるうえ、活性蛋白質の非天然型糖鎖化により活性が減少でき、正確なフォールディング(folding)が行われるべきであり、同種二量体(homodimer)形態の融合蛋白質が生産でき、特に大腸菌由来結合体の製造時に不溶性のミスフォールディング結合体の除去が非常に難しいという問題点がある。ところが、本発明の蛋白質結合体は、かかる問題点を引き起こすことなく、より高い持続性および安定性を達成することができ、ポリペプチドの活性維持の面でも好ましく、糖鎖化された治療蛋白質と非糖鎖化されたＦｃの結合体を製造することができるという長所がある。
【００５７】
一方、カルボジイミドまたはグルタルアルデヒドのような低分子量の化学的結合剤を使用する場合には、前記化学的結合剤が蛋白質のいろいろの部位に同時に結合して蛋白質を変性させるか、あるいは非特異的結合によって結合部位の調節を困難にするか、あるいは結合した蛋白質の精製を難しくするなどの問題点がある。これに反し、本発明の蛋白質結合体は、非ペプチド性重合体を使用するので、結合部位の調節が容易であり、非特異的反応を最小化し、精製が容易であるという長所を持つ。
【００５８】
具体的に、本発明の実施例を中心として本発明の有用性を説明すると、ＰＥＧの両末端に生理活性ポリペプチドと免疫グロブリンＦｃ領域が結合した本発明の蛋白質結合体（ポリペプチド−ＰＥＧ−Ｆｃ）は、ポリペプチド−ＰＥＧ連結体またはポリペプチド−ＰＥＧ−アルブミン結合体より著しく優れた安定性および活性を示す。薬物動力学分析(pharmacokinetic analysis)結果、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）の血中半減期がインターフェロンアルファ−４０ｋＤａ ＰＥＧ連結体（ＩＦＮα−４０Ｋ ＰＥＧ）の場合には天然型に比べて約２０倍増加し、ＩＦＮα−ＰＥＧ−アルブミン結合体の場合には約１０倍増加した反面、本発明のＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体は約５０倍程度に画期的に増加した（表３参照）。また、目的蛋白質としてＩＦＮαの代わりにヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）およびその誘導体（１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ）または赤血球生成因子（ＥＰＯ）を用いた場合にも同一の結果を示したが、ＰＥＧ−Ｆｃを結合させた本発明の蛋白質結合体が天然型蛋白質またはＰＥＧまたはＰＥＧ−アルブミンを結合させた場合に比べて約１０倍まで増加した平均滞留時間（mean residence time；ＭＲＴ）および血中半減期を示した（表４〜表７参照）。
【００５９】
また、Ｆａｂ’−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体は、ＰＥＧ−Ｆｃ連結体がＦａｂ’のＣ末端近くの−ＳＨ基またはＮ末端に連結された場合、いずれも４０Ｋ ＰＥＧ−Ｆａｂ’連結体に比べて２〜３倍延長された血中半減期を示した（図１２参照）。
【００６０】
そして、免疫グロブリンＦｃの糖鎖を除去した脱糖鎖化免疫グロブリンＦｃ（ＤＧ Ｆｃ）と組み換え非糖鎖化免疫グロブリンＦｃ（ＡＧ Ｆｃ）誘導体を用いて蛋白質結合体を製造しても、血中半減期と生体外活性が同様に維持されるものと確認された（表３および８、図１１参照）。
【００６１】
このように、本発明の蛋白質結合体は、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、赤血球生成因子、コロニー刺激因子またはその誘導体および抗体誘導体を含む多様な生理活性ポリペプチドに適用され、卓越した血中半減期と平均滞留時間（ＭＲＴ）を示すので、様々な種類の生理活性ポリペプチドの持続型製剤の開発に利用できる。
【００６２】
本発明の別の様態として、本発明は、
（ａ）両末端に反応基を有する非ペプチド性重合体、生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンＦｃ領域を反応させてこれらをお互い共有結合によって連結させる段階と、
（ｂ）非ペプチド性重合体の両末端に生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンＦｃ領域がそれぞれ共有結合によって連結された結合体を分離する段階とを含む、生体内持続性および安定性が増加した蛋白質結合体の製造方法を提供する。
【００６３】
前記段階（ａ）において、３つの構成要素の共有結合は、順次または同時に起こる。例えば、非ペプチド性重合体の両末端にそれぞれ生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンＦｃ領域を結合させる場合には、生理活性ポリペプチドと免疫グロブリンＦｃ領域のいずれか一つをまず非ペプチド性重合体の一方の末端に結合させた後、残りの成分を非ペプチド性重合体の他方の末端に結合させる方式で順次反応を行うことが、目的蛋白質結合体以外の副産物の生成を最小化するのに有利である。
【００６４】
したがって、前記段階（ａ）は、
（ａ１）非ペプチド性重合体の一方の末端に免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドを共有結合によって連結させる段階と、
（ａ２）前記反応混合物から非ペプチド性重合体に結合した免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチド連結体を分離する段階と、
（ａ３）前記で分離された連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端に免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドを共有結合によって連結し、非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域および生理活性ポリペプチドと結合した蛋白質結合体を生成する段階とを含むことができる。
【００６５】
前記段階（ａ１）において、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体の最適反応モル比は１：２．５〜１：５であり、免疫グロブリンＦｃ領域と非ペプチド性重合体の最適反応モル比は１：５〜１：１０である。
【００６６】
一方、段階（ａ３）において、段階（ａ２）で収得された連結体：免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの反応モル比は、１：０．５〜１：２０の範囲であり、好ましくは１：１〜１：３の範囲である。
【００６７】
段階（ａ１）および段階（ａ３）の反応は、反応に参加する非ペプチド性重合体の両末端反応基の種類を考慮し、必要に応じて還元剤の存在の下で行うことができる。好ましい還元剤としては、ナトリウムシアノボロハイドライド（ＮａＣＮＢＨ３）、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミン硼酸塩またはピリジン硼酸塩などが使用できる。
【００６８】
前記において、段階（ａ２）および（ｂ）は、要求される純度、生成された産物の分子量および電荷量のような特性を考慮し、蛋白質の分離に用いられる通常の方法の中から必要に応じて適切に選択して行うことができる。例えば、サイズ排除クロマトグラフィまたはイオン交換クロマトグラフィを含む様々な公知の方法を適用することができ、必要に応じてはより高純度で精製するために複数の相異なる方法を組み合わせて使用することができる。
【００６９】
本発明の別の様態として、本発明は、本発明の蛋白質結合体を有効成分とし、薬学的に許容可能な担体を含む、生体内持続性および安定性が増加した生理活性ポリペプチドの薬学的組成物を提供する。
【００７０】
本発明において、「投与」はある適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、前記結合体は薬物が目的の組織に到達することができる限り、いずれの一般的な経路を介しても投与できる。例えば、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与が可能であるが、これに制限されない。ところが、経口投与の際、ペプチドは消化されるため、経口用組成物は活性薬剤をコートし、或いは胃における分解から保護するために剤形化することが好ましい。好ましくは、注射剤の形態で投与できる。また、製薬組成物は、活性物質が標的細胞に移動することが可能な任意の装置によって投与できる。
【００７１】
本発明の結合体を含んだ薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容可能な担体を含むことができる。薬剤学的に許容される担体は、経口投与の場合には結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用することができ、注射剤の場合には緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与の場合には基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。本発明の薬剤学的組成物の剤形は、上述したような薬剤学的に許容される担体と混合して様々に製造できる。例えば、経口投与の場合には錠剤、トローチ剤、カプセル、エリキシル剤(elixir)、サスペンション、シロップ、ウェーハなどの形態で製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは多数回投薬の形態で製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、徐方形製剤などに剤形化することができる。
【００７２】
一方、製剤化に適した担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、珪酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシ安息香酸、タルク、ステアリン酸マグネシウムまたは鉱物油などが使用できる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含むことができる。
【００７３】
本発明において、Ｆｃ断片がキャリアとして用いられた薬物の実際投与量は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別並びに体重、および疾患の重症度などのいろいろの関連因子とともに、活性成分である薬物の種類によって決定される。本発明の薬剤学的組成物は、生体内持続性に非常に優れるので、本発明の薬剤学的製剤の投与回数および頻度を著しく減少させることができる。
【００７４】
以下、下記の実施例によって本発明をより詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００７５】
（実施例１）インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ領域（Ｆｃ）結合体の製造Ｉ
（段階１）免疫グロブリンを用いた免疫グロブリンＦｃ領域の製造
免疫グロブリンＦｃ領域を製造するために、１０ｍＭのリン酸塩緩衝液に溶解された分子量１５０ｋＤａの免疫グロブリンＧ（Immunoglobulin G；ＩｇＧ、緑十字）２００ｍｇに蛋白質加水分解酵素パパイン（Papain、Ｓｉｇｍａ社）を２ｍｇ処理して３７℃で２時間徐々に攪拌しながら反応させた。酵素反応後、生成された免疫グロブリンＦｃ領域を精製するために、Ｓｕｐｅｒｄｅｘカラム、プロテインＡカラムおよび陽イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィを順次行った。具体的に、反応液を１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．３）で平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Superdex 200、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に滴下し、同一の緩衝液を用いて流速１ｍＬ／分で溶出させた。免疫グロブリンＦｃ領域より分子量が相対的に大きい未反応免疫グロブリン（ＩｇＧ）とＦ（ａｂ’）２などは早く溶出するので、これを先に除去した。免疫グロブリンＦｃ領域と類似の分子量を持つＦａｂは、次のようにプロテインＡカラムクロマトグラフィを行って除去した（図１）。２０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）にＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムから溶出した免疫グロブリンＦｃ領域含有分画を５ｍＬ／分の流速で負荷した後、カラムに結合していない蛋白質を除去するために同一の緩衝液で十分洗浄した。ここに１００ｍＭのクエン酸ナトリウム（Na citrate、ｐＨ３．０）緩衝液を流して高純度の免疫グロブリンＦｃ領域を溶出させた。プロテインＡカラムで精製されたＦｃ分画を最後に陽イオン交換樹脂カラム（ｐｏｌｙＣＡ、ＰｏｌｙＬＣ社）を用いて精製したが、１０ｍＭの酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．５）を用いた直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０．１５Ｍ→０．４Ｍ）法によって溶出して高純度のＦｃ分画を得、これを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で確認した（図２のレーン２）。
【００７６】
（段階２）ＩＦＮα−ＰＥＧ連結体の製造
両末端にアルデヒド反応基を持つ分子量３．４ｋＤａのポリエチレングリコールＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社）を、ヒトインターフェロンアルファ−２ｂ（ｈＩＦＮα−２ｂ、分子量２０ｋＤａ）が５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解された１００ｍＭのリン酸塩緩衝液にＩＦＮα：ＰＥＧのモル比が１：１、１：２．５、１：５、１：１０および１：２０となるように添加した。ここに還元剤のナトリウムシアノボロハイドライド（ＮａＣＮＢＨ３、Ｓｉｇｍａ社）を最終濃度が２０ｍＭとなるように添加し、４℃で徐々に攪拌しながら３時間反応させた。インターフェロンアルファのアミノ末端部位に選択的にＰＥＧが連結され、ＰＥＧとインターフェロンアルファが１：１で結合した連結体を得るために、前記反応混合物をＳｕｐｅｒｄｅｘ（SuperdexR、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）サイズ排除(size exclusion)クロマトグラフィにかけた。溶出液として１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６.０）を用いてＩＦＮα−ＰＥＧ連結体を精製し、ＰＥＧと結合していないインターフェロンアルファ、未反応ＰＥＧおよび２つのインターフェロンアルファがＰＥＧと連結された二量体副産物を除去した。精製されたＩＦＮα−ＰＥＧ連結体を５ｍｇ／ｍＬの濃度に濃縮した。これにより、反応性が最も良くて二量体などの副産物が少ないＩＦＮα：ＰＥＧの最適反応モル比は１：２．５〜１：５であることを確認した。
【００７７】
（段階３）ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体の形成
前記段階２で精製されたＩＦＮα−ＰＥＧ連結体に免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に結合させるために、段階１で準備された免疫グロブリンＦｃ領域（約５３ｋＤａ）を１０ｍＭのリン酸塩緩衝液に溶解させた後、ＩＦＮα−ＰＥＧ連結体：Ｆｃのモル比がそれぞれ１：１、１：２、１：４および１：８となるように、ＩＦＮα−ＰＥＧ連結体と混合して反応させた。反応液を１００ｍＭのリン酸塩緩衝液状態に作り、還元剤としてＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭとなるように添加した後、４℃で２０時間徐々に攪拌しながら反応させた。これにより、反応性が最も良くて二量体などの副産物が少ないＩＦＮα−ＰＥＧ連結体：Ｆｃの最適反応モル比は１：２であることを確認した。
【００７８】
（段階４）ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体の分離および精製
前記段階３の結合反応後、未反応物質および副産物を除去し、生成されたＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体を精製するためにＳｕｐｅｒｄｅｘサイズ排除クロマトグラフィを行った。反応混合物を濃縮した後、１０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）を用いて流速２．５ｍＬ／分でカラムに通過させ、結合していないＦｃおよび未反応物質を除去し、ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体分画を得た。得られたＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体分画には不純物として少量の未反応Ｆｃおよびインターフェロンアルファ二量体が混在しているから、これを除去するためにさらに陽イオン交換樹脂クロマトグラフィを行った。ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体分画を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で平衡化させたＰｏｌｙＣＡＴ ＬＰカラム（ＰｏｌｙＬＣ社）に仕込み、１Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）緩衝液を用いた直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０Ｍ→０．５Ｍ）法で溶出してさらに精製した。最後に、陰イオン交換カラムを用いてＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体を純粋に獲得した。ＰｏｌｙＷＡＸ ＬＰカラム（ＰｏｌｙＬＣ社）を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液で平衡化させた後、精製されたＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体分画を負荷し、１Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液を直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０Ｍ→０．３Ｍ）方法で流して純粋なＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体を精製した。
【００７９】
（実施例２）ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体の製造ＩＩ
（段階１）Ｆｃ−ＰＥＧ連結体の製造
両末端にアルデヒド反応基を持つ分子量３．４ｋＤａのポリエチレングリコールＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社）を、前記実施例１の段階１で準備された免疫グロブリンＦｃ領域が１５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解された１００ｍＭのリン酸塩緩衝液に免疫グロブリンＦｃ：ＰＥＧのモル比がそれぞれ１：１、１：２．５、１：５、１：１０および１：２０となるように添加した。還元剤のＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭとなるように添加した後、４℃で徐々に攪拌しながら３時間反応させた。免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ末端部位に選択的にＰＥＧ：Ｆｃが１：１で結合した連結体を得るために、前記反応混合物を持ってＳｕｐｅｒｄｅｘ（SuperdexR、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）サイズ排除クロマトグラフィを行った。溶出液として１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６.０）を用いてＦｃ−ＰＥＧ連結体を精製し、ＰＥＧと結合していない免疫グロブリンＦｃ領域、未反応ＰＥＧおよび２つの免疫グロブリンＦｃ領域がＰＥＧに連結された二量体副産物を除去した。精製されたＦｃ−ＰＥＧ連結体を約１５ｍｇ／ｍＬの濃度で濃縮した。これにより、反応性が最も良くて二量体などの副産物が少ないＦｃ：ＰＥＧの最適反応モル比は１：３〜１：１０であることを確認した。
【００８０】
（段階２）Ｆｃ−ＰＥＧ連結体とインターフェロンアルファの結合体の形成および精製
前記段階１で精製されたＦｃ−ＰＥＧ連結体をＩＦＮαのＮ末端に結合させるために、１０ｍＭのリン酸塩緩衝液に溶解されたインターフェロンアルファを使用し、Ｆｃ−ＰＥＧ連結体：ＩＦＮαのモル比がそれぞれ１：１、１：１．５、１：３および１：６となるように添加して反応させた。反応液を１００ｍＭのリン酸塩緩衝液に調製し、還元剤としてＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭとなるように添加した後、４℃で２０時間徐々に攪拌しながら反応させた。反応後、実施例１の段階４と同一の方法で精製して未反応物質および副産物を除去し、これから生成されたＦｃ−ＰＥＧ−ＩＦＮα蛋白質結合体を純粋に分離した。
【００８１】
（実施例３）ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体の製造
インターフェロンアルファの代わりにヒト成長ホルモン（ｈＧＨ、分子量２２ｋＤａ）を使用し、ｈＧＨ：ＰＥＧのモル比を１：５とする以外は、実施例１と同一の方法でｈＧＨ−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体を製造および精製した。
【００８２】
（実施例４）ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体の製造
インターフェロンアルファの代わりにヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を使用し、Ｇ−ＣＳＦ：ＰＥＧのモル比を１：５とする以外は、実施例１と同一の方法でＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体を製造および精製した。
一方、天然型Ｇ−ＣＳＦの１７番目のアミノ酸がセリンで置換された誘導体（１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ）を用いて前記と同一の方法で１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体を製造および精製した。
【００８３】
（実施例５）ヒト赤血球生成因子（ＥＰＯ）−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体の製造
インターフェロンアルファの代わりにヒト赤血球生成因子（Erythropoietin；ＥＰＯ）を使用し、ＥＰＯ：ＰＥＧのモル比を１：５とする以外は、実施例１と同一の方法でＥＰＯ−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体を製造および精製した。
【００８４】
（実施例６）反応基の種類を異にするＰＥＧを用いた蛋白質結合体の製造
両末端の反応基が全てスクシンイミジルプロピオネート（Succinimidyl propionate；ＳＰＡ）であるＰＥＧを用いてＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体を次のように製造した。インターフェロンアルファ１０ｍｇが溶解された１００ｍＭのリン酸塩緩衝液に、両末端にＳＰＡ反応基を持つ分子量３．４ｋＤａのポリエチレングリコールＳＰＡ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社）をＩＦＮα：ＰＥＧのモル比がそれぞれ１：１、１：２．５、１：５、１：１０および１：２０となるように添加し、常温で徐々に攪拌しながら２時間反応させた。インターフェロンアルファのリジン残基のアミノ基部位に選択的にＰＥＧが１：１で結合したＰＥＧ−ＩＦＮα連結体を得るために、反応混合物をもってＳｕｐｅｒｄｅｘサイズ排除クロマトグラフィを行った。溶出液として１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６.０）を用いてＩＦＮα−ＰＥＧ連結体を精製し、ＰＥＧと結合していないインターフェロンアルファ、未反応ＰＥＧ、およびＰＥＧの両末端に２つのインターフェロンアルファが連結された二量体副産物を除去した。ＩＦＮα−ＰＥＧ連結体を免疫グロブリンＦｃのリジン残基のアミノ基部位に融合させるために精製されたＩＦＮα−ＰＥＧ連結体を約５ｍｇ／ｍＬの濃度で濃縮した後、実施例１の段階３および４と同一の方法でＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体を製造および精製した。これにより、反応性が最も良くて二量体などの副産物が少ないインターフェロンアルファ：ＰＥＧの最適反応モル比は１：２．５〜１：５であることを確認した。
【００８５】
一方、前記と同一の方法を行うが、両末端の反応基が全てＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（N-hydroxysuccinimidyl；ＮＨＳ）であるＰＥＧ（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ；Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社)、または両末端の反応基が全てブチルアルデヒド(buthyl aldehyde)であるＰＥＧ（ＢＵＡ−ＰＥＧ−ＢＵＡ；Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社）を用いてＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体の生成を確認した。
【００８６】
（実施例７）分子量の異なるＰＥＧを用いた蛋白質結合体の製造
両末端にアルデヒド反応基を持つ分子量１０ｋＤａのポリエチレングリコールＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社）を用いて実施例１の段階２と同一の方法でＩＦＮα−１０Ｋ ＰＥＧ連結体を製造および精製した。この際、反応性が最も良くて二量体などの副産物が少ないインターフェロンアルファ：１０Ｋ ＰＥＧの最適モル比は、１：２．５〜１：５であることが確認された。精製されたＩＦＮα−ＰＥＧ連結体を約５ｍｇ／ｍＬとなるように濃縮した後、これを用いて実施例１の段階３および４と同一の方法でＩＦＮα−１０Ｋ ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体を製造および精製した。
【００８７】
（実施例８）Ｆａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体の製造（−ＳＨ基）
（段階１）Ｆａｂ’の発現および精製
抗腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’を発現する大腸菌形質転換体ＢＬ２１／ｐｏＤＬＨＦ（寄託番号：ＫＣＣＭ−１０５１１）をＬＢ培地１００ｍＬに接種して一晩中振盪培養した後、５Ｌの発酵器（Ｍａｒｕｂｉｓｈｉ）に接種して温度３０℃、空気投入量２０ｖｖｍ、攪拌速度５００ｒｐｍの条件下で培養した。発酵が進むにつれて、微生物の成長のために足りないエネルギー源を補うために、葡萄糖(glucose)と酵母抽出液(yeast extract)とを微生物の発酵状態に応じて投与し、吸光度６００ｎｍでのＯＤ値が８０となる時期にＩＰＴＧを投与して蛋白質の発現を誘導した。これを４０〜４５時間高濃度で培養して吸光度６００ｎｍでのＯＤ値が１２０〜１４０となるようにした。得られた発酵液を遠心分離（２０，０００ｇ、３０分）して沈殿物は捨て、上澄み液のみを取った。
得られた上澄み液から次の３段階のカラムクロマトグラフィを経て抗腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’を純粋に精製した。２０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたＨｉＴｒａｐプロテインＧカラム（５ｍＬ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に前記上澄み液を滴下した後、１００ｍＭのグリシン（Glycine、ｐＨ３．０）緩衝液で溶出させた。溶出したＦａｂ’分画を１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Superdex 200, Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に滴下し、同一の緩衝液で溶出させた。溶出したＦａｂ’分画をｐｏｌｙＣＡＴ ２１×２５０カラム（ＰｏｌｙＬＣ社）を用いて最終精製したが、１０ｍＭの酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．５）を直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０．１５Ｍ→０．４Ｍ）方法で流して純粋な抗腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’分画を得た。
【００８８】
（段階２）Ｆｃ−ＰＥＧ連結体の製造および精製
免疫グロブリンＦｃのＮ末端のアミノ基にリンカーＰＥＧを結合させるために、前記実施例１の段階１と同一の方法で製造された免疫グロブリンＦｃを１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させ、ここにＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ（３．４ｋＤａ、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社）をＦｃ：ＰＥＧのモル比が１：１０となるように添加した後、４℃で徐々に攪拌しながら１２時間反応させた。
【００８９】
反応終了後、反応緩衝液を２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で交換しながら、反応していないＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬを除去した。緩衝液の交換後、反応物をｐｏｌｙＣＡＴカラム（ＰｏｌｙＬＣ社）に負荷し、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０．１５Ｍ→０．５Ｍ）方法で流して免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ連結体を先に溶出させて得た後、反応していない免疫グロブリンＦｃを溶出させて除去した。
【００９０】
（段階３）Ｆａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体（−ＳＨ基）の製造および精製
Ｆａｂ’の遊離システイン基に免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ連結体を結合させるために、段階１で精製されたＦａｂ’を１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）に２ｍｇ／ｍＬで溶解させた後、同一の緩衝液に段階２で準備された免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ連結体をＦａｂ’：連結体のモル比が１：５となるように入れた。最終蛋白質の濃度が５０ｍｇ／ｍＬとなるように濃縮し、４℃で徐々に攪拌しながら２４時間反応させた。
【００９１】
カップリング反応の終了後、反応液を１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Superdex 200、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に滴下し、同一の緩衝液を１ｍＬ／分の流速で流して溶出させた。カップリングされたＦａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体は、分子量が大きくて先に溶出し、反応していない免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ連結体およびＦａｂ’は後で溶出するため除去することができた。残存する未反応免疫グロブリンＦｃを完全に除去するために、溶出したＦａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体分画をさらにｐｏｌｙＣＡＴ ２１×２５０カラム（ＰｏｌｙＬＣ社）に滴下し、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いた直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０．１５Ｍ→０．５Ｍ）法で溶出し、Ｆｃ−ＰＥＧ連結体がＦａｂ’のＣ末端付近の−ＳＨ基に連結されたＦａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体を純粋に得た。
【００９２】
（実施例９）Ｆａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体の製造（Ｎ末端）
（段階１）Ｆａｂ’−ＰＥＧ連結体（Ｎ末端）の製造および精製
前記実施例８の段階１で得た、精製されたＦａｂ’４０ｍｇを１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させた後、ブチルＡＬＤ−ＰＥＧ−ブチルＡＬＤ（３．４ｋＤａ、Ｎｅｋｔａｒ社）をＦａｂ’：ＰＥＧのモル比が１：５となるように添加した。還元剤としてＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭとなるように添加した後、４℃で徐々に攪拌しがら２時間反応させた。
【００９３】
反応終了後、反応緩衝液を２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で交換した。緩衝液の交換後、反応物をｐｏｌｙＣＡＴカラム（ＰｏｌｙＬＣ社）に負荷し、２０ｍＭの酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．５）を用いた直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０．１５Ｍ→０．４Ｍ）法で溶出し、Ｆａｂ’のＮ末端にリンカーＰＥＧが結合したＦａｂ’−ＰＥＧ連結体分画を先に溶出させて得た後、反応していないＦａｂ’を溶出させて除去した。
【００９４】
（段階２）Ｆａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体の製造および精製
段階１で精製されたＦａｂ’−ＰＥＧ連結体を免疫グロブリンＦｃのＮ末端に結合させるために、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に１０ｍｇ／ｍＬで溶解させた後、同一の緩衝液に溶解された免疫グロブリンＦｃをＦａｂ’−ＰＥＧ連結体：Ｆｃのモル比が１：５となるように入れた。最終蛋白質の濃度が５０ｍｇ／ｍＬとなるように濃縮し、還元剤としてＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭとなるように添加した後、４℃で徐々に攪拌しながら２４時間反応させた。
【００９５】
カップリング反応の終了後、反応液を１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Superdex 200、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に滴下し、同一の緩衝液を１ｍＬ／分の流速で流して溶出させた。カップリングされたＦａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体は、分子量が大きくて先に溶出し、反応していない免疫グロブリンＦｃおよびＦａｂ’−ＰＥＧ連結体は後で溶出するため除去することができた。残存する未反応免疫グロブリンＦｃを完全に除去するために、溶出したＦａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体分画をさらにｐｏｌｙＣＡＴ ２１×２５０カラム（ＰｏｌｙＬＣ社）に負荷し、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いた直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０．１５Ｍ→０．５Ｍ）法で溶出し、免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ連結体がＦａｂ’のＮ末端に連結されたＦａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体を純粋に得た。
【００９６】
（実施例１０）脱糖鎖化免疫グロブリンＦｃの製造および精製
前記実施例１と同一の方法で製造した免疫グロブリンＦｃ２００ｍｇを１００ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した後、脱糖鎖化酵素ＰＮＧａｓｅ Ｆ（ＮＥＢ社）を３００Ｕ／ｍｇとなるように添加した。反応混合物を３７℃で２４時間徐々に攪拌しながら反応させた。反応終了後、脱糖鎖化免疫グロブリンＦｃを精製するために、反応物をＳＰセファロースＦＦカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に負荷し、１０ｍＭの酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．５）条件で１ＭのＮａＣｌを使用した直線濃度勾配（０．１Ｍ→０．６Ｍ）法で溶出させ、天然型免疫グロブリンＦｃ分画を先に溶出させた後、脱糖鎖化免疫グロブリンＦｃ（deglycosylated FC：ＤＧ Ｆｃ）を溶出させて得た。
【００９７】
（実施例１１）ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ結合体の製造
前記実施例１の段階２で精製されたＩＦＮα−ＰＥＧ連結体に、前記実施例１０で製造された脱糖鎖化免疫グロブリンＦｃを結合させるために、ＩＦＮα−ＰＥＧ連結体を１０ｍＭのリン酸塩緩衝液に溶解されたＤＧ ＦｃにＩＦＮα−ＰＥＧ連結体：ＤＧ Ｆｃのモル比がそれぞれ１：１、１：２、１：４および１：８となるように添加して反応させた。反応液を１００ｍＭのリン酸塩緩衝液に調製し、還元剤としてＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭとなるように添加した後、４℃で２０時間徐々に攪拌しながら反応させた。これにより、反応性が最も良くて二量体などの副産物が少ないＩＦＮα−ＰＥＧ連結体：ＤＧ Ｆｃの最適反応モル比は１：２であることを確認した。
【００９８】
結合反応後、未反応物質および副産物を除去し、生成されたＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ蛋白質結合体を精製するために、反応混合物を用いてＳｕｐｅｒｄｅｘ（SuperdexR、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）サイズ排除クロマトグラフィを行った。リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）を用いて流速２．５ｍＬ／分でカラムに通過させ、結合していないＤＧ Ｆｃおよび未反応物質を除去し、ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ蛋白質結合体分画を精製した。これから得られたＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ蛋白質結合体分画には、不純物として少量の未反応ＤＧ ＦｃおよびＩＦＮα−ＰＥＧ連結体が混在しているから、これを除去するためにさらに陽イオン交換樹脂クロマトグラフィを行った。ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ蛋白質結合体分画を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で平衡化させたＰｏｌｙＣＡＴ ＬＰカラム（ＰｏｌｙＬＣ社）に仕込み、１ＭのＮａＣｌを含んだ１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）を用いた直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０Ｍ→０．６Ｍ）法で溶出してさらに精製し、最後に陰イオン交換カラムを用いてＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ蛋白質結合体を純粋に獲得した。ＰｏｌｙＷＡＸ ＬＰカラム（ＰｏｌｙＬＣ社）を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化させた後、精製されたＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ蛋白質結合体分画を負荷し、１Ｍの塩化ナトリウムを含んだ１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０Ｍ→０．３Ｍ）法で溶出して純粋なＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ蛋白質結合体を精製した。
【００９９】
（実施例１２）組み換え非糖鎖化免疫グロブリンＦｃ誘導体の製造および精製
（ＩｇＧ４ Ｆｃ誘導体１発現ベクターの製造）
ヒト免疫グロブリンＩｇＧ４重鎖不変領域を製造するために、天然型ヒンジ領域でアミノ末端から９個のアミノ酸が除去された誘導体１（ＩｇＧ４ ｄｅｌｔａ−Ｃｙｓ）と、１２個のアミノ酸が全て除去されてヒンジ領域が欠失された誘導体２（ＩｇＧ４単量体）を製造した。大腸菌分泌配列を含んだ発現ベクターは、本発明者によって開発されたｐＴ１４Ｓ１ＳＨ−４Ｔ２０Ｖ２２Ｑ（大韓民国特許第３８０６１号）を使用した。
ヒト免疫グロブリンＩｇＧ４の重鎖不変領域を製作するために、ヒトの血液から収得した血球細胞のＲＮＡを鋳型として次のようなＲＴ−ＰＣＲを行った。Ｑｉａｍｐ ＲＮＡ ｂｌｏｏｄキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて約６ｍＬの血液から全体ＲＮＡを収得した後、このＲＮＡを鋳型として配列番号１および２、配列番号２と３のプライマー対を合成した後、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて遺伝子を増幅した。配列番号１は、下記ＩｇＧ４ヒンジ領域の１２個のアミノ酸配列のうち１０番目のアミノ酸配列であるセリンから始まる配列であり、配列番号３は、ＣＨ２ドメインの一番目のアミノ酸であるアラニンから始まるように設計されている。配列番号２は、終結コドンを含んだＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を挿入した。
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12
gag tcc aaa tat ggt ccc cca tgc cca tca tgc cca
ctc agg ttt ata cca ggg ggt acg ggt agt acg ggt
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
それぞれ増幅されたＩｇＧ４不変領域断片を、大腸菌分泌配列誘導体を用いた発現ベクターにクローニングするために、本発明者によって開発された発現ベクターｐＴ１４Ｓ１ＳＨ−４Ｔ２０Ｖ２２Ｑ（大韓民国特許第３８０６１号）を使用した。前記発現ベクターは、配列番号４で表わされる塩基配列を有する熱安定性エンテロトキシン分泌配列誘導体を含む。クローニングを容易にするために、ｐＴ１４Ｓ１ＳＨ−４Ｔ２０Ｖ２２Ｑプラスミドの熱安定性エンテロトキシン分泌配列誘導体に配列番号５および６のプライマー対を使用した部位特異的突然変異誘発(site-directed mutagenesis)を行い、分泌配列の最後の遺伝子配列にＳｔｕＩ制限酵素認識部位を挿入し、塩基配列分析法によって正確にＳｔｕＩ制限酵素認識部位が生成されたことを確認した。ｐＴ１４Ｓ１ＳＨ−４Ｔ２０Ｖ２２ＱプラスミドにＳｔｕＩ制限酵素認識部位が生成されたプラスミドをｐｍＳＴＩＩと命名した。前記のように製作されたプラスミドｐｍＳＴＩＩにＳｔｕＩ／ＢａｍＩＩ制限酵素を処理した後、アガロースゲルに電気泳動を行い、大腸菌熱安定性エンテロトキシ分泌配列誘導体を含む大きい断片（４．７ｋｂ）を回収した。前記増幅された遺伝子をＢａｍＨＩ制限酵素で処理した後発現ベクターに挿入してプラスミドｐＳＴＩＩｄＣＧ４ＦｃおよびｐＳＴＩＩＧ４Ｍｏを製作した。
【０１００】
前記製作された発現ベクターを発現宿主の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させて大腸菌形質転換体ＢＬ２１／ｐＳＴＩＩｄＣＧ４Ｆｃ（ＨＭ１０９３２）とＢＬ２１／ｐＳＴＩＩＧ４Ｍｏ（ＨＭ１０９３３）を得、これらを韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２００４年９月１５日付で寄託した（寄託番号：ＫＣＣＭ−１０５９７、ＫＣＣＭ−１０５９８）。以後、吸光度６００ｎｍでのＯＤ値が８０となる時期に誘導物質(inducer)ＩＰＴＧを投与して発現を誘導した。これを４０〜４５時間高濃度で培養して吸光度６００ｎｍでのＯＤ値が１００〜１２０となるようにした。発酵液から回収された大腸菌細胞を破砕して細胞溶血液(cell lysate)を得、細胞質内に存在する組み換え免疫グロブリン不変領域誘導体を２段階カラムクロマトグラフィによって精製した。
【０１０１】
プロテインＡ親和性カラム（protein A affinity column、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）５ｍＬをＰＢＳで平衡化した後、前記細胞溶血液を５ｍＬ／分の流速で負荷した。結合していない分画をＰＢＳで洗浄した後、１００ｍＭのクエン酸溶液（ｐＨ３．０）で溶出させた。溶出した分画を脱塩カラム（desalting column、ＨｉＰｒｅｐ ２６／１０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で交換した。その後、Ｑ ＨＰ ２６／１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）５０ｍＬを用いて２次陰イオン交換カラムクロマトグラフィを行い、１次精製された組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体分画を結合させた後、１０ｍＭのＴｒｉｓ条件（ｐＨ８．０）で直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０Ｍ→０．２Ｍ）法によって溶出し、組み換え非糖鎖化免疫グロブリンＦｃ（aglycosylated Fc：ＡＧ Ｆｃ）誘導体であるＩｇＧ４ ｄｅｌｔａ−ＣｙｓおよびＩｇＧ４単量体分画を高純度で得た。
【０１０２】
（実施例１３）ＩＦＮα−ＰＥＧ連結体と組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体の結合体の製造
前記実施例１および１１と同一の方法により、実施例１２で製造されたＡＧ Ｆｃ誘導体であるＩｇＧ４ ｄｅｌｔａ−ＣｙｓのＮ末端にＩＦＮα−ＰＥＧ連結体を結合させた。融合反応後、未反応物質および副産物を除去し、生成されたＩＦＮα−ＰＥＧ−ＡＧ Ｆｃ蛋白質結合体（Ｉ）を精製するために、Ｑ ＨＰ２６／１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）５０ｍＬを用いて１次精製した後、高圧カラムのｐｏｌｙＣＡＴ ２１．５×２５０カラム（ＰｏｌｙＬＣ社）で高純度の結合体を精製した。カップリング反応液を脱塩カラムＨｉＰｒｅｐ ２６／１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で交換した後、Ｑ ＨＰ ２６／１０ ５０ｍＬカラムに８ｍＬ／分の流速で負荷して結合させた後、直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０Ｍ→０．２Ｍ）法で所望の分画を得た。溶出した分画を１０ｍＭの酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．２）で平衡化されたｐｏｌｙＣＡＴ２１．５×２５０カラムに１５ｍＬ／分の流速でさらに結合させた後、直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０．１Ｍ→０．３Ｍ）法で溶出させて高純度の分画を得ることができた。同一の方法により、実施例１２で製造された別のＡＧ Ｆｃ誘導体であるＩｇＧ４単量体を用いてＩＦＮα−ＰＥＧ−ＡＧ Ｆｃ蛋白質結合体（ＩＩ）を製造した。
【０１０３】
（実施例１４）ヒト赤血球生成因子（ＥＰＯ）−ＰＥＧ−組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体の結合体の製造
前記実施例１３と同一の方法により、ＥＰＯ−ＰＥＧ連結体とＡＧ Ｆｃ誘導体であるＩｇＧ４ ｄｅｌｔａ−Ｃｙｓとが連結された結合体を製造した。
【０１０４】
（比較例１）ＩＦＮα−４０Ｋ ＰＥＧ連結体の製造
１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にインターフェロンアルファ５ｍｇを溶解して最終体積が５ｍＬとなるように調製した後、ＰＥＧの分子量４０ｋＤａの活性化メトキシ−ＰＥＧ−アルデヒド（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社）をインターフェロンアルファ：４０Ｋ ＰＥＧのモル比が１：４となるように前記溶液に添加した。前記反応溶液に還元剤ＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭとなるように添加した後、４℃で１８時間徐々に攪拌させながら反応させた。インターフェロンアルファに反応していないＰＥＧを不活性化させるために、エタノールアミンを最終濃度が５０ｍＭとなるように添加した。
【０１０５】
未反応ＰＥＧの分離および緩衝液の交替のためにＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いた。まず、２カラム体積（column volume；ＣＶ）の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化させた後、反応混合物を滴下し、波長２６０ｎｍで紫外部吸光計によって吸光度を検出した。前記カラムを同一の緩衝液で溶出させると、大きさが更に大きいＰＥＧでによって（Ｎ末端に:挿入ＫＹＭ）修飾されたインターフェロンアルファが先に溶出し、未反応ＰＥＧは時差をおいて後で溶出するため、ＩＦＮα−４０Ｋ ＰＥＧのみを分離することができる。
【０１０６】
前記で得た溶出液からＩＦＮα−４０Ｋ ＰＥＧ連結体をさらに純粋に分離、精製するために、次のようにクロマトグラフィを行った。３ｍＬのＰｏｌｙＷＡＸ ＬＰカラム（Ｐｏｌｙｗａｘ社）を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化させた。ＰＥＧ−ＩＦＮα連結体を含有する溶出液を１ｍＬ／分の流速でカラムに付加した後、１５ｍＬの平衡緩衝液で洗浄した。３０ｍＬの１Ｍ ＮａＣｌ緩衝液で３０分間０〜１００％の塩濃度勾配方法を用いてトリ−、ジ−およびモノ−ＰＥＧが結合したインターフェロンアルファを順序とおりに溶出させた。
【０１０７】
さらに純粋なモノ−ＰＥＧ結合インターフェロンアルファを分離するために、前記で収得したモノ−ＰＥＧとインターフェロンアルファの連結体溶出分画をもってサイズ排除クロマトグラフィを行った。１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（Superdex 200、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に前記溶出液を濃縮して滴下した後、同一の緩衝液で溶出させた。この際、１ｍＬ／分の流速で緩衝液を流した。トリ−およびジ−ＰＥＧが結合したインターフェロンアルファは、モノ−ＰＥＧが結合したインターフェロンアルファより溶出時間が相対的に早いので、これを除去して、モノ−ＰＥＧが結合したインターフェロンアルファのみを純粋に分離した。
【０１０８】
同一の方法により、ヒト成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子およびその誘導体のアミノ末端に４０Ｋ ＰＥＧが結合したｈＧＨ−４０Ｋ ＰＥＧ、Ｇ−ＣＳＦ−４０Ｋ ＰＥＧおよび４０Ｋ ＰＥＧ−１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体の連結体を製造した。
【０１０９】
（比較例２）ＩＦＮα−ＰＥＧ−アルブミン結合体の製造
実施例１の段階２で精製されたＩＦＮαＦ−ＰＥＧ連結体をアルブミンのアミノ末端に結合させるために、１０ｍＭのリン酸塩緩衝液に溶解されたヒトアルブミン（human serum albumin、ＨＳＡ、約６７ｋＤａ、緑十字）をＩＦＮα−ＰＥＧ連結体：アルブミンのモル比が１：１、１：２、１：４および１：８となるように添加した後、反応させた。反応液を１００ｍＭのリン酸塩緩衝液状態に作り、還元剤としてＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭとなるように添加した後、４℃で２０時間徐々に攪拌しながら反応させた。これより、反応性が最も良くて二量体などの副産物が少ないＩＦＮα−ＰＥＧ連結体：アルブミンの最適反応モル比は１：２であることを確認した。
【０１１０】
結合反応の後、未反応物質および副産物を除去し、生成されたＩＦＮα−ＰＥＧ−アルブミン蛋白質結合体を精製するために、Ｓｕｐｅｒｄｅｘサイズ排除クロマトグラフィを行った。各反応混合物を濃縮した後、１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液を２．５ｍＬ／分の流速でカラムに通過させ、結合していないアルブミンおよび未反応物質を除去し、ＩＦＮα−ＰＥＧ−アルブミン蛋白質結合体のみを精製した。得られたＩＦＮα−ＰＥＧ−アルブミン蛋白質結合体分画には、不純物として少量の未反応アルブミンおよびインターフェロンアルファ二量体が混ぜられているので、これを除去するためにさらに陽イオン交換樹脂クロマトグラフィを行った。ＩＦＮα−ＰＥＧ−アルブミン蛋白質結合体分画を１０ｍＭの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．５）で平衡化させたカラム（ＳＰ５ＰＷ、Ｗａｔｅｒｓ社）に仕込み、１Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含んだ１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）を用いた直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０Ｍ→０．５Ｍ）法で溶出してさらに精製し、ＩＦＮα−ＰＥＧ−アルブミン蛋白質結合体を純粋に獲得した。
【０１１１】
同一の方法により、ヒト成長ホルモン、Ｇ−ＣＳＦおよびその誘導体にそれぞれアルブミンが結合したｈＧＨ−ＰＥＧ−アルブミン、Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−アルブミンおよび１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−アルブミン結合体を製造した。
【０１１２】
（比較例３）Ｆａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体の製造
実施例８の段階１で精製されたＦａｂ’に存在する遊離システイン基を活性化させるために、活性化緩衝液（２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、０．２ｍＭのＤＴＴ）に１時間放置した。ＰＥＧ修飾緩衝液である５０Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ６．５）で緩衝液を交換した後、マレイミド−ＰＥＧ（分子量４０ｋＤａ、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社）をＦａｂ’：４０Ｋ ＰＥＧのモル比が１：１０となるように添加した後、４℃で徐々に攪拌しながら２４時間反応させた。
【０１１３】
反応終了後、反応液を１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Superdex 200、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に滴下し、同一の緩衝液を１ｍＬ／分の流速で流して溶出させた。４０Ｋ ＰＥＧが修飾されたＦａｂ’−４０Ｋ ＰＥＧ連結体は、分子量が大きくて、反応していないＦａｂ’より早く溶出し、Ｆａｂ’は後で溶出するため除去することができた。完全に除去されていないＦａｂ’を除去するために、溶出したＦａｂ’−４０Ｋ ＰＥＧ連結体分画をｐｏｌｙＣＡＴ ２１×２５０カラム（ＰｏｌｙＬＣ社）を用いて最終精製した。２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）を用いた直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０．１５Ｍ→０．５Ｍ）法で溶出し、Ｆａｂ’の−ＳＨ基に４０Ｋ ＰＥＧが連結されたＦａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体を純粋に得た。
【０１１４】
（実験例１）蛋白質結合体の確認および定量
（１−１）蛋白質結合体の確認
前記実施例で製造した蛋白質結合体は、４〜２０％の濃度勾配ゲルおよび１２％のゲルを用いた非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ社）法で確認した。
【０１１５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果、図３に示すように、生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体であるＰＥＧおよび免疫グロブリンＦｃ領域のカップリング反応によってＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体（Ａ）、１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体（Ｂ）およびＥＰＯ−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体（Ｃ）が生成されたことを確認した。
また、前記実施例１０で製造したＤＧ Ｆｃを確認するために非還元性１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果、図６ｂに示すように、天然型Ｆｃに比べて除去された糖鎖分子量だけ減少した位置でＤＧ Ｆｃバンドが検出された。
【０１１６】
（１−２）蛋白質結合体の定量
前記実施例で製造したそれぞれの蛋白質結合体の量は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ２６／６０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）と１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を溶出液として用いるサイズ排除クロマトグラフィ上でピーク面積を対照区と比較して換算する方法によって計算した。既に定量されているＩＦＮα、ｈＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯおよびＦｃでそれぞれサイズ排除クロマトグラフィを行った後、濃度とピーク面積間の換算係数を測定した。各蛋白質結合体の一定量を使用して同一のサイズ排除クロマトグラフィを行い、ここから得られたピーク面積から免疫グロブリンＦｃ領域に該当するピーク面積を差し引いた値を、各蛋白質結合体に存在する生理活性蛋白質の定量値として決定した。図４は精製されたＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体のサイズ排除クロマトグラフィカラム分析結果を示すもので、二量体以上の多量体不純物がない単一ピークを確認した。
【０１１７】
Ｆｃが生理活性ポリペプチドに結合すると、生理活性ポリペプチドの抗体でその量を定量するとき、抗体と前記ポリペプチドとの結合が阻害され、クロマトグラフィによって計算される実際値より少なく定量される。ＥＬＩＳＡ分析結果、ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃの場合には、ＥＬＩＳＡによって測定された値が大略実際値の約３０％程度であると確認された。
【０１１８】
（１−３）蛋白質結合体の純度および質量確認
それぞれの実施例で得た蛋白質結合体に対してサイズ排除クロマトグラフィを行った後、２８０ｎｍの吸光度を測定した。ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ、ｈＧＨ−ＰＥＧ−Ｆｃ、Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−Ｆｃおよび１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−Ｆｃは、分子量７０〜８０ｋＤａの物質の滞留時間帯で単一ピークを示した。
一方、実施例１、１１および１３で獲得した蛋白質結合体ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ、ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ ＦｃおよびＩＦＮα−ＰＥＧ−組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体試料の純度を分析するために、逆相ＨＰＬＣを行った。逆相カラム（Ｖｙｄａｃ社、２５９ ＶＨＰ５４カラム）を用いて分析し、０．５％ＴＦＡの存在下のアセトニトリル溶媒を用いた濃度勾配（４０〜１００％）法によって溶出した。純度は、２８０ｎｍの吸収を測定することによって解析された。その結果、図８から分かるように、結合していないインターフェロンまたは免疫グロブリンＦｃは存在しておらず、ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体（Ａ）、ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ結合体（Ｂ）およびＩＦＮα−ＰＥＧ−組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体結合体（Ｃ）のいずれも９６％以上の純度で純粋に精製された。
【０１１９】
各精製された試料の正確な分子量を確認するために、各試料の質量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ−ＳＴＲ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）超高速質量分析器を用いて分析した。マトリックスとしてはシナピン酸(sinapinic acid)を使用し、それぞれの試験用試料０．５μＬを試料スライドに塗布して自然乾燥させた後、同量のマトリックス溶液を添加し、その後さらに自然乾燥させてイオン源(ion source)に導入した。検出はポジティブ方式でリニアモードＴＯＦ方式の装置を用いて行った。イオンは、遅延したイオン抽出（ＤＥ）を用いる分割抽出供給源で、遅延した抽出時間を７５０ｎｓｅｃ／１５００ｎｓｅｃとして、約２．５ｋＶの全体電位差によって加速化した。
下記表１は前記実施例で得たそれぞれのＦｃ蛋白質結合体のＭＬＡＤＩ−ＴＯＦ質量分析結果を数値化して示したもので、図５はＥＰＯ−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体、図７はＩＦＮα−ＰＥＧ−ＦｃおよびＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ結合体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析結果を示したものである。その結果、収得されたＥＰＯ−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体の純度は９５％以上であり、理論値と非常に近い分子量を示した。また、免疫グロブリンＦｃ領域に赤血球生成因子（ＥＰＯ）が１：１で結合した形態であると確認された。
【０１２０】
【表１】
2007536211.tif 000003
【０１２１】
また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により、実施例１０で製造されたＦｃおよびＤＧ Ｆｃの分子量を測定した結果、ＤＧ Ｆｃの分子量は天然型Ｆｃより３ｋＤａ程度小さい５０ｋＤａと確認された（図６ａ）。減少した３ｋＤａは理論的糖鎖サイズに該当する分子量であって、糖鎖が完全に除去されたことを確認することができた。
下記表２は、前記実施例１１で製造されたＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ結合体と、実施例１３で製造されたＩＦＮα−ＰＥＧ−組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体結合体（ＩおよびＩＩ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析結果を示したものである。ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体の分子量（７５．９ｋＤａ）と比較したとき、ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ結合体は約３ｋＤａ程度小さい分子量を示し、ＩＦＮα−ＰＥＧ−組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体結合体（Ｉ）は約３〜４ｋＤａ程度小さい分子量を示した。Ｆｃ単量体に連結されたＩＦＮα−ＰＥＧ−組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体結合体（ＩＩ）は、Ｆｃ単量体分子量に該当する２４．５ｋＤａが減少した分子量を示した。
【０１２２】
【表２】
2007536211.tif 000004
【０１２３】
（実験例２）薬物動態学的な調査Ｉ
各群当たり５匹のＳＤラットにおいて、天然型生理活性蛋白質（対照群）と前記実施例および比較例で製造した−４０Ｋ ＰＥＧ連結体、−ＰＥＧ−アルブミン結合体、−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体、−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ結合体、および−ＰＥＧ−組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体結合体の血液内安定性および薬物動態学的係数(pharmacokinetic parameters)を比較した。対照群および−４０Ｋ ＰＥＧ連結体、−ＰＥＧ−アルブミン結合体、−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体、−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ結合体、および−ＰＥＧ−組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体結合体（試験群）を各１００μｇ／ｋｇずつ皮下注射した後、対照群は注射してから０．５．１、２、４、６、１２、２４、３０、４８、７２および９６時間後に採血し、試験群は注射してから１、６、１２、２４、３０、４８、７２、９６、１２０、２４０および２８８時間後に採血した。ヘパリンを含有するチューブに血液試料を集めて凝固を防止し、エッペンドルフ高速マイクロ遠心分離機で５分間遠心分離して細胞を除去した。血漿内の蛋白質量は、各生理活性蛋白質に対する抗体を用いてＥＬＩＳＡ方法によって測定した。
【０１２４】
ＩＦＮα、ｈＧＨ、Ｇ−ＣＳＦまたはＥＰＯの天然型蛋白質、これらの−４０Ｋ ＰＥＧ連結体、−ＰＥＧ−アルブミン結合体、−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体、および−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ結合体の薬物動態の分析結果を下記表３〜表７に示した。下記表において、Ｔｍａｘは最高薬物濃度に到達する時間を、Ｔ１／２は薬物の血中半減期を、ＭＲＴ(mean residence time)は薬物分子の平均的な体内滞留時間をそれぞれ意味する。
【０１２５】
【表３】
2007536211.tif 000005
【０１２６】
【表４】
2007536211.tif 000006
【０１２７】
【表５】
2007536211.tif 000007
【０１２８】
【表６】
2007536211.tif 000008
【０１２９】
【表７】
2007536211.tif 000009
【０１３０】
前記表３および図９の薬物動態グラフから分かるように、ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体の場合、血中半減期は９０．４時間であって天然型に比べて約５０倍増加した。これは比較例１で製造したＩＦＮα−４０Ｋ ＰＥＧの半減期である３５．８時間より約２．５倍増加したものである。また、ＩＦＮα−ＰＥＧ−アルブミンの半減期である１７．１時間に比べても、本発明のＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体が著しく優れた血中半減期を示すことを確認した。
【０１３１】
一方、表３および図１１に示すように、ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ結合体の場合には、血中半減期が７１．０時間であって、ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体とほぼ同等なので、糖鎖がなくても生体内安定性には大きい影響がなく、組み換え方法で生産された組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体を用いた結合体も天然型由来のＤＧ Ｆｃと同一の効果を示すことを確認した。ところが、Ｆｃ単量体を使用した結合体の場合には、正常的なＦｃ二量体の結合体と比較したとき、約半分に減少した血中半減期を示した。
【０１３２】
ヒト成長ホルモンの場合も、表４に示すように、本発明の蛋白質結合体が示す血中半減期の増加効果を確認することができる。すなわち、天然型（１．１時間）に比べてｈＧＨ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体およびｈＧＨ−ＰＥＧ−アルブミン結合体の半減期が７．７時間および５．９時間と多少増加した反面、本発明のｈＧＨ−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体の場合には血中半減期が１１．８時間と画期的に増加した。
【０１３３】
表５および表６における顆粒球コロニー刺激因子とその誘導体に対する薬物動態の分析結果においても、天然型、−４０Ｋ ＰＥＧ連結体および−ＰＥＧ−アルブミン結合体に比べて本発明のＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−Ｆｃおよび１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体が一層長い血中半減期を示した。蛋白質の血中持続性を増加させる免疫グロブリンＦｃ領域の効果は、天然型生理活性蛋白質だけでなく、一部のアミノ酸を変形させた誘導体においても天然型とほぼ同一の程度であることを確認することができ、このような結果より、本発明の方法が他の蛋白質の誘導体においても類似の効果を示すことを容易に予想することができる。
【０１３４】
表７および図１０に示すように、糖鎖化されている天然型蛋白質としての赤血球生成因子に対しても本発明の蛋白質結合体の血中半減期増加効果が確認された。すなわち、天然型赤血球生成因子の血中半減期が９．４時間であり、ＥＰＯを高糖鎖化させて血中安定性を高めたダーベポエチン−α（Darbepoetin-α、Ａｒａｎｅｓｐ、Ａｍｇｅｎ社）の場合は半減期が１８．４時間と増加することが分かる。赤血球生成因子に免疫グロブリンＦｃ領域を結合させた本発明のＥＰＯ−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体の場合には、血中半減期がおおよそ６１．５時間と画期的に増加し、糖鎖が除去された大腸菌由来の組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体を使用した結合体の場合には８７．９時間まで半減期の増加を示し、糖鎖が除去されても、血中安定性には影響を及ぼすことなく、抗体機能がない結合体を製造することができることを確認した。
【０１３５】
前記結果から分かるように、本発明によって免疫グロブリンＦｃ領域および非ペプチド性重合体と共有結合した蛋白質結合体は、天然型蛋白質に比べて数倍〜数十倍以上増加した血中半減期を示した。また、免疫グロブリンＦｃを遺伝子組み換え法によって大腸菌で生産し、あるいは酵素処理によって糖鎖を除去しても、これを用いて製造された蛋白質結合体における血中半減期の増加効果はほぼ同様に維持された。
【０１３６】
特に、既存の蛋白質血中持続性を増加させるためのＰＥＧ剤形のうち持続性が最も高い４０ｋＤａ ＰＥＧを修飾した蛋白質との比較においても、免疫グロブリンＦｃ蛋白質結合体が著しく高い血中安定性を示した。また、免疫グロブリンＦｃの代わりにアルブミンを結合させた蛋白質結合体との比較試験においても、本発明の蛋白質結合体が、卓越した血中安定性を示すことから、本発明の蛋白質結合体が持続型蛋白質薬物製剤の開発に効果的であることを確認することができた。点突然変異(point mutation)によるコロニー刺激因子誘導体まで広範囲な範囲の蛋白質において従来のＰＥＧ結合蛋白質またはアルブミン蛋白質結合体より卓越した血中安定性と平均滞留時間（ＭＲＴ）を示す結果からみて、本発明の蛋白質結合体による安定性および持続性増加効果は他の生理活性ポリペプチドにも適用可能であることが分かる。
【０１３７】
一方、非ペプチド性重合体として１０ｋＤａ ＰＥＧを使用したＩＦＮα−１０Ｋ ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体（実施例７）を用いて前記と同一の方法で血中半減期を測定したとき、血中半減期は４８．８時間であって、分子量３．４ｋＤａのＰＥＧを使用した蛋白質結合体の血中半減期である７９．７時間より多少減少した。
【０１３８】
また、非ペプチド性重合体ＰＥＧの分子量の増加に伴って血中半減期はむしろ多少減少したが、このような結果から、蛋白質結合体の血中安定性および持続性の増加の主な要因が非ペプチド性重合体の分子量よりは結合した免疫グロブリンＦｃ領域による効果であることが確認できる。
【０１３９】
ＰＥＧの反応基をアルデヒド反応基以外の反応基に変化させた場合でも、見掛け分子量と血中半減期が、アルデヒド反応基を持つＰＥＧを使用した場合と類似の様相を示した。
【０１４０】
（実験例３）薬物動態学的な調査ＩＩ
実施例８および９で製造されたＦａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ、Ｆａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体および比較例３で製造されたＦａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体の血中半減期を測定するために、Ｆａｂ’を対照群として前記結合体または連結体を用いて実験例２と同一の方法で薬物動態学的な調査を行い、その結果を図１２に示した。
【０１４１】
図１２より、Ｆａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−ＦｃおよびＦａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体が、Ｆａｂ’またはＦａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体に比べて２〜３倍延長された血中半減期を示すことが分かる。
【０１４２】
（実験例４）細胞内活性の測定
（４−１）インターフェロンアルファ蛋白質結合体の細胞内活性比較
インターフェロンアルファ蛋白質結合体の細胞内活性比較のために、ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ（実施例１）、ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ（実施例１１）、ＩＦＮα−ＰＥＧ−組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体（実施例１３）、ＩＦＮα−４０Ｋ ＰＥＧ（比較例１）およびＩＦＮα−ＰＥＧ−アルブミン（比較例２）の抗ウイルス活性を水泡性口内炎ウイルスで飽和させたＭＤＢＫ（Madin Darby Bovine Kidney、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２）を使用する細胞培養生検で測定した。この際、ＰＥＧが結合していないインターフェロンアルファ−２ｂ（ＮＩＢＳＣ国際標準品）を標準物質として使用した。
【０１４３】
ＭＤＢＫ細胞を、ＭＥＭ（minimum essential medium：ＪＢＩ社）に１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンが添加された培地で３７℃、５％ＣＯ-２の条件で培養した。測定しようとする試料および標準物質を一定の濃度で細胞培養培地に希釈して９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬずつ分注した。前記で培養された細胞を回収し、試料が分注されているプレートに１００μＬずつ加えた後、３７℃、５％ＣＯ２の条件で約１時間程度培養した。１時間後、ウイルスの濃度が５〜７×１０３ＰＦＵとなるように調節されたＶＳＶ(Vesilculer stomatitis virus)を５０μＬずつプレートに添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で約１６〜２０時間さらに培養した。試料および標準物質を入れないで細胞とウイルスのみを入れたウェルを陰性対照群として使用し、ウイルス希釈溶液を入れないで細胞のみを入れたウェルを陽性対照群として使用した。
【０１４４】
培養液を除去し、生きている細胞を染色するために、ニュートラルレッド(neutral red)溶液を１００μＬずつ添加した後、３７℃、５％ＣＯ２の条件で２時間培養した。上澄み液を除去した後、１００％のエタノールと１％の酢酸を１：１と混ぜて１００μＬずつ入れた。染色された細胞をよく振って溶解させた後、５４０ｎｍで吸光度を測定した。陰性対照群をブランク(blanｋ)とし、陽性対照群を細胞成長１００％と見なして５０％細胞成長時の濃度（ＥＤ５０-）を計算した。
【０１４５】
【表８】
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【０１４６】
その結果、表８に示すように、ＩＦＮα−４０Ｋ ＰＥＧは、その活性度が天然型の４．８％水準に低下することが確認できる。特に、修飾されたＰＥＧの大きさが大きいほど、血中安定性は増加し、相対的に活性度は徐々に減少したが、インターフェロンアルファの場合、１２ｋＤａ ＰＥＧが修飾された場合には２５％、４０ｋＤａ ＰＥＧが修飾された場合には約７％程度の試験管内活性を持つと報告されたことがある（P. Bailon et al., Bioconjugate Chem. 12: 195-202, 2001）。すなわち、ＰＥＧの分子量が増加すると、血中半減期は長くなるが、相対的に活性は急激に減少するので、血中半減期が長いながら活性も優れた蛋白質結合体の開発が要求されている。また、ＩＦＮα−ＰＥＧ−アルブミン結合体も天然型に比べて約５．２％程度と低い活性を示したが、本発明のＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体およびＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ結合体は、天然型に比べて相対的活性度が２８．１％および２５．７％と画期的に高くなることを確認することができ、組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体を使用した結合体においても類似の活性増加効果を示した。このような結果から、血中半減期の画期的増加に伴ってインターフェロンアルファと免疫グロブリンＦｃ領域の結合体の生体内薬効が非常に優れるものと期待される。
【０１４７】
（４−２）ヒト成長ホルモン蛋白質結合体の細胞内活性比較
ヒト成長ホルモン蛋白質結合体の細胞内活性を比較するために、ｈＧＨ−ＰＥＧ−Ｆｃ、ｈＧＨ−４０Ｋ ＰＥＧおよびｈＧＨ−ＰＥＧ−アルブミンの細胞内活性を比較試験した。
【０１４８】
ヒト成長ホルモン依存的に分裂を行う細胞としてのラット結節リンパ腫(rat node lymphoma)細胞株であるＮｂ２細胞（European Collection of Cell Cultures (ECACC) 97041101）を用いて細胞内活性度を試験管内の分析によって確認した。
【０１４９】
Ｎｂ２細胞を、培養液（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）に１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ、fetal bovine serum）、０．０７５％のＮａＣＯ３、０．０５ｍＭの２−メルカプトエタノールおよび２ｍＭのグルタミンを添加した培地で培養した後、１０％の牛胎児血清を除いた同一の培地で２４時間さらに培養した。培養液で培養された細胞の数を数えて約２×１０４個の細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに入れた後、ｈＧＨ−ＰＥＧ−Ｆｃ、ｈＧＨ−４０Ｋ ＰＥＧ、ｈＧＨ−ＰＥＧ−アルブミン、対照群である国際標準品（National Institute for Biological Standards and Controls、ＮＩＢＳＣ）および天然型ヒト成長ホルモン（ＨＭ−ｈＧＨ）をそれぞれ希釈して濃度別に添加した。その後、３７℃、ＣＯ２の培養器で４８時間培養した。その後、細胞の成長程度（各ウェルの細胞数）を測定するために、細胞染色薬（Cell Titer 96 Aqueous One Solution、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を各ウェルに２５μＬずつ入れた後、４時間培養した。その後、４９０ｎｍで吸光度を測定して各試料の力価を計算し、その結果を下記表９に示した。
【０１５０】
【表９】
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【０１５１】
表９から分かるように、ヒト成長ホルモンの場合も、ｈＧＨ−４０Ｋ ＰＥＧの活性度は天然型の約７．６％と低下し、ｈＧＨ−ＰＥＧ−アルブミン結合体の試験管内活性は天然型に比べて約５．２％程度と低い活性を示した。ところが、本発明のｈＧＨ−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体は、相対的活性度が天然型に比べて２８％以上画期的に増加した。このような結果より、血中半減期の画期的増加に伴ってヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域の蛋白質結合体の生体内薬効が非常に優れるものと期待することができる。また、本発明の免疫グロブリンＦｃ蛋白質結合体の活性増加は、免疫グロブリンＦｃによる血中安定性の増加および受容体との結合力保存、または非ペプチド性重合体によって形成された空間的余裕によるものと把握される。このような作用は、他の生理活性蛋白質の免疫グロブリンＦｃ蛋白質結合体においても類似であるものと期待される。
【０１５２】
（４−３）顆粒球コロニー刺激因子蛋白質結合体の細胞内活性比較
顆粒球コロニー刺激因子誘導体の蛋白質結合体の細胞内活性を比較するために、天然型Ｇ−ＣＳＦ（Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ、第一薬品（株））、１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体、２０Ｋ ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｌａｓｔａ社）、４０Ｋ ＰＥＧ−１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ、１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−アルブミンおよび１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−Ｆｃの細胞内活性を測定した。
【０１５３】
まず、ヒト骨髄由来の細胞株であるＨＬ−６０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０、Promyelocytic leukemia patient/36 yr old Caucasian female）を１０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０倍地で培養してから、細胞の数を約２．２×１０５細胞／ｍＬとなるように調整した後、ＤＭＳＯ（dimethylsulfoxide、ｃｕｌｔｕｒｅ ｇｒａｄｅ、Ｓｉｇｍａ社）を最終１．２５％（ｖ／ｖ）となるように添加した。前記の細胞株を９６ウェルプレート(Corning/low evaporation 96 well plate)に９０μＬずつ入れてウェル当たり細胞が約２×１０４個となるようにした後、５％のＣＯ２が供給される３７℃の培養器で約７２時間培養した。
【０１５４】
Ｇ−ＣＳＦ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、濃度が決定された各試料を同一の濃度となるようにＲＰＭＩ１６４０で希釈し、最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるようにし、これをさらにＲＰＭＩ１６４０で１／２に希釈することを１９回繰り返し行った。こうして作られた試料を培養中のＨＬ−６０細胞株の各ウェルに１０μＬずつ加え、最終濃度が１μｇ／ｍＬから連続的に半減するようにした。前記で製造した蛋白質試料を処理した細胞株は、３７℃の培養器で７２時間をさらに培養した。
【０１５５】
培養後、細胞株の増加程度を調べるために、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ＴＭ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ４１００、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて分析し、増加した細胞株の数は、６７０ｎｍ波長における吸光度を測定することによって決定した。
【０１５６】
【表１０】
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【０１５７】
その結果、表１０から分かるように、Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸を置換させた１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体の免疫グロブリンＦｃ蛋白質結合体も天然型蛋白質の蛋白質結合体と類似の効果を示した。１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧの場合には、ＰＥＧで修飾されていないものに比べて、血中半減期は増加するが活性度は低下すると既に報告されたことがある（大韓民国特許公開第２００４−８３２６８号）。特に、修飾されたＰＥＧの大きさが大きいほど、血中安定性は増加するが、相対的に活性度は徐々に低下することが分かり、１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ−４０Ｋ ＰＥＧは天然型に比べて約１０％以下の非常に低い活性度を示した。すなわち、ＰＥＧの分子量が増加すると、血中半減期は長くなるが相対的に活性は急激に減少するので、血中半減期が長くて活性も優れた蛋白質結合体の開発が要求されている。１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−アルブミンも天然型に比べて約２３％程度と低い活性を示したが、１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−Ｆｃは天然型に比べて相対的活性度が５１％以上と高くなることを確認することができた。これにより、血中半減期の画期的増加に伴って免疫グロブリンＦｃ領域と１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体の結合体の生体内薬効が非常に優れるものと期待することができる。
【０１５８】
（４−４）Ｆａｂ’結合体の細胞毒性中和試験
実施例８および９で製造されたＦａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ、Ｆａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体、および比較例３で製造されたＦａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体の試験管内活性実験を行った。マウス繊維亜細胞株Ｌ９２９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２１４８）を用いてＴＮＦαの細胞毒性を測定する実験を基本骨格として、Ｆａｂ’がＴＮＦαの細胞壊死活性をどれくらい中和させるかを測定した。
【０１５９】
Ｆａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ、Ｆａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体およびＦａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体をそれぞれ２倍ずつ順次希釈して９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬずつ分注した後、ｒｈＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）およびＲＮＡ合成の阻害剤として用いられるアクチノマイシンＤ（actinomycin D、Ｓｉｇｍａ社）をそれぞれ最終濃度が１０ｎｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間反応させた後、分析用マイクロプレートに移した。プレートの各ウェルにＬ９２９細胞株を５×１０４個／５０μＬ培地となるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２の培養器で２４時間培養した。マイクロプレート内の培養液を除去した後、ＰＢＳに５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶けているＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ社）を５０μＬずつ入れた。約４時間３７℃、５％ＣＯ２の培養器で培養した。１５０μＬのＤＭＳＯを添加して溶かした後、５４０ｎｍで吸光度を測定して細胞毒性中和の度合いを確認した。対照群としては、実施例８の段階１で精製したＦａｂ’を使用した。
【０１６０】
その結果、図１３に示すように、実験に使用した全ての蛋白質結合体は、Ｆａｂ’と類似の力価を示しており、このような結果から、Ｆａｂ’のＮ末端またはＣ末端近くの遊離システイン残基にＰＥＧを介して免疫グロブリンＦｃを結合させた蛋白質結合体は、Ｆａｂ’の血中半減期を画期的に増加させることは勿論のこと、生体内活性度も高く維持させることが分かる。
【０１６１】
（４−５）ＣＤＣ活性の測定
-  前記実施例で製造した誘導体と大腸菌形質転換体から発現されて精製された免疫グロブリン不変領域蛋白質とがヒトＣｌｑに結合するか否かを確認するために、下記のように固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）を行った。実験群として、韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２００４年９月１５日付で寄託した形質転換体ＨＭ１０９３２（寄託番号：ＫＣＣＭ−１０５９７）およびＨＭ１０９２７（寄託番号：ＫＣＣＭ−１０５８８）から生産された免疫グロブリン不変領域試料と前記実施例で製造した誘導体を使用し、比較群として、糖が結合している免疫グロブリン（ＩＶＩＧ−グロブリンＳ、緑十字ＰＢＭ）を始めとして、商業化されて治療用抗体として使われているいろいろの抗体を使用した。前記実験群と比較群の試料を１０ｍＭのカーボネート緩衝液（ｐＨ９．６）に１μｇ／ｍＬの濃度で調製した。準備された試料を９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）にウェル当たり２００ｎｇの量で分注した後、４℃で一晩中コートし、その後ウェルプレートをＰＢＳ−Ｔ溶液（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．０５％のツイン２０）で３回洗浄した。牛血清アルブミンを１％の濃度でＰＢＳ−Ｔ溶液に溶解させて準備したブロッキング(blocking)緩衝液２５０μＬを各ウェルに添加した後、常温で１時間放置し、同一のＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。標準液と試料を適切な濃度でＰＢＳ−Ｔ溶液によって希釈した後、抗体がコートされたウェルに加えて常温で１時間放置させて反応させ、その後さらにＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。遮断反応が完了したプレートに２μｇ／ｍＬのＣｌｑ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）を添加した後、２時間常温で反応させ、反応済みのプレートを前記ＰＢＳ−Ｔ溶液で６回洗浄した。ヒトの抗ヒトＣｌｑ抗体とペルオキシダーゼとの結合体（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社、米国）を遮断緩衝溶液に１０００：１で希釈して各ウェルに２００μＬずつ加えた後、１時間常温で反応させた。反応が完了した後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した後、発色溶液ＡとＢ（カラーＡ−安定化ペルオキシダーゼ[Color A-Stabilized peroxide]溶液およびカラーＢ−安定化クロモゲン[Color B-stabilized chromogen]溶液、ＤＹ９９９、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）を同量で混合し、当該混合液を各ウェルに２００μＬずつ添加し、３０分間放置した。その後、反応停止溶液である２Ｍの硫酸を５０μＬずつ添加して反応を停止させた。反応済みのウェルプレートは、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社）を用い、標準液と検液の４５０ｎｍの波長の吸光度を測定し、その結果を図１４、図１５にそれぞれ示した。
【０１６２】
免疫グロブリンのＦｃ領域における補体活性をサブクラスによって比較した結果、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）、ＩｇＧ２（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）、ＩｇＧ４（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）の順にＣｌｑに対する高い結合力を持っていることが確認でき、これにより補体活性もサブクラス間に差異があることが分かった。前記実験に使用したＩＶＩＧの場合、ＩｇＧサブクラスの集合体であるが、ＩｇＧ１がほぼ大部分を占めているので、分離精製されたＩｇＧ１とほぼ類似の親和度を示した。このような対照群と比較するとき、非糖鎖化によるＣｌｑの親和度変異は補体活性が最も強いＩｇＧ１ Ｆｃで著しく減少することが分かり、既に補体反応がないものと知られているＩｇＧ４ ＦｃではＣｌｑに対する結合力が殆どないので、補体活性のない優れた組み換えキャリアであることが分かった（図１４）。
【０１６３】
Ｃｌｑ親和度が除去されたキャリアの特性が生理活性ペプチドと結合体を作った後にも依然として維持されるかを調べるために、ＩＦＮαをモデルとして、糖鎖化Ｆｃ、酵素を用いた脱糖鎖Ｆｃおよび非糖鎖化組み換えＦｃをキャリアとして用いて各結合体を作った後、Ｃｌｑに対する結合力を検討した。糖鎖化ＦｃとＩＦＮα結合体（ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ：Glycosylated IgG1Fc）は、Ｃｌｑに対して依然として高い親和度を維持するが、ここにＰＮＧａｓｅＦなどを用いて脱糖鎖化させたインターフェロン結合体（ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧＦｃ：Deglycosylated IgG1Fc）は、結合力が著しく低くなることを確認し、その程度は大腸菌由来の非糖鎖化Ｆｃ結合体と同様の水準のＣｌｑに対する結合力を示した。それだけでなく、ＩｇＧ１の非糖鎖化Ｆｃを用いたインターフェロン結合体（ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＡＧＦｃＧ１：Aglycosylated IgG1Fc）をＩｇＧ１からＩｇＧ４に変えたインターフェロン結合体（ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＦｃＧ４誘導体１：Aglycosylated IgG4Fc）の場合、Ｃｌｑに対する親和度が完全に除去されることを確認することができ、結合体を非糖鎖化ＩｇＧ４ Ｆｃ単量体に変えた結合体（ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＦｃＧ４誘導体２：Aglycosylated IgG4Fc）の場合にも、やはりＣｌｑに対する結合能力は完全に除去されることからみて、抗体断片のエフェクター(effector)機能がない良いキャリアであることを確認することができた（図１５）。
【産業上の利用可能性】
【０１６４】
本発明の蛋白質結合体は、ポリペプチド薬物の血中半減期の増加が既存に報告されたいずれの修飾蛋白質よりも高く、既存の持続型剤形の最も大きい欠点である力価の減少を克服することにより、従来最も効果が良いものと知られているアルブミンを用いた場合より著しい血中持続性と生体内活性を持つうえ、免疫反応誘発の危険も殆どないため、蛋白質薬物の持続型製剤の開発に有用に利用できる。また、本発明に係る蛋白質薬物の持続型製剤は、頻繁な注射による患者の苦痛を減少させることができ、活性ポリペプチドの血中濃度を持続的に維持して薬効を安定的に示すことができる。
【０１６５】
しかも、本発明の蛋白質結合体の製造方法は、発現システム確立の難しさ、天然型と異なる糖鎖化、免疫反応誘発、蛋白質融合方向性の制限など遺伝子操作による融合蛋白質生産方式の欠点と、反応の非特異性による低い収率、および結合剤として用いられる化学物質の毒性問題など化学的結合方式の問題点を克服することにより、増加した血中半減期と高い活性を持つ蛋白質薬物を容易かつ経済的な方式で提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】図１は、免疫グロブリンをパパインで切断して得た免疫グロブリンＦｃ領域をクロマトグラフィで精製した結果である。
【図２】図２は、精製された免疫グロブリンＦｃ領域をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。
【図３】図３は、カップリング反応後に生成されたＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ（Ａ）、１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−Ｆｃ（Ｂ）およびＥＰＯ−ＰＥＧ−Ｆｃ（Ｃ）結合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。
【図４】図４は、カップリング反応後に精製されたＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体をサイズ排除クロマトグラフィで分析した結果である。
【図５】図５は、ＥＰＯ−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器で分析した結果である。
【図６】図６は、天然型免疫グロブリンＦｃと脱糖鎖化免疫グロブリンＦｃ(deglycosylated Fc：ＤＧ Ｆｃ)のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器およびＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。
【図７】図７は、ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体およびＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ結合体をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器で分析した結果である。
【図８ａ】図８ａは、ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体を逆相ＨＰＬＣで分析した結果である。
【図８ｂ】図８ｂは、ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ結合体を逆相ＨＰＬＣで分析した結果である。
【図８ｃ】図８ｃは、ＩＦＮα−ＰＥＧ−組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体結合体を逆相ＨＰＬＣで分析した結果である。
【図９】図９は、天然型ＩＦＮα、ＩＦＮα−４０Ｋ ＰＥＧ、ＩＦＮα−ＰＥＧ−アルブミン結合体およびＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体の薬物動態グラフである。
【図１０】図１０は、天然型ＥＰＯ、高糖鎖化ＥＰＯ、ＥＰＯ−ＰＥＧ−ＦｃおよびＥＰＯ−ＰＥＧ−ＡＧ Ｆｃ結合体の薬物動態を分析したグラフである。
【図１１】図１１は、ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体、ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ ＦｃおよびＩＦＮα−ＰＥＧ−組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体結合体の薬物動態を分析したグラフである。
【図１２】図１２は、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体、Ｆａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体およびＦａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体の薬物動態を分析したグラフである。
【図１３】図１３は、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体、Ｆａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体およびＦａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体の細胞内活性を分析したグラフである。
【図１４】図１４は、ヒトＩｇＧサブクラスにおける補体Ｃｌｑの結合活性を比較分析したグラフである。
【図１５】図１５は、糖鎖化Ｆｃ、酵素を用いて糖を除去したＤＧ Ｆｃ、および大腸菌で生産したＡＧ Ｆｃをキャリアとして用いたインターフェロン−ＰＥＧ−キャリア結合体における補体Ｃｌｑの結合活性を比較分析したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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