(57)【要約】本発明は、高地肺水腫（HAPE）に対する素因を検出する方法に関する。特に、iNOS（inducible nitric oxide synthase）遺伝子の対立遺伝子変異体であって、HAPEの有病率に関連することが判明している対立遺伝子変異体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
高地肺水腫（HAPE）に対する素因を検出する方法であって、以下の工程を含む方法：
（a）高地肺水腫に伴う症状をモニタリングすることによって被験者を選択する工程、
（b）常法により被験者から白血球のゲノムDNAを抽出する工程、
（c）それぞれ配列番号：2および配列番号：3記載のフォワードオリゴヌクレオチドプライマーおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーを設計および合成して、配列番号：1のヒトiNOS遺伝子のイントロン7を増幅する工程、
（d）ヒトiNOS遺伝子の既存の配列と比較することにより新規な一塩基多型（SNP）をコンピュータを使用して同定する工程、
（e）配列番号：2（フォワードプライマー）および配列番号：3（リバースプライマー）の上記プライマーを用いて、新規な一塩基多型について高地先住民（HA先住民）、低地先住民（HAPE対照）、および低地住民のHAPE患者をスクリーニングする工程
（f）遺伝子型と高地肺水腫との関連を確認するために、工程（d）の集団におけるAA遺伝子型、AG遺伝子型およびGG遺伝子型の頻度をコンピュータで計算する工程、ならびに
（g）上記集団における対立遺伝子変異体（AA遺伝子型、AG遺伝子型およびGG遺伝子型）の分布における差異を予測および統計的に解析する工程であって、ここで第19480位がGG遺伝子型であれば高地肺水腫のリスクが低く、19480位がAA遺伝子型であれば高地肺水腫のリスクが高い工程。
【請求項２】
ヒトiNOS遺伝子のイントロン7を増幅することができるオリゴヌクレオチドプライマーが以下の群より選択される、請求項1記載の方法：
（a）フォワードプライマーである
2007527194.tif 000024
、および
（b）リバースプライマーである
2007527194.tif 000025
。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドプライマーによって、HAPEに関与する1つまたは複数の多型性の部位が同定される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
iNOS遺伝子の対立遺伝子変異体が、AA遺伝子型、AG遺伝子型およびGG遺伝子型を有する、請求項1記載の方法。
【請求項５】
高地肺水腫（HAPE）に対する素因を有するSNP遺伝子型を検出するための診断用キットであって、以下のプライマーおよびプローブを含むキット：
（a）フォワードプライマーである
2007527194.tif 000026
、
（b）リバースプライマーである
2007527194.tif 000027
。
【請求項６】
1つまたは複数の多型性部位を含むiNOS遺伝子領域を増幅するのに適した一対のプライマーであって、以下を含むプライマー：
（a）フォワードプライマーである
2007527194.tif 000028
、
（b）リバースプライマーである
2007527194.tif 000029
。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、高地肺水腫（HAPE）に対する素因の検出法に関する。本発明は特に、HAPEの有病率に関連する事が発見されているiNOS（inducible nitric oxide synthase）遺伝子の対立遺伝子変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景および先行技術
高地肺水腫（HAPE）は、無作為に選抜された登山者の約10％が、標高4000m以上の高地に急に登った後24時間以内に発病する非心臓性肺水腫の一形態である。同様の現象は、さまざまな仕事上の理由で標高3000m以上に徴集された低地住民においても観察される。本疾患の以前の発生で記録されているように、約60％というさらに高い発生率が、HAPEにかかりやすい被験者において示されている（Houston CS et al 1960, Bartsch P et al 1997,1990）。HAPEは、血管拡張薬を予防的に使用するか、またはゆっくり登ることにより効果的に予防することが可能である。それにもかかわらず、依然として、トレッキング中や登山中に高地にさらされる事に関連する死因で最も一般的なものである（Hackett PH et al 1990）。ヒマラヤ登山者の罹患率は、酸素補給または迅速な下山による即座の治療が不可能な場合、50％であると見積もられている（Lobenhoffer HP et al 1982）。人種および民族の集団間において観察される本疾患の臨床像および重症度における差異は、家族内集積とともに、本疾患に対する有意な遺伝的素因があることを支持している。
【０００３】
HAPEの発症に影響を与える要因についての知識は依然として不十分であるが、過度の低酸素性肺血管収縮（HPV）が重要な役割を演じているという実験に基づく証拠がある（Scherrer U et al 1996）。HAPE患者を高地において侵襲的および非侵襲的に測定すると、肺動脈圧が過度に上昇することが実証されている。毛細血管における一様でない血管収縮は、時に、「毛細血管漏出（capillary leakage）」を引き起こし、その後、水腫形成をもたらす（Bartsch P et al 1991）。本疾患にかかりやすい被験者は、高地に短時間置かれただけで増加した肺血管反応を示す。この過度のHPVの根底にある病態生理学的メカニズムは依然不明である。しかしながら、内在性血管拡張物質である一酸化窒素（NO）が血管反応性を調節しているという証拠が存在する（Palmer RMJ et al 1987）。NOによる血管緊張の調節は、cGMP経路の中間体によるものである（Bellamy TC et al 2002）。
【０００４】
以下の研究が、HAPEへのNOの関与を強く示している：
NOは主に、動脈血の酸素飽和度を増大させることにより、換気血流比を改善し、肺胞気-動脈血酸素分圧較差を低下させることを介して、その効果を発揮している（Scherrer U et al 1996）。しかしながら、健常なボランティアでは、低酸素状態でNO合成の拮抗薬であるNG-モノメチル-L-アルギニン（L-NMMA）を投与すると、HAPEで観察されるのと同様に、肺動脈圧および血管抵抗が上昇する。このため、NOは、罹患者におけるHAPEのための吸入療法として使用されてきた（Anand IS et al 1998）。
【０００５】
ホスホジエステラーゼ5は、肺におけるcGMPの加水分解に関与する鍵酵素である。ホスホジエステラーゼ5の阻害剤は、低酸素誘導性肺高血圧症を抑制することがわかっている（Goldstein I et al 1998）。低酸素症は、HAPEにかかりやすい登山者の呼気中のNOを減少させ、これはこのような症例においてNO産生が低下することを示している（Busch et al 2001）。このため、NOレベルを低下させるNO合成機構の欠陥が、HAPEの病的発生過程に関与していると予想することができる。NOは、nNOS（neuronal nitric oxide synthase、NOS1）、iNOS（inducible nitric oxide synthase、NOS2）、およびeNOS（endothelial nitric oxide synthase、NOS3）の3つのイソ酵素によって合成される（Michel T et al 1997）。NOS1およびNOS3は構成的に発現するが、NOS2は誘導時に発現する。これらの中で、HAPEにおいて欠陥があると推定される最上の候補は、eNOS（endothelial nitric oxide synthase）であるが、一方で、iNOS（inducible nitric oxide synthase）の誘導が総NO予備量の迅速な回復のためには不可欠であると考えられている（Xia Y et al 1998）。その上、強固な細胞シグナル伝達機構は一般的に、迅速な初期の生理学的応答のための誘導型遺伝子の動員を助ける。iNOSにその活性化を不可能にするような欠陥により、低酸素状態に曝露された個体は低下したNO量を回復することができず、その結果HAPEになると推測することができる。
【０００６】
iNOSにおける欠陥は、HAPE患者において遺伝子レベルで起こりうる。多数の事例において、遺伝子の発現は、遺伝子配列における多型により変更されることがわかっている（Qadar Pasha MA et al 2001）。したがって、iNOS遺伝子における多型がその発現を変更し、疾患に結びつくことは常に起こりうることである。
【０００７】
HAPEの治療法の現状：
1.NO療法：NOは、HAPEを治療するための吸入療法として利用されている。それは主に、換気血流比の改善、および動脈血酸素飽和度の増大による肺胞気動脈血酸素分圧較差の低下を介してその効果を発揮する。
【０００８】
HAPE被験者の動脈血酸素化におけるNOにより誘導される改善は、水腫部から離れ非水腫部に向かう、肺における肺血流の変化を伴い、毛細血管全体における血管収縮の均等化／均質性をもたらす（Scherrer U et al 1996, Anand IS et al 1998）。
【０００９】
2.迅速な下山：HAPE患者を迅速に下山させることは、悪化を防止するだけでなく、該疾患の病的発生過程を改善しさえする（Hackett PH et al 2001）。
【００１０】
3.携帯用空気室（PAC）：酸素で満たされた小さい円柱状の形をしたPACは、しばしばHAPEのための吸入療法として使用される（Hackett PH et al 2001）。
【００１１】
4.遺伝的素因：これに関連した唯一の研究では、内皮型一酸化窒素合成酵素遺伝子（eNOS）およびアンジオテンシン変換酵素遺伝子（ACE）における遺伝的変異が、個体をHAPEにかかりやすくする素因となりえることを示唆している（Droma Y et al 2002）。結果は以下の通りである：
2007527194.tif 000002
【００１２】
HAPEに利用可能な治療法の限界：
1. HAPE患者が、NO吸入に対して同質の反応をするとは認められない。
さらに、必要とされるNO濃度は、疾患の重症度により変化する。時に、不適当な吸入により、患者は低血圧症、またさらには敗血症性ショックをもたらす。
2. HAPE患者を即座に下山させることは、悪天候および厳しい地形のために、しばしば不可能な状態となる（Anand IS et al 1998, Hackett PH et al 2001）。
【００１３】
3.PACの携行は、過重量という問題があるため、実行可能でないと考えられることがある。空気室の除去は患者を悪化させることから、疾患が改善した状態はしばしば一時的なものである（Hackett PH et al 2001）。
【００１４】
4.報告されているHAPEに関連した多型性は特異的なものではなく、血圧の上昇が見られる糖尿病、冠動脈疾患、高血圧症、および心筋梗塞などの疾患とも関連があることが示されている（Monti LD et al 2003, Via M et al 2003）。記載されている対立遺伝子頻度の差は、他の疾患についても同一であるように思われる。したがって、本疾患に対するこの対立遺伝子の寄与の可能性は、高血圧の様な、HAPEの悪化を伴う他の関連した病態生理学に起因する可能性がある。さらに、この研究は、本疾患が発生する環境と同じ環境で何の問題もなく居住している集団であるHA先住民（HA natives）（高地先住民）を含んでいない。
【００１５】
発明の新規性は、HAPEに対する素因の新規な検出方法を提供している点にある。
【００１６】
さらに別の新規性は、iNOS遺伝子における新規マーカー領域を提供することについてである。
【００１７】
さらに別の新規性は、iNOS遺伝子における新規SNPを提供することについてである。
【００１８】
さらに別の新規性は、iNOS遺伝子の対立遺伝子変異体とHAPEとの関連性を明らかにしていることである。
【００１９】
別の新規性は、新規SNPを含む、増幅のための新規なプライマーおよびプローブを提供することである。
【発明の開示】
【００２０】
発明の目的
本発明の主な目的は、HAPEに対する素因の検出方法であって、上記の限界を回避する方法を提供することである。
【００２１】
さらに別の目的は、iNOS遺伝子における新規SNPを提供することである。
【００２２】
別の目的は、新規SNPを含む、増幅のための新規なプライマーおよびプローブを提供することである。
【００２３】
別の目的は、低地住民とHAPE患者との間の対立遺伝子変異について連関分析を行い、本疾患との関連を評価することである。
【００２４】
発明の概要
本発明は、HAPEに対する素因を検出する方法に関する。特に、iNOS遺伝子の対立遺伝子変異体に関連し、この遺伝子は、HAPEの有病率と関連している。NOレベルを低下させる欠陥一酸化窒素（NO）合成機構が、HAPEの病因に関与していると予想されている。iNOS遺伝子は、NO産生の阻害剤がHAPEの重症度を増加させることから、NO産生に関与することが示されている。本発明では、開示されたマーカー領域内におけるiNOS遺伝子の新規対立遺伝子変異体が、集団におけるHAPEの有病率と負の連関があることが示されていることから、HAPEに対する素因の検出方法が提供される。
【００２５】
本発明の他のさらなる局面、特徴、および利点は、開示目的で記載されている本発明の好適な態様の以下の記載から明白になる。本発明の他の態様も、当業者によって想定されうる。そのような他の態様もすべて、本発明の範囲内あるものとする。
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明は、HAPEに対する素因を検出する方法に関する。特に、iNOS遺伝子の対立遺伝子変異体に関連するが、この遺伝子は、HAPEの有病率と関連することがわかっている。
【００２７】
I．iNOS遺伝子上のマーカー領域の同定：
高地におけるNOの重要な機能を考慮して、iNOS、すなわち誘導型一酸化窒素合成酵素遺伝子を本研究用の候補遺伝子として選択した。
【００２８】
II．調査対象者の選択：
HAPEの臨床的重症度は、レイク・ルイーズ（Lake Louise）急性の山酔い（AMS）採点システムによって評価される。簡単に説明すると、患者を5つの症状、すなわち、頭痛、胃腸の不調、疲労、衰弱、またはその両方、めまい、ふらつき、またはその両方、および睡眠障害の存在について評価した。精神状態の変化、運動失調および末梢性浮腫も評価した。これらの症状のそれぞれを、0から3までにランク付けした。0点は無症状であることを示し、1は軽度の症状、2は中度の症状、および3は重度の症状を示す。HAPEスコアは、8つの症状すべてについての合計であり、患者は、HAPEスコアが6より大きいという特徴を有する（Anand IS et al 1998）。低地住民（LL）は、少なくとも3回高地へ連れ出された後でさえ、上記のいかなる症状も示さないことがわかった被験者である。高地（HA）先住民は、古代からのHA永住者である。
【００２９】
III．白血球からのゲノムDNAの抽出：
ゲノムDNAを、塩析法を用いて血液から抽出した。高塩濃度下で赤血球を溶解した後、細胞核溶解緩衝液（NLB）で処理した。タンパク質を沈殿させ、DNAの抽出をエタノール内で得た。（Miller SA et al 1988）。  
【００３０】
IV．iNOS遺伝子の対立遺伝子変異体の同定：
本発明の新規多型性：
本発明への第一歩として、本出願者らは、自身で設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用い、iNOS遺伝子のマーカー領域のPCR増幅を実施した。このプライマーをヒトのiNOS遺伝子配列（Gene Bankアクセション番号NT_010799）に従って設計した。精製したPCR生成物の配列決定によって、ヒトiNOS遺伝子のイントロン7に新規な一塩基多型があることが明らかになった。したがって、これまでは認識されていなかったヒトiNOS遺伝子の対立遺伝子または亜型があることが明らかになった。
【００３１】
本発明は、データベースにあるヒトiNOS遺伝子の配列と比較して、以下の新規な一塩基多型を含むヒトiNOS遺伝子の対立遺伝子変異体の配列を提供する。
【００３２】
例えば、表1に挙げる多型性部位を有するヒトiNOS遺伝子の対立遺伝子変異体のヌクレオチド配列（配列番号：1）は、以下であってもよい。
2007527194.tif 000003
上記の配列において、SNP*は太字で示されている。
【００３３】
【表１】
2007527194.tif 000004
【００３４】
V．疾患との連関分析
42人のHA先住民、39人のHAPE対照、および18人のHAPE患者におけるSNP分析から、3つの遺伝子型、すなわちAA、AG、およびGGが明らかになった。対立遺伝子の分布を、表2にまとめる。
【００３５】
【表２】
2007527194.tif 000005
【００３６】
G対立遺伝子の頻度は、HA先住民＞HAPE対照＞HAPE患者の順序であることが判明した。生物統計学的分析は、表3に記載されているように、G対立遺伝子とHA順応、およびA対立遺伝子と本疾患との有意な関連を示した。
【００３７】
ここでは、オッズ比（OR）および95％信頼区間が、遺伝子型の組み合わせと本疾患との間の関連の強度を測定するのに使用された。0.05未満のP値を、統計的に有意であると見なした。
【００３８】
【表３】
2007527194.tif 000006
【００３９】
一酸化窒素合成酵素は、その一酸化窒素を合成するための反応に、該反応において共同因子として作用する酸素を必要とする。酸素は、iNOSの酸素添加酵素ドメインに結合し、NOの合成に寄与する。低酸素状態において、酸素の不足は、NO産生を低下させうるが、酸素を必要としないまたはより少ない酸素しか必要としなくなるように酵素の活性を改変する、酸素添加酵素ドメインにおける任意の改変は、正常なNO産生をもたらすことができる。NOは、ヘモグロビンの酸素化を向上させ、正常なNO産生は、順応において作用するメカニズムを必要とするため、酸素添加酵素ドメインにおける任意の改変は、NOの産生に好都合でありうる。本調査において、イントロン7で見つかった新規なSNPは、エキソン7からエキソン16にわたるNOS2遺伝子の酸素添加酵素ドメインの近くに存在する。見つかったSNPが、隣接するSNPと連鎖不均衡にあって、NOS2遺伝子によるNO産生に対する最終的な影響に関与している可能性は十分にある。
【００４０】
VI．診断キット
本発明はさらに、配列番号：2および3に記載されている対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを少なくとも1つまたは複数含む診断キットを提供する。しばしば、このキットは、ある多型の異なった型にハイブリダイズする1つまたは複数対の対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを含む。いくつかのキットにおいて、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドは、基質に固定化されて提供される。例えば、同じ基質が、少なくとも表1に示される多型を検出する対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブを含むことが可能である。このキットのさらなる任意の付加的な構成要素は、例えば、制限酵素、逆転写酵素、もしくはポリメラーゼ、基質であるヌクレオシド三リン酸、標識化に使われる手段（例えば、標識がビオチンならば、アビジン酵素複合体、酵素基質、および色素原）、ならびに、逆転写、PCR、もしくはハイブリダイゼーション反応に適したバッファーなどである。通常、このキットは、本方法を実施するための指示書も含む。
【００４１】
VII．核酸ベクター
変異体遺伝子は、変異体遺伝子が天然またはそれ以外のプロモーターに機能的に連結している発現ベクターにおいて発現させることができる。通常、このプロモーターは、哺乳動物細胞で発現させるための真核生物プロモーターである。転写調節配列は、通常は異種プロモーターおよび任意でエンハンサーを含み、その宿主によって認識される。例えば、trp、lac、ファージプロモーター、糖分解酵素プロモーターおよびtRNAプロモーターなど、適切なプロモーターの選択は、選択された宿主によって決まる。市販されている発現ベクターも使用することができる。適切な宿主細胞は、大腸菌（E. coli）などのバクテリア、酵母、糸状菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞などであり、通常は不死化したもの、例えば、マウス、CHO、ヒトおよびサルの細胞株、およびそれらの派生物を含む。好適な宿主細胞は、変異体遺伝子産物をプロセッシングして適切な成熟ポリペプチドを産生することが可能である。
【００４２】
本発明はさらに、外来の変異体遺伝子を発現させることができるトランスジェニック非ヒト動物であって、かつ／または、この遺伝子をプロモーターおよび任意でエンハンサーに機能的に連結させ、この構築物を接合体に微量注入することによって完成されたトランスジェニック非ヒト動物を提供する。内在性の変異体遺伝子の不活性化は、クローニングされた変異体遺伝子が、ポジティブセレクションマーカーの挿入によって不活性化されている導入遺伝子を形成することによってもたらすことができる。この導入遺伝子は次に、胚幹細胞に導入されて、そこで、内在性の変異体遺伝子と相同的組換えを受ける。マウスおよびその他のげっ歯類が好適な動物である。そのような動物は、有用な薬剤スクリーニング系を提供する。
【００４３】
したがって、本発明の主な態様は、高地肺水腫（HAPE）の素因を検出する方法であって、以下の工程（a）〜（g）を含む方法に関する。
（a）高地肺水腫に伴う症状をモニタリングすることによって被験者を選択する工程、
（b）常法により被験者から白血球のゲノムDNAを抽出する工程、
（c）配列番号：1のヒトiNOS遺伝子のイントロン7を、それぞれ配列番号：2および配列番号：3のフォワードおよびリバースのオリゴヌクレオチドプライマーを設計および合成して増幅する工程、
（d）ヒトiNOS遺伝子の既存の配列と比較することにより新規な一塩基多型（SNP）をコンピュータを使用して同定する工程、
（e）配列番号：2（フォワードプライマー）および配列番号：3（リバースプライマー）の前記プライマーを用いて、新規な一塩基多型について高地先住民（HA先住民）、低地先住民（HAPE対照）、および低地住民のHAPE患者をスクリーニングする工程
（f）遺伝子型と高地肺水腫との関連を確認するために、工程（e）の集団におけるAA、AG、およびGGという遺伝子型の頻度をコンピュータで計算する工程、ならびに
（g）集団における対立遺伝子変異体（AA、AG、およびGGという遺伝子型）の分布における差異を予測および統計解析する工程であって、ここで19480位がGG遺伝子型であれば高地肺水腫のリスクが低く、19480位がAA遺伝子型であれば高地肺水腫のリスクが高い工程。
【００４４】
本発明の別の態様は、以下からなる群より選択される、ヒトiNOS遺伝子のイントロン7を増幅することができるオリゴヌクレオチドプライマーに関する。
（a）フォワードプライマーである
2007527194.tif 000007
、および
（b）リバースプライマーである
2007527194.tif 000008
。
【００４５】
本発明のさらに別の態様は、以下からなる群より選択される、1つまたは複数の多型性部位を含むオリゴヌクレオチドプライマーに関する。
（a）フォワードプライマーである
2007527194.tif 000009
、および
（b）リバースプライマーである
2007527194.tif 000010
【００４６】
本発明のさらに別の態様は、iNOS遺伝子の対立遺伝子変異体がAA、AG、およびGGという遺伝子型を有する対立遺伝子変異体に関連する。
【００４７】
高地肺水腫（HAPE）になりやすい素因を有するSNP遺伝子型を検出するための診断用キットであって、以下のプライマーおよびプローブを含むキット：
（a）フォワードプライマーである
2007527194.tif 000011
、および
（b）リバースプライマーである
2007527194.tif 000012
。
【００４８】
本発明のもう一つの態様は、1つまたは複数の多型性部位を含むiNOS遺伝子領域を増幅するのに適したプライマーに関連し、該プライマーは以下を含む：
（a）フォワードプライマーである
2007527194.tif 000013
（b）リバースプライマーである
2007527194.tif 000014
。
【００４９】
本発明の別の態様は、iNOS遺伝子の対立遺伝子変異体を含む核酸ベクターに関する。
【００５０】
以下の実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。
【００５１】
実施例
実施例1
マーカー遺伝子の同定：
HAにおけるNOの重要な機能を考慮して、iNOS、すなわち誘導型一酸化窒素合成酵素を本研究用の候補遺伝子として選んだ。
【００５２】
実施例2
研究対象の選択：
HAPEの臨床的重症度を、レイク・ルイーズ急性山酔い（AMS）採点システムによって評価した。簡単に説明すると、患者は5つの症状、すなわち、頭痛、胃腸の不調、疲労、衰弱、またはその両方、めまい、ふらつき、またはその両方、および睡眠障害の存在について評価した。精神状態の変化、運動失調および末梢性浮腫も評価した。これらの症状のそれぞれを、0から3までにランク付けした。0点は無症状であることを示し、1は軽度の症状、2は中度の症状、および3は重度の症状を示す。HAPEスコアは、8つの症状すべてについての合計であり、患者は、HAPEスコアが6より大きいと特徴付けされる（Anand IS et al 1998）。LLは、少なくとも3回高地へ連れ出された後でさえ、上記のいかなる症状も示さないことがわかった被験者である。HA先住民は、古代からのHA永住者である。
【００５３】
実施例3
白血球からのゲノムDNAの抽出：
ゲノムDNAを、塩析法を用いて血液から抽出した。高塩濃度下で赤血球を溶解した後、細胞核溶解緩衝液（NLB）で処理した。タンパク質を沈殿させ、塩析法の改変法を用いてDNAを末梢血白血球から抽出した。DNA濃度を、波長260nmで、サンプルの光学的濃度を測定することによって決定した（Miller SA et al 1988）。
【００５４】
実施例4
iNOS遺伝子の対立遺伝子変異体の同定：
本実施例では、本発明による一定のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCRおよび配列決定によるiNOS遺伝子の対立遺伝子変異体の同定について説明する。次に、DNAを、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。
1．
2007527194.tif 000015
（配列番号：2に記載）、および
2．
2007527194.tif 000016
（配列番号：3に記載）。
【００５５】
ポリメラーゼ連鎖反応を、以下の条件を用いて実施した：
工程1  94℃で4分間
工程2  94℃で30秒間
工程3  62.5℃で30秒間
工程4  72℃で45秒間
工程5  工程2までを34回
工程6  72℃で10分間
【００５６】
PCRは、Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600で行なった。この反応により、2%のアガロースゲル電気泳動法によって分析すると258 bpのDNA断片が生成された。このPCR生成物を、Amersham Pharmaciaゲル抽出キット（Amersham）を用いてアガロースゲルから切り出したバンドから精製し、このPCR生成物の両鎖を、ABI Prism 377 自動DNAシーケンサーでダイターミネーター化学法（dye terminator chemistry）を用いて直接配列決定を行った。このPCR生成物は、表1に記載されている新規な一塩基対変異以外、ヒトiNOS遺伝子配列と同一であった。
【００５７】
実施例5
iNOS遺伝子の対立遺伝子変異体のヌクレオチド配列：
実施例1に記載されているとおりの方法を用いて得られた、iNOS遺伝子の対立遺伝子変異体のヌクレオチド配列：
2007527194.tif 000017
上記の配列において、SNP*は太字で示されている。
【００５８】
実施例6
G対立遺伝子は順応と関連し、A対立遺伝子は疾患と関連する：
実施例4に記載されている方法を、HA先住民、HAPE対照、およびHAPE患者から抽出した一連のDNAサンプルに適用する。G対立遺伝子とHA順応、およびA対立遺伝子と疾患との極めて有意な関連が観察されている。結果を、以下の表に要約する。
2007527194.tif 000018
【００５９】
したがって、GG遺伝子型を持つ個体はHAPEに対するリスクが低く、AA遺伝子型を持つ個体はそのリスクが高いということが、別の集団についても当てはまると期待することができる。
【００６０】
実施例7
iNOS変異体配列を含む核酸ベクター：
ベクター、および、表1に記載されているような1つまたは複数の多型性部位を含むiNOS遺伝子の対立遺伝子変異体で形質転換された宿主細胞は、例えば以下に詳述されているようにして調製することができる。
【００６１】
変異体遺伝子は、変異体遺伝子が、天然またはそれ以外のプロモーターに機能的に連結している発現ベクターにおいて発現させることができる。通常、このプロモーターは、哺乳動物細胞において発現させるための真核生物プロモーターである。転写調節配列は、通常は異種プロモーターおよび任意でエンハンサーを含み、宿主によって認識される。例えば、trp、lac、ファージ、糖分解酵素、およびtRNAなど、適切なプロモーター遺伝子の選択は、選択された宿主に依存する。市販されている発現ベクターも使用することができる。適当な宿主細胞は、大腸菌などのバクテリア、酵母、糸状菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞などを含み、通常は不死化したもの、例えば、マウス、CHO、ヒト、およびサルの細胞株、ならびにその派生細胞株などである。好適な宿主細胞は、変異体遺伝子産物をプロセッシングして適切な成熟ポリペプチドを産生することができる。
【００６２】
本発明の長所：
本発明は、HAPEの治療に対して以下の点を加える。
1．HAPE研究用の新規なマーカーとしての誘導型一酸化窒素合成酵素遺伝子。
2．新規SNPを含むPCR生成物の増幅に関与する新規なプライマー配列。
3．さらなる連関研究のために利用することが可能な新規SNP（19480 A/G）。
4．野生型対立遺伝子（A）と疾患との有意な関連（表2および表3）。
5．突然変異対立遺伝子（G）と順応との有意な関連（表2および表3）。
6．HA先住民およびHAPE対照に関する対立遺伝子の頻度における有意な差異（表2および表3）。
7．G対立遺伝子の存在は、個体を病気にかかりにくくする素因となる。
8．それは、個人が、さまざまな理由で高地を訪れる決心をする助けとなることができる。
【００６３】
参考文献
2007527194.tif 000019
2007527194.tif 000020
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）遺伝子の位置を示す概略図である：17 cenq 11.2。縦棒はエキソン領域を表す（Gene bankヌクレオチド配列番号：NT_010799より）。
【図２】AAホモ接合体を持つ個体の配列ファイルを示す。
【図３】GGホモ接合体を持つ個体の配列ファイルを示す。
【図４】AGヘテロ接合体を持つ個体の配列ファイルを示す。
【図５】TCヘテロ接合体を持つ個体の配列ファイルを示す。
【配列表フリーテキスト】
【００６５】
以下に提供されるのは、配列番号：1、2、および3の配列表情報である。
【００６６】
配列表
一般情報
出願人： CSIR
発明の名称：高地肺水腫（HAPE）に対する素因の検出法
配列の総数： 03
連絡先住所：Institute of genomics and integrative biology, CSIR, Delhi University Campus, Mall Road-110007, India。
電話：+91-11-27666156 ファックス： +91-11-27667471
【００６７】
配列番号：1の情報
1．配列特性：
1．LENGTH：258 bp
2．TYPE：DNA
2007527194.tif 000021
3．ORGANISM：ホモ・サピエンス（ヒト）
4．直接の由来源：PCR
5．NAME／KEY：マーカー領域
6．配列番号：1
【００６８】
配列番号：2の情報
1．配列特性： 
1．LENGTH：24 bp
2．TYPE：DNA
2007527194.tif 000022
ORGANISM：人工配列
直接の由来源：合成
NAME／KEY：合成オリゴヌクレオチド
配列番号：2
【００６９】
配列番号：3の情報
1．配列特性：
LENGTH：24 bp
TYPE：DNA
2007527194.tif 000023
ORGANISM：人工配列
直接の由来源：合成
NAME／KEY：合成オリゴヌクレオチド
配列番号：3
【図１】
2007527194.tif 000030
【図２】
2007527194.tif 000031
【図３】
2007527194.tif 000032
【図４】
2007527194.tif 000033
【図５】
2007527194.tif 000034
【配列表】
2007527194000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年7月27日(2006.7.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者において高地肺水腫（HAPE）に対する素因を検出する方法であって、該被験者の誘導型一酸化窒素合成酵素遺伝子のイントロン8における多型を同定する工程を含む方法であり、ここで該多型がアクセッション番号NT_010799を有する第17染色体のコンティグの第845034位にあり、HAPEに対する素因が該位置にAヌクレオチドが存在することによって示される方法。
【請求項２】
ヌクレオチドの同定が被験者のゲノムDNAの領域を配列決定する工程を含み、該領域が前記の位置を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ヌクレオチドの同定が、（a）前記の位置を含む被験者のゲノムDNAの一部を増幅する工程、および（b）該被験者のゲノムDNAの増幅された部分を配列決定する工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応によるものである、請求項3記載の方法。
【請求項５】
増幅が、
（a）ポリメラーゼ連鎖反応条件下で配列番号：2の相補配列にハイブリダイズする配列を含むフォワードプライマーを、ポリメラーゼ連鎖反応条件下で前記の位置の上流にある配列にハイブリダイズさせる工程、および
（b）ポリメラーゼ連鎖反応条件下で配列番号：3の相補配列にハイブリダイズする配列を含むリバースプライマーを、ポリメラーゼ連鎖反応条件下で前記の位置の下流にある配列にハイブリダイズさせる工程
を含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
増幅が、
（a）配列番号：2に記載された配列を含むフォワードプライマーを、ポリメラーゼ連鎖反応条件下で、前記の位置の上流にある配列にハイブリダイズさせる工程、および
（b）配列番号：3に記載された配列を含むリバースプライマーを、ポリメラーゼ連鎖反応条件下で、前記の位置の下流にある配列にハイブリダイズさせる工程
を含む、請求項4記載の方法。
【請求項７】
対立遺伝子特異的プローブを、前記の位置を含む被験者のゲノムDNAの一部、および該被験者の前記の位置を含むゲノムDNAから増幅したDNAからなる群より選択されるDNAにハイブリダイズさせることを含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
対立遺伝子特異的プローブが、ヌクレオチドがAであるときDNAとハイブリダイズするプローブ、および該ヌクレオチドがGであるとき該DNAとハイブリダイズするプローブからなる群より選択される、請求項7記載の方法。
【請求項９】
被験者において高地肺水腫（HAPE）に対する素因を検出するための単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、配列番号：2に記載されている配列を含むフォワードプライマー、および配列番号：3に記載されている配列を含むリバースプライマーからなる群より選択される、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
被験者がヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
1つまたは複数の多型性部位を含むiNOS遺伝子領域を増幅するのに有用なプライマーのセットであって、以下を含むプライマー：
（a）フォワードプライマーである
2007527194.tif 000038
、
（b）リバースプライマーである
2007527194.tif 000039
。
【請求項１２】
ヒト被験者におけるHAPEに対する素因を検出するキットであって、請求項11記載のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むキット。
【手続補正書】
【提出日】平成19年2月1日(2007.2.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007527194000001.app
【国際調査報告】
2007527194.tif 000040
2007527194.tif 000041
2007527194.tif 000042
2007527194.tif 000043
2007527194.tif 000044
2007527194.tif 000045