(57)【要約】      （修正有）【課題】抗体を含む安定した水性薬学的製剤の提供。【解決手段】モノクローナル抗体、トレハロース及びバッファーを含み、製剤中のトレハロースに対するモノクローナル抗体の重量比が約１．６５から約４．９５であり、製剤が約５．５から約７．０のｐＨを有する、製剤。該モノクローナル抗体としては、ベバシズマブ、オビヌツズマブなど。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定した水性薬学的製剤であって、製剤がモノクローナル抗体、トレハロース及びバッファーを含み、製剤中の前記トレハロースに対する前記モノクローナル抗体の重量比が約１．６５から約４．９５であり、製剤が約５．５から約７．０のｐＨを有する、製剤。
【請求項２】
前記トレハロースに対する前記モノクローナル抗体の重量比が約１．６５から約３．３０である、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記トレハロースに対する前記モノクローナル抗体の重量比が約１．７０から約２．９１である、請求項１に記載の製剤。
【請求項４】
前記トレハロースに対する前記モノクローナル抗体の重量比が約２．００から約３．３０である、請求項１に記載の製剤。
【請求項５】
製剤中の前記モノクローナル抗体が約２５ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬである、請求項１から４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６】
製剤中の前記モノクローナル抗体が約４５ｍｇ／ｍＬから約５５ｍｇ／ｍＬである、請求項１から４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項７】
製剤中の前記モノクローナル抗体が約３５ｍｇ／ｍＬから約７５ｍｇ／ｍＬである、請求項１から４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項８】
製剤中の前記トレハロースが約４０ｍＭから約１２０ｍＭである、請求項１から７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項９】
製剤中の前記トレハロースが約５０ｍＭから約７０ｍＭである、請求項１から７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１０】
製剤中の前記トレハロースが約４０ｍＭから約８０ｍＭである、請求項１から７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１１】
前記バッファーが約１５ｍＭから約３５ｍＭの量である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１２】
前記バッファーがヒスチジンである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１３】
バッファーがリン酸ナトリウムである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１４】
安定した水性薬学的製剤であって、製剤が（ａ）約２５ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬの量のモノクローナル抗体；（ｂ）約４０ｍＭから約１２０ｍＭの量のトレハロース；及び（ｃ）約１５ｍＭから約３５ｍＭの量のリン酸ナトリウムを含み、前記製剤が約５．５から約７．０のｐＨを有する、製剤。
【請求項１５】
製剤中の前記トレハロースに対する前記モノクローナル抗体の重量比が約１．６５から約３．３０の間である、請求項１４に記載の製剤。
【請求項１６】
製剤中の前記トレハロースに対する前記モノクローナル抗体の重量比が約１．７０から約２．９１の間である、請求項１４に記載の製剤。
【請求項１７】
前記モノクローナル抗体が約３５ｍｇ／ｍＬから約８５ｍｇ／ｍＬの量である、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１８】
前記モノクローナル抗体が約４５ｍｇ／ｍＬから約５５ｍｇ／ｍＬの量である、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１９】
前記モノクローナル抗体が約５０ｍｇ／ｍＬの量である、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２０】
前記トレハロースが約４０ｍＭから約８０ｍＭの量である、請求項１４から１９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２１】
前記トレハロースが約５０ｍＭから約７０ｍＭの量である、請求項１４から１９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２２】
前記トレハロースが約６０ｍＭの量である、請求項１４から１９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２３】
前記リン酸ナトリウムが約２０ｍＭから約３０ｍＭの量である、請求項１４から２２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２４】
前記リン酸ナトリウムが約２２ｍＭから約２８ｍＭの量である、請求項１４から２２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２５】
前記リン酸ナトリウムが約２５ｍＭの量である、請求項１４から２２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２６】
前記モノクローナル抗体が約５０ｍｇ／ｍＬの量であり；前記トレハロースが約６０ｍＭの量であり；且つ前記リン酸ナトリウムが約２５ｍＭの量である、請求項１４から２２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２７】
界面活性剤を更に含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２８】
前記界面活性剤がポリソルベート又はポロキサマーである、請求項２７に記載の製剤。
【請求項２９】
前記ポリソルベートがポリソルベート２０である、請求項２８に記載の製剤。
【請求項３０】
前記ポロキサマーがポロキサマー１８８である、請求項２８に記載の製剤。
【請求項３１】
前記界面活性剤の濃度が約０．０１％から約０．１％である、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３２】
前記界面活性剤の濃度が約０．０１％から約０．０５％である、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３３】
前記界面活性剤の濃度が約０．０４％である、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３４】
前記製剤が約５．９から約６．５のｐＨを有する、請求項１から３３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３５】
前記製剤が約６．２又は約６．０のｐＨを有する、請求項１から３３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３６】
前記モノクローナル抗体が事前凍結乾燥されていない、請求項１から３５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３７】
前記モノクローナル抗体が完全長抗体である、請求項１から３６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３８】
前記モノクローナル抗体がＩｇＧｌ抗体である、請求項１から３７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３９】
前記モノクローナル抗体がヒト化抗体である、請求項１から３７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４０】
前記モノクローナル抗体が抗原結合領域を含む抗体断片である、請求項１から３６、３８及び３９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４１】
抗体断片がＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２断片である、請求項４０に記載の製剤。
【請求項４２】
前記モノクローナル抗体がＶＥＧＦを結合する、請求項１から４１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４３】
前記抗体がベバシズマブである、請求項４２に記載の製剤。
【請求項４４】
前記モノクローナル抗体がＣＤ２０を結合する、請求項１から４１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４５】
前記抗体がオビヌツズマブである、請求項４４に記載の製剤。
【請求項４６】
前記モノクローナル抗体が凝集を起こしやすい、請求項１から４５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４７】
製剤が−２０℃で少なくとも１２月、少なくとも１８月又は少なくとも２４月の間安定している、請求項１から４６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４８】
無菌である請求項１から４７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４９】
対象に投与される、請求項１から４８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５０】
静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＱ）又は筋肉内（ＩＭ）投与のための、請求項１から４９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５１】
前記モノクローナル抗体が約５０ｍｇ／ｍＬの量のベバシズマブであり、前記トレハロースが約６０ｍＭの量であり、前記リン酸ナトリウムが約２５ｍＭの量であり、且つ前記ポリソルベート２０が０．０４％の量であって、前記製剤が約６．２のｐＨを有する、請求項１に記載の製剤。
【請求項５２】
前記モノクローナル抗体が約５０ｍｇ／ｍＬの量のオビヌツズマブであり、前記トレハロースが約４０ｍＭの量であり、前記ヒスチジンが約２０ｍＭの量であり、且つ前記ポロキサマー１８８が０．０２％の量であって、前記製剤が約６．０のｐＨを有する、請求項１に記載の製剤。
【請求項５３】
請求項１から５２のいずれか一項に記載の安定した水性薬学的製剤を保持する容器を含む製造品。
【請求項５４】
治療用モノクローナル抗体の凝集を低減する方法であって、約４０ｍＭから約１２０ｍＭの量のトレハロース及び約１５ｍＭから約３５ｍＭの量のリン酸ナトリウムを含む製剤中に前記抗体を製剤化することを含み、前記製剤が約５．５から約７．０のｐＨを有し、前記モノクローナル抗体が製剤中約２５ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬの量で製剤化される、方法。
【請求項５５】
製剤中の前記トレハロースに対する前記モノクローナル抗体の重量比が約１．６５から約３．３０である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
製剤中の前記トレハロースに対する前記モノクローナル抗体の重量比が約１．７０から約２．９１である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記リン酸ナトリウムが約２２ｍＭから約２８ｍＭの量である、請求項５４から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記リン酸ナトリウムが約２５ｍＭの量である、請求項５４から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
治療用モノクローナル抗体の凝集を低減する方法であって、方法はトレハロース及びバッファーを含む製剤中に前記抗体を製剤化することを含み、製剤中の前記トレハロースに対する前記モノクローナル抗体の重量比が約１．６５から約４．９５であり、製剤が約５．５から約７．０のｐＨを有する、方法。
【請求項６０】
製剤中の前記トレハロースに対する前記モノクローナル抗体の重量比が約１．６５、１．７０、１．８０、２．００、２．０８、２．２０、２．３１、２．３８、２．４８、２．９１、３．００、３．３０、３．５０、４．００、４．５０、及び４．９５のいずれかである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
製剤中の前記トレハロースに対する前記モノクローナル抗体の重量比が約１．６５から約３．３０である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
製剤中の前記トレハロースに対する前記モノクローナル抗体の重量比が約１．７０から約２．９１である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
製剤中の前記トレハロースに対する前記モノクローナル抗体の重量比が約２．００から約３．００である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
前記モノクローナル抗体が約４５ｍｇ／ｍＬから約５５ｍｇ／ｍＬの量である、請求項５４から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記モノクローナル抗体が約５０ｍｇ／ｍＬの量である、請求項５４から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記モノクローナル抗体が約３５ｍｇ／ｍＬから約７５ｍｇ／ｍＬの量である、請求項５４から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記トレハロースが約５０ｍＭから約７０ｍＭの量である、請求項５４から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記トレハロースが約６０ｍＭの量である、請求項５４から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記トレハロースが約４０ｍＭから約８０ｍＭの量である、請求項５４から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記製剤が界面活性剤を更に含む、請求項５４から６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記界面活性剤がポリソルベート又はポロキサマーである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記ポリソルベートがポリソルベート２０である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記ポロキサマーがポロキサマー１８８である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記界面活性剤の濃度が約０．０１％から約０．１％である、請求項７０から７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記界面活性剤の濃度が約０．０１％から約０．０５％である、請求項７０から７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記界面活性剤の濃度が約０．０４％である、請求項７０から７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記製剤が約５．９から約６．５のｐＨを有する、請求項５４から７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記製剤が約６．２又は６．０のｐＨを有する、請求項５４から７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記モノクローナル抗体がＶＥＧＦを結合する、請求項５４から７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記抗体がベバシズマブである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記モノクローナル抗体がＣＤ２０を結合する、請求項５４から７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記抗体がオビヌツズマブである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
（Ａ）請求項１から５２のいずれか一項に記載の製剤を調製すること；及び（Ｂ）製剤中の抗体の物理的安定性、化学的安定性、又は生物活性を評価することを含む、薬学的製剤を作製する方法。
【請求項８４】
対象における疾患又は障害を治療するであって、疾患又は障害を治療するのに有効な量で請求項１から５２のいずれか一項に記載の製剤を対象に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連技術への相互参照
本出願は、２０１３年３月１３日に出願された米国仮出願第６１／７８０８９９号の利益を主張し、その全内容が本明細書に参照により援用される。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩテキストファイルでの以下の提出内容は、その全内容が本明細書に参照により援用される：コンピュータ読取可能形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１４６３９２０１２４４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、記録日：２０１４年３月１１日、サイズ：２７ＫＢ）。
【０００３】
発明の分野
本発明は、抗体を含む安定した水性薬学的製剤に関する。
【背景技術】
【０００４】
ここ数年、バイオテクノロジーにおける進歩は、組換えＤＮＡ技術を使用し、薬学的使用のための様々なタンパク質の生産を可能にした。タンパク質は従来の有機及び無機薬物と比べて、より大きくより複雑であるため（例えば複雑な三次元構造に加えて複数の官能基を有する）、このようなタンパク質の製剤は特別な問題を提示する。タンパク質が生物活性を保つためには、製剤は、タンパク質のアミノ酸の少なくともコア配列のコンフォメーション完全性を無傷なまま保持すると同時に、タンパク質の複数の官能基を分解から保護しなければならない。タンパク質の分解経路は、化学的不安定性（例えば、新規な化学物質を生じる結合形成又は切断によるタンパク質の修飾を含む任意のプロセス）又は物理的不安定性（例えば、タンパク質の高次構造の変化）を含み得る。化学的不安定性は、アミド分解、ラセミ化、加水分解、酸化、ベータ脱離又はジスルフィド交換から生じ得る。物理的不安定性は、例えば変性、凝集、沈殿又は吸着から生じ得る。三つの最も一般的なタンパク質分解経路は、タンパク質凝集、アミド分解及び酸化である。Cleland et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4): 307-377 (1993)。
【０００５】
薬学的応用のために使用されるタンパク質に含まれるものは抗体である。薬学的抗体に関する安定した水性製剤が開発されてきた。例えば、国際公開第２０１１／０８４７５０を参照のこと。当該技術分野において、ダイマー、可溶型凝集体、及び微粒子の形成を軽減する、抗ＶＥＧＦ抗体及び抗ＣＤ２０抗体などの抗体を含む安定した水性薬学的製剤に対する需要がある。
【０００６】
ＣＤ２０及び抗ＣＤ２０抗体
ＣＤ２０分子（ヒトＢ−リンパ球限定分化抗原又はＢｐ３５とも称される）は、およそ３５ｋＤの分子量を有し、前Ｂ及び成熟Ｂリンパ球に位置する、疎水性の膜貫通タンパクである（Valentine, M.A., et al., J. Biol. Chem. 264(19) (1989) 11282-11287; and Einfield, D.A., et al. (1988) EMBO J. 7(3):711-717; Tedder, T.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (1988) 208-12; Stamenkovic, I., et al., J. Exp. Med. 167 (1988) 1975-80; Tedder, T.F., et al., J. Immunol. 142 (1989) 2560-8）。ＣＤ２０は、末梢血又はリンパ系器官由来のＢ細胞の９０％を超える表面で発見され、早期の前Ｂ細胞発生中に発現し、形質細胞分化まで残存する。ＣＤ２０は、正常Ｂ細胞及び悪性Ｂ細胞の両方に存在する。特に、ＣＤ２０はＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の９０％以上で発現する（Anderson, K.C., et al., Blood 63(6) (1984) 1424-1433)）が、造血幹細胞、プロＢ細胞、正常な形質細胞、又はその他正常な組織には見られない(Tedder, T.F., et al., J. Immunol. 135(2) (1985) 973- 979）。
【０００７】
ＣＤ２０タンパク質の８５アミノ酸カルボキシル末端領域は、細胞質中に位置する。この領域の長さは、それぞれ３、３、２８、１５、及び１６アミノ酸の比較的短い細胞質内領域を有するＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＧ重鎖又は組織適合抗原クラスＩ１ａ若しくはβ鎖等のその他Ｂ細胞特異的表面構造の長さとは対照的である（Komaromy, M., et al., NAR 11  (1983) 6775-6785）。最後の６カルボキシル末端アミノ酸のうち、２１は酸性残基であるが、２のみが塩基性であり、この領域が強い正味の負電荷を有することを示している。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＮＰ−６９０６０５である。ＣＤ２０は、Ｂ細胞の活性化及び分化プロセスの早期段階（複数可）の調節に関与し（Tedder, T.F., et al., Eur. J. Immunol. 16 (8) (1986) 881-887）、カルシウムイオンチャネルとして機能し得る（Tedder, T.F., et al., J. Cell. Biochem. 14D (1990) 195）と考えられる。
【０００８】
ＣＤ２０結合の様式及び生物活性が大きく異なる、２つの異なる型の抗ＣＤ２０抗体が存在する（Cragg, M.S., et al., Blood, 103 (2004) 2738-2743; and Cragg, M.S., et al., Blood, 101 (2003) 1045-1052）。例えばリツキシマブ（通常のグリコシル化パターンを有する非脱フコシル化、非糖鎖改変抗体、「ＲＴＸ」とも命名される）のようなＩ型抗体は、補体媒介性の細胞傷害性において効力があるが、例えばトシツモマブ（Ｂ１）、１１Ｂ８、ＡＴ８０又はヒト化Ｂ‐Ｌｙ１抗体のようなＩＩ型抗体は、ホスファチジルセリン曝露を伴うカスパーゼ非依存性アポトーシスを介して標的の細胞死を効率的に開始させる。
【発明の概要】
【０００９】
一態様において、本発明は、製剤がモノクローナル抗体、トレハロース及びバッファーを含み、製剤中のトレハロースに対するモノクローナル抗体の重量比が約１．６５から約４．９５であり、製剤が約５．５から約７．０のｐＨを有する、安定した水性薬学的製剤を提供する。いくつかの実施態様において、トレハロースに対するモノクローナル抗体の重量比は約１．６５から約３．３０である。いくつかの実施態様において、トレハロースに対するモノクローナル抗体の重量比は約１．７０から約２．９１である。いくつかの実施態様において、トレハロースに対するモノクローナル抗体の重量比は約２．００から約３．３０である。いくつかの実施態様において、トレハロースに対するモノクローナル抗体の重量比は、約１．６５、１．７０、１．８０、１．９０、２．００、２．０８、２．１０、２．２０、２．３０、２．３１、２．３８、２．４０、２．４８、２．５０、２．６０、２．７０、２．８０、２．９０、２．９１、３．００、３．１０、３．２０、３．３０、３．４０、３．５０、３．７０、３．８０、３．９０、４．００、４．１０、４．２０、４．３０、４．４０、４．５０、４．６０、４．７０、４．８０、４．９０、及び４．９５（これらの数字間の全ての値を含む）のいずれかである。いくつかの実施態様において、製剤中のモノクローナル抗体は約２５ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様において、製剤中のモノクローナル抗体は約４５ｍｇ／ｍＬから約５５ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様において、製剤中のモノクローナル抗体は約３５ｍｇ／ｍＬから約７５ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様において、製剤中のトレハロースは約４０ｍＭから約１２０ｍＭである。いくつかの実施態様において、製剤中のトレハロースは約５０ｍＭから約７０ｍＭである。いくつかの実施態様において、製剤中のトレハロースは約４０ｍＭから約８０ｍＭである。いくつかの実施態様において、バッファーは約１５ｍＭから約３５ｍＭの量である。いくつかの実施態様において、バッファーはヒスチジン又はリン酸ナトリウムである。
【００１０】
別の態様において、本発明は、（ａ）約２５ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬの量のモノクローナル抗体；（ｂ）約４０ｍＭから約１２０ｍＭの量のトレハロース；及び（ｃ）約１５ｍＭから約３５ｍＭの量のリン酸ナトリウムを含み、前記製剤が約５．５から約７．０のｐＨ及び任意選択的な界面活性剤を有する、安定した水性薬学的製剤を提供する。いくつかの実施態様において、製剤中のトレハロースに対するモノクローナル抗体の重量比は約１．６５から約３．３０である。いくつかの実施態様において、トレハロースに対するモノクローナル抗体の重量比は約１．７０から約２．９１である。いくつかの実施態様において、トレハロースに対するモノクローナル抗体の重量比は約２．００から約３．３０である。いくつかの実施態様において、トレハロースに対するモノクローナル抗体の重量比は、約１．６５、１．７０、１．８０、１．９０、２．００、２．０８、２．１０、２．２０、２．３０、２．３１、２．３８、２．４０、２．４８、２．５０、２．６０、２．７０、２．８０、２．９０、２．９１、３．００、３．１０、３．２０、３．３０、３．４０、３．５０、３．７０、３．８０、３．９０、４．００、４．１０、４．２０、４．３０、４．４０、４．５０、４．６０、４．７０、４．８０、４．９０、及び４．９５（これらの数字間の全ての値を含む）のいずれかである。
【００１１】
いくつかの実施態様において、本明細書中に記載される製剤中のモノクローナル抗体は約３０ｍｇ／ｍＬから約９０ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬから約８５ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬから７５ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬから約８０ｍｇ／ｍＬ、約４５ｍｇ／ｍＬから約７０ｍｇ／ｍＬ、又は約４５ｍｇ／ｍＬから約５５ｍｇ／ｍＬの量である。いくつかの実施態様において、製剤中のモノクローナル抗体は約２５ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ、約４５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約５５ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ、約６５ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ、約７５ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約８５ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ、約９５ｍｇ／ｍＬ、又は約１００ｍｇ／ｍＬ（これらの数字間の全ての値を含む）である。いくつかの実施態様において、製剤中のモノクローナル抗体は約４５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、又は約５５ｍｇ／ｍＬである。
【００１２】
いくつかの実施態様において、本明細書中に記載される製剤は、約４０ｍＭから約１１０ｍＭ、約４５ｍＭから約１１０ｍＭ、約５０ｍＭから約１００ｍＭ、約５０ｍＭから約９０ｍＭ、約５０ｍＭから約７０ｍＭ、又は約４０ｍＭから約８０ｍＭのトレハロースを含む。いくつかの実施態様において、製剤中のトレハロースは、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１０５ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１１５ｍＭ、又は約１２０ｍＭ（これらの数字間の全ての値を含む）である。いくつかの実施態様において、製剤中のトレハロースは約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、又は約６５ｍＭである。いくつかの実施態様において、製剤はバッファーとしてリン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施態様において、製剤中のリン酸ナトリウムは、約１５ｍＭから約３０ｍＭ、約２０ｍＭから３０ｍＭ、約２２ｍＭから約２８ｍＭである。いくつかの実施態様において、製剤中のリン酸ナトリウムは、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２２ｍＭ、約２５ｍＭ、約２８ｍＭ、約３０ｍＭ、又は約３５ｍＭ（これらの数字間の全ての値を含む）である。いくつかの実施態様において、製剤は、約４５ｍｇ／ｍＬから約５５ｍｇ／ｍＬの量のモノクローナル抗体、約５０ｍＭから約７０ｍＭの量のトレハロース、及び２２ｍＭから約２８ｍＭの量のリン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施態様において、製剤は、約４５ｍｇ／ｍＬから約５５ｍｇ／ｍＬの量のモノクローナル抗体、約５０ｍＭから約７０ｍＭの量のトレハロース、及び２２ｍＭから約２８ｍＭの量のリン酸ナトリウムを含み、トレハロースに対する抗体の重量比は約１．７０から約２．９１である。いくつかの実施態様において、製剤は、約５０ｍｇ／ｍＬの量のモノクローナル抗体、約６０ｍＭの量のトレハロース及び約２５ｍＭの量のリン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施態様において、製剤はバッファーとしてヒスチジン（例えばＬ−ヒスチジン）を含む。いくつかの実施態様において、製剤中のヒスチジンは、約１５ｍＭから約３０ｍＭ、約２０ｍＭから３０ｍＭ、約２２ｍＭから約２８ｍＭである。いくつかの実施態様において、製剤中のヒスチジンは、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２２ｍＭ、約２５ｍＭ、約２８ｍＭ、約３０ｍＭ、又は約３５ｍＭ（これらの数字間の全ての値を含む）である。いくつかの実施態様において、製剤は、約５０ｍｇ／ｍＬの量のモノクローナル抗体、約４０ｍＭの量のトレハロース及び約２０ｍＭの量のヒスチジンを含む。
【００１３】
いくつかの実施態様において、本明細書中に記載される製剤は、界面活性剤を更に含む。いくつかの実施態様において、界面活性剤はポリソルベート（例えばポリソルベート２０）又はポロキサマー（例えばポロキサマー１８８）である。いくつかの実施態様において、界面活性剤の濃度は、約０．０１％から約０．１％、約０．０１％から約０．０５％、又は約０．０２％から約０．０４％である。いくつかの実施態様において、界面活性剤の濃度は、約０．０１％、約０．０２％、約０．０３％、約０．０４％、約０．０５％、又は約０．１％（これらの数字間の全ての値を含む）である。
【００１４】
いくつかの実施態様において、本明細書中に記載される製剤は、約５．５から約６．５、約５．８から約６．８、約５．９から約６．５、約６．０から約６．５、約６．０から約６．４、又は約６．０から約６．２のｐＨを有する。いくつかの実施態様において、製剤は、約５．６、約５．８、約５．９、約６．０、約６．２、約６．４、約６．５、約６．８、又は約７．０（これらの数字間の全ての値を含む）のｐＨを有する。
【００１５】
いくつかの実施態様において、本明細書中に記載される製剤中のモノクローナル抗体は、事前凍結乾燥されていない。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は完全長抗体である。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体はＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体はヒト化抗体、キメラ抗体又はヒト抗体である。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は、抗原結合領域を含む抗体断片である。いくつかの実施態様において、抗体断片はＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２断片である。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体はＶＥＧＦを結合する。いくつかの実施態様において、抗体はベバシズマブである。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は凝集を起こしやすい。いくつかの実施態様において、製剤は、約４５ｍｇ／ｍＬから約５５ｍｇ／ｍＬの量のベバシズマブ、約５０ｍＭから約７０ｍＭの量のトレハロース、及び２２ｍＭから約２８ｍＭの量のリン酸ナトリウム、及び０．０４％の量のポリソルベート２０を含み、且つ約５．９から約６．５のｐＨを有する。いくつかの実施態様において、製剤は、約４５ｍｇ／ｍＬから約５５ｍｇ／ｍＬの量のベバシズマブ、約５０ｍＭから約７０ｍＭの量のトレハロース、及び２２ｍＭから約２８ｍＭの量のリン酸ナトリウム、及び０．０４％の量のポリソルベート２０を含み、且つ約５．９から約６．５のｐＨを有し、トレハロースに対する抗体の重量比は約１．７０から約２．９１である。いくつかの実施態様において、製剤は、約５０ｍｇ／ｍＬの量のベバシズマブ、約６０ｍＭの量のトレハロース、約２５ｍＭの量のリン酸ナトリウム、及び０．０４％の量のポリソルベート２０を含み、約６．２のｐＨを有する。
【００１６】
いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は、事前凍結乾燥されていない。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は完全長抗体である。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体はＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体はヒト化抗体、キメラ抗体又はヒト抗体である。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は、抗原結合領域を含む抗体断片である。いくつかの実施態様において、抗体断片はＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２断片である。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体はＣＤ２０を結合する。いくつかの実施態様において、ＣＤ２０を結合する抗体は、本明細書中に記載されるヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体である。いくつかの実施態様において、ＣＤ２０を結合する抗体は、配列番号３から配列番号１９より選択される重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号２０の軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体である。いくつかの実施態様において、抗体はオビヌツズマブである。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は凝集を起こしやすい。いくつかの実施態様において、製剤は、約４５ｍｇ／ｍＬから約５５ｍｇ／ｍＬの量のオビヌツズマブ、約５０ｍＭから約７０ｍＭの量のトレハロース、及び２２ｍＭから約２８ｍＭの量のリン酸ナトリウム、及び０．０４％の量のポリソルベート２０を含み、且つ約５．９から約６．５のｐＨを有する。いくつかの実施態様において、製剤は、約５０ｍｇ／ｍＬの量のオビヌツズマブ、約６０ｍＭの量のトレハロース、約２５ｍＭの量のリン酸ナトリウム、及び０．０４％の量のポリソルベート２０を含み、約６．２のｐＨを有する。いくつかの実施態様において、製剤は、約５０ｍｇ／ｍＬの量のオビヌツズマブ、約４０ｍＭの量のトレハロース、約２０ｍＭの量のヒスチジン、及び０．０２％の量のポロキサマー１８８を含み、約６．０のｐＨを有する。
【００１７】
いくつかの実施態様において、本明細書中に記載される製剤は、−２０℃で少なくとも約６か月間、少なくとも約１２か月間、少なくとも約１５か月間、少なくとも約１８か月間、少なくとも約１９か月間、少なくとも約２０か月間、又は少なくとも約２年間安定している。いくつかの実施態様において、製剤は無菌である。いくつかの実施態様において、製剤は対象への投与のためのものである。いくつかの実施態様において、製剤は静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＱ）又は筋肉内（ＩＭ）投与のためのものである。
【００１８】
別の態様において、本発明は、本明細書中に記載される安定した水性薬学的製剤を保持する容器を含む製造品を提供する。いくつかの実施態様において、製剤はモノクローナル抗体、トレハロース及びバッファーを含み、製剤中の前記トレハロースに対する前記モノクローナル抗体の重量比は約１．６５から約４．９５であり、製剤は約５．５から約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施態様において、製剤は、（ａ）約２５から約１００ｍｇ／ｍＬの量のモノクローナル抗体；（ｂ）約４０から約１２０ｍＭの量のトレハロース；及び（ｃ）約１５から約３５ｍＭの量のリン酸ナトリウムを含み、前記製剤は約５．５から約７．０のｐＨ及び任意選択的な界面活性剤を有する。いくつかの実施態様において、製剤中のトレハロースに対するモノクローナル抗体の重量比は約１．６５から約３．３０である。いくつかの実施態様において、トレハロースに対するモノクローナル抗体の重量比は約１．７０から約２．９１である。いくつかの実施態様において、トレハロースに対するモノクローナル抗体の重量比は約２．００から約３．３０である。いくつかの実施態様において、製剤中のトレハロースに対するモノクローナル抗体の重量比は、約１．６５、１．７０、１．８０、１．９０、２．００、２．０８、２．１０、２．２０、２．３０、２．３１、２．３８、２．４０、２．４８、２．５０、２．６０、２．７０、２．８０、２．９０、２．９１、３．００、３．１０、３．２０、３．３０、３．４０、３．５０、３．７０、３．８０、３．９０、４．００、４．１０、４．２０、４．３０、４．４０、４．５０、４．６０、４．７０、４．８０、４．９０、及び４．９５（これらの数字間の全ての値を含む）のいずれかである。
【００１９】
いくつかの実施態様において、製剤中のモノクローナル抗体は約３０ｍｇ／ｍＬから約９０ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬから約８５ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬから約７５ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬから約８０ｍｇ／ｍＬ、約４５ｍｇ／ｍＬから約７０ｍｇ／ｍＬ、又は約４５ｍｇ／ｍＬから約５５ｍｇ／ｍＬの量である。いくつかの実施態様において、製剤中のモノクローナル抗体は約２５ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ、約４５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約５５ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ、約６５ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ、約７５ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約８５ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ、約９５ｍｇ／ｍＬ、又は約１００ｍｇ／ｍＬ（これらの数字間の全ての値を含む）である。いくつかの実施態様において、製剤中のモノクローナル抗体は約４５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、又は約５５ｍｇ／ｍＬである。
【００２０】
いくつかの実施態様において、製剤は、約４０ｍＭから約１１０ｍＭ、約５０ｍＭから約１００ｍＭ、約５０ｍＭから約９０ｍＭ、約５０ｍＭから約７０ｍＭ、又は約４０から約８０ｍＭのトレハロースを含む。いくつかの実施態様において、製剤中のトレハロースは、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１０５ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１１５ｍＭ、又は約１２０ｍＭ（これらの数字間の全ての値を含む）である。いくつかの実施態様において、製剤中のトレハロースは約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、又は約６５ｍＭである。いくつかの実施態様において、製剤はバッファーとしてリン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施態様において、製剤中のリン酸ナトリウムは、約１５ｍＭから約３０ｍＭ、約２０ｍＭから３０ｍＭ、約２２ｍＭから約２８ｍＭである。いくつかの実施態様において、製剤中のリン酸ナトリウムは、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２２ｍＭ、約２５ｍＭ、約２８ｍＭ、約３０ｍＭ、又は約３５ｍＭ（これらの数字間の全ての値を含む）である。いくつかの実施態様において、製剤は、約４５ｍｇ／ｍＬから約５５ｍｇ／ｍＬの量のモノクローナル抗体、約５０ｍＭから約７０ｍＭの量のトレハロース、及び２２ｍＭから約２８ｍＭの量のリン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施態様において、製剤は、約４５ｍｇ／ｍＬから約５５ｍｇ／ｍＬの量のモノクローナル抗体、約５０ｍＭから約７０ｍＭの量のトレハロース、及び２２ｍＭから約２８ｍＭの量のリン酸ナトリウムを含み、トレハロースに対する抗体の重量比は約１．７０から約２．９１である。いくつかの実施態様において、製剤は、約５０ｍｇ／ｍＬの量のモノクローナル抗体、約６０ｍＭの量のトレハロース及び約２５ｍＭの量のリン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施態様において、製剤はバッファーとしてヒスチジン（例えばＬ−ヒスチジン）を含む。いくつかの実施態様において、製剤中のヒスチジンは、約１５ｍＭから約３０ｍＭ、約２０ｍＭから３０ｍＭ、約２２ｍＭから約２８ｍＭである。いくつかの実施態様において、製剤中のヒスチジンは、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２２ｍＭ、約２５ｍＭ、約２８ｍＭ、約３０ｍＭ、又は約３５ｍＭ（これらの数字間の全ての値を含む）である。いくつかの実施態様において、製剤は、約５０ｍｇ／ｍＬの量のモノクローナル抗体、約４０ｍＭの量のトレハロース及び約２０ｍＭの量のヒスチジンを含む。
【００２１】
いくつかの実施態様において、製剤は、界面活性剤を更に含む。いくつかの実施態様において、界面活性剤はポリソルベート（例えばポリソルベート２０）又はポロキサマー（例えばポロキサマー１８８）である。いくつかの実施態様において、界面活性剤の濃度は約０．０１％から約０．１％、約０．０１％から約０．０５％、又は約０．０２％から約０．０４％である。いくつかの実施態様において、界面活性剤の濃度は、約０．０１％、約０．０２％、約０．０３％、約０．０４％、約０．０５％、又は約０．１％（これらの数字間の全ての値を含む）である。
【００２２】
いくつかの実施態様において、製剤は、約５．５から約６．５、約５．８から約６．８、約５．９から約６．５、約６．０から約６．５、約６．０から約６．４、又は約６．０から約６．２のｐＨを有する。いくつかの実施態様において、製剤は、約５．６、約５．８、約５．９、約６．０、約６．２、約６．４、約６．５、約６．８、又は約７．０（これらの数字間の全ての値を含む）のｐＨを有する。
【００２３】
いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は、事前凍結乾燥されていない。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は完全長抗体である。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体はＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体はヒト化抗体、キメラ抗体又はヒト抗体である。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は、抗原結合領域を含む抗体断片である。いくつかの実施態様において、抗体断片はＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２断片である。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体はＶＥＧＦを結合する。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は凝集を起こしやすい。いくつかの実施態様において、製剤は、約４５ｍｇ／ｍＬから約５５ｍｇ／ｍＬの量のベバシズマブ、約５０ｍＭから約７０ｍＭの量のトレハロース、及び２２ｍＭから約２８ｍＭの量のリン酸ナトリウム、及び０．０４％の量のポリソルベート２０を含み、且つ約５．９から約６．５のｐＨを有する。いくつかの実施態様において、製剤は、約４５ｍｇ／ｍＬから約５５ｍｇ／ｍＬの量のベバシズマブ、約５０ｍＭから約７０ｍＭの量のトレハロース、及び２２ｍＭから約２８ｍＭの量のリン酸ナトリウム、及び０．０４％の量のポリソルベート２０を含み、且つ約５．９から約６．５のｐＨを有し、トレハロースに対する抗体の重量比は約１．７０から約２．９１である。いくつかの実施態様において、製剤は、約５０ｍｇ／ｍＬの量のベバシズマブ、約６０ｍＭの量のトレハロース、約２５ｍＭの量のリン酸ナトリウム、及び０．０４％の量のポリソルベート２０を含み、約６．２のｐＨを有する。
【００２４】
いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は、事前凍結乾燥されていない。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は完全長抗体である。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体はＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体はヒト化抗体、キメラ抗体又はヒト抗体である。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は、抗原結合領域を含む抗体断片である。いくつかの実施態様において、抗体断片はＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２断片である。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体はＣＤ２０を結合する。いくつかの実施態様において、ＣＤ２０を結合する抗体は、本明細書中に記載されるヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体である。いくつかの実施態様において、ＣＤ２０を結合する抗体は、配列番号３から配列番号１９より選択される重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号２０の軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体である。いくつかの実施態様において、抗体はオビヌツズマブである。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は凝集を起こしやすい。いくつかの実施態様において、製剤は、約４５ｍｇ／ｍＬから約５５ｍｇ／ｍＬの量のオビヌツズマブ、約５０ｍＭから約７０ｍＭの量のトレハロース、及び２２ｍＭから約２８ｍＭの量のリン酸ナトリウム、及び０．０４％の量のポリソルベート２０を含み、且つ約５．９から約６．５のｐＨを有する。いくつかの実施態様において、製剤は、約５０ｍｇ／ｍＬの量のオビヌツズマブ、約６０ｍＭの量のトレハロース、約２５ｍＭの量のリン酸ナトリウム、及び０．０４％の量のポリソルベート２０を含み、約６．２のｐＨを有する。いくつかの実施態様において、製剤は、約５０ｍｇ／ｍＬの量のオビヌツズマブ、約４０ｍＭの量のトレハロース、約２０ｍＭの量のヒスチジン、及び０．０２％の量のポロキサマー１８８を含み、約６．０のｐＨを有する。
【００２５】
いくつかの実施態様において、製剤は、−２０℃で少なくとも約６か月間、少なくとも約１２か月間、少なくとも約１５か月間、少なくとも約１８か月間、少なくとも約１９か月間、少なくとも約２０か月間、又は少なくとも約２年間安定している。いくつかの実施態様において、製剤は無菌である。いくつかの実施態様において、製剤は対象への投与のためのものである。いくつかの実施態様において、製剤は静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＱ）又は筋肉内（ＩＭ）投与のためのものである。
【００２６】
いくつかの実施態様において、容器はシリンジで穿刺可能なストッパーを備えるバイアルであり、バイアルは本明細書中に記載されるいずれかの製剤を含む。いくつかの実施態様において、バイアルは約２−８℃で保管される。いくつかの実施態様において、バイアルは約−２０℃で保管される。いくつかの実施態様において、バイアルは３ｃｃ、２０ｃｃ又は５０ｃｃバイアルである。
【００２７】
別の態様において、本発明は、タンク内に本明細書中に記載される製剤のいずれかを含むステンレス鋼タンクを提供する。いくつかの実施態様において、製剤は凍結している。
【００２８】
別の態様において、本発明は、治療的モノクローナル抗体の凝集を低減する方法を提供する。いくつかの実施態様において、該方法は、トレハロース及びバッファーを含む製剤中のモノクローナル抗体を製剤化することを含み、製剤中のトレハロースに対するモノクローナル抗体の重量比は約１．６５から約４．９５であり、製剤は約５．５から約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施態様において、該方法は、約４０ｍＭから約１２０ｍＭの量のトレハロース及び約１５ｍＭから約３５ｍＭの量のリン酸ナトリウムを含む製剤中の前記抗体を製剤化することを含み、前記製剤は約５．５から約７．０のｐＨを有し、前記モノクローナル抗体は製剤中約２５ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬの量で製剤化される。
【００２９】
本明細書中に記載される方法のいくつかの実施態様において、製剤中の前記トレハロースに対する前記モノクローナル抗体の重量比は約１．６５から約３．３０である。本明細書中に記載される方法のいくつかの実施態様において、トレハロースに対するモノクローナル抗体の重量比は約１．７０から約２．９１である。いくつかの実施態様において、トレハロースに対するモノクローナル抗体の重量比は約２．００から約３．３０である。いくつかの実施態様において、トレハロースに対するモノクローナル抗体の重量比は、約１．６５、１．７０、１．８０、１．９０、２．００、２．０８、２．１０、２．２０、２．３０、２．３１、２．３８、２．４０、２．４８、２．５０、２．６０、２．７０、２．８０、２．９０、２．９１、３．００、３．１０、３．２０、３．３０、３．４０、３．５０、３．７０、３．８０、３．９０、４．００、４．１０、４．２０、４．３０、４．４０、４．５０、４．６０、４．７０、４．８０、４．９０、及び４．９５（これらの数字間の全ての値を含む）のいずれかである。
【００３０】
いくつかの実施態様において、製剤中のモノクローナル抗体は約３０ｍｇ／ｍＬから約９０ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬから約８５ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬから約７５ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬから約８０ｍｇ／ｍＬ、約４５ｍｇ／ｍＬから約７０ｍｇ／ｍＬ、又は約４５ｍｇ／ｍＬから約５５ｍｇ／ｍＬの量である。いくつかの実施態様において、製剤中のモノクローナル抗体は約２５ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ、約４５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約５５ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ、約６５ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ、約７５ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約８５ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ、約９５ｍｇ／ｍＬ、又は約１００ｍｇ／ｍＬ（これらの数字間の全ての値を含む）である。いくつかの実施態様において、製剤中のモノクローナル抗体は約４５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、又は約５５ｍｇ／ｍＬである。
【００３１】
いくつかの実施態様において、製剤は、約４０ｍＭから約１１０ｍＭ、約５０ｍＭから約１００ｍＭ、約５０ｍＭから約９０ｍＭ、約５０ｍＭから約７０ｍＭ、又は約４０から約８０ｍＭのトレハロースを含む。いくつかの実施態様において、製剤中のトレハロースは、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１０５ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１１５ｍＭ、又は約１２０ｍＭである。いくつかの実施態様において、製剤中のトレハロースは、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、又は約６５ｍＭ（これらの数字間の全ての値を含む）である。いくつかの実施態様において、製剤はバッファーとしてリン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施態様において、製剤中のリン酸ナトリウムは、約１５ｍＭから約３０ｍＭ、約２０ｍＭから３０ｍＭ、約２２ｍＭから約２８ｍＭである。いくつかの実施態様において、製剤中のリン酸ナトリウムは、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２２ｍＭ、約２５ｍＭ、約２８ｍＭ、約３０ｍＭ、又は約３５ｍＭ（これらの数字間の全ての値を含む）である。いくつかの実施態様において、製剤は、約４５ｍｇ／ｍＬから約５５ｍｇ／ｍＬの量のモノクローナル抗体、約５０ｍＭから約７０ｍＭの量のトレハロース、及び２２ｍＭから約２８ｍＭの量のリン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施態様において、製剤は、約４５ｍｇ／ｍＬから約５５ｍｇ／ｍＬの量のモノクローナル抗体、約５０ｍＭから約７０ｍＭの量のトレハロース、及び２２ｍＭから約２８ｍＭの量のリン酸ナトリウムを含み、トレハロースに対する抗体の重量比は約１．７０から約２．９１である。いくつかの実施態様において、製剤は、約５０ｍｇ／ｍＬの量のモノクローナル抗体、約６０ｍＭの量のトレハロース及び約２５ｍＭの量のリン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施態様において、製剤はバッファーとしてヒスチジン（例えばＬ−ヒスチジン）を含む。いくつかの実施態様において、製剤中のヒスチジンは、約１５ｍＭから約３０ｍＭ、約２０ｍＭから３０ｍＭ、約２２ｍＭから約２８ｍＭである。いくつかの実施態様において、製剤中のヒスチジンは、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２２ｍＭ、約２５ｍＭ、約２８ｍＭ、約３０ｍＭ、又は約３５ｍＭ（これらの数字間の全ての値を含む）である。いくつかの実施態様において、製剤は、約５０ｍｇ／ｍＬの量のモノクローナル抗体、約４０ｍＭの量のトレハロース及び約２０ｍＭの量のヒスチジンを含む。
【００３２】
いくつかの実施態様において、製剤は、界面活性剤を更に含む。いくつかの実施態様において、界面活性剤はポリソルベート（例えばポリソルベート２０）又はポロキサマー（例えばポロキサマー１８８）である。いくつかの実施態様において、界面活性剤の濃度は、約０．０１％から約０．１％、約０．０１％から約０．０５％、又は約０．０２％から約０．０４％である。いくつかの実施態様において、界面活性剤の濃度は、約０．０１％、約０．０２％、約０．０３％、約０．０４％、約０．０５％、又は約０．１％（これらの数字間の全ての値を含む）である。
【００３３】
いくつかの実施態様において、製剤は、約５．５から約６．５、約５．８から約６．８、約５．９から約６．５、約６．０から約６．５、約６．０から約６．４、又は約６．０から約６．２のｐＨを有する。いくつかの実施態様において、製剤は、約５．６、約５．８、約５．９、約６．０、約６．２、約６．４、約６．５、約６．８、又は約７．０（これらの数字間の全ての値を含む）のｐＨを有する。
【００３４】
いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は、事前凍結乾燥されていない。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は完全長抗体である。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体はＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体はヒト化抗体、キメラ抗体又はヒト抗体である。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は、抗原結合領域を含む抗体断片である。いくつかの実施態様において、抗体断片はＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２断片である。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体はＶＥＧＦを結合する。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は凝集を起こしやすい。いくつかの実施態様において、製剤は、約４５ｍｇ／ｍＬから約５５ｍｇ／ｍＬの量のベバシズマブ、約５０ｍＭから約７０ｍＭの量のトレハロース、及び２２ｍＭから約２８ｍＭの量のリン酸ナトリウム、及び０．０４％の量のポリソルベート２０を含み、且つ約５．９から約６．５のｐＨを有する。いくつかの実施態様において、製剤は、約４５ｍｇ／ｍＬから約５５ｍｇ／ｍＬの量のベバシズマブ、約５０ｍＭから約７０ｍＭの量のトレハロース、及び２２ｍＭから約２８ｍＭの量のリン酸ナトリウム、及び０．０４％の量のポリソルベート２０を含み、且つ約５．９から約６．５のｐＨを有し、トレハロースに対する抗体の重量比は約１．７０から約２．９１である。いくつかの実施態様において、製剤は、約５０ｍｇ／ｍＬの量のベバシズマブ、約６０ｍＭの量のトレハロース、約２５ｍＭの量のリン酸ナトリウム、及び０．０４％の量のポリソルベート２０を含み、約６．２のｐＨを有する。
【００３５】
いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は、事前凍結乾燥されていない。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は完全長抗体である。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体はＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体はヒト化抗体、キメラ抗体又はヒト抗体である。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は、抗原結合領域を含む抗体断片である。いくつかの実施態様において、抗体断片はＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２断片である。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体はＣＤ２０を結合する。いくつかの実施態様において、ＣＤ２０を結合する抗体は、本明細書中に記載されるヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体である。いくつかの実施態様において、ＣＤ２０を結合する抗体は、配列番号３から配列番号１９より選択される重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号２０の軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体である。いくつかの実施態様において、抗体はオビヌツズマブである。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は凝集を起こしやすい。いくつかの実施態様において、製剤は、約４５ｍｇ／ｍＬから約５５ｍｇ／ｍＬの量のオビヌツズマブ、約５０ｍＭから約７０ｍＭの量のトレハロース、及び２２ｍＭから約２８ｍＭの量のリン酸ナトリウム、及び０．０４％の量のポリソルベート２０を含み、且つ約５．９から約６．５のｐＨを有する。いくつかの実施態様において、製剤は、約５０ｍｇ／ｍＬの量のオビヌツズマブ、約６０ｍＭの量のトレハロース、約２５ｍＭの量のリン酸ナトリウム、及び０．０４％の量のポリソルベート２０を含み、約６．２のｐＨを有する。いくつかの実施態様において、製剤は、約５０ｍｇ／ｍＬの量のオビヌツズマブ、約４０ｍＭの量のトレハロース、約２０ｍＭの量のヒスチジン、及び０．０２％の量のポロキサマー１８８を含み、約６．０のｐＨを有する。
【００３６】
いくつかの実施態様において、製剤は、−２０℃で少なくとも約６か月間、少なくとも約１２か月間、少なくとも約１５か月間、少なくとも約１８か月間、少なくとも約１９か月間、少なくとも約２０か月間、又は少なくとも約２年間安定している。いくつかの実施態様において、製剤は無菌である。いくつかの実施態様において、製剤は対象への投与のためのものである。いくつかの実施態様において、製剤は静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＱ）又は筋肉内（ＩＭ）投与のためのものである。
【００３７】
別の態様において、本発明は（Ａ）本明細書中に記載される製剤のいずれか一つを調製すること；及び（ｂ）製剤中の抗体の物理的安定性、化学的安定性、又は生物活性を評価することを含む薬学的製剤を作製する方法を提供する。いくつかの実施態様において、製剤中の抗体の物理的安定性、化学的安定性、又は生物活性は、製剤が（例えば−２０℃又は−４０℃で）保管された後、約６か月間、約１２か月間、約１８か月間、又は約２４か月間評価される。
【００３８】
別の態様において、本発明は、疾患又は障害を治療するのに有効な量の本明細書中に記載の製剤を対象に投与することを含む、対象における疾患又は障害を治療する方法を提供する。いくつかの実施態様において、製剤はＶＥＧＦを結合する抗体を含む。いくつかの実施態様において、抗体はベバシズマブである。いくつかの実施態様において、疾患はがんである。いくつかの実施態様において、がんは結腸直腸がん、肺がん、乳がん、腎性がん、及び膠芽細胞腫から選択される。
【００３９】
別の態様において、本発明は、疾患又は障害を治療するのに有効な量の本明細書中に記載の製剤を対象に投与することを含む、対象における疾患又は障害を治療する方法を提供する。いくつかの実施態様において、製剤はＣＤ２０を結合する抗体を含む。いくつかの実施態様において、抗体はオビヌツズマブである。いくつかの実施態様において、疾患はがんである。いくつかの実施態様において、がんはＣＤ２０発現がん、例えばリンパ腫、リンパ性白血病、及び多発性骨髄腫である。
【００４０】
本明細書中に記載される様々な実施態様の一つ、いくつか又は全ての特性は、本発明のその他実施態様を形成するために組み合わされてもよいことが理解されるべきである。本発明のこれら及びその他の態様は、当業者にとって明らかであろう。本発明のこれら及びその他の実施態様は、以下の詳細な説明により更に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、−４０℃又は−２０℃の温度で２４か月間保管された場合の、様々なベバシズマブ製剤中の高分子量種の存在を示したグラフである。
【図２】図２は、加速凝集条件を受けているにもかかわらず、高分子量種の形成に対し耐性があるロバストなベバシズマブ製剤を表すグラフである。
【図３】図３は、２４か月間保管された場合の、ベバシズマブ製剤中の高分子量種の形成の減少を示したグラフである。（Ａ）図３Ａに示されるベバシズマブ製剤Ｂ（ＦＢ）は、−２０℃で保管された場合、製剤Ａ（ＦＡ）と比較して、加速凝集条件下でさえも凝集の形成に耐性がある。（Ｂ）−４０℃でのベバシズマブ製剤の保管は、全凝集体形成におけるいかなる増加も妨げた。
【図４】図４は、２４か月間保管した場合の、トレイリングエッジダイマー（ＴＥＤ）形成（矢印）を表すピークを含有する製剤Ａ（ＦＡ）と比較した、ベバシズマブ製剤Ｂ（ＦＢ）中のＴＥＤ形成が存在しないことを示すサイズ排除カラムクロマトグラムである。
【図５】図５は、加速凝集条件下０℃未満で保管された場合の、異なる抗体／トレハロース比を含有するオビヌツズマブ製剤中の高分子量種（ＨＭＷＳ）の形成を示すグラフである。Ａ）−２０℃で５２週間保管されたオビヌツズマブ製剤。Ｂ）−４０℃で５２週間保管されたオビヌツズマブ製剤。
【図６】図６は、０℃で５２週間保管された選択されたオビヌツズマブ製剤のサイズ排除クロマトグラムの例を示す。Ｆ２：３５ｍｇ／ｍＬオビヌツズマブ、１６０ｍＭトレハロース；Ｆ５：３５ｍｇ／ｍＬオビヌツズマブ、４０ｍＭトレハロース。
【図７】図７は、−２０℃保管のオビヌツズマブのデータセットの重回帰（ＭＬＲ）分析の結果を示す。Ａ）−２０℃での高分子量種（ＨＭＷＳ）形成に関するスケール化係数及び中央化係数を含む係数プロット。Ｂ）ｃＭＡｂ ＊ ｃＴｒｅｈに関する交互作用プロット。Ｃ）時間を高レベルで固定し、ｃＭＡｂ及びｃＴｒｅｈを軸としたＨＭＷＳに関する反応等高線図。
【００４２】
詳細な説明
Ｉ．定義
本発明を詳細に説明する前に、本発明は特定の組成物又は生物系に限定されるものではなく、当然多種多様であり得ることを理解すべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施態様を説明するためのものであり、限定することを目的としていないことも理解すべきである。本明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を指さない限り複数形を含む。したがって、例えば、「分子（ａ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」についての言及は、任意選択的に二以上のそのような分子等の組合せを含む。
【００４３】
本明細書で用いられる「約」という用語は、容易にこの技術分野における当業者に知られているそれぞれの値についての通常の誤差範囲を意味する。本明細書中の「およそ」の値又はパラメータへの言及は、その値又はパラメータ自体に対する実施態様を含む（記載する）。
【００４４】
本明細書に記載される本発明の態様及び実施態様は、態様及び実施態様を「含む」及び／又は「から本質的になる」を含む。
【００４５】
用語「薬学的製剤」は、有効で含有される活性成分の生物活性を許容するような形態であって、製剤を投与する対象にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。そのような製剤は無菌である。「薬学的に許容される」賦形剤（ビヒクル、添加剤）は、用いられる活性成分の有効量を提供するために、対象となる哺乳動物に対して合理的に投与され得るものである。
【００４６】
「無菌」製剤は、無菌であるか又は全ての生存する微生物及びそれらの胞子がないか若しくは本質的にない。
【００４７】
「凍結」製剤は、０℃未満の製剤である。一般的に、凍結製剤はフリーズドライされておらず、また、事前又は事後に凍結乾燥されない。ある実施態様において、凍結製剤は、（ステンレス鋼タンク中での）保管のための凍結原薬又は（最終的なバイアル構成における）凍結薬物製品を含む。
【００４８】
「安定した」製剤は、その中のタンパク質が、保管時に、物理的安定性及び／又は化学的安定性及び／又は生物活性を本質的に保持する製剤である。好ましくは、製剤は、保管時に、その物理的及び化学的安定性並びにその生物活性を本質的に保持する。保管期間は、一般的に製剤の意図された保管期間に基づき選択される。タンパク質の安定性の測定に関する様々な分析技術が当該技術分野で入手でき、例えばPeptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) and Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)に概説がある。安定性は、選択された期間に関して選択された温度測定され得る。ある実施態様において、製剤は約４０℃で少なくとも約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又はそれ以上の日数間安定している。ある実施態様において、製剤は約４０℃で少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、又はそれ以上の週数間安定している。ある実施態様において、製剤は約２５℃で少なくとも１か月間、２か月間、３か月間、４か月間、５か月間、６か月間、７か月間、８か月間、９か月間、１０か月間、１１か月間、１２か月間、１３か月間、１４か月間、１５か月間、１６か月間、１７か月間、１８か月間、１９か月間、２０か月間、２１か月間、２２か月間、２３か月間、２４か月間、又はそれ以上の月数間安定している。ある実施態様において、製剤は約５℃で少なくとも１か月間、２か月間、３か月間、４か月間、５か月間、６か月間、７か月間、８か月間、９か月間、１０か月間、１１か月間、１２か月間、１３か月間、１４か月間、１５か月間、１６か月間、１７か月間、１８か月間、１９か月間、２０か月間、２１か月間、２２か月間、２３か月間、２４か月間、又はそれ以上の月数間安定している。ある実施態様において、製剤は約−２０℃で少なくとも１か月間、２か月間、３か月間、４か月間、５か月間、６か月間、７か月間、８か月間、９か月間、１０か月間、１１か月間、１２か月間、１３か月間、１４か月間、１５か月間、１６か月間、１７か月間、１８か月間、１９か月間、２０か月間、２１か月間、２２か月間、２３か月間、２４か月間、２５か月間、２６か月間、２７か月間、２８か月間、２９か月間、３０か月間、３１か月間、３２か月間、３３か月間、３４か月間、３５か月間、３６か月間、３７か月間、３８か月間、３９か月間、４０か月間、４１か月間、４２か月間、４３か月間、４４か月間、４５か月間、４６か月間、４７か月間、４８か月間、又はそれ以上の月数間安定している。ある実施態様において、製剤は約５℃又は−２０℃で少なくとも１か月間、２か月間、３か月間、４か月間、５か月間、６か月間、７か月間、８か月間、９か月間、１０か月間、１１か月間、１２か月間、１３か月間、１４か月間、１５か月間、１６か月間、１７か月間、１８か月間、１９か月間、２０か月間、２１か月間、２２か月間、２３か月間、２４か月間、２５か月間、２６か月間、２７か月間、２８か月間、２９か月間、３０か月間、３１か月間、３２か月間、３３か月間、３４か月間、３５か月間、３６か月間、３７か月間、３８か月間、３９か月間、４０か月間、４１か月間、４２か月間、４３か月間、４４か月間、４５か月間、４６か月間、４７か月間、４８か月間、又はそれ以上の月数間安定している。更に、製剤は好ましくは、例えば１、２、３、４、又は５サイクルの凍結及び解凍の後に、製剤を（例えば、−２０℃、−４０℃又は−７０℃へ）凍結すること及び解凍することの後に安定している。安定性は、凝集体形成の評価（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを使用した、濁度の測定及び／又は目視検査による）；陽イオン交換クロマトグラフィー、イメージキャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）又はキャピラリーゾーン電気泳動を使用して電荷不均一性を評定することによる；アミノ末端又はカルボキシ末端配列分析；質量分析；還元抗体とインタクトな抗体を比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析；ペプチドマップ（例えばトリプシン又はＬＹＳ−Ｃ）分析；抗体の生物活性又は抗原結合機能を評価すること等を含む、多種多様な方法において定性的及び／又は定量的に評価され得る。不安定性は、凝集、アミド分解（例えばＡｓｎアミド分解）、酸化（例えばＭｅｔ酸化）、異性化（例えばＡｓｐ異性化）、クリッピング／加水分解／断片化（例えばヒンジ領域断片化）、スクシンイミド形成、不対システイン、Ｎ−末端伸長、Ｃ−末端プロセシング、グリコシル化変化等のうちの一又は複数を含んでもよい。
【００４９】
タンパク質は、それが、色及び／又は透明性の目視検査において、又はＵＶ光散乱又はサイズ排除クロマトグラフィーによる測定により、凝集、沈殿及び／又は変性の徴候を示さないかほとんど示さない場合に、薬学的製剤中において「その物理的安定性を保っている」。
【００５０】
任意の時点で、タンパク質が下記のようなその生物活性を依然保っていると考えられる場合に、タンパク質は「その化学的安定性を保っている」。化学的安定性は化学変成したタンパク質の形態を検出し定量化することによって評価され得る。化学変成はサイズ変化（例えばクリッピング）を含んでもよく、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び／又はマトリックス支援レーザー脱離イオン化法／飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ  ＭＳ）を使用して評価され得る。化学変成の他のタイプは、荷電変化（例えばアミド分解の結果として生じる）を含み、例えばイオン交換クロマトグラフィー又はｉｃＩＥＦによって評価され得る。
【００５１】
例えば抗原結合アッセイにおいて決定されるように、任意の時点での抗体の生物活性が、薬学的製剤が調製された時間に示した生物活性の約１０％内（アッセイのエラーの範囲内）である場合、抗体は「その生物活性を保っている」。他の抗体の「生物活性」アッセイは、本明細書中以下に詳述される。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、モノクローナル抗体の「生物活性」とは、抗原に結合する抗体の能力を指す。それは、抗原に結合する抗体を更に含み、インビトロ又はインビボで測定され得る測定可能な生物学的反応をもたらし得る。このような活性はアンタゴニスト性又はアゴニスト性であってもよい。
【００５３】
本明細書中の「アミド分解」モノクローナル抗体は、その一又は複数のアスパラギン残基が、例えばアスパラギン酸又はイソ−アスパラギン酸に誘導体化されているものである。
【００５４】
「アミド分解を起こしやすい」抗体は、アミド分解し易いと発見されている一又は複数の残基を含むものである。
【００５５】
「凝集を起こしやすい」抗体は、特に凍結及び／又は撹拌の際に、他の抗体分子（一又は複数）と凝集することが発見されているものである。
【００５６】
「断片化を起こしやすい」抗体は、例えばそのヒンジ領域で、二以上の断片に切断されることが発見されているものである。
【００５７】
「アミド分解、凝集、又は断片化を低減する」とは、異なる製剤中で製剤化されたモノクローナル抗体と比較し、アミド分解、凝集、又は断片化を防止する又はその量を低下させることを意図する。
【００５８】
製剤化された抗体は好ましくは、本質的に純粋であり、望ましくは本質的にホモジニアス（例えば混在タンパク質等を含まない）である。「本質的に純粋な」抗体とは、組成物の全重量に対して少なくとも約９０重量％の抗体、好ましくは少なくとも約９５重量％を含む組成物を意味する。「本質的にホモジニアスな」抗体とは、組成物の全重量に対して少なくとも約９９重量％を含む組成物を意味する。
【００５９】
「アイソトニック（等張性）」とは、対象の製剤が、ヒト血液と本質的に同じ浸透圧を有することを意味する。アイソトニック製剤は一般に、約２５０から３５０ｍＯｓｍの浸透圧を有する。等張性は、例えば蒸気圧又は氷結型浸透圧計を使用して測定され得る。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、「バッファー」とは、酸−塩基コンジュゲート成分の作用によってｐＨにおける変化に抵抗する緩衝液を指す。本発明のバッファーは好ましくは、約４．５から約７．０の範囲、好ましくは約５．６から約７．０、例えば５．６から６．９、５．７から６．８、５．８から６．７、５．９から６．６、５．９から６．５、６．０、６．０から６．４、又は６．１から６．３の範囲のｐＨである。ある実施態様において、バッファーは、ｐＨ５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、又は７．０を有する。例えば、リン酸ナトリウムは、この範囲でｐＨを制御するバッファーの一例である。
【００６１】
本明細書において使用される場合、「界面活性剤」とは、界面活性薬剤、好ましくは非イオン性界面活性剤を指す。本明細書中の界面活性剤の例は、ポリソルベート（例えばポリソルベート２０及びポリソルベート８０）；ポロキサマー（例えばポロキサマー１８８）；トリトン；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウリル硫酸ナトリウム；ナトリウムオクチルグルコシド；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、又はステアリル−スルホベタイン；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−又はステアリル−サルコシン；リノレイル−、ミリスチル−、又はセチル−ベタイン；ラウロアミドプロピル−、コカミドプロピル−、リノールアミドプロピル−、ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、又はイソステアラミドプロピル−ベタイン（例えばラウロアミドプロピル）；ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、又はイソステアラミドプロピル−ジメチルアミン；ナトリウムメチルココイル−、又は二ナトリウムメチルオレイル−タウレート；及びＭＯＮＡＱＵＡＴＴＭシリーズ（Mona Industries, Inc., Paterson、N.J.）；ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、並びにエチレン及びプロピレングリコール共重合体（例えばＰｌｕｒｏｎｉｃｓ、Ｐｆ６８等）；等を含む。一実施態様において、本明細書中の界面活性剤はポリソルベート２０である。
【００６２】
薬理学的意味において、本発明の文脈では、抗体の「治療的有効量」とは、抗体が有効である治療について、障害を防止又は治療するのに有効な量を指す。「障害」とは、抗体を用いた治療から恩恵を受けるであろういずれかの状態である。これは、哺乳動物を問題の障害に罹らせる病態を含む、慢性及び急性障害を含む。
【００６３】
「保存料」は、製剤中の細菌の作用を本質的に低減するために製剤中に任意選択的に含まれ得る化合物であり、例えば、多回使用製剤の製造を容易にする。潜在的な保存料の例は、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ヘキサメトニウムクロライド、ベンザルコニウムクロライド（アルキルベンジルジメチルアンモニウムクロライド（アルキル基は長鎖化合物である）の混合物）、及びベンゼトニウムクロライドを含む。他のタイプの保存料は、フェノール、ブチル及びベンジルアルコールなどの芳香族アルコール、メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、並びにｍ−クレゾールを含む。一実施態様において、本明細書中の保存料はベンジルアルコールである。
【００６４】
本明細書中で使用される場合の用語「ＶＥＧＦ」又は「ＶＥＧＦ−Ａ」は、Leung et al. (1989) Science 246:1306, and Houck et al. (1991) Mol. Endocrin 5:1806によって記載されているように、１６５−アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子と、関連する１２１−、１８９−、及び２０６−アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子、並びにそれらの天然に存在する対立遺伝子型及びプロセシング型を指す。また、用語「ＶＥＧＦ」は、マウス、ラット又は霊長類などの非ヒト動物種由来のＶＥＧＦも指す。特定の種由来のＶＥＧＦは、ヒトＶＥＧＦに関してはｈＶＥＧＦ、マウスＶＥＧＦに関してはｍＶＥＧＦなどの用語で表されることがある。また、用語「ＶＥＧＦ」は、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸８から１０９、又は１から１０９を含むポリペプチドの切断型を指すために使用される。そのようなＶＥＧＦ型を指す場合、本願では例えば、「ＶＥＧＦ（８−１０９）」、「ＶＥＧＦ（１−１０９）」又は「ＶＥＧＦ１６５」と表してもよい。「切断型の」天然のＶＥＧＦのアミノ酸位置は、天然のＶＥＧＦ配列に示される数で示される。例えば、切断型の天然ＶＥＧＦのアミノ酸位置１７（メチオニン）は、天然のＶＥＧＦ中の位置１７（メチオニン）でもある。切断型の天然ＶＥＧＦは、天然のＶＥＧＦに匹敵するＫＤＲ及びＦｌｔ−１レセプター結合親和性を有する。
【００６５】
「ＶＥＧＦ生物活性」は、任意のＶＥＧＦレセプターへの結合又は任意のＶＥＧＦシグナル伝達活性、例えば正常及び異常な血管新生及び脈管形成の調節（Ferrara and Davis-Smyth (1997) Endocrine Rev. 18:4-25; Ferrara (1999) J. Mol. Med. 77:527-543）；胚性脈管形成及び血管新生の促進（Carmeliet et al. (1996) Nature 380:435-439; Ferrara et al. (1996) Nature 380:439-442）；並びに雌の生殖器系及び骨の成長及び軟骨形成における周期的血管増殖の調節を含む（Ferrara et al. (1998) Nature Med. 4:336-340; Gerber et al. (1999) Nature Med. 5:623-628）。血管新生及び脈管形成における血管新生因子の存在に加えて、多面的増殖因子として、ＶＥＧＦは、他の生理学的プロセス、例えば内皮細胞の生存、血管透過性及び血管拡張、単球走化性及びカルシウム流入において、複数の生物学的効果を示す（Ferrara and Davis-Smyth (1997)、上記及びCebe-Suarez et al. Cell. Mol. Life Sci. 63:601-615 (2006)）。更に、近年の研究では、少しの非内皮細胞型、例えば網膜色素上皮細胞、膵管細胞、及びシュワン細胞における分裂促進効果が報告されている。Guerrin et al. (1995) J. Cell Physiol. 164:385-394; Oberg-Welsh et al. (1997) Mol. Cell. Endocrinol. 126:125-132; Sondell et al. (1999) J. Neurosci. 19:5731-5740。
【００６６】
「ＶＥＧＦアンタゴニスト」又は「ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト」は、ＶＥＧＦへ結合し、ＶＥＧＦ発現量を低減し、又はＶＥＧＦ生物活性（一又は複数のＶＥＧＦレセプターへのＶＥＧＦ結合並びにＶＥＧＦ媒介性血管新生及び内皮細胞生存又は増殖を含むが、これらに限定されない）を中和し、ブロックし、阻害し、抑制し、低減し、若しくは干渉しうる分子を指す。本発明の方法において有用なＶＥＧＦ特異的アンタゴニストとして含まれるものは、ＶＥＧＦに特異的に結合するポリペプチド、抗ＶＥＧＦ抗体及びその抗原結合断片、ＶＥＧＦに特異的に結合しそれによって一又は複数のレセプターへの結合を隔離するレセプター分子及びその誘導体、融合タンパク質（例えばＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ））、並びにＶＥＧＦ１２１−ゲロニン（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ）である。ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストはまた、ＶＥＧＦポリペプチドのアンタゴニスト変異体、ＶＥＧＦに対するアンチセンス核酸塩基オリゴマー、ＶＥＧＦに対する低分子ＲＮＡ分子、ＲＮＡアプタマー、ペプチボディ、及びＶＥＧＦに対するリボザイムも含む。ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストはまた、ＶＥＧＦに結合する非ペプチド小分子も含み、ＶＥＧＦ生物活性をブロックし、阻害し、抑制し、低減し、又は干渉し得る。したがって、「ＶＥＧＦ活性」は、ＶＥＧＦのＶＥＧＦ媒介性生物活性を特に含む。ある実施態様において、ＶＥＧＦアンタゴニストは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上でＶＥＧＦの発現量又は生物活性を低減し又は阻害する。
【００６７】
「抗ＶＥＧＦ抗体」は、十分な親和性及び特異性でＶＥＧＦに結合する抗体である。ある実施態様において、選択された抗体は、通常ＶＥＧＦに対する十分な結合親和性を有し、例えば、抗体は、１００ｎＭ−１ｐＭ間のＫｄ値でｈＶＥＧＦに結合し得る。抗体の親和性は、例えば表面プラズモン共鳴に基づくアッセイ（例えばＰＣＴ出願公開番号第２００５／０１２３５９号に記載されるＢＩＡｃｏｒｅアッセイなど）；酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）；及び競合アッセイ（例えばＲＩＡ）により決定され得る。
【００６８】
ある実施態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ活性が関与している疾患又は状態を標的とすること及び妨げることにおける治療剤として使用され得る。また、抗体は、例えば治療としての有効性を評価するために、他の生物活性アッセイを施してもよい。このようなアッセイは、当該技術分野で公知であり、標的抗原に依存し、抗体としての使用が意図されている。例として、ＨＵＶＥＣ阻害アッセイ；腫瘍細胞増殖阻害アッセイ（例えば、国際公開第８９／０６６９２号に記載；抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）及び補体媒介性細胞傷害性（ＣＤＣ）アッセイ（米国特許第５５００３６２号）；並びにアゴニスト活性又は造血アッセイ（国際公開第９５／２７０６２号を参照のこと）を含む。抗ＶＥＧＦ抗体は通常、ＶＥＧＦ−Ｂ又はＶＥＧＦ−Ｃなどの他のＶＥＧＦホモログにも、Ｐ１ＧＦ、ＰＤＧＦ又はｂＦＧＦなどの他の増殖因子にも結合しないであろう。一実施態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は、ハイブリドーマＡＴＣＣ ＨＢ１０７０９によって産生されるモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である。別の実施態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は、ベバシズマブ（ＢＶ；ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））として知られる抗体を含むがこれに限定されない、Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599に従って生成される組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である。
【００６９】
「ｒｈｕＭＡｂ  ＶＥＧＦ」又は「アバスチン（登録商標）」としても知られる抗ＶＥＧＦ抗体「ベバシズマブ（ＢＶ）」は、Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599に従って生成される組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である。これは、ヒトＶＥＧＦのそのレセプターへの結合をブロックするマウス抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ４．６．１由来の抗原結合相補性決定領域と変異したヒトＩｇＧ１フレームワーク領域を含有する。大部分のフレームワーク領域を含む、ベバシズマブのおよそ９３％のアミノ酸配列はヒトＩｇＧ１に由来し、配列の約７％はマウス抗体Ａ４．６．１に由来する。ベバシズマブは、約１４９０００ダルトンの分子質量であり、グリコシル化される。ベバシズマブ及び他のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体は、２００５年２月２６日に発行された米国特許第６８８４８７９号に更に記載されており、その全開示が参照により本明細書中に援用される。
【００７０】
本明細書において使用される場合、用語「Ｂ２０シリーズポリペプチド」は、ＶＥＧＦに結合する抗体を含むポリペプチドを指す。Ｂ２０シリーズポリペプチドは、限定するものではないが、米国特許出願公開第２００６／０２８０７４７号、米国特許出願公開第２００７／０１４１０６５号及び／又は米国特許出願公開第２００７／００２０２６７号に記載されたＢ２０抗体又はＢ２０誘導抗体の配列に由来する抗体を含み、これらの特許出願の内容は参照により明示的に本明細書中に援用される。一実施態様において、Ｂ２０シリーズポリペプチドは、米国特許出願公開第２００６／０２８０７４７号、米国特許出願公開第２００７／０１４１０６５号及び／又は米国特許出願公開第２００７／００２０２６７号に記載されたＢ２０−４．１である。別の実施態様において、Ｂ２０シリーズポリペプチドは米国特許第７９１００９８号に記載されたＢ２０−４．１．１であり、その全開示は参照により明示的に本明細書中に援用される。
【００７１】
本明細書において使用される場合、用語「Ｇ６シリーズポリペプチド」は、ＶＥＧＦに結合する抗体を含むポリペプチドを指す。Ｇ６シリーズポリペプチドは、限定するものではないが、米国特許出願公開第２００６／０２８０７４７号、米国特許出願公開第２００７／０１４１０６５号及び／又は米国特許出願公開第２００７／００２０２６７号に記載されたＧ６抗体又はＧ６誘導抗体の配列に由来する抗体を含む。米国特許出願公開第２００６／０２８０７４７号、米国特許出願公開第２００７／０１４１０６５号及び／又は米国特許出願公開第２００７／００２０２６７号に記載されたＧ６シリーズポリペプチドは、限定するものではないが、Ｇ６−８、Ｇ６−２３及びＧ６−３１を含む。
【００７２】
更なる抗体については、米国特許第７０６０２６９号、同第６５８２９５９号、同第６７０３０２０号；同第６０５４２９７号；国際公開第９８／４５３３２号；国際公開第９６／３００４６号；国際公開第９４／１０２０２号；欧州特許第０６６６８６８号；米国特許出願公開第２００６／００９３６０号、同第２００５／０１８６２０８号、同第２００３／０２０６８９９号、同第２００３／０１９０３１７号、同第２００３／０２０３４０９号及び同第２００５／０１１２１２６号；並びにPopkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)を参照のこと。ある実施態様において、他の抗体は、残基Ｆ１７、Ｍ１８、Ｄ１９、Ｙ２１、Ｙ２５、Ｑ８９、Ｉ９１、Ｋ１０１、Ｅ１０３及びＣ１０４を含むか、あるいは残基Ｆ１７、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｄ６３、Ｉ８３及びＱ８９を含むヒトＶＥＧＦ上の機能的エピトープに結合するものを含む。
【００７３】
他の抗ＶＥＧＦ抗体もまた知られており、例えば、Liang et al., J Biol Chem 281, 951-961 (2006)に記載される。
【００７４】
本明細書において使用される場合の「ＣＤ２０」はヒトＢ−リンパ球抗原ＣＤ２０（ＣＤ２０、Ｂ−リンパ球表面抗原Ｂ１、Ｌｅｕ−１６、Ｂｐ３５、ＢＭ５、及びＬＦ５としても知られる；その配列はＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースエントリー番号Ｐ１１８３６により特徴づけられる）を指し、およそ３５ｋＤの分子量を有し、前Ｂ及び成熟Ｂリンパ球に位置する疎水性の膜貫通タンパクである（Valentine, M.A., et al., J. Biol. Chem. 264(19) (1989 11282-11287; Tedder, T.F., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (1988) 208-12; Stamenkovic, I., et al., J. Exp. Med. 167 (1988) 1975-80; Einfeld, D.A., et al., EMBO J. 7 (1988) 711-7; Tedder, T.F., et al., J. Immunol. 142 (1989) 2560-8）。対応するヒト遺伝子は、膜貫通４ドメイン、サブファミリーＡ、メンバー１であり、ＭＳ４Ａ１としても知られる。この遺伝子は、膜貫通４Ａ遺伝子ファミリーのメンバーをコードする。この新生タンパク質ファミリーのメンバーは、共通構造特徴及び類似イントロン／エクソンのスプライス境界により特徴づけられ、造血細胞及び非リンパ系組織間の固有の発現パターンを示す。この遺伝子は、Ｂ−細胞の形質細胞への発生及び分化において役割を果たすＢ−リンパ球表面分子をコードする。このファミリーメンバーは、ファミリーメンバーのクラスター間、１１ｑ１２に局在する。この遺伝子の選択的スプライシングは、同じタンパク質をコードする二つの転写変異体をもたらす。
【００７５】
用語「ＣＤ２０」及び「ＣＤ２０抗原」は、本明細書において区別せずに使用され、細胞により天然に発現したか又はＣＤ２０遺伝子でトランスフェクトされた細胞上に発現したヒトＣＤ２０のホモログの任意の変異体、アイソフォーム及び種を含む。本発明の抗体のＣＤ２０抗原への結合は、ＣＤ２０を不活性化することにより、ＣＤ２０を発現する細胞（例えば腫瘍細胞）の死滅を媒介する。ＣＤ２０を発現する細胞の死滅は、以下の機序の一又は複数により生じ得る：細胞死／アポトーシス誘発、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ。
【００７６】
当該技術分野で認識されているＣＤ２０の同義語は、Ｂ−リンパ球抗原ＣＤ２０、Ｂ−リンパ球表面抗原Ｂ１、Ｌｅｕ−１６、Ｂｐ３５、ＢＭ５、及びＬＦ５を含む。
【００７７】
本発明による用語「抗ＣＤ２０抗体」は、ＣＤ２０抗原に特異的に結合する抗体である。抗ＣＤ２０抗原への抗ＣＤ２０抗体の結合特性及び生物活性に応じて、抗ＣＤ２０抗体の二つの型（Ｉ型及びＩＩ型抗ＣＤ２０抗体）がCragg, M.S., et al., Blood 103 (2004) 2738-2743; and Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052により区別され得る。表１を参照のこと。
2019055962.tif 000003
【００７８】
ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、例えばヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体ＩｇＧ１（国際公開第２００５／０４４８５９号に記載されるようなキメラヒト化ＩｇＧ１抗体）、１１Ｂ８  ＩｇＧ１（国際公開第２００４／０３５６０７号に記載）、及びＡＴ８０  ＩｇＧ１を含む。典型的には、ＩｇＧ１アイソタイプのＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、特徴的なＣＤＣ特性を示す。ＩｇＧ１アイソタイプのＩ型抗体と比較して、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、（ＩｇＧ１アイソタイプの場合）減少したＣＤＣを有する。
【００７９】
Ｉ型抗ＣＤ２０抗体の例は、例えばリツキシマブ、ＨＩ４７  ＩｇＧ３（ＥＣＡＣＣ、ハイブリドーマ）、２Ｃ６  ＩｇＧ１（国際公開第２００５／１０３０８１号に記載）、２Ｆ２  ＩｇＧ１（国際公開第２００４／０３５６０７号及び同第２００５／１０３０８１号に記載）及び２Ｈ７  ＩｇＧ１（国際公開第２００４／０５６３１２号に記載）を含む。
【００８０】
本発明のアフコシル化抗ＣＤ２０抗体は、好ましくはＩＩ型抗ＣＤ２０抗体であり、より好ましくは、国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号に記載されるようなアフコシル化ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体である。
【００８１】
「リツキシマブ」抗体（参照抗体；Ｉ型抗ＣＤ２０抗体の例）は、ヒトＣＤ２０抗原に対する遺伝子操作キメラヒトガンマ１マウス定常ドメイン含有モノクローナル抗体である。しかしながら、この抗体は糖改変されておらず、アフコシル化されていないため、少なくとも８５％のフコースの量を有する。このキメラ抗体は、ヒトガンマ１定常ドメインを含み、１９９８年４月１７日に発行され、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに付与された米国特許第５７３６１３７号（Ａｎｄｅｒｓｅｎ等）の「Ｃ２Ｂ８」という名称で同定されている。リツキシマブは、再発性又は難治性の低悪性度又は濾胞性のＣＤ２０陽性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫の患者の治療に対して承認されている。インビトロ作用機序研究は、リツキシマブがヒト補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を呈することを示している（Reff, M.E., et. al, Blood 83(2) (1994) 435-445）。加えて、リツキシマブは、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を測定するアッセイにおいて活性を呈する。
【００８２】
「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」なる用語は、国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号に開示されたヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体を指し、これらは、マウスモノクローナル抗ＣＤ２０抗体Ｂ−Ｌｙ１（マウス重鎖の可変領域（ＶＨ）：配列番号１；マウス軽鎖の可変領域（ＶＬ）：配列番号２−Poppema, S. and Visser, L., Biotest Bulletin 3 (1987) 131-139を参照のこと）を、ＩｇＧ１由来のヒト定常ドメインを用いてキメラ化し、続いてヒト化することにより取得された（国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号を参照のこと）。これらの「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号に詳細に開示されている。
【００８３】
一実施態様において、「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、配列番号３から配列番号１９の群から選択される重鎖の可変領域（ＶＨ）を有する（国際公開第２００５／０４４８５９及び国際公開第２００７／０３１８７５号のＢ−ＨＨ２からＢ−ＨＨ９及びＢ−ＨＬ８からＢ−ＨＬ１７）。特定の実施態様において、このような可変ドメインは、配列番号３、４、７、９、１１、１３及び１５からなる群より選択される（国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号のＢ−ＨＨ２、ＢＨＨ−３、Ｂ−ＨＨ６、Ｂ−ＨＨ８、Ｂ−ＨＬ８、Ｂ−ＨＬ１１及びＢ−ＨＬ１３）。特定の実施態様において、「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、配列番号２０の軽鎖（ＶＬ）の可変領域（国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号のＢ−ＫＶ１）を有する。特定の実施態様において、「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、配列番号７の重鎖（ＶＨ）の可変領域（国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号のＢ−ＨＨ６）を有する。更に、一実施態様において、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、ＩｇＧ１抗体である。本発明によれば、かかるアフコシル化ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、国際公開第２００５／０４４８５９号、国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００７／０３１８７５号、Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180及び国際公開第９９／１５４３４２号に記載された手順に従ってＦｃ領域において糖改変（ＧＥ）される。一実施態様において、アフコシル化糖改変ヒト化Ｂ−Ｌｙ１はＢ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１  ＧＥである。一実施態様において、抗ＣＤ２０抗体はオビヌツズマブ（INN、WHO Drug Information, Vol. 26, No. 4, 2012, p. 453で推奨）。本明細書で使用される場合、オビヌツズマブは、ＧＡ１０１又はＲＯ５０７２７５９の同義語である。これは、全ての旧版を差し替え（例えばVol. 25, No. 1, 2011, p.75-76）、元はアフツズマブとして知られている（INN, WHO Drug Information, Vol. 23, No. 2, 2009, p. 176;Vol. 22, No. 2, 2008, p. 124で推奨）。いくつかの実施態様において、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖又はその抗原結合断片を含む。いくつかの実施態様において、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、配列番号２１の三つの重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域及び配列番号２２の三つの軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む。
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【００８４】
いくつかの実施態様において、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、アフコシル化糖改変ヒト化Ｂ−Ｌｙ１である。このような糖改変ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、Ｆｃ領域において改変されたグリコシル化パターンを有しており、好ましくは、フコース残基のレベルが低下している。好ましくは、フコース量はＡｓｎ２９７のオリゴ糖の全量の６０％以下である（一実施態様において、フコース量は４０％から６０％の間であり、別の実施態様において、フコース量は５０％以下であり、更に別の実施態様において、フコース量は３０％以下である）。更に、Ｆｃ領域のオリゴ糖は二分されている。これらの糖改変ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は増加したＡＤＣＣを有する
【００８５】
オリゴ糖成分は、物理的安定性、プロテアーゼ攻撃に対する耐性、免疫系との相互作用、薬物動態、及び特定の生物活性を含む、治療用糖タンパク質の効能に関連した特性に有意に影響し得る。そのような特性は、オリゴ糖の有無だけでなく、その特定の構造にも依存し得る。オリゴ糖構造と糖タンパク質機能との間の一般化がなされ得る。例えば、あるオリゴ糖構造は、特定の糖結合タンパク質との相互作用を通じて血流からの糖タンパク質の迅速な排除を媒介する一方、他のものは抗体に結合し、望まれない免疫反応を引き起こす（Jenkins, N., et al., Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-81）。
【００８６】
哺乳動物細胞は、ヒトへの応用に最も適合性のある形態にタンパク質をグリコシル化するその能力のために、治療用糖タンパク質生産のための好ましい宿主である（Cumming, D.A., et al., Glycobiology 1 (1991) 115-30; Jenkins, N., et al., Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-81）。細菌は非常に希にしかタンパク質をグリコシル化せず、酵母、糸状菌、昆虫及び植物細胞等の他のタイプの一般的な宿主と同様に、血流からの迅速な排除、望ましくない免疫相互作用、及びある特定の場合では、生物活性の低下に関与するグリコシル化パターンを生じる。哺乳動物細胞の中で、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、最近２０年間に最も一般的に使用されている。適切なグリコシル化パターンを与えるのに加えて、これらの細胞は、遺伝的に安定で、高度に生産性のクローン細胞株の一貫した産生を可能とする。これらは、簡単なバイオリアクター中で、無血清培地を使用して高密度で培養することが可能で、安全かつ再現性のよいバイオプロセスの開発を可能にする。他の一般的に使用される動物細胞は、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＮＳＯ−及びＳＰ２／０−マウス骨髄腫細胞を含む。より最近では、トランスジェニック動物由来の生産物もまた試験されている（Jenkins, N., et al., Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-981）。
【００８７】
全ての抗体は、重鎖定常領域の保存位置に炭水化物構造を含み、各アイソタイプは、Ｎ結合型等構造の別個のアレイを有し、これらはタンパク質集合、分泌又は機能的活性に様々に影響する（Wright, A., and Morrison, S.L., Trends Biotech. 15 (1997) 26-32）。結合したＮ結合炭水化物の構造は、プロセシングの度合いに応じてかなり変化し、高マンノースの多重に分岐した、並びに二分岐複合体オリゴ糖を含み得る（Wright, A., and Morrison, S.L., Trends Biotech. 15 (1997) 26-32）。典型的には、特定のグリコシル化部位で結合したコアオリゴ糖構造の不均一なプロセシングが存在し、モノクローナル抗体であっても複数の糖形態として存在する。同様に、抗体のグリコシル化における大きな差異が細胞株の間で生じることが示されており、異なる培養条件下で増殖した所定の細胞株に対して更に僅かな差異が見られる（Lifely, M.R., et al., Glycobiology 5(8) (1995) 813-22）。
【００８８】
単純な生産プロセスを維持し、有意な望ましくない副作用を潜在的に回避しながら、効力を大きく増加させる一つの方法は、Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180及び米国特許第６６０２６８４号に記載されるように、そのオリゴ糖成分を操作することにより、モノクローナル抗体の天然の細胞媒介性エフェクター機能を亢進させることである。がん免疫療法において最も一般的に使用される抗体であるＩｇＧ１型抗体は、各ＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に保存されたＮ結合型グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に結合した二つの複合二分岐オリゴ糖は、ＣＨ２ドメイン間に埋まり、ポリペプチド主鎖との広範な接触を形成し、その存在は、抗体が抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）等のエフェクター機能を媒介するのに必須である（Lifely, M.R., et al., Glycobiology 5 (1995) 813-822; Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A., and Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32）。
【００８９】
二分岐オリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ１１（「ＧｎＴＩＩ１７ｙ」）のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における過剰発現が、操作されたＣＨＯ細胞により生産される抗神経芽細胞腫キメラモノクローナル抗体（ｃｈＣＥ７）のインビトロＡＤＣＣ活性を有意に増加させることが既に示されている（Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180；及び国際公開第９９／１５４３４２号を参照のこと。これらの全内容は参照により本明細書中に援用される。）。抗体ｃｈＣＥ７は、高い腫瘍親和性及び特異性を有するが、ＧｎＴＩＩＩ酵素を欠く標準的な工業用細胞株において生産された場合、殆ど効力を有さず臨床的に有用ではない非コンジュゲートモノクローナル抗体の大きなクラスに属する（Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180）。その研究は、二分岐非フコシル化オリゴ多糖を含む、定常領域（Ｆｃ）に結合した二分岐オリゴ糖の割合の増加も引き起こす、ＧｎＴＩＩＩを発現するように、抗体産生細胞を操作することにより、天然に存在する抗体に見出されるレベルを超えて、ＡＤＣＣ活性の大幅な増加が達成され得ることを最初に示したものである。
【００９０】
「治療」とは、治療的処置及び予防的又は防止的対策の両方を指す。治療を必要とする対象は、既にその疾患を有している者、並びに、その疾患を予防すべき者を含む。
【００９１】
「障害」とは、治療から恩恵を受けるであろういずれかの状態で、哺乳動物を問題の障害に罹らせる病態を含む、慢性及び急性障害又は疾患を含むがこれらに限定されない。障害は、血管新生障害を含む。本明細書において使用される「血管新生障害」とは、異常な血管新生又は異常な血管透過性若しくは漏出を含むいずれかの状態を指す。本明細書において治療されるべき血管新生障害の非限定的な例は、悪性及び良性腫瘍；非白血病及びリンパ性悪性疾患；並びに特に腫瘍（がん）転移を含む。
【００９２】
「異常な血管新生」は、病状又は病状を引き起こす状態において、過剰に又はそうでなければ不適切に新生血管が成長する場合（例えば、医学的観点から望ましくない血管新生の位置、タイミング、度合い及び発生）に生じる。いくつかの場合、過剰な、非制御の、又は不適切な血管新生は、病状の悪化又は病状の原因に寄与する新生血管成長が存在する場合に生じる。新生血管は、病変組織に栄養を送り、正常組織を破壊し、がんの場合、新生血管は腫瘍細胞を血液循環中に漏らし、他の器官に留まること（腫瘍転移）を可能にする。異常な血管新生は、限定するものではないが、がん、特に血管固形腫瘍及び転移性腫瘍（結腸、肺がん（特に小細胞肺がん）、又は前立腺がん）、眼球血管新生により生じる疾患、特に糖尿病性失明、一次性糖尿病性網膜症又は加齢性黄斑変性症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼ヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、網膜血管新生及びルベオーシス；乾癬、乾癬性関節炎、血管芽腫、例えば血管腫；炎症性腎疾患、例えば糸球体腎炎、特にメサンギウム増殖性糸球体腎炎、溶血性尿毒症症候群、糖尿病性腎症又は高血圧性腎硬化症；様々な炎症性疾患、例えば関節炎、特に関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬、サルコイドーシス、動脈硬化症並びに移植、子宮内膜症又は慢性喘息及びその他状態の後に生じる疾患を含む。
【００９３】
「異常血管透過性」は、疾患状態又は疾患状態を導く状態において、血管と血管外区画との間の液体、分子（例えば、イオン及び栄養素）及び細胞（例えばリンパ球）の流れが過剰又は他に不適切（例えば、医学的観点から望ましくない血管透過性の位置、タイミング、度合い又は発生）である場合に生じる。異常な血管透過性は、血管を通した、イオン、水、栄養素、又は細胞の過剰な又は他に不適切な「漏出」を導き得る。いくつかの場合において、過剰な、非制御的な、又は他に不適切な血管透過性又は血管漏出は、例えば脳腫瘍を含む腫瘍を伴う浮腫；悪性腫瘍を伴う腹水症；メイグス症候群；肺炎症；ネフローゼ症候群；心膜液貯留；胸水；心筋梗塞及び脳卒中後の状態など心血管疾患を伴う透過性等を含む疾患状態を悪化又は誘発する。本発明は、異常血管透過性又は漏出に伴う疾患又は障害を発生した又は発生する危険性のあるそれらの患者を治療することを考慮する。
【００９４】
用語「細胞増殖性疾患」及び「増殖性疾患」とは、ある程度の異常な細胞増殖と関係している疾患を指す。一実施態様において、細胞増殖性疾患はがんである。一実施態様において、細胞増殖性疾患は腫瘍である。
【００９５】
本明細書において使用される「腫瘍」とは、悪性又は良性であるかを問わず、全ての腫瘍性細胞成長及び増殖並びに全ての前がん性及びがん性の細胞及び組織を指す。用語「がん」、「がん性」、「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」とは、本明細書において言及される場合、互いを排除しない。
【００９６】
用語「がん」及び「がん性」とは、未制御の細胞増殖によって典型的に特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を指す。がんの例は、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病及びリンパ性腫瘍を含む。このようながんのより具体的な例は、扁平上皮細胞がん（例えば上皮性扁平細胞がん）、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺癌、及び肺の扁平上皮癌腫を含む）、腹膜がん、肝細胞がん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）又は腹部（ｓｔｏｍａｃｈ）がん（消化器がん及び胃腸がんを含む）、膵臓がん、膠芽細胞腫、子宮頸管がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、尿路の癌、肝癌、乳がん、大腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓又は腎性がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝臓癌、肛門部の癌腫、陰茎癌腫、メラノーマ、表在性伸展メラノーマ、黒色癌前駆症メラノーマ、末端性黒子性メラノーマ、結節性メラノーマ、多発性骨髄腫及びＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小非分割細胞ＮＨＬ；バルキー疾患ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；及びワルデンストロームのマクログロブリン病を含む）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；毛様細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、並びに、母斑症と関係する異常な血管性増殖、浮腫（脳腫瘍と関係するものなど）、メイグス症候群、脳、並びに頭頸部がん及び関連する転移を含む。ある実施態様において、本発明の抗体による治療に影響を受けやすいがんは、乳がん、結腸直腸がん、直腸がん、非小細胞肺がん、膠芽細胞種、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎細胞がん、前立腺がん、肝臓がん、膵臓がん、柔組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌腫、頭頸部がん、卵巣がん、中皮腫及び多発性骨髄腫を含む。いくつかの実施態様において、がんは、小細胞肺がん、膠芽細胞種、神経芽細胞腫、メラノーマ、乳癌、胃がん、結腸直腸がん（ＣＲＣ）及び肝細胞癌から選択される。更にいくつかの実施態様において、がんは、それらのがんの転移型を含む、非小細胞肺がん、結腸直腸がん、膠芽細胞腫及び乳癌から選択される。
【００９７】
用語「抗がん療法」とは、がんを治療する際に有用な両方を指す。抗がん治療薬の例は、限定するものではないが、例えば、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞傷害剤、放射線療法に使用される薬剤、抗血管形成剤、アポトーシス剤、抗チューブリン薬剤、及びがんを治療するための他の薬剤、例として、抗ＨＥＲ−２抗体、抗ＣＤ２０抗体、上皮性増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）アンタゴニスト（例えばチロシンキナーゼ阻害剤）、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ阻害剤（例えばエルロチニブ（ＴａｒｃｅｖａＴＭ）、血小板由来増殖因子阻害剤（例えばＧｌｅｅｖｅｃＴＭ（メシル酸イマチニブ））、ＣＯＸ−２阻害剤（例えばセレコキシブ）、インターフェロン、サイトカイン、以下の標的ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ又はＶＥＧＦレセプター（複数可）、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２の一又は複数に結合するアンタゴニスト（例えば中和抗体）、及び他の生理活性かつ有機化学的薬剤などが含まれる。また、その組合せが本発明に包含される。
【００９８】
「血管形成因子又は薬剤」は、血管の発達を刺激するのに伴う、例えば血管新生、血管内皮細胞増殖、血管の安定性及び／又は脈管形成などを促進する増殖因子又はそのレセプターである。例えば、血管形成因子は、例えば、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦファミリーのメンバー及びそのレセプター（ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２及びＶＥＧＦＲ３）、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦファミリー、線維芽細胞増殖因子ファミリー（ＦＧＦ）、ＴＩＥリガンド（アンギオポイエチン、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ２）、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２、エフリン、Ｂｖ８、デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）、Ｄｅｌ−１、線維芽細胞増殖因子：酸性（ａＦＧＦ）及び塩基性（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ４、ＦＧＦ９、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ホリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＧＭ−ＣＳＦ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）／スキャッター因子（ＳＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、ＣＸＣＬ１２、レプチン、ミドカイン、ニューロフィリン、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、胎盤増殖因子、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、血小板由来増殖因子、特にＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦＲ−アルファ又はＰＤＧＦＲ−ベータ、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、プログラヌリン、プロリフェリン、形質転換増殖因子−アルファ（ＴＧＦ−アルファ）、形質転換増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−ベータ）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦアルファ）、Ａｌｋ１、ＣＸＣＲ４、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ４、Ｓｅｍａ３Ａ、Ｓｅｍａ３Ｃ、Ｓｅｍａ３Ｆ、Ｒｏｂｏ４などを含むが、これらに限定されるものではない。ＥＳＭ１及びパールカン等の血管新生を促進する因子も更に含むであろう。また、成長ホルモン、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、ＶＩＧＦ、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ＥＧＦ−様ドメイン、マルチプル７（ＥＧＦＬ７）、ＣＴＧＦ及びそのファミリーのメンバー、並びにＴＧＦ−アルファ及びＴＧＦ−ベータなどの、創傷治癒を促進する因子を含むであろう。例えば、Klagsbrun and D’Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39; Streit and Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179; Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12):1359-1364; Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556 （例えば公知の血管新生因子の一覧を示す表１）；及びSato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206を参照のこと。
【００９９】
「抗血管新生剤」又は「血管新生阻害剤とは、直接的又は間接的に、脈管形成又は望ましくない血管透過を阻害する、小分子量の物質、ポリヌクレオチド（例えば、阻害ＲＮＡ（ＲＮＡｉ又はｓｉＲＮＡ）を含む）ポリペプチド、単離したタンパク質、組換えタンパク質、抗体、又はそれらのコンジュゲート又は融合タンパク質を指す。抗血管形成剤は結合して血管形成因子又はそのレセプターの血管形成活性を遮断する薬剤を含むことが理解されるべきである。例えば、抗血管形成剤は、上記に定義したように血管形成剤に対する抗体又は他のアンタゴニスト、例えば、ＶＥＧＦ−Ａ又はＶＥＧＦ−Ａレセプター（例えばＫＤＲレセプター又はＦｌｔ−１レセプター）に対する抗体、ＶＥＧＦ−Ｃに対する抗体、抗ＰＤＧＦＲインヒビター、ＶＥＧＦレセプターシグナル伝達を遮断する小分子（例えば、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２８４、ＳＵ６６６８、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）／ＳＵ１１２４８（スニチニブリンゴ酸塩）、ＡＭＧ７０６、又は例えば国際公開第２００４／１１３３０４号に記載されるもの）である。抗血管新生剤は、以下の薬剤：ＶＥＧＦ阻害剤（例えばＶＥＧＦ−特異的アンタゴニスト）、ＥＧＦ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ、ImClone Systems, Inc., Branchburg, N.J.）、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムバブ、Amgen, Thousand Oaks, Calif.）、ＴＩＥ２阻害剤、ＩＧＦ１Ｒ阻害剤、ＣＯＸ−ＩＩ（シクロオキシゲナーゼＩＩ）阻害剤、ＭＭＰ−２（マトリックスメタロプロテイナーゼ  ２）阻害剤、及びＭＭＰ−９（マトリックスメタロプロテイナーゼ  ９）阻害剤、ＣＰ−５４７，６３２（Pfizer Inc., NY, USA）、アキシチニブ（Pfizer Inc.; AG-013736）、ＺＤ−６４７４（AstraZeneca）、ＡＥＥ７８８（Novartis）、ＡＺＤ−２１７１）、ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ（Regeneron/Aventis）、バタラニブ（ＰＴＫ−７８７、ＺＫ−２２２５８４としても知られる：Novartis & Schering A G）、マクジェン（ペガプタニブオクタナトリウム、ＮＸ−１８３８、ＥＹＥ−００１、Pfizer Inc./Gilead/Eyetech）、ＩＭ８６２（Cytran Inc. of Kirkland, Wash., USA）；リボザイム（Boulder, Colo.）及びカイロン（Emeryville, Calif.）からの合成リボザイムであるアンギオザイム並びにこれらの組合せを含む。その他の血管新生阻害剤は、トロンボスポンジン１、トロンボスポンジン２、コラーゲンＩＶ及びコラーゲンＸＶＩＩＩを含む。ＶＥＧＦ阻害剤は、米国特許第６５３４５２４号及び同第６２３５７６４号に開示されており、これらはあらゆる目的のために全体が援用される。また、抗血管新生剤には、天然の血管新生阻害剤、例えばアンジオスタチン、エンドスタチンなどが含まれる。例えば、Klagsbrun and D’Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39;Streit and Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179（例えば、悪性メラノーマにおける抗血管新生療法の一覧を示す表３）；Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12): 1359-1364;Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556（例えば、公知の抗血管新生因子の一覧を示す表２）；及び、Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206（例えば、臨床試験において使用される抗血管新生剤の一覧を示す表１）を参照のこと。
【０１００】
用語「抗血管新生療法」は、抗血管新生剤の投与を含む血管新生を阻害するために有用な治療を指す。
【０１０１】
本明細書において使用される用語「ＣＤ２０発現がん」は、がん細胞がＣＤ２０抗原の発現を示す全てのがんを指す。本明細書において使用されるＣＤ２０発現がんは好ましくは、リンパ腫（好ましくはＢ−細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））及びリンパ性白血病を指す。このようなリンパ腫及びリンパ性白血病は、例えばａ）濾胞性リンパ腫、ｂ）小型非開裂性細胞リンパ腫／バーキットリンパ腫（地方病性バーキットリンパ腫、散発性バーキットリンパ腫及び非バーキットリンパ腫を含む）ｃ）辺縁帯リンパ腫（節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（粘膜関連リンパ組織リンパ腫、ＭＡＬＴ）、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫及び脾性辺縁帯リンパ腫）、ｄ）マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ｅ）大細胞リンパ腫（Ｂ細胞びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、びまん性混合型細胞リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫、血管中心性肺Ｂ細胞リンパ腫を含む）ｆ）毛様細胞白血病、ｇ）リンパ球性リンパ腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ｈ）急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、ｉ）形質細胞腫、形質細胞骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄腫、ｊ）ホジキン病を含む。
【０１０２】
ＣＤ２０発現がんはより好ましくは、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。特に、ＣＤ２０発現がんは、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、バーキットリンパ腫、毛様細胞白血病、濾胞性リンパ腫、多発性骨髄腫、辺縁帯リンパ腫、移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ＨＩＶ関連リンパ腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、又は中枢神経系原発リンパ腫である。
【０１０３】
本明細書で使用される場合の用語「細胞傷害性薬物」は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。該用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）、化学療法剤（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）、酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素など、抗生物質、小分子毒素などの毒素、又は細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又はその変異体を含む）、及び以下に開示される様々な抗腫瘍剤又は抗癌剤を含むことが意図される。その他細胞傷害性薬剤は、以下に記載される。殺腫瘍剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
【０１０４】
「毒素」は、細胞の成長又は増殖に対して有害な影響を有する任意の物質である。
【０１０５】
「化学療法剤」は、がんの治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例は、チオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標登録））のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパのようなアジリジン類；アルトレートアミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロメラミンを含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビロール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成アナログトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標）、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレチン、及び９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロランブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードのようなナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンのようなニトロソウレア；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１（例えばNicolaou et. al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)を参照のこと）；ＣＤＰ３２３、経口アルファ−４インテグリン阻害剤；ダイネマイシンＡを含むダイネマイシ
ン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン類、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射（ＤＯＸＩＬ（登録商標））、リポソームドキソルビシンＴＬＣ  Ｄ−９９（ＭＹＯＣＥＴ（登録商標））、ペグ化リポソームドキソルビシン（ＣＡＥＬＹＸ（登録商標））及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガフール（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロン及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；コンブレタスタチン；葉酸アナログ、例えばデノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリンアナログ、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン；アンドロゲン類、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー、例えばフロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシノイド類、例えばメイタンシン及びアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（JHS Natural Products, Eugene, Oreg.）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テニュアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジ��；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.）、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ）及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Rhome-Poulene Rorer, Antony, France）；クロランブシル；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；プラチナ薬剤、例えばシスプラチン、オキサリプラチン（例えばＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））及びカルボプラチン；チューブリン重合が微小管を形成するのを妨げるビンカ、例えばビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））及びビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトキサントロン；ロイコボリン；ノバントロン；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド（ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標）
）；ビスホスホネート、例えばクロドロネート（例えばＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）又はＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロン酸（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、パミドロン酸（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロネート（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））、又はリセドロネート（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））を含む）；トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関係するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ及び上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦ−Ｒ）（例えばエルロチニブ（ＴａｒｃｅｖａＴＭ））；及び細胞増殖を低減するＶＥＧＦ−Ａ；ワクチン、例えばＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチン及び遺伝子治療ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤（例えばＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標））；ｒｍＲＨ（例えばＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標））；ＢＡＹ４３９００６（ソラフェニブ；Ｂａｙｅｒ）；ＳＵ−１１２４８（スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ）；ペリホシン、ＣＯＸ−２阻害剤（例えばセレコキシブ又はエトリコキシブ）、プロテオゾーム阻害剤（例えばＰＳ３４１）；ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））；ＣＣＩ−７７９；チピファルニブ（Ｒ１１５７７）；オラフェニブ、ＡＢＴ５１０；ＢＣＬ−２阻害剤、例えばオブリメルセンナトリウム（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））；ピクサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤；チロシンキナーゼ阻害剤；セリン−スレオニンキナーゼ阻害剤、例えばラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標））；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、例えばロナファーニブ（ＳＣＨ６６３６、ＳＡＲＡＳＡＲＴＭ）；及び上述したものの薬学的に許容される塩類、酸類又は誘導体、並びに、上記のうちの二以上の組み合わせ、例えば、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの併用療法の略称）、及びＦＯＬＦＯＸ（５−ＦＵ及びロイコボリンと組み合わせたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ）を用いる治療計画の略称）、及び上記いずれかの薬学的に許容される塩類、酸類又は誘導体類；並びに上記の二以上の組合せを含む。
【０１０６】
本明細書中に定義される化学療法剤は、がんの成長を促し得るホルモンの作用を調節、低減、遮断又は阻害するように働く、「抗ホルモン剤」又は「内分泌治療剤」を含む。それらはそれ自体がホルモンであってよく、限定するものではないが、抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ）を含み、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ．ｃｎｄｏｔ．トレミフェン；副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、フォルメスタニー、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール、及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾール；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド及びゴセレリン；並びにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に接着細胞の増殖に関与しているシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、及びＨ−Ｒａｓ；リボザイム、例えばＶＥＧＦ発現阻害剤（例えばＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標）リボザイム）及びＨＥＲ２発現阻害剤；遺伝子治療ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチンなどのワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ビノレルビン及びエスペラミシン（米国特許第４６７５１８７号を参照のこと）、及び上記いずれかの薬学的に許容される塩類、酸類及び誘導体類；並びに上記の二以上の組合せを含む。
【０１０７】
本明細書において使用される場合の「増殖阻害剤」は、細胞の増殖をインビトロ又はインビボのいずれかで阻害する化合物又は組成物を指す。一実施態様において、増殖阻害剤は、抗体が結合する抗原を発現している細胞の増殖を予防するか又は低減する増殖阻害抗体である。別の実施態様において、増殖阻害剤は、Ｓ期で細胞の割合を有意に減少させるものであり得る。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）遮断する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン類、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、及びアラ−Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami et al., (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、例えば１３頁に見出すことができる。タキサン類（パクリタキセル及びドセタキセル）は、共にイチイに由来する抗がん剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、ローン・プーラン  ローラー）は、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、ブリストル−マイヤー  スクウィブ）の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化する。
【０１０８】
「放射線療法」とは、正常に機能する能力を制限するため又は完全に細胞を破壊するために、細胞に十分な損傷を誘導する有向性のガンマ線又はベータ線の使用を意味する。治療の用量及び継続期間を決定するためには当該技術分野で公知の多くの方法があることは明らかであろう。典型的な治療は、１回の投与として、１日当たり１０から２００単位（グレイ）の典型的な用量として施される。
【０１０９】
治療の目的のための「対象」又は「個体」とは、哺乳動物として分類されるいずれかの動物を指し、ヒト、家畜動物、及び動物園、スポーツ又はペット動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を含む。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０１１０】
本明細書中の用語「抗体」とは、最も広い意味で用いられ、具体的には、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の生物活性を示す限り、抗体断片を含む。
【０１１１】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定及び分離され、及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の研究、診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質を含み得る。いくつかの実施態様において、抗体は、（１）例えばローリー法で測定した場合抗体の９５重量％を超えるまで、及びいくつかの実施態様においては９９重量％を超えるまで、（２）例えばスピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分な程度、又は（３）例えばクーマシーブルー又は銀染色を使用した還元又は非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一まで精製される。単離された抗体は、抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕの抗体を含む。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一つの精製工程により調製される。
【０１１２】
「天然抗体」は、通常、二つの同一の軽（Ｌ）鎖及び二つの同一の重（Ｈ）鎖からなる、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン（ＶＨ）を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、他端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基は、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられる。
【０１１３】
用語「定常ドメイン」は、免疫グロブリンの他の部分、つまり抗原結合部位を含む可変ドメインに対してより保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の一部を指す。定常ドメインは重鎖のＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（総称して、ＣＨ）と軽鎖のＣＨＬ（又はＣＬ）ドメインを含む。
【０１１４】
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖の可変ドメインは「ＶＨ」と称され得る。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」と称され得る。これらのドメインは一般に抗体の最も可変の部分であり、抗原結合部位を含む。
【０１１５】
用語「可変」は、可変ドメインのある部分が、抗体間で配列が広範囲に相違しているという事実を指し、それぞれの特定の抗体のその特定の抗原への結合及び特異性に使用される。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメインにわたって均一に分布しているのではない。それは、軽鎖及び重鎖可変ドメインの双方において、超可変領域（ＨＶＲ）と称される三つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存されている部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ四つのＦＲ領域を含み、大部分がベータシート立体配置をとり三つのＨＶＲにより繋がっており、この三つの超可変領域はβシート構造と繋がり、場合によってはベータシート構造の一部を形成している、ループを形成する。各鎖におけるＨＶＲは、ＦＲ領域により互いに極めて近接した状態で保持され、他の鎖由来のＨＶＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)を参照のこと）。定常ドメインは、抗原との抗体の結合には直接関わっていないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与など、多様なエフェクター機能を呈する。
【０１１６】
任意の哺乳動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（「κ」）及びラムダ（「λ」）と呼ばれる二つの明確に区別される型の一つが割り当てられ得る。
【０１１７】
本明細書において使用される用語ＩｇＧ「アイソタイプ」又は「サブクラス」は、その定常領域の化学的及び抗原性特徴によって定められ免疫グロブリンのサブクラスのいずれかを意味する。
【０１１８】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）は異なるクラスが割り当てられ得る。免疫グロブリンの５つの主要なクラスがあり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、及びこれらのいくつかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２に、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、γ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られており、一般的に、例えばCellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000)に記載されている。抗体は、一又は複数の他のタンパク質又はペプチドとの抗体の共有又は非共有結合によって形成される大きな融合分子の一部であってもよい。
【０１１９】
用語「完全長抗体」、「インタクト抗体」及び「全抗体」は、本明細書においては区別せずに使用され、その実質的にインタクトな形態の抗体を指し、以下に定義するような抗体断片は意味しない。この用語は、特にＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【０１２０】
本明細書における目的に対する「ネイキッド抗体」は、細胞傷害性部分又は放射標識にコンジュゲートされない抗体である。
【０１２１】
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
【０１２２】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる二つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。パパイン処置は、２つの抗原結合部位を有し、なお抗原を架橋することが可能なＦ（ａｂ’）２断片を産生する。
【０１２３】
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小抗体断片である。一実施態様において、２本鎖「Ｆｖ」種は、一本の重鎖と一本の軽鎖の可変ドメインが、堅固な非共有結合をなした二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、柔軟なペプチドリンカーによって１の重鎖及び１の軽鎖可変ドメインは共有結合性に連結することができ、よって軽鎖及び重鎖は、二本鎖Ｆｖ種におけるものと類似の「二量体」構造に結合することができる。この配置において、各可変ドメインの３つのＨＶＲは相互作用し、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つのＨＶＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に対して特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
【０１２４】
「Ｆａｂ」断片は、重鎖と軽鎖可変ドメインを含み、かつまた軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において、Ｆａｂ’の一般名称であり、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つ。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。抗体断片の他の化学結合も知られている。
【０１２５】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓＦＶが抗原結合に望まれる構造を形成することを可能にする。ｓｃＦｖの総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994),頁269-315を参照。
【０１２６】
用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を持つ抗体断片を指し、その断片は、同一ポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。非常に短いために同一鎖上で２つのドメインの対形成ができないリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、２つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは二価でも二特異性であってもよい。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４０９７；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)で、より詳しく説明される。トリアボディ及びテトラボディもHudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載される。
【０１２７】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団、例えば、可能性のある変異体、例えば一般的に少量で存在している天然に存在する変異体を除き、集団を含む個々の抗体から得られる抗体を指す。したがって、修飾語「モノクローナル」は、個別抗体の混合物ではないという抗体の性質を示す。ある実施態様において、このようなモノクローナル抗体は、通常、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、この場合、標的に結合するポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスにより得られる。例えば、この選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールなどの複数のクローンからの唯一のクローンの選択とすることができる。重要なのは、選択された標的結合配列を更に変化させることにより、例えば標的への親和性の向上、標的結合配列のヒト化、細胞培養液中におけるその産生の向上、インビボでの免疫原性の低減、多選択性抗体の生成等が可能になること、並びに、変化させた標的結合配列を含む抗体も、本発明のモノクローナル抗体であることである。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体の調製物は、他の免疫グロブリンで通常汚染されていないという点で有利である。
【０１２８】
修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で作製しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマ法（例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)、組換えＤＮＡ法（米国特許第４８１６５６７号を参照のこと）、ファージディスプレイ技術（例えば、Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 及びLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)を参照のこと）、及びヒト免疫グロブリン配列をコードする免疫グロブリン遺伝子座又は遺伝子の一部又は全部を有する動物においてヒト又はヒト様抗体を産生するための技術（例えば、国際公開第１９９８／２４８９３号；国際公開第１９９６／３４０９６号；国際公開第１９９６／３３７３５号；国際公開第１９９１／１０７４１号；Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (19
93); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993);米国特許第５５４５８０７号;同第５５４５８０６号;同第５５６９８２５号;同第５６２５１２６号;同第５６３３４２５号;及び同第５６６１０１６号;Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); 及びLonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)を参照のこと)を含む様々な技術によって作製されてもよい。
【０１２９】
本明細書においては、モノクローナル抗体は、「キメラ」抗体、即ち、重鎖及び／又は軽鎖の一部分は特定の種に由来する抗体又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一若しくは相同であるが、鎖（複数可）の残りの部分は別の種に由来する抗体又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一若しくは相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びに、所望の生物活性を呈するものである限りそのような抗体の断片を、特に含む（例えば、米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)を参照のこと）。キメラ抗体は、抗体の抗原結合領域が例えば対象の抗原をマカクザルに免疫投与することによって作製される抗体に由来している、ＰＲＩＭＡＴＴＺＥＤ（登録商標）抗体を含む。
【０１３０】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。一実施態様において、ヒト化抗体は、レシピエントのＨＶＲ由来の残基が、非ヒト種、例えば、所望の特異性、親和性、及び／又は能力を有するマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長動物のＨＶＲ（ドナー抗体）由来の残基により置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例においては、ヒト免疫グロブリンのＦＲの残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。更に、ヒト化抗体はレシピエント抗体又はドナー抗体において見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能を更に改良するためになされてもよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの全てを実質的に含み、超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。また、ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン、通常はヒト免疫グロブリン、の定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含む。更なる詳細については、例えばJones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。例えばVaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)；並びに米国特許第６９８２３２１号及び同第７０８７４０９号も参照のこと。
【０１３１】
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するもの、及び／又は本明細書中に開示されるヒト抗体を製造するための任意の技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む、当技術分野で公知の様々な技術を用いて生産され得る。Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)。また、Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)に記載される方法は、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用できる。van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)も参照のこと。抗原曝露に応答して抗体を産生するように修飾されているが、その内在性遺伝子座が無効になっているトランスジェニック動物、例えば免疫化ゼノマウスに抗原を投与することによってヒト抗体を調製することができる（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術に関する米国特許第６０７５１８１号及び同第６１５０５８４号を参照のこと）。また、例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体に関するLi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)も参照のこと。
【０１３２】
「種依存性抗体」は、第二の哺乳動物種からの抗原の相同体に対して有している結合親和性よりも、第一の哺乳動物種からの抗原に対してより強力な結合親和性を有するものである。通常、種依存性抗体は、ヒト抗原（例えば、約１ｘ１０−７Ｍ以下、好ましくは約１ｘ１０−８Ｍ以下、及び好ましくは約１ｘ１０−９Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）値を有する）と「特異的に結合」するが、そのヒト抗原に対する結合親和性よりも、少なくとも約５０倍、又は少なくとも約５００倍、又は少なくとも約１０００倍弱い、第二の非ヒト哺乳動物種からの抗原の相同体に対する結合親和性を有する。種依存性抗体は、上で定義した様々な型の抗体のいずれでもあり得るが、好ましくはヒト化又はヒト抗体である。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般的に、抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの６つのＨＶＲを含む。天然抗体において、Ｈ３及びＬ３は６つのＨＶＲのうちで最も高い多様性を示し、特にＨ３は抗体に高度な特異性を付与するのに独特の役割を果たすと考えられている。例えば、Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003)を参照のこと。実際、重鎖のみからなる天然に生じるラクダ科の抗体は、軽鎖の不存在下で機能的で安定である。例えば、Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)を参照のこと。
【０１３４】
多数のＨＶＲの描写が使用され、ここに含まれる。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は配列可変性に基づいており、最も一般的に使用されている（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに構造的ループの位置に言及している（Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。ＡｂＭ  ＨＶＲは、Ｋａｂａｔ  ＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａ構造的ループの間の妥協を表し、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ  抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」ＨＶＲは、利用できる複合体結晶構造の解析に基づく。これらの各ＨＶＲからの残基は以下に記される。
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【０１３５】
ＨＶＲは、次のような「拡大ＨＶＲ」を含むことができる：ＶＬの２４−３６又は４−３４（Ｌ１）、４６−５６又は５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７又は８９−９６（Ｌ３）と、ＶＨ．の２６−３５（Ｈ１）、５０−６５又は４９−６５（Ｈ２）及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基には、これら各々を定義するために、上掲のKabat et al.に従って番号を付した。
【０１３６】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書で定義しているＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
【０１３７】
用語「Ｋａｂａｔの可変ドメイン残基ナンバリング」又は「Ｋａｂａｔのアミノ酸位置のナンバリング」及びそれらの変形は、上掲のＫａｂａｔ等の抗体の編集の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインに対して用いられるナンバリングシステムを指す。このナンバリングシステムを用いると、実際の線状のアミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲの短縮物又はそれらへの挿入物に相当する、より少ないアミノ酸又は付加的なアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入物（Ｋａｂａｔによれば残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔによれば残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔナンバリングは、「標準的な」Ｋａｂａｔナンバリングされた配列と、抗体の配列相同性がある領域において配列比較することによって、所与の抗体について決定され得る。
【０１３８】
Ｋａｂａｔナンバリングシステムは一般に、可変ドメイン内の残基（およそ軽鎖の残基１−１０７及び重鎖の残基１−１１３）を指す場合に用いられる（例えば、Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）。免疫グロブリン重鎖定常領域内の残基を指す場合には、一般に「ＥＵナンバリングシステム」又は「ＥＵインデックス」を用いる（例えば、上掲のEU index reported in Kabat et al.）。「ＫａｂａｔのＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基番号を指す。
【０１３９】
「線形抗体」という表現は、Zapata et al. (1995 Protein Eng, 8(10):1057-1062)に記載されている抗体を指す。簡潔には、これらの抗体は直列Ｆｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）の対を含み、これは相補的軽鎖ポリペプチドと共に、抗原結合領域の対を形成する。線形抗体は、二重特異性又は単一特異性であり得る。
【０１４０】
ＩＩ．抗体製剤及び調製物
本明細書中の発明は、抗体を含む安定した水性製剤に関する。いくつかの実施態様において、製剤はモノクローナル抗体、トレハロース及びバッファーを含み、製剤中のトレハロースに対するモノクローナル抗体の重量比は約１．６５から約４．９５であり、製剤は約５．５から約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施態様において、製剤は、バッファー（リン酸ナトリウム又はヒスチジン等）を更に含む。いくつかの実施態様において、製剤は（ａ）約２５ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬの量のモノクローナル抗体；（ｂ）約４０ｍＭから約１２０ｍＭの量のトレハロース；及び（ｃ）約１５ｍＭから約３５ｍＭの量のリン酸ナトリウムを含み、前記製剤が約５．５から約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施態様において、製剤中の抗体は、−２０℃で少なくとも約６か月間、少なくとも約１２か月間、又は少なくとも約１８か月間安定している。
【０１４１】
Ａ．抗体調製物
製剤中の抗体は、抗体を生成するための当該技術分野で得られる技術を使用して調製され、その典型的な方法は、以下のセクションでより詳細に説明される。
【０１４２】
抗体は対象の抗原に対するものである。好ましくは、抗原は生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患に罹っている哺乳動物に対する抗体の投与は、その哺乳動物における治療効果をもたらし得る。しかしながら、非ポリペプチド抗原に対する抗体も考慮される。
【０１４３】
抗原がポリペプチドである場合、それは膜貫通分子（例えば受容体）又は増殖因子等のリガンドであり得る。例示的な抗原は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）等の分子；ＣＤ２０；ｏｘ−ＬＤＬ；ｏｘ−ＡｐｏＢ１００；レニン；ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；甲状腺傍ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ−１−抗トリプシン；インシュリンＡ鎖；インシュリンＢ鎖；プロインシュリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体ホルモン；グルカゴン；要因ＶＩＩＩＣ、要因ＩＸ、組織因子及びフォン・ヴィレブランド因子のような凝固因子；タンパク質Ｃのような抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤；ウロキナーゼ又はヒトの尿又は組織タイプ・プラスミノゲン活性剤（ｔ−ＰＡ）のようなプラスミノゲン活性剤；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子−アルファ及びベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ；（通常、Ｔ細胞が発現又は分泌されることによる活性化に規制される）；ヒトのマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；ヒト血清アルブミンのような血清アルブミン；Ｍｕｅｌｌｅｒｉａｎ−阻害物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；ベータ−ラクタマーゼのような微生物のタンパク質；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ−４等のＴ−リンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）；インヒビン；アクティビン；ホルモン又は成長因子用受容体；プロテインＡ又はＤ；リューマチ因子；骨由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のような神経栄養因子、ニューロトロフィン−３、−４、−５、又は−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、又はＮＴ−６）、あるいはＮＧＦ−βのような神経成長因子；血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦとｂＦＧＦのような線維芽細胞増殖因子；上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−アルファ及びＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４又はＴＧＦ−β５を含むＴＧＦベータのような形質転換成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子−Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９及びＣＤ２０）のようなＣＤタンパク質；赤血球生成促進因子；骨誘発因子；抗毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−アルファ、−ベータ及び−ガンマのようなインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ−１からＩＬ−１０）；スーパーオキシド・ジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊加速因子；例えば、ＡＩＤＳ膜の一部のようなウイルスの抗原；輸送タンパク；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４及びＶＣＡＭのようなインテグリン；ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４受容体のような腫瘍関連抗原；並びに上記のリストされたポリペプチドのうちのいずれかの断片等の分子を含む。
【０１４４】
本発明のある実施態様において、本発明に包含される抗体に関する分子標的は、ＶＥＧＦ及びＣＤ２０を含む。いくつかの実施態様において、本明細書中の抗体はヒトＶＥＧＦに結合するものである。いくつかの実施態様において、本明細書中の抗体はヒトＣＤ２０に結合するものである。
【０１４５】
（Ｉ）抗原調製物
他の分子とコンジュゲートされていてもよい可溶型抗原又はその断片は、抗体を生成するための免疫原として使用され得る。受容体等の膜貫通分子に関して、これらの断片（例えば受容体の細胞外ドメイン）が免疫原として使用され得る。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞が免疫原として使用され得る。このような細胞は、天然源に（例えばがん細胞株）に由来し得るか又は、膜貫通分子を発現するために組換え技術によって形質転換した細胞であってもよい。抗体を調製するために有用な他の抗原及びその形態は、当該技術分野で明らかであろう。
【０１４６】
（ｉｉ）ある抗体に基づく方法
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射することにより動物において産生される。免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシン阻害剤に、関連抗原を、二官能性又は誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基によるコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基による）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲとＲ１が異なったアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲにより結合させることが有用であり得る。
【０１４７】
動物は、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ（それぞれ、ウサギ又はマウスの場合）を完全フロイントアジュバント３体積と併せて、この溶液を複数部位に皮内注射することにより、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫化される。一か月後、動物は、完全フロイントアジュバントに入った元の量の１／５から１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫される。７から１４日後、動物は採血され、抗体価について血清が検定される。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫される。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なった架橋結合剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫される。コンジュゲートはまた、タンパク質融合体として組換え細胞培養物においても作製され得る。また、ミョウバン等の凝集剤は、免疫応答を高めるために適切に使用される。
【０１４８】
本発明のモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)により最初に記載され、例えばヒト−ヒトハイブリドーマに関するHongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)、及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)において更に記載されたハイブリドーマ法を使用して作製され得る。更なる方法は、例えばハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒト天然ＩｇＭ抗体の生産に関する米国特許第７１８９８２６号に記載されているものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）は、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005)及びVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載される。
【０１４９】
様々な他のハイブリドーマ技術については、例えば、米国特許出願公開第２００６／２５８８４１号；米国特許出願公開第２００６／１８３８８７号（完全なヒト抗体）、米国特許出願公開第２００６／０５９５７５号；米国特許出願公開第２００５／２８７１４９号；米国特許出願公開第２００５／１００５４６号；米国特許出願公開第２００５／０２６２２９号、並びに米国特許第７０７８４９２号及び同第７１５３５０７号を参照のこと。ハイブリドーマ法を使用するモノクローナル抗体を製造するための例示的プロトコルは次のように記載されている。一実施態様において、マウス又はハムスター等のその他適切な宿主動物は、免疫化に使用されるタンパク質と特異的に結合することになる抗体を産生するか又は産生する能力があるリンパ球を引き起こすように、免疫を与えられる。本発明のポリペプチド又はその断片とアジュバント、例えばモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）／ジクリノミコール酸トレハロース（ＴＤＭ）（Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, Mont.）の複数回の皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射によって、抗体は動物中で産生される。本発明のポリペプチド（例えば抗原）又はその断片は、当該技術分野でよく知られている方法、例えばそのいくらかが本明細書中に更に記載されている組換え法を使用して調製され得る。免疫化した動物からの血清は抗抗原抗体についてアッセイされ、場合によっては追加免疫が行われる。抗抗原抗体を生産する動物からのリンパ球が単離される。あるいは、リンパ球はインビトロで免疫を与えられてもよい。
【０１５０】
次いで、リンパ球はポリエチレングリコール等の適切な融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する。例えば、Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986）を参照のこと。効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベルの産生をサポートし、ＨＡＴ培地等の培地に対して感受性がある骨髄腫細胞が使用され得る。例示的な骨髄腫細胞株は、限定されるものではないが、マウス骨髄種株、例えば、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USAから入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍から誘導されるもの及びAmerican Type Culture Collection, Rockville, Md. USAから入手可能なＳＰ−２又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞を含む。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまた記載されている（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
【０１５１】
したがって、ハイブリドーマ細胞は、好適な培養培地、例えば、非融合の親骨髄腫細胞の成長又は生存を阻害する一又は複数の物質を含む培地中で播種され、培養される。例えば、親骨髄腫細胞に酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）がない場合、ハイブリドーマの培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含むことになり、この物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を妨げる。好ましくは、血清非含有ハイブリドーマ細胞培養法は、例えばEven et al., Trends in Biotechnology, 24(3), 105-108 (2006)に記載されるように、ウシ胎児血清等の動物由来血清の使用を低減するために使用される。
【０１５２】
ハイブリドーマ細胞培養物の生産性を改善するためのツールとしてのオリゴペプチドが、Franek, Trends in Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005)に記載される。特に、標準的な培地は、あるアミノ酸（アラニン、セリン、アスパラギン、プロリン）、又はタンパク質加水分解画分で強化され、アポトーシスは、３から６のアミノ酸残基で構成される合成オリゴペプチドにより有意に抑制され得る。ペプチドはミリモル又はそれより高濃度で存在する。
【０１５３】
ハイブリドーマ細胞が成長する培地は、本発明の抗体に結合するモノクローナル抗体の産生のためにアッセイされ得る。ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降により又はインビトロ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定され得る。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ分析により決定され得る。例えばMunson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)を参照のこと。
【０１５４】
ハイブリドーマ細胞が所望の特異性、親和性及び／又は活性の抗体を産生するとして同定された後、クローンは、限定希釈手順によりサブクローンされ、標準的な方法により培養されてもよい。上掲のＧｏｄｉｎｇを参照のこと。この目的のための好適な培養培地は、例えば、Ｄ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地である。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物における腹水腫瘍としてインビボで培養されてもよい。サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィー等により、培養培地、腹水又は血清から適切に分離される。ハイブリドーマ細胞からタンパク質を単離するための一手順は、米国特許公開第２００５／１７６１２２号及び米国特許第６９１９４３６号に記載される。該方法は、結合プロセスにおいて最小限の塩、例えばリオトロピック塩を使用し、好ましくは、溶離プロセスにおいて少量の有機溶媒も使用することを含む。
【０１５５】
（ｉｉｉ）特定のライブラリースクリーニング法
本発明の抗体は、所望の活性（複数可）を有する抗体についてスクリーニングするためにコンビナトリアルライブラリーを使用することによって作製され得る。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。このような方法は、一般的に、Hoogenboom et al.のMethods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J., 2001)に記載されている。例えば、対象の抗体を生成する一方法は、Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93に記載されるファージ抗体ライブラリーの使用による。
【０１５６】
原理的には、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質に融合した抗体可変領域（Ｆｖ）の様々な断片を表示するファージを含むファージライブラリーをスクリーニングすることによって選択される。このようなファージライブラリーは、所望の抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによってパニングされる。所望の抗原に結合可能なＦｖ断片を発現するクローンは抗原に吸着され、よってライブラリー中の非結合クローンから分離される。次いで、結合クローンを抗原から溶離させ、抗原吸着／溶離の更なるサイクルによって更に濃縮され得る。本発明の抗体のいずれも、対象のファージクローンを選択するために好適な抗原スクリーニング手順を設計し、続いて、対象のファージクローンからのＦｖ配列、及びKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), vols. 1-3に記載の適切な定常領域（Ｆｃ）配列を私用しての完全長抗体クローンの構築によって得ることができる。
【０１５７】
ある実施態様において、抗体の抗原結合ドメインは、各一が軽（ＶＬ）鎖及び重（ＶＨ）鎖由来で双方が３つの超可変ループ（ＨＶＲ）又は相補性決定領域（ＣＤＲ）を提示する約１１０アミノ酸の二の可変（Ｖ）領域から形成される。可変ドメインは、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455(1994)に記載のように、ＶＨ及びＶＬが、短く可動性のペプチドを介して共有結合している一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、又はそれぞれ定常ドメインと融合して非共有的に相互作用しているＦａｂ断片として、ファージ上に機能的にディスプレイされ得る。本明細書において使用される場合、ｓｃＦｖをコードするファージクローン及びＦａｂをコードするファージクローンは、総称して「Ｆｖファージクローン」又は「Ｆｖクローン」と呼ぶ。
【０１５８】
ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングされ得、ファージライブラリーにランダムに再結合され、その後、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されるように、抗原結合クローンについて精査され得る。免疫された起源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴うことなく免疫原に高親和性抗体を提供する。代わりに、Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)に記載されるように、ナイーブレパートリーが、任意の免疫感作無しで、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対して、ヒト抗体の単一起源を提供するために、クローン化され得る。最終的には、ナイーブライブラリーは、また、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388(1992)に記載のように、幹細胞からの再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用して高度可変ＣＤＲ３領域をコードさせ、インビトロでの再配列を達成させることによって、合成的に作製され得る。
【０１５９】
ある実施態様において、線維状ファージは、マイナーコートタンパク質ｐＩＩＩへの融合によって、抗体断片をディスプレイするために使用される。該抗体断片は、例えばMarks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)に記載のように、ＶＨ及びＶＬドメインが可動性ポリペプチドスペーサーによって同一ポリペプチド鎖上に結合されている一本鎖Ｆｖ断片として、又は例えばHoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)に記載のように、一方の鎖がｐＩＩＩと融合し、他方の鎖が、いくつかの野生型コートタンパク質を置換することによってファージ表面上にＦａｂコートタンパク質構造のアセンブリがディスプレイされるようになる細菌宿主細胞のペリプラズムへ分泌されるＦａｂ断片として、ディスプレイされ得る。
【０１６０】
一般に、抗体遺伝子断片をコードする核酸は、ヒト又は動物から収集した免疫細胞から得られる。抗抗原クローンに有利になるように偏ったライブラリーが望ましい場合には、対象は抗原で免疫化され抗体応答を生じさせ、脾臓細胞及び／又は他の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）である循環Ｂ細胞を、ライブラリー構築のために回収される。一実施態様において、抗原免疫化により、抗原に対するヒト抗体を産生するＢ細胞が生じるように、抗抗原クローンに有利になるように偏ったヒト抗体遺伝子断片ライブラリーは、機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを有する（及び機能的な内因性抗体産生系を欠く）トランスジェニックマウス中で、抗抗原抗体応答を生じさせることによって得られる。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスの作製は以下に記載する。
【０１６１】
抗抗原応答性細胞集団の更なる濃縮は、適切なスクリーニング手法を使用して抗原特異的膜結合抗体を発現するＢ細胞を単離すること、例えば、抗原アフィニティ―クロマトグラフィーを使用した細胞分離又は蛍光色素標識抗原への細胞の吸着とその後の蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）によって得ることができる。
【０１６２】
あるいは、非免疫化ドナーからの脾臓細胞及び／又はＢ細胞又は他のＰＢＬの使用は、可能な抗体レパートリーのより良い提示を提供し、また抗原が免疫原性ではない任意の動物（ヒト又は非ヒト）種を使用した抗体ライブラリーの構築を可能にする。インビトロの抗体遺伝子構築を包含するライブラリーに関しては、幹細胞は対象から収集され非再配列の抗体遺伝子セグメントをコードする核酸を提供する。対象の免疫細胞は、様々な動物種、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ目、オオカミ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、及びトリ種等から得ることができる。
【０１６３】
抗体可変遺伝子セグメント（ＶＨ及びＶＬセグメントを含む）をコードする核酸が、対象の細胞から回収され増幅される。再配列したＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリーの場合、所望のＤＮＡは、Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)に記載されているように、リンパ球からのゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを単離し、再配列したＶＨ及びＶＬ遺伝子の５’及び３’末端と一致するプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができ、これによって発現のための多様なＶ遺伝子レパートリーを作製し得る。該Ｖ遺伝子は、Orlandi et al. (1989) and in Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989)に記載のように、成熟Ｖドメインをコードするエクソンの５’末端の逆方向プライマーとＪセグメントに基づいた順方向プライマーにより、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡから増幅され得る。しかしながら、ｃＤＮＡからの増幅のためには、逆方向プライマーは、また、Jones et al., Biotechnol., 9: 88-89 (1991)に記載のようにリーダーエクソンに、順方向プライマーは、Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989)に記載のように定常領域内に基づくことが可能である。相補性を最大にするために、縮重はOrlandi et al.(1989)又はSastry et al.(1989)に記載のように、プライマーへ包含され得る。ある実施態様において、例えば、Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)の方法に記載のように、又はOrum et al., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993)の方法に記載のように、免疫細胞の核酸試料に存在する全ての入手可能なＶＨ及びＶＬ配置を増幅するために、各Ｖ遺伝子ファミリーを標的にしたＰＣＲプライマーを使用して、ライブラリーの多様性は最大化される。発現ベクターへの増幅ＤＮＡのクローニングに関しては、希な制限部位は、Orlandi et al.(1989)に記載のようにタグとしてＰＣＲプライマー内の一端へ導入され得、又はClackson et al., Nature, 352: 624-628(1991)に記載のようにタグプライマーを用いて更なるＰＣＲ増幅を行う。
【０１６４】
合成的に再配列したＶ遺伝子のレパートリーは、Ｖ遺伝子セグメントからインビボで誘導され得る。ほとんどのヒトＶＨ遺伝子セグメントはクローニングされ配列決定され（Tomlinson et al., J. Mol. Biol. 227: 776-798(1992)に報告されている）、マッピングがされている（Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94(1993)）；これらクローニングされたセグメント（Ｈ１及びＨ２ループの全ての主要なコンフォメーションを含む）は、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)に記載のように、多様な配列と長さのＨ３ループをコードするＰＣＲプライマーによる多様なＶＨ遺伝子レパートリーを作製するのに使用され得る。ＶＨレパートリーは、また、Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461(1992)に記載されているように、単一の長さの長いＨ３ループに焦点を合わせた全ての配列多様性を伴って作製され得る。ヒトＶκ及びＶλセグメントはクローニング及び配列決定がなされており（Williams and Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461(1993)）、合成軽鎖レパートリーを作製するのに使用され得る。ＶＨ及びＶＬフォールドの範囲並びにＬ３及びＨ３の長さに基づく合成的Ｖ遺伝子レパートリーは、かなりの構造的多様性を有する抗体をコードする。ＤＮＡをコードするＶ遺伝子の増幅に続いて、生殖系のＶ遺伝子セグメントが、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388(1992)の方法に従ってインビトロで再配列され得る。
【０１６５】
抗体断片のレパートリーは、いくつかの方法でＶＨ及びＶＬ遺伝子レパートリーを共に組み合わせることによって構築され得る。各レパートリーは異なるベクターで作製され得、そのベクターは、例えばHogrefe et al., Gene, 128: 119-126(1993)に記載のようにインビトロで、又はコンビナトリアル・インフェクション、例えばWaterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266(1993)に記載のｌｏｘＰ系によってインビボで作製され得る。このインビボの組換え手法は、大腸菌の形質転換効率によって強いられるライブラリーの大きさの限界を克服するために、二本鎖種のＦａｂ断片を利用する。ナイーブＶＨ及びＶＬレパートリーは、一つはファージミドへ、他方はファージベクターへと個別にクローニングされる。この二つのライブラリーは、その後、各細胞が異なる組み合わせを有し、そのライブラリーの大きさが、存在する細胞の数（約１０１２クローン）によってのみ限定されるように、ファージミド含有細菌のファージ感染によって組み合わせられる。双方のベクターは、ＶＨ及びＶＬ遺伝子が単一のレプリコンへ組み換えられ、ファージビリオンへ共にパッケージされるように、インビボの組換えシグナルを有する。これら巨大なライブラリーは、良好な親和性（約１０−８ＭのＫｄ−１）の多くの多様な抗体を提供する。
【０１６６】
あるいは、該レパートリーは、例えばBarbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982(1991)に記載のように同じベクターへ連続してクローニングされ、又はClakson et al., Nature, 352: 624-628(1991)に記載のようにＰＣＲによってアセンブリした後にクローニングされ得る。ＰＣＲアセンブリは、また、可動ペプチドスペーサーをコードしているＤＮＡとＶＨ及びＶＬ  ＤＮＡを連結させて、単鎖のＦｖ（ｓｃＦｖ）レパートリーを形成することに利用され得る。更に他の技術では、「細胞内でのＰＣＲアセンブリ」は、Embleton et al., Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837(1992)に記載のように、ＰＣＲによってリンパ球内のＶＨ及びＶＬ遺伝子を組み合わせて、その後、連結した遺伝子のレパートリーをクローニングするのに利用される。
【０１６７】
ナイーブライブラリー（天然又は合成のいずれか）によって産生された抗体は、中程度の親和性（約１０６から１０７Ｍ−１のＫｄ−１）である可能性があるが、上掲のWinter et al.(1994)に記載のように二次ライブラリーから構築して再選択することによって、親和性成熟をもインビトロで模倣され得る。例えば、Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226: 889-896(1992)の方法、又はGram et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580(1992)の方法においてエラー・プローンポリメラーゼ（Leung et al, Technique, 1:11-15(1989)で報告されている）を使用することによって、突然変異はインビトロでランダムに導入され得る。加えて、一又は複数のＣＤＲをランダムに変異させることによって、例えば、選択した個々のＦｖクローンにおいて、対象のＣＤＲまで及ぶランダム配列を有するプライマーによるＰＣＲを使用して、より高い親和性クローンをスクリーニングすることにより、親和性成熟が行われ得る。国際公開第９６０７７５４号（１９９６年３月１４日に公開）は、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域へ突然変異生成を誘導して軽鎖遺伝子のライブラリーを作製する方法を記載している。別の有効な手法は、Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783(1992)に記載のように、非免疫化ドナーから得られた天然に存在するＶドメイン変異体のレパートリーを含むファージディスプレイによって選択されたＶＨ又はＶＬドメインを組換えること、及び数回のチェーン・リシャッフリングにおいてより高い親和性についてスクリーニングすることである。この技術は、約１０−９Ｍ又はそれ未満の親和性の抗体及び抗体断片の産生を可能にする。
【０１６８】
ライブラリーのスクリーニングは、当該技術分野で知られている様々な技術によって達成され得る。例えば、抗原は吸着プレートのウェルをコーティングするように使用され、吸着プレートへ付着させた宿主細胞上で発現するか又はセルソーティングで使用され、又はストレプトアビジン被覆ビーズでの捕獲のためにビオチンにコンジュゲートされ、又はファージディスプレイライブラリーをパニングするための任意の他の方法において使用され得る。
【０１６９】
ファージ粒子の少なくとも一部分を吸着剤に結合させるのに適した条件下で、ファージライブラリーの試料は固定化抗原と接触させられる。通常は、生理学的条件を模倣するよう、ｐＨ、イオン強度、温度等を含む条件が選択される。固体相と結合したファージは洗浄され、その後、例えばBarbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982(1991)に記載されているように酸で、又は例えばMarks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597(1991)に記載にされているようにアルカリで、又は例えばClackson et al., Nature, 352: 624-628(1991)の抗原競合法に類似の手順である抗原競合によって溶出される。ファージは、１回目の選択で２０〜１０００倍に濃縮され得る。更に、この濃縮されたファージは、細菌培養液で増殖され、更なる回の選択に供され得る。
【０１７０】
選択の効率は、洗浄の間の解離の動力学、及び単一のファージ上の複数の抗体断片が同時に抗原と関わり得るかどうかを含む多くの要因に依拠する。速い解離動態（及び弱い結合親和性）を有する抗体は、短い洗浄、多価ファージディスプレイ及び固体相の抗原の高いコーティング密度の使用によって保持され得る。高い密度は、多価相互作用を介してファージを安定化するだけでなく、解離したファージの再結合に有利に作用する。遅い解離動態（及び良好な結合親和性）を有する抗体の選択は、Bass et al., Proteins, 8: 309-314(1990)及び国際公開第９２／０９６９０号に記載されているような長い洗浄と一価ファージディスプレイの使用、及びMarks et al., Biotechnol., 10: 779-783(1992)に記載されているような抗原の低コーティング密度によって促進され得る。
【０１７１】
親和性に僅かな違いがあったとしても、抗原に対する異なる親和性のファージ抗体の中で選択することは可能である。しかしながら、選択した抗体のランダム変異（例えば、いくつかの親和性成熟の技術で行われているようなもの）は、多くの変異体を生じやすく、その殆どが抗原と結合し、僅かがより高い親和性を有する。抗原を限定すると、希な高い親和性のファージが競合して除かれることが可能である。全てのより高い親和性の変異体を保持するため、ファージは、過剰のビオチン化抗原とインキュベートされることが可能であるが、抗原の標的モル濃度親和定数よりも低いモル濃度のビオチン化抗原と共にインキュベーションされ得る。次いで、高親和性結合ファージは、ストレプトアビジンでコーティングした常磁性体ビーズによって捕獲され得る。そのような「平衡捕獲」は、結合の親和性に従い、親和性の低い大過剰のファージから、僅かに二倍高い親和性の変異体クローンの単離を可能にする感度で抗体を選択することを可能にする。固体相と結合したファージを洗浄するのに用いる条件を操作して、解離定数に基づいて識別することも可能である。
【０１７２】
抗抗原クローンは、活性に基づいて選択され得る。ある実施態様において、本発明は、抗原を天然に発現する生きた細胞に結合する、又は浮遊抗原又は他の細胞性構造に結合された抗原に結合する抗抗原抗体を提供する。このような抗抗原抗体に対応するＦｖクローンは、（１）上述のようなファージライブラリーから抗抗原クローンを単離して、場合によって、好適な細菌宿主中で集団を増殖させることによって、ファージクローンの単離した集団を増幅する；（２）ブロック活性及び非ブロック活性がそれぞれ望まれる第二タンパク質と抗原を選択する；（３）固定された抗原に抗抗原ファージクローンを吸着する；（４）過剰の第二タンパク質を用いて、第二タンパク質の結合決定基と共有するかオーバーラップする抗原−結合決定基を認識する任意の望ましくないクローンを溶出する；並びに（５）工程（４）の後に吸着されたまま残ったクローンを溶出することによって、選択され得る。場合によっては、所望のブロック／非ブロック特性を有するクローンは、本明細書中に記載の選別手順を一又は複数回繰り返すことによって、更に濃縮され得る。
【０１７３】
ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡ又は本発明のファージディスプレイＦｖクローンは、慣習的な手順を使用して（例えば、ハイブリドーマ又はファージＤＮＡ鋳型の対象の領域をコードする重鎖及び軽鎖を特異的に増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用することにより）容易に分離されて、配列決定される。ＤＮＡは、単離されると、発現ベクター中に配置され得、次いで、これは、他の形では免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞中、例えば、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞中にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞中の所望のモノクローナル抗体の合成を得る。抗体をコードするＤＮＡの最近における組換え発現に関する総説は、Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) and Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992)を含む。
【０１７４】
本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡは、重鎖及び／又は軽鎖定常領域をコードする既知のＤＮＡ配列（例えば好適なＤＮＡ配列は上掲のKabat et al.から得ることができる）と組み合わされ、完全長又は部分長の重鎖及び／又は軽鎖をコードするクローンを形成し得る。このために、いずれかのアイソタイプの定常領域、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ定常領域が使用され得、このような定常領域は任意のヒト又は動物種から得ることができることが理解されるであろう。ある動物（例えばヒト）種の可変ドメインＤＮＡに由来し、次いで「ハイブリッド」である完全長重鎖及び／又は軽鎖のコード配列を形成するために他の動物種の定常領域ＤＮＡに融合したＦｖクローンは、本明細書で使用される「キメラ」及び「ハイブリッド」抗体の定義に含まれる。ある実施態様において、ヒト可変ＤＮＡに由来するＦｖクローンはヒト定常領域ＤＮＡに融合され、完全長又は部分長のヒト重鎖及び／又は軽鎖のコード配列を形成する。
【０１７５】
また、本発明のハイブリドーマ由来の抗抗原抗体をコードするＤＮＡは、例えば、ハイブリドーマクローン由来の相同マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を置換すること（例えばMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984)の方法）によって修飾され得る。ハイブリドーマ又はＦｖクローン由来の抗体又は断片をコードするＤＮＡは、免疫グロブリンコード化配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列の全て又は一部を共有結合させることによって更に修飾され得る。このようにして、本発明のＦｖクローン又はハイブリドーマクローン由来の抗体の結合特異性を有する「キメラ」又は「ハイブリッド」抗体が調製される。
【０１７６】
（ｉｖ）ヒト化及びヒト抗体
非ヒト抗体をヒト化する様々な方法が、当該技術分野で知られている。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトであるソースから導入された一又は複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と呼ばれ、典型的には「インポート」可変ドメインから取得される。ヒト化は、基本的には、Winter and co-workers (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988))の方法に従って、齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列と置換することにより、実施され得る。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ないドメインが、非ヒト種由来の対応する配列により置換されている、キメラ抗体（米国特許第４８１６５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基及び可能であればいくつかのＦＲ残基が齧歯動物抗体における相似部位由来の残基により置換されているヒト抗体である。
【０１７７】
ヒト化抗体を作製する際に使用することになるヒト可変ドメイン（軽鎖と重鎖の両方）の選定は、抗原性を低下させることが非常に重要である。いわゆる「最も適した」方法によれば、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメインの配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次いで、その齧歯動物の配列と最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として採択する（Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)）。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループである、すべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体について使用してもよい（Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)）。
【０１７８】
抗体が、抗原に対する高親和性及び他の望ましい生物学的特性を保持した状態でヒト化されることは、更に重要である。この目標を達成するために、本方法の一実施態様に従って、ヒト化抗体は、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用した、親配列及び多様な概念的ヒト化産物の分析のプロセスにより調製される。三次元の免疫グロブリンモデルは、一般に入手可能であり、当業者にはなじみがある。選択された候補免疫グロブリン配列の推定される三次元立体配座構造を図示及び表示するコンピュータープログラムは、入手可能である。これらの表示を精査することにより、候補免疫グロブリン配列が機能する際に残基が果たすと考えられる役割の分析、即ち、候補免疫グロブリンがその抗原と結合する能力に影響する残基の分析が可能になる。この方式では、ＦＲ残基は、レシピエント配列及びインポート配列から選択され、組み合わされることで、所望の抗体特徴（例えば、標的抗原（複数可）に対する親和性の向上）が達成されるようにすることができる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合への影響を及ぼすことに直接かつ最も実質的に関わっている。
【０１７９】
本発明のヒト抗体は、上述された公知のヒト定常ドメイン配列（複数可）を含むヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列（複数可）により構成され得る。あるいは、本発明のヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法により作成され得る。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は、例えばKozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 及びBoerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)に記載されている。
【０１８０】
免疫化の際に、内因性の免疫グロブリンが産生されなくてもヒト抗体の完全なレパートリーを産生する能力があるトランスジェニック動物（例えばマウス）を作製することが可能である。例えば、キメラマウス及び生殖細胞系突然変異マウスにおいて、抗体の重鎖接合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性が欠失していると、内因性抗体産生は完全に阻害されることが記載されている。そのような生殖細胞系突然変異マウスにおいてヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイを移入することにより、抗原による攻撃を行った際にヒト抗体が産生されるであろう。例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993);及びDuchosal et al. Nature 355:258 (1992)を参照のこと。
【０１８１】
また、遺伝子シャフリングは、ヒト抗体が出発非ヒト抗体と類似した親和性及び特異性を有している場合、非ヒト、例えば齧歯類の抗体からヒト抗体を得るために使用され得る。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法により、本明細書中に記載のファージディスプレイ技術により得られた非ヒト抗体断片の重鎖又は軽鎖可変領域のいずれかが、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換され、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦｖ又はＦａｂキメラの集団を作成する。抗原を選択は、ヒト鎖が初めのファージディスプレイクローンにおいて一致した非ヒト鎖の除去により破壊された抗原結合部位を回復する、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖ又はＦａｂの単離をもたらす、つまり、エピトープがヒト鎖パートナーの選択をつかさどる（インプリントする）。残りの非ヒト鎖を置換するためにこの工程が繰り返されると、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日公開のＰＣＴ特許出願公開第９３／０６２１３号を参照のこと）。ＣＤＲ移植による非ヒト抗体の伝統的なヒト化と異なり、この技術は、非ヒト起源のＦＲ又はＣＤＲ残基を全く持たない完全なヒト抗体を提供する。
【０１８２】
（ｖ）抗体断片
抗体断片は、酵素消化等の従来の手段によって、又は組換え技術によって生成され得る。特定の状況において、完全な抗体ではなく抗体断片の使用が有利である。より小さいサイズの断片により迅速除去が可能となり、固形腫瘍へのアクセスが改善され得る。所定の抗体断片の総説については、Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9: 129-134を参照のこと。
【０１８３】
様々な技術が抗体断片の産生のために開発されてきた。従来、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク分解性消化を介して誘導された（例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992);及びBrennan et al., Science 229:81 (1985)を参照のこと）。しかしながら、これらの断片は、今では組換え宿主細胞により直接産生され得る。Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片は、すべて大腸菌に発現し、分泌され得るため、大量のこれらの断片が容易に産生されることが可能になる。抗体断片は、前述の抗体ファージライブラリーから単離され得る。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、大腸菌から直接回収され、化学的に結合してＦ（ａｂ’）２断片を形成し得る（Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)）。Ｆ（ａｂ’）２断片は、別の方法によって、組換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含む増加したインビボ半減期を有するＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、米国特許第５８６９０４６号に記載される。抗体断片の産生のためのその他の技術は、当業者にとって明らかであろう。ある実施態様において、抗体は一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び同第５５８７４５８を参照のこと。Ｆｖ及びｓｃＦｖは定常領域を欠いたインタクトな結合部位を有する唯一の種であり；したがって、それらはインビボ使用中の非特異的結合減少に適していてもよい。ｓｃＦｖ融合タンパク質は、ｓｃＦｖのアミノ又はカルボキシ末端のいずれかでエフェクタータンパク質の融合を算出するために構成されてもよい。上掲のAntibody Engineering, ed. Borrebaeckを参照のこと。抗体断片はまた、例えば、米国特許第５６４１８７０号に記載されるように「直線抗体」であってもよい。そのような直線抗体は、単一特異的であってよく、又は二重特異的であってもよい。
【０１８４】
（ｖｉ）多重特異性抗体
多重特異性抗体は、少なくとも二の異なるエピトープに対して結合特異性を有し、エピトープは通常、異なる抗原に由来する。このような分子は通常二の異なるエピトープのみに結合するが（即ち二重特異性抗体、ＢｓＡｂｓ）、更なる特異性を有する抗体、例えば三重特異性抗体は、本明細書中で使用される場合、この表現に包含される。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片（例えばＦ（ａｂ’）２二重特性抗体）として調製され得る。
【０１８５】
二重特異性抗体を作製するための方法は、当該技術分野において公知である。完全長の二重特異性抗体の従来の産生は、二つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づいており、この場合の二本の鎖は、異なる特異性を有する（Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)）。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖はランダムに取り合わされるため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生し、１個のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、通常はアフィニティークロマトグラフィー工程により行われるが、相当に面倒であり、産物の収率は低い。類似の手順は、国際公開第９３／０８８２９、及びTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【０１８６】
異なるアプローチによれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原合体部位）は、免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合される。融合は、好ましくはヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖の定常ドメインとの間で行われる。軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）が、融合体のうち少なくとも一に存在することは典型的である。免疫グロブリン重鎖融合体と、所望により免疫グロブリン軽鎖とをコードしているＤＮＡを別々の発現ベクター中に挿入し、好適な宿主生物の中に共にトランスフェクトする。これは、不均等な比率の三本のポリペプチド鎖が構造中で使用された場合に最適な収率が得られる実施態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合を調節する際に大きな柔軟性を提供する。ただし、少なくとも二本のポリペプチド鎖が等しい比率で発現することで収率が高くなるとき、又はその比率が特に重要性をもたないときは、一つの発現ベクター中の二本又は全三本のポリペプチド鎖のコード配列を挿入することが可能である。
【０１８７】
このアプローチの一実施態様において、二重特異性抗体は、第１の結合特異性を一方のアームに、複合免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）を他方のアームに有する、複合免疫グロブリン重鎖から構成される。この非対称構造は、望ましくない免疫グロブリン鎖の組合せからの所望の二重特異性化合物の分離を容易にすることが見出されたが、これは、二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することが容易な分離方式を提供するからである。このアプローチは、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体の生成の更なる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)を参照のこと。
【０１８８】
国際公開第９６／２７０１１号に記載されている別のアプローチによれば、抗体分子対の間の接点は工学操作され、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の比率（％）が最大化され得る。一接点は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子の接点由来の一又は複数の小さいアミノ酸側鎖は、より大きい側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で置き換えられる。大きい側鎖（複数可）と同一又は類似のサイズの代償的な「空洞」は、大きいアミノ酸側鎖をより小さい側鎖（例えばアラニン又はトレオニン）で置き換えることにより、第２の抗体分子の接点上に創出される。これは、ヘテロ二量体の収率をホモ二量体等の他の望ましくない最終産物より高くするメカニズムを提供する。
【０１８９】
二重特異性抗体は、架橋抗体又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体のうち一方はアビジンと、他方はビオチンと、カップリングされ得る。そのような抗体は、例えば、望ましくない細胞に対して免疫系細胞を標的化すること（米国特許第４６７６９８０号）、及びＨＩＶ感染症の治療に用いること（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３及びＥＰ０３０８９）が提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋方法を使用して作製され得る。好適な架橋剤は当該技術分野において公知であり、米国特許第４６７６９８０号において、いくつかの架橋手法と共に開示されている。
【０１９０】
抗体断片から二重特異性抗体を生成させるための技術も、文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学的連結を使用して調製され得る。Brennan et al., Science 229: 81 (1985)は、インタクト抗体をタンパク質分解的に開裂してＦ（ａｂ’）２断片を生成させる手順が記載している。これらの断片は、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元され、隣接するジチオールを安定化させ、分子間のジスルフィド形成を防止する。次いで、生成されたＦａｂ’断片をチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に変換させる。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体のうち一方を、メルカプトエチルアミンを用いた還元によりＦａｂ’−チオールに再変換させ、等モル量の他方のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合させて二重特異性抗体を形成させる。産生された二重特異性抗体は、酵素の選択的な固定化のための作用剤として使用され得る。
【０１９１】
最近の進歩により、大腸菌からのＦａｂ’−ＳＨ断片の直接回収が容易になり、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成し得る。することができる。Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の製造を記載している。各Ｆａｂ’断片は大腸菌から別々に分泌され、インビトロで定方向化学的カップリングを受けて二重特異性抗体を形成する。
【０１９２】
組換え細胞培養物から直接、二重特異性抗体断片を作製し単離するための様々な技術も記載されている。例えば、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体が産生されている（Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合により、二つの異なる抗体のＦａｂ’部分と連結された。抗体ホモ二量体は、ヒンジ領域で還元されて単量体を形成し、次いで、再酸化されて抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法は、抗体ホモ二量体の産生にも利用することができる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)により記載された「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替的メカニズムを提供した。この断片は、きわめて短いために同一鎖上の二つのドメイン間の対形成を可能にするリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と繋がっている重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは、もう一つの断片の相補的なＶＬ及びＶＨドメインとの対形成を強いられ、それにより、二つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用により二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略も報告されている。Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)を参照のこと。
【０１９３】
３価以上の抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体が調製され得る（Tuft et al., J. Immunol. 147: 60 (1991)）。
【０１９４】
（ｖｉｉ）単一ドメイン抗体
いくつかの実施態様において、本発明の抗体は単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含むポリペプチド鎖である。所定の実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, Mass；例えば、米国特許第６２４８５１６号を参照のこと）。一実施態様において、単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部又は一部からなる。
【０１９５】
（ｖｉｉｉ）抗体変異体
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される抗体のアミノ酸配列改変が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に好適な変更を導入することにより、又はペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終構築物に到達させるために作製され得る。アミノ酸改変は、配列が作製されるときに、対象の抗体アミノ酸配列に導入され得る。
【０１９６】
（ｉｘ）抗体誘導体
本発明の抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手されている追加の非タンパク質部分を含むように更に改変され得る。ある実施態様において、抗体の誘導体化に適した成分は、水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体のいずれか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーはいずれかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は様々であってもよく、一以上のポリマーが結合される場合、それらは同一又は異なる分子であり得る。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が特定の条件下で治療に使用されるのか等を考慮しながら決定することができる。
【０１９７】
（ｘ）ベクター、宿主細胞、及び組換え法
抗体はまた、組換え法を使用して産生されてもよい。抗抗原抗体の組換え産生のために、抗体をコードする核酸が単離され、更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために、複製可能なベクター中に挿入される。抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離され得、一般的な手順を用いて例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定され得る。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分は、一般に、限定されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列である。
【０１９８】
（ａ）シグナル配列成分
本発明の抗体は直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列又は成熟タンパク質若しくはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。好ましく選択された異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され加工される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。天然抗体シグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物宿主細胞に対して、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ又は熱安定なエンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。酵母での分泌に関して、天然シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、因子リーダー（酵母菌属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びクルイベロマイシス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）α因子リーダーを含む）、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼリーダー、又は国際公開第９０／１３６４６号に記載されているシグナルにより置換されてもよい。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。
【０１９９】
（ｂ）複製起点
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は宿主染色体ＤＮＡとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製起点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製起点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド起点は酵母に適しており、様々なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製起点成分は不要である（ＳＶ４０起点が典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる）。
【０２００】
（ｃ）選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含み得る。典型的な選択遺伝子は、（ａ）アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート若しくはテトラサイクリンのような抗生物質又は他の毒素に耐性を与え、（ｂ）栄養要求性欠陥を補い、あるいは（ｃ）例えばバシリに対する遺伝子コードＤ−アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【０２０１】
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
【０２０２】
哺乳動物細胞に好適な選択可能なマーカーの他の例は、抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することを可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等である。
【０２０３】
例えば、ＤＨＦＲ遺伝子によって形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含む培地において形質転換体を培養することで同定される。これらの条件下で、ＤＨＦＲ遺伝子は任意の他の共形質転換された核酸と共に増幅される。内因性ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えばＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）が使用され得る。
【０２０４】
あるいは、ＧＳ遺伝子で形質転換された細胞は、ＧＳの阻害剤であるＬ−メチオニンスルホキシイミン（Ｍｓｘ）を含む培地中で形質転換体を培養することによって同定される。これらの条件下で、ＧＳ遺伝子は任意の他の共形質転換された核酸と共に増幅される。ＧＳ選択／増幅系は、上述のＤＨＦＲ選択／増幅系と組み合わせて使用され得る。
【０２０５】
あるいは、対象の抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲ遺伝子、及びアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）のような他の選択可能マーカーと共に形質転換又は共形質転換した宿主細胞（特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、カナマイシン、ネオマイシン又はＧ４１８等のアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択され得る。米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。
【０２０６】
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Stinchcomb et al., Nature, 282:39(1979)）。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号又はＰＥＰ４−１のようなトリプトファン内で増殖する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。酵母宿主細胞ゲノムにｔｒｐ１破壊が存在することは、次いでトリプトファンの不存在下における増殖による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠陥酵母株（ＡＴＣＣ２０６２２又は３８６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
【０２０７】
また、１．６μｍの円形プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クルイヴェロマイセス酵母の形質転換に使用され得る。あるいは、組換え仔ウシのキモシンの大規模生産のための発現系がＫ．ラクティスに対して報告されている。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。クルイヴェロマイセスの工業的な菌株による、成熟組換え体ヒト血清アルブミンの分泌のための安定した複数コピー発現ベクターもまた開示されている。Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)。
【０２０８】
（ｄ）プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは一般に宿主生物体によって認識され抗体核酸に作用可能に連結されたプロモーターを含む。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、βラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターを含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用するプロモーターもまた抗体をコードするＤＮＡと作用可能に連結されたシャイン・ダルガノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含むであろう。
【０２０９】
真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ２５から３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から７０から８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３’末端には、コード配列の３’末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
【０２１０】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例は、３−ホスホグリセラートキナーゼ又は他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼを含む。
【０２１１】
他の酵母プロモーターは、増殖条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、並びにマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域である。酵母の発現に使用される好適なベクター及びプロモーターは、ＥＰ７３６５７号に更に記載されている。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に有利に使用される。
【０２１２】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体の転写は、例えば、ポリオーマウイルス、伝染性上皮腫ウイルス、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サルウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーター、又は異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター若しくは免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節され得る。
【０２１３】
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウイルスを使用して哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させる系が、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の変形例は米国特許第４６０１９７８号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞中でのヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現については、Reyes et al., Nature, 297: 598-601(1982)を参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復がプロモーターとして使用され得る。
【０２１４】
（ｅ）エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物による本発明の抗体をコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用されるであろう。例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００−２７０塩基対）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーを含む。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体コード配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
【０２１５】
（ｆ）転写終結成分
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞）に使用される発現ベクターは、また転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５’、及び時には３’の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗体をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
【０２１６】
（ｇ）宿主細胞の選択及び形質転換
本明細書中のベクター中のＤＮＡをクローニング又は発現させるために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６７１０に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）及び大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）のような他の株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
【０２１７】
完全長抗体、抗体融合タンパク質、及び抗体断片は、治療用の抗体が細胞傷害剤（例えば、毒素）とコンジュゲートし、それ自身が腫瘍細胞の破壊において効果を示す場合など、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合に、細菌で産生され得る。完全長抗体は、循環中でより長い半減期を有する。大腸菌での産生が、より迅速でより費用効率的である。細菌での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号（Carter et al.）、米国特許第５７８９１９９号（Joly et al.）、及び翻訳開始部位（ＴＩＲ）及び発現と分泌を最適化するシグナル配列を記載している米国特許第５８４０５２３号（Simmons et al.）を参照のこと。また大腸菌中での抗体断片の発現について記載しているCharlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254も参照のこと。発現の後、抗体は、大腸菌細胞ペーストから可溶性画分へ分離され、例えば、アイソタイプに応じてプロテインＡ又はＧカラムを介して精製され得る。最終精製は、例えば、ＣＨＯ細胞で発現させた抗体を精製するためのプロセスと同じようにして行われ得る。
【０２１８】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に使用される。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能で本明細書中で有用であり、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイヴェロマイセス宿主、例えばＫ．ラクティス、Ｋ．フラギリス（ＡＴＣＣ１２４２４）、Ｋ．ブルガリカス（ＡＴＣＣ１６０４５）、Ｋ．ウィッケラミイ（ＡＴＣＣ２４１７８）、Ｋ．ワルチイ（ＡＴＣＣ５６５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（ＡＴＣＣ３６９０６）、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア（ＥＰ４０２２２６）；ピチアパストリス（ＥＰ１８３０７０）；カンジダ；トリコデルマ・リーシア（ＥＰ２４４２３４）；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属宿主、例えば偽巣性コウジ菌及びクロカビである。治療用タンパク質の生産のための酵母及び糸状真菌の使用を検討している概説に関しては、例えばGerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)を参照のこと。
【０２１９】
グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトグリコシル化パターンを持つ抗体の生産を生じるある種の真菌及び酵母株が選択され得る。例えば、Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)（ピキア・パストリスにおけるグリコシル化経路のヒト化を記載）；及び上掲のGerngross et al.を参照のこと。
【０２２０】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株及び変異体並びに対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばヨトウガ（毛虫）、アエデス・アエジプティ（蚊）、アエデス・アルボピクトゥス（蚊）、ドゥロソフィラ・メラノガスター（ショウジョウバエ）、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ−１変異体とボンビクス・モリＮＰＶのＢｍ−５株が公に利用でき、そのようなウイルスは本発明に従った本明細書中のウイルスとして使用され得、特にヨトウガ細胞のトランスフェクションに使用され得る。
【０２２１】
綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、ウキクサ（Ｌｅｍｎａｃｅａｅ）、アルファルファ（Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、及びタバコのような植物細胞培養が宿主として利用され得る。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（遺伝子組み換え植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照のこと。
【０２２２】
脊椎動物細胞が宿主として使用され得、培養（組織培養）中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)）；ハムスター乳児腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）；サルの腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザルの腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝がん株（ＨｅｐＧ２）である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及びＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えばYazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 255-268を参照のこと。
【０２２３】
宿主細胞が抗体生産のための上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅させるために適切に変性された従来の栄養培地中で培養される。
【０２２４】
（ｈ）宿主細胞の培養
この発明の抗体を産生するために使用される宿主細胞は種々の培地において培養され得る。市販の培地、例えばＨａｍのＦ１０（シグマ）、最小必須培地（（ＭＥＭ），（シグマ）、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ）及びダルベッコの改良イーグル培地（（ＤＭＥＭ），シグマ）が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980)、米国特許第４７６７７０４号；同第４６５７８６６号；同第４９２７７６２号；同第４５６０６５５号；又は同第５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載されたいずれの培地も宿主細胞に対する培地として使用され得る。これらの培地は、いずれもホルモン及び／又は他の増殖因子（例えばインシュリン、トランスフェリン、又は上皮成長因子）、塩類（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、バッファー（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮＴＭ薬）、微量元素（最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される）及びグルコース又は等価なエネルギー源で必要に応じて補充され得る。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含まれ得る。培養条件、例えば温度、ｐＨ等は、発現のために選択された宿主細胞について過去に使用されているものであり、当業者には明らかであろう。
【０２２５】
（ｘｉ）抗体の精製
組換え技術を使用した場合、抗体は、細胞周辺腔内で細胞内に産生されるか又は、培地中に直接分泌され得る。抗体が細胞内に産生される場合、最初の工程として、宿主細胞か又は溶解断片のいずれかである微粒子状破片は、例えば遠心分離又は限外濾過により除去される。Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順を記載する。簡潔には、細胞ペーストは、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ及びフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で、約３０分間にわたって融解される。細胞破片は、遠心分離により除去され得る。抗体が培地中に分泌される場合、一般的に、そのような発現系からの上清は、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して、最初に濃縮される。ＰＭＳＦ等のプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するように任意の前述の工程に含まれてもよく、抗生物質は、偶発性混入物の成長を妨げるように含まれてもよい。
【０２２６】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製され得、その中でもアフィニティ―クロマトグラフィーが典型的には好ましい精製工程である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依拠する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に使用され得る（Lindmark et al., J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Guss et al., EMBO J. 5: 16571575 (1986)）。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他のマトリクスも使用可能である。孔制御ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成され得るものより早い流量及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂（J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの断片化、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される抗体に応じて利用可能である。
【０２２７】
一般に、研究、試験及び臨床に使用される抗体を調製するための様々な方法は、当該技術分野で十分に確立されており、上述の方法と一致し、及び／又は対象の特定の抗体に対して当業者が適切と考えるものである。
【０２２８】
Ｂ．生物学的に活性な抗体の選択
上記のように生成される抗体は、治療的観点から有利な特性を有する抗体を選択するために、一又は複数の「生物活性」アッセイに課され得る。抗体は、産生された抗原に結合するその能力についてスクリーニングされ得る。例えば抗ＶＥＧＦ抗体については、抗体の抗原結合特性は、ＶＥＧＦに結合する能力を検出するアッセイにおいて評価され得る。別の例において、抗ＣＤ２０抗体については、抗体の抗原結合特性は、ＣＤ２０に結合する能力を検出するアッセイにおいて評価され得る。
【０２２９】
別の実施態様において、抗体の親和性は例えば、飽和結合；ＥＬＩＳＡ；及び／又は競合アッセイ（例えばＲＩＡ）によって決定され得る。
【０２３０】
また、抗体は、例えば治療としての有効性を評価するために、他の生物活性アッセイを施してもよい。このようなアッセイは、当該技術分野で公知であり、標的抗原に依存し、抗体としての使用が意図されている。
【０２３１】
対象の抗原上の特定のエピトープに結合する抗体（例えば、ＶＥＧＦに対する、実施例の抗ＶＥＧＦ抗体の結合をブロックするもの）をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されたもののような従来のクロスブロッキングアッセイが実施され得る。あるいは、抗体が対象のエピトープに結合するかどうかを決定するために、例えばChampe et al., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995)に記載されているようなエピトープマッピングが実施され得る。
【０２３２】
用語「ＣＤ２０抗体の発現」は、細胞、好ましくはＴ又はＢ細胞、より好ましくはＢ細胞の細胞表面上における、それぞれ腫瘍又はがん、好ましくは非固形腫瘍からのＣＤ２０抗原の発現の有意なレベルを示すことが意図される。「ＣＤ２０発現がん」に罹患している患者は、当該技術分野で知られている標準的アッセイにより決定され得る。例えば、ＣＤ２０抗原発現は、免疫組織化学（ＩＨＣ）検出、ＦＡＣＳを使用して、又は対応するｍＲＮＡのＰＣＲに基づく検出を介して測定される。
【０２３３】
Ｃ．製剤の調製
対象の抗体の調製後（例えば、本明細書に開示されるように製剤化可能な抗体を生産するための技術は下に詳述され当該技術分野において既知である）、それを含んでなる薬学的製剤が調製される。ある実施態様において、製剤化される抗体は、事前に凍結乾燥処理されておらず、本明細書中の対象の製剤は水性製剤である。ある実施態様において、抗体は完全長抗体である。一実施態様において、製剤中の抗体はＦ（ａｂ’）２等の抗体断片であり、この場合、完全長抗体に対し生じないであろう問題（Ｆａｂへの抗体のクリッピング等）が対処される必要があり得る。製剤中に存在する抗体の治療的有効量は、例えば投与の所望される投与量及び様式（一又は複数）を考慮することによって決定される。約２５ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬ、又は約３０ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬ又は約４５ｍｇ／ｍＬから約５５ｍｇ／ｍＬが、製剤中の例示的抗体濃度である。
【０２３４】
水性製剤は、ｐＨ緩衝溶液中に抗体を含んで調製される。本発明のバッファーは、約５．５から約７．０の範囲のｐＨを有する。ある実施態様において、ｐＨは、ｐＨ５．５から６．５の範囲、ｐＨ５．７から６．８の範囲、ｐＨ５．８から６．５の範囲、ｐＨ５．９から６．５の範囲、ｐＨ６．０から６．５の範囲、又はｐＨ６．２から６．５の範囲である。本発明のある実施態様において、製剤は６．２又は約６．２のｐＨを有する。本発明のある実施態様において、製剤は６．０又は約６．０のｐＨを有する。この範囲内にｐＨを制御するバッファーの例は、リン酸ナトリウム及びヒスチジン（例えばＬ−ヒスチジン）である。ある実施態様において、バッファーは約１５ｍＭから約３５ｍＭの濃度でリン酸ナトリウムを含む。本発明のある実施態様において、バッファーは、約２０ｍＭから約３０ｍＭ、約２２ｍＭから約２８ｍＭ、又は約２５ｍＭの濃度でリン酸ナトリウムを含む。一実施態様において、バッファーは約２５ｍＭの量の、ｐＨ６．２のリン酸ナトリウムである。ある実施態様において、バッファーは約１５ｍＭから約３５ｍＭの濃度でヒスチジンを含む。本発明のある実施態様において、バッファーは、約２０ｍＭから約３０ｍＭ、約２２ｍＭから約２８ｍＭ、又は約２５ｍＭの濃度でヒスチジンを含む。一実施態様において、バッファーは約２０ｍＭの量のｐＨ６．０のヒスチジンである。
【０２３５】
製剤は約４０ｍＭから約１２０ｍＭの量のトレハロースを更に含む。いくつかの実施態様において、製剤中のトレハロースは、約４０ｍＭから約１００ｍＭ、約４０ｍＭから約９０ｍＭ、約４０ｍＭから約８０ｍＭ、約５０ｍＭから約７０ｍＭ、又は約５５ｍＭから約６５ｍＭである。いくつかの実施態様において、製剤中のトレハロースは、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、又は約１２０ｍＭである。
【０２３６】
いくつかの実施態様において、製剤中のトレハロースに対するモノクローナル抗体の重量比は約１．６５から約４．９５である。いくつかの実施態様において、製剤中のトレハロースに対するモノクローナル抗体の重量比は約１．６５から約３．３０である。いくつかの実施態様において、トレハロースに対するモノクローナル抗体の重量比は約１．７０から約２．９１である。いくつかの実施態様において、トレハロースに対するモノクローナル抗体の重量比は約２．００から約３．３０である。いくつかの実施態様において、トレハロースに対するモノクローナル抗体の重量比は、約１．６５、１．７０、１．８０、１．９０、２．００、２．０８、２．１０、２．２０、２．３０、２．３１、２．３８、２．４０、２．４８、２．５０、２．６０、２．７０、２．８０、２．９０、２．９１、３．００、３．１０、３．２０、３．３０、３．４０、３．５０、３．７０、３．８０、３．９０、４．００、４．１０、４．２０、４．３０、４．４０、４．５０、４．６０、４．７０、４．８０、４．９０、及び４．９５（これらの数字間の全ての値を含む）のいずれかである。本明細書中で使用される場合、トレハロースに対する抗体の重量比を計算するための製剤中のトレハロースの重量は、トレハロース二水和物（ＭＷ３７８．３３）の量に基づく。トレハロースの他の形態（例えば無水トレハロース）が使用される場合、製剤中のトレハロースの重量は、同一モル濃度を有するトレハロース二水和物の重量に変換されるべきである。
【０２３７】
界面活性剤が抗体製剤に添加されてもよい。例示的な界面活性剤は、ポリソルベート（例えばポリソルベート２０、８０等）又はポロキサマー（例えばポロキサマー１８８等）のような非イオン性界面活性剤を含む。添加される界面活性剤の量は、製剤化された抗体の凝集を低減する及び／又は製剤中の粒子の形成を最小化する及び／又は吸着を低減するような量である。例えば、界面活性剤は、約０．００１％から約０．５％、約０．００５％から約０．２％、約０．０１％から約０．１％、又は約０．０２％から約０．０６％、又は約０．０３％から約０．０５％の量で製剤中に存在してもよい。ある実施態様において、界面活性剤は０．０４％又は約０．０４％の量で製剤中に存在する。ある実施態様において、界面活性剤は０．０２％又は約０．０２％の量で製剤中に存在する。一実施態様において、製剤は界面活性剤を含まない。
【０２３８】
一実施態様において、製剤は上記薬剤（例えば抗体、バッファー、トレハロース、及び／又は界面活性剤）を含有し、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノール及び塩化ベンゼトニウム等の一又は複数の保存料を本質的に含まない。別の実施態様において、特に製剤が複数投与製剤の場合、保存料が製剤に含まれてもよい。保存料の濃度は、約０．１％から約２％、好ましくは約０．５％から約１％の範囲であり得る。製剤の所望される特徴に悪影響を及ぼさないことを条件として、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に記載されるもの等、一又は複数の他の薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤が製剤に含まれてもよい。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、用いられる用量及び濃度ではレシピエントに非毒性であり；更なる緩衝剤；共溶媒；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；ＥＤＴＡ等のキレート剤；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；ポリエステル等の生分解性ポリマー；及び／又は塩形成対イオンを含む。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体は、介在性薬物分散剤、例えば、水溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標））、Baxter International, Inc.）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。所定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒＨｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８に開示されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼ等の一又は複数の更なるグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０２３９】
本明細書中のキレート剤の様々な記述はしばしばＥＤＴＡに集中するが、他の金属イオンキレート剤も本発明に包含されることが理解されるであろう。金属イオンキレート剤は当業者によく知られており、必ずしも限定するものではないが、アミノポリカルボキシレート、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（ベータ−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、ＥＤＤＳ（エチレンジアミンジコハク酸）、ＰＤＴＡ（１，３−プロピレンジアミン四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミペンタアセテート酸）、ＡＤＡ（ベータ−アラニン二酢酸）、ＭＧＣＡ（メチルグリシン二酢酸）等を含む。更に、本明細書中のいくつかの実施態様はホスホネート／ホスホン酸キレート剤を含む。
【０２４０】
本明細書中の製剤はまた、治療される特定の適応症に必要な一以上のタンパク質を含み得、好ましくは、他のタンパク質に悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものである。例えば、抗体が抗ＶＥＧＦである場合、これは他の薬剤と組合せられてもよい（例えば、化学療法剤、及び抗腫瘍性剤など）。
【０２４１】
いくつかの実施態様において、製剤中の抗体の物理的安定性、化学的安定性、又は生物活性が評価又は測定される。当該技術分野で知られる任意の方法が安定性及び生物活性を評価するために使用され得る。いくつかの実施態様において、製剤中の抗体は、−２０℃で少なくとも約１２か月間、少なくとも約１８か月間、少なくとも約２１か月間、又は少なくとも約２４か月間（又は少なくとも約５２週間）安定している。いくつかの実施態様において、安定性は、保管後の製剤中の高分子量種（ＨＭＷＳ）の形成により測定される。いくつかの実施態様において、製剤中のＨＭＷＳの割合は、−２０℃で少なくとも約６か月間、少なくとも約１２か月間、少なくとも約１８か月間、又は少なくとも約２４か月間の保管後、約０．８％、約０．９％、又は約１％のいずれかより低い。いくつかの実施態様において、製剤中の全凝集体は、−２０℃で少なくとも約６か月間、少なくとも約１２か月間、少なくとも約１８か月間、又は少なくとも約２４か月間の保管後、約２．５％、又は約３％のいずれかより低い。
【０２４２】
インビボ投与に使用される製剤は、無菌であるべきである。これは、製剤の調製前又は後の滅菌濾過膜を通じた濾過により容易に達成される。
【０２４３】
ＩＩＩ．抗体製剤の投与
製剤は、抗体を用いた治療を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに対して、ボーラス又はある期間にわたる連続的注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、髄腔内、口腔内、局所又は吸入経路による投与などの既知の方法に従って投与される。一実施態様において、製剤は静脈内投与によって哺乳動物に投与される。そのような目的のため、製剤は、例えばシリンジを使用して、又はＩＶラインを介して注射されてもよい。一実施態様において、製剤は皮下投与によって哺乳動物に投与される。
【０２４４】
抗体の適切な用量（「治療的有効量」）は、例えば、治療される状態、状態の重篤性及び経過、抗体が予防的目的のための投与か治療的目的のための投与か、治療歴、患者の病歴及び抗体に対する反応性、使用される抗体のタイプ、並びに主治医の判断に依拠するであろう。抗体は、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与され、その後の診断による任意の時期に患者に投与され得る。抗体は、単一の治療として又は問題の状態を治療するのに有用な他の薬物又は療法と併せて投与されてもよい。
【０２４５】
一般的な提案として、投与される抗体の治療的有効量は、患者の体重について約０．１から約５０ｍｇ／ｋｇの範囲で、一又は複数の投与であり得、使用される抗体の典型的な範囲は例えば約０．３から約２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．３から約１５ｍｇ／ｋｇ毎日投与される。しかしながら、他の投薬計画が有用であり得る。一実施態様において、アンタゴニストは抗ＶＥＧＦ抗体であり、これが約１００又は４００ｍｇの用量で毎１、２、３、又は４週投与されるか、又は約１、３、５、７．５、１０、１５、又は２０ｍｇ／ｋｇの用量を毎１、２、３、又は４週投与される。用量は単回投与として、又は点滴などの複数回投与（例えば２又は３投与）として投与されてもよい。この治療法の進行は従来の技術により容易にモニタリングされる。
【０２４６】
ＩＶ．製造品
本発明の別の実施態様において、本発明の水性薬学的製剤を収容する容器を含む製造品が提供され、場合によっては使用説明書を提供する。好適な容器は、例えば、瓶、バイアル及びシリンジを含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの種々の材料から形成し得る。例示的容器は３−２０ｃｃの使い捨てガラスバイアルである。あるいは、多回投与製剤に関して、容器は３−１００ｃｃガラスバイアルであってもよい。容器は製剤を収容し、容器上の又は容器に付随するラベルは使用の方法を示し得る。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用説明書を伴う添付文書を含む、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含んでもよい。
【０２４７】
当業者が本発明を実施するために、明細書は十分であると考えられる。本明細書に示され記述されているものに加え、本発明の様々な変更が、前述から当業者に明瞭であると考えられ、添付の請求の範囲に含まれる。本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、全ての目的に対し、参照によりその全体が本明細書中に援用される。
【実施例】
【０２４８】
本発明は、以下の実施例を参照して、より十分に理解されるであろう。ただし、これらの実施例は、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。本明細書中に記載される実施例及び実施態様は例示のみを目的としており、それらを考慮して様々な修正又は変更が当業者に対して提案されるであろうこと並びにそれらは本願及び添付の請求項の範囲の精神及び権限内に含まれるべきであることが理解される。
【０２４９】
実施例１：安定したベバシズマブ液体製剤の開発
約２５ｍｇ／ｍＬ−１００ｍｇ／ｍＬの範囲のタンパク質濃度でベバシズマブ、２５ｍＭ又は５１ｍＭの濃度でリン酸ナトリウム、及び約４０ｍＭ−２４０ｍＭの範囲の濃度でトレハロースを含む様々な製剤を、−２０℃又は−４０℃の温度で２４か月保管した場合の高分子量種（ＨＭＷＳ）の形成に関して、それぞれ試験した。ＨＭＷＳの測定前に、製剤溶液にストレスを負荷したか否かのいずれかであった。ストレス条件は、トレハロースを結晶化するために加速化凝集条件を受けた製剤のことである。結果は、ベバシズマブの製剤Ａ（「ＦＡ」と称する）（２５ｍｇ／ｍＬベバシズマブ、５１ｍＭリン酸ナトリウム、１５９ｍＭトレハロース、０．０４％ＰＳ２０、ｐＨ６．２）は−２０℃で保管された場合には凝集を開始したが−４０℃では開始しなかったことを実証した（図１）。とりわけ、タンパク質濃度を２５ｍｇ／ｍＬで一定に保ったときのトレハロースの濃度の減少は、製剤が−２０℃で保管された場合、凝集体の形成を減少させた（Ｆｉｇ．１）。タンパク質濃度が増加され、リン酸ナトリウム及びトレハロースの濃度が一定に保たれたか又は減少させられた場合、ベバシズマブ製剤Ｂ（「ＦＢ」と称する；５０ｍｇ／ｍＬベバシズマブ、２５ｍＭリン酸ナトリウム、６０ｍＭトレハロース、０．０４％ＰＳ２０、ｐＨ６．２）の場合のように、同様の結果が観察された（図１；空洞の円）。これらの結果は、トレハロースの濃度と比較してより高いタンパク質濃度を有するベバシズマブ製剤がトレイリングエッジダイマー（ＴＥＤ）及び可溶型凝集体を減少させ得ることを実証する。
【０２５０】
とりわけ、ＦＢ製剤は、ロバスト製剤領域にあるとみられた。ＦＢ製剤のロバスト性の製造を保証するため、１５ｃｃバイアル中５ｍＬの一容量中に約４５ｍｇ／ｍＬ−５５ｍｇ／ｍＬの範囲のタンパク質濃度でベバシズマブ、約２２ｍＭ−２８ｍＭの範囲の濃度でリン酸ナトリウム、及び約５０ｍＭ−７０ｍＭの範囲の濃度でトレハロースを含む製剤を生成することにより、１０％範囲で様々に変化させたものを試験した（表２）。全ての製剤は、６．２のｐＨと０．０４％ＰＳ２０を有した。−２０℃で１２か月間保管した場合のＨＭＷＳの形成に関して、各製剤を試験した。ＨＭＷＳの測定前に、トレハロースを結晶化させる凝集条件を加速するために製剤溶液にストレスを負荷し、ストレス負荷しなかった製剤溶液と比較した。−２０℃で１、２、３、６、及び１２か月間保管した製剤の凝集体形成分析に関しては、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用した。結果は、試験した製剤溶液は−２０℃の温度で１２か月間保管された場合に凝集しなかったことを示す。これは、ＦＢ製剤がＴＥＤ及び可溶型凝集体レベルを効果的に緩和したロバスト形成領域にあったことを実証した（図２）。
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【０２５１】
ＦＡ製剤、ＦＢ製剤並びに３３ｍｇ／ｍＬベバシズマブ、２５ｍＭリン酸ナトリウム及び６０ｍＭトレハロースを含む代替的な製剤（ＦＣ）を用いて、追加の安定性アッセイを行った。全ての製剤は、６．２のｐＨと０．０４％ＰＳ２０を有した。−２０℃又は−４０℃の温度で２４か月間保管した場合のＨＭＷＳの形成に関して、各製剤を試験した。ＨＭＷＳの測定前に、トレハロースを結晶化させる凝集条件を加速するために技術を誘発する凝集体を使用することにより（図３；閉じた三角形）製剤溶液にストレスを負荷し、ストレス負荷しなかった製剤溶液と比較した（図３；閉じた四角形）。製剤溶液に希釈ＳＥＣ法を施した。１か月保管後、希釈ＳＥＣ法は、凝集を加速するためにストレス負荷した場合、ＦＡ製剤の凝集体レベルが増加したことを示した（図３Ａ）。比較すると、ＦＢ製剤における凝集体形成は、ストレス負荷した場合、約１２か月遅れた。加えて、−４０℃での保管は、試験した全ての溶液に関して、全凝集体形成における増加を妨げるように見えた（図３Ｂ）。ＳＥＣクロマトグラフィーは、−２０℃での２４か月間の保管後にＦＢ製剤と比較してＦＡ製剤中のＴＥＤの存在が増加したことを実証した（図４；矢印）。
【０２５２】
実施例２：安定したオビヌツズマブ液体製剤の開発
約３５ｍｇ／ｍＬ−７５ｍｇ／ｍＬの範囲のタンパク質濃度でオビヌツズマブ、２０ｍＭの濃度でＬ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｖ）の濃度でポロキサマー１８８、約４０ｍＭ−２４０ｍＭの範囲の濃度でトレハロース、及びｐＨ６．０を含む様々な製剤を、−２０℃で５２週間まで又は−４０℃で５２週間まで保管した場合の高分子量種（ＨＭＷＳ）の形成に関して、それぞれ試験した。表３を参照のこと。
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【０２５３】
−２０℃及び−４０℃での長期間の保管前に、トレハロースを結晶化させる加速条件に凍結製剤をさらすことにより、製剤溶液にストレスを負荷した。各分析時点で、各製剤のアリコートを保管から外し、解凍し、サイズ排除クロマトグラフィーによるＨＭＷＳ分析を施した。サイズ排除分析による結果は、オビヌツズマブの複数の製剤が−２０℃で保管された場合はＨＭＷＳ含有量において増加を示したが、−４０℃では経時的な凝集は観察されなかったことを実証した（図５Ａ及び５Ｂ並びに図６）。
【０２５４】
オビヌツズマブ製剤Ｆ２−Ｆ５及びＦ６−Ｆ１１により示されるように、タンパク質の濃度が増加し、トレハロースの濃度が減少した場合には−２０℃で５２週間の凝集体形成の低減又は防止さえも達成された（図５Ａ）。
【０２５５】
抗体濃度の増加はＨＭＷＳ形成の減少をもたらすのに対し、トレハロース濃度の増加は経時的なＨＭＷＳ形成を増加させる。図７は、−２０℃での凝集体形成におけるトレハロース濃度の影響は高い抗体濃度よりも低い抗体濃度でより有意であることを示す。データはＤｏＥ（多因子設計）フォーマット（２製剤因子＋時間）で表されるため、異なるパラメータの影響を推定するために、多重線形回帰（ＭＬＲ）が使用され得る。ＭＬＲ分析は、０．９６８のＲ２を有する高分子量種（ＨＭＷＳ）に関する回帰モデルをもたらし、非常に良好なモデル一致及び良好な予測精度の尺度としての０．９５７の高いＱ２を示す。得られた係数プロット（図７Ａ）は、異なる因子の影響を解釈するために使用され得る信頼区間を有する一致したモデルのそれぞれの回帰係数を示す。統計的に有意な係数は（時間は別として）、製剤因子ｃＭＡｂ（オビヌツズマブ濃度）及びｃＴｒｅｈ（トレハロース濃度）の両方の製剤因子である。ｃＴｒｅ係数は、ｃＭＡｂ及び時間係数よりもはるかに大きいため、トレハロース濃度は最も重要な因子と考えられ得る。係数バーｃＭＡｂ及びｃＴｒｅｈの逆向は、抗体濃度の増加がＨＭＷＳ形成の減少をもたらすのに対し、トレハロース濃度の増加は経時的なＨＭＷＳ形成を増加させるであろうことを示す。更に、モデルは、−２０℃での凝集体形成におけるトレハロース濃度の影響は高い抗体濃度よりも低い抗体濃度でより有意であることを示す有意な２因子交互作用項ｃＭＡｂ＊ｃＴｒｅｈ（図７Ｂ）を含む。図７Ｃは、因子ｃＭＡｂ及びｃＴｒｅｈを軸として、高レベルで固定された時間で、作製された反応等高線図を示す。
【０２５６】
これらの結果は、トレハロースの濃度と比較してより高濃度のタンパク質を有するオビヌツズマブ製剤では、製剤が−２０℃で保管される場合、可溶型凝集体及びトレイリングエッジダイマー（ＴＥＤ）形成のリスクが減少することを実証する。
【図１−０１】
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【図１−０２】
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【図１−０３】
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【図１−０４】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年12月5日(2018.12.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
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