(57)【要約】【課題】  高い安全性を有し、かつ、サルモネラ症に対する防御効果に優れたワクチンを提供すること。【解決手段】  サルモネラ属菌から分泌されるタンパク質とサルモネラ属菌の死菌とを組み合わせを生体に投与すると、それぞれ単独の場合と比較して、サルモネラ属菌の感染に対して極めて優れた防御効果を発揮することを見出した。高い安全性を有し、かつ、サルモネラ症からの防御能に優れたワクチンが提供された。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）5mM  KCl、7.5mM  (NH4)2SO4、0.5mM  K2PO4、38mM  グリセロール、100mM  Tris-HCl、30μM  MgCl2、0.2%  グルコース、0.1%  カザミノ酸の組成でpH5.0の培地でサルモネラ属菌を培養する工程、
（ｂ）培養したサルモネラ属菌から分泌されるタンパク質を回収する工程、および
（ｃ）回収したタンパク質をサルモネラ属菌の死菌と組み合わせる工程、
を含む、サルモネラ症から生体を防御するためのワクチンの製造方法。
【請求項２】
（ａ）5mM  KCl、7.5mM  (NH4)2SO4、0.5mM  K2PO4、38mM  グリセロール、100mM  Tris-HCl、30μM  MgCl2、0.2%  グルコース、0.1%  カザミノ酸の組成でpH5.0の培地でサルモネラ属菌を培養する工程、
（ｂ）培養したサルモネラ属菌から分泌されるタンパク質を回収する工程、および
（ｃ）回収したタンパク質をサルモネラ属菌の死菌との組み合わせで、サルモネラ属菌に感染する生体（但し、ヒトを除く）に投与する工程、
を含む、サルモネラ症から生体（但し、ヒトを除く）を防御する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サルモネラ属菌の分泌タンパク質と死菌との組み合わせを含むサルモネラワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
畜産業におけるサルモネラ症の発生は経済的損失が極めて大きいことから、家畜・家禽に対する感染予防対策は重要である。しかしながら、現在まで、国内の家畜・家禽のサルモネラ症の発生は、完全には抑えられていない。
【０００３】
サルモネラ属菌の感染予防には、ワクチンの利用が試みられている。例えば、サルモネラ経口感染において、弱毒株などの生菌を免疫原として利用すると、感染防御を示すことが報告されている。この弱毒株を用いたワクチン開発は、免疫学・細菌学的な知見に基づく着想と目的達成に向けた優れた戦略性を有しているが、副反応や病原性の復帰の危険性を伴うという問題がある。
【０００４】
このため弱毒株ワクチンは、現在、市販されておらず、専ら、ホルマリンや熱により殺菌したサルモネラ属菌からなる死菌ワクチンが利用されている（例えば、「牛サルモネラ2価ワクチン（株式会社  科学飼料研究所）」、「鶏サルモネラ不活化3混・KS（共立製薬株式会社））。
【０００５】
また、弱毒株を利用しないワクチンとして、特定の条件で培養したサルモネラ属菌の培養上清を利用したワクチンも報告されている。例えば、特許文献１では、SPI-2誘導条件下において、低マグネシウム・低リン酸の培地で培養したサルモネラ属菌の培養上清が、鳥類に感染したサルモネラ属菌の全身への拡がりに対して防御効果を有することが開示されている。
【０００６】
しかしながら、安全性に優れ、かつ、サルモネラ属菌の感染に対して優れた防御効果を有する成分ワクチンは、いまだ開発されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表2010-501599号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、高い安全性を有し、かつ、サルモネラ症に対する防御効果に優れたワクチンを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく、サルモネラワクチンの成分として、弱毒株以外の成分の利用につき鋭意検討を行った。その結果、サルモネラ属菌から分泌されるタンパク質とサルモネラ属菌の死菌のそれぞれ単独投与では、無処置あるいはアジュバントを投与した対照と比較して、サルモネラ属菌の感染に対して有意な防御効果は認められなかった。しかしながら、サルモネラ属菌から分泌されるタンパク質とサルモネラ属菌の死菌とを組み合わせて投与すると、驚くべきことに、サルモネラ属菌の感染に対して極めて優れた防御効果を発揮することが判明した。この防御効果は、検討を行った全てのサルモネラ属菌の感染において認められた。これら事実から、本発明者らは、サルモネラ属菌から分泌されるタンパク質とサルモネラ属菌の死菌との組み合わせが、高い安全性と優れた効果を併せ持つサルモネラワクチンとして、様々なサルモネラ属菌による感染に対して利用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、より詳しくは以下の態様を提供するものである。
【００１１】
（１）サルモネラ属菌から分泌されるタンパク質とサルモネラ属菌の死菌との組み合わせを含む、サルモネラ症から生体を防御するためのワクチン。
【００１２】
（２）タンパク質が、5mM  KCl、7.5mM  (NH4)2SO4、0.5mM  K2PO4、38mM  グリセロール、100mM  Tris-HCl、30μM  MgCl2、0.2%  グルコース、0.1%  カザミノ酸の組成でpH5.0の培地で培養されたサルモネラ属菌から分泌されるものである、（１）に記載のワクチン。
【００１３】
（３）（１）または（２）に記載のワクチンをサルモネラ属菌に感染する生体に投与する、サルモネラ症から生体を防御する方法。
【発明の効果】
【００１４】
サルモネラ属菌から分泌されるタンパク質とサルモネラ属菌の死菌との組み合わせを有効成分とする本発明のワクチンは、生体へ投与することにより、サルモネラ属菌が感染した場合でも極めて高い生存率をもたらすことができた。サルモネラ属菌から分泌されるタンパク質を単独で投与した場合やサルモネラ属菌の死菌を単独で投与した場合には、対照（無処置やアジュバント投与）と比較して有意な効果が認められず、全ての個体が死亡したことを考慮すれば、本発明のワクチンによる効果は、驚くべき相乗効果である。
【００１５】
また、上記タンパク質や死菌を単独投与した場合には、個体が死亡する前から異常な症状が認められたが、それらの組み合わせに係る本発明のワクチンの投与では、このような異常な症状は認められなかった。この事実も、本発明のワクチンの優れた作用を裏付けるものである。
【００１６】
さらに、本発明のワクチンは、血清型の異なる様々なサルモネラ属菌の感染に対して防御効果を示すことができた。従って、サルモネラ症において幅広い応用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】サルモネラ属菌から分泌されたタンパク質および／またはサルモネラ属菌の死菌を免疫したマウスにおける、サルモネラ属菌の感染からの防御効果を示すグラフである。対照として、無処置およびアジュバント投与の結果を示した。
【図２】サルモネラ属菌から分泌されたタンパク質および3種のサルモネラ属菌の死菌の混合物を免疫したマウスにおける、3種のサルモネラ属菌の感染からの防御効果を示すグラフである。対照として、無処置の結果を示した。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、サルモネラ属菌から分泌されるタンパク質とサルモネラ属菌の死菌との組み合わせを有効成分とする、サルモネラ症から生体を防御するためのワクチンを提供する。また、本発明は、当該ワクチンをサルモネラ属菌に感染する生体に投与する、サルモネラ症から生体を防御する方法を提供する。
【００１９】
本発明における「サルモネラ症」とは、サルモネラ属菌により引き起こされる感染症を意味する。サルモネラ症を引き起こす「サルモネラ属菌」としては、例えば、Salmonella  enterica  subsp.  entericaに属するSalmonella  Typhimurium、Salmonella  Choleraesuis、Salmonella  Dublin、Salmonella  Enteritidis、Salmonella  Gallinarum、Salmonella  Pullorumが挙げられるが、これらに制限されない。本発明のワクチンの製造においては、2種以上のサルモネラ属菌を利用して多価のワクチンとすることも可能である。
【００２０】
サルモネラ属菌にタンパク質を分泌させる際の培養においては、酸性の最少培地を用いることが好ましい。酸性の最少培地としては、例えば、5mM  KCl、7.5mM  (NH4)2SO4、0.5mM  K2PO4、38mM  グリセロール、100mM  Tris-HCl、30μM  MgCl2、0.2%  グルコース、0.1%  カザミノ酸の組成でpH5.0の培地を好適に利用することができる。
【００２１】
なお、本発明おいて「タンパク質が、5mM  KCl、7.5mM  (NH4)2SO4、0.5mM  K2PO4、38mM  グリセロール、100mM  Tris-HCl、30μM  MgCl2、0.2%  グルコース、0.1%  カザミノ酸の組成でpH5.0の培地で培養されたサルモネラ属菌から分泌されるものである」とは、タンパク質が当該培地で培養されたサルモネラ属菌から分泌されるという「性質」を有することを意味し、タンパク質の「取得方法」を限定する意味ではない。
【００２２】
本発明においては、サルモネラ属菌から分泌されるタンパク質の全てを利用する必要はなく、例えば、サルモネラ症に対する防除効果に貢献しない分泌タンパク質はワクチン成分から除外してもよい。特定の分泌タンパク質が、サルモネラ症に対する防除効果に貢献するか否かは、当該特定のタンパク質とサルモネラ属菌の死菌との組み合わせをマウスに投与し、当該マウスにサルモネラ属菌を感染させて、その生存率を検定することにより評価することが可能である（本実施例を参照のこと）。
【００２３】
本発明のワクチンにおいて、上記分泌タンパク質との組み合わせで利用されるサルモネラ属菌の「死菌」は、サルモネラ属菌を、例えば、加熱処理、化学消毒剤処理、放射線あるいは紫外線の照射、変異促進物質処理などにより調製することができる。死菌の調製においては、好適には、加熱処理または化学消毒剤であるホルマリンによる処理が用いられる。死菌は、異なるサルモネラ属菌の混合物（例えば、異なる種や異なる血清型のサルモネラ属菌の混合物）であってもよい。これにより感染防御可能なサルモネラ属菌の範囲を広げることが可能である。
【００２４】
本発明のワクチンにおいて、サルモネラ属菌から分泌されるタンパク質とサルモネラ属菌の死菌との「組み合わせを含む」とは、本発明のワクチンが、サルモネラ属菌から分泌されるタンパク質とサルモネラ属菌の死菌の双方を有効成分として含む単剤の形態であっても、サルモネラ属菌から分泌されるタンパク質を有効成分として含む製剤とサルモネラ属菌の死菌を有効成分とする製剤との併用剤の形態であってもよいことを意味する。
【００２５】
本発明のワクチンにおいては、上記有効成分以外に、薬理学的に許容される担体を含むことができる。このような担体としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤などが挙げられるが、これらに制限されない。上記有効成分は、投与方法や治療目的などに応じて、注射剤、エアロゾル剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などの各種形態とすることができる。
【００２６】
また、本発明のワクチンにおいては、免疫応答を増強させるために、さらにアジュバントを添加することができる。アジュバントとしては、例えば、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、オイルアジュバント、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サポニン、ビタミンEなどが挙げられるが、効果を発揮する限り特に制限はない。
【００２７】
本発明のワクチンを投与する「生体」とは、生きた動物およびヒトの身体を意味する。動物としては、サルモネラ属菌が感染し得る動物であれば特に制限はなく、家畜であってもよく、愛玩動物（ペット）であっても、実験動物であっても、それ以外の用途の動物であってもよい。動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、カモ、ウズラ、キジ、ハト、七面鳥、ホロホロ鳥、イヌ、ネコなどが挙げられるが、これらに制限されない。
【００２８】
本発明のワクチンは、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、経口、鼻腔内を含む公知の投与経路で生体に投与し、生体に免疫を付与することができる。本発明のワクチン製剤が併用剤の場合には、各製剤は、同時に投与されてもよく、また、併用の効果を減殺しない範囲内で時間差をおいて投与されてもよい。
【００２９】
本発明のワクチンの投与量は、生体における免疫応答を誘導し得る量であればよく、動物やヒトの年齢や体重、動物の種類、病原細菌の種類（例えば、病原性の高さの違いなど）、並びに、投与の方法や経路などにより変動し得る。有効成分たる分泌タンパク質の1回の投与量は、通常、0.05μg〜1500μgであり、好ましくは5μg〜500μgである。有効成分たる死菌の1回の投与量は、死菌数として、通常、103〜1010であり、好ましくは106〜109である。投与は、複数回に渡って行ってもよく、その場合の投与間隔は、通常、1〜2週間である。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３１】
（１）サルモネラ属菌
サルモネラ属菌として、Salmonella  enterica  subsp.  entericaに属するSalmonella  Typhimurium(S.  Typhimurium)（O4群）、Salmonella  Choleraesuis（S.  Choleraesuis）（O7群）、およびSalmonella  Dublin（S.  Dublin）（O9群）を用いた。
【００３２】
なお、これらのサルモネラ属菌は、American  Type  Culture  Collection（ATCC）より入手可能である。
【００３３】
（２）培地
サルモネラ属菌の培養には、次の培地を用いた。
【００３４】
【表１】
2019199478.tif 000002
【００３５】
【表２】
2019199478.tif 000003
【００３６】
（３）死菌の調製
S.  Typhimurium、S.  Choleraesuis、およびS.  DublinをLB培地にて37℃、一晩静地培養し、菌体を3,000gで20分間遠心し菌体を回収した。その後、1x104CFU/500μl  PBSに調整し、100℃で5分間煮沸殺菌し、Biorutor（ビーエム機器）を用い、Highモードにて30秒間隔で10分間、超音波破砕と休止状態とを繰り返すことにより、菌体を破壊した。
【００３７】
（４）分泌タンパク質の調製
S.  TyphimuriumをLB培地にて37℃、一晩静地培養し、50倍量のLB培地にて37℃、一晩振盪培養（160rpm）した。その後、3,000gで20分間遠心して菌体を回収し、振盪培養で用いた培地の半分量のpH5.0  N-最少培地（minimal  medium）にて37℃で一晩静地培養した。静地培養したpH5.0  N-最少培地の上清を3,000gで30分間遠心し、さらに0.22μmフィルターを用いて菌体を除去した。得られた上清に最終濃度25％  トリクロロ酢酸（ナカライテスク）を加えて4℃で一晩反応させ、20,000gで45分間で遠心してタンパク質を回収した。得られたタンパク質にアセトンを加えて、20,000gで15分間遠心することにより洗浄した後、PBSで2日間透析してトリクロロ酢酸を取り除いた。
【００３８】
（５）免疫方法
5週令の雌のBALB/cマウス（日本エスエルシー）に対し、分泌タンパク質溶液（10μgの分泌タンパク質と等量のフロイントコンプリートアジュバント（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）とを混合して得た溶液の100μl）、および死菌溶液（1x104CFUの死菌を50μlに調整し、等量のコンプリートアジュバントを混合して得た100μlの溶液）をマウスに皮下免疫した。対照として、分泌タンパク質単独、死菌単独、コンプリートアジュバントのみ、または無処置での検証も併せて行った。
【００３９】
免疫後、2週間から6週間の間に、分泌タンパク質および死菌に対し、エライザ法により抗体価を確認した。具体的には、分泌タンパク質または死菌を5μg/mlに調整し、100μl/ウェルで96エライザ用プレートに固相化した。次に、当該プレート上の分泌タンパク質にマウス血清を反応させ、次いでHRP-抗マウス抗体を反応させた後、発色させ、当該発色に基づいて抗体価を測定した。死菌単独を投与した場合において、死菌に対する抗体価が認められない場合は、死菌（1x104CFU/200μl  PBS）をマウスに静脈注射して追加免疫を行った。
【００４０】
（６）生存率の検定
（ａ）感染前に6時間の絶食を行い、その後、50μl  10％炭酸水素ナトリウムを経口投与した。15分後に1x106のS.  Typhimuriumを経口感染させ、その後、30分間の絶飲食を行った。感染後40日間、観察を行った（図１）。
【００４１】
その結果、無処置群およびアジュバント免疫群は、感染後3日目から毛艶の悪化、5日目から元気消失が認められた。また、分泌タンパク質免疫群および死菌免疫群においても感染後5日目から毛艶の悪化、7日目から元気消失が認められた。無処置、アジュバント、分泌タンパク質、死菌免疫群のマウスは感染後6日目から死亡し、感染後10日目までには全匹死亡した。一方、死菌と分泌タンパク質の組み合わせを投与した群は、感染後40日目まで半数が生存した。
【００４２】
以上の結果から、経口感染防御には、サルモネラ属菌の死菌と分泌タンパク質との組み合わせが有効であることが判明した。
【００４３】
（ｂ）次に、分泌タンパク質と死菌との組み合わせからなるワクチンが、S.  Typhimurium（04群）以外の血清型のサルモネラ属菌(S.  Choleraesuis:O7群、S.  Dublin:O9群)に対しても感染防御効果を示すか否かの検討を行った（図２）。これまでサルモネラ症に対するワクチンとしては、各種血清型のサルモネラ属菌を不活化したもの（ホルマリン処理など用いた死菌）の混合物が用いられてきた。そこで、感染に用いる3種類の菌株（S.  Typhimurium、S.  Choleraesuis、S.  Dublin）の死菌の混合物と上記（４）で調製したサルモネラ分泌タンパク質の組み合わせをワクチンとして、上記（６）（ａ）の実験と同様の手法で実験を行った。なお、本実験における経口感染には、100LD50の各菌体（1x106のS.  Typhimurium、1x107のS.  Choleraesuis、1x106のS.  Dublin）を用いた。また、対照として無処置での検証も併せて行った。
【００４４】
その結果、S.  Typhimuriumを経口感染させた場合、図１の結果と一致して、3種類の死菌の混合物と分泌タンパク質の組み合わせを免疫した群が有意に感染防御効果を示した（図２左）。S.  Choleraesuisを経口感染させた場合も、無処置の群は約20日で全匹死亡するのに対して、3種類の死菌と分泌タンパク質の組み合わせを免疫した群は有意に感染防御効果を示した（図２中央）。また、S.  Dublinを経口感染させた場合も、無処置の群は約10日で全匹死亡するのに対して、3種類の死菌と分泌タンパク質を免疫した群は有意に感染防御効果を示した（図２右）。以上の結果から、本発明のワクチンが、血清型が異なるサルモネラ属菌に対しても優れた感染防御効果を示すことが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
感染防御効果の高いサルモネラ属菌ワクチンとしては、弱毒株ワクチンが知られているが、安全性などの問題から市販されていない。安全性の観点からは、死菌や特定のタンパク質を利用したワクチンが望ましい。分泌タンパク質と死菌との組み合わせを利用する本発明のワクチンは、安全性が高く、かつ、家畜などの動物やヒトに対するサルモネラ属菌の感染に対して優れた感染防御効果を発揮しうる。従って、本発明のワクチンは、特に、農業や医療の分野において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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