(57)【要約】【課題】本発明は、細胞やスフェロイドに対して高効率に電気刺激を行うことを可能にする培養装置を提供することを目的とする。【解決手段】培養ウェルを有するゲル体と、該培養ウェルを挟んで設けられている一対の電極とを備えることを特徴とする、培養装置。【選択図】図１
2019110823.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養ウェルを有するゲル体と、該培養ウェルを挟んで設けられている一対の電極とを備えることを特徴とする、培養装置。
【請求項２】
前記ゲル体が表裏両面を有し、前記電極が前記培養ウェルに関して表裏両面側に設けられている、請求項１に記載の培養装置。
【請求項３】
前記電極の少なくとも一部が、前記ゲル体上に配置されている、請求項１又は２に記載の培養装置。
【請求項４】
前記電極の少なくとも一部が、前記ゲル体に包埋されている、請求項１又は２に記載の培養装置。
【請求項５】
前記一対の電極が平面視にて交互に並列されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の培養装置。
【請求項６】
隣接する前記一対の電極の間に前記培養ウェルがそれぞれ設けられている、請求項５に記載の培養装置。
【請求項７】
平面視にて前記一対の電極のうち一方が他方に囲繞されるように設けられている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の培養装置。
【請求項８】
前記培養ウェルと該培養ウェルを挟んで設けられている前記一対の電極が等距離で設けられている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の培養装置。
【請求項９】
前記ゲル体がハイドロゲルである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の培養装置。
【請求項１０】
前記ハイドロゲルは、コラーゲン、グルコマンナン、フィブリン、アルギン酸、ポリビニルアルコール、ＰＰＥＧＤＡ、ＰＰＥＧＤＭ、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、シリコーン、ＤＮハイドロゲル、これらの２種以上の混合物からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項９に記載の培養装置。
【請求項１１】
前記電極は、炭素材料、導電性ポリマー材料、半導体、金属からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の培養装置。
【請求項１２】
前記電極は、カーボンナノチューブ、ケッチェンブラック、グラッシーカーボン、グラフェン、フラーレン、カーボンファイバ、カーボンファブリック、カーボンエアロゲル、ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）、ポリピロール、金、白金からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１１に記載の培養装置。
【請求項１３】
前記ゲル体がポリアクリルアミドを含み、前記電極がポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）を含む、請求項１０又は１２に記載の培養装置。
【請求項１４】
前記電極表面から始端し前記ゲル体内部に伸びるポリマーを備える、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｉＰＳ細胞等の幹細胞に関する技術は、細胞治療・再生医療の分野のみならず、バイオ研究や創薬研究における動物実験の代替ツールとしても、応用展開が期待されている。幹細胞関連産業の発展には、分化細胞を大量に生産する技術の開発が不可欠である。幹細胞を分化誘導して成熟させて分化細胞を培養する技術は、細胞種ごとに開発されているところ、特に神経系及び筋肉系の細胞の分化誘導には電気刺激が有効であることがわかってきた。
細胞に電気刺激を与えながら培養する技術として、例えば、特許文献１には、脳橋核の神経細胞や小脳顆粒細胞を入れた培養容器に第一の電極と第二の電極とを細胞近傍に挿入することで、培養細胞に電気刺激を印加する技術が開示されており、また、特許文献２には、培養基材上に設けられた第一電極と該第一電極に対向して設けられた第二電極とを備える装置により、マウス筋繊維細胞等に電気刺激を印加する技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−３４４００３号公報
【特許文献２】特開２０１５−１１２０８７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記従来の培養装置では、培養物に対する電気刺激を好適化できる余地があった。
本発明は、細胞やスフェロイドに対して高効率に電気刺激を行うことを可能にする培養装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の要旨は以下の通りである。
本発明の培養装置は、培養ウェルを有するゲル体と、該培養ウェルを挟んで設けられている一対の電極とを備えることを特徴とする。
また、本発明の培養装置は、前記ゲル体が表裏両面を有し、前記電極が前記培養ウェルに関して表裏両面側に設けられていることが好ましい。
本発明の培養装置は、前記電極の少なくとも一部が、前記ゲル体上に配置されていてよい。
本発明の培養装置は、前記電極の少なくとも一部が、前記ゲル体に包埋されていてよい。
更に、本発明の培養装置は、前記一対の電極が平面視にて交互に並列されていることが好ましい。
更に、本発明の培養装置は、隣接する前記一対の電極の間に前記培養ウェルがそれぞれ設けられていることが好ましい。
更に、本発明の培養装置は、平面視にて前記一対の電極のうち一方が他方に囲繞されるように設けられていることが好ましい。
更に、本発明の培養装置は、前記培養ウェルと該培養ウェルを挟んで設けられている前記一対の電極が等距離で設けられていることが好ましい。
更に、本発明の培養装置は、前記ゲル体がハイドロゲルであることが好ましい。
更に、本発明の培養装置は、前記ハイドロゲルは、コラーゲン、グルコマンナン、フィブリン、アルギン酸、ポリビニルアルコール、ＰＰＥＧＤＡ、ＰＰＥＧＤＭ、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、シリコーン、ＤＮハイドロゲル、これらの２種以上の混合物からなる群から選択される少なくとも１つであることが好ましい。
更に、本発明の培養装置は、前記電極は、炭素材料、導電性ポリマー材料、半導体、金属からなる群から選択される少なくとも１つであることが好ましい。
更に、本発明の培養装置は、前記電極は、カーボンナノチューブ、ケッチェンブラック、グラッシーカーボン、グラフェン、フラーレン、カーボンファイバ、カーボンファブリック、カーボンエアロゲル、ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）、ポリピロール、金、白金からなる群から選択される少なくとも１つであることが好ましい。
更に、本発明の培養装置は、前記ゲル体がポリアクリルアミドを含み、前記電極がポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）を含むことが好ましい。
更に、本発明の培養装置は、前記電極表面から始端し前記ゲル体内部に伸びるポリマーを備えることが好ましい。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、細胞やスフェロイドに対して高効率に電気刺激を行うことを可能にする培養装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１に、本発明の一例の培養装置の平面図及び断面図を示す。図１（Ａ）に、培養装置の平面図を示し、図１（Ｂ）に、図１（Ａ）の線Ａ−Ａに沿う面による培養装置の断面図を示す。
【図２】図２に、本発明の別の例の培養装置の平面図及び断面図を示す。図２（Ａ）に、培養装置の分解図を示し、図２（Ｂ）に、培養装置の斜視図を示し、図２（Ｃ）に、図２（Ｂ）の線Ａ−Ａに沿う面による培養装置の断面図を示し、図２（Ｄ）に、図２（Ｂ）の線Ｂ−Ｂに沿う面による培養装置の断面図を示す。
【図３】図３に、本発明の更なる例の培養装置の平面図及び断面図を示す。図３（Ａ）に、培養装置の分解図を示し、図３（Ｂ）に、培養装置の斜視図を示し、図３（Ｃ）に、図３（Ｂ）の線Ａ−Ａに沿う面による培養装置の断面図を示し、図３（Ｄ）に、図３（Ｂ）の線Ｂ−Ｂに沿う面による培養装置の断面図を示す。
【図４】図４に、本発明の実施形態の培養装置の製造方法の一態様の概要の説明図を示す。
【図５】図５に、本発明の実施形態の培養装置の製造方法の別の態様の概要の説明図を示す。
【図６】図６に、実施例１で作製した培養装置の外観を示す。（Ａ）に模式図を示し、（Ｂ）に写真を示す。
【図７】図７に、実施例２で作製した培養装置の外観を示す。（Ａ）に模式図を示し、（Ｂ）に写真を示す。（Ｂ）中、左上は全体の写真であり、右下は培養ウェル部分の拡大写真である。
【図８】図８に、実施例２で作製した培養装置の第一ゲル体部分（容器側ゲル体部分）を用いて、サイクリックボルタンメトリ測定及びインピーダンス測定を行ったときの結果を示す。（Ａ）に、実施例２で作製した培養装置の第一ゲル体部分（容器側ゲル体部分）を用いて測定したときの図を示し、（Ｂ）に、対照サンプルとして金電極を使用した第一ゲル体部分を用いて測定したときの図を示す。
【図９】図９に、実施例２で作製した培養装置の第一ゲル体部分（容器側ゲル体部分）を用いて、サイクリックボルタンメトリ測定及びインピーダンス測定を行ったときの結果を示す。（Ａ）に、サイクリックボルタンメトリ測定の結果を示し、（Ｂ）に、インピーダンス測定の結果を示す。
【図１０】図１０に、実施例２で作製した培養装置を用いて、心筋細胞を培養したときの拍動の測定結果を示す。（Ａ）に、電気刺激を与えることなく拍動を測定したときの結果を示し、（Ｂ）に、１Ｈｚの周波数の電気刺激を与えて拍動を測定したときの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、図面を参照して、本発明の培養装置の実施形態について詳細に例示説明する。
【０００９】
（培養装置）
本発明の実施形態の培養装置１は、図１に示すように、培養ウェル３ｗを有するゲル体３と、該培養ウェル３ｗを挟んで設けられている一対の電極２（２１、２２）とを備える。
【００１０】
図１に、本発明の一例の培養装置の平面図及び断面図を示す。図１（Ａ）に、培養装置の平面図を示し、図１（Ｂ）に、図１（Ａ）の線Ａ−Ａに沿う面による培養装置の断面図を示す。
【００１１】
従来の培養装置による細胞やスフェロイド等の培養物に対する電気刺激では、印加されるイオン電流束が不均一であり、実際に与えられる電気刺激の強度は不明であった。一方、本発明の培養装置１によれば、電極２が細胞やスフェロイドＣを挟んで配置されているため、所望の電気刺激のために適切に制御されたイオン電流を細胞やスフェロイドＣに印加することが可能になる。
また、本発明の培養装置によれば、溶液を透過することが可能なゲル製の培養ウェル３ｗが用いられるため、培地交換の手間を省くことができ、バッチ式培養のみならず連続式培養をも可能にする。
【００１２】
本発明の実施形態の培養装置１では、ゲル体３の形状としては、特に限定されることはないが、使用安定性等の観点から表裏両面を有する形状が好ましく、具体的には、四角柱形状（直方体、正方体等）、円柱形状が好ましい。
特に、本発明の一例の培養装置では、図１に示すように、ゲル体３が直方体の形状であり、表裏両面を有している。
【００１３】
本発明の実施形態の培養装置１では、電極２（２１、２２）の配設態様としては、培養ウェル３ｗを挟んで設けられる限り特に限定されることはないが、培養物に対する電気刺激を好適なものとする目的で、培養ウェル３ｗを挟む電極２１、２２どうしを結ぶ線と培養ウェル３ｗの深さ方向とが傾斜角θをなすこと、言い換えれば、培養装置１を水平な台上に静置したときに培養ウェル３ｗを挟む電極２１、２２どうしを結ぶ線と鉛直方向とが傾斜角θをなすことが好ましい。ここで、傾斜角θをなすとは、両方向のなす角度のうち小さい方の角度が９０°未満であることをいう。
特に、本発明の一例の培養装置１では、図１に示すように、電極２（２１、２２）が培養ウェル３ｗに関して表裏両面側に設けられており、電極２１、２２どうしを結ぶ線と培養ウェル３ｗの深さ方向とが傾斜角θ（図１参照）をなしている。
上記傾斜角θとしては、０．１°以上であることが好ましく、１°以上であることが更に好ましく、３°以上であることがより好ましく、また、８９°以下であることが好ましく、６０°以下であることが更に好ましく、３０°以下であることがより好ましい。
【００１４】
本発明の実施形態の培養装置１では、電極２（２１、２２）の配設態様としては、培養ウェル３ｗを挟んで設けられる限り特に限定されることはないが、培養物をイオン電流束の中に確実に位置させる目的で、培養ウェル３ｗを挟む電極２１、２２どうしを結ぶ線上に培養ウェル３ｗが位置するように電極２（２１、２２）が設けられることが更に好ましい。
【００１５】
本発明の実施形態の培養装置１では、電極２がゲルと接触していることが必要であり、電極２がゲル体３上に配置されていてもよく、電極２の少なくとも一部がゲル体３に包埋されていてもよい。
特に、本発明の一例の培養装置１では、図１に示すように、電極２の少なくとも一部が、ゲル体３上に配置されていている。
【００１６】
本発明の実施形態の培養装置１では、図１に示すように、培養ウェル３ｗと該培養ウェル３ｗを挟んで設けられている２つの電極２１、２２とが等距離で設けられている。
かかる構成によれば、細胞やスフェロイドＣに対して均一に電気刺激を行うことができる。
【００１７】
なお、特に、本発明の一例の培養装置１では、図１に示すように、表面側の電極２２及び裏面側の電極２１のそれぞれの外表面に、リーク電流を低減する意味で絶縁層６が設けられている。
【００１８】
本発明の培養装置は、図１に示される本発明の一例の培養装置１に限定されない。
以下、本発明の別の例の培養装置及び更なる例の培養装置について図２及び図３を参照して記載する。図２及び図３では、本発明の一例の培養装置１と同様の要素には同一の符号を付し、その説明は省略する。
【００１９】
図２に、本発明の別の例の培養装置の平面図及び断面図を示す。図２（Ａ）に、培養装置の分解図を示し、図２（Ｂ）に、培養装置の斜視図を示し、図２（Ｃ）に、図２（Ｂ）の線Ａ−Ａに沿う面による培養装置の断面図を示し、図２（Ｄ）に、図２（Ｂ）の線Ｂ−Ｂに沿う面による培養装置の断面図を示す。
【００２０】
本発明の別の例の培養装置１は、図２に示すように、平面視で長方形の培養ウェル３ｗを３つ有し、分岐した第一電極部分２１１と第二電極部分２１２とを有する第一の電極２１が包埋されている、第一ゲル体部分（容器側ゲル体部分）３１と、分岐した第一電極部分２２１と第二電極部分２２２とを有する第二の電極２２が包埋されている、第二ゲル体部分（蓋側ゲル体部分）３２とを備えている。
詳細には、第一ゲル体部分３１において、平面視で長方形の３つの培養ウェルは、電極２（２１、２２）の延在方向に沿うように配置され、且つ電極２（２１、２２）の延在方向に垂直な方向に並列されている。そして、培養ウェル３ｗのうち２つは、第一の電極２１の第一電極部分２１１と第二電極部分２１２との間に設けられており、培養ウェル３ｗのうち１つは、第一の電極２１の第二電極部分２１２よりも外方に設けられている。
ここで、本発明の別の例の培養装置１では、第一ゲル体部分（容器側ゲル体部分）３１と第二ゲル体部分（蓋側ゲル体部分）３２とを図２に示すように組み立てたとき、培養装置１の厚さ方向に沿い、且つ電極２（２１、２２）の延在方向沿う面による断面においては、培養ウェル３ｗのいずれもが、第一の電極２１と第二の電極２２との間に位置しており（図２（Ｃ）参照）、また、培養装置１の厚さ方向に沿い、電極２（２１、２２）の延在方向に垂直な方向に沿う面による断面においては、培養ウェル３ｗのそれぞれが、第一の電極２１の第一電極部分２１１と第二の電極２２の第一電極部分２２１との間、第二の電極２２の第一電極部分２２１と第一の電極２１の第二電極部分２１２との間、第一の電極２１の第二電極部分２１２と第二の電極２２の第二電極部分２２２との間、に位置している（図２（Ｄ）参照）。
【００２１】
図２に示すように、本発明の別の例の培養装置１では、一対の電極２（２１、２２）が平面視にて交互に並列されている。
具体的には、この例では、第一の電極２１の第一電極部分２１１、第二の電極２２の第一電極部分２２１、第一の電極２１の第二電極部分２１２、第二の電極２２の第二電極部分２２２が、平面視にて交互に並列されている。
【００２２】
そして、図２に示すように、本発明の別の例の培養装置１では、隣接する一対の電極２（２１、２２）の間に培養ウェル３ｗがそれぞれ設けられている。
具体的には、この例では、第一の電極２１の第一電極部分２１１と第二の電極２２の第一電極部分２２１との間、第二の電極２２の第一電極部分２２１と第一の電極２１の第二電極部分２１２との間、第一の電極２１の第二電極部分２１２と第二の電極２２の第二電極部分２２２との間に、培養ウェル３ｗがそれぞれ設けられている。
【００２３】
図３に、本発明の更なる例の培養装置の平面図及び断面図を示す。図３（Ａ）に、培養装置の分解図を示し、図３（Ｂ）に、培養装置の斜視図を示し、図３（Ｃ）に、図３（Ｂ）の線Ａ−Ａに沿う面による培養装置の断面図を示し、図３（Ｄ）に、図３（Ｂ）の線Ｂ−Ｂに沿う面による培養装置の断面図を示す。
【００２４】
本発明の更なる例の培養装置１は、図３に示すように、平面視でドーナツ形の培養ウェル３ｗを１つ有し、円環形の第一の電極２１が包埋されている、第一ゲル体部分（容器側ゲル体部分）３１と、円盤形の第二の電極２２が包埋されている、第二ゲル体部分（蓋側ゲル体部分）３２とを備えている。
詳細には、本発明の更なる例の培養装置１では、第一ゲル体部分（容器側ゲル体部分）３１と第二ゲル体部分（蓋側ゲル体部分）３２とを図３に示すように組み立てたとき、培養装置１の厚さ方向に沿い、且つ電極２（２１、２２）の延在方向沿う面による断面においては、培養ウェル３ｗの全体が、第一の電極２１と第二の電極２２との間に位置しており（図３（Ｃ）参照）、また、培養装置１の厚さ方向に沿い、電極２（２１、２２）の延在方向に垂直な方向に沿う面による断面においては、培養ウェル３ｗの各部分が、第一の電極２１と第二の電極２２との間に位置している（図３（Ｄ）参照）。
【００２５】
更なる例の培養装置１では、平面視にて一対の電極２（２１、２２）のうち一方２２が他方２１に囲繞されるように設けられている。言い換えれば、この例では、平面視にて円盤形の第二の電極２２が円環形の第一の電極２１の周囲に設けられている。
【００２６】
本発明の培養装置では、ゲル体３を、一例の培養装置１のように１つ単独のものとしてもよく、別の例の培養装置１及び更なる例の培養装置１のように第一ゲル体部分（容器側ゲル体部分）３１と第二ゲル体部分（蓋側ゲル体部分）３２とを組み合わせたものとしてもよい。
本発明の培養装置では、少なくとも一対の電極２（２１、２２）を備えていればよく、複数対以上（二対以上、三対以上、四対以上等）の電極２を備えていてもよい。
【００２７】
以下、本発明の実施形態の培養装置１の各要素について詳細に記載する。
【００２８】
−電極−
電極２の材料としては、炭素材料、導電性ポリマー材料、半導体、金属等が挙げられる。
ここで、炭素材料としては、カーボンナノチューブ、ケッチェンブラック、グラッシーカーボン、グラフェン、フラーレン、カーボンファイバ、カーボンファブリック、カーボンエアロゲル等が挙げられ；導電性ポリマー材料としては、ポリアニリン、ポリアセチレン、ポリピロール、ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）、ポリ（ｐ−フェニレンビニレン）、ポリチオフェン、ポリ（ｐ−フェニレンスルフィド）等が挙げられ、半導体としては、シリコーン、ゲルマニウム、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）、酸化チタン、酸化銅、酸化銀等が挙げられ；金属としては、金、白金、銀、チタン、アルミニウム、タングステン、銅、鉄、パラジウム等が挙げられる。
電極２の材料としては、特に、電子伝導性、安定性、及び生体親和性の観点から、炭素材料各種、ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）、ポリピロール、金、白金が好ましい。
これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００２９】
−ゲル体−
ゲル体３の材料としては、ハイドロゲル、油性ゲル等が挙げられ、特に、ハイドロゲルが好ましい。
ハイドロゲル材料（分散媒である水に分散させることによってハイドロゲルを形成する材料）としては、例えば、寒天、ゼラチン、アガロース、キサンタンガム、ジェランガム、スクレロチウガム、アラビヤガム、トラガントガム、カラヤガム、セルロースガム、タマリンドガム、グアーガム、ローカストビーンガム、グルコマンナン、キトサン、カラギーナン、クインスシード、ガラクタン、マンナン、デンプン、デキストリン、カードラン、カゼイン、ペクチン、コラーゲン、フィブリン、ペプチド、マトリゲル、コンドロイチン硫酸ナトリウム等のコンドロイチン硫酸塩、ヒアルロン酸（ムコ多糖類）及びヒアルロン酸ナトリウム等のヒアルロン酸塩、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、及びアルギン酸カルシウム等のアルギン酸塩、並びにこれらの誘導体等の天然高分子；メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等のセルロース誘導体及びこれらの塩；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、アクリル酸・メタクリル酸アルキルコポリマー、等のポリ（メタ）アクリル酸類及びこれらの塩；ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレートの重合体（ＰＰＥＧＤＡ、ＰＰＥＧＤＭ）、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリ２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリビニルピロリドン、ポリスチレンスルホン酸、ポリエチレングリコール、カルボキシビニルポリマー、アルキル変性カルボキシビニルポリマー、無水マレイン酸コポリマー、ポリアルキレンオキサイド系樹脂、ポリ（メチルビニルエーテル−ａｌｔ−マレイン酸無水物）とポリエチレングリコールとの架橋体、ポリエチレングリコール架橋体、Ｎ−ビニルアセトアミド架橋体、アクリルアミド架橋体、デンプン・アクリル酸塩グラフトコポリマー架橋物等の合成高分子；シリコーン；相互侵入網目構造ハイドロゲル及びセミ相互侵入網目構造ハイドロゲル（ＤＮハイドロゲル）；これらの２種以上の混合物等が挙げられる。
これらの中でも、生体親和性及び成型容易性を得る観点、機械的強度を高める（脆性を低減する）観点から、コラーゲン、グルコマンナン、フィブリン、アルギン酸、ポリビニルアルコール、ＰＰＥＧＤＡ、ＰＰＥＧＤＭ、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、シリコーン、ＤＮハイドロゲル、これらの２種以上の混合物が好ましい。
これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００３０】
−培養ウェル−
培養ウェル３ｗの平面視形状や断面視形状としては、所望の細胞塊やスフェロイドを培養することができる限り、特に限定されることはない。
培養ウェル３ｗの寸法としては、平面視で長方形（角に丸みを帯びる場合も含む）である場合（図２参照）、長さ：０．０１〜１５０ｍｍ、幅：０．０１〜１５０ｍｍ、深さ：０．０１〜３０ｍｍとしてよい。また平面視で円環形である場合（図３参照）、外径：０．０１〜１５０ｍｍ、幅：０．０１〜１５０ｍｍ、深さ：０．０１〜３０ｍｍとしてよい。
培養ウェルの底面は、平底であってもよく、丸底であってもよく、細胞の収容性の観点から、丸底であることが好ましい。
【００３１】
−その他−
培養装置１を構成するその他の要素については当技術分野で通常用いられるものとしてよい。
【００３２】
（培養装置の製造方法）
本発明の実施形態の培養装置１の製造方法は、特に限定されないが、例えば、電極２を調製し、培養ウェル３ｗを設けたゲル体３を調製し、電極２とゲル体３とを固定させる方法が挙げられる。
電極２とゲル体３とを固定させるには、ゲル体３にモノマー４ｍを含浸させ、電極２や電極２近傍の箇所を重合開始点として該モノマー４ｍの重合を行う手法が挙げられ、具体的には、電解重合の手法（後述）やゲルの相互貫入の手法（後述）が挙げられる。これらの手法では、必要に応じて、電極２表面に重合開始部ＰＩを導入し、重合開始部ＰＩを重合開始点としてモノマー４ｍの重合を行ってよい。
【００３３】
図４に、本発明の実施形態の培養装置の製造方法の一態様の概要の説明図を示す。
本発明の実施形態の培養装置の製造方法の一態様では、ゲルの相互貫入の手法を用いてよい。
かかる手法では、電極表面に重合開始部ＰＩを導入し、ゲル体３中にモノマー４ｍを含浸させ、重合開始部ＰＩを重合開始点としてモノマー４ｍの重合反応を行い、電極２表面からモノマー４ｍを伸長させ、ゲル体３中の高分子と相互に貫入させることによって、接着層５を形成させる。なお、重合開始部ＰＩが設けられる電極２表面には、電極２自体の表面のみならず電極２自体の表面に被覆された被覆層７の表面も含まれるものとする。
【００３４】
図５に、本発明の実施形態の培養装置の製造方法の別の態様の概要の説明図を示す。
本発明の実施形態の培養装置１の製造方法の別の態様では、電解重合の手法を用いてよい。
かかる手法では、電極２にゲル体３を載せた状態で、導電性モノマー４ｃｍの電解重合を行い、電極２近傍において、電極２表面から導電性モノマー４ｃｍを伸長させることによって、導電性の接着層５を形成させる。
【００３５】
ゲル体３に含浸させるモノマー４ｍとしては、上記ゲルの相互貫入の手法を用いる場合には、絶縁性モノマー４ｉｍであっても導電性モノマー４ｃｍであってもよいが、上記電解重合の手法を用いる場合には、導電性モノマー４ｃｍであることが必要となる。
【００３６】
絶縁性モノマー４ｉｍとしては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸・メタクリル酸アルキル等の（メタ）アクリル酸類及びこれらの塩；ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート（ＰＥＧＤＡ、ＰＥＧＤＭ）、ヒドロキシエチルメタクリレート、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ビニルピロリドン、スチレンスルホン酸、エチレングリコール、無水マレイン酸、アルキレンオキサイド、メチルビニルエーテル−ａｌｔ−マレイン酸無水物、Ｎ−ビニルアセトアミド、デンプン；シラノール；等が挙げられ、特に、周辺環境に応じた変形が無い（温度やｐＨ等で膨潤度が変化しない）ことから、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ＰＥＧＤＡ、ＰＥＧＤＭが好ましい。
これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００３７】
導電性モノマー４ｃｍとしては、例えば、３，４−エチレンジオキシチオフェン、アセチレン、ピロール、チオフェン、ビチオフェン、イソチオフェン、ドデシルチオフェン、イソナイトチオフェン、３−ヘキシルチオフェン、イソチアナフテン、チアジル、フルオレン、ジアセチレン、アセン、パラフェニレン、チエニレンビニレン、フェニレンスルフィド等が挙げられ、特に、電子伝導性及び構造安定性の観点から、（３，４−エチレンジオキシチオフェン）、ピロールが好ましい。これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００３８】
モノマーの重合の開始反応としては、熱反応、光反応、酸化還元反応が挙げられ、反応制御の容易性から、光反応が好ましい。これらは、１つ単独で用いてもよく、２つ以上組み合わせて用いてもよい。
【００３９】
開始反応や重合反応の条件は、重合開始部ＰＩやモノマー４ｍの特性に応じて、適宜定めることができる。
【００４０】
重合開始部ＰＩとしては、（Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）シリーズの）アルキルフェノンタイプ、アシルフォスフィンオキサイドタイプ、分子内水素引き抜きタイプ、オキシムエステル等のその他のタイプ、イソブチルベンゾインエーテル、イソプロピルベンゾインエーテル等のベンゾインエーテルタイプ、ベンジルメチルケタール、ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン等のベンジルケタールタイプ、ベンゾフェノン、２−クロロチオキサントン等のケトンタイプ等が挙げられる。
これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００４１】
重合開始部ＰＩの導入においては、オゾン処理（カルボキシル基の導入）、酸素プラズマ処理、コロナ放電処理、ＵＶ処理（例えば、ベンゾフェノンの導入）、シランカップリング剤による処理、チオール化合物による処理等を用いてよく、また、重合開始部ＰＩは、上記電極２表面の処理により、直接的に導入してもよく、重合開始部ＰＩは、上記処理後に、例えば、エステル結合やアミド結合等を介して、更に結合させてもよい。
【００４２】
（培養装置の使用方法）
本発明の実施形態の培養装置１の使用方法としては、例えば、細胞や細胞群を適切な培地と共に培養ウェル３ｗに加え、一対の電極２（２１、２２）に交流又は直流でイオン電流を連続的又は断続的に印加しながら適切な培養条件下で培養し、細胞塊やスフェロイドＣを得るものとしてよい。
【００４３】
用いることができる細胞種としては、特に限定されることなく、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、神経細胞、皮膚表皮細胞等が挙げられる。
得られる細胞塊やスフェロイドＣのサイズとしては、最大径が１０μｍ〜２００００μｍであってよい。
【００４４】
電気刺激としては、交流としても直流としてもよいが、直流が好ましく、電極での水の電界反応を抑制する目的からバイポーラの直流矩形パルスが望ましい。
直流矩形パルスの場合の電気量密度（電流密度［Ｃ／ｓ・ｃｍ２］×パルス幅［ｓ］）としては、水の電界反応を抑制する目的から１Ｃ／ｃｍ２以下とすることが好ましく、５００ｍＣ／ｃｍ２以下とすることが更に好ましく、また、１μＣ／ｃｍ２以上とすることが好ましく、１０μＣ／ｃｍ２以上とすることが更に好ましい。
直流パルスの周波数としては、０．０１Ｈｚ以上とすることが好ましく、０．１Ｈｚ以上とすることが更に好ましい。
【００４５】
培養条件としては、特に限定されることなく、標準的な細胞培養条件を用いることができ、例えば、培養温度を約３７℃、培養雰囲気をＣＯ２濃度約５％、ｐＨ約５〜約９等としてよい。
培地としては、特に限定されることなく、天然培地、合成培地が挙げられ、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等としてよい。
【００４６】
（細胞の培養方法）
本発明の実施形態の細胞の培養方法は、前述の本発明の実施形態の培養装置１の使用方法として記載のとおりに構成してよい。
【００４７】
本発明の実施形態の培養装置１は、幹細胞を分化誘導して成熟させるツールとして、特に電気刺激が有効である神経系及び筋肉系の細胞の分化誘導に好適に用いることができる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。
【００４９】
＜Ａ．培養装置の作製＞
【００５０】
（実施例１）
実施例１の培養装置は、図４に示す本発明の実施形態の培養装置の製造方法の一態様に従って、ゲルの相互貫入の手法を用いて電極とゲル体とを固定することで、培養装置を作製した。
【００５１】
下記の手順に従って、容器側ゲル体部分を作製した。
【００５２】
＜Ａ−１．ＰＥＤＯＴ／ＰＵの作製＞
スライドガラスを洗浄した。スライドガラスバットにスライドガラスを並べ、バット内をアセトンで満たし、１５分間室温（２５℃）で超音波洗浄した。８６％エタノールＩＰ、蒸留水の順で同様に１５分間ずつ超音波洗浄を行う。その後、２−プロパノール内でスライドガラスを保管した。使用する前にスライドガラスを乾燥させた。
【００５３】
電子天秤でポリウレタン顆粒を４．０ｇ量りとり、スクリュー管瓶（５０ｍＬ）に入れた。ガラスピペットでテトラヒドロフランを３５．５ｍＬ入れ、室温（２５℃）で撹拌子で６時間以上攪拌（７００ｒｐｍ程度）し、１０質量％のＰＵ／ＴＨＦ溶液を得た。保管する場合は冷蔵庫（約３℃）で保管した。
【００５４】
以降の操作はクリーンルーム内で行った。
空のスクリュー管瓶（５０ｍＬ）を氷中で冷やしながら、１０質量％ＰＵ／ＴＨＦ溶液３５ｍＬ、１−ブタノール２ｍＬ、３，４−ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｏｘｙｔｈｉｏｐｈｅｎｅ（ＥＤＯＴ）０．８８ｍＬ、Ｉｒｏｎ  ｔｏｓｙｌａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｐＴＳ・Ｆｅ（ＩＩＩ））６．５ｍＬをこの順番で加えた。スクリュー管瓶を円を描くように良く混ぜながらそれぞれの試薬をマイクロピペットで加えてＰＥＤＯＴ／ＰＵ溶液を得た。混ぜるとき水が混入しないよう留意した（水が入るとＰＥＤＯＴ／ＰＵの性能が落ちるため）。
なお、ｐＴＳ・Ｆｅ（ＩＩＩ）は事前に調整する必要があり、Ｃｌｅｖｉｏｓ  Ｃ−Ｂ５４Ｖ３を４．９ｍＬ、１−ブタノールを１．６ｍＬの割合で混合した。１０質量％ＰＵ／ＴＨＦ溶液、１−ブタノール、ＥＤＯＴ、ｐＴＳ・Ｆｅ（ＩＩＩ）はそれぞれ分注して冷蔵保存（約３℃）した。ＥＤＯＴ、ｐＴＳ・Ｆｅ（ＩＩＩ）は褐色瓶で保存した。
【００５５】
乾燥させたスライドガラスをスピンコーターにセットし、作製したＰＥＤＯＴ／ＰＵ溶液をスポイトでスライドガラス全面に滴下した。スピンコーターの蓋を閉め、回転数７５０ｒｐｍ、加速時間５秒、回転時間３０秒でスピンコートした。
【００５６】
＜Ａ−２．ＰＵ薄膜の作製＞
スライドガラスを洗浄した。スライドガラスバットにスライドガラスを並べ、アセトンでバット内を満たし、１５分間常温で超音波洗浄した。８６％エタノールＩＰ、蒸留水の順で同様に１５分間ずつ超音波洗浄を行った。その後、２−プロパノール内でスライドガラスを保管した。スライドガラスは使用する前に乾燥させた。
【００５７】
電子天秤でポリウレタン顆粒を４．０ｇ測りとり、スクリュー管瓶（５０ｍＬ）に入れた。テトラヒドロフランを３５．５ｍＬ入れ、室温（２５℃）で撹拌子で６時間以上攪拌（７００ｒｐｍ程度）し、１０質量％ＰＵ／ＴＨＦ溶液を得た。保管する場合は冷蔵庫で保管した。
【００５８】
以降の操作はクリーンルーム内で行った。
乾燥させたスライドガラスをスピンコーターにセットし、作製した１０質量％ＰＵ／ＴＨＦスポイトでスライドガラス全面に滴下した。スピンコーターの蓋を閉め、回転数５００ｒｐｍ、加速時間５秒、回転時間３０秒でスピンコートした。
【００５９】
１００℃に加熱したホットスターラーにスピンコートしたスライドガラスを載せ、溶媒の揮発を行った。１０分間加熱し、ＰＵ薄膜を得た。
【００６０】
＜Ａ−３．ＰＵ−Ｉｒｇａｃｕｒｅの作製＞
ＰＵ薄膜に重合開始剤ｉｒｇａｃｕｒｅ２９５９を修飾した。
ＰＵ薄膜スライドガラスを卓上ＵＶオゾン表面処理装置（ＰＬ１７−１１０、強度１５ｍＷ／ｃｍ２）にセットし、５分間オゾン処理することで表面改質し、ＰＵ薄膜表面にカルボキシル基を導入した。
【００６１】
０．２ＭＷＳＣ（縮合剤）、５０ｍＭ  Ｉｒｇａｃｕｒｅ２９５９（光重合開始剤）、２．５ｍＭ  ＤＭＡＰ（縮合反応の促進剤）、及び０．１Ｍ  ＭＥＳ（緩衝剤）蒸留水に溶解し、縮合反応溶液を調製した。
【００６２】
縮合反応溶液を角２号シャーレに満たし、ＰＵ薄膜を有するスライドガラスを浸した。シャーレをアルミホイルで覆い遮光しながら室温（２５℃）で一晩（１２時間程度）静置することで、ｉｒｇａｃｕｒｅ２９５９をＰＵ薄膜表面に固定化した。角２号シャーレ１つに対しては、スライドガラス４枚、縮合溶液５０ｍＬが適当であった。
【００６３】
上記縮合反応溶液を捨て、蒸留水を交換しながら洗浄を行った。４５℃に加熱したホットスターラーの上で遮光しながら１５分間撹拌子で撹拌（４００ｒｐｍ程度）しながら未反応物を除去した。この操作を３回繰り返した。
【００６４】
洗浄したＰＵ−ｉｒｇａｃｕｒｅ薄膜を遮光しながら室温（２５℃）で乾燥させた。
【００６５】
＜Ａ−４．ＰＥＤＯＴ／ＰＵ：ＰＵ−Ｉｒｇａｃｕｒｅの作製＞
ＰＵ−ｉｒｇａｃｕｒｅ薄膜を以下の手順に従って、アクリル板の枠を使って剥がした。（１）アクリル板で枠内側の寸法：７８（横）×２８（縦）×２（厚さ）の枠を作成した。
（２）枠にカプトンテープを貼った。
（３）上記枠にＰＵ−ｉｒｇａｃｕｒｅを張り付けた。蒸留水をつけてスライドガラスのみを剥がした。
（４）ＰＵ−ｉｒｇａｃｕｒｅのみが付いたアクリル板の枠を得た。
【００６６】
ｉｒｇａｃｕｒｅ修飾面ではない面にＰＥＤＯＴ／ＰＵ薄膜を張り付けた。蒸留水をつけることで空気が入ることなくきれいに張り付けることができた。
【００６７】
枠から外し、ＰＥＤＯＴ／ＰＵ：ＰＵ−ｉｒｇａｃｕｒｅ薄膜を得た。
【００６８】
レーザー加工機（Ｖｅｒｓａ  Ｌａｓｅｒ  ＶＬ−２００）でＰＥＤＯＴ／ＰＵ：ＰＵ−ｉｒｇａｃｕｒｅ薄膜を任意のデザインにカットした。不要な部分を蒸留水で濡らしながらピンセットで除去した。
【００６９】
ゲルと接着させない部分にシリコンシートを被せた。
【００７０】
上記調製したスライドガラスを窒素を充填したグローブボックス（酸素濃度２％以下）の中に１時間以上遮光しながら静置し、脱酸素を行った。
【００７１】
＜Ａ−５．ハイドロゲルの作製＞
１８０ｍｇ／ｍＬのアクリルアミド（モノマー）、０．１１８ｍｇ／ｍＬのＮ，Ｎ’−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｂｉｓ（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）（ＭＢＡＡ，架橋剤）、２ｍｇ／ｍＬのｉｒｇａｃｕｒｅ２９５９（光重合開始剤）を蒸留水に溶解し、プレポリマー溶液を得た。
【００７２】
一方の平板ＵＶ透過性アクリル板表面に、直径１．５ｍｍの半円筒アクリルを接着し、培養ウェルを形成するための鋳型とした。鋳型付きアクリル板と別の平板ＵＶ透過性アクリル板の間（厚さ１ｍｍのシリコンモールド）にプレポリマー溶液を充填後、窒素を充填したグローブボックス内（酸素濃度２％以下）に入れ、３０２ｎｍ（８Ｗ）のＵＶを２時間照射することでゲル化、ポリアクリルアミドゲルを得た。
（１）ＵＶ透過アクリル板にシリコンシートから切り出した枠を重ねた。プレポリマー溶液で枠内を満たした。
（２）上からＵＶ透過アクリル板を載せた。この際、気泡が入らないように注意した。
（３）サランラップ（登録商標）で全体を包み、クリップでアクリル板を固定した。２時間ＵＶ照射（３０２ｎｍ、８Ｗ）してポリアクリルアミドゲルを得た。
【００７３】
室温（２５℃）で蒸留水に１晩（１２時間程度）浸漬し、未反応物を除去した。
【００７４】
上記調製したゲルをレーザー加工機で直径３５ｍｍの円形に切り出した。
得られる培養ウェルは、長さ６ｍｍ、幅１．５ｍｍ、深さ１．５ｍｍの半円筒形である。
【００７５】
切り出したゲルを１００℃に加熱したホットスターラーの上に載せ乾燥させた。
【００７６】
蒸留水を窒素でバブリング（３０分〜１時間程度）し、脱酸素してグローブボックス内に入れた。脱酸素した蒸留水をシャーレに入れ、切り出したゲルを浸し膨潤させた。この操作によってゲル内の酸素を除いた。
【００７７】
＜Ａ−６．ハイドロゲルとＰＥＤＯＴ／ＰＵ：ＰＵ−Ｉｒｇａｃｕｒｅとの接着（容器側ゲル体部分の作製）＞
実施例１では、ゲルの相互貫入の手法を用いて、電極とゲル体とを固定した。
３０質量％アクリルアミド（モノマー）、０．３ｍｏｌ％（ｏｆアクリルアミド）のＮ，Ｎ’−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｂｉｓ（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）（ＭＢＡＡ、架橋剤）を蒸留水に溶解し、接着溶液を得た。接着溶液を窒素でバブリング（３０分〜１時間程度）し、脱酸素した。バブリング後、窒素を充填したグローブボックス（酸素濃度２％以下）の中に入れ、シャーレに満たした。
【００７８】
上記蒸留水で膨潤したゲルから余分な水分を除去し（滴をふき取る程度）、上記接着溶液に１分間浸した。
【００７９】
浸したゲルを取り出し、余分な接着溶液を除去し（滴をふき取る程度）、前述のとおり得られたＰＥＤＯＴ／ＰＵ：ＰＵ−ｉｒｇａｃｕｒｅの上に載せた。密着させるため上からＵＶ透過アクリル板を落とし蓋として置いた。
【００８０】
ＵＶ（３０２ｎｍ、８Ｗ）を１０分間照射した。
これによりＰＵ−ｉｒｇａｃｕｒｅ表面からゲル内部に向かってポリアクリルアミドが成長し、互いに絡み合うことでＰＥＤＯＴ／ＰＵ：ＰＵ−ｉｒｇａｃｕｒｅとゲルとが接着された。
【００８１】
ゲルとＰＥＤＯＴ／ＰＵ：ＰＵ−ｉｒｇａｃｕｒｅが接着したゲル電極が得られた。
【００８２】
蒸留水に入れ，室温（２５℃）で一晩（１２時間程度）静置して未反応物を除いた。
【００８３】
＜Ａ−７．蓋側ゲル体部分の作製＞
蓋側ゲル体部分は、培養ウェルを設けない点以外は上記容器側ゲル体部分の作製と同様に、作製した。
【００８４】
＜Ａ−８．容器側ゲル体部分と蓋側ゲル体部分との組み立て＞
前述のとおり調製した容器側ゲル体部分と蓋側ゲル体部分とを相互のゲル体が接するように組み立てた。
組み立てたものに適宜リード部分を形成し、電源に接続した。
【００８５】
図６に、実施例１で作製した培養装置の外観を示す。（Ａ）に模式図を示し、（Ｂ）に写真を示す。
【００８６】
実施例１で作製した培養装置では、培養ウェルはいずれも、第一電極と第二電極との真ん中に位置しており、電極どうしを結ぶ線と培養ウェルの深さ方向とが傾斜角はいずれも６０°であった。
【００８７】
（実施例２）
実施例２の培養装置は、図５に示す本発明の実施形態の培養装置の製造方法の別の態様に従って、電解重合の手法を用いて電極とゲル体とを固定することで、培養装置を作製した。
【００８８】
上述の（実施例１）における「Ａ−１．ＰＥＤＯＴ／ＰＵの作製」と同様にＰＥＤＯＴ／ＰＵを調製した。
接着溶液を３，４−エチレンジオキシチオフェン溶液５．５μＬを１ｍＬの蒸留水に溶解させて準備したものとした点以外は、上述の（実施例１）における「Ａ−５．ハイドロゲルの作製」と同様に、ハイドロゲルを調製した。
ＰＥＤＯＴ／ＰＵをハイドロゲルの培養ウェルを設けた側とは反対側に載せた。ＰＥＤＯＴ／ＰＵとハイドロゲルとにそれぞれ電極を接続して、１．０Ｖ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）の電位を印加し、重合量３００ｍＣ／ｃｍ２に達するまで電解重合した。これにより、ハイドロゲルとＰＥＤＯＴ／ＰＵとを接着させた。それ以外は、上述の（実施例１）における「Ａ−６．ハイドロゲルとＰＥＤＯＴ／ＰＵ：ＰＵ−Ｉｒｇａｃｕｒｅとの接着」と同様に処理した。
また、別のＰＥＤＯＴ／ＰＵをハイドロゲルの培養ウェルを設けた側に載せ、上記と同様の条件で電解重合を行った。
両面に電極が設けられたゲル体について適宜リード部分を形成し、電源に接続した。
【００８９】
実施例２の培養装置の詳細については下記のとおりであった。
・第一電極（表面側）：１つ、第二電極（裏面側）：１つ
・培養ウェルの寸法：長さ６ｍｍ、深さ１．５ｍｍ、幅１．５ｍｍの半円筒形
・培養ウェルの設置箇所：第一電極と第二電極との真ん中
・電極どうしを結ぶ線と培養ウェルの深さ方向との傾斜角：６０°
【００９０】
図７に、実施例２で作製した培養装置の外観を示す。（Ａ）に模式図を示し、（Ｂ）に写真を示す。（Ｂ）中、左上は全体の写真であり、右下は培養ウェル部分の拡大写真である。
【００９１】
特に、実施例２の培養装置について、下記のとおり特性評価を行った。
【００９２】
Ｂ．電気刺激の解析
図８に、実施例２で作製した培養装置の第一ゲル体部分（容器側ゲル体部分）を用いて、サイクリックボルタンメトリ測定及びインピーダンス測定を行ったときの様子を示す。（Ａ）に、実施例２で作製した培養装置の第一ゲル体部分（容器側ゲル体部分）を用いて測定したときの様子を示し、（Ｂ）に、対照サンプルとして金電極を使用した第一ゲル体部分を用いて測定したときの様子を示す。
【００９３】
実施例２で作製した培養装置の第一ゲル体部分（容器側ゲル体部分）の電極に対して、電気化学測定システム（品番：ＡＬＳ７６０Ｃ、ＢＡＳ社製）を用いて、サイクリックボルタンメトリ測定及びインピーダンス測定を行った。
参照電極にＡｇ／ＡｇＣｌ（飽和ＫＣｌ）を、対極に白金電極をそれぞれ用い、培養装置の電極を作用極とした。
サイクリックボルタンメトリ測定では、掃引電位：０〜０．５Ｖ、掃引速度：５ｍＶ／ｓの条件とした。
インピーダンス測定では、初期電位０Ｖ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）、振幅５ｍＶ、周波数１〜１０００００Ｈｚの交流電圧を印加して、作用極−参照極間のインピーダンスを計測した。
【００９４】
図９に、実施例２で作製した培養装置の第一ゲル体部分（容器側ゲル体部分）を用いて、サイクリックボルタンメトリ測定及びインピーダンス測定を行ったときの結果を示す。（Ａ）に、サイクリックボルタンメトリ測定の結果を示し、（Ｂ）に、インピーダンス測定の結果を示す。
【００９５】
金（露出状態）の静電容量は０．２１×１０−３Ｆ／ｃｍ２であるのに対してＰＥＤＯＴ／ＰＵの静電容量は４．１７×１０−３Ｆ／ｃｍ２であり、金に比べてＰＥＤＯＴ／ＰＵは高容量のため、細胞培養において培地のｐＨ変化等のファラデー反応を起こさないため、低侵襲な電気刺激が可能であることが示された（図９（Ａ）参照）。
また、金に比べてＰＥＤＯＴ／ＰＵは低インピーダンスのため、感度の良い計測に有効であり、細胞の電気的応答の測定に応用可能である（図９（Ｂ）参照）。
【００９６】
Ｃ．心筋細胞の培養
ヒトｉＰＳ由来心筋細胞（ＲｅｐｒｏＣａｒｄｉｏ２、品番：ＲＣＤＣ００１Ｎ）１．５×１０４個を懸濁した２００μＬの培養培地ＲｅｐｒｏＣａｒｄｉｏ２  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（品番：ＲＣＤＣ１０１、１００Ｕ／ｍＬ  Ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ、１００μｇ／ｍＬ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を９６ｗｅｌｌプレートに加え、インキュベーター内で約３７℃、ＣＯ２濃度約５％の培養条件下で３日間培養し、直径約３００μｍの心筋細胞塊を得た。
その後、実施例２で作製した培養装置において、培養ウェルへ心筋細胞塊をピペットマンを用いて移し、上記培地を満たした。その後、電流値１３ｍＡ／ｃｍ２、パルス幅２４ｍｓ（３２０ｍＣ／ｃｍ２）、周波数１Ｈｚのバイポーラパルス電流を印加して、収縮運動の挙動を顕微鏡で観察した。
【００９７】
Ｄ．心筋細胞培養物の拍動測定
前述のとおり心筋細胞に電気刺激を与えた際に、培養ウェル内の培養物を、倒立顕微鏡（オリンパス社製、品番：ＩＸ７１）を用いて観察し、観察動画に基づいて、心筋細胞培養物の拍動による変位の経時変化を、Ｍｏｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）を用いて解析した。
【００９８】
図１０に、実施例２で作製した培養装置を用いて、心筋細胞を培養したときの拍動の測定結果を示す。（Ａ）に、電気刺激を与えることなく拍動を測定したときの結果を示し、（Ｂ）に、１Ｈｚの周波数の電気刺激を与えて拍動を測定したときの結果を示す。
【００９９】
電気刺激を与えていない自発的な拍動の変位が確認され、約０．５Ｈｚの拍動が観察できた（図１０（Ａ）参照）。
また、１Ｈｚの周波数の電気刺激を加えた心筋細胞の拍動が確認され、刺激の周波数に同期して拍動することが観察された（図１０（Ｂ）参照）。
なお、図１０（Ａ）及び図１０（Ｂ）の両者の心筋細胞の拍動変位量の差は心筋細胞塊の個体差によるものだと考えられる。
【０１００】
図１０（Ａ）及び図１０（Ｂ）に示される結果より、作製した培養装置で心筋細胞に電気刺激を与えることによって、拍動を制御できることが示唆された。
先行研究より、電気刺激を与えて拍動させることで心筋細胞の拍動に関連するタンパク質（トロポニン）の量が増えることが分かっている。このため、拍動を制御する培養装置によって心筋細胞を発達・成熟させられる可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明によれば、細胞やスフェロイドに対して高効率に電気刺激を行うことを可能にする培養装置を提供することができる。
本発明の実施形態の培養装置は、幹細胞を分化誘導して成熟させるツールとして、特に電気刺激が有効である神経系及び筋肉系の細胞の分化誘導に好適に用いることができる。
【符号の説明】
【０１０２】
１        培養装置
２        電極
２１      第一の電極
２１１    第一電極部分
２１２    第二電極部分
２２      第二の電極
２２１    第一電極部分
２２２    第二電極部分
３        ゲル体
３１      第一ゲル体部分（容器側ゲル体部分）
３２      第二ゲル体部分（蓋側ゲル体部分）
３ｗ      培養ウェル
４ｍ      モノマー
４ｉｍ    絶縁性モノマー
４ｃｍ    導電性モノマー
４ｐ      ポリマー
４ｉｐ    絶縁性ポリマー
４ｃｐ    導電性ポリマー
５        接着層
６        絶縁層
７        被覆層
Ｃ        細胞塊・スフェロイド
ＰＩ      重合開始部
【図１】
2019110823.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2019110823.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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