(57)【要約】【課題】酸性糖鎖を分離するために用いるカラムクロマトグラフィー用カラムを提供すること。【解決手段】第１のカラムの流出口の下流に第２のカラムを流路により連結させてなるカラムであり，且つ，以下の（１）又は（２）から選択されるもの：（１）該第１のカラムの担体が，疎水性に修飾されたシリカであって，且つ第一級アミン，第ニ級アミン又は／及び第三級アミンを含む基を有するシリカであり，該第２のカラムの担体が，第一級アミン，第ニ級アミン又は／及び第三級アミンを含む基を有する樹脂であるもの；（２）該第１のカラムの担体が，第一級アミン，第ニ級アミン又は／及び第三級アミンを含む基を有する樹脂であり，該第２のカラムの担体が，疎水性に修飾されたシリカであって，且つ第一級アミン，第ニ級アミン又は／及び第三級アミンを含む基を有するシリカであるもの。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸性糖鎖を分離するために用いられるカラムクロマトグラフィー用カラムであって，該カラムは，第１のカラムの流出口の下流に第２のカラムを流路により連結させてなるものであり，且つ，以下の（１）又は（２）から選択されるもの：
（１）該第１のカラムの担体が，疎水性に修飾されたシリカであって，且つ第一級アミン，第二級アミン又は／及び第三級アミンを含む基を有するシリカ（担体１）であり，
該第２のカラムの担体が，第一級アミン，第ニ級アミン又は／及び第三級アミンを含む基を有する樹脂（担体２）であるもの；
（２）該第１のカラムの担体が，第一級アミン，第ニ級アミン又は／及び第三級アミンを含む基を有する樹脂（担体２）であり，
該第２のカラムの担体が，疎水性に修飾されたシリカであって，且つ第一級アミン，第ニ級アミン又は／及び第三級アミンを含む基を有するシリカ（担体１）であるもの。
【請求項２】
該第１のカラム及び第２のカラムが，いずれも親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムとしての性質を有するものである，請求項１のカラム。
【請求項３】
該担体２が，陰イオン交換樹脂としての性質を有するものである，請求項１又は２のカラム。
【請求項４】
該担体１が，一般式［I］で示される疎水基と，一般式［II］で示されるアミノ基とを有するものである，請求項１〜３のいずれかのカラム。
【化１】
2019090809.tif 000011
［式中，Xは該担体１を構成するシリカ部分を表す。］
【化２】
2019090809.tif 000012
［式中，Xは該担体１を構成するシリカ部分を表す。Rは，−(CH2)n−（n=１〜8）のアルキルを表す。］
【請求項５】
該担体２が，一般式［III］で示されるアミノ基を有するものである，請求項１〜４のいずれかのカラム。
【化３】
2019090809.tif 000013
［式中，Yは該担体２を構成する樹脂部分を表す。ｎは１〜８の整数を表す。］
【請求項６】
該樹脂が，ポリビニルアルコールを基材とするものである，請求項１〜５のいずれかのカラム。
【請求項７】
酸性糖鎖を分析する方法であって，
該酸性糖鎖を，アミノピリジン標識するステップと，
該アミノピリジン標識した酸性糖鎖を，請求項１〜６のいずれかのカラムを用いたカラムクロマトグラフィーに負荷し，次いで，該カラムからの流出液を，連続的に流路に導き，該流路中を流れる該流出液の蛍光強度を連続的に測定するステップであって，該カラムクロマトグラフィーが，移動相を疎水性の高い第１の移動相から疎水性の低い第２の移動相に継時的に変化させながら該カラムに通して行われるものであるステップと，
該測定により得られるクロマトグラムにおいて，該酸性糖鎖に対応する蛍光強度のピークを同定するステップとを含む，
方法。
【請求項８】
該酸性糖鎖が，糖タンパク質から切り出されたものである，請求項７の方法。
【請求項９】
該糖タンパク質が，リソソーム酵素である，請求項８の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，酸性基を有する酸性糖鎖の分離，分析法に関し，特に，酸性糖鎖を分離するために用いることのできるカラムクロマトグラフィー用カラム，及び，糖蛋白質に含まれる酸性基を有する糖鎖を，該カラムクロマトグラフィー用カラムを用いて，分離，分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖蛋白質の糖鎖構造の分析方法として，糖蛋白質をトリプシン処理し，次いでグリコシダーゼで処理して，糖蛋白質から糖鎖を遊離させた後，この糖鎖を２−アミノピリジンで標識（２−アミノピリジン標識）し，これを順相カラムクロマトグラフィーに付して分離分析する方法が知られている（非特許文献１）。
【０００３】
糖鎖の２−アミノピリジン標識は，例えば，糖鎖を含む試料に，２−アミノピリジン溶液を添加して加熱反応させてイミンを形成させた後，ボラン−ジメチルアミン錯体溶液を添加して加熱し，イミンを還元することにより行われる（非特許文献１）。次いで，未反応の２−アミノピリジン等を除去するため，反応後の溶液を，トリエチルアミンとメタノールの１：１混合液，及びトルエンを添加してから乾燥させて乾燥物とし，この乾燥物を，メタノール及びトルエンに溶解させた後，再度乾燥させてから，水性溶媒に溶解させ，この溶液を，ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付して，２−アミノピリジン標識された糖鎖を分取する。このように，糖鎖を２−アミノピリジンで標識する方法は，トルエン等の人体に有害な有機溶媒を気化させて除去する工程を含む（特許文献１，非特許文献２）。従って，糖鎖を２−アミノピリジンで標識するために使用する特殊な装置（Ｔａｋａｒａ  ＰＡＬＳＴＡＴＩＯＮｍｏｄｅｌ  ４０００（タカラバイオ社））が市販されていた。
【０００４】
また，糖蛋白質を構成するＮ−結合型糖鎖，及びＯ−結合型糖鎖を分析する方法として，糖蛋白質を酵素処理して糖鎖を分離させ，この糖鎖をアミノピリジン標識化した後に順相クラマトグラフィーに付して分離する方法が知られている（特許文献２）。この方法によれば，分析の過程で気化される有機溶媒はほとんどない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−２４１３８９号公報
【特許文献２】特開２００５−９１９５３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kuraya N. et. al., J. Biochem. 112. 122-6 (1992)
【非特許文献２】Kondo A. et. al., Agric. Biol. Chem. 54. 2169-70 (1990)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は，糖蛋白質を構成するリン酸基等の酸性基を有する酸性糖鎖を，分離，分析するためのカラムクロマトグラフィー用カラム，及び，該カラムクロマトグラフィー用カラムを用いて，酸性糖鎖を分離，分析する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的に向けた研究において，本発明者らは，一実施態様において，表面が疎水性に修飾されたシリカであって，且つ表面に官能基としてアミノアルキル基が導入されたものを担体とする親水性相互作用クロマトグラフィー用カラム（順相カラムクロマトグラフィー用カラム）と，ポリビニルアルコールを基材とし，官能基としてアミノ基が導入された樹脂を担体とする親水性相互作用クロマトグラフィー用カラム（順相カラムクロマトグラフィー用カラム）とを含むカラムを用いることにより，糖蛋白質を構成する酸性糖鎖を感度よく分離，分析できることを見出し，本発明を完成した。すなわち，本発明は以下を含むものである。
１．酸性糖鎖を分離するために用いられるカラムクロマトグラフィー用カラムであって，該カラムは，第１のカラムの流出口の下流に第２のカラムを流路により連結させてなるものであり，且つ，以下の（１）又は（２）から選択されるもの：
（１）該第１のカラムの担体が，疎水性に修飾されたシリカであって，且つ第一級アミン，第二級アミン又は／及び第三級アミンを含む基を有するシリカ（担体１）であり，
該第２のカラムの担体が，第一級アミン，第ニ級アミン又は／及び第三級アミンを含む基を有する樹脂（担体２）であるもの；
（２）該第１のカラムの担体が，第一級アミン，第ニ級アミン又は／及び第三級アミンを含む基を有する樹脂（担体２）であり，
該第２のカラムの担体が，疎水性に修飾されたシリカであって，且つ第一級アミン，第ニ級アミン又は／及び第三級アミンを含む基を有するシリカ（担体１）であるもの。
２．該第１のカラム及び第２のカラムが，いずれも親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムとしての性質を有するものである，上記１のカラム。
３．該担体２が，陰イオン交換樹脂としての性質を有するものである，上記１又は２のカラム。
４．該担体１が，一般式［I］で示される疎水基と，一般式［II］で示されるアミノ基とを有するものである，上記１〜３のいずれかのカラム。
【化１】
2019090809.tif 000003
［式中，Xは該担体１を構成するシリカ部分を表す。］
【化２】
2019090809.tif 000004
［式中，Xは該担体１を構成するシリカ部分を表す。Rは，−(CH2)n−（n=１〜8）のアルキルを表す。］
５．該担体２が，一般式［III］で示されるアミノ基を有するものである，上記１〜４のいずれかのカラム。
【化３】
2019090809.tif 000005
［式中，Yは該担体２を構成する樹脂部分を表す。ｎは１〜８の整数を表す。］
６．該樹脂が，ポリビニルアルコールを基材とするものである，上記１〜５のいずれかのカラム。
７．酸性糖鎖を分離する方法であって，
該酸性糖鎖を，アミノピリジン標識するステップと，
該アミノピリジン標識した酸性糖鎖を，上記１〜６のいずれかのカラムを用いたカラムクロマトグラフィーに負荷し，次いで，該カラムからの流出液を，連続的に流路に導き，該流路中を流れる該流出液の蛍光強度を連続的に測定するステップであって，該カラムクロマトグラフィーが，移動相を疎水性の高い第１の移動相から疎水性の低い第２の移動相に継時的に変化させながら該カラムに通して行われるものであるステップと，
該測定により得られるクロマトグラムにおいて，該酸性糖鎖に対応する蛍光強度のピークを同定するステップとを含む，
方法。
８．該酸性糖鎖が，糖蛋白質から切り出されたものである，上記７の方法。
９．該糖蛋白質が，リソソーム酵素である，上記８の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば，酸性糖鎖，例えば，糖蛋白質から酵素により切り出された酸性糖鎖を高感度で分析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】pH 2.5に調整した糖鎖プロファイル移動相Ｂを用いて酸性糖鎖を分析した結果を示す図。Ａはカラムクロマトグラフィー条件１（クロマト条件１）でＢＡＰ処理試料を分析して得たクロマトグラム，Ｂはクロマト条件１でＢＡＰ未処理試料を分析して得たクロマトグラム，Ｃはカラムクロマトグラフィー条件２（クロマト条件２）でＢＡＰ処理試料を分析して得たクロマトグラム，Ｄはクロマト条件２でＢＡＰ未処理試料を分析して得たクロマトグラム，をそれぞれ示す。矢印１及び２はリン酸化糖鎖に対応するピークを示す。縦軸は蛍光強度（400nm）を横軸は保持時間をそれぞれ示す。
【図２】pH 3.0に調整した糖鎖プロファイル移動相Ｂを用いて酸性糖鎖を分析した結果を示す図。Ａはクロマト条件１でＢＡＰ処理試料を分析して得たクロマトグラム，Ｂはクロマト条件１でＢＡＰ未処理試料を分析して得たクロマトグラム，Ｃはクロマト条件２でＢＡＰ処理試料を分析して得たクロマトグラム，Ｄはクロマト条件２でＢＡＰ未処理試料を分析して得たクロマトグラム，をそれぞれ示す。矢印１及び２はリン酸化糖鎖に対応するピークを示す。縦軸は蛍光強度（400 nm）を横軸は保持時間をそれぞれ示す。
【図３】pH 3.5に調整した糖鎖プロファイル移動相Ｂを用いて酸性糖鎖を分析した結果を示す図。Ａはクロマト条件１でＢＡＰ処理試料を分析して得たクロマトグラム，Ｂはクロマト条件１でＢＡＰ未処理試料を分析して得たクロマトグラム，Ｃはクロマト条件２でＢＡＰ処理試料を分析して得たクロマトグラム，Ｄはクロマト条件２でＢＡＰ未処理試料を分析して得たクロマトグラム，をそれぞれ示す。矢印１及び２はリン酸化糖鎖に対応するピークを示す。縦軸は蛍光強度（400 nm）を横軸は保持時間をそれぞれ示す。
【図４】pH 4.0に調整した糖鎖プロファイル移動相Ｂを用いて酸性糖鎖を分析した結果を示す図。Ａはクロマト条件１でＢＡＰ処理試料を分析して得たクロマトグラム，Ｂはクロマト条件１でＢＡＰ未処理試料を分析して得たクロマトグラム，Ｃはクロマト条件２でＢＡＰ処理試料を分析して得たクロマトグラム，Ｄはクロマト条件２でＢＡＰ未処理試料を分析して得たクロマトグラム，をそれぞれ示す。矢印１及び２はリン酸化糖鎖に対応するピークを示す。縦軸は蛍光強度（400 nm）を横軸は保持時間をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明において，酸性糖鎖というときは，糖鎖中に硫酸基，カルボキシル基，リン酸基等の酸性基を有するものをいい，コンドロイチン４−硫酸，コンドロイチン６−硫酸，ヘパラン硫酸，デルマタン硫酸，ケタラン硫酸等がこれに含まれる。酸性糖鎖は，糖蛋白質を構成する糖鎖にも含まれることがあり，その糖蛋白質が体内において機能を発揮するうえで重要な働きを有する。例えば，マンノース−６−リン酸（M6P）を糖鎖の還元末端に含む酸性糖鎖は，糖蛋白質がM6P受容体を介して細胞内に取り込まれるために必須のものである。受容体を介して細胞内に取り込まれる糖蛋白質としては，例えば，イズロン酸−２−スルファターゼ，α−ガラクトシダーゼＡ等のリソソーム酵素がある。
【００１２】
本発明の一実施形態において担体１として用いられるカラムの担体は，表面に，疎水基を導入することにより疎水性に修飾されたシリカであって，且つ，第一級アミン，第二級アミン，又は第三級アミンを含む基を有するシリカである。シリカを疎水性に修飾するために導入される疎水基に特に限定はないが，好ましくはメチル基，エチル基，プロピル基等のアルキル基であり，特に好ましくはメチル基である。かかる疎水基は，シリカを構成するケイ素原子と直接共有結合させてもよく，また，酸素原子を介してケイ素原子と共有結合させてもよい。下記の一般式［I］で示されるものは疎水基で修飾されたシリカの好適な一例であり，シリカを構成するケイ素原子に３個のメチル基が結合している。また，下記一般式［I］において，Xは，担体１を構成するシリカ部分を表す。
【００１３】
【化１】
2019090809.tif 000006
【００１４】
また，担体１として用いられるカラムの担体であるシリカに含まれる第一級アミン，第二級アミン，又は／及び第三級アミンは，シリカを構成するケイ素原子と直接共有結合させてもよく，また，酸素原子を介してケイ素原子と共有結合させてもよい。下記の一般式［II］で示されるものは第一級アミンで修飾されたシリカの好適な一例である。
【００１５】
【化２】
2019090809.tif 000007
【００１６】
上記一般式［II］において，Rは，−(CH2)n−で表されるアルキルであり，その鎖長に特に制限はないが，好ましくはｎ＝１〜１０であり，より好ましくは１〜８であり，更に好ましくは１〜４であり，更により好ましくは１〜３であり，例えば，ｎ＝１，ｎ＝２，ｎ＝３である。また，上記一般式［II］において，Xは，担体１を構成するシリカ部分を表す。
【００１７】
本発明の一実施形態において担体２として用いられるカラムの担体は，第一級アミン，第二級アミン，又は／及び第三級アミンを含む基を有する樹脂である。下記の一般式［III］で示されるものは，第一級アミン及び第二級アミンを含む，かかる樹脂の好適な一例である。
【００１８】
【化３】
2019090809.tif 000008
【００１９】
上記一般式［III］において，Yは担体２を構成する樹脂部分を表す。また，式中，ｎは任意の整数であり，好ましくはｎ＝１〜１０であり，より好ましくは１〜８であり，更に好ましくは１〜４である。また，担体２を構成する樹脂は，好ましくは親水性樹脂であり，より好ましくは，ポリビニルアルコール又は変性ポリビニルアルコールを基材とするものである。また，担体２は，陰イオン交換樹脂としての性質を有するものであることが好ましい。
【００２０】
本発明における一実施態様において，酸性糖鎖を分離するために用いられるカラムクロマトグラフィー用カラムは，担体１を充てんさせたカラムと担体２を充てんさせたカラムとを，流路を介して直列に連結させたものである。便宜上，２つのカラムを連結させたときに，流路の上流に位置するカラムを第１のカラム，下流に位置するカラムを第２のカラムという。ここで，第１のカラムが担体１を充てんさせたものであり，第２のカラムが担体２を充てんさせたものでもよく，また，第１のカラムが担体２を充てんさせたものであり，第２のカラムが担体１を充てんさせたものでもよい。
【００２１】
第１のカラムの流出口の下流に第２のカラムを流路により連結させたものは，一体として酸性糖鎖を分離するために用いられるカラムクロマトグラフィー用カラムを構成する。第１のカラムと第２のカラムは，それぞれ親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムとして機能するものであることが好ましく，従って，第１のカラムと第２のカラムを連結させた構成を有するカラムクロマトグラフィー用カラムは，全体として親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムとしての機能を有する。
【００２２】
第１のカラムと第２のカラムを連結させた構成を有するカラムクロマトグラフィー用カラムは，全体として親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムとして機能するものであるので，疎水性の溶液からなる移動相で平衡化させたカラムに，糖鎖を含む試料を負荷すると，親水性の糖鎖は担体に保持される。そして，移動相を徐々に疎水性のものから親水性の溶液に置き換えることにより，疎水性の高いものから順に，糖鎖がカラムから溶出される。酸性糖鎖は，硫酸基，カルボキシル基，リン酸基等を有するので親水性が高く，親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムに負荷したときにより強くカラムに保持される。従って，本発明のカラムによれば，酸性糖鎖が選択的により長時間カラムに保持されることになり，酸性糖鎖の分離能が向上し，更には，これを用いて，酸性糖鎖をより高感度に分析することができることになる。
【００２３】
本発明のカラムクロマトグラフィー用カラムを用いて糖鎖を分析する際に用いられる移動相に，特に制限はないが，カラムクロマトグラフィーの際の移動相は，疎水性の高いもの（親水性の低いもの）から親水性の高いもの（疎水性の低いもの）へと徐々に置き換えられる。例えば，約80％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルと，約2％（ｖ／ｖ）の酢酸と，約18％（ｖ／ｖ）の純水とを含む疎水性の高い第１の移動相でカラムを平衡化し，これに試料を負荷してカラムに糖鎖を保持させた後，移動相を徐々に，約80％（ｖ／ｖ）の純水と，約5％（ｖ／ｖ）の酢酸と，約3％（ｖ／ｖ）のトリエチルアミンとを含み，ｐＨを２〜６に調整した親水性の高い第２の移動相に置き換えることにより，カラムに保持された糖鎖を，概ね親水性の低いものから順に溶出させることができる。
【００２４】
第２の移動相のｐＨは特に重要である。第２の移動相のｐＨは，担体のアミノ基へプロトンを配位させる必要上，酸性側に限られる。この酸性の範囲内でｐＨを高めることにより，酸性糖鎖に含まれる硫酸基，カルボキシル基，リン酸基等が移動相中でより多く陰イオンに解離するので，プロトンを配位したアミノ基を有する担体により強く保持されることになり，溶出されるまでの時間が長くなる。従って，酸性の範囲内で第２の移動相のｐＨを調整することにより，酸性糖鎖のピークを選択的に分離できることなる。ここで，第２の移動相のｐＨは，好ましくは２．０〜６．０に，より好ましくは３．０〜６．０に，更に好ましくは３．５〜６．０に，例えば，ｐＨ３．０，３．５，４．０，４．５，５．０等に調整される。
【００２５】
酸性糖鎖は本発明のカラムクロマトグラフィー用カラムを用いることにより分離することができるが，分離された酸性糖鎖を検出するために，試料中に含まれる糖鎖はあらかじめ蛍光標識することが好ましい。ここで，蛍光標識の方法に特に限定はないが，アミノピリジン標識が好適である。糖又は糖鎖の還元末端においては，環状構造をとる糖が開環して鎖状構造となったときにアルデヒド基又はケトン基が生じ得る。本発明において，２−アミノピリジン標識（又はアミノピリジン標識）というときは，糖又は糖鎖の還元末端を２−アミノピリジンと反応させることによりイミンを形成させ，次いでのこのイミンをボラン−ジメチルアミン錯体等を用いて還元させることにより，糖又は糖鎖の還元末端に２−アミノピリジンを付加させることをいう。また，本発明において，２−アミノピリジン標識化糖鎖，アミノピリジン標識化糖鎖，又は標識化糖鎖というときは，２−アミノピリジン標識（又はアミノピリジン標識）された糖又は糖鎖のことをいう。
【００２６】
アミノピリジン標識された糖鎖は，これを本発明のカラムクロマトグラフィー用カラムに負荷し，カラム通過後の溶液に，蛍光検出器で励起光を連続的に照射して，流出液から放射される蛍光の強度を測定することにより分析できる。このとき照射される励起光は，波長３００〜３４０ｎｍの紫外線であり，例えば，波長３２０ｎｍの紫外線である。また，このとき放射される蛍光は，蛍光検出器により波長３００〜３４０ｎｍの紫外線として，例えば波長３２０ｎｍの紫外線として測定される。
【００２７】
本発明において，分析すべき酸性糖鎖が，糖蛋白質の一部を構成するものである場合，アミノピリジン標識する前に，糖蛋白質から糖鎖を予め切り出す必要がある。糖蛋白質からの糖鎖の切り出しは，酵素処理又は化学処理して行う。酵素処理は，Ｎ−グリコシダーゼ，グリコペプチダーゼＡ，Ｏ−グリコシダーゼ等を用いて行い，化学処理は，ヒドラジン分解等により行う。これらの処理により，糖蛋白質中のアスパラギン残基，セリン残基，スレオニン残基等に結合した糖鎖が切り出される。
【００２８】
カラムクロマトグラフィーの結果として得られるクロマトグラム上で，酸性糖鎖に対応するピークを同定する方法の一例を以下に示す。まず試料を分割して，一方を酸性糖鎖に含まれる酸性基を糖鎖から切断する活性を有する酵素で処理する。次いで，試料をカラムクロマトグラフィーに負荷し，酵素で未処理の糖鎖を分析して得られるクロマトグラム（酵素未処理クロマトグラム）と，酵素処理した糖鎖を分析して得られるクロマトグラム（酵素処理クロマトグラム）を比較し，酵素未処理クロマトグラム上に検出されるが，酵素処理クロマトグラムでは消失するピークを酸性糖鎖に対応するピークとして同定できる。
【００２９】
酸性糖鎖から，硫酸基はスルファターゼを用いて切断することができ，カルボキシル基はデカルボキシラーゼを用いて切断することができ，リン酸基はホスファターゼを用いて切断することができる。
【００３０】
本発明において，糖鎖が分析対象となる糖蛋白質に，特に限定はないが，好ましくはイズロン酸−２−スルファターゼ，α−ガラクトシダーゼＡ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α−Ｌ−イズロニダーゼ，Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ（グルコシルセラミダーゼ），ガルスルファーゼ，リソソーム酸性リパーゼ，酸性α−グルコシダーゼ等のリソソーム酵素，組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ），血液凝固第ＶＩＩ因子，血液凝固第ＶＩＩＩ因子，血液凝固第ＩＸ因子等の血液凝固因子，エリスロポエチン，インターフェロン，トロンボモジュリン，卵胞刺激ホルモン，甲状腺刺激ホルモン，ＧＭ−ＣＳＦ，Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，及び抗体であり，特に，組換え体技術を用いて合成されたヒト等の哺乳動物の組換え糖蛋白質である。
【００３１】
イズロン酸−２−スルファターゼ，α−ガラクトシダーゼＡ等のリソソーム酵素は，マンノース−６−リン酸（M6P）で修飾された酸性糖鎖を有する。従って，リソソーム酵素のM6Pを含む糖鎖は，糖鎖をリソソームから切り出した後，その一部をホスファターゼ処理し，ホスファターゼ処理したものと未処理のものとでクロマトグラムを比較することにより同定することができる。
【実施例】
【００３２】
以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。
【００３３】
〔実施例１〕各種溶液の調製
（ａ）糖鎖プロファイル移動相Ａ：
800 mLのアセトニトリルに20 mLの酢酸を加えて混合した後，アセトニトリルを加えて1 Lとしたものを，糖鎖プロファイル移動相Ａとした。
【００３４】
（ｂ）糖鎖プロファイル移動相Ｂ：
800 mLの純水に50 mLの酢酸と30 mLのトリエチルアミンを加えて混合した後，2 M塩酸を加えてpHを調整し，更に純水を加えて1 Lとしたものを，糖鎖プロファイル移動相Ｂとした。このとき，pHが，2.5，3.0，3.5，及び4.0であるものを調製した。
【００３５】
〔実施例２〕ｈＩ２Ｓ−ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質発現用ベクターの構築
ｈＩ２Ｓ−ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質発現用ベクターは，配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する重鎖からなるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子配列を用いて構築した。
【００３６】
pEF/myc/nucベクター（Invitrogen社）を，KpnIとNcoIで消化し，EF-1αプロモーター及びその第一イントロンを含む領域を切り出し，これをT4 DNAポリメラーゼで平滑末端化処理した。pCI-neo（Invitrogen社）を，BglII及びEcoRIで消化して，CMVのエンハンサー／プロモーター及びイントロンを含む領域を切除した後に，T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化処理した。これに，上記のEF-1αプロモーター及びその第一イントロンを含む領域を挿入して，pE-neoベクターを構築した。pE-neoベクターを，SfiI及びBstXIで消化し，ネオマイシン耐性遺伝子を含む約1kbpの領域を切除した。pcDNA3.1/Hygro(+)（Invitrogen社）を鋳型にしてプライマーHyg-Sfi5’（配列番号３）及びプライマーHyg-BstX3’（配列番号４）を用いて，ＰＣＲ反応によりハイグロマイシン遺伝子を増幅した。増幅したハイグロマイシン遺伝子を，SfiI及びBstXIで消化し，上記のネオマイシン耐性遺伝子を切除したpE-neoベクターに挿入して，pE-hygrベクターを構築した。
【００３７】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖の全長をコードする遺伝子を含むDNA断片（配列番号５）を合成した。このDNA断片の5’側にはMluI配列を，3’側にはNotI配列を導入した。このDNA断片をMluIとNotIで消化し，pE-neoベクターのMluI-NotI間に組み込んだ。得られたベクターを，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖発現用ベクターであるpE-hygr(LC)とした。
【００３８】
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＣ末端側に（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）のアミノ酸配列を有するリンカーを介して配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するｈＩ２Ｓを結合させた蛋白質をコードする遺伝子を含む，配列番号７で示される塩基配列を有するDNA断片を人工的に合成した。このDNA断片は，配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖とｈＩ２Ｓを結合させた蛋白質をコードする。このＤＮＡ断片をMluIとNotIで消化し，pE-neoベクターのMluIとNotIの間に組み込み，pE-neo(HC-I2S)を構築した。
【００３９】
〔実施例３〕ｈＩ２Ｓ−ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質の高発現細胞株の作製
ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ｋ１：American Type Culture Collectionから入手）を，下記の方法により，GenePulser（Bio-Rad社）を用いて，実施例２で構築したpE-hygr(LC)とpE-neo(HC-I2S)との組み合わせで，形質転換させた。細胞の形質転換は概ね以下の方法で行った。
【００４０】
5×105個のＣＨＯ−Ｋ１細胞をCD OptiCHOTM培地（Thermo Fisher Scientific社）を添加した3.5 cm培養ディッシュに播種し，37℃，5% CO2の条件下で一晩培養した。培養後，細胞を5×106細胞/mLの密度となるようにOpti-MEMTMI培地（Thermo Fisher Scientific社）で懸濁した。100 μLの細胞懸濁液を採取し，これにCD OptiCHOTM培地で100 μg/mLに希釈したpE-hygr(LC)及びpE-neo(HC-I2S)プラスミドDNA溶液を5 μLずつ添加した。GenePulser（Bio-Rad社）を用いて，エレクトロポレーションを実施し，細胞にプラスミドを導入した。37℃，5% CO2の条件下で一晩培養した後，細胞を，0.5 mg/mLのハイグロマイシン及び0.8 mg/mLのG418を添加したCD OptiCHOTM培地で選択培養した。
【００４１】
次いで，限界希釈法により，１ウェルあたり１個以下の細胞が播種されるように，96ウェルプレート上に選択培養で選択された細胞を播種し，各細胞が単クローンコロニーを形成するように約10日間培養した。単クローンコロニーが形成されたウェルの培養上清を採取し，ヒト化抗体含量をELISA法にて調べ，ｈＩ２Ｓ−ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質の高発現細胞株を選択した。
【００４２】
このときのELISA法は概ね以下の方法で実施した。96ウェルマイクロタイタープレート（Nunc社）の各ウェルに，ヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体溶液を0.05 M炭酸水素塩緩衝液(pH 9.6)で4 μg/mLに希釈したものを100 μLずつ加え，室温で少なくとも1時間静置して抗体をプレートに吸着させた。次いで，リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)に0.05% Tween20を添加したもの（PBS-T）で各ウェルを3回洗浄後，Starting Block(PBS)Blocking Buffer（Thermo Fisher Scientific社）を各ウェルに200 μLずつ加えてプレートを室温で30分静置した。次いで，各ウェルをPBS-Tで3回洗浄した後，リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)に0.5% BSA及び0.05% Tween20を添加したもの（PBS-BT）で適当な濃度に希釈した培養上清又はヒトＩｇＧ標準品を，各ウェルに100 μLずつ加え，プレートを室温で少なくとも1時間静置した。次いで，プレートをPBS-Tで3回洗浄した後，PBS-BTで希釈したHRP標識抗ヒトＩｇＧポリクロ−ナル抗体溶液を，各ウェルに100 μLずつ加え，プレートを室温で少なくとも１時間静置した。PBS-Tで各ウェルを3回洗浄後，0.4 mg/mL o-フェニレンジアミンを含むリン酸−クエン酸緩衝液(pH 5.0)を100 μLずつ各ウェルに加え，室温で8〜20分間静置した。次いで，1 mol/L 硫酸を100 μLずつ各ウェルに加えて反応を停止させ，96ウェルプレートリーダーを用いて，各ウェルにつき490 nmでの吸光度を測定した。高い測定値を示したウェルに対応する細胞を，ｈＩ２Ｓ−ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質の高発現細胞株として選択した。この細胞株が発現するｈＩ２Ｓとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質をＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体とした。
【００４３】
〔実施例４〕ｈＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体発現株の培養
Ｉ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体を，以下の方法で製造した。実施例３で得たｈＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体発現株を，細胞密度が約2×105個/mLとなるように，4 mM L-アラニル-L-グルタミン，100 μmol/L ヒポキサンチン及び16 μmol/L チミジンを含有する，約200 Lの無血清培地（EX-CELL Advanced CHO Fed-batch Medium，Sigma Aldrich社）に懸濁させた。この細胞懸濁液の140 Lを培養槽に移した。培地をインペラ―で撹拌し，培地の溶存酸素濃度を約40%に保持し，34〜37℃の温度範囲で，約11日間細胞を培養した。培養期間中，培地のグルコース濃度を監視し，培地のグルコース濃度が15 mmol/L未満となった場合には，直ちにグルコース濃度が約36 mmol/Lとなるように，グルコース溶液を培地に添加した。培養終了後に培地を回収した。回収した培地を，Millistak+HC Pod Filter grade D0HC（Merck社)でろ過し，更にMillistak+ HC Pod Filter(grade X0HC, Merck社)でろ過して，Ｉ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体を含む培養上清を得た。この培養上清を，PelliconTM 3 Cassette w/Ultracel PLCTK Membrane(孔径：30 kDa, 膜面積：1.14 m2，Merck社)を用いて限外ろ過して濃縮した。次いで，この濃縮液をOpticap XL600(0.22 μm, Merck社)を用いてろ過した。得られた液を濃縮培養上清とした。
【００４４】
〔実施例５〕ｈＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体の精製
濃縮培養上清を，0.5倍容の140 mM NaClを含有する20 mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.0)を添加した後に，Millipak-200 Filter Unit(孔径：0.22 μm, Merck社)でろ過した。このろ過後の溶液を，カラム体積の4倍容の140 mM NaClを含有する20 mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.0)で平衡化した，プロテインＡアフィニティーカラムであるMabSelect SuRe LXカラム (カラム体積:約3.2 L, ベッド高:約20 cm, GE Healthcare社)に，200 cm/hrの一定流速で負荷し，Ｉ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体をプロテインＡに吸着させた。
【００４５】
次いで，カラム体積の5倍容の500 mM NaCl及び450 mM アルギニンを含有する10 mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.0)を同流速で供給してカラムを洗浄した。次いでカラム体積の2.5倍容の140 mM NaClを含有する20 mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.0)を同流速で供給してカラムを更に洗浄した。次いで，カラム体積の5倍容の140 mM NaClを含有する100 mM グリシン緩衝液(pH 3.5)で，プロテインＡに吸着したＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体を溶出させた。溶出液は， 1 M Tris-HCl緩衝液(pH 7.5)を用いて，直ちに中和した。
【００４６】
上記のプロテインＡアフィニティーカラムからの溶出液に，200 mM リン酸緩衝液(pH 7.0)と，4 M NaCl及び2 mM リン酸緩衝液を含有する10 mM MES緩衝液(pH 7.3)と，1 M Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)とを順次添加し，溶出液に含まれるリン酸ナトリウム及びNaClの濃度を，それぞれ2 mM及び215 mMに調整するとともに，溶出液のpHを7.3に調整した。次いで，この溶出液を，Opticap XL600(孔径：0.22 μm, Merck社)でろ過した。このろ過後の溶液を，カラム体積の4倍容の215 mM NaCl及び2 mM リン酸ナトリウムを含有する10 mM MES緩衝液(pH 7.3)で平衡化した，ハイドロキシアパタイトカラムであるCHT TypeII 40 μmカラム(カラム体積:約3.2 L，ベッド高:約20 cm，Bio-Rad社)に，200 cm/hrの一定流速で負荷し，Ｉ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体をハイドロキシアパタイトに吸着させた。
【００４７】
次いで，カラム体積の5倍容の同緩衝液を同流速で供給してカラムを洗浄した。次いで，カラム体積の5倍容の215 mM NaClを含有する35 mM リン酸緩衝液(pH 7.3)で，ハイドロキシアパタイトに吸着したＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体を溶出させた。
【００４８】
上記のハイドロキシアパタイトカラムからの溶出液に，希塩酸を加えてpHを6.5に調整した。次いで，PelliconTM 3 Cassette w/Ultracel PLCTK Membrane(孔径：30 kDa, 膜面積：1.14 m2，Merck社)を用いて限外ろ過し，溶液中のＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体の濃度が約2 mg/mLとなるまで濃縮した。次いで，この濃縮液をOpticap XL600(0.22 μm, Merck社)を用いてろ過した。
【００４９】
上記の濃縮液を，カラム体積の5倍容の0.8 mg/mL NaCl及び75 mg/mL スクロースを含有する20 mM リン酸緩衝液(pH 6.5)で平衡化した，サイズ排除カラムであるSuperdex 200カラム(カラム体積:約12.6 L, ベッド高:40 cm, GE Healthcare社)に，19 cm/hrの一定流速で負荷し，更に，同緩衝液を同じ流速で供給した。このとき，サイズ排除カラムからの溶出液の流路に，溶出液の吸光度を連続的に測定するための吸光光度計を配置して，280 nmの吸光度をモニターし，280 nmで吸収ピークを示した画分を，Ｉ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体を含む画分として回収し，これをＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体精製品（以下，Ｉ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体）とした。
【００５０】
〔実施例６〕ｈＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体の還元アルキル化
上記実施例５で得たＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体を0. 2mg採取し，減圧乾固させた後，50 μLの蛋白質溶解液（66.8 gのグアニジン塩酸塩，6.1 gのトリスヒドロキシメチルアミノメタン及び0.372 gのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを水に溶かし，1 N塩酸でpH 8.5に調整した後，水を加えて100 mLとしたもの）に溶解させた。次いで，4 μLの還元化溶液（10 mgのジチオスレイトールを50 μLの蛋白質溶解液に溶かしたもの）を添加して振り混ぜ，室温で30分間静置した。次いで，4 μLのヨード酢酸溶液（25 mgのヨード酢酸を60 μLの1 N水酸化ナトリウム水溶液に溶かしたもの）を添加して振り混ぜ，遮光下，室温で30分間静置した。次いで，反応物をゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付して，Ｉ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体を含む画分を分取した。このときゲルろ過カラムクロマグラトフィーは，純水で平衡化させたSephadex（登録商標）G-25 superfine（カラム径5 mm，カラム長150 mm，ＧＥヘルスケア）に反応物を付し，室温で流速1 mL/分で水を流して，紫外吸光光度計で波長215 nmの吸光度をモニターしながら行った。分取したＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体を含む画分を減圧乾固した。
【００５１】
〔実施例７〕トリプシン処理
上記実施例６で得た減圧乾固した還元アルキル化Ｉ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体に，70 μLの70 mmol/L重炭酸アンモニウム水溶液を加えて振り混ぜた。次いで，10 μLのトリプシン溶液（25 μgのトリプシンを50 mLの1 mmol/L塩酸に溶かしたもの）を加えて振り混ぜ，２〜８℃で９時間静置して反応させた。次いで，溶液を９５℃で５分間加熱してトリプシンを失活させ，これをトリプシン消化物とした。
【００５２】
〔実施例８〕グリコシダーゼ処理
上記実施例７で得たトリプシン消化物に，グリコシダーゼ溶液（Ｎ−グリコシダーゼを1,000 units/mLの濃度で純水に溶解させたもの）を5 μL加え，5℃で3時間静置して反応させた。次いで，溶液を95℃で5分間加熱してグリコシダーゼを失活させ，これをグリコシダーゼ消化物とした。
【００５３】
〔実施例９〕糖鎖のアミノピリジン標識
上記実施例８で得たグリコシダーゼ消化物に，20 μLの2-アミノピリジン溶液（150 mgの2-アミノピリジンを50 μLの酢酸に溶解したもの）を加えて振り混ぜ，80℃で1時間反応させた。次いで，20 μLのボラン-ジメチルアミン錯体溶液（20 mgのボラン-ジメチルアミン錯体を100 μLの酢酸に溶解したもの）を加えて振り混ぜ，80℃で1時間反応させた。次いで，100 μLのトルエンを加えて振り混ぜた後，遠心して，糖鎖を沈殿させるとともにトルエン層の上層を除去した。このトルエンによる抽出操作を，更に2回繰り返して行い，未反応の2-アミノピリジンを除去した。また，最後のトルエン抽出の際には，沈殿を残すようにして，可能な限りの溶液を除去した。ここで除去したトルエンを含む液は，有機溶媒廃棄用の容器に回収した。次いで，沈殿させた糖鎖を減圧乾固させた後，50 μLの水に溶解して糖鎖溶解液とし，これをゲルろ過カラムクロマグラトフィーに付して，アミノピリジン標識化糖鎖を含む画分を分取した。
【００５４】
このときゲルろ過カラムクロマグラトフィーは，純水で平衡化させたSEPHADEXTM G-15（カラム内径28 mm，カラム長200 mm，GEヘルスケア社）に糖鎖溶解液を付し，次いで，室温で8 mL/分の流速で0.1 %(v/v) 酢酸水溶液を通して，蛍光検出器（励起波長320 nm，蛍光波長 400 nm）で蛍光強度をモニターしながら行った。糖鎖溶解液をカラムに負荷後，5〜10分に表れるピークに相当する画分を，アミノピリジン標識化糖鎖を含む画分として回収した。回収した画分を減圧乾固させた。
【００５５】
〔実施例１０〕アルカリフォスファターゼ（BAP）処理
実施例９で得た減圧乾固物に1 mLの純水を加えて溶解させた。これを0.5 mLずつ2本のチューブに分注し，減圧乾固させた後，80 μLの純水を加えて溶解させた。新しいチューブに溶解液を52 μL分取し，これに1 unitのアルカリフォスファターゼ（タカラバイオ社）及び6 μLの反応緩衝液（10 mMのMgCl2を含む500 mM Tris-HCl(pH 9.0)）を加えて混合し，50℃で1時間反応させた。反応後の溶液30 μLに，75 μLの糖鎖プロファイル移動相Ａ（実施例１で調製したもの）を加えて混合した。これを，アルカリフォスファターゼ処理試料（BAP処理試料）とした。また，別の新しいチューブに溶解液を52μL分取し，これに2 μLの純水及び6 μLの反応緩衝液（10 mMのMgCl2を含む500 mM Tris-HCl(pH 9.0)）を加えて混合し，50℃で1時間反応させた。反応後の溶液30 μLに，75 μLの糖鎖プロファイル移動相Ａを加えて混合させた。これを，アルカリフォスファターゼ（BAP）未処理試料（BAP未処理試料）とした。
【００５６】
〔実施例１１〕酸性糖鎖の分離及び分析
実施例１０で得た，BAP処理試料及びBAP未処理試料を，以下に示す条件（カラムクロマトグラフィー条件１及びカラムクロマトグラフィー条件２）でカラムに負荷し，それぞれの試料に含まれる糖鎖を分離，分析した。糖鎖プロファイル移動相Ａ，及び糖鎖プロファイル移動相Ｂは，実施例１で調製したものである。なお，AsahipakTM NH2P-50 4Eは，ポリビニルアルコールを基材とし，官能基としてアミノ基が導入された樹脂を担体とする親水性相互作用クロマトグラフィー用カラム（順相カラムクロマトグラフィー用カラム）である。また，TSKgel NH2-100は，表面が疎水性に修飾されたシリカであって，且つ表面に官能基としてアミノアルキル基が導入されたものを担体とする親水性相互作用クロマトグラフィー用カラム（順相カラムクロマトグラフィー用カラム）である。
【００５７】
【表１】
2019090809.tif 000009
【００５８】
【表２】
2019090809.tif 000010
【００５９】
カラムクロマトグラフィー条件１及びカラムクロマトグラフィー条件２ともに，試料を負荷する前に，糖鎖プロファイル移動相Ａと糖鎖プロファイル移動相Ｂとを容量％でそれぞれ70%と30%含む移動相を0.6 mL/分の流速で流すことにより，カラムを平衡化させた。
【００６０】
また，カラムクロマトグラフィーは，島津ＨＰＬＣシステムＬＣ−２０Ａ（島津製作所）にカラムをセットし，カラムオーブンでカラムを５０℃に加熱するとともに，カラムの流出口の下流に蛍光検出器を設置し，カラム通過後の溶液に，励起光として波長320 nmの紫外線を照射し，波長400 nmの蛍光を検出するようにして実施した。
【００６１】
〔実施例１２〕酸性糖鎖の分析結果
最初に，pH 2.5に調整した糖鎖プロファイル移動相Ｂを用いて，実施例１１に示す方法により，酸性糖鎖の分離及び分析を実施した。その結果を図１に示す。カラムクロマトグラフィー条件１（クロマト条件１）での，BAP処理試料（図１中クロマトグラムＡ）及びBAP未処理試料（図１中クロマトグラムＢ）のクロマトグラムを比較すると，BAP未処理試料では確認できるが，BAP処理試料では確認できない，ピーク１及びピーク２がある。これらのピークはそれぞれ，１リン酸化糖鎖と２リン酸化糖鎖に対応する。BAP処理試料によりリン酸基が糖鎖から遊離するので，BAP処理試料ではこれらピークが消失する。次いで，カラムクロマトグラフィー条件２（クロマト条件２）での，BAP処理試料（図１中クロマトグラムＣ）及びBAP未処理試料（図１中クロマトグラムＤ）のクロマトグラムを比較すると，カラムクロマトグラフィー条件１の場合と同じく，BAP未処理試料では確認できるが，BAP処理試料では確認できない，それぞれ１リン酸化糖鎖と２リン酸化糖鎖に対応する，ピーク１及びピーク２がある。カラムクロマトグラフィー条件２では，カラムクロマトグラフィー条件１と比較して，ピーク１及びピーク２が出現するまでの溶出時間が長くなる傾向にある。
【００６２】
次いで，pH 3.0に調整した糖鎖プロファイル移動相Ｂを用いて，実施例１１に示す方法により，酸性糖鎖の分離及び分析を実施した。その結果を図２に示す。カラムクロマトグラフィー条件１での，BAP処理試料（図２中クロマトグラムＡ）及びBAP未処理試料（図２中クロマトグラムＢ）のクロマトグラムを比較すると，BAP未処理試料では確認できるが，BAP処理試料では確認できない，ピーク１及びピーク２がある。図１と同様に，これらのピークはそれぞれ，１リン酸化糖鎖と２リン酸化糖鎖に対応する。次いで，カラムクロマトグラフィー条件２での，BAP処理試料（図２中クロマトグラムＣ）及びBAP未処理試料（図２中クロマトグラムＤ）のクロマトグラムを比較すると，カラムクロマトグラフィー条件１の場合と同じく，BAP未処理試料では確認できるが，BAP処理試料では確認できない，それぞれ１リン酸化糖鎖と２リン酸化糖鎖に対応する，ピーク１及びピーク２がある。カラムクロマトグラフィー条件２では，カラムクロマトグラフィー条件１と比較して，ピーク１及びピーク２が出現するまでの溶出時間が，pH 2.5に調整した糖鎖プロファイル移動相Ｂを用いた場合と比較して，選択的に長くなる傾向にある。
【００６３】
更に，pH 3.5に調整した糖鎖プロファイル移動相Ｂを用いて，実施例１１に示す方法により，酸性糖鎖の分離及び分析を実施した。その結果を図３に示す。カラムクロマトグラフィー条件１での，BAP処理試料（図３中クロマトグラムＡ）及びBAP未処理試料（図３中クロマトグラムＢ）のクロマトグラムを比較すると，BAP未処理試料では確認できるが，BAP処理試料では確認できない，ピーク１及びピーク２がある。図１及び２と同様に，これらのピークはそれぞれ，１リン酸化糖鎖と２リン酸化糖鎖に対応する。次いで，カラムクロマトグラフィー条件２での，BAP処理試料（図３中クロマトグラムＣ）及びBAP未処理試料（図３中クロマトグラムＤ）のクロマトグラムを比較すると，カラムクロマトグラフィー条件１の場合と同じく，BAP未処理試料では確認できるが，BAP処理試料では確認できない，それぞれ１リン酸化糖鎖と２リン酸化糖鎖に対応する，ピーク１及びピーク２がある。カラムクロマトグラフィー条件２では，カラムクロマトグラフィー条件１と比較して，ピーク１及びピーク２が出現するまでの溶出時間が，pH 3.0に調整した糖鎖プロファイル移動相Ｂを用いた場合と比較して，選択的に長くなる傾向にある。
【００６４】
更に，pH 4.0に調整した糖鎖プロファイル移動相Ｂを用いて，実施例１１に示す方法により，酸性糖鎖の分離及び分析を実施した。その結果を図４に示す。カラムクロマトグラフィー条件１での，BAP処理試料（図４中クロマトグラムＡ）及びBAP未処理試料（図４中クロマトグラムＢ）のクロマトグラムを比較すると，BAP未処理試料では確認できるが，BAP処理試料では確認できない，ピーク１及びピーク２がある。図１〜３と同様に，これらのピークはそれぞれ，１リン酸化糖鎖と２リン酸化糖鎖に対応する。次いで，カラムクロマトグラフィー条件２での，BAP処理試料（図４中クロマトグラムＣ）及びBAP未処理試料（図４中クロマトグラムＤ）のクロマトグラムを比較すると，カラムクロマトグラフィー条件１の場合と同じく，BAP未処理試料では確認できるが，BAP処理試料では確認できない，それぞれ１リン酸化糖鎖と２リン酸化糖鎖に対応する，ピーク１及びピーク２がある。カラムクロマトグラフィー条件２では，カラムクロマトグラフィー条件１と比較して，ピーク１及びピーク２が出現するまでの溶出時間が，更に選択的に長くなる傾向にある。
【００６５】
以上の結果から，カラムクロマトグラフィー条件２で酸性糖鎖を分析した場合，酸性糖鎖が溶出するまでの保持時間が選択的に長くなり，酸性糖鎖がより明確に分離されるので，糖鎖中に含まれる酸性糖鎖をより高感度で検出することができる。すなわち，ポリビニルアルコールを基材とし，官能基としてアミノ基が導入された樹脂を担体とする親水性相互作用クロマトカラム（順相カラムクロマトカラム）と，表面が疎水性に修飾されたシリカであって，且つ表面に官能基としてアミノアルキル基が導入されたものを担体とする親水性相互作用クロマトカラム（順相カラムクロマトカラム）とを組み合わせることにより，糖鎖中に含まれる酸性糖鎖をより高感度で検出することができると結論できる。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明によれば，酸性糖鎖，例えば，糖蛋白質から酵素により切り離した酸性糖鎖を高感度で分析することのできるカラムクロマトグラフィー用カラム，及び当該カラムを用いた酸性糖鎖の分析法を提供できる。
【配列表フリーテキスト】
【００６７】
配列番号１：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号２：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のアミノ酸配列
配列番号３：プライマーＨｙｇ−Ｓｆｉ５’，合成配列
配列番号４：プライマーＨｙｇ−ＢｓｔＸ３’，合成配列
配列番号５：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含む塩基配列，合成配列
配列番号７：抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖とｈＩ２Ｓの融合蛋白質をコードする塩基配列，合成配列
配列番号８：抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖とｈＩ２Ｓの融合蛋白質のアミノ酸配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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