(57)【要約】少なくとも１つのＮ−末端ドメインに結合された三重らせん形成ドメインを含んでなる修飾プロ−α鎖であって、Ｎ−末端ドメインはラミニン糖タンパク質または分泌白血球プロテアーゼ阻害剤の少なくとも一部からのポリペプチドを含有する。プロ−α鎖は、保持Ｎ−末端ドメインを有するプロコラーゲン分子の一部を形成しうる。プロコラーゲン分子は、コラーゲンポリマー、マトリクス、およびゲルへ組込まれ、かつ創傷治癒などの用途に使用されうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのＮ−末端ドメインに結合された三重らせん形成ドメインを含んでなる修飾プロ−α鎖であって、Ｎ−末端ドメインがラミニン糖タンパク質の少なくとも部分もしくは分泌白血球プロテアーゼ阻害剤またはその機能的誘導体の少なくとも部分に由来するポリペプチド配列を含有する、修飾プロ−α鎖。
【請求項２】
三重らせん形成ドメインが線維形成プロ−α鎖に由来する、請求項１記載の修飾プロ−α鎖。
【請求項３】
三重らせん形成ドメインがＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、またはＸＩ型プロ−α鎖に由来する、請求項２記載の修飾プロ−α鎖。
【請求項４】
三重らせん形成ドメインがプロα１（ＩＩＩ）鎖に由来する、請求項３記載の修飾プロ−α鎖。
【請求項５】
Ｎ−末端ドメインがラミニン分子の一部を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の修飾プロ−α鎖。
【請求項６】
Ｎ−末端ドメインがラミニン分子のα鎖の球状ドメインに由来する、請求項５記載の修飾プロ−α鎖。
【請求項７】
Ｎ−末端ドメインがα鎖の少なくともＧ３球状ドメインのアミノ酸配列を含んでなる、請求項６記載の修飾プロ−α鎖。
【請求項８】
Ｎ−末端がＧ１〜Ｇ３ドメインのアミノ酸配列を含んでなる、請求項６記載の修飾プロ−α鎖。
【請求項９】
プロ−α鎖のＮ−末端配列がラミニン５の球状鎖のアミノ酸配列の少なくとも部分で置換される、請求項５〜８のいずれか一項に記載の修飾プロ−α鎖。
【請求項１０】
プロコラーゲンＮ−プロペプチド配列がＮ１００の前にラミニン糖タンパク質の配列で置換される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の修飾プロ−α鎖。
【請求項１１】
分泌白血球プロテアーゼ阻害剤の全配列が前記Ｎ−末端ドメインに付着している、請求項１記載の修飾プロ−α鎖。
【請求項１２】
Ｎ−末端プロペプチドドメインと関連したＮ−プロテイナーゼ切断部位が、切断に対するドメインの感受性を変化させるように修飾されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の修飾プロ−α鎖。
【請求項１３】
Ｎ−プロテイナーゼ切断部位が、ドメインが切断されないように修飾されている、請求項１２記載の修飾プロ−α鎖。
【請求項１４】
プロ−α鎖のらせん形成ドメインとＮ−プロペプチド形成ドメインとの間の領域が、Ｎ−プロテイナーゼに対する抵抗性を与えるように修飾されている、請求項１３記載の修飾プロ−α鎖。
【請求項１５】
領域におけるＰｒｏ−ＧｌｎがＬｅｕ−Ｐｒｏに変化されている、請求項１４記載の修飾プロ−α鎖。
【請求項１６】
Ｎ−末端ドメインが配列番号１０のアミノ酸を含有する、請求項８記載の修飾プロ−α鎖。
【請求項１７】
Ｎ−末端ドメインが配列番号１４のアミノ酸を含有する、請求項７記載の修飾プロ−α鎖。
【請求項１８】
Ｎ−末端ドメインが配列番号２７のアミノ酸を含有する、請求項１１記載の修飾プロ−α鎖。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１つによって規定された修飾プロ−α鎖をコード化するＤＮＡ分子。
【請求項２０】
分子が配列番号９の塩基を包含することを特徴とする請求項１９記載の修飾プロ−α鎖をコード化するＤＮＡ分子。
【請求項２１】
分子が配列番号１３の塩基を包含することを特徴とする請求項１９記載の修飾プロ−α鎖をコード化するＤＮＡ分子。
【請求項２２】
分子が配列番号２６の塩基を包含することを特徴とする請求項１９記載の修飾プロ−α鎖をコードするＤＮＡ分子。
【請求項２３】
プロ−α鎖の少なくとも１つが、請求項１〜１８のいずれか１つによって規定された修飾プロ−α鎖であることを特徴とするプロ−α鎖の三量体を含んでなるプロコラーゲン分子。
【請求項２４】
分子のＣ−末端ドメインが除去されている、請求項２３記載のプロコラーゲン分子。
【請求項２５】
コラーゲンモノマーを含むコラーゲンポリマーであって、その中に含有されるコラーゲンモノマーの少なくともいくらかはＮ−プロペプチドを保持し、その保持されたＮ−プロペプチドの少なくともいくらかがラミニン糖タンパク質の少なくとも部分もしくは分泌白血球プロテアーゼ阻害剤またはその機能的誘導体の少なくとも部分に由来するポリペプチド配列を含有することを特徴とする、コラーゲンポリマー。
【請求項２６】
プロペプチドドメインを保持するコラーゲンモノマーが、請求項２３または２４によって規定されたプロコラーゲン分子に由来する、請求項２５記載のコラーゲンポリマー。
【請求項２７】
請求項２３および２４によって規定されたプロコラーゲン分子に由来する修飾プロペプチドドメインを有するコラーゲンモノマーを含んでなるコラーゲンマトリクス。
【請求項２８】
請求項２６によって規定されたコラーゲンポリマー、または請求項２７によって規定されたコラーゲンマトリクスを含んでなる包帯。
【請求項２９】
病状の治療のための請求項１〜２８のいずれか一項に記載の修飾プロ−α鎖、プロコラーゲン分子、ポリマー、マトリクス、または包帯の使用。
【請求項３０】
創傷または線維障害の治療において使用するための薬剤の製造のための請求項１〜２８のいずれか一項に記載の修飾プロ−α鎖、プロコラーゲン分子、ポリマー、マトリクス、または包帯の使用。
【請求項３１】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の修飾プロ−α鎖、プロコラーゲン分子、ポリマー、マトリクス、または包帯の治療有効量をかかる治療を必要とする対象に投与することを含む、創傷または線維障害を治療する方法。
【請求項３２】
請求項２７に記載のコラーゲンマトリクスを含んでなる人工皮膚／組織。
【請求項３３】
請求項２７に記載のコラーゲンマトリクスを含んでなる身体用インプラント。
【請求項３４】
病状の治療のための請求項２７、３２、または３３に記載のコラーゲンマトリクス、人工皮膚／組織、または身体用インプラントの使用。
【請求項３５】
遺伝子療法において使用するための送達システムであって、創傷部位または線維症の部位で修飾プロ−α鎖の発現をもたらすことが可能であり、またはもたらすように転写されている、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子を含んでなる、送達システム。
【請求項３６】
創傷または線維障害を治療するための薬剤の製造における請求項３５において規定された送達システムの使用。
【請求項３７】
請求項３５において規定された送達システムの治療量を治療を必要とする患者に投与することを含む、創傷または線維症状を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、修飾細胞外マトリクス分子、それから製造されるポリマー、マトリクス、およびゲルに関し、かつ創傷治癒などの用途におけるその使用に関する。
【０００２】
（背景技術）
慢性創傷を治療する新しい臨床療法の必要がある。創傷ケア市場は巨大であり、足および脚の潰瘍を治療する保健機関のコストは世界中で年間推定７０億ドルである（ＦＤＡウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／）。かかる創傷に対する既存の治療としては、培養線維芽細胞または多酸基質上に支持された線維芽細胞を含有するグルタルアルデヒド架橋コラーゲンインプラント、Ｉ型コラーゲンゲルが挙げられる。化学的基質、外細胞、および架橋化合物の使用は、移植片拒絶、抗原反応、および創傷縁での不十分な統合の危険性を増大させる。また、前培養細胞を含有する包帯は拡大困難であり、患者に新たに送達することも困難である。
【０００３】
さらに、静脈性潰瘍など慢性創傷に対する標準の治療は、圧迫療法とともに吸収性または非吸収性包帯の使用である。しかし、この方法は中程度でしか有効でなく、患者には不快であり、効果を発揮するには数か月かかる場合があり、治療が完了した大部分の症例において再発が起こる。したがって、遅延治癒の発症の原因となる基礎を成す細胞および分子メカニズムに対処できない高価な包帯の反復使用を回避する慢性創傷の治療および管理の緊急の必要性がある。結果として中程度でしか有効でない創傷治癒の標準の治療をもたらす最も重要な要因の１つは、細胞浸潤障害と関連した創傷部位でのコラーゲン沈着の顕著な減少である。
【０００４】
大部分の細胞は、単純な単細胞生物またはヒト組織の細胞に関係なく、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）として知られ、かつさまざまなタンパク質および多糖類から成る高分子の複雑なネットワークによって取り囲まれている。ＥＣＭの主要なタンパク質は、哺乳動物における全タンパク質の約２５％を構成すると考えられているコラーゲンと呼ばれる関連タンパク質のファミリーである。少なくとも２６個の遺伝学的に明確な型のコラーゲン分子があり、その一部は、通常、長さが数マイクロメートルでありうるとともに、電子顕微鏡によって視覚化されうるコラーゲンフィブリルとして知られる大線維を形成するため、線維コラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、およびＸＩ型コラーゲン）として知られる。
【０００５】
コラーゲンフィブリルは、コラーゲン分子のポリマーから成っており、ポリマーを形成するために集合するコラーゲン分子へのプロコラーゲンの変換を含む過程によって生成される。プロコラーゲンは、分子の中心で三重らせんドメインから成り、アミノ末端（Ｎ−末端プロペプチドとして知られる）およびカルボキシル末端（Ｃ−末端プロペプチドとして知られる）では非らせんドメインを有する。三重らせんドメインは、α鎖として知られる３個のポリペプチド構成されている。プロコラーゲンは、プロ−α鎖（ＮおよびＣ−末端形成プロペプチドドメインを有するα鎖）から細胞内で生成される。プロ−α鎖は膜結合リボソーム上で合成され、その後にプロ−α鎖は小胞体へ挿入される。小胞体内ではプロ−α鎖は集合してプロコラーゲン分子になる。プロコラーゲンは細胞外環境へ分泌され、次いでプロコラーゲンＮ−プロテイナーゼ（Ｎ−末端プロペプチドを切断する）およびプロコラーゲンＣ−プロテイナーゼ（Ｃ−末端プロペプチドを切断する）の作用によってコラーゲンへ変換される。プロペプチドが除去されていると、こうして形成されるコラーゲン分子は自然に自己集合し、コラーゲンフィルビルを形成することが可能である。コラーゲンフィブリルの形成における律速段階は、プロコラーゲンＣ−プロテイナーゼによるＣプロペプチドの除去である。
【０００６】
コラーゲンフィブリルは他のフィブリル、および細胞外マトリクスの他の成分とも相互作用し、インビボで結合組織を形成する。フィブリルはインビトロで集合し、相互作用してコラーゲンマトリクスまたはゲルを形成する。かかるコラーゲンマトリクスは種々の工業用途を有する。例えば、コラーゲンベースの生物医薬品がインプラントとして化粧品および美容増強市場において、かつしわ、ひだ、および顔の傷を滑らかにするために使用される。コラーゲンベースの製品は人工皮膚（例えば、火傷患者の治療用）、創傷包帯などの製造においても使用される。
【０００７】
コラーゲンベースの製品は広範囲に採用されているが、その性能は満足には程遠く、多くの禁忌および副作用が知られている。問題の一部は、これら製品の多くが動物コラーゲン（例えば、牛皮由来）に基づき、そのようなものとしてアレルギーおよび炎症反応や感染を起こすという事実に関係している。他のコラーゲン製品は、死体組織由来であり、それらは結果として炎症およびアレルギー反応の減少がもたらされると提案されている。しかし、かかる製品は製造に費用がかかり、製品品質の管理における困難は性能の変動をもたらしうる。
【０００８】
ＥＣＭの別の重要な機能は、細胞への成長因子の貯蔵および提示である。ＥＣＭのプロテオグリカン成分は多くの成長因子の活性の調節にける中心的な役割を果たし、したがって、有力な病態生理学的調節因子を示す。
【０００９】
プロテオグリカンのファミリーの公知の実施例は、主に２０−２４アミノ酸のロイシンに富む反復配列から成る約４０ｋＤａのコアタンパク質を有する。これらのタンパク質は小さなロイシンに富むプロテオグリカン（Ｓｍａｌｌ  Ｌｅｕｃｉｎｅ−Ｒｉｃｈ  Ｐｒｏｔｅｇｌｙｃａｎ）（ＳＬＲＰ）として知られ、通常、配列ＬＸ３ＬＸＬＸ２ＮＸ（Ｌ／Ｉ）を含有し、ここでＬ＝ロイシン、Ｎ＝アスパラギンは特定の保存位置にあり、Ｘ＝任意のアミノ酸である。
【００１０】
ＳＬＲＰファミリーは少なくとも４個のメンバー、すなわちデコリン、ブグリカン、フィブロモジュリン、およびルミカン（そのすべては１９８０年代後期／１９９０年代初期に詳細に特徴づけられた）を含んでなる。これらのプロテオグリカンは、細胞周期の調節、組織修復、およびコラーゲンフィブリルとのその相互作用による組織の機械的特性の修飾において特殊な機能を有する。デコリンおよび関連プロテオグリカンは、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）ファミリーのメンバーを含む種々の成長因子の活性に結合し、かつこれを修飾することも報告されている。ＴＧＦ−βなどの成長因子は、細胞活性およびＥＣＭ再構築に対する主要な影響を有する。少なくとも５種類のＴＧＦ−β（ＴＧＦ−β１−ＴＧＦ−β５）があり、その化学的構造および活性は広く報告されている（例えば、非特許文献１を参照）。
【００１１】
ＴＧＦ−β（特にＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２）の主要な病理生理学的活性は、創傷治癒の促進である。しかし、これはしばしば瘢痕形成の増大および線維症と関係がある。実際に、ＴＧＦ−βの修飾における臨床的関心は、瘢痕形成を削減するためのその活性の抑制と関係があった（ただし、これは創傷治癒の速度に悪影響を及ぼす）。例えば、特許文献１は、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２の活性を抑制し、特に瘢痕形成の削減に有利である組成物を開示している。
【００１２】
ＴＧＦ−βに結合することが知られている別のプロテオグリカンは、ＩＩＩ型ＴＧＦ−β受容体である。このプロテオグリカンは、ＴＧＦ−βのリザーバとして作用しうるとともに、ベータグリカン（または細胞膜から切断され、ＥＣＭに遊離して存在する場合は可溶性ベータグリカン）としても知られる細胞膜受容体である。
【００１３】
ＴＧＦ−βなど成長因子の活性の修飾は、重要な臨床的関心である。種々の関係者が、薬理的活性剤としてのプロテオグリカンの有用性を調査している。例えば、線維症状、創傷治癒、および瘢痕を調節するかかる分子の使用が以下において意図されている。すなわち、
（１）特許文献２―瘢痕の予防または削減のための薬剤としてのデコリンおよび関連プロテオグリカンの使用に関して、および
（２）特許文献３―抗瘢痕剤としての可溶性ベータグリカンの使用を開示。
【００１４】
本出願人の同時係属出願の特許文献４は、新規の修飾プロコラーゲン分子に関するが、ここで分子の少なくとも１つのＮ−末端ドメインはプロテオグリカンタンパク質コアの少なくとも部分からのポリペプチド配列を含有する。かかる修飾プロコラーゲンからのコラーゲンゲルおよびマトリクスの生成は、創傷部位へ成長因子を引き付けることによって創傷治癒を補助することがわかっている。さらに、プロコラーゲンマトリクスは、細胞収縮に対して増大した耐性を有することがわかっている。
【００１５】
こうした進歩にもかかわらず、依然として、創傷治癒を補助する一方、従来技術の利用で経験された不利点を回避し、または削減するための別の薬剤を開発する必要がある。
【００１６】
ラミニンは、基底膜内に遍在的に分布している多機能的糖タンパク質の大きなファミリーである。ラミニンは、インテグリンおよびＩＶ型コラーゲンを含む細胞表面反応因子を介してその高親和性結合部位によって細胞と相互作用する能力による発達、分化、および遊走における重要な役割を有する。それらは、１つの長い腕と３つの短い腕を有する十字分子へ集合するαβγヘテロ三量体タンパク質である、３つの遺伝学的に明確な鎖から成る。ラミニン−１、ラミニン−２、ラミニン−５、およびラミニン−１０を含む１８種類のラミニンイソ型がある。
【００１７】
ラミニンはケラチン生成細胞に結合することが知られており、皮膚創傷の再上皮形成に必要とされる重要な細胞である上皮細胞およびケラチン生成細胞へ生存および分化のシグナルを提供する。
【００１８】
細胞外マトリクスへ分泌され、創傷治癒に関係する別の分子は、分泌白血球プロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）である。この分子は、抗ロイコプロテアーゼとしても知られ、好中球エラスターゼの１１．７ｋＤカチオン阻害剤である。損傷に対する保護に加えて、これは抗菌および抗炎症として機能することも示されている。ＳＬＰＩは自然に血液によって生成され、皮膚を破壊する基質であるエラスターゼのレベルを修飾する。
【特許文献１】国際公開第９２／１７２０６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９３／０９８８０号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９７／０５８９２号パンフレット
【特許文献４】ＰＣＴ／ＧＢ２００２／００４７８５号明細書
【非特許文献１】スポーン（Ｓｐｏｒｎ）ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１０５、ｐ．１０３９、１９８７年
【００１９】
（発明の開示）
本発明の目的は、従来技術の薬剤および送達システムに関係した問題に対処することである。本発明の別の目的は、技術上周知のコラーゲンマトリクスおよびゲルと関係した問題に対処することである。
【００２０】
本発明は、所望の機能的特性が、三量体化されプロコラーゲン誘導体を形成しうる本発明の第１の態様に従い修飾プロ−α鎖をデザインすることによって薬剤またはコラーゲンマトリクスなどの組成物へ導入されうるという本発明者による理解に基づく。これらは次にコラーゲンモノマー（保持プロペプチドとともに）に変換され、その後に重合されうる。これにより新しい生物学的特性を有する新規のコラーゲンポリマーの合成および集合が可能となる。
【００２１】
このために、本発明の第１の態様は、少なくとも１つのＮ−末端ドメインに結合された三重らせん形成ドメインを含んで成り、Ｎ−末端ドメインがラミニン糖タンパク質の少なくとも部分もしくは分泌白血球プロテアーゼ阻害剤またはその機能的誘導体の少なくとも部分に由来するポリペプチド配列を含有することを特徴とする修飾プロ−α鎖を提供する。
【００２２】
本発明者は、分子生物学的方法を使用して、本発明の第１の態様による修飾プロ−α鎖がそこから発現されうるように、プロ−α鎖をコードする遺伝子を修飾しうることを見出した。したがって、本発明の第２の態様によれば、本発明の第１の態様による修飾プロ−α鎖をコードするＤＮＡ分子が提供される。
【００２３】
次いで、本発明者は、本発明の第１の態様による修飾プロ−α鎖を三量体化し、修飾Ｎ−プロペプチドを有するプロコラーゲン分子を形成した。この三量体は修飾プロ−α鎖のホモ三量体であってよく、または天然のプロ−α鎖をも含有するヘテロ三量体であってもよい。したがって、本発明の第３の態様によれば、プロ−α鎖の三量体を含んで成り、プロ−α鎖の少なくとも１つが本発明の第１の態様によるプロ−α鎖であることを特徴とするプロコラーゲン分子が提供される。
【００２４】
次いで、本発明者は、本発明の第３の態様によるプロコラーゲン分子が重合され、コラーゲンポリマーを形成することを立証する別の実験を行った。さらに本発明者は、コラーゲンポリマーがその表面上でそのＮ−プロペプチドまたはその誘導体を保持するように、ドメインの切断に対する感受性が変更されるようにＮ−末端ドメインを修飾することによってＮ−プロペプチド切断を調節しうることを立証した。これは、プロコラーゲンＮ−プロテイナーゼに耐性であるように本発明の第３の態様によるプロコラーゲン分子をデザインすることによって達成されうる。あるいは、この分子は、部分的にのみ切断され、またはよりゆっくり切断されうる。本発明の第１の態様によるプロ−α鎖は、プロコラーゲンＮ−プロテイナーゼに耐性を与えるアミノ酸配列を含有するようにも修飾されていることが好ましい。
【００２５】
あるいは、本発明者は、プロコラーゲンＮ−プロテイナーゼが阻害されている、または不在である環境下に保持Ｎ−プロペプチドとコラーゲンポリマーを集合しうることを見出した。
【００２６】
本発明の第４の態様によれば、その中に含まれたコラーゲンモノマーの少なくとも一部が、保持Ｎ−末端の少なくとも一部がラミニン糖タンパク質の少なくとも部分、分泌白血球プロテアーゼ阻害剤またはその機能的誘導体の少なくとも部分をコードするポリペプチド配列を含有することを特徴とするＮ末端を保持したコラーゲンモノマーを含んでなるコラーゲンポリマーが提供される。
【００２７】
本発明の第４の態様によるコラーゲンポリマーは、コラーゲンフィブリルを形成しうる。
【００２８】
したがって、コラーゲンポリマーを構成するプロコラーゲンのＣ−末端ドメインは、例えば、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−１）などプロコラーゲンＣ−プロテイナーゼを用いて除去されうる。これは、結果としてフィブリル表面で提示されるＮ−末端プロペプチドが生じることがわかっている。
【００２９】
ＥＰ−Ａ０９８５７３２号明細書は、Ｎ−末端に融合した生物学的に活性のペプチド（例えば、それ自体が成長因子）とともに、重合してフィブリルを形成しうるキメラコラーゲンの生成を意図している。しかし、ＥＰ−Ａ０９８５７３２号明細書は、本発明の第１の態様によるプロ−α鎖のＮ−末端ドメインへのラミニンまたは分泌白血球プロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）の少なくとも部分のポリペプチド配列の添加を意図または開示していない。
【００３０】
本発明の第１の態様による修飾プロ−α鎖は、好ましくは、線維形成プロコラーゲンの修飾形態（例えば、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、またはＸＩ型プロ−α鎖の修飾形態）である。好ましくは、この分子は修飾ＩＩＩ型プロ−α鎖である。この型は、Ｉ型コラーゲンと共集合しうるとともに、ホモ三量体も形成しうるため好ましい。最も好ましくは、修飾プロα１（ＩＩＩ）鎖である。
【００３１】
ラミニン分子の部分のみがプロ−αに付着していることが好ましい。より好ましくは、Ｎ−末端はラミニン分子のα鎖の球状ドメインに由来する。Ｎ−末端はα鎖の少なくともＧ３球状ドメインのアミノ酸配列を含んでなることが最も好ましい。あるいは、Ｎ−末端はＧ１〜Ｇ３ドメインのアミノ酸配列を含んで成りうる。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態においては、プロ−α鎖のＮ−末端配列は、ラミニン−５が上皮源の細胞に高い親和性を有するため、ラミニン−５のα３鎖のアミノ配列の少なくとも部分で置換される。
【００３３】
分泌白血球プロテアーゼ阻害剤の少なくとも部分をコードするポリペプチド配列によるＮ−末端の置換の場合、阻害剤の全配列がＮ−末端ドメインに付着していることが好ましい。
【００３４】
好ましくは、プロ−α鎖のＮ−プロペプチド配列は、Ｎ１００の前にプロコラーゲンＮ−プロペプチド配列を置換し、確実にコラーゲンがそのシグナル配列を保持するようにする。
【００３５】
天然のＮ−末端プロペプチド形成ドメインは、Ｎ−末端の実質的にすべてがラミニン糖タンパク質またはＳＬＰＩによって置換されるように修飾されうる。通常のＮ−末端プロペプチド形成ドメインが置換される程度は、ラミニン分子のケラチン生成細胞結合機能性、またはＳＬＰＩ分子のエラスターゼ阻害機能性が確実に導入されることよりも重要ではない。したがって、Ｎ−末端プロペプチド形成ドメインは完全に置換され、部分的に置換され、またはその全体において（必要な機能性が添加されたという条件で）維持されうる。
【００３６】
三量体化し、Ｎ−プロペプチド切断に耐性であるプロコラーゲンを形成する本発明による一部の修飾プロ−α鎖を作り出すことが望ましい。したがって、本発明の第１の態様による一部の好ましい分子は、かかる切断に耐性のプロコラーゲンを与える修飾Ｎ−プロテイナーゼ切断部位を規定するアミノ酸配列を有する。エーラー・ダンロス（Ｅｈｌｅｒｓ  Ｄａｎｌｏｓ）症候群ＶＩＩ型は、プロコラーゲン分子上のＮ−プロテイナーゼ切断部位を破壊するコラーゲン遺伝子における変異を有する。したがって、この変異を知った上で、かかる修飾を必要とするドメインの領域は容易に同定される。
【００３７】
プロ−α鎖のらせん形成ドメインとＮ−プロペプチド形成ドメインとの間の領域（いわゆるヒンジドメイン）は最も適切に修飾され、Ｎ−プロテイナーゼに耐性を与える。例えば、切断部位でのＰｒｏ−ＧｌｎはＬｅｕ−Ｐｒｏに変化されうる。
【００３８】
本発明の第１の態様による修飾プロ−α鎖は、直接化学結合によって、またはインビトロアミノ酸重合の後、タンパク質折り畳み、必要に応じて、修飾ポリペプチド配列のグリコシル化によって形成されうる。しかし、分子生物学技術を用いて本発明の第２の態様によるＤＮＡ分子をデザインし、細胞またはかかるＤＮＡ分子を含有する発現システムにおいて修飾プロ−α鎖を発現させることが好ましい。
【００３９】
本発明の第２の態様によるＤＮＡ分子は、アミノ酸が添加され、置換され、または欠失されるようにＮ−末端プロペプチド形成ドメインをコードする塩基を操作することによって形成されうる。ラミニン、ＳＬＰＩ、またはその機能的誘導体をコードするヌクレオチド配列が、Ｎ−プロペプチド形成ドメインをコードする塩基へ挿入されることが好ましい。ラミニン糖タンパク質のα鎖の少なくともＧ３ドメインまたはＳＬＰＩ分子のすべてをコードするヌクレオチド配列がＮ−プロペプチド形成ドメインをコードする塩基へ挿入されることが特に好ましい。
【００４０】
好ましい修飾としては、Ｇ３またはＧ１、ラミニン−５のα３鎖のＧ２およびＧ３ドメインをコードするヌクレオチド配列の挿入が挙げられる。
【００４１】
あるいは、天然のプロ−α鎖のＮ−プロペプチド形成ドメインをコードする塩基は完全に削除され、ラミニンのα鎖の球状ドメインの少なくとも１つをコードする塩基、またはＳＬＰＩ分子をコードする塩基で置換されうる。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態によれば、ＤＮＡ分子はＣ−」プロペプチドドメインおよびプロ−α鎖のα鎖をコードしうるとともに、ラミニン糖タンパク質またはＳＬＰＩタンパク質のα鎖の少なくとも１つの球状ドメインをコードする配列によって完全に置換される「天然の」Ｎ−プロペプチドを有しうる。
【００４３】
すでに示されているように、Ｎ−プロペプチド切断に耐性の本発明による一部のプロ−α鎖、プロコラーゲン、またはコラーゲンポリマーを作ることが望ましい。したがって、本発明の第２の態様による一部の好ましいＤＮＡ分子は、かかる切断に耐性のそれから発現されるタンパク質を変化させる修飾Ｎ−プロテイナーゼ切断部位をコードするＤＮＡ配列を有する。好ましくは、発現タンパク質は切断に耐性である。あるいは、発現タンパク質における切断は部分的であり、または非修飾タンパク質におけるよりもゆっくりでありうる。プロ−α鎖のらせん形成ドメインとＮ−プロペプチド形成ドメインとの間の領域（いわゆるヒンジドメイン）は変異され、Ｎ−プロテイナーゼに耐性を与えることが好ましい。例えば、切断部位でのＰｒｏ−Ｇｌｎをコードするヌクレオチドは、Ｌｅｕ−Ｐｒｏをコードするヌクレオチドに変化されうる。
【００４４】
ＤＮＡ分子は適切なベクター内に組込まれ、組換えベクターを形成しうる。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、またはファージでありうる。かかるベクターは多くの場合、１つもしくはそれ以上の選択可能なマーカーを含み、前記ベクターでトランスフェクトされた細胞の選択を可能にし、好ましくは、本発明の第２の態様によるＤＮＡ分子を組込む組換えベクターを収容する細胞の選択を可能にする。
【００４５】
標準の分子生物学技術を用いて、本発明の第２の態様によるＤＮＡ分子を含んでなるベクターを構成することができる。好ましい構成物および発現システムは実施例において詳細に述べられている。
【００４６】
ベクターは発現ベクターであり、ＤＮＡ分子の発現を駆動する調節配列を有しうる。かかる調節配列を含まないベクターも使用されうるとともに、これらはＤＮＡ分子を複製するためのクローニングベクターとして有用である。かかるベクターが使用されると、ＤＮＡ分子は最終的に、本発明のプロコラーゲン誘導体の生成に使用されうる適切な発現ベクターに転移される必要がある。
【００４７】
クローニングベクターにおけるＤＮＡ分子の複製または組換え発現ベクターからのタンパク質生成物の発現は、適切な宿主細胞内で実行される。ＤＮＡ分子は、宿主細胞内のベクター内に組込まれうる。かかる宿主細胞は原核細胞または真核細胞でありうる。真核細胞宿主は、酵母、昆虫、および哺乳動物細胞を含みうる。ＤＮＡ分子によってコードされるタンパク質の発現に使用される宿主は、理想としては安定して変換されるが、不安定に変換された（一過性）宿主の使用は排除されていない。
【００４８】
好ましい宿主細胞はＨＥＫ２９３細胞系およびその誘導体である。
【００４９】
本発明のＤＮＡ分子は、トランスジェニック植物、または好ましくは、動物における発現のためにデザインされた導入遺伝子構成物にも組込まれうる。かかる導入遺伝子構成物の発現のために適切に形成されうるトランスジェニック動物としては、家禽などの鳥、両生動物種、および魚種が挙げられる。タンパク質は体液または他の体内生成物（必要に応じて卵など）から収穫されうる。好ましいトランスジェニック動物は（ヒト以外の）哺乳動物、特に有胎盤哺乳動物である。本発明の第２の態様のＤＮＡ分子の発現生成物は、かかる哺乳動物の乳腺において発現されうるとともに、発現生成物はその後に乳から回収されうる。有蹄動物、特に経済的に重要な有蹄動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、水牛、ラクダ、およびブタは、本発明によるトランスジェニック動物としての使用に最も適した有胎盤哺乳動物である。かかる哺乳動物のトランスジェニック哺乳動物発現システムの生成および有用性は、一般に、および場合により具体的に、国際公開第Ａ８８００２３９号パンフレットおよび同第９００５１８８号パンフレットに開示されている。
【００５０】
宿主は、本発明の第２の態様のＤＮＡ分子のタンパク質生成物から本発明の第１の態様のプロコラーゲン誘導体の集合ための適切な細胞内装置を含有することが好ましい。特に、発現宿主、特にトランスジェニック動物は、発現、集合、分泌を促進する発現の他の外因性ＤＮＡ、または本発明の第３の態様のプロコラーゲン誘導体の生合成の他の態様、および本発明の第４の態様によるコラーゲンポリマーを含有しうる。例えば、発現宿主は、プロリル４−ヒドロキシラーゼを共発現しうるが、これは国際公開第９３０７８８９号パンフレットに開示されているように、プロコラーゲンの天然生合成において重要な翻訳後酵素である。
【００５１】
ＤＮＡ、特に、天然プロ−α鎖をコードするｃＤＮＡが知られており、技術上利用可能である。例えば、国際公開第Ａ９３０７８８９号パンフレット、および国際公開第Ａ９４１６５７０号パンフレット、およびその両方に引用された文献が詳細を示している。かかるＤＮＡは、本発明のＤＮＡ分子を製造するための便利な開始点として使用されうる。組換え技術を使用して、かかる開始点から本発明のＤＮＡ分子を得ることができる。
【００５２】
ＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ、完全ゲノム配列、およびミニ遺伝子（完全長遺伝子に存在するイントロンの全部ではなく、一部を含有するゲノム配列）は、組換え手段によって天然起源のプロ−α鎖（上記の開始点ＤＮＡなど）をコードするＤＮＡ配列へ挿入され、本発明の第２の態様によるＤＮＡ分子を形成しうる。一般にコラーゲン遺伝子に存在する多数のイントロンのため、実験的実用性は通常、ｃＤＮＡ、または、場合により、ミニ遺伝子の使用に有利となる。挿入ＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ、完全ゲノム配列、またはミニ遺伝子は、発現し、本発明の第３の態様によるプロコラーゲンへ集合した場合、かかるプロコラーゲン誘導体のＮ−末端ドメインにおける所望の修飾を生じさせるアミノ酸をコードする。
【００５３】
これらの方法において使用されるＤＮＡ物質のいずれか（ＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ、完全ゲノム配列、およびミニ遺伝子、本発明の第２の態様によるＤＮＡ分子、およびベクターを含む）は、インビトロ方法を含む、連続的ヌクレオチドを連結させ、かつ／またはオリゴ−、および／またはポリ−ヌクレオチドをライゲーションするステップを含む便利な方法によって調製されうる。しかし、組換えＤＮＡ技術が最適な方法を成す。
【００５４】
本発明の第２の態様によるＤＮＡ分子の好ましいベクターは、エピソームとして複製するプラスミドｐＣｅｐ４である。このプラスミドは、ＥＢＶ核抗原でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３などの細胞系におけるクローン化ＤＮＡ分子の高レベルの発現を可能にする。
【００５５】
本発明の第４の態様によるコラーゲンポリマーは、多くの形態でありうる。コラーゲンフィブリルに類似した円筒形ポリマーは、コラーゲン分子が主要な成分である場合、本発明の第３の態様によるプロコラーゲン由来のコラーゲン分子とコラーゲンの混合物から生成される。あるいは、シート状の構造は、通常のコラーゲン分子の非存在下、または実質的に非存在下に本発明の第３の態様によるプロコラーゲン誘導体を使用することによって形成されうる。
【００５６】
本発明の第４の態様によるコラーゲンポリマーの顕著な特徴は、修飾Ｎ−末端プロペプチドが、特に、プロコラーゲンのＣ−末端ドメインが除去されている場合に形成されたポリマー／フィブリルの表面に配置されていることである。本発明者は、天然コラーゲンと本発明の第３の態様による修飾プロコラーゲンの混合物から形成されたフィブリルが、フィブリル表面で修飾Ｎ−プロペプチドを示すが、天然コラーゲン（すなわち、保持Ｎ−プロペプチドを含まないコラーゲン）はフィブリルのコアを形成することを明らかにした。フィブリルにおける分子の配置は、原線維間腔へのＮ−プロペプチドの提示を最適化する。
【００５７】
したがって、本発明者は、本発明の第３の態様によるプロコラーゲン分子および／または本発明の第４の態様によるコラーゲンポリマーからコラーゲンマトリクスを形成することができた。前記コラーゲンマトリクスは、本発明の重要な第５の態様を形成する。
【００５８】
好ましくは、このマトリクスは、コラーゲンモノマーの少なくとも一部が、ラミニン糖タンパク質の少なくとも一部分、または分泌白血球プロテアーゼ阻害剤の少なくとも部分を含有するＮ−末端ドメインを有するという事実によって特徴づけられる。
【００５９】
本発明の第５の態様によるコラーゲンマトリクスは、既知のコラーゲンマトリクスに対していくつかの利点を有する。ラミニン糖タンパク質の球状ドメインのコラーゲンマトリクスへの組込みは、そのケラチン生成細胞結合特性によるケラチン生成細胞のクローリングを促進し、それによって再上皮形成を加速する。したがって、このマトリクスを使用して創傷縁から生きた細胞を補充することができる。
【００６０】
さらに、ＳＬＰＩドメインのコラーゲンマトリクスへの組込みも創傷治癒を補助し、抗菌および抗炎症特性を提供し、皮膚の破壊を削減する。
【００６１】
本発明の第５の態様によるコラーゲンマトリクスは、好ましくは、本発明の第２の態様によるヒト組換えＤＮＡ分子で製造される。この場合には、第３の利点は、マトリクスがヒトに投与されるとアレルギーおよび炎症反応を引き起こす可能性が低いことである。
【００６２】
コラーゲンマトリクスは、コラーゲンモノマーまたはプロコラーゲンの酸性溶液を（適切なプロテイナーゼの存在下に）中和し、温めることによって形成されうる。かかる条件下、コラーゲンモノマーは自然にポリマーフィブリルへ自己集合し、これは次いでもつれた状態になり、水和した多孔性のゲルを形成する。かかるゲルの剛性は、少なくとも部分的に、ゲルを形成するために使用されるコラーゲンの濃度、および形成されるコラーゲンフィブリルの直径によって決まる。コラーゲンマトリクスまたはゲルは、その中に形成される容器の形状を持つ。したがって、一方の寸法が薄く（数ミリメートル）かつ他方の寸法が広大（数センチメートル以上）であるゲルが製造されうる。かかるマトリクスは適切に成形され、代替皮膚または角膜の基礎を形成しうる。あるいは、コラーゲンゲルが、長骨（円筒形および細長い）、上顎骨（鎌形または湾曲）、関節軟骨（円板状）、腱（ロープ状）、または靭帯（ストラップ状）の形状を有する型で成型されうる。
【００６３】
本発明の第４および第５の態様によるコラーゲンポリマーおよびマトリクスは、本発明による修飾プロコラーゲン分子由来の組換えコラーゲンのみを含んで成りうる。あるいは、かかるコラーゲンポリマーまたはマトリクスは、本発明による修飾コラーゲンまたは修飾プロコラーゲン、および商業的供給源から入手可能なものなど、組織または細胞培養から抽出されたコラーゲンの混合物でありうる。例えば、本発明の第４の態様によるコラーゲンポリマーは、ウシＩ型コラーゲンと混合され、本発明の第５の態様によるマトリクスを形成しうる。
【００６４】
本発明によるプロコラーゲンまたはコラーゲンを用いて、天然コラーゲン（例えば、ウシコラーゲン）から形成されたゲルまたはマトリクスでコラーゲンフィブリルの表面を被覆することができ、またはそれらをゲル形成中にフィブリルへ組込むことができる。それによって、プロコラーゲンまたはコラーゲンへ導入された新しい機能的部分は、それらが細胞と相互作用し、または細胞機能に影響を及ぼしうるコラーゲンフィブリルの表面に提示される。プロコラーゲンは、可溶性プロコラーゲンを保持したそのＮ−末端ドメインを有するフィブリル形成コラーゲンに変換し、生体内原位置でゲル形成を可能にするＢＭＰ−１などプロコラーゲンＣ−プロテイナーゼとともに可溶性前駆体として適用されうる。これにより修飾コラーゲンは適用地点でコラーゲンフィブリルと一体化し、ぴったり合うことができる。
【００６５】
本発明の第１−第５の態様による分子は、細胞付着から創傷治癒まで、および細胞分化やアポトーシスから改善された分子および細胞結合特性を有する創傷包帯の製造までの広範囲の生物学的現象を探査するための研究の場で使用されうる。しかし、分子の好ましい使用は、医療または化粧品目的に使用されうるコラーゲンマトリクスの形成におけるものである。
【００６６】
本発明の第６の態様によれば、病状の治療のための本発明の第１−第５の態様のいずれか１つによる分子またはマトリクスの使用が提供される。
【００６７】
本発明の第７の態様によれば、創傷または線維障害の治療において使用するための薬剤の製造のための本発明の第１−第５の態様のいずれか１つによる分子またはマトリクスの使用が提供される。
【００６８】
本発明の第８の態様によれば、本発明の第１−第５の態様のいずれか１つに記載の分子またはマトリクスの治療有効量を治療を必要とする対象に投与するステップを含んでなる創傷を治療する方法が提供される。
【００６９】
治療される病状は、ＥＣＭの再構築によって少なくとも部分的に特徴づけられる状態である。
【００７０】
上記の考慮事項は主にヒトの状態、障害、または疾患に適用されるが、創傷治癒は他の動物、特に家畜または飼いならされた動物（例えば、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ等）においても問題となりうる。例えば、腹部創傷または付着は、瘢痕または線維症をもたらす腱および靭帯損傷のように、ウマ（特に競走馬）を安楽死させなければならない主な理由である。
【００７１】
本発明の第３および第４の態様による分子、および本発明の第５の態様によるマトリクスは、種々の型の薬剤へ調製されうる。本発明の薬剤は、特にその薬剤が使用される様式によって多くの異なる形態をとりうる。したがって、例えば、薬剤は液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、粉末、エアロゾル、または移植可能なデバイス（例えば、バイオポリマースポンジによって）の形態でありうる。
【００７２】
本発明の第３および第４の態様による分子は直接（例えば、液体形態で）投与されうる。しかし、これらの分子は創傷包帯、移植可能なデバイス、人工皮膚、または組織等へ組込まれていることが好ましい。
【００７３】
薬剤は局所適用であることが好ましい。薬剤は皮膚または創傷範囲への局所適用に最も適切に使用されうる。
【００７４】
修飾プロコラーゲン、コラーゲン、またはコラーゲンフィブリルを含んでなる薬剤は、エアロゾルによって送達されうる（例えば、肺の線維状態への送達用に）。
【００７５】
薬剤の賦形剤は患者によって耐容性良好であり、創傷または線維症の部位へのコラーゲンポリマーの放出を可能にするものであるべきことが理解されるであろう。賦形剤は理想としては無菌性であり、付形剤および／または安定剤のほか、薬剤を形成する分子と混合されうる。かかる賦形剤は、好ましくは、生体分解性、生体溶解性、生体吸収性、および／または非炎症性である。
【００７６】
薬剤は多くのやり方で使用されうる。したがって、例えば、患者の創傷において、かつ／またはその周りで適用され、創傷治癒の所望の促進を提供しうる。組成物が「既存の」創傷に適用される場合は、薬剤的に許容される賦形剤は、炎症反応を引き起こすことがなく、または組織に対して毒性であるように十分に「マイルド」となる。明らかに、ＳＬＰＩ分子を含有する修飾コラーゲンの包含は炎症反応の削減を補助するであろう。
【００７７】
本発明の第３または第４の態様による分子は、創傷または線維症部位をカバーし、またはパックするために使用されうる滅菌包帯またはパッチで提供されうる。
【００７８】
薬剤は、より良く放出されうる移植可能なデバイスとして提供されうる。例えば、薬剤はデバイスの生体溶解または分解によって放出されうる。あるいは、超音波など外的刺激がプロコラーゲン、コラーゲンモノマー、またはコラーゲンポリマーの放出を引き起こしうる。
【００７９】
予防的に本発明に基づく薬剤を使用することも可能である。例えば、薬剤はその後に形成される外科創傷の治癒の調節を提供するために手術前に適用されうる。
【００８０】
次いで、コラーゲンマトリクスは、半固体ゲルの形態で対象に（例えば、皮膚、軟骨、筋、または神経組織に）投与されうる。あるいは、創傷包帯、移植可能なデバイス、人工皮膚、または組織等の形成において使用されうる、より固体のマトリクスが形成されうる。
【００８１】
本発明の第５の態様によるマトリクスを含んでなる人工皮膚は、ＥＣＭ成分のみを含んで成り、またはさらに線維芽細胞および／または内皮細胞など培養細胞を含んで成りうる。かかる細胞を含有する人工皮膚は、「生きている」代替皮膚製品として周知である。
【００８２】
コラーゲンマトリクスは、皮膚創傷または火傷への局所適用のために人工皮膚へ形成されることが好ましい。本発明の第５の態様によるマトリクスを含んでなる人工皮膚は、重度の創傷、広範囲の創傷、慢性創傷（例えば、皮膚潰瘍）および火傷を治療するために特に有用である。
【００８３】
マトリクスは、薬剤的に許容される賦形剤中に水和されるべきであることが理解されるであろう。賦形剤は、炎症反応を引き起こすことがなく、または治療される組織に対して毒性であるように十分に無菌で「マイルド」となる。
【００８４】
マトリクスは、創傷または線維症部位をカバーし、またはパックするために使用されうる滅菌包帯またはパッチへ組込まれうる。
【００８５】
好ましい実施形態においては、マトリクスは、コンビダーマ（Ｃｏｍｂｉｄｅｒｍ）Ｎ包帯などの包帯に適用され、次いで脱水される。包帯で実行される脱水ゲルは、次いで創傷に適用される。
【００８６】
マトリクスは移植可能デバイスとして提供されうるが、そこからマトリクスはそれ自体が創傷部位へ放出されうる。放出はデバイスの生体溶解または分解によって引き起こされうる。あるいは、超音波などの外的刺激がコラーゲンポリマー放出を引き起こしうる。
【００８７】
本発明の第５の態様によるコラーゲンマトリクスは、シートへ成型されうる。好ましいシートは厚さ１−数ミリメートル×１平方センチメートルでありうる。かかるシートは無細胞であり、または人工皮膚、軟骨、骨または角膜を生成する間葉および／または線維芽細胞、または心血管パッチを生成する内皮細胞で密集されうる。細胞は患者または組織適合ドナー、患者またはドナーの幹細胞、または培養で増幅された細胞から入手されうる。かかるマトリクスは、本発明の第３および第４の態様による分子で被覆され、ケラチン生成細胞結合機能またはエラスターゼ阻害をマトリクスに与えることができる。コラーゲンマトリクスまたはコラーゲン細胞構成物は、無細胞条件下、および生理的温度下、または極低温条件下に必要とされるまで保存されうる。
【００８８】
治癒および線維症を調節するために必要とされる分子の量は、その生物活性およびバイオアベイラビリティなどの因子の数によって決まり、次に投与方法、および使用される特定の分子の物理化学特性によって決まることが理解されるであろう。例えば、必要とされるコラーゲンマトリクスの量は、ゲルの濃度（これは、水性、粘性、または比較的固体であることが―臨床的必要に応じて―必要とされうる）、その中に含まれる新しい機能的部分を有するコラーゲンの割合などの因子によって決まる。他の因子としては、
Ａ）治療される特定の状態。
Ｂ）状態の重度。
Ｃ）対象の年齢。
Ｄ）送達の部位。
Ｅ）治療される対象における分子の半減期。
が挙げられる。
【００８９】
投与の頻度は、上記の因子、および特に治療される対象内の化合物またはマトリクスの半減期によっても影響されるであろう。
【００９０】
一般に、治療される対象は、それが創傷の７日以内、好ましくは創傷の４８時間以内、より好ましくは創傷の２４時間以内、さらに好ましくは創傷の１２時間以内に投与される場合は、修飾プロコラーゲン、コラーゲンモノマー、またはコラーゲンポリマーの適用から利点を得るであろう。薬剤は、医師の指示により線維症状に罹患した対象に投与されるべきである。これは診断が行われ次第でありうる。治療は創傷が治癒し、または線維障害が消失し、医師が満足するまで継続しなくてはならない。
【００９１】
予防薬として（例えば、手術前に）使用される場合、薬剤は、創傷が発生し、または線維障害が発症しうることが認識され次第、投与されなければならない。例えば、本発明の第４の態様によるコラーゲンポリマーを含有するクリームまたは軟膏は、選択的手術が実行され、かつ創傷治癒の速度増大がその後に望まれる対象の皮膚上の部位に適用されうる。この場合、薬剤は対象の術前準備中に適用され、または（対象の健康状態や年齢、および形成される創傷のサイズによって）手術の数時間前または数日前に適用することが望ましい場合もある。
【００９２】
投与の頻度は、使用される分子の生物学的半減期によって決まる。通常、クリームまたは軟膏は、創傷部位での分子の濃度が治療効果を有するために適したレベルで維持されるように標的組織に適用されなければならない。これには毎日またはさらに１日数回の投与が必要とされうる。
【００９３】
製薬工業によって従来使用されるものなどの既知の手順（例えば、インビボ実験、臨床試験等）を使用し、組成物の特定の処方および正確な治療計画（化合物の１日量および投与の頻度など）を確立することができる。
【００９４】
一般に、本発明に基づく使用には、１ｎｇ〜１０ｍｇの量のコラーゲンポリマー、より好ましくは、１μｇ〜１ｍｇの量のコラーゲンポリマーを含有する薬剤が、１センチメートル当りの線状損傷に適用されうる。単に一例として、約１０μｇのコラーゲンポリマーを含有する薬剤が、１ｃｍの線状切開創傷への適用に適切である。急性創傷と比べ慢性創傷の治癒を刺激するには高用量が必要とされる。
【００９５】
薬剤の有効性、および特に慢性創傷への適用に調製された薬剤の有効性は、プロテアーゼ阻害剤（例えば、ガラドリン（ｇａｌａｄｒｉｎ））と組合されると、有効性を増強させた。プロテアーゼ阻害剤は、創傷、特に慢性創傷において高レベルで確認されうるプロテアーゼによってコラーゲンの分解を阻止し、または遅延させる。プロテアーゼ阻害剤は、好ましくは、広域プロテアーゼ阻害剤である。
【００９６】
本発明の第３、第４、および第５の態様による分子およびマトリクスが、他の創傷治癒または抗線維剤と組合わせて使用され、またはその後に別の薬剤が（例えば、瘢痕の予防のために）使用されることが理解されるであろう。
【００９７】
本発明の第５の態様によるマトリクス（病状の治療、化粧またはその他に使用される）が生体内原位置（すなわち、マトリクスが必要とされる組織／部位）で形成されうることが理解されるであろう。例えば、本発明の第４の態様によるコラーゲンポリマーの溶液またはスラリーを使用し、創傷包帯を十分に湿らせることができる。ゲル形成は、包帯が使用される場合に誘発されうる（例えば、包帯がそのパッケージから取出され、または創傷部位に接触すると反応が開始されうる）。あるいは、本発明の第４の態様によるコラーゲンポリマーの溶液、またはさらに本発明の第３の態様によるプロコラーゲンが標的体組織に注入され、天然コラーゲンでマトリクス形成が進行させられうる。
【００９８】
本発明の第２の態様によるＤＮＡ分子は、遺伝子治療技術において使用されうる。したがって、本発明の第９の態様によれば、遺伝子治療技術に使用される送達システムが提供され、前記送達システムは、創傷部位または線維症の部位で本発明の第１の態様による修飾プロ−α鎖の発現をもたらすように転写されることが可能である本発明の第２の態様によるＤＮＡ分子を含んでなる。
【００９９】
本発明の第１０の態様によれば、創傷または線維障害を治療するための薬剤の使用において使用される前記パラグラフで規定された送達システムの使用が提供される。
【０１００】
本発明の第１１の態様によれば、上記規定の送達システムの治療量を治療を必要とする患者に投与するステップから成る創傷または線維症状を治療する方法が提供される。
【０１０１】
送達システムは、本発明の第３の態様によるプロコラーゲン分子、または本発明の第４の態様によるコラーゲンポリマーの持続レベルを、大部分の従来の送達システムで可能であるよりも長期間にわたって創傷部位または線維症の部位で達成するためにきわめて適切である。修飾プロ−α鎖は、本発明の第２の態様のＤＮＡ分子で変換されている部位での細胞から継続的に発現されうる。したがって、修飾プロコラーゲンまたはコラーゲンポリマーがインビボ薬剤としてきわめて短い半減期を有している場合でも、治療量は治療組織から継続的に発現されうる。
【０１０２】
さらに、本発明の送達システムを使用し、創傷または線維症の部位と接触する軟膏またはクリームにおいて必要とされるものなど従来の医薬賦形剤を使用する必要なしにＤＮＡ分子を提供することができる。これは、創傷治癒に使用される化合物のための十分な賦形剤（非炎症性、生体適合性、生体吸収性であることが必要とされ、活性剤を（貯蔵時または使用時に）分解または不活性化してはならない）を提供することが困難である場合が多いため特に有利である。
【０１０３】
送達システムは、ＤＮＡ分子が（送達システムが患者に投与されると）発現され、プロコラーゲン、および修飾Ｎ−末端を有するコラーゲンポリマーを形成する修飾プロ−α鎖を生成することが可能であるようになっている。次いで、これらの修飾Ｎ−末端は細胞または生物学的活性剤と創傷または線維症の部位で相互作用し、それによって状態を治療する。
【０１０４】
ＤＮＡ分子は、適切なベクター内に含有され、組換えベクターを形成することができる。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、またはファージでありうる。かかる組換えベクターは、ＤＮＡ分子による形質転換細胞のための本発明の送達システムにおいてきわめて有用である。ベクターはｐＣＥＰ４または類似のベクターでありうる。
【０１０５】
組換えベクターは、他の機能的要素も含みうる。例えば、組換えベクターは、ベクターが自動的に細胞の核で複製するようにデザインされうる。この場合、ＤＮＡ複製を含む要素が組換えベクターにおいて必要とされうる。あるいは、組換えベクターは、ベクターおよび組換えＤＮＡ分子が細胞のゲノムへ一体化するようにデザインされうる。この場合、標的一体化（例えば、相同的組換えによる）に有利であるＤＮＡ配列が望ましい。組換えベクターは、クローニング方法における選択的マーカーとして使用されうる遺伝子をコードするＤＮＡも有しうる。
【０１０６】
組換えベクターはさらに必要に応じて遺伝子の発現を制御するプロモーターまたはレギュレーターも含んで成りうる。
【０１０７】
ＤＮＡ分子は（ただし必ずしもそうではないが）、治療される対象の細胞のＤＮＡへ組込まれることになるものでありうる。未分化細胞は安定して変換され、遺伝学的に修飾された娘細胞をもたらしうる（この場合、対象における発現の調節が、例えば、特定の転写因子または遺伝子活性剤により必要とされうる）。あるいは、送達システムは、治療される対象における分化細胞の不安定または一過性の変換に有利であるようにデザインされうる。この場合には、発現の調節は、変換細胞が死滅し、またはタンパク質の発現を停止するとＤＮＡ分子の発現が停止するため（理想としては、創傷、線維症、または瘢痕が治療され、または予防される場合）重要でないとみられる。
【０１０８】
送達システムは、ＤＮＡ分子をベクターへ組込まれることなしに対象に提供しうる。例えば、ＤＮＡ分子は、リポソームまたはウイルス粒子内に組込まれうる。あるいは、「裸の」ＤＮＡ分子は、適切な手段、例えば、直接エンドサイトーシス摂取によって対象の細胞へ挿入されうる。
【０１０９】
ＤＮＡ分子は、トランスフェクション、感染、マイクロインジェクション、細胞融合、原生質体融合、または弾道衝撃によって治療される患者の細胞に転移されうる。例えば、転移は、被覆金粒子、ＤＮＡ分子を含有するリポソーム、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス）、およびプラスミドＤＮＡを創傷範囲に直接、局所適用によって、または注射によって直接ＤＮＡ摂取を提供する手段（例えば、エンドサイトーシス）による弾道トランスフェクションによるものでありうる。
【０１１０】
上記の考慮事項は主にヒトの損傷に適用されるが、創傷治癒は他の動物（特に家畜および飼いならされた動物、例えば、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ等）においても問題となりうる。例えば、腹部創傷または付着は、ウマを安楽死させなければならない主な理由である。上記の薬剤および送達システムは、かかる動物の治療における使用にも適切である。
【０１１１】
次に、以下の非限定的な実施例および図面を参考にして本発明をさらに説明する。
図１  天然プロコラーゲン分子を示す概略図である。
図２  本発明の第３の態様によるプロコラーゲン分子であるｌａｍ−プロコラーゲンを示す概略図である。
図３  実施例１からの本発明の第２の態様によるＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を示す図である。
図４  実施例１からの本発明の第１の態様による修飾プロ−α鎖のアミノ酸配列を示す図である。
図５  実施例１および２に記載されたウェスタンブロットを示す写真である。
図６  実施例２からの本発明の第２の態様によるＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を示す図である。
図７  実施例２からの本発明の第１の態様による修飾プロ−α鎖のアミノ酸配列を示す図である。
図８  実施例３からの本発明の第２の態様によるＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を示す図である。
図９  実施例３からの本発明の第１の態様による修飾プロ−α鎖のアミノ酸配列を示す図である。
図１０  実施例３に記載されているウェスタンブロットを示す写真である。
【０１１２】
図１は、Ｎ−末端プロペプチド１、アルファらせんドメイン２、およびＣ−末端プロペプチド３を有する天然プロコラーゲンを示す。分子のヒンジ領域（１と２の間）におけるプロコラーゲンＮ−プロテイナーゼ切断部位４も示されている。図２は、Ｎ−プロペプチド１がラミニン５の少なくとも１つの球状結合ドメインによって置換されている本発明の第３の態様によるプロコラーゲン分子であるｌａｍ−プロα１（ＩＩＩ）またはＬａｍ−Ｃｏｌｌ（登録商標）を示す。
【０１１３】
（実施例）
実施例１：本発明の第２の態様によるＤＮＡ分子のデザインおよび構成、本発明の第１の態様により発現された修飾プロ−α鎖のアミノ酸配列、および本発明の第３の態様により調製された修飾プロコラーゲンの発現および特徴
プロα１（ＩＩＩ）鎖のＮ−プロペプチドの球状ドメインの代わりにラミニン５のα３鎖のＧ１、Ｇ２、およびＧ３ドメインの全コード領域を含んでなる本発明の第２の態様によるＤＮＡ分子が構成された。
【０１１４】
ＤＮＡ分子の生成のためのクローニング法は、以下の一次ＰＣＲ反応を伴った。
１．基質：  コラーゲンのプロα１（ＩＩＩ）鎖の完全ｃＤＮＡを含有するｐＲＭＩ（Ｘ１４４２０で公的に入手可能）。
オリゴヌクレオチド：
Ｔ３（５’末端）  ５’ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ  ３’          （配列番号１）
ＳＳＧ１−２０Ｒ
（３’末端）  ５’ＡＣＡＧＡＧＡＴＧＴＴＧＣＣＡＡＡＡＴＡＡＴＡＧＴＧＧＧＡＴＧ  ３’      （配列番号２）
生成物Ａ：３００ｂｐ。
【０１１５】
２．基質：  Ａｓｐ７１８Ｉ部位でクローニングされたα３鎖の遺伝子を含有するＬａｍ５α３−ｐＳＥＣＴＡＧ２Ｃ
オリゴヌクレオチド：
ＳＳＧ１−２０Ｆ（５’末端）
５’ＴＡＴＴＴＴＧＧＣＡＡＣＡＴＣＴＣＴＧＴＣＣＴＴＧＴＴＴＣＴＣ  ３’          （配列番号３）
ＬＧ３−２０Ｒ（３’末端）
５’  ＣＴＴＧＡＣＣＡＴＴＡＧＣＡＴＣＴＴＧＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣ  ３’          （配列番号４）
生成物Ｂ：１８００ｂｐ。
【０１１６】
３．基質：  ｐＲＭ１
オリゴヌクレオチド：
ＬＧ３−２０Ｆ（５’末端）
５’  ＧＣＡＡＧＡＴＧＣＴＡＡＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＣＴＣＡＡＧＧＣ  ３’        （配列番号５）
ＩＩＩ−ＪＬ１１（３’末端）
５’  ＡＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＴ  ３’                    （配列番号６）
生成物Ｃ：７００ｂｐ。
【０１１７】
次いで、以下の二次ＰＣＲ反応を行った。
１）  基質：  Ａ（３００ｂｐ）とＢ（１．８ｋｂ）生成物の混合物
オリゴヌクレオチド：  Ｔ３（５’末端）
ＬＧ３−２０Ｒ（３’末端）
生成物ＡＢ：２．１ｋｂ
２）  基質：  Ｂ（１．８ｋｂ）とＣ（７００ｂｐ）の混合物
オリゴヌクレオチド：  ＳＳＧ１−２０Ｆ（５’末端）
ＩＩＩ−ＪＬ１１（３’末端）
生成物ＢＣ：２．５ｋｂ
【０１１８】
ＡＢおよびＢＣ生成物のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔへのクローニング
生成物ＡＢをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔ１で消化し、次いでやはりＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔ１で消化したｐＢＳへライゲーションし、Ｇ１２３ＡＢ−ｐＢＳプラスミドを生成した。生成物ＢＣをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢＡＭＨ１で消化し、次いでやはりＨｉｎｄＩＩＩおよびＢＡＭＨ１で消化したｐＢＳへライゲーションし、Ｇ１２３ＢＣ−ｐＢＳプラスミドを生成した。
【０１１９】
キメラＬａｍＧ１２３コラーゲン遺伝子の生成
Ｇ１２３ＡＢ−ｐＢＳプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔ１で消化し、１．２７ｋｂ断片をゲル精製した。Ｇ１２３ＢＣ−ｐＢＳプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨ１で消化し、１．３６ｋｂ断片をゲル精製した。ｐＲＭＩプラスミドをＮｏｔ１およびＢａｍＨ１で消化し、６．８ｋｂ断片をゲル精製した。
【０１２０】
３つの断片をいっしょにライゲーションし、ＬａｍＧ１２３コラーゲン融合タンパク質をコードする遺伝子を生成した。ｌａｍＧ１２３コラーゲン遺伝子の正確な集合をＤＮＡシークエンシングによって判定した。
【０１２１】
ＬａｍＧ１２３コラーゲン／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドの修飾
ＮｏｔＩ部位を３’でオリゴヌクレオチドＴＡＳ１４ＮｏｔＡおよびオリゴ３２ｍｅｒＴＡＳ１２ＮｏｔＳを用いて標準のＰＣＲ介在部位特異的突然変異誘発法によってコラーゲン配列に導入したが、その詳細は以下の通りである。すなわち、
ＴＡＳ１４ＮｏｔＡ（アンチセンス）
５’ＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣ  ３’      （配列番号７）
オリゴ３２ｍｅｒＴＡＳ１２ＮｏｔＳ（センス）
５’ＧＴＡＴＴＡＣＡＡＴＴＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣ  ３’        （配列番号８）
オリゴヌクレオチドは、ＮｏｔＩ部位をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ配列内にＫｐｎＩ部位の約５０ｂｐ下流で導入する。
【０１２２】
ｐＣＥＰ４へのサブクローニング
ＬａｍＧ１２３コラーゲン／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドをＮｏｔＩで消化し、６ｋｂ断片を得、これはＮｏｔＩ消化およびホスファターゼ化ｐＣＥＰ４（１０．４ｋｂ）ヘライゲーションされた。ｐＣｅｐ４ベクター（インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は市販されており、配列は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ．で確認されうる。６ｋｂ  ＮｏｔＩ断片のｐＣｅｐ４への正確な配向は、ＤＮＡシークエンシングによって判定された。
【０１２３】
上記で概略されたクローニング法を用いて、Ｎ１００前のプロコラーゲンＩＩＩ型Ｎ−プロペプチド配列を、ラミニン５のα３鎖のＧ１２３ドメインの配列で置換したが、コラーゲンＩＩＩシグナル配列を維持した。ＤＮＡ分子の全ヌクレオチド配列は図３（および配列番号９）に示されている。図４（および配列番号１０）は、ＤＮＡ分子から発現されうる修飾プロ−α鎖（本発明の第１の態様による分子）のアミノ酸配列を示す。ラミニンのＧ１２３とプロコラーゲン配列との間の接合が図３および４の下線で示されている。
【０１２４】
発現ベクターＰＣＥＰ４へサブクローニングされたＤＮＡ分子は、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で発現されている。
【０１２５】
ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞は当業者に周知であり、詳細は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／Ｃｏｎｔｅｎｔ／Ｔｅｃｈ−Ｏｎｌｉｎｅ／ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＿ｂｉｏｌｏｇｙ／ｍａｎｕａｌｓ＿ｐｐｓ／２９３ｅｂｎａ＿ｍａｎ．ｐｄｆから入手可能である。
【０１２６】
ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞はプロコラーゲンを分泌することがなく、したがって、コラーゲンを発現する陰性背景に理想的である。重要なことには、これらの細胞は、プロコラーゲン配列におけるプロリン残基の水酸化に対して、したがって、三重らせんの安定性に対してきわめて重要であるプロリル４−ヒドロキシラーゼを含有する。ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ系はＥＢＮＡ１抗原も発現し、これは細胞へトランスフェクトされたプラスミドＤＮＡが、そのプラスミドの存在が適切な抗生物質（一般にハイグロマイシン）によって選択される場合にエピソームとして維持されることを確実にする。
【０１２７】
本発明の第１の態様による修飾プロ−α鎖は、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞の小胞体において生成される。次いで、これらの分子は自動的にホモ三量体（本発明の第３の態様による修飾プロコラーゲン分子）を形成する。前記細胞から生成される修飾プロコラーゲン分子を以下、ＬａｍＧ１２３−ｃｏｌｌと呼ぶ。
【０１２８】
インテグラ（Ｉｎｔｅｇｒａ）ＣＬ３５０フラスコにＤＮＡ分子で変換したＨＥＫ２９３−ＥＰＮＡ細胞を接種し、７日間放置した。次いで、強化培地を毎週３回収穫した（接種後７、９、１２、１４、および１６日）。
【０１２９】
ＬａｍＧ１２３−ｃｏｌｌは、抗コラーゲン抗体を用いてウェスタンブロット法によって特徴づけられた。結果は添付の図面の図５に示されているが、ここでレーン１はＩＩＩ型プロコラーゲン対照であり、レーン２はトランスフェクトされていない２９３細胞からの媒体を有し、レーン３はＬＧ１２３−ｃｏｌｌでトランスフェクトされた２９３ＥＢＮＡ細胞からの媒体を有し、レーン４はＬａｍＧ３−ｃｏｌｌでトランスフェクトされた２９３ＥＢＮＡ細胞からの媒体を有する（以下の実施例２を参照）。
【０１３０】
実施例２：本発明の第２の態様によるＤＮＡ分子のデザインおよび構成、本発明の第１の態様により発現された修飾プロ−α鎖のアミノ酸配列、および本発明の第３の態様により調製された修飾プロコラーゲンの発現および特徴
プロα１（ＩＩＩ）鎖のＮ−プロペプチドの球状ドメインの代わりにラミニン５のα−３鎖のＧ３ドメインのコード領域を含んでなる本発明の第２の態様によるＤＮＡ分子が構成された。
【０１３１】
ＤＮＡ分子の生成のためのクローニング法は、以下の一次ＰＣＲ反応を伴った。
１．基質：  コラーゲンのプロ−α１（ＩＩＩ）の完全ｃＤＮＡを含有するｐＲＭＩ（Ｘ１４４２０で公的に入手可能）。
オリゴヌクレオチド：
Ｔ３（５’末端）      ５’ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ  ３’
（配列番号１）
ＳＳＬＡＭＧ３−２
（３’末端）
５’ＧＣＴＴＣＣＡＧＴＣＴＴＣＣＧＡＧＣＡＴＧＣＣＡＡＡＡＴＡＡＴＡＧＴＧＧＧ３’
（配列番号１１）
生成物Ａ：３００ｂｐ。
【０１３２】
２．基質：  Ａｓｐ７１８Ｉ部位でクローンニングされたα３鎖の遺伝子を含有するＬａｍ５α３−ｐＳＥＣＴＡＧ２Ｃ
オリゴヌクレオチド：
ＳＬＡＭＧ３−１（５’末端）
５’ＣＣＣＡＣＴＡＴＴＡＴＴＴＴＧＧＣＡＴＧＣＴＣＧＧＡＡＧＡＣＴＧＧＡＡＧＣ  ３’
（配列番号１２）
ＬＧ３−２０Ｒ（３’末端）
５’  ＣＴＴＧＡＣＣＡＴＴＡＧＣＡＴＣＴＴＧＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣ  ３’
（配列番号４）
生成物Ｂ：７００ｂｐ。
【０１３３】
次いで、以下の二次ＰＣＲ反応を行った。
１）  基質：  Ａ（３００ｂｐ）とＢ（７００ｂｐ）生成物の混合物
オリゴヌクレオチド：  Ｔ３（５’末端）
ＬＧ３−２０Ｒ（３’末端）
生成物ＡＢ：１．０ｋｂ
【０１３４】
ＡＢ生成物のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔへのクローニング
生成物ＡＢをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔ１で消化し、次いでやはりＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔ１で消化したｐＢＳへライゲーションし、Ｇ３ＡＢ−ｐＢＳプラスミドを生成した。
【０１３５】
キメラＬａｍＧ−コラーゲン遺伝子の生成
Ｇ３ＡＢ−ｐＢＳプラスミドをＮｏｔ１およびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、２００ｂｐ断片をゲル精製した。Ｇ３ＡＢ−ｐＢＳプラスミドをＢａｍＨ１およびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、１．３６ｋｂ断片をゲル精製した。ｐＲＭＩプラスミドをＮｏｔ１およびＢａｍＨ１で消化し、６．８ｋｂ断片をゲル精製した。
【０１３６】
３つの断片をいっしょにライゲーションし、ＬａｍＧ３−コラーゲン融合タンパク質をコードする遺伝子を生成した。ｌａｍＧ３−コラーゲン遺伝子の正確な集合をＤＮＡシークエンシングによって判定した。
【０１３７】
ＬａｍＧ３−コラーゲン／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドの修飾
ＮｏｔＩ部位を３’でオリゴヌクレオチドＴＡＳ１４ＮｏｔＡおよびオリゴ３２ｍｅｒＴＡＳ１２ＮｏｔＳを用いて標準のＰＣＲ介在部位特異的突然変異誘発法によってコラーゲン配列に導入した（上記の実施例１を参照）。
【０１３８】
オリゴヌクレオチドは、ＮｏｔＩ部位をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ配列内にＫｐｎＩ部位の約５０ｂｐ下流で導入する。
【０１３９】
ｐＣＥＰ４へのサブクローニング
ＬａｍＧ３−コラーゲン／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドをＮｏｔＩで消化し、５ｋｂ断片を得、これはＮｏｔＩ消化およびホスファターゼ化ｐＣＥＰ４（１０．４ｋｂ）ヘライゲーションされた。５ｋｂ  ＮｏｔＩ断片のｐＣｅｐ４への正確な配向は、ＤＮＡシークエンシングによって判定された。
【０１４０】
上記で概略されたクローニング法を用いて、Ｎ１００前のプロコラーゲンＩＩＩ型Ｎ−プロペプチド配列を、ラミニン５のα３鎖のＧ３ドメインの配列で置換したが、コラーゲンＩＩＩシグナル配列を維持した。ＤＮＡ分子の全ヌクレオチド配列は図６（および配列番号１３）に示されている。図７（および配列番号１４）は、ＤＮＡ分子から発現されうる修飾プロ−α鎖（本発明の第１の態様による分子）のアミノ酸配列を示す。ラミニンのＧ３とプロコラーゲン配列との間の接合が図６および７の下線で示されている。
【０１４１】
発現ベクターＰＣＥＰ４へサブクローニングされたＤＮＡ分子は、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で発現されている。
【０１４２】
本発明の第１の態様による修飾プロ−α鎖は、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞の小胞体において生成される。次いで、これらの分子は自動的にホモ三量体（本発明の第３の態様による修飾プロコラーゲン分子）を形成する。前記細胞から生成される修飾プロコラーゲン分子を以下、ＬａｍＧ３−ｃｏｌｌと呼ぶ。
【０１４３】
インテグラ（Ｉｎｔｅｇｒａ）ＣＬ３５０フラスコに本実施例からのＤＮＡ分子で変換したＨＥＫ２９３−ＥＰＮＡ細胞を接種し、７日間放置した。次いで、強化培地を毎週３回収穫した（接種後７、９、１２、１４、および１６日）。
【０１４４】
ＬａｍＧ３−ｃｏｌｌは、抗コラーゲン抗体を用いてウェスタンブロット法によって特徴づけられた。結果は添付の図面の図５に示されているが、ここでレーン４はＬａｍＧ３−ｃｏｌｌでトランスフェクトされた２９３ＥＢＮＡ細胞からの媒体を有する。
【０１４５】
実施例３：  本発明の第２の態様によるＤＮＡ分子のデザインおよび構成、本発明の第１の態様により発現された修飾プロ−α鎖のアミノ酸配列、および本発明の第３の態様により調製された修飾プロコラーゲンの発現および特徴
プロα１（ＩＩＩ）鎖のＮ−プロペプチドの球状ドメインの代わりに分泌白血球プロテアーゼ阻害剤前駆体（「ＳＬＰＩ」）の全コード領域を含んでなる本発明の第２の態様によるＤＮＡ分子が構成された。「ＳＬＰＩ−コラーゲン」（またはｓｌｐｉ−ｃｏｌｌ）は、ポリメラーゼ連鎖反応、制限消化、およびライゲーションを含む、ＳＬＰＩＣコラーゲンＩＩＩ／ｐＣＥＰ４構成物を構成することによって生成された。
【０１４６】
ポリメラーゼ連鎖反応
プラチナ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ）（登録商標）Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（インビオロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、英国（Ｕ．Ｋ．））、メーカーによって推奨された対応する処方および循環プログラムをＳＬＰＩ−コラーゲンのクローニングにおいて実行されたすべてのＰＣＲのために使用した。ＳＬＰＩ−コラーゲンＩＩＩ／ｐＣＥＰ４構成物の集合に３回のＰＣＲを必要とした。
【０１４７】
第１回目では、ヒトＳＬＰＩをコードする配列をイメージクローン４７３３９９６（英国（ＵＫ）ヒューマン・ゲノム・マッピング・プロジェクト・リソース・センター（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ）、英国（Ｕ．Ｋ．））から増幅させた。以下のプライマーをＰＣＲにおいて使用した。すなわち、
【化１】
2007527204.tif 000002
【０１４８】
プライマーは結果として、上記の配列においてボールド体の大文字で示される５’末端でＮｏｔＩ制限部位（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）を含有するＳＬＰＩ  ＰＣＲ産物をもたらし、その３’末端で、上記の配列においてイタリック体の小文字で示される、ヒトＩＩＩ型コラーゲンの５’末端をコードする１０個の塩基対が存在した。アニーリング温度は４８℃であった。ＰＣＲ産物は、０．４２キロ塩基対（ｋｂｐ）のサイズを有することが予想された。次いで、これは、キアゲンゲル抽出キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、英国（Ｕ．Ｋ．））を用いてゲル精製された。
【０１４９】
第２回目のＰＣＲでは、ヒトＩＩＩ型コラーゲンをコードする配列の一部を以下のプライマーを用いる構成物ｐＲＭＩから増幅させた。すなわち、
【化２】
2007527204.tif 000003
【０１５０】
イタリック体の小文字は、ＳＬＰＩをコードするヌクレオチドを示す。アニーリング温度は５０℃であった。ｐＲＭＩは、ヒトＩＩＩ型コラーゲン挿入を有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）ベクターである。その結果、ＰＣＲ産物の５’末端は、ＳＬＰＩの３’末端をコードする１０個の塩基対を有した。コラーゲンＩＩＩ  ＰＣＲ産物の予想サイズは１．６０３ｋｂｐであった。次いで、これは、キアゲンゲル抽出キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いてゲル精製された。
【０１５１】
第３回目のＰＣＲでは、ＳＬＰＩ−コラーゲンＩＩＩ断片を精製ＳＬＰＩおよびコラーゲンＩＩＩ  ＰＣＲ産物から増幅させた。以下のプライマーを用いた。すなわち、
【化３】
2007527204.tif 000004
【０１５２】
結果として生じるＰＣＲ産物は、２．０２３ｋｂｐのサイズを有することが予想された。これはＮｏｔＩおよびＸｍａＩ制限部位も含んだ。次いで、これは、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ゲル抽出キットによってゲル精製された。
【０１５３】
制限、消化、およびライゲーション
精製ＳＬＰＩ−コラーゲンＩＩＩＰＣＲ産物を制限酵素（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）、英国（Ｕ．Ｋ．））ＮｏｔＩおよびＸｍａＩで消化すると同時に、ベクターｐＲＭＩをＮｏｔＩおよびＥｃｏＲ  Ｖで消化した後、ＸｍａＩで消化した。次いで、消化物をキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ゲル抽出キットによってゲル精製し、これはその後にアルカリホスファターゼでベクター消化物を脱リン酸化した。挿入および脱リン酸化ベクターの収量を評価するとともに、高濃度のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングランズ・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄｓ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、英国（Ｕ．Ｋ．））を用いて、ライゲーション反応をメーカーの指示に従い設定した。
【０１５４】
形質転換およびコロニースクリーニング
ライゲーション反応物５μｌを化学的コンピテントＤＨ５α細胞へ形質転換した。各コロニーからのＤＮＡをキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ミニプレップキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））によって抽出した。陽性クローンをＸｈｏＩによる制限消化によって区別し、アガロースゲル上で正しいサイズ（１．９３６、２．５２０、４．６８０ｋｂｐ）の断片を得た。
【０１５５】
ＰＣＲ産物のシークエンシング
陽性クローンが同定されると、シークエンシング反応を行い、ポリメラーゼによるＰＣＲ産物への導入に誤りがないことを確実にした。シークエンシング反応において使用されたプライマーが以下に示されている。すなわち、
ＳＫ−Ｔ７  ５’−ｇｔａ  ａｔａ  ｃｇａ  ｃｔｃ  ａｃｔ  ａｔａ  ｇｇｇ  ｃ−３’      （配列番号１９）
Ｃ３Ｆｏｒ１  ５’−ｇｃｔ  ｇｔｔ  ｇａａ  ｇｇａ  ｇｇａ  ｔｇｔ−３’          （配列番号２０）
Ｃ３Ｆｏｒ２  ５’−ａｇａ  ｇｇｃ  ｔｔｃ  ｇａｔ  ｇｇａ  ｃｇａ３’          （配列番号２１）
Ｃ３Ｆｏｒ３  ５’ｇｇａ  ｃｔｇ  ｃｇａ  ｇｇｔ  ｇｇｔ  ｇｃａ３’            （配列番号２２）
Ｃ３Ｒｅｖ１  ５’−ｔｔｃ  ｔｃｃ  ｃａｇ  ｇａａ  ｔａｃ  ｃａｇ−３’          （配列番号２３）
Ｃ３Ｒｅｖ２  ５’−ａｇｇ  ｇａａ  ｔｃｃ  ｇｇｃ  ａｇｔ  ｔｃｃ−３’          （配列番号２４）
Ｃ３Ｒｅｖ３  ５’−ｃｔｃ  ｇｇｇ  ｇａｃ  ｃａｇ  ａｔｇ  ｇｃｃ−３’          （配列番号２５）
【０１５６】
ＳＬＰＩ−コラーゲンＩＩＩ  ＰＣＲ産物のｐＣＥＰ４へのサブクローニング
ＳＬＰＩ−コラーゲンＩＩＩをｐＣＥＰ４へサブクローニングするために、ＳＬＰＩ−コラーゲンＩＩＩ／ＳＫ（＋）をＮｏｔＩで消化した。この後、末端をクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））で充填し、ＨｉｎｄＩＩＩで制限消化した。ＮｏｔＩをＫｐｎＩで置換したことを除き、ベクターｐＣＥＰ４で同じ手順を行った。次いで、挿入およびベクターをキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ゲル抽出キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いてゲル精製した。自己ライゲーションを阻止するために、ベクターもアルカリホスファターゼ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））で脱リン酸化した。
【０１５７】
高濃度のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いるライゲーション反応を、挿入およびベクターの収量を評価した後に設定した。次いで、化学的コンピテントＤＨ５α細胞を構成物で形質転換した。各コロニーからのＤＮＡをキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ミニプレップキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））によって抽出した。ＸｈｏＩによる消化とともに、陽性クローンが得られたＤＮＡ断片のサイズ（１．９２４、２．５２０、および１１．４８０ｋｂｐ）によって示された。
【０１５８】
上記で概略されたクローニング法を用いて、プロコラーゲンＩＩＩ型Ｎ−プロペプチド配列をＳＬＰＩの配列で置換したが、コラーゲンＩＩＩシグナル配列を維持した。ＤＮＡ分子の全ヌクレオチド配列は図８（および配列番号２６）に示されている。図９（および配列番号２７）は、ＤＮＡ分子から発現されうる修飾プロ−α鎖（本発明の第１の態様による分子）のアミノ酸配列を示す。図８および９における下線を引いた部分は、それぞれ、ＳＬＰＩのＤＮＡおよびアミノ酸配列と関連しているが、下線を引いていない部分は、フォン・ヴィレブランド（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子を発端とするヒトプロコラーゲンＩＩＩのＤＮＡおよびアミノ酸配列と関連している。
【０１５９】
ｐＣＥＰ４ベクターへクローニングされたＤＮＡ分子はＨＥＫ２９３  Ｅｂｎａ細胞で発現される（図１０を参照）。ｓｌｐｉ−ｃｏｌのバンドは、抗ｓｌｐｉ抗体へブロッティンッグされたウェスタンにおける単一バンドである。
【０１６０】
上記の実施例は、ラミニンまたはＳＬＰＩ分子の一部または全部を含有する修飾コラーゲンが生成されうることを示す。これらの修飾ドメインは、特定の所望の機能的特徴をコラーゲンに与え、分子の創傷治癒特性を増強することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】天然プロコラーゲン分子を示す概略図である。
【図２】本発明の第３の態様によるプロコラーゲン分子であるｌａｍ−プロコラーゲンを示す概略図である。
【図３】実施例１からの本発明の第２の態様によるＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を示す図である。
【図４】実施例１からの本発明の第１の態様による修飾プロ−α鎖のアミノ酸配列を示す図である。
【図５】実施例１および２に記載されたウェスタンブロットを示す写真である。
【図６】実施例２からの本発明の第２の態様によるＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を示す図である。
【図７】実施例２からの本発明の第１の態様による修飾プロ−α鎖のアミノ酸配列を示す図である。
【図８】実施例３からの本発明の第２の態様によるＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を示す図である。
【図９】実施例３からの本発明の第１の態様による修飾プロ−α鎖のアミノ酸配列を示す図である。
【図１０】実施例３に記載されているウェスタンブロットを示す写真である。
【図１】
2007527204.tif 000005
【図２】
2007527204.tif 000006
【図３】
2007527204.tif 000007
2007527204.tif 000008
【図４】
2007527204.tif 000009
2007527204.tif 000010
【図５】
2007527204.tif 000011
【図６】
2007527204.tif 000012
2007527204.tif 000013
【図７】
2007527204.tif 000014
【図８】
2007527204.tif 000015
2007527204.tif 000016
2007527204.tif 000017
【図９】
2007527204.tif 000018
2007527204.tif 000019
【図１０】
2007527204.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成17年12月21日(2005.12.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007527204000001.app
【国際調査報告】
2007527204.tif 000021
2007527204.tif 000022
2007527204.tif 000023