(57)【要約】  リラキシンレベルの測定をベースとするヒト個体の余命の同定方法を開示する。本発明のある態様では、ヒト個体は、末期の腎臓病患者である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト個体の余命を同定する方法であって、
（ａ）該ヒト個体のリラキシンレベルを測定すること、
（ｂ）該リラキシンレベルを予め定めたデータと比較すること、および、
（ｃ）該比較に基づいて該ヒト個体の余命を同定すること、
の各段階を含む方法。
【請求項２】
該ヒトの該リラキシンレベルが該ヒト個体から採取したサンプルから測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該ヒト個体がＥＳＫＤ患者である、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
該余命が心血管疾患により影響を受けている、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
該ヒト個体が男性のヒト個体である、請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
該予め定めたデータが、排他的に男性または女性の個体群から過去に取得したものである、請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
該比較が、該リラキシンレベルの、該予め定めたデータに関する受診者動作コマンド（receiver operating command）（ＲＯＣ）曲線から判定したカットオフ値との比較である、請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
リラキシンレベルが、全血、血清、血漿および／または尿で測定される、請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
リラキシンレベルが、
（ａ）免疫アッセイ、
（ｂ）均質（homogeneous）免疫アッセイ、
（ｃ）不均質（heterogeneous）免疫アッセイ、
（ｄ）競合的免疫アッセイ、
（ｅ）サンドイッチ免疫アッセイ、および／または
（ｆ）質量分析
により測定される、請求項１ないし請求項８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
リラキシン阻害剤を含む医薬組成物を投与することにより、ヒト個体の余命を延長する方法。
【請求項１１】
該個体がＥＳＫＤ患者である、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
背景
約７５年前、妊娠中のウサギに由来する血清の注射が、メスのモルモットの恥骨間靱帯の弛緩を誘導することが示された（１）。この作用を担うホルモンは、リラキシンと名付けられた。リラキシンは、インシュリン様成長因子ファミリーに相同な約６ｋＤのペプチドホルモンである（１）。黄体、脱落膜および胎盤は、妊娠中にこのホルモンを分泌する。リラキシンが、妊娠において、結合組織の軟化効果、子宮収縮の低減および乳腺の発達および分化の制御を含む、多くの重要な役割を有することが示された（１）。
【０００２】
しかしながら、最近、リラキシンが心血管系においても必須の役割を有することが認識された。慢性心不全の患者では、心筋のリラキシン遺伝子発現が増加し、血漿リラキシン濃度が上昇している（２）。
【０００３】
リラキシンが、単離された灌流ラット心臓からの心房性ナトリウム利尿ペプチドの分泌を刺激すること（３）、およびまた、一酸化窒素に媒介されるメカニズムを介して冠血管血流の用量依存的増加を引き起こすこと（４）が、さらに知られている。
【０００４】
ＥＳＫＤ患者では余命（life expectancy）が実質的に減少していることが、さらに知られている。死亡率は、ＥＳＫＤのない同年齢のヒトと比較して約５０％高い。このことは、主に、心血管疾患に起因する（８、９）。
【０００５】
リラキシンが細い全身的抵抗動脈（small systemic resistance arteries）の強力な血管拡張剤であることがさらに知られている（５）。血管および心臓に対するその直接的効果に加えて、リラキシンは、心臓（６）および腎臓（７）のコラーゲン合成の調節にも関与する。
【０００６】
最近、心臓のトロポニンＴが、末期の腎臓病（ＥＳＫＤ）の患者の死亡率を予測することが判明した（１１）。ＥＳＫＤ患者の余命の短縮を予測する他の以前から知られているリスク因子は、高齢、透析期間、糖尿病、Ｃ反応性タンパク質（ＣｒＰ）レベルの上昇、高いコレステロールレベルおよび低いアルブミンレベルである（表１および２参照）。
【０００７】
例えば心血管疾患に起因する、余命の短縮のそのような指標についての知識は、そのような状況から発生するリスクを低減するために、用心深い測定を行い、特化した処置を開始することを可能にする。
【０００８】
患者の余命の短縮を測定または定量するための代替的かつ独立した尺度は、そのような新規尺度がそれだけでは他の以前から知られている尺度より良好または厳密ではない場合でさえ、有用である。これは、主として、患者の余命の短縮を判定または定量する独立した尺度は、いずれにしても分析全体の精度を高めるのを助けるであろうという理由による。即ち、新規尺度についての情報および以前から知られている尺度についての情報を組み合わせて分析および考察する場合である。
【０００９】
本発明の説明
上述の当分野の現状から出発して、本発明の解決すべき課題は、ヒト個体の余命の短縮を同定（characterise）（または定量）するための代替的かつ独立した尺度の提供である。
本発明は、リラキシン（例えば、リラキシン濃度の上昇）をヒト個体の余命を同定するための独立した尺度として同定することにより、この課題を解決する。
【００１０】
長期血液透析の患者２４５人を、全原因による死亡率および心血管性の死亡率について、７７５日間追跡した。リラキシン、ＣｒＰ、トロポニンＴおよびアルブミンの分析のための血液サンプルは、研究参加時に採取した。カプラン・マイヤー（Kaplan Meier）法およびコックス（Cox）回帰解析により生存を比較した。リラキシン分泌の性別依存性のために、女性および男性のＥＳＫＤ患者で別々に死亡率を分析した。７３人の患者が観察期間中に死亡し、彼らのうち４１人は、心血管疾患のために死亡した。血清リラキシン濃度の上昇は、男性（相対リスク：２.３７６；９５％信頼区間：１.１６２−４.８５６；ｐ＝０.０１８）および女性（相対リスク：２.４９５；９５％信頼区間：１.０６９−５.８２１；ｐ＝０.０３４）における全事例の死亡率に有意に影響した。死因別の下位集団分析により、リラキシンの上昇は男性ＥＳＫＤ患者（相対リスク：３.１９３；９５％信頼区間：１.１５７−８.８０７；ｐ＝０.０２５）において心血管疾患に関連する死亡のリスク因子であるが、女性のＥＳＫＤ患者（相対リスク：１.７８３；９５％信頼区間：０.４６７−６.８０７；ｐ＝０.３９８）においてはそうではないことが明らかになった。
【００１１】
本発明によると、リラキシンは、慢性的に血液透析を受けているＥＳＫＤの女性および男性の全事例の死亡率を予測する、独立したリスク因子である。心血管性の死亡率に対するリラキシンの影響は、性別依存的である。
【００１２】
本発明の方法は、以下を含む：
１. ヒト個体の余命を同定する方法であって、
（ａ）該ヒト個体のリラキシンレベルを測定すること、
（ｂ）該リラキシンレベルを予め定めたデータと比較すること、および、
（ｃ）該比較に基づいて該ヒト個体の余命を同定すること、
の各段階を含む方法。
【００１３】
２. 該リラキシンレベルが該ヒト個体から採取したサンプルから測定される、１項に記載の方法。
３. 該ヒト個体がＥＳＫＤ患者である、１項または２項のいずれかに記載の方法。
４. 該余命が心血管疾患により影響を受けている、１項ないし３項のいずれかに記載の方法。
５. 該ヒト個体が男性のヒト個体である、１項ないし４項のいずれかに記載の方法。
６. 該予め定めたデータが、排他的に男性または女性の個体群から過去に取得したものである、１項ないし５項のいずれかに記載の方法。
【００１４】
７. 該比較が、該リラキシンレベルの、該予め定めたデータに関する受診者動作コマンド（receiver operating command）（ＲＯＣ）曲線から判定したカットオフ値との比較である、１項ないし６項のいずれかに記載の方法。
８. リラキシンレベルが、全血、血清、血漿および／または尿で測定される、１項ないし７項のいずれかに記載の方法。
【００１５】
９. リラキシンレベルが、
（ａ）免疫アッセイ、
（ｂ）均質（homogeneous）免疫アッセイ、
（ｃ）不均質（heterogeneous）免疫アッセイ、
（ｄ）競合的免疫アッセイ、
（ｅ）サンドイッチ免疫アッセイ、および／または
（ｆ）質量分析
により測定される、１項ないし８項のいずれかに記載の方法。
【００１６】
１０. リラキシン阻害剤を含む医薬組成物を投与することにより、ヒト個体の余命を延長する方法。
１１. 該個体がＥＳＫＤ患者である、１０項に記載の方法。
【００１７】
実施例１：
研究集団およびプロトコール
本研究に参加する２４５人の患者を、ドイツのベルリンにある２つの透析センター（Kuratorium fuer Dialyse und Nierentransplantation e. V., Dialysezentrum, Sonnenallee 47, 12045 Berlin および Kuratorium fuer Dialyse und Nierentransplantation e. V., Dialysezentrum - Moabit, Turmstrasse 20A, 10559 Berlin）から募集した。
【００１８】
彼らは、これらのセンターで安定して血液透析を受けている、その時点で重篤な健康上の問題のない全ての患者を代表する。全患者を２０００年３月に研究に含めた。彼らは、週に３回透析を、一回の透析につき４−５時間受ける、定期的な血液透析を受けた。
【００１９】
患者の次の特徴を文書で記録した：年齢、性別、肥満度指数、末期の腎臓病の原因、透析期間、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患（心筋梗塞、心臓カテーテル法により確認される冠動脈心疾患または典型的安定狭心症の罹患歴のある患者）。死亡時点および死因を文書で記録した。我々の部門の職員からの医師が、透析ユニットおよび我々の病院の両方で、唯一の入院患者介護者である。従って、全研究について完全な追跡を行った。患者を７７５日間追跡した。我々は、全ての死亡を個別に評価し、記録を精査した。できるだけ多数の事例で、死体解剖を行った。血液サンプル採取は、研究参加時に実施した。血液サンプルを血液透析開始前に採取し、後に分析するまで（下記参照）−８０℃で保存した。研究は、Humboldt University of Berlin 医学部の倫理委員会により承認された。患者のインフォームドコンセントを各事例で得た。
【００２０】
実験方法
アルブミンおよびクレアチニンを標準化した方法により自動分析装置（各々、Hitachi 747, Hitachi 911 and STA, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany より）で測定した。Ｃ反応性タンパク質を標準化した方法により自動分析装置（Dimenson RxL (DAD, Behring Vertriebs GmbH, Schwalbach, Germany）で測定した。トロポニンＴを Elecsys System 2010 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を用いて測定した。全ての測定されたパラメーターは、品質制御管理にかけられ、the German Society of Clinical Chemistry のガイドラインに従って認証される。血清リラキシン濃度を、最近記載された（２）通りに市販のＥＬＩＳＡ（Immundiagostik GmbH, Bensheim, Germany）を使用して分析した。
【００２１】
統計
全ての連続的パラメーターが死亡と生存との間を弁別する能力を、受診者動作コマンド（ＲＯＣ）曲線下の面積を使用して判定し、最良のカットオフ値を算出した（１０）。リラキシンは性別依存的に分泌されるので（１）、リラキシンのカットオフ値は、女性と男性で別々にも算出した。生存をカプラン・マイヤー法により比較した。起こりえる混同を制御するために、我々は、全研究集団について、並びに、女性および男性について、演繹的にリラキシンおよび終点の死亡に影響を有すると知られている要因（年齢、透析期間、糖尿病、トロポニンＴ、ＣｒＰ、アルブミンおよびコレステロール）を含むコックス回帰分析を行った。
【００２２】
結果
血液透析の開始の必要性を導く、根底にある腎疾患は、次の通りである：２４５人（１２２人の女性、１２３人の男性）の患者のうち、６５人は、糖尿病性腎症を有し、３８人の患者は、高血圧性腎硬化症を有し、３０人の患者は、慢性糸球体腎炎を有し、２８人の患者は、常染色体優性多発性嚢胞腎を有し、２０人の患者は、鎮痛薬性腎症を有した。残りは、様々なまれな腎疾患を有した。４０人の患者では、根底にある腎疾患は不明であった。患者は平均年齢６３.５±５.８歳であり、ベルリンの現在の高齢透析集団を反映していた。肥満度指数は、２５.２±４.６であった。血液透析の平均期間は、５.０±４.８年であった。１５７人の患者は、先在する冠動脈心疾患を有した。２２０人は、高血圧を有した。追跡からもれた患者はいなかった。７３人の患者が死亡した；４１事例では、患者は、心血管疾患で死亡し、急性心筋梗塞を伴う１０人、心臓性突然死の１５人、および慢性心不全による１４人が含まれる。感染性疾患は、二番目に共通する死因であり、２３事例が含まれる。敗血症は、この群で、断然最も共通する死因であった（１８事例）。５人の患者はがんのために死亡した。残りの４人の死亡例は、事故（２ｘ）、高カリウム血症（hyperkalimea）（１ｘ）に関連し、１事例では死因は不明であった。リラキシンの受診者動作コマンド（ＲＯＣ）曲線の分析により、全研究集団、女性および男性で異なる最適カットオフ値が明らかにされ、高齢の集団でもこのホルモンの性別依存性を反映していた。生存と非生存とを弁別するための最良のカットは、各々、全研究集団で３２.７［ｐｇ／ｍｌ］、女性で３８.４［ｐｇ／ｍｌ］、そして男性で２９.４［ｐｇ／ｍｌ］であった。これらのカットオフ値を使用して、我々は、その時点で健康上の問題のない慢性血液透析患者の血清リラキシン濃度の上昇は、その後２年間の全事例の死亡率の独立した予測因子（predictor）であることを立証できた（表１）。心血管疾患に関する死亡例の下位集団分析により、リラキシンは、男性ＥＳＫＤ患者の心血管性の死亡率について、特に重要な予測因子であることが明らかにされた（表２）。
【００２３】
考察
本研究で、我々は、慢性的に血液透析を受けている女性および男性の末期の腎臓病患者において、リラキシンが全事例の死亡率の独立した予測因子であることを初めて立証した。下位集団分析は、リラキシンが、男性ＥＳＫＤ患者の心血管性の死亡率の予測因子として特に重要であることを明らかにした。我々の前向き研究は、平均年齢６３.５歳の高齢コホート（cohort）で実施した。これは、ドイツの大都市、特にベルリンにおける、現在の透析集団を反映している。しかしながら、これに関して、糖尿病、トロポニンＴの上昇および低アルブミンなどの、我々のコホートにおける死亡率を予測するリスク因子は、他の大規模前向き研究（１１、１２、１３）において見つけられたものと同様であることに留意するのは重要である。従って、リラキシンが死亡率予測因子であるという我々の知見は、ＥＳＫＤ患者に全般的影響のあるものである。
【００２４】
齧歯類における外因性リラキシンの効果を調べることにより得られるデータに基づいて、このホルモンが慢性心不全および虚血再灌流障害後の心筋損傷の過程で代償的効果を発揮することが示唆された：
ｉ）リラキシンは、虚血再灌流障害後に、冠動脈流を増加させ、心臓のマロニルジアルデヒド（ＭＤＡ）産生を減少させる（１４）。ＭＤＡは、例えば虚血再灌流障害後の酸素由来フリーラジカルによる細胞膜の脂質過酸化の最終生成物である（１４、１５）。
ｉｉ）リラキシンは、心房性ナトリウム利尿ペプチドの合成を刺激する（３）、
ｉｉｉ）リラキシンは、コラーゲンマトリックス分解を増加させる（１６）、そして、
ｉｖ）組織プラスミノーゲン活性化因子を上方調節することにより、冠血管の血栓現象を防止する（１７）。
【００２５】
この考え（慢性心不全および虚血性心筋損傷の過程におけるリラキシンの代償的効果、上記参照）の裏付けとして、血漿リラキシン濃度および左心室のリラキシンｍＲＮＡ濃度は、慢性心不全の患者で上昇しているという観察がある（２）。
【００２６】
リラキシンは、男性ＥＳＫＤ患者の心血管性の死亡リスクに関し、特に重要であると思われる。男性ＥＳＫＤ患者の数（１２３人）は少ないが、我々は、リラキシンは、この群において、心血管性の死亡率に関し、ＥＳＫＤ患者で心血管性の死亡率を予測する周知のリスク因子であるトロポニンＴ（１１）よりも重要であるとさえ思われると立証できた（表２参照）。心臓の表現型に関するリラキシンの性別依存性も、最近リラキシンノックアウトマウスで見られた（６）。オスのリラキシンノックアウトマウスのみが、心臓の表現型（左心室のコラーゲン合成の上昇および左心室機能の減損）を発現させる。ＥＳＫＤ患者における致死的心血管疾患に対するリラキシンの影響およびリラキシンノックアウトマウスにおける心臓の表現型の性別依存性を説明する分子的経路は、明らかにすべきものである。
【００２７】
以下の引用文献は、本発明の主題に関連するとみなされ、上記で引用されたものである：
1. Bani D. relaxin: A pleiotropic hormone. Gen Pharmac. 1997; 28:13-22
2. Dschietzig T, Richter C, Bartsch C et al., The pregnancy hormone relaxin is a player in human heart failure. FASEB J. 2001; 15(12):2187-95
3. Toth M, Taskinen P, Ruskoaho H. Relaxin stimulates atrial natriuretic peptide secretion in perfused rat heart. J. Endocrinol 1996; 150, 487-495
4. Bani-Sacchi T, Bigazzi M, Bani D et al., Relaxin -induced increased coronary flow through stimulation of nitric oxide production. Br J Pharmacol 1995; 116, 1589-94
5. Fisher C, MacLean M, Morecroft I et al., Is the pregnancy hormone relaxin also a vasodilator peptide secreted by the heart? Circulation. 2002;106(3):292-5
【００２８】
6. Du XJ, Samuel CS, Gao XM et al., Increased myocardial collagen and ventricular diastolic dysfunction in relaxin deficient mice: a gender-specific phenotype. Cardiovasc Res. 2003; 57(2):395-404
7. Garber SL, Mirochnik Y, Brecklin CS et al., Relaxin decreases renal interstitial fibrosis and slows progression of renal disease. Kidney Int. 2001;59(3):876-82
8. Port FK. Morbidity and mortality in dialysis patients. Kidney Int 1994; 46(6):1728-37
9. USRDS: Excerpt from the United States Renal Data System 1999. Annual Data Report. Patients mortality and survival in ESRD. Am J Kidney Dis 1999; 34; S74-S86.
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11. Dierkes J, Domrose U, Westphal S et al., Cardiac troponin T predicts mortality in patients with end-stage renal disease. Circulation 2000; 102(16):1964-9
【００２９】
12. Cano NJ, Roth H, Aparicio M et al., Malnutrition in hemodialysis diabetic patients: evaluation and prognostic influence. Kidney Int. 2002; 62(2):593-601
13. USRDS: Excerpt from the United States Renal Data System 1999. Annual Data Report. Patients mortality and survival in ESRD. Am J Kidney Dis 1999; 34, S74-S86
14. Masini E, Bani D, Bello MG, Bigazzi M, Mannaioni PF, Sacchi TB. Relaxin counteracts myocardial damage induced by ischemia-reperfusion in isolated guinea pig hearts: evidence for an involvement of nitric oxide. Endocrinology. 1997;138(11):4713-20
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16. Unemori, E. N., Pickford, L. B., Salles, A. L., Piercy, C. E., Grove, B. H., Erikson, M. E., Amento, E. P. (1996) Relaxin induces an extracellular matrix-degrading phenotype in human lung fibroblasts in vitro and inhibits lung fibrosis in a murine model in vivo. J Clin Invest 98; 2739-2745
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【００３０】
【表１】
2007506116.tif 000002
【００３１】
【表２】
2007506116.tif 000003
【国際調査報告】
2007506116.tif 000004
2007506116.tif 000005
2007506116.tif 000006
2007506116.tif 000007
2007506116.tif 000008