(57)【要約】ＰＰＡＲγ活性の調節を通して、種々の状態（癌、特に前立腺癌、乳癌、肺癌、卵巣、脳腫瘍、および結腸癌が挙げられる）の処置において、ＮＳＡＩＤおよびＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターを用いる方法が、本明細書中で記載される。種々の実施態様において、ＮＳＡＩＤおよびＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターが、哺乳動物における状態の処置に有用な組成物に含まれ得る。ＮＳＡＩＤおよびＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターを、癌のような疾患状態の処置および予防におけるそれらの使用に関する指示書と共に含むキットも記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における状態を処置するための組成物であって、以下：
非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）；および
ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビター
を含む、組成物。
【請求項２】
前記ＮＳＡＩＤが、アスピリン、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フロクタフェニン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナメート、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダク、テノキシカム、チアプロフェン酸、トルメチン、これらの誘導体、これらのアナログ、これらの薬学的同等物、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターが、組換えヒト化モノクローナル抗体２Ｃ４、アンサマイシン、ゲフィチニブ、エルロチニブ、モノクローナル抗体、ラパマイシン、ｓｒｃインヒビター、チロシンキナーゼインヒビター、化合物ＬＹ２９４００２、イマチニブメシレート、トラスツズマブ、化合物ＣＩ１０３３、化合物ＰＫＩ１６６、化合物ＧＷ２０１６、化合物ＥＫＢ５６９、化合物ＩＭＣ−Ｃ２２５、ならびにこれらの誘導体、これらのアナログ、これらの薬学的同等物およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＮＳＡＩＤがＲ−エトドラクである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターが、組換えヒト化モノクローナル抗体２Ｃ４である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記哺乳動物の１ｋｇあたり約１００ｍｇ〜約５００ｍｇの前記ＮＳＡＩＤの量を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記哺乳動物の１ｋｇあたり約５ｍｇ〜約４０ｍｇの前記ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターの量を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が、腹腔内、経口胃管栄養法、静脈内、舌下、局所、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、鼻内、非経口および直腸からなる群より選択される技術による投与のために処方される、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
ビヒクル、添加物、賦形剤、治療用化合物、薬学的補助剤、前記状態の処置に有用な薬学的因子、キャリアおよびこれらの組み合わせからなる群より選択されるさらなる成分をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
哺乳動物における状態を処置する方法であって、以下：
該哺乳動物に非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の一定量をＮＳＡＩＤ周期で投与する工程；および
該哺乳動物にＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターの一定量をＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビター周期で投与する工程
を包含する、方法。
【請求項１１】
前記ＮＳＡＩＤが、アスピリン、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フロクタフェニン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナメート、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダク、テノキシカム、チアプロフェン酸、トルメチン、これらの誘導体、これらのアナログ、これらの薬学的同等物、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターが、組換えヒト化モノクローナル抗体２Ｃ４、アンサマイシン、ゲフィチニブ、エルロチニブ、モノクローナル抗体、ラパマイシン、ｓｒｃインヒビター、チロシンキナーゼインヒビター、化合物ＬＹ２９４００２、イマチニブメシレート、トラスツズマブ、化合物ＣＩ１０３３、化合物ＰＫＩ１６６、化合物ＧＷ２０１６、化合物ＥＫＢ５６９、化合物ＩＭＣ−Ｃ２２５、ならびにこれらの誘導体、これらのアナログ、これらの薬学的同等物およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＮＳＡＩＤが、Ｒ−エトドラクである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターが、組換えヒト化モノクローナル抗体２Ｃ４である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＮＳＡＩＤの量が、前記哺乳動物の１ｋｇあたり約１００ｍｇ〜約５００ｍｇである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターの量が、前記哺乳動物の１ｋｇあたり約５ｍｇ〜約４０ｍｇである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビター周期が、週２回である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＮＳＡＩＤ周期が、毎日である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＮＳＡＩＤの前記量を投与する工程および前記ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターの前記量を投与する工程が、腹腔内、経口胃管栄養法、静脈内、舌下、局所、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、鼻内、非経口および直腸からなる群より独立して選択される送達技術を用いることをさらに包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物における状態を処置することにおいて使用するためのキットであって、以下：
一定量の非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）；
一定量のＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビター；および
該状態の処置における該ＮＳＡＩＤおよび該ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターの使用のための指示書
を備える、キット。
【請求項２１】
前記ＮＳＡＩＤが、アスピリン、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フロクタフェニン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナメート、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダク、テノキシカム、チアプロフェン酸、トルメチン、これらの誘導体、これらのアナログ、これらの薬学的同等物、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターが、組換えヒト化モノクローナル抗体２Ｃ４（２Ｃ４）、アンサマイシン、ゲフィチニブ、エルロチニブ、モノクローナル抗体、ラパマイシン、ｓｒｃインヒビター、チロシンキナーゼインヒビター、化合物ＬＹ２９４００２、イマチニブメシレート、トラスツズマブ、化合物ＣＩ１０３３、化合物ＰＫＩ１６６、化合物ＧＷ２０１６、化合物ＥＫＢ５６９、化合物ＩＭＣ−Ｃ２２５、ならびにこれらの誘導体、これらのアナログ、これらの薬学的同等物およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
前記ＮＳＡＩＤが、Ｒ−エトドラクである、請求項２０に記載のキット。
【請求項２４】
前記ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターが、組換えヒト化モノクローナル抗体２Ｃ４である、請求項２０に記載のキット。
【請求項２５】
前記使用のための指示書が、前記ＮＳＡＩＤの前記量のうちの少なくとも一部分が前記哺乳動物にＮＳＡＩＤ周期で投与されるべきであること、および前記ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターの前記量のうちの少なくとも一部分がＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビター周期で投与されるべきであることを示す、請求項２０に記載のキット。
【請求項２６】
前記ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビター周期が、週２回である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記ＮＳＡＩＤ周期が、毎日である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２８】
前記ＮＳＡＩＤおよび前記ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターが、各々、腹腔内、経口胃管栄養法、静脈内、舌下、局所、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、鼻内、非経口および直腸からなる群より独立して選択される送達技術による投与のために処方される、請求項２０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明の実施態様は、癌のような、ＰＰＡＲγ経路およびＨＥＲ−キナーゼ軸によって調節される疾患状態を処置および予防する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
癌は、米国において死因の第２位であり、そして毎年百万人を超える人々が癌と診断される。アメリカ人男性の約２人に１人、そしてアメリカ人女性の３人に１人が、その生涯の間になんらかの型の癌を有する。しかし、可能性のある癌の環境的原因および遺伝的原因のいくつかを同定することにおいてかなりの進歩があるものの、この疾患に関係する死亡率は、癌および関連する疾患および障害の治療的介入において相当な改善が必要であることを示す。
【０００３】
ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプター（ＰＰＡＲ）は、核ホルモンレセプタースーパーファミリーのメンバーであり、そしてリガンド誘導転写因子として作用する。リガンド刺激の際に、これらのレセプターはレチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）とヘテロダイマーを形成し、そしてペルオキシソーム増殖因子応答エレメント（ＰＰＲＥ）と結合して標的遺伝子の転写速度を調節する（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．ら、「Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＰＰＡＲｙ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ（ＳＰＡＲＭｓ）」、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．第７巻、第９号、３９５−４００頁（２００１））。ＰＰＡＲ転写活性をネガティブに調節するために利用される、十分に記録されたメカニズムは、マイトジェン活性化プロテイン（ＭＡＰ）キナーゼによるＰＰＡＲのリン酸化によるものである（Ｃａｍｐ，Ｈ．Ｓ．およびＴａｆｕｒｉ，Ｓ．Ｒ．、「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  γ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７２巻、第１６号、１０８１１−１０８１６頁（１９９７）；Ｆｌｏｙｄ，Ｚ．Ｅ．およびＳｔｅｐｈｅｎｓ，Ｊ．Ｍ．、「Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＰＡＲγ  ｉｎ  Ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７７巻、第６号、４０６２−４０６８頁（２００２）；Ｈａｕｓｅｒ，Ｓ．ら、「Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰｅｒｏｘｉｓｏｍｅＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  γ  ｉｓ  Ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  Ｌｉｇａｎｄ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７５巻、第２４号、１８５２７−１８５３３頁（２０００））。このリン酸化事象は、ＰＰＡＲのリガンド結合親和性を減少し、そしてユビキチン−プロテアソーム媒介性分解によるＰＰＡＲタンパク質レベルのダウンレギュレーションをもたらす（Ｆｌｏｙｄ，Ｚ．Ｅ．およびＳｔｅｐｈｅｎｓ，Ｊ．Ｍ．；Ｓｈａｏ，Ｄ．ら、「Ｉｎｔｅｒｄｏｍａｉｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｙ  ＰＰＡＲγ」、Ｎａｔｕｒｅ、第３９６巻、３７７−３８０頁（１９９８））。
【０００４】
転写因子ＰＰＡＲγは、細胞増殖および分化の調節に関わる重要な抗腫瘍形成分子として記載されている（Ｔｏｎｔｏｎｏｚ，Ｐ．ら、「ｍＰＰＡＲγ２：Ｔｉｓｓｕｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ａｎ  Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ」、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．、第８巻、１２２５−１２３４頁（１９９４））。ＰＰＡＲγは、３つのサブタイプ（ＰＰＡＲγ１、ＰＰＡＲγ２、およびＰＰＡＲγ３）に分けられ、それらは異なる転写開始部位とそれに続く選択的スプライシング事象に由来する（Ｆａｊａｓ，Ｌ．ら、「ＰＰＡＲγ３  ｍＲＮＡ：Ａ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ＰＰＡＲγ  ｍＲＮＡ  Ｓｕｂｔｙｐｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｎ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ」、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、第４３８巻、５５−６０頁（１９９８）；Ｇｒｅｅｎ，Ｓ．、「ＰＰＡＲ：Ａ  Ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  Ａｃｔｉｏｎ」、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．第３３３巻、第１、２号、１０１−１０９頁（１９９５）；Ｚｈｕ，Ｙ．ら、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｏｕｏｓｅ  Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  γ（ｍＰＰＡＲγ）Ｇｎｅ：Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  Ｙｉｅｌｄ  Ｔｗｏ  ｍＰＰＡＲγ  Ｉｓｏｆｏｒｍｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９２巻、７９２１−７９２５頁（１９９５））。ＰＰＡＲγ改変体間の有意な機能的相違は報告されていないが、これら改変体の相対的発現は、組織特異的である。例えば、ＰＰＡＲγ１は、いくつかの組織に発現されるようであり、一方ＰＰＡＲγ２は、主に脂肪組織に発現される（Ｆａｊａｓ，Ｌ．ら、「Ｔｈｅ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  ＰＰＡＲγ  Ｇｅｎｅ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７２巻、第３０号、１８７７９−１８７８９頁（１９９７））。研究により、ある組織におけるＰＰＡＲγの活性化が、細胞周期をブロックし、増殖を遅らせ、そして細胞分化を誘導することが示されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。そのような観察は、発癌の処置における化学的予防因子としての、新規ＰＰＡＲγリガンドの開発への研究を促進した。
【０００５】
前立腺癌の研究は、ＰＰＡＲγが原発性前立腺癌において有意に発現されるが、正常な前立腺組織においては非常に低いレベルであることを明らかにし、それを分子治療の有望な候補にした（非特許文献６）。さらに、ＰＰＡＲγの半接合の欠失は、原発性ヒト前立腺癌においてよくみられ、機能の喪失が悪性の表現型に寄与し得ることを示唆する（非特許文献７）。この観察によって、合成リガンドによるＰＰＡＲγの活性化は、インビトロで前立腺癌細胞において前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）ｍＲＮＡの発現をダウンレギュレートすることが見出された（非特許文献８、非特許文献９）。特に、ＰＰＡＲγリガンド、トログリタゾン、ロシグリタゾン、および１５−デオキシ−１２，１４−プロスタグランジンＪ２は、かなりのレベルのＰＰＡＲγを発現する前立腺ガン細胞系統の増殖阻害を示した（非特許文献１０）。さらに、前立腺癌を有する患者におけるトログリタゾン処置の第２相臨床研究は、新規転移または疾患に関連する症状の無いこと、およびより低いＰＳＡレベルによって特徴付けられる、疾患の安定期間の延長と関連していた（非特許文献７）。トログリタゾン（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｍｏｒｒｉｓ  Ｐｌａｉｎｓ、ＮＪのＰａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ事業部からＲＥＺＵＬＩＮの商品名で入手可能）は、ＰＳＡ  ｍＲＮＡの発現をダウンレギュレートする合成リガンドである。
【０００６】
ＰＰＡＲγに対して作用することが知られている１つの治療的処置は、非ステロイド性抗炎症剤、それ以外では「ＮＳＡＩＤ」として公知のグループである。最近、癌細胞または形質転換細胞におけるＮＳＡＩＤの抗増殖活性に注目が集まり、それはＰＰＡＲγとの相互作用を通して媒介される（非特許文献１１）。エトドラクは、そのようなＮＳＡＩＤの１つである（非特許文献１２）。エトドラクは、ピラノカルボン酸であり、化学的には（±）１，８−ジエチル−１，３，４，９−テトラヒドロピラノ−［３，４−ｂ］インドール−１−酢酸と呼ばれる。それは、抗炎症活性、鎮痛活性、および解熱活性を示す。ＮＳＡＩＤの治療的作用の分子的基礎は、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）活性の阻害によると考えられ、それによってプロスタグランジン（ＰＧ）の産生をブロックする。しかし、ＣＯＸ阻害は、多くの望ましくない副作用を引き起こすので、ＣＯＸ阻害から分離し得るＮＳＡＩＤの化学的予防効果および抗転移効果を決定する必要性が存在する（Ａｌｌｉｓｏｎら、１９９２）。エトドラクアナログ、Ｒ−エトドラクは、ＣＯＸ阻害活性を欠き、そしてこの薬剤の「不活性な」エナンチオマーと考えられる（非特許文献１３、非特許文献１４）。それは最近、ＨＥＫ２９３細胞においてβカテニン依存性のＴ細胞およびリンパ系増強転写因子（ＴＣＦ／ＬＥＦ）レポーター遺伝子の転写を阻害することが示され、そして同じ濃度で、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）細胞のインビトロでの生存を減少させた（非特許文献１５）。Ｒ−エトドラクは、現在ＣＬＬを処置する第２相臨床試験において試験されている。
【０００７】
癌の処置における治療的介入の、別の有望な標的のセットとしては、ヒト表皮増殖因子レセプター（ＨＥＲ）またはレセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のＥｒｂＢファミリーのメンバーが挙げられ、それらは細胞増殖、生存、および分化の重要なメディエーターである。それらは例として前立腺、肺、および乳房の固形上皮腫瘍において頻繁にアップレギュレートされており、そしてまた神経膠芽腫においてもアップレギュレートされている。ＨＥＲキナーゼシグナル送達ネットワークは、前立腺癌細胞において活性であり、そしてその疾患の進行に有意に寄与していることが公知である（非特許文献１６）。そのシグナル送達ネットワークは、レセプター特異的リガンド刺激によって活性化され、それはレセプターの二量体化および自己リン酸化を引き起こす。組換えヒト化モノクローナル抗体２Ｃ４、またはｒｈｕＭａｂ２Ｃ４（以下「２Ｃ４」）のような、ＨＥＲ−キナーゼ軸に対して向けられた治療は、前立腺異種移植片の増殖を８０％程度阻害し、ＨＥＲ−キナーゼ軸は前立腺癌増殖の重要なメディエーターであるという考えを実証する（非特許文献１６）。インビボにおける研究は、ＨＥＲ−キナーゼ軸のリガンドが、マイトジェン活性化プロテイン（ＭＡＰ）キナーゼによるＰＰＡＲγのリン酸化を誘導することを示し、それは最終的にはＰＰＡＲγのレベルを調節し得る（非特許文献１７）。しかし、どの研究も、ＰＰＡＲγリガンドによるＨＥＲ−キナーゼ軸の直接的な調節は示唆しなかった。
【０００８】
ＰＰＡＲγ経路またはＨＥＲ−キナーゼ軸のいずれかのみに向けられた治療的処置における有意な制限は、そのレシピエントが、最初に処置に反応した後、その処置効果に対する抵抗性を発達させる傾向があることである。これらの処置は、最初は、癌の処置において強力な抗腫瘍性特性を示し得るが、それらはすぐにより弱くまたは完全に無効になり得る。それに加えて、この抵抗性の原因となる生体分子および病理学上のメカニズムは、医学的研究によって過去に解明されておらず、そのような抵抗性を示した患者にほとんど代替的な治療的処置を残さない。ＰＰＡＲγ経路およびＨＥＲ−キナーゼ軸の両方のメカニズムを理解なしには、そのような処置の治療的可能性および診断的可能性は、ほとんど開発されない。
【非特許文献１】Ｔｏｎｔｏｎｏｚ，Ｐ．ら、「Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｂｙ  ＰＰＡＲ  ｇａｍｍａ  ２，ａ  ｌｉｐｉｄ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ」、Ｃｅｌｌ、１９９４、第７９巻、１１４７−１１５６頁
【非特許文献２】Ｔｏｎｔｏｎｏｚ，Ｐ．ら、「Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  γ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｒｅｔｉｎｏｉｄ  Ｘ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９７、第９４巻、２３７−２４１頁
【非特許文献３】Ｅｌｓｔｎｅｒ，Ｅ．ら、「Ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ  ａｎｄ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ＢＮＸ  ｍｉｃｅ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８、第９５巻、８８０６−８８１１頁
【非特許文献４】Ｋｕｂｏｔａ，Ｔ．ら、「Ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ（ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）ｈａｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｅｃｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｔｈ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９９８、第５８巻、３３４４−３３５２頁
【非特許文献５】Ｓａｒｒａｆ，Ｐ．ら、「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓａｌｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＰＰＡＲｇａｍｍａ」、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１９９８、第４巻、１０４６−１０５２頁
【非特許文献６】Ｓｅｇａｗａ，Ｙ．ら、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＰＰＡＲ）ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ」、Ｐｒｏｓｔａｔｅ、２００２、第５１巻、１０８−１１６頁
【非特許文献７】Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｅ．ら、「Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  γ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２０００、第９７巻、第２０号、１０９９０−１０９９５頁
【非特許文献８】Ｈｉｓａｔａｋｅ，Ｊ．Ｉ．ら、「Ｄｏｗｎ−Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  γ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２０００、第６０巻、５４９４−５４９８頁
【非特許文献９】Ｋｕｂｏｔａ，Ｔ．ら、「Ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  γ（Ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）ｈａｓ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｏｔｈ  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  Ｉｎ  ｖｉｖｏ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９９８、第５８巻、３３４４−３３５２頁
【非特許文献１０】Ｍｕｅｌｌｅｒら、２０００；Ｓｅｇａｗａら、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＰＰＡＲ）ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ」、Ｐｒｏｓｔａｔｅ、２００２、第５１巻、１０８−１１６頁
【非特許文献１１】Ｎａ，Ｈ．Ｋ．およびＹ．Ｊ．Ｓｕｒｈ、「Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ（ＰＰＡＲｇａｍｍａ）ｌｉｇａｎｄｓ  ａｓ  ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００３、第６６巻、１３８１−１３９１頁
【非特許文献１２】Ｄｅｍｅｒｓｏｎら、「Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｔｏｄｏｌａｃ  ａｎｄ  ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｅｎｔｉｏｍｅｒｓ」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９８３、第２６巻、１７７８−１７８０頁
【非特許文献１３】Ａｄａｃｈｉら、「Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ」、Ａｃｔａ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、２００４、第１１１巻、１０７−１２３頁
【非特許文献１４】Ｄｅｍｅｒｓｏｎら、「Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｔｏｄｏｌａｃ  ａｎｄ  ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９８３、第２６巻、１７７８−１７８０頁
【非特許文献１５】Ｌｕら、「Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００４、第１０１巻、３１１８−３１２３頁
【非特許文献１６】Ａｇｕｓ，Ｄ．Ｂ．ら、「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｌｉｇａｎｄ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＥｒｂＢ２  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、２００２、第２巻、１２７−１３７頁
【非特許文献１７】Ｃａｍｐ，Ｈ．Ｓ．およびＴａｆｕｒｉ，Ｓ．Ｒ．、「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９７、第２７２巻、１０８１１−１０８１６頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
当該分野において、ＨＥＲ−キナーゼ軸およびＰＰＡＲγ経路両方の活性化の利点を組み入れ、多くの患者によって示される抵抗性を克服する、癌の良好な治療に関する有意な必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本明細書中において、哺乳動物における状態を処置するのに有用な組成物が記載される。この組成物は、非ステロイド性抗炎症薬剤（ＮＳＡＩＤ）およびＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターを含み、それは、例えば、経口胃管栄養法または腹腔内注射のような、任意の伝統的な手段によって哺乳動物に投与され得る。本発明の組成物はさらに、治療的に簡便な処方を提供するために、および／または組成物の生化学的送達および有効性を増強するために、アジュバントのようなさらなる構成成分を含み得る。本発明のＮＳＡＩＤおよびＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターによって癌を処置または予防する方法もまた、提供される。
【００１１】
それに加えて、本発明の実施態様は、哺乳動物においてＰＰＡＲγ経路を調節する、および哺乳動物において状態を処置する方法を提供する。本発明の方法は、ＮＳＡＩＤおよびＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターを併用して使用することを包含し、それらは、例えば、経口胃管栄養法または腹腔内注射のような任意の伝統的な手段によって投与され得る。さらに、ＮＳＡＩＤおよびＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターは、異なる時間間隔で、またはお互い別々に投与され得、そして様々な手段によって送達され得る。ＮＳＡＩＤおよびＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターは、治療的に簡便な処方を提供するために、および／または組成物の生化学的送達および有効性を増強するために、それぞれさらにアジュバントのようなさらなる構成成分を含み得る。本発明の方法は、癌のような疾患状態を処置するのに有用であり得る。
【００１２】
本発明のさらなる実施態様は、ＮＳＡＩＤおよびＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターを含む、哺乳動物において使用するためのキットを提供する。本発明のキットは、本発明の方法と一致した様式で、ＮＳＡＩＤおよびＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターを使用することを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、非ステロイド性抗炎症性薬剤（ＮＳＡＩＤ）の安定な立体異性体でありかつ新規ＰＰＡＲγモジュレーターであるＲ−エトドラクが、ＰＰＡＲγ経路およびＨＥＲ−キナーゼ軸の両方を調節することによって、明らかな合併症なしに、前立腺癌異種移植片の増殖を効果的に抑制し得るという驚くべき発見に基づく。（Ｈｅｄｖａｔ，Ｍ．ら、「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＥＲ−ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ＥＲＫ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＰＡＲγ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、第５巻、第６号、５６５−５７４頁（２００４））。このクロストーク（ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ）の臨床的有用性は、Ｒ−エトドラク、および現在第２相臨床試験にあるＨＥＲ−２特異的モノクローナル抗体である２Ｃ４の相加的増殖阻害特性によって示される。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、「状態」および「疾患状態」は、癌（特に、前立腺、乳癌、肺癌、卵巣癌、脳腫瘍および結腸癌）を含み得るが、決してこれらに限定されない。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、「処置」および「処置すること」は、癌または他の疾患状態あるいはその症状を予防、阻害、治癒、および軽減すること、ならびに癌の転移を予防、阻害、治癒、および軽減することを含む。「有益な結果」は、疾患状態の重篤度を減少させる、疾患状態が悪化するのを予防する、疾患状態を治癒する、および患者の生命または平均余命を延長することを含み得るが、決してこれらに限定されない。その疾患状態は、ＰＰＡＲγ経路、ＨＥＲ−キナーゼ軸またはその組み合わせに関連するか、またはそれらによって調節される。
【００１６】
特定の癌を「軽減すること」は、腫瘍を退化させること（例えば、構造的な完全性または腫瘍の結合組織を破壊して、処置前の腫瘍サイズと比較して腫瘍サイズを減少させること）を含む。癌の転移を「軽減すること」は、癌が他の器官に広がる速度を減少することを含む。癌の転移を「予防すること」は、癌が特定の組織の外側へ広がることを予防することを含む。癌を「治癒すること」は、治療後に腫瘍が検出され得ないように腫瘍を退化させることを含む。腫瘍を、例えば、血液供給の欠如から萎縮させることによって、または本発明によって投与された１つまたはそれ以上の構成成分によって攻撃または退化させられることによって、サイズが減少し得るか、または検出不可能となり得る。
【００１７】
２Ｃ４との併用療法レジメンにおけるＲ−エトドラクの使用の成功は、上皮癌のＰＰＡＲγリガンドに対する感受性を増加させる２Ｃ４の潜在的な有用性を示した。いかなる理論に束縛されることも望まないが、Ｒ−エトドラクによって発揮される抗腫瘍活性の主なメカニズムは、ＰＰＡＲγレセプターの転写活性の増強によるものであると考えられる。ＰＰＡＲγは、サイクリンＤ１プロモーターの抑制によって、細胞周期の進行に影響を有することが十分に記録されている（Ｗａｎｇら、２００１）。サイクリンＤ１は、分裂促進性シグナルおよび発癌性シグナルに応じて、哺乳動物上皮細胞のＧ１期を通じた進行の速度を決定する（Ｌｅｅら、２０００）。さらに、Ｒ−エトドラクは、ＰＰＡＲγ経路によってサイクリンＤ１の発現をダウンレギュレートすることによって、前立腺癌の進行を阻害すると考えられる。Ｒ−エトドラクはまた、Ｗｎｔ／β−カテニン経路によるアポトーシスのアップレギュレーションによって、腫瘍の阻害に寄与し得る（Ｌｕら、２００４）。
【００１８】
しかし、Ｒ−エトドラク処置後にＰＰＡＲγタンパク質の分解が観察される。転写後のＰＰＡＲγ  ｍＲＮＡの発現に変化は観察されないので、このＰＰＡＲγタンパク質の損失は、転写後の事象である。さらに、ＰＰＡＲγタンパク質の欠如は、ＰＰＡＲγ陽性細胞に対する選択に起因するものではない。下記で議論する複合薬治療研究の結果に基づいて、ＰＰＡＲγ陽性細胞に対する選択は除外された。Ｒ−エトドラクの抗腫瘍形成効果はＰＰＡＲγタンパク質の損失によって作用するという他の結論は、Ｒ−エトドラク処置の２４時間後から７２時間後、大部分の動物におけるＰＰＡＲγレセプターのアップレギュレーションを明らかにした経時的実験のイムノブロットによって否定された。Ｒ−エトドラクを与えられている異種移植片におけるＰＰＡＲγアップレギュレーションの期間は、Ｒ−エトドラク投与後の細胞培養ベースのアッセイにおけるＰＰＡＲγ転写活性のピークと一致する。これらの結果は、Ｒ−エトドラクの最初の効果は、ＰＰＡＲγ活性を増加させることであるという考えを強める。ＰＰＡＲγ分解に必須の条件は、レセプターのリガンド誘導コンフォメーション変化であり、それは転写活性化と関連するので、観察されたＰＰＡＲγタンパク質の損失は、ＰＰＡＲγ活性化に続いて起こると考えられる（Ｈａｕｓｅｒら、２０００）。
【００１９】
ＰＰＡＲγ転写活性をネガティブに調節するために利用される、詳細に記録されたメカニズムは、ＭＡＰキナーゼによるＰＰＡＲγのリン酸化によるものである（ＣａｍｐおよびＴａｆｕｒｉ、１９９７；ＦｌｏｙｄおよびＳｔｅｐｈｅｎｓ、２００２；Ｈａｕｓｅｒら、２０００）。このリン酸化事象は、ＰＰＡＲγのリガンド結合親和性を減少させ、そしてユビキチン−プロテアソーム媒介性分解による、ＰＰＡＲγタンパク質レベルのダウンレギュレーションを引き起こす（ＦｌｏｙｄおよびＳｔｅｐｈｅｎｓ、２００２；Ｓｈａｏら、１９９８）。リン酸化はまた、プロゲステロンレセプターの調節に関しても詳細に記録されている（Ｌａｎｇｅら、２０００；Ｓｈｅｎら、２００１）。Ｒ−エトドラクによる処理がホスホ−ＭＡＰキナーゼのアップレギュレーションおよび続くＰＰＡＲγタンパク質の損失を引き起こすという観察は、同様の調節メカニズムを示唆する。Ｒ−エトドラクの標的であるＰＰＡＲγタンパク質の損失が、薬剤に対する「自己耐性」のメカニズムであり得ると仮定される。ＰＰＡＲγタンパク質の損失はまた、Ｒ−エトドラクのサイクリンＤ１を抑制する能力も損なう。さらに、ＭＡＰキナーゼはホスホ−ＰＰＡＲγ非依存性のメカニズムによってサイクリンＤ１プロモーターを誘導するので、Ｒ−エトドラクによるホスホ−ＭＡＰキナーゼの誘導は、サイクリンＤ１の増加を引き起こす（Ｗａｎｇら、２００１；Ｗａｔａｎａｂｅら、１９９８）。増加したサイクリンＤ１は、ＰＰＡＲγの発現およびトランス活性化（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）を抑制し、その抗腫瘍形成可能性を制限することが記録されている（Ｗａｎｇら、２００３）。これらの事象は、Ｒ−エトドラクの自己耐性メカニズムの一助となる。
【００２０】
自己耐性の現象を、Ｒ−エトドラクと２Ｃ４との併用レジメンの使用によって克服し得ることが発見された。その併用レジメンは、異種移植片におけるＰＰＡＲγタンパク質の維持を促進し、それは増加した抗腫瘍形成性と関連する。Ｒ−エトドラクと併用した２Ｃ４による処置はまた、ＰＰＡＲγタンパク質の維持によって、およびホスホ−ＭＡＰキナーゼ活性の排除によってサイクリンＤ１の阻害を永続させ、それゆえ、Ｒ−エトドラクの自己耐性を克服すると考えられる。本明細書中で開示される併用研究はまた、Ｒ−エトドラクで処理した異種移植片におけるＰＰＡＲγ発現の欠如が、ＰＰＡＲγ陽性細胞に対する選択の結果ではないという意見を支持する。合わせると、これらの観察は、Ｒ−エトドラク媒介性の増殖阻害は、ＰＰＡＲγレセプターの活性化によって達成され、一方自己耐性のメカニズムによってこの活性を調節することを示唆する。この併用療法は、癌およびこれらの系の調節から利益を得ることができる他の状態の治療において特に有効であり得る。
【００２１】
併用療法の結果は、Ｒ−エトドラクがＨＥＲ−キナーゼ軸の刺激によってホスホ−ＭＡＰキナーゼを活性化することを示唆する。ＨＥＲ−キナーゼ軸は、ＨＥＲ−２特異的モノクローナル抗体である２Ｃ４による前立腺異種移植片の増殖阻害曲線（８０％）によって示されたように（Ａｇｕｓら、２００２）、前立腺癌細胞生存のポジティブなレギュレーターである。本明細書中で開示される研究は、２Ｃ４がＰＰＡＲγタンパク質を分解から救出し、そして２Ｃ４増殖阻害がＲ−エトドラク単独で達成されるものと相加的であることを示す。Ｒ−エトドラクの提案された自己耐性のモデルへ支持を与えるのに加えて、その研究はＰＰＡＲγ分解におけるＨＥＲ−キナーゼ軸の関与を示唆する。他の研究により、ＨＥＲ−２ｍＲＮＡの過剰発現がＰＰＡＲγの発現を増強することが示されているが（Ｙａｎｇら、２００３）、この研究はＨＥＲ−２レセプターレベルの変化を示さなかった。Ｒ−エトドラク処理はＨＥＲ−キナーゼレセプターのｍＲＮＡレベルを変化させなかったが（データは示していない）、ＰＰＡＲγトランス活性化因子が、レセプターを構成的に活性にするか、または内因性リガンドの濃度を増加させることが可能である。例えば、類似したシステムにおいて、表皮成長因子および血小板由来成長因子のようなリガンドによるＭＡＰキナーゼの活性化が、ＰＰＡＲγ１のＳｅｒ８２のリン酸化を誘導し、そしてその転写を活性化する能力を減少させる（ＣａｍｐおよびＴａｆｕｒｉ、１９９７）。従って、これらの観察は、前立腺腫瘍形成におけるＨＥＲ−キナーゼ軸およびＰＰＡＲγ経路間の重要なクロストークを明らかにする。
【００２２】
本発明は、１つの実施態様において、ＰＰＡＲγ経路感受性の状態に影響を与えるのに有用な組成物に関連し、ここでその組成物はＮＳＡＩＤおよびＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターを含む。さらに、その組成物のＮＳＡＩＤおよびＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターは、単一の薬剤、互いを含む任意の適切な処方物、または当業者によって容易に認識されるようなさらなるＮＳＡＩＤもしくはＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターを含む任意の適切な処方物として使用するために適当であり得る。
【００２３】
本発明の種々の実施態様に関連して使用されるＮＳＡＩＤは、抗癌特性を示し得る。そのＮＳＡＩＤはＲ−エトドラクまたはＲ−エトドラク誘導体であり得るが、また限定することなく、アスピリン、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フロクタフェニン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナム酸、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダク（ｓｕｎｌｉｎｄａｃ）、テノキシカム、チアプロフェン酸、トルメチン、および薬学的等価物、誘導体および塩、ならびに他の機能的に関連する化合物も挙げられ得るが、当業者によって容易に認識されるような多くの他のＮＳＡＩＤが使用され得る。例えば、特定のＮＳＡＩＤに関するガイドが文献において提供され、そして一般的に当該分野における開業医に入手可能である。例えば米国特許第６，７６１，９１３号（炎症の処置のための、セロリの種子抽出物およびさらなるＮＳＡＩＤの使用を記載）、および米国特許第６，７５９，０５６号（多くのＮＳＡＩＤを含む経皮送達システムを記載）を参照のこと。次の実施例でさらに記載されるように、Ｒ−エトドラクはＰＰＡＲγをアップレギュレートし、そして前立腺癌異種移植片において腫瘍増殖を阻害することが見出され、そしてそれは一般的にレシピエントによく許容された。
【００２４】
本発明の種々の実施態様と関連して使用されるＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターは、抗癌特性を示し得る。そのＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターは、２Ｃ４または２Ｃ４誘導体であり得るが、限定することなしに、アンサマイシン、ゲフィチニブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  ＵＫ  Ｌｔｄ．によって開発された化合物ＺＤ１８３９；商品名ＩＲＥＳＳＡで入手可能；以下「ＩＲＥＳＳＡ」）、エルロチニブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．およびＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．によって開発された化合物ＯＳＩ−７７４；商品名ＴＡＲＣＥＶＡで入手可能；以下「ＴＡＲＣＥＶＡ」）、モノクローナル抗体、ラパマイシン、ｓｒｃ（ラウス肉腫ウイルスの形質転換遺伝子）インヒビター、チロシンキナーゼインヒビター、ＬＹ２９４００２（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌから入手可能）、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣの商品名でＮｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐ．から入手可能、以下「ＧＬＥＥＶＥＣ」）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮの商品名でＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能；以下「ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ」）、ＣＩ１０３３（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．から入手可能）、ＰＫＩ１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＡＧから入手可能）、ＧＷ２０１６（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅから入手可能）、ＥＫＢ５６９（Ｗｙｅｔｈから入手可能）、ＩＭＣ−Ｃ２２５（ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．およびＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏ．から入手可能）、および薬学的等価物、誘導体および塩、ならびに他の機能的に関連する化合物が挙げられ得るが、当業者によって容易に認識されるような、多くの他のＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターが使用され得る。例えば、特定のＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターに関するガイドが、文献において提供され、そして一般的に当該分野における開業医に入手可能である。例えば、米国特許出願第２００２／００４５５７０号（ＨＥＲファミリーチロシンキナーゼの阻害に関する組成物を記載）を参照のこと。次の実施例においてさらに記載されるように、２Ｃ４は、ＰＰＡＲγのＭＡＰ−キナーゼリン酸化を阻害し、それによってＰＰＡＲγタンパク質の分解を妨げることが見出され、そしてそれは一般的にレシピエントによく許容された。
【００２５】
本発明の別の局面において、哺乳動物において癌または癌性腫瘍を処置する方法が提供される。その方法は、ＮＳＡＩＤを提供する工程；ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターを提供する工程；および特定の状態を処置する様式でレシピエントに併用療法を実行する工程を包含し得る。さらに、そのＮＳＡＩＤおよびＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターは、本発明の代替の実施態様によって上記で記載された組成物と同様の特徴を有し得る。
【００２６】
特に、本発明の方法は、癌の処置に限定されない。代わりに、取り組まれた生体分子経路および本発明の方法によって未然に防がれたＰＰＡＲγ経路およびＨＥＲ−キナーゼ軸間のクロストークは、他の疾患状態の治療において適用を見出し得る；従って、ＮＳＡＩＤおよびＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターの併用療法による治療が患者のために有用な結果を引き起こし得るあらゆる疾患状態が、本発明の範囲内に含まれる。
【００２７】
併用療法において、これらの化合物を別々に投与するのではなく、本発明のＮＳＡＩＤおよびＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターを両方含む組成物を投与することを望み得る種々の理由が存在する。使用する特定のＮＳＡＩＤまたはＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターによって、組成物は、臨床的有効性、溶解度、吸収、安定性、毒性および／または患者の許容性に関する限り、すぐれた特徴を有し得る。本発明のＮＳＡＩＤおよびＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターの多くの組み合わせのうちいずれかの組成物をどのように処方し得るかは、当業者に容易に明らかである。それを行うために多くのストラテジーが存在し、そのいずれであっても慣用的な実験によって実行し得る。しかし、本発明のＮＳＡＩＤおよびＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターの薬物動態が、化合物の別々の投与により適当であり得る。
【００２８】
本発明の任意の実施態様において、本発明の組成物は、他の適切な治療的処置と併用して投与され得る。例えば、本発明のＮＳＡＩＤおよびＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターを、化学療法、放射線治療、または癌もしくは他のＰＰＡＲγ経路感受性の状態を処置するための当該分野で公知の任意の他の治療のような、確立した治療に加えて投与し得る。併用療法において使用する適切な薬剤の選択は、従来の薬学的原理によって、当業者によってなされ得る。治療薬の併用は、相乗的に作用して、上記で記載した種々の障害の治療または予防に影響し得る。このアプローチを使用して、より低い用量の各薬剤によって治療的有効性を達成し得、それゆえ有害な副作用の可能性を減少させ得る。
【００２９】
治療的に有効な用量の決定は、当業者の能力の範囲内である。「治療的に有効な」用量とは、治療的に有効な用量の非存在下で生じる効果と比較した、疾患状態の効果を増加または減少させる活性成分の量を指す。治療的有効性および毒性、例えばＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）を、細胞培養または実験動物において標準的な薬学的手順によって決定し得る。治療的効果に対する毒性の用量比は治療係数であり、そしてそれを比（ＬＤ５０／ＥＤ５０）として表し得る。さらに、細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータを、ヒトに使用するための用量の範囲を処方するのに使用し、それは過度の実験なしに当業者によって容易に管理され得る。そのような組成物に含まれる用量を、毒性がほとんどないか、または毒性無しでＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内であるように選択し得る。用量は使用される投薬形態、患者の感受性、および投与経路によって、この範囲内で変化する。
【００３０】
本発明のＮＳＡＩＤおよびＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターの適切な用量は、種々の因子に依存し得る。そのような因子としては、患者の身体的特徴（例えば年齢、体重、性別）、化合物が単一の薬剤として使用されるのかまたはアジュバント治療として使用されるのか、治療されるＰＰＡＲγ経路感受性状態の型、癌または他のＰＰＡＲγ経路感受性状態の進行（すなわち病期）、および当業者によって認識され得る他の因子が挙げられるが、決してこれらに限定されない。さらに、治療的に有効な用量を、最初に細胞培養アッセイ、あるいは動物モデル、通常マウス、ウサギ、イヌ、またはブタにおいて判断し得る。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与経路を決定するために使用され得る。次いで、そのような情報を、ヒトにおいて有用な用量および投与経路を決定するために使用し得る。しかし、正確な用量は、開業医によって、処置を必要とする患者に関する因子を考慮して決定される。
【００３１】
ＮＳＡＩＤは、一般的に、少なくとも約２００ｍｇ／ｋｇ、例えば約２４０ｍｇ／ｋｇの量で、経口胃管栄養法によって投与される。適切な量は、通常、約１００ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇの範囲である。ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターは、一般的に、少なくとも約１８ｍｇ／ｋｇ（例えば、約２０ｍｇ／ｋｇ）の量で、腹腔内注射によって投与される。適切な量は、通常、約５ｍｇ／ｋｇから約４０ｍｇ／ｋｇの範囲である。上記で明白に開示された範囲内の他の範囲も適切であり得る。例えば、特定の用量および送達方法に関するガイドが文献において提供され、そして一般的に当該分野における開業医に入手可能である。
【００３２】
本発明のＮＳＡＩＤおよびＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターの投与としては、限定されることなしに、化合物を一緒に送達する、各化合物を別々に送達する、単一の用量として送達する、周期的に送達する、または化合物を別々におよび／または異なる間隔で送達することが挙げられ得るが、当業者によって容易に認識されるような他の投与スキームが使用され得る。本明細書中で使用される場合、「周期的に」としては、当業者によって認識されるような、１時間ごと、毎日、１週間ごと、１週間に２回、および１ヶ月ごとのようなあらゆる時間間隔が挙げられ得るが、決してこれらに限定されない。本発明の化合物が別々にそして異なる間隔で投与するために処方される実施態様において、ＮＳＡＩＤはＮＳＡＩＤ周期（ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｂａｓｉｓ）で投与され、そしてＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターはＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビター周期で投与される。本明細書中で使用される「ＮＳＡＩＤ周期」としては、当業者によって認識されるような、１時間ごと、毎日、１週間ごと、１週間に２回、および１ヶ月ごとのようなあらゆる時間の間隔が挙げられ得るが、決してこれらに限定されない。本明細書中で使用される「ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビター周期」としては、当業者によって認識されるような、１時間ごと、毎日、１週間ごと、１週間に２回、および１ヶ月ごとのようなあらゆる時間の間隔が挙げられえるが、決してこれらに限定されない。
【００３３】
さらに、上で記載した治療方法のいずれも、そのような治療を必要とする任意の被験体（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、およびヒトのような哺乳動物が挙げられる）に適用し得る。
【００３４】
本発明の種々の実施態様において、ＮＳＡＩＤおよびＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターは、薬学的組成物として処方され得、その組成物は、患者に投与されて治療効果を達成し得る。本発明の薬学的組成物は、ＮＳＡＩＤおよびＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビター、および模倣物、アゴニスト、アンタゴニスト、またはＰＰＡＲγ経路のインヒビターを含み得る。本明細書中で記載される任意の本発明の組成物は、単独で投与されても、安定化化合物のような少なくとも１つの他の薬剤と組み合わせて投与されてもよく、それは任意の滅菌した生体適合性薬学的キャリア（生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、および水が挙げられるが、これらに限定されない）中に投与され得る。その組成物は、患者に単独で投与され得ても、または他の薬剤、薬物またはホルモンと組み合わせて投与されてもよい。
【００３５】
活性成分に加えて、薬学的組成物は、薬学的に使用し得る調製物への活性化合物の処理を促進する賦形剤および補助剤を含む、薬学的に受容可能な適切なビヒクルを含み得る。本発明の薬学的組成物は、多数の経路（経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、くも膜下腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、非経口、局所、舌下、または直腸送達経路が挙げられるがこれら限定されない）によって投与し得る。経口投与のための薬学的組成物を、経口投与のために適切な投薬量で、当該分野で周知の薬学的に受容可能なビヒクルを用いて処方し得る。そのようなビヒクルは、患者による摂取のために、薬学的組成物を錠剤、丸剤、糖剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として処方することを可能にする。
【００３６】
経口使用のための薬学的調製物は、錠剤または糖剤のコアを得るために、活性化合物の固体賦形剤との組み合わせ、必要に応じて得られた混合物の粉砕、および望ましい場合には適切な補助剤を加えた後、顆粒の混合物の処理によって得ることができる。適切な賦形剤は、乳糖、ショ糖、マンニトール、またはソルビトールを含む糖；トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ、または他の植物からのデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース；アラビアゴムおよびトラガカントゴムを含むゴム；ゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質のような、炭水化物またはタンパク質充填剤である。望ましい場合、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムのようなその塩のような、崩壊剤または可溶化剤を加え得る。
【００３７】
糖剤のコアは、濃縮糖溶液のような適切なコーティングと併用して使用され得、それはまたアラビアゴム、滑石、ポリビニルピロリドン、カルボポル（ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物も含み得る。製品の同定のために、または活性化合物の量、すなわち投薬量を特徴付けるために、染料または色素を、錠剤または糖剤コーティングに加え得る。
【００３８】
経口で使用し得る薬学的調製物は、ゼラチンでできた押し込み型のカプセル、およびゼラチンでできた軟らかく、一定の大きさのカプセルおよびコーティング（例えば、グリセロールまたはソルビトール）を含む。押し込み型のカプセルは、乳糖またはデンプンのような充填剤または結合剤、滑石またはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、そして任意で安定化剤と混合した活性成分を含み得る。軟質カプセルにおいて、活性化合物は、安定化剤を含むまたは含まない脂肪油、液体、液体ポリエチレングリコールのような、適切な液体に溶解または懸濁し得る。
【００３９】
非経口投与のために適切な薬学的処方物は、水溶液、好ましくはハンクス溶液、リンガー溶液、または生理学的緩衝化生理食塩水のような、生理学的に適合性の緩衝液中で配合され得る。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランのような、懸濁液の粘性を高める物質を含み得る。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。非脂質ポリカチオン性アミノポリマーも送達のために使用され得る。任意で、その懸濁液はまた、適切な安定化剤、または高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を増加させる薬剤を含み得る。
【００４０】
局所または鼻腔内投与のために、浸透される特定のバリアに適切な浸透剤を、処方において使用する。そのような浸透剤は、一般的に当該分野で公知である。
【００４１】
本発明の薬学的組成物は、当該分野で公知の方式で、例えば従来の混合、溶解、粒状化、糖剤産生、すりつぶし、乳化、カプセル封入、封入、または凍結乾燥によって製造され得る。薬学的組成物は、塩として提供され得、そして多くの酸（塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等が挙げられるが、これらに限定されない）とともに形成され得る。塩は水性溶媒または他のプロトン性溶媒において、対応する遊離の塩形態よりも可溶性である傾向がある。
【００４２】
処方および投与に関する技術についてのさらなる詳細は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ）の最新版において見出され得る。薬学的組成物が調製された後、示された状態の治療のために、それらを適切な容器に入れ、そしてラベルを貼り得る。そのようなラベルは、投与の量、頻度、および方法を含み得る。
【００４３】
本発明はさらに、上記の治療方法のいずれかで使用するキットを提供する。１つの実施態様において、キットはＮＳＡＩＤ、ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビター、および本発明によって企図される状態の治療においてそれらを使用するための指示書を含む。発明のキットにおいて形成される構成成分の正確な性質は、その意図される目的および採用される特定の方法論に依存する。例えば、キットのある実施態様は、患者における癌を治療する目的のために形成される。１つの実施態様において、そのキットは、癌の治療のために、ヒト患者において特にＰＰＡＲγ経路およびＨＥＲ−キナーゼ軸を調節する目的のために形成される。
【００４４】
使用の指示書が、キットに含まれ得る。「使用のための指示書」は、典型的にはＮＳＡＩＤおよびＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターを組み合わせるための工程、および／またはこれらを治療システムにおいて使用するための工程を記載する具体的な表現を含む。必要に応じて、そのキットはまた、希釈剤、薬学的に受容可能なビヒクル、標本容器、および／または計量道具のような、他の有用な構成成分を含み得る。
【００４５】
キットにおいて集められた材料または構成成分を、その操作性および有用性を保つあらゆる簡便かつ適切な方法で保存して提供し得る。例えば、構成成分は、溶解、脱水、または凍結乾燥形態であり得る；それらを室温、冷蔵、または凍結温度で提供し得る。
【００４６】
その構成成分は、典型的には適切な包装材料に含まれる。本明細書中で採用されるような、「包装材料」という語句は、キットの内容物を収納するために使用される１つまたはそれ以上の物理的構造体を指す。包装材料を、好ましくは滅菌、混入物を含まない環境を提供するために、周知の方法によって構築する。キットにおいて採用される包装材料は、その分野で習慣的に使用されるものである。本明細書中で使用されるような、「包装」という用語は、ガラス、プラスチック、紙、ホイル等のような、個々のキット構成成分を維持し得る適切な固体マトリックスまたは材料を指す。従って、例えば包装は、適切な量のＮＳＡＩＤおよびＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターを含むために使用される１つまたはそれ以上のガラスバイアルであり得る。包装材料は、一般的にキットの内容物および／または目的および／またはその構成成分を示す外側ラベルを有する。
【００４７】
好ましくは、本発明のＮＳＡＩＤおよびＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターは、ＮＳＡＩＤおよびＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターの非存在下と比較して、少なくとも約１０、５０、７５、９０、または１００％、またはその間のあらゆるパーセントで、癌を緩和する、またはＰＰＡＲγ経路およびＨＥＲ−キナーゼ軸と関連する疾患状態を緩和する。動物研究は、併用療法の方法は、いかなる治療も受けていない前立腺癌を有する哺乳動物と比較して、前立腺癌を有する哺乳動物の寿命を有意に延長することを示す。動物研究はまた、その方法は腫瘍の増殖を阻害し、前立腺癌の転移の予防に有意な効果を有し、そして前立腺癌に対して顕著な治療効果を有することを示す。
【００４８】
上記の開示は、一般的に本発明を説明し、そして本開示で引用された全ての特許および特許出願は、本明細書中で明白に参考として援用される。以下の実施例を参照することによってより完全な理解を得られ得、それらは例示のみのために提供され、本発明の範囲を限定することは意図されない。
【実施例】
【００４９】
以下の実施例は、癌または他のＰＰＡＲγ感受性状態に罹患した哺乳動物を処置するために使用し得るか、または本発明の種々の実施態様によってそのような哺乳動物を処置するために使用し得る併用療法の有効性を評価するために使用し得る、典型的な手順である。これら実施例の改変は、その状態が本明細書中で記載されたものと異なる哺乳動物を処置しようとする当業者に容易に明らかである。
【００５０】
（実施例１）
（腫瘍モデルの準備）
４週齢から６週齢のヌードマウスを、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ−Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得て、そしてＣｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ飼育場において加圧換気ケージ中で維持した。雄性動物に、アンドロゲン依存性ＬｕＣａＰ−３５異種移植片由来の細かく刻んだ腫瘍組織を皮下接種し（Ｂｕｈｌｅｒ，Ｋ．Ｒ．ら、「ＬｕＣａＰ３５：Ａｎ  Ａｎｄｒｏｇｅｎ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ，Ｐｒｏｓｔａｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ」、Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、第３８巻（１９９７））、そして雌性には、アンドロゲン投与中止後に再増殖および増加した血清前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）に関して腫瘍を選択することによって得た、アンドロゲン非依存性ＣＷＲＳＡ６異種移植片を与えた（Ａｇｕｓ，Ｄ．Ｂ．ら、「Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃｎａｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ：Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ａｎｄｒｏｇｅｎ  Ｗｉｔｈｄｒａｗｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎｄｒｏｇｅｎ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ」、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．、第９１巻、第２１号、１８６９−１８７６頁（１９９９））。これらのモデルは、ＰＳＡの進行、アンドロゲンレセプターの状態およびＨＥＲ−キナーゼ軸に対する依存に関して十分に特徴づけられていたので、ＣＷＲＳＡ６およびＬｕＣａＰ−３５を選択した。これらのモデルは、前立腺癌の２つの区別できる段階、すなわちアンドロゲン依存性の段階（ＬｕＣａＰ−３５）およびアンドロゲン非依存性の段階（ＣＷＲＳＡ６）を表す（Ｃｏｒｅｙ，Ｅ．ら、「ＬｕＣａＰ３５：ａ  ｎｅｗ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｏ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ」、Ｐｒｏｓｔａｔｅ、第５５巻、２３９−２４６頁（２００３）；Ｎａｇａｂｈｕｓｈａｎ，Ｍ．ら、「ＣＷＲ２２：ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｗｉｔｈ  ｓｔｒｏｎｇｌｙ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  ｒｅｌａｐｓｅｄ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｂｏｔｈ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｓｏｆｔ  ａｇａｒ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、第５６巻、３０４２−３０４６頁（１９９６））。Ｒ−エトドラクの活性は、その有効性に関して、アンドロゲン依存性モデルと非依存性モデルとの間を区別しないようであった。アンドロゲンは、前立腺癌の生存および進行において重大な役割を果たし、このことが、アンドロゲン除去治療が転移疾患に対して認可された最初の治療である理由である。前立腺癌は続いて、アンドロゲン非依存性の状態に進行し、その根底にあるメカニズムは明らかでない。この癌状態を処置するための新規治療法を同定する緊急の必要性がその分野に存在するので、それに続く研究は、アンドロゲン非依存性モデルに焦点を合わせた。
【００５１】
Ｎａｇａｂｈｕｓｈａｎ，Ｍ．ら、「ＣＷＲ２２：Ｔｈｅ  Ｆｉｒｓｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｗｉｔｈ  Ｓｔｒｏｎｇｌｙ  Ａｎｄｒｏｇｅｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｐｓｅｄ  Ｓｔｒａｉｎｓ  Ｂｏｔｈ  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｓｏｆｔ  Ａｇａｒ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、第５６巻、１０５８−１０６１頁（１９９６）；Ｗａｉｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ａ．ら、「ＣＷＲ２２：Ａｎｄｒｏｇｅｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｍｏｄｅｌ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｈｕｍａｎ  ＰｒｏｓｔａｔｉｃＣａｒｃｉｎｏｍａ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第５４巻、６０４９−６０５２頁（１９９４）において記載されたように、全ての系統に、再構築した基底膜（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡから入手したＭａｔｒｉｇｅｌ）、および１００μｇ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０と共に注射した。（ＬｕＣａｐ−３５系統に関して）血清テストステロンレベルを維持するために、１２．５ｍｇの徐放性テストステロンペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ；Ｓａｒａｓｏｔａ、Ｆｌｏｒｉｄａから入手した）を、腫瘍細胞接接種を与える１週間前に、マウスに皮下移植した。
【００５２】
（実施例２）
（併用療法の実施）
単一薬剤の有効性研究に関して、処置は、０．５％のメチルセルロースおよび０．５％のポリソルベート８０を補充した水中、２００ｍｇ／ｋｇのＲ−エトドラク（Ｓａｌｍｅｄｉｘ，Ｉｎｃ．；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手した）の毎日の経口胃管栄養法から成っていた。併用レジメン研究は、２００ｍｇ／ｋｇのＲ−エトドラクの毎日の経口胃管栄養法、およびリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の２０ｍｇ／ｋｇの２Ｃ４（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡから得た）の１週間に２回の腹腔内注射から成っていた。
【００５３】
（実施例３）
（併用療法の有効性の統計学的分析）
腫瘍を、副尺付きカリパスで３日〜４日ごとに測定し、そして腫瘍体積を式：π／６×（より大きな直径）×（より小さな直径）２によって計算した。少なくとも６５ｍｍ３の明白に確立した腫瘍を有する動物を、処置群に指定した。Ｒ−エトドラクで処置したＣＷＲＳＡ６異種移植片を用いて、経時的研究を実行した。少なくとも１０００ｍｍ３の明白に確立した腫瘍を有する１４日齢ＣＷＲＳＡ６異種移植片を、２つのコホート：実験およびコントロールに無作為化した。実験群には２００ｍｇ／ｋｇのＲ−エトドラクを毎日経口胃管栄養法で与え、そして処置開始の２４時間後（ｎ＝３）、４８時間後（ｎ＝３）、および７２時間後（ｎ＝３）に屠殺した。コントロールコホートは、研究の開始時に屠殺した。
【００５４】
処置群の腫瘍体積間の相違を、交換試験を用いて、時間とともに比較した。この試験の帰無仮説は、処置は時間とともに腫瘍体積に対して差次的効果を有さないということである。その仮説を試験するために使用した統計（ＳＳ＿Ｄｅｖ）は、全ての時点を合計した平均腫瘍体積間の差の二乗の合計であった。その統計は、２つの処置群の平均腫瘍体積の軌線が異なる量を反映する（Ａｇｕｓ，Ｄ．Ｂ．ら、「Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  ｔｏ  Ａｎｔｉ−ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  Ａｎｄｒｏｇｅｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  −Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｍｏｄｅｌｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、第５９巻、４７６１−４７６４頁（１９９９））。
【００５５】
（実施例４）
（ＲＮＡ抽出）
全ＲＮＡを、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手した）を用いて前立腺腫瘍またはＬＮＣａＰ細胞株から抽出した。サンプルを９５℃で３分間加熱し、そして急冷（ｓｎａｐ−ｃｏｏｌｅｄ）し、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションを防ぐためにＤＮアーゼＩ処理を行った。ＤＮアーゼＩ（Ａｍｂｉｏｎ；Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸから入手した）を使用して、反応を妨げ得るあらゆるゲノムＤＮＡを除去した。サンプルをＤＮアーゼＩで、３７℃で１時間処理した。ＲＮＡの収量を分光計で定量した。
【００５６】
（実施例５）
（リアルタイム定量的逆転写およびＰＣＲ分析）
全ＲＮＡを、ｃＤＮＡへ逆転写（ＲＴ）し、そしてリアルタイムＴＡＱｍａｎ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡから入手した）を用いて、同じ反応物中でポリメラーゼ連鎖反応を行った。この分析のために使用したプライマー／プローブセットの配列は以下のとおりである。ＦおよびＲは、それぞれ順方向プライマーおよび逆方向プライマーであり、そしてＰは蛍光標識プローブである。
【００５７】
【表１】
2007504164.tif 000002
サイクリンＤ１（Ｔａｋａｙａｓｕ，Ｈ．ら、「Ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｄｅｌｅｔｏｎｓ  ａｎｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｇｅｎｅ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１  ａｎｄ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ａｎｄ  ｐｏｏｒｌｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔｏｍａ」、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第７巻、９０１−９０８頁（２００１））およびＨＥＲキナーゼレセプターのｍＲＮＡ発現を、Ａｇｕｓ，Ｄ．Ｂ．ら、「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＥｒｂＢ２  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、第２巻、１２７−１３７頁（２００２）で記載されたようなプライマーセットを用いて分析した。
【００５８】
全てのプライマーセットに関するリアルタイムワンステップＲＴ−ＰＣＲサイクルの条件は以下のとおりであった：ＲＴ工程のために４８℃で３０分；ＡＭＰＬＩＴＡＱ  Ｇｏｌｄ活性化のために９５℃で１０分；そしてｃＤＮＡ変性（９５℃、１５ｓ）、およびアニーリング／伸長工程（６０℃で１分間）のために４０サイクル。各テンプレートについてＰＣＲ反応を、サンプルあたり１μｇの全ＲＮＡを用いて、３連で行った。各遺伝子特異的プライマー対を、標準的な３８４穴プレートで試験した。ＣＷＲＳＡ６腫瘍株から調製した１０ｎｇ〜１０００ｎｇの全ＲＮＡを用いて、標準曲線を作成した。３連の反応からの閾値サイクル（ＣＴ）が、１サイクル数より大きく異ならないように、全ての実験を最適化した。
【００５９】
比較ＣＴ法（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて、βアクチンコントロールと比較した各遺伝子の遺伝子発現の相対的に定量した。最初に、βアクチン反応からのＣＴ値を、３組それぞれに関して平均した。次に、目的の遺伝子反応からのＣＴ値を平均した。目的の遺伝子の平均を、βアクチンの平均で除算して、全ＲＮＡの変動性を考慮した。
【００６０】
（実施例６）
（ウェスタンブロット分析）
腫瘍溶解物（１レーンあたり１００μｇ）またはＬＮＣａＰ細胞からの溶解物（１レーンあたり１００μｇ）のアリコートを用いて、Ｔｏｗｂｉｎ，Ｈ．「Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｇｅｌｓ  ｔｏ  Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｓｈｅｅｔｓ：Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７６巻、第９号、４３５０−４３５４頁（１９７９）において記載されるように、イムノブロットを行った。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｃ．；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡから入手した）を用いて決定した。溶解物を１０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、そしてニトロセルロースフィルターへ移した。その膜を、抗βアクチン抗体（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手したＡ２０６６）と並べて、ＰＰＡＲγ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｉｎｃ．；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡから入手したＳｃ−７２７３）、ＥＲＫ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｉｎｃ．；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡから入手したＳｃ−９４）、およびホスホ−ｐ４４／４２ＭＡＰキナーゼ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ；Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡから入手した９１０１Ｓ）、およびサイクリンＤ１（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手した５５４１８０）に対する抗体と共に、４℃で一晩インキュベートし、そして十分に洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した適切なαマウスまたはαウサギ２次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＫから得た）と共にインキュベートした。
【００６１】
（実施例７）
（細胞培養の維持）
生の２６７．４細胞を、１０％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、１００μｇ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充した、高グルコースを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ；Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹから入手した）中で、３７℃および５％ＣＯ２で維持した。
【００６２】
（実施例８）
（トランスフェクション）
トランスフェクションのために、細胞を、トランスフェクション前に１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で少なくとも２４時間増殖させた。一過性トランスフェクションを、トランスフェクションの前に少なくとも２４時間、１２穴プレートで行った。約５０％コンフルエンスにおいて、０．５μｇのレポータープラスミド（ＡＯｘ）３−ＴＫ−Ｌｕｃ、０．１μｇから０．２μｇのコントロールプラスミドｐＣＭＸβｇａｌ、０．１μｇのＰＰＡＲγ発現プラスミドおよびウェルあたり全部で１μｇのＤＮＡのためのキャリアＤＮＡを用いて、ＦｕＧＥＮＥトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ；Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙから得た）を用いて、製造会社の指示書に従って、細胞をトランスフェクトした。１６時間後、細胞を洗浄し、そして０．５％のＤＭＳＯ中て調製した、適切な量の薬剤を含む新しい培地を、さらに２４時間にわたって細胞に加えた。細胞を、ビヒクル単独（ＤＭＳＯ）、インドメタシン、ロシグリタゾン、または種々の濃度のＲ−エトドラクまたはＳ−エトドラクのいずれかで処理した。
【００６３】
ルシフェラーゼアッセイのために、１％のＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ  Ｃｏ．；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡから入手した）を含むリン酸カリウム緩衝液中で細胞を溶解し、そしてマイクロタイタープレートルミノメーターを用いて、ルシフェリンの存在下で発光を検出した。ルシフェラーゼの値を、βガラクトシダーゼ内部コントロールを用いて、トランスフェクション効率における変動に関して正規化した。その結果を、相対的ルシフェラーゼユニット（ＲＬＵ）として表す。ルシフェラーゼ活性の値は、３連で実施した３つの独立したトランスフェクションの最小値の平均を表す。
【００６４】
（実施例９）
（Ｒ−エトドラクは、ＰＰＡＲγをトランス活性化（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｅ）する）
前立腺癌腫細胞株、２２Ｒｖ１およびＬＮＣａＰ、およびヒト急性単球性白血病（ＴＨＰ−１）細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手し、そして１０％のＦＢＳ、１００μｇ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ；Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹから入手した）中で維持した。３つの異なるアッセイが、Ｒ−エトドラクがＰＰＡＲγトランス活性化因子として機能する能力を有することを示した。
【００６５】
最初に、Ｒ−エトドラクは、一過性トランスフェクションアッセイにおいて、用量依存的な様式で、ＰＰＲＥ配列を含むプロモーターによって促進される、レポーター遺伝子の発現を増強する（図１Ａ）。２２Ｒｖ１細胞を、１００ｍｍの皿に播種し、そして１８時間接着させた。次いで培地を、１００μｇ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン±Ｒ−エトドラクを含む、フェノールレッドフリー、および血清を含まないＲＰＭＩ１６４０で、示した時間にわたって置換した。ＭＡＰキナーゼの活性化を、上で記載した方法を用いて、ウェスタンブロット分析によって評価した。ＬＮＣａＰ細胞を、Ｒ−エトドラクで、２００μＭ、４００μＭ、および６００μＭの濃度で１８時間処理した。全タンパク質およびｍＲＮＡを、前に記載したような方法を用いて単離した。サイクリンＤ１タンパク質およびｍＲＮＡ発現を、前に記載したようにウェスタンブロットおよびリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイによって評価した。このトランス活性化機能は、組換えＰＰＡＲγの存在下のみで媒介される。エトドラクのＣＯＸ阻害アナログ、Ｓ−エトドラクも、ＰＰＡＲγをトランス活性化し得るが、有意に低いレベルである。１００μＭのＲ−エトドラク（１３倍）によるトランス活性化は、１０μＭの既知のＰＰＡＲγリガンドおよびＮＳＡＩＤ、インドメタシンに相当し、Ｒ−エトドラクはＰＰＡＲγトランス活性化活性を有することを示唆する。
【００６６】
別の示されたＰＰＡＲγリガンドであるロシグリタゾンを、ポジティブコントロールとして使用した。２つの他のアッセイが、Ｒ−エトドラクおよびＰＰＡＲγの存在下で脂肪細胞分化の指標としてＣＤ３６の発現および中性脂質の取り込みを示すことによって、Ｒ−エトドラクがＰＰＡＲγトランス活性化因子であるという概念を支持する。
【００６７】
２番目に、ホルボールエステルによるプロテインキナーゼＣの活性化と、ＰＰＡＲγトランス活性化の組み合わせが、マクロファージにおいてスカベンジャーレセプターＣＤ３６を誘導することが報告された（ＨａｎおよびＳｉｄｅｌｌ、２００２）。ＣＤ３６は、ＰＰＡＲγに調節される遺伝子として記録されている（Ｔｏｎｔｏｎｏｚら、１９９８）。下流の指標としてＣＤ３６の発現を使用して、２００μＭのＲ−エトドラクおよび２０μＭのトログリタゾン（示されたＰＰＡＲγ活性化因子）は、フローサイトメトリーアッセイによって測定される、等価な有効性を示した（図１Ｂ）。ＴＨＰ−１細胞を、４０ｎｇ／ｍｌのホルボールエステル（ＴＰＡ）の４８時間の存在下または非存在下で、２００μＭのエトドラク（ラセミ混合物）および２０μＭのトログリタゾンで５日間処理した。細胞を固定し、そして共役していない抗ＣＤ３６およびＦＩＴＣ共役抗ＩｇＧで染色し、そしてフローサイトメトリーで分析した。１０，０００の生存能力のある細胞の集団を、各処理に関して分析した。
【００６８】
３番目に、ＰＰＡＲγは脂肪細胞分化の支配的なレギュレーターとして受け入れられている。中性脂質の取り込みが脂肪細胞分化の指標であり、そしてこれら中性脂質のオイルレッドＯ染色が、この分化現象を示す受け入れられた手順である（Ｔｏｎｔｏｎｏｚら、１９９８）。レトロウイルスで発現させた組換えＰＰＡＲγを安定に過剰発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を、Ｄｒ．Ｒｏｎａｌｄ  Ｅｖａｎｓ（Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）から得た。１μＭのＲ−エトドラクで処理した細胞は、中性脂質の蓄積およびＰＰＡＲγ活性と関連する形態学的変化を示し、それは同様の濃度のトログリタゾンで観察されるものに匹敵する（図１Ｃ）。組換えＰＰＡＲγを安定に発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞（Ｊｏｎａｓ  Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡのＤｒ．Ｒｏｎａｌｄ  Ｅｖａｎｓから入手した）を、１０％のＢＣＳ、１００μｇ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ；Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹから入手した）中で維持した。その細胞を、示した化合物および濃度で７日間処理し、そしてＧｒｅｅｎおよびＫｅｈｉｎｄｅ（「Ｓｕｂｌｉｎｅｓ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ３Ｔ３  ｃｅｌｌｓ  ｔｈａｔ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ  ｌｉｐｉｄ」、Ｃｅｌｌ、第１巻、１１３−１１６頁（１９７４））によって記載されたように、オイルレッドＯで中性脂質を染色した。脂質の取り込みは用量依存性であり、そして５００μＭの濃度のＲ−エトドラクにおいて有意により明白であった。空のレトロウイルスベクターでトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞は、トログリタゾンまたはＲ−エトドラクのいずれによっても脂質の取り込みを示さなかった（データは示していない）。ＰＰＡＲγはＲ−エトドラクによってポジティブに調節され得ることを示し、それを前立腺腫瘍モデルに対して可能性のある治療薬として使用する可能性を有するとみなされた。
【００６９】
（実施例１０）
（Ｒ−エトドラクによる前立腺癌異種移植片の増殖阻害）
イムノブロット分析は、アンドロゲン依存性ＬｕＣａＰ−３５およびアンドロゲン非依存性ＣＷＲＳＡ６異種移植片におけるＰＰＡＲγ１の存在を示した（図２Ａ）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、異種移植片におけるＰＰＡＲγｍＲＮＡの存在をさらに確認した（データは示していない）。ＰＰＡＲγ２に特異的なプライマーは、測定可能なほどの増幅をもたらさず、一方で全ＰＰＡＲγ特異的プライマーは、強い増幅を引き起こして、前立腺癌異種移植片における支配的なアイソフォームがＰＰＡＲγ１であることを示唆した。Ｒ−エトドラク処理の腫瘍細胞増殖に対する効果を調べるために、確立したアンドロゲン非依存性ＣＷＲＳＡ６またはアンドロゲン依存性ＬｕＣａＰ−３５前立腺癌異種移植片を有する動物に、Ｒ−エトドラクを投与した（２００ｍｇ／ｋｇ  ｏ．ｇ．毎日）。この用量において、治療動物の間で致死的な毒性または体重減少（体重の１０％より大きな）は観察されず、そして５００μＭの薬物濃度が血清中で達成された（データは示していない）。Ｒ−エトドラクは、コントロール処理動物と比較して、アンドロゲン非依存性ＣＷＲＳＡ６異種移植片（６６％の増殖阻害、ｐ＝０．００２、ｎ＝１０）およびアンドロゲン依存性ＬｕＣａＰ−３５異種移植片（４６％の増殖阻害、ｐ＝０．０１０３、ｎ＝１０）において有意な腫瘍増殖阻害を示した（図２Ｂ）。これらの研究は、Ｒ−エトドラクがＰＰＡＲγ陽性前立腺癌異種移植片の増殖を阻害することを示す。
【００７０】
（実施例１１）
（Ｒ−エトドラクはサイクリンＤ１発現のダウンレギュレーションを引き起こす）
ＰＰＡＲγのトランス活性化は、サイクリンＤ１プロモーターの抑制によって細胞周期の進行に影響を有することが十分に記載されている（Ｑｉｎ，Ｃ．ら、「Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ  Ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１  ａｎｄ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｉｎ  ＭＣＦ−７  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第６３巻、９５８−９６４頁（２００３）；Ｗａｎｇ，Ｃ．ら、「Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、第２３巻、６１５９−６１７３頁（２００３））。よって、我々は、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞をＲ−エトドラクで１８時間処理した後、サイクリンＤ１ｍＲＮＡ（図３Ａ）およびタンパク質（図３Ｂ）の発現におけるダウンレギュレーションを観察した。サイクリンＤ１発現における減少は、Ｒ−エトドラクの濃度の増加に依存していた。Ｒ−エトドラクによるサイクリンＤ１発現の阻害は、Ｒ−エトドラクが腫瘍増殖を阻害するメカニズムへの洞察を提供する。
【００７１】
（実施例１２）
（Ｒ−エトドラク処理はＰＰＡＲγタンパク質の分解を引き起こす）
前立腺異種移植片に対するＲ−エトドラクの腫瘍阻害メカニズムを明らかにするために、Ｒ−エトドラク処理後の前立腺異種移植片においてＰＰＡＲγタンパク質レベルを分析した。一過性トランスフェクション研究は、Ｒ−エトドラクがＰＰＡＲγトランス活性化因子として作用することを示したので、その薬物が有意な腫瘍増殖の抑制を引き起こしたという理由で、アップレギュレーションまたはＰＰＡＲγタンパク質は変化しないことが予測された。驚くべきことに、ビヒクルで処理したコントロールと比較して、薬剤処理の２週間から３週間後、ＰＰＡＲγタンパク質は腫瘍から完全に除去された（図４Ａ）。この時点でのＰＰＡＲγ１ｍＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析は、それがコントロール動物と同様であったことを示し（図４Ｂ）、ＰＰＡＲγダウンレギュレーションは、主に転写後の事象であることを示した。
【００７２】
ＭＡＰキナーゼによるＰＰＡＲγのリン酸化が、ユビキチン−プロテアソーム媒介性分解経路による核レセプター機能のネガティブな調節を引き起こしたのかどうか明らかにするために、Ｒ−エトドラク処理後のホスホ−ＥＲＫ１およびホスホ−ＥＲＫ２レベルを分析した（Ｆｌｏｙｄ，Ｚ．Ｅ．およびＪ．Ｍ．Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、「Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＰＡＲｇａｍｍａ  ｉｎ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７７巻、４０６２−４０６８頁（２００２））。ホスホ特異的ＭＡＰキナーゼ抗体を用いて、リン酸化ｐ４４／４２レベルの急激な増加が、Ｒ−エトドラク処理の２４時間後に観察された（図５Ａ）。この一過性の増加の後、残りの７２時間までの時間経過にわたってＭＡＰキナーゼの低レベルの持続した活性化が続いた。薬物処理の３週間後、ホスホ−ＥＲＫ１／２タンパク質のイムノブロット分析は、７２時間のものと同様であるようであった（データは示していない）。全ＭＡＰキナーゼの発現に相違は観察されず、そして等量の負荷が抗βアクチン抗体によって確認された。前立腺癌異種移植片におけるこれらの結果は、２２Ｒｖ１前立腺癌細胞を、異種移植片研究において達成されたものと生理学的に同様のＲ−エトドラク濃度（５００μＭ）で処理することによって、インビトロで後に確認された（データは示していない）。ホスホ−ＭＡＰキナーゼ活性化の一過性のピークが、インビボ研究と比較して穏やかであるが、Ｒ−エトドラクの添加の２０分以内に観察され、そして次いで持続する活性化レベルを維持した（図５Ｂ）。トログリタゾン処理によっても観察される、ホスホ−ＭＡＰキナーゼ活性化のそのような一過性のアップレギュレーションは、最終的にＰＰＡＲγタンパク質の分解を引き起こす（Ｂａｅｋ，Ｓ．Ｊ．ら、「Ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ，ａ  Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  γ（ＰＰＡＲγ）Ｌｉｇａｎｄ，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  Ｅａｒｌｙ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ−１  Ｇｅｎｅ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｏｆ  ＰＰＡＲγ．Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７８巻、第８号、５８４５−５８５３頁（２００３））。これらの結果は、Ｒ−エトドラク（２００ｍｇ／ｋｇ  ｏ．ｇ．毎日）処理は、腫瘍増殖に対して２つの対立する効果を発揮することを示唆する。Ｒ−エトドラクは、一過性トランスフェクション研究において示されたようにＰＰＡＲγの抗腫瘍形成潜在能力を増加させるだけでなく、ホスホ−ＥＲＫ１／２のアップレギュレーションによってＰＰＡＲγタンパク質のレベルも調節し得、それはＲ−エトドラクの抗腫瘍形成性に対して結果を有し得る。
【００７３】
（実施例１３）
（併用療法による前立腺腫瘍増殖の抑制）
Ｒ−エトドラクによる処理は、ホスホ−ＭＡＰキナーゼのアップレギュレーション、およびそれに続くＰＰＡＲγタンパク質の分解を引き起こしたので、ホスホ−ＭＡＰキナーゼの阻害はＲ−エトドラクの有効性を増す。ＭＡＰキナーゼの活性化および続くＰＰＡＲγの分解を防ぐために、ＣＷＲＳＡ６異種移植片を、２Ｃ４と組み合わせたＲ−エトドラクのレジメンで処理した。このインヒビター、２Ｃ４は、ＥｒｂＢ２のＨＥＲキナーゼレセプターファミリーのメンバーとのリガンド誘導へテロ二量体化を立体的に阻害することによって、ＭＡＰキナーゼの活性化を排除するヒト化モノクローナル抗体である（Ａｇｕｓ，Ｄ．Ｂ．ら、（２００２））。
【００７４】
確立したＣＷＲＳＡ６異種移植片を有するマウスに、Ｒ−エトドラク（２００ｍｇ／ｋｇ  ｏ．ｇ．毎日  ｎ＝１０）または２Ｃ４（２０ｍｇ／ｋｇ  Ｉ．Ｐ．  週に２回  ｎ＝１０）いずれかの単独療法、またはＲ−エトドラクと２Ｃ４との併用レジメンを３週間（ｎ＝１０）与えた。これらの用量において、致死的な毒性または有意な体重減少は処理した動物において観察されなかった。Ｒ−エトドラクと２Ｃ４との併用レジメンを与えたＣＷＲＳＡ６異種移植片は、Ｒ−エトドラクの単独療法（腫瘍阻害５９％、ｐ＜０．００１、ｎ＝１０）および２Ｃ４単独（腫瘍阻害５１％、ｐ＝０．００１、ｎ＝１０）を与えた動物と比較して、有意な腫瘍阻害を示した（図６Ａ）。これらの結果は、Ｒ−エトドラクの有効性を、ホスホ−ＭＡＰキナーゼを阻害することによって改善し得るという仮説を支持する。
【００７５】
この仮説による１つの予測は、併用療法後のＰＰＡＲγタンパク質の分解からの救出である。これを確かめるために、前の研究において異種移植片から全細胞溶解物を産生し、そしてＰＰＡＲγタンパク質に関するイムノブロット分析にかけた。予測したように、Ｒ−エトドラク単独で処理したサンプルは、ＰＰＡＲγタンパク質が完全に除去され（図６Ｂ、レーン１および２）、そしてＲ−エトドラクと２Ｃ４との併用レジメンを与えた動物は、そのＰＰＡＲγタンパク質発現を維持した（図６Ｂ、レーン５および６）。２Ｃ４単独で処理した異種移植片もＰＰＡＲγを発現した（図６Ｂ、レーン３および４）。Ｒ−エトドラク処理は、ＨＥＲキナーゼレセプターのｍＲＮＡ発現を変化させなかった（データは示していない）。
【００７６】
上記の説明は本発明の特定の実施態様に言及するが、多くの改変がその精神から逸脱することなくなされ得ることが理解される。例えば、本発明の組成物または同様の組成物は、当業者によって、そして過度の実験無しに容易に認識されるような、観察される多くの数の疾患状態の処置に使用され得る。添付の特許請求の範囲は、そのような改変を本発明の真の範囲および精神に含まれるように含むことが意図される。
【００７７】
従って、本明細書中で開示される実施態様は、全ての局面において、限定的ではなく例示的であると考えられ、本発明の範囲は前述の説明ではなく添付の特許請求の範囲によって示され、そしてそれゆえその特許請求の範囲と等価なものの意味および範囲内に含まれる全ての変更は、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１Ａ】図１は、本発明の実施態様による、Ｒ−エトドラクのＰＰＡＲγをトランス活性化する能力を示す。図１Ａは、ＲＡＷ２６７．４マウスマクロファージにおいて、エトドラク、インドメタシン、およびロシグリタゾンの濃度を増加させることによる、ＰＰＡＲγレポーター構築物（ＡＯｘ）３−ＴＫ−ＬｕｃのＲ−エトドラクトランス活性化のグラフ表示である。その結果は、薬剤処理無しのコントロールに対するルシフェラーゼ発現の誘導倍数として示し、そして３つの別々の実験に関して、平均±１標準偏差（ＳＤ）として表す。トランスフェクション効率を、ＣＭＶ−β−ｇａｌレポーター構築物を用いて正規化した。
【図１Ｂ】図１は、本発明の実施態様による、Ｒ−エトドラクのＰＰＡＲγをトランス活性化する能力を示す。図１Ｂは、ＴＨＰ−１細胞におけるＣＤ３６スカベンジャーレセプターの、エトドラクおよびトログリタゾン（ＴＧＺ）による、ホルボールエステル（ＴＰＡ）誘導発現の増強のグラフ表示である。ＣＤ３６発現における増加を、示した薬剤と共にＴＰＡの存在下または非存在下においてフローサイトメトリーによって決定した。その結果を、抗ＣＤ３６抗体とコントロールのアイソタイプがマッチした抗体との間の、平均蛍光の相違として示す。
【図１Ｃ】図１は、本発明の実施態様による、Ｒ−エトドラクのＰＰＡＲγをトランス活性化する能力を示す。図１Ｃは、Ｒ−エトドラクによって誘導された、ＮＩＨ３Ｔ３−ＰＰＡＲγ細胞における脂質の蓄積の写真を示す。組換えＰＰＡＲγを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を、（ｉ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）のみ、（ｉｉ）１μＭのトログリタゾン、（ｉｉｉ）１μＭのＲ−エトドラクまたは（ｉｖ）５００μＭのＲ−エトドラクで７日間処理した。細胞をオイルレッドＯ染料によって中性脂質に関して染色した。写真を４００倍の倍率で示す。濃い斑点は、中性脂質の蓄積を示す。
【図２Ａ】図２は、本発明の実施態様による、ＰＰＡＲγ１陽性前立腺癌異種移植片に対するＲ−エトドラクの効果を示す。図２Ａは、アンドロゲン非依存性ＣＷＲＳＡ６およびアンドロゲン依存性ＬｕＣａＰ−３５ヒト前立腺癌異種移植片から調製されたタンパク質溶解産物におけるＰＰＡＲγ１発現を示す、代表的なウェスタンブロット分析を示す。
【図２Ｂ】図２は、本発明の実施態様による、ＰＰＡＲγ１陽性前立腺癌異種移植片に対するＲ−エトドラクの効果を示す。図２Ｂは、２００ｍｇ／ｋｇの用量を毎日ｏ．ｇ．で投与されたＲ−エトドラク（黒丸）またはビヒクルで処理したコントロール（白丸）に対するＣＷＲＳＡ６、またはＬｕＣａＰ−３５腫瘍の反応のグラフ表示である。結果を、平均腫瘍体積（ｎ＝１０）±ＳＥとして示す。
【図３Ａ】図３は、本発明の実施態様による、Ｒ−エトドラクで処理したＬＮＣａＰ細胞における、サイクリンＤ１  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現の減少を証明する。図３Ａは、１８時間にわたって増加する濃度のＲ−エトドラク（０μＭ、２００μＭおよび４００μＭ）で処理したＬＮＣａＰ細胞におけるサイクリンＤ１ｍＲＮＡの発現を示す、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲアッセイのグラフ表示である。ＲＮＡのレベルを、１８Ｓ  ＲＮＡに関するアッセイを用いて正規化した。未処理細胞におけるサイクリンＤ１転写物レベルを１００％に設定した。このグラフは、３つの独立した実験からの平均±ＳＤを示す。
【図３Ｂ】図３は、本発明の実施態様による、Ｒ−エトドラクで処理したＬＮＣａＰ細胞における、サイクリンＤ１  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現の減少を証明する。図３Ｂは、１８時間にわたって増加する濃度のＲ−エトドラク（０μＭ、２００μＭ、４００μＭおよび６００μＭ）で処理したＬＮＣａＰ細胞におけるサイクリンＤ１タンパク質の発現を示すウェスタンブロット分析を示す。正規化コントロールとして、β−アクチンタンパク質を使用した。この図は、少なくとも３つの独立したアッセイの代表的なものである。
【図４Ａ】図４は、本発明の実施態様による、ＣＷＲＳＡ６およびＬｕＣａＰ−３５前立腺癌異種移植片における、Ｒ−エトドラク処理後のＰＰＡＲγタンパク質の分解を証明する。図４Ａは、ＣＷＲＳＡ６およびＬｕＣａＰ−３５ヒト前立腺癌異種移植片を含むＲ−エトドラクの有効性研究から調製されたタンパク質溶解産物におけるＰＰＡＲγ１の発現を示すウェスタンブロット分析を示す。レーン３、レーン４、レーン７およびレーン８は、ビヒクルで処理したコントロール腫瘍を表し、一方、レーン１およびレーン２は、Ｒ−エトドラクによる処理の１９日後のＣＷＲＳＡ６腫瘍を表し、そしてレーン５およびレーン６は、Ｒ−エトドラクによる処理の１３日後のＬｕＣａＰ−３５腫瘍を表す。同量のタンパク質負荷を、β−アクチン抗体を用いて確認した。
【図４Ｂ】図４は、本発明の実施態様による、ＣＷＲＳＡ６およびＬｕＣａＰ−３５前立腺癌異種移植片における、Ｒ−エトドラク処理後のＰＰＡＲγタンパク質の分解を証明する。図４Ｂは、動物有効性研究の後、ＣＷＲＳＡ６およびＬｕＣａＰ−３５異種移植片におけるＰＰＡＲγ１ｍＲＮＡ発現のリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。ＰＰＡＲγ  ｍＲＮＡの発現レベルを、β−アクチンｍＲＮＡレベルに対して正規化し、そして結果を、コントロール動物に対する平均（ｎ＝５）相対的パーセント±ＳＤとして示す。処理した動物と未処理のコントロール動物との間に有意な差は観察されなかった。
【図５Ａ】図５は、本発明の実施態様による、ＣＷＲＳＡ６異種移植片および２２Ｒｖ１前立腺癌細胞における、増加するホスホ−ＥＲＫ活性におけるＲ−エトドラク処理の効果を示す。図５Ａは、材料および方法で記載したようなタイムコース実験後、Ｒ−エトドラクで処理したＣＷＲＳＡ６異種移植片から調製した溶解産物のウェスタンブロット分析を示す。動物に２４時間ごとにＲ−エトドラクを与えた；レーン１およびレーン２は、処理の２４時間後の腫瘍を示し、レーン３およびレーン４は処理の４８時間後の腫瘍を示し、そしてレーン５およびレーン６はＲ−エトドラクによる処理の７２時間後の腫瘍を示す。レーン７およびレーン８は、処理の７２時間後のビヒクル処理コントロール動物を示す。等量の負荷を、β−アクチン抗体および全ＭＡＰキナーゼに対する抗体によって確認した。
【図５Ｂ】図５は、本発明の実施態様による、ＣＷＲＳＡ６異種移植片および２２Ｒｖ１前立腺癌細胞における、増加するホスホ−ＥＲＫ活性におけるＲ−エトドラク処理の効果を示す。図５Ｂは、示した種々の時間にわたってＲ−エトドラク（５００μＭ）で処理した２２Ｒｖ１細胞から調製した、全細胞溶解産物を示す。代表的な実験を、独立して３回繰り返した。
【図６Ａ】図６は、本発明の実施態様による、２Ｃ４によるＭＡＰキナーゼの阻害は、ＰＰＡＲγタンパク質のＲ−エトドラク誘導分解を妨げ、従ってＲ−エトドラクの有効性を促進することを示す。図６Ａは、２００ｍｇ／ｋｇを毎日ｏ．ｇ．で投与されたＲ−エトドラク（黒丸）、または２０ｍｇ／ｋｇを腹膜内注射で投与された２Ｃ４（黒四角）、または前に述べた用量のＲ−エトドラクおよび２Ｃ４の併用レジメン（白四角）に対するＣＷＲＳＡ６腫瘍の反応のグラフ表示である。矢印は、治療の開始を示す。結果を、平均腫瘍体積（ｎ＝１０）±ＳＤとして示す。
【図６Ｂ】図６は、本発明の実施態様による、２Ｃ４によるＭＡＰキナーゼの阻害は、ＰＰＡＲγタンパク質のＲ−エトドラク誘導分解を妨げ、従ってＲ−エトドラクの有効性を促進することを示す。図６Ｂは、処理の２２日後、アンドロゲン非依存性ＣＷＲＳＡ６ヒト前立腺異種移植片腫瘍を含むＲ−エトドラクと２Ｃ４との併用有効性研究から調製された溶解産物におけるＰＰＡＲγ１の発現を示すウェスタンブロット分析を示す。レーン１およびレーン２は、Ｒ−エトドラクで処理した腫瘍を示し、レーン３およびレーン４は、２Ｃ４のみを与えられた腫瘍を示し、そしてレーン５およびレーン６は、Ｒ−エトドラクと２Ｃ４との組み合わせを与えられた腫瘍を示す。
【図１Ａ】
2007504164.tif 000003
【図１Ｂ】
2007504164.tif 000004
【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年4月6日(2006.4.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における状態を処置するための組成物であって、以下：
非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）；および
ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビター
を含む、組成物。
【請求項２】
哺乳動物における状態を処置するための組成物であって、以下：
ＮＳＡＩＤ周期で投与するのに適切な非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）；および
ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビター周期で投与するのに適切なＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビター
を含む、組成物。
【請求項３】
ビヒクル、添加物、賦形剤、治療用化合物、薬学的補助剤、前記状態の処置に有用な薬学的因子、キャリアおよびこれらの組み合わせからなる群より選択されるさらなる成分をさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＮＳＡＩＤが、アスピリン、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フロクタフェニン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナメート、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダク、テノキシカム、チアプロフェン酸、トルメチン、これらの誘導体、これらのアナログ、これらの薬学的同等物、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターが、組換えヒト化モノクローナル抗体２Ｃ４、アンサマイシン、ゲフィチニブ、エルロチニブ、モノクローナル抗体、ラパマイシン、ｓｒｃインヒビター、チロシンキナーゼインヒビター、化合物ＬＹ２９４００２、イマチニブメシレート、トラスツズマブ、化合物ＣＩ１０３３、化合物ＰＫＩ１６６、化合物ＧＷ２０１６、化合物ＥＫＢ５６９、化合物ＩＭＣ−Ｃ２２５、ならびにこれらの誘導体、これらのアナログ、これらの薬学的同等物およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＮＳＡＩＤが、Ｒ−エトドラクである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターが、組換えヒト化モノクローナル抗体２Ｃ４である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＮＳＡＩＤの量が、前記哺乳動物の１ｋｇあたり約１００ｍｇ〜約５００ｍｇである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターの量が、前記哺乳動物の１ｋｇあたり約５ｍｇ〜約４０ｍｇである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビター周期が、週２回である、請求項２に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＮＳＡＩＤ周期が、毎日である、請求項２に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＮＳＡＩＤの量および前記ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターの量が、腹腔内、経口胃管栄養法、静脈内、舌下、局所、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、鼻内、非経口および直腸からなる群より独立して選択される送達技術による投与に適切である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項１３】
哺乳動物における状態を処置することにおいて使用するためのキットであって、以下：
一定量の非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）；
一定量のＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビター；および
該状態の処置における該ＮＳＡＩＤおよび該ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターの使用のための指示書
を備える、キット。
【請求項１４】
前記ＮＳＡＩＤが、アスピリン、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フロクタフェニン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナメート、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダク、テノキシカム、チアプロフェン酸、トルメチン、これらの誘導体、これらのアナログ、これらの薬学的同等物、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターが、組換えヒト化モノクローナル抗体２Ｃ４（２Ｃ４）、アンサマイシン、ゲフィチニブ、エルロチニブ、モノクローナル抗体、ラパマイシン、ｓｒｃインヒビター、チロシンキナーゼインヒビター、化合物ＬＹ２９４００２、イマチニブメシレート、トラスツズマブ、化合物ＣＩ１０３３、化合物ＰＫＩ１６６、化合物ＧＷ２０１６、化合物ＥＫＢ５６９、化合物ＩＭＣ−Ｃ２２５、ならびにこれらの誘導体、これらのアナログ、これらの薬学的同等物およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１３に記載のキット。
【請求項１６】
前記ＮＳＡＩＤが、Ｒ−エトドラクである、請求項１３に記載のキット。
【請求項１７】
前記ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターが、組換えヒト化モノクローナル抗体２Ｃ４である、請求項１３に記載のキット。
【請求項１８】
前記使用のための指示書が、前記ＮＳＡＩＤの前記量のうちの少なくとも一部分が前記哺乳動物にＮＳＡＩＤ周期で投与されるべきであること、および前記ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターの前記量のうちの少なくとも一部分がＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビター周期で投与されるべきであることを示す、請求項１３に記載のキット。
【請求項１９】
前記ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビター周期が、週２回である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記ＮＳＡＩＤ周期が、毎日である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２１】
前記ＮＳＡＩＤおよび前記ＨＥＲ−キナーゼ軸インヒビターが、各々、腹腔内、経口胃管栄養法、静脈内、舌下、局所、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、鼻内、非経口および直腸からなる群より独立して選択される送達技術による投与のために処方される、請求項１３に記載のキット。
【手続補正書】
【提出日】平成18年4月14日(2006.4.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007504164000001.app
【国際調査報告】
2007504164.tif 000016
2007504164.tif 000017