(57)【要約】【課題】より効率よく育毛などを促進するための組成物を提供する。【解決手段】Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１産生促進能を持つ物質の探索について鋭意検討を重ねた結果、Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ（オランダガラシ、和蘭芥子）がＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１の産生を促進することを見出し、組成物を完成させた。  【選択図】図６
2019194176.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オランダガラシの抽出物を有効成分とする、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１の産生促進剤。
【請求項２】
前記オランダガラシ抽出物が、水、エタノール及び１，３−ブチレングリコールよりなる群から選ばれる少なくとも１種の溶媒で抽出されたものである、請求項１記載のＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１の産生促進剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載のＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１の産生促進剤を含有する、皮膚外用剤。
【請求項４】
請求項３に記載の育毛促進のための皮膚外用剤。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１の産生促進剤を含有する、経口組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の育毛促進のための経口組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主にヒトなどの動物用の育毛を促進するための組成物（剤など）に関する。
【背景技術】
【０００２】
発毛は毛包に存在する休止期の毛包幹細胞が再び細胞分裂を開始し、毛包を再構成することにより始まる。毛包幹細胞はバルジと呼ばれる領域に存在し、立毛筋や神経終末が接する特殊な環境で構成されている。毛包活性化の因子は毛乳頭細胞より産生され、毛乳頭細胞（Ｄｅｒｍａｌ  Ｐａｐｉｌｌａ  ｃｅｌｌｓ（ＤＰｃ））自身が最初に増殖を開始し、その後にバルジ内より細胞が分裂し、上皮間葉系細胞の相互作用により毛包は形成される。
【０００３】
毛包形成のメカニズムは、毛乳頭細胞からの発毛シグナルにより分裂を開始した外毛根鞘（ｏｕｔｅｒ  ｒｏｏｔ  ｓｈｅａｔｈ  （ＯＲＳ））細胞が真皮深層に向かいながら、毛乳頭細胞の直上に毛母領域を形成する。毛母領域を構成する細胞が毛母細胞と呼ばれているが、さらに増殖分化して毛幹と内毛根鞘細胞を形成する。外毛根鞘細胞のバルジ領域と二次毛芽（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｇｅｒｍ）となる部分には、幹細胞マーカーとされているＬｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ５（ＬＧＲ５）を発現する細胞が存在する。休止期には、二次毛芽はバルジのように静止状態にあるが、成長期に誘導される際にはＬＧＲ５陽性細胞が外毛根鞘細胞増殖のきっかけとなる（図１の模式図参照）。ＬＧＲ５陽性細胞はＷｎｔシグナルに依存して増殖し、毛包の恒常性維持に寄与している毛包増殖細胞とされている。興味深いことに、成長期毛包のＬＧＲ５陽性細胞は退行期のあとでも消失せず二次毛芽に残り、次の成長期に構成される。成長期への導入と維持の調整に深く関与するＬＧＲ５は長らくオーファン受容体とされてきたが、近年、分泌タンパクＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ（ＲＳＰＯ：本明細書および図面では、ＲＳＰＯとも表記する）をリガンドすることが報告された（非特許文献１〜４）。
【０００４】
ＬＧＲ５は、甲状腺刺激ホルモン（ｔｈｙｒｏｉｄ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）や卵胞刺激ホルモン（ｆｏｌｌｉｃｌｅ−ｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）などの性腺刺激ホルモン受容体と類似する構造をもつ膜受容体をコードする遺伝子として同定された７回膜貫通型受容体の一種であり、細胞外に長いロイシンリッチリピートをもつことを構造上の特長とする。ＬＧＲ５が腸管上皮幹細胞に特異的に発現が見られることが確認されたことにより（非特許文献５）、新規の幹細胞特異的に発現するタンパク質として注目されるようになった。非特許文献６には、腸および大腸を安定的かつ長期的に培養する方法として、ＲＳＰＯ１（Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１）と免疫グロブリンＦｃの融合タンパク質によって細胞増殖が顕著に促進されたことが記載されている。非特許文献７には、角膜輪部上皮細胞に幹細胞様の細胞が存在すること、およびＬＧＲ５が残存するヒト角膜輪部上皮幹細胞の表現型マーカーになり得ることが記載されている。毛包の外毛根鞘（非特許文献８）や胃上皮（非特許文献９）などの組織においても幹細胞特異的にＬＧＲ５の発現亢進が見られ、幹細胞ニッチ（生体内で幹細胞がその性質を維持するために必要な微小環境）の構築や組織形成に関与していることが報告されている。
【０００５】
毛包形成に関わるＲＳＰＯ類は毛乳頭細胞で発現しており、特にＲＳＰＯ１は休止期末期から成長期にかけて著しく増加し、毛包幹細胞を活性化していることが報告されている（非特許文献１０、図１に模式図を示す）。すなわち、毛乳頭細胞の活性化並びに毛乳頭細胞からのＲＳＰＯ１の発現促進及び／又は低下抑制は、バルジおよび外毛根鞘細胞に存在するＬＧＲ５陽性細胞増殖にとって望ましいことであり、発毛、成長期成熟化に関与すると考えられる。また、Ｗｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎシグナル伝達経路の阻害分子としてＤｉｃｋｋｏｐｆ１（ＤＫＫ１）が知られており、Ｗｎｔの共受容体ＬＲＰ６とＤＫＫ１受容体Ｋｒｅｍｅｎとの複合体を形成することでＷｎｔシグナルは抑制される。脱毛部位ではＤＫＫ１が高発現しているため、上記機序に従いＷｎｔシグナルが抑制されるが、ＲＳＰＯ１はＤＫＫ１−ＬＲＰ５／６−Ｋｒｅｍｅｎ複合体に作用して、Ｗｎｔの結合が促されるよう調節する（非特許文献１１）。
【０００６】
また、Ｚｉｎｃ  ＲＩＮＧ  Ｆｉｎｇｅｒ３（ＺＮＲＦ３）およびそのホモログＲＩＮＧ  ＦＩＮＧＥＲ  ４３（ＲＮＦ４３）は、Ｗｎｔレセプターのエンドサイトーシスを引き起こすＦｒｉｚｚｌｅｄレセプター（ＦＺＤ）をユビキチン化することによって、成体幹細胞におけるＷｎｔシグナル伝達に拮抗するが、ＬＧＲ５−ＲＳＰＯ１複合体はＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３のＦｒｉｚｚｌｅｄユビキチン化を抑制し、Ｗｎｔシグナル伝達を増強する（非特許文献１２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃａｒｍｏｎ  ＫＳ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１１  Ｊｕｌ  １２；１０８（２８）：１１４５２−７．
【非特許文献２】ｄｅ  Ｌａｕ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１１  Ｊｕｌ  ４；４７６（７３６０）：２９３−７．
【非特許文献３】Ｇｌｉｎｋａ    Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．２０１１  Ｓｅｐ  ３０；１２（１０）：１０５５−６１．
【非特許文献４】Ｙｏｏｎ  ＪＫ，Ｌｅｅ  ＪＳ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ．２０１２  Ｆｅｂ；２４（２）：３６９−７７．
【非特許文献５】Ｂａｒｋｅｒ  Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｔｕｒｅ．２００７  Ｏｃｔ  ２５；４４９（７１６５）：１００３−７．
【非特許文献６】Ｏｏｔａｎｉ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００９  Ｊｕｎ；１５（６）：７０１−６．
【非特許文献７】Ｂｒｚｅｓｚｃｚｙｎｓｋａ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２０１２  Ｍａｙ；２９（５）：８７１−６
【非特許文献８】Ｊａｋｓ  Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００８  Ｎｏｖ；４０（１１）：１２９１−９．
【非特許文献９】Ｂａｒｋｅｒ  Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．  ２０１０  Ｄｅｃ  ３；７（６）：６５６−７０．
【非特許文献１０】Ｎａ  Ｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｏｉ．２０１６，Ａｐｒ  ２０；１７（４）．
【非特許文献１１】Ｂｉｎｎｅｒｔｓ  ＭＥ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００７  Ｓｅｐ；１１；１０４（３７）：１４７００−５．
【非特許文献１２】Ｐｅｎｇ  ＷＣ．，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３  Ｄｅｃ  １２；８（１２）：ｅ８３１１０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、より効率よく育毛などを促進するための組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで、本発明の発明者は、上述のように、休止期末期から成長期にかけて著しく増加するＲＳＰＯ１に着目し、ＲＳＰＯ１の産生を促進する物質の探索等を試みた。本発明の発明者は、ＲＳＰＯ１産生促進能を持つ物質の探索について鋭意検討を重ねた結果、Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ（オランダガラシ、和蘭芥子）がＲＳＰＯ１の産生を促進することを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
本発明は、以下の項を含む。
〔項１〕オランダガラシの抽出物を有効成分とする、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１の産生促進剤。
〔項２〕前記オランダガラシ抽出物が、水、エタノール及び１，３−ブチレングリコールよりなる群から選ばれる少なくとも１種の溶媒で抽出されたものである、〔項１〕記載のＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１の産生促進剤。
〔項３〕〔項１〕又は〔項２〕記載のＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１の産生促進剤を含有する、皮膚外用剤。
〔項４〕〔項３〕に記載の育毛促進のための皮膚外用剤。
〔項５〕〔項１〕又は〔項２〕に記載のＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１の産生促進剤を含有する、経口組成物。
〔項６〕〔項５〕に記載の育毛促進のための経口組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、より効率よく育毛などを促進するための組成物を提供できる。この組成物は、休止期末期から成長期にかけて著しく増加するＲＳＰＯ１の産生を促進することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】休止期（Ｔｅｌｏｇｅｎ）から成長期（Ａｎａｇｅｎ）にかけて増加するＲＳＰＯ１の作用の模式図。
【図２】様々な植物エキスでのＲＳＰＯ１の産生確認の結果。
【図３】Ｐ５の毛乳頭細胞およびＰ１２の毛乳頭細胞での所定のマーカー等の産生確認の結果。
【図４】Ｐ５の毛乳頭細胞およびＰ１２の毛乳頭細胞でのＲＳＰＯ１の産生確認の結果。
【図５】Ｐ５の毛乳頭細胞およびＰ１２の毛乳頭細胞でのＡＬＰ活性の結果。
【図６】ＲＳＰＯ１の作用機序のモデル。
【図７】ヒト表皮角化細胞の生存割合を確認することにより、Ｗｎｔ３ａとＲＳＰＯ１とＤＫＫ−１との相互作用が細胞増殖に与える影響を確認した試験結果。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、図面も参照しつつ、本発明の実施形態について説明する。
（ＲＳＰＯ１の産生促進剤）
ＲＳＰＯ１の産生促進剤は、ＲＳＰＯ１の産生を促進するための剤である。この剤は、液体だけでなく、例えば固形等々も挙げられ、例えば皮膚外用剤だけでなく、経口組成物（例えば、固体でも液体でも作製可能）とも考えられている。
【００１４】
（育毛促進）
本明細書等において、「育毛」は、「育毛」だけでなく、例えば「発毛」も含まれる。また、この「育毛」は、例えば、脱毛因子（ＤＫＫ−１、ＩＬ−６など）の発現を抑制することより、毛幹の形成の促進、毛幹の伸長の促進などによる育毛も含む。
ＤＫＫ−１は、Ｗｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路を阻害する因子として、成長期毛包を退行期に移行させるファクターの一つとして考えられており、男性型脱毛に関わる因子と考えられている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ（２０１２），Ｖｏｌｕｍｅ  １３２，  １５５４−１５６０）。
【００１５】
（皮膚外用剤の形態）
本発明による皮膚外用剤は、アンプル、カプセル、粉末、顆粒、液体、ゲル、気泡、エマルジョン、シート、ミスト、スプレー剤等利用上の適当な形態の１）医薬品類、２）医薬部外品類、３）局所用又は全身用の皮膚外用剤類（例えば、化粧水、乳液、クリーム、軟膏、ローション、オイル、パック等の基礎化粧料、固形石鹸、液体ソープ、ハンドウォッシュ等の洗顔料や皮膚洗浄料、マッサージ用剤、クレンジング用剤、除毛剤、脱毛剤、髭剃り処理料、アフターシェーブローション、プレショーブローション、シェービングクリーム、ファンデーション、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナー、マスカラ等のメークアップ化粧料、香水類、美爪剤、美爪エナメル、美爪エナメル除去剤、パップ剤、プラスター剤、テープ剤、シート剤、貼付剤、エアゾール剤等）、４）頭皮・頭髪に適用する薬用又は／及び化粧用の製剤類（例えば、シャンプー剤、リンス剤、ヘアートリートメント剤、プレヘアートリートメント剤、パーマネント液、染毛料、整髪料、ヘアートニック剤、育毛・養毛料、パップ剤、プラスター剤、テープ剤、シート剤、エアゾール剤等）、５）浴湯に投じて使用する浴用剤、６）その他、腋臭防止剤や消臭剤、制汗剤、衛生用品、衛生綿類、ウエットティシュ等が挙げられる。
【００１６】
（皮膚外用剤の構成成分）
また、このような剤には、必要に応じて、本発明の効果を損ねない範囲で以下に例示する成分や添加剤を任意に選択・併用して製造することができ、これらの処方系中への配合量は、特に規定するものではないが、通常、０．０００１〜５０％程度が好ましいと考えられる。
【００１７】
（１）各種油脂類
アボカド油、アーモンド油、ウイキョウ油、エゴマ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラファー油、ゴマ油、カカオ脂、カミツレ油、カロット油、キューカンバー油、牛脂脂肪酸、ククイナッツ油、サフラワー油、シア脂、液状シア脂、大豆油、ツバキ油、トウモロコシ油、ナタネ油、パーシック油、ヒマシ油、綿実油、落花生油、タートル油、ミンク油、卵黄油、パーム油、パーム核油、モクロウ、ヤシ油、牛脂、豚脂、スクワレン、スクワラン、プリスタン又はこれら油脂類の水素添加物（硬化油等）等。
【００１８】
（２）ロウ類
ミツロウ、カルナバロウ、鯨ロウ、ラノリン、液状ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、カンデリラロウ、モンタンロウ、セラックロウ、ライスワックス等。
【００１９】
（３）鉱物油
流動パラフィン、ワセリン、パラフィン、オゾケライド、セレシン、マイクロクリスタンワックス等。
【００２０】
（４）脂肪酸類
ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、１２−ヒドロキシステアリン酸、ウンデシレン酸、トール油、ラノリン脂肪酸等の天然脂肪酸、イソノナン酸、カプロン酸、２−エチルブタン酸、イソペンタン酸、２−メチルペンタン酸、２−エチルヘキサン酸、イソペンタン酸等の合成脂肪酸。
【００２１】
（５）アルコール類
エタノール、イソプロパノール、ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、フィトステロール、フェノキシエタノール等の天然アルコール、２−ヘキシルデカノール、イソステアリルアルコール、２−オクチルドデカノール等の合成アルコール。
【００２２】
（６）多価アルコール類
酸化エチレン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ポリエチレングリコール、酸化プロピレン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ペンチルグリコール、グリセリン、ペンタエリトリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、リビトール、ガラクチトール、ソルビトール、マンニトール、ラクチトール、マルチトール等。
【００２３】
（７）エステル類
ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸ミリスチル、オレイン酸オレイル、オレイン酸デシル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、フタル酸ジエチル、フタル酸ジブチル、酢酸ラノリン、モノステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸プロピレングリコール、ジオレイン酸プロピレングリコール等。
【００２４】
（８）金属セッケン類
ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸カルシウム、パルミチン酸亜鉛、ミリスチン酸マグネシウム、ラウリン酸亜鉛、ウンデシレン酸亜鉛等。
【００２５】
（９）ガム質、糖類又は水溶性高分子化合物
アラビアゴム、ベンゾインゴム、ダンマルゴム、グアヤク脂、アイルランド苔、カラヤゴム、トラガントゴム、キャロブゴム、クインシード、寒天、カゼイン、乳糖、果糖、ショ糖又はそのエステル、トレハロース又はその誘導体、デキストリン、ゼラチン、ペクチン、デンプン、カラギーナン、カルボキシメチルキチン又はキトサン、エチレンオキサイド等のアルキレン（Ｃ２〜Ｃ４）オキサイドが付加されたヒドロキシアルキル（Ｃ２〜Ｃ４）キチン又はキトサン、低分子キチン又はキトサン、キトサン塩、硫酸化キチン又はキトサン、リン酸化キチン又はキトサン、アルギン酸又はその塩、ヒアルロン酸又はその塩、コンドロイチン硫酸又はその塩、ヘパリン、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ニトロセルロース、結晶セルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメタアクリレート、ポリアクリル酸塩、ポリエチレンオキサイドやポリプロピレンオキサイド等のポリアルキレンオキサイド又はその架橋重合物、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレンイミン等。
【００２６】
（１０）界面活性剤
アニオン界面活性剤（アルキルカルボン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩）、カチオン界面活性剤（アルキルアミン塩、アルキル四級アンモニウム塩）、両性界面活性剤：カルボン酸型両性界面活性剤（アミノ型、ベタイン型）、硫酸エステル型両性界面活性剤、スルホン酸型両性界面活性剤、リン酸エステル型両性界面活性剤、非イオン界面活性剤（エーテル型非イオン界面活性剤、エーテルエステル型非イオン界面活性剤、エステル型非イオン界面活性剤、ブロックポリマー型非イオン界面活性剤、含窒素型非イオン界面活性剤）、その他の界面活性剤（天然界面活性剤、タンパク質加水分解物の誘導体、高分子界面活性剤、チタン・ケイ素を含む界面活性剤、フッ化炭素系界面活性剤）等。
【００２７】
（１１）各種ビタミン類
ビタミンＡ群：レチノール、レチナール（ビタミンＡ１）、デヒドロレチナール（ビタミンＡ２）、カロチン、リコピン（プロビタミンＡ）、ビタミンＢ群：チアミン塩酸塩、チアミン硫酸塩（ビタミンＢ１）、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、葉酸類、ニコチン酸類、パントテン酸類、ビオチン類、コリン、イノシトール類、ビタミンＣ群：ビタミンＣ酸又はその誘導体、ビタミンＤ群：エルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）、ジヒドロタキステロール、ビタミンＥ群：ビタミンＥ又はその誘導体、ユビキノン類、ビタミンＫ群：フィトナジオン（ビタミンＫ１）、メナキノン（ビタミンＫ２）、メナジオン（ビタミンＫ３）、メナジオール（ビタミンＫ４）、その他、必須脂肪酸（ビタミンＦ）、カルニチン、フェルラ酸、γ−オリザノール、オロット酸、ビタミンＰ類（ルチン、エリオシトリン、ヘスペリジン）、ビタミンＵ等。
【００２８】
（１２）各種アミノ酸類
バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、シスチン、チロシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒドロキシリジン、アルギニン、オルニチン、ヒスチジン等や、それらの硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、クエン酸塩、或いはピロリドンカルボン酸のごときアミノ酸誘導体等。
【００２９】
（１３）植物又は動物系原料由来の種々の添加物
これらは、添加しようとする製品種別、形態に応じて常法的に行われる加工（例えば、粉砕、製粉、洗浄、加水分解、醗酵、精製、圧搾、抽出、分画、ろ過、乾燥、粉末化、造粒、溶解、滅菌、ｐＨ調整、脱臭、脱色等を任意に選択、組み合わせた処理）を行い、各種の素材から任意に選択して供すれば良い。
【００３０】
尚、抽出に用いる溶媒については、供する製品の使用目的、種類、或いは後に行う加工処理等を考慮した上で選択すれば良いが、通常では、水、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブタノール、イソブタノール等の低級アルコール或いは含水低級アルコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン等の多価アルコール或いは含水多価アルコール、アセトン、酢酸エチル等の各種有機溶媒の中から選ばれる１種若しくは２種以上の混液を用いるのが望ましい。但し、用途により有機溶媒の含有が好ましくない場合においては、水のみを使用したり、若しくは抽出後に除去しやすいエタノールを採用し、単独又は水との任意の混液で用いたりすれば良く、又、搾取抽出したものでも良い。
【００３１】
尚、植物又は動物系原料由来の添加物を、全身用又は局所用の外用剤、化粧品類に供する場合、皮膚や頭髪の保護をはじめ、保湿、感触・風合いの改善、柔軟性の付与、刺激の緩和、芳香によるストレスの緩和、細胞賦活（細胞老化防止）、炎症の抑制、肌質・髪質の改善、肌荒れ防止及びその改善、発毛、育毛、脱毛防止、光沢の付与、清浄効果、疲労の緩和、血流促進、温浴効果等の美容的効果のほか、香付け、消臭、増粘、防腐、緩衝等の効果も期待できる。
【００３２】
さらにこの他にも、これまでに知られている各原料素材の様々な美容的、薬剤的効果を期待し、これらを組み合わせることによって、本発明の目的とする効果の増進を図り、多機能的な効果を期待した製品とすることも可能である。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明の実施例について、添付図面を参照しつつ説明する。
【００３４】
（実施例で挙げる実験で用いた材料について）
Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｂｒａｎ、Ｐｒｕｎｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａ、Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓおよびＰｌａｎｔａｇｏ  ａｓｉａｔｉｃａを５０ｗｔ％のエタノールにて抽出した抽出物を用いた。
【００３５】
図２に示すが、ＲＳＰＯ１の産生は、Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ（オランダガラシ、和蘭芥子（クレソンともいう））抽出物が最も高い値（割合）であった。なお、図２で示すＣｎｔ．は溶媒の５０ｗｔ％のエタノールである。
【００３６】
なお、図２で示す実験（サンプル作製も含む）を以下のように行った。以下「（２）細胞培養の方法」で挙げるように、毛乳頭細胞（継代５（Ｐ５））を、５，０００ｃｅｌｌｓ／ウェルの密度で、プラスチック製の９６ウェルプレート上に播種した。翌日、この抽出物を、培地中の最終濃度が０．２５％になるように、１％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地へ添加した。毛乳頭細胞を２日間培養し、この培養上清を、図２で示すサンプルとして、採取した。そして、ＥＬＩＳＡキット（ＬＳｂｉｏ）を使用して、毛乳頭細胞から分泌されたＲＳＰＯ１の量を定量した。
【００３７】
（実験方法）
（１）Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅの分画物の作製
Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅの粗抽出物の分画は、Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ２０（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を充填したカラムを使用して、それぞれ２０ｗｔ％エタノール、４０ｗｔ％エタノール、６０ｗｔ％エタノール、８０ｗｔ％エタノールおよび１００ｗｔ％エタノールで溶出された５種類の画分（Ｆｒ．）である。なお、図４と図５で示すが、２０ｗｔ％エタノールで溶出された群はＦｒ．１、４０ｗｔ％エタノールで溶出された群はＦｒ．２、６０ｗｔ％エタノールで溶出された群はＦｒ．３、８０ｗｔ％エタノールで溶出された群はＦｒ．４、１００ｗｔ％エタノールで溶出された群はＦｒ．５、溶媒投与群（Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅの抽出分が含有されていない群）はＣｎｔ．、Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ粗抽出物（カラムを通す前のサンプル）はＣｒｕｄｅ、を示している。有意差は、Ｃｎｔ．と比較してのＲＳＰＯ１の産生割合について示している。
【００３８】
（２）細胞培養の方法
毛乳頭細胞を、５，０００ｃｅｌｌｓ／ウェルの密度で、プラスチック製の９６ウェルプレート上に播種した。翌日、上述の各画分を、培地中の最終濃度が０．２５％になるように、１％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地へ添加した。毛乳頭細胞を２日間培養し、この培養したサンプルの上清を、図４および５で示すＥＬＩＳＡアッセイサンプルとして、採取した。
【００３９】
（３）ＲＳＰＯ１のスクリーニングアッセイ
スクリーニングにはＥＬＩＳＡキット（ＬＳｂｉｏ）を使用して、継代５（Ｐ５）の毛乳頭細胞から分泌されたＲＳＰＯ１の量を定量した。ＲＳＰＯ１の産生量は生存細胞数で補正した値を用いた（図３〜５で示す実験）。生存細胞数は、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（ＣＣＫ−８、Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用いて行った。
【００４０】
（４）ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）細胞増殖アッセイ
毛乳頭細胞の増殖を調べるため、ＢｒｄＵ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、ＢｒｄＵ取り込みに基づく細胞増殖について定量した（図２で示す実験）。ＢｒｄＵは、細胞周期のＳ期において新たに合成されたＤＮＡに取り込まれる。ＢｒｄＵが取り込まれた（ＢｒｄＵでラベルされた）ＤＮＡは、抗ＢｒｄＵ抗体で検出することができるため、抗ＢｒｄＵ抗体はＤＮＡ複製を行う増殖細胞の検出ツールとして利用できる。
【００４１】
（５）細胞生存率アッセイおよびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性
生存細胞数は、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（ＣＣＫ−８、Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用いて行った。次に、同じ細胞をＰＢＳで洗浄し、ＡＬＰアッセイキット（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）を用いて、ＡＬＰ活性を測定した（図５で示す実験）。これらの実験は、継代５（Ｐ５）の毛乳頭細胞および継代１２（Ｐ１２）の毛乳頭細胞を用いて行った（図３〜５で示す実験）。なお、継代を重ねた毛乳頭細胞や、発毛の誘導能力が減少した毛包は、ＡＬＰ活性も低下すると考えられているため、ＡＬＰは、毛乳頭細胞の発毛の誘導能力を示す典型的な指標である（図３でも示す）。
【００４２】
（実験結果）
（Ｐ５の毛乳頭細胞およびＰ１２の毛乳頭細胞での所定のマーカー等の確認）
これらの細胞にて、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ取り込み量）、ＲＳＰＯ１産生量およびＡＬＰ活性を確認した。結果を図３に示す。
【００４３】
Ｐ５のＢｒｄＵ陽性細胞の割合は約１００％に対して、Ｐ１２のＢｒｄＵ陽性細胞の割合は約４０％であった（ＢｒｄＵ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎと示した図）。また、Ｐ５と比較してＰ１２のＲＳＰＯ１の産生の割合も顕著に減少した（ＲＳＰＯ１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎと示した図）。Ｐ５と比較してＰ１２でのＡＬＰ活性の割合（％）の減少も有意に確認された。
【００４４】
（Ｐ５の毛乳頭細胞およびＰ１２の毛乳頭細胞でのＲＳＰＯ１の産生確認）
この結果を図４に示す。毛乳頭細胞の継代数の違いにより、各画分のＲＳＰＯ１産生量に差が見られたが、Ｐ５の群（図４中の（Ａ））、Ｐ１２の群（図４中の（Ｂ））でも、Ｆｒ．１（２０％エタノールにて溶出画分された群）では、特にＲＳＰＯ１の産生割合が高かった。
【００４５】
（Ｐ５の毛乳頭細胞およびＰ１２の毛乳頭細胞でのＡＬＰ活性の確認）
この結果を図５に示す。継代数の違いにより、各画分のＡＬＰ活性への影響は若干異なり、エタノール濃度が高い溶出画分（例えばＦｒ．３〜Ｆｒ．５）ではわずかな活性促進が見られた。しかし、図４に示すＲＳＰＯ１の産生割合と異なり、溶出画分の違いによるＡＬＰ活性の亢進の割合が小さい傾向であった。よって、画分の違い（溶媒の違い）を利用して、ＲＳＰＯ１が産生している画分を精製できる可能性が示唆される。
【００４６】
（考察）
これらの上述の結果から、図６に示すような、ＲＳＰＯ１の作用機序が予想される。図４と図５に示す実験結果から、ＲＳＰＯ１の産生が高くなることによりＡＬＰ活性が高くなるとは必ずしも言えないと予想される。Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ抽出物がＲＳＰＯ１の産生亢進に関与し、Ｗｎｔシグナル伝達を補助する可能性を示唆するものである。その結果、Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ抽出物が外毛根鞘細胞の増殖、いわゆる成長期成熟化に関与し、発毛などの効果をもたらすと予想される。
【００４７】
（更なる発毛のメカニズムの解析）
本発明者は、上述の予想されるＲＳＰＯ１の作用機序（図６）を更に解析すること、すなわち発毛のメカニズムを更に解析すること（具体的には、脱毛因子を抑制することにより発毛が促進されるかどうかを分析解析すること）を試みた。
【００４８】
図７では、ヒト表皮角化細胞の生存割合を確認することにより、Ｗｎｔ３ａとＲＳＰＯ１とＤＫＫ−１との相互作用が細胞増殖に影響を与えることを確認した試験結果を示す。図７の縦軸は、添加群（１）の細胞生存割合を１としたときに、添加群（１）と比較したときの細胞生存割合を示す。
ヒト表皮角化細胞（クラボウ社製）に対し、因子（Ｗｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＤＫＫ−１（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）及び／又はＲＳＰＯ１（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製））を添加し、３７℃で４８時間培養し、その後ＣＣＫ−８により、ヒト表皮角化細胞の細胞数を測定した。
図７に示す添加群（１）〜（４）について説明する。図中の「―」は因子を添加していないこと、「＋」は因子を添加していることを示す。例えば、Ｗｎｔ３ａにおいて「＋」はＷｎｔシグナルを活性化している群である。
添加群（１）は因子をどの因子も添加していない群、添加群（２）はＷｎｔ３ａを添加した群、添加群（３）はＷｎｔ３ａとＤＫＫ−１を添加した群、添加群（４）はＷｎｔ３ａとＤＫＫ−１とＲＳＰＯ１を添加した群である。
添加群（１）の細胞生存割合を１としたとき、添加群（２）は１．３５８、添加群（３）は１．１３３、添加群（４）は１．４１１であった。
添加群（２）と添加群（３）の細胞生存割合を比較すると、ＤＫＫ−１により、細胞増殖（Ｗｎｔ活性）が抑制されることが示唆される。添加群（３）と添加群（４）の細胞生存割合を比較すると、ＲＳＰＯ１がＤＫＫ−１に拮抗してＷｎｔ活性を維持する（補助する）ことが示唆され、ＲＳＰＯ１がＤＫＫ−１を無効化する作用があることが示唆される。
【００４９】
更に、本発明者は、ヒト毛乳頭細胞を用いて、Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅの抽出物及びジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）を投与することによる、ＤＫＫ−１、ＩＬ−６及びアンドロゲン受容体（ＡＲ）の産生量の変化の確認を行った。確認結果は、表１から表３に示す。
表１から３に示すＦｒ．１は、上述（図３など）のＦｒ．１である。このＦｒ．１は、図１〜図６に示す実験結果から、ＲＳＰＯ１産生能を有すると推定する。
ヒト毛乳頭細胞（Ｐ５）を、各添加群において５０００ｃｅｌｌｓ／ウェルの密度にて、１％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地上のプレートに播種した。準備後、１％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地へ、Ｆｒ．１及び／又はＤＨＴを添加した。その後、毛乳頭細胞を３７℃で２日間培養し、この培養したサンプルの上清を、表１から表２に示すＥＬＩＳＡアッセイサンプルとして採取した。ＥＬＩＳＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて、タンパク質産生量を測定した結果を表１と表２に示す。ＤＨＴは、添加する場合は、当該培地中の最終濃度が２５０ｎＭとなるように添加した。
また、同様に培養した細胞より抽出した粗タンパク質溶液は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によりタンパク質量を定量後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ウエスタンブロットにより解析した。ブロッキングには、ＰＶＤＦ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、抗ＡＲ抗体（ＣＳＴ社製）と西洋ワサビペルオキシダーゼ結合型２次抗体を用い、化学発光により検出した。この検出した結果を表３に示す。
なお、表１から表３においては、次のように標記する。未添加群は、Ｆｒ．１もＤＨＴも含有していない群である。ＤＨＴについては、「なし」がＤＨＴを添加していない群、「あり」がＤＨＴを添加した群である。Ｆｒ．１については、「なし」がＦｒ．１を添加していない群、数値が記載されている群（添加群２、添加群３、添加群５、添加群６、添加群８及び添加群９）は、当該培地中の最終濃度が、表中にそれぞれ記載されている濃度となるように添加された群である。
ＥＬＩＳＡの測定結果を表１と表２に示し、ウエスタンブロットの結果を表３に示す。表１と表２では、未添加群のタンパク質産生量を１として、添加群１から添加群６のタンパク質産生量を記載している。表３では、添加群７のタンパク質量を１として、未添加群と添加群８と添加群９のタンパク質量を記載している。
表１と２に示すように、添加群２と添加群３の結果と、添加群５と添加群６の結果から、Ｆｒ．１（ＲＳＰＯ１産生能を有すると推定している画分）の濃度依存的な投与により、脱毛因子（ＤＫＫ−１とＩＬ−６）の産生の抑制の傾向が見られた。また、表３に示すように、添加群８と添加群９の結果から、Ｆｒ．１（ＲＳＰＯ１産生能を有すると推定している画分）の濃度依存的な投与により、ＡＲの発現量の抑制の傾向（男性ホルモン受容体の刺激の緩和作用）が見られた。
図１から図７に示す結果を踏まえて、表１から表３に示す実験結果を考察すると、オランダガラシの抽出物が含有される剤は、毛乳頭細胞のＲＳＰＯ１産生量を増加させ、ＺＮＲＦ３およびＫｒｅｍｅｎとＬＲＰの複合体形成を阻害すること、また、脱毛因子自体の発現を抑制することによって細胞膜上のＬＲＰレベルを上げ、Ｗｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎのシグナルを活性化することが考えられる。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
【表２】
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【００５２】
【表３】
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【００５３】
以上、本発明の実施の形態（実施例も含め）について、図面を参照して説明してきたが、本発明の具体的構成は、これに限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、設計変更等があっても、本発明に含まれるものである。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明は、例えば、ヒトなどの動物用の育毛を促進するための組成物（剤など）として利用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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