(57)【要約】  本願発明は、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ物質、そして、神経幹細胞、ニューロン細胞およびニューロン前駆細胞、オリゴデンドロサイトおよびオリゴデンドロサイト前駆細胞の成長と分化を促す方法、および、前記細胞を投与して神経病理を阻害するための物質と方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経細胞または神経前駆細胞の集積、増殖、分化、移動または生存を促す医薬の製造における、血管内皮増殖因子Ｃ(VEGF-Ｃ)産物または血管内皮増殖因子Ｄ(VEGF-Ｄ)産物の使用。
【請求項２】
当該医薬が、ニューロン細胞またはニューロン前駆細胞の集積、増殖、分化、移動または生存を促すためのものである請求項１に記載の使用。
【請求項３】
当該医薬が、オリゴデンドロサイトまたはオリゴデンドロサイト前駆細胞の集積、増殖、または分化を促すためのものである請求項１に記載の使用。
【請求項４】
当該医薬が、ニューロン細胞の異常な成長、ニューロン瘢痕化または神経変性を特徴とする疾患または状態の治療のためのものである請求項１乃至３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
当該医薬が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、運動ニューロン病、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、痴呆症および脳性麻痺からなるグループから選択される神経変性障害に起因する神経変性の治療のためのものである請求項１乃至３のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
当該医薬が、オリゴデンドロサイトまたはオリゴデンドロサイト前駆細胞の異常な成長を特徴とする疾患または状態の治療のためのものである請求項１乃至３のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
当該疾患が、神経系脱髄を特徴とする状態である請求項６に記載の使用。
【請求項８】
当該医薬が、多発性硬化症、フェニルケトン尿症、脳室周囲白質軟化症(ＰＶＬ)、HIV-１脳炎(ＨＩＶＥ)、ギヤン-バレー症候群(ＧＢＳ)、急性炎症性脱髄多発性神経障害(ＡＩＤＰ)、急性運動軸索神経障害(ＡＭＡＮ)、急性運動感覚軸索神経障害(ＡＭＳＡＮ)、フィッシャー症候群、急性自立神経異常、およびクラッベ病からなるグループから選択される状態の治療の治療のためのものである請求項１乃至８のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
当該医薬が、慢性炎症性脱髄多発神経根神経障害(ＣＩＤＰ)の治療のためのものである請求項１乃至３のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
当該ＣＩＤＰが、多病巣性後天性脱髄感覚および運動神経障害(ＭＡＤＳＡＭ；ルイス-スムナー症候群としても周知)および遠位後天性脱髄対称神経障害(ＤＡＤＳ)からなるグループから選択される請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
当該医薬が、神経外傷または神経損傷の治療のためのものである請求項１乃至３のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
当該神経外傷が、発作関連損傷、脊髄損傷、手術後損傷および脳虚血症からなるグループから選択される請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
神経細胞または神経前駆細胞の集積、増殖、分化、移動または生存を促す治療を必要とする哺乳動物を同定し、および
神経細胞または神経前駆細胞の集積、増殖、分化、移動または生存を刺激する上で有効量の血管内皮成長因子Ｃ(VEGF-Ｃ)産物または血管内皮増殖因子Ｄ(VEGF-Ｄ)産物を含む組成物を当該動物に投与する、
工程を含む、哺乳動物において神経細胞または神経前駆細胞の集積、増殖、分化、移動または生存を促す方法。
【請求項１４】
当該同定工程が、ニューロン細胞またはニューロン前駆細胞の集積、増殖、分化、移動または生存を促す治療を必要とする哺乳動物を同定する請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
当該同定工程が、オリゴデンドロサイトまたはオリゴデンドロサイト前駆細胞の集積、増殖または分化を必要とする哺乳動物を同定する請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
精製された神経幹細胞または神経前駆細胞を、当該細胞の生存を促し、または増殖または分化を刺激する上で有効量の血管内皮成長因子Ｃ(VEGF-Ｃ)産物または血管内皮成長因子Ｄ(VEGF-Ｄ)産物を含む組成物と接触させる、
工程を含む、神経幹細胞または神経前駆細胞の増殖、分化、移動または生存を促進する方法。
【請求項１７】
該神経幹細胞が、Ｃ１７.２、精製された神経幹細胞、ＨＳＮ-１細胞、胎児ブタ細胞、神経堤細胞、骨髄由来神経幹細胞、ＨＮＴ細胞およびヒトニューロン前駆細胞系からなるグループから選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
オリゴデンドロサイトまたはオリゴデンドロサイト前駆細胞を、VEGF-Ｃ産物またはVEGF-Ｄ産物を含む組成物と接触させる工程を含み、当該オリゴデンドロサイト前駆細胞が、ＣＧ-４細胞、ＳＶＧ ｐ１２胎児神経膠細胞系、ＤＢＴＲＧ-０５ＭＧ神経膠細胞系、精製されたオリゴデンドロサイト前駆細胞、単離されたＮＧ２プロテオグリカン(ＮＧ２＋細胞)、骨髄由来神経幹細胞、ヒトニューロン前駆細胞系からなるグループから選択される、in vitroにてオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を誘導する方法。
【請求項１９】
哺乳動物から生物学的試料を取得する工程であって、当該試料が、神経幹細胞を含み、および、神経幹細胞を、血管内皮成長因子Ｃ(VEGF-Ｃ)産物または血管内皮成長因子Ｄ(VEGF-Ｄ)産物を含む組成物と接触させる工程を含む、神経幹細胞の増殖または分化を刺激する方法。
【請求項２０】
哺乳動物から生物学的試料を取得する工程であって、当該試料が、ニューロン前駆細胞を含み、および、当該神経前駆細胞を、血管内皮成長因子Ｃ(VEGF-Ｃ)産物または血管内皮成長因子Ｄ(VEGF-Ｄ)産物を含む組成物と接触させる工程を含む、ニューロン前駆細胞の増殖または分化を刺激する方法。
【請求項２１】
哺乳動物から生物学的試料を取得する工程であって、当該試料が、オリゴデンドロサイト前駆細胞を含み、および、当該オリゴデンドロサイト前駆細胞を、血管内皮成長因子Ｃ(VEGF-Ｃ)産物または血管内皮成長因子Ｄ(VEGF-Ｄ)産物を含む組成物と接触させる工程を含む、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖または分化を刺激する方法。
【請求項２２】
当該接触が、VEGF-Ｃ産物またはVEGF-Ｄ産物を含む培地で細胞を培養する工程を含む請求項１６乃至２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
当該接触工程の前に、当該試料から当該細胞を精製および単離する工程をさらに含む請求項１９乃至２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
当該接触工程の後に、当該細胞を精製および単離する工程をさらに含む請求項１６乃至２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
請求項１６乃至２４のいずれかに記載の発明に従って培養された精製および単離された神経細胞。
【請求項２６】
当該接触工程の後に、当該細胞を哺乳動物に投与する工程をさらに含む請求項１９乃至２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
当該接触工程の後に、当該細胞を異種哺乳動物に移植する工程をさらに含む請求項１９乃至２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
当該接触工程の後に、当該細胞を哺乳動物に投与する工程をさらに含む請求項１６乃至１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
当該細胞が、組織、器官または人工マトリックスにex vivoで播種され、および、当該組織、当該器官または当該人工マトリックスが、哺乳動物に固定、埋設または移植される請求項２６乃至２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
当該動物が、ニューロン細胞の異常な成長、ニューロン瘢痕化または神経変性を特徴とする疾患または状態を有する請求項１３乃至１５または２６乃至２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
当該神経変性が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、運動ニューロン病、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、痴呆症および脳性麻痺からなるグループから選択される神経変性障害に起因する請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
当該動物が、オリゴデンドロサイトまたはオリゴデンドロサイト前駆細胞の異常な成長を特徴とする疾患または状態を有する請求項１３乃至１５または２６乃至２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
当該動物が、神経系脱髄を特徴とする状態を有する請求項１３乃至１５または２６乃至２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
当該疾患が、多発性硬化症、フェニルケトン尿症、脳室周囲白質軟化症(ＰＶＬ)、HIV-１脳炎(ＨＩＶＥ)、ギヤン-バレー症候群(ＧＢＳ)、急性炎症性脱髄多発性神経障害(ＡＩＤＰ)、急性運動軸索神経障害(ＡＭＡＮ)、急性運動感覚軸索神経障害(ＡＭＳＡＮ)、フィッシャー症候群、急性自立神経異常、およびクラッベ病である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
当該動物が、慢性炎症性脱髄多発神経根神経障害(ＣＩＤＰ)を有する請求項１３乃至１５または２６乃至２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
当該CIPDが、MADSAM(多病巣性後天性脱髄感覚および運動神経障害；ルイス-スムナー症候群としても周知)およびＤＡＤＳ(遠位後天性脱髄対称神経障害)からなるグループから選択される請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
当該疾患または状態が、神経外傷または神経損傷からなるグループから選択される請求項１３乃至１５または２６乃至２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
当該神経外傷が、発作関連損傷、損傷、脊髄損傷、手術後損傷および脳虚血症からなるグループから選択される請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
当該哺乳動物が、ヒトである請求項１３乃至１５または２６乃至３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
当該産物が、VEGF-Ｃ産物である請求項１乃至２４または２６乃至２８のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項４１】
当該VEGF-Ｃ産物が、精製された哺乳動物プレプロ-VEGF-Ｃポリペプチド、またはVEGFR-３もしくはニューロピリン-２に結合するその断片を含む請求項４０に記載の方法または使用。
【請求項４２】
当該VEGF-Ｃ産物が、VEGF-ＣΔＣ156ポリペプチドを含む請求項４０に記載の方法または使用。
【請求項４３】
当該VEGF-Ｃ産物が、キメラヘアピン-結合VEGF-Ｃポリペプチドを含む請求項４０に記載の方法または使用。
【請求項４４】
当該動物およびプレプロ-VEGF-Ｃポリペプチドが、ヒトである請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
当該VEGF-Ｃ産物が、配列番号：２４の第３２位〜第２２７位のアミノ酸に対して、少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、当該ポリペプチドが、VEGFR-３に結合する請求項４０に記載の方法または使用。
【請求項４６】
当該VEGF-Ｃ産物が、配列番号：２４の第１０３位〜第２２７位のアミノ酸に対して、少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、当該ポリペプチドが、VEGFR-３に結合する請求項４０に記載の方法または使用。
【請求項４７】
当該VEGF-Ｃ産物が、
(ａ)配列番号：２３のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含み、かつVEGFR-３に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
(ｂ)VEGFR-３に結合するポリペプチドをコードする(ａ)の断片；
から選択されるポリヌクレオチドを含む請求項４０に記載の方法または使用。
【請求項４８】
当該VEGF-Ｃ産物が、
(ａ)配列番号：２４に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、当該ポリペプチドはVEGFR-３に結合し；および
(ｂ)VEGFR-３に結合するポリペプチドをコードする(ａ)の断片；
から選択されるポリヌクレオチドを含む請求項４０に記載の方法または使用。
【請求項４９】
当該VEGF-Ｃ産物が、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件下、すなわち、６５℃で、０.５M NaHPO4、７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、１mM EDTAを用いたハイブリダイゼーション、および４７℃で、０.２×SSC/０.１％SDSを用いた洗浄のための条件下で、配列番号：２３の相補体にハイブリダイズし、およびVEGFR-３に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む請求項４０に記載の方法または使用。
【請求項５０】
当該VEGF-Ｃ産物が：
(ａ)配列番号：24のヒトVEGF-Ｃアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；および
(ｂ)VEGFR-３に結合するポリペプチドをコードする(ａ)の断片；
から選択されるポリヌクレオチドを含む請求項４０に記載の方法または使用。
【請求項５１】
当該VEGF-Ｃ産物が、VEGF-ＣΔＣ156ポリペプチドをコードする請求項４０に記載の方法または使用。
【請求項５２】
当該VEGF-Ｃ産物が、キメラヘアピン結合VEGF-Ｃポリペプチドをコードする請求項４０に記載の方法または使用。
【請求項５３】
当該VEGF-Ｃ産物が、ポリヌクレオチドを含有するウイルスベクターを含む請求項４７乃至５２のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項５４】
当該ベクターが、複製-欠陥アデノウイルス、アデノ-関連ウイルス、またはレンチウイルスを含む請求項５３に記載の方法または使用。
【請求項５５】
当該産物が、VEGF-Ｄ産物である請求項１乃至２４または２６乃至３９のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項５６】
当該組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む請求項１乃至２４または２６乃至５５のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項５７】
哺乳動物に神経治療剤を投与する工程をさらに含む請求項１３乃至２４または２６乃至５５のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
当該医薬に、神経治療剤をさらに組み込んでなる請求項１乃至１２のいずれかに記載の使用。
【請求項５９】
当該神経治療剤が、インターフェロンガンマ、神経成長因子、表皮成長因子(ＥＧＦ)、塩基性線維芽細胞成長因子(ｂＦＧＦ)、ニューロゲニン、脳由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)、甲状腺ホルモン、骨形態蛋白質(ＢＭＰ)、白血病阻害性因子(ＬＩＦ)、ソニックヘッジホッグ、神経膠細胞系-由来神経栄養因子(ＧＤＮＦ)、血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)、インターロイキン、インターフェロン、幹細胞因子(ＳＣＦ)、アクチビン、インヒビン、ケモカイン、レチノイン酸および繊毛神経栄養因子(ＣＮＴＦ)からなるグループから選択される神経成長因子を含む請求項５７乃至５８のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項６０】
当該神経治療剤が、インターフェロンガンマ、神経成長因子、表皮成長因子(ＥＧＦ)、塩基性線維芽細胞成長因子(ｂＦＧＦ)、ニューロゲニン、脳由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)、甲状腺ホルモン、骨形態蛋白質(ＢＭＰ)、白血病阻害性因子(ＬＩＦ)、ソニックヘッジホッグ、神経膠細胞系-由来神経栄養因子(ＧＤＮＦ)、血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)、インターロイキン、インターフェロン、幹細胞因子(ＳＣＦ)、アクチビン、インヒビン、ケモカイン、レチノイン酸および繊毛神経栄養因子(ＣＮＴＦ)からなるグループから選択される神経成長因子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む請求項５７乃至５８のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項６１】
当該神経治療剤が、タクリン(Cognex)、ドネペジル(Aricept)、リバスチグミン(Exelon)、ガランタミン(Reminyl)、コリンエステラーゼ阻害剤および抗-炎症剤からなるグループから選択される請求項５７または５８に記載の方法または使用。
【請求項６２】
当該神経治療剤が、抗-コリン作用剤、ドーパミンアゴニスト、カテコール-０-メチル-トランスステアラーゼ(COMTs)、アマンタジン(Symmetrel)、シネメット(Sinemet(登録商標))、セレギリン(Selegiline)、カルビドーパー、ロピニロール(Requip)、コエンザイムＱ10、プラミペキソール(Mirapex)およびレボドーパ(Ｌ-ドーパ)からなるグループから選択される請求項５７または５８に記載の方法または使用。
【請求項６３】
VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物を、PDGF-ＡまたはPDGF-Ｃと共に使用または投与する請求項１乃至２４または２６乃至６２のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項６４】
薬学的に許容される賦形剤または担体に取り込まれたVEGF-Ｃ産物および神経成長因子を含む組成物。
【請求項６５】
薬学的に許容される希釈剤または担体に取り込まれたVEGF-Ｃ産物および神経治療剤を含む組成物。
【請求項６６】
薬学的に許容される希釈剤または担体に取り込まれたVEGF-Ｄ産物および神経成長因子を含む組成物。
【請求項６７】
薬学的に許容される希釈剤または担体に取り込まれたVEGF-Ｄ産物および神経治療剤を含む組成物。
【請求項６８】
PDGF-Ａ産物またはPDGF-Ｃ産物をさらに含む請求項６４乃至６７のいずれかに記載の組成物。
【請求項６９】
神経芽腫または神経腫瘍を治療するための医薬の製造におけるVEGF-Ｃ阻害剤の使用。
【請求項７０】
VEGF-Ｃ阻害剤を含む組成物を、神経芽腫またはニューロン腫瘍を有する動物に投与することを含む、神経芽腫および神経腫瘍の成長および進行を阻害する方法。
【請求項７１】
当該VEGF-Ｃ阻害剤が：
(ａ)VEGF-Ｃに結合するVEGFR-２の細胞外断片を含むポリペプチド；
(ｂ)VEGF-Ｃに結合するVEGFR-３の細胞外断片を含むポリペプチド；
(ｃ)VEGF-Ｃポリペプチドと免疫反応する抗体物質；
(ｄ)VEGF-Ｃアンチセンス分子、および
(ｅ)VEGF-Ｃ ｓｉＲＮＡ；
からなるグループから選択される請求項６９または７０に記載の方法または使用。
【請求項７２】
当該VEGF-Ｃ阻害剤が、VEGF-Ｃに結合するVEGFR-３の細胞外断片、VEGF-Ｃに結合するNRP-１の細胞外断片、およびVEGF-Ｃに結合するNRP-２の細胞外断片を含むポリペプチドからなるグループから選択される請求項６９または７０に記載の方法または使用。
【請求項７３】
当該VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物が、PDGF-Ａ阻害剤またはPDGF-Ｃ阻害剤と共に使用または投与される請求項６７乃至７０のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項７４】
候補薬剤の存在下および不在下で、VEGF-Ｃポリペプチドを含む組成物と神経細胞または神経前駆細胞とを接触させ；
当該候補薬剤の存在下および不在下で、細胞の増殖、移動、分化または生存を測定し；および
当該候補薬剤の存在下および不在下で得られた異なる測定結果から、当該候補薬剤を、神経細胞または神経前駆細胞に関するVEGF-Ｃ効果のモジュレーターとして同定する；
ことを含む、神経幹細胞または神経前駆細胞の増殖、移動、分化または生存に関与するVEGF-Ｃ刺激のモジュレーターをスクリーニングする方法。
【請求項７５】
候補薬剤の存在下および不在下で、VEGF-Ｄポリペプチドを含む組成物と神経細胞または神経前駆細胞とを接触させ；
当該候補薬剤の存在下および不在下で、細胞の増殖、移動、分化または生存を測定し；および
当該候補薬剤の存在下および不在下で得られた異なる測定結果から、当該候補薬剤を、神経細胞または神経前駆細胞に関するVEGF-Ｄ効果のモジュレーターとして同定する；
ことを含む、神経幹細胞または神経前駆細胞の増殖、移動、分化または生存に関与するVEGF-Ｄ刺激のモジュレーターをスクリーニングする方法。
【請求項７６】
当該細胞が、神経幹細胞系を含む請求項７４または７５に記載の方法。
【請求項７７】
当該細胞が、VEGFR-３を発現する神経細胞または神経前駆細胞を含む請求項７４または７５に記載の方法。
【請求項７８】
当該細胞が、ニューロピリン２を発現する請求項７４、７５または７６のいずれかに記載の方法。
【請求項７９】
神経幹細胞または神経前駆細胞の増殖、移動、分化または生存を刺激するアゴニストであるモジュレーターを検出する方法であって、当該アゴニストが、細胞表面の神経細胞マーカーの染色度の増大または細胞内の増殖マーカーの増大によって検出される請求項７４または７５に記載の方法。
【請求項８０】
神経幹細胞または神経前駆細胞の増殖、移動、分化または生存を刺激するアンタゴニストであるモジュレーターを検出する方法であって、当該アンタゴニストが、細胞表面の神経細胞マーカーの染色度の減退または細胞内の増殖マーカーの減少によって検出される請求項７４または７５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、共に2003年９月23日に出願された、米国特許出願第10/669,176号および米国特許仮出願第60/505,607号に基づく優先権を主張する。  ここに本明細書の一部を構成するものとして、すべての基礎出願の内容を援用する。
【０００２】
本願発明は、特に、血管形成および脈管形成、および血管系と神経系との相互作用の分野における、細胞および分子生物学および医薬に関する物質および方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
ニューロピリン受容体タンパク質と、分子のコラプシン／セマフォリンファミリーにおけるそれらのリガンドとの相互作用は、ニューロン成長円錐体および軸索ガイダンス、すなわち、ニューロン組織の発生過程で延長しつつある軸索の経路を調節するプロセスの発達を促す。  ニューロンの不適切な成長は、組織の過剰かつ不要な神経支配をもたらす。
【０００４】
コラプシン／セマフォリンタンパク質は、アミノ末端に約500個のアミノ酸を有する特徴的なセマフォリンドメインを含む分子のファミリーに属する。  分泌性および膜結合形態の双方に関して、現在のところ、２０を超えるセマフォリンファミリーのメンバーが知られており、これらは、一次タンパク質構造に基づいて６つの異なるサブグループに分類することができる。  分泌性および膜結合セマフォリンは、そのいずれもが、ジスルフィド結合ホモダイマーとしてそれらの受容体に結合し、また、膜結合セマフォリンの細胞質末端は、細胞膜内のこれらリガンドのクラスタリングを誘導することができる。
【０００５】
クラスIIIセマフォリン、セマフォリンドメイン、そして、Ｃ２-タイプの免疫グロブリン様ドメインを含む分泌タンパク質は、ニューロン成長円錐体の阻害および崩壊、それに、後根神経節、交感神経ニューロン、および頭側および脊髄ニューロンの不適切な神経支配を妨げるプロセスに総合的に関与することが見出されている。
【０００６】
最近になって、クラスIIIセマフォリンに対する２つの受容体、ニューロピリン-１(NRP-１)(Kolodkin et al., Cell. 90 :753-762 (1997)および He et al., Cell. 90 :739-51 (1997))およびニューロピリン-２(NRP-２)(Chen et al, Neuron, 19; 547 (1997))が同定されている。  もともとはゼノパス神経系から単離されたタイプ-Ｉ膜タンパク質であるニューロピリン-１は、SemaIIIやその他のセマフォリンファミリーメンバーに対する高親和性受容体として、セマフォリンIII受容体の発現のクローニングによって同定されていた。  ニューロピリン-１に相同な配列を用いるＰＣＲによった他の分析によって、関連受容体、すなわち、タンパク質全長にわたってNRP-１に対して約44％の相同性を示すニューロピリン-２が同定されている。
【０００７】
NRP-１およびNRP-２の双方の細胞外部分は、a1/a2、b1/b2およびｃと命名された５種類のタンパク質ドメインを保有する細胞結合ドメインの混合体を含む。  a1/a2(CUB)ドメインは、補体成分C1rおよびCsに認められるタンパク質配列に似ており、他方で、b1/b2ドメインは凝固第Ｖ因子および第VIII因子に認められるドメインと同様である。  メプリン/A5/mu-ホスフォターゼ(MAM)相同性ドメインと同様なcドメインの中央部分は、ニューロピリン二量体化において重要である。  ニューロピリンの細胞内領域は、膜貫通ドメイン、および現在までに知られている触媒活性を有さない43個までのアミノ酸かならなる短くて高度に保存された細胞質末端を含む。  a1/a2およびb1/b2の双方のドメインは、セマフォリンのニューロピリンへの結合を容易ならしめる上で重要である。
【０００８】
ニューロピリンの短い細胞質末端は、シグナリング能力を有していないので、ニューロピリンは、おそらくは、他の受容体と結合して、セマフォリンとの結合を受けて細胞内シグナルを伝達する。  この仮説の研究は、ニューロピリンが、セマフォリン受容体のその他のファミリー、つまり、リン酸化が可能で、下流シグナリングカスケードを開始することができる性的プレキシンドメインを含有する細胞質末端を保有するプレキシンと相互作用すると結論付けている(Tamagnone et al., Trends in Cell Biol., 10: 377-83 (2000))。  プレキシンは、もともと膜結合セマフォリンに対する稀少受容体として単離されたものであって、プレキシンそれ自体は、クラスIIIサブファミリーに属する分泌セマフォリンのような物質に結合することができない。  膨大な数の研究から、クラスIIIセマフォリン結合が、細胞内シグナルの変換に必要なホモ-またはヘテロダイマーニューロピリンおよびプレキシン分子を含む受容体複合体を介して媒介していることが証明されている。  プレキシンとニューロピリンとの相互作用は、セマフォリン結合の特異性を付与し、また、これらリガンドの結合親和性を増加させることもできる。  これら受容体を介するセマフォリンによる信号伝達は、Fujisawa et al.(Current Opinion in Neurobiology, 8: 587 (1998))およびTamagnone et al.(Trends in Cell Biol., 10: 377 (2000))で報告されている。
【０００９】
ニューロピリン-１(Tagaki et al., Neuron 7: 295-307 (1991)；Fujisawa et al., Cell Tissue Res. 290: 465-70 (1997))、そして、その遺伝子が染色体10p12にある140kDタンパク質(Rossingnol et al.,Genomics 57: 459-60 (1999))は、神経組織、心血管系の毛細血管および血管、および骨格組織を含めて、発生過程において多様な組織で発現され、多くの成人組織、最も顕著には胎盤および心臓に常に存在する。  Sema3Aへの結合に加えて、NRP-１はSema3B、Sema3C(SemaE)、およびSema3F(SemaIV)(低親和性を持つ)を含めたいくつかの他のセマフォリンファミリーメンバーにも結合する(He et al., Cell 90: 739-51 (1997); Kolodkin et al., Cell 90: 753-62 (1997))。  NRP-１遺伝子座におけるマウスホモ接合性突然変異体は、軸索ガイダンスにおいて欠陥を示すのみならず、脳での不正常な血管形成、および心臓の主要血管の形成での欠陥ももたらす(Kawasaki et al., Development 126: 4895 (1990))。  興味深いことに、胚におけるNRP-１の過剰発現は、過剰な毛細血管および血管形成および出血をもたらし、このことは、血管発生におけるNRP-１の役割を示す(Kitsukawa et al, Development, 121: 4309 (1995))。
【００１０】
最近の報告によれば、ニューロピリン-１が、胚発生における血管形成および脈管形成の鍵となる媒介物である(Robinson et al., J.Cell Science. 114: 853-65に掲載されている)血管内皮成長因子のイソ形態(VEGF/VEGF-Ａ)に対する受容体として作用することができ(Soker et al, Cell 92:735 (1998))、また、腫瘍脈管形成において重要な役割も果たすことが示されている。  受容体チロシンキナーゼ(RTK) VEGFR-１およびVEGFR-２へのVEGFの結合は、血管の発生を容易にする。  非ヘパリン依存性VEGF121イソ形態およびヘパリン-結合VEGF165は、共にin vitroにおいて同一の親和性を以てしてVEGFR-２に結合するが、同等の生化学的応答を誘導しないことから、さらなる別の因子がVEGFR-２の活性化を媒介することが示されている(Whitaker et al., J Bio Chem. 276: 25520-31 (2001))。  VEGFのいくつかのスプライス変種での結合性の分析は、NRP-１がVEGF121イソ形態に結合しないが、NRP-１のｂドメイン内でヘパリン依存的にVEGF165変種に選択的に結合することが明らかにされている(Giger et al., Neuron 21: 1079-92 (1998))。  NRP-１は、VEGF165イソ形態に対する結合親和性を示し、これはSema3Aリガンドのそれに匹敵する。  VEGF165に対するNRP-１のこの独特の親和性によって、非ヘパリン結合VEGF121に対するスプライス変種の信号伝達能力を説明することができ、また、プレキシン／セマフォリン複合体におけるその役割と同様に、ニューロピリン-１は、VEGF結合における共受容体としてVEGFR-2と相互作用することを示すものでもある(Whitaker et al., 2001)。  VEGF165は、VEGFエクソン７を通じてNRP-１に結合して、VEGF121イソ形態では欠けているヘパリン結合親和性を、この分子に付与する。  NRP-１は、他のVEGFファミリーメンバー、VEGF-Ｂ(Migdal et al., J. Biol. Chem. 273: 22272-78 (1998))、胎盤成長因子(P1GF-2)(Makinen et al., J. Biol. Chem. 274: 21217-222 (1999))およびVEGF-Ｃ(国際公開第WO 00/23565号)にも結合する。
【００１１】
その遺伝子が染色体２q３４に局在している120kDのタンパク質(Rossingnol et al., Genomics 57: 459-60 (1999))であるニューロピリン-２(Chen et al., Neuron 19: 547-59 (1997))は、ニューロピリン-１として発生する胚において同様な組織分布を呈するが、毛細血管の内皮-細胞で発現されているとは考えられない(Chen et al., Neuron 19:547-59 (1997)ものの、リンパ系毛細血管では発現されている。  NRP-２は、Sema3Fに対して高い親和性を有し、また、Sema3C/NRP-１結合に匹敵する親和性でもってしてSema3Cに結合するセマフィリン受容体でもあり、NRP-２は、非常に低い親和性でもってしてSema3Aに相互作用するものと考えられる(Kolodkin et al., Cell 90:753-62 (1997)。  NRP-２欠損マウスは、交感神経および海馬ニューロンのSema3F-依存性形成における欠陥、および末梢および中枢神経系での軸索突起における欠陥を呈し、これは軸索ガイダンスにおけるNRP-２にも関与しており(Chen et al., Neuron 25:43-56 (2000);Giger et al., Neuron29-41(2000))、発生過程でのNRP-１およびNRP-２に対する異なる役割を示唆している。  NRP-２ノックアウトマウスは、発生過程にて小さなリンパ血管および毛細血管の不存在または著しい消失を示し、他方で、動脈、静脈および大径のリンパ血管は正常であり、このことは、小さなリンパ血管および毛細血管の発生において、NRP-２が必要であることを示唆するものである(Yuan et al., Development 129:4797-806 (2002))。  NRP-２の発現は、腸管膜、筋肉および粘膜下叢のような平滑筋細胞を神経支配する部位において認められている(Cohen et al., Biochem. Biophy. Res. Comm. 284:395-403 (2001))。
【００１２】
実験的証拠は、NRP-１と同様に、ニューロピリン-２が、優先的にVEGF165に結合し、VEGF145イソ形態、VEGFのもう一つのヘパリン-結合スプライスに対する結合を実証している(Gluzman-Poltorak et al., J. Biol Chem.275:18040-45 (2000))。  エクソン７を欠いたVEGF145スプライス変種とニューロピリン-２との相互作用は、エクソン７と同様に、ヘパリン結合活性を媒介することができるVEGF145エクソン６を介して媒介される。  VEGF145はNRP-１に結合することができず、これは、血管発生におけるニューロピリン-１およびニューロピリン-２に対する異なる機能の理論を支持するものである。  VEGF145は、もともと、雌生殖管の癌腫から単離されたものであり(Pavelock et al., Endocrinology. 142:613-22 (2001))、ニューロピリン-２の発現は、NRP-１およびVEGFR-２と比較して、ホルモン変化に対する応答において異なる調節を示す。  特別な細胞型における双方のニューロピリン、VEGFおよびVEGFRの共発現は、潜在的受容体／リガンド複合体を形成するものであり、より詳細に研究される必要がある。
【００１３】
VEGF/VEGFR相互作用は、胚血管形成および脈管形成において総合的な役割、ならびに創傷治癒過程での成人組織血管新生、雌生殖系の再構成、および腫瘍成長において相応の役割を果たす。  血管新生および脈管形成の調節に関与するさらなる因子、ならびにそのようなプロセスにおけるそれらの役割の解明は、固体腫瘍の血管形成の防止、および腫瘍後退の誘導、および損傷、外科手術、または組織移植後におけるより迅速で効果的な創傷治癒を促し、また、虚血性組織に栄養を与える血管の脈管形成および動脈形成を誘導することによって虚血症を治療するような血管形成の誘導に関する治療法の開発で役に立つであろう。  事実、脈管形成プロセスの調節は、脳梗塞／脳出血、急性心筋梗塞および虚血症および癌のような、先進国において人類を脅かしている最も重要な多くの疾患の治療または治癒のための手段となり得る。
【００１４】
また、ニューロン成長の調節は、多数の先天性、変性および外傷-関連神経学的疾患の治療における手段でもある。  ニューロピリンおよびVEGFの間に新しく見出された相互作用は、ニューロンおよび血管での疾患および状態の双方についての分子レベルにおける介入に対する標的を提供するものである。  しかしながら、標的とされた療法を開発する能力は、ニューロピリンに対する多数の結合パートナーの存在によって複雑多様となっている。  ニューロピリンに結合して、ニューロピリン活性の調節の同定を可能とし、そのような分子の特異性を最適化して、癌または固体腫瘍の成長時での好ましくない脈管形成の領域における療法を最適化し、そして、創傷の治癒過程で、プロ-脈管形成特性を増強して、必要な血管成長を促して、その成長速度を高め、それにより、ニューロンの成長および組織化に関する療法を最適化する分子設計が待望されているのである。
【発明の開示】
【００１５】
本願発明は、ニューロピリンおよびVEGF-Ｃ分子間、およびニューロピリンおよびVEGFR-３分子間の新規な分子相互作用を同定することによって、脈管形成および神経系の成長および機能の調節に関連する当該技術分野における一つ以上の要望を実現する。  これらの新たな相互作用は、(リンパ形成プロセスを含めた)脈管形成プロセス、および神経細胞の成長、分化および再生に関与するプロセスを調節するための新規な物質および方法の同定を容易とする。  また、新たな相互作用は、単一の受容体-リガンド相互作用を高度に選択的に調節する分子、または多数の相互作用を調節する分子の設計を可能とすることによって、良好な治療的標的化を容易とする。
【００１６】
例えば、VEGF-Ｃ-ニューロピリン相互作用の発見は、VEGF-Ｃ-ニューロピリン相互作用を調節する(アップレギュレートする／活性化する／刺激するまたはダウンレギュレートする／阻害する)新しい治療的分子を同定するための新規なスクリーニングアッセイを提供する。  そのような分子は、リンパまたは血管成長が役割を果たすものを含めて、VEGF-Ｃ／ニューロピリン相互作用が影響を有する疾患および状態、または神経系の疾患および状態に対する治療剤(および／またはリード化合物)として有用である。
【００１７】
ある実施態様によれば、本願発明は：
(ａ)推定モジュレーター化合物の存在下および不存在下で、ニューロピリンポリペプチドを含むニューロピリン組成物を、VEGF-Ｃポリペプチドを含むVEGF-Ｃ組成物と接触させ；
(ｂ) 推定モジュレーターの存在および不存在下で、ニューロピリンポリペプチドおよびVEGF-Ｃポリペプチドの間を検出し；および
(ｃ) 推定モジュレーター化合物の不存在下における結合と比較して、推定モジュレーター化合物の存在下において、ニューロピリンポリペプチドおよびVEGF-Ｃポリペプチドの間の結合の増加または減少に基づいてモジュレーター化合物を同定する；
工程を含む、ニューロピリン受容体およびVEGF-Ｃポリペプチドの間の結合のモジュレーターを同定する方法を提供する。
【００１８】
ある実施態様によれば、この方法は、担体、好ましくは、薬学的に許容される担体中の工程(ｃ)に従って同定された分子をさらに処方して、モジュレーター組成物を調製する工程(ｄ)を含む。  このようなモジュレーターは、動物実験において、特に、組織を視覚化するために、または、ニューロピリン-VEGF-Ｃ相互作用に関連する疾患を治療するための投与療法において有用であり、それら化合物を投与することで、これら分子の有害活性を干渉でき、または有用な活性を促すことができる。  さらに他の実施態様によれば、この方法は、ニューロピリン受容体を発現する細胞を含む動物に、モジュレーター組成物を投与し、次いで、動物におけるモジュレーター組成物の生理学的効果を決定する工程(ｅ)を含む。  この動物は、ヒト、またはヒト用医薬研究用の動物モデル、または家畜またはペットとして重要な動物でもよい。  好ましい態様によれば、(ヒトを含めた)動物は異常なニューロピリン-２／VEGF-Ｃ生物学によって特徴付けられる疾患または状態を有しており、このモジュレーターは(例えば、疾患の兆候を低下させ、疾患進行を遅らせ、疾患を治癒し、またはそうでなければ臨床的結果を改善することによって)動物の状態を改善する。
【００１９】
前述した方法の工程(ａ)は、化合物の存在下および不存在下において、ニューロピリン組成物をVEGF-Ｃ組成物と接触させることを含む。  「ニューロピリン組成物」とは、すべてのニューロピリン受容体ポリペプチドを含むいずれかの組成物、あるいは、特別なアッセイで必要なニューロピリンポリペプチドの少なくとも部分であって、後者の場合、VEGF-Ｃ結合に関与するニューロピリンポリペプチドの部分を含む。  ニューロピリン組成物として、(i)すべてのニューロピリンタンパク質を含む、またはVEGF-Ｃポリペプチドに結合するニューロピリン受容体細胞外ドメイン断片を含む精製されたポリペプチドを含む組成物；(ii)その表面にニューロピリン受容体ポリペプチドを含有するリン脂質膜を含有する組成物；(iii)(例えば、好ましくは、付着されたプロモーターと共にニューロピリン遺伝子を細胞に挿入することによって；または、内因性ニューロピリン遺伝子を増幅することによって;または、外因性プロモーターまたは他の調節配列を挿入して、内因性ニューロピリン遺伝子をアップレギュレートすることによって)その表面のニューロピリン受容体ポリペプチドの増大された量を発現するように組換えにより修飾された生体細胞；および(iv)その表面にニューロピリン受容体ポリペプチドを天然系で発現する単離された細胞または組織を含む。  あるアッセイフォーマットでは、注目するニューロピリン分子(例えば、ニューロピリン受容体細胞外ドメイン断片を含むポリペプチドを含む組成物)をビーズまたはアッセイプレートウェルのような固体支持体に結合させるのが望ましいであろう。  「ニューロピリン組成物」は、このような構造を具備した同様のものをも意図している。  同様に、ニューロピリンポリペプチドが(抗体Fc断片のような)他のタンパク質と融合して、溶解性を改善する、またはマーカーエピトープを供し、またはその他の目的に合致する融合タンパク質も考えられる。  他のアッセイフォーマットでは、可溶性ニューロピリンペプチドが好ましいであろう。  その他の好ましい実施態様によれば、ニューロピリン組成物は、免疫グロブリンFc断片に融合したニューロピリン受容体細胞外ドメイン断片を含むポリペプチドを含む。  現在のところ、二つのファミリーメンバー(ニューロピリン-１およびニューロピリン-２)が知られているが、引き続いて発見されるであろうその他のニューロピリン受容体ファミリーメンバーでの本願発明の実施が考えられる。      
【００２０】
選択されたニューロピリン受容体は、好ましくは、脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、さらに好ましくは霊長類、最も好ましくはヒト由来のものである。  そして、選択されたニューロピリン受容体の機能的部分が、アミノ酸配列において天然受容体と同一であるならば、アッセイが最良な結果を示すことは明らかであるが、そのVEGF-Ｃ結合特性が維持されている限りは、ニューロピリン配列に変異が導入されても、本願発明を依然として実施できることは明らかであろう。  少なくとも90％、95％、96％、97％、98％または99％のアミノ酸同一性を有する変異配列の使用が具体的には考えられる。
【００２１】
VEGF-Ｃ分子は、自然界では、周囲の媒体への放出に先だって、いくつかの酵素切断を受ける分泌因子として生成する。  従って、「VEGF-Ｃ組成物」とは、プレプロ-VEGF-Ｃポリペプチド、プレプロ-VEGF-Ｃの中間体および最終切断産物、ΔNΔC VEGF-Ｃを含み、または特別なアッセイで必要なVEGF-Ｃの少なくとも部分、すなわち、ニューロピリン受容体への結合に関与する部分を含むいずれの組成物も意味するものである。VEGF-Ｃ組成物として：(i)精製された完全なプレプロ-VEGF-Ｃポリペプチドを含む、またはアッセイのために選択されたニューロピリン受容体に結合するプレプロ-VEGF-Ｃポリペプチド断片を含む組成物；および(ii)VEGF-Ｃタンパク質を分泌する細胞からの条件培地を含む。  あるアッセイフォーマットでは、注目するVEGF-Ｃ分子(例えば、VEGF-Ｃ断片を含むポリペプチド)をビーズまたはアッセイプレートウェルのような固体支持体に結合させるのが望ましいであろう。  「VEGF-Ｃ組成物」は、このような構造を具備したものまでをも意図している。  同様に、融合タンパク質が考えられる。  本願明細書に記載のデータは、VEGF-Ｃのイソ形態が、ニューロピリン-１およびニューロピリン-２双方に結合することを示している。  選択されたVEGF-Ｃポリペプチドは、好ましくは、脊椎動物、より好ましくは、哺乳動物、さらに好ましくは、霊長類、最も好ましくはヒト由来のものである。ある実施態様によれば、VEGF-Ｃ組成物は、配列番号:24のアミノ酸103乃至227を含有するヒトプレプロ-VEGF-Ｃの断片を含む。  さらに他の実施態様によれば、VEGF-Ｃ組成物は、配列番号：24のヒトプレプロ-VEGF-Ｃ配列のアミノ酸32乃至227を含む。  アッセイは、もし選択されたVEGF-Ｃの機能的部分が、天然VEGF-Ｃの対応する部分とアミノ酸配列が同一であれば、アッセイが最良な結果を示すことは明らかであるが、本願発明は、そのニューロピリン受容体結合特性が維持されている限りは、VEGF-Ｃ配列に変異が導入されても依然として実施可能である。  少なくとも90％、95％、96％、97％、98％または99％のアミノ酸同一性を持つ変異配列の使用が、具体的に考えられる。
【００２２】
工程(ａ)で使用される推定モジュレーター化合物は、ニューロピリン-VEGF-Ｃ相互作用を調節する能力の試験を必要とする有機または無機化学物質、または生物学的分子、または組成物である。  最も好ましいモジュレーターは、治療剤として投与することができるものであるので、限定された毒性を持つ分子が好ましいことは明らかである。  しかしながら、毒性は、引き続き行われる他のアッセイでスクリーニングすることができ、医薬化学者によって化合物から「設計排除」できる。  製薬会社にて伝統的に維持されている化学ライブラリー、またはコンビナトーリアルライブラリー、ペプチドライブラリーなどを利用したスクリーニングが具体的に考えられる。
【００２３】
前述した方法の工程(ｂ)は、当該化合物の存在下および不存在下において、ニューロピリンおよびVEGF-Ｃの間の結合を検出することを含む。  分子間結合を検出するためのいずれの技術も使用することができる。  結合の定量的測定を行える技術が、好ましい。  例えば、ニューロピリン／VEGF-Ｃの一方または双方は放射性同位体、フルオロフォア、蛍光性タンパク質(例えば、天然または合成緑色蛍光タンパク質)、色素、酵素または基質などのような標識を利用することができる。  そのような標識は、標準的な実験室の機械および技術での定量的検出を容易とする。  イムノアッセイとは、二つの分子の間の結合を検出するための慣用的かつ高度に効果的な技術の一群を指す。
【００２４】
ニューロピリン組成物は、ニューロピリンを天然または組換えによってその表面で発現する細胞を含む場合、例えば、細胞中のVEGF-Ｃ結合-誘導生理学的変化を検出または測定することによって、VEGF-Ｃ結合を間接的に検出することが可能である。  そのような変化として、ニューロピリン会合VEGF-受容体のリン酸化；細胞化学走性；細胞増殖；DNA合成；細胞形態の変化；イオンフラックスなどがある。
【００２５】
概説した方法の工程(ｃ)は、推定モジュレーター化合物の不存在下での結合と比較して、推定モジュレーター化合物の存在下においてニューロピリン受容体ポリペプチドおよびVEGF-Ｃポリペプチドの間の増大または減少した結合に基づいてモジュレーター化合物を同定することを含む。  一般的には、好ましいモジュレーターは、低濃度においてニューロピリン-VEGF-Ｃ結合を活性化し、または阻害し、それにより、医薬組成物でのモジュレーターの有効用量の低減を可能とするものである。
【００２６】
他の実施態様によれば、本願発明は、VEGF-Ｃの生物学的活性のモジュレーターの選択性をスクリーニングする方法を提供する。  「選択性」の用語は、本明細書にてモジュレーターについて言及する場合、一つ以上の結合対(例えば、VEGFR-２、またはVEGFR-３、またはニューロピリン-１とVEGF-Ｃとの結合)でのその他のタンパク質-タンパク質相互作用の相互作用に関する最小効果を示す、一つのタンパク質-タンパク質相互作用(例えば、ニューロピリン-２とVEGF-Ｃとの結合)を調節するモジュレーターの能力を指す。  より選択的なモジュレーターは、他のタンパク質-タンパク質相互作用に対する最小効果を示しながらも、第一のタンパク質-タンパク質相互作用を有意に変化させ、他方で、非選択的モジュレーターは二つ以上のタンパク質-タンパク質相互作用を変化させる。  選択性は、効果的な医薬の設計にとって非常に興味深いものである。  例えば、いくつかの態様において、神経学的成長ではなく血管の成長の調節が所望されているため、VEGF-Ｃ／ニューロピリン相互作用を変化させるが、セマフォリン／ニューロピリン相互作用を変化させないモジュレーターを同定するのが望ましい。  その他に、選択的モジュレーターを用いて、ニューロンの成長を調節するのも望ましい。  いくつかの態様において、例えば、抗腫瘍療法においてすべてのVEGF-Ｃ関連活性を非選択的に阻害するのが望ましい。  本明細書で同定された分子相互作用は、新規なスクリーニングアッセイが、モジュレーターの選択性の同定を補助する。
【００２７】
例えば、VEGF-Ｃ分子は、VEGFR-２およびVEGFR-３チロシンキナーゼ受容体に対する公知のリガンドである。  VEGF-Ｃ/VEGFR-３相互作用は、リンパ血管系の発生および維持に総合的に関与すると考えられ、また、リンパ系を通じての癌転移にも関与する。  VEGF-Ｃ/ニューロピリン相互作用を特異的に調節する上で有用であり、また、VEGF-Ｃ/VEGFR相互作用を選択的に調節する上でも有用である。  本願発明は、ニューロピリン-VEGF-Ｃ結合またはVEGF-Ｃ-VEGFR結合に対するモジュレーターの選択性を同定するカウンタースクリーンアッセイを提供する。
【００２８】
ある実施態様によれば、本願発明は：
(ａ) 化合物の存在下および不存在下で(組成物中での)VEGF-Ｃ組成物をニューロピリン組成物と接触させて、該化合物の存在下および不存在下でVEGF-Ｃおよびニューロピリンの間の結合を検出し、かつ該化合物の存在下および不存在下における異なる結合は、化合物を、VEGF-Ｃおよびニューロピリンの間の結合のモジュレーターとして同定し；
(ｂ) 該化合物の存在下および不存在下で、VEGF-Ｃ組成物を、VEGF-Ｃ結合パートナーを含む組成物と接触させて、該化合物の存在下および不存在下においてVEGF-Ｃおよび結合パートナーの間の結合を検出し、かつ該化合物の存在下および不存在下における異なる結合は、VEGF-Ｃおよび結合パートナーの間の結合のモジュレーターとして該化合物を同定し；および、結合パートナーは：
(i)VEGFR-３細胞外ドメインを含むポリペプチド；および
(ii)VEGFR-２細胞外ドメインを含むポリペプチド；
からなるグループから選択され；および
(ｃ)工程(ａ)および(ｂ)で検出された結合に基づいてモジュレーター化合物の選択性を同定する；
工程を含む方法を提供する。
【００２９】
工程(ａ)は、前述したように、ニューロピリン組成物をVEGF-Ｃ組成物と接触させることを含む。  概説した方法の工程(ｂ)は、同一化合物の存在下および不存在下で、工程(ａ)に記載のVEGF-Ｃ組成物を、VEGF-Ｃ結合パートナーを含む組成物と接触させることを含む。VEGF-Ｃ結合パートナーは(i)VEGFR-３細胞外ドメインを含むポリペプチド；および(ii)VEGFR-２細胞外ドメインを含むポリペプチドからなるグループから選択される。  この方法は、その受容体、VEGFR-２およびVEGFR-３へのVEGF-Ｃ結合に関して、VEGF-Ｃ／ニューロピリン結合のモジュレーターの選択性を測定することを含む。  選択されたVEGF-Ｃ結合パートナーは、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、さらに好ましくは霊長類、最も好ましくはヒト由来のものである。  そして、もし選択されたVEGF-Ｃ結合パートナーの機能的部分が、天然VEGF-Ｃ結合パートナーとアミノ酸配列が同一であれば、アッセイは最良の結果を示すことは明らかであり、本願発明は、そのVEGF-Ｃ結合特性が維持される限りは、VEGF-Ｃ結合パートナー配列に変異が導入されても実施可能であることは明らかである。  少なくとも90％、95％、96％、97％、98％または99％アミノ酸同一性を有する変異配列の使用が具体的に考えられる。  分子間結合を検出するためのいずれの技術も、使用することができる。  例えば、結合パートナーまたはVEGF-Ｃの一方または双方は、放射性同位体、フルオロフォア、蛍光性タンパク質(例えば、天然または合成緑色蛍光タンパク質)、色素、酵素または基質などのような標識を含むことができる。      
【００３０】
このような標識は、標準的な実験室の機器および技術での検出を容易とする。
【００３１】
ある実施態様によれば、結合パートナー組成物は、結合パートナーを天然または組換えにてその表面に発現する細胞を含む。  この状況において、例えば、細胞中のVEGF-Ｃ結合-誘導生理学的変化を検出または測定することによって、VEGF-Ｃ結合を間接的に検出することが可能である。  そのような変化は、会合したVEGFRのリン酸化；細胞化学走性；細胞成長、細胞形態の変化；イオンフラックスなどを含む。
【００３２】
概説した方法の工程(ｃ)は、工程(ａ)および(ｂ)における増大または減少した結合に基づいてモジュレーター化合物の選択性を同定することを含む。  選択的モジュレーターである化合物は、工程(ａ)または工程(ｂ)いずれかにおいて、有意に異なる結合を獲得するが、工程(ａ)および(ｂ)双方において、有意に異なる結合を獲得しない。  非特異的モジュレーターは、工程(ａ)および(ｂ)双方において有意に異なる結合を獲得しない。
【００３３】
さらに他の実施態様によれば、本願発明は：
(ａ)化合物の存在下および不存在下においてニューロピリン組成物をVEGF-Ｃ組成物と接触させて、該化合物の存在下および不存在下においてニューロピリンおよびVEGF-Ｃの間の結合を検出し、そして、該化合物の存在下および不存在下における異なる結合によって、ニューロピリンおよびVEGF-Ｃの間の結合のモジュレーターとして該化合物を同定し；
(ｂ) 該化合物の存在下および不存在下でニューロピリン組成物をニューロピリン結合パートナーを含む組成物と接触させて、該化合物の存在下および不存在下においてニューロピリンおよび結合パートナーの間の結合を検出し、そして、該化合物の存在下および不存在下における異なる結合によって、ニューロピリンおよび結合パートナーの間の結合のモジュレーターとして該化合物を同定し；および、結合パートナーは：
(i) セマフォリン３ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(ii) VEGF-Ａアミノ酸配列、VEGF-Ｂアミノ酸配列、VEGF-Ｄアミノ酸配列、P1GF-２アミノ酸配列、VEGFR-１アミノ酸配列、VEGFR-２アミノ酸配列、VEGFR-３アミノ酸配列を含むポリペプチド；および
(iii) プレキシンポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
からなるグループから選択され；
(ｃ) 工程(ａ)および(ｂ)で検出された結合をコードしてモジュレーター化合物の選択性を同定する；
工程を含む、ニューロピリンの生物学的活性のモジュレーターの選択性をスクリーニングする方法を提供する。
【００３４】
工程(ａ)は、前記したように、ニューロピリン組成物をVEGF-Ｃ組成物と接触させることを含む。  工程(ｂ)は、化合物の存在下および不存在下で、工程(ａ)に記載のニューロピリン組成物をニューロピリン結合パートナーを含む組成物と接触させることを含む。  ニューロピリン結合パートナーは、ニューロピリンが結合するVEGF-Ｃ以外のいずれかのタンパク質を含む。  結合パートナーとして、セマフォリン３ファミリーメンバーポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド；VEGF-Ａアミノ酸配列を含むポリペプチド、VEGF-Ｂアミノ酸配列を含むポリペプチド、VEGF-Ｄアミノ酸配列を含むポリペプチド、P1GF-２アミノ酸配列を含むポリペプチド、VEGFR-１アミノ酸配列を含むポリペプチド、VEGFR-２アミノ酸配列を含むポリペプチド、VEGFR-３アミノ酸配列を含むポリペプチド；およびプレキシンファミリーメンバーのアミノ酸配列を含むポリペプチドがある。  選択された結合パートナーは、好ましくは、脊椎動物、より好ましくは、哺乳動物、さらに好ましくは、霊長類、最も好ましくはヒト由来のものである。  そして、選択されたニューロピリン結合パートナーの機能的部分が、天然配列とアミノ酸配列が同一であれば、アッセイは最良の結果を示すことは明らかであり、また、本願発明は、そのニューロピリン結合特性が維持される限りは、天然配列に変異が導入されても実施可能である。  少なくとも90％、95％、96％、97％、98％または99％アミノ酸同一性を有する変異配列の使用が、具体的には考えられる。
【００３５】
この方法は、化合物の存在下および不存在下において、ニューロピリン組成物および結合パートナーの間の結合を検出することを含む。  分子間結合を検出するいずれの技術も使用することができる。  例えば、結合パートナーまたはニューロピリンの一方または双方は放射性同位体、フルオロフォア、蛍光性タンパク質(例えば、天然または合成緑色蛍光タンパク質)、色素、酵素または基質などのような標識を含むことができる。  そのような標識は、標準的な実験室機器および技術での検出を容易とする。
【００３６】
概説した方法の工程(ｃ)は、工程(ａ)および(ｂ)における増加したまたは減少した結合に基づいて、および前記したように選択的モジュレーター化合物の特徴を有するモジュレーター化合物の選択性を同定することを含む。
【００３７】
さらなる具体例において、本願発明は：
(ａ) 推定モジュレーター化合物の存在下および不存在下で、ニューロピリン組成物をVEGFR-３組成物と接触させ;
(ｂ) 推定モジュレーター化合物の存在下および不存在下で、ニューロピリンおよびVEGFR-３の間の結合を検出し；および、
(ｃ) 推定モジュレーター化合物の不存在下における結合と比較して、推定モジュレーター化合物の存在下におけるニューロピリン組成物およびVEGFR-３の間の結合の減少または増加に基づいてモジュレーター化合物を同定する；
工程を含む、ニューロピリン成長因子受容体およびVEGFR-３ポリペプチドの間の結合のモジュレーターをスクリーニングする方法を提供する。
【００３８】
工程(ａ)は、推定モジュレーター化合物の存在下および不存在下で、前述したニューロピリン組成物を、VEGFR-３組成物と接触させることを含む。  考えられるニューロピリン組成物は前述した通りである。  「VEGFR-３組成物」とは、(i)VEGFR-３タンパク質全体を含む、またはニューロピリンに結合するVEGFR-３断片を含む精製されたポリペプチドを含む組成物；(ii)その表面にVEGFR-３ポリペプチドを含むリン脂質膜を含有する組成物；(iii)その表面で増大した量のVEGFR-３を発現するように組換え修飾された生体細胞；および(iv)その表面で天然でVEGFR-３を発現するいずれかの単離された細胞または組織からなるグループから選択される物質を含む。  あるアッセイフォーマットでは、注目するVEGFR-３分子(例えば、VEGFR-３細胞外ドメイン断片を含むポリペプチド)を、ビーズまたはアッセイプレートウェルのような固体支持体に結合させるのが望ましいであろう。「VEGFR-３組成物」は、同様の構造を含むものまでをも意図している。  同様に、融合タンパク質が考えられる。  他のアッセイフォーマットでは、可溶性VEGFR-３ペプチドが、好ましい。  その他の好ましい実施態様によれば、VEGFR-３受容体は、免疫グロブリンFc断片に融合したVEGFR-３受容体断片を含む。
【００３９】
工程(ｂ)は、化合物の存在および不存在下において、ニューロピリン組成物およびVEGFR-３組成物の間の結合を検出することを含む。  分子間結合を検出するためのいずれの技術を使用することもできる。  例えば、ニューロピリン/VEGFR-３の一方または双方は放射性同位体、フルオロフォア、蛍光性タンパク質(例えば、天然または合成緑色蛍光タンパク質)、色素、酵素または基質などのような標識を含むことができる。  そのような標識は、標準的な実験室機器および技術での検出を容易とする。
【００４０】
一般的に、より好ましいモジュレーターは、低濃度でニューロピリン-VEGFR-３結合を活性化または阻害し、それにより、より低い有効用量での医薬組成物中のモジュレーターの使用を可能とするものである。
【００４１】
さらに他の実施態様によれば、本願発明は：
(ａ) 化合物の存在下および不存在下でVEGFR-３組成物をニューロピリン組成物に接触させて、該化合物の存在下および不存在下でVEGFR-３およびニューロピリンの間の結合を検出し、そして、該化合物の存在下および不存在下における異なる結合によって、VEGFR-３およびニューロピリンの間の結合のモジュレーターとして化合物を同定し；
(ｂ) 化合物の存在下および不存在下でVEGFR-３組成物をVEGFR-３結合パートナーを含む組成物と接触させて、該化合物の存在下および不存在下でVEGFR-３および結合パートナーの間の結合を検出し、そして、該化合物の存在下および不存在下における異なる結合はVEGFR-３および結合パートナーの間の結合のモジュレーターとして該化合物を同定し；および、結合パートナーが：
(i) VEGF-Ｃポリペプチドを含むポリペプチド；および
(ii) VEGF-Ｄポリペプチドを含むポリペプチド；
からなるグループから選択され；および
(ｃ) 工程(ａ)および(ｂ)で選択された結合に基づいてモジュレーター化合物の選択性を同定する；
工程を含む、VEGFR-３の生物学的活性のモジュレーターの選択性をスクリーニングする方法を提供する。
【００４２】
選択的モジュレーターは、工程(ａ)または工程(ｂ)のいずれかにおける有意で異なる結合をもたらすが、工程(ａ)および(ｂ)双方において有意な異なる結合をもたらささない。
【００４３】
ニューロピリン、VEGF-Ｃ、VEGF-ＤおよびVEGFR-３は、すべて、選択的スクリーニングについての多数の置換を招く多数の結合パートナーを有しているので、前述した選択性スクリーニングは、本願発明の特異的選択性スクリーニングの一部のみを示すことは明らかである。  以下の相互作用：(i)ニューロピリン-１/VEGF-Ｃ；(iii)ニューロピリン-２/VEGF-Ｃ；(v)ニューロピリン-１/VEGFR-３；および(vi)ニューロピリン-２/VEGFR3の内の一つを、少なくとも一つの他の相互作用(例えば、これらの分子のうちの一つの公知の相互作用、またはこれまでに記載したものからの第二の相互作用)と共に認められるいずれかの選択的スクリーニングも、本願発明の一部として考えることができる。
【００４４】
同様に、モジュレーターについてのスクリーニング、および選択性スクリーニングのすべては、所望により、以下の工程：(１)薬学的に許容される担体中に選択されたモジュレーターを処方してモジュレーター組成物を調製し；および(２)そのように処方されたモジュレーターを動物またはヒトに投与し、次いで、モジュレーターの効果を測定するための一方または双方の工程を含む。  好ましくは、動物またはヒトは、前述した分子相互作用の一つに関与する疾患または状態を有し、動物またはヒトは、望ましくは、軽減または治癒される疾患または状態に対するモジュレーターの効果を測定するためにモニターされる。
【００４５】
VEGF-Ｃ分子に結合するニューロピリン-２およびニューロピリン-１の発見は、現在知られている多くの疾患状態に関与する生物学的プロセスを研究するための新規かつ有用な物質および方法を提供する。  例えば、本願発明は：
(ａ) ニューロピリン受容体を発現する細胞を有する哺乳動物生物を同定し；および、
(ｂ) 該哺乳動物生物に、VEGF-Ｃポリペプチドに結合するニューロピリンポリペプチドまたはその断片を含む組成物を投与する、工程を含み、
当該組成物は、哺乳動物生物においてニューロピリンを発現する細胞の成長、移動または増殖を調節する上で効果的な量で投与される哺乳動物生物において細胞の成長、移動または増殖を調節する方法を提供する。
【００４６】
好ましくは、哺乳動物生物は、ヒトである。  また、細胞は、好ましくは血管内皮細胞、特に、ヒト微小血管内皮細胞(HMVEC)およびヒト皮下脂肪微小血管細胞(HUCEC)のようなリンパ系由来の細胞を含む。  さらに好ましい実施態様において、生物は内皮細胞の異常な成長、移動または増殖によって特徴付けられる疾患を有する。  投与を行うことで、好ましくは、例えば、それを修正し、またはその重症度を低下させ、またはその有害な兆候または効果を低下させることによって、異常な成長、移動または増殖を変化させる。
【００４７】
例えば、ある実施態様によれば、動物は、癌、特に、ニューロピリンを発現する内皮細胞を含有する血管系を特徴とする癌性腫瘍を有する。  細胞の成長、移動または増殖を減少させ、それにより、新しい血管系の成長を妨げることによって腫瘍の成長を遅らせる組成物が選択される。  そのような状況においては、リガンドのVEGF-ファミリーの阻害剤；エンドスタチン；阻害性アンギオポエチン等のような他の内皮成長因子／受容体相補作用を阻害する薬剤を投与することが望まれる。  阻害剤に、成長因子またはそれらのリガンドに対して特異的な抗体物質を含めることができる。  本願発明では、さらに、VEGFR-３を発現する血管内皮細胞またはVEGFR-３を発現するリンパ系内皮細胞を呈する、リンパ管腫、リンパ管肉腫、および転移性腫瘍を治療することが考えられる。  ある実施態様によれば、VEGFR-３とそのリガンドとの相互作用を阻害する組成物を投与することで、リンパ管形成を減少させ、またはそれを無くし、および癌性細胞の拡大を遅らせる。  さらなる実施態様において、VEGFR-３とそのリガンドとの相互作用を刺激する組成物の投与は、リンパ管形成を増強し、創傷を迅速に治癒する。
【００４８】
さらに、以下の工程：
(ａ) ニューロピリン受容体を発現する細胞を有する哺乳動物生物を同定し；および、
(ｂ) 該哺乳動物生物に組成物を投与する；
工程を含み、当該組成物は、ニューロピリン受容体に対して、およびVEGF-Ｃポリペプチドに対して特異的な二特異的抗体を含み、また、当該組成物は、哺乳動物においてニューロピリン受容体を発現する細胞の成長、移動または増殖を調節するのに有効な量で投与されることを特徴とする、哺乳動物生物において細胞の成長、移動または増殖を調節する方法も意図されている。  他の実施態様において、二特異的抗体は、ニューロピリン受容体に対して、およびVEGFR-３ポリペプチドに対して特異的である。
【００４９】
ある実施態様によれば、本願発明は、ニューロピリン受容体およびVEGF-Ｃポリペプチドに特異的に結合する二特異的抗体を提供する。  その他に、本願発明は、ニューロピリン受容体およびVEGFR-３ポリペプチドに特異的に結合する二特異的抗体を提供する。
【００５０】
ある実施態様によれば、本願発明を用いて、中枢神経系における神経変性を阻害することもできる。  末梢、より具体的には、中枢神経のニューロン損傷の周囲の瘢痕の発生は、セマフォリンリガンドの構成的発現と関連付けられてきた。  また、Sema3F、ニューロピリン-２受容体に対する一次リガンドのアップレギュレーションは、アルツハイマー病患者の脳で検出されている。  本願発明は、神経系において、セマフォリン活性と特異的に干渉するVEGF-Ｃ組成物を用いてセマフォリン-ニューロピリン相互作用を変化させる手段を提供する。
【００５１】
例えば、本願発明は：
(ａ) ニューロピリン受容体を発現するニューロン細胞を有する哺乳動物生物を同定し；および、
(ｂ) 該哺乳動物生物に組成物を投与する；
工程を含み、当該組成物は、ニューロピリン受容体に結合するVEGF-Ｃポリペプチドまたはその断片を含み、そして、当該組成物は、哺乳動物においてニューロピリンを発現する細胞でのニューロン瘢痕を低下させる上で有効な量をもってして投与することを含む、哺乳動物において異常な成長、またはニューロン瘢痕を調節する方法を提供する。
【００５２】
治療すべき他の疾患として、炎症疾患(例えば、慢性関節リウマチ、慢性創傷およびアテローム性動脈硬化症)がある。
【００５３】
同様に、本願発明は、ニューロピリン受容体を発現する細胞の異常な成長、移動、または増殖を特徴とする疾患の治療用の医薬の製造のために用ることが可能な、ニューロピリン受容体に結合するVEGF-Ｃの断片を含むポリペプチドを提供する。
【００５４】
同様に、本願発明は、ニューロピリン受容体を発現する細胞の異常な成長、移動または増殖を特徴とする疾患の治療用の医薬の製造のために用ることが可能な、VEGF-Ｃに結合するニューロピリンの断片を含むポリペプチドを提供する。  膜貫通ドメインを欠いたニューロピリンの可溶性形態が好ましい。  また、本願発明は、VEGFR-３ポリペプチドを発現する細胞の異常な成長、移動または増殖を特徴とする疾患の治療用の医薬の製造のために用ることが可能な、VEGFR-３ポリペプチドに結合するニューロピリン受容体の断片を含むポリペプチドを提供する。
【００５５】
タンパク質製剤の哺乳動物への投与を含む本願発明の態様に関しては、本願発明の関連する態様は、遺伝子治療を含み、それにより、注目するタンパク質をコードする遺伝子は動物における注目するタンパク質の発現を行うように投与される。  例えば、注目する遺伝子は適当なプロモーターに付着されて、注目する標的細胞におけるタンパク質の発現を促し、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、リポソーム、露出したDNAの導入などを含めた、遺伝子を細胞に投与することができる、いずれかの遺伝子治療ベクターで送達される。
【００５６】
VEGF-Ｃが神経栄養および神経保護増殖因子として機能することを支持する証拠は、ニューロンの喪失または機能的血管が問題となる障害を治療するための新しい治療的戦略において役立つ。  加えて、本願発明は、神経由来の神経芽腫またはその他の腫瘍を阻害するための「VEGF-Ｃ阻害剤」を用いる方法を提供する。  任意に、VEGF-Ｃ阻害剤は、VEGFR-３阻害剤、または二つ以上のPDGFまたはPDGFR阻害剤、または神経成長因子阻害剤と共投与される。
【００５７】
ある実施態様によれば、本願発明は、血管内皮成長因子Ｃ(VEGF-Ｃ)産物または血管内皮成長因子Ｄ(VEGF-Ｄ)産物を含む組成物を動物に投与することを含む、哺乳動物においてニューロン細胞またはニューロン前駆細胞の集積、増殖、分化、移動または生存を促進する方法を提供する。  用語「集積」は、ニューロン細胞およびニューロン前駆細胞の神経病理の部位への集積のような、細胞型の集積(例えば、移動)を引き起こす能力を指す。      
【００５８】
用語「増殖」とは、分裂再生をいう。  用語「分化」とは、多能性および他の非末端分化ニューロン前駆細胞が、他の細胞型へと発展するプロセスをいう。  分化は、多能性および十分に分化した細胞型の間に多数の段階を含んでよい。  用語「生存」とは、代謝および他の細胞機能を維持するニューロンまたは前駆細胞の能力をいう。
【００５９】
本願発明で有用な用語「VEGF-Ｃ産物」は、全長(プレプロ-)VEGF-Ｃポリペプチド；VEGF-Ｃ受容体への結合のような、VEGF-Ｃポリペプチドの少なくとも一つの生物学的活性を保有するその断片；VEGF-Ｃポリペプチドをコードし、それを用いて該ポリペプチドを発現することができるVEGF-Ｃポリペプチドおよびその断片；そのようなポリヌクレオチドを含むベクター(特に、発現ベクターおよび遺伝子治療ベクター)；およびVEGF-Ｃポリペプチドを発現する組換え細胞を含む。
【００６０】
VEGF-Ｃポリペプチドは、プレプロ-ペプチドとして天然系で生ずるものであって、このもには、周囲の媒体に分泌される前にシグナルペプチドおよびＣ末端プロ-ペプチドのタンパク質分解作用を受ける。  Ｎ末端プロ-ペプチドを切断するためのさらなるタンパク質分解作用は、十分に分解作用を受けたVEGF-Ｃを放出する。  「VEGF-Ｃ産物」は、プレプロ-VEGF-Ｃポリペプチド、プレプロ-VEGF-Ｃの中間および最終切断産物、VEGF-Ｃ ΔNΔC、VEGF-Ｃ ΔC156、VEGF-Ｃ C156S、VEGF-Ｃ ΔNΔC C156S、キメラヘパリン結合VEGF-Ｃ、またはVEGFR-２、VEGFR-３、ニューロピリン-１およびニューロピリン-２からなるグループより選択されるVEGF-Ｃ受容体に結合するプレ-プロVEGF-Ｃの断片を含む。  好ましくは、VEGF-Ｃポリペプチドは、配列番号:24に記載のアミノ酸配列を含み、またはVEGFR-２もしくはVEGFR-３に結合し、これらの受容体の一方または双方を発現する細胞において、VEGFR-２またはVEGFR-３リン酸化を刺激するその断片を含む。  実験的証拠は、ある種のVEGF-Ｃポリペプチドが、ニューロピリンおよびVEGFR双方には結合しないことを示す。  例えば、VEGF-Ｃ ΔNΔCは、ニューロピリン受容体に結合しないが、VEGFR-３に結合する。  しかしながら、ニューロピリン結合特性を欠くVEGF-Ｃポリペプチドは、VEGF受容体を介して作用する場合、VEGF-Ｃ/VEGFR相互作用を介して媒介される神経栄養影響と同様な神経栄養特性を有するであろう。
【００６１】
VEGF-Ｃ ΔC156ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、本明細書の一部を構成するものとして、その内容を援用した、米国特許第6,130,071号公報およびＰＣＴ公開第WO 93/33917号公報に詳細に記載されている。
【００６２】
ヘパリン結合VEGF-Ｃポリペプチドの例は、(本明細書の一部を構成するものとして、その全内容を援用する)米国仮特許出願第60/478,390号、および2004年6月14日に出願された米国特許出願第10/868,577号、および係属中のPCT出願 (代理人整理番号28967/39359A(PCT)に記載されている。  キメラヘパリン結合VEGF-Ｃポリペプチドの例として、ニューロピリン結合領域、VEGFエクソン７の双方を含む、エクソン６乃至８(CA89)またはエクソン７乃至８(CA65)でコードされた配列など、VEGFのヘアピン結合ドメインに融合したVEGF-ＣのVEGF相同性ドメイン(VHD)を含む。  発現実験において、CA65が分泌されて、上清に放出されるが、ヘパリンが培養基に含まれない限りは、CA89は上清に放出されず、このことは、VEGF189に関して記載されたのと同様な細胞表面ヘパリン硫酸に明らかに結合することを示す。
【００６３】
ある実施態様によれば、VEGFC産物は、配列番号:24のアミノ酸103乃至227を含むヒトプレプロ-VEGF-Ｃの断片を含む。  他の実施態様によれば、VEGF-Ｃ産物は、配列番号:24のヒトプレプロ-VEGF-Ｃ配列のアミノ酸32乃至227を含む。  さらに他の実施態様において、配列番号:24の連続的部分、すなわち、そのアミノ末端として、配列番号:２の位置32乃至111からなるグループから選択されるアミノ酸を有し、かつそのカルボキシル末端として、配列番号:24の位置228乃至419からなるグループから選択されるアミノ酸を有する連続部分を含むアミノ酸を有するポリペプチドが考えられる。  本明細書において改めて詳細に説明するが、VEGF-Ｃの生物学的活性は、アミノ-末端およびカルボキシル-末端プロ-ペプチドの双方のプロセッシングに際して増加する。  従って、配列番号:24の位置102乃至131、または配列番号:24の位置103乃至111からなるグループから選択されるアミノ末端が意図される。  同様に、配列番号:２の位置215乃至227からなるグループから選択されるカルボキシル末端も意図される。
【００６４】
選択されたVEGF-Ｃの機能的部分が、天然VEGF-Ｃの対応する部分と、その構成アミノ酸配列が同一であれば、最良の結果が得られるであろうことは明らかであり、また、その受容体結合特性が維持される限りは、VEGF-Ｃ配列に変異が導入されても、本願発明は依然として実施可能であることは明らかである。  用語「VEGF-Ｃ産物」もまた、配列番号:23および24に記載された配列を特徴とするヒトVEGF-Ｃの対立遺伝子変異によってコードされるポリペプチドを含めることを意図している。  少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、または99％アミノ酸同一性を有する変異配列の使用を考えられる(VEGF-Ｃ産物)は、前述したように、ポリヌクレオチド、ベクター、およびそのような変異をコードまたは発現する細胞も含む。
【００６５】
さらに他の実施態様によれば、VEGF-Ｃ産物は、VEGF-Ｃポリペプチド産物をコードし、かつ細胞へ発現することができるポリヌクレオチドを含む。  例えば、VEGF-Ｃ産物は(ａ)配列番号:24のヒトVEGF-Ｃアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；(ｂ)VEGFR-３に結合するポリペプチドをコードする配列番号:23のヌクレオチド配列と少なくとも90％同一なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;(ｃ)配列番号:24と少なくとも90％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、当該ポリペプチドは、VEGFR-３に結合する;(ｄ)以下のストリンジェントな条件下で配列番号:23の相補体にハイブリダイズし、VEGFR-３に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド:室温における２×SSC/0.1％SDS、55℃における15分間の１×SSC/0.1％SDS、55℃における15分間の0.1×SSC/0.1％SDS;および(ｅ)VEGFR-３に結合するポリペプチドをコードする(ａ)乃至(ｄ)の断片からなるグループから選択されるポリヌクレオチドを含む。  同等なストリンジェンシーの条件は、Ausubel et al.(編),Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(1994), pp.6.0.3-6.4.10に記載されている温度および緩衝液、または塩濃度を修正して達成することができる。
【００６６】
好ましいVEGF-Ｃポリヌクレオチドは、全長プレプロ-VEGF-Ｃ、VEGF-Ｃの中間体および最終切断産物、ならびにその断片および変異を含めた前記VEGF-Ｃポリペプチドをコードする。  ある実施態様によれば、VEGF-Ｃ産物は、配列番号:24に記載されたVEGF-Ｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはVEGFR-３、VEGFR-３、NRP-１またはNRP-２に結合するその断片を含む。  ポリヌクレオチドは、好ましくは、受容体生物の標的細胞においてコードされたVEGF-Ｃタンパク質の発現を促すプロモーターおよび／またはエンハンサー、ならびに停止コドン、ポリアデニル化シグナル配列、および発現を容易ならしめるための他の配列を含む。
【００６７】
プロモーターは、ウイルスプロモーターまたは細胞-特異的プロモーターいずれかとすることができる。  ある実施態様によれば、VEGF-Ｃ産物は、VEGF-Ｃをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを含む。  さらに他の実施態様によれば、この方法はVEGF-Ｃ産物を提供し、当該VEGF-Ｃ産物は、複製-欠陥アデノウイルスおよびアデノ-関連ウイルスベクター、およびそのハイブリッドのようなポリヌクレオチドを含有するウイルスベクターを含む。  さらに、VEGF-Ｃ産物を含む組成物は、さらに、薬学的に許容される担体を含む。
【００６８】
以下に詳述するように、成長因子VEGF-ＤはVEGF-Ｃに対してアミノ酸配列類似性を有しており、プレプロ-VEGF-Ｄ形態からより小さな分泌成長因子形態に至る、同様なタンパク質分解プロセッシングを受けることが知られており、VEGF-Ｃと共に二つのVEGF受容体、すなわち、VEGFR-３およびVEGFR-２を有することが知られている。  これらおよびその他の類似性が故に、VEGF受容体を介して作用するVEGF-Ｄポリペプチドは、VEGF-Ｃ/VEGFR相互作用を介して媒介される神経栄養特性と同様な神経栄養特性を有するものと考えられる。
【００６９】
従って、本願発明の他の態様として、神経幹細胞を刺激するための前記方法(および後出のパラグラフに記載された他の方法)が意図されており、その場合において、VEGF-Ｄ産物は、VEGF-Ｃ産物の代わりに(またはそれに加えて)投与される。
【００７０】
VEGF-Ｃ産物と同様に、用語「VEGF-Ｄ産物」は、プレプロ-VEGF-Ｄポリペプチド、複製-欠陥アデノウイルス、アデノ-関連ウイルスおよびレンチウイルスベクター、およびそのハイブリッドのような、それらを含有するVEGF-Ｄポリヌクレオチドおよび発現産物として、VEGF-Ｄ受容体に結合し、それを刺激するその断片を含む。  ヒトVEGF-Ｄ遺伝子およびタンパク質の詳細な記載は、本明細書の一部を構成するものとして、その全内容を援用する、Achen, et al., Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.,95(2):548-553 (1998);1998年２月26日に公開された国際特許公開WO 98/07832;およびGenbank受託番号AJ000185に開示されている。  ヒトプレプロ-VEGF-ＤについてのcDNAおよび推定アミノ酸配列は、配列番号:25および26に記載されている。
【００７１】
哺乳動物は、ヒト、またはヒト医療研究用の動物モデル、または家畜またはペットとして重要な動物である。  好ましい態様において、動物は、ニューロン、神経前駆体または神経幹細胞の集積、増殖または分化を刺激する必要性を特徴とする疾患または状態を有し、VEGF-Ｃ産物またはVEGF-Ｄ産物の投与は(例えば、疾患兆候を緩和し、疾患の進行を遅らせ、疾患を治癒し、またはそうでなければ臨床的結果を改善することによって)、動物の状態を改良する。
【００７２】
ある実施態様によれば、この方法は、さらに、投与に先立って、神経細胞または神経前駆細胞の集積、増殖、分化、移動または生存の必要な動物を同定する工程を含む。  この同定工程は、神経幹細胞の集積、増殖または分化が有益な疾患または状態を患った動物を同定するための医学的診断を含む。  この方法は、運動技量の評価、MRI脳画像化、および神経変性病および神経病理学をモニタリングするための当該技術分野で周知のその他の試験法に用いることができる。  診断は、所望により、バイオプシーおよび／またはニューロン損傷の細胞ベースのin vitro測定を含む。  例えば、アルツハイマー病が疑われる動物においては、in vitroアッセイによって、アミロイドベータタンパク質、すなわち、アルツハイマー病と一般には関連付けられる分子のレベルを測定して、脳におけるアミロイドが、プラーク形成に関与する程度を決定することができ；また、アルツハイマー病またはパーキンソン病の患者においては、アセチルコリンまたはアセチルコリン受容体のレベルを測定することができる(Banerjee et al., Neurobiol Dis. 7:666-72 (2000))。
【００７３】
ある実施態様において、この同定工程は、ニューロン細胞またはニューロン前駆細胞の集積、増殖、分化、移動または生存を促す治療を必要とする哺乳動物を同定することを含む。  他の態様において、この同定工程は、オリゴデンドロサイト細胞またはオリゴデンドロサイト前駆細胞の集積、増殖、分化、移動または生存を促す治療を必要とする哺乳動物を同定することを含む。
【００７４】
好ましい実施態様において、治療すべき動物およびVEGF-ＣポリペプチドまたはVEGF-Ｄポリペプチドは、ヒトである。
【００７５】
本願発明のその他の実施態様は、哺乳動物から生物学的試料を取得するものであって、当該試料は、神経幹細胞(NSC)を含み、および、血管内皮成長因子Ｃ(VEGF-Ｃ)産物または血管内皮成長因子Ｄ(VEGF-Ｄ)産物を含む組成物と幹細胞とを接触させることを含む、神経幹細胞の増殖または分化を刺激する方法を提供する。  ある態様において、この接触は、VEGF-Ｃ産物またはVEGF-Ｄ産物を含有する培養基において、幹細胞を培養することを含む。  この方法におけるVEGF-ＣまたはVEGF-Ｄの効果は、ヒトまたはその他の動物動物の身体から取り出されたヒトまたは動物動物由来の細胞に付与される。  そのような療法は、副作用を回避する上で、また、医療的手法で用いる細胞試料を調製する上で望ましい。
【００７６】
いずれかのタンパク質、または成長因子のPDGFファミリーの遺伝子メンバーとの組合せ療法もまた意図している。
【００７７】
生物学的試料として、幹細胞が含まれる組織または流体試料を用いることができる。  血液および骨髄は、臍帯同様に、生物学的試料として利用可能な供給源である。  また、神経幹細胞は、成体哺乳動物の海馬、嗅覚葉または成体脳室領域を含む脳から単離される。
【００７８】
ある態様において、生物学的試料は精製および／または単離手法に付されて、接触工程の前に幹細胞を精製し、または単離する。  関連する態様において、この方法は、さらに、接触工程の後に神経幹細胞または神経細胞を精製し、単離する工程を含む。  同様に、本願発明では、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ処理に応じて増殖し、または分化した細胞を選択するための、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄと共に培養した精製または単離された神経幹細胞も意図している。  神経幹細胞は、神経膠、オリゴデンドロサイト、ニューロンまたは神経膠星状細胞を含めたいずれかの神経細胞に分化するよう誘導される。  細胞は、多世代にわたって増殖する能力、ネスチンおよびKi-67の発現、プロト-ニューロン形態学、ならびにニューロンおよび神経膠に分化する能力に基づいて、多能性神経前駆細胞として分類される。
【００７９】
ある実施態様によれば、ヒト動物が考えられる。  さらに他の実施態様によれば、動物がヒトである場合、細胞ドナーは近親の親族であり、あるいは実質的に同一なヒト白血球抗原(HLA)プロフィールを有する。  ある実施態様によれば、細胞は、組織、器官、または人工マトリックスにex vivoで播種され、この組織、器官、または人工マトリックスは、哺乳動物に付着され、埋設され、または移植される。
【００８０】
NSCの他の供給源は、脊髄、胎児組織、網膜および胚を含む。  神経幹細胞および分化した細胞を単離するための本願発明で有用なニューロン特異的マーカーは、ニューロンを染する神経繊維タンパク質(NFP)、および神経膠系統の細胞を同定する神経膠フィブリル酸性タンパク質(GFAP)を含む。  他の陽性神経幹細胞マーカーは、CD9、CD15、CD95、CD3、MHC１およびβ２ミクログロブリンからなるグループから選択される(米国公開特許第20030040023号参照)。
【００８１】
神経網膜から得た幹細胞は、脳由来幹細胞、GD２ガングリオシド、CD15、およびテトラスパニンCD9およびCD81について従前から示されたマーカーを発現する。  GD２とCD15は、最近、真正な神経幹細胞のマーカーであることが報告されており、他方で、テトラスパニンCD９とCD81は、真正の幹細胞に対して低度の特異性を示す。
【００８２】
ある実施態様によれば、この方法は、接触工程の後に神経幹細胞を哺乳動物に投与する工程をさらに含む。  さらに他の実施態様によれば、この方法は、接触工程の後に神経幹細胞を異なる哺乳動物に移植する工程を含む。  この方法の他の態様において、細胞を組織、器官または人工マトリックスにex vivoで播種して、組織、器官、または人工マトリックスは哺乳動物に付着され、埋設され、または移植される。  哺乳動物は、ヒトであることを意図している。
【００８３】
神経幹細胞は、以下に詳細に記載するように、治療すべき疾患または状態に適した方法で、例えば、全身、または局所にて神経病理の部位において、哺乳動物に投与し、または移植することができる。
【００８４】
本願発明の他の実施態様は、神経幹細胞を、VEGF-Ｃ産物またはVEGF-Ｄ産物を含む組成物と接触させることを含む、神経幹細胞の増殖をin vitroで誘導する方法であり、神経幹細胞は、神経幹細胞系C17.2、精製された神経幹細胞、HSN-１細胞、胎児ブタ細胞、神経頭側細胞、骨髄由来神経幹細胞、hNT細胞およびヒトニューロン前駆細胞系からなるグループから選択される。
【００８５】
ある実施態様によれば、接触工程は、VEGF-Ｃ産物を含有する培養基で、幹細胞を培養することを含む。  例えば、１乃至100μgタンパク質／mL成長培地が、使用される。  なお、さらに他の実施態様によれば、この接触は、幹細胞をVEGF-Ｃ導入遺伝子で形質転換またはトランスフェクトすることを含む。
【００８６】
任意に、この方法は、さらに、接触工程の後に幹細胞を哺乳動物に投与する工程を含む。この方法の他の態様において、細胞は、組織、器官または人工マトリックスにex vivoで播種され、この組織、器官または人工マトリックスは、哺乳動物に付着され、埋設され、または移植される。  哺乳動物は、ヒトであることが意図される。
【００８７】
さらに、本願発明の方法は、VEGF-Ｃ産物またはVEGF-Ｄ産物を、神経成長因子と組み合わせて投与されることも意図している。  神経成長因子として、インターフェロンガンマ、神経成長因子、表皮成長因子(EGF)、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、ニューロゲニン、脳由来神経栄養因子(BDNF)、甲状腺ホルモン、骨形成タンパク質(BMP)、白血病阻害因子(LIF)、ソニックヘッジホッグ、および神経膠細胞系-由来神経栄養因子(GDNF)、血管内皮成長因子(VEGF)、インターロイキン、インターフェロン、幹細胞因子(SCF)、アクチビン、インヒビン、ケモカイン、レチノイン酸および毛様体神経栄養因子(CNTF)などがあるが、これらに限定されない。  ある実施態様において、本願発明では、薬学的に許容される希釈剤または担体中のVEGF-Ｃ産物および／またはVEGF-Ｄ産物および神経成長因子を含む組成物も意図されている。
【００８８】
本願発明の方法は、ニューロン細胞の異常な成長、ニューロン瘢痕化および損傷または神経変性を特徴とする疾患または状態を有する動物に対して好適に実施される。  神経細胞および／またはそれらの軸索突起の生存または機能が危うくなれば、疾患または医学的障害は、神経損傷と考えられる。  そのような神経損傷は、損傷部位の近くの軸索突起および／または神経細胞体の変性を引き起こす物理的損傷；発作としての虚血症；癌のようなニューロトキシン、およびシスプラチンおよびジデオキシシチジン(ddC)のようなAIDS化学療法剤への暴露;糖尿病または腎臓機能不全のような慢性代謝病；および特定のニューロン集団の変性を引き起こすパーキンソン病、アルツハイマー病および筋萎縮性側索硬化症(ALS)のような神経変性病を含めた疾患において認められる。  神経損傷を含む疾患として、発作時に認められる神経系への血流の一時的または永久的停止の他に、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、発作、糖尿病多発性神経障害、毒性神経障害、神経膠瘢痕、および脳および脊髄の物理的損傷、または腕および手または身体の他の部分に対する挫傷または切傷によって引き起こされる、神経系に対する物理的損傷を含む。
【００８９】
ある実施態様によれば、治療すべき疾患または状態は神経変性障害であり、この神経変性障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、運動ニューロン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、痴呆症および脳性麻痺からなるグループから選択される。      
【００９０】
さらに他の実施態様によれば、疾患または状態は、神経外傷または神経損傷からなるグループから選択される。  本願発明の方法は、発作、脊髄損傷、手術後損傷、脳虚血症およびその他の外傷に関連する損傷のような神経外傷または損傷を、治療または軽減するために利用することもできる。
【００９１】
本願発明を用いて、種々の疾患に起因する中枢神経系損傷の一つ以上の有害な症状を治療することができる。  血栓、塞栓および全身低血圧は、発作において最も頻繁に認められる原因である。  その他の損傷は、高血圧、高血圧性脳血管病、動脈瘤の破裂、血管腫、血液悪液質、心不全、心臓阻止、心臓性ショック、腎不全、敗血症ショック、頭部外傷、脊髄外傷、発作、腫瘍からの出血、または血液容量または圧力の他の喪失に起因する。      
【００９２】
これらの損傷は、生理学的機能の破壊、ニューロンの持続的な死滅、および患部の壊死(梗塞)に至る。  用語「発作」は、前述した損傷のいずれかに関連する結果として現れる、突然かつ劇的な神経学的欠乏を含む。
【００９３】
本明細書で用いている「虚血症」または「虚血性エピソード」の用語は、組織への血液の供給が欠乏した環境を意味する。  従って、中枢神経系虚血性エピソードは、例えば、脳、小脳または脳幹などの脳内のいずれかの箇所への不十分な血液供給または血液供給の中断に起因するものであるが、これらに限定されない。  血栓または側栓の場合のように、中枢神経系の一部でもある脊髄は、同じく、血流の減少に由来する虚血症になりやすい。虚血性エピソードは、血管の収縮または閉塞によって引き起こされる。  あるいは、虚血性エピソードは、前述したように、心臓停止を含めた心臓機能の重篤な状況に由来もする。血液供給の欠乏が著しく、かつ継続する場合には、病理学的機能に続いて、ニューロンの死滅、および患部の壊死(梗塞)に至る。  損傷に由来する神経学的異常の程度およびタイプは、梗塞または虚血症の病巣の位置および大きさにもよる。  虚血症が発作に関連する場合、その程度は、全身的または病巣部位的のいずれかとなる。
【００９４】
本願発明は、頭部への打撃のような機械的外力に起因する中枢神経系に対する外傷損傷を治療する上でも有用である。  外傷は、哺乳動物の頭部、頚部または脊柱、またはそれに付属する箇所と外来性物体との外傷的接触から生起しえる、磨耗、切開、刺穿、圧縮などから選択される組織損傷を含む。  その他の外傷的損傷は、流体の不適切な蓄積による哺乳動物CNS組織の収縮または圧縮(例えば、正常な脳脊髄液またはガラス質体液の流体生産、代謝性または容量調節の阻害または機能不全、または硬膜下または頭蓋内血腫または浮腫)に由来する。  同様に、外傷的収縮または圧縮は、転移性または原発性腫瘍のような異常な塊状組織に由来する。
【００９５】
さらに、本願発明の方法は、神経治療剤と共にVEGF-Ｃ産物またはVEGF-Ｄ産物を投与することによって実施可能である。  「神経治療剤」とは、神経変性病の治療、または神経外傷および神経損傷を治療するために用いられる薬剤を意味する。  神経治療剤としては、タクリン(Cognex)、ドネペジル(Aricept)、リバスチグミン(Exelon)、ガランタミン(Reminyl)、および、コリンエステラーゼ阻害剤および抗炎症薬物などがあり、これらは、アルツハイマー病ならびに他の神経変性病を治療する上で有用である。
【００９６】
他の神経治療剤として、抗-コリン作動性ドーパミンアゴニスト、カテコール-０-メチル-トランスステアラーゼ(COMT)、アマンタジン(Symmetrel)、Sinemet(登録商標)、セレジリン(Selegiline)、カルビドーパ、ロピニロール(Requip)、コエンチウムＱ10、プラミテキソール(Mirapex)およびレボドーパ(Ｌ-ドーパ)などがあり、これらは、パーキンソン病ならびにその他の神経変性病を治療する上で有用である。  その他の治療剤の詳細については、後述することとする。
【００９７】
オリゴデンドロサイトおよびオリゴデンドロサイト前駆細胞に対する実証されたVEGF-Ｃ効果は、本願発明の他の態様を支持するものである。  例えば、さらに他の実施態様によれば、本願発明は、血管内皮成長因子Ｃ(VEGF-Ｃ)産物または血管内皮成長因子Ｄ(VEGF-Ｄ)産物を含む組成物を動物に投与することを含む、哺乳動物においてオリゴデンドロサイトまたはオリゴデンドロサイト前駆細胞の集積、増殖、分化、移動または生存を促す方法を提供する。  本願発明を実施するためのVEGF-Ｃおよび-Ｄ産物は、ポリペプチド-ベースおよびポリヌクレオチド-ベースの双方の形態の前出の産物を含む。  家庭用動物(例えば、イヌ、ネコ、家畜)および実験室モデル(例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類)に対して、本願発明を実施することができる。  ヒト由来のVEGF-Ｃまたは-Ｄ産物のヒトに対する実施が好ましい。  VEGF-Ｃ産物が、非常に好ましい。
【００９８】
ある実施態様によれば、この方法は、投与に先立って、オリゴデンドロサイトまたはオリゴデンドロサイト前駆細胞の集積、増殖または分化を必要とする哺乳動物を同定または選択する工程をさらに含む。  例えば、オリゴデンドロサイトは、髄鞘の形成に関与し、動物は髄鞘形成を特徴とする疾患または状態であるので、彼らは同定／選択することができる。
【００９９】
関連する実施態様において、本願発明は、VEGF-Ｃまたは-Ｄ産物を用いてオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖または分化を刺激する方法を含む。  例えば、ある方法は、哺乳動物、好ましくは、ヒトから生物学的試料、すなわち、オリゴデンドロサイト前駆細胞を含む試料を取得し、および、血管内皮成長因子Ｃ(VEGF-Ｃ)産物または血管内皮成長因子Ｄ(VEGF-Ｄ)産物を含む組成物とオリゴデンドロサイト前駆細胞と接触させることを含む。
【０１００】
この接触は、VEGF-Ｃまたは-Ｄ産物が標的細胞に効果的に送達されるいずれの手法も含む。  ある実施態様によれば、この接触は、VEGF-Ｃ産物またはVEGF-Ｄ産物を含有する培養基にて、オリゴデンドロサイト前駆細胞を培養することを含む。  さらに他の実施態様によれば、細胞は、VEGF-Ｃまたは-Ｄ産物で形質転換され、またはトランスフェクトされる。
【０１０１】
好ましい実施態様において、VEGF-Ｃまたは-Ｄ産物での治療の前、および／または治療の後に、標的細胞集団を精製して、注目する細胞が豊富化された、または、より好ましくは高度に精製された集団を取得するのが望ましい。  従って、ある実施態様によれば、この方法は、接触工程の前に、試料からオリゴデンドロサイト前駆細胞を精製および単離する工程をさらに含む。  さらに他の実施態様によれば、この方法は、接触工程の後にオリゴデンドロサイト前駆細胞を精製および単離して、VEGF-Ｃまたは-Ｄ産物治療に応答した細胞の集団を単離する工程をさらに含む。  高度に精製する場合には、双方の精製工程が用いられる。  さらに他の実施態様によれば、本願発明は、これら方法に従って培養された精製および単離されたオリゴデンドロサイト前駆細胞を含む。
【０１０２】
このような方法によって培養された細胞は、異常または不十分なオリゴデンドロサイトの機能を特徴とする障害を治療するための細胞置換療法において有用である。  従って、さらに他の実施態様によれば、これらの方法は、任意に、オリゴデンドロサイト前駆細胞を、接触工程の後に哺乳動物に投与する工程をさらに含む。
【０１０３】
細胞は、異種ならびに同種移植法に用いることができる。  従って、さらに他の実施態様によれば、この方法は、接触工程の後に、オリゴデンドロサイト前駆細胞を異なる哺乳動物に移植する工程をさらに含む。
【０１０４】
細胞は、公知の方法を用いて送達することができる。  例えば、ある実施態様によれば、細胞は、組織、器官または人工マトリックスにex vivoにて播種され、この組織、器官または人工マトリックスが、哺乳動物に付着され、埋設され、または移植される。  さらに他の実施態様によれば、中枢神経系または末梢神経系への間接的な注射も意図いている。
【０１０５】
関連する実施態様において、オリゴデンドロサイトは、他の供給源から入手できる。  例えば、本願発明は、オリゴデンドロサイトまたはオリゴデンドロサイト前駆細胞を、VEGF-Ｃ産物またはVEGF-Ｄ産物を含む組成物と接触させることを含む、in vitroにてオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を誘導する方法を含み、オリゴデンドロサイト前駆細胞は、CG-4細胞、SVG p12致死的神経膠細胞系、DBTRG-05MG神経膠細胞系、生成されたオリゴデンドロサイト前駆細胞、単離されたNG2プロテオグリカン(NG２＋細胞)、骨髄由来神経幹細胞、およびヒトニューロン前駆細胞系からなるグループから選択される。  この方法は、任意に、オリゴデンドロサイトまたはオリゴデンドロサイト前駆細胞を、本明細書に記載の通りに、接触工程の後に哺乳動物に投与する工程をさらに含む。
【０１０６】
本明細書の他の箇所で詳細に説明している通り、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物は、任意に、同時に投与され、および／または神経成長因子および／または神経治療剤と共に投与することができる。
【０１０７】
特に、オリゴデンドロサイトまたはオリゴデンドロサイト前駆細胞の異常成長または機能を特徴とする疾患または状態を有する動物に対して、上述した方法の実施が考えられる。特に、神経系での髄鞘形成を特徴とする疾患を有する動物での本願発明の方法の実施が意図される。  治療可能な疾患および状態として、多発性硬化症、フェニルケトン尿症、脳室周囲白質軟化症(PVL)、HIV-１脳炎(HIVE)、ギヤン バレー症候群(GBS)、急性炎症性脱髄多発性神経障害(AIDP)、急性運動軸索神経障害(AMAN)、急性運動感覚軸索神経障害(AMSAN)、フィッシャー症候群、急性自立神経異常およびクラッベ病などがある。
【０１０８】
さらに他の実施態様によれば、慢性炎症性脱髄多発神経根神経障害(CIDP)を有する哺乳動物が治療される。  CIPDとして、MADSAM(多病巣性後天性脱髄感覚および運動神経障害、ルイス-スムナー症候群としても公知)およびDADS(遠位後天性脱髄対称神経障害)がある。
【０１０９】
神経外傷または神経損傷を患った動物も、これら方法の恩恵を受けるものと考えられる。例えば、発作関連損傷、脊髄損傷、手術後損傷および大脳虚血症に罹った動物の治療が考えられる。
【０１１０】
また、VEGF-Ｃ活性の阻害は、ニューロン細胞の過剰増殖を特徴とする病理のための有用な療法であるとも考えられる。  神経幹細胞発生におけるVEGF-Ｃの阻害は、神経芽腫(例えば、交感神経神経節)およびその他の神経由来腫瘍を引き起こすニューロン細胞の増殖を減少させることができ、それにより、癌の進行を遅延させる。  最も頻繁に認められる脳腫瘍は、神経膠腫であり、これは神経膠組織から進行が開始する。  神経膠星状細胞と呼ばれる小さな星形状の細胞から生起する神経膠星状細胞腫は、成人の大脳で最もよく認められる。  グレードIIIの神経膠星状細胞腫は、時として、退形成神経膠星状細胞腫と呼ばれる。  グレードIVの神経膠星状細胞腫は、通常は、神経膠芽腫多形と呼ばれている。  脳幹神経膠腫は、脳の最も下部の幹様部分に発生する。  脳幹は、多くの活性機能を制御する。  ほとんどの脳幹神経膠腫は、高グレードの神経膠星状細胞腫である。  脳室上衣細胞腫は、通常、脳室内部で成長する。  それらは、脊髄でも発生する。  オリゴデンドロサイト腫は、ミエリン、神経を保護する脂肪の被覆を生じる細胞で発生する。これらの腫瘍は、通常、大脳で発生する。  それらは、ゆっくりと成長し、通常は、周囲の脳組織には拡大しない。  髄芽細胞腫は、通常は、出生後に身体に残らない原始的な神経細胞から発生する。  そのために、髄芽細胞腫は、時々、原始的神経外胚葉腫瘍(PNET)とも呼ばれる。  ほとんどの髄芽細胞腫は、小脳で発生するが、それらは同様に他の領域でも発生する。  髄膜腫は、髄膜から成長する。  それらは通常は、良性である。  それら腫瘍は、非常にゆっくり増殖するため、脳はそれらの存在を調節することができ、また、髄膜腫は、それらが兆候を引き起こす以前に大きく成長することがよくある。  それらは、30歳〜50歳の女性に最もよく認められる。  神経線維腫は、聴覚神経を保護するミエリンを生じるシュワン細胞で開始する良性腫瘍である。  聴覚神経腫は、神経線維腫のタイプである。  頭蓋咽頭腫は、視床下部近くの下垂体の領域で発生する。  それらは、通常は良性であるが、それらは視床下部を圧迫し、またはそれを損傷し、および活力のある機能に悪影響を与えかねないため、時として、悪性と考えられる場合がある。  胚細胞腫瘍は、原始的(に発生する)性的細胞、または胚細胞から発生する。  脳において最も頻繁に認められるタイプの胚細胞腫瘍は、胚細胞腫である。  松果領域腫瘍は、松果体中またはその周囲で発生する。  この腫瘍はゆっくりと成長する松果体腫、または迅速に成長する(松果体芽細胞腫)である。  松果領域は、そこに到達するのが非常に困難であり、これらの腫瘍はしばしば除去することができない。  脳腫瘍のための試料は、多数の因子に依存する。  これら因子として、腫瘍のタイプ、位置および大きさ、ならびに患者の年齢および健康状態がある。  通常、脳腫瘍は、外科的処置、放射線療法および化学療法で処理される。  ある態様において、本願発明は、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ阻害剤を含む組成物を、神経芽腫またはニューロン腫瘍を有する動物に投与することを含む、神経芽腫および神経腫瘍の成長および進行を阻害する方法を提供する。
【０１１１】
他の態様において、本願発明は、PDGFアンタゴニストまたはPDGFRアンタゴニストと組み合わせて、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ阻害剤を含む組成物を、神経芽腫またはニューロン腫瘍を有する動物に投与することを含む、神経芽腫および神経腫瘍の成長および進行を阻害する方法を提供する。  ある実施態様によれば、PDGFRアンタゴニストとして、イマチニブメシレート(STI571／グリーベック)がある。  最近の研究論文(Leppanen et al., Circulation. 109;1140-6 (2004))は、STI571／グリーベックが、過剰コレステロール血症ウサギのネオインティマル成長を低下させるための局所的血管内VEGF-Ｃ遺伝子の導入効率を改善することを報告している。  グリーベックは、癌を治療する上で重要なものであり、一般的には、いずれかの薬物の接種を増加させることが知られている間隙圧を低下させることによって、VEGF-Ｃの遺伝子導入を促すとの仮説が出されている。
【０１１２】
VEGF-Ｃ阻害剤は、例えば、その受容体である、VEGFR-２、VEGFR-３、NRP-１またはNRP-２のいずれかへのVEGF-Ｃ結合をブロックすることで、あるいはVEGF-Ｃの発現を低下させることによって、VEGF-Ｃマイトゲン活性を低下させる特異性をもってして作用する分子である。  投与されるVEGF-Ｃ阻害剤は、VEGF-Ｃタンパク質に結合する可溶性VEGFR２ポリペプチド断片、VEGF-Ｃタンパク質に結合する可溶性VEGFR３ポリペプチド断片、VEGF-Ｃタンパク質に結合する可溶性NRP-１ポリペプチド断片、VEGF-Ｃタンパク質に結合する可溶性NRP-２ポリペプチド断片、VEGF-Ｃアンチ-センスポリヌクレオチドまたは短-干渉RNA(siRNA)、抗-VEGF-Ｃ抗体、抗-VEGF-Ｃ抗体の抗原結合断片を含むポリペプチド、およびVEGF-Ｃのいずれかの小さな分子阻害剤を含むポリペプチドである。  VEGF-Ｃ阻害剤と同様なVEGF-Ｄ阻害剤も、本願発明では意図している。
【０１１３】
ある実施態様において、VEGF-Ｃ阻害剤は、可溶性VEGFR-２、VEGFR-３、哺乳動物VEGFR-２の細胞外ドメイン断片を含むNRP-１またはNRP-２ポリペプチド断片、VEGFR-３の細胞外ドメイン断片、NRP-１の細胞外ドメイン断片、またはNRP-２の細胞外ドメイン断片を含み、この断片は、VEGF-Ｃタンパク質に結合する。  好ましくは、VEGFR-２、VEGFR-３、NRP-１またはNRP-２断片は、ヒト由来のものとすある。  ある実施態様によれば、VEGFR-３細胞外ドメイン断片は、免疫グロブリンドメイン、１個乃至３個のVEGFR-３を含む。  さらに他の実施態様によれば、本願発明において利用可能な細胞外ドメイン断片は、配列番号：32に記載されたヒトVEGFR-３のアミノ酸33乃至324を含む。  他の実施態様において、可溶性VEGFR-２、VEGFR-３、NRP-１またはNRP-２断片は、免疫グロブリンFcドメインに連結される。
【０１１４】
ある実施態様によれば、VEGF-Ｃ阻害剤は、VEGF-Ｃ結合活性を有するヒトVEGFR-２(配列番号：30)の細胞外断片を含むアミノ酸に対して少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、または99％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、VEGF-Ｃ結合活性を有するヒトVEGFR-３(配列番号：32)の細胞外ドメインを含むアミノ酸に対して少なくとも90％、95％、96％、97％、98％または99％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、VEGF-Ｃ結合活性を有するヒトNRP-１(配列番号：２)の細胞外断片を含むアミノ酸に対して少なくとも90％、95％、96％、97％、98％または99％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、VEGF-Ｃ結合活性を有するヒトNRP-２ポリペプチド(配列番号：４)の細胞外断片を含むアミノ酸に対して少なくとも90％、95％、96％、97％、98％または99％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０１１５】
さらに他の実施態様によれば、VEGF-Ｃ阻害剤組成物は、中度または高度のストリンジェントな条件下で、配列番号：32のアミノ酸33乃至324をコードするポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む。  中度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば、65℃における0.5M NaHPO4、７％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、１mM EDTAにおけるハイブリダイゼーション、および42℃における0.2×SSC/0.1％SDSにおける洗浄である。  高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば、65℃における0.5M NaHPO4、７％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、１mM EDTA、および68℃の0.1×SSC/0.1％SDSにおける洗浄である。  同等のストリンジェンシーの条件は、Ausubel et al.(編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1994), pp.6.0.3-6.4.10に記載された温度および緩衝液、または塩濃度の変動を参照して決定することができる。
【０１１６】
この方法で用いるVEGF-Ｃアンチセンス核酸分子は、約10乃至500、好ましくは10乃至50の整数の標的配列内の整数個のヌクレオチドに対して相補的な配列を含む。  ある実施態様によれば、例えば、VEGF-Ｃアンチセンス分子は、長さが少なくとも約10、25、50、100、250または500ヌクレオチドの相補的配列、または完全なVEGF-Ｃコード鎖に対して相補的な配列を含む。  具体的には、長さが10、15、20、25、30、35、40、45または50ヌクレオチドのアンチセンス分子が意図される。
【０１１７】
本願発明での利用を意図するsiRNAは、VEGF-Ｃ mRNAのセンスおよびアンチセンスコーディングストランドを提供する。  siRNAは、長さが通常は30ヌクレオチド以下、より好ましくは、21乃至23個のヌクレオチドであり、より長いdsRNAをリボヌクレアーゼIIIで切断して生じる特徴的な２乃至３個のヌクレオチド３'側突出端部を有する。
【０１１８】
また、本願発明は、薬学的に許容される希釈剤または担体内に取り込んだVEGF-Ｃ産物またはVEGF-Ｄ産物および神経成長因子を含む組成物を提供する。  本願発明では、薬学的に許容される希釈剤または担体内に取り込んだVEGF-Ｃ産物またはVEGF-Ｄ産物および神経治療剤を含む組成物がさらに考えられる。
【０１１９】
さらに他の実施態様によれば、本願発明では、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ組成物または産物のいずれかが、PDGF-ＡまたはPDGF-Ｃ組成物または産物の投与と組み合わせて用いられる方法を意図している。  組み合わせは、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ組成物を別々に投与すること、そして、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物を、同時に、先行して、または引き続いて投与される(詳細な記載は後述する)。  関連する実施態様において、PDGF-ＡまたはPDGF-Ｃとの組合せは、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ組成物の投与を含み、この組成物は、PDGF-ＡまたはPDGF-ＣまたはPDGF-ＢまたはPDGF-Ｄをさらに含む。
【０１２０】
「PDGF産物」の定義は、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物のそれと同じであり、例えば、全長、成熟、および断片タンパク質、タンパク質変異、コーディングポリヌクレオチドおよびベクター、宿主細胞などを含む。
【０１２１】
他の態様において、本願発明は、候補薬剤の存在下および不存在下において、VEGF-Ｃポリペプチドを含む組成物および神経細胞または神経前駆細胞を接触させ；当該薬剤の存在および不存在下で細胞の増殖、移動、分化または生存を測定し；および、候補薬剤の存在対不存在下で、異なる測定結果に基づいて、神経細胞または神経前駆細胞に対するVEGF-Ｃ効果のモジュレーターとして候補薬剤を同定することを含む、神経幹細胞または神経前駆細胞の成長、移動、分化または生存のVEGF-Ｃ刺激のモジュレーターに関してスクリーニングする方法を提供する。
【０１２２】
関連する実施態様において、本願発明は、VEGF-Ｃに関連するこれまでの説明において実質的に記載された、VEGF-Ｄ刺激のモジュレーターに関してスクリーニングする方法を提供する。
【０１２３】
さらに他の実施態様によれば、神経前駆細胞は、ニューロン前駆細胞を含む。  さらに他の実施態様によれば、神経前駆細胞は、オリゴデンドロサイト前駆細胞を含む。
【０１２４】
神経幹細胞または神経前駆細胞は、本明細書に記載された神経幹細胞系、または動物から単離された神経幹細胞を含む。  ある実施態様によれば、細胞は、VEGFR-３を発現する神経細胞系または神経前駆細胞を含む。  さらに他の実施態様によれば、神経細胞系または神経前駆細胞は、ニューロピリン２を発現する。  さらに他の実施態様によれば、神経細胞系または神経前駆細胞は、VEGFR-３およびニューロピリン-２の双方を発現する。
【０１２５】
本願発明の目的を鑑みれば、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄのモジュレーターは、神経幹細胞または神経前駆細胞の成長、移動、分化または生存の刺激のアゴニストであって、当該アゴニストは、細胞表面の神経細胞マーカーの染色の増加、または細胞中の増殖性マーカーの増大によって検出される。  本願発明の目的に鑑みれば、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄは、神経幹細胞または神経前駆細胞の増殖、移動、分化または生存の刺激のアンタゴニストであって、このアンタゴニストは、細胞表面の神経細胞マーカーの染色の減少、または細胞中の増殖性マーカーの減少によって検出される。  移動は、標準化学走性またはケモカイネシスアッセイを用いて測定される。
【０１２６】
神経細胞マーカーについては、本明細書において詳細に後述するが、例えば、(オリゴデンドロサイトについての)NG２+、Olig２、Ｏ４、(神経膠細胞についての)GFAP、Glast、(一次ニューロンについての)Tuj-１およびp75 NGF-受容体、パン-サイトケラチン(上皮構造)およびチロシンヒドロキシラーゼ(TH)、神経繊維抗体(分化したニューロン)などがあるが、これらに限定されない。  アゴニストまたはアンタゴニストを検出すると考えられる増殖マーカーとしては、マイトマイシンアッセイ、トリチウム化チミジンまたはBrdu取り込み、またはKi-67染色などがあるが、これらに限定されない。
【０１２７】
治療方法に関連した本願発明の各態様において、本願発明の他の関連態様は、特定の生物学的効果を達成すべく、また、特定の疾患または状態またはその兆候の治療または軽減するための医薬の製造における特定の治療剤または産物の使用を含む。
【０１２８】
従って、その他の実施態様において、本願発明では、神経細胞または神経前駆細胞の集積、増殖、分化、移動または生存を促す医薬の製造における血管内皮成長因子Ｃ(VEGF-Ｃ)産物または血管内皮成長因子Ｄ(VEGF-Ｄ)産物の使用を意図している。  ある実施態様によれば、当該医薬は、ニューロン細胞またはニューロン前駆細胞の集積、増幅、分化、移動または生存を促す。  関連する実施態様において、当該医薬は、オリゴデンドロサイトまたはオリゴデンドロサイト前駆細胞の集積、増殖または分化を促進す。
【０１２９】
さらに、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物は、本明細書に記載された神経障害を治療するための医薬を製造する際に用いることも意図している。  神経病理には、神経変性、神経細胞の異常な成長、神経外傷、および脱髄に関連する疾患または状態を意図している。
【０１３０】
本願発明のさらなる特徴および態様は、本願発明の全開示を参照すれば、当業者にとって自明の事項であり、それらすべての特徴部分は、本願発明の態様として意図している。
【０１３１】
同様に、本願明細書に記載の発明の特徴は、特徴の組合せ自体が本願発明の実施例または実施態様に記載されているか否かにかかわらず、本願発明の態様として意図されており、本願実施態様に組み込むことができる。  また、本願明細書において、本願発明において臨界的であるとするその限定的記載のみが参酌されるべきであって、本願明細書において重要であるとの限定が付加されなかった態様についても、本願発明の実施態様として意図される。
【０１３２】
本願発明の実施態様を、VEGF-Ｃ遺伝子またはタンパク質または阻害剤またはその断片または変異体の使用に関連して記載している。  そのような実施態様のすべてについて、VEGF-Ｄ遺伝子またはタンパク質または断片もしくは変異体を用いる実施態様の実施は、それら実施態様が、VEGF-Ｄまたは組合せ療法に関して具体的な記載(反復)がなされていなくても、組合せ療法として認識される。
【０１３３】
前述の説明に加えて、本願発明は、上述した実施態様よりも狭小な本願発明に属するすべての実施態様を他の実施態様として含む。  本出願人は、本願明細書に添付する請求の範囲に記載の全発明を完成したが、本願明細書に添付する請求の範囲は、先行技術に記載の技術までをも包含することは意図していない。  従って、特許庁または他の法人または個人から、請求の範囲に属する先行技術についての情報が出願人に寄せられた場合には、本出願人は、請求の範囲の範囲からかような先行技術、または先行技術から自明の変更態様を排除した請求の範囲に基づいて、現行の特許法下で補正を行う権利を留保する。  本願発明の範囲は、このようにして補正された請求の範囲によって定義される発明にも及ぶものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１３４】
本願発明は、文献において特徴がすでに決定されているものの、その相互作用は認識されておらず、つまり、その生物学的効果は従前から定かではないタンパク質相互間の新規な相互作用の発見に基づくものである。  多数の分子が、Ganbankデータベースや本願明細書に添付した配列表での注記欄に明示されており、また、種相同物についての配列(「オルソログ」)もデータベースから容易に検索でき、および／または天然から容易に単離することができる。  従って、以下の表および記載は、例示的なものでしかなく、限定を意図するものではない。
【０１３５】
Ａ. 本願発明において有用な分子
【０１３６】
【表１Ａ】
2007506754.tif 000002
【０１３７】
【表１Ｂ】
2007506754.tif 000003
ニューロピリンファミリー
ニューロピリン-１およびニューロピリン-２遺伝子は、各々、120および112kbにわたり、17のエクソンよりなり、そのうち五つは双方の遺伝子において大きさが同一であり、すなわち、これらの遺伝子の遺伝的複製が示唆されている(Rossignol et al, Genomics 70:211-22 (2000))。  今日までにに、ニューロピリンのいくつかのスプライス変異体が単離されており、その機能的重要性は、現在も研究中である。
【０１３８】
NRP2aおよびNRP2bと命名されるNRP-２のイソ形態は、当初は、マウスゲノムから単離されていた(Chen et al., Neuron 19:547-59 (1997))。  マウスでのNRP2aイソ形態は、NRP-２のアミノ酸809の後に、０、５、17または22(5+17)アミノ酸の挿入を含み、各々が、NRP2a(０)(Genbank受託番号AF022854)(配列番号：７および８)、NRP2a(５)(Genbank受託番号AF022861)、NRP2a(17)(Genbank受託番号AF022855)、およびNRP2a(22)(Genbank受託番号AF022856)と命名されている。  マウス変異体NRP2a(17)(Genbank受託番号AF022860)(配列番号：３および４)およびNRP2a(22)に相同な二つのヒトNRP2aイソ形態のみが解明されている。  ヒトa(22)イソ形態は、NRP2a(17)におけるアミノ酸808の後に５つのアミノ酸挿入、配列GENFKを含む。  脳、心臓、肺、腎臓、肝臓および胎盤の組織分析は、a(17)イソ形態が、これらの部位のすべてにおいてより豊富に存在していることを示している。
【０１３９】
ヒトNRP2bイソ形態は、NRP2aまたはNRP-１のいずれにも存在しないエクソン16bと命名されている他のエクソンを発現していると思料される。  マウスNRP2b(０)(Genbank受託番号AF022857)およびNRP2b(５)(Genbank受託番号AF022858)に対して相同な二つのヒトNRP2bイソ形態が同定されており、これは、NRP2b(０)におけるアミノ酸808の後に０または５のいずれかのアミノ酸挿入体(GENFK)を含む(Rossignol et al., Genomics 70:211-22 (2000))。  組織分布分析は、成人脳、心臓、肺、腎臓、肝臓および胎盤において、ヒトNRP2b(５)(Genbank受託番号AF280545)よりもヒトNRP2b(０)(Genbank受託番号AF280544)の発現が高いことを示している。  NRP2aおよびNRP2bイソ形態は、ｃドメインおよび膜貫通ドメインの間のリンカー領域にあるNRP2のアミノ酸808の後において、それらのＣ末端において拡散を示す。  この異なるスプライシングは、二つのイソ形態の組織発現で認められる差異に反映され、NRP2aは、NRP2bの検出可能なレベルのみでもって胎盤、肝臓および肺において豊富に発現されているが、NRP2bは、骨格筋で見出され、そこでのNRP2aの発現はわずかでしかない。  また、双方のイソ形態は、心臓および小腸で発現される。
【０１４０】
ニューロピリンの遺伝的イソ形態に加えて、タンパク質での多様な切形形態はクローン化されている(Gagnon et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 97:2573-78 (2000)；Rossignon et al., Genomics 70:211-22 (2000))。  NRP-１タンパク質の天然切形形態、s11NRP1(Genbank受託番号AF280547)およびS12NRP1はクローン化されており、これは704および644アミノ酸ニューロピリン-１を各々コードし、ａおよびｂドメインを含むが、ｃドメインは含まない。  s12NRP1変異は、イントロン12におけるプレ-mRNAプロセッシングによって生じる。  s11NRP1切形は、アミノ酸621の後に発生して、エクソン12によってコードされる20アミノ酸を欠くが、Ｃ末端において、そこに83個の新規なアミノ酸を付与するイントロン11内で認められたコーディング配列を含む。  このイントロン由来の配列は、公知のタンパク質に対していずれの相同性も示さない。
【０１４１】
NRP-２の天然の可溶性形態は同定されており、これは、ａドメイン、b1ドメイン、b2ドメインの部分を含み、この領域の最後の48アミノ酸を欠く555アミノ酸タンパク質をコードする。  切形は、イントロン９内のアミノ酸547の後で発生し、従って、このタンパク質はs9NRP2(Genbank受託番号AF2805446)と命名されて、Ｃ末端におけるイントロン切断(MGCSVWRPL)に由来する８つの新規なアミノ酸を加える。  Gagnon et al(Proc. Natl. Acad. Sci USA 97: 2573-78 (2000))は、可溶性ニューロピリン-１イソ形態s12NRP1が、全長タンパク質と同等なVEGF165に結合することができるが、VEGF165結合のアンタゴニストとして作用し、VEGF165活性を阻害し、ラット前立腺癌腫モデルにおいて抗腫瘍活性を示す。
【０１４２】
PDGF/VEGFファミリー
成長因子のPDGF/VEGFファミリーは、少なくとも以下のメンバーを含む。  PDGF-Ａ(例えば、GenBank受託番号X06374参照)、PDGF-Ｂ(例えば、GenBank受託番号M12783参照)、VEGF(例えば、誤解を避けるためにここではVEGF-Ａと称するGenBank受託番号Q16889参照；または特定のイソ形態)、PIGF(例えば、GenBank受託番号X54936参照；胎盤成長因子)、VEGF-Ｂ(例えば、GenBank受託番号U48801;VEGF-関連因子(VRF)としても公知)、VEGF-Ｃ(例えば、GenBank受託番号X94216参照；VEGF関連タンパク質(VRPまたはVEGF-2)としても公知)、VEGF-Ｄ(c-fos-誘導成長因子(FIGS)としても公知;例えば、GenBank受託番号AJ000185参照)、VEGF-E(NZ7 VEGFまたはOV NZ7としても公知;例えば、GenBank受託番号S67522参照)、NZ2 VEGF(OV NZ2としても公知;例えば、GenBank受託番号S67520参照)、D1701 VEGF様タンパク質(例えば、GenBank受託番号AF106020参照;Meyer et al., EMBO J 18:363-374)、およびNZ10 VEGF-様タンパク質(国際特許出願PCT/US99/25869に記載)［Stacker and Achen, Growth Factors 17:1-11 (1999);Neufeld et al., FASEB J 13:9-22(1999);Ferrara, J Mol Med 77:527-543(1999)］。  PDGF/VEGFファミリータンパク質は、そのサブユニットが反平行に整然と配置されたジスルフィド結合または非共有結合ホモ-またはヘテロダイマーいずれかを形成する分泌糖タンパク質である［Stacker and Achen, Growth Factors 17:1-11(1999);Muller et al., Structure 5-1325-1338(1997)］。
【０１４３】
PDGF-ＡおよびPDGF-Ｂは、ホモ重合またはヘテロ重合して、三つの異なるイソ形態：PDGF-AA、PDGF-AB、またはPDGF-BBを生成することができる。  PDGF-Ａは、PDGF α-受容体(PDGFR-α/αホモダイマーを含めたPDGFR-α)に結合できるに過ぎない。  PDGF-Ｂは、PDGFR-αおよび第二のPDGF受容体(PDGFR-β)に共に結合することができる。  具体的には、PDGF-Ｂは、PDGFR-α/αおよびPDGFR-β/βホモダイマー、ならびにPDGFR-α/βヘテロダイマーに結合することができる。
【０１４４】
PDGF-AAおよび-BBは腸間膜起源の細胞に対する主な分裂促進物質および化学誘引剤であるが、内皮系細胞に対して全くまたはほとんど効果を有さず、PDGFR-αおよび-βは共に内皮細胞(EC)に発現される。  PDGF-BBおよびPDGF-ABは、新たに形成された血管の安定化／成熟化に関与することが示されている(Isner et al., Nature 415:234-9 (2002); Vale et al., J Interv Cardiol 14:511-28 (2001);Heldil et al., Physiol Rev 79:1283-1316 (1999);Betsholtz et al., Bioassays 23: 494-507 (2001)。  しかしながら、他のデータは、PDGF-BBおよびPDGF-AAが、PDGFR-α信号伝達を介してbFGF-誘導脈管形成を阻害したことを示した。  PDGF-AAは、腸間膜細胞移動において最も優れた刺激体であるが、それは刺激しないか、または最小にES移動を刺激する。  ある条件下では、PDGF-AAは、EC移動を阻害さえする(Thomman et al., J Cell Biochem. 64: 403-13 (1997); De Marchis et al., Blood 99: 2045-53 (2002); Cao et al., FASEB. J. 16: 1573-83 (2002)。  さらに、PDGFR-αは、PDGFR-β-誘導SMC移動に拮抗することが示されており(Yu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 282:697-700 (2001))、PDGF-AAに対する中和抗体は、平滑筋細胞(SMC)移動を増強する(Palumbo, R., et al., Arterioscles. Thromb. Vasc. Biol. 22:405-11 (2002)。  従って、PDGF-Ａおよび-Ｂの脈管形成／動脈形成活性は、特にPDGFR-αを介して信号伝達を行う場合、議論を起こし、かつ不可解であった。
【０１４５】
PDGF-AAおよび-BBは、心血管および神経幹／前駆細胞双方の増殖および分化において重要な役割を演じると報告されている。  PDGF-BBは、Flkl＋胚幹細胞の血管壁在細胞への分化を誘導し(Carmeliet, P., Nature 408:43-45 (2000); Yamashita et al., Nature 408: 92-6 (2000))、潜在的にはニューロスフィア由来ニューロン生存を増加させ(Caldwell et al., Nat Biotechnol. 19:475-479 (2001)、他方で、PDGF-AAは、αvβ3インテグリンを介してオリゴデンドロサイト前駆体増殖を刺激した(Baron, et al., Embo. J. 21:1957-66 (2002))。
【０１４６】
PDGF-Ｃは、PDGFR-α/αホモダイマーに結合し、PDGF-Ｄは、PDGFR-β/βホモダイマーに結合し、双方は、PDGFR-α/βヘテロダイマーに結合すると報告されている。  PDGF-Ｃポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、国際特許公開第WO 00/18212号、米国特許出願公開第2002/0164687 A1号、および米国特許出願第10/303,997号［米国特許公開第2003/0211994号として公開］においてErikssonらによって特徴付けされている。  PDGF-Ｄポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、国際特許公開第WO 00/27879号および米国特許出願公開第2002/0164710 A1号においてErikssonらによって特徴付けされている。
【０１４７】
PDGF-Ｃポリペプチドは、他のVEGF/PDGFファミリーメンバーと比較して独特のタンパク質構造を呈する。  PDGF-Ｃは、他のファミリーメンバーに存在しないＮ-末端領域にCUBドメインを保有し、また、VEGF相同性ドメイン(VHD)において保存されたシステイン３および４の間に三つのアミノ酸挿入体(NCA)を保有する。  PDGF-ＣのVHDは、VEGF-ＣおよびVEGF-Ｄのそれに最も密接に類似している。  PDGF-Ｃ mRNAの発現は、心臓、肝臓、腎臓、膵臓および卵巣で最も高く、胎盤、骨格筋および前立腺を含めたほとんどの他の組織においては低レベルでしか発現しなかった。  VHDを含むPDGF-Ｃの切形形態は、PDGF-α受容体に結合する。
【０１４８】
VEGFサブファミリーは、配列：C-X(22-24)-P-[PSR]-C-V-X(３)-R-C-[GSTA]-G-C-C-X(6)-C-X(32-41)-Cを特徴とするVEGF相同性ドメイン(VHD)を共有するPDGF/VEGFメンバーから構成されている。
【０１４９】
VEGF-Ａは、当初は、内皮細胞に関する分裂促進物質活性と、微小血管透過性を誘導する能力によって、いくつかの供給源から精製されており、血管透過性因子(VPF)とも呼ばれている。  また、VEGF-Ａは、細胞内カルシウムの集積、プラスミノーゲンアクチベータの誘導およびプラスミノーゲンアクチベータ阻害剤-１の合成、in vitroにおける単球移動の促進、ヒト内皮細胞における抗アポトーシスタンパク質の発現の誘導、内皮細胞における開窓の誘導、内皮細胞における細胞接着分子の発現の促進、および酸化窒素媒介血管拡張および低血圧の誘導を含めた多数の生物学的プロセスを誘導することが示されている［Ferrara, J Mol Med 77: 527-543 (1999);Neufeld et al., FASEB J 13:9-22 (1999); Zachary, Intl J Biochem Cell Bio 30:1169-1174 (1998)］。
【０１５０】
VEGF-Ａは、23kDサブユニットから構成される分泌されたジスルフィド結合ホモダイマー糖タンパク質である。  識別可能なmRNAスプライス変異によってコードされ、長さが121、145、165、189または206アミノ酸の五つのヒトVEGF-Ａイソ形態(VEGF121-206)が記載されており、そのすべては内皮細胞において有糸分裂誘発を刺激することができる。  しかしながら、各イソ形態は生物学的活性、受容体特異性、およびVEGF-Ａに対する低親和性受容体として挙動する細胞表面-および細胞外マトリックス-関連ヘパリン-硫酸プロテオグリカンに対する親和性が異なる。  VEGF121は、ヘパリンまたはヘパリン硫酸のいずれにも結合せず；VEGF145およびVEGF165(GenBank受託番号M32977)は、共にヘパリンに結合することができ；および、VEGF189およびVEGF206は、ヘパリンおよびヘパリン-硫酸に対して最大の親和性を示す。  VEGF121、VEGF145、およびVEGF165は、可溶性形態で分泌されるが、VEGF165のほとんどは細胞表面および細胞外マトリックスプロテオグリカンに拘束され、また、その一方で、VEGF189およびVEGF206は、細胞外マトリックスと会合したままである。  VEGF189およびVEGF206は、共にヘパリンまたはヘパリナーゼでの処理によって放出でき、このことは、これらのイソ形態が、プロテオグリカンを介して細胞外マトリックスに結合していることを示すものである。  また、細胞結合VEGF189は、プラスミンのようなプロテアーゼによって切断でき、その結果、活性な可溶性VEGF110が放出される。  VEGFを発現するほとんどの組織は、いくつかのVEGFイソ形態を同時に発現することが観察されているが、VEGF121およびVEGF165が支配的形態であり、その一方で、VEGF206は稀にしか検出されない［Ferrara, J Mol Med 77:527-543 (1999)］。  VEGF145は、それが生殖器官に由来する細胞で主として発現される点で異なる［Neufeld et al., FASEA J 13:9-22 (1999)］。
【０１５１】
VEGF-Ａの発現のパターンは、正常な血管系の発生および維持、および腫瘍成長に関連する脈管形成、および慢性関節リウマチのような他の病理学的疾患へのその関与を示唆する。VEGF-Ａは、発生する血管系に関連する胚組織で発現され、多数の腫瘍細胞系によって分泌される。  標的化遺伝子破壊によってVEGF-Ａがノックアウトされたマウスの分析は、VEGF-Ａが生存に対して臨界的であり、そして、心血管系の発生はVEGF-Ａ濃度勾配に対して高度に感受性であることを示している。  VEGF-Ａの単一コピーを欠くマウスは、妊娠11日目および12日目の間に死亡する。  これらの胚は、不十分な成長、および発生した心血管系での血管などでの発生異常を示す。  VEGF-Ａは、成長、骨発生、成長プレート形態形成および軟骨内骨形成の調節で誕生後に必要とされる。  VEGF-Ａについての要件は、特に、生後４週間後に年齢と共に減少する。  成熟動物においては、VEGF-Ａは、主として、創傷治癒および黄体の発生のようなプロセスにおける活性な脈管形成で必要とされる［Neufeld et al., FASEB J 13: 9-22 (1999);Ferrara, J Mol Med 77:527-543 (1999)］。  VEGF-Ａの発現は、主として、低酸素症、および多数のホルモン、および表皮成長因子(EGF)、TGF-βおよび種々のインターロイキンを含めたサイトカインによる影響を受ける。  調節は、転写により起こり、および増大したmRNA安定性によるなどして転写後に起こる［Ferrara, 前掲］。
【０１５２】
P1GF、VEGFサブファミリーの第二のメンバーは、一般的には、VEGF-Ａと比較して脈管形成および内皮細胞増殖作用が弱い刺激剤であって、P1GFのin vivo作用はよく理解されていない。  代替mRNAスプライシングによって生じたP1GFの三つのイソ形態が、記載されている［Hauser et al., Growth Factors 9:259-268 (1993);Maglione et al., Oncogene 8:925-931 (1993)］。  P1GFは、VEGF-Ａと共に双方のジスルヒド結合ホモダイマーおよびヘテロダイマーを形成する。  このP1GF-VEGF-Ａヘテロダイマーは、P1GFホモダイマーよりも、内皮細胞増殖および脈管形成を誘導する上で効果的である。  P1GFは、主として、胎盤で発現され、また、壁黄身嚢の栄養膜巨細胞における初期胚形成の過程でVEGF-Ａと共発現する［Stacker and Achen, Growth Factors 17:1-11(1999)］。
【０１５３】
本明細書の一部を構成するものとして、そのすべての内容を援用する国際特許公開第WO 96-26736号および米国特許第5,840,693号および第5,607,918号に詳細に記載されたVEGF-Ｂは、VEGF-Ａと約44％のアミノ酸同一性を有する。  VEGF-Ｂのin vivoでの生物学的機能は、完全には理解されていないが、脈管形成特性を有することが示されており、また、細胞の接着および移動、それに、細胞外マトリックスの劣化の調節にも関与する。  VEGF-Ｂは、代替スプライシングによって生じた167および186アミノ酸残基の二つのイソ形態として発現される。  VEGF-Ｂ167は、ヘパリン結合ドメインを介して細胞表面または細胞外マトリックスと会合し、その一方で、VEGF-Ｂ186は分泌される。  VEGF-Ｂ167およびVEGF-Ｂ186は、共に、VEGF-Ａとでジスルヒド結合ホモダイマーまたはヘテロダイマーを形成することができる。  VEGF165VEGF-Ｂ 167ヘテロダイマーの細胞表面への会合は、VEGF-Ｂ成分によって決定されるようであり、このことは、ヘテロダイマー化がVEGF-Ａを分離する上で重要であろうことを示唆する。  VEGF-Ｂは、主として、胚および成人心臓および骨格筋組織で発現される［Joukov et al., J Cell Physiol 173:211-215(1997);Stacker and Achen, Growth Factors 17:1-11(1999)］。  VEGF-Ｂを欠くマウスは生存するが、小さい心臓、機能不全的な冠血管系を有し、心臓虚血症で受けた損傷の回復がみられる［Bellomo et al., Circ Res (2000); E29-E35］。
【０１５４】
VEGFサブファミリーの四番目のメンバーであるVEGF-Ｃは、VEGF-Ａに対してアミノ酸レベルにおいてほぼ30％同一であるVHDを含む。  VEGF-Ｃは、当初は、Balbianiリング３タンパク質に典型的なモチーフ内に縦列反復システイン残基を含有するＣ末端ペプチドと共に、VHDを近接して挟む広範囲のアミノ-およびカルボキシ-末端ペプチド配列を有する大きな前駆体タンパク質、プレプロ-VEGF-Ｃとして発現される。  プレプロ-VEGF-Ｃは、シグナルペプチド、Ｃ-末端プロ-ペプチド、およびＮ-末端プロ-ペプチドを順次に切断する広範なタンパク質分解成熟作用を受けて、十分にプロセッシングされた成熟形態(ΔNΔC VEGF-Ｃ)を生じる。  分泌されたVEGF-Ｃタンパク質は、非共有結合したホモダイマーを含み、そこでの各モノマーはVHDを含有する。  部分的タンパク質分解プロセッシングによって生じたVEGF-Ｃの中間体は、VEGFR-３受容体に対して増大した親和性を示し、成熟タンパク質は、VEGFR-２受容体に結合することもできる［Joukov et al., EMBO J., 16:(13):3898-3911(1997)］。  また、位置156における単一システインがもう一つのアミノ酸によって置換されているか、または失欠しているかのいずれかである突然変異体VEGF-Ｃ(VEGF-Ｃ ΔC156)は、VEGFR-２に結合する能力を失うが、依然としてVEGFR-３に結合して、活性化することができる［米国特許第6,130,071号および国際特許公開第WO 98/33917号］。  配列番号：24のアミノ酸156における例示的な置換は、位置156におけるシステインから置換されたセリン残基を含む(VEGF-Ｃ C156S)。  マウス胚において、VEGF-Ｃ mRNAは、主として、尿膜、頚領域および後腎で発現される［Joukov et al., J Cell Physiol 173:211-215(1997)］。  VEGF-Ｃは、リンパ系脈管形成の調節に関与し：VEGF-Ｃが、トランスジェニックマウスの皮膚で過剰発現されると、過形成リンパ管ネットワークが観察され、このことは、VEGF-Ｃがリンパ成長を誘導することを示唆する［Jeltsch et al., Science, 276:1423-1425(1997)］。  また、成人におけるVEGF-Ｃの継続した発現は、分化したリンパ内皮の維持においての役割を示すものである［Ferrara,J Mol Med 77:527-543(1999)］。  VEGF-Ｃもまた脈管形成特性を示し、その活性は、コラーゲンにおけるウシ毛細血管内皮(BCE)細胞の移動を刺激し、ヒト内皮細胞の成長を促進することができる［例えば、本明細書の一部を構成するものとして、そのすべての内容を援用する米国特許第6,245,530号；米国特許第6,221,839号；および国際特許公開第WO 98/33917号を参照］。
【０１５５】
プレプロ-VEGF-Ｃポリペプチドは、複数の工程でプロセッシングされて、(還元条件下でSDS-PAGEによって評価して)約21乃至23kDの成熟した最も活性なVEGF-Ｃポリペプチドを生じる。  これらプロセッシングは、シグナルペプチド(配列番号：24、残基１乃至31)の切断；(約29kDの部分的にプロセッシングされた形態を生成する配列番号；24のアミノ酸228乃至419にほぼ対応する)カルボキシル末端ペプチドの切断；および約21乃至23kDの十分にプロセッシングされた成熟形態を生成する(配列番号：24のアミノ酸32乃至102にほぼ対応する)アミノ末端ペプチドの(見かけ上は細胞外の)切断片を含む。  実験で得られた結果は、VEGF-Ｃの部分的にプロセッシングされた形態(例えば、29kD形態)の場合、Flt4(VEGF-3)受容体に結合でき、その一方で、VEGFR-２への親和性に富んだ結合は、VEGF-Ｃの十分にプロセッシングされた形態でのみ生じることを示している。  VEGF-Ｃポリペプチドは、天然では、非ジスルヒド結合ダイマーとして会合する。
【０１５６】
さらに、配列番号：24のアミノ酸103乃至227は、VEGF-Ｃ機能を維持する上において、すべて臨界的であるというわけではない、ことが示している。  配列番号：24のアミノ酸112乃至215よりなる(および残基113乃至111および216乃至227を欠く)ポリペプチドは、VEGF-Ｃ受容体に結合し、同受容体を刺激する能力を有し、約131乃至約211の残基において、ポリペプチドは、VEGF-Ｃの生物学的活性を保持すると予測される。  位置156におけるシステイン残基は、VEGFR-２結合能力に対して重要であることが示されている。  しかしながら、VEGF-Ｃ C156ポリペプチド(すなわち、失欠または置換のために、このシステインを欠く類似体)は、依然として、VEGFR-３の優れたアクチベーターである。  配列番号：24の位置165におけるシステインは、いずれかの受容体に結合する場合でも必須であり、その一方で、位置83または137におけるシステインを欠く類似体は、双方の受容体と結合する際に天然VEGF-Ｃと競合し、双方の受容体を刺激する。  また、受容体結合VEGF-Ｃ配列が、もう一つの(天然または合成の)供給源由来のヘパリン結合配列に融合したキメラヘパリン結合VEGF-Ｃポリペプチドは、本願発明で用いることができる。  VEGF-ＣおよびVEGF-Ｄのヘパリン結合形態は、本明細書の一部を構成するものとして、そのすべての内容を援用する米国仮特許出願第60/478,390号および米国特許出願第10/868,577号に詳細に記載されている。  例えば、VEGF-Ｃ(配列番号：24)のシグナル配列およびVEGFホモログドメイン(VHD)、およびヘパリン結合ドメインをコードするVEGFエクソン６乃至８(CA89)またはエクソン７乃至８(CA65)(配列番号：20)よりなるキメラタンパク質をコードするプラスミドが構築されている。  キメラポリペプチドCA65は、分泌されて、上清に放出されるが、ヘパリンが培養基に含まれていなければ、CA89は上清に放出されることはなく、VEGF189について記載されたのと同様な細胞表面ヘパリン硫酸に結合するようである。
【０１５７】
VEGF-Ｄは、構造的および機能的にはVEGF-Ｃに最も密接に関連する［本明細書の一部を構成するものとして、そのすべての内容を援用する米国特許第6,235,713号および国際特許公開第WO 98/07832号を参照］。  VEGF-Ｃと同様に、VEGF-Ｄは、当初は、プレプロ-ペプチドとして発現され、Ｎ-末端およびＣ-末端タンパク質分解プロセッシングを受けて、非共有結合ダイマーを形成する。  VEGF-Ｄは、in vitroで内皮細胞における分裂促進物質応答を刺激する。  胚形成の過程で、VEGF-Ｄは、複雑な時間的および空間的パターンで発現され、その発現は、成人において、心臓、胚および骨格筋に常に存在する。  VEGF-Ｄ ΔNΔCと命名されるVEGF-Ｄの生物学的に活性な断片の単離は、本明細書の一部を構成するものとして、そのすべての内容を援用する国際特許公開第WO 98/07832号に記載されている。  VEGF-Ｄ ΔNΔCは、アフィニティータグペプチドFLAG(登録商標)またはその他の配列に任意に連結することが可能なVEGF-Ｄ(配列番号:26)のアミノ酸残基93乃至201よりなる。
【０１５８】
プロピレ-VEGF-Ｄポリペプチドは、21アミノ酸の推定シグナルペプチドを有し、プロピレ-VEGF-Ｃのプロセッシングと同様のタンパク質分解によりプロセッシングされる。  配列番号：26の残基１乃至92および202乃至354を欠く「組換えにより突然変異した」VEGF-Ｄは、受容体VEGFR-２およびVEGFR-３を活性化する能力を有しており、非共有結合ダイマーとして会合する。  従って、好ましいVEGF-Ｄポリヌクレオチドは、配列番号：26のアミノ酸93乃至201をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。  機能維持修飾をVEGF-Ｃポリペプチドに導入するための前述した手法は、機能維持修飾をVEGF-Ｄポリペプチドに導入する場合にも適用する。  また、VEGF-Ｄのヘパリン結合形態が、考えられる。  本明細書の一部を構成するものとして、そのすべての内容を援用する米国特許仮特許出願第60/478,390号を参照されたい。
【０１５９】
VEGFサブファミリーの四つの他のメンバーが、ヒト、ヒツジおよびヤギに感染するポックスウイルスで同定されている。  OrfウイルスでコードされたVEGF-EおよびNZ2 VEGFは、優れた分裂促進物質および透過性増強因子である。  両者は、哺乳動物VEGF-Ａに対してほぼ25％のアミノ酸同一性を示し、ジスルフィド結合ホモダイマーとして発現される。      
【０１６０】
これらのウイルスによる感染は、内皮細胞増殖、およびこれらのウイルスVEGFタンパク質によって誘導された血管透過性に関与する膿疱性皮膚炎を特徴とする［Fererra, J Mol Med 77:527-543(1999);Stacker and Achen, Growth Factors 17:1-11(1999)］。  VEGF様タンパク質もまたorfウイルスの二つのその他の株、D1701［GenBank受託番号AF106020;Meyer et al., EMBO J 18:363-374(1999)に記載］およびNZ10［本明細書の一部を構成するものとして、そのすべての内容を援用する国際特許出願PCT/US99/25869に記載］から同定されている。  これらのウイルスVEGF-様タンパク質は、宿主内皮に存在するVEGFR-２に結合することが示されており、この結合は、感染の発生および脈管形成のウイルス誘導において重要である［Meyer et al., 前掲；国際特許出願PCT/US99/25869］。
【０１６１】
PDGF/VEGF受容体
PDGF/VEGFファミリーメンバーと相互作用する七つの細胞表面受容体が同定されている。これらは、PDGFR-α(例えば、GenBank受託番号NM006206を参照)、PDGFR-β(例えば、GenBank受託番号NM002609を参照)、VEGFR-１/Flt-１(fms-様チロシンキナーゼ-１；GenBank受託番号X51602;De Vries et al., Science 255:989-991(1992));VEGFR-２/KDR/Flk-1(受容体/胎児肝臓キナーゼ-1を含むキナーゼインサートドメイン；GenBank受託番号X59397(Flk-１)およびL04947(KDR);Termal et al., Biochem Biophys Res Comm 187:1579-１586(1992);Matthews et al., Proc Natl Acad Sci USA 88:9026-9030(1991));VEGFR-３/Flt４(fms-様チロシンキナーゼ４;米国特許第5,776,755号およびGenBank受託番号X68203およびS66407;Pajusola et al., Oncogene 9:3545-3555(1994))、ニューロピリン-１(GenBank受託番号NM003873)、およびニューロピリン-２(GenBank受託番号NM003872)を含む。  二つのPDGF受容体は、前記したPDGFの信号伝達を媒介する。  VEGF121、VEGF165、VEGF-Ｂ、P1GF-１およびP1GF-２は、VEGF-R1に結合し；VEGF121、VEGF145,VEGF165、VEGF-Ｃ、VEGF-Ｄ、VEGF-ＥおよびNZ2 VEGFは、VEGF-R2に結合し；VEGF-ＣおよびVEGF-Ｄは、VEGFR-３に結合し；VEGF165、VEGF-Ｂ、P1GF-２およびNZ2 VEGFは、ニューロピリン-１に結合し；および、VEGF165,およびVEGF145は、ニューロピリン-２に結合する［Neufeld et al., FASEB J 13:9-22(1999);Stacker and Achen, Growth Factors 17:1-１1(1999);Ortega et al., Fron Biosci 4:141-１52(1999);Zachary, Intl J Biochem Cell Bio30:1169-１174(1998);Petrova et al., Exp Cell Res 253:117-１30(1999):Gluzman-Poltorak et al., J.Biol.Chem.275:18040-45(2000)］。
【０１６２】
PDGF受容体は、それらの細胞外ドメインに五つの免疫グログリン-様ループを含有するチオシンキナーゼ受容体(PTK)である。  VEGFR-１、VEGFR-２およびVEGFR-３は、細胞質領域にそれらの細胞外ドメインおよびスプリットキナーゼドメイン中の七つのIgドメインの存在によって区別されるPTKのPDGFサブファミリーのサブグループを含む。  ニューロピリン-１およびニューロピリン-２は、顆粒信号伝達能力を保有することが現在知られていない短い細胞質末端を備えた非-PTK VEGF受容体である。
【０１６３】
VEGFの受容体のいくつかは、一つ以上の形態として発現される。  ７番目のIg-様ループ、膜貫通ドメイン、および細胞質領域を欠くVEGFR-１の可溶性イソ形態は、ヒト臍静脈内皮細胞で発現される。  このVEGFG-１イソ形態は、高い親和性でもってVEGF-Ａに結合し、VEGF-Ａ-誘導分裂促進物質応答を妨げることができる［Ferrara et al., J Mol Med 77:527-543(1999);Zachary, Intl J Biochem Cell Vio30:1169-１174(1998)］。  VEGFR-２のＣ-末端切形形態も報告されている［Zachary, 前掲］。  ヒトでは、それらのＣ末端の長さが異なるVEGFR-３タンパク質の二つのイソ形態がある。  これまでの研究によって、より長いイソ形態が、VEGFR-３の生物学的特性のほとんどを担うことが示唆されている。
【０１６４】
VEGFR-１の発現は、主として内皮細胞で起こるが、そのいくつかは、単球および腎臓糸球体間質細胞［Neufeld et al., FASEB J 13:9-22(1999)］、栄養膜細胞(Charnock-Jones, Biol Reprod 51:524-30.1994)、造血幹細胞(Luttun et al., Ann N Y Acad Sci.979:80-93.2002)、精子形成細胞およびライディッヒ細胞(Korpelainen et a;., J Cell Biol143:1705-１21.1998)および平滑筋細胞(Ishida et al., J.Cell Physiol.188:359-68.2001)に存在している。  高レベルのVEGFR-１ MRNAは、成人器官でも検出されており、このことは、VEGFR-１が、細胞成長に関連しない成熟血管の休止内皮において機能を有することを示唆する。  VEGFR-１-/-マウスは、８.５日および９.５日の間に、子宮内で死亡する。  内皮細胞は、これらの動物で発生するが、機能的血管の形成は著しく損なわれており、VEGFR-１は、細胞移動に関連する細胞-細胞または細胞-マトリックス相互作用に関与する。  最近、チロシンキナーゼドメインのみが失われた突然変異したVEGFR-１を発現するマウスが、正常な脈管形成および生存を示すことが示されており、これは、VEGFR-１の信号伝達能力が必須ことでないことを示唆する［Neufeld et al., 前掲;Ferrara, J Mol Med 77:527-543(1999)］。
【０１６５】
VEGFR-２の発現は、血管内皮で広く認められるが、それは、造血幹細胞、巨核細胞、および網膜前駆細胞にも存在する点でVEGFR-１のそれと同様である［Neufeld et al., 前掲］。  VEGFR-１およびVEGFR-２の発現パターンは、かなり重複しており、ほとんどの細胞型の場合、VEGFR-２は、VEGFのほとんどがそれを介してそれらの生物学的活性を発揮する主な受容体である。  VEGFR-２が欠乏したマウス胚の研究によって、内皮細胞分化および造血細胞の発生の双方において、この受容体が必要であることを示されている［Joukov et al., J Cell Physiol.173:211-215(1997)］。
【０１６６】
VEGFR-３は、初期胚形成の過程で、内皮細胞で広範に発現される。  発生の後期段階の過程で、VEGFR-３の発現は、リンパ血管の発生を制限するようになる［Kaipainen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:3566-3570(1995)］。  成人において、リンパ内皮およびいくつかの高内皮細静脈は、VEGFR-３を発現し、増大された発現が、転移性リンパ節およびリンパ管腫中のリンパ洞で発生する。  VEGFR-３は、過剰発現実験によって示されたVEGF-Ｃの骨髄造血活性の造血を媒介できるCD34+造血細胞のサブセットでの発現される［WO 98/33917］。  マウス胚におけるVEGFR-３遺伝子の標的破壊は、一次血管ネットワークの再構成の失敗、そして、9.5日後には、胚の死滅に至る［Dumont et al., Science, 282:946-949(1998)］。  これらの研究は、胚血管系の発生において、またリンパ管形成の過程におけるVEGFR-３に対する必須の役割を示唆する。
【０１６７】
VEGF受容体の構造的分析は、VEGFR-１およびVEGFR-２でのVEGFR-Ａ結合部位が、第二および第三のIg-様ループに位置することを示す。  同様に、VEGFR-２およびVEGFR-３でのVEGFR-ＣおよびVEGFR-T結合部位は、第二のIg-ループ内に含まれる［Taipale et al., Curr Top Microbiol Immunol 237:85-96(1999)］。  第二のIg-様ループが、ドメインスワッピング実験によって示されるリガンド特異性を付与する［Ferrara, J Mol Med 77:527-543(1999)］。  受容体-リガンド実験は、VEGFファミリータンパク質によって形成されたダイマーが二つのVEGF受容体分子に結合でき、それにより、VEGF受容体を二量体化することを示す。  VEGFR-１上、および、おそらくはVEGFR-２上の四番目のIg-様ループは、レポーターのリガンドダイマーへの結合に際して二つの受容体分子を結合する受容体二量体化ドメインとして作用する［Ferrara, J Mol Med 77:527-543(1999)］。  VEGFR-１およびVEGFR-２に結合するVEGF-Ａの領域はかなり重複するが、これまでの研究は、VEGFR-１またはVEGFR-２いずれかと相互作用するVEGF-Ａ内の二つの別々のドメイン、ならびにリガンド-受容体相互作用で臨界的なこれらのドメイン内の特異的アミノ酸残基を明らにした。      
【０１６８】
ある特定のVEGF受容体の結合を特異的に妨げるいずれかのVEGF受容体-特異的ドメイン内の突然変異も認められている［Neufeld et al., FASEB J 13:9-２2(1999)］。
【０１６９】
VEGFR-１およびVEGFR-２は構造的に同様であり、共通のリガンド(VEGF121およびVEGF165)を共有し、発生の過程で同様な発現パターンを呈する。  しかしながら、同一リガンドによりVEGFR-１およびVEGFR-２を介して媒介されるシグナルはわずかに異なっているようである。  VEGFR-２は、VEGF-Ａに応答する自動リン酸化を受けるようであるが、同一条件下でのVEGFR-１のリン酸化は稀にしか検出できない。  VEGFR-２媒介シグナルは、形態、アクチン再組織化、およびこの受容体を組換えにより過剰発現するブタ大動脈内皮細胞の膜攪乱の顕著な変化を引き起こす。  これらの細胞にあっては、VEGFR-２は、リガンド-誘導化学走性および有糸分裂誘導性を媒介し；その一方で、VEGFR-１でトランスフェクトされた細胞は、VEGF-Ａに対する分裂促進物質応答を欠いた。  VEGFR-２への結合を破壊するVEGF-Ａにおける突然変異は、内皮細胞の増殖を誘導せず、その一方で、VEGFR-１への結合に欠陥があるVEGF-Ａ突然変異体は、依然として、内皮増殖を促進することができる。  同様に、VEGFR-２のみを発現する細胞のVEGF刺激は有糸分裂誘発応答に至り、その一方で、VEGFR-１のみを発現する細胞に相応の刺激を与えた結果、細胞移動が(例えば、単球で)起こり得るが、細胞増殖は誘導しない。  加えて、VEGFR-１およびVEGFR-２と共沈殿するリンタンパク質は区別され、このことは、異なる信号伝達分子が受容体特異的細胞内配列と相互作用することを示唆する。
【０１７０】
脈管形成でのVEGFR-１の一次的機能が、それに結合することで、VEGFR-２とのその相互作用を妨げて、VEGF-Ａの活性を負に調節する一方で、VEGFR-２は、内皮細胞におけるVEGF-Ａシグナルの主なトランジューサーであるという出現仮説がある。  この仮説を裏付けるように、VEGF-Ａに結合することができるが、チロシンキナーゼドメインを欠くEGFR-１受容体を発現するマウスは生存し、異常な胚発生または脈管形成を呈しないが、VEGFR-１が欠損したマウスは胚として死亡するとの現象が認められている。  加えて、VEGFR-２のみに結合するVEGF-Ａ突然変異体の分析は、それらが、内皮細胞において分裂促進物質応答を誘導する能力を有することを示している。  しかしながら、単球のVEGF-媒介移動は、VEGFR-１に依存しており、このことは、この受容体を介する信号伝達は少なくとも一つの生物学的機能において重要であることを示している。  加えて、樹状細胞の成熟化を妨げるVEGF-Ａの能力も、やはりVEGFR-１に関連しており、このことは、VEGFR-１が内皮細胞以外の細胞型で機能できることを示唆する［Ferrara,J Mol Med 77:527-543(1999); Zachary, Intl J Biochem Cell Bio 30: 1169-１174(1998)］。
【０１７１】
本願発明を実施する際に用いられるVEGF-Ｃポリペプチド、ニューロピリンまたはその他のポリペプチドに関しては、天然配列が、通常は最も好ましいと理解されている。  「天然配列」として、プレプロ-ペプチド、プロ-ペプチド、および部分的かつ十分にタンパク質分解プロセッシング処理を受けたポリペプチドをはじめとする、天然に生じるポリヌクレオチドによってコードされる配列などがあるが、これらに限定されない。  前述したように、ポリペプチドの多くは、例えば、代替RNAプロセッシングのために存在するスプライス変異を有し、そして、そのようなスプライス変異は天然配列を含む。  本願明細書に記載された目的の範囲内では、注目する結合特性を保有する断片もまた天然配列と考えるべきである。  さらに、タンパク質が保有する注目に価する活性を破壊することなく修飾、特に、保存されたアミノ酸の置換をほとんどのタンパク質配列において行うことができ、そのように修飾されたタンパク質もまた、本願発明を実施する際に好適に用いることができる。  「保存的アミノ酸置換」は、同様な化学的特徴の側鎖を有するアミノ酸でのアミノ酸の置換を意味する。  保存置換を行うための同様なアミノ酸は、酸性側鎖(グルタミン酸、アスパラギン酸);塩基性側鎖(アルギニン、リジン、ヒスチジン);極性アミド側鎖(グルタミン、アスパラギン);疎水性脂肪族側鎖(ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、グリシン)；芳香族側鎖(フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン);小さな側鎖(グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン)；または脂肪族ヒドロキシル側鎖(セリン、スレオニン)を有するものを含む。
【０１７２】
さらに、アミノ酸の失欠および付加は、しばしば、所望の活性を破壊することなく実施することが可能である。  本願発明において、結合活性が特に興味深く、結合に際して受容体チロシンキナーゼを活性化し、または阻害する分子の能力が特に興味深い場合において、結合アッセイおよびチロシンリン酸化アッセイを、特定のリガンドまたはリガンド変異が(ａ)結合し、(ｂ)RTK活性を刺激し、または阻害するか否かを判断するために取り入れることができる。
【０１７３】
候補VEGF-Ｃ類似体ペプチドは、まず、結合し、VEGF-Ｃ受容体(VEGFR-２、VEGFR-３)の自動リン酸化、またはそれらの受容体(VEGFR-２、VEGFR-３、NRP-１およびNRP-２)を介する細胞活性化を(ある種の受容体に関して)刺激するそれらの能力を迅速にスクリーニングすることができる。  これらの受容体を刺激するポリペプチドは、(例えば、WO 98/33917に記載されているように)培養された毛細管または動脈内皮細胞に対するそれらの分裂促進物質および／または化学走性活性につき迅速にin vitroで再度スクリーニングされる。      
【０１７４】
また、分裂促進物質および／または化学走性活性を有するポリペプチドを、本願発明の方法において、その効率を、本明細書に記載したようにしてin vivoでスクリーニングする。  このように、天然に生じるVEGF-Ｃタンパク質の変異(類似体)は迅速にスクリーニングされて、変異が本願発明で用いる「VEGF-Ｃポリペプチド」を構成する必要な生物学的活性を有するか否かを判断する。
【０１７５】
ポリペプチド変異の属を規定するための二つの指標は、天然ポリペプチドに対するパーセントアミノ酸同一性(例えば、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％同一性が好ましい)、または特定の条件下で相互にハイブリダイズするコーディングポリヌクレオチドの能力を含む。  一つの条件例として、50％ホルムアミド、５×SSC、20mM NaPO4、pH6.8中での42℃におけるハイブリダイゼーション；および、55℃における30分間の１×SSC中での洗浄がある。  同等なハイブリダイゼーション条件を計算し、および／または所望のレベルのストリンジェンシーを達成するための他の条件を選択するための公式はよく知られている。  同等なストリンジェンシーの条件は、Ausubel, et al.(編), Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(1994),pp.6.0.3乃至6.4.10に記載された温度および緩衝液、または塩濃度の変化を参照して実現可能であることは、当該技術分野でよく理解されている。  ハイブリダイゼーション条件の修正は、経験的に決定することができるか、あるいはプローブのグアノシン／シトシン(GC)/塩基対の長さおよびパーセンテージに基づいて正確に計算される。  ハイブリダイゼーション条件は、Sambrook, et al.(編), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York(1989), pp.9.47乃至9.51の記載に従って計算することができる。
【０１７６】
Ｂ．神経幹細胞
本願発明は、血管内皮成長因子Ｃによる神経幹細胞の活性化および増殖、およびVEGF-Ｃを用いた神経病理の治療でのニューロン成長および再生を刺激する方法に関する。
【０１７７】
前駆細胞とも呼ばれる幹細胞は、胚および成人幹細胞の双方を含む。  成人幹細胞は、神経幹細胞、造血幹細胞、内皮幹細胞、および上皮幹細胞を含むが、これらに限定されない。  Tepper et al., Plastic and Reconstructive Surgery, 111: 846-854(2003)を参照されたい。  内皮前駆細胞は、血液中を循環し、損傷した内皮を特徴とする領域まで移動する。  Kaushal et al., Nat. Med., 7:1035-１040(2001)。  異なる造血源に由来するヒトCD34(+)CD133(+)幹細胞の小さな亜集団は、VEGFR-３を共発現する(Salven, et al., Blood, 101(1):168-72(2003))。  これらの細胞は、やはり、リンパおよび／または血管内皮細胞にまで、in vitroで分化する能力を有する。
【０１７８】
用語「幹細胞集積」は、(例えば、骨髄細胞からの)幹細胞の(循環への)集積を引き起こす能力をいう。  用語「増殖」は、有糸分裂再生をいう。  用語「分化」は、多能性幹細胞が、他の細胞型へ発展するプロセスをいう。  分化は、多能性および十分に分化した細胞型の間の多数の段階を含むことができる。
【０１７９】
本願発明は、さらに、神経細胞集団の成長を刺激する方法を提供する。  ニューロンおよび神経膠細胞由来細胞を含めたこれらの神経細胞の集団は、治療的に用いられて、神経障害を呈する動物を治療する。  例えば、本願発明を用いて、アルツハイマー病またはパーキンソン病のような神経変性病、または発作、虚血症または外科的処置のような損傷に由来する神経病理、または脊髄損傷のような外傷損傷を治療する。
【０１８０】
神経幹細胞(NSC)は、発生過程および成人においてさえも存在する未成熟の中立的な細胞であり、CNSは、そのCNS内での特殊な細胞のアレイを生成するものと仮定されている。それらは、自己再生し、ほとんどの(すべてではないとしても)ニューロンおよび神経膠系列の細胞へ分化し、発生および／または変性するCNS領域の集団を形成するそれらの能力によって任意に定義される［Ciage et al., Ann Rev Neurosci 18:159-92 (1995); Whittemore et al., Mol. Neurobiology 12: 13-39 (1996); McKay Science 276:66-71 (1997); Gage F H, Christen Y. (編),Research & Perspectives in Neurosciences: Isolation, Characterization & Utilization of CNS Stem Cells, Springer-Verlag, Heidelberg, Berlin (1997); Snyder, The Neuroscientist 4,408-25 (1998)］。
【０１８１】
成体哺乳動物で認められる神経幹細胞は、主として、海馬、嗅覚球および成体脳室ゾーン、ならびに脊髄から単離される(Temple, S. Nature 414: 112-117 (2001))。  これまでの研究は、成体齧歯類の海馬(特に、歯状回の顆粒状下領域)から単離された前駆細胞は、表皮成長因子または塩基性線維芽成長因子で刺激するとin vitroで増殖し、in vivoでの脳への移植に際して、成熟ニューロンへ移動し、分化する(Gage et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 11879-83 (1995))。
【０１８２】
本願発明により有用な移動する幹細胞として、C17.2ニューロン幹細胞系(Riess et al., Neurosurgery 51: 1043-52 (2002))、精製された神経幹細胞、HSN-１細胞(ヒト大脳皮質)、胎児ブタ細胞および神経頭側細胞、骨髄由来神経幹細胞、hNT細胞(ヒトニューロン細胞系)、ヒトニューロン前駆細胞系(Clonetics, Walkersville, Md., カタログ番号CＣ2599)などがあるが、これらに限定されない。  本願発明で有用なHSN-１細胞は、例えば、Ronnett et al．に記載されるように調製される［Science 248, 603-605 (1990)］。  本願発明で有用なhNT細胞は、例えば、Konobu et al．に記載されたように調製される［Cell Transplant 7, 549-558 (1998)］。  神経頭側細胞の調製は、本明細書の一部を構成するものとして、そのすべての内容を援用するTempel and Anderson(米国特許第5,654,183号)に記載されている。  簡単に述べれば、哺乳動物胚からの神経頭側細胞は、尾側-概ね10の体節を含む領域から単離され、(ラットにおける妊娠10.5日と同等な)初期胚から切り出す。  これらの組織切片は、平衡塩溶液を収容して、通常は４℃にまで冷却された窪んだスライドまで移し、ハワードリンゲル液のような適当な緩衝溶液を用いて、コラゲナーゼで処理する。  ニューロンチューブに体節および脊索が無くなった後に、それらをフィブロネクチン(FN)-被覆培養皿に平板培養して、神経頭側細胞を神経チューブから移動させる。  24時間後に、鋭いタングステン針を備えたチューブの除去に続き、通常は、0.05％のトリプシン溶液での処理によって頭側細胞をFN-被覆プレートから除去する。  次いで、遠心によって脱着した細胞の懸濁液を集め、1.5g/L炭酸水素ナトリウム、4.5g/Lグルコース、90％；胎児ウシ血清10％を含有するように調整された４mM Ｌ-グルタミンを含むダルベッコの修飾イーグル培地のような適当な化学的に規定された培地中で適切な密度、一般的には225細胞／100mm皿で平板培養する。  成長培地は、濾過に先立ってpH7.35に調整すべきである。  米国特許第5,196,315号を参照されたい。
【０１８３】
特異的成長因子および特定の添加剤の濃度は、必要に応じて、神経幹細胞の特定の培養へ最適な成長を与えるように変化させる。  培地は、血清不含のものを用いることもでき、神経頭側幹細胞の成長および自己-再生を可能とする成分を含有する。  培養皿は、適当な層、一般的には、FNおよびポリ-Ｄ-リジン(PDL)の組み合わせで被覆される。
【０１８４】
前記した神経頭側細胞は、低親和性神経成長因子受容体(LNGFR)およびネスチンのそれらの細胞表面発現、および神経膠細胞フィブリル酸性タンパク質(GFAP)を含めたニューロンまたは神経膠系列マーカーの欠如に基づいて単離される。  これらの分子に対する抗体を用いて、神経頭側細胞の集団を精製する。
【０１８５】
この方法に従って培養された単離神経頭側細胞およびそれらの分化から得られた細胞を、本願発明で用いる。
【０１８６】
本明細書で用いる「神経幹細胞」は、プロト-ニューロン／プロト神経膠細胞である神経前駆細胞である。  神経幹細胞の用語は、神経前駆細胞、神経前駆細胞、およびニューロスフィアと相互交換可能に用いる。  発生の過程で、非常に原始的な全能性細胞である胚幹細胞は、それらが神経細胞へ発生する間に、神経幹細胞の段階を通過すると考えられる。  神経幹細胞は、神経膠細胞、オリゴデンドロサイト、ニューロンまたは神経膠星状細胞を含めたいずれかの神経細胞に分化するよう誘導できる。  細胞は、何世代にもわたって増殖する能力、ネスチンおよびKi-67の発現、プロト-ニューロン形態、ならびにニューロンおよび神経膠細胞へ分化する能力に基づいて多能性神経前駆細胞として特徴付けられる。  NSCの供給源は、脳、脊髄、胎児組織、網膜および胚を含めたNSCを含有するいずれの組織であってもよい(米国特許公開第2003/0040023号を参照されたい)が、これらに限定されない。  哺乳動物神経頭側幹細胞および多能性神経幹細胞、ならびにそれらの子孫は、ヒトおよび非ヒト霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタなどからの組織から単離することができる。
【０１８７】
本願発明で用いる神経幹細胞または神経前駆細胞は、ニューロン前駆細胞およびオリゴデンドロサイト前駆細胞のような異なる神経細胞系列前駆体を生成することができる。
【０１８８】
多くの分化剤または神経栄養因子は当業者に知られており、それは成体幹細胞、胚幹細胞、網膜幹細胞、または神経幹細胞を特別なタイプの神経細胞、網膜細胞またはあるタイプの前駆細胞に分化させることができる。  これらの神経栄養因子は、ニューロンの分化機能のための、タンパク質の生存、成長、形態学的可塑性、または合成を調節する内因性可溶性タンパク質を含む。  従って、本願明細書に記載の単離された幹細胞は、もしそのように所望されれば、当業者に知られたいずれかの手段によって分化することができる。分化剤として、インターフェロンガンマ、胎児ウシ血清、神経成長因子、表皮成長因子(EGF)の除去剤、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)(または双方)の除去剤、ニューロゲニン、脳由来神経栄養因子(BDNF)、甲状腺ホルモン、骨形態形成タンパク質(BMP)、LIF、ソニックヘッジホッグ、および神経膠細胞系由来の神経栄養因子(GDNF)、血管内皮成長因子(VEGF)、インターロイキン、インターフェロン、幹細胞因子(SCF)、アクチビン、インヒビン、ケモカイン、レチノイン酸およびCNTFなどがあるが、これらに限定されない。細胞は、永久にまたは一時的に分化してもよい。  例えば、細胞を時間的に分化させて、例えば、同定用マーカーを用いるために、特異的マーカーを発現させることができる。  さらに、分化剤を除去することもでき、そうなると、マーカーはもはや発現することができない。
【０１８９】
必要に応じて、抗分化剤を用いることで、前駆細胞の分化を阻害し、全能性を維持することもできる。  これらの抗分化剤として、TGF-β、TGFα、EGF、FGFおよびデルタ(ノッチリガンド)などがあるが、これらに限定されない。
【０１９０】
前述した神経幹細胞は、神経細胞再生を必要とする疾患または状態に罹った哺乳動物へのこれら細胞の投与および導入を介して神経病理を治療する上で有用である。  VEGF-Ｃ産物またはVEGF-Ｄ産物を、これらの個体に投与して、in vivoで神経幹細胞の再成長を発生させ、以下に記載するいずれかの方法によって投与される。  ある代替方法において、VEGF-Ｃ産物またはVEGF-Ｄ産物は、培養中の細胞に投与して、幹細胞それ自体の増殖を刺激し、または神経細胞の所望の集団の分化を誘導して、治療を必要とする個体に移植される。
【０１９１】
オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)は、神経幹細胞から出現する一つの細胞型である。  OPCの増殖、移動および生存は、以前は、血小板由来成長因子A(PDGF-Ａ)およびその受容体PDGFR-αが必要とされていた(Noble et al., Nature. 333:560-2 (1988); Pringle et al., Development. 115:535-51 (1992); Spassky et al., Development. 128, 1993-5004 (2001); Klinghoffer et al., Dev Cell. 2: 103-13 (2002))。  しかしながら、いくつかの研究は、in vivoでのオリゴデンドロサイト発生は、PDGF-Ａ以外の成長因子を必要とし、PDEFR-α OPCはOPCの全集団を表さないことを示唆している。  まず、OPCは、PDGF-ＡまたはPDGFR-α信号伝達の不存在下で後脳に蓄積する(Fruttiger et al.， 前掲, Klinghoffer et al., 前掲)。  そして、脳中のOPCの亜集団が存在し、これはplp/dm-20の発現によって特徴付けられ(Timsit et al., J Neurosci. 15: 1012-24 (1995))、これはPDGFR-αを発現せず(Spassky et al., J Neurosci. 18: 8331-43 (1998))、生存および増殖にPDGFR-α信号伝達に依存しない(Spassky et al., Development. 128:4993-5004 (2001))。  plp/dm-20を発現するこれらのPDGF-独立OPCは、PDGFR-αを発現する細胞の出現に先立って胚性脳のいくつかの領域で検出される(Spassky et al., J Neurosci. 22: 5992-6004 (2002) および前掲 (2002))。
【０１９２】
PDGF成長因子ファミリーは、VEGFファミリーに密接に関連する。  いくつかの最近の実験は、VEGF-Ａが神経組織の活性および発生、特に、終脳の脳室下帯における神経形成(Louissaint et al., Neuron. 34: 945-60 (2002); Jin et al., Proc Natl Acad Sci USA 99: 11946-50 (2002))、および運動および感覚ニューロンの発生(Oosthuyse et al., Nat Genet 28: 131-8 (2001), Mukouyama et al., Cell. 109: 693-705 (2002))と干渉することを示している。  以前の研究は、VEGF-Ｃがニューロピリン１およびニューロピリン２に結合することを示している(Raper, Curr Opin Neurobiol. 10: 88-94 (2000); Fujisawa et al., Dev Dyn (2004))。  当初は、クラス３セマフォリンに対する受容体として記載されたニューロピリンは、OPCによって発現される(Spassky et al., 前掲)。
【０１９３】
さらに、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ導入遺伝子を運び、かつ哺乳動物細胞を感染し、細胞にVEGF-ＣまたはVEGF-Ｄポリペプチドを分泌させるように設計されたウイルスベクターは、神経病理に対する治療を必要とする動物に直接的に投与され、別法として、in vitro培養中の神経幹細胞に移され、そして、動物に移植されると考えられる。  ウイルスベクターは、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄを分泌し、神経幹細胞増殖を刺激し、神経病理の兆候を軽減するように設計される。
【０１９４】
Ｃ．神経学的適用症およびVEGF-Ｃ/VEGF-Ｄ処置療法
末梢神経系(PLS)は、中枢神経系(CLS)を心臓、肺および腺のような内部器官に結合する感覚ニューロンおよび運動ニューロンを共に含む。  抹消神経系は、感覚神経系および自律神経系に分けられ、これは、さらに、交感および副交感神経系に細分される。  交感神経系は、心拍、血圧、瞳孔拡張、嚥下メカニズム、肝臓活性、血液から筋肉、心臓および脳への運動のような基本的な機能調節を補助する神経伝達物質アセチルコリンおよびノルエピネフリンによって調節される。  交感神経系におけるニューロンまたは他の支持神経系細胞の神経変性は、途方もない全身困難を引き起こしかねない。  VEGF-Ｃが、交感神経細胞前駆体をin vitroで増殖および成長するように刺激するという、ここでの開示は、これらの有害神経病理の効果を克服するために出現する療法として、VEGF-Ｃを指摘するものである。
【０１９５】
神経学の分野における最近の発見は、神経幹細胞が、哺乳動物の成体海馬から単離できることを示す。  海馬は、学習および記憶に臨界的に関与し、脳外傷および虚血症のような損傷に極端に弱い(Nakatomi et al., Cell 110: 429-41 (2002))。  この領域は、しばしば、神経変性病の影響を受ける。
【０１９６】
神経変性病は、弱化された運動機能の結果をもたらす特異的脳領域の進行性編成(すなわち、神経細胞機能障害および死滅)によって特徴付けられ、弱められた認識技量および痴呆症に至り得る。  神経変性病として、アルツハイマー病、パーキンソン病、ALSおよび運動ニューロンの疾患などがあるが、これらに限定されない。
【０１９７】
アルツハイマー病は、痴呆症に至る進行性健忘症と診断される。  ADの脳は、ニューロン喪失に由来する拡大された脳室を伴う散漫な大脳萎縮を示す。  一般的には、海馬領域におけるニューロンは、主として、ADの病理に関与する。
【０１９８】
パーキンソン病は、振せんおよび低下した運動ニューロン機能硬直および運動不能を特徴とする。  これらの神経学的兆候は、黒質の遠心性突起、すなわち、黒質線状体の機能障害によるものである。  ドーパミン作動性系におけるニューロンの細胞体は、PD進行に関与する一次細胞である。  一次パーキンソン症候群として、パーキンソン病(PD)、進行性核上麻痺(PSP)、オリーブ橋小脳変性(OPCD)と共に含まれる線状体黒質変性(SND)、および多発性系萎縮(MSA)として知られた症候群におけるシャイ-ドレーダー症候群(SDS)がある。
【０１９９】
「ローゲリヒ病」とも称される筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、脳および脊髄における運動ニューロンを攻撃する進行性神経変性病である。  ASLにおける運動ニューロンの進行性変性は、結局は、その死滅に至り、筋肉運動を開始し制御する脳の能力を低下させる。
【０２００】
ハンチントン舞踏病(HD)は、遺伝的に受け継がれる疾患ではあるが、線状体媒体棘状GABA作動性ニューロンにおけるニューロンの変性をもたらす(Hickey et al., Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 27: 255-65 (2003))。  この変性は、制御されない運動、知的能力の喪失、および感情の乱れを引き起こす。
【０２０１】
脳性麻痺(CP)は、本願発明の方法によって治療することができるその他の疾患である。      
【０２０２】
CP症候群は、発生異常、または５歳未満に起こる出産期または出産後中枢神経系(CNS)障害ダメージのいずれかから通常は由来する関連運動障害のグループである。  CPは、損なわれた随意運動を特徴とする。
【０２０３】
前記障害のいずれかによって影響される患者を、VEGF-Ｃ産物またはVEGF-Ｄ産物で、全身的に、または好ましくは病理部位にて処置して、in vivoでの神経幹細胞の増殖を刺激する。  別法として、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄを発現するウイルスベクターを含めたVEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物でin vitroにて処理した生物学的試料から、市販の供給源または不滅化神経幹細胞から単離された神経幹細胞を患者に投与する。  そし、神経幹細胞は、それらが神経変性の部位まで移動し、増殖するように、神経の変性障害または神経外傷を持つ患者に投与される。  投与は、以下に記載するようにして、全身または局所のいずれかで行う。
【０２０４】
前記障害のいずれかに罹った患者は、損なわれた運動機能または損なわれた認識機能などの疾患兆候の初期症状において治療して、神経変性の進行を停止させることができる。また、VEGF-Ｃ/ＤまたはVEGF-Ｃ/Ｄ培養ニューロン前駆細胞を、疾患の後期段階に個体に投与して、神経系損傷の進行を遅らせることも考えられる。
【０２０５】
また、神経病理を治療する上で通常用いられる神経治療剤と組み合わせたVEGF-Ｃ産物またはVEGF-Ｄ産物の投与は、二つの治療の相乗作用を生み出し、それによって、単一療法のみを受ける個体と比較して、組合せ療法を受ける患者において顕著な改善を引き起こすことも本願発明では意図している。
【０２０６】
神経変性障害は、いくつかのクラスの神経治療剤によって治療できる。  治療剤として、セクレチン、アマンタジン塩酸、リスペリドン、フルボキサミン、クロニジン、アミスルプリド、ブロモクリプチンクロミプラミンおよびデシプラミンなどがあるが、これらに限定されない。
【０２０７】
アルツハイマー病を治療するために通常用いられる神経治療剤として、限定された時間でいくつかの兆候の進展を妨げることができる、タクリン(Cognex)、ドネペジル(Aricept)、リバスチグミン(Exelon)、またはガランタミン(Reminyl)がある。  また、いくつかの医薬は、不眠、動揺、徘徊、不安および鬱病のようなADの挙動的兆候の制御を補助することができる。  ADに対するさらなる療法は、非ステロイド抗炎症薬物(NSAID)、例えば、COX-２阻害剤(Celebrex)およびナプロキセンナトリウムのような抗炎症性薬物である。  同様に用いられる他の抗炎症剤として、サリシレート、ステロイド、受容体部位ブロッカー、または補体活性化の阻害剤がある。
【０２０８】
プラミペキソール(ミラペックス)およびレボドーパは、初期のパーキンソン病(PD)の運動兆候を治療するための効果的な投薬用薬剤である。  In vitro実験および動物実験は、プラミペキソールが、保護作用を示し、また、レバドーパが、ドーパミンニューロンを保護または損傷することを示唆している。  ニューロイメージングは、PD患者でのドーパミンニューロン変性のためのバイオマーカーとして利用可能である。  パーキンソン患者において低レベルで発現される神経伝達物質であるコエンザイムＱ10も、PDの治療で用いられる。  レボドーパは、カルビドーパのような他の薬物と組み合わせて、Ｌ-ドーパの副作用の軽減を補助することができる。  単独の薬剤として、または組み合わせのために、パーキンソン病を治療するのに用いられる他の薬剤として、(エルデプリルとして市販される)シネメット(Sinemet)、セレギリン(Selegiline)があり、これらは初期パーキンソン兆候を軽減することができる。  アマンタジン(シメトレル(Symmetrel))は、やはり抗パーキンソン効果を供する抗ウイルス薬物であり、シネメットと組み合わせて用いられる場合は、レボドーパに対する「治療的ウィンドウ」を広げるためによく用いられる。
【０２０９】
ベナドリル、アルタンおよびコゲンチンは、振せんを治療するために処方できる抗コリン作動性剤の商品名である。  抗コリン作動性剤は、神経筋肉接合においてアセチルコリンの作用をブロックし、それにより、ドーパミンとの関係で再度平衡化させて、硬直および振せんの程度を低下させる。  効果的ではあるが、これらの薬物は、口渇感、視覚低下、尿滞留および便秘のような副作用を示しかねず、このような現象は、高齢者での使用を制限する。
【０２１０】
ロピニロール(レキプ(Requip))、プラミペキソール(ミラペックス(Mirapex))、ブロモプリプチン(パルロデル(Parlodel))およびペルゴリド(ペルマックス(Permax))は、ドーパミンアゴニストである。  これらの薬剤は、ドーパミン受容体部位において直接脳に入り、レボドーパの各用量の持続性を延長させるために、シネメットと組み合わせてよく処方される。  また、これらは、「ジスキネシア」と称されるレボドーパ誘導不随運動を低下させ得る。  医師は、ゆっくりとドーパミンアゴニストを治療レベルまで試し、そして、徐々にレボドーパ用量を減少させて、ジスキネシアを最小化する。  アポモルフィンは、連続的皮下注入または皮下注射としてよく投与されるドーパミンアゴニストである。
【０２１１】
トルカポンク(タスマール(Tasmar))およびエンタカポンは、COMT(カテコール-０-メチル-トランステラーゼ)阻害剤である。  COMT活性がブロックされると、ドーパミンは長時間脳にとどまる。  それらの作用メカニズムは、ドーパミンアゴニストのそれとは全く異なる。
【０２１２】
例えば、リルテック(Rilutek)(登録商標)、ミオトロフィン(Myotrophin)(登録商標)、コエンザイムＱ、トピラメート、キサリプロデンおよびオキサンドロロンなどは、いずれも、ALSの治療で用いられる製剤である。
【０２１３】
前記神経治療剤のいずれかを投与する前、後または同時に、VEGF-Ｃで治療を行うと、神経治療剤の効果は増強され、それにより、個体によって必要とされる薬剤の量を低下させ、複数または大用量の神経治療剤によって生じる望まない副作用を低下させられる。
【０２１４】
神経変性病に加えて、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄは、自律神経系の疾患の治療において有用であると考えられる。  このような疾患として、複数系萎縮および著しい低血圧を特徴とするシャイ-ドレーガー症候群(Lamarre-Cliche et al., Can J Clin Pharmacol. 6: 213-5 (1999))；緊張性瞳孔および反射消失を特徴とするアーディー症候群(Mak et al., J Clin Neurosci. 7: 452 (2000))；眼の神経支配に影響するホルナー症候群(Patel et al., Optometry 74: 425-56 (2003))；心血管調節に影響する家族性自立神経障害(Bernardi, et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167: 141-9 (2003));および、疼痛および変化した感覚を特徴とする局所的疼痛症候群(Turner-Stokes, L. Disabil. Rehabil. 24: 939-47 (2002))などがある。
【０２１５】
多発性硬化症(MS)は、成人若年層に頻繁に認められる病弱化病である。  この疾患は、おそらくは、自己免疫タイプの炎症反応、およびオリゴデンドロサイト、中枢神経系におけるミエリン形成細胞の喪失にしばしば伴う脱髄を特徴とする。  現在利用可能な治療は、MSの炎症因子に対処するものであるが、再髄鞘形成に関与してもほとんど効果を示さない。  従って、この因子は、オリゴデンドロサイト分化およびMSプラーク内の髄鞘形成に干渉する因子の存在または不存在を同定する上で非常に重要である。  VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物は、MSおよびその他の脱髄病の治療において有用である。  VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物は、単独で、あるいは本願明細書の他の箇所に記載されたMS療法に関連する治療ならびに脱髄病に対する他の治療と組み合わせて用いることができる。
【０２１６】
VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物は、他の強力炎症剤と組み合わせて投与することも可能である。  これら薬剤は、非ステロイド抗炎症薬物(NSAID)、鎮痛剤、グルココルチコイド、またはその他の免疫抑制療法を含む。
【０２１７】
NSAIDとして、イブプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、ビボックス(Vioxx)およびセレブレックス(Celebrex)のようなCox-２阻害剤、およびシアリレートなどがある。  鎮痛剤として、アセトアミノフェン、オキシコドン、プロポルキシフェン塩酸のトラマドールなどがある。  グルココルチコイドとして、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、またはプレドニゾンなどがある。  その他の免疫抑制剤療法として、シクロホスファミド、サイクロスポリン、メトトレキセートまたはペニシラミンなどがある。  本願発明の一つ以上のVEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物および一つ以上の前記慣用的治療剤を含む処方は、本願発明の実施態様に他ならない。
【０２１８】
上述したように、VEGF-ＣおよびVEGF-Ｄ産物は、神経系に対する物理的損傷を治療する上で有用である。  外傷は、脳および脊髄の物理的損傷、または磨耗、切開、挫傷、刺穿、圧縮のような圧潰または切断による損傷、または身体の腕、手またはその他の部分に対する外来性物体による外傷的接触に由来するその他の損傷によって引き起こされるものであり、これらは、神経系部分への血流の一次的または永久的停止も含む。
【０２１９】
Ｄ．遺伝子治療
本願実施例のいくつかを含む適用の多くについて、タンパク質-タンパク質相互作用およびタンパク質投与の点から説明する。  タンパク質の発現または活性の調節を達成するための遺伝子操作も、具体的に説明する。  例えば、タンパク質の投与を意図する場合、注目するタンパク質をin vivoで生成するための遺伝子治療ベクターの投与も意図している。タンパク質の阻害(例えば、抗体または小分子阻害剤の使用を介して)を意図する場合、ノックアウト技術またはアンチセンス療法のような遺伝子技術によるin vivoでのタンパク質の発現の阻害が意図される。
【０２２０】
いずれかの適当なベクターを用いて、注目する導入遺伝子を動物に導入することができる。  文献に記載されているベクターとして、レンチウイルスベクター［Kim et al., J. Virol., 72(1): 811-816(1998);Kingsman & Johnson, Scrip Magazine, October, 1998, pp. 43-46.］;アデノウイルス(例えば、米国特許第5,824,544号；米国特許第5,707,618号；米国特許第5,792,453号；米国特許第5,693,509号；米国特許第5,670,488号；米国特許第5,585,362号；Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2581-2584(1992); Stratford-Perricadet et al., J. Clin. Invest., 90: 626-630(1992); およびRosenfeld et al., Cell, 68: 143-155(1992)参照)、レトロウイルス(例えば、米国特許第5,888,502号；米国特許第5,830,725号；米国特許第5,770,414号；米国特許第5,686,278号；米国特許第4,861,719号)、アデノ関連ウイルス(例えば、米国特許第5,474,935号；米国特許第5,139,941号；米国特許第5,622,856号；米国特許第5,658,776号；米国特許第5,773,289号；米国特許第5,789,390号；米国特許第5,834,441号；米国特許第5,863,541号；米国特許第5,851,521号；米国特許第5,252,479号；Gnatenko et al., J. Investig. Med., 45: 87-98(1997)参照)、アデノウイルス-アデノ関連ウイルスハイブリッド(例えば、米国特許第5,856,152号参照)またはワクシニアウイルスまたはヘルペスウイルス(例えば、米国特許第5,879,934号；米国特許第5,849,571号；米国特許第5,830,727号；米国特許第5,661,033号；米国特許第5,328,688号参照)を含めた複製欠陥レトロウイルスベクター；リポフェクチン-媒介遺伝子導入(BRL);リポソームベクター［例えば、米国特許第5,631,237号(センダイウイルスタンパク質を含むリポソーム)参照］；および、これらの組み合わせを含むは、これらに限定されない。  前掲の文献は、本明細書の一部を構成するものとして、そのすべての内容を援用する。  複製-欠陥アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターおよびレンチウイルスは、好ましい実施態様を構成する。
【０２２１】
ウイルスベクターを使用する実施態様において、好ましいポリヌクレオチドは、注目する標的組織における発現を促す適当なプロモーターおよびポリアデニル化配列を含む。  本願発明の多くの実施態様での利用に供するために、哺乳動物細胞の発現のための適当なプロモーター／エンハンサーは、例えば、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー［Lehner et al., J. Clin. Microbiol., 29: 2494-2502(1991); Boshart et al., Cell, 41: 521-530(1985)］；ラウス肉腫ウイルスプロモーター［Davis et al., Hum. Gene Ther., 4: 151(1993)］；シミアンウイルス40プロモーター、レトロウイルスのロングターミナルリピート(LTR)、ケラチン14プロモーター、およびαミオシン重鎖プロモーターを含む。  加えて、神経特異的プロモーターを用いて、成長因子の発現を侵されたニューロンへ標的化することができ、例えば、ベータ３-チューブリン、ドーパミンデカルボキシラーゼ、またはニューロンにおけるVEGF-Ｃ(または-Ｄ)の発現のためのGABAシンテターゼプロモーターを含む。
【０２２２】
その他の実施態様において、非ウイルス送達を意図している。  これらは、リン酸カルシウム沈殿(Graham and Van Der Eb, Virology, 52:456-467(1973); Chen and Okayama, Mol. Cell Biol., 7:2745-2752,(1987); Rippe, et al., Mol. Cell Biol., 10: 689-695(1990))、DEAE-デキストラン(Gopal, Mol. Cell Piol, 5: 1188-1190(1985))、エレクトロポレーション(Tur-Kaspa, et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718,(1986);Potter, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81: 7161-7165;(1984))、直接的マイクロインジェクション(Harland and Weintraub, J. Cell Biol., 101: 1094-１099(1985))、DNA-負荷リポソーム(Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721: 185-190(1982);Fraley, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 3348-3352(1979);Felgner, Sci. Am., 276(6):102-6(1997);Felgner, Hum. Gene Ther., 7(15):1791-3,(1996))、細胞音波処理(Fechheimer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 8463-8467(1987))、高速マイクロプロジェクタイルを用いる遺伝子衝撃(Yang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 9568-9572(1990))、および受容体媒介トランスフェクション(Wu and Wu, J. Biol. Chem., 262: 4429-4432(1987);Wu and Wu, Biochemistry, 27: 887-892(1988);Wu and Wu, Adv. Drug Delivery Rev., 12: 159-１67(1993))を含む。
【０２２３】
本願発明のある特定の実施態様において、発現構築体(または、実際に前述したペプチド)をリポソーム中に取り込ますことができる。  リポソームは、リン脂質二層膜および内部水性媒体を特徴とする小胞構造である。  多層リポソームは、水性媒体によって隔てられた複数脂質層を有する。  リン脂質を過剰の水性溶液に懸濁させると、それらは自然に形成される。  脂質成分は閉鎖構造の形成前に自己再編成を受けて、水をおよび脂質二層の間に溶解した溶質を取り込む(Ghosh and Bachhawat, 「In Liver Diseases, Targeted Diagnosis And Therapy Using Specific Receptors And Ligands」 Wu, G., Wu, C.編,New York: Marcel Dekker, pp. 87-104(1991))。  DNAのカチオン性リポソームへの添加は、リポソームから光学的複屈折液体-結晶性縮合小滴へのトポロジー的転移を引き起こす(Radler, et al., Science, 275(5301): 810-4,(1997))。  これらのDNA-脂質複合体は、遺伝子治療および送達で用いるための優れた非ウイルスベクターである。
【０２２４】
また、本願発明では、「リポフェクション」技術を含めた種々の商業的手法の利用も意図している。  本願発明のある実施態様においては、リポソームは、赤血球凝集性ウイルス(HVJ)と複合体化させることができる。  これは、細胞膜との融合を促進し、リポソーム-カプセル化DNAの細胞捕獲を促す(Kaneda, et al., Science, 243:375-378 (1989))。      
【０２２５】
他の実施態様において、リポソームは、核非ヒストン染色体タンパク質(HMG-１)と複合化でき、または、それと組み合わせて使用する(Kato, et al., J. Biol. Chem., 266: 3361-3364(1991))。  さらに他の実施態様において、リポソームを、HVJおよびHMG-１双方と複合化することができ、また、それらと組み合わせて使用することもできる。このような発現構築体は、in vitroおよびin vivoで核酸の導入および発現を首尾よく行う際に使用するために、本願発明において適用可能である。
【０２２６】
治療遺伝子をコードする核酸を細胞に送達するために使用できる他のベクター送達系は、受容体媒介送達手段を含む。  これらは、ほとんどすべての真核生物細胞における受容体媒介エンドサイトーシスによるマクロ分子の選択的摂取を利用する。  種々の受容体の細胞型特異的分布のために、送達は高度に選択的である(Wu and Wu(1993)，前掲)。
【０２２７】
受容体媒介遺伝子標的化手段は、一般的には、二つの成分：細胞受容体-特異的リガンドおよびDNA-結合剤よりなる。  いくつかのリガンドが、受容体-媒介遺伝子導入で用いられてきた。  最も広範に特徴付けられているリガンドは、アシアロオロソムコイド(ASOR)(Wu and Wu(1987), 前掲)およびトランスフェリン(Wagner, et al., Proc. Nat'l. Acad Sci. USA, 87(9): 3410-3414 (1990))である。  最近、ASORと同一受容体を認識する合成ネオ糖が遺伝子送達手段として用いられており(Ferkol, et al., FASEB J., 7: 1081-1091(1993); Perales, et al., Proc. Latl. Acad. Sci., USA 91: 4086-4090 (1994))、表皮成長因子(EGF)もまた扁平癌腫細胞に遺伝子を送達するために用いられてきた(Myers, EPO 0273085)。
【０２２８】
その他の実施態様において、送達手段は、リガンドおよびリポソームを含むことができる。  例えば、Nicolau, et al., Methods Enzymol., 149: 157-176(1987)は、リポソームに一体化されたラクトシル-セラミド、ガラクトース末端アシアロガングリオシドを使用し、肝細胞によるインスリン遺伝子の摂取の増加を観察した。 従って、治療遺伝子をコードする核酸は、リポソームの有無、そして受容体-リガンド系の数によって特定の細胞型に特異的に送達することもできる。
【０２２９】
本願発明のさらに他の実施態様によれば、発現構築体は、裸の組換えDNAまたはプラスミドによって構造を単純化することができる。  構築体の導入は、物理的または化学的に細胞膜に浸透する前記した方法のいずれかによって行うことができる。  これは、特にin vitroでの導入において利用可能であるが、それは同様に、in vivoでの使用でも適用できる。  Dubensky, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81: 7529-7533(1984)は、CaPO4沈殿の形態のポリオーマウイルスDNAを、成体および新生マウスの肝臓および脾臓に首尾よく注射し、活性なウイルス複製および急性感染を示した。  また、Benvenisty and Neshif, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83: 9551-9555(1986)は、CaPO4沈殿プラスミドの直接的腹腔内注射の結果、トランスフェクトされた遺伝子が発現されることを示した。
【０２３０】
裸のDNA発現構築体を細胞に導入するための本願発明の他の実施態様は、粒子衝撃を含むことができる。  この方法は、DNA被覆マイクロプロジェクタイルを高速まで加速し、それらを細胞膜に突き刺し、細胞を殺すことなく細胞に進入する能力に依存する(Klein, et al., Nature, 327: 70-73(1987))。  小粒子を加速するためのいくつかの機器が、開発されている。  そのような機器の一つは、電流を発生するための高電圧放電に依拠し、このものは、次に動力を提供する(Yang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87:8568-9572(1990))。  ここで用いたマイクロプロジェクタイルは、タングステンまたは金ビーズのような生物学的に不活性な物質より構成されていた。
【０２３１】
当業者であれば、in vivoおよびex vivo状況に応じて、遺伝子送達をどのようにして実施するかを理解している。  ウイルスベクターでは、一般的には、ウイルスベクターストックが調製される。  ウイルスのタイプおよび達成可能成力化に応じて、１×104、１×105、１×106、１×107、１×108、１×109、１×1010、１×1011または１×1012感染粒子が患者に送達される。  相対的摂取効率を比較することによって、同様な数字をリポソームまたは他の非ウイルス処方のために外挿することができる。  薬学的に許容される組成物としての処方を、以下に説明する。
【０２３２】
種々の細胞型において、種々の経路を意図している。  実際に用いる細胞、組織または器官については、全身投与を意図している。  その他の実施態様においては、種々の直接的、局所的および領域的方法を利用することができる。  例えば、細胞、組織または器官に、発現ベクターまたはタンパク質を直接的に注射することができる。
【０２３３】
その他の実施態様において、ex vivo遺伝子治療の利用を意図している。  Ex vivoの実施態様では、患者から細胞を取り出し、少なくとも所定期間にわたって、それを体外で維持する。  この期間経過後、治療を施した後に、細胞を患者に再導入する。
【０２３４】
アンチセンスポリヌクレオチドは、注目するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを認識し、それにハイブリダイズするので、タンパク質の転写または翻訳を阻害できるポリヌクレオチドであるといえる。  全長および断片アンチセンスポリヌクレオチドを使用することができる。  アンチセンスヌクレオチドを設計し、最適化するための方法はLima et al.,(J Biol Chem; 272: 626-38 (1997))およびKurreck et al.,(Nucleic Acids Res.; 30: 1911-8 (2002))に記載されている。  加えて、アンチセンス配列の選択を最適化し、選択された配列を既知のゲノム配列と比較して、選択された遺伝子についての特異性／選択性の確定を補助するために市販のソフトウェアが利用できる。  そのような特異性は、ハイブリダイゼーション分析によってさらに確認することができる。  アンチセンス核酸は、(例えば、ウイルスベクターまたはリポソームのようなコロイド分散系によって)細胞に導入される。  VEGF-Ｃアンチセンス核酸分子は、約10乃至500、好ましくは約10乃至50のいずれかの整数の、標的配列からのヌクレオチドに相補的な配列を含むものが意図されている。  VEGFR-Ｃアンチセンス分子は、長さが少なくとも約10、25、50、100、250または500ヌクレオチドであるか、または全VEGF-Ｃコード鎖に対して相補的な相補的配列を含む。  アンチセンス核酸は、細胞中の標的ヌクレオチド配列に結合し、標的配列の転写または翻訳を妨げる。  本願発明では、ホスホロチオエートおよびメチルホスホネートアンチセンスオリゴヌクレオチドの治療的使用を、具体的に意図している。  アンチセンスオリゴヌクレオチドは、さらに、ポリ-Ｌ-リシン、トランスフェリンポリリシン、またはコレステロール部位によって、その５'末端を修飾することができる。
【０２３５】
ある実施態様によれば、本願発明のRNAは、二本鎖(dsRNA)(Fire et al., Nature 391: 806-811 (1998))または短-干渉RNA(siRNA)配列(Yu et al., Proc Natl Acad Sci USA.99: 6047-52 (2002))を用いるRNA干渉(RNAi)の誘導ために用いることができる。  「RNAi」は、dsRNAが相補的mRNAの相同性-依存性分解を誘導するプロセスである。 ある実施態様によれば、本願発明の核酸分子は、二本鎖RNAを形成するための本願発明の「センス」リボ核酸との相補的塩基対によってハイブリダイズされる。 少なくとも約20、25、50、100、250または500ヌクレオチドまたは全VEGF-Ｃコード鎖、またはその部分のみに対応するdsRNAアンチセンスおよびセンス核酸分子が提供される。  その他の実施態様において、siRNAは、長さが30ヌクレオチド以下、より好ましくは、21乃至23核酸であり、さらに長いdsRNAからリボヌクレアーゼIII切断によって生じた特徴的な２乃至３ヌクレオチド３'-突出末端を有する。  例えば、Tusch1 T.(Nat Biotechnol. 20: 446-48 (2002))を参照されたい。
【０２３６】
小さなRNA分子の細胞内転写は、siRNA鋳型を、通常は、小さな核RNA(snRNA)U6またはヒトRNAse P RNA H1をコードするRNAポリメラーゼIII(Pol III)転写単位にクローニングすることによって実現される。  二つの方法を用いてsiRNAを発現することができる。  すなわち、一方の実施態様によれば、二本鎖siRNAを構成するセンスおよびアンチセンス鎖が個々のプロモーターによって転写され(Lee, et al. Nat. Biotechnol. 20, 500-505 (2002))；ある実施態様においては、siRNAは、細胞内プロセッシングの後にsiRNAを生成するステム-ループヘアピンRNA構造として発現される(本明細書の一部を構成するものとして、そのすべての内容を援用する)(Brummelkamp et al. Science 296: 550-553 (2002))。
【０２３７】
dsRNA/siRNAは、通常は、生物に送達される前にin vitroでセンスおよびアンチセンスRNA鎖をアニールされてから、投与される。  その他の実施態様において、RNAiは、投与に先立ってアニーリングすることなく、本願発明のセンスおよびアンチセンス核酸を同一溶液内に投与することができ、非常に近接した時間設定で、核酸を別々の手段に投与することさえできる。  加えて、VEGF-Ｃの断片、相同体、誘導体および類似体をコードする核酸分子、またはVEGF-Ｃ核酸配列に相補的なアンチセンス核酸が提供される。
【０２３８】
また、天然細胞および動物が保有する関心がある遺伝子の発現を調節するための新規な転写因子を設計して、遺伝子制御を行うこともできる。  例えば、それらの亜鉛フィンガードメインを介してDNAに結合するCys2-His2亜鉛フィンガータンパク質は、異なる標的配列の認識に至る構造的変化が可能であるとされている。  これらの人工亜鉛フィンガータンパク質は、高い親和性および低い解離定数でもって特異的標的部位を認識し、遺伝子スイッチとして作用して、遺伝子発現を調節することができる。  本願発明の特定の標的配列の知識は、構造に基づくモデリングおよびファージディスプレイライブラリーのスクリーニングの組合せのような公知の方法を用いて、標的配列に特異的な亜鉛フィンガータンパク質を調製することを容易ならしめる［Segel et al., Proc Natl Acad Sci USA 96: 2758-2763 (1999); Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA 94: 5525-30 (1997); Greisman and Pabo Science 275: 657-61 (1997); Choo et al., J Mol Biol 273: 525-32 (1997)］。  各亜鉛フィンガードメインは、通常、三つ以上の塩基対を認識する。  18塩基対の認識配列は、一般的には、いずれかの既知のゲノム内でそれを認識するのに十分な長さであり、亜鉛フィンガーの六つのタンデムリピートよりなる亜鉛フィンガータンパク質は、特定の配列に対する特異性を確実なものとすると考えられる［Segal et al., 前掲］。  標的配列に基づいて設計された人工亜鉛フィンガーリピートは、活性化または抑制ドメインと融合して、遺伝子発現を促進または抑制する［Liu et al., 前掲］。  別法として、亜鉛フィンガードメインを、亜鉛フィンガーペプチドおよびTBPの間のリンカー領域の種々の長さにて、TATAボックス-結合因子(TBP)に融合させて、転写アクチベータまたはリプレッサーのいずれかを調製することができる［Kim et al., Proc Natl Acad Sci USA 94: 3616-3620 (1997)］。  そのようなタンパク質、およびそれらをコードするポリヌクレオチドは、天然細胞および動物の双方、それにヒトにおけるin vivoでの発現を調節するために利用することができる。  新規な転写因子は、転写因子を発現する構築体をトランスフェクトすることによって(遺伝子治療)、またはタンパク質を導入することによって標的細胞に送達することができる。  調製された亜鉛フィンガータンパク質は、アンチセンスまたは接触RNA方法に対する代替法のための治療剤に用いるために、RNA配列に結合するように設計することもできる［McColl et al., Proc Natl Acad Sci USA 96: 9521-6 (1999); Wu et al., Proc Natl Acad Sci USA 92: 344-348 (1995)］。
【０２３９】
Ｅ．抗  体
抗体は、相対的特異性を有する抗体を容易に作り出すために、また、ヒト療法に対する抗体を採用する技術の継続的な改良のために、そして、ニューロピリン-VEGF-Ｃ相互作用およびVEGF-Ｃ分裂促進物質活性を調節する上で有用である。  従って、本願発明では、本願発明に対して関心のあるポリペプチド、特に、ニューロピリン、VEGF受容体、およびVEGF-ＣおよびVEGF-Ｄタンパク質に対して特異的な抗体(例えば、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、二機能性／二特異的抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および相補的決定領域(CDR)-移植抗体；本願発明のポリペプチドを特異的に認識するCDR配列を含む化合物を含む)の使用を意図している。  好ましい抗体は、本明細書の一部を構成するものとして、そのすべての内容を援用する1993年６月20日に公開されたWO 93/11236に記載の方法に従って生産および同定されたヒト抗体である。  Fab、Fab’、F(ab')2およびFvを含めた抗体断片も本願発明によって提供される。  用語「に対して特異的な」は、本願発明の抗体に関する場合、本願発明の抗体の可変領域に専ら関するポリペプチドを認識し、それに結合することを示す(すなわち、局所化された配列同一性、相同性、またはファミリーメンバー相互間の類似性があるにもかかわらず、結合親和性における測定可能な差異に基づいて、関心のあるポリペプチドを同一ファミリーの他の既知のポリペプチドから区別することができる)。  特異抗体は、抗体の可変領域の外側、特に、当該分子の定常領域における配列との相互作用を介して他のタンパク質(例えば、ELISA技術におけるS. aureusタンパク質Ａまたはその他の抗体)と相互作用することができることは理解できよう。  本願発明の抗体の結合特異性を決定するためのスクリーニングアッセイはよく知られており、当該技術分野において日常的に実施されている。  そのようなアッセイの包括的な理論については、Harlow et al. (編), Antibodies A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY(1988)、Chapter 6を参照されたい。  本願発明の抗体は、当該技術分野でよく知られ、かつ日常的に実施されている公知の方法を用いて生産することができる。
【０２４０】
二特異的抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナルの抗体、好ましくは、ヒトまたはヒト化抗体である。  本願発明の場合、結合特異性の一つはNRP-２に対するものであり、他のものは、NRP-２結合パートナーに対するもの、好ましくは、VEGFR-３のような、細胞表面タンパク質または受容体もしくは受容体サブユニットに対するものである。
【０２４１】
ある実施態様によれば、NRP-２およびVEGFR-３の双方に結合する二特異的抗体を用いて、VEGF-ＣとVEGFR-３との相互作用に由来する細胞の成長、移動または増殖を調節する。      
【０２４２】
例えば、二特異的抗体は、VEGF-ＣおよびVEGFR-３の双方、およびNRP-２を発現するリンパ転移性またはその他のタイプの腫瘍を特徴とする腫瘍を有する個体に投与される。  NRP-２およびVEGFR-３の双方に結合する二特異的抗体は、VEGF-ＣのVEGFR-３への結合をブロックし、それにより、VEGF-Ｃ媒介リンパ管形成と干渉し、腫瘍転移の進行を示す。      
【０２４３】
さらに他の実施態様によれば、NRP-２およびVEGF-Ｃに結合する二特異的抗体で同一手法を用いて、すなわち、その抗体を投与することで、可溶性VEGF-Ｃを分離し、VEGFR-３への結合を妨げ、VEGFR-３を介するVEGF-Ｃ媒介信号伝達の阻害剤として有効に作用する。
【０２４４】
二特異的抗体は、文献に記載の標準手法を用いて生産され、単離され、試験に供されることとなる。  例えば、本明細書の一部を構成するものとして、そのすべての内容を援用する、Pluckthun & Pack, Immunotechnology, 3: 83-105 (1997); Carter et al., J. Hematotherapy, 4: 463-470 (1995); Renner & Pfreundschuh, Immunological Reviews, 1995, No. 145, pp. 179-209; Pfreundschuhの米国特許第5,643,759号；Segal et al., J. Hematotherapy, 4: 377-382(1995); Segal et al., Immunobiology, 185: 390-402 (1992); および、Bolhuis et al., Cancer Immunol. Immunother., 34: 1-8 (1991)を参照されたい。
【０２４５】
用語「二特異的抗体」とは、二つの異なる抗原結合部位(可変領域)を有する単一の二価抗体をいう。  後述するように、この二特異的結合剤は、一般的には、抗体、抗体断片、または抗体可変領域に由来する少なくとも一つの相補性決定領域を含む抗体の類似体から調製される。  これら抗体は、種々の方法で製造することができる慣用的な二特異的抗体であってよく(Holliger, P. and Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4: 446-449 (1993))、例えば、そのような二特異的抗体のコード配列のベクターへの連結、および組換えペプチドの生産を介して、またはファージディスプレイによって、ハイブリドーマを用いて化学的に調製することができる。  この二特異的抗体は、いずれの二特異的抗体断片であってもよい。
【０２４６】
ある方法によれば、二特異的抗体断片は、タンパク質分解によって全抗体を(一特異的)F(ab’)2分子へ変換し、これらの断片をFab'分子に分裂させ、Fab'分子を二特異的F(ab')2分子に対する異なる特異性のFab'分子で組み換えることによって構築される(例えば、米国特許第5,798,229号を参照されたい)。
【０２４７】
二特異的抗体は、各々が二つの同一のＬ(軽鎖)-Ｈ(重鎖)の半分子よりなり、一つ以上のジスルフィド結合によって連結された二つの異なるモノクローナル抗体を、二つのF(ab')2分子に酵素変換し、還元条件下で各F(ab')2分子をFab'チオールに分裂させ、各抗体でのこれらFab'分子の一つをチオール活性剤で誘導体化し、NRP-２特異性を担う活性化されたFab'分子を、NRP-２結合パートナー特性を担う非活性化Fab'分子と合わせるか、あるいはその逆法を行って、所望の二特異的抗体F(ab')2断片を得ることで調製できる。
【０２４８】
抗体を、そのF(ab')2分子に変換する上で適当な酵素として、ペプシンおよびパパインを用いることができる。  事例によっては、トリプシンまたはブロメリンが適当である。ジスルフィド結合の遊離SH-基(Fab'分子)への変換は、ジチオスレイトール(DTT)、メルカプトエタノール、およびメルカプトエタノールアミンのような還元性化合物によって行うことができる。  チオール半分子の組換えを妨げる本願発明によるチオール活性化剤は、5,5'-ジチオビス(２-ニトロ安息香酸)(DTNB)、2,2'-ジピリジンジスルフィド、4,4'-ジピリジンジスルフィドまたはテトラチオネート／亜硫酸ナトリウムである(また、Raso et al., Cancer Res., 42: 457 (1982)、およびそこに掲載された文献を参照されたい)。
【０２４９】
チオール-活性化剤での処理は、一般的には、二つのFab'断片の一方のみで行う。  主として、二つのFab'分子の一方を活性化されたFab'断片(例えば、Fab'-TNB)に変換する場合と大差はない。  しかしながら、一般的には、より不安定なFab'断片は、チオール-活性化剤で修飾される。  本願発明の場合、抗腫瘍特異性を担う断片はわずかに不安定であり、従って、好ましくは、このプロセスで用いる。  活性化されたFab'誘導体と、第二のFab'分子の遊離ヒンジ-SH基との、二価F(ab')2抗体を調製するためのコンジュゲーションは、０℃および30℃の間の温度で自然に起こる。  精製されたF(ab')2の収率は(全抗体)から出発して、20乃至40％である。
【０２５０】
二特異的抗体を生産する他の方法は、ハイブリッドハイブリドーマを形成するための二つのハイブリドーマの融合による。  本願明細書で用いる用語「ハイブリッドハイブリドーマ」は、二つのＢ細胞ハイブリドーマの生産的融合について言及する場合に用いる。  今日の標準的な技術を用いて、二つの抗体生産ハイブリドーマを融合させて、娘細胞が得られ、クロノタイプ免疫グロブリン遺伝子の双方の組の発現を維持した細胞を選択する。
【０２５１】
二特異的抗体を同定するために、ELISAのような標準的な方法が用いられ、そこでは、マイクロタイタープレートのウェルを、親ハイブリドーマ抗体の一つと特異的に相互作用し、双方の抗体との交差反応性を欠く試薬で被覆する。  加えて、FACS、免疫蛍光染色、イディオタイプ特異的抗体、抗原結合競合アッセイ、および抗体決定のための当該技術分野で周知のその他の方法を本願発明と組み合わせて用いて、好ましいハイブリドーマを同定することができる。
【０２５２】
本願発明の二特異的分子は、VEGF-ＣまたはVEGFR-３のようなNRP-２の結合パートナーを認識する抗体鎖の少なくとも結合領域をコードする遺伝子に、NRP-２に対する結合特異性をコードする遺伝子をコンジュゲートすることによって調製することもできる。  この構築体を、対応する重鎖または軽鎖を構成的に発現する(骨髄腫のような)宿主細胞にトランスフェクトして、それにより、二特異的一本鎖抗体、NRP-２に対する、およびNRP-２結合パートナーに対する結合特性を有する二鎖抗体(またはFabのようなその単一鎖または二本鎖断片)の再構成を可能とする。  そのような遺伝子構築体の構築およびクローニングは、標準的な手法によって行うことができる。
【０２５３】
また、二特異的抗体は、WO 92/01047に開示された所謂ヒエラルヒーデュアルコンビナトーリアル手法を用いるファージディスプレイスクリーニング方法によって調製することができ、そこでは、Ｈ鎖またはＬ鎖クローンのいずれかを含む個々のコロニーを用いて、他の鎖(ＬまたはＨ)をコードするクローンの完全なライブラリーを感染させ、得られた二本鎖特異的結合メンバーが、同文献に記載されたようなファージディスプレイ技術に従って選択される。  この技術は、Marks et al.にも開示されている(Bio/Technology, 1992, 10: 779-783)。
【０２５４】
本願発明の二特異的抗体断片は、療法のためにヒト患者に投与することができる。  従って、ある実施態様によれば、一つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を取り入れた、少なくとも一つの前記した二特異的抗体断片を有効成分として含む医薬処方に二特異的抗体が供される。  さらに他の実施態様によれば、この化合物は、さらに、二特異的抗体にコンジュゲートされた抗新生物または細胞傷害性剤を含む。
【０２５５】
組換え抗体断片、例えば、scFvsは、異なる標的抗原に対する高度の結合活性および特異的に安定なマルチマーオリゴマーに組み立てるよう設計することもできる。  そのようなダイアボディ(ダイマー)、トリアボディ(トリマー)またはテトラボディ(テトラマー)は、当該技術分野で周知であり、文献にも記載されている。  例えば、Kortt et al., Biomol Eng. (2001 Oct 15); 18(3): 95-108およびTodorovska et al., J Immunol Methods. (2001 Feb 1); 248(1-2): 47-66を参照されたい。
【０２５６】
モノクローナル抗体の生産に加えて、「キメラ抗体」の生産のために開発された技術、すなわち、適当な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのスプライシングを用いることができる(Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81: 6851-6855 (1984); Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314: 452-454 (1985))。  非ヒト抗体は、当該技術分野で周知のいずれかの方法によってヒト化することができる。  好ましい「ヒト化抗体」は、ヒト定常領域を有し、その一方で、抗体の可変領域または少なくともCDRは非ヒト種に由来する。  非ヒト抗体を、ヒト化するための方法は、当該技術分野で周知である(米国特許第5,585,089号および第5,693,762号を参照されたい)。  一般的には、ヒト化抗体は、非ヒトの供給源から、そのフレームワーク領域へ導入された一つ以上のアミノ酸残基を有する。  ヒト化は、例えば、ヒト抗体の対応する領域に代えて齧歯類相補性決定領域(CDR)の少なくとも一部を置き換えることによって、Jones et al．［Nature 321: 522-525 (1986)］、Riechmann et al., ［Nature, 332: 323-327 (1988)］およびVerhoeyen et al．［Science 239: 1534-1536 (1988)］に記載された方法を用いて行うことができる。  抗体を調製するための多数の技術が、例えば、Owens and Young, J. Immunol. Meth., 168: 149-165 (1994)に記載されている。  また、さらなる変化を抗体フレームワークに導入して、親和性または免疫原性を調節することができる。
【０２５７】
Ｆ．医薬組成物の処方
VEGF-Ｃ産物は、好ましくは、一つ以上の薬学的に許容される担体と共に組成物として投与される。  本願発明で用いる医薬担体は、特に、塩基性または酸性基が化合物中に存在する場合、薬学的に許容される塩を含む。  例えば、-COOHのような酸性置換基が存在する場合、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムなどの塩を、生物学的宿主への投与のための好ましい実施態様として意図する。  (アミノまたはピリジルのような塩基性ヘテロアリール基のような)塩基性基が存在すれば、塩酸塩、臭化水素酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ-トルエンスルホン酸塩などのような酸性塩を、生物学的宿主への投与のために好ましい形態として意図する。
【０２５８】
同様に、酸性基が存在する場合、化合物の薬学的に許容されるエステル(例えば、メチル、tert-ブチル、ピバロイルオキシメチル、スクシニルなど)が、化合物にとって好ましい形態として考えられ、そのようなエステルは、徐放性またはプロドラッグ処方に用いられる溶解度および／または加水分解性を修飾するためのものとして当該技術分野で周知である。
【０２５９】
加えて、いくつかの化合物は、水または通常の有機溶媒と共に溶媒和物を形成することができる。  そのような溶媒和物も、同様に意図している。
【０２６０】
医薬VEGF-Ｃ産物組成物は、本願発明の物質および方法を実施する際に直接的に用いることができるが、好ましい実施態様においては、化合物は、薬学的に許容される希釈剤、アジュバント、賦形剤または担体と共に処方される。  「薬学的にまたは薬理学上許容される」の表現は、動物またはヒトに、例えば、経口、局所、経皮、非経口、吸入スプレー、膣、直腸、または頭蓋内注射により投与した場合に、有害、アレルギー性または他の不適当な反応を生じない分子および組成物を指す。  (本願明細書で用いる非経口の用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、槽内注射、または注入技術を含む。  静脈内、経皮、筋肉内、乳房内、腹腔内、クモ膜下腔、眼球後、肺内注射および特定の部位における外科的移植による投与も同様に意図している)。  一般的には、これらは、実質的にパイロジェンを含まない組成物の調製、ならびにヒトまたは動物に有害であり得る他の不純物も含む。      
【０２６１】
用語「薬学的に許容される担体」は、いずれかおよびすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含む。  薬学的に活性な物質に関するかような媒体および製剤の使用は、当該技術分野で周知である。
【０２６２】
上述したVEGF-Ｃ産物を含有する医薬組成物は、例えば、錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性もしくは油性懸濁液、分散性粉末または顆粒、エマルジョン、硬質または軟質カプセル、またはシロップもしくはエリキシルとして経口投与に適した形態にすることが可能である。  経口投与を意図した組成物は、いずれかの公知の方法に従って調製することができ、そのような組成物は、甘味剤、香料、着色剤および保存剤からなるグループから選択される一つ以上の添加剤を含有することで、薬学的に洗練され、嗜好性に富んだ製剤に仕上げることができる。  錠剤は、錠剤の製造に適した非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合して有効成分を含有することができる。  これらの賦形剤として、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムのような不活性な希釈剤；顆粒剤および崩壊剤、例えば、コーンスターチ、アルギン酸；結合剤、例えば、スターチ、ゼラチンまたはアカシア；および、滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクなどがある。  錠剤は、被覆しなくてもよく、あるいは錠剤は公知の技術によって被覆して、胃腸管内での崩壊および吸収を遅延させることができ、それにより、長時間にわたって維持的に作用を奏することができる。  例えば、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートのような時間遅延物質を使用することができる。  それらは、米国特許第4,256,108号；第4,166,452号；および第4,265,874号に記載された技術によって被覆して、制御放出のための浸透圧治療錠剤を形成することもできる。
【０２６３】
経口投与のための処方は、有効成分が不活性な個体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合される硬質ゼラチンカプセル、または有効成分が水または油媒体、例えば、落花生油、流動パラフィン、またはオリーブ油と混合される軟質ゼラチンカプセルとして供することもできる。
【０２６４】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合した活性化合物を含有することができる。  そのような賦形剤として、懸濁化剤、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアカシアガムがあり；分散剤または湿潤剤としては、天然に生じるホスファチド、例えば、レシチン、またはアルキレンオキサイドと脂肪酸との縮合産物、例えば、ポリオキシエチレンステアレート、またはエチレンオキサイドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合産物、例えば、ヘプタデカエチル-エンオキシセタノール、またはポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートのようなエチレンオキサイドと脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合産物、またはエチレンオキサイドと脂肪酸およびヘキシトールアンヒドライドに由来する部分エステルとの縮合産物、例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレエートなどがある。  水性懸濁液は、一つ以上の保存剤、例えば、エチル、またはｎ-プロピル、ｐ-ヒドロキシベンゾエート、一つ以上の着色剤、一つ以上の香料、およびスクロースまたはサッカリンのような一つ以上の甘味剤を含有することもできる。
【０２６５】
油性懸濁液は、有効成分を、植物油、例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油、またはヤシ油、または流動パラフィンのような鉱油に懸濁させることによって処方することができる。  この油性懸濁液は、増粘剤、例えば、ミツロウ、硬質パラフィンまたはセチルアルコールを含有することができる。  前述した甘味剤および香料を加えて、口当たりの良好な経口製剤を提供することができる。  これらの組成物は、アスコルビン酸のような抗酸化剤を添加して保存することができる。
【０２６６】
水を添加して得た水性懸濁液の調製に適した分散性粉末および顆粒は、分散剤もしくは湿潤剤、懸濁化剤および一つ以上の保存剤と混合された活性化合物を提供する。  適当な分散剤もしくは湿潤剤および懸濁化剤の例は、すでに上述した通りである。  さらなる賦形剤、例えば、甘味料、香料および着色剤を利用することもできる。
【０２６７】
本願発明の医薬組成物は、水中油型エマルジョンの形態とすることもできる。  油相には、植物油、例えば、オリーブ油または落花生油、または鉱油、例えば、流動パラフィンまたはこれらの混合物を利用してもよい。  適当な乳化剤として、天然に生じるガム類、例えば、アカシアガム、またはトラガカントガム、天然に生じるホスファチド、例えば、大豆、レシチン、および脂肪酸およびヘキシトールアンヒドライドに由来するエステルまたは部分エステル、例えば、ソルビタンモノオレエート、および部分エステルとエチレンオキサイドとの縮合産物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどがある。  エマルジョンは、甘味料および香料を含有することもできる。
【０２６８】
シロップおよびエリキシルは、甘味剤、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールまたはスクロースで処方することができる。  そのような処方に、粘滑剤、保存剤および香料および着色剤を組み込むことができる。  医薬組成物は、滅菌注射水性または油性懸濁液の形態とすることができる。  この懸濁液は、前記した適当な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて、周知の技術に従って処方することができる。  滅菌注射製剤は、例えば、１,３-ブタンジオールを用いた溶液のような、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒を用いた滅菌注射溶液または懸濁液とすることもできる。      
【０２６９】
使用できる許容された手段および溶媒として、水、リンゲル液および等張塩化ナトリウム溶液がある。  加えて、滅菌不揮発性油は、慣用的には、溶媒または懸濁化媒体として使用される。  この目的に鑑みれば、快い不揮発性油は、いずれのものでも使用することができ、これらには、合成のモノ-またはジグリセリドを含む。  加えて、オレイン酸のような脂肪酸は、注射剤の調製において用いられる。
【０２７０】
また、組成物は、PTPase調節化合物を直腸投与するために坐薬の形態とすることもできる。  これらの組成物は、薬物を、常温では固体であるが、直腸温度では液体であって、従って、直腸内で融解して薬物を放出する適当な非刺激性賦形剤と混合することによって調製することができる。  そのような物質として、例えば、カカオバターおよびポリエチレングリコールがある。
【０２７１】
注射用途に適した医薬形態は滅菌水性溶液もしくは分散液、および滅菌注射溶液もしくは分散液の即席調製のための滅菌粉末を含む。  いずれの場合においても、この形態では、滅菌されていなければならず、かつ容易なシリンジ性を付与する程度に流動的でなければならない。  このことは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染作用から保護されなければならない。  担体として、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体プロピレングリコールなど)、それらの好適な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒体などがある。  適当な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、また、分散液の場合における必要な大きさの粒子を維持することで、また、界面活性剤の使用によって維持することができる。  微生物の作用からの防御は、種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロザルなどによって行うことができる。  大抵の場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めるのが好ましい。  注射組成物の吸収の遅延化は、吸収を遅延する薬剤、例えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチンの組成物を使用することで、実施可能である。
【０２７２】
Ｇ．投与および用量
本願発明のある方法では、ヒトまたは動物へポリペプチドを投与する工程を含む。  ポリペプチドは、適当な薬学的に許容される手段、例えば、薬学的に許容される希釈剤、アジュバント、賦形剤または担体を用いて、適当な方法で投与することができる。  本願発明の方法に従って投与すべき組成物は、好ましくは、(ポリヌクレオチドまたはベクターに加えて)水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、グルコース、または治療剤または造影剤を送達するために慣用的に用いられるその他の担体を含む。
【０２７３】
本願発明に従って行われる「投与」として、注射(例えば、静脈内、筋肉内、皮下、頭蓋内またはカテーテル)；経口摂取；鼻腔内または局所投与などを含めた哺乳動物への直接的または間接的に治療剤を導入するためのいずれかの医学的に許容される手段があるが、これらに限定されない。  神経病を患った動物の場合、特定の哺乳動物で行われている種々の末梢神経を含む領域、または神経系の関与を示す哺乳動物では脊髄または脳に対して、注射によって細胞を投与することが意図されている(Craig et al., J Neurosci. (1996) 16: 2649-58; Frisen et al., CMLS Cell. Mol. Life Sci. 54: 935-45 (1998))。ある実施態様によれば、病巣部位への直接的注射によって、または処方を内部に送達することができる徐放送達または徐放メカニズムを介して治療を必要とする病巣または冒された組織の部位に対して、組成物は投与される。  例えば、組成物(例えば、可溶性ポリペプチド、抗体、または小分子)の徐法送達が可能な生分解性マイクロスフィアまたはカプセルあるいは他の生分解性ポリマーを、病巣近くに移植するための本願発明の処方に含めることができる。
【０２７４】
治療組成物は、患者の複数の部位に送達することができる。  複数投与は、同時に行うことができるし、あるいは数時間にわたって投与することができる。  場合によっては、治療組成物の連続供給を行うのが便利であろう。  さらなる療法は、時間単位、例えば、毎日、毎週または毎月投与することができる。
【０２７５】
投与用ポリペプチドは、摂取または吸収促進剤を用いて処方することで、それらの効率を改善させることができる。  そのような促進剤として、例えば、サリシレート、グリココレート／リノレエート、グリコレート、アプロチニン、バシトラシン、SDSカプレートなどがある。  例えば、Fix(J. Pharm. Sci., 85: 1282-1285 (1996))およびOliyai and Stella(Ann. Rev Pharmacol. Toxicol., 32: 521-544 (1993)などがある。
【０２７６】
本願発明では、本願明細書に記載された神経成長因子および／または神経治療剤のような第二の薬剤と組み合わせたVEGF-Ｃまたは-Ｄ産物のような複数の薬剤の投与を意図している。  これらの薬剤は、同一処方において同時に投与することも意図している。  さらに、薬剤を、別々の処方で、同時に投与するものとし、この場合の同時とは、相互に30分以内に投与する薬剤を指す。
【０２７７】
その他の態様において、第二の薬剤は、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物の投与に先立って投与される。  先立って投与するとは、VEGF-Ｃ/Ｄ産物の投与の30分前までに、VEGF-Ｃ/Ｄ産物での処理に先立って１週間の範囲内で第二の薬剤を投与することを指す。  さらに、第二の薬剤は、VEGF-Ｃ/Ｄ産物の投与に引き続いて投与することも意図している。  引き続いての投与とは、VEGF-Ｃ/Ｄ産物の投与から１週間後までのVEGF-Ｃ/Ｄ産物投与から30分後の投与までを意味している。
【０２７８】
処置時に用いられるポリペプチドの量は、投与対象の個体の大きさ、ならびに治療すべき障害の程度に従って変化する。  例えば、治療に際して、約50mg/日、75mg/日、100mg/日、150mg/日、200mg/日、250mg/日、500mg/日、または1000mg/日の用量で投与する必要がある。  これらの濃度は、単一用量形態として、または複数用量として投与することができる。  当初は、動物モデルにおける、および臨床テストにおける標準的な用量応答実験は、特定の疾患状態および患者の集団についての最適な用量を明らかにする。
【０２７９】
また、もし伝統的な療法が本願発明の治療剤と組み合わせて投与されるのであれば、用量の変更を考慮すべきであることは明らかであろう。  例えば、本願発明の方法と、伝統的な神経治療剤または神経成長因子とを併用した神経病理の治療を意図している。
【０２８０】
Ｈ．キット
さらに他の態様として、本願発明は、本願発明の方法の実施を容易ならしめる目的のキット、すなわち、包装を施した本願発明の一つ以上の化合物または組成物を含むキットを含む。  最も単純な実施態様において、このキットは、本願発明の方法を実施するための化合物または組成物の使用に関する記載を盛り込んだラベル、すなわち、容器に付着されたラベルまたはパッケージに含まれたラベルと共に、密閉ボトルまたは容器のような容器に収容された本願発明の方法を実施する上で有用な本願明細書に記載の化合物または組成物(例えば、個人への投与のための、またはスクリーニングアッセイで用いるためのポリヌクレオチドまたはポリペプチド)を含む。  好ましくは、これら化合物または組成物は、単位投与形態で包装される。  このキットは、さらに好ましい投与経路で組成物を投与するための機器、あるいはスクリーニングアッセイを実施する上で好適な機器を含む。
【０２８１】
本願発明のさらに他の態様および詳細を、以下の実施例に沿って明らかにしていくが、本実施例は、例示目的のものでしかなく、その開示に基づいて、本願発明を限定的に解釈すべきではない。
【実施例】
【０２８２】
実施例１：VEGF-Ｃイソ形態はニューロピリン-２およびニューロピリン-１に結合する。
【０２８３】
以下の実験は、VEGF-Ｃイソ形態が、ニューロピリンファミリーのメンバー、ニューロピリン-２およびニューロピリン-１と相互作用することを示した。
【０２８４】
Ａ．物  質
ニューロピリン-２のVEGF-Ｃへの結合を調べるために、以下の構築体を調製するか、または市販元から購入した：
(ａ) NRP-２/IgGを発現するベクターのクローニング。  hNRP-２の細胞外ドメインを、以下のようにして、ヒトIgG1 Fc末端を用いて、pIgplusベクターにインフレームでクローニングした。  全長NRP-２ cDNA(配列番号３)は、いくつかのIMAGE Consortium cDNA Clones(Incyte Genomics)から組み立てた(図１Ａ)。  用いたImageクローンを、２Ａ(GenBank受託番号AA621145; Clone ID 1046499)、３(AA931763; 1564852)、４(AA127691; 490311)、および５(AW2961861; 2768188)で表し、これらのクローンを、配列決定によって確認した。  代替スプライシングのため、Imageクローン４および５は、各々、ａ17およびａ22イソ形態をコードする。  異なるイメージクローン３からのBamHI-NotI断片を、まずpcDNA3.1z+ベクター(Invitrogen)にクローニングし、そして、クローン２Ａからの断片KpnI-BglII、およびクローン３からのBglII-BamHIを加えて、５'領域(塩基対１乃至2188)を得た。  クローン４および５からのNotI-BamHI断片を、別々にpIgplusベクターに導入し、そして、pcDNA3.1z+ベクターからのKpnI-NctI断片を挿入して、hNRP-２/IgG融合タンパク質の細胞外ドメインをコードする発現ベクターを得た(配列番号３、１乃至2577)。      
【０２８５】
得られたベクター内のNRP-２インサートを配列決定した。  Imageクローン３は、GenBank配列(AAA 1804-１806 GAG|K602E)とは異なる一つのアミノ酸をコードする。  しかしながら、Imageクローン３でのアミノ酸配列はChen et al．によって公表された元の配列と同一である(Chen et al., Neuron, 19: 547. 1997)。
【０２８６】
(ｂ)  最初の三つの免疫グロブリン様ドメイン(配列番号32、アミノ酸１乃至329)を含むVEGFR-３の細胞外ドメイン部分がヒトIgG1のFc部分に融合したVEGFR-３-Fc構築体［Makinen et al., Nat Med., 7: 199-205(2001)］。  全長VEGFR-３ cDNAおよびアミノ酸配列を、配列番号:31および32に記載する。
【０２８７】
(ｃ) ネズミNRP-１(配列番号:５の塩基対248-2914)の細胞外ドメイン部分が、ヒトIgG1のFc部分に融合したNRP-１-Fc構築体(Makinen et al., J. Biol. Chem 274: 21217-222 (1999);および
(ｄ) VEGF165(Genbank受託番号M32997)または全長VEGF-Ｃ(配列番号：24)のいずれかをコードするpREP7骨格における発現ベクターが、最近記載されている(Olofsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2576-81 (1996);および、Johkov et al., EMBO J. 15: 290-298 (1996))。
【０２８８】
Ｂ．VEGF-ＣとNRP-２との共免疫沈澱
FUGENETM6トランスフェクション試薬(Roche Molecular Biochemicals)を用いて、NRP-２、NRP-１、および、VEGFR-３ pIgplus融合構築体をトランスフェクトした。  細胞を、10％胎児ウシ血清(Gibco BRL)、グルタミンおよび抗生物質を補足したダルベッコ修飾イーグル培地中で増殖させた。  トランスフェクションから48時間後に、培地を0.2％BSAを含有するBMEMによって置き換え、20時間後に収集した。
【０２８９】
成長因子生産のために、293EBNA細胞をVEGF165、プレプロ-VEGF-Ｃまたは空のベクター(Mock)をコードする発現ベクターでトランスフェクトした。  トランスフェクションから36時間後に、細胞をまずメチオニンおよびシステインフリーのMEM(Gibco BRL)で45分間インキュベートし、放射性メチオニンおよびシステインを含有する100マイクロキュリー［mCi］/ml Pro-mix［35Ｓ］(Amersham)を補足した同一培地中、６乃至７時間(１mCi=37kBq)、代謝的に標識した。
【０２９０】
免疫沈澱対照では、１mlの標識された培地を、＋４℃にて、回転しつつ、MAB293モノクローナル抗-VEGF-抗体(R&D Systems)、またはVEGF-Ｃに対するウサギ抗血清882(Joukov et al., EMBO J. 16: 3898-3911 (1997))のいずれかと共に２時間インキュベートした。  そして、プロテインＡ-Sepharose(Pharmacia)を加えて、一晩インキュベートした。  免疫沈澱を、氷冷PBS-0.5％Tween20で２回洗浄し、Laemmli試料緩衝液中で加熱し、15％SDS PAGE中で電気泳動した。  ゲルを乾燥させ、Kodak Biomax MRフィルムに暴露した。
【０２９１】
結合実験では、モック-またはVEGF-Ｃトランスフェクト細胞から得た標識された上清を、まず、内因性VEGFの枯渇のためにVEGF抗体(Ｒ&Ｄ Systems)で免疫沈澱させた。  ４mlのhNRP-２ a17-IgGまたは１mlのVEGFR-３-IgGまたはNRP-１-IgG融合タンパク質を含有する培地を結合緩衝液(0.5％BSA、0.02％Tween20)に溶解した１mlの成長因子含有培地(モック)で、VEGFまたはVEGF-Ｃと共に２時間インキュベートし、そして、プロテインＡ-Sepharoseを加えて、一晩インキュベートした。  そして、試料を氷冷結合緩衝液で１回洗浄し、PBSで３回洗浄し、15％SDS PAGEに付した。  放射性標識VEGF-Ｃポリペプチドは、ケミルミネッセンス(ECL)を介して検出した。
【０２９２】
結果は、(ヘテロダイマーとしての)29kDイソ形態および21乃至23kD VEGF-Ｃイソ形態の双方がNRP-２に結合し、その一方で、29kD形態のみがNRP-１に結合することを示した。VEGF-ＣへのVEGFR-３結合を、アッセイでのVEGF-Ｃ結合に関する陽性対照として用いた。ヘパリンが、NRP-２へのVEGF結合を強力に増加させることは以前から示されている(Gluzman-Poltorak et al., J. Biol. Chem. 275: 18040-045 (2000))。  ヘパリンのアッセイ混合物への添加は、VEGF165のNRP-２への結合がヘパリン依存性であり、その一方で、NRP-１へのVEGF165結合はヘパリン結合とは独立していること示していることから、ヘパリンの存在は、その受容体のいずれかへのVEGF-Ｃ結合に影響を与えないと言える。
【０２９３】
Ｃ．天然でニューロピリン受容体を発現する細胞を用いる細胞ベースのアッセイ
上記した実験を、トランスフェクトされた293EBNA細胞に代えて、ニューロピリン受容体(特に、NRP-２)を天然で発現する細胞で置き換えて変更することができる。  具体的には、ニューロピリン受容体を発現する神経細胞、例えば、胚に由来する培養した小脳顆粒細胞の一次培養の使用が意図される。  加えて、NRP-受容体特異的抗体を使用して、ヒト微小血管内皮細胞(HMVEC)、NRP受容体を発現するヒト皮膚脂肪微小血管細胞(HUCEC)のような他の細胞(例えば、血管系に関与する細胞)を同定することができる。
【０２９４】
実施例２：ニューロピリン-２はVEGFR-３と相互作用する。
【０２９５】
最近の報告は、NRP-１が、VEGRF-１単独へのVEGF165結合よりも、VEGFR-２を介する増強されたVEGF165信号伝達をもたらすVEGFR-２との複合体を形成し、かつVEGF165結合に対する共受容体であり、それにより、このリガンドに対する生物学的応答を増強することを示している(Soker et al., Cell 92:735-45 (1998))。  同様な現象が、潜在的VEGFR-３/NRP-２受容体複合体を介するVEGF-Ｃ信号伝達に適用することができる。
【０２９６】
Ａ．結合アッセイ
３'末端に検出可能なタグを付加して、実施例１に記載の手順に従って、NRP-２(a22)の発現ベクターをクローニングした(図１Ｂ)。  NOT I-Bam HI断片(クローン５)をPCRによって構築し、Ｖ５タグ(GKPIPNPLLGLDST)(配列番号：33)および停止コドンを３'末端に導入して、３'末端を構築した。  全長hNRP-２(a22)タンパク質をコードする発現ベクターを得るために、この３'末端を、５'断片を含有するベクターに導入した。  得られたクローンを、V5 NRP-２と命名した。
【０２９７】
VEGFR-３とNRP-２との相互作用を測定するために、６μlのFUGENE TM6(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Indiana)および２μgのDNAを用いて、ヒト胚腎臓細胞(293Tまたは293EBNA)の10cmプレートを、V5 NRP-２構築体またはVEGFR-３でトランスフェクトした。  細胞を、10％胎児ウシ血清(Gibco BRL)、グルタミンおよび抗生物質を補足したダルベッコ修飾イーグル培地で増殖させた。  モックトランスフェクションのために、２μgの空のベクターを用いた。  単一受容体トランスフェクションのために、VEGFR-３-myc/pcDNA3.1(Karkkainel et al, Nat.Genet.25:153-59 (2000))またはNRP-２(a22)/pcDNA3.1z＋および空のベクターを１/１比率で用いた。  また、VEGFR-３/NRP-２共トランスフェクションを１/２比率で行った。  24時間後、293EBNA細胞を一晩飢餓させ、(P.pastoris；(Joukov et al. EMBOJ.16:3898-3911 (1997))で生産された)300ng/mlのΔNΔCVEGF-Ｃを用いて10分間刺激した。  そして、細胞を、バナデート(100μM)およびPMSF(100μM)を含有する氷冷PBSで２回洗浄して、２mMバナデート、１mM PMSF.0.07U/mlアプロチニン、および４μg/mlのロイペプチンを含有する二量体化溶解緩衝液(20mM HEPES pH7.5、150mM NaCl、10％グリセロール、１％トリトンX-100、２mM MgCl2、２mM CaCl2、10μg/mlウシ血清アルブミン(BSA))で溶解させた。  溶解物を、19,000gで、10分間遠心して、清澄化し、VEGFR-３に対する抗体(9d9F；(Jussila et al., Cancer Res.58：1599-1604 (1998))、またはV5(Invitrogen)と共に、＋４℃にて、５時間インキュベートした。  次いで、免疫複合体を、プロテインＡ-Sepharose(Pharmacial)と共に、＋４℃にて、一晩インキュベートし、免疫沈澱を、BSAを含まない二量体化溶解緩衝液で四回洗浄し、試料を、還元条件下で7.5％SDS-PAGEに付した。  半乾燥式移動装置を用いて、タンパク質を、Protranニトロセルロースフィルター(Schleicher & Schuell)に移した。  TDS-T緩衝液(10mMトリス pH7.5、150mM NaCl、0.1％Tween20)に溶解した５％無脂肪乳粉でブロックした後、フィルターをV5抗体、続いて、HRP-コンジュゲーテッドウサギ-抗-マウス免疫グロブリン(Dako)と共にインキュベートして、増強されたケミルミネセンス(ECL)を用いて可視化した。
【０２９８】
293T細胞へ導入されたVEGFR-３およびNRP-２構築体の共免疫沈澱は、NRP-２が、同一細胞で共発現されるとVEGFR-３と相互作用することを示す。  細胞培養基へのVEGF-Ｃの添加後の免疫沈澱は、NRP-２/VEGFR-３の相互作用が、VEGF-Ｃリガンドの存在に依存しないことを示し、これは、これらの受容体が、VEGF-Ｃの存在なくしてin vivoで自然界では結合できることを意味する。  これらの知見は、脈管形成の過程におけるVEGF-Ｃの結合および活性に対して密接な関係を示すものである。  VEGF-Ｃ、リンパ系血管系の成長および発生を促す完全な分子もまた、リンパ系および、見かけ上、少なくともいくつかの固体腫瘍の新生血管形成を介して、癌性細胞の転移に深く関与する(国際特許公開第WO 00/21560号)。  ニューロピリンとVEGF-Ｃとの間の新規な相互作用は、VEGFR-３へのVEGF-Ｃの結合の結果として、リンパ系細胞移動を阻害することによって、固体腫瘍へのこのリンパ系成長を特異的にブロックする手段を提供する。  ニューロピリン-１-２は、いくつかの腫瘍細胞の表面における唯一のVEGF受容体であり、これは、ニューロピリンへのVEGFの結合が腫瘍成長に関連しており(Soker et al., Cell 92:735-45 (1998))、そして、ニューロピリン-２へのVEGF-Ｃの結合がリンパ系を介する腫瘍転移を特異的に標的とする手段となり得ることを示すものである。
【０２９９】
実施例３：ニューロピリンによるVEGF-ＣのVEGFR-３への結合の阻害
VEGF-Ｃとニューロピリン受容体分子との間の結合親和性は、VEGF-受容体-媒介生物学的プロセスの調節、すなわち、それを刺激するまたは阻害するための、VEGF-Ｃ-誘導VEGFR-３受容体信号伝達のモジュレーターに対する治療的応用手段を提供する。  以下の実施例は、この治療概念の証拠をもたらすべく設計されている。
【０３００】
Ａ．In vitro細胞-フリーアッセイ
VEGF-Ｃ刺激に対するニューロピリン-１-Fcおよびニューロピリン-２-Fcの阻害効果を示すために、標識、例えば、ビオチン分子をVEGF-１タンパク質と融合させ、まず、種々のモル比率においてニューロピリン-１-Fc、ニューロピリン-２-Fc、VEGFR-２  FcまたはVEGFR-３-Fcと共にインキュベートし、そして、１マイクログラム/mlのVEGFR-３またはVEGFR-２でプレ-コーティングしたマイクロタイタプレートに適用した。  １％BSA/PBS-Tでのブロッキングの後、新たに標識された混合物または前出のVEGF-Ｃ/受容体-Fc混合物を、４℃で、一晩マイクロタイタプレートに適用する。  その後、プレートをPBS-Ｔで洗浄し、１:1000のアビジン-HRPを加える。  結合したVEGF-Ｃタンパク質を、ABTS基質(KPL)を加えて検出する。  可溶性ニューロピリンまたは可溶性VEGFRの存在下および不存在下で結合した標識VEGF-Ｃを分析し、結合のパーセント阻害を評価し、そして、VEGFR-２またはVEGFR-３被覆マイクロタイタプレートのいずれかへの結合に対してニューロピリンが有する効果を評価する。  関連する方法として、このアッセイでのVEGF-ＣをVEGF-Ｄで置き換えて実施する。
【０３０１】
Ｂ．In vitro細胞-ベースアッセイ
VEGF-Ｃを前述したように用いて、その表面にNRP-２およびVEGFR-３受容体を天然または組換え発現する細胞と接触させる。  その例として、一過的にまたは安定的にニューロピリンおよびVEGFR-３を発現するように組換えて修飾した先に概説した293EBNAまたは293T細胞を使用する。  ある種の天然内皮細胞タイプでは、共に受容体を発現して使用することができ、このようなものとして、ヒト微小血管内皮細胞(HMEC)およびヒト皮膚脂肪微小血管細胞(HUCEC)などがあるが、これらに限定されない。
【０３０２】
VEGFR-３の自動リン酸化を評価するために、10％胎児ウシ血清(GIBCO BRL)、グルタミンおよび抗生物質を補足したダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)で、293Tまたは293EBNAヒト胚腎臓細胞を増殖させ、そして、受容体構築体(VEGFR-３またはVEGFR-３-mycタグおよび/またはニューロピリン-V5タグ)をコードするプラスミドDNAまたは空のpcDNA3.1z＋ベクター(Invitrogen)と共にFUGENE TM6トランスフェクション試薬(Roche Molecular Biochemicals)を用いてトランスフェクトする。  刺激アッセイのために、293EBNA細胞単層を、0.2％BSAを含有する無血清培地中で一晩(トランスフェクション後36時間)飢餓させる。  そして、ニューロピリン-Fcの存在下または不存在下で、293EBNA細胞を300ng/ml組換えDNDC VEGF-Ｃ(Joukov et al., EMBO J.16:3898-3911 (1997))で、＋37℃で、10分間刺激して、VEGF-Ｃ/VEGFR-３結合の阻害を測定する。  そして、細胞を、２mMバナデートおよび２mMフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)を含有する冷リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で２回洗浄し、２mMバナデート、２mM PMSF、0.07U/mlアプロチニン、および４mg/mlロイペプチンを含有するPLCLB緩衝液(150mM NaCl、５％グリセロール、１％トリトンX-100, 1.5m MgCl2、および50mM Hepes, pH7.5)に溶解させる。  溶解物を、19000ｇで、10分間遠心し、２μg/mlのモノクローナル抗-VEGFR-３抗体(9D9f9)(Jussila et al., Cancer Res.58:1599-1604 (1998))、または特異的タグエピトープに対する抗体(1.1mg/mlの抗-V5抗体(Invitrogen)または５μg/mlの抗-Myc抗体(Babco))を含む上清と共に氷上で２時間インキュベートする。  免疫複合体を攪拌しながら、プロテインA sepharose(Pharmacial)と共に、＋４℃で、45分間インキュベートし、sepharoseビーズを冷PLCLB緩衝液(２mMバナデート、２mM PMSF)で三回洗浄する。  結合したポリペプチドを、7.5％SDS-PAGEによって分離し、半乾燥式導入装置を用いて、Protranニトロセルロースフィルター(Schleicher & Schuell)に移す。  TBS-T緩衝液(10mMトリス pH7.5、150mM NaCl、0.1％Tween20)に溶解した５％BSAでのブロッキングの後、フィルターをホスホチロシン-特異的一次抗体(Upstate Biotechnology)、続いて、ビオチニル化ヤギ-抗-マウス免疫グロブリン(Dako)およびビオチン-ストレプトアビジンHRP複合体(Amersham)で染色する。  ホスホチロシン特異的バンドを、増強されたケミルミネセンス(ELC)によって可視化する。  試料を、VEGFR-３の存在に関して分析するために、随時撹拌しつつ、100mM-メルカプトエタノール、２％SDS、62.5mMトリス-HCl pH6.7を用いて、フィルターを、＋55℃で、30分間取り外し、次いで、抗原検出のための、9D9f9抗体およびHRPコンジュゲーテッドウサギ-抗-マウス免疫グロブリン(Dako)で染色する。  低下したVEGFR-３自動リン酸化は、VEGF-Ｃ/VEGFR3結合の好適なニューロピリン-Fc-媒介阻害を示す。
【０３０３】
無血清ハムF-12栄養混合物(７％胎児ウシ血清(FCS)を含有)(GIBCO)に含まれるPC３前立腺癌腫細胞系(ATCC CRL 1435)で調整された培地に天然で分泌されるVEGF-Ｃタンパク質(米国特許第6,221,839号)を用いて、in vitroでVEGFR-３の発現細胞を活性化することができる。  In vitroアッセイのために、細胞を再度播種し、この培地中で増殖させ、引き続いて無血清培地に変える。  先の実験で示したように、CNBr-活性化sepharose CL-4 B(Pharmacial；約１mgのVEGFR-３ECドメイン/ml sepharose樹脂)にカップリングした50マイクロリットルのVEGFR-３細胞外ドメインを含む濃縮されたPC3調整培地を予備処理することで、VEGFR-３チロシンリン酸化は完全に無くなった(米国特許第6,221,839号)。  関連する実験において、PC３条件培地を、ニューロピリン組成物またはsepharoseにカップリングした対照Fcで予備処理することができる。  細胞を溶解させ、抗-VEGFR-３抗血清を用いて免疫沈澱させ、前述したようにして、抗-ホスホチロシン抗体を用いてウェスタンブロットによって分析する。  VEGF-Ｃを分離するニューロピリンは、VEGF-Ｃ結合および下流のVEGFR-３自動リン酸化のパーセント阻害を、生物学的に関連する状況下で測定することができる。
【０３０４】
また、前出の実験を、本願発明のニューロピリン組成物と組み合わせた関連セマフォリンタンパク質で行って、VEGF-Ｃ/ニューロピリン受容体相互作用のブロッキングに対するニューロピリン受容体についてのもう一つの天然リガンドの効果を測定する。  もし、VEGF-Ｃおよびセマフォリンが、受容体上の同一部位のニューロピリンに結合すれば、ニューロピリン-Fcに未結合のVEGF-Ｃの増加に起因して、VEGFR-３へのVEGF-Ｃ結合およびVEGFR-３リン酸化が引き続いて増加するであろう。  しかしながら、もしセマフォリンおよびVEGF-Ｃが、ニューロピリン受容体上の異なる部位に結合し、かつ他の結合を阻害しないのであれば、VEGFR-３へのVEGF-Ｃ結合の量は、セマフォリンの不存在下、すなわち、ニューロピリン-Fc単独での結合に匹敵するであろう。  このアッセイは、VEGF-Ｃ/ニューロピリン相互作用をさらに否定する。
【０３０５】
また、前述のin vitro無細胞および細胞ベースのアッセイを、推定モジュレーター化合物、例えば、VEGF-Ｃ分泌に影響するサイトカイン(TNFa、TGFb、PDGF、TGFa、FGF-4、EGF、IL-１aIL-１b、IL-6)について行い、現行の実験的癌治療剤とニューロピリン組成物とを比較して、炎症および腫瘍増殖の状況において生物学的に活性なVEGF-Ｃモジュレーターの存在下で、VEGF-Ｃ活性をブロックするニューロピリン組成物の効率を測定することもできる。
【０３０６】
実施例４：VEGF-Ｃ関連生物学的機能に対するニューロピリン-２/VEGF-Ｃ結合の効果
VEGF-Ｃは、リンパ管形成および内皮細胞増殖の多くの機能に深く関連する。  In vivoでそのようなVEGF-Ｃに対するNRP-２の影響を、以下のアッセイで検証する。
【０３０７】
Ａ．細胞移動アッセイ
例えば、ヒト微小血管内皮細胞(HMVEC)は、VEGFR-３およびNRP-２を発現し、それら細胞を用いて、それら細胞に対する可溶性および膜結合ニューロピリン受容体の効果を調べることができる。  ニューロピリンおよびVEGF/VEGFR相互作用は、細胞の移動において何らかの役割を果たすものと考えられるので、HMVECまたはその他の適当な細胞を用いる細胞移動アッセイを用いて、ニューロピリン分子の刺激または阻害効果を確認することができる。
【０３０８】
修飾されたBoydenチャンバーアッセイを用いて、ポリカルボネートフィルターウェル(Transwell、Costar、８マイクロメートルポア)を、室温にて、30分間、PBSに溶解した50μg/mlフィブロネクチン(Sigma)、0.1％ゼラチンで被覆し、続いて、37℃で、１時間、DMEM/0.1％BSAで平衡化させる。  自然界でVEGFR-３およびニューロピリン受容体を発現するHMVEC(４乃至９継代、１×105細胞)またはVEGFR-３および/またはNRP-２を組換え的に発現する内皮細胞系を、フィルターウェルの上部チャンバー内で平板培養し、種々の濃度のニューロピリン-１-Fc、ニューロピリン-２-Fc、およびVEGFR-３-Fcタンパク質の存在下で、プレプロ-VEGF-Ｃ、または酵素でプロセッシングしたVEGF-Ｃを補足した無血清培地を含有するウェルの底部チャンバーに向けて、フィルターの下側に移動させる。  ５時間後に、トランスウェルの頂部に接着する細胞を綿棒で除去し、フィルターの下側に移動する細胞を固定し、染色する。  細胞数を定量するために、６つのランダムに選択された400×顕微鏡視野を、フィルター単位で計数する。
【０３０９】
もう一つの態様において、前述した移動アッセイを、公知の構築体で安定にトランスフェクトされたブタ大動脈内皮細胞(PAEC)を用いて行って、NRP-２、VEGFR-３、またはNRP-２およびVEGFR-３相補体(すなわち、PAE/NRP-２、PAE/VEGFR-３、またはPAE/NRP-3/VEGFR-３)を発現させる。  Soker et al., Cell 92:735-745 (1998)に記載された方法を用いてPAECをトランスフェクトする。  トランスフェクトされたPAEC(0.1％BSAで補足した無血清F12培地内の1.5×104細胞)を、前述したようにフィブロネクチンで調製したBoydenチャンバーの上部ウェルで、平板培養する。  増大した濃度のVEGF-ＣまたはVEGF-Ｄを下方チャンバーのウェルに加えて、内皮細胞の移動を誘導する。  ４時間後に、フィルターを通って移動する細胞の数を、位相顕微鏡によって定量する。
【０３１０】
NRP-２またはVEGFR-３の単一トランスフェクタントよりも大きなNRP-２/VEGFR-３二重トランスフェクタントの移動および化学走性の増加は、ニューロピリン-２が、VEGFR-３を通じて信号伝達を行い、生物学的効果、特に、細胞の移動、および、おそらくは、脈管形成リンパ管形成を刺激するVEGF-ＣまたはVEGF-Ｄの能力を増強することを示す。
【０３１１】
加えて、ブタ大動脈内皮細胞移動アッセイを用いて、内皮細胞のNRP-２/VEGFR-３/VEGF-Ｃ媒介刺激のモジュレーターを同定する。  可溶性受容体ペプチド、タンパク質または他の小分子(例えば、モノクローナルおよび二特異的抗体または化合物)のような組成物を、VEGF-Ｃリガンドと共に、Boydenチャンバーの下方ウェルへ添加した後に、PAE/NRP-２/VEGFR-３の発現細胞の移動を評価する。  ペプチド、タンパク質または小分子のいずれかを添加して際に移動値が減少した場合、その化合物は、NRP-２/VEGFR-３媒介化学走性の阻害剤として同定される。
【０３１２】
Ｂ．分裂促進物質アッセイ
VEGFR-３単独、NRP-２単独、またはVEGFR-３およびNRP-２双方を発現する胚内皮細胞を、VEGF-Ｃポリペプチド、およびセマフォリンのようなこの種の相互作用に対して潜在的なモジュレーター、特に、Sema3F、ならびに、VEGF-Ｃ活性をアップレギュレートすることが知られている、例えば、TGF-β、TNF-α、IL-１αおよびIL-１β、IL-6、およびPDGFなどのサイトカインの存在下または不存在下で培養して、細胞数の増加を測定するアッセイ、またはトリチウム化チミジン取り込みを測定するアッセイのような、細胞増殖または移動アッセイなどを用いて、細胞増殖に対する効果をアッセイする。  例えば、Thompson et al, Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 281:H396-403(2001)を参照されたい。
【０３１３】
実施例５：脈管形成アッセイ
脈管形成を刺激して、例えば、創傷治癒を促し、円滑な組織移植および移植を促す薬剤、ならびに脈管形成を阻害する(例えば、腫瘍の増殖を阻害する)薬剤が、長年にわたって待望されている。  さらに、種々の脈管形成刺激剤および阻害剤は、同一または異なる受容体を介して、および循環系の異なる部分(例えば、動脈または静脈または毛細血管；血管またはリンパ)に対して協働して作用する。  脈管形成アッセイを用いて、単独で、または他の脈管形成および抗脈管形成因子と組み合わせて、脈管形成プロセスに対するニューロピリン/VEGF-Ｃ相互作用の効果を検証して、ニューロピリンおよびその他のモジュレーターが関与する好ましい組合せ療法を決定する。  例示的な手法として、以下のものがある。
【０３１４】
Ａ．脈管形成に関するin vitroアッセイ
１．新芽形成アッセイ
HMVEC細胞(５乃至９継代)をコラーゲン被覆ビーズ(Pharmacia)上で密集するまで、５乃至７日間増殖させる。  5.5mg/mlフィブロネクチン(Sigma)、２ユニット/mlトロンビン(Sigma)、DMEM/２％胎児ウシ血清(FBS)、および以下の試験用および対照タンパク質：20mg/ml VEGF、20mg/ml VEGF-Ｃ、または成長因子＋10マイクログラム/mlのニューロピリン-２-Fc、および脈管形成因子およびFc融合タンパク質のいくつかの組合せを含むゲルマトリックス内で前述のビーズを平板培養する。  試験用および対照タンパク質を補足した無血清培地を、２日毎にゲルマトリックスに加え、ビーズの長さを超える内皮細胞出芽の数を計数して、見積りを行う。
【０３１５】
２．移動アッセイ
前出のトランスウェル移動アッセイを、新芽形成アッセイと組み合わせて用いて、本願発明のニューロピリン組成物が、VEGF-Ｃアクチベーターの相互作用および細胞機能に対して奏する効果を測定することもできる。  細胞移動に対するVEGF-Ｃの効果は、本願発明のニューロピリン組成物、または公知の脈管形成または抗脈管形成剤との組合せに対する応答に関して検証を行う。  VEGF-Ｃ刺激後のニューロピリンの存在による細胞移動の減少は、本願発明が、脈管形成を阻害する方法を提供することを示す。
【０３１６】
また、このアッセイは、VEGFR-３またはVEGFR-２のいずれかを天然系で発現する細胞、例えば、優先的にVEGFR-２を発現するウシ内皮細胞で行うこともできる。  特異的受容体をもたらし、自然界で発現する細胞または一過的に発現する細胞の使用は、本願発明のニューロピリン組成物を用いて、VEGFR-３またはVEGFR-２のいずれかの異常な活性に関与する疾患を、優先的に治療することができるものと判断される。
【０３１７】
Ｂ．脈管形成に関するin vivoアッセイ
１．漿尿膜(ＣＡＭ)アッセイ
３日齢の受精白色レグホン卵を砕いて、無傷の黄身を含むニワトリ胚を注意深く、20×100mmのプラスチックペトリ皿に移した。  37℃で、３％CO2にて、６日間のインキュベーションの後、ナイロンメッシュ(３×３mm)上で乾燥したVEGF-Ｃおよび種々の濃度のニューロピリン組成物、VEGFR-３、およびニューロピリン-２およびVEGFR-３複合体を含有するメチルセルロースのディスクを個々の胚CAMに移植して、血管の発生に対するニューロピリンの影響、および血管形成を促進または阻害についての潜在的用途を判断する。  ナイロンメッシュディスクは、(水に溶解した)0.45％メチルセルロースを、10マイクロリットルにまで乾燥して調製する。  ４乃至５日間のインキュベーションの後、胚およびCAMを、立体鏡によって、移植されたディスクの視野において、新しい血管およびリンパ管の形成について検証する。  PBSを含有するメチルセルロースのディスクを陰性対照として用いる。  血管およびリンパ管双方の細胞表面分子を認識する抗体を用いて、血管およびリンパ管をさらに特定する。
【０３１８】
２．角膜アッセイ
５乃至６週齢の雄のC57BL6/Jマウスの両目に、修飾されたvon Graefe白内障ナイフで、角膜微小ポケットを設ける。  ｉ) 血管成長を調節することが知られている因子(例えば、160ngのVEGF、または80ngのFGF-２)、ii) 先に概説したニューロピリンポリペプチド、またはiii) サマフォリン、例えば、Sema-3CおよびSema3Fのような天然ニューロピリンリガンドと組み合わせたニューロピリンポリペプチド、の各々またはそれらの組み合わせを、種々の濃度のVEFG分子(特に、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ)を含有するヒドロンポリマータイプNCC(IFN Science、New Brunswick、NJ)を被覆した硫酸スクロースアルミニウム(Bukh Meditec、Copenhagen、Denmark)のマイクロペレット(0.35×0.35mm)を、各ポケットに移植する。  このペレットを、縁から0.6乃至0.8mmの場所に置く。  移植の後、エリスロマイシン／眼用軟膏を、眼に塗布する。  スリット-ランプバイオ顕微鏡によって、眼を３乃至12日間にわたって調べる。 管の長さ、それに、周囲の新生血管形成およびリンパ管形成の時間を測定する。  さらに、眼球を区画切断して、血管および／またはリンパマーカー(LYVE-１［Prevo et al., J. Biol. Chem., 276:19420-19430 (2001)］、ポドプラニン［Breiteneder-Geleff et al., Am. J. Pathol., 154:385:94 (1999)］およびVEGFR-３)に関する免疫染色を施して、対象とした管の特徴決定をさらに進める。
【０３１９】
実施例６：In vivo腫瘍モデル
ニューロピリン受容体が、腫瘍の成長において重要な役割を果たすという証拠が増えつつある。  ニューロピリン-１受容体は、いくつかの腫瘍細胞系で見出されており、NRP-１のAT2.1細胞へのトランスフェクションは、腫瘍の成長および血管形成を促進することができる(Miao et al., FASEB J. 14:2532-39 (2000))。  加えて、消化管中の神経内分泌細胞に由来する腫瘍をゆっくりと発生させるカルチノイド腫瘍におけるニューロピリン-２の発現の研究は、ニューロピリン-２が、その腫瘍の周りの正常な組織で現実に発現されるが、腫瘍それ自体の内部では発現されないことを示しており(Cohen et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 284:395-403 (2001))、神経内分泌細胞が、VEGF-Ｃ、VEGF-Ｄを分泌し、その細胞表面でVEGFR-３を発現することが確認されている(Partanen et al., FASEB J 14:2087-96 (2000))。  腫瘍内部およびその周囲の血管密度および腫瘍の成長としばしば相関し、VEGF分子と結合するこれらのニューロピリンの異なる発現レベルは、腫瘍の進行または退行を示すものであると言える。
【０３２０】
Ａ．不正常箇所への腫瘍移植
６乃至８週齢のヌード(NU/NU)マウス(SLC, Shizuoka, Japan)の右側腹部に、0.1mlリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)に含有されたC6ラット神経膠芽細胞腫細胞またはPC３前立腺癌細胞を、皮下移植した。  これまでに概説したニューロピリンポリペプチドを、種々の濃度および用量管理下で動物に投与する。  腫瘍の大きさは二次元で測定し、腫瘍容量を、幅2×長さ／２の式に従って計算する。  14日後に、マウスを屠殺および解剖して、ニューロピリンポリペプチドによるVEGF-Ｃ阻害に応答した腫瘍血管系の量および生理学的評価を行う。
【０３２１】
このアッセイは、ヌードマウスまたはその他のマウス種に移植されたその他の腫瘍細胞系を用いて行うこともできる、ことは明らかである。  具体的には、LLC肺癌細胞やB16メラノーマ細胞を移植した野生型マウスの使用が意図されている。
【０３２２】
Ｂ．正常箇所への腫瘍移植
PBSに含有された約１×107個のMCF-7乳癌細胞を、0.72mgの17β-エストラジオール(Innovate Research of America)を含んだ60日間徐放性皮下用ペレットを埋め込まれた子宮摘出SCIDマウスまたはヌードマウスの第二の(腋臭)乳腺脂肪に導入する。  子宮摘出およびペレットの移植は、腫瘍細胞導入の４乃至８日前に行う。  先に概説したニューロピリンポリペプチドおよびVEGF-Ｃポリペプチド、ならびにセマフォリン、特に、Sema3CおよびSema3Fを種々の濃度および投与管理下で動物に投与する。  腫瘍の大きさは二次元で測定し、腫瘍容量を、幅2×長さ／２の式に従って計算する。  14日後に、マウスを屠殺および解剖して、腫瘍血管系の量および生理学的評価を行う。
【０３２３】
PC３細胞を雄マウスの前立腺に移植する同様のプロトコルも使用される。
【０３２４】
Ｃ．リンパ転移モデル
VEGF-Ｃ/VEGFR３相互作用は、成体組織において、リンパ管の組織化および成長との間で関連づけられることが多く、従って、これら部位でのニューロピリン受容体の存在は、いくつかの癌の転移に関与している。  以下のプロトコルは、リンパ転移の阻害に関するニューロピリンポリペプチド、特に、ニューロピリン-２ポリペプチド、またはその断片の能力を示す。
【０３２５】
MDA-MB-435乳癌細胞を、８週齢の無胸腺雌ヌードマウスの第二の乳房脂肪に両側より注射する。  細胞は、12週目までに、リンパ節に転移することが多い。  最初に、腫瘍転移におけるVEGF-ＣおよびVEGFR-３へのニューロピリン-２の結合の役割は、既に決定されたニューロピリン-VEGF-Ｃ結合のモジュレーターを用いて評価することができ、特に、セマフォリンの使用を意図している。  NRP-２遮断に相関する転移の減少は、NRP-２が、腫瘍転移で臨界的であることを示す。  また、［本願発明において］既に決定されたニューロピリン-VEGF-Ｃ結合のモジュレーターを、種々の濃度および投与管理下でて動物に投与する。  さらに、腫瘍転移を低下させるその他の物質と組み合わせて、ニューロピリン-２ポリペプチドを投与する。  例えば、本明細書の一部を構成するものとして、そのすべての内容を援用する国際特許公開第WO 00/21560号を参照されたい。  マウスを、12週間後に屠殺して、組織学分析によってリンパ節を調べる。  ニューロピリン組成物の投与の結果として出現したリンパ管および腫瘍拡大の現象は、本願発明が、腫瘍転移の予防のための治療的化合物であることを示すものである。
【０３２６】
実施例７：コラーゲン反発アッセイによる成長円錐崩壊の評価
中枢神経系におけるセマフォリンの構成的発現は、この領域における神経再生の欠如に関する主要因として考えられている。  坐骨神経の挫傷のような神経損傷後の末梢神経の再生は、損傷直後のセマフォリン-３Ａの発現のダウンレギュレーションによって可能とされる。  Sema3Aの発現は、損傷からほぼ36日後にベースラインレベルにまで戻るが、低下したセマフォリンの発現にまで至るこの期間において引き続き成長は続けられることができ、再生成長する前の損傷箇所での末梢神経の再生は、(Pasterkamp and Verhaagen, Brain Res. Rev. 35:36-54 (2000)で報告された)セマフォリン活性によって停止される。      
【０３２７】
多数のセマフォリンが、CNSおよびPNSで後半部において発現されているが、セマフォリン-３Ｆ、ニューロピリン-２に対する一次リガンドは、ヒトの脳において広範に分布しており、これまで、アルツハイマー患者の特定の脳領域において過剰発現されることが見出されている(Hirsch et al., Brain Res.823:67-79 (1999))。  NRP-２へのVECF-Ｃ結合に関する新たな相互作用に関する知見は、アルツハイマーまたは黄斑変性のような多くの神経変性病において、神経再生を停止させるsema-3F活性の作用を特異的に阻害する因子を提供する。  さらに、(例えば、実施例８に記載された)VEGF-Ｃのみかけの神経栄養効果は、sema-３Ｆ-阻害活性と相乗的に組み合わされて、有利な結果を引き出すことができる。
【０３２８】
コラーゲン反発アッセイで用いるために、Chen et al.(Neuron, 25:43-56 (2000))およびGiger et al.(Neuron, 25:29-41 (2000))の方法に従って、上頚部神経節(SCG)を、Ｅ13.5またはＥ15.5-17.5ラットまたはマウス胚から切り出す。  切り出し後に、後脳-中脳接合エクスプラントを、培養基［１％P/S、Glutamax(Gibco)、５％FCSおよび40mMグルコースを補足した、70：25のOPTI-MEMおよびＦ12］に含まれるコラーゲンマトリックスで、アルカリ性ホスファターゼコンジュゲーテッドSema3Fを発現するように組換え修飾されたCOS細胞、またはモックトランスフェクトCOS細胞と共に、48時間、共培養する。  簡単に記載すると、バイオマトリックス内で規定された点を超えるニューライト延長のパーセンテージを決定することによって、Giger et al.(Nuron, 25:29-41.2000)によって概説されたプロトコルを用いて神経突起の伸長度を定量する。  神経突起の伸長度は、VEGF-Ｃ組成物の不存在下と比較して、種々の濃度のVEGF-Ｃ組成物の存在下で測定することができ、培養へのVEGF-Ｃ添加、およびニューロピリン-２でのSema3F相互作用の遮断の結果に基づいて、神経突起の伸長度に由来する改善項目を評価することができる。
【０３２９】
本願発明によって得られるSema3F阻害の効果は、いくつかの疾患の治療に利用することができ、特に、ニューロン再生は、セマフォリンの存在によって制限を受け、例えば、頭側神経損傷の後に、おそらくはアルツハイマーの脳において瘢痕となって現れる。
【０３３０】
前出の実施例およびそれに続くその変更態様は明らかであって、特許請求の範囲の欄に記載された本願発明の態様に包含されるものである。  例えば、本願実施例に記載された物質および方法は、本願明細書に記載されたポリペプチド相互作用の新しいモジュレーターのスクリーニング、そして、細胞ベースのシステムおよびin vivoでの新規のモジュレーターの効果を証明するために、容易に利用でき、かつ有用である。  換言すれば、本願実施例の物質および方法における手法は、モジュレーターを同定し、そのモジュレーターをin vitroおよびin vivoでの活性をスクリーニングする上で有用である。
【０３３１】
その例として、実施例１には、ニューロピリンへのVEGF-Ｃの結合を調べた実験的プロトコルが記載されている。  同様な結合実験、すなわち、一つ以上の候補薬剤の濃度にて、候補薬剤を結合実験に取り入れて、候補薬剤が、VEGF-Ｃおよびニューロピリンとの間で測定可能な結合を調節する(増加または減少させる)かどうかを決定する。  実施例２には、ニューロピリンへのVEGFR-３結合を調べた実験プロトコルが記載されている。  同様な結合実験、すなわち、候補薬剤を反応系に取り入れて、候補薬剤が、VEGFR-３およびニューロピリンとの間で測定可能な結合を調節する(増加または減少させる)かどうかを決定する。  最初の結合アッセイにおけるモジュレーターとして同定される候補薬剤は、後続の実施例での細胞ベースおよびin vivoのアッセイなどによって、注目する受容体を発現する細胞(例えば、VEGFR-３またはニューロピリン発現細胞)または生物学的システムおよび生体に対する候補薬剤の生物学的効果を測定することができる。
【０３３２】
同様に、多数の実施例には、出願当初の本願明細書に記載された分子間の結合関係をさらに証明する実験において、ニューロピリン受容体またはその他のタンパク質の可溶性形態を用いることが記載されている。  これらの実験は、リガンド／受容体の対または受容体／共受容体の対の一方または双方のメンバーに結合する分子をシステムに加えて、注目する結合対の能力を調節する(特に、阻害する)能力を証明する。  例えば、可溶性NRP分子を実施例３に適用することで、VEGFR-３またはVEGFR-２へのVEGF-ＣまたはVEGF-Ｄの結合を調節(阻害)する。  各VEGFR受容体とVEGF-ＣまたはVEGF-Ｄとの結合の喪失は、VEGFR-３またはVEGFR-２の望ましくないリガンド媒介刺激を特徴とする多数の疾患の治療のための現実的な適用法を示す。  同様な結合実験、すなわち、同一結合反応を調節することが疑われる候補薬剤を、可溶性NRP分子に置換する。  このようにして、実施例の物質および方法を用いて、候補薬剤の治療的価値を同定し、確認する。
【０３３３】
実施例８：ＶＥＧＦ-Ｃ-/-動物の表現型
リンパ管形成およびニューロン成長におけるVEGF-Ｃの役割を分析するために、VEGF-Ｃ遺伝子が欠損したマウスを、VEGF-Ｃ第一コードエクソンを、LacZ遺伝子で置き換えて作出した。
【０３３４】
Ａ．ＶＥＧＦ-Ｃノックアウトマウスの作出
VEGF-Ｃ遺伝子を、５'および３'セグメントにおいて、129Svマウスゲノムライブラリーから単離した。  2.9kbのBamHI-PstI断片を、pNTPloxP標的化ベクターのBamHI部位に平滑末端クローニングして、３'アームを調製した。  3.3kbの５'アームを、HindIIIおよび(部分的)BsmBI消化によって切り出し、LacZ/NeoRブロックの上流のpSDKlacZプラスミドに挿入した。  引き続いて、この構築体のSalIカセットを、３'アームを含有するpNTPloxPプラスミドのXhoI部位にクローニングして、最終の標的化ベクターを作り出した。  ５'アームは、翻訳開始部位の上流の125bp断片、コード領域の最初の147bp(49:)、および(シグナルペプチドを含めた)143bpの最初のイントロンを含めた、最初のエクソンを失欠するように設計した。  このものは、VEGF-Ｃ遺伝子の調節領域の制御下にあるLacZレポーター遺伝子においた。
【０３３５】
標的化構築体を、Ｒ１(129/Sv×129/SvJ)マウスES細胞に、エレクトロポレーションした。  標的化突然変異についてのスクリーニングは、NcoI消化および５'外部プローブを用いたサザーンブロット分析によって行った。  陽性クローンを、WT桑実胚で凝集させて、キメラマウスが得られ、これをICRマウスと共に育種した。  動物の子孫を、サザーンブロッティングによって、またはプライマー５'-TCC GGT TTC CTG TGA GGC-３'(順方向)(配列番号：34)、５'-AAG TTG GGT AAC GCC AGG-３'(標的化対立遺伝子に対して逆方向)(配列番号：35)および５'-TGA CCT CGC CCC CGT C'-３'(VEGF-Ｃの最初のエクソンに対して逆方向)(配列番号：36)を用いたPCRによって遺伝子型分けした。
【０３３６】
Ｂ．ＶＥＧＦ-Ｃ-/-表現型の致死性
VEGF-Ｃ＋/-マウスの243子孫の内の数匹に、VEGF-Ｃ-/-の子孫が見出され、このことは、VEGF-Ｃ欠損の結果、胚致死性がもたらされることを示唆する。  VEGF-Ｃ-/-胚が、予測される頻度で見出され、それらのほとんどは、Ｅ12.5前方からの浮腫状であって、著しく腫れており、成長はＥ18.5において遅延した。  すべてのVEGF-Ｃ-/-胚は、後に死亡した。
【０３３７】
LacZ-VEGF-Ｃマーカー遺伝子を含有する胚におけるβ-ガラクトシダーゼ活性についての全マウント染色は、VEGF-Ｃが、最初のリンパ嚢が形成される頸部領域においてE8.5前方から強く発現されたことを示した(Kukk et al., Development 122,3829 (1996))。  従って、Ｅ10.5 VEGF-Ｃ＋/-胚のセクションにおけるβ-ガラクトシダーゼおよびVEGFR-３についての二重染色は、VEGF-ＣがVEGFR-３陽性頸部静脈に対して後側腸間膜で豊富であり、これはリンパ内皮を生起させることを示した。
【０３３８】
VEGF-Ｃの発現の箇所および時期は、VEGF-Ｃが、リンパ血管系の発生において役割を担っていることを示唆している。  従って、リンパマーカーVEGFR-３、LYVE-１またはポドプラニンに関する頸部領域由来画分の染色は、リンパ嚢が、VEGF-Ｃ-/-胚において形成されず、むしろ、そのVEGF-Ｃ+/-およびVEGF-Ｃ+/+同腹子において明確に認められたことを示すものである。  興味深いことに、VEGFR-３の発現もまた、VEGF-Ｃ-/-胚のいくつかの赤血球含有毛細血管で継続され、その一方で、その同腹子においてもダウンレギュレートされた。  静脈および動脈は、PECAM-１および平滑筋アクチン染色画分において正常に認められた。  Ｅ17.5におけるVEGF-Ｃ-/-胚のVEGFR-３全マウント染色は、後段階では、胸管を含むリンパ管において存在しなかったことを示した。
【０３３９】
Ｃ．ＶＥＧＦ-Ｃ/-胚におけるProx-１の発現
Prox-１は、リンパネットワーク形成の程度を測定する上で有用であるリンパ内皮細胞で発現される転写因子である。  VEGF-Ｃ-/-胚と同様、Prox-１が欠損した胚もまた原始リンパ嚢を形成しない(Wiglg and Olivr. Cell 98, 769(1999)、Wigle et al., PMVO J. 21, 1505(2002))。  Prox-１に対するVEGF-Ｃの発現の効果を測定するために、全マウント免疫蛍光によってProx-１の発現を、VEGF-Ｃ-/-胚で実験した。
【０３４０】
Prox-１抗体を生産するために、Prox-１(配列番号:37)ホメオボックスドメインおよびプロスペロドメイン(ヒトProx-１のアミノ酸578-750、配列番号:38)をコードするcDNAを、pGEX2tベクターにサブクローニングして、GST-Prox-１融合構築体を取得し、製造業者の指示に従って、(Amersham, Piscataway, NJ)、グルタチオンSepharoseを用いて大腸菌からgst-Prox-１融合タンパク質を精製した。  標準的なプロトコルに従って、融合タンパク質を用いて、ウサギを免疫化し、Prox-１特異的抗体を、ビニルスルホンアガロース樹脂(Sigma)に結合したGST-およびGST-Prox-１のカラムを順次用いて、ウサギ血清から単離した。  精製された抗体は、Prox-１でトランスフェクトされた293T細胞に由来する溶解物内の85kDタンパク質を認識したが、空のベクターでトランスフェクトされた細胞由来のものは認識しなかった。  また、抗体は、染色されたリンパ細胞を特異的に染色したが、マウス皮膚の凍結画分内の血液内皮細胞は染色しなかった。
【０３４１】
全マウント外植片から、軸方向血管系、内胚葉部分、およびＥ10-Ｅ13胚由来のすべての中間中胚葉誘導体を分離した。  Ｅ10.5において、強力な内皮Prox-１染色が、すべての胚において形状脈で両側で検出された。  これらProx-１を発現するリンパ内皮細胞は、VEGF-Ｃ+/+およびVEGF-Ｃ+/-胚において新芽形成を開始し、その一方で、VEGF-Ｃ-/-胚におけるProx-１を発現する内皮細胞は、頭側静脈壁に阻まれた。  次いで、VEGF-Ｃ+/+およびVEGF-Ｃ+/-胚におけるProx-１を発現する内皮細胞は、頸部リンパ嚢を形成し、このものは、Ｅ13において明瞭に認められた。  しかしながら、VEGF-Ｃ-/-胚において、この段階にて頭側静脈に残存したProx-１を発現する内皮細胞は数個にすぎず、リンパ様構造は認められなかった。  心筋細胞および肝細胞におけるprox-１の発現は、分析したすべての段階においてVEGF-Ｃ-/-胚では正常に認められた。  このことは、リンパ内皮系列に拘束される細胞にとってVEGF-Ｃは必要ではないが、頭側静脈からのProx-１を発現する内皮細胞の移動、そして、リンパ嚢の継続的な形成においてパラクリンVEGF-Ｃ信号伝達が必須であることを示唆するものである。  VEGF-Ｃの不存在下では、Prox-１を発現する内皮細胞の数は、Ｅ13によってやはり減少し、このことは、これら細胞の生存において、VEGF-Ｃが必要であることを示唆するものである。
【０３４２】
Ｄ．神経系におけるＶＥＧＦ-Ｃの発現
リンパ活性とは別に、VEGF-Ｃ-/-胚発生の領域におけるVEGF-Ｃの発現の分析は、胚形成の過程でのVEGF-Ｃの発現もまた、神経系に認められたことを示した。  VEGF-Ｃ-/-マウスにおけるProx-１の発現の分析は、Prox-１は、中央後脳領域においてVEGF-Ｃと共に局所化され、発生過程の眼や前足の領域においても発現されることを示した。  レベルは、VEGF-Ｃ/-動物での他の部位において認められたものと同一であるが、VEGF-Ｃ-/-胚における中央後脳領域で検出されたProx-１の発現は認められなかった。
【０３４３】
胚形成の種々の段階において、VEGF-Ｃは、中央後脳領域および小脳の壁において強く発現された。  成体脳におけるVEGF-Ｃの発現は、VEGF-Ｃ+/-動物でのin situハイブリダイゼイションを介して検出された。  VEGF-Ｃは、小脳(顆粒およびプルキニエ細胞)、脳における平滑筋細胞、脳室下帯(SVZ)、嗅覚球神経膠細胞、視床下部、海馬、脳幹、視覚帯、大脳皮質の領域、および頭側神経節を含めた成体動物中の脳領域の大部分で検出された。
【０３４４】
脳における広範なVEGF-Ｃの発現は、それがCNSにおいて役割を有することを示唆するものである。  VEGF-Ｃは、CNSにおいて、神経保護剤または神経栄養剤として機能することができる。  加えて、血管の周囲の平滑筋細胞におけるその発現は、VEGF-Ｃが、脳における内皮細胞に対して機能(例えば、生存または透過性機能)することができる脳を示唆するものである。  視覚帯における発現は、VEGF-Ｃが、視覚系の発生および維持において非常に重要な機能を有するであろうことを示唆する。さらに、SVZは、前駆神経を含有することが知られている(Picard-Riera et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99.13211-13216 (2002))。  この帯から、前駆体は、吻側移動系を通って嗅覚球まで移動し、そこで、糸球体周辺および顆粒ニューロンを置換する。  しかしながら、SVZ細胞を、損傷に応答して、より広範に増殖させ、および神経膠星状細胞へ分化するように励起することができる(Picard-Riera et al., 前掲)。  従って、VEGF-Ｃは、神経前駆細胞の生存および増殖および/または移動において役割を果たすことができる。
【０３４５】
Ｄ.１ ＶＥＧＦ-Ｃは、Prox-１陽性細胞の増殖を誘導する。
【０３４６】
アガロースビーズからのVEGF-Ｃ放出を利用して、外因性VEGF-Ｃの効果を、胚日(E)11.5のVEGF-Ｃ-/-およびVEGF-Ｃ+/+胚からの組織外植片で分析した。  Affi-Gel Vblueビーズ(メッシュ大きさ100乃至200; Bio-Rad, Hercules, CA)を、100ng/μlのVEGF-Ｃ((Joukov et al., 1997)に記載されたPichi pastorisが産生したhVEGF-Ｃ ΔNΔＣ6xHis)を含有するPBS内でインキュベートした。  対照試料において、100ng/μlのヒト血清アルブミン(HSA);または、アガロースビーズを含有する１％BSAを用いた。  ビーズを、以下のようにして組織外植片に加えた。  後腎領域に近い後大動脈の側部に二つのビーズ、頭側中腎領域での後大動脈の側部に二つのビーズ、および頸領域での大動脈弓の側部に二つのビーズ。  Trowell型器官培養系(Sainio, 2003)の金属グリットの頂部に設けられたTrack-tech Nucleporeフィルター(孔径０.１μm;Whatmann)上で、外植片を、48時間、培養した。
【０３４７】
48時間培養した後に、胚を固定し、免疫組織化学によってProx-１およびPECAM-１の発現に関して分析した。  免疫組織化学染色のために、組織を、−20℃のメタノール中で、10分間固定し、PBSで三回洗浄し、４℃にて、PBS中の１％BSAで、一時間ブロックした。      
【０３４８】
そして、ブロッキング溶液中に希釈した一次抗体中で、組織を一晩インキュベートした。  用いた一次抗体は、ラット-抗-マウスPECAM-１(Pharmingen. Can Diego, CA)およびアフィニティ-精製ウサギ-抗-Prox１であった。  Cy２、FITCまたはTRITＣ１標識二次抗体(Jackcon Laboratories )染色を用いた。  組織に、Immu-mount(商標)(Thermo Shandon, Pittsburgh, PA)またはVectachield(Vector Laboratories)を設置して、Zeiss Axioplal２蛍光顕微鏡によって分析した。
【０３４９】
一般的に、用いた高濃度のVEGF-Ｃは、血管の正常な動脈/静脈階層を破壊した。  すべての胚において、Prox-１/PECAM-１を発現するリンパ内皮細胞は、VEGF-Ｃ発現用ビーズに向かって移動した。  しかしながら、すべての遺伝子型において、VEGF-Ｃは、Prox-１陽性およびPECAM-１陰性細胞のかなりの細胞増殖を、やはり誘導した。  すべての他のProx-１発現細胞/組織(例えば、肝臓葉基、心臓、後根、神経節；(Oliver et el., Mech Dev.44,3-16 (1993))を、組織調製物から切り出したので、これらの細胞は、発生する交感神経系(交感神経の神経節)に由来しなければならず、つまり、Prox-１が発現されていることが示されていた(Wigle et al., EMBO J. 21,1505-1513 (2002))。
【０３５０】
実施例９：ＶＥＧＦ-Ｃおよび交感神経の神経節の分化
Ａ．ニューロン拡大に対するVEGF-ＣまたはVEGF-Ｄの効果
神経細胞集団を、より詳細に分析するために、胚外植片からの交感神経の神経節を単離し、培養した。  Ｅ11野生型(NMRIマウス)胚を切り出し、VEGF-Ｃ ΔNΔCを用いて、前述したようにして、VEGF-Ｃビーズ実験を行った。  BSAを含有するビーズを、対照として用いた。
【０３５１】
VEGF-ＣノックアウトマウスからのＥ11.5胚またはＥ11マウス(NMRI)野生型胚を、以下のように切り出した。  腹膜後領域から、生殖腺を備えた泌尿性器組織、中腎および後腎葉基を切り出した(Sainio, 2003)。  腸、肝臓葉基、心臓および肺葉基を、摘出した。その腹側外側における後大動脈および交感神経節鎖は、無傷のまま残した。  頸部領域では、大動脈弓および交感神経鎖も無傷のまま残した。
【０３５２】
48時間後、野生型マウスの交感神経節は、VEGF-Ｃビーズの周囲に、明らかに透明で拡大された領域を形成し、これを取り出して、機械的に解離させた。  NMRI外植片を含有するVEGF-Ｃビーズの二つを、フィルターから、EGF(20ng/ml)およびFGF(40ng/ml)を含有する標準の新規に調製された培養基(B27を補足したD-MEM:F12(３:１))に除去して、未分化ニューロンの生存および増殖を補助した。  VEGF-Ｃ(100ng/ml)を培地に加え、ピースを、37℃にて培養した。  72時間後、培地には、透明な神経節球が形成された。  そして、これらの神経節を回収し、VEGF-Ｃ(100mg/ml)を含有する神経幹細胞培地(前記したBMEM/F12)で培養するか、あるいはEGFおよびFGFを含まない培地で平板培養し、これにより、ニューロンの分化を可能とした。
【０３５３】
分化アッセイでは、四つのVEGF-Ｃビーズ-含有NMRI外植片および対照(BSAビーズ含有)外植片を、氷冷メタノールを含む培養基で48時間後に固定し、全マウント免疫組織化学のために処理した。  別法として、細胞分化を検出するために、神経節を解離し、100ng/ml神経成長因子(NGF)を補足したEGF-FGF不含培地を注いだ24-ウエルプレートのウエル内のポリリシン被覆カバーグラス上で、単一細胞として平板培養する。  一次ニューロン(Tuj-１およびp75NGF-受容体)、上皮構造(パンサイトケラチン)および分化したニューロン(チロシンヒドロキシラーゼ(TH)、神経繊維抗体)を検出する抗体を用いて、これらの培養で増殖するものは、交感神経細胞であることを確認し、そして、神経分化に対するVEGF-Ｃの影響を決定する。
【０３５４】
Ｂ．神経突起および軸索発芽後成長に対するVEGF-ＣまたはVEGF-Ｄの効果
上記の実験は、VEGF-Ｃが、神経栄養成長因子として作用することを示す。  成体軸索の増殖または再生に対するVEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物の効果を測定するために、他の神経栄養因子を含む培養の有無に基づいて、VEGF-ＣおよびVEGF-Ｄ産物の存在下および不存在下で、軸索発芽後成長アッセイを行う。
【０３５５】
例えば、上頸部神経節(SCG)を成体ラットから切り出し、Sondell el(J.Neurosci.19,5731/40.1999)に記載のMATRIGEL(登録商標)内に設置した。  35mm培養皿当たり２乃至３の神経節を接種して、外植片培養を、５％CO2の湿潤化チャンバー内のRPMI 1640無血清培地に、48時間または72時間維持する。  外植片を置いて０時間、４時間、６時間、８時間、12時間または24時間の各時点で、VEGF-Ｃ産物またはVEGF-Ｄ産物を培養基に加える。  VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄを、１、10、25、50、100または200ng/mlのようなng/ml乃至μg/mlの用量範囲で加える。  神経成長因子を陽性対照として用い、その一方で、未処理神経節または無関係なタンパク質で処理した神経節を陰性対照として用いる。
【０３５６】
VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物によって誘導された軸索成長の程度を測定するために、培養して成長した軸索の長さおよび密度の双方を測定する。  VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄで処理した神経節における増大した軸索長さおよび軸索密度は、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄが、成体軸索を成長するように誘導し、軸索再生を必要とするヒト神経病理学において軸索成長を促す有用な療法であることを示すものである。
【０３５７】
さらなる実験を行って、他の神経栄養因子またはPDGF-Ａ、Ｂ、Ｃおよび／またはＤ成長因子と組み合わせて、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄで軸索外植片を治療する相乗的効果を測定する。
【０３５８】
VEGF-ＣおよびVEGF-Ｄの効果をさらに胚軸索について評価する。  三叉神経節を、Ｅ10乃至Ｅ12ラット胚から切り出して、Ebendal(1989)に従って調製した三次元コラーゲンマトリックスに埋め込む。  典型的には、３-５神経節を、24-ウェル組織培養プレートに置かれた0.5mlのマトリックス中で培養する。  １％熱不活化ウシ血清を含有する0.5mlのイーグル基礎培地(GIBCO BRL)によって、ゲルを被覆する。  コラーゲンゲルを、同一培地に調製する。  組換えVEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物を培養基に加え、対照培養はいずれかの因子を欠き、また、NGF培養は、陽性対照として供することができる。  神経栄養因子は、一般的には、ng/mlまたはμg/ml濃度、例えば、１、10、25、50、100または200ng/mlで適用される。  外植片培養は、VEGF-Ｃ産物またはVEGF-Ｄ産物の存在下または不存在下で、５％CO2を含有する湿潤雰囲気中で、37℃で、インキュベートし、24時間および48時間後に神経突起出芽後成長に関して検証し、任意に、抗神経繊維抗体で染色して、神経突起を良好に可視化する。
【０３５９】
Ｃ．脊髄損傷のモデルにおけるVEGF-ＣまたはVEGF-Ｄの神経栄養効果
神経外傷または損傷の治療における主な課題は、損傷部位での軸索の再生にある。  軸索再生の刺激に関するVEGF-ＣおよびVEGF-Ｄ産物の神経栄養効果を評価するために、脊髄損傷のラットモデルを用いる。  例えば、Facchiano et al.(J. Neurosurg. 97: 161-68. 2002)に従って、成体ラットを、Ｔ-８レベルの脊髄において横方向に切開し、病巣の部位にて、治療剤の遅延放出を可能とするマトリックスゲルに懸濁させたVEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物を投与する。  動物には、腹腔内、静脈内または眼球後注射のようなその他の周知の治療経路を介して、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物を投与することもできる。  全身投与は任意であるが、損傷部位への局所投与が好ましい。  治療すべき動物の大きさおよび種類に応じて、有効量のVEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物を投与し、１回の治療で投与することができるか、あるいは２日毎、１週間に１回、または治療すべき動物に効果的ないずれかの他の治療管理計画下で投与することができる。  対照動物は、治療を受けないか、またはウシ血清アルブミンのような無関係のタンパク質での治療を受ける。
【０３６０】
VEGF-Ｃ-またはVEGF-Ｄ-治療動物における軸索再生の程度を評価するために、処置の後の種々の時点において、例えば、初期脊髄横方向切開から14日、21日または28日後に脊髄を切開し、軸索の変性を、Facchiano et al.(前掲)の方法に従って測定し、すなわち、横方向切開部位および新規の軸索の先端までの距離を測定して、軸索が成長因子に応答して成長するか否か、またはそれらが応答することができず、単に死滅するのかを検証する。
【０３６１】
対照動物と比較したVEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ治療動物における軸索再生の増加は、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄが潜在的神経栄養因子として作用し、運動ニューロン損傷の修復に対して臨界的な軸索再生を促進することを示す。
【０３６２】
前記した実験での交感神経ニューロンまたは運動ニューロンにおけるVEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ受容体を特徴付けるために、(VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ刺激の前および後の双方での)単離されたニューロン細胞を、VEGFR-２、VEGFR-３、NRP-１およびNRP-２に対する抗体で染色する。
【０３６３】
実施例１０：VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄの存在下におけるニューロン前駆細胞の増殖
交感神経ニューロンの培養において、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物の分裂促進能力を定量するために、増殖(MTT)アッセイを行う。
【０３６４】
ニューロン細胞培地で培養した神経節を、飢餓培地(w/o血清)で、VEGF-Ｃ、VEGF-Ｄ、VEGF-Ｃ ΔC156、またはその他の形態のVEFG-ＣまたはVEGF-Ｄ産物、VEGF(またはその他の成長因子)または対照タンパク質で、48時間刺激する。  細胞を、MTT基質、臭化３-[４、５-ジメチルジアゾール-２-イル]-２,５-ジフェニルテトラゾリウム(５mg/ml)と共に、37℃で、４時間インキュベートし、溶解させ、540nmにおける光学密度を測定する。
【０３６５】
加えて、標識指標として、および細胞増殖の尺度として、ブロモデオキシウリジン(BrdU)取り込み、および／または、トリチウム化チミジン取り込みを用いて、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物を、細胞増殖を刺激する能力に関して試験する［Vicario-Abejon et al., Neuron 15: 105-１14(1995)］。  例えば、ニューロン細胞を平板培養し、および、固定に先立って、VEGF-Ｃまたは対照タンパク質の存在下または不存在下で、設定された量と時間で(例えば、18時間)BrdUをパルスする。  細胞を固定し、中和し、BrdUモノクローナル抗体と共にインキュベートする。  そして、BrdU抗体を標識された二次抗体で検出する。  BrdU-陽性細胞が、ニューロンの特殊なサブセットであるかどうかを調べるために、BrdU標識を、前記したニューロン特異的マーカーのための染色と組み合わせる。
【０３６６】
また、NMR顕微鏡測定によってニューロン密度を測定することで、非侵入的方法でニューロン増殖を、in vivoでも測定する(米国特許第6,245,965号を参照されたい)。  加えて、VEGF-Ｃの投与に先立って、その間および／またはその後に、動物モデルおよび対照にBrdUまたはトリチウム化チミジンを投与することができる。  最終の注射の後、動物を麻酔し、および／または、屠殺し、注目する組織を摘出する。  抗BrdU抗体を用いて、あるいは、細胞抽出物中の[3Ｈ]計数値の量を測定することで、これらの組織を、BrdU取り込みに関して分析する。
【０３６７】
VEGF-ＣおよびVEGF-Ｄポリペプチドの断片および類似体を、前記増殖アッセイで用いて、神経幹細胞の成長および分化において有用な最小VEGF-Ｃ断片を測定する。  神経幹細胞成長を刺激することができる最小VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄポリペプチド断片の設計は、血液脳関門を横切るのに十分な小ささのVEGF-ＣまたはVEGF-Ｄポリペプチドを提供することができる。  脳血液関門を横切って流れる治療剤の開発は、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄポリペプチドの投与の侵入的方法を排除することができ、静脈内または皮下注射のような、より温和な治療形態を可能にする。
【０３６８】
実施例１１：神経障害の治療におけるVEGF-Ｃ-またはVEGF-Ｄ-発現アデノウイルス
アデノウイルス、アデノ関連ウイルスおよびレンチウイルスベクターのような遺伝子治療ベクターは、タンパク質のin vivo生産を誘導するための効果的な外因的に投与される製剤であり、in vivoで特異的部位に長く滞留し、定常状態のタンパク質レベルを提供するように設計される。
【０３６９】
神経幹細胞に対する外因性VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄの効果をin vivoで測定するために、ウイルス遺伝子治療ベクターを使用した。 例えば、VEGF-Ｃ(AdVEGF-Ｃ)を含有するアデノウイルス配列ベクター、または核標的化LacZ(Ad-LacZ)導入遺伝子を、Enholm et al., Circ. Res., 88: 623-629(2001);および、Puumalainen et al.(前掲)に記載されているように構築した。  簡単に述べれば、Ad-VEGF-Ｃについては、全長ヒトVEGF-Ｃ cDNAをpcDNA3ベクター(Invitrogen)内のサイトメガロウイルスプロモーター下で、クローニングを行った。  そして、、このベクターのSV40-由来ポリアデニル化シグナルを、ヒト成長ホルモン遺伝子のそれと交換し、転写単位をBamHI断片としてpAdBglIIベクターに挿入した。      
【０３７０】
複製欠陥組換えＥ1-E3-欠失アデノウイルスが、ヒト胚腎臓293細胞で生産され、前述したように超遠心によって濃縮した(Puumalainen et al., Hum. Gene Ther., 9: 1769-1774 (1998))。  アデノウイルス調製物は、ヘルパーウイルス、リポ多糖および細菌学的汚染物を含まないと分析される(Laitinen et al., Hum. Gene Ther., 9: 1481-1486 (1998))。
【０３７１】
神経病理学におけるVEGF-Ｃの評価で有用な齧歯類モデルとして、パーキンソン病のＮ-メチル-４-フェニル-１,２,３,６-テトラヒドロピリジン(MPTP)マウス(Crocker et al., J Neurosci. 23: 4081-91 (2003))、PDのメタアンフェタミン誘導マウスモデル(Brown et al., Genome Res. 12: 868-84 (2002))、6-OHDA誘導PD(Bjorklund et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 2344-2349(2002))、アルツハイマー病のトランスジェニックTg2576マウスモデル(Quinn et al., J Neuroimmunol. 137: 32-41 (2003))、およびADのPDAPPマウスモデル(Hartman et al., J Neurosci. 22: 10083-7 (2002))などがあるが、これらに限定されない。  神経外傷におけるVEGF-Ｃの役割は、ラット横方向切断モデル(例えば、Krassioukov, et al.(Am. J. Physiol. 268: H2077-H2083 (1995))に記載された第四胸椎の横方向切開、および脊髄圧縮モデル(Gorio et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:9450-5 (2002))を用いて評価される。
【０３７２】
VEGF-Ｃアデノウイルスベクター(Ad-VEGF-Ｃ)またはLacZ対照(Laitinen et al., 前掲)アデノウイルスを(５×106乃至５×109プラーク形成単位(pfu)の範囲の)種々の濃度で、感受性マウスに注射する。  アデノウイルスベクターは、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、または局所にて、神経系外傷の部位に投与される。  Ad-VEGF-Ｃは、アルツハイマーまたはパーキンソン病神経変性様兆候の開始の前に投与される。
【０３７３】
パーキンソン病では、治療した動物および対照動物を、前記したように疾患の進行についてモニターし、前記した神経増殖、VEGF-Ｃ発現および神経細胞分化の組織学的評価のために、疾患開始後(開始から３日、７日、10日、14日または21日後)の種々の時点で屠殺する。  さらに他の実施態様によれば、アデノウイルスベクターは、誘導後０日、１日、３日、７日、14日、21日後、または疾患治療の開始後の種々の時点を含む、疾患の治療過程での種々の時点で投与して、ニューロン病の進行および軽減に関するVEGF-Ｃの投与効果を検証する。  さらに、アデノウイルスベクターを、疾患兆候の開始から数日後のいずれかの多数の時点で投与して、神経病理学の部位におけるVEGF-Ｃタンパク質の一定レベルを維持することを意図する。
【０３７４】
アルツハイマー病モデルは、一般的には、動物モデルにおいてより長期の開発時間を必要とする。  ADの進行に対するVEGF-Ｃの投与の評価は、疾患の実験的誘導モデルにおいて、トランスジェニック動物の誕生または疾患の誘導から数週間乃至数ヵ月後に決定される。  VEGF-Ｃ治療は、AD兆候の開始前の種々の時点において投与される。  対照動物が疾患の症状を呈し始めると、VEGF-Ｃ処理動物を屠殺し、脳画分を神経変性およびプラーク形成程度に関してアッセイする。  また、ADの第一の臨床的症状までVEGF-Ｃ治療は投与されず、そして、所定の投与を、種々の時点にわたって投与することを意図する。  VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄは、毎日、毎週、２週間毎またはADの進行を遅延させる上で有効であると判断される他の間隔で投与することを意図する。
【０３７５】
VEGF-Ｃ治療を施した動物モデルでのいずれかの疾患兆候の改善または疾患進行の遅延は、神経変性病の進行を阻害し、または退行させるVEGF-Ｃに関する治療的利点を示すものである。
【０３７６】
実施例１２：Ex vivo VEGF-Ｃ-またはVEGF-Ｄ-治療神経幹細胞の投与
神経幹細胞を、VEGF-Ｃ産物またはVEGF-Ｄを用いてex vivoで処理して、細胞が増殖するよう誘導する。  そして、これらの細胞を、ニューロン発生および増殖を必要とする動物に埋設する。
【０３７７】
グラフト材料としての神経幹細胞の使用は、前駆神経クローンC17.2によって説明されている［米国特許公開第2002/0045261号; Snyder et al., Cell 68: 33-51 (1992); Snyder et al., Nature 374: 367-370 (1995); Park, J Neurotrauma 16: 675-87 (1999); Aboody-Guterman et al., NeuroRepeat 8: 3801-08 (1997)を参照されたい］。  C17.2は、鳥類myc遺伝子を含有するレトロウイルス構築体での感染によって不滅化された誕生後０日の小脳から得たマウス細胞系である。  この系は、lacZおよびneoR遺伝子を構成的に発現するように変換されている。  脳全体の三叉神経ゾーンに移植されたC17.2細胞は、移動し、分裂を停止し、ネズミ脳脊髄幹に沿って複数段階(胎児乃至成体)における複数領域の正常な発生に関与し、予測されたように多様なタイプのニューロンおよび神経膠細胞に分化する。  神経幹細胞のこのクローンは、CNSへの遺伝子導入に関する効果的な手段であるとされている［Snyder et al., Nature 374: 367-70 (1995); Lacorraza et al., Nature Med 4: 424-29 (1996)］。
【０３７８】
ある例によれば、神経幹細胞の成長および増殖を刺激するのに効果的な最適濃度の可溶性VEGF-Ｃを含む前記VEGF-Ｃビーズと共に神経幹細胞をin vitroで培養する。  VEGF-Ｃの濃度は、与えられた時間にわたって、細胞の増殖速度、形態の変化、または細胞分化の状態のような当該技術分野で周知の技術を用いて最適化される。  一旦最適化されれば、VEGF-Ｃを、この最適時間の間、例えば、ビーズ実験における48時間にわたって、神経幹細胞と共にin vitroで培養する。
【０３７９】
そして、VEGF-Ｃと共に培養した神経幹細胞を、米国特許公開第2002/0045261号に記載されたようにnu/nuマウスに埋設する。  神経幹細胞の大脳内への注射は、以下のようにして行う。  例えば、２部の静菌性0.9％NaCl(Abbott Labs, Abbott, Ill.)、および各々１部の20mg/mlのキシラジン(Rompun, Miles, Kans.)および100mg/mlケタミン(Ketalar(商標), Parke-Davis, N.J.)よりなる70μlの溶液での腹腔内注射によって、有効量の麻酔剤を用いて６乃至８週齢の雄のnu/nuヌードマウスを麻酔する。  動物を、定位装置(Kopf, Tujunga, Calif.)で固定して、中線皮膚切開をして、ブレグマの２mm吻および２mm右にドリルで開口する。  ハミルトンシリンジを用いて、細胞を、少なくとも２分間にわたって硬膜から2.5mmの深さまで注射する。  針は、２分間にわたって徐々に引き戻し、骨ワックス(Ethicon, Somerville, NJ)で開口箇所を閉じて、創傷を、Betabine(Purdue Frederick, Norwalk, Conn.)で洗浄する。  二次注射のために、同一手法を反復する。
【０３８０】
動物を、時間別、例えば、２日、４日、５日、６日、７日、10日、14日または21日目に屠殺して、VEGF-Ｃ処理幹細胞の移動を評価する。  動物に、過剰量の麻酔、および引き続きPBSでの心臓内還流を行い、次いで、４％パラホルムアルデヒドと２mM MgCl2(pH7.4)を与える。  脳を摘出し、４℃にて一晩放置-固定し、および、PBSおよび２mM MgCl2(pH7.4)に含まれる30％スクロースに、３乃至７日間で移して、試料を定温保存する。  脳を−80℃で貯蔵し、そして、クリオスタット(Leica CM 3000, Wetzlar, Germany)を用いて、10乃至15ミクロンの一連の冠状画分を切断する。  また、神経幹細胞は、当該技術分野で周知の方法によって、LacZのようなマーカータンパク質でもってしてトランスフェクトする。  これらの細胞を、前述したように培養中のVEGF-Ｃで、または無関係な対照タンパク質、例えば、ウシ血清アルブミンで処理し、動物に注射し、次いで、LacZ遺伝子の存在下でのβ-gal染色に基づいてin vivoで処理する。
【０３８１】
脳画分を染色することで、VEGF-Ｃ処理神経幹細胞の増殖、移動および分化の程度を決定する。  VEGF-Ｃ処理集団における神経幹細胞数のin vivoでの増加、または対照群と比較した神経由来細胞の総数の増加、および増殖後における適当な部位へのそれらの移動の評価は、VEGF-Ｃがニューロン成長の優れた刺激剤であって、ニューロン再生を必要とする患者の治療において有用な療法を提供することを示すものである。  VEGF-Ｃ処理細胞の組織分布の変化は、細胞に対するVEGF-Ｃの移動および分化効果に関する指標を提供するものである。
【０３８２】
前述した神経幹細胞移植を、パーキンソン病、アルツハイマー病、またはその他の神経変性病の動物モデルで用いて、慢性神経変性病において神経病理を改善するVEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ処理神経幹細胞の能力を評価する。
【０３８３】
例えば、VEGF-Ｃ処理神経幹細胞を、パーキンソン病の(MPTP)マウスモデルの影響を受けるマウスに移植する(Crocker et al., 前掲)。  疾患誘導から０日、１日、３日、７日、14日または21日後を含めた、疾患開始の前または後いずれかの疾患治療計画の過程での種々の時点で神経幹細胞を投与して、ニューロン病の進行および軽減に対するVEGF-Ｃ処理神経幹細胞の投与効果を検証する。  動物を、経時的に、例えば、神経幹細胞移植から２日、４日、５日、６日、７日、10日、14日または21日後に屠殺して、VEGF-Ｃ処理幹細胞の移動を評価し、対照処理マウスと比較した脳病巣の改善の程度を測定する。  VEGF-Ｃ処理幹細胞の投与を受けるPD動物での脳病巣の大きさの縮小、または運動技量の改善は、VEGF-Ｃが、神経幹細胞増殖の優れたアクチベータとして作用し、神経変性病の程度を緩和するた上で有用な治療剤であることを示すものである。
【０３８４】
この手順を反復して、前記した製剤の組合せを評価する。
【０３８５】
実施例１３：神経変性病を有する患者に対するVEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ療法
Ａ．外因性VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄでの患者の治療
神経変性病の兆候を呈するか、または持続性の神経外傷または損傷を有する患者をVEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物で処理して、神経幹細胞またはニューロン前駆細胞の再生、分化および移動を促す。
【０３８６】
神経変性病の兆候を呈する患者において、前述のVEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物の作用を受ける患者の脳に、例えば、脳室内または被穀内注射、または、カテーテルおよび注入ポンプの使用によって直接に投与する(Olson, L. Exp. Neurol. 124: 5-15 (1993))。  VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄを、患者に対して非毒性であると予め決定された治療上有効量で投与する。  VEGF-Ｃ-またはVEGF-Ｄは、ある単一用量または複数の用量で投与でき、複数用量は、１日に、または治療する医師が最も効果的であると判断した計画に沿って投与することができる。
【０３８７】
また、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物は、神経変性病を有する患者、または、神経外傷または損傷を被った脳脊髄液(CSF)に投与することも意図している。
【０３８８】
神経外傷または損傷を被った患者では、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄもまた、VEGF-Ｃ/Ｄ産物の治療上有効量を、静脈内または皮下に注射して全身投与することができるし、また、神経損傷または外傷の部位に局所投与することもできる。  用量(すなわち、治療剤の濃度および投与管理)は、投与する医師によって決定され、治療すべき患者に対応させて調整することもできる。
【０３８９】
Ｂ．VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ処置した幹細胞の神経変性病を持つ患者への移植
In vitroアッセイで同定されたCNSの多能性神経幹細胞、ニューロン前駆細胞、または神経膠前駆体の特徴を有する細胞を、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物で処理し、またはVEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物を発現するウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、アデノ関連、またはレンチウイルスベクター)で感染させ、そして、神経学的障害を呈する哺乳動物に投与して、これら細胞の治療効果を測定する。
【０３９０】
細胞は、好ましくは、同様のMHC遺伝子型を有する哺乳動物から単離される。  ある方法において、胚幹細胞系を単離および培養して、ニューロン細胞の分化を誘導する。  この手順は、前記したニューロン成長因子を用いて行われる。  細胞を、ニューロンまたは神経膠細胞系に関する細胞表面染色に基づいて、分化の状態に関して評価することができる。  これらの細胞を、引き続いてVEGF-Ｃで培養し、神経変性病を患った患者に導入する。
【０３９１】
神経幹細胞の単離は、米国特許第5,196,315号に記載された手順に従って行う。  一例として、大脳皮質組織は、病理学的処置を受けることができる患者、または摘出されたニューロン腫瘍から取得される。  皮質組織を、灰色および白色物質に関して切開して、灰色物質を、12,000〜14,000ダルトン-カットオフを示すチューブで透析して調製された、Ｄ-バリン(MDV)(Gibco, Grald Island, N.Y.)および15％透析胎児ウシ血清(dFBS)(Gibco)を含有する最小必須培地に直ちに入れる。  そして、組織を細かく粉砕し、150μmメッシュワイヤースクリーンに押し込む。  この細胞懸濁液を、平方センチメートル当たり約１×104細胞の密度で、35mm培養ウェルに分配し、37℃で、７％CO2の湿潤化インキュベーターに入れる。  15％dFBSを含有するMDV中で細胞系を維持し、トリプシン化によって継代する［ハンクスの平衡塩溶液(Gibco)での0.05％(w/v)］。  細胞を、種々の濃度のVEGF-ＣまたはVEGF-Ｄでin vitro処理し、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄのいずれかを発現するウイルスベクターでトランスフェクトする。
【０３９２】
培養した細胞を、脊髄または脳または神経外傷または変性を招いたその他の部位に注射する。  細胞を、ある範囲の濃度で注射して、所望の部位への最適濃度を決定し、脳および動物動物のニューロンに、微量を注射する。
【０３９３】
別法として、細胞を、原形質血餅、コラーゲンゲルまたはその他の遅延放出系に導入して、注射の部位からの細胞の迅速な分散を妨げる。  遅延放出系を、神経病理部位またはその近傍において、動物に引き続いて移植する。  例えば、パーキンソン病を患った患者を治療するために、(20％生存率が見込まれる)移植のための細胞は、外科的検体または死亡後の臓器提供から得た胎児／胚または成体脳組織から単離され、これを均質化して、神経幹細胞マーカーで標識する。  次いで、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)を用いて細胞を分類する。  神経マーカー陽性である細胞を回収し、そして、組織培養でさらに成長させてから処理する。  そして、細胞を、パーキンソン病患者の線条体または黒質に移植する。  移植部位を、細胞の生存性および分化に関してモニターする。
【０３９４】
VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ処理を、神経変性病を治療する際に通常用いられる用法と組み合わせることも意図されている。  例えば、パーキンソン病を有する患者の治療のための管理下で、患者に、プラミペキソールまたはレボドーパのような神経治療剤を、VEGF-Ｃ治療と組み合わせて、あるいは、VEGF-Ｃ培養神経幹細胞の投与後に、１日当たり３回、0.5mgの用量で投与する。  あるいは、患者に、VEGF-Ｃ治療の前、同時または後に、または、VEGF-Ｃ処理した神経幹細胞を移植した後に、１日当たり３回、カルビドーパ／レボドーパの25/100mgを、３回投与する。  もし患者が継続した不能を呈するならば、用量を、最初の10週間の内に増量する。  治療する医師によって、処置方法が、変更および最適化されることは当該技術分野で周知の事項であり、それにより、患者に対して効果的な処置が可能となる。  従って、化学治療剤の用量をさらに変更することもでき、また、神経変性病の効果を軽減する上で効果的な薬剤の組合せでも患者に投与することができる。  例えば、もしコエンザイムＱ10を治療剤として用いれば、それは、VEGF-Ｃ産物と組み合わせて300、または600、または1200mg/日の用量範囲で投与することができる。
【０３９５】
これらの技術および方法は、アルツハイマー病またはパーキンソン病のような神経学的変性病の治療において、またはニューロン細胞が損傷および発作する過程で生じる外傷損傷の治療のために用いられる。  動物患者の神経学的状態に対する治療の効果を、モニターする。  例えば、ニューロン幹細胞のin vivoの増殖は、MRIによって検出できる。  動物における所望の治療効果は、神経病理に影響を受ける動物での改善された運動ニューロン機能および減少したニューロン瘢痕またはニューロン病巣を含む。
【０３９６】
前出のいずれかの実施例は、VEGF-Ｃ産物の代わりに、VEGF-Ｄ産物を用いて行うことができる。  VEGF-Ｄは、VEGF-Ｃと同様の神経細胞成長刺激活性をもたらし、また、神経病理に罹った個体への投与、または神経細胞成長をin vitroで刺激するための移植を施すために、神経病理の兆候を示す患者へ投与する場合において、VEGF-Ｃと同様の方法で用いることを意図している。  加えて、VEGF-Ｄ発現ウイルスベクターは、VEGF-Ｃに関して説明した前述の遺伝子治療にも用いることができる。
【０３９７】
実施例１４：オリゴデンドロサイト前駆細胞で検出されたVEGF-ＣおよびVEGFR-３
ニューロンの発生の調節に加えて、神経前駆細胞は、神経膠細胞およびオリゴデンドロサイトのような神経膠にも発生する。  交感神経節に対するVEGF-Ｃの増殖および生存効果は、VEGF-Ｃも、これらの他の神経細胞タイプの発生において役割を果たすことを示唆している。
【０３９８】
オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)は、胚CNSの特定の病巣におけるＥ12前方から発生する(Spassky et al., Glia 29, 143-48 (2000); Richardson et al., Glia 29: 136-142 (2000); Rowitch et al., Trends in Neurosci., 25: 417-422 (2002))。  OPCの亜集団は、ミエリンの主要タンパク質、プロテオリピッドタンパク質をコードするplp遺伝子の初期発現を特徴とする(Spassky et al., Development 218: 4993-5004 (2001))。  その証拠として、plp+OPCが、Ｅ14.5から出発して、胚視神経(ON)のコロニーを形成し、セマフォリン受容体ニューロピリン-１および-２を発現したことが挙げられる。  しかしながら、ニューロピリンリガンドSema3Fに関する転写体は、視神経では検出されなかった。
【０３９９】
発生する胚でのオリゴデンドロサイト前駆細胞における選択されたリガンドおよび受容体分子の発現を測定するために、前脳、特に、視神経でのVEGF-Ｃ、VEGF-Ｄ、VEGF-Ａ、VEGFR-２、VEGFR-３およびニューロピリン-２の発現を、免疫標識によって評価した。  Ｅ15およびＥ16脳のパラフィン画分を、VEGF-ＣまたはVEGFR-３(R&D Systems)で染色し、または、抗VEGF-Ｃで二重標識し、続いて、抗神経膠フィブリル酸性タンパク質抗体(Dako)で処理して、神経膠星状細胞を同定した。
【０４００】
VEGF-Ｃタンパク質の強力な発現は、視神経、キアスマ領域、および腹側間脳内の視覚帯を含めた視覚管に主として局所した神経細胞のＥ15において検出された。  視神経のコロニーを形成すオリゴデンドロサイトの一部を発生させることが知られているキアスマ上ドメインにおいて(Ono et al., Neuron 19: 283-292 (1997))、VEGF-Ｃ+細胞は脳室層および下方の実質層の双方で検出できた。  Ｅ16では、VEGF-Ｃの発現を低下させ、網膜の乳頭までが、視神経の中央領域によって制限を受け、また、VEGF-Ｃを発現する細胞は、GFAP陰性であった。  VEGF-Ｃ+細胞は、網膜に入らなかった。  Ｅ18では、発現は依然として強かったが、視神経の末端部分に制限されていた。  P4では、VEGF-Ｃの発現は低く、かつ緩慢であった。
【０４０１】
VEGF-Ｄタンパク質は、低レベルで発現され、また、散漫な染色を示した(Ｅ15、Ｅ16およびP4)。  ON発生のいずれかの段階においては、VEGF-Ａ+細胞は、神経内で観察されなかった。  Ｅ15およびＥ16において、VEGFR-３の発現は、視神経において低いレベルで検出され、神経の中央領域に制限されていた。
【０４０２】
視神経に加えて、VEGF-Ｃの発現は、嗅覚球、大脳皮質、海馬および視覚皮質、腹側視床下部、後連合および腹側橋を含めた、脳における網膜神経質細胞およびニューロンでの限定された集団にて検出された。  また、VEGF-Ｃに関するmRNA発現の同様なパターンも、ヒトの脳で認められた。  末梢神経系において、VEGF-Ｃは、頭側および後根神経節の細胞によって強く発現された。  VEGF-Ｃとは対照的に、VEGF-ＡまたはVEGF-Ｄは、検証したいずれの発生段階においても、視神経では検出されなかった。  VEGF-Ａの発現は、視神経の近傍の動脈の血管壁で観察され、VEGF-Ｄは歯乳頭で検出された。
【０４０３】
VEGF-Ｃを発現する細胞の表現型を特徴付けるために、我々は、lacZレポーターが、一つのVegf-c対立遺伝子を置換するヘテロ接合性Vegf-cノックインマウスを用いた(Karkkainen et al., Nat Immunol 5: 74-80 (2004))。  Ｅ15.5およびＥ17.5 Vegf-c+/-脳の低温画分を、抗β-gal抗体で標識した。  β-gal発現の空間-時間パターンは、内因性VEGF-Ｃのそれを模倣しており、このことは、視神経細胞が、VEGF-Ｃを生成することを示すものに他ならない。  画分を、放射状神経膠および星状神経膠細胞(抗Glast27)、成熟神経膠星状細胞(抗GFAP)、ニューロンおよび軸索(TuJ1)、内皮細胞(抗PECAM)、またはOPC(抗Olig２)に特異的なマーカーで二重標識した。  免疫組織化学分析を行った。
【０４０４】
Ｅ15.5では、長手方向に神経まで延びるGlast+繊維によってβ-galが発現された。  対照的に、Ｅ17.5の神経末梢で検出されたGFAP+神経膠星状細胞は、β-gal陰性であった。      
【０４０５】
β-gal発現は、網膜神経節細胞から延びるTuj1+軸索において観察されず、また、神経の稀なPECAM+血管によって観察されることはなかった。  神経または腹側間脳のOlig2+OPCでは、β-gal発現は、検出されなかった。  後者の領域では、VEGF-Ｃは、視床下部の腹側正中核に局所的に発現された。  これらを総合すると、これらの結果は、血管内皮成長因子の中で、VEGF-Ｃのみが、生成した視神経の放射状神経膠および星状膠前駆体によって生産され、合成されることを示す。
【０４０６】
胚視神経におけるVEGF受容体の発現を、VEGFR-１、VEGFR-２またはVEGFR-３に対する抗体で標識されたＥ15.5およびＥ17.5ヘッドの系列的低温画分を用いて分析した。  検証したすべての発生段階において、VEGFR-１およびVEGFR-２の発現は、頭部間葉および神経上皮内の血管の内皮で検出され、その一方で、VEGFR-３は、頭部間葉におけるリンパ内皮細胞によって発現された。  Ｅ15.5では、VEGFR-１またはVEGFR-２はそうでなかったが、VEGFR-３の発現は、視神経で観察された。  Ｅ17.5では、多数のVEGFR-３+細胞が視神経で検出された。  VEGFR-３を発現する細胞の表現型を確立するために、低温画分を抗VEGFR3および抗Olig2抗体で標識した。  VEGFR-３標識の点状かつ鎖様パターンは、視神経におけるOPCのOlig2+核染色でもってして局在化した。  視神経に加えて、VEGFR-３の発現は、この発生段階におけるOPCの密集団を有するプレ視覚領域(Prestoz et al., Neuron Glia Biol. 1: 73-83 (2004))、ならびに嗅覚球および扁桃のようなその他の前脳領域でも検出された。  多数の二重標識VEGFR-３+/Olig2+OPCが、これらの領域で検出された。  Ｅ17.5のヘテロ接合性Vegfr-3/lacZ-ノックインマウス(Dumont, et al., Science 282: 946-9 (1998))の脳におけるβ-galおよびOlig2についての二重染色もまた、二重陽性細胞を示した。
【０４０７】
加えて、成体脳でのVEGF-Ｃ受容体の発現は、注目する遺伝子に関するヘテロ接合性LacZレポーターマウスを用いて、成体中枢神経系(CNS)でのVEGFR-２およびVEGFR-３の免疫染色によって評価した。  これらの実験は、VEGFR-３の発現が、中央手綱核、視床前および中央部核、ならびに脳弓下器官を含めた、大脳の明確に定められた領域で検出されたことを示した。  VEGFR-２は、大脳血管、ならびに上衣細胞層によって発現された。
【０４０８】
これらの観察は、視神経における神経膠細胞の補充的集団、および成体CNSが、VEGF-Ｃおよびその高度な親和性を有する受容体VEGFR-３を選択的に発現することを示す。  VEGF-Ｃは、神経に固有の放射状神経膠細胞および／または未成熟星状神経膠細胞によって発現され、その一方で、VEGFR-３は、脳に由来し、神経のコロニー形成を促すOPCによって発現される。  これらの結果は、視神経からの放射状神経膠／星状神経膠-前駆体-由来VEGF-Ｃが、その受容体VEGFR-３を発現するOPCに対して作用することを示すものである。
【０４０９】
実施例１５：VEGF-Ｃはオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を誘導する。
【０４１０】
オリゴデンドロサイトに対するVEGF-Ｃの増殖効果を検証するために、Ｅ16視神経の解離した細胞培養物を、成長因子で培養して、生存および増殖に対する効果を測定した。
【０４１１】
視神経は、Ｅ16.5野生型またはニューロピリン-２-/--lacZノックイン(NPN2ki)マウスのいずれかから単離した。  細胞を解離させ、(非トランスフェクトCOS細胞の50％の上清を含有する)対照培地、あるいはSema 3F、VEGF-ＣまたはVEGF165を分泌するCOS細胞の50％上清の存在下で培養した。  １日開けて、in vitro(１DIV)、BrdUは、48時間で取り込まれた。  培養を、４％パラホルムアルデヒド中で３DIVにて固定し、そして、抗A2B5オリゴデンドロサイト抗体および抗BrdUで染色した。  A2B5+細胞およびA2B5+/BrdU+の数を計数した。  VEGF-Ｃは、対照細胞と比較して２倍のBrdU取り込みを誘導し、その一方で、VEGF165-処理細胞の増殖は、対照細胞と同等であった。  また、Sema 3Fは、OPCに対する栄養効果を示した。  OPCの増殖は、VEGF-ＣおよびSema3Fの組合せによって有意に増加しなかった。  この結果は、双方のリガンドは、同一の受容体、おそらくはニューロピリン-２を用いて、OPCに対するそれらの栄養効果を誘導することを示唆するものである。  Sema 3Fの効果は、OPCの表面におけるニューロピリン-２の発現の不存在下で消失する。
【０４１２】
オリゴデンドロサイト前駆細胞は、VEGF-Ｃの存在下で他の神経細胞型と比較して改善された生存性を示した。
【０４１３】
実施例１６：オリゴデンドロサイト成長を促進するVEGF-Ｃ分泌細胞の同定
VEGFR-３は、視神経およびキアズムにおいてのみならず、脳中のOlig2+オリゴデンドロサイト前駆細胞の大部分において、オリゴデンドロサイト前駆細胞によって特異的に発現されるように思われる。  OPCにおけるVEGFR-３の発現の役割を測定するためには、VEGFR-３またはニューロピリン受容体いずれかを介してOPC増殖を刺激するVEGF-Ｃ-分泌細胞の表現型を同定するのが有用である。
【０４１４】
plp-GFP構築体を発現するマウスを用いて、CNSにおけるVEGF-Ｃの発現を評価する(Jiang et al., J Neurobiol. 44: 7-19 (2000))。  緑色蛍光タンパク質(GFP)構築体は、PLPプロモーターを含むPLP発現構築体に連結させると、GFPは、一次混合神経膠細胞培養物由来のオリゴデンドロサイトで特異的に発現される。  Ｅ16.5視神経および腹側間脳の細胞は、plp-GFP+およびplp-GFP陰性細胞から単離され、各細胞型からのmRNAを単離して、VEGF-Ｃ転写体の存在を評価する。  加えて、これらの単離された細胞を前記したように固定し、VEGF-Ｃ、VEGF-Ｄ、VEGFR-３、GFAPおよびnkx2.1(Ｅ12.5で開始する内因性視神経細胞によって発現される転写因子)に対する抗体、および前述したその他の神経細胞マーカーで免疫標識して、VEGF-Ｃタンパク質を検出する。
【０４１５】
また、神経細胞でのVEGF-Ｃの発現は、VEGF-Ｃ「ノックイン」マウスにおけるlacZ標識の分析を通じて評価するものとし、そこでは、VEGF-Ｃは、ケラチンK14プロモーターへの連結を介して過剰に発現され(Veikkola et al., EMBO J., 20: 1223-1231 (2001))、また、lacZ遺伝子を発現するように設計される。  X-Galの全マウント染色およびWT、+/-および-/-視神経のBlue-O-Gal染色は、Ｅ15.5乃至16.5で行われる。  視神経の全マウント染色では、各眼頂の背後に位置する神経を切断し、視神経が付着した脳を摘出することによって、胚から脳を単離する。  一旦脳が単離されたならば、髄膜を、特に、腹側間脳および視神経の周りで摘出する。  神経を４%PFAで、１時間固定し、300ミクロンの厚みの画分に切断し、これらの画分の少なくとも一つがキアズマおよび二つの視神経を含むように注意する。  組織スライドを洗浄し、X-GalまたはBOGに浸漬して、VEGF-Ｃの染色および発現を明確化する。
【０４１６】
オリゴデンドロサイトは、Ｅ14.5で開始して視神経に入るので、X-Gal染色は、もしオリゴデンドロサイトがVEGF-Ｃを分泌すれば、発生のこの段階において、WTと無変異体との間で修飾されると予測される。  WTと突然変異体細胞との間のX-Gal染色に変化がないことは、VEGF-Ｃが、オリゴによって分泌されないが、内因性神経細胞によって分泌されることを示す。
【０４１７】
オリゴデンドロサイトおよびオリゴデンドロサイト前駆細胞の移動および分化に対するVEGF-ＣおよびVEGF-Ｄの効果は、前述した通りであり、また、当該技術分野で周知の外植片および細胞染色アッセイを用いて行われる(Wang et al., J Neurosci. 14: 4446-57 (1994); Bansal et al., Dev Neurosci. 25: 83-95 (2003))。  加えて、VEGF-Ｃ K14またはVEGFR-３ K14トランスジェニック動物のいずれかにおいて、オリゴデンドロサイト増殖および移動を分析して、オリゴデンドロサイト機能に対するVEGF-Ｃ/VEGFR-３信号伝達の効果を測定する上で有用であろう。
【０４１８】
実施例１７Ａ：VEGF-Ｃは、特に、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖および生存を促すが、神経膠細胞ではそうではない。
【０４１９】
OPCにおけるVEGF-Ｃ/VEGFR-３信号伝達の生物学的有意性を分析するために、VEGF-Ｃに対するOPCの増殖応答をin vitroで検証した。  解離した細胞は、Ｅ16.5視神経に由来し、BrdU、および増大した濃度の組換えラットVEGF-Ｃ(10乃至150ng/ml)の存在下で、24時間および48時間培養した。  これらの培養は、星状神経膠前駆体およびOPCから構成された(Shi et al., J Neurosci 18: 4627-36 (1998); Small et al., Nature 328, 155-7 (1987); Mi, et al., J Neurosci 19: 1049-61 (1999))。  OPCは、A2B5モノクローナル抗体で染色することによって検出し(Shi et al., 前掲;Eisenbarth et al., Proc Natl Acad Sci USA 76: 4913-7 (1979); Raff, et al., J Neurosci 3: 1289-1300 (1983))、それらの増殖は、培養におけるBrdU+/A2B5+二極細胞のパーセンテージとして定量した。
【０４２０】
免疫組織化学分析のために、低温画分を、0.1Mホウ酸緩衝液で、６分間マイクロウェーブ処理した。  すべての一次および二次抗体を、各々、４℃で、一晩、および、室温で、２時間インキュベートした。  ヤギ抗-VEGF-A、-C、-D、-R1、-R2および-R3抗体(R&D Systems)を、200ng/mlで用いた。  反応を、チラミドシグナル増幅キット(TSA Biotin Systems, Perkin Elmer, Life Sciences)で増幅した。  Vegf-c/lacZおよびVegfr-3/lacZノックインマウスにおいて、lacZ+細胞を、ヤギ抗-β-ガラクトシダーゼ抗体(Biotrend)(１:500)、次いで、抗ヤギビオチニル化抗体(Amersham)(１:200)およびストレプトアビジン-Alexafluor-594(Molecular Probes)(１:2000)で検出した。  放射状神経膠細胞／星状神経膠細胞前駆体を、共に１：1000に希釈した、モルモットポリクローナル抗体抗Glast(Shibata et al., J Neurosci 17: 9212-9 (1997))およびAlexafluor-488にコンジュゲートした抗モルモット抗体(Molecular Probes)で標識した。  成熟神経膠星状細胞を、ウサギポリクローナル抗体抗神経膠細胞フィブリル酸性タンパク質(抗GFAP, Dako)(１：200)およびAlexafluor-488にコンジュゲートした抗ウサギ抗体(Molecular Probes)(１：1000)で検出した。  ニューロンおよび軸索を、１：500で希釈したマウスモノクローナル抗体 TuJ1(JgG2a; A. Frankfurter, University of Verginiaの贈物)および１：400希釈cy3-コンジュゲーテッド抗マウスIgG2a(Jackson)で同定した。  マウスモノクローナルA2B5抗体(IgM; American Type Culture Collection, Rockville, MD)、またはウサギポリクローナル抗Olig2抗体(Sun et al., J Neurosci 23: 9547-56 (2003))またはマウスモノクローナルO4抗体(IgM)(Sommer et al., Dev Biol 83:311-27 (1981))を用いてOPCを検出した。  抗Olig2抗体を、１：800希釈し、その一方で、A2B5およびO4抗体を、１：10に希釈した。  増殖する細胞を、１：50で希釈したモノクローナルラット抗マウスKi-67抗体(Dakocytomation, Denmark)で標識した。  細胞の核を、５mM Hoechst 33258(Sigma, St-Louis, MO)との画分のインキュベーションによって可視化した。
【０４２１】
Ｅ16.5視神経(OF1マウス)から解離した細胞を、ポリ-Ｌ-リシンで被覆した96ウェルプレート中で(2.5×104細胞/ウェル)、最小培地(MM)またはBS(１%胎児ウシ血清および9.3μg/mlインスリンを補足したMM)のいずれかで、37℃で、培養した。  増殖アッセイでは、解離したＥ16.5視神経を、BrdU(１：1000)および異なる濃度のラット組換えVEGF-Ｃ(10乃至150ng/ml;Reliatech)、ヒトVEGF-Ｃ156S(100ng/ml;R&D Systems)またはVEGF-Ａ(100ng/ml;R&D Systems)を含有するBSで、48時間、培養した。  VEGFR-３-ブロッキング実験では、細胞を、VEGFR-３-Fc(６μg/ml;R&D Systems)と共にプレインキュベートし、および、BrdU、VEGFR-３-FcおよびVEGF-Ｃで培養した。
【０４２２】
分裂する細胞が、BrdUで48時間処理した培養において観察されたことを示すものに過ぎず、このことは、この発生段階における視神経細胞では、むしろ長めの細胞周期を示すものである。  VEGF-Ｃの存在は、OPCの用量依存性有糸分裂応答を誘導し、BrdU+/A2B5+細胞の数は、150ng/mlのVEGF-Ｃの存在下で倍加した。  対照的に、VEGF-Ａは、統計学的に有意なOPC増殖を誘導しなかった。  VEGF-ＡおよびVEGF-Ｃは、共にVEGFR-２に結合するが、VEGF-ＣのみがVEGFR-３に結合する。  VEGF-Ｃに応答して得られる選択的増殖は、信号伝達がVEGFR-３によって媒介されたことを示唆した。  VEGF-Ｃでの処理に先行する可溶性VEGFR-３-Fcとの培養物のプレインキュベーションは、OPCに対するVEGF-Ｃの増殖効果をブロックし、細胞増殖は、対照レベルをわずかに超えたに過ぎなかった。  さらに、VEGFR-２に結合できない(Joukov et al., J Biol Chem 273: 6599-602 (1998))ヒトVEGF-Ｃの組換え突然変異形態(VEGF-Ｃ156S)は、やはりOPC増殖を有意に増加させており、これは、対照細胞よりも大きな約50％の増加であり、このことは、VEGF-Ｃの増殖効果が、VEGFR-３の活性化によって媒介されていることを確認するものである。
【０４２３】
放射状神経膠細胞/星状神経膠細胞前駆細胞および神経膠星状細胞がVEGF-Ｃの存在下で増殖するように誘導できるか否かを検証するために、抗Glastを用いた増殖テストを反復して、放射状神経膠細胞/星状神経膠細胞前駆体を標識し、抗GFAPを用いた試験を反復して、成熟神経膠星状細胞を標識した。  VEGF-Ｃは、Glast+前駆体またはGFAP+神経膠星状細胞の増殖の増加を誘導せず、神経膠細胞増殖は、対照細胞とほぼ同等であった。  これらのデータは、VEGF-Ｃが、OPCに対して分裂促進性であるが、星状神経膠細胞に対してはそうでないことを示すものであって、この効果は、VEGFR-３によって媒介されるものと考えられる。
【０４２４】
ＯＰＣの生存はVEGF-Ｃに直接的に依存する。
【０４２５】
OPCに対するVEGF-Ｃの栄養効果を、細胞生存を促す能力を試験することで、さらに探求した。
【０４２６】
生存アッセイでは、ラット組換えVEGF-Ａ(100ng/ml)、ラットVEGF-Ｃ(100ng/ml)、PDGF-Ａ(10ng/ml;PeproTech. Inc., Rocky Hill, NJ)またはbFGF(20ng/ml; Roche)、ラットVEGF-Ｃ(100ng/ml)+VEGFR-３-Fc(６μg/ml)、VEGF-Ｃ156S(100ng/ml)の存在下で、最小培地(MM)またはBSにて、Ｅ16.5解離視神経を、104細胞/ウェルで、20時間、培養した。  生存細胞を、核の凝縮または断片化をせずにHoechst+細胞として同定した。  各ウェルについては、生存するHoechst+およびHoechst+A2B5+細胞の合計数を計数し、データをスチューデントのt-検定で比較した。
【０４２７】
Ｅ16.5視神経細胞を解離し、無添加、あるいはVEGF-Ｃまたはその他の成長因子いずれかを補足した、最小培地(MM)の存在下で、低密度(104細胞/ウェル)で培養した。  20時間の培養後に、OPCの生存を、A2B5+細胞の数を計数することによって定量した。  この短い培養期間において、OPCの複製は認められず、生存するOPCの数は、培養基の生存特性を反映する。  VEGF-Ａ(100ng/ml)およびVEGF-Ｃ(100ng/ml)に対する増殖応答の比較は、VEGF-Ａが、OPCに対する生存効果を有さず、その一方で、VEGF-Ｃは、生存するOPCの数を５倍増加したことを示した(対照：37±７ A2B5+細胞/ウェル; VEGF-Ｃ: 183±38 A2B5+細胞/ウェル)。  そして、VEGF-Ｃの生存効果を、インスリン(9.3μg/ml)、bFGF(20ng/ml)、またはPDGFR-αの発現OPCに対する栄養因子であるPDGF-Ａ(10ng/ml)のような神経膠細胞の生存を促すことが知られているその他の因子と比較した(Barres et al., Cell 70: 31-46, 1992; Richardson et al., Cell 53: 309-19 (1988))。  VEGF-Ｃとは対照的に、インスリンも、bFGFも、PDGF-Ａも、この発生段階において、A2B5+OPCの生存を改善できなかった。  これらのデータを総合すると、VEGF-Ｃは、PDGF-Ａ独立性OPCに対する特異的な生存促進効果を発揮することを示す。
【０４２８】
ＯＰＣのVEGF-Ｃ-誘導移動
視神経は、腹側間脳からOPCを引き付ける分泌された因子の供給源であるので、VEGF-Ｃが、キアズマOPCに対する化学誘引物質として作用するかどうかを検証した。
【０４２９】
ポリ-Ｌ-リシンで被覆したTranswell Permeable Supports (Corning)を用いて化学走性アッセイを行った。  キアズマ領域を、Ｅ18.5 OF1(Iffa-Credo, France)から単離し、解離したキアズマ細胞(7.5×104)を、DMEM(Gibco)、およびＮ２補足物(Gibco)を含有するF12培地(Promocell)の50/50ミックスでのトランスウェルチャンバー細胞の上方ウェルに加えた。  VEGF-Ｃ(10、50または100ng/ml, Reliatech)またはVEGF-Ｃ156S(100ng/ml;R&D Systems)のいずれかを補足した同一培地を下方ウェルに加えた。  さらなるアッセイのために、VEGF-Ｃ(100ng/ml)を、上方および下方双方のチャンバーに加えた。  37℃で、16時間のインキュベーションを行った後、膜をPBS中の４％パラホルムアルデヒド(PFA)中で15分間固定し、フィルターの下方側のOPCを、抗Olig2および抗O4で免疫標識した。  OPC/mm2の数の定量のために、各ウェルの10乃至14の視野を写真に取り(×20対物レンズ)、Metamorphソフトウェア(Universal Imaging Corporation, US, バージョン6.1.r4)を用いて分析した。  六つの独立した実験のデータを、Mann-Whitneyテストを用いて比較した。
【０４３０】
Ｅ18.5キアズマ領域に由来するOPCを、無添加、または下方ウェルに増大した濃度のVEGF-Ｃ(10乃至100ng/ml)を補足した、対照培地の存在下で、ミクロ化学走性チャンバーアッセイで用いた。  抗Olig2抗体で染色した後に移動するOPCを定量し、O4抗体、OPCのマーカーで二重標識することによって、Olig2+細胞のオリゴデンドロサイト表現型を確認した(Sommer et al., Dev Biol 83: 311-27 (1981))。  Olig2+細胞のほとんど大部分は、O4+OPCであった(Olig2+O4+/Olig2+: 92±6)。  対照と比較して、50ng/mlおよび100ng/mlのVEGF-Ｃは、フィルターを通じて移動したOlig2+細胞の数を有意に増加させ、これは、移動する細胞の２倍よりも大きな増加を示す。  より低濃度のVEGF-Ｃ(10ng/ml)は、OPC移動に対して有意な効果を示さなかった。  上方および下方チャンバー双方へのVEGF-Ｃの添加もまたOPC移動の有意な刺激(約２倍)を示し、このことは、キアズマOPCに対するVEGF-Ｃの化学誘引効果よりはむしろ、化学動的役割を示唆するものである。  OPC移動の増加が、VEGF-Ｃ156Sで処理した細胞で観察されたが、VEGF-Ｃよりも少ない移動を誘導しており、このことは、VEGFR-３が、VEGF-Ｃの刺激効果を媒介することを示すものと言える。      
【０４３１】
従って、視神経分泌VEGF-Ｃは、キアズマOPCを補充して、神経に入り込んで、コロニー形成を促す。
【０４３２】
実施例１７Ｂ：VEGF-Ｃ-欠乏マウスの胚および新生児の視神経でのOPCの著しい欠如
VEGF-Ｃは、視神経の胚発生に影響する。  Vegf-c-/-マウスは、リンパ血管系の発育不全および組織浮腫を呈し、これはＥ18.5前のホモ接合性動物の死亡に至らしめる(Karkkainen et al., Nat Immunol 5: 74-80 (2004))。  前出のin vitroでの知見に基づき、オリゴデンドロサイトの発生を調節するVEGF-Ｃの能力を、VEGF-Ｃが欠乏したマウスで評価した。  胚発生に対するVEGF-Ｃの効果を決定するために、胚段階Ｅ15.5およびＥ17.5におけるVegf-c+/-およびVegf-c-/-突然変異体の視神経を検証した。
【０４３３】
Ｅ15.5については、放射状神経膠/星状神経膠前駆細胞から実質的に構成される、網膜神経節細胞(RGC)および視神経に固有の細胞集団双方を検証した。  網膜には、VEGF-Ｃ-発現β-gal+RGCが、+/-および-/-胚に正常に存在した。  軸索を標識するためにTuJ1モノクローナル抗体を用いたところ、RGC軸策の数および束形成は、野生型(WT)およびVegf-c-/-動物の間で同様であった。  系列的画分に関してHoechst+核を計数することによって評価された視神経細胞の合計数は、WTおよびVegf-c-/-において同様であった(+/+:2317; -/-: 1821, 各々ｎ=１の動物)。  従って、視神経の放射状神経膠/星状神経膠前駆細胞、またはRGCのニューロン集団も、Ｅ15.5については、Vegf-cの不存在下で影響されないようである。
【０４３４】
加えて、Ｅ17.5におけるVegf-c突然変異体のオリゴデンドロサイト表現型を分析した。      
【０４３５】
WT、Vegf-c+/-およびVegf-c-/-胚におけるキアズマおよび視神経の水平低温画分に関して、Olig2+OPCの数を定量した。  ヘテロ接合性およびホモ接合性Vegf-c胚のキアズマにおいて、Olig2+細胞の数は、対照と比較して50％を超えて減少した(+/+: 912±55, +/-: 275±39, -/-: 398±175, 各々ｎ=２の動物)。  Vegf-c+/-および-/-動物双方の視神経において、対照と比較した場合において、Olig2+細胞の約85％の喪失が観察された(+/+: 576±63, +/-: 83±35, -/-: 112±37, 各々ｎ=３の動物)。  従って、Ｅ17.5については、OPCの集団は、ヘテロ接合性およびホモ接合性Vegf-c突然変異体双方の視神経において著しく欠如していると言える。
【０４３６】
Ｅ18.5によるVegf-c-/-胚の致死性は、そのオリゴデンドロサイト表現型の進化の分析の必要性を排除した。  対照的に、Vegf-c+/-マウスは、皮膚リンパ発育不全およびリンパ浮腫があるにもかかわらず、誕生して、その後も生存する。  Ｐ１において、Vegf-c+/-の視神経におけるOlig2+OPCの数は、WT同腹子と比較して、50％だけ依然として減少しており、このことは、神経当たり約1000のOPCの喪失に対応する(+/+: 2030±30; +/-: 1038±144, ｎ=１)。  神経当たりのHoechst+核の合計数の計数は、細胞数の対応する低下を示し(+/+: 10648±264, +/-: 9286±198)、OPCの選択的欠如を示すものである。  Ｅ17.5およびP1の間のVegf-c+/-マウスの比較は、OPC集団が、Ｐ１において部分的に回復したことを示した。
【０４３７】
この部分的回復が、Ｐ１における増大した細胞増殖に由来するものであるかを決定するために、細胞周期に入った細胞を、Ki-67および抗Olig2抗体で標識した。  視神経におけるKi-67+分裂細胞の数(Vegf-c+/+: 72±7細胞/神経；Vegf-c+/-: 61±17細胞/神経；ｎ=２)ならびに増殖するOPCのパーセンテージ(Ki-67+Olig2+/Olig2+細胞：Vegf-c+/+: 8.44±1, Vegf-c+/-: 7.7±0.8)は、WTおよびVegf-c+/-マウスの間で有意差は認められなかった。  従って、Vegf-c+/-動物子孫におけるOPCによる視神経の部分的再集団は、神経にすでに存在するOPCの増殖に由来するものではないが、むしろ、腹側間脳からのOPCによるコロニー形成の余波によるものであろう。
【０４３８】
CNSにおけるVEGF-Ｃに対する役割は未だ報告されていないが、これらの結果は、VEGF-Ｃが神経のコロニー形成および先駆的OPCへの発展への端緒であることを示唆するものである。  従って、VEGF-Ｃ/VEGFR-３信号伝達系は、オリゴデンドロサイト発生で必要であると思われる。  これらの結果は、VEGF-ＣおよびVEGFR-３が、オリゴデンドロサイトを回復するための潜在的治療標的であると考えられる多発性硬化症のようなオリゴデンドロサイト病理でのVEGF-Ｃに対する役割を示すものである。
【０４３９】
実施例１７Ｃ：オリゴデンドロサイト前駆細胞成長におけるVEGF-ＣおよびPDGFの役割
PDGF-Ａ欠乏動物におけるオリゴデンドロサイトに対する以前の報告(Fruttiger et al., Development 126: 457-67 (1999))は、オリゴデンドロサイトが、PDGF-Ａ欠乏動物においては脊髄および視神経から喪失しているが、それらは脳幹では正常に発達し、皮質では依然として存在することを示している。  このことは、オリゴデンドロサイトの成長、生存および分化を刺激する他の成長因子があることを示すものである。
【０４４０】
オリゴデンドロサイト発生におけるPDGFおよびVEGF-Ｃの役割を調べるために、plp-GFPトランスジェニックマウス(Spassky et al., Developmenet.128:4993-5004 (2001))を、ヘテロ接合性vegf-c欠乏動物(Karkkainen et al., 前掲)と交差させて、plp-GFP x vegf-c+/-マウスを作出した。  In vivoでのplp細胞の発生は、成体段階の日であるE9.5から始めて、Olig2+細胞に対する免疫染色を用いて前述したようにして検証する。
【０４４１】
plp細胞の発生は、少なくとも、PLP、VEGF-ＣおよびVEGFR-３が発現される視神経および嗅覚球のような領域において、 VEGF-Ｃの不存在下で損なわれることが予測される。  加えて、plp-GFP x vegf-c+/-系を用いて、OPC発生のいずれの工程において、VEGF-Ｃが作用するかを決定する。  発生の初期段階(E9.5〜14.5)における脳室層におけるplp細胞の欠乏または不存在は、VEGF-Ｃが、plp細胞において必須であることを示している。  胚発生の後期段階で観察されたplp細胞集団の異常は、VEGF-Ｃが、plp前駆細胞の生存、増殖または移動に作用することを示唆する。  また、誕生後のマウスにおいて検出可能な表現型は、VEGF-Ｃが、plpオリゴデンドロサイトの分化およびミエリン成熟化に対して効果を有することを示す。
【０４４２】
オリゴデンドロサイト発生に対するPDGFおよびVEGF-Ｃの二元的役割をさらに調べるために、ヘテロ接合性pdgf-aノックアウトマウス(Bostrom et al., Cell. 85: 863-73 (1996))をヘテロ接合性vegf-c欠乏動物(Karkkainen et al., 前掲)と交差させることによって、pdgf-a+/- x vegf-c+/-マウスを作出する。  オリゴデンドロサイトの発生は、Ｅ12.5の日で開始して調べる。
【０４４３】
pdgf-a+/- x vegf-c+/-動物は、pdgf-aのみが欠乏した動物と比較して、より厳格なオリゴデンドロサイト表現型を示すものと考えられる。  この観察は、識別可能なオリゴデンドロサイト系列の存在を確認し、オリゴデンドロサイト発生の領域的特異性を示す。  Pdgf-a+/- x vegf-c+/-二重ノックアウト動物におけるOPCの存在は、PDGF-ＡまたはVEGF-Ｃのいずれかにも応答しないOPCの他の供給源の存在を示す。
【０４４４】
実施例１８：脱髄病の動物モデルにおけるVEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ処理
オリゴデンドロサイトは、プロテオリピドタンパク質およびミエリン塩基性タンパク質(MBP)、ミエリン鞘の主な構成要素の主要な生産体である。  ミエリン鞘は、中枢および末梢神経系において、神経に対する絶縁性を形成して、神経信号の伝達を補助する。  中枢または末梢神経の脱髄を特徴とする障害または疾患の結果、神経学的機能および神経信号伝達が損なわれる。
【０４４５】
脱髄病の動物モデルは、ヒト脱髄病に対する潜在的療法および治療計画を研究する上で有用である。  例えば、in vivoで脱髄に対するVEGF-Ｃの効果を研究するには、齧歯類脊髄損傷モデルを用いる(Bambakidis et al., J Neurosurg. 99: 70-5 (2003))。  加えて、ギヤンバレー症候群(Zou et al., J Neuroimmunol. 98: 168-75 (1999))、多発性硬化症(Begolka et al., J Immunol. 161: 4437-46 (1998))、急性炎症性脱髄多発性神経障害(Jander et al., J Neuroimmunol. 114: 253-8 (2001))、遺伝子体末梢神経障害(Schmid et al., J Neurosci. 20: 729-35 (2000))、および、化学的に誘導された脱髄(Matsushima et al., Brain Pathol. 11: 107-16 (2001))に対するモデルを含めた多くの脱髄病の動物モデルが存在する。  ペリツェーウス-メルバッヒャー(PM)病(Boulloche et al., J Child Neurol. 1: 233-9 (1986)のようなヒト脱髄病に関しても、jimpy(jp)マウス(Gencic et al., J Neurosci. 10: 117-24 (1990))、またはミエリン欠乏ラット(Boison et al., EMBO J. 8: 3295-302 (1989))を含めた齧歯類における突然変異体plp(プロテオリピドタンパク質)遺伝子のような動物モデルを有する。  これら全文献を、本明細書の一部を構成するものとして、そのすべての内容を援用する。
【０４４６】
臨床的重要性が大きい脱髄病として、自己免疫疾患多発性硬化症(MS)がある。  MSの患者は、運動ニューロン機能の欠如を示し、また、疾患の後期段階には精神機能の欠如も示す。  病理学的には、MS患者は、プラークと呼ばれる神経脱髄領域を有する。  マウス(Begolka et al., J Immunol. 161: 4437-46 (1998); Liblau et al. Trends Neurosci. 3:134-5(2001))またはラット(Penkowa et al., J Neurosci Res. 2003 72: 574-86 (2003))における実験的自己免疫脳脊髄炎(EAE)のような、MSのいくつかの実験動物モデルが存在する。  EAEに冒された動物は、運動能力の欠如を特徴とする再発-軽減脱髄病を呈し、オリゴデンドロサイト損傷の進行および神経軸索の脱髄に対して、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ処置を施した際のin vivo効果を検証する上で有用である。
【０４４７】
MS-様プラークにおけるVEGF-ＣおよびVEGFR-３の発現を調べるために、ある実施例において、SJL/Jマウスを、アジュバント内の抗原性プロテオリピドタンパク質またはアジュバント内のミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)(Bogolka et al., 前掲;Liblau et al., 前掲)で免疫化し、再発/軽減脱髄病を発生させた。  種々の時点において、例えば、疾患兆候(軟弱な尾および損なわれた歩行能力)の開始の前または後の５日、７日、10日、12日、14日、16日、18日または21日目に、オリゴデンドロサイト増殖および損傷した軸索の再髄形成を誘導するのに効果的な所定量のVEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ動物を投与する。  動物を、疾患の進行過程で屠殺し、脳および脊髄を、Dal Canto et al.(Mult Scler. 1: 95-103 (1995))に記載された軸索脱髄および再髄形成の程度に基づいて評価する。
【０４４８】
加えて、脳および脊髄組織を前述の各抗体で免疫染色、また、in situハイブリダイゼーションにおいて、VEGF-Ｃ/-Ｄ受容体に対するアンチセンスリボプローブを用いることによって、VEGF-Ｃ、VEGF-Ｄ、VEGFR-３、VEGFR-２、NRP-１またはNRP-２のオリゴデンドロサイトの発現を評価する。
【０４４９】
再発軽減脱髄病を有するVEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ処理動物における損傷した軸策の再髄形成の増加は、VEGF-Ｃが、オリゴデンドロサイトの増殖およびミエリンの継続した増加を誘導し、または、予め存在するオリゴデンドロサイトが、ミエリン産物の発現をアップレギュレートするように誘導することを示すものである。  また、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄで処理した罹患したマウスにおける臨床的兆候の重篤度の低減は、VEGF-Ｃ/Ｄ処理が、MSの実験モデルにおける脱髄の深刻さを低下させる上で効果的な治療であり、また、ヒトMS患者で用いる上でも効果的であろうことを示す。
【０４５０】
加えて、多発性硬化症の動物モデルを用いて、疾患兆候の軽減に対する移植された神経幹細胞の効果を評価する(Pluchino et al., Nature 422: 688-94 (2003); Totoiu et al., Exp Neurol. 187: 254-65 (2004))。  動物または前述した神経幹細胞クローンに由来する神経幹細胞を、まず、例えば、lacZ遺伝子または緑色蛍光タンパク質でのトランスフェクションによって検出可能なマーカーで標識し、続いて、無添加、または前述した他の神経成長因子と共にin vitroにてVEGF-Ｃと共に培養して、神経幹細胞の増殖を刺激する。  培養の後、疾患誘導の前、それと同時またはその後の種々の時点において、EAEに罹患した動物または対照動物への静脈内、脳室内またはその他の適当な経路のいずれかによって細胞を投与する(Pluchino et al., 前掲)。  そして、移植された細胞を免疫標識を介して追跡して、移動のパターンおよび増殖状態を測定する。
【０４５１】
また、神経幹細胞の移植の後に、ex vivo刺激細胞を与えられるマウスにVEGF-Ｃ組成物を投与して、神経幹細胞増殖の促進を継続する。  さらに、オリゴデンドロサイト前駆細胞は、VEGF-Ｃ遺伝子(Magy et al., Example. Neurol. 184: 912-22 (2003)を参照されたい)でトランスフェクトし、脱髄病に罹った動物に移植することができる。
【０４５２】
Ki-67染色によって検出されたオリゴデンドロサイト前駆体の増殖の増加、またはVEGF-Ｃ/Ｄ刺激細胞を受ける、および／または補足的VEGF-Ｃ/Ｄ処理を受ける動物における脊髄での再髄形成の増加は、VEGF-Ｃおよび／またはVEGF-Ｄが、オリゴデンドロサイト前駆体刺激における優れた刺激体であり、脱髄によって媒介される疾患または状態によって影響される個体において有用な治療剤を提供することを示す。
【０４５３】
これらの手法は、本願明細書に記載された組合せ療法を用いて反復される。
【０４５４】
実施例１９：VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物でのヒト脱髄病の治療
神経病理の治療に関する実施例12および13に記載されたプロトコルと同様に、ヒト患者を、VEGF-ＣおよびVEGF-Ｄで治療するか、またはオリゴデンドロサイト前駆細胞を投与して、脱髄病に由来する疾患を改善する。  中枢神経系の炎症性脱髄病は、多発性硬化症および白質萎縮症を含む。  加えて、中枢神経系でのある程度の脱髄に由来する疾患または状態は、フェニルケトン尿症、脳室周囲白質軟化症(PVL)、HIV-１脳炎(HIVE)、ギヤン-バレー症候群(GBS)、急性炎症性脱髄多発性神経障害(AIDP)、急性運動軸索神経障害(AMAN)、急性運動感覚軸索神経障害(AMSAN)、フィッシャー症候群、急性自立神経異常、およびクラッベ病を含む。  末梢神経系におけるVEGF-Ｃおよび-Ｄの高発現に基づいて、VEGF-Ｃまたは-Ｄ産物もまた、MADSAM(ルイス-スムナー症候群としても知られた多病巣後天性脱髄感覚および運動神経障害)およびDADS(遠位後天性脱髄対称神経障害)を含めた、慢性炎症性脱髄多発性神経根神経障害(CIDP)を含めた抹消脱髄病の治療で試験することができる。
【０４５５】
例えば、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物を治療と組み合わせて投与して、多発性硬化症に罹った個体において兆候を改善することができる。  MSに対する多くの現行の療法は、インターフェロンベータ１-ａ(Avonex(登録商標))、インターフェロンベータ１-ｂ(Betaseron(登録商標))、酢酸グラチラメール(Copaxone(登録商標))、インターフェロンベータ-１ａ(Rebif(登録商標))、ナタリズマブ(アンテグレン)-アルファ-４インテグリンに対する抗体、ダクリズマブ-CD25分子に対する抗体、または非常に攻撃的な場合における抗新形成薬物ミトキサントロン(Novantrone(登録商標))のような免疫調節療法を含む。  VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物が、非ステロイド抗炎症薬物(NSAID)、鎮痛剤、グルココルチコイド、疾患修飾抗リウマチ薬物(DMARD)またはバイオロジック応答修飾剤を含めた、炎症を軽減することを意図した投薬と組み合わせて投与される処方をさらに意図している。
【０４５６】
MS患者には、推奨される用量において前記した免疫調節療法の内のいずれか一つを投与し、例えば、レビフ(Rebif)が、１週間に３回、44mcgの用量で投与され、また、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物いずれかの治療用量が与えられる。  各産物の用量は、組合せ療法に対して最適化され、例えば、MS治療剤の量は、VEGF-Ｃ/Ｄ療法の添加のため低下させることができる。  そして、不能進行の危険性の低下、疾患重症度の亢進の低下、(MRIで示したような)脳における活動的病巣の数および大きさの低下、および第二の疾患亢進までの時間のいずれかの遅延のような疾患兆候における変化に関して患者を評価する。  VEGF-ＣおよびVEGF-Ｄ産物は、同一組成物において、および／または前述した療法と同一方法を用いて投与されると考えられ、例えば、Avonex(登録商標)は筋肉内注射され、その一方で、Betaseron(登録商標)、Glatiramer(登録商標)、およびRebif(登録商標)は皮下注射される。  別法として、VEGF-Ｃ/Ｄ産物は、別々の治療組成物において静脈内注射を介して投与される。
【０４５７】
また、中枢神経系での脱髄に由来する疾患の兆候を呈する患者においては、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物が罹患した患者の脳または脊髄に直接的に、例えば、脳室内または被殻内注射により、またはカテーテルおよび注入ポンプの使用によって投与される(Olson, L. Exp. Neurol. 124: 5-15 (1993))。  VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄは、患者にとって非毒性であると予め決定された治療上有効量で投与される。  VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄは、ある単一用量または複数の用量で投与することができ、複数用量は１日に、または最も効果的であると治療する医師によって決定された治療計画に沿って投与することができる。  また、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物は、中枢神経系での脱髄に由来する疾患を有する患者の脳脊髄液(CSF)への投与を意図している。
【０４５８】
さらに、脱髄に由来する疾患に罹った動物は、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ処理幹細胞、または処理されたオリゴデンドロサイト前駆細胞の移植を受けることも意図している。
【０４５９】
In vitroアッセイによって同定されたCNSの多能性神経幹細胞、ニューロン前駆体、またはオリゴデンドロサイト/神経膠前駆細胞の特徴を有する細胞を、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物で処理するか、またはVEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ産物を発現するウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、アデノ関連、またはレンチウイルスベクター)で感染させ、神経学的障害を呈する哺乳動物に投与して、これらの細胞の治療効果を測定する。
【０４６０】
この細胞は、好ましくは、同様のMHC遺伝子型を有する哺乳動物から単離される。  ある方法において、胚幹細胞系を単離し、培養して、オリゴデンドロサイトに向けての分化を誘導する。  これは、前述したように、オリゴデンドロサイト成長因子を用いて行われる。  細胞を、オリゴデンドロサイトまたは神経膠細胞系に関する細胞表面染色に基づいて、それらの分化の状態に関して評価できる。  これらの細胞を、VEGF-Ｃで引き続いて培養し、中枢神経系における脱髄に由来する疾患または状態に罹った患者に導入する。  移植されたオリゴデンドロサイトを受ける動物は、病巣の大きさ/髄形成を評価するためのMRIスキャン、または患者の運動性および強度、拡大不能状態スケール(EDSS)(O'Connor et al., Neurology 62: 2038-43 (2004))に関する試験のような技術を用いて、疾患兆候の改善について評価する。
【０４６１】
MSに対する療法としての成長因子、例えば、FGF-２、PDGF-Ａ、IGF-２は、脈管形成性および／または腫瘍形成性であることが多いので、これら因子を用いる試みは、これまでは成功しなかった。  VEGF-Ｃが、リンパ管形成性であると仮定し、かつCNSにはほとんど、または全くリンパが無いという事実を仮定すれば、このことは、有害な二次脈管形成効果が、VEGF-Ｃ産物で治療する場合に最小化されることを示しており、つまり、(VEGF-Ｃ ΔC156を含めた)これら因子は、神経障害の治療での治療的開発のための有望な候補であると言える。  また、これまでの研究は、VEGFR-３陽性およびPDGFR-α陽性OPCが、二つの区別可能な細胞集団であることを示唆している。  従って、VEGF-Ｃ/-ＤおよびPDGF-Ａ双方を用いることで、より広範な効果が、脱髄病を有する患者を治療する上で獲得することができるであろう。
【０４６２】
ニューロピリンまたはVEGF-ＣおよびVEGF-Ｄポリペプチドの代わりにペプチドライブラリーまたは化学化合物ライブラリーをスクリーニングすることによって同定された小さな有機または無機分子を用いる実施例の実施を、特に意図している。  ニューロピリン/VEGF-Ｃ、VEGFR-３/VEGF-Ｃ、VEGF-Ｄ/VEGFR-３および／またはニューロピリン/VEGFR-３相互作用のモジュレーターとして同定された小分子および化学化合物は、ニューロン細胞の成長および再生を必要とする状態を治療するための治療組成物として、また、VEGF-ＣまたはVEGF-Ｄ活性によって媒介されるニューロン細胞またはオリゴデンドロサイト前駆細胞の異常な成長、移動または増殖を特徴とする疾患の治療のための医薬の製造において有用である。
【０４６３】
これまでの説明は、本願発明に関するものであり、また、例示的な説明でしかなく、特許請求の範囲に記載の発明の限定を意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０４６４】
【図１】ニューロピリン-２ IgＧ融合タンパク質ａ17およびａ22の発現ベクターの構築を模式的に示す図である。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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