(57)【要約】本明細書に開示される方法および装置は、増強ラマン分光法による核酸の特徴付けに関する。本発明の特定の態様において、核酸のエキソヌクレアーゼ処理がヌクレオチドの遊離を生じさせる。このヌクレオチドは、反応チャンバーから微小流体チャネルを通過し、ナノチャネルまたはマイクロチャネルに入り得る。このナノチャネルまたはマイクロチャネルは、ラマン検出のためのホットスポットを含むナノ粒子集合体とともに充填されてもよい。ヌクレオチドがナノ粒子ホットスポットを通過する時、これらはラマン分光法によって検出され得る。核酸から遊離するヌクレオチドの配列の同定は、例えば、核酸を配列決定または同定することによって、核酸を特徴付けするために使用される。本発明の他の態様は、核酸配列決定のための装置に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む方法：
a）少なくとも1つの核酸分子の1つの末端からヌクレオチドを連続的に除去する工程；
b）ナノ粒子が充填されたチャネルを通してヌクレオチドを移動させる工程；
c）ラマン分光法によって1つまたは複数のヌクレオチドを同定する工程；および
d）核酸を特徴付ける工程。
【請求項２】
エキソヌクレアーゼ活性によってヌクレオチドが核酸から除去される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
単一のヌクレオチド分子を同定する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
ヌクレオチドが標識されていない、請求項3記載の方法。
【請求項５】
ヌクレオチドが標識されている、請求項3記載の方法。
【請求項６】
単一のアデノシンヌクレオチド分子を同定する工程をさらに含む、請求項3記載の方法。
【請求項７】
アデノシンヌクレオチドおよびグアノシンヌクレオチドのみが同定される、請求項1記載の方法。
【請求項８】
シチジンヌクレオチドおよびチミジンヌクレオチドのみが同定される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
ヌクレオチドからのプリン塩基またはピリミジン塩基を分離する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
分離されたプリン塩基またはピリミジン塩基がラマン分光法によって同定される、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
単一の核酸分子が配列決定される、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
表面増強ラマン分光法（SERS）、表面増強共鳴ラマン分光法（SERRS）、および/またはコヒーレント反ストークスラマン分光法（CARS）によってヌクレオチドが同定される、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
チャネルがナノチャネルまたはマイクロチャネルである、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
核酸を同定する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
核酸を配列決定する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
核酸中の一塩基多型を同定する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
以下の工程を含む方法：
a）標識されたヌクレオチドを含む核酸を調製する工程；
b）核酸の1つの末端からヌクレオチドを連続的に除去する工程；
c）ナノ粒子が充填されたチャネルを通してヌクレオチドを移動させる工程；
d）ラマン分光法によって1つまたは複数のヌクレオチドを同定する工程；および
e）核酸を特徴付ける工程。
【請求項１８】
各種のヌクレオチドが区別可能なラマン標識で標識される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
ピリミジンヌクレオチドのみが標識される、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
プリンヌクレオチドのみが標識される、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
単一のヌクレオチド分子が同定される、請求項17記載の方法。
【請求項２２】
単一のアデノシンヌクレオチド分子を同定する工程をさらに含む、請求項17記載の方法。
【請求項２３】
核酸からヌクレオチドを分離する工程をさらに含む、請求項17記載の方法。
【請求項２４】
チャネルを通してヌクレオチドを移動させるための電場を課す工程をさらに含む、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
各ヌクレオチドがチャネルを通過する時間を記録する工程をさらに含む、請求項12記載の方法。
【請求項２６】
以下を含む装置：
a）反応チャンバー；
b）該反応チャンバーと液体で連絡している第1のチャネル；
c）該第1のチャネルと液体で連絡している第2のチャネル；
d）該第2のチャネル中に充填されている多数のナノ粒子；および
e）ナノ粒子が充填されたチャネルに機能的に連結されているラマン検出器。
【請求項２７】
装置が単一のヌクレオチド分子を検出可能である、請求項26記載の装置。
【請求項２８】
第1のチャネルから第2のチャネルにヌクレオチドを移動させるための第1の電極および第2の電極をさらに含む、請求項26記載の装置。
【請求項２９】
第1のチャネルが微小流体チャネルである、請求項20記載の装置。
【請求項３０】
第2のチャネルがナノチャネルまたはマイクロチャネルである、請求項20記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明の方法、組成物、および装置は、分子生物学およびゲノミクスの分野に関する。より詳細には、これらの方法、組成物、および装置は、ラマン分光法による核酸の特徴付けに関する。特徴付けには、核酸の同定または配列決定が含まれ得る。
【０００２】
関連出願
本願は、2002年5月26日に出願された、米国特許出願番号第10/108,128号の一部継続出願である。
【背景技術】
【０００３】
背景
遺伝情報は、染色体に組織化されている非常に長いデオキシリボ核酸（DNA）の分子の形で保存されている。ヒトゲノムは、約30億塩基のDNA配列を含む。このDNA配列情報は、各個体の複数の特徴を決定する。多くの一般的な疾患は、少なくとも一部、DNA配列のバリエーションに基づいている。
【０００４】
ヒトゲノムの完全配列の決定は、このような疾患の遺伝的基礎を同定するための根拠を提供してきた。しかし、このような疾患に関連する遺伝子のバリエーションを同定するための多くの仕事が行われないままで残っている。これは、疾患を促進するDNA配列の特異的変化を同定するために、各々のこのような疾患を示す個体または家系における染色体の一部のDNA配列決定を必要とする。遺伝情報を処理する際の中間体分子であるリボ核酸（RNA）もまた、種々の疾患の遺伝的基礎を同定するために配列決定されることがある。
【０００５】
サイズによって分離された、蛍光標識された核酸の検出に基づく、核酸配列決定のための既存の方法は、配列決定され得る核酸の長さによって制限されている。典型的には、500〜1000塩基のみの核酸配列が一度に決定され得る。これは、数万または、さらに数十万の塩基長になり得る、遺伝子と呼ばれるDNAの機能的単位の長さよりもはるかに短い。現在の方法を使用すると、完全な遺伝子配列の決定は、産生される遺伝子の多くのコピーが、重複するフラグメントに切断され、かつ配列決定され、その後、重複するDNA配列が完全な遺伝子にアセンブルされ得ることを必要とする。このプロセスは、困難で、高価で、非効率的で、かつ時間がかかる。これはまた、典型的には、蛍光標識または放射性標識の使用を必要とし、このことが潜在的に安全性および廃棄物処理の問題を引き起こし得る。
【０００６】
最近になって、DNAチップ上の特定の位置に結合されている、規定され、配列決定された短いオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを含む、核酸配列決定のための方法が開発された。このような方法は、短い核酸配列を推測するため、または試料中の特定の核酸の存在を検出するために使用され得るが、長い核酸配列を同定するためには適していない。
【発明の開示】
【０００７】
例示的な態様の説明
開示される方法、組成物、および装置は、迅速で、自動化された核酸の配列決定のために有用である。これらの方法および装置は、1,000塩基より大きい、2,000塩基より大きい、5,000塩基より大きい、10,000塩基より大きい、20,000塩基より大きい、50,000塩基より大きい、100,000塩基より大きい、またはさらにそれ以上の長さの非常に長い核酸分子の配列を得るために適切であり得る。先行技術の方法を超えた利点には、一回の配列決定の実行において長い核酸配列を読み取る能力、配列データを得るより速い速度、配列決定のコストの減少、および配列データの単位あたりに必要とされる操作時間量に関する効率化が含まれる。
【０００８】
核酸配列情報は、単一の核酸分子を使用する、一回の配列決定の実行の過程の間で得ることができる。または、核酸分子の複数のコピーが、並行してまたは連続的に配列決定されて、核酸配列を確認するかまたは完全な配列データを得ることができる。他の代替として、核酸分子とその相補鎖の両方が配列決定されて、配列情報の正確さを確認することができる。ヌクレオチドは、例えば、エキソヌクレアーゼ処理によって、表面に結合した核酸から遊離され得る。遊離されたヌクレオチドは、例えば、微小流体系を通してラマン検出器に輸送されて、核酸、エキソヌクレアーゼ、および/または他の系の成分からのバックグラウンドラマンシグナルなしで、遊離されたヌクレオチドの検出を可能にし得る。本明細書に開示された特定の方法は核酸配列決定を含むが、当業者は、同じ種類の方法が、核酸に関する他の情報、例えば、1つもしくは複数の種類の一塩基多型（SNP）または試料中に存在する他の遺伝子のバリエーションを得るために利用され得ることを理解する。
【０００９】
本発明の特定の態様において、配列決定される核酸はDNAであるが、RNAまたは合成ヌクレオチドアナログを含む他の核酸が同様に配列決定され得ることが企図される。以下の詳細な説明は、開示される方法および装置のより徹底的な理解を提供するために、多数の特定の詳細を含む。しかし、これらの方法および装置はこれらの特定の詳細なしで実施され得ることが当業者には明らかである。他の例において、当技術分野において周知であるデバイス、方法、手順、および個々の要素は、本明細書において詳細に記載されていない。
【００１０】
本発明の種々の態様において、未標識のヌクレオチドが、ラマン分光法によって、例えば、表面増強ラマン分光法（SERS）、表面増強共鳴ラマン分光法（SERRS）、コヒーレント反ストークスラマン分光法（CARS）、または他の公知のラマン検出技術によって検出され得る。または、ヌクレオチドは、ラマンシグナルを増強するためにラマン標識に共有結合され得る。ある態様において、標識されたヌクレオチドが、標準的な核酸重合技術を使用して、新規に合成された核酸鎖に取り込まれ得る。典型的には、特異的配列のプライマー、または1つもしくは複数のランダムプライマーのいずれかが鋳型核酸にハイブリダイズされる。ポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドの付加に際して、ラマン標識ヌクレオチドは、プライマーの3'末端に共有結合され、鋳型に対して配列が相補的である標識された核酸鎖の形成を生じる。標識された鎖は、例えば、約95℃まで加熱すること、または他の公知の方法によって、未標識鋳型から分離されてもよい。2つの鎖は、当技術分野において周知である技術によって、互いに分離されてもよい。例えば、プライマーオリゴヌクレオチドは、ビオチン残基で共有結合的に修飾されてもよく、得られるビオチン化核酸は、アビジンまたはストレプトアビジンでコーティングされた表面に結合させることによって分離されてもよい。
【００１１】
標識されたかまたは標識されていないかのいずれかの一本鎖核酸分子は、1種または複数のエキソヌクレアーゼで消化され得る。当業者は、開示された方法は、エキソヌクレアーゼそれ自体に限定されないが、核酸の少なくとも一方の末端からヌクレオチドを連続的に除去することが可能である任意の酵素または他の試薬を利用し得ることを理解する。標識されたかまたは標識されていないヌクレオチドは、核酸の3'末端から連続的に遊離され得る。核酸からの分離後、ヌクレオチドは、ラマン検出ユニットによって検出され得る。連続的に検出されたヌクレオチドに関する情報が、核酸の配列を編集するために使用され得る。核酸の3'末端から遊離したヌクレオチドは、ラマン検出器を過ぎた微小流体流動経路を下って輸送され得る。この検出器は、標識されたかまたは標識されていないヌクレオチドを単一の分子レベルで検出可能であり得る。ラマン検出器によるヌクレオチドの検出の順番は、ヌクレオチドが核酸の3'末端から遊離される順番と同じである。従って、核酸の配列は、遊離したヌクレオチドが検出される順番によって決定され得る。相補鎖が配列決定される場合、鋳型鎖は、標準的なワトソン-クリック水素結合塩基対形成に従って、配列が相補的である（すなわち、アデノシン「A」はチミジン「T」に対して、およびグアノシン「G」はシチジン「C」に対して）。
【００１２】
特定の代替的な方法において、タグ分子は、反応チャンバーまたは検出ユニットの上流の流動経路に加えられてもよい。このタグ分子は、ヌクレオチドが核酸分子から遊離される時に、その遊離のヌクレオチドに結合し、かつタグ化する。この遊離後のタグ化は、核酸分子のヌクレオチドが溶液中へのそれらの遊離の前にタグ化される時に遭遇する問題を回避する。例えば、大量のラマン標識分子の使用は、核酸分子に取り込まれた各々のヌクレオチドがエキソヌクレアーゼ処理の前に標識される時に立体障害を与える可能性があり、これは、効率を低下させ、かつ配列決定反応のために必要とされる時間を増大する。
【００１３】
本発明の特定の態様において、4つの種類の各々のヌクレオチドは、区別可能なラマン標識に結合され得る。ラマン標識をピリミジン残基（CおよびT）のみに取り込むことなどの他の代替が利用可能である。ピリミジンのみを標識すること、および二本鎖DNAの両方の鎖を配列決定することによって、完全な配列のDNA分子が得られ得る。一本鎖DNA分子中の各々のヌクレオチドは、プリンまたはピリミジンのいずれかでなくてはならない。ヌクレオチドがプリンである場合、これは相補鎖中のピリミジンに水素結合しなくてはならない。従って、両方の鎖中のすべてのピリミジンを配列決定することによって、完全な配列が得られる。1つの例示的な態様において、標識されたヌクレオチドは、ビオチン標識デオキシシチジン-5'-三リン酸（ビオチン-dCTP）およびジゴキシゲニン標識デオキシウリジン-5'-三リン酸（ジゴキシゲニン-dUTP）を含み得る。
【００１４】
代替的な方法において、ヌクレオチドは標識されず、未標識ヌクレオチドがラマン分光法によって同定される。上記に議論したように、ヌクレオチドの半分のみを同定すること、および二本鎖DNAの両方の鎖を配列決定することによって、完全な配列データを得ることが可能である。例えば、アデノシンヌクレオチドおよびグアノシンヌクレオチドのみが同定されてもよく、かつ、両方の鎖が配列決定され得、それにより完全な配列決定がなされる。
【００１５】
本発明の種々の態様において、図1において例示されるように、ヌクレオチド110は、例えば、エキソヌクレアーゼを用いる処理によって、1つまたは複数の核酸分子109から連続的に遊離される。ヌクレオチド110は、反応チャンバー101から出て、微小流体チャネル102に移動する。微小流体チャネル102は、チャネル103と液体で連絡しており、これは、ナノチャネルまたはマイクロチャネルであってもよい。ヌクレオチド110は、微小流体チャネル102の側に対して負、およびナノチャネル103またはマイクロチャネル103の側に対して正である電場に応答して、ナノチャネル103またはマイクロチャネル103に入り得る。電場は、例えば、陰極104および陽極105の使用を通して課せられてもよい。ヌクレオチド110がナノチャネル103またはマイクロチャネル103を下降するにつれて、これらは、密に充填されたナノ粒子111の領域を通過し得る。ナノ粒子111は「ホットスポット」を形成するように処理され得る。「ホットスポット」と結合されたヌクレオチド110は増強されたラマンシグナルを生じ、これは、例えば、レーザー106およびCCDカメラ107を含む検出ユニットを使用して検出されてもよい。CCDカメラ107によって検出されるラマンシグナルは、付随するコンピュータ108によって処理されてもよい。ナノ粒子111を通った各ヌクレオチド110の同定および時間は、記録され、かつ核酸109の配列を構築するために使用され得る。本発明のある態様において、ヌクレオチド110は修飾されない。本発明の代替的な態様において、ヌクレオチド110は、例えば、ラマン標識の結合によって、共有結合的に修飾されてもよい。
【００１６】
定義
本明細書で使用される場合、「一つの（a）または（an）」とは、1つまたは複数の要素を意味し得る。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「複数の」要素とは、その要素の2つまたはそれ以上を意味する。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「マイクロチャネル」とは、1マイクロメートル（μm）から999μmの間の断面直径を有する任意のチャネルであるのに対して、「ナノチャネル」とは、1ナノメートル（nm）から999nmの間の断面直径を有する任意のチャネルである。本発明の特定の態様において、「ナノチャネルまたはマイクロチャネル」は、約1μm以下の直径であり得る。「微小流体チャネル」とは、液体が、微小流体の流れによって移動し得るチャネルである。微小流体の流れに対する、チャネル直径、液体の粘度、および流速の効果は、当技術分野において公知である。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「機能的に連結される」とは、2つ以上のユニットの間に機能的相互作用が存在することを意味する。例えば、ラマン検出器は、その検出器が、ヌクレオチドなどの分析物を検出し得るように配置される場合、それらがナノチャネルまたはマイクロチャネルを通過する時に、ナノチャネルまたはマイクロチャネルに「機能的に連結され」得る。
【００２０】
「核酸」は、DNA、RNA、一本鎖、二本鎖、または三本鎖、およびその任意の化学修飾を含む。実質的に任意の核酸の修飾が企図される。「核酸」は、
2007506432.tif 000002
または、さらにそれ以上の塩基長から、全長染色体DNA分子までのほぼ全ての長さであり得る。
【００２１】
「ヌクレオシド」は、デオキシリボースもしくはリボースなどのペントース糖、またはペントース糖の誘導体もしくはアナログに共有結合された、プリン塩基またはピリミジン塩基、またはその任意の化学修飾または構造的アナログを含む分子である。
【００２２】
「ヌクレオチド」は、ペントース糖に共有結合された少なくとも1つのリン酸基をさらに含むヌクレオシドをいう。検出されるヌクレオチドは、リボヌクレオシド一リン酸またはデオキシリボヌクレオシド一リン酸であり得るが、ヌクレオシド二リン酸または三リン酸が使用されてもよい。または、ヌクレオシドは核酸から遊離され得、かつ検出され得る。他の代替において、プリンまたはピリミジンが、例えば、酸処理によって遊離され得、ラマン分光法によって検出され得る。種々の置換または修飾は、それらが、例えば、エキソヌクレアーゼ活性によって、核酸からさらに遊離されることが可能である限り、ヌクレオチドの構造中でなされ得る。例えば、リボース部分またはデオキシリボース部分が、別のペントース糖またはペントース糖アナログで置換され得る。リン酸基は、種々のアナログによって置換され得る。プリン塩基またはピリミジン塩基は、置換、または共有結合的に修飾され得る。標識されたヌクレオチドを含む態様において、標識は、それがエキソヌクレアーゼ処理に干渉しない限り、ヌクレオチドの任意の部分に結合され得る。
【００２３】
「ラマン標識」は、検出可能なラマンシグナルを生じることが可能である、任意の有機もしくは無機の分子、原子、複合体、または構造であり得、合成分子、色素、フィコエリトリンなどの天然に存在する色素、C60、バッキーボール、および炭素ナノチューブなどの有機ナノ構造、金もしくは銀のナノ粒子またはナノプリズムなどの金属ナノ構造、ならびに量子ドットなどのナノスケール半導体を含むがこれらに限定されない。ラマン標識の多数の例は以下に開示される。当業者は、このような例が限定ではないこと、および「ラマン標識」が、ラマン分光法によって検出され得る、当技術分野において公知である任意の有機分子もしくは無機の原子、分子、化合物、または構造を含むことを理解する。
【００２４】
ナノ粒子
本発明の特定の態様は、ヌクレオチドから得られたラマンシグナルを増強するためのナノ粒子の使用を含む。ナノ粒子は、銀または金のナノ粒子であってもよいが、表面増強ラマン分光法（SERS）、表面増強共鳴ラマン分光法（SERRS）、および/またはコヒーレント反ストークスラマン分光法（CARS）のシグナルを提供することが可能である任意のナノ粒子が使用されてもよい。直径が1nmから2μmの間のナノ粒子が使用され得る。または、2nm〜1μm、5nm〜500nm、10nm〜200nm、20nm〜100nm、30nm〜80nm、40nm〜70nm、または50〜60nmの直径のナノ粒子が使用され得る。10〜50nm、50〜100nm、または約100nmの平均直径を有するナノ粒子が、特定の適用のために企図される。このナノ粒子は、形状がほぼ球形であってもよいが、任意の形状または不規則な形状のナノ粒子が使用されてもよい。ナノ粒子を調製する方法は公知である（例えば、米国特許第6,054,495号; 第6,127,120号; 第6,149,868号; LeeおよびMeisel, J. Phys. Chem. 86: 3391-3395, 1982）。ナノ粒子はまた、商業的に入手可能であり得る（例えば、Nanoprobes Inc., Yaphank, NY; Polysciences, Inc., Warrington, PA; Ted-pella Inc., Redding, CA）。
【００２５】
本発明の特定の態様において、ナノ粒子は、ナノ粒子のランダム集合体（コロイド状ナノ粒子）であってもよい。他の態様において、ナノ粒子は、二量体、三量体、四量体、または他の集合体などのナノ粒子の特定の集合体を生じるように架橋されてもよい。SERS、SERRS、および/またはCARSの検出のための「ホットスポット」の形成は、ナノ粒子の特定の集合体と関連し得る。特定の代替的な態様は、異なるサイズの集合体の不均質な集合体の混合物、またはナノ粒子の集合体の均質な集団を使用し得る。選択された数のナノ粒子を含む集合体（二量体、三量体など）は、スクロース溶液中での超遠心分離などの公知の技術によって、濃縮または精製され得る。約100、200、300、400、500、600、700、800、900〜1000nmまたはそれ以上のサイズのナノ粒子集合体が企図される。ナノ粒子集合体は、約100nmから約200nmのサイズの間であり得る。
【００２６】
ナノ粒子を架橋する方法は、当技術分野において公知である（例えば、Feldheim, 「Assembly of metal nanoparticle arrays using molecular bridges」, The Electrochemical Society Interface, Fall, 2001, 22-25頁を参照されたい）。末端のチオール基またはスルフヒドリル基を有するリンカー化合物との金ナノ粒子の反応は公知である（Feldheim, 2001）。単一のリンカー化合物は、両方の末端でチオール基で誘導体化され得る。金ナノ粒子との反応に際して、リンカーは、リンカーの長さによって分離されるナノ粒子二量体を形成してもよい。3個、4個、またはそれ以上のチオール基を有するリンカーは、複数のナノ粒子に同時に結合するために使用されてもよい（Feldheim, 2001）。リンカー化合物に対して過剰のナノ粒子の使用は、複数の架橋およびナノ粒子沈殿の形成を妨害する。銀ナノ粒子の集合体は、当技術分野において公知である標準的な合成方法によって形成されてもよい。
【００２７】
または、使用されるリンカー化合物は、チオール基などの単一の反応基を含み得る。単一の結合したリンカー化合物を含むナノ粒子は、例えば、2つの異なるナノ粒子に結合したリンカー化合物の非共有結合的相互作用によって、二量体に自己集合化し得る。例えば、リンカー化合物は、アルカンチオールを含み得る。金ナノ粒子へのチオール基の結合後に、アルカン基は、疎水性相互作用によって結合する傾向がある。他の代替としては、リンカー化合物は、いずれかの末端に異なる官能基を含んでもよい。例えば、リンカー化合物は、金ナノ粒子への結合を可能にするために一方の末端にスルフヒドリル基を、および他のリンカー化合物への結合を可能にするために他方の末端に異なる反応基を含み得る。多くのこのような反応基は当技術分野において公知であり、本発明の方法および装置において使用され得る。
【００２８】
金または銀のナノ粒子は、アミノシラン、3-グリシドオキシプロピルトリメチルシラン（GOP）、またはアミノプロピルトリメトキシシラン（APTS）などの誘導体化シランでコーティングされてもよい。シランの末端における反応基は、ナノ粒子の架橋集合体を形成するように使用されてもよい。使用されるリンカー化合物は、約0.05、0.1、0.2、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、27、30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、90〜100nm、または、さらにそれ以上の長さの範囲にわたるほぼどのような長さであってもよいことが企図される。不均一な長さのリンカーが使用されてもよい。
【００２９】
ナノ粒子は、それらがリンカー化合物に結合される前に、種々の反応基を含むように修飾されてもよい。修飾されたナノ粒子は市販されており、例えば、Nanoprobes, Inc. (Yaphank, NY) からのNanogold（登録商標）ナノ粒子がある。Nanogold（登録商標）ナノ粒子は、ナノ粒子あたりに結合した、単一もしくは複数いずれかの、マレイミド、アミン、または他の基とともに得られ得る。Nanogold（登録商標）ナノ粒子はまた、電場中でのナノ粒子の操作を容易にするために正または負のいずれかに荷電した形状で利用可能である。このような修飾されたナノ粒子は、ナノ粒子の二量体、三量体、または他の集合体を提供するために種々の既知のリンカー成分に結合されてもよい。
【００３０】
使用されるリンカー化合物の種類は、それが溶液中で沈殿しないナノ粒子の小さな集合体を産生する限り、限定されない。リンカー基はフェニルアセチレンポリマーを含んでもよい（Feldheim, 2001）。または、リンカー基は、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニルピロリドン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、ポリエチレン、または他の公知のポリマーを含んでもよい。有用なリンカー化合物はポリマーに限定されないが、シラン、アルカン、誘導体化シラン、または誘導体化アルカンなどの他の種類の分子もまた含んでもよい。アルカンまたはシランなどの比較的単純な化学構造のリンカー化合物は、ヌクレオチドによって発光したラマンシグナルと干渉することを回避するために使用されてもよい。
【００３１】
ナノ粒子がナノチャネルまたはマイクロチャネルに充填される場合、ナノ粒子集合体は、マイクロ流体工学またはナノ流体工学、水力学的フォーカシング（forcusing）または電気浸透などの、当技術分野において公知である任意の方法によってチャネルに操作されてもよい。電荷を有するリンカー化合物または電荷を有するナノ粒子は、電気的な勾配の使用を通して、チャネルへのナノ粒子の充填を容易にするために使用され得る。
【００３２】
チャネル、反応チャンバー、および集積チップ
材料
反応チャンバー、微小流体チャネル、ナノチャネル、またはマイクロチャネル、および装置の他の要素は、例えば、半導体チップおよび/またはマイクロキャピラリーまたは微小流体チップにおいて公知であるようなチップの形態で、単一のユニットとして形成されてもよい。このようなチップにおける使用が知られている任意の材料が、開示される装置において使用されてもよく、これには、ケイ素、二酸化ケイ素、窒化ケイ素、ポリジメチルシロキサン（PDMS）、ポリメチルメタクリレート（PMMA）、プラスチック、ガラス、石英などが含まれる。装置の一部または全部が、ラマン分光法のために使用される励起および発光の周波数である電磁放射に対して透明であるように選択され得、例えば、ガラス、ケイ素、石英、または任意の他の光学的に透明な材料である。反応チャンバー、微小流体チャネル、およびナノチャネル、またはマイクロチャネルなどの、核酸および/またはヌクレオチドに曝露され得る、液体充填区画に対して、このような分子に曝露される表面は、例えば、表面を疎水性表面から親水性表面に変換するため、および/または表面への分子の吸収を減少させるために、コーティングによって修飾され得る。ガラス、ケイ素、および/または石英などの一般的なチップ材料の表面修飾は当技術分野において公知である（例えば、米国特許第6,263,286号）。このような修飾には、市販されているキャピラリーコーティング（Supelco, Bellafonte, PA）を用いるコーティング、ポリエチレンオキサイドもしくはアクリルアミドなどの種々の官能基を有するシラン、または当技術分野において公知である任意の他のコーティングが含まれ得るがこれらに限定されない。
【００３３】
集積チップの製造
チップのバッチ製作のための技術は、コンピュータチップ製造および/またはマイクロキャピラリーチップ製造の分野において周知である。このようなチップは、フォトリソグラフィーおよびエッチング、レーザー除去、射出成形、鋳造、分子ビームエピタキシー、ディップ-ペンナノリソグラフィー、化学蒸着（CVD）製造、電子ビームもしくは集束イオンビーム技術、またはインプリンティング技術によるなどの、当技術分野において公知である任意の方法によって製造され得る。非限定的な例には、プラスチックまたはガラスなどの、流動性を有する、光学的に透明な材料を用いる従来の成形；二酸化ケイ素のフォトリソグラフィーおよびドライエッチング；二酸化ケイ素基材上にアルミニウムマスクをパターン化するために、ポリメチルメタクリレートレジストを使用する電子ビームリソグラフィー、その後の反応性イオンエッチングが含まれる。微小流体チャネルは、Andersonら (「Fabrication of topologically complex three-dimensional microfluidic systems in PDMS by rapid prototyping」Anal. Chem. 72: 3158-3164,2000)に従って、ポリジメチルシロキサン（PDMS）を成形することによって行われ得る。ナノ電気機械的システムの製造のための方法が使用されてもよい（例えば、Craighead, Science 290: 1532-36,2000を参照されたい)。微細加工されたチップは、Caliper Technologies Inc. (Mountain View, CA) およびACLARA BioSciences Inc. (Mountain View, CA)などの供給業者から市販されている。
【００３４】
微小流体チャネルおよびマイクロチャネル
1つまたは複数の核酸分子から遊離されるヌクレオチドは、微小流体チャネルを下って移動し、次いで、ナノチャネルまたはマイクロチャネルであり得るチャネルに移動し得る。特定の態様において、マイクロチャネルまたはナノチャネルは、約3nmから約1μmの間の直径を有し得る。チャネルの直径は、励起レーザービームよりもサイズがわずかに小さいように選択され得る。微小流体チャネルおよび/またはチャネルは、マイクロキャピラリー（例えば、ACLARA BioSciences Inc. , Mountain View, CAから利用可能である）または液体集積回路（例えば、Caliper Technologies Inc. , Mountain View, CA）を含んでもよい。このような微小流体プラットフォームは、ナノリットル体積の試料のみを必要とする。ヌクレオチドは、溶媒の大きな流れによって、電気浸透によって、または当技術分野において公知である任意の他の技術によって、微小流体チャネルを下って移動し得る。
【００３５】
または、マイクロキャピラリー電気泳動が、ヌクレオチドを移動させるために使用されてもよい。マイクロキャピラリー電気泳動は、一般的に特定の分離媒体で充填してもよいし、または充填しなくてもよい、薄いキャピラリーまたはチャネルの使用を含む。負に荷電したヌクレオチドなど、適切に荷電した分子種の電気泳動は、課せられた電場に応答して起こる。電気泳動は、しばしば、マイクロキャピラリーに同時に加えられる成分の混合物のサイズ分離のために使用されるが、これはまた、核酸分子から連続して遊離される同様のサイズのヌクレオチドを移動させるために使用され得る。プリンヌクレオチドはピリミジンヌクレオチドよりも大きく、したがってより遅く移動するため、差次的な移動が、核酸から遊離したヌクレオチドの順番を混乱させることを防ぐために、種々のチャネルの長さおよび対応する検出器を通過した移動時間は、最小限に保持され得る。または、マイクロキャピラリーに充填した分離媒体は、プリンヌクレオチドまたはピリミジンヌクレオチドの移動速度が類似または同一であるように選択されてもよい。マイクロキャピラリー電気泳動の方法は、例えば、WoolleyおよびMathies (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1 1348-352, 1994)によって開示されている。
【００３６】
マイクロキャピラリー電気泳動デバイスを含む微小流体デバイスの微細加工は、例えば、Jacobsenら (Anal. Biochem, 209: 278-283,1994); Effenhauserら (Anal. Chem. 66: 2949-2953, 1994); Harrisonら (Science 261: 895-897, 1993)および米国特許第5,904,824号において議論されてきた。典型的には、これらの方法は、シリカ、ケイ素、または他の結晶状基材またはチップ上でのミクロンスケールチャネルのフォトリソグラフィーエッチングを含み、かつ開示された方法および装置における使用のために容易に適合され得る。ナノチャネルなどのより小さな直径のチャネルは、直径を狭くするためにナノチャネルの内部をコーティングするか、またはナノリソグラフィー、集束電子ビーム技術、集束イオンビーム技術、もしくは集束原子レーザー技術を使用するなど、公知の方法によって調製され得る。ヌクレオチドの検出を容易にするために、ナノチャネルまたはマイクロチャネルを含む材料は、使用される励起および発光の周波数において、電磁放射に対して透明であるように選択され得る。ガラス、ケイ素、およびラマン分光法のために使用される周波数範囲において一般的に透明である任意の他の材料が使用され得る。ナノチャネルまたはマイクロチャネルは、射出成形または他の公知の技術を使用して、反応チャンバーの製造のために使用されるのと同じ材料から製造されてもよい。
【００３７】
ナノチャネル
ナノチャネルの製造は、ナノスケール製造のために当技術分野において公知である任意の技術を利用してもよい。以下の技術は例示のみである。ナノチャネルは、例えば、高スループット電子ビームリソグラフィーシステムを使用して作製され得る。電子ビームリソグラフィーは、シリコンチップ上に5nm程度の小さな特徴を書き込むために使用され得る。ケイ素表面にコーティングされる、ポリメチル-メタクリレートなどの高感度レジストは、マスクの使用なしでパターン化され得る。電子ビームアレイは、電子ビームの安定性を増大させるためにマイクロチャネル増幅器と電界放射クラスタを組み合わせてもよく、低電流での操作を可能にする。SoftMask（商標）コンピュータ制御システムは、シリコンチップまたは他のチップ上のナノスケール特性の電子ビームリソグラフィーを制御するために使用され得る。
【００３８】
または、ナノチャネルは、集束原子レーザーを使用して製造され得る（例えば、Blochら「Optics with an atom laser beam」Phys. Rev. Lett. 87: 123-321, 2001）。集束原子レーザーは、標準的なレーザーまたは集束電子ビームと非常に類似して、リソグラフィーのために使用され得る。このような技術は、チップ上のミクロンスケールまたは、さらにナノスケールの構造を製造することが可能である。ディップ-ペンナノリソグラフィーもまた、ナノチャネルを形成するために使用され得る（例えば、Ivanisevicら「Dip-Pen' Nanolithography on Semiconductor Surfaces」 J. Am. Chem. Soc., 123: 7887-7889, 2001）。ディップ-ペンナノリソグラフィーは、シリコンチップなどの表面上に分子を沈着させるために、原子間力顕微鏡を使用する。15nm程度の小さなサイズの特徴が形成され得、10nmの空間解像度を有する。ナノスケールチャネルは、規則的なフォトリソグラフィー技術と組み合わせて、ディップ−ペンナノリソグラフィーを使用することにより形成されてもよい。例えば、レジストの層におけるミクロンスケールラインは、標準的なフォトリソグラフィーによって形成され得る。ディップ-ペンナノリソグラフィーを使用して、ラインの幅（およびエッチング後のチャネルの対応する直径）は、レジストの端にさらなるレジスト化合物を沈着させることによって狭くされてもよい。より薄いラインのエッチング後、ナノスケールチャネルが形成され得る。または、原子間力顕微鏡が、フォトレジストを除去し、ナノメートルスケールの特徴を形成するために使用されてもよい。
【００３９】
イオンビームリソグラフィーもまた、チップ上でナノチャネルを作製するために使用され得る（例えば、Siegel,「Ion Beam Lithography」VLSI Electronics, Microstructure Science, 第16巻, EinspruchおよびWatts編, Academic Press, New York, 1987）。微細に集束されたイオンビームは、マスクの使用なしで、レジストの層に、ナノチャネルなどの特徴を直接的に書き込むために使用され得る。または、広範なイオンビームが、100nm程度の小さなスケールの特徴を形成するためにマスクと組み合わせて使用されてもよい。例えば、フッ化水素酸を用いる化学エッチングは、レジストによって保護されていない露出したケイ素を除去するために使用され得る。当業者は、上記に開示された技術が限定ではないこと、およびナノチャネルが当技術分野において公知である任意の方法によって形成され得ることを認識する。
【００４０】
反応チャンバー
反応チャンバーは、水性環境において核酸分子およびエキソヌクレアーゼを保持するように設計され得る。反応チャンバーはまた、核酸分子が結合され得る固定化表面を保持し得る。反応チャンバーは、例えば、ペルティエ（Pelletier）エレメントの組み込みまたは他の公知の方法によって、温度制御されるように設計され得る。少ない体積の液体に対する温度を制御する種々の方法が当技術分野において公知である（例えば、米国特許第5,038,853号、第5,919,622号、第6,054,263号、および第6,180,372号を参照されたい）。反応チャンバーは、約1、2、5、10、20、50、100、250、500、もしくは750ピコリットル、約1、2、5、10、20、50、100、250、500、もしくは750ナノリットル、約1、2、5、10、20、50、100、250、500、もしくは750マイクロリットル、または約1ミリリットルの内部容量を有し得る。反応チャンバーは、上記に述べられたような公知のチップ技術を使用して製造されてもよい。
【００４１】
核酸
配列決定される核酸分子は、当技術分野において公知である任意の技術によって調製され得る。例えば、核酸は、天然に存在するDNA分子またはRNA分子であり得る。実質的に任意の天然に存在する核酸が、開示された方法によって調製および配列決定され得、これには、非限定的に、染色体DNA、ミトコンドリアDNA、および葉緑体DNA、ならびにリボソームRNA、トランスファーRNA、ヘテロ核RNA、およびメッセンジャーRNAが含まれる。種々の形状の細胞性核酸を調製および単離するための方法は公知である（例えば、Guide to Molecular Cloning Techniques, BergerおよびKimmel編, Academic Press, New York, NY, 1987; Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 第2版, Sambrook, FritschおよびManiatis編, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989を参照されたい）。引用される参考文献において開示されている方法は例示のみであって、当技術分野において公知である任意のバリエーションが使用され得る。一本鎖DNA（ssDNA）が配列決定される場合において、ssDNAは、任意の公知の方法によって二本鎖DNA（dsDNA）から調製され得る。このような方法は、dsDNAを加熱する工程およびそれらの鎖を分離させる工程を含んでもよく、または、M13へのクローニングなどの公知の増幅方法もしくは複製方法によるdsDNAからのssDNAの調製を含んでもよい。任意のこのような公知の方法が、ssDNAおよびssRNAを調製するために使用され得る。
【００４２】
エキソヌクレアーゼまたは等価物の基質として働き得る、実質的に任意の種類の核酸が使用され得る。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR（商標））増幅などの種々の増幅技術によって調製される核酸が配列決定され得る（米国特許第4,683,195号、第4,683,202号、および第4,800,159号を参照されたい）。配列決定される核酸は、または、プラスミド、コスミド、BAC（細菌人工染色体）、もしくはYAC（酵母人工染色体）などの標準的なベクター中にクローニングされ得る（例えば、BergerおよびKimmel, 1987; Sambrookら, 1989を参照されたい）。核酸挿入断片は、例えば、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いる切除、それに続くアガロースゲル電気泳動によって、ベクターDNAから単離され得る。挿入核酸の単離のための方法は当技術分野において公知である。
【００４３】
単一の核酸分子の単離
配列決定される核酸分子は、ssDNAまたはssRNAの単一分子であってもよい。単一のssDNAまたはssRNAの分子の選択および操作のための種々の方法が使用されてもよく、これは例えば、水力学的フォーカシング、マイクロ-マニピュレータカップリング、光学的トラッピング、またはこれらおよび類似の方法の組み合わせであり得る（例えば、Goodwinら, 1996, Acc. Chem. Res. 29: 607-619; 米国特許第4,962,037号; 第5,405, 747号; 第5,776, 674号; 第6,136, 543号; 第6,225,068号を参照されたい）。
【００４４】
マイクロ流体工学またはナノ流体工学は、核酸分子を分別および単離するために使用され得る。水力学は、核酸を、マイクロチャネル、マイクロキャピラリー、またはマイクロポアに操作するために使用され得る。水力学的力は、単一の核酸分子を分離するための櫛構造を横切って核酸分子を移動させるために使用され得る。一旦核酸分子が分離されると、反応チャンバー内に分子を配置するために水力学的フォーカシングが使用され得る。熱的もしくは電気的なポテンシャル、圧力、または真空もまた、核酸の操作のための駆動力を供給するために使用され得る。配列決定のための核酸の操作は、米国特許第5,867,266号および第6,214,246号に開示されるような、微細加工されたチャネルおよび統合されたゲル材料を取り込むチャネルブロック設計の使用を含み得る。
【００４５】
核酸分子を含む試料は、固定化表面へのカップリング前に希釈されてもよい。固定化表面は、磁気ビーズもしくは非磁気ビーズ、または他の別個の構造単位の形状であってもよい。適切な希釈の際、各ビーズは、0個または1個の核酸分子を結合する統計学的確率を有する。1個の核酸分子が結合したビーズは、例えば、蛍光色素およびフローサイトメーターソーティングまたは磁気ソーティングを使用して同定され得る。ビーズおよび核酸の相対的なサイズならびに均一性に依存して、結合した単一の核酸分子を含むビーズを分離するために、磁気フィルターおよび重量分離を使用することが可能であり得る。または、単一のビーズもしくは他の固定化表面に結合した複数の核酸が配列決定され得る。
【００４６】
コーティングされたファイバーチップもまた、配列決定のための単一分子の核酸生成に使用され得る（例えば、米国特許第6,225,068号）。固定化表面は、アビジンまたは他の架橋剤の単一分子を含むように調製され得る。このような表面は、配列決定される単一のビオチン化核酸分子を結合し得る。この方法は、アビジン-ビオチン結合系に限定されないが、当技術分野において公知である任意のカップリング系に適合され得る。
【００４７】
他の代替として、光学的トラップが、配列決定のための単一の分子核酸分子の操作に使用されてもよい（例えば、米国特許第5,776,674号）。例示的な光学的トラッピング系は、Cell Robotics, Inc. (Albuquerque, NM), S+L GmbH (Heidelberg, Germany)およびP. A. L. M. Gmbh (Wolfratshausen, Germany)から市販されている。
【００４８】
固定化の方法
本発明の種々の態様において、配列決定される核酸分子は、固体表面に結合（固定化）され得る。核酸分子の固定化は、核酸分子と表面との間の非共有結合または共有結合のいずれかを含む、種々の方法によって達成され得る。例示的な態様において、固定化は、ストレプトアビジンまたはアビジンで表面をコーティングすること、およびビオチン化核酸の結合によって達成され得る（Holmstromら, Anal.Biochem. 209: 278-283, 1993）。固定化はまた、ポリ-L-Lys（リジン）またはポリL-Lys、Phe（フェニルアラニン）でのケイ素、ガラス、または他の表面のコーティング、続く、二官能性架橋試薬を使用する、アミノ-またはスルフヒドリル-のいずれかで修飾された核酸の共有結合によって、行われ得る（Runningら, BioTechniques 8: 276-277, 1990; Newtonら, Nucleic Acids Res. 21: 1155-62,1993）。アミン残基は、架橋のためのアミノシランの使用を通して、表面に導入され得る。
【００４９】
固定化は、化学的に修飾された表面への、5'-リン酸化核酸の直接的共有結合によって行われ得る（Rasmussenら, Anal. Biochem. 198: 138-142,1991）。核酸と表面との間の共有結合は、水溶性カルボジイミドとの縮合によって形成される。この方法は、主にそれらの5'-リン酸を介した、核酸の5'-結合を促進する。
【００５０】
DNAは一般的に、最初にガラス表面をシラン処理し、次いで、カルボジイミドまたはグルタルアルデヒドで活性化することによって、ガラスに結合される。代替的な手順は、分子の3'末端または5'末端のいずれかに取り込まれたアミノリンカーを介して連結されたDNAとともに、3-グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン（GOP）またはアミノプロピルトリメトキシシラン（APTS）などの試薬を使用し得る。DNAは、紫外線照射を使用して膜表面に直接結合され得る。核酸の固定化技術の他の非限定的な例は、米国特許第5,610,287号、第5,776,674号、および第6,225,068号において開示されている。
【００５１】
核酸の固定化に使用される表面の種類は限定されない。材料が核酸配列決定反応を起こすために十分に耐久性があり、かつ不活性である限り、固定化表面は、磁気ビーズ、非磁気ビーズ、平面表面、先の尖った表面、または、ほぼ全ての材料を含む固体表面の任意の他の構造であり得る。使用され得る表面の非限定的な例には、ガラス、シリカ、ケイ酸塩、PDMS、銀、もしくは他の金属コーティングされた表面、ニトロセルロース、ナイロン、活性化石英、活性化ガラス、ポリビニリデンジフルオリド（PVDF）、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、他のポリマー、例えば、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（メタクリル酸メチル）、またはポリ（ジメチルシロキサン）など、ならびに核酸分子との共有結合が形成可能な、ニトレン、カルベン、およびケチルラジカルなどの光反応性種を含むフォトポリマーが含まれる（米国特許第5,405,766号および第5,986,076号を参照されたい）。
【００５２】
二官能性架橋試薬は、核酸分子を表面に結合させるために使用され得る。二官能性架橋試薬は、それらの官能基、例えば、アミノ、グアニジノ、インドール、またはカルボキシルに特異的な基の特異性に従って分けられ得る。これらの遊離のアミノ基に配向される試薬は、それらの商業的な利用可能性、合成の容易さ、およびそれらが適用され得る穏やかな反応条件のために、一般的である。架橋分子のための例示的な方法は、米国特許第5,603,872号および第5,401,511号に開示されている。架橋試薬には、グルタルアルデヒド（GAD）、二官能性オキシラン（OXR）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（EGDE）、およびカルボジイミド、例えば、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）が含まれる。
【００５３】
核酸合成
ポリメラーゼ
本明細書に開示される特定の方法は、プライマー分子への、DNAポリメラーゼなどの合成試薬の結合、およびプライマーの3'末端へのラマン標識ヌクレオチドの付加を含み得る。ポリメラーゼの非限定的な例には、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素、およびRNA依存性RNAポリメラーゼが含まれる。それらの「校正」活性ならびにプライマーおよびプロモーター配列の要求性または要求性の欠如に関するポリメラーゼ間の相違は、当技術分野において公知である。RNAポリメラーゼがポリメラーゼとして使用される場合、配列決定される鋳型分子は二本鎖DNAであり得る。ポリメラーゼの非限定的な例には、サーマトガ  マリティナ（Thermatoga maritima）DNAポリメラーゼ、Amplitaq FS（商標）DNAポリメラーゼ、Taquenase（商標）DNAポリメラーゼ、ThermoSequenase（商標）、Taq DNAポリメラーゼ、Qbeta（商標）レプリカーゼ、T4 DNAポリメラーゼ、サーマス  サーモフィラス（Thermus thermophilus）DNAポリメラーゼ、RNA依存性RNAポリメラーゼ、およびSP6 RNAポリメラーゼが含まれる。
【００５４】
以下を含む多数のポリメラーゼが市販されている：Pwo DNAポリメラーゼ (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN); Bstポリメラーゼ (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA); IsoTherm（商標）DNAポリメラーゼ (Epicentre Technologies, Madison, WI); モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、Pfu DNAポリメラーゼ、鳥類骨髄芽細胞症ウイルス逆転写酵素、サーマス  フラバス (Thermus flavus) (Tfl) DNAポリメラーゼ、およびサーモコッカス  リトラリス（Thermococcus litoralis）(Tli) DNAポリメラーゼ (Promega Corp., Madison,WI); RAV2逆転写酵素、HIV-1逆転写酵素、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ、SP6 RNAポリメラーゼ、大腸菌（E.coli）RNAポリメラーゼ、サーマス  アクアティカス（Thermus aquaticus）DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ+/-3'→5'エキソヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼIのクレノーフラグメント、サーマス属の「偏在性」DNAポリメラーゼ、およびDNAポリメラーゼI (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)。標識されたヌクレオチドの鋳型依存的な重合が可能である、当技術分野において公知の任意のポリメラーゼが使用され得る（例えば、GoodmanおよびTippin, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1(2): 101-9, 2000; 米国特許第6,090,589号を参照されたい)。標識されたヌクレオチドから核酸を合成するためにポリメラーゼを使用する方法は公知である（例えば、米国特許第4,962,037号; 第5,405,747号; 第6,136,543号; 第6,210,896号）。
【００５５】
プライマー
一般的に、プライマーは長さが10から20塩基の間であるが、より長いプライマーが利用されてもよい。プライマーは、鋳型核酸分子の既知の部分に対して配列が相補的であるように設計され得る。既知のプライマー配列は、例えば、プライマーが既知の一定の染色体配列に隣接する配列改変体を同定するために選択される場合、未知の核酸配列が既知の配列のベクターに挿入される場合、または未変成核酸が部分的に配列決定されている場合に使用され得る。任意の配列のプライマー合成方法が公知である。または、ランダムヘキサマーまたはランダムオリゴマーなどのランダムプライマーが、既知のプライマー結合部位の非存在下で核酸重合を開始するために使用され得る。
【００５６】
エキソヌクレアーゼ
核酸配列決定の方法は、核酸分子の遊離末端へのエキソヌクレアーゼの結合、および一度に1個のヌクレオチドの遊離を含み得る。使用され得るエキソヌクレアーゼの種類は限定されない。潜在的に有用なエキソヌクレアーゼの非限定的な例には、大腸菌エキソヌクレアーゼI、III、V、もしくはVII、Bal 31エキソヌクレアーゼ、マングビーンエキソヌクレアーゼ、S1ヌクレアーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼIホロ酵素もしくはクレノーフラグメント、RecJ、エキソヌクレアーゼT、T4もしくはT7 DNAポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼT7遺伝子6、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼ、サーモコッカス  リトラリス、DNAポリメラーゼ、ピロコッカス種 (Pyrococcus sp.) GB-D DNAポリメラーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、S. アウレウス（S. aureus）球菌ヌクレアーゼ、 DNase I、リボヌクレアーゼA、Tl球菌ヌクレアーゼ、または当技術分野において公知である他のエキソヌクレアーゼが含まれる。エキソヌクレアーゼは、New England Biolabs (Beverly, MA)、Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ)、Promega (Madison, WI)、Sigma Chemicals (St. Louis, MO)、またはBoehringer Mannheim (Indianapolis, IN)などの商業的な供給源から利用可能である。
【００５７】
当業者は、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が当技術分野において公知である種々の特性を有することを理解する。エキソヌクレアーゼ活性の速度は、検出器によるヌクレオチドの分析の最適速度と一致するように操作され得る。エキソヌクレアーゼ活性の速度を調整するための種々の方法が公知であり、これには、反応チャンバー中の温度、圧力、pH、塩濃度、または二価カチオン濃度を調整する工程が含まれる。エキソヌクレアーゼ活性の最適化の方法は、当技術分野において公知である。
【００５８】
ヌクレオシド一リン酸は一般的に、エキソヌクレアーゼ活性によって核酸から遊離されるが、開示される方法は、任意の特定の形状の遊離ヌクレオチドまたはヌクレオシドの検出に限定されず、しかし核酸から遊離され得る任意のモノマーを含む。ある場合において、検出される分子は、以下に開示されるような、例えば酸加水分解によって、ヌクレオチドまたはヌクレオシドから遊離されたプリンまたはピリミジンの塩基であり得る。
【００５９】
ラマン標識
本明細書に開示される特定の方法は、1つまたは複数のヌクレオチド、ヌクレオシド、または塩基に標識を結合させて、ラマン検出器によるそれらの検出を容易にする工程を含んでもよい。ラマン分光法のために使用され得る標識の非限定的な例には、TRIT（テトラメチルローダミンイソチオール）、NBD（7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール）、テキサスレッド色素、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレシルファストバイオレット、クレシルブルーバイオレット、ブリリアントクレシルブルー、パラアミノ安息香酸、エリトロシン、ビオチン、ジゴキシゲニン、5-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン、5-カルボキシ-2',4',5',7'-テトラクロロフルオレセイン、5-カルボキシフルオレセイン、5-カルボキシローダミン、6-カルボキシローダミン、6-カルボキシテトラメチルアミノフタロシアニン、アゾメチン、シアニン、キサンチン、スクシニルフルオレセイン、およびアミノアクリジンが含まれる。これらおよび他のラマン標識は、商業的な供給源（例えば、Molecular Probes, Eugene, OR）から入手可能である。
【００６０】
多環式芳香族化合物は、一般的に、当技術分野において公知であるように、ラマン標識として機能し得る。有用であり得る他の標識には、シアン化物、チオール、塩素、臭素、メチル、リン、および硫黄が含まれる。カーボンナノチューブもまた、ラマン標識として有用であり得る。ラマン分光法における標識の使用は公知である（例えば、米国特許第5,306,403号および第6,174,677号）。当業者は、ラマン標識が、異なる種類のヌクレオチドに結合した時に、区別可能なラマンスペクトルを生成するであろうことを理解する。
【００６１】
標識は、ヌクレオチドに直接的に結合され得るか、または種々のリンカー化合物を介して結合され得る。または、ラマン標識に共有結合されるヌクレオチド前駆体は、標準的な商業的供給源から利用可能である（例えば、Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN; Promega Corp., Madison, WI; Ambion, Inc., Austin, TX; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）。ヌクレオチドなどの他の分子と共有結合的に反応するように設計された反応基を含むラマン標識は市販されている（例えば、Molecular Probes, Eugene, OR)）。標識されたヌクレオチドを調製する方法、およびこれらを核酸に取り込む方法は公知である（例えば、米国特許第4,962,037号; 第5,405,747号; 第6,136,543号; 第6,210, 896号）。
【００６２】
検出ユニット
本明細書に開示される例示的な装置は、ラマン分光法によって、ヌクレオチド、ヌクレオシド、プリン、および/もしくはピリミジンを検出ならびに/または定量するように設計されている検出ユニットを含み得る。ラマン分光法によるヌクレオチドの検出のための種々の方法は当技術分野において公知である（例えば、米国特許第5,306,403; 第6,002,471号; 第6,174,677号を参照されたい）。このような既知の方法は、典型的には、蛍光分光法などの代替的な公知の方法によって同定され得るよりも、より高い濃度のヌクレオチドの検出を含む。単一分子レベルのヌクレオチドのラマン検出は、本明細書以前には開示されていない。表面増強ラマン分光法（SERS）、表面増強共鳴ラマン分光法（SERRS）、およびコヒーレント反ストークスラマン分光法（CARS）に対するバリエーションが開示されている。SERSおよびSERRSにおいて、ラマン検出の感度は、銀、金、白金、銅、またはアルミニウムの表面などの粗い金属の表面上に吸収された分子について、106以上の因数で増強される。ラマン検出ユニットの非限定的な例は、米国特許第6,002,471号において開示されている。
【００６３】
励起ビームは、532nm波長のNd:YAGレーザーまたは365nm波長のTi:サファイアレーザーのいずれかによって生成され得る。パルスレーザービームまたは連続レーザービームが使用され得る。励起ビームは、共焦点光学機器および顕微鏡対物レンズを通過し得、充填されたナノ粒子を含むナノチャネルまたはマイクロチャネルに焦点を合わせられ得る。ヌクレオチドからのラマン放射光は、顕微鏡対物レンズおよび共焦点光学機器によって集光され得、スペクトル分離のために単色光分光器に連結され得る。共焦点光学機器は、バックグラウンドシグナルを減少させるために、二色性フィルター、バリアフィルター、共焦点ピンホール、レンズ、および鏡の組み合わせを含み得る。標準的な全分野に及ぶ光学機器は、共焦点光学機器と同様に使用され得る。ラマン発光シグナルはラマン検出器によって検出され得、これは、シグナルの計数およびデジタル化のためにコンピュータとインターフェースを有するアバランシェ光ダイオードを含み得る。
【００６４】
検出ユニットの代替的な例は、例えば、米国特許第5,306,403号に開示されており、これは、単一光子計数モードで操作されるガリウムヒ素光電子増倍管（RCA Model C31034またはBurle Industries Model C3103402）を備えたSpex Model 1403二重格子分光光度計を含む。励起光源には、SpectraPhysicsからの514.5 nmラインアルゴン-イオンレーザー、Model 166、および647.1nmラインのクリプトン-イオンレーザー (Innova 70, Coherent) が含まれ得る。
【００６５】
代替的な励起光源には、337nmの窒素レーザー (Laser Science Inc.) および325nmのヘリウム-カドミウムレーザー (Liconox) (米国特許第6,174,677号)が含まれる。励起ビームは、バンドパスフィルター (Corion) を用いてスペクトル的に精製され得、6×対物レンズ (Newport, Model L6X) を使用して、ナノチャネルまたはマイクロチャネル上に焦点を合わせられ得る。この対物レンズは、励起ビームおよび発光されたラマンシグナルについての直角ジオメトリーを生じるようホログラフィックビームスプリッター (Kaiser Optical Systems, Inc., Model HB 647-26N18) を使用することによって、ヌクレオチドを励起するため、ならびにラマンシグナルを収集するための両方に使用され得る。ホログラフィックノッチフィルター (Kaiser Optical Systems, Inc.) は、レイリー散乱放射を減少するために使用され得る。代替的なラマン検出器には、赤色増強強化電荷結合素子（RE-ICCD）検出システム (Princeton Instruments) を備えたISA HR-320分光器が含まれる。他の型の検出器、例えば、電荷注入デバイス、光ダイオードアレイ、または光トランジスタアレイなどが使用され得る。
【００６６】
当技術分野において公知である、ラマン分光法または関連する技術の任意の適切な形状または構成はヌクレオチドの検出のために使用され得、以下が含まれるがこれらに限定されない：通常のラマン散乱、共鳴ラマン散乱、表面増強ラマン散乱、表面増強共鳴ラマン散乱、コヒーレント反ストークスラマン分光法（CARS）、誘導ラマン散乱、逆ラマン分光法、誘導増幅ラマン分光法、ハイパーラマン散乱、分子光学レーザー試験装置（MOLE）もしくはラマンマイクロプローブもしくはラマン顕微鏡法もしくは共焦点ラマンマイクロ分光法、三次元もしくは散乱ラマン、ラマン飽和分光法、時間分解共鳴ラマン、ラマンデカップリング分光法、またはUV-ラマン顕微鏡法。
【００６７】
情報処理および制御システムおよびデータ分析
核酸配列決定装置は、情報処理システムを含み得る。使用される情報処理システムの種類は限定されない。例示的な情報処理システムは、情報を伝達するためのバスおよび情報処理のためのプロセッサを含むコンピュータを組み込み得る。このプロセッサは、Pentium（登録商標）ファミリーのプロセッサから選択され得、これには、非限定的に、Intel Corp., (Santa Clara, CA) から入手可能であるPentium（登録商標）IIファミリー、Pentium（登録商標）IIIファミリー、Pentium（登録商標）4ファミリーのプロセッサが含まれる。または、このプロセッサは、Celeron（登録商標）、Itanium（登録商標）、またはPentium Xeon（登録商標）のプロセッサ（Intel Corp., (Santa Clara, CA）であってもよい。このプロセッサは、Intel（登録商標）IA-32またはIntel（登録商標）IA-64アーキテクチャのようなIntel（登録商標）アーキテクチャに基づき得る。または、他のプロセッサが使用されてもよい。
【００６８】
検出ユニットは、情報処理システムに機能的に連結され得る。検出ユニットからのデータは、プロセッサによって処理され得、データは主記憶装置に保存され得る。標準的なヌクレオチドについての発光プロフィールに関するデータもまた、主記憶装置またはROMに保存され得る。プロセッサは、ナノチャネルまたはマイクロチャネル中のヌクレオチドからの発光スペクトルを比較し、核酸分子から遊離したヌクレオチドの種類を同定し得る。主記憶装置はまた、核酸分子から遊離したヌクレオチドの配列を保存し得る。プロセッサは、検出ユニットからのデータを分析し、核酸の配列を決定し得る。プリンまたはピリミジンのみが標識および/または検出される場合、プロセッサは、2つの相補的核酸鎖から得られた塩基の配列を比較し、完全な核酸配列を生成し得る。
【００６９】
本明細書に記載されるプロセッサがプログラムされたプロセッサの制御下で実行され得るのに対して、処理はまた、任意のプログラム可能なまたはハードコードされたロジック、例えば、フィールドプログラマブルゲートアレイ（Field Programmable Gate Array）(FPGA)、TTLロジック、または特定用途向け集積回路(ASIC) などによって完全にまたは部分的に実施され得る。さらに、開示される方法は、プログラムされた汎用コンピュータ装置および/またはカスタムハードウェア装置の任意の組み合わせによって実行され得る。
【００７０】
データ収集操作後、データは、データ分析操作に報告され得る。分析操作を容易にするため、検出ユニットによって得られるデータは、デジタルコンピュータを使用して分析され得る。このコンピュータは、収集されたデータの分析および報告と同様に、検出ユニットからのデータの受け取りおよび保存のためにプログラムされ得る。
【００７１】
特注のソフトウェアパッケージは、検出ユニットから得られたデータを分析するために使用され得る。データ分析はまた、情報処理システムおよび公的に利用可能なソフトウェアパッケージを使用して実行され得る。DNA配列分析のために利用可能なソフトウェアの非限定的な例には、PRISM（商標）DNA配列決定分析ソフトウェア (Applied Biosystems, Foster City, CA)、Sequencher（商標）パッケージ (Gene Codes, Ann Arbor, MI)、およびNational Biotechnology Information Facilityを通して入手可能である種々のソフトウェアパッケージが含まれる。
【００７２】
実施例
実施例1：ラマン検出およびナノ粒子を使用する核酸配列決定
図1に例示される本発明の特定の態様は、反応チャンバー101において固定化表面に結合され得る、1つまたは複数の一本鎖核酸分子109の配列決定を含む。反応チャンバー101は、核酸分子109の未結合末端から、一度に1つのヌクレオチド110を連続的に除去する、1種または複数種のエキソヌクレアーゼを含み得る。
【００７３】
ヌクレオチド110が遊離されるにつれて、これらは、微小流体チャネル102を下り、検出ユニットを通過してナノチャネル103またはマイクロチャネル103に移動し得る。検出ユニットは、励起ビームを放射する、レーザーなどの励起光源106を含んでもよい。この励起ビームは、遊離したヌクレオチド110と相互作用し得、その結果、電子がより高いエネルギー状態まで励起される。より低いエネルギー状態へ電子が戻った結果生じるラマン発光スペクトルは、ラマン分光法検出器107、例えば、分光器、単色光分光器、または電荷結合素子（CCD）、例えば、CCDカメラなどによって検出され得る。
【００７４】
励起光源106および検出器107は、ヌクレオチド110が、それらがナノチャネル103またはマイクロチャネル103中の密接に充填されたナノ粒子111の領域を通過する時に、励起および検出されるように配置され得る。ナノ粒子111は、ラマン検出のための「ホットスポット」を形成するように架橋され得る。ナノ粒子111のホットスポットを通してヌクレオチド110を通過させることによって、ラマン検出の感度は、桁違いに増大され得る。
【００７５】
反応チャンバー、微小流体チャネル、およびマイクロチャネルの調製
ボロフロート（Borofloat）ガラスウェハ (Precision Glass & Optics, Santa Ana, CA) は、濃HF（フッ化水素酸）中で短時間プレ-エッチングされ得、プラズマ増強化学蒸着（PECVD）システム (PEII-A, Technics West, San Jose, CA) 中で、アモルファスシリコンの犠牲層の沈着前に洗浄され得る。ウェハは、ヘキサメチルジシラザン（HMDS）で下塗りされ、フォトレジストでスピンコーティングされ (Shipley 1818, Marlborough, MA)、および穏やかにベーキングされ得る。コンタクトマスクアライナー(Quintel Corp. San Jose, CA) が、1つまたは複数のマスク設計にフォトレジスト層を露出するために使用され得、露出されたフォトレジストは、マイクロポジット（Microposit）展開液濃縮物（Shipley）および水の混合物を使用して除去され得る。展開されたウェハは激しくベーキングされ得、露出したアモルファスシリコンは、PECVDリアクター中でCF4（四フッ化炭素）プラズマを使用して除去され得る。ウェハは、反応チャンバー101、微小流体チャネル102、およびマイクロチャネル103を製造するために濃HFを用いて化学的にエッチングされ得る。残りのフォトレジストは取り除かれ得、アモルファスシリコンが除去され得る。
【００７６】
ナノチャネル103は、このプロトコールのバリエーションによって形成され得る。標準的なフォトリソグラフィーは、集積チップのミクロンスケールの特徴を形成するために使用され得る。レジストの薄層がチップにコーティングされ得る。原子間力顕微鏡/走査型トンネルプローブチップは、チップ表面から、レジストの5〜10nm幅のストリップを除去するために使用され得る。このチップは、希HFで短時間にエッチングされ、チップ表面にナノメートルスケールの溝を生じ得る。この非限定的な実施例において、500nmから1μmの間の直径を有するチャネル103が調製され得る。
【００７７】
アクセスホールは、ダイヤモンドドリルビット (Crystalite, Westerville, OH) を用いてエッチングされたウェハに穿孔され得る。完成したチップは、プログラム可能な真空加熱炉中で、2つの補完的なエッチングされたプレートおよび穿孔されたプレートを熱的に互いに結合させることによって調製され得る (Centurion VPM, J. M. Ney, Yucaipa, CA)。反応チャンバー101、微小流体チャネル102、およびナノチャネル103またはマイクロチャネル103を組み込むチップの製造のための代替的な例示的方法は、米国特許第5,867,266号および第6,214,246号において開示されている。2,500ダルトンの分子量カットオフを有するナイロンフィルターは、エキソヌクレアーゼおよび/または核酸109が反応チャンバー101から遊離することを防ぐために、反応チャンバー101と微小流体チャネル102との間に挿入され得る。
【００７８】
ナノ粒子の調製
銀ナノ粒子111は、LeeおよびMeisel (J. Phys. Chem. 86: 3391-3395, 1982)に従って調整され得る。金ナノ粒子111は、Polysciences, Inc.(Warrington, PA), Nanoprobes,Inc. (Yaphank, NY)、またはTed-pella Inc.(Redding, CA)から購入され得る。非限定的な例において、60nmの金ナノ粒子111が使用され得る。当業者は、他のサイズ、例えば、5、10、または20nmなどのナノ粒子111もまた使用され得ることを理解する。
【００７９】
金ナノ粒子111は、5nm〜50nmの範囲の鎖長を有するアルカンジチオールと反応し得る。リンカー化合物は、金ナノ粒子111と反応するために、アルカンの両方の末端においてチオール基を含み得る。リンカー化合物に対して過剰のナノ粒子111が使用され得、リンカー化合物は、大きなナノ粒子の集合体の形成を回避するために、ナノ粒子111にゆっくりと加えられ得る。室温での2時間のインキュベーション後、ナノ粒子111集合体は、1Mスクロース中での超遠心分離によって、単一のナノ粒子111から分離され得る。電子顕微鏡は、この方法によって調製された集合体が、集合体あたり2〜6個のナノ粒子111を含むことを示す。集合したナノ粒子111は、微小流体の流れによってマイクロチャネル103に負荷され得る。マイクロチャネル103の末端における狭窄またはフィルターは、適切な場所にナノ粒子集合体111を保持するために使用され得る。
【００８０】
核酸の調製およびエキソヌクレアーゼ処理
ヒト染色体DNAはSambrookら (1989) に従って精製され得る。Bam H1による消化後、ゲノムDNAフラグメントは、pBluescript（登録商標）IIファージミドベクター (Stratagene, Inc., La Jolla, CA) のマルチクローニングサイトに挿入され得、大腸菌中で増殖され得る。アンピシリン含有アガロースプレート上でのプレーティング後、配列決定のために、単一のコロニーが選択されかつ増殖され得る。ゲノムDNA挿入断片の一本鎖DNAコピーが、ヘルパーファージとの同時感染によってレスキューされ得る。プロテイナーゼK：ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の溶液中での消化後、DNAは、フェノール抽出され、次いで酢酸ナトリウム（pH 6.5、約0.3M）および0.8容量の2-プロパノールの添加によって沈殿され得る。DNA含有ペレットは、Tris-EDTA緩衝液中に再懸濁され得、使用するまで-20℃で保存され得る。
【００８１】
ゲノムDNA挿入断片に隣接して位置する既知のpBluescript（登録商標）配列に相補的であるM13フォワードプライマーは、Midland Certified Reagent Company (Midland, TX) から購入され得る。これらのプライマーは、オリゴヌクレオチドの5'末端に結合されたビオチン部分を含むように共有結合的に修飾され得る。ビオチン基は、(CH2)6スペーサーを介して、プライマーの5'-リン酸に共有結合的に連結され得る。ビオチン標識プライマーは、pBluescript（登録商標）ベクターから調製されたssDNA鋳型分子にハイブリダイズすることが可能になり得る。このプライマー-鋳型複合体は、Dorreら (Bioimaging 5: 139-152, 1997) に従って、ストレプトアビジンコーティングされたビーズに結合され得る。適切なDNA希釈に際して、単一のプライマー-鋳型複合体は、単一のビーズに結合される。単一のプライマー-鋳型複合体を含むビーズは、配列決定装置100の反応チャンバー101に挿入され得る。
【００８２】
プライマー-鋳型は、修飾T7 DNAポリメラーゼ (United States Biochemical Corp., Cleveland, OH) とともにインキュベートされ得る。反応混合物は、未標識デオキシアデノシン-5'-三リン酸（dATP）およびデオキシグアノシン-5'-三リン酸（dGTP）、ジゴキシゲニン標識デオキシウリジン-5'-三リン酸（ジゴキシゲニン-dUTP）、ならびにローダミン標識デオキシシチジン-5'-三リン酸（ローダミン-dCTP）を含み得る。重合反応は、37℃で2時間進められ得る。ジゴキシゲニンおよびローダミンで標識された核酸の合成後、鋳型鎖は、標識された核酸から分離され得、かつ、鋳型鎖、DNAポリメラーゼ、および取り込まれていないヌクレオチドが反応チャンバー101から洗い流され得る。または、重合に使用されるすべてのデオキシヌクレオシド三リン酸が標識されなくてもよい。他の代替において、一本鎖核酸が、相補鎖の重合なしで直接的に配列決定されてもよい。
【００８３】
エキソヌクレアーゼ活性は、反応チャンバー101へのエキソヌクレアーゼIIIの添加によって開始され得る。反応混合液は、pH 8.0および37℃に維持され得る。ヌクレオチド110が核酸の3'末端から遊離されると、それらは微小流体チャネル102を下る微小流体の流れによって輸送され得る。マイクロチャネル103に入る際に、電極の対104、105によって作られる電位勾配が、微小流体チャネル102外へ、およびマイクロチャネル103内に、ヌクレオチド110を駆動するために使用され得る。充填されたナノ粒子111をヌクレオチド110が通過するにつれて、それらは、レーザー106からの励起放射に露出され得る。ラマン放出スペクトルは、以下に開示されるように、ラマン検出器107によって検出され得る。
【００８４】
ヌクレオチドのラマン検出
実施例2において開示されるようなラマン検出ユニットが使用され得る。ラマン検出器107は、検出器107を通過しているdATP、dGTP、ローダミン-dCTP、およびジゴキシゲニン-dUTPの単一ヌクレオチド110を検出ならびに同定することが可能であり得る。標識されたヌクレオチドの検出の時間経過についてのデータは、核酸の配列を得るために、編集および分析され得る。代替的な態様において、検出器107は、単一の未標識ヌクレオチドを検出および同定することが可能であり得る。
【００８５】
実施例2：ヌクレオチドのラマン検出
方法および装置
非限定的な例において、ラマン検出ユニットの励起ビームは、近赤外線波長（750〜950nm）のチタニウム：サファイヤレーザー (CoherentによるMira) 、または785nmもしくは830nmのガリウムアルミニウムヒ素ダイオードレーザー (Process InstrumentsによるPI-ECLシリーズ) によって生成された。パルスレーザービームまたは連続ビームが使用された。励起ビームは、二色性ミラー (Kaiser OpticalによるホログラフィックノッチフィルターまたはChromaもしくはOmega Opticalによる二色性干渉フィルター) を通して、集光されたビームを共線的ジオメトリーに伝達された。伝達されたビームは、顕微鏡対物レンズ (Nikon LU series) を通過し、標的分析物（ヌクレオチドまたはプリンもしくはピリミジン塩基）が局在した場所でラマン活性物質に焦点を合わせられた。
【００８６】
分析物からのラマン分散光は、同じ顕微鏡対物レンズによって集光され、ラマン検出器に向かって二色性ミラーを通過した。ラマン検出器は、集光レンズ、分光器、およびアレイ検出器を含んだ。集束レンズは、ラマン分散光を、分光器の入光スリットを通して焦点を合わせた。分光器 (Acton Research) は、その波長によって光を分散させる格子を含んだ。分散光は、アレイ検出器（RoperScientificによる背面照明付きディープディプリーション（deep-depletion）CCDカメラ）上に画像化された。アレイ検出器は、制御回路に接続され、これは、データ輸送および検出器機能の制御のためにコンピュータに接続された。
【００８７】
表面増強ラマン分光法 (SERS) のために、ラマン活性物質は、金属ナノ粒子または金属コーティングされたナノ構造から構成された。5〜200nmのサイズの範囲の銀ナノ粒子を、LeeおよびMeisel (J. Phys. Chem. 86: 3391, 1982)の方法によって作製した。または、試料を、顕微鏡対物レンズの下のアルミニウム基材上に配置した。以下で議論する図面は、アルミニウム基材上での静止試料中で収集した。検出された分子の数は、照射された試料の光学的収集容量によって決定した。
【００８８】
単一のヌクレオチドはまた、微小流体チャネルを使用して、SERSによって検出され得る。本発明の種々の態様において、ヌクレオチドは、微小流体チャネル（約5から200μmの間の幅）を通してラマン活性物質に送達され得る。微小流体チャネルは、Andersonら (「Fabrication of topologically complex three-dimensional microfluidic systems in PDMS by rapid prototyping」Anal. Chem. 72: 3158-3164, 2000) において開示されている技術を使用して、ポリジメチルシロキサン（PDMS）を成形することによって作製され得る。
【００８９】
SERSが銀ナノ粒子の存在下で実行された場合、ヌクレオチド、プリン、またはピリミジンの分析物は、LiCl（90μM最終濃度）およびナノ粒子（0.25M最終濃度銀原子）と混合された。SERSデータは、室温の分析物溶液を使用して収集した。
【００９０】
結果
ヌクレオシド一リン酸、プリン、およびピリミジンを、上記に開示される系を使用して、SERSによって分析した。表1は、種々の関心対象の分析物についての例示的な検出限界を示す。
【００９１】
（表１）ヌクレオシド一リン酸、プリン、およびピリミジンのSERS検出
2007506432.tif 000003
【００９２】
アデニンヌクレオチドのみについて条件を最適化した。アデニンヌクレオチドの最適なSERS検出を提供するために、LiCL（90μM最終濃度）が決定された。他のヌクレオチドの検出は、他のアルカリ金属ハライド塩、例えば、NaCl、KCl、RbCl、またはCsClなどの使用によって促進され得る。特許請求される方法は、使用される電解質溶液によって限定されず、他の種類の電解質溶液、例えば、MgCl、CaCl、NaF、KBr、LiIなどが有用であり得ることが企図される。当業者は、強力なラマンシグナルを示さない電解質溶液が、ヌクレオチドのSERS検出との最小の干渉を提供することを理解する。これらの結果は、ラマン検出系および上記に開示された方法が、ヌクレオチドおよびプリン塩基の単一分子を検出および同定することが可能であったことを実証する。これは、単一のヌクレオチドレベルでの、未標識ヌクレオチドのラマン検出の最初の報告である。
【００９３】
実施例3. ヌクレオチド、プリン、およびピリミジンのラマン発光スペクトル
関心対象の種々の分析物のラマン発光スペクトルを、指示された修飾を伴って、実施例2のプロトコールを使用して得た。図2は、表面増強の非存在下で、かつラマン標識なしでの4つのヌクレオシド一リン酸の各々の100mM溶液のラマン発光スペクトルを示す。LiClは溶液に加えなかった。10秒間のデータ収集時間を使用した。より低い濃度のヌクレオチドは、より長い収集時間で、表面増強により、標識ヌクレオチドを使用して、および/またはさらなる電解質溶液を添加して、検出し得る。励起は514nmで生じた。以下の図面の各々について、785nmの励起波長を使用した。図2において示されるように、増強されていないラマンスペクトルは、4個の各々の標識されていないヌクレオシド一リン酸についての特徴的な発光ピークを示した。
【００９４】
図3は、LiClおよび銀ナノ粒子の存在下でのグアニンの1nm溶液のSERSスペクトルを示す。グアニンは、Nucleic Acid Chemistry, Part 1, L.B. TownsendおよびR. S. Tipson (編), Wiley-Interscience, New York, 1978において述べられているように、酸処理によってdGMPから得られた。SERSスペクトルは、100m秒間のデータ収集時間を使用して得られた。
【００９５】
図4は、酸加水分解によってdCMPから得られた、10nMシトシン溶液のSERSスペクトルを示す。データは1秒間の収集時間を使用して収集した。
【００９６】
図5は、dTMPの酸加水分解によって得られた、100nMチミン溶液のSERSスペクトルを示す。データは100m秒間の収集時間を使用して収集した。
【００９７】
図6は、dAMPの酸加水分解によって得られた、100pMアデニン溶液のSERSスペクトルを示す。データは1秒間収集した。
【００９８】
図7は、dATPの500nM溶液（下のトレース）およびフルオレセイン標識dATP（上のトレース）のSERSスペクトルを示す。dATP-フルオレセインは、Roche Applied Science (Indianapolis, IN) から購入した。この図は、フルオレセインでの標識に起因する、SERSシグナルの強力な増大を示す。
【００９９】
実施例4. ヌクレオチドおよび増幅産物のSERS検出
銀ナノ粒子形成
SERS検出のために使用される銀ナノ粒子を、LeeおよびMeisel(1982)に従って生成した。18ミリグラムのAgNO3を、100mL（ミリリットル）の蒸留水に溶解し、加熱して沸騰させた。10mLの1%クエン酸ナトリウム溶液を、10分間にわたってAgNO3溶液に滴下して加えた。この溶液を、さらに1時間、沸騰したままに保った。得られる銀コロイド溶液を冷却し、保存した。
【０１００】
アデニンのSERS検出
ラマン検出系は、実施例2において開示されるものと同様であった。1mLの銀コロイド溶液を、2mLの蒸留水で希釈した。希釈した銀コロイド溶液（160μL）（マイクロリットル）を、アルミニウムトレイ上で、20μLの10nM（ナノモル濃度）アデニン溶液および40μLのLiCl（0.5モル濃度）と混合した。LiClは、アデニンのためのラマン増強剤として作用した。試料中のアデニンの最終濃度は、約100〜150フェムトリットルの検出容量中で0.9nMであり、60分子と見積もられるアデニンを含んだ。ラマン発光スペクトルを、785nm励起の励起光源を使用して、100ミリ秒間の収集時間を用いて収集した。図8に示されるように、この手順は、60分子のアデニンの検出を示し、約833nmおよび877nmで検出される強力な発光ピークを伴った。実施例2において述べたように、アデニンの単一分子の検出は、開示された方法および装置を使用して示した。
【０１０１】
ローリングサークル増幅
1ピコモル（pmol）のローリングサークル増幅（RCA）プライマーを、0.1pmolの環状、一本鎖M13 DNA鋳型に加えた。この混合物を、1×T7ポリメラーゼ160緩衝液（20mM（ミリモル濃度）Tris-HCl、pH 7.5、10mM MgCl2、1mMジチオスレイトール）、0.5mM dNTP、および2.5ユニットのT7 DNAポリメラーゼと、37℃で2時間インキュベートし、RCA産物を形成させた。陰性対照を、DNAポリメラーゼなしで同じ試薬を混合およびインキュベートすることによって調製した。
【０１０２】
RCA産物のSERS検出
1μLのRCA産物および1μLの陰性対照試料を、アルミニウムトレイ上に別々にスポットし、風乾した。各スポットを、5μLの1×PBS（リン酸緩衝化生理食塩水）ですすいだ。このすすぎを3回反復し、最終のすすぎ後にアルミニウムトレイを風乾した。
【０１０３】
上記のように調製した1mLの銀コロイド溶液を、2mLの蒸留水で希釈した。8マイクロリットルの希釈した銀コロイド溶液を、2μLの0.5M LiClと混合し、アルミニウムトレイ上のRCA産物のスポットに加えた。同じ溶液を、陰性対照スポットに加えた。上記に開示されたようにラマンシグナルを収集した。図9において実証されたように、RCA産物は、約833および877nmの発光ピークを伴って、SERSにより検出可能であった。LiClエンハンサーを用いるこのプロトコールの条件下で、アデニン部分からのシグナル強度は、グアニン、シトシン、およびチミンについてのシグナル強度よりも強力である。増幅の非存在下ではシグナルが観察されなかったことから、陰性対照（示さず）は、ラマンシグナルがRCA産物に特異的であることを示した。
【０１０４】
実施例5. 核酸のエキソヌクレアーゼ消化
エキソヌクレアーゼ処理は、Sauerら (J. Biotech. 86: 181-201, 2001)に従って実行された。ビオチンで5'末端を標識した単一の核酸分子を、核酸鋳型のPCR増幅によって、5'-ビオチン化オリゴヌクレオチドプライマーを使用して調製する。円錐形状の3μmシングルモード光ファイバー (SMC-A0630B, Laser Components GmbH, Olching, Germany) を準備する。ガラス繊維を、HFで化学的にエッチングし、鋭いチップを形成する。3-メルカプトプロピルトリメトキシシランを用いるコーティング後、チップをγ-マレイミド酪酸N-ヒドロキシスクシンアミド（GMBS）で処理する。繊維のチップを、ストレプトアビジンで活性化し、ビオチン化DNAに結合させる。未結合DNAは洗浄によって除去する。
【０１０５】
結合したDNAの単一分子を含む繊維を、5μmマイクロチャネルに接続したPDMS反応チャンバーに挿入する。エキソヌクレアーゼIを、ssDNAの切断を開始するために反応チャンバーに加える。エキソヌクレアーゼは、光学的トラップの使用によって反応チャンバーに制限される (例えば、Walkerら、FEBS Lett. 459: 39-42,1999 ;Benninkら、Cytometry 36: 200-208, 1999; Mehtaら、Science 283: 1689-95, 1999; Smithら、Am. J. Phys. 67: 26-35,1999)。光学的トラッピングデバイスは、Cell Robotics, Inc. (Albuquerque, NM)、S+L GmbH (Heidelberg, Germany)、および P.A.L.M. Gmbh (Wolfratshausen, Germany)から市販されている。ヌクレオシド一リン酸は、エキソヌクレアーゼ消化によって遊離し、実施例2に開示されているように、微小流体の流れによってラマン検出器を通過して輸送される。溶液中のヌクレオチドは、水力学的フォーカシングの使用を通して、レーザー励起および検出容量中で焦点を合わせられる。90μMの濃度のLiClが、検出混合液に添加され、検出器の近傍の微小流体チャネルは、LeeおよびMeisel (1982)に従って調製される銀ナノ粒子が充填される。単一のヌクレオチドは、それらがラマン検出器を流れ過ぎる時検出され、核酸配列の決定を可能にする。
【０１０６】
本明細書に開示されかつ特許請求されるすべての方法および装置は、本開示に鑑みて、過度の実験なしで行われかつ使用され得る。特許請求される対象の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された方法および装置に対するバリエーションが適用され得ることが当業者には明らかである。より具体的には、化学的および生理学的の両方で関連する特定の物質が、本明細書に記載された物質の代わりに置換され得るが、同じかまたは類似の結果が達成されることが明らかである。当業者に明らかであるこのような同様の置換および修飾のすべてが、特許請求される対象の精神、範囲、および概念の範囲内にあると見なされる。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
以下の図面は本明細書の一部を形成し、開示された方法および装置の特定の局面をさらに実証するために含まれる。これらの方法および装置は、本発明に提示される特定の態様の詳細な記載と組み合わせた、1つまたは複数のこれらの図面に対する参照によってより良好に理解され得る。
【図１】例示的な装置100（スケールを示すものではない）、ならびに表面増強ラマン分光法（SERS）、表面増強共鳴ラマン分光法（SERRS）、および/またはコヒーレント反ストークスラマン分光法（CARS）検出による核酸109配列決定のための方法を図示する。
【図２】100ミリ秒間のデータ収集時間を使用する、100mM濃度における4種類すべてのデオキシヌクレオシド一リン酸（dNTP）のラマンスペクトルを示す。各々異なる種類のヌクレオチドについて示されるような特徴的なラマン発光ピークである。データは、表面増強またはヌクレオチドの標識なしで収集された。
【図３】Nucleic Acid Chemistry, Part 1, L. B. TownsendおよびR. S. Tipson (編), Wiley-Interscience, New York, 1978に従った酸処理によってdGMPから得られた1nMグアニンのSERS検出を示す。
【図４】100nMシトシンのSERS検出を示す。
【図５】100nMチミンのSERS検出を示す。
【図６】酸処理によってdAMPから得られる100pMアデニンのSERS検出を示す。
【図７】フルオレセインで共有結合的に標識されたデオキシアデノシン三リン酸（上のトレース）および未標識dATP（下のトレース）の500nM溶液の比較SERSスペクトルを示す。dATP-フルオレセインは、Roche Applied Science (Indianapolis, IN)から入手した。SERSシグナルの強力な増加が、フルオレセイン標識dATPにおいて検出された。
【図８】アデニンの0.9nM（ナノモル濃度）溶液のSERS検出を示す。検出容量は100〜150フェムトリットルであり、60分子と見積もられるアデニンの分子を含む。
【図９】一本鎖環状M13 DNA鋳型を使用するローリングサークル増幅産物のSERS検出を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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