(57)【要約】本発明は、病原体抵抗性に関するものである。さらに詳細には本発明は、菌類病原体、詳細には土壌フザリウム菌類に対するバナナ植物の抵抗性メカニズムに関与するポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列に関するものである。バナナの二つの抵抗性遺伝子RGA5およびRGA2が単離され、特徴づけされる。本発明は、植物の抵抗性を調整するため、および改変された病原体抵抗性の特性を有する遺伝子改変植物を産生させるためのこれらの配列の使用にも関するものでもある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）植物に病害抵抗性を付与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該配列が配列番号：1もしくは3記載の配列またはその相補体と少なくとも30%の配列同一性を共有するポリヌクレオチド；
（b）配列番号：1もしくは3記載の配列または該配列の相補体の、少なくとも300個の連続するヌクレオチドの長さの部分を含み、該部分が植物に病害抵抗性を付与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号：2または4記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（d）配列番号：2または4記載のアミノ酸配列の、少なくとも100個の連続するアミノ酸残基の長さの部分をコードするヌクレオチド配列を含み、該部分が植物に病害抵抗性を付与するポリヌクレオチド；
（e）配列番号：2または4記載の配列の、少なくとも300個の連続するアミノ酸残基の長さの少なくとも部分と少なくとも50%の配列類似性を共有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ポリペプチドが植物に病害抵抗性を付与するポリヌクレオチド；
（f）植物に病害抵抗性を付与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、少なくとも低厳密性の条件下で（a）、（b）、（c）、（d）、（e）の配列またはそれらの相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（g）配列番号：1もしくは3記載の配列または該配列の相補体の、少なくとも15個の連続するヌクレオチドの長さの部分を含み、該部分が少なくとも低厳密性の条件下で（a）、（b）、（c）、（d）、（e）の配列またはそれらの相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチド、から選択される単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
植物において作動可能である調節エレメントに作動可能に接続した、請求項1記載のポリヌクレオチドを含む核酸構築体。
【請求項３】
ベクターである、請求項2記載の核酸構築体。
【請求項４】
請求項2記載の核酸構築体を含有する単離された宿主細胞。
【請求項５】
植物細胞である、請求項4記載の宿主細胞。
【請求項６】
植物細胞がそのヌクレオームに組込まれた核酸構築体を有する、請求項5記載の宿主細胞。
【請求項７】
植物細胞がそのゲノムに安定に組込まれた核酸構築体を有する、請求項5記載の宿主細胞。
【請求項８】
請求項2記載の核酸構築体を含む細胞を含有する植物。
【請求項９】
植物細胞がそのゲノムに安定に組込まれた核酸構築体を有する、請求項8記載の植物。
【請求項１０】
病害抵抗性を付与するポリヌクレオチドまたはその部分の存在について核酸を検索するた(interrogating)めのプローブであって、請求項1記載のポリヌクレオチドに少なくとも低厳密性の条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む該プローブ。
【請求項１１】
プローブが配列番号：2もしくは4記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の少なくとも部分に対応するか、またはそれに相補的である核酸配列から本質的に構成され、該部分が少なくとも15個のヌクレオチドの長さである、請求項10記載の該プローブ。
【請求項１２】
プローブが少なくとも低厳密性の条件下で配列番号：2または4記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の少なくとも部分にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、該部分が少なくとも15個のヌクレオチドの長さである、請求項10記載の該プローブ。
【請求項１３】
プローブが少なくとも低厳密性の条件下で配列番号：1または3の少なくとも部分にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、該部分が少なくとも15個のヌクレオチドの長さである、請求項10記載の該プローブ。
【請求項１４】
植物における病害抵抗性を調整するための方法であって、該方法が該植物のヌクレオームに構築体を導入する段階および安定に形質転換された植物を再生する段階を含み、該構築体が、
（a）植物に病害抵抗性を付与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該配列が配列番号：1もしくは3記載の配列またはその相補体と少なくとも30%の配列同一性を共有するポリヌクレオチド；
（b）配列番号：1もしくは3記載の配列または該配列の相補体の、少なくとも300個の連続するヌクレオチドの長さの部分を含み、該部分が植物に病害抵抗性を付与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号：2または4記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（d）配列番号：2または4記載のアミノ酸配列の、少なくとも100個の連続するアミノ酸残基の長さの部分をコードするヌクレオチド配列を含み、該部分が植物に病害抵抗性を付与するポリヌクレオチド；
（e）配列番号：2または4記載の配列の、少なくとも300個の連続するアミノ酸残基の長さの少なくとも部分と少なくとも50%の配列類似性を共有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ポリペプチドが植物に病害抵抗性を付与するポリヌクレオチド；および
（f）植物に病害抵抗性を付与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、少なくとも低厳密性の条件下で（a）、（b）、（c）、（d）、（e）の配列またはそれらの相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチド、から選択されるポリヌクレオチドと作動可能に接続した調節エレメントを含む方法。
【請求項１５】
形質転換植物細胞が生じるように構築体が再生可能な植物細胞に導入される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
形質転換植物細胞が分化した植物を再生するために使用される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
再生可能な細胞が再生可能な双子葉植物細胞である、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
再生可能な細胞が再生可能な単子葉植物細胞である、請求項15記載の方法。
【請求項１９】
再生可能な細胞が再生可能なイネ科単子葉植物細胞である、請求項15記載の方法。
【請求項２０】
再生可能な細胞が再生可能な非イネ科単子葉植物細胞である、請求項15記載の方法。
【請求項２１】
再生可能な細胞が再生可能なバナナ細胞である、請求項15記載の方法。
【請求項２２】
ポリヌクレオチドの発現が分化したトランスジェニック植物に増大した病害抵抗性を与える、請求項16記載の方法。
【請求項２３】
病害が菌類病原体によって引き起こされる、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
病害が土壌菌類によって引き起こされる、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
病害がフザリウム種（Fusarium species）によって引き起こされる、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
核酸構築体が分化したトランスジェニック植物からその子孫への完全なサイクルを介して伝達する結果、該構築体が該子孫植物によって発現される、請求項16記載の方法。
【請求項２７】
子孫が分化したトランスジェニック植物から得られた種子、植物の部分、組織、および子孫植物から選択される、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
植物を育種する方法であって、ポリヌクレオチドが、
（a）植物に病害抵抗性を付与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該配列が配列番号：1もしくは3記載の配列またはその相補体と少なくとも30%の配列同一性を共有するポリヌクレオチド；
（b）配列番号：1もしくは3記載の配列または該配列の相補体の、少なくとも300個の連続するヌクレオチドの長さの部分を含み、該部分が植物に病害抵抗性を付与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号：2または4記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（d）配列番号：2または4記載のアミノ酸配列の、少なくとも100個の連続するアミノ酸残基の長さの部分をコードするヌクレオチド配列を含み、該部分が植物に病害抵抗性を付与するポリヌクレオチド；
（e）配列番号：2または4記載の配列の、少なくとも300個の連続するアミノ酸残基の長さの少なくとも部分と少なくとも50%の配列類似性を共有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ポリペプチドが植物に病害抵抗性を付与するポリヌクレオチド；および
（f）植物に病害抵抗性を付与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、少なくとも低厳密性の条件下で（a）、（b）、（c）、（d）、（e）の配列またはそれらの相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチド、から選択される、植物から該ポリヌクレオチドに対応する遺伝物質を交雑および戻し交雑することを経て別の植物に移行させる段階を含む方法。
【請求項２９】
もう一方の植物が病原性の病害に感受性である、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
病害が菌類病原体によって引き起こされる、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
病害がフザリウム種によって引き起こされる、請求項29記載の方法。
【請求項３２】
遺伝物質が天然DNAを含む、請求項28記載の方法。
【請求項３３】
（1）遺伝物質を含有する植物を、病原体に感受性の分類群からの植物と有性交雑する段階；
（2）該交雑の子孫から繁殖物質を回収する段階；および
（3）該繁殖物質から病害に対する抵抗性が増大した植物を成長させる段階、
を含む、請求項28記載の方法。
【請求項３４】
段階（1）の前に、植物におけるポリヌクレオチドの発現を検出することによって、病原性の病害に抵抗性である植物を同定する段階をさらに含む、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
（a）病害抵抗性の子孫を、感受性分類群からの病害感受性の植物と戻し交雑する段階；および
（b）該戻し交雑の子孫の間で、ポリヌクレオチドに対応するか、または該ポリヌクレオチドに関連するマーカー遺伝子に対応する、核酸配列の発現について選択する段階を、該感受性分類群の所望の性質が該子孫に存在するようになるまで繰り返すことをさらに含む、請求項33記載の方法。
【請求項３６】
（i）配列番号：2または4記載の配列と少なくとも50%の類似性を共有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ii）配列番号：2または4記載の配列の、少なくとも100個の連続するアミノ酸残基の長さの部分を含む、植物に病害抵抗性を付与するポリペプチド；
（iii）配列番号：2または4記載の配列の少なくとも部分と少なくとも30%の類似性を共有するアミノ酸配列を含む、該部分が少なくとも100個の連続するアミノ酸残基の長さであるポリペプチド；および
（iv）配列番号：2または4記載の配列の少なくとも部分を含む、該部分が少なくとも5個の連続するアミノ酸残基の長さであり、（i）、（ii）または（iii）から選択される配列と免疫相互作用性である抗原結合分子と免疫相互作用性であるポリペプチド、から選択される単離されたポリペプチド。
【請求項３７】
（a）図2の残基1〜167に対応するドメイン、
（b）図2の残基168〜536に対応するドメイン、および
（c）図2の残基537〜1476に対応するドメイン
から選択される少なくとも一つのドメインを含む、請求項36記載のポリペプチド。
【請求項３８】
（a）で定義されたドメインがコイルドコイルに構造的に同様である、請求項37記載のポリペプチド。
【請求項３９】
（a）で定義されたドメインが図2における対応するドメインと、少なくとも60%の配列類似性もしくは少なくとも30%の配列同一性を有するか、または40個以下のアミノ酸残基が異なる、請求項37記載のポリペプチド。
【請求項４０】
（a）で定義されたドメインが、式（I）：
2007506414.tif 000017
（式中：
Φ1-10のそれぞれは、任意の疎水性アミノ酸残基から独立して選択され、
Zaaは、中性/極性アミノ酸残基であり、
Σaa1-4のそれぞれは、任意の小型アミノ酸残基から独立して選択され、
Baa1-3のそれぞれは、任意の塩基性アミノ酸残基から独立して選択され、
Åaa1-5のそれぞれは、任意の酸性アミノ酸残基から独立して選択され、
Ωaa1-2のそれぞれは、任意の荷電アミノ酸残基から独立して選択され、かつ
Xaa1-33は、任意のアミノ酸残基からそれぞれ独立して選択される）の配列を含む、請求項37記載のポリペプチド。
【請求項４１】
（b）で定義されたドメインが核結合部位（NBS）ドメインに機能的に類似している、請求項37記載のポリペプチド。
【請求項４２】
（b）で定義されたドメインが図2における対応するドメインと、少なくとも70%の配列類似性もしくは少なくとも50 90%の配列同一性を有するか、または40個以下のアミノ酸残基が異なる、請求項37記載のポリペプチド。
【請求項４３】
（b）で定義されたドメインが、式（II）：
2007506414.tif 000018
（式中：
Φ1-27のそれぞれは、任意の疎水性アミノ酸残基から独立して選択され、
Σaa1-18のそれぞれは、任意の小型アミノ酸残基から独立して選択され、
Baa1-4のそれぞれは、任意の塩基性アミノ酸残基から独立して選択され、
Åaa1-5のそれぞれは、任意の酸性アミノ酸残基から独立して選択され、
Ωaa1-10のそれぞれは、任意の荷電アミノ酸残基から独立して選択され、かつ
Xaa1-95は、任意のアミノ酸残基からそれぞれ独立して選択される）の配列を含む、請求項37記載のポリペプチド。
【請求項４４】
（c）で定義されたドメインがロイシンリッチリピート（LRR）ドメインに機能的に類似している、請求項37記載のポリペプチド。
【請求項４５】
（c）で定義されたドメインが図2における対応するドメインと、少なくとも60%の配列類似性もしくは少なくとも30%の配列同一性を有するか、または40個以下のアミノ酸残基が異なる、請求項37記載のポリペプチド。
【請求項４６】
（b）で定義されたドメインが、式（III）：
2007506414.tif 000019
（式中：
Φ1-22のそれぞれは、任意の疎水性アミノ酸残基から独立して選択され、
Σaa1-16のそれぞれは、任意の小型アミノ酸残基から独立して選択され、
Baa1-14のそれぞれは、任意の塩基性アミノ酸残基から独立して選択され、
Åaa1-2のそれぞれは、任意の酸性アミノ酸残基から独立して選択され、
Ωaa1-16のそれぞれは、任意の荷電アミノ酸残基から独立して選択され、かつ
Xaa1-93は、任意のアミノ酸残基からそれぞれ独立して選択される）で示される配列を含む、請求項37記載のポリペプチド。
【請求項４７】
請求項37記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項４８】
請求項37記載のポリペプチドと特異的に免疫相互作用性である抗原結合分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般的に病原体抵抗性に関する。さらに詳細には本発明は、病原体、特に菌類病原体に対する植物の抵抗性メカニズムに関与するポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列に関する。本発明は、植物の抵抗性を調整するための、および改変された病原体抵抗性の性質を有する遺伝子改変植物を産生するためのこれらの配列の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書において著者が参照した一定の刊行物の書誌詳細を、本説明の最後にまとめる。
【０００３】
発明の背景
バナナは、年間世界産出量約9800万トンを有する世界中で最も重要な果実作物の一つである（食料農業機関 (FAO), 2001）。しかし、多くの単一栽培と同様に一連の菌類、ウイルス、細菌および線虫の病害がバナナを冒し、それらの病害は毎年重大な経済的損失を引き起こしている。
【０００４】
萎凋病（Fusarium wilt）は、バナナに最も危害を加える有名な病害の一つである。萎凋病は、パナマ病としても知られているが、これはこの中央アメリカの国の輸出用プランテーションに萎凋病が引き起こした大規模な損害を認めたものである。1960年までに萎凋病は、推定40,000haのグロス・ミッチェル（Gros Michel）に危害を加え（AAA）、輸出産業がキャベンディッシュ（Cavendish）亜群の品種に転換する原因となった（AAA）（Ploetz and Pegg, 2000）。萎凋病は、土壌不完全糸状菌類であるフザリウム・オクシスポルムSchlect. f. sp.クベンセ（Fusarium oxysporum Schlect. f. sp. cubense）によって引き起こされる。この菌は、顕花植物に維管束部萎凋病を引き起こすF.オクシスポルム（F. oxysporum）の120個を超える分化型（formae speciales）の一つである。この病原体は、バショウ属（Musa）およびヘリコニア属（Heliconia）の種を冒し、株は圃場での宿主品種に対する病原性に基づき4つの生理学的品種に分類されている（品種1：「グロス・ミッチェル（Gros Michel）」、品種2：「ブルゴエ（Bluggoe）」、品種3：ヘリコニアspp.、品種4：キャベンディッシュ栽培種、全ての栽培種は品種1および2に感受性である）。最近まで品種4はオーストラリア、南アフリカ、カナリア諸島、および台湾の亜熱帯地域にのみ深刻な損害を引き起こしたことが報告されていた。もしもこの品種がアメリカに定着するようになるとしたら、キャベンディッシュ栽培種に代わる広く受け入れられている代替物がないことから世界の輸出産業は大きく影響を受けるであろう（Bentley et al., 1998）。
【０００５】
一般に、有効な化学防除措置は存在しない。南アフリカで実施された成果では、臭化メチルは病害の発生率を有意に低下させたが、燻蒸された地面に病原体が再定着することが原因で、臭化メチルはわずか３年間しか有効ではなかった。この病害の生物学的および耕種的防除に関する研究は最近始まったばかりである。アーバスキュラー菌根菌（Arbuscular mycorrhizal fungi）は、短期の温室研究で病害の重症度を下げることが示されたが、長期圃場研究の結果は報告されていない（Ortiz et al., 1995）。組織培養小植物体には病原体が存在しないことから、新しい植栽を定着させるためにその植物体をいつでも可能なときに使用すべきである。しかし、小植物体の費用が、自給農業における小植物体の使用を実行不能にするおそれがある。遺伝的抵抗性は、被害土壌においてこの病害を管理する最大の機会を提供する（Ortiz et al., 1995）。
【０００６】
植物は、過敏感反応（HR）と名付けられた迅速な防御応答を誘導することによって、多くの侵入病原体を認識し、それらの病原体に抵抗する。HRの結果として、感染部位に局在する細胞および組織の死滅がもたらされ、このことによって、感染のさらなる拡散が抑止される。この局所応答は、全身獲得抵抗性（SAR）として知られている現象である、植物全体にわたる非特異的抵抗性をしばしば誘発する。一旦誘発されると、SARは広範囲の病原体に対して数日間抵抗性を提供する。HRおよびSARは、植物中の優性または半優性抵抗性遺伝子（R）産物と、対応する優性植物病原体非病原性（Avr）遺伝子産物との間の相互作用に依存する（Baker et al., 1997）。植物R遺伝子または病原体Avr遺伝子のいずれかの欠失または変更は、病害をもたらす（共存性）（Hammond-Kosack and Jones, 1997）。
【０００７】
Rタンパク質は、菌類、細菌、ウイルス、線虫および昆虫のように多様な病原体に対する抵抗性を提供する。予測されたタンパク質の構造の性質により8クラスのR遺伝子が定義されている：（1）細胞質毒素還元酵素；（2）細胞内プロテインキナーゼ；（3）2つのタンデムプロテインキナーゼドメインを有するレセプターキナーゼ様タンパク質；（4）細胞外ロイシンリッチリピート（LRR）ドメインを有するレセプター様プロテインキナーゼ；（5）ヌクレオチド結合部位（NBS）およびロイシンジッパー（LZ）モチーフを有する細胞内LRRタンパク質；（6）Toll-インターロイキン1レセプター（TIR）タンパク質に類似性を有する領域を有する細胞内NBS-LRRタンパク質；（7）膜結合型細胞外タンパク質をコードするLRRタンパク質；および（8）膜結合型細胞内タンパク質をコードするLZタンパク質（図1）。少数の例外を除き、全てのR遺伝子はマップに基づくクローニング法によってクローニングされた。
【０００８】
NBS-LRRクラスは、今日までにクローニングされた遺伝子30個を超える、ずば抜けて最大の群の抵抗性タンパク質である。NBS-LRRクラス内の二つの亜群は、Toll-インターロイキン1レセプターの細胞質シグナル伝達ドメインにアミノ酸配列の類似性を有するアミノN末端領域（TIRドメイン）の有無によって見分けられている（Meyer et al., 1999； Pan et al., 2000）。
【０００９】
いくつかのNBS-LRRタンパク質のN末端は、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）の細胞質エフェクタードメインおよびヒトTOLL-インターロイキン1レセプター（TIRドメイン）に類似している（Hammond-kosack and Jones, 1997）。他のNBS-LRRタンパク質は、種々のN末端ドメインを有し、それらのドメインはしばしば推定上のロイシンジッパー（LZ）モチーフを含有する。シロイヌナズナ属（Arabidopsis）での突然変異分析から、TIR-NBS-LRRおよびLZ-NBS-LRRタンパク質が異なるシグナル伝達経路を使用することが明らかとなった。TIRエフェクタードメインにおけるタンパク質は、予測されたリパーゼであるEDS1を含む経路を経由してシグナルを発するが、試験された大部分のLZ-NBS-LRRタンパク質は、膜関連NDR1タンパク質を使用する（Aarts et al., 1998）。病原体の種類と、これらの病原体を検出するために植物によって使用されるNBS-LRRサブクラスとの間に、明白な相関はない（Ellis and Jones 1998）。これらの事実の全ては、Aartsら（1998）の仮説に一致し、Aartsらは、R遺伝子によって誘発される二つの下流の経路が存在するおそれがあり、Rタンパク質の構造がどの下流の因子が必要かを決定していると示唆した。他の最近の結果は、状況がこのように単純ではないことを示した。シロイヌナズナ属からの二つのR遺伝子であるRPP8およびRPP13（両方ともLZ-NBS-LRRタンパク質）は、EDS1もNDR1も必要とせず、これは、R遺伝子のシグナル伝達のために少なくとも第三の経路が存在することを示唆している（Glazebrook, 2001）。異なるR遺伝子に関する多くの研究は、R-タンパク質のLRRドメインが個別のR遺伝子の独特な認識能に大きく貢献することを示唆したが、最近の一連のL対立遺伝子の分析は、TIRドメインがこの能力にも貢献できることを示した。このように、LRRは必要であるが、Avrタンパク質の特異的認識には十分でなく、かつLRRおよびアミノ末端ドメインが共に進化して協同して機能するようになった可能性がある（Zachary, 2001）。
【００１０】
中央のNBSドメインは、ATPまたはGTPと結合すると予測される三つのモチーフおよび機能が未知である数個の保存されたモチーフを含む（Hammond-KosackおよびJones、1997）。この領域は、動物細胞におけるアポトーシスの二つの活性化因子である、APAF-1およびCEDに相同性を有する。これらの十分に特徴づけされたプログラム細胞死の調節因子に類似して、NBS-LRRタンパク質における対応するドメインは、分子内シグナル伝達物質として作動するおそれがある（Van der Biezen and Jones, 1998; Aravind et al., 1999）。数個のアマL対立遺伝子を伴うドメイン交換は、分子内相互作用の必要性を明らかにし、よってNBS-LRRタンパク質は、認識とシグナルの送達とを連結するアダプター分子として働きうる。例えば、LRRによって感知されるAvrシグナルは、NBSドメインでヌクレオチドの加水分解を開始しうる。これは、NBS-LRRタンパク質のN末端をエフェクタータンパク質に露出するNBS-LRRタンパク質におけるコンホメーション変化が防御応答を誘発するために必要なエネルギーを提供しうる（Van der Biezen and Jones, 1998）。
【００１１】
LRRドメインは、リガンドの結合および病原体の認識に関与すると考えられる。LRRは、規則的な間隔でロイシンまたは他の疎水性残基を含有し、規則的に間隔が空いたプロリンおよびアスパラギンも含有しうる（Bent, 1996）。LRRドメインの比較分析は、超可変性を示し、これは、選択圧が原因の多様化を示唆している。これは、LRRのこの部分に認識特異性残基があることを示している。異なるアマL対立遺伝子の間でインビボおよびインビトロで発生した組換え体の分析によって、Ellisら（1997）は、LRRがAvr産物に対する特異性の主要決定基を構成することを実験的に確認した。Rタンパク質の他と異なる特異性は、LRRをコードする領域内での複製、欠失および配列交換に関連することが多い。最近、酵母2ハイブリッド系においてイネ抵抗性タンパク質PitaのLRR様ドメインがAvr-Pitaとの相互作用に必要であることが示された。さらに、抵抗性を破壊した、Avr-PitaまたはPitaのいずれかにおける突然変異は、インビトロの相互作用も破壊した。これは、LRR含有Rタンパク質とそのコグネイトAvrタンパク質との間の最初に実証された相互作用である（Jia et al., 2000）。
【００１２】
今日までに単離された抵抗性遺伝子のいくつかが、同種または異なる種の感受性品種に移行され、成果を収めた。例えば、タバコモザイクウイルス（TMV）に対する抵抗性のためのN遺伝子がトマトに移行され、この種にTMVに対する抵抗性を与えている（Whitham et al., 1996）。コショウにおけるキサントモナス（Xanthomonas）抵抗性をコードするBs2遺伝子がクローニングされ、この病原体に対する有用な抵抗性遺伝子の数が限られている作物種であるトマトに移行された（Tai et al., 1999）。しかし、シロイヌナズナからのRPS2遺伝子はトランスジェニックトマトにおいて非機能性であり、この現象は「制限された分類学的機能性」と称される（Tai et al., 1999）。これらのデータは、R遺伝子の特異性が原因となって、ある場合では広範囲の抵抗性遺伝子の種間移行が困難であるおそれがあることを示唆している（Ellis et al., 2000）。
【００１３】
R遺伝子を単離および移行できることによって、古典的育種に関連する重大な問題点である望まれていない遺伝的に連鎖している生殖質の保持の問題が排除される。病害抵抗性のトランスジェニック植物は、まだ商業的に入手できないが、病因および植物の防御に関する我々の現在の理解のレベルが改善するにつれて将来的な製品開発が見込まれる（Stuiver and Custers 2002）。
【００１４】
しかし、R遺伝子の生物学的研究の進歩にもかかわらず、感受性品種に有害なバナナの病害に抵抗性を付与できる抵抗性遺伝子は、現在のところ単離されていない。
【００１５】
本発明に至る研究において、四つの遺伝子型のバナナを検討して、品種4のフザリウム・オクシスポルムfspクベンセに抵抗性を付与するであろう候補R遺伝子を同定した。これらの遺伝子型は、以下のとおりであった：品種1に抵抗性であるが品種4に感受性であるキャベンディッシュ；品種1および品種4に抵抗性であるカルカッタ4；品種4に感受性であるムサ・アクミナタsppマラセンシス（Musa acuminata spp malaccensis）；および品種4に抵抗性のムサ・アクミナタsppマラセンシスの三つの子孫。五つのファミリーのR遺伝子がこの研究から同定され、その全てが各遺伝子型のゲノムに存在したが、わずかに異なる配列を有した。驚くことに、これらのファミリーのうち二つ（RGA2およびRGA5）は、トマトに萎凋病に対する抵抗性を付与するI2 R遺伝子と幾分かの配列類似性を共有することが分かった。さらに、RGA2はムサ・アクミナタsppマラセンシスの三つの抵抗性後代では転写されるが、三つの感受性後代には転写されないことが示された。これらの発見は、変形されて、バナナを含めた植物ならびに以下に述べるように改変された病害抵抗性を有する植物および植物の部分、特に遺伝子改変植物、植物細胞、組織、および種子における病害への抵抗性、特に菌類抵抗性を調整するための組成物および方法に実施される。
【発明の開示】
【００１６】
発明の概要
したがって一局面では、本発明は、いくつかの態様で植物に病害抵抗性、特に菌類病原体により引き起こされる病害に対する抵抗性を付与する、単離されたポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドは、一般的に、（a）植物に病害抵抗性を付与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、配列が配列番号：1もしくは3記載の配列またはその相補体と少なくとも30%（ならびに少なくとも31%から少なくとも99%までおよびそれらの間の全ての整数の百分率）の配列同一性を共有するポリヌクレオチド；（b）配列番号：1もしくは3記載の配列またはその配列の相補体の、少なくとも300個の連続するヌクレオチドの長さの部分を含み、部分が植物に病害抵抗性を付与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（c）配列番号：2もしくは4記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；（d）配列番号：2または4記載のアミノ酸配列の、少なくとも100個の連続するアミノ酸残基の長さの部分をコードするヌクレオチド配列を含み、部分が植物に病害抵抗性を付与するポリヌクレオチド；（e）配列番号：2または4記載の配列の、少なくとも300個の連続するアミノ酸残基の長さの少なくとも部分と少なくとも50% （ならびに少なくとも51%から少なくとも99%およびそれらの間の全ての整数の百分率）の配列類似性を共有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ポリペプチドが植物に病害抵抗性を付与するポリヌクレオチド；（f）植物に病害抵抗性を付与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、少なくとも低、中、または高厳密性の条件下で（a）、（b）、（c）、（d）、（e）の配列またはその相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチド；および（g）配列番号：1もしくは3記載の配列またはその配列の相補体の、少なくとも15個の連続するヌクレオチドの長さの部分を含み、部分が少なくとも低、中、または高厳密性の条件下で（a）、（b）、（c）、（d）、（e）の配列またはそれらの相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチド、から選択される。
【００１７】
別の局面では、本発明は、植物に病害抵抗性を付与するための核酸構築体を提供する。これらの構築体は、広く記載されたように一般的に調節エレメントに作動可能に接続したポリヌクレオチドを含み、その調節エレメントは植物において作動可能である。ある態様において、その構築体は、ベクター、特に発現ベクターの形態である。
【００１８】
なお別の局面では、本発明は、広く上述のように核酸構築体を含有する単離された宿主細胞を提供する。ある好都合な態様では、その宿主細胞は、植物細胞である。いくつかの態様において、その植物細胞はヌクレオームに組込まれた、特にゲノムに安定に組込まれた核酸構築体を有する。
【００１９】
なお別の局面では、本発明は、広く上述のように核酸構築体を含む細胞を含有する植物を提供する。ある理想的な態様において、その植物はヌクレオームに、特にそれらの細胞のゲノムに安定に組込まれた核酸構築体を有する。
【００２０】
さらなる局面では、本発明は、病害抵抗性を付与するポリヌクレオチドまたはその部分の存在について核酸を検索するためのプローブを提供する。これらのプローブは、広く上述のようなポリヌクレオチドに、少なくとも低、中、または高厳密性の条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を一般的に含む。ある態様では、プローブは、配列番号：2または4記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の少なくとも部分に対応するか、またはそれに相補的である核酸配列から本質的に構成され、部分は、少なくとも15個のヌクレオチドの長さである。他の態様では、そのプローブは、少なくとも低、中、または高厳密性の条件下で配列番号：2または4記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の少なくとも部分にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、部分は少なくとも15個のヌクレオチドの長さである。まだ他の態様では、そのプローブは、少なくとも低、中、または高厳密性の条件下で配列番号：1または3の少なくとも部分にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、その部分は少なくとも15個のヌクレオチドの長さである。
【００２１】
本発明の別の局面は、植物における病害抵抗性を調整、特に刺激または増大するための方法を提供する。これらの方法は、植物のヌクレオームに広く上述のような構築体を導入する段階および安定に形質転換された植物を再生する段階を一般的に含む。ある態様において、その構築体は、形質転換された植物細胞が生じるように再生可能な植物細胞に導入され、形質転換された植物細胞は適切に同定および選択され、その後分化した植物を再生するために使用される。典型的には形質転換された植物細胞系は、遺伝子改変された植物またはトランスジェニック植物の分化について、形質転換された植物細胞から選択される。いくつかの態様では、再生可能な細胞は、再生可能な双子葉植物細胞である。他の態様では、再生可能な細胞は、再生可能なイネ科単子葉植物細胞および特に再生可能な非イネ科単子葉植物細胞のような再生可能な単子葉植物細胞である。一例では、再生可能な植物細胞は、再生可能なバナナ細胞である。ある好都合な態様では、核酸構築体における調節エレメントに作動可能に連結しているポリヌクレオチドの発現は、分化したトランスジェニック植物が病害、詳細には菌類病原体、特にフザリウム種のような土壌菌類によって引き起こされる病害に対する抵抗性の増大を有するようにする。望ましくは、核酸構築体は、分化したトランスジェニック植物の完全なサイクルを介してその子孫に伝達する結果、子孫植物によって発現される。このように、本発明は分化したトランスジェニック植物から得られた種子、植物部分、組織および子孫植物も提供する。
【００２２】
なお別の局面では、本発明は、広く上述のようなポリヌクレオチドに対応する遺伝物質を、他の植物、特に病原性の病害、特にフザリウム種のような菌類病原体によって引き起こされる病害に感受性の植物と交雑および戻し交雑することを経て移行させる従来の植物育種方法を考えている。いくつかの態様では、その遺伝物質は、広く上述のようなポリヌクレオチドに対応する天然DNAを含む。典型的にはこれらの方法は、（1）遺伝物質を含有する植物を病原体感受性分類群からの植物と有性交雑する段階；（2）交雑の子孫から繁殖物質を回収する段階；および（3）繁殖物質から増大した病害抵抗性を有する植物を成長させる段階を含むであろう。いくつかの態様では、その方法は、段階（1）の前に広く上述のように植物におけるポリヌクレオチドの発現を検出することによって病原性の病害に抵抗性である植物を同定する段階をさらに含むであろう。ある好都合な態様では、これらの方法は、（a）病害抵抗性の子孫を、感受性分類群からの病害に感受性の植物と戻し交雑する段階；および（b）戻し交雑の子孫の間で広く上述のようなポリヌクレオチド（または関連するマーカー遺伝子）に対応する核酸配列の発現について選択する段階を、感受性分類群の所望の性質が、病原体抵抗性を損傷している遺伝子または遺伝子類と共にその子孫に存在するまで繰り返すことをさらに含むであろう。
【００２３】
本発明の別の局面では、単離されたポリペプチドが提供され、そのポリペプチドはいくつかの態様では、植物に病害抵抗性を付与する。これらのポリペプチドは、（i）配列番号：2または4記載の配列と少なくとも50%（ならびに少なくとも51%から少なくとも99%までおよびそれらの間の全ての整数の百分率）の類似性を共有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ii）配列番号：2または4記載の配列の、少なくとも100個の連続するアミノ酸残基の長さの部分を含み、植物に病害抵抗性を付与するポリペプチド；（iii）配列番号：2または4記載の配列の少なくとも部分と少なくとも30%（ならびに少なくとも31%から少なくとも99%までおよびそれらの間の全ての整数の百分率）の類似性を共有するアミノ酸配列を含み、部分が少なくとも100個の連続するアミノ酸残基の長さのポリペプチド；および（iv）配列番号：2または4記載の配列の少なくとも部分を含み、部分が少なくとも5個の連続するアミノ酸残基の長さであり、（i）、（ii）または（iii）から選択される配列と免疫相互作用性である抗原結合分子と免疫相互作用性であるポリペプチド、から一般的に選択される。
【００２４】
いくつかの態様では、ポリペプチドは以下のドメインの一つまたは複数、および一部の場合では全てを含む（付番は図2と同一の付番を指す）：
図2の残基1〜167に対応するドメイン。本ドメインは、コイルドコイルに構造的に類似しうる。いくつかの態様では、本ドメインは、図2に表示した任意の配列の対応するドメインと、少なくとも60、70、80、90、95、または98%（およびそれらの間の全ての整数の百分率）の配列類似性を有するか、または少なくとも30、40、50、60、70または80%（およびそれらの間の全ての整数の百分率）の配列同一性を有するか、または1、2、3、4、5、10、15、20、25、30または40（およびそれらの間の全ての整数）個以下のアミノ酸残基が異なることができる；
図2の残基168〜536に対応するドメイン。本ドメインは、核結合部位（NBS）ドメインに機能的に同様でありうる。いくつかの態様では、本ドメインは、図2に表示した任意の配列の対応するドメインと、少なくとも70、80、90、95、または98%（およびそれらの間の全ての整数の百分率）の配列類似性を有するか、または少なくとも50、60、70、80または90%（およびそれらの間の全ての整数の百分率）の配列同一性を有するか、または1、2、3、4、5、10、15、20、25、30または40（およびそれらの間の全ての整数）個以下のアミノ酸残基が異なることができる；および
図2の残基537〜1476に対応するドメイン。本ドメインは、ロイシンリッチリピート（LRR）ドメインに機能的に類似しうる。いくつかの態様では、本ドメインは、図2に表示した任意の配列の対応するドメインと少なくとも60、70、80、90、95、または98%（およびそれらの間の全ての整数の百分率）の配列類似性を有するか、または少なくとも30、40、50、60、70、80または90%（およびそれらの間の全ての整数の百分率）の配列同一性を有するか、または1、2、3、4、5、10、15、20、25、30または40（およびそれらの間の全ての整数）個以下のアミノ酸残基が異なることができる。
【００２５】
いくつかの態様では、上記領域に一つまたは複数の残基を保存することが望ましい場合があり、それらの残基は図2に表示した配列の間で保存されており、保存されたアミノ酸残基は、同一の残基または同じクラスもしくはサブクラスのアミノ酸残基に属する残基に対応する。
【００２６】
いくつかの態様では、図2の残基1〜167に対応するドメインは、式（I）：
【００２７】
2007506414.tif 000002
（式中：
Φ1-10のそれぞれは、任意の疎水性アミノ酸残基から独立して選択され、
Zaaは、中性/極性アミノ酸残基であり、
Σaa1-4のそれぞれは、任意の小型アミノ酸残基から独立して選択され、
Baa1-3のそれぞれは、任意の塩基性アミノ酸残基から独立して選択され、
Åaa1-5のそれぞれは、任意の酸性アミノ酸残基から独立して選択され、
Ωaa1-2のそれぞれは、任意の荷電アミノ酸残基から独立して選択され、かつ
Xaa1-33は、任意のアミノ酸残基からそれぞれ独立して選択される）で示される配列を含む。
【００２８】
いくつかの態様では、Zaaは、GlnまたはAsnから選択される。
【００２９】
いくつかの態様では、Φaa1は、PheまたはLeuから選択される。いくつかの態様では、Φaa2は、IleまたはValから選択される。いくつかの態様では、Φaa3は、LeuまたはIleから選択される。いくつかの態様では、Φaa4は、LeuまたはPheから選択される。いくつかの態様では、Φaa5は、IleまたはValから選択される。いくつかの態様では、Φaa6は、IleまたはLeuから選択される。いくつかの態様では、Φaa7は、LeuまたはTrpから選択される。いくつかの態様では、Φaa8は、ValまたはLeuから選択される。いくつかの態様では、Φaa9は、LeuまたはIleから選択される。いくつかの態様では、Φaa10は、LeuまたはTrpから選択される。
【００３０】
いくつかの態様では、Σaa1は、Ala Serから選択される。いくつかの態様では、Σaa2は、SerまたはThrから選択される。いくつかの態様では、Σaa3は、Ala Serから選択される。いくつかの態様では、Σaa4は、ThrまたはAlaから選択される。
【００３１】
いくつかの態様では、Baa1は、LysまたはArgから選択される。いくつかの態様では、Baa2は、HisまたはArgから選択される。いくつかの態様では、Baa3は、LysまたはArgから選択される。
【００３２】
いくつかの態様では、Åaa1-5のそれぞれは、AspまたはGluから独立して選択される。
【００３３】
いくつかの態様では、Ωaa1は、LysまたはGluから選択される。いくつかの態様では、Ωaa2は、GluまたはLysから選択される。
【００３４】
いくつかの態様では、Xaa1は、小型または酸性アミノ酸残基であり、例えば、Xaa1は、ThrまたはGluから選択される。いくつかの態様では、Xaa2は、酸性または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばXaa2は、AspまたはAsnから選択される。いくつかの態様では、Xaa3は、小型または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa3は、SerまたはIleから選択される。いくつかの態様では、Xaa4は、中性/極性または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa4は、CysまたはLeuから選択される。いくつかの態様では、Xaa5は、小型または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa5は、Ala Ileから選択される。いくつかの態様では、Xaa6は、中性/極性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa6は、GlnまたはAlaから選択される。いくつかの態様では、Xaa7は、中性/極性または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa7は、GlnまたはGluから選択される。いくつかの態様では、Xaa8は、小型または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa8は、Ala Argから選択される。いくつかの態様では、Xaa9は、塩基性または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa9は、ArgまたはLeuから選択される。
【００３５】
いくつかの態様では、Xaa10は、塩基性または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばXaa10は、ArgまたはGlnから選択される。いくつかの態様では、Xaa11は、塩基性または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa11は、ArgまたはLeuから選択される。いくつかの態様では、Xaa12は、小型または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばXaa12は、ArgまたはGlnから選択される。いくつかの態様では、Xaa13は、疎水性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa13は、LeuまたはAlaから選択される。いくつかの態様では、Xaa14は、酸性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa14は、AspまたはAlaから選択される。いくつかの態様では、Xaa15は、塩基性または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばXaa15は、ArgまたはAsnから選択される。いくつかの態様では、Xaa16は、塩基性または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばXaa16は、ArgまたはAsnから選択される。いくつかの態様では、Xaa17は、塩基性または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばXaa17は、ArgまたはGlnから選択される。いくつかの態様では、Xaa18は、小型または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa18は、ThrまたはArgから選択される。いくつかの態様では、Xaa19は、疎水性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa19は、IleまたはThrから選択される。
【００３６】
いくつかの態様では、Xaa20は、疎水性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa20は、TrpまたはArgから選択される。いくつかの態様では、Xaa21は、非存在であるかまたは中性／極性アミノ酸残基であり、例えばAsnである。いくつかの態様では、Xaa22は、塩基性または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa22は、HisまたはMetから選択される。いくつかの態様では、Xaa23は、塩基性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa23は、LysまたはThrから選択される。いくつかの態様では、Xaa24は、中性／極性または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa24は、AsnまたはAspから選択される。いくつかの態様では、Xaa25は、小型または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa25は、ThrまたはLysから選択される。いくつかの態様では、Xaa26は、酸性または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa26は、GluまたはLeuから選択される。いくつかの態様では、X27は、塩基性または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa27は、ArgまたはMetから選択される。いくつかの態様では、Xaa28は、中性／極性または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa28は、GlnまたはGluから選択される。いくつかの態様では、Xaa29は、小型または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa29は、Ala Trpから選択される。
【００３７】
いくつかの態様では、Xaa30は、疎水性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa30は、TyrまたはAlaから選択される。いくつかの態様では、Xaa31は、中性／極性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa31は、GlnまたはAlaから選択される。いくつかの態様では、Xaa32は、小型または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa32は、Ala Ileから選択される。いくつかの態様では、Xaa33は、中性／極性または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa33は、GlnまたはLeuから選択される。
【００３８】
いくつかの態様では、図2の残基168〜536に対応するドメインは、式（II)：
2007506414.tif 000003
（式中：
Φ1-27のそれぞれは、任意の疎水性アミノ酸残基から独立して選択され、
Σaa1-18のそれぞれは、任意の小型アミノ酸残基から独立して選択され、
Baa1-4のそれぞれは、任意の塩基性アミノ酸残基から独立して選択され、
Åaa1-5のそれぞれは、任意の酸性アミノ酸残基から独立して選択され、
Ωaa1-10のそれぞれは、任意の荷電アミノ酸残基から独立して選択され、かつ
Xaa1-95は、任意のアミノ酸残基からそれぞれ独立して選択される）で示される配列を含む。
【００３９】
いくつかの態様では、Σaa１は、SerまたはThrから選択される。いくつかの態様では、Σaa2は、ThrまたはSerから選択される。いくつかの態様では、Σaa3は、SerまたはProから選択される。いくつかの態様では、Σaa4は、GlyまたはSerから選択される。いくつかの態様では、Σaa5は、SerまたはAlaから選択される。いくつかの態様では、Σaa6は、SerまたはProから選択される。いくつかの態様では、Σaa7は、AlaまたはSerから選択される。いくつかの態様では、Σaa8は、SerまたはGlyから選択される。いくつかの態様では、Σaa9は、AlaまたはGlyから選択される。
【００４０】
いくつかの態様では、Σaa10は、AlaまたはGlyから選択される。いくつかの態様では、Σaa11は、AlaまたはSerから選択される。いくつかの態様では、Σaa12は、ProまたはSerから選択される。いくつかの態様では、Σaa13は、AlaまたはGlyから選択される。いくつかの態様では、Σaa14は、ThrまたはAlaから選択される。いくつかの態様では、Σaa15は、SerまたはGlyから選択される。いくつかの態様では、Σaa16は、SerまたはThrから選択される。いくつかの態様では、Σaa17は、ProまたはSerから選択される。いくつかの態様では、Σaa18は、GlyまたはProから選択される。
【００４１】
いくつかの態様では、Φaa１は、PheまたはLeuから選択される。いくつかの態様では、Φaa2は、ValまたはIleから選択される。いくつかの態様では、Φaa3は、PheまたはValから選択される。いくつかの態様では、Φaa4は、ValまたはLeuから選択される。いくつかの態様では、Φaa5は、ValまたはIleから選択される。いくつかの態様では、Φaa6は、LeuまたはValから選択される。いくつかの態様では、Φaa7は、LeuまたはIleから選択される。いくつかの態様では、Φaa8は、IleまたはValから選択される。いくつかの態様では、Φaa9は、ValまたはIleから選択される。
【００４２】
いくつかの態様では、Φaa10は、TyrまたはPheから選択される。いくつかの態様では、Φaa11は、ValまたはMetから選択される。いくつかの態様では、Φaa12は、LeuまたはIleから選択される。いくつかの態様では、Φaa13は、IleまたはValから選択される。いくつかの態様では、Φaa14は、IleまたはValから選択される。いくつかの態様では、Φaa15は、IleまたはTyrから選択される。いくつかの態様では、Φaa16は、PheまたはIleから選択される。いくつかの態様では、Φaa17は、LeuまたはMetから選択される。いくつかの態様では、Φaa18は、LeuまたはIleから選択される。いくつかの態様では、Φaa19は、LeuまたはTyrから選択される。
【００４３】
いくつかの態様では、Φaa20は、LeuまたはMetから選択される。いくつかの態様では、Φaa21は、LeuまたはTyrから選択される。いくつかの態様では、Φaa22は、IleまたはValから選択される。いくつかの態様では、Φaa23は、MetまたはLeuから選択される。いくつかの態様では、Φaa24は、LeuまたはMetから選択される。いくつかの態様では、Φaa25は、IleまたはValから選択される。いくつかの態様では、Φaa26は、ValまたはLeuから選択される。いくつかの態様では、Φaa27は、PheまたはLeuから選択される。
【００４４】
いくつかの態様では、Baa1-4は、ArgまたはLysからそれぞれ独立して選択される。
【００４５】
いくつかの態様では、Åaa1-5のそれぞれは、AspまたはGluから独立して選択される。 
【００４６】
いくつかの態様では、Ωaa1は、GluまたはArgから選択される。いくつかの態様では、Ωaa2は、GluまたはArgから選択される。いくつかの態様では、Ωaa3は、LysまたはGluから選択される。いくつかの態様では、Ωaa4は、AspまたはLysから選択される。いくつかの態様では、Ωaa5は、ArgまたはAspから選択される。いくつかの態様では、Ωaa6は、LysまたはGluから選択される。いくつかの態様では、Ωaa7は、LysまたはGluから選択される。いくつかの態様では、Ωaa8は、GluまたはArgから選択される。いくつかの態様では、Ωaa9は、AspまたはLysから選択される。いくつかの態様では、Ωaa10は、HisまたはAspから選択される。
【００４７】
いくつかの態様では、Xaa1は、塩基性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa1は、ArgまたはGlyから選択される。いくつかの態様では、Xaa2は、酸性または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa2は、GluまたはValから選択される。いくつかの態様では、Xaa3は、疎水性または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばXaa3は、ValまたはCysから選択される。いくつかの態様では、Xaa4は、酸性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa4は、AspまたはAlaから選択される。いくつかの態様では、Xaa5は、塩基性または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばXaa5は、LysまたはAsnから選択される。いくつかの態様では、Xaa6は、小型または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa6は、SerまたはAspから選択される。いくつかの態様では、Xaa7は、非存在であるかまたは中性/極性アミノ酸残基であり、例えばAsnである。いくつかの態様では、Xaa8は、非存在であるかまたは小型アミノ酸残基であり、例えばSerである。いくつかの態様では、Xaa9は、疎水性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa9は、ValまたはAlaから選択される。
【００４８】
いくつかの態様では、Xaa10は、中性/極性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa10は、AsnまたはLysから選択される。いくつかの態様では、Xaa11は、小型または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa11は、GlyまたはGluから選択される。いくつかの態様では、Xaa12は、中性/極性または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa12は、AsnまたはGluから選択される。いくつかの態様では、Xaa13は、疎水性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa13は、TyrまたはHisから選択される。いくつかの態様では、Xaa14は、塩基性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa14は、HisまたはProから選択される。いくつかの態様では、Xaa15は、中性/極性または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa15は、AsnまたはAspから選択される。いくつかの態様では、Xaa16は、中性/極性または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa16は、AsnまたはAspから選択される。いくつかの態様では、Xaa17は、疎水性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa17は、IleまたはThrから選択される。いくつかの態様では、Xaa18は、小型または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa18は、SerまたはTyrから選択される。いくつかの態様では、Xaa19は、塩基性または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばXaa19は、LysまたはAsnから選択される。
【００４９】
いくつかの態様では、Xaa20は、疎水性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa20は、ValまたはGlyから選択される。いくつかの態様では、Xaa21は、中性／極性または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa21は、GlnまたはPheから選択される。いくつかの態様では、Xaa22は、小型または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa22は、SerまたはMetから選択される。いくつかの態様では、Xaa23は、塩基性または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa23は、LysまたはLeuから選択される。いくつかの態様では、Xaa24は、疎水性または小型 アミノ酸残基であり、例えばXaa24は、LeuまたはThrから選択される。いくつかの態様では、Xaa25は、酸性または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばXaa25は、AspまたはAsnから選択される。いくつかの態様では、Xaa26は、小型または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa26は、ThrまたはMetから選択される。いくつかの態様では、Xaa27は、中性/極性または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa27は、GlnまたはValから選択される。いくつかの態様では、Xaa28は、疎水性または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばXaa28は、IleまたはAsnから選択される。いくつかの態様では、Xaa29は、小型または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa29は、AlaまたはArgから選択される。
【００５０】
いくつかの態様では、Xaa30は、酸性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa30は、GluまたはThrから選択される。いくつかの態様では、X31は、塩基性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa31は、ArgまたはThrから選択される。いくつかの態様では、Xaa32は、小型または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばXaa32は、SerまたはAsnから選択される。いくつかの態様では、Xaa33は、中性/極性または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa33は、AsnまたはAspから選択される。いくつかの態様では、Xaa34は、塩基性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa34は、ArgまたはProから選択される。いくつかの態様では、Xaa35は、酸性または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa35は、AspまたはValから選択される。いくつかの態様では、Xaa36は、塩基性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa36は、ArgまたはSerから選択される。いくつかの態様では、Xaa37は、中性/極性または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa37は、CysまたはLeuから選択される。いくつかの態様では、Xaa38は、疎水性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa38は、PheまたはAlaから選択される。いくつかの態様では、Xaa39は、塩基性または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa39は、LysまたはValから選択される。
【００５１】
いくつかの態様では、Xaa40は、塩基性または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばXaa40は、ArgまたはGlnから選択される。いくつかの態様では、X41は、酸性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa41は、AspまたはSerから選択される。いくつかの態様では、Xaa42は、小型または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa42は、ThrまたはLysから選択される。いくつかの態様では、Xaa43は、小型または酸性残基であり、例えばXaa43は、SerまたはAspから選択される。いくつかの態様では、Xaa44は、疎水性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa44は、IleまたはThrから選択される。いくつかの態様では、Xaa45は、酸性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa45は、GluまたはProから選択される。いくつかの態様では、Xaa46は、小型または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa46は、SerまたはValから選択される。いくつかの態様では、Xaa47は、小型または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa47は、GlyまたはGluから選択される。いくつかの態様では、Xaa48は、中性/極性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa48は、GlnまたはThrから選択される。いくつかの態様では、Xaa49は、小型または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa49は、AlaまたはAspから選択される。
【００５２】
いくつかの態様では、Xaa50は、疎水性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa50は、TyrまたはSerから選択される。いくつかの態様では、X51は、酸性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa51は、GluまたはSerから選択される。いくつかの態様では、Xaa52は、塩基性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa52は、LysまたはSerから選択される。いくつかの態様では、Xaa53は、中性／極性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa53は、CysまたはHisから選択される。いくつかの態様では、Xaa54は、小型または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa54は、GlyまたはArgから選択される。いくつかの態様では、Xaa55は、小型または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa55は、SerまたはGluから選択される。いくつかの態様では、Xaa56は、疎水性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa56は、ValまたはAlaから選択される。いくつかの態様では、Xaa57は、中性／極性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa57は、AsnまたはSerから選択される。いくつかの態様では、Xaa58は、非存在であるかまたは中性／極性アミノ酸残基であり、例えばCysである。いくつかの態様では、Xaa59は、中性／極性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa59は、GlnまたはSerから選択される。
【００５３】
いくつかの態様では、Xaa60は、酸性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa60は、GluまたはProから選択される。いくつかの態様では、X61は、塩基性または中性／極性アミノ酸残基であり、例えばXaa61は、HisまたはAsnから選択される。いくつかの態様では、Xaa62は、疎水性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa62は、LeuまたはProから選択される。いくつかの態様では、Xaa63は、疎水性または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa63は、ValまたはGluから選択される。いくつかの態様では、Xaa64は、小型または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa64は、GlyまたはLysから選択される。いくつかの態様では、Xaa65は、塩基性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa65は、LysまたはSerから選択される。いくつかの態様では、Xaa66は、小型または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa66は、SerまたはLeuから選択される。いくつかの態様では、Xaa67は塩基性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa67は、LysまたはThrから選択される。いくつかの態様では、Xaa68は、小型または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa68は、SerまたはArgから選択される。いくつかの態様では、Xaa69は、疎水性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa69は、LeuまたはSerから選択される。
【００５４】
いくつかの態様では、Xaa70は、疎水性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa70は、ValまたはHisから選択される。いくつかの態様では、X71は、中性／極性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa71は、GlnまたはGluから選択される。いくつかの態様では、Xaa72は、酸性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa72は、GluまたはSerから選択される。いくつかの態様では、Xaa73は、塩基性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa73は、HisまたはSerから選択される。いくつかの態様では、Xaa74は、小型または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa74は、ThrまたはGluから選択される。いくつかの態様では、Xaa75は、疎水性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa75は、ValまたはThrから選択される。いくつかの態様では、Xaa76は、中性／極性または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa76は、GlnまたはGluから選択される。いくつかの態様では、Xaa77は、中性／極性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa77は、GlnまたはProから選択される。いくつかの態様では、Xaa78は、酸性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa78は、GluまたはAlaから選択される。いくつかの態様では、Xaa79は、中性／極性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa79は、AsnまたはSerから選択される。
【００５５】
いくつかの態様では、Xaa80は、疎水性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa80は、ValまたはAlaから選択される。いくつかの態様では、X81は、疎水性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa81は、TrpまたはArgから選択される。いくつかの態様では、Xaa82は、疎水性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa82は、LeuまたはArgから選択される。いくつかの態様では、Xaa83は、中性／極性または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa83は、GlnまたはAspから選択される。いくつかの態様では、Xaa84は、塩基性または中性／極性アミノ酸残基であり、例えばXaa84は、HisまたはAsnから選択される。いくつかの態様では、Xaa85は、塩基性または中性／極性アミノ酸残基であり、例えばXaa85は、HisまたはGlnから選択される。いくつかの態様では、Xaa86は、中性／極性または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa86は、GlnまたはLeuから選択される。いくつかの態様では、Xaa87は、塩基性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa87は、HisまたはThrから選択される。いくつかの態様では、Xaa88は、酸性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa88は、AspまたはGlyから選択される。いくつかの態様では、Xaa89は、疎水性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa89は、LeuまたはArgから選択される。
【００５６】
いくつかの態様では、Xaa90は、疎水性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa90は、TyrまたはArgから選択される。いくつかの態様では、Xaa91は、酸性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa91は、GluまたはThrから選択される。いくつかの態様では、Xaa92は、中性／極性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa92は、GlnまたはHisから選択される。いくつかの態様では、Xaa93は、小型または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa93は、ThrまたはMetから選択される。いくつかの態様では、Xaa94は、酸性または中性／極性アミノ酸残基であり、例えばXaa94は、GluまたはGlnから選択される。いくつかの態様では、Xaa95は、小型または中性／極性アミノ酸残基であり、例えばXaa95は、GlyまたはAsnから選択される。
【００５７】
いくつかの態様では、図2の残基537〜1476に対応するドメインは、式（III)：
2007506414.tif 000004
（式中：
Φ1-22のそれぞれは、任意の疎水性アミノ酸残基から独立して選択され、
Σaa1-16のそれぞれは、任意の小型アミノ酸残基から独立して選択され、
Baa1-14のそれぞれは、任意の塩基性アミノ酸残基から独立して選択され、
Åaa1-2のそれぞれは、任意の酸性アミノ酸残基から独立して選択され、
Ωaa1-16のそれぞれは、任意の荷電アミノ酸残基から独立して選択され、かつ
Xaa1-93は、任意のアミノ酸残基からそれぞれ独立して選択される）で示される配列を含む。
【００５８】
いくつかの態様では、Ωaa1は、HisまたはAspから選択される。いくつかの態様では、Ωaa2は、AspまたはArgから選択される。いくつかの態様では、Ωaa3は、LysまたはAspから選択される。いくつかの態様では、Ωaa4は、GluまたはLysから選択される。いくつかの態様では、Ωaa5は、GluまたはArgから選択される。いくつかの態様では、Ωaa6は、HisまたはAspから選択される。いくつかの態様では、Ωaa7は、ArgまたはGluから選択される。いくつかの態様では、Ωaa8は、GluまたはLysから選択される。いくつかの態様では、Ωaa9は、GluまたはArgから選択される。
【００５９】
いくつかの態様では、Ωaa10は、GluまたはArgから選択される。いくつかの態様では、Ωaa11は、GluまたはLysから選択される。いくつかの態様では、Ωaa12は、LysまたはAspから選択される。いくつかの態様では、Ωaa13は、LysまたはGluから選択される。いくつかの態様では、Ωaa14は、LysまたはGluから選択される。いくつかの態様では、Ωaa15は、GluまたはArgから選択される。いくつかの態様では、Ωaa16は、AspまたはArgから選択される。
【００６０】
いくつかの態様では、Φaa１は、LeuまたはMetから選択される。いくつかの態様では、Φaa2は、LeuまたはPheから選択される。いくつかの態様では、Φaa3は、MetまたはIleから選択される。いくつかの態様では、Φaa4は、IleまたはValから選択される。いくつかの態様では、Φaa5は、IleまたはLeuから選択される。いくつかの態様では、Φaa6は、LeuまたはValから選択される。いくつかの態様では、Φaa7は、PheまたはLeuから選択される。いくつかの態様では、Φaa8は、IleまたはLeuから選択される。いくつかの態様では、Φaa9は、IleまたはValから選択される。
【００６１】
いくつかの態様では、Φaa10は、PheまたはTyrから選択される。いくつかの態様では、Φaa11は、LeuまたはIleから選択される。いくつかの態様では、Φaa12は、LeuまたはMetから選択される。いくつかの態様では、Φaa13は、LeuまたはMetから選択される。いくつかの態様では、Φaa14は、MetまたはTyrから選択される。いくつかの態様では、Φaa15は、LeuまたはMetから選択される。いくつかの態様では、Φaa16は、LeuまたはIleから選択される。いくつかの態様では、Φaa17は、IleまたはLeuから選択される。いくつかの態様では、Φaa18は、MetまたはIleから選択される。いくつかの態様では、Φaa19は、MetまたはIleから選択される。
【００６２】
いくつかの態様では、Φaa20は、LeuまたはPheから選択される。いくつかの態様では、Φaa21は、LeuまたはIleから選択される。いくつかの態様では、Φaa22は、PheまたはTrpから選択される。
【００６３】
いくつかの態様では、Baa1、Baa3-6およびBaa9-14は、ArgまたはLysからそれぞれ独立して選択される。いくつかの態様では、Baa2およびBaa8は、HisまたはArgからそれぞれ独立して選択される。いくつかの態様では、Baa2は、HisまたはLysから選択される。
【００６４】
いくつかの態様では、Σaa１は、AlaまたはThrから選択される。いくつかの態様では、Σaa2は、AlaまたはThrから選択される。いくつかの態様では、Σaa3は、GlyまたはSerから選択される。いくつかの態様では、Σaa4は、SerまたはAlaから選択される。いくつかの態様では、Σaa5は、GlyまたはAlaから選択される。いくつかの態様では、Σaa6は、GlyまたはSerから選択される。いくつかの態様では、Σaa7は、AlaまたはSerから選択される。いくつかの態様では、Σaa8は、ThrまたはSerから選択される。いくつかの態様では、Σaa9は、SerまたはGlyから選択される。
【００６５】
いくつかの態様では、Σaa10は、AlaまたはThrから選択される。いくつかの態様では、Σaa11は、ThrまたはSerから選択される。いくつかの態様では、Σaa12は、ThrまたはAlaから選択される。いくつかの態様では、Σaa13は、SerまたはProから選択される。いくつかの態様では、Σaa14は、ProまたはSerから選択される。いくつかの態様では、Σaa15は、ThrまたはGlyから選択される。いくつかの態様では、Σaa16は、ThrまたはSerから選択される。
【００６６】
いくつかの態様では、Åaa1-2のそれぞれは、AspまたはGluから独立して選択される。
【００６７】
いくつかの態様では、Xaa1は、小型または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa1は、ProまたはLeuから選択される。いくつかの態様では、Xaa2は、小型または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa2は、SerまたはArgから選択される。いくつかの態様では、Xaa3は、塩基性または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa3は、ArgまたはMetから選択される。いくつかの態様では、Xaa4は、塩基性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa4は、LysまたはSerから選択される。いくつかの態様では、Xaa5は、疎水性または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa5は、ValまたはAspから選択される。いくつかの態様では、Xaa6は、中性/極性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa6は、GlnまたはSerから選択される。いくつかの態様では、Xaa7は、塩基性または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばXaa7は、LysまたはAsnから選択される。いくつかの態様では、Xaa8は、小型または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa8は、GlyまたはValから選択される。いくつかの態様では、Xaa9は、酸性または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばXaa9は、GluまたはAsnから選択される。
【００６８】
いくつかの態様では、Xaa10は、酸性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa10は、AspまたはSerから選択される。いくつかの態様では、Xaa11は、疎水性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa11は、IleまたはSerから選択される。いくつかの態様では、Xaa12は、酸性または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばXaa12は、AspまたはAsnから選択される。いくつかの態様では、Xaa13は、疎水性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa13は、IleまたはLysから選択される。いくつかの態様では、Xaa14は、中性/極性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa14は、GlnまたはHisから選択される。いくつかの態様では、Xaa15は、酸性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa15は、AspまたはGlyから選択される。いくつかの態様では、Xaa16は、非存在であるかまたは疎水性アミノ酸残基であり、例えばTyrである。いくつかの態様では、Xaa17は、中性/極性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa17は、CysまたはArgから選択される。いくつかの態様では、Xaa18は、中性/極性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa18は、CysまたはThrから選択される。いくつかの態様では、Xaa19は、疎水性または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばXaa19は、TyrまたはCysから選択される。
【００６９】
いくつかの態様では、Xaa20は、中性／極性または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa20は、AsnまたはLeuから選択される。いくつかの態様では、Xaa21は、塩基性または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa21は、ArgまたはLeuから選択される。いくつかの態様では、Xaa22は、疎水性または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa22は、TrpまたはGluから選択される。いくつかの態様では、Xaa23は、中性／極性または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa23は、GlnまたはGluから選択される。いくつかの態様では、Xaa24は、塩基性または中性／極性アミノ酸残基であり、例えばXaa24は、ArgまたはCysから選択される。いくつかの態様では、Xaa25は、小型または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa25は、SerまたはArgから選択される。いくつかの態様では、Xaa26は、中性／極性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa26は、GlnまたはArgから選択される。いくつかの態様では、Xaa27は、中性／極性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa27は、AsnまたはLysから選択される。いくつかの態様では、Xaa28は、疎水性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa28は、ValまたはAlaから選択される。いくつかの態様では、Xaa29は、酸性または中性／極性アミノ酸残基であり、例えばXaa29は、GluまたはAsnから選択される。
【００７０】
いくつかの態様では、Xaa30は、酸性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa30は、AspまたはProから選択される。いくつかの態様では、X31は、疎水性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa31は、TyrまたはAlaから選択される。いくつかの態様では、Xaa32は、小型または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa32は、SerまたはGluから選択される。いくつかの態様では、Xaa33は、小型または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa33は、SerまたはLysから選択される。いくつかの態様では、Xaa34は、塩基性または中性／極性アミノ酸残基であり、例えばXaa34は、LysまたはAsnから選択される。いくつかの態様では、Xaa35は、疎水性または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa35は、LeuまたはAspから選択される。いくつかの態様では、Xaa36は、中性／極性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa36は、AsnまたはHisから選択される。いくつかの態様では、Xaa37は、中性／極性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa37は、AsnまたはLysから選択される。いくつかの態様では、Xaa38は、中性／極性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa38は、AsnまたはLysから選択される。いくつかの態様では、Xaa39は、塩基性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa39は、LysまたはGlyから選択される。
【００７１】
いくつかの態様では、Xaa40は、小型または中性／極性アミノ酸残基であり、例えばXaa40は、ThrまたはAsnから選択される。いくつかの態様では、X41は、小型または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa41は、ThrまたはAspから選択される。いくつかの態様では、Xaa42は、塩基性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa42は、ArgまたはSerから選択される。いくつかの態様では、Xaa43は、小型または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa43は、ThrまたはArgから選択される。いくつかの態様では、Xaa44は、酸性または中性／極性アミノ酸残基であり、例えばXaa44は、GluまたはGlnから選択される。いくつかの態様では、Xaa45は、小型または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa45は、GlyまたはGluから選択される。いくつかの態様では、Xaa46は、小型または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa46は、SerまたはLysから選択される。いくつかの態様では、Xaa47は、塩基性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa47は、LysまたはThrから選択される。いくつかの態様では、Xaa48は、小型または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa48は、SerまたはArgから選択される。いくつかの態様では、Xaa49は、疎水性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa49は、TyrまたはLysから選択される。
【００７２】
いくつかの態様では、Xaa50は、小型または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa50は、AlaまたはLeuから選択される。いくつかの態様では、X51は、疎水性または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa51は、AlaまたはAspから選択される。いくつかの態様では、Xaa52は、中性／極性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa52は、GlnまたはArgから選択される。いくつかの態様では、Xaa53は、疎水性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa53は、ValまたはGlyから選択される。いくつかの態様では、Xaa54は、非存在であるかまたは小型アミノ酸残基であり、例えばSerである。いくつかの態様では、Xaa55は、非存在であるかまたは小型アミノ酸残基であり、例えばSerである。いくつかの態様では、Xaa56は、非存在であるかまたは疎水性アミノ酸残基であり、例えばLeuである。いくつかの態様では、Xaa57は、酸性または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa57は、GluまたはAlaから選択される。いくつかの態様では、Xaa58は塩基性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa58は、HisまたはGlyから選択される。いくつかの態様では、Xaa59は、疎水性または中性／極性アミノ酸残基であり、例えばXaa59は、LeuまたはCysから選択される。
【００７３】
いくつかの態様では、Xaa60は、疎水性または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa60は、LeuまたはAspから選択される。いくつかの態様では、X61は、疎水性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa61は、ValまたはArgから選択される。いくつかの態様では、Xaa62は、小型または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa62は、SerまたはAspから選択される。いくつかの態様では、Xaa63は、疎水性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa63は、LeuまたはLysから選択される。いくつかの態様では、Xaa64は、中性／極性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa64は、GlnまたはArgから選択される。いくつかの態様では、Xaa65は、塩基性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa65は、HisまたはProから選択される。いくつかの態様では、Xaa66は、疎水性または中性／極性アミノ酸残基であり、例えばXaa66は、PheまたはAsnから選択される。いくつかの態様では、Xaa67は、小型または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa67は、SerまたはGluから選択される。いくつかの態様では、Xaa68は、小型または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa68は、GlyまたはTyrから選択される。いくつかの態様では、Xaa69は、疎水性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa69は、ValまたはSerから選択される。
【００７４】
いくつかの態様では、Xaa70は、酸性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa70は、AspまたはThrから選択される。いくつかの態様では、X71は、疎水性または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa71は、ValまたはAspから選択される。いくつかの態様では、Xaa72は、塩基性または中性／極性アミノ酸残基であり、例えばXaa72は、LysまたはGlnから選択される。いくつかの態様では、Xaa73は、小型または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa73は、GlyまたはGluから選択される。いくつかの態様では、Xaa74は、中性／極性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa74は、AsnまたはSerから選択される。いくつかの態様では、Xaa75は、酸性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa75は、GluまたはThrから選択される。いくつかの態様では、Xaa76は、小型または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa76は、GlyまたはGluから選択される。いくつかの態様では、Xaa77は、疎水性または中性／極性アミノ酸残基であり、例えばXaa77は、TyrまたはCysから選択される。いくつかの態様では、Xaa78は、疎水性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa78は、PheまたはHisから選択される。いくつかの態様では、Xaa79は、塩基性または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa79は、HisまたはIleから選択される。
【００７５】
いくつかの態様では、Xaa80は、疎水性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばXaa80は、ValまたはHisから選択される。いくつかの態様では、X81は、小型または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa81は、ArgまたはGlyから選択される。いくつかの態様では、Xaa82は、疎水性または中性／極性アミノ酸残基であり、例えばXaa82は、ValまたはGlnから選択される。いくつかの態様では、Xaa83は、小型または中性／極性アミノ酸残基であり、例えばXaa83は、SerまたはAsnから選択される。いくつかの態様では、Xaa84は、塩基性または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa84は、HisまたはLeuから選択される。いくつかの態様では、Xaa85は、中性／極性または酸性アミノ酸残基であり、例えばXaa85は、GlnまたはGluから選択される。いくつかの態様では、Xaa86は、中性／極性または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa86は、CysまたはTyrから選択される。いくつかの態様では、Xaa87は、中性／極性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa87は、CysまたはThrから選択される。いくつかの態様では、Xaa88は、小型または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa88は、SerまたはValから選択される。いくつかの態様では、Xaa89は塩基性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa89は、LysまたはSerから選択される。
【００７６】
いくつかの態様では、Xaa90は、疎水性または小型アミノ酸残基であり、例えばXaa90は、LeuまたはGlyから選択される。いくつかの態様では、Xaa91は、塩基性または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa91は、ArgまたはLeuから選択される。いくつかの態様では、Xaa92は、酸性または疎水性アミノ酸残基であり、例えばXaa92は、GluまたはLeuから選択される。いくつかの態様では、Xaa93は、疎水性または中性／極性アミノ酸残基であり、例えばXaa93は、ValまたはAsnから選択される。
【００７７】
なお別の局面では、本発明は、広く上述のような少なくとも一つのドメインをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００７８】
さらに別の局面では、本発明は、広く上述のようなポリペプチドまたは部分と特異的に免疫相互作用性である抗原結合分子を提供する。
【００７９】
（表Ａ）配列の簡単な説明
2007506414.tif 000005
【００８０】
発明の詳細な説明
1.  定義
特に断りのない限り、本明細書に使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の技術者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと同様または同等の任意の方法および物質を本発明の実施または試験において使用できるが、好ましい方法および物質が記載されている。以下の用語が下記に定義されている。これらの定義は例示を目的とし、当技術分野における定義された用語の通常の意味を限定することを意図しない。
【００８１】
冠詞「a」および「an」は、本明細書において一つまたは二つ以上の（すなわち少なくとも一つの）その冠詞の文法上の目的語を参照するために使用される。一例として、「an element」は一つのエレメントまたは二つ以上のエレメントを意味する。
【００８２】
「約」とは、参照量、レベル、値、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1%だけ変動する数量、レベル、値、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さを意味する。
【００８３】
「抗原結合分子」とは、標的抗原に対して結合親和性を有する分子を意味する。本用語は、抗原結合活性を示す免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメントおよび非免疫グロブリン由来タンパク質フレームワークに及ぶものとする。
【００８４】
本明細書で使用する、用語「特異的に結合する」、「特異的に免疫相互作用性である」などは、本発明のポリペプチドもしくはポリペプチドの部分と結合するか、または免疫相互作用性であるが、相同の従来技術のポリペプチドとあまり結合しない抗原結合分子を指す。
【００８５】
「生物学的に活性な部分」とは、完全長親ペプチドまたはポリペプチドの部分を意味し、その部分はその親分子の活性を保持する。例えば、本発明のポリペプチドの生物学的に活性な部分は、病害抵抗性、特にフザリウムのような菌類病原体に対する抵抗性を付与する能力を保持するであろう。本明細書で使用する、用語「生物学的に活性な部分」は、欠失突然変異体およびペプチド、例えば、親分子の活性を含む少なくとも約8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、300、400、500、600、700、800、900または1000の連続するアミノ酸を含む。この種の部分は、標準的な組換え核酸法の適用によって得られるか、または従来の液相または固相合成法を使用して合成されうる。例えばNicholsonによって監修されBlackwell Scientific Publicationsによって出版された標題「Synthetic Vaccines」の出版物に含まれるAthertonおよびShephardによる標題「Peptide Synthesis」の第9章に記載されたような溶液合成または固相合成を参照できる。または、エンドLys-C、エンドArg-C、エンドGlu-Cおよびブドウ球菌（staphylococcus）V8-プロテアーゼのようなプロテアーゼを用いて、本発明のペプチドまたはポリペプチドの消化によってペプチドを産生できる。消化されたフラグメントを、例えば高速液体クロマトグラフィー（HPLC）法によって精製できる。組換え核酸法もそのような部分の産生に使用できる。
【００８６】
本明細書で使用する、用語「シス作用配列」、「シス作用エレメント」または「シス調節領域」または「調節領域」または同様の用語は、発現可能な遺伝子配列に関して適切に配置した場合にその遺伝子の配列の発現を少なくとも部分的に調節可能なヌクレオチドの任意の配列を意味するために使用するものとする。当業者は、シス調節領域が転写レベルまたは転写後レベルで、遺伝子配列の発現および／または細胞型特異性および／または発達特異性のレベルを活性化、サイレンシング、増大、抑制または別様に変更可能でありうることを知っているであろう。本発明のある態様では、シス作用配列は発現可能な遺伝子配列の発現を増大または刺激するアクチベーター配列である。
【００８７】
本明細書にわたり、文脈が別様のものを必要としない限り、語「含む（comprise）」、「含む（comprises）」および「含んでいる（comprising）」は、述べられた段階もしくはエレメントまたは段階もしくはエレメントの群の包含を含意するが、他の任意の段階もしくはエレメントまたは段階もしくはエレメントの群の排除を含意しないものとする。
【００８８】
「対応する」または「対応している」とは、（a）参照ポリヌクレオチド配列の全てもしくは部分に実質的に同一もしくは相補的であるヌクレオチド配列を有するか、または（b）ペプチドもしくはタンパク質におけるアミノ酸配列に同一なアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチドを意味する。この句は、参照ペプチドまたはタンパク質におけるアミノ酸の配列に実質的に同一であるアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドもその範囲内に含む。
【００８９】
本明細書で使用する、用語「培養すること」、「培養」などは、細胞集団（または単一細胞）がインビトロでその細胞の成長または維持を支持することが示されている条件下で、インキュベートされる、インビトロで使用される手順の一式を指す。当技術分野は、培養系で定義される必要のある幅広い数の型式、培地、温度範囲、気体濃度などを認識している。それらのパラメーターは、選択された型式および本明細書に開示された方法を実施する個人の特定の必要性に基づいて変動するであろう。しかし、培養パラメーターの決定は事実上日常的であることが認識されている。
【００９０】
「病害抵抗性」とは、植物が植物-病原体相互作用の転帰である病害の病徴を回避または抑制することが意図される。すなわち、病原体が植物の病害および関連する病害の病徴を引き起こすことが防止される。病害、詳細には萎凋病のような植物病原体によって引き起こされる病害から植物を防御するために、本発明の方法を利用できる。
【００９１】
「発現ベクター」とは、ベクター内に含まれるポリヌクレオチドの転写および適切にポリヌクレオチドによってコードされるペプチドまたはポリペプチドの合成を、指令することが可能な任意の自律性の遺伝子エレメントを意味する。そのような発現ベクターは、当業者に公知である。
【００９２】
本明細書で使用される、用語「遺伝子」は、細胞のゲノムの任意および全ての別個のコード領域ならびに関連する非コード領域および調節領域を指す。この遺伝子は、特異的ポリペプチド、イントロン、ならびに発現の調節に関与する隣接5'および3'非コードヌクレオチド配列をコードするオープンリーディングフレームを意味することも意図する。これに関して、遺伝子はプロモーター、エンハンサー、終止のような制御シグナルおよび／または所定の遺伝子に自然に関連するポリアデニル化シグナルもしくは異種制御シグナルをさらに含みうる。DNA配列は、cDNAもしくはゲノムDNAまたはそれのフラグメントであってよい。染色体外での維持または宿主への統合のために、適切なベクターに遺伝子を導入できる。
【００９３】
本明細書で使用する、用語「成長すること」または「再生」は、植物細胞、植物細胞の群、植物の部分（種子を含む）、または植物片（例えばプロトプラスト、カルス、または組織の部分）から、全体の分化した植物を成長させることを意味する。
【００９４】
本明細書において「ハイブリダイズ」は、DNA-DNAハイブリッドまたはDNA-RNAハイブリッドを産生するための相補ヌクレオチド配列の対形成を表すために使用される。相補性塩基配列は、塩基の対形成の法則によって関係づけられる配列である。DNAでは、AはTと対形成し、CはGと対形成する。RNAでは、UはAと対形成し、CはGと対形成する。これに関して、本明細書で使用する、用語「マッチ」および「ミスマッチ」は、相補性核酸ストランドにおける対形成したヌクレオチドのハイブリダイズポテンシャルを指す。上述の古典的A-TおよびG-C塩基対のようなマッチしたヌクレオチドは、効率的にハイブリダイズする。ミスマッチは、効率的にハイブリダイズしない他の組み合わせのヌクレオチドである。
【００９５】
「免疫相互作用性の」に対する本明細書における参照は、分子間の、特に分子の一方が免疫系の構成要素であるかそれを模倣する場合に、任意の相互作用、反応、または他の形式の関連を含む。
【００９６】
「単離された」とは、天然状態で普通は付随する構成要素が、実質的または本質的に存在しない物質を意味する。例えば、本明細書で使用する、「単離されたポリヌクレオチド」は、天然状態で隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば普通は隣接する配列から取り出されたDNAフラグメントを指す。または、本明細書で使用する、「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」などは、天然細胞環境および細胞の他の構成要素との関連からのペプチドまたはポリペプチド分子のインビトロの単離および／または精製を指し、すなわちそれはインビボの物質に関連しない。
【００９７】
「マーカー遺伝子」とは、マーカー遺伝子を発現している細胞とは別個の表現型を与え、よってそのような形質転換細胞をマーカーを有さない細胞から区別できる遺伝子を意味する。選択可能マーカー遺伝子は、選択された作用因子（例えば除草剤、抗生物質、放射線、熱、または非形質転換細胞に損傷を与える他の処置）に対する抵抗性に基づいて「選択」できる形質を付与する。スクリーニング可能なマーカー遺伝子（またはレポーター遺伝子）は観測または試験によって、すなわち例えば「スクリーニング」（β-グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、または非形質転換細胞に存在しない他の酵素活性を）することによって同定できる形質を付与する。
【００９８】
本明細書で使用する、「天然」核酸分子は、自然に存在するヌクレオチド配列を有するRNAまたはDNA分子を指す。例えば、天然核酸分子は天然タンパク質をコードできる。
【００９９】
「から得られた」とは、例えば特定の供給源から単離されたか、または得られた核酸抽出物またはポリペプチド抽出物のような試料を意味する。例えばその抽出物は、植物、特に単子葉植物、さらに特別にはバナナのような非イネ科単子葉植物から直接単離されうる。
【０１００】
本明細書で使用する、用語「オリゴヌクレオチド」は、ホスホジエステル結合を経て連結した非常に多数のヌクレオチド残基（デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、または改変もしくは置換された糖基などを有するヌクレオチドを含むその関連構造変異体もしくは合成アナログ）からなるポリマー（またはその関連構造変異体もしくは合成アナログ）を指す。このように用語「オリゴヌクレオチド」は、典型的にはヌクレオチド残基およびそれらの間の連鎖が天然であるヌクレオチドポリマーを指すが、この用語は、ペプチド核酸（PNA）、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニラデート（phosphoraniladate）、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、2-O-メチルリボ核酸などを含むがそれらに限定されるわけではない様々なアナログもその範囲に含むものとする。その分子の正確なサイズは、特定の適用に応じて変動できる。オリゴヌクレオチドは、200塩基以下の長さを有するポリヌクレオチドサブセットである。好ましくはオリゴヌクレオチドは、10〜60塩基の長さであり、最も好ましくは12、13、14、15、16、17、18、19、または20〜40塩基の長さである。オリゴヌクレオチドは、普通は例えばプローブには一本鎖であるが、オリゴヌクレオチドは、例えば変異体核酸配列の構築に使用するには二本鎖でありうる。本発明のオリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかでありうる。
【０１０１】
本明細書で使用する、用語「作動可能に接続した」または「作動可能に連鎖した」は、プロモーターの調節性制御下で構造遺伝子を配置することを意味し、プロモーターは次にその遺伝子の転写および場合によっては翻訳を制御する。異種プロモーター/構造遺伝子の組み合わせの構築では、遺伝子の転写開始部位から距離を空けて遺伝子配列またはプロモーターを配置することが一般的に好ましく、その距離はその遺伝子配列またはプロモーターとそれが自然の設定において制御する遺伝子、すなわち遺伝子配列またはプロモーターが得られた遺伝子との間の距離とほぼ同じである。当技術分野で公知のように、機能の喪失することなくこの距離の幾分の変動が適応できる。同様に、調節配列エレメントの制御下で配置すべき異種遺伝子に関連した好ましい配置は、自然の設定におけるそのエレメントの配置、すなわちそれが得られた遺伝子によって定まる。
【０１０２】
用語「病原体」は、本明細書において最も広い意味で使用され生存可能な植物組織の細胞への感染が病害の応答を誘導する生物または感染性作用因子を指す。
【０１０３】
本明細書で使用する、用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、mRNA、RNA、cRNA、cDNAまたはDNAを示す。この用語は、典型的には少なくとも10塩基の長さのヌクレオチド、すなわちリボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれか、またはいずれかの種類のヌクレオチドの改変型がポリマー型になったものを指す。この用語は、一本鎖および二本鎖型のDNAを含む。
【０１０４】
用語「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」は、以下に定義される厳密性の条件下で参照配列とハイブリダイズする参照ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチドと実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチドを指す。これらの用語は、少なくとも一つのヌクレオチドの付加、欠失または置換によって参照ポリヌクレオチドから変動するポリヌクレオチドも包含する。これに関して、例えば突然変異、付加、欠失または置換を包含する一定の変更を参照ポリヌクレオチドにおいて作製することができ、それにより変更されたポリヌクレオチドは参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持することは、当技術分野で十分に理解されている。用語「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」は、天然対立遺伝子変異体も含む。
【０１０５】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において相互交換可能に使用されて、アミノ酸残基のポリマーならびに同ポリマーの変異体および合成アナログを指す。このようにこれらの用語は、一つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の化学アナログのような合成非天然アミノ酸であるアミノ酸ポリマー、および天然アミノ酸ポリマーにあてはまる。
【０１０６】
用語「ポリペプチド変異体」は、少なくとも一つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換によって参照ポリペプチドから見分けられるポリペプチドを指す。ある態様では、参照ポリペプチドの一つまたは複数のアミノ酸残基は、異なるアミノ酸と置換される。以下に記載するように、ポリペプチドの活性の性質を変化させることなく広く類似した特性を有して一部のアミノ酸を他のアミノ酸に交換できることが当技術分野で十分に理解されている（保存的置換）。
【０１０７】
「プライマー」とは、DNAのストランドと対形成したとき、適切なポリマー化作用物質の存在下でプライマー伸長産物の合成が開始可能なオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、増幅中は効率を最大にするために好ましくは一本鎖であるが、あるいは二本鎖でもありうる。プライマーは、ポリマー化作用物質の存在下で伸長産物の合成をプライミングするに足る長さでなければならない。プライマーの長さは、適用、使用する温度、テンプレートの反応条件、他の試薬、およびプライマーの供給源を含めた多くの要因に依存する。例えば標的配列の複雑性に応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは典型的には15個または35個以上のヌクレオチド残基を含有するが、プライマーがより少ないヌクレオチド残基も含有しうる。プライマーは、約35個のヌクレオチドから数キロ塩基以上のような大型ポリヌクレオチドでありうる。ハイブリダイズするように設計され、合成の開始部位として働くテンプレート上の配列に「実質的に相補的」であるようにプライマーを選択できる。「実質的に相補的」とは、そのプライマーが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするに足る相補的であることを意味する。望ましくはプライマーは、そのプライマーがハイブリダイズするように設計されたテンプレートとのミスマッチを含有しないが、これは必須ではない。例えば、プライマー配列の残りがテンプレートに相補的である非相補的ヌクレオチド残基をプライマーの5'末端に付着させることができる。または、非相補ヌクレオチド残基または非相補ヌクレオチド残基のストレッチをプライマーに散在させることができるが、但しそのプライマー配列がテンプレートの配列とハイブリダイズするに足る相補性を有し、それによってプライマーの伸長産物の合成のためのテンプレートとなることを条件とする。
【０１０８】
「プローブ」は、特異的配列もしくは部分配列または別分子の他の一部分に結合する分子を指す。特に断りのない限り、用語「プローブ」は、典型的には「標的ポリヌクレオチド」と呼ばれることの多い別のポリヌクレオチドに、相補性塩基対形成によって結合するポリヌクレオチドプローブを指す。プローブは、ハイブリダイズ条件の厳密性に応じて、そのプローブとの完全な配列相補性を欠く標的ポリヌクレオチドと結合できる。プローブを直接または間接的に標識できる。
【０１０９】
本明細書で使用する、用語「組換えポリヌクレオチド」は、核酸の操作によって自然には普通みられない形態にインビトロで形成されたポリヌクレオチドを指す。例えば、組換えポリヌクレオチドは、発現ベクターの形でありうる。一般的にそのような発現ベクターにはヌクレオチド配列に作動可能に連結した転写および翻訳調節核酸がある。
【０１１０】
「組換えポリペプチド」とは、組換え法を使用して、すなわち組換えまたは合成ポリヌクレオチドの発現によって作製されたポリペプチドを意味する。
【０１１１】
「調節エレメント」または「調節エレメント」とは、特定の宿主細胞における作動可能に連結したコード配列の発現に必要な核酸配列（例えばDNA）を意味する。原核細胞に適した調節配列には、例えばプロモーターと、場合によってはオペレーター配列およびリボソーム結合部位のようなシス作用配列とがある。真核細胞に適した制御配列には、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、転写エンハンサー、翻訳エンハンサー、mRNAの安定性を調整するリーダー配列もしくは足跡配列（trailing sequence）、ならびに転写されたポリヌクレオチドによってコードされた産物を細胞内の細胞内区画または細胞外環境に標的化する標的配列がある。
【０１１２】
本明細書で使用する、用語「配列同一性」は、比較する領域にわたってヌクレオチド対ヌクレオチドベースまたはアミノ酸対アミノ酸ベースで配列が同一である程度を指す。このように、「配列同一性の百分率」は、比較する領域にわたり二つの最適に整列した配列を比較すること、同一の核酸塩基 （例えばA、T、C、G、I）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、CysおよびMet）が両方の配列に存在してマッチした位置の数を生じる位置の数を決定すること、マッチした位置の数を比較する領域（すなわち領域サイズ）における位置の総数で割ること、およびその結果に100を乗じて配列同一性の百分率を得ることによって計算される。本発明のために「配列同一性」は、ソフトウェアに付随する参照マニュアルで使用されるような標準デフォルトを使用してDNASISコンピュータプログラム（Windows用バージョン2.5; Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San Franciso, California, USAから入取可能）によって計算された「マッチ率」を意味するものとする。
【０１１３】
「類似性」は、同一であるか、または下記の表Bに定義される保存的置換を構成するアミノ酸の百分率の数を指す。GAP（Deveraux et al. 1984, Nucleic Acids Research 12,387-395）のような配列比較プログラムを使用して類似性を決定できる。このようにして、本明細書に引用した配列に類似するか、またはそれと実質的に異なる長さの配列が、アラインメントへのギャップの挿入によって比較され、そのようなギャップは、例えばGAPによって使用される比較アルゴリズムによって決定されうる。
【０１１４】
二つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列関連性を記載するために使用される用語には「参照配列」、「比較領域」、「配列同一性」、「配列同一率」および「実質的な同一性」がある。「参照配列」は、少なくとも12個であるが、頻繁に15〜18個であり、しばしば少なくとも25個の長さのヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含むモノマーユニットである。二つのポリヌクレオチドは、それぞれ（1）その二つのポリヌクレオチドの間で同様の配列（すなわち完全ポリヌクレオチド配列の一部のみ）および（2）二つのポリヌクレオチドの間で相違する配列を含みうることから、二つの（またはそれ以上）ポリヌクレオチドの間の配列の比較は、典型的には「比較領域」にわたり二つのポリヌクレオチドの配列を比較して、配列類似性の局所領域を同定および比較することによって行われる。「比較領域」は、配列を同じ数の連続する位置の参照配列と、その二つの配列が最適に整列した後で比較する、少なくとも6個、普通は約50個から約100個、さらに普通は約100個から約150個までの連続する位置の概念上のセグメントを指す。比較領域は、その二つの配列の最適な整列のための参照配列（付加または欠失を含まない）に比べて、約20%以下の付加または欠失（すなわちギャップ）を含みうる。比較領域の整列のための配列の最適な整列は、コンピュータによるアルゴリズムの実行（GAP, BESTFIT, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA）または検証および選択された任意の様々な方法によって発生した最高の整列（すなわち比較領域にわたり最高の相同率がもたらされた）によって実施されうる。例えばAltschulら、1997, Nucl. Acids Res. 25:3389によって開示されたようなBLASTファミリーのプログラムも参照できる。配列分析の詳細な解説を、Ausubelら、"Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc, 1994-1998の15章のユニット19.3に見出すことができる。
【０１１５】
本明細書における、用語「分類群」とは、植物分類学の単位を意味する。よって、分類群には属、種、栽培種、変種、変異体および一致した命名を欠く他の副分類群が含まれる。
【０１１６】
用語「形質転換」は、外来または内因性核酸の導入による生物、例えば細菌、酵母または植物の遺伝子型の変更を意味する。
【０１１７】
「ベクター」とは、ポリヌクレオチドを挿入またはクローニングできる、例えばプラスミド、バクテリオファージ、酵母またはウイルスから得られたポリヌクレオチド分子、好ましくはDNA分子を意味する。ベクターは、好ましくは一つまたは複数の独特の制限部位を含有し、標的細胞もしくは組織または前駆細胞もしくはその組織を含めた一定の宿主細胞での自律性複製が可能であるか、あるいはクローニングされた配列が繁殖可能であるように一定の宿主のゲノムと統合可能でありうる。したがってベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち染色体外の実体として存在するベクターでありうることができ、複製は、染色体の複製、例えば線状または閉鎖環状プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体に依存しない。ベクターは自己複製を保証するための任意の手段を含有しうる。または、ベクターは、宿主細胞に導入した場合にゲノムに統合され、そのベクターが統合された染色体と一緒に複製されるものでありうる。ベクター系は、宿主細胞のゲノムに導入される総DNAを一緒に含有する単一のベクターもしくはプラスミド、二つ以上のベクターもしくはプラスミド、またはトランスポゾンを含みうる。ベクターの選択は、ベクターと、典型的にはベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存するであろう。ベクターは、適切な形質転換体の選択に使用できる抗生物質抵抗性遺伝子のような選択マーカーも含みうる。そのような抵抗性遺伝子の例は当業者に公知である。
【０１１８】
2.  病害抵抗性の調整
本発明は、病原体によって引き起こされる病害抵抗性を調整するための、特に植物における病害抵抗性を刺激または増大するためのポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび方法に関するものである。本発明の病原体には、ウイルスまたはウイロイド、細菌、昆虫、線虫、菌類などがあるが、これに限定されるわけではない。ウイルスには任意の植物ウイルス、例えばタバコモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、輪点ウイルス、ネクロシスウイルス（necrosis virus）、トウモロコシ萎縮モザイクウイルスなどがある。主要作物に関する特異的な菌類病原体およびウイルス病原体には下記が含まれる。
【０１１９】
ダイズ：フィトフトラ・メガスペリスfsp.グリシネア（Phytophthora megasperma fsp. glycinea）、ダイズ炭腐病菌（Macrophomina phaseolina）、ダイズリゾクトニア根腐病菌（Rhizoctonia solani）、ダイズ菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、フザリウム・オクシスポルム、ジアポルテ・ファゼオロルムvar.ソジャエ（Diaporthe phaseolorum var. sojae ）（ポモプシス・ソジャエ（Phomopsis sojae））、ジアポルテ・ファゼオロルムvar.コーリボラ（Diaporthe phaseolorum var. caulivora）、スクレロチウム・ロルフシイ（Sclerotium rolfsii）、セルコスポラ・キクチイ（Cercospora kikuchii）、セルコスポラ・ソジナ（Cercospora sojina）、ペロノスポラ・マンシュリカ（Peronospora manshurica）、コレトトリクム・デマチウム（Colletotrichum dematium ）（コレトトリクム・トルンカツム（Colletotichum truncatum））、コリネスポラ・カッシイコラ（Corynespora cassiicola）、セプトリア・グリシネス（Septoria glycines）、フィロスティクタ・ソジコラ（Phyllosticta sojicola）、アルテルナリア・アルテルナタ（Alternaria alternata）、シュドモナス・シリンゲp.v.グリシネア（Pseudomonas syringae p.v. glycinea）、クサントモナス・カンペストリスp.vフェゼオリ（Xanthomonas campestris p.v. phaseoli）、ミクロスファエラ・ディフュサ（Microsphaera diffusa）、フザリウム・セミテクツム（Fusarium semitectum）、フィアロフォラ・グレガタ（Phialophora gregata）、ダイズモザイクウイルス、グロメレラ・グリシネス（Glomerella glycines）、タバコ輪点ウイルス、タバコ条斑ウイルス、ファコプソラ・パキリジ（Phakopsorapachyrhizi）、ピチウム・アフェニデルマツム（Pythium aphanidermatum）、ピチウム・ウルチムム（Pythium ultimum）、ピチウム・デバリアヌム（Pythium debaryanum）、トマト黄化壊疽ウイルス、ヘテロデラ・グリシネス（Heterodera glycines）、フザリウム・ソラニ（Fusarium solani）。
【０１２０】
カノーラ：アルブゴ・ガンディダ（Albugo candida）、アルテルナリア・ブラシカエ（Alternaria brassicae）、レプストフェエリア・マクランス（Leptosphaeria maculans）、リゾクトニア・ソラニ、スクレロチニア・スクレロチオルム、ミコスフェエレラ・ブラシシコラ（Mycosphaerella brassiccola）、ピチウム・ウルチムム、アブラナ科類べと病菌（Peronospora parasitica）、フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、アルテルナリア・アルテルナタ。
【０１２１】
アルファルファ：クラビバタ・ミシガネゼsubsp.インシジオスム（Clavibater michiganese subsp. insidiosum）、ピチウム・ウルチムム、ピチウム・イレグラレ（Pythium irregulare）、ピチウム・スプレンデンス（Pythium splendens）、ピチウム・デバリアヌム、ピチウム・アフェニデルマツム、フィトフトラ・メガスペリス、アルファルファべと病菌（Peronospora trifolioruｍ）、ホーマ・メディカギニスvar.メディカギニス（Phoma medicaginis var. medicaginis）、セルコスポラ・メジカギニス（Cercospora medicaginis）、シュドペジザ・メディカギニス（Pseudopeziza medicaginis）、レプトトロキラ・メディカギニス（Leptotrochila medicaginis）、フザリウム、アルファルファ斑点細菌病菌（Xanthomonas campestris p.v. alfalfae）、アファノミケス・エウテイケス（Aphanomyces euteiches）、ステンフィリウム・ヘルバルム（Stemphylium herbarum）、ステンフィリウム・アルファルファエ（Stemphylium alfalfae）。
【０１２２】
コムギ：シュドモナス・シリンゲp.v.アトロファシエンス（Pseudomonas syringe p.v. atrofaciens）、ウロシスティス・アグロピリ（Urocystis agropyri）、オーチャードグラス黄枯細菌病菌（Xanthomonas campestris p.v. translucens）、シュドモナス・シリンゲp.v.シリンゲ（Pseudomonas syringae p.v. syringae）、アルテルナリア・アルテルナタ、クラドスポリウム・ヘルバルム （Cladosporium herbarum）、フザリウム・グラミネアルム、フザリウム・アベナケウム（Fusarium avenaceum）、フザリウム・クルモルム（Fusarium culmorum）、ウスチラゴ・トリティキ（Ustilago tritici）、アスコキータ・トリティキ（Ascochyta tritici）、セファロスポリウム・グラミネウム（Cephalosporium gramineum）、コムギ炭疽病菌（Collotetrichum graminicola）、エリシフェ・グラミニスf.sp.トリティキ（Erysiphe graminis f.sp. tritici）、プクキニア・グラミニアスf.sp.トリティキ（Puccinia graminis f.sp. tritici）、プクキニア・レコンディタf.sp.トリティキ（Puccinia recondita f.sp. tritici）、プクキニア・ストリホルミス（Puccinia striiformis）、コムギ黄斑病菌（Pyrenophora tritici-repentis）、セプトリア・ノドルム （Septoria nodorum）、コムギ葉枯病菌（Septoria tritici）、セプトリア・アベナエ（Septoria avenae）、コムギ眼紋病菌（Pseudocercosporella herpotrichoides）、リゾクトニア・ソラニ、リゾクトニア・セレアリス（Rhizoctonia cerealis）、コムギ立枯病菌（Gaeumannomyces graminis var. tritici）、ピチウム・アフェニデルマツム、ピチウム・アレノマネス（Pythium arrhenomanes）、ピチウム・ウルチムム、バイポラリス・ソロキニアナ（Bipolaris sorokiniana）、オオムギ黄萎病ウイルス、ブロムモザイクウイルス、ムギ類萎縮ウイルス、コムギストリークモザイクウイルス（Wheat Streak Mosaic Virs）、コムギスピンドルストリークウイルス（Wheat Spindle Streak Virus）、アメリカコムギストライエートウイルス（American Wheat Striate Virus）、コムギ麦角病菌（Claviceps purpurea）、チレチア・トリチシ（Tilletia tritici）、チレチア・ラエビス（Tilletia laevis）、ウスチラゴ・トリティキ、チレチア・インジカ（Tilletia indica）、リゾクトニア・ソラニ、ピチウム・アレノマネス（Pythium arrhenomannes）、ピチウム・グラミニコラ（Pythium gramicola）、ピチウム・アフェニデルマツム、ハイプレインズウイルス（High Plains Virus）、ヨーロッパコムギストライエートウイルス（European wheat striate virus）。
【０１２３】
ヒマワリ：プラスモホラ・ハルステディ（Plasmophora halstedii）、スクレロチニア・スクレロチオルム、エゾキク萎黄病菌（Aster Yellows）、セプトリア・ヘリアンティ（Septoria helianthi）、ポモプシス・ヘリアンティ（Phomopsis helianthi）、アルテルナリア・ヘリアンティ（Alternaria helianthi）、アルテルナニア・ジンニエ（Alternaria zinniae）、ボトリチス・シネレア（Botrytis cinerea）、ホーマ・マクドナルディイ（Phoma macdonaldii）、マクロホミナ・ファゼオリナ、エリシフェ・チコラセアルム（Erysiphe cichoracearum）、リゾープス・オリザエ（Rhizopus oryzae）、リゾープス・アリズス（Rhizopus arrhizus）、リゾープス・ストロフェル（Rhizopus stolonifer）、プクキニア・ヘリアンティ、ウェルチキリウム・ダリアエ（Verticillium dahliae）、エルウィニア・カロトボラpv.カロトボラ（Erwinia carotovorum pv. carotovora）、セファロスポリウム・アクレモニウム（Cephalosporium acremonium）、フィトフトラ・クリプトゲア（Phytophthora cryptogea）、アルブゴ・トラゴポゴニス（Albugo tragopogonis）。
【０１２４】
トウモロコシ： フザリウム・モニリホルメvar.スブグリチナンス（Fusarium moniliforme var. subglutinans）、エルウィニア・ステワルティイ（Erwinia stewartii）、フザリウム・モニリホルメ、ギベレラ・ゼア（Gibberella zeae）（フザリウム・グラミネアルム）、ステノカルペラ・マイディ（Stenocarpella maydi）（ジプロジア・マイディス（Diplodia maydis）、ピチウム・イレグラレ、ピチウム・デバリアヌム、ピチウム・グラミニコラ、ピチウム・スプレンデンス、ピチウム・ウルチムム、ピチウム・アフェニデルマツム、アスペルギルス・フラブス（Aspergillus flavus）、バイポラリス・マイディスO、T（Bipolaris maydis O, T）（コクリオボルス・ヘテロストロフス（Cochliobolus heterostrophus））、ヘルミントスポリウム・カルボヌム（Helminthosporium carbonum）I、IIおよびIII（トウモロコシ北方斑点病菌（Cochliobolus carbonum））、トウモロコシすす紋病菌I、IIおよびIII（Exserohilum turcicum I,II & III）、ヘルミントスポリウム・ペデイケツラツム（Helminthosporium pedicellatum）、フィソデルマ・マイディス（Physoderma maydis）、フィロスティクタ・マイディス（Phyllosticta maydis）、カバティエラ・マイディス（Kabatiella maydis）、セルコスポラ・ソルギ 、ウスチラゴ・マイディス（Ustilago maydis）、プクキニア・ソルギ（Puccinia sorghi）、プクキニア・レコンディタ（Puccinia polysora）、マクロホミナ・ファゼオリナ、ペニシリウム・オキサリクム（Penicillium oxalicum）、ニグロスポラ・オリザエ（Nigrospora oryzae）、クラドスポリウム・ヘルバルム、クルブラリア・ルナタ（Curvularia lunata）、クルブラリア・イナエカリス（Curvularia inaequalis）、クルブラリア・パレセンス（Curvularia pallescens）、クラビバクテル・ミシガネンセsubsp.ネブラスケンセ（Clavibacter michiganense subsp. nebraskense）、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）、トウモロコシドワーフモザイクウイルス（Maize Dwarf Mosaic Virus）AおよびB、コムギストリークモザイクウイルス、トウモロコシクロロティックドワーフウイルス（Maize Chlorotic Dwarf Virus）、クラビセプス・ソルギ（Claviceps sorghi）、シュドモナス・アベナエ（Pseudonomas avenae）、エルウィニア・クリサンテミpv.ゼア（Erwinia chrysanthemi pv. zea）、エルウィニア・カロトボラ（Erwinia carotovora）、トウモロコシわい化スピロプラスマ（Corn stunt spiroplasma）、ジプロジア・マクロスポラ（Diplodia macrospora）、スクレロフトラ・マクロスポラ（Sclerophthora macrospora）、ペロノスクレロスポラ・ソルギ（Peronosclerospora sorghi）、ペロノスクレロスポラ・フィリピネンシス（Peronosclerospora philippinensis）、ペロノスクレロスポラ・マイディス（Peronosclerospora maydis）、ペロノスクレロスポラ・サッカリ（Peronosclerospora sacchari)、スファケロテカ・レイリアナ、フィセペラ・ゼエ（Physopella zeae）、セファロスポリウム・マイディス（Cephalosporium maydis）、セファロスポリウム・アクレモニウム（Cephalosporium acremonium）、トウモロコシクロロティックモトルウイルス（Maize Chlorotic Mottle Virus）、ハイプレインズウイルス、トウモロコシモザイクウイルス、トウモロコシラヤドフィノウイルス（Maize Rayado Fino Virus）、トウモロコシストリークウイルス（Maize Streak Virus）、トウモロコシストライプウイルス（Maize Stripe Virus）、トウモロコシラフドワーフウイルス（Maize Rough Dwarf Virus）。
【０１２５】
ソルガム：エクセロヒルム・ツルキクム、コレトトリクム・グラミニコラ（Colletotrichum graminicola）（グロメレラ・グラミニコラ（Glomerella graminicola）)、ソルガム紫輪病菌（Cercospora sorghi）、グロエオセルコスポラ・ソルギ（Gloeocercospora sorghi）、ソルガム粒斑病菌（Ascochyta sorghina）、シュドモナス・シリンゲp.v.シリンゲ、クサントモナス・カンペストリスp.v.ホルシコラ（Xanthomonas campestris p.v. holcicola）、シュドモナス・アンドロポゴニス（Pseudomonas andropogonis）、プクキニア・プルプレア（Puccinia purpurea）、マクロホミナ・ファゼオリナ、ペルコニア・サーシナタ（Perconia circinata）、フザリウム・モニリホルメ、アルテルナリア・アルテルナタ、バイポラリス・ソルギコラ（Bipolaris sorghicola）、ヘルミントスポリウム・ソルギコラ（Helminthosporium sorghicola）、クルブラリア・ルナタ（Curvularia lunata）、ホーマ・インシディオサ（Phoma insidiosa）、シュドモナス・アベナエ（Pseudomonas avenae）（シュドモナス・アルボプレシピタンス（Pseudomonas alboprecipitans））、ラムリスポラ・ソルギ（Ramulispora sorghi）、ラムリスポラ・ソルギコラ（Ramulispora sorghicola）、フィラカラ・サッカリ（Phyllachara sacchari）、スポリソリウム・レイリアヌム（Sporisorium reilianum）（（スファケロテカ・レイリアナ（Sphacelotheca reiliana））、ソルガム裸黒穂病菌（Sphacelotheca cruenta）、ソルガム粒黒穂病菌（Sporisorium sorghi）、サトウキビモザイクH、トウモロコシ萎縮モザイクウイルスAおよびB、クラビセブス・ソルギ、リゾクトニア・ソラニ、 アクレオニウム・ストリクツム（Acremonium strictum）、ソルガム黄化萎縮病菌（Sclerophthona macrospora）、ペロノスクレロスポラ・ソルギ、ペロノスクレロスポラ・フィリピネンシス、スクレロポラ・グラミニコラ（Sclerospora graminicola）、フザリウム・グラミネアルム（Fusarium graminearum）、フザリウム・オクシスポルム、フィチウム・アレノマネス（Pythium arrhenomanes）、ピチウム・グラミニコラなど。
【０１２６】
線虫には、ネコブセンチュウ、シストセンチュウ、ネグサレセンチュウ、ニセフクロセンチュウなどの寄生線虫がある。
【０１２７】
害虫には、コウチュウ目（Coleoptera）、ハエ目（Diptera）、ハチ目（Hymenoptera）、チョウ目（Lepidoptera）、ハジラミ目（Mallophaga）、ヨコバイ亜類（Homoptera）、カメムシ目(Hempiptera)、バッタ目（Orthoptera）、アザミウマ目（Thysanoptera）、ハサミムシ目（Dermaptera）、シロアリ目（Isoptera）、シラミ目（Anoplura）、ノミ目（Siphonaptera）、トビケラ目（Trichoptera）など、特にコウチュウ目およびチョウ目の目から選択される昆虫がある。主要作物に関する本発明の害虫には下記が含まれる。
【０１２８】
トウモロコシ：オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）、ヨーロピアンコーンボーラー（European corn borer）；タマナヤガ（Agrotis ipsilon）、ブラックカットワーム（black cutworm）；アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）、コーンイアーワーム（corn earworm）；ツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）、フォールアーミーワーム（fall armyworm）；ジアトラエア・グランジオセラ（Diatraea grandiosella）、サウスウエスタンコーンボーラー（southwestern corn borer）；モロコシマダラメイガ（Elasmopalpus lignosellus）、レサーコーンストークボーラー（lesser cornstalk borer）；ジアトラエア・サッカラリス（Diatraea saccharalis）、シュガーケインボーラー（surgarcane borer）；ジアブロティカ・フィルギフェラ（Diabrotica virgifera）、ウエスタンコーンルートワーム（western corn rootworm）；ジアブロティカ・ロンギコルニス・バルベリ（Diabrotica longicornis barberi）、ノーザンコーンルートワーム（northern corn rootworm）； ジアブロティカ・ウンデシンプンクタータ・ホワルディ（Diabrotica undecimpunctata howardi）、サザンコーンルートワーム（southern corn rootworm）； メラノツスspp.（Melanotus spp.）、ワイアワーム（wireworms）；キクロケファラ・ボレアリス（Cyclocephala borealis）、ノーザンマスクドチェイファ（northern masked chafer）（ネキリムシ）；キクロケファラ・イマクラタ（Cyclocephala immaculata）、サザンマスクドチェイファ（ネキリムシ）；マメコガネ（Popillia japonica）、ジャパニーズビートル；カエトクネマ・プリカリア（Chaetocnema pulicaria）、コーンフレービートル（corn flea beetle）；スフェノフォルス・マイジス（Sphenophorus maidis）、メイズビルバグ（maize billbug）； キビクビレアブラムシ（Rhopalosiphum maidis）、コーンリーフアフィド（corn leaf aphid）；アヌラフィス・マイディラディシス（Anuraphis maidiradicis）、コーンルートアフィド（corn root aphid）；ブリッスススス・ロイコプテルス・ロイコプテルス（Blissus leucopterus leucopterus）、チンチバグ（chinch bug）；メラノプルス・フェムルルブルム（Melanoplusfemurrubrum）、レッドレッグドグラスホッパー（redlegged grasshopper）；メラノプルス・サングイニペス（Melanoplus sanguinipes）、ミグラトリーグラスホッパー（migratory grasshopper）；タネバエ（Hylemya platura）、シードコーンマゴット（seedcorn maggot）；アグロミザ・パルビコルニス（Agromyza parvicornis）、コーンブロットリーフマイナー（corn blot leafminer）；アナホトリプス・オブスクルルス（Anaphothrips obscrurus）、グラススリップス（grass thrips）；ソレノプシス・ミレスタ（Solenopsis milesta）、シーフアント（thief ant）； ナミハダニ（Tetranychus urticae）、ツースポテッドスパイダーマイト（twospotted spider mite）。
【０１２９】
ソルガム：キロ・パルテルス（Chilo partellus）、ソルガムボーラー（sorghum borer）；ツマジロクサヨトウ、フォールアーミーワーム；アメリカタバコガ、コーンイアーワーム；モロコシマダラメイガ 、レサーコーンストークボーラー；フェルチア・スブテラネア（Feltia subterranea）、グラニュレートカットワーム（granulate cutworm）；フィロファガ・クリニタ（Phyllophaga crinita）、ホワイトグラブ（white grub）；エレオデス属（Eleodes）、コノデルス属（Conoderus）、およびアエオルスspp.（Aeolus spp.）、ワイアワーム； オウレマ・メラノプス（Oulema melanopus）、シリアルリーフビートル（cereal leaf beetle）；カエトクネマ・プリカリア、コーンフリービートル（corn flea beetle）；スフェノフォルス・マイディス（Sphenophorus maidis）、メイズビルバグ；キビクビレアブラムシ；コーンリーフアフィド；シファ・フラバ（Sipha flava）、イエローシュガーケーンアフィド（yellow sugarcane aphid）；ブリッスス・ロイコプテルス・ロイコプテルス、チンチバグ；ソルガムタマバエ（Contarinia sorghicola）、ソルガムミッジ（sorghum midge）；ニセナミハダニ（Tetranychus cinnabarinus）、カーマインスパイダーマイト（carmine spider mite）； ナミハダニ、ツースポッテドスパイダーマイト（twospotted spider mite）；コムギ：プセウダレチア・ウニプンクタ（Pseudaletia unipunctata）、アーミーワーム（army worm）；ツマジロクサヨトウ、フォールアーミーワーム；モロコシマダラメイガ、レサーコーンストークボーラー；アグロチス・オルトゴニア（Agrotis orthogonia）、ウエスタンカットワーム（western cutworm）；モロコシマダラメイガ 、レサーコーンストークボーラー；オウレマ・メラノプス、シリアルリーフビートル；ヒペラ・プンクタータ（Hypera punctata）、クローバーリーフウィービル（clover leaf weevil）；ジアブロティカ・ウンデシンプンクタータ・ホワルディ、サザンコーンルートワーム；ロシアンウィートアフィド（Russian wheat aphid）；ムギミドリアブラムシ（Schizaphis graminum）、グリーンバグ（greenbug）；ムギヒゲナガアブラムシ（Macrosiphum avenae）、イングリッシュグレインアフィド（English grain aphid）；メラノプルス・フェムルルブルム、レッドレッグドグラスホッパー；メラノプルス・ディフェレンチアリス（Melanoplus differentialis）、ディファレンシャルグラスホッパー（differential grasshopper）；メラノプルス・サングイニペス、ミグラトリーグラスホッパー；マイエチオラ・デストルクトル（Mayetiola destructor）、ヘシアンフライ（Hessian fly）；ムギアカタマバエ（Sitodiplosis mosellana）、ウィートミッジ（wheat midge）；メロミザ・アメリカーナ（Meromyza americana）、ウィートステムマゴット（wheat stem maggot）；ヒレミア・コアルクタタ（Hylemya coarctata）、ウィートバルブフライ（wheat bulb fly）；フランクリニエラ・フスカ（Frankliniella fusca）、タバコスリップス（tobacco thrips）；ケフス・シンクツス（Cephus cinctus）、ウィートステムソーフライ（wheat stem sawfly）；チューリップサビダニ（Aceria tulipae）、ウィートカールマイト（wheat curl mite）；ヒマワリ：スレイマ・ヘリアンタナ（Suleima helianthana）、サンフラワーバッドモス（sunflower bud moth）；ホメオソマ・エレクテラム（Homoeosoma electellum）、サンフラワーモス（sunflower moth）；チゴグラマ・エクスクラマチオニス（Zygogramma exclamationis）、サンフラワービ��トル（sunflower beetle）；ボチルス・ギボスス（Bothyrus gibbosus）、キャロットビートル（carrot beetle）；ネオラシオプテラ・ムルトフェルドチアナ（Neolasioptera murtfeldtiana）、サンフラワーシードミッジ（sunflower seed midge）；ワタ：ヘリオチス・ウィレケンス（Heliothis virescens）、コットンバッドワーム（cotton budworm）；アメリカタバコガ、コットンボールワーム（cotton bollworm）；シロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）、ビートアーミーワーム（beet armyworm）；ワタアカミムシ（Pectinophora gossypiella）、ピンクボールワーム（pink bollworm）；アントノムス・グランディス・グランディス（Anthonomus grandis grandis）、ボールウィヴィル（boll weevil）；ワタアブラムシ（Aphis gossypii）、コットンアフィド（cotton aphid）；プセウダトモスケリス・セリアツス（Pseudatomoscelis seriatus）、コットンフリーホッパー（cotton fleahopper）；トリアレウロデス・アブチロネア（Trialeurodes abutilonea）、バンデドウイングドホワイトフライ（bandedwinged whitefly）；サビイロカスミカメ（Lygus lineolaris）、ターニッシュドプラントバグ（tarnished plant bug）；メラノプルス・フェムルルブルム、レッドレッグドグラスホッパー；メラノプルス・ディフェレンチアリス、ディファレンシャルグラスホッパー；ネギアザミウマ（Thrips tabaci）、オニオンスリップス（onion thrips）；フランクリンキエラ・フスカ（Franklinkiella fusca）、タバコスリップス；ニセナミハダニ、カーマインスパイダーマイト；ナミハダニ、ツースポッテドスパイダーマイト。
【０１３０】
イネ：ジアトラエア・サッカラリス、シュガーケーンボーラー；ツマジロクサヨトウ、フォールアーミーワーム；アメリカタバコガ、コーンイアーワーム（corn earworm）；コラスピス・ブルネア（Colaspis brunnea）、グレープコラスピス（grape colaspis）；イネミズゾウリムシ（Lissorhoptrus oryzophilus）、ライスウォーターウィーブリ（rice water weevil）；ココクゾウ（Sitophilus oryzae）、ライスウィーブリ（rice weevil）；クロスジツマグロヨコバイ（Nephotettix nigropictus）、ライスリーフホッパー（rice leafhopper）；ブリッスス・ロイコプテルス・ロイコプテルス、チンチバグ；アクロステルヌム・ヒラレ（Acrosternum hilare）、グリーンスティンクバグ（green stink bug）。
【０１３１】
ダイズ：シュドプルシア・インックルデンス（Pseudoplusia includens）、ソイビーンルーパー（soybean looper）；アンチカルシア・ゲマタリス（Anticarsia gemmatalis）、ベルベットビーンキャタピラー（velvetbean caterpillar）；プラチペナ・スカブラ（Plathypena scabra）、グリーンクローバーワーム（greencloverworm）；オストリニア・ヌビラリス、ヨーロピアンコーンボーラー；タマナヤガ、ブラックカットワーム； シロイチモジヨトウ、ビートアーミーワーム；ヘリオチス・ウィレスケンス、コットンバッドワーム；アメリカタバコガ、コットンボールワーム；インゲンテントウ（Epilachna varivestis）、メキシカンビーンビートル（Mexican bean beetle）；モモアカアブラムシ（Myzus persicae）、グリーンピーチアフィド（green peach aphid）；ジャガイモヒメヨコバイ（Empoasca fabae）、ポテトリーフホッパー（potato leafhopper）；アクロステルヌム・ヒラレ、グリーンスティンクバグ；メラノプルス・フェムルルブルム、レッドレッグドグラスホッパー；メラノプルス・ディフェレンチアリス、ディファレンシャルグラスホッパー；タネバエ、シードコーンマゴット；セリコスリップス・バリアビリス（Sericothrips variabilis）、ソイビーンスリップス（soybean thrips）；ネギアザミウマ、オニオンスリップス；テトラニクス・ルツケスタニ（Tetranychus turkestani）、ストロベリースパイダーマイト（strawberry spider mite）； ナミハダニ、ツースポッテドスパイダーマイト。
【０１３２】
オオムギ：オストリニア・ヌビラリス、ヨーロピアンコーンボーラー；タマナヤガ、ブラックカットワーム； ムギミドリアブラムシ、グリーンバグ；ブリッスス・ロイコプテルス・ロイコプテルス、チンチバグ；アクロステルヌム・ヒラレ、グリーンスティンクバグ；エウスキスツス・セルブス（Euschistus servus）、ブラウンスティンクバグ（brown stink bug）；タネバエ、シードコーンマゴット； ヘシアンバエ、ヘシアンフライ； ペトロビア・ラテンス、ブラウンウィートマイト（brown wheat mite）；アブラナ：ダイコンアブラムシ（Brevicoryne brassicae）、キャベジアフィド（cabbage aphid）；フィロトレタ・クルキフェレ（Phyllotreta cruciferae）、フリービートル（Flea beetle）；マメストラ・コンフィグラタ（Mamestra configurata）、バーサアーミーワーム（Bertha armyworm）；コナガ（Plutella xylostella）、ダイアモンドバックモス（Diamond-back moth）；デリアspp.（Delia ssp.）、ルートマゴット。
【０１３３】
ある態様では、植物病原体は菌類、特にフザリウム・オクシスポルム、ウェルチキリウム・ダリアエ、クラドスポリウムおよびラルストナ・ソラナセウム（Ralstona Solanaceum）のような土壌菌類から選択される。
【０１３４】
3.  本発明のポリヌクレオチド
本発明は、一方がムサ・アクミナタカルカッタ4由来、もう一方がムサ・アクミナタsppマラセンシス由来である、バナナ由来の二つの新規なR遺伝子の単離に部分的に基づく。RGA5と呼ばれるカルカッタ4の遺伝子は、4380nt長であり、1441aaの推定上のポリペプチド産物をコードする4321ntの単一オープンリーディングフレームを含む。この遺伝子のヌクレオチド配列およびその推定ポリペプチド配列を、配列番号：1および2にそれぞれ示す。RGA2と呼ばれるムサ・アクミナタsppマラセンシスの遺伝子は、1232aaの推定上のポリペプチド産物をコードする3699ntの単一オープンリーディングフレームを含む。RGA2遺伝子のヌクレオチド配列およびその推定ポリペプチド配列を、配列番号：3および4にそれぞれ示す。
【０１３５】
本発明によると、新規なR遺伝子は、病原性の病害、特に菌類病原体、ウイルス、線虫、昆虫などによって引き起こされる病害に抵抗性である作物植物の構築を促進するために有用であろう。本発明のR遺伝子を、遺伝子マップ作製ならびに対象となる植物における病害抵抗性を評価する際のマーカーとしても使用できる。このように、配列を育種プログラムに使用できる。例えば、Gentzbittelら（1998, Theor. Appl. Genet. 96:519-523）を参照されたい。本発明の配列についての追加の使用には、配列をベイト（bait）として使用して、防御/抵抗性経路の他のシグナル伝達構成要素を単離することおよび対応するプロモーター配列を単離することを含む。配列を使用して、花粉の発生、器官の形状の調節、アリューロンおよびシュート表皮の分化、不定胚形成反応能、ならびに細胞/細胞相互作用のような植物の発生過程も調整できる。一般的にSambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual（2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N. Y.）を参照されたい。本発明の配列を使用して、新しい抵抗性特異性を発生させるために変異体を発生（例えば「ドメインスワッピング」によって）させることもできる。
【０１３６】
本発明は、単離または実質的に精製された核酸またはタンパク質組成物を包含する。「単離」または「精製」された核酸分子もしくはタンパク質、またはその生物学的に活性な部分は、天然環境でみられるような核酸分子もしくはタンパク質に普通は付随するか、またはそれと相互作用する構成要素が、実質的または本質的に存在しない。このように、単離または精製されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドには、組換え法によって産生される場合は他の細胞性物質もしくは培地が実質的に存在しないし、また化学合成される場合は化学前駆物質もしくは他の化学物質が実質的に存在しない。適切には、「単離」されたポリヌクレオチドには、ポリヌクレオチドが得られた生物のゲノムDNAにおいてそのポリヌクレオチドに自然に隣接する配列（特にタンパク質をコードする配列）（すなわちポリヌクレオチドの5'および3'末端に局在する配列）が存在しない。例えば、様々な態様では、単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが得られた細胞のゲノムDNAにおいてポリヌクレオチドに自然に隣接する約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、または0.1kb未満のヌクレオチド配列を含有できる。細胞性物質が実質的に存在しないポリペプチドには、約30%、20%、10%、5%未満（乾燥重量で）の混入タンパク質を有するタンパク質調製物がある。本発明のタンパク質またはそれの生物学的に活性な部分が組換え産生される場合、培地は、化学前駆物質または対象となるタンパク質ではない化学物質の約30%、20%、10%、または5%未満（乾燥重量で）に適切に相当する。
【０１３７】
本発明は、開示されたヌクレオチド配列の部分も包含する。ヌクレオチド配列の部分は、天然ポリペプチドの生物学的活性を保持し、したがって病害抵抗性を調整または調節するポリペプチド部分またはセグメントをコードしうる。または、ハイブリダイズプローブとして有用であるヌクレオチド配列の部分は、そのような生物学的活性を保持するアミノ酸配列を一般的にコードしない。このように、ヌクレオチド配列の部分は、少なくとも約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、80、90、100個のヌクレオチドから、または本発明のポリペプチドをコードする完全長ヌクレオチド配列にほとんど至る範囲でありうる。
【０１３８】
本発明のRポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードするRヌクレオチド配列の部分は、少なくとも約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、300、400、500、600、700、800、900または1000個の連続するアミノ酸残基、または本発明の完全長Rポリペプチドに存在するアミノ酸の総数にほとんど至るアミノ酸残基（例えば配列番号：2または4についてそれぞれ1440または1330個のアミノ酸残基）をコードするであろう。ハイブリダイズプローブまたはPCRプライマーとして有用なRヌクレオチド配列の部分は、一般的にRポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードする必要はない。
【０１３９】
このように、Rヌクレオチド配列の部分は、Rポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードしうるし、またそれは当技術分野で公知の標準的な方法を用いてハイブリダイズプローブまたはPCRプライマーとして使用できるフラグメントでありうる。Rポリペプチドの生物学的に活性な部分は、本発明のRヌクレオチド配列の一つの部分を単離する段階、Rポリペプチドのコードされた部分を発現させる段階（例えばインビトロ組換え発現によって）、およびRポリペプチドのコードされた部分の活性を評価する段階によって調製できる。Rヌクレオチド配列の部分である核酸分子は、少なくとも約15、16、17、18、19、20、25、30、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、または650個のヌクレオチド、または本明細書に開示される完全長Rヌクレオチド配列に存在するヌクレオチドの数にほとんど至るヌクレオチド（例えば配列番号：1または14それぞれについて4375または3690個のヌクレオチド）を含む。
【０１４０】
本発明は、開示されたヌクレオチド配列の変異体も考慮している。核酸変異体は、対立遺伝子変異体（同遺伝子座）、ホモログ（異なる遺伝子座）、およびオーソログ（異なる生物）のように天然の可能性があり、また非天然の可能性もある。これらのような天然変異体を、例えば当技術分野で公知のようなポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびハイブリダイズ法を用いるような周知の分子生物学法を使用して同定できる。非天然変異体を、ポリヌクレオチド、細胞、または生物に適用されるものを含めた突然変異誘発法によって作製できる。変異体は、ヌクレオチドの置換、欠失、逆位および挿入を含有しうる。変異は、コード領域および非コード領域のいずれかまたは両方で起こりうる。変異は、保存的および非保存的アミノ酸置換の両方を生じうる（コードされた産物に比べて）。ヌクレオチド配列については、保存的変異体には遺伝コードの縮退が原因で、本発明のRポリペプチドの一方のアミノ酸配列をコードする配列を含む。変異体ヌクレオチド配列には、例えば部位特異的突然変異誘発を使用することによって発生したもののような、合成的に得られたがまだ本発明のRポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も含む。一般的には、本発明の特定のヌクレオチド配列の変異体は、デフォルトのパラメーターを使用して本明細書の他のどこかに記載した配列アラインメントプログラムによって決定されるような、特定のヌクレオチド配列に対して少なくとも約30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、一般的には少なくとも約75%、80%、85%、望ましくは約90%から95%以上、さらに適切には約98%以上の配列同一性を有するであろう。
【０１４１】
本発明のヌクレオチド配列を使用して、他の生物、特に他の植物から対応する配列を単離できる。方法は、核酸配列のハイブリダイズに関する当該技術分野において容易に入手可能である。他の植物からのコード配列を、本明細書に記載のコード配列との配列同一性に基づいて周知の手法により単離できる。これらの手法において、公知のコード配列の全てまたは部分は、選択された生物からクローニングされたゲノムDNAフラグメントまたはcDNAフラグメントの集団（すなわちゲノムまたはcDNAライブラリー）に存在する他のRコード配列に選択的にハイブリダイズするプローブとして使用される。したがって、本発明は、下記の厳密性の条件下でR遺伝子のヌクレオチド配列またはそれらの構成要素にハイブリダイズするポリペプチドも考慮している。本明細書で使用する、用語「低厳密性、中厳密性、高厳密性、または超高厳密性の条件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイズおよび洗浄のための条件を記載している。ハイブリダイズ反応を行うための手引きは、Ausubelら（1998、上記）、6.3.1〜6.3.6節に見出すことができる。水性および非水性法が参照に記載され、どちらも使用できる。本明細書における低厳密性の条件下に対する参照には、42℃でのハイブリダイズ用に、少なくとも約1v/v%から少なくとも約15v/v%ホルムアミドおよび少なくとも約1Mから少なくとも約2M塩、ならびに42℃での洗浄用に少なくとも約1Mから少なくとも約2M塩を含み包含する。低厳密性の条件下は、65℃でのハイブリダイズ用に1%ウシ血清アルブミン（BSA）、1mM EDTA、0.5M NaHPO4（pH7.2）、7%SDS、および室温での洗浄用に（i）2×SSC、0.1% SDS；または（ii）0.5% BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4（pH7.2）、5% SDSも含みうる。低厳密性の条件下の一態様は、約45℃での6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（SSC）中でのハイブリダイズに続いて、少なくとも50℃での0.2×SSC、0.1%SDS中での2回洗浄（低厳密性の条件下については洗浄温度を55℃に上げることができる）を含む。中厳密性の条件下は、42℃でのハイブリダイズ用に少なくとも約16v/v%から少なくとも約30v/v%ホルムアミドまでおよび少なくとも約0.5Mから約0.9M塩、および55℃での洗浄用に少なくとも約0.1Mから少なくとも約0.2M塩までを含み包含する。中厳密性の条件下は、65℃でのハイブリダイズ用に1%ウシ血清アルブミン（BSA）、1mM EDTA、0.5M NaHPO4（pH7.2）、7% SDS、および60〜65℃での洗浄用に（i）2×SSC、0.1%SDS；または（ii）0.5% BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4（pH7.2）、5% SDSも含みうる。中厳密性の一態様は、約45℃で6×SSC中でのハイブリダイズに続いて、60℃で0.2×SSC、0.1% SDS中で１回または複数回の洗浄を含む。高厳密性の条件下は、42℃でのハイブリダイズ用に少なくとも約31v/v%から少なくとも約50v/v%ホルムアミド、および約0.01Mから約0.15M塩まで、および55℃での洗浄用に少なくとも約0.01Mから約0.02M塩までを含み包含する。高厳密性の条件下は、65℃でのハイブリダイズ用に1% BSA、1mM EDTA、0.5M NaHPO4（pH7.2）、7% SDS、および65℃を超えた温度での洗浄用に（i）0.2×SSC、0.1% SDS；または（ii）0.5% BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4（pH7.2）、1% SDSも含みうる。高厳密性の一態様は、約45℃で6×SSC中でのハイブリダイズに続いて、65℃で0.2×SSC、0.1% SDS中で１回または複数回の洗浄を含む。
【０１４２】
ある態様では、本発明の単離された核酸分子は、超高厳密性の条件下でハイブリダイズする。超高厳密性の条件下の一態様は、65℃で0.5Mリン酸ナトリウム、7%SDSでのハイブリダイズに続いて、65℃で0.2×SSC、1% SDSで１回または数回の洗浄を含む。
【０１４３】
他の厳密性の条件下は、当技術分野で周知であり、技術者は、様々な要因を操作してハイブリダイズの特異性を最適にできることを認識しているであろう。最終洗浄の厳密性の最適化は、高度のハイブリダイズを確実にするように作用しうる。詳細な例には、Ausubelら、上記、2.10.1〜2.10.16頁およびSambrookら（1989、上記）1.101〜1.104節を参照されたい。
【０１４４】
ストリンジェントな洗浄は、典型的には約42℃から68℃の温度で実施されるが、当業者は他の温度がストリンジェントな条件に適している可能性があることを認識しているであろう。DNA−DNAハイブリッドの形成については、最大のハイブリダイズ速度は、典型的にはTmを下回る約20℃から25℃までで起こる。Tmは融解温度、言い換えると二つの相補性ポリヌクレオチド配列が解離する温度であることが当技術分野で周知である。Tmを推定する方法は、当技術分野で周知である（Ausubelら、上記、2.10.8頁を参照されたい）。一般に、完全にマッチしたDNA二本鎖のTmを、次式による近似値として推定できる：
Tm=81.5+16.6（log10M）+0.41（%G+C）-0.63（%ホルムアミド）-（600/長さ）
ここで、Mは、Na+の濃度で、好ましくは0.01モル濃度から0.4モル濃度の範囲であり；%G+Cは、総塩基数に対する百分率としてのグアノシン塩基とシトシン塩基との合計で、30%から75%G+Cの間の範囲であり；%ホルムアミドは、容積百分率で示した濃度であり；長さは、DNA二本鎖における塩基対の数である。二本鎖DNAのTmは、ランダムにミスマッチした塩基対の数が1%増加するごとにおよそ1℃減少する。洗浄は、一般的に高厳密性についてはTm-15℃で、また中厳密性についてはTm-30℃で実施される。
【０１４５】
ハイブリダイズ法の一例では、固定化DNAを含有する膜（例えばニトロセルロース膜またはナイロン膜）を、標識プローブを含有するハイブリダイズ緩衝液（50%脱イオンホルムアミド、5×SSC、5×Denhardt溶液（0.1%フィコール、0.1%ポリビニルピロリドンおよび0.1%ウシ血清アルブミン）、0.1% SDSおよび200mg/mL変性サケ精子DNA）中で42℃で一晩ハイブリダイズする。次に、その膜を、連続的な中厳密性の洗浄2回（すなわち2×SSC、0.1% SDSを45℃で15分間に続いて、2×SSC、0.1% SDSを50℃で15分間）に続いて、連続的なより高い厳密性の洗浄2回（すなわち0.2×SSC、0.1% SDSを55℃で12分間に続いて、0.2×SSCおよび0.1% SDS溶液を65〜68℃で12分間）に供する。
【０１４６】
変異体ヌクレオチド配列は、対象となるポリペプチド中のドメインを他のポリペプチドのドメインとスワップするために使用できる「DNAシャフリング」のような突然変異誘発または組換え誘発法から得られる配列も包含する。DNAシャフリングを用いて一つまたは複数の異なるRコード配列を操作して所望の性質を保有する新しいR配列を生み出すことができる。この手順では、実質的な配列同一性を有し、インビトロまたはインビボで相同組み換えできる配列領域を含む関連するポリヌクレオチドの集団から、組換えポリヌクレオチドのライブラリーを発生させる。例えば、この取り組みを使用して、対象となるドメインをコードする配列モチーフ（例えば本発明のポリペプチドのコイルドコイルドメイン、NBSドメインおよび/またはLRRドメイン）を、本発明のR遺伝子と他の公知のR遺伝子との間でシャフルして、病害抵抗性スペクトルを広げるような、対象となる性質の改善を有するタンパク質をコードする新しい遺伝子を得ることができる。この目的に使用できるであろう実例的な抵抗性R遺伝子を下記の表Bに挙げる。
【０１４７】
（表Ｂ）1994年から2003年にクローニングされた植物病害抵抗性遺伝子
2007506414.tif 000006
【０１４８】
DNAシャフリングの戦略は、当技術分野で公知である。例えば: Stemmer (1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; 1994, Nature 370:389-391); Crameri et al. (1997, Nature Biotech. 15:436-438); Moore et al. (1997, J. Mol.Biol. 272:336-347); Zhang et al. (1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509); Crameri et al. (1998, Nature 391:288-291); and U. S. Pat. Nos. 5,605,793 and 5,837,458を参照。
【０１４９】
4.  本発明のポリペプチド
本発明は、病害抵抗性、特に菌類病原体、ウイルス、線虫、昆虫などによって引き起こされる病害を含めた病原性の病害に対する抵抗性を付与するポリペプチドおよびその生物学的に活性な部分を提供する。本発明のRポリペプチドの生物学的に活性な部分には、少なくとも約6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、40、50、60個のアミノ酸残基の長さの、免疫相互作用活性を有する部分がある。例えば、本発明で考慮される免疫相互作用性フラグメントは、少なくとも6個、望ましくは少なくとも8個のアミノ酸残基の長さであり、そのフラグメントは、本発明のRポリペプチドと免疫相互作用性である抗原結合分子を産生するために動物に免疫応答を誘発できる。そのような抗原結合分子を使用して、構造的および/または機能的に関連したRポリペプチドについて生物、特に植物をスクリーニングできる。典型的には、開示されたRポリペプチドの部分は、相互作用、例えば分子内または分子間相互作用に関与しうる。分子間相互作用は、特異的結合相互作用または酵素相互作用でありうる（例えば、相互作用は一過性であることができ、共有結合が形成または破壊される）。分子間相互作用は、Rポリペプチドと病原体誘導因子タンパク質との間でありうる。Rポリペプチドの生物学的に活性な部分には、開示されたRポリペプチドのアミノ酸配列、例えば配列番号：2または4に示されたアミノ酸配列と十分に同様であるか、またはそれから得られたアミノ酸配列を含むペプチドがあり、そのペプチドは完全長Rポリペプチドよりも少ないアミノ酸を含み、Rポリペプチドの少なくとも一つの活性を示す。典型的には、生物学的に活性な部分は、Rポリペプチドの少なくとも一つの活性、例えば病原体誘導因子タンパク質に結合する能力または病害抵抗性を付与する能力を有するドメインまたはモチーフを含む。Rポリペプチドの生物学的に活性な部分は、例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、300、400、500、600、700、800、900または1000以上のアミノ酸の長さであるポリペプチドでありうる。適切にはその部分は、完全長ポリペプチドの約1%、10%、25%、50%以上の病原体誘導因子タンパク質結合活性または抵抗性付与活性を有する「生物学的に活性な部分」である。
【０１５０】
本発明は、変異体Rポリペプチドも考慮される。「変異体」ポリペプチドには、天然タンパク質のN末端および/またはC末端への一つもしくは複数のアミノ酸の欠失（いわゆる短縮）または付加；天然タンパク質の一つもしくは複数の部位での一つもしくは複数のアミノ酸の欠失または付加；あるいは天然タンパク質の一つもしくは複数の部位での一つもしくは複数のアミノ酸のアミノ酸の置換、によって天然タンパク質から得られたタンパク質がある。本発明に包含される変異体タンパク質は、生物学的に活性であり、すなわち天然タンパク質の所望の生物学的活性を保有し続ける、すなわち病害抵抗性を調整しまたは病原体誘導因子タンパク質との相互作用を行う。そのような変異体は、例えば遺伝的多型またはヒトによる操作に起因しうる。本発明の天然Rタンパク質の生物学的に活性な変異体は、デフォルトのパラメーターを使用して、本明細書の他の箇所に記載した配列アラインメントプログラムによって決定されるように、天然タンパク質に関するアミノ酸配列と、少なくとも40%、50%、60%、70%、一般的に少なくとも75%、80%、85%、好ましくは約90%から95%以上、さらに好ましくは約98%以上の配列類似性を有するであろう。本発明のタンパク質の生物学的に活性な変異体は、わずか1〜15個のアミノ酸残基、6〜10個のようにわずか1〜10個、わずか5個、わずか4、3、2個または1個のアミノ酸残基であっても、そのタンパク質と異なる可能性がある。
【０１５１】
本発明のタンパク質は、アミノ酸の置換、欠失、短縮および挿入を含めた様々な方法で変更されうる。そのような操作のための方法は当技術分野で一般的に公知である。例えば、Rタンパク質のアミノ酸配列変異体を、DNAにおける突然変異により調製できる。突然変異誘発およびヌクレオチド配列変更のための方法は、当技術分野において周知である。例えば、Kunkel (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492), Kunkel et al. (1987, Methods in Enzymol. 154:367-382), U.S. Pat. No. 4,873, 192, Watson, J. D. et al. ("Molecular Biology of the Gene", Fourth Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987)、およびそこに引用された参考文献を参照されたい。対象となるタンパク質の生物学的活性に影響しない適切なアミノ酸置換に関する手引きを、Dayhoff et al. （1978） Atlas of Protein Sequence and Structure（Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.）のモデルに見出すことができる。点突然変異または短縮によって作製されたコンビナトリアルライブラリーからの遺伝子産物のスクリーニング、および選択された性質を有する遺伝子産物についてcDNAライブラリーをスクリーニングするための方法は、当技術分野で公知である。そのような方法は、Rポリペプチドのコンビナトリアル突然変異誘発によって発生した遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用可能である。ライブラリー中の機能的突然変異体の頻度を増大する新しい手法である帰納的統計集団突然変異誘発（recursive ensemble mutagenesis）（REM）を、スクリーニングアッセイと組み合わせて使用して、Rポリペプチド変異体を同定できる（Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6:327-331）。一つのアミノ酸を、同様の性質を有する別のアミノ酸に交換するような保存的置換は、以下にさらに詳細に論じるように望ましい可能性がある。
【０１５２】
変異体ポリペプチドは、本発明のRポリペプチドのアミノ酸配列に比べて、それらの配列に沿った様々な配置で保存的アミノ酸置換を含有しうる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基と置換されたものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野で規定されており、それを一般的に以下のようなサブクラスに分けることができる。
【０１５３】
酸性残基：本残基は、生理学的pHでのHイオンの喪失が原因で負荷電を有し、その残基を含有するペプチドが生理学的pHで水性媒質中に存在する場合に、そのペプチドのコンホメーションにおける表面の位置を探索するように、その残基は水溶液によって引きつけられる。酸性側鎖を有するアミノ酸には、グルタミン酸およびアスパラギン酸がある。
【０１５４】
塩基性残基：本残基は、生理学的pHまたはそれから1または2pH単位以内でHイオンの会合が原因で正荷電を有し（例えばヒスチジン）、その残基を含有するペプチドが生理学的pHで水性媒質中に存在する場合に、そのペプチドのコンホメーションにおける表面の位置を探索するように、その残基は水溶液によって引きつけられる。塩基性側鎖を有するアミノ酸には、アルギニン、リジンおよびヒスチジンがある。
【０１５５】
荷電残基：本残基は、生理学的pHで荷電しており、よって本残基には、酸性または塩基性側鎖を有するアミノ酸（すなわちグルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リジンおよびヒスチジン）がある。
【０１５６】
疎水性残基：本残基は、生理学的pHで荷電しておらず、その残基を含有するペプチドが水性媒質中に存在する場合に、そのペプチドのコンホメーションにおける内部の位置を探索するように、その残基は水溶液によって反発される。疎水性側鎖を有するアミノ酸には、チロシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニンおよびトリプトファンがある。
【０１５７】
中性/極性残基：本残基は、生理学的pHで荷電していないが、その残基を含有するペプチドが水性媒質中に存在する場合に、そのペプチドのコンホメーションにおける内部の位置を探索するに足るほどには、水溶液によって反発されない。中性/極性側鎖を有するアミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、システイン、ヒスチジン、セリンおよびトレオニンがある。
【０１５８】
この説明は、「小型」のような一定のアミノ酸も特徴づけをする。それは、たとえ極性基を欠いていても「小型」アミノ酸の側鎖は、疎水性を付与するに足る大きさではないからである。プロリンを例外として、「小型」アミノ酸は、少なくとも一つの極性基が側鎖上に存在する場合は四つ以下の炭素を、存在しない場合は三つ以下の炭素を有するアミノ酸である。小型側鎖を有するアミノ酸には、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンがある。遺伝子にコードされる第二アミノ酸であるプロリンは、ペプチド鎖の二次コンホメーションに及ぼす作用が知られていることから、特殊である。プロリンの構造は、その側鎖がα-アミノ基の窒素ならびにα-炭素に結合している点で他の全ての天然アミノ酸と異なる。しかし、数個のアミノ酸類似性マトリックス（例えばDayhoff et al. （1978） A model of evolutionary change in proteins. Matrices for determining distance relationships In M.O. Dayhoff, (ed.), Atlas of protein sequence and structure, Vol. 5, pp. 345-358, National Biomedical Research Foundation, Washington DCおよびGonnet et al., 1992, Science 256 (5062): 144301445によって開示されたようなPAM120マトリックスおよびPAM250マトリックス）は、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンと同じ群にプロリンを含む。したがって、本発明の目的のためにプロリンを「小型アミノ酸」に分類する。
【０１５９】
極性または非極性としての分類に必要な引力または反発力の程度は任意であり、よって本発明によって特異的に考えられるアミノ酸を、それらの一方または他方として分類している。特定に挙げられていない大部分のアミノ酸を公知の挙動に基づいて分類できる。
【０１６０】
アミノ酸残基を、残基の側鎖置換基に関する自明の分類である、環状または非環状、および芳香族または非芳香族として、ならびに小型または大型として、さらにサブクラスに分けることができる。追加の極性置換基が存在するならばカルボニル炭素を含めて合計四つ以下の炭素原子；存在しないならば三つ以下の炭素原子を含有する場合に、その残基を小型とみなす。もちろん小型残基は、常に非芳香族である。それらの構造の性質に応じて、アミノ酸残基は二つ以上のクラスに分かれる。天然タンパク質のアミノ酸について、このスキームに従うサブクラス分類を表Cに示す。
【０１６１】
（表Ｃ）アミノ酸のサブクラス分類
2007506414.tif 000007
【０１６２】
したがって本発明は、天然Rポリペプチド配列もしくは親Rポリペプチド配列またはそれらの生物学的に活性なフラグメントの変異体も考慮しており、変異体は、一つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、または置換によって親配列と区別される。一般的に変異体は、例えば配列番号：2または4に記載のような親Rポリペプチド配列と少なくとも約30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%の類似性を示す。望ましくは変異体は、配列番号：2または4に記載のような親Rポリペプチド配列と少なくとも30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%の配列同一性を有するであろう。さらに、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、500以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換が天然配列または親配列と異なるが、病害抵抗性付与または病原体誘導因子結合の性質を保持する配列が考慮される。本発明のポリペプチドは、本明細書に定義されるような厳密性の条件下、特に高厳密性の条件下で、本発明のポリヌクレオチド配列または上記のようなその非コードストランドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む。
【０１６３】
一態様では、変異体ポリペプチドは、少なくとも1個の、しかし50、40、30、20、15、10、8、6、5、4、3、2または1個未満のアミノ酸残基が開示された配列と異なる。別の態様では、変異体ポリペプチドは、少なくとも1%の、しかし20%、15%、10%または5%未満の残基が、配列番号：2または4における対応する配列と異なる。（この比較がアラインメントを必要とするならば、最大の類似性のためにこれらの配列を整列すべきである。欠失もしくは挿入、またはミスマッチから「ループ」アウトされた配列が、差異であると考えられる。）その差異は、適切には可欠残基または保存的置換での差異または交換である。
【０１６４】
「可欠」アミノ酸残基は、一つまたは複数の活性（例えば、病害抵抗性または病原体誘導因子結合の性質）を破壊または実質的に変更することなしにRポリペプチドの野生型配列から変更できる残基である。適切には、変更は、これらの活性のうちの一つを大幅に変更せず、例えば活性が野生型の少なくとも20%、40%、60%、70%または80%である。「不可欠」アミノ酸残基は、本発明のRポリペプチドの野生型配列から変更した場合に、病害抵抗性または病原体誘導因子結合の性質の破壊をもたらす結果、野生型活性の20%未満が存在する残基である。例えば、図2に示したRポリペプチド間で保存されたアミノ酸残基は変更に従わないおそれがある。
【０１６５】
望ましい変異体Rポリペプチドは、保存されたアミノ酸置換を有するものである。保存性置換の例には以下がある：酸性アミノ酸としてアスパラギン酸-グルタミン酸；塩基性アミノ酸としてリジン/アルギニン/ヒスチジン；小型アミノ酸としてセリン/グリシン/アラニン/トレオニン；疎水性アミノ酸としてロイシン/イソロイシン、メチオニン/バリン、アラニン/バリン。保存的アミノ酸置換には側鎖に基づく群分けも含まれる。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；脂肪族ヒドロキシ側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびトレオニン；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミン；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジン；ならびに硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。例えば、ロイシンからイソロイシンまたはバリン、アスパラギン酸からグルタミン酸、トレオニンからセリン、またはアミノ酸から構造的に関連したアミノ酸への同様の置換は、結果として生じる変異体ポリペプチドの性質に大きな作用を有さないであろう。アミノ酸交換の結果として、機能的Rポリペプチドがもたらされるかどうかを、その病害抵抗性付与活性または病原体誘導因子結合活性をアッセイすることによって容易に決定できる。下の表Dの例示的な置換の項目名の下に保存的置換を示す。より好ましい置換を好ましい置換の項目名の下に示す。本発明の範囲内に入るアミノ酸置換は、一般に（a）置換領域中のペプチド主鎖の構造、（b）標的部位での分子の荷電もしくは疎水性、または（c）側鎖の嵩、を維持することに及ぼす作用が著しく異ならない置換を選択することによって成し遂げられる。
【０１６６】
（表Ｄ）例示的なアミノ酸置換と好ましいアミノ酸置換
2007506414.tif 000008
【０１６７】
または、保存的置換を作製するために同様なアミノ酸を、側鎖の同一性に基づき三つのカテゴリーに群分けできる。Zubay, G., Biochemistry, third edition, Wm. C. Brown Publishers (1993) に記載されてるように、第一群には、全て荷電側鎖を有するグルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジンを含み；第二群にはグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、グルタミン、アスパラギンを含み；第三群にはロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンがある。
【０１６８】
このように、Rポリペプチド中の予測される可欠アミノ酸残基は、同一側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基と典型的には置換される。または、飽和突然変異誘発によるようにR遺伝子コード配列の全てまたは一部に沿って突然変異をランダムに導入でき、結果としてもたらされた突然変異体を、病害抵抗性付与活性または病原体誘導因子結合活性についてスクリーニングして、活性を保持する突然変異体を同定できる。コード配列の突然変異誘発の後に、コードされるペプチドを組換え発現させることができ、そのペプチドの活性を決定できる。
【０１６９】
他の態様では、変異体Rポリペプチドは、配列番号：2または4の対応する配列と少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、病害抵抗性付与活性または病原体誘導因子結合活性を有する。
【０１７０】
本発明のRポリペプチドは、例えば図2に示すように相互に共通するかなりの数の構造特性を含有する。本発明のタンパク質および核酸分子を指す場合に、用語「ファミリー」は、本明細書に定義するように共通の構造ドメインまたはモチーフを有し、かつ十分なアミノ酸またはヌクレオチド配列の相同性を有する二つ以上のタンパク質または核酸分子を意味する。そのようなファミリーのメンバーは天然または非天然であることができ、同種または異なる種のいずれか由来でありうる。ファミリーのメンバーは共通の機能的特性も有しうる。
【０１７１】
5.  抗Rポリペプチド抗原結合分子
本発明は、本発明のRポリペプチドと特異的に免疫相互作用性である抗原結合分子も提供する。一態様では、抗原結合分子は、ポリクローナル抗体全体を含む。例えば本発明のポリペプチド、部分または変異体を、マウスまたはウサギを含みうる産生種に注射してポリクローナル抗血清を得ることによって、そのような抗体を調製できる。ポリクローナル抗体を産生させる方法は、当業者に周知である。使用できる例示的なプロトコルが、例えばColiganら、CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,（John Wiley & Sons, Inc, 1991）およびAusubelら（1994-1998、上記）、特に11章のIII節に記載されている。
【０１７２】
産生種から得られたポリクローナル抗血清の代わりに、本発明の一つまたは複数のポリペプチド、フラグメント、変異体または誘導体を接種された産生種から得られた不死化脾臓細胞または他の抗体産生細胞によって、例えばKohlerおよびMilstein（1975, Nature 256, 495-497）によって記載されたような標準的な方法を使用して、または例えばColiganら（1991上記）に記載されたようなその方法のさらに最近の改変によって、モノクローナル抗体を産生できる。
【０１７３】
本発明は、抗原結合分子として、Fv、Fab、Fab'およびF(ab')2免疫グロブリンフラグメントも考慮している。または抗原結合分子は、合成の安定化Fvフラグメントを含むことができる。この種の例示的なフラグメントには、ペプチドリンカーを使用してVHドメインのN末端またはC末端をそれぞれVLドメインのC末端またはN末端と架橋する一本鎖Fvフラグメント（sFv、scFvと称されることも多い）を含む。ScFvは、抗体全体の全ての定常部を欠き、補体を活性化できない。例えば、Kreberら（Kreber et al. 1997, J. Immunol. Methods; 201 (1):35-55）に概略を述べた方法に従ってScFvを調製できる。または、米国特許第5,091,513号、欧州特許第239400号またはWinterおよびMilstein（1991, Nature 349:293）ならびにPluckthunら（1996, In Antibody engineering: A practical approach. 203-252）による論文に記載された方法によってそれらを調製できる。別の態様では、合成の安定化Fvフラグメントは、システイン残基をVHおよびVLドメインに導入する結果、完全にフォールディングしたFv分子においてその二つの残基がその間にジスルフィド結合を形成するであろうジスルフィド安定化Fv（dsFv）を含む。dsFvの産生に適した方法が、例えば（Glockscuther et al. Biocliem. 29:1363-1367; Reiter etal. 1994, J. Biol. Chem. 269:18327-18331; Reiter et al. 1994, Biochein. 33:5451-5459; Reiter et al. 1994. Cancer Res. 54:2714-2718; Webber et al. 1995, Mol. Immunol. 32:249-258）に記載されている。
【０１７４】
Rポリペプチド抗原結合分子を発生するためのファージディスプレイおよびコンビナトリアル法が当技術分野で公知である（例えば、Ladner et al. U. S. Patent No. 5,223,409; Kang et al. International Publication No. WO 92/18619; Dower et al. International Publication No. WO 91/17271; Winter et al. International Publication WO 92/20791; Markland et al. International Publication No. WO 92/15679; Breitling et al. International Publication WO 93/01288; McCafferty et al. International Publication No. WO 92/01047; Garrard et al. International Publication No. WO 92/09690; Ladner et al. International Publication No. WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281;Griffths et al. (1993)EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; and Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982に記載のとおりである）。抗原結合分子を使用して、変異体Rポリペプチドについて発現ライブラリーをスクリーニングできる。それらを使用して、本発明のRポリペプチドを検出および/または単離もできる。このように本発明は、例えばイムノクロマトグラフィーおよび免疫沈降法を含むがそれに限定されるわけではない任意の適切な免疫親和性に基づく方法を使用して、Rポリペプチドを単離するための抗原結合分子の使用も考えている。適切な方法は、抗Rポリペプチド抗原結合分子を適切な樹脂に付着させ、その樹脂と、Rポリペプチドを含有する疑いのある試料とを接触させ、その後もしも存在するならば、Rポリペプチドをその樹脂から溶出させる固相吸着を利用する。実例的な樹脂には、Sepharose（登録商標）（Pharmacia）、Poros（登録商標）樹脂（Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis）、Actigel Superflow（商標）樹脂（Sterogene Bioseparations Inc., Carlsbad Calif.）、およびDynabeads（商標）（Dynal Inc., Lake Success, N.Y.）がある。
【０１７５】
抗原結合分子を、化合物、例えば放射性核種のような標識、またはイメージング剤、例えば放射性、酵素性、または他の例えばイメージング剤、例えばNMRコントラスト剤にカップリングできる。検出可能な放射性放射または蛍光を生じる標識が好ましい。タンパク質の発現の存在度およびパターンを評価するために、抗Rポリペプチド抗原結合分子（例えばモノクローナル抗体）を使用してRポリペプチド（例えば細胞溶解液または細胞上清中）を検出できる。抗Rポリペプチド抗原結合分子を診断的に使用して、作物学的試験法の一部として組織中のRポリペプチドレベルを監視できる。その抗体を検出可能な物質にカップリング（すなわち物理的連鎖）することによって検出を容易にできる（すなわち抗体標識）。検出可能な物質の例には、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質がある。適切な酵素の例には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼがあり；適切な補欠分子団の複合体の例には、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンがあり；適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ロダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンがあり；発光物質の例にはルミノールがあり；生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンがあり、適切な放射性物質の例には、125I、131I、35Sまたは3Hがある。発色化合物、触媒、酵素、蛍光体、化学発光分子、ユウロピウム（Eu34）のようなランタニドイオン、放射性同位体および直接視覚標識を含めた群から標識を選択できる。直接視覚標識の場合、コロイド状金属もしくは非金属粒子、色素粒子、酵素もしくは基質、有機ポリマー、ラテックス粒子、リポソーム、またはシグナル産生物質を含有する他の小胞などを使用できる。
【０１７６】
標識として有用な多数の酵素が米国特許明細書US4366241、US4843000、およびUS4849338に開示されている。本発明に有用な酵素標識には、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼなどがある。その酵素標識を単独または溶液中の第二酵素と組み合わせて使用できる。
【０１７７】
6.  核酸構築体
6.1  原核細胞での発現
本発明はさらに、調節配列に作動可能に連鎖した本発明に記載のポリヌクレオチド、部分または変異体を含む、原核細胞を遺伝子形質転換するために設計された核酸構築体に関するものであり、その調節配列は、典型的には転写制御エレメントまたはプロモーターを含むであろう。適切にはキメラ構築体は、グラム陰性原核細胞において作動可能である。キメラ核酸構築体を構築するための基礎として使用できる多様な原核細胞発現ベクターを、本発明に記載のポリヌクレオチド、部分または変異体を発現させるために利用できる。これらには、染色体ベクター（例えばバクテリオファージλのようなバクテリオファージ）、染色体外ベクター（例えばプラスミドまたはコスミド発現ベクター）があるが、それに限定されるわけではない。発現ベクターは、典型的にはベクターの自律性の複製を可能にする複製起点および形質転換細胞の表現型の選択を可能にする一つまたは複数の遺伝子も含有するであろう。構成性プロモーター配列および誘導性プロモーター配列を含めた多数の適切なプロモーター配列のうち任意のものを発現ベクターに使用できる（例えば、Bitter, et al., 1987, Methods in Enzymology 153:516-544参照）。例えばバクテリオファージγのpL、plac、ptrp、ptac ptrp-lacハイブリッドプロモーターなどのような誘導性プロモーターを使用できる。次に、核酸構築体を使用して所望の原核宿主細胞を形質転換して、例えば組換えRポリペプチドを産生するために組換え原核宿主細胞を産生できる。
【０１７８】
6.2  真核細胞での発現
本発明は、真核宿主細胞に本発明のポリヌクレオチド、部分または変異体を発現させるために設計された核酸構築体も考慮している。これに関して多様な真核宿主発現ベクター系を利用できる。これらには、組換え酵母発現ベクターを用いて形質転換された酵母；組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；もしくは組換えウイルス発現ベクター（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）に感染した動物細胞系、または安定発現用に加工された形質転換動物細胞系があるが、それに限定されるわけではない。ある有利な態様では、以下に記載するような植物の遺伝子形質転換のためにキメラ核酸構築体が設計される。
【０１７９】
6.3  植物での発現
本発明によれば、本発明のR遺伝子ポリヌクレオチド、部分および変異体は、菌類病原体、ウイルス、線虫、昆虫などによって引き起こされる病害を含めた病原性の病害に抵抗性である作物植物の構築を容易にするために有用であろうことが提起される。したがって本発明は、本明細書に記載されたようなポリヌクレオチド、部分または変異体を、植物において機能する調節配列（例えばプロモーターおよび3'非翻訳領域）と作動可能に連鎖して、植物の遺伝子形質転換のために設計された核酸構築体を生み出すことにも関するものである。
【０１８０】
6.3.1  植物プロモーター
植物細胞において活性である無数のプロモーターが文献で記載されているが、その実例的な例には、ノパリンシンターゼ（NOS）プロモーター、オクトピンシンターゼ（OCS）プロモーター（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の腫瘍誘導プラスミドに保有されている）、カリフラワーモザイクウイル（CaMV）19SプロモーターおよびCaMV 35Sプロモーターのようなカリモウイルスプロオーター、ゴマノハグサモザイクウイルス（figwort mosaic virus）35Sプロモーター、リブロース-1,5-ビス-リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ssRUBISCO）由来光誘導性プロモーター、Adhプロモーター、スクロースシンターゼプロモーター、R遺伝子複合体プロモーター、GST-II-27遺伝子プロモーターおよびクロロフィルa/b結合タンパク質遺伝子プロモーターなどがある。
【０１８１】
葉、種子、根または茎のような植物の供給源組織での発現のために、標的遺伝子の発現を指令するプロモーターがこれらの特定の組織において相対的に高い発現を有することが望ましい。この目的のために、組織もしくは細胞特異的発現または増大した発現を有する遺伝子に対する多数のプロモーターから選択できる。文献に報告されているそのようなプロモーターの例には、エンドウ由来葉緑体グルタミンシンセターゼGS2プロモーター、コムギ由来葉緑体フルクトース-1,6-ビホスファターゼ（FBPase）プロモーター、ジャガイモ由来核光合成ST-LS1プロモーター、シロイヌナ（Arabidopsis thaliana）由来セリン/トレオニンキナーゼ（PAL）プロモーターおよびグルコアミラーゼ（CHS）プロモーターを含む。アメリカカラマツ（Larix laricina）由来リブロース-1,5-ビスホスフェートカルボキシラーゼ（RbcS）プロモーター、マツ由来cab遺伝子であるcab6に対するプロモーター、コムギ由来Cab-1遺伝子に対するプロモーター、ホウレンソウ由来CAB-1遺伝子に対するプロモーター、イネ由来cab1R遺伝子に対するプロモーター、コーン由来ピルビン酸オルトホスフェートジキナーゼ（PPDK）プロモーター、タバコLhcb1*2遺伝子に対するプロモーター、シロイヌナSUC2スクロース-H+共輸送体およびホウレンソウ由来チラコイド膜タンパク質（psaD、psaF、psaE、PC、FNR、atpC、atpD、cab、rbcS）に対するプロモーターも、光合成活性組織中で活性であることが報告されている。シロガラシ由来LhcB遺伝子およびPsbP遺伝子に対するプロモーターのようなクロロフィルa/b結合タンパク質に対する他のプロモーターも本発明に利用できる。
【０１８２】
ジャガイモ植物の塊茎、トマトの果実、またはコーン、コムギ、イネおよびオオムギの種子のような、植物のシンク組織での発現のために、標的遺伝子の発現を指令するプロモーターは、これらの特異的組織中で相対的に高い発現を有することが望ましい。クラスIパタチンプロモーター、ジャガイモ塊茎ADPGPP遺伝子の大サブユニットと小サブユニット両方に対するプロモーター、スクロースシンターゼプロモーター、22kdタンパク質複合体およびプロテアーゼ阻害剤を含む主要塊茎タンパク質に対するプロモーター、デンプン粒結合型スターチシンターゼ遺伝子（GBSS）に対するプロモーター、ならびに他のクラスIおよびIIパタチンのプロモーターを含めた塊茎特異的発現または塊茎で増大した発現を有する遺伝子に対する多数のプロモーターが公知である。
【０１８３】
種子または果実のような特定の組織に標的遺伝子を発現させるために他のプロモーターも使用できる。そのようなプロモーターの例には、ナピン（napin）、ファセオリン、ダイズトリプシン阻害剤、ACP、ステアロイル-ACPデサチュラーゼ、ダイズβ-コングリシニンα'サブユニット（soy 7s）、およびオレオシンのような遺伝子由来の5'調節配列がある。さらなる例には、β-コングリシニンに対するプロモーターがある。コーン胚乳(endosperm)にみられる一群の貯蔵タンパク質であるゼインも含まれる。ゼイン遺伝子のゲノムクローンが単離され、15kD、16kD、19kD、22kD、27kDおよび遺伝子類を含めたこれらのクローンからのプロモーターも使用できるであろう。例えばコーンにおいて機能することが公知である他のプロモーターには、例えば以下の遺伝子のプロモーターが含まれる：waxy、Brittle、Shrunken 2、ブランチングエンザイムIおよびII、スターチシンターゼ、デブランチングエンザイム、オレオシン（oleosin）、グルテリンおよびスクロースシンターゼ。コムギでの発現に適したプロモーターの例には、ADPグルコースピロシンターゼ（ADPGPP）サブユニット、デンプン粒結合型および他のスターチシンターゼ、ブランチングおよびデブランチングエンザイム、エンブリオゲネシスアバンダントタンパク質（embryogenesis-abundant protein）、グリアジンおよびグルテニンに対するプロモーターがある。イネでのそのようなプロモーターの例には、ADPGPPサブユニット、デンプン粒結合型および他のスターチシンターゼ、ブランチングエンザイム、デブランチングエンザイム、スクロースシンターゼおよびグルテリンに対するプロモーターがある。オオムギについてのそのようなプロモーターの例には、ADPGPPサブユニット、デンプン粒結合型および他のスターチシンターゼ、ブランチングエンザイム、デブランチングエンザイム、スクロースシンターゼ、ホルデイン、胚グロブリンおよびアリューロン特異的タンパク質に対するものがある。
【０１８４】
根特異的プロモーターも使用できる。そのようなプロモーターの例は、酸性キチナーゼ遺伝子に対するプロモーターである。同定されたCaMV35Sプロモーターの根特異的サブドメインを使用して根組織での発現を成し遂げることもできるであろう。
【０１８５】
培養細胞での発現に望ましいプロモーターは、強力な構成性プロモーターまたは特異的インデューサに応答するプロモーターである（Gatz and Lenk, 1998, Trends Plant Science 3:352-8）。ある態様では、本発明のRポリヌクレオチドを発現する核酸構築体を、感受性であるバナナ植物に導入する。無傷バナナ植物での発現のための例示的な構成性プロモーターは、国際公開公報第02/053744号および同時係属のPCT出願第PCT/AU03/00919号に記載されている。
【０１８６】
6.3.2  3'非翻訳領域
本発明の構築体は、3'非翻訳配列を含むことができる。3'非翻訳配列は、ポリアデニル化シグナルおよびmRNAのプロセシングまたは遺伝子発現に作用可能な他の任意の調節シグナルを含有するDNAセグメントを含む遺伝子部分を指す。ポリアデニル化シグナルは、mRNA前駆体の3'末端にポリアデニル酸トラクトを付加する作用が特徴的である。ポリアデニル化シグナルは、基準形式の5'AATAAA-3'との同一性によって通常は見分けられているが、変異することはまれではない。
【０１８７】
3'非翻訳調節DNA配列は、好ましくは約50から1000個のヌクレオチド塩基対を含み、ポリアデニル化シグナルおよびmRNAのプロセシングまたは遺伝子発現に作用可能な他の任意の調節シグナルに追加して植物転写翻訳終止配列を含有しうる。適切な3'非翻訳配列の例は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリンシンターゼ（nos）遺伝子からのポリアデニル化シグナルを含有する3'転写非翻訳配列領域（Bevan et al., 1983, Nucl. Acid Res., 11:369）およびアグロバクテリウム・ツメファシエンスのオクトピンシンターゼ遺伝子からのT7転写体に対するターミネーターである。または、適切な3'非翻訳配列は、ジャガイモまたはトマト由来プロテアーゼ阻害剤IまたはII遺伝子、ダイズ貯蔵タンパク質遺伝子およびエンドウリブロース-1,5-ビスリン酸カルボキシラーゼのE9小サブユニット（ssRUBISCO）遺伝子の3'末端のような植物遺伝子から得ることができるが、当業者に公知の他の3'エレメントも使用できる。または、3'非翻訳調節配列を、例えばAn（1987, Methods in Enzymology, 153:292）によって記載されたようにデノボ（de novo）で得ることができる。
【０１８８】
6.3.3  任意の配列
本発明の核酸構築体は、必要に応じさらに翻訳エンハンサーまたは転写エンハンサーのいずれかであるエンハンサーを含みうる。これらのエンハンサー領域は当業者に周知であり、ATG開始コドンおよび隣接配列を含みうる。開始コドンは、外来または内因性DNA配列に関係するコード配列のリーディングフレームと同調して配列全体の翻訳を確実にしなければならない。翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の多様な起源でありうる。翻訳開始領域は、転写開始領域の供給源から、または外来もしくは内因性DNA配列から提供されうる。その配列を、転写を指令するために選択されたプロモーターの供給源から得ることもでき、mRNAの翻訳を増やすように特異的に改変できる。
【０１８９】
転写エンハンサーの例には、例えばLastら（米国特許第5,290,924号）が記載したようなCaMV 35Sプロモーターおよびオクトピンシンターゼ遺伝子からのエレメントがあるが、それに限定されるわけではない。植物形質転換に関連して適用した場合に、ocsエレメントのようなエンハンサーエレメント、詳細にはそのエレメントの多数のコピーの使用は、隣接プロモーターからの転写レベルを増やすように作用するであろうと提案されている。または、タバコモザイクウイルスのコートタンパク質遺伝子から得られたオメガ配列（Gallie et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15(8):3257-73）を使用して、本発明に記載のポリヌクレオチドから転写されたmRNAの翻訳を増大させることができる。
【０１９０】
転写開始部位とコード配列の始まりとの間に挿入されたDNA配列、すなわち非翻訳リーダー配列は遺伝子発現に影響できることから、特定のリーダー配列を使用することもできる。好ましいリーダー配列には、Rポリペプチド遺伝子の最適な発現を指令するように選択された配列を含むものがある。例えばそのようなリーダー配列には、例えばJoshi（1987, Nucl. Acid Res., 15:6643）が記載したようにmRNAの安定性を増加または維持でき、不適切な翻訳の開始を防止できる好ましいコンセンサス配列を含む。しかし、他のリーダー配列、例えばRTBVのリーダー配列は、mRNAの安定性を減らし、および/またはmRNAの翻訳を減らすと予想される高度の二次構造を有する。このように、（i）高度の二次構造を有さないか、（ii）mRNAの安定性を阻害せず、および/もしくは翻訳を減らさない高度の二次構造を有するか、または（iii）植物に高度に発現される遺伝子から得られる、リーダー配列が最も好ましい。
【０１９１】
所望であれば、例えばVasilら（1989, Plant Physiol., 91:5175）によって記載されたようなスクロースシンターゼイントロン、例えばCallisら（1987, Genes Develop., II）によって記載されたようなAdhイントロンI、または例えばGallieら（1989, The Plant Cell, 1:301）によって記載されたようなTMVオメガエレメントのような調節エレメントも含めることができる。本発明の実施に有用な他のそのような調節エレメントは、当業者に公知である。
【０１９２】
加えて、標的化配列を使用して、Rポリペプチドを植物細胞内の細胞内区画または細胞外環境に標的づけることができる。例えばトランジットペプチドまたはシグナルペプチド配列をコードするDNA配列を、Rポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分をコードする配列と作動可能に連鎖させる結果、翻訳した場合にそのトランジットペプチドまたはシグナルペプチドは、そのRポリペプチドまたは部分を特定の細胞内または細胞外目標に輸送でき、次に翻訳後に除去されることができる。トランジットペプチドまたはシグナルペプチドは、細胞内の膜、例えば小胞体、液胞、小胞、プラスチド、ミトコンドリアおよび原形質膜を介してタンパク質の輸送を容易にすることによって作用する。例えば標的化配列は、所望のタンパク質を、サイトゾルよりもむしろ液胞またはプラスチド（例えばクロロプラスト）のような特定のオルガネラに向けることができる。このようにその核酸構築体は、本発明に記載のプロモーター領域またはプロモーター変異体と外来または内因性DNA配列との間で作動可能に連鎖したDNA配列をコードするプラスチドトランジットペプチドをさらに含みうる。例えば、Heijneら（1989, Eur.J. Biochem., 180: 535）およびKeegstraら（1989, Ann. Rev. Plant Physio.Plant Mol. Biol., 40: 471）を参照のこと。
【０１９３】
核酸構築体は、典型的にはプラスミドのようなベクターに導入される。プラスミドベクターには、原核細胞および真核細胞における発現カセットの簡単な選択、増幅、および形質転換を提供する追加のDNA配列、例えばpUC由来ベクター、pSK由来ベクター、pGEM由来ベクター、pSP由来ベクター、またはpBS由来ベクターがある。追加のDNA配列には、ベクターの自律性の複製を提供する複製起点、好ましくは抗生物質または除草剤抵抗性をコードする選択マーカー遺伝子、核酸構築体にコードされるDNA配列または遺伝子を挿入するための多数の部位を提供する独特の多クローニング部位、および原核細胞および真核細胞の形質転換を増大させる配列を含む。
【０１９４】
そのベクターは、望ましくは宿主細胞ゲノムへのベクターの安定な統合または細胞のゲノムとは独立して細胞におけるそのベクターの自律複製のいずれかを許容するエレメントを含有する。そのベクターは、宿主細胞に導入されると、その宿主細胞のゲノムに統合されうる。統合のためにそのベクターは、その中に存在する外来もしくは内因性DNA配列、または相同組換えによるゲノムへのベクターの安定統合のためにそのベクターの他の任意のエレメントに依存することができる。またはそのベクターは、宿主細胞のゲノムへの相同組換えによる統合を指令するために追加の核酸配列を含有しうる。追加の核酸配列は、ベクターが染色体中の精密な配置で宿主細胞のゲノムに統合されるのを可能にする。精密な配置に統合される見込みを増やすために、統合用エレメントは、相同組換えの確立を増大させるために対応する標的配列と高度に相同である100から1500塩基対、好ましくは400から1500塩基対、および最も好ましくは800から1500塩基対のような十分な数の核酸を好ましくは含有するはずである。統合用エレメントは、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同である任意の配列でありうる。さらに統合用エレメントは、非コード核酸配列またはコード核酸配列でありうる。
【０１９５】
ベクターは、クローニングおよびサブクローニングのためにそのベクターを細菌細胞のような宿主細胞中で自律複製可能にする複製起点をさらに含みうる。細菌の複製起点の例は、大腸菌（E. coli）での複製を許容するプラスミドpBR322、pUC19、pACYC177、およびpACYC184、ならびにバチルス（Bacillus）での複製を許容するpUB110、pE194、pTA1060、およびpAMβ1の複製起点である。複製起点は、バチルス細胞でその機能を温度感受性にする突然変異を有するものでありうる（例えば、Ehrlich, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1433を参照）。
【０１９６】
6.3.4  マーカー遺伝子
形質転換体の同定を容易にするために、核酸構築体は望ましくは本発明に記載のポリヌクレオチド配列のような、またはそれに追加した選択マーカーまたはスクリーニングマーカー遺伝子を含む。マーカーの実際の選別は、それが選別された植物細胞と組み合わせて機能する（すなわち選択する）限り重大ではない。例えば米国特許第4,399,216号に記載されたような未連鎖の遺伝子の同時形質転換も植物形質転換では効率的な過程であることから、マーカー遺伝子および対象となるRポリヌクレオチド配列は連鎖している必要はない。
【０１９７】
用語、選択マーカーまたはスクリーニングマーカー遺伝子に、形質転換細胞について同定または選択する手段として分泌を検出できる「選択マーカー」をコードする遺伝子が含まれる。例には、抗体相互作用によって同定できる分泌抗原、または触媒活性によって検出できる分泌酵素をコードするマーカーがある、分泌タンパク質には、細胞壁に挿入またはトラップされるタンパク質（例えばエクステンシンまたはタバコPR-Sの発現ユニットにみられるようなリーダー配列を含むタンパク質）、例えばELISAによって検出可能な低分子量拡散タンパク質、および細胞外溶液（例えばα-アミラーゼ、β-ラクタマーゼ、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）から検出可能な低分子量活性酵素があるが、それらに限定されるわけではない。
【０１９８】
6.3.5  選択マーカー
細菌選択マーカーの例は、枯草菌（Bacillus subtilis）またはバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）由来dal遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、エリスロマイシン、クロラムフェニコールまたはテトラサイクリン抵抗性のような抗生物質抵抗性を付与するマーカーである。植物形質転換体の選択のための例示的な選択マーカーには、ヒグロマイシンB抵抗性をコードするhyg遺伝子；例えばPotrykusら（1985, Mol. Gen. Genet. 199:183）が記載したようにカナマイシン、パロモマイシン、G418などに対する抵抗性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（neo）遺伝子；例えばEP-A256223に記載されたようにグルタチオンから得られた枯草剤に対する抵抗性を付与するラット肝臓由来グルタチオン-S-トランスフェラーゼ遺伝子；例えばWO87/05327に記載されたようにホスフィノトリシンのようなグルタミンシンセターゼ阻害剤に対して過剰発現した際に抵抗性を付与するグルタミンシンセターゼ遺伝子；例えばEP-A275957に記載されたように選択薬剤ホスフィノトリシンに対する抵抗性を付与するストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）由来アセチルトランスフェラーゼ遺伝子；例えばHincheeら（1988, Biotech., 6:915）に記載されたようにN- ホスホノメチルグリシンに対する寛容性を付与する5-エノールシキマート-3-ホスファートシンターゼ（EPSPS）をコードする遺伝子；例えばWO91/02071に記載されたようにビアラホスに対する抵抗性を付与するbar遺伝子；ブロモキシニル（bromoxynil）に対する抵抗性を付与するクレブシェラ・オゼネ（Klebsiella ozaenae）からのbxnのようなニトリラーゼ（nitrilase）遺伝子（Stalker et al., 1988, Science, 242:419）；メトトレキサートに対する抵抗性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子（Thillet et al., 1988, J. Biol. Chem., 263:12500）；イミダゾリノン、スルホニル尿素または他のALS阻害化学物質に対する抵抗性を付与する突然変異アセト乳酸シンターゼ（ALS）遺伝子（EP-A-154204）；5-メチルトリプトファンに対する抵抗性を付与する突然変異アントラニル酸シンターゼ遺伝子；または枯草剤に抵抗性を付与するダラポンデハロゲナーゼ遺伝子があるが、それに限定されるわけではない。
【０１９９】
6.3.6  スクリーニングマーカー
好ましいスクリーニング可能マーカーには、様々な発色基質が公知であるβ-グルクロニダーゼ（GUS）酵素をコードするuidA遺伝子；発色基質が公知である酵素をコードするβ-ガラクトシダーゼ遺伝子；カルシウム感受性生物発光検出に使用できるエクオリン遺伝子（Prasher et al., 1985, Biochem. Biophys. Res. Comm., 126:1259）；緑色蛍光タンパク質遺伝子（Niedz et al., 1995 Plant Cell Reports, 14:403）；生物発光検出を可能にするルシフェラーゼ（luc）遺伝子（Ow et al., 1986, Science, 234:856）；様々な発色基質（例えばPADAC、発色セファロスポリン）が公知である酵素をコードするβ-ラクタマーゼ遺伝子（Sutcliffe, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737）；植物組織中のアントシアニン色素（赤色）の生成を調節する生成物をコードするR遺伝子座遺伝子（Dellaporta et al., 1988, in Chromosome Structure and Function, pp.263-282）；α-アミラーゼ遺伝子（Ikuta et al., 1990, Biotech., 8:241）；チロシンをドーパおよびドパキノンに酸化して、ドパキノンは今度は凝縮して容易に検出可能な化合物であるメラニンを形成可能な酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子（Katz et al., 1983,J. Gen. Microbiol., 129:2703）；または発色カテコールを変換できるカテコールジオキシゲナーゼをコードするxylE遺伝子（Zukowsky et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1101）があるが、それらに限定されるわけではない。
【０２００】
7.  植物細胞への核酸構築体の導入
本発明の配列を使用して任意の植物を形質転換またはトランスフェクトできる。このように、遺伝子改変された植物、植物細胞、植物組織、種子などを得ることができる。形質転換のプロトコルならびに植物にヌクレオチド配列を導入するためのプロトコルは、形質転換のために標的化された植物または植物細胞の種類、すなわち単子葉植物または双子葉植物であるかに応じて変動しうる。形質転換プロトコルをR遺伝子の機能を破壊するオリゴヌクレオチド配列のトランスフェクションまたは導入のために使用できることが認識されている。植物細胞にヌクレオチド配列を導入すること、およびその後の植物ゲノムへの挿入に適切な方法には、マイクロインジェクション（Crossway et al., 1986, Biotechniques 4:320-334）、エレクトロポレーション（Riggs et al., 1986, Proc. Natl. Acad Sci. USA 83:5602-5606）、アグロバクテリウム介在性形質転換（Townsend et al., 米国特許第5,563,055号；Zhao et al., 米国特許第5,981,840号）、直接遺伝子導入（Paszkowski et al., 1984, EMBO J. 3:2717-2722）、およびバリスティック粒子加速（例えば、Sanford et al., U. S. Pat. No. 4,945,050; Tomes et al., U. S. Pat. No. 5,879,918; Tomes et al., U. S. Pat. No. 5,886,244; Bidney et al., U. S. Pat. No. 5,932,782; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); and McCabe et al., (1988, Biotechnology 6:923-926) を参照。また、Weissinger et al. (1988 Ann. Rev. Genet. 22:421-477), Sanford et al., (1987, Particulate Science and Technology 5:27-37; onion), Christou et al., (1988, Plant Physiol. 87:671-674; soybean); Datta et al., (1990, Biotechnology 8:736-740; rice), Klein et al. (1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309, maize), Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984, Nature (London) 311:763-764; cereals), Bowen et al., (U. S. Pat. No. 5,736, 369; cereals), Bytebier et al., (1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5345-5349; Liliaceae), De Wet et al. (1985, in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, N.Y.), pp. 197-209; pollen), Kaeppler et al., (1990, Plant Cell Reports 9:415-418; 1992, Theor. Appl. Genet. 84:560-566; whisker-mediated transformation), D'Halluin et al. (1992, Plant Cell 4:1495-1505; electroporation); Li et al., (1993, Plant Cell Reports 12:250-255; rice), Christou and Ford (1995, Annals of Botany 75:407-413; rice) and Osjoda et al. (1996, Nature Biotechnology 14:745-750; maize via Agrobacterium tumefaciens) を参照。植物改良のための形質転換の実施実行はBirthによって提供されている（1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 48: 297-326）。
【０２０１】
ある態様では、本発明は、イネ科および非イネ科単子葉植物を含めた単子葉植物を形質転換することに関するものである。非イネ科単子葉植物の実例的な例には、バショウ科（Musaceae）（バショウ属およびエンセテ属（Ensete））、サトイモ、ショウガ、タマネギ、ニンニク、パイナップル、アナナス、ヤシ、ラン、ユリ、アヤメなどがあるが、それに限定されるわけではない。単子葉植物の形質転換のために現在公知である多様な方法がある。現在、単子葉植物の形質転換に好ましい方法は、移植片または懸濁細胞の微粒子銃および例えばShimamotoら（1989、上記）によって記載されたような直接DNA取り込みまたはエレクトロポレーションである。トランスジェニックトウモロコシ植物は、微粒子銃によってトウモロコシ懸濁培養の不定胚形成細胞にストレプトマイセス・ヒグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）のbar遺伝子を導入することによって得られた（Gordon-Kamm, 1990, Plant Cell, 2:603-618）。コムギおよびオオムギのような他の単子葉作物のアリュ−ロンプロトプラストへの遺伝物質の導入が報告されている（Lee, 1989, Plant Mol. Biol. 13:21-30）。不定胚形成懸濁培養の樹立のために、老化コンパクト不定胚形成カルスおよび結節状不定胚形成カルス組織のみを選択することによって、コムギ植物が不定胚形成懸濁培養から再生された（Vasil, 1990, Bio/Technol. 8:429-434）。これらの作物に対する形質転換系との組み合わせは、単子葉植物への本発明の適用を可能にする。これらの方法を双子葉植物の形質転換および再生のためにも適用できる。例えばBowerら（1996, Molecular Breeding 2:239-249）が記載したようにトランスジェニックサトウキビ植物が不定胚形成カルスから再生された。
【０２０２】
8.  分化したトランスジェニック植物の産生および特徴づけ
8.1  再生
形質転換された細胞を分化した植物に再生するために使用する方法は本発明に重要ではなく、標的植物に適した任意の方法を使用できる。通常は、形質転換過程の後に植物細胞を再生させて植物全体を得る。
【０２０３】
プロトプラストからの再生は、植物の種によって異なるが、一般的にはプロトプラストの懸濁液を最初に作製する。ある種では、次にプロトプラスト懸濁液から自然の胚としての成熟および発芽段階に胚形成を誘導できる。培地は、一般的には成長および再生に必要な様々なアミノ酸およびホルモンを含有するであろう。利用されるホルモンの例には、オーキシンおよびサイトキニンがある。特にコーンおよびアルファルファのような種については培地にグルタミン酸およびプロリンを添加すると有利な場合がある。効率的な再生は、培地、遺伝子型および培養の履歴に依存するであろう。これらの変数を制御するならば再生は再現可能である。再生は、植物のカルス、移植片、器官または部分からも生じる。例えば参照により本明細書に組み込まれているMethods in Enzymology, Vol. 118およびKleeら（1987, Annual Review of Plant Physiology, 38:467）に記載されているように、器官または植物の部分の再生に関連して形質転換を実施できる。Horschら（1985, Science, 227:1229、参照により本明細書に組み込まれている）の葉ディスク形質転換再生法を利用して、選択培地でディスクを培養すると、約2〜4週間後にシュートが形成する。発育したシュートをカルスから切り取り、適切な根誘導選択培地に移植する。根の出現後にできるだけ早期に、発根した小植物体を土に移植する。成熟に達するまでその小植物体を必要に応じて植え替えることができる。
【０２０４】
栄養繁殖した作物では、成熟トランスジェニック植物を挿木することによって、または組織培養法によって繁殖させて多数の同一の植物を産生させる。望ましい遺伝子導入生物（transgenote）の選択を行い、新しい変種が得られ、商業利用のためにそれを栄養繁殖される。
【０２０５】
種子繁殖した作物では、成熟トランスジェニック植物を自家交雑してホモ接合同系繁殖植物を産生できる。同系繁殖植物は、新しく導入された外来遺伝子を含有する種子を産生する。これらの種子を成長させて選択された表現型、例えば早期開花を生じるであろう植物を生み出すことができる。
【０２０６】
花、種子、葉、枝、果実などのような再生された植物から得られた部分は、これらの部分が記載のように形質転換された細胞を含むならば本発明に含まれる。再生された植物の子孫および変異体、ならびに突然変異体も、これらの部分が導入された核酸配列を含むならば本発明の範囲に含まれる。
【０２０７】
文献は、特定の植物の種類を再生するための多数の手法を記載し、さらに多くの手法が絶えず公知になりつつある。当業者は、詳細について文献を参照して、過度の実験なしに適切な手法を選択できる。
【０２０８】
8.2  特徴づけ
再生中の植物における本発明のRポリヌクレオチドの存在を確認するために、多様なアッセイを実施できる。そのようなアッセイには、例えばサザンブロットおよびノーザンブロットおよびPCRのような当業者に周知の「分子生物学的」アッセイがあり、本発明のポリヌクレオチドによって発現したRタンパク質を、例えば本明細書に記載されたような抗原結合分子を使用してアッセイできる。
【０２０９】
本発明を容易に理解し、効果を実現するために、以下の非限定的な実施例により特定の好ましい態様をこれから説明する。
【０２１０】
実施例
実施例1
M.アクミナタ（M. acuminata）由来R遺伝子の同定
CTABによる総DNAの精製
ゲノムDNAを、Stewart & Via (1993)のCTABプロトコルを使用して抽出した。簡潔には、葉組織を液体N2中で凍結し、乳鉢と乳棒で摩砕した。粉末となった組織をCTAB緩衝液（1%サルコシン、0.8M NaCl、0.022M EDTA（pH8.0）、0.22M Tris-HCl（pH7.8）、0.8%CTAB、0.14Mマンニトール）に65℃で再懸濁した。等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（24：1）を直ちに加え、上下逆にして混合し、たまに上下逆にしながら65℃で10分間インキュベートした。微量遠心機で14000rpmで5分間、試料を遠心分離して相を分離した。水層を集め、等量のイソプロパノールを加えた。DNAを巻き取り、70%エタノールで洗浄し、乾燥させてからRNアーゼAを含有するdH2O（1mg/mL）100μLに再懸濁した。
【０２１１】
総RNAの精製
総RNAの抽出をChangら（1933）の方法を使用して行った。組織を液体N2中で凍結し、乳鉢と乳棒で摩砕した。粉末となった組織を、予熱（65℃）した抽出緩衝液（2%CTAB、2%PVP、100mMトリスHCl（pH8）、25mM EDTA、2M NaCl、0.05%スペルミジン、2%ベータ-メルカプトエタノール）に加えた。クロロホルム：イソアミルアルコール（24：1）を加え、得られた懸濁液をボルテックスで撹拌し、試料を微量遠心機で最高速で5分間遠心分離した。水相を集め、等量のDEPC処理した4M LiClを加えた。RNAを4℃で一晩沈殿させてから、最高速で4℃で30分間遠心分離した。ペレットとなったRNAを10×SSTEに再懸濁し、クロロホルム：イソアミルアルコール（24：1）でもう一度抽出した。1/10容のDEPC処理2.5M NaOAc（pH6.0）および21/2容の100%エタノールを添加後に、RNAを-20℃で一晩再沈殿させた。試験管を20分間遠心分離し、得られたペレットを70%エタノールで洗浄し、DEPC処理dH2Oに再懸濁した。
【０２１２】
バナナR遺伝子の逆転写酵素PCR
植物種由来R遺伝子配列を整列させ、NBS領域の保存されたモチーフに対して縮退プライマーを設計した。縮退プライマーを用いて逆転写酵素を使用して総RNAから一本鎖cDNAを発生させてから、その後バナナR遺伝子のNBS領域を増幅させた。NBSドメインの5'領域を発生させるために、5'キャップ構造を除去後にmRNAの5'末端にRNAプライマーを連結させた。連結したmRNAを逆転写酵素を使用して逆転写し、一本鎖cDNAを発生させた。連結したRNAプライマーに相補性であるプライマーおよび公知のNBS配列に対する特異的プライマーを添加し、PCRを行って以下記載のパラメーターを使用してR遺伝子の5'領域を発生させた：最初の変性段階94℃2分間後に、94℃30秒間、55〜65℃30秒間、70℃3〜5分間を5サイクル、次に94℃30秒間、45〜60℃30秒間、72℃3〜5分間を25サイクル、続いて最終アニーリング段階72℃10分間。次に、N末端プライマーおよびC末端プライマーを、以下の条件のPCRを用いてゲノムDNAから完全R遺伝子配列を増幅させるために使用した：最初の変性段階94℃2分間後に、94℃30秒間、55℃30秒間、72℃1〜5分間を25サイクル、続いて最終アニーリング段階72℃10分間。全てのPCR生成物をクローニングおよび配列決定して同一性を実証した。二つのR遺伝子、すなわちRGA5と呼ばれるムサ・アクミナタ（カルカッタ4）から単離された一方およびRGA2と呼ばれるムサ・アクミナタsppマラセンシスからのもう一方についての完全長ヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号：1および3に示す。
【０２１３】
次に、RT-PCRを使用して、フザリウム・オクシスポルムfspクベンセ（FOC）に感受性または抵抗性であるM.アクミナタsppマラセンシス植物の間でR遺伝子の発現を比較した。図3に示した結果は、RGA2遺伝子（レーンC2参照）がFOC抵抗性植物で転写されるがFOC感受性植物では転写されないことを示す。これは、RGA2が感受性植物に病害抵抗性を付与する魅力的な候補でありうることを示唆している。本発明者らは、レース1に抵抗性であるがレース4に感受性であるキャベンディッシュを、相同プロモーター（例えばUbi）または天然RGA2プロモーターの制御下で、（i）RGA2のみで、（ii）RGA5で、および（iii）RGA2とRGA5との両方で、形質転換することを提案する。
【０２１４】
本明細書に引用される各特許、特許出願および公報の開示は、本明細書によりその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０２１５】
本明細書に引用される各特許、特許出願および公報の開示は、本明細書によりその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０２１６】
本明細書における任意の参照の引用を、そのような参照が「従来技術」として本出願に利用可能である承認として解釈してはならない。
【０２１７】
本明細書にわたり、目的は、任意の一つの態様または特性の特定の収集に本発明を限定することなく本発明の好ましい態様を説明することであった。したがって当業者は、本開示に照らして、本発明の範囲から逸脱することなく例示された特定の態様に多様な改変および変更を行うことができることを認識している。そのような全ての改変および変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内の含まれることを意図する。
【０２１８】
参考文献
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2007506414.tif 000010
2007506414.tif 000011
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2007506414.tif 000015
2007506414.tif 000016
【図面の簡単な説明】
【０２１９】
【図１】植物病害抵抗性タンパク質の主要8クラスの配置および構造の概略表示図である。
【図２】例えばDayhoffら (1978) タンパク質における進化的変化のモデル（A model of evolutionary change in proteins）に開示されたようなClustalW多重アラインメントおよびPAM250類似性マトリックスを使用した配列番号：2および4に記載のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。距離関係決定についてのマトリクス、M. O. Dayhoff（出版）、タンパク質配列および構造のアトラス（Atlas of protein sequence and structure）、第5巻、頁345〜358、National Biomedical Research Foundation, Washington DC; およびGonnetら、1992, Science 256 (5062): 144301445。
【図３】M.アクミナタssp.マラセンシスの抵抗性（R）または感受性（S）植物からのテンプレートRNAを使用した各バナナNBSクラスに特異的なプライマーを用いたRT-PCR後のアガロースゲル上の増幅生成物の泳動を示す写真である。総RNAを葉または根組織から抽出してDNAアーゼで処理した。C+レーン：予想された約480bpのアクチン1のcDNAフラグメント、C-レーン：逆転写酵素なし、AD：約100bpのイントロンを含む予想された約580bpのアクチン1のゲノムDNAフラグメント。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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