(57)【要約】  本発明は、試験微生物、指示薬、およびイオン化形態での金属を含んでなり、前記金属の原子価が少なくとも２であるとともに、前記金属の濃度が０．００１Ｍ〜１Ｍである試験培地を提供する。さらに、金属塩が前記試験培地および／または前記流体サンプルに添加されることを特徴とする抗生物質の存在を判定するための方法が提供される。最後に、流体における抗生物質の判定に適したキットが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験微生物、指示薬、およびイオン化形態での金属を含んでなり、前記金属の原子価が少なくとも２であるとともに、前記金属の濃度が０．００１Ｍ〜１Ｍである試験培地。
【請求項２】
前記金属がアルカリ土類金属および／またはランタニドであることを特徴とする請求項１に記載の試験培地。
【請求項３】
前記アルカリ土類金属がカルシウムであることを特徴とする請求項２に記載の試験培地。
【請求項４】
（ａ）試験微生物および指示薬を含んでなる試験培地と前記流体のサンプルとを接触させるステップと、
（ｂ）抗生物質が流体サンプル中に存在しない場合に試験微生物を成長させる期間にわたって試験微生物をインキュベートするステップと、
（ｃ）試験微生物の成長または成長の抑制を指示薬で検出するステップと
を含んでなる流体中の抗生物質の存在を判定するための方法であって、
金属塩（ここで、前記金属の原子価が少なくとも２であり、かつ金属塩が２０℃下の水中で少なくとも０．０２Ｍの溶解度である）が前記試験培地および／または前記流体のサンプルに添加されることを特徴とする方法。
【請求項５】
指示薬が少なくとも１つのｐＨ指示薬および／または少なくとも１つのレドックス指示薬であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
その中の抗生物質が判定されるべき流体が血液または尿であることを特徴とする請求項４〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記金属がアルカリ土類金属および／またはランタニドであることを特徴とする請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記アルカリ土類金属がカルシウムであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記試験培地中および／または前記流体のサンプルへの前記金属塩の濃度が１Ｍを上回ることがないことを特徴とする請求項４〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記金属塩が前記流体のサンプルに添加されることを特徴とする請求項４〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
流体中の抗生物質の判定に適したキットであって、
（ａ）試験微生物と少なくとも１つの指示薬とを含んでなる試験培地で部分的に充填した少なくとも１つの容器と、
（ｂ）金属塩であって、前記金属の原子価が少なくとも２であり、かつ金属塩が２０℃下の水中で少なくとも０．０２Ｍの溶解度である金属塩と、を含んでなり、
または、請求項１〜３のいずれか一項に記載の試験培地を含んでなるキット。
【請求項１２】
設定温度で試験サンプルを保持するのに適した温度調節デバイスをさらに含んでなる請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
サンプル読取りデバイスから得られたデジタルデータを分析するコンピュータに指示を与えるために適したコンピュータプログラムを搭載したデータキャリアをさらに含んでなる請求項１１〜１２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４】
前記金属塩が錠剤、ペーパーディスク、もしくは水溶液中に存在することを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１５】
微生物抑制試験における金属塩の使用。
【請求項１６】
微生物抑制試験における前記サンプル中の抗生物質の有無を判定する前にサンプルを処理する金属塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿および血液中の抗菌薬残留物の有無を迅速に検出するための新たな方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗菌薬は薬物として適用されているだけではなく、獣医薬における成長促進物質としても広く使用されている。近代農業経営においては、飼料添加物としての獣医用医薬品の合法的使用が慣行となっている。これらの飼料添加物は、動物の疾患を予防し、その成長を高め、または飼料効率を高める。この化合物は、動物の飼料、または飲料水に加えられうる。一部の国々では、例えば成長促進物質の注射による投与が許可されており、したがってヒト用食品における抗菌薬の量を増大させる。もちろん獣医用医薬品の非合法の使用も起こりうる。
【０００３】
食品中の抗菌薬の存在は消費者の間で関心が高まっている。抗生物質によって引き起こされるヒト腸内細菌叢に対するアレルギー反応および影響は公知である。別の問題は耐性菌の発現である。抗生物質の濫用（すなわち、これが医療上の理由で必要ではない投与、または不完全な治療経過）が抗生物質耐性の発現の最も重要な原因であることが公知である。また、食品中の抗菌性化合物の存在も薬物耐性菌の増大をもたらす。したがって、ヒト病原菌は、飼料添加物として、かつヒト用医薬において両方に使用される抗菌剤に対する耐性を発現しうる。成長促進剤としての飼料における抗生物質使用の他の欠点は、抗生物質が、スターターカルチャーの抑制により、マイナスの形でソーセージなど発酵肉製品の製造過程に影響を及ぼすことである。
【０００４】
大部分の獣医用医薬品は、食肉処理動物の肉を通じ、または牛乳および卵など畜産物を通じてヒト食物連鎖に入る。
【０００５】
食肉処理動物、畜産物、および食品における抗菌薬の存在に対する管理は食品業界における重要な問題である。大部分の国々では新鮮な肉および肉製品における薬物残留物の最大残留基準値または許容レベルが確立されている。許可されていない化合物に対してはゼロトレランスがあり、かかる物質は決して畜産物中に存在してはならない。大部分の薬物に対しては消退期間が決定されている。これは最後の処理と食肉処理の時間との最小期間である。この期間中に薬物残留物は最大残留基準以下のレベルに低下する。しかし、場合によっては、消退期間後でも高過ぎる薬物濃度が動物中に依然として存在しうる。これは代謝における自然の個体差によって、または疾患による薬物の排泄過程の障害のため引き起こされうる。最後に、諸手順は消退期間において正しく適用されていない場合がある。大部分の国々では、食品中の獣医用医薬品残留物に関する法律が、公的管理プログラムを使用することによって維持されている。一般に、政府機関は、獣医用医薬品残留物の存在について食肉処理動物の一定の割合を試験する。また、食肉処理場またはスーパーマーケットも生肉、肉製品、および腎ならびに肝などの臓器を試験しうる。
【０００６】
大部分の重要な抗菌薬の多くは尿を通じて排泄されるが、尿はこれまでは食肉処理動物における抗菌剤残留物の有無を試験するための基質としてほとんど使用されていない。尿を通じて排泄されている抗菌動物薬の例は、アモキシシリン、アンピシリン、ペニシリンＧ、およびペニシリンＶなどのβ−ラクタム、クロルテトラサイクリンおよびオキシテトラサイクリンなどのテトラサイクリン、ゲンタマイシンおよびストレプトマイシンなどのアミノグリコシド、およびスルファミジンなどのスルホンアミドである。
【０００７】
尿中の抗菌性化合物の量は、動物の食用部分、例えば、筋組織および肝における抗菌性化合物のレベルを示す。尿の試験が莫大な利点を提供することを理解するのは容易である。多くの動物種では、多くの動物は尿が排泄される間の一定時点を有するため、尿サンプルを得ることはきわめて容易である。
【０００８】
肉における抗菌薬の存在を試験するサンプルとしての尿の使用は、食肉処理前に動物が試験されることを可能にするであろう。これは農業従事者に消退期間が予想どおり完了したかどうかチェックする可能性を提供する。完了していない場合には、農業従事者は動物を食品処理場に輸送する前に数日待つことを決めることになる。動物が食肉処理後に抗生物質に対して陽性が確定した場合の経済損失は高い。ヒト食物連鎖における抗菌薬残留物を検出する全管理システムは、動物が食肉処理の後ではなく前に試験される場合にはより効率的になる。
【０００９】
代替として動物の血液サンプルも使用し、食肉処理動物における抗菌薬残留物の有無を判定することができる。尿および血液サンプルはもちろん動物の食肉処理後にも得られうる。その場合には、有用な肉部分はサンプルを得るために損傷される必要はない。
【００１０】
抗菌剤残留物は、微生物抑制試験（例えば、寒天拡散試験）を使用して検出されうる。かかる方法は主に牛乳および肉流体を試験するために使用され、ＧＢＡ  １４６７４３９、ＥＰ０００５８９１、ＤＥ３６１３７９４、ＣＡ２０５６５８１、ＥＰ０２８５７９２、および米国特許第５，４９４，８０５号明細書に記載されている。これらの記述はすべて、試験微生物を使用する試験をいつでも使用できることをテーマにしている。試験微生物は主に寒天培地に組込まれているが、これは指示薬、緩衝液、栄養素、およびプラスまたはマイナスの形で一定の抗菌性化合物の感度を変化する物質を含有しうる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
適切な微生物は、桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、および／または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の菌株である。一般に、試験の原理は、抗菌化合物が試験微生物の成長を阻害するのに十分な濃度でサンプル中に存在する場合、酸／塩基またはレドックス指示薬の色が保持されるが、抑制の非存在下では試験微生物の成長が指示薬の色を変える代謝産物の形成によって達成される。現在利用可能な試験方法は、多くの異なる種類のサンプルにおける抗菌剤残留物の検出に適している。しかし、これらの試験方法の問題は、尿および血液における抗菌剤残留物の検出が妨害物質の存在により不可能であることである。これらの物質は試験を妨げ、偽陽性結果をもたらす。
【００１２】
尿および血液サンプルを調製する一部の方法は周知である。最も簡単な方法は、サンプルを水で（少なくとも３倍）希釈することである。しかし、サンプルの希釈は同じ倍数で感度の損失をもたらすことが明らかである。
【００１３】
各尿または血液サンプルのｐＨを一定の値に調整することは部分的にサンプル間の差を除去する。尿の場合には、ｐＨは相当に異なりうる。これらの変動は、種間、同じ種の動物間、および個々の動物のその日その日で確認される。例えば、飼料および尿サンプルを得るために必要な時間の差異により、ｐＨは酸と塩基の値間できわめて強く変動しうる。しかし、農業従事者の現場で尿サンプルを試験することが最も便利であるため、実際にはかかる方法を使用することはできない。正確なｐＨを測定し、酸性またはアルカリ性溶液を使用して一定のｐＨ値に滴定することは現状では複雑すぎる。この点については、エラスムソン（Ｅｒａｓｍｕｓｏｎ）ら（Ａｎａｌｙｓｔ  １２３、２４９７−２４９９頁（１９９８年））が、ｐＨ５．５への酸性処理によって分析前に尿サンプルから重炭酸塩を除去することを提案した。この方法の欠点は、数アリコートの酸の添加、ｐＨ値の測定、および二酸化炭素を放出させるなど多くの工程を行う必要あり、かつサンプルがそれによって希釈され、感度を低下させることである。さらに、ｐＨの調整により、偽陽性結果がいまだに起こるためサンプルの大部分に十分な溶液が得られないことも確認された。最後に、ｐＨを調整することによっても、主な欠点はこの場合もやはりサンプルの希釈である。
【００１４】
これまで尿および血液サンプルにおける抗菌剤残留物の検出用の適切な試験が利用可能ではないと結論されうる。現在の方法は不確実で時間がかかり、偽陽性結果をもたらしうる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の目的は、流体、特に血液および尿における抗生物質の判定のための改善された試験培地および方法を提供することである。意外にも、われわれは、金属塩を試験培地に適用すると達成できる実質的な改善があることを見出した。
【００１６】
このために、試験微生物、指示薬、およびイオン化形態での金属を含んでなり、前記金属の原子価が少なくとも２であるとともに、前記金属の濃度が０．００１Ｍ〜１Ｍである試験培地が提供される。
【００１７】
さらに、
（ａ）試験微生物および指示薬を含んでなる試験培地と前記流体のサンプルとを接触させるステップと、
（ｂ）抗生物質が流体サンプル中に存在しない場合に試験微生物を成長させる期間にわたって試験微生物をインキュベートするステップと、
（ｃ）試験微生物の成長または成長の抑制を指示薬で検出するステップと
を含んでなる流体中の抗生物質の存在を判定するための方法であって、
金属塩（ここで、前記金属の原子価が少なくとも２であり、かつ金属塩が２０℃下の水中で少なくとも０．０２Ｍの溶解度である）が前記試験培地および／または前記流体のサンプルに添加されることを特徴とする方法が提供される。
【００１８】
また、流体中の抗生物質の判定に適したキットであって、
（ａ）試験微生物と少なくとも１つの指示薬とを含んでなる試験培地で部分的に充填した少なくとも１つの容器と、
（ｂ）金属塩であって、前記金属の原子価が少なくとも２であり、かつ金属塩が２０℃下の水中で少なくとも０．０２Ｍの溶解度である金属塩と、を含んでなり、
または、請求項１〜３のいずれか一項に記載の試験培地を含んでなるキットも提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に示されている用語および略語は本開示の全体を通じて使用され、以下のとおり規定されている。
【００２０】
「抗生物質」という語は、細菌に対して活性を示す１つもしくはそれ以上の物質またはサンプルの化学成分を指す。
【００２１】
「流体」という語は、容易に移動し、塊の分離なしにその相対位置を変え、容易に圧力に屈し、かつ流動が可能である粒子を有する物質または組成物を指す。本発明に関する限りでは、「流体」という語は、水溶液、血液、肉流体、牛乳、尿などの組成物を指す。
【００２２】
「β−ラクタム抗生物質」という語は、その化学構造内のβ−ラクタム基礎構造を含んでなり、かつ細菌に対する活性を示す抗生物質を指す。前記β−ラクタム抗生物質の例は、アモキシシリン、アンピシリン、セファクロール、セファドロキシル、セフプロジル、セフチオフル、セファレキシン、セファピリン、セファラジン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、およびチカルシリンである。
【００２３】
「指示薬」という語は、ある状態から別の状態への変化と同時に色または蛍光における変化など検出可能シグナルを提供する化合物または物質を指す。
【００２４】
「試験」という語は、１つもしくはそれ以上の抗生物質または抗生物質クラスを同定し、特徴づけ、または定量化するために使用される方法、手順、工程、または反応を指す。
【００２５】
「試験デバイス」という語は、それで試験を実施するのに適した構成要素または構成要素の一部を指す。
【００２６】
「試験培地」という語は、試験微生物の、さらに場合により少なくとも１つの指示薬を含んでなり、かつ場合により栄養素および緩衝物質を含んでなる液体または固化懸濁液を指す。好ましくは、試験培地はゲル化剤によってゲルまたはゾルの形で固化されている。
【００２７】
「試験微生物」という語は、抗生物質に対して感受性であり、その成長の有無をモニタリングするのに適している微生物を指す。
【００２８】
「閾値」という語は、それ以上であると所定の抗生物質が存在するとみなされ、それ以下であると前記抗生物質が存在しないとみなされる濃度値を指す。一般に、閾値は、地方、地域、または地域間の当局によって特定のサンプルにおける特定の抗生物質に対して示されているが、一定の研究目的のために事前設定されうる。
【００２９】
「原子価」という語は、元素の原子量がそれと結合し、もしくはそれが置換され、または比較されうる一価元素（水素としての）の原子量の数によって示される金属など元素の結合能の程度を指す。
【００３０】
本発明の第１の態様においては、検出物質として１つもしくはそれ以上の種類の試験微生物、場合により指示薬およびイオン化形態での金属を含んでなる流体中の抗菌性化合物の検出用の試験培地が提供される。意外にも、イオン化形態での金属が試験培地で使用されると、上記の従来技術の問題が試験の感度の保持により克服されうることが見出されている。好ましくは、前記金属の原子価は少なくとも２である。かかる金属の例は、アルミニウム、バリウム、ベリリウム、ビスマス、カルシウム、クロム、コバルト、銅、鉄、ランタン、鉛、マグネシウム、マンガン、ニッケル、ストロンチウム、スズ、チタン、および亜鉛である。より好ましくは、前記金属はアルカリ土類金属および／またはランタニドである。最も好ましくは、前記金属はバリウムまたはカルシウムである。好ましくは、前記試験培地における前記金属の濃度は、０．００５〜１Ｍであり、より好ましくは、０．０１〜０．１Ｍである。金属イオンの適切な対イオンは、溶解度要件を満たすイオンである。好ましい対イオンは、酢酸塩、安息香酸塩、臭化物、塩化物、ヨウ化物、硝酸塩、亜硝酸塩、および場合によっては、硫酸塩である。金属塩は、試験サンプルまたは試験培地における金属塩の容易な溶解を可能にする水中溶解度を有しなければならない。一般に、前記水中溶解度は、０．０１Ｍ以上、好ましくは、０．０２Ｍ以上、より好ましくは、０．１Ｍ以上、最も好ましくは、１Ｍ以上である。好ましい金属塩は、臭化バリウム、塩化バリウム、ヨウ化バリウム、硝酸バリウム、塩化ベリリウム、硝酸ベリリウム、酢酸カルシウム、臭化カルシウム、塩化カルシウム、ヨウ化カルシウム、硝酸カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、および塩化亜鉛である。最も好ましくは、金属塩は塩化カルシウムである。
【００３１】
場合により、試験培地は、栄養素、安定剤、およびプラスまたはマイナスの形で一定の抗菌性化合物に対する感度を変える物質、および／または粘度増加剤も含有しうる。一定の抗菌性化合物に対する感度を変える物質の例は、サルファ化合物に対する試験微生物の感度を改善するアデノシン、およびオルメトプリム、テトロキソプリム、およびトリメトプリムなどの抗葉酸剤、またはテトラサイクリンに対する感度を改善するシュウ酸またはフッ化水素酸の塩である。システインを添加し、必要に応じて、ペニシリンに対する感度を減少させることができる。粘度増加剤の例は、アスコルビン酸メチルシラノールペクチネート、カルボマー、カルボキシメチルセルロース、セテアリルアルコール、セチルアルコール、セチルエステル、コカミドＤＥＡ、乳化ろう、グルコース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラウリルアミドＤＥＡ、リノールアミドＤＥＡ、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、マルトデキストリン、ジステアリン酸ＰＥＧ−８、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ＰＶＰ／ヘキサデセンコポリマー、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、ソイアミドプロピルベタイン、キサンタンガムなどである。あるいは、上記の試験培地の任意の成分も外から添加されうる。
【００３２】
場合により、試験培地は、１つもしくはそれ以上の指示薬を含んでなるが、しかし、これらの化合物は試験方法の間にも添加されうる。少なくとも１つの指示薬が、反応培地において起こる変化を示すために流体のサンプルの存在下で微生物の成長中に存在する。当業者は、多くの指示薬がこのために適していることを理解するであろう。特に有用であるのは、ある状態から他の状態への変化と同時に、色または蛍光における変化など視覚的に検出可能なシグナルを示す指示薬である。かかる指示薬は、「Ｈ．Ｊ．Ｃｏｎｎ’ｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｉｎｓ」、Ｒ．Ｄ．リリー（Ｌｉｌｌｉｅ）編、ボルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）、１９６９年などの手引書から容易に選択されうる。好ましい指示薬は、ｐＨ指示薬および／またはレドックス指示薬である。適切な指示薬の例は、アシドブルー１２０、アシドオレンジ５１、アシドイエロー３８、アリザリンアシド、アリザリンブルー、アズールＡ、アズールＢ、ベーシックブルー３、ブリリアントブラック、ブリリアントクレジルブルー、ブリリアントクロセインＭＯＯ、ブリリアントイエロー、ブロモクレゾールパープル、ブロモフェノールブルー、ブロモフェノールレッド、ブロモチモールブルー、コンゴレッド、ガロシアニン、インジゴカルミン、ヤーヌスグリーンＢ、リトマス、メチレンブルー、ナイルブルーＡ、ニトラゾールイエロー（ニトラジンイエローとも呼ばれる）、ｏ−ニトロフェノール、ｐ−ニトロフェノール、１−１０フェナントロリン、フェノールフタレイン、サフラニンＯ、チオニン、トルイジンブルーである。
【００３３】
本発明の第１の態様の一実施形態においては、試験培地は、好ましくは、ゾルまたはゲルの形である。ゲル化剤の適切な例は、寒天、アルギン酸およびその塩、カラギナン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルグアーおよびその誘導体、ローガストビームガム（カロブ（Ｃａｒｏｂ）ガム）、加工ユーケマ藻類などである。試験培地中のゲル化剤の量は２〜１００ｇ．ｌ−１、好ましくは、５〜５０ｇ．ｌ−１、より好ましくは、１０〜２０ｇ．ｌ−１、最も好ましくは、１２から１５ｇ．ｌ−１である。しかし、当業者は、他の種類の固体試験培地が、セラミック、綿、ガラス、金属粒子、紙、任意の形のポリマー、ケイ酸塩、スポンジ、ウールなどに基づきうることを理解するであろう。プレミ（Ｐｒｅｍｉ）（登録商標）テストまたはデルボテスト（Ｄｅｌｖｏｔｅｓｔ）（登録商標）など市販の試験デバイスの場合、試験培地はチューブまたはプレートに存在する。本発明の目的に有用なデバイスの例は、単一もしくは一連の、またはその中に成形された多くの穴を備えた半透明の材料の塊に結合された透明チューブである。試験デバイスは、好ましくは、確定サイズを有する。これは試験の信頼性のためである。寒天拡散法に基づく試験の場合、好ましくは、チューブが使用される。試験デバイスは、好ましくは、３−３０ｍｍ、より好ましくは、５−１５ｍｍの高さに対応する寒天培地およびサンプルの量を含有するのに十分な高さとなる。試験ユニットの内部断面寸法は、好ましくは、１−３０ｍｍ、より好ましくは、５−１５ｍｍである。試験デバイスは、好ましくは、保存中に気密であり、この条件下でそれらは少なくとも数か月間保存されうる。もちろん、本発明の方法を実行するために適した他の試験デバイスが本発明に含まれる。試験デバイス中の寒天培地量は、試験デバイスの高さ、試験デバイスの内部断面寸法、および寒天培地で充填されている試験デバイスの容積の割合によって決定される。寒天培地量は、好ましくは、０．０１−５ｍｌ、より好ましくは、０．１−１ｍｌである。代わりの実施形態においては、試験デバイスは、試験培地を含有する１つもしくはそれ以上のウェルを含んでなるプレートである。分析される流体のサンプルは、試験培地を含有するウェルに直接添加され、または、例えば、分析される流体のサンプルを最初にペーパーディスクなどキャリア材料に塗布し、次いでキャリア材料を流体が試験培地に付着または吸着している場所に配置する。
【００３４】
本発明の第１の態様の別の実施形態においては、微生物は、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、好ましくは、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、またはストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、好ましくは、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）など熱安定性微生物である。これらの種は、コロニー、またはコロニー形成単位（ＣＦＵ）を産生することが可能な単位として試験に導入されうる。前記ＣＦＵは、胞子、増殖性細胞、または両方の混合物でありうる。前記ＣＦＵの濃度は試験培地ｍｌ当たりのコロニー形成単位で表され（ＣＦＵ．ｍｌ−１）、通常、１×１０５〜１×１０１２ＣＦＵ．ｍｌ−１、好ましくは、１×１０６〜１×１０１０ＣＦＵ．ｍｌ−１、より好ましくは、２×１０６〜１×１０９ＣＦＵ．ｍｌ−１、最も好ましくは、５×１０６〜１×１０８ＣＦＵ．ｍｌ−１、又はなおさら好ましくは５×１０６〜２×１０７である。好ましい菌株の例は、バチルス・ステアロサーモフィルス・ｖａｒ．カリドラクチス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｖａｒ．ｃａｌｉｄｏｌａｃｔｉｓ）Ｃ９５３（デルフト工科大学微生物学研究所（ｔｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｅｌｆｔ）により登録番号ＬＭＤ７４．１、およびｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒａａｌ  Ｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、Ｂａａｒｎ、登録番号ＣＢＳ７６０．８３で寄託）およびストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｔ１０１（ＤＳＭ４０２２）である。両方の菌株は抗菌性化合物、特にサルファ化合物など化学療法剤、およびペニシリンやテトラサイクリンなど抗生物質に対してきわめて感受性である。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株または他の適切なグラム陰性菌を、例えば、キノロンの検出用に使用することができる。バチルス・ステアロサーモフィルス・ｖａｒ．カリドラクチス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｖａｒ．ｃａｌｉｄｏｌａｃｔｉｓ）Ｃ９５３およびストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｔ１０１は急成長性であり、好熱性である利点を有する。例えば、前記バチルス菌株の最適な成長温度は５０°〜７０℃である。好熱性微生物の使用により試験物の保存または輸送中に微生物の成長が妨げられる。試験微生物がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株の場合、好ましくは、胞子懸濁液の形で寒天培地へ組込まれるが、これは周知の方法（例えば、ＧＢＡ  １４６７４３９を参照）によって固化前に寒天培地へ調製および組込まれうる。試験微生物がストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）菌株である場合、細菌は好ましくは、細菌細胞の形で寒天培地へ組込まれ、これは周知の方法（例えば、欧州特許第０２８５７９２号明細書を参照）に従って調製されうる。寒天培地中の試験微生物の濃度は、好ましくは、寒天培地１ｍｌ当たり１０５〜１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ．ｍｌ−１）である。
【００３５】
本発明の第１の態様のさらに別の実施形態においては、栄養素および／または金属の塩が、別の供給源として、例えば、顆粒、粉末、錠剤、ディスク、またはろ紙として添加される。指示薬、安定剤、および／または抗葉酸剤など他の化合物も別の供給源として添加され、場合により、栄養素培地に組込まれている。抗菌剤残留物の非存在下で試験微生物の増殖を可能にする適切な栄養素は、例えば、同化炭素源（例えば、乳糖、グルコース、またはデキストロース）、同化窒素源（例えば、ペプトン）、および成長因子源、ビタミンおよびミネラル（例えば、酵母エキス）である。
【００３６】
本発明の第２の態様においては、尿および血液中の抗菌性化合物の検出を実行する確実かつ簡単な方法が提供される。本発明によれば、２以上の原子価を有する金属塩が、試験システムにサンプルを添加する前に、分析される流体のサンプル、例えば、尿または血液サンプルに添加される。あるいは、試験システム自体は、本発明の第１の態様で概要が示されているように前記金属塩を含有しうる。意外にも、金属塩が試験方法において使用されると、上記の従来技術の問題が試験の感度の保持により克服されうることが見出されている。金属塩、試験培地、指示薬、微生物、および添加成分の要件、および好ましいオプションは、第１の態様で概要が示されたものと同じである。前記金属塩は試験培地および／または分析される流体のサンプルに添加される。
【００３７】
第２の態様の実施形態においては、金属塩は、溶液、好ましくは、水溶液によって分析される流体のサンプルに添加される。
【００３８】
本発明の第２の態様の別の実施形態においては、金属塩は固形で分析される流体のサンプルに添加される。場合により、固形の金属塩および分析される流体のサンプルは分析前に混合される。好ましくは、固形の金属塩は粉末、顆粒、錠剤、ディスク、またはろ紙の形で添加される。前記顆粒、粉末、錠剤、ディスク、またはろ紙は、場合により、栄養素および／または１つもしくはそれ以上の指示薬および／または安定剤、および／またはプラスまたはマイナスの形で一定の抗菌性化合物に対する感度を変える物質、および／または粘度増加剤も本発明の第１の態様において上記で概要が示されているように含有しうる。好ましくは、分析される前記流体のサンプル中の前記金属の濃度は、０．００５〜１Ｍ、より好ましくは、０．０１〜０．１Ｍである。
【００３９】
試験培地に添加される尿または血液サンプルの量は、試験システムによって決まる。試験物は製作者の指示に従ってインキュベートされる。微生物拡散試験では、０．０１−１．０ｍｌ、好ましくは、０．０５−０．５ｍｌは公知の方法を使用して試験培地に添加される。試験物のインキュベーション時間は環境によって決まる。バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を使用する寒天拡散試験の場合には、試験物は水浴または蓄熱ヒーターにおいて６０−７０℃下、好ましくは、６２−６５℃下でインキュベートされる。結果は１．５−４時間後、好ましくは、２．５−３．５時間後に得られうる。
【００４０】
本発明の方法に適切な試験が本発明に含まれる。例は、選択感受性微生物が使用される試験、例えば、微生物寒天拡散試験、および検出される化合物の選択的結合に基づく試験である。選択的結合は、公知の抗体技術を使用し、または特異的トレーサーを使用することによって達成されうる。流体のいかなるサンプルも本発明の方法による分析に適している。注目すべきは、本発明の方法は固形物質にも適していることであり、目的とする流体は、拡散、圧力、または自然の流体喪失のいずれかによって抽出されうる。この後者の特定の例は、分析される流体が含浸されている肉およびキャリア材料である。
【００４１】
本発明の第３の態様においては、本発明の第２の態様の方法を実施するためのキットが提供される。かかるキットは、本発明の第１の態様に記載されている試験培地および金属塩で充填された１つもしくはそれ以上の容器を含んでなる。容器は、任意の形状およびサイズの、および指示薬変化の観察が可能であるという条件で、入手可能な任意の材料の試験管でありうる。また、容器は、マイクロタイタープレートに組込まれたものなどウェルでもありうる。
【００４２】
前記金属塩は、本発明の第１の態様で概要が示されている金属イオンを形成することが可能な金属塩である。金属塩は、溶液、好ましくは、容器に保存された水溶液として存在しうる。好ましくは、前記金属塩は、固形、例えば、錠剤の形、ディスク、またはろ紙の形において存在する。固形中のキットにおいて金属塩を供給する利点は、所定量が、例えば、投与を促進する錠剤に容易に包装されうることである。さらに別の利点は、乾燥型での金属塩の使用によりサンプルの希釈がもたらされず、その結果として試験の感度を低下させることがないことである。
【００４３】
場合により、前記キットは、インキュベーション中に試験培地で充填された前記容器の密閉のための手段、および／または使用説明書を有する挿入物、および／またはインキュベーションに必要な時間を設定するための手段を含んでなる。
【００４４】
第３の態様の一実施形態においては、前記キットは栄養素を含んでなる。好ましくは、前記栄養素は、錠剤、ディスク、またはろ紙など培地内に含まれている。指示薬、安定剤、および／または抗葉酸剤など他の化合物も別の供給源として添加され、場合により、栄養素培地に組込まれうる。前記培地が存在する場合、その中に金属塩を組込むこともきわめて有利である。
【００４５】
本発明の第３の態様の別の実施形態においては、前記キットは温度調節デバイスを含んでなり、それによって試験サンプルが設定温度で維持されうる。好ましくは、前記温度調節デバイスは、試験培地で充填された前記容器を保持しうるような方法で設計されている。場合により、温度調節デバイスは、加熱および／または冷却が設定期間の経過後に停止するようにインキュベーションに必要な時間を設定するための手段に結合されている。
【００４６】
本発明の第３の態様のさらに別の実施形態においては、前記キットは、サンプル読取りデバイスから得られたデジタルデータを分析するコンピュータに指示するために適したコンピュータプログラムを搭載したデータキャリアを含んでなる。前記データキャリアは、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット、ＤＶＤ、メモリースティック、磁気テープ、または同種のものなどデジタル情報を保存するために適したキャリアでありうる。有利には、前記コンピュータプログラムを搭載したデータキャリアは、本発明の方法における使用に適した最新の利用可能なコンピュータプログラムへの容易なアクセスを提供する。
【実施例】
【００４７】
実施例１
尿サンプルへの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の添加
尿サンプルを寒天に存在する栄養素でＥＰ０００５８９１に記載されている方法に従って製造された微生物抑制試験アンプルを使用して試験した。前記試験は、プレミ（Ｐｒｅｍｉ）（登録商標）テスト（ＤＳＭ  デルフト  オランダ（Ｄｅｌｆｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）より市販）としても周知である。
【００４８】
ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ（０．８１ｍｇ、０．００５５ｍｍｏｌ）を、薬物残留物を含有しない豚肉（合計１０個のサンプルを評価）または子牛（合計３５個のサンプルを評価）から得られた尿１００μｌ中に溶解した。対照サンプルにはＣａＣｌ２を添加しなかった。サンプルを試験アンプルに添加した。室温下で２０分間のプレインキュベーション後、サンプルを除去し、メーカーの指示に従って試験物を６４±１℃下で水浴中でインキュベートした。紫色から黄色への色の変化を読むことによって３−４時間後に結果を得た。
【００４９】
以下に要約された結果は、ＣａＣｌ２による尿の処理がプレミ（Ｐｒｅｍｉ）（登録商標）テストにおける偽陽性試験結果を最小限にするために不可欠であることを明らかに示す。
【００５０】
【表１】
2007504811.tif 000002
【００５１】
実施例２
微生物抑制試験に対するＣａＣｌ２の影響
サンプルを実施例１に記載されているように試験した。ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏを水または鶏肉流体中に０、０.００７８、０.０１５６、０.０３１２、０.０６２５、０.１２５、０.２５、０.５、および１Ｍの濃度で溶解した。サンプルを試験アンプルに添加した。室温下で２０分間のプレインキュベーション後、サンプルを除去し、メーカーの指示に従って試験物を６４±１℃下で水浴中でインキュベートした。鶏肉流体については１６５分後、水の場合には１８５分後に、紫色から黄色への色の変化を読むことによって結果を得た。以下に要約された結果は、水中の０．２５ＭまでのＣａＣｌ２の濃度が試験結果に影響を及ぼさないことを明らかに示す。鶏肉流体においては、ＣａＣｌ２の濃度が１Ｍまでの場合に抑制は認められない。
【００５２】
【表２】
2007504811.tif 000003
【００５３】
実施例３
ウシ尿サンプルへの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の添加
本実験においては、尿へのＣａＣｌ２の添加が微生物抑制試験での偽結果を削減することが示されている。
【００５４】
サンプルを寒天に存在する栄養素でＥＰ０００５８９１に記載されている方法に従って製造された微生物抑制試験アンプルを使用して試験した。前記試験は、プレミ（Ｐｒｅｍｉ）（登録商標）テスト（ＤＳＭ  デルフト  オランダ（Ｄｅｌｆｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）より市販）としても周知である。
【００５５】
ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ（１ｍｇ、０．００６８ｍｍｏｌ）を、いかなる薬物残留物をも含有しないウシ（合計２５個のサンプルを評価）から得られた尿１００μｌ中に溶解した。対照サンプルにはＣａＣｌ２を添加しなかった。サンプルを試験アンプルに添加した。室温下で２０分間のプレインキュベーション後、サンプルを除去し、メーカーの指示に従って試験物を６４±１℃下で水浴中でインキュベートした。紫色から黄色への色の変化を読むことによって３−４時間後に結果を得た。
【００５６】
表３に要約された結果は、ＣａＣｌ２による尿の処理がプレミ（Ｐｒｅｍｉ）（登録商標）テストにおける偽陽性試験結果を最小限にするために不可欠であることを明らかに示す。
【００５７】
【表３】
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【００５８】
実施例４
ウシおよびブタ尿サンプルへの酢酸カルシウム（Ｃａ（ＣＨ３ＣＯＯ）２）の添加
本実験では、ＣａＣｌ２またはＣａ（ＣＨ３ＣＯＯ）２のいずれかのアルカリ土類金属カルシウムの尿への添加が、微生物抑制試験での偽結果を削減することが明らかにされている。
【００５９】
サンプルを寒天に存在する栄養素でＥＰ０００５８９１に記載されている方法に従って製造された微生物抑制試験アンプルを使用して試験した。前記試験は、プレミ（Ｐｒｅｍｉ）（登録商標）テスト（ＤＳＭ  デルフト  オランダ（Ｄｅｌｆｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）より市販）としても周知である。
【００６０】
ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ（１．０ｍｇ、０．００６８ｍｍｏｌ）、Ｃａ（ＣＨ３ＣＯＯ）２（１．０ｍｇ、０．００４１ｍｍｏｌ）、およびＣａ（ＣＨ３ＣＯＯ）２（２．０ｍｇ、０．００８２ｍｍｏｌ）を、薬物残留物を含有しないウシ（合計２５個のサンプルを評価）およびブタ（合計９個のサンプルを評価）から得られた尿１００μｌ中に溶解した。対照サンプルにはアルカリ土類金属カルシウムを添加しなかった。サンプルを試験アンプルに添加した。室温下で２０分間のプレインキュベーション後、サンプルを除去し、メーカーの指示に従って試験物を６４±１℃下で水浴中でインキュベートした。紫色から黄色への色の変化を読むことによって３−４時間後に結果を得た。
【００６１】
表４に要約された結果は、アルカリ土類金属カルシウムによる尿の処理がプレミ（Ｐｒｅｍｉ）（登録商標）テストにおける偽陽性試験結果を最小限にすることを明らかに示す。
【００６２】
【表４】
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【国際調査報告】
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