(57)【要約】  エレクトロコンピーテント細胞を滅菌済キュベット内に予備包装し、細胞内容物を冷凍し、細胞内容物を単に解凍することによりエレクトロポレーションを実行し、次にそのキュベットをエレクトロポレーションに適した動力源に電気的に接続する。キュベットは細胞に加えて懸濁媒体、そして好適には細胞のための凍結防止物質を収容する。本発明は、更に、使用、選択的に出荷、または輸送のためにエレクトロポレーション細胞を調製する方法に関し、好ましくは凍結防止物質を含む懸濁媒体内で細胞の懸濁液を形成し、細胞懸濁液を滅菌済エレクトロポレーション細胞キュベット内に入れ、かつキュベット内の細胞を迅速に冷凍することを含む。その後に細胞は、続く使用のために、サブ０°Ｃ温度で保存かつ／または出荷もしくは輸送される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
冷凍エレクトロコンピーテント細胞を収容している、滅菌済エレクトロポレーション細胞キュベット。
【請求項２】
更に懸濁媒体を収容している、請求項１のキュベット。
【請求項３】
更に凍結防止物質を収容している、請求項１のキュベット。
【請求項４】
自動エレクトロポレーション装置における使用に適した、請求項１のキュベット。
【請求項５】
滅菌済エレクトロポレーション細胞キュベットの内面に設置しまたは壁内に埋設した電極を有する、請求項１のキュベット。
【請求項６】
凍結防止物質は、砂糖、砂糖誘導体、グリセロール、ポリエチレングリコール、およびポリビニルピロリドンから選択されている、請求項３のキュベット。
【請求項７】
凍結防止物質は、グリセロールである、請求項６のキュベット。
【請求項８】
キュベット内容物は、約−２５°から−１００°Ｃまでの温度で冷凍されている、請求項１のキュベット。
【請求項９】
キュベット内容物は、約−７０°Ｃの温度で冷凍されている、請求項１のキュベット。
【請求項１０】
（ア）凍結防止物質を選択的に含む懸濁媒体内でエレクトロポレーション細胞の懸濁液を形成し、
（イ）滅菌済エレクトロポレーションキュベット内に細胞懸濁液を入れ、かつ
（ウ）前記キュベット内で細胞を迅速に冷凍する、各工程を含む使用のためにエレクトロポレーション細胞を準備する方法。
【請求項１１】
凍結防止物質を懸濁媒体内に含める、請求項１０の方法。
【請求項１２】
凍結防止物質を砂糖、砂糖誘導体、グリセロール、ポリエチレングリコール、およびポリビニルピロリドンから選択する、請求項１１の方法。
【請求項１３】
凍結防止物質は、グリセロールである、請求項１１の方法。
【請求項１４】
キュベット内容物は、約−２５°から−１００°Ｃまでの温度で冷凍される、請求項１０の方法。
【請求項１５】
キュベット内容物は、約−７０°Ｃの温度で冷凍される、請求項１０の方法。
【請求項１６】
（ウ）の工程は約５分間実行される、請求項１０の方法。
【請求項１７】
冷凍状態で前記キュベットを包装しかつ受領場所へ出荷することを更に含む、請求項１０の方法。
【請求項１８】
受領場所で冷凍キュベットを解凍し、かつエレクトロポレーション法において冷凍した細胞を利用する、請求項１７の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はエレクトロポレーション(electroporation)の分野、特にエレクトロポレーションに使用する細胞材料、その準備、貯蔵、および／または出荷に関する。
【背景技術】
【０００２】
エレクトロポレーションによる細胞の形質転換のための方法および材料は、周知であり広く公表されている。核酸その他の巨大分子を完全な生命細胞へ挿入するための電流使用は、研究調査実験所において相当に利用され、かつ医学治療および生命工学全般に大きな前進を約束する。次の公表された文献例は、エレクトロポレーションの様々な方法ならびにそれらの方法の実施に使用される装置および材料を記載している。各例は参考として本明細書に組み込まれる。
【０００３】
Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, Clifornia, USA)により提供された文献、２００４年１月公表のGene Pulser Xcell System, Bulletin No. 2750US/EG Rev. Bは、種々の種類の細胞、真核生物および原核生物の両生物のエレクトロポレーションのための装置、材料および方法の説明を開示している。Chassy, B.M.他による"Transformation lactobacillus casei by elelctroporation", FEMS Microbibl.Lett.44,173-177(1987)およびPowell, I.B.他による"A Simple and Rapid Method for Genetic Transformation of Lactic Streptococci by Electroporation" Appl.Environ.Microbiol.54(3),655-660(１９８８年３月）は、Bio-Rad Gene Pulserの様々の異なる形質転換の使用を開示する。特別のエレクトロポレーションキュベットがPotter,H.他により"Enhancer-dependent expression of human kappa immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation" Proc.Natl.Acad.Sci.USA81,7161-7165（１９８４年）に開示されている。ポリエチレングリコール処理によるバシルス（Bacillus)原形質体のエレクトロポレーションがShivarova,N.,他により"Microbiological implications of electric field effects.VII.Stimulation of Plasmid transformation of protoplasts by electric field pulses,"Zeitschrift Allge.Mikro.23,595-599（１９８３年）に記載されている。Campylobacier jejumiのflso形質転換はMiller,J.F.他により"High voltage electroporation of bacteria,genetic transformation of Campylobacier jejuni with plasmid DNA",Proc.Natl.Acad.Sci.USA85,856-860（１９８８年）に記載されている。更に、エレクトロポレーション細胞、材料、および方法に関する開示が、Dower,W.J.によるＵＳＰ4910140(1990年3月20日)およびＵＳＰ5186800(1993年2月16日)、Korenstein,R.,他によるＵＳＰ5964726（１９９９年１０月１２日）、Thompson,J.R.によるＵＳＰ5879891 (１９９９年３月９日）、およびGreener,A.L.他によるＵＳＰ6586249 (２００３年７月１日）に知見される。
【０００４】
エレクトロポレーションによる形質転換が意図された細胞は、エレクトロコンピーテント(electrocompetent)細胞として既知であり、エレクトロコンピーテンシはエレクトロポレーション時に円弧状になることを防止するために低伝導媒体中で正常な細胞を懸濁することにより達成される。エレクトロコンピーテント細胞は市場で利用できかつ典型例としてマイクロチューブに入れて販売されている。エレクトロポレーションを実行するために、ユーザーは最初に細胞懸濁液をマイクロチューブから空のチューブに移し、次に核酸または他の転換薬を加え、懸濁液を混合して薬剤を分配し、かつ結合された懸濁液をエレクトロポレーションのための電極を備えたキュベットへ移送する。選択的に、転換薬はマイクロチューブ内でエレクトロコンピーテント細胞懸濁液に加えられ、かつ結合した懸濁液はキュベット内に入れられる。これらの方法に伴う潜在的問題は移送される量が不正確であり、かつ移送設備および介在容器から汚染されることである。
【発明の開示】
【０００５】
［発明の概要］
本発明は、滅菌済キュベット内に予備包装された冷凍エレクトロコンピーテント細胞に関し、冷凍細胞内容物を単に、第一に解凍し、次にエレクトロポレーションに適した動力源にキュベットを電気的に接続することによりエレクトロポレーションを実行する。キュベットは、細胞に加えて、懸濁媒体、代表例として、細胞用の凍結防止物質を収容する。
【０００６】
本発明は、更に、使用のため、または出荷、または輸送のためにエレクトロポレーション細胞を準備（調製）する方法に関し、好適には凍結物質を含む懸濁媒体内でエレクトロポレーション細胞の懸濁液を形成し、その細胞懸濁液を滅菌したエレクトロポレーション細胞キュベット内に入れ、かつ前記キュベット内の細胞を迅速に冷凍することを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の実施に際して、使用に適したキュベットは、エレクトロポレーションを実行できるいずれかの容器である。もっとも興味あるキュベットは、自動エレクトロポレーション装置に適合しかつ細胞懸濁液へ電流を送るために必要な電気コネクタを含むキュベットである。構造に適した材料は電気的に絶縁性であり、細胞懸濁液に不活性であり、かつ強力電界、および典型的エレクトロポレーションの処理において遭遇するその他の条件に耐え得る適宜材料である。硝子、セラミック、およびポリカーボネート等の透明プラスチックが適宜材料例である。プラスチックキュベット金型成形により容易に形成される。適宜キュベット例は、上述のＵＳＰ５１８６８００に示されており、この例において複数の電極がキュベット壁の内面上に固定または壁面内に埋設される。電極間の空間は、好適には約５ｍｍまたはそれ以下であり、更に好適には約１ｍｍから約４ｍｍであり、かつ最も好ましくは約１．０ｍｍから約２．０ｍｍである。電極はいずれの形態であってもよいが、プレートまたはフィルム状電極または金属細片が、比較的広い領域上に電流を生じる能力を有する点で好適である。耐腐食性の一般的導電性金属が好適である。これらの金属例としてアルミニウム、銀、金、および合金がある。電極領域は好適には約５ｍｍ２から約１０ｃｍ２の範囲、更に好適には約１０ｍｍ２から約２ｃｍ２の範囲である。キュベットの寸法は、電極間の質量、例えばエレクトロポレーションが発生する懸濁液の量が約１μＬから約１ｍＬ、更に好適には約２０μＬから約５００μＬ、かつ最も好ましくは約２５μＬから約１５０μＬの範囲となるようなものであることが望ましい。
【０００８】
上記パラメタは単に解説のためであるが、特に市場で入手できるエレクトロポレータ用として設計されたキュベットが使用できる。かかるエレクトロポレータ例として、ＧＥＮＥ  ＰＵＬＳＥＲ（登録商標）Ｘｃｅｌｌマイクロバイアルシステム、ＧＥＮＥ  ＰＵＬＳＥＲ（登録商標）Ｘｃｅｌｌ真核生物システム、ＧＥＮＥ  ＰＵＬＳＥＲ（登録商標）Ｘｃｅｌｌトータルシステム、およびＭＩＣＲＯＰＵＬＳＥＲ（登録商標）エレクトロポレータ、アメリカ合衆国、カリフォルニア、ハークルスのＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのすべて、ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）エレクトロポレータ２５１０、アメリカ合衆国、ニューヨーク、ウエスバリ，Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．のＭＵＬＴＩＰＯＲＡＴＯＲ（登録商標）、ＥＣＭ（登録商標）２００１、ＥＣＭ（登録商標）３９９、ＥＣＭ（登録商標）６３０、およびＥＣＭ（登録商標）８３０エレクトロポレータシステム、アメリカ合衆国、マサチュウセッツ、ホリストン、ＢＴＸ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎの全て、アメリカ合衆国、メリーランド、ゲイタースバーグ、Ａｍａｃａ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（登録商標）ディバイス、ＣＥＬＬＪＥＣＴ  ＵＮＯ、ＣＥＬＬＪＥＣＴ  ＤＵＯおよびＣＥＬＬＪＥＣＴ  ＰＲＯ、カナダ、オンタリオ、ゴームレイ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの全て、ならびにアメリカ合衆国、カリフォルニア、ロスアンジエルス、Ｔｒｉｔｅｃｈ  Ｒｅｓａｒｃｈ，Ｉｎｃ．のＴＨＥ  ＣＬＯＮＩＮＧ  ＧＵＮ （商標）（ＢａｃｔｏＺａｐｅｒ（商標）およびＴＨＥ  ＣＬＯＮＩＮＧ  ＧＵＮ（ＭａｍｍｏＸａｐｐｅｒ（商標）がある。
【０００９】
本発明に使用されるエレクトロコンピーテント細胞はエレクトロポレーション分野で既知の方法により調製されることができる。代表的調製方法は、細胞培養基を予め選択した細胞密度まで成長させ、細胞を迅速に分割する。その後に細胞を遠心分離または濾過により収穫し、好適には水で洗浄するか、または低伝導性媒体で洗浄し、存在する塩の量を低下させ、そのようにして細胞が懸濁媒体内で最終的に懸濁されたときに、懸濁液の導電性がエレクトロポレータ内で弓状化を阻止できるまで低下する。懸濁液内の最終細胞の密度は可変であるが、最良結果は殆どの場合に、細胞濃度が約５ｘ１０９から約５ｘ１０１０細胞／ｍＬの範囲で達成される。懸濁液内の塩濃度は、電気抵抗が約１０００Ωまたはそれ以上、および最も好ましくは約５０００Ωまたはそれ以上となるような十分に低いことが望ましい。
【００１０】
懸濁媒体は冷凍した細胞を保存するために凍結防止物質を含有することが好ましい。凍結防止物質例として、上記リストに挙げた他に、グリセロール、ポリエチレングリコール、およびポリビニルピロリドン、砂糖または砂糖誘導体（砂糖アルコール類）がある。砂糖および砂糖誘導体の例として、グリセルアルデハイド等のトリオース、エリトローズおよびトレオース等のテトロース、アラビノース、キシロース、リボース、およびリキシオース等のペントース、グリコース、マンノース、イドース、グロース、アルトロース、アロースおよびタロース等のヘキソース、スクロース、ラクトース、トレハロース、マルトース、セルロビオスおよびゼンチオビオス等のジサッカリド、ラフィノース等のトリサッカリド、およびアミラーゼ、アミロペクチン、およびグリコーゲン等のオリゴサッカリドがある。
【００１１】
形質転換用としてキュベット内に収容される細胞は、原核生物または真核生物のいずれであってもよい。原核生物細胞はグラム−ポジティブ(gram-positive)]およびグラム−ネガティブ(gram-negative)バクテリア細胞の両方を含む。キュベット内に収容できるグラムポジティブバクテリア例として、スタフィロコッカス（Staphylococcus) 、マイクロコッカス(Micrococcus)、およびサルシナ(Sarcina) 等のマイクロコッカス(Micrococcaceae)、ストレプトコッカス(Streptococcus)およびルコノストッカス(Leuconostoccus)等のストレプトカッス(Streptocacceae)、ラクトバシリウス(Lactobacillus)等のラクトバシラス(Lactobcillaceae)、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、リステリア(Listeria)、およびエリシペロトリックス(Erysipelothrix)等のプロピニバクテリアス(Propionibacteriaceae)、バシルス(Bacillus)およびクロストリジウム(Clostridium)等のバッシラス(Baccilaceae)がある。グラム−ネガティブバクテリアの例として、エシェリチア(Escherichia)、リルウイニア(Erwinia)、シゲラ(Shigella)、サルモネラ(Salmonella)、プロテウス(Proteus)、イエルシニア(Yersinia)等のエンテロバクテリアス (Enterobacteriaceae)、ブルセラ(Brucella)、ボルデテラ(Bordetella)、パステウレラ(Pasteurella)、ヘモフィルス(Hemophilus)等のブルンセラス(Bruncellaceae)、アゾトバクテル(Azotobacter)等のアゾバクテラス(Azobacteraceae)、リゾビウム(Ryzobium)等のリゾビアス(Rhizobiaceae)、ニトロソモナス(Nitrosomonas)、ニトロバクテル(Nitrobacter)、およびチオバシルス(Thiobacillus)等のニトロバステリアス(Nitrobacteriaceae)、プシュウデモナス(Pseudomonas)およびアセトバクテル(Acetobacter)等のプシュウドモナダス(Psuedomonadaceae)、フォトバクテリウム(Photobacterium)、ジモノマス(Zymonomas)、エルモナ(Aermona)、ビブリオ(Vibrio)、デスルフォビブリオ(Desulfovibrio)、およびスピリリウム(Spirilium)等のスピリラス(Spirillaceae)、ならびにマイコバクテリウム(Mycobacterium)、アクチノマイス(Actinomyces)、ノルカルジア(Norcardia)、およびストレプトマイス(Streptomyces)等のアクチノマイセタルス(Actinomycetales)がある。真核生物細胞の例として、哺乳類細胞、および植物原形質体を含む完全な動物の細胞がある。
【００１２】
細胞懸濁液が滅菌したキュベット内に置かれると、細胞懸濁液は０°未満の温度まで冷却することによってキュベット内で冷凍し、かつ使用するまでその温度で無限に保存される。代表的保存温度は、約−１００°Ｃから−２５°Ｃの範囲、好適には少なくとも約−７０°Ｃである。冷凍は比較的迅速、典型的には約５分間、実行される。使用前に、キュベットおよび内容物は温められ、好適にはエレクトロポレーションが行われる温度までゆっくりと温められる。キュベットは、例えば、氷の温度と平衡になるまでウエットアイス上に設置され（大気圧下で）、その後に温められる。次に細胞形質転換薬剤が従来転換法によりキュベットへ添加され、そこでキュベットはエレクトロポレータ内に設置される。細胞は、異なる寸法のエレクトロポレーションキュベット内で冷凍されてよい。例えば、０．０４ｍｌまたは０．０８ｍｌのエレクトロコンピーテント細胞が０．２ｃｍまたは０．４ｃｍのギャップのキュベット内で冷凍できる。
【００１３】
形質転換物質の選択は、全体的に独立に選択でき、キュベット内の細胞懸濁液の予備包装した特性によって制限されない。形質転換物質の例として、核酸、およびタンパク質、酵素、抗毒素、ホルモン、および炭水化物等の巨大分子、または薬剤、染料、標識化ヌクレオチド、およびアミノ酸等の相対的に小さい分子がある。核酸はＤＮＡおよびＲＮＡを直線または円形形態で含む。
【実施例】
【００１４】
本発明の調製、使用例を次に示す。ただし、本発明はこの例に限定されない。
【００１５】
エレクトロポレーションに適したイ−コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のサンプルをその目的に適した条件で成長させる。その細胞を洗浄し、凝縮し、かつ水とグリセロールの混合液中で懸濁して次のごとき構成を得た。
構成要素                                                    重量％
エシェリチア コリ(Escherichia coli)(〜1x1011 細胞 /ml)      ０．００１
グリセロール                                                １０
水                                                          ８９．９９９
【００１６】
次に、０．２μＬの混合物を滅菌０．１ｃｍエレクトロポレーションキュベットの上下電極間の中間に置く。キュベットおよびその内容物をエタノールドライアイス浴槽を使用して約５分間−７０°Ｃまで冷凍し、次に使用または出荷するまで−７０°Ｃ未満の温度で保存する。同様処理をより大きいサンプルおよびキュベットに使用でき、例えば０．４μＬを０．２ｃｍギャップの滅菌エレクトロポレーションキュベットに使用できる。
【００１７】
このようにしてキュベット内で冷凍したエレクトロポレーション細胞のサンプルをバイアル内で冷凍した同様細胞のサンプルと比較試験した。両サンプルを３−６カ月保存し、かつメリーランドからカリフォルニアへ出荷した。
【００１８】
二つの細胞サンプルは、ウエットアイスのバケット内に設置されかつ解凍された。解凍後に、コントロールプラスミドｐＵＣ１９を各サンプルに混合した。バイアル内のサンプルはその後にキュベットへ移した。両キュベットをエレクトロポレータへ設置し、かつ製造者推薦条件で振動させた。次に、１．０ｍＬのＳＯＣ(Super Optimal Catabolite media=超最適分解代謝媒体)を各キュベット内に入れて電流暴露後に細胞回復を援助した。次に各内容物を１７ｘ１００ｍｍの滅菌ポリプロピレン管へ移し、かつ２２５−２５０ｒｐｍで振動しながら１時間３７°Ｃで培養した。各管の内容物は、１：１００にＳＯＣにより希釈され、かつ１００μｇアンピシリン含有ＬＢプレート上に拡げた。形質転換効率が測定された。キュベット内で冷凍したサンプルは、バイアル中で冷凍したサンプルと同レベルで実行された。
【００１９】
本明細書で引用された全刊行物および特許出願はここに記載した範囲で参考として本明細書に組み込まれる。
【００２０】
上記発明は理解の解明のために例示としてある程度詳細に記載されているが、当業者に明らかなように、特許請求の範囲の主旨から逸脱することなく本発明の教示に照らして変更および改良が可能である。
【国際調査報告】
2007536934.tif 000002