(57)【要約】  本発明は、油性酵母菌におけるω−３および／またはω−６脂肪酸の生成方法に関する。したがってＡＲＡおよびＥＰＡの合成のために、リノール酸（ＬＡ）からγ−リノレン酸（ＧＬＡ）、α−リノール酸（ＡＬＡ）からステアリドン酸（ＳＴＡ）、ＧＬＡからジホモ−γ−リノール酸（ＤＧＬＡ）、ＳＴＡからエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）、ＤＧＬＡからアラキドン酸（ＡＲＡ）、ＥＴＡからエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ＤＧＬＡからＥＴＡ、ＥＰＡからドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、およびＡＲＡからＥＰＡへの転換を触媒できるデサチュラーゼおよびエロンガーゼが、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）のゲノムに導入された。
2007504839.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）機能的なω−３／ω−６脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を発酵可能な炭素源の存在下で生育させ、これにより１種もしくはそれ以上のω−３またはω−６脂肪酸を生成せしめ、
ｃ）場合により、ω−３またはω−６脂肪酸を回収すること
を含んでなるω−３またはω−６脂肪酸の製造方法。
【請求項２】
機能的なω−３／ω−６脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子が、Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、およびΔ４デサチュラーゼよりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
発酵可能な炭素源が、単糖類、少糖類、多糖類、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、メタノールおよび炭素含有アミンよりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
油性酵母菌が、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）よりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
油性酵母菌がヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ａ）（ｉ）Δ１２デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子、および
（ｉｉ）オレイン酸からなるデサチュラーゼ基質の供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な炭素源の存在下で生育させ、Δ１２デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子を発現させそしてオレイン酸をリノール酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のリノール酸を回収すること
を含んでなるリノール酸の生成方法。
【請求項７】
ａ）（ｉ）Δ６デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子、および
（ｉｉ）リノール酸からなるデサチュラーゼ基質の供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な炭素源の存在下で生育させて、Δ６デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子を発現させそしてリノール酸をγ−リノレン酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のγ−リノレン酸を回収すること
を含んでなるγ−リノレン酸の製造方法。
【請求項８】
ａ）（ｉ）Δ６デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子、および
（ｉｉ）α−リノール酸からなるデサチュラーゼ基質の供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な発酵可能な炭素基質の存在下で生育させて、Δ６デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子を発現させそしてα−リノール酸がステ
アリドン酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のステアリドン酸を回収すること
を含んでなるステアリドン酸の製造方法。
【請求項９】
ａ）（ｉ）Δ１５デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子、および
（ｉｉ）リノール酸からなるデサチュラーゼ基質の供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な発酵可能な炭素源の存在下で生育させて、Δ１５デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子を発現させそしてリノール酸をα−リノール酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のα−リノール酸を回収すること
を含んでなるα−リノール酸の製造方法。
【請求項１０】
ａ）（ｉ）Ｃ１８／２０エロンガーゼポリペプチドをコードする遺伝子、および
（ｉｉ）γ−リノレン酸からなるエロンガーゼ基質の供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な発酵可能な炭素源の存在下で生育させて、エロンガーゼポリペプチドをコードする遺伝子を発現させそしてγ−リノレン酸をジホモ−γ−リノール酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のジホモ−γ−リノール酸を回収すること
を含んでなるジホモ−γ−リノール酸の製造方法。
【請求項１１】
ａ）（ｉ）Ｃ１８／２０エロンガーゼポリペプチドをコードする遺伝子、および
（ｉｉ）ステアリドン酸からなるエロンガーゼ基質の供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な発酵可能な炭素源の存在下で生育させて、エロンガーゼポリペプチドをコードする遺伝子を発現させそしてステアリドン酸をエイコサテトラエン酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のエイコサテトラエン酸を回収すること
を含んでなるエイコサテトラエン酸の製造方法。
【請求項１２】
ａ）（ｉ）Ｃ２０／２２エロンガーゼポリペプチドをコードする遺伝子、および
（ｉｉ）エイコサペンタエン酸からなるエロンガーゼ基質の供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な発酵可能な炭素源の存在下で生育させて、エロンガーゼポリペプチドをコードする遺伝子を発現させそしてエイコサペンタエン酸をドコサペンタエン酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のドコサペンタエン酸を回収すること
を含んでなるドコサペンタエン酸の製造方法。
【請求項１３】
ａ）（ｉ）Δ５デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子、および
（ｉｉ）ジホモ−γ−リノール酸からなるデサチュラーゼ基質の供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な発酵可能な炭素源の存在下で生育させて、Δ５デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子を発現させそしてジホモ−γ−リノール酸をアラキドン酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のアラキドン酸を回収すること
を含んでなるアラキドン酸の製造方法。
【請求項１４】
ａ）（ｉ）Δ５デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子、および
（ｉｉ）エイコサテトラエン酸からなるデサチュラーゼ基質の供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な発酵可能な炭素源の存在下で生育させて、Δ５デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子を発現させそしてエイコサテトラエン酸をエイコサペンタエン酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のエイコサペンタエン酸を回収すること
を含んでなるエイコサペンタエン酸の生成方法。
【請求項１５】
ａ）（ｉ）Δ４デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子、および
（ｉｉ）ドコサペンタエン酸からなるデサチュラーゼ基質の供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な発酵可能な炭素源の存在下で生育させて、Δ４デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子を発現させそしてドコサペンタエン酸をドコサヘキサエン酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のドコサヘキサエン酸を回収すること
を含んでなるドコサヘキサエン酸の製造方法。
【請求項１６】
ａ）（ｉ）Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子、および
（ｉｉ）ジホモ−γ−リノール酸からなるデサチュラーゼ基質の供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な発酵可能な炭素源の存在下で生育させて、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子を発現させそしてジホモ−γ−リノール酸をエイコサテトラエン酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のエイコサテトラエン酸を回収すること
を含んでなるエイコサテトラエン酸の製造方法。
【請求項１７】
ａ）（ｉ）Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子、および
（ｉｉ）アラキドン酸からなるデサチュラーゼ基質の供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な発酵可能な炭素源の存在下で生育させて、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子を発現させそしてアラキドン酸をエイコサペンタエン酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のエイコサペンタエン酸を回収すること
を含んでなるエイコサペンタエン酸の製造方法。
【請求項１８】
デサチュラーゼまたはエロンガーゼ基質の供給源が、油性酵母菌に内在性である請求項６〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
デサチュラーゼまたはエロンガーゼ基質の供給源が、油性酵母菌に外来性である請求項６〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
油性酵母菌が、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）よりなる群から選択される請求項６〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
油性酵母菌がヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
Δ６デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子が、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、および
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子
よりなる群から選択される請求項７または８のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
エロンガーゼポリペプチドをコードする遺伝子が、
（ａ）配列番号８に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、および
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子
よりなる群から選択される請求項１０、１１および１２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
Δ５デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子が、
（ａ）配列番号４、配列番号１１５、配列番号１１９、および配列番号１２３よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子
よりなる群から選択される請求項１３または１４のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子が、
（ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、および
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子
よりなる群から選択される請求項１６または１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
宿主細胞が、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号８８６２、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号１８９４４、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号７６９８２およびヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＧＡＭＳ（７）１よりなる群から選択される請求項５または２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
ａ）（ｉ）ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路中の酵素をコードする遺伝子、および
（ｉｉ）オレイン酸の内在性供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な発酵可能な炭素源の存在下で生育させて、ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路中の酵素をコードする遺伝子を発現させそしてオレイン酸をエイコサペンタエン酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のエイコサペンタエン酸を回収すること
を含んでなるエイコサペンタエン酸の製造方法。
【請求項２８】
ａ）（ｉ）ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路中の酵素をコードする遺伝子、および
（ｉｉ）オレイン酸の内在性供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な発酵可能な炭素源の存在下で生育させて、ω−３
／ω−６脂肪酸生合成経路中の酵素をコードする遺伝子を発現させそしてオレイン酸をドコサヘキサエン酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のドコサヘキサエン酸を回収すること
を含んでなるドコサヘキサエン酸の製造方法。
【請求項２９】
ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の酵素をコードする遺伝子を含んでなる形質転換された油性酵母菌。
【請求項３０】
ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）よりなる群から選択される請求項２９に記載の油性酵母菌。
【請求項３１】
酵母菌がヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である請求項３０に記載の油性酵母菌。
【請求項３２】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法によって製造される微生物油。
【発明の詳細な説明】
【関連出願との関係】
【０００１】
本願は２００３年５月７日に出願された米国仮出願第６０／４６８６７７号の優先権の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明はバイオテクノロジー分野に関する。より具体的には本発明は、油性酵母菌における長鎖多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の生成に関する。
【背景技術】
【０００３】
特定の多不飽和脂肪酸、すなわちＰＵＦＡが健康な細胞の重要な生物学的構成要素であることが、長期にわたり認識されている。例えばこのようなＰＵＦＡは、
哺乳類において新規に（ｄｅ  ｎｏｖｏ）合成できず、食餌中で得られなくてはならない、またはリノール酸（ＬＡ）またはα−リノレン酸（ＡＬＡ）のさらなる不飽和化と延長によって誘導されなくてはならない「必須」脂肪酸、
リン脂質またはトリグリセリドなどの形態で見いだされてもよい細胞原形質膜の構成物、
特に成長中の幼児の脳において適切な発育、そして組織形成および修復に必要である、
プロスタサイクリン、エイコサノイド、ロイコトリエン、およびプロスタグランジンをはじめとする、哺乳類において重要ないくつかの生物学的に活性なエイコサノイドの前駆物質として認識されている。
【０００４】
１９７０年代に、グリーンランドのエスキモーの観察から、心疾患の低発生率と長鎖ω−３ＰＵＦＡの高摂取量とが結びつけられた（非特許文献１、非特許文献２）。より最近の研究はω−３ＰＵＦＡの心臓血管保護効果を確証した（非特許文献３、非特許文献４）。さらに血管形成術後の再狭窄率、炎症および関節リウマチ、喘息、乾癬および湿疹の症状などのいくつかの障害はω−３脂肪酸による処置に反応することが見いだされている。γ−リノレン酸（ＧＬＡ、ω−６ＰＵＦＡ）はストレスに関係した血圧上昇を低下させ、算術試験能力を改善することが示されている。ＧＬＡおよびジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ、もう１つのω−６ＰＵＦＡ）は、血小板凝集を阻害し、血管拡張を引き起こし、コレステロールレベルを低下させ、血管壁平滑筋および繊維組織の増殖を阻害することが示されている（非特許文献５）。ＧＬＡまたはＤＧＬＡの単独でのまたはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、ω−３ＰＵＦＡ）との組み合わせでの投与は、非ステロイド性抗炎症薬によって引き起こされる消化管出血およびその他の副作用を低下させ、または防止することが示されている（特許文献１）。さらにＧＬＡおよびＤＧＬＡは、子宮内膜症および月経前症候群を防止または治療し（特許文献２）、筋痛性脳脊髄炎およびウィルス感染後の慢性疲労（特許文献３）を治療することが示されている。その他の証拠は、ＰＵＦＡがカルシウム代謝調節に関与するかもしれないことを示唆し、骨粗鬆症および腎臓または尿道結石の治療または防止においてそれらが有用であるかもしれないことを示唆する。最後にＰＵＦＡは癌および糖尿病の治療において使用できる（特許文献４、非特許文献６）。
【０００５】
ＰＵＦＡは、必須脂肪酸であるリノール酸（ＬＡ）およびα−リノレン酸（ＡＬＡ）それぞれの不飽和化および延長によって誘導される、２つの主要なクラス（ω−６およびω−３脂肪酸からなる）に概して分けられる。この「必須」脂肪酸からの共通の誘導にもかかわらず、健康維持のためには、食餌中のω−６とω−３脂肪酸との比率が重要であることが次第に明らかになってきている。ヒト食習慣の変化のために、好ましいω−６：ω−３脂肪酸比率が２：１であるのに対し、現行の比率はおよそ１０：１である（非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）。
【０００６】
ω−６脂肪酸の主要供給源は、多量のＬＡを含有する植物油（例えばコーン油、大豆油）である。ＧＬＡは月見草（Ｏｅｎｏｔｈｅｒａ  ｂｉｅｎｎｉｓ）、ルリヂサ（Ｂｏｒａｇｏ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）およびクロフサスグリ（Ｒｉｂｅｓ  ｎｉｇｒｕｍ）をはじめとするいくつかの植物の種子に見いだされる。モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属（糸状菌）、ハエカビ属（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ）、ピシウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）およびチノリモ属（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）（紅藻）の微生物は、ω−６脂肪酸、アラキドン酸（ＡＲＡ）の商業生産に使用できる。例えば菌・カビ類モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）は、ＡＲＡを含有する油を作り出すのに使用され、他方マーテック社（Ｍａｒｔｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に付与された特許文献５は、ピシウム・インシジウオスム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｎｓｉｄｉｕｏｓｕｍ）を炭素および窒素源を含有する培地中で培養するステップを含んでなる、ＡＲＡを含有する油を製造する方法を教示する。
【０００７】
重要なω−３ＰＵＦＡとしては、どちらも異なるタイプの魚油および海洋性プランクトンに見いだされるＥＰＡおよびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）が挙げられる。マーテック社（Ｍａｒｔｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に付与された特許文献６は、発酵槽内で従属栄養性珪藻、具体的にはキクロテラ種およびニッチア種を培養することで、ＥＰＡを含有する食用油を作り出す方法について述べる。ＤＨＡは冷水海水魚、卵黄画分から、そして渦鞭毛藻綱の特定の従属栄養性微細藻類、具体的にはＣ．コーニー（Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ）などの海産渦鞭毛藻（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）種を培養することで得ることができる（特許文献７および特許文献８）。ＥＰＡおよびＤＨＡの前駆物質であるステアリドン酸（ＳＴＡ）は魚油および植物種子に見いだされ、その商業的供給源としては、トリコデスマ属およびエキウム（Ｅｃｈｉｕｍ）属における生成が挙げられる。ω−３酸のその他の供給源は、それぞれ主にＡＬＡを含有するアマニ油およびクルミ油に見いだされる。
【０００８】
天然供給源からの多様なＰＵＦＡの商業的供給源にもかかわらず、これらの生成方法と結びついたいくつかの不都合がある。第１に魚および植物などの天然供給源は、高度に不均一な油組成物を有しがちである。したがってこれらの供給源から得られた油は、所望のＰＵＦＡの１種もしくはそれ以上を分離または濃縮するために大規模な精製を必要とすることがある。魚油は一般に不快な味と臭いを有し、それは所望の生成物から経済的に分離するのが不可能かもしれず、このような生成物を食物サプリメントとして許容できなくすることができる。不快な味および臭いは、高投薬量の摂取に基づく医療的養生法を望ましくないものにでき、患者の服薬遵守を妨げるかもしれない。さらに魚は環境汚染物質を蓄積するかもしれず、食餌サプリメントとしての魚油カプセル摂取は、望まれない汚染物質の摂取をもたらすかもしれない。天然供給源はまた、制御できない供給のばらつきを被りやすい（例えば天候、疾患、または魚資源の乱獲による）。ＰＵＦＡを生成する作物は、食物生成のために開発されたハイブリダイズ作物と、経済的競争力がないことが多い。またＰＵＦＡを自然に生成するいくつかの生物体（例えばポルフィリディウム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ））の大規模発酵は、商業的規模で培養するのが高価および／または困難なことがある。
【０００９】
上述の限界の結果として、次に向けた大規模な研究が行われている。１．）商業的に容易に生成できるＰＵＦＡの組換え供給源の開発、および２．）所望のＰＵＦＡ生成を可能にする脂肪酸生合成経路の修正。
【００１０】
過去数年間にわたり、様々な生物体からの脂肪酸デサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子の単離、クローニング、および操作において進歩があった。これらの遺伝子配列の知識は、ＰＵＦＡを自然に生成しない新しい宿主生物体中で、所望の脂肪酸および／または
脂肪酸組成物を生成する見込み提供する。文献は、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における以下のようないくつかの例を報告する。
１．非特許文献１０では、海洋珪藻フェオダクチルム・トリコルヌーツムからの２個のデサチュラーゼがＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中にクローン化され、ＥＰＡの生成をもたらす。
２．非特許文献１１では、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）からの遺伝子を使用して、ω−３およびω−６ＰＵＦＡ生合成経路がＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中に再構成される。
３．非特許文献１２では、植物脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ２およびＦＡＤ３）がＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中に発現し、ＡＬＡの生成をもたらす。
４．アボット・ラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のナットゾン（Ｋｎｕｔｚｏｎ）らに付与された特許文献９では西洋油菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）からの１つのデサチュラーゼおよび菌・カビ類モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）からの２個のデサチュラーゼが、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中にクローン化され、ＬＡ、ＧＬＡ、ＡＬＡ、およびＳＴＡの生成をもたらす。
【００１１】
しかしこれらのタイプの遺伝子を発現させて、商業的量の１種もしくはそれ以上のＰＵＦＡの経済的生成を提供できる適切な微生物のシステムに対する必要性がなおもある。さらに特にＥＰＡおよびＤＨＡである特定のＰＵＦＡが濃縮されている油に対する必要性が存在する。
【００１２】
多くの微生物（藻類、細菌、カビ、および酵母菌をはじめとする）は、通常の細胞代謝経路内で油を合成できる。したがって油生成は、微生物を適切な培地中で培養して油を合成させ、引き続き微生物を発酵培地から分離して細胞内油の回収のために処理することを伴う。使用微生物、油生成を可能にする培地および条件などのパラメータを変化させることを伴う発酵手段（ｆｅｒｍｅｎｔｉｖｅ  ｍｅａｎｓ）によって、脂肪酸生成を最適化する試みがなされている。しかしこれらの努力は、油生成能を改善し、または生成する油組成物の特性を制御する能力において、ほとんど不成功であることが立証されている。
【００１３】
しかしＰＵＦＡの生成プラットフォームとしてこれまで調査されていない１つのクラスの微生物は、油性酵母菌である。これらの生物体は、乾燥細胞重量の８０％までの油を蓄積できる。高い油含量で油性酵母菌を生育させる技術は十分に開発されており（例えば特許文献１０、非特許文献１３を参照）、ω−３またはω−６ＰＵＦＡ生成のための商業的な微細藻類発酵と比べてコスト優位性を提供するかもしれない。そのままの酵母菌細胞はまた、機能食品および動物飼料サプリメントで使用するためのω−３またはω−６ＰＵＦＡ−濃縮油を封入する都合よい方法になるかもしれない。
【００１４】
【特許文献１】米国特許第４，６６６，７０１号明細書
【特許文献２】米国特許第４，７５８，５９２号明細書
【特許文献３】米国特許第５，１１６，８７１号明細書
【特許文献４】米国特許第４，８２６，８７７号明細書
【特許文献５】米国特許第５，６５８，７６７号明細書
【特許文献６】米国特許第５，２４４，９２１号明細書
【特許文献７】米国特許第５，４９２，９３８号明細書
【特許文献８】米国特許第５，４０７，９５７号明細書
【特許文献９】米国特許第６，１３６，５７４号明細書
【特許文献１０】欧州特許第０  ００５  ２７７Ｂ１号明細書
【非特許文献１】ダイヤーバーグ（Ｄｙｅｒｂｅｒｇ）Ｊ．ら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ．２８：９５８〜９６６  （１９７５）
【非特許文献２】ダイヤーバーグ（Ｄｙｅｒｂｅｒｇ）Ｊ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  ２（８０８１）：１１７〜１１９（１９７８年７月１５日）
【非特許文献３】シモカワ（Ｓｈｉｍｏｋａｗａ）Ｈ．、Ｗｏｒｌｄ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ  Ｄｉｅｔ、８８：１００〜１０８（２００１）
【非特許文献４】フォンシャッキー（ｖｏｎ  Ｓｃｈａｃｋｙ）Ｃ．およびダイヤーバーグ（Ｄｙｅｒｂｅｒｇ）Ｊ．、Ｗｏｒｌｄ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ  Ｄｉｅｔ、８８：９０〜９９  （２００１）
【非特許文献５】ブレナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）ら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．８３：８５〜１０１（１９７６）
【非特許文献６】ホロビン（Ｈｏｒｒｏｂｉｎ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．５７（付録）７３２Ｓ〜７３７Ｓ（１９９３）
【非特許文献７】クリス−エサートン（Ｋｒｉｓ−Ｅｔｈｅｒｔｏｎ）Ｐ．Ｍ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．７１（１  Ｓｕｐｐｌ．）：１７９Ｓ〜８８Ｓ（２０００）
【非特許文献８】シモプロス  （Ｓｉｍｏｐｏｕｌｏｓ）Ａ．Ｐ．ら、Ａｎｎ．Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂ．４３：１２７〜１３０（１９９９）
【非特許文献９】クラウズ（Ｋｒａｕｓｓ）Ｒ．Ｍ．ら、ＡＨＡ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０２：２２８４〜２２９９（２０００）
【非特許文献１０】ドマーグ（Ｄｏｍｅｒｇｕｅ）Ｆ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：４１０５〜４１１３（２００２）
【非特許文献１１】ボードイン（Ｂｅａｕｄｏｉｎ）Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７（１２）：６４２１〜６（２０００）
【非特許文献１２】ダイヤー（Ｄｙｅｒ）Ｊ．Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｉｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５９：２２４〜２３０（２００２）
【非特許文献１３】ラトレッジ（Ｒａｔｌｅｄｇｅ）Ｃ．、Ｐｒｏｇ．  Ｉｎｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １６：１１９〜２０６（１９８２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上述の利点にもかかわらず、油性酵母菌中の自然に生成されるＰＵＦＡは、１８：２脂肪酸（そしてあまり一般的ではなく１８：３脂肪酸）に限定されるので、これらの生物体は自然にはω−６およびω−３ＰＵＦＡを欠いている。したがって解決すべき問題は、ω−３および／またはω−６脂肪酸が濃縮された油を蓄積する油性酵母菌を開発することである。このような目的で、油性酵母菌におけるω−３および／またはω−６脂肪酸の合成および蓄積を可能にする、飽和化酵素およびエロンガーゼを導入することが必要である。遺伝子工学技術は進歩しているが、このような技術は油性酵母菌については開発されていない。したがってＰＵＦＡ生成のためのこれらの特定宿主生物体の使用に関連した問題を克服しなくてはならない。
【００１６】
出願人は、宿主ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において、異種性ω−６および／またはω−３生合成経路の導入に続くＰＵＦＡの生成を実証することで、既述の問題を解決した。具体的にはＡＲＡ（代表的なω−６脂肪酸）およびＥＰＡ（代表的なω−３脂肪酸）をここで生成して本発明技術を例証する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、ω−３および／またはω−６脂肪酸生成のために、油性酵母菌宿主においてω−３／ω−６脂肪酸生合成経路を含んでなる酵素の発現方法を提供する。したがって本発明は、
ａ）機能的なω−３／ω−６脂肪酸生合成経路を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を発酵可能な炭素源の存在下で生育させて、ω−３またはω−６脂肪酸が生成され、
ｃ）場合によりω−３またはω−６脂肪酸を回収すること
を含んでなる、ω−３および／またはω−６脂肪酸の生成方法を提供する。
【００１８】
特定の一実施態様では、本発明は、
ａ）（ｉ）Δ１２デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子、および
（ｉｉ）オレイン酸の内在性供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な発酵可能な炭素源の存在下で生育させて、Δ１２デサチュラーゼポリペプチドをコードする前記遺伝子を発現させそしてオレイン酸をリノール酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のリノール酸回収すること
を含んでなるリノール酸の生成方法を提供する。
【００１９】
特定の実施態様では、本発明は、新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）生合成または適切な前駆物質からの一段階酵素反応によって、リノール酸（ＬＡ）、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）、ジホモ−γ−リノール酸（ＤＧＬＡ）、およびアラキドン酸（ＡＲＡ）などの特定のω−６脂肪酸の生成を提供する。同様に本発明は、適切な前駆物質からの一段階酵素反応によって、α−リノール酸（ＡＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＴＡ）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、およびドコサヘキサエン酸などの特定のω−３脂肪酸の生成を提供する。
【００２０】
配列説明
本願明細書の一部を形成する以下の詳細な説明および添付の配列説明によって、本発明をより完全に理解できるであろう。
【００２１】
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ  −  ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
【００２２】
配列番号１は、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列を示し、他方配列番号２は、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼのアミノ酸配列を示す。
【００２３】
配列番号３は、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列を示し、他方配列番号４は、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼのアミノ酸配列を示す。
【００２４】
配列番号５は、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列を示し、他方配列番号６は対応するＳ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼのアミノ酸配列を示す。
【００２５】
配列番号７は、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）
高親和力エロンガーゼ遺伝子のＤＮＡ配列を示し、他方配列番号８は、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）高親和力エロンガーゼのアミノ酸配列を示す。
【００２６】
配列番号９は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中における発現のために最適化された、合成Δ１７デサチュラーゼ遺伝子コドンのＤＮＡ配列を示す。
【００２７】
配列番号１０〜３１は、１１対のオリゴヌクレオチドに対応し、それは一緒に、Ｓ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ遺伝子の全コドン最適化コード領域（例えばそれぞれＤ１７−１Ａ、Ｄ１７−１Ｂ、Ｄ１７−２Ａ、Ｄ１７−２Ｂ、Ｄ１７−３Ａ、Ｄ１７−３Ｂ、Ｄ１７−４Ａ、Ｄ１７−４Ｂ、Ｄ１７−５Ａ、Ｄ１７−５Ｂ、Ｄ１７−６Ａ、Ｄ１７−６Ｂ、Ｄ１７−７Ａ、Ｄ１７−７Ｂ、Ｄ１７−８Ａ、Ｄ１７−８Ｂ、Ｄ１７−９Ａ、Ｄ１７−９Ｂ、Ｄ１７−１０Ａ、Ｄ１７−１０Ｂ、Ｄ１７−１１Ａ、およびＤ１７−１１Ｂ）を構成する。
【００２８】
配列番号３２〜３７は、コドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子の合成中にＰＣＲ増幅のために使用される、プライマーＤ１７−１、Ｄ１７−４Ｒ、Ｄ１７−５、Ｄ１７−８Ｄ、Ｄ１７−８Ｕ、およびＤ１７−１１にそれぞれ対応する。
【００２９】
配列番号３８および３９は、ＴＥＦプロモーターを単離するのに使用される、プライマーＴＥＦ５’およびＴＥＦ３’にそれぞれ対応する。
【００３０】
配列番号４０および４１は、ＸＰＲ２転写ターミネーターを単離するのに使用される、プライマーＸＰＲ５’およびＸＰＲ３’にそれぞれ対応する。
【００３１】
配列番号４２および４３は、プラスミドｐＲＳＰ１９から、Ｓ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）の野生型Δ１７デサチュラーゼ遺伝子を増幅するのに使用される、プライマーＹＬ２１ＡおよびＹＬ２２に対応する。
【００３２】
配列番号４４および４５は、ｐＹＳＤ１７Ｍを生じさせるための部位特異的変異誘発のために使用される、プライマーＹＬ５３およびＹＬ５４にそれぞれ対応する。
【００３３】
配列番号４６および４７は、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＵＲＡ３遺伝子を含有する１．７ｋＢのＤＮＡ断片（配列番号４８、配列番号４９としてアミノ酸配列を提供する）を増幅するのに使用される、プライマーＫＵ５およびＫＵ３にそれぞれ対応する。
【００３４】
配列番号５０および５１は、ホウセンカ（Ｉｍｐａｔｉｅｎｓ  ｂａｌｓａｍａ）コンジュガーゼ遺伝子を含有する１．１ｋＢのＤＮＡ断片（配列番号５２、アミノ酸配列は配列番号５３として提供）を増幅するのに使用される、プライマーＫＩ５およびＫＩ３にそれぞれ対応する。
【００３５】
配列番号５４および５５は、ＴＥＦ：：コンジュガーゼ：：ＸＰＲキメラ遺伝子を含有する１．７ｋＢのＤＮＡ断片（配列番号５６、アミノ酸配列は配列番号５７として提供）を増幅するのに使用される、プライマーＫＴＩ５およびＫＴＩ３にそれぞれ対応する。
【００３６】
配列番号５８および５９は、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ハイグロマイシン抵抗性遺伝子を含有する１ｋＢのＤＮＡ断片（配列番号６０、アミノ酸配列は配列番号６１として提供）を増幅するのに使用される、プライマーＫＨ５およびＫＨ３にそれぞれ対応する。
【００３７】
配列番号６２および６３は、ＴＥＦ：：ＨＰＴ：：ＸＰＲ融合遺伝子を含有する１．６
ｋＢのＤＮＡ断片（配列番号６４、アミノ酸配列は配列番号６５として提供）を増幅するのに使用される、プライマーＫＴＨ５およびＫＴＨ３にそれぞれ対応する。
【００３８】
配列番号６６および６７は、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムのＵｒａ遺伝子座中への発現カセットの組み込みを導くのに使用される、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＵＲＡ３遺伝子の４０１ｂｐの５’配列および５６８ｂｐの３’配列にそれぞれ対応する。
【００３９】
配列番号６８〜７１は、ｐＹ２４−４を生じさせる部位特異的変異誘発のために使用される、プライマーＹＬ６３、ＹＬ６４、ＹＬ６５、およびＹＬ６６にそれぞれ対応する。
【００４０】
配列番号７２および７３は、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼを増幅するために使用される、プライマーＹＬ１１およびＹＬ１２にそれぞれ対応する。
【００４１】
配列番号７４〜７７は、ｐＹＺＭ５ＣＨを生じさせる部位特異的変異誘発のために使用される、プライマーＹＬ８１、ＹＬ８２、ＹＬ８３、およびＹＬ８４にそれぞれ対応する。
【００４２】
配列番号７８および７９は、ｐＹＺＭ５ＣＨＰＰを生じさせる部位特異的変異誘発のために使用される、プライマーＹＬ１０５およびＹＬ１０６にそれぞれ対応する。
【００４３】
配列番号８０および８１は、ｐＹＺＭ５ＣＨＰＰＡを生じさせる部位特異的変異誘発のために使用される、プライマーＹＬ１１９およびＹＬ１２０にそれぞれ対応する。
【００４４】
配列番号８２および８３は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＵＲＡ３遺伝子上流の４４０ｂｐの５’−非翻訳ＤＮＡ配列（配列番号８４）を増幅するために使用される、プライマーＹＬ１２１およびＹＬ１２２にそれぞれ対応する。
【００４５】
配列番号８５および８６は、ｐＹＺＶ５およびｐＹＺＶ５Ｐを生じさせる部位特異的変異誘発のために使用される、プライマーＹＬ１１４およびＹＬ１１５にそれぞれに対応する。
【００４６】
配列番号８７は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノム中へのＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼ遺伝子の組み込みおよび発現に適した５．２ｋＢのＤＮＡ断片に対応する。
【００４７】
配列番号８８〜９１は、ｐＹ５８ＢＨを生じさせる部位特異的変異誘発のために使用される、プライマーＹＬ６１、ＹＬ６２、ＹＬ６９、およびＹＬ７０にそれぞれ対応する。
【００４８】
配列番号９２〜９５は、ｐＹ５４ＰＣを生じさせる部位特異的変異誘発のために使用される、プライマーＹＬ７７、ＹＬ７８、ＹＬ７９ＡおよびＹＬ８０Ａにそれぞれ対応する。
【００４９】
配列番号９６は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノム中におけるＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼ、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼ、およびＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼ遺伝子の組み込みおよび協調発現に適する８．９ｋＢのＤＮＡ断片に対応する。
【００５０】
配列番号９７〜１００は、ｐＹＳＤ１７ＳＰＣを生じさせる部位特異的変異誘発のため
に使用される、プライマーＹＬ１０１、ＹＬ１０２、ＹＬ１０３、およびＹＬ１０４にそれぞれ対応する。
【００５１】
配列番号１０１は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノム中におけるＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼ、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼ、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼ、およびコドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子の組み込みおよび協調発現に適する１０．３ｋＢのＤＮＡ断片に対応する。
【００５２】
配列番号１０２〜１１３は、プラスミド構築のために使用される、プライマーＹＬ１、ＹＬ２、ＹＬ３、ＹＬ４、ＹＬ５、ＹＬ６、ＹＬ７、ＹＬ８、ＹＬ９、ＹＬ１０、ＹＬ２３、およびＹＬ２４にそれぞれ対応する。
【００５３】
配列番号１１４は、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）Δ５デサチュラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列を示し、他方配列番号１１５は、Ｓ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）Δ５デサチュラーゼのアミノ酸配列を示す。
【００５４】
配列番号１１６、１１７、１２０、１２１、１２４、および１２５は、様々なΔ５デサチュラーゼをクローニングするのに使用されるプライマーＹＬ１３Ａ、ＹＬ１４、ＹＬ１９Ａ、ＹＬ２０、ＹＬ１５、およびＹＬ１６Ｂにそれぞれ対応する。
【００５５】
配列番号１１８は、ハプト藻（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）Δ５デサチュラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列を示し、他方配列番号１１９は、ハプト藻（Ｉ．ｇａｌｂａｎａ）Δ５デサチュラーゼのアミノ酸配列を示す。
【００５６】
配列番号１２２は、ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ）Δ５デサチュラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列を示し、他方配列番号１２３は、ヤブレツボカビ（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）Δ５デサチュラーゼのアミノ酸配列を示す。
【００５７】
配列番号１２６は、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種中で最適に発現する遺伝子のためのコドン最適化翻訳開始部位に対応する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５８】
主題発明に従って、出願人は油性酵母菌におけるω−３および／またはω−６脂肪酸の生成方法を提供する。具体的には、出願人は、リノール酸、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸の生成方法を提供する。これは組換えの発現のために、油性酵母菌宿主中にΔ１７デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、およびエロンガーゼ活性を与える遺伝子によってコードされる、機能的なω−３／ω−６脂肪酸生合成経路を導入することで達成される。したがってこの開示は油性酵母菌を遺伝子操作して、所望されるあらゆるＰＵＦＡ組成物の生成を可能にできることを実証する。
【００５９】
主題発明には多くの用途がある。ここで開示される方法によって製造されるＰＵＦＡ、またはその誘導体は、食餌代用品、またはサプリメント、特に乳児用調製粉乳として、静脈内栄養補給を受けている患者のために、または栄養不良を防止または処置するために使用できる。代案としては、精製されたＰＵＦＡ（またはその誘導体）は、正常な使用で受領者が食餌栄養補給のための所望量を受容するように調合された、料理用油、脂肪またはマーガリンに組み込まれてもよい。ＰＵＦＡはまた、乳児用調製粉乳、栄養サプリメント
またはその他の食物生成物に組み込まれてもよく、抗炎症薬またはコレステロール低下剤としての用途があるかもしれない。場合により組成物は、医薬品用途（ヒトまたは獣医学）のために使用されてもよい。この場合、ＰＵＦＡは概して経口投与されるが、例えば非経口的（例えば皮下、筋肉内または静脈内）、経直腸、経腟または局所的（例えば皮膚用軟膏またはローションとして）など、それによって成功裏に吸収されるあらゆる経路で投与することができる。
【００６０】
組換え手段によって製造されたＰＵＦＡによるヒトまたは動物の栄養補給は、追加的なＰＵＦＡ、ならびにそれらの代謝子孫の増大したレベルをもたらすことができる。例えばアラキドン酸（ＡＲＡ）による処置は、ＡＲＡの増大したレベルだけでなく、プロスタグランジンなどのＡＲＡの下流生成物をももたらすことができる。複雑な制御機序は、このような機序を防止、制御または克服して、個々の特定のＰＵＦＡの所望のレベルを達成するために、様々なＰＵＦＡを組み合わせ、または異なるＰＵＦＡコンジュゲートを追加することを望ましいものにできる。
【００６１】
定義
本開示では、いくつかの用語および略語が使用される。以下の定義が提供される。
【００６２】
「読み取り枠」はＯＲＦと略記する。
【００６３】
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略記する。
【００６４】
「米国微生物系統保存機関」はＡＴＣＣと略記する。
【００６５】
「多不飽和脂肪酸」はＰＵＦＡと略記する。
【００６６】
「脂肪酸」という用語は、（より長い、およびより短い鎖長の酸の双方も知られているが）約Ｃ１２〜Ｃ２２の様々な鎖長の長鎖脂肪族酸（アルカン酸）を指す。優勢な鎖長は、Ｃ１６〜Ｃ２２の間である。脂肪酸の構造は単純な表記法システム「Ｘ：Ｙ」によって表され、ここでＸは炭素（Ｃ）原子の総数であり、Ｙは二重結合の数である。
【００６７】
概して脂肪酸は、飽和または不飽和として分類される。「飽和脂肪酸」という用語は、炭素主鎖間に「二重結合」を有さない脂肪酸を指す。対照的に「不飽和脂肪酸」は、それらの炭素主鎖に沿って「二重結合」を有するｃｉｓ−異性体である。「一不飽和脂肪酸」は、（例えばパルミトレイン酸（１６：１）およびオレイン酸（１８：１）のように通常９および１０番目の炭素原子の間に）炭素主鎖に沿って１つの「二重結合」のみを有し、他方「多不飽和脂肪酸」（または「ＰＵＦＡ」）は、（例えばリノール酸（１８：２）のように９番目および１０番目、および１２番目および１３番目の炭素原子間、およびα−リノレン酸（１８：３）のように９番目および１０番目、１２番目および１３番目目、および１５番目および１６番目の炭素原子間に）炭素主鎖に沿って少なくとも２個の二重結合を有する。
【００６８】
「ＰＵＦＡ」は、（脂肪酸炭素鎖のメチル末端に最も近い第１の二重結合の位置（ｎ）次第で）２つの主要ファミリーに分類できる。したがって「ω−６脂肪酸」（ω−６またはｎ−６）は、第１の不飽和二重結合を分子のω（メチル）末端から６個めの炭素原子に有し、さらに分子のカルボキシル末端に向かって３個めの追加的な炭素原子にそれぞれの続く不飽和がある、全部で２つ以上の二重結合を有する。対照的に「ω−３脂肪酸」（ω−３またはｎ−３）は、第１の不飽和二重結合を分子のω末端から３個離れた炭素原子に有し、さらに分子のカルボキシル末端に向かって３個目の追加的な炭素原子にそれぞれの続く不飽和がある、全部で３個以上の二重結合を有する。
【００６９】
本開示の目的のために、ω参照システムを使用して、炭素数、二重結合数、およびω炭素（この目的では１番目とする）から数えたω炭素に最も近い二重結合の位置を示す。この命名法を下の表１で、「省略表記法」と題された欄に示す。表の残りは、ω−３およびω−６脂肪酸の共通の名称、明細書全体で使用される略語、および各化合物の化学名をまとめる。
【００７０】
【表１】
2007504839.tif 000003
【００７１】
「必須脂肪酸」と言う用語は、生物体が特定の必須脂肪酸を新規に（ｄｅ  ｎｏｖｏ）合成できないことから、生きるために摂取しなくてはならない特定のＰＵＦＡを指す。例えば、哺乳類は必須脂肪酸ＬＡ（１８：２、ω−６）を合成できない。その他の必須脂肪酸としては、ＧＬＡ（ω−６）、ＤＧＬＡ（ω−６）、ＡＲＡ（ω−６）、ＥＰＡ（ω−３）、およびＤＨＡ（ω−３）が挙げられる。
【００７２】
「脂肪」と言う用語は、２５℃で固体であり、通常、飽和である脂質物質を指す。
【００７３】
「油」と言う用語は、２５℃で液体であり、通常、多不飽和である脂質物質を指す。Ｐ
ＵＦＡは、いくつかの藻類、油性酵母菌および糸状菌の油に見られる。「微生物油」または「単細胞油」は、微生物がそれらの寿命中に自然に生成する油である。このような油は長鎖ＰＵＦＡを含有することができる。
【００７４】
「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」と言う用語は、ＰＵＦＡの生合成に関連した以下の酵素（および前記酵素をコードする遺伝子）のいずれかを指す。Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、および／またはエロンガーゼ。
【００７５】
「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」と言う用語は、適切な条件下で発現すると、ω−３およびω−６脂肪酸の片方または双方の生成を触媒する酵素をコードする一組の遺伝子を指す。典型的にω−３／ω−６脂肪酸生合成経路に関与する遺伝子は、以下の酵素のいくつかまたは全てをコードする。Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、およびΔ４デサチュラーゼ。共通の供給源からいかにしてω−３およびω−６脂肪酸の双方が生成できるかを実証する代表的な経路を図２に示す。「機能性」と言う用語は、ここでω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の文脈における用法では、経路中の遺伝子のいくつかまたは全てが活性酵素を発現することを意味する。いくつかの脂肪酸生成物はこの経路の遺伝子のサブセットの発現のみを必要とするので、「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」または「機能的なω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」は、この段落に列挙する全ての遺伝子が必要であることを暗示しないものとする。
【００７６】
「デサチュラーゼ」と言う用語は、１種もしくはそれ以上の脂肪酸を不飽和化して関心のある一不飽和または多不飽和脂肪酸または前駆物質を生成できる、多酵素複合体のポリペプチド構成要素を指す。特定の脂肪酸を指すために、本願明細書全体を通じてω参照システムを使用するのにもかかわらず、Δシステムを使用して基質のカルボキシル末端から数えることで、デサチュラーゼの活性を示す方が都合よい。ここで特に関心が高いのは、１．）分子のカルボキシル末端から数えて１７番目および１８番目の炭素原子間で脂肪酸を不飽和化し、例えばＡＲＡからＥＰＡへのおよび／またはＤＧＬＡからＥＴＡへの転換を触媒するΔ１７デサチュラーゼ、２．）ＬＡからＧＬＡへのおよび／またはＡＬＡからＳＴＡへの転換を触媒するΔ６デサチュラーゼ、３．）ＤＧＬＡからＡＲＡへのおよび／またはＥＴＡからＥＰＡへの転換を触媒するΔ５デサチュラーゼ、４．）ＤＰＡからＤＨＡへの転換を触媒するΔ４デサチュラーゼ、５．）オレイン酸からＬＡへの転換を触媒するΔ１２デサチュラーゼ、６．）ＬＡからＡＬＡへの転換を触媒するΔ１５デサチュラーゼ、および７．）パルミチン酸からパルミトレイン酸（１６：１）および／またはステアリン酸からオレイン酸（１８：１）への転換を触媒するΔ９デサチュラーゼである。
【００７７】
「エロンガーゼ」と言う用語は、脂肪酸炭素鎖を伸長して、エロンガーゼが作用した脂肪酸基質よりも炭素２個分長い一不飽和または多不飽和脂肪酸が生成できる、多酵素複合体のポリペプチド構成要素を指す。この延長プロセスは、ＣｏＡがアシルキャリアである脂肪酸合成酵素と関連した多段階機序で起きる（ラスナー（Ｌａｓｓｎｅｒ）ら、Ｔｈｅ
Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ８：２８１〜２９２（１９９６））。手短に述べると、マロニル−ＣｏＡが長鎖アシル−ＣｏＡと縮合して、ＣＯ２およびβ−ケトアシル−ＣｏＡ（アシル部分が炭素原子２個分伸長された）を生じる。引き続く反応には、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡへの還元、エノイル−ＣｏＡへの脱水、および伸長されたアシル−ＣｏＡを生じる第２の還元が含まれる。エロンガーゼによって触媒される反応の例は、ＧＬＡからＤＧＬＡ、ＳＴＡからＥＴＡ、およびＥＰＡからＤＰＡへの転換である。したがってエロンガーゼは、異なる特異性を有することができる（例えばＣ１６／１８エロンガーゼはＣ１６基質を好み、Ｃ１８／２０エロンガーゼはＣ１８基質を好み、Ｃ２０／２２エロンガーゼはＣ２０基質を好む）。
【００７８】
「高親和力エロンガーゼ」と言う用語は、その基質特異性が、好ましくはＧＬＡに向けたものである（エロンガーゼ反応の生成物としてのＤＧＬＡを伴う）エロンガーゼを指す。このようなエロンガーゼの１つについて、国際公開第００／１２７２０号パンフレットで述べられている。
【００７９】
「変換効率」および「％基質変換」と言う用語は、それによって特定の酵素（例えばデサチュラーゼまたはエロンガーゼ）が基質から生成物に変換できる効率を指す。変換効率は以下の式に従って測定される。（［生成物］／［基質＋生成物］）×１００（式中、「生成物」には即時の生成物およびそれから誘導される経路中の全生成物が含まれる）。
【００８０】
「油性」と言う用語は、それらのエネルギー源を脂質の形態で保存する傾向がある生物体を指す（ウィーテ（Ｗｅｅｔｅ）「真菌脂質生化学（Ｆｕｎｇａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」第二版、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）、１９８０）。概してこれらの微生物の細胞ＰＵＦＡ含量はＳ字形曲線に従い、対数後期または初期定常増殖相において脂質濃度が最大に達するまで増大し、次に後期定常および死滅期中に徐々に減少する（ヨンマニットチャイ（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ）およびワード（Ｗａｒｄ）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：４１９〜２５（１９９１））。
【００８１】
「油性酵母菌」と言う用語は、少なくとも２５％のそれらの乾燥細胞重量を油として蓄積できる酵母菌として分類される微生物を指す。油性酵母菌の例としては、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられるが、決してこれに限定されるものではない。
【００８２】
「発酵可能な炭素源」と言う用語は、微生物が代謝してエネルギーを引き出す炭素源を意味する。本発明の典型的な炭素源としては、単糖類、少糖類、多糖類、アルカン、脂肪酸、脂肪酸のエステル、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、および炭素含有アミンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８３】
ここでの用法では、「単離された核酸断片」は、場合により合成、非天然または修飾ヌクレオチド塩基を含有する一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡポリマーの形態の単離された核酸断片は、１つまたはそれ以上のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの断片を含んでなってもよい。
【００８４】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「かなりの部分」とは、当業者による配列の手動評価によって、あるいはＢＬＡＳＴ（「基礎的局在性整列化検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）」、アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９３））などのアルゴリズムを使用したコンピュータ支援配列比較および同定によって、遺伝子またはポリペプチドの推定上の同定を得るのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなる部分である。推定的にポリペプチドまたは核酸配列が既知のタンパク質または遺伝子に相同的であると同定するためには、概して１０個以上の隣接するアミノ酸または３０個以上のヌクレオチド配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、２０〜３０個の隣接するヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを配列依存遺伝子同定法（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージ・プラークの原位置（ｉｎ  
ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション）において使用してもよい。さらにプライマーを含んでなる特定の核酸断片を得るために、塩基１２〜１５個の短いオリゴヌクレオチドをＰＣＲで増幅プライマーとして使用してもよい。したがってヌクレオチド配列の「かなりの部分」は、配列を含んでなる核酸断片を特異的に同定および／または単離できるようにする十分な配列を含んでなる。
【００８５】
「相補的」と言う用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係について述べるために用いられる。例えばＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。
【００８６】
「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響しないヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝子コードの性質を指す。当業者は、特定のアミノ酸を特定化するヌクレオチドコドンの使用における、特定の宿主細胞によって示される「コドン−バイアス」についてよく知っている。したがって宿主細胞中の改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好むコドン使用頻度に近くなるように遺伝子をデザインすることが望ましい。
【００８７】
「化学的に合成された」とは、ＤＮＡ配列に関連して構成要素ヌクレオチドが、生体外で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）構築されたことを意味する。ＤＮＡの手動化学合成は確立した手順を使用して達成されてもよく、あるいはいくつかの市販の機器の１つを使用して自動化学合成を実施できる。「合成遺伝子」は、当業者に知られる手順を使用して、化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成単位から構築できる。これらの構成単位をライゲートしアニールして、遺伝子断片を形成し、次にそれを酵素的に構築して所望の遺伝子全体を構成する。したがって遺伝子をヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のために調整し、宿主細胞のコドンバイアスを反映させることができる。当業者は、コドン利用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合の遺伝子発現成功の見込みを理解する。好ましいコドンの判定は、配列情報が利用できる宿主細胞から誘導される遺伝子の調査に基づくことができる。
【００８８】
「遺伝子」とは、コード配列に先行する（５’非コード配列）およびそれに続く（３’非コード配列）制御配列をはじめとする、特定のタンパク質を発現する核酸断片を指す。「天然遺伝子」とは、自然界にそれ自体の制御配列と共に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界に共に見られない制御およびコード配列を含んでなる天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる供給源から誘導される制御配列およびコード配列、あるいは同一供給源から誘導されるが、自然界に見られるのとは異なるやり方で配列される制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内在性の遺伝子」とは、生物体ゲノムにおいてその天然位置にある天然遺伝子を指す。「外来性の」遺伝子とは、宿主生物体において常態では見られないが、遺伝子移入によって宿主生物体に導入される遺伝子を指す。外来性の遺伝子は、非天然生物体中に挿入された天然遺伝子、あるいはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」とは、形質転換によってゲノム中に導入される遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」とは、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好むコドン使用頻度を模倣するようにデザインされる遺伝子である。
【００８９】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な調節配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列内、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、およびステム−ループ構造を含んでもよい。
【００９０】
「プロモーター」とは、コード配列または機能ＲＮＡの発現を調節できるＤＮＡ配列を指す。概してコード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターは、そっくりそのまま天然遺伝子から誘導されてもよく、あるいは自然界に見られる異なるプロモーターから誘導される異なる要素からなってもよく、あるいは合成ＤＮＡセグメントを含んでなってさえよい。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞タイプ中で、あるいは異なる発達段階において、あるいは異なる環境または生理学的条件に呼応して、遺伝子の発現を導いてもよいことが当業者には理解される。ほとんどの細胞タイプ中でほとんどの場合に遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構成プロモーター」と称される。ほとんどの場合、制御配列のはっきりした境界は完全に限定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有してもよいこともさらに認識される。
【００９１】
「３’非翻訳配列」または「転写ターミネーター」と言う用語は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これには、ｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響できる調節シグナルをコードするポリアデニル化認識配列およびその他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆物質の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響することで特性決定される。３’領域は、転写、ＲＮＡプロセッシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響できる。
【００９２】
「ＲＮＡ転写物」とは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼが触媒する転写から得られる生成物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と称され、あるいはそれは一次転写物の転写後プロセッシングから誘導されるＲＮＡ配列であるかもしれず、成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」とはイントロンがなく、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに対して相補的であり、それから誘導される二重鎖ＤＮＡを指す。「センスＲＮＡ」とは、ｍＲＮＡを含み、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的であり、標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１７０，０６５号明細書、国際公開第９９／２８５０８号パンフレット）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物のあらゆる部分、すなわち５’非コード配列、３’非コード配列、またはコード配列にあっても良い。「機能ＲＮＡ」とは、翻訳されないがそれでもなお細胞過程に影響するアンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、またはその他のＲＮＡを指す。
【００９３】
「作動可能に連結した」と言う用語は、１つの機能が他方の機能によって影響される、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターはコード配列の発現に影響できる場合、そのコード配列と作動可能に連結する（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節の下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンスオリエンテーションで制御配列に作動可能に連結できる。
【００９４】
「発現」と言う用語は、ここでの用法では、本発明の核酸断片から誘導されるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指してもよい。
【００９５】
「形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、宿主生物体中への核酸分子の転移を指す。核酸分子は、例えば自律的に複製するプラスミドであってもよく、またはそれは宿主生物体のゲノム中に組み込まれてもよい。形質転換核酸断片を含有する宿主生物体は、「遺伝子組換え」または「組換え」または「形質転換」生物体と称される。
【００９６】
「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」と言う用語は、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外因子を指す。このような因子は、あらゆる供給源から誘導される一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの配列、ゲノム一体化配列、直鎖または環状のファージまたはヌクレオチド配列を自律的に複製するかもしれず、そこではいくつかのヌクレオチド配列が独自の構成に連結または組み換えされ、それは選択された遺伝子産物のために、適切な３’非翻訳配列と共にプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞中に導入することができる。「形質転換カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする因子を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて外来性宿主におけるその遺伝子の促進された発現を可能にする因子を有する特定のベクターを指す。
【００９７】
「配列分析ソフトウェア」と言う用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のために有用なあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものでも、あるいは独立して開発されても良い。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、１．）ウィスコンシン州マディソンのジェネティック・コンピュータ・グループからのＧＣＧパッケージプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（アルシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０））、および３．）ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、４．）ミシガン州アンアーバーのジーン・コーズ社（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ））からのシーケンチャー（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）、および５．）スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）・アルゴリズムを組み入れたＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）著、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４）、１９９２年会議、１１１〜２０、編集者：スハイ，サンドール（Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ）、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）、ニューヨーク州ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ））が挙げられるが、これに限定されるものではない。本願明細書の文脈内では、配列分析ソフトウェアを分析のために使用する場合、分析結果は特に断りのない限り、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。ここでの用法では、「デフォルト値」とは、最初に初期化されたときにソフトウェアに元々ロードされた、あらゆる値またはパラメータの組を意味する。
【００９８】
ここで使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は技術分野で良く知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」第二版、コールドスプリングハーバーラボラトリ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）（１９８９）（以下マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））；シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）Ｔ．Ｊ．、ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）Ｍ．Ｌ．およびエンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）Ｌ．Ｗ．「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）」コールドスプリングハーバーラボラトリ：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）（１９８４）；およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）Ｆ．Ｍ．ら「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」グリーンパブリッシングアッソシエーツ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．）およびワイリーインターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）による出版（１９８７）で述べられている。
【００９９】
脂肪酸の微生物生合成
一般に油性微生物中の脂質の蓄積は、増殖培地中に存在する全体的な炭素と窒素の比率に応答してトリガーされる（図１）。細胞が利用できる窒素供給を消耗した場合（例えば炭素と窒素の比率が約４０を超える場合）、細胞アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）の枯渇は、ミトコンドリア中のＡＭＰ−依存イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性の休止、およびクエン酸の蓄積、クエン酸の細胞質ゾル内への輸送、そして引き続くＡＴＰ−クエン酸リアーゼによるクエン酸の切断をもたらして、アセチル−ＣｏＡおよびオキサロ酢酸が生成する。アセチル−ＣｏＡは、脂肪酸の新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）生合成の主要（ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）構成ブロックである。効果的に代謝されてアセチル−ＣｏＡを生成できるあらゆる化合物が、脂肪酸前駆物質の役割を果たせるが、このタイプの反応ではグルコースが炭素の主な供給源である（図１）。グルコースは解糖を通じてピルビン酸に変換され、次にピルビン酸はミトコンドリア中に輸送され、そこでピルビン酸デヒドロゲナーゼ（「ＰＤ」）によってアセチル−ＣｏＡに変換される。アセチル−ＣｏＡはミトコンドリア膜を越えて細胞質中に直接輸送できないので、アセチル−ＣｏＡからの２個の炭素がオキサロ酢酸と縮合して、クエン酸を生成する（クエン酸合成酵素によって触媒される）。クエン酸は細胞質内に直接輸送されて、そこでにＡＴＰ−クエン酸リアーゼによって切断され、アセチル−ＣｏＡおよびオキサロ酢酸が再生する。オキサロ酢酸は、リンゴ酸への転換を通じて、トリカルボン酸サイクルに再び入る。
【０１００】
マロニル−ＣｏＡの合成は、細胞質内で起きる脂肪酸生合成の第１の前駆ステップである。マロニル−ＣｏＡは、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（「ＡＣＣ」）によって、アセチル−ＣｏＡのカルボキシル化を通じて生成される。脂肪酸合成は、多酵素脂肪酸合成酵素複合体（「ＦＡＳ」）によって触媒され、８個の二炭素断片（アセチル−ＣｏＡからのアセチル基）の縮合によって起き、炭素１６個の飽和脂肪酸であるパルミチン酸が形成する。より具体的には、ＦＡＳは以下が関与する一連の７つの反応を触媒する（スミス（Ｓｍｉｔｈ）Ｓ．、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、８（１５）：１２４８〜５９（１９９４））。１．アセチル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡがＦＡＳのアシルキャリアペプチド（ＡＣＰ）に転移される。次にアセチル基がマロニル基に転移されてβ−ケトブチリル−ＡＣＰが形成し、ＣＯ２を放出する。
２．β−ケトブチリル−ＡＣＰが還元（β−ケトアシル還元酵素による）および脱水（β−ヒドロキシアシルデヒドラターゼによる）を被り、トランス−単不飽和脂肪アシル基が形成する。
３．二重結合がＮＡＤＰＨによって還元され、最初のものよりも炭素が２個分長い飽和脂肪−アシル基が生じる。次に新しいマロニル基と縮合して延長プロセスを繰り返すブチリル基の能力が再生する。
４．脂肪アシル基が炭素１６個の長さになったら、チオエステラーゼ活性がそれを加水分解して遊離パルミチン酸を放出する。
【０１０１】
パルミチン酸（１６：０）は、小胞体膜に存在するエロンガーゼおよびデサチュラーゼの作用を通じた、より鎖長が長い飽和および不飽和脂肪酸（例えばステアリン酸（１８：０）、パルミトレイン酸（１６：１）、およびオレイン酸（１８：１））の前駆物質である。パルミチン酸およびステアリン酸は、Δ９デサチュラーゼの作用によってそれらの不飽和誘導体であるパルミトレイン酸（１６：１）およびオレイン酸（１８：１）酸にそれぞれ変換する。
【０１０２】
トリアシルグリセロール（脂肪酸の主な貯蔵単位）は、リン酸１，２−ジアシルグリセロール（一般にホスファチジン酸として同定される）を生じる、アシル−ＣｏＡの２個の分子からグリセロール−３−リン酸へのエステル化によって形成される（図１）。次にホ
スファチジン酸ホスファターゼによってリン酸が除去され、１，２−ジアシルグリセロールが生成する。第３の脂肪酸を添加すると、ジアシルグリセロール−アシルトランスフェラーゼの作用によってトリアシルグリセロールが形成する。
【０１０３】
Ω−３およびΩ−６脂肪酸の生合成
非常に単純化すると、ＬＡをＧＬＡ、ＤＧＬＡ、およびＡＲＡ（ω−６経路）に、ＡＬＡをＳＴＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、およびＤＨＡ（ω−３経路）に変換する代謝プロセスは、炭素原子の付加を通じた炭素鎖の延長と、二重結合の添加を通じた分子の不飽和化を伴う（図２）。これは小胞体膜に存在する一連の特別な不飽和化および延長酵素を必要とする。
【０１０４】
ω−６脂肪酸
オレイン酸は、Δ１２デサチュラーゼの作用によって、最初のω−６脂肪酸であるＬＡ（１８：２）に変換される。引き続くω−６脂肪酸は、次のようにして生成される。１．）ＬＡがΔ６デサチュラーゼ活性によってＧＬＡに変換され、２．）ＧＬＡがエロンガーゼの作用によってＤＧＬＡに変換され、３．）ＤＧＬＡがΔ５デサチュラーゼの作用によってＡＲＡに変換される。
【０１０５】
ω−３脂肪酸
リノール酸（ＬＡ）は、Δ１５デサチュラーゼの作用によって、最初のω−３脂肪酸であるＡＬＡに変換される。引き続くω−３脂肪酸は、ω−６脂肪酸と類似した一連のステップで生成される。具体的には、１．）ＡＬＡがΔ６デサチュラーゼ活性によってＳＴＡに変換され、２．）ＳＴＡがエロンガーゼ活性によってＥＴＡに変換され、３．）ＥＴＡがΔ５デサチュラーゼ活性によってＥＰＡに変換される。代案としては、ＥＴＡおよびＥＰＡは、Δ１７デサチュラーゼ活性によって、ＤＧＬＡおよびＡＲＡからそれぞれ生成できる。ＥＰＡは、エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼ活性によって、ＤＨＡにさらに変換できる。
【０１０６】
Ω脂肪酸生成に関与する遺伝子
藻類、細菌、カビおよび酵母菌をはじめとする多くの微生物は、通常の細胞代謝経路内でＰＵＦＡおよびω脂肪酸を合成できる。特によく適するのは、ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の種であるスキゾキトリウム・アグレガトム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｇｇｒｅｇａｔｍ）、およびモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｅｒｉｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）をはじめとする菌・カビ類である。さらに多くの渦鞭毛藻類（渦鞭毛藻綱（Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａａｅ））は、高濃度のＰＵＦＡを自然に生成する。したがって油生成に関与する多様な遺伝子が遺伝的手段を通じて同定されており、これらのいくつかの遺伝子のＤＮＡ配列は公的に入手できる（制限を意図しない例を下の表２に示す）。
【０１０７】
【表２】
2007504839.tif 000004
【０１０８】
【表３】
2007504839.tif 000005
【０１０９】
さらに特許文献は、ＰＵＦＡ生成に関与する多くの追加的な遺伝子のＤＮＡ配列（および／または上の遺伝子のいくつかに関する詳細およびそれらの単離方法）を提供する。例えば米国特許第５,９６８,８０９号明細書（Δ６デサチュラーゼ）、米国特許第５,９７２,６６４号明細書および米国特許第６,０７５,１８３号明細書（Δ５デサチュラーゼ）、国際公開第９１／１３９７２号パンフレットおよび米国特許第５,０５７,４１９号明細書（Δ９デサチュラーゼ）、国際公開第９３／１１２４５号パンフレット（Δ１５デサチュラーゼ）、国際公開第９４／１１５１６号パンフレット、米国特許第５,４４３,９７４号明細書および国際公開第０３／０９９２１６号パンフレット（Δ１２デサチュラーゼ）、米国特許出願公開第２００３／０１９６２１７  Ａ１号明細書（Δ１７デサチュラーゼ）、国際公開第０２／０９０４９３号パンフレット（Δ４デサチュラーゼ）、および国際公開第００／１２７２０号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００２／０１３９９７４  Ａ１号明細書（エロンガーゼ）を参照されたい。これらの各特許および出願は、その内容全体を参照によってここに援用したものとする。
【０１１０】
当業者には明らかなように、特定のＰＵＦＡ最終生成物の生成のために宿主生物体に導入する必要がある特定機能は、宿主細胞（およびその未変性ＰＵＦＡプロフィールおよび／またはデサチュラーゼプロフィール）、基質の入手可能性および所望の最終生成物に左右される。図２に示すように、ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴ
Ａ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡは、以下のＰＵＦＡ酵素機能の様々な組み合わせを導入することで、全て油性酵母菌中で生成されてもよい。Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、および／またはエロンガーゼ。当業者は、公的に入手できる文献（例えばジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ））、特許文献、およびＰＵＦＡを製造する能力を有する微生物の実験的分析に従って、上の各酵素をコードする様々な候補遺伝子を同定できるであろう。配列は、例えば天然供給源などから（細菌、藻類、菌・カビ類、植物、動物などから）単離され、半合成または新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）合成経路を通じて生成される、あらゆる供給源に由来してもよい。いくつかの実施態様では、宿主に内在する遺伝子の操作が好ましく、その他の目的では異種性遺伝子を導入する必要がある。
【０１１１】
宿主に導入されるデサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子の特定供給源は、本発明にとって重要でないが、デサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する特定のポリペプチドを選択する上での考慮としては、次が挙げられる。１．）ポリペプチドの基質特異性、２．）ポリペプチドまたはその構成要素が律速酵素であるかどうか、３．）デサチュラーゼまたはエロンガーゼが所望のＰＵＦＡの合成のために必須であるかどうか、および／または４．）ポリペプチドによって必要とされる補助因子。発現するポリペプチドは、好ましくは宿主細胞内のその位置の生化学的環境と適合性のパラメータを有する。例えばポリペプチドは、宿主細胞内で基質獲得のためにその他の酵素と競争しなくてはならないかもしれない。したがってポリペプチドのＫＭおよび特異的活性分析は、特定の宿主細胞内でＰＵＦＡ生成を修正するために、特定のポリペプチドの適性を判定する上で考慮される。特定の宿主細胞で使用されるポリペプチドは、意図される宿主細胞中に存在する生化学的条件下で機能できるものであるが、その他の点では所望のＰＵＦＡを修正できる、デサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有するあらゆるポリペプチドであることができる。
【０１１２】
内在性ＰＵＦＡ遺伝子
場合によっては、その中でＰＵＦＡを生成することが望ましい宿主生物体は、いくつかのＰＵＦＡ生合成経路酵素をコードする内在性遺伝子を有する。例えば油性酵母菌は典型的に１８：２脂肪酸を生成できる（１８：３脂肪酸を合成する追加的能力を有するものもある）。したがって油性酵母菌は、典型的に未変性Δ１２デサチュラーゼ活性を有し、またΔ１５デサチュラーゼも有するかもしれない。したがって次の理由で、いくつかの実施態様では、異種性（または「外来」）酵素よりも未変性デサチュラーゼの発現が好ましい。１．）未変性酵素は、細胞内のその他の酵素およびタンパク質との相互作用のために最適化されている。２．）異種性遺伝子は、宿主生物体内で同一のコドン優先度を共有することがありそうもない。さらに標的を定めた混乱によって内在性遺伝子を容易に混乱できるようになるので、未変性遺伝子の配列が知られている場合は利点がある。
【０１１３】
異種性ＰＵＦＡ遺伝子
多くの場合、所望のＰＵＦＡ生成物の生成を可能にするのに適したデサチュラーゼおよびエロンガーゼは、選ばれた宿主生物体中に存在しない。したがって異種性遺伝子を導入することが必要である。
【０１１４】
ここで本発明の目的では、油性の宿主生物体へのω−３および／またはω−６生合成経路導入の例を実証することが望ましかったので、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼ、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼ、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ、およびＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼをヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に導入した。しかし宿主生物体に導入される特異的酵素（およびこれらの酵素をコードする遺伝子）、
および生成される特異的ＰＵＦＡは、ここで本発明を制限するものでは決してない。
【０１１５】
ここで実証されるように、ＥＰＡの生成が所望ならば、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、およびエロンガーゼ活性を好ましい微生物の宿主中に導入するのに、異なる供給源に由来する多数のその他の遺伝子が適切であることが当業者には明らかである。したがって本発明の一実施態様では、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼおよび高親和力ＰＵＦＡエロンガーゼ、およびＳ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼと実質的に同一であるその他のＤＮＡもまた、油性酵母菌におけるω−６および／またはω−３脂肪酸（例えばＥＰＡ）生成のために使用できる。「実質的に同一」とは、アミノ酸配列または核酸配列が、選択されるポリペプチド、またはアミノ酸配列をコードする核酸配列に対して、好ましい順に少なくとも８０％、９０％または９５％の相同性を示すことが意図される。ポリペプチドでは、比較配列長は概して少なくとも１６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸、または最も好ましくは３５個のアミノ酸である。核酸では、比較配列長は概して少なくとも５０個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも６０個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも７５個のヌクレオチド、および最も好ましくは１１０個のヌクレオチドである。
【０１１６】
相同性は典型的に配列分析ソフトウェアを使用して測定され、「配列分析ソフトウェア」と言う用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のために有用なあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものでも、あるいは独立して開発されても良い。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、１．）ウィスコンシン州マディソンのジェネティック・コンピュータ・グループからのＧＣＧパッケージプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（アルシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０））、および３．）ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、および４．）スミス−ウォーターマン・アルゴリズムを組み入れたＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）著、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４）、１９９２年会議、１１１〜２０、編集者：スハイ，サンドール（Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ）、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）、ニューヨーク州ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ））が挙げられるが、これに限定されるものではない。本願明細書の文脈内では、配列分析ソフトウェアを分析のために使用する場合、分析結果は特に断りのない限り、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。ここでの用法では、「デフォルト値」とは、最初に初期化されたときにソフトウェアに元々ロードされた、あらゆる値またはパラメータの組を意味する。一般にこのようなコンピューターソフトウェアは、様々な置換、欠失、およびその他の変異に相同性の程度を割り当てることで、同様の配列をマッチさせる。
【０１１７】
さらに当業者はポリペプチドが、ポリペプチドの機能が変性しまたは損なわれないように保存的に置換されたアミノ酸を有してもよいことを理解するであろう。ここで述べられるようなデサチュラーゼおよびエロンガーゼ活性を有し、このような保存的置換を有するポリペプチドは、本発明の範囲内と見なされる。保存的置換としては、典型的に以下のグループ内での置換が挙げられる。１．）グリシンおよびアラニン、２．）バリン、イソロイシンおよびロイシン、３．）アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンおよびグルタミン、４．）セリンおよびスレオニン、５．）リジンおよびアルギニン、および６．）フェニルアラニンおよびチロシン。置換はまた、保存された疎水性または親水性に基づいて（カイト（Ｋｙｔｅ）およびドゥリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．１５７：１０５〜１３２（１９８２））、または同様のポリペプチド二次構造を呈する能力に基づいて（チョウ（Ｃｈｏｕ）およびファスマン（Ｆａｓｍａｎ）、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７：４５〜１４８（１９７８））実施されてもよい。
【０１１８】
本発明の代案の実施態様では、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼおよび高親和力ＰＵＦＡエロンガーゼ、およびＳ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼと実質的に同一ではないが、その他のＤＮＡもまた、ここでの目的のために（例えばＡＲＡおよびＥＰＡなどのω−３および／またはω−６ＰＵＦＡの生成のために）使用できる。例えば本発明の教示に従った油性酵母菌への導入に有用なΔ６デサチュラーゼポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ＧＬＡまたはＳＴＡを生成する能力を有する微生物から得られてもよい。このような微生物としては、例えばモルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、コニディオボルス（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、ピシウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、フィトファトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈａｔｈｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ポルフィリディウム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）、コイドスポリウム（Ｃｏｉｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、およびハエカビ属（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ）に属するものが挙げられる。ポルフィリディウム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）属の中で特に関心が高いのは、Ｐ．クルエンタム（Ｐ．ｃｒｕｅｎｔｕｍ）である。モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属の中で、特に関心が高いのは、Ｍ．エロンガタ（Ｍ．ｅｌｏｎｇａｔａ）、Ｍ．イクシグア（Ｍ．ｅｘｉｇｕａ）、Ｍ．ハイグロフィラ（Ｍ．ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）、Ｍ．ラマニアナ（Ｍ．ｒａｍａｎｎｉａｎａ）変種アングリスポラ（ａｎｇｕｌｉｓｐｏｒａ）、およびＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）である。ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属の中で、特に関心が高いのは、Ｍ．シルシネロイデス（Ｍ．ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）およびＭ．ジャヴァニクス（Ｍ．ｊａｖａｎｉｃｕｓ）である。
【０１１９】
代案としては、飽和化酵素がなおもＬＡをＧＬＡに、および／またはＡＬＡをＳＴＡに効果的に変換できると仮定して、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼと実質的に同一でないが、分子のカルボキシル末端から６番目の炭素で脂肪酸分子を不飽和化できる関連デサチュラーゼもまた、Δ６デサチュラーゼとして本発明で有用であろう。このようにして関連デサチュラーゼおよびエロンガーゼは、ここで開示するデサチュラーゼおよびエロンガーゼと実質的に同一に機能する、それらの能力によって同定できる。
【０１２０】
要約すると、ここでの目的に適したＰＵＦＡ生合成経路酵素をコードする遺伝子は、多様な供給源から単離されてもよい。ここでの目的のためのデサチュラーゼは、以下の能力によって特性決定される。１．）分子のカルボキシル末端から１７番目と１８番目の炭素原子の間で脂肪酸を不飽和化し、ＡＲＡからＥＰＡ、ＤＧＬＡからＥＴＡへの転換を触媒する（Δ１７デサチュラーゼ）、２．）ＬＡからＧＬＡおよび／またはＡＬＡからＳＴＡへの転換を触媒する（Δ６デサチュラーゼ）、３．）ＤＧＬＡからＡＲＡおよび／またはＥＴＡからＥＰＡへの転換を触媒する（Δ５デサチュラーゼ）、４．）ＤＰＡからＤＨＡへの転換を触媒する（Δ４デサチュラーゼ）、５．）オレイン酸からＬＡへの転換を触媒する（Δ１２デサチュラーゼ）、６．）ＬＡからＡＬＡへの転換を触媒する（Δ１５デサチュラーゼ）、および／または７．）パルミチン酸からパルミトレイン酸、および／またはステアリン酸からオレイン酸への転換を触媒する（Δ９デサチュラーゼ）。同様にして、ここでの目的のために適切なエロンガーゼは、特定供給源からのものに限定されない。代わりにここでの目的のために用途がある酵素は、エロンガーゼが作用する基質よりも脂肪酸炭素鎖を炭素２個分伸長することにより、一不飽和または多不飽和脂肪酸を生成するそれらの能力によって特徴づけられる。
【０１２１】
特定生物体中での発現のためのΩ脂肪酸遺伝子の最適化
ＰＵＦＡデサチュラーゼまたはエロンガーゼの特定の供給源は、ここでの発明において重要ではないが、代案宿主中で異種性遺伝子が様々な効率で発現することは、当業者には明らかである。したがって関心のある宿主生物体における代案のデサチュラーゼまたはエロンガーゼ発現に比べて、異種性宿主における発現レベルが好ましい、特定のデサチュラーゼまたはエロンガーゼを選択することで、ω−３および／またはω−６ＰＵＦＡ生成を最適化してもよい。さらに関心のある特定のＰＵＦＡ生成物の組成に従って、特定のＰＵＦＡ生合成経路酵素の発現を修正し、それぞれの最適変換効率を達成することが望ましいかもしれない。多様な遺伝子工学技術を利用して、特定酵素の発現を最適化できる。このような技術の２つとしては、下で述べるようにコドン最適化および遺伝子変異が挙げられる。例えばこれらの２つの方法のいずれかによって生成され、デサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼ活性を有する遺伝子は、ここで本発明においてω−３および／またはω−６ＰＵＦＡの合成のために有用である。
【０１２２】
コドン最適化
当業者によって理解されるように、修正されたポリペプチドが、別の宿主によって好まれるコドンを使用するように、外来宿主中で発現される特定のポリペプチドをコードするコドン部分を修正することが有用なことが多い。宿主が好むコドンの使用は、ポリペプチドをコードする外来遺伝子の発現を実質的に増強できる。
【０１２３】
一般に、宿主が好むコドンは、タンパク質中のコドン使用を調べて、どのコドンが最高頻度で使用されるか判定することで、関心のある特定の宿主種（好ましくは最大量を発現するもの）内で判定できる。次に宿主種で好まれるコドンを使用して、デサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する関心のあるポリペプチドのためのコード配列の全体または一部が合成できる。またＤＮＡの全部（または一部）を合成して、転写ｍＲＮＡ中に存在する、二次構造のあらゆる不安定化配列または領域を除去できる。またＤＮＡの全部（または一部）を合成して、塩基組成物を所望の宿主細胞中でより好ましいものに変更できる。
【０１２４】
本発明では、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中における遺伝子発現を増強するために、Δ１７デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするコドンの部分を修正することが望ましかった。宿主に好まれるコドンを用いるために、未変性遺伝子（例えばサプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ）の核酸配列を修正した。当業者は、ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路において、この最適化方法がその他の遺伝子に等しく適用できることを理解するであろう（例えば、参照によって全体をここに援用する同時係属米国仮特許出願第６０／４６８７１８号を参照されたい）。さらにＳ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼの調節は例示のみを意図する。
【０１２５】
遺伝子変異
配列を合成し、配列を一緒にまとめる方法は、文献においてよく確立されている。例えば生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での変異誘発および選択、部位特異的変異誘発、誤りがちなＰＣＲ（メルニコフ（Ｍｅｌｎｉｋｏｖ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２７（４）：１０５６〜１０６２（１９９９年２月１５日、））、「遺伝子シャフリング」またはその他の手段を用いて、自然発生的デサチュラーゼまたはエロンガーゼ遺伝子の変異を得ることができる。これによって生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でデサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性をそれぞれ有し、所望のＰＵＦＡのより長い半減期またはより速い生成速度など、宿主細胞中で機能するためのより望ましい物理的および動力学的パラメータがあるポリペプチドの生成が可能になる。
【０１２６】
必要に応じて、酵素活性に重要な関心のあるポリペプチドの領域（すなわちデサチュラーゼまたはエロンガーゼ）は、ルーチンの変異誘発、得られる変異体ポリペプチドの発現、およびそれらの活性の算出を通じて判定できる。変異体は、欠失、挿入、および点変異、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。典型的な機能分析は、欠失変異誘発に始まって機能に必要なタンパク質のＮ−およびＣ−末端限界を判定し、次に内部欠損、挿入または点変異体を作り出し、機能に必要な領域をさらに判定する。カセット変異誘発または完全合成などのその他の技術もまた使用できる。欠失変異誘発は例えば、エキソヌクレアーゼを使用して、５’または３’コード領域を逐次除去して達成される。このような技術のためのキットが入手できる。欠失後、開始または停止コドンを含有するオリゴヌクレオチドをそれぞれ５’または３’欠失後に、欠失コード領域にライゲーションして、コード領域が完成する。代案としては、部位特異的変異誘発、変異原性ＰＣＲをはじめとする多様な方法によって、または既存の制限部位において消化されたＤＮＡ上へのライゲーションによって、開始または停止コドンをコードするオリゴヌクレオチドをコード領域に挿入する。内部欠損は、部位特異的変異誘発または変異原性ＰＣＲを通じた変異原性プライマーの使用によって、ＤＮＡ中の既存の制限部位の使用をはじめとする多様な方法を通じて同様に作り出せる。挿入は、リンカー−スキャニング変異誘発、部位特異的変異誘発または変異原性ＰＣＲなどの方法を通じて作り出され、他方点変異は、部位特異的変異誘発または変異原性ＰＣＲなどの技術を通じて作り出される。
【０１２７】
化学変異誘発もまた、活性に重要なデサチュラーゼまたはエロンガーゼポリペプチドの領域を同定するために使用できる。変異したコンストラクトが発現し、得られる改変タンパク質がデサチュラーゼまたはエロンガーゼとして機能する能力がアッセイされる。このような構造−機能分析は、どの領域が欠失してもよいか、どの領域が挿入を許容するか、どの点変異によって変異体タンパク質が、未変性デサチュラーゼまたは未変性エロンガーゼと実質的に同じように機能できるようにするかを判定できる。このような全ての変異体タンパク質、およびそれらをコードするヌクレオチド配列は、ここで述べられるコドン最適化遺伝子から誘導され、本発明の範囲内である。
【０１２８】
本発明では、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中における遺伝子発現を増強するために、Δ１７デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするコドンの部分を修正することが望ましかった。宿主に好まれるコドンを用いるために、未変性遺伝子（例えばＳ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ）の核酸配列を修正した。当業者は、ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路においてこれらの最適化方法がその他の遺伝子に等しく適用でき、さらにＳ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ、およびＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼの調節は、例示のみを意図することを理解するであろう。
【０１２９】
ω−３および／またはω−６脂肪酸の微生物による生成
微生物によるω−３および／またはω−６脂肪酸の生成には、魚または植物などの天然供給源からの精製に比べて、例えば以下のようないくつかの利点がある。
１．）多くの微生物は、油組成が高等生物のものと比べてはるかに単純であることが知られており、所望の構成要素の精製を容易にする。
２．）微生物による生成には、天候および食物供給などの外部変数によって引き起こされるばらつきがない。
３．）微生物的に生成された油は、実質的に環境汚染物質による混入物がない。
４．）微生物は特定用途を有するかもしれない特定の形態で、ＰＵＦＡを提供できる。
５．）微生物による油生成は、培養条件を制御することで、特に微生物的に発現される酵素のために特定の基質を提供することで、または化合物の添加／遺伝子工学によって望まれない生化学的経路を抑制することで操作できる。
【０１３０】
これらの利点に加えて、組換え微生物からのω−３および／またはω−６脂肪酸の生成は、宿主中に新しい生合成経路を提供することで、または望まれない経路を抑制することで、所望のＰＵＦＡまたはそれらのコンジュゲートされた形態のレベルを増大させて、望まれないＰＵＦＡのレベルを低下させ、自然発生的な微生物の脂肪酸プロフィールを変更する能力を提供する。例えばこのようにして生成したω−３とω−６脂肪酸の比率を修正する、他のω脂肪酸生成を排除しながらω−３またはω−６脂肪酸のどちらか一方だけを生成する、または他のＰＵＦＡの下流または上流生成物の顕著な蓄積なしに特異的ＰＵＦＡの生成を操作することが可能である。
【０１３１】
発現システム、カセット、およびベクター
ここで述べる遺伝子および遺伝子生成物は、異種性微生物の宿主細胞、特に油性酵母菌（例えばヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））の細胞中で生成されてもよい。組換え微生物の宿主中の発現は、様々なＰＵＦＡ経路中間体の生成のために、またはこれまで宿主を使用してできなかった新しい生成物の合成のための、宿主に既存のＰＵＦＡ経路の調節のために有用かもしれない。
【０１３２】
微生物の発現システム、および外来タンパク質の高レベル発現を導く調節配列を含有する発現ベクターは、当業者によく知られている。これらのいずれも好ましいデサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼ配列のあらゆる遺伝子生成物を生成するためのキメラ遺伝子を構築するのに使用できる。次に形質転換を通じてこれらのキメラ遺伝子を適切な微生物に導入して、コードされた酵素の高レベル発現を提供できる。
【０１３３】
したがって適切なプロモーター制御下における、ＰＵＦＡ生合成経路（例えばここで述べるΔ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、およびエロンガーゼ）をコードするキメラ遺伝子の導入は、ω−３および／またはω−６脂肪酸の増大する生成をもたらすことが予期される。これらのＰＵＦＡデサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子の様々な組み合わせを宿主微生物中で一緒に発現することが、有用であると考察される。特定の発現カセット内に含まれる特定の遺伝子が、宿主細胞、未変性デサチュラーゼおよびエロンガーゼを使用したそのＰＵＦＡ合成能力、基質および所望の最終生成物の利用可能性に左右されることは、当業者には明らかである。例えばΔ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、および／またはエロンガーゼの１種もしくはそれ以上の酵素活性をコードする遺伝子を含んでなる発現カセットを構築することが望ましいかもしれない。したがって本発明は、基質が所望の脂肪酸生成物に変換するように、脂肪酸基質をここで述べるＰＵＦＡ酵素に暴露するステップを含んでなる、ＰＵＦＡを生成する方法を包含する。したがってここで述べる各ＰＵＦＡ遺伝子および対応する酵素生成物（例えば適切なデサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する野生型、コドン最適化、合成および／または変異体酵素）は、ＰＵＦＡの生成のために直接にまたは間接に使用できる。ＰＵＦＡの直接的生成は、脂肪酸基質が中間ステップまたは経路中間体なしに直接に所望の脂肪酸生成物に変換する場合に起きる。例えばＡＲＡの生成は、Δ５デサチュラーゼ活性を提供する発現カセットを添加または導入することで、ＤＬＧＡを生成する宿主細胞、またはＤＬＧＡが提供される宿主細胞中で起きる。
【０１３４】
対照的にＰＵＦＡ生合成経路をコードする複数遺伝子を一連の反応が起きて所望のＰＵＦＡを生成するように組み合わせて使用してもよい。例えばエロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、およびΔ４デサチュラーゼ活性をコードする発現カセットは、自然にＧＬＡを生成する宿主細胞が、代わりにＤＨＡを生成できるようにする（ＧＬＡがエロンガーゼによってＤＧＬＡに変換し、次にＤＧＬＡはΔ５デサチュラーゼによってＡＲＡに変換し、次にＡＲＡはΔ１７デサチュラーゼによってＥＰＡに変換し、それは次にはエロンガーゼによってＤＰＡに変換してもよく、ＤＰＡはΔ４デサチュラーゼによってＤＨＡに変換する）。宿主細胞が油性酵母菌である好ましい実施態様では、これらの生物体において自然に生成されるＰＵＦＡは１８：２脂肪酸（すなわちＬＡ）、もっとまれには１８：３脂肪酸（すなわちＡＬＡ）に限られるので、ＰＵＦＡ生合成に必要な各酵素をコードする発現カセットを生物体に導入しなくてはならない。代案としては基質供給が必要かもしれない。
【０１３５】
適切な宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはＤＮＡカセットは、技術分野でよく知られている。コンストラクト中に存在する配列の特定の選択は、所望の発現生成物（上述）、宿主細胞の性質、および提案される形質転換細胞と非形質転換細胞とを分離する手段に左右される。しかし典型的に、ベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を導く配列、選択性マーカー、および自律性複製または染色体組み込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始を制御する遺伝子の５’領域、および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域を含んでなる。双方の制御領域が、形質転換された宿主細胞の遺伝子に由来することが最も好ましいが、このような制御領域は、必ずしも生成宿主として選択された特定種に天然の遺伝子に由来しなくてよいものと理解される。
【０１３６】
所望の宿主細胞中で、デサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼＯＲＦの発現を推進するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは多数あり、当業者にはなじみが深い。選択された宿主細胞中でのこれらの遺伝子の発現を導くことができる、実質的にあらゆるプロモーターが本発明に適する。宿主細胞中での発現は、一過性または安定様式で達成できる。一過性発現は、関心のある遺伝子に作動可能に連結された、調節可能プロモーターの活性を誘導することで達成できる。安定発現は、関心のある遺伝子に作動可能に連結された構成プロモーターの使用によって達成できる。一例として宿主細胞が酵母菌の場合、酵母菌細胞中で機能する転写および翻訳領域が、特に宿主種から提供される。転写開始調節領域は、例えば、以下から得ることができる。１．）アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（参照によってここに援用する米国特許出願第６０／４８２２６３号明細書参照）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（参照によってここに援用する米国特許出願第６０／４８２２６３号明細書参照）、フルクトース−ビスリン染色体外因子アルドラーゼ（参照によってここに援用する米国特許出願第６０／５１９９７１号明細書参照）、ホスホグルコース−異性化酵素、ホスホグリセラートキナーゼなどの解糖経路中の遺伝子、または２．）酸ホスファターゼ、ラクターゼ、メタロチオネイン、グルコアミラーゼ、翻訳延長因子ＥＦ１−α（ＴＥＦ）タンパク質（米国特許第６，２６５，１８５号明細書）、リボソームタンパク質Ｓ７（米国特許第６，２６５，１８５号明細書）などの調節可能遺伝子。構成または誘導転写が所望されるかどうか、関心のあるＯＲＦを発現する上でのプロモーター効率、構築の容易さなど次第で、いくつかの調節配列のいずれの１つでも使用できる。
【０１３７】
翻訳開始コドン「ＡＴＧ」を取り囲むヌクレオチド配列は、酵母菌細胞中の発現に影響することが分かっている。所望のポリペプチドが酵母菌中で発現不良であれば、外来性遺伝子のヌクレオチド配列を修正して効率的な酵母菌翻訳開始配列を含め、最適遺伝子発現を得ることができる。酵母菌中での発現のためには、これは、非効率的に発現する遺伝子をインフレームで内在性酵母菌遺伝子、好ましくは高度に発現する遺伝子に融合させることによる部位特異的変異誘発によって実施できる。代案としてはここでの発明でヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において実証されるように、宿主中の共通翻訳開始配列を判定して、関心のある宿主中でのそれらの最適発現のために、この配列を異種性遺伝子内に遺伝子操作できる。
【０１３８】
終結領域は、遺伝子の３’領域から誘導されることができ、開始領域はそれから、または異なる遺伝子から得られた。多数の終結領域が知られており、多様な宿主において満足
に機能する（それらが由来する同一のおよび異なる、属および種の双方で使用した際に）。終結領域は、通常、特定の特性のためと言うよりも、便宜上で選択される。好ましくは、終結領域は、特にサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、分裂酵母属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）またはクリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）である酵母菌遺伝子から誘導される。γ−インターフェロンおよびα−２インターフェロンをコードする哺乳類の遺伝子の３’−領域もまた、酵母菌中で機能することが知られている。終結制御領域もまた、好ましい宿主に天然の様々な遺伝子から誘導されてもよい。場合により終結部位は不必要かもしれないが、含まれることが最も好ましい。
【０１３９】
当業者は気づいているように、遺伝子をクローニングベクターに単に挿入するだけでは、それが必要なレベルで成功裏に発現することを確証しない。高発現率の必要性に応えて、転写、翻訳、タンパク質安定性、酸素限界、および宿主細胞からの分泌の側面を制御するいくつかの異なる遺伝的要素を操作することで、多くの特殊化した発現ベクターが作り出されている。より具体的には、遺伝子発現を制御するように操作される分子の特徴のいくつかとして以下が挙げられる。１．）関連転写プロモーターおよびターミネーター配列の性質、２．）クローンされた遺伝子のコピー数、および遺伝子がプラスミド上にあるかまたは宿主細胞のゲノム中に組み込まれているかどうか、３．）合成された外来タンパク質の最終細胞内位置、４．）宿主生物体中の翻訳効率、５．）宿主細胞内のクローン化遺伝子タンパク質の本質的な安定性、および６．）頻度が宿主細胞の好むコドン使用頻度に近づくような、クローン化遺伝子内のコドン使用。これらの各タイプの修正は、ＰＵＦＡ生合成経路酵素の発現をさらに最適化する手段として、本発明中に包含される。
【０１４０】
微生物宿主の形質転換
油性酵母菌中での発現に適したデサチュラーゼまたはエロンガーゼポリペプチドをコードするＤＮＡがひとたび得られると、それは宿主細胞中で自律複製できるプラスミドベクター中に入れられ、またはそれは宿主細胞のゲノム中に直接組み込まれる。発現カセットの組み込みは、宿主ゲノム内で無作為に起きることができ、または宿主遺伝子座内で遺伝子組み換えを標的とするのに十分な宿主ゲノムとの相同性領域を含有するコンストラクトの使用を通じて、標的を定めることができる。コンストラクトが内在性遺伝子座に標的を定めると、全てまたはいくつかの転写および翻訳調節領域が、内在性遺伝子座によって提供できる。
【０１４１】
別々の複製ベクターから２つ以上の遺伝子が発現する場合、各ベクターが異なる選択手段を有することが望ましく、他のコンストラクトに対する相同性を欠いて、安定した発現を維持し、コンストラクト中における要素の再集合を防止すべきである。調節領域、選択手段、および導入コンストラクト増殖方法の思慮深い選択は、全ての導入された遺伝子が必要なレベルで発現して、所望の生成物の合成を提供するように実験的に判定できる。
【０１４２】
関心のある遺伝子を含んでなるコンストラクトは、あらゆる標準的技術によって宿主細胞に導入してもよい。これらの技術としては、形質転換（例えば酢酸リチウム形質転換［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９４：１８６〜１８７（１９９１）］）、プロトプラスト融合、弾道衝撃（ｂｏｌｉｓｔｉｃ  ｉｍｐａｃｔ）、電気穿孔、マイクロインジェクション、または宿主細胞中に関心のある遺伝子を導入するその他のあらゆる方法が挙げられる。油性酵母菌（すなわち、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））に適用できるより具体的な教示としては、米国特許第４，８８０，７４１号明細書および米国特許第５，０７１，７６４号明細書、およびチェン（Ｃｈｅｎ）Ｄ．Ｃ．ら（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８（２）：２３２〜２３５（１９９７））が挙げられる。
【０１４３】
便宜上、ＤＮＡ配列（例えば発現カセット）を取り込むように、あらゆる方法によって操作されている宿主細胞を「形質転換された」または「組換え」とここで称する。形質転換された宿主は、遺伝子がゲノム中に組み込まれるか、増幅されるか、または複数のコピー数を有する染色体外因子上に存在するかどうか次第で、発現コンストラクトの少なくとも１つのコピーを有し、２つ以上を有してもよい。形質転換された宿主細胞は、導入されたコンストラクト上に含有されるマーカーの選択によって同定できる。多くの形質転換技術は、多くのＤＮＡ分子を宿主細胞中に導入するので、代案としては、別々のマーカーコンストラクトを所望のコンストラクトと共に同時形質転換してもよい。典型的に、形質転換された宿主は、選択的培地上で生育するそれらの能力について選択される。選択培地には抗生物質が組み込まれていてもよく、または栄養素または成長因子などの非形質転換宿主の生育に必要な要素が欠如していてもよい。導入されたマーカー遺伝子は、形質転換された宿主中で発現すると、抗生物質抵抗性を与え、または必須成長因子または酵素をコードしてもよく、それによって選択培地上での生育を可能にしてもよい。また発現したマーカータンパク質が直接または間接に検出できる場合に、形質転換された宿主の選択ができる。マーカータンパク質は単独で、または別のタンパク質と融合して発現してもよい。マーカータンパク質は、次によって検出できる。１．）その酵素活性（例えばβ−ガラクトシダーゼは、基質Ｘ−ｇａｌ［５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド］を着色生成物に変換でき、ルシフェラーゼはルシフェリンを発光生成物に変換できる）、または２．）その光生成または修正特性（例えばオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）の緑色蛍光タンパク質は青色光で照明されると蛍光を発する）。代案としては、抗体を使用して、マーカータンパク質、または例えば関心のあるタンパク質の上の分子タグを検出できる。マーカータンパク質またはタグを発現する細胞は、例えば視覚的に、またはＦＡＣＳ、または抗体を使用したパニングなどの技術によって選択できる。酵母菌形質転換体の選択のためには、酵母菌で機能するあらゆるマーカーを使用してもよい。ここで使用するのに好ましいのは、カナマイシン、ハイグロマイシン、およびアミノグリコシドＧ４１８に対する抵抗性、ならびにウラシルまたはロイシン欠乏培地上で生育する能力である。
【０１４４】
形質転換に続いて、組換え的に発現されたデサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼ（そして場合により、宿主細胞内で発現するその他のＰＵＦＡ酵素）に適した基質が、宿主によって自然にまたは遺伝子組換え的に生成されてもよく、またはそれらは外来性に提供されてもよい。
【０１４５】
微生物中でのω−３および／またはω−６脂肪酸生合成の代謝エンジニアリング
生化学的経路を操作する方法は、当業者によく知られており、油性酵母菌、特にヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるω−３および／またはω−６脂肪酸生合成を最大化するために、多数の操作が可能であることが期待される。これは直接ＰＵＦＡ生合成経路内での代謝エンジニアリング、または炭素をＰＵＦＡ生合成経路に与える経路の追加的操作を必要とするかもしれない。
【０１４６】
ＰＵＦＡ生合成経路内での操作の場合、ＬＡの生成を増大させて、ω−６および／またはω−３脂肪酸の増大する生成を可能にすることが望ましいかもしれない。これはΔ９および／またはΔ１２デサチュラーゼをコードする遺伝子を導入および／または増幅することで達成してもよい。
【０１４７】
ＡＲＡなどのω−６不飽和脂肪酸生成を最大化するために、実質的にＡＬＡを含まない宿主微生物中における生成が有利であることが、当業者にはよく知られている。したがって好ましくは宿主は選択され、またはＬＡをＡＬＡに転換させるΔ１５またはω−３タイプのデサチュラーゼ活性を除去または阻害することで得られる。内在性デサチュラーゼ活性は、例えば以下によって低下または除外できる。１．）アンチセンス配列のΔ１５デサ
チュラーゼ転写生成物への転写のためのカセットを提供する。２．）標的遺伝子の全てまたは一部挿入、置換および／または欠失によって、Δ１５デサチュラーゼ遺伝子を混乱させる。または３．）低いまたは皆無のΔ１５デサチュラーゼ活性を自然に有する［または有するように変異された］宿主細胞を使用する。望まれないデサチュラーゼ経路の阻害は、米国特許第４，７７８，６３０号明細書で述べられるような特異的デサチュラーゼ阻害剤の使用を通じても達成される。
【０１４８】
代案としては、ω−３脂肪酸の生成を最大化する（そしてω−６脂肪酸の合成を最小化する）ことが、望ましいかもしれない。したがって上述のいずれかの手段を使用して、オレイン酸からＬＡへの転換を可能にするΔ１２デサチュラーゼの活性が除去または阻害される、宿主微生物が使用できる（例えばその内容全体を本願明細書に引用した同時係属米国仮特許出願第６０／４８４２０９号も参照されたい）。引き続いてＡＬＡのω−３脂肪酸誘導体（例えばＳＴＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡ）への転換のために、適切な発現カセットを適切な基質（例えばＡＬＡ）と共に宿主に導入する。
【０１４９】
さしあたりのＰＵＦＡ生合成経路以降、前駆脂肪酸生合成をもたらすその他のいくつかの酵素的経路の操作は、特定ＰＵＦＡの全体的な正味の生合成に寄与するかもしれないことが期待される。これらの関連経路の同定および操作は、将来有用であろう。
【０１５０】
望ましい生合成経路を上方制御する技術
デサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子の追加的コピーを宿主に導入して、ω−３および／またはω−６脂肪酸生合成経路の産出量を増大させてもよい。デサチュラーゼまたはエロンガーゼ遺伝子の発現はまた、ｍＲＮＡまたはコードされたタンパク質のいずれかから不安定化配列を除去／消去することで、または安定化配列をｍＲＮＡ（米国特許第４，９１０，１４１号明細書）に追加することで、（制御されたまたは構成的な）より強力なプロモーターの使用を通じて増大する発現を引き起こして、転写レベルで増大できる。本発明で実証されるように、デサチュラーゼまたはエロンガーゼ遺伝子の発現を増大させるさらに別のアプローチは、選択された宿主微生物中での最適遺伝子発現のためのコドンで、未変性遺伝子中のコドンを置換することにより、コードされたｍＲＮＡの翻訳効率を増大させることである。
【０１５１】
望ましくない生合成経路を下方制御する技術
反対に、エネルギーまたは炭素についてω−３および／またはω−６脂肪酸生合成経路と競合する生化学的経路、または特定のＰＵＦＡ最終生成物の生成を妨げる未変性ＰＵＦＡ生合成経路酵素を遺伝子混乱によって除去またはその他の手段（例えばアンチセンスｍＲＮＡ）によって下方制御してもよい。遺伝子混乱では、そのコード配列を妨害し、それによって遺伝子を機能的に不活性化するために、混乱させたい構造的遺伝子中に外来ＤＮＡ断片（典型的に選択可能マーカー遺伝子）を挿入し、混乱させる。混乱カセットの宿主細胞中への形質転換は、相同的組み換えによって、機能的未変性遺伝子の非機能的混乱遺伝子による置換をもたらす（例えばハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：４６１７〜４６２２（１９８９）；バルバス（Ｂａｌｂａｓ）ら、Ｇｅｎｅｓ、１３６：２１１〜２１３（１９９３）；ゲルデナー（Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２４：２５１９〜２５２４（１９９６）；およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２７０〜２７７（１９９６）参照）。
【０１５２】
アンチセンス技術は、標的遺伝子配列が知られている場合に遺伝子を下方制御する別の方法である。これを達成するために、所望の遺伝子からの核酸セグメントをクローン化して、ＲＮＡのアンチセンス鎖が転写されるようにプロモーターに作動可能に連結する。次にこのコンストラクトを宿主細胞に導入し、ＲＮＡのアンチセンス鎖を生成する。アンチ
センスＲＮＡは、関心のあるタンパク質をコードするｍＲＮＡの蓄積を防止することで、遺伝子発現を阻害する。当業者は、特定の遺伝子の発現を低下させるために、特別な考察がアンチセンス技術の使用に関連することを理解する。例えば、アンチセンス遺伝子の適切な発現レベルは、当業者には知られている異なる調節因子を使用した、異なるキメラ遺伝子の使用を必要とするかもしれない。
【０１５３】
配列が知られている場合、標的を定めた遺伝子混乱およびアンチセンス技術が遺伝子を下方制御する効果的手段を提供するが、配列ベースではないその他のより特異性が低い方法が開発されている。例えば細胞をＵＶ放射線暴露して、次に所望の表現型についてスクリーンしてもよい。変異体を作り出すために、化学薬品による変異誘発もまた効果的であり、一般に使用される物質としては、非複製ＤＮＡに影響する化学物質（例えばＨＮＯ２およびＮＨ２ＯＨ）、ならびに複製ＤＮＡに影響する薬剤（例えばフレームシフト変異を引き起こすことで注目に値するアクリジン染料）が挙げられる。放射線または化学薬品を使用して変異体を作り出す特定の方法は、技術分野でよく文書化されている。例えばトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）著「バイオテクノロジー：工業微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」第二版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ）、またはデシュパンデ，ムカンド（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ）Ｖ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６：２２７（１９９２）を参照されたい。
【０１５４】
別の非特異的遺伝子混乱方法は、転移因子またはトランスポゾンの使用である。トランスポゾンは、ＤＮＡに無作為に挿入される遺伝的因子であるが、後で配列に基づいて検索して、挿入がどこで起きたのか判定できる。生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）および生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）転位法の双方が知られている。どちらの方法にもトランスポザーゼ酵素と組み合わされた転移因子の使用が関与する。転移因子またはトランスポゾンがトランスポザーゼの存在下で核酸断片に接触すると、転移因子が核酸断片中に無作為に挿入される。混乱された遺伝子は転移因子配列に基づいて同定されてもよいので、技術は、ランダム変異誘発のため、そして遺伝子単離のために有用である。生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）転位のためのキットは市販される。例えば１．）ニュージャージー州ブランチバーグのパーキン・エルマー・アプライド・バイオシステムズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＮＪ））から入手できる酵母菌Ｔｙ１因子に基づく、プライマー・アイランド転位キット、２．）マサチューセッツ州ビバリーのニュー・イングランド・バイオ・ラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ））から入手できる細菌性トランスポゾンＴｎ７に基づくゲノム・プライミング・システム、および３．）ウィスコンシン州マディソンのエピセンター・テクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））から入手できる、Ｔｎ５細菌性転移因子に基づくＥＺ：：ＴＮトランスポゾン挿入システムを参照されたい。
【０１５５】
本発明の文脈では、上述のいずれか１つの方法によって、脂肪酸生合成経路の発現を調節することが有用であるかもしれない。例えば本発明は、ω−３および／またはω−６脂肪酸生成のために、生合成経路中の重要な酵素をコードする遺伝子を油性酵母菌に導入する方法を提供する。これらの遺伝子は、以下の１種もしくはそれ以上をコードする。Δ６デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、およびＰＵＦＡエロンガーゼ。ω−３および／またはω−６脂肪酸生合成経路を自然に有さない油性酵母菌中でこれらの遺伝子を発現させ、これらの遺伝子の発現を協調させ、宿主生物体の代謝工学のための様々な手段を使用して好ましいＰＵＦＡ生成物の生成を最大化することが特に有
用であろう。
【０１５６】
ω−３および／またはω−６脂肪酸の組換え生成のための好ましい微生物宿主
ω脂肪酸生成のための宿主細胞は、広範な温度およびｐＨで、単純または複合炭水化物、有機酸およびアルコール、および／または炭化水素をはじめとする多様な原材料上で生育する微生物の宿主を含んでもよい。
【０１５７】
しかし好ましい微生物の宿主は、油性酵母菌である。これらの生物体は自然に油の合成および蓄積ができ、油は、細胞乾燥重量の約２５％を超え、より好ましくは細胞乾燥重量の約３０％を超え、最も好ましくは細胞乾燥重量の約４０％を超える量を構成できる。油性酵母菌として典型的に同定されている属としては、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。より具体的には、例証的な油合成酵母菌としては、ロドスポリジウム・トルイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェラス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プルケリマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルティナス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、およびヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）として分類された）が挙げられる。
【０１５８】
最も好ましいのは油性酵母菌ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であり、さらなる実施態様で最も好ましいのは、ＡＴＣＣ番号２０３６２、ＡＴＣＣ番号８８６２、ＡＴＣＣ番号１８９４４、ＡＴＣＣ番号７６９８２および／またはＬＧＡＭＳ（７）１と称されるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株である（パパニコラオウ（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ）Ｓ．、およびアゲリス（Ａｇｇｅｌｉｓ）Ｇ．、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８２（１）：４３〜９（２００２））。
【０１５９】
歴史的に、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の様々な株が、イソクエン酸リアーゼ（ＤＤ２５９６３７）、リパーゼ（ＳＵ１４５４８５２、国際公開第２００１０８３７７３号パンフレット、ＤＤ２７９２６７）、ポリヒドロキシアルカノアート（国際公開第２００１０８８１４４号パンフレット）、クエン酸（ＲＵ２０９６４６１、ＲＵ２０９０６１１、ＤＤ２８５３７２、ＤＤ２８５３７０、ＤＤ２７５４８０、ＤＤ２２７４４８、ＰＬ１６００２７）、エリスリトール（欧州特許第７７０６８３号明細書）、２−オキソグルタル酸（ＤＤ２６７９９９）、γ−デカラクトン（米国特許第６，４５１，５６５号明細書、ＦＲ２７３４８４３）、γ−ドデカラトン（ｄｏｄｅｃａｌａｔｏｎｅ）（欧州特許第５７８３８８号明細書）、およびピルビン酸（特開平第０９２５２７９０号公報）の製造および生成のために使用されている。
【０１６０】
ＰＵＦＡ生成のための発酵プロセス
形質転換された微生物宿主細胞をデサチュラーゼおよびエロンガーゼ活性を最適化させる条件下で生育させ、好ましいＰＵＦＡの最大かつ最も経済的な収率を得る。一般に最適化されてもよい培地条件としては、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、
炭素−対−窒素比率、酸素レベル、生育温度、ｐＨ、バイオマス生成相の長さ、油蓄積相の長さ、および細胞収穫時間が挙げられる。油性酵母菌などの関心のある微生物を複合培地（例えば酵母菌抽出物−ペプトン−デキストロース液体培地（ＹＰＤ））上で生育させ、または生育に必要な構成要素が欠如する合成（ｄｅｆｉｎｅｄ）最少培地（例えばミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ））からの酵母菌窒素塩基）上で生育させて、所望の発現カセットの選択を強要する。
【０１６１】
本発明における発酵培地は、適切な炭素源を含有しなくてはならない。適切な炭素源としては、単糖類（例えばグルコース、フルクトース）、二糖類（例えばラクトース、スクロース）、少糖類、多糖類（例えばデンプン、セルロースまたはそれらの混合物）、糖アルコール（例えばグリセロール）または再生可能原材料からの混合物（例えば乳清透過液、コーンスティープリーカー、甜菜モラセス、大麦の麦芽）が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに炭素源としては、アルカン、脂肪酸、脂肪酸エステル、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、および植物油（例えばダイズ油）および動物脂肪をはじめとする脂肪酸の様々な商業的供給源が挙げられる。さらに炭素源としては、重要な生化学的中間体への代謝転換が実証されている一炭素源（例えば二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸および炭素−含有アミン）が挙げられる。したがって本発明で使用される炭素源は多種多様な炭素含有源を包含し、および宿主生物体の選択によってのみ制限されることが考察された。上述の全ての炭素源およびそれらの混合物が本発明で適切であることが期待されるが、好ましい炭素源は糖および／または脂肪酸である。最も好ましいのは、１０〜２２個の炭素含有グルコースおよび／または脂肪酸である。
【０１６２】
窒素は、無機（例えば（ＮＨ４）２ＳＯ４）または有機源（例えば尿素またはグルタミン酸）から供給されてもよい。適切な炭素および窒素源に加えて、発酵培地はまた、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、ビタミン、および当業者には知られている微生物の生育とＰＵＦＡ生成に必要な酵素的経路の促進に適したその他の構成要素を含有しなくてはならない。脂質およびＰＵＦＡの合成を促進するいくつかの金属イオン（例えばＭｎ＋２、Ｃｏ＋２、Ｚｎ＋２、Ｍｇ＋２）が注目されている（ナカハラ（Ｎａｋａｈａｒａ）Ｔ．ら、「単細胞油の工業的応用（Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｏｉｌｓ）」、Ｄ．Ｊ．カイル（Ｋｙｌｅ）およびＲ．コリン（Ｃｏｌｉｎ）編、ｐ６１〜９７（１９９２））。
【０１６３】
本発明における好ましい増殖培地は、ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ））からの酵母菌窒素塩基などの一般的な商業的調製培地である。またその他の合成（ｄｅｆｉｎｅｄ）または合成（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）増殖培地が使用されてもよく、特定の微生物の生育に適した培地は、微生物学または発酵科学の当業者に知られている。発酵に適したｐＨ範囲は、典型的に約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０の間であり、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．０が最初の生育条件の範囲として好ましい。発酵は好気性または好気性条件下で実施されてもよく、マイクロ好気性条件が好ましい。
【０１６４】
典型的に、油性酵母菌細胞におけるＰＵＦＡの高レベルの蓄積は、代謝状態が生育と脂肪合成／貯蔵間で「バランスが取れて」いなくてはならないので、二段階プロセスを必要とする。したがって最も好ましくは、油性酵母菌におけるＰＵＦＡ生成には、二段階発酵プロセスが必要である。このアプローチでは、第１の発酵状態が細胞集団の生成および蓄積に供され、迅速な細胞生育および細胞分割によって特徴づけられる。発酵の第２段階では、培養内の窒素欠乏条件を確立して、高レベルの脂質蓄積を促進することが好ましい。この窒素欠乏の効果は、細胞内のＡＭＰの効果的濃度を低下させることにより、ミトコン
ドリアのＮＡＤ−依存イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させることである。これが起きるとクエン酸が蓄積するので、細胞質中にアセチル−ＣｏＡの豊富なプールが形成し、脂肪酸合成の下準備をする。したがってこの相は、細胞分割休止と、それに続く脂肪酸合成および油蓄積によって特徴づけられる。
【０１６５】
細胞は典型的に約３０℃で生育させるが、いくつかの研究は、より低い温度における不飽和脂肪酸の増大した合成を示している（ヨンマニットチャイ（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ）およびワード（Ｗａｒｄ）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：４１９〜２５（１９９１））。プロセスの経済に基づけば、この温度シフトは、大部分の生物体の生育が起きる二段階発酵の第１相後に起きるはずである。
【０１６６】
デサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼ遺伝子の組換え発現を使用したω脂肪酸の商業生産が所望される場合、多様な発酵プロセスデザインを適用してもよいことが考察される。例えば組換え微生物宿主からのＰＵＦＡの商業生産は、バッチ、供給バッチまたは連続発酵プロセスによって生産されてもよい。
【０１６７】
バッチ発酵プロセスは閉鎖システムであり、培地組成物がプロセス開始時に定められ、プロセス中にｐＨおよび酸素レベル維持のために必要とされるもの以外は、さらなる追加を受けない。したがって培養プロセスの始めに所望の生物体を培地に接種し、培地への追加的供給源（すなわち炭素および窒素源）の添加なしに、生育または代謝活性を生じさせる。バッチプロセスでは、システムの代謝産物およびバイオマス組成物は、培養が終結するまで絶えず変化する。典型的なバッチプロセスでは、細胞は静止対数相から高生育対数相を通過して、最終的に発育速度が減少または停止する定常相に進む。処置されない場合、定常相の細胞は次第に死滅する。標準バッチプロセスのバリエーションが供給バッチプロセスであり、炭素源は発酵プロセス経過中に発酵槽に連続的に添加される。供給バッチプロセスもまた、本発明に適している。供給バッチプロセスは分解産物抑制が、細胞代謝を阻害する傾向がある場合に、またはあらゆる時点で培地中に限定量の炭素源を有することが望ましい場合に有用である。供給バッチシステム中の炭素源濃度の測定は困難であるので、ｐＨ、溶解酸素、および排ガス（例えばＣＯ２）などの測定可能な要素の変化に基づいて推定してもよい。バッチおよび供給バッチ培養方法は一般的で技術分野でよく知られており、実例が以下にある。トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）Ｄ．ブロック（Ｂｒｏｃｋ）著、「バイオテクノロジー：工業的微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」第二版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ）（１９８９）、またはデシュパンデ，ムカンド（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ）Ｖ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６：２２７（１９９２）。これらは参照によってここに援用される。
【０１６８】
デサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼ遺伝子の組換え発現を使用したω脂肪酸の商業生産はまた、連続発酵プロセスによって達成されてもよく、そこでは生成物の回収のため等量の培養物を除去するのと同時に、合成培地をバイオリアクター内に連続的に添加する。連続培養は、概して細胞を一定細胞密度の対数増殖期に保つ。連続または半連続培養法は、細胞生育または最終生成物濃度に影響する１つの因子またはあらゆるいくつかの因子の調節を可能にする。例えば１つのアプローチでは炭素源を制限して、あらゆるその他のパラメータが代謝を調節できるようにしてもよい。その他のシステムでは、培地濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、生育に影響するいくつかの因子を連続的に変化させてもよい。連続システムは定常状態生育を維持することを目指すので、細胞生育率は、培養から培地が抜き取られることによる細胞損失に対してバランスが取れていなくてはならない。連続的培養プロセスのために栄養素および成長因子を調節する方法、ならびに生成物形成速度を最大化する技術は工業微生物学の技術分野でよく知られており
、多様な方法が上記のブロック（Ｂｒｏｃｋ）で詳述される。
【０１６９】
ＰＵＦＡの精製
ＰＵＦＡは、遊離脂肪酸として、またはアシルグリセロール、リン脂質、スルホリピドまたは糖脂質などのエステル化形態で宿主微生物中に見ることができ、技術分野でよく知られている多様な手段を通じて宿主細胞から抽出されてもよい。酵母菌脂質の抽出技術、品質分析、および許容性基準に関する１つのレビューは、Ｚ．ジェーコブス（Ｊａｃｏｂｓ）（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２（５／６）：４６３〜４９１（１９９２））である。下流プロセスに関する簡潔なレビューは、Ａ．シン（Ｓｉｎｇｈ）およびＯ．ワード（Ｗａｒｄ）（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５：２７１〜３１２（１９９７））にもある。
【０１７０】
一般にＰＵＦＡ精製手段は、有機溶剤、超音波処理、超臨界流体抽出（例えば二酸化炭素を使用して）による抽出と、鹸化と、圧搾などの物理的手段またはそれらの組み合わせを含んでもよい。特に興味深いのは、水の存在下でのメタノールおよびクロロホルムによる抽出である（Ｅ．Ｇ．ブライ（Ｂｌｉｇｈ）およびＷ．Ｊ．ダイヤー（Ｄｙｅｒ）、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：９１１〜９１７（１９５９））。望ましい場合、水性層を酸性化して負の電荷を帯びた部分をプロトン化することで、有機層中への所望の生成物の分配を増大できる。抽出後、有機溶剤は窒素流の下で蒸発によって除去できる。コンジュゲートされた形態で単離されると、生成物は酵素的にまたは化学的に切断されて、関心のある遊離脂肪酸またはより単純なコンジュゲートを放出してもよく、次にさらに操作されて所望の最終生成物を生成してもよい。望ましくはコンジュゲートされた形態の脂肪酸は、水酸化カリウムによって切断される。
【０１７１】
さらに精製が必要ならば、標準法を用いることができる。このような方法としては、抽出、尿素処理、分別結晶化、ＨＰＬＣ、分留、シリカゲルクロマトグラフィー、高速遠心分離または蒸留、またはこれらの技術の組み合わせが挙げられる。酸またはアルケニル基などの反応性基の保護は、既知の技術（例えばアルキル化、ヨウ素化）を通じて、あらゆるステップで実施してもよい。使用される方法としては、メチルエステルを生成するための脂肪酸のメチル化が挙げられる。同様に、保護基はあらゆるステップで除去されてもよい。望ましくはＧＬＡ、ＳＴＡ、ＡＲＡ、ＤＨＡ、およびＥＰＡを含有する画分の精製は、尿素および／または分留による処置によって達成されてもよい。
【０１７２】
好ましい実施態様の説明
本発明は、ＰＵＦＡの生成のために、油性酵母菌中にω−３および／またはω−６生合成経路を導入することの実行可能性を実証する。このような目的でＡＲＡ（代表的なω−６脂肪酸）およびＥＰＡ（代表的なω−３脂肪酸）が、油性酵母菌、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で生成するための望ましい生成物として選択された。したがってＡＲＡの合成は、Δ６デサチュラーゼ、エロンガーゼ、およびΔ５デサチュラーゼ活性をコードする遺伝子のヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中への導入を必要とし、他方ＥＰＡの合成は、Δ６デサチュラーゼ、エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、およびΔ１７デサチュラーゼ活性をコードする遺伝子のヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中への導入を必要とした。
【０１７３】
ＤＧＬＡをＡＲＡに、ＥＴＡをＥＰＡに変換する能力を有する、異なる生物体からの多様な公的に入手できるΔ５デサチュラーゼをヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で発現させ、代案の宿主中で最高レベルの活性を示す遺伝子を同定するために、活性についてスクリーニングした。これに基づいて、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼ（配列番号４）が、基質供給試験において約３０％の細胞内ＤＧＬＡをＡＲＡに変換する能力に基づ
き、油性酵母菌中での発現のための好ましい遺伝子として選択された。
【０１７４】
追加的な基質供給試験を行って、以下の遺伝子によってコードされる酵素活性を確認した。
・ＬＡをＧＬＡに、ＡＬＡをＳＴＡに変換するＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼ（配列番号２）（Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中におけるＬＡからＧＬＡへの％基質変換は約３０％であった）、
・ＤＧＬＡをＥＴＡに、ＡＲＡをＥＰＡに変換するサプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ（配列番号６）（Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中におけるＡＲＡからＥＰＡへの％基質変換は約２３％であった）、および
・ＧＬＡをＤＧＬＡに、ＳＴＡをＥＴＡに、ＥＰＡをＤＰＡに変換するＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）高親和力ＰＵＦＡエロンガーゼ（配列番号８）（Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中におけるＧＬＡからＤＧＬＡへの％基質変換は約３０％であった）。
【０１７５】
Ｓ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼの（Δ６およびΔ５デサチュラーゼおよびエロンガーゼに比べて）より低い％基質変換に基づいて、この特定の遺伝子をコドン最適化し、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中でのその発現を増強した。これはヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の構造的遺伝子のコドン使用およびシグネチャを判定し、コドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子をデザインし、次に生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で遺伝子を合成して、代案の宿主中におけるその増大する効率（野生型遺伝子に対して）を可能にすることで達成された。
【０１７６】
ＡＲＡまたはＥＰＡの合成を可能にするために（そしてそれによって油性の宿主が、ω−６およびω−３脂肪酸（すなわちＡＲＡおよびＥＰＡ）の生成のために遺伝子操作される能力の機能検証を実証するために）、２個の異なるＤＮＡ発現コンストラクトを引き続いて調製した。１．）Δ６デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、および高親和力ＰＵＦＡエロンガーゼを含有する第１のコンストラクト、および２．）Δ６デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、高親和力ＰＵＦＡエロンガーゼ、およびコドン最適化Δ１７デサチュラーゼを含有する第２のコンストラクト。双方のコンストラクトを別々にヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中に形質転換して、酵素オロチジン−５’−リン染色体外因子デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．２３）をコードする染色体ＵＲＡ３遺伝子中に組み込んだ。適切な基質を供給した宿主細胞のＧＣ分析からは、ＡＲＡ（実施例５）およびＥＰＡ（実施例６）の生成がそれぞれ検出された。したがってこれは、それによってω−３および／またはω−６生合成経路が油性酵母菌中に導入される、油性酵母菌中におけるＰＵＦＡ生合成の第１の実証である。
【０１７７】
ここで述べる教示および結果に基づいて、油性酵母菌を多様なω−３および／またはω−６ＰＵＦＡの合成ための生成プラットフォームとして使用して作り出される、実現可能性および商業的用途を当業者が認識することが期待される。
【実施例】
【０１７８】
以下の実施例で本発明をさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示しながら、例証のみの目的で提供されるものとする。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の必須特性を把握でき、その精神と範囲を逸脱することなく、本発明の様々な変更および修正を行って、それを様々な使用法および条件に適合できる。
【０１７９】
一般方法
実施例で使用する標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、技術分野でよく知
られており、１．）サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、コールドスプリングハーバーラボラトリ：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）（１９８９）（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））、２．）Ｔ．Ｊ．シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）およびＬ．Ｗ．エンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）、「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）」（コールドスプリングハーバーラボラトリ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８４）、および３．）オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）Ｆ．Ｍ．ら「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（グリーンパブリッシングおよびワイリーインターサイエンスによる出版；１９８７）で述べられる。
【０１８０】
微生物培養の維持および生育に適した材料および方法は、技術分野でよく知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術は、次で述べられる。「一般微生物学方法マニュアル（Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」、フィリップス・ゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレー（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスティロウ（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）、およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシントンＤ．Ｃ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）（１９９４）またはトーマス（Ｔｈｏｍａｓ）Ｄ．ブロック（Ｂｒｏｃｋ）著、バイオテクノロジー：工業的微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）第二版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ）（１９８９）。微生物細胞の生育および維持のために使用される全ての試薬、制限酵素および材料は、特に断りのない限り、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ））、ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ））、メリーランド州ゲーサーズバーグのギブコ／ＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ））、またはミズーリ州セントルイスのシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））から得た。
【０１８１】
大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）コンピテント細胞は、カリフォルニア州サンディエゴのストラタジーン（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）株は、典型的にルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）プレート上で３７℃で生育させた。
【０１８２】
一般分子クローニングは、標準法に従って実施された（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、同上）。オリゴヌクレオチドはシグマ−ジェノシス（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ、テキサス州スプリング（Ｓｐｒｉｎｇ、ＴＸ））によって合成した。部位特異的変異誘発は、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のクイックチェンジ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ）ＴＭ部位特異的変異誘発キットを製造業者の説明書に従って使用して実施した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または部位特異的変異誘発がサブクローニングに関与する場合、コンストラクトは、配列中に確実にいかなる誤りも導入されないように配列された。ＰＣＲ生成物は、ウィスコンシン州マディソンのプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））からのｐＧＥＭ−Ｔ−イージーベクター中にクローン化した。
【０１８３】
ＤＮＡ配列は、ベクターと挿入特異性プライマーの組み合わせを使用して、染料ターミネーター技術（米国特許第５，３６６，８６０号明細書、欧州特許第２７２，００７号明細書）を使用して、ＡＢＩ自動シーケンサー上に生成した。ミシガン州アンアーバーのジーン・コーズ社（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ））からのシーケンチャー（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）中で配列編集を実施した。全配列は、双方向で少なくとも２回のカバレッジを示す。遺伝的配列の比較は、ＤＮＡスター（ＤＮＡ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）からのＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを使用して達成された。代案としては、ウィスコンシン州マディソンのジーンズ・コンピューター・グループ（ＧＣＧ）社（Ｇｅｎｅｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））から入手できる一組のプログラム、ウィスコンシン・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ９．０）を使用して、遺伝的配列の操作が達成された。ギャップ作成デフォルト値１２、およびギャップ延長デフォルト値４でＧＣＧプログラム「パイルアップ（Ｐｉｌｅｕｐ）」を使用した。デフォルトギャップ作成ペナルティ５０、およびデフォルトギャップ延長ペナルティ３で、ＧＣＧ「ギャップ（ギャップ）」または「ベストフィット（Ｂｅｓｔｆｉｔ）」プログラムを使用した。特に断りのない限り、全てのその他の場合において、ＧＣＧプログラムのデフォルトパラメータを使用した。
【０１８４】
略語の意味は以下の通り。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモル（ｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ）を意味し、「ｍＭ」はミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌａｒ）を意味し、「Ｍ」はモル（ｍｏｌａｒ）を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌｅ）を意味し、「μｍｏｌｅ」マイクロモル（ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ）を意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋＢ」はキロベースを意味する。
【０１８５】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の培養
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株ＡＴＣＣ番号７６９８２およびＡＴＣＣ番号９０８１２は、メリーランド州ロックビルの米国微生物系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入した。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、通常、２８℃においてＹＰＤ寒天（１％酵母菌抽出物、２％バクトペプトン、２％グルコース、２％寒天）上で生育させた。形質転換体の選択のために最少培地（ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ））からの硫酸アンモニウムまたはアミノ酸を含まない０．１７％酵母菌窒素ベース、２％グルコース、０．１％プロリン、ｐＨ６．１）を使用した。適切ならばアデニン、ロイシン、リジンおよび／またはウラシル・サプリメントを最終濃度０．０１％に添加した。
【０１８６】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）脂肪酸分析
ブライ（Ｂｌｉｇｈ）Ｅ．Ｇ．およびダイヤー（Ｄｙｅｒ）Ｗ．Ｊ．（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：９１１〜９１７（１９５９））で述べられるように、脂肪酸分析のために、細胞を遠心分離し収集して脂質を抽出した。ナトリウムメトキシド（ローガン（Ｒｏｕｇｈａｎ）Ｇ．およびニシダ（Ｎｉｓｈｉｄａ）Ｉ．Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７６（１）：３８〜４６（１９９０））による脂質抽出物のエステル交換反応によって、脂肪酸メチルエステルを調製し、３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋ
ａｒｄ）カラムを装着したヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０  ＧＣで引き続き分析した。オーブン温度は１７０℃（２５分間保持）から１８５℃に３．５℃／ｍｉｎで上昇させた。
【０１８７】
直接塩基エステル交換のために、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）培養物（３ｍＬ）を収集し、蒸留水で１回洗浄し、スピードバック（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ）中で真空下で５〜１０ｍｉｎ乾燥させた。ナトリウムメトキシド（１００μＬの１％）をサンプルに添加して、次にサンプルをボルテックスし、２０分間振盪した。３滴の１Ｍ  ＮａＣｌおよび４００μＬヘキサンを添加した後、サンプルをボルテックスして遠心分離した。上層を除去して上述のようにＧＣで分析した。
【０１８８】
実施例１
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の異種性遺伝子発現に適したプラスミドの構造
図３に図解するように、ｐＩＮＡ５３２の誘導体であるプラスミドｐＹ５（Ｉｎｓｉｔｕｔ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｒｏｎｏｍｉｃｓ、Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ  Ａｇｒｏ−Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｌｌｅ、ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  ｄｅ
Ｇｅｎｅｔｉｑｕｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ  ｅｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒｉｅ  ＩＮＲＡ−ＣＮＲＳ、Ｆ−７８８５０、Ｔｈｉｖｅｒｖａｌ−Ｇｒｉｇｎｏｎ、Ｆｒａｎｃｅのクロード・ガィヤルダン（Ｃｌａｕｄｅ  Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ）博士からの贈与）、をヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の異種性遺伝子発現のために構築した。
【０１８９】
最初に、ｐＩＮＡ５３２のＡＲＳ１８配列およびＬＥＵ２遺伝子を含有する部分的に消化された３５９８ｂｐのＥｃｏＲＩ断片をカリフォルニア州サンディエゴのストラタジーン（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングしてｐＹ２を生成した。ＴＥＦ５’（配列番号３８）およびＴＥＦ３’（配列番号３９）をプライマーとして使用して、ＰＣＲにより、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムのＤＮＡからＴＥＦプロモーター（ミュラー（Ｍｕｌｌｅｒ）Ｓ．ら「酵母菌（Ｙｅａｓｔ）」１４：１２６７〜１２８３（１９９８））を増幅した。１００ｎｇのヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムＤＮＡと、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．７５）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（最終濃度）を含有するＰＣＲ緩衝液と、各２００μＭのデオキシリボヌクレオチド三リン酸と、１０ｐｍｏｌｅの各プライマーと、カリフォルニア州サンディエゴのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からの１μＬのＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼとを含有する、５０μＬの総容積でＰＣＲ増幅を実施した。増幅は以下のように実施した。９５℃で３ｍｉｎの初期変性、それに続いて９５℃で１ｍｉｎ、５６℃で３０ｓｅｃ、７２℃で１ｍｉｎを３５サイクル。７２℃で１０ｍｉｎの最終延長サイクル実施し、それに続いて４℃での反応終結。４１８ｂｐのＰＣＲ生成物をｐＣＲ−ＢｌｕｎｔにライゲーションしてｐＩＰ−ｔｅｆを生成した。ｐＩＰ−ｔｅｆのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ断片をｐＹ２のＢａｍＨＩ／ＳｍａＩ部位にサブクローニングして、ｐＹ４を生成した。
【０１９０】
テンプレートとしてｐＩＮＡ５３２、プライマーとしてＸＰＲ５’（配列番号４０）およびＸＰＲ３’（配列番号４１）を使用して、ＰＣＲによってＸＰＲ２転写ターミネーターを増幅した。上述の構成要素および条件を使用して、ＰＣＲ増幅を５０μＬの総容積中で実施した。１７９ｂｐのＰＣＲ生成物をＳａｃＩＩで消化し、ｐＹ４のＳａｃＩＩ部位にライゲーションしてｐＹ５を生成した。したがってｐＹ５（図３および４に示す）は、以下を含有するヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）−大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）シャトルプ
ラスミドとして有用である。
１）ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）自律性複製配列（ＡＲＳ１８）、
２）ＣｏｌＥ１プラスミド複製起点、
３）大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）中の選択のためのアンピシリン−抵抗性遺伝子（ＡｍｐＲ）、
４）ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における選択のためのヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＬＥＵ２遺伝子（Ｅ．Ｃ．４．２．１．３３、イソプロピルリンゴ酸異性化酵素をコードする）、
５）ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における異種性遺伝子発現のための翻訳延長プロモーター（ＴＥＦＰ）、
６）ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中の異種性遺伝子発現の転写終結のための細胞外のプロテアーゼ遺伝子ターミネーター（ＸＰＲ２）。
【０１９１】
ｐＹ５−１３（図４）をｐＹ５の誘導体として構築して、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中のサブクローニングおよび異種性遺伝子発現を容易にした。具体的にはｐＹ５をテンプレートとして使用して、６ラウンドの部位特異的変異誘発により、ｐＹ５−１３を構築した。オリゴヌクレオチドＹＬ５およびＹＬ６（配列番号１０６および１０７）を使用して、部位特異的変異誘発によってＳａｌＩおよびＣｌａＩ部位の双方をｐＹ５から除去し、ｐＹ５−５を生成した。オリゴヌクレオチドＹＬ９およびＹＬ１０（配列番号１１０および１１１）を使用して、部位特異的変異誘発によってＳａｌＩ部位をＬｅｕ２遺伝子とＴＥＦプロモーターの間でｐＹ５−５に導入し、ｐＹ５−６を生成した。オリゴヌクレオチドＹＬ７およびＹＬ８（配列番号１０８および１０９）を使用して、ＰａｃＩ部位をＬＥＵ２遺伝子とＡＲＳ１８の間でｐＹ５−６に導入し、ｐＹ５−８を生成した。オリゴヌクレオチドＹＬ３およびＹＬ４（配列番号１０４および１０５）を使用して、ＮｃｏＩ部位をＴＥＦプロモーターの翻訳開始コドン周囲でｐＹ５−８に導入し、ｐＹ５−９を生成した。ＹＬ１およびＹＬ２オリゴヌクレオチド（配列番号１０２および１０３）を使用して、ｐＹ５−９のＬｅｕ２遺伝子の内側のＮｃｏＩ部位を除去し、Ｙ５−１２を生成した。最後に、オリゴヌクレオチドＹＬ６１およびＹＬ６２（配列番号８８および８９）を使用して、ＢｓｉＷＩ部位をＣｏｌＥＩとＸＰＲ２領域の間でｐＹ５−１２に導入し、ｐＹ５−１３を生成した。
【０１９２】
プラスミドｐＹ５の第２の誘導体を構築し、サブクローニングを容易にした。具体的には、ｐＹ５をテンプレートとして使用して、３ラウンドの部位特異的変異誘発によってｐＹ５−４（図４）を構築した。オリゴヌクレオチドＹＬ１およびＹＬ２（配列番号１０２および１０３）を使用して、Ｌｅｕ２レポーター遺伝子内に位置するＮｃｏＩ部位をｐＹ５から除去し、ｐＹ５−１を生成した。オリゴヌクレオチドＹＬ３およびＹＬ４（配列番号１０４および１０５）を使用して、部位特異的変異誘発によってＮｃｏＩ部位をＴＥＦプロモーターとＸＰＲ２転写ターミネーターの間でｐＹ５−１に導入し、ｐＹ５−２を生成した。次にオリゴヌクレオチドＹＬ２３およびＹＬ２４（配列番号１１２および１１３）を使用して、ＰａｃＩ部位をＴＥＦプロモーターとＸＰＲ２転写ターミネーターの間でｐＹ５−２に導入し、ｐＹ５−４を生成した。
【０１９３】
実施例２
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の発現のためのΔ６デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、および高親和力ＰＵＦＡエロンガーゼ遺伝子の選択
ω−３および／またはω−６生合成経路をコードする特定の遺伝子の油性酵母菌への導入に先だって、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中で発現した異種性Δ６デサチュラーゼ、エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、およびΔ１７デサチュラーゼ遺伝子の機能性を確証することが必要であった。これは各野生型遺伝子によってコードされる別の宿主中での変換効率を測定することで達成された。具体的には基質供給試験において、４つのΔ５デサチュラーゼ、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼ、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ、およびＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）高親和力ＰＵＦＡエロンガーゼが別々に発現され、活性についてスクリーニングされた。これらの結果に基づいて、Δ６およびΔ１７デサチュラーゼおよび高親和力ＰＵＦＡエロンガーゼ遺伝子との組み合わせで使用するために、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼ遺伝子が選択された。
【０１９４】
発現プラスミドの構造
一般に野生型デサチュラーゼまたはエロンガーゼ遺伝子は、制限酵素消化によって単離され、あるいはＰＣＲによって増幅され、発現のために適切なベクター中に挿入された。各ＰＣＲ増幅は、１０ｎｇテンプレート、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．７５）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（最終濃度）を含有するＰＣＲ緩衝液と、２００μＭの各デオキシリボヌクレオチド三リン酸と、１０ｐｍｏｌｅの各プライマー、およびカリフォルニア州サンディエゴのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からの１μＬのＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼとを含んでなる５０μＬの総容積中で実施した。増幅を（特に断りのない限り）以下のように実施した。９５℃で３ｍｉｎの初期変性、それに続いて９５℃で１ｍｉｎ、５６℃で３０ｓｅｃ、７２℃で１ｍｉｎを３５サイクル。７２℃で１０ｍｉｎの最終延長サイクルの実施と、それに続く４℃での反応終結。
【０１９５】
野生型モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）（登録番号ＡＦ４６５２８１）Δ６デサチュラーゼ
Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼ遺伝子（配列番号１）を含有するｐＣＧＲ５（米国特許第５，９６８，８０９号明細書）の１３８４ｂｐのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片をｐＹ５−２（実施例１）のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位に挿入してｐＹ５４を生成した。
【０１９６】
野生型モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）（登録番号ＡＦ０６７６５４）Δ５デサチュラーゼ
プライマーとしてオリゴヌクレオチドＹＬ１１およびＹＬ１２（配列番号７２および７３）、テンプレートとしてプラスミドｐＣＧＲ−４（米国特許第６，０７５，１８３号明細書）を使用して、ＰＣＲによって、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼ遺伝子（配列番号３）を増幅した。延長ステップを１．５ｍｉｎ（サイクル１〜３５で）延長したこと以外は、ＰＣＲ増幅を上述のようにして実施した。１３５７ｂｐのＰＣＲ生成物をＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで消化して、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ−消化されたｐＹ５−１３（実施例１で述べられる）にライゲーションし、ｐＹＭＡ５ｐｂ（図５）を生成した。
【０１９７】
野生型サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）（ＡＴＣＣ番号５６８５１）Δ５デサチュラーゼ
プライマーとしてオリゴヌクレオチドＹＬ１３ＡおよびＹＬ１４（配列番号１１６および１１７）、テンプレートとしてプラスミドｐＲＳＰ３（国際公開第０２／０８１６６８号パンフレット）を使用して、ＰＣＲによって、Ｓ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）Δ５デサチュラーゼ遺伝子（配列番号１１４）を増幅した。延長ステップを１．５ｍｉｎ（サイクル１〜３５で）延長したこと以外は、上述のようにしてＰＣＲ増幅を実施した。１．４ｋＢＰＣＲ生成物をＮｃｏＩ／ＰａｃＩで消化し、ＮｃｏＩ／ＰａｃＩ−消化されたｐＹ５−４にライゲーションして（図４、実施例１で述べられる）、ｐＹＳＤ５を生成した。
【０１９８】
野生型ハプト藻（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）ＣＣＭＰ１３２３Δ５デサチュラーゼ
プライマーとしてオリゴヌクレオチドＹＬ１９ＡおよびＹＬ２０（配列番号１２０および１２１）、テンプレートとしてプラスミドｐＲＩＧ−１（国際公開第０２／０８１６６８  Ａ２号パンフレット）を使用して、ＰＣＲによって、ハプト藻（Ｉ．ｇａｌｂａｎａ）Δ５−デサチュラーゼ遺伝子（配列番号１１８）を増幅した。延長ステップを１．５ｍｉｎ（サイクル１〜３５で）延長したこと以外は、上述のようにしてＰＣＲ増幅を実施した。１．４ｋＢ  ＰＣＲの生成物をＢａｍＨＩ／ＰａｃＩＩで消化し、ＢａｍＨＩ／ＰａｃＩＩ−消化されたｐＹ５−４（実施例１で述べられる）にライゲーションして、ｐＹＩＧ５を生成した。
【０１９９】
野生型ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ）（ＡＴＣＣ番号３４３０４）Δ５デサチュラーゼ
プライマーとしてオリゴヌクレオチドＹＬ１５およびＹＬ１６Ｂ（配列番号１２４および１２５）、テンプレートとしてプラスミドｐＲＴＡ４（国際公開第０２／０８１６６８
Ａ２号パンフレット）を使用して、ＰＣＲによって、ヤブレツボカビ（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）Δ５−デサチュラーゼ遺伝子（配列番号１２２）を増幅した。延長ステップを１．５ｍｉｎ（サイクル１〜３５で）延長したこと以外は、上述のようにしてＰＣＲ増幅を実施した。１．４ｋＢのＰＣＲ生成物をＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで消化し、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ−消化されたｐＹ５−２（実施例１で述べられる）にライゲーションして、ｐＹＴＡ５を生成した。
【０２００】
野生型サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）（ＡＴＣＣ番号５６８５１）Δ１７デサチュラーゼ
オリゴヌクレオチドＹＬ２１Ａ（配列番号４２）およびＹＬ２２（配列番号４３）をプライマーとして使用して、ＰＣＲによって、プラスミドｐＲＳＰ１９（米国特許出願公開第２００３／０１９６２１７  Ａ１号明細書）からＳ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）の野生型Δ１７デサチュラーゼ遺伝子を増幅した。ＰＣＲ生成物をＮｃｏＩ／ＰａｃＩで消化し、次にＮｃｏＩ／ＰａｃＩ−消化されたｐＹ５−４（図４、実施例１で述べられる）にライゲーションして、ｐＹＳＤ１７を生成した。
【０２０１】
野生型モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）（登録番号ＡＸ４６４７３１）高親和力エロンガーゼ
Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）高親和力ＰＵＦＡエロンガーゼ遺伝子（配列番号７）のコード領域を含有するｐＲＰＢ２（国際公開第００／１２７２０号パンフレット）の９７３ｂｐのＮｏｔＩ断片を、ｐＹ５（実施例１で述べられる、図３および４）のＮｏｔＩ部位に挿入して、ｐＹ５８を生成した。
【０２０２】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換
チェン（Ｃｈｅｎ）Ｄ．Ｃ．ら（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８（２）：２３２〜２３５（１９９７））の方法に従って、プラスミドｐＹ５４、ｐＹＭＡ５ｐｂ、ｐＹＳＤ５、ｐＹＩＧ５、ｐＹＴＡ５、ｐＹＳＤ１７、およびｐＹ５８を別々にＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号７６９８２中に形質転換した。
【０２０３】
簡単に述べると、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）のロイシン栄養要求株をＹＰＤプレート上に画線し、３０℃でおよそ１８時間生育させた。いくつかの大型白金耳を満たす細胞をプレートからこすり取り、以下を含有する１ｍＬの形質転換緩衝液に再懸濁した。
２．２５ｍＬの５０％ＰＥＧ、平均分子量３３５０、
０．１２５ｍＬの２Ｍ酢酸Ｌｉ、ｐＨ６．０、
０．１２５ｍＬの２ＭＤＴＴ、および
５０μｇの剪断サケ精子ＤＮＡ。
【０２０４】
約５００ｎｇのプラスミドＤＮＡを１００μＬの再懸濁細胞内で培養し、１５ｍｉｎ間隔でボルテックス混合しながら３９℃に１ｈｒ維持した。細胞をロイシン欠乏最少培地プレートに蒔いて、３０℃で２〜３日間維持した。
【０２０５】
％基質変換の算出
ｐＹ５４、ｐＹＭＡ５ｐｂ、ｐＹＳＤ５、ｐＹＩＧ５、ｐＹＴＡ５、ｐＹＳＤ１７またはｐＹ５８を含有する形質転換体Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の単一コロニーをそれぞれ３ｍＬの最少培地（２０ｇ／Ｌグルコース、１．７ｇ／Ｌのアミノ酸なしの酵母窒素ベース、１ｇ／ＬのＬ−プロリン、０．１ｇ／ＬのＬ−アデニン、０．１ｇ／ＬのＬ−リジン、ｐＨ６．１）中で、３０℃でＯＤ６００が約１．０になるまで生育させた。基質供給のために、次に１０μｇの基質を含有する３ｍＬの最少培地内で１００μＬの細胞を３０℃で約２４ｈｒ継代培養した。細胞を引き続き遠心分離によって収集し、脂質を抽出し、エステル交換反応によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続きＧＣ（一般方法で述べられるように）によって分析した。％基質変換を以下のように計算した。［生成物／（基質＋生成物）］×１００。
【０２０６】
Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼによる％基質変換
Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼは、ＬＡをＧＬＡに、ＡＬＡをＳＴＡに変換する。ｐＹ５４を含有するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を上述のように（基質供給は必要でない）生育させ、脂質を分析した。結果は、ｐＹ５４のあるヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株が、約３０％のＬＡをＧＬＡに変換することを示した。
【０２０７】
Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）、Ｓ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）、ハプト藻（Ｉ．ｇａｌｂａｎａ）、およびヤブレツボカビ（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）Δ５デサチュラーゼによる％基質変換
Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）、Ｓ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）、ハプト藻（Ｉ．ｇａｌｂａｎａ）、およびヤブレツボカビ（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）からのΔ５デサチュラーゼは、それぞれＤＧＬＡをＡＲＡに、ＥＴＡをＥＰＡに変換する。ｐＹＭＡ５ｐｂ、ｐＹＳＤ５、ｐＹＩＧ５またはｐＹＴＡ５を含有するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を単一コロニーから別々に生育させ、１０μｇのＤＧＬＡを含有する最少培地で継代培養し、次に上述のように脂質分析にかけた。ｐＹＭＡ５ｐｂ（Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ））を有するヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株は、約３０％の細胞内ＤＧＬＡをＡＲＡに変換し、ｐＹＳＤ５（Ｓ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ））を有するヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株は約１２％を変換し、ｐＹＩＧ５（ハプト藻（Ｉ．ｇａｌｂａｎａ））を有するヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株は約７％を変換し、
ｐＹＴＡ５（ヤブレツボカビ（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ））を有するヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株は、約２３％の細胞内ＤＧＬＡをＡＲＡに変換した。
【０２０８】
Ｓ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼによる％基質変換
Ｓ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼは、ＡＲＡをＥＰＡに、ＤＧＬＡをＥＴＡに変換する。ｐＹＳＤ１７を含有するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を単一コロニーから生育させ、１０μｇのＡＲＡを含有する最少培地で継代培養し、上述のように脂質分析にかけた。ＡＲＡ供給実験の結果は、ｐＹＳＤ１７を有するヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株が約２３％の細胞内ＡＲＡをＥＰＡに変換した
ことを示した。
【０２０９】
野生型Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）高親和力エロンガーゼの％基質変換
Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）高親和力ＰＵＦＡエロンガーゼは、ＧＬＡをＤＧＬＡに、ＳＴＡをＥＴＡに、ＥＰＡをＤＰＡに変換する。ｐＹ５８を含有するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を単一コロニーから生育させ、１０μｇのＧＬＡを含有する最少培地で継代培養し、上述のように脂質分析にかけた。ＧＬＡ供給実験の結果は、ｐＹ５８を有するヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株が、約３０％の細胞内ＧＬＡをＤＧＬＡに変換したことを示した。
【０２１０】
実施例３
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中のコドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子の合成および発現
実施例２の結果に基づいて、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中でそれぞれが約３０％の基質変換ができるΔ６デサチュラーゼ、エロンガーゼおよびΔ５デサチュラーゼ活性をコードする遺伝子が入手できた。しかしＳ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）からのΔ１７デサチュラーゼは、２３％のみの最大％基質変換を有した。したがってヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン使用パターン、ＡＴＧ翻訳開始コドン周囲の共通配列、およびＲＮＡ安定性の一般規則（グハニヨギ（Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ）Ｇ．およびＪ．ブルーアー（Ｂｒｅｗｅｒ）、Ｇｅｎｅ  ２６５（１〜２）：１１〜２３（２００１））に従って、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）ＤＮＡ配列（配列番号５）に基づいて、コドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子をデザインした。
【０２１１】
翻訳開始部位の修正に加えて、１０７７ｂｐのコード領域（１１７のコドンを含んでなる）の１２７ｂｐをコドン最適化した。このコドン最適化ＤＮＡ配列（配列番号９）とＳ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ遺伝子ＤＮＡ配列（配列番号５）との比較を図６に示し、そこでは太字のヌクレオチドが、コドン最適化遺伝子において修正されたヌクレオチドに対応する。コドン最適化遺伝子中の修正のいずれも、コードされたタンパク質（配列番号６）のアミノ酸配列を変化させなかった。
【０２１２】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において好まれるコドン使用の判定
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のおよそ１００個の遺伝子が、アメリカ国立バイオテクノロジー情報センター公共データベースにある。１２１，１６７ｂｐを含んでなるこれらの遺伝子のコード領域をＤＮＡＳｔａｒのＥｄｉｔｓｅｑプログラムによって対応する４０，３８９個のアミノ酸に翻訳し、表３に示すＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のコドン使用プロフィールを判定するために表にした。「Ｎｏ．」と題された欄は、特定のコドンが、４０，３８９個のアミノ酸のサンプル中で特定のアミノ酸をコードする回数を指す。「％」と題された欄は、特定のコドンが特定のアミノ酸をコードする頻度を指す。太字で示されるエントリはヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で好まれるコドンを表す。
【０２１３】
【表４】
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【０２１４】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中でのさらなる遺伝子発現の最適化のために、７９個の遺伝子の「ＡＴＧ」開始コドン周囲の共通配列を調査した。図７では、下線を引いたＡＴＧ翻訳コドンの第１の「Ａ」は、＋１と見なされる。分析された遺伝子の７７％が、−３の位置に「Ａ」を有し、この位置における「Ａ」に対する強い優先度が示された。また−４、−２および−１の位置で「Ａ」または「Ｃ」に、＋５の位置で「Ａ」、「Ｃ」または「Ｔ」に、＋６の位置で「Ｇ」または「Ｃ」に対する優先度があった。したがってＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中における遺伝子の最適発現のためのコドン最適化翻訳開始部位の好ましい共通配列は、「ＭＡＭＭＡＴＧＮＨＳ」（配列番号１２６）であり、そこで使用された核酸退縮コードは、以下のようである。Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｓ＝Ｃ／Ｇ、Ｈ＝Ａ／Ｃ／Ｔ、およびＮ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ。
【０２１５】
コドン最適化遺伝子の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）合成
コドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子を合成するのに使用される方法は、図８で図示される。最初に１１対のオリゴヌクレオチドがデザインされて、Ｓ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ遺伝子（例えば配列番号１０〜３１に対応する、Ｄ１７−１Ａ、Ｄ１７−１Ｂ、Ｄ１７−２Ａ、Ｄ１７−２Ｂ、Ｄ１７−３Ａ、Ｄ１７−３Ｂ、Ｄ１７−４Ａ、Ｄ１７−４Ｂ、Ｄ１７−５Ａ、Ｄ１７−５Ｂ、Ｄ１７−６Ａ、Ｄ１７−６Ｂ、Ｄ１７−７Ａ、Ｄ１７−７Ｂ、Ｄ１７−８Ａ、Ｄ１７−８Ｂ、Ｄ１７−９Ａ、Ｄ１７−９Ｂ、Ｄ１７−１０Ａ、Ｄ１７−１０Ｂ、Ｄ１７−１１Ａ、およびＤ１７−１１Ｂ）のコドン最適化コード領域の全長が延長される。各５’末端の４ｂｐのオーバーハングを例外として、センス（Ａ）およびアンチセンス（Ｂ）オリゴヌクレオチドの各対は相補的である。さらにプライマーＤ１７−１Ａ、Ｄ１７−４Ｂ、Ｄ１７−５Ａ、Ｄ１７−８Ａ、およびＤ１７−８Ｂもまた、それぞれ引き続くサブクローニングのために、ＮｃｏＩ、ＢｇｌＩＩおよびＳａｌＩ制限部位に導入される。
【０２１６】
５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭスペルミジン、０．５ｍＭ  ＡＴＰおよび１０ＵのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含有する２０μＬの容積中で、１００ｎｇの各オリゴヌクレオチドを３７℃で１ｈｒリン酸化した。センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの各対を混合し、以下のパラメータを使用して、サーモサイクラー中でアニールした。９５℃（２ｍｉｎ）、８５℃（２ｍｉｎ）、６５℃（１５ｍｉｎ）、３７℃（１５ｍｉｎ）、２４℃（１５ｍｉｎ）および４℃（１５ｍｉｎ）。このようにしてＤ１７−１Ａ（配列番号１０）をＤ１７−１Ｂ（配列番号１１）にアニールし、二本鎖生成物「Ｄ１７−１ＡＢ」を生成した。同様に、Ｄ１７−２Ａ（配列番号１２）をＤ１７−２Ｂ（配列番号１３）にアニールし、二本鎖生成物「Ｄ１７−２ＡＢ」を生成した。
【０２１７】
次に以下に示すように３個の別個のアニールされた二本鎖オリゴヌクレオチドのプールを一緒にライゲーションした。
・プール１：Ｄ１７−１ＡＢ、Ｄ１７−２ＡＢ、Ｄ１７−３ＡＢ、およびＤ１７−４ＡＢを含んでなる、
・プール２：Ｄ１７−５ＡＢ、Ｄ１７−６ＡＢ、Ｄ１７−７ＡＢ、およびＤ１７−８ＡＢを含んでなる、そして
・プール３：Ｄ１７−９ＡＢ、Ｄ１７−１０ＡＢ、およびＤ１７−１１ＡＢを含んでなる。
【０２１８】
アニールされたオリゴヌクレオチドの各プールを２０μＬの容積中で１０ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼと共に混合し、ライゲーション反応を一晩１６℃で培養した。
【０２１９】
次に各ライゲーション反応の生成物をＰＣＲによって増幅した。具体的には、テンプレートとしてライゲーションされた「プール１」混合物（すなわちＤ１７−１ＡＢ、Ｄ１７−２ＡＢ、Ｄ１７−３ＡＢ、およびＤ１７−４ＡＢ）、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＤ１７−１（配列番号３２）およびＤ１７−４Ｒ（配列番号３３）を使用して、コドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子の第１の部分をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ増幅を１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．７５）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（最終濃度）を含有するＰＣＲ緩衝液と、各２００μＭのデオキシリボヌクレオチド三リン酸と、１０ｐｍｏｌｅの各プライマーと、カリフォルニア州サンディエゴのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からの１μＬのＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼとを含んでなる５０μＬの総容積中で実施した。増幅を以下のようにして実施した。９５℃で３ｍｉｎの初期変性と、それに続く９５℃で１ｍｉｎ、５６℃で３０ｓｅｃ、７２℃で４０ｓｅｃの３５サイクル。７２℃で１０ｍｉｎの最終延長サイクルと、それに続く４℃での反応終結を実施した。４３０ｂｐのＰＣＲ断片をｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））中にサブクローニングして、ｐＴ１７（１−４）を生成した。
【０２２０】
テンプレートとしてライゲーションされた「プール２」混合物（すなわちＤ１７−５ＡＢ、Ｄ１７−６ＡＢ、Ｄ１７−７ＡＢ、およびＤ１７−８ＡＢ）、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＤ１７−５（配列番号３４）およびＤ１７−８Ｄ（配列番号３５）を使用して、コドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子の第２の部分を同様にＰＣＲによって増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ−イージーベクター中にクローンしてｐＴ１７（５−８）を生成した。最後に、テンプレートとして「プール３」ライゲーション混合物（すなわちＤ１７−９ＡＢ、Ｄ１７−１０ＡＢ、およびＤ１７−１１ＡＢ）、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＤ１７−８Ｕ（配列番号３６）、Ｄ１７−１１（配列番号３７）を使用して、同様にＰＣＲによってコドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子の第３の部分を増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ−イージーベクター中にクローンしてｐＴ１７（９−１１）を生成した。
【０２２１】
大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）をｐＴ１７（１〜４）、ｐＴ１７（５〜８）、およびｐＴ１７（９〜１１）で別々に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン−抵抗性形質転換体から単離した。プラスミドＤＮＡを適切な制限エンドヌクレアーゼで精製し消化して、ｐＴ１７（１〜４）の４２０ｂｐ  ＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩ断片、ｐＴ１７（５〜８）の４００ｂｐ  ＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ断片、およびｐＴ１７（９〜１１）の３００ｂｐ  ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ断片を遊離した。次にこれらの断片を組み合わせて一緒にライゲーションして、合成コドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子全体の増幅のためのテンプレートとして使用し、Ｄ１７−１（配列番号３２）およびＤ１７−１１（配列番号３７）をプライマーとして使用した。上述のΔ１７デサチュラーゼ遺伝子の各部分のための条件、および以下のサーモサイクリングを使用して、５０μＬの総容積中でＰＣＲ増幅を実施した。９５℃で３ｍｉｎの初期変性と、それに続く９５℃で１ｍｉｎ、５６℃で３０ｓｅｃ、７２℃で１．１ｍｉｎの３５サイクル。７２℃で１０ｍｉｎの最終延長サイクルと、それに続く４℃での反応終結を実施した。これにより１．１ｋＢのＰＣＲ生成物が生じた。
【０２２２】
コドン最適化Δ１７デサチュラーゼを含有するプラスミドｐＹＳＤ１７ｓの構築
合成Δ１７デサチュラーゼ全体を含んでなる１．１ｋＢのＰＣＲ生成物をＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで消化し、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで消化されたｐＹ５−１３（実施例１）中にサブクローニングして、ｐＹＳＤ１７Ｓ（図９Ａ）を生成した。
【０２２３】
追加的な「対照」として、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中における野生型と合成遺伝子の効率を比較するために、ＹＬ５３（配列番号４４）およびＹＬ５４（配列番号４５）をプライマーとして使用して、部位特異的変異誘発によって、ｐＹＳＤ１７（野生型遺伝子を含んでなる、実施例２で述べられる）中のＡＴに富んだＰａｃＩ部位を除外し、ｐＹＳＤ１７Ｍ（図９Ｂ）を生成した。
【０２２４】
コドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子によるヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換
実施例２で上述した方法に従って、野生型およびコドン最適化Δ１７デサチュラーゼ含有するプラスミドをＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号７６９８２中で別々に形質転換した。この技術を使用して、以下のプラスミドを含有する形質転換体を得た。
【０２２５】
【表５】
2007504839.tif 000007
【０２２６】
コドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子による％基質変換
Δ１７デサチュラーゼは、ＡＲＡをＥＰＡに変換する（図２参照）。一般方法で述べられる方法を使用して、各別のプラスミドコンストラクト、含有するヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で、野生型およびコドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子の％基質変換（［生成物］／［基質＋生成物］×１００）を計算した。
【０２２７】
ＡＲＡ供給実験の結果は、対照プラスミドｐＹＳＤ１７またはｐＹＳＤ１７Ｍを有するヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株が、約２３％の細胞内ＡＲＡをＥＰＡ（図１０Ａ）に変換し、他方、ｐＹＳＤ１７Ｓ内にコドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子を含有するものは、約４５％の細胞内ＡＲＡをＥＰＡ（図１０Ｂ）に変換することを示した。したがってコドン最適化Δ１７デサチュラーゼを含有するヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）は、野生型Ｓ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）遺伝子を含有する株に比べて約２倍のＡＲＡを変換した。
【０２２８】
実施例４
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での複数のΩ脂肪酸生合成遺伝子の協調発現に適したプラスミドの構築
本実施例は、以下を構築するのに必要とされる多様な発現プラスミドの合成について述べる。１．）Δ６デサチュラーゼ、ＰＵＦＡエロンガーゼ、およびΔ５デサチュラーゼ（ＡＲＡ生成のため）発現のためにヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノム中へ組み込むのに適したＤＮＡ断片、および２．）Δ６デサチュラーゼ、ＰＵＦＡエロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、およびΔ１７デサチュラーゼ（ＥＰＡ生成のため）発現のためにヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノム中へ組み込むのに適したＤＮＡ断片。
【０２２９】
プラスミドｐＹ２４の構築
プラスミドｐＹ２４（図１１）は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌ
ｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノム中への組み込みに適した、発現カセット構築の親ベクターであった。ｐＹ２４を以下のようにして構築した。
【０２３０】
プライマーとしてオリゴヌクレオチドＫＵ５およびＫＵ３（配列番号４６および４７）、テンプレートとしてヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムＤＮＡを使用して、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＵＲＡ３遺伝子を含有する１．７ｋＢのＤＮＡ断片（配列番号４８）をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅は、１００ｎｇのヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムＤＮＡと、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．７５）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（最終濃度）を含有するＰＣＲ緩衝液と、各２００μＭのデオキシリボヌクレオチド三リン酸と、１０ｐｍｏｌｅの各プライマーと、カリフォルニア州サンディエゴのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からの１μＬのＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼとを含有する５０μＬの総容積中で実施した。増幅を以下のようにして実施した。９５℃で３ｍｉｎの初期変性と、それに続く９５℃で１ｍｉｎ、５６℃で３０ｓｅｃ、７２℃で２ｍｉｎの３５サイクル。７２℃で１０ｍｉｎの最終延長サイクルと、それに続く４℃での反応終結を実施した。ＰＣＲ生成物をウィスコンシン州マディソンのプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））からのｐＧＥＭ−Ｔイージーベクターに挿入し、ｐＧＹＵＭを生成した。
【０２３１】
オリゴヌクレオチドＫＩ５およびＫＩ３（配列番号５０および５１）を使用して、ホウセンカ（Ｉｍｐａｔｉｅｎｓ  ｂａｌｓａｍａ）のコンジュガーゼ遺伝子（または「ｉｍｐ  Ｈ８」）を含有する１．１ｋＢのＤＮＡ断片（配列番号５２）（ｃｌｏｎｅ  ｉｄｓ．ｐｋ０００１．ｈ８、ウィスコンシン州デラウェアのＥ．Ｉ．デュポン・ドゥ・ヌムール・アンド・カンパニー（Ｅ．Ｉ．ｄｕＰｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ））をＰＣＲ増幅した。１０ｎｇのｉｄｓ．ｐｋ０００１．ｈ８のプラスミドＤＮＡをテンプレートとして使用したこと以外は、上述の構成要素を使用して、５０μＬの総容積中でＰＣＲ増幅を実施した。増幅を以下のようにして実施した。９５℃で３ｍｉｎの初期変性と、それに続く９５℃で１．５ｍｉｎ、５６℃で３０ｓｅｃ、７２℃で１．２ｍｉｎの３５サイクル。７２℃で１０ｍｉｎの最終延長サイクルと、それに続く４℃での反応終結を実施した。ＰＣＲ生成物をＮｏｔＩで消化し、次にｐＹ５（図３）のＮｏｔＩ部位に挿入して、ｐＹ９を生成した。
【０２３２】
オリゴヌクレオチドＫＴＩ５およびＫＴＩ３（配列番号５４および５５）を使用して、ｐＹ９のＴＥＦ：：ＩＭＰＨ８：：ＸＰＲキメラ遺伝子を含有する１．７ｋＢのＤＮＡ断片（配列番号５６）をＰＣＲ増幅した。１０ｎｇのｐＧＹＵＭのプラスミドＤＮＡをテンプレートとして使用したこと以外は、上述のようにして、５０μＬの総容積中でＰＣＲ増幅を実施した。増幅を以下のようにして実施した。９５℃で３ｍｉｎの初期変性と、それに続く９５℃で１ｍｉｎ、５６℃で３０ｓｅｃ、７２℃で２ｍｉｎの３５サイクル。７２℃で１０ｍｉｎの最終延長サイクルと、それに続く４℃での反応終結を実施した。ＰＣＲ生成物をＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））中に挿入して、ｐＹ９Ｒを生成した。ｐＹ９Ｒの１．７ｋＢのＸｈｏ／ＥｃｏＲＶ断片をｐＧＹＵＭのＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＶ断片と交換して、ｐＹ２１を生成した。
【０２３３】
プライマーとしてオリゴヌクレオチドＫＨ５およびＫＨ３（配列番号５８および５９）、テンプレートとしてＫＳ６５のゲノムＤＮＡを使用して、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ハイグロマイシン抵抗性遺伝子（「ＨＰＴ」、カスター（Ｋａｓｔｅｒ）Ｋ．Ｒ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：６８９５〜６９１１（１９８３））を含有する１ｋＢのＤＮＡ断片（配列番号６０）をＰＣＲ増幅した。１０ｎｇのｉｄｓ．ｐｋ０００１．ｈ８のプラスミドＤＮＡをテンプレートとして使用したこと以外は、上述の構成要素を使用して、５０μＬの総容積中でＰＣＲ増幅を実施した。増幅を以下のようにして実施
した。９５℃で３ｍｉｎの初期変性と、それに続く９５℃で１ｍｉｎ、５６℃で３０ｓｅｃ、７２℃で１．２ｍｉｎの３５サイクル。７２℃で１０ｍｉｎの最終延長サイクルと、それに続く４℃での反応終結を実施した。ＰＣＲ生成物をＮｏｔＩで消化し、次にｐＹ５（図３）のＮｏｔＩ部位に挿入して、ｐＴＨＰＴ−１を生成した。
【０２３４】
プライマーとしてオリゴヌクレオチドＫＴＨ５およびＫＴＨ３（配列番号６２および６３）、テンプレートとしてｐＴＨＰＴ−１プラスミドＤＮＡを使用して、ＴＥＦ：：ＨＰＴ：：ＸＰＲ融合遺伝子を含有する１．６ｋＢのＤＮＡ断片（配列番号６４）を上述のように増幅した。ＰＣＲ生成物をＢｇｌＩＩで消化して、次にｐＹ２１中に挿入してｐＹ２４を生成した。
【０２３５】
ｐＹ２４−４の構築
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノム中への組み込みに適した発現カセット構築のために、プラスミドｐＹ２４（図１１）を使用した。ｐＹ２４プラスミド中のＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＵＲＡ３遺伝子からの４０１ｂｐの５’配列（配列番号６６）および５６８ｂｐの３’配列（配列番号６７）を使用して、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムのＵｒａ遺伝子座中への発現カセットの組み込みを導いた。ＢａｍＨＩでの消化および自己−ライゲーションによって、２つのキメラ遺伝子（ＴＥＦ：：ＨＰＴ：：ＸＰＲおよびＴＥＦ：：ＩＭＰＨ８：：ＸＰＲ）を最初にｐＹ２４から除去し、ｐＹ２４−１を生成した。ＹＬ６３／ＹＬ６４（配列番号６８および６９）およびＹＬ６５／ＹＬ６６（配列番号７０および７１）プライマー対をそれぞれ使用して、特異的変異誘発によって、ＰａｃＩおよびＢｓｉＷＩ部位をｐＹ２４−１部位に導入し、ｐＹ２４−４を生成した。
【０２３６】
Δ５デサチュラーゼの発現のための組み込みベクターの構築
ｐＹＭＡ５ｐｂの４２６１ｂｐのＰａｃＩ／ＢｓｉＷＩ断片（Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼ遺伝子を含んでなる、実施例２で述べられる）をｐＹ２４−４のＰａｃＩ／ＢｓｉＷＩ部位（図１１）にライゲーションして、ｐＹＺＭ５（図５）を生成した。プライマー対ＹＬ８１およびＹＬ８２（配列番号７４および７５）およびＹＬ８３およびＹＬ８４（配列番号７６および７７）をそれぞれを使用して、特異的変異誘発によって、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＣｌａＩ部位をｐＹＺＭ５部位に導入し、ｐＹＺＭ５ＣＨを生成した。部位特異的変異誘発によって、ＹＬ１０５およびＹＬ１０６（配列番号７８および７９）をプライマーとして使用して、ＰｍｅＩ部位をｐＹＺＭ５ＣＨ中に導入し、ｐＹＺＭ５ＣＨＰＰを生成した。ＹＬ１１９およびＹＬ１２０（配列番号８０および８１）をプライマーとして使用して、特異的変異誘発によってＡｓｃＩ部位をｐＹＺＭ５ＣＨＰＰ部位に導入し、ｐＹＺＭ５ＣＨＰＰＡを生成した（図５）。
【０２３７】
組み込みベクターを最適化するために、ＹＬ１２１およびＹＬ１２２（配列番号８２および８３）をプライマーとして使用して、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ
ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＵＲＡ３遺伝子（配列番号８４）上流の４４０ｂｐの５’非コーディングＤＮＡ配列をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ生成物をＡｓｃＩおよびＢｓｉＷＩで消化し、次にｐＹＺＭ５ＣＨＰＰＡのＡｓｃＩ／ＢｓｉＷＩ断片（図５および１２）と交換し、ｐＹＺＭ５ＵＰＡ（図１２）を生成した。オリゴヌクレオチドＹＬ１１４およびＹＬ１１５（配列番号８５および８６）を使用して、特異的変異誘発によって、ｐＹＺＭ５ＵＰＡ部位にＡｓｃＩ部位を導入し、ｐＹＺＶ５を生成した。ｐＹＺＶ５中のＵＲＡ３遺伝子の３’−非コード領域のサイズを低下させるために、オリゴヌクレオチドＹＬ１１４およびＹＬ１１５（上述の）を使用して、部位特異的変異誘発によって、この領域の中央に第２のＰａｃＩ部位を導入し、ｐＹＺＶ５Ｐを生成した。ＰａｃＩでの消化および再ライゲーションによって、ｐＹＺＶ５ＰのＰａｃＩ断片を切除し、ｐＹＺＶ１６（図１２）を生成した。ＡｓｃＩによるｐＹＺＶ１６の消化は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉ
ｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノム中のΔ５デサチュラーゼ遺伝子（「ＭＡＤ５」）への組み込みおよび発現に適した、５．２ｋＢのＤＮＡ断片（配列番号８７）を遊離させる。
【０２３８】
高親和力エロンガーゼおよびΔ５デサチュラーゼ発現のための組み込みベクターの構築
ＹＬ６１／ＹＬ６２（配列番号８８および８９）およびＹＬ６９／ＹＬ７０（配列番号９０および９１）プライマー対をそれぞれ使用して、部位特異的変異誘発によって、ＢｓｉＷＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位をｐＹ５８（Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）高親和力ＰＵＦＡエロンガーゼのコード領域を含有する、実施例２で表される）に導入し、ｐＹ５８ＢＨ（図１３、「ＥＬ」と標識されるエロンガーゼ遺伝子）を生成した。ＴＥＦ：：ＥＬ：：ＸＰＲキメラ遺伝子を含有する、ｐＹ５８ＢＨの１．７ｋＢのＢｓｉＷＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＹＺＭ５ＣＨＰＰのＢｓｉＷＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位（構造は図５で表される）にライゲーションして、ｐＹＺＭ５ＥＬ（図１３）を生成した。このプラスミドは、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中のＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼおよび高親和力ＰＵＦＡエロンガーゼ遺伝子の組み込みおよび協調発現に適する。
【０２３９】
Δ６デサチュラーゼ、高親和力エロンガーゼおよびΔ５デサチュラーゼ発現のための組み込みベクターの構築
ＹＬ７７／ＹＬ７８（配列番号９２および９３）およびＹＬ７９Ａ／ＹＬ８０Ａ（配列番号９４および９５）プライマー対をそれぞれ使用して、部位特異的変異誘発によって、ＰａｃＩおよびＣｌａＩ部位をｐＹ５４（Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼを含有する、実施例２で表される）に導入し、ｐＹ５４ＰＣ（図１３、「ＭＡＤ６」と標識されたΔ６デサチュラーゼ遺伝子）を生成した。ＴＥＦ：：ＭＡＤ６：：ＸＰＲキメラ遺伝子を含有するｐＹ５４ＰＣの２ｋＢのＣｌａＩ／ＰａｃＩのＤＮＡ断片をｐＹＺＭ５ＥＬのＣｌａＩ／ＰａｃＩ部位にライゲーションして、ｐＹＺＭ５ＥＬ６（図１３）を生成した。このプラスミドは、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）でのＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼおよび高親和力ＰＵＦＡエロンガーゼ遺伝子ゲノムの組み込みおよび協調発現に適する。
【０２４０】
Δ６デサチュラーゼ、ＰＵＦＡエロンガーゼおよびΔ５デサチュラーゼの発現のためにヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノム中に組み込むのに適したＤＮＡ断片の構築
プラスミドｐＹＺＶ１６（構造は図１２で表される）は、複数の発現カセットを含有するプラスミド構築のために使用された。
【０２４１】
最初にｐＹＺＶ１６の３．５ｋＢのＢｓｉＷＩ／ＰａｃＩ断片をｐＹＺＭ５ＥＬ６（構造は図１３で表される）の７．９ｋＢのＢｓｉＷＩ／ＰａｃＩ断片にライゲーションして、ｐＹＺＶ５ＥＬ６（図１４）を生成した。ＡｓｃＩでのｐＹＺＶ５ＥＬ６の消化によって、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノム中のΔ６デサチュラーゼ、ＰＵＦＡエロンガーゼおよびΔ５デサチュラーゼ遺伝子の組み込みおよび協調発現に適する、８．９ｋＢのＤＮＡ断片（配列番号９６）が遊離された。
【０２４２】
Δ６デサチュラーゼ、ＰＵＦＡエロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、およびΔ１７デサチュラーゼの発現のためにヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムへの組み込むのに適したＤＮＡ断片の構築
実施例３で述べられるように、合成Ｓ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ遺伝子をｐＹ５−１３のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位に挿入してｐＹＳＤ１７Ｓ（図９Ａ）を生成した。ＹＬ１０１／ＹＬ１０２（配列番号９７および９８）およびＹＬ１０３／ＹＬ１０４（配列番号９９および１００）プライマー対をそれぞれ使用して、部位特異的変異誘発によってＣｌａＩおよびＰｍｅＩ部位をｐＹＳＤ１７Ｓに導入し、ｐＹＳＤ１７ＳＰＣを生成した（図１４）。
【０２４３】
ｐＹＺＶ５ＥＬ６の（図１４）の３４７ｂｐのＣｌａＩ／ＰｍｅＩ断片をΔ１７デサチュラーゼ発現カセットを含有するｐＹＳＤ１７ＳＰＣからの１７６０ｂｐ  ＣｌａＩ／ＰｍｅＩ断片と交換して、ｐＹＺＶ５Ｅ６／１７を生成した。ＡｓｃＩでのｐＹＺＶ５Ｅ６／１７の消化により、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノム中におけるΔ６デサチュラーゼ、ＰＵＦＡエロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、およびΔ１７デサチュラーゼ遺伝子の組み込みおよび協調発現に適する１０．３ｋＢのＤＮＡ断片（配列番号１０１）が遊離された。
【０２４４】
実施例５
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換体中のω−６脂肪酸の生合成
実施例２で述べられる方法に従って、ｐＹＺＶ５ＥＬ６（実施例４から、Δ６デサチュラーゼ、ＰＵＦＡエロンガーゼ、およびΔ５デサチュラーゼ遺伝子を含有する）をＡｓｃＩ制限エンドヌクレアーゼで消化して、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に形質転換した。
【０２４５】
ロイシン欠乏最少培地上で選択した５２の形質転換体の内、３４はウラシルもまた欠如している培地上では生育できず、６５％の形質転換体が、標的ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＵＲＡ３遺伝子座中に組み込まれた８．９ｋＢの多遺伝子発現カセットを含有することが示唆された。単一コロニーからの形質転換体をロイシン欠乏最少培地に接種して、３０℃で４８時間まで培養した。
【０２４６】
細胞を遠心分離して収集し、脂質を抽出して脂肪酸メチルエステルをエステル交換反応によって調製し、引き続きヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０  ＧＣで分析した（一般方法で述べられる方法に従った）。
【０２４７】
ＧＣ分析は、３個のキメラ遺伝子（図１５）を含有する形質転換体中のアラキドン酸（ＡＲＡ）の存在を示したが、野生型ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）対照株には示されなかった。これらのデータはヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が遺伝子操作されて、ω−６脂肪酸であるＡＲＡを生成したことを確証した。
【０２４８】
実施例６
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換体中のω−３脂肪酸の生合成
実施例５と同様にして、ｐＹＺＶ５Ｅ６／１７（実施例４から、Δ６デサチュラーゼ、ＰＵＦＡエロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、およびΔ１７デサチュラーゼを含有する）をＡｓｃＩ制限エンドヌクレアーゼで消化して、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ番号７６９８２）に形質転換した。ロイシン欠乏最少培地上で選択した１３３の形質転換体の内、８９はウラシルもまた欠如している培地上では生育できず、６７％の形質転換体が、標的ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＵＲＡ３遺伝子座中に組み込まれた１０．３ｋＢ  多遺伝子発現カセットを含有することが示唆された。
【０２４９】
ＧＣ分析（一般方法で述べられる方法に従った）は、４個のキメラ遺伝子（図１６）を含有する形質転換体中のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の存在を示したが、野生型ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）対照株中には示されなかった。これらのデータはヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が遺伝子操作されて、ω−３脂肪酸であるＥＰＡを生成したことを確証した。
【図面の簡単な説明】
【０２５０】
【図１】油性酵母菌における脂質蓄積のための生化学的機序の概略図を示す。
【図２】ω−３／ω−６脂肪酸の生合成経路を図示する。
【図３】ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での遺伝子発現のためのプラスミドベクターｐＹ５の構築を図示する。
【図４】Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での遺伝子発現のためのプラスミドベクターｐＹ５−４およびｐＹ５−１３の構築を図示する。
【図５】中間ベクターｐＹＺＭ５ＣＨＰＰＡの構築の概略図である。
【図６】サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列と、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現に最適化された合成遺伝子コドンとの比較を示す。
【図７】Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の翻訳開始コドン「ＡＴＧ」周囲の好まれる共通配列を図示する。
【図８】コドン−最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）合成のために用いられるストラテジーを図示する。
【図９】Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の合成コドン−最適化および野生型Δ１７デサチュラーゼ遺伝子発現のためのプラスミドを示す。
【図１０Ａ】野生型Δ１７デサチュラーゼ遺伝子で形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で生成された脂肪酸のガスクロマトグラフィーの分析の結果を示す。
【図１０Ｂ】合成コドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子で形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で生成された脂肪酸のガスクロマトグラフィーの分析の結果を示す。
【図１１】中間ベクターｐＹ２４−４の構築の概略図である。
【図１２】中間ベクターｐＹＺＶ１６の構築の概略図である。
【図１３】組み込みベクターｐＹＺＭ５ＥＬ６の構築の概略図である。
【図１４】組み込みベクターｐＹＺＶ５ＥＬ６およびｐＹＺＶ５ＥＬ６／１７の構築の概略図である。
【図１５】遺伝子操作されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からのＡＲＡ生成を図示するクロマトグラムである。
【図１６】遺伝子操作されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からのＥＰＡ生成を図示するクロマトグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ａ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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