(57)【要約】【解決手段】好ましくは核酸の三量体複合体を形成する、式IまたはIIのメラミン誘導体などの複合化剤の周りに複合した二本鎖核酸のナノ粒子である。代替的実施態様においては、二本鎖核酸複合体に更にポリアルギニンまたはＧｌｎとＡｓｎのポリマーを複合させる。好ましい実施態様においては、二本鎖核酸はＲＮＡ干渉に適した１５〜３０塩基対を有する二本鎖ＲＮＡである。本発明の他の側面においては、すべてのウリジンを５−メチルウリジンに変化させた二本鎖ＲＮＡを製造する。得られた二本鎖ＲＮＡは好ましくは１５〜約３０塩基対を有し、ＲＮＡ干渉に適する。【選択図】図１Ａ【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つ以上の二本鎖（ｄｓ）核酸の複合体を形成し得る化合物と複合した二本鎖核酸。
【請求項２】
前記ｄｓ複合体が更にポリアルギニンポリペプチドと複合した、請求項１のｄｓ核酸。
【請求項３】
ポリペプチド中のアルギニン残基がアルギニンのＤ型およびＬ型光学異性体の混合物である、請求項２のｄｓ核酸複合体。
【請求項４】
ポリアルギニンがアルギニンのＤ型およびＬ型光学異性体の交互配列から成る、請求項３のｄｓ核酸複合体。
【請求項５】
アルギニンのいずれかの末端に他の成分が結合している、請求項２のｄｓ核酸複合体。
【請求項６】
前記成分が炭水化物成分またはポリペプチド成分である、請求項５のｄｓ核酸。
【請求項７】
前記炭水化物がマンノースまたはガラクトースである、請求項６のｄｓ核酸複合体。
【請求項８】
前記ポリペプチドがヒト免疫不全ウイルスのＴＡＴシーケンスまたはその一部である、請求項６のｄｓ核酸複合体。
【請求項９】
前記ｄｓ核酸複合体が更に、グルタミン（Ｇｌｕ）およびアスパラギン（Ａｓｎ）残基であるアミノ酸残基から成るポリペプチドと複合した、請求項１のｄｓ核酸。
【請求項１０】
前記アミノ酸残基がＤ型およびＬ型光学異性体の混合物である、請求項９の核酸複合体。
【請求項１１】
Ｄ型アミノ酸残基がＬ型アミノ酸残基と交互に配列されている、請求項１０のｄｓ核酸複合体。
【請求項１２】
Ｇｌｕ残基がすべてＤ型光学異性体であり、Ａｓｎ残基がすべてＬ型光学異性体である、請求項１１のｄｓ核酸複合体。
【請求項１３】
Ｇｌｕ残基がすべてＬ型光学異性体であり、Ａｓｎ残基がすべてＤ型光学異性体である、請求項１１のｄｓ核酸複合体。
【請求項１４】
前記化合物がｄｓ核酸と、ｄｓ核酸の燐酸基において複合した、請求項１のｄｓ核酸複合体。
【請求項１５】
前記化合物が少なくとも３つのｄｓ核酸と複合し得る、請求項１のｄｓ核酸複合体。
【請求項１６】
前記化合物がメラミン誘導体である、請求項１５のｄｓ核酸複合体。
【請求項１７】
前記メラミン誘導体が、
［式I］
2007504151.tif 000007
と［式II］
2007504151.tif 000008
から成る群から選ばれる、請求項１６のｄｓ核酸複合体。
【請求項１８】
前記ｄｓ核酸がセンス鎖とアンチセンス鎖を有するｄｓリボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項１７のｄｓ核酸複合体。
【請求項１９】
アンチセンス鎖が対象細胞内のｍＲＮＡとハイブリダイズし得る、請求項１８のｄｓ核酸複合体。
【請求項２０】
前記ｄｓＲＮＡの各々が３０個以下のヌクレオチド対を有する、請求項１９のｄｓＲＮＡ複合体。
【請求項２１】
前記ｄｓＲＮＡの各々が１〜１０分子のメラミン誘導体と複合した、請求項１９のｄｓＲＮＡ複合体。
【請求項２２】
前記ｄｓＲＮＡの各々が２０〜２５個のヌクレオチド対を有する、請求項１９のｄｓＲＮＡ複合体。
【請求項２３】
前記ｄｓＲＮＡの各々が１〜７分子のメラミン誘導体と複合した、請求項２２のｄｓＲＮＡ複合体。
【請求項２４】
前記ｄｓＲＮＡ複合体が更にポリアルギニンポリペプチドと複合した、請求項１５のｄｓ核酸複合体。
【請求項２５】
ポリペプチド中のアルギニン残基がアルギニンのＤ型およびＬ型光学異性体の混合物である、請求項２４のｄｓ核酸複合体。
【請求項２６】
ポリアルギニン中のアルギニン残基がアルギニンのＤ型およびＬ型光学異性体の交互配列から成る、請求項２５のｄｓ核酸複合体。
【請求項２７】
前記ポリアルギニンの少なくとも１つに他の成分が結合し、同成分が炭水化物成分とポリペプチドから成る群から選択されたものである、請求項２６のｄｓ核酸複合体。
【請求項２８】
前記ｄｓ核酸複合体が更に、グルタミン（Ｇｌｕ）およびアスパラギン（Ａｓｎ）残基であるアミノ酸残基から成るポリペプチドと複合した、請求項１５のｄｓ核酸。
【請求項２９】
前記アミノ酸残基がＤ型およびＬ型光学異性体の混合物である、請求項２８の核酸複合体。
【請求項３０】
Ｄ型アミノ酸残基がＬ型アミノ酸残基と交互に配列されている、請求項２９のｄｓ核酸複合体。
【請求項３１】
Ｇｌｕ残基がすべてＬ型光学異性体であり、Ａｓｎ残基がすべてＤ型光学異性体である、請求項３０のｄｓ核酸複合体。
【請求項３２】
Ｇｌｕ残基がすべてＤ型光学異性体であり、Ａｓｎ残基がすべてＬ型光学異性体である、請求項３０のｄｓ核酸複合体。
【請求項３３】
２つ以上のｄｓ核酸との複合体を形成し得る化合物と複合してｄｓ核酸複合体を形成しており、更にポリアルギニンと複合したｄｓ核酸。
【請求項３４】
ポリペプチド中のアルギニン残基がアルギニンのＤ型およびＬ型光学異性体の混合物である、請求項３３のｄｓ核酸複合体。
【請求項３５】
ポリアルギニンがアルギニンのＤ型およびＬ型光学異性体の交互配列から成る、請求項３４のｄｓ核酸複合体。
【請求項３６】
アルギニンに他の成分が結合している、請求項３３のｄｓ核酸複合体。
【請求項３７】
ポリアルギニンに結合している成分が炭水化物成分またはポリペプチド成分である、請求項３６のｄｓ核酸。
【請求項３８】
前記炭水化物がマンノースまたはガラクトースである、請求項３７のｄｓ核酸複合体。
【請求項３９】
前記ポリペプチドがヒト免疫不全ウイルスのＴＡＴシーケンスまたはその一部である、請求項３７のｄｓ核酸複合体。
【請求項４０】
前記ｄｓ核酸複合体が更に、グルタミン（Ｇｌｕ）およびアスパラギン（Ａｓｎ）残基であるアミノ酸残基から成るポリペプチドと複合した、請求項３３のｄｓ核酸。
【請求項４１】
前記アミノ酸残基がＤ型およびＬ型光学異性体の混合物である、請求項４０の核酸複合体。
【請求項４２】
Ｄ型アミノ酸残基がＬ型アミノ酸残基と交互に配列されている、請求項４１のｄｓ核酸複合体。
【請求項４３】
Ｇｌｕ残基がすべてＤ型光学異性体であり、Ａｓｎ残基がすべてＬ型光学異性体である、請求項４２のｄｓ核酸複合体。
【請求項４４】
Ｇｌｕ残基がすべてＬ型光学異性体であり、Ａｓｎ残基がすべてＤ型光学異性体である、請求項４２のｄｓ核酸複合体。
【請求項４５】
前記化合物がｄｓ核酸と、ｄｓ核酸の燐酸基において複合した、請求項３３のｄｓ核酸複合体。
【請求項４６】
前記化合物が少なくとも３つのｄｓ核酸と複合し得る、請求項３３のｄｓ核酸複合体。
【請求項４７】
前記化合物がメラミン誘導体である、請求項４５のｄｓ核酸複合体。
【請求項４８】
前記メラミン誘導体が、
［式I］
2007504151.tif 000009
と［式II］
2007504151.tif 000010
から成る群から選ばれる、請求項４７のｄｓ核酸複合体。
【請求項４９】
前記ｄｓ核酸がセンス鎖とアンチセンス鎖を有するｄｓリボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項４８のｄｓ核酸複合体。
【請求項５０】
アンチセンス鎖が対象細胞内のｍＲＮＡとハイブリダイズし得る、請求項４９のｄｓ核酸複合体。
【請求項５１】
前記ｄｓＲＮＡの各々が３０個以下のヌクレオチド対を有する、請求項５０のｄｓＲＮＡ複合体。
【請求項５２】
前記ｄｓＲＮＡの各々が１〜１０分子のメラミン誘導体と複合した、請求項５１のｄｓＲＮＡ複合体。
【請求項５３】
前記ｄｓＲＮＡの各々が２０〜２５個のヌクレオチド対を有する、請求項５０のｄｓＲＮＡ複合体。
【請求項５４】
前記ｄｓＲＮＡの各々が１〜７分子のメラミン誘導体と複合した、請求項５３のｄｓＲＮＡ複合体。
【請求項５５】
前記ｄｓ核酸複合体が更に、グルタミン（Ｇｌｕ）およびアスパラギン（Ａｓｎ）残基であるアミノ酸残基から成るポリペプチドと複合した、請求項５１のｄｓ核酸。
【請求項５６】
前記アミノ酸残基がＤ型およびＬ型光学異性体の混合物である、請求項５５の核酸複合体。
【請求項５７】
Ｄ型アミノ酸残基がＬ型アミノ酸残基と交互に配列されている、請求項５６のｄｓ核酸複合体。
【請求項５８】
Ｇｌｕ残基がすべてＬ型光学異性体であり、Ａｓｎ残基がすべてＤ型光学異性体である、請求項５７のｄｓ核酸複合体。
【請求項５９】
Ｇｌｕ残基がすべてＤ型光学異性体であり、Ａｓｎ残基がすべてＬ型光学異性体である、請求項５７のｄｓ核酸複合体。
【請求項６０】
２つ以上のｄｓ核酸との複合体を形成し得る化合物と複合してｄｓ核酸複合体を形成しており、更にアミノ酸残基がグルタミン（Ｇｌｕ）およびアスパラギン（Ａｓｎ）残基であるアミノ酸から成るポリペプチドと複合したｄｓ核酸。
【請求項６１】
前記アミノ酸残基がＤ型およびＬ型光学異性体の混合物である、請求項６０の核酸複合体。
【請求項６２】
Ｄ型アミノ酸残基がＬ型アミノ酸残基と交互に配列されている、請求項６１のｄｓ核酸複合体。
【請求項６３】
Ｇｌｕ残基がすべてＬ型光学異性体であり、Ａｓｎ残基がすべてＤ型光学異性体である、請求項６２のｄｓ核酸複合体。
【請求項６４】
Ｇｌｕ残基がすべてＤ型光学異性体であり、Ａｓｎ残基がすべてＬ型光学異性体である、請求項６２のｄｓ核酸複合体。
【請求項６５】
前記ｄｓ核酸複合体が更にポリアルギニンポリペプチドと複合した、請求項６０のｄｓ核酸。
【請求項６６】
ポリペプチド中のアルギニン残基がアルギニンのＤ型およびＬ型光学異性体の混合物である、請求項６５のｄｓ核酸複合体。
【請求項６７】
ポリアルギニンがアルギニンのＤ型およびＬ型光学異性体の交互配列から成る、請求項６６のｄｓ核酸複合体。
【請求項６８】
ポリアルギニンのいずれかの末端に他の成分が結合している、請求項６５のｄｓ核酸複合体。
【請求項６９】
前記成分が炭水化物成分またはポリペプチド成分である、請求項６８のｄｓ核酸。
【請求項７０】
前記炭水化物がマンノースまたはガラクトースである、請求項６９のｄｓ核酸複合体。
【請求項７１】
前記ポリペプチドがヒト免疫不全ウイルスのＴＡＴシーケンスまたはその一部である、請求項６９のｄｓ核酸複合体。
【請求項７２】
前記化合物がｄｓ核酸と、ｄｓ核酸の燐酸基において複合した、請求項６９のｄｓ核酸複合体。
【請求項７３】
前記化合物が少なくとも３つのｄｓ核酸と複合し得る、請求項６０のｄｓ核酸複合体。
【請求項７４】
前記化合物がメラミン誘導体である、請求項７３のｄｓ核酸複合体。
【請求項７５】
前記メラミン誘導体が、
［式I］
2007504151.tif 000011
と［式II］
2007504151.tif 000012
から成る群から選ばれる、請求項７４のｄｓ核酸複合体。
【請求項７６】
前記ｄｓ核酸がセンス鎖とアンチセンス鎖を有するｄｓリボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項７５のｄｓ核酸複合体。
【請求項７７】
アンチセンス鎖が対象細胞内のｍＲＮＡとハイブリダイズし得る、請求項７６のｄｓ核酸複合体。
【請求項７８】
前記ｄｓＲＮＡの各々が３０個以下のヌクレオチド対を有する、請求項７７のｄｓＲＮＡ複合体。
【請求項７９】
前記ｄｓＲＮＡの各々が１〜１０分子のメラミン誘導体と複合した、請求項７８のｄｓＲＮＡ複合体。
【請求項８０】
前記ｄｓＲＮＡの各々が２０〜２５個のヌクレオチド対を有する、請求項７７のｄｓＲＮＡ複合体。
【請求項８１】
前記ｄｓＲＮＡの各々が１〜７分子のメラミン誘導体と複合した、請求項２２のｄｓＲＮＡ複合体。
【請求項８２】
前記ｄｓＲＮＡ複合体が更にポリアルギニンポリペプチドと複合した、請求項７８のｄｓ核酸複合体。
【請求項８３】
ポリペプチド中のアルギニン残基がアルギニンのＤ型およびＬ型光学異性体の混合物である、請求項７５のｄｓ核酸複合体。
【請求項８４】
ポリアルギニン中のアルギニン残基がアルギニンのＤ型およびＬ型光学異性体の交互配列から成る、請求項８３のｄｓ核酸複合体。
【請求項８５】
前記ポリアルギニンに他の成分が結合し、同成分が炭水化物成分とポリペプチドから成る群から選択されたものである、請求項８２のｄｓ核酸複合体。
【請求項８６】
すべてのウリジンが５−メチルウリジン（リボチミジン）に置き換えられたセンス鎖とアンチセンス鎖を有する、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）。
【請求項８７】
前記ｄｓＲＮＡが１５〜３０個の塩基対を有する、請求項８６のｄｓＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本明細書に引用した文献の知見はすべてその全体が本明細書に含まれるものと見なされる。
【０００２】
ＲＮＡｉに関連する技術に関して以下に述べる。この記述は後述の本発明の理解に資するためにのみ行うものであり、引用する文献の内容が本発明に関わる先行技術であることを容認するものではない。
【背景技術】
【０００３】
ＲＮＡ干渉は、動物において短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される、配列に固有な、転写後の遺伝子の抑制過程である。Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：８０６（１９９８）およびＨａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６：９５０−９５１（１９９９）を参照されたい。植物においてこれに対応する過程は一般に転写後遺伝子抑制またはＲＮＡ抑制と呼ばれ、菌類に関してはクエリング（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）とも呼ばれている。転写後遺伝子抑制の過程は、外部遺伝子の発現を抑制するための、進化的に保存された細胞防衛機構と考えられ、植物相において各門に広く共有されている［Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，１５：３５８（１９９９）］。このような外部遺伝子の発現防止機構は、ウイルス感染、またはトランスポゾン要素のホスト細胞へのランダムな統合に由来する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生成に対する応答として、相同的な単鎖ＲＮＡまたはウイルスの遺伝子ＲＮＡを特異的に破壊する細胞の応答を経て発展したものと考えられる。細胞中のｄｓＲＮＡの存在によってＲＮＡｉ応答が解発される機構の詳細についてはなお不明な点が多いが、ｄｓＲＮＡに媒介される蛋白質キナーゼＰＫＲおよび２’，５’−オリゴアデニル酸シンターゼの活性化により、ｍＲＮＡがリボヌクレアーゼLで非特異的に切断されるインターフェロン応答とは異なるものと思われる。
【０００４】
長いｄｓＲＮＡが細胞中に存在することにより、ダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼIII酵素の活性が刺激される。ダイサーはｄｓＲＮＡから短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる短いｄｓＲＮＡ断片を作る処理に関与する（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．,前掲、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４０９：３６３（２００１））。ダイサーの活性によって作られたｓｉＲＮＡは典型的にはヌクレオチド約２１〜２３個の長さであり、約１９個の塩基対二本鎖を含む（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，前掲、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５：１８８（２００１））。翻訳調節に関与する保存構造を持つ前駆ＲＮＡの切断による、ヌクレオチド２１個および２２個の小さい一時的ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）の生成にもダイサーが関与する（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３：８３４（２００１））。ＲＮＡｉ応答には、通常ＲＮＡ誘起抑制複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるエンドヌクレアーゼ複合体の一種も関与しており、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に相補的な配列を持つ単鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡの切断はｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に相補的な領域の中央部で起こる(Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５：１８８（２００１））。
【０００５】
ＲＮＡｉはさまざまな系で研究されている。Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：８０６（１９９８）はＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて初めてＲＮＡｉを観察した。Ｂｒａｈｍａｎｉａｎ  &  Ｚａｒｂｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９：２７４−２８３（１９９９）およびＷｉａｎｎｙ  ＆  Ｇｏｅｔｚ，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２：７０は哺乳類においてｄｓＲＮＡに媒介されるＲＮＡｉを報告している。Ｈａｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，  ４０４：２９３（２０００）はｄｓＲＮＡを導入したＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞におけるＲＮＡｉを報告し、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，  ４１１：４９４（２００１）は培養哺乳類細胞（ヒト胎児腎臓細胞、ＨｅＬａ細胞を含む）にヌクレオチド２１個の合成ＲＮＡ二本鎖を導入することにより誘起されるＲＮＡｉを報告した。Ｄｒｏｓｏｐｈｙｌａ胚細胞溶解物を用いた最近の研究（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０：６８７７（２００１））では、ｓｉＲＮＡが有効なＲＮＡｉ活性を媒介するために持つべき長さ、構造、化学組成、配列などの条件が見出されている。これらの研究によって、ヌクレオチド２１個のｓｉＲＮＡ二本鎖は３’末端にジヌクレオチド突出部を持つとき最も活性が高いことが示された。更にｓｉＲＮＡの二本鎖の一方または両方を２’−デオキシ（２’−Ｈ）または２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで置換するとＲＮＡｉ活性が消失するのに対して、３’末端ｓｉＲＮＡ突出部のヌクレオチドの２’−デオキシヌクレオチド（２’−Ｈ）による置換は許容されることも示されている。またｓｉＲＮＡ二本鎖の中心部に配列のミスマッチが１つあってもＲＮＡｉ活性が消失することも認められた。これに加えてこれらの研究では、標的ＲＮＡの切断位置を決定するのがｓｉＲＮＡのガイド配列の５’末端であって３’末端ではないことも示された（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０：６８７７（２００１））。また別の研究によると、ｓｉＲＮＡの活性にはｓｉＲＮＡの標的相補鎖の５’燐酸基が必要であり、ｓｉＲＮＡ上で５’燐酸基を維持するためにＡＴＰが用いられる（Ｎｙｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１０７：３０９（２００１））。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
遺伝子治療、アンチセンス治療、ＲＮＡ干渉治療の分野における最近の発展により、核酸を細胞内に効率的に導入する方法の必要性が高まっているが、核酸を細胞に導入する従来の手法は不幸にして核酸の不安定性、および導入用薬剤の低効率または毒性の制約を受けている。
【０００７】
したがって、有効な治療法を作り出すために二本鎖核酸を効果的に細胞に導入する方法、特にＲＮＡ干渉療法のためにｓｉＲＮＡを導入する方法を提供する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明は、選ばれた細胞への核酸の導入を容易にするため二本鎖核酸複合体を形成する方法を提供することにより、上記の必要性を満たすものである。本発明は特に、哺乳類に二本鎖核酸を投与し、同二本鎖核酸の哺乳類の所望の組織に導入するための方法および組成物に関する。好ましい実施態様においては、核酸は小さい干渉核酸（ｓｉＮＡ）、たとえば二本鎖ＲＮＡ、特にヌクレオチド３０個以下の二本鎖ＲＮＡ、あるいは短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。
【０００９】
本発明の第一の側面は、二本鎖核酸と２，４，６−トリグアニジノトリアジン構造を有する化合物との複合体の形成に関する。
式I
2007504151.tif 000002
【００１０】
他の実施例においては、この化合物は下記の構造を持つ２，４，６−トリアミドサルコシルメラミンである。
式II
2007504151.tif 000003
【００１１】
これらメラミン誘導体は二本鎖核酸の燐酸基の３つの正電荷を持つ位置において複合体を形成するので、理論的には式Iまたは式IIのメラミン誘導体１分子に対して３つの二本鎖核酸が複合体を形成することができる。二本鎖核酸の負電荷を持つ燐酸基は式Iのメラミン誘導体の正電荷を持つグアニジン基と複合体を形成し、同様に二本鎖核酸の負電荷を持つ燐酸基は式IIのメラミン誘導体の正電荷を持つクレアチン基と複合体を形成する。
【００１２】
他の実施態様においては、ｄｓＲＮＡとポリグアニジンペプチドとの複合体を形成する。ポリグアニジンは好ましくは各アルギニン残基の正電荷を持つ原子団が同じ側に並ぶように、Ｄ−アルギニン残基とＬ−アルギニン残基の交替から成る。他の成分をポリアルギニンに付加することにより、核酸複合体を特定の細胞または組織に導入することができる。そのような成分の例としてはマンノース、ガラクトース、ヒト免疫不全ウイルスのＴＡＴポリペプチドなどがある。
【００１３】
他の実施態様においては、ｄｓＲＮＡをグルタミン残基とアスパラギン残基の交替から成るポリペプチドと複合させる。好ましくはアミノ酸残基のＤ型とＬ型が交替し、ある実施態様においてはすべてのグルタミン残基がＤ−グルタミン、すべてのアスパラギン残基がＬ−アスパラギンであるようにし、また他の実施態様においてはすべてのグルタミン残基がＬ−グルタミン、すべてのアスパラギン残基がＤ−アスパラギンであるようにする。
【００１４】
好ましい実施態様においては、ｄｓＲＮＡをメラミン誘導体、ポリアルギニン、Ｇｌｎ−Ａｓｎポリペプチドのいずれかと複合させる。
【００１５】
ｄｓＲＮＡの長さは任意であるが、好ましくはヌクレオチド１５〜３０個、より好ましくは１５〜２５個、最も好ましくは約２０個である。
【００１６】
好ましいｄｓＲＮＡにおいては、すべてのウリジンがリボチミジン（５−メチルウリジン）に置換されており、ＲＮＡアーゼによる分解を受けない。
【００１７】
ヌクレオチド約３０個以下のｄｓＲＮＡを使用すると、細胞内での蛋白質合成を阻害するインターフェロン系を解発することなくｄｓＲＮＡを細胞中に導入することができる。アンチセンス鎖は、後述するＲＮＡ干渉機構によって抑制または破壊したいｍＲＮＡとハイブリダイズされることを目的とする。
【００１８】
本発明はまた特許請求対象のｄｓＲＮＡの製造方法をも包含する。前記メラミン誘導体の一つを含む第一の溶液をジメチルスルホキシドまたはジメチルホルムアミドなどの有機溶媒に溶解し、これにＨＣｌなどの酸を加える。ＨＣｌの濃度はメラミン誘導体１モル当たり３．３モル程度である。次に、極性または親水性溶媒（たとえば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、あるいはそれらの組み合わせなどを含む水性緩衝液）に核酸を溶解または分散させた第二の溶液と第一の溶液とを混合して第一の乳濁液とする。混合は超音波処理、渦流混合、マイクロフルイダイザーなど標準的な方法で行うことができる。これによって核酸とメラミン誘導体との複合体が形成され、三量体核酸複合体が得られる。理論あるいは機構は別として、この３つの核酸分子は１つのメラミン誘導体分子の周りに環状に複合体を形成しており、核酸に含まれるヌクレオチドの数や大きさによって、更にいくつかのメラミン誘導体分子がこの３つの核酸分子と複合し得るものと考えられる。濃度はヌクレオチド２０個の二本鎖核酸１モルに対してメラミン誘導体が少なくとも７モル必要であり、二本鎖核酸が更に大きければメラミン誘導体の所要量も更に増加する。得られた核酸粒子はサイズ排除クロマトグラフィー、電気泳動、またはその両方を用いて精製し有機溶媒を除去することができる。
【００１９】
次に、この核酸複合体ナノ粒子をポリアルギニン、Ｇｌｎ−Ａｓｎポリマー、またはその両者を含む水溶液と混合する。各ポリマーの好ましい分子量は５０００〜１５０００ドルトンである。これによりメラミン誘導体と複合した核酸ナノ粒子とポリアルギニンおよびＧｌｎ−Ａｓｎポリマーとを含む溶液が得られる。この混合工程は、核酸に働く剪断力を最小にするとともに、平均直径２００ｎｍ未満のナノ粒子を生成するように行う。理論あるいは機構は別として、ポリアルギニンは核酸の副溝にある、負電荷を持つ燐酸基と複合し、ポリアルギニンが三量体核酸複合体を包むようになると考えられる。ポリアルギニンのいずれかの末端には他の成分、たとえばＴＡＴポリペプチド、マンノース、またはガラクトースが共有結合し、核酸複合体と特定の組織、たとえばガラクトースを用いた場合には肝臓との直接結合が形成される。理論は別として、Ｇｌｎ−Ａｓｎポリマーは核酸の主溝内部で核酸の塩基との間の水素結合によって結合すると考えられる。ポリアルギニンおよびＧｌｎ−Ａｓｎポリマーは塩基対２０個の核酸１モルに対して２モルの濃度で存在しなければならず、塩基対の数が多ければ濃度もそれに比例して増加しなければならない。たとえば核酸の塩基対が２５個ならば、ポリマー濃度は核酸１モルに対して２．５〜３モルが必要となろう。一つの例はＨＩＶ  ＴＡＴのＮ末端蛋白質導入領域に結合したポリペプチドである。このような蛋白質に用いるＨＩＶ  ＴＡＴ構成体はＶｏｃｅｒｏ−Ａｋｂａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，５：２３−３３（１９９９）に詳細に記述されている。また米国特許出願公開第２００４０１３２１６１号（２００４年７月８日発行）をも参照されたい。
【００２０】
このようにして得られたナノ粒子は、サイズ排除クロマトグラフィーとそれに続く電気泳動などの標準的な方法によって精製することができる。精製された複合ナノ粒子は当業者に周知の方法で凍結乾燥することができる。
【００２１】
二本鎖核酸を導入するこの方法は特にＲＮＡ干渉を利用する治療において有用である。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は大部分の植物および動物細胞において遺伝子の発現を抑制する系である。遺伝子としてはたとえば不適切に発現しているホスト細胞の遺伝子、あるいはウイルス核酸などが考えられる。脅威となる遺伝子が発現したとき、ＲＮＡｉ機構は有害なメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のみを阻害・破壊し、他の遺伝子から発現したｍＲＮＡには影響を及ぼさない。
【００２２】
現在では所望のｍＲＮＡを破壊するＲＮＡｉ機構を解発することのできるｄｓＤＮＡを合成する方法が見出されており、短いアンチセンス鎖（一般に塩基対３０個以下）と、アンチセンス鎖にハイブリダイズするセンス鎖を作成することができる。この短いｄｓＲＮＡは短い（または小さい）干渉ＲＮＡ、すなわちｓｉＲＮＡと呼ばれる。このアンチセンス鎖が、抑制したいｍＲＮＡと特異的に結合する部分である。ｓｉＲＮＡが細胞に導入されると二本鎖が解け、アンチセンス鎖が蛋白質に組み込まれてＲＮＡ誘導抑制複合体（ＲＩＳＣ）を形成する。
【００２３】
抑制複合体の内部では、ｓｉＲＮＡ分子はｍＲＮＡが侵入し得る位置にある。典型的な細胞においてはＲＩＳＣは任意の時点で数千種の異なったｍＲＮＡに遭遇するが、ＲＩＳＣ内のｓｉＲＮＡはそのヌクレオチド配列との相補性の高いｍＲＮＡとのみ結合する。したがって抑制複合体は、細菌感染の際のインターフェロン反応と異なり、標的ｍＲＮＡについては高度に選択的である。
【００２４】
適合するｍＲＮＡが最終的にｓｉＲＮＡと結合すると、スライサーと呼ばれる酵素が捕捉されたｍＲＮＡ鎖を２分割し、ＲＩＳＣがこの２つの断片（既に蛋白質合成を指令する能力を失っている）を放出して次に進む。ＲＩＳＣ自体は変化を受けず、次のｍＲＮＡを見出し切断することができる。
【００２５】
本発明の好ましい実施態様は１００ｎｍ未満のｄｓＲＮＡナノ粒子を用いる。より具体的には、二本鎖ＲＮＡの長さはヌクレオチド塩基対約３０個以下、好ましくは２０〜２５個である。更に具体的には、本発明は２以上の二本鎖を具える複合体に関する
【００２６】
好ましい実施態様においては、ｓｉＲＮＡのリボースウラシルをリボースチミンで置換する。事実、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のすべてのリボースウラシルをリボースチミンに置き換えることによって安定性が著しく向上しＲＮＡアーゼによる分解に対する抵抗性が増すことは意外な発見であった。このようにして、好ましいｄｓＲＮＡは塩基対１５〜３０個を有し、通常存在するリボースウラシルをすべて５−アルキルウリジン、たとえばリボチミジン（ｒＴ）（５−メチルウリジン）で置換したものである。あるいはウラシルの一部のみを置換し、センス鎖に存在するリボースウラシルのみをリボチミジンに変え、あるいはアンチセンス鎖に存在するリボースウラシルのみをリボチミジンに変えることもできる。実施例２および３は本発明のこの側面を示すものである。
【００２７】
たとえば、ＶＥＧＦ受容体１のｍＲＮＡ（米国特許出願公開第２００４／０１３８１号（２００４年７月１５日発行）のＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２０００参照）を標的とする本発明の二本鎖ｓｉＮＡとしては次のようなものがある。
Ｇ．Ｃ．Ａ．ｒＴ．ｒＴ．ｒＴ．Ｇ．Ｇ．Ｃ．Ａ．ｒＴ．Ａ．Ａ．Ｇ．Ａ．Ａ．Ａ．ｒＴｄＴ．ｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）
Ａ．ｒＴ．ｒＴ．ｒＴ．ｒＴ．Ｃ．ｒＴ．ｒＴ．Ａ．ｒＴ．Ｇ．Ｃ．Ｃ．Ａ．Ａ．Ａ．ｒＴ．Ｃ．ｄＴ．ｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）
【００２８】
Ｂ型肝炎ウイルスのＲＮＡを標的とし、更にＨＢＶ ＲＮＡの下位配列を標的とする本発明の二本鎖ｓｉＮＡとしては次のようなものがある。
Ｃ．Ｃ．ｒＴ．Ｇ．Ｃ．ｒＴ．Ａ．ｒＴ．Ｇ．Ｃ．Ｃ．ｒＴ．Ｃ．Ａ．ｒＴ．Ｃ．ｄＴ．ｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）
Ｇ．Ａ．ｒＴ．Ｇ．Ａ．Ｇ．Ｇ．Ｃ．Ａ．ｒＴ．Ａ．Ｇ．Ｃ．Ａ．Ｇ．Ｃ．Ａ．Ｇ．Ｇ．ｄＴ．ｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）
【００２９】
米国特許出願公開第２００３／０３０６８８７号（２００３年１１月６日発行）を参照されたい。
【００３０】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＲＮＡを標的とする本発明の二本鎖ｓｉＮＡとしては次のようなものがある。
ｒＴ．ｒＴ．ｒＴ．Ｇ．Ｇ．Ａ．Ａ．Ａ．Ｇ．Ｇ．Ａ．Ｃ．Ｃ．Ａ．Ｇ．Ｃ．Ａ．Ａ．Ａ．ｄＴ．ｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）
ｒＴ．ｒＴ．ｒＴ．Ｇ．Ｃ．ＲＴ．Ｇ．Ｇ．ｒＴ．Ｃ．Ｃ．ｒＴ．ｒＴ．RＴ．Ｃ．Ｃ．Ａ．Ａ．Ａ．ｄＴ．ｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）
【００３１】
米国特許出願公開第２００３／０１７５９０号（２００３年９月１８日発行）を参照されたい。
【００３２】
ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）のｍＲＮＡを標的とする本発明の二本鎖ｓｉＮＡとしては次のようなものがある。
Ｃ．Ａ．Ｃ．Ｃ．Ｃ．ｒＴ，Ｇ．Ａ．Ｃ．Ａ．Ａ．Ｇ．Ｃ．ｒＴ．Ｇ．Ｃ．Ｃ．Ａ．Ｇ．ｄＴ．ｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）
Ｃ．ｒＴ．Ｇ．Ｇ．Ｃ．Ａ．Ｇ．Ｃ．ｒＴ．ｒＴ．Ｇ．ｒＴ．Ｃ．Ａ．Ｇ．Ｇ．Ｇ．ｒｔ．Ｇ．ｄＴ．ｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）
【００３３】
次のｓｉＮＡもＴＮＦαのｍＲＮＡを標的とする。
ｒＴ．Ｇ．Ｃ．Ａ．Ｃ．ｒＴ．ｒＴ．ｒＴ．Ｇ．Ｇ．Ａ．Ｇ．ｒＴ．Ｇ．Ａ．ｒＴ．Ｃ．Ｇ．Ｇ．ｄＴ．ｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）
Ｃ．Ｃ．Ｇ．Ａ．ｒＴ．Ｃ．Ａ．Ｃ．ｒＴ．Ｃ．Ｃ．Ａ．Ａ．Ａ．Ｇ．ｒＴ．Ｇ．Ｃ．Ａ．ｄＴ．ｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）
【００３４】
ＴＮＦα受容体１ＡのｍＲＮＡを標的とする本発明の二本鎖ｓｉＮＡとしては次のようなものがある。
Ｇ．Ａ．Ｇ．ｒＴ．Ｃ．Ｃ．Ｃ．Ｇ．Ｇ．Ｇ．Ａ．Ａ．Ｇ．Ｃ．Ｃ．Ｃ．Ｃ．Ａ．Ｇ．ｄＴ．ｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）
Ｃ．ｒＴ．Ｇ．Ｇ．Ｇ．Ｇ．Ｃ．ｒＴ．ｒＴ．Ｃ．Ｃ．Ｃ．Ｇ．Ｇ．Ｇ．Ａ．Ｃ．ｒＴ．Ｃ．ｄＴ．ｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）
【００３５】
次のｓｉＮＡもＴＮＦα受容体１ＡのｍＲＮＡを標的とする本発明の二本鎖ｓｉＮＡである。
Ａ．Ａ．Ａ．Ｇ．Ｇ．Ａ．Ａ．Ｃ．Ｃ．ｒＴ．Ａ．Ｃ．ｒＴ．ｒＴ．Ｇ．ｒＴ．Ａ．Ｃ．Ａ．ｄＴ．ｄＴ．（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）
ｒＴ．Ｇ．ｒＴ．Ａ．Ｃ．Ａ．Ａ．Ｇ．ｒＴ．Ａ．Ｇ．Ｇ．ｒＴ．ｒＴ．Ｃ．Ｃ．ｒＴ．ｒＴ．ｒＴ．ｄＴ．ｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）
【００３６】
国際特許出願ＷＯ０３／０７０８９７号「短い干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いたＲＮＡ干渉により媒介されるＴＮＦおよびＴＮＦ受容体スーパーファミリー遺伝子の発現抑制」を参照されたい。これらはリウマチ性関節炎などのＴＮＦ−αに関連する疾病の治療に有用である。
【００３７】
本明細書において「細胞」とは通常の生物学的意味であり、多細胞生物体全体、たとえば具体的にはヒトを意味するものではない。細胞は生物体、たとえば鳥類、植物、哺乳類（ヒト、ウシ、ヒツジ、サル、ブタ、イヌ、ネコ等）内にあってもよく、原核細胞（細菌など）であっても真核細胞（哺乳類、植物など）であってもよい。また細胞は体細胞または生殖細胞、分化全能または多能、分裂性または非分裂性のいずれであってもよく、配偶子または胚細胞、幹細胞、完全に分化した細胞のいずれから得られた、あるいはいずれを含むものでもよい。
【００３８】
本発明は他の側面において、本発明のｓｉＮＡ分子を１個以上含む哺乳類細胞を提供する。これらのｓｉＮＡ分子は互いに独立に、同一部位または異なった部位のいずれをも標的とすることができる。
【００３９】
本明細書において「ＲＮＡ」とは、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子をいう。「リボヌクレオチド」とは、β−Ｄ−リボフラノース部分の２’位置にヒドロキシル基を含むヌクレオチドを意味し、二本鎖ＲＮＡ、単鎖ＲＮＡ、遊離ＲＮＡ（部分的に精製したＲＮＡなど）、実質上純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、遺伝子工学的に作成したＲＮＡ、天然ＲＮＡに１つ以上のヌクレオチドの付加、脱離、置換、変質などの処理を加えて得られる変質ＲＮＡなどを包含する。変質の一例はｓｉＮＡの末端または内部（ＲＮＡのヌクレオチドの一つ）にヌクレオチド以外の物質を付加することである。本発明のＲＮＡ分子の中のヌクレオチドは非標準的なヌクレオチド、たとえば非天然ヌクレオチド、化学合成によるヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどを含んでいてもよい。このような変質ＲＮＡを以後天然ＲＮＡのアナログと称することがある。
【００４０】
「対象」とは対外培養細胞または細胞自体の供給者または受容者となる生体を意味し、また本発明の核酸分子が投与される生体をも意味する。ある実施態様においては対象は哺乳類または哺乳類細胞であり、他の実施態様においては対象はヒトまたはヒト細胞である。
【００４１】
本明細書において「万能塩基」とは、天然ＤＮＡまたはＲＮＡの各塩基とほぼ無差別的に塩基対を形成し得るヌクレオチドの塩基アナログを意味する。万能塩基の例としては、当業者に周知のＣ−フェニル、Ｃ−ナフチルその他の芳香族誘導体、イノシン、アソールカルボキサミド、ニトロアゾール誘導体（３−ニトロピロール、４−ニトロピロール、５−ニトロインドール、５−ニトロインドール、６−ニトロインドールなど）が挙げられるが、これらに限定されるものではない（たとえばＬｏａｋｅｓ，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９，２４３７−２４４７を参照）。
【００４２】
本発明の核酸分子は単独に、または組み合わせて、あるいは他の薬物と同時に、本明細書に述べる疾病あるいは状態の治療に用いることができる。たとえば特定の疾病または状態の治療のために、ｓｉＮＡ分子を患者あるいは当業者に周知の適当な細胞に、単独に、あるいは１つ以上の薬物と組み合わせて、治療に適した条件下で投与することができる。
【００４３】
更に他の実施態様においては、ｓｉＮＡ分子を他の既知の治療法と組み合わせて前記の疾病または状態の治療に用いることができる。たとえば前記各種分子と１種以上の他の治療薬とを組み合わせて疾病または状態の治療に使用することができる。本発明のｓｉＮＡ分子と容易に組み合わせることができる他の治療薬の例としては、酵素の核酸分子、アロステリック核酸分子、アンチセンス、デコイ、またはアプタマー核酸分子、モノクローナル抗体などの抗体、低分子物質、金属、塩、イオンその他の無機・有機化合物などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
「含む」という語は、その目的語を含み、かつそれに限定されないとの意味で用いる。すなわち「含む」の目的語として列挙された諸要素は必須であるが、他の要素は任意であり、存在してもしなくてもよい。「〜から成る」という句は、列挙された諸要素を含み、かつそれに限定するとの意味で用いる。すなわち「〜から成る」として挙げられた諸要素は必須であり、かつ他の要素は存在しない。「実質的に〜から成る」という句は、列挙された諸要素を含み、かつ他の要素は本明細書に開示されたそれらの活性または作用に対して干渉も寄与もしないものに限定されるとの意味で用いる。すなわち「実質的に〜から成る」として挙げられた諸要素は必須であるが、他の要素は任意であり、列挙された諸要素の活性または作用に影響を及ぼすか否かによって、存在し得るかまたは存在してはならない。
【００４５】
核酸分子の合成
ヌクレオチド１００個以上の長さの核酸を合成することは自動化した方法によっては困難であり、またそのコストは治療に用いるには現実的でない。本発明においては、小さい核酸モチーフ（「小さい」とは長さがヌクレオチド１００個未満、好ましくは８０個未満、最も好ましくは５０個未満の核酸モチーフを指す。たとえばｓｉＮＡの個別的なオリゴヌクレオチド配列、あるいはタンデム的に合成されたｓｉＮＡ配列）を外部からの導入に用いることが好ましい。これらの分子は構造が簡単なため蛋白質ないしＲＮＡの標的部分に容易に侵入できる。本発明による分子の典型的なものは化学的に合成され、他の分子も同様に合成できる。
【００４６】
オリゴヌクレオチド（たとえばある種の修飾オリゴヌクレオチド、あるいはオリゴヌクレオチドのうちリボヌクレオチドを含まない部分）は当業者に周知の方法により合成することができる。たとえばＣａｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１１，３−１９；  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＰＣＴ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＷＯ  ９９／５４４５９；  Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４；  Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９；  Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６１，３３−４５；  Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，００１，３１１などの記述を参照されたい。本発明による分子のあるものを含有するＲＮＡはＵｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５；  Ｓｃａｒｉｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，５４３３；  Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３，２６７７−２６８４；  Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９の方法によって得られる。
【００４７】
別の方法として、本発明による核酸分子を個別に合成した後に連結反応（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６，９９２３；  Ｄｒａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＰＣＴ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＷＯ  ９３／２３５６９；  Ｓｈａｂａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，４２４７；  Ｂｅｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１６，９５１（１９９７）；  Ｂｅｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．８，２０４（１９９７））によって、あるいは合成または保護解除後にハイブリダイゼーションによって結合することも可能である。
【００４８】
核酸分子の投与
核酸分子の導入方法はＡｋｈｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，２，１３９（１９９２）；  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｉｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ，１９９５；  Ｍａｕｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．，  １６：１２９−１４０（１９９９）；  Ｈｏｆｌａｎｄ  ＆  Ｈｕａｎｇ，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３７：１６５−１９２（１９９９）に記載されており、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，７５２：１９４−１９２（２０００）およびＳｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ  ＷＯ  ９４／０２５９５には更に酵素の核酸分子を導入する一般的な方法が記述されている。それらのプロトコルは実質上あらゆる可ｋ散文詩の導入に利用することができる。核酸分子を細胞に投与するには当業者に周知のいくつかの方法があり、たとえばリポソーム内へのカプセル化、イオントフォレーゼ、他の媒体（ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、生体接着性微小球など）への包含、蛋白性ベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない(Ｏ’Ｈａｒｅ  ＆  Ｎｏｒｍａｎｄ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＰＣＴ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＷＯ  ００／５３７２２）。あるいは核酸／媒体の組み合わせを直接注射により、あるいは輸液ポンプを用いて局所的に導入することもできる。本発明による核酸分子の直接注射は、皮下、筋内、皮内のいずれであっても、標準的な針と注射器を用いる方法によって行うことができ、またＣｏｎｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，5：２３２０−２３３７（１９９９）およびＢａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＰＣＴ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＷＯ  ９９／３１２６２に記載されている、針を用いない方法によっても可能である。本発明による分子は医薬品として使用することができる。医薬品は患者の疾病状態を予防、軽減、あるいは治療（徴候、好ましくはすべての徴候をある程度軽減）することができる。
【００４９】
このように本発明は本発明の核酸１種以上を適当な媒体、たとえば安定剤、緩衝剤等に含ませた医薬品組成物を含む。本発明による負電荷を有するポリヌクレオチド（ＲＮＡ、ＤＮＡ、蛋白質など）も、標準的な手段により、医薬品組成物を構成する安定剤、緩衝剤等と共に、あるいは単独で投与し患者体内に導入することが可能である。リポソームによる導入機構を利用したい場合は、リポソーム形成のための標準的プロトコルが利用できる。本発明による組成物は経口投与用の錠剤、カプセル、エリキシル剤、直腸投与用の坐剤、注射剤用の無菌溶液または懸濁液、その他当業者に周知の組成物とすることも可能である。
【００５０】
本発明はまた前記諸化合物の薬学的に適切な組成物をも包含する。これらの組成物には上記化合物の塩、たとえば塩化水素酸、臭化水素酸、酢酸、ベンゼンスルホン酸などの酸付加塩が含まれる。
【００５１】
医薬組成物または調剤とは、ヒトを含む細胞または患者への投与、たとえば全身的投与に適した形態の組成物または調剤を意味する。適切な形態は部分的には用法または導入経路、たとえば経口、経皮、注射などに依存する。組成物または調剤が標的細胞（すなわち負電荷を有する核酸を導入すべき細胞）に到達することが形態によって妨げられてはならない。たとえば血流中に注射する医薬組成物は可溶性でなければならない。毒性、あるいは組成物または調剤の効力発揮を妨げる携帯などを含むその他の要因も当業者には周知である。
【００５２】
「全身的投与」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける薬物の血流中への吸収または蓄積と、それに続く前進への分布を意味する。全身的吸収に導く投与経路には、静脈内、皮下、腹腔内、吸入、経口、肺内、筋内などの経路があり、かつこれらに限定されない。これら投与経路はいずれも、接近可能な組織を負電荷を有するポリマー（たとえば核酸）に曝露する。薬物の循環系への進入速度は分子量または分子サイズの関数であることが知られている。リポソームその他の薬物担体に本発明の化合物を包含させることにより、薬物を局在化することが可能であり、たとえば網膜上皮細胞（ＲＥＳ）のような、特定の種類の組織に集中させることができる。リンパ球やマクロファージなどの細胞の表面への薬物の結合を容易にするリポソーム調剤も有用である。このアプローチによれば、マクロファージやリンパ球による、癌細胞などの異常細胞の免疫認識の特異性を利用できるため、薬物を標的細胞に一層有効に供給することが可能である。
【００５３】
「薬学的に適切な調剤」とは、本発明の核酸分子がその意図する活性に最適な部位に効果的に分布するような組成物または調剤を意味する。本発明の核酸分子を含む適切な調剤に用いられる物質の非限定的な例を挙げれば、Ｐ−糖蛋白質阻害剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ８５など）は中枢神経系への薬物の進入を容易にし（Ｊｏｌｌｉｅｔ−Ｒｉａｎｔ  ＆  Ｔｉｌｌｅｍｅｎｔ，Ｆｕｎｄａｍ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３：１６−２６（１９９９））、ポリ（ＤＬ−ラクチドコグリコリド）のような生分解性ポリマーは脳内注入後に持続的な放出を行わせるのに用いられ（Ｅｍｅｒｉｃｈ  ＤＦ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，８：４７−５８（１９９９））（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）、充填ナノ粒子（たとえばポリシアノアクリル酸ブチル製の）は血液脳関門を越えて薬物を導入することができ、神経系による吸収の機構を変化させる可能性がある（Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２３：９４１−９４９（１９９９））。本発明の核酸分子の導入法の非限定的な例として更に、Ｂｏａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８７：１３０８−１３１５（１９９８）；  Ｔｙｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４２１：２８０−２８４（１９９９）；  Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９２：５５９２−５５９６（１９９５）；Ｂｏａｄｏ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，１５：７３−１０７（１９９５）；  Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２６：４９１０−４９１６（１９９８）；  Ｔｙｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９６：７０５３−７０５８（１９９９）に記載された物質が挙げられる。
【００５４】
本発明は更に、ポリ（エチレングリコール）脂質を含む表面修飾リポソーム（ＰＥＧ修飾、長時間循環またはステルスリポソーム）を含む組成物の使用をも包含する。これらの調剤によれば、薬物の標的組織への蓄積を増強することができる。この種の薬物担体は単核食細胞系（ＭＰＳまたはＲＥＳ）によるオプソニン化と排出に対して抵抗力があるため、血中循環時間が長く、カプセル化された薬物への組織の曝露が増大する（Ｌａｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，９５：２６０１−２６２７（１９９５）；  Ｉｓｈｉｗａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，４３：１００５−１０１１（１９９５））。そのようなリポソームは、おそらく新血管が形成された標的組織における管外流出と捕捉により、選択的に腫瘍細胞内に蓄積されることが知られている（Ｌａｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６７：１２７５−１２７６（１９９５）；  Ｏｋｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３８，８６−９０（１９９５））。長時間循環リポソームはＤＮＡやＲＮＡの薬物動態および薬力学的挙動を、特にＭＰＳ組織に蓄積されることが知られている通常のカチオン性リポソームに比べて改善する（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４２：２４８６４−２４８７０（１９９５）；  Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＰＣＴ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＷＯ  ９６／１０３９１；  Ａｎｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＰＣＴ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＷＯ  ９６／１０３９０；  Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＰＣＴ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＷＯ  ９６／１０３９２）。長時間循環リポソームはまた、肝臓や脾臓などの代謝的に攻撃的なＭＰＳ組織への蓄積を避けることができるため、ヌクレアーゼによる分解から薬物を保護する能力がカチオン性リポソームよりも高いと考えられる。
【００５５】
本発明はまた保存および投与のために作成された、薬学的に有効な量の所望の化合物を薬学的に適切な担体または希釈剤に含ませた組成物を含む。治療のために適切な担体または希釈剤は当業者には周知であり、たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｉｒｏ  ｅｄ．，１９８５）に記載されている。たとえば保存剤、安定剤、色素、芳香剤などを使用することができ、そのような物質には安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルなどがある。更に抗酸化剤や懸濁媒も使用可能である。
【００５６】
薬学的に有効な用量とは、疾病状態を予防、軽減、あるいは治療（徴候、好ましくはすべての徴候をある程度軽減）するために必要な用量である。薬学的に有効な用量は疾病の種類、使用する組成物、投与経路、治療対象である哺乳類の種類、同哺乳類の身体的特徴、併用薬物、その他医療従事者には周知の諸要因によって左右されるが、一般には負電荷を有するポリマーの効力に従って０．１〜１００ｍｇ／体重ｋｇ／日の範囲内の量が投与される。
【００５７】
本発明はまた保存および投与のために作成された、薬学的に有効な量の所望の化合物を薬学的に適切な担体または希釈剤に含ませた組成物を含む。治療のために適切な担体または希釈剤は当業者には周知であり、たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｉｒｏ  ｅｄ．，１９８５）に記載されており、これを参照されたい。たとえば保存剤、安定剤、色素、芳香剤などを使用することができ、そのような物質には安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルなどがある。更に抗酸化剤や懸濁媒も使用可能である。
【００５８】
薬学的に有効な用量とは、疾病状態を予防、軽減、あるいは治療（徴候、好ましくはすべての徴候をある程度軽減）するために必要な用量である。薬学的に有効な用量は疾病の種類、使用する組成物、投与経路、治療対象である哺乳類の種類、同哺乳類の身体的特徴、併用薬物、その他医療従事者には周知の諸要因によって左右されるが、一般には負電荷を有するポリマーの効力に従って０．１〜１００ｍｇ／体重ｋｇ／日の範囲内の量が投与される。
【００５９】
本発明の核酸分子およびその調剤は、経口、局所、非経口、吸入または噴霧、直腸などの経路により、無毒で薬学的に適切な通常の担体、添加剤ないし媒体を含む単位用量の調剤として投与することができる。ここにいう非経口投与には、経皮、皮下、血管内（静脈内など）、筋内、髄腔内注射または注入などが含まれる。また本発明の核酸分子と薬学的に適切な担体を含む医薬品調剤も提供される。本発明の核酸分子の１種またはそれ以上を１種またはそれ以上の無毒で薬学的に適切な担体または希釈剤または添加剤、あるいは必要に応じて他の活性成分と共用することも可能である。本発明の核酸分子を含む医薬組成物は経口投与に適した剤型、たとえば錠剤、トローチ、ドロップ剤、水性または油性懸濁液、分散可能な粉末または顆粒、乳濁液、硬質または軟質カプセル、シロップまたはエリキシル剤に形成することができる。
【００６０】
経口投与用の組成物は、医薬品製造の当業者に周知の何らかの方法で製造することができ、またそのような組成物は、薬剤として好ましい風味を与えるため甘味料、香料、着色料、保存料を含むことができる。錠剤には有効成分が、無毒で薬学的に適切な、錠剤の製造に適した賦形剤と共に含まれる。このような賦形剤には、たとえば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、燐酸カルシウム、燐酸ナトリウムなどの不活性希釈剤、コーンスターチやアルギニン酸などの造粒・分解剤、澱粉、ゼラチン、アカシアゴムなどの結合剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、滑石などの潤滑剤がある。錠剤は無被覆であっても、既知の方法により被覆を施したものであってもよい。場合によってはそのような被覆によって胃腸管内での分解、吸収を遅らせ、作用を長時間にわたり持続させることもできる。そのような遅延作用を持つ材料としては、たとえばモノステアリン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリルなどが用いられる。
【００６１】
経口投与用の調剤はまた、有効成分を炭酸カルシウム、燐酸カルシウム、カオリンなどの不活性固体希釈剤と混合した硬質ゼラチンカプセル、あるいは有効成分を水またはピーナッツ油、流動パラフィン、オリーヴ油などの油と混合した軟質ゼラチンカプセルとしても提供することができる。
【００６２】
水性懸濁液は有効成分を、水性懸濁液を調製するのに適した賦形剤と混合したものである。そのような賦形剤は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、アカシアゴムなどの懸濁媒、あるいはレシチンのような天然ホスファチド、アルキレンオキシドと脂肪酸の縮合生成物（ポリステアリン酸オキシエチレンなど）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（ヘプタデカエチレンオキシセタノールなど）、エチレンオキシドと、脂肪酸とヘキシトールに由来する部分的エステルとの縮合生成物（ポリオキシエチレンソルビトールモノオレイン酸エステルなど）、脂肪酸とヘキシトール無水物に由来する部分的エステルとの縮合生成物（（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステルなど）のような分散剤または濡れ促進剤である。水性懸濁液は更に、１種以上の保存剤（ヒドロキシ安息香酸エチルまたはｎ−プロピルなど）、１種以上の着色料、１種以上の香料、１種以上の甘味料（蔗糖、サッカリンなど）を含むことができる。
【００６３】
油性懸濁液は有効成分を、落花生油、オリーヴ油、胡麻油、ココナッツ油などの植物油、または流動パラフィンなどの鉱油に懸濁させて得られる。油性懸濁液は増粘剤（蜜蝋、ハードパラフィン、セチルアルコールなど）を含んでいてもよい。風味の好ましい経口剤を得るため甘味料、香料を加えることもできる。これらの組成物はアスコルビン酸などの抗酸化剤を加えることにより保存が可能である。
【００６４】
水を加えて水性懸濁液を調製するための分散可能な粉末または顆粒は、有効成分を分散剤ないし濡れ促進剤、懸濁媒、および１種以上の保存剤と混合したものである。適当な分散剤、濡れ促進剤、懸濁媒の例は既に挙げた。その他の賦形剤、たとえば甘味料、香料、着色料などを含めることも可能である。
【００６５】
本発明の組成物は水中油滴型乳濁液とすることもできる。油相は植物油、鉱油、それらの混合物のいずれでもよい。適当な乳化剤としては、天然ゴム（アカシアゴム、トラガカントゴムなど）、天然ホスファチド（大豆レシチン、脂肪酸とヘキシトール無水物とのエステルまたは部分エステル（たとえばモノオレイン酸ソルビタン）、あるいは同部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物（ポリオキシエチレンモノオレイン酸ソルビタン）などがある。乳濁液には甘味料、香料を含めることもできる。
【００６６】
シロップおよびエリキシル剤は甘味料、たとえばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、葡萄糖または蔗糖と共に調剤したものであり、鎮痛剤、保存料、香料、着色料を含んでいてもよい。医薬組成物は無菌注射液または油性懸濁液の形態とすることも可能であり、前記の適当な分散剤、濡れ促進剤、懸濁媒を使用して既知の方法で調製することができる。無菌注射液は非経口投与に適した無毒の希釈剤または溶媒中の溶液または懸濁液、たとえば１，３−ブタンジオール溶液として調製することもできる。利用可能な適切な媒体、溶媒としては水、リンゲル液、等張食塩水があり、また無菌の固定油も溶媒または懸濁媒として一般に使用されている。この目的のためには任意の無刺激性固定油（合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む）が用いられる。オレイン酸などの脂肪酸も注射剤の調製に利用されている。
【００６７】
本発明の核酸分子はまた坐剤として直腸などに投与することもできる。このための組成物は、常温で固体、直腸温度で液体の適当な非刺激性賦形剤に薬物を混合して調製することができ、直腸内で融解して薬物を放出する。そのような賦形剤にはココアバター、ポリエチレングリコールなどが含まれる。
【００６８】
本発明の核酸分子は無菌媒体を用いて非経口的に投与することができる。薬物は用いる媒体と濃度に応じて、溶解あるいは懸濁させることができるが、局所麻酔剤、保存料、緩衝剤などの助剤は媒体中に溶解させるのが便利である。
【００６９】
上記の諸条件の治療においては、およそ０．１〜１４０ｍｇ／ｋｇ体重／日（約０．５ｍｇ〜７ｇ／人／日）の投与量が有効である。媒体と組み合わせて投与単位量とする活性成分の量は、治療対象および投与方法によって異なるが、一投与単位は活性成分約１〜５００ｍｇを含むのが一般的である。
【００７０】
特定の患者に対する具体的な投与量は、使用する化合物の活性、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食餌、投与時期、投与経路、排泄率、併用薬物、治療対象疾患の程度など、多数の要因に依存することは言うまでもない。
【００７１】
ヒト以外の動物への投与のため、組成物を動物飼料または飲料水に混合することもできる。治療上適切な量の組成物を食餌と同時に摂取できるように動物飼料および飲料水組成物を調製するのが便利である。また飼料または飲料水に添加するためのプレミックスとして組成物を提供することも便利な場合がある。
【００７２】
本発明による核酸分子は、他の治療用化合物と組み合わせて投与し、総合的な治療効果を向上させることもできる。一つの症状に対して複数の化合物を使用することにより、薬効を増強すると同時に副作用を軽減できる場合もある。
【００７３】
一つの実施態様においては、本発明の組成物は本発明の核酸分子を特定の種類の細胞、たとえば肝細胞に投与するのに好適である。たとえばアシアロ糖蛋白質受容体（ＡＳＧＰｒ）（Ｗｕ  ＆  Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７））は肝細胞に固有であり、アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）などの分岐ガラクトース末端糖蛋白質と結合する。それらの糖蛋白質または合成複合糖質が受容体に結合するときの親和力は、オリゴ糖鎖の分岐度によって大きく異なり、たとえば三分岐型構造は二分岐または無分岐の場合よりも強い親和力をもって結合する（Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ  ＆  Ｆｉｅｔｅ，Ｃｅｌｌ，２２：６１１−６２０（１９８０）；  Ｃｏｎｎｏｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：９３９−９４５（１９８２））。  Ｌｅｅ  ＆  Ｌｅｅ，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．，４：３１７−３２８（１９８７）は受容体に対してガラクトースよりも高い親和力を有するＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを炭水化物部分に用いることにより、高い特異性を得た。この「クラスタリング効果」はマンノシル末端糖蛋白質または複合糖質の結合と吸収についても報告されている（Ｐｏｎｐｉｐｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２４：１３８８−１３９５（１９８１））。細胞膜を通じての外生的化合物の輸送にガラクトースおよびガラクトサミン系複合糖質を利用すれば、ＨＢＶ感染あるいは肝細胞腫瘍などの肝臓疾患の治療において標的投薬が可能になる。またバイオコンジュゲートの利用により、治療に必要な投与量を低減することも可能である。更に、本発明による核酸バイオコンジュゲートの利用により、治療に際してのバイオアベイラビリティ、薬力学、薬物動態に関するパラメータを調節することもできる。
【００７４】
実施例１
メラミン誘導体の調製
２，４，６−トリアミドサルコシルメラミン合成の方法と材料
2007504151.tif 000004
【００７５】
４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）クレアチン
４Ｎ  ＮａＯＨ（３ｍｌ）とアセトン中クレアチン（３９０ｍｇ、３ｍｍｏｌ）溶液を氷水浴で冷却し、Ｍｔｒクロリド（６８０ｍｇ、５．２５ｍｍｏｌ）のアセトン（３ｍｌ）溶液で処理した。混合物を室温で１晩攪拌した後クエン酸１０％水溶液で酸性化し、アセトンを蒸発させて残った水性懸濁液を酢酸エチル各１０ｍｌで３回抽出した。抽出液を併せて硫酸マグネシウム上で乾燥後濾過し、濾液を蒸発乾固した後酢酸エチル：ヘキサン溶液から再結晶させた。
【００７６】
２，４，６−Ｍｔｒ−トリアミドサルコシルメラミン
Ｍｔｒ−クレアチン（６９４ｍｇ、２ｍｍｏｌ）を、メラミン（７６ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（３１０ｍｇ、２ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（４０３μｌ、２ｍｍｏｌ）と共にジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５ｍｌに溶解し、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（３１０μｌ、２ｍｍｏｌ）を添加しつつ混合物を室温で１晩攪拌した。翌日反応混合物を酢酸エチル５０ｍｌで希釈し、クエン酸各１０ｍｌで３回、塩水で１回、１０％重炭酸ナトリウムで３回、塩水で１回抽出した。酢酸エチルを硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、蒸発させて残渣をエーテル：ヘキサンから再結晶させた。
【００７７】
２，４，６−トリアミドサルコシルメラミン
２，４，６−Ｍｔｒ−トリアミドサルコシルメラミン（３４０ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸：チアニソール（９５：５）（５ｍｌ）に溶解し４時間攪拌した。溶液を蒸発により油状とし、エーテルを加えて粉末状とし乾燥した。
【００７８】
２，４，６−トリグアニジノトリアジン合成の方法と材料
2007504151.tif 000005
【００７９】
メラミントリチオ尿素スルホン酸
メラミン（１６２０ｍｇ、１３ｍｍｏｌ）とチオシアン酸メチル（２８７０ｍｇ、１３９ｍｍｏｌ）のエチルアルコール７０ｍｌ溶液との混合物を１時間還流し、蒸発の後、対応する尿素をアルコールの蒸発により分離した。次にトリイソチオ尿素トリアジン中間体を塩化ナトリウムおよび無水モリブデン酸ナトリウムを含有する水（１０ｍｌ）に溶解し、激しく攪拌しながら０℃に冷却し、攪拌中の懸濁液に過酸化水素（３０％、４１ｍｍｏｌ）を滴下した。精製したスルホン酸を濾過により捕集し、冷塩水で洗浄し乾燥した。
【００８０】
２，４，６−トリグアニジノトリアジン
メラミントリチオ尿素スルホン酸（１５２０ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）を適切なアミン（１３ｍｍｏｌ）のアセトニトリル５ｍｌ溶液中に室温で加え、混合物を１晩攪拌し、３Ｎ  ＮａＯＨでｐＨを１２に調節した。生成したグアニジンの分離は、用いたアミンによって、濾過または塩化メチレン抽出によって行った。
2007504151.tif 000006
【００８１】
実施例２
β−ｇａｌ  ｓｉＲＮＡシーケンス
以下に示す二本鎖ｓｉＲＮＡシーケンスを標準的な方法で合成した。このｓｉＲＮＡシーケンスはβ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡを抑制することを目的としており、細胞への導入を容易にするためリポフェクタミン内にカプセル化した。各シーケンスはリボースウラシルのリボースチミンへの置換の位置を除いて同一である。二本鎖４のｓｉＲＮＡはリボースウラシルのいずれもリボースチミンに置換されていない。二本鎖１〜３は本発明によるｓｉＲＮＡであって、二本鎖４のウラシルの全部または一部がリボースチミンに変化している。二本鎖１のｓｉＲＮＡではすべてのウラシルがリボースチミンとなっており、二本鎖２ではセンス鎖のウラシルのみ、二本鎖３ではアンチセンス鎖のウラシルのみがそれぞれリボースチミンに変化している。この実験の目的は、どのｓｉＲＮＡがβ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡの抑制に有効であるかを知ることである。
【００８２】
１．二本鎖１
Ｃ．ｒＴ．Ａ．Ｃ．Ａ．Ｃ．Ａ．Ａ．Ａ．ｒＴ．Ｃ．Ａ．Ｇ．Ｃ．Ｇ．Ａ．ｒＴ．ｒＴ．ｒＴ．ｄＴ．ｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
Ａ．Ａ．Ａ．ｒＴ．Ｃ．Ｇ．Ｃ．ｒＴ．Ｇ．Ａ．ｒＴ．ｒＴ．ｒＴ．Ｇ．ｒＴ．Ｇ．ｒＴ．Ａ．Ｇ．Ｄ．ｄＴ．ｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
【００８３】
２．二本鎖２
Ｃ．ｒＴ．Ａ．Ｃ．Ａ．Ｃ．Ａ．Ａ．Ａ．ｒＴ．Ｃ．Ａ．Ｇ．Ｃ．Ｇ．Ａ．ｒＴ．ｒＴ．ｒＴ．ｄＴ．ｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）
Ａ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ｃ．Ｇ．Ｃ．Ｕ．Ｇ．Ａ．Ｕ．Ｕ．Ｕ．Ｇ．Ｕ．Ｇ．Ｕ．Ａ．Ｇ．ｄＴ．ｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
【００８４】
３．二本鎖３
Ｃ．Ｕ．Ａ．Ｃ．Ａ．Ｃ．Ａ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ｃ．Ａ．Ｇ．Ｃ．Ｇ．Ａ．Ｕ．Ｕ．Ｕ．ｄＴ．ｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
Ａ．Ａ．Ａ．ｒＴ．Ｃ．Ｇ．Ｃ．ｒＴ．Ｇ．Ａ．ｒＴ．ｒＴ．ｒＴ．Ｇ．ｒＴ．Ｇ．ｒＴ．Ａ．Ｇ．ｄＴ．ｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
【００８５】
４．二本鎖４
Ｃ．Ｕ．Ａ．Ｃ．Ａ．Ｃ．Ａ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ｃ．Ａ．Ｇ．Ｃ．Ｇ．Ａ．Ｕ．Ｕ．Ｕ．ｄＴ．ｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）
Ａ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ｃ．Ｇ．Ｃ．Ｕ．Ｇ．Ａ．Ｕ．Ｕ．Ｕ．Ｇ．Ｕ．Ｇ．Ｕ．Ａ．Ｇ．ｄＴ．ｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）
【００８６】
操作
９ＬａｃＺＲ細胞に対するβ−Ｇａｌ活性試験プロトコル
コラーゲン被覆した６ウェルのプレートに９ＬａｃＺ／Ｒ細胞５×１０５個／ウェル（計２ｍｌ／ウェル）接種し、ＤＭＥＭ／高葡萄糖培地上３７℃で５％ＣＯ２雰囲気中で１晩培養した。
【００８７】
導入準備：血清を含まないＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２５０μｌを２０ｐｍｏｌ／ｌのｓｉＲＮＡ  ５μｌと混合し、また別にリポフェクタミン５μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２５０μｌと混合した。両混合物を５分間放置して平衡に達せしめた後、混合して室温に２０分放置し導入用複合体を形成させた。この間に６ウェルプレートから完全培地を吸引し、細胞を不完全ＯｐｔｉＭＥＭで洗浄した。導入用混合物５００μｌをウェルに塗布し、３７℃で4時間放置した。このインキュベーション時間中に穏和な振動を与えることにより細胞の適切な被覆を図った。
4時間のインキュベーションの後、導入用培地をＤＭＥＭ／高葡萄糖完全培地で１回洗浄してから同じ培地で置換した。ついで細胞を５％ＣＯ２雰囲気中３７℃で４８時間インキュベートした。
【００８８】
β−ガラクトシダーゼ試験（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎアッセイキット）
核酸を導入した細胞はＰＢＳで洗浄した後０．５ｍｌのトリプシン／ＥＤＴＡで回収した。細胞分離後のウェルに各１ｍｌのＤＭＥＭ／高葡萄糖完全培地を加え、試料を微量遠心分離管に移し、２５０ｘｇで５分間回転の後、上澄液を除き、試料を４℃の１×リシスバッファーに再分散させ、ドライアイスと３７℃の水浴で凍結融解を２回行った。凍結融解後の試料を４℃で５分間遠心し、上澄液を別の微量遠心分離管に移した。
【００８９】
各試料につきライセート１．５μｌおよび１０μｌを新しい管に移し、滅菌した水を加えて総量３０μｌとし、７０μｌのＯＮＰＧと２００μｌの１×クリベージバッファーをβ−メルカプトエタノールと共に加え、短時間混合の後３７℃で３０分インキュベートした。インキュベーション後５００μｌのストップバッファーを加えて８００μｌとし、試料を使い捨てキュベットにとり４２０ｎｍで読み取った。
【００９０】
蛋白質
蛋白質濃度はＢＣＡ法で測定した。
【００９１】
結果
すべてのｓｉＲＮＡがβ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡの抑制に有効であった。
【００９２】
実施例３
ラット血清中でのｓｉＲＮＡの安定性
目的
この実験の目的は、実施例２のｓｉＲＮＡがラット血清中のリボヌクレアーゼに対してどの程度安定であるかを確認することである。
【００９３】
実施例２の二本鎖ｓｉＲＮＡの各々２０μｇを新鮮なラット血清２００μｌと混合して３７℃でインキュベートした。種々の時点（０、３０、６０、２０ｍｉｎ）で混合物５０μｌを取り出し、直ちにフェノール：クロロホルムで抽出し、２．５容のイソプロパノールを加えて沈澱させたｓｉＲＮＡを７０％エタノールで洗浄し乾燥させた。試料を水とゲルローディングバッファーに溶解した後、７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲル中で分析し、臭化エチジウム染色により可視化し、デンシトメータで定量した。
【００９４】
結果
ラット血清中で安定性を示したのは、すべてのリボースウラシルをリボースチミンに置換した二本鎖１のｓｉＲＮＡのみであった。このことは各構成体をラット血清で処理した後のＳＤＡ  ＰＡＧＥゲル（図１）に示されている。二本鎖修飾（ｒＴ／ｒＴ；Ａ）、一本鎖修飾（Ｕ／ｒＴおよびｒＴ／Ｕ；ＡおよびＢ）、無修飾（Ｕ／Ｕ；Ｂ）の各ｓｉＲＮＡを比較すると、二本鎖修飾ｓｉＲＮＡは一本鎖修飾および無修飾ｓｉＲＮＡよりも顕著に安定である。修飾ｓｉＲＮＡの易動度が通常のｓｉＲＮＡより低いことも注目される。
【００９５】
このようにして、ｓｉＲＮＡのすべてのウリジンを５−メチルウリジン（リボチミジン）で置換することによって予想外に安定な二本鎖ｓｉＲＮＡが得られることが見出された。
【００９６】
本明細書に引用した特許、特許出願公開、および雑誌記事の知見はすべてその全体が本明細書に含まれるものと見なされる。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、実施例３における安定性試験の結果を示すＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルであり、唯一の安定なｓｉＲＮＡ構成体が、すべてのウリジンが５−メチルウリジンリボチミジンに転換された最初の構成体であることを示している。
【図１Ａ】
2007504151.tif 000013
【図１Ｂ】
2007504151.tif 000014
【配列表】
2007504151000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年4月26日(2006.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
15〜30個のヌクレオチドと、アルギニンのD型およびL型光学異性体の交互配列から成るポリアルギニンポリペプチドの2本のRNA鎖から成る、二本鎖RNA(dsRNA)分子。
【請求項２】
15〜30個のヌクレオチドと、アスパラギンのD型およびL型光学異性体の交互配列から成るポリアスパラギンポリペプチドの2本のRNA鎖から成る、二本鎖RNA(dsRNA)分子。
【請求項３】
15〜30個のヌクレオチドと、グルタミンのD型およびL型光学異性体の交互配列から成るポリグルタミンポリペプチドの2本のRNA鎖から成る、二本鎖RNA(dsRNA)分子。
【請求項４】
15〜30個のヌクレオチドと、式I
2007504151.tif 000022
および
式II
2007504151.tif 000023
から成る群から選ばれたメラミン誘導体の2本のRNA鎖から成る、二本鎖RNA(dsRNA)分子。
【請求項５】
前記化合物が少なくとも一方のRNA鎖の末端燐酸基と複合化されている、請求項４のdsRNA複合体。
【請求項６】
標的遺伝子の配列と相同的なセンス鎖と、同センス鎖に相補的なアンチセンス鎖から成り、少なくとも一方のRNA鎖に存在するすべてのウリジンが5-メチルウリジンで置換されている、二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子。
【請求項７】
前記RNA鎖の各々が15〜30個のヌクレオチドを含む、請求項６のdsRNA。
【請求項８】
ヌクレオチド1〜5個の一本鎖オーバーハングを有する、請求項１，２，３，４，７のいずれかのdsRNA。
【国際調査報告】
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