(57)【要約】  本発明は、心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患に関連するヒトAdipoR1を提供する。本発明はまた、心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患の治療または予防に有用な化合物の同定のためのアッセイを提供する。本発明はさらに、AdipoR1へ結合する化合物および/またはAdipoR1の活性を活性化または阻害する化合物ならびにかかる化合物を含む医薬組成物を特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、哺乳類における心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患からなる疾患の群に含まれる疾患の治療に有用な治療薬のスクリーニング方法：
i)被験化合物とAdipoR1 ポリペプチドとを接触させる工程、および、
ii)該被験化合物と該AdipoR1 ポリペプチドとの結合を検出する工程。
【請求項２】
以下の工程を含む、哺乳類における心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患からなる疾患の群に含まれる疾患の治療に有用な治療薬のスクリーニング方法：
i)特定の濃度の被験化合物の存在下または該被験化合物の非存在下でのAdipoR1 ポリペプチドの活性を測定する工程、および、
ii)異なる濃度の該被験化合物の存在下で該ポリペプチドの活性を測定する工程。
【請求項３】
以下の工程を含む、哺乳類における心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患からなる疾患の群に含まれる疾患の治療に有用な治療薬のスクリーニング方法：
i) 特定の濃度の被験化合物の存在下でAdipoR1 ポリペプチドの活性を測定する工程、および、
ii) AdipoR1 ポリペプチドの制御因子であることが知られている化合物の存在下でAdipoR1 ポリペプチドの活性を測定する工程。
【請求項４】
接触工程が細胞内または細胞表面で行われる請求項1〜3のいずれかの方法。
【請求項５】
細胞がインビトロにある請求項1〜3のいずれかの方法。
【請求項６】
接触工程が無細胞システムで行われる請求項1〜3のいずれかの方法。
【請求項７】
ポリペプチドが検出可能な標識に結合している請求項1〜3のいずれかの方法。
【請求項８】
化合物が検出可能な標識に結合している請求項1〜3のいずれかの方法。
【請求項９】
ポリペプチドに最初に結合していたリガンドを被験化合物が置換する請求項1〜3のいずれかの方法。
【請求項１０】
ポリペプチドが固体支持体に結合している請求項1〜3のいずれかの方法。
【請求項１１】
化合物が固体支持体に結合している請求項1〜3のいずれかの方法。
【請求項１２】
以下の工程を含む、哺乳類における心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患からなる疾患の群に含まれる疾患の治療に有用な治療薬のスクリーニング方法：
i)被験化合物とAdipoR1 ポリヌクレオチドとを接触させる工程、および、
ii)該被験化合物の該 AdipoR1 ポリヌクレオチドへの結合を検出する工程。
【請求項１３】
核酸分子がRNAである請求項12の方法。
【請求項１４】
接触工程が細胞内または細胞表面で行われる請求項12の方法。
【請求項１５】
接触工程が無細胞システムで行われる請求項12の方法。
【請求項１６】
ポリヌクレオチドが検出可能な標識に結合している請求項12の方法。
【請求項１７】
被験化合物が検出可能な標識に結合している請求項12の方法。
【請求項１８】
以下の工程を含む、哺乳類における心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患からなる疾患の群に含まれる疾患を診断する方法：
i)該哺乳類から採取したサンプルにおけるAdipoR1 ポリヌクレオチドの量を測定する工程、および、
ii)健康および/または疾患哺乳類におけるAdipoR1 ポリヌクレオチドの量を測定する工程。
【請求項１９】
AdipoR1 ポリペプチドに結合する治療薬を含む、哺乳類における心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患からなる疾患の群に含まれる疾患の治療のための医薬組成物。
【請求項２０】
AdipoR1 ポリペプチドの活性を調節する治療薬を含む、哺乳類における心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患からなる疾患の群に含まれる疾患の治療のための医薬組成物。
【請求項２１】
AdipoR1 ポリペプチドの活性を調節する治療薬を含む、哺乳類における心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患からなる疾患の群に含まれる疾患の治療のための医薬組成物、ここで、該治療薬は以下の何れかである：
i)低分子、
ii) RNA 分子、
iii)アンチセンスオリゴヌクレオチド、
iv)ポリペプチド、
v)抗体、または、
vi)リボザイム。
【請求項２２】
AdipoR1 ポリヌクレオチドを含む、哺乳類における心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患からなる疾患の群に含まれる疾患の治療のための医薬組成物。
【請求項２３】
AdipoR1 ポリペプチドを含む、哺乳類における心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患からなる疾患の群に含まれる疾患の治療のための医薬組成物。
【請求項２４】
哺乳類における心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患からなる疾患の群に含まれる疾患の治療のための医薬組成物の調製のための、AdipoR1の制御因子の使用。
【請求項２５】
以下の工程を含む、哺乳類における心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患からなる疾患の群に含まれる疾患の治療に有用な医薬組成物の調製方法：
i) AdipoR1の制御因子を同定する工程、
ii)該制御因子が、哺乳類における心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患からなる疾患の群に含まれる疾患症状を改善するかどうかを判定する工程; および、
iii)該制御因子と許容される医薬用担体を混合する工程。
【請求項２６】
心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患からなる疾患の群に含まれる疾患を有する哺乳類におけるAdipoR1 活性の制御のためのAdipoR1の制御因子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は分子生物学の分野におけるものであり、より具体的には、本発明は、ヒトAdipoR1の核酸配列およびアミノ酸配列、ならびに哺乳類における心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患の治療のためのその制御に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Gタンパク質共役受容体
AdipoR1は、7回膜貫通型Gタンパク質共役受容体(GPCR)である[Yamauchi et al.、(2003)、WO0112662、WO200190304]。多くの医学的に重要な生物学的過程はGタンパク質を含むシグナル伝達経路に媒介されている [Lefkowitz、(1991)]。Gタンパク質共役受容体(GPCR)のファミリーには、ホルモン、神経伝達物質、成長因子およびウイルスに対する受容体が含まれる。GPCRの具体例としては、以下のような様々な物質の受容体が挙げられる： ドーパミン、カルシトニン、アドレナリン作動性ホルモン、エンドセリン、cAMP、アデノシン、アセチルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子-1、ロドプシン、におい物質、サイトメガロウイルス、Gタンパク質自体、エフェクタータンパク質、例えば、ホスホリパーゼ C、アデニルシクラーゼおよびホスホジエステラーゼ、そしてアクチュエータタンパク質、例えば、タンパク質キナーゼ Aおよびタンパク質キナーゼC。
【０００３】
GPCRは、少なくとも8つの相異なる疎水性ループを連結する7つの保存された膜貫通ドメインを有する。7回膜貫通型、7TM、受容体としても知られるGPCRは、少なくとも8つの相異なる疎水性ループを連結する約 20〜30アミノ酸の7つの保存された疎水性ストレッチを含むものとして特徴づけられている。ほとんどのGPCRは、機能性タンパク質構造を安定化すると考えられているジスルフィド結合を形成する、最初の2つの細胞外ループのそれぞれにおいて1つの保存されたシステイン残基を有する。7回膜貫通型領域は、TM1、TM2、TM3、TM4、TM5、TM6、およびTM7と称されている。TM3はシグナル伝達に関与している。システイン残基のリン酸化および脂質化 (パルミチル化またはファルネシル化)はある種のGPCRのシグナル伝達に影響を及ぼしうる。ほとんどのGPCRは第3細胞質側ループおよび/またはカルボキシ末端において潜在的リン酸化部位を含む。いくつかのGPCR、例えば、ベータアドレナリン作動性受容体については、タンパク質キナーゼ A および/または特異的受容体キナーゼによるリン酸化は受容体脱感作を媒介する。
【０００４】
いくつかの受容体については、GPCRのリガンド結合部位は、いくつかのGPCR 膜貫通ドメインにより形成される親水性ソケットを含むと考えられている。該親水性ソケットは、GPCRの疎水性残基に囲まれている。各GPCR膜貫通ヘリックスの親水性の側は内側を向いており、極性のリガンド結合部位を形成すると考えられている。TM3はいくつかのGPCRについてリガンド結合部位、例えば、TM3 アスパラギン酸残基、を有すると見なされている。 TM5 セリン、TM6 アスパラギン、およびTM6またはTM7 フェニルアラニンまたはチロシンもリガンド結合に関係している。
【０００５】
GPCRはヘテロ三量体Gタンパク質により、様々な細胞内酵素、イオンチャンネルおよびトランスポーターに細胞の内側で共役している。異なるGタンパク質アルファ-サブユニットは特定のエフェクターを優先的に刺激して細胞における様々な生物機能を調節している。GPCRの細胞質内残基のリン酸化はいくつかのGPCRの制御に重要な機構である。例えば、シグナル伝達の一形態において、ホルモン結合の作用は、細胞の内側の酵素、アデニル酸シクラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素活性化は、ヌクレオチド GTPの存在に依存する。GTPはホルモン結合にも影響を及ぼす。Gタンパク質はホルモン受容体をアデニル酸シクラーゼに連結させる。Gタンパク質はホルモン受容体によって活性化されると結合型GDPをGTPと交換する。GTP-担持形態は次いで活性化型アデニル酸シクラーゼに結合する。Gタンパク質自体によって触媒されるGTPのGDPへの加水分解は、Gタンパク質をその基底の不活性形態に戻す。したがってGタンパク質は、受容体からエフェクターへのシグナル伝達の中間体として、そしてシグナルの維持を制御する時計としての二重の役割を果たす。
【０００６】
過去15年間にわたり、7TM 受容体を標的とする350近くの治療薬の上市が成功してきた。これは、これら受容体の治療標的としての歴史が、確立され、解明されていることを示す。明らかに、以下に例示するがそれらに限定されない機能障害または疾患の予防、改善、または解消に役割を果たしうるさらなる受容体の同定および特徴付けの必要性がある：感染症、例えば、細菌、真菌、原生動物、およびウイルス感染症、特にHIV ウイルスによる感染症、癌、喘息等のアレルギー、急性心不全、低血圧、高血圧、狭心症、心筋梗塞等の心循環器疾患、血液病、尿失禁および良性前立腺過形成等の尿生殖器疾患、骨粗鬆症、疼痛、アルツハイマー病およびパーキンソン病等の末梢および中枢神経系障害、呼吸器疾患、代謝性疾患、炎症性疾患、胃腸疾患、内分泌系疾患、皮膚病、筋肉または骨の疾患、免疫疾患、発育疾患または生殖系疾患。
【０００７】
TaqMan-技術/発現プロファイリング
TaqManは、最近開発された技術であり、その技術では、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)中のリアルタイムのハイブリダイゼーションプローブからの蛍光レポーター色素の放出がPCR産物の蓄積に比例する。定量は反応の初期の線形部分に基づき、バックグラウンドを超える蛍光が最初に検出されるサイクル閾値 (CT)を測定することによって行われる。
【０００８】
遺伝子発現技術は、創薬および薬剤開発のいくつかの領域、例えば、標的同定、リード化合物最適化、および作用機作同定において有用であり得る。TaqMan 技術は、正常組織と疾患組織の発現プロファイル間の差の比較に用いることが出来る。発現プロファイリングは様々な疾患において上方または下方制御される遺伝子の同定に用いられてきた。発現プロファイリングの興味深い適用は、疾患進行および薬物治療の間または、健康個体と比較した患者の間での遺伝子発現の変化の時間的モニタリングである。このアプローチの前提は、生理的または環境的刺激 (例えば、薬物)に応答した遺伝子発現パターンの変化が、疾患を引き起こす遺伝子または薬剤標的の間接的な手がかりとして働きうるということである。さらに、効能が確立されている薬剤の全体的な遺伝子発現パターンに対する効果は、新薬候補がそれと比較されうる指標、即ち遺伝子サインを提供しうる。
【０００９】
AdipoR1
AdipoR1のヌクレオチド配列は、公共データベースから受託番号 NM_015999によって入手でき、配列番号1に示されている。AdipoR1のアミノ酸配列は配列番号2に示されている。
【００１０】
アディポネクチン受容体、ADIPOR1およびADIPOR2は、球状の全長アディポネクチンに対する受容体として働き、アディポネクチンによるAMPKおよびPPAR-アルファリガンド活性、ならびに脂肪酸酸化およびグルコース取り込みの上昇を媒介する [Yamauchi et al.、(2003)]。Yamauchi et al. [Yamauchi et al.、(2003)]は、発現クローニングによってADIPOR1およびADIPOR2をコードするcDNAを単離した。
【００１１】
受容体 AdipoR1は[Yamauchi et al.、(2003) ] に公表されている。
【００１２】
発明の概要
本発明は、AdipoR1 ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの疾患との新規な関連に関する。本発明はまた、哺乳類における心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患の治療のための治療薬の新規スクリーニング方法にも関する。本発明はまた、AdipoR1 ポリペプチド、AdipoR1 ポリヌクレオチド、またはAdipoR1制御因子またはAdipoR1 活性の調節因子を含む、哺乳類における心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患の治療のための医薬組成物に関する。本発明はさらに、哺乳類における、心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患の診断方法も含む。
【発明の詳細な説明】
【００１３】
用語の定義
「オリゴヌクレオチド」は、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)においてオリゴマー、アンプリマー（amplimer）またはプローブとして用いるのに十分な数の塩基を有するヌクレオチド残基のストレッチ(stretch)である。オリゴヌクレオチドはゲノムまたはcDNA配列から調製され、特定の細胞または組織における類似のDNAまたはRNAの増幅、解明またはその存在の確認に用いられる。オリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、少なくとも約10ヌクレオチドおよび約35ものヌクレオチド、好ましくは約25ヌクレオチドを有するDNA 配列の部分を含む。
【００１４】
「プローブ」は、天然または組換えの一本鎖または二本鎖核酸由来であっても、化学合成されたものでもよい。プローブは、同一または類似の配列の存在の検出に有用である。かかるプローブは、ニックトランスレーション、Klenow fill-in 反応、PCR またはその他の当該技術分野で周知の方法を用いてレポーター分子によって標識してもよい。核酸プローブを、サザン、ノザンまたはインサイチュハイブリダイゼーションに用いて、あるタンパク質をコードするDNAまたはRNAが、ある細胞タイプ、組織、または器官に存在するか否かを判定することが出来る。
【００１５】
「ポリヌクレオチドの断片」は、所与のヌクレオチド分子の全部または一部を含む核酸であって、断片は約 6 kb未満、好ましくは約 1 kb未満のヌクレオチドを有する。
【００１６】
「レポーター分子」は、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、または発色性の物質であって、特定のヌクレオチドまたはアミノ酸配列に結合し、それによって所与の配列の存在の確認する、または、所与の配列の定量を可能とするものである。
【００１７】
「キメラ」分子は、以下のAdipoR1の特徴の１つまたは数個を変化させると予測されうるさらなる核酸配列を含むベクターに、本発明のヌクレオチド配列の全部または一部を導入することによって構築することが出来る: 細胞内位置、分布、リガンド結合親和性、鎖間親和性、分解/代謝回転速度、シグナル伝達等。
【００１８】
AdipoR1 ポリペプチドに関して「活性」とは、AdipoR1 ポリペプチドの生物学的および/または抗原性活性を維持するAdipoR1 ポリペプチドの形態、断片またはドメインを意味する。
【００１９】
「天然AdipoR1ポリペプチド」とは、遺伝子操作されていない細胞から産生されたポリペプチドをいい、具体的には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化を含むがこれらに限定されないポリペプチドの翻訳後修飾から生じた様々なポリペプチドを意図する。
【００２０】
「誘導体」とは、例えば、ユビキチン化、標識化(上記参照)、ペグ化 (ポリエチレングリコールによる誘導体化)、および、例えば、ヒトタンパク質に通常存在しないオルニチンなどのアミノ酸の化学的挿入または置換といった技術によって化学的に修飾されたポリペプチドを意味する。
【００２１】
「保存的アミノ酸置換」は、１つのアミノ酸とその他の類似の構造および/または化学的性質を有するアミノ酸への置換に起因する。置換としては、例えば、ロイシンとイソロイシンまたはバリンの置換、アスパラギン酸とグルタミン酸の置換、またはスレオニンとセリンの置換が挙げられる。 
【００２２】
「挿入」または「欠失」は典型的には約 1〜5アミノ酸の範囲のものである。許容される変化は、ペプチドを合成的に作り、組換え DNA 技術を用いて配列内に系統的にヌクレオチドの挿入、欠失または置換を作成することによって実験的に決定することが出来る。
【００２３】
「シグナル配列」または「リーダー配列」を用いて、所望の場合、ポリペプチドを細胞膜を横切らせることが出来る。かかる配列は本発明のポリペプチドに天然に存在するものでもよいし、異種の起源から組換えDNA技術によって提供してもよい。  
【００２４】
「オリゴペプチド」はオリゴヌクレオチドから発現されうるアミノ酸残基の短いストレッチである。オリゴペプチドは、少なくとも3、5、10 アミノ酸、最大でも10、15、25 アミノ酸、典型的には少なくとも 9〜13 アミノ酸であって、生物学的活性および/または抗原性活性を示すのに十分な長さを有するアミノ酸残基のストレッチである。
【００２５】
「阻害剤」は、化学的または生理的反応あるいは応答を妨害または予防する物質である。一般的な阻害剤としてはこれらに限定されないが、アンチセンス分子、抗体、およびアンタゴニストが挙げられる。
【００２６】
「標準発現」は比較のための定量的または定性的な尺度である。それは統計的に適切な数の正常サンプルに基づき、診断アッセイの実行、臨床試験の実施、または患者の治療プロファイルの追跡の際に比較の基準として用いられるように作成されたものである。 
【００２７】
本明細書において用いる「動物」は、ヒト、ペット(例えばネコ、イヌなど)、家畜(例えば、ウシ、ウマ、ヒツジなど)または実験動物種(例えば、マウス、ラット、ウサギ等)を含むように定義される。
【００２８】
本発明の意味において、「AdipoR1 ポリヌクレオチド」は、以下からなる群から選択される核酸分子であると理解すべきである：
(i) 配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子、
(ii) 配列番号1の配列を含む核酸分子、
(iii) 配列番号1の配列を有する核酸分子、
(iv) その相補鎖がストリンジェントな条件下で (i)、(ii)、または(iii)の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子;および、
(v)その配列が遺伝暗号の縮重により(iii)の核酸分子の配列と異なる核酸分子;
ここで該核酸分子によりコードされるポリペプチドはAdipoR1 活性を有する。
【００２９】
本発明の意味において、「AdipoR1 ポリペプチド」は以下からなる群から選択されるポリペプチドと理解すべきである：
(i)配列番号2の配列を有するポリペプチド、
(ii)配列番号2の配列を含むポリペプチド、
(iii) AdipoR1 ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド; および、
(iv) (i)、(ii)、または(iii)のポリペプチドと少なくとも 99%、98%、95%、90%、または80%の相同性を示すポリペプチド;
ここで該ポリペプチドはAdipoR1 活性を有する。
【００３０】
AdipoR1をコードするヌクレオチド配列(またはその相補鎖)は、分子生物学の当業者に知られた技術において多数の用途を有する。かかる技術には、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用、PCR用オリゴマーの構築における使用、染色体および遺伝子マッピングのための使用、AdipoR1の組換え産生における使用およびアンチセンス DNAまたはRNA、その化学的アナログなどの作成における使用が含まれる。本明細書に開示するAdipoR1をコードするヌクレオチドの使用は公知技術の例示であり、当業者に知られるいかなる技術における使用にも制限されない。さらに、本明細書に開示するヌクレオチド配列は、現在知られているヌクレオチド配列の性質、例えば、三文字遺伝暗号、特異的塩基対相互作用などに基づく新しい技術であれば、未だに開発されていない分子生物学技術において使用することも可能である。 
【００３１】
当業者であれば、遺伝暗号の縮重の結果、AdipoR1をコードするヌクレオチド配列は複数作ることが出来ることを理解するであろう。それらのなかには公知の天然 AdipoR1のヌクレオチド配列と最小限の相同性しかもたないものもあろう。本発明は、可能なコドンの選択に基づいて組み合わせを選択することにより作ることが出来るヌクレオチド配列のいずれの可能な変化も具体的に含む意図である。これらの組み合わせは天然 AdipoR1ヌクレオチド配列に適用された標準的三文字遺伝暗号にしたがって作成し、すべてのかかる変化は具体的に開示されているとみなされる。
【００３２】
AdipoR1、その誘導体またはその変異体をコードするヌクレオチド配列は、好ましくはストリンジェントな条件下で天然 AdipoR1 ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるものであるが、実質的に異なるコドン使用頻度を有するAdipoR1 ポリペプチドまたはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作るのが有利であろう。コドンは、宿主によって用いられる特定のコドンの頻度にしたがって特定の原核または真核発現宿主において起こるペプチドの発現率を増加させるように選択することが出来る。コードされるアミノ酸配列を変化させずにAdipoR1 ポリペプチドおよび/またはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変化させる別の理由には、天然配列から産生される転写産物と比較してより望ましい性質、例えば、より長い半減期を有するRNA 転写産物を作成することが含まれる。
【００３３】
AdipoR1 ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、様々な他のヌクレオチド配列に、よく確立された組換えDNA技術を用いて結合させることが出来る。AdipoR1 ポリヌクレオチドに結合させるのに有用なヌクレオチド配列としては、種々のクローニングベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ラムダファージ誘導体、ファージミド等が挙げられる。興味の持たれるベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ作成用ベクター、配列決定用ベクターなどが挙げられる。一般的に、目的のベクターは、少なくとも１つの生物において機能する複製起点、便宜な制限エンドヌクレアーゼ感受性部位、および１以上の宿主細胞システムのための選択可能マーカーを含みうる。
【００３４】
本発明の別の側面は、AdipoR1をコードする天然ヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるAdipoR1-特異的ハイブリダイゼーションプローブを提供することである。かかるプローブは、類似のGPCRコード配列の検出に使用することもでき、好ましくはAdipoR1 ポリヌクレオチドに対して少なくとも 40%のヌクレオチド同一性を示すべきである。本発明のハイブリダイゼーションプローブは配列番号1に示すヌクレオチド配列またはネイティブな遺伝子のプロモーター、エンハンサーまたはイントロンを含むゲノム配列から導きうるものである。ハイブリダイゼーションプローブは当該技術分野で周知の技術を用いて様々なレポーター分子で標識してもよい。
【００３５】
AdipoR1 ポリヌクレオチドの多くの欠失アナログまたは突然変異アナログがAdipoR1 ポリヌクレオチドに対する有効なハイブリダイゼーションプローブであることが理解されよう。したがって、本発明はかかるAdipoR1をコードする核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列にも関する。
【００３６】
「ストリンジェントな条件」とは、実質的に関連した核酸配列のハイブリダイゼーションを可能にする条件をいう。例えば、かかる条件は一般に、少なくとも約85%の配列同一性、好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有する配列のハイブリダイゼーションを可能にするものであろう。ハイブリダイゼーション条件およびプローブは、ヒト由来プローブの選択的ハイブリダイゼーションを達成するためによく特徴づけられた方法によって調整することができる。本発明の意味においてストリンジェントな条件は、1 mM EDTA、0.5 M NaHPO4 (pH 7.2)、7 % (w/v) SDSを含むバッファー中65℃である。
【００３７】
ストリンジェントな条件下でAdipoR1 ポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子は機能的に同定することが出来る。これらに限定されないが、ハイブリダイゼーションプローブの使用例としては以下が含まれる: 組織化学的使用、例えば、AdipoR1を発現する組織の同定; mRNAレベルの測定、例えば、サンプルの組織タイプの同定または異常なレベルのAdipoR1を発現する細胞の同定;およびAdipoR1の多型の検出。
【００３８】
PCRは、AdipoR1をコードするヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドのさらなる使用を提供する。PCRに用いられるようなプローブは、組換え起源であってもよいし、化学合成されたものであってもよいし、それらの混合物であってもよい。オリゴマーは特定の組織におけるAdipoR1の同定または診断用途に最適化された条件下で用いられる別々のヌクレオチド配列を含みうる。２つの同じオリゴマー、ネスト化（nested）セットのオリゴマー、あるいはオリゴマーのディジェネレートプールさえも、密接に関連したDNAまたはRNAの同定に、より低いストリンジェンシーの条件で用いることが出来る。
【００３９】
ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) プライマーの設計ルールは既に確立しておりPCRプロトコールに概説されている。ディジェネレートプライマー、即ち、所与の配列位置において異種起源であるプライマー調製物は、AdipoR1と同一ではないが、高度に相同的な核酸配列を増幅するために設計することが出来る。プライマーの一方のみが既知の配列と特異的にハイブリダイズするのに要求される戦略が今や利用可能である。例えば、プライマーの一方に対するハイブリダイゼーションパートナーを提供するために増幅しようとする核酸に適当な核酸プライマーをライゲーションすればよい。このようにして、プライマーの一方のみが増幅しようとする核酸配列に基づくことが必要とされる。
【００４０】
核酸を増幅するPCR法は少なくとも２つのプライマーを利用する。これらプライマーの一方は増幅すべき核酸の第一鎖にハイブリダイズすることができ、第一の方向にて酵素に駆動される核酸合成を開始させることができる。もう一方は第一鎖の相反配列にハイブリダイズすることができ(増幅すべき配列が一本鎖の場合、この配列は最初は仮説上のものであるが、第一の増幅サイクルにおいて合成される)、第一のプライマーのハイブリダイゼーション部位に向かった第一の方向と反対方向にてその鎖からの核酸合成を開始させることが出来る。特に好ましいストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でのかかる増幅の実施条件は周知である。
【００４１】
AdipoR1に対する特異的ハイブリダイゼーションプローブを作る別の方法には、mRNA プローブの産生のためのベクターにAdipoR1または AdipoR1 誘導体をコードする核酸配列をクローニングすることが含まれる。かかるベクターは当該技術分野で知られており、市販されており、適当なRNA ポリメラーゼ、例えばT7またはSP6 RNA ポリメラーゼおよび適当なレポーター分子を付加することによりインビトロでRNA プローブを合成するのに用いることが出来る。
【００４２】
DNA 配列、またはその部分を完全に化学合成によって作ることが可能である。合成の後、核酸配列は当該技術分野で周知の技術を用いて多くの利用可能なDNA ベクターのいずれかに挿入し、それぞれの宿主細胞に導入することができる。さらに、化学合成はヌクレオチド配列に突然変異を導入するのに用いることも出来る。あるいは、突然変異が望ましい配列の一部を合成し、既存のゲノムまたは組換え配列のより長い部分と組換えてもよい。
【００４３】
AdipoR1 ポリヌクレオチドは、組換え DNA 技術の周知の方法を用いて精製オリゴペプチドまたはポリペプチドを産生するのに使用することもできる。オリゴペプチドは原核または真核の様々な宿主細胞において発現しうる。宿主細胞はヌクレオチド配列の由来である同種のものであってもよいし、異種のものでもよい。組換え DNA 技術によってオリゴヌクレオチドを作る利点には、精製に適当な量のタンパク質が得られることおよび簡便な精製手順が利用可能であることが挙げられる。
【００４４】
核酸の定量
ヒト疾患の分子遺伝学分析における重要な工程はしばしば、特定の組織における核酸のコピー数または遺伝子の相対発現の計数である。
【００４５】
数種類のアプローチが現在核酸の定量に用いることが出来る。染色体に基づく技術、例えば、比較ゲノムハイブリダイゼーション (CGH)および蛍光インサイチュハイブリダイゼーション (FISH)は、腫瘍細胞において変化しているゲノム領域を細胞遺伝学的に局在化する試みを助ける。ゲノム変化領域は、ヘテロ接合性の消失分析 (LOH)をさらに用いて限局化することが出来、LOHにおいて疾患 DNAはヘテロ接合性の多型マーカーの消失について分析され、正常DNAと比較される。最初の実験は制限断片長多型(RFLPs) [Johnson、(1989)]、または超可変ミニサテライトDNA [Barnes、2000]を用いた。最近、LOHは、まずマイクロサテライトマーカー のPCR 増幅および放射標識した [Jeffreys、(1985)]または蛍光標識したPCR産物[Weber、(1990)]の電気泳動を用い、そして正常および疾患DNAのペアを比較して行われる。
【００４６】
他の多くの方法が核酸の定量のために開発されている[Gergen、(1992)]。より最近では、サンプル中の核酸量を測定することが出来る、PCRおよびRT-PCR法が開発されている。１つのアプローチでは、例えば、反応生成物がプラトーに達する前の反応の対数期においてPCR産物の量を測定する[Thomas、(1980)]。
【００４７】
すべてのサンプルにおいて比較的一定の量含まれている遺伝子配列は、典型的にはサンプル増幅効率の正規化に用いられる。このアプローチはしかし、いくつかの欠点を有する。この方法は、各サンプルが同一投入量の核酸を有し、サンプル間の増幅効率が分析時点まで同一であることを必要とする。さらに、PCR定量の常套方法、例えば、ゲル電気泳動またはプレート捕捉ハイブリダイゼーションを用いて、その方法に要求されるようにすべてのサンプルが実際に反応の対数期に分析されていたか、決定するのは困難である。
【００４８】
定量的競合 (QC)-PCRと称される別の方法は、その名の通り、各反応に内部標準コンペティターを含めることに依存する [Piatak、(1993)、Biotechnology]。各反応効率は内部コンペティターに対して正規化される。既知量の内部コンペティターを典型的には各サンプルに添加する。未知の標的PCR産物を既知のコンペティター PCR産物と比較して相対的定量を得る。この一般的アプローチの困難な点は、標的分子と同じ効率で増幅する内部標準を開発することにある。
【００４９】
5' 蛍光発生ヌクレアーゼアッセイ
蛍光発生ヌクレアーゼアッセイは、増幅産物の形成をモニターするプローブを用いるリアルタイム定量法である。この方法の基礎は、増幅産物形成のモニタリングが二重標識蛍光性オリゴヌクレオチドプローブを用いる連続的PCR産物蓄積の測定であることであり、このアプローチはしばしば文献において「TaqMan 法」と称される[Piatak,(1993)、Science; Heid、(1996); Gibson、(1996); Holland. (1991)]。
【００５０】
かかるアッセイに用いられるプローブは、２種類の蛍光色素によって標識されている典型的には短い(約 20-25塩基) オリゴヌクレオチドである。プローブの5' 末端はレポーター色素に、3' 末端はクエンチング色素に結合しているが、これら色素はプローブの別の位置に結合していてもよい。プローブは、プローブ結合部位と少なくとも実質的に相補的な配列を有するよう設計される。座位の隣接領域に結合する上流および下流PCR プライマーが反応混合物に加えられる。プローブが未変化の場合、２つのフルオロフォアの間でエネルギー移動が起こり、クエンチャーがレポーターからの発光をクエンチする。PCRの伸長相において、プローブが核酸ポリメラーゼ、例えば、Taq ポリメラーゼの5' ヌクレアーゼ活性によって切断され、それによってオリゴヌクレオチド-クエンチャーからレポーターが放出され、その結果、適当な検出器により測定可能なレポーター発光強度が上昇する。
【００５１】
例えば蛍光性アッセイの際に生じる蛍光発光を測定するのに特に適した検出器の１つは、Foster City、Calif. のApplied Biosystems Incによって製造されたABI 7700または4700 HTである。ABI 7700は、96または384ウェルPCR チューブ配置の各ウェルに連結した光ファイバーを用いる。この装置は標識を励起するレーザーを含み、PCR 増幅の間の連続的モニタリングにより各チューブからの蛍光スペクトル強度を測定することが出来る。各チューブは8.5秒毎に再調査される。
【００５２】
装置に備えられているコンピュータソフトウェアは増幅の過程にわたってレポーターおよびクエンチャーの蛍光強度を記録することが出来る。記録された値は継続的に正規化されたレポーター発光強度の上昇を計算するのに用いられる。発光強度の上昇は時間、即ち増幅サイクル数に対してプロットされ、増幅の連続的測定値が作られる。各増幅反応における座位を定量するために、増幅プロットは産物蓄積の対数期の間の点において調べられる。これはバックグラウンドを上回る蛍光閾値強度を割りあて、各増幅プロットが閾値を超える点を測定することによって達成される (サイクル閾値数またはCtと定義される)。サイクル閾値数における相違を用いて各チューブに含まれるPCR 標的の相対量が定量される。各反応が100% PCR 効率で機能しているとすれば、１Ctの相違は、開始テンプレートの量の２倍の相違を表す。蛍光値は標準曲線と組みあわせて、存在する増幅産物の量を測定するのに用いられる。
【００５３】
プローブに基づかない検出方法
様々な選択肢を形成された増幅産物の測定に用いることが出来る。一つの方法は二本鎖 DNAにのみ結合する標識、例えば、色素、を利用する。このタイプのアプローチにおいて、(二本鎖である)増幅産物は溶液中で色素分子と結合し、複合体を形成する。適当な色素により、溶液中の遊離の色素分子と、増幅産物に結合した色素分子とを区別することが可能である。例えば、ある種の色素は増幅産物に結合した時にだけ、蛍光を発する。この一般的なタイプの方法に用いることができる色素の例としては、これらに限定されないが、Eugene、Oreg のMolecular Probes、Inc.から市販されているSyber Green（商標）およびPico Green、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、クロモマイシン、アクリジンオレンジ、Hoechst 33258、Toto-1、Yoyo-1、DAPI (4',6-ジアミノ-2-フェニルインドールヒドロクロリド)が挙げられる。
【００５４】
リアルタイム検出技術としては、PCR プライマーに結合したフルオロフォアの間の蛍光エネルギー移動の際のエネルギー変化を測定するものがある[Livak、(1995)]。
【００５５】
プローブに基づく検出方法
これらの検出方法は、増幅プライマー対の間の座位にハイブリダイズしたプローブの構造または立体配座の変化を伴う。ある種の例においては、変化は増幅工程における核酸ポリメラーゼによって触媒されるテンプレート依存伸長によって引き起こされる。該変化が、形成した増幅産物の量の間接的尺度である検出可能なシグナルを作り出す。
【００５６】
例えば、いくらかの方法では、伸長反応の際のプローブの分解または消化を伴う。これらの方法は、いくつかの核酸ポリメラーゼに付随する5'-3' ヌクレアーゼ活性の結果である。この活性を有するポリメラーゼは、座位に位置する相補的配列にアニーリングしたオリゴヌクレオチドプローブからモノヌクレオチドまたは小オリゴヌクレオチドを切り出す。
【００５７】
上流プライマーの3'末端は、核酸ポリメラーゼに対する最初の結合部位を提供する。ポリメラーゼが上流プライマーの伸長を触媒し、結合しているプローブに遭遇すると、核酸ポリメラーゼはプローブの5'末端の一部を置換し、そのヌクレアーゼ活性によりプローブからモノヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを切断する。
【００５８】
上流プライマーおよびプローブは互いに近接する相補鎖にアニーリングするように設計するとよい。実際、上流プライマーの3'末端とプローブの5'末端は互いに隣接しうる。かかる状況において、上流プライマーの伸長は、核酸ポリメラーゼがプローブの切断を開始するために必要ではない。介在するヌクレオチドが上流プライマーとプローブとを分離する場合、プライマーの伸長はプローブの5'末端に核酸ポリメラーゼが遭遇する前に必要である。いったん接触が起こり、重合が続くと、核酸ポリメラーゼの5'-3' エキソヌクレアーゼ活性がプローブの5'末端からモノヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを切断し始める。プローブの消化はプローブの残りの部分が相補鎖から解離するまで継続する。
【００５９】
溶液中では、２つの末端部分が互いにハイブリダイズして、ヘアピンループを形成することが出来る。この立体配座において、レポーターおよびクエンチャー色素は、レポーター色素からの蛍光が効率的にクエンチャー色素によってクエンチされるよう十分に近接する。一方、ハイブリダイズしたプローブは、直鎖状立体配座となり、クエンチングの程度が低下する。したがって、２つの色素についての発光変化をモニターすることにより、増幅産物の形成を間接的にモニターすることが可能である。
【００６０】
プローブ
標識されたプローブは、その配列が試験座位または参照座位のセグメントに実質的に相補的になるように選択される。上記のように、プローブが結合する核酸部位は上流および下流増幅プライマーに対するプライマー結合部位の間に配置させるべきである。
【００６１】
プライマー
増幅に用いるプライマーは増幅すべき座位の隣接領域における配列にハイブリダイズすることができるように選択する。プライマーは増幅すべき核酸の別の鎖と少なくとも実質的相補性を有するように選択する。プローブを増幅産物の形成の検出に用いる場合は、プライマーはプローブの両側に隣接するように、即ちプローブの上流および下流に位置するように選択する。
【００６２】
プライマーは重合剤の存在下で伸長産物の合成を開始させることができるように十分な長さを有する必要がある。プライマーの長さと組成は以下のような多くのパラメーターに依存する。例えば、アニーリング反応が行われる温度、プローブ結合部位とプライマー結合部位の距離、プライマーおよびプローブの相対濃度およびプローブの特定の核酸組成。典型的にはプライマーは15-30のヌクレオチドを含む。しかし、プライマーの長さはプライマー結合部位の複雑性や上記の因子に有る程度依存しうる。
【００６３】
プローブおよびプライマーのための標識
本発明のプローブまたはプライマーの標識に用いられ、増幅産物の量に対応するシグナルを提供しうる標識は様々な形態であり得る。5' 蛍光性ヌクレアーゼ方法に関して上記したように、蛍光シグナルは１つの測定可能なシグナルである。しかし、例えば、放射能、比色、吸収、磁気パラメーターまたは酵素活性をモニターすることによっても測定は可能である。したがって、利用可能な標識としてはこれらに限定されないが、フルオロフォア、発色団、放射性同位体、電子密度試薬、酵素、および特異的結合パートナーを有するリガンド(例えば、ビオチン-アビジン)が挙げられる。
【００６４】
蛍光の変化のモニタリングは増幅産物の蓄積をモニターするのに特に有用な方法である。プローブまたはプライマーに結合するのに有用な多数の標識が市販されており、例えば、フルオレセインおよび様々なフルオレセイン誘導体、例えば、FAM、HEX、TETおよびJOE (すべてApplied Biosystems、Foster City、Calif.から市販); ルシファーイエロー、およびクマリン誘導体が挙げられる。
【００６５】
標識は、様々な技術を用いてプローブまたはプライマーに結合させることが出来、5'末端および/または3'末端および/または内部ヌクレオチドに結合させることが出来る。標識は、プローブまたはプライマーに結合される様々なサイズのスペーサーアームに結合させることも出来る。これらスペーサーアームは、プローブまたはプライマーに結合した複数の標識の間を所望の距離にするために有用である。
【００６６】
ある場合においては一重標識を用いればよい; 一方、別の場合、例えば、5' 蛍光発生ヌクレアーゼアッセイの場合、２以上の標識がプローブに結合される。プローブが複数の標識を含む場合、核酸ポリメラーゼの5'-3' ヌクレアーゼ活性によるプローブの消化の際に標識の分離を可能にするのに十分な標識間の距離を維持することが一般に推奨される。
【００６７】
疾患症状を示す患者 
多数の疾患が、特定の遺伝子のコピー数の変化との間に関係を有する。疾患症状を有する患者のために、リアルタイム PCR法を用いて、患者が患う症状と関係がある疾患と連関することが知られているコピー数変化を患者が有するかどうかを判定することが出来る。
【００６８】
AdipoR1 発現
AdipoR1 融合タンパク質
融合タンパク質は、AdipoR1 ポリペプチドに対する抗体の作成および様々なアッセイシステムにおける使用に有用である。例えば、融合タンパク質を用いて、AdipoR1 ポリペプチドの部分と相互作用するタンパク質を同定することが出来る。タンパク質-タンパク質 相互作用のためのタンパク質アフィニティークロマトグラフィーまたはライブラリーに基づくアッセイ、例えば、酵母ツーハイブリッドまたはファージディスプレーシステムをこの目的に利用することが出来る。かかる方法は当該技術分野で周知であり、薬剤スクリーニングに用いることも出来る。
【００６９】
AdipoR1 融合タンパク質は、ペプチド結合により互いに融合した２つのポリペプチドセグメントを含む。第一のポリペプチドセグメントは、配列番号2または上記のような生物学的に活性の変異体の少なくとも 54、75、100、125、139、150、175、200、225、250、または275 連続アミノ酸を含みうる。第一のポリペプチドセグメントは全長 AdipoR1を含むものであってもよい。
【００７０】
第二のポリペプチドセグメントは全長タンパク質であってもタンパク質断片であってもよい。融合タンパク質構築に通常用いられるタンパク質はこれらに限定されないが、以下を含む：βガラクトシダーゼ、β-グルコロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質 (GFP)、自己蛍光タンパク質、例えば、青色蛍光タンパク質 (BFP)、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ (GST)、ルシフェラーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ (HRP)、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ (CAT)。さらに、エピトープタグが融合タンパク質構築に用いられ、例えば、ヒスチジン (His) タグ、FLAG タグ、インフルエンザヘマグルチニン (HA) タグ、Myc タグ、VSV-G タグ、およびチオレドキシン (Trx) タグが挙げられる。その他の融合構築には、マルトース結合性タンパク質 (MBP)、S-タグ、Lex A DNA 結合ドメイン (DBD) 融合、GAL4 DNA 結合ドメイン融合、単純ヘルペスウイルス (HSV) BP16 タンパク質融合およびGタンパク質融合(例えば G(アルファ)16、Gs、Gi)が挙げられる。融合タンパク質はまた、AdipoR1に近接した位置に切断部位を含めるよう操作してもよい。
【００７１】
ポリヌクレオチドの調製
天然 AdipoR1 ポリヌクレオチドは、その他の細胞成分、例えば、膜成分、タンパク質および脂質を含まないよう単離することが出来る。ポリヌクレオチドは細胞によって作り、標準的核酸精製技術を用いて単離することが出来、あるいは増幅技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)を用いて、または自動合成機を用いて合成することも出来る。ポリヌクレオチドの単離方法はルーチン的であり、当該技術分野で公知である。そのようなポリヌクレオチドを得るためのいずれの技術を用いて単離AdipoR1 ポリヌクレオチドを得てもよい。例えば、制限酵素およびプローブを用いてAdipoR1 ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド断片を単離することができる。単離ポリヌクレオチドはその他の分子を完全に無含有であるか、少なくとも 70、80、または90%無含有の調製物中にある。
【００７２】
AdipoR1 cDNA 分子はAdipoR1 mRNA をテンプレートとして用いて標準的分子生物学技術により作ることが出来る。 AdipoR1 cDNA 分子はその後、当該技術分野で公知の分子生物学技術を用いて複製される。増幅技術、例えば、PCRにより、ヒトゲノム DNA またはcDNAをテンプレートとして用いて、さらなる本発明のポリヌクレオチドのコピーを得ることが出来る。
【００７３】
あるいは、化学合成技術を用いてAdipoR1 ポリヌクレオチドを合成することが出来る。遺伝暗号の縮重により、例えば、配列番号2示すアミノ酸配列を有するAdipoR1またはその生物学的に活性の変異体をコードする互換性のあるヌクレオチド配列を合成することが可能である。
【００７４】
ポリヌクレオチドの伸長
様々なPCRに基づく方法を用いて、ヒトAdipoR1をコードする核酸配列を伸長させ、例えば、AdipoR1遺伝子の上流配列、例えば、プロモーターおよび調節要素を検出することができる。例えば、制限部位 PCRは既知の座位に隣接する未知の配列を回収するためにユニバーサルプライマーを用いる。ゲノムDNAは、リンカー配列に対するプライマーおよび既知の領域に特異的なプライマーが存在して初めて増幅される。増幅した配列は、同じリンカープライマーおよび最初のプライマーの内側の別の特異的プライマーによる第二ラウンドの PCRに供される。各ラウンドのPCR産物は、適当な RNA ポリメラーゼにより転写され逆転写酵素を用いて配列決定される。
【００７５】
逆PCR法も、既知の領域に基づく相異なるプライマーを用いた配列の増幅または伸長に用いることが出来る。プライマーは市販のソフトウエア、例えば、OLIGO 4.06 プライマー分析ソフトウエア (National Biosciences Inc.、Plymouth、Minn.)を用いて、22-30 ヌクレオチドの長さ、GC含量50%以上および温度約 68-72℃で標的配列にアニーリングするように設計できる。この方法は、遺伝子の既知の領域において好適な断片を作るよう数種の制限酵素を用いる。断片は分子内ライゲーションにより環状にされ、PCR テンプレートとして使用される。
【００７６】
利用可能なもう一つの方法は捕捉PCRであり、ヒトおよび酵母人工染色体 DNAにおける既知の配列に近接するDNA 断片のPCR 増幅を伴う。この方法において、複数の制限酵素消化およびライゲーションを用いてPCRを行う前にDNA 分子の未知の断片内に操作された二本鎖配列が配置されうる。
【００７７】
全長 cDNAをスクリーニングする場合、より大きなcDNAを含むようサイズ選択されたライブラリーを使用するのが好ましい。ランダムプライムされたライブラリーは、遺伝子の5' 領域を含むより多くの配列を含むという点で好ましい。ランダムプライムされたライブラリーの使用は、オリゴ d(T) ライブラリーによって全長 cDNAが得られない状況で特に好ましいであろう。ゲノムライブラリーは5' 非翻訳調節領域への配列の伸長に有用であり得る。
【００７８】
市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、PCR 産物またはシークエンシング産物のヌクレオチド配列のサイズの分析または確認を行うことが出来る。例えば、キャピラリーシークエンシングは電気泳動分離のための流動性を有するポリマー、レーザーで活性化される４種類の蛍光色素 (１つが各ヌクレオチドに対応)および電荷結合素子カメラによる放射波長の検出を用いることが出来る。適当な装置およびソフトウエア (例えば、GENOTYPERおよびSequence NAVIGATOR、Perkin Elmer)を用いて出力/光度を電気シグナルに変換でき、サンプルのローディングからコンピュータ分析および電子データ表示までの全工程をコンピュータで制御できる。キャピラリー電気泳動は、特定のサンプル中に制限された量しか存在しないDNAの小片のシークエンシングに特に好ましい。
【００７９】
ポリペプチドの取得
AdipoR1は、例えば、ヒト細胞からの精製により、AdipoR1 ポリヌクレオチドの発現により、または直接の化学合成により得ることが出来る。
【００８０】
タンパク質精製
AdipoR1は該受容体を発現するいずれのヒト細胞からも精製でき、例えば、AdipoR1を発現する発現コンストラクトでトランスフェクトされたものからでも精製できる。精製AdipoR1は細胞において通常AdipoR1と関連しているその他の化合物、例えば、特定のタンパク質、炭水化物または脂質から当該技術分野で周知の方法を用いて分離される。かかる方法はこれらに限定されないが、サイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム分画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および分取ゲル電気泳動を含む。
【００８１】
AdipoR1 ポリヌクレオチドの発現
AdipoR1を発現させるためには、AdipoR1 ポリヌクレオチドを挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要な要素を含む発現ベクターに挿入すればよい。当業者に周知の方法を用いて、AdipoR1をコードする配列および適当な転写および翻訳制御要素を含む発現ベクターを構築することが出来る。かかる方法には、インビトロ組換えDNA技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組み換えが含まれる。
【００８２】
AdipoR1をコードする配列を含み、それを発現させるのに様々な発現ベクター/宿主システムを利用することが出来る。それらにはこれらに限定されないが、以下が含まれる：微生物、例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミド DNA 発現ベクターにより形質転換された細菌;酵母発現ベクターにより形質転換された酵母、ウイルス発現ベクター (例えば、バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞システム、ウイルス発現ベクター (例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV; タバコモザイクウイルス、TMV)または細菌発現ベクター (例えば、TiまたはpBR322 プラスミド)で形質転換された植物細胞システム、または動物細胞システム。
【００８３】
制御要素または制御因子の配列（エンハンサー、プロモーター、5'および3'非翻訳領域）はベクターの非翻訳領域にあり、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を行うものである。かかる要素は強度と特異性において変動しうる。用いるベクターシステムと宿主に応じて多数の好適な転写および翻訳要素、例えば、構成的および誘導可能プロモーター、を利用することが出来る。例えば、細菌システムにおけるクローニングの場合、誘導可能プロモーター、例えば、BLUESCRIPT ファージミド (Stratgene、LaJolla、Calif.)のハイブリッドlacZ プロモーターまたはpSPORT1 プラスミド (Life Technologies) などを用いればよい。バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターは昆虫細胞において利用できる。植物細胞のゲノム(例えば、熱ショック、RUBISCO、および貯蔵タンパク質遺伝子)または植物ウイルス(例えば、ウイルスプロモーターまたはリーダー配列)由来のプロモーターまたはエンハンサーをベクターにクローニングしてもよい。哺乳類細胞システムにおいては哺乳類遺伝子または哺乳類ウイルスからのプロモーターが好ましい。AdipoR1をコードするヌクレオチド配列を複数コピー含む細胞株の作成が必要な場合、SV40またはEBVに基づくベクターを適当な選択可能マーカーとともに用いればよい。
【００８４】
細菌および酵母発現システム
細菌システムにおいては、多数の発現ベクターを選択することが出来る。例えば、大量のAdipoR1が抗体の誘導のために必要な場合、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を導くベクターを利用すればよい。かかるベクターにはこれらに限定されないが、以下が含まれる：多機能性大腸菌クローニングベクターおよび発現ベクター、例えば、 BLUESCRIPT (Stratgene)。BLUESCRIPT ベクターでは、AdipoR1をコードする配列を、ハイブリッドタンパク質が産生されるようにアミノ末端 Metおよび続くβ-ガラクトシダーゼの7 残基の配列とインフレームとなるようにベクターにライゲーションすればよい。pIN ベクターまたはpGEX ベクター (Promega、Madison、Wis.)もグルタチオン S-トランスフェラーゼ (GST)との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるのに利用できる。一般に、かかる融合タンパク質は可溶性であり、溶解された細胞から、グルタチオン-アガロースビーズへの吸着、次いで、遊離のグルタチオンの存在下での溶出によって容易に精製することが出来る。かかるシステムで作られるタンパク質は、クローニングされた目的のポリペプチドが思い通りにGST部分から放出できるようにヘパリン、トロンビン、または活性化第X因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【００８５】
植物および昆虫発現システム
植物発現ベクターを用いる場合、AdipoR1をコードする配列の発現は、多数のプロモーターのいずれによって駆動してもよい。例えば、ウイルスプロモーター、例えば、CaMV の35Sおよび19S プロモーターを単独でまたはTMVからのオメガリーダー配列と組み合わせて用いればよい。あるいは、植物プロモーター、例えば、RUBISCOの小サブユニットまたは熱ショックプロモーターを用いてもよい。これらのコンストラクトは、直接DNA形質転換または病原媒介トランスフェクションによって植物細胞に導入することが出来る。
【００８６】
昆虫システムもAdipoR1の発現に用いることが出来る。例えば、かかるシステムの１つでは、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス (AcNPV)が、ヨウトガ（Spodoptera frugiperda）細胞またはトリコプルシア（Trichoplusia）幼虫において外来遺伝子を発現するのにベクターとして用いられる。AdipoR1をコードする配列を、ウイルスの非必須領域、例えば、ポリヘドリン遺伝子にクローニングし、、ポリヘドリンプロモーターの制御下においてもよい。AdipoR1の挿入に成功すると、ポリヘドリン遺伝子は不活性となり、コートタンパク質を欠く組換えウイルスが生じる。該組換えウイルスをヨウトガ（S.frugiperda）細胞またはトリコプルシア（Trichoplusia）幼虫の感染に用いてそこでAdipoR1を発現させてもよい。
【００８７】
哺乳類発現システム
多数のウイルスに基づく発現システムを哺乳類宿主細胞におけるAdipoR1の発現に利用することが出来る。例えば、アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、AdipoR1をコードする配列を後期プロモーターおよび三成分（tripartite）リーダー配列を含むアデノウイルス転写/翻訳複合体にライゲーションすればよい。ウイルスゲノムの非必須 E1またはE3 領域における挿入を用いて感染した宿主細胞においてAdipoR1を発現することが出来る生ウイルスを得ることが出来る [Engelhard、1994)]。所望の場合は、転写エンハンサー、例えば、ラウス肉腫ウイルス (RSV) エンハンサーを用いて、哺乳類宿主細胞における発現を向上させてもよい。
【００８８】
ヒト人工染色体(HAC)もまた、プラスミドに含まれ、発現されうるものより長いDNA断片を送達するのに用いることが出来る。6M〜10MのHACが構築されて常套の送達方法(例えば、リポソーム、ポリカチオン性アミノポリマーまたは媒体)により細胞に送達される。特定の開始シグナルもまた、AdipoR1をコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために用いることが出来る。かかるシグナルにはATG 開始コドンおよび隣接配列が含まれる。AdipoR1をコードする配列、その開始コドン、および上流配列を適当な発現ベクターに挿入する場合、さらなる転写または翻訳制御シグナルは必要ではない。しかし、コード配列のみ、またはその断片のみが挿入される場合、外来翻訳制御シグナル(ATG 開始コドンを含む)を提供しなくてはならない。開始コドンは、完全なインサートの翻訳を確証するためには正しいリーディングフレームにある必要がある。外来翻訳要素および開始コドンは様々な起源のものであってよく、天然でも合成のものでもよい。
【００８９】
宿主細胞
宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節する、または、発現したAdipoR1を所望の様式でプロセシングする能力について選択すればよい。かかるポリペプチドの修飾にはこれらに限定されないが以下が含まれる：アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化。ポリペプチドの「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングもまた、正しい挿入、フォールディングおよび/または機能を促進するのに用いることが出来る。翻訳後活性についての特定の細胞機構および特徴的機構を有する種々の宿主細胞 (例えば、CHO、HeLa、MDCK、HEK293、およびWI38)が、American Type Culture Collection (ATCC; 10801 University Boulevard、Manassas、VA 20110-2209)から入手でき、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確保するために選択することが出来る。
【００９０】
組換えタンパク質の長期にわたる高収率産生のためには、安定な発現が好ましい。例えば、AdipoR1を安定に発現する細胞株は、ウイルス複製起点および/または内在発現要素および選択可能マーカー遺伝子を同一または別々のベクターに含んでいてもよい発現ベクターを用いて形質転換できる。ベクターの導入の後、細胞を1-2 日間強化培地にて培養し、その後、選択培地と交換すればよい。選択可能マーカーの目的は選択に対する耐性を付与することであり、その存在により、導入されたAdipoR1配列を良好に発現する細胞の培養と回収が可能となる。安定に形質転換された細胞の耐性クローンを、細胞タイプに適当な組織培養技術を用いて増殖させればよい。多数の選択システムのいずれを用いて形質転換細胞株を回収してもよい。選択システムにはこれらに限定されないが以下が含まれる：それぞれtk- またはaprt- 細胞において用いることが出来る単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ [Logan、(1984)]およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ [Wigler、(1977)]遺伝子。また、代謝拮抗剤、抗生物質または除草剤耐性を選択の基礎として用いることが出来る。例えば、dhfrはメトトレキセート耐性を付与し[Lowy、(1980)]、nptはアミノグリコシド、ネオマイシンおよびG-418への耐性を付与し[Wigler、(1980)]、alsおよびpatはそれぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼへの耐性を付与する[Colbere-Garapin、1981]。さらなる選択可能遺伝子が既に記載されている。例えば、trpBは細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にし、またはhisDは細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（histinol）を利用することを可能にする。可視マーカー、例えば、アントシアニン、β-グルコロニダーゼおよびその基質GUS、およびルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンは、形質転換体の同定および特定のベクターシステムに起因する一過性または安定なタンパク質発現の定量のために利用できる。
【００９１】
ポリペプチド発現の検出
マーカー遺伝子発現の存在は、AdipoR1 ポリヌクレオチドも存在することを示唆するが、その存在および発現は確認する方がよい。例えば、AdipoR1をコードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入されていると、AdipoR1をコードする配列を含む形質転換細胞はマーカー遺伝子機能の非存在により同定されうる。あるいは、マーカー遺伝子は一つのプロモーターの制御下でAdipoR1をコードする配列とタンデムに配置され得る。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は、通常はAdipoR1 ポリヌクレオチドの発現を示す。
【００９２】
あるいは、AdipoR1 ポリヌクレオチドを含みAdipoR1を発現する宿主細胞は、当業者に知られた様々な手法で同定することが出来る。かかる手法にはこれらに限定されないがDNA-DNAまたはDNA-RNA ハイブリダイゼーションおよびタンパク質バイオアッセイまたはイムノアッセイ技術が含まれ、これらには核酸またはタンパク質の検出および/または定量のための膜、溶液、またはチップに基づく技術が含まれる。例えば、AdipoR1をコードするポリヌクレオチド配列の存在は、プローブまたは断片またはAdipoR1をコードするポリヌクレオチドの断片を用いたDNA-DNAまたはDNA-RNA ハイブリダイゼーションまたは増幅によって検出することが出来る。核酸増幅に基づくアッセイは、AdipoR1 ポリヌクレオチドを含む形質転換体の検出のためにAdipoR1をコードする配列から選択されるオリゴヌクレオチドの使用を伴う。
【００９３】
AdipoR1の発現の検出および測定のための、ポリペプチドの特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかを用いる様々なプロトコールは当該技術分野で知られている。例としては、酵素結合免疫測定法 (ELISA)、ラジオイムノアッセイ (RIA)、および蛍光活性化細胞ソーティング (FACS)が挙げられる。AdipoR1上の２つの非干渉エピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いるツー・サイト（two-site）モノクローナル・ベース・イムノアッセイを用いてもよいし、競合結合アッセイを用いてもよい。
【００９４】
多様な標識および結合技術が当業者に知られており、様々な核酸およびアミノ酸アッセイに用いることが出来る。AdipoR1をコードするポリヌクレオチドに関連する配列の検出のための標識化ハイブリダイゼーションまたはPCR プローブを作る手段には、オリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識、または標識化ヌクレオチドを用いるPCR 増幅が挙げられる。あるいは、AdipoR1をコードする配列をmRNA プローブの産生のためにベクターにクローニングしてもよい。かかるベクターは当該技術分野で知られており、市販されており、RNA プローブをインビトロで標識化 ヌクレオチドおよび適当なRNA ポリメラーゼ、例えば、 T7、T3、またはSP6、の添加により合成するのに用いることが出来る。これらの手法は様々な市販のキットを用いて行えばよい(Amersham Pharmacia Biotech、Promega、およびUS Biochemical)。検出に用いることが出来る好適なレポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、および蛍光、化学発光、または発色性の物質ならびに基質、補因子、阻害剤、磁性粒子などが含まれる。
【００９５】
ポリペプチドの発現および精製
AdipoR1 ポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞は、細胞培養からのタンパク質の発現および回収に好適な条件下で培養すればよい。形質転換細胞により産生されたポリペプチドは用いた配列および/またはベクターに応じて分泌されるか、または、細胞内に含有される。当業者であれば理解するように、AdipoR1 ポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核または真核細胞膜を介して可溶性AdipoR1の分泌を導くか、または、膜結合型 AdipoR1の膜への挿入を導くための、シグナル配列を含むよう設計することが出来る。
【００９６】
上記のように、その他のコンストラクトを用いてAdipoR1をコードする配列を可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に連結させてもよい。かかる精製を促進するドメインとしてはこれらに限定されないが以下が含まれる：金属キレート化ペプチド、例えば、固定化した金属上での精製を可能とするヒスチジン-トリプトファンモジュール、固定化した免疫グロブリン上の精製を可能とするタンパク質 A ドメイン、および、FLAGS 伸長/アフィニティー精製システムに用いられるドメイン(Immunex Corp.、Seattle、Wash.)。切断可能リンカー配列、例えば、活性化第X因子またはエンテロキナーゼに特異的な切断可能リンカー配列(Invitrogen、San Diego、CA)を、精製ドメインとAdipoR1との間に含めることも精製の促進に有用である。かかる発現ベクターの１つは、AdipoR1およびチオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位に先行する6つのヒスチジン残基を含む融合タンパク質の発現を提供する。ヒスチジン残基はIMAC (固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー) Maddox、(1983)]により精製を促進し、エンテロキナーゼ切断部位は融合タンパク質からのAdipoR1の精製手段を提供する [Porath、(1992)]。
【００９７】
化学合成
AdipoR1をコードする配列は、当該技術分野で周知の化学的方法を用いて、全体または一部を合成することができる。あるいは、AdipoR1自体をアミノ酸配列を合成する化学的方法、例えば、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって産生することもできる。タンパク質合成は、手作業の技術を用いて行ってもよいし、自動化しておこなってもよい。自動化合成は、例えば、Applied Biosystems 431A ペプチド 合成機(Perkin Elmer)を用いて達成することが出来る。所望により、AdipoR1の断片を別々に合成し、そして断片を化学的方法を用いて連結して全長分子を作ることも出来る。
【００９８】
新規に合成されたペプチドは、分取高速液体クロマトグラフィーによって実質的に精製すればよい。合成 AdipoR1の組成は、アミノ酸分析または配列決定によって確認することが出来る。さらに、AdipoR1のアミノ酸配列のいずれの部分も直接合成によって変化させる、および/または化学的方法を用いて別のタンパク質からの配列と組みあわせることができ、変異体ポリペプチドまたは融合タンパク質を得ることが出来る。
【００９９】
改変ポリペプチドの産生
当業者に理解されるように、非天然コドンを有するAdipoR1 ポリヌクレオチドを産生するのが有益であり得る。例えば、特定の原核または真核宿主に好まれるコドンを選択して、タンパク質発現速度を上昇させ、または、所望の性質を有するRNA 転写産物を産生することができる。所望の性質には、例えば、天然配列から生じる転写産物の半減期よりも長い半減期が挙げられる。
【０１００】
本明細書において言及されるヌクレオチド配列は当該技術分野で一般に知られている方法を用いて操作して、ポリペプチドまたはmRNA産物のクローニング、プロセシング、および/または発現を修飾する改変を含むがそれらに限定されない様々な理由のためにAdipoR1 ポリヌクレオチドを変化させることが出来る。無作為断片化によるDNA シャッフリングおよび遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのPCR再編成を用いてヌクレオチド配列を操作することが出来る。例えば、部位特異的突然変異誘発を用いて、新規な制限部位の挿入、グリコシル化パターンの改変、コドン優先度の改変、スプライスバリアントの産生、突然変異の導入などを行うことが出来る。 
【０１０１】
抗体
当該技術分野で知られているAdipoR1のエピトープに特異的に結合するあらゆるタイプの抗体を作ることが出来る。
【０１０２】
本明細書において用いる「抗体」には、インタクトな免疫グロブリン分子および、AdipoR1のエピトープに結合することが出来るその断片、例えば、 Fab、F(ab')2、およびFv断片が含まれる。典型的には、少なくとも 6、8、10、または12の連続アミノ酸がエピトープの形成に要求される。しかし、非連続アミノ酸を含むエピトープはより多くの、例えば、少なくとも 15、25、または50アミノ酸を要求しうる。AdipoR1のエピトープに特異的に結合する抗体は、治療的に用いることが出来るし、免疫化学的アッセイ、例えば、ウェスタンブロット、ELISA、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学的アッセイ、免疫沈降またはその他の当該技術分野で知られている免疫化学的アッセイにおいて用いることが出来る。様々なイムノアッセイを用いて、所望の特異性を有する抗体を同定することが出来る。競合結合または免疫照射測定法のための多数のプロトコールは当該技術分野で周知である。かかるイムノアッセイは典型的には、免疫原とAdipoR1 免疫原に特異的に結合する抗体との複合体形成の測定を伴う。
【０１０３】
典型的には、AdipoR1に特異的に結合する抗体は、免疫化学的アッセイに用いた場合その他のタンパク質により提供される検出シグナルよりも少なくとも 5-、10-、または20-倍高い検出シグナルを提供する。好ましくは、AdipoR1に特異的に結合する抗体は免疫化学的アッセイにおいてその他のタンパク質を検出せず、溶液からAdipoR1を免疫沈降させることができるものである。
【０１０４】
AdipoR1は、哺乳類、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サルまたはヒトを免疫して、ポリクローナル抗体を産生するのに利用できる。所望の場合は、AdipoR1 は、キャリアタンパク質、例えば、ウシ血清アルブミン、チログロブリン、およびキーホールリンペットヘモシアニンに結合させてもよい。宿主の種に応じて、様々なアジュバントを用いて免疫応答を上昇させることが出来る。かかるアジュバントにはこれらに限定されないが以下が含まれる：フロイントアジュバント、ミネラルジェル(例えば、水酸化アルミニウム)、および界面活性剤(例えば、リゾレシチン、プルロニック・ポリオール（pluronic polyols）、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノール)。ヒトに用いられるアジュバントのなかでは、BCG (bacilli Calmette-Guerin)およびコリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）が特に有用である。
【０１０５】
AdipoR1に特異的に結合するモノクローナル抗体は培養中の連続継代細胞系による抗体分子の産生を提供するいずれの技術を用いて調製してもよい。これらの技術にはこれらに限定されないが以下が含まれる：ハイブリドーマ技術、ヒト B-細胞ハイブリドーマ技術、およびEBV-ハイブリドーマ技術 [Roberge、(1995)]。
【０１０６】
さらに、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術である、マウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのスプライシングにより適当な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得る技術を利用することが出来る。モノクローナルおよびその他の抗体はまた、治療的に用いた場合に抗体に対する免疫応答を増大させないように患者を予防するために「ヒト化」することもできる。かかる抗体は配列においてヒト抗体に十分に類似しているため治療に直接用いることも出来るが、いくつかの鍵となる残基の改変を要求することもある。げっ歯類抗体とヒト配列との配列の差異は、個々の残基の部位特異的突然変異誘発によって、または、完全な相補性決定領域をばらばらにする（grating）ことによって、ヒト配列における残基と異なる残基を置換することにより最小化することが出来る。AdipoR1に特異的に結合する抗体は、米国特許第5565332号に開示のように部分的または完全にヒト化された抗原結合部位を含みうる。
【０１０７】
あるいは、一本鎖抗体の産生について記載されている技術を当該技術分野で知られている方法の使用に適用して、AdipoR1に特異的に結合する一本鎖抗体を産生することができる。関連する特異性を有するが、異なるイディオタイプ組成である抗体は、ランダムコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーからの鎖シャッフリングにより作ることができる。一本鎖抗体はまた、DNA 増幅方法、例えば、ハイブリドーマ cDNAをテンプレートとして用いるPCRを用いて構築してもよい。一本鎖抗体は一重または二重特異的であってよく、二価でも四価でもよい。四価の二重特異的一本鎖抗体の構築は教示されている。一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列は、手作業または自動化されたヌクレオチド合成を用いて構築することが出来、それを標準的組換え DNA 方法によって発現コンストラクトにクローニングし、コード配列を発現する細胞に以下のようにして導入する。あるいは、一本鎖抗体は、例えば、線状ファージ技術を用いて直接産生することもできる。
【０１０８】
AdipoR1に特異的に結合する抗体はまた、リンパ球集団におけるインビボ産生の誘導または免疫グロブリンライブラリーまたは高度に特異的な結合試薬のパネルのスクリーニングにより産生されうる。その他のタイプの抗体は本発明の方法において治療的に構築および使用することができる。例えば、キメラ抗体はWO 93/03151に開示のようにして構築することが出来る。免疫グロブリン由来であって多価および多重特異的である結合性タンパク質、例えば、WO 94/13804に開示の「二重特異性抗体(diabodies)」を調製することも出来る。
【０１０９】
本発明による抗体は当該技術分野で周知の方法で精製することが出来る。例えば、抗体はAdipoR1が結合しているカラムを通すことによりアフィニティー精製することが出来る。結合した抗体は次いで、高塩濃度のバッファーを用いてカラムから溶出すればよい。
【０１１０】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
アンチセンスオリゴヌクレオチドは特定のDNAまたはRNA 配列に相補的なヌクレオチド配列である。細胞に導入されると、該相補的ヌクレオチドは細胞により産生された天然の配列と結合して複合体を形成し、転写または翻訳を阻害する。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも 11 ヌクレオチド長であるが、少なくとも 12、15、20、25、30、35、40、45、または50、それ以上ヌクレオチドの長さであってもよい。より長い配列を用いることも出来る。アンチセンスオリゴヌクレオチド分子はDNAコンストラクト中に提供され、上記のように細胞に導入されて細胞におけるAdipoR1遺伝子産物のレベルを低下させる。
【０１１１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはそれら両方の組み合わせであってもよい。オリゴヌクレオチドは手作業で合成してもよいし、自動的に合成機で合成してもよく、これは、１つのヌクレオチドの5'末端を別のヌクレオチドの3'末端と以下のような非ホスホジエステルヌクレオチド間結合によって共有結合させて行うことが出来る：例えば、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、アルキルホスホネート、ホスホラミダート、ホスフェートエステル、カーバメート、アセトアミダイト、カルボキシメチルエステル、カーボネートおよびホスフェートトリエステル。
【０１１２】
AdipoR1 遺伝子発現の修飾は、AdipoR1遺伝子の制御、5'、または調節領域と二本鎖を形成するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することによって達成できる。転写開始部位、例えば、開始部位の位置-10から+10由来のオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、阻害は「三重らせん」塩基対方法を用いて達成することも出来る。三重らせん対合はそれが、ポリメラーゼ、転写因子、またはシャペロンの結合に十分に二重らせんが開く能力の阻害をもたらすために有用である。三本鎖 DNAを用いる治療的利点は、文献 [Nicholls、(1993)]に記載されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、リボゾームへの転写産物の結合を妨げることによりmRNAの翻訳をブロックするように設計できる。
【０１１３】
正確な相補性はアンチセンスオリゴヌクレオチドとAdipoR1 ポリヌクレオチドの相補的配列との良好な複合体形成には要求されない。AdipoR1 ポリヌクレオチドに正確に相補的な、例えば、2、3、4、または5以上のストレッチの連続ヌクレオチドを含み、隣接するAdipoR1 ヌクレオチドに相補的でない連続するヌクレオチドのストレッチによってそれぞれが隔てられているアンチセンスオリゴヌクレオチドが、AdipoR1 mRNA に対する十分な標的化特異性を提供しうる。好ましくは、各ストレッチの相補的連続 ヌクレオチドは少なくとも 4、5、6、7、または8またはそれ以上のヌクレオチド長である。非相補的介在配列は好ましくは 1、2、3、または4 ヌクレオチド長である。当業者であれば容易に、アンチセンス-センス対の計算融点を用いて特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドと特定のAdipoR1 ポリヌクレオチド配列との間に許容されるミスマッチの程度を決定することが出来よう。アンチセンスオリゴヌクレオチドはAdipoR1 ポリヌクレオチドにハイブリダイズするその能力に影響を与えることなく修飾することが出来る。かかる修飾はアンチセンス分子の内部であってもよいし、一方の端または両端であってもよい。例えば、ヌクレオシド間ホスフェート結合はアミノ基と末端リボースの間に種々の数の炭素残基を有するコレステリルまたはジアミン部分を添加することによって修飾することが出来る。修飾塩基および/または糖、例えば、リボースの代わりのアラビノース、または3' ヒドロキシル基または5' ホスフェート基が置換されている3'、5'-置換オリゴヌクレオチドも修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドに用いることが出来る。これらの修飾オリゴヌクレオチドは当該技術分野で周知の方法によって調製できる。
【０１１４】
リボザイム
リボザイムは触媒活性を有するRNA 分子である[Uhlmann、(1987)]。リボザイムは当該技術分野で知られているように、RNA 配列を切断することによって遺伝子機能を阻害するのに用いることが出来る。リボザイム作用機構には、リボザイム分子の相補的標的 RNAへの配列-特異的ハイブリダイゼーション、次いでヌクレオチド鎖切断が含まれる。例としては、特定のヌクレオチド配列のヌクレオチド鎖切断を特異的かつ効率的に触媒することが出来る人工ハンマーヘッドモチーフリボザイム分子が挙げられる。AdipoR1 ポリヌクレオチドのコード配列を用いて、AdipoR1 ポリヌクレオチドから転写されたmRNAに特異的に結合するリボザイムを作ることが出来る。別のRNA 分子をトランスに高度に配列特異的に切断することが出来るリボザイムの設計および構築方法が開発されており、当該技術分野で記載されている。例えば、リボザイムの切断活性は、リボザイム中に別個の「ハイブリダイゼーション」領域を導入することによって特定のRNAを標的とすることができる。ハイブリダイゼーション領域は、標的 RNAに相補的な配列を含み、したがって標的 RNAと特異的にハイブリダイズする。
【０１１５】
AdipoR1 RNA 標的内にある特定のリボザイム切断部位は、GUA、GUU、およびGUCの配列を含むリボザイム切断部位について標的分子をスキャンすることによって同定することが出来る。いったん同定した後、15〜20 リボヌクレオチドの短いRNA 配列であって切断部位を含む標的 RNAの領域に対応する配列を標的を動作不能（inoperable）にしうる二次構造的特徴について評価すればよい。候補 AdipoR1 RNA 標的の好適性は、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いる相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの起こりやすさ（accessibility）を試験することによって評価することが出来る。配列番号1に示すヌクレオチド配列およびその相補鎖は好適なハイブリダイゼーション領域配列のソースを提供する。より長い相補的配列を用いることによりハイブリダイゼーション配列の標的へのアフィニティーを上昇させることが出来る。リボザイムのハイブリダイズおよび切断領域は一体的に関連しており、相補性領域を介して標的 RNAにハイブリダイズすると、リボザイムの触媒領域が標的を切断することが出来る。
【０１１６】
リボザイムはDNAコンストラクトの一部として細胞に導入することが出来る。機械的方法、例えば、マイクロインジェクション、リポソーム-媒介トランスフェクション、エレクトロポーレーション、またはリン酸カルシウム沈降を用いて、リボザイムを含有するDNAコンストラクトをAdipoR1 発現の低下が望ましい細胞に導入することが出来る。あるいは、細胞がDNAコンストラクトを安定に担持することが望まれる場合、コンストラクトをプラスミド上に提供し、分離要素として維持するか、または当該技術分野で公知のように細胞のゲノムに組み込む。リボザイムをコードするDNAコンストラクトは転写調節要素、例えば、プロモーター要素、エンハンサーまたはUAS 要素、および転写ターミネーターシグナル、を細胞におけるリボザイムの転写制御のために含んでいてもよい(米国特許第5641673号)。リボザイムはまた、さらなるレベルの制御を提供するよう操作することが出来、それによってリボザイムと標的遺伝子との両方が細胞に含まれるときにのみmRNAの破壊が起こる。
【０１１７】
スクリーニング/スクリーニングアッセイ
制御因子
本明細書において用いる制御因子は、AdipoR1の活性にインビボおよび/またはインビボで影響する化合物をいう。制御因子はAdipoR1 ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストであり得、発現、翻訳後修飾またはその他の手段を介してAdipoR1 活性に影響を与える化合物であり得る。AdipoR1のアゴニストは、AdipoR1に結合すると、AdipoR1の活性を上昇または延長させる分子である。AdipoR1のアゴニストには、タンパク質、核酸、炭水化物、低分子またはその他のAdipoR1を活性化する分子が含まれる。AdipoR1のアンタゴニストは、 AdipoR1と結合した場合、AdipoR1活性の量または持続期間を低下させる分子である。アンタゴニストには、タンパク質、核酸、炭水化物、抗体、低分子、またはその他のAdipoR1の活性を低下させる分子が含まれる。
【０１１８】
用語「調節する」とは、本明細書で用いられる場合、 AdipoR1ポリペプチドの活性における変化をいう。例えば、調節はAdipoR1のタンパク質活性、結合特性、またはその他の生物学的、機能的、または免疫学的性質の上昇または低下を引き起こしうる。
【０１１９】
明細書において用いる、用語「特異的結合」または「特異的に結合する」とは、タンパク質またはペプチドと、アゴニスト、抗体、またはアンタゴニストとの間の相互作用をいう。相互作用は結合性分子 (即ち、抗原決定基またはエピトープ)に認識される特定の構造のタンパク質の存在に依存する。例えば、抗体がエピトープ「A」に特異的であるならば、遊離の標識化Aと抗体とを含む反応における、エピトープ Aを含むポリペプチドの存在、または遊離の非標識 Aの存在が抗体に結合する標識化 Aの量を低下させる。 
【０１２０】
本発明は、心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患の治療に利用できる化合物の同定方法(本明細書において「スクリーニングアッセイ」とも言及される) を提供する。該方法は、AdipoR1に結合する、および/または、AdipoR1の生物学的活性またはその発現に刺激または阻害作用を有する候補または被験化合物または薬剤(例えば、ペプチド、ペプチド疑似体、低分子またはその他の分子)を同定すること、およびこれらの化合物のうちで心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患に関する症状または疾患に対する影響を有するものをインビボアッセイで判定することを含む。
【０１２１】
AdipoR1に結合する、および/または、AdipoR1の活性または発現に刺激または阻害効果を有する、候補または被験化合物または薬剤が、細胞表面にAdipoR1 を発現する細胞を用いるアッセイ(細胞に基づくアッセイ)または単離AdipoR1を用いるアッセイ(無細胞アッセイ)によって同定される。様々なアッセイはAdipoR1の様々な変異体を扱うことが出来る(例えば、全長 AdipoR1、AdipoR1の生物学的に活性の断片またはAdipoR1の全部または一部を含む融合タンパク質)。さらに、AdipoR1はいずれの好適な哺乳類種由来であってもよい(例えば、ヒトAdipoR1、ラットAdipoR1またはマウスAdipoR1)。アッセイは被験化合物または既知AdipoR1 リガンドのAdipoR1への結合の直接的または間接的測定を伴う結合アッセイであってもよい。該アッセイはAdipoR1の活性の直接的または間接的測定を伴う活性アッセイであってもよい。アッセイはまた、AdipoR1 mRNAまたはAdipoR1 タンパク質の発現の直接的または間接的測定を伴う発現アッセイであってもよい。様々なスクリーニングアッセイが、被験化合物の、循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患の症状に対する効果の測定を伴うインビボアッセイと組み合わされる。
【０１２２】
一つの態様において、本発明は、AdipoR1の膜結合型 (細胞表面発現)形態に結合するか、またはその活性を調節する候補または被験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。かかるアッセイは全長 AdipoR1、AdipoR1の生物学的に活性の断片、またはAdipoR1の全部または一部を含む融合タンパク質を用いて行われる。以下に詳細に説明するように、被験化合物はいずれの好適な手段によって得てもよく、例えば、常套の化合物ライブラリーから得てもよい。被験化合物が膜結合型形態のAdipoR1に結合する能力の測定は、例えば、被験化合物のAdipoR1を発現する細胞への結合を複合体における標識化合物の検出によって測定することが出来るように、被験化合物を放射性同位体または酵素標識と結合させることによって達成することが出来る。例えば、被験化合物は直接的または間接的に125I、35S、14C、または3Hで標識してもよいし、放射線が直接のカウントまたはシンチレーションカウンターによるカウントによって検出される放射性同位体によって標識してもよい。あるいは、被験化合物は、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼによって酵素標識してもよく、酵素標識は適当な基質の生成物への変換の測定により検出される。
【０１２３】
競合結合フォーマットにおいて、アッセイは、AdipoR1を発現する細胞とAdipoR1と結合することが知られている化合物とを接触させてアッセイ混合物を形成する工程、アッセイ混合物と被験化合物とを接触させる工程、および被験化合物とAdipoR1を発現する細胞との相互作用能力を判定する工程を含み、ここで被験化合物とAdipoR1を発現する細胞との相互作用能力を判定する工程は、被験化合物が既知の化合物と比較してAdipoR1を発現する細胞に優先的に結合する能力を判定することを含む。
【０１２４】
別の態様において、アッセイは細胞に基づくアッセイであり、細胞表面に発現した膜結合型形態のAdipoR1 (例えば、全長 AdipoR1、生物学的に活性のAdipoR1断片またはAdipoR1の全部または一部を含む融合タンパク質)を発現する細胞を被験化合物と接触させる工程、および、被験化合物が膜結合型形態のAdipoR1活性を調節する (例えば、刺激または阻害する) 能力を判定することを含む。被験化合物が膜結合型形態のAdipoR1活性を調節する能力の判定はAdipoR1の活性の測定に好適ないずれの方法で達成してもよく、例えば、Gタンパク質共役受容体またはその他の7回膜貫通型受容体の活性の測定に好適ないずれの方法でもよい(以下に詳細に説明する)。7回膜貫通型受容体の活性は多くの方法で測定することが出来るが、所与の受容体にとってすべてが好適であるわけではない。活性測定の中には以下が含まれる: 細胞内 Ca2+ 濃度の変化、ホスホリパーゼ Cの活性化、細胞内イノシトール三リン酸 (IP3) 濃度の変化、細胞内ジアシルグリセロール (DAG) 濃度の変化、細胞内環状アデノシン3',5'-一リン酸 (cAMP) 濃度の変化。
【０１２５】
AdipoR1の活性を調節する被験化合物の能力の測定は、例えば、AdipoR1が標的分子に結合するかそれと相互作用する能力の測定によって達成することが出来る。標的分子は天然にてAdipoR1が結合または相互作用する分子であればよく、例えば、AdipoR1を発現する細胞表面分子、第二の細胞の表面分子、細胞外環境にある分子、細胞膜内側表面に結合する分子または細胞質分子が挙げられる。標的分子は細胞外シグナル (例えば、AdipoR1 リガンドの結合により生じたシグナル）の細胞膜および細胞内への伝達を促進するシグナル伝達経路の成分であってよい。標的 AdipoR1 分子は、例えば、触媒活性を有する第二の細胞内タンパク質または下流のシグナル伝達分子とAdipoR1との結合を促進するタンパク質であってよい。
【０１２６】
AdipoR1が標的分子に結合するかそれと相互作用する能力の判定は、直接の結合を測定する上記の方法のいずれかによって達成することが出来る。一つの態様において、本発明のポリペプチドが標的分子に結合するかそれと相互作用する能力の判定は、標的分子の活性を測定することによって達成しうる。例えば、標的分子の活性は、標的の細胞内セカンドメッセンジャー(例えば、細胞内 Ca2+、ジアシルグリセロール、IP3、など)の誘導の検出によって、標的の適当な基質に対する触媒/酵素活性の検出、レポーター遺伝子 (例えば、検出可能マーカー、例えば、ルシフェラーゼをコードする核酸に作動可能に連結した本発明のポリペプチドに応答性の調節要素)の誘導の検出、または細胞応答の検出によって測定することが出来る。
【０１２７】
本発明はまた、無細胞アッセイも含む。かかるアッセイはある形態のAdipoR1 (例えば、全長 AdipoR1、AdipoR1の生物学的に活性の断片、またはAdipoR1の全部または一部を含む融合タンパク質)と被験化合物とを接触させる工程および、被験化合物がAdipoR1に結合する能力を判定する工程を含む。被験化合物のAdipoR1への結合は上記のように直接的または間接的に判定することが出来る。一つの態様において、アッセイは、AdipoR1とAdipoR1と結合することが知られている化合物とを接触させてアッセイ混合物を形成させる工程、アッセイ混合物と被験化合物とを接触させる工程、および、被験化合物がAdipoR1と相互作用する能力を判定する工程を含み、ここで、被験化合物がAdipoR1と相互作用する能力の判定は、既知の化合物と比較して、AdipoR1に優先的に結合する被験化合物の能力を判定することを含む。
【０１２８】
本発明の無細胞アッセイは、膜結合型形態のAdipoR1への使用にもその可溶性断片への使用にも受け入れられる。膜結合型形態のポリペプチドを含む無細胞アッセイの場合、膜結合型形態のポリペプチドが溶液中に維持されるように可溶化剤を用いることが望ましい。かかる可溶化剤の例としては、これらに限定されないが、以下が含まれる： 非イオン性界面活性剤、例えば、 n-オクチルグルコシド、n-ドデシルグルコシド、n-ドデシルマルトシド、オクタノイル-N-メチルグルカミド、デカノイル-N-メチルグルカミド、Triton X-100、Triton X-114、テシット（Thesit）、イソトリデシポリ(エチレングリコールエーテル)n、3-[(3-クロラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホナート (CHAPS)、3-[(3-クロラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホナート (CHAPSO)、またはN-ドデシル=N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホナート。
【０１２９】
本発明の上記アッセイ方法の様々な態様において、AdipoR1 (またはAdipoR1 標的分子)を、タンパク質の一方または両方の非複合体形態から複合体形態を分離するのを促進するために固定化するのが望ましく、また、アッセイの自動化を適用するのが望ましい。候補化合物の存在下および非存在下での被験化合物のAdipoR1への結合、またはAdipoR1と標的分子の相互作用は反応物質を含有するのに好適ないずれの容器で行ってもよい。かかる容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、および微量遠心管が挙げられる。一つの態様において、一方または両方のタンパク質がマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加した融合タンパク質を提供してもよい。例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ (GST) 融合タンパク質またはグルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ (Sigma Chemical; St.  Louis、Mo.）またはグルタチオン誘導化マイクロタイタープレートに吸着させ、それらを次いで被験化合物と混合するか、または被験化合物と非吸着標的タンパク質またはAdipoR1とを混合し、混合物を複合体形成が行われる条件下でインキュベートすればよい(例えば、塩およびpHについて生理的条件下)。インキュベーションの後、ビーズまたはマイクロタイタープレートのウェルを洗浄してあらゆる非結合成分を除去し、複合体形成を例えば上記のようにして直接的または間接的に測定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離させ、AdipoR1の結合または活性のレベルを標準的技術を用いて測定する。
【０１３０】
タンパク質をマトリックスに固定化するその他の技術を本発明のスクリーニングアッセイに用いてもよい。例えば、AdipoR1またはその標的分子を、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を利用して固定化すればよい。本発明のビオチン化ポリペプチドまたは標的分子は当該技術分野で周知の技術 (例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals; Rockford、Ill.)を用いてビオチン-NHS (N-ヒドロキシ-スクシンイミド)から調製することが出来、ストレプトアビジン被覆プレート (Pierce Chemical) のウェルに固定化するとよい。あるいは、AdipoR1または標的分子と反応性の抗体であるが、本発明のポリペプチドとその標的分子との結合に干渉しない抗体をプレートのウェルに誘導体化すればよく、そして非結合の標的または本発明のポリペプチドを抗体結合によってウェルにトラップすればよい。かかる複合体を検出する方法としては、GST-固定化複合体について上記したものに加えて、AdipoR1または標的分子と反応性の抗体を用いる複合体の免疫検出、およびAdipoR1または標的分子に関連する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが含まれる。
【０１３１】
スクリーニングアッセイはAdipoR1の発現をモニターすることも含む。例えば、AdipoR1の発現の制御因子は、細胞を候補化合物と接触させ、AdipoR1タンパク質またはmRNAの細胞における発現を測定する方法によって同定することが出来る。候補化合物の存在下でのAdipoR1タンパク質またはmRNAの発現レベルを、候補化合物の非存在下でのAdipoR1のタンパク質または mRNAの発現レベルと比較する。候補化合物はこの比較に基づいてAdipoR1の発現の制御因子として同定することが出来る。例えば、AdipoR1のタンパク質またはmRNAタンパク質の発現が候補化合物の存在下での方が非存在下より多ければ(統計的に有意に多い)、候補化合物はAdipoR1 タンパク質またはmRNA 発現の刺激因子として同定される。あるいは、AdipoR1のタンパク質またはmRNAの発現が候補化合物の存在下での方が非存在下よりも少なければ (統計的に有意に少ない)、候補化合物はAdipoR1 タンパク質またはmRNA 発現の阻害剤として同定される。細胞におけるAdipoR1 タンパク質またはmRNA 発現レベルは下記の方法によって測定することができる。
【０１３２】
結合アッセイ
結合アッセイのために、被験化合物は好ましくは、AdipoR1 ポリペプチドの活性部位に結合し、その部位を占有し、それによってリガンド結合部位に基質が接触できないようにマスクすることにより、正常の生物学的活性を妨げる低分子である。かかる低分子の例としてはこれらに限定されないが、小ペプチドまたはペプチド様分子が含まれる。本発明のポリペプチドに結合する潜在的(potential)リガンドにはこれらに限定されないが、AdipoR1 GPCRについて知られている天然のリガンドおよびそのアナログまたは誘導体が含まれる。
【０１３３】
結合アッセイにおいて、被験化合物またはAdipoR1 ポリペプチドのいずれも検出可能標識を含んでいてよく、例えば、標識としては、蛍光、放射性同位体、化学発光、または酵素標識、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼが挙げられる。AdipoR1 ポリペプチドに結合した被験化合物の検出は、例えば、放射線の直接のカウントまたはシンチレーションカウンターによるカウントまたは適当な基質の検出可能な生成物への変換の測定によって達成することが出来る。あるいは、被験化合物のAdipoR1 ポリペプチドへの結合はいずれの相互作用物も標識せずに測定することも出来る。例えば、マイクロフィジオメーター（microphysiometer）を用いて被験化合物とAdipoR1 ポリペプチドとの結合を検出することが出来る。マイクロフィジオメーター (例えば、Cytosensor（商標）)は、光位置指定可能電位差測定センサー (LAPS)を用いて細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析装置である。この酸性化速度の変化は被験化合物とAdipoR1との相互作用の指標として用いることが出来る[Haseloff、(1988)]。
【０１３４】
被験化合物がAdipoR1に結合する能力の測定は例えば、リアルタイム生体分子相互作用分析 (BIA) [McConnell、(1992); Sjolander、(1991)]などの技術を用いて達成することも出来る。BIAは、生体分子特異的相互作用を相互作用物のいずれも標識することなくリアルタイムに研究する技術である(例えば、BIAcore（商標）)。光学的現象である表面プラズモン共鳴 (SPR)における変化を、生物学的分子の間のリアルタイム反応の指標として用いることが出来る。
【０１３５】
本発明の別の側面において、AdipoR1-様ポリペプチドをツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおける「ベイトタンパク質」として利用して[Szabo、(1995); U.S. 5,283,317)、AdipoR1に結合するかそれと相互作用して、その活性を調節する別のタンパク質を同定することも出来る。
【０１３６】
ツーハイブリッドシステムは多くの転写因子のモジュール性に基づくものであり、分離可能な DNA-結合ドメインおよび活性化ドメインからなる。簡単に説明すると、該アッセイは２種類のDNA コンストラクトを用いる。例えば、一つのコンストラクトにおいて、AdipoR1をコードするポリヌクレオチドを既知の転写因子 (例えば、GAL-4)のDNA 結合ドメインをコードするポリヌクレオチドと融合させればよい。他方のコンストラクトにおいては、未同定タンパク質 (「プレイ（prey）」または「サンプル」)をコードするDNA 配列を既知の転写因子の活性化ドメインをコードするポリヌクレオチドと融合させればよい。「ベイト」および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用して、タンパク質依存的複合体を形成することが出来れば、転写因子のDNA結合ドメインおよび活性化ドメインは互いに近接するようになる。この近接により、転写因子に応答性の転写制御部位と作動可能に連結されたレポーター遺伝子 (例えば、LacZ)の転写が可能となる。レポーター遺伝子の発現が検出され得、機能性転写因子を含む細胞コロニーの単離が可能となり、それを用いてAdipoR1と相互作用するタンパク質をコードするDNA 配列を得ることが出来る。
【０１３７】
AdipoR1 (またはポリヌクレオチド) または被験化合物のいずれかを固定化して相互作用物の一方または両方の結合型形態と非結合型形態との分離を促進すること、また、アッセイの自動化を行うことが望ましい。したがって、AdipoR1-様ポリペプチド (またはポリヌクレオチド)または被験化合物は固体支持体に結合させてもよい。好適な固体支持体にはこれらに限定されないが、以下が含まれる：ガラスまたはプラスチックスライド、組織培養プレート、マイクロタイターウェル、チューブ、シリコンチップまたは粒子、例えば、ビーズ (これらに限定されないが以下を含む：ラテックス、ポリスチレン、またはガラスビーズ)。当該技術分野で知られているいずれの方法を用いてAdipoR1-様ポリペプチド (またはポリヌクレオチド)または被験化合物を固体支持体へ結合させてもよく、以下のような方法が挙げられる：共有結合および非共有結合、受動的吸収、それぞれポリペプチド (またはポリヌクレオチド)または被験化合物および固体支持体に結合した結合性部分の対の使用。被験化合物は好ましくは個々の被験化合物の位置が追跡できるように固体支持体にアレイにて結合させる。被験化合物のAdipoR1 (またはAdipoR1をコードするポリヌクレオチド)への結合は、反応物質を含むために好適ないずれの容器中で達成してもよい。かかる容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管および微量遠心管が挙げられる。
【０１３８】
一つの態様において、AdipoR1は、AdipoR1の固体支持体への結合を可能とするドメインを含む融合タンパク質である。例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ (Sigma Chemical、St.  Louis、Mo.)またはグルタチオン誘導化マイクロタイタープレートに吸着させて、それを被験化合物または被験化合物と非吸着 AdipoR1と混合すればよい;混合物を次いで複合体形成が起こる条件(例えば、塩およびpHについて生理条件)下でインキュベートする。インキュベーションの後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して非結合成分を除く。相互作用物の結合は上記のように直接的または間接的に測定することが出来る。あるいは、複合体は結合の測定の前に固体支持体から解離させてもよい。
【０１３９】
タンパク質をまたはポリヌクレオチドを固体支持体に固定化するその他の技術も本発明のスクリーニングアッセイに用いることが出来る。例えば、AdipoR1 (またはAdipoR1をコードするポリヌクレオチド )または被験化合物のいずれかを、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を利用して固定化してもよい。ビオチン化 AdipoR1 (またはビオチン化 AdipoR1をコードするポリヌクレオチド)または被験化合物は当該技術分野で周知の技術 (例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals、Rockford、Ill.) を用いてビオチン-NHS (N-ヒドロキシスクシンイミド)から調製することが出来、ストレプトアビジン被覆プレート (Pierce Chemical)のウェルに固定化すればよい。あるいは、AdipoR1、ポリヌクレオチド、または被験化合物に特異的に結合するが所望の結合部位、例えば、AdipoR1活性部位に干渉しない抗体をプレートのウェルに誘導体化してもよい。非結合標的またはタンパク質を、抗体結合によりウェルにトラップすればよい。
【０１４０】
GST-固定化複合体について上記したものの他のかかる複合体の検出方法としては、AdipoR1ポリペプチドまたは被験化合物に特異的に結合する抗体を用いた複合体の免疫検出、AdipoR1 ポリペプチドの活性の検出に依存する酵素結合アッセイ、および非還元条件下でのSDSゲル電気泳動が挙げられる。
【０１４１】
AdipoR1 ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する被験化合物のスクリーニングは、インタクトな細胞において行うことも出来る。AdipoR1 ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含むいずれの細胞を細胞に基づくアッセイシステム用いてもよい。AdipoR1 ポリヌクレオチドは細胞中の天然のものであってもよいし、例えば、上記のような技術を用いて導入されたものであってもよい。被験化合物のAdipoR1またはAdipoR1をコードするポリヌクレオチドへの結合は上記のように測定される。
【０１４２】
機能アッセイ
被験化合物を、AdipoR1 ポリペプチドのAdipoR1 活性を上昇または低下させる能力について試験してもよい。AdipoR1 活性は、例えば、以下の特定の実施例に記載の方法を用いて測定することが出来る。AdipoR1 活性は、精製AdipoR1、細胞膜調製物、またはインタクトな細胞のいずれかと、被験化合物との接触の後に測定すればよい。AdipoR1 活性を少なくとも約 10、好ましくは 約 50、より好ましくは 約 75、90、または100%低下させる被験化合物は、AdipoR1 活性を低下させる潜在的薬剤として同定される。AdipoR1 活性を少なくとも 約 10、好ましくは 約 50、より好ましくは 約 75、90、または100%上昇させる被験化合物は、AdipoR1 活性を上昇させる潜在的薬剤として同定される。
【０１４３】
かかるスクリーニング手法の一つはAdipoR1を発現するようトランスフェクトされたメラニン保有細胞の使用をともなう。かかるスクリーニング技術は1992年2月6日公開のPCT WO 92/01810に記載されている。したがって、例えば、かかるアッセイは、受容体リガンドとスクリーニングすべき化合物との両方の受容体をコードするメラニン保有細胞と接触させることにより本発明の受容体ポリペプチドの活性化を阻害する化合物をスクリーニングするために用いられ得る。リガンドによって生じるシグナルの阻害は、化合物が受容体の潜在的アンタゴニストであることを示し、即ち、化合物は受容体の活性化を阻害することを示す。このスクリーニングを用いてかかる細胞とスクリーニングすべき化合物とを接触させることおよび各化合物がシグナルを生成したか、即ち受容体を活性化したか、を判定することにより受容体を活性化する化合物を同定することが出来る。
【０１４４】
その他のスクリーニング技術は、受容体活性化によって起こる細胞外pH変化を測定するシステムにおいて、AdipoR1を発現する細胞(例えば、トランスフェクトされたCHO細胞)を使用することを含む[Iwabuchi 、(1993)]。例えば、化合物を本発明の受容体ポリペプチドを発現する細胞と接触させ、セカンドメッセンジャー応答、例えば、シグナル伝達またはpH 変化を測定して、受容体を活性化または阻害する潜在的化合物であるかを判定することが出来る。別のかかるスクリーニング技術は、AdipoR1をコードするRNAをアフリカツメガエル卵母細胞に導入して、一過性に受容体を発現させることを含む。受容体卵母細胞を受容体リガンドとスクリーニングすべき化合物と接触させ、次いで受容体の活性化を阻害すると考えられている化合物のスクリーニングの場合はカルシウムシグナルの阻害または活性化を検出すればよい。
【０１４５】
その他のスクリーニング技術には、その受容体がホスホリパーゼ CまたはDと連関している細胞におけるAdipoR1の発現が含まれる。かかる細胞には、内皮細胞、平滑筋細胞、胎児由来腎臓細胞などが含まれる。スクリーニングは上記のようにホスホリパーゼ活性の変化からの受容体の活性化の程度を定量することによって達成することが出来る。
【０１４６】
遺伝子発現
別の態様において、AdipoR1 遺伝子発現を上昇または低下させる被験化合物が同定される。本明細書において用いる、用語「ポリヌクレオチドの発現と相関する」とは、AdipoR1をコードする核酸配列と同一または関連する核酸の存在のノザン分析またはリアルタイム PCRによる検出が、サンプルにおけるAdipoR1をコードする核酸の存在を示し、AdipoR1をコードするポリヌクレオチドからの転写産物の発現と相関していることをいう。本明細書において用いる用語「マイクロアレイ」とは、特定のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが基体に並べられているアレイをいい、基体としては、例えば、紙、ナイロンまたはその他のあらゆるタイプの膜、フィルター、チップ、ガラススライド、またはその他のあらゆる好適な固体支持体が挙げられる。AdipoR1 ポリヌクレオチドは被験化合物と接触され、AdipoR1 ポリヌクレオチドのRNAまたはポリペプチド産物の発現が測定される。適当な mRNAまたはポリペプチドの被験化合物の存在下での発現レベルは、被験化合物の非存在下でのmRNAまたはポリペプチドの発現レベルと比較される。被験化合物はこの比較に基づいて発現の制御因子であると同定することが出来る。例えば、mRNAまたはポリペプチドの発現が被験化合物の存在下での方が非存在下よりも高ければ、被験化合物はmRNAまたはポリペプチド発現 の刺激因子またはエンハンサーであると同定される。あるいは、被験化合物の存在下での mRNAまたはポリペプチドの発現が非存在下よりも低ければ、被験化合物はmRNAまたはポリペプチド発現 の阻害剤として同定される。
【０１４７】
細胞におけるAdipoR1 mRNAまたはポリペプチド発現レベルはmRNAまたはポリペプチドを検出する当該技術分野で周知の方法によって測定することが出来る。定性的または定量的方法のいずれを用いてもよい。AdipoR1 ポリヌクレオチドのポリペプチド産物の存在は、例えば、当該技術分野で公知の様々な技術により判定することが出来、かかる技術としては、免疫化学的方法、例えば、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング、および免疫組織化学が挙げられる。あるいは、ポリペプチド合成は、細胞培養中インビボで、またはインビトロ翻訳システムで、標識化アミノ酸のAdipoR1への取り込みを検出することによって測定することが出来る。
【０１４８】
かかるスクリーニングは無細胞アッセイシステムまたはインタクトな細胞のいずれにおいて行ってもよい。AdipoR1 ポリヌクレオチドを発現するあらゆる細胞が細胞に基づくアッセイシステムに用いることが出来る。AdipoR1 ポリヌクレオチドは細胞中の天然のものであってもよいし、例えば、上記のような技術を用いて導入したものであってもよい。初代培養または樹立細胞株のいずれを用いてもよい。
【０１４９】
被験化合物
本発明のスクリーニングアッセイにおける使用に好適な被験化合物はいずれの好適なソースから得たものであってもよく、例えば、常套の化合物 ライブラリーから得たものでよい。被験化合物は当該技術分野で知られているコンビナトリアルライブラリー方法における多数のアプローチのいずれを用いて得てもよく、ライブラリーとしては以下が含まれる: 生物学的ライブラリー; 空間的に位置指定可能な 並行固相または液相ライブラリー; 解析を要する合成ライブラリー方法;「ワン・ビーズ・ワン（one-bead one）化合物」ライブラリー方法;およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー方法。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限られるが、その他の４つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは低分子化合物のライブラリーにも適用できる[Lam、(1997)]。分子ライブラリーの合成方法の例は当該技術分野で見いだすことが出来る。化合物のライブラリーは溶液中またはビーズ上、細菌、胞子、プラスミドまたはファージにて提供することが出来る。
【０１５０】
制御因子のモデリング
コンピュータモデリングおよびサーチ技術によって、AdipoR1 発現または活性を調節することができる化合物の同定または既に同定された化合物の改良が可能となる。かかる化合物または組成物を同定したら、活性部位または領域が同定される。かかる活性部位は典型的にはリガンド結合部位、例えば、リガンドとAdipoR1の相互作用ドメインであろう。活性部位は当該技術分野で知られている方法を用いて同定することが出来、例えば、ペプチドのアミノ酸配列から、核酸のヌクレオチド配列から、または、関連化合物または組成物とその天然のリガンドとの複合体の研究から同定することが出来る。後者の場合、化学的またはX線結晶解析を用いて、複合体化したリガンドが因子のどこに見いだされるかを見つけることにより活性部位を見いだすことが出来る。 
【０１５１】
次に、活性部位の三次元幾何的構造が決定される。これはX線結晶解析を含む、完全な分子構造を決定することが出来る公知の方法によって行うことが出来る。一方、固相または液相 NMRを用いて特定の分子内距離が測定される。構造決定のいずれのその他の経験的方法を用いて、部分的または完全な幾何的構造を得てもよい。幾何的構造は複合体化した天然または人工リガンドについても決定することが出来、それによって決定された活性部位構造の精度を高めることができる。
【０１５２】
不完全または十分に正確でない構造が決定されると、コンピュータに基づく数値的なモデリング方法を用いて構造を完成させるかその正確さを改良させることが出来る。認識されているいずれのモデリング方法を用いてもよく、特定の生体高分子、例えば、タンパク質または核酸に特異的なパラメーター化モデル、分子運動のコンピュータ計算に基づく分子動力学モデル、熱的アンサンブル（thermal ensembles）に基づく統計力学モデル、または組合せモデルが挙げられる。ほとんどのタイプのモデルにとって、構成原子と官能基の間の力を表す標準的分子力場が必要であり、物理化学において知られている力場から選択することが出来る。不完全または十分に正確でない実験的構造はこれらモデリング方法によって計算される完全でより正確な構造に対する制約として機能しうる。
【０１５３】
最後に、実験的に、モデリングにより、または組み合わせにより、活性部位の構造が決定されると、候補調節化合物が、その分子構造に対する情報とともに化合物を含むデータベースをサーチすることによって同定されうる。かかるサーチは、決定された活性部位構造に適合し、活性部位を規定する官能基と相互作用する構造を有する化合物を探索する。かかるサーチは手作業で行ってもよいが、好ましくはコンピュータによるアシストを受ける。このサーチによって見いだされたこれら化合物は潜在的 AdipoR1 調節化合物である。
【０１５４】
あるいは、これら方法を既知の調節化合物またはリガンドから改良された調節化合物の同定に用いることが出来る。既知の化合物の構成成分を修飾し、修飾の構造的効果を新規構成成分に適用される上記の実験的方法およびコンピュータモデリング方法を用いて測定することが出来る。変化された構造を次いで化合物の活性部位構造と比較して一致または相互作用の上昇が起こるかを判定する。このようにして、構成成分における体系的変化、例えば、側鎖基の変動により、特異性または活性が良好となった修飾調節化合物または修飾リガンドを得るための評価を迅速に行うことが出来る。
【０１５５】
治療指標および方法
本出願によってAdipoR1が様々なヒト組織に発現していることが見いだされた。
【０１５６】
神経学
CNS 障害には、中枢神経系障害と末梢神経系障害が含まれる。
CNS 障害にはこれらに限定されないが、以下が含まれる： 脳障害、脳血管疾患およびその結果、パーキンソン病、大脳皮質基底核変性症、運動神経疾患、ALSを含む認知症、多発性硬化症、外傷性脳障害、脳卒中、脳卒中後、外傷後脳障害、および小血管脳血管疾患。認知症、例えば、アルツハイマー病、血管性認知症、レビー障害型認知症、前頭側頭骨認知症および染色体 17に関連するパーキンソン症、前頭側頭骨認知症、例えば、ピック病、進行性核麻痺（progressive nuclear palsy）、大脳皮質基底核変性症、ハンチントン病、視床変性症、 クロイツフェルトヤコブ認知症、HIV 認知症、認知症を伴う統合失調症およびコルサコフ精神病、定義の意味に含まれるものはCNS 障害とみなす。
【０１５７】
同様に、認知関連障害、例えば、軽度認識障害、加齢による記憶障害、加齢による認識衰退、血管性認識障害、子供における学習障害を伴う注意欠陥障害、注意欠陥多動障害、および記憶障害もCNS 障害とみなす。
【０１５８】
この定義の意味において疼痛もCNS 障害とみなす。疼痛はCNS障害、例えば以下のものと関連している可能性がある： 多発性硬化症、脊髄損傷、坐骨神経痛、脊椎手術失敗症候群、外傷性脳障害、てんかん、パーキンソン病、脳卒中後、および脳および脊髄における血管性傷害 (例えば、梗塞、出血、血管性形成異常)。非中枢神経障害性疼痛には以下が含まれる：乳房切除後疼痛に関連する疼痛、幻覚（phantom feeling）、反射性交感神経性ジストロフィー (RSD)、三叉神経性ジアラジオキュロパシー（trigeminal neuralgiaradioculopathy)、術後疼痛、HIV/AIDS関連疼痛、癌疼痛、代謝性神経障害 (例えば、糖尿病性神経障害、結合組織疾患に二次的な脈管神経障害)、例えば、以下に関連する腫瘍随伴症多発性神経障害： 肺癌、または白血病、またはリンパ腫、または前立腺癌、結腸癌または胃癌、三叉神経神経痛、頭蓋神経痛およびヘルペス後神経痛。末梢神経損傷に関連する疼痛、中心性疼痛(即ち、脳虚血による)および様々な慢性疼痛、即ち、腰痛、背部疼痛(腰部疼痛)、炎症性および/またはリウマチ性疼痛。頭痛(例えば、前兆のある偏頭痛、前兆のない偏頭痛、およびその他の偏頭痛障害)、一過性および慢性緊張性頭痛、緊張性様頭痛、群発性頭痛、および慢性発作性片側頭痛もCNS 障害である。
【０１５９】
内臓疼痛、例えば、膵炎、腸膀胱炎（intestinal cystitis）、月経困難症、過敏性腸症候群、クローン病、胆石疝痛、尿管疝痛、心筋梗塞および骨盤腔疼痛症候群、例えば、外陰部痛、精巣痛、尿道症候群およびプロタトジニア（protatodynia）もCNS 障害である。
【０１６０】
神経系障害とみなされるものには、急性疼痛、例えば術後疼痛、および外傷後疼痛もある。
【０１６１】
ヒトAdipoR1は以下の脳組織において高く発現している: 脳、小脳、後頭葉、頭頂葉、側頭葉、側坐核、被殻、後腹側視床、背部内側視床、脊髄 (前角)、脊髄 (後角)、神経前駆細胞、星状細胞、網膜。脳組織における発現は、ヒトAdipoR1またはmRNAが神経系疾患の診断に利用できることを示す。さらにヒトAdipoR1の活性を調節して神経系疾患を治療することが出来る。
【０１６２】
心血管性障害
心不全は心臓機能の異常の原因が代謝組織の要求にみあう速度で血液を拍出する心臓の不全症である病的生理状態と定義される。それはあらゆる形態の拍出不全を含み、例えば、高出力および低出力、急性および慢性、右側または左側、収縮期または弛緩期が挙げられ、基礎となる原因には依存しない。
【０１６３】
心筋梗塞 (MI)は一般に、動脈硬化によって以前に狭められた冠動脈の血栓性閉塞の後の冠血流量の急激な低下によって引き起こされる。MI 予防 (一次および二次予防)はMIの急性治療および合併症の予防と同様に含まれる。
【０１６４】
虚血性疾患は、冠血流が制限される結果、灌流が心筋の酸素要求を満たすのに十分でなくなる症状である。この群の疾患には、安定狭心症、不安定狭心症および無症候性虚血が含まれる。
【０１６５】
不整脈には、あらゆる形態の心房性および心室性頻脈性不整脈、心房性頻脈、心房性粗動、心房性細動、房室性興奮回帰性頻脈、興奮前症候群、心室性頻脈、心室性粗動、心室性細動、および除脈形態の不整脈が含まれる。
【０１６６】
高血圧性血管性疾患には、一次およびあらゆる種類の二次動脈高血圧、腎臓性高血圧、内分泌性高血圧、神経性高血圧その他が含まれる。高血圧の治療のため、および心循環器疾患に起因するあらゆる合併症予防のため、遺伝子を薬剤標的として用いることができる。
【０１６７】
末梢血管性疾患は、動脈および/または静脈還流が低下し、血液供給と組織酸素要求との不均衡がおこる血管性 疾患であると定義される。それには慢性末梢動脈閉塞性疾患 (PAOD)、急性動脈血栓症および塞栓症、炎症性血管性障害、レイノー病および静脈障害が含まれる。
【０１６８】
アテローム性動脈硬化症は、血管壁が再構築され、血管内腔が損なわれる心血管性疾患である。アテローム硬化性再構築工程は、細胞、平滑筋細胞と単球/マクロファージ炎症性細胞の両方の、血管壁内膜における蓄積を伴う。これら細胞はおそらく循環から脂質を摂取し、成熟アテローム硬化性傷害を形成する。これら傷害の形成は成人の一生にわたって何十年も起こり続ける慢性工程であるが、ほとんどの疾患では、傷害部の破裂時にアテローム性動脈硬化症が起こり、血栓細片が放出され、これが迅速に動脈を閉塞させる。かかる急性事象が冠動脈において起こると、心筋梗塞が続いて起こりえ、最悪の場合、死に至りうる。
【０１６９】
アテローム硬化性傷害の形成は５つの重なり合う段階において起こりうると考えられており、該段階は、例えば、遊走、脂質蓄積、炎症性細胞の動員、血管性平滑筋細胞の増殖、および細胞外マトリックス沈殿である。これらの工程のそれぞれはアテローム性動脈硬化症のヒトおよび動物モデルにおいて起こることを示しうるが、傷害の病因および臨床的意義に対するそれぞれの相対的寄与は明らかではない。
【０１７０】
したがって、心血管性病態、例えば、アテローム性動脈硬化症および冠動脈疾患に関連するその他の症状の治療のための治療方法および薬剤が必要とされている。
【０１７１】
心循環器疾患にはこれらに限定されないが以下が含まれる：心臓および血管系障害、例えば、うっ血性心不全、心筋梗塞、心臓の虚血性疾患、すべての種類の心房性および心室性不整脈、高血圧性血管性疾患、末梢血管性疾患およびアテローム性動脈硬化症。
【０１７２】
高すぎるかまたは低すぎる血流中の脂肪、特に、コレステロールレベルは、長期的問題を引き起こしうる。アテローム性動脈硬化症および冠動脈または頸動脈疾患の発症のリスク(そしてしたがって心臓発作または脳卒中のリスク)は全コレステロールレベルの上昇に伴って上昇する。にもかかわらず、非常にコレステロールレベルが低いことは必ずしも健康であるとはいえない。脂質代謝障害の例には以下が含まれる：高脂血症 (異常に高い血中脂肪レベル(コレステロール、トリグリセリド、またはそれら両方) は高脂血症の家族病歴によって起こりうる)、肥満、高脂肪食、運動不足、中程度から高度のアルコール消費、喫煙、管理の悪い糖尿病、および甲状腺機能の低下、遺伝性高脂血症(I型高リポタンパク血症 (家族性高カイロミクロン血症)、II型高リポタンパク血症 (家族性高コレステロール血症)、III型 高リポタンパク血症、VI型高リポタンパク血症、またはV型高リポタンパク血症)、低リポタンパク血症、(脂肪を代謝する酵素の異常によって起こる)脂質代謝異常、ゴーシェ病、ニーマン・ピック病、ファブリー病、ウォルマン病、脳腱黄色腫症、シトステロール症、レフサム病、またはテイ・サックス病。
【０１７３】
腎臓障害は高血圧または低血圧をもたらしうる。高血圧を導く可能性のある腎臓の問題の例には以下が挙げられる：腎臓動脈狭窄、腎盂腎炎、糸球体腎炎、腎臓腫瘍、多嚢胞性腎臓疾患、腎臓損傷、または腎臓に影響を与える放射療法。排尿の過剰は低血圧を導きうる。
【０１７４】
ヒトAdipoR1は以下の心血管関連組織に高度に発現している: 心臓、心膜、心臓心房 (左心房)、心臓心室 (左心室)、心臓心室 (右心室)、心臓心室 (右心室)、大動脈、冠動脈、腸間膜動脈、(大) 静脈、冠動脈内皮細胞、冠動脈平滑筋一次細胞、大動脈内皮細胞、胎児腎臓、HEK 293 細胞。上記組織における発現は、ヒトAdipoR1またはmRNAが、心循環器疾患の診断に利用することが出来ることを示す。さらにヒトAdipoR1の活性は心循環器疾患の治療のために調節させうる。
【０１７５】
ヒトAdipoR1は腎臓組織に高度に発現している: 胎児腎臓、HEK 293 細胞。腎臓組織における発現は、ヒトAdipoR1またはmRNAが、心血管性障害として血圧障害を診断するのに利用することが出来ることを示す。さらにヒトAdipoR1の活性は、高血圧または低血圧などの血圧障害が含まれるがそれらに限定されない障害の治療のために調節させることが出来る。
【０１７６】
血液学的障害
血液学的障害は、血液およびすべてのその構成要素の疾患を含み、血液のすべての構成成分の生成または分解に関与する臓器および組織の疾患が含まれる。これにはこれらに限定されないが以下が含まれる 1) 貧血、2) 骨髄増殖性障害、3) 出血性障害、4) 白血球減少症、5) 好酸球性障害、6) 白血病、7) リンパ腫、8) 形質細胞悪液質(Plasma Cell Dyscrasias)、9)血液障害の過程における脾臓障害。1)による障害にはこれらに限定されないが以下が含まれる：ヘム合成欠陥または欠乏による貧血、赤血球新生欠乏。2)による障害にはこれらに限定されないが以下が含まれる： 真性多血症、腫瘍関連赤血球増多、骨髄線維症、血小板血症。3)による障害にはこれらに限定されないが以下が含まれる： 血管炎、血小板減少症、ヘパリン誘導性血小板減少症、血栓性血小板減少性紫斑病、溶血性尿毒症症候群、遺伝性および後天性血小板機能障害、遺伝性凝固障害。4)による障害にはこれらに限定されないが以下が含まれる： 好中球減少症、リンパ球減少症。5)による障害にはこれらに限定されないが以下が含まれる： 好酸球増加症、特発性好酸球増多症候群。6)による障害にはこれらに限定されないが以下が含まれる：急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄球性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄異形成症候群。7)による障害にはこれらに限定されないが以下が含まれる： ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、菌状息肉腫皮膚T-細胞リンパ腫。8)による障害にはこれらに限定されないが以下が含まれる： 多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、重鎖疾患。先行する特発性血小板減少性紫斑病の伸展における、鉄欠乏性貧血、巨赤芽球性貧血 (ビタミン B12欠乏症)、再生不良性貧血、サラセミア、悪性リンパ腫骨髄侵襲、悪性リンパ腫皮膚侵襲、溶血性尿毒症症候群、巨大血小板疾患も血液病とみなされる。
【０１７７】
ヒトAdipoR1は血液系の以下の組織において高度に発現している: ジャーカット (T-細胞)、骨髄、赤血球、骨髄 CD71+ 細胞、臍帯血 CD71+ 細胞、臍帯血 CD34+ 細胞、好中球臍帯血、T-細胞末梢血 CD4+、好中球末梢血、脾臓肝硬変。上記組織における発現および特に、疾患組織脾臓肝硬変と健康組織脾臓の間の発現の相違は、ヒトAdipoR1またはmRNAが血液病の診断に利用できることを示す。さらにヒトAdipoR1の活性は血液学的障害の治療のために調節させうる。
【０１７８】
胃腸管および肝臓疾患
胃腸管疾患は原発性または続発性、急性または慢性の胃腸管の臓器の疾患を含み、それは、後天性であっても遺伝性であっても、良性または悪性または異形成であってもよく、胃腸管臓器または全体としての身体に影響を及ぼしうる。それにはこれらに限定されないが以下が含まれる：1) 食道障害、例えば、突発性食道拡張、激しい突発性食道拡張、嚥下障害、輪状咽頭の協調不全、食道前嚥下障害、びまん性食道けいれん症、球感覚、バレット異形成、胃食道逆流、2)胃および十二指腸障害、例えば、機能性消化不良、胃粘膜炎症、胃炎、ストレス胃炎、慢性糜爛性胃炎、胃腺萎縮症、胃組織異形成、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃腫瘍、3) 膵臓障害、例えば、急性または慢性膵炎、膵臓外分泌または内分泌組織の機能不全、例えば、脂肪便、糖尿病、膵臓外分泌または内分泌腺腫瘍、例えば、3.1) 多発性内分泌腫瘍症候群、導管腺癌、嚢胞腺癌、島細胞腫瘍、膵島細胞腫、ガストリン産生腫瘍、カルチノイド腫瘍、グルカゴン産生腫瘍、ゾリンジャー・エリソン症候群、VIP産生腫瘍症候群、吸収不良症候群、4) 腸障害、例えば、腸の慢性炎症性疾患、クローン病、腸閉塞、下痢および便秘、結腸無力症、巨大結腸、吸収不良症候群、潰瘍性大腸炎、4.1) 機能性腸障害、例えば、過敏性腸症候群、4.2) 腸腫瘍、例えば、家族性ポリープ症、腺癌、原発性悪性リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、ポリープ、結腸直腸癌。
【０１７９】
肝臓疾患は肝臓の原発性または続発性、急性または慢性疾患または損傷を含み、後天性または遺伝性、良性または悪性のいずれであってもよく、肝臓または全体としての身体に影響を及ぼしうる。これにはこれらに限定されないが以下が含まれる： ビリルビン代謝障害、黄疸、ギルバート症候群、クリーグラー・ナジャー病、デュビンジョンソンおよびローター症候群; 肝内胆汁うっ滞、肝腫脹、門脈圧亢進症、腹水、バッド・キアリ症候群、門脈体循環性脳、脂肪肝、脂肪症、ライ症候群、アルコールによる肝臓疾患、アルコール性肝炎または肝硬変、線維症および肝硬変、先天性代謝異常症または外来物質による肝臓の線維症および肝硬変、沈着症、ゴーシェ病、ツェルウェガー症候群、ウィルソン病、急性または慢性肝炎、ウイルス肝炎およびその変異体、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、袋形動物による肝臓の炎症性症状; 肝臓の薬物誘発性障害、慢性肝臓疾患、例えば原発性硬化性胆管炎、アルファ1-アンチトリプシン欠乏症、原発性胆汁性肝硬変、術後肝臓障害、例えば、術後肝内胆汁うっ滞、肝肉芽腫、全身性疾患に関連する血管性肝臓障害、肝臓の良性または悪性腫瘍、新生児または未熟児における肝臓代謝障害。
【０１８０】
ヒトAdipoR1は胃腸管系の以下の組織において高度に発現している:胃、胃腫瘍、小腸、直腸、直腸腫瘍。上記組織における発現は、ヒトAdipoR1またはmRNAが胃腸管障害の診断に利用できることを示す。さらにヒトAdipoR1の活性を胃腸管障害の治療のために調節しうる。
【０１８１】
皮膚障害
皮膚は数々の機能を果たす。それは多層器官系であり、有効な保護被覆を構築し、体温を調節し、痛い、また快い刺激を感知し、ものが体内に入らないように維持し、太陽の有害な作用からの遮蔽を提供する。皮膚の色、質感、および折り畳みにより、ヒトを個体として特徴づけることが出来る。したがって、皮膚障害または疾患はしばしば身体健康および精神衛生に重要な結果をもたらす。皮膚障害にはこれらに限定されないが、以下に記載する症状が含まれる。
【０１８２】
掻痒 (痒み)は本能的に掻くことを要求する感覚であり、皮膚症状または全身疾患により起こりうる。
【０１８３】
表面の皮膚障害は皮膚の最上層、角質層またはケラチン層に影響を与え、この層は扁平な死細胞の多層からなり、下にある組織を損傷および感染から保護する障壁として作用する。皮膚表層の障害は、角質層および表皮のより深い層を伴う。
【０１８４】
皮膚表層の障害の例を以下に提供する。
【０１８５】
乾燥肌はしばしば中年以上のヒトに起こり、深刻な乾燥肌 (魚鱗癬)は遺伝性鱗屑性疾患に起因し、例えば、尋常性魚鱗癬または表皮剥離性角質増殖症が挙げられる。魚鱗癬は非遺伝性障害に起因することもあり、例えば、ライ病、甲状腺機能低下、リンパ腫、AIDS、およびサルコイドーシスに起因しうる。
【０１８６】
毛孔性角化症は一般的な障害であり、皮膚の上層から剥がれた死細胞が栓を形成し、毛嚢の開口部をふさぐ障害である。
【０１８７】
皮膚肥厚は角質層またはケラチン層の領域にあり、摩擦が繰り返されることに応答して異常に厚くなった領域である。
【０１８８】
うおのめは足の上にできる豆粒大の、ケラチンの肥厚領域である。
【０１８９】
乾癬は、銀色の鱗屑性の瘤および様々な大きさのプラーク(隆起した斑)によって認識できる慢性の再発性疾患である。皮膚細胞の異常に速い速度の増殖とターンオーバーが鱗屑性をもたらす。
【０１９０】
バラ色粃糠疹は軽度の疾患であり、鱗状、バラ色の、炎症性皮膚をもたらす。バラ色粃糠疹は、同定されているわけではないがおそらく感染体によってもたらされる。
【０１９１】
扁平苔癬は再発性の痒みを伴う疾患であり、小さい散在する瘤の発疹として開始し、次いでそれらが連結してより粗い、鱗状のプラーク(隆起した斑)となる。
【０１９２】
皮膚炎 (湿疹)は、皮膚の上層の炎症であり、水ぶくれ、発赤、腫れ、滲出、痂皮形成、鱗屑性、そして通常は掻痒をもたらす。
【０１９３】
皮膚炎の形態としては、接触性皮膚炎、または手足の慢性皮膚炎、例えば、汗疱が挙げられる。
【０１９４】
皮膚障害のさらなる例は、アトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、貨幣状皮膚炎、全身性剥脱性皮膚炎、うっ滞性皮膚炎、または限局性掻爬皮膚炎(慢性単純性苔癬、神経皮膚炎)である。
【０１９５】
その他の皮膚障害には炎症によって起こるものがある。皮膚は様々な発疹、痛み、および水ぶくれに突然覆われることがある。皮膚発疹のなかには生命を脅かすものもある。
【０１９６】
薬物性発疹は薬物療法の副作用であり、主に薬物療法に対するアレルギー反応である。
【０１９７】
中毒性表皮剥離症は生命を脅かす皮膚疾患であり、皮膚の最上層がシート状に剥がれる。この症状は薬物に対する反応によって、または別の重篤な疾患によって引き起こされうる。
【０１９８】
単純ヘルペスによってしばしば起こる多形性紅斑は、赤色の斑、しばしば的のようにみえ、通常対称的に体中に分布する隆起した皮膚によって特徴づけられる障害である。
【０１９９】
結節性紅斑は、皮膚の下に圧痛のある赤色瘤(小結節)を生じる炎症性障害であり、多くの場合は脛に起こるが、時に腕およびその他の領域に起こることもある。
【０２００】
環状肉芽腫は原因不明の慢性皮膚症状であり、小さな硬い隆起した瘤が環を形成し、中央の皮膚は正常またはわずかにくぼんでいる。
【０２０１】
皮膚障害のなかには、水疱状疾患として特徴づけられるものもある。３つの自己免疫疾患である、天疱瘡、水疱性類天疱瘡、および疱疹状皮膚炎はそのなかでももっとも重篤である。
【０２０２】
天疱瘡は珍しい、致死性の場合もある疾患であり、様々な大きさの水ぶくれ(水疱)が皮膚、口内およびその他の粘膜に発生する。
【０２０３】
水疱性類天疱瘡は水疱形成を引き起こす自己免疫疾患である。
【０２０４】
疱疹状皮膚炎は自己免疫疾患であり、非常に痒い、小さい水ぶくれおよび蕁麻疹様の腫れの集団が起こり、持続する。この疾患を患うヒトでは、コムギ、ライムギ、オオムギ、およびカラスムギ中のタンパク質産物が免疫系を活性化し、それが皮膚の部分を攻撃し、発疹と掻痒のなんらかの原因となる。
【０２０５】
発汗障害も皮膚障害に属する。
【０２０６】
紅色汗疹はたまった汗によって起こる痒い皮膚発疹である。
【０２０７】
発汗過多 (多汗)は皮膚表面全体に影響を及ぼしうるが、手のひら、足の裏、脇の下、または鼠径部にのみ起こることが多い。患部は桃色または青みがかった白であることが多く、重篤な症例では皮膚に亀裂が入り、剥がれ落ち、特に足でそのようになる。
【０２０８】
皮膚障害は皮脂腺に影響を与えうる。皮膚に油分を分泌する皮脂腺は、表面層(表皮)の直下にある皮膚層である真皮に存在する。皮脂腺障害としては、ざ瘡、酒さ、口周囲皮膚炎、および皮脂嚢胞が挙げられる。
【０２０９】
ざ瘡は一般的な皮膚症状であり、皮膚の毛穴が詰まり、にきびおよび炎症性、感染性膿瘍(膿の蓄積)を引き起こす。ざ瘡は十代によく起こる。
【０２１０】
ざ瘡は、表面ざ瘡または深在ざ瘡にさらに分類される。
【０２１１】
酒さは、発赤、非常に小さいにきび、および血管の崩壊を起こす、通常は顔の中央領域におこる持続性皮膚障害である。
【０２１２】
口周囲皮膚炎は赤色の、しばしば凸凹の口のまわりと顎におこる発疹である。
【０２１３】
皮脂嚢胞(角質嚢腫)は、死んだ皮膚、皮膚排出物、およびその他の皮膚粒子を含む、ゆっくりと大きくなる瘤である。これらの膿疱は小さいこともあり、どこにでも起こりうる。
【０２１４】
毛髪障害も皮膚障害である。毛髪障害には、過剰な多毛、禿、および内方発育顎髭が含まれる。
【０２１５】
皮膚は細菌によって感染されうる。細菌性皮膚感染症は小さなざ瘡から生命を脅かす症状まで重篤度の幅が広く、例えば、ブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群が挙げられる。もっとも一般的な細菌性皮膚感染症はブドウ球菌および連鎖球菌によって起こる。皮膚感染症の危険因子は、例えば、糖尿病、AIDSまたは皮膚リーソン（leasons）である。
【０２１６】
膿痂疹はブドウ球菌または連鎖球菌によって起こる皮膚感染症であり、小さな膿疱 (小膿疱)が形成される。
【０２１７】
毛嚢炎はブドウ球菌感染によって起こる毛嚢の炎症である。感染は毛髪に損傷を与え、毛髪が抜けやすくなる。
【０２１８】
炎症性腫れ物 (癰)は毛嚢周囲のブドウ球菌感染によって起こる、大きな、圧痛のある、腫大した、隆起領域である。
【０２１９】
癰は密集した炎症性腫れ物であり、皮膚のひどい腐肉が形成され、瘢痕も形成する。癰は単なる炎症性腫れ物よりもゆっくりと進行および治癒し、発熱と疲労を導きうる。
【０２２０】
丹毒は連鎖球菌によっておこる皮膚感染症に起因する。光沢のある、赤い、わずかに腫大した、圧痛のある発疹が生じ、小さい水ぶくれをしばしば伴う。感染領域のまわりのリンパ節が腫大し、疼痛を伴うようになる。
【０２２１】
蜂巣炎は皮膚の深部層の中、ときには下におこる瀰漫性感染症である。蜂巣炎は多くの場合、連鎖球菌感染症またはブドウ球菌感染症である。しかしながら、その他の多くの細菌も蜂巣炎を引き起こすことがある。
【０２２２】
爪周囲炎は、手指の爪または足指の爪の縁のまわりの感染症である。爪周囲炎はシュードモナスおよびプロテウスを含む多種の細菌およびカンジダを含む真菌によって引き起こされ得る。
【０２２３】
ブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群は広く行き渡った皮膚感染症であり、毒素性ショック症候群を導くことがあり、その症候群では皮膚がやけどしたように剥がれ落ちる。特定のタイプのブドウ球菌は皮膚の最上層(表皮)を皮膚の残りの部分から脱離させる毒性物質を産生する。
【０２２４】
紅色陰癬は皮膚の最上層の、細菌であるコリネバウテリウム・ミヌチッシマム（Corynebacterium minutissimum）による感染症である。
【０２２５】
皮膚感染症はしばしば真菌によって起こる。皮膚に感染する真菌(皮膚糸状菌)は死んだ最上層 (角質層)にのみ生息し、より深く侵入することはない。真菌感染症のなかには症状をもたらさないものもあり、非常にわずかな刺激、鱗屑性、および発赤を起こすものもある。その他の真菌感染症には、掻痒、腫れ、水ぶくれおよび重篤な鱗屑性を起こすものもある。
【０２２６】
白癬は真菌皮膚感染症であり、数種の真菌によって引き起こされ、身体のその位置によって一般に分類される。
【０２２７】
例としては、足白癬 (白癬菌または表皮菌によって起こる足の白癬)、いんきん (様々な真菌および酵母によって起こりうる鼠径部白癬)、頭皮白癬（白癬菌または小胞子菌によって起こる)、爪白癬および体白癬 (白癬菌によって起こる)が挙げられる。
【０２２８】
カンジダ症(酵母感染症、モニリア症)は酵母カンジダによる感染症である。カンジダは通常、皮膚および粘膜、例えば、口内および膣に感染する。まれにではあるが、より深部の組織および血液に侵入し、生命を脅かす全身性カンジダ症を引き起こすことがある。以下のタイプにカンジダ感染症を区別することが出来る:皮下感染症(間擦部感染症)、膣おおよび陰茎カンジダ感染症 (外陰膣炎)、鵝口瘡、口角炎(口角カンジダ感染症)、カンジダ性爪周囲炎 (疼痛を伴う腫れおよび膿を生じる爪床において発達するカンジダ)。
【０２２９】
癜風は真菌感染症であり、皮膚上に白から痰褐色の斑をもたらす。
【０２３０】
皮膚は、寄生虫、主に小さな昆虫または蠕虫、によって冒されることもある。
【０２３１】
疥癬はダニ感染症であり、小さな赤色がかったにきびおよび重篤な掻痒を引き起こす。疥癬は、疥癬虫であるヒゼンダニによって起こる。 
【０２３２】
シラミの発生 (シラミ)は強い掻痒をもたらし、皮膚のほとんどあらゆる領域に影響しうる。アタマジラミとケジラミが２種類の種である。
【０２３３】
皮膚爬行症 (皮膚幼虫移行症)は温暖な湿潤土から皮膚に伝わる鉤虫感染症である。この感染症は通常はイヌおよびネコに生息する鉤虫による。
【０２３４】
多くのタイプのウイルスが皮膚に侵入する。医学的に重要なものは口唇にいぼおよびヘルペス(単純ヘルペス)を引き起こすものである。いぼは乳頭腫ウイルスによって起こり、ヘルペスは単純ヘルペスウイルスによって起こる。皮膚に感染する別の重要なウイルス群はポックスウイルスファミリーに属する。水疱瘡は未だに一般的な小児感染症である。ポックスウイルスはまた、伝染性軟属腫も引き起こし、これは皮膚の着色した、滑らかな、ロウ状の瘤を起こすポックスウイルスによる皮膚の感染症である。
【０２３５】
太陽光は重篤な皮膚損傷をもたらしうる。日光皮膚炎は紫外線B波(UVB)への過剰曝露に起因する。日光皮膚炎のヒトのなかには、発熱、悪寒、および衰弱を伴うものもあり、非常に深刻な日光皮膚炎患者はショック状態に陥り、低血圧、および失神を伴うものもある。
【０２３６】
日光をよくあびるヒトは以下を含む皮膚癌のリスクが高い：扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、そして在る程度は、悪性黒色腫。
【０２３７】
多の原因のなかでも、薬剤は、皮膚光過敏性反応を起こすことがあり、これは数分の露光だけで起こりうる。これらの反応には、発赤、剥離、蕁麻疹、水ぶくれ、および肥厚した鱗屑性斑(光過敏性)が含まれる。
【０２３８】
皮膚障害のなかには色素障害として特徴づけられるものもある。
【０２３９】
色素欠乏症はメラニンが形成されないまれな遺伝性障害である。
【０２４０】
白斑は、メラニン細胞の欠損により滑らかで白色がかった皮膚斑が生じる症状であり、通常でない身体外傷の後に起こることがあり、特定の別の疾患、例えば、アジソン病、糖尿病、悪性貧血および甲状腺疾患、とともに起こる傾向がある。
【０２４１】
癜風は皮膚の真菌感染症であり、時に色素沈着過度を引き起こす。
【０２４２】
肝斑は顔(通常、額、頬、こめかみ、および顎)に色素沈着のほぼ対称的な暗褐色斑の群として現れ、しばしば明確な輪郭をともなう。
【０２４３】
様々なタイプの細胞の異常な蓄積である皮膚増殖は、産まれたときに存在し、後で発達する。非癌性 (良性)増殖および癌性(悪性)増殖タイプに識別される。
【０２４４】
ほくろ (母斑)は小さい、通常暗色の、皮膚増殖であり、皮膚における色素産生細胞(メラニン細胞)から発達する。ほとんどのほくろは無害である。しかし、非癌性ほくろが悪性黒色腫に発達することもある。
【０２４５】
軟性線維腫は、軟らかく小さい、肌色またはわずかに暗色の皮膚のたるみであり、ほとんどは、首、脇の下または鼠径部にみられる。
【０２４６】
脂肪腫は皮膚の下で生育する脂肪性物質の軟らかい沈着物であり、円形または楕円形のこぶが生じる。
【０２４７】
血管腫は異常に高密度の血管またはリンパ管の集まりであり、通常は皮膚の中か下にあり、赤または紫のシミをもたらす。
【０２４８】
血管腫の例としては、ポートワイン母斑、イチゴ状血管腫、海綿状血管腫、クモ状血管腫管腫、およびリンパ管腫が挙げられる。
【０２４９】
化膿性肉芽腫は、緋色、褐色、または青黒色のわずかに隆起した領域であり、毛細血管 (最小の血管)の増殖の上昇および周囲組織の腫れにより引き起こされる。
【０２５０】
脂漏性角化症 (脂漏性いぼと称されることもある)は、肌色、褐色、または黒色の増殖(growths)であり、皮膚のいずれの場所にも起こりうる。
【０２５１】
皮膚線維腫は、皮膚の下の軟組織に生育する線維芽細胞の蓄積によって起こる小さい赤から褐色の瘤(小結節)である。
【０２５２】
角化棘細胞腫は、円形で硬い、通常は肌色の、ペースト状物質を含む中央の異常なくぼみを有する増殖である。
【０２５３】
ケロイドは、滑らかで光沢のある、淡い桃色の、しばしばドーム状の、繊維組織の増殖性発達であり、創傷部または手術創に形成される。
【０２５４】
皮膚癌は、癌のもっとも一般的な形態であるが、ほとんどのタイプの皮膚癌は根治可能である。
【０２５５】
基底細胞癌は表皮最下層に由来する癌である。
【０２５６】
扁平上皮細胞癌は表皮中央層に由来する癌である。
【０２５７】
ボーエン病は表皮に限定された扁平上皮細胞癌の一形態であり、下にある真皮には侵入していないものである。
【０２５８】
黒色腫は、皮膚の色素産生細胞(メラニン細胞)に由来する癌である。
【０２５９】
カポジ肉腫は血管、通常皮膚の血管由来の癌である。
【０２６０】
パジェット病はまれなタイプの炎症性の赤くなった染み(皮膚炎)のように見える皮膚癌である;それは皮膚の中または下にある腺に由来する。
【０２６１】
ヒトAdipoR1は皮膚組織である皮膚において高度に発現している。上記組織における発現は、ヒトAdipoR1またはmRNAは皮膚病の診断に利用できることを示す。さらにヒトAdipoR1の活性はこれら疾患の治療のために調節されうる。
【０２６２】
癌障害
この定義の範囲における癌障害は、その組織における正常または異常細胞の、制御が弱い、または制御を失った増殖、およびその全体としての身体に対する影響によって特徴づけられる哺乳類における器官または組織のあらゆる疾患を含む。定義の範囲における癌疾患は、良性腫瘍、異形成、過形成および転移性増殖を示す腫瘍またはその他のあらゆるトランスフォーメーションであり、例えば、癌の発症にしばしば先立つ白斑症が挙げられる。細胞および組織は、転移性増殖について説明されるように、正常細胞よりも速く増殖して、周囲の健康組織または体のその他の組織に移動または瀰漫し、異常な形状と大きさを示し、核原形質比、核多染性において変化を示し、最終的には死に至りうる場合する癌性である。癌細胞および組織は腫瘍随伴症症候群をもたらすか、または癌が致命的な器官または組織に起こる場合、身体全体に影響を及ぼし、正常機能が阻害または停止し、致死的な結果となりうる。究極的に致命的器官が癌により含まれることは、原発性であっても転移性であっても、罹患した哺乳類を死に至らしめうる。癌は伝播する傾向があり、その伝播の程度は通常、疾患により死亡しない個人の確率に関連する。癌は一般に増殖の三段階の一つであるといわれる:腫瘍がその起源である組織、即ち原発部位に限局している初期の局所段階;腫瘍からの癌細胞が隣接組織に浸潤するか、または局所リンパ節にのみ伝播する拡張に向かう段階;または、癌細胞が血管系またはリンパ系を介して原発部位から体の遠く離れた場所に移動し、罹患の続発性部位が確立する転移段階。癌は治療されなかった場合、死をもたらす傾向があるため悪性であるといわれる。良性腫瘍は、その位置、大きさ、または腫瘍随伴症副作用によって正常な身体機能に干渉することがあっても、通常死をもたらさない。したがって良性腫瘍はこの定義の範囲における癌の定義に該当する。一般に、癌細胞は正常細胞よりも速い速度で分裂するが、癌組織および正常組織の増殖の差は、癌組織自体が癌細胞における部分的または完全な増殖の抑制において欠陥を有すること、およびそれが、正常組織の増殖の機能的平衡を特徴づける有用な限定されたタイプの組織に分化できないことにより、細胞分裂の迅速性ほどには大きくない。癌組織は、なんらかの分子受容体を発現しており、おそらく宿主の感受性と免疫力に影響されるためある種の癌、例えば、乳癌および前立腺癌は、その存在が特定のホルモンに依存していると考えられていることが知られている。定義の範囲内の用語「癌」は単なる良性新生組織形成に限定されず、あらゆるその他の良性および悪性新生組織形成を含み、以下が挙げられる： 1) 癌腫、2) 肉腫、3) 癌肉腫、4)造血組織の癌、5) 脳を含む神経組織の腫瘍、6)皮膚細胞の癌。1)による癌は、体の外側を被覆している組織(皮膚)および、粘膜および臓器の内側空洞構造を規定している上皮組織に起こり、かかる臓器には、例えば、乳房、肺、呼吸器および胃腸管、内分泌腺、および尿生殖器系が挙げられる。管または腺要素は、上皮腫瘍に含まれ、例えば甲状腺癌、胃腺癌、子宮腺癌などの腺癌が挙げられる。皮膚およびある種の粘膜の単層細胞扁平上皮の癌、例えば、舌、唇、咽頭、膀胱、子宮頸部、または陰茎の癌は、それぞれの組織の類表皮または扁平上皮細胞癌とも称されるが、癌の定義の範囲に含まれる。2)の癌は以下のような結合組織に起こる：線維組織、脂肪(脂)組織、筋肉、血管、骨、および軟骨、例えば、骨原性肉腫; 脂肪肉腫、線維肉腫、滑膜肉腫。3)の癌は、上皮および結合組織の両方に起こる癌である。この定義の範囲における癌疾患は原発性または続発性のいずれでもよく、原発性癌はそれがみられる組織に起源を有する癌であり、一方、別の傷害から転移を介して確立するのは続発性部位である。この定義の範囲における癌および腫瘍疾患は良性であっても悪性であってもよく、哺乳類の身体のすべての解剖学的構造に影響を与えうる。限定的ではない例としては、以下が挙げられる：以下における癌および腫瘍疾患：I)骨髄および骨髄由来細胞(白血病)、II)内分泌腺および外分泌腺、例えば、甲状腺、副甲状腺、下垂体、副腎、唾液腺、膵臓 III) 乳房、例えば、男性または女性の乳腺における良性または悪性腫瘍、乳管、腺癌、髄様癌、面皰癌、乳頭のパジェット病、若い女性の炎症性癌腫、IV)肺、V)胃、VI)肝臓および脾臓、VII)小腸、VIII)大腸、IX)骨およびその支持組織および結合組織、例えば、悪性または良性骨腫瘍、例えば、悪性骨原性肉腫、良性骨腫、軟骨腫瘍;例えば、悪性軟骨肉腫または良性軟骨腫; 骨髄腫瘍、例えば、悪性骨髄腫または良性好酸球性肉芽腫、ならびに体のその他の位置の骨組織からの転移性腫瘍; X)口、喉、咽頭、および食道、XI)膀胱および男性および女性の泌尿生殖器系の内部および外部器官および構造、例えば、卵巣、子宮、子宮頸部、精巣、および前立腺、XII)前立腺、XIII)膵臓、例えば、膵臓の管癌; XIV)リンパ組織、例えば、リンパ腫およびその他のリンパ系起源の腫瘍、XV)皮膚、XVI)呼吸および呼吸器系に属するすべての解剖学的構造の癌および腫瘍疾患、例えば、胸部筋肉および裏層、XVII) リンパ節の原発性または続発性癌、XVIII)舌および硬口蓋または洞の骨性構造、XVIV)口、頬、首および唾液腺、XX)血管、例えば、心臓およびその裏層、XXI) 平滑筋または骨格筋およびその靱帯および裏層、XXII) 末梢神経系、自律神経系、中枢神経系、例えば、小脳、XXIII)脂肪組織。
【０２６３】
ヒトAdipoR1 は以下の癌組織において高度に発現している: 胃腫瘍、直腸腫瘍、ジャーカット (T-細胞)、前立腺腫瘍、HEK 293 細胞。上記組織における発現および、特に、疾患組織胃腫瘍と健康組織胃、疾患組織直腸腫瘍と健康組織直腸、疾患組織ジャーカット (T-細胞)と健康組織T-細胞末梢血 CD4+、疾患組織前立腺腫瘍と健康組織前立腺、疾患組織 HEK 293 細胞と健康組織腎臓の、示差的発現は、ヒトAdipoR1またはmRNAが癌の診断に利用できることを示す。さらにヒトAdipoR1の活性は癌の治療のために調節されうる。
【０２６４】
炎症性疾患
炎症性疾患は、急性または慢性炎症性症状を結果的に起こす体組織の炎症をもたらす免疫系または組織の細胞性または非細胞性メディエーターによって引き起こされる疾患を含む。かかる炎症性疾患の例としては、以下が挙げられる：I-IV型過敏性反応、例えば以下に限定されないが、肺の過敏性疾患、例えば、喘息、アトピー性疾患、アレルギー性鼻炎または結膜炎、瞼の血管性浮腫、遺伝性血管性浮腫、抗受容体過敏性反応および自己免疫疾患、橋本病、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、天疱瘡、重症筋無力症、グレーブスおよびライノー病、B型インスリン抵抗性糖尿病、関節リウマチ、乾癬、クローン病、強皮症、混合性結合組織病、多発性筋炎、サルコイドーシス、糸球体腎炎、急性または慢性移植片対宿主反応。
【０２６５】
ヒトAdipoR1は、以下の免疫系の組織および免疫系成分に応答性の組織ならびに炎症メディエーターに応答性の以下の組織において高度に発現している: 骨髄、好中球臍帯血、好中球末梢血、脾臓肝硬変、肺 COPD。上記組織における発現および、特に、疾患組織脾臓肝硬変と健康組織脾臓、疾患組織肺 COPDと健康組織肺との間の示差的発現は、ヒトAdipoR1またはmRNAは炎症性疾患の診断に利用できることを示している。さらにヒトAdipoR1の活性は炎症性疾患の治療のために調節されうる。
【０２６６】
呼吸器関連障害
喘息は多数の遺伝因子と環境因子の相互作用の結果として起こると考えられており、３つの主な特徴によって特徴づけられる: 1)気管支収縮、粘液産生の増加、気道を狭めることになる気道の壁の肥厚、による間欠性および可逆性気道閉塞、2) 気道応答性亢進、および 3) 気道炎症。特定の細胞は喘息の炎症性反応に重要であり、それには、以下が挙げられる：T 細胞および抗原提示細胞、IgE 産生B 細胞、および肥満細胞、好塩基球、好酸球およびその他のIgEに結合する細胞。これらのエフェクター細胞が気道におけるアレルギー反応部位に蓄積し、急性症状および最終的には、障害に関連する組織破壊に寄与する毒性産物を放出する。その他の常在細胞、例えば、平滑筋細胞、肺上皮細胞、粘液産生細胞および神経細胞も喘息個体においては異常であり得、その症状に寄与している可能性がある。臨床的に間欠性喘鳴および息切れとして現れる喘息の気道閉塞は、一般に疾患のもっとも切迫した症状であり、緊急の治療を要求し、疾患に伴う炎症および組織破壊は、非可逆性変化を導き、最終的には喘息を慢性かつ身体に障害を引き起こす長期管理を要求する病気としうる。
【０２６７】
慢性閉塞性肺(または気道)疾患 (COPD)は、一般に気腫と慢性気管支炎による末梢気道閉塞との組合せに一般に起因する気流閉塞として生理学的に定義される症状である[Botstein、1980]。気腫は肺の気腔の異常拡張を導く肺胞壁の破壊によって特徴づけられる。慢性気管支炎は、慢性の喀痰を伴う咳が２年連続して３ヶ月存在する症状として臨床的に定義される。COPDにおいて、気流閉塞は通常進行性であり、部分的にのみ可逆性である。COPDの発症のもっとも重要な危険因子は喫煙であるが、この疾患は非喫煙者においても起こる。
【０２６８】
ヒトAdipoR1は、以下の呼吸器系組織において高度に発現している: 好中球臍帯血、好中球末梢血、右肺上葉、右肺下葉、肺 COPD、気管、原始気管支、続発性気管支、気管支上皮細胞、気管支平滑筋細胞。上記組織における発現および特に、疾患組織 肺 COPDと健康組織肺との間の示差的発現は、ヒトAdipoR1またはmRNA が呼吸器疾患の診断に利用できることを示す。さらにヒトAdipoR1の活性はかかる疾患の治療のために調節されうる。
【０２６９】
泌尿器関連障害
尿生殖器障害は、女性および男性の尿生殖器系を構成する臓器の良性および悪性障害を含み以下が挙げられる：腎臓疾患、例えば、 急性または慢性腎不全、免疫を介する腎臓疾患、例えば、腎臓移植拒絶、ループス腎炎、免疫複合体性腎臓疾患、糸球体症、腎炎、中毒性腎症、閉塞性尿路疾患、例えば、良性前立腺過形成 (BPH)、神経性膀胱症候群、尿失禁、例えば、急迫性、緊張性または溢流性尿失禁、骨盤痛、および勃起機能障害。
【０２７０】
ヒトAdipoR1は以下の泌尿器組織において高度に発現している: 脊髄 (前角)、脊髄 (後角)、前立腺、前立腺、前立腺 BPH、前立腺腫瘍、胎児腎臓、HEK 293 細胞。上記組織における発現および特に、疾患組織前立腺 BPHと健康組織前立腺との間の示差的発現は、ヒトAdipoR1またはmRNAが泌尿器障害の診断に利用できることを示す。さらにヒトAdipoR1の活性を泌尿器障害の治療のために調節させうる。
【０２７１】
ヒトAdipoR1は以下の脊髄組織において高度に発現している: 脊髄 (前角)、脊髄 (後角)。脊髄組織における発現は、ヒトAdipoR1またはmRNAが泌尿器障害としての失禁の診断に利用できることを示す。脊髄組織は泌尿器系の神経制御に関与している。さらにヒトAdipoR1の活性は限定的ではないが失禁の治療のために調節させうる。
【０２７２】
適用
本発明は、心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患の予防および治療の両方の方法を提供する。
【０２７３】
本発明の制御方法は、細胞を、１以上のAdipoR1活性を調節する薬剤と接触させることを含む。活性を調節する薬剤は本明細書に記載のような薬剤であり得、例えば、核酸またはタンパク質、ポリペプチドの天然同族リガンド、ペプチド、ペプチド疑似体、またはあらゆる低分子が挙げられる。一つの態様において、薬剤は１以上のAdipoR1の生理活性を刺激する。かかる刺激性薬剤の例としては、活性 AdipoR1およびAdipoR1の一部をコードする核酸分子が挙げられる。別の態様において、薬剤はAdipoR1の１以上の生理活性を阻害する。かかる阻害性薬剤の例としては、アンチセンス核酸分子および抗体が挙げられる。これら制御方法はインビトロで行ってもよいし(例えば、細胞を薬剤とともに培養することによる)、あるいは、インビボで行ってもよい(例えば、薬剤を対象に投与することによる)。このように、本発明はAdipoR1またはAdipoR1 シグナル伝達経路のタンパク質の望ましくない発現または活性に特徴づけられる疾患または障害を患う個体を治療する方法を提供する。一つの態様において、該方法は薬剤の投与を伴い、それは例えば、本明細書に記載のようなスクリーニングアッセイによって同定されたまたは同定されうるあらゆる薬剤またはかかる薬剤の組み合わせであって、AdipoR1または AdipoR1 シグナル伝達経路のタンパク質の発現または活性を調節、即ち上方または下方制御するものである。別の態様において、該方法はAdipoR1の制御因子を治療として投与し、それによって AdipoR1または AdipoR1 シグナル伝達経路のタンパク質の低下した、または望ましくないほど低い発現または活性を補償することを含む。 
【０２７４】
AdipoR1の活性または発現の刺激は、活性または発現が異常に低く、活性の上昇がおそらく有利な効果を奏する状況において望ましい。逆に、AdipoR1の活性または発現の阻害は、AdipoR1の活性または発現が異常に高く、その活性の低下がおそらく有利な効果を奏する状況において望ましい。
【０２７５】
本発明をさらに以下の実施例によって説明するが、これは限定を意図するものではない。本出願で言及されるすべての引用文献、特許および公開特許出願の内容は引用により本出願に含まれる。
【０２７６】
医薬組成物
本発明はさらに上記のスクリーニングアッセイによって同定される新規薬剤およびその本明細書に記載のような治療における使用に関する。
【０２７７】
本発明の核酸分子、ポリペプチドおよび抗体 (本明細書において「活性化合物」とも言及される)は投与に好適な医薬組成物に組み込むことが出来る。かかる組成物は、典型的には、核酸分子、タンパク質、または抗体および医薬上許容される担体を含む。本明細書において用いる「医薬上許容される担体」との語は、溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などであって、医薬の投与に適合性のあらゆるものを含む意味である。かかる媒体および剤の医薬上活性な物質のための使用は当該技術分野で周知である。常套の媒体または剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物におけるそれらの使用が考慮される。補足的な活性化合物を組成物に含めてもよい。
【０２７８】
本発明は、AdipoR1 発現または活性の制御因子(および/またはAdipoR1 シグナル伝達経路におけるタンパク質の活性または発現の制御因子)を含む医薬組成物および、１以上のかかる制御因子と医薬上許容される担体とを混合することによりかかる組成物を調製する方法を含む。使用指示書とともに包装された本発明のスクリーニングアッセイを用いて同定された制御因子を含む医薬組成物も本発明に含まれる。AdipoR1 活性のアンタゴニスト、またはAdipoR1 発現を低下させる制御因子については、該指示書は、心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患の治療用医薬組成物の使用を特定するものであろう。AdipoR1 活性のアゴニストまたはAdipoR1 発現を上昇させる制御因子については、該指示書は、心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患の治療用医薬組成物の使用を特定するものであろう。
【０２７９】
AdipoR1のアンタゴニストは一般に当該技術分野で知られている方法を用いて作ることが出来る。具体的には、精製AdipoR1を抗体の産生または医薬ライブラリーのスクリーニングに用いて、AdipoR1に特異的に結合するものを同定すればよい。AdipoR1に対する抗体は当該技術分野で周知の方法を用いて作ることも出来る。かかる抗体にはこれらに限定されないが、以下が含まれる：ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖抗体、Fab 断片およびFab 発現ライブラリーにより産生された断片。中和抗体、例えば、二量体形成を阻害する抗体は治療用途に特に好ましい。
【０２８０】
本発明の別の態様においてAdipoR1をコードするポリヌクレオチド、またはその断片またはその相補鎖を治療目的に用いることが出来る。一つの側面において、AdipoR1をコードするポリヌクレオチドの相補鎖は、mRNAの転写を阻害するのが望ましい状況において使用すればよい。具体的には、細胞をAdipoR1をコードするポリヌクレオチドに相補的な配列で形質転換すればよい。したがって相補的分子または断片を用いてAdipoR1 活性を調節することができるし、遺伝子機能の制御を達成することが出来る。かかる技術は現在では当該技術分野で周知であり、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはより大きい断片を、AdipoR1をコードする配列のコード領域または制御領域にそった様々な位置から設計することが出来る。
【０２８１】
レトロウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスまたはワクシニアウイルスあるいは様々な細菌プラスミド由来の発現ベクターを、ヌクレオチド配列を標的化した器官、組織、または細胞集団に送達するのに用いることが出来る。当業者に周知の方法を用いて、AdipoR1をコードする遺伝子のポリヌクレオチドに相補的な核酸配列を発現するベクターを設計することが出来る。これらの技術は、例えば、 [Scott and Smith (1990) Science 249:386-390]に記載されている。
【０２８２】
上記のいずれの治療方法もかかる治療を必要とするあらゆる対象に適用することが出来、対象には、例えば、哺乳類、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルが含まれ、もっとも好ましくはヒトである。
【０２８３】
本発明のさらなる態様は、AdipoR1を医薬上許容される担体と組みあわせて含む、上記のいずれかの治療効果のための医薬組成物の投与に関する。かかる医薬組成物は以下からなるものであってよい：AdipoR1、AdipoR1に対する抗体、およびAdipoR1の疑似体、アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤。組成物は単独で投与してもよいし、少なくとも一つのその他の以下の剤と組み合わせて投与してもよい：例えば、 安定化化合物、これは以下のいずれの無菌、生体適合性医薬用担体中で投与してもよい：生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、および水。組成物は患者に単独で投与してもよいし、その他の剤、薬剤またはホルモンと組み合わせて投与してもよい。
【０２８４】
本発明の医薬組成物は、目的の投与経路に適合性となるよう製剤する。投与経路の例としては、以下が挙げられる：非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口(例えば、吸入)、経皮 (局所)、経粘膜、および直腸投与。非経口、皮内、または皮下施用のための溶液または懸濁液は以下の成分を含んでいてもよい: 無菌希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒; 抗細菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン; 抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム; キレート化剤、例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸; バッファー、例えば、アセテート、シトレートまたはホスフェート、および等張化剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。pHは酸または塩基、、例えば、塩酸または水酸化ナトリウムによって調整すればよい。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックでできたアンプル、使い捨てシリンジまたは反復投与バイアルに含めてもよい。
【０２８５】
注射用途に好適な医薬組成物には、無菌水溶液 (水可溶性)または分散液および無菌注射用溶液または分散液の即時調製のための無菌散剤が含まれる。静脈内投与に好適な担体には、生理的食塩水、静菌水、クレモフォア（Cremophor EM（商標））(BASF、Parsippany、N.J.)またはリン酸緩衝食塩水(PBS)が含まれる。いずれの場合も、組成物は無菌でなければならず、シリンジで扱える程度に流動性であるべきである。それは製造および貯蔵条件で安定でなければならず、微生物、例えば、細菌および真菌の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は溶媒または分散媒であってよく、例えば、水、エタノール、医薬上許容されるポリオール、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの好適な混合物が含まれる。例えば、コーティング、例えば、レシチンの使用により、分散液の場合は所望の粒径の維持により、そして界面活性剤の使用により、適度の流動性が維持され得る。微生物の作用の予防は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成されうる。多くの場合、組成物には好ましくは、等張化剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含める。注射用組成物の長期吸収は、組成物に、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによってもたらされうる。無菌注射用溶液は、所望の量の活性化合物 (例えば、ポリペプチドまたは抗体)を適当な溶媒に、所望により上記成分の１または組み合わせとともに組込み、滅菌ろ過することによって調製することが出来る。一般に、分散液は基本(basic)分散媒と上記のその他の所望の成分を含む無菌媒体に活性化合物を組み込むことによって調製される。無菌注射用溶液の調製用の無菌散剤の場合、調製の好ましい方法は、減圧乾燥および凍結乾燥であり、それによって、活性成分と前もって無菌ろ過したその溶液からのさらなる所望の成分との散剤が得られる。
【０２８６】
経口組成物は、一般に不活性希釈剤または食用担体を含む。それらをゼラチンカプセルに組み込むか、あるいは圧縮して錠剤にする。経口治療投与の目的で、活性化合物は賦形剤とともに組み込んでもよく、錠剤、トローチ剤、またはカプセルの形態にて使用される。経口組成物はまた、うがい薬として使用するため液体担体を用いて調製してもよく、ここで、液体担体中の化合物は経口投与され、うがい後はきだされるか、飲み込まれる。
【０２８７】
医薬上適合性の結合剤および/または アジュバント物質を組成物の一部として含めてもよい。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ剤などは以下の成分または類似の性質の化合物のいずれを含んでいてもよい: 結合剤、例えば、微晶質セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン;賦形剤、例えば、デンプンまたはラクトース、崩壊剤、例えば、アルギン酸、プリモゲル（Primogel）、またはトウモロコシデンプン; 滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステロート（sterotes）;流動促進剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素;甘味剤 、例えば、スクロースまたはサッカリン;あるいは香味剤 、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバー。
【０２８８】
吸入による投与のためには、化合物は、好適な推進剤、例えば、ガス、例えば、二酸化炭素を含む加圧容器またはディスペンザーあるいは噴霧器からのエアロゾルスプレーの形態で送達される。
【０２８９】
全身投与は経粘膜であっても経皮であってもよい。経粘膜または経皮投与のためには、障壁に浸透するのに適当な浸透剤を製剤に用いる。かかる浸透剤は一般に当該技術分野で知られており、例えば、経粘膜投与用には、界面活性剤、胆汁塩およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与はスプレー式点鼻薬または坐剤の使用により達成しうる。経皮投与のためには、活性化合物は、軟膏剤、軟膏、ゲルまたはクリームに、一般に当該技術分野で知られているようにして製剤される。
【０２９０】
化合物は坐剤(例えば、常套の坐剤基剤、例えば、カカオ脂およびその他のグリセリド)または直腸への送達のために停留かん腸の形態で調製してもよい。
【０２９１】
一つの態様において、活性化合物は体からの迅速な排出に対して化合物を保護する担体とともに調製してもよく、例えば、徐放性製剤、例えば移植片およびマイクロカプセル封入送達システムが挙げられる。生分解性、生体適合性ポリマーを用いればよく、例えば、 エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸が挙げられる。かかる製剤の調製方法は当業者に明らかである。材料は、Alza Corporation およびNova Pharmaceuticals、Inc.から購入してもよい。リポソーム懸濁液(例えば、ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体によって感染した細胞を標的とするリポソーム)も医薬上許容される担体として用いることが出来る。これらは当業者に知られた方法によって調製でき、例えば、U.S.4522811に記載されている。
【０２９２】
経口または非経口組成物は、各投与が容易であり投与の均一性が得られるため単位投与剤形に製剤するのが特に有益である。本明細書において用いる単位投与剤形とは、治療すべき対象への単位投与に好適な物理的に離れた単位をいう; 各単位は所望の医薬用担体との関係で所望の治療効果を生じるよう計算された規定された量の活性化合物を含む。本発明の単位投与剤形の決定は、活性化合物固有の特徴および達成すべき特定の治療効果によって決められ、それらに直接依存し、個体の治療のための活性化合物の配合の当該技術分野に独特の制限がある。
【０２９３】
投与指示書と共に、医薬組成物は容器、パック、またはディスペンザーに含めてもよい。AdipoR1 活性のアンタゴニスト、AdipoR1の発現を低下させる化合物、またはAdipoR1 シグナル伝達経路におけるタンパク質の発現または活性を低下させる化合物またはその組み合わせを含む医薬組成物については、投与指示書は、心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患への組成物の使用を特定する。AdipoR1 活性のアゴニスト、AdipoR1の発現を上昇させる化合物またはAdipoR1 シグナル伝達経路におけるタンパク質の発現または活性を上昇させる化合物あるいはその組み合わせを含む医薬組成物については、投与指示書は、心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患への組成物の使用を特定する。
【０２９４】
診断
別の態様において、AdipoR1に特異的に結合する抗体は、AdipoR1の発現を特徴とする障害の診断、または AdipoR1またはAdipoR1のアゴニスト、アンタゴニストおよび阻害剤で治療される患者のモニターのためのアッセイにおいて用いることが出来る。診断目的に有用な抗体は上記の治療薬と同様に調製すればよい。AdipoR1の診断アッセイには、ヒト体液または細胞または組織の抽出物におけるAdipoR1を検出するための抗体および標識を利用する方法が含まれる。抗体は修飾されていてもされていなくてもよく、共有結合または非共有結合にてレポーター分子によって標識化されているのがよい。上記にいくつか挙げた多数のレポーター分子は当該技術分野で知られており、利用することが出来る。
【０２９５】
AdipoR1の測定のための様々なプロトコール、例えば、ELISA、RIAおよびFACSが当該技術分野で知られており、変化したかまたは異常なレベルのAdipoR1 発現の診断の基礎を提供する。AdipoR1 発現の正常または標準値は、正常哺乳類対象、好ましくはヒトから採取した体液または細胞抽出物と、AdipoR1に対する抗体を複合体形成に好適な条件下で混合することにより確立される。標準の複合体形成量は様々な方法で定量でき、好ましくは光度測定手段によって定量する。組織診からの対象サンプルにおいて発現しているAdipoR1の量を標準値と比較する。標準値および対象値の差(deviation)は、疾患の診断のパラメーターを確立する。
【０２９６】
本発明の別の態様において、AdipoR1をコードするポリヌクレオチドを診断目的に使うことができる。使用できるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的 RNAおよび DNA 分子およびPNAが含まれる。ポリヌクレオチドは、AdipoR1の発現が疾患と関連しうる組織診において遺伝子発現を検出および定量するのに用いることが出来る。診断アッセイはAdipoR1の非存在、存在、および過剰の発現を識別するのに用いられ、治療的介入の際のAdipoR1 レベルの制御をモニターするのにも用いられる。
【０２９７】
AdipoR1をコードするポリヌクレオチド配列は、AdipoR1の発現に関連する心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患の診断に用いることが出来る。AdipoR1をコードするポリヌクレオチド配列は以下においてに用いることが出来る：サザン、ノザン、またはドットブロット分析、あるいはその他の膜に基づく技術; PCR 技術;ディップスティック、ピン、およびELISA アッセイ;ならびに患者組織診からの体液または組織を用いるAdipoR1 発現の変化の検出のためのマイクロアレイ。かかる定性的または定量的方法は当該技術分野で周知である。
【０２９８】
特定の側面において、AdipoR1をコードするヌクレオチド配列は、関連する障害、特に上記の障害の存在を検出するアッセイに有用であり得る。AdipoR1をコードするヌクレオチド配列は標準的方法で標識してよく、そして、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で患者からの体液または組織サンプルに添加する。好適なインキュベーション期間の後、サンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者サンプルにおけるシグナル量が対応する対照サンプルにおけるものから有意に変化している場合、ヌクレオチド配列はサンプル中のヌクレオチド配列にハイブリダイズしており、サンプル中のAdipoR1をコードするヌクレオチド配列のレベル変化の存在は、関連する障害の存在を示す。かかるアッセイは動物実験、臨床試験または個々の患者の治療のモニターにおける特定の治療法の有効性を評価するのに利用できる。
【０２９９】
AdipoR1の発現に関連する心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患の診断の基礎を提供するために、発現についての正常または標準プロファイルを確立する。これは、動物またはヒトのいずれかの正常対象から採取した体液または細胞抽出物と、AdipoR1をコードする配列またはその断片とを、ハイブリダイゼーションまたは増幅に好適な条件下で混合することにより達成しうる。正常対象から得た値と実質的に純粋なポリヌクレオチドを既知の量用いた実験からの値とを比較することによって標準ハイブリダイゼーションを定量する。正常サンプルから得た標準値を障害症状を示す患者からのサンプルから得た値と比較する。標準値からの差を用いて障害の存在を証明する。
【０３００】
目的タンパク質に対する好適な結合アフィニティーを有する化合物のハイスループットスクリーニングを提供するのに用い得る薬剤スクリーニングの別の技術は公開PCT出願WO84/03564に記載されている。この方法において、多数の異なる低分子被験化合物を固体基体、例えば、プラスチックピンまたはその他の表面上で合成する。被験化合物を AdipoR1、またはその断片と反応させ、洗浄する。結合したAdipoR1を次いで当該技術分野で周知方法によって検出する。精製AdipoR1を上記薬剤スクリーニング技術における使用のためにプレートに直接コーティングしてもよい。あるいは、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、それを固体支持体に固定化する。
【０３０１】
別の態様において、AdipoR1に結合することが出来る中和抗体が、AdipoR1との結合について被験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイを用いてもよい。このようにして、抗体を用いて、AdipoR1と１以上の抗原決定基を共有するペプチドの存在を検出することが出来る。
【０３０２】
Gタンパク質共役受容体は哺乳類宿主において広範に分布し、多くの病態を含む生物学的機能の原因である。したがって、一方でGタンパク質共役受容体を刺激し、他方でGタンパク質共役受容体の機能を阻害することが出来る化合物および薬剤を見いだすことが望ましい。例えば、Gタンパク質共役受容体を活性化する化合物を治療目的に用いることが出来、例えば、喘息、パーキンソン病、急性心不全、尿閉、および骨粗鬆症の治療に用いることが出来る。具体的には、本発明の受容体を活性化する化合物は、様々な心血管性の病気、例えば、肺血流量の不足または高血圧によって起こる病気の治療に有用である。さらにこれら化合物は、液体および電解質恒常性の異常制御に関連する様々な生理障害の治療および異常なアンジオテンシン誘導性アルドステロン分泌に関連する疾患の治療に用いることが出来る。
【０３０３】
一般に、Gタンパク質共役受容体の活性化を阻害する化合物は様々な治療目的、例えば、とりわけ以下の治療目的に使用することができる：低血圧および/または高血圧、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、良性前立腺肥大、および精神および神経学的障害、例えば、統合失調症、躁病性興奮、抑欝、譫妄、認知症または重症精神遅滞、ジスキネジー、例えば、ハンチントン病またはトゥレット症候群。Gタンパク質共役受容体を阻害する化合物は、内因性拒食症の抑制および過食症の制御においても有用である。
【０３０４】
治療的有効量の決定
治療的有効量の決定は当業者の能力の範囲内である。治療的有効量とは、治療的有効量の非存在下でのAdipoR1 活性と比べてAdipoR1 活性を上昇または低下させる活性成分の量である。いずれの化合物についても、治療的有効量は、まず細胞培養アッセイまたは動物モデル、通常、マウス、ウサギ、イヌまたはブタにおいて評価しうる。動物モデルは、適当な濃度範囲および投与経路の判定にも利用できる。かかる情報を、ヒトにおける投与のための有効量および経路を判定するために利用できる。
【０３０５】
治療効力および毒性、例えば、ED50（集団の50%に治療的に有効な用量)およびLD50 (集団の50%に致死的な用量)は、細胞培養または実験動物において標準的薬学手法によって決定できる。毒性効果と治療効果との用量比が治療指数であり、それは比、LD50/ED50として表される。高い治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得たデータを用いてヒト用の用量範囲を計算する。かかる組成物に含まれる用量は、好ましくはED50を含み毒性がほとんどまたはまったくない循環濃度の範囲内である。用量は、用いる剤形、患者の感受性、および投与経路に依存してこの範囲内で変動する。正確な用量は、治療を要求する対象に関連する因子を鑑みて医師が決定する。用量および投与は、活性成分の十分なレベルの提供または所望の効果の維持の提供のために調節する。考慮しうる因子としては、以下が挙げられる：疾患状態の重篤度、対象の全体的な健康、対象の年齢、体重、および性別、食事、投与の時期および頻度、組み合わされる薬剤、反応感受性、および治療に対する耐性/応答。長時間作用医薬組成物は特定の製剤の半減期およびクリアランス率に応じて3 〜4日間に１回、毎週１回、または２週間に１回投与すればよい。
【０３０６】
正常用量は0.1 mg〜100,000 mgで変動し得、全用量は約 1 gまでであり、投与経路に依存する。特定の用量および送達方法についての教示は文献に提供されており、当該技術分野の医師に一般に入手可能である。当業者はヌクレオチドについての製剤とタンパク質またはその阻害剤についての製剤を異なるものとするであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、症状、位置などに特異的となるであろう。もし試薬が一本鎖抗体であれば、抗体をコードするポリヌクレオチドを構築し、エキソビボまたはインビボでよく確立した以下を含むがそれらに限定されない技術を用いて細胞に導入する：トランスフェリン-ポリカチオン-媒介DNA送達、裸（naked）またはカプセル封入された（encapsulated）核酸によるトランスフェクション、リポソーム-媒介細胞融合、DNA-被覆ラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、エレクトロポーレーション、「遺伝子銃」および DEAE-またはリン酸カルシウム-媒介トランスフェクション。
【０３０７】
発現産物がmRNAの場合、試薬は好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムである。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを発現するポリヌクレオチドを上記のように様々な方法によって細胞に導入することが出来る。好ましくは、試薬はAdipoR1の遺伝子発現またはAdipoR1の活性を試薬の非存在の場合と比べて少なくとも 約 10、好ましくは 約 50、より好ましくは 約 75、90、または100%低下させる。AdipoR1の遺伝子発現またはAdipoR1の活性のレベルを低下させるために選択した機構の有効性は当該技術分野で周知の以下のような方法を用いて評価できる：例えば、ヌクレオチドプローブのAdipoR1-特異的 mRNAへのハイブリダイゼーション、定量的 RT-PCR、AdipoR1の免疫学的検出またはAdipoR1 活性の測定。
【０３０８】
上記のいずれの態様においても、本発明のいずれの医薬組成物も、その他の適当な治療薬と組み合わせて投与することが出来る。併用療法での使用に適当な薬剤の選択は当業者によって常套の薬学の原則にしたがってなし得る。治療薬の組み合わせは、様々な上記の障害の治療または予防に相乗的効果を与えるように作用しうる。このアプローチを用いて、より低い用量の各薬剤により治療効力を達成することが出来、それによって有害な副作用の可能性を低下させうる。上記のいずれの治療方法をかかる治療を必要とする対象に適用してもよく、対象としては、例えば、哺乳類、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルが挙げられ、もっとも好ましくは、ヒトである。
【０３０９】
本発明の核酸分子は以下からなる核酸分子の群に含まれる核酸分子である。
(i)配列番号2のアミノ酸配を含むポリペプチドをコードする核酸分子、
(ii) 配列番号1の配列を含む核酸分子、
(iii)配列番号1の配列を有する核酸分子、
(iv)その相補鎖がストリンジェントな条件下で(i)、(ii)、または(iii)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子;および、
(v)その配列が遺伝暗号の縮重により(iii)の核酸分子の配列と異なっている核酸分子、ここで該核酸分子によってコードされる該ポリペプチドは AdipoR1 活性を有する。
【０３１０】
本発明のポリペプチドは以下からなるポリペプチドの群に含まれるポリペプチドである。
(i)配列番号2の配列を有するポリペプチド、
(ii)配列番号2の配列を含むポリペプチド、
(iii)本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチド、および、
(iv) (i)、(ii)、または(iii)のポリペプチドに対して少なくとも 99%、98%、95%、90%、または80%の相同性を示すポリペプチド、ここで該精製ポリペプチドはAdipoR1 活性を有する。
【０３１１】
本発明の目的は、哺乳類における心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患からなる疾患の群に含まれる疾患の治療に有用な治療薬のスクリーニング方法であり、以下の工程を含む。
(i)被験化合物とAdipoR1 ポリペプチドとを接触させる工程、および、
(ii)該被験化合物の該AdipoR1 ポリペプチドに対する結合を検出する工程。
例えば、AdipoR1 ポリペプチドに結合する化合物はかかる疾患の潜在的治療薬であると同定される。
【０３１２】
本発明の別の目的は、哺乳類における心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患からなる疾患の群に含まれる疾患の治療に有用な治療薬のスクリーニング方法であり、以下の工程を含む。
(i)特定の濃度の被験化合物の存在下または該被験化合物の非存在下でのAdipoR1 ポリペプチドの活性を測定する工程、および、
(ii) 異なる濃度の該被験化合物の存在下での該ポリペプチド活性を測定する工程。
例えば、 (i)および(ii)においてAdipoR1 ポリペプチド活性の差異をもたらす化合物はかかる疾患の潜在的治療薬であると同定される。
【０３１３】
本発明の別の目的は、哺乳類における心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患からなる疾患の群に含まれる疾患の治療に有用な治療薬のスクリーニング方法であり、以下の工程を含む。
(i) 特定の濃度の被験化合物の存在下でAdipoR1 ポリペプチド活性を測定する工程、および、
(ii) AdipoR1 ポリペプチドの制御因子であることが知られている化合物の存在下でAdipoR1 ポリペプチド活性を測定する工程。
例えば、(ii)に用いた化合物と比較して(i) におけるAdipoR1 ポリペプチド活性に同様な効果を示す化合物はかかる疾患の潜在的治療薬であると同定される。
【０３１４】
本発明の別の目的は、接触工程が、細胞内または細胞表面で行われる上記の方法である。
【０３１５】
本発明の別の目的は細胞がインビトロにある上記の方法である。
【０３１６】
本発明の別の目的は、接触工程が無細胞システムで行われる上記の方法である。
【０３１７】
本発明の別の目的は、ポリペプチドが検出可能標識と結合している上記の方法である。
【０３１８】
本発明の別の目的は、化合物が検出可能標識と結合している上記の方法である。
【０３１９】
本発明の別の目的は、ポリペプチドに最初に結合していたリガンドを被験化合物が置換する上記の方法である。
【０３２０】
本発明の別の目的は、ポリペプチドが固体支持体に結合している上記の方法である。
【０３２１】
本発明の別の目的は、化合物が固体支持体に結合している上記の方法である。
【０３２２】
本発明の別の目的は、哺乳類における心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患からなる疾患の群に含まれる疾患の治療に有用な治療薬のスクリーニング方法であり、以下の工程を含む。
(i)被験化合物とAdipoR1 ポリヌクレオチドとを接触させる工程、および、
(ii)該被験化合物と該AdipoR1 ポリヌクレオチドとの結合を検出する工程。
例えば、AdipoR1 ポリヌクレオチドに結合する化合物は、かかる疾患の治療のための潜在的治療薬である。
【０３２３】
本発明の別の目的は、核酸分子がRNAである上記の方法である。
【０３２４】
本発明の別の目的は、接触工程が細胞内または細胞表面で行われる上記の方法である。
【０３２５】
本発明の別の目的は、接触工程が無細胞システムで行われる上記の方法である。
【０３２６】
本発明の別の目的は、ポリヌクレオチドが検出可能標識と結合している上記の方法である。
【０３２７】
本発明の別の目的は、被験化合物が検出可能標識と結合している上記の方法である。
【０３２８】
本発明の別の目的は、哺乳類における心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患からなる疾患の群に含まれる、疾患を診断する方法であり、以下の工程を含む。
(i)該哺乳類から採取したサンプル中のAdipoR1 ポリヌクレオチドの量を測定する工程、および、
(ii)健康および/または疾患哺乳類におけるAdipoR1 ポリヌクレオチドの量を測定する工程。
例えば、疾患哺乳類と比較して該被験哺乳類におけるAdipoR1 ポリヌクレオチドの量が実質的に同等である場合に疾患であると診断される。
【０３２９】
本発明の別の目的は、哺乳類における心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患からなる疾患の群に含まれる疾患の治療のためであり、AdipoR1 ポリペプチドに結合する治療薬を含む医薬組成物である。
【０３３０】
本発明の別の目的は、哺乳類における心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患からなる疾患の群に含まれる疾患の治療のためであり、AdipoR1 ポリペプチド活性を調節する治療薬を含む医薬組成物である。
【０３３１】
本発明の別の目的は、哺乳類における心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患からなる疾患の群に含まれる疾患の治療のためのAdipoR1 ポリペプチド活性を調節する治療薬を含む医薬組成物であり、ここで、該治療薬は、(i)低分子、(ii)RNA 分子、(iii)アンチセンスオリゴヌクレオチド、(iv)ポリペプチド、(v)抗体、または(vi)リボザイムである。
【０３３２】
本発明の別の目的は、哺乳類における心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患からなる疾患の群に含まれる疾患の治療のための、AdipoR1 ポリヌクレオチドを含む医薬組成物である。
【０３３３】
本発明の別の目的は、哺乳類における心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患からなる疾患の群に含まれる疾患の治療のための、AdipoR1 ポリペプチドを含む医薬組成物である。
【０３３４】
本発明の別の目的は、哺乳類における心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患からなる疾患の群に含まれる疾患の治療のための医薬組成物の調製のためのAdipoR1の制御因子の使用である。
【０３３５】
本発明の別の目的は、哺乳類における心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患からなる疾患の群に含まれる疾患の治療に有用な医薬組成物の調製方法であり、以下の工程を含む。
(i) AdipoR1の制御因子を同定する工程、
(ii)該制御因子が、哺乳類における心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患からなる疾患の群に含まれる疾患症状を改善するかを判定する工程;および、
(iii)該制御因子と許容される医薬用担体とを混合する工程。
【０３３６】
本発明の別の目的は、心循環器疾患、皮膚病、胃腸疾患、癌、血液病、炎症、呼吸器疾患、神経系疾患および泌尿器疾患からなる疾患の群に含まれる疾患を有する哺乳類におけるAdipoR1 活性の制御のためのAdipoR1の制御因子の使用である。
【０３３７】
以下の実施例は本発明の例示のために提供される。これら実施例は例示のためであり、本発明を制限する目的で含めているのではない。
【０３３８】
心血管および炎症関連組織におけるヒトAdipoR1の発現は(上記のように)、特定の、しかし限定されない、炎症および心循環器疾患の診断および調節のためのAdipoR1の利用を示唆する。さらに上記の発現は、限定されないが、皮膚病、内分泌疾患、代謝性疾患、癌、胃腸疾患および血液病に対するAdipoR1の利用を示唆する。
【実施例】
【０３３９】
実施例 1:公共配列データベースにおける相同的配列のサーチ
相同性の程度は、公知方法によって容易に計算することが出来る。相同性を判定する好ましい方法は試験する配列の間に最大のマッチを与えるよう設計される。相同性の決定方法は、公共のコンピュータプログラム、例えば、 BestFit、BLASTP、BLASTN、およびFASTAにおいて体系化されている。BLAST プログラムは、NCBIおよびその他のインターネットから公表されている公共のものである。
【０３４０】
AdipoR1について、既知の配列に対する以下のようなヒットがBLAST アルゴリズム [Altschul SF、Madden TL、Schaffer AA、Zhang J、Zhang Z、Miller W、Lipman DJ; Nucleic Acids Res 1997 Sep 1; 25(17): 3389-402]および以下のセットのパラメーターを用いて同定された: マトリックス = BLOSUM62および低複雑性 フィルター。以下のデータベースをサーチした: NCBI (非重複データベース)およびDERWENTパテントデータベース (Geneseq)。
【０３４１】
以下のヒットが見つかった:
>gb|BC001594.2| Homo sapiens adiponectin receptor 1, mRNA (cDNA clone MGC:710IMAGE:2988737), complete cds
Length = 2084, Score = 3905 bits (2031), Expect = 0.0, Identities = 2050/2063 (99%), Gaps = 1/2063 (0%)
>NA2002:ABL90322 Abl90322 Human polynucleotide SEQ ID NO 884. 5/2002
Length = 2155, Score = 3897 bits (2027), Expect = 0.0, Identities = 2048/2064 (99%), Gaps = 2/2064 (0%)
>NA2001A:AAF81745 Aaf81745 Human membrane associated protein MEMAP-5encoding cDNA. 6/2001
Length = 2124, Score = 3890 bits (2023), Expect = 0.0, Identities = 2049/2063 (99%), Gaps = 2/2063 (0%)
>emb|AX083500.1| Sequence 42 from Patent WO0112662
Length = 2124, Score = 3890 bits (2023), Expect = 0.0, Identities = 2049/2063 (99%), Gaps = 2/2063 (0%)
>NA2001A:AAK52767 Aak52767 Human polynucleotide SEQ ID NO 2296.11/2001
Length = 2025, Score = 3794 bits (1973), Expect = 0.0, Identities = 1993/2009 (99%)
>NA2001A:AAH14354 Aah14354 Human cDNA sequence SEQ ID NO:11748. 6/2001
Length = 1877, Score = 3542 bits (1842), Expect = 0.0, Identities = 1846/1848 (99%)
>dbj|BD156346.1| Primer for synthesizing full-length cDNA and use thereof
Length = 1877, Score = 3542 bits (1842), Expect = 0.0, Identities = 1846/1848 (99%)
>NA2000:AAZ65262 Aaz65262 Human secreted protein gene 13. 3/2000
Length = 1583, Score = 2913 bits (1515), Expect = 0.0, Identities = 1540/1556 (98%), Gaps = 1/1556 (0%)
>dbj|BD205645.1| 97 human secreted proteins
Length = 1583, Score = 2913 bits (1515), Expect = 0.0, Identities = 1540/1556 (98%), Gaps = 1/1556 (0%)
>NA2001A:AAK51783 Aak51783 Human polynucleotide SEQ ID NO 328. 11/2001
Length = 1347, Score = 2546 bits (1324), Expect = 0.0, Identities = 1326/1327 (99%)
【０３４２】
実施例 2:発現プロファイリング
細胞の全RNAを２つの以下の標準的方法のいずれかのよって細胞から単離した: 1) グアニジンイソチオシアナート/塩化セシウム密度勾配遠心分離 [Kellogg、(1990)] ; または、製造業者の指示書にしたがったTri-試薬プロトコールの使用(Molecular Research Center、Inc.、Cincinatti、Ohio)。Tri-試薬プロトコールにより調製した全RNAをDNAse Iで処理して、ゲノムDNAのコンタミネーションを除いた。
【０３４３】
AdipoR1のmRNA 分布の相対的定量のために、各細胞または組織源からの全RNAをまず逆転写した。85μgの全RNAを以下を用いて逆転写した：1μMランダムヘキサマープライマー、各0.5 mM dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP (Qiagen、Hilden、Germany)、3000 U RnaseQut (Invitrogen、Groningen、Netherlands)、 最終容積680 μl。第一鎖合成 バッファーおよびOmniscript 逆転写酵素 (2 u/μl)はQiagen、Hilden、Germanyから得た。反応を37℃で90 分間インキュベートし、氷上で冷却した。容積を水で6800 μlに調整し、終濃度 12.5 ng/μlの出発RNAを得た。
【０３４４】
細胞および組織におけるAdipoR1 mRNA分布の相対的定量のために、Applied Biosystems 7900 HT 配列検出システムまたはBiorad iCyclerを製造業者の指示書およびプロトコールにしたがって用いた。PCR 反応はAdipoR1およびハウスキーピング遺伝子 HPRT (ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ)、GAPDH (グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ)、β-アクチンその他、を定量するために設定した。フォワードおよびリバースプライマーおよびAdipoR1用プローブはPerkin Elmer ABI Primer Express（商標）ソフトウエアを用いて設計し、TibMolBiol (Berlin、Germany)によって合成した。AdipoR1 フォワードプライマー配列は: プライマー1 (配列番号3)であった。AdipoR1 リバースプライマー配列はプライマー2 (配列番号4)であった。プローブ1 (配列番号5)は、レポーター色素としてFAM (カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル)で、クエンチャーとしてTAMRA (カルボキシテトラメチルローダミン)で標識し、AdipoR1用プローブとして用いた。以下の試薬を合計25μlとなるよう調製した: 1x TaqMan バッファー A、5.5 mM MgCl2、200 nM dATP、dCTP、dGTP、およびdUTP、0.025 U/μl AmpliTaq Gold（商標）、0.01 U/ μl AmpErase およびプローブ1 (配列番号4)、それぞれ200 nM、AdipoR1 フォワードおよびリバースプライマー、200 nM AdipoR1 FAM/TAMRA-標識化プローブ、および5μlテンプレート cDNA。サーマルサイクラーパラメーターは、2分50℃、次いで10分95℃、次いで40サイクルの、融解95℃15秒およびアニーリング/伸長60℃1分。
【０３４５】
補正した CT 値の算出
CT (サイクル閾値) 値は「核酸の定量」の節で記載したとおりに算出する。CF-値 (サイクル閾値補正因子)は以下のように算出する:
1.PCR 反応を各cDNAサンプルについてハウスキーピング遺伝子 (HKG)を定量するよう設定した。
2.CTHKG-値(ハウスキーピング遺伝子のサイクル閾値) は「核酸の定量」の節で記載したとおりに算出した。
3.各cDNAについてのすべてのHKGのCTHKG-平均値(１つのcDNAに対して試験したすべてのHKGのCT 平均値)を算出する(n = HKGの数):
CTHKG-n-平均値 = (CTHKG1-値 + CTHKG2-値 +...  + CTHKG-n-値) / n 
4.CTパネル 平均値 (試験したすべてのcDNAにおけるすべてのHKGのCT 平均値) = 
(CTHKG1-平均値 + CTHKG2-平均値 +...+ CTHKG-y-平均値) / y
(y = cDNAの数)
5.CFcDNA-n (cDNA nについての補正因子) = CTパネル-平均値 - CTHKG-n-平均値 
6.CTcDNA-n (cDNA nについての試験した遺伝子のCT 値) + CFcDNA-n (cDNA nについての補正因子) = CTcor-cDNA-n (cDNA nに対する遺伝子についての補正した CT 値)
【０３４６】
相対発現の算出
定義 :最高CTcor-cDNA-n≠ 40 を、CTcor-cDNA [high]と定義する。
相対発現 = 2(CTcor-cDNA[high] - CTcor-cDNA-n)
【０３４７】
組織
AdipoR1の発現を表1に挙げる組織において調査した。
【０３４８】
発現プロファイル
mRNA-定量の結果(発現プロファイリング)を表1に示す。
表1: 様々なヒト組織におけるAdipoR1の相対発現
【表１−１】
2007506951.tif 000002
【表１−２】
2007506951.tif 000003
【表１−３】
2007506951.tif 000004
【表１−４】
2007506951.tif 000005
【表１−５】
2007506951.tif 000006
【表１−６】
2007506951.tif 000007
【表１−７】
2007506951.tif 000008
【表１−８】
2007506951.tif 000009
【表１−９】
2007506951.tif 000010
【表１−１０】
2007506951.tif 000011
【表１−１１】
2007506951.tif 000012
【表１−１２】
2007506951.tif 000013
【表１−１３】
2007506951.tif 000014
【表１−１４】
2007506951.tif 000015
【０３４９】
実施例 3:アンチセンス 分析 
AdipoR1をコードする正確な完全cDNA配列を知ることにより、その使用は遺伝子機能の研究におけるアンチセンス技術のためのツールとなりうる。AdipoR1をコードするポリヌクレオチドのアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチド、cDNAまたはゲノム断片は、mRNAの翻訳のインビトロまたはインビボでの阻害に有用である。かかる技術は現在当該技術分野で周知であり、アンチセンス分子は、ヌクレオチド配列に渡って様々な位置で設計することが出来る。細胞または試験動物体のかかるアンチセンス配列での処理により、目的遺伝子は有効に阻害される。しばしば、遺伝子の機能が、細胞内、細胞、組織または生物レベルでの挙動を観察することにより確認される (例えば、致死性、分化機能の喪失、形態変化など)。
【０３５０】
特定のオープンリーディングフレームの転写を阻害するために構築した配列の使用に加えて、遺伝子発現の修飾が以下に対するアンチセンス配列の設計により達成される：イントロン領域、プロモーター/エンハンサー要素、そしてまた、トランス作用制御因子遺伝子。
【０３５１】
実施例 4:AdipoR1の発現 
AdipoR1の発現は、cDNAを適当な発現ベクターにサブクローニングし、ベクターを発現宿主、例えば、大腸菌にトランスフェクトすることによって達成される。特定の場合には、ベクターを操作して以下を含むようにする：クローニングサイト上流のβ-ガラクトシダーゼプロモーター、そして、アミノ末端メチオニンおよび続くβ-ガラクトシダーゼの７残基を含む配列。これら８残基の直後に、操作により人工的なプライミングと転写に有用なバクテリオファージプロモーターを含むようし、クローニングのための多数の特有のエンドヌクレアーゼ制限部位が提供されるようにする。
【０３５２】
標準的方法を用いたイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド (IPTG)によるトランスフェクトされた単離細菌株の誘導により、β-ガラクトシダーゼの最初の７残基、「リンカー」の約 15 残基、およびcDNAにコードされるペプチドに対応する融合タンパク質が産生される。cDNA クローンインサートは実質的にランダムな方法により作られるため、誘導されたcDNAが正しい翻訳のための正しいリーディングフレームにて存在する可能性は33%である。cDNAが正しいリーディングフレームにないときは、以下の周知の方法を用いて適当な数の塩基を欠失または挿入すればよい：インビトロ突然変異誘発、エキソヌクレアーゼ IIIまたはマング・ビーン・ヌクレアーゼ消化、あるいは適当な長さのオリゴヌクレオチドリンカーの包含。
【０３５３】
AdipoR1 cDNAは特定の宿主におけるタンパク質の発現に有用であることが知られている別のベクターに移される。クローニングサイトおよび標的 cDNAの両端のストレッチにハイブリダイズするのに十分なDNA (約 25 塩基) セグメントを含むオリゴヌクレオチドプライマーを標準的方法によって化学合成する。これらプライマーを次いでPCRによって所望の遺伝子セグメントを増幅するのに用いる。その結果得られる遺伝子セグメントを適当な制限酵素で標準的条件下で消化し、ゲル電気泳動で単離する。あるいは、同様の遺伝子セグメントが適当な制限酵素によるcDNA の消化により生成する。適当なプライマーを用いて、２以上の遺伝子からのコード配列セグメントをライゲーションし、適当なベクターにクローニングする。かかるキメラ配列の構築により発現を最適化することが可能である。
【０３５４】
かかるキメラ分子に好適な発現宿主にはこれらに限定されないが、以下が含まれる：哺乳類細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO)およびヒト 293 細胞、昆虫細胞、例えば、Sf9 細胞、酵母細胞、例えば、サッカロマイセス・セレヴィシエおよび細菌細胞、例えば、大腸菌。これら細胞システムのそれぞれのために、有用な発現ベクターは、細菌の増殖を可能とする複製起点、および細菌におけるプラスミド選択を可能とするβ-ラクタマーゼ 抗生物質耐性遺伝子のような選択可能マーカーも含む。さらに、ベクターは、トランスフェクトされた真核宿主細胞における選択を可能とするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のような第二の選択可能マーカーを含んでいてもよい。真核発現宿主に使用するベクターは、目的のcDNA の一部になければ、RNA プロセシング要素、例えば、3' ポリアデニル化配列も必要とする。
【０３５５】
さらに、ベクターは、遺伝子発現を上昇させるプロモーターまたはエンハンサーを含む。かかるプロモーターは宿主特異的であり、以下が含まれる：CHO 細胞には、MMTV、SV40、およびメタロチオネインプロモーター; 細菌宿主には、trp、lac、tac およびT7 プロモーター; 酵母には、アルファ因子、アルコールオキシダーゼおよびPGH プロモーター。転写エンハンサー、例えば、ラウス肉腫ウイルス エンハンサーは哺乳類宿主細胞において用いられる。組換え細胞の均質な培養がいったん標準的培養方法によって得られたら、大量の組換え産生AdipoR1が培養上清から回収され、当該技術分野で知られているクロマトグラフィー方法を用いて分析される。例えば、AdipoR1は例証したように発現ベクター pcDNA3にクローニングすればよい。この産物を用いて、例えば、HEK293またはCOSを当該技術分野で標準的な方法により形質転換すればよい。具体的には、例えば、リポフェクタミン (Gibco BRL カタログ番号18324-020)媒介遺伝子トランスファーを用いる。
【０３５６】
実施例 5:組換え AdipoR1の単離
AdipoR1はタンパク質精製を促進にするため追加された１以上のさらなるポリペプチドドメインとのキメラタンパク質として発現する。かかる精製促進ドメインにはこれらに限定されないが、以下が含まれる：固定化した金属上での精製を可能とする金属キレート化ペプチド、例えば、ヒスチジン-トリプトファンモジュール [Appa Rao、1997] およびFLAGS 伸長/アフィニティー精製システムに用いられるドメイン (Immunex Corp.、Seattle、Washington)。切断可能リンカー配列、例えば、活性化第X因子またはエンテロキナーゼ (Invitrogen、Groningen、The Netherlands) を精製ドメインとAdipoR1 配列の間に含めることは、AdipoR1の発現の促進に有用である。
【０３５７】
実施例 6:キメラ GPCRの試験
機能性キメラGPCRを新規アイソフォームの細胞外受容体配列と既知のアイソフォームの膜貫通および細胞内セグメントと試験目的で組みあわせることにより構築する。この概念はKobilka et al.  (1988)、Science 240:1310-1316に示されており、Kobilkaらは、徐々に多くなるα2-AR 膜貫通配列をβ2-ARに挿入することによって一連のキメラα2-β2 アドレナリン受容体 (AR)を作成した。分子のβ2 立体配座よりもα2立体配座を多くするほど、既知のアゴニストの結合活性は変化し、中間のコンストラクトは混合した特異性を示した。しかしアンタゴニストの結合特異性は、ドメイン VIIのソースと相関していた。リガンド認識のための T7G ドメイン VIIの重要性は、２つの酵母 α-因子受容体を用いたキメラにおいても見いだされ、酵母受容体は種々雑多な受容体として分類されるため重要である。したがって、特定のドメインの機能的役割は、カテゴリーに拘わらずGPCR ファミリーの間で保存されているようである。
【０３５８】
同じように並行して、特定のアイソフォームからの細胞内セグメントまたは細胞質ドメインを既知のGPCRの類似のドメインにより交換し、三量体Gタンパク質への受容体の結合に関与する構造的決定要因を同定するのに用いた。β2-ARからのドメインV、VI、および細胞内連結ループがα2-ARに置換されたキメラ受容体を用いると、α2-AR 特異性によりリガンドに結合するが、β2-AR の様式でアデニル酸シクラーゼを刺激することが示された。これは、アドレナリン作動型受容体では、Gタンパク質の認識はドメインVおよびVIならびに連結ループに存在することを示す。逆の状況を予測し、α1-ARからのV->VIループによりβ2-ARの対応するドメインを置換したキメラについて観察したところ、結果として得られた受容体はβ2-AR 特異性によってリガンドに結合し、α1-ARの様式でGタンパク質-媒介ホスファチジルイノシトールターンオーバーを活性化した。最後に、ムスカリン受容体から構築したキメラでも、V->VI ループがGタンパク質活性の特異性の主な決定要因であることが示された。
【０３５９】
細胞外および膜貫通領域に置換を含むキメラまたは修飾GPCRは、受容体のこれらの部分が、リガンド結合特異性を決定することを示した。例えば、すべてのアドレナリンおよびD カテコールアミンGPCRのドメイン Vにおいて保存されている２つのセリン残基が強力なアゴニスト活性に必要である。これらセリンはGPCR 結合部位内のアゴニストのカテコール部分と水素結合を形成していると考えられている。同様に、すべてのGPCRのドメイン IIIに存在し、生体アミンに結合するAsp 残基は、GPCR 結合部位のリガンドアミン基とイオン対を形成していると考えられている。
【０３６０】
機能的な、クローニングされたGPCRを異種発現システムで発現させ、その生物学的活性を評価する。１つの異種システムでは、哺乳類GPCRと哺乳類Gタンパク質との遺伝子を酵母細胞に導入する。GPCRは適当なリガンド特異性およびアフィニティーを有しており、酵母細胞の適当な生物学的活性化 (増殖停止および形態変化)を引き起こすことが示される。
【０３６１】
キメラ受容体を試験する別の手法は、プリン受容体 (P2u)を利用する手法に基づく。機能はK562 ヒト 白血病培養細胞にて容易に試験される。というのはこれら細胞はP2u 受容体を欠いているためである。K562 細胞を正常またはキメラ P2uのいずれかを含む発現ベクター でトランスフェクトし、Ca++に対する蛍光プローブであるfura-aを添加(load)する。正しくアセンブリーされ、機能的なP2u 受容体の、細胞外 UTPまたはATPによる活性化が細胞内 Ca++を動員し、それがfura-aと反応し、分光蛍光法により測定される。
【０３６２】
上記GPCRと同様に、いずれかの新規なGPCR ポリペプチドの細胞外受容体セグメントの配列と既知のP2u 分子の膜貫通および細胞内セグメントに対するヌクレオチドとを混合してキメラ遺伝子を作成する。適当なリガンドを含むマイクロウェルにトランスフェクトされた K562 細胞を添加する(bath)ことにより、GPCR 分子のエフェクターを特徴づける結合および蛍光活性が導かれる。いったんリガンドと機能が確立すれば、P2u システムは、結合を阻害し、かかる蛍光反応を予防する、アンタゴニストまたは阻害剤を規定するのに有用である。 
【０３６３】
実施例 7: AdipoR1 特異的抗体の産生
２つのアプローチを用いてAdipoR1に対する抗体を作り、各アプローチはポリクローナルまたはモノクローナル抗体の作成に有用である。１つのアプローチにおいて、逆相 HPLC 分離から75 mgもの量の変性タンパク質を得る。この変性タンパク質を用いて標準的プロトコールによりマウスまたはウサギを免疫する; 約 100μgがマウスの免疫化に適当であり、ウサギの免疫には1 mgも使用しなければならない。マウスハイブリドーマを同定するために、変性タンパク質を放射ヨウ素標識し、抗体を産生する潜在的マウスB-細胞ハイブリドーマをスクリーニングする。この手法では、少量のタンパク質しか必要でなく、20 mgが数千のクローンの標識とスクリーニングに十分である。
【０３６４】
第二のアプローチにおいて、cDNAの翻訳から推定した適当な AdipoR1 ドメインのアミノ酸配列を分析して抗原性の高い領域を決定する。適当な親水性領域を含むオリゴペプチドを合成し、好適な免疫化 プロトコールに用いて抗体を作成する。免疫化に最適なアミノ酸配列は通常、タンパク質がその天然の立体配座をとる場合に外部環境に曝されると考えられるポリペプチドのC-末端、N-末端および親水性領域である介在配列である。
【０３６５】
典型的には、約 15 残基長の分泌ペプチドを、fmoc-化学を利用するApplied Biosystems ペプチド合成機 モデル 431Aを用いて合成し、キーホールリンペットヘモシアニン (KLH; Sigma、St.  Louis、MO)を、M-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、MBSとの反応により結合させる。必要であれば、システインをペプチドのN-末端に導入し、KLHへの結合を可能とする。ウサギを、完全フロイントアジュバント中のペプチド-KLH 複合体によって免疫する。その結果得られた抗血清を、プラスチックへのペプチドの結合、1% ウシ血清アルブミンでブロッキング、抗血清との反応、洗浄および標識化 (放射能または蛍光)、アフィニティー精製した特異的ヤギ抗-ウサギ IgGとの反応により抗ペプチド活性について試験する。
【０３６６】
ハイブリドーマを調製し、標準的技術を用いてスクリーニングする。目的のハイブリドーマを標識化 AdipoR1でのスクリーニングにより検出し、所望の特異性を有するモノクローナル抗体を産生する融合を同定する。典型的なプロトコールにおいて、プレートのウェル(FAST; Becton-Dickinson、Palo Alto、CA)をインキュベーション中にアフィニティー 精製した特異的 ウサギ抗-マウス抗体10 mg/ml (または好適な種に対する抗体1 g)でコーティングする。コーティングされたウェルを1% ウシ血清アルブミン (BSA)でブロッキングし、洗浄し、ハイブリドーマからの上清とインキュベートする。洗浄後、ウェルを1 mg/ml標識化 AdipoR1とインキュベートする。特異的抗体を含む上清は、バックグラウンドにおいて検出可能な程度よりもより多くの標識化 AdipoR1と結合する。特異的抗体を産生するクローンを拡張し、限界希釈での２サイクルのクローニングに供する。クローニングされたハイブリドーマをプリスタン処理マウスに注射し、腹水を作らせ、モノクローナル抗体をマウス腹水からタンパク質 Aでのアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。少なくとも108 M-1、好ましくは 109〜1010 M-1 またはより強い親和性のモノクローナル抗体が標準的手法により典型的には作られる。
【０３６７】
実施例 8: AdipoR1 特異的抗体を用いる診断試験
特定のAdipoR1 抗体はシグナル伝達の研究およびAdipoR1または活性シグナル伝達カスケードの下流産物の量または分布の差異によって特徴づけられる感染性または遺伝性症状の診断に有用である。
【０３６８】
AdipoR1の診断試験には、ヒト体液、膜、細胞、組織またはその抽出物におけるAdipoR1を検出するための抗体および標識を用いる方法が含まれる。本発明のポリペプチドおよび抗体は修飾して使用しても修飾せずに使用してもよい。しばしば、ポリペプチドおよび抗体は、それらに共有結合または非共有結合によって検出可能なシグナルを提供する物質を結合することによって標識化される。多様な標識および結合技術が知られており、科学文献と特許文献の両方において詳細に報告されている。好適な標識としては、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光薬剤、化学発光薬剤、発色性物質、磁性粒子などが挙げられる。
【０３６９】
可溶性または膜結合型 AdipoR1を測定するための、タンパク質に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いる様々なプロトコールが当該技術分野で知られている。例えば、酵素結合免疫測定法 (ELISA)、ラジオイムノアッセイ (RIA)および蛍光活性化細胞ソーティング (FACS)が挙げられる。AdipoR1上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する２部位モノクローナル・ベース・イムノアッセイが好ましいが、競合結合アッセイを用いてもよい。
【０３７０】
実施例 9: 特異的抗体を用いるネイティブな AdipoR1の精製 
ネイティブまたは組換え AdipoR1をAdipoR1に特異的な抗体を用いてイムノアフィニティークロマトグラフィーで精製する。一般に、イムノアフィニティーカラムは、抗-TRH 抗体の活性化クロマトグラフィー樹脂への共有結合によって構築される。
【０３７１】
ポリクローナル免疫グロブリンは硫酸アンモニウムによる沈降または固定化タンパク質 A上での精製(Pharmacia LKB Biotechnology、Piscataway N.J.)により、免疫血清から調製する。同様に、モノクローナル抗体はマウス腹水から、硫酸アンモニウム沈降または固定化タンパク質 A上でのクロマトグラフィーにより調製する。部分的に精製した免疫グロブリンをクロマトグラフィー樹脂に共有結合させ、これは例えば、CnBr-活性化セファロース (Pharmacia LKB Biotechnology)により行う。抗体を樹脂に結合させ、樹脂をブロックし、誘導体化樹脂を製造業者の指示に従って洗浄する。
【０３７２】
かかるイムノアフィニティーカラムは、可溶性形態のAdipoR1を含む細胞からの画分を調製することによって、AdipoR1の精製において用いられる。この調製物は、分画遠心法 (界面活性剤を添加してもよいし添加しなくてもよい)またはその他の当該技術分野で周知の方法によって得た細胞全体または亜細胞画分の可溶化に由来する。あるいは、シグナル配列を含む可溶性 AdipoR1は細胞が培養されていた培地に有用な量にて分泌される。
【０３７３】
可溶性 AdipoR1含有調製物をイムノアフィニティーカラムに通し、カラムをAdipoR1の優先的吸着が可能となる条件下(例えば、界面活性剤の存在下での高イオン強度バッファー)で洗浄する。次いで、カラムを抗体/タンパク質結合を破壊する条件下(例えば、pH 2-3のバッファーまたは高濃度のカオトロープ 、例えば、尿素またはチオシアナートイオン)で溶出し、AdipoR1を回収する。
【０３７４】
実施例 10:薬剤スクリーニング
本発明は特に、様々な薬剤スクリーニング技術においてAdipoR1 またはその結合性断片を使用することによる治療用化合物のスクリーニングに有用である。AdipoR1はGタンパク質共役受容体であるため、当該技術分野で一般に用いられているいずれの方法もおそらくAdipoR1 リガンドの同定に用いることが出来る。例えば、AdipoR1などのGタンパク質共役受容体の活性は、受容体の活性化の結果、セカンドメッセンジャーシステムのなんらかのレベルに観察可能な変化が起こる様々な適当な機能性アッセイを用いて測定することが出来、例えば、セカンドメッセンジャーシステムには、アデニル酸シクラーゼ、グアニリルシクラーゼ、カルシウム動員、またはイノシトールリン脂質加水分解が含まれる。あるいは、かかる試験に用いるポリペプチドまたは断片は溶液中に遊離していてもよいし、固体支持体に結合していてもよいし、細胞表面にあってもよいし細胞内に位置していてもよい。薬剤スクリーニングの一つの方法は、ポリペプチドまたは断片を発現する組換え核酸で安定に形質転換された真核または原核宿主細胞を用いる。薬剤は競合結合アッセイにおいてかかる形質転換細胞に対してスクリーニングされる。かかる細胞は、生存形態でも固定化形態でもよく、標準的結合アッセイに用いられる。
【０３７５】
例えば、測定されるのは、AdipoR1と被験薬剤との複合体形成である。あるいは、被験薬剤によってもたらされるAdipoR1とリガンドとの複合体形成の減少を測定してもよい。
【０３７６】
したがって、本発明は、シグナル伝達に影響を与える薬剤候補、薬剤、またはその他の薬剤のスクリーニング方法を提供する。かかる方法は、当該技術分野で周知であり、かかる薬剤とAdipoR1 ポリペプチドまたはその断片とを接触させる工程および以下のいずれかについてアッセイする工程を含む。
(i)薬剤とAdipoR1 ポリペプチドまたは断片との複合体の存在、または、
(ii)AdipoR1 ポリペプチドまたは断片と細胞との複合体の存在。
かかる競合結合アッセイにおいて、AdipoR1 ポリペプチドまたは断片は典型的には標識化されている。好適なインキュベーションの後、遊離のAdipoR1 ポリペプチドまたは断片を結合型形態で存在しているものから分離し、遊離または複合体形成していない標識の量が、特定の薬剤がAdipoR1に結合するか、またはAdipoR1-薬剤複合体に干渉するかの能力の尺度となる。
【０３７７】
薬剤スクリーニングの別の技術は、AdipoR1 ポリペプチドに対する好適な結合アフィニティーを有する化合物のハイスループットスクリーニングを提供する。簡単に説明すると、多数の様々な小ペプチド被験化合物を固体基体上、例えば、プラスチックピンまたはその他の表面で合成する。ペプチド被験化合物をAdipoR1 ポリペプチドと反応させ、洗浄する。結合したAdipoR1 ポリペプチドを当該技術分野で周知の方法で検出する。精製AdipoR1は、上記薬剤スクリーニング技術における使用のために直接プレートにコーティングしてもよい。さらに非中和抗体を用いてペプチドを捕獲し、固体支持体に固定化する。
【０３７８】
本発明はまた、競合薬剤スクリーニングアッセイでの使用も考慮し、該アッセイではAdipoR1に結合することが出来る中和抗体は特異的にAdipoR1 ポリペプチドまたはその断片への結合について被験化合物と競合する。このようにして、抗体は、AdipoR1と１以上の抗原決定基を共有するペプチドの存在の検出に用いられる。
【０３７９】
実施例 11: 合理的薬剤設計
合理的薬剤設計の目的は、目的の生物学的に活性のポリペプチドの構造的アナログまたはそれらと相互作用する低分子、アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤を産生することである。これらの例はいずれもポリペプチドよりもより活性または安定な形態の、またはポリペプチドの機能をインビボで促進または干渉する薬剤の創製に用いられる。
【０３８０】
一つのアプローチにおいて、目的タンパク質またはタンパク質-阻害剤複合体の三次元構造をX線結晶解析、コンピュータモデリングまたはもっとも典型的には、これら２つのアプローチの組み合わせにより決定する。分子の構造解明と活性部位の決定のためにはポリペプチドの形状と電荷の両方が確かめられなければならない。頻度は低いものの、ポリペプチドの構造に関する有用な情報を相同的タンパク質の構造に基づいたモデリングにより得る。両方の場合において、関連する構造情報を用いて有効な阻害剤が設計される。合理的薬剤設計に有用な例としては、活性または安定性が向上した分子またはネイティブなペプチドの阻害剤、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用するものが挙げられる。
【０３８１】
上記のような機能性アッセイによって選択された標的特異的抗体を単離して、その結晶構造を解明することも可能である。このアプローチでは原理的には、次のドラッグデザインに基礎となるファーマコアが得られる。機能的で医薬上活性の抗体に対する抗イディオタイプ抗体(抗-id)を作ることによりタンパク質結晶学をまったく迂回することが可能である。鏡像の鏡像として、抗-idの結合部位が元の受容体のアナログであると予測される。抗-idは次いで化学的または生物学的に産生したペプチドのバンクからのペプチドの同定と単離に用いられる。単離されたペプチドはファーマコアとして作用する。
【０３８２】
本発明によって、X線結晶解析などの分析試験を行うのに十分な量のポリペプチドが入手可能となる。さらに、本明細書に提供するAdipoR1 アミノ酸配列の知識は、X線結晶解析にかわって、またはX線結晶解析に加えてコンピュータモデリング技術を用いる者に対するガイダンスを提供する。
【０３８３】
実施例 12: シグナル伝達複合体のその他のメンバーの同定
本発明の精製AdipoR1は相互作用するGタンパク質またはその他のシグナル伝達経路タンパク質の同定、特徴付けおよび精製のためのリサーチツールである。放射能標識を当該技術分野で知られている様々な方法によって分泌AdipoR1 ドメインに導入し、相互作用する分子の捕捉にインビトロで用いる。好ましい方法には、AdipoR1における一級アミノ基の125I ボルトンハンター試薬による標識が含まれる。この試薬は生物学的活性を欠損させずに様々な分子を標識するのに用いられている。
【０３８４】
標識化 AdipoR1はそれと相互作用する分子の精製のための試薬として有用である。アフィニティー精製の一つの態様において、膜結合型 AdipoR1をクロマトグラフィーカラムに共有結合させる。滑膜細胞または推定標的細胞由来の細胞無含有抽出物をカラムに通し、適当なアフィニティーを有する分子がAdipoR1に結合する。AdipoR1-複合体をカラムから回収し、AdipoR1-結合リガンドを解離させN-末端タンパク質シークエンシングに供する。アミノ酸配列情報を次いで用いて捕捉分子を同定するか、または、適当なcDNA ライブラリーからの関連する遺伝子のクローニング用のディジェネレートオリゴヌクレオチドプローブを設計する。
【０３８５】
別の方法において、AdipoR1に対する抗体、具体的にはモノクローナル抗体を作る。モノクローナル抗体をスクリーニングして標識化 AdipoR1の結合を阻害するものを同定する。これらモノクローナル抗体は治療的に用いられる。
【０３８６】
実施例 13:抗体、阻害剤またはアンタゴニストの使用および投与
シグナル伝達の制限因子（limiter）(LST)であるAdipoR1の抗体、阻害剤またはアンタゴニストまたはその他の治療(treatments)および化合物は、治療的に投与された場合様々な効果を提供する。LSTは、製剤される抗体、阻害剤またはアンタゴニストの特徴および治療される症状により変動するが、好ましくはpH約 5〜8、より好ましくは6 〜8のpHにて非毒性、不活性、医薬上許容される水性担体媒体中に製剤される。LSTの特徴としては、分子の溶解性、その半減期および抗原性/免疫原性が挙げられる。これらおよびその他の特徴により、有効な担体が決定される。ネイティブなヒトタンパク質はLSTとして好ましいが、薬剤スクリーニングから得られる有機または合成分子も特定の状況では同様に有効である。
【０３８７】
LSTは既知の投与経路により送達され、限定されないが、以下が挙げられる：局所用クリームおよびゲル; 経粘膜スプレーおよびエアロゾル; 経皮パッチおよび絆創膏; 注射可能、静脈内および洗浄液製剤; および経口投与される液剤および丸剤、特に胃酸および酵素に抵抗性であるように製剤されたもの。特定の製剤、実際の用量および投与経路は主治医によって決定されそれぞれの特定の状況によって変動する。
【０３８８】
かかる決定は例えば、治療すべき症状、投与すべきLSTおよび特定のLSTの薬物動態プロファイルなどの多数の変動する因子を考慮して行われる。考慮されるさらなる因子には、疾患状態の重篤度、患者の年齢、体重、性別および食事、LST 投与の時期および頻度、その他の可能性のある薬剤の組み合わせ、治療に対する反応感受性および耐性/応答が挙げられる。長時間作用LST製剤は特定の LSTの半減期およびクリアランス率に応じて3〜4 日間に１回、週に一回、または２週間に一回投与すればよい。
【０３８９】
通常の用量は0.1〜105 μgと変動し、全用量約 1 gまでであるが、投与経路に依存する。特定の用量および送達方法の教示は以下の文献に記載されている;米国特許第4657760号;第5206344号;または第5225212号を参照されたい。当業者であれば、種々のLSTの種々の製剤を利用できる。細胞、例えば、神経細胞への投与には、別の細胞、例えば、血管内皮細胞とは異なる様式での送達が必要である。
【０３９０】
AdipoR1 活性をトリガーする異常なシグナル伝達、外傷、または疾患はLSTで治療可能であると考えられる。これら症状または疾患は、上記試験によって特異的に診断され、かかる試験は以下の病気が疑わしい症例について行うべきである：ウイルス、細菌または真菌感染症、アレルギー応答、外傷に関連する機械的損傷、遺伝性疾患、リンパ腫または癌腫、あるいはその他のリンパまたは神経組織の遺伝子を活性化する症状。
【０３９１】
実施例 14:非ヒトトランスジェニック動物の作成
AdipoR1の生理および行動上の役割を解明する動物モデルシステムが、AdipoR1活性が上昇または低下しているか、あるいは発現するAdipoR1のアミノ酸配列が様々な技術によって変化されている非ヒトトランスジェニック動物の作成により作られる。これら技術の例としてはこれらに限定されないが以下が含まれる:
1) マイクロインジェクション、エレクトロポーレーション、レトロウイルストランスフェクションまたはその他の当業者に周知手段によるAdipoR1をコードするDNAの正常または突然変異バージョンの適当な授精胚への挿入によりトランスジェニック動物を作成する、または、
2)これら遺伝子の突然変異または正常、ヒトまたは動物バージョンと、トランスジェニック動物におけるネイティブな遺伝子座との相同組換えにより、これらAdipoR1 配列の発現制御または構造を変化させる。
相同組換え技術は当該技術分野で周知である。それによってネイティブな遺伝子が挿入された遺伝子に置換され、したがってそれは、ネイティブな AdipoR1を発現できないが、例えば、挿入された突然変異 AdipoR1を発現することが出来、組換えにより動物ゲノムにおけるネイティブな AdipoR1が置換され、その結果トランスポーターが過小発現する動物の作成に有用である。マイクロインジェクションは遺伝子をゲノムに追加するが、遺伝子を除去することはなく、該技術はその内在性AdipoR1と追加されたAdipoR1を発現する動物の作成に有用であり、その結果AdipoR1が過剰発現する。
【０３９２】
例えばマウスを用いてトランスジェニック動物を作成する一つの利用できる手段を以下に説明する: 雌性マウスを交尾させ、その結果得られた 受精卵を卵管から切り出す。卵を適当な培地、例えば、塩化セシウム M2 培地に維持する。AdipoR1をコードするDNA またはcDNAを当業者に周知の方法によってベクターから精製する。誘導可能プロモーターをDNAのコード領域に融合させて、導入遺伝子の発現を制御する実験手段を提供することができる。あるいは、またはそれに加えて、組織特異的調節要素をコード領域に融合させて導入遺伝子を組織特異的に発現させることができる。適当に緩衝された溶液中のDNAをマイクロインジェクション針(パイパー・プラーを用いてキャピラリー管から作ることが出来る)に入れ、注入すべき卵を抑制(depression）スライドに入れる。針を卵の前核に挿入し、DNA 溶液を注入する。注入された卵を次いで、偽妊娠を維持するために適当なホルモンで刺激された偽妊娠マウスの卵管に移し、それは子宮へとすすみ、植え付けられ、出産まで成長する。上記のように、マイクロインジェクションは卵にDNAを挿入する唯一の方法ではなく、ここれは単に例示の目的で用いる。
【０３９３】
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【図面の簡単な説明】
【０３９４】
【図１】図1は、AdipoR1 ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列(配列番号1)を示す。
【図２】図2は、AdipoR1 ポリペプチドのアミノ酸配列(配列番号2) を示す。
【図３】図3は、本発明に有用なプライマーのヌクレオチド配列(配列番号3)を示す。
【図４】図4は、本発明に有用なプライマーのヌクレオチド配列(配列番号4)を示す。
【図５】図5は、本発明のタンパク質の検出のためのプローブとして有用なヌクレオチド配列(配列番号5) を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
2007506951000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年5月24日(2006.5.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007506951000001.app
【国際調査報告】
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2007506951.tif 000026
2007506951.tif 000027
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