(57)【要約】【課題】本発明は、マイクロプレートの歪みを無くし、複数の微小容量容器内の溶液に対して均一な変動電界を加えて、同一条件の電界撹拌を行うことを可能とする反応デバイスを提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、複数の微小容量容器２を有するマイクロプレート１と、前記微小容量容器２内の溶液６に変動電界を印加するために用いる電界撹拌用電極とを含む反応デバイスにおいて、  前記電界撹拌用電極は上部電極８と下部電極７とを有しており、前記下部電極７の上部に前記マイクロプレート１を載置し、前記マイクロプレート１を前記上部電極８によって上部から押さえ付けることができる構造を有する反応デバイスを提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の微小容量容器を有するマイクロプレートと、前記微小容量容器内の溶液に変動電界を印加するために用いる電界撹拌用電極とを含む反応デバイスにおいて、
前記電界撹拌用電極は上部電極と下部電極とを有しており、前記下部電極の上部に前記マイクロプレートを載置し、前記マイクロプレートを前記上部電極によって上部から押さえ付けることができる構造を有することにより、
前記マイクロプレートの形状歪みを抑制し、複数の前記溶液に対して同一条件の電界撹拌を行うことを特徴とする反応デバイス。
【請求項２】
前記微小容量容器は、底面と、前記底面の外周に位置する側壁とを有しており、
前記側壁よりも内周側の前記底面上に、囲み枠を有しており、
前記囲み枠の内周側に存在する前記底面は、平面形状であることを特徴とする、請求項１に記載の反応デバイス。
【請求項３】
前記囲み枠の高さと、前記囲み枠の内周側に存在する底面の径との比が、１：２〜１：２０であり、
前記底面と前記囲み枠とで形成される容器の容量が、１０〜３００μｌであることを特徴とする、請求項２に記載の反応デバイス。
【請求項４】
前記上部電極は、前記マイクロプレートの各微小容量容器の位置に対応する、複数の凸部を有しており、
前記複数の凸部が、前記側壁の内周側に挿入できる形状であることを特徴とする、請求項２又は３に記載の反応デバイス。
【請求項５】
前記凸部が円柱形状であり、前記側壁の内周側が円筒形状であることを特徴とする、請求項４に記載の反応デバイス。
【請求項６】
複数の微小容量容器を有するマイクロプレートに変動電界を印加する電界撹拌装置であって、
上部電極及び下部電極と、
前記上部電極及び／又は下部電極に変動電圧を供給する電源装置と、
前記微小容量容器内の溶液の吸光度を測定する吸光光度計と
を有し、
前記下部電極の上部に前記マイクロプレートを載置し、前記マイクロプレートを前記上部電極によって上部から押さえ付けることができる構造を有することにより、
前記マイクロプレートの形状歪みを抑制することで、前記微小容量容器内の溶液に対して同一条件の電界撹拌を行い、
前記微小容量容器内の溶液の吸光度を測定することにより、
複数の被検試料について同時に検査を行うことができる電界撹拌装置。
【請求項７】
前記微小容量容器内への被検試料又は試薬の分注、前記微小容量容器内の溶液への変動電界の印加、前記微小容量容器内の洗浄、及び前記微小容量容器内の溶液の吸光度の測定を自動で行う機構を有する、請求項６に記載の電界撹拌装置。
【請求項８】
複数の微小容量容器を有するマイクロプレートの各微小容量容器内に、被検試料と試薬を分注し、変動電界を印加することにより前記被検試料と前記試薬との反応を促進し、前記被検試料内の目的物質を検出する検出方法において、
変動電界を印加するための電極として、上部電極と下部電極を使用し、
前記下部電極の上部に前記マイクロプレートを載置し、前記マイクロプレートを前記上部電極によって上部から押さえ付けることにより、
前記マイクロプレートの形状歪みを抑制し、複数の前記微小容量容器内の溶液に対して同一条件の電界撹拌を行うことを特徴とする、検出方法。
【請求項９】
前記マイクロプレートとして、
前記微小容量容器内に、底面と、前記底面の外周に位置する側壁とを有しており、
前記側壁よりも内周側の前記底面上に、囲み枠を有しており、
前記囲み枠の内周側に存在する前記底面が、平面形状である
マイクロプレートを使用することにより、
前記底面と前記囲み枠とにより形成される容器の中の溶液について、位置による深さのバラツキを小さくし、
前記溶液の深さ方向に測定光を透過させて、前記溶液の吸光度を測定することを特徴とする、請求項８に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学的分析や臨床検査等に使用する複数の微小容量容器（ウェル）を有するマイクロプレートと、微小容量容器内の溶液に変動電界を印加して溶液を撹拌するために用いる電界撹拌用電極とを含む反応デバイスに関する。また、本発明は、電界撹拌用電極と、電界撹拌用電極に電圧を供給する電源装置と、吸光光度計とを有する電界撹拌装置に関する。さらに本発明は、マイクロプレートと電界撹拌を用いることにより、被検試料内の目的物質を検出する検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロプレートとは、プレート上に多数のくぼみ（ウェル）を形成することにより、多数の微小容量容器が縦横に整列している実験・検査用の器具である。マイクロプレートを用いれば、プレート上の多数の微小容量容器の中で、多数の反応を同時に行うことができる。このため、多数の被検試料を同時に診断する臨床検査や、多数のサンプルを同時に処理する科学実験等に用いられている。マイクロプレートは、特に、抗原抗体反応により被検試料中のタンパク質を検出するＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）によく使用されている。例えば、マイクロプレートを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法では、まず、検出目的となるタンパク質に結合する１次抗体をマイクロプレートの複数の微小容量容器の底面等に固定させる。次に、各被検試料の溶液と、検出目的となるタンパク質に結合する酵素標識付きの２次抗体（微小容量容器内に固定した抗体が結合するタンパク質のエピトープとは別のエピトープに結合するもの）の溶液とを、各微小容量容器内に加えて、抗原抗体反応を行う。これにより、微小容量容器−１次抗体−タンパク質−２次抗体という複合体が微小容量容器内に形成される。そして、結合しなかった２次抗体を洗浄した後に、発色試薬を加えて発色させる。これにより、目的のタンパク質を含む被検試料を加えた微小容量容器のみが発色することとなり、吸光度の測定により、被検試料が目的のタンパク質を含んでいるか否かについて、多数の被検試料を同時に検査することができる。
【０００３】
本発明者らは以前に、液滴に変動電界を印加して高速に振動させることにより、液滴の撹拌を行うことができる「電界撹拌」を用いることによって、抗原抗体反応、ハイブリダイゼーション、発色反応等を促進する方法を開発した（特許文献１）。
さらに、本発明者らは、電界撹拌に適した複数の微小容量容器を有するマイクロプレートに関する発明を開発した。この発明は、従来の微小容量容器の構造では、液滴の分子が微小容量容器の側壁に引き付けられてメニスカスになってしまう割合が大きく、ドーム形状の液滴を形成することができないという欠点を克服するため、微小容量容器内の液滴が側壁と接することがないように底面に台座を設けたものであり、液滴を台座の高さを超えるまで注ぎ入れて、ドーム状の液滴を形成することにより、液滴に変動電界を印加して電界撹拌を行うことを可能としている。（特許文献２）
【０００４】
本発明者らは、電界撹拌を用いて免疫染色（免疫組織化学：ＩＨＣ）を短時間で行う迅速免疫染色法を開発している。この迅速免疫染色法は、検出目的となるタンパク質を発現している組織に、抗体を含む液滴を滴下して微小液滴を形成し、変動電界を印加することより微小液滴を振動させて撹拌し、抗原抗体反応を促進して短時間で免疫染色を行うことを可能とする方法である（特許文献３、非特許文献１）。
さらに、本発明者らは、電界撹拌を用いた迅速免疫染色法を自動で行う装置を開発している（特許文献４）。
本発明者らは、また、電界撹拌を用いて洗浄を行う方法（特許文献５）、電界撹拌用電極（特許文献６）、電界撹拌に用いる液滴形成用シャーレ（特許文献７）を開発している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−１１９３８８号公報
【特許文献２】特許第５８３９５２６号公報
【特許文献３】特開２０１２−０１３５９８号公報
【特許文献４】特許第５６９６３００号公報
【特許文献５】特開２０１４−１６００６１号公報
【特許文献６】特許第５８２５６１８号公報
【特許文献７】特許第５８５７３０９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】戸田洋、外９名、アクタ・ヒストケミカ・エト・サイトケミカ（Acta Histochemica et Cytochemica、略号Acta Cytochem. Cytochem.）、日本組織細胞化学会、２０１１年６月３日発行、４４巻、３号、ｐ．１３３−１３９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
マイクロプレートは繰り返し使用せずに使い捨てにするもので、プラスチック製の金型を用いた射出成形による大量生産が基本である。この成形時に起因する多様な応力等が原因となりマイクロプレートの形状に歪みが存在することが知られている。電界撹拌を適用せずにマイクロプレートで反応を行う場合は、この歪みは反応に影響ないが、複数の微小容量容器内の溶液に対して同一条件の電界撹拌を行うためには、マイクロプレートの歪みを無くす必要があることが明らかとなった。
そこで、本発明は、マイクロプレートの歪みを無くし、複数の微小容量容器内の溶液に対して均一な変動電界を加えて、同一条件の電界撹拌を行うことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、本発明者らは鋭意研究をした結果、電界撹拌用の電極として上部電極と下部電極を用い、下部電極の上部にマイクロプレートを載置し、マイクロプレートを上部電極によって上部から押さえ付ける構造を有する反応デバイスとすることにより、マイクロプレートの形状歪みを抑制し、複数の微小容量容器内の溶液に対して、それぞれ同一条件下の電界撹拌を行うことができることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、反応デバイスに関する下記の第１の発明と、電界撹拌装置に関する下記の第２の発明と、検出方法に関する下記の第３の発明を提供する。
（１）  第１の発明は、複数の微小容量容器を有するマイクロプレートと、前記微小容量容器内の溶液に変動電界を印加するために用いる電界撹拌用電極とを含む反応デバイスに関するものであり、
前記電界撹拌用電極は上部電極と下部電極とを有しており、前記下部電極の上部に前記マイクロプレートを載置し、前記マイクロプレートを前記上部電極によって上部から押さえ付けることができる構造を有することにより、
前記マイクロプレートの形状歪みを抑制し、複数の前記溶液に対して同一条件の電界撹拌を行うことを特徴とする。
（２）  第１の発明の反応デバイスにおいては、前記微小容量容器は、底面と、前記底面の外周に位置する側壁とを有しており、
前記側壁よりも内周側の前記底面上に、囲み枠を有しており、
前記囲み枠の内周側に存在する前記底面は、吸光度の測定のため平面形状であることが好ましい。
（３）  前記（２）の反応デバイスにおいては、前記囲み枠の高さと、前記囲み枠の内周側に存在する底面の径との比が、１：２〜１：２０であり、
前記底面と前記囲み枠とで形成される容器の容量が、１０〜３００μｌであることが好ましい。
（４）  前記（２）又は（３）の反応デバイスにおいては、前記上部電極は、前記マイクロプレートの各微小容量容器の位置に対応する、複数の凸部を有しており、
前記複数の凸部が、前記側壁の内周側に挿入できる形状であることが好ましい。
（５）  前記（４）の反応デバイスにおいては、前記凸部が円柱形状であり、前記側壁の内周側が円筒形状であることが好ましい。
（６）  第２の発明は、複数の微小容量容器を有するマイクロプレートに変動電界を印加する電界撹拌装置に関するものであり、
上部電極及び下部電極と、
前記上部電極及び／又は下部電極に変動電圧を供給する電源装置と、
前記微小容量容器内の溶液の吸光度を測定する吸光光度計と
を有し、
前記下部電極の上部に前記マイクロプレートを載置し、前記マイクロプレートを前記上部電極によって上部から押さえ付けることができる構造を有することにより、前記マイクロプレートの形状歪みを抑制することで、前記微小容量容器内の溶液に対して同一条件の電界撹拌を行い、
前記微小容量容器内の溶液の吸光度を測定することにより、
複数の被検試料について同時に検査を行うことができることを特徴とする。
（７）  第２の発明の電界撹拌装置においては、前記微小容量容器内への被検試料又は試薬の分注、前記微小容量容器内の溶液への変動電界の印加、前記微小容量容器内の洗浄、及び前記微小容量容器内の溶液の吸光度の測定を自動で行う機構を有することが好ましい。
（８）  第３の発明は、複数の微小容量容器を有するマイクロプレートの各微小容量容器内に、被検試料と試薬を分注し、変動電界を印加することにより前記被検試料と前記試薬との反応を促進し、前記被検試料内の目的物質を検出する検出方法に関するものであり、
変動電界を印加するための電極として、上部電極と下部電極を使用し、
前記下部電極の上部に前記マイクロプレートを載置し、前記マイクロプレートを前記上部電極によって上部から押さえ付けることにより、
前記マイクロプレートの形状歪みを抑制し、複数の前記微小容量容器内の溶液に対して同一条件の電界撹拌を行うことを特徴とする。
（９）  第３の発明の検出方法においては、
前記マイクロプレートとして、
前記微小容量容器内に、底面と、前記底面の外周に位置する側壁とを有しており、
前記側壁よりも内周側の前記底面上に、囲み枠を有しており、
前記囲み枠の内周側に存在する前記底面が、平面形状である
マイクロプレートを使用することにより、
前記底面と前記囲み枠とにより形成される容器の中の溶液について、位置による深さのバラツキを小さくし、
前記溶液の深さ方向に測定光を透過させて、前記溶液の吸光度を測定することが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、下部電極の上部に載置したマイクロプレートを、上部電極によって上部から押さえ付けることにより、マイクロプレートの形状歪みを抑制し、複数の微小容量容器内の溶液に対して同一条件の電界撹拌を行うことができるため、反応のバラツキを少なくして、複数の被検試料の検査を精度良く行うことができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の反応デバイスの一つの実施形態を模式的に示す図面である。図１（Ａ）は、下部電極の上部にマイクロプレートを載置した状態を示す断面図であり、図１（Ｂ）は、マイクロプレートを上部電極によって上部から押さえ付けた状態を示す断面図である。
【図２】本発明で使用するマイクロプレートの微小容量容器の構造について、２つの実施形態を模式的に示す図面である。図２（Ａ）は、底面と、側壁と、囲み枠とを有し、底面を平面形状とした微小容量容器の構造を示す断面図であり、図２（Ｂ）は、特許文献２の図１（Ａ）に記載された底面が湾曲形状の微小容量容器の断面図である。
【図３】図２（Ａ）に示される微小容量容器を縦横に複数有するマイクロプレートを模式的に示す図面である。図３（Ａ）は、マイクロプレートの断面図を示し、図３（Ｂ）は、マイクロプレートの平面図を示す。
【図４】変動電界の印加により溶液の液滴が振動する様子を模式的に示す図面である。図４（Ａ）は、上部電極に供給される正の電圧が最も大きくなった状態を示し、図４（Ｂ）は、上部電極に供給される正の電圧が最も小さくなった状態を示す。
【図５】実施例１で作製したマイクロプレートと上部電極の設計図である。図５（Ａ）は、マイクロプレートの微小容量容器の断面の設計図を示し、図５（Ｂ）は、上部電極の断面の設計図を示し、図５（Ｃ）は、上部電極の平面の設計図を示す。
【図６】実施例２の実験結果を示すグラフである。図６（Ａ）は、マイクロプレートを上部電極によって押さえ付けることで、マイクロプレートの形状歪みを抑制した状態でＥＬＩＳＡを行った場合の結果を示し、図６（Ｂ）は、マイクロプレートを上部電極によって押さえ付けない場合の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．  反応デバイス
１−１．  電界撹拌用電極の構造
本発明は、複数の微小容量容器を有するマイクロプレートと、複数の微小容量容器内の溶液に変動電界を印加するために用いる電界撹拌用電極とを含む反応デバイスに関するものである。
本発明の反応デバイスの電界撹拌用電極は、上部電極と下部電極とを有しており、これらの電極が対電極となっている。電源装置を用いて上部電極と下部電極の間に変動電界を発生させることで、微小容量容器内の溶液に変動電界を印加して、溶液の液滴を高速に振動させることで撹拌を行うことが可能である。
【００１３】
本発明の反応デバイスは、下部電極の上部にマイクロプレートを載置し、マイクロプレートを上部電極によって上部から押さえ付けることができる構造を有している。
このような構造を有することにより、本発明の反応デバイスは、マイクロプレートの形状歪みを抑制し、複数の微小容量容器内の溶液に対して、それぞれ同一条件の電界撹拌を行うことができる。
【００１４】
下部電極の形状は、上部にマイクロプレートを載置することができるものであれば、どのような形状であってもよいが、マイクロプレートを安定に載置するためには、マイクロプレートの形状に対応した形状とすることが好ましい。マイクロプレートは、通常、底面が同一平面上にあるため、下部電極の形状は、平面形状の平板電極とすることが好ましい。
マイクロプレートの微小容量容器内に強い電界を印加するためには、下部電極の表面に直接マイクロプレートを載置することが好ましいが、感電や電極への溶液の付着を防止するために、下部電極とマイクロプレートとの間に絶縁性のシートや板を設けてもよい。
【００１５】
本発明の反応デバイスにおいては、マイクロプレートを上部電極によって上部から押さえ付けるために、下部電極と上部電極とを相対的に移動可能な構造とすることが好ましい。例えば、これらに限定されるわけではないが、上部電極のみを上下に移動することができる構造とすることができ、下部電極のみを上下に移動することができる構造とすることができ、あるいは、上部電極と下部電極とがそれぞれ上下に移動することができる構造とすることができる。また、上部電極を上下左右に自在に移動できる構造とすることもできる。
【００１６】
マイクロプレートを上部電極によって上部から押さえ付ける際には、マイクロプレートの微小容量容器内に強い電界を印加できるように、上部電極を直接マイクロプレートに接触させて押さえ付けることが好ましい。しかしながら、上部電極に溶液が付着することを防止するため、マイクロプレートをカバー部材（マイクロプレート蓋）で覆った上で、カバー部材を介してマイクロプレートを上部電極により押さえ付けてもよい。
【００１７】
上部電極及び／又は下部電極の形状は、微小容量容器の位置に対応する複数の凸部を有する形状とすることが好ましい。電極の凸部においては、電気力線が集中して、溶液に対して強い電界を印加することができる。
一方の電極に変動電圧を供給し、他方の電極をアース電位とする場合には、変動電圧を印加する電極のみに凸部を設け、他方の電極は平面形状の平板電極とすることが好ましい。尚、一方の電極に変動電圧を供給する場合においても、上部電極及び下部電極の両方の電極に変動電圧を供給する場合においても、両方の電極に凸部を設ける形態は有り得る。
【００１８】
上部電極に複数の凸部を設ける場合には、この凸部を微小容量容器の側壁に挿入することができる形状とすることが好ましい。これにより、上部電極の凸部を微小容量容器内の溶液に近づけて、さらに強い電界を溶液に印加することが可能となり、また、微小容量容器に対する凸部の位置を正確に合わせることができ、溶液に対して上下方向の変動電界を印加して、好適に撹拌することが可能となる。
【００１９】
以下、本発明の反応デバイスの一つの実施形態を図１に模式的に示す。
図１（Ａ）は、下部電極の上部にマイクロプレートを載置した状態を示す断面図であり、図１（Ｂ）は、マイクロプレートを上部電極によって上部から押さえ付けた状態を示す断面図である。
【００２０】
図１（Ａ）に示されるように、マイクロプレート１は、複数の微小容量容器２ａ，２ｂ，２ｃを有している。それぞれの微小容量容器は、底面３ａ，３ｂ，３ｃと、側壁４ａ，４ｂ，４ｃと、囲み枠５ａ，５ｂ，５ｃとを有している。底面はそれぞれ円形であり、側壁はそれぞれ円筒形状であり、囲み枠はそれぞれリング形状となっている。底面３ａ，３ｂ，３ｃと囲み枠５ａ，５ｂ，５ｃとが形成する容器内に、溶液の液滴６ａ，６ｂ，６ｃを形成することができる。
マイクロプレート１は、プラスチック製のため、形状歪みは成形時に加わる応力によって少なからず存在するものであるため、平板状の下部電極７の上部にマイクロプレート１を載置した場合でも、歪みが生じてしまう。図１（Ａ）の例では、微小容量容器２ｂにおいて、底面３ｂは下部電極７から僅かに浮いた状態となっており、微小容量容器２ａ，２ｃにおいて、底面３ａ，３ｃは、僅かに傾いた状態となっている。このような歪みが生じた状態で、微小容量容器内の溶液６ａ，６ｂ，６ｃに対して変動電界を印加すると、それぞれ傾きの異なる液滴に対して変動電界を印加することとなり均一な撹拌性が維持できなくなる。液滴の僅かな傾きによっても、微小液滴のため、振動挙動が大きく異なり、同一条件の電界撹拌を行うことが難しくなる。歪みが生じた状態で電界撹拌を行った場合に、反応結果にバラツキが生じてしまうことは、後記実施例２の比較例の実験からも明らかである。
【００２１】
そこで、図１（Ｂ）に示すように、マイクロプレート１を上部電極８によって上部から押さえ付けることにより、マイクロプレート１の形状歪みを抑制することができる。
上部電極８は、上下に駆動することができ、上部電極８を下方向に移動させることによって、マイクロプレート１を上部から押さえ付けることができる。
【００２２】
上部電極８は、微小容量容器２ａ，２ｂ，２ｃに対応する位置に、凸部９ａ，９ｂ，９ｃを有している。上部電極の凸部には電気力線が集中するため、凸部９ａ，９ｂ，９ｃと下部電極７とに挟まれた領域に、強い電界が発生することとなり、溶液６ａ，６ｂ，６ｃに強い電界を印加することができる。
上部電極の凸部９ａ，９ｂ，９ｃは、円柱形状であり、円筒形状である側壁４ａ，４ｂ，４ｃの内周側に挿入できる形状となっている。
これにより、凸部９ａ，９ｂ，９ｃを溶液６ａ，６ｂ，６ｃに近づけることができ、さらに強い電界を溶液に印加することができる。
【００２３】
また、上部電極の凸部を側壁の内周側に挿入することにより、凸部９ａ，９ｂ，９ｃと溶液６ａ，６ｂ，６ｃとの正確な位置合わせが可能となる。これにより、溶液に対して上下方向の変動電界を印加し、溶液の液滴を上下方向に振動させて、電界撹拌を好適に行うことが可能となる。凸部と溶液の位置合わせが正確でないと、溶液に対して斜め方向の変動電界が印加されてしまい、電界撹拌を効率的に行うことが難しくなる。
凸部９ａ，９ｂ，９ｃの直径は、側壁４ａ，４ｂ，４ｃの内径よりも小さくし、両者の間に僅かな隙間を設けることが好ましい。これにより、凸部によって側壁に強い力が加わることを防ぎ、マイクロプレートの歪みや破損を防止することができる。
【００２４】
１−２．  マイクロプレートの構造
本発明において、マイクロプレートとは、複数の微小容量容器を有しており、その容器内で溶液の反応、混合、撹拌等を行うものであれば、どのようなものであってもよい。
マイクロプレートの微小容量容器の容量は、通常、１個あたり０．１〜２０００μｌである。マイクロプレートは、通常、微小容量容器を２〜１００００個有することができる。微小容量容器（ウェル）の数を、用途に応じて、６、１２、２４、４８、９６、３８４、１５３６等とし、これらを縦横に整列したマイクロプレートが市販されている。
【００２５】
本発明で使用するマイクロプレートの微小容量容器は、市販のマイクロプレートのように、底面と、その外周に位置する側壁とを有する微小容量容器とすることができる。
しかしながら、本発明においては、微小容量容器の側壁よりも内周側の底面上に、囲み枠を有したマイクロプレートを用いることが好ましい。
このような囲み枠を設けることにより、溶液の分子が側壁に引きつけられてメニスカスを形成してしまうことを防ぎ、溶液を囲み枠の高さを若干越えるまで注ぎ入れることにより、中央が盛り上がった形状の液滴を形成することが可能となる。このような液滴は、変動電界を印加することにより、上下に振動させて効率良く撹拌を行うことが可能である。
【００２６】
また、本発明においては、微小容量容器内の囲み枠の内周側に存在する底面が、平面形状であることが好ましい。
囲み枠とその内周側の底面とにより溶液が収容される容器が形成されることから、その底面を平面形状とすることによって、位置による溶液の深さのバラツキを小さくすることができる。位置による溶液の深さのバラツキを小さくすることによって、吸光光度計を用いて溶液の深さ方向に測定光を透過させて溶液の濃度や発色の程度を測定する際に、測定光を透過させる位置の違いによる光が溶液を透過する距離のバラツキを小さくすることができるため、精度良く吸光度の測定を行うことができる。
【００２７】
変動電界により効率良く撹拌できる液滴を形成するためには、囲み枠の高さと、囲み枠の内周側に存在する底面の径との比が、１：２〜１：２０となるように、マイクロプレートを製造することが好ましい。
ここで、吸光光度計による測定を行う場合には、溶液を透過する透過光の経路長を十分に確保するために、微小容量容器の底面と囲み枠で形成される容器の容量を１０μｌ以上とすることが好ましい。また、試薬を節約し、より多くの被検試料を同時に測定することを可能とするためには、容器の容量を３００μｌ以下とすることが好ましい。
【００２８】
マイクロプレートは、通常、プラスチック成形にて製造することができる。液滴を形成することが難しい場合には、囲み枠の部分を撥水性の材料で成形することにより、液滴を形成し易くすることができる。ここで、撥水性の材料としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素系樹脂、オルガノポリシロキサン等のシリコン系樹脂、ポリプロピレン等のポリオレフィン等を用いることができる。
【００２９】
本発明で使用するマイクロプレートの微小容量容器の構造について、２つの実施形態を図２に模式的に示す。
図２（Ａ）は、底面と、側壁と、囲み枠とを有し、底面を平面形状とした微小容量容器の構造を示す断面図である。図２（Ｂ）は、特許文献２の図１（Ａ）に記載された底面が湾曲形状の微小容量容器の断面図である。
【００３０】
図２（Ａ）に示される微小容量容器２は、底面３と、底面３の外周に設けられた側壁４とを有している。底面３は円形であり、側壁４は円筒形状となっている。
微小容量容器２の側壁４よりも内周側の底面上には、囲み枠５が設けられている。囲み枠５は、円形のリング状であり、囲み枠５と底面３とにより容器が形成されている。この容器内に溶液６を注入すると、溶液６は側壁４に接触しないため、メニスカスを形成せず、囲み枠５の高さまで溶液を注ぎ入れると、表面張力により中央が少し盛り上がった形状の液滴となる。
【００３１】
図２（Ａ）に示されるとおり、囲み枠５の内周側に存在する底面は、平面形状となっている。これにより、溶液６の深さが、位置によって異なることにより生ずるバラツキを小さくすることができる。溶液６の深さのバラツキを小さくすることにより、吸光光度計を用いて溶液の深さ方向に測定光を透過させて溶液の濃度や発色の程度を測定する際に、測定光１０を透過させる位置の違いによる、光が溶液を透過する距離のバラツキを小さくすることができるため、精度良く吸光度の測定を行うことができる。
【００３２】
図２（Ａ）に示されるとおり、囲み枠５の高さＡと、囲み枠５の内周側に存在する底面の径Ｂの比は、１：２〜１：２０の範囲内にある。このような範囲内の比とすることにより、変動電界の印加により効率よく撹拌できる形状の液滴を形成することができる。
また、囲み枠５は溶液を注入し過ぎた場合には、囲み枠を越えて溶液があふれ出すことができ、側壁４と囲み枠５との間には空間が設けられているため、囲み枠５からあふれた溶液を収容できるようになっている。
【００３３】
図２（Ｂ）は、特許文献２（特許第５８３９５２６号公報）の図１（Ａ）に記載された底面が湾曲形状の微小容量容器の断面図であるが、本発明においては、このような形状の微小容量容器を有するマイクロプレートを使用することもできる。
図２（Ｂ）に示されるように、微小容量容器２は、底面３とその外周に位置する側壁４とを有している。底面３は円形であり、側壁４は円筒形状となっている。
そして、側壁４の内周側に隣接して撥水性の囲み枠（台座）５が設けられている。囲み枠（台座）５は、円形のリング状であり、囲み枠５と底面３とにより容器が形成されている。この容器内に溶液６を注入すると、溶液６は側壁４に接触しないため、メニスカスを形成しない。囲み枠（台座）は撥水性であるため、囲み枠５の高さを大きく越えて溶液を注ぎ入れることができ、表面張力により中央が大きく盛り上がったドーム形状の液滴となる。
【００３４】
図２（Ｂ）に示される微小容量容器では、中央が大きく盛り上がったドーム形状の液滴を形成できる上に、底面３が、平面形状ではなく、湾曲形状となっているため、溶液６が中央部ほど深くなる度合いが顕著である。このため、吸光光度計を用いて溶液の濃度や発色の程度を測定する際に、測定光１０を透過させる位置の違いにより、光が溶液を透過する距離のバラツキが大きくなり、吸光度の測定の精度が図２（Ａ）の場合と比較して低くなる。
【００３５】
図２（Ａ）に示される微小容量容器を縦横に複数有するマイクロプレートを図３に模式的に示す。
図３（Ａ）は、マイクロプレートの断面図を示し、図３（Ｂ）は、マイクロプレートの平面図を示す。
図３（Ａ）の断面図に示されるように、マイクロプレート１は、横方向に５個の微小容量容器２を有している。それぞれの微小容量容器２は、底面３と、底面の外周に位置する側壁４を有しており、側壁４よりも内周側の底面上に囲み枠５を有している。底面３は円形であり、側壁４は円筒形状である。底面３と囲み枠５とで形成される容器内に溶液６が収容されている。
【００３６】
図３（Ｂ）の平面図に示されるように、マイクロプレート１は、縦方向にも３個の微小容量容器２を有している。したがって、マイクロプレートは、５×３＝１５個の微小容量容器を有している。囲み枠５は、円形のリング形状であり、溶液６は円形となっている。
【００３７】
２．  電界撹拌装置
本発明は、複数の微小容量容器を有するマイクロプレートに変動電界を印加する電界撹拌装置を提供する。
本発明の電界撹拌装置は、
ｉ）上部電極及び下部電極と、
ii）上部電極及び／又は下部電極に変動電圧を供給する電源装置と、
iii）微小容量容器内の溶液の吸光度を測定する吸光光度計と
を有している。
【００３８】
本発明の電界撹拌装置における上部電極と下部電極は、下部電極の上部にマイクロプレートを載置し、マイクロプレートを上部電極によって上部から押さえ付けることができる構造を有する。
このような上部電極と下部電極の構造は、前記１−１．において詳述したとおりである。
本発明の電界撹拌装置は、下部電極の上部に載置したマイクロプレートを、上部電極によって上部から押さえ付けることにより、マイクロプレートの形状歪みを抑制し、複数の微小容量容器内の溶液に対して同一条件の電界撹拌を行うことができるため、反応のバラツキを少なくして、複数の被検試料の検査を精度良く行うことができる。
【００３９】
本発明の電界撹拌装置で使用する電源装置は、上部電極と下部電極の両方、又は上部電極と下部電極のどちらか一方に、変動電圧を供給する装置である。
上部電極と下部電極のどちらか一方に変動電圧を供給する場合には、他方の電極はアース電位とすることができる。
上部電極に変動電圧を供給する場合には、例えば、これらに限定されるわけではないが、電源装置として、高圧アンプとファンクションジェネレータを用い、ファクションジェネレータから周期的に変化する波形の信号を高圧アンプに供給して、高圧アンプから上部電極に対して周期的に変化する電圧を供給することができる。また、高電圧発生装置として、これらのそれぞれの機能を一台にまとめて装置化し、周期的に変化する電圧を供給することもできる。
【００４０】
上下の電極と電源装置により発生させる電界は、溶液の液滴を振動させるものであればどのような電圧、周期、波形の条件であってもよい。変動電界の大きさは、液滴の大きさにより異なるが、十分に撹拌効果を生じさせるためには、３５０〜３５００Ｖ／ｍｍとするのが好ましく、より好ましくは、７００〜２５００Ｖ／ｍｍとするのがよい。このような電界強度となるように、電極間距離に応じて計算した電圧を、上下の電極間に印加する。また、印加する変動電界を発生させるための信号は、０．１〜８００Ｈｚとするのが好ましい。印加する変動電界を発生させるための信号は、方形波、正弦波、三角波、ノコギリ波などを使用することができるが、撹拌効果を高めるためには、瞬間的な変化の大きい方形波を用いることが好ましい。変動電界を発生させるための信号は、プラスに偏った波形を用いることもできるが、プラスとマイナスの間を反転する波形又はマイナスに偏った波形を用いることもできる。
【００４１】
図４は、変動電界の印加により溶液の液滴が振動する様子を示す模式図である。
図４（Ａ）は、上部電極に供給される正の電圧が最も大きくなった状態を示し、図４（Ｂ）は、上部電極に供給される正の電圧が最も小さくなった状態を示す。
図４（Ａ）に示されるように、上部電極８には高圧アンプ１１から正の電圧が供給される。ここで、高圧アンプ１１には、ファンクションジェネレータ１２からプラス側に偏って周期的に変化する波形の信号が供給されることにより、高圧アンプ１１から上部電極８に対して、電圧が周期的に変化する正の電圧が供給される。
【００４２】
図４（Ａ）は、上部電極８に供給される正の電圧が最も大きくなった状態を示しており、上部電極８に蓄積するプラス電荷１３の量は、この時点で最大となる。そして、上部電極８に蓄積したプラス電荷１３により、溶液の液滴６の表面のマイナス電荷１４が強く引きつけられて、液滴６は中央が盛り上がった形状となる。
図４（Ｂ）は、上部電極８に供給される正の電圧が最も小さくなった状態を示しており、上部電極８に蓄積したプラス電荷１３の量は、この時点で最小となる。そして、上部電極８に蓄積したプラス電荷１３の量が少ないため、液滴６を引きつける上向きの力が極めて弱くなり、液滴６は自重により下方向に落ちて平たい形状となる。
上部電極８に供給される正の電圧は周期的に変化して、図４（Ａ）の状態と図４（Ｂ）の状態の間を周期的に往復する。図４（Ｂ）に示されるように、液滴６は、自重により下方向に落ちるが、底面３での反作用によりバウンドして、電界の変化にあわせて図４（Ａ）の状態にすみやかに戻ることができる。このため、液滴６は、変動電界の周期に従って振動することとなり、液滴内部が撹拌される。液滴の振幅は小さいが、液滴の振動速度（周波数）は大きいため、液滴を効率良く撹拌することができる。
【００４３】
本発明の電界撹拌装置で使用する吸光光度計は、試料溶液の中を特定の波長の測定光を透過させて、溶液を通過した光の量を測定することで、溶液により吸収された光の量を計測する機器である。
本発明の電界撹拌装置では、被検試料と試薬を反応させた後、反応の程度に応じて増大する発色の程度や濃度を、吸光光度計で測定することができ、これにより、被検試料中の特定の物質の検出すること（測定を含む）や、目的の機能を有する物質のスクリーニングを行うこと等が可能となる。
【００４４】
本発明の電界撹拌装置においては、微小容量容器内への被検試料又は試薬の分注、微小容量容器内への変動電界の印加、微小容量容器内の洗浄、及び微小容量容器内の溶液の吸光度の測定を自動で行う機構を有することが好ましい。
このような機構を有することにより、多数の被検試料についての試験を人手によらずに迅速に行うことができ、また、ＥＬＩＳＡのような多段階の反応を必要とする試験であっても、試薬の分注と洗浄を繰り返すことにより、人手によらずに迅速に行うことが可能となる。本発明の電界撹拌装置は、電界撹拌により反応や洗浄の時間を短縮することが可能であるため、自動化との相乗効果により、極めて迅速に多数の被検試料について試験を行うことが可能であり、吸光度の測定によって、検出結果まで自動で得ることが可能である。
【００４５】
３．  検出方法
本発明は、複数の微小容量容器を有するマイクロプレートの各微小容量容器内に、被検試料と試薬を分注し、変動電界を印加することにより被検試料と試薬との反応を促進し、被検試料内の目的物質を検出する検出方法を提供する。
本発明の検出方法においては、変動電界を印加するための電極として、上部電極と下部電極を使用する。そして、下部電極の上部にマイクロプレートを載置し、マイクロプレートを上部電極によって上部から押さえ付けることにより、マイクロプレートの形状歪みを抑制し、複数の微小容量容器内の溶液に対して同一条件の電界撹拌を行うことができるため、反応のバラツキを少なくして、複数の被検試料の検査を精度良く行うことができる。
【００４６】
本発明の検出方法においては、マイクロプレートとして、次の構造を有するマイクロプレートを使用することが好ましい。
ｉ）  微小容量容器内に、底面と、底面の外周に位置する側壁とを有している。
ii）  側壁よりも内周側の底面上に、囲み枠を有している。
iii）  囲み枠の内周側に存在する底面が、平面形状である。
このような構造を有するマイクロプレートの一例は、図２（Ａ）に示されるとおりであり、前記１−２．で詳述したように、前記ｉ）及びii）の構造により、中央が盛り上がった形状の液滴を形成できることから、変動電界を印加することにより、上下に振動させて効率良く撹拌を行うことが可能である。また、前記iii）の構造により、位置による溶液の深さのバラツキを小さくすることができる。位置による溶液の深さのバラツキを小さくすることによって、吸光光度計を用いて溶液の深さ方向に測定光を透過させて溶液の濃度や発色の程度を測定する際に、測定光を透過させる位置の違いによる、光が溶液を透過する距離のバラツキを小さくすることができるため、精度良く吸光度の測定を行うことができる。
【００４７】
本発明の検出方法においては、これらに限定されるわけではないが、例えば、抗原となるタンパク質と抗体を反応させるＥＬＩＳＡ等の抗原抗体反応や、核酸とそれに相補的な核酸プローブを反応させるハイブリダイゼーションや、特定の多糖類又は脂質とそれに親和性のある色素や毒素を結合させる反応等を行うことにより、被検試料内の目的となるタンパク質、核酸、多糖類、脂質等の物質を検出することができる。これらの反応において電界撹拌を行うことにより、反応を促進することができきるため、反応時間を短縮することができ、また、反応に使用する抗体等の試薬の濃度を低くしても、十分な検出感度を得ることができる。
本発明において、「検出」とは、目的となる物質が存在するか否かを判別することのみならず、目的となる物質の量を測定することも含む。
【００４８】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００４９】
（電極及びマイクロプレートの作製）
図２（Ａ）と同一の構造の微小容量容器を８個有するマイクロプレートを作製した。微小容量容器は、底面と側壁とにより、内寸直径７．５ｍｍ、内寸高４．０ｍｍの空間を有するものである。そして、底面上に、内寸直径４．０ｍｍ、高さ０．８ｍｍの囲み枠を設けた。微小容量容器の断面の設計図を図５（Ａ）に示す。
また、上記の微小容量容器の側壁の内周側に挿入出来る凸部を８個有する上部電極を製造した。各凸部は、直径６．０ｍｍ、高さ０．５ｍｍである。上部電極の断面の設計図を図５（Ｂ）に、平面の設計図を図５（Ｃ）に示す。
作製したマイクロプレートは、平面上に載置しても歪みが生じるものであったが、作製した上部電極で上部から押さえ付けることにより、形状歪みを抑制することが出来た。
【実施例２】
【００５０】
（ＥＬＩＳＡ実験）
実施例１で作製したマイクロプレートと上部電極、そして、平板状の下部電極を用い、抗原抗体反応と発色反応において電界撹拌を行うことにより、ＥＬＩＳＡを行った。下部電極の上にマイクロプレートを載置し、その上部から上部電極によって押さえ付けることで、マイクロプレートの形状歪みを抑制した状態でＥＬＩＳＡを行った。
ＥＬＩＳＡは、セルスペクトル株式会社製のトラスツズマブＥＬＩＳＡキット（商品名：クオンテスト）を使用し、次のプロトコールに従って行った。
１）既知濃度のトラスツズマブを含有する被検試料（１２μｌ）をマイクロプレートに注入して、被検試料中のトラスツズマブを、微小容量容器内の底面に固相化された１次抗体へ反応させた。
２）被検試料を取り除き、洗浄液で微小容量容器内を洗浄した。
３）トラスツズマブに結合する２次抗体（標識酵素結合）の溶液（１２μｌ）を微小容量容器内に注入して、２次抗体反応を行った。
４）２次抗体溶液を取り除き、洗浄液で微小容量容器内を洗浄した。
５）標識酵素の発色基質の溶液（１０μｌ）を微小容量容器内に注入して、発色反応を行った。
６）反応停止剤の溶液（５μｌ）を微小容量容器内に注入して、発色反応を停止し、波長４５０ｎｍにおける吸光度の測定を行った。
上記のプロトコールに従い、電界撹拌を行わないＥＬＩＳＡ（従来法）と、１次抗体反応、２次抗体反応、及び発色反応で電界撹拌を行うＥＬＩＳＡ（電界撹拌法）を行った。電界撹拌は、４ｋＶ、４０Ｈｚの変動電圧を上下の電極間に印加することにより行った。
トラスツズマブＥＬＩＳＡキットの通常のプロトコールでは、１次抗体反応と２次抗体反応の時間は、どちらも１時間であり、発色反応の時間は３０分であるが、今回の実験では、１次抗体反応と２次抗体反応の時間をどちらも１０分間とし、発色反応の時間を１０分間とする、短時間での反応とした。
従来法と電界撹拌法において、被検試料中のトラスツズマブの濃度が０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌである被検試料を用いて、それぞれ試験を行った。その結果を図６（Ａ）のグラフに示す。図６（Ａ）において、横軸は、被検試料中のトラスツズマブの濃度を示し、縦軸は、吸光度を測定した結果を示す。
図６（Ａ）のグラフに示されるとおり、従来法では、トラスツズマブＥＬＩＳＡキットの通常のプロトコールよりも短い時間で反応を行っているため、十分な発色ができず、吸光度の値は低いものであった。一方、電界撹拌法では、１次抗体反応、２次抗体反応、及び発色反応を電界撹拌により促進したため、反応時間が短いにもかかわらず、十分な発色が得られた。測定された吸光度の値は、トラスツズマブの濃度に比例したものであり、検量線を引くことができた。
【００５１】
（比較例）
次に、比較例として、マイクロプレートを上部電極によって押さえ付けず、マイクロプレートとの間に僅かな隙間を設けて上部電極を設置し、それ以外の条件は、前記と同じ条件としてＥＬＩＳＡを行った。その結果を、図６（Ｂ）のグラフに示す。図６（Ｂ）において、横軸は、被検試料中のトラスツズマブの濃度を示し、縦軸は、吸光度を測定した結果を示す。
図６（Ｂ）のグラフに示されるように、電界撹拌法では、十分な発色が得られたものの、測定された吸光度の値は、トラスツズマブの濃度に比例したものではなく、検量線を引くことができなかった。これは、マイクロプレートの歪みにより、各微小容量容器における電界撹拌の条件が同一とはならず、反応にバラツキが生じたためであると考えられた。
【符号の説明】
【００５２】
１        マイクロプレート
２        微小容量容器
３        底面
４        側壁
５        囲み枠
６        溶液、液滴
７        下部電極
８        上部電極
９        凸部
１０      測定光
１１      高圧アンプ
１２      ファンクションジェネレータ
１３      プラス電荷
１４      マイナス電荷
Ａ        囲み枠の高さ
Ｂ        囲み枠の内周側に存在する底面の径
【図１】
2019144033.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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