(57)【要約】ブラザー・オブ・レギュレーター・オブ・イムプリンテッド・サイト（ＢＯＲＩＳ）からの非機能性変異体形をコードするヌクレオチド、非機能性の変異したＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド、およびＢＯＲＩＳの修飾されたタンパク質を記載する。これらの分子は癌に対する治療ワクチンとして用いられる。
2007504154.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブラザー・オブ・レギュレーター・オブ・イムプリンテッド・サイト(the Brother of Regulator of imprinted sites) （ＢＯＲＩＳ）タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの非機能的変異体形をコードするポリヌクレオチド、非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド、非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを発現する樹状細胞、および非機能性変異体ＢＯＲＩＳ分子を模倣するいずれかの分子よりなる群から選択される１員を含む免疫原性の組成物。
【請求項２】
非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが、ＤＮＡ結合性を欠く請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが、ジンクフィンガードメインを欠く請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが、医薬的に許容された担体に結合している請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが、タンパク質トランスデューシングドメインに結合している請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが、ＲＯＢＩＳを修飾し、ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの抗原性を保持しまたは高めるペプチドに結合している請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを発現する樹状細胞を変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするＤＮＡでトランスフェクションする請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを発現する樹状細胞が、非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするウイルスベクターに感染している請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを発現する樹状細胞が、ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドまたはＢＯＲＩＳのいずれかの修飾したタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを載せている請求項１、７または８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
アジュバンドを更に含む請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
アジュバンドが、非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするＤＮＡ、または変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドと混合または融合されている請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
アジュバンドが、サイトカイン、ケモカインおよび共刺激性分子よりなる群から選択される請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の免疫原性組成物を含むベクター。
【請求項１４】
ベクターが細菌、哺乳動物、酵母またはウイルスシステム中の発現を可能にする請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物で形質転換された宿主細胞。
【請求項１６】
細胞が細菌細胞、哺乳動物細胞または酵母細胞である請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドからのエピトープを認識する結合部位を含む抗体。
【請求項１８】
ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの非機能的変異体形をコードするポリヌクレオチド、非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド、非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを発現する樹状細胞、および非機能性変異体ＢＯＲＩＳ分子を模倣するいずれかの分子よりなる群から選択される分子を含む癌に対するワクチン。
【請求項１９】
非機能性変異体ＢＯＲＩＳが、少なくとも１つのジンクフィンガーを欠いている請求項１８に記載のワクチン。
【請求項２０】
非機能性変異体ＢＯＲＩＳが、ＤＮＡ結合能力またはいずれかの他のＢＯＲＩＳ機能を欠いている請求項１８および１９のいずれかに記載のワクチン。
【請求項２１】
更にアジュバンドを含む請求項１８〜２０のいずれかに記載のワクチン。
【請求項２２】
更に医薬的に許容し得る担体を含む請求項１８〜２０のいずれかに記載のワクチン。
【請求項２３】
ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの非機能的変異体形をコードするポリヌクレオチド、非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド、非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを発現する樹状細胞、および非機能性変異体ＢＯＲＩＳ分子を模倣するいずれかの分子よりなる群のメンバーの有効量をその必要のある患者に投与することを含む哺乳動物を免疫する方法。
【請求項２４】
非機能的変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチド、非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド、非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質ポリペプチドまたはペプチドを発現する樹状細胞、および非機能性変異体ＢＯＲＩＳ分子を模倣するいずれかの分子が、分子アジュバンドと混合または融合している請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
分子アジュバンドが細胞性免疫反応および／または抗体反応を増加させる分子である請求項２３または２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
分子アジュバンドがいずれかのサイトカイン、ケモカインおよび共刺激性分子よりなる群から選択される請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの非機能的変異体をコードするポリヌクレオチド、非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド、非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを発現する樹状細胞、および非機能性変異体ＢＯＲＩＳ分子を模倣するいずれかの分子が、従来のまたは分子アジュバンドと混合されている請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが、医薬的に許容し得る担体に結合している請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが、ＢＯＲＩＳを修飾し、その抗原性を保持および／または高めるペプチドに結合している請求項１〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが、タンパク質トランスデューシングドメイン（ＰＴＤ）を更に含む請求項１〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
ＢＯＲＩＳを発現する樹状細胞が、変異体ＢＯＲＩＳ分子をコードするＤＮＡでトランスフェクションされている請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
ＢＯＲＩＳを発現する樹状細胞が、非機能性変異体ＢＯＲＩＳ分子をコードするウイルスベクターに感染している請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
ＢＯＲＩＳを発現する樹状細胞が、ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドまたはＢＯＲＩＳのいずれかの修飾したタンパク質形を載せている請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
投与が、筋肉内、皮下、皮内、静脈内、鼻、直腸、膣、または腹膜によって行われる請求項１〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
患者が１以上のタイプの癌を有する請求項１〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
患者が癌を有する請求項１〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
患者が癌を有しない請求項１〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
患者が癌を有しないが、癌に対する遺伝的感受性を有する請求項１〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
正常な患者が、検出可能な癌を有しないが、悪性腫瘍の発生可能性から自分を保護する望みを有する請求項１〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
免疫化が、非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドからのエピトープまたはミメトープを認識するＴ細胞を含む細胞性免疫反応を装備することから生ずる請求項１〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドまたはミメトープを発現する樹状細胞。
【請求項４２】
非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドまたはミメトープを装備した樹状細胞。
【請求項４３】
非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするウイルスベクターが感染した非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを発現する樹状細胞。
【請求項４４】
免疫原性組成物が、ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの非機能的変異体形をコードするポリヌクレオチド、非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド、非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを発現する樹状細胞、および非機能性変異体ＢＯＲＩＳ分子を模倣するいずれかの分子よりなる群から選択される１員を含む、癌に対するワクチンの製造のための免疫原性組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は腫瘍ワクチンの製造のために用いる組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊椎動物は環境からの病原体、そしてまた内部で発達する腫瘍等の異常細胞に対する防御として免疫反応を装備する能力を有する。免疫反応は様々な細胞および因子間の複雑な相互作用の結果であるが一般に２つの主な因子を含む。一つは、細胞性成分であって、特殊化された細胞が直接に防御物質（抗原を有する）を攻撃し、他は体液性成分であって、そこでは抗体分子が抗原に特異的に結合しその除去を助ける。協調して作用して、個々の因子は来襲する病原体の最初の猛襲を限定し、それらを宿主から除去するのに全く効果的である。
【０００３】
免疫反応を提供するのに関与する主な細胞はリンパ球であって一般的に２つの主要な種類を含む。これらの最初のもの、Ｂ細胞またはＢリンパ球と呼ばれる、は骨髄で典型的に生成し、抗体を製造し分泌する役割を果たす。Ｂ細胞抗原生成物は外来抗原と直接反応し、それらを中和するか、またはそれらを次に除去する免疫システムの他の成分を活性化させる。特にオプソニンを作用させる抗体は細胞外の外来抗原に結合し、それにより食作用およびその後の細胞内殺傷を受けやすくする。一方、Ｔ細胞またはＴリンパ球は、胸線中で発育し、成熟し、細胞免疫反応を媒介する役割を果たす。これらの細胞は抗原全体を認識するのではなく、標的細胞そしてまた抗原提示細胞の表面に現れる特殊化されたタンパク質に結合するその短いペプチド断片に反応する。より具体的には、細胞内で製造された、または外部環境から細胞により吸収されたタンパク質は通常の代謝経路によりペプチドに連続的に分解するようである。その結果生じた短い断片は細胞内の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に会合し、ＭＨＣ−ペプチド複合体はＴ細胞による認識のために細胞の表面に運搬される。このようにして、細胞性免疫システムは細胞により製造されまたは消化されたタンパク質の全部のスペクトルを常に監視し外部抗原または腫瘍抗原、即ち、ウイルスによって感染された細胞または癌細胞を除去する体制にある。
【０００４】
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の構造は、２つの同一の重鎖（Ｈ）および２つの同一の免疫グロビリン軽鎖（Ｌ）を含むテトラマーのタンパク質複合体の構造である。これらの鎖はジサルファイド結合により連結されＹ形の抗体複合体を形成する。しかしながら、溶液中ではその分子はより球状の形をとり、生物学的液体中に存在する外来抗体と容易に結合する。免疫グロブリンのアミノ酸分析は、鎖内部に様々な機能的活性を有する特別な領域の定義に導いた。各軽鎖および各重鎖は、最初の１１０のアミノ末端残基内部で定義される可変領域（それぞれＶＬおよびＶＨ）を有する。ＶＬおよびＶＨ領域の３次元ペアリングは、免疫グロブリン分子の抗原認識部分または「抗原結合部位」（「ＡＣＳ］）を構成する。免疫グロブリンのテトラマー的性質のため、１分子あたり２つの同一の抗原結合部位がある。これらの鎖の可変ドメインは配列が高度に異種性で、非常に様々な抗原構造に高度に特異的な抗原結合部位の変化を提供する。可変ドメインの異種性は可変領域全体に均等に分布しているのではなく、ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と命名される相補性決定領域（「ＣＤＲ」）と呼ばれる３つのセグメントに位置する。これらの構造の更なる情報に関しては、Watson et al., 1987,  Molecular Biology of the Gene, Fourth Edition, Benjamin Cummings Publishing Co. Inc. Menlo Park, Calif.を参照。この文献は本明細書の一部を構成する。
【０００５】
重鎖のそれぞれは特別なアイソタイプを定義する定常領域を含み、免疫グロブリンを免疫グロブリンのクラスおよびサブクラスの１つに免疫グロブリンを割り当てる。定常領域は、単一のクラスの抗体間では顕著に変わらないドメインと呼ばれる単位（即ち、ＣＨ１，ＣＨ２，等）を含む。定常領域は抗原結合には関与しないが、細胞表面上のＦｃ受容体への顕著そしてまた補体タンパク質への結合等の「エフェクター効果」として知られる多くの生物学的活性に関係がある。樹状細胞およびマクロファージ等の抗原提示細胞は他の特徴中でＦｃ受容体の存在により一般に区別される。その結果、抗体が病原体に結合するなら、Ｆｃ部分を介して食細胞に結合できる。これは病原体が消化され、食細胞により破壊されること、オプソニゼーションとして知られる過程を可能にする。更に、以下により詳細に論ずるように、様々な病原性の抗原は処理されＡＰＣにより提示され更に、免疫反応を刺激しうる。
【０００６】
重鎖とは異なり、軽鎖は単一の定常領域（ＣＬ）を有する。軽鎖は重鎖の定常領域ＣＨ１をＣＬに結合するジサルファイド結合を介して重鎖と対をなす。更に、重鎖は定常領域ＣＨ１およびＣＨ２を分子の残りから分離するヒンジ領域を有する。テトラマーのフレキシビリティの原因となるのはこのヒンジ領域である。分子の２つの重鎖はヒンジ領域およびＣＨ２間の結合でジサルファイド結合を介して対となる。
【０００７】
そのような広い能力範囲を提供するために、免疫グロブリンは有限の数の遺伝子から莫大な数の異なった免疫グロブリンタンパク質、即ち固有の多型、の製造を可能にするよう進化した。固有の多型のため哺乳動物は無限と思える抗原の多様性に対する抗体を製造することができる。免疫グロブリン遺伝子およびタンパク質の構造のレビューについてはLewin, "Genes III", John Wiley and Sons, N.Y. (1987)およびBenjamini and Leskowitz, 1988, Immunology, Alan R. Liss, Inc., New York を参照、その文献は本明細書の一部を構成する。
【０００８】
過去２，３年の間に、抗体は、その多様性と特異性のため診断および治療利用において極めて重要となっている。分子生物学的技術は科学的利用について抗体の多様性と利用を拡張するのに益々用いられている。例えば、単一抗体を製造するＢ細胞は腫瘍細胞との融合により不滅化され、「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）として知られる単一特異性の抗体のインビトロ源を提供するよう拡張された。そのような不滅のＢ細胞系は「ハイブリドーマ」と呼ばれる。
【０００９】
最近迄、大抵のｍＡｂの源はインビトロで培養さるハツカネズミ（マウス）ハイブリドーマであった。即ち、マウスに典型的には選択した抗原または免疫原を注射した。その後、その動物を犠牲にし、その脾臓から除去した細胞を不死のミエローマ細胞と融合させた。それは診断に広く用いられたが、ハツカネズミｍＡｂは、ヒトを含む大抵の哺乳動物における治療的利用にはよく適さない。これは部分的にはハツカネズミ抗体は他の哺乳動物種により外来と認識され、それ自体が病気を引き起こす免疫反応を引き出すという事実による。
【００１０】
外来のｍＡｂによって生ずる免疫反応および適当なヒトｍＡｂの欠如の問題の少なくともいくつかを克服するため、遺伝子工学を用いてハツカネズミ抗体の抗原を結合する相補性決定領域を含むが、分子の残りは外来として認識されないヒト抗体配列よりなるヒト化キメラ免疫グロブリン分子を構築された。マウス可変領域が腫瘍抗原を認識し、分子のヒト化部分が、身体により急速に除去されることなく免疫反応を媒介することができるのでそのような抗体を用いて腫瘍を治療するのに用いられた。例えば、Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)を参照。その文献は本明細書の一部を構成する。
【００１１】
そのような抗体の他の使用はＷＯ  ９４／１４８４７に詳細に記載されており、その文献は本明細書の一部を構成する。これらの場合において、ウイルスまたは細菌エピトープ等の外来抗原のエピトープは免疫グロブリンの超可変領域にグラフトされ反応を誘導する。即ち、操作された抗体をワクチンとして用いて免疫反応を引き起こし、長期の免疫原性記憶を与え、それにより、患者がその後の感染を退けることを可能にする。
【００１２】
これらのおよびより伝統的なワクチンは、免疫システムの両方のプロングを刺激するのに有効である。免疫システムの体液成分に伴う複雑性に係わらず、哺乳動物が毎日受ける無数の病原体の襲撃から哺乳動物を効果的に守ることはできないであろう。それは高級生物を生き残らせ、増殖させる高度に進化した細胞反応の存在のみである。
【００１３】
上に示したように、骨髄で前駆体から生じたＴリンパ球またはＴ細胞反応、侵入するウイルスおよび他の微生物に対する免疫反応の中心のプレヤーである。前駆幹細胞は胸腺に移動し、そこでいわゆる胸腺細胞として特殊化される。特に、それらは後に成熟Ｔ細胞が感染を検知できる受容体分子を提示し始める。Ｔ細胞はそれらの受容体を介して抗原に結合できねばならない（侵入者の存在の信号をだすタンパク質マーカー）。同時に、それらは、自己反応性のＴ細胞が正常な組織を破壊しうるので、身体によって作られた物質に対して盲目であるべきである。典型的には、有用な受容体を作るこれらの胸腺細胞のみが完全に成熟し、血流に入り身体をパトロールする。効果のない、または身体自身の組織を攻撃するであろう他のものは、健康な個体では、胸腺を去る前にアポトーシスによりなくなる。
【００１４】
細胞障害性Ｔリンパ球またはＴヘルパー細胞として最後に循環に入った成熟Ｔ細胞は、それらの受容体が認識する抗原に出会わないかぎり休んでいる・そのリンパ球が親和性を有する特別の抗原に出会うと、それらは増殖し、エフェクター機能を行い、その結果は外来抗原の除去である。
【００１５】
Ｔ細胞はそれらが行う異なった仕事に基づいていくつかのサブ集団に分類されている。これらのサブ集団はＴおよびＢ細胞反応を促進し、または高めるために必要なヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）；細胞溶解により標的細胞を直接殺す細胞障害性（細胞溶解性）Ｔリンパ球（ＣＴＬ）；免疫反応を下方調節するサプレッサーまたは調節Ｔ細胞（ＴｓまたはＴｒ）を含む。いずれの場合にも、Ｔ細胞は抗原を認識するが、抗原提示細胞の表面に結合した特殊化されたタンパク質複合体により細胞の表面に提示された場合のみである。Ｔ細胞は、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）と特殊な受容体を用いる。ＴＣＲは主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と総称されるタンパク質の群と会合した抗原を認識できる膜貫通タンパク質複合体である。何千もの同一のＴＣＲが各細胞で発現される。ＴＣＲは機能および構造において、Ｂ細胞がその抗原受容体として用いる表面抗体（非分泌性）に関連する。更に、Ｔ細胞の異なる副次集団も様々な細胞表面タンパク質を発現し、そのいくつかは特別な副次集団の特徴であるので「マーカータンパク質」と呼ばれる。例えば大抵のＴｈ細胞は細胞表面ＣＤ４タンパク質を発現し、一方大抵のＣＴＬ細胞は細胞表面ＣＤ８タンパク質を発現し、ＴｒはＣＤ２５およびＣＤ４分子を発現する。これらの表面タンパク質は、ＡＰＣの表面上の特別のタンパク質またはタンパク質複合体の認識およびその間の相互作用に依存する免疫反応の開始および維持に重要である。
【００１６】
ある場合には主要組織適合複合体即ちＭＨＣは別の４要素からなる構造を含む一連のグリコシル化タンパク質を実際に含むことが知られている。一般に構造は２つのタイプ：細胞内部で作られたタンパク質からのペプチドを表示するクラスＩＭＨＣ（自己タンパク質またはウイルス複製に続いて製造されるタンパク質）、および外側から細胞に入ったタンパク質からのペプチドを一般に表示するクラスＩＩＭＨＣ（細菌毒等の可溶性抗原）。様々な抗原の認識は、生じうるいずれかの病原性ペプチドを結合することができるＭＨＣ分子の多様なプールを連続的に提供する遺伝された多形により確実にされる。本質的には、すべての核のある細胞はクラスＩＭＨＣを製造し、発現する。クラスＩＭＨＣは天然のペプチド、腫瘍関連ペプチドまたはウイルス侵入者により製造されるペプチド示す。逆にいくつかの他の核のある細胞、およびそれらの中で特殊化されたリンパ球、抗原提示細胞として一般に知られるものは、はクラスＩＩＭＨＣタンパク質を製造し発現する。細胞のタイプに関係なく、両方のクラスのＭＨＣは細胞表面にペプチドを運び、それらを休止しているＴリンパ球に提示する。通常Ｔｈ細胞はクラスＩＩＭＨＣタンパク質−抗原複合体を認識し、ＣＴＬはクラスＩＭＨＣタンパク質−抗原複合体を認識する傾向があるが、抗原のクロス提示も起こる。
【００１７】
適当なＴＣＲを有する休止しているＴ細胞は、その表面にペプチドを表示するＡＰＣに出会った場合、ＴＣＲはペプチド−ＭＨＣ複合体に結合する。特に具体的には、数百のＴＣＲが多数のペプチド−ＭＨＣ複合体に結合する。十分なＴＣＲが接触した場合、蓄積する効果がＴ細胞を活性化させる。ＭＨＣ−抗原複合体の特異的な認識およびそれに対する反応の原因であるＴ細胞上の受容体は数個の内在性血漿膜タンパク質よりなる。前に議論したＭＨＣ複合体に関し、ＴＣＲの多数のプールが固有の多形により確実にされ、体の再配置に導く。ＴＣＲのプールは多数であるがそれぞれ個々のＴ細胞は単一の特異的なＴＣＲを発現するだけである。しかしながら、各Ｔ細胞は、各細胞の表面にたった１つのペプチドに対して特異的なことが強調されるべきである。この受容体の幾千ものコピーを典型的には示す。更に、いくつかの他のタイプの膜関連タンパク質はＴ細胞結合および活性化に関連する。
【００１８】
Ｔ細胞の活性化は一連の化学シグナル（一次サイトカイン）を必要とし、細胞テイキング直接作用または他の免疫システムの細胞の刺激をもたらす。クラスＩＭＨＣ−抗原活性化の場合、ＣＴＬは増殖し同じ抗原を提示する感染した細胞を破壊するように働く。感染した細胞を殺すことは、ウイルスから生命支持を奪い、抗体に接近可能にし、抗体はウイルスを最終的に除去する。対照的にクラスＩＩＭＨＣ−抗原複合体によるＴｈ細胞の活性化は抗原提示細胞（宿主防御システムの部分である）を破壊せず、むしろＴｈ細胞を刺激し増殖させ、様々な細胞に影響するシグナル（再度一次サイトカイン）を生み出す。他の結果の中で、そのシグナルはＢ細胞刺激、マクロファージ活性化、ＣＴＬ分化および炎症の増進に導く。この協調した発現は比較的特異的であり、クラスＩＩＭＨＣシステムにより提示されるペプチドを有する外来因子に指示される。
【００１９】
免疫システムに接近できる身体におけるこれらの構造のいたるところのエピトープの常なる監視は、「自己」を認識し、維持し、身体を侵略し、または病理学的に現れるエピトープおよびその担体を破壊するための非常に有効な手段を提供する。免疫反応を適当に作動させることは顕微鏡的病原体および身体中で連続的に生ずると信じられ、検出可能の前に免疫システムにより大部分除去される新生物（腫瘍）細胞を除去するのに驚くほど有効である。脳、目、および精巣等の身体のある領域は、免疫監視から保護され、これらの部位は免疫特権(privilege)と呼ばれる。一般に自己認識の複雑な機構は非常に効率的であり、強い反応が外来抗原を排他的に指示することを可能にする。不幸なことに、免疫システムは場合によりうまく機能せず、宿主の細胞に向かい自己免疫反応を引き起こす。典型的には、自己免疫は免疫細胞上の抗原受容体が健康な細胞上の特異的抗原を認識し、これらの特別な物質を有する細胞を死滅させる。多くの場合、自己免疫は、それらをセットオフする抗原が除去された場合消滅するという点で自己限定的である。しかしながら、ある場合には自己反応性のリンパ球はそうあるべきより長く生き残り、アポトーシスを誘導し、またはさもなければ正常な細胞を除去し続ける。
【００２０】
現在のデータは癌に対する免疫的保護には悪性の細胞により発現されるユニークな腫瘍抗原に対して強力な細胞性免疫反応の生成が必要となる。その結果、免疫保護の成功には先ず腫瘍細胞（腫瘍特異的抗原）で発現するユニークな抗原を必要とし、第２には腫瘍抗原を標的にする強力なＴ細胞免疫反応の誘導を必要とする。
【００２１】
いくつかの腫瘍関連抗原が現在知られており、ワクチンを生成するための臨床前および臨床研究に用いられている。例えば、ＰＳＭＡ、ＰＡＰ，およびＰＳＡは前立腺の腫瘍細胞で発現される抗原である。Ｈｅｒ２／ｎｅｕおよびＭＵＣ１は乳癌、および肺、卵巣、結腸、膵臓の腫瘍を含む他の癌腫により発現される。ＭＡＧＥおよびＭＡＲＴ−１はメラノーマ腫瘍細胞関連抗原であり、ＣＥＡは膵臓または結腸・直腸の癌と関連する抗原である。他の組織および／または腫瘍特異的抗原も記載されている。しかしながら、これらの抗原のすべては正常なまたは異常な形で腫瘍中で発現されるが、それらは様々な正常な細胞中でも発現され、従って予防ワクチンとして用いられない。換言すれば、これらの腫瘍関連抗原は免疫細胞により自己分子として未だ認識され、免疫システムの真の活性化は起こらない。これはワクチンのベースとしてこれらの腫瘍関連分子を標的にするために少なくとも２つの障害がありことを示す。最初の障害物は自己分子に対する免疫システムの非反応性（寛容）であり、それは強力な細胞免疫反応を生み出すその能力を制限する。第２は生じたいかなる強力な細胞免疫反応も標的抗原を発現する正常な細胞に向かうべきではないと言うことである。これが上で論じたすべての腫瘍関連抗原が治療的なワクチン化の標的としての使用のためにのみ提案されている理由である。
【００２２】
公知の腫瘍関連抗原に関連する問題を克服することができる新規なタンパク質が最近記載された。ブラザー・オブ・レギュレーター・オブ・イムプリンテッド・サイト(the Brother of Regulator of Imprinted Sites) （ＢＯＲＩＳ）は精巣において見出されたＤＮＡ結合タンパク質として最初に記載された。このタンパク質は多価の１１ジンクフィンガー核因子であるＣＣＣＴＣ結合因子（ＣＴＦＥ）と１１のジンクフィンガー（ＺＦ）ドメインを共有する。ＣＴＦＣは遺伝子制御の様々な側面に関与する保存された、偏在する高度に用途の広い因子であり、Ｘ染色体不活性化および印を押した遺伝子の発現を制御するメチル化感受性のインシュレーターを形成する。しかしながら、ＢＯＲＩＳはＮおよびＣ末端でＣＴＣＦと異なり、雄の生殖細胞発育の間ＣＴＣＦと相互に排他的な方法で発現する。ＢＯＲＩＳ発現は精巣に限定され、次に雄の生殖細胞発育の間メチル化マークの再セットに関与する精母細胞の選択細胞副次集団の内部でのみに限定される。この精巣細胞副次集団はＣＴＣＦを発現しない唯一の正常な細胞タイプである。培養細胞におけるＣＴＣＦ発現の阻害はアポトーシスに導くので、ＢＯＲＩＳが活性化され精巣細胞におけるきわめて重要なＣＴＣＦ機能のいくつかを維持すると想定するのは合理的である(Loukinov et al. (2002) Proc Natl. Acad. Sci. 99(10): 6806-6811; この文献は本明細書の一部を構成する)。
【００２３】
より最近、ＣＴＣＦ過発現は細胞増殖をブロックするが、正常なＢＯＲＩＳ陰性細胞におけるＢＯＲＩＳの発現はトランスフォーメションに導きうる細胞の成長を促進することが示された(Klenova et al. (2002) Cancer Biol. 12:399-414; この文献は本明細書の一部を構成する)。ヒトＢＯＰＲＩＳは２０ｑ１３領域に染色体上で位置付けられ、ＣＴＣＦがある１６ｑ１２上のパラロガスな座で異形接合性の喪失（ＬＯＨ）をもしばしば示す多くの同じタイプの腫瘍で観察される頻繁な増大および／または拡大についてよく知られている。これらの領域は、乳房、前立腺、卵巣、胃、肝臓、子宮内膜、グリオーム、結腸および食道癌そしてまたＷｉｌｍｓ腫瘍と関連する「ホットスポット」と関連する。重要なことはＢＯＲＩＳ発現の異常な活性化は、顕著な割合の広い種類の新生物で見出されるようである。ノーザンブロットまたはＲＴ−ＰＣＲを用いて、Klenova et al. (2002)はヒト腫瘍の主要な形の大部分を表す２００以上の癌細胞系でＢＯＲＩＳｍＲＮＡレベルを分析し、試験した細胞系の１／２以上で転写物を検出した、乳癌試料についての１次的な癌のその後の分析は細胞系で得られた結果を確認した。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明はブラザー・オブ・レギュレーター・オブ・イムプリンテッド・サイト(the Brother of Regulator of Imprinted Sites) （ＢＯＲＩＳ）腫瘍抗原をコードする非機能性変異体ポリヌクレオチド、および１次性または転移性の癌の予防的ワクチン化および免疫療法のためのそのようなポリヌクレオチドの使用に関する。ポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。１つの好ましい態様では、腫瘍抗原はＤＮＡ結合能力を欠いたＢＯＲＩＳ分子の非機能性の変異した形である。他の好ましい態様では、少なくとも１つのジンクフィンガー（ＺＦ）ドメインが変異または削除のため非機能性であり、ＢＯＲＩＳの機能が除去される。他の好ましい態様では、ジンクフィンガードメインのいずれかの組み合わせが変異または除去され、ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチド、ペプチドの機能が除去される。他の好ましい態様では、すべてのＺＦ結合サイトが除去される。他の好ましい態様では、ＢＯＲＩＳの変異した形をコードするポリヌクレオチドは分子アジュバンドと融合する。他の好ましい態様では、ＢＯＲＩＳの非機能性の変異した形をコードするポリヌクレオチドは分子アジュバンドをコードする少なくとも１つの他のポリヌクレオチドと混合する。細胞性免疫反応を増加させるいずれの分子アジュバンドも使用できる。サイトカイン、ケモカインおよび共刺激性分子は特に好ましい。とくに好ましいサイトカイン、ケモカインおよび共刺激性分子はベータ−デフェンシン２，Ｉｌ２，ＩＬ１８，ＭＩＰα３，ＩＦＮγおよびＣＤ８０／８６である。
【００２５】
本発明はＢＯＲＩＳの非機能性の変異した形をコードするポリヌクレオチドを含むベクターにも関する。好ましい態様ではベクターは細菌、哺乳動物、酵母またはウイルスシステムでの発現を指示する。
【００２６】
本発明はＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの非機能性の修飾した（変異体）形に関する。非機能性変異体は、非機能性のタンパク質をもたらす配列中の削除、置換または付加を導入するいずれの方法によっても作ることができる。好ましい態様では、変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドはＤＮＡ結合能力を欠いている。他の好ましい態様では、変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは従来のアジュバンドと混合する。他の好ましい態様では、非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを医薬的に許容し得る担体（骨格）に結合する。他の好ましい態様では、非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをＢＯＲＩＳを修飾し、その抗原性を保持するペプチドに結合させる。他の好ましい態様では、非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをタンパク質トランスデューシングドメイン（ＰＴＤ）に結合させる。
【００２７】
本発明は非機能性変異体ＢＯＲＩＳ分子を発現する樹状細胞にも関する。好ましい態様では、樹状細胞は変異体ＢＯＲＩＳ分子をコードするＤＮＡでトランスフェクションされている。他の好ましい態様では、樹状細胞は非機能性変異体ＢＯＲＩＳ分子をコードするウイルスベクターに感染している。他の好ましい態様では、樹状細胞は非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドまたはＢＯＲＩＳのいずれかの非機能性の修飾されたタンパク質を装備している。
【００２８】
本発明はＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの非機能性の変異体、またはＢＯＲＩＳのいずれかの非機能性の修飾されたタンパク質に対して生成した細胞性免疫反応を包含する。本発明はＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの非機能性の変異体、またはＢＯＲＩＳのいずれかの非機能性の修飾されたタンパク質に対して生ずる抗体を含む。
【００２９】
本発明はＢＯＲＩＳの非機能性の変異体形をコードするポリヌクレオチド、非機能性の変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド、または非機能性の変異体ＢＯＲＩＳ分子を発現する樹状細胞を含む癌予防または治療ワクチンを包含する。
【００３０】
本発明は、有効量の、ＢＯＲＩＳの非機能性変異体形をコードするポリヌクレオチド、非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド、または非機能性変異体ＢＯＲＩＳ分子を発現するか含む樹状細胞をその必要のある患者に投与する（予防的ワクチン）ことを含む癌を処置する方法に関する。投与は筋肉内、皮下、皮内、静脈内、直腸、膣、または腹膜経路によって行われ得る。癌は１次的或いは転写性癌であり得る。患者は多数の異なったタイプの癌を有し得る。好ましい態様では癌は乳癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、肝臓癌、子宮内膜癌、グリオーム、結腸癌または食道癌である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明は多くの異なる形をとりえるが、本発明の原理を例示する具体的な説明的な態様を開示する。本発明は説明された具体的な態様に限定されるものでないことを強調する。
【００３２】
本発明は免疫特権の精巣細胞でのみ発現され、多くのトランスフォームされた腫瘍細胞で現れ、他の腫瘍抗原を誘導しうる許容効果を防止する抗原の使用を含む。本発明はまた副作用および自己免疫をなくするため抗原をコードするＤＮＡに特別の変化を導入することを含む。本明細書で次の定義を適用する。
【００３３】
用語「腫瘍」、「癌」、「新生物」、「新生組織形成」およびそれらの語源的関連物は本明細書では互換的に用い、一般に異常増殖細胞および付随的な影響を及ばされる細胞または細胞集団を言う。好ましくは異常増殖細胞は免疫特権抗原を発現する。
【００３４】
細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）はエフェクターＴ細胞、通常ＣＤ８＋であり、ＭＨＣ分子と会合する抗原ペプチドを有する標的細胞の溶解を媒介できる。他の細胞障害性細胞にはガンマ／デルタおよびＣＤ４＋ＮＫ１．１＋細胞を含む。
【００３５】
免疫特権(privilege)および免疫特権抗原は免疫システムからの身体内のある部位および抗原の分離を言い、従って免疫反応が正常に発達していない抗原に関する。異所的に発現する免疫特権抗原（即ち、それらの正常に免疫特権された部位の外側）は自己免疫または腫瘍免疫をもたらすかも知れない。免疫特権抗原はある腫瘍により発現され、同じ免疫特権抗原を発現する腫瘍および非腫瘍部位に対し免疫反応をもたらす。
【００３６】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、樹状細胞、マクロファージ、およびＢ細胞を含む細胞であり、クラスＩまたはクラスＩＩＭＨＣ分子に会合して抗原性ペプチドを処理し提示し、Ｔ細胞活性化に必要な共刺激シグナルを運ぶことができる。
【００３７】
「ジンクフィンガードメイン」は小さい独立にフォールドされたドメインであり、その構造を安定化させるために１以上の亜鉛イオンの配位を必要とする。フィンガーは３つの塩基ペアサブサイトに結合し、特異的な接触はαヘリックスのスタートから位置１，２，３および６にあるアミノ酸により媒介される。
【００３８】
「ＢＯＲＩＳの非機能的変異体」は機能を欠いたＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを言う、「機能を欠いた」とは、ＤＮＡ結合、父性ＤＮＡ−メチル化パターン、等の野生型のＢＯＲＩＳ分子の重要な活性のいずれかを行うことができないことを意味することを意図する。
【００３９】
「非機能的変異体」とは生じたタンパク質の野生型活性を破壊するＤＮＡまたはアミノ酸レベルでの変化を言う。そのような変化は、触媒部位として作用し、および／またはＤＮＡ若しくはタンパク質の結合に参加する分子の領域におけるアミノ酸置換、削除、または付加であり得る。活性を破壊することができる変化の例は触媒的および／または結合の相互作用に参加する重要なアミノ酸の削除または置換、触媒的または結合相互作用に関与する部位の必要な３次元構造を変化させるアミノ酸の付加、フレームシフトを起こすヌクレオチドの付加または削除であり、かくして必要な３次元構造を破壊する。変異はＰＣＲ，オリゴヌクレオチドの使用、等の一般的な分子技術を用い行なわれる（例えば、Sambrook, Maniatis and Fritsch を参照）。自然におこる変異も細胞集団から単離できる（例えば、ambrook, Maniatis and Fritsch を参照）。
【００４０】
「ペプチド」とはペプチド結合により結合された少なくとも２つのアミノ酸を含む分子を言う。「ポリペプチド」とはペプチド結合により結合された少なくとも１０のアミノ酸を含む分子を言う。「タンパク質」少なくとも２０のアミノ酸を含む分子を言う。
【００４１】
「ＢＯＲＩＳの非機能性変異体をコードするポリヌクレオチド」とは、ヒト（配列番号１）またはマウス（配列番号３）ＢＯＲＩＳポリヌクレオチドと少なくとも５０％、６０％、または７０％の配列同一性、より好ましくは７５％、８０％、９０％，９５％または９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するいずれかのポリヌクレオチドを言う。
【００４２】
「非機能性変異体ＢＯＲＩＳペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質」とは、ＤＮＡ結合、父性のＤＮＡメチル化パターンの再確立等の野生型のＢＯＲＩＳ分子の重要な活性のいずれか１つ行えないＢＯＲＩＳ分子を言う。「非機能性変異体ＢＯＲＩＳペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質」とはヒト（配列番号１）またはマウス（配列番号２）ＢＯＲＩＳペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質と少なくとも５０％、６０％、７０％、の配列同一性、より好ましくはヒト（配列番号２）またはマウス（配列番号４）ＢＯＲＩＳペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質と７５％、８０％、９０％，９５％または９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
【００４３】
非機能性変異体ＢＯＲＩＳ分子はトランスフォームされた腫瘍細胞においてのみ発現される非自己抗原として認識され、先行技術の限界を克服する抗原として用いられる。ＢＯＲＩＳの変異体形は理想的な非毒性ワクチンとして使用される。何故ならそれはＤＮＡ結合活性および／または天然の機能によって起こるいずれの望ましくない副作用を有しないからである。換言すれば、ワクチン化に用いられる変異体ＢＯＲＩＳは機能的活性を有さず、免役源（抗原）としてのみ存在する。他の腫瘍特異的抗原とは異なってＢＯＲＩＳは女性では正常な組織では発現しない。更に、ＢＯＲＩＳは、男性における正常な精巣の思春期に関する発育の間に発現したとしても、非機能性変異体ＢＯＲＩＳの導入および／または発現は有害ではない。何故なら精巣は免疫特権組織（免疫細胞が接近できない）からである。換言すれば、免疫化後に生じた抗ＢＯＲＩＳ免疫反応は正常細胞に危険ではなく、ＢＯＲＩＳワクチンは自己免疫を誘導しない。更に、強力な免疫反応の生成が保証される。何故ならＢＯＲＩＳは他の腫瘍特異的抗原とは異なり、外来抗原として認識されるからである。ＢＯＲＩＳ特異的なＴ細胞は胸腺で除去されず、変異体ＢＯＲＩＳを非自己抗原として認識し、免疫応答を生ずるからである。
【００４４】
１態様においては、マウス（ｍＢＯＲＩＳ）ＢＯＲＩＳをコードするｃＤＮＡをマウスまたはヒトの精巣から単離したｍＲＮＡ上でＲＴ−ＰＣＲにより生成させる。その分子のＤＮＡ結合ドメインを除去し、単鎖Ｆｖドメイン抗体の製造においてよく作用することが知られている小さいスペーサーで置換する。正しい配列は自動ヌクレオチド配列分析により確認される。生じた分子は１１のＺＦドメインを欠き、１８のアミノ酸スペーサーを介してＣ末端（アミノ酸５７３−６３６）に結合したｍＢＯＲＩＳのＮ末端領域（アミノ酸１−２５８）よりなる。
【００４５】
変異させたｃＤＮＡをｈＥＦ１−ＨＴＬＶプロモーターのコントロールの下、ｐＯＲＦベクターにクローニングするが、他の発現ベクターも使用できる。変異させたｃＤＮＡは、宿主細胞で発現を起こすことができるプロモーターおよび／または調節分子に作動可能に結合させる。αウイルスＤＮＡまたはＲＮＡベクター、アデノウイルスおよびレトロウイルスを含むウイルスベクターが使用できる（Vasilevko,V. et al. (2003) Clin. Exp Metastas. 20:489-98; Leitner, W. W. et al. (2003) Nat Med 9:33-39; Ribas, A. et al. (2002) Curr. Gene Ther. 2:57-58 参照）。
【００４６】
上記に加えて、本発明は、アデノウイルス、ヒトＢ型肝炎、ヒトＣ型肝炎、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、等の非機能性変異体ＢＯＲＩＳ分子をコードするウイルス様粒子を用いることを包含する。異なったウイルスからの組換えウイルスタンパク質はウイルス様粒子（ＶＬＰ）中への自己集合という望ましい性質を有する。これらの粒子はウイルスの核酸を含まず、それ故非複製性、非感染性であり、コンフォメーション的に正しい抗原エピトープを保持する。ＶＬＰの製造は、哺乳動物細胞、バキュロウイルス感染昆虫細胞、酵母、Ｅ．ｃｏｌｉ，細胞を有しないシステム、および遺伝形質を転換した植物等の多くの実験システムで示されている。重要なことは、ＶＬＰによるワクチン化は体液性ばかりでなく、細胞性の免疫反応の製造を生み出す。ＶＬＰは専門的ＡＰＣに感染し、次にＣＤ４＋Ｔｈ１（ＣＤ８＋Ｔ細胞を助けるＣＤ４＋細胞のタイプ）およびＣＤ８＋ＣＴＬ反応を含む保護的な細胞免疫反応を含む。このように、ＶＬＰは、細胞性免疫反応を活性化する（Ｔ細胞反応）例外的な能力を明らかに示した。予防的ワクチンとしてのＶＬＰの使用可能性は多くの異なる臨床的試みで現在評価されつつある。これらの試みからの結果は、各試みで報告された優れた許容性および高い免疫原性で勇気付けられている。末端をきって短くしたＢＯＲＩＳ抗原よりなるＶＬＰワクチンの生成はこの腫瘍関連抗原を発現する癌細胞に対する強力な細胞免疫反応の誘導を促進するであろう。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コア抗原（ＨＢｃＡｇ）およびＶＳＶは適当なＶＬＰの例である。
【００４７】
より強力な細胞免疫反応を作り出すために、トランケートしたまたは変異させたｍＢＯＲＩＳを、ベクターへのクローニングの前にＢ７共刺激性分子、β−デフェンシン２／３、ＭＩＰ３α、ＩＦＮγ、サイトカイン、等の分子アジュバンドと融合させる。他の適当な分子アジュバンドを下の表にリストする。
【表１】
2007504154.tif 000003
【００４８】
或いは、ＤＮＡ免疫のためＴｗｅｅｎ ８０，５％エタノール、ブピバカイン等の従来のアジュバンドを用いることができる。従来のアジュバンドの他の例は、鉱物塩（水酸化アルミニウムおよび燐酸アルミニウムゲル等の）、オイルエマルジョンおよびＭＦ５９，ＱＳ２１，ＡＳ０８（ＳＢＡＳ２）、オイルインウオターエマルジョン＋ＭＰＬ＋ＱＳ２１）、モンタナイドＩＳＡ−５１およびＩＳＡ７２０、ビロソメス等の微粒子アジュバンド、ＡＳ０４（ＭＰＬとの（ＳＢＡＳ４）Ａｌ塩）、ＩＳＣＯＭＳ、ポリラクチド・コグリコリド（ＰＬＧ）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）を含む微生物誘導体（天然および合成）、Detox (MPL+ M. Phlei 細胞壁骨格)、AGP(RC-529), DC_Chol, OM-174(lipid A  誘導体）、CpGモチーフ、修飾したLTおよびCT（遺伝的に修飾した細菌毒）、GM-CSF等の内生的な免疫モジュレーター、IL-2、Immudapin、そしてまた上の表に掲げたすべての他のケモカイン、サイトカインおよび共刺激性分子、および金粒子等の不活性のビークルを含む。
【００４９】
アジュバンドはブラザー・オブ・レギュレーター・オブ・イムプリンテッド・サイト(the Brother of Regulator of Imprinted Sites) （ＢＯＲＩＳ）タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの非機能性変異体をコードするポリペプチド、非機能性変異体BORISタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド、および非機能性変異体BORISタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを発現する樹状細胞と混合する。
【００５０】
更なるペプチド分子を非機能性変異体BORIS構築物に含め、MHCクラス経路の専門的な抗原提示細胞（APC）による非機能性変異体BORISの提示を高め／促進する。この１例はペプチドトランスデューシングドメイン（PTD)で作った構築物である。一般に、免疫反応は本来の抗原プロセッシングおよび提示に頼る。腫瘍関連抗原は、細菌、酵母または哺乳動物細胞で発現されうるが、これらのシステムで発現したタンパク質抗原はＴ細胞反応（ＣＴＬ反応またはＴｈ−１に偏した反応）を最大には刺激しないであろう。何故なら、可溶性の外来のタンパク質はＭＨＣクラスＩＩ経路により主に処理されるからである。事実、多くの抗腫瘍ワクチンはＣＤ８＋ＣＴＬの誘導に頼るが、これは通常タンパク質がＡＰＣのサイトゾル内部で合成されることを必要とする。不幸なことに、一般に、真核細胞の血漿膜は大部分のタンパク質を通さない。しかしながら、タンパク質トランスデューシングドメイン（PTD)と融合した外来タンパク質は血漿膜を通ることができ、タンパク質を細胞内部に蓄積できることが最近見出された。これは抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＡＰＣのＭＨＣクラスＩ分子による外来ペプチドの提示を高める。
【００５１】
ワクチン化／免疫化
本発明のワクチン製剤は免疫原量の非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチド、非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド、または非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質を発現する樹状細胞を、医薬的に許容し得る担体とともに含む。関係しない配列のポリペプチドであるが、非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに対応する３次元構造を有し、同じ方法で免疫学的に機能するミメトープを用いることができる。ＢＯＲＩＳ構造に関係しないミメトープは、同一の３−ｄ抗原エピトープを有し、抗ＢＯＲＩＳ  Ｔ細胞により認識される。
【００５２】
「免疫原量」は、ワクチンが投与される患者において免疫反応を引き起こすに十分な非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチド、非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド、または非機能性変異体ＢＯＲＩＳタンパク質を発現する樹状細胞の量である。投与される量は所望の免疫反応および所望の程度の保護を誘導する量である。例示的な医薬的に許容し得る担体は、限定するものではないが、滅菌した、発熱物質を含まない水、および滅菌した、発熱物質を含まない生理学的食塩水を含む。
【００５３】
本発明のワクチン製剤は限定するものではないが乳房、前立腺、卵巣、胃、肝臓、子宮内膜、グリオーム、結腸、および食道癌を含む少なくとも１つのタイプの癌を有すると診断された患者に適している。本発明のワクチン製剤は癌に対して遺伝的な感受性を有することが知られている患者にも適している。更に、本発明のワクチン製剤は癌のない、癌に対して遺伝的な感受性がないヒトを含め、野生タイプのＢＯＲＩＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを発現する少なくとも１つのタイプの癌に対して保護を祈ることを願う一般的な個体群に適している。
【００５４】
ワクチン製剤の投与は、非経口の注射（腹膜内、皮下、筋肉内注射）、皮内、静脈内、鼻の、直腸の、膣の、または気管表面に対する、を含む適当な手段により行いうる。ウイルスの気管表面に対する局所的適用は鼻腔内投与により（例えば医薬製剤を鼻腔内に置くスポイド、綿棒、または吸入器により）行える。ウイルスの気管表面に対する局所的適用は、エアゾル懸濁液としてレプリコンを含む医薬製剤の呼吸に適している粒子（固体粒子および液体粒子を含む）を作り、患者に呼吸可能な粒子を吸入させることのよる吸入投与によっても行われ得る。医薬製剤の呼吸可能な粒子に対する投与のための方法と装置はよく知られており、いずれの従来の技術も用いることができる。「免疫原量」とはワクチンを投与した患者において免疫反応を引き起こすに十分なレプリコン粒子の量である。
【００５５】
ＲＮＡまたはＤＮＡをワクチンとして用いる場合、ＲＮＡまたはＤＮＡを金ビーズ（遺伝子ガン）による運搬、リポソームによる運搬または直接的な注入等の技術を用いて直接投与できる。１以上の構築物または転写するＲＮＡを患者において免疫原性反応を導出するのに有効な組み合わせで用いることができる。一般的に、投与される核酸ワクチンは所望の免疫反応および所望の保護の程度を誘導するであろう量であり得る。投与すべきワクチンの正確な量は医者の判断により、各患者および抗原に特有であり得る。
【００５６】
ワクチンは単一投与スケジュールで、好ましくは多数投与スケジュールで投与され、ワクチン化の第一次のコースは１−１０の別の投与、それに続く免疫反応を維持し、強化するのに必要なその後の時間間隔、例えば１−４月に第２の投与、およびもし必要なら数ヶ月後にその後の投与、で与えられる他の投与で与えられる。適当な免疫化スケジュールは（ｉ）０，１月および６月、(ii)０，７日、および１月、(iii)０および１月、(iv)０および６月、または保護的免疫を与え、または病気の症状を減少させ、または病気の重篤を減少させることが予期される所望の免疫反応を引き出すのに十分な他のスケジュールを含む。
【００５７】
ヒト（ｈＢＯＲＩＳ）はヒトの精巣から単離し、同じ方法で操作しうる。同様に、ＢＯＲＩＳはいずれかの哺乳動物または脊椎動物の精巣から単離し、同様に用い得る。
【実施例】
【００５８】
１．ｈＥＦ１−ＨＴＬＶプロモーターの下のｍＢＯＲＩＳ分子からＺＦを除去した形をコードするプラスミドの生成
ＲＴ−ＰＣＲ反応を、マウスの精巣からのポリＡ  ＲＮＡおよび次のプライマーを用いて行った。
【化１】
2007504154.tif 000004
ＰＣＲ条件は９４℃３０秒間、６０℃３０秒間、７２℃２分間である。３０サイクルを行う。
【００５９】
ＰＣＲの生産物をＰＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（Invitogen）にサブクローンする。ＰＣＲＩＩ−ＴＯＰＯのＣ末端ｃＤＮＡはＢａｍＨＩ酵素で制限され、挿入物を含む陽性のクローンをプールし、次にHindIII酵素で制限する。スペーサープライマー（ＳｐＦおよびＳｐＲ）をアニールし、突出する付着末端を作り、BamHI-HindIII制限ベクターにライゲートする。Ｎ末端をコードする断片をHindIIIで制限し、ベクターから今分離した挿入物をプールし、Ｃ末端およびスペーサーを含むHindIIIで消化された構築物にライゲートする。適当な配向を有するクローンを次に選択し、配列決定し（例えば、以下のＺＦを除去したＢＯＲＩＳ分子の配列を参照）、ｐＯＲＦプラスミド中にhEF1-HTLVプロモーター(Invitrogen）の下にサブクローンする。
【００６０】
ＣＨＯ細胞を標準的な分子技術を用いて生じた構築物でトランスフェクションする（Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T (1989) molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor を参照。同文献は本明細書の一部を構成する）
【００６１】
ジンクフィンガーを除去したｍＢＯＲＩＳ構築物の発現は標準的な分子技術を用いてトランスフェクションしたＣＨＯ細胞から単離したｍＲＮＡのノーザンブロットにより分析する(Sambrook等参照)。
【００６２】
２．ＢORIS分子のＺＦを除去した形をコードするＤＮＡでのマウスの免疫
ＺＦを除去したｍＢＯＲＩＳ構築物をコードするプラスミドをEndoFreeプラスミドマキシキット(Qiagen）を用いて単離する。プラスミドDNAの純度はＵＶ分光光度計（２６０nm／２８０nm  吸光度比＞１．７）およびゲル電気泳動により確認する。
【００６３】
金のビーズをDNA(１μｇ/0.5ｍｇ金）で被覆し、５−７週の古いBalb/cマウスをHelios 遺伝子ガン（Gene Gun）を用いて免疫する。マウスを同じ方法で隔週に３度ブーストする。最後のブーストの１０日後、マウスから血液を採り、１．０ｘ１０４または１．０ｘ１０５の乳癌細胞で攻撃する。腫瘍のサイズを毎日または２，３日毎にカリパスを用いて測定する。
【００６４】
３．保護の研究
プラスミドワクチンによるマウスの免疫
予防の抗癌ワクチンアプローチの１例は、ジンクフィンガードメインを欠き、それ故DNA結合性を有しないマウスBORISの削除形をコードするＤＮＡの使用である。
【００６５】
精製したプラスミドを用いて、我々が以前に記載したように（Ghochikyan et al, (2003) Eur J. Immunol 33:3232-41）金ビーズを被覆する（２μgプラスミド／０．５ｍｇ金粒子）。BALB/cマウスのプラスミドによる免疫をRossにより記載されたように（2000, Nat. Immumol 1:127-131）Helios遺伝子ガン(Bio-Rad Hercules, CA)を用いて、剃った腹部の皮膚で行った。短く言えば、マウスを４００psiのヘリウム圧力セッティングで約１μｍの金ビーズ(DeGussa-Huls Corp., Ridefield Park, NJ)０．５ｇ当たり２μｇのＤＮＡを含む用量で３回砲撃する。マウスは免疫され、隔週に同じ方法によりブーストし、記載されたように（Vasilevko et al., 2003）最後のブーストの１０日後、２つの異なる用量の４Ｔ１乳癌細胞（１０５または１０４）で攻撃する。異なった群のマウスをある分子アジュバンドをコードするＤＮＡと混合した修飾ＢＯＲＩＳ分子をコードするプラスミドで免疫する（詳細は表１を参照）。そのような分子アジュバンドは様々な抗原に対し細胞性免疫反応を増加させることが知られている。
【表２】
2007504154.tif 000005
【００６６】
マウスＢＯＲＩＳ分子（Ａｄ５−ＢＯＲＩＳ）のＺＦ除去形をコードするアデノウイルスベクターの生成とマウスの免疫
Ａｄ５−ＢＯＲＩＳ組換えアデノウイルスをStratageneからのAdEasy XL Adenoviral Vectorシステムを用いて調製した。シャトルベクターを、ＺＦ削除ｍＢＯＲＩＳ断片をプラスミドｐシャトル−ＣＭＶにサブクローニングすることにより構築する。この目的のため、ＢＯＲＩＳ断片をテンプレートとしてｐＯＲＦ−ｍＢＯＲＩＳプラスミドおよび次のプライマーを用いてＰＣＲにより合成する。
【化２】
2007504154.tif 000006
【００６７】
ＰＣＲ生成物をＰＣＲ４−ＴＯＰＯクローニングベクター（Invirogen）にサブクローニングする。BORIS断片をSa1lおよびNot制限エンドヌクレアーゼを用いて制限する。生じた生成物をアガロースゲルを用いて精製し、SalI-Notクローニングサイトを用いてｐシャトル−ＣＭＶベクターにサブクローニングする。
【００６８】
ＺＦ欠失ｍＢＯＲＩＳのインビトロ発現をイムノブロッティングによりＣＨＯ細胞で分析する（下図参照）
【表３】
2007504154.tif 000007
【００６９】
削除したＲＯＢＩＳを有するシャトルベクターをPmelで線形化し、アガロースゲルで精製する。電気穿孔コンピテント細胞BJ−５１８３−Ad-1をPme消化ｐシャトル−ｍBORIS DNAプラスミドで形質転換し、組換えＡｄプラスミドを製造する。ＡＤ−２９３細胞を選択した組換えＡｄ−ＢＯＲＩＳ  ＤＮＡで形質転換し１次ウイルスストックを製造する。生じた１次ウイルスストック（１０７pfu／ｍｌ）をAD-293細胞で増幅させ、次にCsClグラジエントで精製する。精製したウイルスをPBD-5%蔗糖に対し透析し、マウスの免疫に用いた。
【００７０】
Balb/cマウスをｐＢＯＲＩＳで免疫しAd5-BORIS（１０９ｐｆｕ）で隔週に４回筋肉内にブーストする。ベクターを注入された対照動物はＡｄ５でブーストする。最後のブーストの１０日後、記載されたように（Vasilevko et al., 2003）マウスを２つの異なった用量の４Ｔ１乳癌細胞で攻撃する。
【００７１】
腫瘍細胞系
F. Miller博士（Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI）によって提供された乳房腫瘍細胞系を用いる。４Ｔ１．２細胞は突然変異原なしに４１０．４細胞（BALB/c fC3Hマウスにおける単一の自発的に生じた乳房腫瘍から単離された乳房腫瘍細胞系）に由来するチオグアニン耐性変異体である。その細胞を少ないグルコースを含み、および５％ウシ胎児血清、５％の生まれたての子牛血清、２ｍMグルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．１ｍM非必須アミノ酸および１ｍMピルビン酸ナトリウム（D10)（Life Technologies, Inc.）を補ったDulbecco改変Eagle必須培地（DMEM)中で培養する（３７℃、１０％CO2）。
【００７２】
腫瘍容積の測定
腫瘍容積は式、Ｌｘ（Ｗ２）／２（式中、Ｌは腫瘍の長さを。Ｗは幅を表す）を用いて２次元測定および計算により、毎日測定する。実験は、マウスが瀕死のように見えるか、腫瘍が１０４の細胞での攻撃を含む実験で約１．５ｃｍ３および１０５の４Ｔ１細胞での攻撃を含む実験で約２ｃｍ３に達した場合に終了する。
出現時間（潜伏期間）は０．１ｃｍ３過剰の体積を有する腫瘍が生ずる前に経過した時間として示される。腫瘍成長速度を決定するために、散乱したプロットを腫瘍増殖のほとんど線形の期間において分析する。
【００７３】
統計的解析
腫瘍の少瘤の出現の平均時間（潜伏期間）および腫瘍の増殖（腫瘍体積）そしてまた生き残り時間の結果は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびTurkeyの多重比較事後テストを用いて試験する。
【００７４】
４．免疫学
Borisに対するBおよびTsaの反応を２つの異なる免役プロトコールを用いて分析する。
【００７５】
１．マウスＢＯＲＩＳタンパク質の製造およびマウスの免疫
マウスBORISのＺＦ削除断片をＣ末端の６のＨｉｓタグと共に枠内のＮｃｏＩ−ＸｈｏＩクローニングサイトを用いることによって細菌の発現ベクターｐＥＴ２４ｄ（＋）中にサブクローニングする。両方のサイトを導入し、終止コドンをクローニングのＰＣＲ工程の間に除去する。更に、プロテイン・トランスダクション・ドメイン（ＰＴＤ）と融合した削除したＢＯＲＩＳ分子をコードするプラスミドを構築する。ＨＩＶ−Ｔａｔタンパク質トランスダクション・ドメイン（Ｔａｔ４７−５７ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）をＰＣＲによって削除したＢＯＲＩＳのＮ末端に融合システム、次にｐＥＴ２４ｄ（＋）ベクターＮｃｏｌ−Ｘｈｏｌクローニングサイトにクローニングする。生じたpＥＴ−ｍＢＯＲＩＳまたはｐＥＴ−ＴＡＴｍＢＯＲＩＳプラスミドでトランスフェクションしたＥ，ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株をＡ６００が０．８に達するまで２８℃でカナマイシンを有するＬＢで増殖させる。タンパク質合成は、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧの添加により誘導される。細胞を３−５時間後、遠心分離により収穫し、ニッケル−ＮＴＡ（ニトリロトリ酢酸）カラム（Qiagen）でアフィニティクロマトグラフィーによりタンパク質精製に用いる。
【表４】
2007504154.tif 000008
【００７６】
更に、PTDと融合したBORISのZF削除断片を、シグナル配列と共にEcoRI-Xbalに枠内で酵母発現ベクターｐGAPZアルファにサブクローニングする。両方のサイトを導入し、ATG開始コドンをクローニングのPCR工程の間に除去する。Pichia pastoris X33株をAvrII制限酵素を用いて線形化したｐGAPZ-BORISでエレクトロポーレーションにより形質転換し、陽性のクローンを１００μｇ／ｍｌZeocinを含むYPD培地で選択する。発現分析のために、選択した陽性クローンをYPD/Zeocinブロス中で増殖させ、発現をイムノブロッティングにより異なった時間ポイントで、上澄液中で分析する。
【００７７】
２．樹状細胞（ＤＣ）によるマウスの免疫
１次骨髄ＤＣはマウスの骨髄前駆体から次のようにして得る。大腿骨および脛骨から採取した赤血球を放血したハツカネズミ骨髄細胞を組換えハツカネズミＧＭ−ＣＳＦ（１００Ｕ／ｍｌ）を補った完全ＲＰＭＩ−１０培地にプレートする。３日目に非接着性の顆粒球おだやかに除去し、新鮮な培地を添加する。非接着性のＤＣを７日目に収穫し、ＣＤ１１ｃマイクロビーズを用いる陽性選択キット（Miltenyi）により精製する。
【００７８】
培養の７日目に収穫し、陽性選択により精製したＤＣを１０００−２０００の感染多様性でＲＰＭＩ１６４０中で１０７細胞／ｍｌでのインキュベーションによりＡｄ５−ＲＯＢＩＳを感染させる。１時間後、完全培地を加えてＤＣを最終濃度１ｘ１０６−２ｘ１０６細胞／ｍｌまで希釈する。細胞は２４時間後に収穫し、アデノウイルス粒子の繰り越しを捨てるために洗浄し、免疫に用いた。更に、培養の７日目に収穫し、陽性選択により精製したＤＣを１０μｇ／ｍｌのＺＦ除去ｍＢＯＲＩＳタンパク質と３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートし、ＰＢＳで２度洗浄する。ＤＣによるタンパク質の取り込みは抗マウスＢＯＲＩＳ抗体およびＦＩＴＣで標識した適当な２次抗体を用いてフローサイトメトリーによりアリコートで分析する。Ｂａｌｂ／ｃマウスを腹膜腔内に３週間に３回１ｘ１０６のＤＣで免疫し脾細胞培養の培養物中の最後のブーストの１０日後分析する。
【００７９】
５．結果
免疫の結果を図１−４に示す。
ＤＮＡ結合機能を欠いた癌特異的マウスＢＯＲＩＳ（１１のジンクフィンガーを削除）の変異体形をコードするＤＮＡは哺乳動物発現ベクターpORF(Invitogen)およびAdEasy XLアデノウイルスベクターシステム（Stratagene)を用いて構築された。これらのワクチンはマウス乳癌モデルにおける予防的抗癌ワクチンとして用いられた。このモデルにおいて我々は、BALB/ｃマウス（H-2dハプロタイプ）および４T1天然の哺乳動物腫瘍細胞系を用いた。それは変異原処理なしに４１０．４細胞から誘導されたチオグアニン耐性変異体である。重要なことは、これらのマウスの乳癌細胞は、我々がRT-PCRにより証明したように、完全なマウスBORIS分子を発現しつつある。従ってこれは保護的な癌ワクチンとして用いるべきＢＯＲＩＳ分子の能力の調査のための理想的なモデルである。
【００８０】
２つの異なったタイプの実験を行った。最初のタイプの実験は分子アジュバンドとして異なったマウスのサイトカインをコードするＤＮＡ（ｐＧＭ−ＣＳＦ；ｐＩＬ１２／ＩＬ１８；pＩＦＮγ）と混合したｐＢＯＲＩＳ（削除したマウスＢＯＲＩＳ分子をコードするプラスミド）でワクチン化したマウスの群を含む。マウスは対照としてベクター（ｐＯＲＦ）またはｐＩＬ１２／ＩＬ１８を注入された。マウスを、遺伝子ガン技術を用いて免疫し、ブーストし、次に１０４または１０５の４ＴＩ細胞で攻撃した。
【００８１】
第２のタイプの実験は、ｐＢＯＲＩＳでワクチン化し、ＺＦを削除したマウスのＢＯＲＩＳ分子を発現するよう修飾された複製欠陥アデノウイルスベクター（Ａｄ５）でブーストした１群のマウスを含んでいた（Ａｄ５−ＢＯＲＩＳ）。ベクターを注入しＡｄ５でブーストした１群のマウスを対照として用いた。その動物を１０４または１０５の４Ｔ１細胞で攻撃し、腫瘍の出現と増殖を分析した。我々は１０４という少ない４Ｔ１．２細胞のＢＡＬＢ／ｃマウスの乳腺への注入が攻撃した動物の１００％において乳癌の局所的増殖をもたらすことを以前に見出していたことに注目する。
【００８２】
ｐＢＯＲＩＳ＋ｐＩＬ１２／ＩＬ１８またはｐＢＯＬＩＳに続くＡｄ５−ＢＯＲＩＳでのワクチン化は、１０４の非修飾４Ｔ１腫瘍細胞での攻撃からマウスの保護をもたらした。ｐＩＬ１２／ＩＬ１８と混合したｐＢＯＬＩＳで免疫した群のマウスの５０％は小さい腫瘍を生じたが、それらはすべて３９日まで生き残った。すべての実験マウスは約１０日早く死んだ。
【００８３】
Ａｄ５−ＢＯＲＩＳでワクチンしたマウスについての結果はより極端であった。２４日目に、対照群のマウスは腫瘍増殖から死んだが、Ａｄ５−ＢＯＲＩＳで免疫化したマウスの１００％は生きていたばかりではなく、腫瘍を全く生じなかった。事実、それらは攻撃後３３日目まで腫瘍を生成しなかった。これらの結果はＺＦを削除したＢＯＲＩＳワクチンが１０４の乳房腫瘍細胞による攻撃から動物を効果的に保護したことを示す。
【００８４】
第２組の実験はよりきびしい条件を用いて行われ、１０５の４T1腫瘍細胞でマウスを攻撃した。プラスミドｐBORIS＋ｐIFNγまたはｐIL12/IL18でのワクチン化は２ｃｍ３の容積までの腫瘍増殖の時間を顕著に長引かせ、BALB/cの生き残りを増加させた。ワクチン化は１０５の４T1腫瘍細胞で攻撃したマウスにおける腫瘍増殖速度をも低下させた。より深い効果が、１０５の非修飾４T1腫瘍細胞で攻撃する前に、ｐBORISでワクチン化し、Ad5-BORISでブーストで検出された。２３日目に対照群におけるすべてのマウスが腫瘍増殖から死んだとき、Ａｄ５−ＢＯＲＩＳで免疫したマウスの８０％は生きており、生き残った動物は顕著に小さいサイズの腫瘍を有していた。
【００８５】
別の群のBALB/cマウスをE.coliシステムから精製した削除したマウスPORISタンパク質で免疫した。ここでは、Quil  A Th1タイプの従来のアジュバンド（Sigma)を混合物したタンパク質（５０μｇ／マウス）を皮下に注入した。４回の免役後、すべての動物は顕著な力価の抗BORIS抗体を誘導した。他の群の５匹のマウスをAd5−BORISを感染させた単離した樹状細胞で同時に腹膜腔内へ免疫した。３回の注入後、ｍBORISタンパク質で活性化した有管細胞の培養中でインビトロで検出されたｍBPRISに対するT細胞反応をマウスは生じた。それ故、BORISによる免疫化はマウスでBおよびT細胞免疫反応を誘導し、これらの免疫反応は攻撃から動物を保護している。
【００８６】
６．サブユニットワクチンとしてＰＴＤに結合したトランケートされたＢＯＲＩＳ
PTDを非機能性のトランケートされたまたは変異体BORISタンパク質に結合させ、融合生成物が酵母発現システムで生成した。PTDおよび非機能性変異体BORISをコードする遺伝子をｐGAPZα等の酵母発現ベクターにサブクローンする。発現し分泌されたタンパク質を標準的な分子技術を用いて精製する。マウスを２つの異なった従来のアジュバンドで製剤化し、免疫反応そしてまた腫瘍抗原に対する保護を分析する。
【００８７】
７．サブユニットワクチンとして非機能性変異体ＢＯＲＩＳをコードするウイルス様粒子
B型肝炎ウイルス（HBV)コア抗原（HBｃAg)をベースにしたVLP-BORISサブユニットワクチンを生成させる。この抗原は酵母細胞での発現後にVLPに自己集合する。外来配列を、集合プロセスを破壊することなくHBｃAgのいくつかの領域に挿入する。従って、マウスの免疫に用いるキメラHBｃAg-BORIS粒子が生成する。
【００８８】
８．ＢＡＬＢ／ｃおよびｐ５３ＫＯマウスにおける分析
攻撃なしのBAB/cマウスおよびその年齢では腫瘍を発生してない若いｐ５３ノックアウトマウスにおける免疫反応を分析する。異なるＢＯＲＩＳワクチンで免疫したマウスにおける体液性および細胞性免疫反応の両方を測定した。免疫化されたマウスからの血清を３月の実験期間の間抗BORIS抗体生産の検出について分析する。BALB/cマウスの攻撃前および後のCD4+およびCD8+T細胞増殖およびT調節細胞の活性化を測定する。同時に哺乳動物腫瘍細胞を直接殺すNK細胞の活性化を分析する。乳房腫瘍４T1細胞の攻撃前および後のBORIS特異的細胞障害性Tリンパ球（CTL)の機能的活性が示される。野生のBORIS分子を天然に発現するP815腫瘍細胞をNKおよびCTL活性の検出のため４T1細胞と共に標的細胞として用いる。
【００８９】
更なる文献：
【表５】
2007504154.tif 000009
【００９０】
本発明をこのように記述した。当業者ないは本発明を実施するための材料および方法の様々な修飾がなされることが明らかであろう。そのような修飾は請求の範囲により定義される本発明の範囲内であると考えるべきである。
【００９１】
本明細書に引用した特許および定期的過剰からのそれぞれの文献はその全体が本明細書の一部を構成する。
【００９２】
配列の記述：ZFを削除したBORIS分子のヌクレオチド配列
【化３】
2007504154.tif 000010
【００９３】
配列の記述：マウスBORISの野生型ヌクレオチド配列
【化４】
2007504154.tif 000011
【化５】
2007504154.tif 000012
【００９４】
配列の記述：ヒトBORISの野生型ヌクレオチド配列
【化６】
2007504154.tif 000013
【化７】
2007504154.tif 000014
【００９５】
配列の記述：ヒトBORISのアミノ酸配列
【化８】
2007504154.tif 000015
【００９６】
配列の記述：マウスBORISのアミノ酸配列
【化９】
2007504154.tif 000016
【００９７】
配列の記述：ZFを削除したマウスBORIS分子のアミノ酸配列
【化１０】
2007504154.tif 000017
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図１ａ、ｂおよびｃはｐＢＯＲＩＳ（ＤＮＡ免疫化）ＰＩＬ１２／ＩＬ１８（分子アジュバンド）によるマウス（ｎ＝１０）のワクチン化の結果を示す。これはマウスＢＯＲＩＳを天然に発現する１０４４Ｔ１腫瘍細胞による攻撃からのマウスの保護をもたらす。図１ａは、ｐＢＯＲＩＳ／ｐＩＬ１２／ＩＬ１８，ｐＩＬ１２／ＩＬ１８およびベクターのみについての、Ｙ軸には生存率およびＸ軸には腫瘍攻撃後の日数を示す。図１ｂはｐＢＯＲＩＳ／ｐＩＬ１２／ＩＬ１８，ｐＩＬ１２／ＩＬ１８およびベクターのみについての、腫瘍体積と腫瘍攻撃後の日数の間の関係を示す。図１ｃは、ｐＢＯＲＩＳ／ｐＩＬ１２／ＩＬ１８対ｐＩＬ１２／ＩＬ１８およびベクターのみで免疫化した群間の２１日目における腫瘍容積の顕著な相違を示す（＊ｐ＜０．００１）。
【００９９】
【図２】図２ａおよび２ｂはｐＢＯＲＩＳ（ＤＮＡ免疫化）ワクチン化した後Ａｄ５−ＢＯＲＩＳ（ウイルス様粒子）が続き１０４の４Ｔ１細胞で攻撃したマウスについて生存率パーセントと腫瘍攻撃（ａ）、および腫瘍容積と攻撃後の日数の間の関係を示す。データは少なくとも３３日の攻撃後の腫瘍攻撃に対する完全な保護を示す。
【０１００】
【図３】図３ａ、ｂ、ｃはＢＯＲＩＳ＋ｐＩＦＮγまたはｐＩＬ１２／ＩＬ１８によるマウスの遺伝子ガン免疫、その後の１０５４Ｔ１腫瘍細胞攻撃の結果を示す。図３ａは２ｃｍ３の容積までの腫瘍増殖の延長された期間を示し、図３ｂは腫瘍増殖速度の低下を示す。図３ｃは、群ｐＢＯＲＩＳ／ｐＩＦＮγ対ベクター（ｐ＜０．０５）、ｐＢＯＲＩＳ／ｐＩＬ１２／ＩＬ１８対ｐＩＬ１２／ＩＬ１８（ｐ＜０．０５）およびｐＢＯＲＩＳ／ｐＩＬ１２／ＩＬ１８対ベクター（ｐ＜０．０１）間の１４日目における腫瘍容積の有意な相違を示す。
【０１０１】
【図４】図４ａ、ｂ、およびｃは、ＢＯＲＩＳ（ＤＮＡ免役）に続くＡｄ５−ＢＯＲＩＳ（ウイルス様粒子）によりワクチン化されたマウスの結果を示す。図４ａはワクチン化されたマウスの顕著に延長された生き残りを示すのに対し、図４ｂはこれらのマウスが１０５の４Ｔ１腫瘍細胞によるマウスの攻撃後腫瘍増殖速度を低下させ、２ｃｍ３の容積になるまでの腫瘍増殖の時間を延長することを示す。図４ｃはＡｄ５−ＢＯＲＩＳ対Ａｄ５間の１５日目における顕著な相違を示す（Ｐ＜０．００１）。
【０１０２】
【図５】図５はギャップ延長についてはゼロペナルティを有するプログラムのＧＣＧパッケイジにより作られたヒトおよびマウスＢＯＲＩＳポリペプチドのベストフィットアライメントを示し、保存されたジンクフィンガー領域は目立たせ、ＺＦ−１１として示す。
【図１】
2007504154.tif 000018
【図２】
2007504154.tif 000019
【図３】
2007504154.tif 000020
【図４】
2007504154.tif 000021
【図５】
2007504154.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】平成18年4月28日(2006.4.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007504154000001.app
【国際調査報告】
2007504154.tif 000023
2007504154.tif 000024
2007504154.tif 000025
2007504154.tif 000026
2007504154.tif 000027
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