(57)【要約】  細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の実質的には非存在下で細胞に溶解的に伝染するか、または、細胞におけるアポトーシスを誘導することができる単離されている選択されたピコルナウイルス、および対象物の治療方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の実質的には非存在下で細胞に溶解的に伝染するか、または、細胞におけるアポトーシスを誘導することができる単離されている選択されたピコルナウイルス。
【請求項２】
選択されたピコルナウイルスは細胞上の崩壊促進因子（ＤＡＦ）を介して細胞に溶解的に感染することができる請求項１に記載のピコルナウイルス。
【請求項３】
ピコルナウイルスは、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ポリオウイルス、未分類のエンテロウイルス、ライノウイルス、パラエコーウイルス、ヘパトウイルスおよびカルジオウイルスを含むエンテロウイルスのプロトタイプ株および臨床単離株からなる群から選択される請求項１に記載のピコルナウイルス。
【請求項４】
ピコルナウイルスはコクサッキーウイルスである請求項１に記載のピコルナウイルス。
【請求項５】
コクサッキーウイルスはＡ型である請求項４に記載のピコルナウイルス。
【請求項６】
コクサッキーウイルスはコクサッキーウイルスＡ２１である請求項４に記載のピコルナウイルス。
【請求項７】
ピコルナウイルスはエコーウイルスである請求項１に記載のピコルナウイルス。
【請求項８】
エコーウイルスは、エコーウイルスの６型、７型、１１型、１２型、１３型または２９型である請求項７に記載のピコルナウイルス。
【請求項９】
ピコルナウイルスはポリオウイルスである請求項１に記載のピコルナウイルス。
【請求項１０】
ポリオウイルスは、ポリオウイルスの１型、２型または３型である請求項９に記載のピコルナウイルス。
【請求項１１】
ピコルナウイルスはライノウイルスである請求項１に記載のピコルナウイルス。
【請求項１２】
ライノウイルスはライノウイルスの主要群またはライノウイルスの非主要群のメンバーである請求項１１に記載のピコルナウイルス。
【請求項１３】
ピコルナウイルスは、ＩＣＡＭ−１を有しない細胞に溶解的に感染することができないピコルナウイルスを、ＩＣＡＭ−１を有しないＤＡＦ発現細胞株において継代培養し、ＩＣＡＭ−１を有しない細胞に溶解的に感染することができる選択されたピコルナウイルスを回収することによって生物選抜される請求項１に記載のピコルナウイルス。
【請求項１４】
ピコルナウイルスは、例えば、部位特異的変異誘発、または、ＩＣＡＭ−１への接近が抗ＩＣＡＭ−１抗体の使用によって阻止される細胞における継代培養などによって変化され、または変異され、または改変される請求項１に記載のピコルナウイルス。
【請求項１５】
選択されたピコルナウイルスは、野生型ウイルスと比較して、１つまたは複数のカプシドタンパク質において変化を有する請求項１に記載のピコルナウイルス。
【請求項１６】
ピコルナウイルスは、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３から選択されるカプシドタンパク質において変化を含むコクサッキーウイルスである請求項１５に記載のピコルナウイルス。
【請求項１７】
変異が、ＶＰ３のＲ９６Ｈ、ＶＰ３のＥ１０１Ａ、ＶＰ３のＡ２３９Ｓ、ＶＰ２のＳ１６４ＬおよびＶＰ２のＶ２０９の１つまたは複数から選択される請求項１６に記載のピコルナウイルス。
【請求項１８】
選択されたピコルナウイルスは、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群から選択される核酸配列によってコードされるカプシドタンパク質を含む請求項１に記載のピコルナウイルス。
【請求項１９】
細胞は新生物である請求項１に記載のピコルナウイルス。
【請求項２０】
新生物は、ＤＡＦを発現する新生物である請求項１９に記載のピコルナウイルス。
【請求項２１】
新生物は、肺ガン、前立腺ガン、結腸直腸ガン、甲状腺ガン、腎臓ガン、副腎ガン、肝臓ガン、白血病、メラノーマ、前ガン性細胞、食道ガン、乳ガン、脳ガン、卵巣ガン、胃ガンおよび腸ガンからなる群から選択される請求項２０に記載のピコルナウイルス。
【請求項２２】
細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の実質的には非存在下で細胞に溶解的に感染するか、または、細胞におけるアポトーシスを誘導することができる単離されたピコルナウイルスから由来する核酸分子。
【請求項２３】
核酸分子は一本鎖ＲＮＡまたは相補的ＤＮＡである請求項２２に記載の核酸分子。
【請求項２４】
細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の実質的には非存在下で細胞に溶解的に感染することができるピコルナウイルスを生物選抜するための方法であって、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の実質的には非存在下で細胞に溶解的に感染することができないピコルナウイルスを十分な数の継代培養にわたって好適な細胞株において培養すること、および、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の実質的には非存在下で細胞に溶解的に感染することができるピコルナウイルスを選択することを含む方法。
【請求項２５】
細胞株は、横紋筋肉腫、肺ガン、前立腺ガン、結腸直腸ガン、甲状腺ガン、腎臓ガン、副腎ガン、肝臓ガン、白血病、メラノーマ、前ガン性細胞、食道ガン、乳ガン、脳ガン、卵巣ガン、胃ガンおよび腸ガンなどのヒトのガンから選択される請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
細胞株は、ＩＣＡＭ−１を発現しないＤＡＦ発現細胞株である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項２４に記載の方法から得られるピコルナウイルス。
【請求項２８】
細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の実質的には非存在下で細胞に溶解的に伝染するか、または、細胞におけるアポトーシスを誘導することができる単離されたピコルナウイルスを好適な医薬的に許容され得る賦形剤または希釈剤と一緒に含有する医薬組成物。
【請求項２９】
細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の実質的には非存在下で細胞に溶解的に伝染するか、または、細胞におけるアポトーシスを誘導することができるピコルナウイルスのウイルス核酸分子を好適な医薬的に許容され得る賦形剤または希釈剤と一緒に含有する医薬組成物。
【請求項３０】
新生物に罹患している哺乳動物における新生物を治療するための方法であって、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の実質的には非存在下で細胞に溶解的に伝染するか、または、細胞におけるアポトーシスを誘導することができる単離されたピコルナウイルスの効果的な量を、新生物の細胞のウイルス媒介による腫瘍崩壊を生じさせる条件のもとで哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項３１】
新生物は、ＤＡＦを発現する新生物である請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
新生物は、肺ガン、前立腺ガン、結腸直腸ガン、甲状腺ガン、腎臓ガン、副腎ガン、肝臓ガン、白血病、メラノーマ、前ガン性細胞、食道ガン、乳ガン、脳ガン、卵巣ガン、胃ガンおよび腸ガンからなる群から選択される請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
新生物に罹患している哺乳動物における新生物を治療するための方法であって、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の実質的には非存在下で細胞に溶解的に伝染するか、または、細胞におけるアポトーシスを誘導することができる単離されたピコルナウイルスから由来する核酸分子の効果的な量を、新生物の細胞のウイルス媒介による腫瘍崩壊を生じさせる条件のもとで哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項３４】
新生物は、ＤＡＦを発現する新生物である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
新生物は、肺ガン、前立腺ガン、結腸直腸ガン、甲状腺ガン、腎臓ガン、副腎ガン、肝臓ガン、白血病、メラノーマ、前ガン性細胞、食道ガン、乳ガン、脳ガンおよび卵巣ガンからなる群から選択される請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
治療方法または処置方法における、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の実質的には非存在下で細胞に溶解的に伝染するか、または、細胞におけるアポトーシスを誘導することができる単離されたピコルナウイルスの使用。
【請求項３７】
治療方法または処置方法における、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の実質的には非存在下で細胞に溶解的に伝染するか、または、細胞におけるアポトーシスを誘導することができる単離されているピコルナウイルスから誘導された核酸分子の使用。
【請求項３８】
細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の実質的には非存在下で細胞に溶解的に感染するか、または、細胞におけるアポトーシスを誘導することができる単離されている選択されたピコルナウイルスの使用であって、哺乳動物における新生物を治療するための医薬品の製造における使用。
【請求項３９】
哺乳動物における新生物を治療するためにウイルスを生じさせるための接種物を哺乳動物に適用するためのアプリケーターであって、アプリケーターは、接種物が哺乳動物と接触させられ得るように接種物を含浸させた領域を含み、かつ、ウイルスは、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の実質的には非存在下で細胞に溶解的に感染するか、または、細胞におけるアポトーシスを誘導することができる単離されている選択されたピコルナウイルスであるアプリケーター。
【請求項４０】
ここに規定されるＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの形の単離されている選択されたピコルナウイルス。
【請求項４１】
ここに規定されるＣＶＡ２１＃２７２１０１，２７５２３８および２７２５９８からなる群から選択されたＣＶＡ２１形の単離されている選択されたピコルナウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変された腫瘍崩壊性ピコルナウイルスおよび対象の治療方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
細胞表面分子に対するウイルスの付着はウイルス複製の最初の段階であり、従って、細胞の特異的なウイルス受容体がウイルスの組織親和性のための主要な決定因子である。崩壊促進因子（ＤＡＦ／ＣＤ５５）は、４つの細胞外の短いコンセンサス反復（ＳＣＲ）からなる７０ｋＤａのグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固定の補体調節タンパク質であり、この崩壊促進因子が、いくつかのエコーウイルス（ＥＶ）、コクサッキーＢ型ウイルス（ＣＶＢ）およびコクサッキーウイルスＡ２１（ＣＶＡ２１）をはじめとする数々のヒトエンテロウイルスに対する膜付着タンパク質として役立っている。一般に、ＤＡＦだけに対するウイルスの結合は、エンテロウイルスの感染を許すには不十分であり、ＤＡＦとの相互作用は、細胞進入のための必要条件であると見なされている１３５Ｓの変化型（Ａ）粒子を誘導しない。エンテロウイルスの感染のためのＤＡＦの生理学的な役割は、感染性ウイルスと結合し、これを濃縮し、これにより、第２の機能的な細胞進入受容体との相互作用を介する細胞進入のための増大した機会を生じさせる膜隔離受容体としてであることが主張されている。
【０００３】
多くの他のピコルナウイルス受容体（これらはポリオウイルスによって用いられ、ライノウイルスおよびコクサッキーＢ型ウイルスの主要な受容体群である）の場合と同様に、ＣＶＡ２１細胞内在化受容体、すなわち、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１／ＣＤ５４）は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、５重に軸を取り囲むカプシドの谷の内部で結合する。そのような谷の底でのウイルス受容体との間での相互作用はカプシドを脱安定化させ、立体配座の変化、すなわち、ウイルスが脱外皮することへの準備段階を誘導する。
【０００４】
ＣＶＡ２１のプロトタイプ株（Ｋｕｙｋｅｎｄａｌｌ）は呼吸器感染症の原因因子であり、ＩＣＡＭ−１およびＤＡＦの両方に結合する。しかしながら、表面に発現しているＤＡＦに対するＣＶＡ２１のプロトタイプ株の結合は、増殖性感染またはＡ粒子の形成を開始させるために十分でなく、ＩＣＡＭ−１との相互作用が細胞進入のために要求される。ＣＶＡ２１感染時におけるＤＡＦについてのより機能的な役割が、表面のＤＡＦが、ＤＡＦのウイルス非結合ドメインに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって架橋され、これにより、ＩＣＡＭ−１の非存在下での感染が可能であるときに観測される。
【０００５】
本出願人は、ＩＣＡＭ−１を認識する腫瘍崩壊性ウイルスを使用して悪性腫瘍を治療するための新しい方法を以前に開発していた（国際特許出願公開ＷＯ０１／３７８６６）。優れた治療結果が、様々なコクサッキーウイルスＡ型株を多数のガン細胞タイプについて使用することによって得られていた。可能なガン治療を拡大し、また、さらに一層有効な治療を提供するために、本発明者らは、改善された腫瘍崩壊特性および殺傷特性を有する新しい腫瘍崩壊性ウイルスを改変および生物選抜によって得ている。
【発明の開示】
【０００６】
第１の態様において、本発明は、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の実質的には非存在下で細胞に溶解的に伝染するか、または、細胞におけるアポトーシスを誘導することができる単離されている選択されたピコルナウイルスを提供する。
【０００７】
好ましくは、選択されたピコルナウイルスは細胞上の崩壊促進因子（ＤＡＦ）を介して細胞に溶解的に感染することができる。
【０００８】
好ましくは、ピコルナウイルスは、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ポリオウイルス、未分類のエンテロウイルス、ライノウイルス、パラエコーウイルス、ヘパトウイルスおよびカルジオウイルスを含むエンテロウイルスのプロトタイプ株および臨床単離株の両方からなる群から選択される。
【０００９】
好ましい形態において、ピコルナウイルスはコクサッキーウイルスである。好ましくは、コクサッキーウイルスはＡ型またはＢ型であり、より好ましくはコクサッキーウイルスＡ型であり、さらにより好ましくは、コクサッキーウイルスはコクサッキーウイルスＡ２１である。
【００１０】
好ましい形態において、ピコルナウイルスはエコーウイルスである。好ましくは、エコーウイルスは、エコーウイルスの６型、７型、１１型、１２型、１３型または２９型である。
【００１１】
好ましい形態において、ピコルナウイルスはポリオウイルスである。好ましくは、ポリオウイルスは、ポリオウイルスの１型、２型または３型である。
【００１２】
好ましい形態において、ピコルナウイルスはライノウイルスである。好ましくは、ライノウイルスはライノウイルスの主要群またはライノウイルスの非主要群のメンバーである。
【００１３】
１つの好ましい形態において、ピコルナウイルスは、ＩＣＡＭ−１を有しない細胞に溶解的に感染することができないピコルナウイルスを、ＩＣＡＭ−１を有しないＤＡＦ発現細胞株において継代培養し、ＩＣＡＭ−１を有しない細胞に溶解的に感染することができる選択されたピコルナウイルスを回収することによって生物選抜される。
【００１４】
別の好ましい形態において、ピコルナウイルスは、任意の既知の手段によって、例えば、部位特異的変異誘発、または、ＩＣＡＭ−１への接近が抗ＩＣＡＭ−１抗体の使用によって阻止される細胞における継代培養などによって変化させ、または変異させ、または改変することができる。
【００１５】
好ましくは、選択されたピコルナウイルスは、野生型ウイルスと比較して、１つまたは複数のカプシドタンパク質において変化を有する。例えば、コクサッキーウイルスでは、カプシドタンパク質が、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３から選択される。より好ましくは、変異が、ＶＰ３のＲ９６Ｈ、ＶＰ３のＥ１０１Ａ、ＶＰ３のＡ２３９Ｓ、ＶＰ２のＳ１６４ＬおよびＶＰ２のＶ２０９の１つまたは複数から選択される。
【００１６】
好ましくは、細胞は新生物であり、より好ましくは、新生物は、ＤＡＦを発現する新生物である。例には、肺ガン、前立腺ガン、結腸直腸ガン、甲状腺ガン、腎臓ガン、副腎ガン、肝臓ガン、白血病、メラノーマ、前ガン性細胞、食道ガン、乳ガン、脳ガン、卵巣ガン、胃ガンおよび腸ガンが含まれるが、これらに限定されない。
【００１７】
第２の態様において、本発明は、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の実質的には非存在下で細胞に溶解的に感染することができる単離されたピコルナウイルスの核酸分子を提供する。１つの実施形態において、核酸分子はピコルナウイルスに由来することができ、また、ウイルス由来の一本鎖ＲＮＡまたは相補的ＤＮＡであり得る。好ましくは、核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００１８】
第３の態様において、本発明は、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の実質的には非存在下で細胞に溶解的に感染することができるピコルナウイルスを生物選抜するための方法を提供し、この場合、この方法は、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の実質的には非存在下で細胞に溶解的に感染することができないピコルナウイルスを十分な数の継代培養にわたって好適な細胞株において培養すること、および、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の実質的には非存在下で細胞に溶解的に感染することができるピコルナウイルスを選択することを含む。
【００１９】
好ましくは、細胞株はヒトのガンから選択され、例えば、横紋筋肉腫、肺ガン、前立腺ガン、結腸直腸ガン、甲状腺ガン、腎臓ガン、副腎ガン、肝臓ガン、白血病、メラノーマ、前ガン性細胞、食道ガン、乳ガン、脳ガン、卵巣ガン、胃ガンおよび腸ガンなどから選択される。より好ましくは、細胞株は、ＩＣＡＭ−１を発現しないＤＡＦ発現細胞株である。
【００２０】
典型的には、十分な数の継代培養は一般には約１０回までである。しかしながら、１回〜１００回またはそれ以上の継代培養が、ピコルナウイルスおよび細胞タイプに依存して使用され得ることが理解される。１つの実施形態では、４回の継代培養が使用される。別の実施形態では、５回の継代培養が使用される。さらに別の実施形態では、６回、７回または８回の継代培養を使用することができる。
【００２１】
第４の態様において、本発明は、本発明の第３の態様による方法から得られるピコルナウイルスを提供する。
【００２２】
第５の態様において、本発明は、本発明の第１の態様または第４の態様による単離されたピコルナウイルスを好適な医薬的に許容され得る賦形剤または希釈剤と一緒に含有する医薬組成物を提供する。
【００２３】
第６の態様において、本発明は、本発明の第２の態様によるウイルス核酸分子またはウイルス核酸の相補的なＤＮＡ複製体を好適な医薬的に許容され得る賦形剤または希釈剤と一緒に含有する医薬組成物を提供する。
【００２４】
第７の態様において、本発明は、新生物に罹患している哺乳動物における新生物を治療するための方法を提供し、この場合、この方法は、本発明の第１の態様または第５の態様による単離されたピコルナウイルスの効果的な量を、新生物の細胞のウイルス媒介による腫瘍崩壊を生じさせる条件のもとで哺乳動物に投与することを含む。
【００２５】
好ましくは、新生物は、ＤＡＦを発現する新生物である。例には、肺ガン、前立腺ガン、結腸直腸ガン、甲状腺ガン、腎臓ガン、副腎ガン、肝臓ガン、白血病、メラノーマ、前ガン性細胞、食道ガン、乳ガン、脳ガン、卵巣ガン、胃ガンおよび腸ガンが含まれるが、これらに限定されない。
【００２６】
第８の態様において、本発明は、新生物に罹患している哺乳動物における新生物を治療するための方法を提供し、この場合、この方法は、本発明の第２の態様による核酸分子またはウイルス核酸の相補的なＤＮＡ複製体の効果的な量、あるいは、本発明の第６の態様による医薬組成物の効果的な量を、新生物の細胞のウイルス媒介による腫瘍崩壊を生じさせる条件のもとで哺乳動物に投与することを含む。
【００２７】
好ましくは、新生物は、ＤＡＦを発現する新生物である。例には、肺ガン、前立腺ガン、結腸直腸ガン、甲状腺ガン、腎臓ガン、副腎ガン、肝臓ガン、白血病、メラノーマ、前ガン性細胞、食道ガン、乳ガン、脳ガンおよび卵巣ガンが含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
第９の態様において、本発明は、治療方法または処置方法における、本発明の第１の態様または第５の態様による単離されたピコルナウイルスの使用を提供する。
【００２９】
第１０の態様において、本発明は、治療方法または処置方法における、本発明の第２の態様による核酸分子の使用を提供する。
【００３０】
第１１の態様において、本発明は、本明細書中で定義されるようなＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの形態における単離されている選択されたピコルナウイルスまたはその改変形態もしくは変化形態を提供する。
【００３１】
第１２の態様において、本発明は、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の実質的には非存在下で細胞に溶解的に感染するか、または、細胞におけるアポトーシスを誘導することができる単離されている選択されたピコルナウイルスの使用であって、哺乳動物における新生物を治療するための医薬品の製造における使用を提供する。好ましい実施形態において、新生物の細胞の少なくとも一部が殺されるようにピコルナウイルスを用いて哺乳動物における新生物を治療するための医薬品の製造における、本発明のピコルナウイルスを生じさせるための接種物の使用が提供される。
【００３２】
第１３の態様において、本発明は、哺乳動物における新生物を治療するためにウイルスを生じさせるための接種物を哺乳動物に適用するためのアプリケーターが提供され、この場合、アプリケーターは、接種物が哺乳動物と接触させられ得るように接種物を含浸させた領域を含み、かつ、ウイルスは、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の実質的には非存在下で細胞に溶解的に感染するか、または、細胞におけるアポトーシスを誘導することができる単離されている選択されたピコルナウイルスである。
【００３３】
本明細書中に記載されるウイルスのサンプルが、ブダペスト条約の条項に従って、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、１  Ｓｕａｋｉｎ  Ｓｔｒｅｅｔ（ＰＯ  ＢＯｘ  ３８５）、Ｐｙｍｂｌｅ、ＮＳＷ  ２０７３、オーストラリア）に寄託された。単離体ＣＶＡ２１＃２７２１０１（受入番号ＮＭ０５／４３９９３）、同ＣＶＡ２１＃２７５２３８（受入番号受入番号ＮＭ０５／４３９９１）および同ＣＶＡ２１＃２７２５９８（受入番号ＮＭ０５／４３９９２）が２００５年１月１４日に寄託された。ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖは受入番号ＮＭ０５／４３９９６で２００５年１月１７日に寄託された。
【００３４】
本明細書全体を通して、文脈が他のことを要求しない限り、語句「含む（“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”）」または変化形（“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”または“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”など）は、言及された要素、完全体または工程、あるいは、要素、完全体または工程の群を包含することを意味し、任意の他の要素、完全体または工程、あるいは、要素、完全体または工程の群を除外することを意味しないことが理解される。
【００３５】
本明細書に含まれている文書、行為、材料、デバイスまたは論文などの議論はいずれも、ある特定の状況を本発明に提供するという目的のためだけである。そのことは、これらの事柄のいずれかまたはすべてが先行技術の基礎の一部を形成しているか、あるいは、本出願の優先日の前において、本発明に関連する分野における広く既知の一般的な知識であったことを認めるものとして理解してはならない。
【００３６】
本発明がより明快に理解され得るために、好ましい形態が、下記の図面および実施例を
参照して記載される。
図１は抗ＩＣＡＭ−１  ＭＡｂの存在下および非存在下における（Ａ）ＤＡＦ発現ＣＨＯ細胞および（Ｂ）ＩＣＡＭ−１発現ＣＨＯ細胞に対する、［３５Ｓ］−メチオニン標識されたＣＶＡ２１プロトタイプ（Ｋｕｙｋｅｎｄａｌｌ）および３つのＣＶＡ２１臨床単離体（＃２７２１０１、＃２７５２３８および＃２７２５９８）の結合。結合した［３５Ｓ］−メチオニン標識ウイルスのレベルを液体シンチレーション計数によって求めた。結果が三連のサンプルの平均＋ＳＤとして表される。Ｙ軸は、結合したウイルスを示す（ｃｍｐｘ１０２）。
図２は抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１  ＭＡｂ処理、抗ＩＣＡＭ−１ドメイン１  ＭＡｂ処理および／またはＰＩ−ＰＬＣ処置の存在下におけるＨｅＬａ細胞に対する、［３５Ｓ］−メチオニン標識されたＣＶＡ２１プロトタイプ（Ｋｕｙｋｅｎｄａｌｌ）（Ａ）および臨床単離体＃２７２１０１（Ｂ）の結合。結合した［３５Ｓ］−メチオニン標識ウイルスのレベルを液体シンチレーション計数によって求めた。結果が三連のサンプルの平均＋ＳＤとして表される。Ｙ軸は、結合したウイルスを示す（ｃｍｐｘ１０２）。
図３はＤＡＦまたはＩＣＡＭ−１のいずれかを単独または組合せで発現するＣＨＯ細胞に対する、［３５Ｓ］−メチオニン標識されたＣＶＡ２１プロトタイプ（Ｋｕｙｋｅｎｄａｌｌ）および３つのＣＶＡ２１臨床単離体（＃２７２１０１、＃２７５２３８、＃２７２５９８）の結合。（Ａ）表面のＤＡＦ発現およびＩＣＡＭ−１発現のフローサイトメトリー分析。トランスフェクションされたＣＨＯ細胞を、コンジュゲート単独、抗ＤＡＦ  ＭＡｂ（ＩＨ４）または抗ＩＣＡＭ−１  ＭＡｂ（ＷＥＨＩ）のいずれかとインキュベーションし、特異的な結合をＦＡＣＳｔａｒ分析装置で測定した。黒塗りのヒストグラムはコンジュゲートの結合を表し、白抜きのヒストグラムは抗ＤＡＦ  ＭＡｂの結合を表し、点線のヒストグラムは抗ＩＣＡＭ−１  Ｍａｂの結合を表す。（Ｂ）結合した［３５Ｓ］−メチオニン標識ウイルスのレベルを液体シンチレーション計数によって求めた。結果が三連のサンプルの平均＋ＳＤとして表される。Ｙ軸は、結合したウイルスを示す（ｃｍｐｘ１０２）。
図４は抗ＤＡＦ  ＭＡｂのＩＡ１０（ＳＣＲ１）、ＶＩＩＩＡ７（ＳＣＲ２）、ＩＨ４（ＳＣＲ３）およびＩＩＨ６（ＳＣＲ４）の存在下におけるＣＶＡ２１プロトタイプ（Ｋｕｙｋｅｎｄａｌｌ）および臨床単離体（＃２７２１０１、＃２７５２３８、＃２７２５９８）によるＩＣＡＭ−１陰性ＲＤ細胞の溶解性感染。抗ＤＡＦ  ＭＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）を、９６ウエルプレートで培養されたＲＤ細胞の単層物に加えた。３７℃で１時間インキュベーションした後、細胞を約１０３ＴＣＩＤ５０／ウエルのＣＶＡ２１単離体により攻撃し、３７℃で４８時間インキュベーションした。細胞溶解を、細胞単層物をクリスタルバイオレット／メタノール溶液により染色し、その後、吸光度を５４０ｎｍで測定することによって評価した。結果が二連のウエルの平均パーセント溶解として表される。
図５はプロトタイプＣＶＡ２１Ｋｕｙｋｅｎｄａｌｌ株および臨床単離体（＃２７２１０１、＃２７５２３８および＃２７２５９８）についての、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のカプシドタンパク質の多配列アラインメント。Ｋｕｙｋｅｎｄａｌｌ株に対する臨床単離体におけるアミノ酸変化が太字で表される。配列アラインメントを、ＣｌｕｓｔａｌＸプログラムを使用して作製した。ＣＶＡ２１−ＩＣＡＭ−１の結合フットプリントを構成する個々のアミノ酸配列が黒塗りの四角によって強調される。
図６はＣＶＡ２１親株およびＣＶＡ２１−ＤＡＦｖによるＳｋＭｅｌ２８細胞およびＲＤ細胞の感染。（Ａ）ＲＤ細胞およびＳｋＭｅｌ２８細胞におけるＩＣＡＭ−１発現およびＤＡＦ発現のフロ−サイトメトリー分析。実線のヒストグラムはコンジュゲートのみの結合を表し、点線のヒストグラムは抗ＩＣＡＭ−１ｍＡｂの結合を表し、抗ＤＡＦｍＡｂの結合が黒塗りのヒストグラムによって示される。（Ｂ）９６ウエルプレートにおけるＳｋＭｅｌ２８細胞およびＲＤ細胞の単層物をＣＶＡ２１親株およびＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの１０倍希釈物とインキュベーションした。７２時間のインキュベーションの後、単層物を固定し、クリスタルバイオレット溶液により染色した。＋は、顕微鏡検査によって検出されたＣＰＥを示す。（Ｃ）ＲＤ細胞上におけるＣＶＡ２１−ＤＡＦ変化体と比較したときの、ＳｋＭｅｌ２８細胞上におけるＣＶＡ２１親株およびＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの代表的なプラーク形態。細胞にウイルスの連続希釈物を感染させ、０．７％のアガロースを含有するＤＭＥＭを感染後１時間して重層した。プレートを３７℃でインキュベーションし、感染後４８時間でクリスタルバイオレットにより染色した。
図７はＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの結合および溶解性感染に対する抗ＤＡＦｍＡｂおよび抗ＩＣＡＭ−１ｍＡｂの影響。（Ａ）ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−ＤＡＦ細胞、ＣＨＯ−ＩＣＡＭ−１細胞およびＤＯＶ１３細胞におけるＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１の表面レベルのフローサイトメトリー分析。実線のヒストグラムはコンジュゲートのみの結合を表し、点線のヒストグラムは抗ＩＣＡＭ−１ｍＡｂの結合を表し、抗ＤＡＦｍＡｂの結合が黒塗りのヒストグラムによって示される。ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−ＩＣＡＭ−１細胞、ＣＨＯ−ＤＡＦ細胞およびＤＯＶ１３細胞における表面発現したＩＣＡＭ−１（Ｂ）およびＤＡＦ（Ｃ）に対する放射能標識ウイルスの結合を液体シンチレーション計数によって測定した。結果が三連のサンプル＋ＳＤとして表される。（Ｄ）ＲＤ細胞およびＤＯＶ１３細胞のＣＶＡ２１溶解性感染に対するＤＡＦのｍＡｂ架橋の影響。９６ウエルプレートにおける単層物を抗ＤＡＦ  ＳＣＲ３ｍＡｂとプレインキュベーションし、その後、ＣＶＡ２１親株およびＣＶＡ２１−ＤＡＦｖ（１−１０６ＴＣＩＤ５０／ウエル）により攻撃した。３７℃で７２時間のインキュベーションの後、細胞単層物を固定し、クリスタルバイオレット溶液により染色した。＋は、顕微鏡検査によって検出されたＣＰＥを示す。＊１０１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ未満のウイルス力価。
図８はＤＡＦからのＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの溶出。（Ａ）表面のＤＡＦに対するＣＶＡ２１親株およびＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの結合の厳格さ（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）の比較。ＣＨＯ−ＤＡＦ細胞を放射能標識ウイルスと４℃で２時間インキュベーションし、その後、細胞に結合しているウイルスを、氷上で１時間、様々な濃度の抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１ｍＡｂ（ＩＡ１０）により溶出した。上清を、溶出されたウイルスのレベルについてモニターした。結果が、細胞から溶出された放射能標識ウイルスの％として表される。（Ｂ）ＤＡＦ結合ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖビリオンおよびＩＣＡＭ−１結合ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖビリオンの沈降。ＣＨＯ−ＤＡＦ細胞およびＣＨＯ−ＩＣＡＭ−１細胞を放射能標識されたＣＶＡ２１−ＤＡＦｖビリオンと４℃で２時間インキュベーションし、３７℃で２時間溶出させた。溶出されたビリオンの沈降を５％〜３０％のスクロースグラジエントで分析した。成熟ビリオン（１６０Ｓ）およびプロビリオン（１２５Ｓ）を内部移動コントロールとして使用した。
図９は抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１ｍＡｂおよび可溶性ＤＡＦ（ｓＤＡＦ）によるＣＶＡ２１−ＤＡＦｖ溶解性感染の阻害。（Ａ）ＲＤ細胞のコンフルエント単層物を、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖによる感染の前に抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１ｍＡｂのＩＡ１０とインキュベーションした。３７℃で２４時間インキュベーションした後、細胞を細胞溶解について調べ、写真撮影した。（Ｂ）ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖをｓＤＡＦ（８５μｇ／ｍｌ）と３７℃で１時間インキュベーションし、ＲＤ細胞の単層物に加えた。３７℃で４８時間インキュベーションした後、細胞を細胞溶解について調べ、写真撮影した。
図１０はＣＶＡ２１の予測される受容体−ウイルス結合表面の詳細図。（Ａ）ＶＰ１が黄色で描かれ、ＶＰ２がピンク色で描かれ、ＶＰ３がマゼンダ色で描かれる等表面（ｉｓｏｓｕｒｆａｃｅ）として示される１つのＣＶＡ２１プロトマーの上面図。数字は、二十面体の５回軸、３回軸および２回軸の対応する位置を示す。相互作用するＩＣＡＭ−１分子およびＤＡＦ分子がウォーム描図として示され、ＤＡＦがコムギ色で、谷と結合しているＩＣＡＭ−１が緑色で示される。ＣＶＡ２１親株におけるＶＰ３のＲ９６残基の位置（空間充填モデル）がＶＰ１のＣ末端ループによって部分的に覆われ、かつ、アルギニン側鎖における１つの窒素原子（星印の隣の青色表面）だけをウイルスの表面から見ることができる。（Ｂ）上記のように着色されたタンパク質と、空間充填モデルにおいて強調されるＶＰ３のＲ９６残基およびＥ１０１残基とを伴うＣＶＡ２１プロトマーの側面図。この図はプログラムｐｙｍｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）を用いて作製された。
図１１はキメラなＤＡＦ／ＣＤ４６受容体に対する放射能標識ＣＶＡ２１の結合。（Ａ）野生型ＤＡＦ分子、野生型ＣＤ４６分子およびＤＡＦ／ＣＤ４６キメラ分子の概略図。（Ｂ）ＤＡＦの個々のＳＣＲおよびＣＤ４６に向けられたｍＡｂの結合のフローサイトメトリー分析。抗ＤＡＦｍＡｂは、ＩＡ１０（ＳＣＲ１）、ＩＨ４（ＳＣＲ３）、ＩＩＨ６（ＳＣＲ４）であり、抗ＣＤ４６ｍＡｂ（ＳＣＲ１）はＭＣＩ２０．６であった。適切なｍＡｂとのインキュベーションの後、細胞をＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳにおけるヤギ抗マウス免疫グロブリンのＲ−フィコエリトリンコンジュゲート化Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ、デンマーク）の１００μｌに再懸濁し、氷上で２０分間インキュベーションした。細胞を上記のように洗浄およびペレット化し、ＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳｔａｒ分析装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ、Ｓｙｄｎｅｙ、オーストラリア）を使用してＤＡＦおよびＣＤ４６の発現について分析した。（Ｃ）ＤＡＦ分子、ＣＤ４６分子またはキメラなＤＡＦ／ＣＤ４６分子を発現するＣＨＯ細胞に対する放射能標識ＣＶＡ２１の結合。細胞を約２ｘ１０５ｃｐｍの３５Ｓ標識されたＣＶＡ２１と３７℃で１時間インキュベーションし、その後、ＰＢＳにより４回洗浄した。細胞に結合したＣＶＡ２１の量を液体シンチレーションによって測定した。結果が三連の平均＋ＳＤとして表される。
図１２は時間、温度、および、インキュベーション媒体のｐＨに応答したＤＡＦ発現ＣＨＯ細胞からのＣＶＡ２１溶出。（Ａ）ＣＶＡ２１を、細胞表面に発現したＤＡＦに４℃で結合させ、温度を３７℃に上げることによって２時間後に、さらに０分間、１分間、５分間、１５分間、３０分間および６０分間にわたって溶出させた。溶出されたＣＶＡ２１のレベルを液体シンチレーション計数によって求めた。（Ｂ）ＣＶＡ２１を、細胞表面に発現したＤＡＦに４℃で２時間結合させ、その後、適切な温度でさらに３０分間インキュベーションすることによって溶出させた。（Ｃ）ＣＶＡ２１を、細胞表面に発現したＤＡＦに４℃で２時間結合させ、その後、適切なｐＨの媒体においてさらに３０分間インキュベーションすることによって溶出させた。
図１３はＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１から溶出された後におけるＣＶＡ２１の感染性。（Ａ）細胞表面に発現したＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１に対する４℃での［３５Ｓ］−メチオニン標識ＣＶＡ２１の結合のレベル、および、３７℃でのインキュベーションの後におけるそれぞれの受容体からの放射能標識ウイルスの溶出のレベル。結合した［３５Ｓ］−メチオニン標識ウイルスのレベルを１４５０Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  ＴＲＩＬＵＸ（Ｗａｌｌａｃ、Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）での液体シンチレーション計数によって測定した。結果が三連のサンプル＋ＳＤとして表される。（Ｂ）細胞表面に発現したＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１への結合、そして、それらからの溶出の後におけるＣＶＡ２１によるＲＤ−ＩＣＡＭ−１細胞の溶解性感染。細胞の生存をクリスタルバイオレット／メタノール溶液による染色によって四連のウエルから定量化し、染色された細胞単層物の相対的な吸光度をマルチスキャン酵素結合免疫吸着アッセイプレートリーダー（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭｃＬｅａｎ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、米国）で５４０ｎｍにおいて読み取った。５０パーセントのエンドポイント力価を、ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈの方法を使用して計算した。この場合、吸光度がウイルス非含有コントロール−３倍の標準偏差よりも小さいならば、ウエルは陽性としてスコア化された。
図１４は架橋されたＤＡＦからの溶出の後におけるＣＶＡ２１の感染性。（Ａ）ＲＤ細胞における細胞表面に発現したＩＣＡＭ−１（ＲＤ−ＩＣＡＭ−１）およびＲＤ細胞におけるｍＡｂ架橋ＤＡＦからの［３５Ｓ］−メチオニン標識ＣＶＡ２１の０℃および３７℃での溶出。溶出された［３５Ｓ］−メチオニン標識ウイルスのレベルを１４５０Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  ＴＲＩＬＵＸ（Ｗａｌｌａｃ、Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）での液体シンチレーション計数によって測定した。結果が、三連のサンプルから溶出されたパーセントウイルス＋ＳＤとして表される。（Ｂ）コントロールのＣＶＡ２１と比較される、ＩＣＡＭ−１およびｍＡｂ架橋ＤＡＦに対する結合、そして、それらからの溶出の後におけるＣＶＡ２１によるＲＤ−ＩＣＡＭ−１細胞の溶解性感染。細胞の生存をクリスタルバイオレット／メタノール溶液による染色によって四連のウエルから定量化し、染色された細胞単層物の相対的な吸光度をマルチスキャン酵素結合免疫吸着アッセイプレートリーダー（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭｃＬｅａｎ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、米国）で５４０ｎｍにおいて読み取った。５０パーセントのエンドポイント力価を、図１３に記載されるように計算した。（Ｃ）ＩＣＡＭ−１または架橋ＤＡＦに対するＣＶＡ２１結合の厳格さ。ＲＤ−ＩＣＡＭ−１細胞またはＤＡＦ架橋のＲＤ細胞［抗ＤＡＦ  ＳＣＲ３（ＩＨ４）ｍＡｂとプレインキュベーションされたＲＤ細胞］を約２ｘ１０５ｃｐｍの３５Ｓ標識されたＣＶＡ２１と０℃で２時間インキュベーションした。冷ＰＢＳによる４回の洗浄の後、細胞を多数のチューブに分割し、様々な濃度（０〜１００μｇ／ｍｌ）の抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１ｍＡｂまたは抗ＩＣＡＭ−１ドメイン１ｍＡｂのいずれかと０℃で１時間インキュベーションした。細胞および上清を放射能について液体シンチレーション計数によってモニターした。結果が、細胞から溶出された３５Ｓ標識ＣＶＡ２１の％として表される。
図１５はＩＣＡＭ−１発現の遅れた誘導の後におけるＲＤ細胞のＣＶＡ２１誘導による溶解性感染。（Ａ）アデノウイルスにより形質導入されたＩＣＡＭ−１発現の経時変化。ＲＤ細胞を、ヒトＩＣＡＭ−１のｃＤＮＡを含有する組換えアデノウイルスの２．５ｘ１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌによる形質導入によりヒトＩＣＡＭ−１を発現させるために誘導した。細胞を、抗ＩＣＡＭ−１ドメインｍＡｂ（ＩＨ４）を使用してアデノウイルス接種後の様々な時間でＩＣＡＭ−１の発現についてフローサイトメトリーによって評価した。（Ｂ）モック形質導入後２４時間、あるいは、ヒトのＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡまたはＣＤ３６ｃＤＮＡを含有する組換えアデノウイルスによる形質導入の後２４時間での、ＤＡＦ、ＩＣＡＭ−１およびＣＤ３６の表面発現を示すＲＤ細胞のフローサイトメトリー分析。黒塗りのヒストグラムはＤＡＦ発現を表し、一方、ピンク色のヒストグラムはＩＣＡＭ−１発現を表し、青色のヒストグラムはＣＤ３６発現を表す。ＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡまたはＣＤ３６ｃＤＮＡを含有する組換えアデノウイルスを、Ａｄｅｎｏ−ｑｕｅｓｔキット（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ）を製造者の説明書に従って使用して構築した。（Ｃ）２４時間後までのＩＣＡＭ−１の遅れた発現を介するＲＤ細胞のＣＶＡ２１溶解性感染。ＲＤ細胞を、ＤＡＦに対するＣＶＡ２１（ｍｏｉ＝１．０ＴＣＩＤ５０）の結合の後０時間、６時間および２４時間で、ＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡまたはＣＤ３６ｃＤＮＡを含有する組換えアデノウイルスの２．５ｘ１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌによる形質導入によりＩＣＡＭ−１受容体またはＣＤ３６受容体を発現させるために誘導した。非形質導入のＲＤ細胞がコントロールとして役立った。四連のウエルからの細胞生存をクリスタルバイオレット／メタノール溶液による染色によって定量化し、染色された細胞単層物の相対的な吸光度をマルチスキャン酵素結合免疫吸着アッセイプレートリーダー（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭｃＬｅａｎ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、米国）で５４０ｎｍにおいて読み取った。５０パーセントのエンドポイント力価を、ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈの方法を使用して計算した。この場合、吸光度がウイルス非含有コントロール−３倍の標準偏差よりも小さいならば、ウエルは陽性としてスコア化された。（Ｄ）ＣＶＡ２１により誘導される溶解性感染。モック形質導入後２４時間、あるいは、ヒトのＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡまたはＣＤ３６ｃＤＮＡを含有する組換えアデノウイルスによる形質導入の後２４時間で、ＣＶＡ２１（ｍｏｉ＝１．０ＴＣＩＤ５０）とのインキュベーションの直後におけるＲＤ細胞単層物の顕微鏡写真（Ｘ２００）。
図１６は乳ガン、卵巣ガン、前立腺ガンおよび結腸ガンの細胞株における受容体発現。３つの乳ガン細胞株、卵巣ガン細胞株、前立腺ガン細胞株および結腸ガン細胞株におけるＩＣＡＭ−１発現およびＤＡＦ発現のフローサイトメトリー分析。黒実線のヒストグラムはコンジュゲートのみを表し、ＩＣＡＭ−１発現が灰色のヒストグラムによって表され、ＤＡＦ発現が白抜きのヒストグラムによって示される。
図１７はＣＶＡ２１−ＤＡＦｖによるインビボ腫瘍崩壊。ヒトの乳ガン細胞、卵巣ガン細胞、前立腺ガン細胞および結腸ガン細胞のインビトロ培養物のＣＶＡ２１−ＤＡＦｖ誘導による感染の顕微鏡写真。細胞単層物にＣＶＡ２１親株またはＣＶＡ２１−ＤＡＦｖを感染させ、細胞単層物を細胞傷害作用についてモニターした。感染後７２時間経った後、単層物を写真撮影した。
図１８はヒトの乳ガン細胞株、卵巣ガン細胞株、前立腺ガン細胞株および結腸ガン細胞株におけるＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの腫瘍崩壊能力の定量化。９６ウエルプレートにおけるガン細胞の単層物にＣＶＡ２１親株またはＣＶＡ２１−ＤＡＦｖのストック調製物の１０倍希釈物を接種した。７２時間のインキュベーションの後、単層物を細胞傷害作用の存在について調べた。５０パーセントの感染エンドポイント力価を、顕微鏡により検出可能な細胞傷害作用（ＣＰＥ）を陽性として示したウエルをスコア化することによって、ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈの方法を使用して計算した。
図１９はＣＶＡ２１−ＤＡＦｖによるヒト前立腺異種移植片のインビボ腫瘍崩壊。２ｘ１０６個のＰＣ３細胞を注入した後、脇腹で成長している皮下のＰＣ３腫瘍（約５０ｍｍ３〜１００ｍｍ３）を有するＳＣＩＤ（重症複合免疫不全）マウスに、単回用量のＣＶＡ２１親株、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖまたはＰＢＳによる静脈内注射を与えた。平均腫瘍サイズをカリパスにより体外から測定し、腫瘍体積を、球状体についての式を使用して推定する。腫瘍体積が６匹の処置マウスの平均＋／−ＳＥとして表される。
図２０はＣＶＡ２１＃２７２５９８単離体のカプシドコード領域の配列。（Ａ）ヌクレオチド配列および（Ｂ）翻訳されたアミノ酸配列（これらは配列番号１および配列番号２にそれぞれ対応する）。
図２１はＣＶＡ２１＃２７５２３８単離体のカプシドコード領域の配列。（Ａ）ヌクレオチド配列および（Ｂ）翻訳されたアミノ酸配列（これらは配列番号３および配列番号４にそれぞれ対応する）。
図２２はＣＶＡ２１＃２７２１０１単離体のカプシドコード領域の配列。（Ａ）ヌクレオチド配列および（Ｂ）翻訳されたアミノ酸配列（これらは配列番号５および配列番号６にそれぞれ対応する）。
図２３はＣＶＡ２１−ＤＡＦｖのカプシドコード領域の配列。（Ａ）ヌクレオチド配列および（Ｂ）翻訳されたアミノ酸配列（これらは配列番号７および配列番号８にそれぞれ対応する）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
一部の天然に存在するピコルナウイルスおよび他のウイルス（例えば、レオウイルスなど）が、限定されたタイプのガンの治療における使用に好適であることが知られているが、改善された治療を開発することが依然として求められている。ガン治療の可能な範囲を拡大し、また、さらに一層有効な治療を提供するために、本発明者らは、改善された腫瘍崩壊性を有する新しい腫瘍崩壊性ピコルナウイルスを改変および生物選抜によって得ている。
【００３８】
本明細書中に記載されるように、本発明者らは、野生型ピコルナウイルスが、ＤＡＦを発現し、かつ、ＩＣＡＭ−１を発現しない細胞（そのような細胞は通常、野生型ピコルナウイルスの感染に対して抵抗性である）に溶解的に感染させるために生物選抜され得ることを発見している。ピコルナウイルスの感染に対する細胞の「抵抗性」は、ウイルスによる細胞の感染が著しいウイルス産生またはウイルス収量を生じさせなかったことを示す。「感受性」である細胞は、細胞傷害作用の誘導、ウイルスタンパク質の合成および／またはウイルス産生を明らかにする細胞である。
【００３９】
これらの観測結果に基づいて、本発明者らは、哺乳動物における新生物を治療する際の使用に好適である新しいピコルナウイルスを得るための方法を開発している。哺乳動物はヒトであり得るか、あるいは、マウス、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、非ヒト霊長類およびヒト（これらに限定されない）を含む、社会的、経済的または研究的に重要な任意の生物種の個体であり得る。好ましい実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００４０】
ピコルナウイルスは、天然に存在していてもよく、または、改変されてもよい。ピコルナウイルスは、ピコルナウイルスを自然界の供給源から単離することができ、かつ、それが研究室においてヒトによって意図的に改変されていないとき、「天然に存在している」。例えば、ピコルナウイルスを、「現場の供給源」から、すなわち、ヒト患者から得ることができる。
【００４１】
ピコルナウイルスは改変することができるが、依然として、ＤＡＦおよび／またはＩＣＡＭ−１を発現する哺乳動物細胞に溶解的に感染することができる。ピコルナウイルスは、天然に存在しているピコルナウイルスを、改変されたピコルナウイルスが得られるまで多数回の継代にわたって細胞株において培養することによって生物選抜することができる。好適な細胞株には、ＤＡＦを発現する細胞（例えば、ガン細胞株など）が含まれる。他の細胞株もまた好適であることが理解される。
【００４２】
ピコルナウイルスは、対象の細胞への投与に先立って、（例えば、プロテアーゼ（例えば、キモトリプシンまたはトリプシンなど）による処理によって）化学的または生化学的に前処理することができる。プロテアーゼによる前処理により、ウイルスの外皮またはカプシドが除かれ、ウイルスの感染性を増大させることができる。ピコルナウイルスは、ピコルナウイルスに対する免疫性を発達させている哺乳動物からの免疫応答を低下または防止するためにリポソームまたはミセルで覆うことができる。例えば、ビリオンを、ミセル形成濃度のアルキルスルファート界面活性剤の存在下においてキモトリプシンにより処理して、新しい感染性サブビリオン粒子を作製することができる。
【００４３】
ピコルナウイルスは、異なる抗原性決定基を含有し、それにより、ピコルナウイルスのサブタイプに以前にさらされた哺乳動物による免疫応答を低下または防止するように病原性表現型が異なる２つ以上のタイプのピコルナウイルスに由来する組換えピコルナウイルスであってもよい。そのような組換えビリオンは、異なるサブタイプのピコルナウイルスによる哺乳動物細胞の同時感染、その結果としての、異なるサブタイプのコートタンパク質の再分類、および、生じたビリオンカプシドへのそれらの組み込みによって生じさせることができる。
【００４４】
ピコルナウイルスは、変異しているコートタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３など）をビリオンの外側カプシドに組み込むことによって改変することができる。コートタンパク質は、置換、挿入または欠失によって変異させることができる。置換には、本来のアミノ酸の代わりに異なるアミノ酸を挿入することが含まれる。挿入には、さらなるアミノ酸残基を１つまたは複数の場所においてタンパク質に挿入することが含まれる。欠失には、タンパク質における１つまたは複数のアミノ酸残基の欠失が含まれる。そのような変異は、この分野で既知の様々な方法によって生じさせることができる。例えば、コートタンパク質の１つをコードする遺伝子のオリゴヌクレオチド部位特異的変異誘発により、所望する変異型コートタンパク質を生じさせることができる。ピコルナウイルスが感染した哺乳動物細胞におけるインビトロでの変異タンパク質の発現は変異タンパク質のピコルナウイルスビリオン粒子への組み込みをもたらす。
【００４５】
ピコルナウイルスはまた、ピコルナウイルスに対する免疫反応を低下または除去するために改変することができる。そのような改変されたピコルナウイルスは「免疫保護ピコルナウイルス」と呼ばれる。そのような改変では、哺乳動物の免疫系からピコルナウイルスを遮蔽するためのリポソーム、ミセルまたは他のビヒクルにピコルナウイルスを包むことを含むことができる。あるいは、外側カプシドに存在するタンパク質は宿主の体液性応答および細胞性応答の主要な決定因子であるので、ピコルナウイルスビリオン粒子の外側カプシドを除去または変化させることができる。
【００４６】
本発明の方法において、ピコルナウイルスは個々の哺乳動物における新生物に投与される。使用することができるヒトピコルナウイルスの代表的なタイプには、エンテロウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ポリオウイルスおよび未分類のエンテロウイルス、ライノウイルス、パラエコーウイルス、ヘパトウイルスならびにカルジオウイルスが含まれる。好ましい形態において、ピコルナウイルスはコクサッキーウイルスである。好ましくは、コクサッキーウイルスはＡ型であり、より好ましくはコクサッキーウイルスＡ２１である。異なる血清型および／または異なる株のピコルナウイルス（例えば、異なる動物種からのピコルナウイルスなど）の組合せを使用することができる。ピコルナウイルスは「天然に存在している」。すなわち、ピコルナウイルスは自然界の供給源から単離することができ、かつ、研究室においてヒトによって意図的に改変されていない。例えば、ピコルナウイルスを、「現場供給源」から、すなわち、ヒト患者から生物選抜することができる。所望されるならば、ピコルナウイルスは、新生物への投与に先立って、（例えば、プロテアーゼ（例えば、キモトリプシンまたはトリプシンなど）による処理によって）化学的または生化学的に前処理することができる。そのような前処理により、ウイルスの外皮が除かれ、それにより、ウイルスのより良好な感染性がもたらされ得る。
【００４７】
新生物は充実性新生物（例えば、肉腫またはガン腫）であり得るか、または、造血系を冒すガン性の成長物（「造血系新生物」；例えば、リンパ腫または白血病）であり得る。新生物は、正常な組織成長よりも迅速に細胞増殖によって成長する、明瞭な塊を一般には形成する異常な組織成長物である。新生物は、正常な組織との構造的な組織化および機能的な協調の部分的または完全な喪失を示す。本明細書中で使用されるように、「新生物」は「腫瘍」としてもまた示されるが、造血系新生物ならびに充実性新生物を包含することが意図される。新生物の細胞の少なくとも一部はＤＡＦおよび／またはＩＣＡＭ−１を発現する。本発明の方法による治療に対して特に感受性である新生物の１つがメラノーマである。発明の方法による治療に対して特に感受性である他の新生物には、乳ガン、脳ガン（例えば、神経膠芽細胞腫）、肺ガン、前立腺ガン、結腸直腸ガン、甲状腺ガン、腎臓ガン、副腎ガン、肝臓ガン、白血病、卵巣ガン、胃ガンおよび腸ガンなどが含まれる。
【００４８】
ピコルナウイルスは、典型的には、生理学的に許容され得るキャリアまたはビヒクル（例えば、リン酸塩緩衝化生理的食塩水など）において新生物に投与される。「新生物への投与」は、ピコルナウイルスが新生物の細胞（これはまた本明細書中では「新生物細胞」として示される）と接触するような様式でピコルナウイルスが投与されることを示す。ピコルナウイルスが投与される経路は、配合物、キャリアまたはビヒクルと同様に、新生物の存在位置ならびにタイプに依存する。広範囲の様々な投与経路を用いることができる。例えば、近づくことができる充実性新生物については、ピコルナウイルスを注射によって新生物に対して直接に投与することができる。造血系新生物については、例えば、ピコルナウイルスを静脈内または血管内に投与することができる。体内において容易に近づくことができない新生物（例えば、転移物または脳ガンなど）については、ピコルナウイルスは、ピコルナウイルスが哺乳動物の身体中を通って全身に輸送され、それにより、新生物に到達し得るような様式で投与される（例えば、クモ膜下、静脈内または筋肉内）。あるいは、ピコルナウイルスを１つだけの充実性新生物に対して直接に投与することができ、この場合、ピコルナウイルスは、その後、全身的に身体中を通って転移物に運ばれる。ピコルナウイルスはまた、皮下、腹腔内、局所的（例えば、メラノーマの場合）、経口（例えば、口腔または食道の新生物の場合）、直腸（例えば、結腸直腸の新生物の場合）、膣（例えば、子宮頸部または膣の新生物の場合）、鼻腔に、または、吸入スプレー（例えば、肺の新生物の場合）によって投与することができる。
【００４９】
一般には、好適な組成物を当業者に既知の方法に従って調製することができ、従って、好適な組成物は、医薬的に許容され得るキャリア、希釈剤および／または補助剤を含むことができる。
【００５０】
このような組成物は標準的な経路によって投与することができる。一般に、組成物は、非経口経路（例えば、静脈内経路、髄腔内経路、皮下経路または筋肉内経路）、経口経路または局所経路によって投与することができる。より好ましくは、投与は非経口経路によってである。
【００５１】
キャリア、希釈剤および補助剤は、組成物の他の成分との適合性を有し、かつ、その被投与者に対して有害でないという点で「許容され得る」ことが必要である。
【００５２】
医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤の例には、脱塩水または蒸留水；生理的食塩水溶液；植物系オイル、例えば、ピーナッツ油、ベニバナ油、オリーブ油、綿実油、ダイズ油、ゴマ油、例えば、ピーナッツ油、ベニバナ油、オリーブ油、綿実油、ダイズ油、ゴマ油、ラッカセイ油またはココナッツ油など；シリコーンオイル、ポリシロキサン（例えば、メチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサンおよびメチルフェニルポリシロキサンなど）が含まれる；揮発性シリコーン；鉱油、例えば、流動パラフィン、軟パラフィンまたはスクアレンなど；セルロース誘導体、例えば、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど；低級アルカノール、例えば、エタノールまたはイソプロパノール；低級アラルカノール；低級ポリアルキレングリコールまたは低級アルキレングリコール、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールまたはグリセリンなど；脂肪酸エステル、例えば、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピルまたはオレイン酸エチルなど；ポリビニルピロリドン；寒天；トラガカントゴムまたはアラビアゴム、およびワセリンがある。典型的には、キャリアは組成物の１０重量％〜９９．９重量％を形成する。
【００５３】
本発明の組成物は、注射による投与のために好適な形態、経口摂取のために好適な配合物の形態（例えば、カプセル、錠剤、カプレット、エリキシル剤）、局所投与のために好適な軟膏、クリームまたはローションの形態、点眼剤としての送達のために好適な形態、吸入による投与（例えば、鼻腔内吸入または経口吸入などによる投与）のために好適なエアロゾル形態、非経口投与（すなわち、皮下注射、筋肉内注射または静脈内注射）のために好適な形態にすることができる。
【００５４】
注射可能な溶液または懸濁物として投与される場合、非毒性の非経口的に許容され得る希釈剤またはキャリアには、リンゲル液、等張性の生理的食塩水、リン酸塩緩衝化生理的食塩水、エタノールおよび１，２−プロピレングリコールが含まれ得る。
【００５５】
経口使用される好適なキャリア、希釈剤、賦形剤および補助剤のいくつかの例には、ピーナッツ油、流動パラフィン、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム、トラガカントゴム、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、ゼラチンおよびレシチンが含まれる。加えて、これらの経口配合物は、好適な矯味矯臭剤および着色剤を含有することができる。カプセル形態で使用されるとき、カプセルは、崩壊を遅らせる化合物（例えば、グリセリルモノステアラートまたはグリセリルジステアラートなど）でコーティングすることができる。
【００５６】
補助剤には、典型的には、皮膚軟化剤、乳化剤、増粘剤、保存剤、殺菌剤および緩衝化剤が含まれる。
【００５７】
経口投与される固体形態物は、ヒトおよび動物の製薬実務において許容され得る結合剤、甘味剤、崩壊剤、希釈剤、矯味矯臭剤、コーティング剤、保存剤、滑剤および／または時間遅延剤を含有することができる。好適な結合剤には、アラビアゴム、ゼラチン、トウモロコシデンプン、トラガカントゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースまたはポリエチレングリコールが含まれる。好適な甘味剤には、スクロース、ラクトース、グルコース、アスパルテームまたはサッカリンが含まれる。好適な崩壊剤には、トウモロコシデンプン、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、グアールガム、キサンタンガム、ベントナイト、アルギン酸または寒天が含まれる。好適な希釈剤には、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、デキストロース、カオリン、セルロース、炭酸カルシウム、ケイ酸カルシウムまたはリン酸二カルシウムが含まれる。好適な矯味矯臭剤には、ハッカ油、ウインターグリーン油、サクランボ、オレンジまたはラズベリーの香料が含まれる。好適なコーティング剤には、アクリル酸および／またはメタクリル酸および／またはそれらのエステルのポリマーまたはコポリマー、ワックス、脂肪アルコール、ゼイン、セラックまたはグルテンが含まれる。好適な保存剤には、安息香酸ナトリウム、ビタミンＥ、α−トコフェロール、アスコルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベンまたは重亜硫酸ナトリウムが含まれる。好適な滑剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウムまたはタルクが含まれる。好適な時間遅延剤には、グリセリルモノステアラートまたはグリセリルジステアラートが含まれる。
【００５８】
経口投与される液体形態物は、上記の薬剤に加えて、液体キャリアを含有することができる。好適な液体キャリアには、水、オイル、例えば、オリーブ油、ピーナッツ油、ゴマ油、ヒマワリ油、ベニバナ油、ラッカセイ油、ココナッツ油、流動パラフィン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセロール、脂肪アルコール、トリグリセリドなど、またはその混合物が含まれる。
【００５９】
経口投与される懸濁物は分散化剤および／または懸濁化剤をさらに含むことができる。好適な懸濁化剤には、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウムまたはアセチルアルコールが含まれる。好適な分散化剤には、レシチン、脂肪酸（例えば、ステアリン酸など）のポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレアートまたはポリオキシエチレンソルビトールジオレアート、ポリオキシエチレンソルビトールモノステアラートまたはポリオキシエチレンソルビトールジステアラート、ポリオキシエチレンソルビトールモノラウラートまたはポリオキシエチレンソルビトールジラウラート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートまたはポリオキシエチレンソルビタンジオレアート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアラートまたはポリオキシエチレンソルビタンジステアラート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラートまたはポリオキシエチレンソルビタンジラウラートなどが含まれる。
【００６０】
経口投与されるエマルションは１つまたは複数の乳化剤をさらに含むことができる。好適な乳化剤には、上記で例示されたような分散化剤、または、天然ゴム（例えば、グアールガム、アラビアガムまたはトラガカントガムなど）が含まれる。
【００６１】
非経口投与可能な組成物を調製するための様々な方法が当業者には明らかであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、これは本明細書により参考として本明細書中に組み込まれる）においてより詳しく記載される。
【００６２】
本発明の局所配合物は、１つまたは複数の許容され得るキャリアと一緒での有効成分と、必要な場合には任意の他の治療的成分とを含む。局所投与のために好適な配合物には、治療が必要とされる部位への皮膚を介した浸透のために好適な液体または半液体の調製物（例えば、リニメント剤、ローション、クリーム、軟膏またはペーストなど）、および、眼、耳または鼻への投与のために好適な滴剤が含まれる。
【００６３】
本発明による滴剤は無菌の水性または油性の溶液または懸濁物を含むことができる。これらは、有効成分を、殺菌剤および／または抗真菌剤および／または任意の他の好適な保存剤の水溶液に溶解し、そして、必要な場合には、表面活性剤を含むことによって調製することができる。得られる溶液は、その後、ろ過によって清澄化され、好適な容器に移され、滅菌され得る。滅菌は、オートクレーブ処理するか、または、９０℃〜１００℃で半時間維持することによって、あるいは、ろ過し、その後、無菌技術によって容器に移すことによって達成することができる。滴剤に含めるために好適な殺菌剤および抗真菌剤の例には、硝酸フェニル水銀または酢酸フェニル水銀（０．００２％）、ベンザルコニウムクロリド（０．０１％）および酢酸クロルヘキシジン（０．０１％）がある。油性溶液を調製するための好適な溶媒には、グリセロール、希釈されたアルコールおよびプロピレングリコールが含まれる。
【００６４】
本発明によるローションには、皮膚または眼に対する適用のために好適なローションが含まれる。眼用ローションは、殺菌剤を場合により含有する無菌の水溶液を含むことができ、滴剤の調製に関連して上記で記載された方法と類似する方法によって調製することができる。皮膚に適用されるローションまたはリニメント剤はまた、乾燥を急がせ、また、皮膚を冷やすための薬剤（例えば、アルコールまたはアセトンなど）、および／または、保湿剤（例えば、グリセロールなど）、または、オイル（例えば、ひまし油またはラッカセイ油など）を含むことができる。
【００６５】
本発明によるクリーム、軟膏またはペーストは、外用適用のための有効成分の半固体配合物である。それらは、細かく分割された形態または粉末化された形態での有効成分を、単独で、あるいは、水性流体または非水性流体における溶液または懸濁物で、脂肪性または非脂肪性の基剤と混合することによって作製することができる。このような基剤は、炭化水素（例えば、硬パラフィン、軟パラフィンまたは流動パラフィンなど）、グリセロール、蜜ろう、金属石けん；粘漿剤；天然起源のオイル、例えば、アーモンド油、トウモロコシ油、ラッカセイ油、ひまし油またはオリーブ油など；羊毛脂またはその誘導体、あるいは、アルコール（例えば、プロピレングリコールまたはマクロゴールなど）と一緒での脂肪酸（例えば、ステアリン酸またはオレイン酸など）を含むことができる。
【００６６】
本発明の組成物は、任意の好適な界面活性剤、例えば、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤など、例えば、ソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体などを含むことができる。懸濁化剤（例えば、天然ゴム、セルロース誘導体または無機物質（例えば、ケイ酸系シリカなど）など）および他の成分（例えば、ラノリンなど）もまた含めることができる。
【００６７】
ピコルナウイルス、または、ピコルナウイルスから得られる核酸、または、ピコルナウイルスに由来する核酸が、新生物を治療するために十分である量（例えば、「効果的な量」）で投与される。新生物は、新生物の細胞に対するピコルナウイルスの投与が新生物細胞の溶解を生じさせ、新生物のサイズの減少または新生物の完全な除去をもたらすときに「治療される」。新生物のサイズの減少、または、好ましくは、新生物の除去は、一般には、ピコルナウイルスによる新生物細胞の溶解（「腫瘍崩壊」）によって引き起こされる。効果的な量は個体に基づいて決定され、少なくとも部分的には、ピコルナウイルスのタイプ；個体の体格、年齢、性別；新生物のサイズおよび他の特徴の検討に基づくことができる。例えば、ヒトの治療については、約１０２〜１０１２プラーク形成ユニット（ＰＦＵ）のピコルナウイルスを、存在する腫瘍のタイプ、サイズおよび数に依存して使用することができる。好ましくは、接種物は約１０５ＰＦＵよりも多く含有し、例えば、約１０５ＰＦＵ〜１０６ＰＦＵの間または約１０６ＰＦＵ〜１０７ＰＦＵの間を含有する。より好ましくは、接種物は約１ｘ１０６ＰＦＵ〜約５ｘ１０６ＰＦＵの間（例えば、約３ｘ１０６ＰＦＵなど）を含有することができる。例えば、ヒトにおけるメラノーマの治療については、約３ｘ１０６ＰＦＵの１回または複数回の接種を使用することができる。ピコルナウイルスは単回服用量または多数回の服用量（すなわち、２回以上の服用量）で投与することができる。多数回の服用量を同時に投与することができ、または、連続して（例えば、数日または数週間の期間にわたって）投与することができる。典型的には、治療的適用において、治療は疾患状態の継続期間にわたり、例えば、少なくとも、新生物が従来の手段によってもはや検出できなくなるまでである。例えば、検出不可能な新生物が存在するかもしれないことを治療医師が疑う場合には、検出可能な新生物の存在が認められなくなった後も一定の期間、治療を継続することが望ましい場合があることもまた意図される。ピコルナウイルスまたは核酸はまた、同じ個体における２つ以上の新生物に対して投与することができる。
【００６８】
ピコルナウイルスの多数回の投与が所望される場合、異なるウイルスを、前回に投与されたウイルスに対する何らかの免疫応答の影響を避け、または最小限に抑えるために、毎回投与することができ、また、治療の経過を、主治医によって決定され得るように１週間〜２週間またはそれ以上にわたって延長することができる。最も好ましくは、哺乳動物が以前にさらされていないウイルス、または、哺乳動物が、標準的な技術によって明らかにされ得るような比較的軽微な免疫応答を生じさせるウイルスを投与することができる。
【００６９】
本発明は、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の実質的には非存在下で細胞に溶解的に感染することができるピコルナウイルスの単離された核酸分子を包含する。１つの実施形態において、核酸分子はそのようなピコルナウイルスに由来することができ、ウイルスに由来する一本鎖ＲＮＡまたは相補的なＤＮＡであり得る。本発明の核酸配列は、例えば、ウイルスの生成を可能にするために、または、細胞における溶解性感染を誘発することができるために、ウイルスゲノムをコードする核酸配列またはその十分な配列を含む、ピコルナウイルスに由来した核酸配列を包むことが理解される。例えば、核酸分子は、一本鎖ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子（例えば、相補的なＤＮＡ分子など）、あるいは、異なるウイルス配列をコードする多数のそのような分子を含むことができる。
【００７０】
本明細書中で使用される用語「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチド塩基、リボヌクレオチド塩基、または既知のアナログもしくは天然のヌクレオチド、またはその混合物の一本鎖ポリマーまたは二本鎖ポリマーを示す。
【００７１】
本明細書に関連して、「由来する」の用語は、配列が、ピコルナウイルスから直接に単離されたウイルスＲＮＡ、合成ＲＮＡ、単離された配列に対応するｃＤＮＡであり得ることを包含することを理解しなければならない。この用語はまた、野生型配列または元の配列と比較して、例えば、カプシドタンパク質における変異を含めて、１つまたは複数の変異を配列に含む合成ポリヌクレオチド配列を包含する。
【００７２】
ウイルスＲＮＡを単離するための任意の好適な方法を使用することができ、これには、フェノール／クロロホルム抽出の使用に基づく方法（例えば、ウイルスＲＮＡを単離するための市販のキット形態などで提供され、例えば、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）ＬＳ試薬（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、米国）などがある）、磁気ビーズに基づく単離を利用する方法（例えば、Ａｍｂｉｏｎ  ＭａｇＭａｘ（商標）ウイルスＲＮＡ単離キットなど）が含まれる。ウイルスＲＮＡを単離するための様々な方法が、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．他編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９２、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、および、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に一般的に記載される。
【００７３】
本発明は、核酸配列がウイルスから直接的に単離されるか、または、合成されるか、または、プラスミド分子として提供されるか、または、混入物（例えば、細胞破片など）を有しないために、インビトロで、例えば、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用してｃＤＮＡテンプレートから作製されるとしても、核酸配列（例えば、ウイルスＲＮＡなど）が、本明細書に関連して「単離された（されている）」と見なされることを必要としないことが理解される。従って、本明細書に関連して、ＲＮＡは、供給源材料からの非ＲＮＡ成分（例えば、細胞のタンパク質など）がＲＮＡから部分的または完全に除かれているとき、単離された（されている）と見なされる。例えば、ＲＮＡは、５０％を超える非ＲＮＡ物質が除かれているとき、「単離された（されている）」と見なされる。６０％を超える非ＲＮＡ物質が除かれること、より好ましくは、７０％、８０％または９０％を超える非ＲＮＡ物質が除かれることが好ましい。典型的には、ＲＮＡは１０％未満の混入物質（より典型的には、５％未満の混入物質）を含有する。従って、ＲＮＡは、好ましくは、ウイルスＲＮＡについて９５％を超えて純粋であり、さらに一層より好ましくは、９７％を超えて、または、９９％を超えて純粋である。
【００７４】
好ましくは、核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群から選択される核酸配列を含む。当業者は、遺伝暗号の縮重性を考慮して、かなりの配列変化がこれらのポリヌクレオチド分子の間で可能であることを認識する。
【００７５】
本発明はまた、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７）に実質的に類似する単離されたポリヌクレオチド配列を提供し、この場合、そのような配列は、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の実質的には非存在下で細胞に溶解的に感染する能力をピコルナウイルスに提供する。ポリヌクレオチド配列変化体は、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７の配列の１つまたは複数と共通して、質的な生物学的活性を有する。用語「実質的に類似する」は、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７のいずれか１つに示される配列に対して少なくとも約６０％（より好ましくは、少なくとも約７０％、さらに一層より好ましくは、さらに少なくとも約８０％）の配列同一性を有する配列を示すために本明細書中では使用される。典型的には、そのような配列は、より好ましくは、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７のいずれか１つに対して少なくとも約９０％が同一であり、最も好ましくは、少なくとも約９５％以上が同一である。
【００７６】
本明細書中で使用される「配列同一性」は、この分野で既知のコンピュータープログラムによって、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰ（Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン８（１９９６年８月）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、米国、５３７１１）（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４８、４４３〜４５３）などによって指定の比較範囲にわたって最大限の一致のためにアラインメントされたときに同じである、２つの配列における残基を示す。
【００７７】
本発明の配列の上記記載に加えて、本発明の配列には、様々な変化体配列、例えば、ポリペプチド配列については、１つまたは複数のアミノ酸置換、アミノ酸欠失および／またはアミノ酸変化を含む配列、例えば、保存的アミノ酸変化など、そして、ポリヌクレオチド配列については、１つまたは複数のアミノ酸置換、アミノ酸欠失および／またはアミノ酸変化（例えば、１つまたは複数の保存的アミノ酸変化など）を含むポリペプチド配列をコードする配列が含まれることが理解される。これらの変化は、好ましくは、性質が軽微であり、すなわち、配列の活性（例えば、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の実質的には非存在下で細胞に溶解的に感染する能力をウイルスに付与することなど）に著しく影響しない保存的アミノ酸置換および他の置換である。保存的アミノ酸置換およびその導入方法がこの分野で知られており、それらは、一般には、１つのアミノ酸を、ポリペプチド鎖（タンパク質の一次配列）内において類似する性質を有する別のアミノ酸に置き換えるか、または取り替えることを示す。例えば、荷電アミノ酸のグルタミン酸（Ｇｌｕ）を同様に荷電したアミノ酸のアスパラギン酸（Ａｓｐ）に置き換えることは保存的アミノ酸置換である。下記の表を１つの指針として使用することができる：
2007527719.tif 000002
【００７８】
変化体配列は、例えば、本明細書中に記載されるカプシドタンパク質変化の保存的置換を含む。例えば、変異型ＶＰ３のＲ９６Ｈの保存的置換（例えば、ＶＰ３のＲ９６Ｋ）を含む配列は所望の性質を有し得ることが予想される。同様に、変異型ＶＰ３のＥ１０１Ａの保存的置換（例えば、ＶＰ３のＥ１０１Ｇ、ＶＰ３のＥ１０１Ｔ、ＶＰ３のＥ１０１ＳまたはＶＰ３のＥ１０１Ｍ）を含む１つまたは複数の配列は所望の性質を有し得ることが予想される。さらなる一例として、変異型ＶＰ３のＡ２３９Ｓの保存的置換（例えば、ＶＰ３のＡ２３９Ｇ、ＶＰ３のＡ２３９ＴまたはＶＰ３のＡ２３９Ｍなど）を含む１つまたは複数の配列は所望の性質を有し得ることが予想される。なおかつさらに、例として、変異型ＶＰ２のＳ１６４Ｌの保存的置換（例えば、ＶＰ２のＳ１６４ＩまたはＶＰ２のＳ１６４Ｖなど）を含む１つまたは複数の配列は所望の性質を有し得ることが予想される。
【００７９】
変化体配列は、本明細書中に記載されるように本発明に従って機能性について容易に試験することができる。
【００８０】
ピコルナウイルスは、ＲＮＡゲノムまたはゲノムの相補的なＤＮＡ複製体を使用することによって間接的に投与することができることもまた理解される。投与されたとき、ピコルナウイルスは、依然として、細胞内で複製することができ、かつ、所望される溶解性感染および殺傷を生じさせることができる。
【００８１】
従って、無傷のウイルスではなく、ウイルスを生じさせるための核酸を組み込むウイルスプラスミドまたは他のプラスミドまたは発現ベクターを、治療を行うために腫瘍細胞により取り込まれ、かつ、無傷のウイルスを細胞内で生じさせるために腫瘍内に注入することができる。好適な発現ベクターには、ウイルスを生じさせるために必要なウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）インサートを発現することができるプラスミドが含まれる。発現ベクターは、典型的には、挿入された核酸が機能的に連結されている転写調節制御配列を含む。「機能的に連結されている（される）」によって、核酸インサートが、挿入された配列の転写を、目的の読み枠がずれることなく可能にするための転写調節制御配列に連結されている（される）ことが意味される。そのような転写調節制御配列には、転写を開始させるためにＲＮＡポリメラーゼの結合を容易にするためのプロモーター、および、転写されたｍＲＮＡに対するリボソームの結合を可能にするための発現制御エレメントが含まれる。
【００８２】
より具体的には、本明細書中で使用される用語「調節制御配列」は、所与のＤＮＡ配列の転写を行わせ、かつ、その転写レベルを制御（すなわち、調節）することに関与する任意のＤＮＡを包含することを理解しなければならない。例えば、５’調節制御配列は、コード配列の上流側に位置するＤＮＡ配列であり、これはプロモーターおよび５’非翻訳リーダー配列を含むことができる。３’調節制御配列は、コード配列の下流側に位置するＤＮＡ配列であり、これは、１つまたは複数のポリアデニル化シグナルをはじめとする好適な転写終結（および／または）調節シグナルを含むことができる。本明細書中で使用される用語「プロモーター」は、転写開始時にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識され、かつ（直接的または間接的に）結合される任意のＤＮＡ配列を包含する。プロモーターは、転写開始部位、ならびに、転写開始因子およびＲＮＡポリメラーゼに対する結合部位を含み、また、遺伝子発現調節タンパク質が結合し得る様々な他の部位または配列（例えば、エンハンサー）を含むことができる。
【００８３】
哺乳動物細胞のトランスフェクションのために好適な数多くの発現ベクターがこの分野では知られている。哺乳動物細胞のトランスフェクションのために好適な発現ベクターには、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＥＦ−ＰＧｋ．ｐｕｒｏ、ｐＴｋ２、ならびに、ポリアデニル化部位および伸長因子１−ｘプロモーターを組み込む非複製アデノウイルスシャトルベクター、ならびに、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを最も好ましくは組み込むｐＡｄＥａｓｙ型発現ベクター（例えば、Ｈｅ他（１９９８）を参照のこと）が含まれる。ポリペプチド伸長因子−α２をプロモーターとして用いるプラスミドｐＥＦＢＯＳもまた利用することができる。ウイルスを生じさせるために必要なウイルスタンパク質をコードするｃＤＮＡを、ウイルスＲＮＡゲノムまたはそのフラグメントを逆転写することによって調製することができ、また、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、および、Ａｕｓｕｂｅｌ他（１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（米国、第１巻および第２巻）に記載されるようなこの分野で広く既知の組換え技術を利用して好適なベクターに組み込むことができる。
【００８４】
細胞を、ｃＤＮＡではなく、精製されたビリオンから抽出されたウイルスＲＮＡによりトランスフェクションすることができ、または、例えば、ＲＮＡ転写物を、Ａｎｓａｒｄｉ、Ｄ．Ｃ．他（２００１）に記載されるようにバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを利用してｃＤＮＡテンプレートからインビトロで生じさせることができる。
【００８５】
同様に、１個だけのプラスミド分子またはＲＮＡ分子をウイルスタンパク質の発現またはウイルスの生成のために投与することができ、あるいは、ウイルスタンパク質の異なるタンパク質をコードする多数のプラスミド分子またはＲＮＡ分子を、細胞をトランスフェクションし、ウイルスを生じさせるために投与することができる。
【００８６】
プラスミドまたはＲＮＡは、例えば、局所的に、あるいは、細胞のトランスフェクションを容易にするためのキャリアビヒクルの非存在下、または、そのようなビヒクルとの組合せでの腫瘍細胞による取り込みのための注入によって、それらのいずれでも腫瘍に投与することができる。好適なキャリアビヒクルには、この分野では従来から既知の水中油型のエマルションとして典型的には提供されるリポソームが含まれる。リポソームは、典型的には、脂質（特に、リン脂質、例えば、高い相転移温度のリン脂質など）と、通常の場合には、膜安定性をリポソームに提供するための１つまたは複数のステロイドまたはステロイド前駆体（例えば、コレステロールなど）との組合せを含む。リポソームを提供するために有用な脂質の例には、ホスファチジル化合物、例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セレブロシドおよびガングリオシドが含まれる。ジアセチルホスファチジルグリセロール類が特に好適であり、この場合、脂質成分は１４個〜１８個の炭素原子（より好ましくは１６個〜１８個の炭素原子）を含有し、かつ、飽和している。
【００８７】
ピコルナウイルスまたはピコルナウイルスを含む組成物はリポソームの形態で投与することができる。リポソームは、一般には、リン脂質または他の脂質物質に由来し、水性媒体に分散される単層または多層の水和した液晶によって形成される。リポソームを形成することができる生理学的に許容可能かつ代謝可能な任意の非毒性の脂質を使用することができる。リポソーム形態での組成物は、安定化剤、保存剤および賦形剤などを含有することができる。好ましい脂質は、天然および合成の両方で、リン脂質およびホスファチジルコリン（レシチン）である。リポソームを形成させるための様々な方法がこの分野では知られており、これに関連して、Ｐｒｅｓｃｏｔｔ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第ＸＩＶ巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９７６）、３３頁以降）が特に参照される（その内容は本明細書中に参考として組み込まれる）。
【００８８】
リポソームと標的細胞との相互作用は受動的または能動的であり得る。能動的な標的化では、標的細胞によって発現される対応するリガンドと結合するか、または、そうでない場合には、標的細胞によって発現される対応するリガンドと相互作用する特異的なリガンドをリポソームの膜に組み込むことによるリポソームの修飾が伴う。そのようなリガンドには、例えば、モノクローナル抗体またはその結合性フラグメント（例えば、ＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメント）、糖または糖脂質成分、あるいは、ウイルスタンパク質、ＤＡＦに対して特異的なモノクローナル抗体が含まれ、これらは特に好ましい。
【００８９】
ピコルナウイルスは他の治療的因子との組合せで投与することができる。例えば、ピコルナウイルスは１つまたは複数の異なる血清型または株のピコルナウイルスと一緒に投与することができる。さらなる血清型または株のピコルナウイルスは、本発明のピコルナウイルスと同じまたは異なる、細胞感染のための受容体要求を有することができる。
【００９０】
さらなる一例として、ピコルナウイルスまたはその組合せは、治療されている個体において免疫応答を調節または抑制することができる１つまたは複数の薬剤との組合せで投与することができる。この様式では、ウイルス感染に対する個体の生来的な免疫応答が変化させられ、それにより、好ましくは、より有効なウイルス感染および／または腫瘍崩壊の結果を可能にし得る。典型的には、免疫応答を変化させることができる薬剤は、免疫応答を抑制することができる薬剤である。個体（例えば、ヒト個体など）において免疫応答を調節または抑制することができる薬剤が、例えば、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ（第１３版、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．Ｉｎｃ、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ、米国）に記載される（その内容は本明細書中に参考として組み込まれる）。
【００９１】
ピコルナウイルスまたはその組合せは１つまたは複数の化学療法剤（これはまた抗新生物剤とも呼ばれる）との組合せで使用することができる。様々な抗新生物剤が、例えば、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ（第１３版、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．Ｉｎｃ、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ、米国）に記載される。例えば、ピコルナウイルスは下記の化学療法剤と一緒に投与することができる：例えば、アドリアマイシン、タキソール、フルオロウラシル、メルファラン、シスプラチン、α−インターフェロン、ＣＯＭＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、メトトレキサートおよびプレドニゾン）、エトポシド、ｍＢＡＣＯＤ（メトトレキサート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチンおよびデキサメタゾン）、ＰＲＯＭＡＣＥ／ＭＯＰＰ（プレドニゾン、メトトレキサート（ロイコボリンレスキューとともに）、ドキソルビシン、シクロホスファミド、タキソール、エトポシド／メクロレタミン、ビンクリスチン、プレドニゾンおよびプロカルバジン）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、アンギオインヒビン類、ＴＮＰ−４７０、ペントサンポリスルファート、血小板因子４、アンギオスタチン、ＬＭ−６０９、ＳＵ−１０１、ＣＭ−１０１、テクガラン、サリドマイドおよびＳＰ−ＰＧなど。他の化学療法剤には、下記が含まれる：アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード、これには、メクロレタミン、メルファン、クロラムブチル、シクロホスファミドおよびイホスファミドが含まれる；ニトロソウレア系、これには、カルムスチン、ロムスチン、セムスチンおよびストレプトゾシンが含まれる；アルキルスルホナート系、これには、ブスルファンが含まれる；トリアジン系、これには、ダカルバジンが含まれる；エチエンイミン系、これには、チオテパおよびヘキサメチルメラミンが含まれる；葉酸アナログ、これには、メトトレキサートが含まれる；ピリミジンアナログ、これには、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシドが含まれる；プリンアナログ、これには、６−メルカプトプリンおよび６−チオグアニンが含まれる；抗腫瘍抗生物質、これには、アクチノマシンＤが含まれる；アントラサイクリン系、これには、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣおよびメトラマイシンが含まれる；ホルモンおよびホルモンアナログ、これには、タモキシフェンおよびコルチコステロイド類が含まれる；ならびに、その他の薬剤、これには、シスプラチンおよびブレキナルが含まれる。ピコルナウイルスは、例えば、メラノーマの治療のためには、ブレオマイシン、ビンデシン、ビンクリスチン、ダクチノマイシン、プロカルバジン、ロムスチンまたはダカルバジンの１つまたは複数との組合せで使用することができる。ピコルナウイルスは、例えば、卵巣ガンの治療のためには、シスプラチンおよびカルボプラチンの１つまたは複数との組合せで使用することができる。ピコルナウイルスとの組合せで使用することができる化学療法剤のさらなる例には、例えば、乳ガンの治療については、シクロホスファミド（シトキサン）、メトトレキサート（アメトプテリン、メキサート、ホレクス）およびフルオロウラシル（フルオロウラシル、５−���Ｕ、アドルシル）［これはＣＭＦと略記される］；シクロホスファミド、ドキソルビシン（アドリアマイシン）およびフルオロウラシル［これはＣＡＦと略記される］；ドキソルビシン（アドリアマイシン）およびシクロホスファミド［これはＡＣと略記される］；パクリタキセル（タキソール）を伴うドキソルビシン（アドリアマイシン）およびシクロホスファミド；ドキソルビシン（アドリアマイシン）、その後、ＣＭＦ；シクロホスファミド、エピルビシン（エレンス）およびフルオロウラシルが含まれる。乳ガンの女性を治療するために使用される他の化学療法薬物には、例えば、ドセタキセル（タキソテレ）、ビノレルビン（ナベルビン）、ゲムシタビン（ジェムザール）およびカペシタビン（キセロダ）が含まれる。
【００９２】
１つまたは複数の薬剤／因子（例えば、１つまたは複数のさらなるピコルナウイルス、免疫応答を調節または刺激することができる１つまたは複数の薬剤、あるいは、１つまたは複数の抗新生物剤など）との「組合せで」のピコルナウイルスの使用または投与は、ピコルナウイルスおよびさらなる薬剤／因子が治療効果（例えば、重なる一時的な効果など）を有する任意の様式での使用または投与を意味することが理解される。組合せの各要素は同時に投与することができ、または、所望する治療的効果を提供する任意の順序で個々に投与することができる。混合治療のために意図されるとき、ピコルナウイルスおよびさらなる薬剤／因子は物理的混合の状態であり得るか、または、例えば、投与のための説明書を伴うか、または伴わないキット形態などで、別個に提供され得る。本発明によるキットはまた、本発明の方法を行うために要求される他の構成成分（例えば、緩衝液および／または希釈剤など）を含むことができる。キットは、典型的には、様々な構成成分と、キットの構成成分を本発明の方法において使用するための説明書とを収容するための容器を含む。
【００９３】
本発明の医薬組成物には、１つまたは複数のさらなる治療的薬剤／因子との物理的な混合でのピコルナウイルスの組成物、ならびに、ピコルナウイルスを唯一の治療的に活性な因子として含む組成物が含まれることが理解される。
【００９４】
本発明の方法において、ピコルナウイルスは、新生物の治療するための他の方法（例えば、新生物の手術による縮小化もしくは切除および／または化学療法および／または放射線療法など）との併用で使用され得ることもまた理解される。例えば、充実性新生物の治療が所望される場合、ピコルナウイルスを、新生物の手術による縮小化または切除に対する補助として使用することができる。
【００９５】
本明細書中で使用されるように、「単離された（されている）」ウイルスは、ウイルスが、天然に存在しているウイルスであるか、あるいは、ヒトによって意図的または非意図的に改変されたウイルスであるとしても、ウイルスがともに見出される成分の一部またはすべてから除かれているウイルス、すなわち、ウイルスがともに見出される成分の一部またはすべてが除かれているウイルスである。そのような成分は混入成分と呼ばれることがある。「単離された（されている）」ウイルスは、すべての混入成分が除かれているという意味で、ウイルスの純粋な調製物である必要はないことが理解される。従って、ウイルスは、非ウイルス成分がウイルスから部分的または完全に除かれているとき、「単離された（されている）」と見なされる。例えば、ウイルスは、約５０％を超える混入物質が除かれているとき、「単離された（されている）」と見なされる。約６０％を超える混入物質が除かれ、より好ましくは、約７０％を超える混入物質が除かれることが好ましい。典型的には、単離された（されている）ウイルスは、約８０％を超える混入物質または約９０％を超える混入物質が除かれている。より典型的には、約９５％を超える混入物質または約９７％を超える混入物質が除かれる。１つの実施形態において、９９％を超える混入物質が除かれる。
【００９６】
本明細書中で使用される「ＩＣＡＭ−１の実質的には非存在下で」は、細胞に関連して使用されるとき、細胞が最小限のＩＣＡＭ−１を発現するか、または、ＩＣＡＭ−１を全く発現していないことを意味する。具体的には、そのような細胞は、感染のためにＩＣＡＭ−１の存在を必要とするウイルスによる細胞への溶解性感染のための基礎を提供するためには不十分なＩＣＡＭ−１を発現することが理解される。
【００９７】
本明細書中で使用されるように、細胞をウイルスと「接触させる」ことは、ウイルスを細胞の培養物に入れ、その結果、ウイルスが、細胞と接触するための機会を有するようになり、これにより、ウイルスによる成功した感染またはアポトーシスによる細胞死の誘導が生じ得ることを示す。
【００９８】
本明細書中で使用される「ウイルス感染」は、細胞内へのウイルスの進入、および、それに続く、細胞におけるウイルスの複製またはアポトーシスによる細胞死の誘導を示す。
【００９９】
本明細書中で使用される「感染多重度」は、ウイルスが、細胞と接触させるために使用されるとき、細胞の数に対するウイルスの数の比率を示す。
【０１００】
本明細書中で使用される「細胞溶解」は、細胞の細胞膜の破壊、および、細胞の内容物のすべてもしくは一部のその後の放出またはアポトーシスによる細胞死の誘導を示す。
【０１０１】
本明細書中で使用される「完全な溶解」は、多数の細胞からなる培養物におけるすべての細胞の溶解を示す。
【０１０２】
本明細書中で使用される「培養条件」は、細胞培養において使用される条件を示し、これには、温度、培養容器のタイプ、湿度、培養容器において使用されるＣＯ２または任意の他のガスの濃度、培養培地のタイプ、培養された細胞の初期密度、および、細胞にウイルスが感染させられるならば、最初の感染多重度が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０３】
本明細書中で使用されるように、「細胞と会合している」ウイルスは、ウイルスが産生されている細胞の一部に付着しているか、または、ウイルスが産生されている細胞の一部に捕捉されているウイルスを示す。従って、ウイルスは、宿主細胞が溶解される前には細胞と会合している。細胞溶解が始まるとき、ウイルスは依然として、破壊された細胞の一部に付着し、または、破壊された細胞細胞の一部に捕捉され、細胞と会合したままであり得る。しかしながら、ウイルスが培地中に放出されて自由になったとき、ウイルスはもはや細胞と会合していない。
【０１０４】
本明細書中で使用されるように、細胞は、細胞膜が破裂し、細胞内容物の少なくとも一部が細胞から放出されるとき、「破壊」されている。細胞を、例えば、凍結・融解、超音波処理または界面活性剤処理によって破壊することができる。
【０１０５】
本明細書中で使用されるように、ウイルスを「集める」は、産生されたウイルスを、ウイルスが以前から感染している細胞培養物から収集するという行為を示す。ウイルスを集めることは、ウイルスが依然として細胞と会合しているならば、宿主細胞を破壊することが伴う。あるいは、しかし、あまり好ましくはないが、培養培地に放出されているウイルス粒子を培地から集めることができる。
【０１０６】
本明細書中で使用される「細胞傷害作用」は、細胞が外見において膨張し、粒状なり、かつ、細胞膜が破壊されることによって示される。細胞傷害作用を示す細胞は、染色色素を取り込むので生細胞計数において陰性に染色され、または、細胞ＤＮＡの分解を示す。
【０１０７】
本明細書中で使用される「接着性細胞」は、細胞培養において培養容器に接着する細胞を示す。接着性細胞の例には、培養容器の表面において細胞の単一層を形成する細胞である単層細胞が含まれる。「懸濁細胞」または「懸濁された細胞」は、細胞培養において培養容器に接着していない細胞を示す。懸濁細胞は「スピン培養」（これは、培養培地が培養プロセス期間中に継続的に撹拌される培養である）で成長させることができる。
【０１０８】
本明細書中で使用される「細胞の生存性」または「生存し続ける細胞の百分率」は、集団において細胞傷害作用を示さない細胞の百分率である。
【０１０９】
本明細書中で使用される「取り入れ時間」は、ピコルナウイルスが回収および精製される時点を示す。ウイルスは、好ましくは、力価が十分に高くなり、かつ、ウイルスが依存として細胞と会合しているときに集められる。ウイルスは、完全な細胞溶解が生じた後でさえ集めることができるが、精製プロセスを簡略化するために、ウイルスが細胞から放出される前にウイルスを集めることが望ましい。従って、細胞の生存性が、ウイルスが依存として細胞と会合しているどうかの目安として日常的に測定される。ウイルスは、一般には、細胞の少なくとも５％が生存しているときに集められる。好ましくは、ウイルスは、細胞の２０％〜９５％が生存しているときに集められ、より好ましくは、３５％〜９０％の細胞が依然として生存しているときに集められ、最も好ましくは、５０％〜８０％の細胞が依然として生存しているときに集められる。
【０１１０】
本発明がより明快に理解され得るために、好ましい形態が、下記の実施例および図面（これらは、本発明の範囲を限定するとして解釈すべきではない）を参照して記載される。
【実施例】
【０１１１】
材料および方法
細胞およびウイルス
コクサッキーウイルスＡ２１（ＣＶＡ２１）プロトタイプ株Ｋｕｙｋｅｎｄａｌｌおよび３つの臨床単離体（＃２７２１０１、＃２７２５９８および＃２７５２３８）をＭａｒｇｅｒｙ  Ｋｅｎｎｅｔｔ博士（Ｅｎｔｅｒｏ−ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、オーストラリア）から得た。単離体＃２７２１０１はＨＩＶ感染の２６歳の男性から得られ、単離体＃２７５２３８は、乳児突然死症候群のために死亡した３ヶ月の乳児から得られ、単離体＃２７２５９８は、クループの激しい症状発現に苦しんでいる８歳の男児から得られた。これらの臨床ＣＶＡ２１単離体は、ＨｅＬａ細胞および／またはヒトの肺繊維芽細胞もしくはＨｅＬａ−Ｔ細胞において約３回、そして、ＩＣＡＭ−１を発現する横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞（ＲＤ−ＩＣＡＭ−１）において１回、継代培養された（Ｓｈａｆｒｅｎ，Ｄ．Ｒ．、Ｄ．Ｊ．Ｄｏｒａｈｙ、Ｒ．Ａ．Ｉｎｇｈａｍ、Ｇ．Ｆ．ＢｕｒｎｓおよびＲ．Ｄ．Ｂａｒｒｙ、１９９７、コクサッキーウイルスＡ２１は崩壊促進因子に結合するが、細胞間接着分子１を細胞進入のために要求する、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１：４７３６〜４７４３）。ＣＡＶ２１のプロトタイプ株は、ＨｅＬａ細胞および／またはヒトの肺繊維芽細胞もしくはＨｅＬａ−Ｔ細胞において約１０回、そして、ＲＤ−ＩＣＡＭ−１細胞において３回〜４回、継代培養された。
【０１１２】
ＣＶＡ２１プロトタイプ株（Ｋｕｙｋｅｎｄａｌｌ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ４６５５１５）はＭａｒｇｅｒｙ  Ｋｅｎｎｅｔｔ博士から得られ、ＳｋＭｅｌ２８細胞において二重プラーク精製された（これは本明細書中ではＣＶＡ２１親株と呼ばれる）。ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖが、本明細書中に記載されるように、ＲＤ細胞における連続継代培養によって、ＩＣＡＭ−１陰性細胞において成長させるために生物選抜された。インビボ研究のためのウイルスをＳｋＭｅｌ２８細胞の単層物（ＣＶＡ２１親株）またはＲＤ細胞の単層物（ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖ）において調製し、以前に記載されたように５％〜３０％のスクロースグラジエントでの速度遠心分離によって精製し、ピーク画分をプールし、ＰＢＳに対して透析し、−８０℃で保存した。ウイルスストック物（ＣＶＡ２１親株およびＣＶＡ２１−ＤＡＦｖ）の力価を、ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈのエンドポイント法を使用してＳｋＭｅｌ２８細胞に対して求めた。
【０１１３】
ＨｅＬａ細胞をＡｍｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ、米国）から得た。一方、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をＢｒｕｃｅ  Ｌｏｖｅｌａｎｄ博士（Ａｕｓｔｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、オーストラリア）から得た。
【０１１４】
ヒトメラノーマ細胞株のＳｋＭｅｌ２８を、Ｓ．Ｊ．Ｒａｌｐｈ博士（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｍｏｎａｓｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、オーストラリア）から得た。横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞をＭａｒｇｅｒｙ  Ｋｅｎｎｅｔｔ博士（Ｅｎｔｅｒｏ−ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、オーストラリア）から得た。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をＢｒｕｃｅ  Ｌｏｖｅｌａｎｄ博士（Ａｕｓｔｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、オーストラリア）から得た。卵巣ガン細胞株のＤＯＶ１３をＩａｎ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ博士（Ｐｅｔｅｒ  ＭａｃＣａｌｌｕｍ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、オーストラリア）から得た。ＩＣＡＭ−１またはＤＡＦを安定的に発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＤＡＦ細胞およびＣＨＯ−ＩＣＡＭ−１細胞）。ＣＶＡ２１プロトタイプ株（Ｋｕｙｋｅｎｄａｌｌ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ４６５５１５）をＭａｒｇｅｒｙ  Ｋｅｎｎｅｔｔ博士から得て、ＳｋＭｅｌ２８細胞において増殖させた。
【０１１５】
ヒト乳ガン細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ１５７、ＭＤＡ−ＭＢ４５３、ＺＲ−７５−１）、上皮卵巣ガン細胞株（ＯＶＨＳ−１、ＯＡＷ−４２、ＤＯＶ１３）および不死化された正常なヒト卵巣表面上皮細胞株（ＨＯＳＥ）をＰｅｔｅｒ  ＭａｃＣａｌｌｕｍ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、オーストラリア）から得た。ヒト前立腺細胞株（ＰＣ３およびＤＵ１４５）をＧａｒｖａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｓｙｄｎｅｙ、オーストラリア）から得て、ＬＮＣａＰ細胞をＥｌｉｚａｂｅｔｈ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ（Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｓｕｒｇｅｒｙ（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、オーストラリア）から得た。ヒト結腸直腸ガン細胞株（ＨＣＴ１１６、ＳＷ６２０）をＰｅｔｅｒ  ＭａｃＣａｌｌｕｍ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅから得て、ＨＴ−２９をＪｏｈｎ  Ｈｕｎｔｅｒ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ、オーストラリア）から得た。
【０１１６】
抗体
ＩＣＡＭ−１の最初のドメインに対して特異的な抗ＩＣＡＭ−１  ＭＡｂのＷＥＨＩ（Ｂｅｒｅｎｄｔ，Ａ．Ｒ．、Ａ．ＭｃＤｏｗｅｌｌ、Ａ．Ｇ．Ｃｒａｉｇ、Ｐ．Ａ．Ｂａｔｅｓ、Ｍ．Ｊ．Ｅ．Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ、Ｋ．Ｍａｒｓｃｈ、Ｃ．Ｉ．ＮｅｗｂｏｌｄおよびＮ．Ｈｏｇｇ、１９９２、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）感染赤血球についてのＩＣＡＭ−１上の結合部位は重なるが、ＬＦＡ−１結合部位とは異なる、Ｃｅｌｌ、６８：７１〜８１）はＡｎｄｒｅｗ  Ｂｏｙｄ博士（Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ、オーストラリア）によって提供された。抗ＤＡＦ  ＭＡｂのＩＡ１０（ＩｇＧ２ａ）はＤＡＦの最初の短いコンセンサス反復（ＳＣＲ）を認識し、ＶＩＩＩＡ７（ＩｇＧ１）は、３番目のＳＣＲと、２番目のＳＣＲの一部とを認識し（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ｔ．、Ｍ．Ｅ．Ｍｅｄｏｆ、Ｒ．ＳｉｌｂｅｒおよびＶ．Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ、１９８５、正常者および発作性夜間ヘモグロビン尿症患者の末梢血における崩壊促進因子の分布、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１６２：７５〜９２）、ＩＨ４（ＩｇＧ１）はＤＡＦの３番目のＳＣＲを認識し（Ｃｏｙｎｅ，Ｋ．Ｅ．、Ｅ．Ｓ．Ｈａｌｌ、Ｍ．Ａ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｍ．Ａ．Ａｒｃｅ、Ｔ．Ｋｉｎｏｓｈｏｉｔａ、Ｔ．Ｆｕｊｉｔａ、Ｄ．Ｊ．Ａｎｓｔｅｅ、Ｗ．ＲｏｓｓｅおよびＤ．Ｍ．Ｌｕｂｌｉｎ、１９９２、ヒトの崩壊促進因子におけるエピトープ、グリコシル化部位および補体調節ドメインのマッピング、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４９：２９０６〜２９１３）、一方、ＩＩＨ６（ＩｇＧ１）は４番目のＳＣＲを認識する（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ｔ．、Ｍ．Ｅ．Ｍｅｄｏｆ、Ｒ．ＳｉｌｂｅｒおよびＶ．Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ、１９８５、正常者および発作性夜間ヘモグロビン尿症患者の末梢血における崩壊促進因子の分布、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１６２：７５〜９２）。ＭＡｂのＩＡ１０、ＶＩＩＩＡ７およびＩＩＨ６は木下タロウ博士（免疫不全疾患研究分野、大阪大学、大阪、日本）からの譲渡であり、ＭＡｂ  ＩＨ４はＢｒｕｃｅ  Ｌｏｖｅｌａｎｄ博士（Ａｕｓｔｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、オーストラリア）からの譲渡であった。
【０１１７】
抗ＤＡＦｍＡｂのＩＨ４（これはＤＡＦのＳＣＲ３に対して特異的であり（Ｃｏｙｎｅ，Ｋ．Ｅ．、Ｅ．Ｓ．Ｈａｌｌ、Ｓ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｍ．Ａ．Ａｒｃｅ、Ｔ．Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ、Ｔ．Ｆｕｊｉｔａ、Ｄ．Ｊ．Ａｎｓｔｅｅ、Ｗ．ＲｏｓｓｅおよびＤ．Ｍ．Ｌｕｂｌｉｎ、１９９２、ヒトの崩壊促進因子におけるエピトープ、グリコシル化部位および補体調節ドメインのマッピング、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４９：２９０６〜２９１３）、かつ、ヒト組換え可溶性ＤＡＦ（ｓＤＡＦ）に対して特異的である）はＢｒｕｃｅ  Ｌｏｖｅｌａｎｄ博士からの譲渡であった。ＳＣＲ１に向けられた抗ＤＡＦｍＡｂのＩＡ１０は木下タロウ博士（免疫不全疾患研究分野、大阪大学、大阪、日本）からの譲渡であった。抗ＩＣＡＭ−１  ＷＥＨＩｍＡｂはＩＣＡＭ−１のＮ末端ドメインに向けられており（Ｈｏｏｖｅｒ−Ｌｉｔｔｙ，Ｈ．およびＪ．Ｍ．Ｇｒｅｖｅ、１９９３、ライノウイルス−可溶性ＩＣＡＭ−１複合体の形成およびビリオンにおける立体配座変化、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６７：３９０〜３９７）、Ａｎｄｒｅｗ  Ｂｏｙｄ博士（Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ、オーストラリア）によって提供された。
【０１１８】
ウイルスの精製および放射能標識による結合アッセイ
６ウエル組織培養プレートにおけるＲＤ−ＩＣＡＭ−１細胞のコンフルエント単層物に、３７℃で１時間、５００μｌの適切な株のＣＶＡ２１（１ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を接種した。非結合ウイルスを、メチオニン／システイン非含有ＤＭＥＭ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ａｕｒｏｒａ、Ｏｈｉｏ、米国）により３回洗浄することによって除き、そして、メチオニン／システイン非含有ＤＭＥＭを加えた後、細胞単層物をさらに２時間インキュベーションし、その後、３００μＣｉの［３５Ｓ］−メチオニン／システインＴｒａｎｓ−Ｌａｂｅｌ（ＩＣＮ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｒｖｉｎｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）を加えた。その後、感染させた単層物を５％ＣＯ２の環境において３７℃で１２時間インキュベーションした。３回の凍結／融解サイクルの後、ウイルス溶解物を５％〜５０％のスクロースグラジエントで精製した（Ｓｈａｆｒｅｎ，Ｄ．Ｒ．、Ｒ．Ｃ．Ｂａｔｅｓ、Ｍ．Ｖ．Ａｇｒｅｚ、Ｒ．Ｌ．Ｈｅｒｄ、Ｇ．Ｆ．ＢｕｒｎｓおよびＲ．Ｄ．Ｂａｒｒｙ、１９９５、コクサッキーウイルスＢ１、Ｂ３およびＢ５は崩壊促進因子を細胞付着のための受容体として使用する、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６９：３８７３〜３８７７）。分画物を各チューブの底から回収し、１４５０Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  ＴＲＩＬＵＸ（Ｗａｌｌａｃ、Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）での液体シンチレーション計数によってモニターして、放射能標識ウイルス結合アッセイにおいて使用される１６０Ｓピーク画分を突き止めた。
【０１１９】
ＨｅＬａ細胞を使用する放射能標識ウイルス結合アッセイを２４ウエル組織培養プレートで行った（Ｓｈａｆｒｅｎ他、１９９５）。トランスフェクションされたＣＨＯ細胞のウイルス結合アッセイを、細胞懸濁物を使用して行った。１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する８００μｌのＤＭＥＭにおける約１ｘ１０６個の細胞を、３００μｌ（約１ｘ１０５ＣＰＭ）の［３５Ｓ］−メチオニン標識ウイルスの存在下、室温で２時間インキュベーションした。その後、細胞を、２００μｌの０．２Ｍ  ＮａＯＨ−１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）に溶解された血清非含有ＤＭＥＭにより４回洗浄し、その後、結合した［３５Ｓ］−メチオニン標識ウイルスの量を液体シンチレーション計数によって求めた。必要とされるときには、細胞を２０μｇ／ｍｌの抗ＤＡＦ  ＭＡｂまたは抗ＩＣＡＭ−１  ＭＡｂまたはホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｙｄｎｅｙ，Ｎｅｗ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗａｌｅｓ、オーストラリア）（１．０Ｕ／５ｘ１０６細胞）（Ｄａｖｉｔｚ，Ｍ．Ａ．、Ｍ．Ｇ．ＬｏｗおよびＶ．Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ、１９８６、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）による細胞膜からの崩壊促進因子（ＤＡＦ）の放出：補体調節タンパク質の選択的修飾、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１６３：１１５０〜１１６１）と３７℃で１時間プレインキュベーションし、その後、放射能標識されたウイルスを加えた。
【０１２０】
ウイルス感染性アッセイ
９６ウエル組織培養プレートにおけるＲＤ細胞単層物およびＲＤ−ＩＣＡＭ−１細胞単層物に、１％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＤＭＥＭにおけるＣＶＡ２１の１０倍連続希釈物（１００μｌ／ウエル、四連で）を接種し、これを５％ＣＯ２の環境において３７℃で４８時間インキュベーションした。細胞の生存を、接種された単層物を１００μｌ／ウエルのクリスタルバイオレット／メタノール溶液（ＰＢＳにおける０．１％クリスタルバイオレット、２０％メタノール、４．０％ホルムアルデヒド）により２４時間染色することによって定量した。蒸留水で洗浄した後、染色された細胞単層物の相対的な吸光度をマルチスキャン酵素結合免疫吸着アッセイプレートリーダー（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭｃＬｅａｎ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、米国）で５４０ｎｍにおいて読み取った。５０パーセントエンドポイント力価を、吸光度の値がコントロールのウイルス非含有ウエルの３倍の標準偏差（ＳＤ）よりも小さいならば、ウエルを陽性としてスコア化することによってＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈの方法を使用して計算した（Ｒｅｅｄ，Ｌ．Ｊ．およびＨ．Ａ．Ｍｕｅｎｃｈ、１９３８、５０パーセントエンドポイントを推定する簡便な方法、Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．、２７：４９３〜４９７）。
【０１２１】
抗受容体ＭＡｂによる細胞単層物の前処理が必要とされた場合、細胞をＭＡｂ（１μｇ／ｍｌ）の存在下において３７℃で１時間インキュベーションした。その後、細胞単層物に適切なウイルスの四連のサンプルを接種し、これを５％ＣＯ２の環境において３７℃で４８時間インキュベーションし、その後、上記で記載されたように染色した。
【０１２２】
細胞トランスフェクション
ＣＨＯ細胞およびＲＤ細胞を、以前に記載されたように、ＩＣＡＭ−１および／またはＤＡＦを発現させるためにトランスフェクションした（Ｓｈａｆｒｅｎ，Ｄ．Ｒ．、Ｄ．Ｊ．Ｄｏｒａｈｙ、Ｓ．Ｊ．Ｇｒｅｉｖｅ、Ｇ．Ｆ．ＢｕｒｎｓおよびＲ．Ｄ．Ｂａｒｒｙ、１９９７、ヒトの細胞間接着分子−１を発現するマウス細胞はコクサッキーウイルスＡ２１による感染に対して感受性である、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１：７８５〜７８９）。簡単に記載すると、５００μｌアリコートの細胞（５ｘ１０６細胞／ｍｌ〜１ｘ１０７細胞／ｍｌ）をエレクトロポレーション緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、０．７ｍＭのＮａ２ＰＯ４、６ｍＭのグルコース、ｐＨ７．０５）に再懸濁し、エレクトロポレーションキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）において、ＤＡＦまたはＩＣＡＭ−１をコードする７５μｇのｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．およびＳ．Ｎａｇａｔａ、１９９０、ｐＥＦ−ＢＯＳ：強力な哺乳動物発現ベクター、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．、１８：５３２２）および５μｇのｐｃＤＮＡ．ｎｅｏと混合した。細胞に、Ｂｉｏ−Ｒａｄジーンパルサーを用いて３００Ｖおよび２５０μＦでパルスを与え、その後、細胞を組織培養フラスコに播種し、コンフルエントな単層物が形成されるまで３７℃で４８時間インキュベーションした。受容体を発現するトランスフェクションされた細胞を、Ｇ−４１８（４００μｇ／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭで選択し、そして、適切な抗受容体ＭＡｂを使用して蛍光活性化細胞分取によってさらに濃縮した。
【０１２３】
フローサイトメトリー
トランスフェクションされた細胞におけるＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１の表面発現をフローサイトメトリーによって分析した。簡単に記載すると、分散された細胞（１ｘ１０６個）を適切なＭＡｂ（ＰＢＳにおいて５μｇ／ｍｌ）と氷上で２０分間インキュベーションした。その後、細胞をＰＢＳにより洗浄し、１０００ｘｇで５分間ペレット化し、そして、ＰＢＳで希釈されたヤギ抗マウス免疫グロブリンのＲ−フィコエリトリンコンジュゲート化Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ、デンマーク）の１００μｌに再懸濁し、氷上で２０分間インキュベーションした。細胞を上記のように洗浄およびペレット化し、ＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳｔａｒ分析装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ、Ｓｙｄｎｅｙ、オーストラリア）を用いてＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１の発現について分析した。
【０１２４】
分散された細胞（１ｘ１０６個）を抗ＤＡＦ  ＩＨ４ｍＡｂまたは抗ＩＣＡＭ−１ｍＡｂ（５μｇ／ｍｌ、リン酸塩緩衝化生理的食塩水［ＰＢＳ］で希釈される）と氷上で２０分間インキュベーションした。その後、細胞をＰＢＳにより洗浄し、１０００ｘｇで５分間ペレット化し、そして、ＰＢＳで１：１００希釈されたヤギ抗マウス免疫グロブリンのＲ−フィコエリトリンコンジュゲート化Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ、デンマーク）の１００μｌに再懸濁し、氷上で２０分間インキュベーションした。細胞を上記のように洗浄およびペレット化し、ＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳｔａｒ分析装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ、Ｓｙｄｎｅｙ、オーストラリア）を使用してＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１の発現について分析した。
【０１２５】
ウイルスＲＮＡの配列分析
ＣＶＡ２１単離体をＲＤ−ＩＣＡＭ−１細胞のコンフルエントな単層物において増殖させた。ウイルス細胞溶媒物を低速遠心分離によって事前に清澄化し、上清中のビリオンを４℃で４００００ｒｐｍにおける３時間にわたるＳＷ４１Ｔｉローターでの超遠心分離によってペレット化した。ウイルスのペレットをＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に再懸濁し、ＲＮＡを、ＴＲＩＺＯＬ  Ｌｓ試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して各株から単離し、ゲノムのＰ１領域を、以前に記載された遠距離法を使用することによって増幅した（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ，Ａ．Ｍ．、Ｃ．ＰｏｌａｃｅｋおよびＳ．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ、１９９７、遠距離ＰＣＲによる完全なエンテロウイルスゲノムの増幅およびクローニング、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．、６５：１９１〜１９９）。ＣＶＡ２１のＰ１領域のヌクレオチド配列を、精製されたＰＣＲアンプリコンから、プライマーウォーキング法を使用し、かつ、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ＢｉｇＤｙｅ（商標）ターミネーターサイクル配列決定用調製済み反応キット（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、スウェーデン）（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ他、１９９７）を製造者の説明書に従って用いて決定した。ヌクレオチド配列アラインメントを、ＣｌｕｓｔａｌＸプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．、Ｄ．Ｇ．ＨｉｇｇｉｎｓおよびＴ．Ｊ．Ｇｏｂｓｏｎ、１９９４、Ｃｌｕｓｔａｌ＿Ｗ−配列重みづけ、位置特異的ギャップペナルティーおよび重み行列選択を用いて連続多配列アラインメントの感度を改善する、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２２：４６７３〜４６８０）を使用して得た。
【０１２６】
ヌクレオチドの受入番号
本研究において記載されるＣＶＡ２１臨床単離体（＃２７２１０１、＃２７５２３８および＃２７２５９８）のＰ１領域（カプシドコード領域）のヌクレオチド配列をＧｅｎＢａｎｋに付託し、これらには、ＡＹ３１９９４２、ＡＹ３１９９４３およびＡＹ３１９９４５４の受入番号がそれぞれ付与された。
【０１２７】
ウイルスの分子的特長づけおよび構造のモデル化
ウイルスＲＮＡを、ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキットを使用してＣＶＡ２１親株およびＣＶＡ２１−ＤＡＦｖ株から抽出し、カプシドコード領域を、ＣＶＡ２１特異的プライマーを使用してワンステップＲＴ−ＰＣＲ（Ｑｉａｇｅｎ  ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキット）を製造者の説明書に従って用いて増幅した。ヌクレオチド配列を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ＢｉｇＤｙｅ（商標）ターミネーターサイクル配列決定用調製済み反応キット（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、スウェーデン）を製造者の説明書に従って使用するサイクル配列決定反応において、精製されたＰＣＲ生成物（ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット、ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）を使用して決定した。
【０１２８】
ＣＶＡ２１の主要な構造タンパク質（ＶＰ１〜ＶＰ３）のモデルを、ポリオウイルスの受容体構造を予測するために使用されたのと同様な様式でＤＥＣアルファステーションにおいてプログラムＭｏｄｅｌｌｅｒを用いて組み立てた。ＣＶＡ２１親株の配列を、分子構造が以前に決定され、５０％を超える配列同一性を含有する相同的なエンテロウイルスカプシドタンパク質に対してアラインメントした。これらには、ポリオウイルス１、ＥＶ１、ＥＶ１１、ＣＶＢ３、ＣＶＡ９およびブタ水疱病ウイルスが含まれ（それぞれ、１ＡＲ７、１ＥＶ１、１Ｈ８Ｔ、１ＣＯＶ、１Ｄ４Ｍおよび１ＯＯＰのＰＤＢコード）、アライメントがＦＡＳＴＡによって得られた。ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖカプシドに対するＩＣＡＭ−１およびＤＡＦの位置が、ヒトのライノウイルス３およびＥＶ１２とのそれらのリガンド接触に従ってそれぞれアラインメントされた。
【０１２９】
ウイルス感染性アッセイ
９６ウエルプレートにおけるコンフルエントな細胞単層物に１００μｌの１０倍連続希釈物のウイルスを接種し、これを３７℃で７２時間インキュベーションした。細胞の生存を定量するために、プレートを、クリスタルバイオレット／メタノール溶液による固定の前に顕微鏡により検査した。５０パーセントエンドポイント力価を、ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈの方法を使用して計算した（Ｒｅｅｄ，Ｌ．Ｊ．およびＨ．Ａ．Ｍｕｅｎｃｈ、１９３８、５０パーセントエンドポイントを推定する簡便な方法、Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．、２７：４９３〜４９７）。ウイルス媒介による細胞溶解のｍＡｂの影響を評価するために、細胞単層物を５０μｌの抗ＤＡＦ  ＳＣＲ３  ＩＨ４（５μｇ／ｍｌ）ｍＡｂと３７℃で１時間インキュベーションし、その後、上記のように、ウイルスを加え、細胞溶解を定量した。抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１ｍＡｂ遮断による細胞溶解アッセイのために、６ウエルプレートにおけるＲＤ細胞の単層物を抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１ｍＡｂ（１５μｇ／ｍｌ）により前処理し、その後、ウイルス（１０６ＴＣＩＤ５０）により攻撃した。３７℃で１時間インキュベーションした後、非結合ウイルスを除き、単層物にダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を重層した。抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１ｍＡｂの阻害を、ＳｋＭｅｌ２８細胞に対する力価測定によってウイルス収量を調べて評価した。
【０１３０】
放射能標識ウイルス結合アッセイ
親株およびＣＶＡ２１−ＤＡＦｖ株を３５Ｓ−メチオニンによりＳｋＭｅｌ２８細胞およびＲＤ細胞においてそれぞれ放射能標識し、５％〜３０％のスクロースグラジエントで精製した。分散された細胞（１ｘ１０６個）をｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ、１％ウシ血清アルブミン［ＢＳＡ］を含有するＤＭＥＭで希釈される）と室温で１時間プレインキュベーションし、その後、２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＤＭＥＭにおいて室温で１時間、３５Ｓ標識されているスクロース精製ウイルス（５ｘ１０５ｃｐｍ）とインキュベーションした。ＤＭＥＭ−２％ＦＣＳによる３回の洗浄の後、結合した３５Ｓ−メチオニン標識ウイルスの量を１４５０Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  ＴＲＩＬＵＸ（Ｗａｌｌａｃ、Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）での液体シンチレーション計数によって測定した。
【０１３１】
ＤＡＦ結合ビリオンおよびＩＣＡＭ−１結合ビリオンの沈降
精製された放射能標識されている１６０ＳのＣＶＡ２１−ＤＡＦｖビリオン（２．５ｘ１０６ｃｐｍ）をＤＭＥＭ−１％ＢＳＡにおいてＣＨＯ−ＤＡＦ細胞またはＣＨＯ−ＩＣＡＭ−１細胞（２ｘ１０７個）と４℃で２時間インキュベーションした。非結合ウイルスをＤＭＥＭ−２％ＦＣＳによる４回の洗浄によって除き、細胞に結合しているビリオンを３７℃で２時間溶出させた。細胞を遠心分離によって除き、溶出されたビリオンを５％〜３０％のスクロースグラジエントに重層し、ＳＷ４１Ｔｉローターにおいて３６．０００ｒｐｍで４℃で９５分間遠心分離した。分画物（約７００μｌ）をグラジエントの底から回収し、放射能を液体シンチレーション計数によって求めた。
【０１３２】
抗ＤＡＦｍＡｂによる細胞結合ウイルスの溶出
ＣＨＯ−ＤＡＦ細胞（３ｘ１０６個）を放射能標識ウイルス（４ｘ１０５ｃｐｍ）と４℃で２時間インキュベーションした。非結合ウイルスを氷冷のＤＭＥＭ−２％ＦＣＳによる４回の洗浄によって除き、細胞を１００μｌのＤＭＥＭ−２％ＦＣＳに再懸濁し、様々な濃度（０〜５０μｇ／ｍｌ）の抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１ｍＡｂとインキュベーションした。氷上での１時間のｍＡｂ競合の後、細胞をペレット化した。上清を集め、溶出されたウイルスのレベルについてモニターした。結果が、細胞から溶出された放射能標識ウイルスの百分率として表される。
【０１３３】
可溶性ＤＡＦによるウイルスの中和
ヒト組換えｓＤＡＦ（８５μｇ／ｍｌ、ＰＢＳで希釈される）を１０００の５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）のＣＶＡ２１−ＤＡＦｖとインキュベーションした。３７℃で１時間インキュベーションした後、ウイルス−ＤＡＦ混合物を９６ウエルプレートにおけるＲＤ細胞の単層物に加え、４８時間さらにインキュベーションした。
【０１３４】
前立腺腫瘍異種移植片のＣＶＡ２１−ＤＡＦｖ治療
ＳＣＩＤマウスを、Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ大学の動物管理・倫理委員会により承認されたプロトコルに従って病原体非含有条件で飼育した。ＰＣ３細胞をインビトロで成長させ、集め、ＰＢＳにより２回洗浄し、無菌ＰＢＳに再懸濁した。異種移植のために使用された細胞の９５％超が、トリパンブルー染色によって評価されたとき、生存していた。異種移植に先だって、動物を３％イソフルオランにより麻酔した。腫瘍細胞を、麻酔した７週齢ＳＣＩＤマウスの脇腹に２ｘ１０６個のＰＣ３細胞の脇腹での皮下注入によって異種移植した。異種移植片の成長を毎日モニターし、カリパスを用いて測定した。腫瘍体積の推定値を、球状体についての式を使用して計算した。触診可能な腫瘍が確立されると（５０ｍｍ３〜１００ｍｍ３）、ＰＣ３腫瘍に、ＣＶＡ２１親株、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖ（３ｘ１０７ＴＣＩＤ５０）またはＰＢＳを静脈内注射によって投与し、４２日の期間にわたってモニターした。血清中のウイルス力価をウイルス感染性アッセイによってモニターした。
【０１３５】
結果
１．エンテロウイルスカプシドの相互作用
ＣＶＡ２１の臨床株はＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１に結合する
ＣＶＡ２１の臨床単離体が、プロトタイプのＫｕｙｋｅｎｄａｌｌ株の様式と類似するか、または異なるかのいずれかである様式でＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１に結合するかどうかを明らかにするために、ＤＡＦまたはＩＣＡＭ−１のいずれかを発現させるために安定的にトランスフェクションされたＣＨＯ細胞を放射能標識ウイルス結合アッセイで使用した。ＤＡＦまたはＩＣＡＭ−１の非存在下でのＣＨＯ細胞に対する著しい結合はＣＶＡ２１単離体のいずれについても観測されなかった（図１）。ＣＶＡ２１株のすべてが、ＤＡＦを発現するＣＨＯ細胞に結合した（図１Ａ）。これは、プロトタイプのＣＶＡ２１Ｋｕｙｋｅｎｄａｌｌ株について以前に明らかにされた相互作用である。予想されたように、すべての臨床ＣＶＡ２１単離体もまた、ＣＨＯ細胞の表面に発現したＩＣＡＭ−１に結合した（図１Ｂ）。ＣＶＡ２１／ＩＣＡＭ−１相互作用の特異性の確認が、ＩＣＡＭ−１に対するウイルスの結合を完全に無効にする抗ＩＣＡＭ−１ドメイン１特異的ＭＡｂの作用によって立証された（図１Ｂ）。全体的には、これらの結果から、ＣＶＡ２１の臨床単離体がプロトタイプ株の相互作用と同様な様式で２つの別個の細胞受容体（ＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１）に結合することが確認される。
【０１３６】
ＣＶＡ２１の臨床単離体とＤＡＦ／ＩＣＡＭ−１との相互作用をさらに特徴づけるために、ＣＶＡ２１ウイルス結合アッセイを、ＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１を遍在的に同時発現するＨｅＬａ細胞に対して着手した。ＣＶＡ２１の結合を個々の受容体のＭＡｂ遮断または組合せでのＭＡｂ遮断によって評価した（図２）。プロトタイプＫｕｙｋｅｎｄａｌｌ株の細胞付着（図２Ａ）を臨床ＣＶＡ２１単離体＃２７２１０１の細胞付着（図２Ｂ）と比較した。両者とも、ＭＡｂ受容体遮断の非存在下においてＨｅＬａ細胞に対する高レベルの結合を示した（図２）。ＤＡＦ  ＳＣＲ１の特異的なＭＡｂ遮断はウイルスの結合を部分的に阻止した。しかしながら、ＩＣＡＭ−１との相互作用のためにウイルスの付着を完全に無効にすることはできなかった。ＩＣＡＭ−１への接近がＭＡｂ遮断によって阻害されたとき、ウイルスの結合が低下し、臨床単離体＃２７２１０１についてはプロトタイプよりも大きく低下したが、ウイルス結合は、ＤＡＦへの代わりのウイルス付着のために完全には阻害されなかった。ＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１のＮ末端ドメインについてのＣＶＡ２１の臨床株およびプロトタイプ株の特異性が、抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１  ＭＡｂおよび抗ＩＣＡＭ−１ドメイン１  ＭＡｂが、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（これはＧＰＩ結合タンパク質を切断する）と抗ＩＣＡＭ−１  ＭＡｂとの組合せにより細胞を前処理したときと同じ程度にウイルスの付着を阻害できることによって明らかにされた。まとめると、これらの結果から、臨床単離体＃２７２１０１は、プロトタイプ株と同様に、ＤＡＦの最初のＳＣＲおよびＩＣＡＭ−１のＮ末端ドメインに結合することが確認される。
【０１３７】
ＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１へのＣＶＡ２１の結合は付加的でない
ＤＡＦまたはＩＣＡＭ−１のいずれかと単独または組合せで結合するＣＶＡ２１臨床単離体の能力を、宿主細胞の表面における両方の受容体の存在が付加的なビリオン細胞付着に寄与したかどうかを明らかにするために評価した。この疑問に取り組むために、ＣＨＯ細胞を、ＤＡＦまたはＩＣＡＭ−１のいずれかを単独または組合せで発現させるためにトランスフェクションした。フローサイトメトリー分析により、いずれかの受容体を単独または組合せで発現する細胞におけるＤＡＦ発現またはＩＣＡＭ−１発現のレベルが同程度であることが明らかにされた（図３Ａ）。ＣＨＯ細胞に対するバックグラウンド結合の最少レベルがすべてのＣＶＡ２１株について観測された。個々に発現させたＤＡＦまたはＩＣＡＭ−１に対する結合の著しいレベルがすべてのＣＶＡ２１株によって示された（図３Ｂ）。驚くべきことに、ＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１の両方を同時発現するＣＨＯ細胞に結合した放射能標識ウイルスの量は、これらの受容体のいずれかが単独で発現したときに結合した量と比較して著しく低下していた（図３Ｂ）。
【０１３８】
ＣＶＡ２１の臨床単離体はＤＡＦとの相互作用を介してＩＣＡＭ−１陰性細胞の溶解性感染を誘導することができる
ＩＣＡＭ−１は、ＣＶＡ２１プロトタイプ株の宿主細胞進入を成功させるための主要な決定因子である。しかしながら、ＩＣＡＭ−１発現を有しない細胞のＣＶＡ２１媒介による溶解性感染がＭＡｂ架橋ＤＡＦの存在下で可能である。本発明者らは、臨床ＣＶＡ２１単離体が、架橋されたＤＡＦとの異なった相互作用を介してＩＣＡＭ−１陰性細胞に溶解的に感染し得るかどうかを調べた。ＲＤ細胞の単層物を処理せず、あるいは、ＳＣＲ１、ＳＣＲ２、ＳＣＲ３もしくはＳＣＲ４のそれぞれに対する特異的なＭＡｂにより、または、ＤＡＦの抗ＳＣＲ１および抗ＳＣＲ３の組合せにより前処理し、その後、１の投入多重度のＣＶＡ２１により攻撃した。ＣＶＡ２１媒介による溶解性感染が、ＤＡＦのＳＣＲ２、ＳＣＲ３およびＳＣＲ４に対するＭＡｂにより前処理されたＲＤ細胞の培養物において観測された（図４）。実際、特異的なＣＶＡ２１カプシド／ＤＡＦ相互作用により、溶解性の細胞感染が媒介されたことの確認が、抗ＳＣＲ１  ＤＡＦ  ＭＡｂを、抗ＳＣＲ３  ＤＡＦ  ＭＡｂにより前処理された細胞に加えることにより、細胞溶解が完全に阻止されたという発見によって裏付けられた。
【０１３９】
興味深いことに、臨床ＣＶＡ２１単離体の２つ（＃２７５２３８および＃２７２５９８）は抗ＤＡＦ  ＭＡｂによる架橋の非存在下でＩＣＡＭ−１陰性ＲＤ細胞に溶解的に感染することができた（図４）。一般に、ＤＡＦに対するエンテロウイルスの結合は、さらなる内在化受容体との相互作用のためのビリオンの隔離と見なされており、その結果、今日まで、もっぱらＤＡＦとの相互作用を介して媒介される細胞溶解性感染を明らかにする結論的な報告は１つもなされていない。ＣＶＡ２１臨床単離体の＃２７５２３８および＃２７２５９８がＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１の両方の抗体架橋の非存在下で細胞に溶解的に感染することができることは、そのような受容体使用法を最初に明らかにするものである。抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１  ＭＡｂによる遮断の後におけるこれらの株による細胞溶解の完全な阻害（図４）および子孫ウイルス産生の著しい減少は、この発見が整合していることをさらに裏付けている。
【０１４０】
この新規なＤＡＦ使用法の分析を続けるために、ＣＶＡ２１の臨床株およびプロトタイプ株を、ＤＡＦを単独で発現する単層細胞培養物（ＲＤ）、または、ＩＣＡＭ−１との組合せで発現する単層細胞培養物（ＲＤ−ＩＣＡＭ−１）に対する溶解性の感染性について力価測定した。ＣＶＡ２１のすべての株が、ＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１の両方を発現する細胞において高レベルの細胞溶解活性を示し、一方、＃２７５２３８および＃２７２５９８の単離体のみが、ＤＡＦのみを発現するＲＤ細胞において溶解性力価を誘導し、その溶解性力価が、ＲＤ−ＩＣＡＭ−１細胞で得られる溶解性力価と同程度であることが観測された。実際、単離体＃２７５２３８では、ＲＤ細胞において、ＲＤ−ＩＣＡＭ−１細胞の場合よりも約２０倍大きい溶解性力価が得られた。興味深いことに、ウイルス投入多重度が高い場合、単離体＃２７２１０１は、ＤＡＦのみを発現するＲＤ細胞の著しいレベルの溶解性感染をさらに示した。プロトタイプ株によるＲＤ細胞における、最少ではあるが、検出可能なレベルの溶解活性は、強化されたＤＡＦ使用表現型を有するビリオンの少数集団のためであると考えられる。
【０１４１】
ＣＶＡ２１臨床単離体のＩＣＡＭ−１結合フットプリントの分析
調べられたＣＶＡ２１のすべての株が強いＩＣＡＭ−１付着／内在化表現型を示したので（図１）、本発明者らは、それらが、保存されたＩＣＡＭ−１結合フットプリントを有するかどうかを調べた。ＣＶＡ２１−ＩＣＡＭ−１受容体結合フットプリントを構成する残基が、精製されたＩＣＡＭ−１およびプロトタイプＫｕｙｋｅｎｄａｌｌビリオンを用いて、極低温電子顕微鏡観察を使用して以前に特定されている。すべてのＣＶＡ２１株のＰ１コード領域のアミノ酸配列分析により、ＶＰ２の１６８におけるＡｌａからＶａｌへの保存的なコード変化を除いて以前に発表されたフットプリントを同一である保存されたＩＣＡＭ−１フットプリントの存在が明らかにされた（図５）。
【０１４２】
プロトタイプに対して、ＩＣＡＭ−１の非存在下でＤＡＦ発現細胞に溶解的に感染するＣＶＡ２１臨床単離体の増大した能力（図４）を説明することを目指して、本発明者らは、ＩＣＡＭ−１結合フットプリントの外側におけるアミノ酸の違いについて検索した（図５）。数多くのアミノ酸変化が３つのＣＶＡ２１臨床単離体とプロトタイプ株との間でＰ１領域において検出された（図５）。アミノ酸変化が、ＶＰ４コード領域ではＣＶＡ２１株のいずれの間にも検出されなかった。ＶＰ３、ＶＰ２およびＶＰ１のカプシドタンパク質において、同じ位置での１３個の同一の変化が、プロトタイプ株に対して、すべての臨床単離体で検出された。加えて、単離体＃２７２１０１は、それ以外の２つの臨床単離体におけるＡｌａと比較してＳｅｒを有するＶＰ３の２３９位において異なる変化を示し、かつ、プロトタイプ株に対して、ＶＰ１全体、ＶＰ２全体、ＶＰ３全体に散らばったさらに９個の異なったアミノ酸変化を有していた（図５）。アミノ酸レベルで、＃２７２５９８および＃２７２２３８の単離体は同一であり、一方、ヌクレオチドレベルでは、これら２つの間における多数のサイレント変異が検出された。
【０１４３】
ＩＩ．コクサッキーウイルスＡ２１変化体の生物選抜および分子的特長づけ
ＩＣＡＭ−１相互作用とは無関係に溶解的に感染するＣＶＡ２１変化体の生物選抜
ＣＶＡ２１プロトタイプ株の細胞付着がＤＡＦおよび／またはＩＣＡＭ−１への結合によって媒介される。ＩＣＡＭ−１の相互作用のみが、細胞内在化、および、ＣＶＡ２１との間での相互作用を促進させ、ＤＡＦは、ＤＡＦが抗ＤＡＦｍＡｂにより架橋されない限り、増殖性の溶解性細胞感染を誘導しない。ＣＶＡ２１はまた、細胞がＩＣＡＭ−１によりトランスフェクションされているとき、ＤＡＦを発現するＲＤ細胞に溶解的に感染することができる。このことは、ＣＶＡ２１がＲＤ細胞において複製できないことが単に細胞進入のレベルでのことにすぎないことを強調している。ヒトメラノーマ細胞株のＳｋＭｅｌ２８は、ＣＶＡ２１のプロトタイプ株が高いウイルス力価に成長することを支援しており、フローサイトメトリー分析により、高レベルのＩＣＡＭ−１およびＤＡＦ（４３．２の幾何平均蛍光［ＧＭＦ］）の表面発現が明らかにされた（図６Ａ）。
【０１４４】
ＳｋＭｅｌ２８細胞において二重プラーク精製されたＣＶＡ２１プロトタイプ株の調製物（本発明ではＣＶＡ２１親株と呼ばれる）を、反復した継代培養（４回の継代培養）によって、ＲＤ細胞の迅速な溶解性感染を生じさせるために順応させた。フローサイトメトリー分析により、ＲＤ細胞が、ＳｋＭｅｌ２８細胞と同程度である高レベルのＤＡＦ（６４．０のＧＭＦ）を発現したが、表面ＩＣＡＭ−１を発現していないことが明らかにされた（図６Ａ）。ＲＤ細胞における親株ＣＶＡ２１の連続した継代培養により、ＩＣＡＭ−１の非存在下での迅速な溶解性感染を誘導することができる能力を有するＣＶＡ２１変化体（ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖと呼ばれる）を親株集団から生物選抜した。ＩＣＡＭ−１およびＤＡＦを二重に発現するＳｋＭｅｌ２８細胞は、１０７のＴＣＩＤ５０／ｍｌの過度の力価の親株およびＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの両方の溶解性感染を支援し、一方、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖのみがＲＤ細胞において同程度の溶解性感染を誘導しただけであった（図６Ｂ）。
【０１４５】
ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの表現型性質
ＩＣＡＭ−１陰性ＲＤ細胞への順応の後、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖは、ＳｋＭｅｌ２８細胞およびＲＤ細胞の両方の単層物において類似する効率でプラークを生じさせた（５ｘ１０７ＰＦＵ／ｍｌ）。プラークが、ＲＤ細胞における親株については、高いウイルス投入多重度（ＳｋＭｅｌ２８細胞に対して１ｘ１０８ＰＦＵ／ｍｌ）にもかかわらず、観測することができなかった。ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖは、異なる細胞基質での表現型におけるわずかな違いを伴ってプラークを誘導した：ＲＤ細胞では、大きく、曇ったプラークが感染後２日以内に観測され、これに対して、輪郭がはっきりした小さいプラークのみがＳｋＭｅｌ２８細胞では認められただけであった（図６Ｃ）。ＳｋＭｅｌ２８細胞におけるＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの１０回の連続した戻し継代培養では、親株表現型への復帰体を選択することができず、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖは依然として、低い感染多重度（１ＴＣＩＤ５０／９６ウエル）でＲＤ細胞に溶解的に感染する能力を保持していた（データは示されず）。従って、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの強化されたＤＡＦ使用法は、安定かつ望ましい表現型であるようである。さらに興味深いことは、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖ（１０２ＴＣＩＤ５０）が、親株（１０２ＴＣＩＤ５０）と比較して、内在化されるために、より高レベルのプールされた免疫グロブリンを必要としたことであった（１：６３対１：１７８）。これは、ＲＤ細胞における生物選抜時におけるＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの血清学的特異性の部分的変化を暗示するものである。
【０１４６】
ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖはＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１のＮ末端ドメインに結合する
ＣＶＡ２１のプロトタイプ株はＩＣＡＭ−１およびＤＡＦの両方のＮ末端ドメインに結合する。ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖがプロトタイプ株と同様な様式でＩＣＡＭ−１および／またはＤＡＦに直接的に結合するかどうかを調べるために、放射能標識結合アッセイを、ＩＣＡＭ−１またはＤＡＦを安定的に発現するＣＨＯ細胞、ＲＤ細胞、および、卵巣ガン細胞株ＤＯＶ１３を使用して行った。フローサイトメトリー研究により、それぞれのトランスフェクションされたＣＨＯ細胞株におけるＤＡＦまたはＩＣＡＭ−１の高レベルの表面発現が示され（ＣＨＯ−ＤＡＦ細胞でのＤＡＦ発現についてのＧＭＦ、２９６．２）、ＤＡＦのみがＲＤ細胞およびＤＯＶ１３細胞の表面で発現していた（ＲＤ細胞およびＤＯＶ１３細胞でのＤＡＦ発現についてのＧＭＦ、それぞれ、６４．０および８４．０）（図６Ａおよび図７Ａ）。ＣＶＡ２１親株はＩＣＡＭ−１およびＤＡＦの両方に結合した（図７Ｂおよび図７Ｃ）。著しいレベルのＣＶＡ２１−ＤＡＦｖがＣＨＯ−ＤＡＦ細胞およびＣＨＯ−ＩＣＡＭ−１細胞の両方に結合し、一方、バックグラウンド結合のみがＣＨＯ細胞について観測された（図７Ｂおよび図７Ｃ）。トランスフェクションされたＣＨＯ細胞における表面発現したＩＣＡＭ−１およびＤＡＦとのウイルスの相互作用の特異性が、ウイルス付着の特異的な抗ＤＡＦｍＡｂ遮断および抗ＩＣＡＭ−１ｍＡｂ遮断を使用して確認された。抗ＩＣＡＭ−１（ＷＥＨＩ）ｍＡｂおよび抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１（ＩＡ１０）ｍＡｂによる遮断は両ウイルスの結合をバックグランドレベルに低下させ、一方、抗ＤＡＦ  ＳＣＲ３（ＩＨ４）ｍＡｂによる遮断は、トランスフェクションされたＣＨＯ細胞に対するいずれかのＣＶＡ２１調製物のウイルス結合に影響しなかった（図７Ｂおよび図７Ｃ）。親株と同様に、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖはＩＣＡＭ−１およびＤＡＦのＮ末端ドメインに結合することができると結論される。
【０１４７】
ＤＡＦの抗体架橋はＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの細胞感染性を高めない
わずかな違いが存在するならば、そのわずかな違いがＣＶＡ２１親株とＣＶＡ２１−ＤＡＦｖ株との間でのＤＡＦ結合／使用法において存在するかどうかを調べるために、放射能標識ウイルス結合アッセイを用いて、表面ＤＡＦの架橋の存在下および非存在下におけるＲＤ細胞およびＤＯＶ１３細胞に対する付着の相対的なレベルを評価した。親株ＣＶＡ２１およびＣＶＡ２１−ＤＡＦｖはともに、高レベルの表面ＤＡＦを発現するＣＨＯ細胞に結合し（図７）、一方、ＣＶＡ２１のプロタイプ株は、ＤＡＦを発現するＩＣＡＭ−１陰性のＲＤ細胞に不良に結合する。これは、この研究で使用されたＣＨＯ−ＤＡＦ細胞における、ＲＤ細胞およびＤＯＶ１３細胞での場合よりも高レベルの表面発現したＤＡＦのためであることが最も考えられる（図６Ａおよび図７Ａ）。生物選抜されたＣＶＡ２１−ＤＡＦｖはＲＤ細胞およびＤＯＶ１３細胞の両方に対する著しいレベルの付着を示し、一方、これらの細胞に対する付着が親株についてはほとんど観測されなかった（図７Ｃ）。ＣＨＯ−ＤＡＦ細胞と同様に、ＲＤ細胞およびＤＯＶ１３細胞に対するＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの特異的な結合が、抗ＳＣＲ１ｍＡｂによる前処理によってバックグラウンドレベルに減少した（図７Ｃ）。
【０１４８】
表面発現したＤＡＦを、ＤＡＦのウイルス非結合性ＳＣＲ３ドメインに対するｍＡｂと架橋することにより、ＲＤ細胞に対するプロトタイプＣＶＡ２１の結合が増大し、また、細胞が溶解性感染に対して感受性になった。次に、本発明者らは、ＣＨＯ−ＤＡＦ細胞およびＤＯＶ１３細胞の表面におけるＤＡＦの架橋が、ＲＤ細胞について観測されるような増大したウイルス結合を生じさせるかどうかを調べた。抗ＳＣＲ３による前処理は親株ＣＶＡ２１のウイルス結合をＲＤ細胞において８倍増強し、ＤＯＶ１３細胞において４倍増強した（図７Ｃ）。ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの場合、抗ＤＡＦ  ＳＣＲ３による前処理は、ＲＤ細胞またはＤＯＶ１３細胞のいずれかに対する結合を強化することにおいてほとんど影響を有していなかった。実際、ＤＯＶ１３細胞に対するＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの結合におけるわずかな減少が観測された（図７Ｃ）。ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖがｍＡｂ架橋ＤＡＦの非存在下でＲＤ細胞およびＤＯＶ１３細胞に対して著しいレベルで結合することができることは、親株と比較して、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの強化されたＤＡＦ結合表現型を示唆している。両方のウイルスについてのＣＨＯ−ＤＡＦ細胞に対するウイルス付着は、抗ＤＡＦ  ＳＣＲ３ｍＡｂによる前処理によって影響されなかった（図７Ｃ）。安定的にトランスフェクションされたＣＨＯ−ＤＡＦ細胞における表面発現したＤＡＦのレベルは、一過性にＤＡＦを発現するＣＨＯ細胞よりも著しく高かった。このことは、抗ＤＡＦ  ＳＣＲ３ｍＡｂによる前処理がなぜ親株ＣＶＡ２１のウイルス付着を増大させることができなかったかの１つの考えられる説明を提供する。
【０１４９】
抗ＤＡＦ  ＳＣＲ３ｍＡｂによる前処理が、ＣＶＡ２１親株またはＣＶＡ２１−ＤＡＦｖのいずれかによる溶解性感染に対するＲＤ細胞およびＤＯＶ１３細胞の感受性に影響を及ぼしたかどうかを明らかにするために、ＲＤ細胞およびＤＯＶ１３細胞のコンフルエントな単層物をウイルス攻撃の前に抗ＤＡＦ  ＳＣＲ３ｍＡｂとプレインキュベーションした。ウイルス感染を３７℃で３日間行わせ、その後、単層物を溶解性感染について評価した。抗ＤＡＦ  ＳＣＲ３ｍＡｂの架橋がない場合、ＲＤ細胞およびＤＯＶ１３細胞はともに、高いウイルス投入多重度（１０６ＴＣＩＤ５０／ウエル）でさえ、ＣＶＡ２１親株による感染に対して抵抗性であった。対照的に、ＲＤ細胞およびＤＯＶ１３細胞は抗ＤＡＦ  ＳＣＲ３ｍＡｂによる前処理によって親株ＣＶＡ２１の溶解性感染に対して感受性になった（図７Ｄ）。ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖはＩＣＡＭ−１陰性のＲＤ細胞およびＤＯＶ１３細胞の両方において溶解性ウイルス力価（１０５．５ＴＣＩＤ５０／ｍｌを超える）を誘導する。驚くべきことに、抗ＤＡＦ  ＳＣＲ３ｍＡｂによる前処理は、ｍＡｂが存在しなかったときに測定される力価と比較して、ＲＤ細胞およびＤＯＶ１３細胞の両方でＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの溶解性力価を約１／１００に低下させた（図７Ｄ）。ＤＡＦ発現細胞に対するＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの結合は、抗ＤＡＦ  ＳＣＲ３ｍＡｂによる前処理によって強化されず（図７Ｃ）、ＤＯＶ１３細胞の場合には、低下した付着を生じさせた。これらの発見は、ＤＡＦ  ＳＣＲ３のｍＡｂ遮断がＤＡＦ  ＳＣＲ１に結合したＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの細胞進入機構を妨害し得ることを示唆している（図７）。
【０１５０】
ＤＡＦではなく、ＩＣＡＭ−１の相互作用がＣＶＡ２１−ＤＡＦｖのカプシドの立体配座変化を誘導する
ＤＡＦに結合し、かつ、ＩＣＡＭ−１陰性細胞に溶解的に感染するＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの増大した能力を背景にして（図６および図７）、本発明者らは、親株ＣＶＡ２１およびＣＶＡ２１−ＤＡＦｖのＤＡＦに対する相対的な結合の厳格さ（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）を比較した。放射能標識されたビリオンをＣＨＯ−ＤＡＦ細胞に４℃で２時間結合させ、非結合ビリオンを除いた後、細胞に結合しているビリオンを、増大する濃度の抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１ｍＡｂを用いて細胞から溶出した。約１０倍高い濃度の抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１ｍＡｂが、ＣＶＡ２１親株ビリオンと比較して、ＣＨＯ−ＤＡＦ細胞の表面からＣＶＡ２１−ＤＡＦｖビリオンを追い出すために必要とされた（図８Ａ）。この発見は、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖが、ＣＶＡ２１親株が結合するよりも接近しにくいカプシドの部位においてＤＡＦに結合するか、または、より大きい親和性でＤＡＦに結合することを示唆している。
【０１５１】
ＤＡＦは、エンテロウイルスの隔離受容体として機能することが主張され、また、一般に、ＤＡＦ−エンテロウイルスの相互作用はカプシドの検出可能な立体配座変化の形成を誘導することができない。ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖのＡ粒子形成が、表面発現したＤＡＦまたはＩＣＡＭ−１との相互作用によって誘導されたかどうかを調べるために、精製された１６０ＳビリオンをＣＨＯ−ＤＡＦ細胞またはＣＨＯ−ＩＣＡＭ−１細胞と４℃で２時間インキュベーションした。非結合ビリオンを除いた後、細胞に結合しているビリオンを３７℃で２時間溶出させ、その後、５％〜３０％のスクロースグラジエントでの速度遠心分離に供した。ＩＣＡＭ−１から溶出されたＣＶＡ２１−ＤＡＦｖビリオンは、Ａ粒子の形成を示す低下した沈降係数を示し、また、ＣＶＡ２１プロトタイプ株について観測された感染性と同様に、感染性をほとんど保持していなかった。ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの強化されたＤＡＦ相互作用にもかかわらず、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖビリオンが、検出可能な立体配座変化を何ら伴うことなくＤＡＦから溶出し（図８Ｂ）、このビリオンは高レベルの感染性を保持していた。
【０１５２】
ＤＡＦの遮断はＲＤ細胞におけるＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの溶解性感染を阻害する
溶解性細胞感染アッセイおよび競合的結合アッセイにより、ＣＶＡ２１親株と比較して、表面発現したＤＡＦと、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖとの間での強化された相互作用が示唆される（図７および図８）。この観測された増大した相互作用のために、本発明者らは、抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１ｍＡｂが、親株とは対照的に、ＲＤ細胞のＣＶＡ２１−ＤＡＦｖ溶解性感染を阻止し得るかどうかを調べた。抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１ｍＡｂは、１０６ＴＣＩＤ５０／ウエルの投入多重度でさえＲＤ細胞のＣＶＡ２１−ＤＡＦｖ誘導による溶解性感染からの完全な保護をもたらした（図９Ａ）。さらに、抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１ｍＡｂによるＲＤ細胞の前処理は子孫ウイルスの産生を著しく阻害した。
【０１５３】
ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖが表面ＤＡＦとの直接的な相互作用を細胞感染性のために必要としたかどうかをさらに立証するために、ＲＤ細胞の感染を阻害するヒト組換えｓＤＡＦの能力（Ｂｒｕｃｅ  Ｌｏｖｅｌａｎｄ博士、未発表連絡）を評価した。ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖとの可溶性ＤＡＦの相互作用は細胞溶解性感染を著しく低下させたが、ＤＡＦ非結合性のＣＶＡ２０による感染を低下させることに対する検出可能な影響を全く有していなかった。ＣＶＡ２０もまたＩＣＡＭ−１に結合する一方で、ＣＶＡ２０は、未だ特定されていない受容体を細胞進入のために必要とする（図９Ｂ）。全体的には、これらの発見は、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの溶解性感染が抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１ｍＡｂおよびｓＤＡＦによって阻害されることを明らかにしており、このことは、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの進入におけるＤＡＦ相互作用の重要性を立証している。
【０１５４】
ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖのＤＡＦ表現型を付与する分子的決定因子
ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの拡大された細胞親和性および増大したＤＡＦ使用表現型をさらに調べるために、ＣＶＡ２１親型およびＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの両方のカプシドコード領域のヌクレオチド配列を決定した。カプシドタンパク質配列を、ＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１との相互作用が十分に特徴づけられているＣＶＡ２１Ｋｕｙｋｅｎｄａｌｌプロトタイプ株のカプシドタンパク質配列と比較した。二重プラーク精製された親株のカプシドコード領域の配列分析により、ＣＶＡ２１プロトタイプの配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ４６５５１５）と比較したとき、ＶＰ２における１つのコード置換（Ｓ１６４Ｌ）が明らかにされた。ＣＶＡ２１親株のＤＡＦ結合特性およびＩＣＡＭ−１結合特性（図７）は、このＶＰ２アミノ酸置換によってプロトタイプ株に関して変化していなかった。ＲＤ細胞における生物選抜の後、ＶＰ１のＬ１６４残基はＣＶＡ２１−ＤＡＦｖに残っており、一方、２つのさらなるアミノ酸置換がＶＰ３において検出され（Ｒ９６ＨおよびＥ１０１Ａ）、１つのサイレント変異がＶＰ２において検出された（Ｖ２０９）。ＶＰ２のＬ１６４アミノ酸置換は親株およびＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの間でともに有されるので、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの強化されたＤＡＦ結合表現型を付与することに関与しているとは考えられない。ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖはヌクレオチド位置２０３８（ＶＰ３  １０１）で混合集団（Ｃ／Ａ）を示し、これはＡｌａ／Ｇｌｕをもたらし、一方、Ａ（Ｇｌｕ）のみがこの位置において親株ＣＶＡ２１によってコードされていた。
【０１５５】
ＣＶＡ２１の分子構造は原子的分解能で決定されていないので、本発明者らは、ＣＶＡ２１親株とＣＶＡ２１−ＤＡＦｖとの間でのＤＡＦ結合における違いについての説明を提供することを目指して、関連したピコルナウイルスの以前に決定された構造に対する類似性に基づいて親株ＣＶＡ２１の構造をモデル化した。ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの強化されたＤＡＦ結合表現型を付与すると考えられる変異（ＶＰ３のＲ９６ＨおよびＥ１０１Ａ）が、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のカプシドタンパク質の境界に埋め込まれていることが予測される（図５および図１０）。ＶＰ３残基のＲ９６およびＥ１０１は、ＶＰ３のＣ末端によって側面が覆われ、ＶＰ１のＣ末端によって上部が覆われ、アルギニン（Ｒ９６）の側鎖窒素原子のみが溶媒の接近を可能にする（図１０Ａにおける青色の球）。ＤＡＦに対するＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの付着は、ＥＶ１２について当てはまるように、カプシドの谷の外側で生じることが主張されている。ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖのＶＰ３のＨ９６変異およびＡ１０１変異は、提案されたＥＶ１２−ＤＡＦ結合部位において直接的には位置していないが、それらの配置は、ＤＡＦ結合フットプリントに対する強化された立体配座および接近性を与え、これにより、親株の結合親和性と比較して、ＤＡＦに対する増大した結合親和性をもたらし得る（図８Ａ）。
【０１５６】
ＩＩＩ．ＤＡＦおよびコクサッキーウイルスＡ２１により媒介される細胞感染性
ＣＶＡ２１はＤＡＦのＮ末端ドメインに結合する
ＤＡＦの個々の短いコンセンサス反復（ＳＣＲ）に対する予備的な抗体遮断研究では、ＣＶＡ２１がＤＡＦのＳＣＲ１に結合することが示唆されている。しかしながら、エンテロウイルスのＤＡＦ結合エピトープの存在位置をマッピングすることがＤＡＦ結合ｍＡｂからの立体的な障害によって間接的に影響され得るという可能性が高い。そのような疑問に取り組むために、表面に発現させたキメラなＤＡＦ分子およびＤＡＦ欠失構築物を使用して、ＳＣＲ１に対するＥＶ７０のＤＡＦ結合ドメイン（Ｋａｒｎａｕｃｈｏｗ，Ｔ．Ｍ．、Ｓ．Ｄａｗｅ、Ｄ．Ｍ．ＬｕｂｌｉｎおよびＫ．Ｄｉｍｏｃｋ、１９９８、崩壊促進因子の短いコンセンサス反復ドメイン１がエンテロウイルス７０の結合のために要求される、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２：９３８０〜９３８３）、ＣＶＢ３のＳＣＲ２〜３に対するＥＶ７０のＤＡＦ結合ドメイン（Ｂｅｒｇｅｌｓｅｎ，Ｊ．Ｍ．、Ｊ．Ｇ．Ｍｏｈａｎｔｙ、Ｒ．Ｌ．Ｃｒｏｗｅｌｌ、Ｎ．Ｆ．Ｓｔ．Ｊｏｈｎ、Ｄ．Ｍ．ＬｕｂｌｉｎおよびＲ．Ｗ．Ｃｒｏｗｅｌｌ、１９９５、ＲＤ細胞における成長に順応したコクサッキーウイルスＢ３は崩壊促進因子（ＣＤ５５）に結合する、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６９：１９０３〜１９０６）、ＳＣＲ３に対するＥＶ７のＤＡＦ結合ドメイン（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｒ．Ｍ．、Ｔ．Ｗａｒｄ、Ｄ．Ｊ．ＥｖａｎｓおよびＪ．Ｗ．Ａｌｍｏｎｄ、１９９７、エコーウイルス７とその受容体（崩壊促進因子（ＣＤ５５）との間での相互作用：Ａ粒子形成における二次的な細胞因子に対する証拠、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１：９３０６〜９３１２）がマッピングされている。ＣＶＡ２１−ＤＡＦ結合領域の存在位置を確認することを目指して、本発明者らは、ＣＤ４６メンブランコファクタープロテイン（ＭＣＰ［ＣＤ４６］）のドメインがＤＡＦの対応するドメインによって置き換えられたキメラなＤＡＦ／ＣＤ４６受容体（図１１Ａ）を用い、放射能標識されたＣＶＡ２１と結合するその能力について評価した。キメラ受容体および野生型受容体の表面発現の相対的なレベルを、個々のＤＡＦ  ＳＣＲについて特異的なｍＡｂ、および、ＣＤ４６について特異的なｍＡｂを使用してフローサイトメトリー分析によって評価した（図１１Ｂ）。抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１ｍＡｂ（ＩＡ１０）、抗ＤＡＦ  ＳＣＲ３ｍＡｂ（ＩＨ４）および抗ＤＡＦ  ＳＣＲ４ｍＡｂ（ＩＩＨ６）は、野生型ＤＡＦ、および、ＤＡＦのＳＣＲ１／２、ＳＣＲ３またはＳＣＲ４をそれぞれ有するＤＡＦ／ＣＤ４６キメラ受容体に結合しただけであった。これらの抗ＤＡＦｍＡｂはどれも野生型のＣＤ４６には結合しなかった。ＣＤ４６のＳＣＲ１を認識する抗ＣＤ４６ｍＡｂ（ＭＣＩ２０．６）は、野生型ＣＤ４６、または、ＣＤ４６のＳＣＲ１を有するＤＡＦ／ＣＤ４６キメラ受容体に結合しただけであった。著しいレベルの放射能標識ＣＶＡ２１が野生型ＤＡＦおよびＤＡＦ  ＳＣＲ１／ＣＤ４６キメラ受容体に結合し、野生型ＣＤ４６または残りのキメラ構築物には結合しなかった（図１１Ｃ）。野生型ＤＡＦおよびキメラなＤＡＦ  ＳＣＲ１／ＣＤ４６分子の両方に対するＣＶＡ２１の結合が、抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１ｍＡｂによる抗体遮断によって阻害された。ＤＡＦ  ＳＣＲ２／ＣＤ４６キメラ受容体��この研究について利用できないにもかかわらず、上記の発見は、ＥＶ７０のＣＶＡ２１カプシド結合エピトープと同様なＣＶＡ２１カプシド結合エピトープが、最も可能性があることには、ＤＡＦ分子の最初のＳＣＲに存在することを明瞭に明らかにしている。
【０１５７】
ＣＶＡ２１の結合およびＤＡＦからのＣＶＡ２１の溶出
ピコルナウイルスの細胞付着およびその後の細胞進入は、最初に付着した後、高レベルのウイルス粒子の、その特異的な細胞表面受容体からの溶出によって特徴づけられる。このことは、受容体媒介によるウイルス溶出がピコルナウイルス感染の病理発生において重要な役割を果たし得ることを示唆している。多くのピコルナウイルスと同様に、ＣＶＡ２１がその生来的な内在化受容体（この場合にはＩＣＡＭ−１）から溶出されるとき、ＣＶＡ２１は著しく低下した感染性を有しており、従って、その後の感染を開始させるその能力を最小限に抑えている。しかしながら、表面発現したＤＡＦから直接的に溶出されたＣＶＡ２１粒子の相対的な速度論および感染性を特徴づけることは以前には着手されていない。従って、本発明者らは、本発明者らの研究を、ＤＡＦからのＣＶＡ２１の溶出に対する時間、温度およびｐＨの影響に集中した。この場合、放射能標識ウイルス結合アッセイが、ＤＡＦを発現するＣＨＯ細胞をＣＶＡ２１結合基質として使用して行われた。ＤＡＦからのＣＶＡ２１の溶出は１５分で最大レベルに達し、さらなる著しい溶出の増大はこの時間の後では認められなかった（図１２Ａ）。ＤＡＦから溶出されたＣＶＡ２１の量は、３０分の一定の溶出時間を維持しながら、温度を４℃から４２℃に徐々に上げることによって増大した（図１２Ｂ）。この環境では、最大レベルのＣＶＡ２１が４２℃で溶出された。驚くべきことではないが、４２℃で溶出されたウイルスの感染性は、３７℃で溶出されたウイルスよりも著しく小さかった。３７℃を超える温度はビリオンカプシドの一体性に対する悪影響を有しており、これは、低下した受容体結合、および、従って、弱まった感染力をもたらし得る。溶出環境のｐＨを、３０分の溶出時間および３７℃の温度を維持しながらｐＨ５．５からｐＨ８．０に上げることにより、ＤＡＦから溶出されたＣＶＡ２１のレベルの連続的な増大がもたらされた（図１２Ｃ）。
【０１５８】
ＤＡＦから溶出されたＣＶＡ２１は感染性を保持する
溶出されたピコルナウイルス粒子の大部分は、細胞に結合しているビリオンが、特異的な受容体により誘導されるカプシド立体配座変化を受けていることの結果として、非感染性であることが一般に認識されている。表面発現したＤＡＦまたはＩＣＡＭ−１のいずれかに対する結合、および、表面発現したＤＡＦまたはＩＣＡＭ−１のいずれかからの溶出がＣＶＡ２１の感染性に対して及ぼす相対的な影響を比較するために、放射能標識ウイルス結合アッセイおよび細胞溶解アッセイを、ＣＨＯ―ＤＡＦ発現細胞およびＣＨＯ−ＩＣＡＭ−１発現細胞をＣＶＡ２１結合基質として使用して行った。フローサイトメトリー分析により、適切なトランスフェクションされたＣＨＯ細胞の表面におけるＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１の高レベルの発現が明らかにされた。類似するレベルの放射能標識されたＣＶＡ２１が、トランスフェクションされた細胞の表面におけるＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１の両方に結合し、また、トランスフェクションされた細胞の表面におけるＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１の両方から溶出した（図１３Ａ）。ＩＣＡＭ−１から溶出されたウイルスとは対照的に、ＤＡＦから溶出されたＣＶＡ２１のみが感染性の十分な保持を示した（＞１０５ＴＣＩＤ５０／１００ＣＰＭ）（図１３Ｂ）。ＣＶＡ２１が架橋ＤＡＦからの溶出の後で高レベルの感染性を保持していたかを明らかにするために、ＤＡＦを抗ＤＡＦ  ＳＣＲ３ｍＡｂ（ＩＨ４）による前処理により架橋するとともに、類似するプロトコルを用いた。ＩＣＡＭ−１からの溶出を、ＩＣＡＭ−１によりトランスフェクションされたＲＤ細胞（ＲＤ−ＩＣＡＭ−１）から評価した。最少レベルのＣＶＡ２１が０℃で両方の受容体から溶出され、これに対して、結合ウイルスの１５％〜２０％が３７℃で両方の受容体から溶出された（図１４Ａ）。しかしながら、以前に観測されたように（図１３Ａ）、ＩＣＡＭ−１から溶出されたＣＶＡ２１は感染性をほとんど有しておらず（＜１．０ＴＣＩＤ５０／１００ＣＰＭ）、一方、架橋ＤＡＦから溶出されたＣＶＡ２１は著しい感染性を示した（＞１０２．５ＴＣＩＤ５０／１００ＣＰＭ）（図１４Ｂ）。低レベルのＤＡＦがＲＤ−ＩＣＡＭ−１細胞の表面に存在するにもかかわらず、感染性のＣＶＡ２１がウイルス溶出液に存在しないことは、両方の受容体が細胞表面に同時発現されるとき、ＣＶＡ２１がＤＡＦよりもＩＣＡＭ−１に結合することについての優先性を示唆している。
【０１５９】
表面のＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１に対するＣＶＡ２１結合の相対的な厳格さを評価することを目指して、放射能標識ビリオンを、ＲＤ−ＩＣＡＭ−１細胞上のＩＣＡＭ−１に、または、ＲＤ細胞の表面におけるｍＡｂされた架橋ＤＡＦに０℃で結合させた。非結合ビリオンを除いた後、増大する濃度のＣＶＡ２１受容体阻止ｍＡｂ（抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１または抗ＩＣＡＭ−１ドメイン１）を適切な架橋ＤＡＦ細胞懸濁物またはＩＣＡＭ−１発現細胞懸濁物に加えた。ＲＤ−ＩＣＡＭ−１細胞への抗ＩＣＡＭ−１ドメイン１ｍＡｂの添加は、ＩＣＡＭ−１結合ＣＶＡ２１を追い出すことに対してほとんど影響を有していなかった（図１４Ｃ）。対照的に、０．１μｇ／ｍｌもの低い濃度での抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１ｍＡｂによる架橋ＤＡＦ  ＲＤ細胞の処理は約５０％のＤＡＦ結合ＣＶＡ２１の放出を促進し、その一方で、ｍＡｂの濃度を１．０μｇ／ｍｌに増大したとき、本質的にはすべてのＤＡＦ結合ウイルスの放出がもたらされた（図１４Ｃ）。
【０１６０】
ＣＶＡ２１はＤＡＦに結合し、感染性を保持し、かつ、ＩＣＡＭ−１の遅れた発現の後で増殖性感染を開始させることができる
表面発現したＤＡＦから溶出されたＣＶＡ２１が高レベルの感染性を保持することが明らかにされたので（図１３および図１４）、研究は、ＤＡＦから溶出されたウイルスが天然のＣＶＡ２１感染の病理発生において積極的な役割を果たし得るかどうかに集中した。検討すべきこの具体的な疑問は、表面発現したＤＡＦによって隔離されたウイルスが、細胞表面のＩＣＡＭ−１の遅れた誘導を利用して増殖性感染を開始させることができるかどうかを明らかにすることであった。ヒト身体中における内因性ＩＣＡＭ−１の表面発現は比較的低く、炎症性サイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αおよびインターロイキン（ＩＬ）−１βなど）の作用による誘導を待っていることが一般に受け入れられている。そのような環境を模倣することを目指して、ＣＶＡ２１の溶解性感染に対して通常の場合には抵抗性であるＤＡＦ発現ＲＤ細胞（ＩＣＡＭ−１陰性）を、ＩＣＡＭ−１またはＣＤ３６を発現させるために、（組換えアデノウイルスベクターを使用して）、表面ＤＡＦに対するＣＶＡ２１結合の後０時間、６時間および２４時間で形質導入した。フローサイトメトリー分析により、形質導入後４時間での著しいレベルの表面ＩＣＡＭ−１の発現、そして、この発現がアデノウイルス接種後の約１６時間で最大レベルに増大したことが明らかにされた（図１５Ａ）。さらなるフローサイトメトリー分析（図１５Ｂ）およびウエスタンブロットアッセイにより、ＩＣＡＭ−１およびＣＤ３６の両方の高レベルの発現が、適切な受容体保有組換えアデノウイルスによるＲＤ細胞の形質導入後２４時間で確認され、一方、内因性ＤＡＦの発現はすべての細胞の間で同程度であった。ウイルス感染性アッセイを、内因性ＤＡＦに対するウイルス結合の後０時間、６時間または２４時間の時間で、形質導入されたＩＣＡＭ−１受容体発現およびＣＤ３６受容体発現の存在下で増殖させた子孫ＣＶＡ２１のレベルを比較するために行った。ＣＶＡ２１による最初の接種後０時間、６時間または２４時間でＩＣＡＭ−１を発現させるために誘導されたＲＤ細胞は、モック受容体（ＣＤ３６）を発現させるために誘導された細胞、または、形質導入されていないＲＤ細胞よりも著しく高いウイルス収量（約２００倍）をもたらした（図１５Ｃ）。ＤＡＦ結合後０時間、６時間または２４時間でＩＣＡＭ−１を発現させるために形質導入されたＲＤ細胞におけるＣＶＡ２１の多サイクル複製は、細胞単層物の完全な溶解性破壊をもたらし、これに対して、細胞溶解が、ＣＤ３６を発現する細胞、または、形質導入されていない細胞では全く観測されなかった（図１５Ｄ）。
【０１６１】
ＩＶ．コクサッキーウイルスＡ２１のＤＡＦ変化体によるヒト乳ガン細胞、前立腺ガン細胞、結腸ガン細胞および卵巣ガン細胞のインビトロ溶解
ＣＶＡ２１プロトタイプ株は、高レベルのＣＶＡ２１細胞受容体、すなわち、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）および崩壊促進因子（ＤＡＦ）を発現する悪性メラノーマ細胞を迅速に標的化し、これを溶解することができる。近年、本発明者らは、生物選抜されたＣＶＡ２１−ＤＡＦｖ株が、強化された受容体特異性を示し、かつ、ＩＣＡＭ−１またはＤＡＦのいずれか、あるいは、両受容体の組合せを発現する細胞に迅速に感染し、かつ、その細胞を溶解することができることを示している。本研究では、ウイルス受容体発現が、多様な組織起源の１２個のヒトガン細胞株の集団について調べられた：ヒト乳ガンに由来する３つの腫瘍細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ１５７、ＭＤＡ−ＭＢ４５３、ＺＲ−７５−１）、３つの卵巣ガン細胞株（ＤＯＶ１３、ＯＡＷ−４２、ＯＶＨＳ−１）、３つの前立腺ガン性細胞（ＤＵ１４５、ＬＮＣａＰ、ＰＣ３）および３つのヒト結腸ガン細胞（ＨＣＴ１１６、ＨＴ−２９、ＳＷ６２０）。フローサイトメトリーによって明らかにされるように、著しいレベルのＩＣＡＭ−１が、３／３の乳ガン細胞株、１／３の卵巣ガン細胞株、２／３の前立腺ガン細胞株および３／３の結腸ガン細胞株で検出され、一方、１２個の細胞株のすべてが高レベルのＤＡＦを発現することが見出された（図１６）。
【０１６２】
ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖが、ＣＶＡ２１親株の腫瘍崩壊能力よりも広範囲の腫瘍崩壊能力を示すかどうかを調べるために、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖを使用して、乳房、卵巣、前立腺および結腸のガン性細胞の集団を攻撃した。顕微鏡検査では、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖにより攻撃された１２個のインビトロ培養物のすべてが、細胞死で終わる丸い表現型（細胞傷害作用の特徴）を示したことが明らかにされた。対照的に、細胞傷害作用が、ＣＶＡ２１の親株により攻撃された１２個のうちの７個のみのガン性細胞株について観測されただけであった（図１７）。ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの腫瘍崩壊能力の定量化により、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖが、１２個の試験されたインビトロ培養物のすべての、１０３ＴＣＩＤ５０／ｍｌを超える力価での溶解性感染を支援し、一方、ＣＶＡ２１親株は１２個のうちの７個のみのガン性細胞株（２／３の乳ガン細胞株、１／３の卵巣ガン細胞株、２／３の前立腺ガン細胞株および２／３の結腸ガン細胞株）で著しい溶解性感染（＞１０４ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を誘導したことが明らかにされた（図１８）。無視できるほどの量の表面ＩＣＡＭ−１を発現する細胞株（ＺＲ−７５−１、ＤＯＶ１３、ＯＡＷ−４２、ＬＮＣａＰおよびＨＣＴ１１６）はＣＶＡ２１の親株の複製を支援せず、その一方で、これらの細胞株には、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖが容易に感染したことが観測された。ＩＣＡＭ−１ではなく、表面ＤＡＦの存在のみが、生物選抜されたＣＶＡ２１−ＤＡＦｖによる溶解性感染のために要求されるので、従って、この株は、より広範囲の様々なヒトガン性細胞株を殺すことにおいて、明らかに、ＣＶＡ２１親株よりも効果的である。
【０１６３】
Ｖ．ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖによるヒト前立腺移植移植片のインビボ腫瘍崩壊
インビボデータにより、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖが、ＩＣＡＭ−１および／またはＤＡＦを細胞表面に発現するヒトガン性細胞を特異的かつ効果的に標的化することが明らかにされた。ガン性細胞の集団の観測されたインビトロ腫瘍崩壊がインビボでの抗ガン治療としてのＣＶＡ２１−ＤＡＦｖを予測するかどうかを調べるために、本発明者らは、前立腺腫瘍異種移植片に対するＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの治療効果を評価した。事前に形成されたＰＣ３前立腺異種移植片（５０ｍｍ３〜１００ｍｍ３）を有するＳＣＩＤマウスに、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖ、ＣＶＡ２１親株またはＰＢＳの単回静脈内服用量を与え、腫瘍負荷量を４２日の期間にわたって評価した（図１９）。ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖまたはＣＶＡ２１親株のいずれかにより処置されたマウスの腫瘍体積における著しい減少がウイルス投与後１１日もの早期に観測された。倫理的理由のために、ＰＢＳにより処置されたマウスはウイルス処置後１４日で安楽死させられた；それらの腫瘍負荷量が、大学の動物倫理委員会により課された上限に達したからであった。類似する血清中のウイルス量（約１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ〜１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）が、溶解性ウイルス感染性アッセイによって測定されたとき、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖ処置マウスおよびＣＶＡ２１親株処置マウスの両方について観測された（データは示されず）。これらの結果は、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖが、ヒト前立腺異種移植片の腫瘍負荷量を減少させることにおいてＣＶＡ２１親株と同じくらい効果的であることを明らかにしている。
【０１６４】
考察
Ｉ．エンテロウイルスカプシドの相互作用
ＣＶＡ２１のプロトタイプ株による増殖性細胞感染が、表面発現したＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１との異なった相互作用によって媒介される。これに関連して、ＤＡＦは、カプシドの立体配座変化および細胞進入を誘導するＩＣＡＭ−１とのその後の相互作用のためにＣＶＡ２１を細胞表面に隔離するように機能する。しかしながら、多数のインビトロ細胞継代が受容体使用法のこのパターンに寄与するか否かに関する疑問は、さかんに議論されているテーマである。特に、ＤＡＦ結合表現型は、系統発生的に関連したプロトタイプＡ群のコクサッキーウイルスＡ１３、Ａ１５、Ａ１８およびＡ２０（これらもまたＩＣＡＭ−１を細胞内在化受容体として用いる）は表面発現のＤＡＦに結合しないことを考慮すれば、ほとんど推測の域であった。従って、様々な研究が、ＣＶＡ２１プロトタイプ株ＫｕｙｋｅｎｄａｌｌのＤＡＦ結合表現型がＣＶＡ２１の低いインビトロ継代培養された臨床単離体において保存されていたか、または、単に細胞培養における多数回の継代の人為的結果にすぎなかったかを観測するために着手された。
【０１６５】
本明細書中に示される放射能標識ウイルス結合アッセイは、ＣＶＡ２１の３つの臨床単離体がプロトタイプＣＶＡ２１株（Ｋｕｙｋｅｎｄａｌｌ）と類似する受容体付着パターン（これは、ＤＡＦまたはＩＣＡＭ−１のいずれかに独立的に結合することができることによって特徴づけられる）を示したことを示している（図１）。ＤＡＦまたはＩＣＡＭ−１のいずれかに向けられたＭＡｂ遮断はウイルスの結合を完全に阻害することができないこと（図２）は、両方の受容体がＣＶＡ２１の臨床単離体の付着／感染プロセスにおいて不可欠な役割を果たしていることを示している。一方、ＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１の高レベル同時発現の環境でのＣＶＡ２１結合への研究は、２つの受容体が個々に発現された環境での場合よりも、ウイルス結合の程度が低下することを明らかにしている（図３）。これらの発見は、多数の受容体の高レベル同時発現が、実際には、最適な溶解性感染に対して阻害的であるかもしれないことを示唆している。宿主細胞表面に同時発現したとき、ＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１が非常に接近することは、受容体結合部位の利用性の低下を引き起こす立体的な障害を生じさせることが考えられる。このことが当てはまるならば、宿主細胞における両受容体の高レベル発現は、増大した付着レベルと必ずしも相関しない一方で、これら２つの異なる細胞受容体の発現レベルが１つのウイルスについて異なっている環境は潜在的に好都合であるかもしれないことが推論され得る。そのような環境は、ＤＡＦの発現が遍在的であり、かつ、ＩＣＡＭ−１（その内因性の発現レベルは比較的低く、適切なサイトカインによる誘導を待っている）よりも著しく高いレベルにあるヒト腸管の粘膜表面において生じる可能性がある。
【０１６６】
本研究の予想外の発見は、低い継代の臨床ＣＶＡ２１単離体が、抗体架橋の非存在下でのＤＡＦ結合を介するだけでＲＤ細胞に溶解的に感染することによって、ＤＡＦ相互作用をより機能的な役割で利用することができることであった（図４）。これらの新規な発見に対する１つの考えられる説明は、臨床ＣＶＡ２１単離体のウイルスカプシドは、プロタイプ株よりも実質的な様式でＤＡＦを架橋することができ、それにより、抗ＤＡＦ  Ｍａｂの人為的な架橋作用と類似する機構でウイルスの内在化を可能するということである（図４）。同様に、受容体使用法の違いが、ＣＶＢ３プロトタイプと、低い継代の臨床単離体との間で観測されている。より近年には、種々のαｖインテグリンの利用における変動が口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）の研究室株および現場株の間で報告されており、ウイルス単離体がその細胞受容体について変化した親和性を示し得ることが明らかにされている。
【０１６７】
本発明において、本発明者らは、ＩＣＡＭ−１の非存在下において、ＭＡｂ架橋のＤＡＦがプロトタイプ株および臨床ＣＶＡ２１株の両方についての機能的な内在化受容体として役立ち得ることを確認している（図４）。ＭＡｂにより架橋されたＤＡＦにより媒介されるＣＶＡ２１の進入が、ＩＣＡＭ−１とのウイルス相互作用の期間中に用いられるクラスリン被覆ピット進入経路とは対照的に、小胞を介して生じることが以前から提案されている。架橋されたＤＡＦを含有する小胞を介するＣＶＡ２１進入の仮説は、ＭＡｂによりクラスター化されたＤＡＦが小胞への補充の後で食作用を受けることを示す証拠によって裏付けられる。小胞媒介によるＣＶＡ２１進入におけるＤＡＦ相互作用についての可能な役割が、脂質ラフト（ｒａｆｔ）および／または小胞を介するＥＶ１１のＤＡＦ結合性株の細胞内在化の最近の報告によって確認されている。
【０１６８】
哺乳動物の身体中におけるＤＡＦの広範囲の発現は、適合可能な利点を、ＤＡＦについてより大きい親和性を示し、かつ、この受容体を内在化のために利用することができるウイルスに提供する。そのようなウイルスは、ヒトの身体中を移動するための容易に利用可能なビヒクルをＤＡＦ結合ウイルスに提供する赤血球におけるＤＡＦの発現のために、他の株と比較して、増大した病原性を有する場合がある。興味深いことに、分極した上皮細胞におけるコクサッキーウイルスのＢ３単離体およびＢ５単離体の連続した継代培養（この場合、それらの生来的な内在化受容体（コクサッキーウイルスおよびアデノウイルスの受容体）が、密になった細胞−細胞接合部に位置し、ＤＡＦが先端表面に位置する）により、ＤＡＦ結合性の変化体が選択された。このことは上皮細胞粘膜表面のＤＡＦ感染のための重要な役割を示唆している。
【０１６９】
カプシドの構造的タンパク質をコードするゲノムのＰ１領域の遺伝子分析により、数多くの違いが推定アミノ酸配列において臨床ＣＶＡ２１単離体およびプロトタイプ株の間で検出された（図５）。認められたコード変化はどれも、以前に決定されたＩＣＡＭ−１フットプリントにマッピングされず、また、そのような違いは、ＶＰ１全体、ＶＰ２全体およびＶＰ３全体に散らばっていた。ＩＣＡＭ−１フットプリントを構成する残基は、ＶＰ２におけるアミノ酸１６８を除いて、プロトタイプＫｕｙｋｅｎｄａｌｌ株およびすべての臨床単離体の両方で保存されていた（図５）。ＶＰ２の１６８位において、このアミノ酸置換はＶａｌからＡｌａへであり、ＩＣＡＭ−１結合部位の立体配座において保存されており、潜在的にはあまり重要でない。ＤＡＦのみを発現するＲＤ細胞において著しい溶解活性を示したが、その活性が残りの臨床単離体ほど大きくない臨床単離体＃２７２１０１は、プロトタイプ株に対してすべての臨床単離体の間で認められた１４個のコード変化のうちの１３個を有した。他の臨床単離体と比較して＃２７２１０１におけるさらに９個のさらなる変化の存在は、＃２７５２３８および＃２７２７５９８の単離体によって示される強化されたＤＡＦ使用表現型に何らかのタイプの抑制を及ぼしているかもしれない。ＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１がともに高い環境での高まったＤＡＦ使用表現型を有する臨床ＣＶＡ２１単離体の反復されたインビトロ細胞継代培養は、機能的なＤＡＦ相互作用を低下させることの犠牲のもとで、強化されたＩＣＡＭ−１使用法を有するビリオンの生物選抜のための圧力を及ぼしているかもしれない。そのようなビリオン集団が生じることは、変化した受容体使用表現型に関わる重要なＰ１アミノ酸変化の特定をもたらし得る。
【０１７０】
単離体＃２７２１０１の低下したＤＡＦ使用法に対する１つの考えられる説明が、そのＤＡＦ結合表現型を失っている生物選抜されたＥＶ１１変化体が特異的なアミノ酸変化をＶＰ１のＢＣループおよびＶＰ２のパフ領域に有していたという報告から提供される。本発明者らの配列分析では、そのような特異な違いが＃２７２１０１のＶＰ１のＢＣループおよびＶＰ２のパフ領域に存在し、他のＣＶＡ臨床単離体の同じカプシド領域には存在しないことが明らかにされた（図５）。結論であることが示されていないが、ウイルスの付着／細胞進入の環境において、すべての臨床単離体およびプロトタイプの間におけるこれらの認められた１３個のアミノ酸変化は、強化されたＤＡＦ使用表現型の発達においてある役割を潜在的に果たしているかもしれない。しかしながら、本研究では検討されていないが、細胞溶解性感染を媒介することにおけるウイルスゲノムの他の領域（例えば、５’非翻訳領域）に存在するさらなる変化の関与を退けることができない。
【０１７１】
しかしながら、ＤＡＦ／ＥＶ７、ＤＡＦ／ＣＶＢ３相互作用およびＤＡＦ／ＣＶＡ２１相互作用の間における著しい違いは、ＤＡＦのＳＣＲ２、ＳＣＲ３またはＳＣＲ４がＥＶおよびＣＶＢの結合に関与し、その一方で、ｓＤＡＦのＳＣＲ１がＣＶＡ２１の付着に関与することである。ＥＶ７、ＣＶＢ３およびＣＶＡ２１のカプシドの間における全体的な構造的類似性を考えると、ＣＶＡ２１のカプシド上にそれら自身の異なった結合部位を有する２つの異なった受容体（すなわち、ＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１）のＮ末端ドメインの関与が感染期間中の任意の段階で存在し得ることが提案される。しかしながら、ＥＶ７／ＣＶＢ３の結合におけるＤＡＦのＳＣＲ２〜ＳＣＲ４の関与は、さらなる受容体（例えば、ＣＶＢ３の場合におけるＣＡＲなど）との相互作用が、ウイルスのカプシドにおける特異的なＤＡＦ結合エピトープへの接近の妨害を最小限に抑えるために、ＤＡＦとの相互作用の後で存在し得ることを示唆している。わずかな違いが、ＩＣＡＭ−１陰性のＲＤ細胞に溶解的に感染することができる臨床単離体に対して、プロトタイプ株のＶＰ１の遊走において検出されることはかなり注目されるかもしれない。同様に、ＣＶＢ３プロトタイプの変化体（ＣＢ３−ＲＤ）（これはＲＤ細胞における連続した継代培養の後で得られた）は、プロトタイプに対して変化したＶＰ１移動度を示し、親株と比較した場合、ＤＡＦに対する変化した受容体特異性と相関していた。
【０１７２】
まとめると、示された研究における結果は、その細胞受容体に対する臨床単離体の全体的な結合能力がプロトタイプ株に対して保存されているが、かなり異なった違いが、これらの受容体を利用する臨床ＣＶＡ２１単離体の能力において存在するようであることを示している。ＣＶＢ３の現場株と同様に、臨床ＣＶＡ２１単離体は、ヒトにおける継代の結果としてであることが最も可能性が高いと考えられるが、細胞溶解性感染におけるＤＡＦの増大した使用を容易にする表現型を有する。ＣＶＡ２１が宿主細胞の付着および／または感染のためにＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１の両方を利用することができることは、個々および／または多数の受容体使用法を可能にし、それにより、ウイルスの組織親和性を拡大し、かつ、増殖性感染の機会を著しく増大させる有利な表現型が保存されていることを示唆する。
【０１７３】
ＩＩ．コクサッキーウイルスＡ２１変化体の生物選抜および分子的特長づけ
多くの他のエンテロウイルスについてそうであるように、ＤＡＦはＣＶＡ２１のプロトタイプ株に対する付着受容体として使用され、だが、ＩＣＡＭ−１が増殖性ＣＶＡ２１感染のためには要求される。本研究では、本発明者らは、ＩＣＡＭ−１陰性細胞においてインビトロで生物選抜されたＣＶＡ２１の変化体で、変化および拡大した細胞親和性を獲得しているそのような変化体を記載する（図６および図７）。本明細書中に示される放射能標識ウイルス結合アッセイでは、ＩＣＡＭ−１陰性ＲＤ細胞における多数回の継代培養にもかかわらず、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖが、ＩＣＡＭ−１のＮ末端ドメインまたはＤＡＦのＳＣＲ１のいずれかに独立して結合する能力を保持していたことが示される（図７）。極めて高レベルの表面発現したＤＡＦの環境（すなわち、最大レベルの発現について選択されたＣＨＯ−ＤＡＦ細胞）では、親株およびＣＶＡ２１−ＤＡＦｖはともに、類似するレベルでＤＡＦに結合し、一方、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖのみが、内因性ＤＡＦの著しく少ない表面発現を示したＲＤ細胞およびＤＯＶ１３細胞に付着した。以前の研究と一致して、抗ＤＡＦ  ＳＣＲ３ｍＡｂによるＤＡＦのｍＡｂ架橋は、ＤＡＦ発現のＲＤ細胞およびＤＯＶ１３細胞に対する親株ＣＶＡ２１の結合を著しく増大させ、また、ＩＣＡＭ−１の非存在下での溶解性感染を促進させた（図７）。しかしながら、ｍＡｂ架橋されたＲＤ細胞およびＤＯＶ１３細胞に対するＣＶＡ２１−ＤＡＦｖによるウイルス結合または溶解性感染の増大は何ら観測されなかった。この発見は、親株との比較で、生物選抜されたＣＶＡ２１−ＤＡＦｖがＤＡＦとのその相互作用を最適化していること、および、そのような相互作用はＤＡＦのｍＡｂ架橋によってさらに強化されないことを示唆する。親株ＣＶＡ２１のビリオンがエピトープ競合の抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１ｍＡｂとのインキュベーション時において表面発現のＤＡＦからＣＶＡ２１−ＤＡＦｖよりも容易に追い出されることを示すデータは、親株と比較して、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの強化されたＤＡＦ結合表現型の仮説をさらに裏付けている（図８）。
【０１７４】
ＣＶＡ２１プロトタイプ株に対するＤＡＦの役割は、ウイルスを感染性の状態で保ち、これにより、進入受容体（ＩＣＡＭ−１）との相互作用を待つことであり、また、ＤＡＦだけへの直接的な結合はＣＶＡ２１プロトタイプ株による増殖性感染を開始させないことが主張されている。トランスフェクションされたＣＨＯ細胞の表面におけるＤＡＦまたはＩＣＡＭ−１の高レベルの表面発現（図７）にもかかわらず、親株ＣＶＡ２１またはＣＶＡ２１−ＤＡＦｖによる検出可能な細胞感染を観測することができなかった（データは示されず）。しかしながら、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖによる強化されたＤＡＦ使用法を裏付ける証拠が、高いウイルス投入量でさえ、抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１ｍＡｂ遮断だけによって完全に阻止され得るＩＣＡＭ−１陰性ＲＤ細胞およびＤＯＶ１３細胞の溶解性感染によって提供される（図９）。このことは、ＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１の同時発現の多受容体環境（この場合、ＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１の両方に対するｍＡｂが、感染を完全に阻止するために要求される）で使用されたときにＣＶＡ２１プロトタイプ株について同じｍＡｂによって観測された部分的な阻止とは対照的である。これらの発見は、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖが表面ＤＡＦを機能的な細胞受容体として用いるという仮説を裏付けている。ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖによる感染が、エンテロウイルスの感染に対する阻害的影響を示すことが以前に示された濃度と同程度である濃度でｓＤＡＦによって開始されたという観測結果により、ＲＤ細胞のＣＶＡ２１−ＤＡＦｖ感染におけるＤＡＦの役割の重要性がさらに強調される（図９）。加えて、生物選抜プロセス期間中において、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖが、ＩＣＡＭ−１の非存在下での細胞内在化に関与する別の、未だ特定されていない二次的な細胞受容体を使用するために順応しているという可能性に反論する証拠が得られている。親株ＣＶＡ２１のＤＡＦ結合表現型と比較して、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの強化されたＤＡＦ結合表現型（図７および図８）は、ＲＤ細胞においてだけでなく、ＤＡＦを発現する卵巣ガン細胞（ＤＯＶ１３）においてもまた、増大した細胞溶解性感染に転換されるようである（図７）。
【０１７５】
数多くの異なった違いが、ＤＡＦに対する多くのヒトエンテロウイルスの結合相互作用において存在する。ＣＶＢ３、ＥＶ７およびＥＶ１２のビリオンにおけるＤＡＦ結合部位が二十面体の２回対称軸でのカプシドの谷の外側に位置することが主張されている。ＥＶ１１もまた、カプシドの谷の外側でＤＡＦと相互作用する一方で、ＤＡＦ結合フットプリントがビリオンの５回軸の近くに位置することが主張されている。ＤＡＦに付着するヒトエンテロウイルスのなかで、エンテロウイルス７０およびＣＶＡ２１のみがＤＡＦのＮ末端のＳＣＲ１ドメインに結合し、残るＤＡＦ結合性エンテロウイルスは中央のドメイン（ＳＣＲ２〜ＳＣＲ４）と相互作用する。ＤＡＦに対するエンテロウイルス結合が谷の外側に位置するという事実に加えて、これらの相互作用は、細胞感染またはＡ粒子の形成をもたらさないことが報告されている。ＥＶ１１の場合、それについてのＤＡＦ結合が定量的に評価されているが、ＤＡＦとの相互作用は親和性が低く、このことは、類似する親和性であるが、より遅い速度論を有するライノウイルス３に対する谷結合性ＩＣＡＭ−１分子の相互作用とは対照的である。
【０１７６】
ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖが、強化されたＤＡＦ結合表現型を示しているにもかかわらず、カプシドコード領域における２個のアミノ酸だけが親株とは異なる。生物選抜プロセス期間中において、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖは、ＩＣＡＭ−１と結合する能力を保持していた（図７）。従って、驚くべきことではないが、認められたカプシド変異はどれも、以前に決定されたＩＣＡＭ−１結合フットプリント（これは、北側および南側の谷の縁に広がることが主張されている）に位置していなかった。ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの認められた変異は、ＶＰ２のＥＦループと、ＶＰ１およびＶＰ３のＣ末端とによって取り囲まれるＶＰ３のαらせん（ＣＤループ）においてカプシドの谷の外側に位置することが予測される（図１０）。２つの変異が、ＶＰ１のＲ２７０およびＶＰ３のＨ３２９との相互作用を介してＶＰ１およびＶＰ３のＣ末端と非常に接近していることが予測される。ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖのＶＰ３における認められた変異は、ＥＶ１２の表面におけるＤＡＦ結合フットプリントに対応する、ＶＰ３のαらせんと、ＶＰ１のＣ末端領域との立体配座を強化することに関与しているかもしれないことが提案される。そのような立体配座変化はＣＶＡ２１−ＤＡＦｖカプシドとＤＡＦとの間においてより良好な接触をもたらす。ＤＡＦと、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖビリオンの２回軸凹部との間での増大した親和性はＶＰ３のＨ９６およびＡ１０１の存在に起因するという仮説は、抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１ｍＡｂによる攻撃によって、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖを表面発現のＤＡＦから追い出すことが親株ビリオンよりも困難であることの発見と一致する（図８Ａ）。ＣＶＡ２１の低い継代の臨床単離体（これはＤＡＦのｍＡｂ架橋およびＩＣＡＭ−１発現の非存在下でＤＡＦ発現ＲＤ細胞に様々な程度で溶解的に感染することができる）はまた、ＶＰ３のＨ９６変異をコードしているが、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖで認められたＡ１０１変異をコードしていない。比較において、プロトタイプＣＶＡ２１株はＶＰ３のＲ９６をコードする。表面ＤＡＦに付着する放射能標識ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖビリオンの強化された能力は、他のウイルスゲノム領域の関与ではなく、むしろ、カプシドコード領域内の変異を反映する。
【０１７７】
プロトタイプＣＶＡ２１による架橋ＤＡＦ媒介による細胞溶解性感染が、ＩＣＡＭ−１の相互作用を介して媒介される細胞溶解性感染よりも遅い速度で生じ、この場合、細胞進入が、異なる進入機構を介して生じることが示唆される。プロトタイプＣＶＡ２１の架橋されたＤＡＦにより媒介される進入は、検出可能なＡ粒子の形成を伴うことなく生じており、小胞（ＥＶ１、および、ＥＶ１１のＤＡＦ結合性株の進入において最近になって関係づけられた新規な進入経路）を伴うことが主張される。ＥＶ１が細胞表面上のその受容体α２β１に付着することにより、インテグリンのクラスター化がもたらされ、また、そのような付着は、架橋されたＤＡＦを介するプロトタイプＣＶＡ２１媒介による進入と類似する様式でのウイルスの進入を容易にすることが示唆される。ｍＡｂ架橋の後、ＤＡＦはより有利な立体配座で細胞表面に提示され、それにより、細胞をプロトタイプＣＶＡ２１による感染に対して感受性にすることが主張される。表面ＤＡＦに対するＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの結合はＡ粒子の検出可能な形成の非存在下で生じるようである（図８Ｂ）。この発見に対する１つの考えられる説明は、低い継代の臨床ＣＶＡ２１単離体（これもまたＶＰ３のＨ９６残基を有する）について以前に主張されたのと類似する様式で、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖビリオンがＤＡＦを効果的に架橋し、かつ、それにより、ｍＡｂを架橋する人為的な作用に関連した機構によって細胞内への進入を獲得し得るということである。細胞表面から溶出された検出可能なＣＶＡ２１−ＤＡＦｖのＡ粒子が明らかに存在しないことは、Ａ粒子が形成されていないことを証明していない。Ａ粒子は、その後の脱外皮事象が１６０Ｓ粒子から１３５Ｓ粒子への最初のＤＡＦ媒介による変換よりも速い速度で生じるならば蓄積しない。ＥＶ１（これはα２β１インテグリンを細胞進入のために使用する）はカプシドの谷においてα２β１インテグリンの機能的なα２ｌドメインに結合する。古典的な谷結合性の受容体であるにもかかわらず、α２ｌとのＥＶ１の相互作用は、ポリオウイルスに対するポリオウイルス受容体の可溶性形態の結合およびライノウイルスに対するＩＣＡＭ−１の結合とは対照的に、ウイルスの脱外皮をもたらさない。しかしながら、α２β１発現細胞とＥＶ１との間での相互作用はビリオンの立体配座変化を媒介することが示唆されており、しかし、さらなる細胞分子がＥＶ１の脱外皮のために必要とされるかどうかは明らかでないままである。同様の様式で、さらなる細胞タンパク質がＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの脱外皮のために必要とされること、または、ウイルスのカプシドにおける変異の存在がカプシドを脱安定化させ、それにより、受容体媒介による立体配座変化の必要性を回避し得るかどうかは除外することができない。
【０１７８】
ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖが、表現型および組織起源が異なる２つのガン性細胞株（ＲＤおよびＤＯＶ１３）に溶解的に感染することができることにより、機能的な受容体としてのＤＡＦの獲得された使用が、生物選抜プロセスで用いられた特定の細胞基質に限定されないことが強調される。ＤＡＦおよび他の補体調節タンパク質の発現が、補体媒介による攻撃から細胞を保護するために、正常な細胞に対して、異なる起源の多くの腫瘍細胞の表面で高まっている。表面発現したＤＡＦとの特異的なカプシド相互作用を介するＣＶＡ２１−ＤＡＦｖ媒介による腫瘍崩壊（これは、強化されたＤＡＦ結合表現型に起因する）は、いくつかのヒト悪性腫瘍の根絶において潜在的に効果的であり得ることが示唆される。この方法を裏付けとして、悪性メラノーマ細胞の表面にともに過剰発現されるＩＣＡＭ−１およびＤＡＦを介して標的化されるメラノーマ腫瘍の根絶において効果的であるＣＶＡ２１のプロトタイプ株の成功した適用がある。本研究の大きな発見は、ウイルスの生物選抜は、腫瘍を標的化する新規な腫瘍崩壊性エンテロウイルスの開発における直接的な遺伝子操作に対する実用的な代替法であり得るということである。
【０１７９】
ＩＩＩ．コクサッキーウイルスＡ２１−ＤＡＦにより媒介される細胞感染性
ＤＡＦとのエンテロウイルスの相互作用はプロトタイプおよび臨床単離体の間では異なるようである。ＩＣＡＭ−１発現および抗体により架橋されたＤＡＦの非存在下では、ＣＶＡ２１の臨床単離体は、様々な程度ではあるが、おそらくは特異的なウイルスカプシド相互作用を介してＤＡＦを架橋することによって宿主細胞の溶解性感染を達成する。しかしながら、ＤＡＦの相互作用がエンテロウイルスの数多くの臨床単離体について詳しく記載されているにもかかわらず、溶解性感染時におけるＤＡＦについての直接的な機能的役割は今も明らかにされていない。エンテロウイルス−ＤＡＦの相互作用を調べる多くの研究から得られた一般的な総意は、ＤＡＦがウイルス隔離受容体として機能し、それにより、さらなる機能的な内在化受容体に対するウイルス提示を高めるということである。
【０１８０】
本研究では、本発明者らは、ＤＡＦ結合性のエコーウイルスおよびコクサッキーＢ群ウイルスとは異なり、ＣＶＡ２１がＤＡＦのＮ末端のＳＣＲに結合することを確認している（図１１）。ＤＡＦからのＣＶＡ２１の溶出に対する生物物理学的パラメーター（例えば、時間、温度およびｐＨなど）の影響を検討する研究では、ＣＶＡ２１粒子がＤＡＦから比較的迅速に溶出されること、および、この溶出が、温度およびｐＨの増大に対して影響されやすいことが強調される（図１２）。ＩＣＡＭ−１からのＣＶＡ２１の溶出は、ＤＡＦから溶出されたビリオンと比較した場合、ウイルス感染性における劇的な減少によって特徴づけられる（図１３および図１４）。ＩＣＡＭ−１から溶出されたＣＶＡ２１ビリオンは、受容体結合が、ビリオンを、結合させることができないままにし、かつ、溶解性感染を開始させることができないままにしておくことの結果として、不可逆的なカプシド立体配座変化を受ける。対照的に、ｍＡｂ架橋ＤＡＦとのＣＶＡ２１の相互作用はＡ粒子の形成を生じさせない。受容体結合時における非感染性Ａ粒子への立体配座変化は数多くのピコルナウイルス（例えば、ＰＶ、主要群のＨＲＶおよびＣＶＢ３など）について特徴的である。ＤＡＦから溶出された粒子が依然として感染性を保ち続けることができることは、最も可能性のあることには、ＤＡＦがＣＶＡ２１カプシドの立体配座変化を誘導することができないことの結果である。ＤＡＦを発現するＣＨＯ細胞から溶出されたＣＶＡ２１粒子は、感染性の１６０Ｓ粒子と類似する沈降係数をスクロースグラジエントにおいて有し、これに対して、ＩＣＡＭ−１を発現するＣＨＯ細胞から溶出されたＣＶＡ２１粒子は、１３５Ｓの変化した粒子の沈降係数により近い低下した沈降係数を示した。ＤＡＦ相互作用の後におけるＣＶＡ２１感染性の維持は、ＩＣＡＭ−１結合に関与する領域と比較して、ビリオンカプシドの異なる領域がＤＡＦ結合に関与することの結果としてであり得る。ＣＶＡ２１の谷がＩＣＡＭ−１に対する付着部位であり、一方、ＤＡＦは、カプシドのより容易に接近可能な２回軸凹部において結合することが主張される（これは、極低温電子顕微鏡観察による再構成を使用してＥＶ７について最近において確認された提案である）。同様に、ＥＶ１１はまた、谷の外側のカプシドの領域でＤＡＦと結合することが主張されている。しかしながら、この場合、結合は、二十面体の５回軸を伴うことが提案されている。これらの発見は、２回軸凹部における結合がカプシド立体配座における検出可能な変化の引き金にはならないことが主張されているので、ＤＡＦが主に細胞付着に関与するという理論を裏付けている。
【０１８１】
エンテロウイルスのカプシドに対するＤＡＦ結合の性質は、非常に速い解離速度定数の結果のために親和性が低いことが示唆される。対照的には、類似する構造のウイルスカプシドとのＩＣＡＭ−１の相互作用は、親和性が同程度であるが、比較的接近しにくい部位（カプシドの谷）に対する結合と一致する著しくより遅い速度論を有する。ＤＡＦに結合したビリオンが、その受容体結合エピトープについて競合するｍＡｂにさらされている間に、ＩＣＡＭ−１に結合したビリオンよりも容易に追い出されるという発見は、結合がＤＡＦよりもＩＣＡＭ−１に対して厳格であることを示唆する。従って、ＤＡＦに結合したＣＶＡ２１のｍＡｂ媒介による追い出しにおける明らかな違いは、カプシド表面における受容体結合部位の個々の存在位置に対する相対的な接近のためであり得ることが示唆される（すなわち、ウイルスＤＡＦ結合のより容易な解離は２回軸凹部における強化されたｍＡｂ接近性に起因し、ウイルスＩＣＡＭ−１結合の困難な解離はカプシドの谷に対するｍＡｂの制限された接近に起因する）。
【０１８２】
ＤＡＦとのＣＶＡ２１相互作用の可逆性が、ＣＶＡ２１が（ＩＣＡＭ−１陰性細胞において）ＤＡＦに結合し、かつ、引き続き２４時間まで感染性の状態に留まることができることによって強調された。感染性の保持は、ＤＡＦ結合のビリオンが、遅れたＩＣＡＭ−１発現とともに提示されたとき、細胞進入およびその後の溶解性感染を受けることを可能にしていた（図１５）。細胞病理学における検出可能な変化がない場合、ＲＤ細胞の単層物、および、アデノ−ＣＤ３６により形質導入されたＲＤ細胞の単層物における比較的高いレベルの感染性ＣＶＡ２１（図１５Ｃ）が研究期間中を通して持続した；ＤＡＦに結合した残存するウイルス接種物が感染性を保持しているためであることが最も考えられる（図１３および図１４）。あるいは、強化されたＤＡＦ使用表現型を有し、これにより、ＤＡＦの架橋を可能にし、かつ、その後の遅い感染を開始させるＣＶＡ２１プロトタイプ調製物内のビリオンの亜集団の存在のためであり得る（これは、ＣＶＡ２１の臨床単離体について以前に記載された発見である）。
【０１８３】
ＣＶＡ２１がＤＡＦを付着受容体として使用することができ、かつ、非常に感染性の能力を保持することができることは、哺乳動物の身体中におけるＤＡＦの広範囲にわたる分布（特に赤血球における分布）を考えた場合、極めて好都合な機構である。この環境において、ＤＡＦを発現する赤血球は、感染性ウイルスが赤血球表面から離れ、溶解性感染のためにＩＣＡＭ−１発現細胞と相互作用することができる身体中を通るすぐに使用される輸送ビヒクルをウイルスに提供する。ＩＣＡＭ−１の細胞表面発現が炎症性サイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αおよびインターロイキン（ＩＬ）−１βなど）の存在下で高められる。天然のヒトライノウイルスの感染期間中に、感染細胞は、周りの細胞における強化されたＩＣＡＭ−１発現を媒介するそのようなサイトカインを放出する。
【０１８４】
本明細書中に示されたデータでは、ＣＶＡ２１の溶解性感染の期間中におけるＤＡＦの主要な役割が、隔離受容体として作用し、これにより、ウイルスを、ＩＣＡＭ−１相互作用を介する細胞進入のための機会を待つ感染性の状態で保つことであることが確認される。ＣＶＡ２１が、結合および溶出の比較的短い循環によって示されるように、細胞感染期間中に何度も、ＤＡＦと結合し、また、ＤＡＦから溶出することが最も起こり得る。本発明者らは、ＤＡＦからの溶出が、増殖性感染をより後の段階で開始するＣＶＡ２１の能力にとって有害でなく、実際には、このウイルスが少なくとも２つの異なった機構によって宿主細胞進入を達成することの機会を増大させることを示唆する。第１に、ウイルスは、受容体結合能力と、従って、細胞感染性とを依然として保持しながらＤＡＦに結合し、かつ、溶出することができる。第２に、ＣＶＡ２１はＤＡＦに結合し、かつ、ウイルスの内在化およびその後の溶解性感染を可能にするために同じ細胞または近接する細胞における著しいレベルのＩＣＡＭ−１発現を利用できることを待つことができる。ウイルスの進化および病理発生の両方の観点で、ＤＡＦに結合することができることは、細胞感染性を最大にすることにおいてＣＶＡ２１のプロトタイプ株および他のＤＡＦ結合性のエンテロウイルスについて最も好都合であると見なされるに違いない（これは、毒性の臨床ＣＶＡ２１単離体において保持され、かつ、強化さえされる表現型である）。
【０１８５】
ＩＶ．コクサッキーウイルスＡ２１のＤＡＦ変化体（ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖ）によるヒト乳ガン細胞、前立腺ガン細胞、結腸ガン細胞および卵巣ガン細胞のインビトロ溶解
本発明で示される研究では、インビトロ選択法によって単離されたＣＶＡ２１−ＤＡＦｖによる特異的な腫瘍崩壊能力が記載される。１２個のヒトガン性細胞株の集団を使用して、本発明者らは、この生物選抜された株が、試験されたすべての腫瘍由来細胞株に迅速に感染することを明らかにしている。対照的に、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖが得られたＣＶＡ２１親株は、試験された１２個のガン性細胞株のうちの７個において腫瘍崩壊を媒介しただけであった。重要なことは、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの優れた腫瘍崩壊活性が、親株ＣＶＡ２１と比較した場合、この生物選抜された株が生じたＲＤ細胞に限定されず、試験された多様な組織起源の他のヒトガン細胞株の大部分で観測された（図１８）。ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖが、ＩＣＡＭ−１の存在を細胞進入のために必要とする親株ＣＶＡ２１との比較で、試験された非常に多数の腫瘍細胞株に溶解的に感染するという本発明者らの観測結果は大きな臨床的影響を有し得る。ヒトの充実性腫瘍は、一般には、密に詰まった細胞の大きな塊であるが、その細胞はＩＣＡＭ−１を必ずしも発現していない場合がある。さらに、ＩＣＡＭ−１の発現は、前立腺ガン細胞の転移の潜在的可能性と相関することが示されている。すなわち、ＩＣＡＭ−１は、転移性があまりないＬＮＣａＰ細胞と比較して、転移性がより大きい細胞株のＤＵ１４５およびＰＣ３において発現している。本発明者らの研究において、本発明者らは、ＬＮＣａＰ細胞がＣＶＡ２１の親株による感染に対して抵抗性であるが、この細胞株、ならびに、ＤＵ１４５およびＰＣ３は、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの生物選抜された株によって溶解されることを示している。
【０１８６】
Ｖ．ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖによるヒト前立腺異種移植片のインビボ腫瘍崩壊
ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖは、ＣＶＡ２１親株よりも広範囲の様々なガン性細胞株に対する腫瘍崩壊活性を示したが、生物選抜された株の１回だけの服用は、腫瘍負荷量をインビボヒト前立腺異種移植片モデルにおいて減少させることにおいて同等に効果的であった。まとめると、本明細書中に示される証拠は、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖが、数多くの不均一なガンタイプについてのバイオ治療剤としての大きな効力で使用される潜在的可能性を有することを明らかにしている。
【０１８７】
要約
ＣＶＡ２１の低い細胞培養継代による臨床単離体は、ＤＡＦ結合表現型を伴って、ＩＣＡＭ−１に加えてＤＡＦと結合することが示されており、従って、このことは、細胞培養における多数回の継代培養から獲得されているとは考えられない。エンテロウイルスの感染におけるＤＡＦのより機能的な役割についてのますますの証拠が、抗ＤＡＦｍＡｂ架橋または表面発現したＩＣＡＭ−１の非存在下でＤＡＦ発現細胞に溶解的に感染する能力を有するそのような臨床ＣＶＡ２１単離体の強化されたＤＡＦ使用表現型によって明らかにされている。
【０１８８】
本発明者らは、ＩＣＡＭ−１陰性の横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞に溶解的に感染させるために生物選抜されたＣＶＡ２１の変化体（ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖ）の受容体使用法の性質を調べた。本発明者らは、ＤＡＦを発現するＲＤ細胞における多数回の継代培養の後で、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖが、ＩＣＡＭ−１と結合する潜在的能力を保持しながら、親株と比較して、ＤＡＦに結合する強化された能力を示すことを示した。ＲＤ細胞の溶解性感染が、抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１ｍＡｂ遮断によって完全に無効にされた。このことは、ＤＡＦだけとの相互作用により、溶解性感染が媒介されることを示唆している。ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの細胞相互作用の分子的基礎のより良い理解を得ることを目指して、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖのカプシドコード領域のヌクレオチド配列を決定し、親株ＣＶＡ２１のヌクレオチド配列と比較した。配列比較により、ＤＡＦとの強化されたウイルスカプシド相互作用を付与することが予測される、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖのＶＰ３における２つの特異なアミノ酸置換の存在が明らかにされた。
【０１８９】
数多くの変化および／または改変が、広く記載された本発明の精神または範囲から逸脱することなく、具体的な実施形態において示されたように本発明に対して行われ得ることが当業者によって理解される。従って、本発明の実施形態は、すべての点で、限定としてではなく、例示として見なさなければならない。
【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１】抗ＩＣＡＭ−１  ＭＡｂの存在下および非存在下における（Ａ）ＤＡＦ発現ＣＨＯ細胞および（Ｂ）ＩＣＡＭ−１発現ＣＨＯ細胞に対する、［３５Ｓ］−メチオニン標識されたＣＶＡ２１プロトタイプ（Ｋｕｙｋｅｎｄａｌｌ）および３つのＣＶＡ２１臨床単離体（＃２７２１０１、＃２７５２３８および＃２７２５９８）の結合を示す。
【図２】抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１  ＭＡｂ処理、抗ＩＣＡＭ−１ドメイン１  ＭＡｂ処理および／またはＰＩ−ＰＬＣ処置の存在下におけるＨｅＬａ細胞に対する、［３５Ｓ］−メチオニン標識されたＣＶＡ２１プロトタイプ（Ｋｕｙｋｅｎｄａｌｌ）（Ａ）および臨床単離体＃２７２１０１（Ｂ）の結合を示す。
【図３】ＤＡＦまたはＩＣＡＭ−１のいずれかを単独または組合せで発現するＣＨＯ細胞に対する、［３５Ｓ］−メチオニン標識されたＣＶＡ２１プロトタイプ（Ｋｕｙｋｅｎｄａｌｌ）および３つのＣＶＡ２１臨床単離体（＃２７２１０１、＃２７５２３８、＃２７２５９８）の結合を示す。
【図４】抗ＤＡＦ  ＭＡｂのＩＡ１０（ＳＣＲ１）、ＶＩＩＩＡ７（ＳＣＲ２）、ＩＨ４（ＳＣＲ３）およびＩＩＨ６（ＳＣＲ４）の存在下におけるＣＶＡ２１プロトタイプ（Ｋｕｙｋｅｎｄａｌｌ）および臨床単離体（＃２７２１０１、＃２７５２３８、＃２７２５９８）によるＩＣＡＭ−１陰性ＲＤ細胞の溶解性感染を示す。
【図５】プロトタイプＣＶＡ２１Ｋｕｙｋｅｎｄａｌｌ株および臨床単離体（＃２７２１０１、＃２７５２３８および＃２７２５９８）についての、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のカプシドタンパク質の多配列アラインメントを示す。
【図６】ＣＶＡ２１親株およびＣＶＡ２１−ＤＡＦｖによるＳｋＭｅｌ２８細胞およびＲＤ細胞の感染。（Ａ）ＲＤ細胞およびＳｋＭｅｌ２８細胞におけるＩＣＡＭ−１発現およびＤＡＦ発現のフロ−サイトメトリー分析。実線のヒストグラムはコンジュゲートのみの結合を表し、点線のヒストグラムは抗ＩＣＡＭ−１ｍＡｂの結合を表し、抗ＤＡＦｍＡｂの結合が黒塗りのヒストグラムによって示される。（Ｂ）９６ウエルプレートにおけるＳｋＭｅｌ２８細胞およびＲＤ細胞の単層物をＣＶＡ２１親株およびＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの１０倍希釈物とインキュベーションした。７２時間のインキュベーションの後、単層物を固定し、クリスタルバイオレット溶液により染色した。＋は、顕微鏡検査によって検出されたＣＰＥを示す。（Ｃ）ＲＤ細胞上におけるＣＶＡ２１−ＤＡＦ変化体と比較したときの、ＳｋＭｅｌ２８細胞上におけるＣＶＡ２１親株およびＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの代表的なプラーク形態を示す。
【図７】ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの結合および溶解性感染に対する抗ＤＡＦｍＡｂおよび抗ＩＣＡＭ−１ｍＡｂの影響。（Ａ）ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−ＤＡＦ細胞、ＣＨＯ−ＩＣＡＭ−１細胞およびＤＯＶ１３細胞におけるＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１の表面レベルのフローサイトメトリー分析。実線のヒストグラムはコンジュゲートのみの結合を表し、点線のヒストグラムは抗ＩＣＡＭ−１ｍＡｂの結合を表し、抗ＤＡＦｍＡｂの結合が黒塗りのヒストグラムによって示される。ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−ＩＣＡＭ−１細胞、ＣＨＯ−ＤＡＦ細胞およびＤＯＶ１３細胞における表面発現したＩＣＡＭ−１（Ｂ）およびＤＡＦ（Ｃ）に対する放射能標識ウイルスの結合を液体シンチレーション計数によって測定した。結果が三連のサンプル＋ＳＤとして表される。（Ｄ）ＲＤ細胞およびＤＯＶ１３細胞のＣＶＡ２１溶解性感染に対するＤＡＦのｍＡｂ架橋の影響を示す。
【図８】ＤＡＦからのＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの溶出。（Ａ）表面のＤＡＦに対するＣＶＡ２１親株およびＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの結合の厳格さ（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）の比較。ＣＨＯ−ＤＡＦ細胞を放射能標識ウイルスと４℃で２時間インキュベーションし、その後、細胞に結合しているウイルスを、氷上で１時間、様々な濃度の抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１ｍＡｂ（ＩＡ１０）により溶出した。上清を、溶出されたウイルスのレベルについてモニターした。結果が、細胞から溶出された放射能標識ウイルスの％として表される。（Ｂ）ＤＡＦ結合ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖビリオンおよびＩＣＡＭ−１結合ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖビリオンの沈降を示す。
【図９】抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１ｍＡｂおよび可溶性ＤＡＦ（ｓＤＡＦ）によるＣＶＡ２１−ＤＡＦｖ溶解性感染の阻害。（Ａ）ＲＤ細胞のコンフルエント単層物を、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖによる感染の前に抗ＤＡＦ  ＳＣＲ１ｍＡｂのＩＡ１０とインキュベーションした。３７℃で２４時間インキュベーションした後、細胞を細胞溶解について調べ、写真撮影した。（Ｂ）ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖをｓＤＡＦ（８５μｇ／ｍｌ）と３７℃で１時間インキュベーションし、ＲＤ細胞の単層物に加えた。
【図１０】ＣＶＡ２１の予測される受容体−ウイルス結合表面の詳細図。（Ａ）ＶＰ１が黄色で描かれ、ＶＰ２がピンク色で描かれ、ＶＰ３がマゼンダ色で描かれる等表面（ｉｓｏｓｕｒｆａｃｅ）として示される１つのＣＶＡ２１プロトマーの上面図。数字は、二十面体の５回軸、３回軸および２回軸の対応する位置を示す。相互作用するＩＣＡＭ−１分子およびＤＡＦ分子がウォーム描図として示され、ＤＡＦがコムギ色で、谷と結合しているＩＣＡＭ−１が緑色で示される。ＣＶＡ２１親株におけるＶＰ３のＲ９６残基の位置（空間充填モデル）がＶＰ１のＣ末端ループによって部分的に覆われ、かつ、アルギニン側鎖における１つの窒素原子（星印の隣の青色表面）だけをウイルスの表面から見ることができる。（Ｂ）上記のように着色されたタンパク質と、空間充填モデルにおいて強調されるＶＰ３のＲ９６残基およびＥ１０１残基とを伴うＣＶＡ２１プロトマーの側面図を示す。
【図１１】キメラなＤＡＦ／ＣＤ４６受容体に対する放射能標識ＣＶＡ２１の結合。（Ａ）野生型ＤＡＦ分子、野生型ＣＤ４６分子およびＤＡＦ／ＣＤ４６キメラ分子の概略図。（Ｂ）ＤＡＦの個々のＳＣＲおよびＣＤ４６に向けられたｍＡｂの結合のフローサイトメトリー分析。抗ＤＡＦｍＡｂは、ＩＡ１０（ＳＣＲ１）、ＩＨ４（ＳＣＲ３）、ＩＩＨ６（ＳＣＲ４）であり、抗ＣＤ４６ｍＡｂ（ＳＣＲ１）はＭＣＩ２０．６であった。適切なｍＡｂとのインキュベーションの後、細胞をＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳにおけるヤギ抗マウス免疫グロブリンのＲ−フィコエリトリンコンジュゲート化Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ、デンマーク）の１００μｌに再懸濁し、氷上で２０分間インキュベーションした。細胞を上記のように洗浄およびペレット化し、ＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳｔａｒ分析装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ、Ｓｙｄｎｅｙ、オーストラリア）を使用してＤＡＦおよびＣＤ４６の発現について分析した。（Ｃ）ＤＡＦ分子、ＣＤ４６分子またはキメラなＤＡＦ／ＣＤ４６分子を発現するＣＨＯ細胞に対する放射能標識ＣＶＡ２１の結合。細胞を約２ｘ１０５ｃｐｍの３５Ｓ標識されたＣＶＡ２１と３７℃で１時間インキュベーションし、その後、ＰＢＳにより４回洗浄した。細胞に結合したＣＶＡ２１の量を液体シンチレーションによって測定した。
【図１２】時間、温度、および、インキュベーション媒体のｐＨに応答したＤＡＦ発現ＣＨＯ細胞からのＣＶＡ２１溶出。（Ａ）ＣＶＡ２１を、細胞表面に発現したＤＡＦに４℃で結合させ、温度を３７℃に上げることによって２時間後に、さらに０分間、１分間、５分間、１５分間、３０分間および６０分間にわたって溶出させた。溶出されたＣＶＡ２１のレベルを液体シンチレーション計数によって求めた。（Ｂ）ＣＶＡ２１を、細胞表面に発現したＤＡＦに４℃で２時間結合させ、その後、適切な温度でさらに３０分間インキュベーションすることによって溶出させた。（Ｃ）ＣＶＡ２１を、細胞表面に発現したＤＡＦに４℃で２時間結合させ、その後、適切なｐＨの媒体においてさらに３０分間インキュベーションすることによって溶出させた。
【図１３】ＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１から溶出された後におけるＣＶＡ２１の感染性。（Ａ）細胞表面に発現したＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１に対する４℃での［３５Ｓ］−メチオニン標識ＣＶＡ２１の結合のレベル、および、３７℃でのインキュベーションの後におけるそれぞれの受容体からの放射能標識ウイルスの溶出のレベル。結合した［３５Ｓ］−メチオニン標識ウイルスのレベルを１４５０Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  ＴＲＩＬＵＸ（Ｗａｌｌａｃ、Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）での液体シンチレーション計数によって測定した。結果が三連のサンプル＋ＳＤとして表される。（Ｂ）細胞表面に発現したＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１への結合、そして、それらからの溶出の後におけるＣＶＡ２１によるＲＤ−ＩＣＡＭ−１細胞の溶解性感染を示す。
【図１４】架橋されたＤＡＦからの溶出の後におけるＣＶＡ２１の感染性。（Ａ）ＲＤ細胞における細胞表面に発現したＩＣＡＭ−１（ＲＤ−ＩＣＡＭ−１）およびＲＤ細胞におけるｍＡｂ架橋ＤＡＦからの［３５Ｓ］−メチオニン標識ＣＶＡ２１の０℃および３７℃での溶出。溶出された［３５Ｓ］−メチオニン標識ウイルスのレベルを１４５０Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  ＴＲＩＬＵＸ（Ｗａｌｌａｃ、Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）での液体シンチレーション計数によって測定した。結果が、三連のサンプルから溶出されたパーセントウイルス＋ＳＤとして表される。（Ｂ）コントロールのＣＶＡ２１と比較される、ＩＣＡＭ−１およびｍＡｂ架橋ＤＡＦに対する結合、そして、それらからの溶出の後におけるＣＶＡ２１によるＲＤ−ＩＣＡＭ−１細胞の溶解性感染。細胞の生存をクリスタルバイオレット／メタノール溶液による染色によって四連のウエルから定量化し、染色された細胞単層物の相対的な吸光度をマルチスキャン酵素結合免疫吸着アッセイプレートリーダー（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭｃＬｅａｎ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、米国）で５４０ｎｍにおいて読み取った。５０パーセントのエンドポイント力価を、図１３に記載されるように計算した。（Ｃ）ＩＣＡＭ−１または架橋ＤＡＦに対するＣＶＡ２１結合の厳格さ。ＲＤ−ＩＣＡＭ−１細胞またはＤＡＦ架橋のＲＤ細胞［抗ＤＡＦ  ＳＣＲ３（ＩＨ４）ｍＡｂとプレインキュベーションされたＲＤ細胞］を約２ｘ１０５ｃｐｍの３５Ｓ標識されたＣＶＡ２１と０℃で２時間インキュベーションした。
【図１５】ＩＣＡＭ−１発現の遅れた誘導の後におけるＲＤ細胞のＣＶＡ２１誘導による溶解性感染。（Ａ）アデノウイルスにより形質導入されたＩＣＡＭ−１発現の経時変化。ＲＤ細胞を、ヒトＩＣＡＭ−１のｃＤＮＡを含有する組換えアデノウイルスの２．５ｘ１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌによる形質導入によりヒトＩＣＡＭ−１を発現させるために誘導した。細胞を、抗ＩＣＡＭ−１ドメインｍＡｂ（ＩＨ４）を使用してアデノウイルス接種後の様々な時間でＩＣＡＭ−１の発現についてフローサイトメトリーによって評価した。（Ｂ）モック形質導入後２４時間、あるいは、ヒトのＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡまたはＣＤ３６ｃＤＮＡを含有する組換えアデノウイルスによる形質導入の後２４時間での、ＤＡＦ、ＩＣＡＭ−１およびＣＤ３６の表面発現を示すＲＤ細胞のフローサイトメトリー分析。黒塗りのヒストグラムはＤＡＦ発現を表し、一方、ピンク色のヒストグラムはＩＣＡＭ−１発現を表し、青色のヒストグラムはＣＤ３６発現を表す。ＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡまたはＣＤ３６ｃＤＮＡを含有する組換えアデノウイルスを、Ａｄｅｎｏ−ｑｕｅｓｔキット（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ）を製造者の説明書に従って使用して構築した。（Ｃ）２４時間後までのＩＣＡＭ−１の遅れた発現を介するＲＤ細胞のＣＶＡ２１溶解性感染。ＲＤ細胞を、ＤＡＦに対するＣＶＡ２１（ｍｏｉ＝１．０ＴＣＩＤ５０）の結合の後０時間、６時間および２４時間で、ＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡまたはＣＤ３６ｃＤＮＡを含有する組換えアデノウイルスの２．５ｘ１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌによる形質導入によりＩＣＡＭ−１受容体またはＣＤ３６受容体を発現させるために誘導した。非形質導入のＲＤ細胞がコントロールとして役立った。四連のウエルからの細胞生存をクリスタルバイオレット／メタノール溶液による染色によって定量化し、染色された細胞単層物の相対的な吸光度をマルチスキャン酵素結合免疫吸着アッセイプレートリーダー（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭｃＬｅａｎ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、米国）で５４０ｎｍにおいて読み取った。５０パーセントのエンドポイント力価を、ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈの方法を使用して計算した。この場合、吸光度がウイルス非含有コントロール−３倍の標準偏差よりも小さいならば、ウエルは陽性としてスコア化された。（Ｄ）ＣＶＡ２１により誘導される溶解性感染を示す。
【図１６】乳ガン、卵巣ガン、前立腺ガンおよび結腸ガンの細胞株における受容体発現を示す。
【図１７】ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖによるインビボ腫瘍崩壊。ヒトの乳ガン細胞、卵巣ガン細胞、前立腺ガン細胞および結腸ガン細胞のインビトロ培養物のＣＶＡ２１−ＤＡＦｖ誘導による感染の顕微鏡写真を示す。
【図１８】ヒトの乳ガン細胞株、卵巣ガン細胞株、前立腺ガン細胞株および結腸ガン細胞株におけるＣＶＡ２１−ＤＡＦｖの腫瘍崩壊能力の定量化を示す。
【図１９】ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖによるヒト前立腺異種移植片のインビボ腫瘍崩壊。２ｘ１０６個のＰＣ３細胞を注入した後、脇腹で成長している皮下のＰＣ３腫瘍（約５０ｍｍ３〜１００ｍｍ３）を有するＳＣＩＤ（重症複合免疫不全）マウスに、単回用量のＣＶＡ２１親株、ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖまたはＰＢＳによる静脈内注射を与えた。
【図２０Ａ】ＣＶＡ２１＃２７２５９８単離体のカプシドコード領域の配列。（Ａ）ヌクレオチド配列。
【図２０Ｂ】ＣＶＡ２１＃２７２５９８単離体のカプシドコード領域の配列。（Ｂ）翻訳されたアミノ酸配列。
【図２１Ａ】ＣＶＡ２１＃２７５２３８単離体のカプシドコード領域の配列。（Ａ）ヌクレオチド配列。
【図２１Ｂ】ＣＶＡ２１＃２７５２３８単離体のカプシドコード領域の配列。（Ｂ）翻訳されたアミノ酸配列。
【図２２Ａ】ＣＶＡ２１＃２７２１０１単離体のカプシドコード領域の配列。（Ａ）ヌクレオチド配列。
【図２２Ｂ】ＣＶＡ２１＃２７２１０１単離体のカプシドコード領域の配列。（Ｂ）翻訳されたアミノ酸配列。
【図２３Ａ】ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖのカプシドコード領域の配列。（Ａ）ヌクレオチド配列。
【図２３Ｂ】ＣＶＡ２１−ＤＡＦｖのカプシドコード領域の配列。（Ｂ）翻訳されたアミノ酸配列。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図１】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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