(57)【要約】ａ）ＰＸ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（配列番号１）；ｂ）ＰＳＸ４Ｓ（配列番号２）；ｃ）ＱＸ５Ｘ６Ｘ７Ｑ（配列番号３）およびｄ）ＳＸ８Ｓ（配列番号４）（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３は同一または異なっていてもよく、それぞれアミノ酸残基を表し、Ｘ４は、アミノ酸残基を表し、Ｘ５、およびＸ７は同一または異なっていてもよく、それぞれアミノ酸残基を表し、そしてＸ６はアミド側鎖を有するアミノ酸残基を表わし、Ｘ８は脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基を表す。）から選択されるアミノ酸配列よりなる、または含むペプチド。そのペプチドは樹状細胞および他のタイプの細胞に結合する。そのペプチドはそのような細胞に対して標的非ウイルスおよびウイルスベクターとして用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＰＸ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（配列番号１）
ｂ）ＰＳＸ４Ｓ（配列番号２）
ｃ）ＱＸ５Ｘ６Ｘ７Ｑ（配列番号３）
ｄ）ＳＸ８Ｓ（配列番号４）
（式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３は同一または異なっていてもよく、それぞれアミノ酸残基を表し、
Ｘ４は、アミノ酸残基を表し、
Ｘ５、およびＸ７は同一または異なっていてもよく、それぞれアミノ酸残基を表し、そしてＸ６はアミド側鎖を有するアミノ酸残基を表わし、
Ｘ８は脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基を表す。
但し、配列番号１，２，３または４のアミノ配列を含むペプチドは天然の完全長のたんぱく質ではない。）
から選択されるアミノ酸配列よりなる、または含むペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列ＰＸ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（配列番号１）（式中、Ｘ２はＮまたはＬを表す）を含む請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
Ｘ２はＬを表す請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
Ｘ1はＳ，ＡまたはＰを表す請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
Ｘ3はＳ，ＫまたはＴを表す請求項3に記載のペプチド。
【請求項６】
Ｘ1はＡを表す請求項３〜５のいずれかに記載のペプチド。
【請求項７】
Ｘ3はＴを表す請求項３〜６のいずれかに記載のペプチド。
【請求項８】
アミノ酸配列ＰＡＬＫＴよりなる、または含む請求項３に記載のペプチド。
【請求項９】
Ｘ2はＮを表す請求項1または２に記載のペプチド。
【請求項１０】
Ｘ1はＳまたはＰを表す請求項９に記載のペプチド。
【請求項１１】
Ｘ３はＳまたはＴを表す請求項９または１０に記載のペプチド。
【請求項１２】
アミノ酸配列ＰＡＬＫＴ（配列番号６）、ＰＳＮＳＴ（配列番号８）またはＰＰＮＴＴ（配列番号９）よりなる、または含む請求項１に記載のペプチド。
【請求項１３】
Ｃ末端にＡまたはＶ残基を有する請求項１〜１２のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１４】
Ｎ末端にＡ、ＳまたはＴ残基を有する請求項１〜１３のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１５】
配列ＳＴＰＰＮＴＴ（配列番号１７）、ＡＰＳＮＳＴＡ（配列番号１５）およびＳＰＡＬＫＴＶ（配列番号１６）を有する請求項１２または１３に記載のペプチド。
【請求項１６】
アミノ酸配列ＰＳＸ４Ｓ（配列番号２）(式中、Ｘ2はＮまたはＬを表す)よりなる、または含む請求項1に記載のペプチド。
【請求項１７】
Ｎ末端にＡまたはＬ残基を有する請求項１６に記載のペプチド。
【請求項１８】
配列ＬＰＳＬＳ（配列番号２２）を有する請求項１７に記載のペプチド。
【請求項１９】
Ｎ末端に１以上の更なる残基を有する請求項１６〜１８のいずれかに記載のペプチド。
【請求項２０】
配列ＭＬＰＳＬＳ（配列番号２３）またはＰＭＬＰＳＬＳ（配列番号２４）を有する請求項１９に記載のペプチド。
【請求項２１】
アミノ酸配列ＱＸ５Ｘ６Ｘ７Ｑ（配列番号３）（式中、独立にＸ６はＮまたはＱ残基を表す）よりなる、または含む請求項１に記載のペプチド。
【請求項２２】
独立にＸ５がＫまたはＳを表し、Ｘ７はＰまたはＹを表す請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２３】
Ｘ５がＫで、Ｘ６がＮで、Ｘ７がＰであるか、またはＸ５がＳで、Ｘ６がＱで、Ｘ７がＹである請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２４】
Ｎ末端にＳまたはＦ残基を有しおよび/またはＣ末端にＭまたはＫ残基を有する請求項２１〜２３のいずれかに記載のペプチド。
【請求項２５】
配列ＳＱＫＮＰＱＭ（配列番号２５）またはＦＱＳＱＹＳＱＫ（配列番号２６）を有する請求項２４に記載のペプチド。
【請求項２６】
アミノ酸ＳＸ８Ｓ（配列番号４）（式中、Ｘ８はＬまたはＩを表す）よりなる、または含む請求項１に記載のペプチド。
【請求項２７】
Ｎ末端に独立にＡまたはＰ残基のいずれかまたは両方を有し、Ｃ末端にＭ残基を有する請求項２６に記載のペプチド。
【請求項２８】
Ｎ末端および/またはＣ末端に１以上の更なる残基を有する請求項２７に記載のペプチド。
【請求項２９】
配列ＰＭＬＰＳＬＳまたはＭＡＳＩＳＭＫまたは１以上の末端残基が除かれているその変異体を有する請求項２７または２８に記載のペプチド。
【請求項３０】
請求項１に記載され、表１に記載されたペプチド。
【請求項３１】
Ｎ末端および/またはＣ末端に１以上の更なるアミノ酸残基を有する請求項１に記載のペプチド。
【請求項３２】
30までのアミノ、例えば２０までのアミノ酸、例えば１２までのアミノ酸、例えば７アミノ酸を有する請求項１〜３０のいずれかに記載のペプチド。
【請求項３３】
アミノ酸の環状領域を含む請求項１〜３２のいずれかに記載のペプチド。
【請求項３４】
ペプチドが１以上のジサルファイド結合を形成できる２以上のシステイン残基を含む請求項３３に記載のペプチド。
【請求項３５】
請求項1〜３４のいずれかに記載のペプチドであるが、請求項１の但し書きを受けず、そのペプチドはポリカチオン性核酸結合成分に結合しているペプチド。
【請求項３６】
ポリカチオン性核酸結合成分がポリエチレンイミンまたはデンドリマーである請求項３５に記載のペプチド。
【請求項３７】
ポリカチオン性核酸結合成分が１以上のカチオン性モノマーを含むオリゴペプチドである請求項３５に記載のペプチド。
【請求項３８】
オリゴペプチドがオリゴリシン、オリゴアルギニン、オリゴヒスチジンまたはヒスチジン、アルギニンおよびリシン残基のいずれかの組み合わせを含む混合オリゴマーである請求項３７に記載のペプチド。
【請求項３９】
カチオン性オリゴペプチドが５〜２５のモノマー、好ましくは１０〜２０のモノマーを有する請求項３７または３８に記載のペプチド。
【請求項４０】
オリゴペプチドがオリゴリシンである請求項３９に記載のペプチド。
【請求項４１】
オリゴリシンが１４〜１８のモノマー、例えば６モノマーを有する請求項４０に記載のペプチド。
【請求項４２】
ペプチドがポリカチオン性核酸結合成分にスペーサー要素を介して結合している請求項３５〜４１のいずれかに記載のペプチド
【請求項４３】
スペーサー要素がＧＧ  または  ＧＡであるか、またはジペプチドスペーサーＧＧ（グリシン−グリシン）およびＧＡ（グリシン−アラニン）より長いおよび/または疎水性である請求項４２に記載のペプチド。
【請求項４４】
スペーサー要素がＧＡである請求項４２または４３に記載のペプチド。
【請求項４５】
スペーサー要素が化学結合である請求項４２に記載のペプチド。
【請求項４６】
ペプチドがポリエチレンイミンとジサルファイド結合によりただし結合している請求項３６に記載のペプチド。
【請求項４７】
式Ａ−Ｂ−Ｃ
（式中、Ａはポリカチオン性核酸結合成分、Ｂは化学結合またはスペーサー要素であり、そしてＣは，請求項１〜３４のいずれかに記載のペプチドであり、そのペプチドは請求項１の但し書きを受けない）
のペプチド誘導体。
【請求項４８】
ポリカチオン性核酸結合成分が請求項３６〜４１のいずれかに定義した通りである請求項４７に記載のペプチド誘導体。
【請求項４９】
スペーサー因子が請求項４２〜４６のいずれかに定義した通りである請求項４７に記載のペプチド誘導体。
【請求項５０】
誘導体が請求項３６〜４１のいずれかに記載したペプチドの形である請求項４７に記載のペプチド誘導体。
【請求項５１】
（ｉｉ）脂質成分
(iii）ポリカチオン性核酸結合性成分および
(iｖ）請求項１〜３４のいずれかにペプチド（そのペプチドは請求項１の        ）
を含む非ウイルス性トランスフェクション混合物。
【請求項５２】
ポリカチオン性核酸結合成分が請求項３６〜４１のいずれかに定義した通りである請求項５１に記載の混合物。
【請求項５３】
成分（ｉｉｉ）および（ｉｖ）が請求項３９〜５０のいずれかに記載したペプチドまたはペプチド誘導体の形である請求項５１に記載の混合物。
【請求項５４】
脂質成分がカチオン性脂質および膜不安定化またはフソジェニック（fusogenic）な性質を有する脂質から選択される１以上の脂質であるか、または含む請求項５１〜５３のいずれかに記載の混合物。
【請求項５５】
脂質成分が中性の脂質ジオレイルホスファチジル-エタノ−ルアミン(ＤＯＰＥ)または類似の膜不安定化またはフソジェニックな性質を有する脂質であるか、または含む請求項５４に記載の混合物。
【請求項５６】
脂質成分がカチオン性脂質Ｎ-〔１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル〕-Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）または類似のカチオン性の性質を有する脂質であるか、または含む請求項５４または５５に記載の混合物。
【請求項５７】
脂質成分がＤＯＰＥおよびＤＯＴＭＡの混合物、特にその等モル混合物であるか、または含む請求項５６に記載混合物。
【請求項５８】
脂質成分：ペプチド/ポリカチオン性核酸結合成分の比が重量で０．７５：４、またはモルベースで０．５ｎｍｏｌ：１．２５ｎｍｏｌである請求項５７に記載の混合物。
【請求項５９】
脂質成分が２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−〔２-（スペルミジンカルボキサミド）エチル〕−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオリドアセテート（ＤＯＳＰＡ）またはＤＯＳＰＡに類似の性質を有する脂質であるか、または含む請求項５１〜５８のいずれかに記載の混合物。
【請求項６０】
脂質成分がＤＯＰＥおよびＤＯＳＰＡの混合物、特に１重量部のＤＯＰＥに対して３重量部のＤＯＳＰＡである混合物であるか、または含む請求項５９に記載の混合物。
【請求項６１】
脂質成分が、一般式（Ｉ）：
【化１】
2007527208.tif 000017
（式中、  Ｘ１およびＸ２は同一または異なり、−ＯＣＨ２−および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−から選択され；
Ｒ１およびＲ２は同一または異なり、直鎖または分枝の、飽和または不飽和のＣ７〜Ｃ２４ハイドロカルビル基であり、ヒドロキシ、ハロゲンおよびＯＲ’から選択された１以上の置換基により置換され、または置換されず、Ｒ’はＣ１〜Ｃ６のヒドロカルビル基であり；
それぞれのＲ３およびＲ４は同一または異なり直鎖または分枝の、飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビル基であり、ヒドロキシ、ハロゲン、ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ．−ＣＮ，ＮＲ’Ｒ”，および−Ｃ（Ｏ）Ｒ”から選択されろ１以上の置換基により置換されるか、または置換されず、Ｒ’およびＲ”は同一または異なり、Ｃ１〜Ｃ６のヒドロカルビル基である）、
一般式（ＩＩ）：
【化２】
2007527208.tif 000018
（式中、  Ｘ１およびＸ２は同一または異なり、上に定義した通りである。
Ｒ１およびＲ２は同一または異なり、上に定義した通りである。
Ｒ５は−Ｎ＋（Ｒ３）２−Ｒ６（各Ｒ３は同一または異なり、上に定義した通りである）である。
Ｒ６は
（ａ）−[A-Y-]-nＲ４：
（式中、
各Ｙは同一または異なり、−Ｎ＋（Ｒ４）２−であり、Ｒ４は上に定義した通りである
各Ａは同一または異なりＣ１−２０アルキレン基であり、ヒドロキシ、ハロゲン、ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＮ，ＮＲ’Ｒ”，および−Ｃ（Ｏ）Ｒ”から選択される（Ｒ’およびＲ”は同一または異なり、Ｃ１〜Ｃ６のヒドロカルビル基である）１以上の置換基で置換されるかまたは置換されない。
ｎは１〜１０であり、Ｒ４は上に定義した通りである）であるか、または
(b) −[B-O-]-mB-Q
（式中、
各Ｂは同一または異なり、ヒドロキシ、ハロゲン、ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ．−ＣＮ，ＮＲ’Ｒ”，および−Ｃ（Ｏ）Ｒ”から選択される（Ｒ’およびＲ”は同一または異なり、Ｃ１〜Ｃ６のヒドロカルビル基である）１以上の置換基で置換されまたは置換されないＣ１−1０アルキレン基であり、
ｍは１〜１０であり；
Ｑは−Ｎ＋（Ｒ３）３、−ＯＨ，ＯＲ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’，およびハロゲンから選択され、Ｒ３およびＲ’は上に定義した通りである。）
）である）、または
一般式（ＩＩＩ）：
【化３】
2007527208.tif 000019
（式中、Ｒは，同一または異なり、
（ａ）Ｈ，
（ｂ）−ＣＨ２−Ｎ＋（Ｒ２）２−ＣＨ２−ＣＨ２−［Ｙ−（ＣＨ２）ｐ］ｑ−Ｚ、または
（ｃ）−ＣＨ２−Ｎ＋（Ｒ４）３
である。但し１つのＲはＨで、他は基（ｂ）であるか、両方のＲが基（ｃ）である。
Ｘは同一または異なり、ＯＣＨ２またはＯ−Ｃ（Ｏ）である。
Ｒ１は同一または異なりＣ７〜Ｃ２３の飽和または不飽和鎖である。
Ｒ2は同一または異なりＣ１〜Ｃ６の飽和または不飽和鎖である。
ＹはＮＨ，ＣＨ２，Ｏ，またはＮ（アセチル）である。
ＺはＯ（Ｃ１〜Ｃ４），ＯＣ（Ｏ）Ｒ３，Ｎ＋Ｒ３４，ＯＨ，Ｆ，Ｃｌ，ＢｒまたはＩでる（Ｒ３はＣ１〜Ｃ６アルキルである）である。
Ｒ４は同一または異なり、Ｃ１〜Ｃ６鎖である。
ｎは２，３，または４である。
ｍは１〜２００であり、それが少なくとも２の場合、生じた繰り返し単位は同一または異なり得る）
の脂質のいずれかの１以上であるか、または含む請求項５１〜５３に記載の混合物。
【請求項６２】
混合物脂質成分、請求項１〜１４のいずれかに記載のペプチド（そのペプチドは請求項１の但し書きを条件としない）およびポリカチオン性核酸結合成分としての〔Ｋ〕１６を含む請求項51〜61のいずれかに記載の混合物。
【請求項６３】
脂質成分：ペプチド/ポリカチオン性核酸結合成分の比が重量で１２：４：１である請求項６２に記載の混合物。
【請求項６４】
請求項５１〜６３のいずれかに記載の混合物の製造方法であって、成分（ｉｉ），（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を混合することを含む方法。
【請求項６５】
(i)核酸
（ｉｉ）脂質成分
(iii）ポリカチオン性核酸結合性成分
(iｖ）請求項１〜３４のいずれかに記載のペプチド（そのペプチドは請求項１の但し書きを条件としない）
のペプチド
を含む非ウイルス性トランスフェクション複合体。
【請求項６６】
ポリカチオン性核酸結合成分が請求項３６〜４１のいずれかに定義した通りである請求項６５に記載の複合体。
【請求項６７】
成分（ｉｉｉ）および（ｉｖ）が請求項３９〜５０のいずれかに記載のペプチドまたはペプチド誘導体の形である請求項６５に記載の混合物。
【請求項６８】
脂質成分が請求項５４〜６３のいずれかに定義の通りである請求項６５〜６７のいずれかに記載の複合体。
【請求項６９】
核酸成分が遺伝子治療、遺伝子ワクチン化またはアンチセンス治療に適当な核酸配列、または所望のタンパク質をコードする請求項６５〜６８のいずれかに記載の複合体。
【請求項７０】
核酸成分がタンパク質のコード配列、ｃＤＮＡコピー、およびそのゲノムバージョン（イントロンそしてまたエクソンを含む）、遺伝子の調節上流および下流配列、遺伝子修復および相同的組換えに関与する配列、プラスミドに含まれる短い配列、またはプラスミドまたは核酸の組み込みを媒介する他の大きい核酸、例えばファージインテグラーゼ、または「眠れる美」トランスポゾン、アンチセンス調節のために、または転写因子デコイとして有用なＤＮＡ，ワクチン反応をブーストするアジュバンドとして有用なオリゴヌクレオチド、例えばＣｐＧリッチな配列、またはスモール・インターフェアリングＲＮＡである請求項６５〜６９のいずれかに記載の複合体。
【請求項７１】
核酸の転写および／または翻訳調節因子が提供され、核酸が場合によりファージまたはベクターにパックされる請求項６９または７０に記載の複合体。
【請求項７２】
核酸成分がＤＮＡである請求項６５〜７１のいずれかに記載の複合体。
【請求項７３】
核酸成分がＲＮＡである請求項６５〜７１のいずれかに記載の複合体。
【請求項７４】
核酸および請求項５１〜６３のいずれかに記載のトランスフェクション混合物を含む請求項６５に記載の複合体。
【請求項７５】
核酸が請求項６９〜７３のいずれかに記載の通りである請求項７４に記載の複合体。
【請求項７６】
成分（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を混合することを含む請求項６５〜７３のいずれかに記載の複合体の製造方法。
【請求項７７】
成分を次の順序：脂質成分、ペプチド／ポリカチオン性核酸結合成分、核酸で混合する請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
核酸を請求項５１〜６３のいずれかに記載の混合物と共に導入することを含む請求項７４または７５に記載の複合体の製造方法。
【請求項７９】
請求項７６〜７８のいずれかに記載の方法により得られうる請求項６５〜７５のいずれかに記載の複合体。
【請求項８０】
（ｉ）核酸
(iiｉ）ポリカチオン性核酸結合性成分
(iｖ）ポリカチオン性核酸結合成分、および
(iv) 請求項１〜３４のいずれかに記載のペプチド（そのペプチドは請求項１の但し書きを条件としない）
を含む非ウイルス性トランスフェクション複合体。
【請求項８１】
核酸が請求項６９〜７３のいずれかに定義する通りであり、ポリカチオン性核酸結合成分が請求項３６〜４１のいずれかに定義する通りであり、そして場合によりペプチドが請求項３５〜４６のいずれかに定義する通りであるか、または請求項４７〜５０のいずれかに記載するペプチド誘導体である請求項８０に記載の複合体。
【請求項８２】
請求項８０または８１に記載の複合体の製造方法であって、成分（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を次の順序：ペプチド／ポリカチオン性核酸結合成分、核酸で混合することを含む方法。
【請求項８３】
請求項８２の方法により得られ得る請求項８０または８１に記載の方法。
【請求項８４】
請求項１〜３４のいずれかに記載のペプチドを含むウイルスベクター。
【請求項８５】
ウイルスベクターがレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）またはヘルペス単純ウイルスの遺伝的に操作され、複製欠陥誘導体である請求項８４に記載のウイルスベクター。
【請求項８６】
ウイルスベクターがアデノウイルスである請求項８５に記載のウイルスベクター。
【請求項８７】
アデノウイルスがアデノウイルスタイプ５である請求項８５に記載のウイルスベクター。
【請求項８８】
ペプチドがウイルスキャプシドまたはことのタンパク質に導入されている請求項８４〜８７のいずれかに記載のウイルスベクター。
【請求項８９】
ペプチドがアデノウイルスキャプシドの線維タンパク質のＨＩ領域に導入される請求項８７または８８に記載のウイルスベクター。
【請求項９０】
ペプチドがベクターと複合体を形成し、そのペプチドはウイルスキャプシドまたは外被に静電的に結合することができるカチオン性ドメインを含む請求項８４〜８７のいずれかに記載のウイルスベクター。
【請求項９１】
ペプチドが請求項３５〜４６のいずれかに記載の通りであるか、または請求項４７〜５０のいずれかに記載のペプチド誘導体の形である請求項９０に記載のウイルスベクター。
【請求項９２】
ペプチドがウイルスに結合することができる抗体によりウイルスベクターで導入される請求項８４〜８７のいずれかに記載のウイルスベクター。
【請求項９３】
抗体がペプチドおよびウイルスに結合することができる２特異性抗体である請求項９２に記載のウイルスベクター。
【請求項９４】
ペプチドおよび抗体が融合タンパク質の形である請求項９２に記載のウイルスベクター。
【請求項９５】
抗体がウイルスキャプシドまたはこと上のエピトープに結合する請求項９２〜９４のいずれかに記載のウイルスベクター。
【請求項９６】
抗体がいずれかのクラスの抗体であるか、抗原結合ドメインであるか、および/またはキメラまたはヒト化抗体である請求項９２〜９５のいずれかに記載のウイルスベクター。
【請求項９７】
細胞を核酸でトランスフェクトする方法であって、細胞をインビトロまたはインビボで請求項６５〜７５，７９〜８１，および８３〜９６のいずれかに記載のトランスフェクション複合体またはウイルスベクターと接触させることを含む方法。
【請求項９８】
請求項６５〜７５，７９〜８１，および８３〜９６のいずれかに記載のトランスフェクション複合体またはウイルスベクターを、医薬的に適当な担体と混合してまたは結合して含む医薬組成物。
【請求項９９】
遺伝子の欠陥または欠陥によりヒトまたは非ヒト動物に起こる状態の治療または予防のための方法であって、ヒトまたは非ヒト動物に請求項６５〜７５，７９〜８１，および８３〜９６のいずれかに記載のトランスフェクション複合体またはウイルスベクターを投与することを含む方法。
【請求項１００】
ヒトまたは非ヒト動物の治療的または予防的免疫化方法であって、ヒトまたは非ヒト動物に請求項６５〜７５，７９〜８１，および８３〜９６のいずれかに記載のトランスフェクション複合体またはウイルスベクターを投与することを含む方法。
【請求項１０１】
アンチセンス治療方法であって、ヒトまたは非ヒト動物に請求項６５〜７５，７９〜８１，および８３〜９６のいずれかに記載のトランスフェクション複合体またはウイルスベクターを投与することを含む方法。
【請求項１０２】
薬剤またはワクチンとしての使用のための請求項６５〜７５，７９〜８１，および８３〜９６のいずれかに記載のトランスフェクション複合体またはウイルスベクター
【請求項１０３】
遺伝子の欠陥および/または欠陥によりヒトまたは非ヒト動物に起こる状態の治療または予防のための、または治療的若しくは予防的免疫化のための、またはアンチセンス治療のための薬剤の製造のための請求項６５〜７５，７９〜８１，および８３〜９６のいずれかに記載のトランスフェクション複合体またはウイルスベクターの使用。
【請求項１０４】
（ｉ）核酸、
（ｉｉ）脂質成分、
（ｉｉｉ）ポリカチオン性核酸結合成分、および
（ｉｖ）請求項１〜３４のいずれかに記載のペプチド（そのペプチドは請求項１の但し書きを条件としない）
を含むキット。
【請求項１０５】
（ｉ）核酸、
（ｉｉｉ）ポリカチオン性核酸結合成分、および
（ｉｖ）請求項１〜３４のいずれかに記載のペプチド（そのペプチドは請求項１の但し書きを条件としない）
を含むキット。
【請求項１０６】
ウイルスおよび請求項１〜３４のいずれかに記載のペプチドに結合できる２特異性抗体。
【請求項１０７】
請求項１〜３４のいずれかに記載のペプチド融合ペプチドで（そのペプチドは請求項１の但し書きを条件としない）およびウイルスに結合できる抗体を含む融合ペプチド。
【請求項１０８】
ｓｉＲＮＡを同定する方法であって、標的遺伝子を発現する細胞をｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、発現レベルを定量することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は樹状細胞に結合するペプチドリガンド、および改良された効率の遺伝子移転を有するとりわけベクターシステムにおけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療および遺伝子ワクチン化は、アンチセンス治療と同様に様々な病気の治療および／または予防のための興味ある可能性を提供する技術である。そのような技術は、問題の核酸を標的細胞に導入する必要がある。充分な核酸を特別な標的細胞に移転させる能力は、遺伝子治療、アンチセンス治療および遺伝子ワクチン化の発展に対する主な制限の１つとして残っている。ウイルスおよび非ウイルス核酸運搬システムの両方が提案されている。核酸は通常ＤＮＡであるが、ある場合にはＲＮＡを用いる。
【０００３】
「遺伝子」という用語は遺伝子ワクチン化および特に遺伝子治療に関連して幾分曖昧に使用されている。最初にこれに関連して「遺伝子」という用語は、例えばタンパク質のコード配列を示すのに用いられたが、その用語は有用な核酸を指すため一般的な意味で今用いられる。遺伝子治療および／または遺伝子ワクチン化に用いることができる核酸の例は、タンパク質のコード配列およびｃＤＮＡコピーおよびそのゲノムバージョンを含み、後者はイントロンそしてまたエクソン、並びに調節上流および下流配列をも含む。他の有用な核酸は、修復遺伝子および相同的組換えに関与する配列を含む。これらはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ(Bandyopadhyay et al., 1999; Cole-Strauss et al., 1996; Kren et al., 1998; Yoon et al., 1996)またはＤＮＡオリゴヌクレオチド(Goncz et al., 1998)等の分子であり得る。有用な核酸はプラスミドに含まれる短い配列、または核酸の組み込みを媒介する酵素をコードする核酸、例えばφＣ３１ファージａｔｔＢ／インテグラーゼシステム(Groth et al., 2000; Olivares et al., 2001; Stoll et al., 2002; Thyagarajan et al., 2000; Thyagarajan et al., 2001)、および「眠れる美）」トランスポゾン／トランスポゼーズ(Yant et al., 2000)をコードする他の大きい核酸であり得る。
【０００４】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドはアンチセンス調節の目的に(Bachmann et al., 1998; Knudsen and Nielsen, 1997; Mannion et al., 1998; Woolf et al., 1995) または転写因子デコイとして(Ehsan et al., 2001; Ehsan et al., 2002; Mann et al., 1999; Morishita et al., 1995)運搬されうる。ＣｐＧの豊富なオリゴヌクレオチド配列は、ワクチン応答を押し上げるためのアジュバンドとして有用でありうる（Kreig et al,1993）。
【０００５】
遺伝子治療に用い得る他の重要な新しい種類の核酸は。スモールインターフェアリング（ｓｉＲＮＡ）として知られる長さ２０−３０ｎｔの２本鎖ＲＮＡを含む。哺乳動物におけるＲＮＡインターフェアレンスは、高度の特異性を有する遺伝子発現の調節への重要な新しいアプローチとして過去２または３年に明らかになった(レビュー Shi 2003)。ｓｉＲＮＡ分子はｍＲＮＡのホモロガス領域を標的にし、次にｍＲＮＡ標的の崩壊に導く保存された経路を活性化する。ｓｉＲＮＡの作用の正確な機構は熱心な研究中であるが、哺乳動物細胞へのｓｉＲＮＡの適用は機能的ゲノムの分野に革命を起こす可能性を有する。哺乳動物細胞での遺伝子の発現を簡単に、効果的に、そして特異的に下方調節する能力は、巨大な科学的、商業的、そして治療的可能性を保持する。
【０００６】
現在有効なｓｉＲＮＡ標的を予言する方法はなく、非常に多くの配列のスクリーニングが行われ、非常に多くの可能性のある分子をスクリーニングしなければならない。そのようなスクリーニングは、非ウイルスベクターにより運搬される化学的に合成したｓｉＲＮＡ分子で最も便利に行われる。ｓｉＲＮＡトランスフェクションのための改良されたベクターは、価格効果性そしてまたより大きい機能性という利益を提供する。動物モデルにおけるｓｉＲＮＡのインビボの使用は開発のおおいに早期の段階にあるが可能性も巨大である。
【０００７】
核酸を細胞に移動させる２つの主な様式がある。即ち裸の核酸の移動およびベクターを媒介する移動である。非ウイルス性または合成ベクターは３つの主なグループがある。脂質ベクター（リポレックスベクター）、ペプチド、デンドリマーおよびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む他の非脂質性カチオン性ポリマ−を含むベクター（ポリプレックスベクター）、カチオン性ポリマ−および脂質の両方を含むベクター(Felgner et al., 1997)。標的にするベクターはウイルスベクターおよび受容体標的合成ベクターを含む。
【０００８】
遺伝子導入、並びに従って遺伝子治療および遺伝子ワクチン化に一般的に用いるウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の遺伝的に操作された複製に欠陥のある誘導体を含む。それらは、ウイルスがトロフィックである、即ち天然の受容体を含む細胞の種類において、インビトロで、そしてある場合にはインビボで高効率の遺伝子導入を一般的に示す。しかしながら、遺伝子導入はウイルスに対する天然の受容体を含まない細胞タイプでは不十分である。更に、レトロウイルスは、素早く分裂するトランスデューシング細胞に限定される。更に、たいていのウイルスベクターは、核酸に対するパッケージ容量が限定される。例えば、ＡＡＶ  ５ｋｂ；アデノウイルス  ７−８ｋｂ；ヘルパー依存性アデノウイルス  ３５ｋｂ；およびレトロウイルス１０ｋｂである。ＨＳＶは１３５ｋｂまでのずっと大きい構築物をパッケージできる(Wade-Martins et al., 2003)。複製に欠陥のあるウイルスベクターを製造する方法は一般的に長いプロセスであり、ある場合にはウイルスの収率は低い。
【０００９】
受容体媒介遺伝子導入は受容体媒介エンドサイトーシスの生理学的な細胞の過程を利用して核酸を自己のものとする遺伝子導入の非ウイルス方法である。例としてはインスリン受容体に対して標的とするベクター（例えばRosenkranz et al Experimental Cell Research 199, 323-329 (1992)を参照）ベクター、アシアログリコプロテイン受容体に対して標的とするベクター（例えばWu & Wu, Journal of Biological Chemistry 262, 4429-4432 (1987), Chowdhury et al Journal of Biological Chemistry 268, 11265-11271 (1993)を参照）、トランスフェリン受容体に対して標的とするベクター（例えば、Ciriel et al, Proc. Natl. Acad. Ｓci. USA88, 8850-8854を参照。）を含む。ベクターの更なる例は神経芽細胞腫細胞上の受容体を標的とするモノクローナル抗体（(Yano et al, 2000)）、リポソームに共役した葉酸(Reddy & Low 2000, Reddy et al. 1999)、肝臓細胞を標的とするガラクトース(Han et al. 1999 Bettinger et al. 1999)、および肝臓細胞に対するアシアロジルコプロテイン(Wu et al. 1991)を含む。
【００１０】
受容体媒介非ウイルスベクターはウイルスベクターに優るいくつかの利点がある。特にそれらは病原性を欠いている。それらは特定の細胞型へ標的にした遺伝子運搬を可能にし、パッケージされる核酸分子のサイズに限定されない。遺伝子発現は、トランスフェクション複合体の核酸成分がエンドソームから、細胞液に無傷で放出され、次に核膜を横切り核転写機構にアクセスする時にのみ達成される。しかしながら、トランスフェクション効率は、核酸成分のエンドソーム分解、核酸が核に入るのに失敗すること、およびクラスリン被覆小孔から約１５０ｎｍより大きい凝集物の排除のために、ウイルスベクターに比べて一般的に悪い。
【００１１】
ベクターについての標的にするリガンドの望ましい性質は、それらが細胞表面の受容体に高い親和性および特異性で結合すべきであり、効果的なベクター自己化を媒介すべきことである。短いペプチドは標的リガンドとして特別な利点を有する。何故ならそれらは高純度で合成することが簡単であり、重要なことはインビボ使用でそれらが低い免疫原性を有するからである。
【００１２】
ＷＯ９８／５４３４７はインテグリン結合性成分、ポリカチオン性核酸結合成分および脂質成分を含む混合物を開示し、
（ｉ）核酸、特に問題の配列をコードする核酸、
(ii) インテグリン結合性成分、
(iii) ポリカチオン性核酸結合成分、および
(iv)脂質成分
を含むトランスフェクション複合体をも開示する。
トランスフェクション複合体は主としてインテグリン媒介トランスフェクションベクターである。
【００１３】
ＷＯ９８／５４３４７に記載された成分は静電的に会合し、ベクター複合体を形成すると考えられ、そのベクターはリポポリプレックス型である。ＷＯ９８／５４３４７のベクター複合体はある範囲の細胞系および初代細胞培養を高効率で、インテグリン特異的に低毒性でトランスフェクトすることが見出された。例えば血管平滑筋細胞を５０％の効率で、内皮細胞を３０％の効率で、造血細胞を１０％の効率でトランスフェクトする。更に、ラットの肺およびブタの肺の気管支上皮のインビボトランスフェクションはアデノウイルスベクターのそれと匹敵する効率を有することが示された。
【００１４】
遺伝子移転を媒介するインテグリン受容体を用いるベクターは、それらがインテグリン受容体が比較的広くゆきわたっているので、身体の多数の様々なタイプの細胞を標的にする利点を有する。例えば、ある環境においては、インビトロ処理においてはしかしながら、より特異的に受容者の細胞を標的にすることが好ましいかも知れない。
【００１５】
樹状細胞は免疫系のもっとも強力な抗原提示細胞であり、ナイーブなＴ細胞クローンを刺激することができる唯一の抗原提示細胞である。ナイーブなＴ細胞クローンはＭＨＣにより提示された抗原性ペプチドばかりでなく、共刺激分子を結合することも必要である。未熟な樹状細胞の主な機能は周囲の環境からの抗原取り込みである。危険シグナルに細胞がさらされると成熟が起こり、その細胞の機能は抗原取り込みからＭＨＣ分子上へのペプチド提示に変化する。これは樹状細胞のリンパ節への運搬と組み合わさる。樹状細胞がリンパ節内に入った時完全な成熟が起こり、成熟樹状細胞の注入または他の投与は細胞のホーミングの障害を起こす。
【００１６】
未熟な樹状細胞の形質導入またはトランスフェクションはサイトカイン遺伝子の導入を可能にし、免疫応答を増加させながら、それらが注入された環境から取り込んだペプチドの提示を可能にする。
【００１７】
非ウイルスベクターを用いる未熟な樹状細胞への形質導入の効率は、部分的には毒性のため低かった。アデノウイルスを用いる未熟な樹状細胞へのトランスフェクションの効率は、少なくとも部分的には、未熟な樹状細胞表面での主たるアデノウイルス受容体、コックスサッキー−アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）の少量のため高い力価を必要とした。非ウイルスベクターを用いて、効率は用いる脂質を変えることにより増加した、樹状細胞のアデノウイルス形質導入を増加させるために様々な戦略が試みられ、これには２特異的抗体断片（ｓｃFV） (Brandao 2003)を用いる標的化を含む。より少ないアデノウイルスとより短い形質導入時間は、臨床目的のための ｅｘ vivo形質導入のため好ましいであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
高められた細胞標的性を有する改良されたベクター複合体を提供するのが本発明の目的である。本発明は、従来のリガンドより、より細胞型選択的であるリガンドを有する合成の標的非ウイルス性ベクター複合体の開発に基づく。
【００１９】
効果的な標的ベクターの開発においては数個の異なる標的結合リガンドを用いることができるのが有用である。効果的な標的化されたトランスフェクションは良好な標的化ばかりでなくベクター核酸の標的細胞の核への効果的な同入をも必要とする。リガンドが標的化および標的細胞への結合において効果的であるとしても効果的な遺伝子トランスフェクションは必ずしも起こらない。その理由は現在明らかではない。したがって、標的細胞に効果的に結合するリガンドが効果的なトランスフェクションをもたらすかどうかに関しαある程度の非予測可能性がある。従って、有効なトランスフェクションリガンド選択されうるいずれかの特別な細胞表面受容体に対する利用可能なリガンドの「プール」を有することが望ましい。そのような選択は、例えばリポーター遺伝子を用いる遺伝子運搬アッセイにより、またはいずれかの他の適当な手段により起こりうる。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は特殊なアミノ酸モチーフを含むペプチドの同定に基づき、そのペプチドはヒトの未熟な樹状細胞に結合する。同定されたペプチドモチーフはヒト樹状細胞への結合を媒介し、他の型の細胞への結合をも媒介する。
【００２１】
本発明は、
ａ）ＰＸ1Ｘ2Ｘ3Ｔ（配列番号１）
ｂ）ＰＳＸ4Ｓ（配列番号２）
ｃ）ＱＸ5Ｘ6Ｘ7Ｑ（配列番号３）
ｄ）ＳＸ8Ｓ（配列番号４）
から選択されるアミノ酸配列を有する、よりなる、または含むペプチドに関する。
式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3は同一または異なっていてもよく、それぞれアミノ酸残基を表し、Ｘ4は、アミノ酸残基を表し、Ｘ5およびＸ7は同一または異なっていてもよく、それぞれアミノ酸残基を表し、そしてＸ6はアミド側鎖、例えばＮまたはＱを有するアミノ酸残基を表わし、Ｘ8は脂肪族側鎖、例えばＬまたはＩを有するアミノ酸残基を表す。
【００２２】
慣用の１文字省略をアミノ酸を表すために用いる。
【００２３】
本発明は、核酸または他の分子、例えば治療的にまたは薬学的に活性な分子、または細胞に対して検出可能な標識を含む分子であり得る物質を標的とする本発明のペプチドの使用を提供する。
【００２４】
本発明は、式Ａ−Ｂ−Ｃ
（式中、Ａは本発明のペプチドであり、Ｂは化学結合またはスペーサー要素であり、そしてＣは，ポリカチオン性核酸結合性成分である）
のペプチド誘導体をも提供する。
【００２５】
本発明は更に、
（ｉ）脂質成分
(ii）ポリカチオン性核酸結合性成分および
(iii）本発明のペプチド
を含むトランスフェクション混合物を提供する。
【００２６】
本発明は更に、
（ｉ）脂質成分
(ii）ポリカチオン性核酸結合性成分
(iii）本発明のペプチド
(iv)核酸
を含む非ウイルス性トランスフェクション複合体を提供する。
【００２７】
本発明のトランスフェクション混合物またはトランスフェクション複合体において成分(ii)および(iii)は、好ましくは本発明のペプチド誘導体の形である。
【００２８】
本発明はウイルスベクターをも提供し、そのベクターは本発明のペプチドを含む。
【００２９】
１つの態様において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターに、例えばアデノウイルスタイプ５のキャプシド中の繊維タンパク質のHI領域に、本発明のペプチドを導入することにより天然のCAR受容体から再標的化されたアデノウイルスである。
【００３０】
本発明は本発明のトランスフェクション混合物、トランスフェクション複合体、およびウイルスベクターの製造方法をも提供する。
【００３１】
本発明は更に医薬組成物を提供し、その組成物は医薬的に適当な担体と混合して、または結合して、トランスフェクション混合物、トランスフェクション複合体、またはウイルスベクターを含む。
【００３２】
本発明は更に、遺伝子の欠陥および／または欠乏によりヒトまたは非ヒト動物において起こる状態の治療または予防の方法を提供し、その方法はヒトまたは非ヒト動物に本発明のトランスフェクション複合体およびウイルスベクターを投与することを含む。
【００３３】
本願明細書で使用する「遺伝子の欠陥および／または欠乏」という用語は、遺伝子のコード領域における欠陥および／または欠乏のみならず、遺伝子の調節因子、例えばトランスおよびシスの調節因子の欠陥および／または欠乏、または直接的か間接的かを問わず遺伝子の転写または翻訳に関与するいずれかの他の因子の欠陥および／または欠乏をもしめす。
【００３４】
本発明はヒトまたは非ヒト動物の治療的予防的免疫化方法を提供し、その方法は、ヒトまたは非ヒト動物に対するアンチセンス核酸を含む本発明のトランスフェクション複合体、またはウイルスベクターを投与することを含む。
【００３５】
本発明は、アンチセンス治療の方法を提供し、その方法は、核酸がアンチセンス治療での使用に適した核酸である、ヒトまたは非ヒト動物に対する本発明のトランスフェクション複合体またはウイルスベクターを投与することを含む。
【００３６】
本発明は更に、医薬またはワクチンとしての使用のための本発明のトランスフェクション複合体またはウイルスベクターを提供する。
【００３７】
本発明は、ヒトまたは非ヒト動物において遺伝子の欠陥および／または欠乏により起こる状態の予防のための、治療的または予防的免疫化のための、またはアンチセンス治療のための薬剤の製造のための本発明のトランスフェクション複合体またはウイルスベクターの使用を提供する。
【００３８】
本発明は更に、
（ｉ）核酸
(ii)脂質成分
(iii)ポリカチオン性核酸結合性成分
(iv）本発明のペプチド
を含むキット；
（ｉ）核酸
(iii)ポリカチオン性核酸結合性成分
(iv）本発明のペプチド、
を含むキット；そして
(ii)脂質成分
(iii)ポリカチオン性核酸結合性成分
(iv）本発明のペプチド、
を含むキットを提供する。
【００３９】
本発明のキットにおいて、成分(iii)および(iv)は好ましくは上に記載したように本発明のペプチド誘導体の形である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
本発明は、特殊なアミノ酸モチーフを含むペプチドの同定に基づき、そのペプチドは樹状細胞に結合する。同定されたペプチドモチーフは、ヒトの未熟単球由来樹状細胞、およびヒト一次マクロファージ、Ｎ２ａ細胞（ニューロ２Ａ細胞ともよばれる）、マウス神経芽細胞腫細胞系、ＨＡＥｏ−細胞（ヒト気道上皮細胞系）、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝細胞細胞系）を含む他のタイプの細胞系、並びに骨髄由来樹状細胞およびＳｃａｌ＋ｖｅマウス幹細胞を含むマウス一次細胞への結合を媒介する。
【００４１】
本発明は、
ａ）ＰＸ1Ｘ2Ｘ3Ｔ（配列番号１）
ｂ）ＰＳＸ4Ｓ（配列番号２）
ｃ）ＱＸ5Ｘ6Ｘ7Ｑ（配列番号３）
ｄ）ＳＸ8Ｓ（配列番号４）
から選択されるアミノ酸配列を有する、よりなる、または含むペプチドに関する。
式中、Ｘ1、Ｘ2、およびＸ3は同一または異なっていてもよく、それぞれアミノ酸残基を表し、Ｘ4は、アミノ酸残基を表し、Ｘ5およびＸ7は同一または異なっていてもよく、それぞれアミノ酸残基を表し、そしてＸ6はアミド側鎖、例えばＮまたはＱを有するアミノ酸残基を表表わし、Ｘ8は脂肪族側鎖、例えばＬまたはＩを有するアミノ酸残基を表す。
【００４２】
ペプチドそれ自体に関する本発明の態様において、本発明は、そのペプチドは天然に存在する完全長タンパク質である、配列番号１，２，３または４のアミノ酸配列を含むペプチドを含まない。
【００４３】
慣用の１文字省略をアミノ酸を表すために用いる。そのシステムによればＡはアラニン、Ｒはアルギニン、Ｎはアスパラギン、Ｄはアスパラギン酸、Ｃはシステインまたはシスチン、Ｇはグリシン、Ｅはグルタミン酸、Ｑはグルタミン、Ｈはヒスチジン、Ｉはイソロイシン、Ｌはロイシン、Ｋはリシン、Ｍはメチオニン、Ｆはフェニルアラニン、Ｐはプロリン、Ｓはセリン、Ｔはトレオニン、Ｗはトリプトファン、ＹはチロシンおよびＶはバリンを表わす。本明細書では「Ｘ｝は、任意のアミノ酸を表わすために用いる。
【００４４】
ペプチドＰＸ1Ｘ2Ｘ3Ｔ（配列番号１）において、Ｘ2は、例えばＮまたはＬであり得、ペプチドＰＸＮＬＸＴ（配列番号３９）を与え、時々生ずるモチーフである（下記参照）。Ｘ1は例えばＳ，Ａ，またはＰであり得る。Ｘ3は例えばＳ，ＫまたはＴであり得、またはＡであり得る。
【００４５】
Ｘ2がＬであるペプチドＰＸ1Ｘ2Ｘ3ＴはＰＸ1ＬＸ3Ｔ（配列番号５）である。Ｘ1およびＸ3は同一または異なり、上に定義した通りである。例えば、Ｘ1はＳ，Ａ，またはＰ，例えばＡであり得る。例えば、Ｘ3はＳ，Ｋ，またはＹ，例えばＫであり得る。ＰＸ1ＬＸ3Ｔの例はＰＡＬＫＴ（配列番号６）である。
【００４６】
ペプチドＰＸ1Ｘ2Ｘ3Ｔ（配列番号１）においてＸ2はＮであり得、そのペプチドはＰＸ1ＮＸ3Ｔ（配列番号７）であり、時々起こるモチーフである（下記参照）。Ｘ3は例えばＳまたはＴ，例えばＳであり、ＰＸＮＴ/ＳＴ（配列番号４０）を与え、時々生ずるモチーフである（下記参照）。Ｘ1およびＸ3は同一または異なる。Ｘ1は例えばＳまたはＰ，例えばＳである。Ｘ1およびＸ3の両方がＳであり得る。ペプチドＰＸ1ＮＸ3Ｔの例はペプチドＰＳＮＳＴ（配列番号８）、およびＰＰＮＴＴ（配列番号９）である。
【００４７】
ペプチドＰＸ1Ｘ2Ｘ3Ｔ（配列番号１）はＮ末端および/またはＣ末端に１以上の更なる残基を含ンでもよい。例えば、ペプチドＰＸ1Ｘ2Ｘ3Ｔ、上記の配列番号１のいずれかは更なる残基、例えばＡまたはＹ残基を含んでもよい。そのようなペプチドはＰＸ1Ｘ2Ｘ3ＴＸ9（配列番号１０）を有し、Ｘ9はアミノ酸残基、例えばＡまたはＶを表す。そのようなペプチドの例はＰＸ1ＬＸ3ＴＸ9（配列番号１1）およびＰＸ1NＸ3ＴＸ9（配列番号１２）である。
【００４８】
独立に、ペプチドＰＸ1Ｘ2Ｘ3ＴはＮ末端に更なる残基を有してもよく、そのペプチドは配列Ｘ10ＰＸ1Ｘ2Ｘ3Ｔ（配列番号１３）（式中、Ｘ10はアスパラギン酸残基、例えばＡ、ＳまたはＴ残基を表す）を有する。
【００４９】
更なる残基がＮ末端およびＣ末端の両方に存在する場合、ペプチドＸ10ＰＸ1Ｘ2Ｘ3ＴＸ9のペプチド中でＸ10ＰＸ1Ｘ2Ｘ3ＴＸ9（配列番号１４）を有し、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ9、およびＸ10は上に与えた好ましい意味を有する。
【００５０】
更なる残基を有する配列番号１のペプチドの例はＡＰＳＮＳＴＡ（配列番号１５）、ＳＰＡＬＫＴＶ（配列16）、およびＳＴＰＰＮＴＴ（配列番号１７）を含む。そのようなペプチドの変異体はＮ−末端および／またはＣ末端残基が省略される。
【００５１】
ペプチドＰＳＸ4Ｓ（配列番号２）においてＸ4は、例えばＮまたはＬであり得る。ペプチドＰＳＸ4Ｓの例はＰＳＮＳ（配列番号１８）およびＰＳＬＳ（配列番号１９）を含む。
【００５２】
ペプチドＰＳＸ4Ｓは独立にＮ−末端および／またはＣ末端に１以上のアミノ酸残基、例えばＮ末端にＡまたはＬ残基を有し、ペプチドＸ11ＰＳＸ4Ｓ（配列番号２０）を与える（式中、Ｘ11はＡまたはＬを表す）。そのようなペプチドＡＬＰＳＸＳ（配列番号４１）であり，それは時々生ずるモチーフである。下記参照。そのようなペプチドにおいてＸ4はＮまたはＬであり得る。そのようなペプチドの例はＡＰＳＮＳ（配列番号２１）およびＬＰＳＬＳ（配列番号２２）を含む。
【００５３】
望ましいなら、１以上の更なる残基がＮ末端に、例えばＭＬＰＳＬＳ（配列番号２３）およびＰＭＬＰＳＬＳ（配列番号２４）におけるように、存在しうる。
【００５４】
ペプチドＱＸ5Ｘ6Ｘ7Ｑ（配列番号３）において、Ｘ6はＮまたはＱ残基であり得る。そのようなペプチドはＱＸＮ/ＱＸＱ（配列番号４２）であり、時々生ずるモチーフである。Ｘ3は例えばＫまたはＳであり得る。Ｘ5は例えばＰまたはＹであり得る。
【００５５】
ペプチドＱＸ5Ｘ6Ｘ7Ｑは、独立にＮ−末端および／またはＣ末端に１以上のアミノ酸残基を有しうる。ペプチドＱＸ5Ｘ6Ｘ7Ｑは、例えばＮ末端にＳまたはＦ残基を有し、Ｃ末端に独立にＭまたはＫ残基を有し得る。そのようなペプチドは例えば、ＳＱＫＮＰＱＭ（配列番号２５）およびＦＱＳＱＹＱＫ（配列番号２６）およびＮ−末端および／またはＣ末端残基が除かれている変異体を含む。
【００５６】
本発明の更なるペプチドはモチーフＳＸ8Ｓ（配列番号４）（式中、Ｘ8は脂肪族側鎖例えばＬまたはＩを有するアミノ酸残基である）を有する。そのようなペプチドＳＬ/ＩＳ（配列番号４３）であり、時々生ずるモチーフである。下記参照。ペプチドＳＸ8Ｓは独立にＮ−末端および／またはＣ末端に１以上のアミノ酸残基を有しえる。そのようなペプチドの例はＭＡＳＩＳＭＫ（配列番号２７）およびＮ−末端および／またはＣ末端残基の１以上が除かれる誘導体を含む。
【００５７】
本発明のペプチドは長さが３０までのアミノ酸であり得、またはより長くても良い。本発明のペプチドは少なくとも約５のアミノ酸を有するが、例えば配列番号２および３のペプチドの場合におけるようにより少なくても良い。一般的に本発明のペプチドは約６〜約３０のいずれかの数のアミノ酸を有する。ペプチドは６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２９，または３０のアミノ酸を有しえる。一般的に、本発明のペプチドは２５またはそれ以下のアミノ酸、例えば２０またはそれ以下、例えば１５またはそれ以下のアミノ酸を有しえる。例えば本発明のペプチドは１２のアミノ酸またはそれ以下、例えば１０アミノ酸またはそれ以下を有する。一般的に、本発明のペプチドは５またはそれ以上を有することが好ましい。例えば本発明のペプチドは６またはそれ以上のアミノ酸、例えば７またはそれ以上のアミノ酸を有する。配列番号２を含むペプチドの場合、最小の大きさは４アミノ酸であり；配列番号１を含むペプチドの場合、最小の大きさは５アミノ酸であり；配列番号３を含むペプチドの場合、最小の大きさは５アミノ酸である。一般的に、臨床的用途の場合、免疫原性反応を避けるために短いペプチドを用いるのが好ましい。
【００５８】
一般的に本発明のペプチドは、長さで１００またはそれ以下のアミノ酸、例えば５０またはそれ以下のアミノ酸であり、例えば１００のアミノ酸またはそれ以下、例えば９５のアミノ酸またはそれ以下、例えば９０のアミノ酸またはそれ以下、例えば８５のアミノ酸またはそれ以下、例えば８０のアミノ酸またはそれ以下、例えば７５のアミノ酸またはそれ以下、例えば７０のアミノ酸またはそれ以下、例えば６５のアミノ酸またはそれ以下、例えば６０のアミノ酸またはそれ以下、例えば５５のアミノ酸またはそれ以下、例えば５０のアミノ酸またはそれ以下、例えば４５のアミノ酸またはそれ以下、例えば４０のアミノ酸またはそれ以下、例えば３５のアミノ酸またはそれ以下、例えば３０のアミノ酸またはそれ以下がある。典型的にはそれらは上に記載した大きさを有する。
【００５９】
本発明のモチーフまたはペプチドのいずれかは公知の天然のタンパク質中に存在する限りでは（実施例４を参照）、ペプチドそれ自体に関する本発明の態様は、そのような公知の天然の完全長のタンパク質を含まない。
【００６０】
本発明のペプチドは環状領域を含み得る。例えば本発明のモチーフは、１またはそれ以上のジサルファイド結合を形成することができる２またはそれ以上のシステインにより隣接されうる。
【００６１】
ある場合には、ペプチドが上に記載したより大きいのが望ましい。本発明のペプチドは組み換えポリペプチドの部分または融合タンパク質、例えば所望の機能、例えばアフィニティクロマトグラフィーに適した配列を有するアミノ酸配列に融合したタンパク質の部分であり得る。融合タンパク質の更なる例は本発明のペプチドおよびウイルスキャプシドタンパク質または標的化された運搬のためのその領域、または標的目的のためペプチド表示を促進するタンパク質を含む。
【００６２】
更なる融合タンパク質は本発明のペプチドおよびウイルスキャプシドタンパク質またはそのサブユニットに対する抗体を含む。抗体成分はいずれの種類の抗体であっても浴、適当な抗原結合ドメインであってもよく、およびキメラまたはヒト化抗体であってもよく、それらに由来するモノでも良い。ウイルスベクターを再標的化する場合に用いうるそのような融合タンパク質は本発明の一部である。
【００６３】
本発明のペプチドは樹状細胞、特にヒト樹状細胞、例えば未熟なヒト樹状細胞およびマウス樹状細胞に結合する。従って本発明のペプチドはそのような細胞にたいする所望の物質を標的にするため用いられる。例えば本発明のペプチドは、核酸または樹状細胞に対する抗原を標的にするために用いうる。本発明のペプチドは樹状細胞に対する医薬的に活性な物質を標的にするのに用いうる。
【００６４】
樹状細胞のどの受容体に本発明のペプチドが結合するのかは未だ知られていない。しかしながら、本発明のペプチドが、ヒト一次マクロファージ、Ｎ２ａ細胞（Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞、マウス神経芽腫細胞系）、ＨＡＥｏ細胞（ヒト気道上皮細胞系）、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝細胞系）および骨髄由来樹状細胞およびＳｃａ１＋ｖｅマウス幹細胞を含む一次マウス細胞を含む他の細胞および他の種類の細胞にも結合することを我々は見出した。本発明のペプチドはそのような細胞に対して物質、例えば核酸、抗原、および医薬的に活性な物質を標的にするのに用いられ得る。
【００６５】
本発明のペプチドの同定および様々な細胞型に対するその結合は容易に、例えば全細胞フローサイトメトリー、例えばＦＡＣＳまたはファージの力価決定を用いるファージペプチドクローンスクリーニングアッセイにより、または問題のペプチドを有する再標的化アデノウイルスでの細胞の形質導入により、容易に決定しうる。
【００６６】
本発明のペプチド、例えば樹状細胞結合成分はオリゴマーペプチドのペプチドライブラリー、例えば、一般的に同じ長さのランダムペプチドオリゴマーのライブラリーからの選択により同定しうる。原理的にはオリゴマーペプチドはいかなる長さをも有し得るが、長すぎるペプチドは化学的合成の困難性を示し、インビボで免疫原性であり、一方短すぎるペプチドは結合ドメインを有しないかも知れない。一般的に適当な標的モチーフの例は約４〜約３０のアミノ酸残基を有するものである。下記参照。
【００６７】
以下の実施例で詳細に記載する研究において、繊維状のファージ粒子上に提示されるランダム７マー（７つのアミノ残基を有するペプチド）を用いた。用いたその７マーライブラリーはＣ７Ｃライブラリー、即ちシステイン残基により隣接されるランダム７マーペプチドであり、New  England  Biolabs  Incから得た。
【００６８】
上記の様に、本発明の樹状細胞結合ペプチドはシステイン残基により隣接され環化を可能にする長さ７つの残基のランダムペプチド配列を含むファージディスプレーライブラリーからの選択により同定した。そのような選択方法は一般的に知られている。そのような方法によれば、ファージの懸濁液を標的細胞とともにインキュベートする。非結合のファージを次に洗い去り、次に結合ファージを、残存細胞を低ｐＨの緩衝液で洗浄するか、細胞を溶解することにより抽出する。Ｅ．ｃｏｌｉを次に放出されたファージで感染させ。第一ラウンドのファージの製造物を得る。そのサイクルは繰り返し、例えば３回行い、標的にするファージを豊富にするためにストリンジェンシー条件は選択の後のラウンドでは、例えば洗浄工程の数を増加させる、溶出前に低ｐＨ洗浄を導入する、および培地ブロッカーでコートしたウエルで前選択することにより増加させうる。
【００６９】
ファージ増幅の連続したラウンドによる選択の後、樹状細胞に高い親和性を有するファージを更にホールセルフローサイトメトリーおよびファージ力価決定（titration）アッセイにより選択しうることを我々は見出した。
【００７０】
第一の実験において細胞溶解溶出Ｃ７Ｃファージから得たクローンのアミノ酸配列を表１に示す。
【表１】
2007527208.tif 000002
【００７１】
上にリストしたそれぞれのペプチドは上に記載したようにそのより長いおよびより短い誘導体と同様に本発明の部分である。
【００７２】
表１に示したファージクローンからの１６の結合配列の分析は、４つの最小モチーフ、即ちＰＸ1Ｘ2Ｘ3Ｔ（配列番号１）、ＰＳＸ4Ｓ（配列番号２）、ＱＸ5Ｘ6Ｘ7Ｑ（配列番号３）およびＳＸ8Ｓ（配列番号４）を同定した。これらは樹状細胞上の受容体への結合に重要な役割を果たしている可能性があると考えられる。ＰＸ1Ｘ2Ｘ3Ｔは、ＰＸＸＸＴＡ／Ｖ（配列番号３７）、ＰＸＮＸＴ（配列番号３８）、ＰＸＮ／ＬＸＴ（配列番号３９）、およびＰＸＮT／SＴ（配列番号４０）を含む数個のモチーフを含む。ＰＳＸ4Ｓに基づく時々起こるモチーフはＡ／ＬＰＳＸＳ（配列番号４１）であり、ＱＸ5Ｘ6Ｘ7Ｑに基づく時々起こるモチーフはＱＸＮ／ＱＸＱ（配列番号４２）である。ＳＬ／ＩＳ（配列番号４３はモチーフＳＸＳの時々起こる形である。
【００７３】
配列決定したクローンの中で４６％は上のモチーフの１またはそれ以上を含み、最も頻繁なクローンはＡＰＳＮＳＴＡであり３つの他のペプチド配列ＳＰＡＬＫＴＶ，ＳＴＰＰＮＴＴおよびＰＭＬＰＳＬＳとある程度の相同性を示す。
【００７４】
ファージを回収し、未熟な樹状細胞へのファージクローン結合の各ラウンドから力価決定した。その過程を要約すると、２ｘ１０11のブロックされたファージを５ｘ１０4のブロックされた単球由来の未熟な樹状細胞に氷上で１時間加えた後、細胞を３回ＰＢＳ−０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄し、ＴＢＳ  ｐＨ５．５でファージを溶出し、細胞を溶解し結合されて残っているファージを収穫した。細胞溶解により収穫したファージの数はプラーク生成単位（ｐｆｕ）として計算した。図１はいくつかの力価決定結果を示す。図１に示した結合したファージの配列決定は、ペプチドをＡＰＳＮＳＴＡ，ＱＬＬＴＧＡＳ，ＴＡＲＤＹＲＬ，ＦＱＳＱＹＱＫ，ＰＬＭＰＳＬＳ，ＦＰＲＡＰＨＨ，ＭＡＳＩＳＭＫ，ＤＷＷＨＴＳＡ，ＳＨＶＫＬＮＳおよびＳＰＡＬＫＴＶとして同定した。
【００７５】
未熟な樹状細胞に結合するファージクローンの力価決定の第三ラウンドからの細胞会合画分からの８１ファージクローンの配列決定は１６の様々な配列を同定した。表２を参照。
【表２】
2007527208.tif 000003
【００７６】
３つの最も頻繁なファージクローンは２１％（ＡＰＳＮＳＴＡ）、２０％（ＤＷＷＨＴＳＡ）および１２％（ＳＨＶＫＬＮＳ）存在し、残りは７％以下で存在する。ファージクローンからの１６の結合配列の分析は５つの最小モチーフ、即ちＰＸＮＴ／ＳＴ、ＰＸＸＸＴＡ／Ｖ、Ａ／ＬＰＳＸＳ、ＳＬ／ＩＳおよびＱＸＮ／ＱＸＱを同定した。表３参照。そのモチーフは樹状細胞上の受容体への結合に重要な役割を果たし得る。配列決定したすべてのクローンの内、４６％は１またはそれ以上のモチーフを含み、最も頻繁なクローンはＡＰＳＮＳＴＡであり、３つの他のペプチド配列とある程度の相同性を示す。表３参照。
【表３】
2007527208.tif 000004
【００７７】
同一のアミノ酸は太字でかつイタリックで、類似のアミノ酸はイタリックで示す。
【００７８】
たいていの場合、樹状細胞に結合するファージクローンの力価決定は、ペプチド挿入物を有するクローンは、細胞中に挿入物を有しないファージより、細胞により大きい程度で結合することを示した。２つのクローンＦＰＲＡＰＨＨおよびＭＡＳＩＳＭＫは、マウスの樹状細胞へのファージ結合の力価決定を含め、すべての力価決定において最高の数で結合した。プラスチックに対するファージ結合の数は試験したすべてのクローンについて低く、これらの実験における高力価により示されるファージ結合は細胞の結合のためであって、ウエルまたはブロッキング分子へのバックグラウンドの非特異的結合のためではないことを示唆する。
【００７９】
６の最も頻繁なクローン、即ちＡＰＳＮＳＴＡ，ＦＱＳＱＹＱＫ、ＤＷＷＨＴＳＡ、ＳＨＶＫＬＮＳ、ＳＰＡＬＫＴＶおよびＳＱＫＮＰＱＭでの５つの異なる樹状細胞ドナーからの樹状細胞へのファージ結合のＦＡＣＳ分析は、１つのクローンＳＰＡＬＫＴＶを除くすべてのクローンは挿入物を有しないファージクローンより高いパーセントの細胞に結合することが検出された。
【００８０】
結合のパターンは、ペプチドＡＰＳＮＳＴＡ、ＤＷＷＨＴＳＡ、およびＳＨＶＫＬＮＳを含むものと同様に樹状細胞に最高量で結合する３つのクローンを同定した。そのクローンも選択から３つの最も頻繁に単離されたものであった。試験した第２のセットの６つのクローン、即ちペプチドＱＬＬＴＧＡＳ、ＴＡＲＤＹＲＬ，ＰＭＬＰＳＬＳ，ＦＰＲＡＰＨＨ、ＭＡＳＩＳＭＫ，およびＳＴＰＰＮＴＴを含むものについては、すべてのクローンが挿入物を有しない対照より結合されたファージについて陽性のより高いパーセントの細胞を示した。ＱＬＬＴＧＡＳは他よりわずかに多い細胞に結合する。図３を参照。
【００８１】
１６ファージの配列のうちの５つ、即ちＳＨＶＫＬＮＳ（ペプチドＡ）、ＡＰＳＮＳＴＡ（ペプチドＢ）、ＭＡＳＩＳＭＫ（ペプチドＣ）、ＦＰＲＡＰＨＨ（ペプチドＤ）およびＤＷＷＨＴＳＡ（ペプチドＦ）は、それらが最も頻繁なクローンであり、ファージクローン結合のＦＡＣＳアッセイにおけるトップのバインダーであるという根拠に基づいて合成のために選択した。
【００８２】
表からモチーフがいくつかのクローンに存在することが見られる。これはこれらのモチーフが樹状細胞結合のために重要であることを示唆する。どの樹状細胞受容体にその配列が結合するのか現在のところ分からない。様々なモチーフが同じ受容体を標的にするかもしれないし、それらが樹状細胞上の異なる受容体を標的にするかも知れない。
【００８３】
良好な結合は、高いアフィニティ相互作用および／または細胞表面に多数存在する細胞表面受容体の結合を示す。
【００８４】
ペプチドＡ〜ＦをＤＮＡ結合[Ｋ]16ドメイン、ＧＡＣ（インターおよびＣ末端  ＣＧグループを有するコンストレインされた形で合成した。そのペプチド誘導体を、ＤＮＡおよび脂質を有するトランスフェクション複合体で未熟な樹状細胞をトランスフェクトするそれらの能力について試験した（「ＬＩＤ］または「リポポリプレックス」ベクター、Ｌは脂質を表わし、Ｉはペプチド誘導体を表わし、Ｄは核酸を表す）。結果を図４に示す。
【００８５】
ＦＡＣＳにより測定したリポーター遺伝子ＥＧＦＲに対して陽性の細胞のパーセントにより非最適化実験で測定した６日細胞におけるトランスフェクション効率、正の対照、ペプチド６（それはインテグリン結合ペプチドＲＲＥＴＡＷＡである）、および負の対照６Ｊ（ペプチド６のスクランブルバージョン）の約１．５倍のレベルまでファージ由来のペプチドＡ（ＳＨＶＫＬＮＳ）の使用により増加した。ペプチドＢ（ＡＰＳＮＳＴＡ）はペプチド６のそれと等しいトランスフェクションレベルを示した。図４ａ参照。個々のペプチドに対する条件の最適化はトランスフェクション効率の改良をもたらすかも知れない。トランスフェクトされた細胞のパーセントはおそらく樹状細胞におけるトランスフェクション過程の毒性効果のため５％に達しなかった。
【００８６】
リポフェクチンおよび４日の樹状細胞トランスフェクションを用いるＬＩＤフォーマットにおけるすべての５つのペプチド合成誘導体のトランスフェクション効率の比較は、Ａ，ＢおよびＤを最良のトランスフェクション効率を与えるものとして同定し、すべては樹状細胞の１０％以上をトランスフェクトし、ペプチドＣはその値の約半分を与え、ペプチドＦは劣って行われ、細胞の１％未満がトランスフェクトされた。図４ｂを参照。
【００８７】
ＦＡＣＳにより測定したリポーター遺伝子ＥＧＦＰに陽性の細胞のパーセントにより測定したトランスフェクション効率は、正の対照、ペプチド６，インテグリン結合ペプチドＲＲＥＴＡＷＡおよび負の対照ペプチド６Ｊ（ペプチド６のスクランブルバージョン）の約１．５倍のレベルまで、ファージ由来ペプチドＡ（ＳＨＶＫＬＮＳ）の使用により増加した。ペプチドＢ（ＡＰＳＮＳＴＡ）はペプチド６のそれと等しいトランスフェクションレベルを与えた。トランスフェクトされた細胞のパーセントは、おそらく樹状細胞におけるトランスフェクション過程の毒性効果により５％に達しなかった。
【００８８】
ＤＮＡ結合性[Ｋ]16ドメインと共に合成した４つのコンストレインされたペプチドＡ，Ｂ，ＣおよびＤを、商業的に利用できる脂質リポフェクチンおよびリポフェクタミンを含むリポポリプレックス（ＬＩＤ）トランスフェクションにおける４日の未熟な樹状細胞をトランスフェクトするそれらの能力について試験した。図５ａ参照。リポフェクチンを用いた場合、すべてのペプチドはペプチド６（インテグリン結合ペプチド）のそれ以上のトランスフェクション効率を得た。ペプチドＡは１７％という最高の効率を与え、ペプチドＢおよびＤは１１％の陽性の細胞を与え、Ｃは７％、ペプチド６およびペプチドなしの対照で達成されたより僅か２％上であった。脂質を用いなかった場合、トランスフェクションはペプチドＡについて１％未満であって、複合体の効率についての脂質の重要性を示す。
【００８９】
リポフェクタミン２０００は、３％の陽性の細胞を与えるペプチド６を除いてリポフェクチンより一般的に低いトランスフェクション効率、５および８％の間を与えた。毒性はすべての場合、４０および５３％の間で高く（図５ｂ参照）、リポフェクチンはペプチドＣおよびペプチドのない場合を除いて（その場合リポフェクタミン２０００はリポフェクチンより顕著に毒性が高い）リポフェクタミン２０００と類似の毒性レベルを与える。この毒性は実験の間変わり得、リポフェクチンは１７〜４６％の範囲で細胞死をもたらし、リポフェクタミン２０００は２６〜５３％の範囲で細胞死をもたらす。メタフェテンを製造者の指示に従って使用した場合、ずっと高いレベルの細胞死、７８〜８４％が見られ（データ示さず）、脂質の選択がトランスフェクション後の細胞死にひどく影響することを示唆する。
【００９０】
３日の樹状細胞のトランスフェクション効率は、７％ＥＦＰ陽性細胞で低く、対照ペプチド６（それは１４％の効率を与える）を除いて４日の樹状細胞よりかなり低い（図６ａ参照）。細胞死は２８％と４８％の間ですべての試料において高く、リポフェクチンはリポフェクタミン２０００より僅かに毒性が低い。図６ｂ参照。
【００９１】
標的ペプチドを用いる単球のトランスフェクションはペプチド６を用いるトランスフェクションに匹敵する効率を与え、ペプチドＡ，Ｂ，およびＤは再度最高のパーセントのトランスフェクトされた細胞を与えたが、レベルは４日樹状細胞より低く、僅か６％がＥＧＦＰ（ペプチドＡをリポフェクチンと組み合わす）について陽性の最高のパーセントであった。毒性は、ペプチドＦまたはペプチドなしがリポフェクチンと組み合わされた場合を除いて（その場合細胞死はそれぞれ２５％および２０％に上昇した）、５および１４の間の細胞死でかなり低かった（図７ｂ参照）。興味深いことにこれらはトランスフェクション効率が最低である条件であった。
【００９２】
未熟な４日の樹状細胞のトランスフェクションは細胞表面でのＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８６分子の上方調節をもたらし（図８参照）、樹状細胞の活性化が起こりつつあることを示す。ＥＧＦＰ陽性および陰性細胞の両方は上方調節されたマーカーを示し、すべてではないトランスフェクトされた樹状細胞は上方調節されたマーカーを示し、トランスフェクション過程はおよびＥＧＦＰの発現しないことは活性化の原因であることを示唆する。
【００９３】
ＬＰＳを用いるトランスフェクション後の樹状細胞の成熟はＬＰＳなしのトランスフェクトされた樹状細胞へのＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８６の類似の程度の上方調節を示したが、ＬＰＳとインキュベートしたトランスフェクトされない樹状細胞と比べて活性化の程度は小さく、トランスフェクションは活性化に僅かに阻害作用を有することを示唆する（図９更に）。４日または６日細胞に対するＬＰＳの添加は活性化レベルに小さい影響を有し、ＣＤ８６は、４日に比べて６日にＬＰＳとともに細胞をインキュベートする場合、僅かに小さい活性化を示した。
【００９４】
本発明のペプチド配列は、樹状細胞を用いて同定されたが、それらの有用性は樹状細胞での使用に限定されない。ペプチドが結合する受容体は他の細胞タイプにおいても発現しうる。本発明のペプチドが使用しうる細胞のタイプはいずれかの適当なスクリーニング方法で同定しうる。
【００９５】
例えば、トランスフェクションベクターにおけるペプチドＡおよびＢを、他の細胞系をトランスフェクトするそれらの能力について試験した。トランスフェクション効率を存在するタンパク質１ｍｇあたりのルシフェラーゼ活性により測定した。試験したすべての細胞系、即ち、ＨＭＥＣ−１，ＨＡＥｏ−およびＮ２ａ細胞において、ペプチドＡおよびＢの少なくとも１つがペプチド６，インテグリン標的ペプチドでみられたのと等しい、またはそれ以上のトランスフェクション効率を与えた。
【００９６】
ＨＭＥＣ−１細胞において、ペプチドＡはペプチド６で見られたのとほぼ等しいトランスフェクション効率を有し、ペプチドＢはペプチド６のそれの１．５倍効率を増加させることができる。図５参照。
【００９７】
ＨＡＥｏ−細胞においては、ペプチドＡは最高のトランスフェクション効率、ペプチド６でみられるものの約２倍を与え、ペプチドＢを用いる効率はペプチド６を用いるそれの１．５倍であった。図６を参照。
【００９８】
Ｎ２ａ（Ｎｅｕｒｏ２Ａ）細胞においては、ペプチドＡのみがペプチド６で見られるのと等しいトランスフェクション効率を与え、ペプチドＢはその値の半分以下の効率を有した。図７を参照。
【００９９】
更に、以下で詳細に記載する様に、本発明のペプチドはその普通の標的以外の細胞に対しウイルスベクターを再標的化するのに用い得る。
【０１００】
完全培地において１０００００ウイルス粒子／細胞で２つの異なったドナーからの未熟な樹状細胞に再標的化したＥＧＦＰ−リポーター遺伝子を有するアデノウイルス構築物の遺伝子導入をＦＡＣＳにより測定した。両方のドナーにおいて、ペプチドＡまたはペプチドＢでアデノウイルスを再標的化することは、６４および７９％の間の形質導入効率を得、両方は類似の効率であり、両方はキャプシドにおける野生タイプの繊維タンパク質（４３および４６％の間陽性）、ＫＯ１繊維タンパク質（０．７および１．４％の間）、および無関係なペプチドを有する繊維タンパク質（１２および２０％の間）を有するアデノウイルスと比べて顕著に高いパーセントの細胞を形質導入した。顕著な毒性はいずれの形質導入でも見られず、その細胞死は５および１５％の間で測定された（図８参照）。
【０１０１】
同じウイルスベクターを用いて、２．５％の血清中の１００００ウイルス粒子／細胞でヒト単球由来一次マクロファージの形質導入も、ペプチドＡ（６７．６％の細胞が形質導入された）またはペプチドＢ（３４．６％の細胞が形質導入された）をウイルスのこと中に導入することは野生タイプの繊維タンパク質（１３．３％）またはＫＯ１繊維タンパク質（９．２％細胞が形質導入された）を有するウイルスにみられる以上の形質導入の効率を顕著に増加させた（図８参照）。
【０１０２】
すべての他の細胞タイプにおいて、そして同じウイルスベクターを用いて、ウイルスをＯｐｔｉＭＥＭにおいて細胞あたり１０，０００粒子で添加した場合、ペプチドＡまたはペプチドＢを有するウイルスは、野生タイプの繊維タンパク質、ＫＯ１繊維タンパク質、および無関係なペプチドを有する繊維タンパク質を有するウイルスより顕著に高い形質導入効率をもたらした。
【０１０３】
Ｎ２ａ細胞において、ペプチドＡを有するウイルスは６３．５％の形質導入された細胞を、ペプチドＢは５３．７％の形質導入された細胞を作ったが、野生タイプのウイルスは２４．３％を、ＫＯ１ウイルスは１．４％を、および無関係なペプチドウイルスは１．３％を形質導入した。
【０１０４】
ＨＡＥｏ−細胞において、ペプチドＡは８２．９％の形質導入された細胞を、ペプチドＢは７９％の形質導入された細胞を作ったが、野生タイプの繊維タンパク質を有するウイルスは４５．８％を、ＫＯ１ウイルスは２％を、および無関係なペプチドを有するウイルスは３．２％を形質導入した。
【０１０５】
同じパターンの形質導入効率はＨＭＥＣ細胞（ペプチドＡ  ９５．７％、ペプチドＢ９４．２％、野生タイプ７３．３％、ＫＯ１  ２．７％、および無関係２５．１％）およびＨｅｐＧ２細胞（ペプチドＡ  ８８．５％、ペプチドＢ  ７９．７％、野生タイプ６３．８％、ＫＯ１  １．７％、および無関係９．７％）について見られた。
【０１０６】
ペプチドＳＨＶＫＬＮＳまたはＡＰＳＮＳＴＡのアデノウイルスＨＩループへの導入は、一次マウス樹状細胞の形質導入効率を、それぞれ７１．７％および５４．１％まで増加させ、レベルは野生タイプのＡｄ５（１３．５％）（表６参照）より顕著に良好であった。マウスのＳｃａｌ陽性の幹細胞のずっと低い形質導入効率がすべてのアデノウイルス試料で達成され、ＳＨＶＫＬＮＳまたはＡＰＳＮＳＴＡで再標的化されたアデノウイルス５．４５という最良の形質導入効率、Ａｄ５ウイルス２．２％を形質導入し、ＫＯ１は０．６％を形質導入した。ネズミ科の神経芽腫細胞（Ｎｅｕｒｏ−２Ａ）も野生タイプウイルスより効率的に形質導入され、野生タイプウイルスについての２４％と比べてＳＨＶＫＬＮＳおよびＡＰＳＮＳＴＡ再標的化ウイルスについてそれぞれ６３．５％および５３．７％のＧＦＰ陽性の細胞を作った。
【０１０７】
ＬＰＳに反応して成熟する樹状細胞の能力を、５つの成熟マーカー；ＨＬＡ−ＤＲ，ＣＤ４０，ＣＤ８３およびコスチミュラトリー分子ＣＤ８０およびＣＤ８６を研究することにより、ウイルス的に形質導入したおよび形質導入しない試料で測定した。すべての５のマーカーのレベル（フローサイトメトリーで試験）は、ＬＰＳにより形質導入しない細胞の成熟に基づいて増加した。表１１参照。
【０１０８】
本発明は式Ａ−Ｂ−Ｃのペプチド誘導体を提供し、式中、Ａはポリカチオン性核酸結合成分であり、Ｂは化学結合またはスペーサー要素であり、Ｃは本発明のペプチドである。
【０１０９】
ポリカチオン性核酸結合成分ＡはＤＮＡまたはＲＮＡに結合できるいずれかのポリカチオンである。ポリカチオンはポリカチオンそのものでも良いが、ＤＮＡまたはＲＮＡに結合する能力が保持されるならいずれかの数のカチオン性モノマー有しても良い。例えば、３〜１００のカチオン性モノマーが存在してもよく、例えば１０〜２０，例えば１４〜１８，例えば約１６のカチオン性モノマーが存在しても良い。
【０１１０】
核酸結合ポリカチオン分子の例は１またはそれ以上のカチオン性アミノ酸を含むオリゴペプチドである。そのようなオリゴペプチドは例えば、３〜３５，例えば５〜２５のリシン残基、例えば１０〜２０リシン残基、例えば１４〜１８のリシン残基、例えば１６のリシン残基を有するオリゴリシン分子、例えば３〜３５の、例えば５〜２５の，例えば１０〜２０の、例えば１４〜１８、例えば１６のヒスチジンまたはアルギニンを有するオリゴヒスチジン分子またはオリゴアルギニン分子、またはヒスチジン、アルギニン、リシン残基のいずれかの組み合わせを含み、例えば、全体で３〜３５の、例えば５〜２５，好ましくは例えば１０〜２０、例えば１４〜１８、例えば１６残基を有する組み合わされたオリゴマーでありえる。
【０１１１】
例えば３〜３５の，例えば２〜２５のリシン残基、例えば１０〜２０のリシン残基、例えば１３〜１９の、例えば１４〜１８のリシン残基、例えば１５〜１７の、例えば１６の残基、即ち[Ｋ]16を有するオリゴリシン（「Ｋ］はリシンを示す）が特に好ましい。
【０１１２】
ポリカチオン性成分の更なる例は、デンドリマーおよびポリエチレンイミンを含む。ポリエチレンミン（ＰＥＩ）は非毒性の架橋性のカチオン性ポリマ−であり、遺伝子運搬可能性を有する(Proc. Natl. Acad. Sci., 1995, 92, 7297-7301)。ポリエチレンミンはＦｌｕｋａ（８００ｋＤａ）またはＳｉｇｍａ（５０ｋＤａ）から、またはＰｏｌｙＰｌｕｓ−トランスフェクション（Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、フランス）からトランスフェクション目的のためにあらかじめ希釈されて入手できる。典型的には、ＰＥＩはｐＨ５〜８で、ＤＮＡの９倍過剰に用いられた場合最も有効であり、過剰比はＰＥＩ窒素：ＤＮＡ燐酸として計算される。そのようなパラメーターは当業者によく知られた方法で最適化される。
【０１１３】
ポリカチオン性核酸結合成分は、本発明のペプチドと結合するかさもなければ付着してＡ−Ｂ−Ｃ（式中、Ｃは本発明のペプチドを表わし、Ｂは結合またはスペーサー要素を表わし、Ａはポリカチオン性核酸結合成分を表わす）のペプチド誘導体を形成しうる。ポリカチオン性成分はペプチドのいずれかの適当な位置で結合しうる。ポリカチオン性核酸結合成分は例えば本発明のペプチドに化学的に直接結合してもよい。その場合成分Ｂは化学結合を表す。例えば本発明のペプチドはペプチド結合により、例えばオリゴリシンポリカチオン性核酸結合成分の場合は結合してもよい。本発明のペプチド誘導体の例は例えば本発明のペプチド、例えば上記のペプチドにペプチド結合により結合した、オリゴリシン、例えば[Ｋ]16である。本発明のペプチド誘導体の更なる例は本発明のペプチド、例えば上記のペプチドに共有結合により結合したポリエチレンイミンである。そのような共有結合は例えば、当業界で知られた方法、例えばGene Therapy, 1999, 6, 138-145を用いるジサルファイド橋またはスクシンイミヂル橋であり得る。
【０１１４】
他の態様では、本発明のペプチドはスペーサーを介してポリカチオン性核酸結合成分に結合し、本発明のペプチド誘導体を形成してもよい。
【０１１５】
スペーサー要素は一般的にペプチドである、即ちそれはアミノ酸残基を含む。そのアミノ酸は天然のまたは非天然であり得る。それらはＬ−またはＤ−立体配置を有し得る。スペーサーは２以上のアミノ酸を有しうる。それは例えば３以上、例えば４以上、例えば５以上、例えば１０までのアミノ酸残基またはそれ以上のアミノ酸残基を有し得る。アミノ酸は同一でも異なってもよいが多数のリシン残基（またはベクター複合体のポリカチオン性核酸結合成分での使用に適する他のカチオン性アミノ酸）の使用は、オリゴリシン配列はポリカチオン性核酸結合成分としての活性を有するので一般的にスペーサーにおいては避けるべきである。
【０１１６】
スペーサーは例えばジペプチドグリシン−グリシン（ＧＧ）またはグリシン−アラニン（ＧＡ）で有り得る。一般的にはスペーサーはジペプチドスペーサーＧＧおよびＧＡより長くおよび／または疎水性であるのが好ましい。
【０１１７】
スペーサーはジペプチドＧＧおよびＧＡより疎水性で有り得る。例えばグリシンおよびアラニンより疎水性であるアミノ酸を用い得る。疎水性アミノ酸の例はよく知られ、ε−アミノヘキサン酸を含む。
【０１１８】
スペーサーはジペプチドＧＧおよびＧＡより長くまたは疎水性であり得、より長くまたはより疎水性で有り得る。後者のタイプのスペーサーの例はＸＳＸＧＡ（式中、Ｓはセリン、Ｇはグリシン、Ａはアラニン、Ｘはε−アミノヘキサン酸である）。このスペーサーは高度に疎水性である。
【０１１９】
組み合わせたペプチド／ポリカチオン性核酸結合成分、即ち本発明のペプチド誘導体は以下で成分「Ｉ」と呼ぶ。
【０１２０】
本発明は、
(i)脂質成分
(ii)ポリカチオン性核酸結合性成分、および
(iii）本発明のペプチド
を含むトランスフェクション混合物を更に提供する。
【０１２１】
本発明は、
(i)脂質成分
(ii)ポリカチオン性核酸結合性成分、
(iii）本発明のペプチド、および
(iv)核酸
を含む非ウイルストランスフェクション複合体をも更に提供する。
【０１２２】
本発明のトランスフェクション混合物またはトランスフェクション複合体において、成分(ii)および(iii)は、好ましくは例えば上記のように本発明のペプチド誘導体の形である。
【０１２３】
本発明のトランスフェクション混合物またはトランスフェクション複合体の脂質成分はカチオン性リポソームであるかカチオン性リポソームを形成しうる。
【０１２４】
脂質成分はカチオン性脂質および膜不安定化またはフソジェニック性を有する脂質、特にカチオン性脂質および膜不安定化性を有する脂質の組み合わせ、より選択される１以上の脂質であり、または脂質を含む。
【０１２５】
好ましい脂質成分（「Ｌ］）は、中性の脂質ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（本願明細書で「ＤＯＰＥ］と呼ぶ）であるか、または含む。ＤＯＰＥは膜不安定化の性質を有し、時には「フソジェニック（fusogenic）」と呼ばれる(Farhood et al. 1995)。他の脂質、例えば膜不安定化性、特にDOPEのそれのように膜不安定化性を有する中性の脂質はＤＯＰＥの代わりに、または同様に用い得る。
【０１２６】
少なくとも１つの長鎖アルキル基を有する他のリン脂質、例えばジ（長鎖アルキル鎖）ホスホリピッドを用い得る。リン脂質はホスファチジル基、例えばホスファチジルアルカノールアミン基、例えばホスファチジル−エタノールアミン基を含み得る。
【０１２７】
更なる好ましい脂質成分はＮ−〔１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル〕−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（本明細書では「ＤＯＴＭＡ］と言う）であり、または含む。ＤＯＴＭＡはカチオン性を有する。他のカチオン性脂質、特にＤＯＴＭＡと類似の性質を有するカチオン性脂質もＤＯＴＭＡに加え、または代わりに用い得る。そのような脂質は例えば３つの短鎖アルキル基と１つの長鎖アルキルにより置換された４級アンモニウム塩である。短鎖アルキル基は同一または相異なり得、メチルおよびエチル基より選択しうる。少なくとも１つのそして３つ迄の短鎖アルキル基はメチル基でありえる。長鎖アルキル基は直鎖または分枝鎖、例えばジ（直鎖アルキル）アルキル基を有し得る。
【０１２８】
他の好ましい脂質成分は、脂質２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−〔２-（スペルミジンカルボキサミド）エチル〕−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオリドアセテート（本明細書では「ＤＯＳＰＡ］と言う）であるか、含む。類似の脂質ＤＯＳＰＡに加えて、またはその代わりに、特にＤＯＳＰＡと類似の性質を有する脂質を用い得る。そのような脂質は例えばＤＯＳＰＡにおけるそれとは異なる短鎖を有する。
【０１２９】
好ましい脂質成分はＤＯＰＥおよび１以上の、例えば上に記載した脂質成分を含む。特に好ましいのはＤＯＰＥおよびＤＯＴＭＡの混合物を含む脂質成分である。そのような混合物はカチオン性リポソームを形成する。ＤＯＰＥおよびＤＯＴＭＡの等モル混合物は特に効果的であることが解っている。そのような混合物は「リポフェクチン」として一般的に知られ、「リポフェクチン」の名前で商業的に利用できる。用語「リポフェクチン」はＤＯＰＥおよびＤＯＴＭＡの等モル混合物を示すのに一般的に用いる。リポフェクチンと似た性質を有するカチオン性リポソームである他の脂質混合物は用いうる。リポフェクチンは試験したすべての細胞タイプで効果的であるので特に有用である。
【０１３０】
更に好ましい脂質成分はＤＯＰＥおよびＤＯＳＰＡの混合物を含む。そのような混合物もカチオン性リポソームを形成する。重量比３：１のＤＯＳＰＡ：ＤＯＰＥのＤＯＰＥおよびＤＯＳＰＡの混合物は特に効果的である。膜濾過した水中のそのような混合物は「リポフェクタミン」、例えばリポフェクタミン２０００の名で商業的に利用できる。ＤＯＰＥ，ＤＯＴＭＡおよびＤＯＳＰＡを含む混合物は、例えばリポフェクチンおよびリポフェクタミン混合物は用い得る。
【０１３１】
他のカチオン性脂質例えばＤＯＴＡＰ（Beringer-Mannheim）およびTfx範囲（Promega)中の脂質は商業的に利用できる。DOTAPはN-〔1-（2，3-ジオリルオキシ）プロピル〕−N,N,N-トリメチルアンモニウムメチルサルフェートである。Tfx試薬は合成カチオン性脂質、N,N,N',N'-テトラメチル−N,N'-ビス（２−ヒドロキシエチル）−２，３−ジ（オレイルオキシ）−１，４−ブタンジアンモニウムおよびＤＯＰＥの混合物である。すべての試薬は同量のカチオン性脂質成分を含むが、異なるモル量のfusogenic脂質液、DOPEを含む。
【０１３２】
しかしながら、リポフェクチンとリポフェクタミンは、ＤＯＴＰＡおよびＴｆｘ試薬より核酸で細胞のトランスフェクションを促進するのに著しくより効果的であるようである。
ＷＯ  ０３／０９４９７４（ＰＣＴ／ＧＢ０３／０１９８５）は数個の脂質を記載する。そのような脂質はジカチオン性脂質、カチオン中心の間にスペーサーを導入するＰＥＧをベースとする脂質、およびエリスリトールをベースとする脂質を含む。
【０１３３】
ＷＯ  ０３／０９４９７４に記載された脂質の２つは、一般式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する：
【化１】
2007527208.tif 000005
（式中、
Ｘ1およびＸ2は同一または異なり、−ＯＣＨ2−および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−から選択され；
Ｒ1およびＲ2は同一または異なり、直鎖または分枝の、飽和または不飽和のＣ7〜Ｃ24カルビル基であり、ヒドロキシ、ハロゲンおよびＯＲ’から選択された１以上の置換基により置換され置換されず、Ｒ’はＣ1〜Ｃ6のヒドロカルビル基であり；
それぞれのＲ3およびＲ4は同一または異なり直鎖または分枝の、飽和または不飽和のＣ1〜Ｃ10ヒドロカルビル基であり、ヒドロキシ、ハロゲン、ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ．−ＣＮ，ＮＲ’Ｒ”，および−Ｃ（Ｏ）Ｒ”から選択される１以上の置換基により置換されまたは置換されず、Ｒ’およびＲ”は同一または異なり、Ｃ1〜Ｃ6のヒドロカルビル基である）
【化２】
2007527208.tif 000006
（式中、
Ｘ1およびＸ2は同一または異なり、上に定義した通りである。
Ｒ1およびＲ2は同一または異なり、上に定義した通りである。
Ｒ5は−Ｎ+（Ｒ3）2−Ｒ6（各Ｒ3は同一または異なり、上に定義した通りである）である。
Ｒ6は
（ａ）−［Ａ−Ｙ−］−nＲ４
（式中、
各Ｙは同一または異なり、−Ｎ+（Ｒ4）2−であり、Ｒ4は上に定義した通りである
各ＡはＣ1-20アルキレン基であり、ヒドロキシ、ハロゲン、ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＮ，ＮＲ’Ｒ”，および−Ｃ（Ｏ）Ｒ”から選択される（Ｒ’およびＲ”は同一または異なり、Ｃ1〜Ｃ6のヒドロカルビル基である）１以上の置換基で置換されまたは置換されない。
ｎは１〜１０である）、または
(b) −[B-O-]-mB−Q
各Ｂは同一または異なり、ヒドロキシ、ハロゲン、ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ．−ＣＮ，ＮＲ’Ｒ”，および−Ｃ（Ｏ）Ｒ”から選択される（Ｒ’およびＲ”は同一または異なり、Ｃ1〜Ｃ6のヒドロカルビル基である）１以上の置換基で置換されまたは置換されないＣ1-10アルキレン基であり、
ｍは１〜１０であり；
Ｑは−Ｎ+（Ｒ3）3、−ＯＨ，ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’，およびハロゲンから選択され、Ｒ３およびＲ’は上に定義した通りである。）
である。
【０１３４】
ＷＯ  ０３／０９４９７４は構造式ＩＩＩを記載し、それはエリスリトールをベースにした脂質である。
【化３】
2007527208.tif 000007
（式中、
Ｒは，同一または異なり、
（ａ）Ｈ，
（ｂ）−ＣＨ2−Ｎ+（Ｒ2）2−ＣＨ2−ＣＨ2−［Ｙ−（ＣＨ2）ｐ］ｑ−Ｚ、または
（ｃ）−ＣＨ2−Ｎ+（Ｒ4）3
である。但し１つのＲはＨで、他は基（ｂ）であるか、両方のＲが（ｃ）群である。
Ｘは同一または異なり、ＯＣＨ2またはＯ−Ｃ（Ｏ）である。
Ｒ1は同一または異なりＣ７〜Ｃ２３の飽和または不飽和鎖である。
Ｒ2は同一または異なりＣ１〜Ｃ６の飽和または不飽和鎖である。
ＹはＮＨ，ＣＨ２，Ｏ，またはＮ（アセチル）である。
ＺはＯ（Ｃ1〜Ｃ4），ＯＣ（Ｏ）Ｒ3，Ｎ+Ｒ34，ＯＨ，Ｆ，Ｃｌ，ＢｒまたはＩでる（Ｒ3はＣ１〜Ｃ６アルキルである）である。
Ｒ4は同一または異なり、Ｃ１〜Ｃ６鎖である。
ｎは２，３，または４である。
ｍは１〜２００であり、それが少なくとも２の場合、生じた繰り返し単位は同一または異なる）
【０１３５】
ＷＯ  ０３／０９４９７４に記載された脂質のいずれも本発明による脂質成分として、または本発明による脂質成分の１要素として用いてもよく、例えば上記の  ＷＯ  ０３／０９４９７４による脂質は他のいずれかの脂質成分、例えば上に記載した好ましい脂質の１つと組み合わせて使用してもよい。好ましい比は例えば上に記載した通りである。
【０１３６】
本発明のトランスフェクション複合体の核酸成分は例えば天然源から得てもよく、組換え的にまたは化学合成により製造しうる。
【０１３７】
核酸成分は例えば特殊な機能を有する分子、例えば各標的分子よりなるか、または含む。核酸はＤＮＡまたはＲＮＡで有り得る。ＤＮＡは単鎖または２本鎖で有り得る。核酸配列は、遺伝子治療において、遺伝子ワクチンにおいて、またはアンチセンス治療における使用に適している。核酸は特定の遺伝子治療に対する標的であり得るか、関係しうるか、または遺伝子ワクチンとして、またはアンチセンス治療剤として機能できる分子で有り得る。核酸は完全なコード配列であり得るか、対応し得、コード配列の部分であり得る。
【０１３８】
或いは、核酸は商業的に有用な、例えば産業的にまたは科学的に有用なタンパク質、例えば酵素であるタンパク質をコードしうる。それは例えば薬剤またはワクチンとして治療的にまたは予防的に使用できる医薬的に有用なタンパク質であり、タンパク質はＥＬＩＳＡにおける使用のための抗原として診断的に有用である。商業的に有用なタンパク質を製造できる宿主細胞は時に「細胞工場」と呼ばれる。
【０１３９】
発現されるべき核酸配列の場合には適当な転写および翻訳調節因子が一般的に提供される。
【０１４０】
核酸は一般的にはＤＮＡであるが、ＲＮＡはある場合、例えば癌ワクチンにおいて用いられる。核酸成分は以下で「プラスミド成分」または成分「Ｄ］と呼ぶかも知れない。
【０１４１】
遺伝子治療および／または遺伝子ワクチンにおいて用いることができる核酸の例は、タンパク質のコード配列、ｃＤＮＡコピー、およびそのゲノムバージョン（イントロンそしてまたエクソンを含む）、調節上流および下流配列を含む。他の有用な核酸は遺伝子修復および相同的組換えに関与する配列である。これらは、ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ(Bandyopadhyay et al., 1999; Cole-Strauss et al., 1996; Kren et al., 1998; Yoon et al., 1996)またはＤＮＡオリゴヌクレオチド(Goncz et al., 1998)であり得る。有用な核酸はプラスミドに含まれる短い配列、またはプラスミドまたは核酸の組み込みを媒介する他の大きい核酸、例えばファージインテグラゼ(Groth et al., 2000; Olivares et al., 2001; Stoll et al., 2002; Thyagarajan et al., 2000; Thyagarajan et al., 2001)および「眠れる美」トランスポゾン(Yant et al., 2000)であり得る。
【０１４２】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドはアンチセンス調節(Bachmann et al., 1998; Knudsen and Nielsen, 1997; Mannion et al., 1998; Woolf et al., 1995)の目的で、または転写因子デコイ(Ehsan et al., 2001; Ehsan et al., 2002; Mann et al., 1999; Morishita et al., 1995)として運搬される。ＣｐＧリッチなオリゴヌクレオチド配列はブーストワクチン反応に対するアジュバンドとして有用であり得る(Krieg et al., 1995)。
【０１４３】
遺伝子治療で用いることができる他の重要な新しい種類の分子は、スモール・インターフェアリングＲＮＡである。上で説明したように、哺乳動物細胞におけるＲＮＡインターフェアレンスは、高度の特異性を有する遺伝子発現の調節への重要な新しいアプローチとして過去２または３年内に出現した(レビユー Shi 2003)。スモール・インターフェアリングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られる長さ２０−３０ｎｔの２本鎖ＲＮＡ分子はｍＲＮＡの相同的領域を標的にする。次にそれらはｍＲＮＡ標的を崩壊へと導く保存された経路を活性化する。ｓｉＲＮＡの作用の正確なメカニズムは熱心な研究中であるが、ｓｉＲＮＡの哺乳動物への適用は機能的ゲノムの分野を革命化する可能性を有する。簡単に、効果的に、特異的に哺乳動物における遺伝子の発現をした方調節する能力は巨大な科学的、商業的、および治療的可能性を保持する。
【０１４４】
現在効果的なｓｉＲＮＡ標的を予測する方法はないので多数の配列のスクリーニングがおこなわれ多数の可能性のある分子をスクリーニングしなければならない。そのようなスクリーニングは非ウイルスベクターにより運搬される化学的に合成したｓｉＲＮＡ分子を用いて最も便利に行われる。サブシークエントスクリーニングのためのｓｉＲＮＡ分子をトランスフェクトするための本発明のトランスフェクション複合体の使用は従って費用効果性そしてまたより大きい機能性の利益を提供する。ｓｉＲＮＡ分子は治療的にも使用しうる。そのようなトランスフェクションおよびｓｉＲＮＡのその後のスクリーニングは本発明の部分である。
【０１４５】
本発明のペプチドのトランスフェクションの効率、ポリカチオン性核酸結合成分、本発明のペプチド誘導体、脂質成分、またはそれらのいずれかの組み合わせは本明細書に記載した方法を用いて容易に決定しうる。
【０１４６】
トランスフェクションベクターとして上記したトランスフェクション複合体を用いるトランスフェクションの効率は脂質成分：ペプチド／ポリカチオン性核酸結合成分の比、即ち本発明のペプチド誘導体：ＤＮＡまたはＲＮＡの比により影響される。トランスフェクトされるべきいずれかの個々の細胞タイプに対する成分のいずれかの選択された組み合わせについて、最適比は異なる割合の成分を混合し、その細胞タイプについて例えば上記のように測定することにより簡単に測定できる。
【０１４７】
リポフェクチンおよびリポフェクタミンが上記したシステムにおいてトランスフェクションを高めるのに特に効果的であるようである。リポフェクチンは非常に少量のみが必要であるという利点を有する。生じ得るいずれかの副作用は従って最小化される。ＷＯ  ０３／９４９７４に記載されたカチオン性脂質も特に効果的である。
【０１４８】
脂質およびＤＮＡ成分の間の適当な重量比は０．７５〜４：１で有り得る。０．７５：１の比が適当であることが見出された。いずれかのあるトランスフェクション実験においてこの比は当業者に知られた方法で最適化されうる。
【０１４９】
本発明のトランスフェクション混合物は、成分（ｉ）、脂質成分、成分(ii)、ポリカチオン性核酸結合成分、成分(iii)本発明のペプチドを混合することにより製造されうる。上記のトランスフェクション複合体は（ｉ）、(ii)、(iii）および(iv）を混合することにより製造しうる。成分(ii)および(iii）は好ましくは本発明のペプチド誘導体の形である。
【０１５０】
成分はいずれの順序で混合してもよいが、脂質成分は最後に加えないことが一般的に好ましい。ペプチド誘導体を用いる場合、次の順序：脂質成分；ペプチド誘導体；ＤＮＡまたはＲＮＡ成分、で成分を混合する、即ち脂質成分とペプチドを混合し最後に核酸成分を脂質／ペプチド混合物を混合することが好ましい。
【０１５１】
ペプチド誘導体および脂質成分を含むトランスフェクション混合物を用いて、核酸のトランスフェクション混合物での導入、例えば混合により核酸を含むトランスフェクション複合体を作りうる。或いは、トランスフェクション混合物を核酸成分ではなくポリカチオン性核酸結合成分、例えばタンパク質を含むベクター複合体の製造に用い得る。
【０１５２】
本発明のトランスフェクション混合物は一般に４℃での貯蔵に安定である。従って、トランスフェクション混合物をバルクで作って、必要に応じ、必要な場合トランスフェクション混合物の部分を用いて選択した核酸を導入するトランスフェクション複合体を製造するのが便利である。
【０１５３】
本発明のトランスフェクション混合物は脂質成分として等モル混合物のＤＯＰＥおよびＤＯＴＭＡ（リポフェクチン）、本発明のペプチド、特に本発明のペプチド誘導体、例えば［Ｋ］16ペプチドを好ましくは含む。上記のスペーサーはペプチド誘導体中に存在してもよい。好ましいモル比、リポフェクチン：ペプチド誘導体は０．７５：４である。
【０１５４】
本発明のトランスフェクション混合物の個々の成分はそれぞれ本明細書に記載する。トランスフェクション混合物およびトランスフェクション複合体について、好ましい成分、好ましい成分の組み合わせ、好ましい成分の比、および好ましい混合順序およびその製造は本明細書に記載する。
【０１５５】
本発明は更に、
（ｉ）核酸、
(iii）ポリカチオン性核酸結合成分、および
(iv）本発明のペプチド
を含む非ウイルストランスフェクション複合体を提供する。
【０１５６】
本発明のペプチドを含むトランスフェクション複合体によりトランスフェクトされうる細胞は、例えば内皮および上皮細胞、例えば気管支および肺の上皮を含む気道のいずれかの部分の細胞を含む。気道上皮は嚢胞性繊維症および喘息のための遺伝子療法に対する重要な標的である。
【０１５７】
本発明はウイルスベクターをも提供し、そのベクターは本発明のペプチドを含む。
【０１５８】
ウイルスベクターはウイルスが結合する受容体を標的にし、その宿主細胞への入り口を得る。そのようなベクターは、本発明のペプチドをベクターに結合することにより再標的化されうる。ペプチドはそのような方法でそのような部位で結合されるべきであるのでベクター宿主細胞に結合できなおベクターとして作用する。
【０１５９】
ウイルスベクターは目的の核酸をも含む。そのような核酸は本発明のトランスフェクション複合体と関連して上に記載した通りであル。ウイルスベクターへの本発明のペプチドの導入は核酸で妨げるべきではない。本発明のペプチドは、核酸がベクターに挿入される前または後にウイルスベクターと共に導入され得る。
【０１６０】
ウイルスベクター、例えばアデノウイルスは、コックスサキー−アデノウイルス受容体（CAR）である天然の受容体である。これはアデノウイルスのための主な受容体である。第２の受容体はインテグリンおよびプロテオグリカンを含む。ＣＡＲは多くの細胞タイプに見出されるが、樹状細胞では低レベルでのみ、そして気道上皮細胞の先端の表面ではないかまたは低レベルでのみ見出され、そのことが細胞および組織におけるアデノウイルスベクターの効率を限定する。アデノウイルスベクターは、例えばキャプシドの繊維タンパク質のＨＩ領域への、本発明のペプチドの導入により再標的化される(Nicklin et al., 2001)。
【０１６１】
例えばアデノウイルスタイプ５は、広い範囲の細胞タイプを高効率で形質導入するので原理的には良いベクターであるが、樹状細胞につてはそのような細胞が低レベルのＣＡＲ受容体を有しているので貧弱なベクターである。本発明のペプチドをキャプシドの繊維タンパク質のＨＩ領域に挿入すると樹状細胞についてのトランスフェクション効率はキャプシドの野生タイプの繊維タンパク質を有するアデノウイルスタイプ５ベクターを用いて測定して２０〜４５％から６４および７９％の間まで増加した。更に、トランスフェクション効率の増加は、樹状細胞ばかりでなく他の細胞でも認められた。例えば、本発明のペプチドを導入する再標的化アデノウイルスを用いるヒトの一次マクロファージは、野生タイプウイルスで認められた約１３％からペプチドＳＨＶＫＬＮＳについて約６７％迄、ペプチドＡＰＳＮＳＴＡについて約３５％まで増加した。Ｎ２ａ細胞の場合、トランスフェクション効率は野生タイプベクターについての約２４％と比較して再標的化したベクターについて約８３％であり；ＨＡＥｏ細胞の場合、その値はペプチドＳＨＶＫＬＮＳについて約７９％、ＡＰＳＮＳＴＡについて約７９％であるのに対し、野生タイプ繊維を有するベクターは約４５％の形質導入効率、ＫＯ１ウイルスは約２％、そして無関係なペプチドを有するウイルスは約３２％であった。同じパターンの形質導入効率がＨＭＥＣ−１内皮細胞について見られた。ペプチドＳＨＶＫＬＮＳは約９５％、ペプチドＡＰＳＮＳＴＡは約９４％、野生タイプは約７３％、ＫＯ１ウイルスは約３％２．７％および無関係なペプチドは約２５％であり、ＨｅｐＧ２肝癌細胞ではペプチドＳＨＶＫＬＮＳは約８８％、ペプチドＡＰＳＮＳＴＡは約８０％、野生タイプは約６４％、ＫＯ１は約２％および無関係なペプチドは約１０％であった。
【０１６２】
或いは、ウイルスベクターは静電的にウイルスキャプシドまたは外被に結合することができるカチオン性ドメインを含む本発明のペプチドとの複合体の形成により再標的化されうる。そのようなペプチドの例は本発明のペプチド誘導体であり、それはポリカチオン性核酸結合成分、例えば３〜３２のリシン、例えば上記のように例えば［Ｋ］16を有するポリカチオン性オリゴリシンを含む。ウイルスと修飾したペプチドの間の静電的複合体はウイルスおよびペプチドの溶液を混合することにより製造しうる。そのような複合体は本発明の部分である。
【０１６３】
更なる代替では、本発明のペプチドをウイルスに結合することができる抗体によってウイルスベクターで導入する。抗体はペプチドおよびウイルスに結合することができる２特異性であってもよいし、ペプチドおよび抗体が融合タンパク質の形であってもよい。どちらの場合もペプチドを用いてアデウイルス結合を媒介しウイルス上で提示し、再標的化形質導入を可能にする(Watkins et al., 1997)。抗体成分はいずれの種類の抗体であってもよく、適当な抗原結合ドメインであってもよく、キメラまたはヒト化抗体であってもよく、由来しても良い。そのような融合タンパク質は本発明の部分である。２特異的抗体およびペプチド、またはペプチド−抗体融合タンパク質はウイルスベクターと接触し、結合を可能にする。２特異的抗体およびペプチド／抗体融合タンパク質を製造し、選択する方法は当業者に知られている。例えば(Nicklin et al., 2001; Pereboev et al., 2002; Tillman et al., 1999; Watkins et al., 1997; Wickham et al., 1997)を参照。
【０１６４】
複合体、２特異的抗体、およびペプチド−抗体融合タンパク質は本発明のすべての部分である。
【０１６５】
野生タイプのベクターの効率と比較して、いずれかの個々の細胞または細胞タイプについての本発明のウイルスベクターのトランスフェクション効率は、例えば以下の実施例３に記載のように容易に決定できる。アデウイルスに関して上に記載したが、本発明のウイルスベクターは、本発明のペプチドを用いて再標的化できるウイルスベクターである。そのようなウイルスベクターの例は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）および単純ヘルペスウイルスの遺伝的に操作され、複製欠陥性の誘導体である。
【０１６６】
特に述べない限り、本発明のウイルスベクターは本発明のトランスフェクション複合体と類似的に、例えば同じ目的に用い得る。
【０１６７】
本発明は宿主細胞中で核酸を発現させる方法をも提供し、その方法は宿主細胞をインビトロまたはインビボで核酸を含む本発明のトランスフェクション複合体またはウイルスベクターに接触させ、宿主細胞を細胞が核酸を発現させることができる条件下に培養することを含む。
【０１６８】
本発明は更に宿主細胞中でタンパク質を製造する方法を提供し、その方法は宿主細胞をインビトロまたはインビボでタンパク質をコードする核酸を含む本発明のトランスフェクション複合体またはウイルスベクターに接触させ、細胞がタンパク質を発現することを可能にし、タンパク質を得ることを含む。タンパク質は宿主細胞から、または培地から得られ得る。適当な宿主はよく知られている。適当な宿主細胞の例はチャイニーズハムスターオバリー（ＣＨＯ）細胞(Watkins et al., 1997)、ＢＨＫ細胞(Cruz et al., 2002)、２９３細胞（Castilho et al、2002）およびＳｆ９等の昆虫細胞[Wang, 2000 #1964]を含む。
【０１６９】
本発明は更に細胞をトランスフェクトする方法を提供宿主、その方法は細胞を本発明によるトランスフェクション複合体またはウイルスベクターと接触させることを含む。そのようなトランスフェクションはインビトロまたはインビボで行い得る。インビトロでトランスフェクトされた細胞は、望むなら、治療目的のためヒトまたは非ヒト動物に投与しうる。以下参照。
【０１７０】
本発明は更に本発明による方法により核酸でトランスフェクトされた細胞およびそのような細胞の子孫を提供する。
【０１７１】
本発明は、医薬的に適当な担体と混合して、または結合して核酸を含む本発明のトランスフェクション複合体またはウイルスベクターを含む医薬組成物をも提供する。その組成物はワクチンであり得、その場合アジュバンドを含み得る。
【０１７２】
本発明は遺伝子の欠陥および／または欠陥によりヒトまたは非ヒト動物において起こされる状態の治療または予防方法をも提供し、その方法は欠陥および／または欠陥を正すに適当な核酸を含む本発明のトランスフェクション複合体またはウイルスベクターをヒトまたは非ヒト動物に投与することを含む。
【０１７３】
本発明はヒトまたは非ヒト動物の治療的または予防的免疫方法を提供宿主、その方法はヒトまたは非ヒト動物に、適当な核酸を含む本発明のトランスフェクション複合体またはウイルスベクターを投与することを含む。
【０１７４】
本発明はヒトまたは非ヒト動物のアンチセンス治療方法をも提供し、その方法はヒトまたは非ヒト動物にアンチセンス核酸を含む本発明のトランスフェクション複合体またはウイルスベクターをアンチセンスＤＮＡを投与することを含む。
【０１７５】
本発明は、遺伝子の欠陥および／または欠陥によりヒトまたは非ヒト動物に起こされる状態の予防のための薬剤の製造のための本発明のトランスフェクション複合体またはウイルスベクターの使用、ヒトまたは非ヒト動物の治療的または予防的免疫のための使用、およびヒトまたは非ヒト動物のアンチセンス治療のための使用を提供する。
【０１７６】
本発明の複合体またはベクターの投与の代替はインビトロでトランスフェクトした細胞を投与することである。
【０１７７】
非ヒト動物は例えば哺乳動物、鳥、魚であり、商業的に育てられた動物である。
【０１７８】
トランスフェクション複合体またはウイルスベクターにおける核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡは意図した使用のため、例えば遺伝子治療、遺伝子ワクチン、アンチセンス治療またはタンパク質生産に適当である（上記参照）。ＤＮＡまたはＲＮＡ従ってトランスフェクション複合体またはウイルスベクターは意図する目的に有効量投与する。
【０１７９】
治療および上記の使用はそれぞれのトランスフェクション複合体、ウイルスベクター、または薬剤または薬品を適当な方法で投与することにより行いうる。例えば投与は標的細胞の部位および意図する効果によって全身的、区域的の、または局所的であり得る。例えば気道上皮の場合には運搬は一般的に区域的の、または局所的であり、噴霧療法または気管支鏡法を含む。目の治療のためには投与は眼内である。他の標的の場合には全身的投与が必要であるかも知れず、その場合投与は注射、例えば静脈内、筋肉内、または腹膜内であり得る。
【０１８０】
更なる態様において本発明は、核酸を含むトランスフェクション複合体またはウイルスベクターを含むキットを提供する。
【０１８１】
本発明は次のものを含むキットをも提供する：（ａ）本発明のペプチド；（ｂ）ポリカチオン性核酸結合成分；および（ｃ）脂質成分。そのようなキットは更に、（ｄ）核酸を含み得る。成分（ａ）および（ｂ）は好ましくは本発明のペプチド誘導体の形である。或いは、キットは（ａ）、（ｂ）および（ｄ）を含み得る。
【０１８２】
そのような核酸は単鎖または２本鎖であり得、プラスミドまたは人工的染色体であり得る。核酸成分はその核酸の発現に適当なトランスフェクション複合体により提供去れ、ベクター複合体は空であるかまたは核酸を含む。
【０１８３】
成分（ａ）〜（ｄ）キットは例えばトランスフェクションベクター混合物またはトランスフェクション複合体に関して記載した通りである。
【０１８４】
ポリカチオン性核酸結合成分は上に記載したように好ましくはオリゴリシンである。脂質成分は好ましくはカチオン性リポソームを形成でき、好ましくはＤＯＰＥおよび／またはＤＯＴＭＡ、であるか、それらを含み、例えばそれらの等モル混合物であるか、またはＤＯＳＰＡであるか、それを含み、例えばＤＯＰＥおよびＤＯＳＰＡの混合物、例えば重量比１：３のＤＯＰＥ：ＤＯＳＰＡの混合物である。成分間の比は、成分の混合順序と同様に好ましくは上に記載した通りである。
【０１８５】
キッは一般的に指示を含み、例えば上記のように好ましくは成分の好ましい比、および成分の使用または混合の好ましい順序を含む。キットは遺伝子治療、遺伝子ワクチン、またはアンチセンス治療に用いうる。或いは、商業的に有用なタンパク質をコードする核酸で宿主細胞形質転換するのに、いわゆる「細胞工場」を作るのに用いうる。
【０１８６】
遺伝子治療の標的はよく知られており、単一遺伝子による障害、例えば嚢胞性線維症、様々な癌、および感染症、例えばウイルス感染、例えばＨＩＶによる感染を含む。例えば、ｐ５３遺伝子によるトランスフェクションは癌治療のための大きい可能性を提供する。遺伝子ワクチンの標的もよく知られており、天然の源に由来するワクチンがヒトへの使用にあまりに危険であり、組み換えワクチンが必ずしも有効出ない、例えばＢ型肝炎、ＨＩＶ、ＨＣＶおよび単純ヘルペスウイルス病原に対するワクチンを含む。アンチセンス治療の標的も知られている。遺伝子治療およびアンチセンス治療の更なる標的は、遺伝子ワクチンの更なる標的と同様に、病気の遺伝的基礎についての知識が増加するに従い、提案されつつある。本発明はトランスフェクションの効率、従って治療の有効性を高める。
【０１８７】
プロ炎症性サイトカインによる細胞のトランスフェクションは、自己免疫病、例えばリュウマチ性関節炎および多発性硬化症癌の治療においてアンチ炎症性サイトカインと共に癌免疫治療で用い得る。
【０１８８】
細胞を抗脈管形成性の遺伝子、例えば癌治療のための可溶性ＶＥＧＦ−Ｒ、または心筋の病気、または末梢脈管病のため脈管形成性の遺伝子、例えばＶＥＧＦでトランスフェクトしうる。
【０１８９】
本発明の非ウイルス性のトランスフェクション複合体は、例えば通常のベクターを用いて特に困難な１２５ｋｂより大きいＤＮＡの細胞内輸送に有効であり得る。これは人工染色体を細胞に導入することを可能にする。
【０１９０】
気道、例えば気管支の上皮のトランスフェクションは、嚢胞性繊維症、肺気腫、喘息、肺線維症、肺高血圧、および肺癌等の例えば呼吸器の病気の遺伝子治療に対して有用性を示す。
【０１９１】
嚢胞性繊維症（ＣＦ）は、コーカーシア人における最も一般的な単一遺伝子障害である。病的状態は主に肺の病気を伴う。ＣＦは嚢胞性繊維症膜貫通伝導性調節タンパク質（ＣＦＴＲ）、クロライドイオンの分泌を媒介する細胞膜チャンネルをコードする遺伝子における突然変異により起こる。ＣＦＴＲ遺伝子導入による気管支細胞のこの欠陥の修正は、生化学的な輸送の欠陥および従って肺の病気を修正するであろう。現在までの臨床的試みは、勇気づけるデータを生み出したがもっと有効で非毒性のベクターの必要性を強調している。
【０１９２】
高められたレベルのトランスフェクションは本発明の方法を所望のタンパク質を製造できる宿主細胞、いわゆる「細胞工場」の製造に特に適している。長期の製造のために、導入された核酸が宿主細胞のゲノムに導入されるか、さもなければ安定に維持されることが望ましい、それは容易に確かめることができる。上に示したように、この方法で製造されるタンパク質は大きく、科学的および産業的使用のための酵素、治療および予防のためのタンパク質、ワクチンにおける使用のための免疫源、診断に使用する抗原を含む。
【０１９３】
本発明は高効率のトランスフェクションができる受容体標的ベクター複合体について特に有用である。好ましい態様では、ベクター複合体は４つのモジュラー要素；オリゴリシン、特に[Ｋ]16、ＤＮＡ結合性またはＲＮＡ結合性因子；本発明のペプチド、例えば本明細書に記載したペプチド；場合によりプラスミド中の、そして場合によりウイルスプロモーターおよびエンハンシング因子により調節されるＤＮＡまたはＲＮＡ；カチオン性のリポソームＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（リポフェクチン）を含む。オリゴリシン−ペプチド／ＤＮＡまたはＲＮＡ複合体のカチオン性リポソーム処方ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥの組み合わせは強力な組み合わせである。或いは、ＤＯＰＥ／ＤＯＳＰＡ処方をＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ処方の代わりに、またはそれに加えて用い適しても良い。複合体形成に関する変数およびＬＩＤベクター複合体によるトランスフェクション様式の最適化は示されている。
【０１９４】
最適のトランスフェクション複合体の形成における最も重要な変数は３つの成分の比およびその混合順序のようである。
【０１９５】
本発明は更にｓｉＲＮＡを同定する方法を提供する。２０−３０のヌクレオチドの長さのｓｉＲＮＡ分子のパネルを標的遺伝子配列を通してばらまかれた領域に対する相同性について設計する。ｓｉＲＮＡ分子は商業的源、例えばQiagen  Promegaにより合成できる。標的遺伝子を発現する細胞を個々のｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、発現レベルを標準的な関連したタンパク質アッセイまたはｍＲＮＡアッセイにより定量する。
【０１９６】
本発明はペプチドが結合する細胞または細胞タイプに対する物質を標的にするための本発明のペプチドの使用を提供する。その物質は核酸または他の分子、例えば治療的または薬学的に活性な分子、または検出可能な標識を含む分子であり得る。次の非限定的な実施例は本発明を説明する。
【０１９７】
実施例
実施例１：ペプチドモチーフの同定
材料および方法
（ｉ）抗体
次の抗ヒト抗体をフローサイトメトリーに用いた。ＨＬＡ−ＤＲ，ＣＤ４０，ＣＤ８６並びにマウスＩｇＧ１およびＩｇＧ２蛍光イソタイプ対照抗体(Beckton Dickinson UK Ltd, Cowley, UK)およびＣＤ８０およびＣＤ８３(Caltag Medsystems Lts, Towcester, UK)、そのすべてはフィコエリスリン（ＰＥ）で標識された。
【０１９８】
（ｉｉ）細胞系
次の細胞系を用いた、ＨＭＥＣ−１(CDC, Atlanta, GA 30333, U.S.A.)，ＨＡＥｏ細胞(courtesy DC Gruenert, Human Molecular Genetics Unit, Department of Medicine, University of Vermont, Burlington, VT 05405, USA)、Ｎ２ａ細胞としても知られているＮｅｕｒｏ−２ａ細胞(LGC Promochem, Teddington, Middlesex, UK)、およびＨｅｐＧ２細胞。
【０１９９】
ヒト気道上皮細胞系（１ＨＡＥｏ−）を、１０％の胎児子牛血清（FCS, Sigma, Poole, UK）、１００U/mlペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン(InVitrogen, Paisley, U. K.)および２ｍM  L-グルタミン(InVitrogen, Paisley, U. K.)を補ったEagleの最少必須培地（MEM)HEPES改変(Sigma, Poole, U.K.)中に保持した。
【０２００】
ヒト微小血管の内皮細胞系HMEC-1を１ＨＡＥｏ−細胞の場合のようにだが１ｍｇ／Lハイドロコーチゾン(R & D Systems Europe Ltd, Abingdon, U. K.)１０ｍｇ／Lの表皮性増殖因子(EGF; Sigma, Poole, U.K)を補ったMCDB31培地(Invitrogen, Paisly, U.K)中に保持した。
【０２０１】
マウス神経芽腫細胞系Neuro-２Ａは、１０％ＦＣＳ，１ｍＭピルビン酸ナトリウム(InVitrogen, Paisley, U. K.)、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび０．１ｍM非必須アミノ酸を有するＧｌｕｔａｍａｘ−１(InVitrogen, Paisley, U. K.)を有するダルベッコのＭＥＭ中に保持した。
【０２０２】
ヒト肝癌細胞系HepG2はイーグルのベイシック塩溶液（ＢＳＳ）、１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム、０．１ｍM非必須アミノ酸(Sigma, Poole, U.K.)を含むイーグルのＭＥＭ中に保持し、１ｍＭピルビン酸ナトリウムを除いて１ＨＡＥｏ細胞の場合のように補った。
【０２０３】
（ｉｉｉ）マクロファージの生成
単球は上記のように末梢血から調製した。単核細胞を１０％ＦＣＳ，ＲＰＭＩ中に１−２時間２５ｃｍ3のフラスコ中にプレートした（１０ｍｌの血液あたり１フラスコ）した後、上澄みを除去し、新鮮な１０％ＦＣＳ、ＲＰＭＩ＋１０ｎｇ／ｍｌ  ＭＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）(R&D System)を添加した。４８時間後、培地の半分を新鮮な１０％ＦＣＳ、ＲＰＭＩ＋ＭＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で置換し、細胞６日に用い、ウエルから細胞を削ることにより収穫した。
【０２０４】
（ｉｖ）ペプチドライブラリー
用いたライブラリーＣ７ＣはNew England Biolabs Incから商業的に得、ファージ、力価決定および増殖課程は製造者のハンドブックに記載された通り行った。ライブラリーはランダムペプチド配列長さで７の残基よりなり、システイン残基が隣接し、環化を可能にする。コンストレインされた環状ペプチドはその線状対応物より高い結合親和性をしばしば示す。
【０２０５】
（ｖ）未熟なヒト樹状細胞の生成
未熟な樹状細胞を以下に記載するように末梢血液単球から調製した。この方法を用いてヒトおよびマウスの樹状細胞を作り得る。
【０２０６】
１０ｍｌまたは４０ｍｌの末梢血試料をハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ；Gibco BRL-InVitrogen, Paisley, U.K.）で１：１希釈し、次にLymphoprep(Nycomed (UK) Ltd, Sheldon , Birmingham)に層にし、７５０ｇで３０分間遠心分離し、リンパ球を界面から単離した。過剰のLymphoprepは細胞を２５０ｇで１０分間スピンダウンすることにより除去し、存在する血小板はＨＢＳＳで２度洗浄し、細胞を１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより除去した。次に単球を、製造者のプロトコールに記載のようにＭＡＣｓ  ＣＤ１４磁気マイクロビーズ(Miltenyi Biotec Ltd., Bisley, Surrey)を用いて除去した。単球を、ウェルあたり３ｍｌの、組み換えヒトGM-CSF(顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Schering Plough/ Sandoz, Innishannon, Irelandから得た）およびIL-4（PreproTech EC Ltd, London,UK) cytokinesから得た）サイトカインを補った（それぞれ１００ｎｇ／ｍｌおよび２５ｎｇ／ｍｌ最終濃度）完全培地（HEPES緩衝RPMI）(InVitogenn,Paisley, U.K.)＋１０％胎児子牛血清（FCS Myclone low LPS, InVitogenn, Paisley, U.K.）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンで６ウエルプレートにウエル当たり１ｘ１０6細胞で接種し、３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。新鮮なサイトカインＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４をインキュベーションの３日に添加し、非付着性の未熟な樹状細胞をウイルス形質導入のために６日に、非ウイルス形質導入のために３または４日に収穫した。
【０２０７】
（ｖｉ）溶液中の樹状細胞選択（「パンニング」）
ペプチドライブラリーからの樹状細胞結合ファージの選択（「パンニング」）は、溶液中でラウンドあたり実施例１（ｉｖ）に記載した方法により得た約１ｘ１０6の生存している樹状細胞を用いて、そしてＣ７Ｃライブラリーから２ｘ１０11ファージを用いて（実施例１（ｉ）参照）行った。
【０２０８】
細胞にファージライブラリーを添加する前に、両者は１ｍｌの２％のマーベル（ドライミルク）５％のＢＳＡ−ＰＢＳ（燐酸塩緩衝の血清、ｐＨ７中のウシ血清アルブミン）４℃でアップアンドダウンターンテーブル（垂直に回転する輪）中で３０分間ブロックして非特異的相互作用を減少させた。そのファージを回転することにより混合して４℃で２時間細胞に結合させた後、細胞を３１５ｇ（２０００ｒｐｍ）で３分間遠心分離し、上澄みを除去する。上澄みは非結合性のファージを含む。次に細胞を２％ＢＳＡ−ＰＢＳで、５回、各５分洗浄し、細胞を各時にきれいな試験管に移し、非特異的または弱く結合するファージを除去した。ＰＢＳのみにおける２回の洗浄を次に行い、アップアンドダウンターンテーブル（垂直に回転）中で混合することで１０分間７６ｍＭクエン酸緩衝液を用いて溶出した。細胞はスピンダウンし、溶出液を除去し、６００μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５の添加により中和し、４℃で貯蔵した（「溶出した画分」）。残った細胞を１ｍｌ  ３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡで１時間氷上で溶解した後、短くボルテックスし、後のファージ力価決定のために４℃で貯蔵した。以下の実施例１（ｖｉｉ）を参照。
【０２０９】
各細胞溶解画分から収穫したファージは、プラーク形成単位（ＰＦＵ）として力価決定した後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２７３８(New England Biolabs (UK) Ltd, Hitchin, Herts)中で製造者の指示に記載のように増幅させ、力価決定し、次のパンニングラウンドのためのインプットファージとして用いた。第３ラウンドのパンニングは、ＨＬＡ特異的結合ペプチドの単離を避けるため、各ラウンドについて２つの異なるドナーからの樹状細胞を用いて行った。すべてのパンニングは４℃またはそれ以下で行い、樹状細胞表現型の変化を妨げた。第２および第３ラウンドのパンニングの場合、少ない数のファージが収穫されるなら、２％ＢＳＡ−ＰＢＳで３度およびＰＢＳのみで２度に洗浄ストリンジェンシーを減少させうる。第３ラウンドの画分からのファージの力価決定後、単一のよく単離されたプラークを選び取り、配列決定およびＦＡＣＳまたは力価決定によるクローン結合特性決定のために精製した。
【０２１０】
ファージを回収し、各ラウンドの選択から次の様に力価決定した。２ｘ１０11のブロックしたファージを５ｘ１０4のブロックした単球由来未熟な樹状細胞に氷上で１時間添加した後、細胞を３度０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで洗浄し、ファージをＴＢＳ  ｐＨ５．５で溶出し、細胞を溶解し、結合して残っているファージを収穫した。細胞溶解により収穫したファージの数をプラーク形成単位（ｐｆｕ）として計算した。図１はいくつかの力価決定の結果を示す。図１に示した結合したファージの配列決定は、ペプチドをＡＰＳＮＳＴＡ、ＱＬＬＴＧＡＳ，ＴＡＲＤＹＲＬ，ＦＱＳＱＹＱＫ，ＰＬＭＰＳＬＳ，ＦＰＲＡＰＨＨ、ＭＡＳＩＳＭＫ、ＤＷＷＨＴＳＡ、ＳＨＶＫＬＮＳおよびＳＰＡＬＫＴＶとして同定した。
【０２１１】
（ｖｉｉ）選択したファージの細胞結合の特性決定
ヒト単球由来未熟な樹状細胞（樹状細胞）へのファージの結合は全細胞フローサイトメトリーおよびファージ力価決定アッセイにより研究した。
【０２１２】
（ａ）全細胞フローサイトメトリー
実施例１（ｖ）で記載したように製造し非粘着性未熟なヒト樹状細胞を収穫した。５ｘ１０4の樹状細胞および２ｘ１０11の個々の精製したファージクローンを１ｍｌ  ＭＢＳＡ（２％  Marvel、PBS中で５％BSA）中でターンテーブルで混合して４℃で３０分間ブロックした。その樹状細胞を２０００ｒｐｍでスピンダウンし、それらを溶解することなく５分間４℃でペレット細胞までゆるやかな遠心分離し、そのペレットをブロックしたファージ溶液に再懸濁した。その混合物を氷上で３０分間保ち、ファージを結合した後、細胞をスピンダウンし、上澄みを除き、細胞を１ｍｌの１％BSA,０．０５％のTween20-PBSで洗浄した。その細胞を再びスピンし、上澄みを除き、細胞を１ｍｌの１％パラホルムアルデハイド中で氷上で３０分固定した。細胞をＰＢＳ中で２度洗浄し、１ｍｌの１％Marvel、PBS中の２．５％BSAおよび２μｌのＦＩＴＣ（フルオレセイン−イソチオシアネート）標識抗Ｆｄ抗体(Sigma, Poole, Dorset)（３ｍｇ／ｍｌ）に再懸濁した。細胞を氷上で３０分抗体とインキュベートした後、スピンダウンし、０．０５％のTween20、１％のBSA PBS中で２度洗浄し、２００μｌのPBS中に再懸濁し、FACS分析によるFITCについて陽性の細胞のパーセントを測定した。
【０２１３】
或いは、５ｘ１０4の樹状細胞をファージライブラリーのパンニングについて記載したように２ｘ１０11の個々のファージクローンと混合物した。ファージおよびDC懸濁液の混合物を氷上で３０分間保った後、細胞を遠心分離し上澄みを除去し、１ｍｌの１％BSA、０．０５％のTween20-PBSで洗浄した。細胞を再び遠心分離によりペレットにし、次に１ｍｌの１％パラホルムアルデヒド中に氷上で３０分間再懸濁することによりフローサイトメトリーのために固定した。固定した樹状細胞をPBSで２度洗浄し、１％のマーベル、PBS中の２．５％のBSA中に再懸濁し、２  ｌのFITC-抗ｆｄファージ抗体溶液と３ｍｇ／ｍｌ(Sigma, Poole, U. K.)で混合した。細胞を抗体と氷上でインキュベートし、次に遠心分離によりペレットにし、０．０５％のTween20、１％のBSA  PBSで２度洗浄し、２００  ｌのｐBSに再懸濁した。FITC陽性の細胞のパーセントはEpics  XLフローサイトメーター(Beckman Coulter, High Wycombe, UK.)を用いてフローサイトメトメトリーにより測定した。
【０２１４】
（ｂ）細胞に結合するファージクローンの力価決定
各力価決定について、５ｘ１０4の単球由来樹状細胞（５または６日）を、２００μｌのブロック用緩衝液（DMEM/２％マーベル／１％BSA）中で３０分間４℃でインキュベートし、コンスタントに混合することにより、最初にブロックした。２ｘ１０11のファージも２００μｌのブロック用緩衝液で３０分間４℃でブロックした。樹状細胞を２０００ｒｐｍで５分間４℃でスピンダウンし、ファージ溶液に再懸濁し、ファージを１時間氷上で時々混合しながら結合させた。次に細胞をPBS-Tween  ２０（０．０５％）で三回洗浄した後、ファージを１６６μｌのTBS  ｐH5.5で１０分間、氷上で溶出させた。溶出液は３４μｌの１M Tris-HCｌ  ｐH８で中和し、細胞をスピンダウンし、上澄みを除去し、溶出液として貯蔵した。細胞ペレットを２００μｌの細胞溶解緩衝液（３０ｍM  Tris-HCl、１ｍM EDTA  ｐH8.0)中に１時間氷上で振とうしながら再懸濁した。細胞断片を５０００ｒｐｍで５分間スピニングすることにより除去し、上澄みを回収した。溶出液中のファージおよび細胞溶解液をNEB  C7C技術ビュレチンに記載するようにE,coli  ER2738中でプラーク形成単位（ｐｆｕ）を測定することにより力価決定した。
【０２１５】
ファージクローン結合の力価決定は、対照としてプラスチックへの結合を用いて、ヒトおよびマウス樹状細胞を用いて行った。ヒト細胞は以下に述べるドナーから得た。
【０２１６】
（ｃ）ファージペプチド挿入物の配列決定
第３ラウンドの樹状細胞選択後の細胞溶解画分から単離した８１の個別のファージクローンを、少スケールポリエチレングリコール（ＰＥＧ）生成物から精製し（ＮＥＢテクニカルビュレチンを参照）、単鎖ファージＤＮＡを配列決定のために作った[Kay, 1996 #50]。
【０２１７】
簡単に言えば、タンパク質の外被をフェノールクロロホルム抽出により試料から除去し、ＤＮＡをエタノール沈殿によりペレットにした。微量の塩はペレットから氷冷７０％エタノールで洗浄した後、そのＤＮＡをトリＥＤＴＡ（ＴＥ）(10 mM Tris Hcl, ImMEDIA, pH7.5)に再懸濁した。５０−１００ｎｇの精製したＤＮＡをビッグダイ(Applied Biosystems, Foster City, California, USA)ターミネーターサイクル配列決定反応に、９６プライマー(5’-CCCTCATTAGCGTAACG-3’)（Ｃ７Ｃライブラリーで供給）を用いキットの指示に記載されたようにエタノール沈殿によりローディングするために精製した。試料はＡＢＩ３７７シークエンサー(Applied Biosystems, Foster City, California, USA)上で操作し、結果はプログラム(Informax Inc, Oxford UK)のVector NTI Suiteを用いて分析した。
【０２１８】
結果
ペプチドの同定
「パンニング」は実施例１（ｖｉ）に記載するように行って、ファージの力価決定を得た。図１はいくつかの力価決定の結果を示す。図１に示された結合したファージの配列決定はペプチドを、ＡＰＳＮＳＴＡ、ＱＬＬＴＧＡＳ，ＴＡＲＤＹＲＬ，ＦＱＳＱＹＱＫ，ＰＬＭＰＳＬＳ，ＦＰＲＡＰＨＨ、ＭＡＳＩＳＭＫ、ＤＷＷＨＴＳＡ、ＳＨＶＫＬＮＳおよびＳＰＡＬＫＴＶとして同定した。
【０２１９】
未熟な樹状細胞に結合するファージクローンの力価決定の第３ラウンドから細胞に関連する画分からの８１ファージクローンの配列決定は１６の異なった配列を同定した。
【表４】
2007527208.tif 000008
【０２２０】
３つの最も頻繁なファージクローンは、２１％（ＡＰＳＮＳＴＡ）、２０％（ＤＷＷＨＴＳＡ）および１２％（ＳＨＶＫＬＮＳ）で残りは７％以下存在した。ファージクローンからの１６の結合配列の分析は５つの最小モチーフ、即ち、PＸＮＴ/ＳＴ，ＰＸＸＸＡ/Ｖ，Ａ/ＬＰＳＸＳ，ＳＬ/ＩＳおよびＱＸＮ/ＱＸＱを同定し（表３参照）、そのモチーフは樹状細胞上の受容体への結合に重要な役割を果たしているかもしれない。配列決定したすべてのクローンの中で、４６％は１以上のモチーフを含み、最も頻繁なクローンは、ＡＰＳＮＳＴＡであり、３つの他のペプチド配列とある程度の相同性を示した、表３参照。
【表５】
2007527208.tif 000009
【０２２１】
同一のアミノ酸は太字およびイタリックで、類似のアミノ酸はイタリックのみで示した。
【０２２２】
大部分の場合樹状細胞に対して結合するファージクローンの力価決定は、クローンは細胞中に挿入物を有さないファージより、大きい程度で細胞に結合することを示した。２つのクローンＦＰＲＡＰＨＨおよびＭＡＳＩＳＭＫは、マウス樹状細胞へ結合するファージ結合の力価決定を含み、すべての力価決定で最高数で結合した。プラスチックに結合するファージの数は試験したすべてのクローンで低く、これらの実験において、高力価により証明されるファージ結合は細胞への結合によるものであり、ウエルへのバックグラウンドの非特異的結合または分子ブロッキングでないことを示唆する。図１および表４参照。
【表６】
2007527208.tif 000010
【０２２３】
６つの最も頻繁なクローン、即ちＡＰＳＮＳＴＡ、ＦＱＳＱＹＱＫ、ＤＷＷＨＴＳＡ、ＳＨＶＫＬＮＳ、ＳＰＡＬＫＴＶおよびＳＱＫＮＰＱＭは、１つＳＰＡＬＫＴＶを除いてすべてのクローンが挿入物を有さないファージクローンより高いパーセントまで結合が検出された。図２ａおよび２ｂを参照。
【０２２４】
結合のパターンは３つのクローンが、これらがペプチドＡＰＳＮＳＴＡ、ＤＷＷＨＴＳＡおよびＳＨＶＫＬＮＳを含むので最高量で樹状細胞に結合することを示し。そのクローンは選択から最も頻繁に単離された。試験した６つのクローンの第２セット、即ちペプチドＱＬＬＴＧＡＳ、ＴＡＲＤＹＲＬ、ＰＭＬＰＳＬＳ，ＦＰＲＡＰＨＨ、ＭＡＳＩＳＭＫおよびＳＴＰＰＮＴＴを含むものについて、すべてのクローンは挿入物を有さない対照より結合したファージについて高いパーセントの細胞が陽性であることを示した。ＱＬＬＴＧＡＳは他よりわずかに多い細胞に結合する。図３ａおよび３ｂを参照。
【０２２５】
１６のファージ配列のうち、５つ、即ちＡＰＳＮＳＴＡ、ＳＨＶＫＬＮＳ、ＭＡＳＩＳＭＫ、ＦＰＲＡＰＨＨおよびＤＷＷＨＴＳＡが、それらが最も頻繁なクローンの内であり、ファージクローン結合のＦＡＣＳアッセイにおけるトップのバインダーの内であることを根拠に合成のために選ばれた。
【０２２６】
実施例２：非ウイルストランスフェクション
材料および方法
（ｉ）ペプチドの合成
望ましい細胞結合およびエントリー特性を示すファージから同定されたペプチドＡ，Ｂ，Ｃ，ＤおよびＦ（表７参照）を標準的な合成化学を用いて合成し、１６のリシンの尾、ＧＡＣリンカーおよびＣ−末端  ＣＧ基を有する。ペプチド６，ＲＲＥＴＥＷＡはインテグリン結合ペプチドである。ペプチド６Ｊ、ＡＴＲＷＡＲＥはペプチド６のスクランブルバージョンであり、対照ペプチドとして役立つ。ペプチド誘導体という用語は以下に示す合成したペプチド配列を示すのに用いる。即ち、「ペプチドＡ」はＳＨＶＫＬＮＳを示し、「ペプチドＡ誘導体」は［Ｋ］16−ＧＡＣＳＨＶＫＬＮＳＣＧを示す。ペプチドおよびペプチド誘導体の詳細は以下の表５に示す。
【表７】
2007527208.tif 000011
【０２２７】
（ｉｉ）リポポリプレックス（ＬＩＤ）トランスフェクション複合体の形成および未熟な樹状細胞のトランスフェクション
（ａ）未熟な樹状細胞のためのトランスフェクション複合体
脂質（Ｌ）、ペプチド（上に記載したペプチド誘導体の形で）（Ｉ）およびＤＮＡ（Ｄ）を含むリポポリプレックス（ＬＩＤ）トランスフェクション複合体を製造した。脂質成分はリポフェクチンまたはリポフェクタミン２０００(Invitrogen Ltd, Paisley, UK)であり、ペプチドは上の表７に記載した合成したペプチドＡ〜Ｆ，６または６Ｊ誘導体であり、ＤＮＡはプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１(Clontech, BD Biosciences, Palo Alto, CA)であった。
【０２２８】
トランスフェクション複合体において、ペプチド成分対ＤＮＡ電荷の比（+/-）は１．５：１，３：１および７：１で用いた。脂質成分（リポフェクチンまたはリポフェクタミン２０００）ＤＮＡに対して重量で０．７５：１という一定の割合で保持した。トランスフェクション複合体の製造の前に、方法Ａでは脂質成分を１５μｇ／ｍｌの濃度に希釈し。ペプチドは０．１ｍｇ／ｍｌで、ＤＮＡ（プラスミド pEGFP-N1, BD Biosciences, Cowley, UK, EndoFree プラスミドキット, Qiagen Ltd, Crawley, UKを用いて製造）は１０μｇ／ｍｌで調製した。すべての希釈はＯｐｔｉＭＥＭを減少させた組織培養培地（(Life Technologies Ltd, Paisley, UK)）で行った。方法Ｂではトランスフェクション複合体を作る前に脂質成分を３０μｇ／ｍｌの濃度まで希釈し、ペプチドは０．１ｍｇ／ｍｌで調製し、ＤＮＡ（プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１、BD Biosciences, Cowley, UK,
EndeFree プラスミドキット Quiagen Ltd, Crawley UK）４０μｇ／ｍｌであった。すべての希釈は血清を含まないＲＰＭＩで行った。
【０２２９】
トランスフェクション複合体は成分を１）脂質（５０μｌ）、次に２）ペプチド（７０μｌ）および最後に３）ＤＮＡ（５０μｌ）の順に混合し、次にＯｐｔｉＭＥＭまたは血清を含まないＲＰＭＩで、３００μｌ（ＯｐｔｉＭＥＭ）あたり、または５００μｌ（ＲＰＭＩ）あたり２μｇのＤＮＡ成分に対する濃度まで、適当なように希釈した。
【０２３０】
（ｂ）未熟な樹状細胞および単球のトランスフェクション
実施例１（ｖ）で記載したように得られた未熟な６日樹状細胞を完全培地中にウエルあたり５ｘ１０4細胞で４８ウエルプレートにプレートし、３時間３７℃でかすを沈殿させた。上記のように得たトランスフェクション複合体の３００μｌまたは５００μｌ（適当に応じて）を各ウエルに加えた。トランスフェクション複合体は製造５分以内に細胞に加えた。トランスフェクションインキュベーションは３７℃で４時間行い、その後、培地を２４時間サイトカインを有する完全培地で置換した。細胞をスクレイピングにより収穫し、スピンダウンし、ＦＡＣＳ分析のために３００  ｌのＰＢＳに再懸濁し、リポーター遺伝子ＥＧＦＰ(Enhanced Green Fluorescent Protein)に陽性の細胞のパーセントを決定した。各トランスフェクションは３つのウエルで行った。
【０２３１】
単球のトランスフェクションのために、末梢血単球を、実施例１（ｖ）において単球由来樹状細胞の製造方法において記載するようにLymphoprep遠心分離およびCD14ビーズ選択を用いて調製した。これらの細胞を次に単球のトランスフェクション（および３または４日の未熟な樹状細胞のも）を溶液中で行ったことを除いて樹状細胞につて記載したようにトランスフェクトした。
【０２３２】
（ｉｉｉ）他の細胞タイプのトランスフェクション
（ａ）他の細胞タイプ
用いた他の細胞タイプは、HMEC-1細胞(CDC, Atlanta, GA 30333, U.S.A)、HAEo細胞（courtesy DC Gruenert, Human Molecular Genetics Unit, Department of Medicine, University of Vermont, Burlington, VT 05405, USA)）、およびNeuro-2a（N2a細胞としても知られている）(LGC Promochem, Teddington, Middlesex, UK)。
【０２３３】
（ｂ）他の細胞タイプについてのトランスフェクション複合体
脂質、ペプチド、およびDNAを含むトランスフェクション複合体を調製した。脂質成分はリポフェクチン(Invitrogen Ltd, Paisley, UK)であり、ペプチド成分は、上記のようにペプチドA〜F、６，または６J誘導体であり、DNAはプラスミドpCILuc (Promega UK Ltd, Southampton)であった。トランスフェクション複合体においてペプチド対DNA電荷比（＋／−）は３：１，５：１および７：１で用いた。脂質成分はDNAに対して重量で０．７５：１の一定の比を維持した。トランスフェクション複合体の製造の前に、脂質成分を１５μｇまたは３０μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。ペプチドは０．１ｍｇ／ｍｌで、ＤＮＡは４０μｇ／ｍｌであった。すべての希釈はＯｐｔｉＭＥＭ減少血清組織培養培地(Life Technologies)で行った。トランスフェクション複合体は成分を１）脂質、次に２）ペプチドおよび最後に３）ＤＮＡの順に混合し、次にＯｐｔｉＭＥＭで、３００μｌ（ＯｐｔｉＭＥＭ）あたり、または２００μｌあたり０．２５μｇのＤＮＡ成分に対する濃度まで希釈した。
【０２３４】
（ｃ）他の細胞タイプのトランスフェクション
これらのタイプの細胞、即ちHMEC,  HAEo-、N2aおよびHepG2のトランスフェクションのために、１ｘ１０４の細胞を９６ウエルプレートに一晩接種した。（ｂ）に従って製造したトランスフェクション複合体の２００μｌ懸濁液を各ウエルに加えた。懸濁液は調製の５分以内に細胞に加えた。トランスフェクションインキュベーションは３７℃で４時間行い、その後、培地を２４時間適当な完全培地で置換した。各トランスフェクションは６回行った。
【０２３５】
細胞を含まない抽出物におけるルシフェラーゼリポーター遺伝子アッセイを、製造者のプロトコールを用いてPromega UK Ltdからのルシフェラーゼアッセイを用いて２４時間インキュベートした後行った。光単位は各抽出物内部でタンパク質濃度に標準化された。
【０２３６】
（ｉｖ）トランスフェクトされた樹状細胞のフェノタイピング
未熟な４日の樹状細胞を、ペプチドAをDNA（プラスミドｐＥＧＦＰ）に対して７：１の電荷比でLID複合体でトランスフェクトし、リポフェクチンをRPMI中で４時間DNAに対して重量比０．７５で加えた後、２４時間サイトカインを有する完全培地中でインキュベートした。対照として、樹状細胞を２４時間完全培地中でインキュベートした（未熟な樹状細胞）。細胞をかきとることにより収穫し、成熟マーカーの存在について次の様に染色した：２ｍｌ以下の培地の体積中の最小５ｘ１０4の細胞を推奨される量の抗体に添加し２０分間氷上でインキュベートした。２ｍｌの氷冷却PBSを添加した後、３００ｘｇで５分間４℃で遠心分離した。上澄みを飛ばし去りペレットを３００  ｌの氷冷１％パラホルムアルデハイド−PBS中に再懸濁した。各試料からの細胞をHLA-DRに対する抗体で、およびCD86およびアイソトープマッチした対照抗体で染色した。細胞をEpics  XL(Beckman Coulter, High Wycombe, UK.)およびEXPO32分析ソフトウエア（Beckman Coulter）を用いてフローサイトメトリーにより分析した。
【０２３７】
（ｖ）トランスフェクトされた樹状細胞の成熟とフェノタイピング
未熟な４日の樹状細胞を、ペプチドDをDNA（プラスミドｐＥＧＦＰ-Ｎ１）に対して７：１の電荷比でLID複合体でトランスフェクトし、リポフェクチンRPMI中で４時間DNAに対して重量比０．７５で加えた（上記のように）。１つの試料において、２４時間のトランスフェクションの直後LPSを完全培地に５０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加し、他では細胞を完全培地で２日間インキュベートした後、LPSを更に２４時間添加した。対照として、樹状細胞を完全培地中で（未熟なDC）、またはLPSを有する完全培地中で（成熟DC）で２４時間インキュベートした。次に細胞をスクレイピングで収穫試料、成熟マーカーの存在について次のように染色した。細胞をかきとりにより収穫し、成熟マーカーの存在にゆいて次のように染色した。２ｍｌ以下の培地の体積中の最小５ｘ１０4の細胞を推奨される量の抗体に添加し２０分間氷上でインキュベートした。２ｍｌの氷冷却PBSを添加した後、３００ｘｇで５分間４℃で遠心分離した。上澄みを飛ばし去りペレットを３００  ｌの氷冷１％パラホルムアルデハイド−PBS中に再懸濁した。各試料からの細胞をHLA-DRに対する抗体、およびCD86およびアイソトープマッチした対照抗体で染色した。細胞をEpics  XL(Beckman Coulter, High Wycombe, UK.)およびEXPO32分析ソフトウエア（Beckman Coulter）を用いてフローサイトメトリーにより分析した。
【０２３８】
結果
DNA結合［K］16を有する合成した束縛されたペプチドを、未熟な樹状細胞をDNAおよび脂質を有するリポポリプレックス（LID)トランスフェクション複合体でトランスフェクトするそれらの能力について試験した。結果を図４に示す。
【０２３９】
リポフェクチンおよび４日樹状細胞を用いるLIDフォーマット中のすべての５つの合成されたペプチド誘導体A、B、C、DおよびFのトランスフェクション効率の比較は、ペプチドA,B,およびDを最良のトランスフェクション効率を与えると同定し、すべては樹状細胞の１０％以上をトランスフェクトしペプチドCはおよそ半分の価を与え、ペプチドFは不十分に挙動し、細胞の１％未満がトランスフェクトされた。図４ｂを参照。
【０２４０】
FACSにより測定したリポーター遺伝子EGFPについて陽性の細胞のパーセントで測定したトランスフェクション効率は正の対照、ペプチド６，インテグリン結合ペプチドＰＲＥＴＡＷＡおよび負の対照、ペプチド６J(ペプチド６のスクランブルバージョン）のそれの約１．５倍レベルまで、ファージ由来ペプチドA（ＳＨＶＫＬＮＳ）の使用により増加した。ペプチドＢ（ＡＰＳＮＳＴＡ）はペプチド６のそれと等しいレベルのトランスフェクションレベルを与えた。トランスフェクトされた細胞のパーセントは、多分樹状細胞におけるトランスフェクション過程の毒性効果のため５％に達しなかった。
【０２４１】
ＤＮＡ結合〔Ｋ〕16ドメインを有する合成された４つのコンストレインされたペプチドＡ，Ｂ，ＣおよびＤを、商業的に利用できる脂質リポフェクチンおよびリポフェクタミンを含むリポポリプレックス（ＬＩＤ）トランスフェクションにおける４日の未熟な樹状細胞をトランスフェクトするそれらの能力について試験した。図５ａ参照。リポフェクチンを用いた場合、すべてのペプチドはペプチド６（インテグリン結合細胞）のそれを超えるトランスフェクション効率を得た。ペプチドＡは１７％という最高の効率を得、ペプチドＢおよびＤは１１％の陽性の細胞を得、Ｃは約７％陽性であり、ペプチド６および非ペプチド対照で達成された２％の少し上であった。脂質を用いなかった場合、ペプチドＡについてトランスフェクションは１％以下であり、複合体の効率のための脂質の重要性を証明する。
【０２４２】
リポフェクタミン2000は、３％陽性の細胞を与えたペプチド６を除いて、リポフェクチンより低いトランスフェクション効率、５および８％の間を与えた。毒性はすべての場合に高く（図５ｂ参照）４０および５３％の間であり、リポフェクチンは、リポフェクタミンが、リポフェクチンより顕著により毒性であるペプチドＣおよびペプチドなしの場合を除いてリポフェクタミン2000と似たレベルの毒性を与えた。この毒性は実験間で変化し、リポフェクチンは17-４６％の間、リポフェクタミン2000は26-53％の間の細胞死であった。メタフェテンを製造者の指示に従って用いた場合、ずっと高いレベルの細胞死、78-84％の間が見られ、脂質の選択はトランスフェクション後の細胞死にひどく影響しうることを示唆する。
【０２４３】
３日の樹状細胞のトランスフェクション効率は、７％ＥＧＦＰ陽性細胞で対照ペプチド６（１４％の効率を与えた）を除いて４日樹状細胞よりかなり低かった。細胞死はすべての試料で２８および４８％の間で高く、リポフェクチンはリポフェクタミン２０００より毒性が僅かに低かった。図６ｂ参照。
【０２４４】
標的ペプチドを用いる単球のトランスフェクションはペプチド６を用いるトランスフェクションに匹敵する効率を与え、ペプチドＡ、ＢおよびＤはトランスフェクトされた細胞の最高のパーセントを与えたが（図７ａ参照）、レベルは４日樹状細胞より低く、僅か６％がＥＧＦＰについて陽性の最高のパーセントであった（ペプチドＡをリポフェクチンと組み合わせる）。毒性はほとんどの場合５および１４％の細胞死であった（図７ｂ参照）。但しペプチドＦまたはペプチドなしをリポフェクチンと共に用いた場合は除き、それらの細胞死はそれぞれ２５％および２０％に上昇した、興味深いことに、これらはトランスフェクション効率が最低の条件であった。
【０２４５】
未熟な４日樹状細胞のトランスフェクションは細胞表面でのＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８６分子の上方調節をもたらし、樹状細胞の活性化が生じつつあることを示す。ＥＧＦＰ陽性および陰性の両方の細胞は上方調節されたマーカーを示し、すべてではないトランスフェクトされた樹状細胞は上方調節されたマーカーを示し、トランスフェクション過程およびＥＧＦＰの発現のないことは活性化の原因であることを示唆する。
【０２４６】
ＬＰＳを用いるトランスフェクション後の樹状細胞の成熟は、ＬＰＳなしのトランスフェクトされた樹状細胞と同程度のＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８６の上方調節を示したが、ＬＰＳとインキュベートしたトランスフェクトしない樹状細胞に比べ低い程度の活性化であり、トランスフェクションは活性化に僅かに阻害的効果を有し得ることを示唆する。４日または６日の細胞に対するＬＰＳの添加は活性化レベルに小さい影響を有し、ＣＤ８６は細胞が、４日に比べ６日でＬＰＳとインキュベートした場合僅かに小さい活性化を示した。
【０２４７】
他の細胞タイプの場合、トランスフェクション効率は存在するタンパク質１ｍｇあたりのルシフェラーゼ活性により測定した。試験したすべての細胞系、即ちＨＭＥＣ−１，ＨＡＥｏ−、およびＮ２ａ細胞において、少なくとも１つのペプチドがペプチド６で見られたのと等しいか、または以上のトランスフェクション効率を与えた。
【０２４８】
ＨＭＥＣ−１細胞においてはペプチドＡはペプチド６で見られたのとほぼ等しいトランスフェクション効率を与えたが、ペプチドＢはペプチド６の１．５倍効率を増加させることができる。図１０参照。
【０２４９】
ＨＡＥｏ−細胞においては、ペプチドＡは最高のトランスフェクション効率、ペプチド６で見られたそれのおよそ２倍を与え、ペプチドＢを用いる効率はペプチド６を用いたそれ１．５倍であった。図１１参照。
【０２５０】
Ｎｅｕｒｏ２Ａ（Ｎ２ａ）においては、ペプチドＡのみがペプチド６を用いる場合に見られたのと等しいトランスフェクション効率を与え、ペプチドＢは半分以下の効率を与えた。図１２参照。
【０２５１】
実施例３：再標的化アデノウイルス
材料および方法
（ｉ）マウス骨髄由来樹状細胞
マウス樹状細胞を５週齢Ａ／Ｊマウスの大腿骨および頸骨の髄腔から流した全骨髄から調製し、１０％ＦＣＳ，ペニシリンおよびストレプトマイシンおよび２ｎｇ／ｍｌの組み換えＧＭ−ＣＳＦを補ったＨｅｐｅｓ緩衝ＲＰＭＩ＋Ｇｌｕｔａｘ（InVitrogen, Paisley, U. K.）中で培養した。サイトカインを３日に同じ濃度まで添加死、樹状細胞を６日にＭＡＣｓ  ＣＤ１１ｃマイクロビーズ(Milteny Biotec, Bisley, UK）により浮いている細胞画分から単離した。
【０２５２】
（ｉｉ）マウスＳｃａｌ＋ｖｅ幹細胞
マウス骨髄細胞を上のように単離しＳｃａｌ＋ｖｅ細胞をＭＡＣｓ  Ｓｃａｌマイクロビーズ（Milte nyi Biotec, Bisley, U. K.）を用いて単離した。これらの細胞を、３０％ＦＣＳおよびペニシリン/ストレプトマイシンを含んだGlutamax-1および次のサイトカインネズミSCF(50 ng/ml; Preprotech, London, UK）、ＩＬ−６（20ng/ml; Preprotech, London, UK）およびＦｌｔ３−Ｌ（１０ｎｇ／ｍｌ）（R&D Systems, Oxford, U. K.）と共に、７ｘ１０4細胞／ＲＰＭＩ中の５００  ｌでプレートした。
【０２５３】
（ｉｉｉ）再標的化アデノウイルス／組換えアデノウイルスの製造および定量
ペプチドＡ〜Ｆを有し、またはキャプシドの線維タンパク質のＨＩ領域に挿入された再標的化アデノウイルスタイプ５（Ａｄ５）を構築し、Nicklin 2001 Mol Ther  2001 Dec;4(6):534-42に記載された方法を用いてDr Dan von Seggern, Scripps Research Institute, California, USAの実験室で生産した。
【０２５４】
線維タンパク質のＨＩループに挿入されたＤＣ結合タンパク質を有するＡｄ５粒子を実質的に以前に記載したように製造した。ペプチド配列SHVKLNS ( 5' CC GGA AGC CAC GTG AAG CTG AAC AGC G 3' および 5' CC GGC GCT GTT CAG CTT CAC GTG GCTT 3') または APSNSTA ( 5' CC GGA GCC CCC AGC AAC AGC ACC GCC G 3' および 5' CC GGC GGC GGT GCT GTT GCT GGG GGCT 3')をコードする相補的オリゴヌクレオチドを合成した（Operon Technologies, Alameda CA U. S. A.）。オリゴペアをキナーゼ化し、アニールし、ｐＤＶ１３７のユニークなＢｓｐＥ１部位に結合し、ＣＡＲ結合およびＨＩループ中のリンカー／制限部位をブロックしてｐＤＶ１７８（ＳＨＶＫＬＮＳ）およびｐＤＶ１７９（ＡＰＳＮＳＴＡ）を作る２重ポイント変異体を有するＡｄ５線維タンパク質をコードする発現構築物を作った。配列確認の後、そのプラスミドを用いて、上記のように２９３細胞に一時的にトランスフェクションすることにより線維を除いたベクターＡｄ５．ＧＦＰ．  Ｆをｔｒａｎｓ補足した。ウイルス粒子を凍結／解凍溶解およびＣｓＣｌグラジエント遠心分離により精製し、４０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ｐＨ８．１／０．９％ＮａＣｌ／１０％グリセロール中で透析し、−８０℃で貯蔵した。ウイルスをＢＳＡ標準に対するタンパク質アッセイ（BioRad, Hercules CA, U. S. A.）により、そして１μｇのウイルスタンパク質は４ｘ１０9ウイルス粒子に等しいという関係を用いて定量した。
【０２５５】
（ｉｖ）アデノウイルスを用いる形質導入
ペプチドＡまたはＢを有する再標的化アデノウイルスを以下に記載する形質導入実験に用いた。野生タイプのアデノウイルスタイプ５およびＫＯ１線維を有するタイプ５アデノウイルスはすべてDr Dan von Seggernにより提供され、Nicklin 2001 Mol Ther  2001 Dec;4(6):534-42)に記載のように、対照として用いた。
【０２５６】
（ａ）樹状細胞の形質導入
６日樹状細胞（上記実施例１（ｖ）参照）またはマウス骨髄由来樹状細胞またはＳｃａｌ＋ｖｅ幹細胞（（ｉ）および（ｉｉ）参照）５００μｌの完全培地中で４８ウエルプレート中でウエルあたり５ｘ１０4細胞でプレートし、３時間３７℃で静置した。形質導入は完全培地中で行い、ウイルスは２４時間の間１０００００ウイルス粒子／細胞で添加した。細胞をかき取り、６５０ｇ（２０００ｒｐｍ）で５分間スピンダウンし、３００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、分析前に氷上で保った。ＧＦＰ陽性の細胞のパーセントにより測定したウイルス形質導入はＦＡＣＳ分析により測定した。生存力パーセントを測定するため、１０μｌの７−アミノ−アクチノマイシンＤ（7AAd; Sigma, Poole Dorst）を分析の直前に添加した。
【０２５７】
マクロファージのウイルス形質導入は、２．５％のＦＣＳを含む培地中で１０,０００粒子／細胞で行った。他の細胞タイプについては、細胞を適当な培地中で２４ウエルプレート中でウエルあたり５ｘ１０4細胞で一晩接種した。アデウイルス１０，０００ウイルス粒子／細胞、ウエルあたり１ｍｌでＯｐｔｉＭＥＭ中で３回添加し、２４時間、３７℃でインキュベートした。次に細胞をＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン化し、３回のウエルをプールし、３５０ｇで５分間スピンダウンし、３００μｌのＰＢＳ中に再懸濁した後、細胞生存力を測定するフローサイトメトリーにより分析し、１０  ｌの７ＡＡＤを分析の直前に添加した。
【０２５８】
細胞を結果の計算のため３回の別の形質導入実験からプールした。
【０２５９】
（ｂ）ヒト一次マクロファージの形質導入
１次マクロファージ以下に記載のように末梢血液単球から作った。
【０２６０】
１０ｍｌの末梢血液をＨＢＳＳで１：１に希釈し、次にLymphoprep（Nycomed）上に層にし、７５０ｇで３０分間スピンアウトし、精製したリンパ球を界面から単離した。過剰のLymphoprepを、細胞を２５０ｇで１０分間遠心分離することにより除き、存在する血小板をHBSS中で洗浄し、１２００ｒｐｍで１０分間細胞を遠心分離することにより除いた。次に単球を製造者のプロトコールに記載のようにMACｓ  ＣＤ１４マイクロビーズを用いて単離した。単核細胞を１０％ＦＣＳ，ＲＰＭＩ中で１−２時間、２５ｃｍ3フラスコ（１０ｍｌの血液あたり１フラスコ）にプレートした後、上澄みを除き、新鮮な１０％ＦＣＳ，ＲＰＭＩ＋１０ｎｇＭＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）を添加した。半分の培地を新鮮な１０％ＦＣＳ，ＲＰＭＩ＋ＭＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で４８時間後置き換え、細胞をウエルから引きはがすことにより収穫し、６日に用いた。
【０２６１】
ウイルス形質導入は２．５％ＦＣＳを含む培地中で１００００粒子／細胞で行った。ＧＦＰ陽性細胞のパーセントにより決定したウイルス形質導入はＦＡＣＳ分析により測定した。細胞を結果の計算のため３つの別の形質導入実験からプールした。
【０２６２】
（ｃ）他の細胞タイプの形質導入
Ｎ２ａ細胞、ＨＡＥｏ−細胞、ＨＭＥＣ−１細胞およびＨｅｐＧ１細胞を再標的化したアデノウイルスで形質導入した。Ｎ２ａ細胞、ＨＡＥｏ−細胞、ＨＭＥＣ−１細胞は上の実施例２（ｉｉｉ）（ａ）に記載した源から得た。ＨｅｐＧ１細胞はLGC Promochem, Teddington, Middlesex, UKから得た。
【０２６３】
これらの他の細胞タイプの形質導入のために、細胞を適当な培地中で２４ウエルプレート中でウエルあたり５ｘ１０4細胞で一晩接種した。アデノウイルスはＯｐｔｉＭＥＭ中に１００００ウイルス粒子／細胞、ウエルあたり１ｍｌ、３回添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。次に細胞を２回ＰＢＳ中で洗浄し、トリプシン化し、３回のウエルをプールし、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、３００μｌのＰＢＳ中に再懸濁した後、ＦＡＣＳにより分析した。細胞生存可能性を測定すべき場合、１０μｌの７−アミノ−アクチノマイシンＤ（7AAD; Sigma, Poole, Dorset）を分析直前に添加した。細胞を結果の計算のため３つの別の形質導入実験からプールした。
【０２６４】
（ｄ）再標的化アデノウイルスで形質導入後の６日の未熟な樹状細胞の成熟とフェノタイピング
６日の未熟な樹状細胞を再標的化したＡｄまたはＡｄ５で完全培地中で２４時間、細胞あたり１００，０００粒子で感染させ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ０２６：Ｂ６リポポリサッカライド（ＬＢＳ）を３時間のインキュベーションの後５０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。対照として、樹状細胞を完全培地で２４時間インキュベートするか、完全培地中で２４時間ＬＰＳの添加により成熟させた。すべての試料において、ＩＬ−４およびＧＮ−ＣＳＦがそれぞれ２５ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌ存在した。細胞を次に次の様に染色することにより表現型化した。２ｍｌ以下の容積の培地中に最小５ｘ１０4の細胞を推奨される量の抗体に添加し、氷上で２０分インキュベートした。２ｍｌの氷冷ＰＢＳを添加後、３００ｇで５分間４℃で遠心分離した。上澄みを飛ばし、ペレットを３００  ｌの冷ｐＢＳ中に再懸濁した。各試料からの細胞をＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０，ＣＤ８０，Ｃｄ８３，ＣＤ８６に対する抗体およびイソタイプにマッチした対照抗体で染色した。細胞の生存可能性も測定する場合、１０  ｌの７ＡＡＤを分析の直前に添加した。細胞をＥｐｉｃｓ  ＸＬ（Beckman Coulter, High Wycombe, UK）およびＥＸＰＯ３２分析ソフトウエア（Beckman Coulter）を用いてフローサイとめとりーにより分析した。
【０２６５】
結果
アデウイルス形質導入
Ａｄ５ベクターの貧弱な樹状細胞ＤＣ伝染性は細胞表面上にＡｄ５線維受容体（ＣＡＲ）の欠如によることが示された。線維タンパク質を向け直して樹状細胞を結合するために、ＳＨＶＫＬＮＳまたはＡＰＳＮＳＴＡペプチドを改変したＡｄ５線維タンパク質のＨＩループ中に遺伝的に挿入した。この線維もＣＡＲ結合をブロックすることが以前に示されている２重ポイント変異（ＫＯ１）の包含により「脱標的化」された。生じた線維で偽タイプ化したＧＦＰ−マークしたＡｄ５粒子の感染性を修飾しないＡｄ５線維の場合のそれと、またはＫＯ１変異のみを含む線維と比較した。
【０２６６】
完全培地中の１０００００ウイルス粒子／細胞で２つの異なるドナーからの未熟樹状細胞への再標的ＥＧＦＰリポーター遺伝子を有するアデノウイルス構築物の遺伝子導入をＦＡＣＳにより測定した。両方のドナーにおいて、ペプチドＡまたはＢのどちらかによるアデノウイルスの再標的化は６４％および７９％の間、例えば７８．９％の形質導入効率を与え、両方は、キャプシド中に野生タイプ線維タンパク質を有するアデノウイルス、４３および４６％の間、と比較して、顕著に高いパーセントの細胞を形質導入し、ＫＯ１線維タンパク質では０．７％および１．４％の間、例えば０．７％であった。表６および図１３を参照。
【０２６７】
顕著な毒性はいずれの形質導入でも見られず、細胞死は５％および１５％の間で測定され、ウイルス間に差はなかった。
【表８】
2007527208.tif 000012
【０２６８】
２．５％血清中の１００００ウイルス粒子／細胞でのヒト一次マクロファージの形質導入も、ペプチドＡ（６７．６％の細胞形質導入）またはペプチドＢ（３４．６％の細胞が形質導入）をウイルスの外被に導入することは野生タイプの線維タンパク質（１３．３％）またはＫＯ１線維タンパク質（９．２％の細胞が形質導入された）を有するウイルスで見られた以上に形質導入効率を顕著に増加させた。表７を参照。
【表９】
2007527208.tif 000013
【０２６９】
すべての他の細胞タイプにおいて、ウイルスがＯｐｔｉＭＥＭ中の細胞あたり１００００粒子で添加された場合、ペプチドＡまたはペプチドＢを有するウイルスは野生タイプの線維タンパク質または無関係なペプチドを有する線維タンパク質を有するウイルスより顕著に高い形質導入効率をもたらした。表８を参照。
【表１０】
2007527208.tif 000014
【０２７０】
Ｎｅｕｒｏ−２Ａ（Ｎ２ａ）細胞においては、ペプチドＡを有するウイルスは６３．５％の形質導入細胞を、ペプチドＢでは５３．７％を与え、一方野生タイプは２４．３％，ＫＯ１は１．４％を無関係なペプチドは１．３％を与えた。
【０２７１】
ＨＡＥｏ−細胞においては、ペプチドＡは８２．９％の形質導入細胞を、ペプチドＢでは７９％を与え、一方野生タイプは４５．８％，ＫＯ１ウイルスは２％を無関係なペプチドは３．２％を与えた。
【０２７２】
同じパターンの形質導入効率はＨＭＥＣ細胞（ペプチドＡ９５．７％、ペプチドＢ９４．２％、野生タイプ７３．３％、ＫＯ１  ２．７％、無関係２５．１％）、そしてＨｅｐＧ２細胞（ペプチドＡ８８．５％、ペプチドＢ７９．７％、野生タイプ６３．８％、ＫＯ１  １．７％および無関係９．７％）でも見られた。
【０２７３】
ネズミ細胞の形質導入
ＳＨＶＫＬＮＳまたはＡＰＳＮＳＴＡのアデノウイルスＨＩループへの導入は一次マウス樹状細胞の形質導入効率をそれぞれ７１．７％および５４．１％まで増加させ、そのレベルは野生タイプＡｄ５（１３．５％）(表６参照)で達成されたより顕著に良好なレベルであった。マウスＳｃａｌ陽性の幹細胞のずっと低い形質導入効率がすべてのアデノウイルス試料で達成され、ＳＨＶＫＬＮＳまたはＡＰＳＮＳＴＡペプチドで再標的化されたアデノウイルスは、最良の形質導入効率5.4％を与え、Ａｄ５ウイルスは２．２％の形質導入を、ＫＯ１は０．６％を与えた。ネズミ神経芽腫細胞（Ｎｅｕｒｏ−２Ａ）も野生タイプウイルスより効率的に形質導入し、野生タイプウイルスの２４％と比較して、ＳＨＶＫＬＮＳおよびＡＰＳＮＳＴＡ再標的ウイルスについてそれぞれ６３．５％および５３．７％のＧＦＰ陽性の細胞を得た。
【０２７４】
樹状細胞の成熟
ＬＰＳに反応して成熟する樹状細胞の能力をウイルス的に形質導入したおよび形質導入しない試料において、５つの成熟マーカー；ＨＬＡ−ＤＲ，ＣＤ４０．ＣＤ８３および共刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６を研究することにより測定した。すべての５つのマーカー（フローサイトメトリーで試験した）のレベルはＬＰＳによる形質導入しない細胞の成熟について増加した。表９参照。
【表１１】
2007527208.tif 000015
【０２７５】
アデノウイルス形質導入細胞は、形質導入しない細胞とＬＰＳに反応してマーカーにおいて同じ増加を示さなかった。ＣＤ８６のレベルはウイルス感染に関係なくすべてのＬＰＳ処理細胞で増加したが、ＨＬＡ−ＤＲ，ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６の誘導は野生タイプウイルスに感染したものと比べて再標的化アデノウイルスで形質導入した細胞においては減少した（表６）。ＣＤ４０の場合、少ない（０．５％）未熟な樹状細胞が検出可能なレベルを示したが、これは形質導入されないＬＰＳ成熟樹状細胞での３０．２％まで増加し、似たレベルの成熟が野生タイプウイルス（２６．４％）で形質導入細胞で見られた。しかしながら、再標的化ウイルスで形質導入した樹状細胞上のＣＤ４０のレベル波、野生タイプウイルスで形質導入後誘導されたそれ以下であった（ＳＨＶＫＬＮＳについて１５．６％およびＡＰＳＮＳＴＡについて９．８％）。ペプチド再標的化ウイルスが野生タイプウイルスに比べてＬＰＳに反応して樹状細胞上で成熟マーカーの低レベルをもたらすこのパターンはＨＬＡ−ＤＲ，ＣＤ８０およびＣＤ８３についても見られた。ＨＬＡ−ＤＲ，およびＣＤ８３染色についてのフローサイトメトリープロットは、成熟はＥＧＦＰの最大域値まで発現するウイルス的に感染した細胞で起こり、それ以上成熟は阻害されるようであることを示す。図１４参照。この効果はＥＧＦＰ発現が域値を超える野生タイプのウイルスでも見られるが、多分形質導入されＥＧＦＰを発現する細胞のより多い数のため再標的化されたアデノウイルスで感染した試料でより著しい。
【０２７６】
実施例４  ＢＬＡＳＴによるペプチド配列分析
ペプチドＡＰＳＮＳＴＡおよびＳＨＶＫＬＮＳを２つの標的ペプチドのＢＬＡＳＴ配列分析により公知のリガンドに対する類似性について研究した。表１０はペプチドＡＰＳＮＳＴＡに対する相同性を有することが見出されたタンパク質を示す。表１０において、太字でハイライトされた残基は同一性を示し、イタリックで示した残基は類似性を示す。
【表１２】
2007527208.tif 000016
【０２７７】
３つの異なったウイルスの受容体標的タンパク質がペプチドＡＰＳＮＳＴＡと相同性を有することが見出された。これらのタンパク質はＨＩＶ−１のｇｐ１２０（アクセッションナンバー：ＡＡＲ９５７１２）、ヒトエコウイルス-７のＶＰ−１（ＥＶ−７）（アクセッションナンバー：ＡＡＫ１３４１１）およびヒトヘルペス６（ＨＨＶ６）のｇｐ８２／１０５およびＨＨＶ７（ アクセッションナンバー：ＡＡＦ０６０２０）であった。ｇｐ１２０はＨＩＶビリオン粒子をＣＤ４およびＣタイプレクチン受容体（ＣＬＲ）によって樹状細胞と結合し、一方ＥＶ−７のＶＰ１は樹状細胞を含むたいていの細胞で発現する崩壊促進因子（ＤＡＦ；ＣＤ５５）を結合し、ｇｐ８２−１０５は樹状細胞にも存在するヘパリンおよびヘパリン硫酸塩グリコプロテインに結合する。しかしながら、ペプチドの完全長の機能的タンパク質との単なる相同性はペプチドがタンパク質と同じ方法で機能するかどうかを決定するのに十分ではない。
【０２７８】
ペプチドＳＨＶＫＬＮＳは多くのタンパク質と近い類似性を共有するが、いずれも可能性ある樹状細胞リガンドとして候補物ではない。
【０２７９】
文献
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【図面の簡単な説明】
【０２８０】
【図１】プラスチックに対する結合を対照としてヒトおよびマウス樹状細胞へのファージクローンの結合の力価決定の結果を示す。図１はドナーＪＤ，ＳおよびＬＡから得た６日ヒト単球由来未熟な樹状細胞への結合を示す。多くのファージをプラーク形成単位（ｐｆｕ）として示した。結合したファージの配列決定はペプチドＡＰＳＮＳＴＡ、ＱＬＬＴＧＡＳ、ＴＡＲＤＹＲＬ、ＦＱＳＱＹＱＫ、ＰＬＭＰＳＬＳ、ＦＰＲＡＰＨＨ、ＭＡＳＩＳＭＫ、ＤＷＷＨＴＳＡ、ＳＨＶＫＬＮＳおよびＳＰＡＬＫＴＶを同定し、非挿入ペプチドを有するファージをも示す。
【０２８１】
【図２ａ】蛍光活性細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）により測定した、４日ヒト単球由来未熟な樹状細胞に対するファージクローンの結合を示す。ＦＩＴＣに対して陽性の細胞のパーセントをＦＡＣＳ分析により測定した。図２ａはドナーＳＢ，Ｕ，ＳＨ，ＫＧおよびＡＭからの細胞に対する結合を示す。
【図２ｂ】図２ｂはドナーＡ〜Ｅからの細胞に対する結合を示す。両方の場合において、結合ファージの配列決定はペプチドＡＰＳＮＳＴＡ、ＦＱＳＱＹＱＫ、ＤＷＷＨＴＳＡ、ＳＨＶＫＬＮＳ、ＳＰＡＬＫＴＶおよびＳＱＫＮＰＱＭを同定した。
【０２８２】
【図３ａ】ＦＡＣＳにより測定した、４日ヒト単球由来未熟な樹状細胞に対するファージクローンの結合を示す。図３ａはＫＧおよびＳＢからの細胞への結合を示す。
【図３ｂ】図３ｂはドナーＡおよびＢの細胞への結合を示す。両方の場合において、結合したファージの次の配列決定はペプチドＱＬＬＴＧＡＳ、ＴＡＲＤＹＲＬ、ＰＬＭＰＳＬＳ、ＦＰＲＡＰＨＨ、ＭＡＳＩＳＭＫ、ＳＴＰＰＮＴＴを同定した。
【０２８３】
【図４ａ】脂質−ペプチド−ＤＮＡ（ＬＩＤ）におけるファージ由来標的ペプチドを用いるヒト単球由来未熟な樹状細胞のトランスフェクションを示す。図４ａはファージ由来ペプチドＡ誘導体（［Ｋ］16−ＧＡＣＳＨＶＫＬＮＳＣＧ）、ペプチドＢ誘導体（［Ｋ］16−ＧＡＣＡＰＳＮＳＴＡＣＧ）、ペプチド６誘導体（［Ｋ］16−ＧＡＣＲＲＥＥＷＡＣＧ）またはスクランブル対照ペプチド６Ｊ（［Ｋ］16−ＧＡＣＡＴＲＷＡＲＥＣＧ）で６日単球由来樹状細胞のトランスフェクションを示す。ペプチドＡおよびＢ誘導体はファージＤＮＡに対する比で１．５：１（Ａ１．５，Ｂ１．５）３：１（Ａ３，Ｂ３）および７：１（Ａ７，Ｂ７）のトランスフェクション複合体で用いた。対照はトランスフェクション複合体を添加しないもの（ＯｐｔｉＭＥＭのみ）、並びにペプチド６誘導体およびペプチド６Ｊ（そのスクランブル対照）でトランスフェクションしたものをペプチド：ＤＮＡの３：１の比で含む。それぞれの結果は３つのプールしたトランスフェクション反応からのＧＦＰ陽性の細胞のパーセントである。
【図４ｂ】図４ｂはファージ由来ペプチドＡ、Ｂ、Ｃ（［Ｋ］16−ＧＡＣＭＡＳＩＳＭＫＣＱ）、Ｄ（［Ｋ］16−ＧＡＣＦＰＲＡＰＨＨＣＧ）およびＦ（［Ｋ］16−ＧＡＣＤＷＷＨＴＳＡＣＧ）で４日の単球由来樹状細胞のトランスフェクションの結果を示す。
【０２８４】
【図５】脂質−ペプチド−ＤＮＡ（ＬＩＤ）トランスフェクションベクターを用いた４日未熟な単球由来樹状細胞のトランスフェクション後のトランスフェクションと細胞死を示す（図４の注を参照）。ペプチド誘導体Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄおよび６を用い、ペプチドを含まないベクターを対照として用いた。脂質としてリポフェクチンまたはリポフェクタミン２０００を含むベクターを用い、ペプチド誘導体Ａを含むベクターおよび脂質を用いないのも対照として用いた。脂質：ＤＮＡの比は重量で０．７５：１であった。すべてのペプチド：ＤＮＡ電荷比は７：１であった。図５ｂは図５ａのベクターを用いたトランスフェクション後の細胞死を示す。細胞死はトランスフェクション後２４時間のフローサイトメトリーにより測定した７ＡＡＤの保持により測定した。
【０２８５】
【図６】図５の短い記述で記載した同じベクターシステムにおけるペプチド誘導体Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｆおよび６を用いる３日樹状細胞のトランスフェクション後のトランスフェクションおよび細胞死を示す。図６ａはトランスフェクション効率を示す。図６ｂは細胞死を示す。
【０２８６】
【図７】ペプチド誘導体Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｆおよび６並びに対照ちしてペプチドを用いないで、図５の注に記載したＬＩＤベクターシステムを用いてヒト末梢血単球のトランスフェクション後のトランスフェクションと細胞死を示す。図７ａはトランスフェクション効率を示す。図７ｂは細胞死を示す。
【０２８７】
【図８】ペプチドＡおよびリポフェクチンを含むＬＩＤトランスフェクションベクター（図５の注を参照）でトランスフェクトした４日の未熟な樹状細胞がＣＤ８６とＨＬＡ−ＤＲを上方調節することを示す。セル（Ａ）の上の列はトランスフェクトしておらず、セル（Ｂ）の上の列はトランスフェクトしている。各試料からの細胞を、フローサイトメトリーの前にＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８６に対するＰＥコンジュゲート抗体で染色した。結果は２つの別のトランスフェクションからのプールした細胞を示し、他のドナーからの樹状細胞の場合も再現可能であった。
【０２８８】
【図９ａ】ＬＰＳ（リポポリサッカライド）に反応して４日樹状細胞のトランスフェクションの成熟を示す。未熟な細胞をペプチドＤおよびリポフェクチンを含みＬＩＤベクターでトランスフェクトした（図５の注を参照）。細胞を図８のように抗体で染色した。示した結果は２つの別のトランスフェクションからのプールした細胞である。列Ａは未熟な細胞を示し、列ＢはＬＰＳで成熟した細胞を示す。
【図９ｂ】列Ｃは４日にトランスフェクトしＬＰＳで成熟した細胞を示し、列Ｄは４日にトランスフェクトし、６日にＬＰＳで成熟した細胞を示す。
【０２８９】
【図１０】ファージ由来ペプチドＡおよびＢ誘導体（図４の注を参照）でのＨＭＥＣ−１細胞系のトランスフェクションを示す。結果はＲＬＵ／ｍｇで示す。ＲＬＵは比較の光単位である。ペプチドＡおよびＢ誘導体、および対照ペプチド６誘導体およびそのスクランブル対照ペプチド６Ｊを用いる細胞のトランスフェクションは、３：１，５：１および７：１を含むペプチド：ＤＮＡ電荷比で行われた（Ａ３，Ａ５，Ａ７，Ｂ３，Ｂ５およびＢ７，６３、６５および６Ｊ５）。対照はトランスフェクション複合体を添加しない細胞（ＯｐｔｉＭＥＭのみ）、インテグリン結合ペプチド（ペプチド６誘導体）でトランスフェクトした細胞、ペプチド６Ｊ誘導体でトランスフェクとした細胞（ペプチド６Ｊはペプチド６のスクランブルした対照である）を含む。各結果は３のプールしたトランスフェクション反応からのＧＦＰ陽性の細胞のパーセントである。各結果は６つの値の平均であり、誤差の棒は平均についての標準偏差である。
【０２９０】
【図１１】ファージ由来合成ペプチドおよび図１０について記載した対照についてのＨＡＥｏ−細胞系のトランスフェクションを示す。
【０２９１】
【図１２】ファージ由来合成ペプチドおよび図１０について記載した対照についてのＮ２ａ（Ｎｅｕｒｏ２ａ）ネズミ細胞のトランスフェクションを示す。
【０２９２】
【図１３】ペプチドＡ（カラムＡ）またはペプチドＢ（カラムＢ）をキャプシドの線維タンパク質のＨＩ領域に導入することにより再標的化した６日のヒト単球由来未熟な樹状細胞のトランスフェクションを、キャプシドのＫＯ１線維タンパク質（カラムＫＯ１）、キャプシドの野生タイプの線維タンパク質（カラムＷＴ）、ブランクを対照として示す。暗い影にしたカラムは形質導入を示し、明るい影にしたカラムは細胞死％を示す。
【０２９３】
【図１４ａ】ＬＰＳに反応して成熟する６日の樹状細胞の能力におよぼすアデノウイルス形質導入の影響を示す。未熟な樹状細胞を野生タイプのＡＤ５で、またはペプチドＳＨＢＫＬＮＳまたはペプチドＡＰＳＮＳＴＡで再標的化したＡＤ５で感染させた。ＬＰＳは３時間のインキュベートの後、添加した。上の列はＨＬＡ−ＤＲを示し、下の列はＣＤ８３を示す。示した結果は３つの別の形質導入からプールした細胞であり、他のドナーからの樹状細胞について再現可能である。
【図１４ｂ】図１４ａの続きである。
【図１】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年2月6日(2006.2.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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