(57)【要約】本発明は、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きい糖部分の３’位における置換基を有するヌクレオチド類似体の改善された取り込みを示す修飾ポリメラーゼ酵素に関する。特に、ＤＮＡ配列決定との関連で、ポリヌクレオチド中にヌクレオチドを取り込むためにポリメラーゼを使用する方法についても記載する。【選択図】図１
2007504817.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対照ポリメラーゼ酵素に比べて、置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドの取り込みを改善することのできる改変されたポリメラーゼ酵素。
【請求項２】
対照ポリメラーゼに比べて、置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドの取り込み速度の増加を示す請求項１に記載のポリメラーゼ。
【請求項３】
４種の塩基Ａ、Ｔ、ＣおよびＧの各々を含み、置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドを取り込むことができる請求項１または２に記載のポリメラーゼ。
【請求項４】
３０℃の反応温度において、置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドを取り込むことができる請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項５】
３０℃から３７℃までの全範囲にわたる反応温度において、置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドを取り込むことができる請求項４に記載のポリメラーゼ。
【請求項６】
４５℃の反応温度において、置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドを取り込むことができる請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項７】
６５℃から８０℃までの全範囲にわたる反応温度において、置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドを取り込むことができる請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項８】
４５℃から８０℃までの全範囲にわたる反応温度において、置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドを取り込むことができる請求項７に記載のポリメラーゼ。
【請求項９】
３０℃から８０℃までの全範囲にわたる反応温度において、置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドを取り込むことができる請求項８に記載のポリメラーゼ。
【請求項１０】
約２５マイクロモルの基質濃度において、置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドを取り込むことができる請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項１１】
ＤＮＡポリメラーゼである請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項１２】
ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼである請求項１１に記載のポリメラーゼ。
【請求項１３】
任意のファミリーＢ古細菌ＤＮＡポリメラーゼ、ヒトＤＮＡポリメラーゼαまたはＴ４、ＲＢ６９およびφ２９ファージＤＮＡポリメラーゼから選択される請求項１２に記載のポリメラーゼ。
【請求項１４】
Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ、９°ＮおよびＰｆｕポリメラーゼから選択される請求項１３に記載のファミリーＢ古細菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１５】
９°Ｎポリメラーゼである請求項１４に記載のポリメラーゼ。
【請求項１６】
ファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼである請求項１１に記載のポリメラーゼ。
【請求項１７】
Ｔａｑポリメラーゼである請求項１６に記載のポリメラーゼ。
【請求項１８】
対照ポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼまたはエキソヌクレアーゼ活性を欠くその変異体である請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項１９】
対照ポリメラーゼは、Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列と機能的に等価な以下の置換または二重置換突然変異：Ｙ４１２Ｖ、Ｙ４１２Ｌ、Ｙ４１２Ｆ、Ｑ４８６Ｅ、Ｑ４８６Ｌ、Ｒ４８７Ｋ、Ａ４８８Ｃ、Ａ４８８Ｓ、Ａ４８８Ｌ、Ａ４８８Ｉ、Ａ４８８Ｆ、Ａ４８８Ｖ、Ｋ４９０Ａ、Ｋ４９０Ｒ、Ｋ４９０Ｎ、Ｎ４９４Ｄ、Ｓ４９５Ａ、Ｙ４９６Ｆ、Ｙ４９６Ｌ、Ｙ４９７Ｓ、Ｙ４９７Ｆ、Ｙ４９９Ｌ、Ｙ４９９Ｆ、Ａ４８８Ｃ／Ｙ４９９ＦまたはＡ４８８Ｌ／Ｙ４９９Ｌのいずれかを含む請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項２０】
対照ポリメラーゼは、前記置換または二重置換突然変異の一つを含むＶｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼである請求項１９に記載のポリメラーゼ。
【請求項２１】
対照ポリメラーゼは、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列と機能的に等価な以下の置換または二重置換突然変異：Ａ４８５ＬまたはＹ４０９Ｖ／Ａ４８５Ｌのいずれかを含む請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項２２】
対照ポリメラーゼは、前記置換突然変異または二重置換突然変異の一つを含む９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼである請求項２１に記載のポリメラーゼ。
【請求項２３】
対照ポリメラーゼは、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列と機能的に等価な以下の置換突然変異：Ａ４８６Ｙを含む請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項２４】
対照ポリメラーゼは、前記置換突然変異を含むＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼである請求項２３に記載のポリメラーゼ。
【請求項２５】
対照ポリメラーゼは、Ｔｓｐ  ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列と機能的に等価な以下の置換または二重置換突然変異：Ａ４８５Ｔ、Ｐ４１０ＬまたはＹ４８５Ｔ／Ｐ４１０Ｌのいずれかを含む請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項２６】
対照ポリメラーゼは、前記置換突然変異または二重置換突然変異の一つを含むＴｓｐ  ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼである請求項２５に記載のポリメラーゼ。
【請求項２７】
ポリメラーゼが突然変異Ｖｅｎｔ（商標）ポリメラーゼである場合、ポリメラーゼは、モチーフＡ領域中にそれ以上の置換突然変異がないときは単一アミノ酸置換Ｙ４１２Ｖ、Ｙ４１２ＬまたはＹ４１２Ｆのいずれも有さず、
ポリメラーゼが突然変異９°Ｎポリメラーゼである場合、ポリメラーゼは、モチーフＡ領域中にそれ以上の置換突然変異がないときはアミノ酸置換Ａ４８５Ｌと併せてアミノ酸置換Ｙ４０９Ｖを有さず、
ポリメラーゼが突然変異Ｔｓｐ  ＪＤＦ−３ポリメラーゼである場合、ポリメラーゼは、モチーフＡ領域中にそれ以上の置換突然変異がないときは単独で、あるいは突然変異Ａ４８５Ｔと併せてアミノ酸置換Ｐ４１０Ｌを有さない
という条件で、モチーフＡ領域中に１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換突然変異を含む請求項１〜２６のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項２８】
モチーフＡ領域中の第１、第２または第３のアミノ酸位置において１つのアミノ酸置換突然変異を含む請求項２７に記載のポリメラーゼ。
【請求項２９】
モチーフＡ領域中の第２のアミノ酸位置において１つのアミノ酸置換突然変異を含む請求項２８に記載のポリメラーゼ。
【請求項３０】
置換突然変異は、モチーフＡ領域の第１、第２および第３のアミノ酸位置のうち２つの任意の組合せで起きる、２つのアミノ酸置換突然変異を含む請求項２７に記載のポリメラーゼ。
【請求項３１】
モチーフＡ領域の第１および第２のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換突然変異を含む請求項３０に記載のポリメラーゼ。
【請求項３２】
モチーフＡ領域の第１、第２および第３のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換突然変異を含む請求項２７に記載のポリメラーゼ。
【請求項３３】
モチーフＡ領域の第１のアミノ酸は、突然変異される場合、
芳香族アミノ酸、特にチロシン（Ｙ）またはフェニルアラニン（Ｆ）、
脂肪族側鎖のあるアミノ酸、特にイソロイシン（Ｉ）、アラニン（Ａ）もしくはバリン（Ｖ）、またはグルタミン酸（Ｑ）、
システイン（Ｃ）またはセリン（Ｓ）
から選択されるアミノ酸に突然変異される請求項２７〜３２のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項３４】
モチーフＡ領域の第２のアミノ酸は、突然変異される場合、
アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）またはグリシン（Ｇ）、最も好ましくはアラニン（Ａ）から選択されるアミノ酸に突然変異される請求項２７〜３３のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項３５】
モチーフＡ領域の第３のアミノ酸は、突然変異される場合、
セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）、
β分岐側鎖を有するアミノ酸、特にイソロイシン（Ｉ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）またはロイシン（Ｌ）
から選択されるアミノ酸に突然変異される請求項２７〜３４のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項３６】
モチーフＡ領域の第２のアミノ酸は、アラニン（Ａ）に突然変異される請求項２９に記載のポリメラーゼ。
【請求項３７】
モチーフＡ領域は、以下のアミノ酸配列、すなわちＦＡＰ、ＹＡＰまたはＶＡＰのうち１つを有する請求項３１に記載のポリメラーゼ。
【請求項３８】
モチーフＡ領域は、以下のアミノ酸配列、すなわちＹＳＴ、ＦＡＩ、ＡＡＡ、ＹＡＳ、ＹＡＶ、ＹＧＩ、ＹＳＧ、ＳＧＧ、ＣＳＴ、ＩＡＬ、ＣＧＧ、ＳＡＬ、ＳＡＡ、ＣＡＡ、ＹＡＡ、ＱＡＳ、ＶＳＳ、ＶＡＧ、ＶＡＶ、ＦＡＶ、ＡＧＩ、ＹＳＳ、ＡＡＴ、ＦＳＳまたはＶＡＬのうち１つを有する請求項３４に記載のポリメラーゼ。
【請求項３９】
モチーフＡ領域は、アミノ酸配列ＹＡＶまたはＹＡＳを有する請求項３８に記載のポリメラーゼ。
【請求項４０】
モチーフＢ領域中に少なくとも１つのアミノ酸置換突然変異をさらに含む請求項２７〜３９のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項４１】
モチーフＢ領域の第２のアミノ酸残基における置換突然変異を含む請求項４０に記載のポリメラーゼ。
【請求項４２】
モチーフＢ領域の第２のアミノ酸は、ロイシン、フェニルアラニン、イソロイシン、セリン、バリンまたはシステインに突然変異される請求項４１に記載のポリメラーゼ。
【請求項４３】
モチーフＡ領域中の３つの置換突然変異およびモチーフＢ領域中の２つまたは３つの置換突然変異を有する請求項４０に記載のポリメラーゼ。
【請求項４４】
９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列と機能的に等価な以下の一連の置換突然変異、すなわち
Ｌ４０８Ｗ／Ｙ４０９Ａ／Ｐ４１０Ｌ  Ｒ４８４Ｓ／Ａ４８５Ｋ／Ｉ４８６Ｎ
Ｌ４０８Ｄ／Ｙ４０９Ｖ／Ｐ４１０Ｇ  Ｒ４８４Ｇ／Ａ４８５Ｒ／Ｉ４８６Ｄ
Ｌ４０８Ｍ／Ｙ４０９Ｌ／Ｐ４１０Ｆ  Ｒ４８４Ｋ／Ａ４８５Ｈ／Ｉ４８６Ｎ
Ｌ４０８Ｖ／Ｙ４０９Ｄ／Ｐ４１０Ｇ  Ｒ４８４Ｇ／Ｉ４８６Ｌ
Ｌ４０８Ｖ／Ｙ４０９Ａ／Ｐ４１０Ｌ  Ｒ４８４Ｉ／Ａ４８５Ｓ／Ｉ４８６Ｎ
Ｌ４０８Ｓ／Ｙ４０９Ｓ／Ｐ４１０Ｌ  Ｒ４８４Ｎ／Ｉ４８６Ｑ
Ｌ４０８Ｙ／Ｙ４０９Ａ／Ｐ４１０Ｌ  Ｒ４８４Ｔ／Ａ４８５Ｈ／Ｉ４８６Ｈ
のいずれか１つを含む請求項４３に記載のポリメラーゼ。
【請求項４５】
９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列と機能的に等価な以下の突然変異、すなわち
Ｌ４０８Ｖ／Ｙ４０９Ａ／Ｐ４１０Ｌ  Ｒ４８４Ｉ／Ａ４８５Ｓ／Ｉ４８６Ｎ
の各々を含む請求項４４に記載のポリメラーゼ。
【請求項４６】
エキソヌクレアーゼ活性を欠く請求項１〜４５のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項４７】
配列番号２０、配列番号２２、配列番号１８または配列番号１２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む変異９°Ｎポリメラーゼ。
【請求項４８】
配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含むが、残基４０８と４１０の間、場合により残基４８４と４８６の間のアミノ酸配列中に１つまたは複数の変化を有し、その他のアミノ酸変化がないときにアミノ酸４０９がバリン残基でアミノ酸４８５がロイシン残基であるタンパク質をもたらす変化は除外される変異９°Ｎポリメラーゼであって、配列番号１４として示されるアミノ酸配列を有する９°Ｎポリメラーゼに比べて、置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドの改善された取り込みを示す変異９°Ｎポリメラーゼ。
【請求項４９】
残基４０８と４１０の間および残基４８４と４８６の間のアミノ酸配列中に１つまたは複数の変化を含む請求項４８に記載のポリメラーゼ。
【請求項５０】
置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドは、プリンまたはピリミジン塩基および３’炭素原子が構造−Ｏ−Ｚの基と結合しているような、共有結合した除去可能な３’−ＯＨ保護基を有するリボースまたはデオキシリボース糖部分を含む修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシド分子を含み、
式中、Ｚは、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｏ−Ｒ’’、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｈ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｓ−Ｒ’’および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｆのいずれかであり、
各Ｒ’’は、除去可能な保護基またはその一部であり、
各Ｒ’は、独立して、水素原子、アルキル、置換アルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、アシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシもしくはアミド基、または結合基を介して結合した検出可能な標識であるか、あるいは、（Ｒ’）２は、式＝Ｃ（Ｒ’’’）２のアルキリデン基を表し、各Ｒ’’’は、同一または異なってもよく、水素およびハロゲン原子ならびにアルキル基を含む群から選択され、
前記分子は、反応して、各Ｒ’’がＨと交換されるか、あるいはＺが−Ｃ（Ｒ’）２−Ｆの場合、ＦがＯＨ、ＳＨまたはＮＨ２、好ましくはＯＨと交換された中間体が得られ、その中間体は水性条件下で解離し、遊離の３’ＯＨを含む分子が得られ、
ただし、Ｚが−Ｃ（Ｒ’）２−Ｓ−Ｒ’’の場合、両Ｒ’基は、Ｈではない請求項１〜４９のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項５１】
修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドのＲ’は、アルキルまたは置換アルキルである請求項４９に記載のポリメラーゼ。
【請求項５２】
修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドの−Ｚは、式−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ３である請求項５１に記載のポリメラーゼ。
【請求項５３】
Ｚは、アジドメチル基である請求項５２に記載のポリメラーゼ。
【請求項５４】
置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドは、切断可能なリンカーが下式を含む群から選択される部分を含むことを特徴とする、切断可能なリンカーを介して検出可能な標識と結合する塩基を有するヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む請求項１〜４９のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【化１】
2007504817.tif 000008
［式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨおよびＮＱ（Ｑは、Ｃ１−１０置換または非置換アルキル基である）を含む群から選択され、Ｙは、Ｏ、Ｓ、ＮＨおよびＮ（アリル）を含む群から選択され、Ｔは、水素またはＣ１−１０置換もしくは非置換アルキル基であり、＊は、その部分が、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの残部と結合している場所を示す。］
【請求項５５】
検出可能な標識は、蛍光標識を含む請求項５４に記載のポリメラーゼ。
【請求項５６】
各ヌクレオチドタイプは、異なる蛍光標識を有する請求項５５に記載のポリメラーゼ。
【請求項５７】
請求項２７〜４９のいずれか一項に記載の改変されたポリメラーゼをコードする核酸分子。
【請求項５８】
変異９°Ｎポリメラーゼをコードする請求項５７の核酸分子であって、核酸分子は、配列番号１３のヌクレオチド配列を含むが、ヌクレオチド１２２２からヌクレオチド１２３０までの領域中に核酸配列の１つまたは複数の変化を有し、前記核酸分子は、アミノ酸残基４０８からアミノ酸残基４１０までの領域中に１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換突然変異を有する突然変異９°Ｎポリメラーゼ酵素をコードするが、ただし、核酸分子は、アミノ酸置換突然変異Ｙ４０９ＶとＡ４８５Ｌを一緒に有する突然変異９°Ｎポリメラーゼをコードしない核酸分子。
【請求項５９】
配列番号１３に比べて、ヌクレオチド１４４９からヌクレオチド１４５７までに領域中のヌクレオチド配列に１つまたは複数の変化がさらに含まれる請求項５８に記載の核酸分子であって、核酸分子によってコードされる突然変異９°Ｎポリメラーゼ酵素には、アミノ酸残基４８４から残基４８６までの領域中に１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換突然変異がさらに含まれるような核酸分子。
【請求項６０】
変異９°Ｎポリメラーゼ酵素をコードする核酸分子であって、核酸分子は、ヌクレオチド配列、配列番号１９、配列番号２１、配列番号１７または配列番号１１のうち１つを含む核酸分子。
【請求項６１】
請求項５７〜６０のいずれか一項に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項６２】
ポリヌクレオチド中へヌクレオチドを取り込むための請求項１〜５６のいずれか一項に記載のポリメラーゼの使用。
【請求項６３】
ヌクレオチドは、置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルにおいて修飾されている請求項６２に記載の使用。
【請求項６４】
置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドをＤＮＡ中に取り込むための方法であって、以下の構成要素、すなわち、
−請求項１〜５６のいずれか一項に記載のポリメラーゼ
−ＤＮＡテンプレート、および
−置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドを含有するヌクレオチド溶液
を相互作用させることを含む方法。
【請求項６５】
ＤＮＡテンプレートのＤＮＡ配列を決定するため、置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドの取り込みが検出される請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドは、プリンまたはピリミジン塩基および３’炭素原子が構造−Ｏ−Ｚの基と結合しているような、共有結合した除去可能な３’−ＯＨ保護基を有するリボースまたはデオキシリボース糖部分を含む修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシド分子を含み、
式中、Ｚは、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｏ−Ｒ’’、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｈ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｓ−Ｒ’’および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｆのいずれかであり、
各Ｒ’’は、除去可能な保護基またはその一部であり、
各Ｒ’は、独立して、水素原子、アルキル、置換アルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、アシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシもしくはアミド基、または結合基を介して結合した検出可能な標識であるか、あるいは、（Ｒ’）２は、式＝Ｃ（Ｒ’’’）２のアルキリデン基を表し、各Ｒ’’’は、同一または異なってもよく、水素およびハロゲン原子ならびにアルキル基を含む基から選択され、
前記分子は、反応して、各Ｒ’’がＨと交換されるか、あるいはＺが−Ｃ（Ｒ’）２−Ｆの場合、ＦがＯＨ、ＳＨまたはＮＨ２、好ましくはＯＨと交換された中間体が得られ、その中間体は水性条件下で解離し、遊離の３’ＯＨを含む分子が得られ、
ただし、Ｚが−Ｃ（Ｒ’）２−Ｓ−Ｒ’’の場合、両Ｒ’基は、Ｈではない請求項６４または請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドのＲ’は、アルキルまたは置換アルキルである請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドの−Ｚは、式−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ３である請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
Ｚは、アジドメチル基である請求項６８に記載のポリメラーゼ。
【請求項７０】
ポリメラーゼは、請求項３９に記載の通りである請求項６４〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドを蛍光標識し、それらの検出を可能にする請求項６４または請求項６５に記載の方法。
【請求項７２】
置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドは、切断可能なリンカーが下式を含む基から選択される部分を含むことを特徴とする、切断可能なリンカーを介して検出可能な標識と結合する塩基を有するヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む請求項６４または請求項６５に記載の方法。
【化２】
2007504817.tif 000009
［式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨおよびＮＱ（Ｑは、Ｃ１−１０置換または非置換アルキル基である）を含む群から選択され、Ｙは、Ｏ、Ｓ、ＮＨおよびＮ（アリル）を含む群から選択され、Ｔは、水素またはＣ１−１０置換もしくは非置換アルキル基であり、＊は、その部分が、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの残部と結合している場所を示す。］
【請求項７３】
検出可能な標識は、蛍光標識を含む請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
各ヌクレオチドタイプは、異なる蛍光標識を有する請求項７１〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
蛍光標識されたヌクレオチドは、標識ヌクレオチドに特異的な波長のレーザー光線を用いて検出される請求項７１〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
蛍光は、ＣＣＤカメラによって検出される請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
１つまたは複数のＤＮＡテンプレートは、表面上に固定化される請求項６４〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
複数のＤＮＡテンプレートが表面上に固定化されてアレイを形成する請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
アレイは、単分子アレイを含み、アレイ上で検出可能である各部位に単一ＤＮＡテンプレート分子がある請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
アレイは、クラスターアレイを含む請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
アレイ上の各テンプレートについて最初の１０〜１００個のヌクレオチドの配列が決定される請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
アレイ上の各テンプレートについて最初の２５個のヌクレオチドの配列が決定される請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
アレイ上のテンプレートから得られる配列を整列するステップと、適当なバイオインフォマティクスシステムを用いて１つの参照配列または複数の参照配列と比較するステップとをさらに含む請求項８１または８２に記載の方法。
【請求項８４】
得られるアライメントを用い、遺伝的変異を確認する請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
遺伝的変異は、ＳＮＰを含む請求項８４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、ポリメラーゼ酵素、より詳細には、対照ポリメラーゼに比べて、修飾ヌクレオチドの改善された取り込みを示す修飾ＤＮＡポリメラーゼに関する。本発明には、高密度アレイの使用を含む、ＤＮＡ配列決定のためにポリメラーゼを使用する方法も含まれる。
【背景】
【０００２】
すべての生物体は、それらのゲノムの複製および維持をＤＮＡポリメラーゼに依存している。ＤＮＡポリメラーゼは、塩基間の相補性を検出すること、ならびに塩基の付加的な構造的特徴を認識することにより、ＤＮＡの忠実度の高い複製を可能にする。
【０００３】
ＤＮＡポリメラーゼには、それらの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩとのアミノ酸類似性に基づき、３つの主要なスーパーファミリーが存在する。それらは、それぞれファミリーＡ、ＢおよびＣポリメラーゼと呼ばれる。ファミリーＡおよびＢポリメラーゼの結晶学的解析は、ヌクレオチド結合部位について共通の構造的コアを示すものの、ファミリー内でよく保存されている配列モチーフは、ファミリー間では弱く保存されているに過ぎず、これらのポリメラーゼがヌクレオチド類似体を区別する方法には著しい違いがある。
【０００４】
ＤＮＡポリメラーゼによる初期の実験は、ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）などの修飾ヌクレオチドを取り込む困難さを示した。したがって、ヌクレオチド類似体の取り込み速度を高めるためにＤＮＡポリメラーゼを修飾したいくつかの例が存在する。これらの大部分は、ジデオキシヌクレオチド連鎖停止剤の取り込みを増すためのファミリーＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ）の変異体に焦点を当ててきた。
【０００５】
例えば、Ｔａｂｏｒ，Ｓ．およびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｃ．Ｃ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ）９２：６３３９は、サーマスアクアチカス（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼにおけるフェニルアラニン６６７のチロシンによる置換について記載しており、ＤＮＡポリメラーゼによるジデオキシヌクレオチドの区別に対する効果を有する。
【０００６】
修飾ヌクレオチドの取り込み効率を高めるため、ＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く（ｅｘｏ−で表される）ように利用または操作されてきた。９°Ｎポリメラーゼのｅｘｏ−変異体は、Ｐｅｒｌｅｒ他、１９９８米国特許第５７５６３３４号パンフレットおよびＳｏｕｔｈｗｏｒｔｈ他、１９９６  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：５２８１によって記載されている。
【０００７】
Ｇａｒｄｎｅｒ  Ａ．Ｆ．およびＪａｃｋ  Ｗ．Ｅ．（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｕｇａｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎ  ａｒｃｈａｅｏｎ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：２５４５、１９９９）は、リボ−、２’および３’デオキシリボ−および２’３’−ジデオキシ−リボヌクレオチドの取り込みを増強するＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼにおける突然変異について記載している。Ｖｅｎｔポリメラーゼにおける２つの個別突然変異、Ｙ４１２ＶおよびＡ４８８Ｌは、ヌクレオチドＡＴＰにより酵素の相対活性を増強した。さらに、Ｙ４１２およびＡ４８８における他の置換も、それ程ではないがリボヌクレオチド取り込みを増加させた。残基４１２におけるアミノ酸側鎖のかさが「立体ゲート（ｓｔｅｒｉｃ  ｇａｔｅ）」として働き、リボヌクレオチド糖の２’−ヒドロキシルの結合部位への接近を妨害すると結論づけた。しかしながら、コルジセピン（３’デオキシアデノシン三リン酸）による速度増強は２倍に過ぎず、Ｙ４１２Ｖポリメラーゼ変異体は、３’糖ヒドロキシルの欠如にも感受性であることが示唆された。残基Ａ４８８の場合、活性の変化は、合理的に説明するのが難しい。Ａ４８８は、ヌクレオチド結合部位から離れて指示すると予想される。活性の増強は、酵素反応に必要な活性化エネルギーに対する変化によって説明された。Ｖｅｎｔにおけるこれらの突然変異は、９°ＮポリメラーゼにおけるＹ４０９およびＡ４８５に対応する。
【０００８】
Ａ４８８Ｌ突然変異の普遍性は、以下の超好熱性ポリメラーゼにおける相同的突然変異によって裏付けられている。
【０００９】
１）Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼのＡ４８６Ｙ変異体（Ｅｖａｎｓ他、２０００。Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２８：１０５９）。一連のランダム突然変異をポリメラーゼ遺伝子中に導入し、ｄｄＮＴＰの改善された取り込みを有する変異体を確認した。Ａ４８６Ｙ突然変異は、野生型に比べて、配列決定ラダーにおけるｄｄＮＴＰ／ｄＮＴＰの比を１５０倍改善した。しかしながら、Ｙ４１０のＡまたはＦへの突然変異は、野生型酵素より劣る配列決定ラダーをもたらす変異体を生じた。さらなる情報については、国際公開番号国際公開第０１／３８５４６号パンフレットを参照されたい。
【００１０】
２）９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのＡ４８５Ｌ変異体（ＧａｒｄｎｅｒおよびＪａｃｋ、２００２。Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：６０５）。この研究は、アミノ酸４８５におけるアラニンのロイシンへの突然変異が、３’糖ヒドロキシル部分を欠くヌクレオチド類似体（ａｃｙＮＴＰおよびジデオキシＮＴＰ）の取り込みを増強することを立証した。
【００１１】
３）Ｔｓｐ  ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼのＡ４８５Ｔ変異体（Ａｒｅｚｉ他、２００２。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２２：７１９）。この論文では、ＪＤＦ−３ポリメラーゼ中にランダム突然変異を導入し、ｄｄＮＴＰの増強された取り込みを有する変異体を確認した。個別に、２つの突然変異、Ａ４８５ＴおよびＰ４１０Ｌは、野生型酵素に比べて、ｄｄＮＴＰ取り込みを改善した。共同して、これらの突然変異は、相加効果を有し、ｄｄＮＴＰ取り込みを２５０倍改善した。この論文は、ＤＮＡポリメラーゼの２つの領域の同時突然変異が、ヌクレオチド類似体取り込みに対して相加効果を有することがあることを示している。さらに、この論文は、上述のＹ４０９に隣接するＰ４１０が、ヌクレオチド糖類似体の区別においても役割を果たしていることを示している。
【００１２】
４）国際公開第０１／２３４１１号パンフレットは、ジデオキシヌクレオチドおよびアシクロヌクレオチドのＤＮＡ中への取り込みにおけるＶｅｎｔのＡ４８８Ｌ変異体の使用について記載している。また、前記出願は、これらのヌクレオチド類似体および残基４８５において突然変異された９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼの変異体を用いる配列決定の方法を包含している。
【００１３】
Ｓａｇｎｅｒ他（１９９１  Ｒａｐｉｄ  ｆｉｌｔｅｒ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ：ｄｉｒｅｃｔ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ．Ｇｅｎｅ  ９７：１１９）は、新規なＤＮＡポリメラーゼを確認するための方法を開示している。
【００１４】
上記の議論から明らかなように、ポリメラーゼは、リボースまたはデオキシリボース糖部分の３’炭素においてヒドロキシル基を欠くヌクレオチドを取り込むように修飾されてきた。しかしながら、今回、驚いたことに、発明者らは、天然の３’ヒドロキシル基より大きな３’置換基を有する修飾ヌクレオチドの取り込みが、修飾ＤＮＡポリメラーゼによって実現できることを見いだした。
【発明の説明】
【００１５】
本発明者らは、さらなるヌクレオチドの取り込みを妨害する３’糖ヒドロキシル基において修飾を有するヌクレオチド類似体を用いるＤＮＡを配列決定するための方法を考案してきた。３’ブロックを有するヌクレオチドの使用は、制御的にポリヌクレオチド鎖中に連続してヌクレオチドを取り込ませる。各ヌクレオチド付加後、３’ブロックの存在は、鎖中へのさらなるヌクレオチドの取り込みを妨げる。一旦、取り込まれたヌクレオチドの性質が決定されたら、ブロックを除去し、次のヌクレオチドを付加するための遊離３’ヒドロキシル基を残すことができる。
【００１６】
このＤＮＡ配列決定法の効率を改善するため、発明者らは、そのような３’置換ヌクレオチド類似体の改善された取り込み速度を生じるようにＤＮＡポリメラーゼを修飾できるか否かについて検討してきた。
【００１７】
上述のように、他のグループは、ｄＮＴＰ上で天然に見いだされる３’糖ヒドロキシル部分への変化に感受性のポリメラーゼ変異体を確認してきた。しかしながら、これらの酵素の特徴は、３’位においてヒドロキシル基を欠くｄｄＮＴＰとｄＮＴＰを区別することであった。本発明がそれらと異なるのは、以前の研究では、「修飾」ｄｄＮＴＰのリボース環がｄＮＴＰより小さいからである。対照的に、発明者らの配列決定法において利用されるヌクレオチド類似体は、天然の３’−ヒドロキシルよりサイズが大きい３’置換基を有する。したがって、以前の研究は、本発明と異なる問題に対処してきたため、ポリメラーゼにとって望ましい基質分子の性質の違いは、以前の研究を、本発明が対処する問題に外挿できないことを意味する。したがって、どのポリメラーゼ配列が、本発明において利用される３’修飾ヌクレオチド類似体のＤＮＡ中への取り込みを改善するかを予測することは困難である。
【００１８】
置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドを効率的に取り込むことができる変異ＤＮＡポリメラーゼが依然として要求される。多くのヌクレオチドの場合、３’糖ヒドロキシル基の修飾は、ＤＮＡ合成を終了させる基質をもたらす。しかしながら、適切な条件下で反応して３’ヒドロキシル基を形成することができる３’糖位置における修飾を有するヌクレオチドも存在する。これらのヌクレオチドは、「可逆的停止剤」と呼ばれる。そのような３’保護ヌクレオチドを取り込む能力を有するＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ配列決定などのＤＮＡ合成に関わる応用例を有する。さらに、変異ＤＮＡポリメラーゼは、たとえ取り込みの効率が高まっても、修飾ヌクレオチドに対する塩基特異性を維持できなければならない。特に、マンガンイオンなどの特定の補助因子は、ＤＮＡポリメラーゼによるヌクレオチド誤取り込みを増加させることが分かっている。しかしながら、ＤＮＡ配列決定などの特定の応用例については、修飾ヌクレオチドの忠実度の高い取り込みを可能にする反応条件を選択することが重要である。このような場合、誤取り込みを増加させるマンガンまたは他の補助因子が反応混合物中に含まれないことが好ましいであろう。
【００１９】
今回、本発明者らは、驚いたことに、望ましい類似体の改善された取り込みを示し、多くの他の関連する利点を有する特定の改変されたポリメラーゼを確認した。本発明のポリメラーゼの驚くべき特徴および大きな利点を以下の通り要約する。
【００２０】
（１）大きな３’置換基部分を有するヌクレオチドを取り込む能力
これは、本発明のポリメラーゼの重要な利点であり、３’−保護ヌクレオチドの使用に基づく配列決定プロトコルにおける有用性と直接関係する。上述のように、修飾ヌクレオチドの取り込みに関する以前の研究は、修飾ポリメラーゼが３’位におけるヒドロキシル基を欠くヌクレオチドを取り込む能力に焦点を当ててきた。したがって、発明者らが、天然の３’ヒドロキシルより実質的にサイズが大きい３’置換基部分を有する修飾ヌクレオチドを取り込むことができる改変されたポリメラーゼを調製することができたことは最も驚くべきことである。天然のヒドロキシル基のサイズに比べて、取り込むことができる置換基の全体のサイズおよび取り込むことができる様々な化学的部分の範囲は最も予想外である。
【００２１】
（２）一次アミノ酸配列における最少の変異
発明者らは、修飾ヌクレオチドを取り込む能力が、酵素のヌクレオチド結合部位におけるほんの１つのアミノ酸変化によって付与されることを明らかにした。酵素の基質特異性に対するこのような著しい効果をとにかく実現できることは極めて驚くべきことであるが、一次アミノ酸配列におけるこのような限定された変化によってこのような効果が実現できることはさらに予想外である。
【００２２】
（３）４種の天然ＤＮＡ塩基すべてを取り込む能力
さらに、発明者らは、改変されたポリメラーゼが、４種の天然ＤＮＡ塩基Ａ、Ｔ、ＣおよびＧすべてを含有する修飾ヌクレオチド取り込むことができることを観察した。この場合も、異なる塩基を含有する類似体を取り込むには異なる修飾ポリメラーゼを設計しなければならないであろうと当業者が合理的に予想するように、このことは予想外の知見である。このことは、配列決定反応を行うためには、異なるポリメラーゼのカクテル、おそらく最適な活性のために異なる反応条件を必要とするカクテルが必要とされるであろうことを意味している。したがって、単一の酵素が４種の天然ＤＮＡ塩基の各々を含有する修飾ヌクレオチド類似体を取り込むことができるように、改変されたポリメラーゼを構築できるという驚くべき知見が、配列決定プロトコルにおける大きな利点を提供するのは、とりわけ、同一の反応条件下で４種の塩基すべてを取り込むことができるためである。
【００２３】
（４）取り込み速度の実質的増加
本発明のポリメラーゼによって実現された修飾類似体の取り込み速度のすべての増加も大いに予想外であったのは、特に、そのような改善が、一次アミノ酸配列におけるそのような限定された変化によって実現できたためである。添付の実施例で示すように、最も好ましい改変されたポリメラーゼは、酵素処理の第１サイクルで２０秒以下という５０％生成物変換までの時間、第２サイクルでは１．５分以下という対応する活性を示し、一方、対照酵素は、同一反応条件下、酵素処理の第１および第２サイクルで検出可能な取り込みを示さない。
【００２４】
（５）低温における活性
また、本発明の改変されたポリメラーゼは、広い温度範囲にわたって活性を示し、より具体的には、等価な野生型酵素に最適な温度とは懸け離れた低温において活性を示す。添付の実施例で示すように、発明者らは、改変されたポリメラーゼが、９°Ｎポリメラーゼにとって最適な８０℃という温度とは懸け離れた４５°、さらには３０℃という低い温度において活性であることを明らかにした。したがって、改変されたポリメラーゼは、低温および高温において行われる配列決定プロトコルにおける使用に適している。この場合も、この知見が極めて予想外であるのは、一般に、修飾ヌクレオチド類似体の許容できる取り込み速度を観察するためには、野生型酵素の活性にとっての最適条件、例えば、９°Ｎポリメラーゼについての８０℃という温度に近い条件で働かせることが必要であろうと合理的に予想されるからである。
【００２５】
（６）低い基質濃度における活性
さらに、発明者らは、本発明の改変されたポリメラーゼを用いる取り込みを実現するのに必要な修飾ヌクレオチド類似体基質の濃度が、予測されたよりもはるかに低いことを観察した。当業者は、取り込みを実現し、酵素に修飾ヌクレオチドを効率的に取り込ませるには高濃度の修飾ヌクレオチドが必要であろうと予想していたかもしれない。非特異的結合の減少ならびにより経済的であることにつながるため、より低い濃度の基質を使用する能力は重要である。
【００２６】
（７）複数の取り込みサイクルにわたる活性
改変されたポリメラーゼ酵素は、複数の酵素サイクルにわたり、修飾ヌクレオチドの改善された取り込みを示す。この場合も、この特性は、ポリヌクレオチド鎖中へのヌクレオチドの逐次的取り込みを必要とする合成による配列決定応用例にとって重要である。酵素処理の１サイクルにおいて修飾ヌクレオチドを取り込むことができる酵素が配列決定において限定された価値しかないのは、異なるサイクルにおいて異なるポリメラーゼを添加することが必要になるためである。
【００２７】
大きな３’置換基を有するヌクレオチドの取り込みが確認された修飾ポリメラーゼは、天然ヌクレオチドおよび他のヌクレオチド類似体を取り込むこともできるであろうことが予測される。
【００２８】
要約すれば、発明者らは、大きな３’置換基を有する修飾ヌクレオチドを取り込むことができ、多くの有利な特性を示す改変されたポリメラーゼを作り出した。
【００２９】
したがって、本発明の第１の態様において、対照ポリメラーゼ酵素に比べて、置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドの取り込みを改善することのできる改変されたポリメラーゼ酵素が提供される。
【００３０】
「取り込み」は、修飾ヌクレオチドの５’リン酸基とのホスホジエステル結合の形成を介して第２のヌクレオチドの遊離３’ヒドロキシル基に修飾ヌクレオチドを結合することを意味する。通常、修飾ヌクレオチドが結合される第２のヌクレオチドは、ポリヌクレオチド鎖の３’末端に生じるはずである。
【００３１】
特に指定のない限り、用語「修飾ヌクレオチド」および「ヌクレオチド類似体」は、本発明との関連で使用される場合、置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドを指す。これらの用語は、互換可能に使用することができる。
【００３２】
用語「大きな１種または複数の３’置換基」は、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きい、３’糖ヒドロキシルにおける置換基を指す。
【００３３】
本明細書において、「改善された」取り込みには、対照ポリメラーゼ酵素に比べて、少なくとも１種の修飾ヌクレオチドの取り込みの効率および／または観測取り込み速度の増加が含まれると定義される。しかしながら、本発明は、修飾ヌクレオチドの絶対取り込み速度の改善だけに限定されるものではない。上記に要約したように、改変されたポリメラーゼは、ヌクレオチド類似体の取り込みに関係する他の望ましい特性を示すため、用語「取り込みの改善」は、取り込み速度の増加の有無にかかわらず、そのような他の特性のいずれかにおける改善も包含していると解釈されるべきである。
【００３４】
例えば、配列決定反応におけるヌクレオチド類似体の逐次取り込みを考慮する場合、取り込みの効率および／または観測取り込み速度における改善は、酵素処理の任意のサイクルで示されるが、２つ以上のサイクル、最も好ましくはすべてのサイクルで生じることがある。「改善」は、すべてのサイクルにわたって一定である必要はない。
【００３５】
改変されたポリメラーゼは、１つのタイプの修飾ヌクレオチドについて、または一連の異なる修飾ヌクレオチドについて、取り込みの効率および／または観測取り込み速度の改善を示すことがある。例えば、このポリメラーゼは、同一の３’置換基を有するが、塩基部分または検出可能な標識の存在などのヌクレオチド分子のいくつかの他の部分において異なる一連の修飾ヌクレオチドを取り込むことができることがある。他のポリメラーゼは、異なる３’置換基を有する一連の修飾ヌクレオチドを取り込むことができることがある。
【００３６】
対照ポリメラーゼに対して、改変されたポリメラーゼによって実現される取り込みの効率および／または速度の改善は、適当なアッセイ系において同一の一種または複数の修飾ヌクレオチドを取り込む２種のポリメラーゼの能力を比較することによって判定することができる。さらに、１種または複数の修飾ヌクレオチドを取り込む改変されたポリメラーゼの能力も、特定のアッセイ系における取り込みの絶対尺度を参照することにより定義することができる。例えば、このようなアッセイ系の１つは、添付の実施例２に記載のゲルをベースとした取り込みアッセイである。修飾ヌクレオチドを取り込む能力を示す好ましいポリメラーゼは、実施例２のアッセイ系において１５分間の４５℃、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、４ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．０５（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ、５０μｇ／ｍｌ酵素、および２μＭ  ３’修飾ヌクレオチドにおける酵素処理のあるサイクルで検出可能な（すなわち、バックグラウンド以上の）生成物変換を示すポリメラーゼである。好ましい実施形態において、ポリメラーゼは、４５℃、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、４ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．０５（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ、５０μｇ／ｍｌ酵素、および２μＭ  ３’修飾ヌクレオチドの酵素処理の第２サイクルで、１９．５分以下、より好ましくは５分以下最も好ましくは１．５分以下という５０％生成物変換までの時間を示すことがある。最も好ましいポリメラーゼの場合、第１サイクルでの生成物変換は、実施例２に記載のように、これらの条件下で１分未満であろう。
【００３７】
また、修飾ヌクレオチドを取り込む改変されたポリメラーゼの増強された能力は、様々なヌクレオチド濃度における取り込み速度の測定によって判定することができる。望ましい「改善された活性」を示す改変されたポリメラーゼは、２５μＭの濃度において１０％を超えるヌクレオチド取り込みを示すことが好ましい。
【００３８】
上記のように、修飾ヌクレオチドの取り込み速度の改善は本発明の重要な態様であるが、本発明は、酵素反応速度論の改善を示す改変されたポリメラーゼにのみ限定されるものではない。実際、本発明は、実用的および経済的利益のある修飾ヌクレオチドの取り込みにおいて他の「改善」を示す改変されたポリメラーゼ酵素も包含する。
【００３９】
他の実施形態において、改変されたポリメラーゼによって示される「改善」は、天然のＤＮＡ塩基Ａ、Ｔ、ＣおよびＧの各々を含有する修飾ヌクレオチドを取り込む能力であってよい。単一の酵素により４種の塩基すべてを取り込む能力は、配列決定プロトコルにおいて実用的および経済的価値が大いにある。たとえ、例えば、各々が異なる塩基Ａ、Ｔ、ＣまたはＧを含有する修飾ヌクレオチドに対する特異性を有する４種の異なる酵素と、４種の塩基の各々を含有するヌクレオチドを取り込むことができる単一の酵素との間で取り込みの絶対速度が同程度であっても、４種の塩基すべてを取り込むことができる単一酵素の使用にはかなりの実用上の利点があるであろう。単一酵素の使用は、異なるポリメラーゼに最適な反応条件を提供する際のいかなる問題も回避する。
【００４０】
他の実施形態において、「改善」は、低温において、および／または対照酵素より広い温度範囲にわたって修飾ヌクレオチドを取り込む能力であってよい。本発明の改変されたポリメラーゼは、４５℃、さらには３０℃という低い温度において修飾ヌクレオチドを取り込むことができる。好ましいポリメラーゼは、３０℃の温度において、および／または４５℃の温度において修飾ヌクレオチドの検出可能な取り込みを示すポリメラーゼである。
【００４１】
実際、この酵素は、３０℃もしくは４５℃以上および／または以下の一連の温度にわたって修飾ヌクレオチドの検出可能な取り込みを示すはずである。このポリメラーゼは、３０℃または４５℃から、好熱性の種に由来する酵素については８０℃という高いことがある等価な野生型（またはｅｘｏ−）酵素の活性に最適な温度までの全温度範囲にわたって検出可能な取り込み活性を示すことがある。好ましいポリメラーゼは、３０℃から３７℃まで、または３０℃から４５℃まで、および／または６５℃から８０℃までの全温度範囲にわたって検出可能な取り込み活性を示すことがある。取り込み速度は、酵素が検出可能な取り込み活性を示す全温度範囲にわたって一定でなくてもよく、取り込み速度は、３０℃また４５℃において最大である必要はない。たとえ、所与の修飾ヌクレオチドの取り込みの絶対速度が、例えば、低温（例えば、３０℃または４５℃）において働く改変されたポリメラーゼと、酵素活性にとって普通の最適な温度（例えば、９°Ｎポリメラーゼについては８０℃）の近くで働く野生型ポリメラーゼとの間で同程度であっても、より低温において働くことができることに依然として実用的利益が大きいのは、配列決定系における他の構成要素を高温条件に耐えるようにする必要条件を軽減するからである。しかしながら、配列決定反応の構成要素がこれらの高温に耐える他の状況においては、ＤＮＡテンプレートにおける二次構造の領域による正確なＤＮＡ合成のため、より高温において取り込みを行う利点があるかもしれない。したがって、あるＤＮＡポリメラーゼが広範囲な動作温度を有する能力は、様々な配列決定応用例についての有用性を提供する。
【００４２】
さらに他の実施形態において、「改善」は、基質として低濃度の修飾ヌクレオチドを使用する場合の修飾ヌクレオチドを取り込む能力であってよい。改変されたポリメラーゼは、マイクロモル範囲の基質濃度において働く場合に、修飾ヌクレオチドの検出可能な取り込みを示すことが好ましい。好ましいポリメラーゼは、０．２μＭから５０μＭまでの範囲の基質濃度において、より好ましくは２５μＭの基質濃度において働く場合に、修飾ヌクレオチドの検出可能な取り込みを示すことがある。しかしながら、本発明のポリメラーゼは、０．２μＭ以下（および／または５０μＭ以上）の基質濃度において働く場合に、修飾ヌクレオチドの検出可能な取り込みを示すことがある。本発明による特定のポリメラーゼは、５０ｎＭという低い基質濃度において働く場合に、修飾ヌクレオチドの検出可能な取り込みを示す。
【００４３】
たとえ、修飾類似体の取り込み速度が、改変されたポリメラーゼと対照ポリメラーゼの間で同程度であっても、改変されたポリメラーゼが実質的に低濃度の基質を必要とするならば、修飾ヌクレオチドの製造コストが高いことから、このことは経済的利益が大きく、酵素反応が表面上で起きる場合には、低濃度の試薬は、非特異的結合を軽減すると予想されるであろう。
【００４４】
誤解を避けるために本明細書によって述べるが、対照酵素と比べて修飾ヌクレオチドの実質的に等しい取り込み速度を示すが、それにもかかわらず同一の対照酵素と比べて、上記に列挙した他の望ましい特性（すなわち、忠実度、すべての塩基を取り込む能力、低温／広い温度範囲における活性、低い基質濃度など）のいずれか１つまたは複数における改善を示す改変されたポリメラーゼは、本発明の範囲内に含まれなければならない。
【００４５】
「改変されたポリメラーゼ酵素」は、ポリメラーゼが、対照ポリメラーゼ酵素に比べて少なくとも１つのアミノ酸変化を有することを意味する。通常、この変化は、少なくとも１つのアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含むものとする。場合によっては、これらの変化は、タンパク質の全体的な電荷分布を維持するための保存的変化であろう。しかしながら、本発明は、保存的置換のみに限定されるものではない。非保存的置換も、本発明において想定される。さらに、ポリメラーゼ配列中の修飾が、１つまたは複数のアミノ酸のタンパク質からの欠失またはタンパク質への付加であってよいが、ただし、そのポリメラーゼが、対照ポリメラーゼ酵素に比べて、置換基が天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルにおいて修飾されているヌクレオチドの取り込みに関して改善された活性を有することは、本発明の意図内にある。
【００４６】
本明細書において、「ヌクレオチド」には、ヌクレオチドとヌクレオシドが共に含まれると定義される。ヌクレオシドは、ヌクレオチドについては、リボースまたはデオキシリボースとグリコシド結合したプリンまたはピリミジン塩基を含むが、ヌクレオシドは、それらをヌクレオチドにするリン酸残基を欠く。合成ヌクレオチドおよび天然のヌクレオチドは、３’糖ヒドロキシルにおけるそれらの修飾より前に、この定義内に含まれる。
【００４７】
通常、改変されたポリメラーゼは、「単離」または「精製」ポリペプチドとする。「単離ポリペプチド」は、天然においてポリペプチドと結びつくことがある炭水化物、脂質、核酸または他のタンパク性不純物などの汚染細胞成分を本質的に含まないポリペプチドを意味する。通常、単離ポリメラーゼの調製物は、極めて精製された形態、すなわち、少なくとも純度約８０％、好ましくは少なくとも純度約９０％、より好ましくは少なくとも純度約９５％、より好ましくは少なくとも純度約９８％、最も好ましくは少なくとも純度約９９％のポリメラーゼを含有する。酵素の調製物の純度は、例えば、標準的なＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における単一バンドの出現によって評価することができる。
【００４８】
改変されたポリメラーゼは、「組換え」ポリペプチドであってよい。
【００４９】
本発明による改変されたポリメラーゼは、ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ、またはその突然変異体もしくは変異体であってよい。ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼには、多くの古細菌ＤＮＡポリメラーゼ、ヒトＤＮＡポリメラーゼαならびにＴ４、ＲＢ６９およびφ２９ファージＤＮＡポリメラーゼが含まれる。これらのポリメラーゼは、Ｔａｑ、およびＴ７  ＤＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼが含まれるファミリーＡポリメラーゼに比べてあまり研究されていない。一実施形態において、ポリメラーゼは、任意のファミリーＢ古細菌ＤＮＡポリメラーゼ、ヒトＤＮＡポリメラーゼαまたはＴ４、ＲＢ６９およびφ２９ファージＤＮＡポリメラーゼから選択される。
【００５０】
古細菌ＤＮＡポリメラーゼは、多くの場合、超好熱性古細菌由来であり、このことは、ポリメラーゼがしばしば耐熱性であることを意味する。したがって、他の好ましい実施形態において、ポリメラーゼは、Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ、９°ＮおよびＰｆｕポリメラーゼから選択される。ＶｅｎｔおよびＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔは、超好熱性古細菌サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）から単離されたファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼに使用される商業名である。９°Ｎポリメラーゼもサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属から確認された。Ｐｆｕポリメラーゼは、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）から単離された。本発明において最も好ましいポリメラーゼは、９°Ｎポリメラーゼであり、その突然変異体および変異体が含まれる。
【００５１】
当然のことながら、本発明は、ファミリーＢポリメラーゼの突然変異体または変異体に限定されることを意図していない。また、改変されたポリメラーゼは、ファミリーＡポリメラーゼ、またはその突然変異体もしくは変異体、例えば、ＴａｑもしくはＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ酵素の突然変異体または変異体、または、例えば、逆転写酵素などのファミリーＡにもファミリーＢにも属さないポリメラーゼであってよい。
【００５２】
本明細書において、「対照ポリメラーゼ」は、改変されたポリメラーゼの活性が比較されるポリメラーゼと定義される。本発明の一実施形態において、対照ポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼまたはそのｅｘｏ−変異体を含むことができる。特に指定のない限り、「野生型」は、通常、そのポリメラーゼが、天然に見いだされるように、天然のアミノ酸配列を含むことを意味する。
【００５３】
しかしながら、本発明は、野生型等価体または変異されているポリメラーゼのｅｘｏ−変異体に対する改変されたポリメラーゼの活性の比較のみに限定されない。アミノ酸配列が修飾され（例えば、アミノ酸置換突然変異により）、本発明によって提供される改善されたポリメラーゼの修飾ヌクレオチド取り込み効率を評価する際に使用するのに適している対照であると証明することができる多くのポリメラーゼが存在する。したがって、対照ポリメラーゼは、当技術分野において知られている突然変異ポリメラーゼを含む任意の知られているポリメラーゼを含むことができる。望ましいヌクレオチド類似体の取り込みに関する選択された「対照」ポリメラーゼの（不）活性は、取り込みアッセイによって判定することができる。好ましい対照ポリメラーゼは、実施例２に記載の取り込みアッセイにおいて修飾ヌクレオチドの検出可能な取り込みを示さないポリメラーゼである。
【００５４】
野生型（またはｅｘｏ−変異体）基本ポリメラーゼの配列に比べて１つまたは複数のアミノ酸置換突然変異を有する多くの適当な対照ポリメラーゼを以下に要約する。
【００５５】
【表１】
2007504817.tif 000003
【００５６】
対照ポリメラーゼは、所与の基本ポリメラーゼ（またはそのｅｘｏ−変異体）のアミノ酸配列と機能的に等価な列挙された置換突然変異のいずれか１つを含むことができる。したがって、対照ポリメラーゼは、述べられた突然変異のうち１つまたは突然変異の組合せを有する、好ましくは上述の突然変異における以外の基本ポリメラーゼ（または、そのｅｘｏ−変異体）のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する列挙された基本ポリメラーゼの突然変異体であってよい。あるいは、対照ポリメラーゼは、述べられた基本ポリメラーゼ以外のポリメラーゼの相同的な突然変異体であってよく、それらには、基本ポリメラーゼのアミノ酸配列に関して記載された突然変異と機能的に等価であるか、あるいは相同的な突然変異（または、突然変異の組合せ）が含まれる。実例として、対照ポリメラーゼは、Ｖｅｎｔ（商標）アミノ酸配列に比べて、上述の突然変異のうち１つ、または突然変異の組合せを有するＶｅｎｔ（商標）ポリメラーゼの突然変異体であってよいか、あるいは、Ｖｅｎｔ（商標）アミノ酸配列を参照することにより列挙された突然変異（または複数の突然変異）と機能的に等価な突然変異（または複数の突然変異）を内蔵する別のポリメラーゼの突然変異体、例えば、突然変異９°Ｎポリメラーゼであってよい。
【００５７】
「機能的に等価な」は、対照ポリメラーゼが、もっぱら異なるポリメラーゼを使用する研究の場合、酵素において同一の機能的役割を有する他のポリメラーゼにおいてアミノ酸位置において起きると考えられるアミノ酸置換を含むことを意味する。一例として、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼにおける４１２位のチロシンからバリンへの突然変異（Ｙ４１２Ｖ）は、９°Ｎポリメラーゼにおける４０９位のチロシンからバリンへの置換（Ｙ４０９Ｖ）と機能的に等価であろう。このアミノ酸残基のかさは、ヌクレオチド糖の２’−ヒドロキシルの結合部位への接近を妨害する「立体的ゲート」としての役割をすると考えられている。また、Ｖｅｎｔポリメラーゼにおける残基４８８は、Ｖｅｎｔにおける４８８のアラニンからロイシンへの突然変異（Ａ４８８Ｌ）が、９°ＮポリメラーゼにおけるＡ４８５Ｌ突然変異と等価であると見なされるように、９°Ｎポリメラーゼにおけるアミノ酸４８５と等価であると見なされる。この残基は、酵素反応に必要な活性化エネルギーを変える際に役割を果たすと考えられている。
【００５８】
通常、２種以上の異なるポリメラーゼにおける機能的に等価な置換突然変異は、ポリメラーゼのアミノ酸配列における相同的アミノ酸位置において起きる。したがって、本明細書における用語「機能的に等価な」の使用は、突然変異アミノ酸の特定の機能が知られているか否かにかかわらず、所与の変異と「位置的に等価な」または「相同的な」突然変異をも包含する。配列アライメントおよび／または分子モデリングに基づき、２種以上の異なるポリメラーゼのアミノ酸配列中の位置的に等価であるか、あるいは相同的なアミノ酸残基を確認することが可能である。
【００５９】
注目すべきは、本明細書を通じて、ポリメラーゼのアミノ酸配列内の突然変異は、
（ｉ）野生型ポリメラーゼで見いだされる１文字アミノ酸、
（ｉｉ）ポリメラーゼのアミノ酸配列における変化の位置、
（ｉｉｉ）改変されたポリメラーゼで見いだされる１文字アミノ酸
の形で書かれる。
【００６０】
したがって、アミノ酸配列の４０９位における野生型ポリメラーゼ中のチロシン残基の改変されたポリメラーゼ中のバリン残基への突然変異は、Ｙ４０９Ｖと書かれるであろう。
【００６１】
２種の異なるポリメラーゼの野生型アミノ酸配列内の機能的に等価で、位置的に等価で、かつ相同的なアミノ酸は、必ずしも同じタイプのアミノ酸残基である必要はないが、機能的に等価で、位置的に等価で、かつ相同的なアミノ酸は一般的に保存される。例えば、９°ＮポリメラーゼのモチーフＡ領域は、配列ＬＹＰを有し、Ｖｅｎｔ（商標）ポリメラーゼの機能的に相同的な領域も配列ＬＹＰを有する。これらの２種のポリメラーゼの場合、相同的アミノ酸配列は一致するが、他のポリメラーゼにおける相同的な領域は、異なるアミノ酸配列を有することがある。機能的に等価で、位置的に等価で、かつ相同的な突然変異に言及する場合、通常、突然変異アミノ酸は、突然変異ポリメラーゼの各々における同じタイプのアミノ酸残基であり、例えば、９°Ｎポリメラーゼにおける突然変異Ｙ４０９Ａは、Ｖｅｎｔ（商標）ポリメラーゼにおける突然変異Ｙ４１２Ａと機能的に等価であるか、あるいは相同的である。
【００６２】
好ましい改変されたポリメラーゼタンパク質
驚いたことに、発明者らは、本明細書において「モチーフＡ領域」と呼ばれるヌクレオチド結合部位の特定の３アミノ酸領域におけるアミノ酸配列変異が、ヒドロキシル基よりも大きい３’位における置換基を有するヌクレオチド類似体を取り込むポリメラーゼの能力に対して著しい効果を有することを突き止めた。
【００６３】
本出願との関連で、用語「モチーフＡ領域」は、具体的に、９°Ｎポリメラーゼにおけるアミノ酸４０８−４１０と機能的に等価であるか、あるいは相同的な３つのアミノ酸を指す。用語「モチーフＡ領域」および「領域Ａ」は、全体を通して互換可能に使用され、任意の特定のアミノ酸配列よりむしろポリメラーゼタンパク質の定義された３アミノ酸領域を指す。
【００６４】
用語「モチーフＢ領域」は、具体的に、９°Ｎポリメラーゼにおけるアミノ酸４８４−４８６と機能的に等価であるか、あるいは相同的な３つのアミノ酸を指す。
【００６５】
当技術分野において、用語「モチーフＡ」および「モチーフＢ」は、ファミリーＢおよび他のポリメラーゼのヌクレオチド結合部位における配列相同性の領域を指すために使用されてきた。しかしながら、本出願との関連で、これらの用語は、上述の具体的なアミノ酸領域のみを指すために使用される。
【００６６】
９°Ｎ以外のポリメラーゼの機能的に等価であるか、あるいは相同的な「モチーフＡ領域」および「モチーフＢ領域」は、アミノ酸配列アライメントおよび／または分子モデリングに基づいて確認することができる。配列アライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴなどの当技術分野において知られている標準的アライメントツールのいずれかを用いてコンパイルすることができる。
【００６７】
例えば、いくつかのポリメラーゼの機能的に等価な「モチーフＡ領域」および「モチーフＢ領域」を以下の通り示す。
ポリメラーゼ 「モチーフＡ領域」 「モチーフＢ領域」
９°Ｎ            ４０８−４１０        ４８４−４８６
Ｖｅｎｔ（商標）  ４１１−４１３        ４８７−４８９
Ｐｆｕ            ４０９−４１１        ４８５−４８７
ＲＢ６９          ４１５−４１７
ＪＤＦ−３        ４０８−４１０        ４８４−４８６
Ｔａｑ            ６１４−６１６
【００６８】
上記リストは、本発明を例示することを意図しており、これらの特定のポリメラーゼに本発明を限定していると解釈されてはならない。機能的に等価な「モチーフＡ領域」および「モチーフＢ領域」は、ファミリーＡポリメラーゼ、逆転写酵素などを含む他の非ファミリーＢポリメラーゼ中にも存在する。
【００６９】
モチーフＡ領域の突然変異単独で、酵素中の他の場所における他の配列変異がなくても、ヒドロキシル基より大きい３’位における置換基を有するヌクレオチド類似体を取り込むポリメラーゼの能力を実質的に改善するのに十分である。
【００７０】
さらに驚いたことに、ポリメラーゼのモチーフＡ領域における単一アミノ酸の置換突然変異は、置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドを取り込むポリメラーゼの能力を改善するのに十分であることを突き止めた。モチーフＡ領域における２つまたは３つすべてのアミノ酸の置換突然変異も、望ましい類似体を取り込むポリメラーゼの能力を改善することができる。
【００７１】
したがって、本発明による好ましい改変されたポリメラーゼは、本明細書において「モチーフＡ領域」と呼ばれるポリメラーゼの３アミノ酸領域中に１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換突然変異を含む突然変異ポリメラーゼである。１つまたは複数の置換突然変異は、以下の条件に従って、任意の知られている天然または合成アミノ酸の取り込みをもたらすことができる。
【００７２】
（１）ポリメラーゼが突然変異Ｖｅｎｔ（商標）ポリメラーゼである場合、単一アミノ酸置換Ｙ４１２Ｖ、Ｙ４１２ＬまたはＹ４１２Ｆを有する突然変異体は、本発明の範囲から除外される。これらの置換は、例えば、本発明の範囲内でモチーフＡ領域中に２つまたは３つの置換突然変異を有する変異体などの他の突然変異を有するＶｅｎｔ（商標）突然変異体中に存在することがあるが、単独で、すなわち、この単一アミノ酸置換における以外は野生型Ｖｅｎｔ（商標）配列を有する突然変異体中に存在してはならない。
【００７３】
（２）ポリメラーゼが突然変異９°Ｎポリメラーゼである場合、アミノ酸置換Ａ４８５Ｌと併せてアミノ酸置換Ｙ４０９Ｖを有する突然変異体は、本発明の範囲から除外される。しかしながら、Ｙ４０９Ｖ置換は、本発明の範囲内でＡ４８５Ｌ突然変異がない場合、存在してもよく、例えば、Ｙ４０９Ｖは、単独で存在するか、あるいはモチーフＡ領域中に２つまたは３つの置換突然変異を有する９°Ｎ突然変異体中に存在してもよい。
【００７４】
（３）ポリメラーゼが突然変異Ｔｓｐ  ＪＤＦ−３ポリメラーゼである場合、単独で、あるいは他の突然変異Ａ４８５Ｔと併せて単一アミノ酸置換Ｐ４１０Ｌを有する突然変異体は、本発明の範囲から除外される。しかしながら、Ｐ４１０Ｌ突然変異は、例えば、本発明の範囲内でモチーフＡ領域中に２つまたは３つの置換突然変異を有するＴｓｐ  ＪＤＦ−３突然変異体中に存在してもよい。
【００７５】
条件（１）、（２）および（３）の下で記載された具体的ポリメラーゼは、本発明から除外される。改変されたポリメラーゼは、条件（１）、（２）および（３）の下で記載されたポリメラーゼと機能的に等価であるか、あるいは相同的なアミノ酸変化を有する様々なタイプのポリメラーゼではないことが好ましいが、そのような相同的ポリメラーゼは、除外されない。
【００７６】
添付の実施例で示すように、発明者らは、モチーフＡ領域中のみのアミノ酸配列の変異が、ポリメラーゼの望ましい活性の改善をもたらし、３’位に大きな置換基を有するヌクレオチド類似体の取り込み速度を実質的に改善することができることを突き止めた。さらに、発明者らは、モチーフＡ領域を構成する３つのアミノ酸についてコンセンサス配列優先度を突き止めた。
【００７７】
したがって、好ましい実施形態において、
モチーフＡ領域の第１のアミノ酸は、
芳香族アミノ酸、特にチロシン（Ｙ）またはフェニルアラニン（Ｆ）、
脂肪族側鎖のあるアミノ酸、特にイソロイシン（Ｉ）、アラニン（Ａ）もしくはバリン（Ｖ）、またはグルタミン酸（Ｑ）、
システイン（Ｃ）またはセリン（Ｓ）から選択されることが好ましい。
【００７８】
「モチーフＡ領域の第１のアミノ酸」は、９°Ｎポリメラーゼのアミノ酸残基４０８と機能的に等価であるか、あるいは相同的なアミノ酸を意味する。
【００７９】
「モチーフＡ領域の第２のアミノ酸」は、９°Ｎポリメラーゼのアミノ酸残基４０９と機能的に等価であるか、あるいは相同的なアミノ酸を意味する。
【００８０】
モチーフＡ領域の第２のアミノ酸は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）またはグリシン（Ｇ）から選択されることが好ましく、アラニン（Ａ）であることが最も好ましい。
【００８１】
ポリメラーゼが、第２のアミノ酸位置においてモチーフＡ領域中の単一アミノ酸置換のみを含む場合、このアミノ酸は、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびフェニルアラニン（Ｆ）でないことが好ましい。しかしながら、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはフェニルアラニン（Ｆ）への置換は、モチーフＡ領域中の第１および／または第３のアミノ酸位置における他の置換と併せて存在してもよい。
【００８２】
「モチーフＡ領域の第３のアミノ酸」は、９°Ｎポリメラーゼのアミノ酸残基４１０と機能的に等価であるか、あるいは相同的なアミノ酸を意味する。
【００８３】
モチーフＡ領域の第３のアミノ酸は、
セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）、
β分岐側鎖を有するアミノ酸、特にイソロイシン（Ｉ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、またはロイシン（Ｌ）
から選択されることが好ましい。
【００８４】
領域Ａにおける第１および第２のアミノ酸位置の一方または両方におけるアミノ酸置換の存在下でのみ、第３のアミノ酸位置において野生型アミノ酸プロリンが含まれることも望ましい。
【００８５】
モチーフＡ領域中にのみ１つのアミノ酸置換突然変異を有する改変されたポリメラーゼにおいて、置換は、上記に示された条件に従い、モチーフＡ領域の第１、第２または第３のアミノ酸位置に存在することがある。しかしながら、単一アミノ酸置換は、第２のアミノ酸位置に存在することが好ましく、これは、９°Ｎポリメラーゼのアミノ酸残基４０９と機能的に等価であるか、あるいは相同的なアミノ酸である。
【００８６】
モチーフＡ領域中に単一置換突然変異を有する実施形態において、突然変異アミノ酸は、モチーフＡ領域の第１、第２および第３のアミノ酸について上記に記載のアミノ酸優先度に従って選択されることが好ましい。モチーフＡ領域中に単一置換突然変異を有する特に好ましいポリメラーゼは、モチーフＡ領域の第２のアミノ酸残基がアラニン（Ａ）に突然変異されたポリメラーゼである。したがって、好ましい突然変異ポリメラーゼには、突然変異Ｙ４０９Ａを有する９°Ｎポリメラーゼ、突然変異Ｙ４１２Ａを有するＶｅｎｔ（商標）ポリメラーゼ、突然変異Ｙ４１０Ａを有するＰｆｕポリメラーゼ、突然変異Ｙ４０９Ａを有するＪＤＦ−３ポリメラーゼ、および突然変異Ｅ６１５Ａを有するＴａｑポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００８７】
誤解を避けるために、モチーフＡ領域中に単一アミノ酸置換突然変異を有するポリメラーゼには、野生型に比べて、本発明の範囲内でモチーフＡ領域外の酵素の領域中に他の置換突然変異が含まれてもよい。
【００８８】
モチーフＡ領域中に２つのアミノ酸置換突然変異を有する改変されたポリメラーゼにおいて、突然変異は、任意の組合せで存在してよく、すなわち、第１および第２のアミノ酸が突然変異体であるか、第１および第３のアミノ酸が突然変異体であるか、あるいは、第２および第３のアミノ酸が突然変異体であってよい。通常、モチーフＡ領域の第１および第２のアミノ酸が突然変異体であり、第３のアミノ酸は野生型であることが好ましい。
【００８９】
モチーフＡ領域中に２つの置換突然変異を有する実施形態において、この場合も、突然変異アミノ酸は、モチーフＡ領域の第１、第２および第３のアミノ酸について上記に記載されたアミノ酸優先度に従って選択されることが好ましい。第１、第２および第３のアミノ酸について上記に示されたアミノ酸優先度の２つの可能な組合せはすべて、本発明の範囲内に想定されている。しかしながら、２つの置換突然変異を有する特に好ましいポリメラーゼは、モチーフＡ領域の第１のアミノ酸残基がバリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）に突然変異され、モチーフＡ領域の第２のアミノ酸残基がアラニン（Ａ）に突然変異され、モチーフＡ領域の第３のアミノ酸残基が野生型であるポリメラーゼである。したがって、好ましい突然変異ポリメラーゼには、二重突然変異Ｌ４０８Ｆ／Ｙ４０９Ａ、Ｌ４０８Ｖ／Ｙ４０９ＡまたはＬ４０８Ｙ／Ｙ４０９Ａのうち１つを有する９°Ｎポリメラーゼ、二重突然変異Ｌ４１１Ｙ／Ｙ４１２Ａ、Ｌ４１１Ｖ／Ｙ４１２ＡまたはＬ４１１Ｆ／Ｙ４１２Ａのうち１つを有するＶｅｎｔ（商標）ポリメラーゼ、二重突然変異Ｌ４０９Ｙ／Ｙ４１０Ａ、Ｌ４０９Ｖ／Ｙ４１０ＡまたはＬ４０９Ｆ／Ｙ４１０Ａのうち１つを有するＰｆｕポリメラーゼ、二重突然変異Ｌ４０８Ｆ／Ｙ４０９Ａ、Ｌ４０８Ｙ／Ｙ４０９ＡまたはＬ４０８Ｖ／Ｙ４０９Ａのうち１つを有するＪＤＦ−３ポリメラーゼ、および二重突然変異Ｉ６１４Ｆ／Ｅ６１５Ａ、Ｉ７０９Ｖ／Ｅ７１０ＡまたはＩ６１４Ｙ／Ｅ６１５Ａのうち１つを有するＴａｑポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９０】
この場合も、誤解を避けるために述べるが、モチーフＡ領域中に２つのアミノ酸置換突然変異を有するポリメラーゼには、野生型に比べて、本発明の範囲内でモチーフＡ領域外の酵素の領域中に他の置換突然変異が含まれてもよい。
【００９１】
また、本発明による改変されたポリメラーゼには、モチーフＡ領域中に３つのアミノ酸置換突然変異が含まれてもよい。モチーフＡ領域中に３つの置換突然変異を有する実施形態において、突然変異アミノ酸は、この場合も、モチーフＡ領域の第１、第２および第３のアミノ酸について上記に記載したアミノ酸優先度に従って選択されることが好ましい。第１、第２および第３のアミノ酸について上記で示したアミノ酸優先度の３つの可能な組合せはすべて、本発明の範囲内に想定されている。しかしながら、本発明の最も好ましい実施形態において、ポリメラーゼのモチーフＡ領域は、以下の突然変異アミノ酸配列、すなわちＹＳＴ、ＦＡＩ、ＡＡＡ、ＹＡＳ、ＹＡＶ、ＹＧＩ、ＹＳＧ、ＳＧＧ、ＣＳＴ、ＩＡＬ、ＣＧＧ、ＳＡＬ、ＳＡＡ、ＣＡＡ、ＹＡＡ、ＱＡＳ、ＶＳＳ、ＶＡＧ、ＶＡＶ、ＦＡＶ、ＡＧＩ、ＹＳＳ、ＡＡＴ、ＦＳＳまたはＶＡＬのうち１つを有することができる。
【００９２】
実験の項でさらに明らかにされるように、これらの領域Ａ配列を内蔵する修飾ＤＮＡポリメラーゼは、９°Ｎ二重突然変異体に比べて、置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドの実質的に改善された取り込みを示す。最も効果的な突然変異体は、領域Ａ配列ＹＡＶおよびＹＡＳを有する突然変異体である。したがって、本発明による好ましいポリメラーゼは、モチーフＡ領域中にアミノ酸配列ＹＡＶまたはＹＡＳを有するポリメラーゼである。最も好ましい突然変異ポリメラーゼには、三重突然変異Ｌ４０８Ｙ／Ｙ４０９Ａ／Ｐ４１０ＳまたはＬ４０８Ｙ／Ｙ４０９Ａ／Ｐ４１０Ｖのうち１つを有する９°Ｎポリメラーゼ、三重突然変異Ｌ４１１Ｙ／Ｙ４１２Ａ／Ｐ４１３ＶまたはＬ４１１Ｙ／Ｙ４１２Ａ／Ｐ４１３Ｓのうち１つを有するＶｅｎｔ（商標）ポリメラーゼ、三重突然変異Ｌ４０９Ｙ／Ｙ４１０Ａ／Ｐ４１１ＶまたはＬ４０９Ｙ／Ｙ４１０Ａ／Ｐ４１１Ｓのうち１つを有するＰｆｕポリメラーゼ、三重突然変異Ｌ４０８Ｙ／Ｙ４０９Ａ／Ｐ４１０ＶまたはＬ４０８Ｙ／Ｙ４０９Ａ／Ｐ４１０Ｓのうち１つを有するＪＤＦ−３ポリメラーゼ、および三重突然変異Ｉ６１４Ｆ／Ｅ６１５Ａ／Ｌ６１６ＶまたはＩ６１４Ｙ／Ｅ６１５Ａ／Ｌ６１６Ｓのうち１つを有するＴａｑポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９３】
この場合も、誤解を避けるために述べるが、モチーフＡ領域中に３つのアミノ酸置換突然変異を有するポリメラーゼには、野生型に比べて、本発明の範囲内でモチーフＡ領域外の酵素の領域中に他の置換突然変異が含まれてもよい。
【００９４】
特定の実施形態において、モチーフＡ領域中に１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換突然変異を示すポリメラーゼは、モチーフＢ領域中に１つ、２つまたは３つの置換突然変異をさらに含むことができる。特定の領域Ｂ突然変異は、領域Ａ突然変異と併せて、ポリメラーゼの活性をさらに増強することがあると判明している。
【００９５】
ポリメラーゼには、モチーフＢ領域の第１、第２または第３のアミノ酸残基における単一アミノ酸置換が含まれてもよいか、２つまたは３つの突然変異の任意の組合せが含まれてもよいか、あるいは領域Ｂ中の３つの残基すべてにおいて突然変異されていてもよい。あるポリメラーゼについて、モチーフＢ領域の第１のアミノ酸は、９°Ｎポリメラーゼアミノ酸配列の残基４８４と機能的に等価であるか、あるいは相同的なアミノ酸と定義され、モチーフＢ領域の第２のアミノ酸は、９°Ｎポリメラーゼアミノ酸配列の残基４８５と機能的に等価であるか、あるいは相同的なアミノ酸と定義され、モチーフＢ領域の第３のアミノ酸は、９°Ｎポリメラーゼアミノ酸配列の残基４８６と機能的に等価であるか、あるいは相同的なアミノ酸と定義される。
【００９６】
本発明による好ましい改変されたポリメラーゼには、モチーフＡ領域中の配列変異の他に、モチーフＢ領域の第２のアミノ酸における置換突然変異が含まれてもよく、これは、９°Ｎポリメラーゼアミノ酸配列の残基４８５と機能的に等価であるか、あるいは相同的なアミノ酸である。通常、この残基（または、９°Ｎ以外のポリメラーゼにおける機能的等価体もしくは相同体）の突然変異は、全体的なポリメラーゼ活性を増強することが観察されている。したがって、この位置に突然変異を含めることは、領域Ａ変異と併せ、領域Ａ変異単独に比べて、活性のさらなる増強を生み出すことができる。以下の置換、すなわちＡ４８５Ｌ、Ａ４８５Ｆ、Ａ４８５Ｉ、Ａ４８５Ｓ、Ａ４８５ＶおよびＡ４８５Ｃが好ましく、Ａ４８５Ｌが最も好ましい。
【００９７】
モチーフＢ領域の第２のアミノ酸（９°Ｎポリメラーゼアミノ酸配列の残基４８５と機能的に等価であるか、あるいは相同的な）における置換突然変異は、単独で存在するか（モチーフＢ領域中にその他の突然変異が存在しないことを意味する）、あるいはモチーフＢ領域中に１つまたは２つの他の置換と一緒に存在することがある。
【００９８】
モチーフＡ領域中の突然変異の他に、モチーフＢ領域中に２つの置換突然変異を有するポリメラーゼにおいて、突然変異は、任意の組合せで、すなわち、突然変異した第１および第２、第１および第３または第２および第３の残基で起きることがある。しかしながら、第１および第３の残基が一緒に突然変異されることが好ましい。特に好ましい組合せは、第３のアミノ酸位置におけるロイシンへの突然変異と併せたモチーフＢ領域の第１のアミノ酸位置におけるグリシンへの突然変異、または第３のアミノ酸位置におけるグルタミンへの突然変異と併せたモチーフＢ領域の第１のアミノ酸位置におけるアスパラギンへの突然変異である。
【００９９】
モチーフＡ領域中の突然変異の他に、モチーフＢ領域中に３つのアミノ酸置換を有する改変されたポリメラーゼにおいて、モチーフＢ領域に適している突然変異アミノ酸配列には、以下のＳＫＮ、ＧＲＤ、ＫＨＮ、ＩＳＮおよびＴＨＨが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１００】
本発明の改変されたポリメラーゼには、いかなる領域Ｂ突然変異もなしに、あるいは本明細書に記載の特定の領域Ｂ突然変異のいずれかもしくは突然変異の組合せと併せて、本明細書に記載の領域Ａ突然変異のいずれかもしくは突然変異の組合せが含まれてもよい。
【０１０１】
本発明は、モチーフＡおよびモチーフＢ領域の各々に少なくとも１つの突然変異を含み、突然変異の総数が２を超える改変されたポリメラーゼを包含する。特に、本発明は、モチーフＢ領域中の１つの突然変異と一緒にモチーフＡ領域中に２つまたは３つの突然変異を有するポリメラーゼを包含するが、それらに限定されるものではない。
【０１０２】
本発明による特に好ましいポリメラーゼは、以下のモチーフＡ領域配列、すなわちＦＡＰ、ＶＡＰ、ＹＳＴ、ＦＡＩ、ＡＡＡ、ＹＡＳ、ＹＡＶ、ＹＧＩ、ＹＳＧ、ＳＧＧ、ＣＳＴ、ＩＡＬ、ＣＧＧ、ＳＡＬ、ＳＡＡ、ＣＡＡ、ＹＡＡ、ＱＡＳ、ＶＳＳ、ＶＡＧ、ＶＡＶ、ＦＡＶ、ＡＧＩ、ＹＳＳ、ＡＡＴ、ＦＳＳまたはＶＡＬのうち１つ、最も好ましくはＹＡＶまたはＹＡＳを、その上、領域Ｂ中の４８５位における置換突然変異、最も好ましくはＡ４８５Ｌを有する９°Ｎポリメラーゼである。しかし、当然のことながら、本発明は、相同的アミノ酸置換を含む、例えば、Ｖｅｎｔ（商標）ポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、ＪＤＦ−３ポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼなど（リストは、例示的であり、限定するものではない）の９°Ｎ以外のポリメラーゼも包含する。
【０１０３】
驚いたことに、前段落に記載の好ましい９°Ｎポリメラーゼはすべて、添付の実施例で示すように、９°Ｎポリメラーゼ二重突然変異体（９°Ｎ  ＤＭ、突然変異Ｙ４０９Ｖ／Ａ４８５Ｌを有する）対照ポリメラーゼに比べて、置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチド類似体の改善された取り込みを示す。モチーフＡ領域配列ＹＡＶまたはＹＡＳを含むポリメラーゼは、実施例の条件下で試験されたそのようなポリメラーゼの望ましい類似体に対して最も良い取り込み速度を示した。
【０１０４】
したがって、本発明は、配列番号２０として示されるアミノ酸配列を含む９°Ｎポリメラーゼ分子および配列番号２２として示されるアミノ酸配列を含む９°Ｎポリメラーゼ分子にも関する。配列番号２０は、実験の項で試験された９°ＮポリメラーゼＹＡＳ突然変異体（突然変異Ａ４８５Ｌも含まれる）の全アミノ酸配列を表し、一方、配列番号２２は、９°ＮポリメラーゼＹＡＶ突然変異体（突然変異Ａ４８５Ｌも含まれる）の全アミノ酸配列を表す。また、本発明は、ポリメラーゼの機能に重大な程度までは影響を及ぼさないアミノ酸変化に限り配列番号２０および２２として示されるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリメラーゼを包含する。この場合、ポリメラーゼの関連機能は、対照タンパク質と比べて、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きい３’糖ヒドロキシルにおける置換基を有する修飾ヌクレオチドを取り込む改善された能力と定義される。したがって、ＹＡＶまたはＹＡＳポリメラーゼ変異体のこの活性にとって重要でない残基における保存的置換は、本発明の範囲内に含まれるであろう。酵素の機能に対する他の突然変異の効果は、例えば、添付の実施例に記載の取り込みアッセイを用い、容易に試験することができる。
【０１０５】
また、本発明は、配列番号１８として示されるアミノ酸配列を含む９°Ｎポリメラーゼ分子に関する。配列番号１８は、実験の項で試験された９°Ｎポリメラーゼ「ＥＤ」突然変異体の全アミノ酸配列を表し、これには、モチーフＢ領域中のＡ４８５Ｌ突然変異の他にモチーフＡ領域配列ＶＡＬが含まれる。このポリメラーゼ変異体は、９°Ｎポリメラーゼ二重突然変異体（Ｙ４０９Ｖ／Ａ４８５Ｌ）に比べて、ヒドロキシル基より大きな置換基を有する３’修飾ヌクレオチド類似体の改善された取り込みを示す。
【０１０６】
本発明の特定の実施形態において、ポリメラーゼ変異体は、モチーフＡ領域中の３つのアミノ酸置換突然変異およびモチーフＢ領域中の２つまたは３つのアミノ酸置換突然変異を含むことがある。適当なポリメラーゼ変異体の例は、９°ＮポリメラーゼにおいてモチーフＡ領域およびモチーフＢ領域に同時に突然変異を導入することによって発見された。ポリメラーゼ変異体のライブラリーは、３’修飾ヌクレオチド類似体の取り込みについてスクリーニングされた。親のクローンに比べて増強された取り込みレベルを示した変異体を精製および試験し、それらの活性を確認した。
【０１０７】
したがって、本発明は、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列と機能的に等価であるか、あるいは相同的な以下の一連の置換突然変異、すなわち
Ｌ４０８Ｗ／Ｙ４０９Ａ／Ｐ４１０Ｌ  Ｒ４８４Ｓ／Ａ４８５Ｋ／Ｉ４８６Ｎ
Ｌ４０８Ｄ／Ｙ４０９Ｖ／Ｐ４１０Ｇ  Ｒ４８４Ｇ／Ａ４８５Ｒ／Ｉ４８６Ｄ
Ｌ４０８Ｍ／Ｙ４０９Ｌ／Ｐ４１０Ｆ  Ｒ４８４Ｋ／Ａ４８５Ｈ／Ｉ４８６Ｎ
Ｌ４０８Ｖ／Ｙ４０９Ｄ／Ｐ４１０Ｇ  Ｒ４８４Ｇ／          ／Ｉ４８６Ｌ
Ｌ４０８Ｖ／Ｙ４０９Ａ／Ｐ４１０Ｌ  Ｒ４８４Ｉ／Ａ４８５Ｓ／Ｉ４８６Ｎ
Ｌ４０８Ｓ／Ｙ４０９Ｓ／Ｐ４１０Ｌ  Ｒ４８４Ｎ／          ／Ｉ４８６Ｑ
Ｌ４０８Ｙ／Ｙ４０９Ａ／Ｐ４１０Ｌ  Ｒ４８４Ｔ／Ａ４８５Ｈ／Ｉ４８６Ｈ
のいずれか１つを含む改変されたポリメラーゼも提供するが、これらに限定されるものではない。
【０１０８】
実験の項で示されるように、これらの具体的な突然変異ＤＮＡポリメラーゼはすべて、対照ポリメラーゼ酵素に比べて、置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドの改善された取り込みを示す。対照ポリメラーゼは、野生型９°Ｎポリメラーゼであるか、あるいはＹ４０９Ｖ／Ａ４８５Ｌ二重突然変異９°Ｎポリメラーゼ（９ＤＭ）などの置換ポリメラーゼであってよい。
【０１０９】
実験において上記で列挙された７つの具体的な領域Ａおよび領域Ｂ変異体のうち好ましい改変されたポリメラーゼの１つは、Ｌ４０８Ｖ／Ｙ４０９Ａ／Ｐ４１０Ｌ  Ｒ４８４Ｉ／Ａ４８５Ｓ／Ｉ４８６Ｎ  ９°Ｎ突然変異体（２Ｅと呼ばれる）であった。このポリメラーゼ変異体は、９°Ｎポリメラーゼ二重突然変異体（Ｙ４０９Ｖ／Ａ４８５Ｌ）に比べて、ヒドロキシル基より大きな置換基を有する３’修飾ヌクレオチド類似体の改善された取り込みを示す。
【０１１０】
したがって、本発明は、配列番号１２で示されるアミノ配列を含む９°Ｎポリメラーゼ分子にも関する。配列番号１２は、２Ｅタンパク質のアミノ酸配列を表す。また、本発明は、ポリメラーゼの機能に重大な程度までは影響を及ぼさないアミノ酸変化に限り配列番号１２として示されるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリメラーゼを包含する。この場合、関連機能は、対照タンパク質と比べて、修飾ヌクレオチドを取り込むポリメラーゼの改善された能力であろう。したがって、２Ｅポリメラーゼのこの活性にとって重要でない残基における保存的置換は、本発明の範囲内に含まれるであろう。
【０１１１】
さらに他の態様において、本発明は、残基４０８と４１０の間、場合により残基４８４と４８６の間のアミノ酸配列における１つまたは複数の変化と共に、配列番号１４で示されるアミノ酸配列（エキソヌクレアーゼ活性を欠く９°Ｎポリメラーゼの配列）を含む９°Ｎポリメラーゼを提供するが、アミノ酸４０９がバリン残基でアミノ酸４８５がロイシン残基であるタンパク質、または残基４０８と４１０の間もしくは残基４８４と４８６の間のアミノ酸配列中にその他の変化がなく、アミノ酸４８５がロイシン残基であるタンパク質をもたらすと思われる変化は除外される。
【０１１２】
配列番号１４中に導入されるアミノ酸変化は、残基４０９をバリンに、残基４８５をロイシンに変えるか、あるいはアミノ酸４８５をロイシンに変えるだけではないようでなければならない。これらの変化は、９°Ｎポリメラーゼのアミノ酸配列における他の変化から孤立して、一緒に（二重突然変異体）または単独で（４８５位におけるロイシン）生じることがあるが、生じてはならない。単一アミノ酸変化は、修飾ヌクレオチドの取り込みに関して９°Ｎの機能性を改善するのに十分なことがある。アミノ酸配列の変化は、任意の知られている天然または合成アミノ酸を取り込むことができる。本発明のこれらの態様の好ましい実施形態において、変異９°Ｎポリメラーゼは、置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドの改善された取り込みを触媒するはずである。
【０１１３】
単独で、あるいはモチーフＢ領域中の突然変異と併せてモチーフＡ領域中に突然変異を有する上述のポリメラーゼ変異体すべての好ましい実施形態は、ヌクレオチド結合部位のモチーフＣ領域中に野生型配列を有する。本明細書において、「モチーフＣ領域」は、９°Ｎポリメラーゼアミノ酸配列の残基４９３、４９４および４９６と機能的に等価であるか、あるいは相同的なアミノ酸残基と定義される。しかし、当然のことながら、モチーフＢ領域中の変化の有無にかかわらず、モチーフＡ領域中の変化の他にこの領域中の１つまたは複数のアミノ酸変化を有する変異体は除外されない。特に、モチーフＣ領域中に保存的アミノ酸変化を有する変異体は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１１４】
当然のことながら、上述のモチーフＡ領域、場合によりモチーフＢ領域中のアミノ酸置換の他に、本発明の改変されたポリメラーゼには、等価な野生型タンパク質と比べて、アミノ酸配列中の他の変化が含まれてもよい。他のアミノ酸置換、欠失、付加、融合などは、例えば、酵素中に望ましい特性を導入し、および／または組換え発現を改善し、および／またはタンパク質の精製を容易にし、および／または酵素の望ましくない特性を除くために取り込むことができる。また、改変されたポリメラーゼは、それ自体は、ポリメラーゼ活性に対して有意または検出可能な効果を有さず、ポリメラーゼのその他の機能を変えたり、いかなる望ましい特性も付与したりしないアミノ酸変化を取り込むことができる。これらには、例えば、モチーフＡ領域およびモチーフＢ領域外のタンパク質の領域における保存的アミノ酸置換が含まれてもよい。
【０１１５】
例えば、本発明の好ましい実施形態において、本発明の改変されたポリメラーゼ酵素は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くように、さらに変異させることができる。この３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼなどの特定のＤＮＡポリメラーゼには存在しない。修飾ヌクレオチドを使用する場合、このエキソヌクレアーゼ校正活性を取り除き、取り込み後にエキソヌクレアーゼが非天然ヌクレオチドを除去するのを防ぐことは有用である。したがって、ＤＮＡポリメラーゼ酵素へのこのような変化は、３’修飾ヌクレオチドが関わるＤＮＡ配列決定応用例にとって有益である。古細菌ＤＮＡポリメラーゼを、保存的エキソヌクレアーゼモチーフ内で遺伝子組み換えし、アミノ酸配列をＤＩＥからＡＩＡに変え、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を取り除くことができる。かつて、このような変化は、ＶｅｎｔおよびＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼについて行われている（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９９、Ｖｏｌ．２７、Ｎｏ．１２およびＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００２、Ｖｏｌ．３０、Ｎｏ．２を参照）。９°Ｎポリメラーゼにおいて、エキソヌクレアーゼ活性は、置換突然変異Ｄ１４１ＡおよびＥ１４３Ａを含めることによって取り除くことができる。
【０１１６】
改変されたポリメラーゼをコードする核酸
さらに、本発明は、本発明の改変されたポリメラーゼ酵素をコードする核酸分子に関する。
【０１１７】
アミノ酸配列および好ましくはポリメラーゼをコードする野生型ヌクレオチド配列も知られているポリメラーゼの突然変異体である改変されたポリメラーゼの場合、分子生物学の基本原理に従い、突然変異体をコードするヌクレオチド配列を得ることが可能である。例えば、９°Ｎポリメラーゼをコードする野生型ヌクレオチド配列が知られているならば、標準的遺伝子コードを用い、１つまたは複数のアミノ酸置換を有する９°Ｎのある突然変異体をコードするヌクレオチド配列を推定することが可能である。同様に、ヌクレオチド配列を、例えば、Ｖｅｎｔ（商標）、Ｐｆｕ、Ｔｓｐ  ＪＤＦ−３、Ｔａｑなどの他のポリメラーゼの突然変異体について容易に導き出すことができる。次いで、必要なヌクレオチド配列を有する核酸分子を、当技術分野において知られている標準的分子生物学技法を用いて構築することができる。
【０１１８】
１つの特定の実施形態において、本発明は、９°Ｎポリメラーゼの突然変異体をコードする核酸分子に関する。したがって、本発明は、配列番号１３として示されるヌクレオチド配列を含むが、ヌクレオチド１２２２からヌクレオチド１２３０まで（これらのヌクレオチドを含めて）の領域中に核酸配列の１つまたは複数の変化を有する核酸分子を提供し、前記核酸分子は、アミノ酸残基４０８からアミノ酸残基４１０までの領域中に１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換突然変異を有する突然変異９°Ｎポリメラーゼ酵素をコードするが、ただし、核酸分子は、アミノ酸置換突然変異Ｙ４０９ＶおよびＡ４８５Ｌを一緒に有する突然変異９°Ｎポリメラーゼをコードしない。
【０１１９】
核酸配列には、突然変異９°Ｎポリメラーゼ酵素ポリメラーゼ酵素に、アミノ酸残基４８４から残基４８６までの領域中に１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換突然変異がさらに含まれるように、配列番号１３として示される配列に比べて、ヌクレオチド１４４９からヌクレオチド１４５７まで（これらの残基を含めて）の領域中に１つまたは複数の変化が場合によってさらに含まれてもよい。
【０１２０】
本発明のこの態様による配列番号１３として示される核酸配列における変化は、ポリメラーゼのアミノ酸配列を変えるようでなければならない。９°Ｎポリメラーゼの全体的なアミノ酸配列に関してサイレントである核酸配列中の変化は、本発明のこの態様には含まれない。アミノ酸残基４０９のバリンへの、および残基４８５のロイシンへの変化、またはアミノ酸４８５のロイシン残基への変化は、ポリメラーゼに対してなされる唯一の変化であってはならない。これらの変化は生じることがあるが、ｅｘｏ−突然変異Ｄ１４１ＡおよびＥ１４３Ａ以外の９°Ｎポリメラーゼのアミノ酸配列中のさらなる変化がない場合に一緒に（二重突然変異体）生じてはならない。
【０１２１】
特定の好ましい実施形態において、本発明は、突然変異９°Ｎポリメラーゼをコードする核酸分子を提供し、核酸分子は、以下のヌクレオチド配列、すなわち
配列番号１９（実験の項に記載のＹＡＳ突然変異体をコードする）、
配列番号２１（実験の項に記載のＹＡＶ突然変異体をコードする）、
配列番号１７（実験の項に記載のＥＤ突然変異体をコードする）、または
配列番号１１（実験の項に記載の２Ｅ突然変異体をコードする）
のうち１つを含む。
【０１２２】
本発明によれば、定義された核酸には、同一の核酸ばかりでなく、特に、保存的アミノ酸置換における縮重コドンに起因する同義語コドン（同じアミノ酸残基を指定する異なるコドン）をもたらす場合の置換を含む任意の小さい塩基変異も含まれる。用語「核酸配列」には、塩基変異に関して示される任意の一本鎖配列に対して相補的な配列も含まれる。
【０１２３】
また、本明細書に記載の核酸分子は、適当な宿主において核酸からコードされるポリメラーゼタンパク質を発現するための適当な発現ベクター中に含まれることが有利である。前記細胞の引き続く形質転換および形質転換細胞の引き続く選択に適している発現ベクター中へのクローン化ＤＮＡの取り込みは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに提供されているように、当業者によく知られている。
【０１２４】
このような発現ベクターには、前記ＤＮＡ断片の発現を行うことができ、プロモーター領域などの制御配列と動作可能に結合された本発明による核酸を有するベクターが含まれる。用語「動作可能に結合された」は、記載の構成要素が、意図したようにそれらを機能させる関係にある並置を指す。このようなベクターを適当な宿主細胞に形質転換し、本発明によるタンパク質の発現を提供することができる。
【０１２５】
核酸分子は、成熟タンパク質またはプロ配列を有するタンパク質をコードすることができ、宿主細胞によって切断されて成熟タンパク質を生成するプレタンパク質上のリーダー配列をコードする核酸分子が含まれる。
【０１２６】
ベクターは、例えば、複製起点が提供されるプラスミド、ウイルスまたはファージベクター、場合により、前記ヌクレオチドの発現のためのプロモーター、場合により、プロモーターの制御因子であってよい。ベクターは、例えば、抗生物質耐性遺伝子などの１種または複数の選択可能なマーカーを含むことができる。
【０１２７】
発現に必要な制御要素には、ＲＮＡポリメラーゼと結合し、適切なレベルの転写開始を進めるプロモーター配列と、さらにリボソーム結合のための翻訳開始配列が含まれる。例えば、細菌発現ベクターには、ｌａｃプロモーターなどのプロモーター、翻訳開始のためのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列、および開始コドンＡＵＧが含まれてもよい。同様に、真核細胞発現ベクターには、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにとって非相同的または相同的なプロモーター、下流のポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボソームの脱離のための終止コドンが含まれてもよい。このようなベクターは、市販で得られるか、あるいは当技術分野でよく知られている方法によって記載された配列から組み立てることができる。
【０１２８】
高等真核生物によるポリメラーゼをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を含めることによって最適化することができる。エンハンサーは、プロモーターに作用して転写のレベルを高めるＤＮＡのシス作用性エレメントである。通常、ベクターには、選択可能なマーカーの他に、複製起点も含まれるものとする。
【０１２９】
「修飾ヌクレオチド」の性質
上述のように、本発明のポリメラーゼは、対照ポリメラーゼに比べて、置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドの改善された取り込みを触媒するそれらの能力に従って選択される。
【０１３０】
本発明のポリメラーゼによってより効率的に取り込まれると思われる好ましいヌクレオチドは、プリンまたはピリミジン塩基および３’炭素原子が構造−Ｏ−Ｚの基と結合しているような、共有結合した除去可能な３’−ＯＨ保護基を有するリボースまたはデオキシリボース糖部分によって例示され、
式中、Ｚは、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｏ−Ｒ’’、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｈ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｓ−Ｒ’’および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｆのいずれかであり、
各Ｒ’’は、除去可能な保護基またはその一部であり、
各Ｒ’は、独立して、水素原子、アルキル、置換アルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、アシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシもしくはアミド基、または結合基を介して結合した検出可能な標識であるか、あるいは、（Ｒ’）２は、式＝Ｃ（Ｒ’’’）２のアルキリデン基を表し、各Ｒ’’’は、同一または異なってもよく、水素およびハロゲン原子ならびにアルキル基を含む群から選択され、
前記分子は、反応して、各Ｒ’’がＨと交換されるか、あるいはＺが−Ｃ（Ｒ’）２−Ｆの場合、ＦがＯＨ、ＳＨまたはＮＨ２、好ましくはＯＨと交換された中間体が得られ、その中間体は水性条件下で解離し、遊離の３’ＯＨを含む分子が得られ、
ただし、Ｚが−Ｃ（Ｒ’）２−Ｓ−Ｒ’’の場合、両Ｒ’基は、Ｈではない。
【０１３１】
本発明のポリメラーゼによって取り込まれるヌクレオシドまたはヌクレオチドは、プリンまたはピリミジン塩基および好ましくは３’Ｏ位置において共有結合している保護基を有するリボースまたはデオキシリボース糖部分を含み、追加のヌクレオチドの取り込みを防ぐために３’−ＯＨ基の保護を必要とする技法、例えば、配列決定反応、ポリヌクレオチド合成、核酸増幅、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、一塩基多型研究および他のそのような技法、に有用な分子を与える。
【０１３２】
一旦、保護基が除去されたら、遊離の３’−ＯＨ基に別のヌクレオチドを取り込むことが可能である。
【０１３３】
好ましい修飾ヌクレオチドは、参照により全体として本明細書に組み込まれているＳｏｌｅｘａ  Ｌｉｍｉｔｅｄの名による国際特許出願公開番号国際公開第２００４／０１８４９７号パンフレットに例示されている。
【０１３４】
好ましい実施形態において、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドのＲ’基は、アルキルまたは置換アルキルである。他の実施形態において、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドの−Ｚ基は、式−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ３である。最も好ましい実施形態において、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドには、アジドメチル基であるＺ基が含まれる。
【０１３５】
モチーフＡ領域配列ＹＡＶまたはＹＡＳを有する本発明の好ましいポリメラーゼ（最も好ましくはＡ４８５Ｌ突然変異と併せてこのモチーフＡ配列を有する突然変異９°Ｎポリメラーゼ）は、Ｚがアジドメチル基であるヌクレオチド類似体の取り込みにとって特に好ましい。
【０１３６】
修飾ヌクレオチドは、塩基を介し、望ましいリンカーによって検出可能な標識と結合させることができ、その標識は、例えば、フルオロフォアであってよい。望ましい場合、代わりに、検出可能な標識を式「Ｚ」の保護基中に取り込むことができる。リンカーは、酸に不安定であるか、感光性か、あるいはジスルフィド結合を含んでもよい。その内容が全体として本明細書に組み込まれている国際公開第２００４／０１８４９７号パンフレットでより詳しく記載されているように、他の結合、特に、ホスフィンによって切断可能なアジド含有リンカーを本発明で用いることができる。
【０１３７】
好ましい標識および結合には、国際公開第０３／０４８３８７号パンフレットに開示されている標識および結合が含まれる。この参考文献を全体として本明細書に組み込む。
【０１３８】
一実施形態において、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドは、切断可能なリンカーが下式を含む群から選択される部分を含むことを特徴とする、切断可能なリンカーを介して検出可能な標識と結合する塩基を有するものとする。
【０１３９】
【化３】
2007504817.tif 000004
［式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨおよびＮＱ（Ｑは、Ｃ１−１０置換または非置換アルキル基である）を含む群から選択され、Ｙは、Ｏ、Ｓ、ＮＨおよびＮ（アリル）を含む群から選択され、Ｔは、水素またはＣ１−１０置換もしくは非置換アルキル基であり、＊は、その部分が、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの残部と結合している場所を示す。］
【０１４０】
一実施形態において、検出可能な標識は、蛍光標識を含む。適当なフルオロフォアは、当技術分野においてよく知られている。好ましい実施形態において、各々の異なるヌクレオチドタイプは、異なる蛍光標識を有するものとする。このことは、特定のヌクレオチドの取り込みの確認を容易にする。したがって、例えば、修飾アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンはすべて、それらをお互いと容易に区別させるために別々のフルオロフォアと結合していたであろう。驚いたことに、発明者らは、改変されたポリメラーゼが、多くの異なる蛍光標識を有する修飾ヌクレオチド類似体を取り込むことができることを見いだした。さらに、このポリメラーゼは、４種の塩基すべてを取り込むことができる。これらの特性は、核酸配列決定プロトコルにおける使用に関して実質的な利点を提供する。
【０１４１】
上述のように、モチーフＡ領域配列ＹＡＶおよびＹＡＳを有する突然変異酵素は、３’位においてＯ−アジドメチル官能基を含むヌクレオチド類似体の取り込みにとって最も好ましい。当然のことながら、他のヌクレオチド類似体の場合、最適な取り込みにとって好ましいモチーフＡ領域のアミノ酸配列は変わることがある。あるヌクレオチド類似体の場合、最適な領域Ａ配列優先度は、実験によって、例えば、ライブラリーまたは不連続な数の突然変異体の構築と、続く取り込みアッセイ系における個々の変異体の試験によって決定することができる。
【０１４２】
しかしながら、本明細書で確認された好ましい領域Ａ変異ポリメラーゼは、３’保護基の全体的サイズを増やす他の置換基を有する多くの異なるＯ−アジドメチル保護基を含む修飾ヌクレオチド、Ｏ−アジドメチル官能基をベースにしない３’保護基を含む修飾ヌクレオチド類似体、および多くの異なる蛍光標識を有する修飾ヌクレオチドの改善された取り込みも示すことが分かった。したがって、本発明の改変されたポリメラーゼは、異なるサイズおよび様々な化学的性質の大きな３’置換基を有する広範囲な修飾ヌクレオチドの改善された取り込み能力を持つと結論された。
【０１４３】
改変されたポリメラーゼの好ましい使用
他の態様において、本発明は、ヌクレオチドをポリヌクレオチド中へ取り込むための本発明による改変されたポリメラーゼの使用に関する。
【０１４４】
好ましい実施形態において、ヌクレオチドは、置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾した修飾ヌクレオチドである。
【０１４５】
本発明のポリメラーゼは、天然のヒドロキシル基よりサイズが大きい３’糖ヒドロキシル位置における置換基を有する修飾ヌクレオチドを、ポリヌクレオチド鎖中に取り込めることが必要である／望ましい任意の技術領域において使用することができる。本発明のポリメラーゼは、酵素の望ましい特性、具体的には、ヌクレオチド類似体の改善された取り込み速度、標識（例えば、蛍光）類似体を取り込む能力、４種の塩基すべてを取り込む能力、低温におけるおよび／または広い温度範囲にわたる活性、低い基質濃度における活性、取り込みの複数サイクルにわたる活性、および高い忠実度のいずれかが利点を提供する任意の技術領域において使用することができる。このことは、実用的、技術的または経済的利点と考えられる。
【０１４６】
改変されたポリメラーゼは、大きな３’置換基を有する修飾ヌクレオチドの取り込みに関して望ましい特性を示すが、この酵素の有用性は、そのようなヌクレオチド類似体の取り込みに限定する必要はない。改変されたポリメラーゼの望ましい特性は、当技術分野において知られている酵素に比べて、非修飾ヌクレオチドを含むその他のヌクレオチドの取り込みに関して利点を提供することができる。本質的に、本発明の改変されたポリメラーゼを使用し、取り込む能力を有する任意のタイプのヌクレオチドを取り込むことができる。
【０１４７】
本発明のポリメラーゼは、ヌクレオチドのポリヌクレオチド中への取り込みを必要とする様々な技法において有用であり、それには、配列決定反応、ポリヌクレオチド合成、核酸増幅、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、一塩基多型研究、および他のそのような技法が含まれる。本発明の修飾ポリメラーゼを利用するこのような使用および方法はすべて、本発明の範囲内に含まれる。
【０１４８】
また、本発明は、置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドをＤＮＡ中に取り込むための方法であって、以下の構成要素、すなわち、
−本発明によるポリメラーゼ（上述通り）
−ＤＮＡテンプレート、および
−置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドを含有するヌクレオチド溶液
を相互作用させることを含む方法に関する。
【０１４９】
上記構成要素は、修飾ヌクレオチドの５’リン酸基とＤＮＡテンプレート上の遊離３’ヒドロキシル基との間のホスホジエステル結合の形成を可能にする条件下で相互作用させ、それによって、修飾ヌクレオチドは、ポリヌクレオチド中に取り込まれる。
【０１５０】
取り込み反応は、自由溶液中で起きることがあり、またはＤＮＡテンプレートは、固体支持体に固定されてもよい。
【０１５１】
天然のヒドロキシル基よりサイズが大きい３’糖ヒドロキシル位置における置換基を有する修飾ヌクレオチドをポリヌクレオチド鎖中に取り込めることが必要である／望ましい任意の技術領域において、本発明のポリメラーゼを実用的に使用するためには、酵素が、許容できる速度で類似体を取り込むことができることだけが必要である。実用面で「許容できる」取り込み速度は、実施例２のアッセイ系において４５℃、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、４ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．０５（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ、５０μｇ／ｍｌ酵素、および２μＭ  ３’修飾ヌクレオチドにおける酵素処理の１回または複数回のサイクルでの検出可能な（すなわち、バックグラウンド以上の）生成物変換と定義することができる。好ましい実施形態において、ポリメラーゼは、４５℃、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、４ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．０５（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ、５０μｇ／ｍｌ酵素、および２μＭ  ３’修飾ヌクレオチドにおける酵素処理の第２サイクルで、１９．５分以下、より好ましくは５分以下、最も好ましくは１．５分以下の５０％生成物変換までの時間を示すことがある。
【０１５２】
突然変異酵素によって示される３’修飾ヌクレオチド類似体の取り込み速度は、突然変異酵素、または由来する等価な野生型酵素によって示される非修飾ヌクレオチドの取り込み速度と同程度であってよい。しかしながら、３’修飾類似体の取り込み速度は、実用的に使用される突然変異酵素についての非修飾ヌクレオチドの取り込み速度と同程度である必要はない。必要なのは、３’修飾類似体の取り込み速度が、取り込みの少なくとも１サイクルで、上記で提供された定義に従って「許容できる」ことだけである。取り込み速度は、非修飾ヌクレオチドおよび／または置換基がヒドロキシル基より小さいように修飾されたヌクレオチドの取り込み速度に比べて小さくても、等しくても、または大きくてもよい。
【０１５３】
本発明の１つの特定の実施形態において、本発明の改変されたポリメラーゼを使用し、合成による配列決定プロトコルとの関連で修飾ヌクレオチドをポリヌクレオチド鎖中に取り込むことができる。この方法のこの特定の態様において、置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドを検出し、ＤＮＡテンプレートの配列を決定するものとする。
【０１５４】
したがって、さらに他の態様において、本発明は、ＤＮＡを配列決定する方法であって、
以下の構成要素、すなわち、
−本発明によるポリメラーゼ（上述通り）
−ＤＮＡテンプレート、および
−置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチドを含有するヌクレオチド溶液
を相互作用させることと、続いて取り込まれた修飾ヌクレオチドを検出し、ＤＮＡテンプレートの配列決定を可能にすることを含む方法を提供する。
【０１５５】
通常、配列決定反応のためのＤＮＡテンプレートは、配列決定反応において他のヌクレオチドを付加するためのプライマーまたは開始点としての役割を果たす遊離３’ヒドロキシル基を有する二本鎖領域を含むものとする。配列決定されるＤＮＡテンプレートの領域は、相補鎖上にこの遊離３’ヒドロキシル基を突き出すものとする。遊離３’ヒドロキシル基を有するプライマーを、配列決定されるテンプレートの領域とハイブリダイズする別の構成要素（例えば、短いオリゴヌクレオチド）として付加してもよい。あるいは、プリマーおよび配列決定されるテンプレート鎖は各々、例えば、ヘアピンループ構造などの分子内二重鎖を形成することができる部分的に自己相補的な核酸鎖の一部を形成することができる。ヌクレオチドは、遊離の３’ヒドロキシル基へ連続的に付加され、５’から３’方向でポリヌクレオチド鎖の合成が行われる結果となる。各ヌクレオチド付加後に、付加された塩基の性質を決定し、ＤＮＡテンプレートのための配列情報を提供する。
【０１５６】
このようなＤＮＡ配列決定は、修飾ヌクレオチドが連鎖停止剤として働くことができる場合に可能かもしれない。一旦、配列決定されているテンプレートの領域と相補的な伸長中のポリヌクレオチド鎖中に修飾ヌクレオチドが取り込まれると、それ以上の配列伸長を指示するのに利用できる遊離３’−ＯＨ基が存在しないため、ポリメラーゼは、それ以上のヌクレオチドを付加することができない。一旦、伸長中の鎖中に取り込まれた塩基の性質が決定されたら、３’ブロックを除去し、次の連続するヌクレオチドの付加を可能にすることができる。これらの修飾ヌクレオチドを用いて誘導される生成物を順序づけることにより、ＤＮＡテンプレートのＤＮＡ配列を推論することが可能である。修飾ヌクレオチドの各々が、特定の塩基に対応することが知られている異なる標識を取り付けている場合、このような反応を単一の実験で行い、各取り込みステップにおいて付加された塩基間の区別を容易にすることができる。あるいは、修飾ヌクレオチドの各々を含む別々の反応を別々に行ってもよい。
【０１５７】
好ましい実施形態において、修飾ヌクレオチドは、それらの検出を容易にするための標識を有する。これは、蛍光標識であることが好ましい。各ヌクレオチドタイプは、異なる蛍光標識を有することができる。しかしながら、検出可能な標識は、蛍光標識である必要はない。ＤＮＡ配列中へのヌクレオチドの取り込みの検出を可能にする任意の標識を使用することができる。
【０１５８】
本発明の第２および第３の態様において使用するのに適している蛍光標識ヌクレオチドを検出するための１つの方法は、標識ヌクレオチドに特異的な波長のレーザー光線を用いること、または他の適当な照明源の使用を含む。
【０１５９】
一実施形態において、ヌクレオチド上の標識からの蛍光は、ＣＣＤカメラによって検出することができる。
【０１６０】
ＤＮＡテンプレートが表面上に固定化される場合、ＤＮＡテンプレートは、表面上に固定化されて高密度アレイを形成することが好ましい。本発明の出願人によって開発された技術によれば、高密度アレイは、単分子アレイを含み、アレイ上で検出可能である各々の個別部位に単一ＤＮＡ分子が存在することが最も好ましい。光学的手段によって個々に解析可能な核酸分子からなる単分子アレイおよび配列決定におけるそのようなアレイの使用については、例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれている国際公開第００／０６７７０号パンフレットに記載されている。ヘアピンループ構造を含む個々に解析可能な核酸分子からなる単分子アレイについては、その内容も参照により本明細書に組み込まれている国際公開第０１／５７２４８号パンフレットに記載されている。本発明のポリメラーゼは、国際公開第００／０６７７０号パンフレットまたは国際公開第０１／５７２４８号パンフレットの開示に従って調製された単分子アレイと併せて使用するのに適している。しかし、当然のことながら、本発明の範囲は、単分子アレイと併せたポリメラーゼの使用に限定されることを意図していない。
【０１６１】
単分子アレイをベースとした配列決定法は、単分子アレイに蛍光標識修飾ヌクレオチドおよび改変されたポリメラーゼを添加することによって機能することができる。相補的ヌクレオチドは、各ヌクレオチド断片の第１の塩基と塩基対を形成し、改善されたポリメラーゼ酵素によって触媒される反応においてプライマーに付加されるであろう。残った遊離ヌクレオチドは、取り除かれるであろう。
【０１６２】
次いで、各修飾ヌクレオチドにとって特異的な波長のレーザー光線は、取り込まれた修飾ヌクレオチド上の適切な標識を励起し、標識蛍光を引き起こすであろう。この蛍光は、アレイ全体をスキャンすることができる適当なＣＣＤカメラによって検出され、各断片上の取り込まれた修飾ヌクレオチドが確認されるであろう。すなわち、数百万の部位を並行して検出できる可能性がある。次いで、蛍光は、取り除かれるであろう。
【０１６３】
取り込まれた修飾ヌクレオチドの識別は、対合されるサンプル配列中の塩基の正体を明らかにするであろう。次いで、取り込み、検出および確認のサイクルを約２５回繰り返すと、検出可能である、アレイに結合した各オリゴヌクレオチド断片中の最初の２５塩基が決定されるであろう。
【０１６４】
したがって、検出可能であるアレイ上のすべての分子を同時に配列決定することにより、アレイに単一コピーで結合している何億ものオリゴヌクレオチド断片について最初の２５塩基を決定することができるであろう。本発明が、２５塩基を配列決定することに限定されないことは明白である。必要とされる配列情報の詳細のレベルおよびアレイの複雑さに応じて、さらに多くの、またはさらに少ない塩基を配列決定することができるであろう。
【０１６５】
適当なバイオインフォマティクスプログラムを用い、生成された配列を整列させ、特定の参照配列と比較することができる。このことは、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）などの任意の数の既知および未知の遺伝的変異の判定を可能にする。
【０１６６】
本発明の改変されたポリメラーゼの有用性は、単分子アレイを用いる配列決定応用例に限定されるものではない。これらのポリメラーゼは、ポリヌクレオチド鎖中にヌクレオチドを取り込むためにポリメラーゼの使用を必要とする任意のタイプのアレイをベースとした（特に、任意の高密度アレイをベースとした）配列決定技術、特に、３’保護基などの大きな３’置換基（天然のヒドロキシル基より大きな）を有する修飾ヌクレオチドの取り込みに依存する任意のアレイをベースとした配列決定技術と併せて使用することができる。
【０１６７】
本発明のポリメラーゼは、固体支持体上の核酸分子の固定化によって形成される本質的に任意のタイプのアレイ上の核酸配列決定に使用することができる。単分子アレイの他に、適当なアレイには、例えば、アレイ上の異なる領域が、個々のポリヌクレオチド分子の複数のコピーまたは少数の異なるポリヌクレオチド分子の複数のコピー（例えば、２つの相補的核酸鎖の複数のコピー）を含むマルチ−ポリヌクレオチドまたはクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ）アレイが含まれてよい。
【０１６８】
特に、本発明のポリメラーゼは、その内容が参照により本明細書に組み込まれている国際公開第９８／４４１５２号パンフレットに記載の核酸配列決定法において利用することができる。この国際出願は、固体支持体上の異なる位置に置かれた複数のテンプレートの並行配列決定の方法について記載している。この方法は、ポリヌクレオチド鎖中への標識ヌクレオチドの取り込みに依存している。
【０１６９】
本発明のポリメラーゼは、その内容が参照により本明細書に組み込まれている国際出願国際公開第００／１８９５７号パンフレットに記載の方法において利用することができる。この出願は、多数の異なる核酸分子が配置され、核酸コロニーの形成を介して高密度で同時に増幅され、続いて、核酸コロニーが配列決定される、固相核酸増幅および配列決定の方法について記載している。本発明の改変されたポリメラーゼは、この方法の配列決定ステップにおいて利用することができる。
【０１７０】
核酸分子のマルチ−ポリヌクレオチドまたはクラスターアレイは、当技術分野において一般的に知られている技法を用いて製造することができる。例えば、国際公開第９８／４４１５１号パンフレットおよび国際公開第００／１８９５７号パンフレットは、固定化核酸分子のクラスターまたは「コロニー」からなるアレイを形成するために、増幅生成物を固体支持体上に固定化させる核酸増幅の方法について記載している。クラスターアレイの調製および核酸配列決定のためのテンプレートとしてのそのようなアレイの使用に関する国際公開第９８／４４１５１号パンフレットおよび国際公開第００／１８９５７号パンフレットの内容を、参照により本明細書に組み込む。これらの方法に従って調製されるクラスターアレイ上に存在する核酸分子は、本発明のポリメラーゼを用いる配列決定に適しているテンプレートである。しかしながら、本発明は、これらの特定の方法に従って調製されるクラスターアレイ上で行われる配列決定反応におけるポリメラーゼの使用を意図していない。
【０１７１】
さらに、本発明のポリメラーゼは、Ｍｉｔｒａ他Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２０、５５〜６５、２００３によって記載された方法などの、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ配列決定の方法において使用することができる。
【０１７２】
次に、以下の非限定的実施例および添付の図面で本発明をさらに説明する。
【０１７３】
実施例１
本明細書において、３’修飾ヌクレオチド類似体の取り込みを改善する一連のポリメラーゼ変異体を報告する。これらの変異酵素の一部は、６つの無作為なアミノ酸残基にわたり、お互いと類似した配列を共有し、対照的に、改善された取り込みを示す他の酵素は、これらの領域中に配列類似性を有さない。
【０１７４】
突然変異は、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼ配列の２つの領域、残基４０８−４１０、および残基４８４−４８６で同時に導入した。３’修飾ヌクレオチド類似体の取り込みについて、ポリメラーゼ変異体のライブラリーをスクリーニングした。親クローンに比べて増強された取り込みレベルを示した変異体を精製して試験し、それらの活性を確認した。
【０１７５】
変異ポリメラーゼは、実験において利用される修飾ヌクレオチドに対する増加した活性を有する。すなわち、変異ポリメラーゼは、プライマー伸長アッセイにおいて、対照ポリメラーゼとしての役割を果たすことができる９°Ｎ（−ｅｘｏ）Ｙ４０９Ｖ／Ａ４８５Ｌ二重突然変異体（本明細書では９ＤＭで表す）などの以前から利用可能であるポリメラーゼより速く、置換基が、天然の３’ヒドロキシル基よりサイズが大きくなるように３’糖ヒドロキシルを修飾したヌクレオチド類似体を取り込むように見える。
【０１７６】
表ＩＩ  突然変異誘発の標的となる全領域の新規な改善されたＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の比較。９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中の様々な置換突然変異の部位を、野生型９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列および９ＤＭ  ９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列と比較して示す。変異は、２つの領域、モチーフＡ（アミノ酸４０８−４１０）およびモチーフＢ（アミノ酸４８４−４８６）中で行われた。各クローンには個々の識別子、容易な確認を可能にする省略名を与えた。
【０１７７】
【表２】
2007504817.tif 000005
【０１７８】
方法：
突然変異ポリメラーゼのライブラリーの構築。
ＤＮＡ中に突然変異を導入するための多くの方法がある（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１およびその中の参考文献を参照）。アミノ酸４０８−４１０およびアミノ酸４８４−４８６における９°Ｎの突然変異誘発について、使用されてきた一方法を以下に記載する。
【０１７９】
出発材料として、配列決定されて機能が確認されたポリメラーゼのクローンを使用する。この特定の実施例では、９°Ｎ（−ｅｘｏ）Ｙ４０９Ｖ／Ａ４８５Ｌ（９°Ｎ  ＤＭ）二重突然変異体由来のプラスミドを利用した（配列番号１５）。
【０１８０】
表ＩＩＩは、突然変異誘発実験において突然変異９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのライブラリーを作成するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列を示している。
【０１８１】
【表３】
2007504817.tif 000006
【０１８２】
１．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を標準的実験手順（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１）に従って利用し、５０マイクロリットルの反応物は、製造者の指針に従って、９°Ｎ  ＤＭテンプレート、ｄＮＴＰ、適当な反応緩衝液およびＰＦＵターボホットスタート（ストラタジーン）を含んでいた。９４℃で１０秒間の初期インキュベーション後、ＤＮＡを、各々が３つのステップ、すなわち９４℃で１０秒、５０℃で３０秒、６８℃で１５０秒を含む２５サイクルにより増幅させ、以下の生成物を製造した。
２．生成物１：−「９°Ｎ  ａｔｇ  ｌｏｎｇ」対「９°Ｎ  １２２１−１１９８」＝（１３３−１対１２５−１）。
３．生成物２：−「９°Ｎ  ｔｅｒｍ  ｌｏｎｇ」対「９°Ｎ  １４６０−１４８３」＝（１３３−３対１２５−２）。
４．生成物３：−「９°Ｎ  １１９８−１２５１  ＮＮＫ」対「９°Ｎ  １４８３−１４２８」＝（１１９−３対１１９−６）。
５．ゲル上で５μｌを分析し、ＤｐｎＩ（１μｌ）を用いて容積の残りを消化し、次いで、消化した生成物をゲル精製する。
６．生成物１および生成物３の各々２μｌを混ぜ合わせ、上記の条件を用いてプライマー、「９°Ｎ  １４８３−１４６０」対「ｒｅａｍｐ  ９°Ｎ  ａｔｇ  ｌｏｎｇ」＝（１１９−７対１３３−２）で増幅する。
７．生成物３および生成物２の各々２μｌを混ぜ合わせ、上記の条件を用いてプライマー、「９°Ｎ  １１９８−１２２１」対「ｒｅａｍｐ  ９°Ｎ  ｔｅｒｍ  ｌｏｎｇ」＝（１１９−５対１３３−３）で増幅する。
８．両生成物をゲル精製し、各々２μｌを混ぜ合わせ、上記の条件を用いて「ｒｅａｍｐ  ９°Ｎ  ａｔｇ  ｌｏｎｇ」対「ｒｅａｍｐ  ９°Ｎ  ｔｅｒｍ  ｌｏｎｇ」＝（１１９−７対１３３−４）で再増幅する。
９．最終ＤＮＡ生成物を、３７℃で２時間、ＮｃｏＩ（５０単位）およびＢａｍＨＩ（１００単位）制限酵素で消化し、この断片を、製造者の使用説明書に従い、Ｑｉａｑｕｉｃｋ手順（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてさらに精製した。得られたＤＮＡを、ｐＥＴ３ｄプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）中に連結し、標準的手順（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１）に従い、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ酵素で切断した。
【０１８３】
形質転換
連結物の一部を、変異遺伝子の発現を可能にするＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳなどの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の菌株、あるいは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αなどの中間体宿主中に直接形質転換させた。
【０１８４】
１．形質転換は、製造者によって提供される標準的手順に従い、関連するコンピテント細胞について行った。２つの２０ｃｍ×２０ｃｍ  ＬＢ寒天およびカルベニシリン（ＬＢＣ）プレート上に細胞をプレートした。
２．コロニーを一夜増殖させると、おおよその数は、５０，０００個の独立したクローンを示した。
３．プレートにＬＢカルベニシリンブロスの各々５０ｍｌをかぶせた。コロニーを、使い捨て細菌スプレッダーで溶液中に手でかき混ぜた。溶液をいくつかのファルコンチューブに移し、手でさらにかき混ぜ、すべてのコロニーが培地中に分布されたことを確認した。
４．３７℃で２時間のインキュベーションのため、チューブをオービタルシェーカーに移した。
５．細菌ブロスを採集し、ライブラリープラスミドＤＮＡを標準的手順によって抽出した。
６．ライブラリープラスミドＤＮＡを用い、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細菌発現宿主を形質転換し、このプラスミド調製物／宿主組合せについてコロニー形成単位（ＣＦＵ）の力価を確立した。
【０１８５】
３’修飾ヌクレオチド類似体の取り込みについてのコロニーのスクリーニング
Ｓａｇｎｅｒ他（１９９１）の方法の変形例であるヌクレオチド取り込みをスクリーニングするための多くの様々な方法がある。本明細書では、関連するヌクレオチド類似体のジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチル−カルボニル−ｅ−アミノカプロン酸（ＤＩＧ）誘導体（ｆｆＴ−ＤＩＧ）を使用する３’修飾ヌクレオチド類似体の取り込みに適している一方法について記載する。
【０１８６】
１日目
１．ＢＬ２１（ＤＥ３）＊ｐＬｙｓＳ菌株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にライブラリー連結物を形質転換し、１００μｇ／ｍｌカルベニシリン（ｃａｒｂ）および３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（ｃａｍ）を添加したＬＢ寒天プレート上にプレートアウトする。２２ｃｍ２プレートにつき１×１０５個のコロニーを目指す。３７℃で一夜インキュベートする。
【０１８７】
２日目
２．１００μｇ／ｍｌカルベニシリン、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加した新鮮なＬＢ寒天プレート上でＨｙｂｏｎｄ  Ｃ  Ｅｘｔｒａニトロセルロースフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を予め濡らす。黒のボールペン（ｂｉｒｏ）でフィルターに番号をつけ、フィルターを得たプレートにも番号をつける。注意深く、気泡を閉じ込めないように、コロニーの上に濡れた濾紙を置き、約１分間そのままにしておく。針で方向マークの印をつける（その後のアライメントを助けるためにフィルターの縁の周りに１つ、２つおよび３つのスポット）。濾紙を注意深く持ち上げ、ｃａｒｂ／ｃａｍ／ＩＰＴＧプレート上にコロニー側を上にして置く。紙を持ち上げて再び置くことによりすべての気泡を除去する。プレート上で３７℃において４時間、このフィルターをインキュベートする。また、コロニーリフトを行った元のプレートをインキュベートし、コロニーを再増殖させる。
【０１８８】
３．溶解
Ｃｅｌｌ  Ｌｙｔｉｃ  Ｂ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃｅｌｌ溶解／抽出試薬（Ｓｉｇｍａ）溶液５０ｍｌに、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）２μｌを添加する。白色のトレイ上の正方形の３ＭＭ紙（Ｗｈａｔｍａｎ）に注ぎ入れ、すべての気泡を取り除き、平らで湿っているがあまり濡れない程度まで１０ｍｌピペットで転がすことによって過剰の溶液を除去する。過剰の溶液を捨てる。室温で１時間、この紙の上にコロニー側を上にしてフィルターを置く。３ＭＭ紙が乾ききらないことをチェックする。８０℃でオーブンを予熱する。
【０１８９】
４．熱処理
新しいペトリ皿に３ＭＭ紙を入れ、ｄＨ２Ｏで濡らす。過剰のｄＨ２Ｏを捨て、５ｍｌピペットの端を用いて紙を平らにする。濡れた３ＭＭ紙の上にコロニー側を上にしてフィルターを置き、赤い電気テープでペトリ皿を密封する。８０℃のオーブン内の加湿ボックス（トレイの底のある程度の水と共にすでに８０℃まで平衡化された）内に１時間置く。（大きな２２ｃｍ２プレートの場合、加湿ボックスの代わりに、テープで貼り付けられたオートクレーブバッグ内に置く）。１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を解凍する。
【０１９０】
５．取り込み
テープおよび３ＭＭ紙を取り除き、フィルターをペトリ皿に戻す。取り込みを試験することになっている温度まで予め温めた取り込み溶液を添加する。（フィルターあたり１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ溶液ｐＨ８．８＋０．０５μＭ  ｆｆｔ−ＤＩＧ＋０．０５μＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）。小さな丸いペトリ皿あたり１０ｍｌ容積を使用する。（大きな２２ｃｍ２プレートの場合は９０ｍｌを使用する）。４５℃以上でインキュベートする場合には、ペトリ皿の外側の周りにテープを巻く。必要な温度で３０分間、静かにインキュベートする。
【０１９１】
６．洗浄
取り込み緩衝液を捨て、ｄＨ２Ｏで洗い落とす。ロッカー上でＤＩＧ洗浄緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）により２×５分、洗浄する。ロッカー上で一夜、ＤＩＧブロッキング緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）約１０ｍｌ中でインキュベートする。（大きな２２ｃｍ２プレートの場合はＤＩＧブロッキング緩衝液５０ｍｌ）。
【０１９２】
３日目
７．抗体結合および検出
小さな丸いフィルターあたりＤＩＧブロッキング緩衝液１０ｍｌ（大きな２２ｃｍ２プレートの場合は５０ｍｌ）で抗ＤＩＧアルカリホスファターゼ結合抗体（Ｒｏｃｈｅ）を１：５０００に希釈する。ロッカー上で室温において４５分間、抗体と一緒にフィルターをインキュベートする。ロッカー上で各々１５分間、ＤＩＧ洗浄緩衝液でフィルターを２回洗浄する。ロッカー上で２分間、ＤＩＧ検出緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）１０ｍｌ（大きな２２ｃｍ２プレートの場合は５０ｍｌ）でフィルターを平衡化する。小さな丸いフィルターあたり新鮮なＤＩＧ検出溶液１０ｍｌにＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｒｏｃｈｅ）２０μｌを添加し、ロッカー上で２０分間室温でインキュベートする（大きな２２ｃｍ２プレートの場合はＤＩＧ検出溶液５０ｍｌにＮＢＴ／ＢＣＩＰ  １００μｌ）。検出中は、フィルターが入っているペトリ皿をホイルにくるんでおくこと。数分間水道水でフィルターを十分に洗い流し、反応を停止させる。３ＭＭ紙上、３７℃でフィルターを乾燥する。
【０１９３】
一般化された取り込み実験
これは、一般化された方法である。標準手順（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１）に従い、１５％ポリアクリルアミド／尿素配列決定ゲルを作製する。時点毎に、ラック中のラベル付きエッペンドルフにホルムアミド−ブロモフェノールブルー、シアン化物ローディングダイ（Ｓｉｇｍａ；ストップミックス）５μｌを添加する。また、各反応のために、ＣＨＡＳＥミックス１μｌが入っているエッペンドルフを用意する。氷の上ですべてのフリーザー構成要素を解凍する。
【０１９４】
反応ミックス例
反応毎に、氷の上のエッペンドルフ中で、
２μＭテンプレート５μｌ
２Ｕ／μｌ  ９°Ｎ  ＤＭ  ２．５μｌ
１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液、またはＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ、ｐＨ８  ５μｌ
ｄＨ２Ｏ  ３０．５μｌ
を混ぜ合わせる（総容積５０μｌ）。
【０１９５】
通常使用されるミックスの他の構成要素は、ＭｎＣｌ２、Ｔｗｅｅｎ、ＮａＣｌまたは他の塩、ＥＤＴＡおよびＤＴＴであってよい。他の緩衝液または化学物質を使用して取り込み条件を試験する場合。６５℃か、必要に応じて低く設定されたホットブロックにチューブを入れる。各反応物に標識プライマー（１μＭ）５μｌを添加する。０分時点については、ストップミックス５μｌが入っている０分時点用チューブに５μｌを移す。１００ｍＭ  ＭｇＳＯ４＋ｄＮＴＰ、または必要に応じてヌクレオチド類似体２μｌを、必要な濃度（例えば、各２マイクロモル）で添加することによって反応を開始する。最初の反応物にＭｇＳＯ４／ｄＮＴＰミックスを添加した直後にタイマーをスタートさせる。各時点で、ストップミックス５μｌが入っているラック中の適切な時点用のチューブに５μｌを移す。最終時点後、エッペンドルフ中のＣＨＡＳＥミックス１μｌに反応物５μｌを添加する。６５℃で１０分間インキュベートする。ホルムアミドローディング色素５μｌを添加する。ゲル上に各反応物３μｌをロードする。５５Ｗで２時間１５分間ゲルを泳動する。ゲルを乾燥する。蛍光スクリーンに一夜曝露し、ホスホイメージャー機器を用いてスキャンし、適切なソフトウエアで解析する
【０１９６】
実施例２
実施例１では、３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン中の突然変異（アミノ酸Ｄ１４１Ａ；Ｄ１４３Ａ）および酵素の触媒部位における突然変異（アミノ酸Ｙ４０９Ｖ；Ｙ４８５Ｌ）を含む古細菌９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのいわゆる「二重突然変異体」変異体を修飾し、本明細書において領域Ａ（アミノ酸４０８−４１０）および領域Ｂ（アミノ酸４８４−６）と名付けられたタンパク質の２つの異なる領域に突然変異を組み込んだ。その結果、７種の改変されたポリメラーゼの一団について記載し、各々は、領域ＡとＢの双方に突然変異を有する。
【０１９７】
どちらの領域が改善された活性を担うかを確認するため、領域Ａの変化（これらは、「２Ｅ」変異体由来の領域Ａ突然変異ＶＡＬである）のみを有するポリメラーゼ変異体を構築し、領域Ｂは、９°Ｎ  ＤＭの親配列（Ａ４８５Ｌ）に戻した。「ＥＤ」として知られるこの変異体は、領域ＡとＢに共に変化を有する元の突然変異体に比べて、修飾ヌクレオチドの増強された取り込み速度を示した。このことから、ポリメラーゼ遺伝子の単一領域のみの突然変異が、対照ポリメラーゼに比べて、３’修飾ヌクレオチド類似体について増強された酵素活性を有するタンパク質をコードできることが示唆された。したがって、この知見から、領域Ａのみに変化を有するポリメラーゼ変異体の大きな一団を構築し、ヌクレオチド類似体の取り込みについてスクリーニングした。
【０１９８】
領域Ａクローンのスクリーニングによって確認されたポリメラーゼ変異体は、親タンパク質９°Ｎ  ＤＭに比べて、ヌクレオチド類似体の増強された取り込み速度を示し、これらの新しい変異体の多くは、ＥＤポリメラーゼに比べて改善された活性を示した。さらに、タンパク質において領域Ａと一緒にヌクレオチド結合ポケットの一部を形成するポリメラーゼの第３の領域（本明細書では領域Ｃと呼ばれる；９°Ｎポリメラーゼのアミノ酸４９３、４９４および４９６）への突然変異は、ポリメラーゼ活性に改善をもたらさなかった。これらのデータは、新しいポリメラーゼの増強された活性にとっては、ヌクレオチド結合ポケット内の特定のアミノ酸のみへの変化が重要であることを示した。
【０１９９】
材料および方法
クローンＥＤの構築
ポリメラーゼ変異体ＥＤは、以下の変異、すなわちＬ４０８Ｖ、Ｖ４０９Ａ、Ｐ４１０Ｌを有する９°Ｎ  ＤＭ  ＤＮＡポリメラーゼの誘導体である。このクローンは、標準的な分子生物学の方法に従い、様々な方法で構築することができる。ＥＤをコードする遺伝子を構築する一方法を本明細書で説明し、我々の実験で使用した。
【０２００】
２Ｅ遺伝子生成物をコードするＤＮＡ（実施例１に記載）を単離し、製造者の使用説明書に従って制限酵素ＸｈｏＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＮＥＢ）で消化した。アミノ酸４０８−４１０にまたがる領域をコードする得られたＤＮＡ断片は、標準的方法を用い、アガロースゲルから精製した。次いで、このＤＮＡ断片を、標準的手順に従い、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いて９°Ｎ  ＤＭプラスミドｐＮＥＢ９１７（ＮＥＢ；実施例１に記載）のＸｈｏＩで消化したベクター主鎖中に連結させた。再連結したベクター主鎖のバックグラウンドは、標準的手順に従って子ウシ腸ホスファターゼ（ＮＥＢ）による前処理によって減少した。連結反応の生成物を、製造者の使用説明書に従ってｌｉｂｒａｒｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。次いで、以下の組成、すなわち、ＤＮＡ／コロニー水溶液、１μｌ、０．１μＭプライマー、２００ｕＭ  ｄＮＴＰ、１単位Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、２μｌ  １０×Ｔａｑ反応緩衝液の反応混合物２０μｌ中、２Ｅ配列と特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマー（プライマー２Ｅ  ４０８−４１０；配列５’  ＧＡＣＴＴＣＣＧＣＴＣＧＧＴＴＧＣＧＴＴＧ  ３’配列番号２３）および９°Ｎ  ＤＭベクター主鎖（プライマー配列５’  ＡＡＧＣＣＣＣＴＣＡＣＧＴＡＧＡＡＧＣＣ  ３’配列番号２４）を用いるＰＣＲによってコロニーをスクリーニングした。反応は、９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で２分を３０回サイクルさせ、アガロースゲル電気泳動による反応生成物の検査によって陽性コロニーを確認した。
【０２０１】
領域Ａに変異を有するクローン（アミノ酸４０８−４１０をコードする）のライブラリーの構築
突然変異タンパク質のライブラリーの構築は、様々な方法によって行うことができる。この研究で使用した方法は、２つの段階、すなわち、突然変異ポリメラーゼをコードするＤＮＡテンプレートの縮重ミックスの形成、および適当な発現ベクター中へのこれらのＤＮＡ断片のクローニングを含んでいた。縮重ＤＮＡテンプレートのプールは、オリゴヌクレオチドプライマーＸｂａ４０８−４１０（５’  ＧＴＧＴＡＴＣＴＡＧＡＣＴＴＣＣＧＣＴＣＧＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＣＡＡＴＣＡＴＣＡＴＡＡＣＣＣＡＣＡＡＣ  ３’配列番号２５；Ｎ、Ｇ、Ａ、ＴとＣ塩基の等モル混合物；Ｋ、ＧとＴ塩基の等モル混合物）および９°Ｎ  ＤＭ遺伝子配列とハイブリダイズするＢａｍＨＩ  ３’  ９°Ｎ  ５’  ＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴＴＣＴＴＣＣＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＣＡＣＧＣ  ３’配列番号２６）を用いるＰＣＲによって形成された。９°Ｎ  ＤＭテンプレートＤＮＡ１０ｎｇを用い、上述のように反応物２０μｌ中のＰＣＲによってＤＮＡ断片を増幅した。１２００ｂｐのＤＮＡ生成物を、製造者の使用説明書に従い、ゲル精製法（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル精製し、製造者によって推奨される１０×ＢａｍＨＩ緩衝液（ＮＥＢ）を用い、制限酵素ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ（ＮＥＢ）で断片を消化した。第２段階では、以下の通り２ステップ手順で構築される発現プラスミドｐＳＶ１３、これはｐＮＥＢ９１７の誘導体（ＮＥＢ）である、のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩベクター主鎖中にこれらのＤＮＡ断片をクローニングした。まず、ｐＮＥＢ９１７プラスミドのポリリンカー中のＸｂａＩ制限部位を、標準的分子生物学手順（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１）を用い、ＸｂａＩによるプラスミドの切断、得られた３’オーバーハングのＫｌｅｎｏｗポリメラーゼによる伸長、およびＴ４リガーゼによる平滑末端ＤＮＡの再連結によって破壊した。次いで、このプラスミドｐＳＶ１２をさらに突然変異させ、９°Ｎ  ＤＮＡ配列中の１２０６位における独特なＸｂａＩ部位の導入によってｐＳＶ１３を作成した。この突然変異は、第１の反応ではオリゴヌクレオチドプライマーＸｂａＩ  ｍｕｔ  ５’（５’  ＧＧＧＡＣＡＡＣＡＴＴＧＴＧＴＡＴＣＴＡＧＡＣＴＴＣＣＧＣＴＣＧＣＴＧＧＴＧＣＣＴＴＣ  ３’配列番号２７）および１７６９Ｒ（５’  ＧＴＣＴＡＴＣＡＣＡＧＣＧＴＡＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＧ  ３’配列番号２８）を、第２の反応ではＸｂａＩ  ｍｕｔ  ３’（５’  ＧＡＡＧＧＣＡＣＣＡＧＣＧＡＧＣＧＧＡＡＧＴＣＴＡＧＡＴＡＣＡＣＡＡＴＧＴＴＧＴＣＣＣ  ３’配列番号２９）および１０３２Ｆ  ５’  ＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣ  ３’配列番号３０）を用いるＰＣＲ突然変異誘発によって行った。これらの増幅のためのＰＣＲサイクリング条件は、１反応あたりＴａｑ  １．５単位およびプライマー１μＭを用い、９５℃で１分間、６０℃で３０秒間および７２℃で１．５分間を３０サイクルとした。これらのＰＣＲの生成物は、プライマー１０３２Ｆ／１７６９Ｒによる第２のＰＣＲ反応で使用され、同一の反応条件を用いて７３７ｂｐのＤＮＡ生成物を作成する２つの部分的にオーバーラップするＤＮＡ断片であった。この最終生成物を、Ｘｈｏ���（１０４０および１３７２におけるＸｈｏＩ部位は、ＸｂａＩ突然変異に隣接する）で消化し、ＸｈｏＩ切断ｐＳＶ１２と連結させた。挿入の方向は、制限消化によってチェックし、得られたプラスミドをｐＳＶ１３と名付けた。ｐＳＶ１２とｐＳＶ１３の双方を、変化を受けた領域にわたって配列決定した。
【０２０２】
ｐＳＶ１３中への縮重ＤＮＡ断片の連結後、ＤＮＡを、製造者の手順に従ってコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に形質転換し、実施例１に記載のように単一コロニーへプレートアウトした。
【０２０３】
別の実験では、様々なオリゴヌクレオチドプライマーの組を用い、ｐＳＶ１３中へのクローニングのためのＤＮＡテンプレートの混合物を作成した。また、これらのプライマーは、９°Ｎ  ＤＭのアミノ酸４０８−４１０をコードする一連の縮重塩基の生成をもたらしたが、領域Ａに対するこれらの変化の他に、アミノ酸４９３、４９４および４９６にまたがる領域Ｃにも突然変異が同時に導入された。ＤＮＡ断片のこの縮重プールを作成するのに使用される方法は、上述の反応条件を用い、第１の反応においてプライマーＸｂａ４０８−４１０（上述）および４９３−６Ｒｅｖ（５’  ＧＣＧＴＡＧＣＣＧＴＡＭＮＮＧＣＣＭＮＮＭＮＮＧＣＴＧＴＴＧＧＣＧＡＧＧＡＴＴＴＴＧＡＴＣＡＧＣＣＴＣ  配列番号３１；Ｍは、塩基ＡとＣの等モル混合物を表し、Ｎは、４種の塩基すべての等モル混合物を表す）による３元（３−ｗａｙ）ＰＣＲ反応を含んでいた。次いで、この反応の生成物を、上述の条件を用いるプライマーＸｂａ４０８−４１０およびＢａｍＨＩ  ３’（５’  ＧＣＧＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴＴＣＴＴＣＣＣＣＴＴＣＡＣＣ  配列番号３２）による第２のＰＣＲ反応におけるテンプレートＤＮＡとして使用した。この第２のＰＣＲからのＤＮＡ生成物を、制限酵素ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ベクターｐＳＶ１３中にクローニングした。
【０２０４】
修飾ヌクレオチドの取り込みのための突然変異ポリメラーゼのスクリーニング
使用したスクリーニング手順については、実施例１に記載する。一実験では、４．２×１０４個のコロニーのライブラリー（ＡおよびＣ領域が同時にランダム化された）から合計２５１個の陽性コロニーが確認され、第２の実験では、７×１０４個のコロニーのライブラリー（領域Ａのみがランダム化された）から２５５個の陽性コロニーが確認された。
【０２０５】
単離コロニーに対するポリメラーゼ活性のさらなるスクリーニング
フィルタースクリーン（ｆｉｌｔｅｒ  ｓｃｒｅｅｎ）からの数百の陽性コロニーのうちどれが高い取り込み活性を有するかを確認するため、我々は、関連する３’保護ヌクレオチド類似体のジゴキシゲニン標識体（ｆｆＴ−ＤＩＧ；実施例１に記載）のビオチン化オリゴヌクレオチドヘアピン基質への酵素的付加を測定するためのプレートをベースとしたアッセイを考案した。突然変異ポリメラーゼタンパク質を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーを、振盪しながら一夜増殖させ、この培養液を用い、カルベニシリンおよびクロラムフェニコールを含有するＬＢ  ０．８ｍＬに播種し、振盪しながら３７℃で３時間増殖させた。３時間後、１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加によってタンパク質発現を誘導し、培養液をさらに２．５時間増殖させた。遠心分離によって細胞をペレット化し、洗浄して、４ｍｇ／ｍｌリゾチームを含有する洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．９、５０ｍＭグルコース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）３０μｌに再懸濁し、室温で１５分間インキュベートした。次いで、１ｍＭフッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ；Ｓｉｇｍａ）および０．５％  ＮＰ−４０を含有する等容積の溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．９、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）の添加によって細胞を溶解し、７５℃で１時間インキュベートした後、細胞片をペレット化した。突然変異ポリメラーゼ酵素を含有する上清を４℃で保存した。
【０２０６】
取り込み反応は、以下の通り設定した。１０ｎＭビオチン化基質ＤＮＡを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８中のストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレート（Ｓｉｇｍａ）のウエルに添加した。ウエルを、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した後、緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、４ｍＭ  ＭｇＳＯ４）４０μＬ容積中の０．２μＭ  ｆｆＴ−ＤＩＧ、および組換え酵素を含有する細菌上清（上記）１０μＬを添加した。反応物を３０℃または６５℃で１５分間インキュベートし、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １０μＬの添加により停止させた。反応溶液を除去し、前のようにＰＢＳ−Ｔでウエルを洗浄した。取り込まれたＤＩＧの存在は、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗−ＤＩＧ抗体（Ｒｏｃｈｅ）および３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質（Ｓｉｇｍａ）を用いて検出した。
【０２０７】
一部の実験では、細菌上清から組換えタンパク質を精製し、組換えタンパク質の量を測定した。この場合、溶液中でＤＮＡ基質、酵素およびｆｆＴ−ＤＩＧを混ぜ、反応混合物のアリコート（５０μＬ）を０．５Ｍ  ＥＤＴＡ溶液１０μＬ中に希釈することによって異なった時間に反応を停止することにより、異なるポリメラーゼ酵素の取り込み反応の速度を比較することが可能であった。次いで、これらの異なるサンプルを、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレートのウエルに添加した。ＤＩＧ取り込みの量は、上記手順と同一の方法で測定した。
【０２０８】
タンパク質精製法
突然変異ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡは、製造者の使用説明書を用い、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ  Ｃｏｄｏｎ  Ｐｌｕｓコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に形質転換した。形質転換細菌の単一コロニーを用い、カルベニシリンおよびクロラムフェニコールを含有するＬＢブロスのフラスコに播種し、この培養液を、振盪しながら３７℃で一夜増殖させた。この培養液を用い、１：１００の希釈でカルベニシリンおよびクロラムフェニコールを含有するより大容積のＬＢブロスに播種し、この培養液を、６００ｎｍにおける吸光度が約０．４〜０．６となるまで、振盪しながら３７℃で増殖させた。１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加によってタンパク質発現を誘導し、培養液を３７℃でさらに２．５時間増殖させた。遠心分離によって細胞をペレット化し、ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。次いで、４ｍｇ／ｍｌリゾチームを含有する元の体積の１００分の１の洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．９、５０ｍＭグルコース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に細胞を再懸濁し、室温で１５分間インキュベートした。次いで、１ｍＭ  ＰＭＳＦおよび０．５％  ＮＰ−４０を含有する等容積の溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．９、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）の添加によって細胞を溶解し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、サンプルを７５℃で３０分間加熱し、４℃で３０分間、１８０００ｒｐｍで遠心分離し、変性タンパク質を除去した。洗浄緩衝液（上記）中でペレットを洗浄した後、サンプルを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣＬ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００中、３倍に希釈し、ＤＥＡＥ  ＦＦ  ＨｉＴｒａｐクロマトグラフィーカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にかけた。標的タンパク質はフロースルー分画中に存在し、１０ｍＭ  ＫＰＯ４、ｐＨ６．９、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００中の希釈後、Ｈｅｐａｒｉｎ  ＦＦカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いるクロマトグラフィーによってさらなる精製を行う。分画は、同じ緩衝液中、カラムから溶出し、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１に記載のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブリリアントブルー染色による染色により、標的タンパク質を含有する分画を確認した。
【０２０９】
突然変異ポリメラーゼの取り込み速度の分析
実施例１において一般的に記載したゲルをベースとしたアッセイを用い、突然変異ポリメラーゼを、３’保護ヌクレオチド類似体を取り込むそれらの能力について評価した。修飾ヌクレオチドの取り込み速度は、１ラウンドの取り込みと２ラウンドのヌクレオチド取り込みにより、精製された形態の関連ＤＮＡポリメラーゼと比較した。これらの実験に使用されたＤＮＡテンプレートは、市販の合成ビオチン化オリゴヌクレオチドであった。
【０２１０】
２サイクルの取り込みの方法は、ＤＮＡプライマー−テンプレートのストレプトアビジンでコーティングされたビーズ（Ｄｙｎａｌｂｅａｄｓ）との結合を含む。それらは、以下の通り調製される。
【０２１１】
上下のピペット操作により保存ポット中にビーズを再懸濁する
ビーズ２０μＬを取る
ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）２００μＬで３回洗浄する
Ｂ＆Ｗ緩衝液（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５；１Ｍ  ＮａＣｌ、０．５μＭ  ＥＤＴＡ）５０μＬ
２５μＬ  Ｈ２Ｏ
３２Ｐ標識ビオチンＤＮＡテンプレート（最終濃度１００ｎＭ）２５μＬを添加する
【０２１２】
プロトコルを通じ、ビーズを３〜５分毎に撹拌し、反応が進行していることを確認しなければならない。
【０２１３】
室温で１５分間インキュベートする
ビーズをＴＥ緩衝液２００μＬで３回洗浄する
ＴＥ１００μｌ中に再懸濁し、サンプル５μＬを取り出し、０．０５Ｍ  ＥＤＴＡと一緒にゲルローディング緩衝液（ホルムアミド：Ｈ２Ｏ  ４：１中の０．５％ブロモフェノールブルー０．５％キシレンシアノール；Ｓｉｇｍａ  Ｂ３２６９）５μＬを添加する
ＴＥ緩衝液を除去する
【０２１４】
酵素的取り込みの第１サイクルは、以下の通り、これらのビーズ上で行う。
【０２１５】
取り込みミックス１を、上記からのビーズペレットに添加する。
取り込みミックス１：
０．１ｍＭ  ３’修飾ヌクレオチド三リン酸  ２μＬ
５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０  １０μＬ
１％  Ｔｗｅｅｎ−２０  ５μＬ
１００ｍＭ  ＭｇＳＯ４  ４μＬ
５０μｇ／ｍｌ精製ポリメラーゼ
１００μＬの容積にするためのＨ２Ｏ
【０２１６】
反応物を４５℃で１５分間インキュベートする
サンプル５μＬを取り出し、ＥＤＴＡと一緒にゲルローディング緩衝液に添加する
第２のサンプル５μＬを取り出し、これに４種の天然ヌクレオチド三リン酸（Ｓｉｇｍａ）１μＬを添加し、４５℃でさらに１０分間インキュベートする。このサンプル５μＬに、ＥＤＴＡと一緒にゲルローディング緩衝液１μｌを添加する
【０２１７】
次いで、酵素処理の第１サイクルを、以下の通り、トリ（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）による処理によってデブロックする。
【０２１８】
ビーズをＴＥ緩衝液２００μＬで３回洗浄する
水に溶かしたＴＣＥＰ（１００ｍＭ）６５μＬを添加し、６５℃で１５分間インキュベートする
ビーズをＴＥ緩衝液２００μＬで３回洗浄する
ＴＥ緩衝液６５μＬを添加し、サンプル５μＬを取り出し、ＥＤＴＡと一緒にゲルローディング緩衝液に添加する
【０２１９】
ＴＥ緩衝液の除去後、酵素的取り込みの第２サイクルを、以下の通り、取り込みミックス２の添加によって行う。
【０２２０】
デブロックしたビーズ（上記）に、
０．１ｍＭ  ３’修飾ヌクレオチド類似体  １μＬ
５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０  ５μＬ
１％  Ｔｗｅｅｎ−２０  ２．５μＬ
１００ｍＭ  ＭｇＳＯ４  ２μＬ
５０μｇ／ｍｌ精製ＤＮＡポリメラーゼ
５０μＬの容積にするためのＨ２Ｏを添加する
【０２２１】
１／２、１、２、４、１０、３０、６０分にサンプル５μＬを取り、ＥＤＴＡと一緒にゲルローディング緩衝液に添加する。
【０２２２】
すべてのサンプルを９５℃まで１０分間加熱し、１２％アクリルアミドゲル上に３μｌをロードする（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１）
【０２２３】
結果
以下は、９°Ｎ  ＤＭに比べて、改善された活性を示すＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸４０８−４１０の配列である
ＹＳＴ
ＦＡＩ
ＦＡＰ
ＶＡＰ
ＡＡＡ
ＹＡＳ＆
ＹＡＶ＆
ＹＧＩ＆
ＹＳＧ＆
ＳＧＧ＃
ＣＳＴ
ＩＡＬ
ＣＧＧ
ＳＡＬ
ＳＡＡ
ＣＡＡ
ＹＡＡ
ＱＡＳ
ＶＳＳ
ＶＡＧ
ＶＡＶ
ＦＡＶ
ＡＧＩ
ＹＳＳ
ＡＡＴ
ＦＳＳ
ＶＡＬ
＃このポリメラーゼは、領域Ｃ中にＦ４９３Ｈ突然変異も含んでいた
＆このクローンは、領域ＡとＣの双方をランダム化したライブラリーから得られたが、領域Ｃのアミノ酸配列は、野生型と同一であった
【０２２４】
選択されたクローンの中の領域Ａ中の各位置におけるアミノ酸頻度
３つの位置の各々におけるアミノ酸の頻度は、以下の配列優先度を示唆している：
【０２２５】
４０８：芳香族アミノ酸、特にＹおよびＦの優先
脂肪族側鎖のあるアミノ酸、例えば、Ｉ、Ａ、Ｖの優先
システインおよびセリン（ＣおよびＳ）の優先
荷電アミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｄ、Ｅ）がないこと
プロリン（Ｐ）がないこと
グルタミン酸（Ｑ）の出現
【０２２６】
４０９：Ａの優先
小さな側鎖のあるアミノ酸（Ａ、Ｓ、Ｇ）の優先
荷電アミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｄ、Ｅ）がないこと
プロリン（Ｐ）がないこと
【０２２７】
４１０：小さな側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ａ、Ｇ）の優先
β分岐側鎖のあるアミノ酸（Ｉ、Ｔ、Ｖ、Ｌ）の優先
プロリン（Ｐ）の優先
【０２２８】
選択されたポリメラーゼ突然変異体の活性
４５℃、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、４ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．０５（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ、５０μｇ／ｍｌ酵素、および２μＭ  ３’修飾ヌクレオチドにおける酵素処理の第２サイクルでの５０％生成物変換までの時間（分）。取り込みの第１サイクルでの５０％生成物変換までの時間を括弧内に示す。他の突然変異体については、これらの実験において第１サイクルでの５０％生成物変換までの時間は測定しなかった。
残基４０８−４１０ 時間
ＶＡＬ（ＥＤポリメラーゼ）      ５．２分（１６秒）
ＹＡＳ                          １．５分
ＹＡＶ                          １．２分（５秒）
ＦＡＰ                          ５．５分
ＦＡＩ                          ２．２分
ＹＳＴ                          ２．１分
ＣＳＴ                          １９．５分
ＡＡＡ                          ６．９分
ＣＡＡ                          １５分
ＶＡＰ                          ５．９分
９°Ｎ  ＤＭ  第１または第２サイクルにおいてこれらの条件下で生成物変換はなし
【０２２９】
実施例３−様々な３’保護ヌクレオチドの取り込み
前の実施例に記載の修飾ポリメラーゼが、糖の３’位において大きな修飾を有する様々なヌクレオチド類似体を取り込む能力を有するか否かを判定するため、３種の異なるウラシルヌクレオチド類似体（３’Ｏ−アリル、３’Ｓ−メチル、および３’Ｏ−アジドメチル）を、２種の異なる修飾ヌクレオチド（９°Ｎ  ＥＤ変異ポリメラーゼ、および９°Ｎ  ＹＡＶ変異ポリメラーゼ）によって取り込まれるそれらの能力について、対照ポリメラーゼ（９°Ｎ  ＤＭ）と比較して試験した。ヌクレオチド取り込みの単一サイクルは、下述の「単回取り込み」法を用いて異なる時間間隔で行った。取り込み反応の結果（図３）は、糖に異なる３’修飾を有するヌクレオチド類似体がすべて、異なるＤＮＡポリメラーゼによって効率的に取り込まれることを明らかに示している。
【０２３０】
方法
単回取り込み
１．きれいな反応チューブの中で、以下の成分、すなわち
１００ｎＭ  ３２Ｐ標識二本鎖ＤＮＡ基質
５０μｇ／ｍｌ単離ＤＮＡポリメラーゼ
５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８
０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０
４７μＬまでの水
を混ぜる
２．混合物を４５℃でインキュベートする
３．２からの反応混合物に、総反応容積が５０μｌになるように４ｍＭ  ＭｇＳＯ４および２μＭ  ３’修飾ヌクレオチドを添加する
４．様々な時間間隔で反応チューブからアリコート５μＬを取り出し、ゲルローディング緩衝液（実施例２に記載）５μＬと混ぜる
５．サンプルを加熱し、実施例２に記載のようにアクリルアミドゲル上にロードする。
【０２３１】
実施例４−四種の塩基すべておよび様々な蛍光リポーター基に関する３’保護ヌクレオチドの取り込み
前の実施例に記載のＤＮＡポリメラーゼがＡ、Ｇ、ＣおよびＴ塩基の３’修飾ヌクレオチド誘導体を取り込み、かつ様々な蛍光リポーター基によってさらに修飾されたヌクレオチド誘導体も取り込むことができるかどうかを判定するため、以下の３’Ｏ−アジドメチルヌクレオチド誘導体について、単回取り込み反応（実施例３に記載）を行った。
【０２３２】
【表４】
2007504817.tif 000007
【０２３３】
いずれの場合にも、９°Ｎ  ＥＤポリメラーゼ変異体は、４５℃で３分以内にヌクレオチドの２μＭ濃度において９０％を超える基質変換能力を有していた。
【０２３４】
実施例５−領域Ａ中に単一突然変異を有するＤＮＡポリメラーゼの活性
領域Ａ中の単一突然変異が、対照ポリメラーゼより改善された活性を付与することができるかどうかを判定するため、点突然変異を９°Ｎ  ＤＭポリメラーゼに導入し、コドン４０９をアラニン（９°Ｎ  ＤＭ  Ｖ４０９Ａ）またはグリシン（９°Ｎ  ＤＭ  Ｖ４０９Ｇ）に変えた。突然変異は、テンプレートとしての９°Ｎ  ＤＭ  ＤＮＡ、ならびに変異プライマー対として、９°Ｎ  ＤＭ  Ｖ４０９Ａ突然変異についてはＶ４０９Ａ  ５’  ＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＧＧＣＧＣＣＡＧＣＧＡＧＣＧＧＡＡＧ  ３’（配列番号３３）およびＶ４０９Ａ逆５’  ＣＴＴＣＣＧＣＴＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＧＴＣＡＡＴＣＡＴＣ  ３’（配列番号３４）を、９°Ｎ  ＤＭ  Ｖ４０９Ｇ突然変異については９ＤＭ  ４０９Ｇ  ５’  ＧＡＴＧＡＴＴＧＡＡＧＧＧＣＣＣＡＧＣＧＡＧＣＧＧＡＡＧ  ３’（配列番号３５）および９ＤＭ  ４０９Ｇ逆５’  ＣＴＴＣＣＧＣＴＣＧＣＴＧＧＧＣＣＣＴＴＣＡＡＴＣＡＴＣ  ３’（配列番号３６）を用い、製造者の使用説明書に従ってＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ  ＸＬ部位方向特異的突然変異誘発手順（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて９°Ｎ  ＤＭ遺伝子中に導入した。陽性クローンをＤＮＡ配列決定によって検証し、実施例２に記載のプロトコルを用いて、各ポリメラーゼの精製調製物を調製した。異なるポリメラーゼの活性を判定するため、実施例２に記載の３’Ｏ−アジドメチル修飾ヌクレオチドを用いて２サイクルの取り込みを行った。データは、９°Ｎ  ＤＭ  Ｖ４０９Ａと９°Ｎ  ＤＭ  Ｖ４０９Ｇポリメラーゼが共に、糖に大きな３’修飾を有するヌクレオチドを用いる場合、９°Ｎ  ＤＭ対照ポリメラーゼよりも大幅に３’修飾ヌクレオチドを取り込むことができることを示している（図４）。
【０２３５】
実施例６
３０℃における修飾ＤＮＡポリメラーゼによる３’保護ヌクレオチド類似体の取り込み
異なる温度における３’保護ヌクレオチド類似体の取り込みを測定するため、マイクロタイターをベースとした取り込みアッセイ（実施例２に記載）の修正版を開発した。このアッセイでは、１０ｎＭ濃度のビオチン化ＤＮＡ基質と５０ｎＭ濃度の精製ポリメラーゼ酵素の混合物を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０および１０ｍＭ  ＫＣｌを含む緩衝液中で混ぜた。別の反応チューブでは、第１の混合物について記載した緩衝液と同一の緩衝液中で、０．２μＭ  ｆｆＴ−ＤＩＧ（実施例２に記載）と４ｍＭ  ＭｇＳＯ４の混合物を作成した。チューブ１中の混合物が４０μＬを占め、チューブ２が１０μＬを占めるように反応容積を調整した。実験に必要な時点の数に応じて、反応容積を適切に増やした。すべてのチューブを適切な温度で予熱し、チューブ２の内容物をチューブ１に添加して取り込み反応を開始させた。様々な時間間隔で、混ぜ合わせた反応混合物５０μＬを取り出し、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ（最終濃度）の添加によって取り込み反応を終了させた。次いで、停止した反応混合物の様々なアリコートを、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレートの別々のウエルに添加し、ｆｆＴ−ＤＩＧ取り込みの程度を実施例２に記載のように評価した。
【０２３６】
３０℃における９°Ｎ  ＤＭ  ＥＤおよび２Ｅポリメラーゼ変異体によるｆｆＴ−ＤＩＧヌクレオチド類似体の取り込みの結果を、９°Ｎ  ＤＭ対照ポリメラーゼの活性の比較と一緒に図５に示す。
【０２３７】
実施例７
修飾ＤＮＡポリメラーゼによる様々な濃度の３’修飾ヌクレオチドの取り込み
ヌクレオチド濃度のどのような範囲にわたって、修飾ＤＮＡポリメラーゼが３’修飾ヌクレオチド類似体を効率的に取り込むことができるのかを判定するため、実施例２に記載のように２サイクルの取り込み実験を行った。３’Ｏ−アジドメチル修飾ヌクレオチド（実施例２に記載）についての取り込み速度を、ｆｆＴ０．２μＭから５０μＭまでのヌクレオチド濃度の範囲にわたって測定した。９°Ｎ  ＹＡＶ変異ポリメラーゼ（ｅｘｏ−）についての結果を図６に示す。これらのデータは、本明細書に記載の修飾ポリメラーゼが、酵素的取り込みの第２サイクルで、広範囲なヌクレオチド濃度にわたって３’修飾ヌクレオチドを取り込むことができることを示している。実際、これらのデータは、これらの修飾ポリメラーゼが、５０μＭ以上、および０．２μＭ以下の濃度で３’保護ヌクレオチドを取り込むことができるであろうことも示唆している。さらに、実施例３に記載の単一サイクル実験を用いることにより、３’修飾ヌクレオチド類似体について、酵素的取り込みの第１サイクルにおけるヌクレオチド取り込みの速度を測定することが可能であった。これらの条件下で、４５℃において、９°Ｎ  ＹＡＶポリメラーゼ変異体について５０ｎＭという低い濃度で３’保護ヌクレオチドの取り込みを測定することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０２３８】
【図１】９ＤＭ対照９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼに対して、修飾ヌクレオチドを取り込む変異９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのライブラリーの能力を比較している。相対的な速度の増加は、試験された変異９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼの各々について示されている。
【図２】４５℃、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、４ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．０５（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ、５０μｇ／ｍｌ酵素および２μＭ  ３’修飾ヌクレオチドにおける酵素処理の酵素の第１サイクルで様々なポリメラーゼについての活性（％生成物変換対時間（分））を図示している。
【図３】３種の異なるウラシルヌクレオチド類似体（３’Ｏ−アリル、３’Ｓ−メチルおよび３’Ｏ−アジドメチル）を用いるヌクレオチド取り込みの単一サイクルで、対照９°Ｎ  ＤＭポリメラーゼと比べた９°Ｎ  ＥＤ突然変異ポリメラーゼおよび９°Ｎ  ＹＡＶ突然変異ポリメラーゼの活性（％生成物変換対時間（分））を図示している。
【図４】Ｏ−アジドメチル修飾ヌクレオチドの取り込みの２サイクルで、対照９°Ｎ  ＤＭポリメラーゼと比べた突然変異ポリメラーゼ９°Ｎ  ＤＭ  Ｖ４０９Ａおよび９°Ｎ  ＤＭ  Ｖ４０９Ｇの活性（％生成物変換対時間（分））を図示している。
【図５】３０℃における様々なポリメラーゼの活性（％生成物変換対時間（分））を図示している。
【図６】様々な異なる基質濃度におけるモチーフＡ領域中にアミノ酸配列ＹＡＶを有する９°Ｎ  （ｅｘｏ−）突然変異ポリメラーゼによる３’保護ヌクレオチドの取り込み（％取り込み対時間（分））を図示している。
【図１】
2007504817.tif 000010
【図２】
2007504817.tif 000011
【図３】
2007504817.tif 000012
【図４】
2007504817.tif 000013
【図５】
2007504817.tif 000014
【図６】
2007504817.tif 000015
【配列表】
2007504817000001.app
【国際調査報告】
2007504817.tif 000016
2007504817.tif 000017
2007504817.tif 000018
2007504817.tif 000019