(57)【要約】  本発明は、複数の異なる結合曲線を含み、その各々が検体とリガンドの相互作用の経時的な進行を示す１組のデータ・セットから、溶液中の１つの検体と固定化したリガンドとの相互作用に関する少なくとも１つの速度パラメータを決定するためのコンピュータを使った方法であって、以下のステップ：ａ）予め定めた相互作用の動態モデルに対して、全データ・セット又はそのサブセットの中の少なくとも１つの適合を行い；ｂ）ステップａ）で行った適合の結果に基づき、許容できない品質の結合曲線を識別し、排除し；ｃ）残りのデータ・セットに対して最終適合を行い；そしてｄ）その結果から、速度パラメータ又はパラメータ群を得る；を含む方法に関する。本発明は、又、本方法を実施するための分析システム、並びに、コンピュータ・プログラム、コンピュータ・プログラム製品及び本方法を実行するためのコンピュータ・システムにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の異なる結合曲線を含み、その各々が検体とリガンドの相互作用の経時的な進行を示す１組のデータ・セットから、溶液中の１つの検体と固定化したリガンドとの相互作用に関する少なくとも１つの速度パラメータを決定するためのコンピュータを使った方法であって、以下のステップ：
ａ）予め定めた相互作用の動態モデルに対して、全データ・セット又はそのサブセットの少なくとも１つの適合を行い；
ｂ）ステップａ）で行った適合の結果に基づき、許容できない品質の結合曲線を識別、排除し；
ｃ）残りのデータ・セットに対して最終適合を行い；そして
ｄ）その結果から、速度パラメータ又はパラメータ群を得る；
を含む方法。
【請求項２】
請求項１のステップｃ）の残りのデータ・セットが、ステップａ）で適合が行われたデータ・セットと同じである場合は、ステップｃ）は省略され、請求項１のステップｄ）が請求項１のステップａ）の結果に適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１のステップａ）において全データ・セットに対して適合が行われ、そして請求項１のステップｂ）で結合曲線が排除されない、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１のステップａ）において全データ・セットのサブセットに対して適合が行われ、そして請求項１のステップｂ）において結合曲線の排除が行われた後の、残りのデータ・サブセットが、請求項１のステップａ）で適合が行われたデータ・サブセットと同じである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
１群のデータ・セットが処理され、そして各データ・セットに対して少なくとも１つの速度パラメータが決定される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１のステップｄ）が、少なくとも１つの品質パラメータに関して選別した、最終適合の結果を提示することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
品質パラメータが適合の良好さを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１のステップｂ）における結合曲線の排除が、少なくとも部分的に、残差分析に基づく、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１のステップｂ）における結合曲線の排除が、少なくとも部分的に、交差確認に基づく、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
許容できない品質の結合曲線が、残差分析によって確認される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの適合を全データ・セットに対して行い、各結合曲線に関する適合の品質を残差分析によって決め、許容できない品質の結合曲線を確認する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
データ・セットを複数のサブセットに分割し、各サブセットについて動態モデルに対する個別の適合を行い、違うサブセットの適合を互いに比較し、データ・セットが許容できない品質の結合曲線を含むかを決める、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１のステップａ）及びｂ）が、請求項１のステップｃ）に進む前に少なくとも一回繰り返される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１のステップａ）に先立ち、少なくとも１つの予め定めた曲線品質基準を満たさない結合曲線を排除するための品質管理を行う、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１のステップａ）における動態モデルが、物質移動と１対１の結合を示す微分方程式又は微分方程式のシステムである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
決定する少なくとも１つの速度パラメータが、会合速度定数及び解離速度定数から選択される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
各データ・セットに含まれる複数の結合曲線には、異なる検体濃度を示す結合曲線が含まれる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
各データ・セットの検体−リガンド相互作用がバイオセンサーによって測定される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
バイオセンサーが、エバネセント波センシング、特に表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づくものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
（ｉ）少なくとも１つの検出表面、少なくとも１つの検出表面において分子間相互作用を検出する検出手段、及び個々の相互作用の経時的進行を示す結合曲線を表わす検出データを作る手段を含むセンサー装置、及び（ii）請求項１〜１９のいずれか１項に記載した請求項１のステップａ）からｄ）を実施するためのデータ処理手段を含む、分子結合の相互作用を検出する分析システム。
【請求項２１】
プログラムがコンピュータ上で実行されるときに、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の速度パラメータを決定するためのプログラム・コード手段を含む、コンピュータ・プログラム。
【請求項２２】
プログラムがコンピュータ上で実行されるときに、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の速度パラメータを決定するための、コンピュータによって読み取り可能な媒体に保存された、又は電気或いは光シグナルで伝達されるプログラム・コード手段を含む、コンピュータ・プログラム製品。
【請求項２３】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載された、速度パラメータ決定を実行するためのプログラムを搭載したコンピュータ・システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出表面における分子結合の相互作用の分析方法、より詳細には、得られる分子間相互作用を示すデータから速度パラメータを決定する、少なくとも部分的に自動化した方法に関する。本発明は、自動化した動力学的評価の手段を含む分析システムに加えて、本方法を実行するためのコンピュータ・プログラム、方法を実行するためのプログラム・コード手段を含むコンピュータ・プログラム製品及びプログラムを搭載したコンピュータ・システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子等の分子間相互作用をリアルタイムに観察できる分析センサー・システムに対して、関心が高まりつつある。それらのシステムは、しばしば、光学バイオセンサー（生体内感知装置）に基づいており、通常、相互作用分析センサー又は生体特異的相互作用分析センサーと呼ばれる。このようなバイオセンサーの代表は、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ社（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）が販売しているＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）装置であり、この装置には、サンプル中の分子と検出表面に固定化した分子構造における分子間の相互作用を検出するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が使われている。サンプルがセンサー表面を通過するため、結合の進行は、相互作用が起こる時点での速度を、直接的に反映する。サンプル注入の次にバッファーが流され、その間の検出器の反応は、表面上の複合体が解離する速度を反映する。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムからの代表的な出力は、経時的な分子間相互作用の進行を示すグラフ又は曲線である。通常コンピュータ画面に表示されるこの結合曲線は、しばしば「センサグラム」と呼ばれる。
【０００３】
従って、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システム（及び類似のセンサー・システム）を用いると、標識化技術を使うことなく、そしてしばしば関与する物質を精製することなく、サンプル中の特定の分子の存在及び濃度のみならず、分子間相互作用における結合及び解離の運動速度定数を含めた付加的な相互作用のパラメータをも、リアルタイムで測定することができる。会合及び解離の速度定数は、出て来た運動データを、微分方程式の形で表した相互作用モデルの数学的表現に適合させることによって、得ることができる。その様な動態解析は、通常は専用ソフトウェアによって支援されるが、対話式の曲線適合工程の間、とりわけ同定する工程、及び、例えばサンプル中に粒子が存在する等のアッセイに関係する失敗等により、不適合になる曲線を排除する工程では、オペレーターの介入が必要である。例えば、液体の流れの中の気泡によって起こる空気スパイク等の、機器に関連した欠陥に起因した許容できない品質の結合曲線は、通常は動態解析の前に実施される曲線品質管理により廃棄される。
【０００４】
増加の一途をたどる分析における処理能力及び情報密度を供えたシステムを指向する最近の傾向は、オペレーターに増々重い負担を課している。オペレーターの仕事量をある程度軽減させるために、自動化した曲線の品質管理法を、本発明者等の国際特許出願第ＰＣＴ／ＳＥ２００３／０００５００号（ＷＯ公報第０３／０８１２４５号）に開示した。しかし、バイオセンサー・システムで得られる分子間相互作用のデータ、特にセンサグラムのように、大きな一連の相互作用データが作り出される場合には、動力学的評価を容易にする方法が必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、リアルタイムのバイオセンサー・データのような、分子間相互作用データの動力学的評価を改善することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
従って、１つの側面において、本発明は、複数の異なる結合曲線を含み、その各々が検体とリガンドの相互作用の経時的な進行を示す１組のデータ・セットから、溶液中の１つの検体と固定化したリガンドとの相互作用に関する少なくとも１つの速度パラメータを決定するためのコンピュータを使った方法であって、以下のステップ：
ａ）予め定めた相互作用の動態モデルに対して、全データ・セット又はそのサブセットの少なくとも１つの適合を行い；
ｂ）ステップａ）で行った適合の結果に基づき、許容できない品質の結合曲線を識別し、排除し；
ｃ）残りのデータ・セットに対して最終適合を行い；そして
ｄ）その結果から、速度パラメータ又はパラメータ群を得る；
を含む方法を提供する。
【０００７】
場合によって、許容できない品質の結合曲線が確認されなくなるまで、ステップａ）及びｂ）を繰り返してもよい。
【０００８】
もし、ステップｂ）の後の残りのデータ・セットが、ステップａ）で適合が行われたデータ・セット（全データ・セット又はデータのサブセット）と同じであるなら、ステップｃ）は省略でき、速度パラメータ（群）はステップａ）における適合から得ることができる（結合曲線の排除がない場合、ステップｃ）の「残りの」データ・セットは、勿論、ステップａ）の全データ・セットと同じである）。
【０００９】
本明細書で使う用語「検体」及び「リガンド」は、広義に解釈される。基本的に、リガンドとは、特定の検体に対して既知又は未知の親和性を有するものを意味する。リガンドは、天然物又は合成されたものであってもよい。リガンドは、通常は生体分子である。
【００１０】
一般的な検体には、生体分子（タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ等）、生物材料の抽出物（例えば、植物抽出物）から精製した化学物質、合成化学物質（低分子物質を含む）、細胞及びウイルスが含まれる。
【００１１】
もう１つの側面において、本発明は、上記の方法を実施するためのデータ処理手段を含む、分子間相互作用研究のための分析システムを提供する。
【００１２】
更にもう１つの側面において、本発明は、上記方法を実施するためのプログラム・コード手段を含むコンピュータ・プログラムを提供する。
【００１３】
更にもう１つの側面において、本発明は、コンピュータによって読み取り可能な媒体に保存された、又は電気或いは光シグナルで伝達されるプログラム・コード手段を含む、上記方法を実施するためのコンピュータ・プログラム製品を提供する。
【００１４】
更にもう１つの側面において、本発明は、上記方法を実施するための、プログラム・コード手段を含むコンピュータ・プログラムを搭載した、コンピュータ・システムを提供する。
【００１５】
本発明のこれらの側面及び他の側面は、添付の図面及び以下の詳細な説明を参照することにより、明確になるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
他に定義しない限り、本明細書に使用する全ての技術的及び科学的な用語は、本発明に関連する当業者が共通に理解するものと同じ意味を有する。又、単数形の［ａ］、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、特に断らない限り複数の場合が含まれることを意味する。
【００１７】
上記のように、本発明は、分子間相互作用を調査し、結果を、相互作用の進行と共に、しばしばセンサグラムと呼ばれる検出曲線の形でリアルタイムに提示する分析的センサー法、特にバイオセンサーに基づく方法に関する。
【００１８】
バイオセンサーは、一般に、例えば固定層の質量、屈折率又は厚さの変化等を検出する標識なしの技術に基づくが、ある種の標識に依存するセンサーもある。典型的なセンサー検出技術として、光学的、熱光学的及び圧電性の又は音波法（例えば、表面弾性波（ＳＡＷ）及び水晶振動微量天秤（ＱＣＭ）法を含む）等の質量検出法及び電位差測定、電気伝導率測定、電流測定並びに静電容量／電気抵抗法等の電気化学的方法が挙げられるが、これに限定されない。光学的な検出法に関して、代表的な方法には、内部反射及び外部反射の両者を含む、反射光学的方法のような表面質量濃度、角度、波長、偏光又は位相分解を検出する方法、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を経由してエバネセント場を増強することができる、エバネセント波偏光分析法及びエバネセント波分光分析法（ＥＷＳ、又はＩｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、Ｂｒｅｗｓｔｅｒ角度屈折計法、臨界角屈折計法、漏れ全反射（ＦＴＲ）、内部散乱全反射（ＳＴＩＲ）、散乱を増強する標識、導光板センサー、外部反射画像表示、エバネセント波を基にした映像法、例えば、臨界角分解映像法、Ｂｒｅｗｓｔｅｒ角度分解映像法、ＳＰＲ角度分解映像法等が挙げられる。更に、導波路干渉計、導波路リーキングモード分光計、反射干渉分光計（ＲＩｆＳ）、透過干渉測定、ホログラフィック分光法及び原子間力顕微鏡（ＡＦＲ）に加えて、測光及び画像顕微法、それ自体又は反射法との組み合わせ、例えば表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）、表面増強共鳴ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ）、エバネセント波蛍光発光法（ＴＩＲＦ）及びリン光発光法を挙げることができる。
【００１９】
市販のバイオセンサーとして、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ社（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）から販売されているＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システム機器があり、それは表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づいて、固定されたリガンドと対象とする検体間の表面結合相互作用を、リアルタイムにモニターすることを可能にする。
【００２０】
ＳＰＲの現象はよく知られており、あえて言えば、ＳＰＲは、異なる屈折率を有する２つの媒体間の、通常は銀又は金等の金属フィルムでコーティングされたインターフェース（接合部）内で、或る条件の下で光が反射したときに発生する。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）機器では、媒体はサンプル及びミクロ流路系によってサンプルと接触するガラスのセンサーチップである。金属フィルムはチップ表面上の金の薄層である。ＳＰＲは、ある特定の反射角度のときに反射光の強度を減衰させる。この最小反射光強度の角度は、反射光の反対側の表面、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムではサンプル側に近い屈折率によって異なる。
【００２１】
ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムの略図を、図１に示す。センサーチップ１には、例えば抗体等の捕捉分子３を固定する金フィルム２が付いており、そこで流路５を通った検体４（例えば抗原）を含むサンプル流に接触する。光源７（ＬＥＤ）からの単色ｐ−偏光６は、プリズム８でガラス／金属インターフェース９に連結され、そこで光は全反射する。反射光線１０の強度は、光検出ユニット（光検知器アレー）１１で検出される。
【００２２】
ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）機器の技術的側面及びＳＰＲの現象の詳細な論議は、米国特許第５,３１３,２６４号に記載されている。バイオセンサーの検出表面の基盤コーティングに関するより詳細な情報は、例えば米国特許第５,２４２,８２８号及び第５,４３６,１６１号に記載されている。更に、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）機器に接続して使われる、バイオセンサーチップに関する技術の詳細な議論は、米国特許第５,４９２,８４０号に記載されている。上記の米国特許で開示された全ては、参照することにより本明細書の一部にに組み込まれている。
【００２３】
サンプル内の分子がセンサーチップ表面上の捕捉分子と結合すると、濃度が変わり、その結果表面における屈折率が変化し、ＳＰＲ反応が検出される。相互作用の過程の応答を時間に対してプロットすると、相互作用の進行を定量的に測定することができる。このプロットは、通常、センサグラムと呼ばれる。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムでは、ＳＰＲ応答値は、共鳴単位（ＲＵ）で表示される。１ＲＵは、最小反射光で強度の角度において０.０００１度の変化を表し、それは、殆んどのタンパク質及び他の生体分子の場合、センサー表面で約１ｐｇ／ｍｍ2の濃度変化に相当する。検体を含むサンプルがセンサー表面に接触すると、「会合」と呼ばれる段階に入り、センサー表面に固定されたリガンドが検体と相互作用する。この段階は、初めてサンプルをセンサー表面に接触させるため、センサグラム上にはＲＵの上昇として表示される。逆に、「解離」は通常、サンプル流を例えばバッファー流に切り替えた場合に起こる。この段階は、表面に固定されたリガンドから検体が解離するため、センサグラム上にはＲＵの経時的な下降として表示される。
【００２４】
センサーチップ表面の可逆的な相互作用の代表的なセンサグラム（結合曲線）を、固定化した捕捉分子、例えば抗体、を有する検出表面をサンプル中の検体と相互作用させて、図２に示した。Ｙ軸は応答量（ここでは共鳴単位、ＲＵ）を示し、Ｘ軸は時間（ここでは秒）を示す。最初に、検出表面にバッファーを通過させて、センサグラムに反応ベースラインＡを描かせる。サンプル注入の間、検体の結合によるシグナルの上昇が観察される。この部分Ｂの結合曲線は、通常「会合相」と呼ばれる。最終的に、定常状態になると、共鳴シグナルはＣで水平状態になる。サンプル注入の最後に、サンプルは連続した流れのバッファーに切り替えられ、その後のシグナルの減衰は表面からの検体の解離、即ち検体の放出を示す。結合曲線のこの部分Ｄは、通常、「解離相」と呼ばれる。分析は、通常、結合した検体を表面から除去でき、しかも（理想的には）リガンドの活性が保持できる溶液をセンサー表面に注入する、再生の段階（図２には表示していない）で終了する。バッファーの注入でベースラインＡが回復し、センサー表面は新たな分析の準備が整う。
【００２５】
以下により詳しく説明するように、それぞれＢ及びＤに対応する会合相及び解離相のグラフは、相互作用の速度に関する有益な情報を提供し、そして共鳴シグナルの高さは表面の濃度を示す（即ち、相互作用から生じる応答は、表面の質量濃度の変化に関係する）。
【００２６】
上述の他の検出原理に基づくバイオセンサー・システムで作られた検出曲線、即ちセンサグラムは、類似した外見になる。
【００２７】
検体Ａと表面結合（固定）捕捉分子、即ちリガンドＢの間の可逆的反応（拡散又は物質移動に限定しない）（一次反応）を仮定する。
【数１】
2007506967.tif 000002
このモデル（通常、Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルと呼ばれる）は、検体（Ａ）が一価で且つ均一系である、リガンド（Ｂ）は均一系である、そして全ての結合事象は独立していると仮定しており、現実に、大多数の事例に適用できる。
【００２８】
検体注入時の、Ａの表面濃度変化の速度は：
【数２】
2007506967.tif 000003
で表わされ、ここで、Γは結合した検体の濃度、Γmaxは表面の最大結合容量、ｋassは会合速度定数、ｋdissは解離速度定数、Ｃはバルク検体の濃度である。この方程式を書き換えると以下の式：
【数３】
2007506967.tif 000004
になる。全ての濃度を同じ単位で測定すると、等式は以下の式：
【数４】
2007506967.tif 000005
になる。ここで、ＲはＲＵで表した応答である。統合した形にすると、方程式は以下の式：
【数５】
2007506967.tif 000006
になる。
【００２９】
方程式（３）に従い、ｄＲ／ｄｔを結合した検体濃度Ｒに対してプロットすると、傾きはｋassＣ＋ｋdissであり、縦軸の切片はｋassＲmaxＣとなる。もし、バルク濃度Ｃが解っていて、Ｒmaxが（例えば、表面を大過剰の検体で飽和にして）決められていれば、会合速度定数ｋass及び解離速度定数ｋdissは計算できる。しかし、より都合のよい方法は、統合した関数（４）の適合、即ち数値計算及び微分方程式（３）の適合であり、好ましくは、そのために以下に述べるようにコンピュータ・プログラムを使うことである。
【００３０】
解離速度は以下：
【数６】
2007506967.tif 000007
のように表すことができる。統合した形は以下の式：
【数７】
2007506967.tif 000008
のようになり、ここで、Ｒ0は解離相が始まる時の応答である。
【００３１】
代わりに、方程式（６）は線形化することができ：
【数８】
2007506967.tif 000009
そして、ｔに対するｌｎ［Ｒ／Ｒ0］のプロットは、−ｋdissの傾斜の直線になる。
親和性は、会合定数ＫA＝ｋass／ｋdiss、又は解離定数ＫD＝ｋdiss／ｋassで表される。
【００３２】
ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）機器によって作られた運動データの分析は、通常は、微分速度方程式を計算するための数値積分、及び速度パラメータを適合させるための非線形回帰式を使う専用のＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ社、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ製）を使って行われる。基本的に、この様なソフトウェア支援のデータ分析は、以下のようにして行われる。バックグラウンド・ノイズを差し引いた後の測定データに対して、上記の式（４）及び（６）で表されたＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルの、上記の単純１：１の適合を試みる。通常は、結合モデルは、異なる検体濃度Ｃ（又は異なるレベルの表面誘導体化、Ｒmax）で得られた多数の結合曲線にも、同時に適合する。センサグラムのデータを基に、この様な「包括的」な適合で、単一の包括的ｋass又はｋdissが全てのデータに対してよく適合するか否かを立証する。完了した適合の結果は、オリジナルのセンサグラム曲線に適合させた曲線をオーバーレイして表示したグラフとして、オペレーターに提示される。又、適合の近似は、標準的な統計的尺度のカイ二乗（χ2）値で示される。良好な適合では、カイ二乗値はノイズのＲＵ2と同じ強さである。場合によって、実験データが適合する曲線からどれだけ乖離するかをグラフにし、各曲線について実験データと適合データの違いを示す、「残差プロット」が提示される。そこでオペレーターは、適合が十分によいかどうかを判定する。もしよくなければ、最も適合品質の悪いセンサグラムを除外して、減らしたセンサグラムのセットで、適合の手順を再度行う。満足な適合が得られるまで、この手順を繰り返す。
【００３３】
時により、上記の１：１結合反応モデルは無効になり、１つ又はそれ以上の他の反応モデルを使って再分析するデータ・セットが必要になる。そのような代替モデルとして、例えば、物質移動の影響を受ける１対１の反応、２つの平行した独立の１対１の反応、２つの競合する反応及び二状態反応が挙げられる。平行反応は、固定化したリガンドが異成分から成る場合に起こり、その結果不均質な検体が競合反応を起こす。二状態反応とは、リガンドと検体の複合体が、徐々に、より安定になる構造変化を指す。これらの代替反応モデルを示す微分速度方程式に関しては、例えば、「Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．、ａｎｄＦaｌｔ、Ａ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００（１９９７）１２１−１３３」を参照することができる（この開示内容は、参照することにより本明細書の一部に組み込まれる）。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムに関する曲線適合の理解し易い解説については、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアー・ハンドブック（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ社、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を参照することができる（その開示内容は、参照することにより本明細書の一部に組み込まれる）。
【００３４】
上記のコンピュータ支援の適合方法が、例えば、約１００個のセンサグラム又は５個の検体−リガンド相互作用等、中程度の数のセンサグラム又は個別の検体−リガンド相互作用を対象にするオペレーターにとって非常に管理し易いのに対して、多数のセンサグラム、例えば１０００個のセンサグラム又は５０個の検体−リガンド相互作用について速度定数を決定することは、極めて退屈で時間の掛かる仕事になるであろうということは直ちに理解できる。従って、最近の動向が、比較的短時間に大量のセンサグラムセットを作り出すことができる、高処理能力のバイオセンサー・システムに向かっていることを考慮すると、結合データ評価工程の更なる自動化が必要になる。本発明に従えば、オペレーターの仕事を実質的に手助けし、多数のセンサグラムの動力学的評価が短時間で可能になる、動態解析方法が提供される。
【００３５】
基本的に、本発明の方法は、自動化した曲線の適合及び評価の方法を提供するものであり、それは途中のオペレーターによる判定なしに、不適切なセンサグラムを排除し、少なくなったデータ・セットで適合の行程を繰り返し、そして計算した速度定数を、好ましくは適合度の情報を添えてオペレーターに提示する。１セットの結合曲線データ、例えば種々の濃度の異なる検体と固定化したリガンドの間の相互作用に対して、上記方法は以下のステップ：
ａ）データ・セットの全部又は一部について少なくとも１つの適合を行い；
ｂ）ステップａ）の結果から、データ・セット内の許容できない結合曲線を識別して排除し；
ｃ）データ・セットの残りの結合曲線について最終適合を行い；そして
ｄ）結果を提示する。
を含む。
ステップａ）及びｂ）は、許容できない結合曲線が識別されなくなるまで繰り返してもよい。
【００３６】
もしも、２つ以上のデータ・セットが同時に処理された場合、ステップｃ）の結果は、好ましくは品質順に提示される。
【００３７】
場合によって、ステップａ）で実施した適合又は実施した適合の１つが許容できる場合、勿論、最終適合は必要ないと考えてよい。これは、例えば、データ・セット全部について適合を行い、結合曲線が一つも除外されないで結果が許容できる場合、又は結合曲線は除外されているが、残りのデータ・セットが、既にステップａ）で適合が行われたデータサブセットと同じである場合である。
【００３８】
本明細書に使われる用語「結合曲線」は、広義に解釈されることに注意する必要がある。従って、図２は、一定の濃度の検体と固定化されたリガンドの、一時的な相互作用をモニタリングした場合に得た応答曲線を示しているが、「結合曲線」は、応答曲線全体だけでなく、例えば会合部分（又はその一部）又は解離部分（又はその一部）のような、その一部分だけをいうこともできる。又、例えば、米国特許出願第２００３／０１４３５６５Ａ１号に記載された段階的滴定方法のような、速度パラメータを決定するための滴定形式の分析法、及び本発明者等の国際特許出願第ＰＣＴ／ＳＥ２００４／０００８７３号に記載した「逐次的反応速度の方法論」（この開示内容は、参照することにより本明細書の一部に組み込まれている）においては、リガンドを固定する表面に、異なる検体溶液、例えば段階的に濃度を変えた検体溶液を、固定化したリガンドを途中で再生又は更新することなしに、逐次的に接触させる。この場合、実験全体の応答曲線は、連続した複数の「結合曲線」から成るといえ、１つの検体溶液（例えば、検体濃度）に対して１つが対応する。
【００３９】
本発明の基本的な特徴は、最終適合に含めてもよい結合曲線の自動的な評価及び選択である。
【００４０】
１つの変法として、交差確認型の方法が使われる。交差確認は、当業者には周知であり、例えば、Ｗｏｌｄ，Ｓ．，Ｔｅｃｈｎｏｍｅｔｒｉｃｓ，２０（１９７８）３９７−４０６に記載されている（その関連する開示内容は、参照することにより本明細書の一部に組み込まれている）。交差確認は、全体の交差確認又は分割した交差確認の何れかで行うことができる。初めの場合は、一度に結合曲線が１つずつ続けて排除され、適合は残りの曲線について行われ、例えば、会合速度定数又は解離速度定数として提示される適合の結果が、排除された曲線のそれらと対比される。この様な方法で許容できない結合曲線が検出され、データ・セットから排除される。
【００４１】
分割した交差確認では、データ・セットは多数のサブセットに分割され、その各々は個別に適合が行われ、例えば、会合速度定数又は解離速度定数として提示される各サブセットの結果は、互いに比較される。このやり方は、「１個抜き法」の交差確認に比べて、粗悪な結合曲線を検出するのに必要な計算の数が少なくなると考えられている。
【００４２】
もう１つの変法として、データ・セット全部に対して適合が行われ、各結合曲線に関する適合度は、次に、例えば残差分析型の方法によって決定される。これは一方で、適合度についての記述子を必要とし、他方で、結合曲線が許容されるか否かを規定して、適合度を制限する。典型的な記述子には、例えば上記の残差のプロットが挙げられる。適切な制限は、熟練者によって容易に決められる。最終の適合は、拒絶された曲線を除いた後に行われる。
【００４３】
本発明の交差確認に基づく１つの実施態様（但し、これに限定しない）を、図３の演算手順を参照して説明する。動態解析は、多数の検体−リガンド相互作用について得た結合データから、例えば、異なる固定化したリガンドとそのリガンドに対応する特異的な検体によって作られる、多数のスポットの配列（１次又は２次元の）を使って行われるものと想定される。
【００４４】
好ましくは、曲線品質管理は、装置関連の欠点（例えば、ベースラインの傾き、空気スパイク、測定間の持ち越し）のあるセンサグラムを排除するために、初めに、前述の本発明者等の国際特許公報ＷＯ第０３／０８１２４５号に記載の自動化した方法（その開示内容は、参照することのより本明細書の一部に組み込まれている）を使って行う。
【００４５】
次いで、オペレーターが、分析する特定の検体及び固定化したリガンドのスポットを選択し、動態解析のための関連する結合データを自動的に抽出させる。
【００４６】
図３を参照すると、演算手順の最初のステップ（３０）は、各データ・セット又はシリーズ（即ち、特定の検体−リガンドの組み合わせそれぞれに対応する、センサグラムのグループ）について、データ・シリーズの会合相及び解離相、より具体的には、分析に含めるセンサグラムのグループの部分を規定する。バックグラウンド・ノイズは、検体濃度がゼロ（０）を越す液体のサンプル注入を示す全てのセンサグラムから、検体濃度がゼロ（０）の液体のサンプル注入を示すセンサグラムを差し引いて補正する。この処置はゼロ減算とよばれる。
【００４７】
次のステップ（３１）では、例えば正の傾きの解離センサグラムのような、明らかに誤りのある運動データを排除する、単純な品質管理をする。
【００４８】
次に、ステップ（３２）では、各データシリーズ又はセンサグラムのグループを、幾つかのサブシリーズ又はサブグループに分割して交差確認を行う。初期推定値（ｋass、ｋdiss、Ｒmax）を各サブシリーズ及び各データ・シリーズについて計算し、次にサブシリーズを相互作用の動態モデルに対して適合させ、表示されたケースでは物質移動限界（ＭＴＬ）と１：１の結合である。
【００４９】
データ・シリーズの全てのサブシリーズからの適合の結果を一緒にする（３３）。異なるサブシリーズ間に小さな違いしかなければ結果は許容できるとみなし、交差確認の結果から得た初期推定値を用いて、動態モデルを全ての許容されるセンサグラムに適合させることによって、最終適合が行われる（３４）。
【００５０】
他方、大きな違いがあるなら、データ・シリーズを分析して悪い結果の元になる１つ又はそれ以上のセンサグラムを見つけるための、第二の品質管理を行う（３５）。もし見つかったら、そのセンサグラムを排除し、モデルに対して最終適合を行う（３４）。
【００５１】
これが、全てのデータ・シリーズ（即ち、検体と固定化したリガンドの全組み合わせ）について行われた場合、前記のカイ二乗（χ2）又はχ2／（Ｒmax）2検定のような品質についての仕分けをするために、例えば、適合度「良」によって測定結果が表示される（３６）。場合によって、数個の異なる良の基準を設けてもよい。オペレーターは直ちに全ての適合を見て、実施された自動的な評価結果を採用又は拒否することができる。
【００５２】
本発明の残りの分析に基づくもう１つの実施態様（但し、限定しない）を、図４を参照して以下に説明する。
【００５３】
図３に概説した実施態様と同じ方法で、演算手順の最初のステップ（４０）は、会合及び解離相を規定し、各データ・シリーズ（それぞれの検体とリガンドの組み合わせ）のゼロ減算を行い、そして第２のステップ（４１）で簡単な品質管理を行う。
【００５４】
次のステップ（４２）では、各データ・シリーズの広範囲適合を、相互作用（ここでは物質移動限界と１：１の結合）の動態モデルに対して行い、そして残差分析、即ち広範囲適合で得た速度パラメータを使って分析を行う。全てのセンサグラムについて適合させた曲線が作られ、各曲線に対する適合の近似性は、残差値によって決められる。
【００５５】
次に、残差値を評価し（４３）、そして全ての値が十分に小さく、即ち、所定のレベルより低くければ、そのデータ・シリーズ、そしてそれによる適合の結果は採用される。
【００５６】
適合の品質、速度パラメータの信頼性及び、場合により、他の基準が定められ、その結果は試験及び評価（４４）を行うためにオペレーターに提示される。
【００５７】
反対に、もし残差値が受け入れられるだけ小さくなければ、そのデータ・シリーズを分析し（４５）、あまりに大きな残差（異常値）を持つ個々のセンサグラムを特定し排除する。ステップ（４５）の排除基準は、上記ステップ（４３）で用いる排除基準と異なってもよいものとする。ここで、修正したデータ・シリーズについて、動態モデルに対する新たな適合が行われる。
【００５８】
品質の記述子／基準がそこで決定され、結果は上記（４４）のように提示される。
【００５９】
ステップ（４４）で提示された結果を吟味した後に、場合によって、更に（悪い）センサグラムを排除し、修正したデータ・シリーズを再適合させ、それから最終結果が提示されてよい。
【００６０】
上記の、速度定数等の速度パラメータを自動的に決定するための手法は、手順のステップを実施するソフトウェアを実行するコンピュータ・システムの形で容易に実施される。本発明は、又、コンピュータ・プログラム、特に本発明の品質評価法を実現するように適応させた、担体上又は内のコンピュータ・プログラムにまで拡大する。担体は、プログラムを保持することができるどのような実体又は器具でもよい。例えば、担体には、ＲＯＭ、ＣＤ  ＲＯＭ又は半導体ＲＯＭ、或いは例えばフロッピーディスク又はハードディスク等の磁気記録媒体が含まれる。担体は、又、電気又は光ケーブルを経由して、或いは無線又は他の手段によって伝達される、電気又は光シグナルのような、伝導性の担体であってもよい。或いは、担体は、プログラムが組み込まれた集積回路でもよい。
【００６１】
本発明を実施するために、いかなる好適なコンピュータ言語が使われてもよいが、最近では、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）モジュール・ファイル（Ｔｈｅ  ＭａｔｈＷｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ，ＵＳＡ）一式を使用することが好ましい。
【００６２】
本発明は、一般に、例えば生物相互作用のリアルタイム分析で得られる、運動データの評価に応用されるが、１つの際立った応用例は、タンパク質薬品の製造における品質管理への適用、即ち、異なるバッチのタンパク質サンプルが、その標的と結合する場合に同じ反応速度を示す試験への適用である。
【００６３】
次に、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例】
【００６４】
ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｓ５１（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ社，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用い、３種類の薬品、ＣＢＳＡ（４−カルボキシベンゼンスルホンアミド）、インダパミド及びフロセミドと、Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ社，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に固定化した炭酸脱水酵素の相互作用の、センサグラムの生データを得た（全ての試薬は自社供給、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ社，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。それぞれの薬品は、多数の異なる濃度で注入した。得られたセンサグラム・データは、それぞれ図５、６及び７の「Ａ」に、オーバーレイ・センサグラムとして示した。
【００６５】
次に、センサグラムの生データを、ＭＡＴＬＡＢ５．３．１．２９２１５ａ（Ｒ１１．１）（Ｔｈｅ  ＭａｔｈＷｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ，ＵＳＡ）における本発明の単純な実施態様の演算手順を、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＮＴ  ４.０を搭載したＰＣを用いて実行し、自動化した動力学的評価にかけ、会合速度定数ｋa及び解離定数ｋdを決定した。使用したプログラムを以下に示す。
【００６６】
2007506967.tif 000010
【００６７】
2007506967.tif 000011
【００６８】
2007506967.tif 000012
【００６９】
2007506967.tif 000013
【００７０】
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【００７１】
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【００７２】
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【００７３】
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【００７４】
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【００７５】
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【００７６】
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【００７７】
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【００７８】
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【００７９】
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【００８０】
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【００８１】
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【００８２】
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【００８３】
評価の結果は、図５、６及び７に示した。それぞれの図のＢは、Ａに示したセンサグラムのオーバーレイを示すが、（ｉ）本プログラムで行った曲線適合によって得られた対応する結合曲線を示す細い実線、及び（ii）プログラムによって悪いセンサグラム、つまり「異常値」として検出されたセンサグラムを示す太い点線が補足されている。異常値を除き、残りのセンサグラムを本プログラムで最終適合を行った後の、得られたセンサグラム及び対応する適合後の結合曲線を、それぞれの図のＣに示した。又、異なる薬剤の速度定数は、それぞれ図５、６及び７に示した。
【００８４】
本発明は、上記した特定の実施態様に限定するものではなく、発明の範囲は、添付の請求項によって規定される。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】ＳＰＲに基づくバイオセンサー・システムの側面図である。
【図２】目に見える結合相及び解離相を有する結合曲線の代表的センサグラムである。
【図３】本発明の方法を進めるための、模範的な演算手順を示すフローチャートである。
【図４】本発明の方法を進めるための、もう１つの模範的な演算手順を示すフローチャートである。
【図５】（Ａ）薬剤（ＣＢＳＡ）と検出表面の相互作用についてのオーバーレイ・センサグラム、（Ｂ）適合した結合曲線と組合せた対応センサグラム及び異常表示されたセンサグラム及び（Ｃ）異常値を除いた後の適合した結合曲線と組み合せた対応センサグラムを示す。
【図６】（Ａ）薬剤（インダパミド）と検出表面の相互作用についてのオーバーレイ・センサグラム、（Ｂ）適合した結合曲線と組合せた対応センサグラム及び異常表示されたセンサグラム及び（Ｃ）異常値を除いた後の適合した結合曲線と組合せた対応センサグラムを示す。
【図７】（Ａ）薬剤（フロセミド）と検出表面の相互作用についてのオーバーレイ・センサグラム、（Ｂ）適合した結合曲線と組合せた対応センサグラム及び異常表示されたセンサグラム及び（Ｃ）異常値を除いた後の適合した結合曲線と組合せた対応センサグラムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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