(57)【要約】  第一基板の第一の大きな表面に開いた第一の凹部の配列を有する第一基板を有する、細胞構成要素を取り扱うための装置であって、第一凹部は、細胞構成要素を保持するようにされ、装置は、各々の凹部に開口した流体流路を更に有する。凹部は、各々の凹部に所定の位置で細胞構成要素を位置付けるために、先細りされており、流体流路は、第一基板の大きな表面上に面するようにされて、配置された更なる基板の大きな表面上に形成されていて、更なる基板は、第一基板に取り外し可能に固定される。
2007504816.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一基板の第一の大きな表面に開口する第一凹部の配列を有する、前記第一基板を有する装置であって、
前記第一凹部は、細胞構成要素を保持するようにされ、
各々の前記凹部に、開口する１以上の流体流路を更に有する、装置。
【請求項２】
前記凹部は、各々の凹部の所定の位置で、前記細胞構成要素を位置付けるように、先細りされている、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
少なくとも一つの前記一以上の流体流路が、更なる基板の大きな表面と、前記第一基板の大きな表面と、の間に形成されて、前記更なる基板は、前記第一基板に取り外し可能に固定される、請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
少なくとも一つの前記一以上の流体流路が前記更なる基板の大きな表面と、前記第一基板の大きな表面に形成されていて、前記更なる基板は、前記第一基板に取り外し可能に固定される請求項１または２に記載の装置。
【請求項５】
少なくとも一つの前記一以上の流体流路は、前記第一基板または更なる基板の本体に形成されていて、前記流路は、他の基板のポートまたは凹部と一直線になる開口部を有していて、前記基板は、前記開口部の周りにシールを提供するようにされた、シーリング面が設けられた、請求項１〜４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６】
前記一以上の流体流路は、また、前記第一基板の前記第一の大きな表面の一以上の第二の凹部に開口する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７】
前記凹部は、前記基板を通って、基板の更なる大きな面に延びており、前記一以上の流体流路は、前記第一基板の更なる大きな表面に、面するようにされて配置された、更なる基板の大きな表面に形成され、前記更なる基板は、前記第一基板に取り外し可能に固定される、請求項１または２に記載の装置。
【請求項８】
前記流体流路は、前記第一凹部から横に、配置されていて、前記細胞構成要素は、前記流体流路を観察することなしに、大きな表面に略垂直な、前記第一基板または更なる基板を通して、観察されることができる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項９】
一つの基板の前記開口部と、他の基板のポートまたは凹部は、流体流路を満たしたときに、流体の溶媒に、気泡が閉じ込められることを避けるために、大きな表面から距離とともに小さくなるように、先細りにされている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１０】
一以上の流体流路は、流体で満たされたときに、前記流体流路からガスポケット（gas pockets）または気泡を取り除くことを可能にする、ガス浸透可能領域が設けられた、請求項１〜９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１１】
前記第一基板と更なる基板を一直線に保持し、それらを互いに係合させる、クランプ手段を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の装置と、他の細胞構成要素取り扱い手段を含む、細胞構成要素取り扱いシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞と他の細胞構成要素、詳細には、胚と卵母細胞を取り扱う装置と方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピペット等を使用して、単一の細胞を操作して、アレーフォーマット(array format)中の凹部に単一の細胞を隔離することが知られている。凹部は、細胞以上に大きいほうがよい。篩のような(sieve like)、またはフィルターのような基板中の細胞保持配列は、規則正しい配列または、ランダムパターンの位置で細胞を保持することが知られている。細胞は、基板を通る液体の流れを与える、吸引を使用して一般的に位置付けられるが、電気泳動、脱イオン化電気泳動または重力の下での沈殿のような他の力も従来技術で使用されている。この配列に基づいた装置を使用する際には、細胞の周りの液体の状態を正確に制御することは困難であるが、必要とされる液体の量を最小化する。このことは、液体が重要なとき、または、例えば、胚と卵母細胞の成長するように、液体の段階的な変化または変化のパターンが必要とされる場合には、不都合となる。
【０００３】
米国特許第６，１９３，６４７号は、胚を取り扱うためのマイクロ流体流路のネットワークを開示し、これらの胚は、流れに引きずられて”胚運搬流路”を通って流体中を動かされて、流路の”構造”、特に収縮を使用して、必要とされる位置で保持される。これは、所定の流路からの単一の胚の挿入と取り出しを簡単にするが、一以上の胚が流路の中にある場合には、有利点がより少なくなる。
【０００４】
胚のグループと卵母細胞を培養するための特定の用途における有利点が知られている。多くの胚は、同じ流路中に含まれることができるが、特定の一つに接近することは難しい。米国特許第６，１９３，６４７号においては、所定のグループから単一の胚を選択するための手段が開示されていない。米国特許第６，１９３，６４７号で示されている実施形態では、比較的大量の溶媒が、所定の胚を浸すためと、所定の胚を覆う溶媒を交換するために必要とされる。米国特許第６，１９３，６４７号で開示されている装置は、多くの不都合を有している。例えば、その装置は、胚装置の大量生産用に、比較的複雑な組立体、例えば、シリコンのマイクロ加工を必要とする。その装置は、また、簡単なロボットによって、胚の挿入および取り出しを実行するようにされていない。
【０００５】
本発明は、細胞、胚そして卵母細胞のような、細胞構成要素を取り扱うための改良された装置を提供する。この装置は、グループ中の個々の細胞構成要素に容易に接近することを可能にすると同時に、例えば、それらの成長または新陳代謝をプログラムするために、または、それらに試験手順を行うためにグループを、共通の液体状態にさらす。本発明は、マイクロ流体アプローチの有利点を結合することである。マイクロ流体アプローチの有利点は、細胞構成要素が、マイクロ流体流路に連通する事前に形成された凹部で保持される、アレーフォーマットによって可能にされる簡単な操作により、細胞構成要素は、装置の所定の位置で保持されることができると同時に、流体の流れが、それらの近傍で維持されることができることである。
【０００６】
細胞構成要素は、本発明によって取り扱われることが可能であり、胚、卵母細胞、または他の細胞の複合体、個々の細胞それ自体、そして単一のまたは混合された形式の細胞グループを含む。一般的な細胞は胚または卵母細胞より小さいが、同様の原理が、より小さなサイズの大きさの細胞に適用される。胚、卵母細胞、細胞および細胞構成要素の用語は、以下の記述において、置き換え可能に使用される。
【０００７】
本発明に従った、請求項で特定されるような装置が提供される。
【０００８】
本発明は、一以上の胚または細胞構成要素を、従来の流体ロボットを使用して、同時に扱うための装置および方法を提供する。
装置は、多数の胚を、共通な流体状態にさらさせることが可能であると同時に、他の胚への最小限の障害で、個々の胚を選択して取り扱うことができ、
個々のまたは胚のグループを覆う、媒体の素早い交換を可能にすることができ、
ある実施形態では、その場での視覚的評価と選択を可能にするように、卵母細胞の良好な視認性を達成することができ、
胚の環境の制御された状態を維持しながら、搬送または貯蔵のための装置から、所定の閉じ込め構成部材を隔離することができ、
装置の使い捨て部品が、大量に安く作られることを可能にすることができる。
【０００９】
装置と方法は、例えば、クローニング(cloning)、体外受精、幹細胞中の単一細胞と細胞グループの培養と成長または他の研究のような処置の際の、胚または卵母細胞の培養と成長に使用されることができる。
【００１０】
本発明の実施形態は、添付図面を参照して、単に例として説明されるであろう。
【発明の開示】
【００１１】
図１ａ〜１ｃは、第一基板(１０)に、基板の大きな表面、に開口する第一凹部(１２)の配列が設けられている、本発明に従った装置を示す。各々の凹部１２は、胚または他の細胞構成要素（１４）を保持するようにされている。本発明では、凹部は、細胞構成要素を各々の凹部の、特定の位置に位置付けるために、先細りにされている。装置はまた、各々の凹部に開いている一以上の流体の流路(３２)を具備している。
【００１２】
図１ａ〜１ｃで示された実施形態では、流体の流路は、更なる基板(２０)の大きな表面に形成されていて、その表面は、凹部の配列を運ぶ第一基板に面するようにされて、配置されている。本発明の更なる基板は、シーリング面(２２)で基板を閉じるふたを形成し、ふたは、インレット流路ポート２４、インレット流路２６、アウトレット流路２８およびアウトレットポート３０を有し、また、基板に対して閉じられるときに、一以上の凹部１２に連通して、流体がインレットポートからアウトレットポートに、通って流れることができる、流路３２を形成する流路構成部分を有する。図１ａで示した流体の連絡の配置は概略であり、流路の連絡路は既知のいかなる方法でなされてもよいことが理解されるであろう。
【００１３】
基板は、好ましくは透明で、凹部１２は、倒置顕微鏡を使用して、下からの視認性をよくするようにされるのが好ましい。あるいは、ふた２０は透明で、流路構成部分３２の上側の表面は、光学的品質がよいので、細胞構成要素は、上から観察されることができる。基板と凹部は、ピペットを使用して、上からの接近を可能にするように設計されている。凹部は、例えば、図７で示したように、ロボットを使用したピペットで素早い接続が可能となる、ＳＢＳマイクロプレート標準規格に従った位置で、１Ｄ配列（1D array）または、２Ｄ配列（2D array）で、規則的に間隔を空けてもよい。
【００１４】
凹部１２は、先細りであって、上方から凹部への簡単な接近を可能にするようにし、同時に、凹部ベースの小さな領域に細胞構成要素を位置付けることを可能にするようにされているのが好ましい。凹部は、図２ａで示されるように、それらが、細胞構成要素１４の直径の大きさに近接するような寸法に作られることができる。このケースでは、小さな直径のピペットが、構成要素を取り扱うために必要とされるであろう。取り扱う際に、構成要素は、ピペットの中に吸引される流体に引きずられないが、その代わり、ピペット保持の慣用的方法のように、ピペットの端部で保持されるだろう。凹部は、周りの溶媒と一緒にピペット中に構成要素を引きずり込むために、十分な内径が使用されることをピペットに可能にするような大きさに作られているのが好ましい。凹部は、次に図２ｂで示されるように、その直径に近接する細胞構成要素ための保持位置で先細りとなっているのが好ましい。細胞構成要素は、凹部のベースに収容されて、凹部は、流路３２を通る流れによって、細胞構成要素が影響されないような大きさである。流路３２は、その中を通リ抜けることから、細胞構成要素を妨げるような大きさに作られてもよい。
【００１５】
図１ａの実施形態においては、流路３２は、ふたの表面に形成されているように示される。他の実施形態においては、流路３２は、基板１０の表面に形成され、その結果、ふたは、凹部の位置上で、平らな外形を有する。
【００１６】
ふたと基板との間のシーリング面２２は、２つの間に閉じられた流路を形成する必要がある。シールは、対応した面２２、例えば、基板またはふたに取り付けられたガスケットの使用により達成されてもよく、あるいは、ふたは、部分的に、または全体的にＰＤＭＳのような複合材料で形成されてもよい。シールは、流路３２中の溶液がシール表面２２を濡らすように広がらないように、疎水性のシール領域を使用して、形成されてもよい。疎水性の表面は、基板またはふた、またはこの両方用の疎水性材料、疎水性のガスケットまたは、一または両方の表面へのコーティングを使用して達成されてもよい。
【００１７】
ふたと基板を、それぞれに対して位置付けて、シールを達成し、基板に対してふたを固定して保持する、クランプ手段（図示しない）を使用して、ふたは基板にクランプされることが好ましい。
【００１８】
別の実施形態（図示しない）では、溶液は、表面２２を濡らしてもよく、それらの間のぬれる割合は、シール領域の液体のフィルムと、流路を通る液体の流れとの間の構成要素の交換時に受け入れることができる設計において、ぬれる割合は、無視できるように受け入れられることができる。
【００１９】
図１の装置が使用される方法は、以下の通りである。
【００２０】
ふたが取り外されると、基板は、自動分注器の中に置かれて、細胞構成要素の一つが、凹部に、凹部をほぼ満たす溶媒の量と共に配置される。ピペットは、細胞構成要素をその中に保持するような大きさに作られている。細胞構成要素は、その後、凹部のベース中の保持位置で沈殿する。ふたがその後、取り付けられて、クランプ機構（図示しない）を使用して適所に保持され、液体が流路３２を通って流されて、凹部のメニスカス（meniscus）に接触する。
【００２１】
凹部の内容物は、凹部外へ活発に流されない。流路と凹部との間の化合物の交換は、拡散によってなされる。凹部と流路は、この交換が適切に素早く行われるように拡大または縮小される。通常、装置において、卵母細胞または胚の成長のための化学環境の急激な変化は必要とされない（そして、通常は避けられる）そのため、必要とされる拡散時間は長く、従って、流路と凹部の大きさは小さすぎない。
【００２２】
完全平衡のための典型的な拡散時間と距離は、Ｄt/l2＝1によって説明される。典型的な成熟溶媒中で、最も大きな分子である典型的な小さなたんぱく質は、Ｄ＝１０-6ｃｍ2ｓ-1 であり、１００μｍの深い凹部には、１００ｓの平衡時間を与え、２００μｍの凹部には、４００ｓの平衡時間を与える。一つのたんぱく質をもう一つのたんぱく質へのほとんど完全な交換は、Dt/l2の約５倍に相当する、より長い維持間がかかる。これらの時間は、長いが、卵母細胞の成長への適用のためには長すぎない。
【００２３】
流路３２は、ふたが、基板から取り外される前に好ましくは空にされる。本発明の実施形態では、これは、強制的にガスを流路に通して、アウトレットを通って、液体を移動させることにより、達成される。凹部は、アウトレットを有していないので、凹部中の液体レベルは、図３ａと３ｂで示されるように、わずかしか影響されない。ふたは、そのため、液体から自由に、取り外されることができ、凹部の細胞構成要素環境は、影響されないようにされたままである。
【００２４】
取り扱うシステムは、各々の凹部中の細胞構成要素と、凹部中への複合物への適用の状態を追跡記録するための方法を有しているのが好ましい。それらの位置で、各々の細胞構成要素になされた観察結果に相互に関連付けられた、自動マイクロスコープステージとデータ入力システムに接続してもよく、それにより実験データを簡単に扱い、追跡記録することを可能にする。
【００２５】
各々の凹部は、単一の細胞構成要素を受承することを通常目的としているが、場合によっては、各々に一以上の細胞構成要素に使用できてもよい。凹部は、細胞構成要素がピペットから凹部の中に提供され、重力の下で堆積して、または、凹部中の保持位置に向かって、液体の中を、引きずられて動くことがきるような寸法に作られている。細胞構成要素は、米国特許第６，１９３，６４７号の流路中の液体の流れによって、回転動作を伴いながら、移動されない。むしろ、従来技術に類似した凹部中に提供されるが、凹部中の選択された位置で細胞構成要素を保持するのに適した凹部を与え、そして、細胞構成要素周りの液体を容易に交換するという、改良された特徴を伴う。
【００２６】
卵母細胞の培養においては、一定限度の溶媒の量を維持する必要がある。一般的に、溶媒は、空気中の５％の二酸化炭素と釣り合うのが理想であり、卵母細胞による新陳代謝は、ガスが、卵母細胞の近くの溶媒に供給されることが必要とされることを意味する。旧来の培養では、このことは、培養器の空気から溶媒を通って拡散することによって、生じる。本発明の装置においては、ガスは、前側の流路の溶媒から、凹部の中および外に拡散する。特に、もし培養液が、一定期間の間、動かない場合には、凹部へのガスの絶え間ない供給を確実にすることは、使用目的によっては有利である。このことは、ふた２０が図１ａと同じの図１ｃで示した実施形態で達成される。しかしながら、基板１０は、凹部のベース（側面）に近接して、走っている、付加的なガス供給流路３４を具備していて、ガス透過可能材によって、凹部の内部から分離されている。このことは、実際には、ＰＤＭＳのようなガス透過可能ポリマーで、凹部のベース、または、基板１０の全体を単に組立てることによって達成される。凹部のベースは、基板構成中に、重ねられたガス透過可能材の層によって形成されてもよい。同様に、多孔製のフッ化炭素フィルムのような、多孔性の疎水性材料が、凹部のベースを形成するために、重ねられた構造で使用されてもよい。
【００２７】
他の実施形態では、凹部は、図４ａ〜図４ｏで示されるように、そのベースから第二凹部に通じる流路を備えていて、または、第一凹部から流路中に流れる液体を保持するように作用し、または上から流路中に流れる流体を提供されることができる流路を備えている。少なくとも一つの第一凹部は、また、その内容物がピペット中に吸引されるように設計されている。第二凹部は、吸引の間、第二凹部から第一凹部に液体の流れを提供するように作用し、この流れは、細胞構成要素を凹部からピペットに運ぶように作用する。
【００２８】
細胞構成要素の観察は、下からまたは上からなされてもよい。凹部中の細胞構成要素のための保持位置は、凹部のベースに好ましくはあって、基板の材料は透明であり、そのため、倒立顕微鏡を使用して、下から、細胞構成要素をすぐに視認することを可能にする。あるいは、細胞構成要素の保持位置は、細胞構成要素を位置付けるような、収縮作用により、ベースよりも上の高さでもよい。カバーが蒸発を減少するために設けられてもよく、凹部の体積を規定してもよく、凹部の液体容量は、使用時に、ふた面より下に位置付けられて、または、ふたに接触してもよい。この後の配置は、光学的にはっきりした接触面を備えるため、上から観察する場合に有利である。
【００２９】
凹部は、分離していてもよく、また、一以上の共通の流体の流路と連結されてもよく、そのため、凹部への液体の共通の供給を可能にする。凹部へのおよび、凹部からの液体の流れは、上からピペット手段によって完全になされてもよく、または、これと、凹部を連通する流路を通る流れとの、組み合わせでもよい。ある実施形態においては、ガス圧力が、第一と第二凹部との間の液体の運搬に使用されてもよく、これらの凹部のいずれかまたは両方と、共通の流路との間の液体の運搬に使用されてもよい。このように、液体は、基板上の一以上の凹部中に提供されて、その後、外部のガス圧力によって、基板上で動かされる。ガス圧力は、正圧または負圧でもよい。詳細には、第一凹部から第二凹部に液体が流れることを生じるように第二凹部に働かされ、保持位置で細胞構成要素を位置付けられるように、または、その位置で同時に、細胞構成要素を通り過ぎる液体の流れを生じるように、かのいずれかの、負圧が使用されてもよい。
【００３０】
凹部は、液体、および細胞構成要素のロボットの取り扱いを容易にするために、基板上に配置されるのが好ましい。例えば、凹部は、ＳＢＳ規格の１５３６の凹部プレート上の凹部位置に、位置付けられてもよい。この凹部は、凹部の必要とされる大きさに適した細胞構成要素密度よりもプレート上に低い細胞構成要素密度を有するが、外部ロボットの容易な結合を可能にする。凹部の密度は、より正確な液体取り扱い装置が使用される場合には、高くしてもよい。
【００３１】
基板への流体接続は、ピペットだけでなされてもよい。すなわち、液体が流れて通る基板に物理的な接続がなく、または、基板上の一以上の位置にそのような接続があってもよい。流体接続は、基板の下側になされてもよく、または、ピペットの接近領域の傍で開いている基板の上側の領域になされてもよく、凹部への接続は、基板の流路または、これらの両方によって、なされる。あるいは、基板は、接続が必要とされるときは、基板に接続し、例えば、ピペットの上面に接近が必要とされるときのように、接続が必要とされないときは、取り外される移動可能な構成要素によって、接続がなされてもよい。凹部への流れの流路は、構成要素の接続により形成されてもよく、いくつかの実施形態では、次に、動作サイクルのある点でのある凹部および流路と、他の点の他の凹部および流路を接続するように、基板上の流体接続をプログラムするように作用できる。そのような接続構成要素は、基板に接触して、流体密封のシールを達成するための、適合部分を有する。
【００３２】
基板は、細胞構成要素環境への、望まれる連続する変化を達成するために、各々の凹部に、連続するピペットの液体の付加を計画する、取り扱いシステムの一部として使用されるのが好ましい。システムは、細胞構成要素の観察の容易な記録を可能にするように、自動顕微鏡ステージに連結するのが好ましい。いくつかの実施形態では、観察は上からなされて、ふたの構成要素は、はっきりした視界のための、形成された液体接面を与えるように適当な位置にある必要があってもよい。システムは、その後、ふたが取り外されたときの、後の実行のための細胞構成要素の取り扱い決定を記録する。標準配置の凹部のレイアウトは、このことを助けて、そのようなシステムの使用は、オペレータの努力の必要性を最小限にすると同時に、非常に多くの数の細胞構成要素が、単一の基板上で、取り扱われることを可能にする。
【００３３】
実施例２
図４ａから４ｈは、図１ａ〜図１ｃに従った、基板の一部に形成された凹部構造の部分的な図を示す。図４ａの実施形態は、細胞構成要素を受承するようにされた、各々が第二凹部を有する流路５２を介して連通する一以上の第一凹部を有する、基板１０を有する、流路は、細胞構成要素が、中を通り抜けることができない第一凹部の中に閉じ込められることを目的とするような寸法に作られている。ふた６０は、シール面６２で基板を閉じて、第一凹部と第二凹部を連通する一以上の流れ流路（６４，６６)を有している。凹部中の流れのパターンが、ふたの流路の配置によって、決定されるのが、本発明の特徴である。図４ａは、紙面の平面に垂直に走っていて、一以上の第一凹部と第二凹部とを連通してもよい、ふた流路の配置を示す。この配置は、図４ｂの平面図で示されていて、複数の第一凹部５０と第二凹部５４が、インレット流路６４とアウトレット流路６６にそれぞれ、平行に接続されている。本実施形態の基板１０は、図４ｃで、ふたは、図４ｄで示されている。
【００３４】
別の実施形態では、基板１０の表面に形成された流路６４と６６の一つまたは両方が形成され、第一凹部と第二凹部にそれぞれ結合している。ふた６０は、次に、凹部の位置で、平面の外形を有している。本実施形態では、ふたの設計よりもむしろ、基板の設計により、凹部への流体接続および凹部間の流体接続が固定される。本実施形態は、より単純なふたの設計を可能にし、結合されるときに、ふたと基板間の配置のいくらかある制限を緩やかにすることを可能にする。
【００３５】
別の、ふたの流路の配置は、図４ｅの平面図と図４ｆの断面図で示されている。流路７６は、第一ペアの凹部の第二凹部５４を第二ペアの凹部の第一凹部５０に接続し、それゆえ、凹部をインレットポート６８からアウトレットポート７４に連続して接続する。本実施形態では、ふた２０が基板に取り付けられたときに形成される、空洞をシステムから取り除くための手段を備える必要があり、基板は、その上に空間を伴いながら、各々の凹部に液体の塊を有する。このことは、ふたの流路の中、好ましくは、凹部の上のガス透過可能領域７８の手段によって、達成される。システムがまず、加圧されると、空気が、これらの領域を通って、強制的に吐き出されて、液体に、システムを通る連続経路を形成することを可能にする。
【００３６】
使用においては、細胞構成要素は、基板の第一凹部にピペットで入れられて、ふたが取付けられて、その後、インレット流路６４を通って、インレット凹部６８から第一凹部に溶媒が流される。
【００３７】
第二凹部５４は、第一凹部よりも小さな直径でもよく、または、それらが、配置または吸引をピペットに可能にする場合には、同じ大きさまたは、より大きな直径でもよく、または、アウトレット流路と接続されない、簡単な、オーバーフロー凹部として機能してもよい。いくつかの実施形態では、それらは、それらが満たせれた時に、空気を逃がすことを可能にするふたを通して、放出されてもよい。
【００３８】
本発明のペアになった凹部の有効性が図４ｇで図示されている。第一の凹部５０は、顕微鏡の観察のための容易な位置を与えるために、凹部に閉じこめられた位置で、細胞構成要素１４を保持するようにされるのに有利である。理想的には、位置は、ｘ、ｙ、ｚの次元に限局されていて、自動化されたステージは、高倍率時で、ほぼ焦点が合う視野内に、細胞構成要素を運ぶ。もし凹部５０のベースが上側の部分８２よりも小さな直径の領域８４を有している場合には、このことは達成されることができ、ベースはピペット８０により接近することが可能なように、より広いほうが有利である。閉じ込め部分８４は、その中を通る流れがない場合には、液体により簡単に流されない、このことは、流路５２と第二凹部５４の使用時に達成される。
【００３９】
第一凹部５０は、さまざまな方法で構成されることができて、細胞構成要素が規定された位置で保持され、第一凹部から第二凹部への流れに対して制限されることができるという共通の特徴を有する。図４ｈでは、別の実施形態は、くびれ８６がそのベースというよりもむしろ凹部の中に備えられている。このことは、細胞構成要素が、流れにより、くびれ上に集められるという利点を有し、そのため、凹部は、細胞構成要素より著しく大きくなるが、依然として、正確な設置を達成できる。このことは、本発明の装置に、哺乳類の細胞のような、卵母細胞より小さな細胞にもまた簡単に適用される。
【００４０】
凹部５０および、くびれ８６は、型成形、型押し、レーザドリル、旧来のドリルのような、公知であるいかなる手段により作られてもよい。あるいは、くびれは、シリコン型のような構成要素に形成されることができ、その中に、公知である手段によって貫通穴を形成し、凹部を形成する基板に取り付けられる。くびれの性質は、卵母細胞または細胞が観察される方法を規定する。くびれが不透明であれば、観察は、上方からなされ、その場合には、ふたと基板を有する本発明の装置は、更に有利である。マイクロ供給流路を有するふたは、取り外されることができて、観察中には、その場所に、光学的に透明なふたが取り付けられる。
【００４１】
図４ａ〜４ｈの実施形態の流路５２は、型成形、型押し、レーザドリルまたは切断、または、機構を形成するための適切な層の層状組織のような、公知であるいかなる適切な手段によって形成されてもよい。流路は、凹部間で、均一の断面であって、または、流動抵抗を最小にするように他の部分には、より大きな寸法を有しながら、細胞構成要素を保持するために、凹部に近接して、より小さな最小寸法部分を有するのが好ましい。流路を形成する好ましい手段は、二つの非多孔層間の多孔材料の層を、重なることである。第一凹部（卵母細胞を含んでいる）は、それ自体、多孔材料の層の部分的に切り取られた領域でもよく、第二凹部に導くより大きな流路に連通する材料のもう一つの端部でもよい。
【００４２】
更に好ましい実施形態では、下方からの視認性が必要とされない用途に役立ち、第一凹部のベースは、多孔材料によって形成されて、溶媒がその中に拡散した材料と種を通って流れることが出来て、そのように、細胞構成要素の下側に到達する。
【００４３】
実施例２ａ
図４ｉは、細胞構成要素の保持位置が従来の実施形態よりも、より近接してパックされることができる実施形態を示す。このことは、下位の液体の量全体に、保持位置を取り囲むことを可能にする。ここで、卵母細胞は、基板１５０中のマイクロ凹部１５２に保持されて、マイクロ凹部は、前側の流れ流路１５４と後ろ側の流れ流路１５６に連通している。前側の流れ流路は、基板１５０と取り外し可能なふた１５８との間に形成されていて、取り外されたときに、ピペットによって、卵母細胞を加える、または取り除くために、接近することを可能にする。基板に対して閉じられた位置のときは、図１ａの実施形態のように、インレットから、流路１５４を通ってアウトレットへの流体密封経路を形成する。後ろ側の流路１５６は、基板と取り外し可能な後ろ側構成要素１６０との間に、同様に形成されてもよく、あるいは、後ろの構成要素１６０は、基板に永久に固着されてもよく、または、流路１５６は、基板自体の中に形成されてもよい。後ろ側の流路は、示されたように、インレットとアウトレットとの間に流れてもよく、また、液体が、どちらの方向にも流れることができる、単一の接続を単に導いてもよい。
【００４４】
図４ｉの実施形態の使用においては、前述したように動作する。ふた１５８が取り外されると共に、卵母細胞が、ピベットにより加えられ、または取り除かれて、凹部のベースの流路１６２を通る、支持溶液の流れは、流路１５６の圧力によって制御される。ふた１５８が置き換えられると、溶液は、流路１５４を通って流される。空気を流路から吐き出すために、凹部の液体に接触するように、流路内でメニスカスを前進させる必要がある。これは、凹部の適切な設計によって、いずれも配置されることができ、メニスカスが凹部の上部に置かれて、または、後ろ側の流路にわずかな後ろへの圧力の使用によって、前方の液体は、それに接触することになる。マイクロ型成形、マイクロ型押し、レーザドリル、湿式または乾燥式化学エッチングに従った、写真平板術のパターンのような、マイクロ加工の公知である適切な手段によって、マイクロ凹部は、基板に形成されることが可能である。マイクロ凹部は、例えば、ポリマー成分の部分に穴のパターンを空けるレーザによって、基板が作られる材料で形成されてもよい。あるいは、マイクロ凹部は、その後、基板構成要素１５０に取り付けられる、別の構成要素に形成されてもよい。この場合には、たとえば、シリコン基板にエッチング凹部、フォトエキポキー(photoexpoxy)ＳＵ８または類似の公知手段のような、フォトパターンナブル(photo-patternable)材料に、凹部の配置をパターンして形成する、有利な加工手段がある。
【００４５】
実施形態２ｂ
図４ｊ、4ｋおよび４ｌは、ここで、凹部のベースから横方向に通じる流路１６２は、下からの卵母細胞の視認性を、よりよくすることを可能にすることを除いて、図４ｉの特長に類似した特長を有する更なる実施形態である。図４ｋは、図４ｉで番号付けられた部分の平面図を示す。図４ｊは、卵母細胞凹部を通る図４ｋのＡＡでの断面図を示し、図４ｌは、ＢＢでの断面図を示し、どのように流路１６２が後ろ側の流れ流路１５６を妨害するかを示している。
【００４６】
実施形態２ｃ
図４ｍは、卵母細胞を保持するように作用する、その中にくびれを有する基板１５０に形成された、卵母細胞凹部１５２の更なる実施形態を示す。凹部は、貯蔵毛管のように作用し、溶媒を満たされたときに、表面張力手段により、溶媒を保持する。基板１５０は、親水性材料（例えばアクリル）から形成されることができ、凹部の一般的な直径は、１ｍｍよりも小さく、そのため、毛管の保持力は、有効である。卵母細胞は、単に、基板の上面と下面をカバー１６６と１６８で覆うことによって、それらの凹部の中に、保持される。これは、卵母細胞を運搬する、非常に簡単で、取り扱うことが簡単な手段を形成する。卵母細胞が、溶媒中で還流された場合には、その後、カバーは、図４ｎで示されるような流れふた１５８、１６０に置き換えられる。インレット流路１５８を通って、流された液体は、その後、凹部のメニスカスに接触して、溶媒を、凹部を通って流すことを可能にする。メニスカスへの接触と、インレット流路１５８からの空気の排除は、メニスカスが下側から凹部１５２の上部に動くように、加えられる圧力によって助けられる。
【００４７】
使用時に、卵母細胞は、上からピペットで凹部に入れられて、設置位置上で重力により安定させられる。凹部は、図４ｍと４ｎで完全にいっぱいになっているように示されているが、ピペットの体積は、凹部の端部にメニスカスが、正確ではないが、近接し続けるように選択されることができる。卵母細胞は、視認性が十分なときには、凹部の軸に平行に、上から観察されることができる。あるいは、凹部は、側面から観察されることができる。装置は、標準的な倒立顕微鏡が使用されることを可能にするように、その側面で動作されることが可能であり、その後、ピペットに接近を可能にするように、垂直に戻って移動される。側面の視認性が必要とされる場合には、凹部は、１Ｄ配列として配置される凹部であり、上部からの視認性が適切な場合には、それは、２Ｄ配列で配置されることができる。どちらの場合にも、小さな大きさの凹部とそれらの近接配置は、比較的小さな装置で、多くの数の卵母細胞が培養されることができることを意味する。装置が使用されるシステムは、どの卵母細胞が、以下の検査の介入を必要とするかを、記録するコンピュータを有することが予想される。それぞれの正しい動作は、一度、基板がピペット方位に戻されると、自動的に行われることが可能である。
【００４８】
図４ｏは、流れ流路ふたが置かれたときに、卵母細胞が、個々の位置で積極的に保持される、更なる実施形態を示す。この実施形態では、ふた１５８は、凹部１５２に一直線になって間隔が開いた一以上の流路１７４に連通する、前側流れ流路１５４を有する。流路の直径は、卵母細胞の直径よりも小さく、そのため、ふた１５８と基板１５０の組み合わせが、傾かされて、逆さまに回転されたときに、逆流の条件の下で、または重力の下で卵母細胞が流路１５４に入ることを妨げる。本実施形態では、後ろ側の流路１５６は、分離可能な構成要素の接触によるというよりも、むしろ基板１５０の一部分として形成される。本実施形態は、溶媒による、卵母細胞の還流培養を可能にする、卵母細胞搬送装置に適している。
【００４９】
本発明のいかなる実施形態も、卵母細胞の個々の識別が必要されない場合には、所定の凹部に一以上の卵母細胞または、他の細胞構成要素を収容できてもよい。図４ｍ．４ｎおよび４ｏは、このために特に適している。凹部１５２は、卵母細胞が連続的に保持されるように、卵母細胞に近い直径で作られてもよい。凹部は、一定の直径であってもよく、または、図４ａのように、凹部の口でより大きな直径で、卵母細胞に近い直径のより狭いベースを有してもよい。凹部の口は卵母細胞の寸法に近い場合には、分注器は、凹部の中に収容されず、そのため、ピペットを使用する過程の間、凹部の口周りで、基板１５０の表面を閉じるように配置されることが可能である。
【００５０】
実施形態３
図５ａ〜５ｂは、本発明の他の実施形態を示す。図５ａでは、第一凹部５０は、細胞構成要素を収容するように選択された、直径のベース部分９０と、凹部中の液体のピペット操作に適合するように作用するより大きな口部分９２を有している。流路５２は、第二凹部５４に連通し、さらに、ベース部分９４と口部分９６に連通している。図５ｂでは、第一および第二流路６４と６６を有するふた１２が取り付けられた、基板が示されている。これらの流路は、図１ａの方法で、インレット凹部からアウトレット凹部に流れる。各々の凹部には、より広い口部分とより狭いベース部分の間の接合部分に、毛管ストップがある。基板の材料は、親水材料で用意されていて、そのため、より大きな流路のメニスカスよりも、小さな流路のメニスカスにより大きな圧力が横切る。それゆえ、低圧力でより大きな部分中のメニスカスを動かすのに十分であるが、より小さな部分中のメニスカスを動かすのには、十分ではない。
【００５１】
使用時には、卵母細胞は、一定量の溶媒と一緒に、第一凹部にピペットで入れられる。液体は、流路５２を通って、第二凹部５４に毛管作用によって流れる。第二凹部は、第一凹部よりもより狭くて、そして、狭いベースがより広い口に接する位置で、メニスカス１００を、毛管作用で満たす。第一凹部のメニスカス９８は、第一凹部の毛管ストップ位置より上にある。卵母細胞は、下から観察される。卵母細胞周りの液体が交換される必要がある場合には、ふた１２が取り付けられて、液体が流路６６を通って流される。これが、メニスカス１００に接触するとき、凹部５４の毛管ストップが壊される。流路６６の圧力は、その後、下げられて、液体が、第一凹部から第二凹部に、第一凹部のメニスカスが、狭いベース位置の最初の位置に到達すまで、流れる。その位置は、毛管ストップのように、狭める作用をし、毛管ストップ位置で、メニスカスを横切る圧力より、すくない圧力を流路６６に与える。流路６４を介して第一凹部に加えられた液体は、メニスカスに接触していて、毛管ストップは壊される。液体は、その後、第二凹部を介して第一凹部を通り、メニスカスが、再度、毛管ストップ位置に到達するまで、流れる。
【００５２】
本発明の毛管ストップの特徴は、また、直径の変化に関連して、または直径の変化の代わりに使用されてもよい公知であるような、凹部の壁への液体の接触角度の変化を使用して達成されてもよい。凹部の下側の部分は、親水性の材料で出来ていて、上側の部分は、非親水性材料または、疎水性材料でできている。凹部は、メニスカスが、親水性の部分の最初の位置に到達するまで、次に、流路５２からの負圧の下で空になる傾向があり、（第一凹部５０の上側の部分が疎水性であれば、正圧がこの部分のメニスカスを横切る）接触角度が減少するとすぐ、メニスカスを横切る圧力が増加し、流路５２と第二凹部５４の正確な設計が与えられるとすぐに、流れが止まる。
【００５３】
図５ａと５ｂの実施形態が、例えば、標準的なプラスチック成型過程によって、組立てられる。第一凹部のベース部分９０は小さく、５００ミクロン以下が好ましい。このベース部分が型で作られてもよく、または、例えばレーザドリル過程によって、穴を空けられてもよい。第二凹部５４は、実際には、その中に液体の毛管力を働かせるいかなる構造でもよく、例えば、毛管流路、基板中の浅い凹部、または、最小寸法よりも大きな凹部または部屋に置かれた吸収材料でもよい。基板は、単一の材料または一以上の材料から形成されてもよく、特に、第一凹部の上側部分に異なった接触角度が必要とされる場合には、上側部分は、下側の部分の材料と固着される異なったプラスチックから形成されることができる。あるいは、表面被覆または表面処理は、２つの部分の接触角度を制御するのに使用されることができる。凹部の下側部分は、例えば、ＳＵ８フォトエポキシのフォトパターンニングによって、基板のサブコンポーネントに形成されている。サブコンポーネントは、その後、凹部の上側部分を有する塑性成形部分に取り付けられる。
【００５４】
実施形態４
前の実施形態では、装置は、基板の凹部への流路を備えるためにふたを有している。図６ａと図６ｂは、前の実施形態のように流路手段によって、達成される凹部を通る液体の流れと共に、連続するピペット操作によって、液体を凹部に供給する実施形態を示す。これらの実施形態では、取り外し可能なふたはもはや必要でなく、第一凹部は、開けられたままにでき、処置のすべての段階で、ピペット操作のために、接近可能である。基板１０は、凹部流路５２に連通する１以上のアウトレット流路６６を有する。わずかな負圧が、流路６６の液体に加えられ、この圧力は、液体が、インレット凹部の毛管ストップを過ぎるのを強制するのに必要とされる圧力よりも少ない。ピペットが操作され、凹部中に入れられる、各々の一定量のために、溶液は、第一凹部から、流路６６に、メニスカスが毛管ストップに到達し、すぐに流れが止まるまで、流れる。凹部を通る流れは、ピペット操作の動作によって制御される。この様に、ピペット操作された体積がベース部分９０の体積よりも大きいと、卵母細胞は、最後にピペット操作されたいかなる溶液にも浸される。ピペット操作された体積が、より少ない場合には、ベース部分に混合された溶液が共存し、拡散によって、ゆっくりと混合する。このシステムの時間による、混合の変化を達成するために、凹部中での拡散混合への信頼性が必要である。（卵母細胞を、上部から下部への濃度の変化にさらし、そのため、望ましくないかも知れない）または、一連の一定分量の徐々に変化する濃度に間接的に混合することと、それらを連続的に凹部にピペット操作により入れることが必要である。図６ａと６ｂの実施形態では、卵母細胞は、凹部のベースの位置で保持される。同じ原理が、図６ｃの実施形態に適用されて、卵母細胞は、凹部のベース部分のくびれ１０６で保持される。
【００５５】
実施例５
図８と９は、図４ｏで示されたタイプの更なる実施形態を示し、流れ流路ふたが配置されたときに、卵母細胞、胚、または他の細胞のような１以上の細胞構成要素が、基板上の個々の位置に、確実に保持される。簡単のために、図８の装置は、単一の保持位置を示すが、本発明は、複数のそのような保持位置を有する装置を包含することが理解される。基板（ベース構成要素としてこの例では説明される）１５０とふた構成要素１５８は、各々流れシステムを有し、卵母細胞位置を通る流路を完成するように、互いがフィットするように配置され、装置に卵母細胞を乗せる、または、卵母細胞を装置から取り除くために、分離可能なように配置されている。ベース構成要素は、ベースシーリング表面１５３を有し、ふたは、ふたシーリング表面１５９を有していて、近接させられるときに、ベースとふたとの間に１以上の液体の経路を完成するように作用する。図８は、ベース上に組立てられたふたを示す。図９は、装置が分解されたときに、２つの構成要素の外観を示すように、ベースから上方に動かされたふたを示す。共通の番号は、図４ｏと図８と９の共通部分を示す。
【００５６】
ベース構成要素１５０は、一以上の第一の流れシステムを含み、各々が、ベースシーリング表面１５３に開いている凹部１５２を有し、凹部は、一以上の卵母細胞を含むようにされていて、流路１５６は、凹部から延びており、流路は、卵母細胞が凹部から離れるのを防ぐようにされていて、流路は、ポート１５７に液体で連通していて、一以上の更なる流路を介してもよい。液体接続２１８は、ポート１５７と外部流れシステムとの間の流体の連通を容易にするようにベース構成要素部分として、設けられてもよい。あるいは、流体接続は、ベース構成要素がその中またその上に位置付けられる、装置に関連付けられてもよい。凹部１５２は、その深さにわたり、単一の断面寸法でもよい。凹部は、幅広い開口部２００とより狭い内側領域２０２を有してもよく、開口部は、凹部の中に１以上の卵母細胞を提供し、および/または、一以上の卵母細胞を凹部から吸収するように、ピペットの進入を可能にするような寸法に作られていて、より狭い領域２０２は、所定の位置に卵母細胞を位置付けるような寸法に作られている。流路１５６は、卵母細胞が凹部から離れることを防ぐように位置付けられ、防ぐような寸法に作られている、くびれ１６４を有してもよい。
【００５７】
図８及び９で示されるように、ベース構成要素には、一以上の第二の流れシステムが含まれてもよく、各々は、ベースシーリング面１５３上のポート２１５に延びる流路２１４を有していて、流路２１４は、更なるポート２１７に流体で連通しており、一以上の流路２１６を介してもよい。流体接続２２０は、ポート２１７と外部流れシステムとの間の流体での連通を容易にするように、ベース構成要素部分として設けられてもよい。あるいは、流体接続は、ベース構成要素がその中またはその上に位置付けられる装置に関連付けられてもよい。
【００５８】
ふた構成要素１５８は、１以上の流れシステムを含み、各々、図４ｏの実施形態の流路１７４に類似の流路２０４を有し、ふたがベースに取り付けられたときに、凹部１５２に流体での連通を生じさせる。流路２０４は、ふたに形成されたアウトレットポート２１３に流体で連通している。流れシステムは、ポート２１３に延びる流体経路を形成する、流路２０４から延びる１以上の更なる流路１５４を有してもよい。一つまたは両方の流路２０４と流路１５４は、卵母細胞が流路２０４から離れることを防ぐようにされている。流体接続（図８と９では図示しない）は、ポート２１３と外部流れシステムとの間の流体での連通を容易にするようにふた構成要素部分として設けられてもよい。あるいは、流体接続は、ふた構成要素が、その中にまたはその上に位置付けられる装置に関連付けられてもよい。
【００５９】
図８と９の実施形態は、好ましい配置を有していて、ポート２１３は、ふたのシーリング面１５９上に位置付けられていて、ふたの流れシステムへの流体接続は、上述したようなベース構成要素１５０に含まれる第二の流れシステムを介してなされ、ベース構成要素中のこの第二の流れシステムは、ベースシーリング面１５３に形成される第一ポート２１５を有し、ポート２１５から第二ポート２１７に延びる流体の経路を形成する。ふたとベース中の流れシステムは、ふたがベース上に組立てられたときに、ベースシーリング面１５３とふたシーリング面１５９が近接され、流路２１２がポート２１３と２１５を介してベースの第二の流れシステムに流体での連通を生じさせる。この第二の流れシステムは、ポート２１７と、ふたのポート２１３従って、凹部１５２との間に流体での連通を提供する。
【００６０】
流路２０４は、いかなる均一の断面寸法でもよい。図８と９で示される好ましい実施形態では、流路２０４は、凹部１５２の開口部の直径とほぼ同じ直径の開口部を有する、先細りした、円形断面である。
【００６１】
一つまたは両方の流路２０４と流路１５４は、凹部１５２から外部接続への流体の経路を通りすぎることから卵母細胞を防ぐような寸法に作られてもよい。図８と９で示されるように、流路１５４に沿って、卵母細胞が通過することを妨げるように作用する、くびれ２１０が、流路１５４に設けられている。
【００６２】
図８と９の実施形態は、部分１５７と２１７に隣接する管状の部分を有する、おとり形式（Lure-type)の流体接続２１８と２２０を示す。これらの接続は、装置の流れシステムと、装置へ、または装置から流れる流体を提供するのに使用されるいかなる外部流れシステムまたは装置と、の間の連通を適切にするいかなる形式をとってもよい。例えば、いかなるまたは全てのポートは、公知のいかなる方法で外部装置と関連付けられるポートに連通させられてもよい。装置は、外部装置に設置されたポートにポートを一直線にするような方法で、外部装置に適合するように設計されてもよい。
【００６３】
ベース１５０とふた１５８は、それらが組立てられたときに、それらが一緒に保持されることを引き起こす特徴を有して設けられてもよい。そのような特徴は、ベース、ふた、または両方の部分として形成された、スナップ式の特徴、または他のクリップのような特徴でもよい。あるいは、別個のクリップ又は取り付け装置が、ベースとふたを一緒に保持するように、設けられてもよい。複数のベースとふた構成要素は、例えば、それらが、グループとして取り扱われることを可能にする、共通の取り付け装置に収容されてもよい。この実施形態は、標準的な、ロボット使用の流体取り扱い装置に対応する形式で配置される、多くのより小さな装置を可能にすることが、特別な有利点でもよい。
【００６４】
シーリング面１５３と１５９は、平面で、または、それらが近接して保持されるときには、それらを通る流体経路を閉じることを助ける特徴を有してもよい。そのような特徴は、面を互いに保持し、または、表面に平行に面を調整するように作用する、くぼみ、またはキー（keying）の特徴を含んでもよい。面の少なくとも一つは、弾性材料から形成されていて、面全体を覆ってまたは、ポートの周辺だけのいずれかに配置されてもよい。一つ又は両方の面のポートを取り囲む、突起部分のような特徴は、面を一緒に保持するために使用される所定の力ので、これらの領域に、より高い圧力でシールするために、設けられるのが好ましい。
【００６５】
装置は、公知のさまざまな手段によって、組立てられることができる。図８と９で示された実施形態は、幅広い範囲の材料と加工手段が使用されることを可能にするデザインを有している。特に有利な特徴は、透明な材料が使用される場合には、卵母細胞は、凹部１５２または流路２０４のいずれかに位置付けられるときに、特に卵母細胞が凹部の内側領域２０２に位置付けられるときには、卵母細胞は、しっかりと観察され、そのような場合には、卵母細胞は、凹部の固体のベースを通して観察される。図８と９のデザインでは、このベースは、組み立て過程で、簡単に選ばれて、制御されることができる、光学的な特性を有している。そのデザインは、凹部の固体のベース材料の光学的な特性に適合されることができる対物レンズ（lens objectives）を使用する観察を可能にし、可変の液体媒体の深さと不明確な特性を通して、不確定なコントラストを有する、フィルター媒体を通して、または、フィルター媒体に対して観察は行われない。
【００６６】
本体部分２３０を有するように示される図８と９の実施形態のベース構成要素で示され、凹部、流路、くびれ、ポート及び外部の流体接続を容易にする特徴を含む流れシステムの構成要素が形成される。本体部分の大きな表面に開いている構成要素は、開口流路または他の特徴の形式である。本体部分は、平面構成要素２３２で密閉されていて、本体構成要素の下側面に形成された流れ構成要素を閉じるように作用する。同じように、本体部分２３４を有するように示されるふた構成要素は、平面構成要素２３６により閉じられている。好ましい組み立て手段は、本体構成要素を型成形されたＰＭＤＳから形成し、平面構成要素２３２と２３６を、ガラスから形成し、その後、接着するために、一方のまたは両方の接着面にプラズマ活性化を使用する。そのような組み立て手段は、非常に公知である。例えば、可塑性の平面閉鎖構成要素の使用、改良されたプラズマ接着過程により、または、例えば、クランプ又はクリップ取り付けにより、本体部分と平面部分を一緒に保持する力を使用することのいずれかの、他の組み立て手段が知られている。射出成形または型押しのような、可塑性のある形成手段は、一方のまたは両方の構成要素を形成するのに使用されてもよい。一方、図８の実施形態は、本体構成要素２３０、２３４に形成された、流路または他の流れ構成要素を示し、他の実施形態では、一以上の流れ構成要素が、平面構成要素２３２、２３６の全体に、または部分的に形成される。
【００６７】
装置の流体機構の典型的な寸法は、取り扱われる細胞構成要素のタイプと、対象となる用途に適するように選択される。いくつかの用途では、単一の細胞構成要素または、細胞構成要素の小グループは、個々の化学環境を達成するように、または、それらをＸ-Ｙ位置に簡単に位置付け可能に、配置するように、個々の凹部に保持されることが、要求される。そのような用途の例は、胎生学で、例えば、卵母細胞と胚を取り扱うときに生じ、化学環境の個々の制御が望ましくてもよく、素早いＸ-Ｙステージの動作を行う装置で、その場で、多くの卵母細胞または胚を観察することができることが有益である。そのような用途では、凹部の内側領域が、単に単一のまたは、少量の細胞構成要素を保持するような寸法で作られている。それ故、凹部の内側領域の断面寸法は、細胞構成要素の最大の断面寸法の１から約１０倍の範囲であることが好ましく、その最大寸法の１倍と５倍との間であることがより、好ましい。例えば、最大寸法１００μｍの卵母細胞と胚を使用するためには、凹部の内側領域は、１００μｍから１ｍｍの範囲の寸法を有することが好ましく、１００μｍから５００μｍの範囲の寸法を有することがより好ましい。単一の哺乳類の細胞または、小グループの細胞を培養し、または取り扱うために、凹部寸法は、１０μｍから１００μｍの範囲が好ましく、１０μｍから５０μｍの範囲がより好ましい。他の実施形態では、凹部の内側領域の部分は、細胞構成要素の最大寸法よりも小さな断面寸法を有する。
【００６８】
凹部と、流れシステムの他の機構は、用途および組み立て手段に適した、いかなる断面外形をも有することができる。詳細には、簡単な組立てのために、凹部は、円形断面を有してもよい。流路が、機械加工成形から、型成形または型押しによって、成形される場合には、略矩形断面を有してもよく、また、中実基板からエッチング処理された場合、例えば、既知の、写真平板術、膜蒸着、エッチング処理過程のような、標準的なミクロ加工過程で使用されるような、ミクロ加工技術手段を使用する場合には、円形形状を有してもよい。
【００６９】
凹部から、または、存在する場合には、流路のくびれから、導かれる、流路の最小寸法は、細胞構成要素が圧力の元で変形するような、あらゆる傾向のために作られた遊びを有し、凹部と流路を通る流体の流れの動作に対して、細胞構成要素を十分に保持されるように選択される。くびれの望ましい最小寸寸法は、細胞構成要素の最小寸法の半分である。
【００７０】
卵母細胞と、胚に使用するための図８と図９の実施形態のための寸法例は、以下の通りである。（全ての寸法は概略である）円形断面の凹部１５２は、ベースシーリング面１５３に形成された開口部２００で３ｍｍの直径であり、先細りして、内側領域２０２で直径５００μｍである。凹部は深さ約３ｍｍである。流路２０４はまた、円形断面の先細りした凹部の形で、ふたのシーリング面１５９に形成された、開口部２０６で３ｍｍの直径であり、流路１５４の接点近くの流路の内側領域で直径１ｍｍである。くびれ１６４と２１０は、高さ５０μｍである。
【００７１】
流体接続の例と装置の操作が以下で示される。接続と操作の他の形式が可能であり、本発明の範囲に含まれる。
【００７２】
装置は、まず初めに、凹部１５２に接近するために、分解される。凹部１５２は、次に、流体接続２１８を使用して、流路１５６を介して、ポート１５７を通る溶媒により、部分的に満たされる。一以上の細胞構成要素が、凹部中に、ピペット操作により入れられ、ふた１５８は、ベース１５０上で組み立てられる。装置を通る流体の経路は、その後、ポート１５７を介して満たされることができ、一方、卵母細胞または複数の卵母細胞は、くびれ１６４と２１０との間の流体経路の領域中、すなわち、凹部１５２と流路２０４によって形成される空間に保持される。溶媒は、その後、どちらの方向でも、凹部を通って流されることができる。卵母細胞は、前の従来技術のように、ふたを取り外して、凹部１５２からのピペット操作により、凹部から取り出されることが可能である。流路１５６を通る流れは、吸引過程を助けることが可能であってもよい。動作時には、気泡を閉じ込めることなしに、凹部に液体を完全に満たすことを達成するのに有利であって、万一気泡が取り込まれてもシステムから効率的に気泡を取り除くのに有利である。装置が組立てられたときには、流体の経路は、先細りした流路２０４に隣接する、先細りした凹部１５２を具備する、図８と９の配置は、例えばこの配置が、正方形のベースを伴う、または、突き出した部分または突然の直径の変化を有する組立てられた装置の経路を伴う、凹部などの、他の配置よりも、よりよい呼び水とその後の気泡の排除、を与えるということが実験で分かったという、この点で特に好ましい。この結果、凹部１５２中の開口部２００と流路２０４の開口部のデザインは、同じ断面形状であるのが好ましい。凹部１５２と流路２０４の開口部が円形断面で、同じ直径である、本実施形態は、特に好ましい。
【００７３】
図１０、１１及び１２は、更なる実施形態を示し、その実施形態では、複数の凹部が備えられ、各々が、図８と９の実施形態で説明されたような流れシステムに関連付けられ、複数の凹部に平行に、流体接続を設けるように配置された更なる流路とポートに関連付けられている。凹部に関連付けられた流れシステムの配置は、図８と９で示される配置と類似していて、同じ機構は、同じ番号で示される。図１０は、組立てられたときの装置の平面図を示し、図１１は、Ｘ-Ｘでの断面図を、図１２は、Ｙ-Ｙでの断面図を示す。
【００７４】
装置は、ベース構成要素１５０とふた構成要素１５８を有し、インレットポートからアウトレットポートに装置を通る閉じられた流体経路を形成するように、互いに組立てられることができ、凹部１５２に接近するために、分解されることができる。ベース構成要素は、ベースシーリング面１５３を有し、ふたは、ふたシーリング面１５９を有していて、近接されたときに、ベースとふたの間に、多くの個々の流体経路を完成するように作用する。ベース構成要素は、複数の流れシステムを含んでいて、各々が、ベースシーリング面１５３に開いている凹部１５２を有し、卵母細胞が、凹部から離れることを妨げる、流路内に任意のくびれ１６４を伴う、凹部から延びている、少なくとも一つの流路１５６を有する。流路１５６は、１以上のポート２５３、２５４に伸びる、第一の連結流路２５０に、流体で連通し、各々が、流体接続２１８に流体により連通し、ポートまたは複数のポートは、装置の外部の流れシステムへ流体の流れを、および、流れシステムから流体の流れを可能にするように作用する。図１０では、ポート２５３に近接した管２１８のように流体接続が示されるが、図８，９の実施形態で示される、おとりの流れ接続のような、公知のいかなる適切な流体接続が使用されてもよい。
【００７５】
図１０の実施形態は、図８と９の実施形態と、類似の好ましい配置を有していて、流体接続は、ベース構成要素１５０を介して作られる。それ故、ベース構成要素は、また、複数の流路２１４を有する、第二の流れシステムを含み、各々が、ベース構成要素のシーリング面１５３に形成されたポート２１５に延びていて、流路２１４は、第二連結流路２５２に流体で連通している。第二連結流２５２は、一以上のポート２５５，２５６に伸びていて、各々が、流体接続２１８に流体で連通していて、ポートは、装置の外部の流れシステムに流体の流れを可能にし、装置外部の流れシステムからの流体の流れを可能にするよう作用する。
【００７６】
ふた構成要素１５８は、複数の流れシステムを含み、各々が、ふたシーリング面１５９に開口する流路２０４を有していて、流路は、図１１と１２で示されるような、先細りした凹部の形式で、あってもよく、流路２０４は、ふたに形成されたポート２１３に流体で連通する。流れシステムは、ポート２１３に延びる流体の経路を形成する、１以上の更なる流路１５４を有してもよい。流路２０４と流路１５４のいずれか一方は、例えば、凹部との接点で、流路中にくびれ２１０を設けることによって、卵母細胞を、流路２０４から離れることを妨げるようにされる。
【００７７】
図１０，１１および１２で示された好ましい実施形態では、ふたの流れシステムが、ベースの第二の流れシステムを介して作られて、更なる流路２１２が、流路２０４に連通して、ふたシーリング面１５９に形成されたポート２１３に開口するふたの流れシステム中に設けられる。ふたとベースの流れシステムは、ふたがベース上に組立てられるときに、ベースシーリング面１５３とふたシーリング面１５９が近接され、流路２１２が、ポート２１３と２１５を介して、ベースの第二の流れシステムの流路２１４に流体で連通されるように、配置される。この第二の流れシステムは、第二の連結流路２５２と流路２０４、従って凹部１５２の上側開口部との間に流体での連通を提供する。
【００７８】
凹部が組立てられたときに、各々の凹部１５２への開口部は、各々の流路２０４への開口部に流体で連通され、ふたの流路２１２は、各々の流れシステムのために、ベースの流路２１４に流体で連通される。このことは、第一の連結流路２５０から流路１５６を通る、各々の凹部を通る閉じられた流体経路と、くびれ１６４（もしあれば）、凹部１５２、ふたの流路２０４、ふたのくびれ２１０（もしあれば）、流路１５４と２１２、流路２１４と第二の連結流路２５２を確立する。
【００７９】
各々の流体システムの流路２０４への流体での連通が、ふたの構成要素に関連付けられた一以上の流体接続を介して達成される、実施形態が本発明に含まれている。この場合には、上述したベースの第二の流れシステムは、省略されることが可能である。このことは、ふたに設置されたポート２１３を介して、ふたの各々の流れシステムへの独立した、流体接続を含んでもよい。第二の連結流路２５２が、ふた構成要素に形成される実施形態が、本発明に含まれる。この場合には、一以上の流体接続が、ふたに関連付けられた流体接続を介して、第二の連結流路に作られてもよい。あるいは、ふたの第二の連結流路の各々の端部に流体で連通する、接続流路が、ふたとベースに設けられてもよく、装置が組立てられたときに、個々の流れシステムのために上述した方法で、流体の連通を一直線にして確立する。
【００８０】
第一のおよび第二の連結流路は、その全長に沿って、単一の断面寸法でもよく、または、断面は、その全長に沿って変わってもよい。凹部１５２と連通流路を含む流れシステムは、本質的に、互いに類似していてもよく、または、異なって設計されてもよい。各々の流れシステムは、第一の連結流路と第二の連結流路との間に連通する、他の流れシステムに平行に見える。液体で満たされるときは、各々の流れシステムを通る流れは、各々の流れシステムを通る、液体の流動抵抗に比例する。装置は、連結流路の端部のポート間で測定されたときに、各々の流れシステムを通って、類似の、液体の流動抵抗を有するように設計されるのが有利である。装置が、連結流路の流動抵抗が各々の流れシステムを通る、流動抵抗と比較して無視できるように設計されている場合には、その結果、各々の流れシステムを類似に設計することにより、各々の流れシステムを通る流れが類似する。しかしながら、連結流路に大きな流動抵抗がある場合には、その結果、連結流路の寸法は、その長さに沿って、変わるように設計される、または、類似の全流動抵抗を作るために、従って、各々の凹部を通る流体の流れを作るために、流れシステムの寸法は、互いに異なるように設計されるかのいずれかである。ある場合には、凹部を通る流れを等しくなくするように設定することが有利であってもよく、その場合には、連結流路および／または、流れシステムの寸法は、適宜に設定される。
【００８１】
図１０、１１および１２の実施形態は、図８、９またはいかなる前の実施形態のために使用されたような同じ手段によって、組立てられる。流路の配置と他の流れ機構の類似の変化は、本発明の範囲内である。図１０と１１および１２の本発明の機構の寸法は、図８と図９の実施形態で特定された機構の寸法と類似する。
【００８２】
流体接続と装置の操作の例は以下に示される。接続と動作の他の形式が可能であり、本発明の範囲である。
【００８３】
２以上の接続が、図１０で示されるように第一の連結流路に設けられ、次に、第一の連結(２６０)が、流体のインレットとして機能して、第二の連結(２６２)が、通気孔として機能する。異なった液体の溶媒が装置に取り込まれることが必要とされる場合には、更なる連結が、更なるインレットとして作用するように設けられてもよい。いくつかの実施形態では、一つの流体接続だけが、第一の連結流路に作られて、その場合には、凹部と連通流路を有する流れシステムを通って、達成される、流体のインレットおよび通気孔として作用する。流体接続(２６４、２６６）は、第二の連結流路の先端に少なくとも設けられているのが好ましい。通常の使用時には、これらは流体のアウトレットとして作用する。バルブ２７２は、通気孔２６２を開閉するために設けられていて、バルブ２７４と２７６は、アウトレット２６４、２６６のために設けられている。ポンプ２７０は、インレット２６０の中に液体の流れを作動するために設けられている。
【００８４】
使用時には、装置は、凹部１５２に接近するように、最初に分解される。第一の連結流路２５０は、空気孔バルブ２７２を開けて、ポンプ２７０の手段によって、溶媒で洗い流される。バルブ２７２は、次に閉じられて、凹部１５２は、第一の連結流路を通る媒体で、ポンプを使用して、部分的に満たされる。卵母細胞は、次に、ピペット操作により、凹部に入れられて、ふた構成要素が取り付けられる。バルブ２７４と２７６を開けて、バルブ２７２を閉じながらのポンプの作動は、流れシステムの残りの部分を満たす。第二の連結流路２５２の両先端でのアウトレット部分の提供が、空気に、両方向に液体によって、移動させられることを可能にし、空気とアウトレット間の第二の連結流路に位置付けられた液体の塊によって捕えられる空気を、一つのアウトレットだけに生じる状況を避ける。第二の連結流路は、両方のアウトレットを液体で満たして、次に、２７４のバルブの一つが、閉じられて、液体が、他のアウトレットポートと、アウトレットバルブ２７６を介して、システムを通って流れる。最適な通気を達成することが必要とされる場合には、２以上のアウトレットが、第二の連結流路との長さに沿った位置で設けられてもよい。
【００８５】
図１０、１１及び１２の実施形態は、第一の連結流路と第二の連結流路の間に平行に連結された多くの流れシステムを示す。他の形式の流体接続が、本発明の範囲に含まれることが理解される。例えば、装置の全てのまたはいくつかの流れシステムの連続した連結が予想される。また、更なる、第一の連結流路と第二の連結流路とが設けられてもよく、各々の一対は、流れシステムの更なるグループに連通する。分配流路は、装置の一部として設けられてもよく、流体の流れを提供し、それらから、流体の流れが提供されるために、更なる第一の連結流路と第二の連結流路に連通する。これらの更なる流路は、ベース構成要素全体または、ふた構成要素全体に形成されてもよく、または、それらが組立てられたときに、それらの間で、形成されて、閉じられてもよい。それらは、上述した方法の流体の連通を生じさせるポート手段によって、ベース構成要素とふた構成要素との間に通ってもよい。
【００８６】
流体の貯蔵凹部が、上述したいかなる実施形態に従った装置に組みこめられてもよく、装置に含まれた、いかなるまたは全ての凹部と流れシステムに流体を供給し、いかなるまたは全ての凹部と流れシステムから流体を受け取るように作用する。これらの貯蔵凹部は、ベース構成要素またはふた構成要素、またはそれらに流体接続を生じるベース構成要素またはふた構成要素に適合するようにされた更なる構成要素に設置されてもよい。ポンプとバルブは、また、ベースの部分、ふたの部分または更なる構成要素のいずれかとして、その装置に設けられてもよい。流体の貯蔵凹部、バルブ、ポンプを有する構成要素は、ベースからふたを取り外すことなしに、装置から取り外し可能なように、または、取り付け可能なように、設計されてもよい。
【００８７】
本発明の装置は、装置に流体の流れを提供して制御するそして、装置から流体の流れを提供されて、制御する外部装置と一緒に作動するように設計されてもよい。外部装置は、一以上のそのような装置を収容してもよい。外部装置は、装置に流体を供給し、また装置から流体を受けとってもよく、また、例えば、装置の流体の貯蔵凹部にガス圧力を加える事によって、または、その中に流体の流れを引き起こすために装置の変形可能な部分に物理的な力を加えることによって、装置の貯蔵凹部に流体の流れを生成するように、または、装置の貯蔵装置から、流体の流れを生成するように装置に作用してもよい。装置は、ポンプ、バルブ、測定機器および温度制御装置のような、電動構成要素、または電気制御された構成要素のような、更なる構成要素を有してもよく、それゆえ、外部装置の相当する接続部分に接触させるための電気的な接続が設けられてもよい。装置は、装置がそのように設置されたときに、流体ポートの連通を生じさせ、および／または電気接続を接触させるように、外部装置の上にまたは外部装置に設置してもよい。装置は、装置が外部装置から離されたときに、電力を蓄え、そのような構成要素を動かすことができる、電源が設けられてもよい。装置は、外部装置から独立している期間動作することを可能にするように、更なる、ポータブル電源および、外部制御手段により、動作可能に設計されるのが有利であり、第一の外部装置から離れて設置され、一つの外部装置ともう一つの外部装置との間の装置中で、細胞構成要素を輸送するために使用されることができるのに有利である。
【００８８】
凹部から卵母細胞を取り出す更なる手段は、ふたの流路２０４が、ピペットが収容されるのに、充分広い凹部の形であるときに、使用可能である。卵母細胞は、流れにより凹部１５２と流路２０４の間で動かされることができて、または、まだ組み立てられている間に、凹部が反転されても、卵母細胞は、凹部から流路間の沈殿物である。ベース１５０は、次に、ふたから取り外されて、開口部２０６お通って、ピペットで接近することを可能にするように流路２０４を開けたままにさせる。卵母細胞は、次に、流路２０４の内側領域２０８から、ピペットに吸引される。図８と９で示される実施形態は、この更なる取り出し手段のために適していて、適用されると、流路２０４が凹部の形であって、凹部１５２の内側領域の直径よりも、その内側の領域２０８でより大きな直径を有する。このことは、凹部１５２の外に、ピペット操作で取り出すよりも、容易に、ふたの流路２０４の外に、ピペット操作で取り出すことを可能にし、一方、溶媒にさらされることを制御し、または容易な光学的な観察のための卵母細胞の正確な配置を制御するために、凹部１５２の内側領域に閉じ込められた環境を依然として与える。いくつかの実施形態では、第二凹部２０４は、凹部の底に到達するようにピペット操作を可能にするのに、十分大きな内側領域を有してもよい。他の実施形態では、第二凹部は、ピペットの先端を卵母細胞または複数の卵母細胞への到達を制御するために、底の上に一定間隔でピペットを位置付けるような寸法に作られてもよい。流路または凹部２０４は、次に、卵母細胞を動かして取り扱うために使用されてもよく、複数のそのような凹部が設けられた場合には、前の実施形態の凹部５０、１５２で説明されたような同じ方法で、ロボットを使用するピペット操作装置とともに使用されるようにされてもよい。
【００８９】
本発明は、他の基板に接する一つの基板の表面で、その長さに沿って、閉じている流路を有する一つの装置を提供する。本発明は、流路が２つの基板のどちらかまたは、両方に形成されて、ポートの開口部、または凹部の周りにシールが設けられたシール面を伴う、一直線になったポート、開口部または、流体の経路を備える凹部のような係合をもたらす。どちらの場合でも、ふたの基板とベースの基板は、完全な流体の経路を形成するように接続する。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１ａ】図１ａは、本発明に従った第一装置の断面図を示す。
【図１ｂ】図１ｂは、本発明に従った第一装置の平面図を示す。
【図１ｃ】図１ｃは、別の実施形態の断面図を示す。
【図２ａ】図２ａは、好ましい凹部形状の断面図を示す。
【図２ｂ】図２ｂは、好ましい凹部形状の別の断面図を示す。
【図３ａ】図３ａは、装置中の液体が、空気圧を使用してどのように動かされるかを示す。
【図３ｂ】図３ｂは、装置中の液体が、空気圧を使用してどのように動かされるかを示す。
【図４ａ】図４ａは、本発明に従った他の実施形態の断面図を示す。
【図４ｂ】図４ｂは、本発明に従った他の実施形態の平面図を示す。
【図４ｃ】図４ｃは、本発明に従った他の実施形態の別の平面図を示す。
【図４ｄ】図４ｄは、本発明に従った他の実施形態の別の平面図を示す。
【図４ｅ】図４ｅは、本発明に従った他の実施形態の別の平面図を示す。
【図４ｆ】図４ｆは、本発明に従った他の実施形態の別の断面図を示す。
【図４ｇ】図４ｇは、本発明に従った他の実施形態の別の断面図を示す。
【図４ｈ】図４ｈは、本発明に従った他の実施形態の別の断面図を示す。
【図４ｉ】図４ｉは、本発明に従った他の実施形態の別の断面図を示す。
【図４ｊ】図４ｊは、本発明に従った他の実施形態の別の断面図を示す。
【図４ｋ】図４ｋは、本発明に従った他の実施形態の別の平面図を示す。
【図４ｌ】図４ｌは、本発明に従った他の実施形態の別の断面図を示す。
【図４ｍ】図４ｍは、本発明に従った他の実施形態の別の断面図を示す。
【図４ｎ】図４ｎは、本発明に従った他の実施形態の別の断面図を示す。
【図４ｏ】図４ｏは、本発明に従った他の実施形態の別の断面図を示す。
【図５ａ】図５ａは、本発明に従った更なる実施形態の断面を示す。
【図５ｂ】図５ｂは、本発明に従った更なる実施形態の別の断面を示す。
【図６ａ】図６ａは、本発明に従った更なる実施形態の断面を示す。
【図６ｂ】図６ｂは、本発明に従った更なる実施形態の別の断面を示す。
【図６ｃ】図６ｃは、本発明に従った更なる実施形態の別の断面を示す。
【図７】図７は、本発明に従った装置を伴うロボットを利用したピペットの斜視図を示す。
【図８】図８は、共に組み立てられた第一および第二基板を有する、別の実施形態断面を示す。
【図９】図９は、第一および第二基板が分離された、図８の実施形態を示す。
【図１０】図１０は、組み立てられたときの装置の平面図を示す。
【図１１】図１１は、Ｘ-Ｘ断面に沿う、図１０の装置の断面図を示す。
【図１２】図１２は、Ｙ-Ｙ断面に沿う、図１０の装置の断面図を示す。
【図１ａ】
2007504816.tif 000003
【図１ｂ】
2007504816.tif 000004
【図１ｃ】
2007504816.tif 000005
【図２ａ】
2007504816.tif 000006
【図２ｂ】
2007504816.tif 000007
【図３ａ】
2007504816.tif 000008
【図３ｂ】
2007504816.tif 000009
【図４ａ】
2007504816.tif 000010
【図４ｂ】
2007504816.tif 000011
【図４ｃ】
2007504816.tif 000012
【図４ｄ】
2007504816.tif 000013
【図４ｅ】
2007504816.tif 000014
【図４ｆ】
2007504816.tif 000015
【図４ｇ】
2007504816.tif 000016
【図４ｈ】
2007504816.tif 000017
【図４ｉ】
2007504816.tif 000018
【図４ｊ】
2007504816.tif 000019
【図４ｋ】
2007504816.tif 000020
【図４ｌ】
2007504816.tif 000021
【図４ｍ】
2007504816.tif 000022
【図４ｎ】
2007504816.tif 000023
【図４ｏ】
2007504816.tif 000024
【図５ａ】
2007504816.tif 000025
【図５ｂ】
2007504816.tif 000026
【図６ａ】
2007504816.tif 000027
【図６ｂ】
2007504816.tif 000028
【図６ｃ】
2007504816.tif 000029
【図７】
2007504816.tif 000030
【図８】
2007504816.tif 000031
【図９】
2007504816.tif 000032
【図１０】
2007504816.tif 000033
【図１１】
2007504816.tif 000034
【図１２】
2007504816.tif 000035
【国際調査報告】
2007504816.tif 000036
2007504816.tif 000037
2007504816.tif 000038
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