(57)【要約】本発明は、体液試料中のハプトグロビン1前駆体の濃度を評価することによって、卵巣癌を検出する方法、卵巣癌の処置の有効性をモニタリングする方法、および卵巣癌の重篤度を評価する方法に関する。本発明はまた、卵巣癌の診断、卵巣癌の処置の有効性のモニタリング、または卵巣癌の重篤度の評価において使用するための、ハプトグロビン1前駆体に特異的な抗体または核酸プローブを含むキットにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵巣癌を患うことが疑われる被験者由来の体液試料中のハプトグロビン1前駆体濃度を決定する段階を含む、卵巣癌を検出する方法であって、対照試料中におけるハプトグロビン1前駆体濃度と比べて増大したハプトグロビン1前駆体濃度が、癌の存在の指標となる、方法。
【請求項２】
卵巣癌を患うことが疑われる被験者由来の体液試料中のハプトグロビン1前駆体濃度を決定する段階を含む、卵巣癌の処置の有効性をモニタリングする方法であって、処置前のレベルと比べて減少したハプトグロビン1前駆体レベルが、処置の有効性の指標となる、方法。
【請求項３】
卵巣癌と診断された、または卵巣癌を患うことが疑われる被験者の体液中のハプトグロビン1前駆体濃度を定量的に決定する段階を含む、卵巣癌の重篤度を評価する方法であって、対照試料中におけるハプトグロビン1前駆体濃度と比べて増大したハプトグロビン1前駆体濃度が、癌の存在および/または重篤度の指標となる、方法。
【請求項４】
体液が、血液、血漿、血清、腹水、または尿である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
体液が、多量のタンパク質を減少させ、それによって少量のタンパク質の検出感度を増大させるための予備段階に供される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
ハプトグロビン1前駆体レベルと、1つまたは複数の他の卵巣癌マーカーとを相関させる段階をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
他のマーカーが、インテグリン結合キナーゼ（ILK）、CA125、TADG-12、メソテリン（mesothelin）、カリクレイン10、プロスタシン（prostasin）、オステオポンチン、クレアチンキナーゼβ、セロトランスフェリン（serotransferrin）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（lipocalin）（NGAL）、CD163、またはGc-グロブリンである、請求項6記載の方法。
【請求項８】
他のマーカーが、インテグリン結合キナーゼ（ILK）、CA125、セロトランスフェリン、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（NGAL）、またはCD163である、請求項6または7記載の方法。
【請求項９】
a）卵巣癌の診断；b）卵巣癌の処置の有効性のモニタリング；またはc）卵巣癌の重篤度の評価において使用するための、ハプトグロビン1前駆体に特異的な抗体または核酸プローブを含むキット。
【請求項１０】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求項9記載のキット。
【請求項１１】
抗体が、α鎖内のエピトープと反応しない、請求項9または10記載のキット。
【請求項１２】
抗体が、ハプトグロビン1前駆体に特異的である、請求項9〜11のいずれか一項記載のキット。
【請求項１３】
a）卵巣癌の診断；b）卵巣癌の処置の有効性のモニタリング；またはc）卵巣癌の重篤度の評価における、ハプトグロビン1前駆体に特異的な抗体または核酸プローブの使用。
【請求項１４】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求項13記載の使用。
【請求項１５】
抗体が、α鎖内のエピトープと反応しない、請求項13または14記載の使用。
【請求項１６】
抗体が、ハプトグロビン1前駆体に特異的である、請求項13〜15のいずれか一項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の診断法およびモニタリング法に関する。特に本発明は、特に疾患初期における卵巣癌および他の生殖器官の癌のスクリーニング法、ならびに、卵巣癌および他の癌の処置および臨床管理に関するモニタリングおよび予後、ならびに、これらの方法で有用な分子マーカーを対象とする。
【０００２】
なお本出願は、2003年9月5日付の豪州仮出願第2003904844号に基づく優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
本明細書において引用された、任意の特許または特許出願を含む全ての参考文献は、参照として本明細書に組み入れられる。いずれの参考文献も、先行技術を構成するとは認められない。参考文献の考察は、それらの著者らが主張することについて記述するものであり、かつ本出願人は、引用文献の正確性および妥当性に疑問を呈する権利を保有する。本明細書においては、多くの先行技術刊行物が参照されているが、これらの文献のいずれかが、当技術分野、豪州、または他の任意の国における共通の一般知識の一部を形成することを、この参照が容認するものでないことは、明らかに理解されるであろう。
【０００４】
卵巣癌は、婦人科学的悪性腫瘍による死亡の主要原因であり、かつ、豪州の女性における癌死の4番目の主要原因である。癌は高度に転移性であり、離れた部位での二次成長をもたらし、かつ、進行した上皮卵巣癌と診断された患者の大部分は、広範囲にわたる転移を有する。卵巣癌についての惨憺たる結果は、初期の治療可能な段階で腫瘍を検出できないことに起因する。グレードI腫瘍の90%は現在の管理方法によって治癒可能であるので、初期段階で診断された場合、卵巣癌患者は十分に回復の見込みがある。現在、初期の治療可能な段階において卵巣癌を同定するための唯一の実行可能な方法は、癌細胞において過剰発現し、それゆえ癌細胞から腹膜腔へと分泌され、かつ最終的に循環血液へと吸収されるタンパク質の同一性を確認することであると考えられている。
【０００５】
現在まで、初期段階でのスクリーニングの目的に適切な卵巣癌の明確なマーカーは同定されていない。CA125は卵巣癌と関連する血清抗原であり、かつ、この抗原に対するモノクローナル抗体は、状態の診断およびモニタリングにおいて広く使用されている。しかし、この抗原のレベルは、他の婦人科学的癌、卵巣嚢胞、子宮内膜症もしくは子宮筋腫のような非悪性の婦人科学的状態、肝臓病、腎不全、または膵臓炎において、かつ、時には感染にさえ応答して増大する（MackayおよびCreasman、1995）ため、CA125値は卵巣癌の特異的な指標ではない。さらに、卵巣癌の症例の一部においては、CA125値と疾患進行との関係が同定されておらず、そのため、これは卵巣癌の初期スクリーニングのマーカーとして信頼できない。より最近になって、ポリメラーゼ連鎖反応によってクローニングされたセリンプロテアーゼである、腫瘍関連性差次的発現遺伝子（tumour-associated differentially expressed gene）-12（TADG-12）が、約75%の卵巣癌腫において過剰発現することが示され、かつ代替マーカーとして示唆されている（Underwood LJ、2000）。しかし、このマーカーは卵巣癌との関連度が低いので、偽陰性となる可能性がある。
【０００６】
したがって、卵巣癌による死亡率を低下させるためには、血液中、血漿中、または血清中で好ましくは検出可能である分子マーカーを同定し、初期段階疾患の検出における既存の試験の使用を補完することが、甚だしく必要である。
【０００７】
プロテオミクスは、患者の血清、他の体液、および組織でのハイスループット発見アプローチにおいてタンパク質分子を同定することができる新技術であり、これによって、十分な濃度で腫瘍細胞から分泌または放出されるタンパク質に関する情報が提供される。癌患者の血清タンパク質は、疾患進行に伴う血清タンパク質プロファイルの改変のために、バイオマーカーの豊富な供給源となる。血清は、疾患を有する器官を循環しつつ、腫瘍およびその宿主の微環境によって産生されたタンパク質を取り込む。それゆえに、癌関連血清プロテオームは、疾患プロセスの結果として過剰発現され、もしくは異常に流出したタンパク質を表すか、または、タンパク分解性分解経路の異常な活性化の結果としてプロテオームから除去されるタンパク質を表す。したがって、癌細胞特異的なタンパク質分子における小さいが有意な変化は、疾患の最も初期の段階においてさえ血清プロテオームに反映される可能性があり、これにより、疾患の検出およびモニタリングにおいて、より有効であると考えられるバイオマーカーの組合せを同定することが可能になる。癌細胞から分泌されて循環血液によって吸収される過剰発現タンパク質は、血清中のタンパク質産物を測定するアッセイにおいて使用するための潜在的な候補となるマーカーである。分泌されたタンパク質は、患者における抗体応答を引き起こし、この場合、抗体に基づく血清マーカーが実現可能となる。
【０００８】
プロテオミクス法で一般的に使用される、エレクトロスプレーイオン化質量分析、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（MALDI-TOFMS）、および表面増感レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（SELDI-TOFMS）の技術は、何千種類ものタンパク質におけるパターンまたは変化を同定する可能性、および、血清または血漿などの複合体液に存在するほとんど全ての低分子量タンパク質の広域分析を可能にする可能性を有する。
【０００９】
94%の陽性的中率で癌性群と非癌性群とを識別する、卵巣癌患者の血清学的プロテオミクスパターンが最近記載された（Petricoinら、2002）。このアプローチは、卵巣癌の初期段階スクリーニング用のバイオマーカーを発見するための探索において新規な方向性を表し、ここで、初期癌患者由来のタンパク質の独特なプロファイルは、診断用基準として使用できる健常被験者のプロファイルに対して識別可能なタンパク質パターンを作成することができる。しかし、特異性が低いため、このアプローチの適用性は未だ評価中である。
【００１０】
ハプトグロビンは、ヘモグロビンと結合する急性期糖タンパク質であり、したがって、炎症または傷害の結果としての鉄欠乏および腎障害を予防する（Wassell、2000）。天然型の成熟ハプトグロビンは、分子間ジスルフィド結合によって結合した、同一でない2つのαおよびβサブユニットから構成される、分子量約90,000kDaの四量体である（HanleyおよびHeath、2000）。ハプトグロビンは、ハプトグロビン1-1、ハプトグロビン2-1、およびハプトグロビン2-2という3種類の主要な表現型形状を有し、いずれかまたは全ての対立遺伝子が単一の個体中に存在しうる。個々の表現型は、心血管性および自己免疫性の障害、ならびにいくつかの悪性状態を含む、種々の状態と関連している。しかしながら、前立腺癌など他の癌においては、悪性転換の結果としてハプトグロビン発現が消失する（Meechanら、2002）。
【００１１】
インビボにおいて、ハプトグロビンは、分子量38,000kDaを呈する単一のポリペプチド前駆体として合成される。成熟タンパク質の3つの表現型全てが、ハプトグロビン1前駆体という単一の前駆体に由来すると考えられる。ポリペプチド前駆体はタンパク質分解的にプロセスされ、天然タンパク質のαおよびβサブユニットを形成する（Haugenら、1981）。前駆体タンパク質は、α鎖の前のアミノ末端18残基シグナル配列、および/または、α領域とβ領域との間の介在ポリペプチドを含む（Misumiら、1983）。インビボにおいて翻訳後事象は、膜関連酵素系によるシグナル配列のタンパク質分解性除去、および、β領域へのコアオリゴ糖側鎖の取込みをもたらす（Haugenら、1981）。翻訳後修飾はまた、前駆体ポリペプチドのα領域およびβ領域双方の開裂をもたらし、天然型タンパク質を形成させ得る（Haugenら、1981）。ハプトグロビンの生合成およびプロセシングにおける独特な様式の生物学的重要性は未だ明らかでないが、新たに合成されたハプトグロビンの相当の割合が単一のポリペプチド前駆体として分泌されることが示されている（Misumiら、1983）。
【００１２】
1970年代の初期に、高濃度の血清ハプトグロビンが卵巣癌患者において最初に報告された。ハプトグロビン濃度は、腫瘍の負荷量の程度に影響されることが示されたが、卵巣悪性腫瘍の組織学的タイプまたはグレードには依存しなかった（Muellerら、1971）。いくつかの研究により、卵巣癌患者の血清ハプトグロビンにおける、フコシル化の増大および他のグリコシル化の変化が示されている（Thompsonら、1992）。近年、ハプトグロビン、CA 125、およびインターロイキン6のレベル間の相関が、卵巣癌において示されている（Dobryszyckaら、1999）。これらの研究が、ハプトグロビンの分光測光的検出（Muellerら、1971）、免疫拡散的検出（Thompsonら、1992）、および電気泳動的検出（Thompsonら、1992）に依拠していたことから、ハプトグロビン前駆体よりも、むしろ相同な天然タンパク質が検出された。
【００１３】
Onoら（2000年）は、卵巣腫瘍組織におけるハプトグロビンα(15)-β前駆体に対応するmRNAの発現を開示している。これらの著者は、ハプトグロビン1前駆体が卵巣癌患者の血清および腹水液において検出できることを示唆しなかった。体液中の成熟ハプトグロビンの発現が、癌、関節炎、およびタンパク尿症などの状態において上方制御されることが公知であるにもかかわらず、前駆体型のハプトグロビンは、これらの状態において検出されていない。
【００１４】
体液中の任意のハプトグロビン前駆体の検出または測定が、卵巣癌または任意の他の癌の診断、段階付け、または予後において有用でありうることを、これらの過去の報告は、いずれも示唆していない。
【発明の開示】
【００１５】
発明の概要
プロテオミクスおよびウエスタンブロッティングのアプローチを用いて、本発明者らは、目下、初期卵巣癌患者の血清中のハプトグロビン1前駆体を同定している。本発明者らは、ハプトグロビン1前駆体の濃度が、健常者と比べて卵巣癌患者の血清中では上昇することを示している。したがって本発明者らは、バイオマーカーの開発の候補としてハプトグロビン1前駆体を提唱する。さらに、ハプトグロビン1前駆体の発現が、卵巣癌の進行に伴って増大するという本発明者らの知見により、ハプトグロビン1前駆体は、広く使用されているが特異的ではないCA125マーカーを補完するか、またはそれに取って代わる理想的な候補となる。
【００１６】
第1の局面において、本発明は、卵巣癌を患うことが疑われる被験者由来の体液試料中のハプトグロビン1前駆体濃度を決定する段階を含む、卵巣癌を検出する方法を提供するが、ここで、対照試料中におけるハプトグロビン1前駆体の濃度と比べて増大したハプトグロビン1前駆体濃度が、癌の存在の指標となる。
【００１７】
ハプトグロビン1前駆体の検出に体液試料を使用できることにより、生検などの組織試料を得ることと比べて、試料を得ることが比較的容易になる。さらに、生検試料は疾患の進行の後期にしばしば取得されるため、これにより、卵巣癌発生のより初期にハプトグロビン1前駆体を検出することが可能になる。卵巣癌の場合、腫瘍が外科的に切除されるまで、生験はしばしば取得されない。
【００１８】
第2の局面において、本発明は、卵巣癌を患うことが疑われる被験者由来の体液試料中のハプトグロビン1前駆体濃度を決定する段階を含む、卵巣癌の処置の有効性をモニタリングする方法を提供するが、ここで、処置前のレベルと比べて減少したハプトグロビン1前駆体レベルが、処置の有効性の指標となる。
【００１９】
第3の局面において、本発明は、卵巣癌と診断された、または卵巣癌を患うことが疑われる被験者の体液中のハプトグロビン1前駆体濃度を定量的に決定する段階を含む、卵巣癌の重篤度を評価する方法を提供するが、ここで、対照試料中のハプトグロビン1前駆体濃度と比べて増大したハプトグロビン1前駆体濃度が、癌の存在および/または重篤度の指標となる。本発明の3つのアプローチ全てにおいて、ハプトグロビン1前駆体のレベルは、任意で、一つまたは複数の他の卵巣癌マーカーと相関していてもよい。
【００２０】
本発明の3つの局面の全てにおいて、体液は、血液、血漿、血清、腹水、または尿でありうる。当業者は、唾液など他の体液も使用可能であるかどうか、容易に決定できるであろう。
【００２１】
ELISA、ラジオイムノアッセイ、化学発光アッセイ、リアルタイムPCR、核酸ハイブリダイゼーション法などを含むがこれらに限定されない、ハプトグロビン1前駆体タンパク質またはそれをコードする核酸を検出するための任意の便利な方法により、ハプトグロビン1前駆体の濃度が決定されうる。ハプトグロビン1前駆体に対して方向付けられる、モノクローナル抗体を含む特異的抗体を、従来の技術を使用して容易に調製することができ、かつこのような方法において使用することができる。これらの抗体は、α鎖内のエピトープと反応しないことが好ましい。濃度は、定性的または定量的に決定されうる。
【００２２】
体液試料は任意で、Affi-Gel Blue Protein AもしくはBlue Sepharose-Protein Aカラムを用いた、または、2002年8月23日に出願された豪州特許仮出願第2002951240号に対応する、Royal Women's Hospital名義で2003年8月22日に出願された国際特許出願第PCT/AU03/01075号に記載の方法を用いた、アルブミンなど多量のタンパク質を減少させるための予備段階に供されうる。これにより、少量のタンパク質の検出感度が増大する。
【００２３】
本発明の方法はまた、任意で、インテグリン結合キナーゼ（ILK）、CA125、TADG-12、メソテリン（mesothelin）、カリクレイン10、プロスタシン（prostasin）、オステオポンチン、クレアチンキナーゼβ、セロトランスフェリン（serotransferrin）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（lipocalin）（NGAL）、CD163、またはGc-グロブリンなど、別の卵巣癌マーカーのレベルを決定する段階をも含む。あるいは、メソテリン、カリクレイン10、プロスタシン、オステオポンチンまたはクレアチンキナーゼβなどの、一つまたは複数の他の推定卵巣癌マーカーの上昇した発現を検出することもできる。第2のマーカーは、当技術分野において公知の方法を用いて、DNA、RNA、またはタンパク質のレベルで検出されうる。
【００２４】
第4の局面において、本発明は、
a）卵巣癌の診断；
b）卵巣癌の処置の有効性のモニタリング；または
c）卵巣癌の重篤度の評価
において使用するための、ハプトグロビン1前駆体に特異的な抗体または核酸プローブを含むキットを提供する。
【００２５】
第5の局面において、本発明は、
a）卵巣癌の診断；
b）卵巣癌の処置の有効性のモニタリング；または
c）卵巣癌の重篤度の評価
における、ハプトグロビン1前駆体に特異的な抗体または核酸プローブの使用を提供する。
【００２６】
本発明の第4および第5の局面の双方において、好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。より好ましくは、抗体はα鎖内のエピトープと反応せず、かつさらにより好ましくは、抗体はハプトグロビン1前駆体に特異的である。
【００２７】
本発明は、ヒトにおける使用に適していることが特に意図されるが、イヌおよびネコなどの愛玩動物、ならびに、ウマ、ウシ、およびヒツジなどの家畜、または、非ヒト霊長類、ネコ科の動物、イヌ科の動物、ウシ科の動物、および有蹄類など動物園の動物における使用を含む獣医学的使用にも適用可能である。
【００２８】
発明の詳細な説明
定義
本明細書に記載の特定の材料および方法は変動する可能性があるため、本発明はこれらに限定されないことが明確に理解されねばならない。また、本明細書中で使用される用語は特定の態様を記載する目的のみのものであって、本発明の範囲を限定することを意図したものではなく、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることもまた、理解されねばならない。
【００２９】
文脈上明確に特記しない限り、本明細書において使用される単数形「1つの」、および「その」（"a", "an", and "the"）には、対応する複数形も含まれる。したがって、例えば、「1つのタンパク質」への言及は複数のこのようなタンパク質を含み、「1つの分子」への言及は1つまたは複数の分子への言及である。特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同一の意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似または同等の任意の材料および方法が、本発明の実施または試験に使用されうるが、好ましい材料及び方法については以下に記載する。
【００３０】
他の場合に言語または必要な含意を表現するために文脈上必要な場合を除き、添付の特許請求の範囲および本発明の上記記載において、「含む」という用語またはその語尾変化の用語は、包括的な意味において、すなわち、記述された特徴の存在を特定するが、本発明の様々な態様における更なる特徴の存在または追加を妨げないように使用される。
【００３１】
値の範囲が表現される場合には、この範囲が、範囲の上下の限界、およびそれらの限界の間にある全ての値を含むことが、明確に理解されるであろう。
【００３２】
「ハプトグロビン1」とは、分子量約90kDの、糖付加された成熟四量体を指す。
【００３３】
「ハプトグロビン1前駆体」とは、18アミノ酸シグナル配列を含む、分子量約38kDの単一鎖前駆体タンパク質を指す。
【００３４】
「免疫反応性ハプトグロビン1前駆体」とは、成熟ハプトグロビン1に対するモノクローナル抗体を用いて検出されるハプトグロビン1前駆体を指す。
【００３５】
本明細書において用いられる略語は、以下の通りである。
1-DE：一次元電気泳動
2-DE：二次元電気泳動
ir：免疫反応性
MALDI-TOF：マトリックス支援レーザ脱離干渉-飛行時間型
MS：質量分析法
MS/MS：タンデム質量分析法
SELDI-TOF MS：表面増感レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析法
TOF MS：飛行時間型質量分析法
【００３６】
本発明者らは、ハプトグロビン前駆体が、グレード1、グレード2、およびグレード3の卵巣癌患者の腹水中および血清中に存在することを見出した。卵巣癌組織において、免疫反応性ハプトグロビン1前駆体は、上皮細胞、ストローマ、および卵巣血管に存在する。ハプトグロビン1前駆体は、成熟ハプトグロビンに対して>90%の相同性を有する。それゆえに、ハプトグロビンに対するモノクローナル抗体は、免疫反応性ハプトグロビン1前駆体を検出することができる。
【００３７】
これらのデータは、ハプトグロビン1前駆体の過剰発現が、卵巣癌発症の初期事象であるという仮説と一致している。したがって、ハプトグロビン1前駆体の増強された発現は急性応答の状態を表す可能性があり、これは、腫瘍進行の前提要件である。
【００３８】
提唱された機構のいずれにも制限されることを望まないが、本発明者らは、大部分の分泌タンパク質が、ゴルジ体または関連小胞いずれかの内部において、分泌過程の後期で開裂される拡張（extended）NH2末端配列を有するより大きな前駆体として最初に合成されるので、癌細胞に特異的である不完全な細胞内プロセシングが、癌患者の血清におけるハプトグロビン1前駆体のレベルの上昇を引き起こすと考える。
【００３９】
転写プロファイリング、または、遺伝子発現、差分的ハイブリダイゼーション、およびディファレンシャルディスプレイ技術の関連する連続分析により、14個の卵巣癌マーカーの候補が同定されている（Mokら、2001; Schummerら、1999）。これらのタンパク質の中で、メソテリンおよびカリクレイン10はそれぞれ、モノクローナル抗体アプローチおよび候補遺伝子アプローチによって同定された（Schollerら、1999; Luoら、2001）。メソテリンは、76%の卵巣癌患者の血清において上昇し（Diamandisら、2000）、かつカリクレイン10は、56%の卵巣癌患者において上昇する（Luoら、2001）。メソテリンおよび/またはカリクレイン10についての試験はCA125試験を補完しうることが示唆されており、これにより、治療可能な初期段階で卵巣癌を検出する期待が増大する。
【００４０】
遺伝子アレイ技術を用いて、卵巣癌患者由来の血清において上昇するものとして、前立腺分泌物中で以前に同定されたセリンプロテアーゼであるプロスタシン、分泌される骨モルフォゲンであるオステオポンチン、ならびに、腎臓癌および肺癌に対するマーカーであるクレアチンキナーゼBが同定された。（Mokら、2001; Kimら、2002）。DNAまたはRNAレベルでのスクリーニングアプローチにより、現在使用されているCA125試験を補完し、かつ特異性および感度を増大させる可能性をも有する一連のマーカーを同定できる可能性があることが、これらのデータによって示されている。
【００４１】
本発明者らは最近、癌のステージと高度に相関する卵巣癌に対するマーカーとして、無細胞免疫反応型のインテグリン結合キナーゼ（ILK）を同定した。2003年8月20日に出願された、Royal Women's Hospital名義の国際特許出願第PCT/AU03/01058号を参照されたい。
【００４２】
ILK（第PCT/AU03/01058号）、CA125（MackayおよびCreasman、1995）、TADG-12（Underwood LJ、2000）、または、より最近記載されたマーカーである、セロトランスフェリン（Kawakamiら、1999）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（Kjeldsenら、1994）、可溶性CD163（Baetonら、2003）、およびGc-グロブリン（Jorgensenら、2004）などの、卵巣癌に対する一つまたは複数のさらなるマーカーを、ハプトグロビン1前駆体の検出の付属物として、本発明の方法において使用してもよい。
【００４３】
一般的方法
二次元電気泳動および質量分析法
一次元分離：
25μgの血清タンパク質を、再水和緩衝液（7 M尿素、2 Mチオ尿素、100 mMジチオスレイトール（DTT）、4% 3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート（3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate）（CHAPS）、0.5%担体両性電解質、0.01%ブロモフェノールブルー（BPB）、40 mM Tris（pH4〜7)）と混合して最終容量200μlとし、かつ室温で1時間インキュベートした。次に、この混合物をReady Strip（11 cm、pH4〜7；Bio-Rad Laboratories、USA）に適用し、50V、20℃において16時間、能動的に再水和させた。血清タンパク質を、250Vで15分間、等電点電気泳動に供した；その後、電圧を150分間で8000Vまでゆっくりと上昇させ、次に、合計35000Vh/ゲル（すなわちゲルあたり合計42000Vh）となるように8000Vで維持した。その後、二次元分離まで、Ready Stripを-80℃で保存した。
【００４４】
二次元分離：
一次元分離で得たReady Stripを、5mlの平衡緩衝液（50 mM Tris-HCl（pH8.8）、6 M尿素、30%グリセロール、2% ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、0.01% BPB、2 mMトリブチルホスフィン（TBP)）中で平衡化した。細片（Strip）を、Tris-グリシン-SDS泳動緩衝液（25 mM Tris、192 mMグリシン、0.1% w/v SDS（pH8.3)）中で濯ぎ、次に10% Tris-HCl Precast Criterion Gel（Bio-Rad Laboratories、USA）の上端に適用した。低融点アガロース（BPB含有泳動緩衝液中0.5%）を、細片の上に重層した。分子量マーカー（150kDa、100kDa、75kDa、50kDa、37kDa、および25kDa）を同時に泳動した。ゲルを、10 mA/ゲルで1時間、20 mA/ゲルで2時間、かつ、その後30 mA/ゲルで30分間、電気泳動した。次に、ゲルをメタノール/酢酸（dH2O中40%/10%）中において、室温で1時間固定し、かつ振とう台（rocking platform）上、SYPRO Ruby（Bio-Rad laboratories、USA）中において、室温で16時間インキュベートした。ゲルを、メタノール/酢酸（dH2O中10%/7%）中で1時間脱色し、Bio-Rad FXイメージャを用いて解像度100 nmで画像化し、その後、PDQuest バージョン6 ソフトウェア（Bio-Rad laboratories、USA）を用いて分析した。コンピュータプログラムにより、ゲルのデジタル化画像からタンパク質スポットが同定された。異なるゲルにおける実験間の多様性を評価するために、いくつかの血清試料の分析を3回繰り返した。
【００４５】
質量分析法：
画像化後、タンパク質バンドの視覚的な同定および単離を可能にするために、ゲルをクーマシーブルーで染色した。クーマシー染色されたバンドをゲルから切り出し、かつトリプシンで消化した。Ettan MALDI-TOF装置（Amersham Bioscience、UK）およびAPI QSTAR Pulsar i Mass spectrometer（Applied Biosystems、MDS Sciex、Framingham、USA）により質量分析実験を行った。TOFMSデータは、Analyst Software（Applied Biosystems、MDS Sciex、Framingham、USA）に含まれるPepSea Serverを通じて検索した。タンデムMSデータは、MASCOT検索エンジンを通じて検索した。
【００４６】
以下の非制限的な実施例および図面のみを参照して、本発明を詳細に記載する。
【００４７】
実施例1  ヒト血清からの多量のアルブミンの除去
ヒト血清試料は、スピンカラムの形状のAffigel-BlueとプロテインAとの混合物（5:1）で処理された（Bio-Rad Laboratories、USA）。スピンカラムはAffi-Gel BlueとプロテインAとの混合物を含んでおり、これは、アルブミンおよびイムノグロブリンと選択的に結合して除去する。1000×gで20秒間遠心分離することにより、スピンカラムを1 mlの結合緩衝液（20mMリン酸緩衝液、pH7.0）で2回洗浄した。血清50μlを結合緩衝液150 mlに添加し、ボルテックスにより混合して、スピンカラムに載せた。室温における1時間のインキュベーションの後、カラムを1000×gで20秒間遠心分離して、溶出液を収集した。カラムを200μlの結合緩衝液で洗浄し、第1の溶出液と合わせて、除去後血清試料（depleted serum sample）を形成した。合わせた溶出液の総タンパク質濃度を決定した。さらなる分析まで、溶出液を-80℃で保存した。
【００４８】
図1aは、SYPRO Ruby染色により可視化された典型的な2-DEヒト血清プロファイルを示す。300種類を上回るタンパク質が検出され、かつpI4〜7および分子量範囲20kDa〜200kDaに局所化された。未処理血清中には68kDa付近のアルブミンスメアが存在していたが、Affi-Gel BlueおよびプロテインA処理の1時間以内に、他のタンパク質の有意な損失が提示されることなく、アルブミンの有意な損失が達成された。図1bに示すように、アルブミンの除去に付随して、いくつかのタンパク質スポットの染色強度が有意に増強された。ヒト血清のAffi-Gel BlueおよびプロテインA処理により多量のアルブミンが除去される結果となり、それによって、アルブミン存在下では不明瞭なままであったと考えられる少量のタンパク質の検出が増大することが、これらの結果により示される。本発明者らは、卵巣癌患者の血清において差次的に発現する少量のタンパク質の同定のための、アルブミンクリアランスの本アプローチを実行している。
【００４９】
実施例2  卵巣癌患者由来の血清および腹水におけるハプトグロビン1前駆体の発現
健常な女性および卵巣癌患者の血清におけるハプトグロビン1前駆体の発現を評価するために、プロテオミクス分析および質量分析法を用いた。癌患者は、標準の組織学的方法によって等級分けされた（Silverberg、2000）。
【００５０】
対照群における女性および卵巣癌を有する女性の平均年齢は、それぞれ47歳および62歳であった。全血（10ml）を静脈穿刺によって収集し、血清用の簡素な収集管に入れた（血液を、室温で30分間凝固させた）。試料を2000gで10分間遠心分離し、その後血清を収集した。総タンパク質の判定のために、アリコート（100μl）を取り出した。分析まで、血清を-80℃で保存した。
【００５１】
正常な女性被験者8人および卵巣癌患者19人に由来する血清試料を、ハプトグロビン1前駆体の発現に関して分析した。患者のうち、6人がグレード1、8人がグレード2、24人がグレード3であった。卵巣癌患者の腹水もまた、ハプトグロビン1前駆体の発現に関して試験された。ハプトグロビン1前駆体の発現は、成熟ハプトグロビンに対するモノクローナル抗体（Sigma、St Louis、USA）を用いた、プロテオミクス分析および非還元状態下でのウエスタンブロッティングによって、血清中および腹水中で検出された。ハプトグロビン1前駆体は、成熟ハプトグロビンに対して>90%の相同性を有する。それゆえ、ハプトグロビンに対するモノクローナル抗体は、免疫反応性ハプトグロビン1前駆体を検出することができる。
【００５２】
全血（2ml）を静脈穿刺によって収集し、簡素な収集管に入れ、室温で30分間凝固させた。次に、試料を2,000gで10分間遠心分離し、その後血清を収集した。総タンパク質の判定のために、アリコート（100μl）を取り出した。分析まで、血清を-80℃で保存した。血液検体を室温で解凍して、かつ検体に対して二次元電気泳動を行った。
【００５３】
図2は、正常被験者ならびにグレード1、グレード2、およびグレード3の卵巣癌患者の血清における、ハプトグロビン1前駆体の発現のプロテオミクス分析の結果を示す。図3は、卵巣癌患者由来の腹水におけるハプトグロビン1前駆体の発現のプロテオミクス分析の結果を示す。
【００５４】
実施例3  異なる組織学的グレードにおける卵巣癌患者の血清タンパク質プロファイル
グレード1（n＝6）、グレード2（n＝8）、およびグレード3（n＝24）の卵巣癌患者の血清のタンパク質プロファイルを2-DEによって分析し、かつSYPRO-Rubyを用いた染色によって可視化した。PDQuestソフトウェアを用いて、癌患者由来の試料の反復セットのタンパク質プロファイルを健常女性（n＝8）の血清と比較し、ガウス（Gaussian）プロファイルを図4に示した。健常者に対してグレード1、グレード2、またはグレード3の卵巣癌患者において差次的に発現した血清タンパク質の定量的な評価を、スチューデントt検定を用いて行った。血清タンパク質の全体プロファイルにおける有意差が、正常な健常ボランティアと比較したグレード1、2、および3の卵巣癌患者において得られた。正常血清と比較して、24種類のタンパク質が、グレード1の卵巣癌患者の血清において差次的に発現した（図4a）。これらのタンパク質の中で、15種類のタンパク質が2倍上方制御され、4種類のタンパク質が5倍上方制御され、2種類のタンパク質が10倍上方制御された。対照的に、それぞれ1種類のタンパク質が、2倍、5倍、および10倍下方制御された。グレード2の癌患者においては、31種類のタンパク質の差次的発現が観察され、そのうち、25種類が2倍上方制御され、4種類が5倍上方制御され、2種類が10倍上方制御された。グレード3の癌患者由来の血清の分析により、差次的に発現した25種類のタンパク質のうち13個のタンパク質が2倍下方制御されたことが示された（図4bおよび図4c）。それぞれ、6種類のタンパク質が2倍上方制御され、3種類が5倍上方制御され、2種類が10倍上方制御された（p<0.05）。
【００５５】
一部のタンパク質は、特定の病理学的グレードの癌患者の血清においてのみ独自に発現することが見出され、かつ、一部のタンパク質は、癌患者の3つの組織学的グレードにおいて一貫的には発現しなかった。観察された差次的発現プロファイルの一貫性を確実にするため、異なる3日において調製された同一患者由来の血清試料の分析を3回繰り返し、試料の取扱いに起因しうる交絡（confounding）因子を排除するために検査した。異なる日に繰り返された同一試料のタンパク質スポットのプロファイルにおいて、実質的な変動は検出されなかった。
【００５６】
差次的に発現した血清タンパク質の中で、10種類のタンパク質が、グレード1、2、および3の癌患者において一貫して発現することが見出された（p>0.05）。これらのタンパク質のうち、分子量約40kDaおよびpI約5.9〜6.6を有する6種類は、グレード1、2、および3の卵巣癌患者の血清において有意に過剰発現した。これらを、さらなる分析および同定のために選択した。
【００５７】
実施例4  卵巣癌患者において過剰発現するタンパク質の同定
卵巣癌患者において過剰発現することが実施例3で見出された6種類のタンパク質を、ナノ-エレクトロスプレー四極子四極子飛行時間型質量分析（ESIQ(q)TOF MS）およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（MALDI-TOF MS）分析によって同定した。
【００５８】
図5で示される、6種類のタンパク質に由来する質量フィンガープリントスペクトルは、同一のペプチド断片化パターンを示し、これにより、異なるpIおよび/または分子量の値において分離する単一タンパク質の一連の翻訳後修飾の可能性が示唆された。6種類のタンパク質のMS/MS分析により、正常血清中に存在する肝臓糖タンパク質ハプトグロビンと90%の相同性を共有し分子量38.42kDaおよびpI6.1〜6.6を有するタンパク質であるハプトグロビン1前駆体のアイソフォーム（Swissprotアクセッション番号P00737）としての、それらの同一性が確認された（Beutlerら、2002）。これらのペプチドのアミノ酸配列を表1に要約する。得られたペプチド配列は、ハプトグロビン1前駆体の異なる領域に相当するアミノ酸配列を含んでいた。
【００５９】
（表１）グレード3の卵巣癌患者の血清中のスポット1〜6のペプチド配列
2007504463.tif 000002
Blast検索の結果：
Swiss Protアクセッション番号：P00737
質量：38,427 D
同定されたタンパク質：ヒトハプトグロビン1前駆体
【００６０】
全長ハプトグロビン1前駆体配列におけるこれらのペプチドの位置を、表2に示す。
【００６１】
（表２）ハプトグロビン1前駆体分子に相当するスポット1〜6に由来するペプチド（下線）
2007504463.tif 000003
【００６２】
タンパク質のグリコシル化パターンにおける相違は、タンパク質のpIおよび分子量の双方を変化させる可能性を有しており、2-DEアプローチを用いて、異なるシアル酸付加型のハプトグロビンが正常血清において示された（Wilsonら、2002）。ハプトグロビン1前駆体の6種類の異なるアイソフォームが卵巣癌患者の血清中に存在することを実証する本発明者らの結果は、これらの観察と一致している。
【００６３】
これらのタンパク質がハプトグロビン1前駆体のアイソフォームであるということのさらなる確証が、抗ヒトハプトグロビンモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングによって得られた。ハプトグロビン1前駆体の6種類のアイソフォームが、わずかに異なる分子量および異なるpIを有する一連のタンパク質スポットとして、1-DEまたは2-DEおよびウエスタンブロッティングによって検出された。天然タンパク質は前駆体に対して90%の相同性を有するので、抗ハプトグロビンモノクローナル抗体は、2-DEウエスタンブロットにおいてハプトグロビンアイソフォーム前駆体を可視化することが期待される。
【００６４】
ウエスタンブロットのために、血清試料を5倍容量のLaemmli緩衝液と共にインキュベートした。等量のタンパク質（60μg）を含む検体を、非還元条件下で10%SDS-PAGEゲル上で電気泳動し、その後ニトロセルロース膜に転写した。膜を、一次ハプトグロビン抗体（Sigma、USA）、続いてペルオキシダーゼ標識二次抗体（Amersham、UK）を用いてプローブ検査し、かつ製造業者の取扱説明書に従ってECL検出系（Amersham、UK）によって可視化した。結果を図6および図7に示す。
【００６５】
図6aは、健常ボランティアおよび卵巣癌患者の血清における、ハプトグロビン分子の1-DEウエスタンプロファイルを示す。抗体は主に、分子量約20kDa、約40kDa、および約70kDaにおける3種類のバンドを認識する。興味深いことに、抗ハプトグロビン抗体によって40kDaおよび70kDaに同定されたタンパク質の発現は、健常成人よりもグレード1および3の癌患者において強かった。このことに一致して、2-DEウエスタンブロッティングにより、分子量40kDaにおける6種類のタンパク質のセットに関して高い反応性が観察された（図6b、図6c、および図6d）。図7に図示した通り、2-DEおよびウエスタンブロッティングを用いた同様の結果が得られた。反応性はまた、分子量20kDaおよび70kDaの2種類のさらなるタンパク質に関しても観察され、これは1-DEプロファイルと一致した。分子量20kDaおよび70kDaのタンパク質の同一性は未知であり、調査中である。わずかに異なる分子量および異なるpIを有する一連のタンパク質スポットとして呈される、ハプトグロビン1前駆体の6種類のアイソフォームは、翻訳後修飾の存在を示唆する。
【００６６】
例えばELISAまたはラジオイムノアッセイによる、卵巣癌患者の血清におけるハプトグロビン1前駆体の発現の定量化を、スクリーニング目的のための診断マーカーとして使用できることが、これらの結果により示される。
【００６７】
実施例5  免疫組織化学的分析
パラフィン処理された保存組織は、Department of Pathology、Royal Women's Hospital、Melbourneから得られた。これらには対照比較に必要な正常卵巣（n＝6）が含まれていたが、これは、疑わしい超音波像、触知可能な腹部腫瘤、および家族歴の結果として手術を受けた患者から除去されたものである。病理学診断および腫瘍グレードは、Department of Pathology、Royal Women's Hospital、Melbourne内の2人の勤務病理医によって決定された。腫瘍の分類は、臨床診断の一部として行われた。卵巣癌腫の組織学的等級分けは、Silverberg（2000）により記載された方法によって行った。
【００６８】
組織切片を4μm厚に切断し、ポリ‐L‐リジンでコーティングされたスライドに載せて、60℃で1時間インキュベートした。切片を水に入れ、それぞれキシレンおよびエタノールで3回交換した。電子レンジ中で、クエン酸緩衝液（pH6.0）を用いて抗原アンマスキング（unmasking）を行った。3%過酸化水素のメタノール溶液を用いて内因性ペルオキシダーゼを除去し、かつ希釈卵白（蒸留水中に5%）および希釈脱脂粉乳（蒸留水中に5%）を連続的に用いて内因性ビオチン活性を妨害した。切片は、1%BSAを含むトリス緩衝溶液（100mM、pH7.6）中で1/10000に希釈した抗ハプトグロビンモノクローナル抗体（Sigma、St Louis、USA）において、1時間インキュベートされた。抗体結合は、ビオチンおよびストレプトアビジンHRP（DAKO、Denmark）をそれぞれ15分間使用して増幅され、かつ、複合体はジアミノベンジジンを使用して可視化された。核はMayerのヘマトキシリンによって軽く染色された。抗体の代わりに、適切に希釈されたアイソタイプIgG1を陰性対照とした。
【００６９】
切片を陽性ジアミノベンジジン染色に関して顕微鏡で評価した。ハプトグロビン発現の強度は、陰性の、弱い、中程度の、または強い免疫反応性として、ブラインド様式で記録された。染色の種類に加えて、染色の組織分布および細胞分布が決定された。
【００７０】
図8は、正常卵巣上皮の試料と、異なるグレードにおける漿液性および類内膜性の卵巣腫瘍の試料との間の、免疫組織化学的比較の結果を示す。図8aに示すように、免疫反応性ハプトグロビン1前駆体は、正常な卵巣表面上皮またはストローマにおいて検出されなかった。それぞれ図8b、図8c、および図8dで示される、グレード1およびグレード3の漿液性および類内膜性の卵巣腫瘍において、免疫反応性ハプトグロビン1前駆体の高度な発現が、上皮、ストローマ、および卵巣血管において検出された。染色は主に細胞質性であり、染色の大部分は、散在する細胞群において観察された。腺状パターンを有する腫瘍は、より染色される傾向があった。強い染色は、粘液腫性ストローマまたは脈管間隙を有する領域、および卵巣血管において明らかであった。提唱された機構のいずれにも制限されることを望まないが、本発明者らは、ハプトグロビン前駆体は卵巣腫瘍細胞によって発現されること、しかし卵巣癌患者の血清におけるハプトグロビン前駆体の濃度の上昇は肝臓起源である可能性がきわめて高いことを、これらの結果が示唆すると考える。
【００７１】
実施例6  化学療法前後のハプトグロビン1前駆体の発現
6サイクルの化学療法の前後に卵巣癌患者由来の体液からの試料におけるハプトグロビン1前駆体の発現を検出することの有効性が評価された。
【００７２】
化学療法処置は、手術後のカルボプラチン（AUC 5）/タキソール（175mg/m2体重）からなる従来の併用療法を含んだ。配合剤を静脈内注入によって3週間毎に患者に与えた。化学療法前試料は手術前に入手し、化学療法後試料は、治療完了から5ヵ月後に入手した。試験された体液は血清であった。ハプトグロビン1前駆体およびCA 125の値は、治療の各サイクルの前後で入手した血清試料において決定された。
【００７３】
化学療法前後のハプトグロビン1前駆体の発現は、図9aおよび図9bに示される。ハプトグロビン1前駆体の発現レベルが、化学療法前のレベルに対して化学療法後に減少したことが分かる。
【００７４】
手術前、この患者由来の血清中のCA 125のレベルは376U/mlであった。化学療法完了後、CA 125のレベルは16U/mlに減少した。したがって、化学療法処置後の体液中のハプトグロビン1前駆体のレベルの減少は、化学療法後の体液中のCA 125のレベルの減少と相関した。
【００７５】
実施例7  体液中のハプトグロビン1前駆体の濃度およびそのアイソフォームの評価
卵巣癌の処置の有効性、処置後の疾患再発、および卵巣癌発生の早期の検出は、以下によって体液中のハプトグロビン1前駆体およびそのアイソフォームの濃度を定量することにより評価される：
（i）中間体およびβ鎖エピトープを標的とするポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体のいずれかを用いた、直接的もしくは間接的なサンドイッチELISA、
（ii）蛍光ビーズに基づくイムノアッセイ（Luminx技術）、ならびに/または
（iii）磁気ビーズに基づくイムノアッセイおよび質量分析法。
【００７６】
CA125（MackayおよびCreasman、1995）、ILK（第PCT/AU03/01058号）、TADG-12（Underwood LJ、2000）、セロトランスフェリン（Kawakamiら、1999）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（Kjeldsenら、1994）、可溶性CD163（Baetonら、2003）、およびGc-グロブリン（Jorgensenら、2004）に関するELISAアッセイ法を含むがこれらに限定される訳ではない、当技術分野において公知の方法を用いる、卵巣癌に関連する他の分析物の判定と共に、ハプトグロビン1前駆体のアッセイ法が実行される。
【００７７】
表3に示すように、試験の感度および特異性を改善するために、他のマーカーと共に、ハプトグロビン1前駆体の発現レベルを使用できる。
【００７８】
（表３）化学療法前後の卵巣癌患者の血清における、ハプトグロビン1前駆体、セロトランスフェリン、および可溶性インテグリン結合キナーゼの発現
2007504463.tif 000004
【００７９】
化学療法後の患者2番におけるハプトグロビン1前駆体の抑制の欠如は、CA 125濃度の増大と相関する。この結果は、化学療法剤に対する耐性の発生を示す可能性があり、更に調査されている。
【００８０】
考察
本発明者らの知見により、ハプトグロビン1前駆体の血清中濃度が初期卵巣癌患者において有意に増大することが示される。提唱された機構のいずれにも制限されることを望まないが、本発明者らは、ハプトグロビン前駆体の肝臓での合成の増強が、卵巣癌患者における急性期応答によって起こる可能性があり、それによって血清ハプトグロビン前駆体の濃度の上昇がもたらされると考えている。本発明者らは、ハプトグロビン前駆体の発現レベルと癌のグレードとの間の半定量的相関関係を実証した。本発明者らは、イムノアッセイなどの定量的アッセイ法を使用して、定量的相関関係を容易に確立できると構想する。本発明者らは、ハプトグロビン1前駆体が、卵巣癌診断のための新規かつ有用なバイオマーカーとなると考える。正常上皮における免疫反応性ハプトグロビン1前駆体の発現の欠如、および進行段階の腫瘍における免疫反応性ハプトグロビン1前駆体の発現の増大は、ハプトグロビン1前駆体が卵巣癌の進行に重要であることを示唆する。
【００８１】
本発明は明瞭性および理解の目的で、ある程度詳細に記載されているが、本明細書において開示された発明概念の範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の態様および方法に対する種々の修正および改変を行うことができることは、当業者にとって明らかであろう。
【００８２】
本明細書において引用された参考文献を以下に列挙する。
【００８３】
参考文献
2007504463.tif 000005
2007504463.tif 000006
2007504463.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】二次元電気泳動（2-DE）の前のAffi-Gel BlueおよびプロテインAによる血清試料の前処理の結果を示すものであり、これによって、アルブミンの減少および少量のタンパク質の検出の増強が示される。図1a：SYPRO Rubyによる染色によって可視化された正常血清の二次元電気泳動プロファイル；図1b：Affi-Gel Blueおよびタンパク質で前処理された血清の2-DEプロファイル。
【図２】二次元電気泳動の結果を示すものであり、これによって、プロテオミクス分析によって同定された健常被験者と比較した、卵巣癌患者の血清中のハプトグロビン1前駆体の6種類の異なるアイソフォームの発現の増強が図示される。図2a：正常被験者；図2b：グレード1卵巣癌患者；図2c：グレード2卵巣癌患者；および図2d：グレード3卵巣癌患者。
【図３】卵巣癌患者由来の腹水（AS）におけるハプトグロビン1前駆体の発現を実証する二次元電気泳動プロファイルを示す。
【図４】異なるグレードの卵巣癌患者の二次元電気泳動プロファイルを示すものであり、これによって、タンパク質の差次的発現が実証される。図4a：グレード1；図4b：グレード2；図4c：グレード3。
【図５】2-DEゲルから単離された6種類のタンパク質のMALDI-TOF MS、および、n-ESIQ(q)TOF MS質量フィンガープリント分析の結果を示す。
【図６】図6aは、一次元電気泳動、および抗ハプトグロビンモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットによって決定された、グレード1およびグレード3の卵巣癌患者の血清中における38kDaの免疫反応性ハプトグロビン1前駆体のレベルを図示する。図6bは、一次元電気泳動、および抗ハプトグロビンモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットによって決定された、正常被験者、良性被験者、およびボーダーライン（boarderline）被験者、ならびにグレード1、グレード2、およびグレード3の卵巣癌患者の血清中における38kDaの免疫反応性ハプトグロビン1前駆体のレベルを図示する。図6cは、正常被験者、良性被験者、およびボーダーライン被験者、ならびにグレード1、グレード2、およびグレード3の卵巣癌患者の血清中におけるハプトグロビン1前駆体の発現のレベルを示す。
【図７】図7a、図7b、および図7cは、正常血清のレベルと比較した、（a）正常被験者、（b）グレード1、および（c）グレード3の卵巣癌患者の血清における免疫反応性ハプトグロビン1前駆体アイソフォームのレベルの上昇を示す。発現レベルは、二次元ゲル電気泳動、および抗ハプトグロビンモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングにより決定された。
【図８】ハプトグロビンに対するモノクローナル抗体を用いた、組織試料における免疫反応性ハプトグロビン1前駆体の免疫組織化学的検出の結果を示す。免疫反応性ハプトグロビン1前駆体は、正常卵巣（パネルa）には存在しなかったが、グレード1、2、および3の卵巣腫瘍組織（パネルbは漿液性腫瘍、パネルcおよびdは類内膜腫瘍）には存在した。
【図９】図9aは、二次元電気泳動で測定された、化学療法処置前後の、グレード3の卵巣癌患者由来の試料におけるハプトグロビン1前駆体の発現プロファイルを図示する。図9bは、化学療法処置前後の、卵巣癌患者由来の試料におけるハプトグロビン1前駆体の異なるアイソフォームの相対的な発現レベルを示す。
【図１】
2007504463.tif 000008
【図２ａ】
2007504463.tif 000009
【図２ｂ】
2007504463.tif 000010
【図２ｃ】
2007504463.tif 000011
【図２ｄ】
2007504463.tif 000012
【図３】
2007504463.tif 000013
【図４】
2007504463.tif 000014
2007504463.tif 000015
【図５ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ】
2007504463.tif 000016
【図５ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ】
2007504463.tif 000017
【図６ａ】
2007504463.tif 000018
【図６ｂ】
2007504463.tif 000019
【図６ｃ】
2007504463.tif 000020
【図７】
2007504463.tif 000021
【図８】
2007504463.tif 000022
2007504463.tif 000023
【図９ｂ】
2007504463.tif 000024
【国際調査報告】
2007504463.tif 000025
2007504463.tif 000026
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