(57)【要約】  膵島細胞中における糖質コルチコイド誘導性のキナーゼＳＧＫ１の活性の調節は、インスリン放出を回復させる。また、糖質コルチコイド誘発性２型真性糖尿病の治療に有用な方法および化合物も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＧＫ１を発現する膵島細胞とＳＧＫ１を調節する物質とを接触させることを含む、インスリン分泌の改変方法。
【請求項２】
発現されたＳＧＫ１が選択されたＳＮＰ変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＳＧＫ１のモジュレータが阻害剤である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
モジュレータがＳＧＫ１の活性化剤である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
ＳＧＫ１の阻害がグルコースの脱分極作用の逆転、電位作動型のＣａ−チャネルの活性化およびインスリン放出を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
阻害の前に多型ＳＧＫ１  ＳＮＰ変異が診断される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
インスリン分泌のアップレギュレーションを特徴とする、請求項１から４に記載の方法。
【請求項８】
治療される対象が２型真性糖尿病の症状に罹患している、請求項１から４に記載の方法。
【請求項９】
膵島細胞におけるＳＧＫ１の活性を調節することによって、糖質コルチコイド誘発性２型真性糖尿病を、そのような治療を必要としている対象において軽減する方法。
【請求項１０】
治療される対象がストレス誘発性高血糖症に罹患している、請求項１から４に記載の方法。
【請求項１１】
治療される対象が低血糖症に罹患している、請求項１から４に記載の方法。
【請求項１２】
疾患状態の個体から試料を採取することを含む、ＳＧＫ１の発現を測定することによって疾患の進行、退行または発症を判定する方法。
【請求項１３】
前記ＳＧＫ１が選択されたＳＮＰ変異を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＳＧＫ１阻害剤と製薬上有効な担体、賦形剤または希釈剤とを含む薬剤組成物。
【請求項１５】
インスリン分泌障害によって引き起こされる障害を治療する医薬品を製造するための、一般式ＩまたはＩＩを有する列挙された化合物から選択されるＳＧＫ１阻害剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
ＳＧＫ１を発現する膵島細胞を、ＳＧＫ１を調節する物質と接触させることにより、ＳＧＫ１の阻害がグルコースの脱分極作用の逆転を伴い、したがって電位作動型のカルシウムチャネルおよびインスリン放出の活性化を引き起こすことを含む、インスリン分泌の改変方法。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
糖質コルチコイド治療は２型真性糖尿病を誘発し、これは薬物を中止したあとに容易に改善することができる（ＨｏｏｇｗｅｒｆおよびＤａｎｅｓｅ、１９９９；Ｓｃｈａｃｋｅ他、２００２）。末梢性インスリン耐性および糖新生を刺激することによる肝臓でのグルコース産生の増加に加えて（ＭｃＭａｈｏｎ他、１９８８）、糖質コルチコイドは膵臓細胞のインスリン分泌を妨げる（Ｌａｍｂｉｌｌｏｔｔｅ他、１９９７；Ｐｉｅｒｌｕｉｓｓｉ他、１９８６）。鋭意研究にもかかわらず、その分子機構には依然として論議の余地がある。核糖質コルチコイド受容体の拮抗剤である抗黄体ホルモンのミフェプリストン（ＲＵ４８６）は、デキサメタゾンに誘導されるインスリン分泌の阻害を完全に無効にし（Ｌａｍｂｉｌｌｏｔｔｅ他、１９９７）、糖質コルチコイド依存性遺伝子発現の関与を示している。
【０００３】
糖質コルチコイド感受性遺伝子には、とりわけ血清・糖質コルチコイド誘導性のキナーゼＳＧＫ１が挙げられる（Ｗｅｂｓｔｅｒ他、１９９３ｂ；Ｗｅｂｓｔｅｒ他、１９９３ａ、ＵＳ６３２６１８１号）。ＳＧＫ１は、例えば鉱質コルチコイド（Ｃｈｅｎ他、１９９９、Ｎａｒａｙ−Ｆｅｊｅｓ−Ｔｏｔｈ他、１９９９、Ｓｈｉｇａｅｖ他、２０００、Ｂｒｅｎｎａｎ他、２０００、Ｃｏｗｌｉｎｇ他、２０００）などのいくつかの刺激によって影響を受ける（Ｌａｎｇ他、２００１）。
【０００４】
ＳＧＫ１は、インスリン様成長因子ＩＧＦ１、インスリン、ならびにホスホイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）およびホスホイノシトール依存性キナーゼＰＤＫ１が関与するシグナルカスケードを介した酸化的ストレスによって調節されることが示されている（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ＆  Ｃｏｈｅｎ、１９９９、Ｐａｒｋ他、１９９９、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ他、１９９９）。ＰＤＫ１によるＳＧＫ１の活性化は、セリン４２２のリン酸化を含む。さらに、ｓｅｒ４２２からアスパラギン酸への変異（S422DＳＧＫ１）により、継続的に活性化されたキナーゼがもたらされることが示されている（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ他、１９９９）。
【０００５】
糖質コルチコイド誘導性のキナーゼＳＧＫ１の活性の測定には、様々なアッセイ系が利用可能である。シンチレーション近接アッセイ（Ｓｏｒｇ他、Ｊ．ｏｆ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、２００２、７、１１〜１９）およびフラッシュプレート（ｆｌａｓｈｐｌａｔｅ）アッセイでは、タンパク質またはペプチドを基質として、γＡＴＰを用いて放射性リン酸化を測定する。阻害性化合物の存在下では、放射性シグナルが検出されない、または低い放射性シグナルしか検出可能でない。さらに、ホモジニアス時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＨＴＲ−ＦＲＥＴ）および蛍光偏光（ＦＰ）技術がアッセイ方法に有用である（Ｓｉｌｌｓ他、Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、２００２、１９１〜２１４）。非放射性ＥＬＩＳＡに基づいた他のアッセイ方法では、特異的なホスホ−抗体（ＡＢ）を用いる。ホスホ−ＡＢはリン酸化された基質のみに結合する。この結合は、ペルオキシダーゼ結合抗ヒツジ二次抗体を用いて、化学発光によって検出可能である（Ｒｏｓｓ他、２００２、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、原稿ＢＪ２００２０７８６）。
【０００６】
以前の結果により、ＳＧＫ１が腎上皮Ｎａ+チャネルの強力な刺激剤であることが示されている（Ｄｅ  ｌａ  Ｒｏｓａ他、１９９９、Ｂｏｅｈｍｅｒ他、２０００、Ｃｈｅｎ他、１９９９、Ｎａｒａｙ−Ｆｅｊｅｓ−Ｔｏｔｈ他、１９９９、Ｌａｎｇ他、２０００、Ｓｈｉｇａｅｖ他、２０００、Ｗａｇｎｅｒ他、２００１）。
【０００７】
ＳＧＫ１に関連する別の発見は、エクソン８における（ＣＣ／ＣＴ）のヌクレオチドの組合せの一塩基多型（ＳＮＰ）およびイントロン６におけるさらなる多型（ＣＣ）が血圧の上昇に関連していることであり（Ｂｕｓｊａｈｎ他、２００２）、このことから、ＳＧＫ１が血圧調節および高血圧に重要であり得ると結論づけられた。
【０００８】
ＳＧＫ１の活性の上昇は、腎臓におけるナトリウムの再吸収を増加させることによって高血圧をもたらす腎上皮Ｎａ+チャネルの活性と相関しているので（Ｌｉｆｔｏｎ、１９９６；Ｓｔａｅｓｓｅｎ他、２００３；Ｗａｒｎｏｃｋ、２００１）、ＳＧＫ１の対立遺伝子変異の組合せ次第で腎臓におけるＮａ+の再吸収の増加が起こり得、これは立ち代って血圧の上昇をもたらすことが決定的であった（Ｂｕｓｊａｈｎ他、２００２）。
【０００９】
現在までに、膵島のインスリン分泌細胞が相当する量のＳＧＫ１を発現することが示されておらず（Ｋｌｉｎｇｅｌ他、２０００）、一般に、未処置の膵島細胞はＳＧＫ１を発現しないか、少量のみ発現すると考えられている。
【００１０】
長期間にわたる高用量の糖質コルチコイド治療は、少なくとも部分的にはインスリン分泌の機能障害によって、真性糖尿病の発生の素因となる。その根底にある機構は依然として説明が困難であり、治療行為を可能にする標的は現在知られていない。本出願はこのような新しい機構および分子標的を定義すると同時に、真性糖尿病を克服することを目的として前述の病理学的機序を妨害する新しい化合物を同定する方法を教示する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
発明の概要
本出願では、糖質コルチコイドで事前に処理した膵島細胞が、インスリン分泌島細胞においてＳＧＫ１の転写レベルおよび発現の顕著な増加を示すことが予想外に実証された。
【００１２】
過剰の糖質コルチコイドは、少なくとも部分的にインスリン分泌の機能障害によって真性糖尿病の発生の原因となり、本発明の方法は、膵島細胞におけるＳＧＫ１の活性を調節することによって、糖質コルチコイド誘発性２型真性糖尿病を、そのような治療を必要としている対象において軽減するためのものである。
【００１３】
本発明は、他の態様と共に、とりわけ、ＳＧＫ１を発現する膵島細胞とＳＧＫ１を調節する物質とを接触させることによってインスリン分泌を回復させるのに有用な、治療上活性のある化合物の同定方法を教示する。このようにして、グルコースの脱分極作用が逆転され、その結果、電位作動型のカルシウムチャネルの活性化および続くインスリン放出がもたらされる。
【００１４】
ＳＧＫ１の調節は、ＳＧＫ１遺伝子の一塩基多型によって定義される臨床的に関連のある表現型または遺伝子型に適用した場合に特に有用である。したがって、治療を必要としている個体由来の試料中の多型ＳＧＫ１  ＳＮＰ変異の解析が、別の用途となりうる。さらに、本発明は、ＳＧＫ１の発現を測定することによって疾患の進行、退行または発症を判定する方法について述べる。疾患状態の個体から採った試料により、選択されたＳＧＫ１  ＳＮＰ変異の解析、および例えば糖質コルチコイドを用いた長期治療によって誘発されるような、疾患または他の状態の素因とのその相関の解析が、さらに可能となり得る。別の態様は、疾患に関連するＳＧＫ１を調節する新しい薬物候補を同定するためのスクリーニング方法に関連する。特に有用なモジュレータは、ＳＧＫ１の機能を妨害し、その結果インスリン分泌のアップレギュレーションをもたらす化合物である。ＳＧＫ１の阻害剤は、２型真性糖尿病の症状に罹患している、治療後の対象に特に有用である。ＳＧＫ１のモジュレータも、ストレス誘発性高血糖症に罹患している対象または低血糖症に罹患している対象の治療に有用である。
【００１５】
本発明に従って行った薬物スクリーニング方法により、ＳＧＫ１に向けられた治療化合物の発見がもたらされた。２つの異なる化合物クラス、すなわち一方はアシルヒドラゾン誘導体のクラスに属し、他方がピリドピリミジン誘導体のクラスに属する化合物クラスが同定されている。製薬上有効な担体、賦形剤または希釈剤を含む薬剤組成物中における選択されたＳＧＫ１阻害性化合物は、糖質コルチコイド誘発性２型真性糖尿病の治療に有用である。所望の治療的プロファイルを有する新しい薬物の同定に用いるスクリーニング方法が本出願中に開示する化合物に限定されないことは、本発明において重要である。さらに、ＳＧＫ１調節化合物をスクリーニングするための１ステップのアプローチまたは２ステップのアプローチが適用に有用であり得ることは、当業者には明らかである。このようなスクリーニングの第１ステップには、ＳＧＫ１キナーゼの活性を妨げる化合物の同定が含まれる。様々なアッセイ様式が利用可能であり、好ましいアッセイでは、タンパク質またはペプチドを基質として、γＡＴＰと共に用いたＳＧＫ１触媒の放射性リン酸化の測定を用いる。ＳＧＫ１阻害化合物の存在下では、放射性シグナルが検出されない、または低い放射性シグナルしか検出可能でない。スクリーニングの第２ステップでは、ＳＧＫ１阻害化合物を、ＳＧＫ１を阻害した際に、例えばＩＮＳ−１細胞などの糖質コルチコイドｄで処置した膵島細胞においてインスリン分泌を回復させるその潜在性について試験した。しかし、他の読み出し活性を測定することでインスリンの放出を測定することも有用であり得る。
【００１６】
発明の詳細な説明
糖質コルチコイド誘発性糖尿病の根底にある機構は、現在まで依然として説明が困難であった。本発明では、デキサメタゾンなどの糖質コルチコイドがインスリン分泌細胞中の血清・糖質コルチコイド誘導性のキナーゼＳＧＫ１の転写ならびに発現のアップレギュレーションを行うことが示されており、これは、核糖質コルチコイド受容体の拮抗剤であるミフェプリストン（ＲＵ４８６）によって逆転させることができる作用である。アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞中で同時発現された場合、ＳＧＫ１は電位作動型のＫ+チャネルであるＫｖ１．５の活性を増大させる。ＩＮＳ−１細胞では、デキサメタゾンはＫｖ１．５の転写を刺激し、再分極化する外向き電流を増加させ、グルコース誘発性のインスリン放出を低減させる。後者２つの効果は、Ｋ+チャネルブロッカーである４−ＡＰおよびＴＥＡによって逆転される。デキサメタゾンは、野生型マウスから単離した膵島でのグルコース誘発性のインスリン放出を事実上無効にし、この効果はＳＧＫ１ノックアウトマウスから単離した膵島では有意に減衰している。結論として、糖質コルチコイドはＳＧＫ１の転写を刺激し、これは立ち代って電位作動型のＫ+チャネルの活性のアップレギュレーションを行う。続く過分極がグルコースの脱分極作用を相殺し、電位作動型のＣａ2+チャネルの活性化、Ｃａ2+の流入およびインスリン放出が防がれる。
【００１７】
本発明は、インスリン分泌の調節における、ＳＧＫ１およびＳＧＫ１依存性チャネルの活性の役割に関する。
【００１８】
リアルタイムＰＣＲによれば、ＳＧＫ１の転写レベルは未処置のＩＮＳ−１細胞中で低く（図１Ａ）、この所見はヒト膵島について以前に報告されている低い転写レベルに沿っている（Ｋｌｉｎｇｅｌ他、２０００）。しかし、ＩＮＳ−１細胞を１００ｎＭのデキサメタゾンと共に２〜２３時間インキュベーションを行うことによってｍＲＮＡ転写レベルが上昇し、この効果は糖質コルチコイド受容体拮抗剤ＲＵ４８６によって完全に抑止された（図１Ａ）。２３時間以内に、デキサメタゾンが、マウスの膵島中においてデキサメタゾンで処置したあとに上昇する細胞性ＳＧＫ１の転写レベルを上昇させた（図１Ａ）。同様に、糖質コルチコイドによるＳＧＫ１転写の強力な刺激が他の細胞種で観察された（Ｉｔａｎｉ他、２００２；Ｒｏｚａｎｓｋｙ他、２００２）。ウェスタンブロットから明らかなように、ＳＧＫ１タンパク質は未処置の細胞中では検出不可能であったが、デキサメタゾンへ暴露して２時間以内に既に現れ、次の２３時間以内にさらに増加した（１００ｎＭ）（図１Ｂ）。ＳＧＫ１タンパク質の存在比の増加は、ＲＵ４８６によって完全に逆転される。したがって、デキサメタゾンはインスリン分泌細胞においてＳＧＫ１の発現を刺激する。
【００１９】
図１Ｄに示すように、アフリカツメガエル卵母細胞におけるＳＧＫ１およびＫｖチャネルの同時発現は、異種発現させたＫｖ１．５チャネルの活性よりも約２倍アップレギュレーションされる（図１Ｄ）。これらのチャネルは以前に、ＩＮＳ−１細胞（Ｓｕ他、２００１）ならびにげっ歯類およびヒトβ細胞（Ｐｈｉｌｉｐｓｏｎ他、１９９４；Ｒｏｅ他、１９９６）で発現されることが示されている。ＩＮＳ−１細胞では、チャネルはＫ+チャネルブロッカーである４−ＡＰによって阻害される（Ｓｕ他、２００１）。図２Ａおよび２Ｂに例示するように、実際、デキサメタゾンを用いた処置のあとには４−ＡＰ感受性の電位作動型の外向き電流の上昇が続いた。未処置の細胞では、Ｋ+チャネルブロッカー４−ＡＰは外向き電流の１０％（０．１ｍＭ）および２８％（１ｍＭ）しか阻害しなかった。１００ｎＭのデキサメタゾンを用いた４時間の処置後、４−ＡＰ感受性の電流が２８％（０．１ｍＭの４−ＡＰ）および４０％（１ｍＭの４−ＡＰ）まで増加した。これらのデータは、インスリン分泌細胞においてＫｖ１．５チャネルの活性がデキサメタゾンによって増強されることを示している。糖質コルチコイドは、心臓（ＴａｋｉｍｏｔｏおよびＬｅｖｉｔａｎ１９９４）、骨格筋および下垂体においてＫｖ１．５チャネルの発現を増加させるが、視床下部および肺（Ｌｅｖｉｔａｎ他、１９９６）では増加させないことが見出されている。
【００２０】
さらに、甲状腺機能低下性にした、副腎摘出したラットからの左心室において、Ｔ３がＫｖ１．５ｍＲＮＡレベルを上昇させるのにデキサメタゾンが必要であった（Ｎｉｓｈｉｙａｍａ他、１９９７）。リアルタイムＰＣＲから、４時間以内のデキサメタゾン（１００ｎＭ）での処置により、ＩＮＳ細胞中のＫｖ１．５ｍＲＮＡの存在量比が約１０倍上昇することが明らかとなっている。したがって、デキサメタゾンはＳＧＫ１の発現を刺激し、これは立ち代ってＫｖチャネルの活性を増大させる。
【００２１】
デキサメタゾンによるインスリン放出の鈍化に対するＫｖチャネルおよびＳＧＫ１の影響を解明するために、追加の実験を行った。図３に例示するように、ＩＮＳ−１細胞をデキサメタゾン（１００ｎＭ）で事前に処置することによって、グルコース誘発性のインスリン分泌が６２％阻害された。この阻害はＫｖチャネルブロッカーであるＴＥＡおよび４−ＡＰによって逆転され、インスリン分泌のデキサメタゾン媒介性阻害がＫｖチャネルの活性に依存することが示される。
【００２２】
インスリン分泌に対するデキサメタゾンの阻害効果におけるＳＧＫ１の寄与を推測するため、野生型の同腹仔（ｓｇｋ１+/+）と比較した、ＳＧＫ１ノックアウトマウス（ｓｇｋ-/-）における、インスリン分泌に対するデキサメタゾンの効果を研究した。デキサメタゾンの事前処置なしでは、グルコース（１６．７ｍＭ）に曝したあとのインスリン分泌も、アデニル酸シクラーゼの活性化（５μＭのフォルスコリン）も、プロテインキナーゼＣの刺激（１００ｎＭのＰＭＡ）も、ｓｇｋ１-/-マウスから単離した膵島とｓｇｋ１+/+マウスから単離した膵島とで有意差がなかった（図４ＡおよびＢ、黒いバー）。しかし、デキサメタゾンでの処置により、インスリン分泌に対するグルコース、フォルスコリンまたはＰＭＡの刺激効果が、ｓｇｋ１-/-の膵島よりもｓｇｋ１+/+の膵島で有意に低下した。これらのデータは、ＳＧＫ１が、デキサメタゾンによるインスリン分泌のダウンレギュレーションに役割を果たしていることを示している。
【００２３】
結論として、本発明の実験は、インスリン分泌の調節の新規機構を開示している。グルコココルチコイドであるデキサメタゾンは、インスリン分泌細胞におけるＳＧＫ１の転写および発現を増強する。このキナーゼがＫｖ１．５を含めた電位作動型のＫ+チャネルのアップレギュレーションを行う。Ｋｖチャネルの過剰発現はβ−細胞膜を過分極化し、したがって電位作動型のＣａ２+チャネルの活性化を妨げる。
【００２４】
したがって、このキナーゼは、糖質コルチコイド過剰の際にインスリン放出の阻害に寄与する。
【００２５】
図面の簡単な説明
図１は、デキサメタゾンがインスリン分泌ＩＮＳ−１細胞においてＳＧＫ１の発現を誘発することを示す図である。
【００２６】
ＩＮＳ−１細胞を培養中に、１００ｎＭのデキサメタゾンまたはビヒクル（ＤＭＳＯ）を用いて表示した時間処理した。デキサメタゾンはＳＧＫ１の発現を２時間以内に有意に誘発した。１μｍｏｌ／ｌのＲＵ４８６はデキサメタゾンの効果を完全に阻害した。
【００２７】
（Ａ）逆転写酵素Ｍ−ＭｕＬＶ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ドイツ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて細胞性ＲＮＡをｃＤＮＡへと転写させた。光サイクラーシステム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ドイツ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中でのリアルタイムＰＣＲによってＳＧＫ１  ｍＲＮＡを定量した。用いたプライマーは以下の通りである：ＳＧＫ１上流：５’−ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＡＣＣ  ＣＴＴ  ＧＣ−３’；下流：５’−ＡＴＴ  ＧＡＡ  ＣＡＡ  ＡＧＧ  ＴＴＧ  ＧＧＧ  ＧＧ−３。表示した実験数の平均±ＳＥＭを示す。
【００２８】
（Ｂ）全細胞溶解液を１％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ、ドイツ、Ｄａｓｓｅｌ）にプロットした。プロットをＳＧＫ１に対する抗体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、米国マサチューセッツ州Ｂｅｖｅｒｌｙ）と共にインキュベーションした。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した第２の抗体を用いて、結合した抗体を可視化した。
【００２９】
（Ｃ）Ｋｖ１．５のリアルタイムＰＣＲを、光サイクラーシステム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ドイツ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて行った。図１Ａに記載の実験と同じＲＮＡ調製物を解析した。３つの独立した実験の平均±ＳＥＭを示す。
【００３０】
（Ｄ）アフリカツメガエル卵母細胞におけるＳＧＫ１およびＫｖチャネルの同時発現はＫ+電流を増加させる。ヒトＳＧＫ１のｍＲＮＡ（μｇ／ｍｌ）およびＫｖ１．５のｍＲＮＡ（μｇ／ｍｌ）を卵母細胞内に注入し、２電位クランプ法を用いて、注入２日後に全細胞電流を測定した。代表的なトレースおよび平均±ＳＥＭを示す。
【００３１】
図２は、デキサメタゾンがＩＮＳ−１細胞においてｋｖチャネルの活性を増強することを示す図である。
【００３２】
細胞は、実験前に１００ｎＭのデキサメタゾンで４時間処置した。（２Ａ）全細胞電流は、−７０ｍｖ〜＋５０ｍｖまで１０ｍｖずつのステップで上昇する２００ｍｓの電圧パルスによって誘発した。（２Ｂ）４−ＡＰ（０．１および１ｍＭ）ならびにｔｅａ（１および１０ｍＭ）に対する感度は、細胞中でデキサメタゾン処置の前（黒いカラム）および後（白いカラム）に試験した。−７０〜５０ｍｖの、２００ｍｓの持続時間の電圧パルスを印加した。表示した実験数平均±ｓｅｍを示す。*は、同一阻害剤濃度における対照である未処置の細胞中での電流に対する有意性（ｐ＜０．０５）を表す。Ｉｎｓ−１細胞は以前に記載されているように培養した（Ａｂｅｌ他、１９９６；Ａｓｆａｒｉ他、１９９２）。外部パッチクランプ溶液は以下を含んでいた：１４０ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、５．６ｍｍｏｌ／ｌのＫＣｌ、１．２ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ2、２．６ｍｍｏｌ／ｌのＣａＣｌ2、０．５ｍｍｏｌ／ｌのグルコースおよび１０ｍｍｏｌ／ｌのＨＥＰＥＳ、ＰＨ７．４。内部溶液は以下を含んでいた：３０ｍｍｏｌ／ｌのＫＣＬ、９５ｍｍｏｌ／ｌのＫ+−グルコン酸、１ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ2、１．２ｍｍｏｌ／ｌのＮａＨ2ＰＯ4、４．８ｍｍｏｌ／ｌのＮａ2ＨＰＯ4、５ｍｍｏｌ／ｌのＮａ2ＡＴＰ、１ｍｍｏｌ／ｌのＮａ3ＧＴＰ、５ｍｍｏｌ／ｌのＥＧＴＡ、ＰＨ７．２。電流の測定にはＥｐｃ９パッチクランプアンプリファイアー（Ｈｅｋａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ、ドイツ、Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ）を用いた。
【００３３】
図３は、Ｋｖチャネルの阻害がＩＮＳ−１細胞のインスリン分泌のデキサメタゾン誘発性の阻害を逆転することを示す図である。
【００３４】
実験の前に、ＩＮＳ−１細胞を培養中にデキサメタゾン、１００ｎＭで４時間処置した。細胞を２回洗浄し、以下を含むＨＥＰＥＳ緩衝塩溶液中でプレインキュベーションした：１４０ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、５．６ｍｍｏｌ／ｌのＫＣｌ、１．２ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ2、２．６ｍｍｏｌ／ｌのＣａＣｌ2、０．５ｍｍｏｌ／ｌのグルコース、１０ｍｍｏｌ／ｌのＨＥＰＥＳおよび５ｇ／ｌのウシ血清アルブミン、３７℃でｐＨ７．４。その後、試験物質を適切な濃度で含む新鮮な溶液中で、細胞を３０分間３７℃でインキュベーションした。インスリンは、ラットインスリン抗血清（Ｌｉｎｃｏ、Ｂｉｏｔｒｅｎｄ  Ｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ  ＧｍｂＨ、ドイツ、Ｃｏｌｏｇｎｅ）、Ｉ125−インスリン（ＣＩＳ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ  ＧｍｂＨ、ドイツ、Ｄｒｅｉｅｉｃｈ）およびラットインスリン（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、ドイツ、Ｍａｉｎｚ）を標準として用いたラジオイムノアッセイによって、またはインスリンＥｌｉｓａキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ、スウェーデン、Ｕｐｐｓａｌａ）によって測定した。
【００３５】
図４ＡおよびＢは、デキサメタゾンがＳＧＫ１ノックアウトマウス由来の膵島からの分泌に影響を与えなかったことを示す図である。
【００３６】
単離した膵島を、１１ｍｍｏｌ／ｌのグルコースを含むＲＰＭＩ１６４０中で終夜培養した。デキサメタゾン（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＤＭＳＯ（対照）を、実験の５時間前に加えた。培養後、膵島を１時間３７℃で、以下を含むインキュベーションバッファー中でプレインキュベーションした：１４０ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、５．６ｍｍｏｌ／ｌのＫＣｌ、１．２ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ2、２．６ｍｍｏｌ／ｌのＣａＣｌ2、２．８ｍｍｏｌ／ｌのグルコース、１０ｍｍｏｌ／ｌのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および５ｇ／ｌのウシ血清アルブミン（画分Ｖ、Ｓｉｇｍａ、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）。その後、５個の膵島／０．５ｍｌのバッチを、各実験について表示した試験物質の存在下で、３０分間３７℃でインキュベーションした。インスリンは、Ｅｌｉｓａキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ、スウェーデン、Ｕｐｐｓａｌａ）を用いて測定した。
【００３７】
さらなる方法および材料
実施例１：Ｓｇｋ１−／−マウスの作製
１２個のエクソン上の転写される全領域を包含する７ｋｂの断片からコンディショナル  ターゲティングベクターを作製した（Ｗｕｌｆｆ他、２００２）。ネオマイシン耐性カセットには２つのｌｏｘＰ部位が隣接しており、イントロン１１内に挿入された。ｓｇｋ１キナーゼドメインをコードしているエクソン４〜１１は、第３のｌｏｘＰ部位をイントロン３内に挿入することによって「フロックス（ｆｌｏｘ）させた」。第１および第３のｌｏｘＰ部位の間に組換えを有するクローン（１型組換え）をＣ５７ＢＬ／６未分化胚細胞内に注入した。雄のキメラをＣ５７ＢＬ／６および１２９／ＳｖＪの雌と交配させた。ヘテロ接合性ｓｇｋ１欠損マウスを１２９／ＳｖＪ野生型マウスと２世代戻し交配し、その後、相互交配させてホモ接合性ｓｇｋ１−／−およびｓｇｋ１＋／＋同腹仔を作製した。
【００３８】
実施例２：細胞培養およびインスリン分泌の測定
ラット膵島細胞腫由来のＩＮＳ−１細胞（ＣＢ  Ｗｏｌｌｈｅｉｍ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｖａ、スイスから好意により提供）を、１０％ウシ胎児血清（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、ドイツ、Ｂｅｒｌｉｎ）、１ｍｍｏｌ／ｌのＨＥＰＥＳ、１ｍｍｏｌ／ｌのピルビン酸Ｎａ、１０μｍｏｌ／ｌのβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ドイツ、Ｍｕｎｉｃｈ）および抗生物質を添加したＨＥＰＥＳ緩衝ＲＰＭＩ１６４０中で、他の文献中に記載のように培養した（Ａｂｅｌ他、１９９６；Ａｓｆａｒｉ他、１９９２）。細胞を２．０〜２．５  １０5個の細胞／ｍｌの細胞密度で、２４ウェル培養プレート中に播種し、実験前に２日間培養した。細胞を、以下を含むＨＥＰＥＳ緩衝塩溶液で２回洗浄した：１４０ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、５．６ｍｍｏｌ／ｌのＫＣｌ、１．２ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ2、２．６ｍｍｏｌ／ｌのＣａＣｌ2、０．５ｍｍｏｌ／ｌのグルコース、１０ｍｍｏｌ／ｌのＨＥＰＥＳおよび５ｇ／ｌのウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４。３０分間３７℃でプレインキュベーションした。その後、培地を廃棄し、試験物質を適切な濃度で含む新鮮な培地を加えた。細胞を３０分間３７℃でインキュベーションした。インキュベーションを氷上で停止させ、培地を除去し、ラットインスリン抗血清（Ｌｉｎｃｏ、Ｂｉｏｔｒｅｎｄ  Ｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ  ＧｍｂＨ、ドイツ、Ｃｏｌｏｇｎｅ）、Ｉ125−インスリン（ＣＩＳ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ  ＧｍｂＨ、ドイツ、Ｄｒｅｉｅｉｃｈ）およびラットインスリン（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、ドイツ、Ｍａｉｎｚ）を標準として用いたラジオイムノアッセイによって、またはインスリンＥｌｉｓａキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ、スウェーデン、Ｕｐｐｓａｌａ）によって測定するまで、上清中に放出されたインスリンを−２０℃で凍結した。インスリン含量は、酸エタノール（１．５（ｖ／ｖ）％ＨＣｌ／７５％エタノール）を用いて終夜４℃で抽出したのちに測定した。
【００３９】
ＳＧＫ１  ＫＯおよび野生型の同腹仔マウスからの膵島の単離には、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（Ｓｅｒｖａ、ドイツ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を含む３ｍｌのコラゲナーゼ溶液を、総胆管を介してｉｎ  ｓｉｔｕで膵臓内に注入した。腺全体を取り出し、１０分間３７℃で消化した。その後、解剖用顕微鏡下で新鮮な培地中に集めることによって、膵島を外分泌組織から単離した。膵島を、１１ｍｍｏｌ／ｌのグルコースおよびデキサメタゾン（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＤＭＳＯ（対照）を含むＲＰＭＩ１６４０中で終夜培養した。培養後、膵島を１時間３７℃で、以下を含むインキュベーションバッファー中でプレインキュベーションした：１４０ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、５．６ｍｍｏｌ／ｌのＫＣｌ、１．２ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ2、２．６ｍｍｏｌ／ｌのＣａＣｌ2、２．８ｍｍｏｌ／ｌのグルコース、１０ｍｍｏｌ／ｌのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および５ｇ／ｌのウシ血清アルブミン（画分Ｖ、Ｓｉｇｍａ、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）。その後、５個の膵島／０．５ｍｌのバッチを、各実験について表示した試験物質の存在下で、３０分間３７℃でインキュベーションした。インスリンは、Ｅｌｉｓａキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ、スウェーデン、Ｕｐｐｓａｌａ）を用いて測定した。
【００４０】
実施例３：膜電流の測定
ＩＮＳ−１細胞を２〜４日間、ポリ−Ｌ−オルニチン（１０ｍｇ／ｌ、Ｓｉｇｍａ、ドイツ、Ｍｕｎｉｃｈ）をコーティングしたガラス製カバーガラス上で、適切な細胞密度（１．２×１０6個の細胞／ｍｌ）で培養した。カバーガラスを倒立顕微鏡（ＩＭ、Ｚｅｉｓｓ、ドイツ、Ｊｅｎａ）のステージ上のバスチャンバに装着した。細胞は、各実験について表示したように室温または３４℃で維持し、以下を含む溶液で灌流した：１４０ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、５．６ｍｍｏｌ／ｌのＫＣｌ、１．２ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ2、２．６ｍｍｏｌ／ｌのＣａＣｌ2、０．５ｍｍｏｌ／ｌのグルコースおよび１０ｍｍｏｌ／ｌのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４。ＤＭＺ−ユニバーサルプラー（Ｚｅｉｔｚ、ドイツ、Ａｕｇｓｂｕｒｇ）を用いて４〜６ＭΩの抵抗を有するパッチクランプピペット（Ｃｌａｒｋ−Ｍｅｄｉｃａｌ、英国Ｒｅａｄｉｎｇ）を引っ張った。これらに以下を含む内部溶液を満たした：３０ｍｍｏｌ／ｌのＫＣｌ、９５ｍｍｏｌ／ｌのＫ+−グルコン酸、１ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ2、１．２ｍｍｏｌ／ｌのＮａＨ2ＰＯ4、４．８ｍｍｏｌ／ｌのＮａ2ＨＰＯ4、５ｍｍｏｌ／ｌのＮａ2ＡＴＰ、１ｍｍｏｌ／ｌのＮａ3ＧＴＰ、５ｍｍｏｌ／ｌのＥＧＴＡ、ｐＨ７．２。電流の測定にはＥＰＣ９パッチクランプアンプリファイアー（Ｈｅｋａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ、ドイツ、Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ）を用いた。安定した電流の測定値のみ、すなわち対応する阻害薬を除去したあとに電流が対照電流の少なくとも９０％に達した場合にのみ、解析に用いた。
【００４１】
実施例４：リアルタイムＰＣＲ
ＩＮＳ−１細胞を７０ｃｍ2のフラスコ中で培養し、培養を除去し、６００μｌの溶解バッファー（Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ、Ｈｉｌｄｅｎ）を加えた。溶解した細胞を掻き取り、溶解物をエッペンドルフチューブ内に集めた。Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔを用いて細胞性ＲＮＡを単離し、逆転写酵素Ｍ−ＭｕＬＶ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ドイツ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて２μｇのＲＮＡをｃＤＮＡへと転写させた。各実験について表示したＲＮＡの量に対応するｃＤＮＡのアリコートを用いて、光サイクラーシステム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ドイツ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いたリアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡの定量を行った。ラットＫｖ１．５チャネルの特異的プライマーは、センス：５’−ＡＴＣ  ＴＴＣ  ＡＡＧ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＣＧＣ  ＣＡＣ  ＴＣＣ  ＡＡＧ  ＧＧ−３’；アンチセンス：５’−ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＴＧＧ  ＡＡＡ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＴＴＡ−３’であった。用いたラットＳＧＫ１のプライマーは：センス：５’−ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＡＣＣ  ＣＴＴ  ＧＣ−３’；アンチセンス：５’−ＡＡＴ  ＧＡＡ  ＣＡＡ  ＡＧＧ  ＴＴＧ  ＧＧＧ  ＧＧ−３であった。単離したマウス膵島を培養し、指示したようにデキサメタゾンで処置した。その後、膵島を集め、溶解バッファー（Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ、Ｈｉｌｄｅｎ）中で、膵島をインスリンシリンジ内に繰り返して吸い込むことによって溶解した。
【００４２】
実施例５：ウェスタンブロット
ＩＮＳ−１細胞を、デキサメタゾンなし（対照）、または１００ｎｇ／ｍｌのデキサメタゾンと共に、表示した時間、７０ｃｍ2のフラスコ中で培養した。その後、培地を除去し、３００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、２．５ｍＭのＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍｌのペプスタチンＡ、１０μｇ／ｍｌのアプロチニンおよび０．１ｍＭのＰＭＳＦを含む溶液中で細胞を溶解した。クマシーブルーＧ染色（ブラッドフォード色素アッセイ、Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ、Ｍｕｎｉｃｈ）によって定量した５０μｇの全細胞性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１％）に供し、ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ、ドイツ、Ｄａｓｓｅｌ）上にプロットした。プロットをＳＧＫ１に対する抗体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、米国マサチューセッツ州Ｂｅｖｅｒｌｙ）と共にインキュベーションした。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した二次抗体を用いて結合した抗体を可視化した。
【００４３】
実施例６：ＳＧＫ１を調節する化合物
６．１．一般式Ｉの化合物、その製薬上有用な誘導体、塩、溶液および立体異性体、ならびにそれらの混合物。
【００４４】
【化１】
2007527876.tif 000002
【００４５】
式中、
Ｒ1、Ｒ5は、Ｈ、ＯＨ、ＯＡ、ＯＡｃまたはメチルのいずれかであり、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10は、Ｈ、ＯＨ、ＯＡ、ＯＡｃ、ＯＣＦ3、Ｈａｌ、ＮＯ2、ＣＦ3、Ａ、ＣＮ、ＯＳＯ2ＣＨ3、ＳＯ2ＣＨ3、ＮＨ2またはＣＯＯＨのいずれかであり、
Ｒ11は、ＨまたはＣＨ3であり、
Ａは、１、２、３または４個のＣ原子を有するアルキルであり、
Ｘは、ＣＨ2、ＣＨ2ＣＨ2、ＯＣＨ2または−ＣＨ（ＯＨ）−であり、
Ｈａｌは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。
【００４６】
以下の化合物群から選択される式Ｉによる化合物：
（３−ヒドロキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−ヒドロキシ−フェニル）−酸性酸−［１−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−フェニル）−エチリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド。
フェニル酸性酸−（３−フルオロ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（４−ヒドロキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３，４−ジクロロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
ｍ−トリル−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
ｏ−トリル−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（２−クロロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−クロロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（４−フルオロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（２−クロロ−４−フルオロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−フルオロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２，６−ジメチル−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（３−フルオロ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−［１−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−フェニル）−エチリデン］ヒドラジド、
（３−メチルスルホニルオキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３，５−ジヒドロキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−フルオロ−フェニル）−酸性酸−（３−フルオロ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（４−アセトキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−トリフルオロメチル−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
３−（３−メトキシ−フェニル）−プロピオン酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（２，４−ジヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェノキシ）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−ニトロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（５−クロロ−２−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（２−ヒドロキシ−５−ニトロ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
２−ヒドロキシ−２−フェニル−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（２−エトキシ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−ブロモ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−［１−（４−ヒドロキシ−フェニル）−エチリデン］−ヒドラジド、
（３，５−ジフルオロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−ヒドロキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メチル−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−ヒドロキシ−フェニル）−酸性酸−（２−エトキシ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−ヒドロキシ−フェニル）−酸性酸−（２−メトキシ−４−ヒドロキシ−６−メチルベンジリデン）−ヒドラジド、
（２−フルオロ−フェニル）−酸性酸−（２−メトキシ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド
６．２．一般式ＩＩの化合物、その製薬上有用な誘導体、塩、溶液および立体異性体、ならびにそれらの混合物
【００４７】
【化２】
2007527876.tif 000003
【００４８】
式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5は、Ｈ、Ａ、ＯＨ、ＯＡ、アルケニル、アルキニル、ＮＯ2、ＮＨ2、ＮＨＡ、ＮＡ2、Ｈａｌ、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＡ、−ＯＨｅｔ、−Ｏ−アルキレン−Ｈｅｔ、−Ｏ−アルキレン−ＮＲ8Ｒ9もしくはＣＯＮＲ8Ｒ9；Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5から選択された２つの基；ならびに−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−、−Ｏ−ＣＨ2−Ｏ−または−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−のいずれかであり、
Ｒ6、Ｒ7は、Ｈ、Ａ、Ｈａｌ、ＯＨ、ＯＡまたはＣＮのいずれかであり、
Ｒ8、Ｒ9は、ＨまたはＡのいずれかであり、
Ｈｅｔは、１つもしくは複数のＨａｌ、Ａ、ＯＡ、ＣＯＯＡ、ＣＮまたはカルボニルオキシゲン（＝Ｏ）で置換された、１〜４個のＮ−、Ｏ−および／またはＳ原子を有する飽和あるいは不飽和の複素環であり、
Ａは、１〜１０個のＣ原子を有し、１〜７個のＨ原子がＦおよび／または塩素で置換されていてもよいアルキルであり、
Ｘ、Ｘ’は、ＮＨであるか、欠如しているかのいずれかであり、
Ｈａｌは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。
【００４９】
以下の化合物群から選択される式ＩＩによる化合物：
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（２−フルオロ−５−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（４−クロロ−５−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（２，４−ジフルオロフェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（２，６−ジフルオロフェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（３−フルオロ−５−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（４−フルオロ−５−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−ＳＨ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（４−メチル−５−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（２，４−ジブロモ−６−フルオロ−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（２−フルオロ−６−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（２−フルオロ−５−メチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（２，３，４−トリフルオロ−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（４−ブロモ−２，６−ジフルオロ−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（２−フルオロ−３−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［２−（１−ｔｅｒｔ．−ブチルオキシカルボニル−ピペリジン−４−イル）−フェニル］−尿素、
Ｎ−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−２，４−ジクロロベンズアミド、
Ｎ−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−４−クロロ−５−トリフルオロメチル−ベンズアミド、
Ｎ−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−２−フルオロ−５−トリフルオロメチル−ベンズアミド、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［３−クロロ−５−トリフルオロメチル−２−（ピペリジン−４−イルオキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［（２−フルオロ−５−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［５−フルオロ−２−（ピペリジン−４−イルオキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［４−クロロ−５−トリフルオロメチル−２−（ピペリジン−４−イルオキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［２−（ピペリジン−４−イルオキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［２−フルオロ−５−（２−ジエチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［２−フルオロ−５−［２−（ピペリジン−１−イル）−エトキシ］−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［４−フルオロ−２−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［４−フルオロ−２−（２−ジエチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［３−クロロ−４−［２−（モルホリン−４−イル）−エトキシ］−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［４−フルオロ−２−［２−（モルホリン−４−イル）−エトキシ］−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［３−クロロ−４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［３−クロロ−４−（２−ジエチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［４−クロロ−２−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［２−クロロ−５−（２−ジエチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−尿素、
ならびにその製薬上有用な誘導体、溶媒和物、塩、互変異性体および立体異性体、ならびにそれらの混合物。
【００５０】
実施例８：ＳＧＫ９ヌクレオチド多型
任意の高血圧患者のイントロン６を規定するヌクレオチド配列は．．．ａａｔｔａｃａｔｔｇＣｇｃａａｃｃｃａｇ．．であり、健康な集団を表すヌクレオチド配列は．．．．ａａｔｔａｃａｔｔｇＴｇｃａａｃｃｃａｇ．．．である。いずれの配列も、寄託番号ＧＩ２４６３２００、位置２０７１から入手可能である。任意の高血圧性患者のエクソン８の配列は、ホモ接合性．．ｔａｃｔｇａＣｔｔｃｇｇａｃｔ．．もしくは．．．．ｔａｃｔｇａＴｔｔｃｇｇａｃｔ．．．．またはヘテロ接合性．ｔａｃｔｇａＣｔｔｃｇｇａｃｔ．．．および．．．ｔａｃｔｇａＴｔｔｃｇｇａｃｔ．のいずれかである。これら配列は、寄託番号ＮＭ＿００５６２７．２、位置７７７から入手可能である。
【００５１】
ＴＴヌクレオチドの組合せを有するホモ接合性の個体は、同時にＣＣ一塩基多型をイントロン６内に表す場合も保護される。
【００５２】
実施例９：統計
データは平均±ＳＥＭとして表す。複数群のＡＮＯＶＡおよびスチューデントｔ試験を統計的解析に用いた。統計的有意性を示すためにｐ値＜０．０５が許容される。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】デキサメタゾンがインスリン分泌ＩＮＳ−１細胞においてＳＧＫ１の発現を誘発することを示す図である。
【図２】デキサメタゾンがＩＮＳ−１細胞においてｋｖチャネルの活性を増強することを示す図である。
【図３】Ｋｖチャネルの阻害がＩＮＳ−１細胞のインスリン分泌のデキサメタゾン誘発性の阻害を逆転することを示す図である。
【図４】デキサメタゾンがＳＧＫ１ノックアウトマウス由来の膵島からの分泌に影響を与えなかったことを示す図である。（Ａ）野生型の膵島。（Ｂ）ノックアウトの膵島。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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