(57)【要約】  本発明はチーズ又はチーズ様製品を調製又は改質する方法であって、熱殺菌したエキソ多糖産生微生物の発酵物を、当該発酵物中のエキソ多糖をその他の成分から分離せずにチーズ製造混合物中又は製品中に混入することを含んで成る方法を提供する。本発明はまた、ミルクタンパク質濃縮物を改質するための類似の方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
チーズ又はチーズ様製品を調製又は改質する方法であって、熱殺菌したエキソ多糖産生微生物の発酵物を、当該発酵物中のエキソ多糖をその他の成分から分離せずにチーズ製造混合物中又は製品中に混入することを含んで成る方法。
【請求項２】
熱殺菌した発酵物がチーズ製造混合物中に直接混入される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
熱殺菌した発酵物が前記製品の製造に使用する成分中に混入される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
熱殺菌した発酵物がラクトースに富んだ培地とエキソ多糖産生微生物を用いて調製した発酵物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物がラクトースを加水分解せず、且つ前記発酵物が添加したラクターゼ、ガラクトシダーゼ酵素あるいはラクトース加水分解酵素産生微生物を含んで成る、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記培地が１．０％（ｗ／ｖ）超のラクトースを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ラクトースに富む培地がミルクの画分である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記画分が血清又は母液；あるいはミルク又はスキムミルク又はバターミルク又はホエー又は血清又は母液又はパーミエート由来のラフィネート又はブレイクスルー；あるいはミルク又はスキムミルク又はバターミルク又はホエー又は血清又は母液又はパーミエート又はラフィネート又はブレイクスルー由来のパーミエートである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物が食品として許容される微生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ラクトースに富む培地が乳製品のパーミエートを含んで成る、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
乳製品のパーミエートがミルクパーミエート又はホエーパーミエートである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物がキサントモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestris)、スフィンゴモナス・パウチモビリス(Sphingomonas paucimobilis)及び乳酸菌から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記微生物がキサントモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestris)及びスフィンゴモナス・パウチモビリス(Sphingomonas paucimobilis)から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記微生物がラクトバチルス・デルブルキ サブスピーシーズ・ブルガリカス(Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus)；ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシズ・クレモリス(Lactococcus lactis ssp cremoris)；ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシズ・ラクチス(Lactococcus lactis ssp lactis)；ストレプトコッカス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サーモフィラス(Streptococcus salivarius ssp thermophilus)；ラクトバチルス・カゼイ サブスピーシーズ・カゼイ(Lactobacillus casei ssp casei)；ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）；ラクトバチルス・ヘルビチカス(Lactobacillus helviticus)；ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)；ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）；ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)及びラクトバチルス・サケイ(Lactobacillus sakei)から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
発酵が２０〜３５℃で実施される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
発酵物が１６〜２４０時間インキュベートされる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
混合物が６０〜１２０時間インキュベートした発酵物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
発酵物が加熱されてスプレー乾燥される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
発酵物が熱殺菌されて乳製品と直接混合される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ミルクタンパク質濃縮物を改質する方法であって、エキソ多糖産生微生物の熱殺菌発酵物を、当該発酵物中のエキソ多糖をその他の成分から分離せずに当該濃縮物に対し添加することを含んで成る方法。
【請求項２１】
チーズ又はチーズ様製品を製造する方法であって、
（ａ）熱殺菌したエキソ多糖産生微生物の発酵物を、当該発酵物中のエキソ多糖をその他の成分から分離せずにチーズミルクに添加する工程；
（ｂ）タンパク質分解酵素を混合物に添加する工程；
（ｃ）生じたカードを回収する工程；
（ｄ）カードを更に処理してチーズ又はチーズ様製品を製造する工程、
を含んで成る方法。
【請求項２２】
チーズ又はチーズ様製品を製造する方法であって、
（ａ）ミルクタンパク質を含んで成るチーズ前駆体混合物を準備する工程、
（ｂ）熱殺菌したエキソ多糖産生微生物の発酵物を、当該発酵物中のエキソ多糖をその他の成分から分離せずに前記チーズ前駆体混合物に添加する工程、
（ｃ）生成物がゲル化する条件を提供する工程、
を含んで成る方法。
【請求項２３】
（ｃ）の条件が、混合物を調理してミルクタンパク質を変性させ、そして混合物をゲル化させることにより提供される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記製品がチーズである、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記製品がプロセスチーズである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌性エキソ多糖を含むチーズ及びチーズ様製品の製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌性エキソ多糖（ＥＰＳ）は、細菌の構造におけるそれらの役割で周知なだけでなく、食品成分としても周知である。特に、それらは、食品における増粘剤及び安定剤として有用であることが明らかとなっている(Weinbreck et al., Polymerix 2000. Symposium europeen Polymerix 2000. European symposium Rennes 2000-06-07)。
【０００３】
多くの場合、ＥＰＳはヨーグルト、チーズ及びデザートのような製品の食感を改善するためにin situで使用される（例えば、Duboc and Mollet, Int Dairy J11, 759-768, 2001）。他の場合でも、エキソ多糖は最初に単離され、そして次に食品に添加される。例えば、キサントモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestris)の発酵はエキソ多糖の産生で周知であり、これは、食品業界及び医薬業界で広く使用されるキサンタンガムを形成するために単離されうる(Powell, In Microbial Polysaccharides and Polysaccharases. R. C. Berkeley, G. W. Gooday, D. C. Ellwood (Ed). Academic Press, Inc. New York pp. 117-160,1979. ; Morris,. In Food Polysaccharides and Their Application. A. M. Stephen (Ed). Marcel Dekker, Inc. pp. 341-375,1995)。
【０００４】
概して、エキソ多糖、例えばキサンタンガムが乳製品、例えばアイスクリーム、ヨーグルト、チーズスプレッド及びクリームチーズに導入される場合、エキソ多糖は発酵から外へと分離された抽出物の又は精製された多糖である。例えば、市販のキサンタンガムは、熱処理及びキサンタンガムを他の発酵成分から分離するためのイソプロパノールによる抽出、を伴う方法で製造される。
【０００５】
例えば、米国特許第５，４３４，０７８号において、ホエーパーミエートはキサントモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestris)の人工菌株により発酵され、そしてキサンタンＥＰＳはイソプロパノール沈殿により単離され、そして増粘剤(viscosifier)として使用するために乾燥される。
【０００６】
通常、グルコースの工業形態は微生物の基質として使用されるが、多くの研究者はミルク又はホエーパーミエートなどの乳業からの低価値のサイドストリーム(sidestreams)をより安価なＥＰＳの供給源として利用することを試みてきた。しかしながら、多くの微生物はごくわずかにこれらの基質を利用するだけである。
【０００７】
乳製品のエキソ多糖含量を増大させる別のアプローチは、当該製品に生菌を含めることである(Broadbent et al., 11,433-439. 2001; Christiansen et al., Milchwissenschaft 54, 138-140. 1999; Perry et al., J Dairy Sci, 81, 799-805,1997).。
【０００８】
これらのアプローチはいずれも欠点を有している。発酵混合物からエキソ多糖を分離するのに必要な処理工程は、そのようなエキソ多糖調製物が高価であり、そして微量の沈殿剤を含みうるということを意味している。生菌の添加は、添加したエキソ多糖の量及び質の制御の問題を生みだしている。また、生菌の添加は乳製品中への微生物の副産物の混入を招くことがある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、エキソ多糖を産生し、そしてチーズ又はチーズ様製品に添加するための単純な制御方法を提供し、あるいは少なくとも公衆に有用な選択肢を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
１つの側面において、本発明はチーズ又はチーズ様製品を調製又は改質(modify)する方法であって、熱殺菌したエキソ多糖産生微生物の発酵物を、当該発酵物中のエキソ多糖をその他の成分から分離せずにチーズ製造混合物中又は製品中に混入することを含んで成る方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
「チーズ様製品」とは、消費者が摂取する際に、チーズを摂取する感覚を賦与するミルクタンパク質含有製品である。本発明の方法の製品には、プロセスチーズ及びプロセスチーズスプレッド、カッテージチーズ及びプティ・スイスが含まれる。特に参照される製品には、プロセスチーズ及びプロセスチーズスプレッドが含まれる。用語「チーズ様製品」には、一部の規制当局によってはチーズとみなされえない製品が含まれる。
【００１２】
熱殺菌した発酵物は、チーズ製造混合物中に直接混入してもよい。あるいは、当該発酵物を前記製品の製造に使用する成分中に混入してもよい。
【００１３】
好ましくは、熱殺菌した発酵物は、ラクトースに富んだ培地とエキソ多糖産生微生物を用いて調製される発酵物である。前記微生物がラクトースを加水分解しないような場合には、当該発酵物は、ラクターゼ又はガラクトシダーゼ酵素あるいはラクトース加水分解酵素を産生する微生物の添加を要する。ラクトースに富む培地は、０．５％（ｗ／ｖ）超、好ましくは１．０％（ｗ／ｖ）超のラクトースを含む培地である。
【００１４】
好ましくは、ラクトースに富む培地は、ミルクの画分、例えばスキムミルク又はバターミルク又はホエー又は血清又は母液；あるいはミルク又はスキムミルク又はバターミルク又はホエー又は血清又は母液又はパーミエート由来のラフィネート又はブレイクスルー；あるいはミルク又はスキムミルク又はバターミルク又はホエー又は血清又は母液又はパーミエート又はラフィネート又はブレイクスルー由来のパーミエートである。
【００１５】
好ましくは、前記微生物は食品として許容される微生物である。
【００１６】
好ましくは、ラクトースに富む培地は乳製品のパーミエートを含んで成る。
【００１７】
好ましくは、乳製品のパーミエートはミルクパーミエート又はホエーパーミエートである。
【００１８】
乳製品のパーミエートを使用する場合、本発明は、乳製品工場で直ちに利用可能な副産物が、それを更に処理して他の場所に輸送しなければならないという欠点無しに使用されるという利点を提供する。更に、この観点において、本発明は、使用する同じプラント内で生産される乳製品のストリーム(dairy stream)の組み合わせが高付加価値製品を提供するのを可能にする。
【００１９】
本発明で使用するのに好ましい微生物は、キサントモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestris)、スフィンゴモナス・パウチモビリス(Sphingomonas paucimobilis)及び乳酸菌である。
【００２０】
現在特に好ましいものは、それぞれ、キサンタン、ジェランとして知られているエキソ多糖を産生するキサントモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestris)、スフィンゴモナス・パウチモビリス(Sphingomonas paucimobilis)である。
【００２１】
本発明の方法において有用な乳酸菌には、ラクトバチルス・デルブルキ サブスピーシーズ・ブルガリカス(Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus)；ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシズ・クレモリス(Lactococcus lactis ssp cremoris)；ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシズ・ラクチス(Lactococcus lactis ssp lactis)；ストレプトコッカス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サーモフィラス(Streptococcus salivarius ssp thermophilus)；ラクトバチルス・カゼイ サブスピーシーズ・カゼイ(Lactobacillus casei ssp casei)；ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）；ラクトバチルス・ヘルビチカス(Lactobacillus helviticus)；ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)；ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）；ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)；ラクトバチルス・サケイ(Lactobacillus sakei)が含まれる。
【００２２】
通常、発酵条件は、エキソ多糖の収率及び質を最大化するよう選択される。
【００２３】
典型的に、インキュベーションは２０〜３５℃で実施される。
【００２４】
典型的に、前記微生物は、微生物用の栄養素、例えば適切な塩、補助的な窒素源及び酵母抽出物が添加された乳製品パーミエート培地に添加される。この混合物は、続いて、典型的に１６〜２４０時間、通常６０〜１２０時間インキュベートされる。エキソ多糖濃度を決定してもよい。この段階で、発酵物は加熱してスプレー乾燥してもよく、そして次にチーズ製造混合物又は成分に添加してもよい。あるいは、当該発酵物は熱殺菌してチーズ製造混合物又は成分と直接混合してもよい。本発明の方法は、エキソ多糖を培地から分離しない点で、従来技術で一般的に使用されているものと異なる。費用の削減に加え、これによりエキソ多糖の特性を改質しうるあらゆる過酷な抽出方法が回避される。本発明の方法は、添加したエキソ多糖の量及び質をより簡単に制御することができる点で、例えば、エキソ多糖濃度を測定することができ、そしてインキュベーション条件、例えば、炭素：窒素比を容易に調節し、そして制御することができる点で生菌を組み込むことを包含するものと異なり、且つそれらより有利なものである。
【００２５】
エキソ多糖含有熱殺菌発酵物は、ミルク又はミルクタンパク質濃縮物に添加してチーズの製造に使用することができる。そのような改質したミルク又はミルクタンパク質濃縮物を、常用のチーズ製造方法、及びタンパク質分解酵素をチーズミルクに添加してカードを製造する方法において使用することは、チーズ製造方法の間にホエータンパク質の損失が最小化されるという利点を有している。従って、本発明は、チーズ又はチーズ様製品を製造する方法であって、
（ａ）熱殺菌したエキソ多糖産生微生物の発酵物を、当該発酵物中のエキソ多糖をその他の成分から分離せずにチーズミルクに添加する工程；
（ｂ）タンパク質分解酵素を前記の混合物に添加する工程；
（ｃ）生じたカードを回収する工程、
を含んで成る方法、
という態様を提供する。
【００２６】
本発明の方法はまた、プロセスチーズを調製するためのチーズカードの処理の間に、又は他のタイプのチーズ製造方法、例えば、米国特許第６，１７７，１１８号の方法、そして米国特許第６，１８３，８０５号及び第６，１８３，８０４号並びにＰＣＴ国際特許出願ＷＯ０３／５１１３０に記載のような酵素による加水分解を用いない他のチーズ製造方法において使用することもできる。従って、本発明は、チーズ又はチーズ様製品を製造する方法であって、
（ａ）ミルクタンパク質を含んで成るチーズ前駆体混合物を準備する工程、
（ｂ）熱殺菌したエキソ多糖産生微生物の発酵物を、当該発酵物中のエキソ多糖をその他の成分から分離せずに前記チーズ前駆体混合物に添加する工程、
（ｃ）生成物がゲル化する条件を提供する工程、
を含んで成る方法という態様を提供する。
【００２７】
典型的に、（ｃ）の条件は、前記ミルクをカードにせしめるタンパク質分解酵素を添加することで提供される。
【００２８】
別の観点において、本発明は、ミルクタンパク質濃縮物の改質方法であって、熱殺菌したエキソ多糖産生微生物の発酵物を、当該発酵物の他の成分からエキソ多糖を分離することなく前記濃縮物に添加することを含んで成る方法を提供する。前記ミルクタンパク質濃縮物は、チーズの伸展に使用してもよい。前記ミルクタンパク質濃縮物をチーズ製造法に使用するミルクに添加する場合、通常のミルクタンパク質のようにチーズが高収率で得られるという利点がある。更に、チーズ内のホエータンパク質の保存性が向上するという追加の利点もある。また、エキソ多糖の存在は一部のチーズの型において望ましい様式でチーズの稠度を変更する。
【００２９】
次に、本発明の好ましい態様を本明細書に添付する図面を参照して説明する。
【実施例】
【００３０】
以下の実施例は、本発明の実施を更に例示する。パーセンテージの基準が省略されている場合、それは固体の場合ｗ／ｗ、固体／液体の場合ｗ／ｖ、そして液体の場合ｖ／ｖである。
【００３１】
実施例１
スフィンゴモナス・パウチモビリス(Sphingomonas paucimobilis)（ＡＴＣＣ３１４６１）は、多数の振とうフラスコ中のミルクパーミエート上で培養して、ジェランとして知られている陰イオン性の多糖を含む粘性のある培養液を生成させた。スフィンゴモナス・パウチモビリスの種菌をトリプチケースソイブロス中で維持し、そして発酵培地中に２．５％（ｖ／ｖ）で導入した。ミルクパーミエート培地（０．１％酵母抽出物(Difco)を含むミルクパーミエート）を培養物の摂取前及び発酵後に、１０分間１００℃でフリー・スチーム(free-steam)にかけた。培地のｐＨは加熱前に調節しなかった。各２５０ｍｌの振とうフラスコに２５ｍｌのミルクペー未エーとを含ませ、そしてこれをオービタルシェーカー上で９６時間３０℃でインキュベートした。
【００３２】
インキュベーション後、フラスコを以下のように多糖について解析した。発酵物のアリコート（１ｇ）を遠心管内で計量し、これを加熱して１０分間煮沸し、そして次に２ｍｌのエタノール（９９％）と混合した。凝集塊沈殿物(floccular precipitate)を１２，０００ＲＣＦで遠心分離し、そして上精を捨てた。ペレットを１．５ｍｌの水に再溶解し、そして３．５ｍｌの９９％エタノール中で再沈殿させた。再び遠心した後、ペレットを水に溶解し、そして２００ｍｌにした。この溶液のアリコート（１ｍｌ）を１ｍｌのフェノール溶液（５％、新しく調製したもの）と混合した。濃硫酸（５ｍｌ）を添加し、そして溶液の吸光度を３０分間放置した後４８５ｎｍで測定した。多糖の濃度は、グルコース当量で、水の試料からブランクの値を差し引いた後、純粋なグルコースを用いたアッセイから構築した更正プロットを参照して吸光度から算出した。
【００３３】
２０個のフラスコを一緒にして、合計３．７ｇの多糖を作り出した。これを逆浸透（ＲＯ）水で７５０ｍｌに希釈し、そして７５０ｍｌの再構成したホール・ミルク（２０％固体／ＲＯ水）と一緒によく混合した。このミルクを５０℃に加熱し、そして次に入り口温度が１８０℃、出口温度が９０℃のスプレー乾燥機内に導入した。自由流動性の粉末を回収し、そしてジェラン含量をプロテアーゼ(フレーバーザイム、 Novozyme)とのインキュベーションによりミルクを最初に加水分解した前後と同一の方法で決定した。ジェラン含量はミルク固体上で２．５％であることが明らかとなった。
【００３４】
粉末をＲＯ水に溶解して１０、１５及び２０％の固体の溶液を生成した。同一濃度のコントロール試料をスプレー乾燥したホールミルク粉末を用いて多糖を添加せずに調製した。異なるミルクの粘度を毛細管粘度計(Cannon-Fenske, Size 300)を用いて２５℃で測定した。多糖を含む粉末は、表１に示すとおり、はるかに高粘度のミルクを生成した。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
多糖を含むホールミルクは、レンネットを添加し、そして次にホエーのカードをドレン排出することでチーズへと生成することができる。より高収率のチーズカードが生じるものと予測される。
【００３７】
実施例２
キサントモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestris)（ＡＴＣＣ  １３９５１）を、「ＹＭ」アガー上で維持し、そして「ＩＳＰ」培地中で再構成した。これをラクターゼ処理したミルクパーミエート（全容量の６０％）、ウレア（０．１％ｗ／ｖ）、Ｋ2ＨＰＯ4（０．２０％ｗ／ｖ）、及びＭｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏ（０．０１％ｗ／ｖ）から成る発酵媒地中に接種した（５％ｖ／ｖ）。ウレア及び鉱物を別々に滅菌し、そして１００℃の蒸気に当てた加水分解ミルクパーミエートと一緒にプールした。最終的な培地のｐＨは７．０であった。
【００３８】
発酵は、振とうフラスコ（２５０ｍｌ）内で１００ｍｌの容量で行った。フラスコは、オービタルシェーカー上で１８０ｒｐｍで振とうしながら９６時間２８℃でインキュベートした。この後、培地は粘性のある淡黄色のブロスになり、若干不快な臭いを有していた。
【００３９】
続いて８個のフラスコを一緒にして、そして、９倍の総容積の水で洗浄した粒状活性炭(Norid GAC 1240)の加圧型ろ過床（１８ｍｍｘ１２５ｍｍ直径）を通過させた。ブロスの粘性は、ろ過床中に保持されていた水と混合したため、最初の通過で１５０ｍＰａから１２６ｍＰａに低下したが、更に３回のサイクルろ過床にかけた後一定のままであった。これは、ブロスを脱色し、そして脱臭するには十分であった。
【００４０】
ＥＰＳ含量の解析（実施例１の方法による）の後、４．９ｇのキサンタン多糖を含有する７００ｇのブロスを２．２リットルのＲＯ水中４８５ｇのミルクタンパク質濃縮物（７０％タンパク質）と混合した。当該混合物をSilversonのオーバーヘッドホモジェナイザーで５分間ホモジェナイズし、篩（目開き(aperture)３００μｍ）を通過させ、５０℃に加温し、そして次にスプレー乾燥機にポンプで送った。この入り口温度は１８０℃であり、そしてミルクを供給する流速は、出口温度が８０〜９０℃に維持されるように調節された。
【００４１】
自由流動性の粉末を回収した結果、実施例１で使用したのと同一の解析方法により、１．０５６％のキサンタン多糖を含有することが明らかとなった。この粉末を使用して、パネラ又はケソ・フレスコとして知られている南米のチーズに似ているソフトホワイトチーズを作った。このチーズの基本的な組成は１４〜１８％がタンパク質であり、１０〜１２％が乳脂肪であり、そして７０〜７５％が水分であった。このチーズは、乳脂肪エマルジョンとミルクタンパク質濃縮物とを混合し、酸性化し、塩を加え、そして次にチーズが固まるまでレンネットと一緒にインキュベートすることで作った。
【００４２】
ミルクタンパク質濃縮物（２０ｇ）を４８０ｇのＲＯ水中５０℃で分散させた。融解した乳脂肪（５００ｇ）を添加し、そして粗いエマルジョンをSilversonのホモジェナイザーで作った。これを続いてRannieのホモジェナイザー内で７０／５０バールで完全にホモジェナイズした。
【００４３】
２つのミルクを続いて調整し、一方をコントロールのスプレー乾燥したミルクタンパク質濃縮物とし、そしてもう一方を１．０５６％のキサンタン多糖を含有するミルクタンパク質濃縮物とした。ミルクタンパク質濃縮物（１７０ｇ）は４９４ｇのＲＯ水中に５０℃で乳棒と乳鉢で分散させた。溶液をHeidolph RZR 50スターラーで１時間攪拌し、そして次に３００μｍの篩を通過させた。
【００４４】
続いて、６つの異なるチーズミルクを表２に従い、ミルクベース、脂肪エマルジョン、水、及び乳酸を５０℃で混合し、続いて塩を添加することで調製した。
【００４５】
ミルクの温度を続いて３８℃弱に調節し、レンネット(Chymax)を添加し、そして次にミルクをポトル容器に分配し、そして３８℃のインキュベーターに４０分間据えて凝集させた。ポトル容器を４℃の冷却室に移し、そして一晩冷却した。
【００４６】
【表２】
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【００４７】
次の日、固形分含量、食感及びチーズからのホエー損失を測定し、水分を１０２℃で一晩オーブン乾燥することで決定した。
【００４８】
チーズの食感をＴＡ  ＸＴ２テクスチャーアナライザー(Stable Micro Systems, Surrey, England)で測定し、そして試料を作った次の日に実施した。スカルペルを使用してプラスチックのポトル容器を切り離し、そして１０ｍｍの立方体をチーズから切り取った。チーズの立方体が中心に据えられ、力がかけられた２枚のプレートを用いたＴＡ  ＸＴ２テクスチャーアナライザーを５℃で使用する測定を実施した。試験速度は５ｍｍ／ｓであり、前記立方体を７ｍｍにまで圧縮した。この試験は、最低４回実施した。結果を時間に対する力としてプロットし、そしてグラフ下面積をチーズの固さの測定値として算出した。
【００４９】
遊離ホエーの測定のために、５℃でチーズを５ｍｍの立方体に切断し、そして、最低５ｇが添加されるまで円錐状の底を有する５０ｍｌの遠心管内に据えた。測定は４回一組で実施した。チーズを２１℃のインキュベーター内に３時間放置し、続いて１０分間遠心した（ＲＣＦ１１２）。ホエーを捨て、そして計量した。続いて遠心管を３０℃で２分間反転させ、そして残りの排出されたホエーを計量に加えた。ホエーの損失はチーズの元重量のパーセンテージとして算出した。
【００５０】
６個のチーズの結果を表３に示す。チーズ中の測定された固体は、２つのタンパク質レベルについての算出した値２７．４８％及び２５．７４％と密接に関連している。
【００５１】
試料間の固さの違いはわずかであったが、ミルク粉末中最高レベルのキサンタン及び最高レベルのタンパク質を含むチーズは除かれる。このチーズは他のものより若干固さがなく、これはより低レベルのタンパク質を含む試料の食感に一致していた。このタイプのチーズは極めて柔らかいのが特徴であり、この違いはチーズを口の中で比較した時にかろうじて検出可能であった。
【００５２】
チーズ間のホエーの損失の違いははるかに大きかった。最高レベルのキサンタン及びタンパク質を含むチーズは他の全てのチーズよりも有意により少ないホエーを失い、そしてこのレベルの多糖を含む、明らかにより少ないミルクタンパク質濃度が、このレベルのタンパク質でコントロール試料と等しいホエー保持能力のチーズを作成するために必要とされるであろう。１％多糖を含む２５．７４％ミルクタンパク質濃縮物で作られたチーズは、２７．４８％のタンパク質濃度チーズとホエー保持能力が同等であった。このことは、６％超のミルク粉末の節約を意味する。
【００５３】
【表３】
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【００５４】
Ｋ2ＰＯ4（０．２０％ｗ／ｖ）、ＭｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏ（０．０１％ｗ／ｖ）及び酵母抽出物（１．０％ｗ／ｖ）を含むラクターゼで加水分解したミルクパーミエート上でのキサントモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestris)菌株１３９５１の発酵によりブロスを調製した。
【００５５】
イーストマルトペプトンアガーを前記生物に接種し、そしてミルク培地に５％のレベルで添加した。
【００５６】
発酵は、振とうフラスコ（２５０ｍｌ）内で１００ｍｌの容量で行った。フラスコは、オービタルシェーカー上で１８０ｒｐｍで振とうしながら９６時間２８℃でインキュベートした。この後、培地は粘性のある淡黄色のブロスになり、若干不快な臭いを有していた。複数のフラスコを続いて一緒にして、そして、実施例１の方法によりＥＰＳ含量について解析し、そしてスキムミルク粉末に対してスプレー乾燥する準備を整えた。
【００５７】
逆浸透（ＲＯ）水を５０℃に加熱した。Heidolph RZR 50オーバーヘッドスターラーで一定に攪拌しながら、ＷＭＰを所望の固体濃度（〜２０％）になるよう添加し、そして３０分間混合した。この時点で、発酵ＥＰＳを添加し、そして処理前に１０分間混合した。添加した発酵物の量を算出し、乾燥粉末中のＥＰＳレベルを２．３％にした。試料をSilverson laboratoryのミキサー／エマルシファイアーを用いて低速で５分間ホモジェナイズした。試料を更にHeidolphミキサーを用い２０分間５０℃で混合し、そしてSilversonミキサーで１０分間ホモジェナイズした。３００μｍメッシュの篩を使用してあらゆる塊を除去し、これを続いて乳棒と乳鉢を用いて粉砕し、そして混合して溶液中に戻し、そしてこれを再び篩にかけた。
【００５８】
溶液を水浴中で５０℃に維持し、１８０℃の入り口温度及び８０〜９０℃の出口温度を有するAnhydro Lab S1スプレー乾燥機（デンマーク）にポンプで送り込んだ。流量を調節して出口温度が一定に維持されるようにした。スプレー乾燥した粉末を、光及び水分不透過性バッグ内で真空包装した。コントロールの粉末であるＥＰＳを含まないＷＭＰ粉末も調製した。
【００５９】
コントロール及びＥＰＳ含有粉末を混合して様々なＥＰＳ濃縮物を入手した。測定した粉末を徐々にＲＯ水に添加し、所望の全固形分濃度（１５％）を手に入れ、そしてこれを１時間混合した。粘性はコーンプレート型のRheometric Scientific SR-5000粘度計を用いて測定した（コーン直径４０ｎｍ及びコーン角度０．０４度）。ストレススイープの調節は、試験開始から６０秒遅れで、且つ０．０６Ｐａの初応力で実施した。温度は５℃に維持した。
【００６０】
発酵溶液ＥＰＳを含むミルク溶液は、０．０５〜１０００ｓ-1のせん断速度の全範囲にわたりコントロールのミルクよりも粘性があり、特に低いせん断速度で粘性があった。これはキサンタン及び他の多糖の特徴である（図１）。
【００６１】
多糖を含むホールミルクは、レンネットを添加し、そして次にカードからホエーを排出することでチーズにすることができる。コントロールのミルクより高収率のチーズカードをもたらされることが予想される。
【００６２】
実施例４
２．７１％のケルトロールを含むスプレー乾燥したホールミルク粉末を使用して、ＥＰＳ含有ミルクに対するテストパネリストの反応を見出した。ケルトロールはＣＰ  Ｋｅｌｃｏ（米国サンディエゴ）から入手し、そして実施例１で詳述した方法で解析した場合８４．８％のキサンタンＥＰＳを含有することが明らかとなった。前記粉末は、ＷＭＰを５０℃の脱イオン水に対し添加し、同時に激しく３０分間攪拌して２０％の溶液を作ることで調製した。この時点で、十分なケルトロールを添加して、最終粉末中２．３％のレベルのキサンタンＥＰＳを生成させ、そしてこれを１０分間混合した。試料をSilverson laboratoryのミキサー／エマルシファイアーを用いて低速で５分間ホモジェナイズした。試料を更にHeidolphミキサーを用い２０分間５０℃で混合し、そしてSilversonミキサーで１０分間ホモジェナイズした。３００μｍメッシュの篩を使用してあらゆる塊を除去し、これを続いて乳棒と乳鉢を用いて粉砕し、そして混合して溶液中に戻し、そしてこれを再び篩にかけた。
【００６３】
溶液を水浴中で５０℃に維持し、１８０℃の入り口温度及び８０〜９０℃の出口温度を有するAnhydro Lab S1スプレー乾燥機（デンマーク）にポンプで送り込んだ。流量を調節して出口温度が一定に維持されるようにした。スプレー乾燥した粉末を、光及び水分不透過性バッグ内で真空包装した。コントロールの粉末であるＥＰＳを含まないＷＭＰ粉末も調製した。
【００６４】
２つの試験を実施した。第一に、コントロールとキサンタンＥＰＳ含有粉末を混合して０．０２％キサンタン含有ＷＭＰ粉末を生成させた。これを再構成して１３．３％の固体濃度にした。再構成した１５％ＷＭＰコントロールミルクも調製した。両溶液の粘性はコーンプレート型のRheometric Scientific SR-5000粘度計を用いて測定した（コーン直径４０ｎｍ及びコーン角度０．０４度）。ストレススイープの調節は、試験開始から６０秒遅れで、且つ０．０６Ｐａの初応力で実施した。温度は５℃に維持した。結果を図２に示す。
【００６５】
キサンタンを含有するミルクの粘度は、キサンタンミルクはミルク粉末中２％少なかったにも関わらず、コントロールよりも若干高かったことがわかる。
【００６６】
３点比較法を使用して、消費者が前記２つのミルク間の違いを検出するか否かを決定した。３２人のパネリストのうち１１人が正確に異なる試料を見分けた。統計解析によると(Larmond, E. (1977). Laboratory Methods for Sensory Evaluation of Food. Canada Department of Agriculture Publication 1637. Kromar Printing Ltd.)、この結果は５％の信頼水準では有意ではなく、消費者は２つの試料間の違いがわからないと結論付けられる。この結果、ＥＰＳは、０．０２％ＥＰＳが１５％ＷＭＰ溶液のうち１．７％の全固形分に置き換えた場合、ＷＭＰ全固形分の代わりとなることができることがわかった。
【００６７】
第二の試験において、キサンタンＥＰＳを含有するスプレー乾燥したＷＭＰをコントロールＷＭＰと混合して、種々のＥＰＳ濃縮物入手し、そして再構成した。試験試料は、０．０１５、０．０４、及び０．０７９％のレベルでキサンタンＥＰＳを含有する１５％の固体を有していた。コントロールは、２０％の固形分となるように再構成したＷＭＰ（ＥＰＳ無し）から構成される。
【００６８】
前記ミルクの粘性はコーンプレート型のRheometric Scientific SR-5000粘度計及び２１℃でのストレススイープを用いて一定範囲のせん断速度にわたり測定した（図３）。
【００６９】
３２人のパネリストに対し、生成物のクリーミーさ、濃さ、風味、及び全体的な嗜好について嗜好尺度（好き／嫌い）で試料を比較するよう求めた。また、彼等にクリーミーさ及び濃さについて強度尺度で試料を格付けするよう求めた。
【００７０】
統計解析によると、風味及び全体的な嗜好の属性についての嗜好による格付けは、２項分布に従った。これは、人々が生成物を好きか嫌いかということを反映したものである。試験した人は濃いミルク生成物に馴染みがなく、そして大部分がコントロール及び試験ミルクの両方を嫌った。濃いミルクを飲む習慣がある消費者では異なる結果が得られるであろう。
【００７１】
平均した嗜好による格付けの統計解析によると、風味、全体的な嗜好、クリーミーさ及び濃さについて、４つの試料間で有意差はなかった（５％の信頼水準）。従って、キサンタンＥＰＳの添加は試験者のミルクに対する好き嫌いに有意な影響を与えなかった。
【００７２】
クリーミーさ及び濃さについての強度による格付けは全四試料について正規分布を示した。コントロール（２０％ＷＭＰ）及び０．０４％、０．０７９％キサンタンを含有する試験用の１５％ＷＭＰ試料の濃さ及びクリーミーさについての格付け間に有意差はなかった。しかしながら、コントロール試料は、０．０１５％キサンタンを含む試験用１５％ＷＭＰ試料よりも濃く、且つよりクリーミーであることが認識された。明らかに、このレベルのキサンタンでは、固形分レベルの５％の違いを埋め合わせるのに不十分であった。
【００７３】
実施例５
キサントモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestris)ＡＴＣＣ  １３９５１を、５ｇ／Ｌのトリプトン及び３ｇ／Ｌの酵母抽出物を含むＩＳＰ培地中で凍結乾燥試料から再構成した。これを４℃の傾斜のＹＭアガー上（ＹＭ培地は３ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ麦芽抽出物、５ｇ／Ｌペプトン、及び１０ｇ／Ｌグルコースを含み、そして２０ｇ／Ｌのアガーをこの固体のアガーの傾斜に使用した）で維持した。予備発酵槽の接種物は、１．２ｇ／ＬのＮＨ4ＮＯ3、２ｇ／ＬのＫ2ＨＰＯ4、０．１ｇ／ＬのＭｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏ、及びラクトザイム３０００Ｌで予めグルコースとガラクトースに予め加水分解したミルクパーミエート（５％ｗ／ｖラクトース）を含んでいた。バッチの発酵物は、ミルクパーミエート−ラクトースを発酵前に加水分解せず、そして消泡剤（Bevaloid 6618, Rhodia)を泡の制御のために使用したことを除き、同一培地中で取り扱った。全ての培地をｐＨ７に調節した。
【００７４】
接種物は、常用のプロトコールにより、結果として生じる培養液の容積の１０％（ｖ／ｖ）に等しい量で段階的に取り扱った。接種物は、ＹＭアガーのスラント上で保存した生物の神聖な培養物を含む三角フラスコ中に４ｘ７０ｍｌ容量の「ＹＭ」培地を接種し、そしてこの培養物をオービタルシェーカー上１８０ｒｐｍの回転速度で、２９℃の温度で２４時間培養することにより生成した。続いて、培養物は、２Ｌの三角フラスコ中の４ｘ６３０ｍｌ容量の培養液に個別に移し、同じ条件下で４８時間培養し、そして無菌的にプールした。これはバッチ発酵のための接種物としての役割を果たした。
【００７５】
バッチ発酵が機能する合計の容量は５５Ｌであり、これは無機塩を含む５１Ｌのミルクパーミエート（約５％ｗ／ｖラクトース）、０．９ＬのＮＨ4ＮＯ3ストック溶液（別々に滅菌）、２．８Ｌの種培養物、及び消泡剤（５５ｍｌ）と酵素溶液から成るバランス、から構成された。発酵物はＬＨバイオリアクター（６０Ｌ容量の反応装置）中で取り扱った。温度を２９℃に制御し、そしてｐＨを０．５ＭのＫＯＨで７．０に維持した。攪拌は７００ｒｐｍで維持し、これ以上の攪拌速度は過剰に泡立つため実行可能ではなかった。ラクターゼ酵素溶液を接種直後に発酵槽の容器中にろ過して移した。７２時間の発酵後、ブロスを冷蔵庫に移した。
【００７６】
ブロス中のＥＰＳ濃度は、実施例１で概説した方法で決定したところ、０．２５２％であることが明らかとなった。続いてブロスは、容量が〜２Ｌに減るまで１０，０００Ｄａのカットオフスパイラル型膜を通じて限外ろ過した。これを蒸留水で希釈し、そして保持液(retentate)が実質的に無色且つ無臭となるまでダイアフィルとレーションにかけた。保持液のＥＰＳ含量は０．５９３％であることが明らかとなった。
【００７７】
保持液のアリコート（１３０ｇ）を１Ｌに希釈し、そして２００ｇのミルクタンパク質濃縮物（ＭＰＣ）粉末（７０％タンパク質）を分散するために使用した。分散物を続いてSilversonミキサーで粉末が完全に溶解するまで攪拌した。溶液を水浴中で５０℃に加熱し、１８０℃の入り口温度及び８０〜９０℃の出口温度を有するAnhydro Lab S1スプレー乾燥機（デンマーク）にポンプで送り込んだ。流量を調節して出口温度が一定に維持されるようにした。０．３８５％の保持液ＥＰＳを含むスプレー乾燥粉末を、光及び水分不透過性バッグ内で真空包装した。ブロス保持液を含まないコントロールのＭＰＣ粉末も調製した。
【００７８】
ＭＰＣ中の乳脂肪の濃縮エマルジョンは、コントロールのＭＰＣ粉末２０ｇを４８０ｇのＲＯ水中５０℃で３０分間混合することで生成させた。再結合(recomgining)用の新鮮な凍結乳脂肪（５００ｇ）を融解し、そしてＭＰＣ溶液に添加し、そしてSilversonミキサーで粉末が均質になるまで低速でホモジェナイズした。続いてこれを４５℃で７０／５０バールのRannieのホモジェナイザーにかけた。
【００７９】
続いて、コントロールのミルク溶液は、１２１．５ｇのＭＰＣを５０℃に加熱した３７８．５ｇのＲＯ水中で溶解することで生成させた。溶液を１時間攪拌して完全に水和させた。
【００８０】
続いて、ミルク含有ＵＦ保持液は、０．３８５％のブロス保持液ＥＰＳを含む１２１．５ｇのＭＰＣを５０℃に加熱した３７８．５ｇのＲＯ水中で溶解することで生成させた。この溶液をHeidolph RZR 50スターラーで１時間攪拌し、そして次に３００μｍの篩を通過させてあらゆる塊又は泡を除去した。存在しているあらゆる塊を乳棒と乳鉢で粉砕し、そして混合して溶液中に戻し、そしてこれを３００μｍの篩を通過させてた。１．３９％の濃乳酸及び９８．６１％のＲＯ水を含んで成る乳酸溶液を生成させた。最終的に４つのチーズミルクを表４の割合に従い混合した。
【００８１】
【表４】
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【００８２】
ミルクを３８℃に加温し、５分間混合し、０．０１５％のレンネット(Christian Hansen, 540 IMCU/ml)に接種し、そして所望のチーズ量になるまでポトル容器に注いだ。ポトル容器を３８℃の水浴に４０分間据え、そしてチーズを一晩４℃で冷却した。
【００８３】
チーズの食感及び搾り取ったホエーを実施例２と同様の方法で測定し、結果を表５に示す。
【００８４】
【表５】
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【００８５】
保持液ＥＰＳを含有するＭＰＣで作ったチーズは、コントロールのチーズよりもソフトで、且つホエーの損失が少なかった。１００ｇのフレッシュチーズで開始すると、コントロールは合成後わずかに８０．６５ｇの重さであり、ＥＰＳ含有チーズの重さは８２〜８３ｇであった。保持液ＥＰＳを含有するＭＰＣを使用してフレッシュホワイトチーズを作った場合、排出後に等量のチーズを作るのにさほどＭＰＣは必要とされないことは明らかである。
【００８６】
実施例６
ラクトバチルス・デルブルキ サブスピーシーズ・ブルガリカス(Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus)ＡＣＣ菌株２４８３の母培養物は、滅菌したミルクのボトル（１０ｇのスキムミルク粉末（ＳＭＰ）／９０ｇのＲＯ水）に前記の生物を滅菌条件下で接種することで調製した。接種後、ボトルを３７℃で約１８時間インキュベーションし、この後これは厚いゲルになった。接種物を主要な実験に必要とされるまで冷蔵庫で保持した。
【００８７】
２Ｌの丸底フラスコ及び付属品を電気滅菌器で滅菌した。続いて、フラスコを３７℃の水浴中に固定し、そしてｐＨスタット、スターラーを備え付け、炭酸カルシウム懸濁液でプライミングした蠕動ポンプから供給させた。
【００８８】
５．５ｇのＳＭＰ及び５．５ｇの酵母抽出物(GibcoBRL)を含むミルクパーミエート（１．１Ｌ）と加熱して沸騰させ、そして次に３７℃に冷却させた。溶液の一部をその後の粘度測定のために取っておいて、そして培地の大部分を丸底フラスコに添加した。攪拌は、渦を作らずに液体を動かすのに丁度十分な低さの速さ開始した。母培養物（１０ｍｌ）を添加してフラスコを再び密封した。ｐＨが６まで低下したら、ｐＨスタット及び蠕動ポンプを開始した。
【００８９】
発酵を約１８時間続けた。この時間までにｐＨは４．８に下がっていた。炭酸カルシウムの注入は、ｐＨを６に安定させるのには不十分であり、これは当初の意図通りであった。ブロスを続いて９０〜１００℃に数分間加熱し、冷蔵庫で冷却して保存した。
【００９０】
ブロスの粘度は、２０℃のＲＯ水で標準化したＵ字管の粘度計で測定した。相対粘度は、元の未接種の培地の１．２２と比較して１．７９であった。
【００９１】
相対粘度の増大は、多少ＥＰＳが発酵の間に形成されていたことを示唆していたので、ＥＰＳの濃度を実施例１の方法で測定した。ＥＰＳ濃度は０．１ｇ／ｋｇブロスであることが明らかとなった。
【００９２】
残りのブロスは、酸化カルシウムをゆっくり添加することでｐＨ６．５に調節した。ブロスを濾過した後、これを用いて１００ｇのホールミルク粉末（ＷＭＰ）を溶解した。生じたミルクを水浴中で５０℃に加熱し、そして次に１８０℃の入り口温度及び８０〜９０℃の出口温度を有するAnhydro Lab S1スプレー乾燥機（デンマーク）にポンプで送り込んだ。流量を調節して出口温度が一定に維持されるようにした。スプレー乾燥した粉末を、光及び水分不透過性バッグ内で真空包装した。ブロスを含まないコントロールのＷＭＰも調製した。ＷＭＰ中のＥＰＳのレベルは０．１％であると推測された。
【００９３】
２つのスプレー乾燥した粉末の脱イオン水溶液（１５％固体）は、Ferranti-Shirley粘度計において、１００ｍｍのコーン及び０〜９３５ｓ-1のせん断スイープを用いて試験した。１００ｓ-1のときの見かけの粘度（Ｖ１００）、稠度係数（Ｋ）及び流動作用指数（ｎ）を指数法則の式から算出し、そして表６に示した。
【００９４】
【表６】
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表６．ラクトバチルス・デルブルキ サブスピーシーズ・ブルガリカス(Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus)ＡＣＣ菌株２４８３により産生されたＥＰＳを含む再構成ホールミルクと含まない再構成ホールミルクの粘度。ラクトバチルスのＥＰＳを含むＷＭＰから再構成したミルクは、コントロールのミルクよりも粘性があり、そしてより大きなをずり流動化（shear thinning）特性を示した。これは、より濃い乳製品として、又はより低濃度でコントロールのミルクと同様の食感を有するものとして使用することができる。このミルクはまた、レンネットを添加することでチーズに変換することもでき、そしてコントロールよりもチーズの収量を増大させることが予想される。
【００９５】
上記実施例は本発明の実施を例示をしたものである。当業者は、本発明が多数の改良及び変更により実施可能であることを認識するであろう。例えば、使用する微生物の型は変更可能である。使用する微生物によっては異なるエキソ多糖の産生株となりうる。発酵培地、炭素源及び時間及び温度も変更可能である。熱殺菌した発酵物を使用して異なる型のチーズ及びチーズ様製品を作ることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、種々の濃度の発酵溶液ＥＰＳを含む再構成したＷＭＰ（水中で１５％）の粘度の、一定のせん断速度にわたるグラフを示す。
【図２】図２は、０．０２％のキサンタンＥＰＳを含む試験用の再構成したミルク（１３．３％）と比較した、水中で再構成したＷＭＰ（１５％）の粘度の、一定のせん断速度にわたるグラフを示す。
【図３】図３は、キサンタンＥＰＳを含む試験用の再構成したミルク（１５％）と比較した、水中で再構成したＷＭＰ（２０％）の粘度の、一定のせん断速度にわたるグラフを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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