(57)【要約】  本発明は，少なくとも二つの官能基のカップリング反応の操作条件をスクリーニングするための方法、特に前記カップリング反応において有用な触媒、ならびに前記方法を実行するためのキットに関する。本発明は、基礎および応用研究へ、特に化学、アグロフード、薬学、および環境保護の領域において、合成反応の性能を開発および最適化するべく適用されることが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも二つの官能基のカップリング反応の操作条件をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
i）少なくとも二つの化合物：
・式Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１
［式中、Ｇ１は前記少なくとも二つの官能基の一番目を表し、Ｘ１は共有結合または第一のスペーサー基を表しており、一方Ｅ１は第一の分子Ｍ１の残基を表し、それに対して第一の特異抗体ＡＣ１が利用可能である］
の第一の化合物、および
・式Ｅ２−Ｘ２−Ｇ２
［式中、Ｇ２は前記少なくとも二つの官能基の二番目を表し、Ｘ２は共有結合または第二のスペーサー基を表しており、Ｘ１と同じかまたは異なってよく、一方Ｅ２は、Ｍ１とは異なる第二の分子Ｍ２の残基であって且つこれに対しては第二の特異抗体ＡＣ２が利用可能であるか、あるいはカップリング剤の存在下に抗体ＡＣ１と少なくとも一つの共有結合を形成することができる基を表す］
の第二の化合物、
を一緒に反応させる工程であって；
前記少なくとも二つの化合物が、一つの溶媒中の溶液中で、あらかじめ操作された条件下に反応させられており、少なくともその一つは、反応媒体および、鎖Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１−Ｇ２−Ｘ２−Ｅ２を含んでいる化合物Ｚのこの媒体における形成を得るための、候補操作条件であって、これにおいてＸ１、Ｘ２、Ｅ１、およびＥ２は上記と同様の意味を有し、一方Ｇ１−Ｇ２は、前記少なくとも二つの官能基のカップリングから結果として生じる原子団を表しており；
ｉｉ）反応媒体中の化合物Ｚの濃度を、あらかじめ決められた反応時間ｔにおいて、少なくとも抗体ＡＣ１を用いた少なくとも一つのイムノアッセイによって測定する工程；および
ｉｉｉ）そのようにして測定された化合物Ｚの濃度を用いて、前記カップリング反応に対する候補操作条件の影響を評価する工程、
を含む方法。
【請求項２】
前記カップリング反応が、エステル化反応、アミド反応、アルドール反応およびニトロアルドール反応、ヘック反応、ベイリス・ヒルマン反応、マイケル反応、メタセシス反応、ディールス・アルダー反応、ソノガシラ反応、スズキ反応、クマダ反応、スティール反応、ヒヤマ反応、リーベスキンド・スログル反応、マンニッヒ反応、ハンチュ反応、ボシオらの反応、ウギ反応、およびそれらの変形からなる群から選ばれる、請求項１の方法。
【請求項３】
Ｅ１またはＥ２がヒスタミン残基を表す、請求項１または請求項２の方法。
【請求項４】
Ｅ１またはＥ２がホモバニリン酸残基を表す、請求項１または請求項２の方法。
【請求項５】
Ｅ１またはＥ２が、以下の式（ＩＩＩ）：
【化１】
2007527367.tif 000020
［式中、Ｒ１は水素原子か、または保護基を表す］
に相当する、請求項３の方法。
【請求項６】
Ｅ１またはＥ２が、以下の式（ＩＶ）：
【化２】
2007527367.tif 000021
［式中、Ｒ２は水素原子か、または保護基を表す］
に相当する、請求項５の方法。
【請求項７】
Ｅ２が、アミン、カルボン酸、アルデヒド、チオール、フェノール、アルケニルおよびアジド基、および光活性化可能な基から選ばれる基を表す、請求項１または請求項２の方法。
【請求項８】
Ｅ２が、アミンまたはチオール基を表す、請求項７の方法。
【請求項９】
化合物Ｚのための前記少なくとも一つのイムノアッセイが固相アッセイである、請求項１〜８のいずれか一項の方法。
【請求項１０】
Ｅ２が、分子Ｍ２の残基に相当することから、工程ｉｉ）が以下の工程：
ａ１）反応時間ｔにおいて得られた反応媒体を、その上に第一の抗体ＡＣ１が固定されている固相と接触させ、この抗体とこの化合物の残基Ｅ１との間の免疫結合により、この固体相への化合物Ｚの付着を得る工程；
ｂ１）固相を、標識へ結合された第二の抗体ＡＣ２を含んでいるコンジュゲートと接触させ、前記第二の抗体ＡＣ２と、前記固相へ付着された化合物Ｚの残基Ｅ２との間の免疫結合により、該コンジュゲートの、該固相への付着を得る工程；
ｃ１）抗体ＡＣ２に結合された標識により、固相へ付着されたコンジュゲートの量を測定する工程；および
ｄ１）そのようにして測定されたコンジュゲートの量から、前記時間ｔにおける反応媒体中の化合物Ｚの濃度を、基準範囲において測定する工程；
を含んでおり、
前記工程ｉｉ）がまた、工程ａ１）とｂ１）の間、および工程ｂ１）とｃ１）の間に、固相を洗浄することからなる一以上の操作も含んでいる、請求項１〜６のいずれか一項の方法。
【請求項１１】
Ｅ２が、第一の抗体ＡＣ１と少なくとも一つの共有結合を形成することができる基に相当することから、工程ｉｉ）が以下の工程：
ａ２）反応時間ｔにおいて得られた反応媒体を、その上に第一の抗体ＡＣ１が固定されている固相と接触させ、該抗体と該化合物の残基Ｅ１との間の免疫結合により、該固相への化合物Ｚの付着を得る工程；
ｂ２）カップリング剤を、前記固相上に固定された第一の抗体ＡＣ１および、該固相へ付着された化合物Ｚの基Ｅ２と反応させ、該抗体と該基との間に一以上の共有結合の形成を得る工程；
ｃ２）前記固相上に固定された第一の抗体ＡＣ１と、前記固相へ付着された化合物Ｚの残基Ｅ１との間に存在する免疫結合を変性させ、該固相から該残基を放出する工程；
ｄ２）前記固相を、標識へ結合された第一の抗体ＡＣ１を含んでいるコンジュゲートと接触させ、前記抗体と、そのように放出された化合物Ｅ１−Ｘ−Ｇ１−Ｇ２−Ｙ−Ｅ２の残基Ｅ１との間の免疫結合により、該固相への該コンジュゲートの付着を得る工程；
ｅ２）抗体ＡＣ１に結合された標識により、前記固相へ付着されたコンジュゲートの量を測定する工程；および
ｆ２）そのようにして測定されたコンジュゲートの量から、前記時間ｔにおける反応媒体中の化合物Ｚの濃度を、基準範囲において測定する工程；
を含んでおり、
前記工程ｉｉ）がまた、工程ａ２）とｂ２）の間、ｂ２）とｃ２）の間、ｃ２）とｄ２）の間、およびｄ２）とｅ２）の間、に、固相を洗浄することからなる一以上の操作も含んでいる、請求項１、２、７、または８のいずれか一項の方法。
【請求項１２】
前記第一の抗体ＡＣ１がモノクローナル抗体である、先行する請求項のいずれか一項の方法。
【請求項１３】
前記第二の抗体ＡＣ２がモノクローナル抗体である、請求項１〜６または１０のいずれか一項の方法。
【請求項１４】
前記固相が、その上に前記第一の抗体ＡＣ１が吸着されている、マイクロタイトレーション用プレートのウエルの壁である、先行する請求項のいずれか一項の方法。
【請求項１５】
前記標識が酵素、好ましくはアセチルコリンエステラーゼである、請求項１０または請求項１１の方法。
【請求項１６】
前記工程ｉ）およびｉｉ）の間に、反応媒体の希釈からなる操作を含んでいる、先行する請求項のいずれか一項の方法。
【請求項１７】
前記カップリング反応の収率が、反応媒体中の化合物Ｚの濃度から測定される、先行する請求項のいずれか一項の方法。
【請求項１８】
前記カップリング反応が、２、３、または４個の官能基のカップリングからなる、先行する請求項のいずれか一項の方法。
【請求項１９】
前記カップリング反応が二つの官能基Ｇ１およびＧ２のカップリングからなり：
−工程ｉ）において、式Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１およびＥ２−Ｘ２−Ｇ２の化合物は一緒に反応され、前記反応媒体中で、式Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１−Ｇ２−Ｘ２−Ｅ２
［式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｅ１、およびＥ２は上記と同様の意味を有し、Ｇ１−Ｇ２は前記官能基Ｇ１およびＧ２の間のカップリングから結果として生じる原子団を表す］
に相当する化合物Ｚの形成が得られ、一方
−工程ｉｉ）において、前記反応媒体中の化合物Ｚの濃度は、単一のイムノアッセイによって測定される、
請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記カップリング反応が三つの官能基Ｇ１、Ｇ２、およびＧ３のカップリングからなり：
−工程ｉ）においては、式Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１およびＥ２−Ｘ２−Ｇ２の化合物は、式Ｅ３−Ｘ３−Ｇ３
［式中、Ｘ３は共有結合か、または第三のスペーサー基を表し、Ｘ１および／またはＸ２と同じかまたは異なってよく、一方Ｅ３は、Ｍ１およびＭ２とは異なる第三の分子Ｍ３の基であり，それに対して第三の特異抗体ＡＣ３が利用可能であるか、あるいは、カップリング剤の存在下に抗体ＡＣ１と共有結合を形成することが可能な基を表すが、Ｅ２がすでにかかる基を表していることはないという条件下である］
の第三の化合物と反応され、前記反応媒体中で、以下の式：
【化３】
2007527367.tif 000022
［式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３は、上記と同様の意味を有し、かつ
【化４】
2007527367.tif 000023
は、前記官能基Ｇ１、Ｇ２、およびＧ３のカップリングから結果として生じる原子団を表す］
の一つに相当する化合物Ｚの形成を得るようにし；一方
−工程ｉｉ）においては、反応媒体中の化合物Ｚの濃度が、二つの異なるイムノアッセイにより測定される、
請求項１８の方法。
【請求項２１】
前記カップリング反応が４つの官能基Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、およびＧ４のカップリングからなり：
−工程ｉ）においては、式Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１およびＥ２−Ｘ２−Ｇ２の化合物は、前文に定義された式Ｅ３−Ｘ３−Ｇ３の第三の化合物と、および式Ｅ４−Ｘ４−Ｇ４
［式中、Ｘ４は共有結合か、または第４のスペーサー基を表し、Ｘ１、Ｘ２および／またはＸ３と同じかまたは異なってよく、一方Ｅ４は、Ｍ１、Ｍ２、およびＭ３とは異なる第四の分子Ｍ４の残基であり，それに対して第四の特異抗体ＡＣ４が利用可能であるか、あるいは、カップリング剤の存在下に抗体ＡＣ１と共有結合を形成することが可能な基を表すが、Ｅ２、およびＥ３がすでにかかる基を表していることはないという条件下である］
の第４の化合物と反応され、
前記反応媒体中で、以下の式：
【化５】
2007527367.tif 000024
［式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４は、上記と同様の意味を有し、かつ
【化６】
2007527367.tif 000025
は、前記官能基Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、およびＧ４のカップリングから結果として生じる原子団を表す］
の一つに相当する化合物Ｚの形成を得るようにし；一方
−工程ｉｉ）においては、前記反応媒体中の化合物Ｚの濃度が、三つの異なるイムノアッセイにより測定される、
請求項１８の方法。
【請求項２２】
前記候補操作条件が、溶媒、触媒，温度レベル、圧力レベル、超音波の利用、濃度、化学量論比、反応時間、およびそれらの組合せからなる群より選ばれる、先行する請求項のいずれか一項の方法。
【請求項２３】
前記候補操作条件が触媒である、先行する請求項のいずれか一項の方法。
【請求項２４】
少なくとも二つの官能基のカップリング反応の操作条件をスクリーンする方法を実行するためのキットであって、適当な量の：
−一緒に反応することが意図された少なくとも二つの化合物、
・式Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１
［式中、Ｇ１は前記少なくとも二つの官能基の一番目を表し、Ｘ１は共有結合または第一のスペーサー基を表しており、Ｅ１は第一の分子Ｍ１の残基を表す］
の第一の化合物；および
・式Ｅ２−Ｘ２−Ｇ２
［式中、Ｇ２は前記少なくとも二つの官能基の二番目を表し、Ｘ２は共有結合または第二のスペーサー基を表し、Ｘ１と同じかまたは異なってよく、Ｅ２は、Ｍ１とは異なる第二の分子Ｍ２の残基である］
の第二の化合物；
−少なくとも二つの抗体：
・第一の分子Ｍ１に特異的な第一の抗体ＡＣ１であり、該抗体は任意に複数の固相へ付着されており；および
・第二の分子Ｍ２に特異的な第二の抗体ＡＣ２であり、該抗体は標識へ結合されており；
−鎖Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１−Ｇ２−Ｘ２−Ｅ２を含んでいる化合物Ｚであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｅ１、およびＥ２は上記と同様の意味を有し、一方Ｇ１−Ｇ２は、前記少なくとも二つの官能基のカップリングから結果として生じる原子団を表しており；さらに、任意に：
−標識を可視化するための試薬、たとえば標識が酵素であれば基質；および
−適当に選ばれた緩衝液、
を含むキット。
【請求項２５】
少なくとも二つの官能基のカップリング反応の操作条件をスクリーンする方法を実行するためのキットであって、適当な量の：
−一緒に反応することが意図された少なくとも二つの化合物、
・式Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１
［式中、Ｇ１は前記少なくとも二つの官能基の一番目を表し、Ｘ１は共有結合または第一のスペーサー基を表しており、Ｅ１は第一の分子Ｍ１の残基を表す］
の第一の化合物；および
・式Ｅ２−Ｘ２−Ｇ２
［式中、Ｇ２は前記少なくとも二つの官能基の二番目を表し、Ｘ２は共有結合または第二のスペーサー基を表し、Ｘ１と同じかまたは異なってよく、Ｅ２は、カップリング剤の存在下に、分子Ｍ１に特異的な抗体と一以上の共有結合を形成することのできる基を表す］
の第二の化合物；
−少なくとも一つの抗体、この抗体は分子Ｍ１に特異的な前記抗体であり；
−標識へ結合された、分子Ｍ１に特異的な前記抗体を含んでいるコンジュゲート；
−鎖Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１−Ｇ２−Ｘ２−Ｅ２を含んでいる化合物Ｚであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｅ１、およびＥ２は上記と同様の意味を有し、一方Ｇ１−Ｇ２は、前記少なくとも二つの官能基のカップリングから結果として生じる原子団を表しており；さらに、任意に：
−標識を可視化するための試薬、
−カップリング剤、
−免疫結合を変性させることができる試薬、および
−適当に選ばれた緩衝液、
を含むキット。
【請求項２６】
請求項１〜２３のいずれか一項のスクリーニング法の、または、請求項２４または請求項２５のキットの、スクリーニングのための、特に、二つの官能基間のカップリング反応において有用な触媒の「ハイスループット」スクリーニングのための用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、参考として本明細書に含まれる、２００３年４月１５日出願のフランス特許出願番号第０３  ５０１０６号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、化学カップリング反応の操作条件のスクリーニング法、およびこの方法が実行されることを可能にするための好適なキットに関する。
【０００３】
さらに明確には、本発明は、種々の操作条件の影響を、反応の収率について同時に検査するための方法であって、たとえば、結果としてこの収率の最適化を生じる一つまたはいくつかの条件を選択する目的で、少なくとも二つの官能基をカップリングすることを含む方法に関する。
【０００４】
このような操作条件は、定性的および定量的の双方であってよい。
【０００５】
従って、この方法は、触媒または溶媒といった、特定のカップリング反応においてそれらが有用であり得るかどうかを決定することが所望される物質をスクリーンするべく使用されることが可能であり、また、反応媒体としてカップリング反応の収率に対するその影響を測定することが要求されるレベル、たとえば温度または圧力レベル，濃度、化学量論比、または、反応時間または反応媒体の撹拌時間のような時間を、スクリーニングするべく使用されてよい。
【０００６】
本発明の方法は、それゆえ、基礎および応用の双方の研究の分野において、数多くの適用を見出しやすい。
【０００７】
したがってそれは、たとえば、化学的であれ生物学的であれ、均一系または不均一系の触媒作用の機構のよりよい理解を目的とする基礎的研究において使用されることが可能である。
【０００８】
それはまた、応用調査研究において、特に化学、アグロフード、薬学、および環境保護の領域において、より効果的でありかつ特定の制約に対し特異的に反応し得る触媒を開発すること、または、合成反応の収率または実験条件を、たとえばこれらの反応の実行の経費を低減するべく最適化すること、という目的で使用されることが可能である。
【０００９】
それは特に、「野生型」酵素の触媒性能レベルを改善する目的で、突然変異した酵素のライブラリをスクリーンするべく、あるいは既知または未知の組成を有する生物学的媒体を、これらの媒体中の特定の触媒活性の存在を同定する目的でスクリーンするべく使用されることが可能である。
【背景技術】
【００１０】
カップリング反応の操作条件をスクリーニンするという点においては、これらは本質的には、今日までに提案されてきた触媒をスクリーンするべく意図された方法である。
【００１１】
こうした方法は、すべて、種々の候補触媒の存在下に、それについてカップリング反応が使用されやすい化合物のファミリーを代表する、二つの特定の化合物を反応させることからなる工程、およびその後の、前記反応に対するこれらの触媒の有効性を評価することからなる工程を含む。
【００１２】
したがって、第一に、カップリング反応の終了時に、反応媒体の組成を分析することを目的とした、高圧力液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による既知の方法があり、そのことは、たとえばシリカゲルカラム上での濾過により、それらがまず精製されねばならないことを意味している。
【００１３】
これらはそれゆえ、実行するのに骨の折れる方法であり、一日あたり限られた数の検査しか行なうことができず、結果的にミディアム−またはハイ−スループットスクリーニングには完全に不適当である。
【００１４】
第二に、カップリング反応の終了時に、このカップリング反応に関与する化合物のうちの一つと、または前記反応から派生した産物または副産物と反応して、呈色、脱色、または蛍光または化学発光の放出といったシグナルを発生することができる、化学反応を使用することを目的とした方法がある。
【００１５】
単なる例として、以下が参照される：
−ラバストル（Lavastre）およびモルケン（Morken）によりAngew. Chem. Int. Ed. １９９９年、第３８巻，第２１号、ｐ．３１６３−３１６５、［１］において記述された、アリル位アルキル化において有用な触媒のスクリーニングのための方法であり、このアルキル化の過程で産生される１−ナフトールを、「ファーストレッドバイオレットＬＢ」として知られるジアゾニウム塩と反応させ、明橙色化することによって検出することを目的とする；
−ベーム（Boehm）およびハーマン（Herrmann）により、Eur. J. Org. Chem. ２０００年、ｐ．３６７９−３６８１、［２］において記述された、ソノガシラ（Sonogashira）反応において有用な触媒をスクリーンするためのものであって、この反応の産物を、ＫＭｎＯ４で酸化して反応媒体の脱色を引き起こすことによって示すことからなる；
−レーバー（Loeber）らにより、J. Am. Chem. Soc. ２００１年、第１２３巻，ｐ．４３６６−４３６７、［３］において提唱された、アニリンのようなアリールアミンによる１，３−ジエンのハイドロアミネーションにおいて有用な触媒をスクリーンするためのものであって、残存するアニリンを、その効果が反応媒体を赤色に着色することである、酸の存在下にフルフラールと反応させることによって示すことからなる。
【００１６】
この第二のタイプの方法は、それ自身、カップリング反応に関与する化合物の一つに、あるいはこの反応によって形成される産物に、特異的な反応物を必要とするという欠点を示しており、そのことが、化合物に関連するかまたは、かかる反応物をそれに利用することができる産物を結果として生じる、反応のスクリーニングへの、その使用を制限している。
【００１７】
また、カップリング反応に関係する化合物の一方が固形担体へ付着されており、他方が蛍光プローブで標識されている方法も存在する。二つの化合物は反応されるため、触媒の有効性は、結果として固形担体上に反応由来の産物の形成を生じる。この担体は次に、反応していない化合物の分画を除去し、かつ反応に由来する産物を前記担体上に存在する蛍光を読取ることによって検出する目的で、洗浄されねばならない。
【００１８】
このような方法の実例は、ショーネシー（Shaugnessy）らによる文献（J. Am. Chem. Soc. １９９９年、第１２１巻，ｐ．２１２３−２１３２、［４］）において、ヘック（Heck）反応において有用な触媒のスクリーニングについて例示されている。この実例においては、第一の化合物は架橋されたポリスチレン樹脂（ワング（wang）樹脂）へ付着されているハロゲン化アリールであり、一方第二の化合物はクマリンで標識されたアクリレートである。
【００１９】
後者のタイプの方法は、二つの主要な欠点を示す。まず、触媒作用は不均一媒体中で行なわれる。現在、不均一媒体中で高い触媒活性を示す触媒が、均一媒体中では完全に無効であることを証明することが可能であることが知られている。さらに、触媒作用の査定は本質的に定性的であって、カップリング反応の収率を計算することは、この計算が固形担体上の第一の化合物のグラフティングの度合いについての知識を必要とすることから困難である。
【００２０】
もう一つのタイプの方法は、有効な触媒の存在下では、無効な触媒の存在下よりも、反応による熱の放出がより迅速に起こるという事実に基づいている。したがって、熱量測定法によるか、または前記反応媒体の上に固定された超高感度赤外線カメラを使用したサーモグラフィーによって、反応媒体の温度変異を測定することにより、触媒の有効性を査定することが可能である。
【００２１】
このタイプの方法の一つの態様の実例は、ブラックモンド（Blackmond）らによる刊行物（Organic Process Research & Development、１９９９年、第３巻，第４号，ｐ．２７５−２８０、［５］）において、ヘック反応において有用な触媒のスクリーニングについて例示されている。
【００２２】
熱分析スクリーニング法は、相当な、かつ費用のかかる材料を必要とするという欠陥を有する。さらに、それは反応収率の計算を可能にはしない。最後に、それはゆっくりと起こる反応には適用可能ではなく、その結果として、検出不能または充分に有意ではない熱の量を出してしまう。
【００２３】
最後に、ヒンダーリング（Hinderling）およびチャン（Chen）により、Angew. Chem. Int. Ed.、１９９９年、第３８巻、第１５号、ｐ．２２５３−２２５６、［６］において、オレフィン重合触媒のスクリーニングを行なうための、エレクトロスプレー質量分析法の使用が提唱されている。ここでもまた、相当な、かつ費用のかかる材料を必要とする方法が含まれている。
【非特許文献１】Lavastre and Morken, Angew. Chem. Int. Ed. 1999, 38(21), 3163-3165
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
それゆえ、カップリング反応に対する種々の操作条件の影響、およびさらに詳細にはこの反応における触媒の潜在的な有用性、を検査することを可能にする方法、および全般的に、今日までに提案されたスクリーニング法によって示されたすべての欠点がない方法に対し、真の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明は、少なくとも二つの官能基のカップリング反応の操作条件をスクリーニングする方法を提供することにより、この必要性を的確に満たすものであり、以下の工程：
i）少なくとも二つの化合物：
・式Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１
［式中、Ｇ１は前記少なくとも二つの官能基の一番目を表し、Ｘ１は共有結合または第一のスペーサー基を表しており、一方Ｅ１は第一の分子Ｍ１の残基を表し、それに対し第一の特異抗体ＡＣ１が利用可能である］
の第一の化合物、および
・式Ｅ２−Ｘ２−Ｇ２
［式中、Ｇ２は前記少なくとも二つの官能基の二番目を表し、Ｘ２は共有結合または第二のスペーサー基を表しており、Ｘ１と同じかまたは異なってよく、一方Ｅ２は、Ｍ１とは異なる第二の分子Ｍ２の残基でありかつ第二の特異抗体ＡＣ２がそれに対して利用可能であるか、あるいはカップリング剤の存在下に抗体ＡＣ１と少なくとも一つの共有結合を形成することができる基を表す］
の第二の化合物、
を一緒に反応させることであって；
前記少なくとも二つの化合物は、一つの溶媒において溶液中で、あらかじめ操作された条件下に反応されており、少なくともその一つは、反応媒体および、鎖Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１−Ｇ２−Ｘ２−Ｅ２を含んでいる化合物Ｚのこの媒体における形成を得るための、候補操作条件であって、これにおいてＸ１、Ｘ２、Ｅ１、およびＥ２は上記と同様の意味を有し、一方Ｇ１−Ｇ２は、前記少なくとも二つの官能基のカップリングから結果として生じる原子団を表しており；
ｉｉ）反応媒体中の化合物Ｚの濃度を、あらかじめ決められた反応時間ｔにおいて、少なくとも抗体ＡＣ１を用いた少なくとも一つのイムノアッセイによって測定する工程；および
ｉｉｉ）そのようにして測定された化合物Ｚの濃度を用いて、前記カップリング反応に対する候補操作条件の影響を評価すること、
を含む。
【００２６】
したがって、本発明の方法においては、それについて操作条件をスクリーンすることが所望されかつ、この適例ではＧ１およびＧ２の少なくとも二つの官能基を含むカップリング反応は、反応物として、各々が一端にこれらの官能基のうちの一つを、他端には、それに対して特異抗体、各々ＡＣ１およびＡＣ２が利用可能である各々分子Ｍ１およびＭ２の残基、を、あるいは第二の化合物の場合には、分子Ｍ１に特異的な抗体ＡＣ１と一以上の共有結合を形成することの可能な基を含んでいる、少なくとも二つの化合物を使用して、カップリング剤の存在下に行なわれる。
【００２７】
カップリング反応によって産生される化合物Ｚの反応媒体中の濃度は、したがって、選択された反応時間ｔにおいて、少なくとも一つのイムノアッセイによって容易に測定されることが可能であり、このアッセイは抗体ＡＣ１のみか、または二つの抗体ＡＣ１およびＡＣ２を使用する。
【００２８】
ひとたび化合物Ｚの濃度がわかれば、次に、カップリング反応の収率を計算によって測定すること、およびその下にそれが行なわれた操作条件の影響を査定することが可能である。これらの影響はまた、しかしながら、前記濃度を、異なる操作条件下にあらかじめ得られていた一以上の濃度と比較すること、および基準値としての役割を果たすことによっても査定されることが可能である。
【００２９】
上記のおよび以下の本文において：
−用語「候補操作条件」は、それについて、カップリング反応に対する影響が検査される、操作条件を意味することが意図される；
−用語、分子Ｍ１の「残基」は、前記分子が、Ｘ１が共有結合またはスペーサー基を表すかに依存して官能基Ｇ１またはスペーサー基へ、共有結合によって付着された場合、式Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１の化合物中に残っているこの分子部分を意味することが意図される；同様に、用語、各々Ｍ２、Ｍ３、またはＭ４の分子の「残基」は、前記分子が、Ｘ２、Ｘ３、またはＸ４が共有結合またはスペーサー基を表すかに依存して各々官能基Ｇ２、Ｇ３、またはＧ４か、またはスペーサー基へ、共有結合によって付着された場合、式Ｅ２−Ｘ２−Ｇ２、Ｅ３−Ｘ３−Ｇ３、またはＥ４−Ｘ４−Ｇ４の化合物中に残っているこの分子部分を意味することが意図される。
【００３０】
さらに、用語、分子に「特異的な抗体」は、この分子を特異的に認識すること、および抗原−抗体免疫反応によりそれと結合することのできる抗体を意味することが意図される。
【００３１】
前文に示したように、化合物Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１およびＥ２−Ｘ２−Ｇ２において、Ｇ１およびＧ２は、操作条件をスクリーンすることが所望されるカップリング反応に少なくとも関与している二つの官能基に相当し、それゆえこの反応によって選ばれる。
【００３２】
二つの官能基を含み、かつ本発明による方法がそれに使用可能であるカップリング反応は、特に以下の分子間カップリング反応である：
−エステル化反応、カルボン酸（Ｒ−ＣＯＯＨ）または、たとえば、酸ハロゲン化物（Ｒ−ＣＯ−Ｈａｌ）のようなカルボン酸誘導体と、アルコール（Ｒ′−ＯＨ）とのカップリングからなるような、エステル基（Ｒ−ＣＯ２Ｒ′）を得るようにする反応；
−アミド反応、カルボン酸（Ｒ−ＣＯＯＨ）またはカルボン酸誘導体と、第一級（Ｒ′−ＮＨ２）または第二級（Ｒ′−ＮＨ−Ｒ′′）アミンとのカップリングからなるような、アミド（Ｒ−ＣＯＮＨ−Ｒ′またはＲ−ＣＯＮＲ′−Ｒ′′）を得るようにする反応；
−アルドール反応、二つのアルデヒド（Ｒ−ＣＨＯ）または二つのケトン（Ｒ−ＣＯ−Ｒ′）のカップリングか、またはアルデヒドとケトンのカップリングからなるような、アルドールまたはケトールを得るようにする反応、およびニトロアルドール反応のようなその変形で、アルデヒドが窒素化合物（Ｒ′−ＣＨ２−ＮＯ２）とカップリングされてニトロアルコール（Ｒ−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＮＯ２）−Ｒ′）を得るようにするような反応；
−ヘック反応、オレフィン（Ｒ′−ＣＨ＝ＣＨ２）と有機ハロゲン化物（Ｒ′−Ｈａｌ）とのカップリングからなり、アルケン（Ｒ−ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ′）を得るようにする反応、およびその変形；
−ベイリス・ヒルマン（Baylis-Hillman）反応、アルケン（Ｒ−ＣＨ＝ＣＨ２）とアルデヒド（Ｒ′−ＣＨＯ）とのカップリングからなり、アリルアルコール（Ｒ′−Ｃ（ＣＨ２）−ＣＨ（ＯＨ）−Ｒ′）を得るようにする反応、およびその変形；
−マイケル（Michael）反応、求核性化合物と不飽和電子受容体化合物（たとえば、Ｒ−ＣＨ＝ＣＨ２）との間の付加反応からなる反応、およびその変形；
−メタセシス反応、二つのオレフィン（たとえば、Ｒ−ＣＨ＝ＣＨ２およびＲ′−ＣＨ＝ＣＨ２）のカップリングからなり、第三のオレフィン（Ｒ−ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ′）を得るようにするような反応；
−ディールス・アルダー（Diels-Alder）反応であり、ジエンとジエノフィルとの間の環付加化からなる反応；
−ソノガシラ反応、アルキン（Ｒ−Ｃ＝ＣＨ）とハロゲン化アリール（Ａｒ−Ｈａｌ）とのカップリングからなる反応、およびその変形；
−スズキ（Suzuki）反応、アリールボロン酸（Ａｒ−Ｂ（ＯＨ）２）とハロゲン化アリール（Ａｒ′−Ｈａｌ）とのカップリングからなり、ジアリール（Ａｒ−Ａｒ′）を得るようにする反応，およびその変形；
−クマダ（Kumada）反応、グリニャール試薬（Ｒ−Ｍｇ−Ｈａｌ）とハロゲン化アルキル、ハロゲン化ビニル、またはハロゲン化アリールとのカップリングからなる反応、およびその変形；
−スティール（Stille）反応、有機スズ化合物（たとえば、Ａｒ−ＳｎＢｕ３）と有機ハロゲン化物（たとえば、Ａｒ′−Ｂｒ）とのカップリングからなる反応，およびその変形；
−ヒヤマ（Hiyama）反応、有機シラン（たとえば、Ａｒ−ＳｉＲ３）と有機ハロゲン化物（たとえば、Ａｒ′−Ｂｒ）とのカップリングからなる反応、およびその変形；
−リーベスキンド・スログル（Liebeskind-Srogl）反応、ボロン酸（たとえば、Ａｒ−Ｂ（ＯＨ）２）とチオールエステル（Ｒ−ＣＯ−Ｓ−Ｒ′）のカップリングからなり、ケトンを得るようにする反応、および変形。
【００３３】
三つの官能基を含むカップリング反応は、特に、活性水素を有する化合物と、エノール化不能なアルデヒドおよび、第一級または第二級アミンとのカップリングからなり、アミノメチル化合物を得るようにするマンニッヒ（Mannich）反応、アミンと、アルデヒドおよび、α−ブロモケトンとのカップリングからなり、ピロールを得るようにするハンチュ（Hantzsch）反応、およびα−ケトアルデヒドと、カルボン酸および、イソニトリルとのカップリングからなり、オキサゾールを得るようにするボシオ（Bossio）らの反応であり、一方４つの官能基を含むカップリング反応は、たとえば、カルボン酸、第一級アミン、カルボニル化合物、およびイソシアニドのカップリングからなり、α−アミノカルボキサミドを得るようにするウギ（Ugi）反応である。
【００３４】
さらに、式Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１、およびＥ２−Ｘ２−Ｇ２の化合物においては、Ｅ１は分子Ｍ１の残基を表し、それに対し第一の特異抗体ＡＣ１が利用可能であり、一方Ｅ２は分子Ｍ２の残基を表し、それに対し第二の特異抗体ＡＣ２が利用可能である。
【００３５】
これら二つの残基は、それらが由来した分子Ｍ１およびＭ２のものと同様の抗原性を示さねばならず、各々、抗体ＡＣ１および抗体ＡＣ２によって認識されて、それらと免疫結合を形成するが、しかしカップリング反応の進行を、特に立体障害によって損なうことも、この反応を妨害することもあってはならない。
【００３６】
したがって、分子Ｍ１およびＭ２は好ましくはハプテン、すなわち低分子であって、タンパク質（ウシ血清アルブミン，γ−免疫グロブリンなど）または多糖のようなベクター上へのグラフティングの後、それらに対して特異的に指示された抗体の産生を動物に誘発することができる。
【００３７】
これらのハプテンは、特に、まずにそれらがベクター上にグラフトされ、二番目に官能基Ｇ１およびＧ２か、または、Ｘ１およびＸ２がそのような基である場合にはスペーサー基へ付着されるようにすることができる反応性の基、好ましくはカルボン酸、アミン、またはチオールで置換された、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、ビシクロ［２．２．２］オクタン、ビシクロ［２．２．２］ヘプタン、２，２−ジメチル−３−メチル−４，４−ジメチルペンタン、アダマンタン、パーヒドロフェナレン、およびパーヒドロアントラセンといった、炭化水素であることが可能である。かかる炭化水素は、事実上、化学的にかなり不活性であるという利点をもつ。
【００３８】
しかしながら、これらのハプテンはまた、炭化水素以外の分子であることも可能であり、その場合、もし化合物Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１、およびＥ２−Ｘ２−Ｇ２において、これらの分子の残基が、カップリング反応が行なわれる条件下に反応することが可能な一以上の遊離の官能基を含む場合には、この、またはこれらの官能基は、カップリング反応が行なわれる前、すなわちこの方法の工程ｉ）に先立ち選択された、適当な保護基で保護されるべきであり、次に、工程ｉ）と工程ｉｉ）との間で脱保護される。
【００３９】
二つの分子が、本発明の方法を実行するために特に有利なハプテンを構築するために見出されている。これらは、第一にヒスタミンであって、以下の式（Ｉ）：
【００４０】
【化１】
2007527367.tif 000002
【００４１】
に相当し、これに対しては、少なくとも１０−８Ｍに等しいＫｄを示すいくつかのモノクローナル抗体を得ることが可能になっており、第二にはホモバニリン酸であって、以下の式（ＩＩ）：
【００４２】
【化２】
2007527367.tif 000003
【００４３】
に相当し、これに対しては、少なくとも１０−６Ｍに等しいＫｄを示すいくつかのモノクローナル抗体を得ることが可能になっている。
【００４４】
したがって、本発明の方法の第一の好ましいアレンジメントによれば、化合物Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１におけるＥ１、またはＥ２−Ｘ２−Ｇ２におけるＥ２は、以下の式（ＩＩＩ）：
【００４５】
【化３】
2007527367.tif 000004
【００４６】
［式中、Ｒ１は水素原子か、または、たとえば、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）基またはベンジル基のような、アミン官能基−保護基を表す］に相当する。
【００４７】
したがって、本発明の方法のもう一つのの好ましいアレンジメントによれば、化合物Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１におけるＥ１、またはＥ２−Ｘ２−Ｇ２におけるＥ２は、以下の式（ＩＶ）：
【００４８】
【化４】
2007527367.tif 000005
【００４９】
［式中、Ｒ２は水素原子か、または、たとえば、ジメチルｔｅｒｔ−ブチルシリルタイプのシリル化された基、ジヒドロピラン、さもなければベンジル、アリル、またはアセタール基といったアルコール官能基−保護基を表す］に相当する。
【００５０】
化合物Ｅ２−Ｘ２−Ｇ２においては、Ｅ２が分子Ｍ２の残基ではなく、カップリング剤の存在下に抗体ＡＣ１と少なくとも一つの共有結合を形成することができる基を表すことが可能であり、その場合、この基はアミン、カルボン酸、アルデヒド、チオール、フェノール、アルケニル、およびアジド基、およびたとえば、ベンゾフェノンおよびアリールアジド基のような光活性化可能な基から都合よく選ばれる。
【００５１】
好ましくは、Ｅ２はアミンまたはチオール基である。前文に示したように、Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１およびＥ２−Ｘ２−Ｇ２の化合物において、Ｅ１およびＥ２は、官能基Ｇ１およびＧ２に対し、直接的に、またはスペーサー基を介して付着されてよい。
【００５２】
これらのスペーサー基は、その機能は、第一にＥ１と官能基Ｇ１との間に、第二にＥ２と官能基Ｇ２との間に、ただブリッジを形成することのみであり、エチレン（−（ＣＨ２）２−），プロピレン（−（ＣＨ２）３−）、またはブチレン（−（ＣＨ２）４−）タイプなどの飽和炭化水素基のような任意の官能基を欠いている基か、またはカップリング反応が実行される操作条件下では反応することができない一以上の官能基を含む基か、さもなければカップリング反応が実行される前に、適当な保護基で保護されている一以上の官能基を含む基である。
【００５３】
本発明によれば、化合物Ｚのための前記少なくとも一つのイムノアッセイは、実現の単純さを理由に、好ましくは固相アッセイである。
【００５４】
本発明による方法の第一の好ましい態様によれば、Ｅ２は、化合物Ｅ２−Ｘ２−Ｇ２において分子Ｍ２の残基に相当することから、化合物Ｚのための前記少なくとも一つのイムノアッセイは、「サンドイッチ」タイプ（または２サイト）のアッセイであり、工程ｉｉ）は以下の工程：
ａ１）反応時間ｔにおいて得られた反応媒体を、その上に抗体ＡＣ１が固定されている固相と接触させ、この抗体とこの化合物の残基Ｅ１との間の免疫結合により、この固体上への化合物Ｚの付着を得る工程；
ｂ１）固相を、標識へ結合された抗体ＡＣ２を含んでいるコンジュゲートと接触させ、この抗体と、前記固相へ付着された化合物Ｚの残基Ｅ２との間の免疫結合により、該コンジュゲートの、該固相への付着を得る工程；
ｃ１）抗体ＡＣ２に結合された標識により、固相へ付着されたコンジュゲートの量を測定する工程；および
ｄ１）そのようにして測定されたコンジュゲートの量から、前記時間ｔにおける反応媒体中の化合物Ｚの濃度を、基準範囲において測定する工程；
を含んでおり、
前記工程ｉｉ）はまた、工程ａ１）とｂ１）の間、および工程ｂ１）とｃ１）の間に、固相を洗浄することからなる一以上の操作も含む。
【００５５】
このアッセイは、それゆえ二つの抗体ＡＣ１およびＡＣ２を使用しており、抗体ＡＣ１は固相上に固定され、抗体ＡＣ２は標識へ結合される。
【００５６】
本発明による方法のもう一つの好ましい態様によれば、Ｅ２は、化合物Ｅ２−Ｘ２−Ｇ２において、抗体ＡＣ１と少なくとも一つの共有結合を形成することができる基に相当することから、化合物Ｚのための前記少なくとも一つのイムノアッセイは、ＵＳ−Ａ−５，４７６，７７０［７］において記述された、「ＳＰＩＥ−ＩＡ」タイプ（固相エピトープイムノアッセイ（Solid-Phase Epitope ImmunoAssey））のアッセイであり、工程ｉｉ）は以下の工程：
ａ２）反応時間ｔにおいて得られた反応媒体を、その上に抗体ＡＣ１が固定されている固相と接触させ、この抗体とこの化合物の残基Ｅ１との間の免疫結合により、この固相への化合物Ｚの付着を得る工程；
ｂ２）カップリング剤を、固相上に固定された抗体ＡＣ１および、この固相へ付着された化合物Ｚの基Ｅ２と反応させ、該抗体と該基との間に一以上の共有結合の形成を得る工程；
ｃ２）固相上に固定された抗体ＡＣ１と、前記固相へ付着された化合物Ｚの残基Ｅ１との間に存在する免疫結合を変性させ、該固相から該残基を放出する工程；
ｄ２）固相を、標識へ結合された抗体ＡＣ１を含んでいるコンジュゲートと接触させ、前記抗体と、そのように放出された化合物Ｚの残基Ｅ１との間の免疫結合により、該コンジュゲートの付着を得る工程；
ｅ２）抗体ＡＣ１に結合された標識により、固相へ付着されたコンジュゲートの量を測定する工程；および
ｆ２）そのようにして測定されたコンジュゲートの量から、前記時間ｔにおける反応媒体中の化合物Ｚの濃度を、基準範囲において測定する工程；
を含んでおり、
前記工程ｉｉ）はまた、工程ａ２）とｂ２）の間、ｂ２）とｃ２）の間、ｃ２）とｄ２）の間、およびｄ２）とｅ２）の間、に、固相を洗浄することからなる一以上の操作も含む。
【００５７】
このアッセイ自体は、抗体ＡＣ１のみを使用するが、二つの異なる形状：固相上に固定されている第一の形状、および標識へ結合されている第二の形状、
においてである。
【００５８】
工程ｂ２）において使用されるカップリング剤は化学的反応物でよく、その場合、それはバイファンクショナルであるべきであり、すなわち、それは化合物Ｅ２−Ｘ２−Ｇ２の基Ｅ２と反応することができる第一の官能基と、抗体ＡＣ１と反応することができる、第一のものと同じかまたは異なる第二の官能基を含むべきである。
【００５９】
これらの官能基が同じかまたは異なることにより、それらはグルタールアルデヒド、ジフルオロジニトロベンゼン、ビス（マレイミド）ヘキサン、またはスベリン酸スクシンイミジルのような、ホモバイファンクショナル試薬か、またはＮ−スクシンイミジル−３−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートまたはスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートのような、ヘテロバイファンクショナル試薬でよい。
【００６０】
グルタールアルデヒドまたは、スベリン酸ジスクシンイミジルが、好ましくは使用される。
【００６１】
変形として、カップリング剤は、Ｅ２が光活性化可能な基である場合には、照射、たとえば紫外線照射でよい。
【００６２】
工程ｃ２）において、抗体ＡＣ１と、化合物Ｚの残基Ｅ１との間に存在する免疫結合の変性は、適当な試薬により、さもなければ超音波または熱の反応を通して、慣例的に行なわれることが可能である。
【００６３】
この試薬は、ＨＣｌのような酸、ＮａＯＨのような塩基、たとえば、メタノールタイプのアルコールのような有機溶媒、界面活性剤、および無機塩から選ばれてよい。
【００６４】
化合物Ｚをアッセイするために選ばれた技術が何であれ：
−抗体ＡＣ１および、適切な場合には抗体ＡＣ２は、一般的には、その特異性がより大きいことを理由にモノクローナル抗体を使用することが好ましいが、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体でよく；
−固相上への抗体ＡＣ１の固定は、受動的または能動的な固定であることが可能であり；したがって、この固定は、固相の表面への前記抗体の単純な吸着により、共有結合により、アビジン・ビオチン系のような結合分子により、さもなければニッケルまたは銅／ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）複合体と結合したポリヒスチジンタグによって得られることが可能であり；抗体ＡＣ１がモノクローナル抗体であるとき、その固相上への固定はまた、この固相の表面にあらかじめ吸着されたポリクローナル抗体によっても得られることが可能であり；
−固相は、チューブの壁、マイクロタイトレーション用プレートのウエル、ポリスチレンまたはニトロセルロースのようなプラスチックからなる膜、ガラスビーズ、磁気ビーズ、および、一般に、受動的または能動的に、そこへ抗体を付着させることができる任意の表面のような、イムノアッセイに通常使用される固相の任意の一つであることが可能であり；さらに
−標識は、ヨウ素１２５、クロム５１、またはトリチウムのような同位元素、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、またはグルコースオキシダーゼのような酵素、ピロガロールルミノールまたはイソルミノールのような発光標識、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、またはシアニンのような蛍光標識、さもなければ、ビオチンおよびその構造上の類似体のような、アビジンまたはストレプトアビジンと反応することができる物質であることが可能であり；後者の場合には、アビジンまたはストレプトアビジンは、たとえば酵素または蛍光色素によってそれ自体が標識されている。
【００６５】
好ましくは、抗体ＡＣ１および、適切な場合には抗体ＡＣ２は、モノクローナル抗体であり；固相はマイクロタイトレーション用プレートのウエルの壁であり；抗体ＡＣ１の固定は、この相の表面におけるこの抗体の受動的な吸着によって実行され、標識は酵素、特に、その代謝回転（秒当たり、および部位当たり、１６０００分子の基質を加水分解）の故に、アセチルコリンエステラーゼであり、それを含むコンジュゲートに高い比活性を与える。
【００６６】
本発明によれば、方法は工程ｉ）とｉｉ）との間に、反応媒体の希釈からなる操作を都合よく含む。
【００６７】
さらに、カップリング反応に対する候補操作条件の影響は、好ましくは、工程ｉｉｉ）において、工程ｉｉ）で測定された反応媒体中の化合物Ｚの濃度から、この反応の収率を測定することにより評価される。
【００６８】
この収率は、たとえば、以下の式：
【００６９】
【数１】
2007527367.tif 000006
【００７０】
［式中：
・［Ｚ］は、工程ｉｉ）において測定された反応媒体中の化合物Ｚの濃度であり、ｆは、後者が工程ｉ）とｉｉ）との間に希釈を受けた場合の該媒体についての希釈比であり、一方
・［Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１］は、反応媒体中の化合物Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１の初濃度である］
を適用することにより計算されることが可能である。
【００７１】
前文に示したように、その操作条件をスクリーンすることが所望されるカップリング反応は、二つまたは二つより多い官能基のカップリングからなることが可能であり、この反応に関与する官能基の数は、好ましくは２、３、または４に等しい。
【００７２】
カップリング反応が二つの官能基Ｇ１およびＧ２のカップリングからなるとき：
−工程ｉ）においては、式Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１およびＥ２−Ｘ２−Ｇ２の化合物は一緒に反応され、反応媒体中で、式Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１−Ｇ２−Ｘ２−Ｅ２［式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｅ１、およびＥ２は上記と同様の意味を有し、Ｇ１−Ｇ２は前記官能基Ｇ１およびＧ２の間のカップリングから結果として生じる原子団を表す］に相当する化合物Ｚの形成が得られ、一方
−工程ｉｉ）においては、反応媒体中の化合物Ｚの濃度は、単一のイムノアッセイによって測定され、それは好ましくは上述の「サンドイッチ」タイプまたは「ＳＰＩＥ−ＩＡ」タイプの固相アッセイである。
【００７３】
カップリング反応が三つの官能基Ｇ１、Ｇ２、およびＧ３のカップリングからなるとき：
−工程ｉ）においては、式Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１およびＥ２−Ｘ２−Ｇ２の化合物は、式Ｅ３−Ｘ３−Ｇ３
［式中、Ｘ３は共有結合か、または第三のスペーサー基を表し、Ｘ１および／またはＸ２と同じかまたは異なってよく、一方Ｅ３は、Ｍ１およびＭ２とは異なる第三の分子Ｍ３の残基であり，それに対して第三の特異抗体ＡＣ３が利用可能であるか、あるいは、カップリング剤の存在下に抗体ＡＣ１と共有結合を形成することが可能な基を表すが、Ｅ２がすでにかかる基を表していることはないという条件下である］
の第三の化合物と反応され、反応媒体中で、以下の式：
【００７４】
【化５】
2007527367.tif 000007
【００７５】
［式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３は、上記と同様の意味を有し、かつ
【００７６】
【化６】
2007527367.tif 000008
【００７７】
は、前記官能基Ｇ１、Ｇ２、およびＧ３のカップリングから結果として生じる原子団を表す］
の一つに相当する化合物Ｚの形成を得るようにし；一方
−工程ｉｉ）においては、反応媒体中の化合物Ｚの濃度は、二つの異なるイムノアッセイにより測定される。
【００７８】
これらのアッセイは、平行に、すなわち、反応媒体の二つの異なるサンプルについて、または反応媒体の同一のサンプルについて交互に、行なわれてよく、好ましくは固相において両方行なわれる。
【００７９】
したがって、それらは二つの「サンドイッチ」タイプのアッセイでよく、以下：
−第一のアッセイ用には、固相上に固定された抗体ＡＣ１および、第一の標識へ結合された抗体ＡＣ２、および
−第二のアッセイ用には、固相上に固定された抗体ＡＣ１および、第二の標識へ結合された抗体ＡＣ３、
を用いて行なわれ、第一および第二の標識は、二つのアッセイが平行して行なわれる場合にはおそらくは同一であるが、それらが交互に行なわれる場合には異なるべきである。
【００８０】
変形として、第一のアッセイは、上記のような抗体ＡＣ１を用いて行なわれる「ＳＰＩＥ−ＩＡ」タイプのアッセイでよく、この場合、第二のアッセイは、化合物Ｅ２−Ｘ２−Ｇ２およびＥ３−Ｘ３−Ｇ３において、「ＳＰＩＥ−ＩＡ」アッセイを通じて抗体ＡＣ１と一以上の共有結合を形成することができる基を表すものがＥ２であるか、またはＥ３であるかに依存して、標識へ結合された抗体ＡＣ２または抗体ＡＣ３を用いて行なわれる「サンドイッチ」タイプアッセイである。
【００８１】
全ての場合に、反応媒体中の化合物Ｚの形成は、二つのアッセイによって測定された該化合物の濃度の類似性によって保証される。
【００８２】
カップリング反応が４つの官能基Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、およびＧ４のカップリングからなるとき：
−工程ｉ）においては、式Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１およびＥ２−Ｘ２−Ｇ２の化合物は、前文に定義された式Ｅ３−Ｘ３−Ｇ３の第三の化合物と、および式Ｅ４−Ｘ４−Ｇ４
［式中、Ｘ４は共有結合か、または第４のスペーサー基を表し、Ｘ１、Ｘ２および／またはＸ３と同じかまたは異なってよく、一方Ｅ４は、Ｍ１、Ｍ２、およびＭ３とは異なる第四の分子Ｍ４の残基であり，それに対して第四の特異抗体ＡＣ４が利用可能であるか、あるいは、カップリング剤の存在下に抗体ＡＣ１と共有結合を形成することが可能な基を表すが、Ｅ２、およびＥ３がすでにかかる基を表していることはないという条件下である］
の第４の化合物と反応され、
反応媒体中で、以下の式：
【００８３】
【化７】
2007527367.tif 000009
【００８４】
［式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４は、上記と同様の意味を有し、かつ
【００８５】
【化８】
2007527367.tif 000010
【００８６】
は、前記官能基Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、およびＧ４のカップリングから結果として生じる原子団を表す］
の一つに相当する化合物Ｚの形成を得るようにし；一方
−工程ｉｉ）においては、反応媒体中の化合物Ｚの濃度は、三つの異なるイムノアッセイにより測定される。
【００８７】
ここではまた、これらのアッセイは、平行して、または交互に行なわれることが可能であり、三つはすべて好ましくは固相において行なわれる。それらは三つの「サンドイッチ」タイプのアッセイか、または「ＳＰＩＥ−ＩＡ」タイプのアッセイとそれに続く二つの「サンドイッチ」タイプのアッセイでよく、反応媒体中の化合物Ｚの形成は、ここで再び、得られた結果の類似性によって保証される。
【００８８】
本発明によれば、候補操作条件は、好ましくは、溶媒、触媒，温度レベル、圧力レベル、超音波の利用、濃度（反応された物質および／または触媒の）、化学量論比（これらの物質間の）、反応時間、およびそれらの組合せからなる群より選ばれる。
【００８９】
したがって、本発明の方法は，たとえば、触媒または温度レベル、または圧力レベルといった単一タイプの操作条件のスクリーニングのため、および、溶媒／触媒、溶媒／触媒／反応時間，温度／圧力、または触媒／温度／圧力の組合せなどといった、異なるタイプの操作条件の組合せのスクリーニングのための双方に使用されることが可能である。
【００９０】
上記のおよび下記の本文において、用語「触媒」は、反応媒体中にそれが存在することだけで、反応のカイネティクスを加速することができる、任意の薬剤を意味することが意図される。
【００９１】
この触媒は、たとえば、有機化合物、無機塩基，金属、金属塩、金属酸化物またはハイブリッド、有機金属化合物、金属−リガンド複合体、ハロゲン化物、さもなければそれらの組合せなどといった、化学的触媒、および生物学的触媒の双方でよく、後者については非常に多様な形状にあることが可能であり、特に、臓器、組織、細胞、細胞の分画、細胞オルガネラ，酵素抽出物、分子複合体、さもなければ単純な分子、たとえば単離および精製された酵素の形状にある。
【００９２】
本発明の方法は、多くの利点を有する。特に：
−直接的にまたはスペーサー基を介して官能基上へグラフトされることが可能な少なくとも一つの分子と、この分子を特異的に認識することおよび、それと結合することが可能な少なくとも一つの抗体とが利用可能である限り、二つの官能基のカップリングから結果として生じる化合物を、後者の如何を問わず、アッセイすることを可能にし；結果として、本発明の方法により，非常に多くのカップリング反応の操作条件をスクリーンすることを可能にするためには、利用可能ないくつかのグラフト可能な分子および、これらの分子に特異的ないくつかの抗体をもつことで充分である；
−種々のタイプの操作条件を、それらが定性的条件であろうと定量的条件であろうと、平行して、または組合せて、同時に検査することを可能にし；
−すべての触媒系と、それらが化学的であろうと生物学的であろうと、適合性であり；
−カップリング反応の最後に、得られた反応媒体を精製することからなる操作を何ら必要とせず；
−カップリング反応の収率を得ることを可能にすることにより、操作条件の影響を定性的に評価することを可能にし；
−１０−９Ｍまでの低濃度の化合物Ｚの検出を可能にすることが見出されていることから、非常に感度がよく、微量の試薬および溶媒を用いてそれを実現することを可能にし；
−再現性があり；
−実行することが単純であり、費用のかかるおよび／または容易に入手できない装置を何ら必要とせず；
−高速でスクリーニングを実行することが可能であり；したがって、比較的単純な自動化された装置、すなわち固相の洗浄、酵素標識用の基質の分布、酵素／基質反応の読取りを提供するが、他の試薬の分布は提供しない、自動化された装置は、単回の実験で一日に約千回の検査を行なうことを可能にする。それゆえこの速度は、本発明による方法の完全な自動化を可能にする装置を使用することにより、１０倍（すなわち１日１０，０００回のテスト）まで増大されることが可能である。
【００９３】
本発明の方法は、それゆえ「ハイスルーアウト」スクリーニンを実行するために特に好適である。
【００９４】
本発明の主題はまた、少なくとも二つの官能基のカップリング反応の操作条件をスクリーンする方法を実行するためのキットであって、適当な量の：
−一緒に反応することが意図された少なくとも二つの化合物、
・式Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１
［式中、Ｇ１は前記少なくとも二つの官能基の一番目を表し、Ｘ１は共有結合または第一のスペーサー基を表しており、Ｅ１は第一の分子Ｍ１の残基を表す］
の第一の化合物；および
・式Ｅ２−Ｘ２−Ｇ２
［式中、Ｇ２は前記少なくとも二つの官能基の二番目を表し、Ｘ２は共有結合または第二のスペーサー基を表し、Ｘ１と同じかまたは異なってよく、Ｅ２は、Ｍ１とは異なる第二の分子Ｍ２の残基である］
の第二の化合物；
−少なくとも二つの抗体：
・第一の分子Ｍ１に特異的な第一の抗体ＡＣ１であり、この抗体は任意に複数の固相へ付着されており；および
・第二の分子Ｍ２に特異的な第二の抗体ＡＣ２であり、この抗体は標識へ結合されており；
−鎖Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１−Ｇ２−Ｘ２−Ｅ２を含んでいる化合物Ｚであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｅ１、およびＥ２は上記と同様の意味を有し、一方Ｇ１−Ｇ２は、前記少なくとも二つの官能基のカップリングから結果として生じる原子団を表しており；さらに、任意に：
−標識を可視化するための試薬、たとえば標識が酵素であれば基質；および
−適当に選ばれた緩衝液（希釈液、洗浄緩衝液など）
を含む。
【００９５】
本発明の主題はまた、少なくとも二つの官能基のカップリング反応の操作条件をスクリーンする方法を実行するためのキットであって、適当な量の：
−一緒に反応することが意図された少なくとも二つの化合物、
・式Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１
［式中、Ｇ１は前記少なくとも二つの官能基の一番目を表し、Ｘ１は共有結合または第一のスペーサー基を表しており、Ｅ１は第一の分子Ｍ１の残基を表す］
の第一の化合物；および
・式Ｅ２−Ｘ２−Ｇ２
［式中、Ｇ２は前記少なくとも二つの官能基の二番目を表し、Ｘ２は共有結合または第二のスペーサー基を表し、Ｘ１と同じかまたは異なってよく、Ｅ２は、カップリング剤の存在下に、分子Ｍ１に特異的な抗体と一以上の共有結合を形成することのできる基を表す］
の第二の化合物；
−少なくとも一つの抗体、この抗体は分子Ｍ１に特異的な前記抗体であり；
−標識へ結合された、分子Ｍ１に特異的な前記抗体を含んでいるコンジュゲート；
−鎖Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１−Ｇ２−Ｘ２−Ｅ２を含んでいる化合物Ｚであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｅ１、およびＥ２は上記と同様の意味を有し、一方Ｇ１−Ｇ２は、前記少なくとも二つの官能基のカップリングから結果として生じる原子団を表しており；さらに、任意に：
−標識を可視化するための試薬、
−カップリング剤、
−免疫結合を変性させることができる試薬、および
−適当に選ばれた緩衝液を含む。
【００９６】
本発明の主題はまた、スクリーニングのための、特に、二つの官能基間のカップリング反応において有用な触媒の「ハイスループット」スクリーニングのための、前文に定義されたスクリーニング法またはキットの用途である。
【００９７】
上記のアレンジメントの他に、本発明はまた、以下の付加的な記述から現れるであろう、他のアレンジメントも含んでおり、それは操作条件の「ハイスループット」スクリーニングのための、その実現性および利点の双方を実証することを可能にした、本発明の方法の態様の実施例に関係する。
【００９８】
この付加的な記述は、何ら制限するものではない単なる例証として示されており、添付の図面について言及している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９９】
（実施例１）
本実施例は、本発明の方法の第一の態様を例示しており、これにおいて：
−カップリング反応は、
【０１００】
【化９】
2007527367.tif 000011
【０１０１】
によって表されるニトロアルドール反応であり：
−スクリーニングは、組合わされた三つのタイプの操作条件、すなわち溶媒のタイプ、触媒のタイプ、および反応時間、に関係しており；かつ
−反応媒体中の化合物Ｚの濃度は、「サンドイッチ」タイプの固相ＥＬＩＳＡアッセイにより測定される。
【０１０２】
化合物Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１は、以下の式（V）：
【０１０３】
【化１０】
2007527367.tif 000012
【０１０４】
に相当し、６−ニトロカプロン酸とヒスタミンとのカップリングからの結果として生じる。
【０１０５】
化合物Ｅ２−Ｘ２−Ｇ２自体は、以下の式（ＶＩ）に相当し：
【０１０６】
【化１１】
2007527367.tif 000013
【０１０７】
かつ、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−（４−ホルミルフェニル）プロピオンアミドとホモバニリ酸とのカップリングからの結果として生じる。
【０１０８】
化合物Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１およびＥ２−Ｘ２−Ｇ２のカップリング反応は：
−二つの候補溶媒：テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）および塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）：
−１２の候補触媒：フッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）、フッ化カリウム（ＫＦ）、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、ピリジン（ＰＹＲ）、ジイソプロピルアミン（ＤＩＡ）、ジアザビシクロオクタン（ＤＡＢＣＯ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、ナトリウムメトキシド（ＮａＯＭｅ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、および炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）、および
−４つの候補反応時間：３０分、１時間、４時間、および１２時間、
を用いて行なわれる。
【０１０９】
このカップリング反応によって産生された化合物Ｚ（式Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１−Ｇ２−Ｘ２−Ｅ２の）の免疫酵素アッセイは：
−ヒスタミンに向けられたモノクローナル抗体（抗体Ｈｉｓ−３１；Ｋｄ：１０−９Ｍ）、ポリスチレン・マイクロタイトレーション用プレート（３００μｌ／ウエルに等しい容量の）のウエルの壁上に、コーティングにより、すなわちポリスチレン表面における該抗体の受動的な吸着によって固定されている；
−アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）へ結合された、ホモバニリン酸に向けられたモノクローナル抗体（抗体Ｈ６−９２；Ｋｄ：１０−７Ｍ）を含んでいるコンジュゲート、
このコンジュゲートは、タラン（Taran）らにより、Clin. Chem. １９９７年、第４３巻、第２号、ｐ．３６３−３６８、［８］において記述されたように調製および貯蔵され；さらに
−可視化剤、固相へ付着された抗体Ｈ６−９２／ＡＣｈＥのコンジュゲート量を測定するための、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の、７．５Ｈ１０−４Ｍのヨウ化アセチルチオコリン、および２．５Ｈ１０−４Ｍの５，５′−ジチオビス−（２−ニトロ）安息香酸（エルマン（Ellman）試薬）の混合物、
を用いて行なわれる。
【０１１０】
マイクロタイトレーション用プレートのウエルの壁の表面への抗体Ｈｉｓ−３１の吸着は、１００μｌのこの抗体溶液（０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中、５μｌ／ｍｌ）を、これらの各ウエル内へ入れ、プレートを周囲温度において１８時間静置することによって得られた。これに続き、ウエルは３００μｌのＥＩＡ緩衝液で洗浄および飽和され、プレートはスコッチテープで覆われ、その使用まで４℃において貯蔵された。
【０１１１】
そのいくつかの工程が図１に図示されたこの方法は、以下の方法に従って行なわれた。
【０１１２】
１）方法：
＊カップリング反応（図１の工程Ａ）：
化合物Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１に存在するヒスタミン残基（残基Ｅ１）の含窒素環によって保持された第二級アミン官能基を、ＢＯＣ基（図１のＧＰ１）により、また化合物Ｅ２−Ｘ２−Ｇ２に存在するホモバニリン酸の環（残基Ｅ２）によって保持されたヒドロキシル官能基を、ジメチルｔｅｒｔ−ブチルシリル基（図1のＧＰ２）によって保護した後、ポリプロピレン・マイクロタイトレーション用プレートの各ウエル（容量：３００μｌ／ウエル）へ、以下のもの：
−５０μｌの化合物Ｅ１−Ｘ−Ｇ１の５ｍＭ有機溶液、
−５０μｌの化合物Ｇ２−Ｙ−Ｅ２の５ｍＭ有機溶液、および
−２５μｌの候補触媒の１ｍＭ有機溶液、
が連続して入れられ、
単一かつ同一の溶媒（ＴＨＦまたはＣＨ２Ｃｌ２）が各ウエルにおいて使用される。
【０１１３】
マイクロタイトレーション用プレートは、４０℃の温度において、インキュベ−ターシェイカー内に置かれ、そこで所望の反応時間にわたって保持される。
【０１１４】
＊カップリング反応の停止および脱保護（図１の工程Ｂ）：
１２５μｌの純粋なトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のウエルへの添加により、カップリング反応は停止され、保護基は除去される。プレートは、周囲温度において１５分間振盪される。
【０１１５】
＊反応媒体の希釈（図１の工程Ｃ）：
各反応媒体は、１０μｌの該媒体を移し、それをディープウエルプレートのウエル（容量：２ｍｌ／ウエル）に収容された１ｍｌのＥＩＡ緩衝液（０．１Ｍリン酸緩衝液；０．１５Ｍ  ＮａＣｌ；０．１％ＢＳＡ；０．０１％アジ化ナトリウム；ｐＨ７．４）へ添加することにより希釈される。
【０１１６】
この操作は２回繰返され、各反応媒体が１０６倍に希釈されるようにする。
【０１１７】
＊化合物Ｚのアッセイ
５０μｌの各々の希釈された反応媒体は、ウエルの壁が抗体Ｈｉｓ−３１でコートされたマイクロタイトレーション用プレートのウエルに入れられる（図１の工程Ｄ）。
【０１１８】
プレートは、周囲温度において１時間振盪され、次いで、０．０５％のツイーン（Tween）（登録商標）２０を含む０．０１Ｍのリン酸緩衝液，ｐＨ７．４からなる洗浄緩衝液で５回洗浄される（図１の工程Ｅ）。
【０１１９】
次に、５０μｌのＨ６−９２／ＡＣｈＥコンジュゲートが、５エルマン（Ellman）単位／ｍｌ（ＥＵ）（１エルマン単位は、２５℃において１ｃｍの光路に対し、１単位の吸光度の増加をエルマン試薬に１ｍｌを１分で生じることができる酵素の量として定義される）で、各ウエルへ入れられる（図１の工程Ｆ）。
【０１２０】
プレートは周囲温度において３時間振盪され、次いで洗浄緩衝液で５回洗浄される（図１の工程Ｇ）。
【０１２１】
２００μｌの可視化試薬（ＲＶ）が次に各ウエルへ投入される。プレートは周囲温度において１時間振盪され、その時間の終わりに、各ウエルに含まれる媒体の４１４ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）が自動読取り装置によって測定される。
【０１２２】
そのようにして得られたＯＤ値から、各反応媒体について化合物Ｚの濃度が基準範囲（吸光度値を化合物Ｚの濃度へ対応させることを可能にする）を参照して測定され、次いでニトロアルドール反応の収率が、収率を計算するための上記の式によって測定される。
【０１２３】
２）結果：
結果は、図２において、反応収率（％として表される）が、０と１０％の間か、１０と３０％の間か、３０と５０％の間か、または５０と７０％の間であるかによって、白色、ライトグレー、ミディアムグレー、またはダークグレーの円によって記号化された、マトリックスの形状で示されている。
【０１２４】
このような円は、各々候補反応時間に対応して８行にわたり、また候補触媒に対応して１２列にわたって分布され、上の４行はＴＨＦ中で行なわれた反応の収率を示しており、下の４行はＣＨ２Ｃｌ２中で行なわれた反応の収率を示している。
【０１２５】
図２は、たとえば、ニトロアルドール反応がＴＨＦ中で４時間行なわれる場合、ジアザビシクロオクタン（ＤＡＢＣＯ）およびジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）のみが５０％より高い収率を得ることを可能にするのに対し、それがＣＨ２Ｃｌ２中で同じ時間行なわれる場合には、フッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）の存在下でのみ、かかる収率が得られることを示している。
【０１２６】
（実施例２）
この実施例は、本発明による方法の第二の態様を例示しており：
−カップリング反応は：
【０１２７】
【化１２】
2007527367.tif 000014
金属／リガンド
塩基−Ｃｕ＋１
【０１２８】
によって表されるソノガシラ反応であり；
−スクリーニングは、組合わされた二つのタイプの操作条件、すなわち，溶媒のタイプおよび触媒のタイプに関係しており；かつ
−反応媒体中の化合物Ｚの濃度は、「ＳＰＩＥ−ＩＡ」タイプの固相免疫酵素アッセイによって測定される。
【０１２９】
この実施例においては、化合物Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１は以下の式（ＶＩＩ）：
【０１３０】
【化１３】
2007527367.tif 000015
【０１３１】
に相当し、５−ヘキシン酸とヒスタミンのカップリングからの結果として生じる。
【０１３２】
化合物Ｅ２−Ｘ２−Ｇ２自体は、以下の式（ＶＩＩＩ）：
【０１３３】
【化１４】
2007527367.tif 000016
【０１３４】
に相当する。
【０１３５】
化合物Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１およびＥ２−Ｘ２−Ｇ２のカップリングからなる反応は以下を用いて行われる：
−三つの候補溶媒：ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）、およびＴＨＦ；
−in situで調製された触媒のライブラリであり、各触媒は：
（１）以下の複合体Ｍ１〜Ｍ７から選ばれた、金属複合体Ｍ：
Ｍ１：Ｐｄ２ｄｂａ３
Ｍ２：Ｐｄ（ＰＰｈ３）４
Ｍ３：Ｐｄ（ＯＡｃ）２
Ｍ４：ＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２
Ｍ５：ＰｄＣｌ２（Ｃ６Ｈ５ＣＮ）２
Ｍ６：Ｐｄ（ＮＨ３）４（ＮＯ３）２
Ｍ７：Ｎｉ（ａｃａｃ）、および
（２）以下の２３リガンドから選ばれるリガンドＬ：
・式ＰＲ３［式中、Ｒは各々ｎ−ブチル、ｎ−オクチル、ｔ−ブチル、−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−Ｎ（ＣＨ３）２、フェニル、ｏ−トリル、−ＣＨ＝ＣＨ２、ｏ，ｐ−ジ−ＯＣＨ３Ｃ６Ｈ３、またはｏ−フリル基である］に相当するリガンドＬ１〜Ｌ１２；
・式Ｒ２Ｐ（ＣＨ２）ｎＰＲ２［式中、Ｒはメチル基であり、かつｎは１または２に等しい（Ｌ１３，Ｌ１４）か、またはＲはフェニル基であり、かつｎは１、２、または４に等しい（Ｌ１５，Ｌ１６，Ｌ１７）］に相当するリガンドＬ１３〜L１７；
・リガンド１８または式：
【０１３６】
【化１５】
2007527367.tif 000017
【０１３７】
のリガンドＤＩＯＰ；
・式ＡｓＰｈ３、および（Ｐｈ２）Ａｓ（ＣＨ２）２Ａｓ（Ｐｈ２）のヒ素複合体Ｌ１９およびL２０；
・式：
【０１３８】
【化１６】
2007527367.tif 000018
【０１３９】
［式中、Ｒはエチル基であり、Ｒ′はメチル基であり（Ｌ２１）；ＲおよびＲ′はｔ−ブチル基であり（Ｌ２２）；ＲおよびＲ′は２，６−ジイソプロピルベンゼン基である］に相当するイミダゾリウム、L２１〜Ｌ２３、
（３）ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）およびカリウムt−ブトキシド（ｔＢｕＯＫ）から選ばれる塩基、ヨウ化銅（ＣｕＩ）および銅トリフラート（ＣｕＯＴｆ）から選ばれる銅塩の存在下、
の間の組合せに相当する。
【０１４０】
カップリング反応によって産生された化合物Ｚ（式Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１−Ｇ２−Ｘ２−Ｅ２の）の免疫酵素アッセイは：
−ヒスタミンに向けられたモノクローナル抗体（抗体Ｈｉｓ−７６；Ｋｄ：１０−８Ｍ）であり、ポリスチレン・マイクロタイトレーション用プレート（容量：３００μｌ／ウエル）のウエルの壁上に、コーティングにより、実施例１に記述されたものと同様の技術によって固定されている；
−アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）へ結合された、該抗体を含んでいるコンジュゲート；および
−実施例１で記述された、固相へ付着されたＨｉｓ−７６／ＡＣｈＥコンジュゲートの量を測定するための可視化剤、
を用いて行なわれる。
図３に図式的に示された方法の様々な工程は、以下の手続きに従って実行される。
【０１４１】
１）方法
＊カップリング反応（図３の工程Ａ）：
化合物Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１に存在するヒスタミン残基Ａ（残基Ｅ１）の含窒素環によって保持されたアミン官能基、および化合物Ｅ２−Ｘ２−Ｇ２のアミン官能基を、ＢＯＣ基で保護した後（図３のＧＰ）、ポリプロピレン・マイクロタイトレーション用プレートの各ウエル（等しい容量：３００μｌ／ウエル）へ、不活性雰囲気下に、以下のもの：
−５μｌの溶媒または、金属複合体Ｍの１６ｍＭ有機溶液、
−５μｌの溶媒または、リガンドＬの３２ｍＭ有機溶液、
−２５μｌの、１６０ｍＭの化合物Ｅ２−Ｘ２−Ｇ２、６．４ｍＭの銅塩、４８０ｍＭの塩基を含む有機溶液、および
−５μｌの、化合物Ｅ１−Ｘ１−Ｇ１の８００ｍＭ有機溶液、
が連続的に入れられ、
単一かつ同一の溶媒（ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、またはＴＨＦ）が各ウエルにおいて使用される。
【０１４２】
プレートは、２５℃の温度において、インキュベ−ターシェイカー内に置かれ、そこで２４時間保持される。
【０１４３】
＊カップリング反応の停止および脱保護（図３の工程Ｂ）：
４０μｌの純粋なトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の各ウエルへの添加により、カップリング反応は停止され、ＢＯＣ基は除去される。プレートは、周囲温度において１時間振盪される。
【０１４４】
＊反応媒体の希釈（図３の工程Ｃ）：
各反応媒体は、１０μｌの該媒体を移し、それをディープウエルプレートのウエル（容量：２ｍｌ／ウエル）に収容された１ｍｌのＥＩＡ緩衝液へ添加することにより希釈される。
【０１４５】
この操作は２回繰返され、各反応媒体が１０６倍に希釈されるようにする。
【０１４６】
＊化合物Ｚのアッセイ
１００μｌの各々の希釈された反応媒体は、ウエルの壁が抗体Ｈｉｓ−７６でコートされたマイクロタイトレーション用プレートのウエルに入れられる。
【０１４７】
プレートは、周囲温度において１時間振盪され、次いで、０．０５％のツイーン（Tween）（登録商標）２０を含む０．０１Ｍのリン酸緩衝液，ｐＨ７．４からなる洗浄緩衝液で５回洗浄される（図３の工程Ｄ）。
【０１４８】
次に、１００μｌの０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９）、および１０μｌの、ＤＭＦ中１０ｍｇ／ｍｌのスベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）が各ウエルへ入れられる。
【０１４９】
プレートは周囲温度において１５分間振盪され、次いで洗浄緩衝液で５回洗浄される（図３の工程Ｅ）。
【０１５０】
１５０μｌの１Ｎ  ＮａＯＨが次に各ウエルへ投入され、反応を見るために周囲温度において５分間放置される。この時間の終わりに、プレートは洗浄緩衝液で５回洗浄される（図３の工程Ｆ）。
【０１５１】
１００μｌの、１エルマン単位／ｍｌのＨｉｓ−７６／ＡＣｈＥコンジュゲート溶液が各ウエルへ投入され、プレートは周囲温度において１時間振盪され、次いで洗浄緩衝液で５回洗浄される（図３の工程G）。
【０１５２】
固相へ付着されたコンジュゲートの量を測定するため、方法は実施例１と同様に行なわれ、４１４ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）の測定は、酵素反応の３０分または１時間後に行なわれる。
【０１５３】
そのようにして得られたＯＤ値から、各反応媒体について化合物Ｚの濃度が基準範囲を参照して測定され、次いでソノガシラ反応の収率が、上記の実施例１において使用されたものと同様の式によって測定される。
【０１５４】
２）結果：
単なる例として、結果のいくつかが図４において、反応収率（％として表される）が、０と１０％の間か、１０と２０％の間か、２０と３０％の間か、３０と４０％の間か、または４０と５０％の間であるかによって、白色からダークグレーまでの円によって記号化された、マトリックスの形状で示されている。
【０１５５】
これらの円は、８行にわたり、１番目は金属複合体Ｍの不在（Ｍ０の行）に、他の７つ金属複合体Ｍ１〜Ｍ７のうちの一つに相当して、また２４列にわたり、１番目はリガンドＬの不在（Ｌ０の列）に、他の２３列はリガンドＬ１〜Ｌ２３に相当して分布されている。
【０１５６】
図４に示された結果は、溶媒としてＤＭＦを、塩基としてＤＩＥＡを、銅塩としてヨウ化銅を、２％の金属Ｍ、および４％のリガンドＬを用いて得られたものである。
【０１５７】
これらの結果を考慮すれば、パラジウムと組合わされた場合、二つのリガンド（Ｌ１２およびＬ１９）が最も有効であるとわかることが注目されてよい。
【０１５８】
（参考文献）
2007527367.tif 000019
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】本発明のスクリーニング法の第一の態様の種々の工程を、図式的に表した図である。
【図２】図１に例示された本発明の方法の第一の態様によって行なわれた操作条件のスクリーニングの結果を、％として表された反応収率で示す図である。
【図３】本発明の方法の第二の態様の種々の工程を、図式的に表した図である。
【図４】図３に例示された本発明の方法の第二の態様によって行なわれた操作条件のスクリーニングの結果を、％として表された反応収率で示す図である。
【図１】
2007527367.tif 000026
【図２】
2007527367.tif 000027
【図４】
2007527367.tif 000028
【図３】
2007527367.tif 000029
【国際調査報告】
2007527367.tif 000030
2007527367.tif 000031
2007527367.tif 000032
2007527367.tif 000033
2007527367.tif 000034
2007527367.tif 000035