(57)【要約】治療剤（例えば、サイトカイン、リンホカインおよび免疫毒素）への患者の耐容性を予測するための方法が、開示される。この方法は、脈管漏出症候群（ＶＬＳ）のインビトロモデルを利用して、問題の薬剤の効果を、内皮細胞（ＥＣ）のコンフルエントな単層を横切る大型タンパク質の透過性において評価する。本発明の方法は、内皮細胞単層を通したタンパク質の漏出をモニタリングするアッセイシステムを、問題の治療後の耐容性を予測するために利用する。このアッセイは、種々の免疫治療に対するヒトにおける耐容性を予測するために特に適している。
2007527242.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択された治療剤に対する患者による耐容性または不耐容性を予測するための、インビトロの方法であって、該方法は、以下：
（ａ）接着培養基に付着した内皮細胞のコンフルエントな単層を、提供する工程；
（ｂ）該単層を、以下：
（ｉ）該選択された治療剤、または該治療剤を使用して活性化させた末梢血単核細胞によって産生されるリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞の調製物、もしくは該ＬＡＫ細胞からの上清、および
（ｉｉ）検出可能にラベルされた高分子であって、該検出可能にラベルされた高分子は、該コンフルエントな単層がインタクトである場合に該単層により実質的に保持される、高分子
と、接触させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）からの該単層を、該検出可能にラベルされた高分子が、該コンフルエントな単層を、そして該単層の完全性が崩壊している場合は該接着培養基を通過することが可能な条件下で、一定時間インキュベートする工程；ならびに
（ｄ）該治療剤に対する患者による耐容性または不耐容性の指標として、該コンフルエントな単層および該接着培養基を通過する高分子を検出する工程
を、包含する方法。
【請求項２】
前記治療剤が、免疫治療剤、免疫毒素または低分子化学療法薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫治療剤が、インターロイキン−２（ＩＬ−２）ムテインである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記接着培養基が、コラーゲンマトリックスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記内皮細胞が、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記検出可能にラベルされた高分子が、検出可能にラベルされたアルブミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記検出可能にラベルされたアルブミンが、ラベルされたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＢＳＡが、蛍光ラベルされている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記蛍光ラベルが、ＦＩＴＣである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
インターロイキン−２（ＩＬ−２）ムテインに対する患者による耐容性または不耐容性を予測するための、インビトロの方法であって、該方法は、以下：
（ａ）接着培養基に付着した内皮細胞のコンフルエントな単層を、提供する工程；
（ｂ）該単層を、以下：
（ｉ）該ＩＬ−２ムテインを使用して活性化させた末梢血単核細胞によって産生されるリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞の調製物、および
（ｉｉ）検出可能にラベルされた高分子であって、該検出可能にラベルされた高分子は、該コンフルエントな単層がインタクトである場合に該単層により実質的に保持される、高分子
と、接触させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）からの該単層を、該検出可能にラベルされた高分子が、該コンフルエントな単層を、そして該単層の完全性が崩壊している場合は該接着培養基を通過することが可能な条件下で、一定時間インキュベートする工程；ならびに
（ｄ）該ＩＬ−２ムテインに対する患者による耐容性または不耐容性の指標として、該コンフルエントな単層および該接着培養基を通過する高分子を検出する工程
を、包含する方法。
【請求項１１】
前記接着培養基が、コラーゲンマトリックスを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記内皮細胞が、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出可能にラベルされた高分子が、検出可能にラベルされたアルブミンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記検出可能にラベルされたアルブミンが、ラベルされたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＢＳＡが、蛍光ラベルされている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記蛍光ラベルが、ＦＩＴＣである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
インターロイキン−２（ＩＬ−２）ムテインに対する患者による耐容性または不耐容性を予測するための、インビトロの方法であって、該方法は、以下：
（ａ）コラーゲンマトリックスを含む接着培養基に付着した、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のコンフルエントな単層を、提供する工程；
（ｂ）該単層を、以下：
（ｉ）該ＩＬ−２ムテインを使用して活性化させた末梢血単核細胞によって産生されるリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞の調製物、および
（ｉｉ）蛍光ラベルしたアルブミン
と、接触させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）からの該単層を、該蛍光ラベルしたアルブミンが、該コンフルエントな単層を、そして該単層の完全性が崩壊している場合は該接着培養基を通過することが可能な条件下で、一定時間インキュベートする工程；ならびに
（ｄ）該ＩＬ−２ムテインに対する患者による耐容性または不耐容性の指標として、該コンフルエントな単層を通過する、蛍光ラベルしたアルブミンを検出する工程
を、包含する方法。
【請求項１８】
前記蛍光ラベルされたアルブミンが、ラベルされたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記蛍光ラベルが、ＦＩＴＣである、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、インビトロアッセイ方法に属する。特に、本発明は、特定の治療剤（ＩＬ−２ムテインのような免疫治療剤を含む）に耐える患者の能力を予測するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＴ細胞の増殖および機能の強力な刺激物質である（非特許文献１）。この天然に存在するリンホカインは、単独であろうと、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）と組み合わせた場合であろうと、種々の悪性腫瘍に対する抗腫瘍活性を有することが示されている（例えば、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５および非特許文献６を参照）。ＩＬ−２の抗腫瘍活性は、転移メラノーマおよび腎細胞癌を有する、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ．から市販されるＩＬ−２処方物）を用いた患者において、最もよく記載されている。他の疾患（リンパ腫を含む）もまた、ＩＬ−２処置に応答性であると考えられる（非特許文献７）。
【０００３】
多くの他の治療剤もまた、その抗腫瘍活性に起因して、ガンを処置するために使用されている。このような薬剤としては、インターロイキン（ＩＬ−３、ＩＬ−４を含む）、インターフェロン（ＩＦＮ）−α、ＧＭ−ＣＳＦ、抗ガングリオシド抗体、シクロスポリンＡ、シクロホスファミド、マイトマイシンＣ、ＦＫ９７３、モノクロタリンピロールおよびシトシンアラビノシド；ならびに、リシンＡ鎖（ＲＴＡ）、結合（ｂｌｏｃｋｅｄ）リシン（ｂｌＲ）、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）（ＳＡＰ）、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）およびシュードモナス属体外毒素（ＰＥ）のような多くの免疫毒素、が挙げられる。
【０００４】
しかし、これらの多くの治療剤の治療有用性は、低い耐容性および毒性によって邪魔される。例えば、高用量のＩＬ−２免疫治療は、脈管漏出症候群（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｌｅａｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＶＬＳ）、重いインフルエンザ様症状（熱、悪寒、嘔吐）、低血圧および神経学的変化によって最も顕著に表れる激しい毒性を伴う（例えば、非特許文献８、非特許文献９および非特許文献１０を参照）。ＶＬＳはまた、上述のような他の化学療法薬が使用される際にも観察される。ＶＬＳのメカニズムは、活性化ＰＢＭＣと内皮細胞との相互作用、サイトカインの産生、炎症媒介物質、または薬剤固有の構造モチーフによって媒介される内皮の損傷に起因し得る（非特許文献１１、非特許文献１２を参照）。このような毒性およびＶＬＳの根底にある正確なメカニズムは明らかでないが、累積的なデータは、ＩＬ−２誘導性ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、炎症性促進性サイトカインの過剰産生の結果として、用量律速的毒性（ＤＬＴ）を引き起こすことを示唆している。これらの炎症促進性サイトカインとしては、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６が挙げられ、これらは、単球／マクロファージを活性化し、そして一酸化窒素（ＮＯ）の産生を誘発して、その後の内皮細胞の損傷をもたらす（Ｄｕｂｉｎｅｔｔら、１９９４年、Ｓａｍｌｏｗｓｋｉら、１９９５年）。
【０００５】
天然の分子により示される毒性を克服するため、いくつかのＩＬ−２変異体が開発されている。これらの変異体の例は、２００４年３月５日に出願された、共有に係る同時継続中の米国仮特許出願第６０／５５０，８６８号において記載される。
【０００６】
ＶＬＳのメカニズムを調べるために、インビトロモデルが開発されている。例えば、非特許文献１３は、内皮細胞単層を横切る経内皮高分子フラックスにおける、ＩＬ−２活性化キラー（ＩＡＫ）リンパ球および多くのリンホカインの効力を試験するためのインビトロ試験システムを記載する。このシステムは、ヒト臍帯内皮細胞を横切るＦＩＴＣ−アルブミンのフラックスを測定する。非特許文献１４は、リンホカイン活性化細胞媒介性細胞毒性のメカニズムの決定のためのインビトロアッセイを記載し、このアッセイもまた、内皮細胞単層を使用する。非特許文献１５は、毒媒介性ＶＬＳについてのインビトロモデルに属し、このモデルは、微小孔性支持体上で増殖し、リシン毒素Ａ鎖の存在下または非存在下で低圧力下で培養した、ヒト内皮細胞を使用する。
【０００７】
これらの試験システムは、ＶＬＳの機構を研究するために使用されてきたが、これらは、種々の治療（例えば、改変リンホカインを用いた免疫治療および化学治療用免疫毒素を用いた免疫治療）に対する患者の耐容性を予測するためには、これまで利用されてこなかった。
【非特許文献１】Ｍｏｒｇａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９７６年、第１９３巻、ｐ．１００７−１０１１
【非特許文献２】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、１９８７年、第３１６巻、ｐ．８８９−８９７
【非特許文献３】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．、１９８８年、第２０８巻、ｐ．１２１−１３５
【非特許文献４】Ｔｏｐａｌｉａｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１９８８年、第６巻、ｐ．８３９−８５３
【非特許文献５】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、１９８８年、第３１９巻、ｐ．１６７６−１６８０
【非特許文献６】Ｗｅｂｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１９９２年、第１０巻、３３−４０
【非特許文献７】Ｇｉｓｓｅｌｂｒｅｃｈｔら、Ｂｌｏｏｄ、１９９４年、第８３巻、ｐ．２０２０−２０２２
【非特許文献８】Ｄｕｇｇａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、１９９２年、第１２巻、ｐ．１１５−１２２
【非特許文献９】Ｇｉｓｓｅｌｂｒｅｃｈｔら、Ｂｌｏｏｄ、１９９４年、第８３巻、ｐ．２０８１−２０８５
【非特許文献１０】ＳｚｎｏｌおよびＰａｒｋｉｎｓｏｎ、Ｂｌｏｏｄ、１９９４年、第８３巻、ｐ．２０２０−２０２２
【非特許文献１１】ＢａｌｕｎａおよびＶｉｔｅｔｔａ、Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１９９７年、第３７巻、ｐ．１１７−１３２
【非特許文献１２】Ｂａｌｕｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９９年、第９６巻、ｐ．３９５７−３９６２
【非特許文献１３】ＤａｍｌｅおよびＤｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９８９年、第１４２巻、ｐ．２６６０−２６６９
【非特許文献１４】Ｋｏｔａｓｅｋら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９８８年、第４８巻、ｐ．５５２８−５５３２
【非特許文献１５】Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍら、Ｂｌｏｏｄ、１９９７年、第９０巻、ｐ．２３２３−２３３４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、特定の治療剤（例えば、免疫治療剤）に耐える患者の能力を予測し、これによりその分子の治療有効性を予測するための、単純かつ有効なインビトロアッセイ法を提供する。本発明の方法は、内皮細胞単層を通したタンパク質の漏出をモニタリングするアッセイシステムを、問題の治療後の耐容性を予測するために利用する。このアッセイは、種々の免疫治療に対するヒトにおける耐容性を予測するために特に適している。これらの免疫治療は全て、例えば、ヒトにおけるＤＬＴ（熱／悪寒、ＶＬＳおよび低血圧）のように、炎症促進性サイトカインおよび一酸化窒素（ＮＯ）の産生との微分相関（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）を有する。
【０００９】
従って、一つの実施形態において、本発明は、選択された治療剤に対する患者による耐容性または不耐容性を予測するためのインビトロの方法に関する。この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）接着培養基（ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）に付着した内皮細胞のコンフルエントな単層を、提供する工程；
（ｂ）この単層を、以下：
（ｉ）選択された治療剤、またはこの治療剤を使用して活性化させた末梢血単核細胞によって産生されるリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞の調製物、もしくはこのＬＡＫ細胞からの上清、および
（ｉｉ）検出可能にラベルされた高分子であって、コンフルエントな単層がインタクトである場合にこの単層により実質的に保持される、高分子
と、接触させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）からの単層を、検出可能にラベルされた高分子が、コンフルエントな単層を、そして単層の完全性が崩壊している場合は接着培養基を通過することが可能な条件下で、一定時間インキュベートする工程；ならびに
（ｄ）この治療剤に対する患者による耐容性または不耐容性の指標として、コンフルエントな単層および接着培養基を通過する高分子を検出する工程。
【００１０】
本発明の特定の実施形態において、この治療剤は、ＩＬ−２ムテインのような免疫治療剤、免疫毒素または低分子化学療法薬である。
【００１１】
追加の実施形態において、この方法において使用される接着培養基は、コラーゲンマトリックスを含む。
【００１２】
なおさらなる実施形態において、この方法において使用される内皮細胞は、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）である。
【００１３】
他の実施形態において、この方法において使用される検出可能にラベルされた高分子は、検出可能にラベルされたアルブミン（例えば、ラベルされたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））である。このＢＳＡは、（例えば、ＦＩＴＣで）蛍光ラベルされ得る。
【００１４】
なおさらなる実施形態において、本発明は、ＩＬ−２ムテインに対する患者による耐容性または不耐容性を予測する、インビトロの方法に関する。この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）接着培養基に付着した内皮細胞のコンフルエントな単層を、提供する工程；
（ｂ）この単層を、以下：
（ｉ）ＩＬ−２ムテインを使用して活性化させた末梢血単核細胞によって産生されるリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞の調製物、および
（ｉｉ）検出可能にラベルされた高分子であって、コンフルエントな単層がインタクトである場合にこの単層により実質的に保持される、高分子
と、接触させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）からの単層を、検出可能にラベルされた高分子が、コンフルエントな単層を、そして単層の完全性が崩壊している場合は接着培養基を通過することが可能な条件下で、一定時間インキュベートする工程；ならびに
（ｄ）ＩＬ−２ムテインに対する患者による耐容性または不耐容性の指標として、コンフルエントな単層および接着培養基を通過する高分子を検出する工程。
【００１５】
特定の実施形態において、この方法において使用される接着培養基は、コラーゲンマトリックスを含む。
【００１６】
さらなる実施形態において、この方法において使用される内皮細胞は、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）である。
【００１７】
他の実施形態において、この方法において使用される検出可能にラベルされた高分子は、検出可能にラベルされたアルブミン（例えば、ラベルされたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））である。このＢＳＡは、（例えば、ＦＩＴＣで）蛍光ラベルされ得る。
【００１８】
追加の実施形態において、本発明は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）ムテインに対する患者による耐容性または不耐容性を予測する、インビトロの方法に関する。この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）コラーゲンマトリックスを含む接着培養基に付着した、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のコンフルエントな単層を、提供する工程；
（ｂ）この単層を、以下：
（ｉ）ＩＬ−２ムテインを使用して活性化させた末梢血単核細胞によって産生されるリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞の調製物、および
（ｉｉ）蛍光ラベルしたアルブミン
と、接触させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）からの単層を、蛍光ラベルしたアルブミンが、コンフルエントな単層を、そして単層の完全性が崩壊している場合は接着培養基を通過することが可能な条件下で、一定時間インキュベートする工程；ならびに
（ｄ）ＩＬ−２ムテインに対する患者による耐容性または不耐容性の指標として、コンフルエントな単層を通過する、蛍光ラベルしたアルブミンを検出する工程。
【００１９】
この方法の特定の実施形態において、蛍光ラベルされたアルブミンは、ＢＳＡである。このＢＳＡは、（例えば、ＦＩＴＣで）蛍光ラベルされ得る。
【００２０】
本発明のこれらの実施形態および他の実施形態は、本発明の開示を受けて、当業者により容易に想到される。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、表示しない場合、当該分野の技術の範囲内で、薬理学、化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および免疫学の従来方法を使用する。このような技術は、文献において完全に説明される。例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ巻〜第ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，最新版）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照。
【００２２】
（Ｉ．定義）
本発明の記載において、以下の用語が使用され、下に示すように規定されることを意図される。
【００２３】
本明細書中および明細書中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、そうでないことを明記しない限り、複数の言及を含むことに、最も留意すべきである。したがって、例えば、「一つの細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」という言及は、２以上の細胞を含む、などである。
【００２４】
用語「含む（含有する）（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「構成する（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、したがって、Ｘを「含む」組成物は、ただＸのみから構成されてもよく、または追加の何か（例えば、Ｘ＋Ｙ）を含んでもよい。
【００２５】
用語「実質的に」は、「完全に」を排除するものではなく、例えば、Ｙを「実質的に含まない」は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要な場合、語「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
【００２６】
用語「由来する」は、本明細書中で、分子の本来の供給源を特定するために使用されるが、この分子が作製された手段を限定することを意味しない。（例えば、化学合成または組換え手段によって作製され得る）。
【００２７】
用語「免疫治療剤」は、本明細書中で、免疫増強物質または免疫抑制薬であり、ガンを処置するのに有用である薬剤をいう。このような薬剤としては、非限定で、種々のサイトカインおよびリンホカインが挙げられる。例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１２およびこれらの分子のムテインを含む多くのインターロイキン；インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γおよびそれらのムテインが挙げられるが、これらに限定されない）；コロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのムテイン）；腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β並びにこれらの分子のノムテイン）である。用語「免疫治療剤」にはまた、免疫毒素も含まれる。「免疫毒素」は、抗体−毒素結合体を意味し、これは、この抗体に相同な抗原を有する特定の標的細胞（例えば、腫瘍細胞）を破壊することを目的とする。抗体と結合される毒素の例としては、リシンＡ鎖（ＲＴＡ）、結合リシン（ｂｌＲ）、サポリン（ＳＡＰ）、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）およびシュードモナス属体外毒素（ＰＥ）および他の毒性成分（例えば、放射性同位体）ならびに他の化学治療薬物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
用語ＩＬ−２は、本明細書中で使用される場合、正常な末梢血リンパ球によって産生され低濃度で体内に存在するリンホカインに由来する、タンパク質である。ＩＬ−２は、Ｍｏｒｇａｎら（１９７６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９３：１００７−１００８によって最初に記載され、そして元来、刺激されたＴリンパ球の増殖を誘導するその能力ゆえに、Ｔ細胞増殖因子と呼ばれていた。これは、１３，０００〜１７，０００の範囲の分子量を有するタンパク質であると報告されており（ＧｉｌｌｉｓおよびＷａｔｓｏｎ（１９８０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５９：１７０９）、そして６〜８．５の範囲の等電点を有する。完全長ＩＬ−２およびその生物学的に活性なフラグメントの両方が、この定義に含まれる。この用語はまた、ＩＬ−２の発現後修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など）をも含む。
【００２９】
用語「ムテイン」は、本明細書中で使用される場合、天然配列への、欠失、切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、付加および置換のような改変を含むタンパク質をいう。代表的に、このタンパク質は生物学的な活性を有し、すなわち、抗腫瘍活性を有する。これらの改変は、部位特異的突然変異誘発として意図的であっても、または、例えばこのタンパク質を産生する宿主の変異、もしくはＰＣＲ増幅に起因するエラーを介した、偶発的なものであってもよい。用語「ムテイン」は、用語「改変体」および「アナログ」と相互交換可能に使用される。このようなムテインのアミノ酸配列は、参照配列に対し、２つの配列を並べた場合に、高度な配列相同性（例えば、５０％を超えるか、一般に、６０〜７０％を超えるか、さらにより具体的には８０〜８５％以上（例えば、少なくとも９０〜９５％以上）のアミノ酸配列相同性）を有し得る。しばしば、アナログは、同じ数のアミノ酸を含むが、本明細書中で説明されるように、置換を含む。ポリペプチドムテインを作製する方法は、当該分野で公知であり、以下でさらに説明される。
【００３０】
ムテインは、天然で保存的または非保存的な置換を含む。保存的配列は、その側鎖において関連する、アミノ酸のファミリー内に起こる置換である。特に、アミノ酸は、一般に、４つのファミリーに分けられる：（１）酸性・・アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性・・リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性・・アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；ならびに（４）非電化極性・・グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、時々、芳香族アミノ酸として分類される。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンでの、アスパラギン酸のグルタミン酸での、トレオニンのセリンでの単一の置換、または同様の構造的に関連したアミノ酸でのアミノ酸の保存的置換は、生物学的活性に重要な効果を有さない。例えば、目的のタンパク質は、約５〜１０までの保存的もしくは非保存的なアミノ酸置換、あるいはさらに約１５〜２５、５０もしくは７５、またはその分子の所望の機能がインタクトに保たれる限り、５〜７５の間の任意の整数の、保存的もしくは非保存的なアミノ酸置換を含み得る。当業者は、目的の分子の、変更に耐え得る領域を、容易に決定し得る。
【００３１】
用語「ムテイン」はまた、天然分子の誘導体をいう。「誘導体」により、目的の天然のポリペプチド、天然のポリペプチドのフラグメント、またはその対応するアナログ（例えば、グリコシル化、リン酸化、ポリマー結合（ポリエチレングリコールなど）、もしくは天然のポリペプチドの所望の生物学的活性が保持される限り、他の外来性部分の付加）の、任意の適切なポリペプチドが意図される。ポリペプチドフラグメント、アナログおよび誘導体を作製する方法は、一般に、当該分野で利用可能である。
【００３２】
「フラグメント」は、インタクトな完全長の配列および構造の一部分のみからなる分子を意図する。フラグメントは、天然のポリペプチドの、Ｃ末端欠失、Ｎ末端欠失および／または内部欠失を含み得る。特定のタンパク質の活性なフラグメントは、一般に、完全長分子の少なくとも約５〜１０の連続するアミノ酸残基、好ましくは完全長分子の少なくとも約１５〜２５の連続するアミノ酸残基、最も好ましくは完全長分子の少なくとも約２０〜５０の連続するアミノ酸残基、または、問題のフラグメントが本明細書中で規定される生物学的活性（例えば、抗腫瘍活性）を保持するならば、５アミノ酸と完全長配列との間の任意の整数の連続するアミノ酸残基を含む。
【００３３】
「単離された」は、ポリペプチドをいう場合、分子が、その分子が天然に存在する生物全体から別々に分離されているか、または、同型の他の生物学的高分子の実質的非存在下で存在することを意味する。ポリヌクレオチドに関して、用語「単離された」は、天然で通常共に存在する配列；または天然に存在する配列であるが、その上に結合した異種配列を有する配列；あるいは染色体から解離された分子の、全体または一部を欠いている核酸分子である。
【００３４】
用語「細胞培養」および「組織培養」は、相互交換可能に使用され、液体培地中の懸濁培養液中か、または液体培地と共に提供される、ガラス、プラスチックもしくは寒天、または他の適切なマトリックスの表面上における、細胞のインビトロでの維持を意味する。一般に、「細胞培養」は、一定の適切なｐＨを維持するために緩衝化された培地を必要とする。細胞培養において必要とされる培地は、一般に、必要な栄養の適切な供給を含み、そして維持される特定の細胞に応じて浸透圧的に調整され得、温度および気体相もまた、適切な限度内に制御され得る。細胞培養技術もまた、当該分野で周知である。例えば、Ｍｏｒｇａｎら，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ（１９９３），およびＡｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．Ｐ．Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｓ，第２版，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９９０）を参照。
【００３５】
用語「内皮細胞」は、本明細書中で使用される場合、分化した、心臓ならびに血管およびリンパ管の腔に広がる細胞の最内の層由来の扁平上皮細胞をいう。内皮細胞は、中胚葉性胚性細胞層に由来する。内皮細胞の例は、以下に提供される。
【００３６】
「末梢血単核細胞」または「ＰＢＭＣ」は、哺乳動物（例えば、ヒト）の末梢血から、例えば密度遠心分離法を使用して、単離された細胞の集団を意味する。一般に、ＰＢＭＣ集団は、主にリンパ球および単球を含み、そして赤血球およびほとんどの多形核球ならびに顆粒球を含まない。
【００３７】
「継代」は、細胞集団の植え継ぎ培養（ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）の行為をいう。「植え継ぎ培養」は、新鮮な滅菌培地の、先代培養からのサンプルでの播種によって確立される、細胞培養をいう。各々の繰り返しの植え継ぎ培養は、１回の継代事象と数えられる。
【００３８】
本発明のアッセイにおいて使用される適切な「高分子」は、コンフルエントな単層によって、（単層が破壊されない限り）実質的に保持される、十分な大きさの高分子である。単層が破壊されることにより、コンフルエントな単層を通る高分子の透過性が増大する。「増大した」透過性は、単層を通る高分子の移動が、破壊剤の非存在下での単層を通る動きと比較して、より多い量であるか、またはより速い速度であること（すなわち、ＬＡＫ細胞が、血管漏出症候群を引き起こす免疫治療剤によって刺激されること）を意味する。特に有用な単核細胞としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のような血清アルブミン、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、および当業者に周知の他のタンパク質が挙げられる。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「ラベル」および「検出可能なラベル」は、検出の可能な分子をいい、放射性同位元素、蛍光剤、半導体ナノ結晶、化学発光剤、発色団、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えば、ビオチン、ストレプトアビジンまたはハプテン）などが挙げられるが、これらに限定されない。用語「蛍光剤」は、検出可能な範囲で蛍光を呈示可能な物質またはその部分をいう。本発明の下で使用され得るラベルの特定の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フルオレセイン化合物（例えば、フルオレセイン５（６）−イソチオシアネートまたはフルオレセインイソチオシアネート異性体Ｉ、共に「ＦＩＴＣ」として知られる）、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ）、テキサスレッド、ルミノール、ＮＡＤＰＨおよびα−β−ガラクトシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
（ＩＩ．発明を実施する様式）
本発明を詳細に説明する前に、本発明は、特定の処方または過程のパラメータ（無論、変わり得る）に限定されないことが、理解されるべきである。また、本明細書中で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を説明する目的のみのものであり、限定を意図しないことが、理解されるべきである。
【００４１】
本明細書中で記載される方法および材料と類似するかまたは等価である、多くの方法および材料が使用され得るが、好ましい材料および方が、本明細書中に記載される。
【００４２】
上で説明したとおり、免疫治療（例えば、ＩＬ−２治療）が、種々のガン（例えば、転移メラノーマ、腎細胞腫、およびリンパ腫）を処置するために使用される。しかし、処置方法は、免疫治療に伴う激しい毒性（例えば、血管漏出症候群（ＶＬＳ）、重いインフルエンザ様症状（熱、悪寒、嘔吐）、低血圧、神経学的変化および一酸化窒素（ＮＯ）産生（その後の内皮細胞の損傷を導く）によって妨げられる。従って、免疫治療剤の多くのムテイン（例えば、リンホカインムテイン）は、上記の副作用を回避する望みをもって作製されている。本発明は、これらのムテインおよび他の治療剤を、毒性の指標について試験する、インビトロの手段を提供する。
【００４３】
特に、本発明は、インビトロ方法論が、ＩＬ−２治療を受ける際に起こり得る通常の副作用を伴わない特定のＩＬ−２ムテインを使用した治療に患者が耐える能力を、正確にかつ効率的に予測するために使用され得るという発見に基づく。本発明のアッセイ方法は、インビトロ内皮透過性モデルを使用し、コンフルエントな内皮細胞単層を通した高分子の漏出をモニタリングする。このアッセイにおいて、高分子は、通常、コンフルエントな単層によって保持されるか、わずかに漏出するのみである。しかし、（例えば、血管漏出症候群を引き起こす治療剤への曝露、またはこの治療剤を使用して産生され、血管漏出症候群などを引き起こすＬＡＫ細胞（もしくはその上清）への曝露によって）単層の強度が損なわれると、高分子の内皮細胞を超える透過性の上昇が起こる。
【００４４】
本発明のアッセイは、ヒトにおける、種々のリンホカインベースの免疫治療（例えば、ＩＬ−２免疫治療）に対する耐容性を、ヒトにおけるＤＬＴ（熱／悪寒、ＶＬＳおよび低血圧）として予測するために、特に適する。これらの免疫治療は、全て、炎症促進性サイトカインおよびＮＯ産生との微分相関を有する。
【００４５】
多くの透過性アッセイが、当該分野で公知であり、治療剤（例えば、ＩＬ−２ムテイン）を試験するために使用され得る。例えば、ＤａｍｌｅおよびＤｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８９）１４２：２６６０−２６６９；Ｋｏｔａｓｅｋら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９８８）４８：５５２８−５５３２；Ｓｔｏｎｅ−Ｗｏｌｆｆら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８４）１５９：８２８；Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍら，Ｂｌｏｏｄ（１９９７）９０：２３２３−２３３４を参照。
【００４６】
一般に、これらのアッセイは、コンフルエントな単層への接着培養基を使用する。これらの接着培養基は、通常、可溶性栄養、代謝物およびホルモン因子などの物質を通過させ、同時にこれを通した細胞移動を実質的に防ぐ（コンフルエントな単層が損なわれない限り）。本発明のアッセイにおける使用のためのコンフルエントな単層は、代表的に、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞およびリンパ管内皮細胞）から産生される。このような細胞の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＡＣ）（以下に記載のように、容易に得られる：Ｊａｆｆｅら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９７３）５２：２７４５；Ｓｔｒｏｎｃｅｋら，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ（１９８６）１３７：１７３５−１７４２、および多くの供給者から、商業的に得られる（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ（例えば、カタログ番号ＣＲＬ−１７３０）およびＣａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）；ＷＢ５７２細胞（自発的に変換したヒト伏在静脈血管平滑筋細胞）；ＳＶ−Ｅ６細胞（Ｅ６ウイルス性オンコジーンで安定的にトランスフェクションされるヒト伏在静脈細胞）；Ａ７Ｒ５細胞（自発的に変換したラット胸大動脈平滑筋細胞；ＡＴＣＣ）；ＧＨ３Ｂ６細胞（ラット下垂体細胞；ＡＴＣＣ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．）；ＰＶＥＣ細胞（ラット胚血管内皮細胞；Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｒｅｓ．（１９８６）１０：９）；ＣＰＡ４７（ウシ内皮細胞；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７３３）；ＣＰＡＥ細胞（ウシ内皮細胞；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２０９）；ＥＪＧ細胞（ウシ内皮細胞；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８６５９）；ＦＢＨＥ（ウシ内皮細胞；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １３９５）；ＨＷ−ＥＣ−Ｃ細胞（ヒト内皮細胞；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７３０）；およびＴ／ＧＨＡ−ＶＳＭＣ細胞（ヒト血管平滑筋細胞；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １９９９））。
【００４７】
本発明のアッセイにおいて使用する前に、細胞を、慣用的に継代し、そして適切な（当業者に周知の）培地で培養する。例えば、内皮細胞は、市販の培地中で培養され得る（例えば、実施例に記載されるＲＰＭＩ−１０ＡＢ培地；ＤａｍｌｅおよびＤｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，（１９８９）１４２：２６６０−２６６９に記載されるＲＰＭＩ１６４０補充培地；Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍら，Ｂｌｏｏｄ（１９９７）９０：２３２３−２３３４に記載されるＭ１９９補充培地；Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤから購入可能で、２％のウシ胎仔血清を含有する内皮増殖培地（ＥＧＭ）；および当業者に周知の他の組織培養培地）。例えば、内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）、ヘパリンなどの追加の因子が、使用され得る。例えば、Ｔｈｏｒｎｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２２２：６２３を参照。使用前の継代のおよその回数は変動し、かつ、使用する細胞株の寿命の期待値に依存する。一般に、ＨＵＶＡＣは、２〜２０回の継代、より代表的には、３〜１０回の継代、なおより代表的には、５回未満（例えば、２回、３回、４回）の継代で、アッセイにおいて使用される。
【００４８】
所望の回数の継代の後、約１×１０３〜１×１０８個、好ましくは１×１０４〜１×１０７個（例えば１×１０５〜１×１０６個）の細胞を、適切な接着培養基に加える。コンフルエントな単層を、使用する細胞の型に基づく適切な時間培養することにより確立する。例えば、ＨＵＶＡＣは、代表的に、約１〜７日間、一般に２〜５日間、例えば、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間または７日間、コンフルエントな単層が確立されるまでインキュベートする。コンフルーエンシーは、当該分野で周知の技術（例えば、クリスタルバイオレットでの試験）を用いて評価し得る。
【００４９】
本発明のアッセイにおいて使用される適切な物質としては、膜状の支持体（例えば、組織培養のために開発された微小孔性浸透性薄膜）であって、一般に、物質（可溶性栄養、代謝物およびホルモン因子）の膜を通した自由な透過を許すが、これを通した細胞の移動を防ぐ支持体が、挙げられる。接着性支持体としては、例えば、デキストランポリマー、塩化ポリビニル、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ  ｃｏｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）および／またはシリコンが挙げられる。代表的に、基質はまた、コラーゲン、フィブリン、フィブロネクチン、ラミニンおよび／またはヒアルロン酸を含む。このような支持体は、当該分野で周知であり、例えば、Ｃｏｓｔａｒ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から購入可能である。１つの例は、ＴｒａｎｓｗｅｌｌＴＭ支持体（例えば、２５〜５０μｍの厚み、０．４〜３．０μｍの孔の大きさを有するＴＲＡＮＳＷＥＬＬ−ＣＯＬ  ＰＴＦＥ膜（ウシ胎盤由来のＩ型コラーゲンおよびＩＩ型コラーゲンで処理されている）である。このような支持体は、物質を単層を通して上側チャンバからチャンバした側へと通過させ、これを回収および計測可能である。しかし、任意の透過可能な膜支持体が、単層を通した移動がモニタリングされ得る限り、本発明の方法での使用を見出す。
【００５０】
一旦、コンフルエントな単層が確立されると、検出可能にラベルされた高分子が、単層に（例えば、ｔｒａｎｓｗｅｌｌ支持体の上側チャンバに）、試験物質の非存在下で、バックグラウンドの測定を提供するために加えられる。検出可能にラベルした高分子は、コンフルエントな単層が、単層への損傷を引き起こす分子の存在に起因して漏出性になっていない限り、単層によって実質的に保持されるために十分な大きさの高分子である。上で説明されたように、本発明のアッセイにおいて代表的に使用される高分子としては、血清アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリンおよび当業者に周知の他のタンパク質が挙げられる。ラベルされた高分子が加えられた後、アッセイは、１５分間から数時間まで（例えば、３０分間から４８時間まで、好ましくは１時間から２４時間まで、より好ましくは２時間から１２時間まで（例えば、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１２時間、２０時間、２４時間、４０時間、４８時間またはそれ以上））進められる。単層を、例えば下側チャンバへ通過した、ラベルされた分子は、基線測定を提供するために、（例えば、分光光度計を使用して）モニタリングされ得る。蛍光ラベルが使用される場合、蛍光は、分光光度計を使用して測定され、そして相対的蛍光単位で表される。測定は、定性的であっても、定量的であってもよい。例えば、アルブミンのクリアランスは、以下の式を用いて計算され得る：アルブミンクリアランス（μｌ）＝ＶＬ×Ａ／Ｌ、ここでＶＬは、サンプリング時の下側チャンバの容量であり、Ａは、サンプリング時の下側チャンバの蛍光単位／μｌであり、そしてＬは、アッセイ開始時の上側チャンバの蛍光単位／μｌである。アルブミンクリアランス（μｌ／分）は、線状回帰分析によって計算され得る。例えば、クリアランス（μｌ±ＳＥＭ／分）が、決定され得る。
【００５１】
適切な測定がなされた後、残留したラベル高分子は全て除去され、そして試験化合物が、ラベル分子を含む培地と共に（例えば、上部ウェルに）加えられる。例えば、目的の治療剤または問題の治療剤を用いて刺激されているＬＡＫ細胞（もしくはその上清）を、以下に詳述するように、コントロールと同様に加える。ＬＡＫ細胞は、抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）を活性化するために選択された治療剤を用いて、ＰＢＭＣによって産生される。活性化のためのＰＢＭＣは、全血から、当該分野で周知の技術を用いて（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配を用いて）単離され得る。遠心分離後、接着性の単核細胞が、プラスチックへの接着の連続循環によって（例えば、３７℃で４５分間）、非接着性単核細胞（ＮＡＭＮＣ）から分離され得るが、分離されなくてもよい。活性化細胞を調製するため、問題の治療剤およびＰＢＭＣを合わせる。加えられる薬剤の量は、試験される特定の物質に依存する。したがって、例えば、リンホカイン（例えば、ＩＬ−２）ムテインを評価する場合、ムテインを、１０〜５００ｎＭ（一般に、２５〜２５０ｎＭ、なおより好ましくは、３５〜１００ｎＭ）の濃度で加える。当業者は、使用のための適切な濃度を容易に決定し得る。例えば、ＤａｍｌｅおよびＤｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８９）１４２：２６６０−２６６９；Ｄａｍｌｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８７）  １３８：１７７９；ＤａｍｌｅおよびＤｏｙｌｅ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９８７）４０：５１９；Ｄａｍｌｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８６）１３７：２８１４を参照。
【００５２】
このアッセイは、基線測定に関して、上述のように進められる。サンプルは、下側チャンバから多数の時点で採取され得、存在するラベル分子の評価が実施される。以下の実施例で詳述するように、種々のコントロールが行われ得る。特に、改善された耐容性を有する治療剤は、ＶＬＳを起こす治療剤の非存在下で起こる漏出の基線を確立するためのネガティブコントロールとして使用され得る。例えば、ＩＬ−２ムテインであるＦ４２ＥおよびＹ１０７Ｒは、上昇した耐容性を示す置換変異体である。共有に係る同時継続中の米国仮特許出願公開第６０／５５０，８６８号（２００４年３月５日出願）を参照。これらのムテインはまた、インビトロモデルおよびインビボモデルにおいて、ＮＫ細胞増殖およびＴ細胞増殖、ならびにＮＫ／ＬＡＫ／ＡＤＣＣ活性の点で、エフェクター機能をも維持する。さらに、ポジティブコントロールは、細胞単層を損傷することが知られる界面活性剤（例えば、サポニン）などを使用し得る。培地コントロールもまた使用され得る。
【００５３】
上で説明したように、本発明の方法は、治療剤（例えば、ＩＬ−２ムテイン）を患者の耐容性について試験するために使用される。多くのＩＬ−２ムテインが公知であり、そして以下にさらに記載される。しかし、本発明の方法は、本明細書中で特に記載されない他のＩＬ−２ムテインにも同様に適用可能である。このようなＩＬ−２ムテインは、任意の種から得られるＩＬ−２に由来し得る。このような改変体は、天然ポリペプチドの所望の生物学的活性を保持し、それにより、被験体に投与した場合、改変体ポリペプチドを含む薬学的組成物が、天然ポリペプチドを含む薬学的組成物と同じ治療効果を有する。すなわち、改変体ポリペプチドは、治療上活性な化合物として薬学的組成物中で、天然ポリペプチドについて認められるのと同じ様式で役立つ。方法は、改変体ポリペプチドが所望の生物学的活性を保持し、従って、薬学組成物中で治療上活性な成分として役立つか否かを決定するために、当該分野で利用可能である。生物学的活性は、天然のポリペプチドまたはタンパク質の活性を測定するために特別に設計されたアッセイを使用して、測定され得る。天然に存在するＩＬ−２の生物学的に活性な、適切なムテインは、上で規定したように、ＩＬ−２ポリペプチドの、フラグメント、アナログおよび誘導体であり得る。
【００５４】
例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列改変体は、クローニングした、目的の天然ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列における変異によって、調製され得る。突然変異誘発およびヌクレオチド配列改変の方法は、当該分野で周知である。例えば、以下を参照：ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ，編（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；米国特許第４，８７３，１９２号；およびこれらの中に挙げられた参考文献。目的のポリペプチドの生物学的活性に影響しない適切なアミノ酸置換に関しての手引きは、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）におけるモデルにおいて見出され得る。１アミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸と置換する保存的置換が、好ましくあり得る。保存的置換の例としては、
【００５５】
【数１】
2007527242.tif 000003
が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
残基置換、欠失または挿入のいずれかにより改変され得るＩＬ−２タンパク質の領域に関する手引きは、当該分野において見出され得る。例えば、以下において議論される構造／機能の関係および／または結合研究を参照：Ｂａｚａｎ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：４１０−４１２；ＭｃＫａｙ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：４１２；Ｔｈｅｚｅら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１７：４８１−４８６；ＢｕｃｈｌｉおよびＣｉａｒｄｅｌｌｉ（１９９３）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０７：４１１−４１５；Ｃｏｌｌｉｎｓら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：７７０９−７７１３；Ｋｕｚｉｅｌら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５７３１；Ｅｃｋｅｎｂｅｒｇら（１９９７）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ９：４８８−４９８。
【００５７】
目的のＩＬ−２ポリペプチドの改変体の構築において、ムテインが所望の活性を持ち続けるような改変が行われる。明らかに、ＤＮＡにおいて行われる改変体ポリペプチドをコードするいかなる変異も、配列をオープンリーディングフレーム外に配置してはならないし、そして好ましくは、二次ｍＲＮＡ構造を産生し得る相補的領域を作らない。欧州特許出願公開第７５，４４４号を参照。
【００５８】
ＩＬ−２の生物学的に活性なムテインは、一般に、参照ＩＬ−２ポリペプチド分子（例えば、天然ヒトＩＬ−２、比較の基礎として役立つ）のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％〜９５％またはそれ以上、最も好ましくは少なくとも約９８％、９９％またはそれ以上の、アミノ酸配列同一性を有する。配列同一性百分率は、１２のギャップオープンペナルティおよび２のギャップ拡張ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）、６２のＢＬＯＳＵＭマトリックスでのアフィン（ａｆｆｉｎｅ）ギャップ検索を使用する、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．（１９８１）２：４８２−４８９において教示される。改変は、例えば、１〜１５アミノ酸残基ほど少なく、１〜１０（例えば６〜１０）残基ほど少なく、５残基ほど少なく、４残基、３残基、２残基または１アミノ酸残基ほど少なくすらあり得る。
【００５９】
２つのアミノ酸配列の最適なアラインメントについて、改変アミノ酸配列の連続したセグメントは、参照アミノ酸配列と、同じ数のアミノ酸、付加したアミノ酸残基または欠失したアミノ酸残基を有し得る。参照アミノ酸配列との比較のために使用する連続したセグメントは、少なくとも２０の連続したアミノ酸残基を含み、そして３０、４０、５０またはそれ以上のアミノ酸残基であり得る。保存的残基置換またはギャップでの配列同一性の修正は、行い得る（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを参照）。目的の天然のＩＬ−２ポリペプチドの生物学的に活性な改変体は、１〜１５残基ほど少ないアミノ酸でか、１〜１０（例えば６〜１０）残基ほど少ないか、５残基ほど少ないか、４残基、３残基、２残基または１アミノ酸残基ほど少ないアミノ酸残基で、天然のポリペプチドから異なり得る。
【００６０】
ＩＬ−２活性を有するポリペプチドの正確な化学構造は、因子の数に依存する。イオン化アミノおよびカルボキシル基が分子内に存在する場合、特定のポリペプチドが、酸性塩もしくは塩基性塩、または中性形態で得られ得る。適切な環境条件におかれた場合その生物学的活性を有する、全てのこのような調製物は、本明細書中で使用される場合、ＩＬ−２活性を有するポリペプチドの定義に含まれる。さらに、ポリペプチドの第一級アミノ酸配列は、糖（ｓｕｇａｒ）部分を用いた誘導体化（グリコシル化）または他の追加の分子（例えば、脂質、リン酸基、アセチル基など）による誘導体化によって、強化され得る。また、糖類（ｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）との結合によっても強化され得る。このような強化の特定の局面は、産生する宿主の転写後修飾系を通して達成される；他のこのような修飾は、インビトロで導入され得る。任意の事象において、このような修飾は、ポリペプチドのＩＬ−２活性が破壊されない限り、本明細書中で使用されるＩＬ−２ポリペプチドの定義に含まれる。このような修飾は、種々のアッセイにおいて、ポリペプチドの活性の増強または漸減のどちらかによって、定量的または定性的に活性に影響し得ることが、予測される。さらに、鎖内の個々のアミノ酸残基は、酸化、還元または他の誘導体化により修飾され得、そしてポリペプチドは、切断されて、活性を保持するフラグメントが得られる。活性を破壊しないこのような変更は、本明細書中で使用される場合、目的のＩＬ−２ポリペプチドの定義からポリペプチド配列を除去しない。
【００６１】
当該技術は、ポリペプチド改変体の調製および使用に関する実質的な手引きを提供する。ＩＬ−２ムテインの調製において、当業者は、天然タンパク質ヌクレオチドまたはアミノ酸配列へのどの改変が、本発明の方法において使用される薬学的組成物の治療的に活性な構成成分としての使用に適した改変体を生じるかを、容易に決定し得る。
【００６２】
本発明の方法における使用のためのＩＬ−２ムテインは、任意の供給源由来であり得るが、好ましくは、組み換え的に作製される。「組換えＩＬ−２」または「組換えＩＬ−２ムテイン」は、天然のＩＬ−２と同等の生物学的活性を有し、かつ、例えば、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ  ３０２：３０５−３１０およびＤｅｖｏｓ（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：４３０７−４３２３によって記載されるような組換えＤＮＡ技術によって調製されているか、またはＷａｎｇら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：１４３１−１４３３によって記載されるように変異的に変更されている、インターロイキン−２またはその改変体を意図する。一般に、問題のＩＬ−２をコードする遺伝子は、クローニングされ、次いで、形質転換された生物（好ましくは、微生物）において発現される。宿主生物は、発現条件下で外来性遺伝子を発現し、ＩＬ−２ムテインを産生する。ＩＬ−２の細胞からの増殖、回収、破壊または抽出の過程は、例えば、米国特許第４，６０４，３７７号、同第４，７３８，９２７号、同第４，６５６，１３２号、同第４，５６９，７９０号、同第４，７４８，２３４号、同第４，５３０，７８７号、同第４，５７２，７９８号、同第４，７４８，２３４号、同第および４，９３１，５４３号において、実質的に記載される。
【００６３】
ＩＬ−２ムテインの例としては、欧州特許第１３６，４８９号（天然に存在するＩＬ−２のアミノ酸配列における１以上の以下の変更：Ａｓｎ２６からＧｌｎ２６へ；Ｔｒｐ１２１からＰｈｅ１２１へ；Ｃｙｓ５８からＳｅｒ５８へまたはＡｌａ５８へ、Ｃｙｓ１０５からＳｅｒ１０５へまたはＡｌａ１０５へ；Ｃｙｓｌ２５からＳｅｒｌ２５へまたはＡｌａｌ２５へ；Ａｒｇ１２０より後の全ての残基の欠失；およびそのＭｅｔ−１形態を開示する）を参照；ならびに、１９８３年１０月１３日出願の欧州特許出願第８３３０６２２１．９号（公開番号第１０９，７４８号で１９８４年５月３０日に発行）（ベルギー特許第８９３，０１６号および共有に係る米国特許第４，５１８，５８４号に相当する）に記載される組換えＩＬ−２ムテイン（天然ヒトＩＬ−２に従う番号付けで位置１２５のシステインが欠失しているかまたは中性アミノ酸と置換されている組換えヒトＩＬ−２ムテイン、アラニン−ｓｅｒ１２５−ＩＬ−２およびｄｅｓ−アラニン−ｓｅｒ１２５−ＩＬ−２を開示する）を参照。また、以下のＩＬ−２ムテイン：
【００６４】
【数２】
2007527242.tif 000004
を開示する米国特許第４，７５２，５８５号、および米国特許第４，９３１，５４３号（ｄｅｓ−アラニン−１、セリン−１２５ヒトＩＬ−２、および他のＩＬ−２ムテインを開示する）も参照。
【００６５】
位置１０４のメチオニンが保存的アミノ酸と置換されている、組換えＩＬ−２ムテインを開示する欧州特許公報第２００，２８０号（１９８６年１２月１０日発行）もまた、参照。例としては、以下のムテインが挙げられる：
【００６６】
【数３】
2007527242.tif 000005
天然分子として見出された、Ｎ末端アミノ酸としてメチオニンの代わりにアラニンを有する未グリコシル化ヒトＩＬ−２ムテイン；最初のメチオニンが欠失した（プロリンがＮ末端アミノ酸である）未グリコシル化ヒトＩＬ−２；およびＮ末端アミノ酸メチオニンとアミノ酸プロリンとの間にアラニンが挿入されているアミノ酸未グリコシル化ヒトＩＬ−２を開示する、欧州特許公報第１１８，６１７号および米国特許第５，７００，９１３号もまた、参照。
【００６７】
他のＩＬ−２ムテインとしては、国際公開第９９／６０１２８号に開示されるＩＬ−２ムテイン（位置２０のアスパラギン酸とヒスチジンまたはロイシンとの置換、位置８８のアスパラギン酸とアルギニン、グリシンまたはイソロイシンとの置換、または位置１２６のグルタミンとロイシンまたはグルタミン酸との置換）、これは、ＮＫ細胞よりも優先してＴ細胞レセプターを発現する細胞によって発現される高親和性ＩＬ−２レセプターについての選択的な活性、および低減されたＩＬ−２毒性を有することが報告されている；米国特許第５，２２９，１０９号に開示されるムテイン（位置３８のアルギニンとリジンとの置換、または位置４２のフェニルアラニンとリジンとの置換）、これは、天然ＩＬ−２と比較して高親和性ＩＬ−２レセプターへの低減された結合を示す一方、刺激されたＬＡＫ細胞に対する能力を維持する；国際公開第００／５８４５６号に開示されるムテイン（天然ＩＬ−２中の天然に存在する（ｘ）Ｄ（ｙ）配列の変更または欠失であって、ここで、Ｄはアスパラギン酸であり、（ｘ）はロイシン、イソロイシン、グリシンまたはバリンであり、そして（ｙ）はバリン、ロイシンまたはセリンである）；国際公開第００／０４０４８号に開示されるＩＬ−２  ｐｌ−３０ペプチド（ＩＬ−２の最初の３０アミノ酸に対応、ＩＬ−２のα−ヘリックスＡ全体を含み、ＩＬ−２レセプターのｂ鎖と相互作用する）；同様に国際公開第００／０４０４８号に開示されるＩＬ−２  ｐｌ−３０ペプチドの変異形態（位置２０のアスパラギン酸とリジンでの置換）が、挙げられる。
【００６８】
予測される低減した毒性を有するＩＬ−２ムテインのさらなる例は、米国仮特許出願第６０／５５０，８６８号（２００４年３月５日出願）に開示される。これらのムテインは、成熟ヒトＩＬ−２配列の位置１２５においてシステインと置換されたセリン、および成熟ヒトアミノ酸配列内の少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換を有する成熟ヒトＩＬ−２のアミノ酸配列を含み、これにより、このムテインは、以下の機能特性を有する：比較可能なアッセイ条件下で、類似の量のｄｅｓ−アラニン−１、Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２と比較した場合に、（１）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を維持するかまたは増強する、そして（２）ＮＫ細胞による炎症促進性サイトカイン産生のレベルの低下を誘導する。いくつかの実施形態において、このさらなる置換は、以下からなる群から選択される：
【００６９】
【数４】
2007527242.tif 000006
ここで、アミノ酸残基位置は、成熟ヒトＩＬ−２アミノ酸配列の番号付けに関連する。他の実施形態において、これらのムテインは、成熟ヒトＩＬ−２配列の位置１２５においてシステインと置換されたアラニン、および成熟ヒトアミノ酸配列内の少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換を有する成熟ヒトＩＬ−２のアミノ酸配列を含み、これにより、このムテインは、上記の同じ機能特性を有する。いくつかの実施形態において、この更なる置換は、以下からなる群から選択される：
【００７０】
【数５】
2007527242.tif 000007
ここで、アミノ酸残基位置は、成熟ヒトＩＬ−２アミノ酸配列の番号付けに関連する。代替の実施形態において、これらのムテインは、成熟ヒトアミノ酸配列内の少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換を有する成熟ヒトＩＬ−２のアミノ酸配列を含み、これにより、このムテインは、上記の同じ機能特性を有する。いくつかの実施形態において、この更なる置換は、以下からなる群から選択される：
【００７１】
【数６】
2007527242.tif 000008
ここで、アミノ酸残基位置は、成熟ヒトＩＬ−２アミノ酸配列の番号付けに関連する。米国仮特許出願第６０／５５０，８６８号に開示されるさらなるムテインは、成熟ヒトＩＬ−２配列の位置１における最初のアラニン残基の欠失を有するほかは、上で定められたムテインを含む。
【００７２】
ＩＬ−２ムテインはまた、第２のタンパク質と融合しているか、またはポリプロリンもしくは水溶性ポリマーと共有結合し、服用回数を減らすかまたはＩＬ−２耐容性を改善するＩＬ−２を含む、ＩＬ−２融合体またはＩＬ−２結合体であり得る。例えば、ＩＬ−２ムテインは、ヒトアルブミンまたはアルブミンフラグメントと、当該分野で公知の方法（国際公開第０１／７９２５８号を参照）を用いて融合され得る。あるいは、ＩＬ−２ムテインは、当該分野に公知の技術（例えば、米国特許第４，７６６，１０６号、同第５，２０６，３４４号および同第４，８９４，２２６号を参照）を用いて、ポリプロリンと共有結合し得るか、またはポリエチレングリコールホモポリマーおよびポリオキシエチル化（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌａｔｅｄ）ポリオールと共有結合し得、ここで、このホモポリマーは、一端でアルキル基と置換されるかまたは置換されず、そしてポリオール（ｐｏｐｌｙｏｌ）は置換されない。
【００７３】
本発明のアッセイ方法は、他の治療剤（他の免疫治療剤、サイトカインムテインおよびリンホカインムテイン、ならびに免疫毒素および低分子化学治療剤）を試験するためにも、また有用である。このような薬剤としては、非限定で、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１２およびこれらのムテインを含む）；インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γおよびこれらのムテインであるが、これらに限定されない）；ＧＭ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのムテイン；腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βならびにこれらの分子のムテイン）；抗ガングリオシド抗体、シクロスポリンＡ、シクロホスファミド、マイトマイシンＣ、ＦＫ９７３、モノクロタリンピロールおよびシステインアラビノシド、ならびにこれらの分子のムテイン；ならびに種々の免疫毒素が挙げられる。
【実施例】
【００７４】
（ＩＩＩ．実施例）
以下は、本発明の実施のための特定の実施形態の例である。これらの例は、例示的な目
的のみで提供され、本発明の範囲を限定することを決して意図しない。
【００７５】
使用された数字（例えば、量、温度など）に関して、精度を確実にする努力がなされているが、何らかの実験的エラーおよび逸脱は、無論許されるべきである。
【００７６】
（材料および方法）
（Ａ．培地および試薬）
・ＰＢＳ（Ｃａ／Ｍｇ非含有）、氷冷；
・培地２００（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）；
・培地２００ＰＲＦ（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）；
・ＬＳＧＳ：低血清増殖補強（５０×）。（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）。補充培地の構成成分の終濃度は、以下のとおりであった：ウシ胎仔血清、２％  ｖ／ｖ；ヒドロコルチゾン、１μｇ／ｍｌ；ヒト上皮増殖因子、１０ｎｇ／ｍｌ；塩基性線維芽細胞増殖因子、３ｎｇ／ｍｌおよびヘパリン、１０μｇ／ｍｌ；
・ＰＳＡ溶液（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）：完全培地の終濃度は、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢを含んだ；
・トリプシン（０．２５％）／ＥＤＴＡ（０．１％）（Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）；
・ＦＩＴＣ−アルブミン（５０ｍｇ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；
・ＦＩＴＣ−ＢＳＡストック溶液（２０×）。ＦＩＴＣ−ＢＳＡを、２．５ｍｌの完全培地２００に懸濁した。
【００７７】
・ヒトＡＢ血清（ＳｅｒａＣａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏｃｅａｎｓｉｄｅ，ＣＡ）
・ヒトＡＢ培地（５００ｍＬ）
ＲＰＭＩ（フェノールレッド非含有）・・・・・・・４２６．５ｍｌ
ヒトＡＢ−熱不活性化＊・・・・・・・・・・・・・・・・５０ｍｌ
Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（終濃度１００ｇ／ｍｌ）・・・・・・・５ｍｌ
ＨＥＰＥＳ（１Ｍストック溶液、最終２５ｍＭ）・・・１２．５ｍｌ
Ｌ−グルタミン（１００×ストック溶液、最終２ｍＭ）・・・５ｍｌ
ファンギゾン（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）（２５０μｇ／ｍｌストック溶液、最終０．５μｇ／ｍｌ）・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１ｍｌ
４℃で４週間までの保存培地
＊血清を４℃で一晩解凍し、５６℃で４５分間、熱不活性化する
・ＲＰＭＩ：氷冷、血清非含有
・ＰＢＳ／ＥＤＴＡ：５．７ｍｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡを５００ｍｌのＰＢＳ（Ｃａ／Ｍｇ非含有）に加えた、最終ｐＨ７．２；
・トリパンブルー染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，または同等の０．４％溶液）；
・１０％サポニンストック溶液：２５ｍｌＰＢＳ中２．５ｇサポニン、４℃で保存；
・完全培地２００
培地２００／培地２００ＰＲＦ・・・５００ｍｌ
ＬＳＧＳ・・・・・・・・・・・・・・１０ｍｌ
ＰＳＡ溶液・・・・・・・・・・・・・・１ｍｌ。
【００７８】
（Ｂ．細胞培養：）
ＨＵＶＥＣ（ヒト臍静脈内皮細胞）を、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲから得た。各バイアルは、５×１０５細胞以上を含んだ。バイアルを、３７℃の水に浸すことによって解凍した。細胞を、完全培地２００を用いて１０ｍｌまで希釈し、そしてｍｌあたりの生存細胞数を、トリパンブルー計数を用いて決定した。次いで、完全培地２００を用い、バイアルの内容物を、１．２５×１０４生存細胞／ｍｌまで希釈した。５ｍｌまたは１５ｍｌの細胞懸濁液を、それぞれ２５ｃｍ２または７５ｃｍ２フラスコに入れ、そしてこの培地を、フラスコ内で回して、細胞を分散させた。培養物を、加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にてインキュベートした。２４〜３６時間後およびその後毎日、培地を新しい補充培地２００と交換し、培養物が約８０％コンフルエントになるまで行った。これには、約５〜６日かかった。
【００７９】
次いで、ＨＵＶＥＣを、以下のように継代培養した。培養培地を除去し、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液をフラスコに加え、細胞をタッピングによってはがし、そしてアスピレーションして、完全培地２００を加えて細胞を無菌の１５ｍｌ円錐チューブに移した。細胞を、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、計数し、そして２．５×１０３生存細胞／ｃｍ２で播種した。
【００８０】
細胞を、２代または３代の継代の間、冷凍培地（９０％  ＦＢＳ、１０％  ＤＭＳＯ）中で凍結保存し、液体窒素中で将来の使用のために保管した。
【００８１】
（実施例１）
（ＩＬ−２ムテインをスクリーニングするためのインビトロアッセイ）
ＩＬ−２ムテインの患者耐容性を予測する能力を試験するために、以下のアッセイを行った。改善された耐容性を有する２種のＩＬ−２ムテインを、原理の証明のためにこのアッセイにおいて使用した。これらのムテインは、Ｆ４２Ｅ置換変異体およびＹ１０７Ｒ置換変異体であった。共有に係る同時継続中の米国仮特許出願第６０／５５０，８６８号（２００４年３月５日出願）を参照。これらのムテインは、ＮＫ細胞増殖およびＴ細胞増殖、ならびにＮＫ／ＬＡＫ／ＡＤＣＣ活性に関して、インビトロモデルおよびインビボモデルにおいてエフェクター機能を有する。さらに、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標），Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡを、ＶＬＳを引き起こし得る代表的ＩＬ−２分子として使用した。この処方物中のＩＬ−２は、組換え的に作製された、未グリコシル化ヒトＩＬ−２ムテイン（ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎと呼ばれる）であり、これは、最初のアラニン残基の欠失および位置１２５でのシステイン残基のセリンによる置換により、天然のＩＬ−２アミノ酸配列と異なっている（ｄｅｓ−アラニン−１、セリン−１２５ヒトインターロイキン−２と呼ばれる）。このＩＬ−２ムテインは、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現され、そしてその後、ダイアフィルトレーションおよび陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製される（米国特許第４，９３１，５４３号に記載の通りである）。Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）として市販されるこのＩＬ−２処方物は、無菌の、白〜オフホワイトの保存料非含有の、バイアル中凍結乾燥粉末であり、１．３ｇのこのタンパク質を含む（２２ＭＩＵ）。
【００８２】
このアッセイにおいて使用するためのリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞を、以下のように調製した。全血を、正常なドナーから集め、そしてＶａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＣＰＴチューブ（ＡＣＤＡ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）内に置いた。ＰＢＭＣを、ＣＰＴ製造業者説明書にしたがって分離した。簡潔には、チューブを、ひっくり返して混合し、１５００〜１８００×ｇで２０分間遠心分離して、軟膜を除去し、円錐バイアル内に入れて、ＰＢＳ  ２％  ＦＢＳで洗浄した（最大３００×ｇ、１５分間）。上清を除去し、そして細胞を２回洗浄した。ＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ−１０ＡＢ培地内に懸濁し、そしてトリパンブルー色素排除により、血球計を用いて計数した。ＰＢＭＣを、１．５×１０６細胞／ｍｌでＲＰＭＩ−１０ＡＢ（フェノールレッド非含有）中に懸濁した。１ｍｌのＰＢＭＣ懸濁液を、２４ウェル組織培養プレートの各ウェルに添加し、３７℃の、５０ｎｍの所望のＩＬ−２ムテインを含むＲＰＭＩ−１０ＡＢ培地１ｍｌ／ウェルもまた、加えた。プレートをカバーし、そして、加湿した３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーター内で３日間インキュベートし、その後、このプレートを氷上に約３０分間置いた。上清を除去し、そして３００×ｇ、４℃で５分間遠心分離して、５０ｍｌの円錐チューブ中で氷上に保存した。１ｍｌの氷冷ＰＢＳ／ＥＤＴＡを各ウェルに加え、そして２０分間インキュベートした。接着性の細胞を除去し、そして氷上のチューブに加えた。１ｍｌの冷ＰＢＳを、各ウェルに加えた。５０ｍｌの円錐チューブを５分間、３００×ｇ、４℃で遠心分離した。その間、ウェルを洗浄し、そして洗浄液を、氷上の５０ｍｌ円錐チューブに入れた。上清をデカントし、細胞ペレットを１２ｍｌの冷ＲＰＭＩ中に懸濁し、そしてＰＢＳ洗浄液に加えた。これを再び５分間、３００×ｇ、４℃で遠心分離した。上清を、再びデカントし、そして上のように細胞ペレットを懸濁して、遠心分離した。洗浄した細胞を、冷完全ＲＰＭＩ中に懸濁し、そしてトリパンブルー排除によって計数した。
【００８３】
６００μｌの完全培地２００ＰＲＦを、コラーゲンコーティングしたｔｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ−ＣＯＬＴＭ、コラーゲンコーティングＰＴＦＥ膜、Ｃｏｓｔａｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｍｉｎｇ，ＮＹ））の下側チャンバに加え、、ＨＵＶＥＣ（上述のように５回未満継代したもの）を、フラスコから取り出して、１．０×１０６細胞／ｍｌで完全培地２００ＲＰＦ中に懸濁した。１００μｌのＨＵＶＥＣ懸濁液を、ｔｒａｎｓｗｅｌｌの上側チャンバに加えた。培地を加えたが細胞を加えていないコントロールのｔｒａｎｓｗｅｌｌもまた、コラーゲン膜を横切るＦＩＴＣ−ＢＳＡの最大移動を測定するために配置した。ｔｒａｎｓｗｅｌｌを、加湿した５％  ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で３日間インキュベートし、コンフルエントな単層を確立した。４日目に、単層をクリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；２．３％  ｗ／ｖ、シュウ酸アンモニウム  ０．１％  ｗ／ｖ、エチルアルコール、ＳＤ３Ａ  ２０％  ｖ／ｖ）で染色して、コンフルエンスを確かめた。単層が９０％コンフルエントになったら、アッセイを進めた。
【００８４】
完全培地２００を、ｔｒａｎｓｗｅｌｌの上側チャンバから完全に除去し、そしてＦＩＴＣ−ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）含有１００μｌ完全培地２００を、試験ｔｒａｎｓｗｅｌｌおよびコントロールｔｒａｎｓｗｅｌｌの両方に加えた。プレートを、アルミニウム箔でカバーし、そして１０μｌのサンプルをｔｒａｎｓｗｅｌｌの下側チャンバから取り出して透明な底の黒色９６ウェルプレートに入れることにより、３０分間サンプリングした。次いで、１０μｌの完全培地を下側チャンバに加えた。４０μｌの完全培地２００を、黒色９６ウェルプレートに加え、そして混合した。サンプルを、ＩＬ−２ムテイン−フルオレセイン（４８５／５７５ｎｍ、１．０秒）を用いて測定した。ｔｒａｎｓｗｅｌｌを、蛍光強度読み出しに基づいて再配分した（９０％以上のコンフルエントな単層につき、６０００未満でなければならない）。３時間のインキュベーションの後、プレートを、上述のように、再びサンプリングし、そして測定した。３時間の強度読み出しを、基線または時間０と考えた。
【００８５】
ＦＩＴＣ−ＢＳＡを、上側チャンバから除去し、そしてＦＩＴＣ−ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）含有の１００μｌの試験化合物を上側チャンバに加えた：（１）ＩＬ−２ムテインＦ４２Ｅ、Ｙ１０７ＲまたはＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）（２５  ｎＭ）；（２）３日間２５ｎＭ  ＩＬ−２−ムテイン刺激ＰＢＭＣ上清；（３）３日間２５ｎＭ  ＩＬ−２−ムテイン刺激ＬＡＫ細胞；および（４）上清中３日間２５ｎＭ  ＩＬ−２−ムテイン刺激ＬＡＫ細胞。さらに、サポニンは単層を破壊するので、０．０５％サポニンをポジティブコントロールとして使用し、そして完全培地２００を培地コントロールとして使用した。このプレートを、アルミニウム箔でカバーし、そして３７℃でインキュベートした。サンプルを、３時間および２２時間のインキュベーション後に試験化合物について得、そして蛍光測定を上述のように行った。
【００８６】
結果を、図１〜図４に示す。図に示したデータは、３回の独立した実験からのデータであり、ｎ＝５または６／試験条件であり、３人の異なる正常なヒトドナーに由来する。図１Ａ〜図１Ｃに見られるように、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）刺激ＰＢＭＣ（ＬＡＫ）および上清は、内皮細胞単層に、有意な損傷をもたらした。試験した３人のドナーのうちの２人において、Ｆ４２ＥおよびＹ１０７Ｒムテインは、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）と比較し、有意に低いＶＬＳを示した。図２Ａ〜図２Ｃに示すように、試験した３人のドナーのうち２人は、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）誘導ＬＡＫ細胞のみが、培地コントロールサンプルを超える有意に高いＶＬＳを示したが、培地コントロールとＦ４２ＥまたはＹ１０７Ｒとの間に有意差は観察されなかった。図３Ａ〜図３Ｃにおいて見られるように、ＩＬ−２誘導ＰＢＭＣからの培養上清のみは、インビトロで、ＶＬＳ症候群の有意な誘導に十分ではなかった。図４Ａ〜図４Ｃにおいて示されるように、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）またはＦ４２ＥのみおよびＹ１０７Ｒのみのどちらも、ＥＣ単層への損傷を直接的に誘導しなかった。図１〜図４に示すように、Ｆ４２ＥのみおよびＹ１０７Ｒのみ、Ｆ４２Ｅ刺激上清およびＹ１０７Ｒ刺激上清、Ｆ４２Ｅ刺激ＬＡＫ細胞およびＹ１０７Ｒ刺激ＬＡＫ細胞と、培地コントロールとの間に、有意差はなかった。
【００８７】
従って、内皮細胞のコンフルエントな単層を横切るＦＩＴＣ−ＢＳＡの透過率を測定するＶＬＳのインビトロモデルは、妥当であり、かつ一貫性がある。
【００８８】
従って、ＩＬ−２ムテインへの患者の耐容性を予測するための、新規のインビトロ試験系が、開示される。本発明の好ましい実施形態は、ある程度詳細に記載されているが、特許請求の範囲で記載するように、明らかなバリエーションが、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが、理解される。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１Ａ〜図１Ｃは、それぞれ、３人の異なった被験体由来の刺激を受けた培養物からの上清の存在下で、２５ｎＭ  ＩＬ−２ムテイン刺激ＬＡＫ細胞を用いて行った実験の結果を示す。蛍光強度は、ＬＡＫ細胞および上清との２２時間のインキュベーション後の、ＨＵＶＥＣ単層を横切るＦＩＴＣ−ＢＳＡの移動の尺度として使用される。＊：対培地コントロールのＰ値＜０．１、ｔ検定：平均について２組のサンプル（ｎ＝５）；＄：対Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）のＰ値＜０．１、ｔ検定：平均について２組のサンプル（ｎ＝５）；＆：対Ｆ４２ＥのＰ値＜０．１、ｔ検定：平均について２組のサンプル（ｎ＝５）；＠：対ｒＩＬ−２のＰ値＜０．１、ｔ検定：平均について２組のサンプル（ｎ＝５）。
【図２】図２Ａ〜図２Ｃは、それぞれ、３人の異なった被験体由来の２５ｎＭ  ＩＬ−２ムテイン刺激ＬＡＫ細胞を用いて行った実験の結果を示す。蛍光強度は、上清なしで、ＬＡＫ細胞との２２時間のインキュベーション後の、ＨＵＶＥＣ単層を横切るＦＩＴＣ−ＢＳＡの移動の尺度として使用される。＊：対培地コントロールのＰ値＜０．１、ｔ検定：平均について２組のサンプル（ｎ＝５）；＄：対Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）のＰ値＜０．１、ｔ検定：平均について２組のサンプル（ｎ＝５）；＆：対Ｆ４２ＥのＰ値＜０．１、ｔ検定：平均について２組のサンプル（ｎ＝５）；＠：対ｒＩＬ−２のＰ値＜０．１、ｔ検定：平均について２組のサンプル（ｎ＝５）。
【図３】図３Ａ〜図３Ｃは、それぞれ、３人の異なった被験体由来の２５ｎＭ  ＩＬ−２ムテイン刺激ＬＡＫ細胞からの上清を用いて行った実験の結果を示す。蛍光強度は、上清との２２時間のインキュベーション後の、ＨＵＶＥＣ単層を横切るＦＩＴＣ−ＢＳＡの移動の尺度として使用される。＊：対培地コントロールのＰ値＜０．１、ｔ検定：平均について２組のサンプル（ｎ＝５）；＄：対Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）のＰ値＜０．１、ｔ検定：平均について２組のサンプル（ｎ＝５）；＆：対Ｆ４２ＥのＰ値＜０．１、ｔ検定：平均について２組のサンプル（ｎ＝５）；＠：対ｒＩＬ−２のＰ値＜０．１、ｔ検定：平均について２組のサンプル（ｎ＝５）。
【図４】図４Ａ〜図４Ｃは、２５ｎＭ  ＩＬ−２ムテインを用いて行った３回の独立した実験の結果を示す。蛍光強度は、ＩＬ−２との２２時間のインキュベーション後の、ＨＵＶＥＣ単層を横切るＦＩＴＣ−ＢＳＡの移動の尺度として使用される。＊：対培地コントロールのＰ値＜０．１、ｔ検定：平均について２組のサンプル（ｎ＝５）；＄：対Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）のＰ値＜０．１、ｔ検定：平均について２組のサンプル（ｎ＝５）；＆：対Ｆ４２ＥのＰ値＜０．１、ｔ検定：平均について２組のサンプル（ｎ＝５）；＠：対ｒＩＬ−２のＰ値＜０．１、ｔ検定：平均について２組のサンプル（ｎ＝５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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