(57)【要約】  本発明は、現在入手可能な方法と比較して、出血状態に対するより迅速且つ有効な保護を供するために、又は非出血期におけるこのような患者のより有効な保護を供するために、第VIII因子欠乏を伴う患者に対してブタＢドメイン欠損第VIII因子（ＯＢＩ−１）を投与する方法を供する。本発明は、組換えブタＢドメイン欠損ｆVIII、ＯＢＩ−１と称される、がブタ血漿から部分的に精製された天然ブタｆVIII、ＨＹＡＴＥ：Ｃと称される、と比較して、高い生物学的利用能を有することの発見に基づく。このように本発明の方法は、ｆVIII欠乏を伴う患者において同等の保護を供するために、ＨＹＡＴＥ：Ｃと比較してより低い単位用量のＯＢＩ−１を使用し、あるいはＨＹＡＴＥ：Ｃと比較してより長い投与間隔を有する。本発明は更に、医薬的に許容される担体との組み合わせにおけるＯＢＩ−１を含んで成り、ｆVIIIを必要な患者をより有効に治療するために有用である、医薬組成物及びキットを供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第VIII因子欠乏を伴う患者に対してブタＢドメイン欠損第VIII因子（ＯＢＩ−１）を投与する方法であって、ここでブタＢドメイン欠損第VIII因子が、上記患者において治療的に有効なレベルの第VIII因子を達成し且つ維持するために十分な頻度において、上記患者に適当ないずれかの抗体の中和用量以上の約１０〜１００ユニット／ｋｇ体重において、生理的に許容される担体と組み合わせて上記患者に対して静脈内投与される方法。
【請求項２】
ＯＢＩ−１の用量が、前記患者の体重のｋｇあたり約１０〜５０ユニットである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＯＢＩ−１の用量が、前記患者の体重のｋｇあたり約１５ユニットである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
患者が出血状態である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
患者が非出血状態であり、そしてＯＢＩ−１が１日あたり１回以下の頻度において投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
第VIII因子欠乏を伴う患者に対してブタＢドメイン欠損第VIII因子（ＯＢＩ−１）を投与する方法であって、ここでブタＢドメイン欠損第VIII因子が、２日間で４回以下の投与において、上記患者に適当ないずれかの抗体の中和用量以上の約１０〜１００ユニット／ｋｇ体重において、生理的に許容される担体と組み合わせて投与される方法。
【請求項７】
患者が出血状態である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＯＢＩ−１が１日あたり２回以下の投与頻度において投与される、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
第VIII因子欠乏を伴う患者における血液凝固時間を減少させる方法であって、患者の血液凝固時間を減少するために十分な量において、ブタＢドメイン欠損第VIII因子（ＯＢＩ−１）及び生理的に許容される担体を含んで成る組成物を患者に投与することを含んで成り、ここで患者の血液凝固時間を減少するために十分なＯＢＩ−１の量が、ブタＢドメイン欠損第VIII因子（ＯＢＩ−１）を投与した場合に得られる血液凝固時間の同じ減少を達成するために十分な血漿由来ブタ第VIII因子の量の１／２〜１／１０である、方法。
【請求項１０】
血漿由来ブタｆVIIIがＨＹＡＴＥ：Ｃである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
患者の血液凝固時間を所望の値に減少するブタＢドメイン欠損ｆVIII（ＯＢＩ−１）の第一投与後に患者の血液凝固時間を所望値に減少するブタＢドメイン欠損ｆVIII（ＯＢＩ−１）の第二投与を行い、このような時間間隔において患者の血液凝固時間が上記所望値又はその付近において減少したままであり、そして上記時間間隔が、同じ用量のブタ血漿由来ｆVIIIの投与により上記所望値を維持できるような対応する時間間隔よりも少なくとも２倍長い、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ブタ血漿由来ｆVIIIがＨＹＡＴＥ：Ｃである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
生理的に許容される担体との組み合わせにおいてブタＢドメイン欠損ｆVIII（ＯＢＩ−１）を投与することを含んで成る、ｆVIII欠乏を伴う患者を治療する方法。
【請求項１４】
ブタＢドメイン欠損ｆVIIIが、上記患者において治療的有効レベルの第VIII因子を達成し且つ維持するために十分な頻度において、上記患者に適当ないずれかの抗体中和用量以上の約１０〜１００ユニット／ｋｇ体重の用量において投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＯＢＩ−１の用量が前記患者の体重のｋｇあたり約１０〜５０ユニットである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＯＢＩ−１の用量が前記患者の体重のｋｇあたり約１５ユニットである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ブタＢドメイン欠損ｆVIII（ＯＢＩ−１）をこのような投与が必要な患者に対して投与する方法であって、
ａ）患者から血漿試料を獲得する工程；
ｂ）試料中のｆVIII活性を測定する工程；
ｃ）一定量の血漿試料に、さまざまな量のブタＢドメイン欠損ｆVIII（ＯＢＩ−１）活性を添加する工程；
ｄ）工程ｃ）後の所望の時間において、上記一定分量からのｆVIII活性の回収を測定する工程；
ｅ）工程ｄ）由来のデータを使用し、ＯＢＩ−１に対するいずれかの既存の阻害物質を中和するために十分なブタＢドメイン欠損ｆVIII（ＯＢＩ−１）の用量を計算し、それから所望値により患者の血液凝固時間を減少するための用量を計算する工程；及び
ｆ）患者に対して工程ｅ）において計算した用量を投与する工程、
を含んで成る方法。
【請求項１８】
ＯＢＩ−１、界面活性剤、塩化カルシウム、ショ糖、塩化ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、及び緩衝液を含んで成る、アミノ酸を欠く溶液の凍結乾燥により得ることができる固形医薬組成物であって、当該溶液が凍結乾燥前及び注射用水における再構成後に６〜８のｐＨを有する組成物。
【請求項１９】
界面活性剤がポリソルベートである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
界面活性剤がポリソルベート８０である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
緩衝液がトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミンである、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
ｐＨ範囲が６．５〜７．５である、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項１８〜２２に記載の固形医薬組成物、及び任意的に塩化ナトリウムを含む無菌水を含んで成るキット。
【請求項２４】
患者において治療的有効レベルの第VIII因子を達成し、且つ維持するためのｆVIII欠乏を伴う患者に対する投与のための医薬組成物であって、ここで当該組成物が、５０〜１０，０００ユニット／ｍＬの濃度におけるＯＢＩ−１、及び生理的に許容される担体を含んで成る組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年５月３日に出願された仮出願第６０／５６８，０１５号、及び２００４年５月７日に出願された第６０／５６９，０００号の利益を主張し、これらは共に本明細書に相反しない範囲において本明細書中に組み入れられている。
【背景技術】
【０００２】
血友病Ａは、多様な臨床症状をもたらし、そして最終的に生命を危うくする、血液凝固における欠陥により特徴付けられる疾患である。当該疾患の標準的な治療は、凝固第VIII因子（ｆVIII）の投与であり、血友病Ａの患者において３００ｋＤａの血漿タンパク質が欠損し、あるいは欠乏している。当該治療投与は根底にある疾患を治療しないが、当該症状を寛解させる。従って、患者は生涯にわたりｆVIIIの頻回用量を受けなければならない。ヒトｆVIIIを血友病Ａ患者に対して投与することは有効な治療法であるが、長期間の治療は患者人口に有意に比率した低下した有効性をもたらす。ヒトｆVIIIが血漿由来であるか又は組換え技術により作成されたかに関わらず、約２０〜３５％の血友病Ａ患者はヒトｆVIIIに対する阻害抗体を発生する。ヒトｆVIIIに対する阻害抗体を発生する患者は治療の低下した有効性、及びより長時間の出血症状を経験する。このような患者は、実質的に相同なタンパク質であるブタｆVIIIにより成功的に治療されている。ブタｆVIIIは、しばしば阻害性患者において見られる抗ヒトｆVIII抗体に対して、有意に低い反応性である。ブタのプール血漿から部分的に精製された天然ブタｆVIIIであるＨＹＡＴＥ：Ｃは、長い間商業的に利用されてきた。血漿から精製されたヒト及びブタｆVIIIは共にウイルス又はプリオン粒子由来の汚染の危険性がある。このような危険性は、生涯の治療にわたり頻回の用量を受ける血友病患者に特に懸念される。組換えヒトｆVIII、及び、より近年には組換えブタｆVIIIがこれらのそれぞれの症状に開発されている。より具体的には、大半のＢドメインを欠乏している組換えブタｆVIIIが産生されており、そして現在ブタのプール血漿から精製されたブタｆVIIIに代わるものとして臨床適応のために試験されている［参考例として本明細書中に組み入れられている米国特許第６，４５８，５６３号］。これらの製品に適用される用語は、ＨＴＡＴＥ：Ｃ（ブタのプール血漿から部分的に単離された天然ブタｆVIII）；ＯＢＩ−１（組換えＢドメイン欠損ブタｆVIII）である。ＯＢＩ−１はまた米国特許第６，４５８，５６３号においてＰＯＬ−１２１２と命名されている。ＯＢＩ−１及びＰＯＬ−１２１２の両方の名称は、ＢドメインのＮ末端部分における１２のアミノ酸及びＢドメインのＣ末端部分における１２のアミノ酸以外が欠失したＢドメインを有するブタｆVIIIである、同じ物質を意味する。以前の研究 [Doering, C. B. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 39345-38349] は、ブタｆVIIIのＢドメインは活性を失うことなく欠失できることを記載している。
【０００３】
医薬組成物又は製剤において安定なｆVIIIを供するための多様な方法のいくつかの報告が存在する。これらの製剤を安定化するためにしばしばアルブミンが利用されている。しかしながら、安定化剤としてアルブミンを使用することに関するコスト及びリスクのために、当業界において、いくつかのｆVIIIを含有するアルブミンを含まない医薬組成物が存在する。例えば、米国特許第５，５６５，４２７号は、アミノ酸又はその塩、及び洗浄剤、例えば、ポリソルベート若しくはＴＷＥＥＮ８０、又は有機ポリマー、例えば、ＰＥＧを含むｆVIII組成物を記載し；米国特許第５，６０５，８８４号は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、及びヒスチジンから成る高イオン強度媒体におけるｆVIII組成物を開示し；米国特許第５，７６３，４０１号及び５，８７４，４０８号は、グリシン、ヒスチジン、ショ糖、塩化ナトリウム、及び塩化カルシウムを含む組換えｆVIII組成物を開示する。更に、多様な塩、非イオン性界面活性剤、及び抗酸化剤を有するｆVIII組成物の例が存在する（米国特許第5，９６２，６５０号，米国特許第５，９７２，８８５号，ＷＯ８９／０９７８４，及びＷＯ９４／０７５１０）。ＷＯ０３／０８０１０８は、ｆVIII、界面活性剤、塩化カルシウム、ショ糖、塩化ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、及び緩衝液を含み、そして凍結乾燥前及び注射用水中の再構成後にｐＨ６〜８を有する、アミノ酸を欠く安定な固形医薬組成物を記載する。
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
本発明は、ＨＹＡＴＥ：Ｃと比較してＯＢＩ−１が２〜６倍高い生物学的利用能を有するという驚くべき実験的発見に関する。生物学的利用能とは、与えられた用量の投与後に達成され且つ維持される血中濃度を意味する。生物学的利用能は、与えられた用量の投与後の時間の関数としてプロットされた血中濃度の曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することにより評価することができる。結果的に、ＨＹＡＴＥ：Ｃと比較して、ＯＢＩ−１は重篤な出血症状に対する同様の保護を供するために、あるいは非出血状態における血友病患者の出血症状の予防において、ユニット／ｋｇ体重において表現される、実質的により低い用量において投与することができる。あるいは、ＯＢＩ−１は、ＨＹＡＴＥ：Ｃと同量又は近似量において供することができるが、ＨＹＡＴＥ：Ｃと比較して投与回数を減らすことができ、より迅速な出血制御をもたらし、複数回投与に関する不便性を減らす。ＯＢＩ−１がユニット／ｍｌにおいてＨＹＡＴＥ：Ｃより高濃度で利用できるという事実と併せて、当該発見は、患者の福祉及び生活の質により有利である新規な投与方法を供する。ＨＹＡＴＥ：Ｃ（１００ユニット／ｋｇ体重）による現在の治療は、典型的には、６〜８時間ごとに反復して、１分あたり２〜５ｍｌの割合において、２８０ｍｌのＨＹＡＴＥ：Ｃ溶液の静脈内注入が必要とされる。このような治療は面倒であり、２時間以上かかる場合があり、そして患者の移動及び生活の質を極度に制限する。これに対して、本発明においては、ＯＢＩ−１は、約１０〜１００ユニット／ｋｇ体重、例えば、１４ｍｌの１回の静脈内注射として投与することができ、添付文書に従い一度の出血症状を停止するために２日間にわたり８回の分離投与の薬を摂取するＨＹＡＴＥ：Ｃに対して、出血を停止するために、投与するのにたった５〜１５分で済み、且つ１〜４回だけでよい。このような治療が必要な血友病患者が、ＯＢＩ−１と有意に交差反応するヒトｆVIIIに対する既存の阻害抗体を有する場合、当該抗体を中和するために本明細書中に与えられた投与量を超えるＯＢＩ−１が必要である。ＯＢＩ−１を使用する場合にはより高いｆVIIIレベルがより迅速に達成できるために、出血の制御が促進される。以下に議論するとおり、個々に投与される実際の用量は、いくつかの個々の因子、例えば、体重、血漿容量、及びＯＢＩ−１に対する残留抗体価に依存する。個々の投与量の計算方法は、ＨＹＡＴＥ：Ｃでの研究により良く確立されている。ＯＢＩ−１投与量の計算方法は、更に、新たに発見されたＯＢＩ−１の生体内における有効性及び生物学的利用能を考慮することが必要である。
【０００５】
本発明はまた、より迅速且つ有効な手段において、ｆVIIIを必要とする患者を治療するために有用なＯＢＩ−１を含む医薬組成物及びキットを供する。
【０００６】
発明の詳細な説明
一般的に、本明細書において使用される語及び語句は、当業界において認識される意味を有し、これらは標準教科書に対する参考文献、学術文献、及び当業者に既知な背景により見出すことができる。本発明の文脈中のこれらの特定の使用を明らかにするために以下の定義が供される。
【０００７】
本明細書に使用される「生理的に許容される担体」の語は、医薬組成物において、本発明の活性成分であるＯＢＩ−１の担体／安定化剤として役立つ有機又は無機組成物である。生理的に許容される担体の例は、制限されることなく、水、リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水、水性溶媒を含み、ここで水は低級アルカノール、植物油、ポリアルキレングリコール、石油関連ゼリー、エチルセルロース、オレイン酸エチル、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリジン、ミリスチン酸イソプロピルと混合される。生理的に許容される担体は、更に、アルブミン、アミノ酸（例えば、グリシン、ヒスチジン、又はこれらの塩）、洗浄剤（イオン性及び非イオン性）、例えば、ポリソルベート又はＴＷＥＥＮ８０、ナトリウム塩、カルシウム塩、及び／又はヒスチジンから成る高イオン強度媒体、モノ−、ジ−、若しくはポリサッカライド（例えば、ショ糖）、又は糖アルコール、及び当業界に既知の他の希釈剤、添加剤、又は担体を含む。多様な担体及び添加剤の詳細な説明は、これらの全体が引用により全て組み入れられている、米国特許第５，９２５，７３９号；米国特許第５，７３３，８７３号；米国特許第５，６０５，８８４号；米国特許第５，５６５，４２７号；米国特許第５，７６３，４０１号；米国特許第５，８７４，４０８号；米国特許第５，９６２，６５０号；米国特許第５，９７２，８８５号；ＷＯ８９／０９７８４及びＷＯ９４／０７５１０を参照のこと。
【０００８】
ＯＢＩ−１を含んで成る医薬組成物は、好ましくはＯＢＩ−１、界面活性剤若しくは洗浄剤、塩化カルシウム、ショ糖、塩化ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、及び緩衝液を含んで成る、アミノ酸を欠く溶液の凍結乾燥により得ることができる固形組成物である。当該溶液は凍結乾燥前及び注射用水における再構成後に６〜８のｐＨを有する。当該界面活性剤は、好ましくは非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート、及びブロックコポリマー、例えば、ポロキサマー（即ち、ポリエチレンとプロピレングリコールのコポリマー）である。より好ましい界面活性剤は、２０〜１００のモノマー単位（好ましくは約８０）の平均重合度を有するポリソルベートである。最も好ましい界面活性剤は、植物に由来するポリソルベート８０である。当該緩衝液は、好ましくはトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン（「トリス」として慣習的に知られている）である。典型的には、当該固形医薬組成物は、５０〜１０，０００ユニット／ｍＬの濃度範囲おけるＯＢＩ−１、臨界ミセル濃度〜１％ｖ／ｖの濃度範囲における界面活性剤、０．５〜１０ｍＭにおける塩化カルシウム、５〜５０ｍＭにおけるショ糖、０．１５〜５００．５Ｍにおける塩化ナトリウム、１〜５０ｍＭにおけるクエン酸三ナトリウム、及び１〜５０ｍＭにおける緩衝液を含む溶液から凍結乾燥により調製される。凍結乾燥前及び注射用水における再構成後の当該医薬組成物のｐＨは、好ましくは約６．５〜７．５、より好ましくは約７．０である。ＯＢＩ−１を含有する固形医薬組成物は、ｆVIIIを必要とする患者に投与する前に、任意的に塩化ナトリウムを含む無菌水で希釈することができる。このような組成物の投与は典型的には静脈内において行われる。投与される組成物の最適用量は、治療する医者によって各患者の疾患の重篤度に基づき決定される。本明細書にその全体における引用として組み入れられている、ＷＯ０３／０８０１０８は、本明細書に記載されるＯＢＩ−１を含んで成る固形医薬組成物の調製方法の詳細な説明を開示する。
【０００９】
「約」の語は、考慮される値の周辺を意味する。本願において使用される「約Ｘ」は、Ｘ−Ｘの１０％〜Ｘ＋Ｘの１０％の間、好ましくはＸ−Ｘの５％〜Ｘ＋Ｘの５％の間を意味する。
【００１０】
本発明に使用される「血液凝固時間の減少」は、ＨＹＡＴＥ：Ｃが投与される場合と比較してＯＢＩ−１が投与される場合のｆVIII欠乏を伴う与えられた患者において生じる血液凝固のための時間の減少した長さ、即ちＯＢＩ−１で治療した患者において生じる血液凝固のための時間の長さとＨＹＡＴＥ：Ｃ投与で治療したものとの差を意味する。
【００１１】
本明細書に使用される「第VIII因子の治療的に有効なレベル又は濃度」は、患者において測定可能な改善又は保護を示すのに十分である（例えば、出血を止めるために）、ＯＢＩ−１の医薬組成物を受けたｆVIII欠乏を伴う患者の血漿中のｆVIIIのレベルを意味する。ｆVIII欠乏を伴う患者は典型的には血友病Ａ患者であるが、「後天性血友病」と診断された対象も含み、先天的血友病でない患者における状態は、彼らのｆVIIIに対する阻害抗体を自然発生的に生じ、重篤なｆVIII欠乏を生じる。一般に、治療的有効レベルは、正常な非血友病Ａの対象において、約１％、好ましくは約１０％、最も好ましくは約２５〜３５％及びそれ以上のｆVIIIレベルであると推定される。正常な非血友病Ａのヒト中のｆVIIIの濃度範囲は、少なくとも２０の正常なドナーに由来する試料血漿プールにおいて見られる５０％〜２００％のｆVIIIの活性として定義される。正常なヒトにおけるｆVIIIのレベルは、多様な生理的及び非生理的刺激に応答して、正常な範囲を介して変動する（TC, "The Diagnostic Approach to the Bleeding Disorders", page 1302, Chapter 48 in Lee GR, Bithell TC, Foerster J, Athens JW and Lukens JN (eds), Wintrobe's Clinical Hematology, ninth edition, 1993, Lea & Febiger, Malvern, PAを参照のこと）。
【００１２】
「ＯＢＩ−１の抗体中和用量」の語句は、ＯＢＩ−１に対して作られる患者の既存の抗体を中和するための投与に必要なＯＢＩ−１の量を表す。ブタｆVIIIに対する血友病Ａ患者の抗体レベルは各個人に異なる。存在する抗ＯＢＩ−１抗体の量は、当業界に既知な標準的方法を使用して抗体価を測定することにより容易に計算することができ、そして当該値から抗体を中和するために必要なＯＢＩ−１の量を推測することができる。各患者の阻害抗体の結合性及び不活性の個々の違いにより、必要とされるＯＢＩ−１の正確な量が推測できるだけであり、投与される正確な量は経験的に決定（又は「滴定される」）されなければならない。
【００１３】
ヒトｆVIII欠乏は、血液凝固形成の工程が全ての脊椎動物に共通し、そしていくつかの種のｆVIIIタンパク質は高い配列相同性を有することが知られていることから、ｆVIII欠乏哺乳類において研究することができる。また、生物学的利用能は非血友病サルにおいて評価することができる。血液量における種の差異、及び基礎ｆVIIIレベル等を考慮した後、動物実験による結果をヒトにおける結果の一般的予想とする。本発明は実験結果から開発され、以下に詳細に説明する。４種類の実験を行った：サル及び血友病イヌにおける生物学的利用能の実験、血友病イヌ及び血友病マウスにおける有効性の実験、ヒト血漿における試験管内活性回収実験、及び６人のヒト対象における生体内生物学的利用能の実験。
【００１４】
生物学的利用能は与えられた用量を投与した後に一定の時間において活性の回収を測定することにより評価した。有効性は血友病イヌにおける角質出血時間 (cuticle bleeding time)（ＣＢＴ）における与えられた用量の効果を測定すること、及び血友病マウスの尾切断出血モデルにおける死亡率により評価した。また、ＯＢＩ−１及びＨＹＡＴＥ：Ｃの回収は各物質をヒト血友病血漿試料及びヒト血友病阻害血漿試料に添加することにより試験管内において測定した。生物学的利用能は更に１００Ｕ／ｋｇの標準用量を投与した後の一定時間において活性の回収を測定することにより６人のヒト対象において評価した。
【００１５】
活性回収（生物学的利用能）の最初の実験において、非血友病サルに、血液中のｆVIIIレベルを上げるためにＯＢＩ−１又はＨＹＡＴＥ：Ｃを静脈内的に与えた。時間における動物の血流中のｆVIII活性及び生産物の残留を測定するために血液試料を定期的に採取した。ＯＢＩ−１の生物学的利用能はＨＹＡＴＥ：Ｃよりも数倍高いことが判明した（表１及び２、並びに図１を参照のこと）。表３及び４に示されるとおり、血友病イヌにおける生物学的利用能の実験において、ＨＹＡＴＥ：ＣとＯＢＩ−１の間に同様の違いが観察された。
【００１６】
１つの有効性実験において、ＯＢＩ−１又はＨＹＡＴＥ：Ｃの用量範囲を使用して、出血時間のために、アシの爪の角質を切った後、血友病イヌを試験した。ｆVIII生産物の有効性を評価するために角質出血時間（ＣＢＴ）を測定した。ＯＢＩ−１及びＨＹＡＴＥ：Ｃは共に非血友病イヌにおいて観察される正常な範囲に向かいＣＢＴを減少させたが、結果は不定であった。以下に示すマウス実験に一致して、比較可能な基礎単位において、ＯＢＩ−１はＨＹＡＴＥ：Ｃの場合よりもＣＢＴの減少においてより有効であるように見えた。
【００１７】
有効性実験は更に、ｆVIII「ノックアウト」マウス（ｆVIIIをコードする遺伝子が不活性化されたマウス）系統で行った。このようなマウスは平凡な損傷後の出血に極めて感受性である。尾の遠位２ｃｍの切断は、大半の血友病マウスにとって２４時間以内に致死的な出血に導くであろう。尾の切断から１５分前に、ＯＢＩ−１又はＨＹＡＴＥ：Ｃの用量範囲を血友病マウスに投与することにより、５０％の死亡率のマウスを保護する用量（ＥＤ50）を推測することが可能となった。ＯＢＩ−１及びＨＹＡＴＥ：Ｃが別々に試験されたこれらの実験において、ＯＢＩ−１のＥＤ50（ユニット  ｋｇ）は、表６及び７において解るように、ＨＹＡＴＥ：Ｃのおよそ１／４であると思われる。
【００１８】
血友病マウス及びイヌを使用する実験において、ＯＢＩ−１とＨＹＡＴＥ：Ｃの比較用量は、標準ｆVIII凝固アッセイに基づきＨＹＡＴＥ：ＣよりもＯＢＩ−１の優れた回収をもたらした。
【００１９】
集積された結果は、ＨＹＡＴＥ：Ｃよりも有意に低い有効量においてＯＢＩ−１を投与できることを示す（これらの活性レベルは標準ｆVIIIアッセイにより測定された）。当業者は、当該有効量は、個々の患者の必要性、例えば、患者の血漿中に存在するｆVIIIの残留レベル、及び中和しなければならない患者の血漿中の阻害抗体レベルに従い較正することができる。
【００２０】
また、ＯＢＩ−１及びＨＹＡＴＥ：Ｃの回収は、これらを１Ｕ／ｍｌの名目上の濃度において阻害物質を伴う血友病患者由来のヒト血漿試料に添加後に試験管内において測定した。ＯＢＩ−１及びＨＹＡＴＥ：Ｃの回収は共に名目上の濃度よりも低く、これは交差反応性の阻害抗体に一部よるものである。しかしながら３５試料中２５において、回収されたＯＢＩ−１活性は回収されたＨＹＡＴＥ：Ｃよりも高く、そして３５試料中１８において、回収されたＯＢＩ−１活性は回収されたＨＹＡＴＥ：Ｃの２倍以上高かった。
【００２１】
更に、実施例６に記載するとおり、生物学的利用能実験を無作為化、二重盲検、ダブルダミー、並行群盲検法において、ＯＢＩ−１に対する阻害抗体が非存在又は最小である６人のヒト対象において行った。表８並びに図３及び４に示されるとおり、１００Ｕ／ｋｇにおいて共に投与した場合、ＯＢＩ−１の生物学的利用能はＨＹＡＴＥ：Ｃよりも極めて高かった。
【００２２】
ＨＹＡＴＥ：Ｃと比較してＯＢＩ−１の実質的高い回収及び生物学的利用能は驚くべきことであり、そしてＯＢＩ−１が組換え生産物であり、ＨＹＡＴＥ：Ｃが血漿由来生産物である事実からは予想することも説明することもできない。実際に、ヒト第IX因子（血友病Ｂの治療に使用される）によって、実際に、血漿由来生産物は組換え由来生産物の約２倍高い回収を示している（０．８６＋／−０．３１３ＩＵ／ｄＬ／ＩＵ／ｋｇと比較して１．７１＋／−０．７３ＩＵ／ｄＬ／ＩＵ／ｋｇ [Ewenstein BM et al. Transfusion (2002), 42: 190を参照のこと]。同様に重要なこととして、Ｂドメイン欠失組換えヒトｆVIII生産物を血漿由来ヒトｆVIII生産物と比較した場合、２つの生産物が生物学的に同等であることが判明された[Kessler, CM, et al. Hemophilia (2005), 11:84.を参照のこと]。
【００２３】
ＯＢＩ−１及びＨＹＡＴＥ：Ｃの臨床結果は、サル、血友病イヌ、及び血友病マウスを使用して得られた薬物動態データに一致する。これらの結果は更に、ＨＹＡＴＥ：Ｃと比較した場合、ｆVIII欠乏を伴う患者において同様な治療効果を生じるために、ＯＢＩ−１がより低用量において投与できること、あるいは同じく重要なこととして、極めて少ない頻度において投与することができることを示す。また当該データは、同量のＨＹＡＴＥ：Ｃよりも極めて迅速にピーク及び治療レベルに達し、より迅速な出血の制御を許容することを示す。
【実施例】
【００２４】
実施例１
サルにおける生物学的利用能の実験
ＯＢＩ−１とＨＹＡＴＥ：Ｃの生物学的利用能を比較するために、非血友病カニクイザル（cynomolgus monkey)を使用した。１００Ｕ／ｋｇのＨＹＡＴＥ：Ｃ、又は４９若しくは７７Ｕ／ｋｇのいずれかの用量におけるＯＢＩ−１の１回量を４匹のサルのグループに与えた。その後一定の時間において血液試料を採取し、そして薬物動態パラメーター、例えば、時間において集積した活性レベルを計算するために、得られたｆVIIIレベルを使用した。積算値は、一定の時間間隔の曲線下面積（ＡＵＣ0→t）に基づく。
【００２５】
非コンパートメント法を使用して薬物動態分析を計算し、ベースラインを補正した（実験動物中の内在ｆVIIIレベル）。最大血漿濃度のＣmax、及び最大血漿濃度までの時間のＴmaxをデータから直接得た。時間ゼロから最終試料までの曲線下面積（ＡＵＣ0→t）は直線台形法を使用して計算した。結果を図１に示す。
【００２６】
ＯＢＩ−１の２つの用量間において、Ｃmax及びＡＵＣ0→tは用量に比例して増加した。１００Ｕ／ｋｇのＨＹＡＴＥ：Ｃを受けたサルの平均血漿ｆVIIIレベルは、４９．５及び７７Ｕ／ｋｇの両方でＯＢＩ−１を受けたサルのｆVIIIレベルよりも１時点を除き全ての時点において低かった。１００Ｕ／ｋｇのＨＹＡＴＥ：Ｃ（２９９±１９１ｈ・Ｕ／ｄＬ）の生物学的利用能は、４９．５Ｕ／ｋｇの用量において与えられたＯＢＩ−１（９００±３１１ｈ・Ｕ／ｄＬ）のわずか約１／３であり、そして７７Ｕ／ｋｇの用量において与えられたＯＢＩ−１（１１７８±６６９ｈ・Ｕ／ｄＬ）のわずか約１／４であった。ある時点、０．６６時間において測定されたｆVIIIレベルは、数種の動物に疑わしく思われ、血漿検体の取り扱いミスによるものと考えられる。０．６６時間におけるｆVIII値を含む薬物動態値の計算は、ＡＵＣ0→24に対して極めて僅かな変化をもたらしただけであった。
【００２７】
表１は、サルにおけるＨＹＡＴＥ：Ｃ及びＯＢＩ−１の静脈内投与後のベースライン補正ｆVIIIレベルの薬物動態パラメーターを示す。
【表１】
2007536230.tif 000002
【００２８】
結論として、４９．５又は７７Ｕ／ｋｇの用量においてカニクイザルに投与されたＯＢＩ−１は、１００Ｕ／ｋｇのＨＹＡＴＥ：Ｃの場合よりも、時間−濃度曲線下の極めて広い面積をもたらした。この新たな発見は、ＯＢＩ−１とＨＹＡＴＥ：Ｃ間の予測できない違いを明確にし、特にサルに投与した場合、ＨＹＡＴＥ：Ｃと比較して、ＯＢＩ−１は生体内活性を増強したことを示す。表１のデータを同量の基礎Ｕ／ｋｇと比較した場合、４９．５Ｕ／ｋｇ用量のＯＢＩ−１が１００Ｕ／ｋｇのＨＹＡＴＥ：Ｃよりも約６倍大きなＡＵＣ0→24を供したことがわかる。７７Ｕ／ｋｇ用量のＯＢＩ−１は、１００Ｕ／ｋｇのＨＹＡＴＥ：Ｃよりも約５倍大きなＡＵＣ0→24を供した。４０５Ｕ／ｋｇのＯＢＩ−１を受けた５匹のサルを使用する分離実験においても同様の結果が得られた。ここで５匹のサルが１００Ｕ／ｋｇのＯＢＩ−１を受け、そして６匹のサルが１００Ｕ／ｋｇのＨＹＡＴＥ：Ｃを受けた（表２）。
【表２】
2007536230.tif 000003
【００２９】
実施例２
血友病イヌにおける生物学的利用能
自然突然変異として最初に発見された、血友病Ａを伴うイヌは２０年間にわたり保護コロニーにおいて維持されている。Kingston, OntarioにあるQueens大学において保管されたコロニーは第１０世代である。これらは循環ｆVIII活性又はタンパク質を有さず、そしてこれらの表現像は、再発性の重篤な自発性軟部組織及び関節出血、並びに慢性関節変形、を伴うヒトにおける重篤な血友病Ａに類似する。これらは、出血を制御するためにイヌ由来血漿又はクリオプレシピテートの頻回注射を必要とする。
【００３０】
少なくとも６ｋｇの抗ブタｆVIII抗体を欠損している６月齢以上の８匹の健康なイヌにそれぞれ、単一用量のＨＹＡＴＥ：Ｃ又はＯＢＩ−１のいずれかを投与した。各２匹の動物は３Ｕ／ｋｇ、２５Ｕ／ｋｇ、又は１００Ｕ／ｋｇの各生産物を受けた。ベースライン、及び生産物の注射後の以下の時点：０．２５、０．５、１、２、４、８、１２、２４、３６、４８、及び７２時間、において血液試料を採取した。一段階凝固アッセイ及び発色アッセイ法の両方によりｆVIIIレベルを測定した。
【００３１】
ＨＹ９８Ｐと命名したブタｆVIII標準に対するｆVIIIレベルを測定した。これらの血友病イヌは測定可能なイヌｆVIII活性を示さず、且つこれらの血液中にｆVIII抗原は存在しなかったが、ブタｆVIII標準に対して試験した場合、ベースライン（０．１〜０．３Ｕ／ｍｌ）において測定可能なｆVIII活性を有することが判明した。当該ブタ標準は、様々な量の実際の試験生産物のＨＹＡＴＥ：Ｃ又はＯＢＩ−１（１％ウシ血清アルブミン／イミダゾール緩衝液中）を第VIII因子欠乏ヒト血友病血漿に添加することにより作成した。薬物動態パラメーターを測定する目的のために、測定したベースライン活性を、各時点において測定した活性から減算し、そしてｆVIII活性における差を全ての計算のために入力した。試験した両生産物において、各用量レベルにおいて試験したイヌから得られた薬物動態値において実質的な違いが存在した。
【００３２】
選択された薬物動態パラメーターの平均値を表３（発色アッセイ）及び表４（一段階凝固アッセイ）に示す。
【表３】
2007536230.tif 000004
【表４】
2007536230.tif 000005
【００３３】
凝固アッセイと発色アッセイの結果は類似した。ＯＢＩ−１の血液中の最大濃度（Ｃmax）は全ての用量においてＨＹＡＴＥ：Ｃよりも高かった。最大濃度までの平均時間（Ｔmax）は、３及び２５Ｕ／ｋｇ用量においては、ＯＢＩ−１はＨＹＡＴＥ：Ｃよりも短かったが、１００Ｕ／ｋｇの用量においては逆であった。平均回収率は、２５及び１００Ｕ／ｋｇにおける用量においてＯＢＩ−１はＨＹＡＴＥ：Ｃよりも高く、ＯＢＩ−１の回収値はＨＹＡＴＥ：Ｃの約２〜５倍であった。曲線下面積において、処理グループに関わらず、ＡＵＣの幾何平均値は用量の増加に従い増加した。２つのアッセイ法、一段階凝固アッセイ及び発色アッセイ、により測定した全ての薬物動態値は、ほとんどのパラメーターにおいて同じ傾向に従った。
【００３４】
実施例３
血友病イヌにおける有効性
ＣＢＴ、イヌの足爪角質（toenail cuticle)を切った後の出血が止まるまでの時間、は血友病イヌにおける有効性の測定に有用である。角質は通常約２分で出血を止めるが、血友病を伴う未処理のイヌにおいて、短時間の出血ではなく、少なくとも１２分間又は傷害部が焼灼されるまで絶えず再出血した。通常のＣＢＴは５分以下の出血及び焼灼を必要としないことと定義する。先天性血友病を伴うイヌにおけるＣＢＴは、治験ｆVIII生産物の有効性の測定として広く使用されている。
【００３５】
実験計画を実施例２に記載する。表５は各注射の各犬のＣＢＴ結果における個々の変化を示す。
【表５】
2007536230.tif 000006
【００３６】
個々のイヌにおいて実質的な違いが存在したが、当該データはＯＢＩ−１を与えられたイヌにおいてより優れた生体内における有効性を示唆する。ＯＢＩ−１及びＨＹＡＴＥ：Ｃにおける全ての用量のＣＢＴの平均的な減少は、それぞれ４．７８分及び１．２５分であった。この違いは統計的には有意ではないが、有意な趨勢である（ｐ＝０．１０、ｔ試験）。ＯＢＩ−１とＨＹＡＴＥ：Ｃの有効性における違いは３Ｕ／ｋｇと２５Ｕ／ｋｇの低用量においてより明白であり、数匹のイヌにおいてＯＢＩ−１はＣＢＴを減少させたが、ＨＹＡＴＥ：Ｃは減少させなかった。
【００３７】
実施例４
マウス有効性実験
ｆVIII遺伝子のエキソン１６の標的破壊により血友病Ａマウスを作成した。当該Ｅ１６マウスは検出不可能なｆVIII活性、時々の自然出血、及び遷延性出血を有し、そして尾血管の切断又は断裂後の死亡率が増加した。尾の遠位２ｃｍの切断後のＥ１６マウスの死亡率を低下するｆVIIIの能力を評価する、有効なモデルを開発した。
【００３８】
ベビーハムスターの腎臓株化細胞中でＯＢＩ−１ｃＤＮＡを発現させる工程、及びDoering et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 38345-9に記載される２ステップクロマトグラフィー法を使用する無血清発現培地からの精製によりリサーチ・グレードのＯＢＩ−１を調製した。尾切断モデル中のＯＢＩ−１の有効性を試験するために以下の実験を計画した。
【００３９】
９〜１０週齢の雄又は雌の血友病Ａマウスに多様な濃度のＯＢＩ−１又はコントロール緩衝液で尾静脈に注射した。当該マウスを麻酔し、そして注射から１５分後、尾の遠位２ｃｍを切断し、そして自由に出血させた。報告によれば、当該傷害は大半のＥ１６血友病Ａマウスにおいて２４時間以内に致死的である。
【００４０】
２４時間における生存率を以下の結果を伴い判定した：
【００４１】
【表６】
2007536230.tif 000007
上記データは、１．２ユニット／ｋｇのｆVIIIの用量が当該モデルの死亡の防止において有効であるという記載に一致する。０．４及び１．２ユニット／ｋｇにおけるデータを組み合わせにおいて、コントロール（未処理）グループ中の６／３８匹の生存数と比較して、１４／１４匹の生存数であった。５０％の生存率を与える推測用量（ＥＤ50）は０．０４４Ｕ／ｋｇであった。更に、少なくとも０．４Ｕ／ｋｇを受けた全てのマウスが生存した。
【００４２】
血友病マウスにおけるＨＹＡＴＥ：Ｃの有効性
ＨＹＡＴＥ：Ｃ（０〜１００ｆVIIIユニット／ｋｇ）、又はプラセボ（生理食塩水）の尾静脈注射の前に、尾静脈を拡張するためにマウスを６０ワットランプ下で２分間温めた。注射から１５分後、マウスをメトファン（Metofane)で麻酔し、そして尾の遠位２ｃｍを切断した。マウスをリターの代わりにペーパタオルを伴う清潔なケージにおき、そして生存率を測定するために２４時間観察した。通常のウォーターボトル及び乾燥飼料に加えて、良く湿らせた食餌を各ケージ内においた。メトファンを使用し、その後頚椎脱臼により２４時間後に生存を終了させた。
【００４３】
生産物注射後の両処理グループの生存率において用量依存型の増加が存在した（表７）。
【表７】
2007536230.tif 000008
ＨＹＡＴＥ：Ｃの推定ＥＤ50は０．２Ｕ／ｋｇであり、ＯＢＩ−１の推定よりも４〜５倍高く、ＯＢＩ−１の優れた有効性が予想された。全体的な、ＨＹＡＴＥ：ＣとＯＢＩ−１の比較的な有効性は血友病Ａマウスにおいて厳密に実験していない。
【００４４】
実施例５
ヒト血漿からの回収
材料
正常なクエン酸プールヒト血漿（ＦＡＣＴ、製品番号００２０−０）及びｆVIII欠乏血漿（ヒト血友病Ａ血漿、製品番号０８００）はGeorge King Bio-medical, Inc. から購入した。これらは−７０℃で保管した。活性部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）試薬（商品番号３５５１３）は Organon Teknika Corp から購入した。これは凍結乾燥状態において４℃で保管した。ＯＢＩ−１媒体、ロット番号２１４−０２−００１、はバイアル（全６０バイアル）あたり１ｍｌの注射用水で再構成した。ＯＢＩ−１の４つのバイアル、ロット番号２１４−０２−００１、をそれぞれ１ｍｌの注射用水で再構成し、製造者のラベルに従い５５０Ｕ／ｍｌの推定濃度を産生した。ＯＢＩ−１を５９．６ｍｌの再構成したＯＢＩ−１媒体の添加により更に１５．９倍希釈し、３４．６Ｕ／ｍｌの予測濃度を産生した。ＨＹＡＴＥ：Ｃの３つのバイアル、ロット番号６５６、を２０ｍｌの注射用水で再構成し、商業者のラベルに従い、３４．６Ｕ／ｍｌの予測濃度を産生した。ＨＹＡＴＥ：Ｃを各０．５ｍｌの１２０の一定分量に細分割し、そして−７０℃で凍結した。ＯＢＩ−１を各０．５ｍｌの１２７の一定分量に細分割し、そして−７０℃で凍結した。
【００４５】
ｆVIIIに対する阻害抗体を伴う患者由来のクエン酸血漿をドライアイス上でいくつかの血友病治療センターからEmory大学に輸送した。使用まで試料を−７０℃で凍結させた。得られた５８つの血漿から２５つを実験のためにランダムに選択した。
【００４６】
ｆVIIIアッセイ
Diagnostica Stago, ST art 4 Coagulation Instrument を使用してｆVIII一段階凝固アッセイを行った。凍結乾燥したａＰＴＴ試薬を製造業者の取り扱い説明書に従い３ｍｌのＨ2Ｏ中に溶解し、そして使用するまで室温に保った。３７℃の水浴中で素早く解凍後、ＦＡＣＴ及びｆVIII欠乏血漿を氷上で保管した。ｆVIII欠乏血漿（５０μｌ）を試料キュベットに添加し、そして残りの試薬の添加の前に３０〜４５秒間温めた。ｆVIII標準又は希釈試料（５μｌ）を添加し、続いて５０μｌのａＰＴＴ試薬を添加し、そして２５０秒間インキュベートした。ケーブルピペットを使用してあらかじめ加温した５０μｌのＣａＣｌ2溶液の添加により血液凝固を開始させた。当該添加は内部タイマを活性化し、そして凝血時間秒数を記録する。ＦＡＣＴをハンクス緩衝生理食塩水の４つの希釈液：無希釈、１／３、１／１１、及び１／２１、を使用して標準曲線を調製した。無希釈のＦＡＣＴのｆVIII濃度は約１Ｕ／ｍｌであり、製造業者によれば１．０４〜１．０９Ｕ／ｍｌの範囲である。血液凝固時間をｆVIII濃度の対数に対してプロットし、そして直線回帰により標準曲線を計算した。結果に記載されるとおり、標準曲線における補間により、より大規模な測定をおこなったＯＢＩ−１及びＨＹＡＴＥ：Ｃのストック溶液の分析の場合を除き、試料のｆVIII濃度を測定した。
【００４７】
ＯＢＩ−１又はＨＹＡＴＥ：Ｃを加えた血漿由来のｆVIII活性の再構成を３３の入手可能な阻害血漿試料において測定した（図２）。全ての場合において、血漿が０．９Ｕ／ｍｌの予測ｆVIII活性に加えられた。更に、George Kingから得られた２つの血友病Ａ血漿を含み、図右端に示されている。「良い」血漿は、ＨＹＡＴＥ：Ｃ及びＯＢＩ−１中のｆVIIIの回収が予測範囲に存在することがあらかじめ知られている商業的に入手可能な血漿試薬に対応する。「悪い」血漿は、ＨＹＡＴＥ：Ｃ中のｆVIIIの回収が１０％以下の予測であることがあらかじめ知られているIpsen社の血漿に対応する。当該結果は、ＯＢＩ−１の予測された回収が「良い」血漿中で得られたこと、及びＨＹＡＴＥ：Ｃの回収が予想範囲に近かったことを確認する。しかしながら、ＨＹＡＴＥ：Ｃを再度加えた「悪い」血漿由来の活性の回収は極めて乏しいことが観察された。当該血漿由来のＯＢＩ−１の回収は顕著に高かったが、予想よりも低かった。
【００４８】
患者の阻害血漿中のｆVIII活性の回収は極めて低く、ほとんど全ての単一のＨＹＡＴＥ：Ｃ添加血漿において０．１Ｕ／ｍｌ以下であった。これらと同じ血漿にＯＢＩ−１を加えた場合、回収は有意に高かったが、予想よりも低かった（阻害抗体の存在のため）。ＨＹＡＴＥ：Ｃに対する阻害抗体に陰性であると前もってアッセイされたいくつかの血漿をアッセイし、図２に示す。これらの試料の大半においてＨＹＡＴＥ：Ｃの回収は乏しかった。これは、血友病Ａ血漿とＨＹＡＴＥ：Ｃのより長いインキュベーション時間、例えば、Bethesdaアッセイにおける２時間のインキュベーションに生じる、がＨＹＡＴＥ：Ｃの活性の増加した回収に導いた可能性を高めた。しかしながら、ＨＹＡＴＥ：ＣがＨＹＡＴＥ：Ｃ阻害物質陰性患者試料の１つに添加した場合、２時間にわたり活性の上昇は存在しなかった。
【００４９】
結論において、ＯＢＩ−１がヒト血漿に導入される場合、これがヒトｆVIIIに対する阻害抗体を含むか否かに関わらず、試験管内における回収はＨＹＡＴＥ：Ｃよりも高い。この発見は、ＨＹＡＴＥ：Ｃよりも極めて低用量のＯＢＩ−１を投与することにより、患者にお同じ循環レベルのｆVIIIを達成できることを意味する。
【００５０】
実施例６
ヒト対象におけるＨＹＡＴＥ：Ｃに対するＯＢＩ−１の薬物動態
ヒト対象におけるＨＹＡＴＥ：Ｃに対するＯＢＩ−１の多様な薬物動態パラメーターを評価するために、以下の無作為化した、並行群盲検比較実験を９人のヒト患者で行った。これらの９人の患者のうち５人はベースラインにおいて検出可能な抗ブタ阻害物質を有さず（即ち、０．８ベセスダ単位以下）、そして１人（ＯＢＩ−１グループに帰属）は１．０ベセスダ単位の極めて低い阻害物質を有した。ブタｆVIIIに対して既存の阻害物質を有さない、あるいは極めて低い阻害物質を有する当該６人の患者のうち３人がＨＹＡＴＥ：Ｃを受け、そして３人がＯＢＩ−１を受けた。有意により高レベルの阻害物質を有する３人の患者は、このような阻害物質が生物学的利用能を抑制し、それにより分析が混乱することから、生物学的利用能の評価から除外した。全ての患者は、１２歳以上とし、血友病Ａと臨床的に診断され、そしてそれまで非出血状態であった。バイアルあたり５３５ユニットのｆVIII活性を含む無菌バイアル中にＯＢＩ−１を供した。各バイアルを１．０ｍｌの注射用無菌水ＵＳＰで再構成し、５３５Ｕ／ｍｌの最終濃度とした。バイアルあたり５４１ユニットのｆVIII活性を含む無菌バイアル中にＨＹＡＴＥ：Ｃを供した。各バイアルを２０ｍｌの注射用無菌水ＵＳＰで再構成し、２７ＩＵ／ｍｌの最終濃度とした。投与した各生産物の用量は、対象の抗体価に関わらず１００ＩＵ／ｋｇとした。研究者、患者、及びスポンサーは、二重盲検、ダブルダミー計画において、どの患者がどの活性生産物を受けたかをわからなくした。患者は１００ＩＵ／ｋｇの活性ＨＹＡＴＥ：Ｃ、続いてプラセボ（３人の患者）、又はプラセボ、続いて１００ＩＵ／ｋｇの活性ＯＢＩ−１（３人の患者）のいずれかを受け、その間、安定で、非出血状態であった。各患者は第一生産物（同じ用量のＨＹＡＴＥ：Ｃ又はプラセボ）の約１時間にわたる注入を受け、続いて第二生産物（同じ用量のＯＢＩ−１又はプラセボ）を１０分間にわたり注射器からゆっくりと注入した。
【００５１】
ｆVIII標準としてヒトプール血漿を使用する一段階凝固アッセイ及び発色アッセイ法の両方による血漿ｆVIII活性レベルの検出のために、最初の注射から０（注射前）、２０、４０、６０、６５、７５、８５、１０５、及び１２５分後、並びに３、６、９、２４、２７、３０、及び４８時間後において血液試料を採取した。これらのレベルから、標準的な薬物動態分析が行われ、そして結果を表８並びに図３及び４に示す。当該実験において測定された薬物動態パラメーターは、クリアランス（ＣＬ、ｍｌ／ｈ／ｋｇ）、曲線下面積（ＡＵＣ、Ｕ／ｄＬ）、最大濃度（Ｃmax、Ｕ／ｍｌ）、分配量（Ｖｚ）、最大濃度までの平均時間（Ｔmax、ｈ）、及び半減時間（Ｔ1/2、ｈ）を含む。
【表８】
2007536230.tif 000009
【００５２】
表８並びに図３及び４からわかるとおり、ＯＢＩ−１のＡＵＣ値は、ＨＹＡＴＥ：Ｃのものよりも約２〜２．５倍高かった。ＯＢＩ−１とＨＹＡＴＥ：ＣにおけるＡＵＣの違いは一段階活性アッセイよりも発色アッセイにおいてより明確であった。ＯＢＩ−１の血液中の最大濃度（Ｃmax）はＨＹＡＴＥ：Ｃよりも約３倍高かった（発色アッセイにおいて５３に対して１５１）。最大濃度までの平均時間（Ｔmax）は、ＯＢＩ−１の方がＨＹＡＴＥ：Ｃよりも約２．５〜３倍短かった。これらの結果は、サル、血友病イヌ、及び血友病マウスを使用して得られた前述の薬物動態データに一致し、そして更にＨＹＡＴＥ：Ｃと比較してＯＢＩ−１が極めて高い生物学的利用能を有することを示す。このように、ＯＢＩ−１は、ＨＹＡＴＥ：Ｃと比較して、ｆVIII欠乏患者において等価的な治療効果を得るためにより少ない用量において投与すること、あるいはより少ない投与頻度で投与することができる。そしてＨｙａｔｅ：Ｃと同量のＯＢＩ−１は、出血のより迅速な制御をもたらすことができる。
【００５３】
実施例７
ＯＢＩ−１及びＨＹＡＴＥ：Ｃの回収値における違いの臨床的な有意性
上述に開示した実験は、同じ用量の注射後において、血漿由来ブタｆVIII（ＨＹＡＴＥ：Ｃ）よりも組換えブタｆVIIIＢドメイン欠失（ＯＢＩ−１）のヒト血漿からの回収、最大濃度（Ｃmax）、及び曲線下面積（ＡＵＣ）が、極めて高かったことを示す。
【００５４】
正常な非血友病Ａ対象におけるｆVIII濃度は約１００ユニット／ｄＬである。ｆVIIIの血漿レベルが正常レベルの約２５％及び３５％に達し、且つ数時間維持される場合、典型的な出血症状は極めて制御されるようである(Roberts H and Hoffman M, "Hemophilia A and Hemophilia B, " Chapter 123 in Beutler E, Lichtman M, Coller B, Kipps T and Seligsohn U (Eds), Williams Hematology, 6th edition (2001) :1639-1657頁; McGraw-Hill, New York)。ブタＦVIIIに対する阻害物質を有さない、あるいは低い阻害物質を伴うこれらの対象から得られた薬物動態データ（実施例６に記載したとおり、ＯＢＩ−１，ｎ＝３；ＨＹＡＴＥ：Ｃ，ｎ＝３）を使用して、ｆVIIIの治療レベル（即ち、２５〜３５％）に対応するＯＢＩ−１とＨＹＡＴＥ：Ｃ投与の薬物動態値を測定するために更なる計算を行った。当該結果を表９に示す。
【表９】
2007536230.tif 000010
【００５５】
上の表からわかるとおり、（１）ＯＢＩ−１の２５％及び３５％以上のＡＵＣは、ＨＹＡＴＥ：Ｃの約５倍高い（表９）；（２）ＯＢＩ−１のピーク濃度（Ｃmax）は、Ｈｙａｔｅ：Ｃの２〜３倍高い（表８）；（３）ＯＢＩ−１はＨｙａｔｅ：Ｃよりも極めて迅速にそのピーク濃度に達する（Ｈｙａｔｅ：Ｃの１．５〜２．０時間と比較して、ＯＢＩ−１のＴmaxは約０．６時間である、表８のＴmaxを参照のこと）；そして（４）１００Ｕ／ｋｇにおけるＯＢＩ−１の投与後のＦVIIIが治療的範囲である時間の長さは、１００Ｕ／ｋｇにおけるＨＹＡＴＥ：Ｃよりも長い（約１．５〜２倍）。
【００５６】
概要すると、本発明に供されるデータは、ｆVIII欠乏性を有する患者において、単位が同じ場合、ＯＢＩ−１はＨＹＡＴＥ：Ｃよりも極めて迅速に、有効に、且つ遷延性の出血制御を達することができることを示す。
【００５７】
概要
実施例１〜６の総合データは、ヒト及び動物の血漿中でＯＢＩ−１がＨＹＡＴＥ：Ｃと異なる挙動をするという予想外の発見を示す。特に、ヒト患者を利用する実施例６に記載の実験は、ヒトにおいて、組換えブタｆVIII（ＯＢＩ−１）が血漿由来ブタｆVIII（ＨＹＡＴＥ：Ｃ）よりも極めて優れた生物学的利用能を実際に有することを証明する。この驚くべき結果は、血漿由来濃度が組換え第IX因子生産物よりも有意に優れた回収率及び生物学的利用能を有した、第IX因子に見られたものと正反対である(Ewenstein et al. supra)。更に、無作為化された、３方向クロスオーバー実験で測定された多様な薬物動態パラメーターにおいて、Ｂドメイン欠失組換えヒトｆVIII（ReFacto（登録商標）)が血漿由来ヒトｆVIII(Hemofil（登録商標）M)と生物学的同等性であることが発見された、Kessler et alによる報告(Haemophilia (2005) 11:84-91)に照らして、ＨＹＡＴＥ：Ｃと比較したＯＢＩ−１のより優れた生物学的利用能もまた驚くべきことであった。
【００５８】
全ての動物及びヒト実験の結果を合わせると、慣習的な方法、及びＨＹＡＴＥ：Ｃに使用される投与量とは実質的に異なる、ＯＢＩ−１の投与のための新規なプロトコルを考案することが可能である。本発明の１つの観点は、ＯＢＩ−１の新規な用法を供し、これによりＯＢＩ−１は、患者に対して、ＨＹＡＴＥ：Ｃに推奨されるユニット／ｋｇにおける標準活性用量の１／６程度の少量において投与することができる。ＨＹＡＴＥ：Ｃの推奨用量は、ブタｆVIIIに対するいずれかの患者抗体を中和するために必要な用量以上の１００ＩＵ／ｋｇ体重である。ブタｆVIIIに対する患者の抗体レベルは各個人で異なる。患者の抗体を中和するために必要なＯＢＩ−１の用量は、当業界に既知な標準的な方法を使用する抗体価の測定から推測することができる。従って、与えられた患者のために、中和用量以上の約１０〜２０Ｕ／ｋｇ体重程度の低用量においてＨＹＡＴＥ：Ｃの代わりにＯＢＩ−１を投与することができる。血友病Ａ患者がｆVIIIに対する阻害抗体を有する場合、当該阻害抗体を中和するためによりＯＢｌが必要とされるであろう。有効量のＯＢＩ−１は、ＨＹＡＴＥ：Ｃの用量を投与に必要な溶液の容量の何分の一かで投与することができる。これは、ＯＢＩ−１がより濃縮形態にいて調製するこができるだけでなく、より少量のＯＢＩ−１が、２〜６倍高い用量のＨＹＡＴＥ：Ｃに匹敵する活性の回収を生じることができるためである。一方１００Ｕ／ｋｇのＯＢＩ−１を用量として利用される場合、患者は、出血を止めるのに必要な極めて少ない回数の注入、又はＯＢＩ−１の注射のきわめて長い間隔により成功的に管理することができる。例えば、ＨＹＡＴＥ：Ｃの場合、１回の出血症状を止めるために、２日間にわたり平均８回の注入が必要とされるが、ＯＢＩ−１は１〜４回のこれらの注入を必要とするだけでよく、患者の治療において顕著な利点を有する。更に、急性出血症状は、添付文書に報告されるＨＹＡＴＥ：Ｃの平均投与量である、２日にわたる８用量と比較して、少ない回数で且つ少量のＯＢＩ−１で治療することができる。ＯＢＩ−１の投与量は、出血のより迅速な制御をもたらし、従ってＨｙａｔｅ：Ｃよりも有効で安全であると思われる。また、患者の快適性及び生活の質にも有利であり、並びに注射及び混入による副作用のリスクの低下を供する。ｆVIIIの治療レベルは、濃縮したＯＢＩ−１生産物を注入することによって、より迅速に達成することができる。本発明の他の観点は、個々の患者における最適用量を確立するためのプロセスの一部としてＯＢＩ−１回収を測定する工程を含む治療プロトコルを供する。ＯＢＩ−１の回収は、測定した量のＯＢＩ−１活性を、患者の血漿試料に添加し、それから短い時間間隔後に試料から回収した活性を測定することにより、基本的に実施例５に記載したように測定することができる。このような一連の試験は、各患者に適当なＯＢＩ−１用量を確立することができる。あるいは、個々の回収データは患者において直接測定することができる。
【００５９】
前述の例示的な記載及び説明的に好ましい本発明の態様は、改変を伴い、そして態様を教示しながら、図面及び詳細な説明において説明されている。本発明がこのように示され、記載され、そして説明される一方、形態及び詳細において等価な変更は、本発明の精神及び範囲から離れることなく本明細書中においてなされ、そして当業者は、本発明の範囲は先行技術により妨げられるものとして除かれるクレームのみが制限されることを理解すべきである。更に、本発明に開示される発明は、本明細書に開示される特定の要因の存在なく適当に実施することができる。
【００６０】
範囲が明細書中に与えられている場合、例えば、温度範囲、時間範囲、又は組成物若しくは濃度範囲において、当該範囲中に含まれる全ての中間範囲及び部分的な範囲、並びに個々の値が開示中に含まれることが意図される。
【００６１】
明細書中に言及される全ての特許及び刊行物は、本発明が属する当業界のレベルを示している。本発明に引用される参考文献は、これらの出願日における技術状況を示すためにその全体において本明細書中に含まれており、これは当該情報が本明細書において利用され、そして必要であれば、先行技術における特定の態様を除外することを意図する。例えば、化合物がクレームされる場合、本願発明の前の業界において知られ且つ入手可能な化合物、例えば、有効な開示が本明細書に引用された参考文献において供される化合物は、本明細書の請求項に記載の組成物中に含まれることを意図しないことを理解すべきである。
【００６２】
本明細書中に使用される「含んで成る」は、「含む」、「含有する」、又は「〜により特徴付けられる」と同義であり、そして包括的であり、あるいは制限がなく、そして追加的な列挙されていな要因又は方法工程を除外しない。本明細書中に使用される「から成る」は、クレーム要因に特定されていないいずれかの要因、工程、又は成分を除外する。本明細書中に使用される「から基本的に成る」は、クレームの基本的且つ新規な特性に物質的に影響しない物質又は工程を除外しない。本明細書中の各例において、「含んで成る」、「から基本的に成る」、及び「から成る」の語は、他の２つの語のいずれかと置き換えることができる。本明細書において適当に説明的に記載された発明は、本発明に特に開示されていないいずれかの要因又は要因群、制限又は制限群の不存在下において実施することができる。
【００６３】
当業者は、具体的に例示されているもの以外の出発物質、試薬、固形基質、合成方法、精製方法、及び分析方法を、不当な実験に頼ることなく、本発明の実施において利用することができることを理解する。これらのいずれかの物質及び方法の全ての業界的に知られている機能的な等価物は、本発明に含まれることが意図される。使用された語及び表現は、説明の語として使用され、制限のためのものではなく、そして示され且つ記載された特性のいずれかの等価物又はこれらの一部を除外するこれらの語及び表現の使用において意図されないが、クレームされる本発明の範囲中において多様な改変が可能であることが認識される。従って、本発明は好ましい態様及び任意的な特性により具体的に開示されるが、本明細書中に開示されるコンセプトの改変及び変更は当業者により修復されてもよく、そしてこのような改変及び変更は付随の請求項に定義される本発明の範囲内にあることを考慮すべきである。
【００６４】
本明細書に引用される全ての参考文献は、本明細書の開示と不一致がない程度に、引用により本明細書に組み入れられている。本明細書に供されるいくつかの参考文献は、出発材料、追加的な出発材料、追加的な試薬、追加的な合成方法、追加的な分析方法、及び追加的な本発明の使用のソースに関する詳細を供するために引用により組み入れられている。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】実施例１に記載した指示された用量におけるＨＹＡＴＥ：Ｃ又はＯＢＩ−１のいずれかのカニクイザルへの単回注射後のｆVIIIベースラインを補正したｆVIIIの活性回収のグラフである（実施例１）。
【００６６】
【図２】実施例５に記載された実験から得られた結果のグラフである。個々の患者の血漿を横軸に沿って並べている。縦軸は実施例５に記載したとおりｆVIIIの添加後の個々の血漿から回収したＵ／ｍｌのｆVIII活性を示す。King George Biomedical 血漿のデータは「良い」又は「悪い」として、後者の血漿の異常な挙動に基づき命名されている（実施例５を参照のこと）。
【００６７】
【図３】ＯＢＩ−１又はＨＹＡＴＥ：Ｃの静脈内投与後の６人のヒト患者におけるｆVIIIの血漿濃度を示すグラフである。Ｙ軸は一段階活性アッセイにより測定した個々の血漿から回収したＵ／ｍｌのｆVIII活性を示す。
【００６８】
【図４】ＯＢＩ−１又はＨＹＡＴＥ：Ｃの静脈内投与後の６人のヒト患者におけるｆVIIIの血漿濃度を示すグラフである。Ｙ軸は本明細書に記載する発色アッセイにより測定した個々の血漿から回収したＵ／ｍｌのｆVIII活性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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