(57)【要約】      （修正有）【課題】接着性が付与された抗菌ペプチドの製造方法及び接着性が付与された抗菌ペプチドの抗菌コーティング方法の提供。【解決手段】抗菌ペプチドの末端にリンカー及びＤＯＰＡ（3,4-dihydroxyphenylalanine）を結合させた、接着性が付与された抗菌ペプチド、該抗菌ペプチドの製造方法、該抗菌ペプチドを表面にコーティングする段階を含む抗菌コーティング方法、及び該抗菌ペプチドを含む抗菌コーティング用組成物。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗菌ペプチドの末端にリンカー及びＤＯＰＡ（3,4-dihydroxyphenylalanine）を結合させた、接着性が付与された抗菌ペプチド。
【請求項２】
前記抗菌ペプチドは、配列番号１からなるアミノ酸配列を含むＮＫＣである、請求項１に記載の接着性が付与された抗菌ペプチド。
【請求項３】
前記リンカーは、配列番号２からなるアミノ酸配列を含むものである、請求項１に記載の接着性が付与された抗菌ペプチド。
【請求項４】
前記リンカーは、抗菌ペプチドとＤＯＰＡの相互活性阻害を最小限にするものである、請求項１に記載の抗菌ペプチド。
【請求項５】
前記ＤＯＰＡは、３個〜７個が連結されたものである、請求項１に記載の抗菌ペプチド。
【請求項６】
抗菌ペプチドの末端にリンカー及びＤＯＰＡ（3,4-dihydroxyphenylalanine）を結合し、接着性が付与された抗菌ペプチドを製造する段階を含む、接着性が付与された抗菌ペプチドの製造方法。
【請求項７】
（ａ）抗菌ペプチドの末端にリンカー及びＤＯＰＡ（3,4-dihydroxyphenylalanine）を結合し、接着性が付与された抗菌ペプチドを製造する段階、及び（ｂ）前記接着性が付与された抗菌ペプチドを表面にコーティングする段階を含む抗菌コーティング方法。
【請求項８】
前記コーティングは、接着性抗菌ペプチドを５０〜２００μＭの濃度でコーティングするものである、請求項７に記載の抗菌コーティング方法。
【請求項９】
前記コーティングは、１０分〜１０時間コーティングするものである、請求項７に記載の抗菌コーティング方法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の接着性が付与された抗菌ペプチドを含む抗菌コーティング用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、接着性が付与された抗菌ペプチドの製造方法及び接着性が付与された抗菌ペプチドの抗菌コーティング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、世界的に感染疾患が持続的に増加しており、これにより、年間６００億ドル以上が治療費として使用されている。米国及び欧州では、年間５万人が感染疾患により死亡し、大韓民国でも年間１千人以上が感染疾患により死亡することが報告された。このような感染疾患を治療するために抗生剤を使用しているが、抗生剤の過剰使用により、抗生剤耐性のスーパーバクテリアが出現し、感染疾患の致死率が増加している（年平均１５％増加、疾病管理本部の資料）。これとともに、１９８０年代以降に新たな抗生剤が開発されていないことも問題となっている。このように、抗生剤耐性菌の問題と新薬の不在により感染疾患の治療が困難になり、治療の前に感染を予防することが、より重要な問題となった。
【０００３】
一般的な感染は、接触感染、空気感染、飛沫感染に起因するが、このうち、接触感染の頻度が最も多い。日常生活における感染は、最近多く使用している携帯電話、コンピュータ、歯ブラシなどで数多くの細菌が存在するという報告からも知られている。一例として、携帯電話の場合には、１平方インチあたり２万５千匹以上の細菌が存在するが、その中には抗生剤の耐性菌としても知られている大腸菌（Escherichia coli）、黄色ブドウ球菌（Staphilococcus aureus）、連鎖球菌（Streptococcus）も存在することが報告された。また、病院で起こる医療感染の場合、手術器具などで２〜３３％の感染率が報告され、２０１４年に韓国内では医療感染に関連して２５００億ウォン以上の費用が要された。接触感染遮断の代表的な解決策が抗菌コーティング剤であるが、現在では銀や銅が多くの割合を占めている。しかし、これらの抗菌効能が足りず、ナノ構造による細胞毒性を引き起こすという問題がある。これにより、新規な抗菌コーティング剤の必要性が台頭し、そのうちの１つの代案として発見されたものが、抗菌ペプチドを用いたコーティング剤である。
【０００４】
抗菌ペプチド（antimicrobial peptide、AMP）は、ほとんどの生命体が感染のような外部の危険から自らを守るために使用される先天免疫の一部として知られている。これらは動植物をはじめとする昆虫と、一部の微生物まで生命体の全般に広く存在しており、１９６０年代にカエルの皮膚粘液からその存在が初めて確認され、現在数千種余りにも及ぶ抗菌ペプチドが、多様な種から明らかになり、合成され、研究されている。現在までバクテリア、無脊椎動物、脊椎動物、植物を含む多様な種から自然由来３９００種余り、合成されたペプチド１６００種余りなど、計５５００種類以上の抗菌ペプチドが存在していることが知られており、そのうち、抗菌、抗ウイルス、抗真菌、抗寄生虫、抗がん効果と関連付けられたそれぞれ５３００種余り、１１００種余り、１５００種余り、１０種余り、１００種余りのペプチドが明らかになった。
【０００５】
このように、抗菌ペプチドは、細菌、真菌及びウイルスなどの微生物をはじめとして一部の癌細胞でも活性を示す広い作用範囲を有しており、特有の作用機序により、抗菌効果が即刻的であることが知られている。優れた抗生作用以外にも、先天免疫と後天免疫を連結する中間子の役割をはじめとして傷の治療、血管新生など、身体の機能的な調節において重要な役割をすることが明らかになっており、自己免疫疾患及び炎症との関連性も研究されている。
【０００６】
このような抗菌ペプチドは、それ自体でコーティング力がないため、抗菌ペプチドをコーティング剤として使用するために、コーティングしようとする製品や素材の表面に化学薬品を処理して反応基を付与し、これにペプチドをコーティングする方法を利用している。  
【０００７】
しかしながら、従来の抗菌コーティング技術は、化学薬品を処理し、多段階反応を経て表面に固定化する方法を使用し、その効果が持続的でなかったり、固定化する方法が複雑で使用される化学薬品の毒性の問題があったりして、環境にやさしい抗菌コーティング技術に関するニーズが増加している（Gallo J et al., Int. J. Mol. Sci. (2014) 15: 13849-13880, Onaizi SA and Leong SSJ, Biotechnol. Adv. (2011)29:67-74（非特許文献１））。
【０００８】
一方、海洋生命体であるムール貝（mussel）は、接着タンパク質（adhesive proteins）を生産及び分泌することにより、ムール貝自らを海の中の岩のような湿った固体表面にしっかりと付着することができ、波の衝撃や海水の浮力効果に影響を受けない。ムール貝の接着タンパク質は、強力な自然の接着剤として知られており、このようなムール貝の接着タンパク質に接着力を付与する核心要素は、タンパク質内に存在するL-3,4-dihydroxyphenylalanine（DOPA）である。ムール貝の接着タンパク質は、化学合成接着剤と比較したとき、ほとんどのエポキシ樹脂より約二倍程度の高い引張強度を示すとともに、曲折可能な柔軟性を有している。また、ムール貝の接着タンパク質は、プラスチック、ガラス、金属、テフロン及び生体物質などの多様な表面に接着することができる能力を有しており、これまで化学接着剤の開発において未完の課題として残っている濡れた表面での接着も数分で可能である。
【０００９】
そこで、本発明者らは、環境にやさしい方法で抗菌ペプチドに接着性を付与すべく鋭意研究努力した結果、ムール貝の接着タンパク質を構成する非天然アミノ酸であるＤＯＰＡを抗菌ペプチドのＣ末端に結合して抗菌ペプチドに接着性を付与し、結合したＤＯＰＡの数及びコーティング時間による抗菌力を確認し、最適なコーティング方法を設定することにより本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Gallo J et al., Int. J. Mol. Sci. (2014) 15: 13849-13880, Onaizi SA and Leong SSJ, Biotechnol. Adv. (2011)29:67-74
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の一つの目的は、抗菌ペプチドの末端にリンカー及びＤＯＰＡ（3,4-dihydroxyphenylalanine）を結合させた、接着性が付与された抗菌ペプチドを提供することにある。
【００１２】
本発明の他の一つの目的は、抗菌ペプチドの末端にリンカー及びＤＯＰＡ（3,4-dihydroxyphenylalanine）を結合し、接着性が付与された抗菌ペプチドを製造する段階を含む、接着性が付与された抗菌ペプチドの製造方法を提供することにある。
【００１３】
本発明のもう一つの目的は、（ａ）抗菌ペプチドの末端にリンカー及びＤＯＰＡ（3,4-dihydroxyphenylalanine）を結合し、接着性が付与された抗菌ペプチドを製造する段階、及び（ｂ）前記接着性が付与された抗菌ペプチドを表面にコーティングする段階を含む抗菌コーティング方法を提供することにある。
【００１４】
本発明のもう一つの目的は、前記接着性が付与された抗菌ペプチドを含む抗菌コーティング用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記課題を解決するための本発明の一つの態様は、抗菌ペプチドの末端にリンカー及びＤＯＰＡ（3,4-dihydroxyphenylalanine）を結合させた、接着性が付与された抗菌ペプチドを提供する。
【００１６】
以下、本発明における接着性が付与された抗菌ペプチドの製造及びその用途を具体的に説明する。
【００１７】
本発明における用語、「接着性が付与された抗菌ペプチド」とは、抗菌ペプチドの末端にリンカーを連結し、リンカーの末端にＤＯＰＡを連結して抗菌ペプチドの抗菌活性を有するとともにＤＯＰＡの接着性を有するペプチドを意味する。
【００１８】
本発明における用語、「抗菌ペプチド（antimicrobial peptide）」とは、生命体の内在免疫反応（innate immune response）の一部であり、宿主防御ペプチド（host defense peptide、HDP）とも呼ばれ、アミノ酸で構成された生体由来の抗菌物質を意味する。前記抗菌ペプチドは、細胞膜を瓦解させたり、細胞内の物質と結合して細菌を死滅させる方法で抗菌性を示すため、耐性を誘発する可能性が低く、グラム陰性及びグラム陽性菌だけでなく、ウイルスまたは一部の癌細胞さえも死滅させることができ、広い範囲の微生物に対して活性を有する。また、抗菌作用の後に簡単に分解され、宿主に対して安全であるという長所がある。
【００１９】
本発明の抗菌ペプチドは、リンカー及びＤＯＰＡと結合して抗菌活性を失わない抗菌ペプチドであれば、如何なるペプチドでも使用可能であるが、具体的にはＮＫＣであってもよい。
【００２０】
前記ＮＫＣは、配列番号１のアミノ酸配列を含む抗菌ペプチドであり、既存の化学抗生剤と類似の抗菌力を有し、上皮成長因子受容体（Epidermal growth factor receptor、EGFR）を通じて細胞の再生効果を示し、細胞毒性を示さず、生体内で抗菌用途として使用するのに効果的である。
【００２１】
前記ＮＫＣは、抗菌力が低下しない限り、配列番号１からなるアミノ酸配列にアミノ酸が追加または欠失したものを含むことができる。
【００２２】
本発明における用語、「リンカー」とは、配列番号２のアミノ酸配列を含む、二つのタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸を連結するポリペプチドを意味する。
【００２３】
前記リンカーは、抗菌ペプチド及びＤＯＰＡの結合過程で両方を連結するとともに、相互活性阻害を最小限に抑え、抗菌ペプチドの接着性を向上させることができる。
【００２４】
リンカーの種類としては、ＧＳリンカー（４個のグリシンと１個のセリンで構成されたＧＧＧＧＳの２，３，４などの反復体）、ＰＴリンカー（アミノ酸プロリンとトレオニンで構成されたリンカー）があってもよいが、これらに限定されない。
【００２５】
前記リンカーは、結合されたタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸の活性をさらに減少させない限り、配列番号２からなるアミノ酸配列にアミノ酸が追加または欠失したものを含むことができる。
【００２６】
本発明の一実施例では、ＮＫＣとＤＯＰＡの相互活性阻害を最小限に抑えるために、ＮＫＣのＣ末端及びＤＯＰＡのＮ末端との間にＧＧＧＧＳ配列を二回反復したリンカーを追加した（表１）。
【００２７】
本発明における用語、「DOPA（3,4-dihydroxyphenylalanine）」とは、α−アミノ酸の一種であり、水溶液は非常に不安定で、特にアルカリ性溶液は、空気中で容易に酸化され、赤色を経て黒色に変わってメラニンを生成する。動植物組織内におけるメラニン生成過程では、チロシンがモノフェノールモノ酸素添加酵素により酸化され、まずＤＯＰＡを生成させ、再びドーパキノンを経て酸化が進行される。
【００２８】
また、前記ＤＯＰＡは、ムール貝の接着タンパク質で接着力に重要な役割をし、多様な表面でも優れた接着力を示し、水中でも接着力を有する長所がある。
【００２９】
前記接着性が付与された抗菌ペプチドはＤＯＰＡを１個〜７個、具体的には３個〜７個、より具体的には５個〜７個の連結されたものであってもよい。
【００３０】
本発明の一実施例では、連結されたＤＯＰＡの数に応じたコーティング力を確認した結果、個数依存的なコーティング力の増加が示され、特に３個以上のＤＯＰＡが連結されている場合、コーティング力が著しく高くなることを確認した（図１）。
【００３１】
もう一つの様態として、本発明は、抗菌ペプチドの末端にリンカー及びＤＯＰＡ（3,4-dihydroxyphenylalanine）を結合し、接着性が付与された抗菌ペプチドを製造する段階を含む、接着性が付与された抗菌ペプチドの製造方法を提供する。
【００３２】
本発明における用語、「接着性が付与された抗菌ペプチド」、「抗菌ペプチド」とは、前記で記載した通りである。
【００３３】
もう一つの様態として、本発明は、（ａ）抗菌ペプチドの末端にリンカー及びＤＯＰＡ（3,4-dihydroxyphenylalanine）を結合し、接着性が付与された抗菌ペプチドを製造する段階、及び（ｂ）前記接着性が付与された抗菌ペプチドを表面にコーティングする段階を含む抗菌コーティング方法を提供する。
【００３４】
本発明における用語、「接着性が付与された抗菌ペプチド」、「抗菌ペプチド」とは、前記で記載した通りである。
【００３５】
本発明における用語、「コーティング（coating）」とは、元となる材料の表面に膜を被せることを意味し、具体的には、本発明のコーティングは、特定の材料の表面に接着性が付与された抗菌性ペプチドからなる膜を被せて前記材料の表面が抗菌活性を帯びるようにすることを意味する。
【００３６】
前記表面は、これに限定されないが、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、チタン、シリコンなどがあり、具体的にはポリスチレン、チタン及びシリコンであってもよい。
【００３７】
前記（ｂ）段階でコーティングする方法は、当業界において使用される方法であれば如何なる方法も使用可能であり、非限定的な例として、押出加工、カレンダー加工、浸漬、噴霧、電着がある。
【００３８】
また、前記（ｂ）段階で接着性が強化された抗菌ペプチドをコーティングするための条件は、これに限定されないが、ペプチド２５μＭ〜２００μＭ、具体的には４０μＭ〜１７０μＭ、より具体的には５０μＭ〜１５０μＭの濃度で１０分〜１２時間、具体的には２〜１１時間、より具体的には３〜１０時間コーティングするものであってもよい。
【００３９】
もう一つの様態として、本発明は、前記接着性が付与された抗菌ペプチドを含む抗菌コーティング用組成物を提供する。
【００４０】
本発明における用語、「接着性が付与された抗菌ペプチド」、「抗菌ペプチド」、「コーティング」とは、前記で記載した通りである。
【００４１】
本発明の一実施例では、抗菌性ペプチドであるＮＫＣにリンカーとＤＯＰＡを結合して接着性が付与された抗菌ペプチドを作製し、濃度、連結されたＤＯＰＡの数及びコーティング時間のようにコーティングに最適化された条件を分析し、コーティング方法を設定した。
【００４２】
したがって、本発明は、接着性が付与された抗菌ペプチドを含む抗菌コーティング組成物を提供することを示唆している。
【発明の効果】
【００４３】
本発明の抗菌コーティング方法は、細胞毒性がなく、優れた抗菌力を有する接着性が付与された抗菌ペプチドを、多様な表面に最適の効率でコーティング可能であるため、医療用品、工業用品に抗菌性を付与する方法として広く使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ＮＫＣに結合されたＤＯＰＡの数に応じた接着力の分析結果を示したグラフである。
【図２】ＮＫＣに結合されたＤＯＰＡの数及び接着性抗菌ペプチドの濃度に応じた抗菌力の分析結果を示したグラフである。
【図３】コーティング時間に応じたコーティング力の分析結果を示した図である。
【図４】コーティング時間に応じた抗菌力の分析結果を示したグラフである。
【図５】基質（ポリスチレン、チタン、ＰＤＭＳ）によるコーティング力の分析結果を示した図であり、具体的には、図５ａはＸＰＳ分析によるコーティング力の分析結果を示した図であり、図５ｂはＡＦＭ画像の解析結果を示した図である。
【図６】基質（ポリスチレン、チタン、ＰＤＭＳ）による抗菌力の分析結果を示したグラフである。
【図７】抗菌ペプチドコーティングの細菌付着防止効果を示した図である。
【図８】コーティングされた抗菌ペプチドの抗菌力持続性を確認した図である。
【図９】１００μＭの濃度の抗菌ペプチドコーティングの細胞毒性の結果を示したグラフである。
【図１０】２００μＭの濃度の抗菌ペプチドコーティングの細胞毒性の結果を示したグラフであり、具体的には、図１０ａは抗菌ペプチドコーティングの溶血活性を確認したグラフであり、図１０ｂは抗菌ペプチドコーティングのヒト細胞に対する細胞毒性を確認したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
以下、本発明を実施例を通じてより詳しく説明する。しかし、これら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。
【００４６】
実験例１．接着性抗菌ペプチドの製作
実験例１−１．抗菌ペプチドに対する接着性の付与
広い範囲の微生物に対して抗菌力が強いペプチドであるＮＫＣを抗菌コーティング剤として活用するために、生体にやさしく、表面に無関係に強い接着力を示すムール貝の接着タンパク質において接着力に重要な役割をすることが知られている非天然アミノ酸であるＤＯＰＡ（3、4-dihydroxyphenylalanine）をＮＫＣの末端に結合して抗菌ペプチドに接着性を付与した。このとき、最適のＤＯＰＡ数を確認するために、それぞれ１、３、５、７個のＤＯＰＡをＮＫＣの末端に結合させ、ＮＫＣとＤＯＰＡが互いの活性に影響を与えないように、柔軟性連結配列であるＧＧＧＧＳをＮＫＣとＤＯＰＡ配列の間に追加した。前記ＮＫＣとＤＯＰＡが結合したアミノ酸配列情報については表１に示した。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
実験例１−２．接着性抗菌ペプチドの抗菌力の確認
実験例１−１を通じて製造された接着性抗菌ペプチドの抗菌力を確認するために、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．２００８；３（２）：１６３−１７５に記載された方法により、大腸菌（E.coli）に対して成長を阻害する最小濃度（MIC、Minimal Inhibitory Concentration）を確認した。簡単に説明すると、単一コロニー（single colony）を１６時間育てた培養液を継代培養し、対数増殖期に該当するＯＤ６００＝０．４〜０．６になるまで育てた後、ＯＤ値により細胞数をカウントし、１０６ｃｅｌｌ／ｍｌで細胞数を設定した。ポリプロピレン９６ウェルプレートにＭＨＢ（Mueller Hinton Broth）を入れるとき、プレートの最初の行に９０ｕｌ、対照群に１００ｕｌを入れ、残りのウェルに５０ｕｌずつ入れた後、ペプチド溶液を６４０μＭの濃度で準備し、最初の行にそれぞれ１０ｕｌずつ入れた。その後、マルチピペットでペプチド溶液を培地と混合した後、第２行目（Ｂ）に５０ｕｌを移した。この時、ペプチドは、濃度が１／２に希釈され、同様な方法で第７行目までペプチドを移し、６４μＭ〜１μＭのペプチドが培地に溶けるように構成した。ここで、先に用意した１０６ｃｅｌｌ／ｍｌの大腸菌を入れてプレートを１８時間培養した。したがって、実験に使用されたペプチドの最終濃度の範囲は、３２μＭ〜０．５μＭとなる。１８時間の培養の後、マイクロプレートリーダー（Tecan i-control200 pro）を用いてＯＤ値を測定し、ＭＩＣ値を確認した。
【００４９】
その結果、表１で示したように、ＤＯＰＡを結合していないＮＫＣのＭＩＣ値は１であり、これと比較し、連結配列及び１個以上のＤＯＰＡを結合したＮＫＣのＭＩＣ値は８〜１６と確認され、接着性を付与したＮＫＣの抗菌力が減少したことを確認したが、これは他の抗菌ペプチドのＭＩＣ値（ＬＬ−３７（ＭＩＣ：４〜３２μＭ）、Ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ（ＭＩＣ：３６〜７２μＭ））と比較したとき、類似したレベルを示すため、細菌を死滅させるに十分な濃度であると考えられた。
【００５０】
実験例２．接着性抗菌ペプチドを用いたコーティング組成物の機能性の確認
実験例２−１．ＤＯＰＡ結合数に応じた接着性抗菌ペプチドのコーティング力の確認
ＤＯＰＡの結合数に応じた接着性のレベルについて知られていないため、最適なＤＯＰＡ数を確認するために、実験例１−１で製造したペプチドをポリスチレンの表面に１００μＭで１２時間コーティングし、ついているペプチドの量を確認した。具体的には、１００μＭのペプチド溶液をポリスチレン２４ウェルプレートに３００μｌずつ入れ、３７℃の培養器で１２時間コーティングした。コーティングした後、ウェルの溶液をピペットで取って体積を確認し、ＢＣＡアッセイを通じてコーティングされていないペプチドの濃度を測定した。最終的には、コーティング後の溶液の体積を考慮してペプチドの量を計算し、これをコーティング前の溶液のペプチド量と比較して溶液及び表面に存在するペプチドの量を確認した。
【００５１】
その結果、図１で示したように、ＤＯＰＡの数が多いほど、コーティング力が増加することを確認し、特に、ＤＯＰＡ数が３個以上である時、大幅に増加したことを確認した。
【００５２】
実験例２−２．接着性抗菌ペプチドがコーティングされた状態における抗菌力の確認
抗菌ペプチドがコーティングされた状態における抗菌力を確認するために、一部の方法が変更されたＩＳＯ  ２２１９６の方法で実験を行った。前記実験例２−１の結果に基づいて抗菌力の実験は、ＤＯＰＡがそれぞれ３、５、７個が結合されたＮＫＣ（それぞれＮＫＣ−Ｌ−Ｏ３、ＮＫＣ−Ｌ−Ｏ５、ＮＫＣ−Ｌ−Ｏ７）のみを使用した。ポリスチレンの表面にＮＫＣ−Ｌ−Ｏ３、ＮＫＣ−Ｌ−Ｏ５及びＮＫＣ−Ｌ−Ｏ７を濃度別（２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ）でコーティングした後、コーティングされた表面に対数増殖期である１０６ｃｅｌｌ／ｍｌの大腸菌を２４時間培養した。培養した後、培養液を一定の濃度に希釈してプレートに塗抹し、１６時間後にＣＦＵ値を確認した。前記ＣＦＵ値をコーティングしていない表面におけるＣＦＵ値と比較した大腸菌の死滅レベルを下記式を用いて示した。
【００５３】
抗菌力＝（１−試料表面のＣＦＵ／対照群のＣＦＵ）×１００
【００５４】
その結果、図２で示したように、ＮＫＣ−Ｌ−Ｏ５  １００μＭをコーティングした場合に最も高い抗菌活性を示し、ＮＫＣ−Ｌ−Ｏ３またはＮＫＣ−Ｌ−Ｏ５の場合、ＤＯＰＡの数及びＮＫＣの濃度に依存的な抗菌活性を示した。これは、ＮＫＣが濃度依存的な抗菌活性を示し、ＤＯＰＡの数に応じてコーティング力が増加するためであると判断される。
【００５５】
実験例３．接着性抗菌ペプチドのコーティング時間の最適化
実験例３−１．コーティング時間に応じたコーティング力の確認
実験例２−２で抗菌力が最も高いことが確認されたＮＫＣ−Ｌ−Ｏ５  １００μＭのコーティング条件を最適化するために、コーティング時間に応じた抗菌ペプチドのコーティング程度をＸ線光電子分光法（X-ray photoelectron spectroscopy、XPS）の分析を通じて確認した。ＸＰＳは、試料の表面にＸ線を入射し、放出される光電子を探知し、その結合エネルギーに基づいて試料表面の元素組成及び化学的な結合状態が分かる分光法である。ペプチドが表面にコーティングされた場合、コーティングされていない表面には存在しない窒素元素の含有量が増加するため、これを通じてペプチドが表面に存在することが分かる。ポリスチレン及びチタンの表面に１００μＭのＮＫＣ−Ｌ−Ｏ５を０（未処理群）、１、３、６、１２時間コーティングした後、Ｍｏｎｏｃｈｒｏｍａｔｉｃ  Ａｌ  Ｋα  Ｘ−ｒａｙを用いて炭素、窒素、酸素及びチタンに対する照射スペクトル（survey spectrum）及び高解像度スペクトル（high resolution spectrum）を確認した。
【００５６】
その結果、図３で示したように、ポリスチレン及びチタンはいずれもコーティング時間に応じて窒素含有量が増加し、チタンの場合、チタン元素の含有量が減少することを確認し、ＮＫＣ−Ｌ−Ｏ５がコーティング時間に応じて効果的にコーティングされることを確認した。
【００５７】
実験例３−２．コーティング時間に応じた抗菌力の確認
ＮＫＣ−Ｌ−Ｏ５  １００μＭのコーティング時間に応じた抗菌力を測定するために、コロニー計数アッセイ（colony counting assay）を行った。ポリスチレン２４ウェルプレートに１００μＭのＮＫＣ−Ｌ−Ｏ５を０（未処理群）、１、３、６、１２時間コーティングした後、コーティングされた表面に対数増殖期である１０６ｃｅｌｌ／ｍｌの大腸菌を２４時間培養した。培養した後、ＳＣＤＬＰ培地を３００ｕｌ入れて大腸菌細胞を回収し、これを一定の濃度に希釈し、ＬＢアガープレートに塗抹した。プレートを３７℃で１６時間培養した後、コロニーを計数した。  
【００５８】
その結果、図４で示したように、６時間まではコーティング時間に依存的な抗菌活性を示したが、１２時間コーティング時には、大腸菌の数が減少したことを確認した。したがって、１００μＭの濃度のＮＫＣ−Ｌ−Ｏ５を６時間コーティングする場合、最も優れた抗菌活性を有すると判断することができる。
【００５９】
さらに、ペプチドの濃度を２倍に増加した場合、コーティング時間を短縮させることができるかどうかを確認するために、２００μＭの濃度のＮＫＣ−Ｌ−Ｏ５を５分、１０分、３０分、１時間、３時間、６時間コーティングし、前記明示したような方法で抗菌力及びコーティング力を確認した。その結果、２００μＭのＮＫＣ−Ｌ−Ｏ５を１０分コーティングしたとき、１００μＭで６時間コーティングした表面と同程度の強い抗菌力を示した（＞９９．９９９％）（図４）。
【００６０】
実験例４．コーティングされた表面の特性の分析
実験例３−１のように、ＸＰＳ分析を通じて２００μＭのＮＫＣ−Ｌ−Ｏ５を１０分コーティングした基質の表面の特性を分析した。三つの基質（ポリスチレン、チタン、ＰＤＭＳ）に対して試験した結果、コーティングしていない表面に比べＮＫＣ−Ｌ−Ｏ５をコーティングしたポリスチレン（polystyrene）、チタン（titanium）、ＰＤＭＳ表面の窒素（Ｎ）の含有量が１４％台に増加し、チタン、ＰＤＭＳ表面の場合、コーティング後のＴｉの含有量またはＳｉの含有量が大幅に減少した（図５ａ）。これは、ＮＫＣ−Ｌ−Ｏ５が三つの表面に効果的にコーティングされることを示唆する。
【００６１】
また、コーティングしていない表面及びコーティングされた表面を原子間力顕微鏡（Atomic force microscope(AFM)）で確認した。ＡＦＭは探針が試料表面に触れながら、表面の形態（morphology）をイメージングする顕微鏡であり、これを利用して三つの基質（ポリスチレン、チタン、ＰＤＭＳ）に対してコーティング前後の表面を観測した。その結果、ＮＫＣ−Ｌ−Ｏ５が各表面に均一にうまくコーティングされることを確認した（図５ｂ）。
【００６２】
コーティングされた表面に対し、主要な感染菌株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対して抗菌力を示すかについて実験例３−２で記載した通り試験した。その結果、コーティングした表面に三つの菌株をそれぞれ２時間培養したとき、すべて死滅させた（図６）。
【００６３】
表面上に残っている微量のバクテリア（bacteria）が生物膜（biofilm）を形成しうるため、ＮＫＣ−Ｌ−Ｏ５でコーティングした場合、ｂａｃｔｅｒｉａが表面にくっつかず、成長することができないか、あるいは表面上に残っている細胞（cell）が生きている細胞（live cell）なのか、死んだ細胞（dead cell）なのかを確認するために、１０６の濃度のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓをコーティングしていない表面及びペプチドをコーティングした共焦点（confocal）用ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｌｉｄｅの表面に、３７℃で２４ｈ培養した後、表面を０．８５％のＮａＣｌ緩衝液（buffer）で洗浄した後、ＳＹＴＯ９及びＰｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）で表面に付いている細菌を染色し、共焦点レーザー走査型顕微鏡（confocal laser scanning microscope）で確認した。ＳＹＴＯ９は、生菌と死菌をいずれも染色することができる緑色の染料であり、ＰＩは死菌のみ染色することができる染料である。その結果、コーティングしていない表面では、多量の生菌が存在し、ＮＫＣ−ＤＯＰＡ５でコーティングされた表面では、微量の死菌が形態（morphology）が変わった状態で存在した（図７）。このような結果を通じてペプチドがコーティングされた表面で細菌が成長できないことを確認した。
【００６４】
実験例５．抗菌活性の持続性の確認
コーティングされたペプチドが如何に活性を維持できるかを確認するために、ＮＫＣ−Ｌ−Ｏ５がコーティングされた２４  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅを４℃あるいは２５℃で１、３、７、１４、２８、５６、８４日間保管した後、実験例３−２と同様な方法で抗菌活性を確認した。その結果、４℃で保管した場合、８４日まで高い抗菌活性を維持し、２５℃で保管した場合にも、９９．２％の抗菌活性を有した（図８）。  
【００６５】
実験例６．接着性抗菌ペプチドのヒト細胞株に対する細胞毒性の確認
ヒト細胞株に対する細胞毒性を確認するために、ＮＫＣ−Ｌ−Ｏ５をコーティングしたポリスチレン及びチタン、シリコンカテーテルの表面にヒトケラチン細胞であるＨａＣａＴ細胞株を培養した後、ＭＴＴアッセイを通じて細胞生存率を確認した。具体的には、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、１％ＮＥＡＡ）で培養したＨａＣａＴ細胞をとり、１２ウェル細胞培養プレートにウェル当たり５×１０４個の細胞を入れた。プレートを３７℃／５％のＣＯ２培養器で２４時間培養した。２４時間後、培養液を無血清ＤＭＥＭに交換した後、各ｗｅｌｌに１ｃｍ２の大きさのコーティングしていない表面またはＮＫＣ−Ｌ−Ｏ５を１００μＭの濃度で６時間コーティングした表面を入れた。陰性対照群として、界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を２％含むＤＭＥＭを入れて細胞を培養した。２４時間培養した後、１ｃｍ２の表面及び培地を除去し、ＭＴＴを含むＤＭＥＭ培地を入れ、３７℃／５％ＣＯ２の培養器で４時間培養した。培養した後、可溶化／停止のミックス溶液を入れ、一晩培養した後、５７０ｎｍで吸光度を測定した。
【００６６】
その結果、図９で示したように、コーティングしていない表面で培養した対照群の細胞生存率と比較し、ＮＫＣ−Ｌ−Ｏ５をコーティングした表面で培養した実験群の細胞生存率が有意な差を示さなかったことを確認し、ＮＫＣ−Ｌ−Ｏ５がヒト細胞株の成長に影響を与えない安全性の高いペプチドであることを確認した。
【００６７】
総合すると、本発明の接着性抗菌ペプチドは、ＮＫＣ−Ｌ−Ｏ５の形態で１００μＭの濃度で６時間コーティングしたとき、最も優れた抗菌力を示し、前記の条件でも細胞毒性を示さず、安全性の高い抗菌ペプチドであることを確認した。
【００６８】
さらに、ＮＫＣ−Ｌ−Ｏ５の濃度を２倍高めて２００μＭの濃度でコーティングした場合、１０分以内に効果的に表面にコーティングされて強い抗菌活性を示し（図４）、ヒト細胞に対する毒性を示さないことを確認した（図１０）。接着性抗菌ペプチドコーティングの溶血活性を検証するために、ヒツジ血液（sheep blood）をＰＢＳで洗浄した後、同一な緩衝液（buffer）を利用して５％（ｖ／ｖ）に希釈し、このように用意された赤血球溶液１００ｕｌを接着性抗菌ペプチドがコーティングされた９６ウェルプレートに入れ、３７℃で１時間反応させた後、反応液を遠心分離して得た上澄み液を新たな９６ウェルプレートに移した後、４１５ｎｍで吸光度を測定し、赤血球膜の損傷に伴うヘモグロビン（hemoglobin）の流出を確認した。この時、接着性抗菌ペプチドがコーティングされていないウェル（well）に処理された試料の吸光度を０％の溶血反応、０．２％のｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を処理した試料の吸光度を１００％の溶血反応と定義し、その結果、接着性抗菌ペプチドコーティングが溶血活性を示さないことを確認した（図１０ａ）。
【００６９】
また、ＮＫＣ−Ｌ−Ｏ５の濃度を２００μＭでコーティングした場合、ヒト細胞に対する細胞毒性を確認するために、ヒトケラチン細胞であるＨａＣａＴ細胞株を、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭを用いて８０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で２４ウェルプレートに入れた後、５％のＣＯ２の存在下で１６時間培養した。接着性抗菌ペプチドがコーティングされたＰＤＭＳピース（１ｃｍ２）をコーティングされた面が細胞（cell）と接触するようにウェルに入れた後、３７℃で２４時間反応させ、ＰＤＭＳピースを除去した後、細胞の生存度をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６−細胞増殖分析キット（cell proliferation assay kit(promega)）を使用して５９５ｎｍで吸光度を測定した。その結果、接着性抗菌ペプチドがコーティングされた生体材料（ＰＤＭＳ）がヒト細胞に対して毒性を示さないことを確認した（図１０ｂ）。
【００７０】
総合すると、本発明の接着性抗菌ペプチドは、ＮＫＣ−Ｌ−Ｏ５の形態で１００μＭの濃度だけでなく、前記濃度を２倍に高めた２００μＭでも優れた抗菌力を示し、前記条件でも細胞毒性を示さず、安全性の高い抗菌ペプチドであることを確認した。
【００７１】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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