(57)【要約】  本発明は、Ｃ型肝炎のポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びＣ型肝炎のポリペプチドＮＳ５ｂを含むペプチド化合物に関する。本発明はまた、ヌクレオチド配列がポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂをコードするアデノウイルス及びポックスウイルスといった発現ベクターにも関する。本発明の化合物は、治療の適用に用いることもできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルスのポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４、及びＣ型肝炎ウイルスのポリペプチドＮＳ５ｂを含むことを特徴とする、ペプチド組成物。
【請求項２】
ＮＳ３及び／又はＮＳ４及び／又はＮＳ５ｂが、異なる遺伝子型のウイルスに由来することを特徴とする、請求項１記載のペプチド組成物。
【請求項３】
ＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５ｂが、同じ遺伝子型、好ましくは遺伝子型１ｂのウイルスに由来することを特徴とする、請求項１記載のペプチド組成物。
【請求項４】
ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコードするヌクレオチド配列、及びポリペプチドＮＳ５ｂをコードするヌクレオチド配列、並びにそれらの発現に必要な手段を含むことを特徴とする、発現ベクター。
【請求項５】
ヌクレオチド配列が、異なる遺伝子型のウイルスに由来するポリタンパク質及びポリペプチドをコードすることを特徴とする、請求項４記載の発現ベクター。
【請求項６】
ヌクレオチド配列が、同じ遺伝子型、好ましくは遺伝子型１ｂのウイルスに由来するポリタンパク質及びポリペプチドをコードすることを特徴とする、請求項４記載の発現ベクター。
【請求項７】
該ベクターが、アデノウイルスであることを特徴とする、請求項４〜６のいずれか１項記載の発現ベクター。
【請求項８】
アデノウイルスのゲノムが、Ｅ１領域が発現カセットＣＭＶ−ＮＳ３−ＮＳ４により置換され、そしてＥ３領域が発現カセットＳＶ４０−ＮＳ５ｂにより置換されるように改変されていることを特徴とする、請求項７記載の発現ベクター。
【請求項９】
該ベクターが、ポックスウイルスであることを特徴とする、請求項４〜６のいずれか１項記載の発現ベクター
【請求項１０】
ポックスウイルスのゲノムが、発現カセットｐｈ５ｒ−ＮＳ３−ＮＳ４が挿入され、そして発現カセットｐ７．５−ＮＳ５ｂが挿入されるように改変されていることを特徴とする、請求項９記載の発現ベクター。
【請求項１１】
請求項４〜１０のいずれか１項記載の発現ベクターにより形質転換した微生物又は宿主細胞。
【請求項１２】
動物、好ましくはヒトのＣ型肝炎ウイルスにより引き起こされる感染の阻害、予防又は制御を意図した医薬製造のための、請求項１〜３のいずれか１項記載のペプチド組成物のか、又は請求項４〜１０のいずれか１項記載の発現ベクターのか、又はポリペプチドＮＳ５ｂをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを伴うポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター又は該ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及び該ポリペプチドＮＳ５ｂをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターの使用であって、該ヌクレオチド配列が請求項４〜１０のいずれか１項記載の発現ベクターに含まれる配列に対応し、該ペプチドの構成的及び／又は誘導的発現に必要なエレメントの制御下に置かれている、使用。
【請求項１３】
有効成分として、請求項１〜３記載のペプチド組成物、又は請求項４〜１０のいずれか１項記載の発現ベクター、又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを伴ってポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む、医薬組成物、特にワクチン。
【請求項１４】
薬学的に適切な媒体も含むことを特徴とする、請求項１３記載の医薬用組成物。
【請求項１５】
ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの発現ベクター及びポリペプチドＮＳ５ｂをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの発現ベクターを含むことを特徴とする、医薬用キット、特にワクチンのキット。
【請求項１６】
請求項７又は８記載の少なくとも１つの発現ベクター及び請求項９又は１０記載の少なくとも１つの発現ベクターを含むことを特徴とする、医薬用キット、特にワクチンのキット。
【請求項１７】
請求項４〜１０のいずれか１項記載の少なくとも１つの発現ベクター、又はポリペプチドＮＳ５ｂをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを伴ってポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの発現ベクター、及び
（ｉ）請求項１〜３記載の少なくとも１つのペプチド組成物、又は
（ii）ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列
含む医薬用キット、特にワクチンのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対抗する予防的及び治療的ワクチン接種の分野に関する。特に、２つの共直線性タンパク質ＮＳ３及びＮＳ４（以下、ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４と記載する）に対応するポリタンパク質、及びＮＳ５ｂにより構成されるポリペプチド含む新規組成物、この組成物を発現することができる、アデノウイルス又はポックスウイルスといったベクター、並びにそれらのワクチンとしての使用に関する。
【０００２】
Ｃ型肝炎は、輸血による後天性肝炎の主要な原因である。Ｃ型肝炎は、他の経皮ルートにより、例えば、静脈内ルートによる医薬の注射により伝染することもある。その上、健康についての専門家のこの汚染のリスクは無視できない。性的伝染については、すでに記載されている。
【０００３】
Ｃ型肝炎は、Ａ型、Ｂ型又はＤ型の肝炎といったウイルスに関連する肝臓疾患の他の型とは異なる。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ又はＨＣＶ）による感染は、多くの場合（５〜２０％）で、そして先進国では肝臓移植の３０％を示して、大抵は慢性的に肝臓の疾患、例えば、肝炎、肝硬変及び癌に至る。
【０００４】
輸血によるウイルスの伝染リスクは１９９０年代のスクリーニングテストの導入により減少したとはいえ、新たなＨＣＶ感染の頻度は依然高い。例えば、近年の研究において、フランス国では今日、年間でなおも１０，０００〜１５，０００の新たな感染例があると報告されている（S.Deufficら、Hepatology 1999; 29: 1596-1601）。現在、約１７，０００万人の人々が世界中で、慢性的にＨＣＶに感染している（Ｃ型肝炎：Global prevalence（最新版）、2000年、Weekly Epidemiological Record、Vol 75(3)）。このハイリスク人口は、主に病院関係者や注射薬の使用者であるが、これらのハイリスクグループに属さず、そして抗ＨＣＶ抗体の循環が見いだされた無症状の血液ドナーもいる。後者については、感染ルートは未だ特定されていない。従って、ＨＣＶ感染は存在し（５〜１０％の間であると見積もられる）、孤発性の感染として知られ、その病因は未知であり、そして制御することができない。
【０００５】
ＨＣＶは、分子生物学技術の手法により単離された第１の肝臓向性ウイルスであった。そのウイルスゲノム配列は、ウイルス粒子が可視化される前に、クローン化された。
【０００６】
ＨＣＶは、Flaviviridaeファミリー、hepacivirusesの新しい属である。９．５kbの、ポジティブの一本鎖ＲＮＡウイルスであり、それは相補的ＲＮＡコピーにより置換され、そしてその翻訳産物は約３，０００個のアミノ酸のポリタンパク質の前駆物質である。ＨＣＶゲノムの５’末端は、構造タンパク質、ヌクレオカプシドのコアタンパク質、２つのエンベロープ糖タンパク質、Ｅ１及びＥ２、並びにｐ７と称する小さいタンパク質をコードする遺伝子に隣接する非翻訳領域に対応する。５’非翻訳領域及び遺伝子コアは、異なる遺伝子型においても比較的よく保存されている。エンベロープタンパク質Ｅ１及びＥ２は、ある単離と別のものとではより可変である領域によりコードされている。タンパク質ｐ７は、極めて疎水性のタンパク質であり、イオンチャンネルを構成するかもしれない。ＨＣＶゲノムの３’末端は、非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５）及びよく保存されたドメインを保有する３’非コード配列領域をコードする遺伝子を含む（Major ME、Feinstone SM、Hepatology、1997年6月、25(6): 1527-1538）。
【０００７】
現在、Ｃ型肝炎の治療に最も有効な治療では、ペグ化したインターフェロン及びリバビリン（ribavin）を組み合わせる（Manns MPら、The Lancet、第22、2001年9月、Vol.358、958-965）。この治療は特に遺伝子型２及び３に属するウイルス株により感染された患者の場合には有効であるが、遺伝子型１ａ、１ｂ及び４についての効果は限定される（MannsMPら、前記）。処置した患者の５０％未満が、「長期的応答者」となっている。さらに、この治療は高額な診療であり（患者一人当たり年間１０，０００〜１５，０００ユーロ）、そして毒作用と関連する。実際、患者の５〜１０％が、やむを得ず完了前に治療を断念する。
【０００８】
従って、全ての遺伝子型をターゲットとするワクチン組成物の開発が必要である。
【０００９】
現在、いくつかの研究が、自然で（自発性の解決）又は処置後（治療的解決）ＨＣＶにより引き起こされる感染の制御は、Ｔ−ＣＤ４＋及びＴ−ＣＤ８＋リンパ球が関与する細胞媒介性の免疫応答の誘導又は相乗作用と関連すると、示している（例えば、LECHNER. F.ら、Eur. J. Immunol.、30: 2479-2487(2000)及びThimme R.ら、2001年、J. Exp. Med.、194(10): 1395-1406に記載されている）。
【００１０】
主要な組織適合性複合体の分子（ＭＨＣ、ヒトではＨＬＡとしても知られる）には、クラスＩ及びクラスＩＩがある。クラスＩ分子は、事実上全ての有核細胞に発現しており、そしてＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）へのエピトープ又はペプチドを提示することができる。クラスＩＩ分子は、ＣＤ４＋Ｔ細胞へエピトープを提示することができるが、その発現は抗原提示細胞に限定される。
【００１１】
Ｃ型肝炎ウイルスに対するワクチンは現在、アジュバンド組換えタンパク質、ペプチド、発現ベクターの使用に基づいて提起されており、それらのうちでは、ウイルス性若しくは細菌性由来であるか、又は裸のＤＮＡのベクターを挙げることができる。この場合、１つ以上のウイルス性タンパク質又は１つ以上のこれらのウイルス性タンパク質をコードする遺伝子を用いる。
【００１２】
いくつかのウイルス性タンパク質又はこれらのウイルス性タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を選択する場合、後者はしばしばいくつかの又は全部の構造タンパク質によってか（Makimuraら、1996年、Vaccine、14: 28-34; Fournilier A.ら、1999年、J. Virology、73: 7497-7504）、又は個別の非構造タンパク質によってか、又は少なくとも２つの隣接するタンパク質を含んでか（Brinsterら、2001年、Hepatology、34: 1206-1217）、又は構造及び非構造タンパク質の混合物によってかで（Pancholiら、2003年、J. Virology、77: 382-390）、構成される。
【００１３】
特許出願ＷＯ９９／３８８８０には、別々に３つのタンパク質ＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５（ａ及びｂ）をコードする３つの遺伝子の、これらの３つのタンパク質をそれぞれ別々に発現する３つのＤＮＡワクチンを含むワクチン組成物における使用が記載されている。この筆者は、マウスの３つの抗原に特異的なＴリンパ球の誘導を示す。ＮＳ５ａ及びｂを発現するワクチンだけが、保護試験においてｉｎ  ｖｉｖｏで試験されている。
【００１４】
特許出願ＷＯ０１／３０８１２には、非構造タンパク質ＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５ａにより構成される融合タンパク質であって、必要な場合には非構造タンパク質ＮＳ５ｂとの組み合わせにおける使用が記載されている。この筆者は、この組み合わせによりＨＣＶ特異的Ｔ細胞を活性化させることができると、示している。この特許出願は、単に特異的Ｔリンパ球により媒介される特異的免疫応答を誘導するために、融合タンパク質ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、又はタンパク質ＮＳ５ａを発現するワクチン製剤（裸のＤＮＡ、組換えアデノウイルス又は組換えワクシニアウイルス型）の能力を記載しているにすぎない。
【００１５】
出願人はここに、全予想に反し、非構造タンパク質ＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５ｂの特別な組み合わせ、共直線性に発現されるＮＳ３及びＮＳ４が、これらの非構造タンパク質とは違って、タンパク質ＮＳ５ａ及び／又は他のＨＣＶの構造タンパク質、例えば、コア、Ｅ１又はＥ２も含むワクチンと共に得られるものよりも優れた免疫原性の力と保護力を有し、そして特異的免疫応答を誘導するウイルス株により感染された患者に由来する細胞の能力に影響を及ぼすことを実証した。
【００１６】
このように、本発明の目的は、Ｃ型肝炎ウイルスのポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４だけでなく、Ｃ型肝炎ウイルスのポリペプチドＮＳ５ｂも含むペプチド組成物である。
【００１７】
本発明の目的はまた、このペプチド組成物をコードするヌクレオチド配列を含むベクター、例えば、アデノウイルス及びポックスウイルス、並びにこれらのベクターにより形質転換した微生物又は宿主細胞である。
【００１８】
最後に本発明の目的は、本発明のペプチド組成物に対する抗体、並びにＣ型肝炎ウイルスにより引き起こされる感染の阻害又は制御を意図した医薬製造のための、ワクチン組成物における、ペプチド組成物、ベクター及び抗体の使用である。
【００１９】
従って、本発明はＨＣＶのポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂにより構成される新規なペプチド組成物を提案するが、該組成物はＨＣＶに特異的な細胞媒介性の免疫応答を刺激する能力を有し、そのためＣ型肝炎に対する予防的及び治療的ワクチン接種の分野において有用である。
【００２０】
本発明のペプチド組成物のポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４は、タンパク質ＮＳ３並びにタンパク質ＮＳ４ａ及びｂにより構成されるが、天然のポリタンパク質におけるのと同じように、ペプチド配列内に中断はない。実際、前記したように、ＨＣＶゲノムはポリタンパク質へ転写される単一のオープンリーディングフレームを含む。このＨＣＶポリタンパク質は開裂して、少なくとも１０個の明確な部分、ＮＨ２−コア−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨを産生することができる。
【００２１】
タンパク質ＮＳ３は、ポリタンパク質のおよそアミノ酸１０２７からアミノ酸１６５７にあらわれる、６３０個のアミノ酸のタンパク質である。タンパク質ＮＳ４は、３１４個のアミノ酸のタンパク質であり、およそアミノ酸１６５８からアミノ酸１９７２にあらわれる（番号付けはＨＣＶ−１に関する）（Chooら、1991年、Proc. Natl. Acad. Sci.、vol88: 2451-2455）。従って、ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４は、アミノ酸１０２７からアミノ酸１９７２にあらわれる。
【００２２】
ポリペプチドＮＳ５ｂについても、本発明の組成物に含まれ、これは５９０個のアミノ酸により構成され、そしてポリタンパク質のおよそアミノ酸２４２１からアミノ酸３０１１にあらわれる（Chooら、1991年、前記）。
【００２３】
タンパク質ＮＳ３は、２つの異なる構造ドメイン、すなわちウイルス性ポリタンパク質の成熟に関与する有効なセリンプロテアーゼ活性を与えるＮ末端ドメイン、及びウイルスゲノムの複製に一役担うＮＴＰアーゼと関連するヘリカーゼ活性を含むＣ末端ドメインを含む。
【００２４】
「ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４」及び「ポリペプチドＮＳ５ｂ」については、もちろん全てのＨＣＶ株由来の天然アミノ酸配列を有するポリタンパク質及びポリペプチドだけでなく、その類似体、突然変異体及び相同体をも意味する。
【００２５】
ポリタンパク質及びポリペプチドの「類似体」又は「突然変異タンパク質」については、所望とする活性を有するような、すなわち前記細胞媒介性の免疫応答を刺激することができる関連分子の生物学的に活性な誘導体を意味する。
【００２６】
一般的に、用語「類似体」とは、天然のポリペプチド配列並びに１つ以上の付加、置換（一般的に天然では保存されている）及び／又はアミノ酸の欠失がある構造を有する化合物に、天然分子に比較して、改変が免疫原性の活性を破壊しない程度までで言及する。用語「突然変異タンパク質」については、特許出願ＰＣＴ  ＷＯ９１／０４２８２に記載されるような、ペプチドを疑似する１つ以上のエレメントを有するペプチド（ペプトイド）を意味する。好ましくは、類似体又は突然変異体は、少なくとも天然分子と同じ免疫活性を有する。ポリペプチド類似体及び突然変異体を作成する方法は、当該技術分野の技術者には既知であり、以下に記載する。
【００２７】
特に好ましい類似体には、天然で保存されている置換、すなわちアミノ酸のファミリーで行なわれる置換が挙げられる。特異的に、アミノ酸は４つのファミリー、すなわち（１）アスパラギン酸やグルタミン酸といった酸性アミノ酸、（２）リジン、アルギニンやヒスチジンといった塩基性アミノ酸、（３）アラニン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンやトリプトファンといった非極性アミノ酸、及び（４）グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニンやチロシンといった極性荷電アミノ酸に、一般的には分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、時には芳香族アミノ酸として分類される。例えば、ロイシンがイソロイシン又はバリンに、アスパラギン酸がグルタミン酸に、スレオニンがセリンにといった隔離された置換、又は１個のアミノ酸が構造的に関係のある別のアミノ酸にという類似する保存的置換は、生物学的活性に主要な効果を有することはないものと、合理的に予見することができる。当該技術分野の技術者であれば、当該技術分野で周知であるHopp/ WoodsやKyte-Doolittle plotsを参照することにより、変更を許容することができる目的ペプチド分子の領域を容易に決定することができるであろう。
【００２８】
「相同性」とは、ポリタンパク質やポリペプチドといった、２つのペプチド分子間の同一性の百分率を意味する。２個のアミノ酸配列は、その配列が少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０〜８５％でもあり、より好ましくは少なくとも９０％でもあり、そしてなおもより好ましくは少なくとも９５〜９８％又はそれ以上のペプチド分子の明確にした長さにわたる配列同一性を有する場合に、互いに「より高く又はより低く相同性」である。
【００２９】
一般的に、用語「同一性」とは、２つのペプチド配列のアミノ酸とアミノ酸との正確な一致に言及する。同一性の百分率は、配列を整列し、２つの整列した配列間のミスマッチの正確な数を計数し、より短い配列の長さで割り、そしてその結果を１００で掛けることによる２つの分子間の配列情報の直接比較によって、決定することができる。同一性の百分率は、Atlas of Protein Sequence and Structure M. O. Dayhoffed.におけるDayhoff, M. O.、1981年、補足5、3: 482-489、ALIGNといったコンピュータプログラムを用いて決定することもできる。
【００３０】
ＨＣＶ株及び分離株、並びに特にタンパク質ＮＳ３、タンパク質ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂのかなりの数の核酸及びアミノ酸配列は、すでに決定されている。
【００３１】
例えば、分離株ＨＣＶ−Ｊ１が、Okamoto H.ら、1992年、Nucleic Acids Res.、20: 6410-6410に記載されている。２つの独立したＨＣＶ分離株、すなわち分離株ＨＣＶ−Ｊ及び−ＢＫの完全なコード配列は、Katoら、1990年、Proc. Natl. Acad.、Sci.、87: 9524-9528及びTakamizawaら、1991年、J. Virol.、65: 1105-1113にそれぞれ記載されている。分離株ＨＣＶ−１に関しては、Chooら、1990年、Brit. Med. Bull.、46: 423-441及びChooら、1991年、前記に記載されている。分離株ＨＣＶ−Ｈは、Inchauspe G.ら、1991年、Proc. Natl. Acad. Sci.、88: 10292-10296に記載されている。分離株ＨＣＶ−Ｇ９は、Okamoto H.ら、1994年、J. Gen. Virol.、45: 629-635に記載されている。分離株ＨＣＶ−Ｊ６及び−Ｊ８は、Okamoto H.ら、1991年、J. Gen. Virol.、72: 2697-2704及びOkamoto H.ら、1992年、Virology、188: 331-341にそれぞれ記載されている。分離株ＨＶＣ−ＢＥＢＥ１は、Nako H.ら、1996年、J. Gen. Virol.、141: 701-704に記載されており、そして分離株ＨＣＶ−ＮＺＬ１は、Sakamoto M.ら、1994年、J. Gen. Virol.、75: 1761-1768に記載されている。分離株ＨＣＶ−Ｔｒに関しては、Chayama K.ら、1994年、J. Gen. Virol.、75: 3623-3628に記載されている。分離株ＨＣＶ−ＥＤ４３及び−ＥＵＨ１４８０は、Chamberlain R. W.ら、1997年、J. Gen. Virol.、78: 1341-1347及びChamberlain R. W.ら、1997年、Biochem. Biophys. Res. Commun.、236: 44-49にそれぞれ記載されている。分離株ＨＣＶ−ＥＵＨＫ２は、Adams A.ら、1997年、Biochem. Biophys. Res. Commun.、234: 393-396に記載されている。分離株ＨＣＶ−ＶＮ２３５、−ＶＮ４０５及び−ＶＮ００４は、Tokita H.ら、1998年、J. Gen. Virol.、79: 1847に記載されている。最後に、分離株ＨＣＶ−ＪＫ０４９及び−ＪＫ０４６に関しては、Tokita H.ら、1996年、J. Gen. Virol.、77: 293-301に記載されている。
【００３２】
ＨＣＶ株及び分離株は、前記したように、異なる遺伝子型、すなわち遺伝子型１ａ（分離株ＨＣＶ−１、−Ｊ１及び−Ｈ）、１ｂ（分離株ＨＣＶ−Ｊ及びＢＫ）、１ｃ（分離株ＨＣＶ−Ｇ９）、２ａ（分離株ＨＣＶ−Ｊ６）、２ｂ（分離株ＨＣＶ−Ｊ８）、２ｃ（分離株ＨＣＶ−ＢＥＢＥ１）、３ａ（分離株ＨＣＶ−ＮＺＬ１）、３ｂ（分離株ＨＣＶ−Ｔｒ）、４ａ（分離株ＨＣＶ−ＥＤ４３）、５ａ（分離株ＨＣＶ−ＥＵＨ１４８０）、６ａ（分離株ＨＣＶ−ＥＵＨＫ２）、７ｂ（分離株ＨＣＶ−ＶＮ２３５）、８ｂ（分離株ＨＣＶ−ＶＮ４０５）、９ａ（分離株ＨＣＶ−ＶＮ００４）、１０ａ（分離株ＨＣＶ−ＪＫ０４９）及び１１ａ（分離株ＨＣＶ−ＪＫ０４６）を有していてもよい。
【００３３】
本発明の一実施態様に従えば、ＮＳ３及び／又はＮＳ４及び／又はＮＳ５ｂは、異なる遺伝子型のウイルスに由来する。
【００３４】
別の実施態様に従えば、ＮＳ３及び／又はＮＳ４及び／又はＮＳ５ｂは、同じ遺伝子型、好ましくは遺伝子型１ｂのウイルスに由来する。
【００３５】
本発明のペプチド組成物に含まれるポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂは、天然由来であっても、組換え体由来であってもよい。
【００３６】
天然由来のポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂは、ＨＣＶ株又は分離株から、天然ウイルスの配列を増幅するように働く合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、標的とするウイルスの遺伝子型に感染した患者の血清からか、又は例えば、患者の血液又は肝臓に、若しくは予め発現ベクターにおいて遊離又はクローン化された相補的ＤＮＡに、また若しくは生物学的試料若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖系から精製したウイルス粒子に由来するすでに精製したウイルスＲＮＡからの遺伝子型から得られる。
【００３７】
組換え体由来の本発明のポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂも、遺伝子工学技術により得られるが、これは以下の工程：
−前記ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４又は前記ポリペプチドＮＳ５ｂをコードするヌクレオチド配列を用いて形質転換した微生物又は真核生物細胞の培養、及び
−前記微生物又は前記真核生物細胞により産生されるペプチドの回収
を含む。
【００３８】
この技術は、当該技術分野の技術者には周知である。これに関してより詳しくは、以下の研究：Recombinant DNA Technology I、Editors Ales Prokop、Raskesh K Bajpai; Annals of the New-York Academy of Sciences、Volume 646、1991年を参照するとよい。
【００３９】
ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂをコードするヌクレオチド配列は、遺伝子工学的アプローチと併せた化学合成によってか、遺伝子工学単独によって、当該技術分野の技術者に周知であり、そして例えば、Sambrook J.ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、1989年に記載された技術を用いて調製することができる。
【００４０】
ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂをコードするヌクレオチド配列は、本発明のペプチド組成物を得るために、適切な発現系で発現ベクターに挿入することができる。
【００４１】
もちろん、ヌクレオチド配列は、単一の発現ベクターへも、又は２つの異なる発現ベクターへも挿入することができる。後者の場合は、ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコードする配列を２つのベクターのうちの一方に挿入し、そしてポリペプチドＮＳ５ｂをコードする配列を他方のベクターに挿入するが、これらの２つのベクターは性質について同一であっても異なっていてもよい。
【００４２】
このように、本発明の別の目的は、ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコードするヌクレオチド配列及びポリペプチドＮＳ５ｂをコードするヌクレオチド配列、並びにそれらの発現に必要な手段を含む発現ベクターである。
【００４３】
ペプチドの発現に必要な手段については、タンパク質、ポリタンパク質、ポリペプチド等といった全てのペプチド分子に用いられる用語、ペプチド、特にプロモーター、転写終結因子、複製起点、及び好ましくは選択マーカーを得ることを可能とする全ての手段を意味する。
【００４４】
ペプチドの発現に必要な手段は、目的ペプチドをコードする核酸配列に、作動的に連結される。「作動的に連結する」とは、発現に必要な前記エレメントの、そして目的ペプチドをコードする遺伝子の並列を意味し、それらは予想される方法でそれらが機能できるような関係にある。例えば、付加塩基は、それらの機能的関係が保存される程度に、プロモーターと目的遺伝子の間に存在することができる。
【００４５】
ペプチドの発現に必要な手段は相同な手段であってもよく、すなわち用いるベクターのゲノムに含まれるか、又は非相同であってもよい。後者の場合は、前記手段を、発現させる目的ペプチドと共にクローン化する。
【００４６】
異種性のプロモーターの例としては、（ｉ）ウイルス性プロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（サルウイルス４０）、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子のプロモーター（ＴＫ−ＨＳＶ−１）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の即時第１プロモーター及びアデノウイルス主要最終プロモーター（ＭＬＰ）、並びに（ii）上記真核生物におけるペプチドをコードする遺伝子の転写を制御する全ての細胞プロモーター、例えばジホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子（ＰＧＫ）の構成プロモーター（Adraら、1987年、Gene、60: 65-74）、平滑筋細胞に特異的な、肝臓特異的アルファ−１抗トリプシン及びＦＩＸ遺伝子及びＳＭ２２プロモーター（Moesslerら、1996年、Development、122: 2415-2425）が挙げられる。
【００４７】
本発明の一実施態様に従えば、前記ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及び前記ポリペプチドＮＳ５ｂをコードするヌクレオチド配列は、異なる遺伝子型に由来する。
【００４８】
別の実施態様に従えば、前記ポリタンパク質及び前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、同じ遺伝子型、好ましくは遺伝子型１ｂのウイルスに由来する。
【００４９】
ここでまた、「ヌクレオチド配列」については、前記したように、天然ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及び天然ポリペプチドＮＳ５ｂだけでなく、それらの類似体、突然変異タンパク質及び相同体をコードする配列全てを意味する。
【００５０】
発現ベクターに含まれる前記配列は、直接的に単一のプロモーター及び／又は単一の発現調節エレメントの制御下に連結されてもよいし、又はそれぞれ独立して同一の又は異なる発現プロモーター及び／又はレギュレーターに依存して、分離していてもよい。
【００５１】
本発明の目的にとって適切な発現ベクターとしては、例えば、プラスミド、アデノウイルス型ウイルスベクター、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、サルモネラ型細菌ベクター、ＢＣＧを挙げることができる。
【００５２】
アデノウイルスは、多くの動物種で検出されているが、組み込みはせず、そして病原性はほんのわずかである。それらは種々の細胞型、分割中の細胞及び静止時の細胞に感染することができる。それらは、気管支上皮への天然指向性を有する。さらに、それらは長年にわたり腸内の生ワクチンとして、極めて安全な特性をもって使用されてきた。最後に、それらは容易に増殖させることも、大量に精製することもできる。これらの特徴は、アデノウイルスが特に発現ベクターとして、そして特に治療目的やワクチンのための遺伝子治療ベクターとしての使用に適切であることを意味する。
【００５３】
好ましい実施態様によれば、本発明のベクターは、アデノウイルスである。
【００５４】
本発明に用いられるアデノウイルスの例は、ヒト又は動物起源のいかなる源に由来するものであってもよく、特にイヌ起源（例えば、ＣＡＶ−１又はＣＡＶ−２；それぞれGenbank CAV1GENOM及びCAV77082を参照のこと）、トリ起源（Genbank AAVEDSDNAを参照のこと）、ウシ起源（例えば、BAV3、Seshidhar Reddyら、1998年、J. Virol.、72: 1394-1402）、ヒツジ、ネコ、ブタ起源、サル起源、又はそれらのハイブリッドのいずれかに由来するものであってもよい。いかなる血清型を用いてもよい。しかし、ヒト起源のアデノウイルス、特にアデノウイルス５（ＡｄＩＶ）が好ましい。
【００５５】
一般的に、前記したウイルスは、ＡＴＣＣコレクションズから入手可能であり、そしてその配列、その機構及びその生物学を記載するたくさんの刊行物の題材があり、それにより当該技術分野の技術者が容易にそれらを用いることが可能である。例えば、アデノウイルスの型５の配列は、Genbankデータベース（Ｍ７３２６０及びＭ２９９７８）に記載されており、そして参照により本明細書中に取り込まれている。
【００５６】
アデノウイルスのゲノムは、ウイルスサイクルの終結に必要な約３０遺伝子より多い約３６kbを担持する２本鎖直鎖ＤＮＡ分子により構成される。第１の遺伝子は、アデノウイルスのゲノムに分散している４つの領域に分割されている（Ｅ１〜Ｅ４）。Ｅ１、Ｅ２及びＥ４領域は、ウイルス複製に必要不可欠である。Ｅ３領域は、突然変異体ウイルスが自然に生じること、又はこのＥ３領域を失ったハイブリッドウイルスは培養細胞中で野生型ウイルスのように複製し続けるという観察に基づくと、必要不可欠な領域ではないと見なされる（Kelly及びLewis、1973年、J. Virol.、12: 643-652）。最後の遺伝子（Ｌ１〜Ｌ５）は、主にウイルスキャプシドを構成する構造遺伝子をコードする。それらは、少なくとも部分的に第１転写ユニットに重なり、そして単一のプロモーターから転写される（主要な後のプロモーターについては、ＭＬＰ）。さらに、アデノウイルスゲノムは、ＤＮＡ複製に必要不可欠なシスに働く領域の２つの末端で、５’及び３’の反転した末端反復（ＩＴＲｓ）並びにパッケージング配列をそれぞれ担持する。
【００５７】
現在、遺伝子治療プロトコールで用いられているアデノウイルスは、Ｅ１領域の大部分をはぎとり、その複製のレベルでウイルスを不完全とし、そのため環境や宿主生物体においてその伝播が避けられている。さらに、ほとんどのアデノウイルスは、Ｅ３領域もはぎとり、そのクローニング能を増大させている。これらのベクターを用いた遺伝子移入の可能性は、種々の組織においてｉｎ  ｖｉｖｏで実証されている（例えば、Yeiら、1994年、Hum. Gene Ther.、5: 731-744; Daiら、1995年、Proc. Natl. Acad Sci. USA、92: 1401-1405; US6,099,831; 及びUS6,013,638を参照のこと）。
【００５８】
好ましくは、発現ベクターとしてアデノウイルスに用いられるプロモーターは、ＣＭＶやＳＶ４０プロモーターといった異種性のプロモーターである。
【００５９】
また好ましくは、ＣＭＶプロモーターはポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４のプロモーターであり、そして発現ベクターは該ポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列として、発現カセットＣＭＶ−ＮＳ３−ＮＳ４を含む。
【００６０】
「発現カセット」とは、ベクターに挿入される、目的ペプチドの発現のためのプロモーター及びオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ配列を意味する。
【００６１】
また好ましくは、ＳＶ４０プロモーターはポリペプチドＮＳ５ｂのプロモーターであり、そして発現ベクターは該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列として、発現カセットＳＶ４０−ＮＳ５ｂを含む。
【００６２】
本発明の一実施態様に従えば、アデノウイルスのゲノムは、Ｅ１領域が発現カセットＣＭＶ−ＮＳ３−ＮＳ４により置換され、そしてＥ３領域が発現カセットＳＶ４０−ＮＳ５ｂにより置換されるように改変されている。
【００６３】
発現ベクターへのＤＮＡ配列の抑制及び／又は挿入の方法は、当該技術分野の技術者に周知であり、そして特に、酵素消化及び連結の工程からなる。
【００６４】
本発明の目的に特に適切な別の発現ベクターはポックスウイルスであり、これは本発明の別の実施態様を構成する。
【００６５】
ポックスウイルスは、外皮に包まれた複合体ウイルスのグループを構成し、その通常の形態、その大きいＤＮＡゲノム及びその細胞質複製部位は主に異なっている。ポックスウイルス（poxviridae）の数個のエレメントのゲノムは、ワクシニアウイルス（ＶＶ）のコペンハーゲン株（Goebelら、1990年、Virol.、179: 247-266及び517-563）、及び改変されたワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）株（Antoineら、1998年、Virol.、244: 635-396）を含み、マッピングされ、そして配列決定されている。ＶＶ株は約２００個のタンパク質をコードする約１９２kbの２本鎖ＤＮＡゲノムを保有しており、そのうち約１００個はウイルスの組立に関与している。ＭＶＡ株は、ワクシニアウイルス株を高度に弱毒化した株であり、トリ胚繊維芽細胞上での５００継代を越える一連のワクシニアウイルスアンカラ株（ＣＶＡ）によって産生された（Mayrら、1975年、Infection、3: 6-16）。ＭＶＡウイルスは、the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ）に番号１−７２１で、寄託されている。ＭＶＡゲノムの完全な配列の決定及びＶＶのものとの比較により、ウイルスゲノムにある変更の正確な同定、並びに断片化したオープンリーディングフレームに至る、７個の欠失（Ｉ〜VII）及び多数の突然変異の決定が可能となる（Antoineら、1998年、Virology、244: 365-396）。
【００６６】
本発明の目的に適切なポックスウイルスの他の例としては、カモポックス、家禽ポックス、ウシポックス、昆虫ポックス、サルポックス、ブタポックス及びペンギンポックスが挙げられる。
【００６７】
ポックスウイルスには、２つの形態学的に異なる型が見いだされており、細胞内成熟ウイルス（ＩＭＶ）及び外皮に包まれた細胞外ウイルス（ＥＥＶ）と称する。
【００６８】
本発明の発現ベクターとして用いられるポックスウイルスは、以下の特徴：
（ｉ）ポックスウイルスが、ＭＶＡウイルスであること、
（ii）ポックスウイルスが、ＩＭＶ形態の型であること、及び
（iii）ポックスウイルスのゲノムが、発現カセットＮＳ３／ＮＳ４が挿入され、そして発現カセットＮＳ５ｂが挿入されるように改変されていること
のうちの少なくとも１つを、単独又は組み合わせで有する。
【００６９】
ポックスウイルスのゲノムに目的の２つのカセットを挿入するように改変する際は、その発現に必要な手段は相同性となる。このように、ＭＶＡウイルスを用いる場合は、ＮＳ３／ＮＳ４の発現は、例えばプロモーターｐｈ５ｒの制御下に、対応する発現カセットがｐｈ５ｒ−ＮＳ３−ＮＳ４となるようにすることができ、そしてＮＳ５ｂの発現は、例えばプロモーターｐ７．５の制御下に、対応する発現カセットがｐ７．５−ＮＳ５ｂとなるようにすることができ、そして逆もまた同じである。
【００７０】
特別な実施態様に従えば、ポックスウイルスのゲノムを２つの目的カセットを挿入するように改変する際は、２つの該発現カセットを同じ方向に志向させる。
【００７１】
別の特別な実施態様に従えば、それらは反対の方向に志向させられる。
【００７２】
ここでも、発現カセットは、ポックスウイルスのゲノム中へ当該技術分野の技術者に既知の方法で、前記したように挿入される。
【００７３】
本発明のベクターは、特別な細胞区画に向けたペプチドを標的とするのに必要な配列を含むこともできる。標的とする例は、アデノウイルスのタンパク質Ｅ３に由来するリーダー配列型のアドレス配列を用いて得られる小胞体に向けての標的とすることである（Ciernik I.F.ら、The Journal of Immunology、1999年、162、3915-3925）。
【００７４】
それらはまた、樹状細胞に向けた標的とするために、そして細胞の膜での標的とするために、必要な配列を含むこともできる。
【００７５】
本発明の目的はまた、本発明の発現ベクターにより形質転換した微生物及び真核生物細胞でもある。
【００７６】
本発明の目的に適した微生物の例としては、酵母を挙げることができるが、例えば以下のファミリー：Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Kluveromyces、Pichia、Hanseluna、Yarrowia、Schwantomyces、Zygosaccharomyces、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces carlsbergensis及びKluveromyces lactisのものが好ましく、そして細菌、例えばE.coli、そして以下のファミリー：Lactobacillus、Lactococcus、Salmonella、Streptococcus、Bacillus及びStreptomycesのものが挙げられる。
【００７７】
真核生物細胞の例としては、ほ乳類、は虫類、昆虫及びそれに相当するものなどの動物に由来する細胞が挙げられる。好ましい真核生物細胞は、チャイニーズハムスター（ＣＨＯ細胞）、サル（ＣＯＳ及びＶｅｒｏ細胞）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ細胞）、ブタ腎臓（ＰＫ１５細胞）及びウサギ腎臓（ＲＫ１３細胞）、ヒト骨肉腫細胞系（１４３Ｂ）、ＨｅＬａヒト細胞系及びヒト肝癌細胞系（Ｈｅｐ  Ｇ２型細胞）、並びに昆虫細胞系（例えば、Spodoptera frugiperda）由来の細胞が挙げられる。
【００７８】
宿主細胞は、懸濁で又はフラスコ内での培養で、組織培養、器官培養やそれに等しいものとして、提供される。宿主細胞は、トランスジェニック動物であってもよい。
【００７９】
本発明はまた、前記本発明のペプチド組成物のいずれか、又は前記本発明の発現ベクターのいずれかに対する抗体にも関する。
【００８０】
本発明に従った抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。
【００８１】
前記ポリクローナル抗体は、動物を、「目的の抗原」として本発明のペプチド組成物で、又は本発明のベクターで免疫化し、その後該動物の血清をサンプリングすることにより、精製した形で狙った抗体の回収をし、そして抗体が特異的に認識する抗原、特には目的のウイルス抗原を固定したカラムでアフィニティークロマトグラフィーを特にすることにより、血清中の他の成分から該抗体を分離して、得ることができる。
【００８２】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術によって得ることができ、その一般的原理を以下に再度記載する。
【００８３】
第１の工程では、動物、一般的にはマウスを、（又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫化の枠組みでの培養の細胞を）、「目的の抗原」として本発明のペプチド組成物で、又は本発明のベクターで免疫化し、それによりそのＢリンパ球は該抗原に対する抗体を産生することができる。そして、これらの抗体産生リンパ球を「不死の」ミエローマ細胞（例えば、マウスの）と融合させ、ハイブリドーマを産生する。そして、このようにして得られた細胞の異種性混合物から、特別な抗体を産生し、不確定に増殖することができる細胞の選択がなされる。各ハイブリドーマをクローンの型で増殖させると、それぞれモノクローナル抗体を産生することとなり、目的の抗原に対する認識特性は、例えばＥＬＩＳＡ、１以上の次元でのイムノトランスファー、免疫蛍光により、又はバイオカプターを用いて、試験することができる。このようにして選択したモノクローナル抗体を、その次に特には前記アフィニティークロマトグラフィー技術に従って、精製する。
【００８４】
ペプチド組成物、発現ベクター、前記ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及び前記ポリペプチドＮＳ５ｂをコードするヌクレオチド配列、並びに本発明の抗体は、ＨＣＶウイルスを保因する患者の感染の阻害、予防及び制御に特に有効であり、医薬の調製のためのそれらの使用は、本発明の別の目的を構成する。
【００８５】
本発明はまた、有効性分として本発明のペプチド組成物、又は本発明の発現ベクター、又はポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコードするヌクレオチド配列を、ポリペプチドＮＳ５ｂをコードするヌクレオチド配列若しくは該ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及び該ポリペプチドＮＳ５ｂをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを伴って、含む発現ベクターを含有する薬学的組成物、特にワクチンにも関し、本発明の発現ベクターに含まれる配列に対応する前記ヌクレオチド配列は、本発明の前記ペプチド、又は少なくとも１つの抗体から構成され、及び／又は誘導されうる発現に必要なエレメントの制御下に置かれている。
【００８６】
ペプチドの構成的な発現に必要なエレメントとは、真核生物細胞に遍在するか又は特異的なプロモーターを意味する。
【００８７】
ペプチドから誘導されうる発現に必要なエレメントとしては、テトラサイクリン耐性のためのＥ．ｃｏｌｉのオペロンの調節エレメントが挙げられる（Gossen M.ら、Proc Natl Acad Sci USA、89: 5547-5551(1992年)）。
【００８８】
本発明の特別な実施態様に従えば、薬学的組成物は薬学的に適切な媒体も含む。もちろん、当該技術分野の技術者であれば、容易に薬学的に適切な媒体の性質及び薬学的組成物の成分の作用として用いられるポリペプチドの量を決定することができるであろう。
【００８９】
薬学的に適切な媒体の量及び性質は、当該技術分野の技術者によれば容易に決定することができる。それらは、所望とする剤形及び投与方法に従って、選択される。
【００９０】
本発明の薬学的組成物は、経口、舌下、皮膚下、筋肉内、静脈内、局所的、局所性、気管内、鼻腔内、経皮、直腸、眼内、耳介内投与に適しており、前記有効成分は投与の単位剤形で投与することができる。
【００９１】
投与の単位剤形は、例えば錠剤、ゼラチンカプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤若しくは注射可能な経口懸濁剤、経皮パッチ剤、舌下、頬側、気管内、眼内、鼻腔内、耳介内の、又は吸入投与の形、局所的、経皮、皮膚下、筋肉内若しくは静脈内投与の形、直腸投与の形又は植込錠であってもよい。局所投与については、クリーム剤、ゲル剤、軟膏、ローション剤又は洗眼液が予想される。
【００９２】
これらの生薬の形は、当該技術分野で慣用の方法に従って、調製される。
【００９３】
前記単位剤形は、製剤形態に従って、体重１kg当たり０．００１〜１０mgの有効成分が一日に投与されるように、服用される。
【００９４】
より高い又はより弱い服用が適する特別な場合もあり、本発明の範囲はこのような用量を超えない。通常の治療によれば、各患者に適した用量は、投与方法、患者の体重や応答に従って、医師により決定される。
【００９５】
本発明の別の実施態様に従えば、本発明はまた、Ｃ型肝炎と関連する症状の治療法にも関し、これは有効量の本発明の医薬を患者に投与することを含む。
【００９６】
本発明の薬学的組成物は、予防的及び治療的ワクチン接種において有用となるように、好ましくは有効成分として、本発明のベクター、又はポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコードするヌクレオチド配列を、ポリペプチドＮＳ５ｂをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを伴って、含む発現ベクターのいずれかを含有する。
【００９７】
予防的及び治療的ワクチン接種は、本発明の１以上の発現ベクターに基づくワクチンを、発現ベクター又はベクターが最終的に有効成分としてポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂをコードする程度に、注射することにより実行することができ、該注射は追加免疫しても、又はしなくてもよい。最初にアデノウイルスを、そしてポックスウイルスを、同時に又は別々に、そして逆もまた同様に、本発明の発現ベクターの２つの異なる型を注射して実行してもよい。
【００９８】
これらのベクターを、薬学的キットに含ませてもよい。
【００９９】
また、本発明の別の目的は、ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの発現ベクター及びポリペプチドＮＳ５ｂをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの発現ベクターを含む薬学的キット、特にワクチンのものである。
【０１００】
本発明の別の目的は、前記アデノウイルス型の少なくとも１つの発現ベクター及び／又は前記ポックスウイルス型の少なくとも１つの発現ベクターを含む薬学的キット、特にワクチンのものである。
【０１０１】
予防的及び治療的ワクチン接種はまた、本発明の少なくとも１つの発現ベクター、又はポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコードするヌクレオチド配列を、ポリペプチドＮＳ５ｂをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを伴って、含む発現ベクター、そして本発明のペプチド組成物又は本発明の抗体により構成される本発明の少なくとも１つの薬学的組成物に基づいたワクチンの接種により実行することができる。本発明の少なくとも１つの発現ベクター、又はポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコードするヌクレオチド配列を、ポリペプチドＮＳ５ｂをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを伴って、含む発現ベクター、そしてポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に基づいたワクチンの接種によっても実行することができる。
【０１０２】
また、本発明の別の目的は、本発明の少なくとも１つの発現ベクター、又はポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコードするヌクレオチド配列を、ポリペプチドＮＳ５ｂをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを伴って、含む発現ベクター、そして本発明の少なくとも１つの薬学的組成物又はポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む薬学的キット、特にワクチンのものである。
【０１０３】
本発明は以下の実施例を用いてより深く理解されるであろうが、それらは説明の手段としてのみ与えられるものであり、限定的なものではなく、また添付の図１〜７を用いており、ここで：
−図１Ａ〜１Ｋは、本発明に従ったアデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために用いられる異なるプラスミドの地図を表しており、そこには異なる制限酵素、及びＮＳ３／ＮＳ４を、そしてＮＳ５ｂをコードする配列断片の位置が示されている、
−図２Ａ〜２Ｈは、本発明に従ったポックスウイルスＭＡＶ  ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために用いられた異なるプラスミドの地図を表しており、そこには異なる制限酵素、及びＮＳ３／ＮＳ４及びＮＳ５ｂをコードする配列断片の位置が示されている、
−図３は、エピトープＧＬＬを用いて培養の脾細胞を刺激し、そしてＣＴＬターゲットを負荷し、そしてその結果、エフェクター／ターゲット比率の関数として、特異的な溶解百分率を表すＣＴＬ試験（図３Ａ）によるか、又はエピトープＧＬＬに特異的なＥＬＩＳＰＯＴ試験（図３Ｂ）によって、結果をスポット／１０６細胞個の数で示し、アデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４により誘導された細胞の応答を示している、
−図４は、エピトープＡＬＹ及びＫＬＰに特異的な試験ＥＬＩＳＰＯＴによって、アデノウイルスＡｄＮＳ５ｂにより誘導された細胞の応答を示している、
−図５は、エピトープＤＬＭを用いて培養の脾細胞を刺激し、そしてＣＴＬのターゲットを負荷し、そしてその結果、エフェクター／ターゲット比率の関数として、特異的な溶解百分率を表すＣＴＬ試験により、アデノウイルスＡｄＣＥ１Ｅ２により誘導された細胞の応答を示している、
−図６は、異なるアデノウイルスの組合わせ：ＡｄＮＳ３ＮＳ４＋ＡｄＮＳ５ｂ（第１のグループ）、アデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４＋ＡｄＮＳ５ｂ＋ＡｄＮＳ５ａ（第２のグループ）、アデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４＋ＡｄＮＳ５ｂ＋ＡｄＣＥ１Ｅ２（第３のグループ）及びアデノウイルスＡｄβＧａｌ（第４のグループ）により免疫化した８匹のマウスの４つのグループについて、pfu／ml／mg卵巣での、トライアル試験による結果から、組換えワクシニアウイルスのタイターを示す、
−図７は、以下の異なるアデノウイルスの組合わせ：ＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂ（第１のグループ）、ＡｄＮＳ３ＮＳ４＋ＡｄＮＳ５ｂ（第２のグループ）及びＡｄβＧａｌ（第３のグループ）により免疫化した８匹のマウスの３つのグループについて、pfu／ml／mg卵巣での、トライアル試験による結果から、組換えワクシニアウイルスのタイターを示す。
【０１０４】
実施例１：本発明に従った、タンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びＮＳ５ｂを発現することができるアデノウイルスの調製
１．アデノウイルス
組換えアデノウイルスを、ＰａｃＩによるゲノムの直線化後、相補性系２９３（Graham、Smileyら、1977年）のトランスフェクションにより産生する。組換えウイルスを増殖させ、この同じ系について増幅させ、そして感染した細胞からそれらの精製を行う。細胞を遠心分離（１５００rpm、１０分）して回収し、３回の凍結／解凍サイクルにより溶解させる。細胞ライセートを２回遠心分離（２０００rpm、１０分；８０００rpm、１５分）して清澄にし、次に２回連続して超遠心分離して精製する。最初に、塩化セシウム勾配（密度１．４及び１．２５）を、３０，０００rpmで１時間実施した。第２に、塩化セシウムクッション（密度１．３４）を、３５，０００rpmで１８時間実施した。ビリオンを含有する相を除去し、そして６０％ショ糖緩衝液で半分に希釈する。次に、ウイルス懸濁液をフォーミュレーション緩衝液（１０リットルについて、３４２３ｇのショ糖；１２．１１ｇのＴｒｉｓ；２．０３３ｇのＭｇＣｌ２；８７．７ｇのＮａＣｌ）に対して透析し、そしてアリコートとする。それらの滴定は、異なるウイルス希釈で感染した２９３個の細胞についての間接免疫蛍光により実施し、アデノウイルスのＤＮＡ結合タンパク質（α７２Ｋ  Ｂ６−８）に特異的な抗体によりマークする（Reich、Sarnowら、1983年）。
【０１０５】
２．アデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４の調製
このアデノウイルスは、ＣＭＶプロモーターの制御下で、ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４（配列番号１及び２）をコードする遺伝子を発現することができる。
【０１０６】
２．１ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコードするヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅
これをするために、以下のオリゴヌクレオチド：
【０１０７】
【表１】
2007527207.tif 000002
【０１０８】
、及び以下の試薬：
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ緩衝液、ＭｇＣｌ  １．５mM及びｄＮＴＰ  １０mM（Invitrogen）を用いた。
【０１０９】
ＰＣＲ条件は、以下のように：
９４℃で５分、次に
シリーズ：９４℃で４５秒、６２℃で４５秒及び７２℃で１分、を３０サイクル、そして
７２℃で１０分
とした。
【０１１０】
２．２転移プラスミドｐＴＧ１３３８７へのＰＣＲ断片ＮＳ３／ＮＳ４の挿入
以下の工程：
−プラスミドｐＴＧ１３３８７（図１Ａ、Transgene）を、ＮｈｅＩ／ＭｌｕＩ（ＮｈｅＩ、Invitrogen、反応４緩衝液中、そしてＭｌｕＩ、Invitrogen、反応３緩衝液中）により酵素消化、
−断片ＮＳ３／ＮＳ４を、ＮｈｅＩ／ＭｌｕＩにより酵素消化、
−反応緩衝液（Invitrogen）中でライゲーション（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Invitrogen)）、
−細菌の形質転換（株５Ｋ、（Transgene））、
−細菌クローンの、ＬＢ培地（Difco）＋アンピシリン（１００μg／ml、Duchefa）での選択、
−制限分析後の陽性クローンのプラスミドの最大調製（Qiagen、製造者のプロトコールに従う）、
−制限分析：ＳｍａＩ（Invitrogen、反応４緩衝液中）による消化、及び断片：５４５０、２１６４、９０９、２１４及び１８０bpの獲得、
−そのＥ１領域から欠失し、ＣＭＶプロモーターの制御下で配列ＮＳ３／ＮＳ４を含むプラスミドｐＩＶ３１５の取得（図１Ｂ）
を実施した。
【０１１１】
２．３プラスミドｐＴＧ６６２４に含まれるそのＥ３領域から欠失した完全なアデノウイルスのゲノムとの相同性の組換え
以下の工程：
−前記獲得したプラスミドｐＩＶ３１５を、ＰａｃＩ／ＰｖｕＩ（ＰａｃＩはＮＥＢ１緩衝液中、Ｂｉｏｌａｂｓ及びＰｖｕＩは反応７緩衝液中、Invitrogen）により酵素消化；カセットｐＣＭＶ−ＮＳ３−ＮＳ４を含む断片のアガロースゲルでの単離、
−プラスミドｐＴＧ６６２４（図１Ｃ）を、ＣｌａＩ（反応１緩衝液中、Invitrogen）により酵素消化、
−細菌の形質転換（株ＢＪ、（Transgene）、２つのプラスミド断片間での相同性の組換えを実施するため）、
−細菌クローンの、ＬＢ培地＋アンピシリン（１００μg／ml）での選択、
−制限分析後の陽性クローンのプラスミドの最大調製（Qiagen）、
−制限分析：ＳｍａＩによる消化、及び断片：２２６３、６２１、３８１４、２１４、２１６４、９０９、１８０、２４６３、６４８０、１３９８、４４５６、１４５５、３５４０、３３８６、２３０及び３６８５bpの獲得、
−そのＥ３及びＥ１領域から欠失し、後者を発現カセットｐＣＭＶ−ＮＳ３−ＮＳ４で置換した完全なアデノウイルスのゲノム、アデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４の獲得（ｐＩＶ３１７、図１Ｄ）
を実施した。
【０１１２】
３．アデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂの調製
このアデノウイルスは、ＣＭＶプロモーターの制御下で、ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコードする遺伝子の発現を、そしてＳＶ４０プロモーターの制御下でポリペプチドＮＳ５ｂをコードする遺伝子の発現をすることができる。
【０１１３】
３．１アデノウイルスのＥ３領域で、コード配列のクローニングをすることができる転移プラスミドの、ＣＭＶプロモーターの制御下での構築
以下の工程：
−プラスミドｐＴＧ４６６４（図１Ｅ、Transgene）を、ＢｇｌＩＩ（反応３緩衝液中、Invitrogen）により酵素消化、
−プラスミドｐＴＧ３０７４（図１Ｆ、Transgene）を、ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ（反応３緩衝液中、Invitrogen）により酵素消化、
−ライゲーション（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）、細菌の形質転換（株５Ｋ）、
−細菌クローンの、ＬＢ培地＋アンピシリン（１００μg／ml）での選択、
−制限分析後の陽性クローンのプラスミドの最大調製（Qiagen）、
−制限分析：ＳｍａＩによる消化、及び断片：４９４０、１３０５及び２３０bpの獲得、
−プラスミドｐＩＶ２６７の獲得（図１Ｇ）、
−このようにして得たプラスミドｐＩＶ２６７の、ＣｌａＩ／ＭｕｎＩ（反応１緩衝液中、Invitrogen）による消化、
−ＤＮＡポリメラーゼＩ、大きい（クレノウ）断片（反応２緩衝液中、Invitrogen）による処理、
−ライゲーション（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）、
−細菌の形質転換（株５Ｋ）、
−細菌クローンの、ＬＢ培地＋アンピシリン（１００μg／ml）での選択、
−プラスミドの最大調製（Qiagen）、
−制限分析：ＳｍａＩによる消化、及び断片：４６９２、１３０５及び２３０bpの獲得、
−プラスミドｐＩＶ２７０、アデノウイルスのＥ３領域で、コード配列を、ＣＭＶプロモーターの制御下にクローニングをすることができる転移プラスミドの獲得（図１Ｈ）、
を実施した。
【０１１４】
３．２ｐＩＶ２７０における、ＣＭＶプロモーターのＳＶ４０プロモーターによる置換
以下の工程：
−ＳＶ４０プロモーターに対応するヌクレオチド断片を、市販のプラスミドｐｃＤＮＡＨｙｇｒｏ（Clontech）から、以下のオリゴヌクレオチド：
【０１１５】
【表２】
2007527207.tif 000003
【０１１６】
を用いて、温度を６２℃の代わりに５８℃とした以外は、前記ポイント２．１に記載の手順に従って、ＰＣＲ増幅、
−ｐＩＶ２７０を、ＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ（反応１０緩衝液中、Invitrogen）により酵素消化、
−ＰＣＲ断片を、ＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩにより酵素消化、
−ライゲーション（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）、細菌の形質転換（株５Ｋ）、
−細菌クローンの、ＬＢ培地＋アンピシリン（１００μg／ml）での選択、
−制限分析後の陽性クローンのプラスミドの最大調製（Qiagen）、
−制限分析：ＳｍａＩによる消化、及び断片：４６９２、７１９、８０及び２３０bpの獲得、
−プラスミドｐＩＶ３３０、アデノウイルスのＥ３領域で、コード配列を、ＳＶ４０プロモーターの制御下にクローニングすることができる転移プラスミドの獲得（図１Ｉ）、
を実施した。
【０１１７】
３．３ＰＣＲ断片ＮＳ５ｂの、転移プラスミドｐＩＶ３３０への挿入
以下の工程：
−タンパク質ＮＳ５ｂをコードするヌクレオチド配列（配列番号３及び４）を、以下のヌクレオチド：
【０１１８】
【表３】
2007527207.tif 000004
【０１１９】
を用いて、温度を６２℃の代わりに６０℃とした以外は、前記ポイント２．１に記載の手順に従って、ＰＣＲ増幅、
−前記で得たプラスミドｐＩＶ３３０を、ＸｂａＩ（反応２緩衝液中、Invitrogen）により酵素消化、
−ＰＣＲ断片を、ＸｂａＩにより酵素消化、
−ライゲーション（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）、細菌の形質転換（株５Ｋ）、
−細菌クローンの、ＬＢ培地＋アンピシリン（１００μg／ml）での選択、
−制限分析後の陽性クローンのプラスミドの最大調製（Qiagen）、
−制限分析：ＳｍａＩによる消化、及び断片：４６９２、１５０５、７６０、７１９及び２３０bpの獲得、
−プラスミドｐＩＶ３３６、Ｅ３欠失に配列ＮＳ５ｂを含み、ＳＶ４０プロモーターの制御下にある転移プラスミドの獲得（図１Ｊ）、
を実施した。
【０１２０】
３．４組換えアデノウイルスのゲノムｐＩＶ３１７を用いた相同性組換えによる、表題アデノウイルスの獲得
以下の工程：
−前記ポイント２．３で獲得したプラスミドｐＩＶ３１７を、ＳｒｆＩ（ユニバーサル緩衝液中、Stratagene）により消化、
−ポイント３．３で獲得したプラスミドｐＩＶ３３６を、ＮｈｅＩ／ＳａｃＩＩ（緩衝液Ｔ中、Amersham Pharmacia Biotech）により消化、及びアガロースゲルでのカセットｐＳＶ−ＮＳ５ｂを含む断片の単離、
−２つのプラスミド間の相同性組換えを実施するための、細菌の形質転換（株ＢＪ）、
−細菌クローンの、ＬＢ培地＋アンピシリン（１００μg／ml）での選択、
−制限分析後の陽性クローンのプラスミドの最大調製（Qiagen）、
−制限分析：ＳｍａＩによる消化、及び断片：６４８０、４４５６、３８１４、３５４０、３３８６、２７３９、２４６３、２２６３、２１６４、１４５５、１３９８、１１０５、９０９、７６０、７１９、６２１、２３０、２１４及び１８０bpの獲得、
−Ｅ１領域から欠失して、後者を発現カセットｐＣＭＶ−ＮＳ３−ＮＳ４で置換し、そしてＥ３領域から欠失して、後者を発現カセットｐＳＶ−ＮＳ５Ｂで置換した、所望とする完全なアデノウイルスのゲノムの獲得（プラスミドｐＩＶ３４２、図１Ｋ）、
を実施した。
【０１２１】
４．異なるアデノウイルスへ挿入した抗原の発現の確認
アデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４、ＡｄＮＳ５ｂ及びＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂによりコードされるＨＣＶ抗原の発現を、Ｈｕｈ７細胞の感染後、ウェスタンブロットにより検証した。
【０１２２】
予想通り、全ての抗原が発現した。
【０１２３】
実施例２：本発明に従った、タンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びＮＳ５ｂを発現することができるポックスウイルスの調製
１．ＭＶＡポックスウイルス
改変ウイルスアンカラＭＶＡＴＧ  Ｎ３３の株を、ＴＲＡＮＳＧＥＮＥ  Ｓ．  Ａ．（フランス国ストラスブール）により提供した。
【０１２４】
２．ｐｈ５ｒプロモーターの制御下の、遺伝子ＮＳ３／ＮＳ４を発現することができる転移プラスミドの調製
２．１ＭＶＡの組換えアームＢＲＧ２及びＢＲＤ２、並びにプロモーターｐｈ５ｒ（ＭＶＡ）制御下の選択遺伝子ＧＰＴ、その後に続く目的遺伝子を発現させるための第２のプロモーターｐｈ５ｒを含むｐＩＶ２５０ベクターの構築
この目的では、断片ｐｈ５ｒ−ＧＰＴ−ＢＲＧ３−ｐｈ５ｒ（プラスミドｐＴＧ９９９７に由来する、Transgene）を、組換えアームＢＲＧ２及びＢＲＤ２を含むプラスミドｐＴＧ６０１８（Transgene）へ挿入することが、所望とされる。
【０１２５】
これをするために、以下の工程：
−ＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ（反応２緩衝液中、Invitrogen）により、ベクターｐＴＧ６０１８を酵素消化（図２Ａ）、
−プラスミドｐＴＧ９９９７を、ＢａｍＨＩにより酵素消化、次にＳａｃＩにより部分的に消化（図２Ｂ）、
−ｐｈ５ｒ−ＧＰＴ−ＢＲＧ３−ｐｈ５ｒをコードする配列を含む１０４７bpの制限断片を、ＱＩＡＧＥＮのプロトコルに従って精製、
−ライゲーション（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）、細菌の形質転換（株ＴＧ１、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、
−細菌クローンの、アンピシリン（１００μg／ml）での選択、
−制限分析（ＥｃｏＲＶ＋ＨｉｄＩＩＩ（反応２緩衝液中、Invitrogen）：２４６、４３９、４７６、８２６及び２７８９bpの断片；ＳａｃＩ：９１５及び３８６１bpの断片）後の陽性クローンのプラスミドの最大調製（Qiagen）、
−狙ったプラスミドの獲得（ｐＩＶ２５０、図２Ｃ）、
を実行した。
【０１２６】
２．２タンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコードするヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅
以下のオリゴヌクレオチド：
【０１２７】
【表４】
2007527207.tif 000005
【０１２８】
を用いて、温度を６２℃の代わりに５２℃とした以外は、前記実施例１のポイント２．１の手順に従った。
【０１２９】
２．３プラスミドｐＩＶ２５０へのＰＣＲ  ＮＳ３−ＮＳ４断片の挿入
これをするために、以下の工程：
−前記ポイント２．１で獲得したプラスミドｐＩＶ２５０の、ＰｓｔＩ（反応２緩衝液中、Invitrogen）／ＸｂａＩによる酵素消化、
−ＰＣＲ断片ＮＳ３／ＮＳ４の、ＰｓｔＩ／ＸｂａＩによる酵素消化、
−ライゲーション（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）、細菌の形質転換（株ＴＧ１）、
−細菌クローンの、アンピシリン（１００μg／ml）での選択、
−制限分析：（ＨｉｎｄＩＩＩ（反応２緩衝液中、Invitrogen）：４７６３及び２７８９bpの断片；ＳｐｈＩ（反応６緩衝液中、Invitrogen）：１５３４及び５９９１bp；ＮｃｏＩ（反応３緩衝液中、Invitrogen）：２７６４及び４７６１bp）後、陽性クローンのプラスミドの最大調製（Qiagen）、
−プロモーターｐｈ５ｒの制御下で、ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコードする配列を含む転移プラスミドの獲得（ｐＩＶ３２７、図２Ｄ）
を実施した。
【０１３０】
３．ｐ７．５プロモーターの制御下で、タンパク質ＮＳ５ｂを発現させるプラスミドｐＩＶ３２８の調製
３．１タンパク質ＮＳ５ｂをコードするヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅
以下のヌクレオチド：
【０１３１】
【表５】
2007527207.tif 000006
【０１３２】
を用いて、温度を６２℃の代わりに５２℃とした以外は、前記実施例１のポイント２．１の手順に従った。
【０１３３】
３．２プラスミドの獲得
以下の工程：
−ＮＳ５ｂをコードするＰＣＲ断片の、ＳａｌＩ／ＳｐｈＩによる酵素消化、
−ｐＴＧ１８６（図２Ｅ、Transgene）の、ＳａｌＩ／ＳｐｈＩによる酵素消化、
−ベクターｐＴＧ１８６（ＲＯＣＨＥアルカリホスファターゼ）の脱リン酸、
−ライゲーション（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）、細菌の形質転換（株ＴＧ１）、
−細菌クローンの、アンピシリン（１００μg／ml）での選択、
−制限分析：（ＨｉｄＩＩＩ：１９８４、２６２７及び４４３７bpの断片；ＢｇｌＩＩ：３２１、５５７、１３６１、１４５１、２２３７及び３１２１bpの断片；ＫｐｎＩ（反応４緩衝液中、Invitrogen）：２７８７及び６２６１bpの断片）後、陽性クローンのプラスミド最大調製（Qiagen）、
−ｐ７．５プロモーターの制御下で、ポリペプチドＮＳ５ｂをコードする配列を含む転移プラスミドの獲得（ｐＩＶ３２８、図２Ｆ）、
を実施した。
【０１３４】
４．ｐｈ５ｒプロモーターの制御下でポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコードする遺伝子を、そしてｐ７．５プロモーターの制御下でポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコードする遺伝子を発現させる転移プラスミドｐＩＶ３２９及びｐＩＶ３４４の調製
これをするために、以下の工程：
−タンパク質ＮＳ５ｂをコードするヌクレオチド配列を、前記ポイント３．２で獲得したプラスミドｐＩＶ３２８から、以下のオリゴヌクレオチド：
【０１３５】
【表６】
2007527207.tif 000007
【０１３６】
を用いて、温度を６２℃の代わりに５２℃とした以外は、前記実施例１のポイント２．１の手順に従ったＰＣＲ増幅、
−ＰＣＲ断片を、ＸｂａＩにより酵素消化、
−前記ポイント２．３で獲得したプラスミドｐＩＶ３２７を、ＸｂａＩにより酵素消化、
−ライゲーション（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）、細菌の形質転換（株ＴＧ１）、
−細菌クローンの、アンピシリン（１００μg／ml）での選択、
−制限分析：（ＰｓｔＩ：ｐＩＶ３２９：３０３３及び６４６６bpの断片、ｐＩＶ３４４：４６４１及び４８５８bpの断片；ＡｐａＩ（反応４緩衝液中、Invitrogen）：ｐＩＶ３２９：４５４、９６０及び８０８５bpの断片、ｐＩＶ３４４：４５４、１４１８及び７６２７bpの断片；ＮｃｏＩ：ｐＩＶ３２９：４２６９、４６９及び４７６１bpの断片、ｐＩＶ３４４：３０５３、１６８５及び４７６１bpの断片；ＳｍａＩ：ｐＩＶ３２９：２１４、２１６４、１４４４及び５６７７bpの断片、ｐＩＶ３４４：２１４、２１６４、９２８及び６１９３bpの断片）後、２つの陽性クローンのプラスミドの最大調製（Qiagen）、
−ｐｈ５ｒプロモーターの制御下でポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４を、そしてｐ７．５プロモーターの制御下でタンパク質ＮＳ５ｂを発現させる転移プラスミドであって、２つの発現カセットが同じ方向に置かれているものか（ｐＩＶ３２９、図２Ｇ）、又はｐｈ５ｒプロモーターの制御下でポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４を、そしてｐ７．５プロモーターの制御下でタンパク質ＮＳ５ｂを発現させる転移プラスミドであって、２つの発現カセットが反対の方向に置かれているもの（ｐＩＶ３４４、図２Ｈ）の獲得、
を実施した。
【０１３７】
５．異なるポックスウイルスへ挿入した抗原の発現の確認
Ｈｕｈ７細胞を、ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂをコードする配列を含むポックスウイルスｐＩＶ３２９及びｐＩＶ３４４に関するポックスウイルスで感染後、発現した前記ＨＣＶ抗原を、ウェスタンブロットにより確認した。
【０１３８】
実施例３：ＮＳ３／ＮＳ４及びＮＳ５ｂの組合せの免疫原性の実証
１．マウスの免疫化
ＨＬＡ−Ａ２．１トランスジェニックマウスを、一旦、以下のアデノウイルス：
−前記実施例１（ポイント２．３）で調製したＡｄＮＳ３ＮＳ４、
−前記実施例１（ポイント３．３）で調製したＡｄＮＳ５、
−以下のヌクレオチドプライマー：
【０１３９】
【表７】
2007527207.tif 000008
【０１４０】
を用いて、ポリペプチドＮＳ５ａをコードするヌクレオチド配列（配列番号５及び６）を増幅し、ＰＣＲ温度を５６℃の代わりに６２℃とし、ｐＴＧ１３３８７及び断片ＮＳ５ａの酵素消化をＫｐｎＩ／ＸｂａＩにより、１８０及び７２５１bpの断片を産生するｐＴＧ１３３８７を、そして２２６３、６２１、５６１５、１８０、２４６３、６４８０、１３９８、４４５６、１４５５、３５４０、３３８６、２３０及び３６８５bpの断片を産生するｐＴＧ６６２４をＳｍａＩにより消化する制限分析を実施した以外は、実施例１のポイント２の手順に従って調製したＡｄＮＳ５ａ、
−以下のヌクレオチドプライマー：
【０１４１】
【表８】
2007527207.tif 000009
【０１４２】
を用いて、コア−Ｅ１−Ｅ２ポリタンパク質（ＣＥ１ＣＥ２とも称する）をコードするヌクレオチド配列（配列番号７及び８）を増幅し、ＰＣＲ温度を５６℃の代わりに６２℃とし、ｐＴＧ１３３８７及び断片ＣＥ１ＣＥ２の酵素消化をＮｈｅＩ／ＸｂａＩにより、１６３、４３５、２２７０、１８０及び５２５４bpの断片を産生するｐＴＧ１３３８７を、そして２２６３、６２１、３６１８、１６３、４３５、２２７０、１８０、２４６３、６４８０、１３９８、４４５６、１４５５、３５４０、３３８６、２３０及び３６８５bpの断片を産生するｐＴＧ６６２４をＳｍａＩにより消化する制限分析を実施した以外は、実施例１のポイント２の手順に従って調製したＡｄＣＥ１ＣＥ２、
−前記実施例１（ポイント３）で調製したＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂ、及び
−ＡｄβＧａｌ（Transgene）
から選択される少なくとも１つのアデノウイルスを筋肉注射して、そして以下のプロトコル：
−ＡｄＮＳ３ＮＳ４を１０９pfu、又は
−ＡｄＮＳ５ｂを１０９pfu、又は
−ＡｄＣＥ１Ｅ２を１０９pfu、又は
−ＡｄＮＳ３ＮＳ４を１０９pfu及びＡｄＮＳ５ｂを１０９pfu、又は
−ＡｄＮＳ３ＮＳ４を１０９pfu、ＡｄＮＳ５ｂを１０９pfu及びＡｄＮＳ５ａを１０９pfu、
−ＡｄＮＳ３ＮＳ４を１０９pfu、ＡｄＮＳ５ｂを１０９pfu及びＡｄＣＥ１Ｅ２を１０９pfu、
−ＡｄＮＳ３ＮＳ４  ＮＳ５ｂを１０９pfu、又は
−コントロールとして、Ａｄβ−Ｇａｌを１０９pfu
に従って、免疫化した。
【０１４３】
免疫化の前に、免疫化に用いた異なるアデノウイルスによるＨＣＶ及びβ−Ｇａｌ抗原の発現を、ウェスタンブロットにより検証した。
【０１４４】
２．ＣＴＬ及びＥＬＩＳＰＯＴ試験
感染後１５日で、マウスの脾臓細胞（脾細胞）を単離して、細胞応答を分析し、そしてＣＴＬ試験及びＥＬＩＳＰＯＴ試験を以下のように実施した：
【０１４５】
ＣＴＬ試験では、これらの脾細胞を２４ウェルプレート上で：
−ＡｄＮＳ３ＮＳ４を受けたマウスに由来する脾細胞の場合は、エピトープＧＬＬ（ＧＬＬＧＣＩＩＴＳＬ、配列番号２４）を５μＭ、ＡｄＮＳ５ｂを受けたマウスに由来する脾細胞の場合は、エピトープＡＬＹ（ＡＬＹＤＶＶＳＴＬ、配列番号２５）を５μＭ若しくはエピトープＫＬＱ（ＫＬＱＤＣＴＭＬＶ、配列番号２６）を５μＭ、又はＡｄＣＥ１Ｅ２を受けたマウスに由来する脾細胞の場合は、エピトープＤＬＭ（ＤＬＭＧＹＩＰＬＶ、配列番号２７）を５μＭであるが、前記エピトープは（Eurogentex）からの合成ペプチドであり、そして
−５日間で、アルファ最小必須培地（αＭＥＭ）中、ml当たり１０Ｕのマウス組換えインターロイキン２（Brinsterら、Hepatology 2001年）
の存在下、培養した。５日目に、再刺激のステージを実施したが、これは２日間、前記エピトープの存在下にある培養中の脾細胞へ、未処置のマウス脾細胞を添加することからなるものであった。７日目に、ＣＴＬ試験を実施したが、これは培養７日後の免疫化したマウスの脾細胞（エフェクター細胞）と、１０μＭの前記エピトープを負荷し、Ｃｒ５１で標識したＥＬ４  Ｓ３−Ｒｏｂ  ＨＤＤ細胞（標的細胞）を、接触させることからなるものであった。エフェクター細胞の特異的な細胞障害性活性は、標的細胞とのインキューベーションの４時間後に、標的細胞を溶解して遊離したＣｒ５１を、γ−Ｃｏｂｒａ  ＩＩ計測機器（Packard、フランス国ランギス）を用いて測定し、決定した。培地単独で、又は溶解緩衝液（ＨＣｌ  ＩＮ）のいずれかを含むウェルからの最大の自然遊離を測定した。細胞毒性の特異的な百分率は、式：
（試験での遊離−自然な遊離）／（最大の遊離−自然な遊離）×１００
により計算した。エピトープ特異的な溶解は、前記エピトープの存在下で、又は欠損下で得た特異的な溶解の百分率間の差異により決定した。
【０１４６】
ＥＬＩＳＰＯＴ試験は、抗インターフェロンガンマ抗体（ＩＦＮγ）（１０μg／ml最終）で予め被覆したマルチスクリーン９６ウェルプレート（Millipore）で、脾細胞を４８時間培養することにより実施した。前記したように、脾細胞をαＭＥＭ中でml当たり、１０μＭの適切なエピトープ及び１０Ｕのマウス組換えインターロイキン２の存在下、培養した。ポジティブコントロールとして、脾細胞をコンカナバリンＡ（５μg／ml）の存在下で培養した。ネガティブコントロールとしては、脾細胞を、配列ＤＬＭＧＹＩＰＬＶ（無関係のペプチドともいう）の、ＨＣＶのキャプシドタンパク質に属する非特異的ペプチドの存在下、又はエピトープ欠損の培地単独中で、培養した。ウェルを０．０５％ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで、次にＰＢＳでそれぞれ３回洗浄したが、操作後、ビオチン化マウスの抗ＩＦＮｙ抗体と共に２時間インキュベーションした。洗浄後、ウェルをストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ複合体と共に１時間インキュベーションし、そして酵素活性をＡＥＣ（アミノエチルカルバゾール）基質の分解により発生させた。得られたスポットを、Zeiss ELISpotリーダー（KS-ELISpotソフトウェアを伴ったZeiss顕微鏡）を用いて計数した。
【０１４７】
結果を図３〜５に示すが、図中Ｍはマウスに、そしてＮｅｇ．マウスはコントロールのマウスに対応する。
【０１４８】
これらの結果は、
−図３Ａ及び３Ｂに図示したように、ＮＳ３に含まれるエピトープＧＬＬに特異的なＴリンパ球の検出により、ＡｄＮＳ３ＮＳ４は、明らかに発現した抗原に特異的な細胞媒介性の応答を誘導すること、
−図４に図示したように、ＮＳ５ｂに含まれるエピトープＡＬＹ及びＫＬＱに特異的なＴリンパ球の検出により、ＡｄＮＳ５ｂは、明らかに発現した抗原に特異的な細胞媒介性の応答を誘導すること、
−図５に図示したように、コアタンパク質に含まれるエピトープＤＬＭに特異的なＴリンパ球の検出により、ＡｄＣＥ１Ｅ２は、明らかに発現した抗原に特異的な細胞媒介性の応答を誘導すること
を実証する。
【０１４９】
３．組換えワクシニアウイルスを用いたｉｎ  ｖｉｖｏトライアル試験
異なるアデノウイルスに誘導される特異的な免疫応答が、感染の疾患トライアルに対する保護（「ｉｎ  ｖｉｖｏ保護」）を誘導することができるか否かを評価するために、このようなトライアルに対するマウスをワクチン接種した。
【０１５０】
ＨＣＶにより直接感染されないマウスを、感染に対する特異的な免疫応答及び耐性の誘導と関連するように、ＨＣＶの非構造タンパク質（ＮＳ２〜ＮＳ５ｂ）をコードする組換えワクシニアウイルス（株ＷＲ）を用いて、このトライアルを実施した。この組換えワクシニアウイルスを、１０７pfuをマウスに腹膜内注射後、動物内で複製させる。このウイルスの複製は、ワクシニア抗原及びＨＣＶ抗原の両者に特異的な免疫応答を誘導し、またＨＣＶのＮＳタンパク質を発現する。マウスはＨＣＶ抗原を発現するワクチンをすでに受けたので、このＨＣＶ抗原に特異的な応答は全て、より有効で、活発となる。言い換えれば、より有効なワクチン接種（この場合は、組換えアデノウイルスで実施した）がなされると（すなわち、マウスの免疫系がワクチンにより有効に「抗原刺激された」）、組換えワクチンウイルスによるトライアル後は、より強い抗ＨＣＶ応答がなされ、結果的にマウスがこのトライアルに対してより「保護」される。実際、マウスで計数される残留ワクシニアウイルスがより低いと、ワクチン接種に起因する保護又は中和はより有効となった。
【０１５１】
ワクシニアウイルスの中和は、ＨＣＶタンパク質により誘導される細胞応答と、ワクシニアタンパク質により誘導される細胞応答との両方を反映する。中和は、以下のようにして、動物の卵巣から残留のワクシニアウイルスを滴定することにより評価する：卵巣をトライアル後４日に除去し、超音波処理し、次に遠心分離後３回凍結解凍し、上清の連続希釈をＨｕｔｋ細胞で溶解プラーク技術（Murataら、PNAS、vol.100、p.6753-6758）に従って、滴定する。ウイルスタイターは、卵巣のpfu／ml／mgで決定する。
【０１５２】
４．ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂを組合わせたワクチン接種の優れた保護の実証
ワクチンの組換えウイルスタイターを、以下のアデノウイルスの組合せ：ＡｄＮＳ３ＮＳ４＋ＡｄＮＳ５ｂ（第１グループ）、ＡｄＮＳ３ＮＳ４＋ＡｄＮＳ５ｂ＋ＡｄＮＳ５ａ（第２グループ）、ＡｄＮＳ３ＮＳ４＋ＡｄＮＳ５ｂ＋ＡｄＣＥ１Ｅ２（第３グループ）及びＡｄβＧａｌ（第４グループ）により、免疫化した８匹のマウスの４つのグループについて決定した。
【０１５３】
結果を図６に示すが、これは平均の比較に基づき、２つの独立したサンプルｘ及びｙの値の比較させるWilcoxon Mann-Whitney non-parametric試験（Methodes Statistiques a l'usage des medecins et des biologistes、Collection Statistique en Biologie et en Medecine、Flammarion Medecine Sciences、(D.Schwarz)、1977年）に基づいて統計学的に処理している。
【０１５４】
この試験は、以下のように実施している：比較する２つのグループｘ及びｙの全ての値を、増大する様式で分類する。次に、各値に対して順位を割り当て、そしてその順位の合計を計算する。そして、Ｗｘ及びＷｙを得る。次に、（Ｗｘ）ｔと称する参考値（ＷｘはＷｙと異ならないとするヌル仮説での理論値）を計算し、比率：ｎ（Ｎ＋１）／２により、ｎ＝グループｘの試験したマウスの数、及びＮ＝グループｘ及びｙの試験したマウスの数と連関させる。
【０１５５】
Ｗｘが（Ｗｘ）ｔより低ければ（マウスのワクシニアウイルスの低い残留レベル）、ワクチン接種の結果である中和が有意に有効であるという結論となる。
【０１５６】
ｙを印したグループＡｄβＧａｌと比較して、ｘを印したグループＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂの例を挙げれば、以下の値を得ることができる。：
Ｗｘ＝１＋２＋４＋６＋８＋１１＋１３＋１４＝５９（試験した８匹のマウス）
Ｗｙ＝３＋５＋７＋９＋１０＋１２＋１５＋１６＝７７（試験した８匹のマウス）
【０１５７】
帰無仮説では、ＷｘはＷｙとは異ならず、予想される値は：（Ｗｘ）ｔ＝（１／２）＊８＊１７＝６８となる。
【０１５８】
Ｗｘ＜（Ｗｘ）は、グループＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂで得られた値がグループＡｄβＧａｌで得られた値より小さいこと、そしてワクチン接種の結果である中和が有意に有効であることの表れである。
【０１５９】
マウスの他のグループについての統計値を、以下の表１に示す。：
【０１６０】
【表９】
2007527207.tif 000010
【０１６１】
前記表１の値は、アデノウイルスＮＳ３ＮＳ４及びアデノウイルスＮＳ５ｂの組合せによるマウスのワクチン接種のみが、ＡｄβＧａｌによりワクチン接種したコントールのマウスのグループに対して、トライアルで用いたワクシニアウイルスの複製の有意な中和を誘導することができることを示す。（ＡｄＮＳ３ＮＳ４＋ＡｄＮＳ５ｂ＋ＡｄＮＳ５ａ）又は（ＡｄＮＳ３ＮＳ４＋ＡｄＮＳ５ｂ＋ＡｄＣＥ１Ｅ２）を含む組合せを用いて実施したワクチン接種は、ＡｄβＧａｌによりワクチン接種したコントロールのマウスのグループと比較して、有意差の結果とはなっていない。
【０１６２】
従って、これらの結果は、予期せぬことに、ポリタンパク質ＮＳ３ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂを組合わせたワクチン接種の優れた保護を実証することができることとなる。
【０１６３】
５．同じベクターにより一緒に発現するポリタンパク質ＮＳ３ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂを組合わせたワクチン接種の保護の確認
組換えワクシニアウイルスのタイターを、以下のアデノウイルスの組合せ：ＡｄＮＳ３ＮＳ４ＡｄＮＳ５ｂ（第１グループ）、ＡｄＮＳ３ＮＳ４＋ＡｄＮＳ５ｂ（第２グループ）及びＡｄβＧａｌ（第３グループ）により、免疫化した８匹のマウスの３つのグループについて決定した。
【０１６４】
結果を図７に示すが、これは前記実験に示したように、Wilcoxon Mann-Whitney non-parametric試験に基づいて統計学的に処理している。
【０１６５】
コントロールのグループＡｄβＧａｌに比較した、グループ１及び２についての統計値を以下の表２に示す。：
【０１６６】
【表１０】
2007527207.tif 000011
【０１６７】
前記表２の値は、３つの抗原ＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５ｂをすべてコードするアデノウイルスによるマウスのワクチン接種は、アデノウイルスＮＳ３ＮＳ４及びアデノウイルスＮＳ５ｂの組合せのように、アデノβＧａｌによりワクチン接種したコントロールのマウスのグループに対して、トライアルで用いたワクシニアウイルスの複製の優位な中和を誘導することができることを示す。この結果は、同じベクターにより一緒に発現するポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂを組合わせたワクチン接種の保護を確認する。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明に従ったアデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために用いられる異なるプラスミドの地図を表しており、そこには異なる制限酵素、及びＮＳ３／ＮＳ４を、そしてＮＳ５ｂをコードする配列断片の位置が示されている。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明に従ったアデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために用いられる異なるプラスミドの地図を表しており、そこには異なる制限酵素、及びＮＳ３／ＮＳ４を、そしてＮＳ５ｂをコードする配列断片の位置が示されている。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本発明に従ったアデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために用いられる異なるプラスミドの地図を表しており、そこには異なる制限酵素、及びＮＳ３／ＮＳ４を、そしてＮＳ５ｂをコードする配列断片の位置が示されている。
【図１Ｄ】図１Ｄは、本発明に従ったアデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために用いられる異なるプラスミドの地図を表しており、そこには異なる制限酵素、及びＮＳ３／ＮＳ４を、そしてＮＳ５ｂをコードする配列断片の位置が示されている。
【図１Ｅ】図１Ｅは、本発明に従ったアデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために用いられる異なるプラスミドの地図を表しており、そこには異なる制限酵素、及びＮＳ３／ＮＳ４を、そしてＮＳ５ｂをコードする配列断片の位置が示されている。
【図１Ｆ】図１Ｆは、本発明に従ったアデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために用いられる異なるプラスミドの地図を表しており、そこには異なる制限酵素、及びＮＳ３／ＮＳ４を、そしてＮＳ５ｂをコードする配列断片の位置が示されている。
【図１Ｇ】図１Ｇは、本発明に従ったアデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために用いられる異なるプラスミドの地図を表しており、そこには異なる制限酵素、及びＮＳ３／ＮＳ４を、そしてＮＳ５ｂをコードする配列断片の位置が示されている。
【図１Ｈ】図１Ｈは、本発明に従ったアデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために用いられる異なるプラスミドの地図を表しており、そこには異なる制限酵素、及びＮＳ３／ＮＳ４を、そしてＮＳ５ｂをコードする配列断片の位置が示されている。
【図１Ｉ】図１Ｉは、本発明に従ったアデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために用いられる異なるプラスミドの地図を表しており、そこには異なる制限酵素、及びＮＳ３／ＮＳ４を、そしてＮＳ５ｂをコードする配列断片の位置が示されている。
【図１Ｊ】図１Ｊは、本発明に従ったアデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために用いられる異なるプラスミドの地図を表しており、そこには異なる制限酵素、及びＮＳ３／ＮＳ４を、そしてＮＳ５ｂをコードする配列断片の位置が示されている。
【図１Ｋ】図１Ｋは、本発明に従ったアデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために用いられる異なるプラスミドの地図を表しており、そこには異なる制限酵素、及びＮＳ３／ＮＳ４を、そしてＮＳ５ｂをコードする配列断片の位置が示されている。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明に従ったポックスウイルスＭＡＶ  ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために用いられた異なるプラスミドの地図を表しており、そこには異なる制限酵素、及びＮＳ３／ＮＳ４及びＮＳ５ｂをコードする配列断片の位置が示されている。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明に従ったポックスウイルスＭＡＶ  ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために用いられた異なるプラスミドの地図を表しており、そこには異なる制限酵素、及びＮＳ３／ＮＳ４及びＮＳ５ｂをコードする配列断片の位置が示されている。
【図２Ｃ】図２Ｃは、本発明に従ったポックスウイルスＭＡＶ  ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために用いられた異なるプラスミドの地図を表しており、そこには異なる制限酵素、及びＮＳ３／ＮＳ４及びＮＳ５ｂをコードする配列断片の位置が示されている。
【図２Ｄ】図２Ｄは、本発明に従ったポックスウイルスＭＡＶ  ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために用いられた異なるプラスミドの地図を表しており、そこには異なる制限酵素、及びＮＳ３／ＮＳ４及びＮＳ５ｂをコードする配列断片の位置が示されている。
【図２Ｅ】図２Ｅは、本発明に従ったポックスウイルスＭＡＶ  ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために用いられた異なるプラスミドの地図を表しており、そこには異なる制限酵素、及びＮＳ３／ＮＳ４及びＮＳ５ｂをコードする配列断片の位置が示されている。
【図２Ｆ】図２Ｆは、本発明に従ったポックスウイルスＭＡＶ  ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために用いられた異なるプラスミドの地図を表しており、そこには異なる制限酵素、及びＮＳ３／ＮＳ４及びＮＳ５ｂをコードする配列断片の位置が示されている。
【図２Ｇ】図２Ｇは、本発明に従ったポックスウイルスＭＡＶ  ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために用いられた異なるプラスミドの地図を表しており、そこには異なる制限酵素、及びＮＳ３／ＮＳ４及びＮＳ５ｂをコードする配列断片の位置が示されている。
【図２Ｈ】図２Ｈは、本発明に従ったポックスウイルスＭＡＶ  ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために用いられた異なるプラスミドの地図を表しており、そこには異なる制限酵素、及びＮＳ３／ＮＳ４及びＮＳ５ｂをコードする配列断片の位置が示されている。
【図３Ａ】図３Ａは、エピトープＧＬＬを用いて培養の脾細胞を刺激し、そしてＣＴＬターゲットを負荷し、そしてその結果、エフェクター／ターゲット比率の関数として、特異的な溶解百分率を表すＣＴＬ試験によって、結果をスポット／１０６細胞個の数で示し、アデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４により誘導された細胞の応答を示している。
【図３Ｂ】図３Ｂは、エピトープＧＬＬを用いて培養の脾細胞を刺激し、そしてＣＴＬターゲットを負荷し、そしてその結果、エフェクター／ターゲット比率の関数として、エピトープＧＬＬに特異的なＥＬＩＳＰＯＴ試験によって、結果をスポット／１０６細胞個の数で示し、アデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４により誘導された細胞の応答を示している。
【図４】図４は、エピトープＡＬＹ及びＫＬＰに特異的な試験ＥＬＩＳＰＯＴによって、アデノウイルスＡｄＮＳ５ｂにより誘導された細胞の応答を示している。
【図５】図５は、エピトープＤＬＭを用いて培養の脾細胞を刺激し、そしてＣＴＬのターゲットを負荷し、そしてその結果、エフェクター／ターゲット比率の関数として、特異的な溶解百分率を表すＣＴＬ試験により、アデノウイルスＡｄＣＥ１Ｅ２により誘導された細胞の応答を示している。
【図６】図６は、異なるアデノウイルスの組合わせ：ＡｄＮＳ３ＮＳ４＋ＡｄＮＳ５ｂ（第１のグループ）、アデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４＋ＡｄＮＳ５ｂ＋ＡｄＮＳ５ａ（第２のグループ）、アデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４＋ＡｄＮＳ５ｂ＋ＡｄＣＥ１Ｅ２（第３のグループ）及びアデノウイルスＡｄβＧａｌ（第４のグループ）により免疫化した８匹のマウスの４つのグループについて、pfu／ml／mg卵巣での、トライアル試験による結果から、組換えワクシニアウイルスのタイターを示す。
【図７】図７は、以下の異なるアデノウイルスの組合わせ：ＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂ（第１のグループ）、ＡｄＮＳ３ＮＳ４＋ＡｄＮＳ５ｂ（第２のグループ）及びＡｄβＧａｌ（第３のグループ）により免疫化した８匹のマウスの３つのグループについて、pfu／ml／mg卵巣での、トライアル試験による結果から、組換えワクシニアウイルスのタイターを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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