(57)【要約】  本発明は、重鎖定常領域がＣＨ１の鎖間システインで終了している抗体Ｆａｂフラグメントを提供する。１個又は複数のエフェクター分子が結合している、重鎖定常領域がＣＨ１の鎖間システインで終了している抗体Ｆａｂフラグメントもまた提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖定常領域がＣＨ１の鎖間システインで終了していることを特徴とする、抗体Ｆａｂフラグメント。
【請求項２】
ＣＨ１の鎖間システインがＣＬの鎖間システインに共有結合している、請求項１に記載の抗体Ｆａｂフラグメント。
【請求項３】
ＣＨ１の鎖間システインが重鎖の２３３位にある、請求項１又は請求項２に記載の抗体Ｆａｂフラグメント。
【請求項４】
ＣＨ１の鎖間システインが重鎖の１２７位にある、請求項１又は請求項２に記載の抗体Ｆａｂフラグメント。
【請求項５】
ＣＨ１の鎖間システインが重鎖の１２８位にある、請求項１又は請求項２に記載の抗体Ｆａｂフラグメント。
【請求項６】
ＣＨ１の鎖間システインが重鎖の２３５位にある、請求項１又は請求項２に記載の抗体Ｆａｂフラグメント。
【請求項７】
軽鎖定常領域の鎖間システインが軽鎖の２１４位にある、請求項１から５までに記載の抗体Ｆａｂフラグメント。
【請求項８】
重鎖定常領域が、配列番号１に示される配列に対して少なくとも９０％の同一性若しくは類似性を有する配列を含むか、又はその配列からなる、請求項１から３までに記載の抗体Ｆａｂフラグメント。
【請求項９】
軽鎖定常領域が、配列番号２に示される配列に対して少なくとも９０％の同一性若しくは類似性を有する配列を含むか、又はその配列からなる、請求項８に記載の抗体Ｆａｂフラグメント。
【請求項１０】
重鎖定常領域が、配列番号３に示される配列に対して少なくとも９０％の同一性若しくは類似性を有する配列を含むか、又はその配列からなる、請求項１、２、及び６に記載の抗体Ｆａｂフラグメント。
【請求項１１】
軽鎖定常領域が、配列番号４に示される配列に対して少なくとも９０％の同一性若しくは類似性を有する配列を含むか、又はその配列からなる、請求項１０に記載の抗体Ｆａｂフラグメント。
【請求項１２】
１個又は複数のエフェクター分子が結合している、請求項１から１１までに記載の抗体Ｆａｂフラグメント。
【請求項１３】
２つ以上のエフェクター分子が結合している、請求項１２に記載の抗体Ｆａｂフラグメント。
【請求項１４】
エフェクター分子が軽鎖定常領域中のシステイン及び重鎖定常領域中のシステインに結合している、請求項１３に記載の抗体フラグメント。
【請求項１５】
エフェクター分子に結合している、重鎖及び軽鎖定常領域中のシステイン残基は、エフェクター分子が結合していない場合、ジスルフィド結合を介して互いに連結されると見込まれる、請求項１４に記載の抗体フラグメント。
【請求項１６】
エフェクター分子が結合している軽鎖システインはＣＬの鎖間システインであり、且つエフェクター分子が結合している重鎖システインはＣＨ１の鎖間システインである、請求項１５に記載の抗体フラグメント。
【請求項１７】
エフェクター分子がＰＥＧである、請求項１２から１６までに記載の抗体Ｆａｂフラグメント。
【請求項１８】
請求項１２から１７までに記載の抗体Ｆａｂフラグメントを産生する方法であって、
ａ．請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１に記載の抗体Ｆａｂフラグメントを還元剤で処理する工程であって、前記還元剤が、重鎖及び軽鎖定常領域のシステイン中に遊離チオール基を生成できる工程
ｂ．処理したフラグメントをエフェクター分子と反応させる工程
を含む方法。
【請求項１９】
還元剤が非チオール系還元剤である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
還元剤がトリアルキルホスフィンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
非チオール系還元剤がトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
非チオール系還元剤がトリス（３−ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰ）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ａ）及び（ｂ）のいずれか又はその両方をキレート剤の存在下で実行する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
キレート剤がＥＤＴＡである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ａ）及び（ｂ）の両方をＥＤＴＡの存在下で実行する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
２種以上の抗体Ｆａｂフラグメントを含む混合物であって、混合物がＦａｂフラグメントで富化されており、ＣＨ１ドメインが鎖間システインで終止しており、フラグメント中の重鎖が軽鎖に共有結合しておらず、フラグメントが軽鎖及び重鎖の定常領域中のシステインに結合しているエフェクター分子を有することを特徴とする混合物。
【請求項２７】
混合物の５０％超がＦａｂフラグメントを含んでおり、ＣＨ１ドメインが鎖間システインで終了し、前記フラグメント中の重鎖は軽鎖に共有結合しておらず、且つ前記フラグメントは軽鎖及び重鎖の定常領域中のシステインに結合したエフェクター分子を有する、請求項２６に記載の混合物。
【請求項２８】
請求項３から１１までのいずれか一項に記載の抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖及び／又は軽鎖の定常領域をコードする、単離されたＤＮＡ配列。
【請求項２９】
請求項２８に記載の１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む、クローニングベクター又は発現ベクター。
【請求項３０】
配列番号５に示される配列を含む、請求項２９に記載のベクター。
【請求項３１】
配列番号６に示される配列を更に含む、請求項３０に記載のベクター。
【請求項３２】
配列番号７に示される配列を含む、請求項２９に記載のベクター。
【請求項３３】
配列番号８に示される配列を更に含む、請求項３２に記載のベクター。
【請求項３４】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１に記載の抗体Ｆａｂフラグメントを発現する宿主細胞。
【請求項３５】
請求項２９から３３までに記載の１つ又は複数のクローニングベクター又は発現ベクターを含む、請求項３４に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
請求項３４に記載の宿主細胞を培養し、前記フラグメントを単離することを含む、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１に記載の抗体Ｆａｂフラグメントを産生する方法。
【請求項３７】
請求項１から１７まで及び２６から２７までに記載の抗体Ｆａｂフラグメントを、１種又は複数の医薬として許容可能な賦形剤、希釈剤、又は担体とともに含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良された抗体フラグメント、より詳細には、１つ又は複数、好ましくは２つ以上のエフェクター分子が結合する改良された抗体フラグメント、及びそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体可変領域は特異性及び親和性が高いので、該領域は、特にタンパク質間相互作用を調節するための理想的な診断剤及び治療剤になる。抗体フラグメントは、ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）などの製品の最近の成功に見られるように、多用途の治療剤となることが判明しつつある。Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、及び他の抗体フラグメントにコードされている標的対応官能基は、直接使用できるか、或いは効力を増加させるために、細胞毒性薬剤、毒素、又はポリマー分子などの１種又は複数のエフェクター分子に複合できる。例えば、これらのフラグメントはＦｃ領域を欠くために、動物中で短い循環半減期を有するが、これは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの特定の型のポリマーへの複合によって改良できる。複合したＰＥＧのサイズを増加させると、数分間から何時間までも循環半減期が増加することが判明しており、５ｋＤａから１００ｋＤａまでの範囲のＰＥＧを用いるＦａｂ’の修飾が実証された（Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，７８０−７８３；Ｌｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，１６，１０６−１１９；Ｃｈａｐｍａｎ，２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４，５３１−５４５）。ＰＥＧ化された抗体フラグメント（例えば、ＣＤＰ８７０）は現在臨床試験を受けており、ここでは、複合ＰＥＧの効果は、循環半減期を、治療のために許容可能なレベルにまで導くことである。
【０００３】
エフェクター分子は、多数の異なる方法によって抗体フラグメントに結合していることが可能であり、これには、アルデヒド糖を経由するもの、又はより一般的には、抗体フラグメント中に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖、又は末端アミノ酸官能基、例えば、任意の遊離のアミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、又はカルボキシル基を経由するものが含まれる。エフェクター分子の結合の部位は、ランダムであるか、又は部位特異的のいずれかであってもよい。
【０００４】
ランダム結合は、しばしば、リジンのようなアミノ酸を経由して達成され、そしてこれは、リジンの位置に依存して、抗体フラグメント全体を通して多数の部位において結合しているエフェクター分子を生じる。これは、いくつかの場合において成功したが、結合するエフェクター分子の正確な位置及び数は制御不可能であり、且つこれは活性の損失（例えば、結合するエフェクター分子が少なすぎる場合）及び／又は親和性の損失（例えば、エフェクター分子が結合部位を妨害する）をもたらす可能性がある（Ｃｈａｐｍａｎ，２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４，５３１−５４５）。その結果、エフェクター分子の制御された部位特異的結合は、通常、選択方法である。
【０００５】
エフェクター分子の部位特異的結合は、最も一般的には、システイン残基に対する結合によって達成される。なぜなら、このような残基は、抗体フラグメントにおいて比較的一般的ではないからである。抗体のヒンジは、部位特異的結合のためのよく知られた領域である。なぜなら、これらはシステイン残基を含み、且つ抗原結合に関与するらしい抗体の他の領域から離れているからである。適切なヒンジはフラグメント中に天然に存在するか、又は組換えＤＮＡ技術を使用して作製できるかのいずれかである（例えば、米国特許第５，６７７，４２５号；国際公開第９８／２５９７１号；Ｌｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，１６，１０６−１１９；Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，７８０−７８３を参照のこと）。或いは、又は更に、部位特異的システインは、例えば、表面に露出したシステインを作製するために抗体フラグメントに操作できる（米国特許第５，２１９，９９６号）。
【０００６】
エフェクター分子をシステインを介して部位特異的に結合しようとする場合、抗体フラグメント中の標的チオールは、しばしば、グルタチオンなどの小さな発酵関連ペプチド産物によってキャップするか、又は抗体フラグメントの抽出及び精製の間に使用する５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）などの化学的添加物によって意図的にキャップする。これらのキャッピング剤は、標的（ヒンジ又は表面）チオールを活性化するために除去する必要がある。抗体フラグメントは、重鎖の定常領域と軽鎖の定常領域（ＣＨ１及びＣＬ）の間の未変性の鎖間ジスルフィド結合を有し、これは一般的には、抗体の安定性及び結合特性を維持する上で必須であると見なされてきた。その結果、ＣＬ：ＣＨ１間のジスルフィドが損なわれないように、標的ヒンジ又は表面チオールの活性化は、ある程度の注意を払って実行しなければならない。それゆえに「穏和な」還元条件を、エフェクター分子との反応の前に、チオールキャッピング剤を除去するために使用するのが都合が良い。これは通常、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、β−メルカプトエチルアミン（β−ＭＡ）、及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）などのチオール系還元剤を使用することによって達成される。しかし、これらの還元剤の各々は、還元するつもりのシステインと反応し、且つそれに結合したままとなり得るため、（Ｂｅｇｇ及びＳｐｅｉｃｈｅｒ，１９９９  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１０，１７−２０）エフェクター分子の結合効率を低下させることが知られている。したがって、還元及びエフェクター分子との反応の後、高い比率の抗体フラグメントが、エフェクター分子を全く結合せず、これらは、適数のエフェクター分子を結合した抗体フラグメントから除去しなければならない。この乏しい修飾効率は、最大限の生産効率を実現することが重要である、修飾された治療用抗体フラグメントの大規模生産中には明確に欠点となる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、エフェクター分子が結合してもよい新規クラスの抗体Ｆａｂフラグメントを提供する。これらのフラグメントの特別な利点は、これらのフラグメント中に存在するシステイン残基にある。このようなシステイン残基は、修飾されたヒンジ領域及び／又は表面アミノの酸置換を操作する必要性を回避しながら、エフェクター分子の部位特異的結合のために使用できる。エフェクター分子が本発明の抗体Ｆａｂフラグメントに結合する場合、重鎖と軽鎖の間に鎖間共有結合は存在しない。重鎖と軽鎖の間に全く共有結合がなく、しかもエフェクター分子が結合しているにも関わらず、本発明のフラグメントは、多数のインビトロ及びインビボの試験において野生型フラグメントと比較し得る性能を示す。驚くべきことに、これらの新規なフラグメントは、野生型フラグメントと抗原に対する同じ親和性、及び野生型フラグメントと同様のインビボ及びインビトロ安定性を有する。これらのフラグメントのさらなる利点は、それらのフラグメントへのエフェクター分子の結合の容易さ、特に、結合の効率にある。したがって、このフラグメントは、エフェクター分子の結合後に、本来の鎖間共有結合を保持している、現在利用できるフラグメントに対する低コストの代替品を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明によれば、重鎖定常領域がＣＨ１の鎖間システインで終止していることを特徴とする、抗体Ｆａｂフラグメントが提供される。
【０００９】
本発明の抗体Ｆａｂフラグメントは、可変領域（ＶＨ／ＶＬ）及び定常領域（ＣＨ／ＣＬ）を有する任意の重鎖及び軽鎖の対であってもよい。好ましくは、重鎖及び軽鎖の対は、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域中の鎖間システインを介して共有結合したＶＨ／ＣＨ１及びＶＬ／ＣＬである。用語「鎖間システイン」は、本明細書で使用する場合、天然の生殖細胞系抗体遺伝子においてコードされる対応する重鎖又は軽鎖の定常領域中のシステインに対しては、ジスルフィド結合すると思われる、重鎖又は軽鎖の定常領域中のシステインを指す。特に、本明細書の鎖間システインは、天然の抗体において互いにジスルフィド結合している、軽鎖（ＣＬ）定常領域中のシステイン、及び重鎖の第１の定常領域（ＣＨ１）中のシステインである。このようなシステインの例は、代表的には、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７、免疫学的に興味が持たれるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，ＵＳＡによって規定されるように、ヒトＩｇＧ１の軽鎖の２１４位及び重鎖の２３３位において、ヒトＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の重鎖の１２７位、並びにヒトＩｇＤ及びＩｇＡ２Ｂの重鎖の１２８位において見い出すことができる。マウスＩｇＧ１において、鎖間システインは軽鎖の２１４位及び重鎖の２３５位において見い出し得る。これらのシステインの正確な位置は、任意の修飾、例えば、欠失、挿入、及び／又は置換が抗体Ｆａｂフラグメントになされた場合には、天然の抗体の位置から変化し得ることが理解されよう。
【００１０】
本発明の抗体Ｆａｂフラグメントにおいて、重鎖定常領域はＣＨ１の鎖間システインで終了している。したがって、本発明の抗体ＦａｂフラグメントのＣＨ１ドメイン中の最後のアミノ酸はシステインである。ＣＨ１ドメインが切断されている本発明の抗体Ｆａｂフラグメントは、当該分野において公知の任意の適切な方法によって調製できる。例えば、本発明の抗体Ｆａｂフラグメントは、任意の適切な酵素的な切断及び／又は消化の技術を使用して、例えば、ペプシン又はパパイン及びｃ末端プロテアーゼを用いる処理によって、任意の全体の抗体、とりわけ、全体のモノクローナル抗体から入手できる。好ましくは、本発明の抗体Ｆａｂフラグメントは、抗体の可変領域及び定常領域をコードするＤＮＡの操作及び再発現を含む組換えＤＮＡ技術の使用によって調製できる。標準的な分子生物学的技術が、所望されるような更なるアミノ酸又はドメインを修飾し、付加し、又は欠失させるために使用できる。可変領域又は定常領域に対する任意の変更が、本明細書で使用される用語「可変」領域及び「定常」領域によってなお包含される。好ましくは、ＰＣＲはＣＨ１の鎖間システインをコードするコドンの直後に終止コドンを導入するために使用され、その結果、ＣＨ１ドメインの翻訳は鎖間システインで終止する。適切なＰＣＲプライマーを設計するための方法は当該分野において周知であり、且つ抗体ＣＨ１ドメインの配列は容易に利用可能である（Ｋａｂａｔら、前出）。或いは、終止コドンは、Ｗｈｉｔｅ（編）、ＰＣＲプロトコール：最新の方法及び応用（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９３））に記載のものなどの部位特異的な変異誘発技術を使用して導入できる。本発明の抗体フラグメント出発物質は、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ及びそれらのサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む）を含む任意の抗体アイソタイプに由来してもよい。好ましくは、本発明の抗体ＦａｂフラグメントはＩｇＧ１に由来する。抗体フラグメントの出発物質は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ、又はヒトを含む任意の種から入手できる。抗体フラグメントの部分は１種又は複数の種から入手でき、例えば、抗体フラグメントはキメラであってもよい。一例では、定常領域は１つの種由来であり、且つ可変領域は別の種由来である。抗体フラグメントの出発物質はまた、修飾されてもよい。一例では、抗体フラグメントの可変領域は組換えＤＮＡ操作技術を使用して作製される。このような操作して得た改変体には、例えば、天然の抗体のアミノ酸配列における又はそれに対する挿入、欠失、又は置換によって天然の抗体の可変領域から作製されたものが含まれる。この型の特定の例には、少なくとも１つのＣＤＲ、並びに場合により、１つの抗体からの１つ以上のフレームワークアミノ酸、及び第２の抗体からの可変領域ドメインの残りの部分を含む、可変領域ドメインが操作して得たものが含まれる。これらの抗体フラグメントを作製及び製造するための方法は当該技術分野において周知である（例えば、以下を参照のこと：Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，３３１，４１５号；Ｓｈｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第９２／０２５５１号；Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，３８３３；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３２２，３２３；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５８５，０８９号；Ａｄａｉｒ、国際公開第９１／０９９６７号；Ｍｏｕｎｔａｉｎ及びＡｄａｉｒ、１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ，１０，１−１４２；Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５−１８１）。
【００１１】
本発明の抗体フラグメントは、一般的に、抗原に選択的に結合可能であろう。該抗原は、任意の細胞関連抗原、例えば、細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、内皮細胞、若しくは腫瘍細胞などの細胞上の細胞表面抗原であってもよく、又は可溶性抗原であってもよい。抗原はまた、疾患又は感染の間にアップレギュレートされた抗原などの任意の医学関連抗原、例えば、レセプター及び／又はそれらの対応するリガンドであってもよい。細胞表面抗原の特定の例には、接着分子、例えば、β１インテグリンなどのインテグリン（例えば、ＶＬＡ−４）、Ｅ−セレクチン、Ｐセレクチン若しくはＬ−セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、並びにＶＥＧＦ、並びに適切な場合、これらのレセプターが含まれる。可溶性抗原には、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１６、又はＩＬ−１７などのインターロイキン、ウイルス抗原、例えば、呼吸器合胞体ウイルス又はサイトメガロウイルス抗原、ＩｇＥなどの免疫グロブリン、インターフェロンα、インターフェロンβ、又はインターフェロンγなどのインターフェロン、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、並びにＰＤＧＦα及びＰＤＧＦβなどの血小板由来成長因子、並びに適切な場合、これらのレセプターが含まれる。
【００１２】
本発明は、重鎖定常領域がＣＨ１の鎖間システインで終了していることを特徴とする、抗体Ｆａｂフラグメントを提供する。一実施形態では、重鎖及び軽鎖定常領域はヒトＩｇＧ１に由来する。一実施形態では、本発明は、重鎖定常領域が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むか、又はその配列からなる抗体Ｆａｂフラグメントを提供する。本発明はまた、重鎖定常領域が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むか、又はその配列からなり、且つ軽鎖定常領域が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むか、又はその配列からなる抗体Ｆａｂフラグメントを提供する。すべての配列及びこれらの配列番号は図５に示す。
【００１３】
別の態様において、重鎖及び軽鎖定常領域はマウスＩｇＧ１に由来する。この態様において、本発明は、重鎖定常領域が、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むか、又はその配列からなる抗体Ｆａｂフラグメントを提供する。本発明はまた、重鎖定常領域が配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むか、又はその配列からなり、且つ軽鎖定常領域が配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むか、又はその配列からなる抗体Ｆａｂフラグメントを提供する。
【００１４】
本発明はまた、重鎖の定常領域が、配列番号１に示される配列に対して少なくとも９０％の同一性若しくは類似性を有する配列を含むか、又はその配列からなる抗体Ｆａｂフラグメントを提供する。
【００１５】
「同一性」とは、本明細書で使用される場合には、整列した配列中の任意の特定の位置において、アミノ酸残基が配列間で同一であることを示す。「類似性」とは、本明細書で使用される場合には、整列した配列中の任意の特定の位置において、アミノ酸残基が配列間で類似の型であることを示す。例えば、ロイシンは、イソロイシン又はバリンの代わりに置換されることがある。しばしば相互に置換し得る他のアミノ酸には以下のものが含まれるが、これらに限定されない。
−フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；
−リジン、アルギニン、及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；
−アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；
−アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）並びに
−システイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）。
同一性及び類似性の程度は容易に計算できる（コンピュータを利用する分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；バイオコンピュータ計算．インフォマティックス及びゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；配列データのコンピュータ分析、第１部（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １）、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；並びに配列分析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ）、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１）。好ましくは、本発明のこの態様の抗体Ｆａｂフラグメントは重鎖を含み、ここでこの重鎖の定常領域は、配列番号１に示される配列に対して少なくとも９０％、９５％、又は９８％の同一性若しくは類似性を有する配列を含む。
【００１６】
本発明はまた、重鎖の定常領域が、配列番号１に示される配列に対して少なくとも９０％の同一性若しくは類似性を有する配列を含むか、又はその配列からなり、且つ軽鎖の定常領域が、配列番号２に示される配列に対して少なくとも９０％の同一性若しくは類似性を有する配列を含むか、又はその配列からなる抗体Ｆａｂフラグメントを提供する。好ましくは、本発明のこの態様の抗体Ｆａｂフラグメントは、重鎖の定常領域が配列番号１に示される配列に対して少なくとも９０％、９５％、又は９８％の同一性若しくは類似性を有する配列を含む重鎖、及び軽鎖の定常領域が配列番号２に示される配列に対して少なくとも９０％、９５％、又は９８％の同一性若しくは類似性を有する配列を含む軽鎖を含む。
【００１７】
本発明はまた、重鎖の定常領域が、配列番号３に示される配列に対して少なくとも９０％の同一性若しくは類似性を有する配列を含むか、又はその配列からなる抗体Ｆａｂフラグメントを提供する。一実施形態では、本発明は、重鎖の定常領域が、配列番号３に示される配列に対して少なくとも９０％の同一性若しくは類似性を有する配列を含むか、又はその配列からなり、且つ軽鎖の定常領域が、配列番号４に示される配列に対して少なくとも９０％の同一性若しくは類似性を有する配列を含むか、又はその配列からなる抗体Ｆａｂフラグメントを提供する。好ましくは、本発明のこの態様の抗体Ｆａｂフラグメントは、重鎖の定常領域が配列番号３に示される配列に対して少なくとも９０％、９５％、又は９８％の同一性若しくは類似性を有する配列を含む重鎖、及び軽鎖の定常領域が配列番号４に示される配列に対して少なくとも９０％、９５％、又は９８％の同一性若しくは類似性を有する配列を含む軽鎖を含む。
【００１８】
配列番号１〜４に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列は、当該分野において公知の方法を使用して設計できる。一実施形態では、本発明は、配列番号１〜４に示す重鎖及び／又は軽鎖定常領域をコードする単離されたＤＮＡ配列を提供する。一実施形態では、配列番号１、２、３、及び４に示すアミノ酸配列をコードする各核酸配列は、それぞれ配列番号５、６、７、及び８に示されるものである。
【００１９】
本発明はまた、本発明の１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニングベクター又は発現ベクターに関する。したがって、本発明の抗体Ｆａｂフラグメントをコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニングベクター又は発現ベクターが提供される。特に、本発明のクローニングベクター又は発現ベクターは、配列番号５〜８に示すような、本発明の抗体定常領域をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む。一実施形態では、このベクターは、配列番号５及び配列番号６に示される配列を含む。別の実施形態において、このベクターは配列番号７及び配列番号８に示される配列を含む。
【００２０】
ベクターがそれによって構築できる一般的方法、トランスフェクション方法、及び培養方法は当業者に周知である。これに関して、参照が、「分子生物学の最新のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９９９、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、及びＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇによって作製されたＭａｎｉａｔｉｓのマニュアルに対してなされる。
【００２１】
ＣＨ１ドメインが鎖間システインで終了する抗体Ｆａｂフラグメントを発現する宿主細胞もまた、本発明によって提供される。任意の適切な宿主細胞／ベクター系が、本発明の抗体ＦａｂをコードするＤＮＡ配列の発現のために使用できる。したがって、本発明の抗体フラグメントをコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む１つ又は複数のクローニングベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞もまた、提供される。特に、宿主細胞は、配列番号５〜８に示すような、本発明の抗体の定常領域をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む本発明のクローニングベクター又は発現ベクターを含む。細菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）及び他の微生物系が使用されてもよく、又は真核生物、例えば、哺乳動物宿主細胞発現系もまた使用されてもよい。本発明に使用するための適切なＥ．ｃｏｌｉ株は、組換えタンパク質を産生できる天然株又は変異株であってもよい。特定の宿主Ｅ．ｃｏｌｉ株の例には、ＭＣ４１００、ＴＧ１、ＴＧ２、ＤＨＢ４、ＤＨ５α、ＤＨ１、ＢＬ２１、ＸＬ１  Ｂｌｕｅ、及びＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）が含まれる。適切な哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ細胞、ミエローマ細胞、又はハイブリドーマ細胞が含まれる。本発明の抗体Ｆａｂフラグメントを発現する宿主細胞を培養する工程、及びフラグメントを単離する工程を含む、本発明の抗体Ｆａｂフラグメントを産生する方法もまた提供される。一旦宿主細胞中で産生されると、抗体Ｆａｂフラグメントは、当該分野において公知である任意の適切な方法を使用して抽出及び精製できる。熱抽出は、鎖間ジスルフィド結合の存在に起因して、米国特許第５，６６５，８６６号において記載されるように使用できる。適切な精製方法には、サイズ排除、疎水性相互作用クロマトグラフィー、プロテインＡ、プロテインＧ、又はプロテインＬのアフィニティークロマトグラフィー、及びイオン交換を含まれるがこれらに限定されない。
【００２２】
所望される場合、本発明の抗体Ｆａｂフラグメントは、それに結合する１個又は複数のエフェクター分子を有してもよい。用語エフェクター分子は、本明細書で使用される場合には、例えば、抗新生物剤、薬物、毒素（例えば、細菌又は植物起源の酵素的に活性な毒素及びそのフラグメント、例えば、リシン及びそのフラグメント）、生物活性タンパク質、例えば、酵素、他の抗体又は抗体フラグメント、合成又は天然ポリマー、核酸及びそのフラグメント、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそのフラグメント、放射性核種、特に放射性ヨウ素、放射性同位元素、キレートされた金属、ナノ粒子、並びにレポーター基、例えば、蛍光化合物又はＮＭＲ若しくはＥＳＲスペクトル測定によって検出できる化合物を含む。
【００２３】
特定の抗新生物剤には、細胞毒性剤及び細胞増殖抑制剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロランブシル、メルファラン、メクロレタミン、シクロホスファミド、又はウラシルマスタード）及びその誘導体、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、ブスルファン、又はシスプラチンなどのアルキル化剤；メトトレキサート、フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、フルオロ酢酸又はフルオロクエン酸などの代謝拮抗剤、ブレオマイシン（例えば、硫酸ブレオマイシン）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン（例えば、マイトマイシンＣ）、アクチノマイシン（例えば、ダクチノマイシン）、プリカマイシン、カリキマイシン及びその誘導体、又はエスペラマイシン及びその誘導体などの抗生物質、エトポシド、ビンクリスチン又はビンブラスチン、及びその誘導体などの分裂抑制剤；エリプシチンなどのアルカロイド；タキシン−Ｉ又はタキシン−ＩＩなどのポリオール；アンドロゲンなどのホルモン（例えば、ドロモスタノロン若しくはテストステロン）、プロゲスチン（例えば、酢酸メゲストロール若しくは酢酸メドロキシプロゲステロン）、エストロゲン（例えば、ジメチルスチルベストロール二リン酸、リン酸ポリエストラジオール、若しくはリン酸エストラムスチン）又は抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；ミトキサントロンなどのアントラキノン、ヒドロキシウレアなどのウレア；プロカルバジンなどのヒドラジン；又はデカルバジンなどのイミダゾールが含まれる。
【００２４】
キレートされた金属には、２から８まで（両端を含む）配位数を有する、２価又は３価の正電荷を有する金属のキレートが含まれる。このような金属の特定の例には、テクネチウム（Ｔｃ）、レニウム（Ｒｅ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、鉛（Ｐｂ）、ビスマス（Ｂｉ）、インジウム（Ｉｎ）、ガリウム（Ｇａ）、イットリウム（Ｙ）、テルビウム（Ｔｂ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、及びスカンジウム（Ｓｃ）が含まれる。一般的に、この金属は好ましくは放射性核種である。特定の放射性核種には、９９ｍＴｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５８Ｃｏ、６０Ｃｏ、６７Ｃｕ、１９５Ａｕ、１９９Ａｕ、１１０Ａｇ、２０３Ｐｂ、２０６Ｂｉ、２０７Ｂｉ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８８Ｙ、９０Ｙ、１６０Ｔｂ、１５３Ｇｄ、及び４７Ｓｃが含まれる。
【００２５】
キレートされた金属は、例えば、任意の適切な多座（ｐｏｌｙａｄｅｎｔａｔｅ）キレート剤、例えば、非環状又は環状ポリアミン、ポリエーテル（例えば、クラウンエーテル及びその誘導体）；ポリアミド；ポルフィリン；及び炭素環誘導体でキレートされた上記の型の金属の１つであってもよい。
【００２６】
一般的に、キレート剤の型は、使用する金属に依存する。しかし、本発明による結合体における、１つの特に有用なキレート剤の群は、非環状及び環状ポリアミン、とりわけポリアミノカルボン酸、例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸及びその誘導体、並びに大環状アミン、例えば、環状トリアザ及びテトラアザ誘導体（例えば、国際特許明細書の国際特許公開第９２／２２５８３号に記載されているようなもの）；並びにポリアミド、とりわけデスフェリオックス−アミン及びその誘導体である。
【００２７】
他のエフェクター分子には、タンパク質、ペプチド、及び酵素が含まれる。対象とする酵素には、タンパク質分解性酵素、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが含まれるがこれらに限定されない。対象とするタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドには、免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、若しくはジフテリア毒素などの毒素、インスリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、若しくは組織プラスミノーゲン活性化因子などのタンパク質、血栓剤若しくは血管形成剤（例えば、アンギオスタチン若しくはエンドスタチン）、又はリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、若しくは他の成長因子及び免疫グロブリンなどの生物学的応答調節剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
他のエフェクター分子は、例えば、診断において有用である検出可能な物質を含んでもよい。検出可能な物質の例には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射活性核種、陽電子放出金属（陽電子放出断層撮影に使用するため）、及び非放射活性常磁性金属イオンが含まれる。一般的には、診断剤としての使用のために抗体に複合され得る金属イオンについては、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適切な酵素には、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ；適切な補欠分子族には、ストレプトアビジン、アビジン、及びビオチンが含まれ；適切な蛍光物質には、アンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド、及びフィコエリトリンが含まれ；適切な発光物質にはルミノールが含まれ；適切な生物発光物質には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエオクリンが含まれ；並びに適切な放射活性核種には１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、及び９９Ｔｃが含まれる。
【００２９】
エフェクター分子としての使用のための合成又は天然ポリマーには、例えば、任意選択で置換された直鎖若しくは分枝鎖のポリアルキレン、ポリアルケニレン、若しくはポリオキシアルキレンポリマー、又は直鎖若しくは分枝鎖の多糖類（例えば、ラクトース、アミロース、デキストラン、又はグリコーゲンなどのホモ若しくはヘテロ多糖類）が含まれる。
【００３０】
上述の合成ポリマー上に存在する可能性のある特定の任意選択の置換基には、１つ以上のヒドロキシ基、メチル基、又はメトキシ基が含まれる。合成ポリマーの特定の例には、任意選択で置換された直鎖若しくは分枝鎖のポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、又はその誘導体、とりわけ、メトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体などの任意選択で置換されたポリ（エチレングリコール）が含まれる。
【００３１】
「誘導体」は、本明細書で使用される場合には、反応性誘導体、例えば、α−ハロカルボン酸又はエステル、例えば、ヨードアセトアミドなどのチオール選択性反応基、イミド、例えば、マレイミド、ビニルスルホン、又はジスルフィドマレイミドなどを含むことを意図する。反応基は、直接的に、又はポリマーへのリンカーセグメントを通して結合できる。このような基の残基は、いくつかの例においては、抗体フラグメントとポリマーとの間の連結基としての生成物の一部を形成することが理解されよう。
【００３２】
ポリマーのサイズは、所望通りに変化させてもよいが、一般的には、５００Ｄａから５０，０００Ｄａまで、好ましくは５，０００から４０，０００Ｄａまで、並びにより好ましくは１０，０００から４０，０００Ｄａまで、及び２０，０００から４０，０００Ｄａまでの範囲の平均分子量である。ポリマーのサイズは、特に、生成物の意図する用途、例えば、腫瘍などの特定の組織に局在するか、又は循環半減期を延長する能力に基づいて選択してもよい（概説としては、Ｃｈａｐｍａｎ，２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４，５３１−５４５を参照のこと）。したがって、例えば、生成物が循環系を出て、組織に浸透することを意図する場合、例えば、腫瘍の治療に使用するために、低分子量ポリマー、例えば、約５，０００Ｄａの分子量を有するポリマーを使用することが有利となり得る。生成物が循環中に留まる用途に対しては、より高分子量ポリマー、例えば、２５，０００Ｄａから４０，０００Ｄａまでの範囲の分子量を有するポリマーを使用することが有利となり得る。
【００３３】
特に好ましいポリマーには、ポリ（エチレングリコール）などのポリアルキレンポリマー、又は、とりわけ、メトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体、及びとりわけ、約１０，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの範囲の分子量を有するポリマーが含まれる。
【００３４】
本発明のポリマーは、市販品を入手してもよいし（例えば、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｏｉｌ  ａｎｄ  Ｆａｔｓ；Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓより）、又は市販の出発物質から、便利な化学的手順を使用して調製してもよい。
【００３５】
エフェクター分子は、該抗体フラグメントを直接、又はカップリング剤を介してエフェクター分子へ連結する、標準的な化学的手順又は組換えＤＮＡ手順を使用して結合してもよい。このようなエフェクター分子を抗体に複合するための技術は当該分野において周知である（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，制御薬物送達（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ），第２版、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編、１９８７，６２３〜５３頁；Ｔｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８、及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８３，６７−１２３）。特定の化学的手順には、例えば、国際特許明細書の国際公開第９３／０６２３１号、国際公開第９２／２２５８３号、国際公開第９０／０９１９５号、国際公開第８９／０１４７６号、国際公開第９９１５５４９号、及び国際公開第０３０３１５８１号に記載されるものが含まれる。或いは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、結合は、例えば、欧州特許明細書第３９２７４５号に記載のような組換えＤＮＡ手順を使用して達成できる。
【００３６】
エフェクター分子は、抗体フラグメント中にある任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば、任意の遊離のアミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、又はカルボキシル基を通して本発明の抗体フラグメントに結合できる。このようなアミノ酸は抗体フラグメント中に天然に存在してもよく、又は組換えＤＮＡ法を使用してフラグメントに操作して得られてもよい。例えば、米国特許第５，２１９，９９６号を参照されたい。好ましくは、エフェクター分子は、天然又は改変された抗体フラグメント中にあるシステイン残基のチオール基を通して共有結合している。この共有結合は、一般的にはジスルフィド結合であり、又は特に、硫黄−炭素結合である。チオール基が適切に活性化されたエフェクター分子の結合点として使用される場合、例えば、マレイミド及びシステイン誘導体などのチオール選択的誘導体が使用できる。
【００３７】
抗体フラグメントに結合する２つ以上のエフェクター分子が存在する場合、これらは同一であってもよく又は異なっていてもよく、且つ異なる部位で抗体フラグメントに結合してもよいことが理解される。２つ以上のエフェクター分子は、例えば、２つ以上のエフェクター分子を連結し、且つ結合の単一の部位を提供するために、分枝状結合構造の使用により単一の部位で抗体フラグメントに結合できることもまた、理解される。
【００３８】
本発明の好ましい態様において、抗体フラグメントに結合した少なくとも１個のエフェクター分子は、ポリマー分子、好ましくはＰＥＧ又はその誘導体である。結合するポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に関しては、一般的に、「ポリエチレングリコールの化学、生物技術的及び生物医学的応用（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、１９９２、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ（編）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；「ポリエチレングリコールの化学及び生物学的応用（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、１９９７、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ及びＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ、並びに「生物医科学のための生物複合タンパク質カップリング技術（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、１９９８、Ｍ．Ａｓｌａｍ及びＡ．Ｄｅｎｔ，Ｇｒｏｖｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００３９】
好ましくは、本発明のＦａｂフラグメントに結合したすべてのエフェクター分子はＰＥＧであり、且つ各分子が、マレイミド基を介して、抗体フラグメント中の１個又は複数のチオール基に共有結合している。このＰＥＧは任意の直鎖又は分枝状分子であってもよい。ＰＥＧは、５００Ｄａから５０，０００Ｄａまで、好ましくは５，０００から４０，０００Ｄａまで、並びにより好ましくは１０，０００から４０，０００Ｄａまで、及び２０，０００から４０，０００Ｄａまでの範囲の平均分子量である、任意の直鎖又は分枝状分子であってもよい。分枝状ＰＥＧ分子を結合するために、リジン残基が、好ましくはマレイミド基に共有結合している。リジン残基上のアミン基の各々に、好ましくはメトキシ（ポリ（エチレングリコール）ポリマーが結合している。一例では、リジンに結合した各ポリマーの分子量は約２０，０００Ｄａであり、それゆえに全ポリマー分子の全分子量は約４０，０００Ｄａである。好ましくは、本発明のＦａｂフラグメントに結合しているＰＥＧ分子は線状である。
【００４０】
１個又は複数のエフェクター分子が本発明の抗体Ｆａｂフラグメントに結合できる。好ましい態様において、少なくとも２つのエフェクター分子がＦａｂフラグメントに結合しており、１つが軽鎖定常領域のシステイン、及び１つが重鎖定常領域のシステインに結合している。好ましくは、エフェクター分子が結合しているシステイン残基は、さもなくば、エフェクター分子が結合していない場合、ジスルフィド結合によって互いに連結される。結合のための適切なシステインには、軽鎖及び／又は重鎖の定常領域に存在する天然のシステイン（例えば、鎖間システイン）が含まれる。本発明の好ましい態様において、エフェクター分子は、抗体Ｆａｂフラグメント中のＣＬの鎖間システイン及びＣＨ１の鎖間システインに結合している。一実施形態において、エフェクター分子が結合しているＣＬの鎖間システインは軽鎖の２１４位にあり、エフェクター分子が結合しているＣＨ１の鎖間システインは重鎖の２３３位にある。定常領域がマウスＩｇＧ１に由来する別の実施形態において、エフェクター分子が結合しているＣＬの鎖間システインは軽鎖の２１４位にあり、エフェクター分子が結合しているＣＨ１の鎖間システインは重鎖の２３５位にある。他の適切なシステインには、組換えＤＮＡ技術を使用して定常領域に操作して得たものが含まれる。例えば、２つのシステインが抗体フラグメントに操作して得られ、１つが重鎖定常領域及び軽鎖定常領域の各々に結合していることが可能であり、好ましくは、それにより、その位置でこれらは互いにジスルフィド結合を形成できる。
【００４１】
本発明のこの態様に従う特定のフラグメントは以下の場合のものを含む：
（ｉ）エフェクター分子に結合している重鎖及び軽鎖の定常領域中のシステイン残基は、さもなくば、エフェクター分子が結合していない場合、ジスルフィド結合を介して互いに連結される、又は
（ｉｉ）エフェクター分子が結合している軽鎖システインはＣＬの鎖間システインであり、且つエフェクター分子が結合している重鎖システインはＣＨ１の鎖間システインである。
【００４２】
本発明の抗体Ｆａｂフラグメントにおけるシステインへのエフェクター分子の結合の間、本明細書に記載されるように、システイン間のいかなる共有結合も、還元剤を使用して除去される。このようなフラグメントにおいて、重鎖はもはや軽鎖に共有結合しておらず、且つＣＬの鎖間システインとＣＨ１の鎖間システインの間の、天然の抗体において見い出されるジスルフィド結合は存在しない。
【００４３】
したがって、本発明の抗体Ｆａｂフラグメントにエフェクター分子を結合させるための方法もまた、本発明によって提供される。この方法は以下の工程を含む：
ａ）本発明の抗体Ｆａｂフラグメントを還元剤で処理する工程であって、この還元剤は、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域のシステイン中の遊離チオール基を生成できる工程
ｂ）処理したフラグメントをエフェクター分子と反応させる工程。
【００４４】
好ましい態様において、この方法は以下の工程を含む：
ａ）本発明の抗体ＦａｂフラグメントにおけるＣＨ１の鎖間システインとＣＬの鎖間システインとの間の鎖間ジスルフィド結合を還元する工程
ｂ）処理したフラグメントをエフェクター分子と反応させる工程。
【００４５】
本発明によって提供される方法は、１個又は複数のエフェクター分子が抗体フラグメント中のシステイン、特に定常領域中のシステインに結合していることを可能にする。２つ以上のエフェクター分子は、本明細書に記載される方法を使用して、この方法を同時又は連続的にのいずれかで反復することによって、抗体フラグメントに結合できる。
【００４６】
追加のエフェクター分子は、抗体フラグメント中の他の箇所、特に定常領域に結合できる。したがって、本発明の方法はまた、上記の還元方法の前及び／又は後で１つ又は複数の工程に拡張され、ここでは、追加のエフェクター分子が、以前に記載された任意の適切な方法を使用して、例えば、アミノ基及びイミノ基などの他の利用可能なアミノ酸側鎖を介して抗体フラグメントに結合している。
【００４７】
本発明の方法に使用するための還元剤は、本発明の抗体Ｆａｂフラグメント出発物質中のシステインを還元して、遊離チオールを産生できる任意の還元剤である。好ましくは、この還元剤は、システインへのエフェクター分子の結合を可能にするために、重鎖定常領域のシステインと軽鎖定常領域のシステインとの間の、例えば、ＣＬの鎖間システインとＣＨ１の鎖間システインとの間の鎖間ジスルフィド結合を還元する。本発明の抗体Ｆａｂフラグメントは、意外にも鎖間ジスルフィド結合についての要求性を有していないので、鎖間ジスルフィド結合を保持する野生型抗体フラグメントで従来使用されるものよりも強力な還元剤が使用できる。その結果、より多くの数の遊離チオールを有するＦａｂ分子が産生され、且つより高い割合の抗体フラグメントが正確に修飾され、即ち、正確な数のエフェクター分子が結合している。更に、本発明の抗体ＦａｂフラグメントにおけるＣＨ１の末端の鎖間システインは、ＣＨ１鎖間システインに対してＣ末端である上流のヒンジ又は他のアミノ酸の存在に起因して、立体的又は局所的な静電的効果が存在し得る通常のＦａｂフラグメントよりも、エフェクター分子結合及び還元のためにより高度にアクセス可能である。したがって、本発明の抗体フラグメントは、従来の抗体フラグメントよりも効率的且つコスト効果が高く修飾できる。適切な還元剤が、抗体フラグメントが還元剤で処理される後で産生される遊離チオールの数を決定することによって同定できることは当業者には明らかである。遊離チオールの数を決定するための方法は当該分野において周知であり、例えば、Ｌｙｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｅｅｒｉｎｇ，３，７０３を参照のこと。本発明に使用するための還元剤は当該分野において広範に公知である（例えば、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２５１，１６７−７３に記載されるもの）。特定の例には、還元グルタチオン（ＧＳＨ）、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、β−メルカプトエチルアミン（β−ＭＡ）、及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）などのチオール系還元剤が含まれる。本発明の抗体フラグメントを還元するための他の方法には、電気分解的方法を使用すること（例えば、Ｌｅａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９６５，Ｄｉｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃｈｅｍ，４，２３−２７において記載される方法）、及び光還元的方法を使用すること（例えば、Ｅｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２８（２），３２４−３２６に記載される方法）が含まれる。しかし、好ましくは、本発明に使用するための還元剤は、抗体フラグメント中の１つ以上のチオールを遊離させることが可能である非チオール系還元剤である。好ましくは、非チオール系還元剤は、抗体フラグメント中の鎖間チオールを遊離させることが可能である。本発明に使用するための好ましい還元剤は、トリアルキルホスフィン還元剤である（Ｒｕｅｇｇ  ＵＴ及びＲｕｄｉｎｇｅｒ，Ｊ．，１９７７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，４７，１１１−１２６；Ｂｕｒｎｓ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ，５６，２６４８−２６５０；Ｇｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７３，７３−８０；Ｈａｎ及びＨａｎ、１９９４，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２０，５−１０；Ｓｅｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２６，１２６５−１２７３）。これらの特定の例には、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリスブチルホスフィン（ＴＢＰ）、トリス−（２−シアノエチル）ホスフィン、トリス−（３−ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰ）、及びトリス−（２−ヒドロキシエチル）ホスフィンが含まれる。最も好ましくは、本発明に使用するため還元剤は、ＴＣＥＰ又はＴＨＰのいずれかである。本発明に使用するための還元剤の濃度は、例えば、還元剤の濃度を変化させること、及び産生した遊離チオールの数を測定することによって経験的に決定できることは当業者には明らかである。代表的には、本発明に使用するための還元剤は、抗体フラグメントよりも過剰で、例えば、２倍から１０００倍モル濃度過剰で使用される。好ましくは、この還元剤は、２、３、４、５、１０、１００、又は１０００倍過剰である。一実施形態では、還元剤は２から５ｍＭで使用する。
【００４８】
本発明による修飾抗体Ｆａｂフラグメントは、エフェクター分子、好ましくは、チオール選択性活性化エフェクター分子と、少なくとも１つの反応性システイン残基を含む本明細書に記載されるような抗体Ｆａｂフラグメントを反応細胞させることによって調製できる。上記の工程（ａ）及び（ｂ）における反応は、一般的に、溶媒、例えば、酢酸又はリン酸などの水性緩衝溶液中で、中性ｐＨ、例えば、約ｐＨ４．５から約ｐＨ８．５、典型的にはｐＨ４．５から８、適切にはｐＨ６から７において実行できる。反応は、一般的に、任意の適切な温度、例えば、約５℃から約７０℃の間、例えば、室温で実行できる。溶媒は、場合により、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＣＤＴＡ、又はＤＴＰＡなどのキレート剤を含んでもよい。好ましくは、溶媒は、ＥＤＴＡを、１から５ｍＭの間、好ましくは２ｍＭで含む。或いは、又は更に、溶媒は、クエン酸、シュウ酸、葉酸、ビシン、トリシン、トリス、又はＡＤＡなどのキレート剤緩衝液であってもよい。エフェクター分子は、一般的に、抗体フラグメントの濃度に比較して過剰の濃度で利用される。代表的には、エフェクター分子は、２から１００倍モル濃度過剰、好ましくは５、１０、又は５０倍過剰である。
【００４９】
必要である場合、所望の数のエフェクター分子を含む所望の生成物は、いずれかの開始物質、又は製造工程の間に生成される他の生成物から、通常の手段によって、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、プロテインＡ、プロテインＧ、若しくはプロテインＬのアフィニティークロマトグラフィー、又は疎水性相互作用クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー技術によって分離できる。
【００５０】
本発明によって、２種以上の抗体Ｆａｂフラグメントを含む混合物もまた提供され、この混合物はＦａｂフラグメントで富化されており、ここでフラグメント中の重鎖定常ドメインがＣＨ１の鎖間システインで終了しており、フラグメント中の重鎖が軽鎖に共有結合しておらず、フラグメントが軽鎖及び重鎖の定常領域中のシステインに結合したエフェクター分子を有することを特徴とする。この混合物は、本発明によって提供される方法を使用して産生できる。「富化される」によって、本発明者らは、結合したエフェクター分子の所望の数を有する抗体Ｆａｂフラグメントが、この混合物の５０％以上を占めることを意味する。好ましくは、結合したエフェクター分子の所望の数を有する抗体Ｆａｂフラグメントは、この混合物の５０％から９９％の間を占める。好ましくは、この混合物は、５０％超、好ましくは６０％超、より好ましくは７０％超を占める。所望の数のエフェクター分子を有する抗体Ｆａｂフラグメントを含むこのような混合物の割合は、本明細書に記載されるようなサイズ排除ＨＰＬＣ法を使用することによって決定できる。
【００５１】
本発明による抗体フラグメントは、多数の疾患又は障害の検出又は治療において有用であってもよい。このような疾患又は障害には、感染性疾患、例えば、細菌感染；真菌感染；炎症性疾患／自己免疫、例えば、関節リウマチ、骨関節炎、炎症性腸疾患；癌；アレルギー性／アトピー性疾患、例えば、喘息、湿疹；先天性疾患、例えば、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血；皮膚科学的疾患、例えば、乾癬；神経学的疾患、例えば、多発性硬化症；移植、例えば、移植臓器拒絶、移植片対宿主疾患；及び代謝性／特発性疾患、例えば、糖尿病の一般的な標題の下で記載されるものが含まれる可能性がある。
【００５２】
本発明による抗体フラグメントは、治療及び／又は診断に使用するために製剤化してもよく、本発明のさらなる態様によれば、重鎖定常領域がＣＨ１の鎖間システインで終了している抗体Ｆａｂフラグメントを、１種又は複数の医薬として許容可能な賦形剤、希釈剤、又は担体とともに含む医薬組成物を提供する。重鎖定常領域がＣＨ１の鎖間システインで終了しており、重鎖が軽鎖に共有結合しておらず、且つフラグメントが軽鎖及び重鎖の定常領域中のシステインに結合したエフェクター分子を有する抗体Ｆａｂフラグメントを、１種又は複数の医薬として許容可能な賦形剤、希釈剤、又は担体とともに含む、医薬組成物もまた提供する。
【実施例】
【００５３】
本発明を以下に図面を参照しながら、例示のみのために説明する。
【００５４】
（実施例１）
新規な「切断型」Ｆａｂフラグメントの作製
実施例２における抗体Ｆａｂ分子は、ヒヒ血小板由来成長因子レセプター（ＰＤＧＦｒ）に結合するｇ１６３であった。実施例３〜６における抗体Ｆａｂ分子は、可溶性サイトカインを結合するヒトＦａｂ（本明細書では以後ＦＡＢ（Ｂ）と呼ばれる）であった。実施例７〜８における抗体Ｆａｂ分子は、可溶性サイトカインを結合するマウスＦａｂ、ｍ１３であった。ｇ１６３及びＦＡＢ（Ｂ）を産生するために、ＰＣＲプライマーをヒトＩｇＧ１  ＣＨ１領域に基づいて設計し、ＰＣＲ変異誘発を使用して、ＣＨ１の鎖間システインの直後に終止コドンを挿入した。ｍ１３を産生するために、ＰＣＲプライマーをマウスＩｇＧ１  ＣＨ１領域に基づいて設計し、ＰＣＲ変異誘発を使用して、ＣＨ１の鎖間システインの直後に終止コドンを挿入した。重鎖及び軽鎖の定常領域の配列を以下及び図５に示す。
【００５５】
野生型ヒトγ１Ｆａｂ定常領域：
κ（配列番号２）
ＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ＊
ＣＨ１（配列番号９）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＡＡ＊
ｇ１６３及びＦａｂ（Ｂ）において使用されるヒト「切断型」γ１  Ｆａｂ定常領域：
κ（配列番号２）
ＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳ  ＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ＊
ＣＨ１（配列番号１）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣ＊
ｍ１３において使用されるマウス「切断型」γ１  Ｆａｂ定常領域
κ（配列番号４）
ＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＧＥＣ＊
ＣＨ１（配列番号３）
ＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡＰＧＳＡＡＱＴＮＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＥＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲＤＣ＊
下線を付したシステイン残基は、エフェクター分子が結合できる鎖間システインを示す。
【００５６】
Ｆａｂフラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０において産生され、且つ標準的な方法を使用して精製された（Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２６，３０９−３２０）。
【００５７】
（実施例２）
ｇ１６３のＰＥＧ化
すべての還元及びＰＥＧ化を、０．１Ｍリン酸ｐＨ  ６．０；２ｍＭ  ＥＤＴＡ中で実行した。Ｆａｂの濃度は５ｍｇ／ｍｌであり、還元剤の濃度は４０ｍＭの最終濃度であった。すべての場合において、還元を室温（約２４℃）で３０分間行い、タンパク質をＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で脱塩し、次いでＦａｂに対して５倍モル濃度過剰の２０ｋＤａ  ＰＥＧ−マレイミドと混合した。２０ｋＤａ  ＰＥＧはＮｉｐｐｏｎ  Ｏｉｌｓ  ａｎｄ  Ｆａｔｓ（ＮＯＦ）製であった。ＰＥＧ化されたＦａｂを、ＰＥＧ化されていないＦａｂから、サイズ排除ＨＰＬＣによって、分析用Ｚｏｒｂａｘ  ＧＦ−４５０カラム及びＧＦ−２５０カラム上で、順次に分離した。これらを、０．２Ｍリン酸ｐＨ  ７．０＋１０％エタノールの３０分間の定組成勾配で、１ｍｌ／分にて展開し、Ｆａｂを２１４ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸収を使用して検出した。
【００５８】
ｇ１６３  Ｆａｂを、２種の非チオール系還元剤、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリスブチルホスフィン（ＴＢＰ）を使用して還元し、２つの２０ｋＤａ  ＰＥＧ分子を鎖間システインに結合させた。ＰＥＧ化は、鎖間ジスルフィドが還元されたときに、両方のシステイン上で起こることが予想された。両方の部位のＰＥＧ化を、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した（図１）。レーンＢは、ＴＣＥＰを用いる還元後に結合した２つのＰＥＧ分子を有する、ｇ１６３切断型Ｆａｂに対応する。１００ｋＤａ付近でともに非常に密接している２つの高分子量バンドは、１つの結合したＰＥＧ分子を有する重鎖及び軽鎖から構成される。４５ｋＤａ付近のより低分子量のバンドは、結合したＰＥＧを有しない、少量の未修飾Ｆａｂである。２５ｋＤａ付近のより低分子量のバンドは、遊離の重鎖及び軽鎖である。レーンＤは、水性緩衝液及びタンパク質とより適合性でないＴＢＰを使用して還元した、同じフラグメントである。還元剤としてＴＣＥＰ及びＴＢＰを使用して二重ＰＥＧ化されるｇ１６３切断型Ｆａｂのパーセンテージは、ＨＰＬＣによって決定されるように、それぞれ７６％及び２１％であった。したがって、ＴＣＥＰは、本発明の修飾抗体フラグメントを製造するための有用な還元剤である。
【００５９】
（実施例３）
還元剤ＴＣＥＰ及びＴＨＰを使用する、Ｆａｂ（Ｂ）のＰＥＧ化の効率の比較
本実施例において、還元及びＰＥＧ化を、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ６．８中で実行した。Ｆａｂ（Ｂ）（２０ｍｇ／ｍｌ）の還元を、１０ｍＭの還元剤ＴＣＥＰ又はＴＨＰを使用して、１時間、大気温度で実行した。還元剤のキャリーオーバーを阻止するために、厳密なカットを用いて、還元剤をＰＤ１０脱塩カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で除去した。ＰＥＧ化を、Ｆａｂに対して３倍モル濃度過剰の２０ｋＤａ  ＰＥＧ−マレイミドを使用して、一晩、大気温度で実行した。図２は、ＴＨＰもまた、本発明の抗体フラグメントにＰＥＧを結合させるための有用な還元剤であることを示す。
【００６０】
（実施例４）
マウスＦａｂ、ｍ１３の二重ＰＥＧ化
マウス切断型Ｆａｂ、ｍ１３の鎖間システインを、２０ｋＤａ線状ＰＥＧを使用してＰＥＧ化した。還元及びＰＥＧ化を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．１４中２０．０６ｍｇ／ｍｌのＦａｂ、１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（最終）及び４モル濃度過剰の２０ｋＤａ  線状ＰＥＧで、室温で実行した。両方の部位のＰＥＧ化は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３）によって確認された。レーン１は二重ＰＥＧ化されたｍ１３であり（非還元）、レーン２は還元し二重ＰＥＧ化されたｍ１３であり、レーン３は非還元ｍ１３（ＰＥＧなし）であり、レーン４は還元したｍ１３（ＰＥＧなし）である。
【００６１】
（実施例５）
マウスにおけるｍ１３  Ｆａｂ−ＰＥＧ（２×２０ｋＤａ）の薬物動態
動物中における両方のポリペプチド（実施例４に記載のようなもの）上のｍ１３  Ｆａｂ  ＰＥＧ化の循環半減期を決定した。１２５Ｉ標識されたＰＥＧ化Ｆａｂ分子を、皮下又は静脈内でマウスに注射し、血清性能を決定した。
【００６２】
マウスを、頸部の背側に皮下で、又は軽度の麻酔の下で尾静脈中に静脈内注射をした。注射量はマウスあたり１００μｌであった。これは、１３μｇタンパク質及び１．２μＣｉアイソトープ線量（比活性（０．１μＣｉ／μｇ）と等価であった。４匹のマウスを、各時点において心臓穿刺によって出血させた。ヘパリン処理血液を、あらかじめ秤量したチューブに収集した。血液の重量を測定後、γカウンター中で放射能を計数した。
調べた時間の点は以下の通り：
静脈内；注射の０．５、２、４、６、２４、４８、７２、及び１４４時間後
皮下；注射の３、６、２４、３０、４８、７２、及び１４４時間後
【００６３】
【表１】
2007536898.tif 000003
【００６４】
表１及び図４の結果は、ＰＥＧ化Ｆａｂ中の重鎖及び軽鎖は共有結合していないが、循環半減期は、非ＰＥＧ化Ｆａｂ（ｔ１／２＝約３０分間）及び一層短い可能性がある遊離のＬＣ又はＨＣより長いことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】重鎖定常領域がＣＨ１の鎖間システインで終了しているＰＥＧ化ｇ１６３  Ｆａｂの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である。レーンＢは、ＴＣＥＰを用いる還元後に結合したＰＥＧを有するｇ１６３Ｆａｂを示す。レーンＤは、ＴＨＰを用いる還元後に結合したＰＥＧを有するｇ１６３Ｆａｂを示す。
【図２】Ｆａｂ（Ｂ）のＰＥＧ化効率に対する還元剤ＴＨＰ及びＴＣＥＰの比較の図である。
【図３】ＰＥＧ化マウスＦａｂ、ｍ１３のＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である。
【図４】マウスにおける１２５Ｉ標識  ｍ１３  ＰＥＧ−二重ＰＥＧ（２×２０ｋＤａ）の薬物動態の図である。
【図１】
2007536898.tif 000004
【図２】
2007536898.tif 000005
【図３】
2007536898.tif 000006
【図４】
2007536898.tif 000007
【図５】
2007536898.tif 000008
【国際調査報告】
2007536898.tif 000009
2007536898.tif 000010
2007536898.tif 000011