(57)【要約】  好酸球形態変化、細胞骨格変化、接着分子アップレギュレーションもしくはカルシウムフラックスのような、ヒスタミンＨ４受容体により媒介される作用を検出するために全血を分析するアッセイ方法が記述される。そのような方法は、臨床および診断用途において有用である。
2007506983.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）供給源からの全血をヒスタミンＨ４受容体アンタゴニストで処理し、処理サンプルを生成せしめること；
処理サンプルにヒスタミンおよび特異的ヒスタミンＨ４受容体アゴニストから選択されるアッセイ試薬を加え、アッセイサンプルを生成せしめること；および
ヒスタミンＨ４受容体により媒介される作用を検出するためにアッセイサンプルを分析すること
を含んでなる段階により全血の処理サンプルに対して研究アッセイ（ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  ａｓｓａｙ）を行うこと
を含んでなるヒスタミンＨ４受容体により媒介される作用のアッセイ方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、該加える段階が、処理サンプルにヒスタミンＨ２受容体アンタゴニストを加えることをさらに含んでなる方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、該分析することの前に：
インキュベーション反応を促進する温度および時間でアッセイサンプルをインキュベーションすること；および
インキュベーション反応を停止させ、そしてアッセイサンプルを固定剤で固定することをさらに含んでなる方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法において、該分析することが、アッセイサンプルにおける赤血球を溶解することおよびフローサイトメトリーを用いて好酸球形態変化を検出することを含んでなる方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法において、該分析することが、アッセイサンプルに染色試薬を加えることおよびフローサイトメトリーを用いて接着分子アップレギュレーションを検出することを含んでなる方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、該染色試薬が蛍光色素標識およびフィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｅｒｉｎｅ）コンジュゲート抗ＣＤ１１ｂおよび抗ＣＤ５４抗体から選択される方法。
【請求項７】
請求項３に記載の方法において、該分析することが、フローサイトメトリーを用いて細胞内遊離カルシウムのレベルをモニターすることを含んでなる方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において、全血をフッ素化剤で処理することをさらに含んでなり、そしてさらに細胞内遊離カルシウムのレベルの該モニタリングが蛍光の変化を測定することを含んでなる方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法において、該分析することが、アッセイサンプルを蛍光色素で染色することを含んでなる方法。
【請求項１０】
請求項３に記載の方法において、該分析することが、蛍光顕微鏡を用いて細胞骨格変化を観察することを含んでなる方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、該分析することの前にアッセイサンプルを蛍光色素で染色することをさらに含んでなる方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法において、供給源が臨床研究におけるヒト被験体であり、そして
該方法が：
（ｂ）未処理のサンプルにアッセイ試薬を加え、コントロールサンプルを生成せしめること；および
ヒスタミンにより媒介される作用を検出するためにコントロールサンプルを分析すること
を含んでなる段階により供給源からの全血の未処理のサンプルにコントロールアッセイを行うこと；ならびに
（ｃ）処理サンプルへの研究アッセイの結果をコントロールサンプルへのコントロールアッセイの結果と比較すること
をさらに含んでなる方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、研究アッセイ（ａ）の該加える段階が、処理サンプルにヒスタミンＨ２受容体アンタゴニストを加えることをさらに含んでなり、そしてコントロールアッセイ（ｂ）の該加える段階が、未処理のサンプルに該ヒスタミンＨ２受容体アンタゴニストを加えることをさらに含んでなる方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法において、該処理する段階が、投与処方計画に従ってヒト被験体にヒスタミンＨ４受容体アンタゴニストを投与することを含んでなり、そしてコントロールサンプルへの該アッセイが、該処理することの前に行われる方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法において、処理サンプルを一定期間ごとに提供するために投与スケジュールの間に選択された時間間隔でヒト被験体から全血を採取すること、および処理サンプルの各々に該研究アッセイを行うことをさらに含んでなる方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法において、供給源が、ヒスタミンＨ４受容体活性により媒介される疑いがある疾患もしくは病状の診断を受けているヒト患者である方法。
【請求項１７】
（ａ）未処理のサンプルにヒスタミンおよび特異的ヒスタミンＨ４受容体アゴニストから選択されるアッセイ試薬を加え、コントロールサンプルを生成せしめること；および
ヒスタミンＨ４受容体により媒介される作用を検出するためにコントロールサンプルを分析すること
を含んでなる段階により任意のヒスタミンＨ４受容体アンタゴニストで未処理の供給源からの全血のサンプルにコントロールアッセイを行うこと
を含んでなるヒスタミンＨ４受容体により媒介される作用をアッセイする方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法において、該加える段階が、未処理のサンプルにヒスタミンＨ２受容体アンタゴニストを加えることをさらに含んでなる方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法において、該分析することが好酸球形態変化、細胞骨格変化、接着分子アップレギュレーションもしくはカルシウムフラックスを検出することを含んでなる方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法において、
（ｂ）供給源からの全血をヒスタミンＨ４受容体アンタゴニストで処理して、処理サンプルを生成せしめること；
処理サンプルにヒスタミンおよび特異的ヒスタミンＨ４受容体アゴニストから選択されるアッセイ試薬を加え、アッセイサンプルを生成せしめること；および
ヒスタミンＨ４受容体により媒介される作用を検出するためにアッセイサンプルを分析すること
を含んでなる段階により全血の処理サンプルに研究アッセイを行うこと；ならびに
（ｃ）コントロールサンプルのコントロールアッセイの結果を処理サンプルの研究アッセイの結果と比較すること
をさらに含んでなる方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法において、コントロールアッセイ（ａ）の該加える段階が、処理サンプルにヒスタミンＨ２受容体アンタゴニストを加えることをさらに含んでなり、そして研究アッセイ（ｂ）の該加える段階が、未処理のサンプルに該ヒスタミンＨ２受容体アンタゴニストを加えることをさらに含んでなる方法。
【請求項２２】
請求項２０に記載の方法において、全血の該処理がインビボで行われる方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法において、該供給源が哺乳類である方法。
【請求項２４】
請求項２２に記載の方法において、該供給源がヒトである方法。
【発明の詳細な説明】
【先行出願へのクロスリファレンス】
【０００１】
本願は、２００３年９月２６日に出願された米国仮出願第６０／５０６，４３４号の優先権の利益を請求する。
【０００２】
本発明は、ヒスタミンＨ４受容体により媒介される好酸球形態変化を検出するかもしくは測定するために全血をアッセイする方法に関する。本発明はまた、細胞骨格変化、接着分子アップレギュレーションもしくはカルシウムフラックス応答のような、全血におけるヒスタミンＨ４受容体により媒介される他の作用を検出するかもしくは測定するアッセイにも関する。そのような方法は、製薬学的研究および開発において、例えば臨床試験において患者もしくは被験体に投与するヒスタミンＨ４受容体モジュレーターの作用をモニターするバイオマーカーアッセイとして有用である。
【背景技術】
【０００３】
エオタキシンおよび他のケモカイン受容体アンタゴニストを調べるある種の全血アッセイは報告されている。例えば、非特許文献１を参照。また、非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４も参照。しかしながら、ヒスタミンＨ４受容体により媒介される作用の全血アッセイの必要性がある。
【０００４】
ヒスタミンは、体内の異なる生理系の調節において重要な役割を果たす生体アミンである。ヒスタミンは、マスト細胞、好塩基球、エンテロクロマフィン様細胞およびニューロンのような、特定の細胞タイプにおいてヒスチジン脱炭酸反応によりＬ−ヒスチジンから合成される。ヒスタミンの多様な生物学的作用は、異なるヒスタミン受容体を介して媒介され、それらは全てＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。
【０００５】
４種の異なるヒスタミン受容体、すなわち、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３およびＨ４受容体が同定されている（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。最近同定されたヒスタミン受容体ファミリーの新規メンバー、Ｈ４受容体は、他のヒスタミン受容体と低い相同性を有する。ヒスタミン受容体ファミリーにおけるその最も近いメンバーはＨ３受容体であり、それはＨ４受容体と３５％のみのアミノ酸相同性を共有する。Ｈ４受容体の薬理学的特性は、Ｈ４受容体でトランスフェクションした細胞を用いて研究されている（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。Ｈ１およびＨ２受容体特異的リガンドは、Ｈ４受容体に結合しない。対照的に、クロベンプロピット（ｃｌｏｂｅｎｐｒｏｐｉｔ）、イメチット（ｉｍｅｔｉｔ）、Ｒ−α−メチルヒスタミンおよびチオペラミドのような、ある種のＨ３受容体アゴニストおよびアンタゴニストは、Ｈ４受容体と様々な程度の交差反応性を示す。最近、Ｈ３もしくはＨ４受容体に特異的なアンタゴニストが作製されている。例えば、非特許文献１１；非特許文献１２；および特許文献１を参照。そのような化合物は、Ｈ３およびＨ４受容体の生物学的役割を分析する有益な手段として役立つことができる。
【０００６】
４種のヒスタミン受容体はそれらの発現プロフィールにおいて異なり、そしてそれらは異なる生物学的作用を媒介する。Ｈ１受容体は、平滑筋収縮、血管拡張および感覚神経活性化を包含する、アレルギー反応の症状を媒介する。Ｈ２受容体は、胃における胃酸分泌を高める。そしてＨ３受容体は、ニューロンによるヒスタミンおよび神経伝達物質の放出を調節する（非特許文献１３）。Ｈ４受容体の発現は、造血系の細胞、特にマスト細胞、好塩基球および好酸球に限定される（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特
許文献８；非特許文献１０）。
【０００７】
Ｈ４受容体は、マスト細胞走化性を媒介することが見出されている（非特許文献１４）。好酸球へのヒスタミンの走化性作用もまた、初期の研究において示唆されている（非特許文献１５）。最近、ヒスタミンに向かう好酸球走化性は、チオペラミドにより阻止されることが見出され、従って、Ｈ４受容体により媒介されることが示唆された（非特許文献１６）。
【０００８】
好酸球は通常は組織に、特に呼吸器系および腸系にそして子宮に存在する骨髄由来の顆粒球性白血球である。血流における好酸球数は比較的低く、そして組織に向かう好酸球遊走の制御は接着分子およびケモカインに起因している（非特許文献１７；非特許文献１８）。好酸球は後期アレルギー反応における重要なエフェクター細胞であり、そしてそれらはアレルギー性疾患の病因に関与している（非特許文献１９）。好酸球の活性化は、気道上皮損傷および喘息における気管支過敏性の発症をもたらすと考えられる有毒な顆粒タンパク質の放出をもたらす。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ  ０２／０７２５４８号明細書
【非特許文献１】Ｂｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，“Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ｔｏ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ  ｂｙ  ｎｏｖｅｌ  ＣＣ−ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ，”Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１６５，１６０２−１６０９
【非特許文献２】Ｍｅｎｚｉｅｓ−Ｇｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，“Ｅｏｔａｘｉｎ（ＣＣＬ１１）ａｎｄ  ｅｏｔａｘｉｎ−２（ＣＣＬ２４）ｉｎｄｕｃｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ，ｂａｓｏｐｈｉｌｓ，ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ，ａｎｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｓ  ｗｅｌｌ  ａｓ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ−  ａｎｄ  ｌａｔｅ−ｐｈａｓｅ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｔｏｐｉｃ  ａｎｄ  ｎｏｎａｔｏｐｉｃ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ，”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９，２７１２−２７１８
【非特許文献３】Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，“Ｂａｓｏｐｈｉｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ａｒｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｂｏｔｈ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ａｎｄ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６５，７２２４−７２３３
【非特許文献４】Ｐｅｎｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，“ＬＰＳ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ＣＣＲ３  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ＲＡＮＴＥＳ  ａｎｄ  ｅｏｔａｘｉｎ，”Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５，７０７−７１６
【非特許文献５】Ｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｙｐｅ  ｏｆ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，３６７８１−３６７８６
【非特許文献６】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，“Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｏｕｒｔｈ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｈ４）ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ，”Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５９，４２０−４２６
【非特許文献７】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ，ｍｏｕｓｅ，ｒａｔ，ａｎｄ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  Ｈ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ，”Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９９，１２１−１３０
【非特許文献８】Ｍｏｒｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，“Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，”Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９６，１０５８−１０６６
【非特許文献９】Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ，”Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５９，４２７−４３３
【非特許文献１０】Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，“Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，”Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５９，４３４−４４１
【非特許文献１１】Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，“Ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  Ｈ３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ，”Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１２，３３０９−３３１２
【非特許文献１２】Ｊａｂｌｏｎｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，“Ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｎｏｎ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｈｕｍａｎ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  Ｈ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ，”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４６（１９），３９５７−３９６０
【非特許文献１３】Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７、“Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．ＸＩＩＩ．Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，”Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．，４９，２５３−２７８
【非特許文献１４】Ｈｏｆｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，“Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  Ｈ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ａｎｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌｓ，”Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，３０５，１２１２−１２２１
【非特許文献１５】Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５，“Ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ，”Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１４２，１４６２−１４７６
【非特許文献１６】Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  Ｈ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ−ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ，”Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．，２２，４３１−４４８
【非特許文献１７】Ｌｕｋａｃｓ，２００１，“Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｓｔｈｍａ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１，１０８−１１６
【非特許文献１８】Ｔａｃｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，“Ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，”Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２８，１８−２０
【非特許文献１９】Ｂｏｕｓｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，“Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｓｔｈｍａ，”Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２３，１０３３−１０３９
【発明の開示】
【０００９】
［発明の要約］
ヒスタミンＨ４受容体が、以下に説明するように細胞形態変化および接着分子アップレギュレーションとともに好酸球走化性を媒介することを確定したことにより、今や、全血ヒスタミンアッセイが開発された。
【００１０】
従って、一つの一般的な態様として、本発明は、供給源からの全血をヒスタミンＨ４受容体アンタゴニストで処理し、処理サンプルを生成せしめること；処理サンプルにヒスタミンおよび特異的ヒスタミンＨ４受容体アゴニストから選択されるアッセイ試薬を加え、アッセイサンプルを生成せしめること；およびヒスタミンＨ４受容体により媒介される作用を検出するためにアッセイサンプルを分析することを含んでなる段階により全血の処理サンプルに研究アッセイ（ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  ａｓｓａｙ）を行うことを含んでなる、ヒスタミンＨ４受容体により媒介される作用をアッセイする方法に関する。別の一般的な態様として、本発明は、未処理のサンプルにヒスタミンおよび特異的ヒスタミンＨ４受容体アゴニストから選択されるアッセイ試薬を加え、コントロールサンプルを生成せしめること；およびヒスタミンＨ４受容体により媒介される作用を検出するためにコントロールサンプルを分析することを含んでなる段階により任意のヒスタミンＨ４受容体アンタゴニストで未処理の全血のサンプルにコントロールアッセイを行うことを含んでなる、ヒスタミンＨ４受容体により媒介される作用をアッセイする方法に関する。好ましい態様として、コントロールアッセイおよび研究アッセイを比較目的のために組み合わせる。
【００１１】
本発明のアッセイの利点、ならびに実例となる態様および別の特徴は、添付の図面と併せて理解される以下の詳細な記述から明らかである。
【００１２】
図面に示す実験結果は、以下の詳細な記述においてさらに説明され、それは本発明のアッセイの実例となるそして好ましい態様ならびにバックグラウンド実験を説明する。
【００１３】
［本発明の詳細な記述およびその好ましい態様］
マスト細胞はヒスタミンの主要な生産者であり、そしてマスト細胞および好酸球は両方ともアレルギー反応における既知のエフェクター細胞であるので、ヒスタミンを介した好酸球の漸増におけるマスト細胞の役割を以下に記述する実験を行うことにより調べた。以下に説明するように、好酸球は細胞形態を変化すること、接着分子のアップレギュレーションおよび走化性においてヒスタミンに応答する。Ｈ４受容体特異的アンタゴニストを用いて、全てのこれらの応答が好酸球上に発現されるＨ４受容体により媒介されることを決定した。
【００１４】
バックグラウンド実験
材料
ヒト細胞系ＨＭＣ−１、ＨＬ６０．１５および一次ＨＵＶＥＣ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。ＲＮｅａｓｙキットは、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）からであった。ＲＴ反応キットおよびＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からであった。Ｈ３受容体特異的アンタゴニストの化合物ＢならびにＨ４受容体特異的アンタゴニストの化合物Ａは合成し（ＷＯ  ０１／７４８１５およびＷＯ  ０２／０７２５４８を参照、これらの開示は、本明細書に引用することにより組み込まれる）、そしてそれらのヒスタミン受容体特異性は以前に記述された（Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，上記；Ｊａｂｌｏｎｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，上記）。全てのケモカインおよびサイトカインは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。全ての抗体は、ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。全ての他の試薬は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ヒスタミン、イメチット、クロベンプロピットおよび全ての他の試薬は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。
【００１５】
異なるヒト造血細胞タイプの精製
好酸球および好中球は、健康な志願者から集めた血液サンプルから精製した。簡潔に言えば、ヘパリン添加全血の遠心分離により多血小板血漿を除いた。好中球および好酸球で濃縮される多形核白血球（ＰＭＮＬ）を不連続血漿−パーコール勾配（密度１．０８２ｇ／ｍｌ）上で２０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から分離した。ＰＭＮＬにおける赤血球細胞は、低張ショック溶解により除いた。ＰＭＮＬをヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、そして分別細胞計数を行った。好酸球計数は、全ＰＭＮＬ数の２〜１０％の間であった。ヒト好中球は、磁気細胞分離系（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡからのＡｕｔｏＭＡＣＳ）において抗ＣＤ１６コンジュゲートミクロビーズを用いて正の選択によりＰＭＮＬから精製した。ＰＭＮＬを０．５％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳにおいて抗ＣＤ１６コンジュゲートミクロビーズとインキュベーションし、それらは好中球に選択的に結合する。好中球は、ＡｕｔｏＭＡＣＳ系において磁場に細胞懸濁液を通すことにより精製された。好酸球は、負の選択によりＰＭＮＬから精製した。ＰＭＮＬを０．５％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳにおいて抗ＣＤ１６、抗ＣＤ３、抗ＣＤ１９および抗ＣＤ１４コンジュゲートミクロビーズのカクテルとインキュベーションし、それらはＰＭＮＬ懸濁液におけるそれぞれ好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞および単球に選択的に結合する。好酸球は、ＡｕｔｏＭＡＣＳ系においてミクロビーズに結合した細胞を除くことにより精製され、Ｈ＆Ｅ染色によれば＞９７．５％の純度の好酸球集団をもたらした。精製された好酸球をバッファー（１０ｍＭ  Ｃａ２＋およびＭｇ２＋、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭグルコースおよび０．１％  ＢＳＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４）において１回洗浄し、そして実験にすぐに使用した。
【００１６】
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＰＢＭＣから精製した。ヒトＰＢＭＣを不連続血漿−パーコール勾配（密度１．０８２ｇ／ｍｌ）上でＰＭＮＬから分離した。ＰＢＭＣにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＡｕｔｏＭＡＣＳ系において抗ＣＤ４コンジュゲートミクロビーズを用いて正の選択により精製した。ＣＤ４＋Ｔ細胞をＴ細胞分化のためにサイトカインもしくは抗体の存在下で固定化抗ＣＤ３（培養プレートをＰＢＳ中５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３で一晩被覆し、そして次に使用前にＰＢＳで２回すすいだ）および２μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８で７日間刺激した。Ｉ型ヘルパーＴ細胞分化のためには、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１２および１０μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−４を培養培地に加えた。ＩＩ型ヘルパーＴ細胞分化のためには、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−４ならびに１０μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−１２および抗ＩＦＮ−γを培養培地に加えた。ヒトＩＬ−２をＴ細胞刺激の４日目に２０Ｕ／ｍｌで培養物に加えた。７日目のＴ細胞をＲＮＡ調製用に集めた。Ｉ型もしくはＩＩ型ヘルパーＴ細胞は、それぞれ、ＩＦＮ−γもしくはＩＬ−４のそれらの生産を特徴とした。７日の分化後のエフェクター細胞タイプを確かめるために、Ｔ細胞のアリコートを固定化抗ＣＤ３で一晩再刺激し、そして細胞上清をＥＬＩＳＡによりＩＬ−４もしくはＩＦＮ−γについて試験した。
【００１７】
ＰＢＭＣにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＡｕｔｏＭＡＣＳ系において抗ＣＤ８コンジュゲートミクロビーズを用いて正の選択により精製した。精製されたＣＤ８＋Ｔ細胞をＲＰＭＩ  １６４０培地において固定化抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で一晩刺激した。一晩活性化後の細胞をＲＮＡ調製用に採取した。
【００１８】
ＰＢＭＣにおける単球は、ＡｕｔｏＭＡＣＳ系において抗ＣＤ１４コンジュゲートミクロビーズを用いて正の選択により精製した。樹状細胞は、未成熟樹状細胞表現型に到達するように精製された単球を５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４および８００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦの存在下で１０日間培養することにより血液単球から生成せしめた。次に、未成熟樹状細胞を１００Ｕ／ｍｌのＴＮＦ−αで２４ｈ処理して細胞を成熟樹状細胞表現型に導いた。成熟樹状細胞をＲＮＡ調製に使用した。
【００１９】
ヒト好酸球細胞系の分化
ヒトＨＬ６０．１５細胞系を１０％のＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地において培養し、そして細胞を０．５μＭの酪酸および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−５で２日間処理することにより好酸球に分化させた。
【００２０】
Ｈ４およびＨ３受容体ＲＮＡ発現の検出
精製されたヒト細胞からＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、そしてＲＴ反応キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。Ｈ４受容体ＲＮＡは、ヒトＨ４受容体特異的プライマー５’−ＡＴＧＣＣＡＧＡＴＡＣＴＡＡＴＡＧＣＡＣＡおよび５’−ＣＡＧＴＣＧＧＴＣＡＧＴＡＴＣＴＴＣＴを用いてＲＴ−ＰＣＲにより検出した。Ｈ４受容体の増幅ＰＣＲバンドは１１７０ｂｐである。Ｈ３受容体ＲＮＡは、ヒトＨ３受容体特異的プライマー５’−ＡＴＧＧＡＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣＧＡＣＧＧＧおよび５’−ＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＣＡＴＧＴＣＴＧを用いることにより検出した。Ｈ３受容体の増幅ＰＣＲバンドは１１２０ｂｐである。
【００２１】
フローサイトメトリーを用いた好酸球形態変化の測定
好酸球形態変化応答を調べるためにヒトＰＭＮＬサンプルを使用した。ＰＭＮＬを上記のように調製し、そして細胞をアッセイバッファー（１０ｍＭ  Ｃａ２＋およびＭｇ２＋、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭグルコースおよび０．１％  ＢＳＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４）に再懸濁した。細胞のアリコート（８０μｌのアッセイバッファー中５ｘ１０５のＰＭＮＬ）を室温でヒスタミン受容体アナログ（ジフェンヒドラミン、ラニチジン、チオペラミド、化合物ＡもしくはＨ３受容体アンタゴニスト）で１０分間前処理した後に１００μｌの最終容量で１．２ｍｌのポリプロピレンクラスターチューブ（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）においてヒスタミンもしくはケモカインを加えた。チューブを３７℃の水浴に１０分間（もしくは示すとおり）置き、その後でそれらを氷水浴に移し、そして２５０μｌのよく冷えた固定剤（ＰＢＳ中２％のパラホルムアルデヒド）を加えて反応を停止させ、そして細胞形態変化を維持した。細胞形態変化は、フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）で分析した。ＰＭＮＬにおける好酸球は、好中球のものと比較してそれらの高い自己蛍光に基づいてゲーティングした（ｇａｔｅｄ）。細胞形態変化は、前方散乱シグナルにおいてモニターした。ＰＭＮＬにおける好酸球および好中球を同定するために、細胞を氷上で飽和濃度のＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＣＲ３もしくは抗ＣＤ１６抗体（これらは、それぞれ、好酸球もしくは好中球に特異的である）で３０分間染色した。抗体染色後のサンプルをフローサイトメトリーにおいて分析した。
【００２２】
接着分子の細胞表面発現の検出
接着分子の細胞表面発現を調べるために精製された好酸球を使用した。好酸球を１０ｍＭ  Ｃａ２＋およびＭｇ２＋、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭグルコースおよび０．１％  ＢＳＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４に再懸濁した。細胞のアリコート（５ｘ１０５のＰＭＮＬ）をヒスタミン受容体アナログ（上記のとおり）で１０分間前処理した後に１００μｌの最終容量で１．２ｍｌのポリプロピレンクラスターチューブ（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）においてヒスタミンもしくはケモカインを加えた。チューブを３７℃の水浴に１０分間（もしくは示すとおり）置き、その後でそれらを氷水浴に移し、そして２５０μｌのよく冷えた固定剤（ＰＢＳ中０．５％のパラホルムアルデヒド）を加えた。次に、サンプルを飽和濃度のＦＩＴＣもしくはフィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｅｒｉｎｅ）コンジュゲート抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１１ｂもしくは抗ＣＤ５４抗体のいずれかと氷上で３０分間インキュベーションし、洗浄し、そして次にフローサイトメトリーにより分析した。
【００２３】
インビトロ走化性アッセイ
５μｍの細孔サイズを有するトランスウェル（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ）を１００μｌの１００ｎｇ／ｍｌヒトフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）で室温で２ｈ被覆した。過剰のフィブロネクチンの除去後に、０．５％のＢＳＡおよび異なる濃度のヒスタミン（０．０１〜１００μＭ）を含有する６００μｌのＲＰＭＩ−１６４０培地を下側のチャンバーに加えた。好酸球（２ｘ１０５／ウェル）を上側のチャンバーに加えた。ヒスタミン受容体アナログ（ジフェンヒドラミン、ラニチジン、チオペラミド、化合物Ａもしくは化合物Ｂ）を上側および下側の両方のチャンバーに１０μＭの最終濃度になるようにもしくは図の説明文に記載するような他の濃度で加えた。プレートを３７℃で２ｈインキュベーションし、そしてフローサイトメーターを用いて下側のチャンバーに遊走する細胞の数を１分間計数した。
【００２４】
統計
実験データは、独立したサンプルの数（ｎ）から平均±標準偏差（ＳＤ）として示される。ＩＣ５０もしくはＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＵＳＡ）を用いて非線形回帰分析により濃度−作用曲線から計算した。統計的有意性（Ｐ）は、スチューデントＴ検定により決定した。
【００２５】
結果：好酸球はＨ４受容体を発現するが、Ｈ３受容体を発現しない。
【００２６】
異なる精製されたヒト造血細胞タイプおよび細胞系におけるＨ４受容体の発現を調べた。有意なレベルのＨ４受容体ｍＲＮＡが、ＲＴ−ＰＣＲにより好酸球および樹状細胞において検出された（図１Ａ）。好酸球におけるＨ４受容体発現と対照的に、Ｈ３受容体はこれらの細胞において検出されなかった（図１Ｂ）。Ｈ４受容体のわずかな発現はＣＤ４＋Ｔｈ１およびＴｈ２エフェクター細胞において見出されたが、好中球、単球および活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞では検出されなかった（図１Ａ）。Ｈ４受容体発現はまた、好酸球前駆細胞系ＨＬ６０．１５においても検出され、そしてその発現は、細胞を好酸球に分化するようにＩＬ−５により誘導した場合に有意に増加された。ヒトＨＭＣ−１マスト細胞系は、検出可能なレベルのＨ４受容体を発現した。
【００２７】
結果：Ｈ４受容体は好酸球形態変化を媒介する。
【００２８】
ゲーティング（ｇａｔｅｄ）自己蛍光前方散乱（ＧＡＦＳ）アッセイとして知られている、フローサイトメトリーによる好酸球細胞形態変化の分析は、化学誘引物質により誘導される細胞形態変化の定量的測定を可能にする（Ｓａｂｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，“Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｖｉａ  ＣＣＲ３  ａｎｄ  ｎｏｎ−ＣＣＲ３  ｐａｔｈｗａｙｓ，”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２，２９４６−２９５５）。ヒト好酸球の細胞形態へのヒスタミンの可能な作用をフローサイトメトリーにより調べた。好中球および好酸球で濃縮された多形核白血球（ＰＭＮＬ）をヒト血液サンプルから調製し、そしてヒスタミンへのこれらの細胞の応答を調べた。好酸球は高レベルの自己蛍光を有し、そしてフローサイトメトリーにより好中球から区別することができた（図２Ａ）。図２Ａに示すように、高レベルの自己蛍光を有するＰＭＮＬにおける細胞集団はＣＣＲ３＋好酸球で非常に濃縮され、一方、低い自己蛍光を有する集団は主としてＣＤ１６＋好中球からなった。１μＭのヒスタミンは、好酸球に有意な細胞形態変化を誘導したが、好中球には影響がなかった（図２Ｂおよび２Ｃ）。
【００２９】
ヒスタミンは、ヒスタミン処理後早くも１分でフローサイトメトリーにより検出することができる好酸球への迅速なそして一時的な細胞形態変化を誘導し、５分で最大限に変化し、そして４０分後に元の細胞形態に徐々に戻った（図３Ａ）。経時的なヒスタミン作用
の消失は、細胞上清におけるヒスタミン活性の喪失のためではなかった。これらの細胞上清は、新たに調製した好酸球に通常の細胞形態変化を依然として引き起こすことができた（図３Ｂ）。好酸球形態変化は、ヒスタミンを除いた場合に維持されなかった。図３Ｂに示すように、ヒスタミンで５分間処理し、続いて洗浄した好酸球は、細胞形態変化を全く保持しなかった。しかしながら、これらの細胞は、ヒスタミンで再処理した場合に形態変化応答を依然として完全に再び開始することができた（図３Ｂ）。対照的に、ヒスタミンと６０分インキュベーション後の好酸球は、元の細胞形態に戻っただけでなく、ヒスタミン再刺激へのそれらの応答も失った。これらの細胞は、それらをヒスタミンがないように洗浄した後に再刺激した場合でさえヒスタミンにもはや応答しなかった（図３Ｂ）。
【００３０】
好酸球形態変化は、濃度依存的にヒスタミンにより誘導された（図３Ｃ）。好酸球への最大形態変化のためのヒスタミンの最適濃度は、〜１μＭであった。この形態変化は、ヒスタミン濃度が１μＭより高い場合に目立たなくなり、そして１００μＭのヒスタミンで形態変化は見出されなかった。好酸球形態変化へのヒスタミンのＥＣ５０は４４ｎＭであり、一方、ケモカインのエオタキシン、エオタキシン−２およびＭＣＰ−３のＥＣ５０は、それぞれ、１７ｐＭ、２１ｐＭおよび２０２ｐＭであった（図３Ｄ）。
【００３１】
好酸球形態変化を媒介することにおけるヒスタミンとケモカインとの間の可能な相乗効果を調べた。ヒスタミンおよびケモカインのＭＣＰ−３の両方の滴定ならびに好酸球形態変化へのそれらの組み合わせた効果をモニターした（図３Ｅ）。ヒスタミンもしくはＭＣＰ−３のいずれかが次善濃度範囲である場合に部分的相加効果が示された。この効果はヒスタミンもしくはＭＣＰ−３濃度依存的であり、そしてそれらがそれらの最大有効用量に達する場合にさらなる増大は見出されなかった。同様の相加効果はまた、ヒスタミンを好酸球形態変化研究においてエオタキシン−２と組み合わせた場合にも認められた。
【００３２】
好酸球形態変化に関与するヒスタミン受容体を決定するために特異的ヒスタミン受容体リガンドを使用した。１０μＭでＨ４受容体特異的アンタゴニストの化合物ＡおよびＨ３／Ｈ４受容体アンタゴニストのチオペラミドは、ヒスタミンによって誘導される好酸球形態変化を完全に阻止した（図４Ａ）。対照的に、Ｈ３受容体アンタゴニストの化合物Ｂ、Ｈ１受容体アンタゴニストのジフェンヒドラミンおよびＨ２受容体アンタゴニストのラニチジンは、いかなる阻害効果も示さなかった（図４Ａ）。１μＭのヒスタミンによって誘導される好酸球形態変化を阻止することにおける化合物ＡおよびチオペラミドのＩＣ５０は、それぞれ、２７０ｎＭおよび１２８ｎＭであり、一方、Ｈ３受容体特異的アンタゴニストは、３０μＭまで効果がなかった（図４Ｂ）。Ｈ３／Ｈ４受容体アゴニストのイメチットおよびＨ４受容体特異的アゴニストのクロベンプロピットは、好酸球における部分的形態変化を引き起こすことにおいてヒスタミン作用を模倣することができた（図４Ｃ）。従って、ヒスタミンによって誘導される好酸球形態変化は、Ｈ４受容体により媒介されるように思われた。
【００３３】
結果：ヒスタミンはＨ４受容体を介して細胞表面接着分子をアップレギュレーションする。
【００３４】
好酸球細胞表面上の接着分子発現へのヒスタミンの作用を、特異的抗体を用いてフローサイトメトリーにおいて調べた。好酸球上のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８（Ｍａｃ−１）およびＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）の細胞表面発現は、濃度依存的にヒスタミンにより誘導された（図５Ａ）。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８およびＣＤ５４の最大のアップレギュレーションのための最適ヒスタミン濃度は、１０分の刺激で１０μＭであった。興味深いことに、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８のようなβ２−インテグリンの別のメンバー、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（ＬＦＡ−１）の発現は、ヒスタミンにより誘導されなかった（図５Ａ）。接着分子の細胞表面発現の増加は、１０分のヒスタミン処理で認められた（図５Ａおよび５Ｂ）。一時的な形態変化応答と異なり、細胞表面接着分子の増加は、ヒスタミンと６０分のインキュベーション後に維持された（図５Ｂ）。
【００３５】
好酸球上の接着分子アップレギュレーションに関与するヒスタミン受容体を異なる特異的ヒスタミン受容体アンタゴニストを用いて調べた。図５Ｃに示すように、１０μＭの化合物Ａもしくはチオペラミドはいずれも、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８およびＣＤ５４発現のアップレギュレーションをなくした。対照的に、ジフェンヒドラミン、ラニチジンおよびＨ３受容体アンタゴニストの化合物Ｂは全て、好酸球上の接着分子のアップレギュレーションを阻止することにおいて効果がなかった。
【００３６】
結果：ヒスタミンはＨ４受容体を介して好酸球走化性を媒介する。
【００３７】
好酸球へのヒスタミンの走化性作用を精製されたヒト血液好酸球を用いて調べた。インビトロ走化性研究をトランスウェル系において行った。ヒスタミンは、８３ｎＭのＥＣ５０で濃度依存的に好酸球遊走を誘導した（図６Ａおよび６Ｂ）。好酸球への最大走化性作用は、１μＭのヒスタミンで得られた（図６Ａ）。ケモカインのエオタキシン−２およびＭＣＰ−３を比較のために同じアッセイにおいて用いた。好酸球走化性へのケモカインのエオタキシン−２およびＭＣＰ−３のＥＣ５０は、それぞれ、１．９ｎＭおよび４３ｎＭであった（図６Ｂ）。ヒスタミン濃度勾配の崩壊は好酸球遊走を完全になくしたので、好酸球へのヒスタミン作用は走化性であったが、ケモキネシスではなかった。
【００３８】
好酸球走化性へのヒスタミンとケモカインとの間の可能な相乗効果を調べた。ケモカインのエオタキシン−２およびＭＣＰ−３の滴定を次善濃度のヒスタミンの存在下もしくは不在下で行い、そして好酸球走化性への効果を調べた。図６Ｃに示すように、０．５μＭのヒスタミンの添加は、エオタキシン−２およびＭＣＰ−３により誘導される好酸球の走化性を高めた。
【００３９】
好酸球走化性に関与するヒスタミン受容体を決定するためにヒスタミン受容体アンタゴニストを使用した。１０μＭでチオペラミドおよび化合物Ａはヒスタミンによって誘導される好酸球走化性を完全に阻害し、一方、ジフェンヒドラミン、ラニチジンもしくはＨ３受容体アンタゴニストの阻害効果は最小であった（図６Ｄ）。化合物Ａおよびチオペラミドは両方とも、それぞれ、８６ｎＭおよび５１９ｎＭのＩＣ５０で、１μＭのヒスタミンによって誘導される好酸球走化性を阻止することにおいて濃度依存的効果を示した（図６Ｅ）。これらの結果は、ヒスタミンによって誘導される好酸球走化性がＨ４受容体により媒介されることを示唆する。
【００４０】
実験結果の説明
上記に示すように、好酸球はＨ４受容体を発現したが、Ｈ３受容体を発現しなかった。Ｈ４受容体はまた、樹状細胞において有意なレベルでそしてＣＤ４＋エフェクターＴ細胞において低いレベルで発現された。他の報告（Ｍｏｒｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，上記；Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，上記；Ｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，上記）と異なり、好中球および単球においてＨ４受容体ＲＮＡメッセージを検出することはできなかった。
【００４１】
好酸球、マスト細胞、好塩基球および樹状細胞におけるＨ４受容体の発現は、アレルギー反応にヒスタミンおよびＨ４受容体が関与している可能性を示唆する。典型的なアレルギー反応の確立は、２つの異なる段階：アレルゲン感作段階およびアレルギー反応段階を伴う。アレルゲン感作段階の間に、樹状細胞は抗原を獲得し、そしてＴ細胞活性化のためにドレーニング（ｄｒａｉｎｉｎｇ）リンパ節に移動する。マスト細胞から放出されるヒスタミンは、Ｈ４受容体を介して樹状細胞機能に影響を及ぼし、そしてＴ細胞活性化に影響を与えることができる。アレルゲン攻撃の段階で、アレルゲンへのマスト細胞の暴露は、マスト細胞脱顆粒およびヒスタミンの放出をもたらす。ヒスタミンは、アレルギー反応の部位でマスト細胞の蓄積を増大し、そして後期応答として好酸球を漸増することができる。ヒスタミンＨ１およびＨ２受容体は、Ｉ型およびＩＩ型ヘルパーＴ細胞上で異なって発現され、そしてそれらはＴ細胞エフェクター機能の調節において役割を果たすことが以前に示されている（Ｊｕｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，“Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈ１  ａｎｄ  Ｈ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，”Ｎａｔｕｒｅ，４１３，４２０−４２５）。Ｈ４受容体は、アレルギー反応の複雑なプロセスに関与する別のヒスタミン受容体であることが可能である。
【００４２】
上記の実験の結果は、ヒスタミンが好酸球の化学誘引物質であることを示す。好酸球は、細胞形態変化、細胞表面上の接着分子のアップレギュレーションならびに走化性でヒスタミンに応答する。Ｈ４受容体特異的アンタゴニストを用いて、好酸球へのこれらのヒスタミン作用の全てがＨ４受容体により媒介されたことをこれらの結果は示す。走化性は化学誘引物質勾配のより高い方への指向性細胞運動であり、そして細胞極性の樹立、従って、指向性シグナルに向かう細胞形態変化を必要とする。好酸球形態変化を測定するためにＧＡＦＳアッセイを用いて、ヒスタミンが濃度依存的に好酸球における迅速な形態変化を誘導することを示した。イメチットはＨ３およびＨ４受容体の両方のアゴニストであることが既知であり、一方、クロベンプロピットはＨ４受容体のアゴニストしかしＨ３受容体のアンタゴニストとして作用する（Ｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｙｐｅ  ｏｆ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，３６７８１−３６７８６；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，“Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｏｕｒｔｈ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｈ４）ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ，”Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５９，４２０−４２６；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ，ｍｏｕｓｅ，ｒａｔ，ａｎｄ，ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  Ｈ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ，”Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９９，１２１−１３０；Ｍｏｒｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，“Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，”Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９６，１０５８−１０６６  Ｍｏｒｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，“Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，”Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５９，４３４−４４１）。我々の研究において、イメチットおよびクロベンプロピットは両方ともアゴニストとして働き、そして好酸球形態変化を誘導することにおいてヒスタミン作用を模倣した。この結果は、ヒスタミンにより誘導される好酸球形態変化がＨ４受容体により媒介されることをさらに裏付ける。
【００４３】
ヒスタミンへの好酸球形態変化応答は、迅速であるが一時的であった。形態変化は、ヒスタミンとの１分のインキュベーション後に認められ、そして５分で最大応答に達した。ヒスタミンの除去は、好酸球形態変化を即座になくした。ヒスタミンへの短い暴露後に、好酸球はヒスタミン再刺激の際に形態変化応答を依然として完全に再び開始することができた。しかしながら、この好酸球形態変化応答は、高濃度（＞１００μＭ）のもしくは長期間（＞４０分）にわたるヒスタミンとのインキュベーション後に消失した。これらの好
酸球は脱感作されるように思われ、そして再刺激の際にヒスタミンにもはや応答しなかった。受容体内在化は、エオタキシンへの好酸球応答の脱感作を説明すると報告されている（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，“Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｅｏｔａｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ，”Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１１，９７−１０５）。ヒスタミンもまた、Ｈ４受容体の内在化を誘導することが示されている（Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ，”Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５９，４２７−４３３）。我々がここで認めたヒスタミンへの好酸球応答の脱感作もまた、Ｈ４受容体内在化の結果であることは可能である。
【００４４】
白血球化学誘引物質は、循環血液におけるそして微小血管内皮細胞における細胞間の協調的な一連の接着性相互作用を開始することが知られている。白血球遊走の段階は、接着、伸展、血管内皮細胞の漏出、および組織への浸潤を含んでなる（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，１９９４，“Ｔｒａｆｆｉｃ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｆｏｒ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｅｍｉｇｒａｔｉｏｎ：ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｓｔｅｐ  ｐａｒａｄｉｇｍ，”Ｃｅｌｌ，７６，３０１−３１４）。細胞表面上の接着分子のアップレギュレーションは、細胞遊走のプロセスにおける細胞伸展および漏出に必須である。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８（Ｍａｃ−１）およびＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）の細胞表面発現は、Ｈ４受容体を介してヒスタミンによりアップレギュレーションされたことを結果は示す。このアップレギュレーションは１０分以内に起こり、そしておそらくタンパク質合成と無関係である。一時的な形態変化応答と異なり、細胞表面上の接着分子アップレギュレーションは、はるかに長期間にわたって（６０分まで）保持された。ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（ＬＦＡ−１）発現レベルはヒスタミンにより誘導されなかったが、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３のようなそのリガンドへのアビディティの変化を除外することはできない。
【００４５】
ヒスタミンに向かう好酸球走化性を媒介することにおけるＨ４受容体の作用をトランスウェルインビトロ系において示した。好酸球へのヒスタミン作用は走化性であったが、ケモキネシスではなかった。他の典型的な好酸球ケモカインと比較して、ヒスタミンは比較的弱い走化性因子である。好酸球形態変化および走化性応答を引き起こすことにおけるヒスタミンの有効濃度は、エオタキシン−２およびＭＣＰ−３のようなケモカインにより誘導されるものより高い。さらに、血清におけるヒスタミン半減期は非常に短く（約１分）、そしてその血清濃度は標準状態において１ｎＭの範囲であり、そして全身性アレルギー反応において１０ｎＭに達することができるだけである（Ｃｈｕｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，５．６章，“Ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｂａｓｏｐｈｉｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”Ａｌｌｅｒｇｙ（Ｈｏｇａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．），Ｒａｖｅｒｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。測定した場合の好酸球走化性についてのヒスタミンのＥＣ５０は８３ｎＭであることを考慮すると、血流中のヒスタミンが好酸球遊走を引き起こすことができるとは考えにくい。しかしながら、組織におけるヒスタミン濃度は、特にマスト細胞脱顆粒が起こっている領域において、はるかに高いレベルに達することができる。組織において放出されるヒスタミンは、ヘパリン硫酸と複合体を形成してその半減期を延長し、そしてヒスタミン濃度勾配の樹立のために細胞外マトリックスと相互作用することができる。好酸球は、インビボ系の異なる区画を通るそれらの遊走経路において異なる走化性因子に依存することが可能である。ヒスタミンは、好酸球をそれらが血液循環から出た後に漸増するために組織においてその直接的走化性作用を及ぼすことができる。好酸球走化性応答を媒介することにおける他のケモカインとヒスタミンとの可能な協調効果を調べると、相加効果は認められたが、ヒスタミンとケモカインとの間の相乗効果は認められなかった。
【００４６】
アレルギー反応では、大量のヒスタミンがアレルゲン暴露の部位で局所的にマスト細胞から放出される。好酸球浸潤が後期応答として次に起こり、そしてこれらの細胞はアレルギーの発症において主要な役割を果たす。アレルギー反応の部位でのマスト細胞、好塩基球および好酸球の蓄積数は、疾患重症度と相関することが多い（Ｂｏｕｓｑｕｅｔ  ｅｔ
ａｌ．，１９９０，“Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｓｔｈｍａ，”Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２３，１０３３−１０３９；Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，“Ｂａｓｏｐｈｉｌｓ，ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ  ａｎｄ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａｔｏｐｉｃ  ａｎｄ  ｎｏｎａｔｏｐｉｃ
ａｓｔｈｍａ  ａｎｄ  ｉｎ  ｌａｔｅ−ｐｈａｓｅ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇ  ａｎｄ  ｓｋｉｎ，”Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０５，９９−１０７）。ここでの結果は、アレルギー反応の部位に特定の炎症細胞タイプを漸増することにおけるヒスタミンの役割を立証する。好酸球は、慢性アレルギー性疾患における重要な関与するものの一つである。細胞形態変化および接着分子のアップレギュレーションのようなＨ４受容体により媒介される好酸球応答は、全血において検出することができ、従って、Ｈ４受容体アンタゴニストの動物もしくは臨床研究、Ｈ４受容体を介して媒介される疾患および病状を調べるかまたは特定の実験的もしくは市販の薬剤が特定の患者を処置することにおいて有用である可能性があるかどうかを決定するための予後もしくは診断試験におけるバイオマーカーとして役立つことができる。そのような疾患および病状には、アレルギー性気道疾患および以下（その開示は、本明細書に引用することにより組み込まれる）：国際公開第ＷＯ  ０２／０７２５４８号および第ＷＯ  ０２／０５６８７１号；ならびに米国特許出願公開第ＵＳ  ２００３−０１３３９３１号および第ＵＳ２００４−００５８９３４号に記述されているものが包含される。
【００４７】
従って、本発明は、上記の要約に記述するような全血をアッセイする一般法に関する。そのようなアッセイにおいて、血液サンプルは、アッセイの前に任意の希釈または他の操作もしくは調製の必要なしに直接都合よく使用することができる。血液サンプルにおける試験中のもしくは市販の薬剤化合物の濃度は維持されることができ、そしてＨ４受容体機能を阻止すること、阻害することもしくは調節することにおけるそれらの効果をエクスビボで都合よくモニターすることができる。
【００４８】
コントロールサンプルとして、全血は、動物、例えば動物モデルの被験体、またはヒト、例えば臨床試験の被験体もしくはヒスタミンＨ４受容体活性により媒介されると考えられる疾患もしくは病状を有する患者のような供給源から入手することができる。アッセイサンプルには、例えばＨ４受容体アンタゴニストを投与することによる被験体のインビボ投与もしくはエクスビボでの血液への直接添加によって、Ｈ４受容体アンタゴニストでその血液が処理されている動物もしくはヒトからサンプルが得られる。典型的な動物には、マウス、ラット、モルモット、イヌおよびヒツジのような哺乳類が包含される。
【００４９】
それらの効能についてアッセイすることができる典型的なＨ４受容体アンタゴニストには、以下（その開示は、本明細書に引用することにより組み込まれる）：国際公開第ＷＯ
０２／０７２５４８号および第ＷＯ  ０２／０５６８７１号；ならびに米国特許出願公開第ＵＳ  ２００３−０１３３９３１号および第ＵＳ２００４−００５８９３４号に記述されているものが包含される。
【００５０】
Ｈ４受容体アンタゴニストの追加の例には、以下の頭部基もしくは部分：
【００５１】
【化１】
2007506983.tif 000003
【００５２】
に基づく一般クラスのメンバーが包含される。そのようなＨ４受容体アンタゴニストの特定の例には、以下の化合物が包含される：
（５−クロロ−７−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（２−クロロ−３−メチル−４Ｈ−チエノ［３，２−Ｂ］ピロール−５−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（２，３−ジメチル−４Ｈ−チエノ［３，２−Ｂ］ピロール−５−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（２，３−ジクロロ−４Ｈ−チエノ［３，２−Ｂ］ピロール−５−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（７−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（７−アミノ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（５−ブロモ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（５，７−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−ピペラジン−１−イル−メタノン；
（２，３−ジクロロ−６Ｈ−チエノ［２，３−Ｂ］ピロール−５−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（５−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（４，５−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−（５−トリフルオロメチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−メタノン；
（５−フルオロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（５，７−ジフルオロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（５−アミノ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（５−ヒドロキシ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−（３−メチル−４Ｈ−チエノ［３，２−Ｂ］ピロール−５−イル）−メタノン；
（７−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−［４−（２−ヒドロキシ−エチル）−ピペラジン−１−イル］−メタノン；
（２−クロロ−６Ｈ−チエノ［２，３−Ｂ］ピロール−５−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（５−クロロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（５−フルオロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（３，４−ジメチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（５，６−ジフルオロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（５，７−ジメチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（２−クロロ−３−メチル−４Ｈ−チエノ［３，２−Ｂ］ピロール−５−イル）−ピペラジン−１−イル−メタノン；
（４−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（６−ヒドロキシ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（（Ｒ）−３−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（（Ｓ）−３−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（４−ブロモ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（２−クロロ−４Ｈ−チエノ［３，２−Ｂ］ピロール−５−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（３−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（５−フルオロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−ピペラジン−１−イル−メタノン；
（７−アミノ−１Ｈ−インドール−２−イル）−ピペラジン−１−イル−メタノン；
（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−（５−ニトロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−メタノン；
（７−ヒドロキシ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（６−クロロ−５−フルオロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（７−ブロモ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（２−クロロ−６Ｈ−チエノ［２，３−Ｂ］ピロール−５−イル）−ピペラジン−１−イル−メタノン；
（３−ブロモ−４Ｈ−チエノ［３，２−Ｂ］ピロール−５−イル）−（４−メチル−ピペ
ラジン−１−イル）−メタノン；
（３−メチル−４Ｈ−チエノ［３，２−Ｂ］ピロール−５−イル）−ピペラジン−１−イル−メタノン；
（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−（６Ｈ−チエノ［２，３−Ｂ］ピロール−５−イル）−メタノン；
（５−クロロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−ピペラジン−１−イル−メタノン；
１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−カルボン酸（８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−アミド；
（５−ブロモ−ベンゾフラン−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（１Ｈ−インドール−２−イル）−（３−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；（１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；（６−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−（４Ｈ−チエノ［３，２−Ｂ］ピロール−５−イル）−メタノン；
（１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタンチオン；
（４−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−ピペラジン−１−イル−メタノン；
（２，３−ジメチル−４Ｈ−フロ［３，２−Ｂ］ピロール−５−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
［５−（３−メトキシ−フェニル）−１Ｈ−インドール−２−イル］−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（４−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−（３−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
（３−メチル−ピペラジン−１−イル）−（３−メチル−４Ｈ−チエノ［３，２−Ｂ］ピロール−５−イル）−メタノン；
（２−クロロ−６Ｈ−チエノ［２，３−Ｂ］ピロール−５−イル）−（ヘキサヒドロ−ピロロ［１，２−Ａ］ピラジン−２−イル）−メタノン；
（６−ブロモ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；
５−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−カルボン酸（８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−アミド；および
（３−ブロモ−４Ｈ−チエノ［３，２−Ｂ］ピロール−５−イル）−（３−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン。
【００５３】
他の適当なアンタゴニストは、当該技術分野において既知であるかもしくは利用できるようになる他の化合物から選択することができる。
【００５４】
アッセイする血液サンプルにアッセイ試薬としてヒスタミン（４−（２−アミノ−エチル）イミダゾール、これは適当な形態で、例えば塩酸塩もしくはリン酸塩として使用することができる）またはイメチットもしくはクロベンプロピットのような特異的ヒスタミンＨ４受容体アゴニストを加える。他の適当なアゴニスト化合物は、当該技術分野において既知であるかもしくは利用できるようになるものから選択することができる。
【００５５】
アッセイ試薬の添加後に、アッセイサンプルを約室温〜約４０℃および約１〜６０分の時間のような適当なインキュベーション温度および時間で反応させる。例えば、インキュベーションは、約３７℃の温度および約１０分の時間で実施することができる。インキュ
ベーション後に、反応を例えばよく冷えた水浴でクエンチする。反応の停止後に、サンプルをＰＢＳ中２％のパラホルムアルデヒドのような適当な固定剤で固定する。
【００５６】
好酸球形態変化の検出を容易にするために、アッセイサンプルの赤血球を例えばＱｉａｇｅｎもしくはＯｐｔｉｌｙｓｅのような低張溶解溶液で溶解する。細胞形態変化を分析するために、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターのような、自己蛍光分析器もしくはフローサイトメーターを用いることができる。
【００５７】
あるいはまた、ヒスタミンＨ４受容体により媒介される他の作用を分析することができる。例えば、細胞内カルシウムフラックス、接着分子アップレギュレーションもしくは細胞骨格変化を検出することができる。
【００５８】
本発明のアッセイの実例となる態様を以下の実施例に記述する。
【実施例】
【００５９】
［実施例１Ａおよび１Ｂ］フローサイトメトリーを用いた好酸球形態変化の測定
［実施例１Ａ］
出発物質は、上記の実験に記述するようにして得た。好酸球形態変化応答を調べるためにヒト全血サンプルを使用した。健康なドナーから集めたヒト血液サンプルを抗凝血剤として３．８％のクエン酸３ナトリウム（もしくは他の抗凝血剤）で処理し、そして３００ｒｐｍで遠心分離した。サンプルを１時間以内に実験に使用した。８０μｌの全血のアリコートをヒスタミン受容体アナログ（Ｈ１受容体アンタゴニストのジフェンヒドラミン、Ｈ２アンタゴニストのラニチジン、Ｈ４受容体アンタゴニストのチオペラミドおよび化合物Ａ、ならびにＨ３受容体アンタゴニストの化合物Ｂのような）で１０分間前処理した後に１００μｌの最終容量で１．２ｍｌのポリプロピレンクラスターチューブ（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）においてヒスタミンもしくはケモカインを加えた。チューブを３７℃の水浴に１０分間置き、その後でそれらを氷水浴に移し、そして２５０μｌのよく冷えた固定剤（ＰＢＳ中２％のパラホルムアルデヒドもしくは他の固定剤）を加えて反応を停止させ、そして細胞形態変化を維持した。赤血球を３ｍｌのＱｉａｇｅｎ溶解溶液（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で４℃で１０分間溶解した。白血球を２０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により回収し、１０ｍＭ  Ｃａ２＋およびＭｇ２＋、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭグルコースおよび０．１％  ＢＳＡを含有するＰＢＳ（図１０および１１について）もしくは０．５％  ＢＳＡおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ（他の図について）のいずれかで１回洗浄し、そして次に同じバッファーに再懸濁した。細胞形態変化をＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）上で分析した。好酸球を好中球と比較してそれらの高い自己蛍光に基づいてゲーティングし、そして形態変化を前方散乱シグナルにおいてモニターした。データは、１５００の高蛍光性好酸球イベントについて得られた。結果は、非刺激細胞と比較したＦＳＣのパーセンテージ増加として表される。得られた結果を以下の表ＩおよびＩＩに提供し、それらはまたそれぞれ図７および図８にも対応する。
【００６０】
【表１】
2007506983.tif 000004
【００６１】
【表２】
2007506983.tif 000005
【００６２】
好酸球は、さらなる分析用にこれらの細胞のゲーティングを可能にするそれらの明確な高レベルの自己蛍光により血液サンプル中の他の白血球から区別することができた。図７に示されるように、ヒスタミンによって誘導される好酸球形態変化の程度は、ヒスタミン濃度に依存した。有意な好酸球形態変化は、〜０．１μＭのヒスタミンで検出された。ケモカインのエオタキシン−２は、アッセイにおける陽性コントロールとして用いた。０．１〜１０μＭのヒスタミンにより誘導される好酸球形態変化は、化合物Ａにより阻止された（図８）。
【００６３】
［実施例１Ｂ］
この実施例において、出発物質は、実施例１Ａに記述するようにして得た。好酸球形態変化応答を調べるためにヒト全血サンプルを使用した。健康なドナーから集めたヒト血液サンプルを抗凝血剤として３．８％のクエン酸３ナトリウム（もしくは他の抗凝血剤）で処理し、そして３００ｒｐｍで遠心分離した。サンプルを１時間以内に実験に使用した。８０μｌの全血のアリコートをヒスタミン受容体アナログ（Ｈ１受容体アンタゴニストのジフェンヒドラミン、Ｈ２アンタゴニストのラニチジン、Ｈ４受容体アンタゴニストのチオペラミドおよび化合物Ａ、ならびにＨ３受容体アンタゴニストの化合物Ｂのような）で５分間前処理した後に１００μｌの最終容量で１．２ｍｌのポリプロピレンクラスターチューブ（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）においてヒスタミンもしくはケモカインを加えた。チューブを３７℃の水浴に５分間置き、その後でそれらを氷水浴に移し、そして１５０μｌのよく冷えた固定剤（ＰＢＳ中２％のパラホルムアルデヒドもしくは他の固定剤）を加えて反応を停止させ、そして細胞形態変化を維持した。赤血球を３ｍｌのＱｉａｇｅｎ溶解溶液（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で４℃で１０分間溶解した。白血球を２０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により回収し、１０ｍＭ  Ｃａ２＋およびＭｇ２＋、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭグルコースおよび０．１％  ＢＳＡを含有するＰＢＳ（図１０および１１について）もしくは０．５％  ＢＳＡおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ（他の図について）のいずれかで１回洗浄し、そして次に同じバッファーに再懸濁した。細胞形態変化をＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）上で分析した。好酸球を好中球と比較してそれらの高い自己蛍光に基づいてゲーティングし、そして形態変化を前方散乱シグナルにおいてモニターした。データは、１５００の高蛍光性好酸球イベントについて得られた。結果は、非刺激細胞と比較したＦＳＣのパーセンテージ増加として表される。
【００６４】
図１０に示されるように、ヒスタミンでの処理の際に認められる好酸球形態変化は、Ｈ２受容体アンタゴニスト、ラニチジンの添加により増加され、従って、Ｈ４受容体依存的形態変化応答を分離した（ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ）。このＨ４受容体依存的作用は、用量依存的にその後の化合物Ａでの処理により相殺された（図１１）。
【００６５】
［実施例２］ヒスタミンにより媒介される接着分子アップレギュレーションの検出
この実施例は、接着分子の細胞表面発現を調べるためにヒト全血を使用することができる方法を記述する。健康なドナーから集めたヒト血液サンプルを抗凝血剤として３．８％のクエン酸３ナトリウムで処理し、そして全血サンプルを１時間以内に実験に使用する。８０μｌの全血のアリコートをヒスタミン受容体アナログ（ジフェンヒドラミン、ラニチジン、チオペラミド、化合物Ａ、およびＨ３受容体アンタゴニストの化合物Ｂ）で１０分間前処理した後に１００μｌの最終容量で１．２ｍｌのポリプロピレンクラスターチューブ（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）においてヒスタミンを加える。チューブを約１０分間約３７℃（室温のようなより低い温度を用いる場合には、インキュベーション時間は必要に応じて１０分より長い）のような、インキュベーションに適当な温度および時間で水浴中に置き、その後でそれらを氷水浴に移し、そして２５０μｌのよく冷えた固定剤（ＰＢＳ中２％のパラホルムアルデヒド）を加えて反応を停止させ、そして接着分子のアップレギュレーションを維持する。次に、サンプルを飽和濃度の蛍光色素標識（例えばＦＩＴＣもしくはフィコエリトリンコンジュゲート）抗ＣＤ１１ｂもしくは抗ＣＤ５４抗体のいずれかと氷上で３０分間インキュベーションし、洗浄し、そして次にフローサイトメトリーにより分析する。
【００６６】
［実施例３］ヒスタミンにより媒介されるカルシウムフラックスの検出
この実施例は、Ｈ４受容体に結合するヒスタミンにより誘導される、ヒト全血サンプル中の好酸球における細胞内カルシウムフラックス応答をフローサイトメトリーにより測定することができる方法を説明する。血液細胞にプロベネシド（２．５μＭ）およびＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７（０．０２％）の存在下でｆｌｕｏ−３アセトキシメチルエステル（２μＭ）もしくは別の適当な蛍光色素を２０分間負荷し、そしてカルシウム（１．８μＭ）およびマグネシウム（１μＭ）で５分間平衡化する。全血サンプルをヒスタミン受容体アナログ（ジフェンヒドラミン、ラニチジン、チオペラミド、化合物Ａおよび化合物Ｂ）で１０分間前処理する。血液サンプルにおけるヒスタミンの添加後すぐに、細胞内遊離カルシウムのレベルをフローサイトメトリーにより蛍光の変化としてモニターする。
【００６７】
［実施例４］全血サンプルにおけるヒスタミンにより媒介される細胞骨格変化の検出
好酸球におけるヒスタミンにより誘導される細胞形態変化は、アクチン重合による細胞骨格再構成の結果である。健康なドナーから集めたヒト血液サンプルを抗凝血剤として３．８％のクエン酸３ナトリウムで処理し、そして全血サンプルを１時間以内に実験に使用する。全血のアリコートをヒスタミン受容体アナログ（ジフェンヒドラミン、ラニチジン、チオペラミド、化合物Ａおよび化合物Ｂ）で１０分間前処理した後にヒスタミンを加える。細胞骨格変化をよく冷えた固定剤（ＰＢＳ中２％のホルムアルデヒド）で固定し、そして次にローダミンを結合したファロイジン（１：４０）で暗所において３０分間染色する。細胞をＰＢＳで数回洗浄し、その後で蛍光顕微鏡分析用にミクロスライドにおいて標本にする。
【００６８】
［実施例５］臨床試験におけるバイオマーカーとしての全血におけるヒスタミンにより媒介される好酸球形態変化
臨床試験における志願者に臨床プロトコルに従ってＨ４受容体化合物（アンタゴニスト）を与える。インビボでＨ４受容体により媒介される作用を阻止することにおける化合物の効果を全血形態変化アッセイにおいて試験する。化合物を投与した個体から集めた血液サンプルを抗凝血剤として３．８％のクエン酸３ナトリウムで処理し、そして全血サンプルを１時間以内に実験に使用する。ヒスタミンを１００μｌの最終容量で１．２ｍｌのポリプロピレンクラスターチューブ（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）において８０μｌの全血のアリコートに加える。チューブを３７℃の水浴に１０分間（もしくは適切なように）置き、その後でそれらを氷水浴に移し、そして２５０μｌのよく冷えた固定剤（ＰＢＳ中２％のパラホルムアルデヒド）を加えて反応を停止させ、そして細胞形態変化を維持する。赤血球を３ｍｌのＱｉａｇｅｎ溶解溶液（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）もしくは別の適当な低張溶解溶液で４℃で１０分間溶解する。白血球を２０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により回収し、０．５％  ＢＳＡおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳで１回洗浄し、そして次に同じバッファーに再懸濁する。細胞形態変化をＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）上で分析する。好酸球を好中球と比較してそれらの高い自己蛍光に基づいてゲーティングし、そして形態変化を前方散乱シグナルにおいてモニターする。
【００６９】
本発明は実例となる実施例および好ましい態様に関連して上記に詳細に記述されているが、本発明の範囲は先の記述によってではなく、特許法の原則の下で適切に解釈されるような添付の請求項により定義されることを当業者は理解する。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１Ａ−１Ｂ】Ｈ４受容体発現が好酸球および樹状細胞に限定されることを説明する結果を示す。図１Ａおよび１Ｂでは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３もしくはＨ４受容体でトランスフェクションしたヒトＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞をヒスタミン受容体検出の特異性のコントロールとして使用した。ＲＮＡサンプルにおけるＧ３ＰＤＨ  ｍＲＮＡをＰＣＲ反応におけるコントロールとして特異的プライマーで増幅した。
【図１Ａ】異なる精製された細胞タイプおよび細胞系におけるＨ４受容体ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ検出。異なる細胞タイプからの全ＲＮＡを逆転写し、そしてＰＣＲの鋳型として使用した（２５ＰＣＲサイクルをＨ４受容体の増幅のために行った）。
【図１Ｂ】ヒト好酸球はＨ４受容体を発現するが、Ｈ３受容体を発現しない。特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによりヒト好酸球におけるＨ３もしくはＨ４受容体ｍＲＮＡを検出した。２５ＰＣＲサイクルをＨ４受容体の増幅のために行った。
【図２Ａ−２Ｅ】ヒスタミンが好酸球形態変化を誘導することを示す結果を説明する。
【図２Ａ】好酸球（Ｒ１）が、高レベルの自己蛍光を有する細胞へのゲーティングによりヒトＰＭＮＬにおける好中球（Ｒ２）から区別されることを示すフローサイトメトリー分析。
【図２Ｂ】Ｒ１群としてゲーティングされる、高い自己蛍光を有する細胞集団の大部分がＣＣＲ３＋好酸球であることを示すフローサイトメトリー分析。
【図２Ｃ】Ｒ２群としてゲーティングされる、低い自己蛍光を有する細胞集団の大部分がＣＤ１６＋好中球であることを示すフローサイトメトリー分析。
【図２Ｄ】好酸球上でヒスタミンによって誘導される細胞形態変化。ヒトＰＭＮＬを１μＭのヒスタミンで１０分間処理し、そして細胞形態の変化をフローサイトメトリーによりモニターした。ヒト好酸球を好中球の自己蛍光から区別されるようなそれらの自己蛍光に基づいてフローサイトメトリー分析においてゲーティングした（図２Ａおよび２Ｂを参照）。ヒスタミンで処理したサンプルにおける細胞サイズを未処理のコントロールサンプルのものと比較した。前方散乱シグナル（ＦＳＣ）における細胞サイズの平均を示す。
【図２Ｅ】好中球上ではヒスタミンによって誘導される細胞形態変化はない。ヒトＰＭＮＬを１μＭのヒスタミンで１０分間処理し、そして細胞形態の変化をフローサイトメトリーによりモニターした。ヒト好中球を好酸球の自己蛍光から区別されるようなそれらの自己蛍光に基づいてフローサイトメトリー分析においてゲーティングした（図２Ａおよび２Ｂを参照）。ヒスタミンで処理したサンプルにおける細胞サイズを未処理のコントロールサンプルのものと比較した。前方散乱シグナル（ＦＳＣ）における細胞サイズの平均を示す。
【図３Ａ−３Ｅ】好酸球形態変化を引き起こすことにおけるヒスタミンの反応速度論および効能を示す結果を表す。
【図３Ａ】結果は、ヒスタミンによって誘導される好酸球形態変化の反応速度論を示す。ヒトＰＭＮＬを１μＭのヒスタミンで処理し、そして異なる時間点での好酸球細胞形態の変化をフローサイトメトリーにより調べた。細胞形態変化のパーセンテージは、未処理のサンプルのものからの増加に基づいて計算した。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝３である。
【図３Ｂ】異なる条件下でのヒスタミンへのヒト好酸球の形態変化応答を調べた。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝３である。
【図３Ｃ】ヒト好酸球形態変化へのヒスタミン作用の滴定およびケモカインとの比較の結果を示す。ヒトＰＭＮＬを異なる濃度のヒスタミンもしくはケモカイン（エオタキシン−２もしくはＭＣＰ−３）で１０分間処理した。好酸球形態変化をフローサイトメトリーによりモニターした。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝２である。
【図３Ｄ】好酸球形態変化へのヒスタミンおよびケモカインのＥＣ５０値の決定の結果を示す。ヒトＰＭＮＬを異なる濃度のヒスタミンもしくはケモカイン（エオタキシン、エオタキシン−２およびＭＣＰ−３）で処理した。好酸球形態変化をフローサイトメトリーによりモニターした。示すデータは、５回の反復実験の代表である。ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍプログラムで計算した。
【図３Ｅ】ヒスタミンが、ケモカインＭＣＰ−３と組み合わせた場合に好酸球形態変化を増大することを示す結果を説明する。ヒトＰＭＮＬをケモカインのＭＣＰ−３の組み合わせにおいてヒスタミンで１０分間処理した。好酸球形態変化をフローサイトメトリーによりモニターした。示すデータは、４回の反復実験の代表である。
【図４Ａ−４Ｃ】ヒスタミンによって誘導される好酸球形態変化は、Ｈ４受容体により媒介されることを示す結果を表す。
【図４Ａ】ヒスタミンによって誘導される好酸球形態変化は、Ｈ４受容体アンタゴニストの（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン（化合物Ａ）、Ｈ３／Ｈ４受容体アンタゴニストのチオペラミドにより阻止されたが、Ｈ１、Ｈ２もしくはＨ３受容体アンタゴニストにより阻止されなかった。研究に使用するＨ１、Ｈ２およびＨ３受容体アンタゴニストは、それぞれ、ジフェンヒドラミン、ラニチジンおよび（７−メチル−２−［４−（３−ピペリジン−１−イル−プロポキシ）−フェニル］−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン）（化合物Ｂ）であった。ヒトＰＭＮＬを１０μＭの異なるヒスタミン受容体アンタゴニストで前処理し、続いて１μＭのヒスタミンで１０分処理した。好酸球形態変化をフローサイトメトリーによりモニターした。細胞形態変化のパーセンテージは、未処理のサンプルのものからの増加に基づいて計算した。示すデータは、３回の反復実験の代表である。データは、平均±ＳＤおよびｎ＝３である。サンプルとヒスタミンのみのコントロールとの間の違いの統計的有意性（Ｐ値）は、スチューデントＴ検定により決定した。
【図４Ｂ】ヒスタミンによって誘導される好酸球形態変化への化合物Ａ、チオペラミドおよびＨ３受容体アンタゴニスト（化合物Ｂ）のＩＣ５０値の決定。ヒトＰＭＮＬを異なるアンタゴニストで１０分間前処理した後に１μＭのヒスタミンで細胞形態変化を誘導した。好酸球形態変化をフローサイトメトリーによりモニターした。阻害のパーセンテージは、１μＭのヒスタミンのみで処理したサンプルと比較した形態変化の減少に基づいて計算した。示すデータは、４回の反復実験の代表である。ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍプログラムで計算した。
【図４Ｃ】ヒト好酸球形態変化へのヒスタミン、Ｈ３／Ｈ４受容体アゴニストのイメチットおよびＨ４受容体アンタゴニストのクロベンプロピットの濃度依存的作用。
【図５Ａ−５Ｃ】好酸球上のヒスタミン誘導性接着分子発現がＨ４受容体により媒介されることを示す結果を表す。
【図５Ａ】好酸球上の接着分子ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８およびＣＤ５４の細胞表面発現は、ヒスタミンによりアップレギュレーションされた。ヒトＰＭＮＬを３７℃で異なる濃度のヒスタミンもしくはケモカインのエオタキシン−２で１０分間処理した。細胞サンプルをパラホルムアルデヒドで固定し、そしてＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ａもしくはＣＤ５４に特異的なＦＩＴＣコンジュゲート抗体で染色した。好酸球上の接着分子の発現をフローサイトメトリーによりモニターした。アップレギュレーションのパーセンテージは、未処理のサンプルの発現レベルからの増加に基づいて計算した。
【図５Ｂ】好酸球上の接着分子アップレギュレーションの反応速度論。ヒトＰＭＮＬを３７℃で１μＭのヒスタミンもしくは１ｎＭのケモカインのエオタキシン−２で１０分もしくは６０分間処理した。細胞サンプルをパラホルムアルデヒドで固定し、そしてＣＤ１１ｂもしくはＣＤ５４に特異的なＦＩＴＣコンジュゲート抗体で染色した。データは、平均±ＳＤおよびｎ＝３である。
【図５Ｃ】好酸球上のヒスタミンによって誘導される接着分子アップレギュレーションは、Ｈ４受容体アンタゴニストの化合物ＡおよびＨ３／Ｈ４受容体アンタゴニストのチオペラミドにより阻止されたが、Ｈ１、Ｈ２もしくはＨ３受容体アンタゴニストにより阻止されなかった。研究に使用するＨ１、Ｈ２およびＨ３受容体アンタゴニストは、それぞれ、ジフェンヒドラミン、ラニチジンおよび化合物Ｂであった。ヒトＰＭＮＬを１０μＭの異なるヒスタミン受容体アンタゴニストで１０分間前処理し、続いて３７℃で１μＭのヒスタミンで１０分処理した。細胞サンプルをパラホルムアルデヒドで固定し、そしてＣＤ１１ｂもしくはＣＤ５４に特異的なＦＩＴＣコンジュゲート抗体で染色した。データは、平均±ＳＤおよびｎ＝３である。サンプルとヒスタミンのみのコントロールとの間の違いの統計的有意性（Ｐ値）は、スチューデントＴ検定により決定した。
【図６Ａ−６Ｅ】ヒスタミンによって誘導されるヒト好酸球走化性は、Ｈ４受容体により媒介されることを示す結果を表す。
【図６Ａ】ヒト好酸球走化性へのヒスタミン作用の滴定。異なる濃度のヒスタミンに向かう精製されたヒト好酸球の走化性をトランスウェル系において調べた。ヒト好酸球をトランスウェルに置き、そしてヒスタミンを下側のチャンバーにおいて加えた。２時間のインキュベーション後に下側のチャンバーに遊走した好酸球をフローサイトメトリーにより１分間計数した。示すデータは、３回の反復実験の代表である。データは、平均±ＳＤおよびｎ＝３である。サンプルと未処理のコントロールとの間の違いの統計的有意性（Ｐ値）は、スチューデントＴ検定により決定した。
【図６Ｂ】好酸球走化性へのヒスタミンおよびケモカインのＥＣ５０値の決定。ヒト好酸球走化性をヒスタミンまたはケモカインのエオタキシン−２もしくはＭＣＰ−３の滴定で調べた。示すデータは、２回の反復実験の代表である。データは、平均±ＳＤおよびｎ＝３である。ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍプログラムで計算した。
【図６Ｃ】ヒスタミンは、ケモカインによって誘導される好酸球走化性を高めた。異なる濃度のケモカイン、エオタキシン−２もしくはＭＣＰ−３により誘導される好酸球走化性へのヒスタミン（０．５μＭ）の効果を調べた。示すデータは、３回の反復実験の代表である。データは、平均±ＳＤおよびｎ＝３である。統計的有意性（Ｐ値）は、スチューデントＴ検定により決定した。
【図６Ｄ】ヒスタミンによって誘導される好酸球走化性は、Ｈ４受容体アンタゴニストの化合物ＡおよびＨ３／Ｈ４受容体アンタゴニストのチオペラミドにより阻止されたが、Ｈ１、Ｈ２もしくはＨ３受容体アンタゴニストにより阻止されなかった。研究に使用するＨ１、Ｈ２およびＨ３受容体アンタゴニストは、それぞれ、ジフェンヒドラミン、ラニチジンおよび化合物Ｂであった。１０μＭのヒスタミンを下側のチャンバーにおいて加え、一方、１０μＭの異なるヒスタミン受容体アンタゴニストを両方のチャンバーにおいて加えた。示すデータは、４回の反復実験の代表である。データは、平均±ＳＤおよびｎ＝３である。統計的有意性（Ｐ値）は、スチューデントＴ検定により決定した。
【図６Ｅ】好酸球走化性アッセイにおけるＨ４受容体アンタゴニストの化合物ＡおよびチオペラミドのＩＣ５０値の決定。１μＭのヒスタミンを下側のチャンバーにおいて加え、一方、異なる濃度の化合物Ａもしくはチオペラミドを両方のチャンバーにおいて加えた。阻害のパーセンテージは、１μＭのヒスタミンのみで処理したサンプルと比較した遊走細胞数の減少に基づいて計算した。示すデータは、４回の反復実験の代表である。データは、平均±ＳＤおよびｎ＝３である。
【図７】ヒスタミンおよびエオタキシン２は、全血ＧＡＦＳアッセイにおいてヒト好酸球形態変化を誘導することを示す結果を表す。
【図８】ヒスタミンＨ４受容体（Ｈ４Ｒ）アンタゴニストは、ヒスタミンによって誘導される形態変化を阻止することを示す結果を表す。
【図９Ａ−９Ｂ】２つの市販されているＨ４Ｒアゴニスト、イメチットおよびクロベンプロピットは、好酸球形態変化を誘導することにおいてヒスタミンを模倣することを示す全血形態変化アッセイの結果を表す。
【図１０】ヒスタミンおよびＨ２アンタゴニスト、ラニチジンの両方での全血サンプルの処理によるＨ４特異的形態変化応答の分離を示す。
【図１１】増加する濃度の化合物Ａは、ヒスタミンおよびラニチジンの両方での全血サンプルの共処理により分離されるＨ４特異的形態変化応答を用量依存的に阻害することを示す。
【図３Ａ】
2007506983.tif 000006
【図３Ｂ】
2007506983.tif 000007
【図３Ｃ】
2007506983.tif 000008
【図３Ｄ】
2007506983.tif 000009
【図３Ｅ】
2007506983.tif 000010
【図４Ａ】
2007506983.tif 000011
【図４Ｂ】
2007506983.tif 000012
【図４Ｃ】
2007506983.tif 000013
【図５Ａ】
2007506983.tif 000014
【図５Ｂ】
2007506983.tif 000015
【図５Ｃ】
2007506983.tif 000016
【図６Ａ】
2007506983.tif 000017
【図６Ｂ】
2007506983.tif 000018
【図６Ｃ】
2007506983.tif 000019
【図６Ｄ】
2007506983.tif 000020
【図６Ｅ】
2007506983.tif 000021
【図７】
2007506983.tif 000022
【図８】
2007506983.tif 000023
【図９Ａ】
2007506983.tif 000024
【図９Ｂ】
2007506983.tif 000025
【図１０】
2007506983.tif 000026
【図１１】
2007506983.tif 000027
【図１Ａ】
2007506983.tif 000028
【図１Ｂ】
2007506983.tif 000029
【図２Ａ】
2007506983.tif 000030
【図２Ｂ】
2007506983.tif 000031
【図２Ｃ】
2007506983.tif 000032
【図２Ｄ】
2007506983.tif 000033
【図２Ｅ】
2007506983.tif 000034
【配列表】
2007506983000001.xml
【国際調査報告】
2007506983.tif 000036