(57)【要約】【課題】効果的な脳卒中予防剤の提供。【解決手段】薬用人参を含有する、脳卒中予防剤。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬用人参を含有する、脳卒中予防剤。
【請求項２】
薬用人参が紅参である、請求項１に記載の脳卒中予防剤。
【請求項３】
薬用人参のみを生薬として含有する、請求項１又は２に記載の脳卒中予防剤。
【請求項４】
脳卒中が脳梗塞又は脳出血である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の脳卒中予防剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の脳卒中予防剤を含む、脳卒中予防用の医薬品。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の脳卒中予防剤を含む、脳卒中予防用の食品。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の脳卒中予防剤を含む、脳卒中予防用の飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳卒中予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳卒中（脳血管障害）は、先進国において心疾患及び癌と並ぶ三大死因の１つである。脳卒中は、脳の血管が破れる出血性脳卒中（主に脳出血、くも膜下出血）と、脳の血管が詰まる虚血性脳卒中（主に脳梗塞）の２種類に大きく分けられる。脳卒中は高い割合で死亡又は重篤な脳機能障害を引き起こすことから、脳卒中の予防は依然として切実な課題である。しかし脳卒中を効果的に予防する薬剤は未だ開発されていない。
【０００３】
薬用人参（高麗人参とも呼ばれる）は、ウコギ科オタネニンジン（学名Panax ginseng C.A. Meyer）の根から調製される生薬である。日本薬局方では薬用人参は滋養強壮、虚弱体質、胃腸虚弱、食欲不振などに適用があると記載されている。薬用人参は主に中国で数千年以上にわたり、治療薬として使用されてきた。薬用人参の主な有効成分としてはジンセノサイドと呼ばれるサポニン群が知られている。しかし薬用人参やその含有成分の薬理効果はまだ十分に明らかになっていない。
【０００４】
薬用人参には、加工法の違いにより、紅参、白参、水参などの種類が存在する。非特許文献１は、紅参であるKRG（Korean Red Ginseng）に、in vivoモデル及びin vitroモデルで抗アレルギー効果があることを報告している。
【０００５】
特許文献１は還流抽出により得た高麗人参抽出物、刺五加抽出物、当帰抽出物、及び黄ごん抽出物からなる複合生薬材抽出物を含む、脳卒中及び神経変性疾患の予防及び治療用組成物を開示している。しかし特許文献１はそれらの個々の抽出物の作用について開示しておらず、例えば高麗人参抽出物が単独で脳卒中の予防又は治療効果を有するかどうかについては記載していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００６／０８０５９０号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ji-Ye Kee et al., J. Ginseng Res., (2017) 41: pp.134-143
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、効果的な脳卒中予防剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、薬用人参が脳卒中の発症を効果的に抑制することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下を包含する。
[1] 薬用人参を含有する、脳卒中予防剤。
[2] 薬用人参が紅参である、上記[1]に記載の脳卒中予防剤。
[3] 薬用人参のみを生薬として含有する、上記[1]又は[2]に記載の脳卒中予防剤。
[4] 脳卒中が脳梗塞又は脳出血である、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の脳卒中予防剤。
[5] 上記[1]〜[4]のいずれかに記載の脳卒中予防剤を含む、脳卒中予防用の医薬品。
[6] 上記[1]〜[4]のいずれかに記載の脳卒中予防剤を含む、脳卒中予防用の食品。
[7] 上記[1]〜[4]のいずれかに記載の脳卒中予防剤を含む、脳卒中予防用の飼料。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、脳卒中の発症を効果的に抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１はKRG投与実験期間中の体重（Ａ）及び食餌量（Ｂ）の変化を示す図である。丸はWKY群、四角はSHRSP対照群、三角は0.06% KRG群、ひし形は0.1% KRG群を表す。*p<0.01： SHRSP対照群、0.06% KRG群、及び0.1% KRG群（WKY群との比較）。
【図２】図２はKRG投与実験期間中の血圧の変化を示す図である。Ａは収縮期血圧、Ｂは拡張期血圧、Ｃは平均血圧を示す。丸はWKY群、四角はSHRSP対照群、三角は0.06% KRG群、ひし形は0.1% KRG群を表す。
【図３】図３はKRG投与実験期間中の脳卒中発症率（Ａ）及び生存率（Ｂ）の推移を示す。丸はWKY群、四角はSHRSP対照群、三角は0.06% KRG群、ひし形は0.1% KRG群を表す。*p<0.05、**p<0.01：SHRSP対照群との比較。
【図４】図４はKRG投与後の腹部大動脈の組織切片のHE染色像を示す写真である。Ａ：WKY群、Ｂ：SHRSP対照群、Ｃ：0.06% KRG群、Ｄ：0.1% KRG群。
【図５】図５はKRG投与後の脳の組織切片のHE染色像を示す写真である。Ａ：WKY群、Ｂ：SHRSP対照群、Ｃ：0.06% KRG群、Ｄ：0.1% KRG群。
【図６】図６はKRG投与後の脳のMRI画像を示す写真である。Ａ：SHRSP対照群、Ｂ：0.1% KRG群。
【図７】図７はKRG投与後の脳のMRI画像に基づいて算出した、大脳当たりの梗塞巣のスコアを示す。*p<0.05：SHRSP対照群との比較。
【図８】図８はKRG又はKRG抽出画分投与実験期間中の脳卒中発症率（Ａ）及び生存率（Ｂ）の推移を示す。四角は対照群、三角は0.06% KRG群、丸は0.04%サポニン群、ひし形は0.04%非サポニン群を表す。
【図９】図９はKRG又はKRG抽出画分投与実験において死亡したラットの脳の出血状態を調べた結果を示す写真の一例である。Ａ：対照群、Ｂ：0.06% KRG群、Ｃ：0.04%サポニン群、Ｄ：0.04%非サポニン群。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は薬用人参を含有する剤に関する。本発明は、薬用人参を含有する、脳卒中予防剤を提供する。
【００１４】
薬用人参は、高麗人参又は朝鮮人参とも呼ばれ、ウコギ科オタネニンジン（学名Panax ginseng C.A. Meyer）の根から調製される生薬である。薬用人参は、加工法の違いにより、主に水参、白参、紅参に分けられる。水参は未加工の生人参である。白参は生人参を皮を剥くか又は剥かずに太陽熱又は熱風で乾燥させた白っぽい外観の乾燥人参である。紅参は皮を剥かずに蒸した後、乾燥させて得られる赤褐色の外観の乾燥人参である。薬用人参、水参、白参、及び紅参は、元の人参の形状のものに加えて、切片、粉末、顆粒等の様々な形態に加工されたものを指す。本発明においては、このような薬用人参を有効成分として用いる。より好ましい実施形態では、薬用人参は紅参である。紅参はKRG（Korean Red Ginseng）とも呼ばれる。薬用人参は韓国産のオタネニンジンから調製したものであってよい。
【００１５】
一実施形態では、本発明に係る脳卒中予防剤は、生薬として、薬用人参のみを含有するものであり得る。本発明に係る脳卒中予防剤は、高麗人参抽出物、刺五加抽出物、当帰抽出物、及び黄ごん抽出物からなる複合生薬材抽出物を含まない。「生薬」とは、薬効を有する天然物（主に植物、動物、真菌、又は細菌等）の全体又は一部を、有効成分を精製することなく、未加工で、又は部位選別、乾燥、加熱、湯通し、蒸熱、切断、粉砕、抽出、及び／若しくは濃縮等の簡単な加工のみを施して薬用として用いるものを指す。本発明において薬用人参は、抽出物であってもよいが、サポニンと非サポニン成分とを分離した抽出物画分（例えば薬用人参の水抽出物のサポニン画分又は非サポニン画分）などの精製画分や粗精製画分は包含しない。なお薬用人参に代えて、薬用人参の水抽出物のサポニン画分又は非サポニン画分を用いても、脳卒中予防効果が認められるが、薬用人参の方が優れた予防効果が得られる。
【００１６】
本発明において「脳卒中」は、脳の血管が破れる出血性脳卒中（例えば、脳出血、くも膜下出血）と、脳の血管が詰まる虚血性脳卒中（例えば、脳梗塞）を包含する。一実施形態では、本発明に係る脳卒中予防剤は、例えば、脳梗塞及び／又は脳出血を予防するために好適に用いることができる。本発明において、脳卒中の予防とは、脳卒中の発症を防止又は遅延させることにより脳卒中の発症を抑制し（脳卒中発症率の上昇の抑制）、脳卒中を発症したとしても症状を軽度に抑えて脳卒中による死亡のリスクを低減する（生存率の増加）ことを指す。脳卒中の症状としては、例えば、歩行障害、立毛（とりわけ非ヒト動物の場合）、痙攣発作、麻痺、突然の激しい頭痛（しばしば吐き気やおう吐を伴う）、突然の記憶障害や言語障害、しびれ、突然の視力低下や視野狭窄等の視覚障害などが挙げられる。脳卒中の少なくとも１つの症状の出現を、脳卒中の発症の診断指標として用いることができる。脳卒中の発症はまた、脳のCT（computed tomography；コンピューター断層撮影法）検査、MRI（magnetic resonance imaging；磁気共鳴画像）検査、MRA（magnetic resonance angiography；磁気共鳴血管造影）検査等により、診断することができる。
【００１７】
本発明は、薬用人参又は本発明に係る脳卒中予防剤を含む、脳卒中予防用の医薬品も提供する。本発明に係る医薬品は、薬用人参を有効量で含有する。
【００１８】
本発明に係る脳卒中予防剤、及び脳卒中予防用の医薬品は、薬用人参に加えて、保存剤、賦形剤、緩衝剤、界面活性剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁化剤、コーティング剤などの製薬上許容される担体又は添加剤を含んでもよい。本発明に係る医薬品はまた、他の薬効成分等をさらに含有してもよい。本発明に係る医薬品は、複数の有効成分を含み、複数の薬効を有する複合製剤であってもよい。本発明に係る医薬品は、生薬としては、薬用人参のみを含有するものであってもよい。本発明に係る医薬品は、高麗人参抽出物、刺五加抽出物、当帰抽出物、及び黄ごん抽出物からなる複合生薬材抽出物を含まない。
【００１９】
本発明に係る医薬品は、限定するものではないが、経口投与用であることが好ましい。本発明に係る医薬品は、任意の剤形であってよく、例えば、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、ゲル剤、フィルム剤、顆粒剤、細粒剤、粉剤、徐放性製剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤、液剤、スプレー剤等の剤形でありうる。
【００２０】
本発明は、薬用人参又は本発明に係る脳卒中予防剤を含む、脳卒中予防用の食品も提供する。本発明に係る食品は、薬用人参を有効量で含有する。
【００２１】
本発明の食品は、飲料と、飲料以外の食品とを包含する。本発明に係る食品は、任意の種類の食品であってよく、飲料、菓子、乳製品、惣菜、パン、米・麺類、調味料等であってもよい。本発明に係る食品は、機能性食品であってもよい。「機能性食品」とは、生体に対して通常の栄養摂取ではない一定の薬理効果を付与することを目的とした食品を意味し、例えば、特定保健用食品（条件付きトクホ[特定保健用食品]を含む）や栄養機能食品を含む保健機能食品、機能性表示食品、特別用途食品（介護用食品、乳幼児用食品、妊産婦用食品、病者用食品、乳児用調製乳、高齢者用食品等）、健康食品、サプリメント（例えば、錠剤、被覆錠、糖衣錠、カプセル及び液剤などの各種剤形のもの）及び美容食品（例えばダイエット食品）などを包含する。本発明に係る機能性食品は、コーデックス（FAO/WHO合同食品規格委員会）の食品規格に基づく健康強調表示（Health claim）が適用される健康食品を包含する。本発明に係る食品の形状は特に限定されず、固形、液状、流動食状、ゼリー状、フィルム状、タブレット状、顆粒状、カプセル状など、任意の食品形状であってよい。本発明に係る食品は、薬用人参に加えて、様々な食品素材を含んでよく、例えば、糖質、タンパク質、脂質、食物繊維、ビタミン類、ミネラル類、及び食品添加物（例えば、香料、保存剤、pH調整剤等）などを含んでもよい。本発明に係る食品は、生薬としては、薬用人参のみを含有するものであってもよい。本発明に係る食品は、高麗人参抽出物、刺五加抽出物、当帰抽出物、及び黄ごん抽出物からなる複合生薬材抽出物を含まない。
【００２２】
本発明は、薬用人参又は本発明に係る脳卒中予防剤を含む、脳卒中予防用の飼料も提供する。本発明に係る飼料は、薬用人参を有効量で含有する。本発明において「飼料」は、非ヒト哺乳動物に与える食物を指す。本発明に係る飼料は、後述の非ヒト対象のためのものであってよい。
【００２３】
本発明に係る飼料は、薬用人参に加えて、様々な飼料成分や飼料素材を含んでよく、例えば、糖質、タンパク質、脂質、食物繊維、ビタミン類、ミネラル類、及び飼料添加物（例えば、香料、保存剤、pH調整剤等）などを含んでもよい。本発明に係る飼料は、生薬としては、薬用人参のみを含有するものであってもよい。本発明に係る飼料は、高麗人参抽出物、刺五加抽出物、当帰抽出物、及び黄ごん抽出物からなる複合生薬材抽出物を含まない。
【００２４】
薬用人参、並びに本発明に係る脳卒中予防剤、医薬品、食品及び飼料は、脳卒中の予防のために用いることができ、特に脳卒中の発症抑制のために用いることができる。薬用人参、又は本発明に係る脳卒中予防剤、医薬品、食品若しくは飼料を対象に投与（好ましくは、経口投与）することにより、対象における脳卒中を予防し、例えば、脳卒中の発症を抑制し、また脳卒中による死亡リスクを低減することができる。すなわち本発明は、脳卒中リスク低減のために有用である。本発明における投与量は、対象の年齢、体重、基礎疾患等の身体状態などにも依存し、以下に限定するものではないが、例えば体重1kg当たり0.1mg〜1gの薬用人参に相当する日用量を対象に投与してもよい。本発明に係る脳卒中予防剤、医薬品、食品、又は飼料は、以下に限定するものではないが、少なくとも一定期間（例えば、４又は８週間以上）にわたり、１日１回又は複数回（例えば２〜４回）投与又は摂取することが好ましい。
【００２５】
薬用人参、又は本発明に係る脳卒中予防剤等の剤、医薬品、食品若しくは飼料を投与又は摂取する対象としては、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、ニホンザル等の霊長類、ラット、マウス等のげっ歯類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラバ、ラクダ等の家畜、イヌ、ネコ、フェレット、ウサギ等の愛玩動物などを含む哺乳動物が挙げられる。特に、脳卒中の兆候又は素因（遺伝的又は環境的要因）を有する対象、脳卒中の既往歴を有する対象、脳卒中のリスクが高い疾患や状態を有する対象や脳卒中の予防が特に望まれる対象（例えば、高齢者、妊婦、宇宙飛行士）等は、本発明における好ましい投与・摂取対象である。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２７】
［実施例１］
(1) 飼料
げっ歯類用通常（標準）飼料CE-2（日本クレア株式会社）に、薬用人参KRG（Korean Red Ginseng）（販売名：正官庄コウジン末、大韓民国人参公社）を0.06%又は0.1%添加することにより調製された飼料を次の動物実験に用いた。ここで用いたKRGは、ウコギ科オタネニンジン（学名Panax ginseng C.A. Meyer）の根を、皮を剥くことなく、120〜130℃の水蒸気で2〜3時間蒸した後、乾燥して得られた生薬製剤（紅参）である。
【００２８】
(2) 動物実験
4週齢の雄性脳卒中易発症性高血圧自然発症ラット（SHRSP）（日本SLC）を、1日12時間の定時間照明下、恒温（24℃）及び恒湿（55±5%）で飼育した。なお、SHRSPは、5週齢で高血圧を呈し、おおよそ12週齢で脳卒中を発症する。SHRSPラットは3群に分け、i) 通常飼料CE-2（SHRSP対照群）、ii) KRG 0.06%含有飼料（0.06% KRG群）、又はiii) KRG 0.1%含有飼料（0.1% KRG群）をそれぞれの群に被験飼料として与えた。5週齢から被験飼料と、脳卒中の発症時期を揃える目的で1% NaCl水溶液を、自由摂取させた。対照ラットとして、WKYラット（Wistar Kyoto Rat）（日本SLC）を用い、通常飼料CE-2を被験飼料として与えること以外はSHRSPと同様の条件で飼育した（WKY群）。
【００２９】
被験飼料の給餌開始後、ラットの体重、食餌量、及び血圧を週1回測定した。血圧の測定は、非観血自動血圧測定装置（BP-98A、ソフトロン）を用いて行った。また、脳卒中症状（歩行障害、立毛、痙攣発作、及び麻痺）を観察し、１つ以上の症状が観察された場合には脳卒中を発症したと判断した。各群の脳卒中発症率と生存率（累積％）を算出した。１回の実験で各群5〜6匹のラットを使用し、同じ実験を3回繰り返した。
【００３０】
得られたデータは、平均値±標準誤差で表した。有意差検定にはTukey-Kramer多重比較を行い、危険率5％（p＜0.05）をもって統計学的に有意差があるものと判定した。但し、脳卒中発症率と生存率については、log-rank検定を行った。
【００３１】
図１に体重及び食餌量の変化を示す。WKY群、SHRSP対照群、0.06% KRG群、及び0.1% KRG群の全ての群で体重は経時的に増加したが、SHRSPを用いた3群（SHRSP対照群、0.06% KRG群、及び0.1% KRG群）はいずれも、8週齢以降はWKY群と比較して有意に少ない体重増加を示した（図１Ａ）。一方、1週間あたりの食餌量に各群で差はなかった（図１Ｂ）。これらの結果は、体重や食餌量がKRG摂取の影響を受けないことを示している。
【００３２】
図２に、血圧の変化を示す。収縮期血圧（Systolic blood pressure；SBP）はWKY群では、週齢（6〜15週齢）によってほとんど変化しなかった（6週齢：122.7±1.8mmHg、15週齢：135.8±1.9mmHg）。一方、SHRSP対照群では収縮期血圧は6週齢で156.7±2.2mmHg、12週齢で234.1±3.0mmHgと高値を示し、全ての週齢でWKY群より収縮期血圧が大幅に高かった。0.06% KRG群及び0.1% KRG群もWKY群と比較して同様に高い収縮期血圧を示した（図２Ａ）。0.1% KRG群では、SHRSP対照群と比べて6、7、8、11週齢において収縮期血圧が有意に減少し、高血圧初期の収縮期血圧の上昇が緩和されることが示されたが、経時的な血圧上昇自体はKRGにより阻止できなかった。拡張期血圧（Diastolic blood pressure；DBP）は、WKY群では週齢によって大きな変化がなかったのに対し、SHRSP対照群、0.06% KRG群及び0.1% KRG群ではいずれも週齢とともに増加し、KRGの効果は認められなかった。また平均血圧（Mean blood pressure；MBP）も、全ての週齢でWKY群と比べてSHRSP対照群、0.06% KRG群及び0.1% KRG群で高かった。
【００３３】
図３Ａに、脳卒中発症率の推移を示す。WKY群のラットは実験期間内で脳卒中症状を示さなかった。一方、通常飼料を摂取したSHRSP対照群では、13週齢から脳卒中の発症が確認され、15週齢までに全てのラットが脳卒中を発症した（発症率100%）。これに対し、0.06% KRG群及び0.1% KRG群の両群とも、15週齢までの発症率は約33%であり、SHRSP対照群と比較して統計学的に有意に低かった。
【００３４】
図３Ｂに、生存率の推移を示す。15週齢における生存率は、WKY群では100%であったが、SHRSP対照群では約17%と大きく低下した。一方、0.06% KRG群では15週齢の生存率は約83%、0.1% KRG群では約67%となった。
【００３５】
以上の結果から、KRGは脳卒中の発症を抑制し、脳卒中による生存率低下を抑制することが示された。一方で、KRGは高血圧に対する十分な治療効果を示さず、KRGの脳卒中予防効果が高血圧に対する効果とは関連していないことが判明した。
【００３６】
［実施例２］
実施例１に記載したようにしてKRGを自由摂取させたラット（死亡又は長期生存ラット）を、（生存している場合はイソフルラン麻酔下で）断頭し、脳及び腹部大動脈を摘出した。摘出した脳及び腹部大動脈の組織を、4％パラホルムアルデヒド含有PBS液で24時間固定した後、PBS液で3回洗浄した。次いで70％エタノールに浸し、4℃で保存した。固定した組織は自動包埋装置（Tissue-Tek(R) TECTM；サクラ精機）でパラフィンに包埋後、ミクロトームで6μm厚に薄切し、ポリ-L-リジンでコートされたスライドガラス上に組織切片を調製した。その組織切片を脱パラフィン後、ヘマトキシリンで核を5分間染色した。次にエオシンで対比染色（HE染色）し、脱水処理後封入剤により封入した。
【００３７】
図４に腹部大動脈（12週齢）の組織切片のHE染色像を示す。WKY群、SHRSP対照群、0.06% KRG群、及び0.1% KRG群の間で、腹部大動脈の血管壁の厚さに違いは見られなかった。
【００３８】
図５に脳（12週齢）の組織切片の代表的なHE染色像を示す。SHRSP対照群では、脳卒中症状を示す個体が現れ始める12週齢において大脳皮質にHE染色で染まらない組織損傷（矢印で示す）が認められたが、0.06% KRG群、及び0.1% KRG群では組織損傷はほぼ認められなかった（図５）。
【００３９】
脳内の梗塞を評価するため、摘出した脳を上記と同様に4％パラホルムアルデヒド含有PBS液で固定した後、70％エタノールに浸した脳組織についてMRI解析を行い、脳梗塞巣の発生を調べた。MRI画像に基づき、梗塞巣の大きさによって小梗塞巣（< 0.1 mm2）を1点、中梗塞巣（0.1〜0.4 mm2）を2点、大梗塞巣（> 0.4 mm2）を3点と点数化し、それぞれの大脳全体での数値（梗塞巣のスコア）を算出した。
【００４０】
図６にSHRSP対照群及び0.1% KRG群の脳の代表的なMRI画像を示す。図６のSHRSP対照群のラット個体は18週齢で脳卒中症状を呈し、20週齢に死亡したが、その大脳皮質には明らかな梗塞巣が認められた。0.1% KRG群のラット（24週齢）の大脳皮質には梗塞巣は認められなかった。
【００４１】
図７に各群の脳組織（12〜15週齢）について算出した梗塞巣のスコアを示す。SHRSP対照群と比較して、0.06% KRG群、及び0.1% KRG群では、梗塞巣のスコアが有意に低下したことから、KRGが脳梗塞の発症を大きく抑制したことが示された。
【００４２】
以上の組織解析の結果から、KRGが脳梗塞の発症に対して高い予防効果をもたらすことが示された。KRGの脳梗塞予防効果は、血管壁の厚みの低減を伴わなかった。
【００４３】
［実施例３］
(1) サポニン画分及び非サポニン画分の調製
薬用人参KRG（Korean Red Ginseng）（販売名：正官庄コウジン末、大韓民国人参公社）250 gについて2500 mLの水を用いて室温で抽出を行い、得られた抽出液を凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物（51.3g）を水に溶解し、Amberlite(R) XAD-II（オルガノ社）充填カラム（7cm×30cm）に通液し、水でカラムを洗浄した後、20%メタノール及び100%メタノールを用いて非サポニン画分及び粗サポニン画分をそれぞれ溶出した。それぞれの溶出液を40℃で減圧濃縮し、凍結乾燥を行い、試料として用いた。
【００４４】
なお、各画分を、順相シリカゲル薄層クロマトグラフィー（60F254）を用い、クロロホルム-メタノール-水混液（65:35:10）（下層）を用いて展開することにより、粗サポニン画分にはサポニンが含まれており、一方、非サポニン画分にはサポニンが含まれていないことを確認した。
【００４５】
(2) 飼料
げっ歯類用通常（標準）飼料CE-2（日本クレア株式会社）に、薬用人参KRG（Korean Red Ginseng）（販売名：正官庄コウジン末、大韓民国人参公社）（0.06%）、上記で調製したサポニン画分試料（0.04%）、又は非サポニン画分試料（0.04%）を添加することにより調製された飼料を次の動物実験に用いた。
【００４６】
(3) 動物実験
4週齢の雄性脳卒中易発症性高血圧自然発症ラット（SHRSP）（日本SLC）を、1日12時間の定時間照明下、恒温（24℃）及び恒湿（55±5%）で飼育した。SHRSPラットは4群に分け、i) 通常飼料CE-2（対照群）、ii) KRG 0.06%含有飼料（0.06% KRG群）、iii) 0.04% KRG由来粗サポニン画分含有飼料（0.04%サポニン群）、又はiv) 0.04% KRG由来非サポニン画分含有飼料（0.04%非サポニン群）をそれぞれの群に被験飼料として与えた。5週齢から被験飼料と、脳卒中の発症時期を揃える目的で1% NaCl水溶液を、自由摂取させた。
【００４７】
被験飼料の給餌開始後、脳卒中症状（歩行障害、立毛、痙攣発作、及び麻痺）を観察し、１つ以上の症状が観察された場合には脳卒中を発症したと判断した。各群の脳卒中発症率と生存率（累積％）を算出した。各群5匹のラットを使用した。
【００４８】
図８Ａに、脳卒中発症率の推移を示す。通常飼料を摂取した対照群では、13週齢から脳卒中の発症が確認され、15週齢までに全てのラットが脳卒中を発症した（発症率100%）。一方、0.06% KRG群、0.04%サポニン群、及び0.04%非サポニン群では脳卒中症状の初発がそれぞれ15週齢、14週齢、15週齢と対照群よりも遅く、中でも0.06% KRG群の脳卒中発症率は16週齢でも40％に留まっていた。
【００４９】
図８Ｂに、生存率の推移を示す。対照群は15週齢で死亡し始め、16週齢までに全ての個体が死亡した。一方、0.06% KRG群、0.04%サポニン群、及び0.04%非サポニン群は生存率の低下開始が対照群よりも遅く、特に0.06% KRG群は16週齢でも高いレベルで安定した生存率を示していた。
【００５０】
(4) 組織解析
上記の動物実験における各群の15〜18週齢の死亡ラットから脳を摘出し、4％パラホルムアルデヒド含有PBS液で脳組織を24時間固定した後、PBS液で3回洗浄した。次いで70％エタノールに浸し、4℃で保存した。固定した組織は自動包埋装置（Tissue-Tek(R) TECTM；Sakura Finetek）でパラフィンに包埋後、ミクロトームで6μm厚に薄切し、ポリ-L-リジンでコートされたスライドガラス上に組織切片を調製した。
【００５１】
脳の出血状態を調べるため、Berlin Blue染色を行った。具体的には、組織切片（脳切片）を脱パラフィン後、染色液である2% K4[Fe(CN)6]・3H2O及び1% HClの当量混合液に組織切片を浸し、室温で20分間インキュベーションした。次いでエオシンを用いた対比染色を行い、脱水処理した後、封入剤を用いて封入した。染色脳切片を顕微鏡を用いて観察し、デジタルカメラ（SONY AVCHD MEGAPIXELS 16-1, NEX-5R）を用いて撮影した。
【００５２】
出血箇所のみ青く染まるBerlin Berlin Blue染色の結果、対照群のみで明らかな染色（矢印）が見られ、0.06% KRG群、0.04%サポニン群、及び0.04%非サポニン群では染色は全く見られなかった（図９）。この結果は脳出血の予防におけるKRGの有効性を示している。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明は、脳卒中を効果的に予防するための薬剤、医薬品、食品又は飼料として利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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