(57)【要約】      （修正有）【課題】被験体の試料中の無傷のおよび／または切断されたキニノーゲンの値（例えば、パーセンテージ）に基づき、被験体、例えば、血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）媒介またはブラジキニン媒介障害の危険がある、またはこれを患う被験体を評価する方法により、評価および治療において有用な、血漿カリクレイン媒介血管浮腫（ＫＭＡ）、またはｐＫａｌにより媒介される他の疾患を有する患者の分析が可能になる。そのような方法は切断されたキニノーゲンまたは無傷のキニノーゲンに優先的に結合する検出剤の使用を含むことができる。かかる方法に関連する医薬組成物の提供。【解決手段】被験体のｐＫａｌ媒介疾患の治療における使用のための医薬組成物であって、該組成物は、ｐＫａｌ阻害剤および薬学的に許容される担体を含み、被験体は、基準値から逸脱する切断されたキニノーゲンの値、無傷のキニノーゲンの値、またはその両方を有する、医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体のｐＫａｌ媒介疾患の治療における使用のための医薬組成物であって、
前記組成物は、ｐＫａｌ阻害剤および薬学的に許容される担体を含み、
前記被験体は、基準値から逸脱する切断されたキニノーゲンの値、無傷のキニノーゲンの値、またはその両方を有する、
医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／７５４，６０７号の出願日の恩典を主張する。この参照される出願の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）は循環血液中での主なブラジキニン生成酵素である。ｐＫａｌの活性化は遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）と関連する疾患病状と関連している接触系を介して起こる。ブラジキニンは疼痛、炎症、浮腫および血管新生の主要メディエーターである。
【０００３】
キニノーゲンはキニン、例えばブラジキニンおよびカリクレインの前駆体である。２つの型のヒトキニノーゲン、高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）および低分子量キニノーゲン（ＬＭＷＫ）が存在し、それらはスプライシングバリアントである。ＨＭＷＫは凝固および炎症に対する補助因子として主に作用し、ｐＫａｌ媒介ブラジキニン生成のための好ましい基質である。ＨＭＷＫおよびＬＭＷＫはどちらもシステインプロテアーゼインヒビターである。
【発明の概要】
【０００４】
血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）は接触系のセリンプロテアーゼ成分であり、循環血液中の主なブラジキニン生成酵素である。接触系は異質または負電荷を持つ表面への曝露での第ＸＩＩａ因子、または内皮細胞表面上でのプロリルカルボキシペプチターゼにより活性化される（Ｓａｉｎｚ  Ｉ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ９８，  ７７−８３，  ２００７）。血漿カリクレインの活性化は、第ＸＩＩ因子のそのフィードバック活性化による内因性凝固を増幅し、炎症促進性ノナペプチドブラジキニンの産生により炎症を増強させる。循環血液中の主なキニノゲナーゼとして、ｐＫａｌは脈管構造内でのブラジキニンの生成に大きな役割を果たす。Ｃ１インヒビタータンパク質（Ｃ１−ＩＮＨ）、血漿カリクレインの主な天然インヒビターにおける遺伝的欠損により、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）が引き起こされる。ＨＡＥ患者は未知のトリガーによりしばしば誘発される有痛性浮腫の急性発作に苦しんでいる（Ｚｕｒａｗ  Ｂ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５９，  １０２７−１０３６，  ２００８）。動物モデルにおける薬理作用薬の使用または遺伝学的研究を通して、血漿カリクレイン−キニン系（血漿ＫＫＳ）は様々な疾患に関与している。
【０００５】
本明細書で記載されるように、ウエスタンブロットアッセイは、特異的に（例えば、優先的に）無傷のキニノーゲンまたは切断されたキニノーゲンのいずれかに結合し、任意で、ＬＭＷＫに結合しない検出試薬（例えば、抗体）を使用する、無傷の（１−鎖）および切断された（２−鎖）高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）の検出のために開発された。そのような検出試薬は、患者血漿中の１−鎖および２−鎖ＨＭＷＫの相対量をモニタするために使用することができる。この方法を適用することにより、患者試料中の切断されたキニノーゲンのレベル（例えば、パーセンテージ）は、過剰なｐＫａｌ活性化により媒介されることが知られている疾患状態、例えば浮腫性ＨＡＥ発作において上昇することが見出された。他の疾患を有する患者の血漿中の切断されたキニノーゲンパーセントはその後、試験することができ、活性ｐＫａｌが疾患と関連するかどうかが決定される。試験され、健康な血漿に比べ、切断されたキニノーゲンの上昇を有することが示された他の疾患としては、関節リウマチ（ＲＡ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、およびクローン病が挙げられる。
【０００６】
したがって、本開示の１つの態様は、ｐＫａｌ媒介障害の危険がある、またはこれを有する被験体を同定するための方法に関し、方法は下記を含む：（ａ）例えば、ウエスタンブロットアッセイにより、被験体の試料（例えば、血液試料または血漿試料）中の、切断されたキニノーゲン（例えば、ＨＭＷＫ）のレベルおよび無傷のキニノーゲン（例えば、ＨＭＷＫ）のレベルを測定すること；（ｂ）試料中の、切断されたキニノーゲンの値（例えば、パーセンテージ）、無傷のキニノーゲンの値（例えば、パーセンテージ）、または両方を決定すること；ならびに（ｃ）切断されたキニノーゲンの値、無傷のキニノーゲンの値、または両方が基準値から逸脱する場合、被験体をｐＫａｌ媒介障害の危険がある、またはこれを有するとして同定すること。いくつかの例では、切断されたキニノーゲンのパーセンテージが決定され、試料中の切断されたキニノーゲンのパーセンテージが基準値にある、またはそれを超える場合、被験体は、標的疾患の危険がある、またはこれを有するとして同定される。
【０００７】
いくつかの実施形態では、切断されたキニノーゲンおよび無傷のキニノーゲンのレベルは、切断されたまたは無傷のキニノーゲンのいずれかに特異的に（例えば、優先的に）結合する検出剤（例えば、抗体）により測定される。そのような検出剤（例えば、抗体）は、無傷のおよび切断されたキニノーゲンの両方に結合することができるが、ＬＭＷＫに結合しない。他の実施形態では、切断されたキニノーゲンおよび無傷のキニノーゲンのレベルは、無傷のキニノーゲンと比べて切断されたキニノーゲンに特異的に結合する、または切断されたキニノーゲンと比べて無傷のキニノーゲンに特異的に結合する検出剤（例えば、抗体）により測定される。１つの例では、検出試薬は、無傷のキニノーゲンと比べて切断されたキニノーゲンに特異的に結合する抗体である。別の例では、検出剤は、ＬＭＷＫ中に存在しない、切断されたキニノーゲンの軽鎖のＣ末端に結合する抗体である
【０００８】
ｐＫａｌ媒介障害は遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、またはクローン病とすることができる。被験体が、ｐＫａｌ媒介障害の危険がある、またはこれを有するとして同定される場合、本明細書で記載される方法はさらに有効量のｐＫａｌ阻害剤を被験体に投与することを含むことができる。いくつかの例では、ｐＫａｌ阻害剤はＤＸ−８８、ＥＰＩＫＡＬ−２またはＤＸ−２９３０である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、試料は、ｐＫａｌ媒介障害の症状を有する被験体由来であり、限定はされないが、浮腫、腫脹の再発性発作、腫脹（前記腫脹は完全にまたは主に末梢性である）、蕁麻疹、感染の証拠がない場合の発赤、疼痛、および腫脹；またはヒスタミンに媒介されない浮腫が挙げられる。他の実施形態では、試料は、試料を採取した時点でｐＫａｌ媒介障害の症状を有さない、ｐＫａｌ媒介障害の症状の病歴を有さない、またはｐＫａｌ媒介障害の病歴を有さない被験体由来である。あるいは、または加えて、被験体は、抗ヒスタミン療法、コルチコステロイド療法、または両方に耐性がある。
【００１０】
別の態様では、本開示は、障害がｐＫａｌ阻害剤による治療の影響を受けやすいかどうかを決定するための方法を提供し、方法は下記を含む：（ａ）障害を有する被験体の試料（例えば、血液試料または血漿試料）中の切断されたキニノーゲン（例えば、ＨＭＷＫ）のレベルおよび無傷のキニノーゲン（例えば、ＨＭＷＫ）のレベルを測定すること；（ｂ）試料中の、切断されたキニノーゲンの値（例えば、パーセンテージ）、無傷のキニノーゲンの値（例えば、パーセンテージ）、または両方を決定すること；ならびに（ｃ）切断されたキニノーゲンの値、無傷のキニノーゲンの値、または両方が基準値から逸脱する場合、障害を、ｐＫａｌ阻害剤による治療の影響を受けやすいとして同定すること。１つの例では、切断されたキニノーゲンのパーセンテージが決定され、切断されたキニノーゲンのパーセンテージが基準値にある、またはそれを超える場合、疾患は治療の影響を受けやすいとして同定される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、切断されたキニノーゲンおよび無傷のキニノーゲンのレベルは、無傷のキニノーゲンと比べて切断されたキニノーゲンに特異的に結合する、または切断されたキニノーゲンと比べて無傷のキニノーゲンに特異的に結合する検出剤（例えば、抗体）により測定される。いくつかの例では、検出試薬は、無傷のキニノーゲンと比べて切断されたキニノーゲンに特異的に結合する抗体である。他の実施例では、検出試薬は、切断されたキニノーゲンの軽鎖のＣ末端に結合する抗体である。本明細書で記載される方法のいずれにおいても、無傷のキニノーゲンおよび切断されたキニノーゲンのレベルはウエスタンブロットアッセイにより測定することができる。
【００１２】
障害が、ｐＫａｌ阻害剤の治療の影響を受けやすいとして同定された場合、方法はさらに被験体に有効量のｐＫａｌ阻害剤を投与することを含むことができ、これらとしては、ＤＸ−８８、ＥＰＩＫＡＬ−２、またはＤＸ−２９３０が挙げられるが、それらに限定されない。
【００１３】
さらに別の態様では、本開示は、被験体におけるｐＫａｌ媒介障害の治療を評価するための方法を提供し、方法は下記を含む：（ａ）治療前後または治療の過程中に被験体から採取された試料（例えば、血液試料または血漿試料）中の、切断されたキニノーゲン（例えば、ＨＭＷＫ）のレベルおよび無傷のキニノーゲン（例えば、ＨＭＷＫ）のレベルを測定すること；（ｂ）同じ試料中の切断されたおよび無傷のキニノーゲンのレベルに基づき、各試料中の切断されたキニノーゲンの値（例えば、パーセンテージ）、無傷のキニノーゲンの値（例えば、パーセンテージ）、または両方を決定すること；ならびに（ｃ）治療の前後または治療の過程にわたる、切断されたおよび／または無傷のキニノーゲンの値の変化に基づいて治療の有効性を評価すること。例えば、治療後または治療の過程にわたる切断されたキニノーゲンパーセンテージの減少は、治療が被験体に対して有効であることを示す。いくつかの実施形態では、治療は被験体に有効量のｐＫａｌ阻害剤、例えば、ＤＸ−８８、ＥＰＩＫＡＬ−２またはＤＸ−２９３０を投与することを含む。
【００１４】
本明細書で記載される評価方法のいずれにおいても、切断されたキニノーゲンおよび無傷のキニノーゲンのレベルは、無傷のキニノーゲンと比べて切断されたキニノーゲンに特異的に結合する、または切断されたキニノーゲンと比べて無傷のキニノーゲンに特異的に結合する検出剤（例えば、抗体）により測定することができる。いくつかの例では、検出試薬は無傷のキニノーゲンと比べて切断されたキニノーゲンに特異的に結合する抗体である。他の例では、検出剤は切断されたキニノーゲンの軽鎖のＣ末端に結合する抗体である。本明細書で記載される方法のいずれにおいても、無傷のキニノーゲンおよび切断されたキニノーゲンのレベルはウエスタンブロットアッセイにより測定することができる。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ｐＫａｌ媒介障害は遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、またはクローン病である。
【００１６】
さらに、本開示は、試料中の、切断されたキニノーゲンの値、無傷のキニノーゲンの値、または両方を決定するための方法を提供し、方法は下記を含む：（ａ）無傷のおよび切断されたキニノーゲンを含む試料（例えば、血液試料または血漿試料）を検出試薬と、検出剤と無傷のおよび切断されたキニノーゲンの間の相互作用を可能にする条件下で接触させることであって、検出剤は無傷のキニノーゲンと比べて切断されたキニノーゲンに特異的に結合し、または切断されたキニノーゲンと比べて無傷のキニノーゲンに特異的に結合する、こと；（ｂ）それらの検出試薬との相互作用に基づき、試料中の切断されたキニノーゲンおよび／または無傷のキニノーゲンのレベルを測定すること；ならびに（ｃ）切断されたキニノーゲンおよび無傷のキニノーゲンのレベルに基づき、試料中の、切断されたキニノーゲンの値（例えば、パーセンテージ）、無傷のキニノーゲンの値（例えば、パーセンテージ）、または両方を決定すること。いくつかの実施形態では、検出試薬は抗体、例えば、切断されたキニノーゲンと比べて無傷のキニノーゲンに特異的に結合する抗体、または切断されたキニノーゲンの軽鎖のＣ末端に結合する抗体である。いくつかの実施形態では、無傷のキニノーゲンおよび切断されたキニノーゲンの量はウエスタンブロットアッセイにより測定される。
【００１７】
下記もまた、本開示の範囲内にある：（ｉ）治療の必要な被験体に、有効量の、本明細書で記載されるｐＫａｌ阻害剤を投与することを含む、ｐＫａｌ媒介疾患を治療するための方法であって、被験体は、基準値から逸脱する、切断されたキニノーゲンの値（例えば、パーセンテージ）、無傷のキニノーゲンの値（例えば、パーセンテージ）、または両方を有する、方法、（ｉｉ）被験体のｐＫａｌ媒介疾患を治療するのに使用するための医薬組成物であって、組成物はｐＫａｌ阻害剤および薬学的に許容される担体を含み、被験体は、基準値と比べて、切断されたキニノーゲンおよび／または無傷のキニノーゲンの逸脱した値を有する、医薬組成物、ならびに（ｉｉｉ）ｐＫａｌ媒介疾患、例えば、ＨＡＥを治療するのに使用するための薬剤を製造するための医薬組成物の使用。いくつかの実施形態では、切断されたおよび／または無傷のキニノーゲンの値は、試料中の、切断されたおよび／または無傷のキニノーゲンのパーセンテージである。
【００１８】
下記実施形態もまた、本開示の範囲内にある：
【００１９】
被験体、例えば、ｐＫａｌ媒介またはブラジキニン媒介障害の危険がある、またはこれを患う被験体を評価する方法が、本明細書で提供される。提供される方法により、評価および治療において有用な、血漿カリクレイン媒介血管浮腫（ＫＭＡ）、またはｐＫａｌにより媒介される他の疾患を有する患者の分析が可能になる。
【００２０】
本開示の実施形態は、バイオマーカーおよび、患者、例えば、血漿カリクレインにより生成されるブラジキニンにより引き起こされる浮腫を患う患者の同定および治療におけるその使用を提供する。本明細書で開示される方法、組成物および装置は、多くの点で有用である。例えば、ｐＫａｌマーカーのレベルは、上昇した接触系活性化と関連する障害を同定するために使用することができる。初期スクリーニングに続いて、例えば、疾患の前臨床モデルにおいて、血漿カリクレイン阻害剤（例えばＤＸ−８８、ＥＰＩＫＡＬ２、またはＤＸ−２９３０）によるインビトロまたはインビボ試験を用いて実施することができる。本明細書で開示されるマーカーはまた、薬力学的バイオマーカーとして、または別のやり方で、被験体のカリクレイン阻害剤に対する応答をモニタするために使用することができる。本明細書で開示されるマーカーはコンパニオン診断で使用することができ、血漿カリクレインにより媒介される疾患の治療が可能になり、ｐＫａｌ媒介またはブラジキニン媒介障害、例えば、下記の予防的療法中の用量が管理される：ＨＡＥ、ヒスタミン非依存性特発性血管浮腫、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、ループス、アルツハイマー病、敗血症性ショック、熱傷、脳虚血／再灌流傷害、脳浮腫、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、黄斑浮腫、血管炎、動脈または静脈血栓症、補助人工心臓またはステントと関連する血栓症、血栓症を伴うヘパリン誘導血小板減少症、血栓塞栓性疾患、および不安定狭心症を伴う冠動脈心疾患、浮腫、眼疾患、痛風、腸疾患（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）、口腔粘膜炎、神経障害性疼痛、炎症痛、脊柱管狭窄−変性脊椎疾患、術後イレウス、大動脈瘤、変形性関節症、遺伝性血管浮腫、肺塞栓症、脳卒中、頭部外傷またはペリ腫瘍（ｐｅｒｉ−ｔｕｍｏｒ）脳浮腫、敗血症、急性中大脳動脈（ＭＣＡ）虚血性イベント（脳卒中）、再狭窄（例えば、血管形成術後）、全身性エリテマトーデス腎炎（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｉｓ  ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、自己免疫疾患、炎症疾患、心血管疾患、神経疾患、タンパク質ミスフォールディングと関連する疾患、血管新生と関連する疾患、高血圧性腎症および糖尿病性腎症、アレルギー性および呼吸器疾患（例えばアナフィラキシー、喘息、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸促迫症候群、嚢胞性線維症、持続性、鼻炎）および組織傷害（例えば火傷または化学的損傷）。
【００２１】
本開示は被験体を評価または治療する、例えば、ｐＫａｌ媒介障害、例えば、ブラジキニン媒介血管浮腫をヒスタミン媒介障害から区別する、またはｐＫａｌ媒介障害の将来の発作を予想する方法を提供し、これは、本明細書で開示される、ｐＫａｌ活性化と相関する１つ以上のマーカー（ｐＫａｌマーカー）、例えば、無傷のキニノーゲンおよび切断されたキニノーゲンのレベルを取得する、例えば決定すること、これによって、前記被験体を評価または治療することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ヒスタミン媒介炎症反応と相関する１つ以上のマーカー（Ｈ−マーカー）、例えば、トリプターゼのレベルを取得する、例えば、検出することを含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、前記ｐＫａｌ媒介障害はＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤ、またはＩＢＳである。いくつかの実施形態では、前記ｐＫａｌ媒介障害は下記から選択される：ヒスタミン非依存性特発性血管浮腫、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、ループス、アルツハイマー病、敗血症性ショック、熱傷、脳虚血／再灌流傷害、脳浮腫、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、黄斑浮腫、血管炎、動脈または静脈血栓症、補助人工心臓またはステントと関連する血栓症、血栓症を伴うヘパリン誘導血小板減少症、血栓塞栓性疾患、および不安定狭心症を伴う冠動脈心疾患、浮腫、眼疾患、痛風、腸疾患、口腔粘膜炎、神経障害性疼痛、炎症痛、脊柱管狭窄−変性脊椎疾患、術後イレウス、大動脈瘤、変形性関節症、遺伝性血管浮腫、肺塞栓症、脳卒中、頭部外傷またはペリ腫瘍脳浮腫、敗血症、急性中大脳動脈（ＭＣＡ）虚血性イベント（脳卒中）、再狭窄（例えば、血管形成術後）、全身性エリテマトーデス腎炎、自己免疫疾患、炎症疾患、心血管疾患、神経疾患、タンパク質ミスフォールディングと関連する疾患、血管新生と関連する疾患、高血圧性腎症および糖尿病性腎症、アレルギー性および呼吸器疾患（例えばアナフィラキシー、喘息、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸促迫症候群、嚢胞性線維症、持続性、鼻炎）および組織傷害（例えば火傷または化学的損傷）。
【００２３】
本開示はまた、被験体を評価または治療する方法を提供し、前記被験体はｐＫａｌ媒介障害、例えば、ブラジキニン媒介血管浮腫、およびヒスタミン関連障害の両方と一致する症状を有し、方法は下記を含む：ａ）任意で、前記被験体が、ｐＫａｌ媒介障害およびヒスタミン関連障害の１つまたは両方と一致する症状、例えば、浮腫または腹部不快感を有することを決定すること；ｂ）前記被験体が前記症状のために抗ヒスタミン療法で治療されていない場合、それから、前記被験体を抗ヒスタミン療法で治療すること；ｃ）ｐＫａｌ活性化と相関する１つ以上のマーカー（ｐＫａｌマーカー）、例えば、無傷のキニノーゲンおよび切断されたキニノーゲンのレベルを取得する、例えば、検出すること；ｄ）前記レベルがあらかじめ決められた判断基準を満たす場合、例えば、それが基準レベルにある、またはそれを超える場合：被験体をカリクレイン阻害剤療法のために選択すること；またはカリクレイン阻害剤を前記被験体に投与し、これによって、前記被験体を評価または治療すること。いくつかの実施形態では、方法は被験体をカリクレイン阻害剤療法のために選択することを含む。ある一定の実施形態では、方法はカリクレイン阻害剤を前記被験体に投与することを含む。特定の実施形態では、カリクレイン阻害剤療法のための被験体の選択；またはカリクレイン阻害剤を前記被験体に投与することは、被験体が前記抗ヒスタミン療法に反応しないことを決定する前に起こり、例えば、抗ヒスタミン療法による前記治療の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０時間以内に起こる。いくつかの実施形態では、前記被験体がｐＫａｌ媒介障害およびヒスタミン関連障害の両方と一致する症状を有することを決定すること、ならびにｐＫａｌマーカーのレベルを決定するための前記患者由来の試料の取得は、互いの３０分、１、２または３時間以内；またはヘルスケア提供者への同じ訪問において起こる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、前記ｐＫａｌ阻害剤はＤＸ−８８、ＤＸ−２９３０、またはＥｐｉＫａｌ−２から選択される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、方法は、ヒスタミン媒介炎症反応と相関する１つ以上のマーカー（Ｈ−マーカー）のレベルを取得する、例えば、決定することを含む。ある一定の実施形態では、前記被験体はｐＫａｌ媒介障害に対する易罹患性について評価される。ある一定の実施形態では、前記被験体はｐＫａｌ媒介障害、例えば、浮腫、例えば、ＨＡＥの、例えば、これと一致する症状を有する。ある一定の実施形態では、前記被験体は望まれないｐＫａｌ活性化により特徴付けられる障害の症状を有し、前記被験体は抗ヒスタミン療法が投与されている。特定の実施形態では、前記抗ヒスタミン療法は、本明細書で開示される決定工程の前後１、２、３、４、５、６、７、８、８または１０時間以内に投与される。特定の実施形態では、方法はさらに、抗ヒスタミン療法を、例えば、本明細書で開示される評価または決定前後、または中に前記被験体に投与することを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、前記決定または評価に応答して、カリクレイン阻害剤を前記被験体に投与すること。ある一定の実施形態では、前記被験体は下記症状または特性の１つ以上または全てを有し：腫脹の再発性発作；腫脹、ここで前記腫脹は完全にまたは主に末梢性であり、例えば、被験体は著しい腹部または気道腫脹を有さず；蕁麻疹；感染の証拠がない場合の発赤、疼痛、および腫脹；抗ヒスタミン薬またはコルチコステロイド療法に応答することができず；またはヒスタミンに媒介されない浮腫を有する。ある一定の実施形態では、前記被験体は持続性または再発性浮腫を有し、抗ヒスタミンおよびステロイド療法の１つまたは両方に対し非応答性である。ある一定の実施形態では、被験体はｐＫａｌ媒介障害、例えば、ＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤ、またはＩＢＳの病歴を有さず；被験体はｐＫａｌ媒介障害、例えば、ＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤ、またはＩＢＳの病歴を有し、被験体はＨＡＥの病歴を有さず；被験体はＨＡＥの病歴を有し；被験体はＩＡＥの病歴を有さず；被験体はＩＡＥの病歴を有し；被験体はＩＢＤまたはＩＢＳの病歴を有さず；被験体はＩＢＤまたはＩＢＳの病歴を有し；被験体はヒスタミン媒介障害、例えば、食物アレルギーの病歴を有さず；被験体は、ヒスタミン媒介障害、例えば、食物アレルギーの病歴を有し；被験体はｐＫａｌ媒介障害、例えば、ＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤまたはＩＢＳの病歴を有さず、ヒスタミン媒介障害、例えば、食物アレルギーの病歴を有さず；または被験体はｐＫａｌ媒介障害、例えば、ＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤまたはＩＢＳの病歴を有さず、ヒスタミン媒介障害、例えば、食物アレルギーの病歴を有し：被験体はｐＫａｌ媒介障害、例えば、ＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤまたはＩＢＳの病歴を有し、ヒスタミン媒介障害、食物アレルギーの病歴を有さず；または被験体はｐＫａｌ媒介障害、例えば、ＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤまたはＩＢＳの病歴を有し、ヒスタミン媒介障害、例えば、食物アレルギーの病歴を有する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、被験体は、例えば、予防療法において、例えば、ＨＡＥために、カリクレイン阻害剤で治療されており、被験体のカリクレイン阻害剤に対する応答が評価され、またはモニタされ、および任意で、前記モニタリングに応じて、療法が選択され、または投与され、例えば、決定に応じて、カリクレイン阻害剤の用量が調整される。いくつかの実施形態では、ｐＫａｌマーカーの決定は、コンパニオン診断との関連で実施され、任意で、決定に基づいて治療薬の投与が与えられ、または保留される。ある一定の実施形態では、対応して、前記治療は切迫急性発作、例えばＨＡＥまたはＩＥＡ発作を同定することに依存する。特定の実施形態では、前記被験体は特発性血管浮腫に対する易罹患性について評価される。特定の実施形態では、前記評価は、前記被験体がｐＫａｌ媒介障害、例えば、ブラジキニン媒介障害、例えば、ｐＫａｌ媒介血管浮腫、またはヒスタミン媒介障害、例えば、アレルギー性食物反応を患っているかを決定することを含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、被験体はｐＫａｌ媒介障害、例えば、ＨＡＥまたはＩＡＥの病歴を有さない。いくつかの実施形態では、被験体はｐＫａｌ媒介障害、例えば、ＨＡＥまたはＩＡＥの病歴を有する。いくつかの実施形態では、被験体はｐＫａｌ媒介障害の病歴、例えば、ＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤまたはＩＢＳを有さず；被験体はｐＫａｌ媒介障害、例えば、ＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤまたはＩＢＳの病歴を有し、被験体はＨＡＥの病歴を有さず；被験体はＨＡＥの病歴を有し；被験体はＩＡＥの病歴を有さず；被験体はＩＡＥの病歴を有し；被験体はＩＢＤまたはＩＢＳの病歴を有さず；被験体はＩＢＤまたはＩＢＳの病歴を有し；被験体は、ヒスタミン媒介障害、例えば、食物アレルギーの病歴を有さず；被験体はヒスタミン媒介障害、例えば、食物アレルギーの病歴を有し；被験体はｐＫａｌ媒介障害、例えば、ＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤまたはＩＢＳの病歴を有さず、ヒスタミン媒介障害、例えば、食物アレルギーの病歴を有さず；または被験体はｐＫａｌ媒介障害、例えば、ＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤまたはＩＢＳの病歴を有さず、ヒスタミン媒介障害、例えば、食物アレルギーの病歴を有し：被験体はｐＫａｌ媒介障害、例えば、ＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤまたはＩＢＳの病歴を有し、ヒスタミン媒介障害、食物アレルギーの病歴を有さず；または被験体はｐＫａｌ媒介障害、例えば、ＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤまたはＩＢＳの病歴を有し、ヒスタミン媒介障害、例えば、食物アレルギーの病歴を有する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ｐｋａマーカー、例えば、本明細書で開示されるｐＫａｌマーカー、は抗体に基づく試薬により検出される。ある一定の実施形態では、ｐＫａｌマーカーは、サンドイッチ免疫−アッセイにより検出される。ある一定の実施形態では、方法は、例えば、電気泳動（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｉｅｔｉｃ）分離アッセイ、例えば、ウエスタンブロットにより、キニノーゲン、例えば、無傷のまたは切断されたキニノーゲンの１つまたは両方のレベルを取得する、例えば、検出することを含む。いくつかの実施形態では、ｐＫａｌマーカー、例えば、キニノーゲンは、分析物の他の生成物からの分離、例えば、ウエスタンブロットによる、例えば、電気泳動分離に依存するアッセイにおいて検出される。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ｐＫａｌマーカーは、サンドイッチ免疫−アッセイにより検出され、第２のｐＫａｌマーカー、例えば、キニノーゲンは、分析物の他の生成物からの分離、例えば、ウエスタンブロットによる、例えば、電気泳動分離に依存するアッセイにおいて検出される。ある一定の実施形態では、ｐＫａｌマーカーの検出は定性的である。ある一定の実施形態では、ｐＫａｌマーカーの検出は定量的である。特定の実施形態では、無傷のキニノーゲンおよび切断されたキニノーゲンのレベルがそれぞれ検出される。
【００３１】
いくつかの実施形態では、方法は、ｐＫａｌマーカー、例えば、無傷のキニノーゲンまたは切断されたキニノーゲンのレベルを基準値と比較することを含む。ある一定の実施形態では、前記基準値はＨＡＥにおける、例えば、１以上のＨＡＥ被験体における前記ｐＫａｌマーカーのレベルの関数である。ある一定の実施形態では、前記基準値は、発作中のＨＡＥにおける、例えば、急性発作中の１以上のＨＡＥ被験体における、前記ｐＫａｌマーカーのレベルの関数である。ある一定の実施形態では、前記基準値はＩＡＥにおける、例えば、１以上のＩＡＥ被験体におけるｐＫａｌマーカーのレベルの関数である。ある一定の実施形態では、前記基準値は急性発作中のＩＡＥにおける、例えば、急性発作中の１以上のＩＡＥ被験体におけるｐＫａｌマーカーのレベルの関数である。ある一定の実施形態では、前記基準値はＨＡＥまたはＩＡＥがない場合の、例えば、ＨＡＥまたはＩＡＥの病歴がない１以上の被験体におけるｐＫａｌマーカーのレベルの関数である。
【００３２】
特定の実施形態では、方法は、例えば、比較に応じて、被験体を分類する、例えば、被験体を、ｐＫａｌ媒介障害の危険に対して分類すること、または前記被験体に療法を投与する、または保留することを含む。ある一定の実施形態では、方法は、例えば、比較に応じて、前記被験体に対する治療を選択することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、例えば、比較に応じて、前記被験体に療法、例えば下記を投与する、または保留することを含む：カリクレイン結合剤；ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニスト；またはＣ１−ＩＮＨ補充剤。特定の実施形態では、前記治療はｐＫａｌ阻害剤、例えば、ＤＸ−８８；ＥｐｉＫａｌ−２、およびＤＸ−２９３０から選択されるｐＫａｌ阻害剤の投与である。
【００３３】
いくつかの実施形態では、前記被験体由来の試料は、例えば下記からの２つ以上のマーカーのための捕捉剤を含む基材と接触させられ：ｐＫａｌマーカーまたはＨマーカー、例えば、抗Ｈマーカー抗体；任意で、少なくとも１つの捕捉剤は、ｐＫａｌマーカーのための捕捉剤である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、方法は、前記被験体から、試料、例えば、血液または血漿試料を取得することを含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、第１の捕捉剤（第１のマーカーのため）および第２の捕捉剤（第２のマーカーのため）が基材上に配置され、第１のマーカーの存在に対するシグナルは第２のマーカーの存在に対するシグナルから区別することができる。ある一定の実施形態では、前記第１の捕捉剤（第１のマーカーのため）は、第１の位置またはアドレスに配置され、前記第２の捕捉剤（第２のマーカーのため）は、第２の位置またはアドレスに配置される。特定の実施形態では、前記第１の位置またはアドレスおよび前記第２の位置またはアドレスは前記基材上で重ならない。ある一定の実施形態では、前記第１の捕捉剤は第１のｐＫａｌマーカーのためである。ある一定の実施形態では、前記第１の捕捉剤は第１のｐＫａｌマーカーのためであり、前記第２の捕捉剤は第２のｐＫａｌマーカーのためである。ある一定の実施形態では、前記第１の捕捉剤はｐＫａｌマーカーのためであり、前記第２の捕捉剤はＨ−マーカーのためである。
【００３６】
ある一定の実施形態では、方法は、基材を検出可能な、例えば、抗体と接触させ、ｐＫａｌマーカーの存在または量を決定することを含む。ある一定の実施形態では、前記抗体は、着色生成物を生成する、光子を放出する、光子を吸収する、基材を変化させる、または基材の導電率を変化させる部分で標識される。ある一定の実施形態では、前記抗体は、電気化学発光を利用する部分で標識される。ある一定の実施形態では、前記抗体は、レジニウム（ｒｅｓｉｎｉｕｍ）で標識される。特定の実施形態では、前記基材はメソスケールディスカバリ（ｍｅｓｏ  ｓｃａｌｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）装置において提供される。特定の実施形態では、前記基材は、血液および血漿の１つまたは両方と共に使用するのに好適なディップスティック装置として提供される。特定の実施形態では、前記第１の捕捉剤および前記第２の捕捉剤は、共通のまたは流動的に接続されたチャンバ、例えば、１つのチャンバ、例えば、１つのウェルまたは凹み、マルチチャンバ装置、例えば、マルチウェルプレート中に配置される。特定の実施形態では、前記第１の捕捉剤および前記第２の捕捉剤は基材上にプリントされる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、第１のｐＫａｌマーカーのための前記捕捉剤は前記基材上の第１の位置にあり、第２のｐＫａｌマーカーのための前記捕捉剤は前記基材上の第２の位置にあり、前記第１および第２の位置は、前記基材上に、第１のｐＫａｌマーカーの存在に対するシグナルが、第２のｐＫａｌマーカー由来のシグナルから区別できるように配置される。ある一定の実施形態では、前記基材は第３の位置に第３のマーカーのための捕捉剤を含み、第３の位置は、前記基材上に、第３のマーカーの存在に対するシグナルが前記第１および第２のマーカー由来のシグナルから区別できるように配置される。
【００３８】
いくつかの実施形態では、試料中のｐＫａｌマーカーのレベルの決定は、基材の前記試料との接触の１、２、３、４、または５時間以内に実施することができる。いくつかの実施形態では、試料中の２つのｐＫａｌマーカーのレベルの決定は基材の前記試料との接触の１、２、３、４、または５時間以内に実施することができる。いくつかの実施形態では、２つのｐＫａｌマーカーのレベルの決定は、同時に実施されるアッセイにおいて行われ、例えば、試験のためのインキュベーションまたは他の間隔は、互いに重なる。
【００３９】
別の態様では、本発明は、例えば、本明細書で記載される複数のｐＫａｌマーカーのための捕捉剤を含む基材を提供する。
【００４０】
さらなる態様では、本発明は、障害がｐＫａｌ阻害剤による治療の影響を受けやすいかどうかを決定する方法を提供し、方法は下記を含み：例えば、前記障害を患う被験体、または前記障害のための動物モデルにおいて、例えば、本明細書で記載される１つまたは複数のｐＫａｌマーカーのレベルを評価すること；決定されたレベルを基準と比較すること、ここで、あらかじめ決められた判断基準を満たすレベル、例えば、それが基準レベルにある、またはそれを超える場合、障害はｐＫａｌ阻害剤による治療の影響を受けやすいことを示す。いくつかの実施形態では、方法はカリクレイン阻害剤の影響を、インビトロまたはインビボで、または前記障害の動物モデルにおいて評価することを含む。
【００４１】
別の態様では、本発明は、下記を含む、ｐＫａｌ媒介障害、例えば、ブラジキニン媒介障害を有する被験体を治療する方法を提供する：例えば、本明細書で記載される方法により、本明細書で記載されるｐＫａｌマーカーのレベルを評価すること、決定すること、ならびに前記評価に応じて、治療を選択すること、例えば、カリクレイン阻害剤の投与量または投与頻度の１つまたは両方を選択すること。いくつかの実施形態では、方法はカリクレイン阻害剤を前記被験体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、前記患者は、前記評価前に、カリクレイン阻害剤が投与されている。ある一定の実施形態では、方法は、前記選択された用量または頻度でカリクレイン阻害剤を投与することを含む。
【００４２】
さらなる態様では、本発明は、下記を含む、障害がｐＫａｌ阻害剤による治療の影響を受けやすいかどうかを決定する方法を提供し：例えば、前記障害を患う被験体、または前記障害のための動物モデルにおいて、例えば、本明細書で記載される１つまたは複数のｐＫａｌマーカーのレベルを評価すること；決定されたレベルを基準と比較すること、ここで、あらかじめ決められた判断基準を満たすレベルは、例えば、それが基準レベルにある、またはそれを超える場合、障害はｐＫａｌ阻害剤による治療の影響を受けやすいことを示す。いくつかの実施形態では、方法はカリクレイン阻害剤の影響を、インビトロまたはインビボで、または前記障害の動物モデルにおいて評価することを含む。
【００４３】
別の態様では、発明は、最小限の接触活性化で、試料、例えば、血液を採取するための方法および装置を特徴とする。一実施形態では、発明は、その中に、本明細書で記載される捕捉試薬、例えば、カリクレイン阻害剤、例えば、配列がＤＸ−８８と同様のポリペプチド、例えば、ＤＸ−８８と、１、２、または５以下のアミノ酸残基だけ異なるもの、例えば、ＥＰＩＫＡＬ−２が配置された容器を特徴とする。容器は、例えば、開口部、開口、セプタム、などを有するように構成され、よって、試料、例えば、血液の被験体からの採取および試料中のｐＫａｌ関連マーカー、例えば、ｐＫａｌの捕捉試薬との結合が、同じ容器内で可能になる。結合された種、例えば、ｐＫａｌの測定は同じ容器内で実施することができ、あるいは実施形態では、基材は容器から測定前に除去され、例えば、測定は別の装置上または内で実施することができる。実施形態では、容器の体積は０．５−１００、０．５−５０、．５−１０、１−１００、１−５０、１−２５ｍｌである。一実施形態では、捕捉試薬、例えば、ｐＫａｌ捕捉試薬は容器の内表面に配置される。捕捉試薬は表面に結合された第１の特異的結合パートナーおよび捕捉試薬に結合された第２の特異的結合パートナーにより表面に結合させることができる。特異的結合パートナーの例はビオチンおよびアビジンである。一実施形態ではビオチン化捕捉試薬、例えば、ｐＫａｌ捕捉試薬、例えば、カリクレイン阻害剤、例えば、配列がＤＸ−８８と同様のポリペプチド、例えば、ＤＸ−８８と、１、２、または５以下のアミノ酸残基だけ異なるもの、例えば、Ｅｐｉｋａｌ−２がアビジンでコートされた容器の表面上に配置される。
【００４４】
本開示は、評価および治療において有用な、血漿カリクレイン媒介血管浮腫（ＫＭＡ）、またはｐＫａｌにより媒介される他の疾患を有する患者を同定することができるバイオマーカーを提供する。
【００４５】
バイオマーカーによるｐＫａｌ活性化を提示することが示された患者は、ｐＫａｌ阻害剤、例えばＤＸ−８８、ＨＡＥと関連する急性浮腫性発作の治療に対して認可されたｐＫａｌの小タンパク質阻害剤による治療の候補となる。他のｐＫａｌ阻害剤としてはＤＸ−２９３０（完全ヒト抗体阻害剤である）が挙げられる。いくつかの実施形態では、バイオマーカーによるｐＫａｌ活性化を提示することが示された患者は、ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニスト、例えば、インカチバント（Ｉｎｃａｔｉｂａｎｔ）（Ｆｉｒａｚｙｒ（登録商標））による治療の候補となる。いくつかの実施形態では、バイオマーカーによるｐＫａｌ活性化を提示することが示された患者は、Ｃ１−ＩＮＨ補充剤、例えば、精製ヒト低温殺菌ナノ濾過Ｃ１−ＩＮＨ濃縮物（Ｂｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標））による治療の候補となる。
【００４６】
発明の実施形態はバイオマーカーおよび患者、例えば、血漿カリクレインにより生成されるブラジキニンにより引き起こされる浮腫を患う患者の同定および治療におけるその使用を提供する。本明細書で開示される方法、組成物および装置は、多くの点で有用である。例えば、ｐＫａｌマーカーのレベルは上昇した接触系活性化と関連する障害を同定するために使用することができる。例えば、疾患の前臨床モデルにおいて、初期スクリーニングに続いて、インビトロまたはインビボで血漿カリクレイン阻害剤（例えばＤＸ−８８、ＥＰＩＫＡＬ−２、またはＤＸ−２９３０）による試験を実施することができる。本明細書で開示されるマーカーはまた、薬力学的バイオマーカーとして、またはそうでなければ、被験体のカリクレイン阻害剤に対する応答をモニタするために使用することができる。本明細書で開示されるマーカーはコンパニオン診断で使用することができ、血漿カリクレインにより媒介される疾患の治療が可能になり、ＨＡＥの予防療法中の投与が管理され、または切迫急性ＨＡＥ発作が同定される。
【００４７】
本出願を通して引用される参照文献、登録特許、公開された、または公開されていない特許出願を含む全ての引用文献ならびに以下で列挙されるものの内容はこれにより、本明細書で言及される目的または主題のために、その全体が明確に参照により組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】血漿カリクレインの接触系活性化に関与する要素を示した図である。
【図２】ウエスタンブロット分析による切断されたキニノーゲン検出を示す図である。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（３−８％トリス−酢酸）を用いて、還元条件下で分析し、続いて、ＰＶＤＦ膜に転写し、免疫ブロットした。レーン１−５０ｎＭ無傷のキニノーゲン；レーン２−５０ｎＭ切断されたキニノーゲン；レーン３−５０ｎＭ低分子量キニノーゲン；レーン４−１：２０クエン酸ナトリウム添加ヒト血漿（ガラス採取管）；レーン５−１：２０クエン酸ナトリウム添加ヒト血漿（プラスチック）カリクレイン処理；レーン６−１：２０クエン酸ナトリウム添加ヒト血漿（プラスチック）；レーン７−１：２０クエン酸ナトリウム添加ヒト血漿（プラスチック）２０ｎＭ  ２鎖キニノーゲン添加。
【図３】発作中に得られた患者試料中の無傷のキニノーゲン（すなわち、１−鎖）の検出を示す。患者血漿試料をアンチプロテアーゼカクテルを含むクエン酸塩添加血漿管中に採取した。
【図４】１−鎖ＨＭＷＫおよびｐＫａｌによる切断後の２−鎖ＨＭＷＫのドメイン構造の概略図、および切断されたキニノーゲンの軽鎖に結合する抗体を用いてＨＭＷＫの鎖−１および鎖−２を検出するウエスタンブロットを示す。Ｃ１＝１−鎖ＨＭＷＫ、Ｃ２＝２−鎖ＨＭＷＫ、Ｇ＝ガラス、Ｐ＝プラスチック。
【図５】半定量的アッセイとしての精製ＨＭＷＫのＬＩＣＯＲ検出を示す。精製ヒトＨＭＷＫおよび切断されたＨＭＷＫを９０μｇ／ｍＬ〜５．６μｇ／ｍＬでＨＭＷＫ欠損ヒト血漿中滴定した。試料を１：２０でＴＢＳおよび試料ローディング緩衝液（ＤＴＴを有する）中に希釈した。希釈試料を４−１２％ビス−トリスゲル上で泳動させ、電気泳動後、ニトロセルロース膜に転写した。ブロッキング後、ブロットをマウス抗ヒトＨＭＷＫ抗体（クローン＃１１Ｈ０５）（ＨＭＷＫの軽鎖に特異的である）およびヤギ抗マウスＩＲ染料６８０を用いて可視化した。ゲルをＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＩＲスキャナを用いて走査し、これはＩＲ染料６８０の励起シグナルを検出することができる。
【図６】ＨＡＥ患者試料のウエスタンブロットおよびＬＩＣＯＲ分析を示す図であり、ＨＡＥ患者試料は切断されたＨＭＷＫのより高い内在性レベルを示すことが証明される。基礎および発作ＨＡＥ患者血漿はどちらも、Ｌｉｃｏｒ分析によると、無病血漿に比べてより高いパーセントの切断されたＨＭＷＫを有した。分析される血漿試料をアンチプロテアーゼ溶液中に採取し、これは、同じ患者由来の、同じ採取時間でのクエン酸ナトリウム添加血漿試料と比べると、ＨＡＥ患者血漿をさらなる接触活性化から保護した。グラフ中のエラーバーは標準偏差を表す。
【図７】ＦＸＩＩａ活性化条件の評価を示すウエスタンブロットおよびグラフを示す。図７Ａ：異なる濃度のＦＸＩＩａにより異なる温度（氷対３７℃）およびインキュベーション時間（１０対３０分）で活性化させた正常ヒト血漿のＬｉｃｏｒ検出を有するウエスタンブロットである。レーン１：分子量マーカー；レーン２：精製１−鎖および２−鎖ＨＭＷＫ；レーン３：正常ヒト血漿；レーン４：正常ヒト血漿＋２．５ｎＭ  ＦＸＩＩａ、１０分間、３７℃；レーン５：正常ヒト血漿＋２．５ｎＭ  ＦＸＩＩａ、３０分間、３７℃；レーン６：正常ヒト血漿＋２．５ｎＭ  ＦＸＩＩａ、１０分間、氷上；レーン７：正常ヒト血漿＋２．５ｎＭ  ＦＸＩＩａ、３０分間、氷上；レーン８：正常ヒト血漿＋５ｎＭ  ＦＸＩＩａ、１０分間、３７℃；レーン９：正常ヒト血漿＋５ｎＭ  ＦＸＩＩａ、３０分間、３７℃；レーン１０：正常ヒト血漿＋５ｎＭ  ＦＸＩＩａ、１０分間、氷上；レーン１１：正常ヒト血漿＋５ｎＭ  ＦＸＩＩａ、３０分間、氷上；レーン１２：正常ヒト血漿＋７．５ｎＭ  ＦＸＩＩａ、１０分間、３７℃；レーン１３：正常ヒト血漿＋７．５ｎＭ  ＦＸＩＩａ、３０分間、３７℃；レーン１４：正常ヒト血漿＋７．５ｎＭ  ＦＸＩＩａ、１０分間、氷上；レーン１５：正常ヒト血漿＋７．５ｎＭ  ＦＸＩＩａ、３０分間、氷上。図７Ｂ：Ｌｉｃｏｒシグナル強度を使用して決定した各レーンにおける２−鎖ＨＭＷＫのパーセント［％２−鎖ＨＭＷＫ＝（４６ｋＤａシグナル＋５６ｋＤａシグナル）／（４６ｋＤａシグナル＋５６ｋＤａシグナル＋１１０ｋＤａシグナル）］。
【図８】ｐＫａｌ活性のＦＸＩＩａ活性化に対するＤＸ−８８およびＤＸ−２９３０の阻害効果を示すウエスタンブロットおよびグラフを示す。図８Ａ：ヒト血漿にエクスビボで添加されると、エカランチドおよびＤＸ−２９３０はｐＫＡＬによるＨＭＷＫの切断を阻害することを示すウエスタンブロット分析である。図８Ｂ：ＦＸＩＩａの存在下での、切断されたＨＭＷＫの生成に対するＤＸ−８８およびＤＸ−２９３０の効果を示すチャートである。プールされたクエン酸ナトリウム添加ヒト血漿を、ＤＸ−２９３０またはエカランチドのいずれかにより、１３７０〜３４．３ｎＭの範囲の濃度で前処理した。全ての試料（未処理試料を含む）を、２．５ｎＭ  ＦＸＩＩａの添加により活性化させた。酵素をその後、プロテアーゼインヒビターカクテルの添加により阻害した。等モル濃度のエカランチドおよびＤＸ−２９３０は、未処理血漿試料に比べると、プールされたヒト血漿中で、切断されたＨＭＷＫの量を同等に低減させる。Ｃ＝２５ｎＭ  １および２鎖ＨＭＷＫ；Ｎ＝正常血漿；＋＝活性化ヒト血漿（薬物なし）。
【図９】潰瘍性大腸炎（ＵＣ）および関節リウマチ（ＲＡ）を有する患者における接触系活性化のウエスタンブロット分析を示す。レーン１：分子量マーカー；レーン２：精製１−鎖および２−鎖ＨＭＷＫ；レーン３〜５：正常ヒト血漿；レーン６〜１０：ＵＣ患者由来の血漿；レーン１１〜１５：ＲＡ患者由来の血漿。各レーン中の試料に関するさらなる詳細は表３に提供される。
【図１０】クローン病（ＣＤ）を有する患者における接触系活性化のウエスタンブロット分析を示す。レーン１：分子量マーカー；レーン２：精製１−鎖および２−鎖ＨＭＷＫ；レーン３〜５：正常ヒト血漿；レーン６〜１０：ＣＤ患者由来の血漿。各レーン中の試料に関するさらなる詳細は表４に提供される。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
定義
便宜上、本発明をさらに説明する前に、明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において使用される一定の用語をここで規定する。他の用語は、明細書中で現れるように規定される。
【００５０】
単数形「１つの（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈で明確に別記されない限り、複数の言及物を含む。
【００５１】
本明細書では、「取得する」または「取得すること」は、物理的実体または値を「直接取得する」または「間接的に取得する」ことにより、物理的実体の所有物、または値、例えば、数値を得ることを示す。「直接取得する」は、物理的実体または値を得るために、プロセスを実施する（例えば、試料に対してアッセイまたは試験を実施する、またはその用語が本明細書で規定されるように「試料を分析する」）ことを意味する。「間接的に取得する」は、別の関係者または供給源（例えば、物理的実体または値を直接取得した第三者研究室）から物理的実体または値を受理することを示す。物理的実体を直接取得することは、プロセス実施する、例えば、試料を分析することを含み、これは物理的物質、例えば、開始材料における物理的変化を含む。例示的な変化は、２つ以上の開始材料から物理的実体を製造すること、物質をせん断またはフラグメント化すること、物質を分離または精製すること、２つ以上の別々の実体を合わせて混合物にすること、共有または非共有結合を破壊または形成することを含む化学反応を実施することを含む。値を直接取得することは、試料または別の物質の物理的変化を含むプロセス実施すること、例えば、物質、例えば、試料、分析物、試薬における物理的変化を含む分析プロセスを実施すること（時として、本明細書では、「物理分析」と呼ばれる）、分析法、例えば、下記の１つ以上を含む方法を実施することを含む：物質、例えば、分析物、またはそのフラグメントもしくは他の誘導体を、別の物質から分離または精製すること；分析物、またはそのフラグメントもしくは他の誘導体を別の物質、例えば、緩衝液、溶媒、または反応物と組み合わせること；または例えば、分析物の第１および第２の原子の間で、共有または非共有結合を破壊または形成することにより、分析物、またはそのフラグメントもしくは他の誘導体の構造を変化させること；または例えば、試薬の第１および第２の原子の間で、共有または非共有結合を破壊または形成することにより、試薬、またはそのフラグメントもしくは他の誘導体の構造を変化させること。
【００５２】
本明細書では、試料を「分析すること」は、試料または別の物質、例えば、開始材料における物理的変化を含むプロセス実施することを含む。例示的な変化は、２つ以上の開始材料から物理的実体を製造すること、物質をせん断またはフラグメント化すること、物質を分離または精製すること、２つ以上の別々の実体を合わせて混合物にすること、共有または非共有結合を破壊または形成することを含む化学反応を実施することを含む。試料を分析することは、物質、例えば、試料、分析物、または試薬における物理的変化を含む分析プロセスを実施すること（時として、本明細書では、「物理分析」と呼ばれる）、分析法、例えば、下記の１つ以上を含む方法を実施することを含むことができる：物質、例えば、分析物、またはそのフラグメントもしくは他の誘導体を、別の物質から分離または精製すること；分析物、またはそのフラグメントもしくは他の誘導体を別の物質、例えば、緩衝液、溶媒、または反応物と組み合わせること；または例えば、分析物の第１および第２の原子の間で、共有または非共有結合を破壊または形成することにより、分析物、またはそのフラグメントもしくは他の誘導体の構造を変化させること；または、例えば、試薬の第１および第２の原子の間で、共有または非共有結合を破壊または形成することにより、試薬、またはそのフラグメントもしくは他の誘導体の構造を変化させること。
【００５３】
「アゴニスト」という用語は、本明細書では、タンパク質の生理活性を模倣するまたは上方制御する（例えば、増強するまたは補充する）作用物質を示すことが意味される。アゴニストは、野生型タンパク質または野生型タンパク質の少なくとも１つの生理活性を有するその誘導体とすることができる。アゴニストはまた、タンパク質の少なくとも１つ生理活性を増加させる化合物とすることができる。アゴニストはまた、ポリペプチドの別の分子、例えば、標的ペプチドまたは核酸との相互作用を増加させる化合物とすることができる。
【００５４】
「アンタゴニスト」という用語は、本明細書では、タンパク質の少なくとも１つ生理活性を下方制御する（例えば、抑制するまたは阻害する）作用物質を示すことが意味される。アンタゴニストは、タンパク質と別の分子、例えば、標的ペプチドまたは酵素基質の間の相互作用を阻害するまたは減少させる化合物とすることができる。アンタゴニストはまた、存在する発現タンパク質の量を低減させるまたは阻害する化合物とすることができる。典型的に、タンパク質または遺伝子を阻害することは、タンパク質または遺伝子の発現または関連活性を少なくとも１０％またはそれ以上、例えば、２０％、３０％、４０％、または５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上だけ低減させること、または、本明細書で記載される、または当技術分野で認識される１つ以上の方法により測定すると、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍またはそれ以上超の発現または関連活性の減少を示す。
【００５５】
本明細書では、「結合親和性」は見かけの会合定数またはＫａを示す。Ｋａは解離定数（Ｋｄ）の逆数である。結合タンパク質は、例えば、特定の標的分子に対して少なくとも１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０および１０１１Ｍ−１の結合親和性を有し得る。第２の標的に比べて第１の標的への、結合タンパク質のより高い親和性結合は、第２の標的への結合に対するＫａ（または数値Ｋｄ）よりも高い第１の標的への結合に対するＫａ（またはより小さな数値Ｋｄ）により示すことができる。そのような場合、結合タンパク質は、第２の標的（例えば、第２の立体構造にある同じタンパク質またはその模倣物；または第２のタンパク質）に比べ、第１の標的（例えば、第１の立体構造にあるタンパク質またはその模倣物）に対して特異性を有する。結合親和性の差（例えば、特異性または他の比較に対して）は少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、３７．５、５０、７０、８０、９１、１００、５００、１０００、または１０５倍とすることができる。
【００５６】
結合親和性は、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、またはスペクトロスコピー（例えば、蛍光アッセイを使用する）を含む様々な方法により決定することができる。結合親和性を評価するための例示的な条件はトリス−緩衝液（５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）中である。これらの技術を使用して、結合されたおよび遊離の結合タンパク質の濃度を、結合タンパク質（または標的）濃度の関数として測定することができる。結合された結合タンパク質の濃度（［結合］）は、遊離の結合タンパク質の濃度（［遊離］）および標的上の結合タンパク質ための結合部位の濃度に関連し、（Ｎ）は下記式による、結合部位数／標的分子である：
［結合］＝Ｎ・［遊離］／（（１／Ｋａ）＋［遊離］）。
【００５７】
Ｋａの正確な決定をすることは、必ずしも必要ではないが、時として、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ分析などの方法を使用して決定された、親和性の量的測定値を得ることは十分であり、Ｋａに比例するので、よって、比較に使用することができ、例えば親和性がより高いかどうか、例えば、２倍高いかを決定することができ、例えば、機能アッセイ、例えば、インビトロまたはインビボアッセイにおける活性により、親和性の質的測定値、または親和性の推論が得られる。
【００５８】
「結合タンパク質」という用語は、標的分子と相互作用することができるタンパク質を示す。この用語は、「リガンド」と同じ意味で使用される。「血漿カリクレイン結合タンパク質」は、血漿カリクレインと、相互作用することができる（例えば、結合する）タンパク質を示し、特に、血漿カリクレインと優先的にまたは特異的に相互作用する、および／またはこれを阻害するタンパク質を含む。タンパク質は、タンパク質がなく、同じ条件下での血漿カリクレインの活性と比べて、血漿カリクレインの活性の減少が引き起こされた場合、血漿カリクレインを阻害する。いくつかの実施形態では、血漿カリクレイン結合タンパク質は抗体である。
【００５９】
「捕捉試薬」という用語は、そのリガンドに特異的に結合する部分を示す。
【００６０】
本明細書では、「複合体」または「複合体形成」という用語は、互いに対して特異的親和性を有するメンバー間の複合体を示す。
【００６１】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられたものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野において規定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。
【００６２】
生体高分子に対するモチーフ配列は、変更されたアミノ酸とすることができる位置を含むことができる。例えば、そのような文脈中の記号「Ｘ」は一般に、他に特に規定がなければ、任意のアミノ酸（例えば、２０の天然アミノ酸のいずれか）を示し、例えば、任意のシステインでないアミノ酸を示す。他の許容されるアミノ酸はまた、例えば、丸括弧およびスラッシュを使用して示すことができる。例えば、「（Ａ／Ｗ／Ｆ／Ｎ／Ｑ）」は、アラニン、トリプトファン、フェニルアラニン、アスパラギン、およびグルタミンがその特定の位置で許容されることを意味する。
【００６３】
本明細書では、「検出試薬」は、検出される部分に結合する部分を示す。典型的には、これは、シグナル、例えば、蛍光を発生させ、または測定可能な化合物を生成する。
【００６４】
「エピトープ」は、結合タンパク質（例えば、Ｆａｂまたは全長抗体などの抗体）により結合される標的化合物上の部位を示す。標的化合物がタンパク質である場合、部位はアミノ酸成分から完全に構成され、タンパク質のアミノ酸の化学修飾部分（例えば、グリコシル部分）から完全に構成され、またはそれらの組み合わせから構成され得る。オーバーラップエピトープは少なくとも１つの共通のアミノ酸残基、グリコシル基、リン酸基、硫酸基、または他の分子特徴を含む。
【００６５】
第１の結合タンパク質（例えば、抗体）は、第１の結合タンパク質が第２の結合タンパク質が結合する標的化合物上の同じ部位に結合する、または第２の結合タンパク質が結合する部位と重なる（例えば、アミノ酸配列または他の分子特徴（例えば、グリコシル基、リン酸基、または硫酸基）の観点から、例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％重なる）部位に結合する場合、第２の結合タンパク質（例えば、抗体）と「同じエピトープに結合する」。
【００６６】
第１の結合タンパク質（例えば、抗体）は、第１の結合タンパク質のそのエピトープへの結合が（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれ以上だけ）そのエピトープに結合する第２の結合タンパク質の量を減少させる場合、第２の結合タンパク質（例えば、抗体）と「結合のために競合する」。競合は直接的（例えば、第１の結合タンパク質は、第２の結合タンパク質により結合されるエピトープと同じ、または重なるエピトープに結合する）、または間接的（例えば、第１の結合タンパク質のそのエピトープへの結合が、標的化合物において立体変化を引き起こし、これが、第２の結合タンパク質のそのエピトープに結合する能力を減少させる）とすることができる。
【００６７】
本明細書では、「機能的」生体分子は、特性および／または活性（これによって、特徴付けられる）を示す形態の生体分子である。
【００６８】
２つの配列の間の「相同性」または「配列同一性」の計算（これらの用語は、本明細書で同じ意味で使用される）は下記の通り実施される。配列は最適比較目的のために整列される（例えば、ギャップを最適整列のために第１および第２のアミノ酸または核酸配列の１つまたは両方に導入することができ、非相同配列は比較目的のために無視することができる）。最適整列は１２のギャップペナルティ、４のギャップ伸長ペナルティ、および５のフレームシフトギャップペナルティを有する、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２スコア行列を有するＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムを使用して、ベストスコアとして決定される。対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドがその後、比較される。第１の配列内のある位置が第２の配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められている場合、そうすると、分子はその位置で同一である（本明細書では、アミノ酸または核酸「同一性」はアミノ酸または核酸「相同性」に等しい）。２つの配列間のパーセント同一性はそれらの配列により共有される同一位置の数の関数である。
【００６９】
好ましい実施形態では、比較目的のために整列された基準配列の長さは基準配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、またはさらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、または１００％である。例えば、基準配列は免疫グロブリン可変ドメイン配列の長さであってもよい。
【００７０】
本明細書では、「低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、高ストリンジェンシー、または超高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」という用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を記載する。ハイブリダイゼーション反応を実施するためのガイダンスはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９），  ６．３．１−６．３．６において見出すことができる。水性および非水性法がその文献で記載されており、いずれかを使用することができる。本明細書で言及される特定のハイブリダイゼーション条件は下記の通りである：（１）６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中約４５℃で低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、続いて０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、少なくとも５０℃で２回洗浄（低ストリンジェンシー条件では、洗浄の温度は５５℃まで増加させることができる）；（２）６ＸＳＳＣ中約４５℃で中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、続いて０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６０℃で１回以上の洗浄；（３）６ＸＳＳＣ中約４５℃で高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、続いて０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で１回以上の洗浄；ならびに（４）超高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ、６５℃、続いて０．２ＸＳＳＣ、１％ＳＤＳで６５℃にて１回以上の洗浄である。超高ストリンジェンシー条件（４）が好ましい条件であり、他に特に規定がなければ、使用すべき条件である。開示は低、中、高、または超高ストリンジェンシーを用いて、本明細書で記載される核酸またはその相補体、例えば、本明細書で記載される結合タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸を含む。核酸は、基準核酸の長さと同じ長さまたはその３０、２０、もしくは１０％以内とすることができる。核酸は本明細書で記載される免疫グロブリン可変ドメイン配列をコードする領域に対応することができる。
【００７１】
「単離組成物」は、単離組成物が得られ得る天然試料の少なくとも９０％の少なくとも１つ構成成分から除去された組成物を示す。人工的にまたは自然に生成された組成物は対象となる種または種の集団が重量−重量ベースで少なくとも５、１０、２５、５０、７５、８０、９０、９２、９５、９８、または９９％純粋である場合、「少なくともある程度の純度を有する組成物」とすることができる。
【００７２】
本明細書では、「インビトロ」という用語は、多細胞生物内ではなく、人工環境、例えば、試験管または反応槽中、細胞培養物中、などで起こるイベントを示す。
【００７３】
本明細書では、「インビボ」という用語は、多細胞生物、例えばヒトまたは非ヒト動物内で起こるイベントを示す。
【００７４】
「単離組成物」は、単離組成物が得られ得る天然試料の少なくとも９０％の少なくとも１つ構成成分から除去された組成物を示す。人工的にまたは自然に生成された組成物は、対象となる種または種の集団が重量−重量ベースで少なくとも５、１０、２５、５０、７５、８０、９０、９２、９５、９８、または９９％純粋である場合、「少なくともある程度の純度を有する組成物」とすることができる。
【００７５】
「単離」タンパク質は、単離タンパク質が得られ得る天然試料の少なくとも９０％の少なくとも１つ構成成分から除去されたタンパク質を示す。タンパク質は対象となる種または種の集団が重量−重量ベースで少なくとも５、１０、２５、５０、７５、８０、９０、９２、９５、９８、または９９％純粋である場合、「少なくとも」ある程度の純度を有することができる。
【００７６】
「カリクレイン」という用語（例えば、血漿カリクレイン）は、ペプチダーゼ（タンパク質中のペプチド結合を切断する酵素）、セリンプロテアーゼファミリーのサブグループを示す。血漿カリクレインはキニノーゲンを切断し、キニン、強力な炎症促進性ペプチドを生成させる。
【００７７】
「カリクレイン阻害剤」という用語は、カリクレインを阻害する任意の作用物質または分子を示す。例えば、ＤＸ−８８（本明細書では「ＰＥＰ−１」とも呼ばれる）は血漿カリクレイン（ＮＰ＿０００８８３）の強力で（Ｋｉ＜１ｎＭ）特異的な阻害剤である。（例えば、ＷＯ９５／２１６０１号またはＷＯ２００３／１０３４７５号も参照されたい）。
【００７８】
本明細書では「ＤＸ−２９２２」という用語は、「Ｘ１０１−Ａ０１」という用語と同じ意味で使用される。この抗体の他のバリアントは以下に記載される。
【表１】
2019055975.tif 000002
【００７９】
本明細書では「ＤＸ−２９３０」という用語は、「Ｘ１２４−Ｇ０１」という用語と同じ意味で使用される。この抗体の他のバリアントは以下に記載される。
【表２】
2019055975.tif 000003
【００８０】
「モジュレーター」という用語は、調節を引き起こすことができる、ポリペプチド、核酸、巨大分子、複合体、分子、小分子、化合物、種など（天然起源または非天然起源）、または生物学的材料、例えば細菌、植物、真菌、または動物細胞もしくは組織から製造される抽出物を示す。モジュレーターは、アッセイに含めることにより、機能的特性、生物活性またはプロセス、またはそれらの組み合わせの阻害剤または活性化剤としての潜在活性に対して評価することができる（直接または間接的に）（例えば、アゴニスト、部分アンタゴニスト、部分アゴニスト、インバースアゴニスト、アンタゴニスト、抗菌薬、微生物感染または増殖の阻害剤、など）。そのようなアッセイでは、多くのモジュレーターが、１度にスクリーニングされ得る。モジュレーターの活性は知られており、未知であり、または一部知られている可能性がある。
【００８１】
「非必須」アミノ酸残基は、結合剤、例えば、抗体の野生型配列から、生物活性を消滅させることなく、またはより好ましくは、これを実質的に変化させることなく、変化させることができる残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基を変更すると、活性の実質的な損失となる。
【００８２】
対象の方法により治療される「患者」「被験体」または「宿主」（これらの用語は同じ意味で使用される）はヒトまたは非ヒト動物のいずれかを意味することができる。いくつかの実施形態では、被験体は、カリクレイン媒介障害、例えば、ブラジキニン媒介障害、例えば、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）の疑いがある、またはその危険がある、またはこれを患う。いくつかの実施形態では、被験体は、下記の危険がある、またはこれを患う：ヒスタミン非依存性特発性血管浮腫、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、ループス、アルツハイマー病、敗血症性ショック、熱傷、脳虚血／再灌流傷害、脳浮腫、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、黄斑浮腫、血管炎、動脈または静脈血栓症、補助人工心臓またはステントと関連する血栓症、血栓症を伴うヘパリン誘導血小板減少症、血栓塞栓性疾患、および不安定狭心症を伴う冠動脈心疾患、浮腫、眼疾患、痛風、腸疾患、口腔粘膜炎、神経障害性疼痛、炎症痛、脊柱管狭窄−変性脊椎疾患、術後イレウス、大動脈瘤、変形性関節症、遺伝性血管浮腫、肺塞栓症、脳卒中、頭部外傷もしくはペリ腫瘍脳浮腫、敗血症、急性中大脳動脈（ＭＣＡ）虚血性イベント（脳卒中）、再狭窄（例えば、血管形成術後）、全身性エリテマトーデス腎炎、自己免疫疾患、炎症疾患、心血管疾患、神経疾患、タンパク質ミスフォールディングと関連する疾患、血管新生と関連する疾患、高血圧性腎症および糖尿病性腎症、アレルギー性および呼吸器疾患（例えばアナフィラキシー、喘息、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸促迫症候群、嚢胞性線維症、持続性、鼻炎）および組織傷害（例えば火傷または化学的損傷）。
【００８３】
「プレカリクレイン」および「血漿プレカリクレイン」という用語は、本明細書で同じ意味で使用され、活性血漿カリクレインのチモーゲン形態を示し、これはプレカリクレインとしても知られている。
【００８４】
被験体において疾患を「防止すること」または「防止する」という用語は、被験体を医薬治療、例えば、薬物の投与に供し、疾患の少なくとも１つの症状を防止することを示し、すなわち、望まれない病状（例えば、宿主動物の疾患または他の望まれない状態）の臨床徴候前に投与され、そのため、宿主は望まれない病状の発症に対して保護される。疾患を「防止すること」はまた、「予防」または「予防的治療」と呼ばれ得る。
【００８５】
本明細書では、「実質的に同一」（または「実質的に相同」）という用語は、第２のアミノ酸または核酸配列に対し、十分な数の同一または等価の（例えば、同様の側鎖を有する、例えば、保存アミノ酸置換）アミノ酸残基またはヌクレオチドを含む第１のアミノ酸または核酸配列を示すために本明細書で使用され、そのため、第１および第２のアミノ酸または核酸配列は、同様の活性、例えば、結合活性、結合優先、または生物活性を有する（または有するタンパク質をコードする）。抗体の場合、第２の抗体は同じ特異性を有し、同じ抗原に対し、少なくとも５０％、少なくとも２５％、または少なくとも１０％の親和性を有する。
【００８６】
本明細書で開示される配列と同様または相同の配列（例えば、少なくとも約８５％配列同一性）もまた、本出願の一部である。いくつかの実施形態では、配列同一性は約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上とすることができる。
【００８７】
加えて、核酸セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件（例えば、高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件）下で、ストランドの相補体にハイブリダイズする場合、実質的な同一性が存在する。核酸は全細胞中、細胞溶解物中、または部分的に精製されたもしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。
【００８８】
生体高分子のためのモチーフ配列は、変更されたアミノ酸とすることができる位置を含むことができる。例えば、そのような文脈中の記号「Ｘ」は一般には、他に特に規定がなければ、任意のアミノ酸（例えば、２０の天然アミノ酸のいずれか）を示し、例えば、任意のシステインでないアミノ酸を示す。他の許容されるアミノ酸はまた、例えば、丸括弧およびスラッシュを使用して示すことができる。例えば、「（Ａ／Ｗ／Ｆ／Ｎ／Ｑ）」は、アラニン、トリプトファン、フェニルアラニン、アスパラギン、およびグルタミンがその特定の位置で許容されることを意味する。
【００８９】
統計学的有意性は、任意の当技術分野で知られている方法により決定することができる。例示的な統計検定としては下記が挙げられる：スチューデントＴ検定、マンホイットニーのＵノンパラメトリック検定、およびウィルコクソンノンパラメトリック統計検定。いくつかの統計的に有意な関係は０．０５または０．０２未満のＰ値を有する。「誘導する」、「阻害する」、「増強する」、「上昇させる」、「増加させる」、「減少させる」などという用語（例えば、２つの状態間の区別可能な質的または量的な差異を示す）は、２つの状態間の差異、例えば、統計的に有意な差異を示し得る。
【００９０】
本明細書では、「試料」は、被験体由来の組織、例えば、血液、血漿またはタンパク質を含む組成物を示す。試料は被験体から得られた初期未加工試料ならびにその後に加工処理された、例えば、部分的に精製されたまたは保存された形態の両方を含む。例示的な試料としては、血液、血漿、涙、または粘液が挙げられる。いくつかの実施形態では、試料は血液または血漿試料である。
【００９１】
「治療的有効用量」は、好ましくは、測定可能なパラメータ、例えば、血漿カリクレイン活性を、統計的に有意な程度または少なくとも約２０％だけ、より好ましくは少なくとも約４０％だけ、さらにより好ましくは少なくとも約６０％だけ、さらにより好ましくは少なくとも約８０％だけ、未治療被験体に比べ調節する。化合物の、測定可能なパラメータ、例えば、疾患関連パラメータを調節する能力は、ヒト障害および病状における効力を予測する動物モデル系において評価することができる。あるいは、組成物のこの特性は、化合物のパラメータをインビトロで調節する能力を検査することにより評価することができる。
【００９２】
被験体において疾患（または病状）を「治療すること」または疾患を有する被験体を「治療すること」は、被験体を医薬治療、例えば、薬物の投与に供し、疾患の少なくとも１つの症状が治癒され、軽減され、または減少されることを示す。
【００９３】
被験体において疾患を「防止すること」という用語は、被験体を医薬治療、例えば、薬物の投与に供し、よって、疾患の少なくとも１つの症状が防止されることを示し、すなわち、望まれない病状の臨床徴候（例えば、宿主動物の疾患または他の望まれない状態）前に投与され、よって、宿主は、望まれない病状を発症しないように保護される。疾患を「防止すること」は「予防」または「予防的治療」とも呼ばれ得る。
【００９４】
「予防的有効用量」は、投与時または必要とされる期間の間に、所望の予防的結果を達成するのに有効な量を示す。典型的には、予防的用量は被験体において疾患前に、またはその初期段階に使用されるので、予防的有効用量は治療的有効量より少ない。
【００９５】
アルファベットまたは数字見出しを含む見出しは、理解および解釈を容易にするためのものにすぎず、反対のことを示す表現がない限り、時間的順序または優先度の序列を課すものではない。
【００９６】
切断されたおよび無傷のＨＭＷＫの検出
血漿カリクレインは、大部分がその基質、高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）に結合されたプレカリクレインと呼ばれる不活性チモーゲンとして循環する。刺激に応じて、ＦＸＩＩは、ＦＸＩＩａに活性化される。ＦＸＩＩａはプレカリクレインを切断し、活性血漿カリクレインを形成させる（図１）。循環プレカリクレインのおよそ７５−９０％がＨＭＷＫに、ＨＭＷＫのドメイン６との非活性部位相互作用により結合される。遊離のおよびＨＭＷＫ−結合された活性ｐＫａｌは、切断されたＨＭＷＫおよびブラジキニンを生成させる。血漿カリクレイン活性化のバイオマーカーが表２に示される。バイオマーカーの適合性は、ＨＡＥの急性発作の存在下、およびそれなしのそのレベルに従い証明することができる。これらのバイオマーカーのレベルもまた、ブラジキニン媒介浮腫またはｐＫａｌ活性により媒介される他の疾患の発作中に変化され得る。表２を参照されたい。
【００９７】
表２．ＫＭＡと関連するバイオマーカー
表２はｐＫａｌまたはブラジキニン媒介障害に対して被験体を評価するための表２および本明細書のどこかに記載される方法により評価することができるマーカーを提供する。表２はｐＫａｌまたはブラジキニン媒介障害と関連するマーカーのレベルにおける変化の方向を示す。
【表３】
2019055975.tif 000004
【００９８】
本開示は、少なくとも一部、患者試料中の特定の形態のＮＭＷＫの値（例えば、切断されたＨＭＷＫのパーセンテージ）が、ある一定のｐＫａｌ媒介疾患（例えば、ＨＡＥ）および自己免疫疾患（例えば、ＲＡ、ＵＣ、およびクローン病）と相関するという発見に基づく。よって、切断されたＨＭＷＫ、無傷のＨＭＷＫ、または両方の値（例えば、パーセンテージ）は、そのような疾患を有する、またはその危険がある被験体を同定する、ｐＫａｌ阻害剤による治療の影響を受けやすい可能性のある障害を同定する、１つ以上のｐＫａｌ阻害剤を含む疾患治療の有効性を評価するためのバイオマーカーとして使用することができる。
【００９９】
検出試薬
いくつかの実施形態では、ＨＭＷＫの１つの形態に、ＨＭＷＫの他の形態と比べて特異的に（優先的に）結合する検出試薬（例えば、抗体）を、試料（候補患者由来の生体試料（例えば、血液試料または血漿試料）とすることができる）中の切断されたＨＭＷＫのレベルを決定するための本明細書で記載されるアッセイ法において使用することができる。１つの例では、検出試薬は無傷のＨＭＷＫと比べて切断されたＨＭＷＫに特異的に結合する抗体である。別の例では、検出試薬は切断された形態と比べて無傷のＨＭＷＫに特異的に結合する抗体である。あるいは、または加えて、抗体は、切断されたＨＭＷＫの軽鎖のＣ末端に特異的に結合する。そのような抗体はＨＭＷＫをＬＭＷＫから区別するために使用することができ、というのも、ＬＭＷＫは選択的スプライシングによる切断されたＨＭＷＫの軽鎖のＣ末端フラグメントを含まないからである。
【０１００】
抗原またはエピトープに「特異的に結合する」検出試薬は、当技術分野においてよく理解された用語であり、そのような特異的結合を決定するための方法もまた、当技術分野でよく知られている。抗体などの検出試薬は、別の標的よりも、より頻繁に、より迅速に、より大きな持続期間でおよび／またはより大きな親和性で特定の標的抗原と反応または結合する場合、「特異的結合」を示すと言われる。検出試薬は、他の物質（例えば、無傷のＨＭＷＫ）に結合するよりも、より大きな親和性、結合活性で、より迅速に、および／またはより大きな持続期間で結合する場合、標的抗原（例えば、切断されたＨＭＷＫ）またはそのエピトープに「特異的に結合する」。例えば、抗原（例えば、切断されたＨＭＷＫまたは切断されたＨＭＷＫの軽鎖のＣ末端）またはその中の抗原エピトープに特異的に（または優先的に）結合する抗体は、この標的抗原に、他の抗原（例えば、無傷のＨＭＷＫ）または同じ抗原中の他のエピトープに結合するよりも、より大きな親和性、結合活性で、より迅速に、および／またはより大きな持続期間で結合する抗体である。この定義を読めば、例えば、第１の標的抗原に特異的に結合する抗体は、特異的にまたは優先的に第２の標的抗原に結合しても、しなくてもよいことも理解される。そのようなものとして、「特異的結合」または「優先的結合」は、必ずしも排他的結合を要求しない（が、これを含むことができる）。一般に、必ずしもではないが、結合への言及は優先的結合を意味する。いくつかの例では、標的抗原またはそのエピトープに「特異的に結合する」抗体は、他の抗原または同じ抗原中の他のエピトープに結合しなくてもよい。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、本明細書で記載されるアッセイ法において使用するための抗体は、標的抗原または抗原エピトープ（例えば、切断されたキニノーゲン、無傷のＨＭＷＫ、または切断されたキニノーゲンの軽鎖のＣ末端）に対し好適な結合親和性を有する。本明細書では、「結合親和性」は、見かけの会合定数またはＫＡを示す。ＫＡは解離定数（ＫＤ）の逆数である。本明細書で記載される抗体は、少なくとも１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０Ｍ、またはそれ以下の結合親和性（ＫＤ）を有し得る。増加した結合親和性は減少したＫＤに対応する。第２の抗原に比べて第１の抗原に対してより高い抗体の親和性結合は、第２の抗原への結合に対するＫＡ（または数値ＫＤ）よりも、第１の抗原への結合に対するより高いＫＡ（またはより小さな数値ＫＤ）により示すことができる。そのような場合、抗体は第２の抗原に比べ、第１の抗原に対して特異性を有する。結合親和性の差異（例えば、特異性または他の比較に対する）は、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、３７．５、５０、７０、８０、９１、１００、５００、１０００、１０，０００または１０５倍とすることができる。
【０１０２】
本明細書では、「抗体」という用語は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質を示す。例えば、抗体は重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書では、ＶＨと省略）、および軽（Ｈ）鎖可変領域（本明細書では、ＶＬと省略）を含むことができる。別の例では、抗体は２つの重（Ｈ）鎖可変領域および２つの軽（Ｈ）鎖可変領域を含む。「抗体」という用語は、抗体の抗原結合フラグメント（例えば、単鎖抗体、ＦａｂおよびｓＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ、およびドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント（ｄｅ  Ｗｉｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９６；  ２６（３）：６２９−３９．））ならびに完全抗体を含む。抗体はＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（ならびにそのサブタイプ）の構造的特徴を有し得る。抗体は任意の起源由来とすることができるが、霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類）ならびに霊長類化が好ましい。
【０１０３】
ＶＨおよびＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）と呼ばれるより保存された領域が散在された「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超可変性の領域に、さらに細分することができる。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は正確に規定されている（Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１−３２４２、およびＣｈｏｔｈｉａ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７を参照されたい、ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋも参照されたい）。Ｋａｂａｔ定義が本明細書で使用される。各ＶＨおよびＶＬは、典型的には３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで下記順序で配列される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【０１０４】
抗体のＶＨまたはＶＬ鎖はさらに、重または軽鎖定常領域の全てまたは一部を含むことができ、よって、それぞれ、重または軽免疫グロブリン鎖が形成される。１つの実施形態では、抗体は２本の重免疫グロブリン鎖および２本の軽免疫グロブリン鎖の四量体であり、ここで、重および軽免疫グロブリン鎖は、例えば、ジスルフィド結合により相互接続される。ＩｇＧでは、重鎖定常領域は３つの免疫グロブリンドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。軽鎖定常領域はＣＬドメインを含む。重および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は典型的には、抗体の宿主組織または因子、例えば免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）への結合を媒介する。免疫グロブリンの軽鎖はκまたはλ型とすることができる。１つの実施形態では、抗体はグリコシル化される。抗体は抗体依存性細胞傷害および／または補体媒介細胞傷害に対して機能的であり得る。
【０１０５】
抗体の１つ以上の領域はヒトまたは効果的にヒトとすることができる。例えば、可変領域の１つ以上はヒトまたは効果的にヒトとすることができる。例えば、ＣＤＲの１つ以上はヒト、例えば、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、およびＬＣ  ＣＤＲ３とすることができる。軽鎖ＣＤＲの各々はヒトとすることができる。ＨＣ  ＣＤＲ３はヒトとすることができる。フレームワーク領域の１つ以上、例えば、ＨＣまたはＬＣのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４はヒトとすることができる。例えば、Ｆｃ領域はヒトとすることができる。１つの実施形態では、全てのフレームワーク領域はヒトであり、例えば、ヒト体細胞、例えば、免疫グロブリンを産生する造血細胞または非造血細胞により産生される抗体のフレームワークの配列を有する。１つの実施形態では、ヒト配列は、例えば、生殖系列核酸によりコードされる生殖系列配列である。１つの実施形態では、選択されるＦａｂのフレームワーク（ＦＲ）残基は、ほとんどの同様の霊長類生殖系列遺伝子、とりわけヒト生殖系列遺伝子における対応する残基のアミノ酸型に変換することができる。定常領域の１つ以上はヒトまたは効果的にヒトとすることができる。例えば、免疫グロブリン可変ドメイン、定常領域、定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＬ１）、または抗体全体の少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９８、または１００％はヒトまたは効果的にヒトとすることができる。
【０１０６】
抗体の全てまたは一部は免疫グロブリン遺伝子またはそのセグメントによりコードされ得る。例示的なヒト免疫グロブリン遺伝子としてはκ、λ、α（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、γ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、δ、εおよびμ定常領域遺伝子、ならびに多くの免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５ＫＤａまたは約２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端（約１１０アミノ酸）で可変領域遺伝子、およびＣＯＯＨ−末端でκまたはλ定常領域遺伝子によりコードされる。全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０ＫＤａまたは約４４６アミノ酸）は、同様に、可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸）および他の前記定常領域遺伝子の１つ、例えば、γ（約３３０アミノ酸をコードする）によりコードされる。ヒトＨＣの長さは、ＨＣ  ＣＤＲ３が約３アミノ酸残基から３５アミノ酸残基超まで変動するので、かなり変動する。
【０１０７】
全長抗体の「抗原結合フラグメント」という用語は、対象となる標的に特異的に結合する能力を保持する全長抗体の１つ以上のフラグメントを示す。全長抗体の「抗原結合フラグメント」という用語内に含まれる結合フラグメントの例としては、下記が挙げられる：（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）、これはＶＨドメインから構成される；ならびに（ｖｉ）機能性を保持する、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によりコードされるが、それらは、組換え方法を使用して、単一タンパク質鎖として形成させることができる合成リンカーにより一緒にすることができ、この場合、ＶＬおよびＶＨ領域が対合し、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる一価分子を形成する。例えば、米国特許５，２６０，２０３号、４，９４６，７７８号、および４，８８１，１７５号；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；ならびにＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照されたい。
【０１０８】
抗体フラグメントは任意の適切な技術、例えば当業者に知られている従来の技術を使用して得ることができる。「単一特異抗体」という用語は、特定の標的、例えば、エピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す抗体を示す。この用語は「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」を含み、これらは、本明細書では、抗体がどのように作製されたかに関係なく、単一分子組成の抗体またはそのフラグメントの調製物を示す。
【０１０９】
本明細書では、「ヒト化」免疫グロブリン可変領域は、十分な数のヒトフレームワークアミノ酸位置を含むように改変された免疫グロブリン可変領域を示し、そのため、免疫グロブリン可変領域は、正常ヒトにおいて免疫原性応答を誘発しない。「ヒト化」免疫グロブリンの説明としては、例えば、Ｕ．Ｓ．６，４０７，２１３号およびＵ．Ｓ．５，６９３，７６２号が挙げられる。
【０１１０】
阻害定数（Ｋｉ）は阻害剤効力の測定基準を提供する；これは酵素活性を半分だけ低減させるのに必要とされる阻害剤の濃度であり、酵素または基質濃度に依存しない。見かけのＫｉ（Ｋｉ，ａｐｐ）は、異なる基質濃度で、異なる濃度の阻害剤（例えば、阻害結合タンパク質）の反応の程度（例えば、酵素活性）に対する阻害効果を測定することにより得られ；阻害剤濃度の関数としての擬一次速度定数の変化をＭｏｒｒｉｓｏｎ式（式１）にフィッティングすると、見かけのＫｉ値の推定値が得られる。Ｋｉは、Ｋｉ，ａｐｐ対基質濃度のプロットの線形回帰分析から抽出したｙ切片から得られる。
【数１】
2019055975.tif 000005
式１
式中ｖ＝測定した速度；ｖ０＝阻害剤がない場合の速度；Ｋｉ，ａｐｐ＝見かけの阻害定数；Ｉ＝総阻害剤濃度；ならびにＥ＝総酵素濃度。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本明細書で記載される検出試薬は検出可能な標識にコンジュゲートさせることができ、検出試薬の対象となる抗原（例えば、切断されたＨＭＷＫおよび無傷のＨＭＷＫ）への結合は、検出可能な標識から放出されたシグナルの強度に基づいて決定することができる。あるいは、検出試薬に特異的な二次抗体を使用することができる。１つ以上の抗体が検出可能な標識に結合され得る。当技術分野で知られている任意の好適な標識が本明細書で記載されるアッセイ法において使用され得る。いくつかの実施形態では、検出可能な標識はフルオロフォアを含む。本明細書では、「フルオロフォア」という用語（「蛍光標識」または「蛍光染料」とも呼ばれる）は、規定励起波長の光エネルギーを吸収し、異なる波長の光エネルギーを放出する部分を示す。いくつかの実施形態では、検出部分は酵素であり、またはこれを含む。いくつかの実施形態では、酵素は、無色基質から着色生成物を生成させるもの（例えば、β−ガラクトシダーゼ）である。
【０１１２】
高分子量キニノーゲン
高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）は血漿中に、およそ１１０ｋＤａの分子量を有する単一ポリペプチド（１−鎖）多ドメイン（ドメイン１−６）タンパク質として存在する（図４）。ＨＭＷＫはドメイン４内でｐＫａｌにより切断され、９アミノ酸の、炎症促進性ペプチドブラジキニンおよびＨＭＷＫの２−鎖形態（切断されたキニノーゲン）が放出される。ＨＭＷＫの２鎖は重鎖（これは、ＨＭＷＫのドメイン１−３を含む）、および軽鎖（これはＨＭＷＫのドメイン５および６を含む）である。重および軽鎖は、それぞれ、およそ５６および４６キロダルトンの分子量を有する。図４。
【０１１３】
無傷のＨＭＷＫ
無傷の高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）は、本明細書では「無傷のキニノーゲン」とも呼ばれ、例えば、凝固薬または免疫学的方法、例えば、ラジオイムノアッセイを使用してアッセイすることができる（例えば、Ｋｅｒｂｉｒｉｏｕ−Ｎａｂｉａｓ，  Ｄ．Ｍ．，  Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ，  １９８４，  ５６（２）：２７３４−８６を参照されたい）。ヒトＨＭＷＫの軽鎖に対するモノクローナル抗体は知られている。例えば、Ｒｅｄｄｉｇａｒｉ，  Ｓ．Ｒ．  ＆  Ｋａｐｌａｎ，  Ａ．Ｐ．，  Ｂｌｏｏｄ，  １９９９，  ７４：６９５−７０２を参照されたい。発色性基質に依存するＨＭＷＫのためのアッセイもまた使用することができる。例えば、Ｓｃｏｔｔ，  Ｃ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ，  １９８７，  ４８（６）：６８５−７００；Ｇａｌｌｉｍｏｒｅ，  Ｍ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ，  ２００４，  １１４（２）：９１−９６を参照されたい。
【０１１４】
ＨＭＷＫをコードするヒト遺伝子はキニノーゲン１（ＫＮＧ１）である。ＫＮＧ１は転写およびその代わりにスプライシングされ、ｍＲＮＡが形成され、これはＨＭＷＫまたは低分子量キニノーゲン（ＬＭＷＫ）のいずれかをコードする。ＨＭＷＫの例示的なタンパク質配列が以下で提供される：
＞ｇｉ｜１５６２３１０３７｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿００１０９５８８６．１｜キニノーゲン−１アイソフォーム１前駆体［ホモサピエンス］
MKLITILFLCSRLLLSLTQESQSEEIDCNDKDLFKAVDAALKKYNSQNQSNNQFVLYRITEATKTVGSDT
FYSFKYEIKEGDCPVQSGKTWQDCEYKDAAKAATGECTATVGKRSSTKFSVATQTCQITPAEGPVVTAQY
DCLGCVHPISTQSPDLEPILRHGIQYFNNNTQHSSLFMLNEVKRAQRQVVAGLNFRITYSIVQTNCSKEN
FLFLTPDCKSLWNGDTGECTDNAYIDIQLRIASFSQNCDIYPGKDFVQPPTKICVGCPRDIPTNSPELEE
TLTHTITKLNAENNATFYFKIDNVKKARVQVVAGKKYFIDFVARETTCSKESNEELTESCETKKLGQSLD
CNAEVYVVPWEKKIYPTVNCQPLGMISLMKRPPGFSPFRSSRIGEIKEETTVSPPHTSMAPAQDEERDSG
KEQGHTRRHDWGHEKQRKHNLGHGHKHERDQGHGHQRGHGLGHGHEQQHGLGHGHKFKLDDDLEHQGGHV
LDHGHKHKHGHGHGKHKNKGKKNGKHNGWKTEHLASSSEDSTTPSAQTQEKTEGPTPIPSLAKPGVTVTF
SDFQDSDLIATMMPPISPAPIQSDDDWIPDIQIDPNGLSFNPISDFPDTTSPKCPGRPWKSVSEINPTTQ
MKESYYFDLTDGLS（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
【０１１５】
切断されたＨＭＷＫ
切断された高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）は、本明細書では「切断されたキニノーゲン」とも呼ばれ、例えば、実施例１、および３〜７で記載される方法、例えば、ウエスタンブロットを使用して評価することができる。いくつかの実施形態では、切断されたＨＭＷＫの軽鎖は評価することができる。切断されたＨＭＷＫに結合する抗体、例えば切断されたＨＭＷＫの軽鎖（例えば、Ｃ末端残基を含むエピトープ）に結合する抗体を使用することができる。１つの例はマウスｍＡｂクローン１１Ｈ０５である。加えて、切断されたＨＭＷＫは質量分析を使用して評価することができる。切断されたＨＭＷＫのレベルを評価するための免疫ブロット技術が当技術分野で知られている。、例えば、Ｂｕｈｌｅｒ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，  １９９５，  ６（３）：２２３−２３２を参照されたい。
【０１１６】
切断されたキニノーゲンの重および軽鎖の例示的な配列が以下で提供される。
＞切断されたキニノーゲン−１重鎖
QESQSEEIDCNDKDLFKAVDAALKKYNSQNQSNNQFVLYRITEATKTVGSDTFYSFKYEI
KEGDCPVQSGKTWQDCEYKDAAKAATGECTATVGKRSSTKFSVATQTCQITPAEGPVVTA
QYDCLGCVHPISTQSPDLEPILRHGIQYFNNNTQHSSLFMLNEVKRAQRQVVAGLNFRIT
YSIVQTNCSKENFLFLTPDCKSLWNGDTGECTDNAYIDIQLRIASFSQNCDIYPGKDFVQ
PPTKICVGCPRDIPTNSPELEETLTHTITKLNAENNATFYFKIDNVKKARVQVVAGKKYF
IDFVARETTCSKESNEELTESCETKKLGQSLDCNAEVYVVPWEKKIYPTVNCQPLGMISL
MK（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
＞切断されたキニノーゲン−１軽鎖
SSRIGEIKEETTVSPPHTSMAPAQDEERDSGKEQGHTRRHDWGHEKQRKHNLGHGHKHER
DQGHGHQRGHGLGHGHEQQHGLGHGHKFKLDDDLEHQGGHVLDHGHKHKHGHGHGKHKNK
GKKNGKHNGWKTEHLASSSEDSTTPSAQTQEKTEGPTPIPSLAKPGVTVTFSDFQDSDLI
ATMMPPISPAPIQSDDDWIPDIQIDPNGLSFNPISDFPDTTSPKCPGRPWKSVSEINPTT
QMKESYYFDLTDGLS（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）
【０１１７】
アッセイフォーマット
本明細書で開示されるバイオマーカーの値（例えば、絶対量もしくはレベルまたは相対量もしくはレベル、例えばパーセンテージ）、または本明細書で開示されるバイオマーカーの値の変化は、本明細書で記載されるアッセイおよび／または当技術分野で知られているアッセイを使用して評価することができる。いくつかの実施形態では、被験体由来の試料中の切断されたキニノーゲンのパーセンテージは本明細書で記載される方法のいずれかにおいて使用される。
【０１１８】
バイオマーカーのレベルを評価するために使用することができるアッセイとしては、例えば、イムノアッセイ、例えば、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）（例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、電気化学発光に基づく検出アッセイ、および関連技術が挙げられる。質量分析に基づくアプローチもまた使用することができる。発色性基質に依存するアッセイもまた使用することができる。アッセイ、例えば、ウエスタンブロットアッセイはさらに定量的イメージングシステム、例えば、ＬＩＣＯＲイメージング技術の使用を含み、これは市販されている（例えば、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＯｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ＣＬｘ赤外線イメージングシステムを参照されたい）。いくつかの実施形態では、電気化学発光検出アッセイまたは電気化学発光およびパターンアレイ技術の組み合わせに依存するアッセイが使用される（例えば、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）からのＥＣＬまたはＭＵＬＴＩ−ＡＲＲＡＹ技術アッセイ）。
【０１１９】
本明細書では、「測定すること」または「測定」あるいは「検出すること」または「検出」という用語は、試料内の物質の存在、非存在、分量または量（有効量とすることができる）を評価することを意味し、そのような物質の質的または量的濃度レベルの誘導、または他の方法で、被験体のものの値またはカテゴリー化を評価することが含まれる。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、提供されるアッセイは、ハイスループットプラットフォームで実施することができる。いくつかの実施形態では、マルチウェルプレート、例えば、２４−、４８−、９６−、３８４−またはそれ以上のウェルプレートがハイスループットアッセイのために使用され得る。個々のアッセイは各ウェルで並行して実施することができる。よって、アッセイスループットを増加させるためには、複数のウェルを並行して測定するためにプレートリーダーを使用することが一般に望ましい。いくつかの実施形態では、複数のウェル（例えば、４、１６、２４、４８、９６、３８４、またはそれ以上のウェル）を並行してイメージングすることができるプレートリーダーを、このプラットフォームのために使用することができる。例えば、市販のプレートリーダー（例えば、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡから入手可能なプレート：：視覚システム）が使用され得る。このプレートリーダーは動力学に基づく蛍光分析が可能である。プレート：：視覚システムは、高収集効率光学を有し、並行して９６ウェルを分析するために設計された特別な光学を有する。追加の好適なパラレルプレートリーダーとしては下記が挙げられるが、それらに限定されない：ＳＡＦＩＲＥ（Ｔｅｃａｎ、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ）、ＦＬＩＰＲＴＥＴＲＡ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、ＦＤＳＳ７０００（Ｈａｍａｍａｔｓｕ、Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪ）、およびＣｅｌｌＬｕｘ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）。いくつかの実施形態では、発明のハイスループットスクリーニングアッセイは自動化される（例えば、ロボットアッセイに適合される）。
【０１２１】
キット
本開示はまた、そのようなものを含む試料、例えば、ヒト患者由来の生体試料中の切断されたおよび／または無傷のキニノーゲンを評価する際に使用するためのキットを提供する。そのようなキットは他の形態、および任意で、対照としての切断されたキニノーゲンおよび／または無傷のキニノーゲンと比べて、切断されたキニノーゲンまたは無傷のキニノーゲンのいずれかに特異的に結合する検出試薬を含むことができる。いくつかの実施形態では、キットはさらに、検出試薬の切断されたおよび／または無傷のキニノーゲンへの結合を検出するための二次抗体および／または試薬を含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、キットは本明細書で記載される方法のいずれかにしたがい使用するための説明書を含むことができる。含められる説明書は、試料（ヒト患者から採取した生体試料とすることができる）中の切断されたおよび／または無傷のキニノーゲンのレベルを測定するためのキットに含まれる構成要素の使用の仕方の記載を含むことができる。
【０１２３】
キットの使用に関する説明書は一般に、各構成要素の量および本明細書で記載されるアッセイ法を実施するのに好適な条件に関する情報を含む。キット中の構成要素は単位用量、バルクパッケージ（例えば、多回投与パッケージ）、またはサブユニット用量とすることができる。発明のキット中で供給される説明書は典型的にはラベルまたは添付文書（例えば、キットに含まれる紙シート）にかかれた説明書であるが、機械可読説明書（例えば、磁気または光記憶ディスク上で運ばれる説明書）もまた許容される。
【０１２４】
ラベルまたは添付文書は、キットは切断されたおよび／または無傷のキニノーゲンのレベルを評価するために使用されることを示す。説明書は本明細書で記載される方法のいずれかを実施するために提供され得る。
【０１２５】
この発明のキットは好適なパッケージング内にある。好適なパッケージングとしては、バイアル、瓶、ジャー、可撓性パッケージング（例えば、密封Ｍｙｌａｒまたはプラスチックバッグ）、などが挙げられるが、それらに限定されない。特定の装置、例えば吸入器、経鼻投与装置（例えば、アトマイザ）または注入装置、例えばミニポンプと組み合わせて使用するためのパッケージもまた企図される。キットは無菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は静注用溶液バッグまたは皮下注射針により穿刺可能な栓を有するバイアルであってもよい）。容器もまた、無菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は静注用溶液バッグまたは皮下注射針により穿刺可能な栓を有するバイアルであってもよい）。
【０１２６】
キットは任意で、追加の構成要素、例えば緩衝剤および解釈情報を提供し得る。普通は、キットは容器および容器上のまたはこれと関連するラベルまたは添付文書（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、本開示は以上で記載されるキットの内容物を含む製造物品を提供する。
【０１２７】
疾患診断および予後におけるアッセイ法の適用
本明細書で記載されるアッセイ法およびキットは疾患の評価、例えば、疾患の診断または予後のために適用することができる。評価は被験体を、本明細書で記載される疾患、例えば、ｐＫａｌ媒介障害、例えばＨＡＥおよび自己免疫疾患、例えばＲＡ、ＵＣ、およびクローン病の危険がある、またはこれを有するとして同定することを含み得る。評価はまた、疾患の治療をモニタすること、例えばｐＫａｌ媒介障害、例えばＨＡＥに対する治療の有効性を評価することを含み得る。さらに、評価はｐＫａｌ阻害剤により治療することができる疾患を同定することを含み得る。
【０１２８】
Ａ．診断
いくつかの実施形態では、アッセイ法およびキットは、候補被験体（例えば、ｐＫａｌ媒介障害、例えばＨＡＥまたは自己免疫疾患、例えばＲＡ、ＵＣ、およびクローン病を有する疑いがあるヒト患者）から採取した生体試料（例えば、血液試料または血漿試料）中の切断されたキニノーゲンおよび／または無傷のキニノーゲンのレベルを決定するために実施される。切断されたキニノーゲンのレベルはその後、試料中の、無傷のキニノーゲンまたはキニノーゲンの総量のいずれかと比較することができ、試料中の、切断されたキニノーゲンの値（例えば、パーセンテージ）、無傷のキニノーゲンの値、または両方が決定される。切断されたキニノーゲンおよび／または無傷のキニノーゲンの値は、基準値と比較することができ、被験体がｐＫａｌ媒介障害、例えばＨＡＥまたは自己免疫疾患、例えばＲＡ、ＵＣ、およびクローン病を有するか、またはその危険があるかどうか決定される。例えば、切断されたキニノーゲンのパーセンテージが基準数字にある、またはそれより高い場合、被験体は、ｐＫａｌ媒介障害、例えばＨＡＥ、ＲＡ、ＵＣ、およびクローン病を有する、またはその危険があるとして同定することができる。あるいは、無傷のキニノーゲンのパーセンテージが基準数字にある、またはそれより低い場合、被験体はｐＫａｌ媒介障害、例えばＨＡＥ、ＲＡ、ＵＣ、およびクローン病を有する、またはその危険があるとして同定することができる。
【０１２９】
基準値は切断されたキニノーゲンパーセンテージの対照レベルとすることができる。いくつかの実施形態では、対照レベルは、対照試料、例えば健康な被験体または健康な被験体の集団（好ましくは候補被験体と同じ種である）から得られた試料（例えば、血液または血漿試料）中の切断されたキニノーゲンのパーセンテージである。本明細書では、健康な被験体は、切断されたおよび／または無傷のキニノーゲンのレベルが測定される時に、見かけ上、標的疾患（例えば、ｐＫａｌ媒介障害、例えばＨＡＥまたは自己免疫疾患、例えばＲＡ、ＵＳ、およびクローン病）を有さない、または疾患の病歴を有さない被験体である。
【０１３０】
対照レベルはまた、あらかじめ決められたレベルとすることができる。そのようなあらかじめ決められたレベルは、標的疾患を有さない、またはその危険がない被験体の集団における切断されたキニノーゲンのパーセンテージを表すことができる。これはまた、標的疾患を有する被験体の集団における切断されたキニノーゲンのパーセンテージを表すことができる。
【０１３１】
あらかじめ決められたレベルは様々な形態をとることができる。例えば、単一のカットオフ値、例えば中央値または平均とすることができる。いくつかの実施形態では、そのようなあらかじめ決められたレベルは比較群に基づいて確立することができ、例えばその場合、１つの規定された群は標的疾患を有することが知られており、別の規定された群は標的疾患を有さないことが知られている。あるいは、あらかじめ決められたレベルは範囲、例えば、あらかじめ決められた百分率内の対照集団における切断されたキニノーゲンのパーセンテージを表す範囲とすることができる。
【０１３２】
本明細書で記載される対照レベルはルーチン技術により決定することができる。いくつかの例では、対照レベルは、対照試料（本明細書で記載される）について、従来の方法（例えば、本明細書で記載される試験試料中の、切断されたおよび／または無傷のキニノーゲンのレベルを得るための同じアッセイ）を実施することにより得ることができる。他の実施例では、切断されたおよび／または無傷のキニノーゲンのレベルは、対照集団のメンバーから得ることができ、結果は、例えば、コンピューターによるプログラムにより分析することができ、対照集団における、切断されたおよび／または無傷のキニノーゲンのレベルを表す対照レベル（あらかじめ決められたレベル）が得られる。
【０１３３】
候補被験体から得られた試料中の切断されたキニノーゲンのパーセンテージを、本明細書で記載される基準値と比較することにより、候補被験体がｐＫａｌ媒介疾患（例えば、ＨＡＥまたは自己免疫疾患、例えばＲＡ、ＵＣ、およびクローン病）を有するか、またはその危険があるかどうかについて決定することができる。例えば、候補被験体の試料中の切断されたキニノーゲンのパーセンテージが、基準値から逸脱する（例えば、基準値と比べて増加した）場合、候補被験体は疾患を有する、またはその危険があるとして同定され得る。基準値が標的疾患を有する被験体の集団における切断されたキニノーゲンのパーセンテージ範囲を表す場合、範囲内にある候補の試料中の切断されたキニノーゲンのパーセンテージは、候補被験体が標的疾患を有するか、またはその危険があることを示す。
【０１３４】
本明細書では、「上昇したレベルまたは基準値を超えるレベル」は、切断されたキニノーゲンのレベル／パーセンテージが、基準値、例えば、対照試料中の切断されたキニノーゲンのレベル／パーセンテージの予め決められた閾値より高いことを意味する。対照レベルは本明細書で詳細に記載される。切断されたキニノーゲンの上昇したパーセンテージは、基準値より、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれ以上高い切断されたキニノーゲンパーセンテージを含む。切断されたキニノーゲンの上昇したパーセンテージはまた、ゼロ状態（例えば、試料中の捕捉試薬に結合した切断されたキニノーゲンおよび／または無傷のキニノーゲンなし、または検出不能）から非ゼロ状態（例えば、いくらかの、または検出可能な切断されたキニノーゲンおよび／または無傷のキニノーゲン）への現象の増加を含む。
【０１３５】
本明細書では、「減少したパーセンテージ／レベルまたは基準値より低いパーセンテージ／レベル」は切断されたパーセンテージ／レベルが基準値、例えば対照試料中の切断されたキニノーゲンの予め決められた閾値より低いことを意味する。対照レベルは本明細書で詳細に記載される。切断されたキニノーゲンの減少したレベルは、基準値より、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれ以上低い切断されたキニノーゲンを含む。捕捉試薬に結合した切断されたキニノーゲンの減少したレベルはまた、非ゼロ状態（例えば、試料中のいくらかの、または検出可能な切断されたキニノーゲン）からゼロ状態（例えば、試料中の切断されたキニノーゲンなし、または検出不能）への現象の減少を含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、候補被験体はｐＫａｌ媒介障害、例として、例えばＨＡＥまたは自己免疫疾患、例えばＲＡ、ＵＣ、およびクローン病の症状を有するヒト患者である。例えば、被験体は浮腫、腫脹（ここで、前記腫脹は完全にまたは主に末梢性である）；蕁麻疹；感染の証拠がない場合の発赤、疼痛、および腫脹；ヒスタミンに媒介されない浮腫、腫脹の再発性発作、またはそれらの組み合わせを有する。他の実施形態では、被験体は、試料を採取した時点でｐＫａｌ媒介障害の症状を有さず、はｐＫａｌ媒介障害の症状の病歴を有さず、またはｐＫａｌ媒介障害、例えばＨＡＥの病歴を有さない。さらに他の実施形態では、被験体は、抗ヒスタミン療法、コルチコステロイド療法、または両方に耐性がある。
【０１３７】
（ｉ）ＨＡＥ
いくつかの実施形態では、血漿カリクレイン活性が関与する疾患または病状は遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）である。遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）は「クインケ浮腫」、Ｃ１エステラーゼインヒビター欠損、Ｃ１インヒビター欠損、および遺伝性血管神経性浮腫（ＨＡＮＥ）としても知られている。ＨＡＥは、重篤な腫脹の再発性エピソード（血管浮腫）により特徴付けられ、これは、例えば、肢、顔、生殖器、胃腸管、および気道に影響し得る。ＨＡＥの症状としては、例えば、腕、脚、唇、眼、舌、および／または咽頭における腫脹；咽頭腫脹および突然の嗄声が関与し得る気道閉塞；明らかな原因のない腹部疝痛の反復エピソード；および／または腸の腫脹（重篤であり、腹部疝痛、嘔吐、脱水、下痢、疼痛、および／またはショックにつながることがある）が挙げられる。このＨＡＥを有する個体の約３分の１が発作中に輪状紅斑と呼ばれるかゆみのない皮膚発疹を発症する。
【０１３８】
気道の腫脹は生命を危うくする可能性があり、いくらかの患者において死因となっている。死亡率は１５−３３％と推定される。ＨＡＥにより、約１５，０００−３０，０００救急部来診／年に到達している。
【０１３９】
外傷またはストレス、例えば、歯科手順、疾病（例えば、風邪およびインフルエンザなどのウイルス病）、月経、および外科手術は血管浮腫の発作を引き起こし得る。ＨＡＥの急性発作を防止するために、患者は前に発作を引き起こした特定の刺激を回避しようと努めることができる。しかしながら、多くの場合、発作はトリガーがわからないまま起こる。典型的に、ＨＡＥ症状は最初に幼児期に現れ、思春期の間に悪化する。平均して、未治療の個体は、１〜２週毎に発作を有し、ほとんどのエピソードは約３〜４日続く（ｇｈｒ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ／ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ−ａｎｇｉｏｅｄｅｍａ）。発作の頻度および持続期間は、遺伝性血管浮腫を有する人々の間で、さらに同じファミリー内の人々の間で大きく変動する。
【０１４０】
Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型として知られている３つの型のＨＡＥが存在する。ＨＡＥは、５０，０００の人々のうちの１人が罹患すること、Ｉ型は症例の約８５パーセントを占め、ＩＩ型は症例の約１５パーセントを占め、ＩＩＩ型は非常にまれであると推定される。ＩＩＩ型は最も最近説明された型であり、女性においてのみ起こると元々考えられていたが、罹患した男性を有するファミリーが同定されている。
【０１４１】
ＨＡＥは常染色体優性パターンで遺伝し、そのため、罹患した人間は突然変異を一人の罹患した親から受け継ぐことができる。遺伝子中の新たな突然変異もまた起こる可能性があり、よって、ＨＡＥはまた、それらのファミリーにおいて障害の病歴のない人々において起こり得る。症例の２０−２５％が新しい自然突然変異に起因すると推定される。
【０１４２】
ＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子における突然変異は遺伝性血管浮腫Ｉ型およびＩＩ型を引き起こす。ＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子は、Ｃ１インヒビタータンパク質を作るための指示を提供し、それは、炎症を制御するために重要である。Ｃ１インヒビターは炎症を促進するある一定のタンパク質の活性をブロックする。遺伝性血管浮腫Ｉ型を引き起こす突然変異は、血液中のＣ１インヒビターのレベルを低減させる。対照的に、ＩＩ型を引き起こす突然変異により、異常に機能するＣ１インヒビターが産生される。適正なレベルの機能的Ｃ１インヒビターがないと、過剰量のブラジキニンが生成される。ブラジキニンは、血管壁を通って体組織中への流体の漏れを増加させることにより、炎症を促進する。体組織中での流体の過剰蓄積は、遺伝性血管浮腫Ｉ型およびＩＩ型を有する個体において見られる腫脹のエピソードを引き起こす。
【０１４３】
Ｆ１２遺伝子における突然変異は、遺伝性血管浮腫ＩＩＩ型のいくつかの症例と関連する。Ｆ１２遺伝子は、凝固因子ＸＩＩを作るための指示を提供する。血液凝固（凝固）において重要な役割を果たすことに加えて、第ＸＩＩ因子はまた、炎症の重要な刺激物質であり、ブラジキニンの産生に関与する。Ｆ１２遺伝子におけるある一定の突然変異により、増加した活性を有する第ＸＩＩ因子が産生される。その結果、より多くのブラジキニンが生成され、血管壁はより漏出性となり、腫脹のエピソードが誘発される。遺伝性血管浮腫ＩＩＩ型の他の症例の原因は未知のままである。１つ以上のいまだ同定されていない遺伝子における突然変異はこれらの症例における障害の一因である可能性がある。
【０１４４】
ＨＡＥは同様に、アレルギーまたは他の医学的状態に起因する血管浮腫の他の形態を提示する可能性があるが、これは、原因および治療が著しく異なっている。遺伝性血管浮腫がアレルギーと誤診された場合、最も一般的には抗ヒスタミン薬、ステロイド、および／またはエピネフリンで治療され、これらは典型的にはＨＡＥにおいて無効であるが、エピネフリンは生命を危うくする反応に対して使用することができる。誤診はまた、腹部腫脹を有する患者に対し不必要な試験手術をもたらし、何人かのＨＡＥ患者では、腹部疼痛が心因性と間違って診断されている。
【０１４５】
ＨＡＥの症状は、例えば、質問表、例えば、患者、臨床医、または家族により記入される質問表を用いて評価することができる。そのような質問表は当技術分野で知られており、例えば、視覚的アナログスケールが挙げられる。例えば、ＭｃＭｉｌｌａｎ，  Ｃ．Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐａｔｉｅｎｔ．  ２０１２；５（２）：１１３−２６を参照されたい。
【０１４６】
（ｉｉ）関節リウマチ
関節リウマチ（ＲＡ）は関節腫脹および疼痛を引き起こす自己免疫性、慢性炎症疾患であり、普通は関節破壊が起こる。ＲＡは一般に、疾患活動性の「再燃」が疾患症状の緩解によって中断される、再発／緩解過程をたどる。ＲＡは多くの追加の炎症性障害、例えば下記と関連する：シェーグレン症候群（涙および唾液腺の炎症により引き起こされるドライアイおよびマウス）、胸膜炎（深呼吸および咳嗽時に疼痛を引き起こす胸膜の炎症）、リウマトイド結節（肺内で発症する炎症の結節性部位）、心膜炎（横になるまたは前かがみになると疼痛を引き起こす心膜の炎症）、フェルティ症候群（ＲＡと共に観察される脾腫および白血球減少症、被験体が感染しやすくなる）、および血管炎（血流をブロックする可能性のある血管の炎症）。血漿カリクレインは関節リウマチに関与する。
【０１４７】
活性ＲＡの症状としては、疲労、食欲不振、微熱、筋肉および関節痛、ならびにこわばりが挙げられる。筋肉および関節のこわばりは、通常朝に、および不活動期間後に最も顕著である。再燃中、関節は、一般に滑膜炎の結果として、頻繁に赤くなり、腫脹し、痛み、および圧痛がある。
【０１４８】
関節リウマチのための治療は、薬物療法、安静、関節強化運動、および関節保護の組み合わせを含む。２つのクラスの薬物療法が関節リウマチの治療において使用される：抗炎症「第一選択薬物」および「疾患修飾性抗リウマチ薬」（ＤＭＡＲＤ）。第一選択薬物としては、ＮＳＡＩＤ（例えば、アスピリン、ナプロキセン、イブプロフェン、およびエトドラク）およびコルチゾン（コルチコステロイド）が挙げられる。ＤＭＡＲＤ、例えば金（例えば、金塩、金チオグルコース、金チオマレート、経口金）、メトトレキサート、スルファサラジン、Ｄ−ペニシラミン、アザチオプリン、シクロホスファミド、クロランブシル、およびシクロスポリン、レフルノミド、エタネルセプト、インフリキシマブ、アナキンラ、およびアダリムマブ、およびヒドロキシクロロキンは疾患緩解を促進し、進行性関節破壊を防止するが、これらは抗炎症薬ではない。
【０１４９】
ＲＡおよびＲＡの症状を評価するのに有用なスケールとしては、例えば、関節リウマチ重症度スケール（ＲＡＳＳ；Ｂａｒｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ４１（１）：３８−４５）、ＳＦ−３６関節炎特異健康インデックス（ＡＳＨＩ；Ｗａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｍｅｄ．  Ｃａｒｅ．  ３７（５  Ｓｕｐｐｌ）：ＭＳ４０−５０）、関節炎衝撃測定スケールまたは関節炎衝撃測定スケール２（ＡＩＭＳまたはＡＩＭＳ２；Ｍｅｅｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ３５（１）：１−１０）；スタンフォード健康評価質問表（ＨＡＱ）、ＨＡＱＩＩ、または改変ＨＡＱ（例えば、Ｐｉｎｃｕｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ２６（１１）：１３４６−５３を参照されたい）が挙げられる。
【０１５０】
（ｉｉｉ）腸疾患（ＩＢＤ）−クローン病および潰瘍性大腸炎
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は大腸および、場合によっては、小腸の炎症状態の群である。ＩＢＤの主要な形態はクローン病および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）である。ずっと少ない症例には他の形態のＩＢＤが関与している：コラーゲン大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、便流変更性大腸炎、ベーチェット症候群、感染性大腸炎、および不確定大腸炎。クローン病とＵＣの間の主な違いは炎症性変化の位置および性質である。クローン病は口から肛門までの胃腸管の任意の部分に影響する可能性があるが（スキップ病変）、症例の大部分は回腸末端において始まる。潰瘍性大腸炎は、対照的に、結腸および直腸に限定される。顕微鏡的に、潰瘍性大腸炎は粘膜（腸の上皮層）に限定されるが、クローン病は腸壁全体に影響する。最後に、クローン病および潰瘍性大腸炎は異なった割合で腸外徴候を与える（例えば肝臓障害、関節炎、皮膚徴候および眼障害）。
【０１５１】
ＩＢＤの症状としては、腹部疼痛、嘔吐、下痢、血便、体重減少、体重増加および様々な関連する愁訴または疾患（関節炎、壊疽性膿皮症、原発性硬化性胆管炎）が挙げられる。診断は、一般に病理学的病変の生検を伴う大腸内視鏡検査による。
【０１５２】
ＩＢＤのための治療は、重症度のレベルによって、症状を制御するために免疫抑制を必要とする場合がある。免疫抑制剤、例えばアザチオプリン、メトトレキサート、または６−メルカプトプリンが使用され得る。より一般的には、ＩＢＤの治療には、メサラミンの一形態が必要とされる。しばしば、ステロイドが疾患再燃を制御するために使用されており、かつては、維持薬物として許容されていた。生物製剤、例えばインフリキシマブは、クローン病または潰瘍性大腸炎を有する患者を治療するために使用されてきた。重篤な症例は、外科手術、例えば腸切除、狭窄形成あるいは一時的または永久的人工肛門造設または回腸瘻造設を必要とする場合がある。ＩＢＤのための別の医薬治療は様々な形態で存在するが、しかしながら、そのような方法は、長期のステロイド曝露または外科的切除を回避するために、基礎病理を制御することに集中する。通常、治療は、高い抗炎症効果を有する薬物、例えばプレドニゾンを投与することにより開始される。炎症がうまく制御されるとすぐに、患者は通常、より軽い薬物、例えばアサコール−またはメサラミン−に切り換えられ、疾患が緩解で維持される。うまくいかなければ、前記免疫抑制剤薬物のメサラミン（抗炎症効果も有し得る）との組み合わせが、患者によって、投与されることがあり、またはされないこともある。
【０１５３】
（ｉｖ）他のｐＫａｌ媒介またはブラジキニン媒介障害
血漿カリクレイン活性と関連する他の例示的な疾患または病状としては下記が挙げられる：ヒスタミン非依存性特発性血管浮腫、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、ループス、アルツハイマー病、敗血症性ショック、熱傷、脳虚血／再灌流傷害、脳浮腫、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、黄斑浮腫、血管炎、動脈または静脈血栓症、補助人工心臓またはステントと関連する血栓症、血栓症を伴うヘパリン誘導血小板減少症、血栓塞栓性疾患、および不安定狭心症を伴う冠動脈心疾患、浮腫、眼疾患、痛風、腸疾患、口腔粘膜炎、神経障害性疼痛、炎症痛、脊柱管狭窄−変性脊椎疾患、術後イレウス、大動脈瘤、変形性関節症、遺伝性血管浮腫、肺塞栓症、脳卒中、頭部外傷もしくはペリ腫瘍脳浮腫、敗血症、急性中大脳動脈（ＭＣＡ）虚血性イベント（脳卒中）、再狭窄（例えば、血管形成術後）、全身性エリテマトーデス腎炎、自己免疫疾患、炎症疾患、心血管疾患、神経疾患、タンパク質ミスフォールディングと関連する疾患、血管新生と関連する疾患、高血圧性腎症および糖尿病性腎症、アレルギー性および呼吸器疾患（例えばアナフィラキシー、喘息、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸促迫症候群、嚢胞性線維症、持続性、鼻炎）および組織傷害（例えば火傷または化学的損傷）。
【０１５４】
本明細書で記載されるｐＫａｌ媒介障害を有する、またはその危険があるとして同定された被験体は好適な治療、例えば本明細書で記載されるものに供することができる。
【０１５５】
Ｂ．治療有効性評価
本明細書で記載されるアッセイ法はまた、ｐＫａｌ媒介障害（例えば、ＨＡＥ）に対する治療の有効性を評価するために適用することができる。例えば、複数の生体試料（例えば、血液または血漿試料）は治療前後または治療の過程中のいずれかに、治療が実施される被験体から採取することができる。切断されたおよび／または無傷のキニノーゲンのレベルは、本明細書で記載されるアッセイ方法のいずかれにより測定することができ、切断されたおよび／または無傷のキニノーゲンの値（例えば、パーセンテージ）はこれに応じて決定することができる。切断されたキニノーゲンのパーセンテージが治療後または治療の過程にわたって減少した（初期に採取された試料中のものと比べた場合の、後に採取された試料中の切断されたキニノーゲンパーセンテージ）または無傷のキニノーゲンのパーセンテージが治療後または治療の過程にわたって増加した場合、治療が有効であることを示す。いくつかの例では、治療は治療薬、例えば本明細書で記載されるカリクレイン結合剤、本明細書で記載されるブラジキニンＢ２受容体アンタゴニスト、または本明細書で記載されるＣ１−ＩＮＨ補充剤を含む。治療薬の例としては、ＤＸ−２９３０またはＤＸ８８が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１５６】
被験体が、治療に応答しないとして同定された場合、より高い用量および／または投与頻度の治療薬が同定された被験体に投与される。いくつかの実施形態では、治療に応答する、またはさらなる治療は必要ないとして同定された被験体においては、治療薬の用量または投与頻度が維持され、低くされ、または中止される。あるいは、異なる治療を、第１の治療に応答しないと見出された被験体に適用することができる。
【０１５７】
ｐＫａｌ阻害剤による治療の影響を受けやすい障害の同定
切断されたキニノーゲンおよび／または無傷のキニノーゲンの値はまた、ｐＫａｌ阻害剤により治療可能であり得る障害を同定するために頼ることができる。この方法を実施するために、標的疾患を有する被験体から採取した試料（例えば、血液試料または血漿試料）中の切断されたキニノーゲンのレベルおよび／または無傷のキニノーゲンのレベルは、好適なアッセイ、例えば、本明細書で記載されるもの、例えばウエスタンブロットアッセイに測定することができる。切断されたおよび／または無傷のキニノーゲンの値、例えばパーセンテージは本明細書で記載されるように決定することができる。切断されたキニノーゲンおよび／または無傷のキニノーゲンの値は、本明細書で記載される基準値と比較することができる。切断されたキニノーゲン／無傷のキニノーゲンの値が、基準値から逸脱する場合（例えば、上昇したまたは減少した）、ｐＫａｌ阻害剤は、疾患の治療に有効であり得ることを示す。例えば、切断されたキニノーゲンのパーセンテージが治療後または治療の過程にわたって減少する場合、治療は有効であるとして同定することができる。あるいは、無傷のキニノーゲンのパーセンテージが治療後または治療の過程にわたって増加する場合、治療は有効であると同定される。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、切断されたおよび／または無傷のキニノーゲンのレベルは、キニノーゲンの他の形態と比べて、切断されたキニノーゲンまたは無傷のキニノーゲンのいずれかに特異的に結合する検出試薬（例えば、抗体）を使用して測定することができる。いくつかの例では、抗体は、無傷のキニノーゲンと比べて切断されたキニノーゲンに特異的に結合する。他の実施例では、抗体は、切断されたキニノーゲンの軽鎖のＣ末端に特異的に結合する。
【０１５９】
疾患がｐＫａｌ阻害剤の影響を受けやすい（これにより治療することができる）と同定された場合、方法はさらに、疾患を有する被験体に有効量のｐＫａｌ阻害剤、例えば、ＤＸ−８８、ＥＰＩＫＡＬ−２、またはＤＸ−２９３０を投与することを含むことができる。
【０１６０】
治療
本明細書で記載される方法のいずかにより同定される、ｐＫａｌ媒介またはブラジキニン媒介障害の危険がある、またはこれを患う（例えば、有する）被験体は任意の適切な治療薬で治療することができる。いくつかの実施形態では、提供される方法は、提供されるアッセイ、例えば、バイオマーカー検出のアウトプットに基づき、被験体に対する治療を選択することを含む。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、方法は、アッセイ、例えば、バイオマーカー検出のアウトプットに基づき、被験体への投与のための、治療薬、例えば、本明細書で記載されるカリクレイン結合剤、例えば、本明細書で記載されるブラジキニンＢ２受容体アンタゴニスト、例えば、本明細書で記載されるＣ１−ＩＮＨ補充剤を選択すること、または投与することの１つまたは両方を含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、血漿カリクレイン結合タンパク質またはポリペプチドは被験体に投与される。いくつかの実施形態では、カリクレイン結合剤はカリクレイン阻害剤、例えば、ペプチド、小分子阻害剤、カリクレイン抗体、またはそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、ブラジキニンＢ２受容体のアンタゴニストが被験体に投与される。いくつかの実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨ補充治療薬が被験体に投与される。
【０１６３】
治療薬、例えば、カリクレイン阻害剤、例えば、ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニスト、例えば、Ｃ１−ＩＮＨ補充剤は、血漿カリクレインおよび／またはブラジキニン活性が関与する疾患または病状の治療のための併用療法の一部としての別の療法と共に投与することができる。例えば、カリクレイン阻害剤、ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニスト、またはＣ１−ＩＮＨ補充剤の１つ以上、例えば、カリクレイン阻害剤、ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストまたはＣ１−ＩＮＨ補充剤の１つ以上と、別の療法との併用療法が、複数の異なる構造で提供され得る。第１の薬剤は、他の療法の投与前後に投与され得る。場合によっては、第１の薬剤および別の療法（例えば、治療薬）は同時に、または時間的に非常に近接させて（例えば、注射間の短い間隔で、例えば同じ治療セッション中）投与される。第１の薬剤および他の療法はまた、より大きな時間間隔で投与され得る。
【０１６４】
血漿カリクレイン結合剤
血漿カリクレイン結合剤（例えば、結合タンパク質、例えば、ポリペプチド、例えば、阻害ポリペプチド、例えば、抗体、例えば、阻害抗体、または他の結合剤、例えば、小分子）は様々な疾患および病状、例えば、血漿カリクレイン活性が関与する疾患および病状に有用な治療薬である。例えば、いくつかの実施形態では、血漿カリクレイン活性が関与する疾患または病状は遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）である。いくつかの実施形態では、血漿カリクレイン結合タンパク質またはポリペプチドはｐＫａｌ媒介またはブラジキニン媒介障害の危険があるまたはこれを患う被験体に投与される。
【０１６５】
カリクレイン、または組織および／または血漿カリクレインの多くの有用なタンパク質阻害剤はクニッツドメインを含む。本明細書では、「クニッツドメイン」は少なくとも５１のアミノ酸を有し、少なくとも２つ、好ましくは３つのジスルフィドを含むポリペプチドドメインである。ドメインは１番目と６番目のシステイン、２番目と４番目、および３番目と５番目のシステインがジスルフィド結合を形成するように折り畳まれ（例えば、５８のアミノ酸を有するクニッツドメインでは、システインは、以下で提供されるＢＰＴＩ相同配列の番号に従い、アミノ酸５、１４、３０、３８、５１、および５５に対応する位置に存在することができ、ジスルフィドは、位置５と５５、１４と３８、および３０と５１のシステイン間で形成し得る）、または、２つジスルフィドが存在する場合、それらはそれらのシステインの対応するサブセット間で形成することができる。個々のシステイン間のスペーシングは、以下で提供されるＢＰＴＩ配列の番号付けに従い、以下に対応する位置の間の下記のスペーシングの７、５、４、３、２、１または０アミノ酸内とすることができる：５〜５５、１４〜３８、および３０〜５１。ＢＰＴＩ配列は任意の一般的なクニッツドメイン中の特定の位置を示す基準として使用することができる。対象となるクニッツドメインのＢＰＴＩとの比較は、最適整列を同定することにより実施することができ、この場合、整列されたシステインの数が最大化される。
【０１６６】
ＢＰＴＩのクニッツドメインの３Ｄ構造（高分解能）が知られている。Ｘ線構造の１つはＢｒｏｏｋｈａｖｅｎタンパク質データバンクに「６ＰＴＩ」として登録されている。いくつかのＢＰＴＩホモログの３Ｄ構造が知られている（Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ３（７）：５９１−５９８；  Ｈｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２９：１００１８−１００２２）。少なくとも８１のクニッツドメイン配列が知られている。既知のヒトホモログは組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）としても知られているＬＡＣＩの３つクニッツドメイン（Ｗｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）    Ｊ．  Ｂｉｏｌ．    Ｃｈｅｍ．  ２６３（１３）：６００１−６００４；  Ｇｉｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３８：５１８−２０；  Ｎｏｖｏｔｎｙ  ｅｔ  ａｌ，  （１９８９）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．    Ｃｈｅｍ．，  ２６４（３１）：１８８３２−１８８３７）インターα−トリプシンインヒビター、ＡＰＰ−Ｉの２つクニッツドメイン（Ｋｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．    Ｃｈｅｍ．，  ２６３（３４）：１８１０４−１８１０７）、コラーゲン由来のクニッツドメイン、ＴＦＰＩ−２の３つのクニッツドメイン（Ｓｐｒｅｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，  ９１：３３５３−３３５７）、肝細胞増殖因子アクチベータインヒビター１型のクニッツドメイン、肝細胞増殖因子アクチベータインヒビター２型のクニッツドメイン、米国特許公開番号第２００４−０１５２６３３号において記載されるクニッツドメインを含む。ＬＡＣＩは３つのクニッツドメインを含む、３９ｋＤａの分子量を有するヒト血清リン糖タンパク質である（表１におけるアミノ酸配列）。
【表４】
2019055975.tif 000006
【０１６７】
上記クニッツドメインはＬＡＣＩ−Ｋ１（残基５０〜１０７）、ＬＡＣＩ−Ｋ２（残基１２１〜１７８）、およびＬＡＣＩ−Ｋ３（２１３〜２７０）と呼ばれる。ＬＡＣＩのｃＤＮＡ配列は、Ｗｕｎら（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．    Ｃｈｅｍ．，  １９８８，  ２６３（１３）：６００１−６００４）において報告されている。Ｇｉｒａｒｄら（Ｎａｔｕｒｅ，  １９８９，  ３３８：５１８−２０）は３つクニッツドメインの各々のＰ１残基が変化された突然変異研究を報告している。ＬＡＣＩ−Ｋ１はＦ．ＶＩＩａが組織因子と複合体化した時に第ＶＩＩａ因子（Ｆ．ＶＩＩａ）を阻害し、ＬＡＣＩ−Ｋ２は第Ｘａ因子を阻害する。
【０１６８】
例示的なクニッツドメインを含むタンパク質としては下記が挙げられ、丸括弧内はＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受入番号である：
A4_HUMAN  (P05067), A4_MACFA  (P53601), A4_MACMU  (P29216), 
A4_MOUSE  (P12023), A4_RAT   (P08592), A4_SAISC  (Q95241), 
AMBP_PLEPL (P36992), APP2_HUMAN (Q06481), APP2_RAT  (P15943), 
AXP1_ANTAF (P81547), AXP2_ANTAF (P81548), BPT1_BOVIN (P00974), 
BPT2_BOVIN (P04815), CA17_HUMAN (Q02388), CA36_CHICK (P15989), 
CA36_HUMAN (P12111), CRPT_BOOMI (P81162), ELAC_MACEU (O62845), 
ELAC_TRIVU (Q29143), EPPI_HUMAN (O95925), EPPI_MOUSE (Q9DA01), 
HTIB_MANSE (P26227), IBP_CARCR  (P00993), IBPC_BOVIN (P00976), 
IBPI_TACTR (P16044), IBPS_BOVIN (P00975), ICS3_BOMMO (P07481), 
IMAP_DROFU (P11424), IP52_ANESU (P10280), ISC1_BOMMO (P10831), 
ISC2_BOMMO (P10832), ISH1_STOHE (P31713), ISH2_STOHE (P81129), 
ISIK_HELPO (P00994), ISP2_GALME (P81906), IVB1_BUNFA (P25660), 
IVB1_BUNMU (P00987), IVB1_VIPAA (P00991), IVB2_BUNMU (P00989), 
IVB2_DABRU (P00990), IVB2_HEMHA (P00985), IVB2_NAJNI (P00986), 
IVB3_VIPAA (P00992), IVBB_DENPO (P00983), IVBC_NAJNA (P19859), 
IVBC_OPHHA (P82966), IVBE_DENPO (P00984), IVBI_DENAN (P00980), 
IVBI_DENPO (P00979), IVBK_DENAN (P00982), IVBK_DENPO (P00981), 
IVBT_ERIMA (P24541), IVBT_NAJNA (P20229), MCPI_MELCP (P82968), 
SBPI_SARBU (P26228), SPT3_HUMAN (P49223), TKD1_BOVIN (Q28201), 
TKD1_SHEEP (Q29428), TXCA_DENAN (P81658), UPTI_PIG  (Q29100), 
AMBP_BOVIN (P00978), AMBP_HUMAN (P02760), AMBP_MERUN (Q62577), 
AMBP_MESAU (Q60559), AMBP_MOUSE (Q07456), AMBP_PIG  (P04366), 
AMBP_RAT  (Q64240), IATR_HORSE (P04365), IATR_SHEEP (P13371), 
SPT1_HUMAN (O43278), SPT1_MOUSE (Q9R097), SPT2_HUMAN (O43291), 
SPT2_MOUSE (Q9WU03), TFP2_HUMAN (P48307), TFP2_MOUSE (O35536), 
TFPI_HUMAN (P10646), TFPI_MACMU (Q28864), TFPI_MOUSE (O54819), 
TFPI_RABIT (P19761), TFPI_RAT  (Q02445), YN81_CAEEL (Q03610)
【０１６９】
様々な方法を使用して配列データベースからクニッツドメインを同定することができる。例えば、クニッツドメインの既知のアミノ酸配列、コンセンサス配列、またはモチーフ（例えば、ＰｒｏＳｉｔｅ  Ｍｏｔｉｆ）は、ＧｅｎＢａｎｋ配列データベース（国立バイオテクノロジー情報センター、国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ）に対して、例えば、ＢＬＡＳＴを使って；ＨＭＭ（隠れマルコフモデル）のＰｆａｍデータベースに対して、例えば、Ｐｆａｍ検索用のデフォルトパラメータを使って；ＳＭＡＲＴデータベースに対して；またはＰｒｏＤｏｍデータベースに対して検索することができる。例えば、Ｐｆａｍ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ９のＰｆａｍ受入番号ＰＦ０００１４は、多くのクニッツドメインおよびクニッツドメインを同定するためのＨＭＭを提供する。Ｐｆａｍデータベースの説明は、Ｓｏｎｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ２８（３）：４０５−４２０において見出すことができ、ＨＭＭの詳細な説明は、例えば、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８３：１４６−１５９；  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：４３５５−４３５８；    Ｋｒｏｇｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２３５：１５０１−１５３１；およびＳｔｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  ２：３０５−３１４において見出すことができる。Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：５８５７  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２８：２３１において記載されるＨＭＭのＳＭＡＲＴデータベース（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ，  ＥＭＢＬ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，  ＤＥ）。ＳＭＡＲＴデータベースは、ＨＭＭｅｒ２検索プログラムの隠れマルコフモデルを使ったプロファイリングによって同定されたドメインを含む（Ｒ．  Ｄｕｒｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ：  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ．  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）。データベースはまた、アノテーションが付され、モニタされる。ＰｒｏＤｏｍタンパク質ドメインデータベースは相同ドメインの自動編集から構成される（Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９），  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２７：２６３−２６７）。ＰｒｏＤｏｍの最新バージョンは、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ３８およびＴＲＥＭＢＬタンパク質データベースの再帰的ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索を使用して構築される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２；  Ｇｏｕｚｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：３３３−３４０）。データベースは自動的に、各ドメインについてコンセンサス配列を生成す��。Ｐｒｏｓｉｔｅではクニッツドメインがモチーフとして列挙され、クニッツドメインを含むタンパク質が同定される。例えば、Ｆａｌｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３０：２３５−２３８（２００２）を参照されたい。
【０１７０】
クニッツドメインは、主として、２つループ領域（「結合ループ」）中のアミノ酸を使って標的プロテアーゼと相互作用する。第１のループ領域は、ＢＰＴＩのアミノ酸１３−２０にほぼ相当する残基間にある。第２のループ領域はＢＰＴＩのアミノ酸３１−３９にほぼ相当する残基間にある。クニッツドメインの例示的なライブラリは、第１のおよび／または第２ループ領域中の１つ以上のアミノ酸位置を変化させる。カリクレインと相互作用するクニッツドメインをスクリーニングする、または改善された親和性バリアントを選択するのに、変化させるのが特に有用な位置としては、下記が挙げられる：ＢＰＴＩの配列に関して１３、１５、１６、１７、１８、１９、３１、３２、３４、および３９位。これらの位置の少なくともいくらかは、標的プロテアーゼと密接に接触すると予想される。他の位置、例えば、３次元構造において前記位置に隣接する位置を変化させることもまた有用である。
【０１７１】
クニッツドメインの「フレームワーク領域」は、クニッツドメインの一部である残基であるが、第１および第２の結合ループ領域中の残基、すなわち、ＢＰＴＩのアミノ酸１３−２０およびＢＰＴＩの３１−３９にほぼ相当する残基を特に除外した残基であると規定される。反対に、結合ループ中にない残基は、より広い範囲のアミノ酸置換（例えば、保存的および／または非保存的置換）を許容し得る。
【０１７２】
１つの実施形態では、これらのクニッツドメインは、ヒトリポタンパク質関連凝固インヒビター（ＬＡＣＩ）タンパク質のクニッツドメイン１を含む、ループ構造のバリアント形態である。ＬＡＣＩは３つの内部の、明確に定義された、ペプチドループ構造を含み、それらはパラダイムクニッツドメインである（Ｇｉｒａｒｄ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９．  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３８：５１８−５２０）。本明細書で記載される、ＬＡＣＩのクニッツドメイン１のバリアントはスクリーニングされ、単離されており、カリクレインに増強された親和性および特異性で結合する（例えば、米国特許第５，７９５，８６５号および６，０５７，２８７号を参照されたい）。これらの方法はまた、他のクニッツドメインフレームワークに適用することができ、カリクレイン、例えば、血漿カリクレインと相互作用する他のクニッツドメインが得られる。カリクレイン機能の有用なモジュレーターは、典型的には、カリクレイン結合および阻害アッセイを使用して決定されるように、カリクレインに結合および／または阻害する。
【０１７３】
いくつかの態様では、カリクレイン結合剤（例えば、結合タンパク質、例えば、ポリペプチド、例えば、阻害ポリペプチド、例えば、抗体、例えば、阻害抗体、または他の結合剤、例えば、小分子）は血漿カリクレインの活性形態に結合する。いくつかの実施形態では、カリクレイン結合剤、血漿カリクレイン、例えば、ヒト血漿カリクレインおよび／またはマウスカリクレインに結合し、阻害する。
【０１７４】
血漿カリクレイン結合タンパク質は全長（例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、およびＩｇＥ）とすることができ、または抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖフラグメント）のみを含むことができる。結合タンパク質は２つの重鎖免疫グロブリンおよび２つの軽鎖免疫グロブリンを含むことができ、または単鎖抗体とすることができる。血漿カリクレイン結合タンパク質は組換えタンパク質、例えばヒト化、ＣＤＲグラフト、キメラ、脱免疫化、またはインビトロ生成抗体とすることができ、任意でヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の定常領域を含み得る。１つの実施形態では、血漿カリクレイン結合タンパク質はモノクローナル抗体である。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、カリクレイン結合タンパク質は血漿カリクレイン、例えば、ヒト血漿カリクレインおよび／またはマウスカリクレインに結合し、阻害する。例示的な血漿カリクレイン結合タンパク質は米国公開第２０１２０２０１７５６号（その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）で開示される。いくつかの実施形態では、カリクレイン結合タンパク質は、下記からなる群より選択される抗体の軽および／または重鎖を有する抗体（例えば、ヒト抗体）である：Ｍ１６２−Ａ０４、Ｍ１６０−Ｇ１２、Ｍ１４２−Ｈ０８、Ｘ６３−Ｇ０６、Ｘ１０１−Ａ０１（本明細書ではＤＸ−２９２２とも呼ばれる）、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ１１５−Ｂ０７、Ｘ１１５−Ｄ０５、Ｘ１１５−Ｅ０９、Ｘ１１５−Ｈ０６、Ｘ１１５−Ａ０３、Ｘ１１５−Ｄ０１、Ｘ１１５−Ｆ０２、Ｘ１２４−Ｇ０１（本明細書ではＤＸ−２９３０とも呼ばれる）、Ｘ１１５−Ｇ０４、Ｍ２９−Ｄ０９、Ｍ１４５−Ｄ１１、Ｍ０６−Ｄ０９およびＭ３５−Ｇ０４。いくつかの実施形態では、血漿カリクレイン結合タンパク質は、Ｍ１６２−Ａ０４、Ｍ１６０−Ｇ１２、Ｍ１４２−Ｈ０８、Ｘ６３−Ｇ０６、Ｘ１０１−Ａ０１（本明細書ではＤＸ−２９２２とも呼ばれる）、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ１１５−Ｂ０７、Ｘ１１５−Ｄ０５、Ｘ１１５−Ｅ０９、Ｘ１１５−Ｈ０６、Ｘ１１５−Ａ０３、Ｘ１１５−Ｄ０１、Ｘ１１５−Ｆ０２、Ｘ１２４−Ｇ０１（本明細書ではＤＸ−２９３０とも呼ばれる）、Ｘ１１５−Ｇ０４、Ｍ２９−Ｄ０９、Ｍ１４５−Ｄ１１、Ｍ０６−Ｄ０９およびＭ３５−Ｇ０４と競合し、またはこれと同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、血漿カリクレイン結合タンパク質はＤＸ−２９３０である。
【０１７６】
ＤＸ−２９３０の重鎖および軽鎖可変領域配列が以下で提供される。
ＤＸ−２９３０重鎖可変領域：
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＨＹＩＭＭＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＹＳＳＧＧＩＴＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＹＲＲＩＧＶＰＲＲＤＥＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
ＤＸ−２９３０軽鎖可変領域：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＫＡＳＴＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＮＴＹＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）
【０１７７】
いくつかの態様では、血漿カリクレインの活性形態に結合する、カリクレイン結合ポリペプチド（例えば、阻害ポリペプチド）。例示的なポリペプチド血漿カリクレイン剤が、下記において開示される：米国特許第５，７９５，８６５号、米国特許第５，９９４，１２５号、米国特許第６，０５７，２８７号、米国特許第６，３３３，４０２号、米国特許第７，６２８，９８３号、および米国特許第８，２８３，３２１号、米国特許第７，０６４，１０７号、米国特許第７，２７６，４８０号、米国特許第７，８５１，４４２号、米国特許第８，１２４，５８６号、米国特許第７，８１１，９９１号、および米国公開第２０１１００８６８０１号（それらの各々の全内容が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、カリクレイン結合ポリペプチドはＤＸ−８８である（非天然起源のカリクレイン阻害剤、ＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）（エカランチド）としても知られている、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）。いくつかの実施形態では、カリクレイン阻害剤は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸３−６０の約５８−アミノ酸配列を含み、またはこれから構成され、またはＤＸ−８８ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の６０−アミノ酸配列を有する。
Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）
【０１７８】
いくつかの実施形態では、血漿カリクレイン結合タンパク質はＥＰＩＫＡＬ−２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）であり、これは５８残基アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の残基３−６０に対応する）を有し、ＩｌｅのＳｅｒへの残基３４での、およびＧｌｕのＧｌｙへの残基３９でのアミノ酸置換を有する非天然起源のカリクレイン阻害剤である。ＥＰＩＫＡＬ−２の配列が以下に示される：
ＥｐｉＫａｌ２：  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）
【０１７９】
いくつかの実施形態では、血漿カリクレイン結合タンパク質は、本明細書で記載される結合タンパク質に対し、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、血漿カリクレイン結合タンパク質は、ＨＣおよび／またはＬＣフレームワーク領域（例えば、ＨＣおよび／またはＬＣ  ＦＲ１、２、３、および／または４）において、本明細書で記載される結合タンパク質に対し、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、血漿カリクレイン結合タンパク質はＨＣおよび／またはＬＣ  ＣＤＲ（例えば、ＨＣおよび／またはＬＣ  ＣＤＲ１、２、および／または３）において、本明細書で記載される結合タンパク質に対し、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、血漿カリクレイン結合タンパク質は、定常領域（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、および／またはＣＬ１）において、本明細書で記載される結合タンパク質に対し、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有することができる。
【０１８０】
いくつかの態様では、小分子は血漿カリクレインの活性形態に結合する。
【０１８１】
ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニスト
いくつかの実施形態では、ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストは被験体に投与される。例示的なブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストとしては、インカチバント（Ｆｉｒａｚｙｒ（登録商標））が挙げられ、これは１０アミノ酸を含むペプチド模倣薬であり、これは、天然ブラジキニンのブラジキニンＢ２受容体への結合をブロックする。
【０１８２】
Ｃ１−ＩＮＨ補充剤
いくつかの実施形態では、補充Ｃ１−ＩＮＨ剤は被験体に投与される。例示的なＣ１−ＩＮＨ補充剤は、公的に入手可能であり、例えば、Ｂｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）が挙げられ、これは、精製ヒト低温殺菌ナノ濾過Ｃ１−ＩＮＨ濃縮物である。
【０１８３】
実施例
実施例１：切断されたキニノーゲン
接触系の分析に基づいて、切断されたキニノーゲンは接触系活性化を測定するのに好適なバイオマーカーである。切断されたキニノーゲンは以前、ＨＡＥ発作中、硬変において、および敗血症中接触系活性化の結果として、上昇したことが示されている。抗体ファージディスプレイライブラリを、無傷のキニノーゲンの枯渇と組み合わせて、切断されたキニノーゲンに対してパニングした。並行してマウスを、切断されたキニノーゲンおよびハイブリドーマ細胞株から得られたモノクローナル抗体により免疫化した。どちらの試みも、切断されたおよび無傷のキニノーゲンの両方に結合する多くの異なるモノクローナル抗体を提供したが、切断されたキニノーゲンのみに結合する抗体は提供されなかった。
【０１８４】
多くの抗体を、ウエスタンブロットアッセイにおける適合性においてスクリーニングし、いくつかが、うまく働くと同定され、図２に示されるマウスｍＡｂ（クローン１１Ｈ０５）が含まれる。このアッセイは、ヒト血漿試料中の切断されたキニノーゲンを検出することができることが明らかである。さらに、図２のデータにより、ガラス中での血漿採取は、接触活性化およびキニノーゲン切断を防止するのに十分であることが確認される。
【０１８５】
質量分析に基づくアプローチもまた、患者血漿中の切断されたキニノーゲンを検出するために使用することができる。このアプローチでは、１つの免疫がキニノーゲンを患者試料から吸着し、溶離されたキニノーゲンをタンパク分解的に消化し、ペプチドフラグメントをＬＣ−ＭＣにより分析する。
【０１８６】
実施例２：無傷のおよび切断されたキニノーゲン
ウエスタンブロットを使用して、発作中に得られ、アンチプロテアーゼカクテルを含むクエン酸塩添加血漿管中に採取した、患者由来の血漿は、無傷のキニノーゲン（すなわち、１−鎖）の量の減少を示すことを示した（図３）。切断されたキニノーゲン（すなわち、２−鎖）の増加が観察された。
【０１８７】
実施例３：切断されたキニノーゲンのレベルを測定するためのアッセイ
無傷の（１−鎖）および切断された（２−鎖）高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）の検出のためのウエスタンブロットアッセイを、Ｌｉｃｏｒ検出を使用してさらに最適化させた。本明細書で記載されるこのアッセイは、動物を２−鎖ＨＭＷＫで免疫化し、ハイブリドーマ融合物を１−鎖および２−鎖ＨＭＷＫの両方に対し、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングすることにより、ハイブリドーマ技術により生成されたマウスモノクローナル抗体（クローン１１Ｈ０５）を使用する。１１Ｈ０５ｍＡｂをウエスタンブロットアッセイにおけるその性能、ＨＭＷＫの軽鎖に特異的に結合し、重鎖に結合しないその能力に基づいて選択した。軽鎖バインダーが好ましく、というのも、軽鎖は他の血漿キニノーゲン（低分子量キニノーゲン、ＬＭＷＫ）に存在しないからであり、それはｐＫａｌ基質ではない。アッセイはまた、血漿をプラスチック管に採取する重要性を証明するために使用され、というのも、ガラス管中での採取は接触系活性化となってしまったからである（図４）。
【０１８８】
いくつかの例では、下記材料および条件を本明細書で記載されるウエスタンブロットアッセイにおいて使用した：
【０１８９】
材料
ＸＣｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ（登録商標）ミニセル、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃａｔ．＃ＥＩ０００１
Ｇｅｌ  Ｂｏｘパワーサプライ
ｉＢｌｏｔ（登録商標）ウエスタンブロッティングトランスファー装置、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃａｔ．  ＃  ＩＢ１００１
ｉＢｌｏｔ（登録商標）トランスファースタック、ニトロセルロース、ミニ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃａｔ．  ＃  ＩＢ３０１００１
Ｍａｔｒｉｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｍｐａｃｔ２多チャネルピペッター、または等価物
Ｒａｉｎｉｎ  Ｐｉｐｅｔｍａｎ、様々な体積範囲、Ｒａｉｎｉｎ、Ｃａｔ  ＃：Ｐ−１０、Ｐ−２０、Ｐ−１００、Ｐ−２００、およびＰ−１０００、または等価物
チャートレコーダを備えた−８０℃フリーザー
チャートレコーダを備えた−２０℃フリーザー
チャートレコーダを備えた２−８℃冷蔵庫
０．２２μｍポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）Ｆｉｌｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ＃４３１０９６または等価物
脱イオンおよび精製水（ＤＩ水）、Ｒｉｃｃａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｃａｔ＃９１５０−５、または等価物
ＮｕＰＡＧＥ７％トリス−酢酸ゲル、１５ウェル、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃａｔ．  ＃  ＥＡ０３５５５Ｂｏｘ
トリス−酢酸ＳＤＳ泳動用緩衝液（２０Ｘ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃａｔ．＃ＬＡ００４１
ＮｕＰＡＧＥ試料還元剤（１０Ｘ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃａｔ．＃ＮＰ０００９
ＮｕＰＡＧＥ試料緩衝液（４Ｘ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃａｔ．＃ＮＰ０００７
ＮｕＰＡＧＥ４−１２％ビス−トリスゲル、１５ウェル、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃａｔ．  ＃  ＮＰ０３３６ＢＯＸ
ＭＥＳ  ＳＤＳ泳動用緩衝液（２０Ｘ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃａｔ．＃ＮＰ０００２
Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液、ＬＩ−ＣＯＲ、Ｃａｔ．＃９２７−４００００
Ｔｗｅｅｎ２０、Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．＃Ｐ１３７９
リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４、Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃Ｐ−３８１３または等価物
トリス、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ．  ＃  Ｔ３９３−５０００
塩化ナトリウム、ＪＴ  Ｂａｋｅｒ、Ｃａｔ．  ＃  ３６２４−１９
６Ｎ塩酸、ＥＭＤ、Ｃａｔ．＃ＨＸ０６０３Ｍ−６
３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．２、Ｔｅｋｎｏｖａ、Ｃａｔ．＃Ｓ０２９６
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＩｇＧおよびプロテアーゼなし、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ．  ＃  ００１−０００−１６２
マウスモノクローナル抗ＬＣ  ＨＭＷＫ抗体クローン、クローン１１Ｈ０５（＃１６）、１．４ｍｇ／ｍＬ、Ｄｙａｘ
ヤギ抗マウスＩＲＤｙｅ  ６８０ＲＤ、ＬＩ−ＣＯＲ、Ｃａｔ．＃９２６−６８０７０
Ｏｄｙｓｓｅｙ１色分子量マーカー、ＬＩ−ＣＯＲ、Ｃａｔ．  ＃  ９２８−４００００
アンチプロテアーゼインヒビターカクテル（１０Ｘ）、Ｄｙａｘにより提供
第ＸＩＩａ因子、１．４７ｍｇ／ｍＬ（２１．６μＭ）、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ、Ｄｙａｘにより提供
キニノーゲン欠損血漿、Ｈｙｐｈｅｎ−Ｂｉｏｍｅｄ、Ｄｙａｘにより提供
単鎖ＨＭＷＫ、１．６１ｍｇ／ｍＬ、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ、Ｃａｔ．  ＃  ＨＫ２７００
２−鎖ＨＭＷＫ、２．０１ｍｇ／ｍＬ、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ、Ｃａｔ．  ＃  ＨＫ２３６２
正常ヒト血漿試料、ＨＡＥ患者試料、およびＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ試料、Ｄｙａｘにより提供
ＤＸ２９３０、Ｄｙａｘ、Ｌｏｔ＃ＰＵＲＤＸ１−Ｌ０１、３２．１ｍｇ／ｍＬ
ＤＸ８８、Ｄｙａｘ、Ｌｏｔ＃Ｂ２００７−０２９、１０．１ｍｇ／ｍＬ
【０１９０】
プロトコル概略：
【表５】
2019055975.tif 000007
【０１９１】
ｍＡｂ  １１Ｈ０５の１−鎖および２−鎖ＨＭＷＫを検出する能力を評価するために、精製タンパク質をＨＭＷＫ欠損血漿中に、正常血漿中で観察されるレベルを含む濃度で、添加した（図５）。還元条件下、１１Ｈ０５は、１−鎖を、２−鎖ＨＭＷＫよりも高い感度で検出することが明らかになった。２つの形態のＨＭＷＫに対するｍＡｂの感度差を説明することにより、このアッセイを使用して、患者血漿中の１−鎖および２−鎖ＨＭＷＫの濃度を正確に定量することができる。あるいは、パーセント２−鎖シグナルは、接触活性化が関与する疑いがある血漿試料中で決定することができ、正常で健康な個体由来の血漿と比較することができる。この後者のアプローチを使用すると、アッセイを使用して異なる疾患由来の試料をスクリーニングし、接触系活性化と関連する疾患を同定することができる。
【０１９２】
アッセイ間および内精度および正確さ試験もまた実施した。非還元および還元条件の両方下で、許容可能にアッセイを実施し、試験したパラメータ全てにわたり、≦２５％のパーセントＣＶ値が生成された。
【０１９３】
凍結−解凍安定性試験もまた、正常ヒト血漿に対して実施した。ＨＭＷＫは、０と３の間の凍結−解凍サイクルでは分解しないと考えられることが決定された。
【０１９４】
ウエスタンブロットアッセイを遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）、過剰な接触系活性化およびｐＫａｌ活性により引き起こされることが知られている疾患を有する患者由来の血漿試料を使用して検証した。図６に示されるように、ＨＡＥ血漿中の切断されたＨＭＷＫのパーセンテージはおよそ２０％であり、これは正常血漿よりも著しく高い。ＨＡＥ発作中、このアッセイを使用して検出されるパーセント切断されたＨＭＷＫはさらに上昇する。このデータは明らかに、静止状態（基礎）疾患状態中の、ＨＡＥ血漿中の切断されたＨＭＷＫの増加を証明する。よって、アッセイは治療的ｐＫａｌ阻害剤の有効性を、それらが切断されたキニノーゲンの正常レベルを回復させる程度の評価を介して、モニタするために使用することができる。
【０１９５】
負電荷を持つ表面または粒子、例えばリン脂質またはポリリン酸は、接触系の有効な活性化剤であることが知られており、これにより、活性ｐＫａｌの形成および１−鎖ＨＭＷＫのタンパク質分解からのブラジキニンの生成が引き起こされる。ＨＡＥ発作において接触系活性化を引き起こす生理的表面のアイデンティティは知られていない。しかしながら、ＨＡＥ発作は、ＦＸＩＩａ生成と関連する。荷電物質、例えばデキストラン硫酸またはカオリンではなく、ＦＸＩＩａの接触系開始剤としての使用により、より再現性の高い接触系活性化および最適化アッセイ性能が可能になる。ＦＸＩＩａの濃度および反応条件を、ＨＡＥ患者で観察されるパーセント切断されたキニノーゲンに近似させるように決定した（約２０−５０％）（図７、表１）。
【表６】
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【０１９６】
２．５ｎＭのＦＸＩＩａ濃度および最適化反応条件を使用して、１５人の男性および１５人の女性由来の正常ヒト血漿を、１０μｇ／ｍＬのＤＸ−２９３０（ｐＫａｌ活性の強力な抗体阻害剤）の存在または非存在下で検査し、およびパーセント２−鎖ＨＭＷＫを決定した（表２）。アッセイは血漿中のＨＭＷＫタンパク質分解の血漿カリクレイン阻害を検出することができることが明らかである。ＤＸ−２９３０はこのアッセイにおいてエカランチド、ＨＡＥ発作の治療のための認可されたｐＫａｌ阻害剤とおよそ等価の効力を示すことが示された（図８）。このインビトロアッセイにおけるエカランチドと等しい効力は、等価の薬物レベルがＨＡＥにおいて等しく有効であり得ることを示唆する。
【表７】
2019055975.tif 000009
【０１９７】
潰瘍性大腸炎（ＵＣ）および関節リウマチ（ＲＡ）を有する患者由来の試料もまた、このウエスタンブロットアッセイを使用して試験した。患者血漿試料をＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎから取得し、プラスチック管内の抗凝固薬中に採取した。切断されたキニノーゲンのパーセントは、ＵＣおよびＲＡ患者の両方において、正常対照患者に比べ上昇することが見出された（図９、表３）。
【表８】
2019055975.tif 000010
【０１９８】
クローン病（ＣＤ）を有する患者由来の試料もまた、ウエスタンブロットアッセイを使用して試験した。患者血漿試料をＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎから取得し、プラスチック管内の抗凝固薬中に採取した。切断されたキニノーゲンのパーセントは、正常対照患者に比べ、ＣＤ患者において上昇することが見出された（図１０、表４）。
【表９】
2019055975.tif 000011
【０１９９】
実施例４：ＦＸＩＩａおよびＤＸ２９３０の正常ヒト血漿（ＮＨＰ）試料に対する効果
目的：
この実験の目的は、ＤＸ−２９３０のＦＸＩＩａ接触系活性化に対する効果を決定することであった。ＤＸ２９３０は血漿カリクレイン阻害することができ、ＦＸＩＩａによる治療に応じて、測定される２−鎖対１−鎖比を減少させる。５人の男性および５人の女性由来のクエン酸ナトリウム添加ＮＨＰ試料を、未処理で、ＦＸＩＩａ活性化後、および、試料を１０μｇ／ｍＬのＤＸ−２９３０で前処理した場合のＦＸＩＩａ活性化後に試験した。各試料セットを非還元および還元条件下でアッセイした。
【０２００】
手順：
試料調製
１．ＮＨＰ試料を凍結貯蔵から取り出し、室温に平衡化させた。下記男性ＮＨＰ試料を試験した：ＢＲＨ７４５０５０、ＢＲＨ７４５０５１、ＢＲＨ７４５０５２、ＢＲＨ７４５０５３、およびＢＲＨ７４５０５４。下記女性試料を試験した：ＢＲＨ７４５０６５、ＢＲＨ７４５０６６、ＢＲＨ７４５０６７、ＢＲＨ７４５０６８、およびＢＲＨ７４５０６９。
２．ＤＸ２９３０を、３．３５μＬのＤＸ２９３０ストック（Ｌｏｔ＃ＰＵＲＤＸ１−Ｌ０１、３２．１ｍｇ／ｍＬ）を４９６．６５μＬの１Ｘ  ＴＢＳに添加することにより、２１５μｇ／ｍＬで調製した。
３．ＦＸＩＩａ溶液の１：１０中間体を、５μＬのＦＸＩＩａストック溶液（２５，３００ｎＭ）を４５μＬのＴＢＳに添加することにより調製した。５６．２５ｎＭのＦＸＩＩａ溶液を、４．４５μＬの１：１０中間体を１９５．５５μＬのＴＢＳに添加することにより調製した。
４．各ＮＨＰ試料を１０μｇ／ｍＬのＤＸ２９３０を用いて、２μＬの２１５μｇ／ｍＬ  ＤＸ２９３０溶液を４１μＬのＮＨＰに添加することにより調製した。
５．各ＮＨＰ試料を、２．５ｎＭのＦＸＩＩａを用いて、２μＬの５６．２５ｎＭ  ＦＸＩＩａ溶液を４３μＬの各ＮＨＰ試料に、ＤＸ２９３０あり、およびなしで添加することにより調製した。
６．試料を、ＦＸＩＩａと共に３７℃で１０分インキュベートした。反応を、５μＬの１０Ｘアンチプロテアーゼインヒビターを添加することにより停止させた。
７．各ＮＨＰ試料、ＦＸＩＩａあり、ＤＸ２９３０およびＦＸＩＩａあり、ならびに未処理試料を、５μＬの試料を９５μＬのＴＢＳに添加することにより、５％血漿まで希釈した。
８．非還元試料を、５μＬの４Ｘ試料緩衝液を１５μＬの試料に添加することにより調製した。
９．還元試料を５μＬの４Ｘ試料緩衝液および２μＬの１０Ｘ還元剤を１３μＬの試料に添加することにより調製した。
１０．試料は全て９５℃で５分、熱ブロックを用いて加熱した。
ゲルローディング、泳動、および転写
１．１Ｌの体積の１Ｘトリス−酢酸ＳＤＳ泳動用緩衝液を５０ｍＬの２０Ｘトリス−酢酸ＳＤＳ泳動用緩衝液を９５０ｍＬのＤＩ水に添加することにより調製した。
２．１Ｌの体積の１Ｘ  ＭＥＳ泳動用緩衝液を、５０ｍＬの２０Ｘ  ＭＥＳ  ＳＤＳ泳動用緩衝液を９５０ｍＬのＤＩ水に添加することにより調製した。
３．アッセイ緩衝液（０．２％Ｔｗｅｅｎを有するＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液）を、１ｍＬのＴｗｅｅｎ−２０を４９９ｍＬのＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液に添加することにより調製した。
４．洗浄緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎを有するＰＢＳ）を、１パケットのＰＢＳおよび１ｍＬのＴｗｅｅｎ−２０を９００ｍＬのＤＩ水に添加することにより調製した。溶液をよく混合し、ＤＩ水を用いて１Ｌに適量化した。最終溶液を、０．２２μＭ  ＰＥＳ濾過システムに通して濾過した。
５．４μＬの体積の１色タンパク質マーカーを、２つのゲルのレーン１に添加した。
６．１３μｌの体積の非還元試料を、７％トリス−酢酸ゲルの適切なレーンに添加した。
７．１３μＬの体積の還元試料を、４−１２％ビス−トリスゲルの適切なレーンに添加した。
８．ゲルを１２５ボルトで約７５分泳動させた。
９．各ゲルを、ｉＢｌｏｔミニ−トランスファースタックおよびｉＢｌｏｔ転写システムのプログラムＰ０を使用して、個々に膜に転写させた。
１０．各膜を、２０ｍＬのＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液を含むプラスチックトレーに移した。膜を、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液中、プレートシェーカー上、室温で１時間インキュベートした。
１１．１μｇ／ｍＬの一次抗体溶液を２８．５８μＬのマウス抗ＨＭＷＫ  ｍＡｂ、クローン＃１１Ｈ０５、１．４ｍｇ／ｍＬを２９，９７１．４２μＬのアッセイ緩衝液に添加することにより調製した。
１２．ブロッキング緩衝液をプラスチックトレーから除去した。２０ｍＬの体積の一次抗体溶液を、各トレーに添加し、膜をプレートシェーカー上で、室温にて１時間インキュベートした。
１３．ヤギ抗マウスＩｇＧ  ＩＲＤｙｅ６８０の１：１０中間体を、５μＬのヤギ抗マウスＩｇＧ  ＩＲＤｙｅ６８０を４５μＬのアッセイ緩衝液に添加することにより調製した。二次抗体溶液を、２６．６６μＬの１：１０ヤギ抗マウスＩｇＧ  ＩＲＤｙｅ６８０中間体を３９，９７３．３４μＬのアッセイ緩衝液に添加することにより、１：１５，０００希釈で調製した。
１４．一次抗体溶液をトレーから除去した。
１５．各膜を５分間、２０ｍＬの洗浄緩衝液で洗浄し、その後、洗浄溶液を廃棄した。洗浄を繰り返し、合計、４回の洗浄とした。
１６．２０ｍＬの体積の二次抗体溶液を、各トレーに添加し、膜をプレートシェーカー上で、室温にて１時間インキュベートした。
１７．二次抗体溶液をトレーから除去した。
１８．各膜を５分間、２０ｍＬの洗浄緩衝液で洗浄し、その後、洗浄溶液を廃棄した。洗浄を繰り返し、合計、４回の洗浄とした。
１９．各膜をＰＢＳで５分間すすいだ。
２０．膜をＬｉＣｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＣＬｘを使用して走査した。
【０２０１】
結果：
表５および６は非還元試料データを含む。表７および８は還元試料データを含む。切断されたＨＭＷＫのパーセントを２つの方法を使用して計算した。レーン中の２−鎖のパーセントを下記式を使用して決定した：２−鎖シグナルの和／総シグナルの和。未処理シグナルからの２−鎖のパーセントを下記式を使用して決定した：１−（処理単鎖シグナル／未処理単鎖シグナル）。処理および未処理試料を、試料調製において、わずかに高いパーセンテージの血漿を有する未処理試料を用いてわずかに異なって調製した。よって、未処理試料は、処理試料よりもわずかに高い全体シグナルを生成させた。処理および未処理試料の間のわずかに異なる試料調製のために、レーン中の２−鎖のパーセント値を使用して、パーセント切断されたＨＷＭＫを決定した。
【０２０２】
表１６は、活性化および阻害結果の概要を含む。還元条件下では、未処理男性および女性ＮＨＰ試料は、それぞれ、平均、１６．１％および９．６％の切断されたＨＭＷＫを含んだ。ＦＸＩＩａで処理した男性および女性ＮＨＰ試料は、それぞれ、平均、４２．０％および４３．８％の切断されたＨＭＷＫを含んだ。ＤＸ−２９３０で前処理し、続いてＦＸＩＩａで処理した男性および女性ＮＨＰ試料は、それぞれ、平均、２９．５％および２６．４％の切断されたＨＭＷＫを含んだ。
【０２０３】
非還元条件下、未処理男性および女性ＮＨＰ試料は、それぞれ、平均、３２．０％および２１．５％の切断されたＨＭＷＫを含んだ。ＦＸＩＩａで処理した男性および女性ＮＨＰ試料は、それぞれ、平均、６１．２％および５０．２％の切断されたＨＭＷＫを含んだ。ＤＸ−２９３０で前処理し続いてＦＸＩＩａで処理した男性および女性ＮＨＰ試料は、それぞれ、平均、４３．６％および３０．３％の切断されたＨＭＷＫを含んだ。
【０２０４】
結論：
ＮＨＰ試料のＦＸＩＩａによる処理は、未処理試料に比べ、パーセント切断されたＨＭＷＫを増加させた。ＤＸ−２９３０で前処理し、続いてＦＸＩＩａ活性化させたＮＨＰ試料は、ＦＸＩＩａのみで処理した試料よりも少ない切断されたＨＭＷＫを生成させたが、未処理試料に比べ、わずかに高いパーセント切断されたＨＭＷＫを生成させた。還元未処理ＮＨＰ試料は非還元未処理ＮＨＰ試料よりも少ない切断されたＨＭＷＫを含んだ。未処理、ＦＸＩＩａで処理、ＤＸ−２９３０で前処理し続いてＦＸＩＩａで処理したＮＨＰ試料は、再現性のある結果を生成させたこともまた、見出された。
【表１０】
2019055975.tif 000012
【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【０２０５】
実施例６．ＤＸ−２９３０およびＤＸ−８８を用いたＦＸＩＩａ活性化の阻害
目的：
この実験の目的はＦＸＩＩａ活性化の阻害に対するＤＸ−２９３０およびＤＸ−８８の有効性を決定することであった。ＤＸ−２９３０を５つの濃度で試験した：２００、１００、３０、１２、および５μｇ／ｍＬ。ＤＸ−８８を５つの濃度で試験した：９．４、４．７、１．４、０．５６、および０．２４μｇ／ｍＬ。ＤＸ−２９３０およびＤＸ−８８で前処理した試料をＦＸＩＩａで処理した。前処理した試料に加えて、１つの未処理試料、およびＦＸＩＩａのみで処理した２つの試料を試験した。試料を還元条件下で試験した。
【０２０６】
手順：
１．ＮＨＰプールを、２５０μＬの各血漿試料、ＢＲＨ７４５０７０、ＢＲＨ７４５０７１、およびＢＲＨ７４５０４８を１．５ｍＬマイクロ遠心チューブに添加することにより調製し、よく混合した。
２．４５００μｇ／ｍＬ  ＤＸ２９３０溶液を、４．２１μＬのＤＸ２９３０ストック溶液（３２．１ｍｇ／ｍＬ）を２５．７９μＬのＴＢＳに添加することにより調製した。２２５０μｇ／ｍＬ  ＤＸ２９３０溶液を１５μＬの４５００μｇ／ｍＬ溶液を１５μＬのＴＢＳに添加することにより調製した。６７５μｇ／ｍＬ  ＤＸ２９３０溶液を６μＬの２２５０μｇ／ｍＬ溶液を１４μＬのＴＢＳに添加することにより調製した。２７０μｇ／ｍＬ  ＤＸ２９３０溶液を、８μＬの６７５μｇ／ｍＬ溶液を１２μＬのＴＢＳに添加することにより調製した。１１２．５μｇ／ｍＬ  ＤＸ２９３０溶液を、１０μｌの２７０μｇ／ｍＬ溶液を１４μＬのＴＢＳに添加することにより調製した。
３．ＤＸ−２９３０で前処理した５つの血漿試料を、２μＬの各ＤＸ２９３０溶液を４１μＬのＮＨＰプールに添加することにより調製した。
４．２１１．５μｇ／ｍＬ  ＤＸ８８溶液を、６．２８μＬのＤＸ８８ストック溶液（１０．１ｍｇ／ｍＬ）を２９３．７２μＬのＴＢＳに添加することにより調製した。１０５．７５μｇ／ｍＬ  ＤＸ８８溶液を、１５μＬの２１１．５μｇ／ｍＬ溶液を１５μＬのＴＢＳに添加することにより調製した。３１．５μｇ／ｍＬ  ＤＸ８８溶液を、８．９４μＬの１０５．７５μｇ／ｍＬ溶液を２１．０６μＬのＴＢＳに添加することにより調製した。１２．６μｇ／ｍＬ  ＤＸ８８溶液を、１２μＬの３１．５μｇ／ｍＬ溶液を１８μＬのＴＢＳに添加することにより調製した。５．４μｇ／ｍＬ  ＤＸ８８溶液を１２．８６μＬの１２．６μｇ／ｍＬを１７．１４μＬのＴＢＳに添加することにより調製した。
５．ＤＸ−８８で前処理した５つの血漿試料を、２μＬの各ＤＸ−８８溶液を４１μＬのＮＨＰプールに添加することによりを調製した。
６．ＦＸＩＩａの１：１０中間体を、５μＬのストック溶液（２５，３００ｎＭ）を４５μＬのＴＢＳに添加することにより調製した。５６．２５ｎＭ  ＦＸＩＩａ溶液を、４．４５μＬの１：１０中間体を１９５．５５μＬのＴＢＳに添加することにより調製した。
７．ＤＸ−２９３０およびＤＸ８８で前処理した各血漿試料を、２μＬの５６．２５ｎＭ  ＦＸＩＩａ溶液を各試料に添加することにより、２．５ｎＭのＦＸＩＩａで処理した。
８．ＦＸＩＩａのみを含む２つの試料を、２μＬのＴＢＳおよび２μＬの５６．２５ｎＭ  ＦＸＩＩａ溶液を４１μＬのＮＨＰプールに添加することにより調製した。
９．１つの未処理試料を、４μＬのＴＢＳを４１μＬのＮＨＰプールに添加することにより調製した。
１０．ＦＸＩＩａを含む試料は全て、３７℃で１０分間インキュベートした。
１１．５μＬの体積のアンチプロテアーゼインヒビターを、未処理試料を含む各試料に添加した。各同型物の総試料体積は５０μＬとした。
１２．各試料を、５μＬの試料を９５μＬのＴＢＳに添加することにより、約５％血漿に希釈した。
１３．試料を、５μＬの４Ｘ試料緩衝液および２μＬの１０Ｘ還元剤を１３μＬの試料に添加することにより調製した。
１４．試料は全て９５℃で５分、熱ブロックを使用して加熱した。
１５．１Ｌの体積の１Ｘ  ＭＥＳ泳動用緩衝液を、５０ｍＬの２０Ｘ  ＭＥＳ  ＳＤＳ泳動用緩衝液を９５０ｍＬのＤＩ水に添加することにより調製した。
１６．アッセイ緩衝液（０．２％Ｔｗｅｅｎを有するＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液）を、１ｍＬのＴｗｅｅｎ−２０を４９９ｍＬのＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液に添加することにより調製した。
１７．洗浄緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎを有するＰＢＳ）を、１パケットのＰＢＳおよび１ｍＬのＴｗｅｅｎ−２０を９００ｍＬのＤＩ水に添加することにより調製した。溶液をよく混合し、ＤＩ水を用いて１Ｌに適量化した。最終溶液を、０．２２μＭ  ＰＥＳ濾過システムに通して濾過した。
１８．４μＬの体積の１色タンパク質マーカーを、２つのゲルのレーン１に添加した。
１９．１３μＬの体積の還元試料を、４−１２％ビス−トリスゲルの適切なレーンに添加した。
２０．ゲルを１２５ボルトで約７５分間泳動させた。
２１．ゲルを、ｉＢｌｏｔミニ−トランスファースタックおよびｉＢｌｏｔ転写システム上のプログラムＰ０を使用して、膜に転写させた。
２２．膜を、２０ｍＬのＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液を含むプラスチックトレーに移した。膜をＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液中、プレートシェーカー上で、室温にて１時間インキュベートした。
２３．１μｇ／ｍＬ一次抗体溶液を、１４．２９μＬのマウス抗ＨＭＷＫ  ｍＡｂ、クローン＃１１Ｈ０５、１．４ｍｇ／ｍＬを１９，９８５．７μＬのアッセイ緩衝液に添加することにより調製した。
２４．ブロッキング緩衝液をプラスチックトレーから除去した。２０ｍＬの体積の一次抗体溶液を、膜に添加し、プレートシェーカー上で室温にて１時間インキュベートした。
２５．ヤギ抗マウスＩｇＧ  ＩＲＤｙｅ６８０の１：１０中間体を、５μＬのヤギ抗マウスＩｇＧ  ＩＲＤｙｅ６８０を４５μＬのアッセイ緩衝液に添加することにより調製した。二次抗体溶液を、１３．３３μＬの１：１０ヤギ抗マウスＩｇＧ  ＩＲＤｙｅ６８０中間体を１９，９８６．７μＬのアッセイ緩衝液に添加することにより、１：１５，０００希釈で調製した。
２６．一次抗体溶液をトレーから除去した。
２７．膜を５分間、２０ｍＬの洗浄緩衝液で洗浄し、その後洗浄溶液を廃棄した。洗浄を繰り返し、合計、４回の洗浄とした。
２８．２０ｍＬの体積の二次抗体溶液を、膜に添加し、プレートシェーカー上で室温にて１時間インキュベートした。
２９．二次抗体溶液をトレーから除去した。
３０．膜を５分間、２０ｍＬの洗浄緩衝液で洗浄し、その後洗浄溶液を廃棄した。洗浄を繰り返し、合計、４回の洗浄とした。
３１．膜をＰＢＳで５分間すすいだ。
３２．膜をＬｉＣｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＣＬｘを使用して走査した。
【０２０７】
結果：
表１０は、ＤＸ−２９３０およびＤＸ−８８阻害実験に対する結果を含む。２−鎖のパーセントを各レーン内で計算し、処理シグナルを未処理シグナルと比較することにより計算した。この比較のために、レーン中の２−鎖のパーセントを使用した。未処理ＮＨＰプールは、３．８％の２−鎖のパーセント値を生成させた。ＮＨＰプールをＦＸＩＩａのみで処理した場合、２つ同型試料は、２４．４％の２−鎖のパーセント値を生成させた。ＤＸ−２９３０で前処理した試料は、ＤＸ−８８で調製した試料に比べ、わずかに低い２−鎖のパーセント値を生成させた。５μｇ／ｍＬのＤＸ−２９３０および０．２４μｇ／ｍＬのＤＸ−８８で前処理した試料は、それぞれ、２２．３％および２３．９％の２−鎖のパーセント値を生成させた。これらの値はＦＸＩＩａのみで処理した試料における２−鎖のパーセント値に非常に近い。
【０２０８】
結論：
ＤＸ−２９３０で前処理した試料は、ＤＸ−８８で前処理した試料よりもわずかに低い２−鎖のパーセント値を生成させた。
【表１５】
2019055975.tif 000017
【０２０９】
実施例７．ＨＡＥ、ＲＡ、ＵＣ、およびＣＤ患者試料における切断されたキニノーゲンのレベルの決定
目的：
この実験の目的は、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）を有する患者由来のアンチプロテアーゼ処理血漿試料を評価することであった。各患者由来の２つのＨＡＥ試料を試験し、１つは基礎試料であり、１つは発作試料とした。試料を還元および非還元条件下で試験した。加えて、クローン病、関節リウマチ、および潰瘍性大腸炎と診断された患者由来の試料を試験した。正常ヒト血漿試料もまた試験した。追加の試料を還元条件下のみで試験した。
【０２１０】
手順：
１．６組のＨＡＥ患者試料を試験した。各血漿試料を５μＬの試料を９５μＬのＴＢＳに添加することにより調製した。
２．５つのクローン病血漿試料、５つの関節リウマチ血漿試料、および５つの潰瘍性大腸炎試料を試験した。各血漿試料を、５μＬの試料を９５μＬのＴＢＳ添加することにより調製した。
３．７つの正常ヒト血漿試料を、対照として使用するために、５μＬの試料を９５μＬのＴＢＳに添加することにより調製した。
４．非還元試料を、５μＬの４Ｘ試料緩衝液を１５μＬの試料に添加することにより調製した。
５．還元試料を、５μＬの４Ｘ試料緩衝液および２μＬの１０Ｘ還元剤を１３μＬの試料に添加することにより調製した。
６．試料は全て９５℃で５分、熱ブロックを使用して加熱した。
７．１Ｌの体積の１Ｘトリス−酢酸ＳＤＳ泳動用緩衝液を、５０ｍＬの２０Ｘトリス−酢酸ＳＤＳ泳動用緩衝液を９５０ｍＬのＤＩ水に添加することにより調製した。
８．２Ｌの体積の１Ｘ  ＭＥＳ泳動用緩衝液を、１００ｍＬの２０Ｘ  ＭＥＳ  ＳＤＳ泳動用緩衝液を１９００ｍＬのＤＩ水に添加することにより調製した。
９．アッセイ緩衝液（０．２％Ｔｗｅｅｎを有するＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液）を、２ｍＬのＴｗｅｅｎ−２０を９９８ｍＬのＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液に添加することにより調製した。
１０．洗浄緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎを有するＰＢＳ）を１パケットのＰＢＳおよび１ｍＬのＴｗｅｅｎ−２０を９００ｍＬのＤＩ水に添加することにより調製した。溶液をよく混合し、ＤＩ水を用いて１Ｌに適量化した。最終溶液を、０．２２μＭ  ＰＥＳ濾過システムに通して濾過した。
１１．４μＬの体積の１色タンパク質マーカーを、４つのゲルのレーン１に添加した。
１２．１３μｌの体積の非還元試料を、７％トリス−酢酸ゲルの適切なレーンに添加した。
１３．１３μＬの体積の還元試料を、４−１２％ビス−トリスゲルの適切なレーンに添加した。
１４．ゲルを１２５ボルトで約７５分間泳動させた。
１５．各ゲルを、ｉＢｌｏｔミニ−トランスファースタックおよびｉＢｌｏｔ転写システム上のプログラムＰ０を使用して、個々に膜に転写させた。
１６．各膜を、２０ｍＬのＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液を含むプラスチックトレーに移した。膜をＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液中、プレートシェーカー上で、室温にて１時間インキュベートした。
１７．１μｇ／ｍＬ一次抗体溶液を５７．１４μＬのマウス抗ＨＭＷＫ  ｍＡｂ、クローン＃１１Ｈ０５、１．４ｍｇ／ｍＬを７９，９４２．８６μＬのアッセイ緩衝液に添加することにより調製した。
１８．ブロッキング緩衝液をプラスチックトレーから除去した。２０ｍＬの体積の一次抗体溶液を、各トレーに添加し、膜をプレートシェーカー上で室温にて１時間インキュベートした。
１９．ヤギ抗マウスＩｇＧ  ＩＲＤｙｅ６８０の１：１０中間体を、１０μＬのヤギ抗マウスＩｇＧ  ＩＲＤｙｅ６８０を９０μＬのアッセイ緩衝液に添加することにより調製した。二次抗体溶液を、５３．３３μＬの１：１０ヤギ抗マウスＩｇＧ  ＩＲＤｙｅ６８０中間体を７９，９４６．６７μＬのアッセイ緩衝液に添加することにより、１：１５，０００希釈で調製した。
２０．一次抗体溶液をトレーから除去した。
２１．各膜を５分間２０ｍＬの洗浄緩衝液で洗浄し、その後、洗浄溶液を廃棄した。洗浄を繰り返し、合計、４回の洗浄とした。
２２．２０ｍＬの体積の二次抗体溶液を、各トレーに添加し、膜をプレートシェーカー上で室温にて１時間インキュベートした。
２３．二次抗体溶液をトレーから除去した。
２４．各膜を５分間、２０ｍＬの洗浄緩衝液で洗浄し、その後、洗浄溶液を廃棄した。洗浄を繰り返し、合計、４回の洗浄とした。
２５．各膜をＰＢＳで５分間すすいだ。
２６．膜を、ＬｉＣｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＣＬｘを使用して走査した。
【０２１１】
結果：
予想通りに、ほとんどの患者試料は、基礎試料とは対照的に、発作試料において２−鎖ＨＭＷＫの上昇したレベルを示した。表１１および１２はこの実験に対するＨＡＥデータを含む。表１３は潰瘍性大腸炎および関節リウマチ患者試料に対するデータセットを含む。表１４はクローン病患者試料に対するデータを含む。
【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【０２１２】
他の実施形態
この明細書で開示される特徴は全て、任意の組み合わせで組み合わせることができる。この明細書で開示される各特徴は同じ、等価な、または同様の目的を果たす他の特徴により置換することができる。よって、明確に別記されない限り、開示される各特徴は、包括的な一連の等価なまたは同様の特徴の一例にすぎない。
【０２１３】
上記記載から、当業者は容易に本発明の必須特性を確認することができ、その精神および範囲から逸脱せずに、様々な用途および条件に適合させるように、発明の様々な変更および改変を行うことができる。よって、他の実施形態もまた、特許請求の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年12月27日(2018.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体のｐＫａｌ媒介疾患の治療における使用のための医薬組成物であって、
前記組成物は、血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）阻害剤またはブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストまたはＣ１−ＩＮＨ補充剤と、薬学的に許容される担体と、を含み、
前記被験体は、基準値から逸脱する、切断された高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）の値、無傷のＨＭＷＫの値、またはその両方を有し、
前記基準値は、健康な被験体から取得された対照試料における切断されたＨＭＷＫまたは無傷のＨＭＷＫのレベルを表す、
医薬組成物。
【請求項２】
前記切断されたＨＭＷＫまたは前記無傷のＨＭＷＫの値は、前記試料中のＨＭＷＫの総量に対する前記切断されたＨＭＷＫのパーセンテージまたは前記無傷のＨＭＷＫのパーセンテージである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記被験体は、前記対照試料における切断されたＨＭＷＫのパーセンテージを表す前記基準値と比較して、切断されたＨＭＷＫのパーセンテージが高い、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記被験体は、ｐＫａｌ媒介疾患を有するヒト患者である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ｐＫａｌ媒介疾患は、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、またはクローン病である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
クニッツドメインポリペプチドまたはｐＫａｌ結合抗体であるｐＫａｌ阻害剤を含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ｐＫａｌ阻害剤は、ＤＸ−２９３０、ＤＸ−８８またはＥＰＩＫＡＬ−２である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記被験体は、
（ｉ）前記被験体の試料における切断されたＨＭＷＫのレベルおよび無傷のＨＭＷＫのレベルを測定するステップと、
（ｉｉ）前記切断されたＨＭＷＫのレベル、前記無傷のＨＭＷＫのレベルまたはその両方に基づいて前記試料中の切断されたＨＭＷＫまたは無傷のＨＭＷＫの値を決定するステップと、
（ｉｉｉ）前記切断されたＨＭＷＫまたは無傷のＨＭＷＫの値を前記基準値と比較するステップと、
を含むプロセスによって同定される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記試料は、血液試料または血漿試料である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記被験体は、抗ヒスタミン療法、コルチコステロイド療法、またはその両方に耐性がある、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。