(57)【要約】      （修正有）【課題】所望の結合動態プロファイルを有し、また、ＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１相互作用をブロックすることによってＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１軸に拮抗する、強力なＰＤ‐１結合分子を提供する。【解決手段】カニクイザルＰＤ‐１及びヒトＰＤ‐１の両方に結合できる選択された抗ＰＤ‐１抗体：ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４又はＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５、並びにこれらの抗体のヒト化及びキメラバージョン。【選択図】図１９
2019055948.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインを含む、多重特異性抗ヒトＰＤ‐１結合分子であって、
前記可変重鎖ドメインは、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインを含み、前記可変軽鎖ドメインは、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインを含み：
（Ａ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号７１、配列番号７２及び配列番号７３を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号７６、配列番号７７及び配列番号７８を含み；
又は
（Ｂ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号８５、配列番号８６及び配列番号８７を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号９０、配列番号９１及び配列番号９２を含み；
又は
（Ｃ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号９９、配列番号１００及び配列番号１０１を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１０４、配列番号１０５及び配列番号１０６を含み；
又は
（Ｄ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１０９、配列番号１１０及び配列番号１１１を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１１４、配列番号１１５及び配列番号１１６を含み；
又は
（Ｅ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１１９、配列番号１２０及び配列番号１２１を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１２４、配列番号１２５及び配列番号１２６を含み；
又は
（Ｆ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１２９、配列番号１３０及び配列番号１３１を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６を含み；
又は
（Ｇ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１３９、配列番号１４０及び配列番号１４１を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１４４、配列番号１４５及び配列番号１４６を含み；
又は
（Ｈ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１６１、配列番号１６２及び配列番号１６３を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１６６、配列番号１６７及び配列番号１６８を含み；
又は
（Ｉ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１７１、配列番号１７２及び配列番号１７３を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１７６、配列番号１７７及び配列番号１７８を含み；
又は
（Ｊ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１９２、配列番号１９３及び配列番号１９４を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１９７、配列番号１９８及び配列番号１９９を含み；
又は
（Ｋ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２０２、配列番号２０３及び配列番号２０４を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２０７、配列番号２０８及び配列番号２０９を含み；
又は
（Ｌ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２１２、配列番号２１３及び配列番号２１４を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２１７、配列番号２１８及び配列番号２１９を含み；
又は
（Ｍ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２２２、配列番号２２３及び配列番号２２４を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２２７、配列番号２２８及び配列番号２２９を含み；
又は
（Ｎ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２３２、配列番号２３３及び配列番号２３４を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２３７、配列番号２３８及び配列番号２３９を含み；
又は
（Ｏ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２４２、配列番号２４３及び配列番号２４４を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２４７、配列番号２４８及び配列番号２４９を含み；
又は
（Ｐ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１３９、配列番号１４０及び配列番号１４１を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１５７、配列番号１４５及び配列番号１４６を含み；
又は
（Ｑ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．３）の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１３９、配列番号１４０及び配列番号１４１を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．３）の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１５７、配列番号１５８及び配列番号１４５を含み；
又は
（Ｒ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９（２．２）の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１８３、配列番号１７２及び配列番号１７３を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９（２．２）の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１８８、配列番号１８９及び配列番号１７８を含む、多重特異性抗ヒトＰＤ‐１結合分子。
【請求項２】
可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインを含む、抗ヒトＰＤ‐１結合単一特異性モノクローナル抗体であって、
前記可変重鎖ドメインは、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインを含み、前記可変軽鎖ドメインは、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインを含み：
（Ａ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号７１、配列番号７２及び配列番号７３を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号７６、配列番号７７及び配列番号７８を含み；
又は
（Ｂ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号８５、配列番号８６及び配列番号８７を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号９０、配列番号９１及び配列番号９２を含み；
又は
（Ｃ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号９９、配列番号１００及び配列番号１０１を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１０４、配列番号１０５及び配列番号１０６を含み；
又は
（Ｄ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１０９、配列番号１１０及び配列番号１１１を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１１４、配列番号１１５及び配列番号１１６を含み；
又は
（Ｅ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１２９、配列番号１３０及び配列番号１３１を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６を含み；
又は
（Ｆ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１６１、配列番号１６２及び配列番号１６３を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１６６、配列番号１６７及び配列番号１６８を含み；
又は
（Ｇ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１７１、配列番号１７２及び配列番号１７３を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１７６、配列番号１７７及び配列番号１７８を含み；
又は
（Ｈ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１９２、配列番号１９３及び配列番号１９４を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１９７、配列番号１９８及び配列番号１９９を含み；
又は
（Ｉ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２０２、配列番号２０３及び配列番号２０４を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２０７、配列番号２０８及び配列番号２０９を含み；
又は
（Ｊ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２１２、配列番号２１３及び配列番号２１４を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２１７、配列番号２１８及び配列番号２１９を含み；
又は
（Ｋ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２２２、配列番号２２３及び配列番号２２４を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２２７、配列番号２２８及び配列番号２２９を含み；
又は
（Ｌ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２３２、配列番号２３３及び配列番号２３４を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２３７、配列番号２３８及び配列番号２３９を含み；
又は
（Ｍ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２４２、配列番号２４３及び配列番号２４４を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２４７、配列番号２４８及び配列番号２４９を含み；
又は
（Ｎ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９（２．２）の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１８３、配列番号１７２及び配列番号１７３を含み；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９（２．２）の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１８８、配列番号１８９及び配列番号１７８を含む、抗ヒトＰＤ‐１結合単一特異性モノクローナル抗体。
【請求項３】
前記抗体は、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項２に記載の抗ヒトＰＤ‐１結合単一特異性モノクローナル抗体。
【請求項４】
（Ａ）前記分子は、配列番号７９、配列番号９３、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１７９、配列番号１８１若しくは配列番号２５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み；
又は
（Ｂ）前記分子は、配列番号８１、配列番号９５、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１８４、配列番号１８６若しくは配列番号２５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項１に記載の多重特異性抗ヒトＰＤ‐１結合分子。
【請求項５】
（Ａ）前記抗体は、配列番号７９、配列番号９３、配列番号１７９、配列番号１８１若しくは配列番号２５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み；
又は
（Ｂ）前記抗体は、配列番号８１、配列番号９５、配列番号１８４、配列番号１８６若しくは配列番号２５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項２又は３に記載の抗ヒトＰＤ‐１結合単一特異性モノクローナル抗体。
【請求項６】
前記分子は、ヒトＰＤ‐１及び第２のエピトープに同時に結合できる二重特異性結合分子である、請求項１又は４に記載の多重特異性抗ヒトＰＤ‐１結合分子。
【請求項７】
前記第２のエピトープは、免疫細胞の表面上に存在する免疫チェックポイントの制御に関与する分子のエピトープである、請求項６に記載の多重特異性抗ヒトＰＤ‐１結合分子。
【請求項８】
前記第２のエピトープは、Ｂ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ２２６、ＣＴＬＡ‐４、ガレクチン‐９、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＨＨＬＡ２、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３、ＬＩＧＨＴ、ＭＨＣクラスＩ若しくはＩＩ、ＮＫＧ２ａ、ＮＫＧ２ｄ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ１Ｈ、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＰＤ‐Ｌ２、ＰＶＲ、ＳＩＲＰａ、ＴＣＲ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ‐３又はＶＩＳＴＡのエピトープである、請求項６に記載の多重特異性抗ヒトＰＤ‐１結合分子。
【請求項９】
前記第２のエピトープは、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ‐４、ＬＡＧ‐３、ＯＸ４０、ＴＩＧＩＴ又はＴＩＭ‐３のエピトープである、請求項８に記載の多重特異性抗ヒトＰＤ‐１結合分子。
【請求項１０】
ＬＡＧ‐３エピトープ結合部位を含み、
前記ＬＡＧ‐３エピトープ結合部位は：
（Ａ）（１）アミノ酸配列：配列番号４２、配列番号４３及び配列番号４４をそれぞれ含む、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １の可変重鎖のＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメイン；並びに
（２）アミノ酸配列：配列番号４６、配列番号４７及び配列番号４８をそれぞれ含む、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １の可変軽鎖のＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメイン；
又は
（Ｂ）（１）アミノ酸配列：配列番号４２、配列番号４３及び配列番号４４をそれぞれ含む、ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＨ１の可変重鎖のＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメイン；並びに
（２）アミノ酸配列：配列番号５５、配列番号４７及び配列番号４８をそれぞれ含む、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ４の可変軽鎖のＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメイン；
又は
（Ｃ）（１）アミノ酸配列：配列番号５７、配列番号５８及び配列番号５９をそれぞれ含む、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６の可変重鎖のＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメイン；並びに
（２）アミノ酸配列：配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６３をそれぞれ含む、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６の可変軽鎖のＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメイン；
又は
（Ｄ）（１）配列番号５７、配列番号５８及び配列番号５９をそれぞれ含む、ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＨ１の可変重鎖のＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメイン；並びに
（２）アミノ酸配列：配列番号２９８、配列番号６２及び配列番号６３をそれぞれ含む、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６の可変軽鎖のＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメイン
を含む、請求項９に記載の多重特異性抗ヒトＰＤ‐１結合分子。
【請求項１１】
前記分子は：
（Ａ）ダイアボディであって、前記ダイアボディは、２つ、３つ、４つ又は５つのポリペプチド鎖を含む共有結合複合体である、ダイアボディ；あるいは
（Ｂ）３価結合分子であって、前記３価結合分子は、３つ、４つ又は５つのポリペプチド鎖を含む共有結合複合体である、３価結合分子；あるいは
（Ｃ）二重特異性抗体
である、請求項１、４又は６〜１０のいずれか１項に記載の多重特異性抗ヒトＰＤ‐１結合分子。
【請求項１２】
前記分子はダイアボディであり、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む、請求項１１に記載の多重特異性抗ヒトＰＤ‐１結合分子。
【請求項１３】
前記分子又は前記抗体はＦｃ領域を含む、請求項１、４若しくは６〜１１のいずれか１項に記載の多重特異性抗ヒトＰＤ‐１結合分子、又は請求項２若しくは３に記載の抗ヒトＰＤ‐１結合単一特異性モノクローナル抗体。
【請求項１４】
前記Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプのものである、請求項１３に記載の多重特異性抗ヒトＰＤ‐１結合分子、又は請求項１３に記載の抗ヒトＰＤ‐１結合単一特異性モノクローナル抗体。
【請求項１５】
前記分子又は前記抗体は、ヒンジドメインを更に含む、請求項１４に記載の多重特異性抗ヒトＰＤ‐１結合分子、又は請求項１４に記載の抗ヒトＰＤ‐１結合単一特異性モノクローナル抗体。
【請求項１６】
前記Ｆｃ領域及び前記ヒンジドメインは、ＩｇＧ４アイソタイプのものであり、
前記ヒンジドメインは、安定化突然変異を含む、請求項１５に記載の多重特異性抗ヒトＰＤ‐１結合分子、又は請求項１５に記載の抗ヒトＰＤ‐１結合単一特異性モノクローナル抗体。
【請求項１７】
前記Ｆｃ領域は変異型Ｆｃ領域であって、
前記変異型Ｆｃ領域は：
（ａ）ＦｃγＲに対する前記変異型Ｆｃ領域の親和性を低減する１つ若しくは複数のアミノ酸修飾；及び／又は
（ｂ）前記変異型Ｆｃ領域の血清半減期を増大させる１つ若しくは複数のアミノ酸修飾
を含む、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の多重特異性抗ヒトＰＤ‐１結合分子、又は請求項１３〜１６に記載の抗ヒトＰＤ‐１結合単一特異性モノクローナル抗体。
【請求項１８】
ＦｃγＲに対する前記変異型Ｆｃ領域の親和性を低減する前記修飾は、Ｌ２３４Ａ；Ｌ２３５Ａ；又はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの置換を含み、前記置換の番号付与は、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスの番号付与である、請求項１７に記載の多重特異性抗ヒトＰＤ‐１結合分子、又は請求項１７に記載の抗ヒトＰＤ‐１結合単一特異性モノクローナル抗体。
【請求項１９】
前記変異型Ｆｃ領域の血清半減期を増大させる前記修飾は、Ｍ２５２Ｙ；Ｍ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ；Ｍ２５２Ｙ及びＴ２５６Ｅ；Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ；又はＫ２８８Ｄ及びＨ４３５Ｋの置換を含み、前記置換の番号付与は、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスの番号付与である、請求項１７若しくは１８に記載の多重特異性抗ヒトＰＤ‐１結合分子、又は請求項１７若しくは１８に記載の抗ヒトＰＤ‐１結合単一特異性モノクローナル抗体。
【請求項２０】
（ａ）配列番号２６７であって、Ｘ1がＡｌａであり、Ｘ2がＴｙｒであり、Ｘ3がＴｈｒであり、Ｘ4がＧｌｕである、配列番号２６７、及び配列番号２６８；又は
（ｂ）配列番号２６７であって、Ｘ1がＧｌｙであり、Ｘ2がＴｙｒであり、Ｘ3がＴｈｒであり、Ｘ4がＧｌｕである、配列番号２６７、及び配列番号２６８；又は
（ｃ）        配列番号２６７であって、Ｘ1がＧｌｙであり、Ｘ2がＭｅｔであり、Ｘ3がＳｅｒであり、Ｘ4がＴｈｒである、配列番号２６７、及び配列番号２６８；又は
（ｄ）配列番号２６９及び２７０；又は
（ｅ）配列番号２７１及び２７２；又は
（ｆ）配列番号２７３、２７４、２７５及び２７６；又は
（ｇ）配列番号２７７、２７８、２７９及び２８０；又は
（ｈ）配列番号２８１、２８２及び２８３；又は
（ｉ）配列番号２９０及び２９１；又は
（ｊ）配列番号２９２及び２９３
を含むダイアボディである、請求項１１、１３〜１６又は１７〜１９のいずれか１項に記載の多重特異性抗ヒトＰＤ‐１結合分子。
【請求項２１】
（Ａ）請求項１、４若しくは６〜２０のいずれか１項に記載の多重特異性抗ヒトＰＤ‐１結合分子又は請求項２、３、５若しくは１３〜１９のいずれか１項に記載の抗ヒトＰＤ‐１結合単一特異性モノクローナル抗体；及び
（Ｂ）薬学的に許容可能なキャリア
を含む、組成物。
【請求項２２】
前記分子、抗体又は組成物は、Ｔ細胞仲介型免疫応答の刺激を必要とする被験者のＴ細胞仲介型免疫応答を刺激するために使用される、請求項１、４若しくは６〜２０のいずれか１項に記載の多重特異性抗ヒトＰＤ‐１結合分子、請求項２、３、５若しくは１３〜１９のいずれか１項に記載の抗ヒトＰＤ‐１結合単一特異性モノクローナル抗体、又は請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記分子、抗体又は組成物は、抑制された免疫系に関連する疾患又は状態の治療に使用される、請求項１、４若しくは６〜２０のいずれか１項に記載の多重特異性抗ヒトＰＤ‐１結合分子、請求項２、３、５若しくは１３〜１９のいずれか１項に記載の抗ヒトＰＤ‐１結合単一特異性モノクローナル抗体、又は請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記疾患又は状態は、癌又は感染症である、請求項２３に記載の多重特異性抗ヒトＰＤ‐１結合分子、抗体、又は組成物。
【請求項２５】
前記癌は：副腎癌；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；発色性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成症；胆嚢若しくは胆管癌；消化器癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；膵島細胞腫；カポジ肉腫；腎臓癌、白血病、脂肪腫／良性リポソーム腫瘍、脂肪肉腫／悪性リポソーム腫瘍、肝臓癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；卵巣癌；膵臓癌；乳頭状甲状腺癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；希少な血液学的障害；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮細胞癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移性癌；及び子宮癌の細胞からなる群から選択される癌細胞の存在を特徴とする、請求項２４に記載の多重特異性抗ヒトＰＤ‐１結合分子、抗体、又は組成物。
【請求項２６】
前記癌は：結腸直腸癌；肝細胞癌；神経膠腫；腎臓癌；乳癌；多発性骨髄腫；膀胱癌；神経芽細胞腫；肉腫；非ホジキンリンパ腫；非小細胞肺癌；卵巣癌：膵臓癌；直腸癌；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；急性Ｂリンパ芽球性白血病（Ｂ‐ＡＬＬ）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；毛様細胞白血病（ＨＣＬ）；芽球性形質細胞様樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）；マントル細胞白血病（ＭＣＬ）及び小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）を含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；ホジキンリンパ腫；全身性肥満細胞症；又はバーキットリンパ腫である、請求項２４に記載の多重特異性抗ヒトＰＤ‐１結合分子、抗体、又は組成物。
【請求項２７】
前記分子又は前記抗体は、検出可能に標識され、ＰＤ‐１の検出に使用される、請求項１、４若しくは６〜２０のいずれか１項に記載の多重特異性抗ヒトＰＤ‐１結合分子、請求項２、３、５若しくは１３〜１９のいずれか１項に記載の抗ヒトＰＤ‐１結合単一特異性モノクローナル抗体、又は請求項２１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許出願第６２／１９８，８６７号（２０１５年７月３０日出願；係属中）、米国特許出願第６２／２３９，５５９号（２０１５年１０月９日出願；係属中）、米国特許出願第６２／２５５，１４０号（２０１５年１１月１３日出願；係属中、及び米国特許出願第６２／３２２，９７４号）２０１６年４月１５日出願；係属中）に対する優先権を主張するものであり、これらの特許出願はそれぞれ、参照によりその全体が本出願に援用される。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、連邦規則法典第３７巻第１．８２１節以下による１つ又は複数の配列表を含み、これらの配列表は、コンピュータ可読媒体（ファイル名：１３０１＿０１２２ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、２０１６年７月１日作成、サイズ：２８２，７８９バイト）において開示されており、上記ファイルは、参照によりその全体が本出願に援用される。
【０００３】
本発明は、カニクイザルＰＤ‐１及びヒトＰＤ‐１の両方に結合できる選択された抗ＰＤ‐１抗体：ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ
７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４又はＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５のＰＤ‐１結合ドメインを備える、ＰＤ‐１結合分子を対象とする。本発明は特に、このような抗体のヒト化若しくはキメラバージョンである、又はこのような抗ＰＤ‐１抗体のＰＤ‐１結合断片（特に免疫結合体、ダイアボディ、ＢｉＴＥ、二重特異性抗体等）を備える、ＰＤ‐１結合分子に関する。本発明は特に、免疫細胞の表面上に存在する免疫チェックポイントの制御に関与する分子のエピトープに更に結合できる、このようなＰＤ‐１結合分子に関する。本発明はまた、ＰＤ‐１の検出又は免疫応答の刺激のためにこのようなＰＤ‐１結合分子を使用する方法に関係する。本発明はまた、上述のような選択された抗ＰＤ‐１抗体の１つ又は複数のＰＤ‐１結合ドメインを備えるＰＤ‐１結合分子を、免疫応答を刺激するのに効果的な１つ若しくは複数の追加の分子と組み合わせて、及び／又は癌抗原に特異的に結合する１つ若しくは複数の追加の分子と組み合わせて投与する、併用療法に関する。
【背景技術】
【０００４】
関連技術の説明
Ｉ．細胞仲介性免疫応答
ヒト及び他の哺乳類の免疫系は、感染及び疾患に対して保護を提供する役割を果たす。このような保護は、体液性免疫応答及び細胞仲介性免疫応答の両方によって提供される。体液性免疫応答により、異物標的（抗原）を認識して中和できる抗体及び他の生体分子の産生が得られる。対照的に、細胞仲介性免疫応答は、Ｔ細胞によるマクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び抗原特異性細胞毒性Ｔリンパ球の活性化、並びに抗原の認識に応じた様々なサイトカインの放出を伴う（非特許文献１）。
【０００５】
抗原に対して免疫応答を最適に仲介するＴ細胞の能力は、２つの別個のシグナリング相互作用を必要とする（非特許文献２、３）。まず、抗原提示細胞（抗原‐Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ：ＡＰＣ）の表面上に存在する抗原を、抗原特異性ナイーブＣＤ４+Ｔ
細胞に対して提示する必要がある。このような提示により、提示された抗原に対して特異
的となる免疫応答を開始するようにＴ細胞に指示するＴ細胞受容体（Ｔ‐Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＣＲ）を介して、シグナルが送達される。次に、ＡＰＣと別個のＴ細胞表面分子との間の相互作用によって仲介される一連の共刺激及び阻害シグナルが、まずＴ細胞の活性化及び増殖を、最終的にはＴ細胞の阻害をトリガする。従って、第１のシグナルは免疫応答に対して特異性を付与し、第２のシグナルは、上記応答の性質、強さ及び持続時間を決定する役割を果たす。
【０００６】
免疫系は、共刺激及び共阻害リガンド及び受容体によって厳密に制御される。これらの分子は、Ｔ細胞活性化のための第２のシグナルを提供し、また自己に対する免疫を制限しながら感染に対する免疫応答を最大化するための、ポジティブ及びネガティブシグナルの平衡ネットワークを提供する（非特許文献４、５）。自己寛容を維持し、免疫応答の期間及び振幅を変調するために重要な阻害経路を、まとめて免疫チェックポイントと呼ぶ。特に重要なのは、抗原提示細胞のＢ７．１（ＣＤ８０）及びＢ７．２（ＣＤ８６）リガンドと、ＣＤ４+Ｔリンパ球のＣＤ２８及びＣＴＬＡ‐４受容体との間の結合である（非特許
文献６、１、７）。ＣＤ２８に対するＢ７．１又はＢ７．２の結合は、Ｔ細胞活性化を刺激し、ＣＴＬＡ‐４に対するＢ７．１又はＢ７．２の結合は、上記活性化を阻害する（非特許文献１、７、８）。ＣＤ２８は、Ｔ細胞の表面上に恒常的に発現し（非特許文献９）、その一方でＣＴＬＡ‐４の発現は、Ｔ細胞活性化に続いて急速に上方制御される（非特許文献１０）。ＣＴＬＡ‐４は高親和性受容体である（非特許文献６）ため、結合はまず（ＣＤ２８による）Ｔ細胞増殖を開始させ、その後（ＣＴＬＡ‐４の初期発現によって）Ｔ細胞増殖を阻害し、これにより、増殖がもはや必要ない場合にその効果を減衰させる。
【０００７】
ＣＤ２８受容体のリガンドに対する更なる調査により、関連するＢ７分子のセット（「Ｂ７スーパファミリー（Ｂ７  Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）」の識別及び特性決定が得られた（非特許文献１１、６、８、１２、１３、３、１４、１５、１６、１７）。現在、上記ファミリーの複数のメンバーが公知である：Ｂ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、誘導性共刺激因子リガンド（ＩＣＯＳ‐Ｌ）、プログラム死‐１リガンド（ＰＤ‐Ｌ１；Ｂ７‐Ｈ１）、プログラム死‐２リガンド（ＰＤ‐Ｌ２；Ｂ７‐ＤＣ）、Ｂ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４及びＢ７‐Ｈ６（非特許文献１２、１８）。
【０００８】
ＩＩ．プログラム死‐１（「ＰＤ‐１」）
プログラム死‐１（「ＰＤ‐１」、「ＣＤ２７９」としても公知）は、免疫応答を幅広く下方制御するＴ細胞制御因子の拡張ＣＤ２８／ＣＴＬＡ‐４ファミリーの、およそ３１ｋＤのＩ型膜タンパク質メンバーである（非特許文献１９、特許文献１〜９）。
【０００９】
ＰＤ‐１は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞及び単球上で（非特許文献２０、２１）、並びにナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞中において低レベルで（非特許文献２２、２３）、発現する。
【００１０】
ＰＤ‐１の細胞外領域は、ＣＴＬＡ‐４の同等のドメインに対して２３％の同一性を有する単一免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｖドメインで構成される（非特許文献２３）。細胞外ＩｇＶドメインには、膜透過性領域及び細胞内テールが続く。細胞内テールは、免疫受容体チロシン系阻害モチーフ及び免疫受容体チロシン系スイッチモチーフ内に位置する２つのリン酸化部位を含有し、これは、ＰＤ‐１がＴＣＲシグナルを下方制御することを示唆している（非特許文献１９、２４）。
【００１１】
ＰＤ‐１は、Ｂ７‐Ｈ１及びＢ７‐ＤＣへの結合によって、免疫系の阻害を仲介する（非特許文献１４、特許文献１０〜１７）。
【００１２】
Ｂ７‐Ｈ１及びＢ７‐ＤＣは、心臓、胎盤、筋肉、胎児の肝臓、脾臓、リンパ節及び胸
腺、並びにマウスの肝臓、肺、腎臓、膵臓の島細胞及び小腸といった、ヒト及びマウス組織の表面上で広く発現する（非特許文献２３）。ヒトでは、Ｂ７‐Ｈ１タンパク質発現は、ヒト内皮細胞（非特許文献２５、２６、２７）、心筋（非特許文献２８）、合胞体栄養細胞（非特許文献２９）において見られた。上記分子はまた、いくつかの組織の常在性マクロファージによって、インターフェロン（ＩＦＮ）‐γ又は腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ
ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ：ＴＮＦ）‐αによって活性化されたマクロファージによって（非特許文献３０）、及び腫瘍内において（非特許文献３１）も発現される。
【００１３】
Ｂ７‐Ｈ１とＰＤ‐１との間の相互作用は、Ｔ及びＢ細胞に対する重大な下方共刺激シグナル（非特許文献２３）、並びに細胞死誘導因子としての機能（非特許文献１９、３２）を提供することが分かっている。より具体的には、低濃度のＰＤ‐１受容体とＢ７‐Ｈ１リガンドとの間の相互作用は、抗原特異性ＣＤ８+Ｔ細胞の増殖を強く阻害する阻害シ
グナルの伝達をもたらすことが分かっており；高濃度では、ＰＤ‐１との相互作用はＴ細胞増殖を阻害しないものの、複数のサイトカインの産生を明らかに低減させる（非特許文献６）。休止ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞並びに既に活性化されたＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の両方、更には臍帯血由来のナイーブＴ細胞による、Ｔ細胞増殖及びサイトカイン産生は、可溶性Ｂ７‐Ｈ１‐Ｆｃ融合タンパク質によって阻害されることが分かっている（非特許文献３３、３０、３４、６）。
【００１４】
Ｔ細胞活性化及び増殖におけるＢ７‐Ｈ１及びＰＤ‐１の役割は、これらの生体分子が、炎症及び癌の治療のための治療標的として機能し得ることを示唆している。従って、感染及び腫瘍の治療並びに適応免疫応答の上方調節のための抗ＰＤ‐１抗体の使用が提案されている（特許文献１８、１９、２０、２、２１、２２、２３、２４、２５、２６を参照）。ＰＤ‐１に特異的に結合できる抗体は、非特許文献２０及び３５によって報告されている（特許文献２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、２７、２５、３６、２５、３７、３８、３９、２６、４０、４１、４２、４３、４４も参照）。
【００１５】
しかしながら、上述のようなこれまでのあらゆる進歩にもかかわらず、癌細胞又は病原体感染細胞を、特に比較的低い治療濃度で攻撃するよう、身体の免疫系により強力に指示できる、改良された組成物に対する需要が存在し続けている。というのは、適応免疫系は、癌及び疾患に対する強力な防護機構であり得るものの、ＰＤ‐１の発現等の、腫瘍の微環境中の免疫抑制機構によって妨げられる場合があるためである。更に、腫瘍環境において腫瘍細胞、免疫細胞及び間質細胞が発現する共阻害性分子は、癌細胞に対するＴ細胞応答を支配的に弱化させる場合がある。よって、強力なＰＤ‐１結合分子に対する需要が存在し続けている。特に、所望の結合動態プロファイルを有し、また、ＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１相互作用をブロックすることによってＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１軸に拮抗する（これは、癌又は他の疾患及び状態に離間した患者に対して改善された治療的価値を提供できる）、強力なＰＤ‐１結合分子に対する需要が存在し続けている。本発明は、これらの及びその他の目標を対象とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００７／０２０２１００号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００８／０３１１１１７号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００９／０１１０６６７号
【特許文献４】米国特許第６，８０８，７１０号
【特許文献５】米国特許第７，１０１，５５０号
【特許文献６】米国特許第７，４８８，８０２号
【特許文献７】米国特許第７，６３５，７５７号
【特許文献８】米国特許第７，７２２，８６８号
【特許文献９】国際公開第０１／１４５５７号
【特許文献１０】米国特許第６，８０３，１９２号
【特許文献１１】米国特許第７，７９４，７１０号
【特許文献１２】米国特許出願公開第２００５／００５９０５１号
【特許文献１３】米国特許出願公開第２００９／００５５９４４号
【特許文献１４】米国特許出願公開第２００９／０２７４６６６号
【特許文献１５】米国特許出願公開第２００９／０３１３６８７号
【特許文献１６】国際公開第０１／３９７２２号
【特許文献１７】国際公開第０２／０８６０８３号
【特許文献１８】米国特許出願公開第２０１０／００４０６１４号
【特許文献１９】米国特許出願公開第２０１０／００２８３３０号
【特許文献２０】米国特許出願公開第２００４／０２４１７４５号
【特許文献２１】米国特許出願公開第２００９／０２１７４０１号
【特許文献２２】米国特許第７，５２１，０５１号
【特許文献２３】米国特許第７，５６３，８６９号
【特許文献２４】米国特許第７，５９５，０４８号
【特許文献２５】国際公開第２００４／０５６８７５号
【特許文献２６】国際公開第２００８／０８３１７４号
【特許文献２７】米国特許第８，００８，４４９号
【特許文献２８】米国特許第８，５５２，１５４号
【特許文献２９】米国特許出願公開第２００７／０１６６２８１
【特許文献３０】米国特許出願公開第２０１２／０１１４６４８号
【特許文献３１】米国特許出願公開第２０１２／０１１４６４９号
【特許文献３２】米国特許出願公開第２０１３／００１７１９９号
【特許文献３３】米国特許出願公開第２０１３／０２３０５１４号
【特許文献３４】米国特許出願公開第２０１４／００４４７３８号
【特許文献３５】国際公開第２００３／０９９１９６号
【特許文献３６】国際公開第２００４／００４７７１号
【特許文献３７】国際公開第２００４／０７２２８６号
【特許文献３８】国際公開第２００６／１２１１６８号
【特許文献３９】国際公開第２００７／００５８７４号
【特許文献４０】国際公開第２００９／０１４７０８号
【特許文献４１】国際公開第２００９／０７３５３３号
【特許文献４２】国際公開第２０１２／１３５４０８号
【特許文献４３】国際公開第２０１２／１４５５４９号
【特許文献４４】国際公開第２０１３／０１４６６８号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Dong, C. et al. (2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules,” Immunolog. Res. 28(1):39‐48
【非特許文献２】Viglietta, V. et al. (2007) “Modulating Co‐Stimulation,” Neurotherapeutics 4:666‐675
【非特許文献３】Korman, A.J. et al. (2007) “Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy,” Adv. Immunol. 90:297‐339
【非特許文献４】Wang, L. et al. (March 7, 2011) “VISTA, A Novel Mouse Ig Superfamily Ligand That Negatively Regulates T‐Cell Responses,” J. Exp. Med. 10.1084/jem.20100619:1‐16
【非特許文献５】Lepenies, B. et al. (2008) “The Role Of Negative Costimulators During Parasitic Infections,” Endocrine, Metabolic & Immune Disorders ‐ Drug Targets 8:279‐288
【非特許文献６】Sharpe, A.H. et al. (2002) “The B7‐CD28 Superfamily,” Nature Rev. Immunol. 2:116‐126
【非特許文献７】Lindley, P.S. et al. (2009) “The Clinical Utility Of Inhibiting CD28‐Mediated Costimulation,” Immunol. Rev. 229:307‐321
【非特許文献８】Greenwald, R.J. et al. (2005) “The B7 Family Revisited,” Ann. Rev. Immunol. 23:515‐548
【非特許文献９】Gross, J., et al. (1992) “Identification And Distribution Of The Costimulatory Receptor CD28 In The Mouse,” J. Immunol. 149:380-388
【非特許文献１０】Linsley, P. et al. (1996) “Intracellular Trafficking Of CTLA4 And Focal Localization Towards Sites Of TCR Engagement,” Immunity 4:535-543
【非特許文献１１】Coyle, A.J. et al. (2001) “The Expanding B7 Superfamily: Increasing Complexity In Costimulatory Signals Regulating T‐Cell Function,” Nature Immunol. 2(3):203‐209
【非特許文献１２】Collins, M. et al. (2005) “The B7 Family Of Immune‐Regulatory Ligands,” Genome Biol. 6:223.1‐223.7
【非特許文献１３】Loke, P. et al. (2004) “Emerging Mechanisms Of Immune Regulation: The Extended B7 Family And Regulatory T‐Cells.” Arthritis Res. Ther. 6:208‐214
【非特許文献１４】Flies, D.B. et al. (2007) “The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity,” J. Immunother. 30(3):251‐260
【非特許文献１５】Agarwal, A. et al. (2008) “The Role Of Positive Costimulatory Molecules In Transplantation And Tolerance,” Curr. Opin. Organ Transplant. 13:366‐372
【非特許文献１６】Lenschow, D.J. et al. (1996) “CD28/B7 System of T‐Cell Costimulation,” Ann. Rev. Immunol. 14:233‐258
【非特許文献１７】Wang, S. et al. (2004) “Co‐Signaling Molecules Of The B7‐CD28 Family In Positive And Negative Regulation Of T Lymphocyte Responses,” Microbes Infect. 6:759‐766)
【非特許文献１８】Flajnik, M.F. et al. (2012) “Evolution Of The B7 Family: Co‐Evolution Of B7H6 And Nkp30, Identification Of A New B7 Family Member, B7H7, And Of B7's Historical Relationship With The MHC,” Immunogenetics epub doi.org/10.1007/s00251‐012‐0616‐2
【非特許文献１９】Ishida, Y. et al. (1992) “Induced Expression Of PD‐1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death,” EMBO J. 11:3887‐3895
【非特許文献２０】Agata, Y. et al. (1996) “Expression Of The PD‐1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And B Lymphocytes,” Int. Immunol. 8(5):765‐772
【非特許文献２１】Yamazaki, T. et al. (2002) “Expression Of Programmed Death 1 Ligands By Murine T‐Cells And APC,” J. Immunol. 169:5538‐5545)
【非特許文献２２】Nishimura, H. et al. (2000) “Facilitation Of Beta Selection And Modification Of Positive Selection In The Thymus Of PD‐1‐Deficient Mice,” J. Exp. Med. 191:891‐898
【非特許文献２３】Martin‐Orozco, N. et al. (2007) “Inhibitory Costimulation And Anti‐Tumor Immunity,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288‐298
【非特許文献２４】Blank, C. et al. (2006) “Contribution Of The PD‐L1/PD‐1 Pathway To T‐Cell Exhaustion: An Update On Implications For Chronic Infections And Tumor Evasion Cancer,” Immunol. Immunother. 56(5):739‐745
【非特許文献２５】Chen, Y. et al. (2005) “Expression of B7‐H1 in Inflammatory Renal Tubular Epithelial Cells,” Nephron. Exp. Nephrol. 102:e81‐e92
【非特許文献２６】de Haij, S. et al. (2005) “Renal Tubular Epithelial Cells Modulate T‐Cell Responses Via ICOS‐L And B7‐H1” Kidney Int. 68:2091‐2102
【非特許文献２７】Mazanet, M.M. et al. (2002) “B7‐H1 Is Expressed By Human Endothelial Cells And Suppresses T‐Cell Cytokine Synthesis,” J. Immunol. 169:3581‐3588
【非特許文献２８】Brown, J.A. et al. (2003) “Blockade Of Programmed Death‐1 Ligands On Dendritic Cells Enhances T‐Cell Activation And Cytokine Production,” J. Immunol. 170:1257‐1266
【非特許文献２９】Petroff, M.G. et al. (2002) “B7 Family Molecules: Novel Immunomodulators At The Maternal‐Fetal Interface,” Placenta 23:S95‐S101)
【非特許文献３０】Latchman, Y. et al. (2001) “PD‐L2 Is A Second Ligand For PD‐1 And Inhibits T‐Cell Activation,” Nat. Immunol 2:261‐268
【非特許文献３１】Dong, H. (2003) “B7‐H1 Pathway And Its Role In The Evasion Of Tumor Immunity,” J. Mol. Med. 81:281‐287
【非特許文献３２】Subudhi, S.K. et al. (2005) “The Balance Of Immune Responses: Costimulation Verse Coinhibition,” J. Molec. Med. 83:193‐202
【非特許文献３３】Freeman, G.J. et al. (2000) “Engagement Of The PD‐1 Immunoinhibitory Receptor By A Novel B7 Family Member Leads To Negative Regulation Of Lymphocyte Activation,” J. Exp. Med. 192:1‐9
【非特許文献３４】Carter, L. et al. (2002) “PD‐1:PD‐L Inhibitory Pathway Affects Both CD4(+) and CD8(+) T‐cells And Is Overcome By IL‐2,” Eur. J. Immunol. 32(3):634‐643
【非特許文献３５】Berger, R. et al. (2008) “Phase I Safety And Pharmacokinetic Study Of CT-011, A Humanized Antibody Interacting With PD-1, In Patients With Advanced Hematologic Malignancies,” Clin. Cancer Res. 14(10):3044-3051
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、カニクイザルＰＤ‐１及びヒトＰＤ‐１の両方に結合できる選択された抗ＰＤ‐１抗体：ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ
７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４又はＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５のＰＤ‐１結合ドメインを備える、ＰＤ‐１結合分子を対象とする。本発明は特に、このような抗体のヒト化若しくはキメラバージョンである、又はこのような抗ＰＤ‐１抗体のＰＤ‐１結合断片（特に免疫結合体、ダイアボディ、ＢｉＴＥ、二重特異性抗体等）を備える、ＰＤ‐１結合分子に関する。本発明は特に、免疫細胞の表面上に存在する免疫チェックポイントの制御に関与する分子のエピトープに更に結合できる、このようなＰＤ‐１結合分子に関する。本発明はまた、ＰＤ‐１の検出又は免疫応答の刺激のためにこのようなＰＤ‐１結合分子を使用する方法に関係する。本発明はまた、上述のような選択された抗ＰＤ‐１抗体の１つ又は複数のＰＤ‐１結合ドメインを備えるＰＤ‐１結合分子を、免疫応答を刺激するのに効果的な１つ若しくは複数の追加の分子と組み合わせて、及び／又は癌抗原に特異的に結合する１つ若しくは複数の追加の分子と組み合わせて投与する、併用療法に関する。
【００１９】
詳細には、本発明は、３つの重鎖ＣＤＲドメイン、即ちＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３と、３つの軽鎖ＣＤＲドメイン、即ちＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３とを備える、抗ヒトＰＤ‐１結合分子を提供し：
（Ａ）（１）上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号７１、配列番号７２及び配列番号７３を有し；
（２）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号７６、配列番号７７及び配列番号７８を有し；
又は
（Ｂ）（１）上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号８５、配列番号８６及び配列番号８７を有し；
（２）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号９０、配列番号９１及び配列番号９２を有し；
又は
（Ｃ）（１）上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号９９、配列番号１００及び配列番号１０１を有し；
（２）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１０４、配列番号１０５及び配列番号１０６を有し；
又は
（Ｄ）（１）上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１０９、配列番号１１０及び配列番号１１１を有し；
（２）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１１４、配列番号１１５及び配列番号１１６を有し；
又は
（Ｅ）（１）上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１１９、配列番号１２０及び配列番号１２１を有し；
（２）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１２４、配列番号１２５及び配列番号１２６を有し；
又は
（Ｆ）（１）上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１２９、配列番号１３０及び配列番号１３１を有し；
（２）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６を有し；
又は
（Ｇ）（１）上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１３９、配列番号１４０及び配列番号１４１を有し；
（２）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１４４、配列番号１４５及び配列番号１４６を有し；
又は
（Ｈ）（１）上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１
６１、配列番号１６２及び配列番号１６３を有し；
（２）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１６６、配列番号１６７及び配列番号１６８を有し；
又は
（Ｉ）（１）上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１７１、配列番号１７２及び配列番号１７３を有し；
（２）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１７６、配列番号１７７及び配列番号１７８を有し；
又は
（Ｊ）（１）上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１９２、配列番号１９３及び配列番号１９４を有し；
（２）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１９７、配列番号１９８及び配列番号１９９を有し；
又は
（Ｋ）（１）上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２０２、配列番号２０３及び配列番号２０４を有し；
（２）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２０７、配列番号２０８及び配列番号２０９を有し；
又は
（Ｌ）（１）上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２１２、配列番号２１３及び配列番号２１４を有し；
（２）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２１７、配列番号２１８及び配列番号２１９を有し；
又は
（Ｍ）（１）上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２２２、配列番号２２３及び配列番号２２４を有し；
（２）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２２７、配列番号２２８及び配列番号２２９を有し；
又は
（Ｎ）（１）上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２３２、配列番号２３３及び配列番号２３４を有し；
（２）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２３７、配列番号２３８及び配列番号２３９を有し；
又は
（Ｏ）（１）上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２４２、配列番号２４３及び配列番号２４４を有し；
（２）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメ
インは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２４７、配列番号２４８及び配列番号２４９を有し；
又は
（Ｐ）（１）上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメ
インは、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１３９、配列番号１４０及び配列番号１４１を有し；
（２）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメ
インは、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１５７、配列番号１４５及び配列番号１４６を有し；
又は
（Ｑ）（１）上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメ
インは、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．３）の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１３９、配列番号１４０及び配列番号１４１を有し；
（２）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメ
インは、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．３）の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１５７、配列番号１５８及び配列番号１４５を有し；
又は
（Ｒ）（１）上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメ
インは、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９（２．２）の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１８３、配列番号１７２及び配列番号１７３を有し；
（２）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメ
インは、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９（２．２）の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１８８、配列番号１８９及び配列番号１７８を有する。
【００２０】
本発明は更に、上記分子が抗体であり、特に上記分子がキメラ抗体又はヒト化抗体である、全てのこのような抗ヒトＰＤ‐１結合分子の実施形態に関する。
【００２１】
本発明は更に、上記重鎖可変ドメインが、配列番号７９、配列番号９３、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１７９、配列番号１８１又は配列番号２５０のアミノ酸配列を有する、このような抗ヒトＰＤ‐１結合分子の実施形態に関する。
【００２２】
本発明は更に、上記軽鎖可変ドメインが、配列番号８１、配列番号９５、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１８４、配列番号１８６又は配列番号２５１のアミノ酸配列を有する、このような抗ヒトＰＤ‐１結合分子の実施形態に関する。
【００２３】
本発明は更に、上記抗ヒトＰＤ‐１結合分子が、ヒトＰＤ‐１及び第２のエピトープに同時に結合できる二重特異性結合分子である実施形態に関し、特に、上記第２のエピトープが、免疫細胞の表面上に存在する免疫チェックポイントの制御に関与する分子のエピトープである（特に、上記第２のエピトープが、Ｂ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ２２６、ＣＴＬＡ‐４、ガレクチン‐９、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＨＨＬＡ２、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３、ＬＩＧＨＴ、ＭＨＣクラスＩ若しくはＩＩ、ＮＫＧ２ａ、ＮＫＧ２ｄ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ１Ｈ、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＰＤ‐Ｌ２、ＰＶＲ、ＳＩＲＰａ、ＴＣＲ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ‐３又はＶＩＳＴＡのエピトープであり、また最も詳細には上記第２のエピトープがＣＤ１３７、ＣＴＬＡ‐４、ＬＡＧ‐３、ＯＸ４０、ＴＩＧＩＴ又はＴＩＭ‐３のエピトープである）実施形態に関する。
【００２４】
本発明は更に、上記抗ヒトＰＤ‐１結合分子が、ＬＡＧ‐３エピトープ結合部位を備え
る二重特異性分子であり、特に上記ＬＡＧ‐３エピトープ結合部位が以下を備える、実施形態に関する：
（Ａ）（１）アミノ酸配列：配列番号４２、配列番号４３及び配列番号４４をそれぞれ有する、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １の可変重鎖のＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメイン；並びに
（２）アミノ酸配列：配列番号４６、配列番号４７及び配列番号４８をそれぞれ有する、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １の可変軽鎖のＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメイン；
又は
（Ｂ）（１）アミノ酸配列：配列番号４２、配列番号４３及び配列番号４４をそれぞれ有する、ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＨ１の可変重鎖のＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメイン；並びに
（２）アミノ酸配列：配列番号５５、配列番号４７及び配列番号４８をそれぞれ有する、ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ４の可変軽鎖のＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメイン；
又は
（Ｃ）（１）アミノ酸配列：配列番号５７、配列番号５８及び配列番号５９をそれぞれ有する、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６の可変重鎖のＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメイン；並びに
（２）アミノ酸配列：配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６３をそれぞれ有する、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６の可変軽鎖のＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメイン；
又は
（Ｄ）（１）配列番号５７、配列番号５８及び配列番号５９をそれぞれ有する、ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＨ１の可変重鎖のＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメイン；並びに
（２）アミノ酸配列：配列番号２９８、配列番号６２及び配列番号６３をそれぞれ有する、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６の可変軽鎖のＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメイン。
【００２５】
本発明は更に、上記分子がダイアボディであり、また特に、上記ダイアボディが、２つ又は３つ又は４つ又は５つのポリペプチド鎖を含む共有結合複合体である、このような抗ヒトＰＤ‐１結合分子の実施形態に関する。本発明は更に、上記分子が３価結合分子であり、また特に上記３価結合分子が、３つ、４つ、５つ又は６つ以上のポリペプチド鎖を含む共有結合複合体である、このような抗ヒトＰＤ‐１結合分子の実施形態に関する。本発明は更に、上記分子がＦｃ領域を備える、このような抗ヒトＰＤ‐１結合分子の実施形態に関する。本発明は更に、上記分子がアルブミン結合ドメイン、特に脱免疫化アルブミン結合ドメインを備える、このような抗ヒトＰＤ‐１結合分子の実施形態に関する。
【００２６】
本発明は更に、上記分子がＦｃ領域を備え、また上記Ｆｃ領域は変異型Ｆｃ領域であり、上記変異型Ｆｃ領域は、ＦｃγＲに対する上記変異型Ｆｃ領域の親和性を低減する、及び／又は血清半減期を増大させる１つ又は複数のアミノ酸修飾を含み、また更に詳細には、上記修飾は、以下：
（１）Ｌ２３４Ａ；Ｌ２３５Ａ；
（２）Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；
（３）Ｍ２５２Ｙ；Ｍ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ；
（４）Ｍ２５２Ｙ及びＴ２５６Ｅ；
（５）Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ；又は
（６）Ｋ２８８Ｄ及びＨ４３５Ｋ；
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、この番号付与は、Ｋａ
ｂａｔにおけるようなＥＵインデックスの番号付与である、全てのこのような抗ヒトＰＤ‐１結合分子の実施形態に関する。
【００２７】
本発明は更に、上述のＰＤ‐１結合分子のうちのいずれを用いて、Ｔ細胞仲介型免疫応答を刺激する、実施形態に関する。本発明は更に、上述のＰＤ‐１結合分子のうちのいずれを、抑制された免疫系に関連する疾患又は状態、特に癌又は感染症の治療に使用する実施形態に関する。
【００２８】
本発明は特に、癌の治療又は診断又は予後における上述のような使用に関し、上記癌は：副腎癌；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；発色性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成症；胆嚢若しくは胆管癌；消化器癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；膵島細胞腫；カポジ肉腫；腎臓癌、白血病、脂肪腫／良性リポソーム腫瘍、脂肪肉腫／悪性リポソーム腫瘍、肝臓癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；卵巣癌；膵臓癌；乳頭状甲状腺癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；希少な血液学的障害；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮細胞癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移性癌；及び子宮癌の細胞からなる群から選択される癌細胞の存在を特徴とする。
【００２９】
本発明は特に、癌の治療又は診断又は予後における上述のような使用に関し、上記癌は：結腸直腸癌；肝細胞癌；神経膠腫；腎臓癌；乳癌；多発性骨髄腫；膀胱癌；神経芽細胞腫；肉腫；非ホジキンリンパ腫（non-Hodgkin’s lymphoma）；非小細胞肺癌；卵巣癌：
膵臓癌；直腸癌；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；急性Ｂリンパ芽球性白血病（Ｂ‐ＡＬＬ）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；毛様細胞白血病（ＨＣＬ）；芽球性形質細胞様樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）；マントル細胞白血病（ＭＣＬ）及び小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）を含む非ホジキンリンパ腫（non-Hodgkin’s lymphomas：ＮＨＬ）；ホジキンリンパ腫；全身性肥満細胞症；又はバーキットリンパ腫である。
【００３０】
本発明は更に、上述のＰＤ‐１結合分子のうちのいずれを検出可能に標識し、ＰＤ‐１の検出に使用する実施形態に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、それぞれＥコイル又はＫコイルヘテロ二量体促進ドメインを有する２つのポリペプチド鎖からなる２つのエピトープ結合部位を有する、代表的な共有結合ダイアボディの概略図である。図３Ｂに示すように、システイン残基がリンカー中及び／又はヘテロ二量体促進ドメイン中に存在してよい。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。
【図２】図２は、連結した鎖がＦｃ領域の全体又は一部を形成するように、それぞれＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する２つのポリペプチド鎖からなる２つのエピトープ結合部位を有する、代表的な共有結合ダイアボディ分子の概略図である。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。
【図３Ａ−３Ｃ】図３Ａ〜３Ｃは、２ペアのポリペプチド鎖（即ち合計４つのポリペプチド鎖）からなる４つのエピトープ結合部位を有する、代表的な４価ダイアボディの概略図である。各ペアのうちの１つのポリペプチドは、連結した鎖がＦｃ領域の全体又は一部を形成するように、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。上記２ペアのポリペプチド鎖は、同一であってよい。（図３Ａ〜３Ｃに示すように）ＶＬ及びＶＨドメインが異なるエピトープを認識する実施形態では、得られた分子は４つのエピトープ結合部位を有し、二重特異性であり、結合する各エピトープに対して２価である。ＶＬ及びＶＨドメインが同一のエピトープを認識する（例えば同一のＶＬドメインＣＤＲ及び同一のＶＨドメインＣＤＲを両方の鎖に対して使用する）実施形態では、得られた分子は４つのエピトープ結合部位を有し、単一特異性であり、単一のエピトープに対して４価である。あるいは、上記２ペアのポリペプチドは異なっていてよい。（図３Ｃに示すように）ポリペプチドの各ペアのＶＬ及びＶＨドメインが異なるエピトープを認識する実施形態では、得られた分子は４つのエピトープ結合部位を有し、四重特異性であり、結合する各エピトープに対して１価である。図３Ａは、システイン残基を含むペプチドヘテロ二量体促進ドメインを含有するＦｃダイアボディを示す。図３ＢはＦｃ領域含有ダイアボディを示し、これは、システイン残基及び（任意のシステイン残基を有する）リンカーを含む、Ｅコイル及びＫコイルヘテロ二量体促進ドメインを含有する。図３Ｃは、抗体ＣＨ１及びＣＬドメインを含有するＦｃ領域含有ダイアボディを示す。
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａ及び４Ｂは、３つのポリペプチド鎖からなる２つのエピトープ結合部位を有する、代表的な共有結合ダイアボディ分子の概略図である。上記ポリペプチド鎖のうちの２つは、連結した鎖がＦｃ領域の全体又は一部を形成するように、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する。ＶＬ及びＶＨドメインを備えるポリペプチド鎖は、ヘテロ二量体促進ドメインを更に備える。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。
【図５】図５は、５つのポリペプチド鎖からなる４つのエピトープ結合部位を有する、代表的な共有結合ダイアボディの概略図である。上記ポリペプチド鎖のうちの２つは、連結した鎖がＦｃ領域の全体又は一部を含むＦｃ領域を形成するように、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する。ＶＬ及びＶＨドメインを備えるポリペプチド鎖は、ヘテロ二量体促進ドメインを更に備える。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。
【図６Ａ−６Ｆ】図６Ａ〜６Ｆは、３つのエピトープ結合部位を有する、代表的なＦｃ領域含有３価結合分子の概略図である。図６Ａ及び６Ｂはそれぞれ、ダイアボディ型結合ドメインがＦｃ領域に対するＮ末端又はＣ末端となる異なるドメイン配向を有する、２つのダイアボディ型結合ドメイン及びＦａｂ型結合ドメインを備える３価結合分子のドメインを示す。図６Ａ及び６Ｂの分子は４つの鎖を備える。図６Ｃ及び６Ｄはそれぞれ、Ｆｃ領域に対するＮ末端である２つのダイアボディ型結合ドメインと、軽鎖及び重鎖がポリペプチドスペーサを介して連結されたＦａｂ型結合ドメイン、又はｓｃＦｖ型結合ドメインとを備える、３価結合分子のドメインを示す。図６Ｅ及び６Ｆの３価結合分子はそれぞれ、Ｆｃ領域に対するＣ末端である２つのダイアボディ型結合ドメインと、連結されたＦａｂ型結合ドメイン、又は上記ダイアボディ型結合ドメインがその中に存在するｓｃＦｖ型結合ドメインとを備える、３価結合分子のドメインを、概略的に示す。図６Ｃ〜６Ｆの３価結合分子は、３つの鎖を備える。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。
【図７Ａ−７Ｄ】図７Ａ〜７Ｄは、抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １〜１５がヒトＰＤ‐１に結合することを示している。ｓｈＰＤ‐１‐Ｈｉｓに対する結合に関する結合曲線を、図７Ａ（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９）、図７Ｂ（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７）、並びに図７Ｃ（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５）に示す。ｓｈＰＤ‐１‐ヒトＦｃに対する結合に関する結合曲線を、図７Ｄ（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５）に示す。
【図８Ａ−８Ｃ】図８Ａ〜８Ｃは、抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １〜１５がカニクイザルＰＤ‐１に結合することを示している。ｓｃｙｎｏＰＤ‐１‐ｈＦｃに対する結合に関する結合曲線を、図８Ａ（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７）、図８Ｂ（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９）、並びに図８Ｃ（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５）に示す。
【図９Ａ−９Ｄ】図９Ａ〜９Ｄは、抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １〜１５の、ヒトＰＤ‐１に対するヒトＰＤ‐Ｌ１の結合をブロックする能力を示す。阻害曲線を、図９Ａ（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ）、図９Ｂ（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４）、図９Ｃ（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ）、並びに図９Ｄ（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ）に示す。
【図１０Ａ−１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｂは、抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７の組織特異性を示す。図１０Ａは、正常な結腸（パネルｉ及びｖｉｉ）、肝臓（パネルｉｉ及びｖｉｉｉ）、肺（パネルｉｉｉ及びｉｘ）、膵臓（パネルｉｖ及びｘ）、腎臓（パネルｖ及びｘｉ）並びに心臓（パネルｖｉ及びｘｉｉ）組織の、組織学的染色を示す。図１０Ａ、パネルｉ〜ｖｉは、標識ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（０．３１３μｇ／ｍＬ）を用いてインキュベートした組織の結果を示す。図１０Ａ、パネルｖｉｉ〜ｘｉｉは、標識アイソタイプ対照ｍＡｂ（０．３１４μｇ／ｍＬ）を用いてインキュベートした組織の結果を示す。図１０Ｂは、皮膚（パネルｉ及びｉｖ）、扁桃（パネルｉｉ及びｖ）、並びにＰＤ‐１を発現するＮＳＯ細胞（パネルｉｉｉ及びｖｉ）の、組織学的染色を示す。図１０Ｂ、パネルｉ〜ｉｉｉは、標識ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（０．３１３μｇ／ｍＬ）を用いてインキュベートした組織の結果を示す。
【図１１】図１１は、ヒト化抗ヒトＰＤ‐１抗体ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．１）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９（１．１）、並びに細胞表面ＰＤ‐１に結合するためのＩｇＧ１（ＡＡ）又はＩｇＧ４（Ｐ）を有する基準抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂの、結合プロファイルを示す。
【図１２Ａ−１２Ｂ】図１２Ａ〜１２Ｂは、ヒト化抗ＰＤ抗体ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．１）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９（１．１）、並びにＩｇＧ１（ＡＡ）又はＩｇＧ４（Ｐ）を有する基準抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂの、細胞表面ヒトＰＤ‐１に対する可溶性ヒトＰＤ‐Ｌ１（図１２Ａ）及び可溶性ヒトＰＤ‐Ｌ２（図１２Ｂ）の結合をブロックする能力を示す。
【図１３】図１３は、ヒト化抗ＰＤ抗体ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．１）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９（１．１）、並びにＩｇＧ１（ＡＡ）又はＩｇＧ４（Ｐ）を有する基準抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂの、ＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１相互作用をブロックして、Ｊｕｒｋａｔ‐ｌｕｃ‐ＮＦＡＴ／ＣＨＯ‐ＰＤ‐Ｌ１ルシフェラーゼリポータアッセイにおけるＴ細胞応答の下方制御を防止することにより、ＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１軸に拮抗する能力を示す。
【図１４】図１４は、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５が、基準抗ＰＤ‐１抗体（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂ）と同等の、又は更に高いレベルまで、サイトカイン産生を刺激できること、並びにＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５をＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １と組み合わせて用いた治療が、サイトカイン放出の最大の増強を提供したことを示す。抗ＰＤ‐１及び抗ＬＡＧ‐３抗体を単独で及び組み合わせて用いて処置したブドウ球菌腸毒素Ｂ（ＳＥＢ）刺激ＰＢＭＣからのＩＦＮγ分泌プロファイル。
【図１５Ａ−１５Ｂ】図１５Ａ〜１５Ｂは、ヒト化抗ＰＤ抗体ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９（１．１）、並びにＩｇＧ１（ＡＡ）又はＩｇＧ４（Ｐ）を有する基準抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂの、サイトカイン産生を刺激する能力を示す。抗ＰＤ‐１抗体を用いて処置したＳＥＢ刺激ＰＢＭＣからの、ＩＦＮγ（図１５Ａ）及びＴＮＦα（図１５Ｂ）の分泌プロファイル。
【図１６Ａ−１６Ｂ】図１６Ａ〜１６Ｂは、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ構成物ＤＡＲＴ  Ａ、ＤＡＲＴ  Ｄ、ＤＡＲＴ  Ｅ、ＤＡＲＴ  Ｆ、ＤＡＲＴ  Ｇ及びＤＡＲＴ  Ｈが、抗ＰＤ‐１  ｍＡｂ＋抗ＬＡＧ‐３  ｍＡｂの組み合わせ（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ＋ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ）の投与時に観察されるものと同等の、又は更に高いレベルまで、サイトカイン産生を刺激できること、並びにＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ構成物ＤＡＲＴ  Ａ、ＤＡＲＴ  Ｄ、ＤＡＲＴ  Ｅ、ＤＡＲＴ  Ｆ及びＤＡＲＴ  Ｇが、サイトカイン放出の最大の増強を提供したことを示す。ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ、又は単独の及び組み合わせられた抗ＰＤ‐１及び抗ＬＡＧ‐３抗体を用いて処置された、低濃度のＳＥＢ（０．２ｎｇ／ｍＬ）で刺激されたＰＢＭＣのＩＦＮγ分泌プロファイルをプロットしている。２体の代表的なドナーからの、ＰＢＭＣを用いた結果を、図１６Ａ及び図１６Ｂに示す。
【図１７Ａ−１７Ｂ】図１７Ａ〜１７Ｂは、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ構成物ＤＡＲＴ  Ａ、ＤＡＲＴ  Ｂ及びＤＡＲＴ  Ｃが、抗ＰＤ‐１  ｍＡｂ＋抗ＬＡＧ‐３  ｍＡｂの組み合わせ（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ＋ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ）の投与時に観察されるものと同等の、又は更に高いレベルまで、サイトカイン産生を刺激できることを示す。ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ、又は単独の及び組み合わせられた抗ＰＤ‐１及び抗ＬＡＧ‐３抗体を用いて処置された、高濃度のＳＥＢ（８５ｎｇ／ｍＬ）で刺激された２体の代表的なドナーからのＰＢＭＣのＩＦＮγ分泌プロファイルをプロットしている。２体の代表的なドナーからの、ＰＢＭＣを用いた結果を、図１７Ａ及び図１７Ｂに示す。
【図１８Ａ−１８Ｂ】図１８Ａ〜１８Ｂは、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ構成物ＤＡＲＴ  Ａ、ＤＡＲＴ  Ｂ及びＤＡＲＴ  Ｃが、抗ＰＤ‐１  ｍＡｂ＋抗ＬＡＧ‐３  ｍＡｂの組み合わせ（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ＋ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ）の投与時に観察されるものと同等の、又は更に高いレベルまで、サイトカイン産生を刺激できることを示す。ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ、又は単独の及び組み合わせられた抗ＰＤ‐１及び抗ＬＡＧ‐３抗体を用いて処置された、中程度の濃度のＳＥＢ（０．５ｎｇ／ｍＬ）で刺激された２体の代表的なドナーからのＰＢＭＣのＩＦＮγ分泌プロファイルをプロットしている。２体の代表的なドナーからの、ＰＢＭＣを用いた結果を、図１８Ａ及び図１８Ｂに示す。
【図１９】図１９は、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ構成物ＤＡＲＴ  Ｄ及びＤＡＲＴ  Ｈが、抗ＰＤ‐１  ｍＡｂ＋抗ＬＡＧ‐３  ｍＡｂの組み合わせ（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ＋ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ）の投与時に観察されるものと同等の、又は更に高いレベルまで、サイトカイン産生を刺激できること、並びにＤＡＲＴ  Ｄが、サイトカイン放出の最大の増強を提供することを示す。ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ、又は単独の及び組み合わせられた抗ＰＤ‐１及び抗ＬＡＧ‐３抗体を用いて処置された、高濃度のＳＥＢ（８５ｎｇ／ｍＬ）で刺激された代表的なドナーからのＰＢＭＣのＩＬ‐２分泌プロファイルをプロットしている。
【図２０】図２０は、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ構成物ＤＡＲＴ  Ｂ及びＤＡＲＴ  Ｉが、抗ＰＤ‐１  ｍＡｂ＋抗ＬＡＧ‐３  ｍＡｂの組み合わせ（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ＋ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）＋ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １（１．４）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）＋ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６（１．１））の投与時に観察されるものと同等の、又は更に高いレベルまで、サイトカイン産生を刺激できることを示す。ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ、又は単独の及び組み合わせられた抗ＰＤ‐１及び抗ＬＡＧ‐３抗体を用いて処置された、中程度の濃度のＳＥＢ（０．５ｎｇ／ｍＬ）で刺激された代表的なドナーからのＰＢＭＣのＩＦＮγ分泌プロファイルをプロットしている。
【図２１Ａ−２１Ｄ】図２１Ａ〜２１Ｄは、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディＤＡＲＴ  Ｉが、抗ＰＤ‐１  ｍＡｂ＋抗ＬＡＧ‐３  ｍＡｂの組み合わせ（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ＋ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ）の投与時に観察されるものと同等の、又は更に高いレベルまで、サイトカイン産生を刺激できることを示す。ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディＤＡＲＴ‐Ｉ、組み合わせられた抗ＰＤ‐１及び抗ＬＡＧ‐３抗体、又はアイソタイプ対照を用いて処置された、破傷風トキソイド（５μｇ／ｍＬ）で刺激された２体の代表的なドナーからのＣＤ４メモリ細胞の、ＩＦＮγ（図２１Ａ及び２１Ｃ）並びにＩＬ‐２（図２１Ｂ及び２１Ｄ）分泌プロファイルをプロットしている。２体の代表的なドナーからのＣＤ４メモリＴ細胞を用いた７日目の結果を図２１Ａ〜Ｂ及び図２１Ｃ〜Ｄに示す。
【図２２】図２２は、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子、ＤＡＲＴ  Ｉの薬学動態が、カニクイザルの抗ＰＤ‐１抗体、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４（Ｐ）の薬学動態と同等であることを示す。この細胞株は、ＤＡＲＴ  Ｉ（実線）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ（破線）の平均血清濃度を示す。オス（黒）及びメス（白）のサルに関する個々の値を、ＤＡＲＴ  Ｉ（三角形）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ（円）に関してプロットしている。
【図２３Ａ−２３Ｃ】図２３Ａ〜２３Ｃは、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上の結合済みＰＤ‐１の血清抗体濃度及びパーセンテージを、異なる抗ＰＤ‐１抗体を用いた処置後の動物において経時的に示す。抗ＰＤ‐１  ｍＡｂ処置後のＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上の結合済みＰＤ‐１のパーセンテージを、右のＹ軸上にプロットし、シンボルは、個々の動物に関するＴ細胞上の結合済みＰＤ‐１の％を表し、破線は平均値を表す。血清ｍＡｂ濃度を左のＹ軸上にプロットし、シンボルは、個々の動物に関する血清レベルを表し、実線は、データの非線形フィットを表す。各パネルは、１０ｍｇ／ｋｇのｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）（図２３Ａ）、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４（Ｐ）（図２３Ｂ）、又はＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂ  ＩｇＧ４（Ｐ）（図２３Ｂ）を１日目にＩＶ注入によって投与した動物（ｎ＝１／性別／群）に関するデータを表す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、カニクイザルＰＤ‐１及びヒトＰＤ‐１の両方に結合できる選択された抗ＰＤ‐１抗体：ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ
７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４又はＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５のＰＤ‐１結合ドメインを備える、ＰＤ‐１結合分子を対象とする。本発明は特に、このような抗体のヒト化若しくはキメラバージョンである、又はこのような抗ＰＤ‐１抗体のＰＤ‐１結合断片（特に免疫結合体、ダイアボディ、ＢｉＴＥ、二重特異性抗体等）を備える、ＰＤ‐１結合分子に関する。本発明は特に、免疫細胞の表面上に存在する免疫チェックポイントの制御に関与する分子のエピトープに更に結合できる、このようなＰＤ‐１結合分子に関する。本発明はまた、ＰＤ‐１の検出又は免疫応答の刺激のためにこのようなＰＤ‐１結合分子を使用する方法に関係する。本発明はまた、上述のような選択された抗ＰＤ‐１抗体の１つ又は複数のＰＤ‐１結合ドメインを備えるＰＤ‐１結合分子を、免疫応答を刺激するのに効果的な１つ若しくは複数の追加の分子と組み合わせて、及び／又は癌抗原に特異的に結合する１つ若しくは複数の追
加の分子と組み合わせて投与する、併用療法に関する。
【００３３】
Ｉ．抗体及びその結合ドメイン
本発明の抗体は、当該免疫グロブリン分子の可変ドメインに位置する少なくとも１つの抗原認識部位によって、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の標的に特異的に結合できる、免疫グロブリン分子である。本明細書において使用される場合、用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ及びａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、ラクダ化抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合二重特異性Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、細胞内抗体、及び以上のうちのいずれかのエピトープ結合断片を包含する。特に抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の断片、即ち抗原結合部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子は、いずれのタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスのものとすることができる。抗体は、診断学におけるその公知の使用法に加えて、治療剤として有用であることが示されている。抗体は、ポリペプチド又はタンパク質又は非タンパク質分子に免疫特異的に結合できる。というのは、このような分子上に特定のドメイン又は部分又は形態（「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」）が存在するためである。エピトープ含有分子は、免疫学的活性を有することができ、これにより、動物における抗体産生応答を誘発する。このような分子を「抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）」と呼ぶ。この数十年、抗体の治療的潜在能力に対する関心が再び高まっており、抗体は、生命工学由来の薬剤の筆頭となるクラスの１つとなっている（Chan, C.E. et al. (2009) “The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases,” Singapore Med. J. 50(7):663-666）。２００を超える抗体系薬剤が使用認可済み、又は開発中である。
【００３４】
用語「モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は均質な抗体の集団を指し、上記モノクローナル抗体は、抗原の選択的結合に関わる（自然に発生する又は自然に発生しない）アミノ酸から構成される。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一のエピトープ（又は抗原部位）に対して指向性を有する。用語「モノクローナル抗体」は、完全なモノクローナル抗体及び全長モノクローナル抗体だけでなく、これらの断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）2、Ｆｖ等）、単鎖（ｓｃＦｖ）、その突然変異体、
抗体部分を備える融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、及び必要な特異性及び抗原への結合能力を有する抗原認識部位を備える免疫グロブリン分子の他のいずれの修飾構成を包含する。抗原の源又は抗原を作製する方法（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現、遺伝子導入動物等による）に関して、限定は意図されていない。この用語は、免疫グロブリン全体、及び「抗体」の定義において上述した断片等を含む。モノクローナル抗体の作製方法は当該技術分野において公知である。採用してよい１つの方法は、Kohler, G. et al. (1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity,” Nature 256:495-497の方法又はその修正例である。典型的には、モノクローナル抗体はマウス、ラット又はウサギにおいて発現する。上記抗体は、動物を、所望のエピトープを含有する免疫原性量の細胞、細胞抽出物又はタンパク製剤で免疫化することによって産生される。免疫原は、一次細胞、培養された細胞株、癌細胞、タンパク質、ペプチド、核酸又は組織とすることができるが、これらに限定されない。免疫化に使用してよい細胞は、これらを免疫原として使用するよりもある期間（例えば少なくとも２４時間）だけ前に、培養してよい。細胞は単独で、又はＲｉｂｉ等の非変性アジュバントと組み合わせて、免疫原として使用してよい（Jennings, V.M. (1995) “Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production,” ILAR J. 37(3):119-125参照）。一般に細胞は、免疫原として使用される際、完全
な状態、及び好ましくは生存できる状態に維持しなければならない。完全な細胞は、破裂した細胞よりも、免疫性を与えられた動物が抗原をより良好に検出できるようにすること
ができる。変性又は強いアジュバント、例えばフロイントアジュバントの使用は、細胞を破裂させる場合があり、従って推奨されない。免疫原は、２週間に１回若しくは１週間に１回等、周期的な間隔で複数回投与してよく、又は動物中（例えば組織組み換え中）に生存能力を維持できるように投与してよい。あるいは、所望の病原性エピトープに対する免疫特異性を有する既存のモノクローナル抗体及び他の同等の抗体は、当該技術分野で公知のいずれの手段によって、組み換え配列及び産生できる。一実施形態では、このような抗体を配列し、続いてポリヌクレオチド配列を発現又は繁殖のためのベクターにクローン化する。関心対象の抗体をエンコードする配列は、宿主細胞中のベクター中に保持され、続いて上記宿主細胞を、将来使用するために膨張させて冷凍できる。このような抗体のポリヌクレオチド配列は、本発明の単一特異性又は多重特異性（例えば二重特異性、三重特異性及び四重特異性）分子、並びに親和性最適化済み、キメラ抗体、ヒト化抗体及び／又はイヌ化抗体を生成することによって、抗体の親和性又は他の特徴を改善するための、遺伝子操作のために使用してよい。抗体をヒト化する際の一般原理は、抗体の抗原結合部分の塩基配列を保持しながら、抗体の非ヒト残部をヒト抗体配列と交換するステップを伴う。
【００３５】
天然抗体（ＩｇＧ抗体等）は、２つの重鎖と複合体化した２つの軽鎖からなる。各軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）を含有する。各重鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）、並びにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に位置するヒンジドメインを含有する。従って、自然に発生する免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）の基本構造単位は、通常は約１５０，０００Ｄａの糖タンパク質として発現される、軽鎖及び２つの重鎖を有する三量体である。各鎖のアミノ末端（「Ｎ末端」）部分は、抗原認識に主要な役割を果たす約１００〜１１０個の可変ドメインを含む。各鎖のカルボキシ末端（「Ｃ末端」）部分は定常領域を画定し、軽鎖は単一の定常ドメインを有し、重鎖は通常３つの定常ドメイン及び１つのヒンジドメインを有する。従って、ＩｇＧ分子の軽鎖の構造はｎ‐ＶＬ‐ＣＬ‐ｃであり、ＩｇＧ重鎖の構造はｎ‐ＶＨ‐ＣＨ１‐Ｈ‐ＣＨ２‐ＣＨ３‐ｃである（ここでＨはヒンジドメインであり、ｎ及びｃはそれぞれ、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端を表す）。ＩｇＧ分子の可変ドメインは、エピトープと接触した残基を含有する複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）、及びフレームワークセグメント（ＦＲ）と呼ばれる非ＣＤＲセグメントからなり、上記フレームワークセグメントは、一般にＣＤＲループの構造を維持してＣＤＲの位置を決定することにより、このような接触を可能とする（ただし特定のフレームワーク残基も抗原に接触し得る）。従って、ＶＬ及びＶＨドメインは、構造ｎ‐ＦＲ１‐ＣＤＲ１‐ＦＲ２‐ＣＤＲ２‐ＦＲ３‐ＣＤＲ３‐ＦＲ４‐ｃを有する。抗体軽鎖の第１、第２及び第３のＣＤＲである（又は第１、第２及び第３のＣＤＲとして機能し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインと呼ばれる。
同様に、抗体重鎖の第１、第２及び第３のＣＤＲである（又は第１、第２及び第３のＣＤＲとして機能し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれＣＤＲH１ドメイン、ＣＤ
ＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインと呼ばれる。よって、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン、ＣＤＲL３ドメイン、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン、及びＣＤＲH３ドメインという用語は、あるタンパク質に組み込まれた場合に、当該タンパク質が、軽鎖及び重鎖若しくはダイアボディ若しくは単鎖結合分子（例えばｓｃＦｖ、ＢｉＴｅ等）を有する抗体であるか、又は別のタイプのタンパク質であるかにかかわらず、当該タンパク質を、特定のエピトープに結合できるようにする、ポリペプチドを対象としている。従って本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ結合断片（ｅｐｉｔｏｐｅ‐ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、あるエピトープに免疫特異的に結合できる抗体の断片を意味し、用語「エピトープ結合部位（ｅｐｉｔｏｐｅ‐ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）」は、エピトープ結合において役割を果たすエピトープ結合断片を含む分子の当該部分を指す。エピトープ結合部位は、このような抗体のＣＤＲドメインのうちの１、２、３、４、５個又は６個全てを含有してよく、このようなエピトープに免疫特異的に結合できるものの、このような抗体のエピトープとは異なるエピトープに対する免疫特異性、親和性又
は選択性を呈してもよい。しかしながら好ましくは、エピトープ結合断片は、このような抗体のＣＤＲドメインのうちの６個全てを含有することになる。ある抗体のエピトープ結合断片は、単一のポリペプチド鎖（例えばｓｃＦｖ）であってよく、又はそれぞれがアミノ末端及びカルボキシ末端を有する２つ以上のポリペプチド鎖（例えばダイアボディ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）2断片等）を含んでよい。
【００３６】
本発明は特に、本発明の抗ＰＤ‐１抗体の単鎖可変ドメイン断片（「ｓｃＦｖ）」、及びこれを備える多重特異性結合分子を包含する。単鎖可変ドメイン断片は、短い結合ペプチドを用いて軽鎖及び／又は可変ドメインを結合することによって作製される。Bird et al.(1988)（"Single-Chain Antigen-Binding Proteins," Science 242:423-426）は、一
方の可変ドメインのカルボキシ末端と他方の可変ドメインのアミノ末端との間の約３．５ｎｍを埋める連結ペプチドの例を記載している。他の配列のリンカーも設計及び使用されている（Bird et al. (1988), "Single-Chain Antigen-Binding Proteins," Science 242:423-426）。リンカーは、薬剤又はアタッチメントを固体支持体に取り付ける等の更なる機能のために修飾できる。単鎖変異型は、組み換え又は合成によって産生できる。ｓｃＦｖの合成産生のために、自動合成器を使用できる。ｓｃＦｖの組み換え産生のためには、ｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドを含有する好適なプラスミドを、酵母、植物、昆虫又は哺乳類細胞等の真核細胞又は大腸菌等の原核細胞といった、好適な宿主細胞に導入できる。関心対象のｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションといった慣用の操作によって作製できる。得られたｓｃＦｖは、当該技術分野において公知の標準的なタンパク質精製技法を用いて単離できる。
【００３７】
本発明は特に、本発明の抗ＰＤ‐１抗体のヒト化変異型、及びこれを含む多重特異性結合分子も包含する。用語「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）」抗体は、キメラ分子であって、一般に組み換え技術を用いて調製され、非ヒト種からの免疫グロブリンの抗原結合部位と、残りの、ヒト免疫グロブリンの構造及び／又は配列に基づく分子の免疫グロブリン構造とを有する、キメラ分子を指す。本発明の抗ヒトＰＤ‐１抗体は、抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１、ＰＤ‐１
ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４又はＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５の、ヒト化、キメラ又はイヌ化変異体を含む。このような抗体の可変ドメインのポリヌクレオチド配列は、上記誘導体を生成するため及び上記抗体の親和性又は他の特徴を改善するための遺伝子操作のために使用できる。抗体をヒト化する際の一般原理は、抗体の抗原結合部分の塩基配列を保持しながら、抗体の非ヒト残部をヒト抗体配列と交換するステップを伴う。モノクローナル抗体をヒト化するためには、４つの一般的なステップが存在する。上記ステップは以下の通りである：（１）開始抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインのヌクレオチド及び予測されるアミノ酸配列を決定するステップ；（２）ヒト化抗体又はイヌ化抗体を設計するステップ、即ちヒト化又はイヌ化プロセス中に使用する抗体フレームワーク領域を決定するステップ；（３）実際のヒト化又はイヌ化法／技術；並びに（４）ヒト化抗体のトランスフェクション及び発現。例えば米国特許第４，８１６，５６７号；米国特許第５，８０７，７１５号；米国特許第５，８６６，６９２号；及び米国特許第６，３３１，４１５号を参照。
【００３８】
抗原結合部位は、定常ドメインに融合する完全可変ドメイン、又は適切なフレームワーク領域にグラフトされたこのような可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを備えてよい。抗原結合部位は野生型であってよく、又は１つ若しくは複数のアミノ酸置換によって修飾してよい。これにより、ヒト個体の免疫原である定常領域が排除されるが、外来可変ドメインの可能性は残る（LoBuglio, A.F. et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sc
i. (U.S.A.) 86:4220‐4224）。別のアプローチは、ヒト由来定常領域を提供することだ
けでなく、上記可変ドメインをヒト形態に可能な限り近くなるように変形させるために上記可変ドメインを修飾することにも、焦点を当てている。重鎖及び軽鎖両方の可変ドメインは、問題となる抗原に応答して変化して結合能力を決定する、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）が隣接する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を内包することが知られており、上記フレームワーク領域は、ある所与の種において相対的に保存され、またＣＤＲのための足場を提供するものと推定される。ある特定の抗原に対して非ヒト抗体を調製する際、非ヒト抗体由来のＣＤＲを、修飾されるヒト抗体内に存在するＦＲに移植することによって、可変ドメインを「再成形」又は「ヒト化」できる。様々な抗体に対するこのアプローチの適用は、Sato, K. et al. (1993) “Reshaping A Human Antibody To Inhibit The Interleukin 6‐Dependent Tumor Cell Growth,” Cancer Res 53:851‐856. Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323‐327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534‐1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR‐Grafting: The Importance Of Framework残基 On Loop Conformation,” Protein Engineering 4:773‐3783; Maeda, H. et al. (1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV‐Neutralizing Activity,” Human Antibodies Hybridoma 2:124‐134; Gorman, S. D. et al. (1991) 
“Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181‐4185; Tempest, P.R. et al. (1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo,” Bio/Technology 9:266‐271; Co, M. S. et al. (1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,
” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869‐2873; Carter, P. et al. (1992) “Humanization Of An Anti‐p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285‐4289; 及びCo, M.S. et al. (1992) “Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen,” J. Immunol. 148:1149
‐1154によって報告されている。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は全てのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体からの６つのＣＤＲ全てを含有するヒト化マウス抗体）。他の実施形態では、ヒト化抗体は、オリジナルの抗体に対して配列が異なる改変された１つ又は複数のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つ）を有する。
【００３９】
非ヒト免疫グロブリン由来の抗原結合部位を備える多数の「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）」抗体分子が説明されており、これらは、げっ歯類又は修飾げっ歯類可変ドメインと、ヒト定常ドメインに融合した、これらに関連する相補性決定領域（ＣＤＲ）とを有するキメラ抗体を含む（例えばWinter et al. (1991) “Man-made Antibodies,” Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224
(1989); Shaw et al. (1987) “Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen,” J. Immunol. 138:4534-4538;及びBrown et al. (1987) “Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody,” Cancer Res. 47:3577-3583を参照）。他の参照文献は、適切なヒト抗体定常ドメインと融合する前にヒト支持性フレームワーク領域（ＦＲ）にグラフと重合される、げっ歯類ＣＤＲについて説明している（例えば、Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534-1536;及びJones et al. (1986) “Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse,” Nature 321:522-525を参照）。別の参照文献は、組み換えによってベニアリングされたげっ歯類フレームワーク領域によって支持されたげっ歯類ＣＤＲについて説明している。例えば欧州公開特許第５１９，５９６号を参照。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレ
シピエントのこれらの部分の治療的応用の期間及び効果を制限する、げっ歯類抗ヒト抗体分子に対する望ましくない免疫学的応答を最小化するよう設計される。抗体をヒト化するために利用してよい他の方法は、Daugherty et al. (1991) “Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A マウスMonoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins,” Nucl.
Acids Res. 19:2471-2476並びに米国特許第６，１８０，３７７号；米国特許第６，０５４，２９７号；米国特許第５，９９７，８６７号；及び米国特許第５，８６６，６９２号によって開示されている。
【００４０】
ＩＩ．Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）
２つの重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインは相互作用してＦｃ領域を形成し、このＦｃ領域は、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）を含むがこれに限定されない細胞Ｆｃ受容体によって認識されるドメインである。本明細書において使用される場合、用語「Ｆｃ領域（Ｆｃ  ｒｅｇｉｏｎ）」は、ＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。例示的なヒトＩｇＧ１のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１）：
231     240          250          260          270          280
APELLGGPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSHED   PEVKFNWYVD
290          300          310          320          330
GVEVHNAKTK   PREEQYNSTY   RVVSVLTVLH   QDWLNGKEYK   CKVSNKALPA
340          350          360          370          380
PIEKTISKAK   GQPREPQVYT   LPPSREEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDIAVE
390          400          410          420          430
WESNGQPENN   YKTTPPVLDS   DGSFFLYSKL   TVDKSRWQQG   NVFSCSVMHE
440      447
ALHNHYTQKS   LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【００４１】
例示的なヒトＩｇＧ２のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号２）：231     240          250          260          270          280
APPVA-GPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSHED   PEVQFNWYVD 
290          300          310          320          330
GVEVHNAKTK   PREEQFNSTF   RVVSVLTVVH   QDWLNGKEYK   CKVSNKGLPA 
340          350          360          370          380
PIEKTISKTK   GQPREPQVYT   LPPSREEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDISVE
390          400          410          420          430
WESNGQPENN   YKTTPPMLDS   DGSFFLYSKL   TVDKSRWQQG   NVFSCSVMHE 
440      447
ALHNHYTQKS   LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【００４２】
例示的なヒトＩｇＧ３のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号３）：231     240          250          260          270          280
APELLGGPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSHED   PEVQFKWYVD 
290          300          310          320          330
GVEVHNAKTK   PREEQYNSTF   RVVSVLTVLH   QDWLNGKEYK   CKVSNKALPA
340          350          360          370          380
PIEKTISKTK   GQPREPQVYT   LPPSREEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDIAVE
390          400          410          420          430
WESSGQPENN   YNTTPPMLDS   DGSFFLYSKL   TVDKSRWQQG   NIFSCSVMHE
440      447
ALHNRFTQKS   LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【００４３】
例示的なヒトＩｇＧ４のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号４）：231     240          250          260          270          280
APEFLGGPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSQED   PEVQFNWYVD 
290          300          310          320          330
GVEVHNAKTK   PREEQFNSTY   RVVSVLTVLH   QDWLNGKEYK   CKVSNKGLPS 
340          350          360          370          380
SIEKTISKAK   GQPREPQVYT   LPPSQEEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDIAVE 
390          400          410          420          430
WESNGQPENN   YKTTPPVLDS   DGSFFLYSRL   TVDKSRWQEG   NVFSCSVMHE 
440      447
ALHNHYTQKS   LSLSLGX
であり、これはＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【００４４】
本明細書全体を通して、ＩｇＧ重鎖の定常領域の残基の番号付与は、Kabat et al.、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5thEd. Public Health Service、NH1、MD (1991)（「Ｋａｂａｔ」、これは参照により明示的に本明細書に援用される）によ
るＥＵインデックスの番号付与である。「ＫａｂａｔににおけるようなＥＵインデックス（ＥＵ  ｉｎｄｅｘ  ａｓ  ｉｎ  Ｋａｂａｔ）」は、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の番号付与を指す。免疫グロブリンの成熟重鎖及び軽鎖の可変ドメインからのアミノ酸は、鎖内のアミノ酸の位置によって指定される。Ｋａｂａｔは、抗体に関する多数のアミノ酸配列を記載し、各サブグループに関するアミノ酸コンセンサス配列を識別し、また各アミノ酸に残基番号を割り当てており、ＣＤＲはＫａｂａｔによって定義されているように識別される（Chothia, C. & Lesk, A. M.（(1987) “Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobrins,”. J. Mol. Biol. 196:901‐917）によって定義される
ＣＤＲH１は、５残基前から始まることを理解されたい）。Ｋａｂａｔの番号付与スキー
ムは、保存されたアミノ酸を参照して、問題となる抗体を、Ｋａｂａｔ中のコンセンサス配列のうちの１つと整列させることによって、Ｋａｂａｔの概要に含まれていない抗体にまで拡張可能である。残基番号を割り当てるための上記方法は、当該技術分野において標準的なものとなっており、キメラ又はヒト化変異体を含む異なる抗体中の同等の位置のアミノ酸を容易に識別する。例えば、ヒト抗体軽鎖の５０位のアミノ酸は、マウス抗体軽鎖の５０位のアミノ酸と同等の位置を占有する。
【００４５】
多型は、抗体定常領域内の多数の異なる位置（例えばＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスによる番号付与で、１９２位、１９３位及び２１４位を含むがこれらに限定されないＣＨ１位置；並びに２７０位、２７２位、３１２位、３１５位、３５６位及び３５８位を含むがこれらに限定されないＦｃ位置）において観察されており、従ってここで提示される配列と従来技術の配列との間にはわずかな差異が存在し得る。ヒト免疫グロブリンの多型形態は、十分に特性決定されている。現在、１８個のＧｍアロタイプが公知である：Ｇ１ｍ（１，２，３，１７）又はＧ１ｍ（ａ，ｘ，ｆ，ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）又はＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５，６，１０，１１，１３，１４，１５，１６，２１，２４，２６，２７，２８）又はＧ３ｍ（ｂ１，ｃ３，ｂ３，ｂ０，ｂ３，ｂ４，ｓ，ｔ，ｇ１，ｃ５，ｕ，ｖ，ｇ５）（Lefranc, et al., The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefra
nc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199‐211）。特に、本発明の抗体が、いずれの免疫グロブリン遺伝子のいずれのアロタイプ、アイソアロタイプ又はハプロタイプを組み込むことができ、本明細書中で提示される配列のアロタイプ、アイソアロタイプ又はハプロタイプに限定されないと考えられる。更に、発現系によっては、ＣＨ３ドメインのＣ末端アミノ酸残基（上記太字）は、翻訳後に除去できる。従ってＣＨ３ドメインのＣ末端残基は、本発明のＰＤ‐１結合分子の任意のアミノ酸残基である。本発明によって具体的に包含されるのは、ＣＨ３ドメインのＣ末端残基が欠けたＰＤ‐１結合分子である。また本発明によって具体的に包含されるのは、ＣＨ３ドメインのＣ末端リシン残基を含む構造である。
【００４６】
活性化及び阻害信号は、細胞Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）へのＦｃ領域のライゲーションによって形質導入される。正反対の機能をもたらすこのようなライゲーションの能力は、異なるＦｃγＲ間の構造的差異に起因する。免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）及び免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）と呼ばれる、受容体の細胞質シグナリングドメイン内の２つの別個のドメインが、異なる応答の原因となる。これらの構造に対する異なる細胞質酵素の補充は、ＦｃγＲ仲介細胞応答の結果を決定づける。ＩＴＡＭ含有ＦｃγＲ複合体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡを含み、その一方でＩＴＩＭ含有複合体はＦｃγＲＩＩＢしか含まない。ヒト好中球は、ＦｃγＲＩＩＡ遺伝子を発現する。免疫複合体又は特異性抗体架橋によるＦｃγＲＩＩＡのクラスタリングは、ＩＴＡＭを、ＩＴＡＭリン酸化を促進する受容体関連キナーゼと凝集させる役割を果たす。ＩＴＡＭリン酸化は、Ｓｙｋキナーゼのドッキング部位として役立ち、その活性化は、下流基質（例えばＰＩ3Ｋ）の活性化をもたらす。細胞活性化は、炎症
促進性メディエータの放出につながる。ＦｃγＲＩＩＢ遺伝子は、Ｂリンパ球上で発現し、その細胞外ドメインはＦｃγＲＩＩＡと９６％同一であり、またＩｇＧ複合体に、区別できない様式で結合する。ＦｃγＲＩＩＢの細胞質ドメイン中のＩＴＩＭの存在は、ＦｃγＲの上述の阻害型サブクラスを定義する。最近、この阻害の分子的基礎が確率された。活性化ＦｃγＲと共同結紮すると、ＦｃγＲＩＩＢ中のＩＴＩＭはリン酸化され、ポリリン酸イノシトール５’‐ホスファターゼ（ＳＨＩＰ）のＳＨ２ドメインを誘引し、これは、ＩＴＡＭ含有ＦｃγＲ仲介チロシンキナーゼ活性化の結果として放出されたホスホイノシトールを加水分解し、その結果、細胞内Ｃａ++の流入を防止する。従って、ＦｃγＲＩＩＢの架橋は、ＦｃγＲ結紮に対する活性化応答を弱め、細胞応答性を阻害する。このようにして、Ｂ細胞活性化、Ｂ細胞増殖及び抗体分泌が中断される。
【００４７】
ＩＩＩ．二重特異性抗体、多重特異性ダイアボディ及びＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディ
抗体が抗原のエピトープに結合する能力は、抗体のＶＬ及びＶＨドメインの存在並びにアミノ酸配列に依存する。抗体軽鎖と抗体重鎖との相互作用、特にそのＶＬドメインとＶＨドメインとの相互作用は、天然抗体の２つのエプトープ結合部位のうちの１つを形成する。天然抗体は、１つのエピトープ種にのみ結合できる（即ちこれらは単一特異性である）が、これらは上記種の複数の複製に結合できる（即ち２価性又は多価性を示す）。
【００４８】
本発明の結合ドメインは、エピトープに、「免疫特異的な」様式で結合する。本明細書において使用される場合、抗体、ダイアボディ又は他のエピトープ結合分子は、代替的なエピトープに比べて、より頻繁に、より迅速に、より長期間、及び／又はより高い親和性で当該エピトープと反応又は連結する場合、別の分子のある領域（即ちエピトープ）に「免疫特異的に」結合する、と言い表される。例えば、あるウイルスエピトープに免疫特異的に結合する抗体は、他のウイルスエピトープ又は非ウイルスエピトープに免疫特異的に結合するよりも、より高い親和性、結合活性で、より容易に、及び／又はより長い期間、当該ウイルスエピトープに結合する抗体である。この定義を読めば、例えば第１の標的に免疫特異的に結合する抗体（又は部分若しくはエピトープ）は、第２の標的に特異的又は
優先的に結合してもしなくてもよいことも理解される。従って「免疫特異的結合（ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、排他的結合を必ずしも必要としない（ただし含むことはできる）。一般に、ただし必ずしもそうではないが、結合に関する言及は「特異的」結合を意味する。２つの分子は、これらの結合が、これら２つの分子それぞれのリガンドに受容体が結合する特異性を呈する場合に、「生理学的に特異的な（ｐｈｙｓｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）」様式で互いに結合できると言い表される。
【００４９】
抗体の機能性は、２つの別個の異なる抗原（若しくは同一の抗原の異なるエピトープ)
に同時に結合できる多重特異性抗体ベースの分子を生成することにより、並びに／又は同一のエピトープ及び／若しくは抗原に関してより高い価（即ち３つ以上の結合部位）を有する抗体ベースの分子を生成することにより、増強できる。
【００５０】
天然抗体より高い能力を有する分子を提供するために、幅広い組み換え二重特異性抗体フォーマットが開発されており（例えば国際公開第２００８／００３１１６号；国際公開第２００９／１３２８７６号；国際公開第２００８／００３１０３号；国際公開第２００７／１４６９６８号；国際公開第２００９／０１８３８６号；国際公開第２０１２／００９５４４号；国際公開第２０１３／０７０５６５参照）、その殆どは、更なるエピトープ結合断片（例えばｓｃＦｖ、ＶＬ、ＶＨ等）を抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭ）へ若しくは上記抗体コア内に融合させるため、又は複数のエピトープ結合断片（例えば２つのＦａｂ断片若しくはｓｃＦｖ）を融合させるために、リンカーペプチドを使用する。代替的なフォーマットは、エピトープ結合断片（例えばｓｃＦｖ、ＶＬ、ＶＨ等）を、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン又は代替となるポリペプチド等の二量体化ドメインに融合させるために、リンカーペプチドを使用する（国際公開第２００５／０７０９６６号；国際公開第２００６／１０７７８６Ａ号；国際公開第２００６／１０７６１７Ａ号；国際公開第２００７／０４６８９３号）。典型的には、このようなアプローチは妥協及びトレードオフを伴う。例えば国際公開第２０１３／１７４８７３号；国際公開第２０１１／１３３８８６号；及び国際公開第２０１０／１３６１７２号は、リンカーの使用によって、治療的設定に問題が生じる場合があることを開示しており、２つ以上の抗原に結合できるように、ＣＬ及びＣＨ１ドメインがそれぞれの自然位置から切り替わり、かつＶＬ及びＶＨドメインが多様化されている、三重特異性抗体を教示している（国際公開第２００８／０２７２３６号；国際公開第２０１０／１０８１２７号）。従って、これらの文書に開示されている分子は、結合特異性を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。国際公開第２０１３／１６３４２７号、及び国際公開第２０１３／１１９９０３号は、ＣＨ２ドメインを修飾して、結合ドメインを備える融合タンパク付加物を含有させるステップを開示している。この文書は、ＣＨ２が、エフェクタ機能の仲介において最低限の役割しか果たさないらしいことを記載している。国際公開第２０１０／０２８７９７号；国際公開第２０１００２８７９６号；及び国際公開第２０１０／０２８７９５号は、Ｆｃ領域が追加のＶＬ及びＶＨドメインで置換されて、３価結合分子を形成している、組み換え抗体を開示している。国際公開第２００３／０２５０１８号；及び国際公開第２００３０１２０６９号は、個々の鎖がｓｃＦｖドメインを含有する組み換えダイアボディを開示している。国際公開第２０１３／００６５４４号は、単一のポリペプチド鎖として合成された後、タンパク質分解に供されることによってヘテロ二量体構造が得られる、多価ｆａｂ分子を開示している。従って、これらの文書に開示されている分子は、エフェクタ機能を仲介する能力の全て又はある程度を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。国際公開第２０１４／０２２５４０号；国際公開第２０１３／００３６５２号；国際公開第２０１２／１６２５８３号；国際公開第２０１２／１５６４３０号；国際公開第２０１１／０８６０９１号；国際公開第２００８／０２４１８８号；国際公開第２００７／０２４７１５号；国際公開第２００７／０７５２７０号；国際公開第１９９８／００２４６３号；国際公開第１９９２／０２２５８３号；及び国際公開第１９９１／００３４９３号は、追加の結合ドメイン又は官能基を抗体又は抗体部分に付加するステップ（例えば抗体の
軽鎖にダイアボディを付加するステップ、又は抗体の軽鎖及び重鎖に追加のＶＬ及びＶＨドメインを付加するステップ、又は異種融合タンパク質を互いに対して付加するステップ若しくは複数のＦａｂドメインを互いに対して連鎖させるステップ）を開示している。従って、これらの文書に開示されている分子は、ナイーブ抗体構造を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。
【００５１】
本技術分野は更に、２つ以上の異なるエピトープ種と結合できる（即ち２価性又は多価性に加えて二重特異性又は多重特異性を呈することができる）という点でこのような天然抗体とは異なるダイアボディを産生できる可能性に注目している（例えばHolliger et al. (1993) “‘Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448;米国特許第２００４／００５８４００号
（Hollinger et al.);米国特許第２００４／０２２０３８８号；国際公開第０２／０２７８１号（Mertens et al.）； Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672；国際公開第０２／０２７８１  号（Mertens et al.）； Olafsen, T. et al. (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Protein Eng. Des. Sel. 17(1):21-27; Wu, A. et al. (2001) “Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange,” Protein Engineering 14(2):1025-1033; Asano et al. (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) “Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For
Cancer Therapy,” Cancer Res. 69(12):4941-4944を参照）。
【００５２】
ダイアボディの設計は、単鎖可変ドメイン断片（ｓｃＦｖ）として公知の抗体誘導体に基づく。このような分子は、軽鎖及び／又は重鎖可変ドメインを、短い連鎖ペプチドを用いて連結することによって作製される。Bird et al. (1988) (“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,” Science 242:423-426)は、一方の可変ドメインのカルボキシ末端と
他方の可変ドメインのアミノ末端との間の約３．５ｎｍを埋める連結ペプチドの例を記載している。他の配列のリンカーも設計及び使用されている（Bird et al. (1988) “Single-Chain Antigen-Binding Proteins,” Science 242:423-426）。リンカーは、薬剤の付
着又は剛性支持体の付着といった追加の機能のために修飾できる。単鎖変異体は、組み換えによって又は合成によって産生できる。ｓｃＦｖの合成産生に関しては、自動化されたシンセサイザを使用できる。ｓｃＦｖの組み換え産生に関しては、ｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドを含有する好適なプラスミドを、酵母、植物、昆虫若しくは哺乳類細胞等の真核細胞又は大腸菌等の原核細胞である好適な宿主細胞に導入できる。関心対象のｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーション等の従来の操作によって作製できる。得られたｓｃＦｖは、当該技術分野で公知の標準的なタンパク質精製技術を用いて単離できる。
【００５３】
非単一特異性ダイアボディの提供は、異なるエピトープを発現する複数の細胞を共連結（ｃｏ‐ｌｉｇａｔｅ）して共存させることができる能力を含むがこれに限定されない、抗体を上回る有意な利点を提供する。従って二重特異性ダイアボディは、療法及び免疫診断を含む広範な用途を有する。二重特異性は、様々な用途におけるダイアボディの設計及び加工の大幅な柔軟性を可能とし、これにより、多量体抗原の結合活性の上昇、異なる複数の抗原の架橋、及び両標的抗原の存在に基づく特定の細胞タイプに対する指向性標的化
を提供する。当該技術分野において公知のダイアボディ分子は、（〜５０ｋＤａ以下の小さいサイズのダイアボディに関して）その高い結合価、低い解離率及び循環からの迅速な排除により、腫瘍撮像の分野での特定の使用も示している（Fitzgerald et al. (1997) 
“Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,” Protein Eng. 10:1221）。
【００５４】
ダイアボディの二重特異性により、異なる細胞の共連結、例えば細胞毒性Ｔ細胞と腫瘍細胞との架橋のために上記ダイアボディを使用できるようになる（Staerz et al. (1985)
“Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells,” Nature 314:628-631, and Holliger et al. (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305; Marvin et al. (2005) “Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies,” Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658）。あるいは又は更に、二重特異性ダイアボディを用いて、異なる細胞の表面上又は単一の細胞上に受容体をコライゲーションできる。異なる細胞及び／又は受容体のコライゲーションは、エフェクタ機能及び／又は免疫細胞シグナリングを変調するために有用である。エピトープ結合部位を含む多重特異性分子（例えば二重特異性ダイアボディ）は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、抗原提示細胞又は他の単核細胞上で発現する、Ｂ７‐Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７‐Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ３２、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ６４、ＣＤ７０（ＣＤ２７Ｌ）、ＣＤ８０（Ｂ７‐１）、ＣＤ８６（Ｂ７‐２）、ＣＤ９４（ＫＬＲＤ１）、ＣＤ１３７（４‐１ＢＢ）、ＣＤ１３７Ｌ（４‐１ＢＢＬ）、ＣＤ２２６、ＣＴＬＡ‐４（ＣＤ１５２）、ガレクチン‐９、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＨＨＬＡ２、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＩＣＯＳＬ（ＣＤ２７５）、キラー活性化受容体（ＫＩＲ）、ＬＡＧ‐３（ＣＤ２２３）、ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４、ＣＤ２５８）、ＭＨＣクラスＩ若しくはＩＩ、ＮＫＧ２ａ、ＮＫＧ２ｄ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ１３４Ｌ）、ＰＤ１Ｈ、ＰＤ‐１（ＣＤ２７９）、ＰＤ‐Ｌ１（Ｂ７‐Ｈ１、ＣＤ２７４）、ＰＤ‐Ｌ２（Ｂ７‐ＣＤ、ＣＤ２７３）、ＰＶＲ（ＮＥＣＬ５、ＣＤ１５５）、ＳＩＲＰａ、ＴＣＲ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ‐３（ＨＡＶＣＲ２）、及び／又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ‐１Ｈ）といった、いずれの免疫細胞の表面決定因子を指向し得る。特に、免疫チェックポイント（又はそのリガンド）の制御に関与する細胞表面受容体を指向するエピトープ結合部位は、免疫チェックポイント分子の阻害シグナリングに拮抗するか又はこれをブロックすることによって、被験者の免疫応答を刺激、上方制御又は増強する、二重特異性又は多重特異性結合分子の生成において有用である。免疫チェックポイントの制御に関与する分子としては、限定するものではないが、Ｂ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ２２６、ＣＴＬＡ‐４、ガレクチン‐９、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＨＨＬＡ２、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３、ＬＩＧＨＴ、ＭＨＣクラスＩ若しくはＩＩ、ＮＫＧ２ａ、ＮＫＧ２ｄ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ１Ｈ、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＰＤ‐Ｌ２、ＰＶＲ、ＳＩＲＰａ、ＴＣＲ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ‐３及び／又はＶＩＳＴＡが挙げられる。
【００５５】
しかしながら、上述の利点は顕著なコストにつながる。このような非単一特異性ダイアボディの形成は、２つ以上の別個の異なるポリペプチドの良好な集合を必要とする（即ち上記形成は、ダイアボディが、異なるポリペプチド鎖種のヘテロ二量体形成によって形成されることを必要とする）。この事実は、同一のポリペプチド鎖のホモ二量体形成によって形成される単一特異性ダイアボディとは対照的である。非単一特異性ダイアボディを形成するために少なくとも２つの異なるポリペプチド（即ち２つのポリペプチド種）を提供しなければならないため、及びこのようなポリペプチドのホモ二量体形成は不活性分子をもたらす（Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588
）ため、このようなポリペプチドの産生は、同一種のポリペプチド間での共有結合を防止する（即ちホモ二量体化を防止する）ような方法で達成しなければならない（Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588）。従って本技術分野
は、このようなポリペプチドの非共有結合的連結を教示している（例えばOlafsen et al.
(2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem.
76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588; Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody
To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor
Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672
参照）。
【００５６】
しかしながら、本技術分野は、非共有結合的に連結したポリペプチドで構成される二重特異性ダイアボディが不安定であり、非機能性モノマーへと容易に分解することを認識している（例えばLu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672参照）。
【００５７】
この課題をものともせず、本技術分野は、ＤＡＲＴ（登録商標）（Ｄｕａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅ‐Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ）ダイアボディと呼ばれる、安定した共有結合ヘテロ二量体性非単一特異性ダイアボディの開発に成功した（例えば米国公開特許第２０１３‐０２９５１２１号；米国公開特許第２０１０‐０１７４０５３号；及び米国公開特許第２００９‐００６０９１０号；欧州公開特許第２７１４０７９号；欧州公開特許第２６０１２１６号；欧州公開特許第２３７６１０９号；欧州公開特許第２１５８２２１号；並びに国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号、並びにSloan, D.D. et al. (2015) “Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells,” PLoS Pathog. 11(11):e1005233. doi: 10.1371/journal.ppat.1005233; Al Hussaini, M. et al. (2015) “Targeting CD123 In AML Using A T-Cell Directed Dual-Affinity Re-Targeting (DART(R)) Platform,” Blood pii: blood-2014-05-575704; Chichili, G.R. et al. (2015) “A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates,” Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82; Moore, P.A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. et al. (2010) “Therapeutic Control
Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory
Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,” Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; Johnson, S. et al. (2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion,” J. Mol. Biol. 399(3):436-449参照）。このようなダイアボディは、２つ以上の共有結合的に複合体化したポリペプチドを備え、１つ又は複数のシステイン残基を、ジスルフィド結合を形成でき、これによって２つのポリペプチド鎖を共有結合させる、採用したポリペプチド種それぞれの中へと加工するステップを伴う。例えば、このような構造のＣ末端へのシステイン残基の追加は、ポリペプチド鎖間のジスルフィド結
合を可能とすることが分かっており、これは、２価分子の結合特性に干渉することなく、得られるヘテロ二量体を安定化させる。
【００５８】
最も単純な二重特異性ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディの２つのポリペプチドはそれぞれ、３つのドメインを備える。第１のポリペプチドは（Ｎ末端からＣ末端への方向に）：（ｉ）第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の結合領域を備える第１のドメイン；（ｉｉ）第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を備える第２のドメイン；及び（ｉｉｉ）システイン残基（又はシステイン含有ドメイン）と、上記ダイアボディの上記第２のポリペプチドとのヘテロ二量体化を促進して、上記ダイアボディの上記第１及び第２のポリペプチドを互いに共有結合させる役割を果たす、ヘテロ二量体促進ドメインとを含有する、第３のドメインを備える。第２のポリペプチドは（Ｎ末端からＣ末端への方向に）：（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）の結合領域を備える第１のドメイン；（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）の結合領域を備える第２のドメイン；及び（ｉｉｉ）システイン残基（又はシステイン含有ドメイン）と、上記第１のポリペプチド鎖の上記ヘテロ二量体促進ドメインと複合体化して、上記第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体を促進する、相補的ヘテロ二量体促進ドメインとを含有する、第３のドメインを含有する。上記第２のポリペプチド鎖の上記第３のドメインのシステイン残基（又はシステイン含有ドメイン）は、上記ダイアボディの上記第１のポリペプチド鎖に対する上記第２のポリペプチド鎖の共有結合を促進する役割を果たす。このような分子は安定しており、強力であり、また２つ以上の抗原を同時に結合する能力を有する。一実施形態では、上記第１及び第２のポリペプチドの上記第３のドメインはそれぞれ、上記ポリペプチドをジスルフィド結合によって一体に結合させる役割を果たすシステイン残基を含有する。図１は、このようなダイアボディの概略図を提供し、上記ダイアボディは、Ｅコイル／Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメイン及びシステイン含有リンカーを、共有結合のために利用する。図２及び図３Ａ〜３Ｃにおいて提示されているように、上記ポリペプチドのうちの一方又は両方は更に、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの配列を有してよく、これにより、上記２つのダイアボディポリペプチド間の複合体化によって、細胞（例えばＢリンパ球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球及び肥満細胞）のＦｃ受容体に結合できるＦｃ領域が形成される。以下でより詳細に提示されるように、このようなポリペプチド鎖のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインは、配列が同一である必要はなく、有利には、これら２つのポリペプチド鎖間の複合体化を促進するよう修飾される。
【００５９】
このような分子の多数の変異型が記載されている（例えば、米国公開特許第２０１５／０１７５６９７号；米国公開特許第２０１４／０２５５４０７号；米国公開特許第２０１４／００９９３１８号；米国公開特許第２０１３／０２９５１２１号；米国公開特許第２０１０／０１７４０５３号；及び米国公開特許第２００９／００６０９１０号；欧州公開特許第２７１４０７９号；欧州公開特許第２６０１２１６号；欧州公開特許第２３７６１０９号；欧州公開特許第２１５８２２１号；及び国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号参照）。これらのＦｃ領域含有ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディは、２ペアのポリペプチド鎖を含んでよい。第１のポリペプチド鎖は（Ｎ末端からＣ末端への方向に）：（ｉ）第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の結合領域を備える第１のドメイン；（ｉｉ）第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を備える第２のドメイン；（ｉｉｉ）システイン残基（又はシステイン含有ドメイン）を含有し、上記ダイアボディの上記第２のポリペプチドとのヘテロ二量体化を促進して、上記ダイアボディの上記第１及び第２のポリペプチドを互いに共有結合させる役割を果たす、第３のドメイン；並びに（ｉｖ）ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを備える。第２のポリペプチドは（Ｎ末端からＣ末端への方向に）：（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）の結合領域を備える第１のドメイン；（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）の
結合領域を備える第２のドメイン；及び（ｉｉｉ）システイン残基（又はシステイン含有ドメイン）と、上記第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化を促進するヘテロ二量体促進ドメインとを含有する、第３のドメインを含有する。ここで、２つの第１のポリペプチドは互いに複合体化して、Ｆｃ領域を形成する。図３Ａ〜３Ｃは、異なるヘテロ二量体促進ドメインを利用するこのようなダイアボディの３つの変異型の概略図を提示する。
【００６０】
他のＦｃ領域含有ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディは、３つのポリペプチド鎖を含んでよい。このようなＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディの第１のポリペプチドは、３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。このようなＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディの第２のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）ダイアボディの第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメインを含有する。このようなＤＡＲＴ（商標登録）ダイアボディの第３のポリペプチドは、ＣＨ２‐ＣＨ３配列を備える。従って、このようなＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディの第１及び第２のポリペプチド鎖は、一体として関連して、エピトープに結合可能なＶＬ１／ＶＨ１結合部位、及び第２のエピトープに結合可能なＶＬ２／ＶＨ２結合部位を形成する。このような比較的複雑なＤＡＲＴ（登録商標）分子はまた、共有結合複合体を形成する機能を果たすシステイン含有ドメインを有する。よって上記第１及び第２のポリペプチドは、それぞれの第３のドメイン内のシステイン残基が関与するジスルフィド結合を介して、互いに結合される。特に、第１及び第３のポリペプチド鎖は互いと複合体化して、ジスルフィド結合によって安定化されたＦｃ領域を形成する。図４Ａ〜４Ｂは、３つのポリペプチド鎖を含むこのようなダイアボディの概略図を提示する。
【００６１】
更に他のＦｃ領域含有ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディは、最大３つの異なる免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖可変ドメイン（ＶＬ１／ＶＨ１、ＶＬ２／ＶＨ２及びＶＬ３／ＶＨ３と呼ばれる）由来の結合領域を備えてよい、５つのポリペプチド鎖を含み得る。例えば、このようなダイアボディの第１のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有してよい。このようなダイアボディの第２及び第５のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；及び（ｉｉ）ＣＬ含有ドメインを含有してよい。このようなダイアボディの第３のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメイン；（ｉｖ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｖ）ＶＨ３含有ドメイン：及び（ｖｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを含有してよく、上記ヘテロ二量体促進ドメインは、第３の鎖と第４の鎖との二量体化を促進する。このようなダイアボディの第４のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ３含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）上記ダイアボディの第３のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメインを含有してよい。ここで上記第１及び第３のポリペプチドは互いに複合体化して、Ｆｃ領域を形成する。このような比較的複雑なＤＡＲＴ（登録商標）分子はまた、共有結合複合体を形成する機能を果たすシステイン含有ドメインも有し、これにより各ポリペプチド鎖は、システイン残基を伴うジスルフィド結合によって、少なくとも１つの追加のポリペプチド鎖に結合する。好ましくは、このようなドメインは、Ｎ末端からＣ末端への方向に並ぶ。図５は、５つのポリペプチド鎖を含むこのようなダイアボディの概略図を提示する。
【００６２】
４価分子が望ましいもののＦｃは必要ない場合の用途のために、代替的な構成が当該技術分野において公知であり、これは、ＶＨ１、ＶＬ２、ＶＨ２、及びＶＬ２ドメインをそれぞれ有する２つの同一の鎖のホモ二量体化によって形成される「ＴａｎｄＡｂ」とも呼ばれる４価タンデム抗体を含むが、これに限定されない（例えば米国公開特許第２００５-００７９１７０号；米国公開特許第２００７-００３１４３６号；米国公開特許第２０１０-００９９８５３号；米国公開特許第２０１１-０２０６６７号；米国公開特許第２０１
３-０１８９２６３号；欧州公開特許第１０７８００４号；欧州公開特許第２３７１８６
６号；欧州公開特許第２３６１９３６号；及び欧州公開特許第１２９３５１４号；国際公開第１９９９／０５７１５０号；国際公開第２００３／０２５０１８号；及び国際公開第２０１３／０１３７００号参照）。
【００６３】
近年、２つのダイアボディ型結合ドメイン及び１つの非ダイアボディ型結合ドメイン、並びにＦｃ領域を組み込んだ３価構造が記載されている（例えばＰＣＴ出願第PCT/US15/33076号、名称「Tri‐Specific Binding Molecules and Methods of Use Thereof」、２０１５年５月２９日出願；及びＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／３３０８１号、名称「Tri
‐Specific Binding Molecules That Specifically Bind to Multiple Cancer Antigens and Methods of Use Thereof」、２０１５年５月２９日出願を参照）。このような３価分子を利用して、単一特異性、二重特異性又は三重特異性分子を生成してよい。図６Ａ〜６Ｆは、３つ又は４つのポリペプチド鎖を含むこのような３価分子の概略図を提示する。
【００６４】
ＩＶ．本発明の抗ヒトＰＤ‐１結合分子
本発明の好ましいＰＤ‐１結合分子としては、抗体、ダイアボディ、ＢｉＴＥ等が挙げられ、これらは、ヒトＰＤ‐１（CD２７９）の連続又は不連続（例えば配座）部分（エピトープ）に結合できる。本発明のＰＤ‐１結合分子は好ましくは、１つ又は複数の非ヒト種、特に霊長類種（及び特にカニクイザル等の霊長類種）のＰＤ‐１分子に結合する能力も示す。代表的なヒトＰＤ‐１ポリペプチド（ＮＣＢＩ配列ＮＰ＿００５００９．２；２０アミノ酸残基シグナル配列（下線）及び２６８アミノ酸残基成熟タンパク質を含む）は、アミノ酸配列（配列番号６８）：
MQIPQAPWPV VWAVLQLGWR PGWFLDSPDR PWNPPTFSPA LLVVTEGDNA
TFTCSFSNTS ESFVLNWYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQL
PNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE
VPTAHPSPSP RPAGQFQTLV VGVVGGLLGS LVLLVWVLAV ICSRAARGTI
GARRTGQPLK EDPSAVPVFS VDYGELDFQW REKTPEPPVP CVPEQTEYAT
IVFPSGMGTS SPARRGSADG PRSAQPLRPE DGHCSWPL
を有する。
【００６５】
特定の実施形態では、本発明のＰＤ‐１結合分子は、以下の基準のうちのいずれ（１つ又は複数）を特徴とする：
（１）刺激ヒトＴ細胞の表面に内在的に発現したヒトＰＤ‐１に特異的に結合する；
（２）平衡結合定数（ＫD）４０ｎＭ以下でヒトＰＤ‐１に特異的に結合する；
（３）平衡結合定数（ＫD）５ｎＭ以下でヒトＰＤ‐１に特異的に結合する；
（４）オン速度（Ｋa）１．５×１０4Ｍ-1分-1以上でヒトＰＤ‐１に特異的に結合する；
（５）オン速度（Ｋa）９０．０×１０4Ｍ-1分-1以上でヒトＰＤ‐１に特異的に結合する；
（６）オフ速度（Ｋd）７×１０-4分-1以下でヒトＰＤ‐１に特異的に結合する；
（７）オフ速度（Ｋd）２×１０-4分-1以下でヒトＰＤ‐１に特異的に結合する；
（８）非ヒト霊長類ＰＤ‐１（例えばカニクイザルのＰＤ‐１）に特異的に結合する；
（９）ＰＤ‐１に対するＰＤ‐１リガンド（ＰＤ‐Ｌ１／ＰＤ‐Ｌ２）の結合／阻害活性を阻害する（即ちブロックするか若しくはこれに干渉する）；
（１０）免疫応答を刺激する；及び／又は
（１１）抗ヒトＬＡＧ‐３抗体との相乗効果により、抗原特異性Ｔ細胞応答を刺激する。
【００６６】
本明細書において使用される場合、用語「抗原特異的Ｔ細胞応答（ａｎｔｉｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ‐ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」は、Ｔ細胞が特異的である抗原に
よるＴ細胞の刺激に起因する、Ｔ細胞の応答を指す。抗原特異的刺激に対するＴ細胞の応答の非限定的な例としては、増殖及びサイトカイン産生（例えばＴＮＦ‐α、ＩＦＮ‐γ産生）が挙げられる。抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する、分子の能力は、例えば本明細書に記載されている黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢ型抗原（「ＳＥＢ」）刺激ＰＢＭＣアッセイを用いて決定できる。
【００６７】
本発明の好ましいＰＤ‐１結合分子は、マウス抗ヒトＰＤ‐１モノクローナル抗体「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １」、「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２」、「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３」、「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４」、「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５」、「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６」、「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７」、「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８」、「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９」、「ＰＤ‐１
ｍＡｂ  １０」、「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１」、「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２」、「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３」、「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４」又は「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５」のＶＨ及び／又はＶＬドメインを有し、より好ましくは、このような抗ヒトＰＤ‐１モノクローナル抗体の、ＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て、及び／
又はＶＬドメインのＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを有する。このような
好ましい抗ヒトＰＤ‐１結合分子は、二重特異性（又は多重特異性）抗体、キメラ又はヒト化抗体、ＢｉＴｅ、ダイアボディ等、及び変異型Ｆｃ領域を有するこのような結合分子を含む。
【００６８】
本発明は特に、以下：
（Ａ）（１）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １のＶＨドメインの３つのＣＤＲH；
（２）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（３）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １のＶＨドメインの３つのＣＤＲH、及びＰＤ‐１  
ｍＡｂ  １のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（４）ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １  ＶＨ１のＶＨドメイン；
（５）ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １  ＶＬ１のＶＬドメイン；
（６）ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １のＶＨ及びＶＬドメイン；
（Ｂ）（１）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２のＶＨドメインの３つのＣＤＲH；
（２）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（３）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２のＶＨドメインの３つのＣＤＲH、及びＰＤ‐１  
ｍＡｂ  ２のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（４）ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２  ＶＨ１のＶＨドメイン；
（５）ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２  ＶＬ１のＶＬドメイン；
（６）ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２のＶＨ及びＶＬドメイン；
（Ｃ）（１）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３のＶＨドメインの３つのＣＤＲH；
（２）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（３）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３のＶＨドメインの３つのＣＤＲH、及びＰＤ‐１  
ｍＡｂ  ３のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（Ｄ）（１）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４のＶＨドメインの３つのＣＤＲH；
（２）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（３）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４のＶＨドメインの３つのＣＤＲH、及びＰＤ‐１  
ｍＡｂ  ４のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（Ｅ）（１）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５のＶＨドメインの３つのＣＤＲH；
（２）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（３）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５のＶＨドメインの３つのＣＤＲH、及びＰＤ‐１  
ｍＡｂ  ５のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（Ｆ）（１）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のＶＨドメインの３つのＣＤＲH；
（２）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（３）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のＶＨドメインの３つのＣＤＲH、及びＰＤ‐１  
ｍＡｂ  ６のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（Ｇ）（１）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７のＶＨドメインの３つのＣＤＲH；
（２）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７若しくはｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ２若しくはｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ３のＶＬドメインの３つのＣＤＲL;
（３）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７のＶＨドメインの３つのＣＤＲH、及びＰＤ‐１  
ｍＡｂ  ７若しくはｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ２若しくはｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ３のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（４）ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＨ１若しくはｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＨ２のＶＨドメイン；
（５）ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ１若しくはｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ２若しくはｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ  ３のＶＬドメイン；
（６）ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．１）若しくはｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）若しくはｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．３）若しくはｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（２．１）若しくはｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（２．２）若しくはｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（２．３）のＶＨ及びＶＬドメイン；
（Ｈ）（１）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８のＶＨドメインの３つのＣＤＲH；
（２）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（３）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８のＶＨドメインの３つのＣＤＲH、及びＰＤ‐１  
ｍＡｂ  ８のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（Ｉ）（１）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９若しくはｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９  ＶＨ２のＶＨドメインの３つのＣＤＲH；
（２）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９若しくはｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９  ＶＬ２のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（３）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９若しくはｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９  ＶＨ２のＶＨドメインの３つのＣＤＲH及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９若しくはｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９  Ｖ
Ｌ２のＶＬドメインの３つのＣＤＲL； 
（４）ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９  ＶＨ１若しくはｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９  ＶＨ２のＶＨドメイン；
（５）ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９  ＶＬ１若しくはｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９  ＶＬ２のＶＬドメイン；
（６）ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９（１．１）若しくはｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９（１．２）若しくはｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９（２．１）若しくはｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９（２．２）のＶＨ及びＶＬドメインｌ
（Ｊ）（１）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０のＶＨドメインの３つのＣＤＲH；
（２）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（３）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０のＶＨドメインの３つのＣＤＲH、及びＰＤ‐１
ｍＡｂ  １０のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（Ｋ）（１）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１のＶＨドメインの３つのＣＤＲH；
（２）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（３）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１のＶＨドメインの３つのＣＤＲH、及びＰＤ‐１
ｍＡｂ  １１のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（Ｌ）（１）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２のＶＨドメインの３つのＣＤＲH；
（２）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（３）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２のＶＨドメインの３つのＣＤＲH、及びＰＤ‐１
ｍＡｂ  １２のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（Ｍ）（１）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３のＶＨドメインの３つのＣＤＲH；
（２）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（３）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３のＶＨドメインの３つのＣＤＲH、及びＰＤ‐１
ｍＡｂ  １３のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（Ｎ）（１）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４のＶＨドメインの３つのＣＤＲH；
（２）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（３）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４のＶＨドメインの３つのＣＤＲH、及びＰＤ‐１
ｍＡｂ  １４のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（Ｏ）（１）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５のＶＨドメインの３つのＣＤＲH；
（２）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（３）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５のＶＨドメインの３つのＣＤＲH、及びＰＤ‐１
ｍＡｂ  １５のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（４）ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５  ＶＨ１のＶＨドメイン；
（５）ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５  ＶＬ１のＶＬドメイン；
（６）ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５のＶＨ及びＶＬドメイン；
を有するか、又はＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４若しくはＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５と同一のエピトープに結合する、若しくは結合に関して競合する、ＰＤ‐１結合ドメインを備えるＰＤ‐１結合分子に関する。
【００６９】
Ａ．抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １
１．マウス抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号６９）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）。
DVQLQESGPG RVKPSQSLSL TCTVTGFSIT NDYAWNWIRQ FPGNKLEWMG 
HITYSGSTSY NPSLKSRISI TRDTSKNHFF LQLSSVTPED TATYYCARDY 
GSGYPYTLDY WGQGTSVTVS S
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １のＣＤＲH１（配列番号７１）：NDYAWN
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １のＣＤＲH２（配列番号７２）：HITYSGSTSYNPSLKS
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １のＣＤＲH３（配列番号７３）：DYGSGYPYTLDY
【００７０】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １のＶＨドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号７０（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
cagatccagt gatgtgcagc ttcaggagtc gggacctggc cgggtgaaac 
cttctcagtc tctgtccctc acctgcactg tcactggctt ctcaatcacc 
aatgattatg cctggaactg gatccgacag tttccaggaa acaaactgga 
gtggatgggc cacataacct acagtggcag cactagctac aacccatctc 
tcaaaagtcg aatctctatc actcgggaca catccaagaa ccacttcttc 
ctgcagttga gttctgtgac tcctgaggac acagccacat attactgtgc 
aagagattac ggtagtggct acccctatac tttggactac tggggtcaag 
gtacctcagt caccgtctcc tcc
である。
【００７１】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号７４）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
QIVLTQSPAL MSASPGEKVT MTCSATSIVS YVYWYQQKPG SSPQPWIYLT 
SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISSMEAE DAATYYCQQW SDNPYTFGGG 
TKLEIK
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １のＣＤＲL１（配列番号７６）：SATSIVSYVY
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １のＣＤＲL２（配列番号７７）：LTSNLAS
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １のＣＤＲL３（配列番号７８）：QQWSDNPYT
【００７２】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １のＶＬドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号７５（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
caaattgttc tcacccagtc tccagcactc atgtctgcat ctccagggga 
gaaggtcacc atgacctgca gtgccacctc aattgtaagt tacgtttact 
ggtaccagca gaagcctgga tcctcccccc aaccctggat ttatctcaca 
tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc ttcagtggca gtgggtctgg 
gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa gatgctgcca 
cttattactg ccagcagtgg agtgataacc cgtacacgtt cggagggggg 
accaagctgg aaataaaa
である。
【００７３】
２．「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １」の形成のための、抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １のヒト化
上述のマウス抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １を、抗原エピトープが識別された場合にヒト化し、更に脱免疫化して、ヒトレシピエントへの投与時にその抗原性を低減するための抗ヒトＰＤ‐１抗体のヒト化の能力を実証した。ヒト化により、ここでは「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １  ＶＨ１」と呼ばれる１つのヒト化ＶＨドメインと、ここでは「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １  ＶＬ１」と呼ばれる１つのヒト化ＶＬドメインとが得られた。従って、上記ヒト化ＶＨドメインと対合した上記ヒト化ＶＬドメインを備える抗体を、「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １」と呼ぶ。
【００７４】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １  ＶＨ１のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号７９）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
DVQLQESGPG LVKPSQTLSL TCTVSGFSIS NDYAWNWIRQ PPGKGLEWIG 
HITYSGSTSY NPSLKSRLTI TRDTSKNQFV LTMTNMDPVD TATYYCARDY 
GSGYPYTLDY WGQGTTVTVS S
【００７５】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １  ＶＨ１をエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号８０（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは下線を付して示す）：
gacgtacagc tccaggaaag tggcccaggt ctggtgaagc catcccagac 
actgagcctg acttgcaccg tgagtggctt ctccatctca aatgactacg 
cctggaattg gattaggcag cctcccggta aagggctgga gtggatcggc 
cacatcacat acagcggctc cacatcatat aatcccagtc tgaagagccg 
tcttaccatt actcgcgaca ctagtaagaa ccagtttgtt ctgaccatga 
ccaacatgga ccctgtggat actgcaacat actattgtgc tcgagattat 
ggttctggtt acccttatac actcgactac tggggacagg gaaccactgt 
gaccgtgagc tcc
である。
【００７６】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １  ＶＬ１のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号８１）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
EIVLTQSPAT LSVSPGEKVT ITCSATSIVS YVYWYQQKPG QAPQPLIYLT 
SNLASGIPAR FSGSGSGTDF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SDNPYTFGGG 
TKVEIK
【００７７】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １  ＶＬ１をエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号８２（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
gaaatcgttc tgacccagag cccagcaacc ctgtctgtct cccccggaga 
aaaggtcacc attacttgct ctgctacttc tatcgtgtcc tacgtgtact 
ggtatcagca gaagcccggt caggctcccc agccattgat atatctgacc 
agcaacctgg cttctggtat cccagctcgt ttttccggta gcgggtccgg 
gactgatttc actttgacta tcagctctct ggaggcagaa gacgccgcca 
cctattattg tcaacagtgg tcagacaatc catacacttt tggcggtggc 
accaaagtcg aaataaag
である。
【００７８】
Ｂ．抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２
１．マウス抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号８３）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFVFS SFGMHWVRQA PEKGLEWVAY 
ISSGSMSISY ADTVKGRFTV TRDNAKNTLF LQMTSLRSED TAIYYCASLS 
DYFDYWGQGT TLTVSS
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２のＣＤＲH１（配列番号８５）：SFGMH
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２のＣＤＲH２（配列番号８６）：YISSGSMSISYADTVKG
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２のＣＤＲH３（配列番号８７）：LSDYFDY
【００７９】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２のＶＨドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号８４（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
gatgtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc 
ccggaaactc tcctgtgcag cctctggatt cgttttcagt agctttggaa 
tgcactgggt tcgtcaggct ccagagaagg ggctggagtg ggtcgcatac 
atcagtagtg gcagtatgag catttcctat gcagacacag tgaagggccg 
attcaccgtc accagagaca atgccaagaa caccctgttc ctgcaaatga 
ccagtctaag gtctgaggac acggccattt attactgtgc atccctgagt 
gactactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctcc
である。
【００８０】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号８８）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DVVMSQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSTGNTYLHW YLQKPGQSPK 
LLIYRVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV FFCSQTTHVP 
WTFGGGTKLE IK
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２のＣＤＲL１（配列番号９０）：RSSQSLVHSTGNTYLH
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２のＣＤＲL２（配列番号９１）：RVSNRFS
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２のＣＤＲL３（配列番号９２）：SQTTHVPWT
【００８１】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２のＶＬドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号８９（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
gatgttgtga tgtcccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga 
tcaagcctcc atctcttgca gatctagtca gagccttgtt cacagtactg 
gaaacaccta tttacattgg tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag 
ctcctgatct acagggtttc taaccgattt tctggggtcc ccgacaggtt 
cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agtagagtgg 
aggctgagga tctgggagtt tttttctgct ctcaaactac acatgttccg 
tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa
である。
【００８２】
２．「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２」を形成するための、抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２のヒト化
上述のマウス抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２を、抗原エピトープが識別された場合にヒト化し、更に脱免疫化して、ヒトレシピエントへの投与時にその抗原性を低減
するための抗ヒトＰＤ‐１抗体のヒト化の能力を実証した。ヒト化により、ここでは「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２  ＶＨ１」と呼ばれる１つのヒト化ＶＨドメインと、ここでは「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２  ＶＬ１」と呼ばれる１つのヒト化ＶＬドメインとが得られた。従って、上記ヒト化ＶＨドメインと対合した上記ヒト化ＶＬドメインを備えるいずれの抗体を、「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２」と呼ぶ。
【００８３】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２  ＶＨ１のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号９３）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFVFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY 
ISSGSMSISY ADTVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRTED TALYYCASLS 
DYFDYWGQGT TVTVSS
【００８４】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２  ＶＨ１をエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号９４（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
gaagtgcaat tggttgagag tggtggtggc ctggtgcagc caggtggaag 
tctgcggttg tcctgtgcag caagcggatt tgtgttcagc tcttttggga 
tgcattgggt gcgccaggct cccggcaagg gtctcgagtg ggtagcatac 
atctccagcg ggtccatgtc tattagttat gccgacacag tgaaaggcag 
gtttactatc tcccgtgaca atgcaaaaaa cacactgtac ctgcaaatga 
atagcctgcg caccgaggac accgccttgt actactgcgc ttccctgtct 
gattacttcg actactgggg tcagggcaca actgtgacag tttcttcc
である。
【００８５】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２  ＶＬ１のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号９５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCRSSQSLV HSTGNTYLHW YLQKPGQSPQ 
LLIYRVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCSQTTHVP 
WTFGQGTKLE IK
【００８６】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２  ＶＬ１をエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号９６（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
gacgttgtga tgacacagtc accactgagt ctgccagtta ccctgggcca 
gccagccagt atttcttgtc ggagttcaca gagtctggta cattccacag 
gaaatacata tctccattgg tacctgcaaa aaccagggca gagcccccag 
ctgctgattt atagagtgtc taatcgattt tctggcgtgc cagatcggtt 
cagcggcagc gggtctggca ctgatttcac actgaaaatc tctagggtgg 
aggcagagga cgtaggcgtt tactactgta gtcagaccac ccatgtaccc 
tggacttttg gccaaggtac taagctggaa atcaag
である。
【００８７】
Ｃ．マウス抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号９７）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）；
QVQLQQSGAE LVRPGASVTL SCKASGYTFT DYVMHWVKQT PVHGLEWIGT 
IDPETGGTAY NQKFKGKAIL TADKSSNTAY MELRSLTSED SAVYYFTREK 
ITTIVEGTYW YFDVWGTGTT VTVSS
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３のＣＤＲH１（配列番号９９）：DYVMH
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３のＣＤＲH２（配列番号１００）：TIDPETGGTAYNQKFKG
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３のＣＤＲH３（配列番号１０１）： EKITTIVEGTYWYFDV
【００８８】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３  のＶＨドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号９８（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
caggttcaac tgcaacagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc 
agtgacgctg tcctgcaagg cttcgggcta cacatttact gactatgtaa 
tgcactgggt gaagcagaca cctgtgcatg gcctggaatg gattggaact 
attgatcctg aaactggtgg tactgcctac aatcagaagt tcaagggcaa
ggccatactg actgcagaca agtcctccaa cacagcctac atggagctcc
gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactttac aagagagaag 
attactacga tagtagaggg gacatactgg tacttcgatg tctggggcac 
agggaccacg gtcaccgtct cctca
である。
【００８９】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０２）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DVLLTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQNIV HSNGDTYLEW YLQKPGQSPK 
LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHLP 
YTFGGGTKLE IK
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３のＣＤＲL１（配列番号１０４）：RSSQNIVHSNGDTYLE
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３のＣＤＲL２（配列番号１０５）：KVSNRFS
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３のＣＤＲL３（配列番号１０６）：FQGSHLPYT
【００９０】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３  のＶＬドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１０３（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）
：
gatgttttgc tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga 
tcaagcctcc atctcttgca gatctagtca gaacattgta catagtaatg 
gagacaccta tttggaatgg tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag 
ctcctgatct ataaagtttc caaccgattt tctggggtcc cagacaggtt 
cagtggcagt gggtcaggga cagattttac actcaaaatc agcagagtgg 
aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatcttccg 
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa
である。
【００９１】
Ｄ．マウス抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１０７）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFVFS SFGMHWVRQA PEKGLEWVAY 
ISSGSMSISY ADTVKGRFTV TRDNAKNTLF LQMTSLRSED TAIYYCASLT 
DYFDYWGQGT TLTVSS 
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４のＣＤＲL１（配列番号１０９）：SFGMH
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４のＣＤＲL２（配列番号１１０）：YISSGSMSISYADTVKG
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４のＣＤＲL３（配列番号１１１）：LTDYFDY
【００９２】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４のＶＨドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１０８（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
gatgtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc 
ccggaaactc tcctgtgcag cctctggatt cgttttcagt agctttggaa 
tgcactgggt tcgtcaggct ccagagaagg ggctggagtg ggtcgcatat 
attagtagtg gcagtatgag tatttcctat gcagacacag tgaagggccg 
attcaccgtc accagagaca atgccaagaa caccctgttc ctgcaaatga 
ccagtctaag gtctgaggac acggccattt attactgtgc atccctgact 
gactactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca
である。
【００９３】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１１２）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DVVMSQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSTGNTYFHW YLQKPGQSPK 
LLIYRVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQTTHVP 
WTFGGGTKLE IK
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４のＣＤＲL１（配列番号１１４）：RSSQSLVHSTGNTYFH
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４のＣＤＲL２（配列番号１１５）：RVSNRFS
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４のＣＤＲL３（配列番号１１６）：SQTTHVPWT
【００９４】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４のＶＬドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１１３（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
gatgttgtga tgtcccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga 
tcaagcctcc atctcctgca gatctagtca gagccttgtt cacagtactg 
gaaacaccta tttccattgg tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag 
ctcctgatct acagggtttc taaccgattt tctggggtcc ccgacaggtt 
cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg 
aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaactac acatgttccg 
tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa
である。
【００９５】
Ｅ．マウス抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１７）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
QVQLQQPGVE LVRPGASVKL SCKASGYSFT AYWMNWMKQR PGQGLEWIGV 
IHPSDSETWL NQKFKDKATL TVDKSSSTAY MQLISPTSED SAVYYCAREH 
YGSSPFAYWG QGTLVTVSA 
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５のＣＤＲH１（配列番号１１９）：AYWMN
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５のＣＤＲH２（配列番号１２０）：VIHPSDSETWLNQKFKD
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５のＣＤＲH３（配列番号１２１）：EHYGSSPFAY
【００９６】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５のＶＨドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１１８（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
caggtccaac tgcagcagcc tggggttgaa ctggtgaggc ctggagcttc 
agtgaagctg tcctgcaagg cttctggcta ctccttcacc gcctactgga 
tgaactggat gaaacagagg cctggacaag gccttgagtg gattggcgtg 
attcatcctt ccgatagtga aacttggtta aatcagaagt tcaaggacaa 
ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac atgcaactca 
tcagcccgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagagagcac 
tacggtagta gcccgtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt 
ctctgca
である。
【００９７】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１２２）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRANESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIYAASNQGS GVPARFSGSG SGTDFSLNIH PMEEDDTAMY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKLEI K
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５のＣＤＲL１（配列番号１２４）：RANESVDNYGMSFMN
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５のＣＤＲL２（配列番号１２５）：AASNQGS
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５のＣＤＲL３（配列番号１２６）：QQSKEVPYT
【００９８】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５のＶＬドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１２３（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca 
gagggccacc atctcctgca gagccaacga aagtgttgat aattatggca 
tgagttttat gaactggttc caacagaaac caggacagcc acccaaactc 
ctcatctatg ctgcatccaa ccaaggatcc ggggtccctg ccaggtttag 
tggcagtggg tctgggacag atttcagcct caacatccat cctatggagg 
aggatgatac tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtac 
acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa
である。
【００９９】
Ｆ．マウス抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１２７）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
EVKLVESGGG LVNPGGSLKL SCAASGFTFS SYGMSWVRQT PEKRLEWVAT 
ISGGGSDTYY PDSVKGRFTI SRDNAKNNLY LQMSSLRSED TALYYCARQK 
ATTWFAYWGQ GTLVTVST 
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のＣＤＲH１（配列番号１２９）：SYGMS
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のＣＤＲH２（配列番号１３０）：TISGGGSDTYYPDSVKG
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のＣＤＲH３（配列番号１３１）：QKATTWFAY
【０１００】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のＶＨドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１２８（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
gaaatcgtac tcacccagtc acctgcaacc ctttctctga gccccggtga 
acgtgccact ctcagctgca gagcaagtga gagtgtggac aattacggca 
tgtccttcat gaactggttt cagcagaagc ctgggcagcc acctaagctg 
ctcatccacg ccgcctctaa ccgcggatct ggggtgcctt cacgtttttc 
tggatcagga agtggcactg acttcaccct tacaatcagc tctctggagc 
cagaggactt tgccgtctat ttctgccagc aatctaaaga ggtgccctat 
acttttggtg gcgggaccaa ggttgagatc aaa
である。
【０１０１】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１３２）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASESVD NYGISFMNWF QQKPGQPPKL 
LIYPASNQGS GVPARFSGSG SGTDFSLNIH PMEEDDAAMY FCQQSKEVPW 
TFGGGTKLEI K
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のＣＤＲL１（配列番号１３４）：RASESVDNYGISFMN
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のＣＤＲL２（配列番号１３５）：PASNQGS
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のＣＤＲL３（配列番号１３６）：QQSKEVPWT
【０１０２】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のＶＬドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１３３（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca 
gagggccacc atctcctgca gagccagcga aagtgttgat aattatggca 
ttagttttat gaactggttc caacagaaac caggacagcc acccaaactc 
ctcatctatc ctgcatccaa ccaaggatcc ggggtccctg ccaggtttag 
tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat cctatggagg 
aggatgatgc tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtgg 
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa
である。
【０１０３】
Ｇ．抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７
１．マウス抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１３７）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
QVQLQQPGAE LVRPGASVKL SCKASGYSFT SYWMNWVKQR PGQGLEWIGV 
IHPSDSETWL DQKFKDKATL TVDKSSTTAY MQLISPTSED SAVYYCAREH 
YGTSPFAYWG QGTLVTVSS
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７のＣＤＲH１（配列番号１３９）：SYWMN
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７のＣＤＲH２（配列番号１４０）：VIHPSDSETWLDQKFKD
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７のＣＤＲH３（配列番号１４１）：EHYGTSPFAY
【０１０４】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７のＶＨドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１３８（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
gaggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaggc ctggagcttc 
agtgaagctg tcctgcaagg cttctggcta ctccttcacc agctactgga 
tgaactgggt gaagcagagg cctggacaag gccttgagtg gattggcgtg 
attcatcctt ccgatagtga aacttggtta gatcagaagt tcaaggacaa 
ggccacattg actgtagaca aatcctccac cacagcctac atgcaactca 
tcagcccgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagggagcac 
tacggtacta gcccgtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt 
gtcttcc
である。
【０１０５】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１４２）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRANESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNQGS GVPARFSGSG FGTDFSLNIH PMEEDDAAMY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKLEI K
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７のＣＤＲL１（配列番号１４４）：RANESVDNYGMSFMN
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７のＣＤＲL２（配列番号１４５）：AASNQGS
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７のＣＤＲL３（配列番号１４６）：QQSKEVPYT
【０１０６】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７のＶＬドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１４３（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca 
gagggccacc atctcctgca gagccaacga aagtgttgat aattatggca 
tgagttttat gaactggttc caacagaaac caggacagcc acccaaactc 
ctcatccatg ctgcatccaa ccaaggatcc ggggtccctg ccaggtttag 
tggcagtggg tttgggacag acttcagcct caacatccat cctatggagg 
aggatgatgc tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtac 
acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa
である。
【０１０７】
２．「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７」を形成するための、抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７のヒト化
上述のマウス抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７を、抗原エピトープが識別された場合にヒト化し、更に脱免疫化して、ヒトレシピエントへの投与時にその抗原性を低減するための抗ヒトＰＤ‐１抗体のヒト化の能力を実証した。ヒト化により、ここでは「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＨ１」及び「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＨ２」と呼ばれる２つのヒト化ＶＨドメインと、ここでは「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ１」、「ｈＰＤ‐１
ｍＡｂ  ７  ＶＬ２」及び「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ３」と呼ばれる３つのヒト化ＶＬドメインとが得られた。ヒト化ＶＬドメインのうちのいずれが、ヒト化ＶＨドメインのうちのいずれと対合し得る。従って、上記ヒト化ＶＨドメインと対合した上記ヒト化ＶＬドメインのうちの１つを備えるいずれの抗体を、「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７」と呼び、ヒト化ＶＨ／ＶＬドメインの特定の組み合わせを、具体的なＶＨ／ＶＬドメインに対する参照によって呼称する。例えばｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＨ１及びｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ２を備えるヒト化抗体は、具体的に「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）」と呼ばれる。
【０１０８】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＨ１のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１４７）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV 
IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH 
YGTSPFAYWG QGTLVTVSS
【０１０９】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＨ１をエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１４８（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
caagttcaat tggtacagag cggggcagag gtgaagaaac ccggcgccag 
tgttaaggtg tcctgcaaag ccagcggtta cagctttaca agctattgga 
tgaattgggt gcgtcaagca ccagggcagg gtctggaatg gattggggtg 
atacatcctt ctgacagcga aacatggttg gaccagaaat ttaaagatcg 
tgtgacaatt acagtcgata agtccacaag cactgcttac atggaactct 
ccagcttgcg gtccgaggac accgctgtgt attattgcgc cagagagcac 
tacggcacat caccttttgc atactggggc cagggaactc tcgtaaccgt 
atcctcc
である。
【０１１０】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＨ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１４９）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWAGV 
IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH 
YGTSPFAYWG QGTLVTVSS
【０１１１】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＨ２をエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１５０（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
caagttcaat tggtacagag cggggcagag gtgaagaaac ccggcgccag 
tgttaaggtg tcctgcaaag ccagcggtta cagctttaca agctattgga 
tgaattgggt gcgtcaagca ccagggcagg gtctggaatg ggctggggtg 
atacatcctt ctgacagcga aacatggttg gaccagaaat ttaaagatcg 
tgtgacaatt acagtcgata agtccacaag cactgcttac atggaactct 
ccagcttgcg gtccgaggac accgctgtgt attattgcgc cagagagcac 
tacggcacat caccttttgc atactggggc cagggaactc tcgtaaccgt 
atcctcc
である。
【０１１２】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ１のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１５１）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRANESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKVEI K
【０１１３】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ１をエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１５２（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
gaaatcgtac tcacccagtc acctgcaacc ctttctctga gccccggtga 
acgtgccact ctcagctgca gagcaaatga gagtgtggac aattacggca 
tgtccttcat gaactggttt cagcagaagc ctgggcagcc acctaagctg 
ctcatccacg ccgcctctaa ccagggatct ggggtgcctt cacgtttttc 
tggatcagga agtggcactg acttcaccct tacaatcagc tctctggagc 
cagaggactt tgccgtctat ttctgccagc aatctaaaga ggtgccctat 
acttttggtg gcgggaccaa ggttgagatc aaa
である。
【０１１４】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１５３）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKVEI K
【０１１５】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ２をエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１５４（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
gaaatcgtac tcacccagtc acctgcaacc ctttctctga gccccggtga 
acgtgccact ctcagctgca gagcaagtga gagtgtggac aattacggca 
tgtccttcat gaactggttt cagcagaagc ctgggcagcc acctaagctg 
ctcatccacg ccgcctctaa ccagggatct ggggtgcctt cacgtttttc 
tggatcagga agtggcactg acttcaccct tacaatcagc tctctggagc 
cagaggactt tgccgtctat ttctgccagc aatctaaaga ggtgccctat 
acttttggtg gcgggaccaa ggttgagatc aaa
である。
【０１１６】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１５５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNRGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKVEI K
【０１１７】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ３をエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１５６（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
gaaatcgtac tcacccagtc acctgcaacc ctttctctga gccccggtga 
acgtgccact ctcagctgca gagcaagtga gagtgtggac aattacggca 
tgtccttcat gaactggttt cagcagaagc ctgggcagcc acctaagctg 
ctcatccacg ccgcctctaa ccgcggatct ggggtgcctt cacgtttttc 
tggatcagga agtggcactg acttcaccct tacaatcagc tctctggagc 
cagaggactt tgccgtctat ttctgccagc aatctaaaga ggtgccctat 
acttttggtg gcgggaccaa ggttgagatc aaa
である。
【０１１８】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ２及びｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ３の両方のＶＬドメインのＣＤＲL１は、アスパラギンからセリンへのアミノ酸置換を含み、アミノ酸配列
：RASESVDNYGMSFMN（配列番号１５７、置換されたセリンは下線を付して示す）を有する
。同様の置換は、上述のＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＣＤＲL１ドメインのいずれにも組み込
むことができると考えられる。
【０１１９】
更にｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ３のＶＬドメインのＣＤＲL２は、グルタミンから
アルギニンへのアミノ酸置換を含み、アミノ酸配列：AASNRGS（配列番号１５８、置換さ
れたアルギニンは下線を付して示す）を有する。同様の置換は、上述のＰＤ‐１  ｍＡｂ
７  ＣＤＲL２ドメインのいずれにも組み込むことができると考えられる。
【０１２０】
Ｈ．マウス抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１５９）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
EGQLQQSGPE LVKPGASVKI SCKASGYTFT DYYMNWVKQN HGKSLEWIGD 
INPKNGDTHY NQKFKGEATL TVDKSSTTAY MELRSLTSED SAVYYCASDF 
DYWGQGTTLT VSS
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８のＣＤＲH１（配列番号１６１）：DYYMN
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８のＣＤＲH２（配列番号１６２）：DINPKNGDTHYNQKFKG
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８のＣＤＲH３（配列番号１６３）：DFDY
【０１２１】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８のＶＨドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１６０（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
gagggccagc tgcaacaatc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc 
agtgaagata tcctgtaagg cttctggata cacgttcact gactactaca 
tgaactgggt gaagcagaac catggaaaga gccttgagtg gattggagat 
attaatccta aaaatggtga cactcactac aaccagaagt tcaagggcga 
ggccacattg actgtagaca agtcctccac cacagcctac atggagctcc 
gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc gagcgatttt 
gactactggg gccaaggcac cactctcaca gtctcctcc
【０１２２】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１６４）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DVVMTQTPLS LPVGLGDQAS ISCRSSQTLV YSNGNTYLNW FLQKPGQSPK 
LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP 
FTFGSGTKLE IK
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８のＣＤＲL１（配列番号１６６）：RSSQTLVYSNGNTYLN
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８のＣＤＲL２（配列番号１６７）：KVSNRFS
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８のＣＤＲL３（配列番号１６８）：SQSTHVPFT
【０１２３】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８のＶＬドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１６５（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtcg gtcttggaga 
tcaagcctcc atctcttgca gatctagtca gacccttgta tatagtaatg 
gaaacaccta tttaaattgg ttcctgcaga agccaggcca gtctccaaag 
ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt tctggggtcc cagacaggtt 
cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg 
aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttcca 
ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa
【０１２４】
Ｉ．抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９
１．マウス抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１６９）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
EVMLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SYLVSWVRQT PEKRLEWVAT 
ISGGGGNTYY SDSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQISSLRSED TALYYCARYG 
FDGAWFAYWG QGTLVTVSS
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９のＣＤＲH１（配列番号１７１）：SYLVS
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９のＣＤＲH２（配列番号１７２）：TISGGGGNTYYSDSVKG
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９のＣＤＲH３（配列番号１７３）：YGFDGAWFAY
【０１２５】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９のＶＨドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１７０（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc 
cctgaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agttatcttg 
tgtcttgggt tcgccagact ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc 
attagtggtg gtggtggtaa cacctactat tcagacagtg tgaagggtcg 
attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac ctgcaaatca 
gcagtctgag gtctgaggac acggccttgt attactgtgc aaggtatggt 
ttcgacggcg cctggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt 
ctcttcc
である。
【０１２６】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９（配列番号１７４）のＶＬドメインのアミノ酸配列を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIQMTQSPAS LSASVGDIVT ITCRASENIY SYLAWYQQKQ EKSPQLLVYN 
AKTLAAGVPS RFSGSGSGTQ FSLTINSLQP EDFGNYYCQH HYAVPWTFGG 
GTRLEIT
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９のＣＤＲL１（配列番号１７６）：RASENIYSYLA
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９のＣＤＲL２（配列番号１７７）：NAKTLAA
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９のＣＤＲL３（配列番号１７８）： QHHYAVPWT
【０１２７】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９のＶＬドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１７５（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga 
tattgtcacc atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agttatttag 
catggtatca gcagaaacag gaaaaatctc ctcagctcct ggtctataat 
gcaaaaacct tggcagcagg tgtgccatca aggttcagtg gcagtggatc 
aggcacacag ttttctctga ccatcaacag cctgcagcct gaagattttg 
ggaattatta ctgtcagcat cattatgctg ttccgtggac gttcggtgga 
ggcaccagac tggaaatcac a
である。
【０１２８】
２．「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９」を形成するための、抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９のヒト化
上述のマウス抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９を、抗原エピトープが識別された場合にヒト化し、更に脱免疫化して、ヒトレシピエントへの投与時にその抗原性を低減
するための抗ヒトＰＤ‐１抗体のヒト化の能力を実証した。ヒト化により、ここでは「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９  ＶＨ１」及び「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９  ＶＨ２」と呼ばれる２つのヒト化ＶＨドメインと、ここでは「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９  ＶＬ１」及び「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９  ＶＬ２」と呼ばれる２つのヒト化ＶＬドメインとが得られた。ヒト化ＶＬドメインのうちのいずれが、ヒト化ＶＨドメインのうちのいずれと対合し得る。従って、上記ヒト化ＶＨドメインと対合した上記ヒト化ＶＬドメインのうちの１つを備えるいずれの抗体を、一般に「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９」と呼び、ヒト化ＶＨ／ＶＬドメインの特定の組み合わせを、具体的なＶＨ／ＶＬドメインに対する参照によって呼称する。例えばｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９  ＶＨ１及びｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９  ＶＬ２を備えるヒト化抗体は、具体的に「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９（１．２）」と呼ばれる。
【０１２９】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９  ＶＨ１のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１７９）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
EVQLVESGGG LVRPGGSLKL SCAASGFTFS SYLVSWVRQA PGKGLEWVAT 
ISGGGGNTYY SDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TATYYCARYG 
FDGAWFAYWG QGTLVTVSS
【０１３０】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９  ＶＨ１をエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１８０（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
gaggtgcagc tggtggaaag tgggggcggc ctggtgcgac ccgggggaag 
tctgaaactg tcctgtgcag catcaggatt tactttttca tcttatctcg 
tgtcttgggt aagacaagca cccggaaaag gcttggaatg ggtggccact 
atctccggtg gaggtggcaa cacctactat agcgacagtg tcaagggaag 
atttaccatc agtcgcgaca acgctaagaa tagcctgtac ctccagatga 
actccctgcg cgccgaggac accgccacct attactgtgc acgctatgga 
tttgacggcg catggtttgc ctactgggga cagggcacat tggtaaccgt 
tagctcc
である。
【０１３１】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９  ＶＨ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１８１）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
EVQLVESGGG LARPGGSLKL SCAASGFTFS SYLVGWVRQA PGKGLEWTAT 
ISGGGGNTYY SDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSARAED TATYYCARYG 
FDGAWFAYWG QGTLVTVSS
【０１３２】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９  ＶＨ２をエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１８２（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
gaggtgcagc tggtggaaag tgggggcggc ctggcgcgac ccgggggaag 
tctgaaactg tcctgtgcag catcaggatt tactttttca tcttatctcg 
tgggctgggt aagacaagca cccggaaaag gcttggaatg gacggccact 
atctccggtg gaggtggcaa cacctactat agcgacagtg tcaagggaag 
atttaccatc agtcgcgaca acgctaagaa tagcctgtac ctccagatga 
actccgcacg cgccgaggac accgccacct attactgtgc acgctatgga 
tttgacggcg catggtttgc ctactgggga cagggcacat tggtaaccgt 
tagctcc
である。
【０１３３】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９  ＶＨ２のＶＨドメインのＣＤＲH１は、セリンからグリシン
へのアミノ酸置換を含み、アミノ酸配列：SYLVG（配列番号１８３、置換されたグリシン
は下線を付して示す）を有する。同様の置換は、上述のＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９  ＣＤＲH
１ドメインのいずれにも組み込むことができると考えられる。
【０１３４】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９  ＶＬ１のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１８４）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASENIY SYLAWYQQKP GKAPKLLIYN 
AKTLAAGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQH HYAVPWTFGQ 
GTKLEIK
【０１３５】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９  ＶＬ１をエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１８５（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
gacattcaga tgactcagtc tcccagcagt ctgtccgcat ccgtggggga 
tcgggtcacc atcacctgcc gtgcctcaga aaacatctat tcatacctcg 
cctggtatca acagaaacct ggtaaagccc caaaattgct catttacaac 
gccaagaccc tcgcagctgg cgtgccaagt aggttctcag gcagcggctc 
agggacagat ttcaccctca ccatatcctc actgcagccc gaggattttg 
ccacttacta ctgccagcat cattacgcag tgccctggac cttcggacaa 
ggcactaagc tcgagatcaa a
である。
【０１３６】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９  ＶＬ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１８６）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASENIY NYLAWYQQKP GKAPKLLIYD 
AKTLAAGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQH HYAVPWTFGQ 
GTKLEIK 
【０１３７】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９  ＶＬ２をエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１８７（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
gacattcaga tgactcagtc tcccagcagt ctgtccgcat ccgtggggga 
tcgggtcacc atcacctgcc gtgcctcaga aaacatctat aactacctcg 
cctggtatca acagaaacct ggtaaagccc caaaattgct catttacgac 
gccaagaccc tcgcagctgg cgtgccaagt aggttctcag gcagcggctc 
agggacagat ttcaccctca ccatatcctc actgcagccc gaggattttg 
ccacttacta ctgccagcat cattacgcag tgccctggac cttcggacaa 
ggcactaagc tcgagatcaa a
【０１３８】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９  ＶＬ２のＶＬドメインのＣＤＲL１は、セリンからアスパラ
ギンへのアミノ酸置換を含み、アミノ酸配列：RASENIYNYLA（配列番号１８８、置換され
たアスパラギンは下線を付して示す）を有する。同様の置換は、上述のＰＤ‐１  ｍＡｂ
９  ＣＤＲL１ドメインのいずれにも組み込むことができると考えられる。
【０１３９】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９  ＶＬ２のＶＬドメインのＣＤＲL２は、アスパラギンからア
スパラギン酸へのアミノ酸置換を含み、アミノ酸配列：DAKTLAA（配列番号１８９、置換
されたアスパラギン酸は下線を付して示す）を有する。同様の置換は、上述のＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＣＤＲL２ドメインのいずれにも組み込むことができると考えられる。
【０１４０】
Ｊ．マウス抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１９０）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
EVILVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS NYLMSWVRQT PEKRLEWVAS 
ISGGGSNIYY PDSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRSED TALYYCARQE 
LAFDYWGQGT TLTVSS
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０のＣＤＲH１（配列番号１９２）：NYLMS
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０のＣＤＲH２（配列番号１９３）：SISGGGSNIYYPDSVKG
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０のＣＤＲH３（配列番号１９４）：QELAFDY
【０１４１】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０のＶＬドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１９１（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）
：
gaagtgatac tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc 
cctgaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aactatctca 
tgtcttgggt tcgccagact ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaagt 
attagtggtg gtggtagtaa tatctactat ccagacagtg tgaagggtcg 
attcaccata tccagggaca atgccaagaa caccctgtac ctgcaaatga 
acagtctgag gtctgaggac acggccttgt attactgtgc aagacaagaa 
ctggcttttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctcc
である。
【０１４２】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１９５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRTSQDIS NFLNWYQQKP DGTIKLLIYY 
TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GSTLPWTFGG 
GTKLEII
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０のＣＤＲL１（配列番号１９７）：RTSQDISNFLN
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０のＣＤＲL２（配列番号１９８）：YTSRLHS
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０のＣＤＲL３（配列番号１９９）：QQGSTLPWT
【０１４３】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０のＶＬドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１９６（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）
：
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga 
cagagtcacc atcagttgca ggacaagtca ggacattagc aattttttaa 
actggtatca gcagaaacca gatggaacta ttaaactcct gatctactac 
acatcaagat tacactcagg agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc 
tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa gaagatattg 
ccacttactt ttgccaacag ggtagtacgc ttccgtggac gttcggtgga 
ggcaccaagc tggaaatcat a
である。
【０１４４】
Ｋ．マウス抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２００）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
EVQLQQSGTV LARPGASVKM SCKTSGYTFT GYWMHWVKQR PGQGLKWMGA 
IYPGNSDTHY NQKFKGKAKL TAVTSASTAY MELSSLTNED SAIYYCTTGT 
YSYFDVWGTG TTVTVSS
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１のＣＤＲH１（配列番号２０２）：GYWMH
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１のＣＤＲH２（配列番号２０３）：AIYPGNSDTHYNQKFKG
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１のＣＤＲH３（配列番号２０４）：GTYSYFDV
【０１４５】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１のＶＨドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号２０１（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）
：
gaggttcagc tccagcagtc tgggactgtg ctggcaaggc ctggggcttc 
agtgaagatg tcctgcaaga cttctggcta cacatttacc ggctactgga 
tgcactgggt aaaacagagg cctggacagg gtctgaaatg gatgggggct 
atttatcctg gaaatagtga tactcactac aaccagaagt tcaagggcaa 
ggccaaactg actgcagtca catccgccag cactgcctac atggagctca 
gcagcctgac aaatgaggac tctgcgatct attactgtac tactgggacc 
tactcgtact tcgatgtctg gggcacaggg accacggtca ccgtctcctc a
である。
【０１４６】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２０５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DILLTQSPAI LSVSPGERVS FSCRASQSIG TSIHWYQHRT NGSPRLLIKY 
ASESISGIPS RFSGSGSGTD FTLSINSVES EDIADYYCQQ SNSWLTFGAG 
TKLELK
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１のＣＤＲL１（配列番号２０７）：RASQSIGTSIH
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１のＣＤＲL２（配列番号２０８）：YASESIS
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１のＣＤＲL３（配列番号２０９）：QQSNSWLT
【０１４７】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１のＶＬドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号２０６（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）
：
gacatcttgc tgactcagtc tccagccatc ctgtctgtga gtccaggaga 
aagagtcagt ttctcctgca gggccagtca gagcattggc acaagcatac 
actggtatca gcacagaaca aatggttctc caaggcttct cataaagtat 
gcttctgagt ctatctctgg gatcccttcc aggtttagtg gcagtggatc 
agggactgat tttactctta gcatcaacag tgtggagtct gaagatattg 
cagattatta ctgtcaacaa agtaatagct ggctcacgtt cggtgctggg 
accaagctgg agctgaaa
【０１４８】
Ｌ．マウス抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２１０）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
QGHLQQSGAE LVRPGASVTL SCKASGFTFT DYEMHWVKQT PVHGLEWIGT 
IDPETGGTAY NQKFKGKAIL TVDKSSTTTY MELRSLTSED SAVFYCSRER 
ITTVVEGAYW YFDVWGTGTT VTVSS
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２のＣＤＲH１（配列番号２１２）：DYEMH
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２のＣＤＲH２（配列番号２１３）：TIDPETGGTAYNQKFKG
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２のＣＤＲH３（配列番号２１４）：ERITTVVEGAYWYFDV
【０１４９】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２のＶＨドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号２１１（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）
：
cagggtcacc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc 
agtgacgctg tcctgcaagg cttcgggctt cacatttact gactatgaga 
tgcactgggt gaaacagaca cctgtgcatg gcctggaatg gattgggact 
attgatcctg aaactggtgg tactgcctac aatcagaagt tcaagggcaa 
ggccatactg acagtagaca aatcttccac tacaacctac atggagctcc 
gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct tttattgttc aagagagagg 
attactacgg ttgttgaggg ggcatactgg tacttcgatg tctggggcac 
agggaccacg gtcaccgtct cctca
である。
【０１５０】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２１５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQNIV HSNGNTYLEW YLQKPGQSPK 
LLICKVSTRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHVP 
YTFGGGTKLE IK 
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２のＣＤＲL１（配列番号２１７）：RSSQNIVHSNGNTYLE
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２のＣＤＲL２（配列番号２１８）：KVSTRFS
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２のＣＤＲL３（配列番号２１９）：FQGSHVPYT
【０１５１】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２のＶＬドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号２１６（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）
：
gatgttttga tgacccagac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga 
tcaagcctcc atctcttgca gatctagtca gaacattgta catagtaatg 
gaaacaccta tttagaatgg tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag 
ctcctgatct gcaaagtttc cacccgattt tctggggtcc cagacaggtt 
cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg 
aggctgagga tctgggagtt tattattgct ttcaaggttc acatgttccg 
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa
である。
【０１５２】
Ｍ．マウス抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２２０）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
EVMLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SHTMSWVRQT PEKRLEWVAT 
ISGGGSNIYY PDSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMSSLRSED TALYYCARQA 
YYGNYWYFDV WGTGTTVTVS S
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３のＣＤＲH１（配列番号２２２）：SHTMS
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３のＣＤＲH２（配列番号２２３）：TISGGGSNIYYPDSVKG
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３のＣＤＲH３（配列番号２２４）：QAYYGNYWYFDV
【０１５３】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３のＶＨドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号２２１（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）
：
gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc 
cctgaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agccatacca 
tgtcttgggt tcgccagact ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc 
attagtggtg gtggttctaa tatctactat ccagacagtg tgaagggtcg 
attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac ctgcaaatga 
gcagtctgag gtctgaggac acggccttgt attactgtgc aagacaagct 
tactacggta attactggta cttcgatgtc tggggcacag ggaccacggt 
caccgtctcc tcc
である。
【０１５４】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２２５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIQMTQSPAT QSASLGESVT ITCLASQTIG TWLAWYQQKP GKSPQLLIYA 
ATSLADGVPS RFSGSGSGTK FSFKISSLQA EDFVSYYCQQ LDSIPWTFGG 
GTKLEIK
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３のＣＤＲL１（配列番号２２７）：LASQTIGTWLA
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３のＣＤＲL２（配列番号２２８）：AATSLAD
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３のＣＤＲL３（配列番号２２９）：QQLDSIPWT
【０１５５】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３のＶＬドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号２２６（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）
：
gacattcaga tgacccagtc tcctgccacc cagtctgcat ctctgggaga 
aagtgtcacc atcacgtgcc tggcaagtca gaccattggt acatggttag 
catggtatca gcagaaacca gggaaatctc ctcagctcct gatttatgct 
gcaaccagct tggcagatgg ggtcccatca aggttcagtg gtagtggatc 
tggcacaaaa ttttctttca agatcagcag cctacaggct gaagattttg 
taagttatta ctgtcaacaa cttgacagta ttccgtggac gttcggtgga 
ggcaccaagc tggaaatcaa a
である。
【０１５６】
Ｎ．マウス抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２３０）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKASGYNFI SYWITWVKQR PGQGLQWIGN 
IYPGTDGTTY NEKFKSKATL TVDTSSSTAY MHLSRLTSED SAVYYCATGL 
HWYFDVWGTG TTVTVSS
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４のＣＤＲH１（配列番号２３２）：SYWIT
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４のＣＤＲH２（配列番号２３３）：NIYPGTDGTTYNEKFKS
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４のＣＤＲH３（配列番号２３４）：GLHWYFDV
【０１５７】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４のＶＨドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号２３１（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）
：
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag cttgtgaagc ctggggcttc 
agtgaagatg tcctgcaagg cttctggcta caacttcatc agctactgga 
taacctgggt gaaacagagg cctggacaag gccttcagtg gattggaaat 
atttatcctg gtactgatgg tactacctac aatgagaagt tcaagagcaa 
ggccacactg actgtagaca catcctccag cacagcctac atgcacctca 
gtcgcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aactgggcta 
cactggtact tcgatgtctg gggcacaggg accacggtca ccgtctcctc c
である。
【０１５８】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２３５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIVMTQSQKF MSTSVGDRVS VTCKASQSVG TNVAWYQQKP GQSPKALIYS 
ASSRFSGVPD RFTGSGSGTD FTLTISNVQS EDLAEYFCQQ YNSYPYTFGG 
GTKLEIK
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４のＣＤＲL１（配列番号２３７）：KASQSVGTNVA
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４のＣＤＲL２（配列番号２３８）：SASSRFS
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４のＣＤＲL３（配列番号２３９）：QQYNSYPYT
【０１５９】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４のＶＬドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは
、配列番号２３６（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）
：
gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga 
cagggtcagt gtcacctgca aggccagtca gagtgtgggt actaatgtag 
cctggtatca acagaagccc ggtcaatctc ctaaagcact gatttactcg 
gcatcctccc gattcagtgg cgtccctgat cgcttcacag gcagtggatc 
tgggacagat ttcactctca ccatcagtaa tgtgcagtct gaagacttgg 
cagagtattt ctgtcagcaa tataacagct atccgtacac gttcggaggg 
gggaccaagc tggaaataaa a
である。
【０１６０】
Ｏ．抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５
１．マウス抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２４０）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
EVMLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFIFS SYLISWVRQT PEKRLEWVAA 
ISGGGADTYY ADSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMSSLRSED TALYYCTRRG 
TYAMDYWGQG TSVTVSS
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５のＣＤＲH１（配列番号２４２）：SYLIS
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５のＣＤＲH２（配列番号２４３）：AISGGGADTYYADSVKG
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５のＣＤＲH３（配列番号２４４）：RGTYAMDY
【０１６１】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５ＶＨドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号２４１（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc 
cctgaaactc tcctgtgcag cctctggatt cattttcagt agctatctca 
tctcttgggt tcgccagact ccggagaaga ggctggagtg ggtcgctgcc 
attagtggtg gtggtgctga cacctactat gccgacagtg tgaagggtcg 
attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtat ctgcaaatga 
gcagtctgag gtctgaggac acggccttat attactgtac aagacgaggg 
acctatgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc c
である。
【０１６２】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２４５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIQMTQSPAS QSASLGESVT ITCLASQTIG TWLAWYQQKP GKSPQLLIYA 
ATSLADGVPS RFSGSGSGTK FSFKISSLQA EDFVNYYCQQ LYSIPWTFGG 
GTKLEIK
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５のＣＤＲL１（配列番号２４７）：LASQTIGTWLA
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５のＣＤＲL２（配列番号２４８）：AATSLAD
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５のＣＤＲL３（配列番号２４９）：QQLYSIPWT
【０１６３】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５のＶＬドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号２４６（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）
：
gacattcaga tgacccagtc tcccgcctcc cagtctgcat ctctgggaga 
aagtgtcacc atcacatgcc tggcaagtca gaccattggt acatggttag 
catggtatca gcagaaacca gggaaatctc ctcagctcct gatttatgct 
gcaaccagct tggcagatgg ggtcccatca aggttcagtg gtagtggatc 
tggcacaaaa ttttctttca agatcagcag cctacaggct gaagattttg 
taaattatta ctgtcaacaa ctttacagta ttccgtggac gttcggtgga 
ggcaccaagc tggaaatcaa a
である。
【０１６４】
２．「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５」を形成するための、抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５のヒト化
上述のマウス抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５を、抗原エピトープが識別された場合にヒト化し、更に脱免疫化して、ヒトレシピエントへの投与時にその抗原性を低減するための抗ヒトＰＤ‐１抗体のヒト化の能力を実証した。ヒト化により、ここでは「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２  ＶＨ１」と呼ばれる１つのヒト化ＶＨドメインと、ここでは「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １  ＶＬ１」と呼ばれる１つのヒト化ＶＬドメインとが得られた。上記ヒト化ＶＨドメインと対合した上記ＶＬドメインを備える抗体を「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５」と呼ぶ。
【０１６５】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５  ＶＨ１のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２５０）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
EVQLVESGGG LVRPGGSLRL SCAASGFTFS SYLISWVRQA PGKGLEWVAA 
ISGGGADTYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TATYYCARRG 
TYAMDYWGQG TLVTVSS
【０１６６】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５  ＶＨ１をエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号２５１（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
gaagtgcaac tggttgaaag tggcggcggg ctggtgcggc caggtggttc 
actcagactg tcttgtgcag cttcaggctt tacattctcc tcttatctta 
tctcttgggt gcgccaagcc ccaggtaagg gccttgaatg ggtcgccgcc 
attagtgggg gtggtgccga tacatattat gccgacagcg tcaagggacg 
tttcaccatc agcagggaca acgccaagaa tagcctttac ctgcagatga 
actcacttag agctgaagac accgctactt attactgtgc ccggcgcggg 
acttacgcta tggactattg gggccagggc accttggtca ctgtctcatc c
【０１６７】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５  ＶＬ１のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２５２）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCLASQTIG TWLAWYQQKP GKAPKLLIYA 
ATSLADGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDFATYYCQQ LYSIPWTFGQ 
GTKLEIK
【０１６８】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５  ＶＬ１をエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号２５３（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは、下線を付して示す）：
gatatccaga tgacccagtc tcccagctct ctcagtgcaa gcgtaggcga 
ccgtgtgacc atcacctgtc tggccagtca gaccattgga acctggctcg 
cctggtatca gcagaaacct ggcaaggccc ctaagctgct gatttacgcc 
gccacctccc tcgcagatgg agtgccctcc cgatttagcg ggtccgggtc 
cggcaccgac ttcacattca caatcagcag cctccagccc gaggatttcg 
ctacatacta ctgtcaacag ctctactcca ttccatggac ctttggtcag 
ggtactaaac tggagatcaa a
【０１６９】
Ｖ．抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １〜１５、及び操作済みＦｃ領域を有するその誘導体
従来の免疫機能では、抗体‐抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用は、抗体依存性細胞毒性、肥満細胞脱顆粒及び食作用等のエフェクタ機能から、リンパ球増殖及び抗体分泌
を制御するもの等の免疫調節性信号にまで及ぶ、広範な応答をもたらす。これらの相互作用は全て、抗体又は免疫複合体のＦｃ領域の、造血細胞上の特殊化された細胞表面受容体への結合によって開始される。抗体及び免疫複合体によってトリガされる細胞応答の多様性は、３つのＦｃ受容体：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の構造不均質性によって得られる。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は活性化（即ち免疫系増強）受容体であり；ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）は阻害性（即ち免疫系減衰）受容体である。更に、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との相互作用は、エンドソームから細胞表面へのＩｇＧ分子の再循環及び血中への放出を仲介する。例示的な野生型ＩｇＧ１（配列番号１）、ＩｇＧ２（配列番号２）、ＩｇＧ３（配列番号３）及びＩｇＧ４（配列番号４）のアミノ酸配列は、既に提示されている。
【０１７０】
Ｆｃ領域の修飾は通常、表現型の変化、例えば血清半減期の変化、安定性の変化、細胞酵素に対する感受性の変化又はエフェクタ機能の変化につながる。本発明の抗体又は他の結合分子をエフェクタ機能に関して修飾して、例えば癌の治療におけるこのような分子の有効性を増強することが望ましい場合がある。例えば、作用機序が、標的抗原を担持する細胞の殺滅ではなく遮断又は拮抗作用を伴う抗体の場合といった、特定の場合においては、エフェクタ機能の低減又は削減が望ましい。エフェクタ機能の上昇は、ＦｃγＲが低いレベルで発現する腫瘍及び外来細胞、例えばＦｃγＲＩＩＢのレベルが低い腫瘍特異性Ｂ細胞（例えば非ホジキンリンパ腫、ＣＬＬ及びバーキットリンパ腫）といった、望ましくない細胞を対象とする場合に一般に望ましい。上記実施形態では、エフェクタ機能活性が与えられた又は変更された本発明の分子は、エフェクタ機能活性の効率の増強が望ましい疾患、障害又は感染の治療及び／又は予防のために有用である。
【０１７１】
特定の実施形態では、本発明のＰＤ‐１結合分子は、野生型Ｆｃ領域（例えば配列番号１）のアミノ酸の配列に対する１つ又は複数の修飾（例えば置換、欠失又は挿入）を有するＦｃ領域を備え、上記修飾は、上記Ｆｃ領域の、従って本発明の分子の、１つ又は複数のＦｃγＲ受容体に対する親和性及び結合活性を低下させる。他の実施形態では、本発明の分子は、野生型Ｆｃ領域のアミノ酸に対する１つ又は複数の修飾を有するＦｃ領域を備え、上記修飾は、上記Ｆｃ領域の、従って本発明の分子の、１つ又は複数のＦｃγＲ受容体に対する親和性及び結合活性を上昇させる。他の実施形態では、上記分子は変異型Ｆｃ領域を含み、ここで上記変異型は、Ｆｃドメインを含まない、又は野生型Ｆｃドメインを含む分子に対して、抗体依存性細胞仲介型細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性の上昇、及び／又はＦｃγＲＩＩＡへの結合の増大を与える、又は仲介する。代替実施形態では、上記分子は変異型Ｆｃ領域を含み、ここで上記変異型は、Ｆｃ領域を含まない、又は野生型Ｆｃ領域を含む分子に対して、ＡＤＣＣ活性（若しくは他のエフェクタ機能）の低下、及び／又はＦｃγＲＩＩＢへの結合の増大を与える、又は仲介する。いくつかの実施形態では、本発明は、変異型Ｆｃ領域を含むＰＤ‐１結合分子を包含し、上記変異型Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域を含む同等の分子と比べて、いずれのＦｃγＲに対する検出可能な結合を示さない。他の実施形態では、本発明は、変異型Ｆｃ領域を含むＰＤ‐１結合分子を包含し、上記変異型Ｆｃ領域は、単一のＦｃγＲ、好ましくはＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、又はＦｃγＲＩＩＩＡのうちの１つにしか結合しない。このような上昇した親和性及び／又は結合活性は好ましくは、当該細胞内において（修飾されたＦｃ領域を有しない）親分子の結合活性が検出できない場合に低いレベルのＦｃγＲを発現する細胞における、又は３００００〜２００００分子／細胞の密度、２００００〜１００００分子／細胞の密度、１００００〜５０００分子／細胞の密度、５０００〜１０００分子／細胞の密度、１０００〜２００分子／細胞の密度、若しくは２００分子／細胞以下（ただし少なくとも１０、５０、１００若しくは１５０分子／細胞）の密度で非ＦｃγＲ受容体標的抗原を発現する細胞において、検出可能なＦｃγＲへの結合又はＦｃγＲ関連活性の程度をインビトロで測定することによって評価される。
【０１７２】
本発明のＰＤ‐１結合分子は、活性化及び／又は阻害Ｆｃγ受容体に関する親和性が変化した変異型Ｆｃ領域を備えてよい。一実施形態では、上記ＰＤ‐１結合分子は、野生型Ｆｃ領域を備えた同等の分子に対して、ＦｃγＲＩＩＢに関する親和性が増大し、かつＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＡに関する親和性が低下した、変異型Ｆｃ領域を備える。別の実施形態では、本発明のＰＤ‐１結合分子は、野生型Ｆｃ領域を備えた同等の分子に対して、ＦｃγＲＩＩＢに関する親和性が低下し、かつＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＡに関する親和性が増大した、変異型Ｆｃ領域を備える。更に別の実施形態では、本発明のＰＤ‐１結合分子は、野生型Ｆｃ領域を備えた同等の分子に対して、ＦｃγＲＩＩＢに関する親和性が低下し、かつＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＡに関する親和性も低下した、変異型Ｆｃ領域を備える。更に別の実施形態では、本発明のＰＤ‐１結合分子は、野生型Ｆｃ領域を備えた同等の分子に対して、ＦｃγＲＩＩＢに関する親和性が変化しておらず、かつＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＡに関する親和性が低下（又は増大）した、変異型Ｆｃ領域を備える。
【０１７３】
特定の実施形態では、本発明のＰＤ‐１結合分子は、免疫グロブリンが増強されたエフェクタ機能を有するように、ＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＡに対する親和性が変化した変異型Ｆｃ領域を含む。エフェクタ細胞機能の非限定的な例としては、抗体依存性細胞仲介細胞毒性、抗体依存性細胞食作用、食作用、オプソニン作用、オプソニン食作用、細胞結合、ロゼット形成、Ｃ１ｑ結合、及び相補性決定細胞仲介細胞毒性が挙げられる。
【０１７４】
ある好ましい実施形態では、親和性又はエフェクタ機能の変化は、野生型Ｆｃ領域を含む同等の分子に対して少なくとも２倍、好ましくは少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、又は少なくとも１００倍である。本発明の他の実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域を含む分子に対して少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、又は２５０％高い親和性で、１つ又は複数のＦｃＲに免疫特異的に結合する。このような測定は、インビボ又はインビトロアッセイとすることができ、好ましい実施形態では、ＥＬＩＳＡ又は表面プラズモン共鳴アッセイ等のインビトロアッセイである。
【０１７５】
様々な実施形態において、本発明のＰＤ‐１結合分子は、変異型Ｆｃ領域を含み、上記変異型は、ＦｃγＲ受容体の少なくとも１つの活性を刺激するか、又はＦｃγＲ受容体の少なくとも１つの活性に拮抗する。好ましい実施形態では、上記分子は、ＦｃγＲＩＩＢの１つ又は複数の活性、例えば、Ｂ細胞受容体‐仲介型シグナリング、Ｂ細胞の活性化、Ｂ細胞増殖、抗体産生、Ｂ細胞の細胞内カルシウム流入、細胞周期進行、ＦｃεＲＩシグナリングのＦｃγＲＩＩＢ‐仲介型阻害、ＦｃγＲＩＩＢのリン酸化、ＳＨＩＰ動員、ＳＨＩＰリン酸化及びＳｈｃとの連結、又はＦｃγＲＩＩＢシグナル伝達経路中の１つ若しくは複数の下流分子の活性（例えばＭＡＰキナーゼ、ＪＮＫ、ｐ３８若しくはＡｋｔ）に拮抗する変異体を含む。別の実施形態では、本発明のＰＤ‐１結合分子は、ＦｃεＲＩの１つ又は複数の活性、例えば肥満細胞活性化、カルシウム可動化、脱顆粒、サイトカイン産生又はセロトニン放出を刺激する変異体を含む。
【０１７６】
特定の実施形態では、上記分子は、２つ以上のＩｇＧアイソタイプ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）からのＦｃ領域含有領域を含む。本明細書において使用される場合、Ｆｃ領域は、そのアミノ酸配列が、他のＩｇＧアイソタイプに比べてある特定のＩｇＧアイソタイプと最も高い相同性を有する場合に、当該ＩｇＧアイソタイプのものであると表現される。上記様々なＩｇＧアイソタイプは、例えばFlesch, and Nepper
t (1999) J. Clin. Lab. Anal. 14: 141-156; Chappel et al. (1993) J. Biol. Chem. 33:25124-25131; Chappel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:9036-9040; 又はBruggemann et al. (1987) J. Exp. Med 166: 1351-1361に記載されているような、そのヒンジ及び／又はＦｃ領域のアミノ酸配列の違いにより、血清半減期、補体結合、ＦｃγＲ結合親和性及びエフェクタ機能活性（例えばＡＤＣＣ、ＣＤＣ等）を含む様々な物理的及び機能的特性を呈する。このタイプの変異型Ｆｃ領域を、単独で、又はアミノ酸修飾と組み合わせて使用して、Ｆｃ仲介型エフェクタ機能及び／又は結合活性に影響を及ぼすことができる。組み合わせにおいて、アミノ酸修飾及びＩｇＧヒンジ／Ｆｃ領域は、同様の機能性（例えばＦｃγＲＩＩＡに対する親和性の上昇）を示すことができ、また相加的に、又はより好ましくは相乗的に作用して、野生型Ｆｃ領域を含む本発明の分子と比べて、本発明の分子のエフェクタ機能性を修飾できる。他の実施形態では、アミノ酸修飾及びＩｇＧ  Ｆｃ領域は反対の機能性（例えばそれぞれＦｃγＲＩＩＡに対する親和性の上昇及び低下）を示すことができ、また、同一のアイソタイプの、Ｆｃ領域を含まない又は野生型Ｆｃ領域を含む本発明の分子と比べて、本発明の分子の特異的機能性を選択的に調節又は低下させるよう作用できる。
【０１７７】
好ましい具体的実施形態では、本発明のＰＤ‐１結合分子は、変異型Ｆｃ領域を含み、上記変異型Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域に対する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、これにより、上記変異体Ｆｃ領域が、Sondermann et al. (2000) Nature 406:267-73に開示されているもののようなＦｃ‐ＦｃＲ相互作用の結晶学的及び構造的分析に基づいて、ＦｃγＲと直接接触する位置において置換を有しない場合に上記分子のＦｃＲに対する親和性が変化する。ＦｃγＲと直接接触するＦｃ領域内の位置の例は、アミノ酸残基２３４〜２３９）、アミノ酸残基２６５〜２６９（Ｂ／Ｃループ）、アミノ酸残基２９７〜２９９（Ｃ’／Ｅループ）及びアミノ酸残基３２７〜３３２（Ｆ／Ｇループ）である。いくつかの実施形態では、本発明の分子は、構造的及び結晶学的分析に基づいてＦｃγＲと直接接触しない、例えばＦｃ‐ＦｃγＲ結合部位内にない、少なくとも１つの残基の修飾を含む、変異型Ｆｃ領域を含む。
【０１７８】
変異型Ｆｃ領域は当該技術分野において公知であり、例えばＮＫ依存性又はマクロファージ依存性アッセイにおいて機能的にアッセイされるような、Ｆｃ領域（若しくはその一部）を備える本発明の分子が呈するエフェクタ機能を付与又は改変するために、いずれの公知の変異型Ｆｃ領域を本発明において使用してよい。例えば、変化したエフェクタ機能として識別されるＦｃ領域変異型は、国際公開第０４／０６３３５１号；国際公開第０６／０８８４９４号；国際公開第０７／０２４２４９号；国際公開第０６／１１３６６５号；国際公開第０７／０２１８４１号；国際公開第０７／１０６７０７号；及び国際公開第２００８／１４０６０３号において開示されており、開示されているいずれの好適な変異体を、本発明の分子において使用してよい。
【０１７９】
特定の実施形態では、本発明のＰＤ‐１結合分子は、１つ又は複数の領域において１つ又は複数のアミノ酸修飾を有する変異型Ｆｃ領域を含み、上記１つ又は複数の修飾は、変異型Ｆｃ領域の、阻害型ＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＩＢ等）に対する親和性に対する活性化ＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＩＡ又はＦｃγＲＩＩＩＡ等）に対する親和性の比率を、（野生型Ｆｃ領域に対して）変化させる：
【０１８０】
【数１】
2019055948.tif 000003
【０１８１】
（野生型Ｆｃ領域に対して）変異型Ｆｃ領域の親和性の比率が１を超える変異型Ｆｃ領域を有する本発明のＰＤ‐１結合分子が特に好ましい。このような分子は、例えば癌又は感染症といった、ＦｃγＲが仲介するエフェクタ細胞機能（例えばＡＤＣＣ）の効率の増強が望まれる疾患、障害、若しくは感染の治療的若しくは予防的処置、又はその症状の寛解を提供するにあたって特定の用途を有する。対照的に、親和性の比率が１未満である変異型Ｆｃ領域は、エフェクタ細胞機能の効率の低下を仲介する。表１は、例示的な単一、二重、三重、四重及び五重突然変異を、その親和性の比率が１を超えるか１未満であるかによって列挙している。
【０１８２】
【表１】
2019055948.tif 000004
【０１８３】
ある具体的な実施形態では、変異型Ｆｃ領域において、２３５、２４０、２４１、２４３、２４４、２４７、２６２、２６３、２６９、２９８、３２８、又は３３０位のうちのいずれにおけるいずれのアミノ酸修飾（例えば置換）、及び好ましくは以下の残基：Ａ２４０、Ｉ２４０、Ｌ２４１、Ｌ２４３、Ｈ２４４、Ｎ２９８、Ｉ３２８又はＶ３３０のうちの１つ又は複数。異なる具体的な実施形態では、変異型Ｆｃ領域において、２６８、２
６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８３、２８５、２８６、２８９、２９２、２９３、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８又は４３９位のうちのいずれにおけるいずれのアミノ酸修飾（例えば置換）、好ましくは以下の残基：Ｈ２８０、Ｑ２８０、Ｙ２８０、Ｇ２９０、Ｓ２９０、Ｔ２９０、Ｙ２９０、Ｎ２９４、Ｋ２９５、Ｐ２９６、Ｄ２９８、Ｎ２９８、Ｐ２９８、Ｖ２９８、Ｉ３００又はＬ３００。
【０１８４】
ある好ましい実施形態では、変化した親和性でＦｃγＲに結合する変異型Ｆｃ領域において、２５５、２５６、２５８、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３００、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３２０、３２２、３２６、３２９、３３０、３３２、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３３９、３４０、３５９、３６０、３７３、３７６、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８又は４３９位のうちのいずれにおけるいずれのアミノ酸修飾（例えば置換）。好ましくは、上記変異型Ｆｃ領域は、以下の残基のうちのいずれか１つを有する：Ａ２５６、Ｎ２６８、Ｑ２７２、Ｄ２８６、Ｑ２８６、Ｓ２８６、Ａ２９０、Ｓ２９０、Ａ２９８、Ｍ３０１、Ａ３１２、Ｅ３２０、Ｍ３２０、Ｑ３２０、Ｒ３２０、Ｅ３２２、Ａ３２６、Ｄ３２６、Ｅ３２６、Ｎ３２６、Ｓ３２６、Ｋ３３０、Ｔ３３９、Ａ３３３、Ａ３３４、Ｅ３３４、Ｈ３３４、Ｌ３３４、Ｍ３３４、Ｑ３３４、Ｖ３３４、Ｋ３３５、Ｑ３３５、Ａ３５９、Ａ３６０又はＡ４３０。
【０１８５】
異なる実施形態では、低下した親和性で（そのＦｃ領域を介して）ＦｃγＲに結合する変異型Ｆｃ領域において、２５２、２５４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７８、２８９、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３００、３０１、３０３、３２２、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１４、４１６、４１９、４３４、４３５、４３７、４３８、又は４３９位のうちのいずれにおけるいずれのアミノ酸修飾（例えば置換）。
【０１８６】
異なる実施形態では、増強された親和性で（そのＦｃ領域を介して）ＦｃγＲに結合する変異型Ｆｃ領域において、２８０、２８３、２８５、２８６、２９０、２９４、２９５、２９８、３００、３０１、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３３１、３３３、３３４、３３７、３４０、３６０、３７８、３９８、又は４３０位のうちのいずれにおけるいずれのアミノ酸修飾（例えば置換）。異なる実施形態では、増強された親和性でＦｃγＲＩＩＡに結合する変異型Ｆｃ領域において、以下の残基のうちのいずれか１つ：Ａ２５５、Ａ２５６、Ａ２５８、Ａ２６７、Ａ２６８、Ｎ２６８、Ａ２７２、Ｑ２７２、Ａ２７６、Ａ２８０、Ａ２８３、Ａ２８５、Ａ２８６、Ｄ２８６、Ｑ２８６、Ｓ２８６、Ａ２９０、Ｓ２９０、Ｍ３０１、Ｅ３２０、Ｍ３２０、Ｑ３２０、Ｒ３２０、Ｅ３２２、Ａ３２６、Ｄ３２６、Ｅ３２６、Ｓ３２６、Ｋ３３０、Ａ３３１、Ｑ３３５、Ａ３３７又はＡ４３０。
【０１８７】
好ましい変異体は、２２８、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２７１、２７３、２７５、２８１、２８４、２９１、２９６、２９７、２９８、２９９、３０２、３０４、３０５、３１３、３２３、３２５、３２６、３２８、３３０又は３３２位のうちのいずれにおける１つ又は複数の修飾を含む。
【０１８８】
特に好ましい変異体は、群Ａ〜ＡＩから選択された１つ又は複数の修飾を含む：
【０１８９】
【表２】
2019055948.tif 000005
【０１９０】
更に特に好ましい変異体は、群１〜１０５から選択された１つ又は複数の修飾を含む：
【０１９１】
【表３】
2019055948.tif 000006
2019055948.tif 000007
【０１９２】
一実施形態では、本発明の多ＰＤ‐１結合分子は、Ｆｃ領域において少なくとも１つの修飾を有する変異型Ｆｃ領域を含む。特定の実施形態では、上記変異型Ｆｃドメインは、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、及びＰ３９６Ｌからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含む。
【０１９３】
ある具体的実施形態では、変異型Ｆｃ領域は以下を含む：
（Ａ）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、及びＰ３９６Ｌからなる群から選択される、少なくとも１つの置換；
（Ｂ）（１）Ｆ２４３Ｌ及びＰ３９６Ｌ；
（２）Ｆ２４３Ｌ及びＲ２９２Ｐ；並びに
（３）Ｒ２９２Ｐ及びＶ３０５Ｉ；
からなる群から選択される、少なくとも２つの置換；
（Ｃ）（１）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＹ３００Ｌ；
（２）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＶ３０５Ｉ；
（３）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＰ３９６Ｌ；並びに
（４）Ｒ２９２Ｐ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ；
からなる群から選択される、少なくとも３つの置換；
（Ｄ）（１）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ及びＰ３９６Ｌ；並びに
（２）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ；
からなる群から選択される、少なくとも４つの置換；又は
（Ｅ）（１）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ；並びに
（２）Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ及びＰ３９６Ｌ
からなる群から選択される、少なくとも５つの置換。
【０１９４】
別の具体的実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、以下の置換を含む：
（Ａ）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、及びＹ３００Ｌ；
（Ｂ）Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、及びＰ３９６Ｌ；又は
（Ｃ）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、及びＰ３９６Ｌ。
【０１９５】
一実施形態では、本発明のＰＤ‐１結合分子は、（野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番
号１）が呈する結合に比べて）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が低減された（又は略全く結合しない）変異型Ｆｃ領域を備える。一実施形態では、本発明のＰＤ‐１結合分子は、ＦｃγＲ（例えばＦｃγＲＩＩＩＡ）に対する結合が低減し（又は略結合せず）、かつＡＤＣＣエフェクタ機能が低下した（又は上記機能を有しない）、変異型Ｆｃ領域を備える。特定の実施形態では、上記変異型Ｆｃ領域は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ｑ及びＮ２９７Ｇからなる群から選択された少なくとも１つの置換を含む。ある具体的実施形態では、上記変異型Ｆｃ領域は：Ｌ２３４Ａ；Ｌ２３５Ａ；Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；Ｄ２６５Ａ；Ｎ２９７Ｑ又はＮ２９７Ｇの置換を含む。
【０１９６】
本発明のＰＤ‐１結合分子のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましいＩｇＧ１配列は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換（配列番号５）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSPGX
を有し、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか又は不在である。
【０１９７】
異なる実施形態では、本発明のＰＤ‐１結合分子は、（野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号１）が呈する結合に対して）ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）に対する結合が低減し（若しくは略結合せず）、及び／又はエフェクタ機能が低下した、Ｆｃ領域を備える。ある具体的実施形態では、本発明のＰＤ‐１結合分子はＩｇＧ２  Ｆｃ領域（配列番号２）又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域（配列番号４）を備える。ＩｇＧ４  Ｆｃ領域を利用する場合、本発明は、鎖の交換の発生を低減するためのＩｇＧ４ヒンジ領域Ｓ２２８Ｐ置換（例えば、配列番号１３：ESKYGPPCPPCP（Lu et al., (2008) “The Effect Of A Point Mutation On The Stability Of Igg4 As Monitored By Analytical Ultracentrifugation,” J.
Pharmaceutical Sciences 97:960‐969）を参照）等の安定化突然変異の導入も包含する。当該技術分野において公知である他の安定化突然変異をＩｇＧ４  Ｆｃ領域に導入してもよい（Peters, P et al., (2012) “Engineering an Improved IgG4 Molecule with Reduced Disulfide Bond Heterogeneity and Increased Fab Domain Thermal Stability,”
J. Biol. Chem., 287:24525-24533；国際公開第２００８／１４５１４２号）。
【０１９８】
他の実施形態では、本発明は：Jefferis, B.J. et al. (2002) Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR: Current Models," Immunol. Lett. 82:57-65; Presta, L.G. et al. (2002) "Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function " Biochem. Soc. Trans. 30:487-90; Idusogie, E.E. et al. (2001) "Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement," J. Immunol. 166:2571-75; Shields, R.L. et al. (2001) "High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgGl For Fc Gamma RI, Fc Gamma RII, Fc Gamma RIII, And FcRn And Design Of IgGl Variants With Improved Binding To The Fc gamma R " J. Biol. Chem. 276:6591-6604; Idusogie, E.E. et al. (2000) "Mapping Of The Clq Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc," J. Immunol. 164:4178-84; Reddy, M.P. et al. (2000) "Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4 " J. Immunol. 164: 1925-1933; Xu, D. et al. (2000) "In Vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies " Cell. Immunol. 200: 16-26; Armour, K.L. et al. (1999) "Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities " Eur. J. Immunol. 29:2613-24; Jefferis, R. et al. (1996) "Modulation Of
Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions " Immunol. Lett. 54: 101-04; Lund, J. et al. (1996) "Multiple Interactions
Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And
Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains " J. Immunol. 157:4963-4969; Hutchins et al. (1995) "Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-IH," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92: 11980-84; Jefferis, R. et al.
(1995) "Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation," Immunol. Lett. 44: 111-17; Lund, J. et al. (1995) "Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors " FASEB J. 9: 115-19; Alegre, M . et al. (1994) "A Non-Activating "Humanized" Anti-CD3
Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo," Transplantation 57: 1537-1543; Lund et al. (1992) "Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma RII," Mol. Immunol. 29:53-59; Lund et al. (1991) "Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG," J. Immunol. 147:2657-2662; Duncan, A.R. et al. (1988) "Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG," Nature 332:563-564；米国特許第５，６２４，８２１号；米国特許第５，８８５，５７３号；米国特許第６，１９４，５５１号；米国特許第７，２７６，５８６号；及び米国特許第７，３１７，０９１号；並びに国際公開第００／４２０７２号及び国際公開第９９／５８５７２号に開示されているもの等の、公知のいずれの変異型Ｆｃ領域の使用を包含する。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、本発明の分子は更に、１つ又は複数のグリコシル化部位を備えてよく、これにより、１つ又は複数の炭水化物部分は上記分子に共有結合によって付着する。好ましくは、Ｆｃ領域に１つ若しくは複数のグリコシル化部位及び／又は１つ若しくは複数の修飾を有する、本発明の分子は、未修飾抗体と比べて、増強された抗体仲介性エフェクタ機能、例えば増強されたＡＤＣＣ活性を与える、又は有する。いくつかの実施形態では、本発明は更に、Ｆｃ領域の炭水化物部分と直接的又は間接的に相互作用することが分かっている、２４１、２４３、２４４、２４５、２４５、２４９、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６５、２９６、２９９及び３０１位のアミノ酸を含むがこれらに限定されないアミノ酸の１つ又は複数の修飾を含む、分子を含む。Ｆｃ領域の炭水化物部分と直接的又は間接的に相互作用するアミノ酸は当該技術分野において公知であり、例えばJefferis et al. (1995) Immunology Letters, 44: 111-7（この文献は参照によりその全体が本出願に援用される）を参照されたい。
【０２００】
別の実施形態では、本発明は、好ましくは当該分子の機能性、例えば標的分子又はＦｃγＲへの結合活性を変化させることなく、１つ又は複数のグリコシル化部位を、当該分子の１つ又は複数の部位に導入することによって修飾された、分子を包含する。グリコシル化部位は、本発明の分子の可変及び／又は定常領域に導入してよい。本明細書において使用される場合、「グリコシル化部位（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）」は、オリゴ糖（即ち一体に連結した２つ以上の単糖を含有する炭水化物）が特異的に共有結合によって付着する、抗体中のいずれの具体的なアミノ酸配列を含む。オリゴ糖側鎖は典型的には、Ｎ結合又はＯ結合を介して抗体のバックボーンに連結する。Ｎ結合グリコシル化は、アスパラギン残基の側鎖へのオリゴ糖部分の付着を表す。Ｏ結合グリコシル化は、例えばセリン、トレオニンといったヒドロキシアミノ酸へのオリゴ糖部分の付着を表す。本発明の分子は、Ｎ結合及びＯ結合グリコシル化部位を含む、１つ又は複数のグリコシル化部位を備えてよい。当該技術分野において公知のＮ結合又はＯ結合グリコシル化のためのいずれのグリコシル化部位を、本発明に従って使用してよい。本発明の方法に従って使用できる例示的なＮ結合グリコシル化部位は、アミノ酸配列：Ａｓｎ‐Ｘ‐Ｔｈｒ／Ｓｅｒであり、ここでＸはいずれのアミノ酸であってよく、Ｔｈｒ／Ｓｅｒはトレオニン又はセリ
ンを示す。このような１つ又は複数の部位は、本発明が関与する技術分野において公知の方法を用いて、本発明の分子に導入してよい（例えばIN VITRO MUTAGENESIS, RECOMBINANT DNA: A SHORT COURSE, J. D. Watson, et al. W.H. Freeman and Company, New York, 1983, chapter 8, pp. 106-116（その全体は参照によって本出願に援用される）を参照のこと）。グリコシル化部位を本発明の分子に導入するための例示的な方法は：分子のアミノ酸配列を修飾するか若しくは突然変異させて、所望のＡｓｎ‐Ｘ‐Ｔｈｒ／Ｓｅｒ配列を得るステップを含んでよい。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、本発明は、グリコシル化部位を追加又は欠失することによって、本発明の分子の炭水化物含量を改変する方法を包含する。抗体（及び抗体ドメイン、例えばＦｃ領域を含む分子）の炭水化物含量を改変する方法は、当該技術分野において公知であり、本発明に包含される。例えば米国特許第６，２１８，１４９号；欧州特許第０３５９０９６Ｂ１号；米国特許出願第２００２／００２８４８６号；国際公開第０３／０３５８３５号；米国特許出願第２００３／０１１５６１４号；米国特許第６，２１８，１４９号；米国特許第６，４７２，５１１号（これらの全体は参照によって本出願に援用される）を参照されたい。他の実施形態では、本発明は、当該分子の１つ又は複数の内因性炭水化物部分を欠失することによって、本発明の分子の炭水化物含量を改変する方法を包含する。ある具体的実施形態では、本発明は、２９７位に隣接する位置を修飾することによって、抗体のＦｃ領域のグリコシル化部位をシフトするステップを包含する。ある具体的実施形態では、本発明は２９６位を修飾することによって、２９７位ではなく２９６位をグリコシル化するステップを包含する。
【０２０２】
エフェクタ機能はまた、Ｆｃ領域に１つ又は複数のシステイン残基を導入することによって、この領域における鎖間ジスルフィド結合を可能とし、その結果として吸収能力が改善され得る、並びに／又は補体仲介型細胞殺滅及びＡＤＣＣが増大し得るホモ二量体抗体を生成することにより、修飾できる（Caron, P.C. et al. (1992) "Engineered Humanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies J. Exp. Med. 176: 1191-1195; Shopes, B. (1992) "A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced Cytolytic Activity," J. Immunol. 148(9):2918-2922）。抗腫瘍活性が増強されたホモ二量体抗体はまた、Wolff, E.A. et al. (1993) "Monoclonal Antibody Homodimers: Enhanced Antitumor Activity In Nude Mice," Cancer Research 53:2560-2565に記載されているようなヘテロ二機能性クロスリンカーを用いて調製できる。あるいは、二重Ｆｃドメインを有し、それによって補体溶解及びＡＤＣＣ能力が増強され得る抗体を加工できる（Stevenson, G.T. et al. (1989) "A Chimeric Antibody With Dual Fc Regions (bisFabFc) Prepared By Manipulations At The IgG Hinge " Anti-Cancer Drug Design 3:219-230）
。
【０２０３】
Ｆｃ領域を備える本発明の分子の血清半減期は、ＦｃＲｎに関するＦｃ領域の結合親和性を増大させることによって増大させることができる。本明細書において使用される場合、用語「半減期（ｈａｌｆ‐ｌｉｆｅ）は、投与後の分子の平均生存時間の尺度となる、分子の薬物動態特性を意味する。半減期は、血清中で（即ち循環半減期）又は他の組織中で測定した場合に、分子の既知の量の５０パーセント（５０％）が被験者の身体（例えばヒト患者若しくは他の哺乳類）又はその特定の体腔から排除されるために必要な時間として表すことができる。一般に、半減期の増大は、投与される分子の循環における平均滞留時間（ＭＲＴ）の増大につながる。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、本発明のＰＤ‐１結合分子は、変異型Ｆｃ領域を備え、上記変異型Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域に対して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、従って上記分子は、（野生型Ｆｃ領域に対して）増大した半減期を有する。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、本発明のＰＤ‐１結合分子は、変異型Ｆｃ領域を具え、上記変異型Ｆｃ領域は、２３８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５７、２５６、２６５、２７２、２８６、２８８、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、４２８、４３３、４３４、４３５及び４３６からなる群から選択される１つ又は複数の位置に半減期延長アミノ酸置換を含む。Ｆｃ領域含有分子の半減期を増大させることができる多数の具体的な突然変異が当該技術分野において公知であり、例えばＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ及びこれらの組み合わせが挙げられる。例えば：米国特許第６，２７７，３７５号；米国特許第７，０８３，７８４号；米国特許第  ７，２１７，７９７号；米国特許第８，０８８，３７６号；米国公開特許第２００２／０１４７３１１号；米国公開特許第２００７／０１４８１６４号；並びに国際公開第９８／２３２８９号；国際公開第２００９／０５８４９２号；及び国際公開第２０１０／０３３２７９号（これらは参照によりその全体が本出願に援用される）に記載されている突然変異を参照。半減期が増強されたＦｃ領域含有分子としては、Ｆｃ領域残基２５０、２５２、２５４、２５６、２５７、２８８、３０７、３０８、３０９、３１１、３７８、４２８、４３３、４３４、４３５及び４３６のうちの２つ以上における置換、特にＴ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｋ２８８Ｄ、Ｔ３０７Ｑ、Ｖ３０８Ｐ、Ａ３７８Ｖ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ、Ｈ４３５Ｋ及びＹ４３６Ｉから選択される２つ以上の置換を有するものも挙げられる。
【０２０６】
ある具体的実施形態では、上記変異型Ｆｃ領域は、以下の置換を含む：
（Ａ）Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ；
（Ｂ）Ｍ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ；
（Ｃ）Ｍ２５２Ｙ及びＴ２５６Ｅ；
（Ｄ）Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ；
（Ｅ）Ｔ３０７Ｑ及びＮ４３４Ａ；
（Ｆ）Ａ３７８Ｖ及びＮ４３４Ａ；
（Ｇ）Ｎ４３４Ａ及びＹ４３６Ｉ；
（Ｈ）Ｖ３０８Ｐ及びＮ４３４Ａ；又は
（Ｉ）Ｋ２８８Ｄ及びＨ４３５Ｋ。
【０２０７】
本発明は更に：
（Ａ）エフェクタ機能及び／又はＦｃγＲを変化させる１つ又は複数の突然変異；並びに
（Ｂ）血清半減期を延長させる１つ又は複数の突然変異
を含む、変異型Ｆｃ領域も包含する。
【０２０８】
ＶＩ．二重特異性抗ヒトＰＤ‐１結合分子
本発明の一実施形態は、「第１のエピトープ」及び「第２のエピトープ」に結合できる二重特異性結合分子に関し、ここで上記第１のエピトープは、ヒトＰＤ‐１のエピトープであり、上記第２のエピトープは、ＰＤ‐１の同一の若しくは異なるエピトープであり、又は免疫細胞（例えばＴリンパ球等）の表面上に存在して免疫チェックポイントの制御に関与する別の分子のエピトープである。一実施形態では、上記第２のエピトープは、Ｂ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ３２、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ２２６、ＣＴＬＡ‐４、ガレクチン‐９、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＨＨＬＡ２、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３、ＬＩＧＨＴ、ＭＨＣクラスＩ若しくはＩＩ、ＮＫＧ２ａ、ＮＫＧ２ｄ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ１Ｈ、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＰＤ‐Ｌ２、ＰＶＲ、ＳＩＲＰａ、ＴＣＲ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ‐３又はＶＩＳＴＡのエピトープである。一実施形態では、上記第２のエピトープはＰＤ‐
１のエピトープではない。ある具体的実施形態では、上記第２のエピトープは、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ‐４、ＬＡＧ‐３、ＯＸ４０、ＴＩＧＩＴ又はＴＩＭ‐３である。特定の実施形態では、二重特異性分子は、３つ以上のエピトープ結合部位を備える。このような二重特異性分子は、ＬＡＧ‐３の２つ以上の異なるエピトープ、及びＬＡＧ‐３ではない分子の少なくとも１つのエピトープに結合してよい。
【０２０９】
本発明は、ＰＤ‐１及び上記第２のエピトープ（例えばＢ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ‐４、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ、ＯＸ４０、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＣＲ、ＴＩＭ‐３等）に同時に結合できる二重特異性抗体を包含する。いくつかの実施形態では、ＰＤ‐１及び上記第２のエピトープに同時に結合できる上記二重特異性抗体は、国際公開第１９９８／００２４６３号、国際公開第２００５／０７０９６６号、国際公開第２００６／１０７７８６号、国際公開第２００７／０２４７１５号、国際公開第２００７／０７５２７０号、国際公開第２００６／１０７６１７号、国際公開第２００７／０４６８９３号、国際公開第２００７／１４６９６８号、国際公開第２００８／００３１０３号、国際公開第２００８／００３１１６号、国際公開第２００８／０２７２３６号、国際公開第２００８／０２４１８８号、国際公開第２００９／１３２８７６号、国際公開第２００９／０１８３８６号、国際公開第２０１０／０２８７９７、国際公開第２０１００２８７９６号、国際公開第２０１０／０２８７９５号、国際公開第２０１０／１０８１２７号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１１／０８６０９１号、国際公開第２０１１／１３３８８６号、国際公開第２０１２／００９５４４号、国際公開第２０１３／００３６５２号、国際公開第２０１３／０７０５６５号、国際公開第２０１２／１６２５８３号、国際公開第２０１２／１５６４３０号、国際公開第２０１３／１７４８７３号、及び国際公開第２０１４／０２２５４０号に記載の方法のうちのいずれを用いて産生され、上記文献はそれぞれ、参照によりその全体が本出願に援用される。
【０２１０】
Ａ．Ｆｃ領域を有しない二重特異性ダイアボディ
本発明の一実施形態は、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含み、最も好ましくは上記第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖から構成される、二重特異性ダイアボディに関し、その配列は、上記ポリペプチド鎖が互いに対して共有結合して、第１のエピトープ及び第２のエピトープ（これらのエピトープは互いに同一ではない）に同時に結合できる共有結合ダイアボディを形成することを可能とする。従ってこのような二重特異性ダイアボディは、上記第１のエピトープに結合できる「ＶＬ１」／「ＶＨ１」ドメインと、上記第２のエピトープに結合できる「ＶＬ２」／「ＶＨ２」ドメインとを備える。表記法「ＶＬ１」及び「ＶＨ１」はそれぞれ、このような二重特異性ダイアボディの「第１の」エピトープに結合する可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインを指す。同様に、表記法「ＶＬ２」及び「ＶＨ２」はそれぞれ、このような二重特異性ダイアボディの「第２の」エピトープに結合する可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインを指す。ある特定のエピトープが第１のエピトープ又は第２のエピトープのいずれとして指定されるかは無関係であり、このような表記法は、本発明の結合分子のポリペプチド鎖のドメインの存在又は配向にもに関連する。一実施形態では、このようなエピトープのうちの１つは、ＰＤ‐１のエピトープであり、このようなエピトープのうちのもう１つは、ＰＤ‐１のエピトープではない（例えばＢ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ‐４、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ、ＯＸ４０、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＣＲ、ＴＩＭ‐３等のエピトープである）。
【０２１１】
上記第１のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、上記第２のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、第１の抗原（即ちＰＤ‐１又は上記第２のエピトープを含有する抗原）に特異的な第１の官能性抗原結合部位を形成する。同様に上記第２のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、上記第１のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、第２の抗原
（即ち上記第２のエピトープを含有する抗原又はＰＤ‐１）に特異的な第２の官能性抗原結合部位を形成する。従って、上記第１及び第２のポリペプチド鎖の上記ＶＬ及びＶＨドメインの選択は、上記ダイアボディの上記２つのポリペプチド鎖が合わせて、ＰＤ‐１のエピトープ及び上記第２のエピトープの両方に結合できるＶＬ及びＶＨドメインを備える（即ちこれらは、ＶＬPD‐1／ＶＨPD‐1及びＶＬ２／ＶＨ２（ここでＰＤ‐１は「第１の（ｆｉｒｓｔ）」エピトープである）、又はＶＬ１／ＶＨ１及びＶＬPD‐1／ＶＨPD‐1（ここでＰＤ‐１は「第２の（ｓｅｃｏｎｄ）エピトープ」である）を含む）。
【０２１２】
このような二重特異性ダイアボディのある実施形態の第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；上記第１又は第２のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＬ１ドメイン（即ちＶＬPD‐1又はＶＬEpitope 2）；第１の介在スペーサペプチド（リンカー１）；（上記第１のポリペプチド鎖がＶＬPD‐1を含有する場合は）上
記第２のエピトープ、又は（上記第１のポリペプチド鎖がＶＬEpitope 2を含有する場合
は）第１のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＨ２ドメイン；任意にシステイン残基を含有する第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）；ヘテロ二量体促進ドメイン；及びＣ末端を含む（図１）。
【０２１３】
二重特異性ダイアボディのこの実施形態の第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＰＤ‐１又は上記第２のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＬ２ドメイン（即ちＶＬPD‐1又はＶＬEpitope 2；及び上記ＶＬドメインは上記ダイアボディの上記第１のポリペプチド鎖に含まれないよう選択される）；第１の介在スペーサペプチド（リンカー１）；（上記第２のポリペプチド鎖がＶＬPD‐1を含有する場合
は）上記第２のエピトープ、又は（上記第２のポリペプチド鎖がＶＬEpitope 2を含有す
る場合は）ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨ１ドメイン；任意にシステイン残基を含有する第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）；ヘテロ二量体促進ドメイン；及びＣ末端を含む（図１）。
【０２１４】
最も好ましくは、上述のＶＬドメインとＶＨドメインとを隔てる介在リンカーペプチド（例えばリンカー１）の長さは、上記ポリペプチド鎖の上記ＶＬ及びＶＨドメインが互いに対して結合するのを実質的に又は完全に防止するよう選択される。従って第１のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、互いに対して結合することが実質的に又は全くできない。同様に、第２のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、互いに対して結合することが実質的に又は全くできない。好ましい介在スペーサペプチド（リンカー１）は、配列（配列番号１４）：GGGSGGGGを有する。
【０２１５】
上記第２の介在リンカーペプチド（リンカー２）の長さ及び組成は、ヘテロ二量体促進ドメインの選択に基づいて選択される。典型的には、上記第２の介在リンカーペプチド（リンカー２）は、３〜２０個のアミノ酸残基を含む。特に上記ヘテロ二量体促進ドメインがシステイン残基を含まない場合、システイン含有第２の介在リンカーペプチド（リンカー２）が利用される。システイン含有第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）は、１つ、２つ、３つ又は４つ以上のシステインを含有する。好ましいシステイン含有スペーサペプチド（リンカー２）は、配列番号１５：GGCGGGの配列を有する。あるいは、リンカー２はシステインを含まず（例えば、GGG、GGGS（配列番号２９）、LGGGSG（配列番号２６
１）、GGGSGGGSGGG（配列番号２６２）、ASTKG（配列番号３０）、LEPKSS（配列番号３３）、APSSS（配列番号３４）等）、以下で説明されるシステイン含有ヘテロ二量体促進ド
メインが使用される。任意に、システイン含有リンカー２及びシステイン含有ヘテロ二量体促進ドメインの両方が使用される。
【０２１６】
ヘテロ二量体促進ドメインは、一方のポリペプチド鎖上にGVEPKSC（配列番号１６）又
はVEPKSC（配列番号１７）又はAEPKSC（配列番号１８）、及び他方のポリペプチド鎖上に
GFNRGEC（配列番号１９）又はFNRGEC（配列番号２０）を含む（米国特許第２００７／０
００４９０９号）。
【０２１７】
しかしながらより好ましくは、このようなダイアボディのヘテロ二量体促進ドメインは、少なくとも６つ、少なくとも７つ又は少なくとも８つのアミノ酸残基を含む、反対の極の１つ、２つ、３つ又は４つのタンデム反復コイルドメインから形成され、これにより上記ヘテロ二量体促進ドメインは実効電荷を有する（Apostolovic, B. et al. (2008) “pH‐Sensitivity of the E3/K3 Heterodimeric Coiled Coil,” Biomacromolecules 9:3173-3180; Arndt, K.M. et al. (2001) “Helix‐stabilized Fv (hsFv) Antibody Fragments: Substituting the Constant Domains of a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled‐coil Domain,” J. Molec. Biol. 312:221‐228; Arndt, K.M. et al. (2002) “Comparison of In Vivo Selection and Rational Design of Heterodimeric Coiled Coils,”
Structure 10:1235‐1248; Boucher, C. et al. (2010) “Protein Detection By Western Blot Via Coiled-Coil Interactions,” Analytical Biochemistry 399:138‐140; Cachia, P.J. et al. (2004) “Synthetic Peptide Vaccine Development: Measurement Of
Polyclonal Antibody Affinity And Cross‐Reactivity Using A New Peptide Capture And Release System For Surface Plasmon Resonance Spectroscopy,” J. Mol. Recognit. 17:540‐557; De Crescenzo, G.D. et al. (2003) “Real‐Time Monitoring of the Interactions of Two‐Stranded de novo Designed Coiled‐Coils: Effect of Chain Length on the Kinetic and Thermodynamic Constants of Binding,” Biochemistry 42:1754‐1763; Fernandez‐Rodriquez, J. et al. (2012) “Induced Heterodimerization And Purification Of Two Target Proteins By A Synthetic Coiled‐Coil Tag,” Protein
Science 21:511‐519; Ghosh, T.S. et al. (2009) “End‐To‐End And End‐To‐Middle Interhelical Interactions: New Classes Of Interacting Helix Pairs In Protein Structures,” Acta Crystallographica D65:1032‐1041; Grigoryan, G. et al. (2008)
“Structural Specificity In Coiled‐Coil Interactions,” Curr. Opin. Struc. Biol. 18:477‐483; Litowski, J.R. et al. (2002) “Designing Heterodimeric Two‐Stranded α‐Helical Coiled‐Coils: The Effects Of Hydrophobicity And α‐Helical Propensity On Protein Folding, Stability, And Specificity,” J. Biol. Chem. 277:37272‐37279; Steinkruger, J.D. et al. (2012) “The d′‐‐d‐‐d′ Vertical Triad
is Less Discriminating Than the a′‐‐a‐‐a′ Vertical Triad in the Antiparallel Coiled‐coil Dimer Motif,” J. Amer. Chem. Soc. 134(5): 2626-2633; Straussman, R. et al. (2007) “Kinking the Coiled Coil - Negatively Charged Residues at the Coiled‐coil Interface,” J. Molec. Biol. 366:1232‐1242; Tripet, B. et al. (2002) “Kinetic Analysis of the Interactions between Troponin C and the C‐terminal Troponin I Regulatory Region and Validation of a New Peptide Delivery/Capture System used for Surface Plasmon Resonance,” J. Molec. Biol. 323:345-362; Woolfson, D.N. (2005) “The Design Of Coiled‐Coil Structures And Assemblies,” Adv.
Prot. Chem. 70:79‐112; Zeng, Y. et al. (2008) “A Ligand‐Pseudoreceptor System Based On de novo Designed Peptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With Altered Tropism,” J. Gene Med. 10:355‐367）。
【０２１８】
このような反復コイルドメインは、完全な反復であってよく、又は置換を有してよい。例えば、第１のポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインのコイルドメインは、上記ヘテロ二量体促進ドメインに対して負の電荷を与えるよう選択された８つのアミノ酸残基のシーケンスを含んでよく、第２のポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインのコイルドメインは、上記ヘテロ二量体促進ドメインに対して正の電荷を与えるよう選択された８つのアミノ酸残基のシーケンスを含んでよい（又はその逆であってよい）。反対の電荷のコイルを他方のポリペプチド鎖に対して使用する場合、第１又は第２のポリペプチド鎖にどちらのコイルを設けるかは重要ではない。正荷電アミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒス
チジン等であってよく、及び／又は負荷電アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸等であってよい。正荷電アミノ酸は好ましくはリジンであり、及び／又は負荷電アミノ酸は好ましくはグルタミン酸である。（このようなドメインはホモ二量体化を阻害し、これによってヘテロ二量体化を促進するため）単一のヘテロ二量体促進ドメインしか採用できないが、本発明のダイアボディの第１及び第２のポリペプチド鎖両方が、ヘテロ二量体促進ドメインを含有することが好ましい。
【０２１９】
好ましい実施形態では、ヘテロ二量体促進ドメインのうちの１つは、４つのタンデム「Ｅコイル」螺旋ドメイン（配列番号２１：EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK）を備え、そのグルタミン酸残基は、ｐＨ７において負の電荷を形成し、またその一方で、ヘテロ二量体促進ドメインのうちのもう一方は、４つのタンデム「Ｋコイル」ドメイン（配列番号２２：KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE）を備え、そのリジン残基は、ｐＨ７において正の電荷を形成する。このような荷電ドメインの存在により、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の連結が促進され、従ってヘテロ二量体形成が促進される。特に好ましいのは、配列番号２１の上記４つのタンデム「Ｅコイル」螺旋ドメインのうちの１つが、システイン残基：EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号２３）を含有するように修飾されている、ヘテロ二量体促進ドメインである。同様に、特に好ましいのは、配列番号２２の上記４つのタンデム「Ｋコイル」螺旋ドメインのうちの１つが、システイン残基：KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号２４）を含有するように修飾されている、ヘテロ二量体促進ドメインである。
【０２２０】
国際公開第２０１２／０１８６８７号に開示されているように、ダイアボディのインビボ薬物動態特性を改善するために、ダイアボディを、ダイアボディの末端のうちの１つ又は複数に血清結合タンパク質のポリペプチド部分を含有するように修飾してよい。最も好ましくは、このような血清結合タンパク質のポリペプチド部分は、ダイアボディのＣ末端に配置されることになる。アルブミンは、血漿中に最も豊富なタンパク質であり、ヒトにおいて１９日の半減期を有する。アルブミンは複数の小さな分子結合部位を有し、これによりアルブミンは他のタンパク質に非共有結合して血清半減期を延長できる。連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）は、安定した３重螺旋束を形成する４６個のアミノ酸残基からなり、広範なアルブミン結合特異性を有する（Johansson, M.U. et al. (2002) “Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules,” J. Biol. Chem. 277(10):8114‐8120）。従って、ダイアボディのインビボ薬物動態特性を改善するための、血清結合タンパク質の特に好ましいポリペプチド部分は、連鎖球菌タンパク質Ｇからのアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、及びより好ましくは、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）（配列番号２５）：LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALPである。
【０２２１】
国際公開第２０１２／１６２０６８号（参照により本出願に援用される）に開示されているように、配列番号２５の「脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）」変異型は、ＭＨＣクラスＩＩ結合を減衰させる又は排除する能力を有する。組み合わさった突然変異の結果に基づいて、以下の置換の組み合わせが、このような脱免疫化ＡＢＤを形成するための好ましい置換であると考えられる：６６Ｄ／７０Ｓ＋７１Ａ；６６Ｓ／７０Ｓ＋７１Ａ；６６Ｓ／７０Ｓ＋７９Ａ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｓ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｄ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｅ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｓ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｄ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｅ。修飾Ｌ６４Ａ、Ｉ６５Ａ及びＤ７９Ａ、又は修飾Ｎ６６Ｓ、Ｔ７０Ｓ及びＤ７９Ａを有する変異型ＡＢＤ。アミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLID66NAKS70 A71EGVKALIDE ILAALP（配列番号２６）
又はアミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNA64A65NNAKT VEGVKALIA79E ILAALP（配列番号２７）
又はアミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIS66NAKS70 VEGVKALIA79E ILAALP（配列番号２８）を有する、変異型脱免疫化ＡＢＤが特に好ましい。というのは、このような脱免疫化ＡＢＤは、ＭＨＣクラスＩＩ結合の減衰を提供しながら、略野生型の結合を呈するためである。従って、ＡＢＤを有するこのようなダイアボディの上記第１のポリペプチド鎖は、好ましくはこのようなポリペプチド鎖のＥコイル（又はＫコイル）ドメインに対してＣ末端に位置決めされることによって、上記Ｅコイル（又はＫコイル）ドメインとＡＢＤ（これは好ましくは脱免疫化ＡＢＤである）との間に介在する、ペプチドリンカーを含有する。このようなペプチドリンカーの好ましい配列は、配列番号２９：GGGSである。
【０２２２】
Ｂ．Ｆｃ領域を含有する二重特異性ダイアボディ
本発明の一実施形態は、ＰＤ‐１及び第２のエピトープ（例えばＢ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ‐４、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ、ＯＸ４０、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＣＲ、ＴＩＭ‐３等）に同時に結合できるＦｃ領域を備える、二重特異性ダイアボディに関する。上記ダイアボディポリペプチド鎖のうちの一方又は両方にＩｇＧ  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを追加して、上記ダイアボディ鎖の複合体化によってＦｃ領域が形成されるようにすると、上記ダイアボディの生物学的半減期が増大し、及び／又は価数が変化する。上記ダイアボディポリペプチドの両方にＩｇＧ  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを組み込むと、２鎖二重特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディの形成が可能となる（図２）。
【０２２３】
あるいは、上記ダイアボディポリペプチドのうちの一方にＩｇＧ  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを組み込むと、より複雑な４鎖二重特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディの形成が可能となる（図３Ａ〜３Ｃ）。図３Ｃは、定常軽鎖（ＣＬ）ドメイン及び定常重鎖ＣＨ１ドメインを有する代表的な４鎖ダイアボディを示すが、このようなドメインの断片及び他のポリペプチドを代わりに採用してもよい（例えば図３Ａ及び３Ｂ、米国公開特許第２０１３‐０２９５１２１号；米国公開特許第２０１０‐０１７４０５３号及び米国公開特許第２００９‐００６０９１０号；欧州公開特許第２７１４０７９号；欧州公開特許第２６０１２１６号；欧州公開特許第２３７６１０９号；欧州公開特許第２１５８２２１号、及び国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号を参照）。従って例えば、ＣＨ１ドメインの代わりに、ヒトＩｇＧのヒンジドメイン由来のアミノ酸配列GVEPKSC（配列番号１６）、VEPKSC（配列番号１
７）又はAEPKSC（配列番号１８）を有するペプチドを採用してよく、またＣＬドメインの代わりに、ヒトκ軽鎖のＣ末端６アミノ酸、GFNRGEC（配列番号１９）又はFNRGEC（配列
番号２０）を採用してよい。４鎖ダイアボディを含有する代表的なペプチドを図３Ａに示す。あるいは、又は更に、対向する電荷のタンデムコイルドメイン、例えば「Ｅコイル」螺旋ドメイン（配列番号２１：EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK又は配列番号２３：EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK）；及び「Ｋコイル」ドメイン（配列番号２２：KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE又は配列番号２４：KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE）を備えるペプチドを採用してよい。４鎖ダイアボディを含有する代表的なコイルドメインを図３Ｂに示す。
【０２２４】
本発明のＦｃ領域含有ダイアボディ分子は一般に、介在リンカーペプチド（リンカー）を含む。典型的には、この追加のリンカーは３〜２０個のアミノ酸残基を含む。本発明のＦｃ領域含有ダイアボディ分子において採用できる追加の又は代替のリンカーとしては、：GGGS（配列番号２９）、LGGGSG（配列番号２６１）、GGGSGGGSGGG（配列番号２６２）
、ASTKG（配列番号３０）、DKTHTCPPCP（配列番号３１）、EPKSCDKTHTCPPCP（配列番号３２）、LEPKSS（配列番号３３）、APSSS（配列番号３４）、及びAPSSSPME（配列番号３５
）、LEPKSADKTHTCPPC（配列番号３６）、GGC、及びGGGが挙げられる。クローニングを容
易にするために、GGG又はGGCの代わりに配列番号３３を使用してよい。更に、アミノ酸ＧＧＧ又は配列番号３３の直後に配列番号３１を続けることによって、代替リンカー：GGGDKTHTCPPCP（配列番号２６３）；及びLEPKSSDKTHTCPPCP（配列番号３７）を形成してよい
。本発明のＦｃ領域含有ダイアボディ分子は、リンカーに加えて又はリンカーに代えて、ＩｇＧヒンジ領域を組み込んでよい。例示的なヒンジ領域としては：ＩｇＧ１からのEPKSCDKTHTCPPCP（配列番号３２）；ＩｇＧ２からのERKCCVECPPCP（配列番号１１）；ＩｇＧ
４からのESKYGPPCPSCP（配列番号１２）；及び鎖交換を低減するための安定化置換を含むＩｇＧ４ヒンジ変異型からのESKYGPPCPPCP（配列番号１３）が挙げられる。
【０２２５】
図３Ａ〜３Ｃに提示されているように、本発明のダイアボディは４つの異なる鎖を含んでよい。このようなダイアボディの第１及び第３のポリペプチド鎖は、４つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメイン；及び（ｉｖ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。第２及び第４のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを含有し、上記ヘテロ二量体促進ドメインは、第１／第３のポリペプチド鎖と第２／第４のポリペプチド鎖との二量体化を促進する。第３及び第４のポリペプチド鎖のＶＬ及び／又はＶＨドメイン、並びに第１及び第２のポリペプチド鎖のＶＬ及び／又はＶＨドメインは、同一であっても異なっていてもよく、これにより、単一特異性、二重特異性又は四重特異性の４価結合が可能となる。表記法「ＶＬ３」及び「ＶＨ３」はそれぞれ、このようなダイアボディの「第３の」エピトープに結合する可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインを指す。同様に、表記法「ＶＬ４」及び「ＶＨ４」はそれぞれ、このようなダイアボディの「第４の」エピトープに結合する可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインを指す。本発明の代表的な４鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディのポリペプチド鎖の一般構造を表２に提示する。
【０２２６】
【表４】
2019055948.tif 000008
【０２２７】
ある具体的実施形態では、本発明のダイアボディは、合計４つのポリペプチド鎖からなる、二重特異性、４価（即ち４つのエピトープ結合部位を有する）、Ｆｃ含有ダイアボディ（図３Ａ〜３Ｃ）である。本発明の二重特異性、４価、Ｆｃ含有ダイアボディは、ＰＤ‐１に免疫特異的な２つのエピトープ結合部位（これらはＰＤ‐１の同一のエピトープ又はＰＤ‐１の異なるエピトープに結合できる）、及び第２のエピトープ（例えばＢ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ‐４、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ、ＯＸ４０、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＣＲ、ＴＩＭ‐３等）に特異的な２つのエピトープ結合部位を備える。
【０２２８】
更なる実施形態では、上記二重特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディは、３つのポリペプチド鎖を含んでよい。このようなダイアボディの第１のポリペプチドは、３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。このようなダイアボディの第２のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）上記ダイアボディの第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメインを含有する。このようなダイアボディの第３のポリペプチドは、ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含む。従ってこのようなダイアボディの上記第１及び第２のポリペプチド鎖は、一体に連結して、上記第１のエピトープに結合できるＶＬ１／ＶＨ１結合部位、及び上記第２のエピトープに結合できるＶＬ２／ＶＨ２結合部位を形成する。上記第１及び第２のポリペプチドは、それぞれの第３のドメインのシステイン残基が関わるジスルフィド結合によって、互いに結合する。特に上記第１及び第３のポリペプチド鎖は、互いに複合体化して、ジスルフィド結合によって安定化されたＦｃ領域を形成する。このようなダイアボディは、強度が増強されている。図４Ａ及び４Ｂは、このようなダイアボディの構造を示す。このようなＦｃ領域含有二重特異性ダイアボディは、２つの配向（表３）のうちのいずれを有してよい。
【０２２９】
【表５】
2019055948.tif 000009
【０２３０】
ある具体的実施形態では、本発明のダイアボディは、合計３つのポリペプチド鎖からなる、二重特異性、２価（即ち２つのエピトープ結合部位を有する）、Ｆｃ含有ダイアボディ（図４Ａ〜４Ｂ）である。本発明の二重特異性、２価Ｆｃ含有ダイアボディは、ＰＤ‐１に免疫特異的な１つのエピトープ結合部位、第２のエピトープ（例えばＢ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ‐４、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３  ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ、ＯＸ４０、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＣＲ、ＴＩＭ‐３等）に特異的な１つのエピトープ結合部位を備える。
【０２３１】
更なる実施形態では、上記二重特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディは、合計５つのポリペプチド鎖を含んでよい。ある特定の実施形態では、上記５つのポリペプチド鎖のうちの２つは、同一のアミノ酸配列を有する。このようなダイアボディの第１のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。上記第１のポリペプチド鎖は、ＶＨ１及び重鎖定常領域を含有する抗体の重鎖であってよい。このようなダイアボディの第２及び第５のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；及び（ｉｉ）ＣＬ含有ドメインを含有する。このようなダイアボディの上記第２及び／又は第５のポリペプチド鎖は、上記第１／第３のポリペプチド鎖のＶＨ１に対して相補的なＶＬ１を含有する抗体の軽鎖であってよ
い。上記第１、第２及び／又は第５のポリペプチド鎖は、自然に発生する抗体から単離できる。あるいはこれらは、組み換えによって構成できる。このようなダイアボディの第３のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメイン；（ｉｖ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｖ）ＶＨ３含有ドメイン；及び（ｖｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを含有し、上記ヘテロ二量体促進ドメインは、上記第３の鎖と上記第４の鎖との二量体化を促進する。このようなダイアボディの第４のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ３含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）上記ダイアボディの第３のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメインを含有する。
【０２３２】
従って、このようなダイアボディの上記第１及び第２のポリペプチド鎖と上記第３及び第５のポリペプチド鎖とは、互いに連結して、第１のエピトープに結合できる２つのＶＬ１／ＶＨ１結合部位を形成する。このようなダイアボディの上記第３及び第４のポリペプチド鎖は、互いに連結して、第２のエピトープに結合できるＶＬ２／ＶＨ２結合部位、及び第３のエピトープに結合できるＶＬ３／ＶＨ３結合部位を形成する。上記第１及び第３のポリペプチドは、それぞれの定常領域のシステイン残基が関わるジスルフィド結合によって、互いに結合する。特に上記第１及び第３のポリペプチド鎖は、互いに複合体化して、Ｆｃ領域を形成する。このようなダイアボディは、強度が増強されている。図５は、このようなダイアボディの構造を示す。ＶＬ１／ＶＨ１、ＶＬ２／ＶＨ２及びＶＬ３／ＶＨ３ドメインは、同一であっても異なっていてもよく、これにより、単一特異性、二重特異性又は三重特異性である結合が可能となることが理解されるだろう。しかしながら、本明細書において提示されるように、これらのドメインは好ましくは、ＰＤ‐１を第２のエピトープ（例えばＢ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ‐４、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３  ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ、ＯＸ４０、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＣＲ、ＴＩＭ‐３等）に結合するように選択される。
【０２３３】
上記ポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、所望のエピトープに特異的なＶＬ／ＶＨ結合部位を形成するよう選択される。上記ポリペプチド鎖の連結によって形成されるＶＬ／ＶＨ結合部位は、同一であっても異なっていてもよく、これにより、単一特異性、二重特異性、三重特異性又は四重特異性である４価結合が可能となる。特に上記ＶＬ及びＶＨドメインは、二重特異性ダイアボディが、第１のエピトープに関する２つの結合部位及び第２のエピトープに関する２つの結合部位、又は第１のエピトープに関する３つの結合部位及び第２のエピトープに関する１つの結合部位、又は（図５に示すように）第１のエピトープに関する２つの結合部位、第２のエピトープに関する１つの結合部位及び第３のエピトープに関する１つの結合部位を備えるように選択してよい。本発明の代表的な５鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディのポリペプチド鎖の一般構造を表４に示す。
【０２３４】
【表６】
2019055948.tif 000010
【０２３５】
ある具体的実施形態では、本発明のダイアボディは、第１のエピトープに関する２つの結合部位及び第２のエピトープに関する２つの結合部位を有する、合計５つのポリペプチド鎖からなる、二重特異性、４価（即ち４つのエピトープ結合部位を有する）、Ｆｃ含有ダイアボディである。一実施形態では、本発明の二重特異性、４価、Ｆｃ含有ダイアボディは、ＰＤ‐１に免疫特異的な２つのエピトープ結合部位（これらはＰＤ‐１の同一のエピトープ又はＰＤ‐１の異なるエピトープに結合してよい）、及び第２のエピトープ（例えばＢ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ‐４、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３  ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ、ＯＸ４０、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＣＲ、ＴＩＭ‐３等）に特異的な２つのエピトープ結合部位を備える。別の実施形態では、本発明の二重特異性、４価、Ｆｃ含有ダイアボディは、ＰＤ‐１に免疫特異的な３つのエピトープ結合部位（これらはＰＤ‐１の同一のエピトープ又はＰＤ‐１の異なるエピトープに結合してよい）、及び第２のエピトープ（例えばＢ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ‐４、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３  ＭＨＣ  クラスＩ又はＩＩ、ＯＸ４０、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＣＲ、ＴＩＭ‐３等）に特異的な１つのエピトープ結合部位を備える。別の実施形態では、本発明の二重特異性、４価、Ｆｃ含有ダイアボディは、ＰＤ‐１に免疫特異的な１つのエピトープ結合部位、及び第２のエピトープ（例えばＢ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ‐４、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３  ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ、ＯＸ４０、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＣＲ、ＴＩＭ‐３等）に特異的な３つのエピトープ結合部位を備える。
【０２３６】
Ｃ．Ｆｃ領域を含有する二重特異性３価結合分子
本発明の更なる実施形態は、Ｆｃ領域を備え、第１のエピトープ、第２のエピトープ及び第３のエピトープに同時に結合できる、二重特異性、３価結合分子に関し、ここで上記
エピトープのうちの少なくとも１つは、別のものと同一ではない。従ってこのような二重特異性ダイアボディは、第１のエピトープに結合できる「ＶＬ１」／「ＶＨ１」ドメイン、第２のエピトープに結合できる「ＶＬ２」／「ＶＨ２」ドメイン、及び第３のエピトープに結合できる「ＶＬ３」／「ＶＨ３」ドメインを備える。一実施形態では、上記エピトープのうちの１つ又は２つは、ＰＤ‐１のエピトープであり、上記エピトープのうちの別の（又は他の）ものは、ＰＤ‐１のエピトープではない（例えばＢ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ‐４、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ、ＯＸ４０、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＣＲ、ＴＩＭ‐３等のエピトープである）。このような二重特異性３価結合分子は、３つのエピトープ結合部位を備え、そのうちの２つは、結合部位Ａ及び結合部位Ｂを提供するダイアボディ型結合ドメインであり、１つは、結合部位Ｃを提供する非ダイアボディ型結合ドメインである（例えば図６Ａ〜６Ｆ、並びにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／３３０８１号、及びＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／３３０７６号参照）。
【０２３７】
典型的には、本発明の３価結合分子は、４つの異なるポリペプチド鎖を含む（図６Ａ〜６Ｂ参照）が、上記分子は、例えばこれらのポリペプチド鎖を（例えばペプチド結合によって）互いに融合させることによって、又はこれらのポリペプチドを「分割（ｄｉｖｉｄｉｎｇ）」して追加のポリペプチド鎖を形成することによって、又はより少数若しくは追加のポリペプチド鎖をジスルフィド結合によって連結することによって、より少数又はより多数のポリペプチド鎖を含むことができる。図６Ｂ〜６Ｆは、３つのポリペプチド鎖を有する分子を概略的に示すことによって、本発明のこの態様を図示している。図６Ａ〜６Ｆに提示されているように、本発明の３価結合分子は、上記ダイアボディ型結合ドメインがＦｃ領域に対するＮ末端（図６Ａ、６Ｃ及び６Ｄ）又はＣ末端（図６Ｂ、６Ｅ及び６Ｆ）となる交互の配向を有してよい。
【０２３８】
特定の実施形態では、本発明のこのような３価結合分子の第１のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメイン；及び（ｉｖ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。上記ＶＬ１及びＶＬ２ドメインは、表５（図６Ａ及び６Ｂ）に提示されるように、上記ＣＨ２‐ＣＨ３含有ドメインに対してＮ末端又はＣ末端に位置する。このような実施形態の第２のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを含有する。このような実施形態の第３のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ３含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。上記第３のポリペプチド鎖は、ＶＨ３及び重鎖定常領域を含有する抗体の重鎖であってよい。このような実施形態の第４のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ３含有ドメイン；及び（ｉｉ）ＣＬ含有ドメインを含有する。上記第４のポリペプチド鎖は、上記第３のポリペプチド鎖のＶＨ３に対して相補的なＶＬ３を含有する抗体の軽鎖であってよい。上記第３又は第４のポリペプチド鎖は、自然に発生する抗体から単離できる。あるいはこれらは、組み換えによって、合成によって、又は他の手段によって構成できる。
【０２３９】
上記第１及び第２のポリペプチド鎖の可変軽鎖ドメインは、介在スペーサリンカーによって、このようなポリペプチド鎖の可変重鎖ドメインから隔てられ、上記介在スペーサリンカーは、これらのＶＬ１／ＶＨ２（又はこれらのＶＬ２／ＶＨ１）ドメインを一体に連結して、第１又は第２のエピトープに結合できるエピトープ結合部位を形成することを可能にするには短すぎる長さを有する。この目的のために好ましい介在スペーサペプチド（リンカー１）は、配列（配列番号１４）：GGGSGGGGを有する。上記３価結合分子の他のドメインは、任意にシステイン残基を含む、１つ又は複数の介在スペーサペプチドによって隔てられていてよい。３価結合分子の生成に有用な例示的なリンカーは、本明細書に提示されており、またＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／３３０８１号；及びＰＣＴ出願第ＰＣ
Ｔ／ＵＳ１５／３３０７６号にも提示されている。従ってこのような３価結合分子の第１及び第２のポリペプチド鎖は、一体に連結して、第１のエピトープに結合できるＶＬ１／ＶＨ１結合部位、及び第２のエピトープに結合できるＶＬ２／ＶＨ２結合部位を形成する。このような３価結合分子の第３及び第４のポリペプチド鎖は、一体に連結して、第３のエピトープに結合できるＶＬ３／ＶＨ３結合部位を形成する。ＶＬ１／ＶＨ１、ＶＬ２／ＶＨ２及びＶＬ３／ＶＨ３ドメインは同一であっても異なっていてもよく、これにより単一特異性、二重特異性又は三重特異性である結合が可能となることが理解されるだろう
【０２４０】
上述のように、本発明の３価結合分子は、３つのポリペプチドを含んでよい。３つのポリペプチド鎖を含む３価結合分子は、第４のポリペプチドＮ末端のドメインを第３のポリペプチドのＶＨ３含有ドメインに連結することによって得ることができる。あるいは、以下の３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ３含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ３含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する本発明の３価結合分子の第３のポリペプチド鎖が利用され、ここでＶＬ３及びＶＨ３は、これらのドメインが連結してエピトープ結合部位を形成できるようにするために十分な長さ（少なくとも９以上のアミノ酸残基）を有する介在スペーサペプチドによって、互いから隔てられる。
【０２４１】
ＶＬ１／ＶＨ１、ＶＬ２／ＶＨ２及びＶＬ３／ＶＨ３ドメインは、同一であっても異なっていてもよく、これにより、単一特異性、二重特異性又は三重特異性である結合が可能となることが理解されるだろう。しかしながら本明細書において提示されるように、これらのドメインは好ましくは、ＰＤ‐１及び第２のエピトープ（又は第２及び第３のエピトープ）を結合させるよう選択される（好ましくは、上記エピトープは、Ｂ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ‐４、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３  ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ、ＯＸ４０、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＣＲ、ＴＩＭ‐３等のエピトープである）。
【０２４２】
特にＶＬ及びＶＨドメインは、３価結合分子が、第１のエピトープに関する２つの結合部位及び第２のエピトープに関する１つの結合部位、又は第１のエピトープに関する１つの結合部位及び第２のエピトープに関する２つの結合部位、又は第１のエピトープに関する１つの結合部位、第２のエピトープに関する１つの結合部位及び第３のエピトープに関する１つの結合部位を含むよう、選択してよい。本発明の代表的な３価結合分子のポリペプチド鎖の一般構造を、図６Ａ〜６Ｆ及び表５に提示する。
【０２４３】
【表７】
2019055948.tif 000011
【０２４４】
本発明の一実施形態は、ＰＤ‐１に関する２つのエピトープ結合部位、及びＰＤ‐１以外の分子（例えばＢ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ‐４、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ、ＯＸ４０、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＣＲ、ＴＩＭ‐３等）上に存在する第２のエピトープに関する１つのエピトープ結合部位を備える、二重特異性３価結合分子に関する。ＰＤ‐１に関する２つのエピトープ結合部位は、同一のエピトープ又は異なるエピトープに結合してよい。本発明の別の実施形態は、ＰＤ‐１に関する１つのエピトープ結合部位、及びＰＤ‐１以外の分子（例えばＢ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ‐４、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ、ＯＸ４０、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＣＲ、ＴＩＭ‐３等）上に存在する第２の抗原に関する２つのエピトープ結合部位を備える、二重特異性３価結合分子に関する。上記第２の抗原に関する２つのエピトープ結合部位は、上記抗原の同一のエピトープ又は異なるエピトープ（例えばＬＡＧ‐３の同一の又は異なるエピトープ）に結合してよい。上述のように、このような二重特異性３価結合分子は、３つ又は４つのポリペプチド鎖を含んでよい。
【０２４５】
ＶＩＩ．定常ドメイン及びＦｃ領域
ここで提示されるのは、本発明のＰＤ‐１結合分子（例えば、抗体、ダイアボディ、３価結合分子等）の生成に有用な抗体定常ドメインである。
【０２４６】
好ましいＣＬドメインは、ヒトＩｇＧＣＬκドメインである。例示的なヒトＩｇＧ  ＣＬκドメインのアミノ酸配列は、（配列番号８）：
RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG
NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK
SFNRGEC
である。
【０２４７】
あるいは、例示的なＣＬドメインは、ヒトＩｇＧ  ＣＬλドメインである。例示的なヒトＩｇＧ  ＣＬλドメインのアミノ酸配列は、（配列番号９）：
QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA 
GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP
TECS
である。
【０２４８】
本明細書において提示されるように、本発明のＰＤ‐１結合分子は、Ｆｃ領域を備えてよい。本発明のこのような分子のＦｃ領域は、いずれのアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）のものであってよい。本発明のＰＤ‐１結合分子は更に、ＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジ領域を備えてよい。上記ＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジ領域が存在する場合、上記ＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジ領域は、いずれのアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）のものであってよく、好ましくは所望のＦｃ領域と同一のアイソタイプのものである。
【０２４９】
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１０）：
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV
である。
【０２５０】
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号２５７）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV
である。
【０２５１】
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ４  ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ４  ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号２５４）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV 
である。
【０２５２】
ある例示的なヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。例示的なヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸配列は、（配列番号３２）：EPKSCDKTHTCPPCPである。
【０２５３】
別の例示的なヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域である。例示的なヒトＩｇＧ２ヒンジ領域のアミノ酸配列は、（配列番号１１）：ERKCCVECPPCPである。
【０２５４】
別の例示的なヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域である。例示的なヒトＩｇＧ４ヒンジ領域のアミノ酸配列は、（配列番号１２）：ESKYGPPCPSCPである。本明細書に記載されているように、ＩｇＧ４ヒンジ領域は、Ｓ２２８Ｐ置換等の安定化突然変異を含んでよい。例示的な安定化されたＩｇＧ４ヒンジ領域のアミノ酸配列は、（配列番号１３）：ESKYGPPCPPCPである。
【０２５５】
本発明のＦｃ領域含有分子（例えば抗体、ダイアボディ及び３価分子）のＦｃ領域は、完全なＦｃ領域（例えば完全ＩｇＧ  Ｆｃ領域）であっても、又はＦｃ領域の断片のみであってもよい。任意に、本発明のＦｃ領域含有分子のＦｃ領域は、Ｃ末端リシンアミノ酸残基を含まない。特に、本発明のＦｃ領域含有分子のＦｃ領域は、操作済み変異型Ｆｃ領域であってよい。本発明の二重特異性Ｆｃ領域含有分子のＦｃ領域は、１つ又は複数のＦ
ｃ受容体（例えば１つ又は複数のＦｃγＲ）に結合できる能力を有してよいが、より好ましくは、上記変異型Ｆｃ領域は、（野生型Ｆｃ領域が呈する結合に対して）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）若しくはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が変化しているか、又は１つ若しくは複数の阻害性受容体に結合する能力が低下しているか若しくは上記能力を有しない。従って、本発明の二重特異性Ｆｃ領域含有分子のＦｃ領域は、完全Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのうちのある程度若しくは全体及び／若しくはＣＨ３ドメインのうちのある程度若しくは全体を含んでよく、又は（例えば完全Ｆｃ領域のＣＨ２若しくはＣＨ３ドメインに対する１つ若しくは複数の挿入及び／若しくは１つ若しくは複数の欠失を含んでよい）変異型ＣＨ２及び／若しくは変異型ＣＨ３配列を備えてよい。このようなＦｃ領域は、非Ｆｃポリペプチド部分を備えてよく、又は自然に発生しない完全Ｆｃ領域の部分を備えてよく、又はＣＨ２及び／若しくはＣＨ３ドメインの自然に発生しない配向を備えてよい（例えば２つのＣＨ２ドメイン若しくは２つのＣＨ３領域、若しくはＮ末端からＣ末端への方向において、ＣＨ３ドメインと、これが連結したＣＨ２ドメイン、等）。
【０２５６】
変化したエフェクタ機能として表されるＦｃドメイン修飾は当該技術分野において公知であり、活性化型受容体に対する結合を増大させる修飾（例えばＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ））、及び阻害型受容体に対する結合を低下させる修飾（例えばＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ））が含まれる（例えばStavenhagen, J.B. et al. (2007) “Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low‐Affinity Activating Fcgamma Receptors,” Cancer Res. 57(18):8882‐8890を参照）。ＣＤ３２Ｂへの結合が低下した、及び／又はＣＤ１６Ａへの結合が増大した、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域の例示的な変異型は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ又はＰ２９６Ｌ置換を含有する。これらのアミノ酸置換は、いずれの組み合わせ又は部分組み合わせで、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域内に存在してよい。一実施形態では、上記ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域変異型は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＹ３００Ｌ置換を含有する。別の実施形態では、上記ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域変異型は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ２９６Ｌ置換を含有する。
【０２５７】
特に、本発明のＦｃ領域含有分子のポリペプチド鎖のＦｃ領域に関して、（野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号１）が呈する結合に対して）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が低下している（又はこれらに略結合しない）ことが好ましい。変異型Ｆｃ領域、及びこのような変化した結合を仲介できる突然変異の形態については、上述されている。ある具体的実施形態では、本発明のＦｃ領域含有分子は、ＡＤＣＣエフェクタ機能が低下したＩｇＧ  Ｆｃ領域を備える。ある好ましい実施形態では、このようなＦｃ領域含有分子の第１及び／又は第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、以下の置換：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ｑ、及びＮ２９７Ｇのうちのいずれの１つ、２つ又は３つを含む。別の実施形態では、上記ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域変異型は、Ｎ２９７Ｑ置換、Ｎ２９７Ｇ置換、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換又はＤ２６５Ａ置換を含有するが、それはこれらの突然変異がＦｃＲ結合を消失させるためである。あるいは、（野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号１）が呈する結合に対して）ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）に対する結合が元来低い（又は略結合しない）、及び／又はエフェクタ機能が元来低いＦｃ領域のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを利用する。ある具体的実施形態では、本発明のＦｃ領域含有分子は、ＩｇＧ２  Ｆｃ領域（配列番号２）又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域（配列番号４）を備える。ＩｇＧ４  Ｆｃ領域を利用する場合、本発明は、上述のヒンジ領域Ｓ２２８Ｐ置換（例えば配列番号１３参照）等の安定化突然変異の導入も包含する。Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｑ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＤ２６
５Ａ置換はエフェクタ機能を消失させるため、エフェクタ機能が望まれる状況下では、これらの置換は採用しないことが好ましい。
【０２５８】
特に、本発明のＦｃ領域含有分子のポリペプチド鎖のＦｃ領域に関して、（対応する野生型Ｆｃ領域が呈する半減期に対して）血清半減期が増大することが好ましい。血清半減期が延長された変異型Ｆｃ領域及び突然変異形態については上述されている。ある好ましい実施形態では、このようなＦｃ領域含有分子の第１及び／又は第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、以下の置換：Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅのうちのいずれの１つ、２つ又は３つを含む。本発明は更に：
（Ａ）エフェクタ機能及び／又はＦｃγＲを変化させる、１つ又は複数の突然変異；並びに
（Ｂ）血清半減期を延長させる、１つ又は複数の突然変異
を含む変異型Ｆｃ領域を備える、本発明のＦｃ領域含有分子を包含する。
【０２５９】
本発明のＦｃ領域含有分子のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましいＩｇＧ１配列は、置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（配列番号２５８）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSPGX
を含み、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか又は不在である。
【０２６０】
本発明のＦｃ領域含有分子のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましいＩｇＧ４配列は、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ置換（配列番号２５９）：
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSLGX
を含み、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか又は不在である。
【０２６１】
第１及び第３のポリペプチド鎖が同一ではないダイアボディ及び３価結合分子に関して、２つの第１のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３のドメイン間、又は２つの第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン間でのホモ二量体化の発生を低減又は防止することが望ましい。このようなポリペプチド鎖のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインは配列において同一である必要はなく、有利には２つのポリペプチド鎖間の複合体形成を促進するために修飾される。例えば、ＣＨ２又はＣＨ３ドメインにアミノ酸置換（好ましくは「ノブ（ｋｎｏｂ）」を形成する嵩高な側鎖基、例えばトリプトファンを含むアミノ酸による置換）を導入して、立体障害により、同様に変異させたドメインとの相互作用を防止し、上記変化させたドメインを、相補的な又は適応した変異（例えばグリシンによる置換）を施されたドメイン、即ち「ホール（ｈｏｌｅ）」と対合させることができる。このような一連の突然変異は、Ｆｃ領域を形成するＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドのいずれのペアに施すことができる。ホモ二量体化を抑えてヘテロ二量体化を促進するためのタンパク質加工の方法は、特に免疫グロブリン様分子の加工に関して当該技術分野で公知であり、本明細書に包含される（例えばRidgway et al. (1996) “‘Knobs-Into-Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617-621; Atwell et al. (1997) “Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270:
26-35;及びXie et al. (2005) “A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95-101を参照（これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される））。好ましくは、「ノブ」は第１のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに加工され、「ホール」は、これらのポリペプチド鎖を含むダイアボディの第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに加工される。従って「ノブ」は、第１のポリペプチド鎖がそのＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを介してホモ二量体化するのを防止する役割を果たすことになる。第３のポリペプチド鎖は好ましくは「ホール」置換基を含有するため、第１のポリペプチド鎖とヘテロ二量体化し、かつそれ自体とホモ二量体化する。この戦略は、上述のように３つ、４つ又は５つの鎖を含むダイアボディ及び３価結合分子に関して利用してよく、ここで「ノブ」は、第１のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに加工され、「ホール」は、第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに加工される。
【０２６２】
好ましいノブは、ＩｇＧ  Ｆｃ領域を修飾して修飾基Ｔ３６６Ｗを含有させることによって生成される。好ましいホールは、ＩｇＧ  Ｆｃ領域を修飾して修飾基Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含有させることによって生成される。ホール担持第３のポリペプチド鎖ホモ二量体を、二重特異性ヘテロ二量体Fc領域含有分子から精製するのを補助するために、好ましくは、第３のポリペプチド鎖のホール担持ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのタンパク質Ａ結合部位を、位置４３５（Ｈ４３５Ｒ）におけるアミノ酸置換によって変異させる。このようにして、ホール担持第３のポリペプチド鎖ホモ二量体はタンパク質Ａに結合せず、その一方で二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、第１のポリペプチド鎖のタンパク質Ａ結合部位を介してタンパク質Ａに結合する能力を有したままとなる。代替実施形態では、ホール担持第３のポリペプチド鎖は、４３４位及び４３５位にアミノ酸置換を組み込んでよい（Ｎ４３４Ａ／Ｎ４３５Ｋ）。
【０２６３】
本発明のＦｃ領域含有分子の第１のポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましいＩｇＧ１アミノ酸配列は、「ノブ担持」配列（配列番号６）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSPGX
を有し、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか又は不在である。
【０２６４】
２つのポリペプチド鎖（又は３つ、４つ若しくは５つのポリペプチド鎖を有するＦｃ領域含有分子の第３のポリペプチド鎖）を有する、本発明のＦｃ領域含有分子の第２のポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましいＩｇＧ１アミノ酸配列は、「ホール担持」配列（配列番号７）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNRYTQKS LSLSPGX
を有し、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか又は不在である。
【０２６５】
上述のように、配列番号６及び配列番号７のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、アラニンによる２３４位の置換及びアラニンによる２３５位の置換を含み、従って、（野生型Ｆｃ領域（配列番号１）が示す結合と比べて）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が低下した（又は結合を実質的に示さない）Ｆｃ領域
を形成する。本発明はまた、Ｆｃ領域のエフェクタ機能及び／又はＦγＲ結合活性を修正する代替及び／又は追加としての置換を含む、このようなＣＨ２‐ＣＨ３ドメインも包含する。本発明はまた、１つ又は複数の半減期延長アミノ酸置換を更に含む、このようなＣＨ２‐ＣＨ３ドメインも包含する。特に本発明は、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを更に含む、このようなホール担持及びノブ担持ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを包含する。
【０２６６】
第１のポリペプチド鎖が、配列番号６のもの等の「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３配列を有することが好ましい。しかしながら、理解されるように、第１のポリペプチド鎖中に「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号７）を採用でき、この場合「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号６）は、２つのポリペプチド鎖を有する本発明のＦｃ領域含有分子の第２のポリペプチド鎖中（又は３つ、４つ若しくは５つのポリペプチド鎖を有するＦｃ領域含有分子の第３のポリペプチド鎖中）に採用される。
【０２６７】
上述のように、本発明は、野生型ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する、又は上述の置換の組み合わせを含むＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する、Ｆｃ領域含有分子（例えば抗体及びＦｃ領域含有ダイアボディ）を包含する。このような変異型を包含するＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの例示的なアミノ酸配列は、（配列番号２６０）：
APEX1X2GGPSV FLFPPKPKDT LX3IX4RX5PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLX6CX7VK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLX8SKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHX9X10YTQKS LSLSPGX11
であり、ここで：
（ａ）Ｘ1及びＸ2はいずれもＬ（野生型）であるか、又はいずれもＡ（ＦｃγＲ結合低下）であり；
（ｂ）Ｘ3、Ｘ4及びＸ5はそれぞれＭ、Ｓ及びＴ（野生型）であるか、又はＹ、Ｔ及び
Ｅ（半減期延長）であり；
（ｃ）Ｘ6、Ｘ7及びＸ8はそれぞれＴ、Ｌ及びＹ（野生型）であるか、又はＷ、Ｌ及び
Ｙ（ノブ）、若しくはＳ、Ａ及びＶ（ホール）であり；
（ｄ）Ｘ9及びＸ10はそれぞれＮ及びＨ（野生型）であるか、又はＮ及びＲ（タンパク
質Ａ結合なし）、若しくはＡ及びＫ（タンパク質Ａ結合なし）であり；
（ｅ）Ｘ11はＫであるか、又は不在である。
【０２６８】
他の実施形態では、本発明は、国際公開第２００７／１１０２０５号；国際公開第２０１１／１４３５４５号；国際公開第２０１２／０５８７６８号；国際公開第２０１３／０６８６７号（これらは全て、参照によりその全体が本出願に援用される）において開示されているもの等の当該技術分野で公知の突然変異を用いて、ホモ二量体化よりもヘテロ二量体化を指向するよう操作されたＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを備える、ＰＤ‐１結合分子を包含する。
【０２６９】
ＶＩＩＩ．ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性結合分子
本発明は特に、抗ＰＤ‐１抗体、好ましくは本明細書において提供される新規の抗ヒトＰＤ‐１抗体のうちの１つのエピトープ結合断片と、抗ヒトＬＡＧ‐３抗体、好ましくは本明細書において提供される新規の抗ヒトＬＡＧ‐３抗体のうちの１つのエピトープ結合断片とを含む、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性結合分子（例えば二重特異性抗体、二重特異性ダイアボディ等）に関する。本発明の好ましいＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性結合分子は、このＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性結合分子を、２つの異なるエピトープ：ＰＤ‐１のエピトープ及びＬＡＧ‐３のエピトープに協調的に結合させることによって、上記分子の阻害活性を減衰させることができる、抗体のエピトープ結合断片を有する。本明細書中で使用される場合、このような減衰（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）は、検出可能な
ＰＤ‐１及び／若しくはＬＡＧ‐３阻害活性の少なくとも２０％の減衰、少なくとも５０％の減衰、少なくとも８０％の減衰若しくは少なくとも９０％の減衰、又は検出可能なＰＤ‐１及び／若しくはＬＡＧ‐３阻害活性の完全な排除を指す。抗ヒトＰＤ‐１抗体及び抗ＬＡＧ‐３抗体のエピトープ結合断片（例えばＶＬ及びＶＨドメイン）の選択は、このようなＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性結合分子を構成するポリペプチド鎖が会合して、第１の抗原（即ちＰＤ‐１又はＬＡＧ‐３）に対して特異的な少なくとも１つの官能性抗原結合部位と、第２の抗原（即ち上記第１の抗原が何であるかに応じてＰＤ‐１又はＬＡＧ‐３）に対して特異的な少なくとも１つの官能性抗原結合部位とを形成するように、調整される。
【０２７０】
ある特定の実施形態では、本発明のＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性結合分子は二重特異性ダイアボディであり、これは好ましくは、本明細書に記載されているように、２、３、４又は５個のポリペプチド鎖を含む。別の特定の実施形態では、本発明のＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性結合分子は二重特異性抗体であり、これは好ましくは、本明細書に記載されているように、２、３又は４個のポリペプチド鎖を含む（例えば国際公開第２００７／０２４７１５号；国際公開第２００７／１１０２０５号；国際公開第２００９／０８０２５１号；国際公開第２００９／０８０２５４号；国際公開第２００９／０８９００４号；国際公開第２０１１／０６９１０４号；国際公開第２０１１／１１７３２９号；国際公開第２０１１／１３１７４６号；国際公開第２０１１／１３３８８６号；国際公開第２０１１／１４３５４５号；国際公開第２０１２／０２３０５３号；国際公開第２０１３／０６０８６７号（これらの文献は全て、参照によりその全体が本出願に援用される）も参照）。
【０２７１】
Ａ．抗ヒトＬＡＧ‐３抗体
ヒトＬＡＧ‐３に対して免疫特異的である例示的な抗体を以下に挙げる。更なる望ましい抗体は、ＬＡＧ‐３若しくはそのペプチド断片を用いて誘発された抗体分泌ハイブリドーマを単離することによって、又はＬＡＧ‐３若しくはそのペプチド断片への結合に関して組み換え抗体ライブラリをスクリーニングすることによって、作製できる。（２８アミノ酸残基シグナル配列（下線を付して示す）及び４９７アミノ酸残基成熟タンパク質を含む）ヒトＬＡＧ‐３は、アミノ酸配列（配列番号３８）：
MWEAQFLGLL FLQPLWVAPV KPLQPGAEVP VVWAQEGAPA QLPCSPTIPL
QDLSLLRRAG VTWQHQPDSG PPAAAPGHPL APGPHPAAPS SWGPRPRRYT
VLSVGPGGLR SGRLPLQPRV QLDERGRQRG DFSLWLRPAR RADAGEYRAA
VHLRDRALSC RLRLRLGQAS MTASPPGSLR ASDWVILNCS FSRPDRPASV
HWFRNRGQGR VPVRESPHHH LAESFLFLPQ VSPMDSGPWG CILTYRDGFN
VSIMYNLTVL GLEPPTPLTV YAGAGSRVGL PCRLPAGVGT RSFLTAKWTP
PGGGPDLLVT GDNGDFTLRL EDVSQAQAGT YTCHIHLQEQ QLNATVTLAI
ITVTPKSFGS PGSLGKLLCE VTPVSGQERF VWSSLDTPSQ RSFSGPWLEA
QEAQLLSQPW QCQLYQGERL LGAAVYFTEL SSPGAQRSGR APGALPAGHL
LLFLILGVLS LLLLVTGAFG FHLWRRQWRP RRFSALEQGI HPPQAQSKIE
ELEQEPEPEP EPEPEPEPEP EPEQL
を有する。
【０２７２】
１．ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ
本明細書では「ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ」と呼ばれる抗ヒトＬＡＧ‐３抗体ＢＭＳ‐９８６０１６（２５Ｆ７；Ｍｅｄａｒｅｘ／ＢＭＳ）及びその変異型については、既に説明されている（例えば国際公開第２０１４／００８２１８号を参照）。ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ
Ａの重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、アミノ酸配列（配列番号３９）（ＣＤＲは下線を付して示す）：
QVQLQQWGAG LLKPSETLSL TCAVYGGSFS DYYWNWIRQP PGKGLEWIGE
INHNGNTNSN PSLKSRVTLS LDTSKNQFSL KLRSVTAADT AVYYCAFGYS
DYEYNWFDPW GQGTLVTVSS
を有する。
【０２７３】
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａの軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、アミノ酸配列（配列番号４０）（ＣＤＲは下線を付して示す）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSIS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD
ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQRSNWPLTFGQ
GTNLEIK
を有する。
【０２７４】
固有の結合特性を有する追加のマウス抗ヒトＬＡＧ‐３抗体が、最近同定された（米国特許出願第６２／１７２，２７７号を参照）。本発明の好ましいＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性結合分子は、抗ヒトＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のエピトープ結合断片を含み、これは新規のエピトープに結合し、ＬＡＧ‐３結合に関してＢＭＳ‐９８６０１６と競合しない。特に好ましいのは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ
１又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のヒト化ＶＨ及び／又はＶＬドメインを有する、本発明のＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性結合分子である。
【０２７５】
２．ＬＡＧ‐１  ｍＡｂ  １
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号４１）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFR NYGMNWVKQA PGKVLKWMGW
INTYTGESTY ADDFEGRFAF SLGTSASTAY LQINILKNED TATYFCARES
LYDYYSMDYW GQGTSVTVSS
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＣＤＲH１（配列番号４２）：RNYGMN
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＣＤＲH２（配列番号４３）：WINTYTGESTYADDFEG
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＣＤＲH３（配列番号４４）：ESLYDYYSMDY
【０２７６】
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号４５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DVVVTQTPLT LSVTIGQPAS ISCKSSQSLL HSDGKTYLNW LLQRPGQSPE
RLIYLVSELD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCWQGTHFP
YTFGGGTKLE IK
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＣＤＲL１（配列番号４６）：KSSQSLLHSDGKTYLN
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＣＤＲL２（配列番号４７）：LVSELDS
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＣＤＲL３（配列番号４８）：WQGTHFPYT
【０２７７】
本明細書では「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＨ１」及び「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １
ＶＨ２」と呼ばれる、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １の２つの例示的なヒト化ＶＨドメイン、並びにＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １の４つの例示的なヒト化ＶＬドメイン「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ１」、「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ２」、「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ
１  ＶＬ３」及び「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ４」を、以下に挙げる。上記ヒト化ＶＬドメインのいずれを、ヒト化ＶＨドメインのいずれと対合させて、ＬＡＧ‐３結合ドメインを生成できる。従って、上記ヒト化ＶＨドメインと対合した上記ヒト化ＶＬドメインのうちの１つを備えるいずれの抗体を、一般に「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １」と呼び、ヒト化ＶＨ／ＶＬドメインの特定の組み合わせを、具体的なＶＨ／ＶＬドメインに対する参照によって呼称する。例えばｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＨ１及びｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ２を備えるヒト化抗体は、具体的に「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １（１．２）」と呼ばれる。
【０２７８】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＨ１のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号４９）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW
INTYTGESTY ADDFEGRFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYYCARES
LYDYYSMDYW GQGTTVTVSS
【０２７９】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＨ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号５０）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW
INTYTGESTY ADDFEGRFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYFCARES
LYDYYSMDYW GQGTTVTVSS
【０２８０】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ１のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号５１）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDGKTYLNW LLQKPGQSPE
RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP
YTFGGGTKVE IK
【０２８１】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号５２）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDGKTYLNW LLQRPGQSPE
RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP
YTFGGGTKVE IK
【０２８２】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号５３）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDGKTYLNW LLQKPGQPPE
RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP
YTFGGGTKVE IK
【０２８３】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ４のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号５４）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPE
RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP
YTFGGGTKVE IK
【０２８４】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ４のＶＬドメインのＣＤＲL１は、グリシンからアラ
ニンへのアミノ酸置換を含み、アミノ酸配列：KSSQSLLHSDAKTYLN（配列番号５５、置換されたアラニンは下線を付して示す）を有する。同様の置換は、上述のＬＡＧ‐３  ｍＡｂ
１  ＣＤＲL１ドメインのいずれにも組み込むことができると考えられる。
【０２８５】
３．ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号５６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
EVLLQQSGPE LVKPGASVKI PCKASGYTFT DYNMDWVKQS HGESLEWIGD
INPDNGVTIY NQKFEGKATL TVDKSSSTAY MELRSLTSED TAVYYCAREA
DYFYFDYWGQ GTTLTVSS
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＣＤＲH１（配列番号５７）：DYNMD
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＣＤＲH２（配列番号５８）：DINPDNGVTIYNQKFEG
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＣＤＲH３（配列番号５９）： EADYFYFDY
【０２８６】
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号６０）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：
DIVMTQSHRF MSTSVGDRVS ITCKASQDVS SVVAWYQQKP GQSPKLLIFS
ASYRYTGVPD RFTGSGSGTD FTFTISSVQA ADLAVYYCQQ HYSTPWTFGG
GTKLEIK
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＣＤＲL１（配列番号６１）：KASQDVSSVVA
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＣＤＲL２（配列番号６２）：SASYRYT
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＣＤＲL３（配列番号６３）：HYSTPWT
【０２８７】
本明細書では「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＨ１」及び「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６
ＶＨ２」と呼ばれる、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６の２つの例示的なヒト化ＶＨドメイン、並びにＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６の２つの例示的なヒト化ＶＬドメイン「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＬ１」及び「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＬ２」を、以下に挙げる。上記ヒト化ＶＬドメインのいずれを、ヒト化ＶＨドメインのいずれと対合させて、ＬＡＧ‐３結合ドメインを生成できる。従って、上記ヒト化ＶＨドメインと対合した上記ヒト化ＶＬドメインのうちの１つを備えるいずれの抗体を、一般に「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６」と呼び、ヒト化ＶＨ／ＶＬドメインの特定の組み合わせを、具体的なＶＨ／ＶＬドメインに対する参照によって呼称する。例えばｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＨ１及びｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＬ２を備えるヒト化抗体は、具体的に「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６（１．２）」と呼ばれる。
【０２８８】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＨ１のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２９４）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYNMDWVRQA PGQGLEWMGD 
INPDNGVTIY NQKFEGRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCAREA 
DYFYFDYWGQ GTTLTVSS
【０２８９】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＨ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２９５）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS DYNMDWVRQA PGKGLEWVSD 
INPDNGVTIY NQKFEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREA 
DYFYFDYWGQ GTTLTVSS
【０２９０】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＬ１のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２９６）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS SVVAWYQQKP GKAPKLLIYS 
ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYSTPWTFGG 
GTKLEIK
【０２９１】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＬ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２９７）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIVMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS SVVAWYQQKP GKAPKLLIYS 
ASYRYTGVPD RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIAVYYCQQ HYSTPWTFGG 
GTKLEIK
【０２９２】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＬ１及びＶＬ２のＶＬドメインのＣＤＲL１は、リシン
からアルギニンへのアミノ酸置換を含み、アミノ酸配列：RASQDVSSVVA（配列番号２９８
、置換されたアルギニンは下線を付して示す）を有する。同様の置換は、上述のＬＡＧ‐
３  ｍＡｂ  ６  ＣＤＲL１ドメインのいずれにも組み込むことができると考えられる。
【０２９３】
Ｂ．Ｅ／Ｋコイルを有する例示的な４鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディ
（「ＤＡＲＴ  Ａ」、「ＤＡＲＴ  Ｂ」、「ＤＡＲＴ  Ｃ」及び「ＤＡＲＴ  Ｉ」と呼ばれる）Ｅ／Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメインを備える、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性４鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディを生成した。これらのＦｃ領域含有ダイアボディの構造を以下に詳述する。これらの例示的なＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３ダイアボディは、本発明の範囲を例示することを意図しており、限定を意図したものではない。
【０２９４】
１．ＤＡＲＴ  Ａ
ＤＡＲＴ  Ａは、ＰＤ‐１に対して特異的な２つの結合部位、ＬＡＧ‐３に対して特異的な２つの結合部位、半減期の延長のために操作された変異型ＩｇＧ４  Ｆｃ領域、及びシステイン含有Ｅ／Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメインを有する、二重特異性４鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディである。ＤＡＲＴ  Ａの第１及び第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＬＡＧ‐３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬLAG‐3  ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ４）（配列番号５４）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号１４））；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD‐1  ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＨ１）（配列番号１
４７）；システイン含有介在リンカーペプチド（リンカー２：GGCGGG（配列番号１５））；システイン含有ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK
‐EVAALEK（配列番号２３））；安定化ＩｇＧ４ヒンジ領域（配列番号１３）；置換Ｍ２
５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを含みＣ末端残基を含まない、変異型ＩｇＧ４  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号２５９）；及びＣ末端を含む。
【０２９５】
ＤＡＲＴ  Ａの第１及び第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号２６７の変異型：
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDX1KTYLNW LLQKPGQPPE 
RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 
YTFGGGTKVE IKGGGSGGGG QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT 
SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY 
MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAC 
EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKESKYGPP CPPCPAPEFL GGPSVFLFPP 
KPKDTLX2IX3R X4PEVTCVVVD VSQEDPEVQF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ 
FNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KGLPSSIEKT ISKAKGQPRE 
PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP 
PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS RWQEGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSL 
G
であり、ここでＸ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4は独立して選択され、Ｘ1はＡ又はＧであり；Ｘ2はＹ又はＭであり；Ｘ3はＴ又はＳであり；Ｘ4はＥ又はＴである。
【０２９６】
ＤＡＲＴ  Ａの第１及び第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号２６７であり、ここでＸ1はＡであり；Ｘ2はＹであり；Ｘ3はＴであり；Ｘ4はＥである。
【０２９７】
ＤＡＲＴ  Ａの第２及び第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬPD‐1  ｈＰＤ‐１
ｍＡｂ  ７  ＶＬ２）（配列番号１５３）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号１４））；ＬＡＧ‐３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨLAG‐3  ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＨ１）（配列番号４９）；システイン含有介在リンカーペプチド  （リンカー２：GGCGGG（配列番号１５））；システイン含有ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号２４
）；及びＣ末端を含む。
【０２９８】
ＤＡＲＴ  Ａの第２及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２６８）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN 
YGMNWVRQAP GQGLEWMGWI NTYTGESTYA DDFEGRFVFS MDTSASTAYL 
QISSLKAEDT AVYYCARESL YDYYSMDYWG QGTTVTVSSG GCGGGKVAAC 
KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKE
である。
【０２９９】
２．ＤＡＲＴ  Ｂ
ＤＡＲＴ  ＢはＤＡＲＴ  Ａと同一であるが、ＤＡＲＴ  Ｂの第１及び第３のポリペプチド鎖は、ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ３のＶＬドメイン（配列番号５３）を備え、これはＣＤＲL１におけるアミノ酸置換を含む点のみが異なる。従って、ＤＡＲＴ  Ｂの
第１及び第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＬＡＧ‐３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬLAG‐3  ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １
ＶＬ３）（配列番号５３）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号１４））；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD‐1  ｈＰ
Ｄ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＨ１）（配列番号１４７）；介在リンカーペプチド（リンカー２：GGCGGG（配列番号１５））；システイン含有ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号２３））；安定化ＩｇＧ４ヒンジ領域（配列番号１３）；置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを含みＣ末端残基を含まない、ＩｇＧ４  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの変異型（配列番号２５９）；及びＣ末端を含む。
【０３００】
ＤＡＲＴ  Ｂの第１及び第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は配列番号２６７であり、ここでＸ1はＧであり；Ｘ2はＹであり；Ｘ3はＴであり；Ｘ4はＥである。
【０３０１】
ＤＡＲＴ  Ｂの第２及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号２６８である。
【０３０２】
３．ＤＡＲＴ  Ｃ
ＤＡＲＴ  ＣはＤＡＲＴ  Ｂと同一であるが、ＤＡＲＴ  Ｃの第１及び第３のポリペプチド鎖は、Ｃ末端残基を含まない野生型ＩｇＧ４  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４）を備える点のみが異なる。従って、ＤＡＲＴ  Ｃの第１及び第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＬＡＧ‐３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬLAG‐3  ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ３）（配列番号５３）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号１４））；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD‐1  ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＨ１）（配
列番号１４７）；介在リンカーペプチド（リンカー２：GGCGGG（配列番号１５））；システイン含有ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号２３））；安定化ＩｇＧ４ヒンジ領域（配列番号１３）；Ｃ末端残基を含まないＩｇＧ４  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４）；及びＣ末端を含む。
【０３０３】
ＤＡＲＴ  Ｃの第１及び第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は配列番号２６７であり、ここでＸ1はＧであり；Ｘ2はＭであり；Ｘ3はＳであり；Ｘ4はＴである。
【０３０４】
ＤＡＲＴ  Ｃの第２及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号２６８である。
【０３０５】
４．ＤＡＲＴ  Ｉ
ＤＡＲＴ  Ｉは、ＰＤ‐１に対して特異的な２つの結合部位、ＬＡＧ‐３に対して特異的な２つの結合部位、半減期の延長のために操作された変異型ＩｇＧ４  Ｆｃ領域、及びシステイン含有Ｅ／Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメインを有する、二重特異性４鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディである。ＤＡＲＴ  Ｉの第１及び第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＬＡＧ‐３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬLAG‐3  ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＬ１）（配列番号２９６）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号１４））；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD‐1  ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＨ１）（配列番号
１４７）；システイン含有介在リンカーペプチド（リンカー２：GGCGGG（配列番号１５））；システイン含有ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号２３））；安定化ＩｇＧ４ヒンジ領域（配列番号１３）；置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを含みＣ末端残基を含まない、変異型ＩｇＧ４  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号２５９）；及びＣ末端を含む。
【０３０６】
ＤＡＲＴ  Ｉの第１及び第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２９０）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS SVVAWYQQKP GKAPKLLIYS 
ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYSTPWTFGG 
GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYSFTSYWMN 
WVRQAPGQGL EWIGVIHPSD SETWLDQKFK DRVTITVDKS TSTAYMELSS 
LRSEDTAVYY CAREHYGTSP FAYWGQGTLV TVSSGGCGGG EVAACEKEVA 
ALEKEVAALE KEVAALEKES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT 
LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY 
RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT 
LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS 
DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG
である。
【０３０７】
ＤＡＲＴ  Ｉの第２及び第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン  （ＶＬPD‐1  ｈＰＤ‐
１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ２）（配列番号１５３）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号１４））；ＬＡＧ‐３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨLAG‐3  ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＨ１）（配列番号２９４）；システイン含有介在リンカーペプチド（リンカー２：GGCGGG（配列番号１５））；システイン含有ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号２４）；及びＣ末端を含む。
【０３０８】
ＤＡＲＴ  Ｉの第２及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２９１）：EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTD 
YNMDWVRQAP GQGLEWMGDI NPDNGVTIYN QKFEGRVTMT TDTSTSTAYM 
ELRSLRSDDT AVYYCAREAD YFYFDYWGQG TTLTVSSGGC GGGKVAACKE 
KVAALKEKVA ALKEKVAALK E
である。
【０３０９】
Ｃ．ＣＬ／ＣＨ１ドメインを有する例示的な４鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディ
「ＤＡＲＴ  Ｄ」、「ＤＡＲＴ  Ｅ」、「ＤＡＲＴ  Ｊ」及び「ＤＡＲＴ  １」と呼ば
れる、ＣＬ／ＣＨ１ドメインを備えるＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性４鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディを生成した。これらのＦｃ領域含有ダイアボディの構造を以下に詳述する。これらの例示的なＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３ダイアボディは、本発明の範囲を例示することを意図しており、限定を意図したものではない。
【０３１０】
１．ＤＡＲＴ  Ｄ
ＤＡＲＴ  Ｄは、ＰＤ‐１に対して特異的な２つの結合部位、ＬＡＧ‐３に対して特異的な２つの結合部位、ＣＬ／ＣＨ１ドメイン、及び半減期の延長のために操作された変異型ＩｇＧ４  Ｆｃ領域を有する、二重特異性４鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディである。ＤＡＲＴ  Ｄの第１及び第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬPD‐1  ｈＰＤ‐１  ｍＡ
ｂ  ７  ＶＬ２）（配列番号１５３）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号１４））；ＬＡＧ‐３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨLAG‐3  ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＨ１）（配列番号４９）；介在リンカーペプチド（リンカー２：LGGGSG（配列番号２６１））；ＩｇＧ４  ＣＨ１ドメイン（配列番号２５４）；安定化ＩｇＧ４ヒンジ領域（配列番号１３）；置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを含みＣ末端残基を含まない、ＩｇＧ４  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの変異型（配列番号２５９）；及びＣ末端を含む。
【０３１１】
ＤＡＲＴ  Ｄの第１及び第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２６９）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN 
YGMNWVRQAP GQGLEWMGWI NTYTGESTYA DDFEGRFVFS MDTSASTAYL 
QISSLKAEDT AVYYCARESL YDYYSMDYWG QGTTVTVSSL GGGSGASTKG 
PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA 
VLQSSGLYSL SSVVTVPSSS LGTKTYTCNV DHKPSNTKVD KRVESKYGPP 
CPPCPAPEFL GGPSVFLFPP KPKDTLYITR EPEVTCVVVD VSQEDPEVQF 
NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ FNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN 
KGLPSSIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS 
DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS RWQEGNVFSC 
SVMHEALHNH YTQKSLSLSL G
である。
【０３１２】
ＤＡＲＴ  Ｄの第２及び第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＬＡＧ‐３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬLAG‐3  ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ４）（配列番号５４）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号１４））；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD‐1  ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＨ１）（配列番号１４７）；介在リンカーペプ
チド（リンカー２：LGGGSG（配列番号２６１））；κＣＬドメイン（配列番号８）；及びＣ末端を含む。
【０３１３】
ＤＡＲＴ  Ｄの第２及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２７０）：
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPE 
RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 
YTFGGGTKVE IKGGGSGGGG QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT 
SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY 
MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSL GGGSGRTVAA 
PSVFIFPPSD EQLKSGTASV VCLLNNFYPR EAKVQWKVDN ALQSGNSQES 
VTEQDSKDST YSLSSTLTLS KADYEKHKVY ACEVTHQGLS SPVTKSFNRG 
EC
である。
【０３１４】
２．ＤＡＲＴ  Ｅ
ＤＡＲＴ  Ｅは、ＰＤ‐１に関して特異的な２つの結合部位、ＬＡＧ‐３に関して特異的な２つの結合部位、ＣＬ／ＣＨ１ドメイン、及び半減期の延長のために操作された変異型ＩｇＧ４  Ｆｃ領域を有する、別の二重特異性４鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディである。ＤＡＲＴ  ＥのＰＤ‐１及びＬＡＧ‐３結合部位の位置は、ＤＡＲＴ  Ｄと比較して反転されている。
【０３１５】
ＤＡＲＴ  Ｅの第１及び第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＬＡＧ‐３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬLAG‐3  ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ４）（配列番号５４）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号１４））；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD‐1  ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＨ１）（配列番号１４７）；介在リンカーペプ
チド（リンカー２：LGGGSG（配列番号２６１））；ＩｇＧ４  ＣＨ１ドメイン（配列番号２５４）；安定化ＩｇＧ４ヒンジ領域（配列番号１３）；置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを含みＣ末端残基を含まない、ＩｇＧ４  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの変異型（配列番号２５９）；及びＣ末端を含む。
【０３１６】
ＤＡＲＴ  Ｅの第１及び第３のポリペプチド鎖は、（配列番号２７１）：
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPE 
RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 
YTFGGGTKVE IKGGGSGGGG QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT 
SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY 
MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSL GGGSGASTKG 
PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA 
VLQSSGLYSL SSVVTVPSSS LGTKTYTCNV DHKPSNTKVD KRVESKYGPP 
CPPCPAPEFL GGPSVFLFPP KPKDTLYITR EPEVTCVVVD VSQEDPEVQF 
NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ FNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN 
KGLPSSIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS 
DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS RWQEGNVFSC 
SVMHEALHNH YTQKSLSLSL G
である。
【０３１７】
ＤＡＲＴ  Ｅの第２及び第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬPD‐1  ｈＰＤ‐１
ｍＡｂ  ７  ＶＬ２）（配列番号１５３）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号１４））；ＬＡＧ‐３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨLAG‐3  ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＨ１）（配列番号４９）；介在リンカーペプチド（リンカー２：LGGGSG（配列番号２６１））；κＣＬドメイン（配列番号８）；及びＣ末端を含む。
【０３１８】
ＤＡＲＴ  Ｅの第２及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２７２）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN 
YGMNWVRQAP GQGLEWMGWI NTYTGESTYA DDFEGRFVFS MDTSASTAYL 
QISSLKAEDT AVYYCARESL YDYYSMDYWG QGTTVTVSSL GGGSGRTVAA 
PSVFIFPPSD EQLKSGTASV VCLLNNFYPR EAKVQWKVDN ALQSGNSQES 
VTEQDSKDST YSLSSTLTLS KADYEKHKVY ACEVTHQGLS SPVTKSFNRG 
EC
である。
【０３１９】
３．ＤＡＲＴ  Ｊ  
ＤＡＲＴ  Ｊは、ＰＤ‐１に関して特異的な２つの結合部位、ＬＡＧ‐３に関して特異的な２つの結合部位、ＣＬ／ＣＨ１ドメイン、及び半減期の延長のために操作された変異型ＩｇＧ４  Ｆｃ領域を有する、二重特異性４鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディである。ＤＡＲＴ  Ｊの第１及び第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＬＡＧ‐３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬLAG‐3  ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＬ１）（配列番号２９６）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号１４））；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＨPD‐1  ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＨ１）（配列番号１４７）；介在リンカーペプチド
（リンカー２：LGGGSG  （配列番号２６１））；ＩｇＧ４  ＣＨ１ドメイン（配列番号２５４）；安定化ＩｇＧ４ヒンジ領域（配列番号１３）；置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを含みＣ末端残基を含まない、ＩｇＧ４  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの変異型（配列番号２５９）；及びＣ末端を含む。
【０３２０】
ＤＡＲＴ  Ｊの第１及び第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２９２）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS SVVAWYQQKP GKAPKLLIYS 
ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYSTPWTFGG 
GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYSFTSYWMN 
WVRQAPGQGL EWIGVIHPSD SETWLDQKFK DRVTITVDKS TSTAYMELSS 
LRSEDTAVYY CAREHYGTSP FAYWGQGTLV TVSSLGGGSG ASTKGPSVFP 
LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 
GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP 
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS 
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSLG
である。
【０３２１】
ＤＡＲＴ  Ｊの第２及び第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬPD‐1  ｈＰＤ‐１
ｍＡｂ  ７  ＶＬ２）（配列番号１５３）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号１４））；ＬＡＧ‐３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨLAG‐3  ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＨ１）（配列番号２９４）；介在リンカーペプチド（リンカー２：LGGGSG（配列番号２６１））；κＣＬドメイン（配列番号８）；及びＣ末端を含む。
【０３２２】
ＤＡＲＴ  Ｊの第２及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２９３）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTD 
YNMDWVRQAP GQGLEWMGDI NPDNGVTIYN QKFEGRVTMT TDTSTSTAYM 
ELRSLRSDDT AVYYCAREAD YFYFDYWGQG TTLTVSSLGG GSGRTVAAPS 
VFIFPPSDEQ LKSGTASVVC LLNNFYPREA KVQWKVDNAL QSGNSQESVT 
EQDSKDSTYS LSSTLTLSKA DYEKHKVYAC EVTHQGLSSP VTKSFNRGEC
である。
【０３２３】
４．ＤＡＲＴ  １
ＤＡＲＴ  １は、ＰＤ‐１に関して特異的な２つの結合部位、ＬＡＧ‐３に関して特異的な２つの結合部位、ＣＬ／ＣＨ１ドメイン、及びＦｃγＲ結合の低減のために操作された変異型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を有する、二重特異性４鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディである。ＤＡＲＴ  １の第１及び第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬPD‐1  ＰＤ‐１  
ｍＡｂ  Ａ  ＶＬ）（配列番号６５）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号１４））；ＬＡＧ‐３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨLAG‐3  ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ  ＶＨ１）（配列番号３９）；介在リンカーペプチド（リンカー２：LGGGSG（配列番号２６１））；ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン（配列番号１０）；ＩｇＧ１ヒンジ領域（配列番号３２）；置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａを含みＣ末端残基を含まない、ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの変異型（配列番号５）；及びＣ末端を含む。
【０３２４】
ＤＡＲＴ  １の第１及び第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２８４）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSIS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD 
ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPLTFGQ 
GTNLEIKGGG SGGGGQVQLV ESGGGVVQPG RSLRLDCKAS GITFSNSGMH 
WVRQAPGKGL EWVAVIWYDG SKRYYADSVK GRFTISRDNS KNTLFLQMNS 
LRAEDTAVYY CATNDDYWGQ GTLVTVSSLG GGSGASTKGP SVFPLAPSSK 
STSGGTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV LQSSGLYSLS 
SVVTVPSSSL GTQTYICNVN HKPSNTKVDK RVEPKSCDKT HTCPPCPAPE 
AAGGPSVFLF PPKPKDTLYI TREPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE 
VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE 
KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES 
NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH 
NHYTQKSLSL SPG
である。
【０３２５】
ＤＡＲＴ  １の第２及び第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＬＡＧ‐３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬLAG‐3  ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ  ＶＬ）（配列番号４０）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号１４））；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD‐1  ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ  ＶＨ）（配列番号６４）；介在リンカーペプチド（リン
カー２：LGGGSG（配列番号２６１））；κＣＬドメイン（配列番号８）；及びＣ末端を含む。
【０３２６】
ＤＡＲＴ  １の第２及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２８５）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD 
ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SSNWPRTFGQ 
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLQ QWGAGLLKPS ETLSLTCAVY GGSFSDYYWN 
WIRQPPGKGL EWIGEINHNG NTNSNPSLKS RVTLSLDTSK NQFSLKLRSV 
TAADTAVYYC AFGYSDYEYN WFDPWGQGTL VTVSSLGGGS GRTVAAPSVF 
IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ 
DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC
である。
【０３２７】
Ｄ．例示的な５鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディ
「ＤＡＲＴ  Ｆ」及び「ＤＡＲＴ  Ｇ」と呼ばれる、ＣＬ／ＣＨ１ドメイン及びＥ／Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメインを含む２つの例示的なＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性５鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディを生成した。これらのＦｃ領域含有ダイアボディの構造を以下に詳述する。これらの例示的なＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３ダイアボディは、本発明の範囲を例示することを意図しており、限定を意図したものではない。
【０３２８】
１．ＤＡＲＴ  Ｆ
ＤＡＲＴ  Ｆは、ＰＤ‐１に対して特異的な３つの結合部位、ＬＡＧ‐３に対して特異的な１つの結合部位、ＣＬ／ＣＨ１ドメイン、にＦｃγＲ結合の低減及び半減期の延長のために操作された変異型ノブ／ホール担持ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、並びにＥ／Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメインを有する、二重特異性５鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディである。ＤＡＲＴ  Ｆの第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD‐1  ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  
ＶＨ１）（配列番号１４７）；ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン（配列番号１０）；ＩｇＧ１ヒンジ領域（配列番号３２）；置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｎ４３４Ａ／Ｈ４３５Ｋを含みＣ末端残基を含まない、ホール担持ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号２６０、ここでＸ1はＡであり、Ｘ2はＡであり、Ｘ3
はＹであり、Ｘ4はＴであり、Ｘ5はＥであり、Ｘ6はＳであり、Ｘ7はＡであり、Ｘ8はＶ
であり、Ｘ9はＡであり、Ｘ10はＫであり、Ｘ11は不在である）；及びＣ末端を含む。
【０３２９】
ＤＡＲＴ  Ｆの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２７３）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV 
IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH 
YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD 
YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY 
ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK 
DTLYITREPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS 
TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV 
YTLPPSREEM TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL 
DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHAKYTQ KSLSLSPG
である。
【０３３０】
ＤＡＲＴ  Ｆの第２及び第５のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬPD‐1  ｈＰＤ‐１
ｍＡｂ  ７  ＶＬ２）（配列番号１５３）、κＣＬドメイン（配列番号８）；及びＣ末端を含む。
【０３３１】
ＤＡＲＴ  Ｆの第２及び第５のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２７４）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV 
QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV 
THQGLSSPVT KSFNRGEC
である。
【０３３２】
ＤＡＲＴ  Ｆの第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD‐1  ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ
７  ＶＨ１）（配列番号１４７）；ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン（配列番号１０）；ＩｇＧ１ヒンジ領域（配列番号３２）；置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを含みＣ末端残基を含まない、ノブ担持ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号２６０、ここでＸ1はＡであり、Ｘ2はＡであり、Ｘ3はＹであり、Ｘ4はＴであり、Ｘ5はＥであり、Ｘ6はＷであり、Ｘ7はＬであり、Ｘ8はＹであり、Ｘ9はＮであり
、Ｘ10はＨであり、Ｘ11は不在である）；介在リンカーペプチド（GGGSGGGSGGG（配列番
号２６２））；ＬＡＧ‐３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬLAG‐3
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ４）（配列番号５４）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号１４））；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD‐1  ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＨ１）（配列番号１４７）；システ
イン含有介在リンカーペプチド（リンカー２：GGCGGG（配列番号１５））；ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号２１））；及びＣ末端を含む。
【０３３３】
ＤＡＲＴ  Ｆの第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２７５）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV 
IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH 
YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD 
YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY 
ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK 
DTLYITREPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS 
TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV 
YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL 
DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGGG 
GSGGGSGGGD IVMTQTPLSL SVTPGQPASI SCKSSQSLLH SDAKTYLNWL 
LQKPGQPPER LIYLVSELDS GVPDRFSGSG SGTDFTLKIS RVEAEDVGVY 
YCWQGTHFPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS 
CKASGYSFTS YWMNWVRQAP GQGLEWIGVI HPSDSETWLD QKFKDRVTIT 
VDKSTSTAYM ELSSLRSEDT AVYYCAREHY GTSPFAYWGQ GTLVTVSSGG 
CGGGEVAALE KEVAALEKEV AALEKEVAAL EK
である。
【０３３４】
ＤＡＲＴ  Ｆの第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬPD‐1  ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ
７  ＶＬ２）（配列番号１５３）；介在リンカーペプチド（リンカー１：ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１４））；ＬＡＧ‐３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨLAG‐3  ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＨ１）（配列番号４９）；システイン含有介在リンカーペプチド（リンカー２：GGCGGG（配列番号１５））；ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号２２））；及びＣ末端を含む。
【０３３５】
ＤＡＲＴ  Ｆの第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２７６）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN 
YGMNWVRQAP GQGLEWMGWI NTYTGESTYA DDFEGRFVFS MDTSASTAYL 
QISSLKAEDT AVYYCARESL YDYYSMDYWG QGTTVTVSSG GCGGGKVAAL 
KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKE
である。
【０３３６】
２．ＤＡＲＴ  Ｇ
ＤＡＲＴ  Ｇは、ＰＤ‐１に対して特異的な２つの結合部位、ＬＡＧ‐３に対して特異的な２つの結合部位、ＣＬ／ＣＨ１ドメイン、ＦｃγＲ結合の低減及び半減期の延長のために操作された変異型ノブ／ホール担持ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、並びにＥ／Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメインを有する、二重特異性５鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディである。ＤＡＲＴ  Ｇの第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＬＡＧ‐３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨLAG‐3  ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １
ＶＨ１）（配列番号４９）；ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン（配列番号１０）；ＩｇＧ１ヒンジ領域（配列番号３２）；置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｎ４３４Ａ／Ｈ４３５Ｋを含みＣ末端残基を含まない、ホール担持ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号２６０、ここでＸ1はＡであり、Ｘ2はＡであり、Ｘ3
はＹであり、Ｘ4はＴであり、Ｘ5はＥであり、Ｘ6はＳであり、Ｘ7はＡであり、Ｘ8はＶ
であり、Ｘ9はＡであり、Ｘ10はＫであり、Ｘ11は不在である）；及びＣ末端を含む。
【０３３７】
ＤＡＲＴ  Ｇの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２７７）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW 
INTYTGESTY ADDFEGRFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYYCARES 
LYDYYSMDYW GQGTTVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK 
DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 
YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP 
KDTLYITREP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN 
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ 
VYTLPPSREE MTKNQVSLSC AVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 
LDSDGSFFLV SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHAKYT QKSLSLSPG
である。
【０３３８】
ＤＡＲＴ  Ｇの第２及び第５のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＬＡＧ‐３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬLAG‐3  ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ４）（配列番号５４）；κＣＬドメイン（配列番号８）；及びＣ末端を含む。
【０３３９】
ＤＡＲＴ  Ｇの第２及び第５のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２７８）：
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPE 
RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 
YTFGGGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAK 
VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE 
VTHQGLSSPV TKSFNRGEC
である。
【０３４０】
ＤＡＲＴ  Ｇの第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＬＡＧ‐３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨLAG‐3  ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＨ１）（配列番号４９）；ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン（配列番号１０）；ＩｇＧ１ヒンジ領域（配列番号３２）；置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを含みＣ末端残基を含まない、ノブ担持ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号２６０、ここでＸ1はＡであり、Ｘ2はＡであり、Ｘ3はＹであり、Ｘ4はＴ
であり、Ｘ5はＥであり、Ｘ6はＷであり、Ｘ7はＬであり、Ｘ8はＹであり、Ｘ9はＮであ
り、Ｘ10はＨであり、Ｘ11は不在である）；介在リンカーペプチド（GGGSGGGSGGG（配列
番号２６２））；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬPD‐1
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ２）（配列番号１５３）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号１４））；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD‐1  ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＨ１）（配列番号１４７）；システ
イン含有介在リンカーペプチド（リンカー２：GGCGGG（配列番号１５））；ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号２１））；及びＣ末端を含む。
【０３４１】
ＤＡＲＴ  Ｇの第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２７９）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW 
INTYTGESTY ADDFEGRFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYYCARES 
LYDYYSMDYW GQGTTVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK 
DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 
YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP 
KDTLYITREP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN 
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ 
VYTLPPSREE MTKNQVSLWC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 
LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGG 
GGSGGGSGGG EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF 
QQKPGQPPKL LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY 
FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS 
CKASGYSFTS YWMNWVRQAP GQGLEWIGVI HPSDSETWLD QKFKDRVTIT 
VDKSTSTAYM ELSSLRSEDT AVYYCAREHY GTSPFAYWGQ GTLVTVSSGG 
CGGGEVAALE KEVAALEKEV AALEKEVAAL EK
である。
【０３４２】
ＤＡＲＴ  Ｇの第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬPD‐1  ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ
７  ＶＬ２）（配列番号１５３）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号１４））；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD‐1
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＨ１）（配列番号１４７）；システイン含有介在リンカーペプチド（リンカー２：GGCGGG（配列番号１５））；ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号２２）；及びＣ末端を含む。
【０３４３】
ＤＡＲＴ  Ｇの第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２８０）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYSFTS 
YWMNWVRQAP GQGLEWIGVI HPSDSETWLD QKFKDRVTIT VDKSTSTAYM 
ELSSLRSEDT AVYYCAREHY GTSPFAYWGQ GTLVTVSSGG CGGGKVAALK 
EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE
である。
【０３４４】
Ｅ．Ｅ／Ｋコイルを有する例示的な３鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディ
本発明は更に、Ｅ／Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメインを備えるＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性３鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディを提供する。「ＤＡＲＴ  Ｈ」と呼ばれる、Ｅ／Ｋヘテロ二量体促進ドメインを備える例示的なＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性３鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディを生成した。このＦｃ領域含有ダイアボディの構造を以下に詳述
する。この例示的なＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３ダイアボディは、本発明の範囲を例示することを意図しており、限定を意図したものではない。
【０３４５】
ＤＡＲＴ  Ｈは、ＰＤ‐１に対して特異的な１つの結合部位、ＬＡＧ‐３に対して特異的な１つの結合部位、ＦｃγＲ結合の低減のために操作された変異型ノブ／ホール担持ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、及びＥ／Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメインを含む、二重特異性３鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディである。
【０３４６】
ＤＡＲＴ  Ｈの第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬPD‐1  ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ
７  ＶＬ２）（配列番号１５３）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号１４））；ＬＡＧ‐３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨLAG
‐3  ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＨ１）（配列番号４９）；システイン含有介在リン
カーペプチド（リンカー２：GGCGGG（配列番号１５））；ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号２１））；介在リンカー（スペーサリンカー３：GGGDKTHTCPPCP（配列番号２６３））；置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ
を含み、Ｃ末端リシン残基を有する、ノブ担持ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号６）；及びＣ末端を含む。
【０３４７】
ＤＡＲＴ  Ｈの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２８１）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN 
YGMNWVRQAP GQGLEWMGWI NTYTGESTYA DDFEGRFVFS MDTSASTAYL 
QISSLKAEDT AVYYCARESL YDYYSMDYWG QGTTVTVSSG GCGGGEVAAL 
EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP 
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE 
QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR 
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT 
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS
PGK
である。
【０３４８】
ＤＡＲＴ  Ｈの第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＬＡＧ‐３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬLAG‐3  ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ４）（配列番号５４）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号１４））；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD‐1  ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＨ１）（配列番号１４７）；システイン含有介在リンカ
ーペプチド（リンカー２：GGCGGG（配列番号１５））；ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号２２））；及びＣ末端を含む。
【０３４９】
ＤＡＲＴ  Ｈの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２８２）：
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPE 
RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 
YTFGGGTKVE IKGGGSGGGG QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT 
SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY 
MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGKVAAL 
KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKE
である。
【０３５０】
ＤＡＲＴ  Ｈの第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ヒンジ領域（DKTHTCPPCP（配列番号３１）；置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａを含み、Ｃ末端リシン残基を有する、ホール担持ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号７）；及びＣ末端を含む。
【０３５１】
ＤＡＲＴ  Ｈの第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２８３）：
DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED 
PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK 
CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK 
GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG 
NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGK
である。
【０３５２】
Ｆ．例示的な二重特異性抗体
「ＢＳＡＢ  Ａ」と呼ばれる例示的なＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３  ４鎖二重特異性抗体を生成した。この二重特異性抗体の構造を以下に詳述する。この例示的なＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性抗体は、本発明の範囲を例示することを意図しており、限定を意図したものではない。
【０３５３】
ＢＳＡＢ  Ａは、ＰＤ‐１に対して特異的な１つの結合部位、ＬＡＧ‐３に対して特異的な１つの結合部位、並びにＦｃγＲ結合の低減及び２つの異なる重鎖ポリペプチド間の複合体化の促進（例えば国際公開第２０１１／１４３５４５号を参照）のために操作された、変異型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を有する、二重特異性抗体である。
【０３５４】
ＢＳＡＢ  Ａの第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD‐1  ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ
７  ＶＨ１）（配列番号１４７）；ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン（配列番号１０）；置換Ｄ２２１Ｅ／Ｐ２２８Ｅ（ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスによる番号付与；以下の配列番号２８６において下線が付されている）を含む変異型ＩｇＧ１ヒンジ領域；置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｌ３６８Ｅ（以下の配列番号２８６において下線が付されている）を含みＣ末端残基を含まない、変異型ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン；及びＣ末端を含む。
【０３５５】
ＢＳＡＢ  Ａの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２８６）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV 
IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH 
YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD 
YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY 
ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCEKTHTCPE CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK 
DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS 
TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV 
YTLPPSREEM TKNQVSLTCE VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL 
DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPG
である。
【０３５６】
ＢＳＡＢ  Ａの第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬPD‐1  ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ
７  ＶＬ２）（配列番号１５３）；κＣＬドメイン（配列番号８）；及びＣ末端を含む。
【０３５７】
ＢＳＡＢ  Ａの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２８７）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV 
QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV 
THQGLSSPVT KSFNRGEC
である。
【０３５８】
ＢＳＡＢ  Ａの第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＬＡＧ‐３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨLAG‐3  ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＨ１）（配列番号４９）；ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン（配列番号１０）；置換Ｄ２２１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ（以下の配列番号２８８において下線を付して示す）を含む変異型ＩｇＧ１ヒンジ領域；置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｌ４０９Ｒ（以下の配列番号２８８において下線を付して示す）を含みＣ末端残基を含まない、変異型ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン；及びＣ末端を含む。
【０３５９】
ＢＳＡＢ  Ａの第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２８８）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW 
INTYTGESTY ADDFEGRFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYYCARES 
LYDYYSMDYW GQGTTVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK 
DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 
YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCRKTHTCP RCPAPEAAGG PSVFLFPPKP 
KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN 
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ 
VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 
LDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG
である。
【０３６０】
ＢＳＡＢ  Ａの第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＬＡＧ‐３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬLAG‐3  ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ４）（配列番号５４）；κＣＬドメイン（配列番号８）；及びＣ末端を含む。
【０３６１】
ＢＳＡＢ  Ａの第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２８９）：
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPE 
RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 
YTFGGGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAK 
VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE 
VTHQGLSSPV TKSFNRGEC
である。
【０３６２】
ＩＸ．基準抗体
Ａ．基準抗ヒトＰＤ‐１抗体
本発明の新規の抗ヒトＰＤ‐１結合分子を評価及び特性決定するために、以下の基準抗体を採用した：ニボルマブ（５Ｃ４、ＢＭＳ‐９３６５５８、ＯＮＯ‐４５３８、ＭＤＸ‐１１０６としても公知であり、Ｂｒｉｓｔｏｌ‐Ｍｙｅｒｓ  ＳｑｕｉｂｂによってＯＰＤＩＶＯ（登録商標）として市販されている）、本明細書において「ＰＤ‐１  ｍＡｂ
Ａ」と呼ばれるヒトＩｇＧ４抗体；及びペンブロリズマブ（旧名ランブロリズマブであり、ＭＫ‐３４７５、ＳＣＨ‐９００４７５としても公知であり、ＭｅｒｃｋによってＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）として市販されている）、本明細書において「ＰＤ‐１  ｍ
Ａｂ  Ｂ」と呼ばれるヒトＩｇＧ４抗体。
【０３６３】
１．ニボルマブ（「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ」）
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａの重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、アミノ酸配列（配列番号６４）（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL DCKASGITFS NSGMHWVRQA PGKGLEWVAV
IWYDGSKRYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLF LQMNSLRAED TAVYYCATND
DYWGQGTLVT VSS
を有する。
【０３６４】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａの軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、アミノ酸配列（配列番号６５）（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD
ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQSSNWPRTFGQ
GTKVEIK
を有する。
【０３６５】
２．ペンブロリズマブ（「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂ」）
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂの重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、アミノ酸配列（配列番号６６）（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
QVQLVQSGVE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYYMYWVRQA PGQGLEWMGG
INPSNGGTNF NEKFKNRVTL TTDSSTTTAY MELKSLQFDD TAVYYCARRD
YRFDMGFDYW GQGTTVTVSS
を有する。
【０３６６】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂの軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、アミノ酸配列（配列番号６７）（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASKGVS TSGYSYLHWY QQKPGQAPRL
LIYLASYLES GVPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQHSRDLPL
TFGGGTKVEIK
を有する。
【０３６７】
ＩＸ．産生の方法
抗ヒトＰＤ‐１ポリペプチド、並びに他のＰＤ‐１アゴニスト、アンタゴニスト及びモジュレータは、当該技術分野において公知の方法によって、例えば合成又は組み換えにより、抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １〜１５のポリヌクレオチド及び／又は配列から生成できる。このようなペプチドアゴニスト、アンタゴニスト及びモジュレータを製造する１つの方法は、ポリペプチドの化学合成と、これに続く、天然立体配座、即ち正しいジスルフィド結合を得るために適切な酸化条件下での処理とを伴う。これは、当業者に公知の方法論を用いて達成できる（例えばKelley, R. F. et al. (1990) In: Genetic Engineering Principles and Methods, Setlow, J.K. Ed., Plenum Press, N.Y., vol. 12, pp 1‐19; Stewart, J.M et al. (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical
Co., Rockford, ILを参照；米国特許第４，１０５，６０３号；米国特許第３，９７２，８５９号；米国特許第３，８４２，０６７号；及び米国特許第３，８６２，９２５号も参照）。
【０３６８】
本発明のポリペプチドは、固相ペプチド合成を用いて便利に調製できる（Merrifield, B. (1986) “Solid Phase Synthesis,” Science 232(4748):341‐347; Houghten, R.A. (1985) “General Method For The Rapid Solid‐Phase Synthesis Of Large Numbers Of
Peptides: Specificity Of Antigen‐Antibody Interaction At The Level Of Individu
al Amino Acids,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15): 5131‐5135; Ganesan, A. (2006) “Solid‐Phase Synthesis In The Twenty‐First Century,” Mini Rev. Med.
Chem. 6(1):3‐10）。
【０３６９】
更に別の代替例では、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４若しくはＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５のＣＤＲのうちの１つ若しくは複数を有する、又はヒトＰＤ‐１若しくはその可溶形態への結合に関してＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４若しくはＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５と競合する、完全ヒト抗体を、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するよう加工された市販のマウスを用いて得ることができる。ヒト化又はヒト抗体の生成のために、より望ましい（例えば完全なヒト抗体）又はよりロバストな免疫応答を生成するよう設計された遺伝子組み換え動物も使用してよい。このような技術の例は、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．，フレモント、ＣＡ）並びにＨＵＭＡｂ‐Ｍｏｕｓｅ（登録商標）及びＴＣ  ＭＯＵＳＥ（商標）（いずれもＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．，プリンストン、ＮＪ）である。
【０３７０】
ある代替案では、当該技術分野において公知の方法を用いて、抗体を組み換えによって作製し、発現させてよい。抗体は、まず宿主動物から作製された抗体を単離し、遺伝子配列を取得し、上記遺伝子配列を使用して宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞）内で抗体を組み換え発現させることによって作製できる。採用できる別の方法は、植物（例えばタバコ）又はトランスジェニックミルク中で抗体配列を発現させることである。植物又はミルク中で抗体を組み換え発現させるための好適な方法は、開示されている（例えばPeeters et al.
(2001) "Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants," Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) "Human Antibodies From Transgenic Mice," Int. Rev. Immunol 13:65-93; and Pollock et a/.(1999) "Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies," J. Immunol Methods 231 : 147-157を参照）。例えばキメラ、ヒト化、単鎖等の抗体の誘導体を作製するための好適な方法は、当該技術分野において公知である。別の代替案では、抗体はファージディスプレイ技術によって、組み換えによって作製できる（例えば米国特許第５，５６５，３３２号；米国特許第５，５８０，７１７号；米国特許第５，７３３，７４３号；米国特許第６，２６５，１５０号；及びWinter, G. et al. (1994) "Making Antibodies By Phage Display Technology," Annu. Rev. Immunol. 12.433-455を参照）。
【０３７１】
関心対象の抗体又はタンパク質は、エドマン分解による配列決定に供してよく、これは当業者には公知である。質量分析又はエドマン分解から生成されるペプチド情報を用いて、関心対象のタンパク質をクローニングするために使用されるプローブ又はプライマを設計できる。
【０３７２】
関心対象のタンパク質クローニングの代替的な方法は、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４若しくはＰＤ‐１  ｍＡｂ  １のＣＤＲのうちの１つ若しくは複数を有する、又はヒトＰＤ‐１への結合に関してＰＤ‐１  
ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ
８、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４若しくはＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５と競合する、関心対象の抗体又はタンパク質を発現する細胞に関して、精製したＰＤ‐１又はその部分を用いて「パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）」することによるものである。「パンニング」手順は、ＰＤ‐１を発現する組織又は細胞からｃＤＮＡライブラリを取得し、上記ｃＤＮＡを第２の細胞タイプにおいて過剰発現させ、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ
８、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４若しくはＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５の存在又は不在下での、ＰＤ‐１への特異的結合に関して、第２の細胞タイプのトランスフェクト細胞をスクリーニングすることによって、実施してよい。「パンニング」による、細胞表面タンパク質に関する哺乳類遺伝子コーディングのクローニングにおいて使用される方法の詳細な説明は、従来技術中に見ることができる（例えばAruffo, A. et al. (1987) "Molecular Cloning Of A CD28 cDNA By A High-Efficiency COS Cell Expression System " Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:8573-8577 and Stephan, J. et al. (1999) "Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation " Endocrinol. 140:5841-5854を参照）。
【０３７３】
関心対象のポリヌクレオチドを含有するベクターは：電気穿孔；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ‐デキストラン又は他の物質を使用したトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；及び感染（例えばベクターがワクシニアウイルス等の感染性因子である場合）を含む多数の適切な手段のうちのいずれによって、宿主細胞に導入できる。ベクター又はポリヌクレオチドの導入の選択は、宿主細胞の特徴に左右される場合が多い。
【０３７４】
関心対象の抗体、ポリペプチド、又はタンパク質をエンコードする遺伝子を単離する目的で、異種ＤＮＡを過剰発現できるいずれの宿主細胞を使用できる。好適な哺乳類宿主細胞の非限定的な例としては、ＣＯＳ、ＨｅＬａ及びＣＨＯ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、宿主細胞は、対応する関心対象の内因性抗体又はタンパク質（これらが宿主細胞中に存在する場合）より５倍高い、より好ましくは１０倍高い、更に好ましくは２０倍高いレベルのｃＤＮＡを発現する。ＬＡＧ‐３への特異的結合に関する宿主細胞のスクリーニングは好ましくは、イムノアッセイ又はＦＡＣＳによって実行される。関心対象の抗体又はタンパク質を過剰発現する細胞を識別できる。
【０３７５】
本発明は、本発明の抗体のアミノ酸配列を備えるポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドは、当該技術分野において公知の手順で産生できる。上記ポリペプチドは、抗体のタンパク質分解若しくは他の分解によって、上述のような組み換え法（即ち単一若しくは融合ポリペプチド）によって、又は化学的合成によって産生できる。上記抗体のポリペプチド、特にアミノ酸最高約５０個分の比較的短いポリペプチドは、化学的合成によって便利に作製される。化学的合成方法は当該技術分野において公知であり、市販されている。例えば抗ＬＡＧ‐３ポリペプチドは、固相法を採用した自動ポリペプチド合成器によって産生してよい。
【０３７６】
本発明は、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ
７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐
１  ｍＡｂ  １１、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４又はＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５抗体、及び上記抗体の、ＰＤ‐１に結合するいずれのポリペプチド断片の変異型（上記分子の特性に有意な影響を及ぼさない、機能的に同等の抗体及び融合ポリペプチド、並びに活性が増強した又は低下した変異型を含む）を含んでよい。ポリペプチドの修飾は、当該技術分野において慣用的に実践されており、本明細書で詳細に説明する必要はない。修飾されたポリペプチドの例としては、アミノ酸残基の保存的置換を有するポリペプチド、機能的活性を大きく劣化するように変化させない１つ若しくは複数の欠失若しくは追加、又は化学的類似体の使用が挙げられる。互いを保存的に置換できるアミノ酸残基としては：グリシン／アラニン；セリン／トレオニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；リジン／アルギニン；及びフェニルアラニン／チロシンが挙げられるが、これらに限定されない。これらのポリペプチドとしては、グリコシル化及び非グリコシル化ポリペプチド、並びに例えば異なる複数の糖によるグリコシル化、アセチル化及びリン酸化といった、その他の変換後修飾を有するポリペプチドも挙げられる。好ましくは、アミノ酸置換は保存的であり、即ち置換されたアミノ酸は、オリジナルのアミノ酸と同様の化学的特性を有する。このような保存的置換は当該技術分野において公知であり、その例は上述されている。アミノ酸修飾は、１つ又は複数のアミノ酸を変化させるか又は修飾することから、可変ドメイン等の領域の完全な再設計にまで及んでよい。可変ドメインの変化は、結合親和性及び／又は特異性を変化させる。他の修飾方法としては、酵素的手段、酸化的置換及びキレート化を含むがこれらに限定されない、当該技術分野において公知の連結技術の使用が挙げられる。修飾は例えば、イムノアッセイのための標識の付与、例えばラジオイムノアッセイのための放射性部分の付与等のために使用できる。修飾されたポリペプチドは、当該技術分野において確立された手順を用いて作製され、また当該技術分野において公知の標準的なアッセイを用いてスクリーニングできる。
【０３７７】
本発明は、本発明のポリペプチドのうちの１つ若しくは複数、又はＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４若しくはＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５抗体を備える融合タンパク質も包含する。一実施形態では、軽鎖、重鎖又は軽鎖及び重鎖の両方を備える、融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、異種免疫グロブリン定常領域を含有する。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、公的に寄託されたハイブリドーマから産生された抗体の軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含有する。本発明の目的のために、抗体融合タンパク質は、ＰＤ‐１、及びネイティブ分子内では上記抗体融合タンパク質が付着しない別のアミノ酸配列、例えば別の領域からの異種配列又は同種配列に特異的に結合する、１つ又は複数のポリペプチドドメインを含有する。
【０３７８】
ＸＩ．本発明のＰＤ‐１結合分子の使用
本発明は、本発明のＰＤ‐１結合分子（例えば、抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐１二重特異性ダイアボディ等）、このような分子由来のポリペプチド、このような分子又はポリペプチドをエンコードする配列を含むポリヌクレオチド、及び本明細書に記載の他の作用剤を含む、医薬組成物を含む組成物を包含する。
【０３７９】
Ａ．治療のための使用
既に議論したように、ＰＤ‐１は、Ｔ細胞の増殖、機能及びホメオスタシスの下方制御において重要な役割を果たす。本発明のＰＤ‐１結合分子のうちのいくつかは、ＰＤ‐１の機能を阻害することによって、ＰＤ‐１仲介性免疫系阻害を反転させる能力を有する。従って、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐
１  ｍＡｂ  ６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５、これらのヒト化誘導体、並びにこれらのＰＤ‐１結合断片を含む分子（例えば、二重特異性抗体、二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ、ＤＡＲＴ‐Ｂ、ＤＡＲＴ‐Ｃ、ＤＡＲＴ‐Ｄ、ＤＡＲＴ‐Ｅ、ＤＡＲＴ‐Ｆ、ＤＡＲＴ‐Ｇ、ＤＡＲＴ‐Ｈ、ＤＡＲＴ‐Ｉ及びＤＡＲＴ‐Ｊ）を含むがこれらに限定されない）等）、又はこのような抗体との結合に関して競合する分子を用いて、ＰＤ‐１仲介性免疫系阻害をブロックすることにより、上記免疫系の活性化を促進できる。
【０３８０】
ＰＤ‐１及び細胞表面上に存在する免疫チェックポイントの制御に関与する別の分子（例えばＬＡＧ‐３）に結合する、本発明のこのような二重特異性ＰＤ‐１結合分子は、ＰＤ‐１及び上記免疫チェックポイント分子が仲介する免疫系阻害をブロックすることによって、免疫系を増強する。従って本発明のこのようなＰＤ‐１結合分子は、被験者の免疫応答（例えばＴ細胞仲介性免疫応答）を増強するために有用である。特に本発明のこのようなＰＤ‐１結合分子を用いて、病原体の存在に関連する癌及び疾患（例えば細菌、真菌、ウイルス又は原虫感染）を含む、望ましくない様式で抑制された免疫系に関連するいずれの疾患又は状態を治療できる。
【０３８１】
本発明のこのようなＰＤ‐１結合分子で治療できる癌としては、以下の細胞：副腎腫瘍；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星状細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄の癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；嫌色素性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚の良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成；胆嚢又は胆管癌；消化器癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；膵島細胞腫瘍；カポジ肉腫；腎癌；白血病；脂肪腫／良性脂肪腫；脂肪肉腫／悪性脂肪腫；肝癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；卵巣癌；膵臓癌；甲状腺乳頭癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；希少な血液学的障害；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移癌；及び子宮癌からなる群から選択される癌細胞の存在を特徴とする癌が挙げられる。本発明の三重特異性結合分子は、結腸直腸癌、肝細胞癌、神経膠腫、腎臓癌、乳癌、多発性骨髄腫、膀胱癌、神経芽細胞腫；肉腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌及び直腸癌の治療に使用できる。
【０３８２】
特に本発明のこのようなＰＤ‐１結合分子は、本発明の三重特異性結合分子は、結腸直腸癌、肝細胞癌、神経膠腫、腎臓癌、乳癌、多発性骨髄腫、膀胱癌、神経芽細胞腫；肉腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌及び直腸癌の治療に使用できる。
【０３８３】
本発明のこのようなＰＤ‐１結合分子で治療できる病原体関連疾患としては、慢性ウイルス、細菌、真菌及び寄生虫感染が挙げられる。本発明のＰＤ‐１結合分子で治療できる慢性感染としては：エプスタイン・バーウイルス；Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）；Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）；ヘルペスウイルス（例えばＨＳＶ‐１、ＨＳＶ‐２、ＨＨＶ‐６、ＣＭＶ）；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）；桿菌；シトロバクター；コレラ；ジフテリア；エンテロバクター；淋菌；ヘリコバクター・ピロリ；クレブシエラ；レジオネラ；髄膜炎菌；マイコバクテリア；シュードモナス；肺炎球菌；リケッチア細菌；サルモネラ；セラチア；ブドウ球菌；連鎖球菌；破傷風；アスペルギルス（フミガーツス、クロコウジカビ等）；ブラストミセス・デルマチチジス；カンジダ（アルビカンス、クルセイ、グラブラタ、トロピカリ
ス等）；クリプトコッカス・ネオフォルマンス；ムコラエ属（ケカビ、ユミケカビ、クモノスカビ）；スポロスリックス・シェンキー；パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス；コクシジオイデス・イムチス；ヒストプラスマ・カプスラツム；レプトスピラ症；ボレリア・ブルグドルフェリ；蠕虫性寄生虫（鉤虫、条虫、吸虫、扁虫（例えば住血吸虫））；ランブル鞭毛虫；トリキネラ属；二核アメーバ；トリパノソーマ・ブルセイ；トリパノソーマ・クルージ；及びドノバン・リーシュマニアが挙げられる。
【０３８４】
本発明のこのようなＰＤ‐１結合分子は、他の抗癌剤、特に癌抗原に特異的に結合する分子（例えば抗体、ダイアボディ）と組み合わせることができる。本発明のＰＤ‐１結合分子と組み合わせてよい抗癌療法としては、以下を含む１つ又は複数の癌抗原に特異的に結合する分子が挙げられる：結腸癌、胃癌ムチンに見られる１９．９；４．２；Ａ３３（結腸直腸癌抗原；Almqvist, Y. 2006、Nucl Med Biol. Nov;33(8):991‐998）；ＡＤＡＭ‐９（米国公開特許第２００６／０１７２３５０号；ＰＣＴ公開番号第０６／０８４０７５号）；胃癌に見られるＡＨ６；ＡＬＣＡＭ（ＰＣＴ公開番号第０３／０９３４４３号）；ＡＰＯ‐１（悪性ヒトリンパ球抗原）（Trauth et al. (1989) “Monoclonal Antibody-Mediated Tumor Regression By Induction Of Apoptosis,” Science 245:301-304）；
Ｂ１（Egloff, A.M. et al. 2006, Cancer Res. 66(1):6-9）；Ｂ７-Ｈ３（Collins, M. et al. (2005) “The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands,” Genome Biol. 6:223.1-223.7).  Chapoval, A. et al. (2001) “B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production,” Nature Immunol. 2:269-274; Sun, M. et al. (2002) “Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes,” J. Immunol. 168:6294-6297）；ＢＡＧＥ（Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84）；β‐カテニン（Prange W. et al. 2003 J Pathol. 201(2):250-9）；結腸腺癌に見られる血液型ＡＬｅb／Ｌｅy；バーキットリンパ腫抗原‐３８．１３；結腸腺癌に見られるＣ１４；ＣＡ１２５（卵巣癌抗原）（Bast, R.C. Jr. et al. 2005 Int J Gynecol Cancer 15 Suppl
3:274-81 ; Yu et al. (1991) “Coexpression Of Different Antigenic Markers On Moieties That Bear CA 125 Determinants,” Cancer Res. 51(2):468-475）；カルボキシ
ペプチダーゼＭ（米国公開特許第２００６／０１６６２９１号）；ＣＤ５（Calin, G.A. et al. 2006 Semin Oncol. 33(2):167-73；ＣＤ１９（Ghetie et al. (1994) “Anti-CD19 Inhibits The Growth Of Human B-Cell Tumor Lines In Vitro And Of Daudi Cells In
SCID Mice By Inducing Cell Cycle Arrest,” Blood 83:1329-1336; Troussard, X. et
al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48）；ＣＤ２０（Reff et al. (1994) “Depletion Of B Cells In Vivo By A Chimeric Mouse Human Monoclonal Antibody To CD20,
” Blood 83:435-445; Thomas, D.A. et al. 2006 Hematol Oncol Clin North Am. 20(5):1125-36）；ＣＤ２２（Kreitman, R.J. 2006 AAPS J. 18;8(3):E532-51）；ＣＤ２３（Rosati, S. et al. 2005 Curr Top Microbiol Immunol. 5;294:91-107）；ＣＤ２５（Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48）；ＣＤ２７（Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9):1234-40）；ＣＤ２８（Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9):1234-40）；ＣＤ３３（Sgouros et al. (1993) “Modeling And Dosimetry Of Monoclonal Antibody M195 (Anti-CD33) In Acute Myelogenous Leukemia,” J. Nucl. Med.34:422-430）；ＣＤ３６（Ge, Y. 2005 Lab Hematol. 11(1):31-7）；ＣＤ４０／ＣＤ１５
４（Messmer, D. et al. 2005 Ann N Y Acad Sci. 1062:51-60）；ＣＤ４５（Jurcic, J.G. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):339-46）；ＣＤ５６（Bataille, R. 2006 Haematologica
91(9):1234-40）；ＣＤ４６（米国特許第７，１４８，０３８号；ＰＣＴ公開番号第０３／０３２８１４号）；ＣＤ５２（Eketorp, S.S. et al. (2014) “Alemtuzumab (Anti-CD52 Monoclonal Antibody) As Single-Agent Therapy In Patients With Relapsed/Refractory Chronic Lymphocytic Leukaemia (CLL)-A Single Region Experience On Consecutive Patients,” Ann Hematol. 93(10):1725-1733; Suresh, T. et al. (2014) “New Antibody Approaches To Lymphoma Therapy,” J. Hematol. Oncol. 7:58; Hoelzer, D. (2013) “Targeted Therapy With Monoclonal Antibodies In Acute Lymphoblastic Leukemi
a,” Curr. Opin. Oncol. 25(6):701-706）；ＣＤ５６（Ｂataille, R. 2006 Haematologica 91(9):1234-40）；ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ（Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48; Chu, P.G. et al. 2001 Appl Immunohistochem Mol Morphol. 9(2):97-106）；ＣＤ１０３（Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48）；ＣＤ３１７（Kawai, S. et al. (2008) “Interferon-Α Enhances CD317 Expression And The Antitumor Activity Of Anti-CD317 Monoclonal Antibody In Renal Cell
Carcinoma Xenograft Models,” Cancer Science 99(12):2461-2466; Wang, W. et al. (2009) HM1.24 (CD317) Is A Novel Target Against Lung Cancer For Immunotherapy Using Anti-HM1.24 Antibody,” Cancer Immunology, Immunotherapy 58(6):967-976; Wang, W. et al. (2009) “Chimeric And Humanized Anti-HM1.24 Antibodies Mediate Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Against Lung Cancer Cells. Lung Cancer,” 63(1):23-31; Sayeed, A. et al. (2013) “Aberrant Regulation Of The BST2 (Tetherin)
Promoter Enhances Cell Proliferation And Apoptosis Evasion In High Grade Breast
Cancer Cells,” PLoS ONE 8(6)e67191, pp. 1-10）；ＣＤＫ４（Lee, Y.M. et al. 2006 Cell Cycle 5(18):2110-4）；ＣＥＡ（癌胎児性抗原；Foon et al. (1995) “Immune Response To The Carcinoembryonic Antigen In Patients Treated With An Anti-Idiotype Antibody Vaccine,” J. Clin. Invest.96(1):334-42); Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46; Tellez-Avila, F.I. et al. 2005 Rev Invest Clin. 57(6):814-9）；ＣＥＡＣＡＭ９／ＣＥＡＣＡＭ６（Zheng, C. et al. (2011) “A Novel Anti-CEACAM5 Monoclonal Antibody, CC4, Suppresses Colorectal Tumor Growth and Enhances NK Cells-Mediated Tumor Immunity,” PLoS One 6(6):e21146, pp. 1-11）；ＣＯ１７‐１Ａ（Ragnhammar et al. (1993) “Effect Of Monoclonal Antibody 17-1A And GM-CSF In Patients With Advanced Colorectal Carcinoma - Long-Lasting, Complete Remissions Can Be Induced,” Int. J. Cancer53:751-758）；ＣＯ‐４３（血液型Ｌｅb）；腺癌に見られるＣＯ‐５１４（血液型Ｌｅa）；ＣＴＡ‐１；ＣＴＬＡ‐４（Peggs, K.S. et al. 2006 Curr Opin Immunol. 18(2):206-13）；サイトケラチン８（ＰＣＴ公開番号第０３／０２４１９１号）；Ｄ１．１；Ｄ1５６‐２２；ＤＲ５（Abdulghani, J. et al. (2010) “TRAIL Receptor Signaling And Therapeutics,” Expert Opin. Ther. Targets 14(10):1091-1108; Andera, L. (2009) “Signaling Activated By The Death Receptors Of The TNFR Family,” Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech. Repub. 153(3):173-180; Carlo-Stella, C. et al. (2007) “Targeting TRAIL Agonistic
Receptors for Cancer Therapy,” Clin, Cancer 13(8):2313-2317; Chaudhari, B.R. et al. (2006) “Following the TRAIL to Apoptosis,” Immunologic Res. 35(3):249-262）；膵臓癌に見られるＥ1シリーズ（血液型Ｂ）；ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体；Adenis, A. et al. 2003 Bull Cancer. 90 Spec No:S228-32）；エフリン受容体（及び特にＥｐｈＡ２（米国特許第７，５６９，６７２号；ＰＣＴ公開番号第０６／０８４２２６号）；Ｅｒｂ（ＥｒｂＢ１；ＥｒｂＢ３；ＥｒｂＢ４；Zhou, H. et al. 2002 Oncogene 21(57):8732-8740; Rimon, E. et al. 2004 Int J Oncol. 24(5):1325-1338）；ＧＡＧＥ（ＧＡＧＥ‐１；ＧＡＧＥ‐２；Akcakanat, A. et al. 2006 Int J Cancer. 118(1):123-128）；ＧＤ２／ＧＤ３／ＧＭ２（Livingston, P.O. et al. 2005 Cancer Immunol Immunother. 54(10):1018-1025）；ガングリオシドＧＤ２（ＧD2；Saleh et al. (1993) “Generation Of A Human Anti-Idiotypic Antibody That Mimics The GD2 Antigen,” J.Immunol., 151, 3390-3398）；ガングリオシドＧＤ３（ＧD3；Shitara et al. (1993) “A Mouse/Human Chimeric Anti-(Ganglioside GD3) Antibody With Enhanced Antitumor Activities,” Cancer Immunol. Immunother. 36:373-380）；ガングリオシドＧＭ２（ＧM2；Livingston et al. (1994) “Improved Survival In Stage III Melanoma Patients With GM2
Antibodies: A Randomized Trial Of Adjuvant Vaccination With GM2 Ganglioside,” J. Clin. Oncol.12:1036-1044）；ガングリオシドＧＭ３（ＧM3；Hoon et al. (1993) “Molecular Cloning Of A Human Monoclonal Antibody Reactive To Ganglioside GM3 Antigen On Human Cancers,” Cancer Res.53:5244-5250）；ＧＩＣＡ１９‐９（Herlyn et 
al. (1982) “Monoclonal Antibody Detection Of A Circulating Tumor-Associated Antigen. I. Presence Of Antigen In Sera Of Patients With Colorectal, Gastric, And Pancreatic Carcinoma,” J. Clin. Immunol.2:135-140）；ｇｐ１００（Lotem, M. et al. 2006 J Immunother. 29(6):616-27）；Ｇｐ３７（ヒト白血病Ｔ細胞抗原；Bhattacharya-Chatterjee et al. (1988) “Idiotype Vaccines Against Human T Cell Leukemia. II. Generation And Characterization Of A Monoclonal Idiotype Cascade (Ab1, Ab2, and Ab3),” J. Immunol. 141:1398-1403）；ｇｐ７５（黒色腫抗原；Vijayasardahl et al.(1990) “The Melanoma Antigen Gp75 Is The Human Homologue Of The Mouse B (Brown) Locus Gene Product,” J. Exp. Med.171(4):1375-1380）；ｇｐＡ３３（Heath, J.K. et al. (1997) “The Human A33 Antigen Is A Transmembrane Glycoprotein And A Novel Member Of The Immunoglobulin Superfamily,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 94(2):469-474; Ritter, G. et al. (1997) “Characterization Of Posttranslational Modifications Of Human A33 Antigen, A Novel Palmitoylated Surface Glycoprotein Of Human Gastrointestinal Epithelium,” Biochem. Biophys. Res. Commun. 236(3):682-686; Wong, N.A. et al. (2006) “EpCAM and gpA33 Are Markers Of Barrett's Metaplasia,” J. Clin. Pathol. 59(3):260-263）；ＨＥＲ２抗原（ＨＥＲ２／ｎｅｕ，ｐ１８５HER2；  Kumar, Pal S et al. 2006 Semin Oncol. 33(4):386-91）；ＨＭＦＧ（ヒト乳脂肪球抗原；国際公開第１９９５０１５１７１号）；ヒトパピローマウイルス‐Ｅ６／ヒトパピローマウイルス‐Ｅ７（DiMaio, D. et al. 2006 Adv Virus Res. 66:125-59；ＨＭ
Ｗ‐ＭＡＡ（高分子量黒色腫抗原；Natali et al. (1987) “Immunohistochemical Detection Of Antigen In Human Primary And Metastatic Melanomas By The Monoclonal Antibody 140.240 And Its Possible Prognostic Significance,” Cancer 59:55-63; Mittelman et al. (1990) “Active Specific Immunotherapy In Patients With Melanoma. A Clinical Trial With Mouse Antiidiotypic Monoclonal Antibodies Elicited With Syngeneic Anti-High-Molecular-Weight-Melanoma-Associated Antigen Monoclonal Antibodies,” J. Clin. Invest. 86:2136-2144)；Ｉ抗原（分化抗原；Feizi (1985) “Demonstration By Monoclonal Antibodies That Carbohydrate Structures Of Glycoproteins And Glycolipids Are Onco-Developmental Antigens,” Nature 314:53-57）；ＩＬ１３Ｒα２（ＰＣＴ公開番号第２００８／１４６９１１号；Brown, C.E. et al. (2013) “Glioma IL13Rα2 Is Associated With Mesenchymal Signature Gene Expression And Poor Patient Prognosis,” PLoS One. 18;8(10):e77769; Barderas, R. et al. (2012) “High Expression Of IL-13 Receptor Α2 In Colorectal Cancer Is Associated With Invasion, Liver Metastasis, And Poor Prognosis,” Cancer Res. 72(11):2780-2790; Kasaian, M.T. et al. (2011) “IL-13 Antibodies Influence IL-13 Clearance In Humans By Modulating Scavenger Activity Of IL-13Rα2,” J. Immunol. 187(1):561-569; Bozinov, O.
et al. (2010) “Decreasing Expression Of The Interleukin-13 Receptor IL-13Ralpha2 In Treated Recurrent Malignant Gliomas,” Neurol. Med. Chir. (Tokyo) 50(8):617-621; Fujisawa, T. et al. (2009) “A novel role of interleukin-13 receptor alpha2 in pancreatic cancer invasion and metastasis,” Cancer Res. 69(22):8678-8685
）；インテグリンβ６（ＰＣＴ公開番号第０３／０８７３４０号）；ＪＡＭ‐３（ＰＣＴ公開番号第０６／０８４０７８号）；ＫＩＤ３（ＰＣＴ公開番号第０５／０２８４９８号）；ＫＩＤ３１（ＰＣＴ公開番号第０６／０７６５８４号）；ＫＳ  １／４癌腫抗原（Perez et al. (1989) “Isolation And Characterization Of A cDNA Encoding The Ks1/4 Epithelial Carcinoma Marker,” J. Immunol. 142:3662-3667; Moller et al. (1991) 
“Bi-specific-Monoclonal-Antibody-Directed Lysis Of Ovarian Carcinoma Cells By Activated Human T Lymphocytes,” Cancer Immunol. Immunother.33(4):210-216; Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-80);Ｌ６及びＬ２０(human lung carcinoma antigens; Hellstrom et al. (1986) “Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinoma,” Cancer Res.46:3917-3923）；ＬＥＡ；ＬＵＣＡ‐２（米国公開
特許第２００６／０１７２３４９号；ＰＣＴ公開番号第０６／０８３８５２号）；Ｍ１：
２２：２５：８；Ｍ１８；Ｍ３９；ＭＡＧＥ（ＭＡＧＥ‐１；ＭＡＧＥ‐３；Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84）；ＭＡＲＴ（Kounalakis, N. et al. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):377-82；メソセリン（Chang K,  and Pastan I. 1996 ”Molecular cloning of mesothelin, a differentiation antigen present on mesothelium, mesotheliomas, and ovarian cancers,” Proc Natl Acad Sci USA 93:136-40）；ＭＵＣ‐１
（Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46）；ＭＵＭ‐１（Castelli, C. et al. 2000 J Cell Physiol. 182(3):323-31）；Ｍｙｌ；Ｎ‐アセチルグルコサ
ミニルトランスフェラーゼ（Dennis, J.W. 1999 Biochim Biophys Acta. 6;1473(1):21-34）；ネオ糖タンパク質；腺癌に見られるＮＳ‐１０；ＯＦＡ‐１；ＯＦＡ‐２；オンコ
スタチンＭ（オンコスタチン受容体β；米国特許第７，５７２，８９６号；ＰＣＴ公開番号第０６／０８４０９２号）；ｐ１５（Gil, J. et al. 2006 Nat Rev Mol Cell Biol. 7(9):667-77）；ｐ９７（黒色腫関連抗原；Estin et al. (1989) “Transfected Mouse Melanoma Lines That Express Various Levels Of Human Melanoma-Associated Antigen p97,” J. Natl. Cancer Instit. 81(6):445-454）；ＰＥＭ（多型上皮ムチン；Hilkens et
al. (1992) “Cell Membrane-Associated Mucins And Their Adhesion-Modulating Property,” Trends in Biochem. Sci. 17:359-363）；ＰＥＭＡ（多型上皮ムチン抗原）；ＰＩＰＡ（米国特許第７，４０５，０６１号；ＰＣＴ公開番号第０４／０４３２３９号）；ＰＳＡ（前立腺特異性抗原；Henttu et al. (1989) “cDNA Coding For The Entire Human Prostate Specific Antigen Shows High Homologies To The Human Tissue Kallikrein
Genes,” Biochem. Biophys. Res. Comm.10(2):903-910; Israeli et al.(1993) “Molecular Cloning Of A Complementary DNA Encoding A Prostate-Specific Membrane Antigen,” Cancer Res.53:227-230; Cracco, C.M. et al. 2005 Minerva Urol Nefrol. 57(4):301-11）；ＰＳＭＡ（前立腺特異性膜抗原；Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-180）；前立腺リン酸塩（Tailor et al. (1990) “Nucleotide Sequence Of Human
Prostatic Acid Phosphatase Determined From A Full-Length cDNA Clone,” Nucl. Acids Res.18(16):4928）；黒色腫に見られるＲ24；ＲＯＲ１（米国特許第５，８４３，７
４９号）；スフィンゴ脂質；ＳＳＥＡ‐１；ＳＳＥＡ‐３；ＳＳＥＡ‐４；ｓＴｎ（Holmberg, L.A. 2001 Expert Opin Biol Ther. 1(5):881-91）；皮膚T細胞リンパ腫からのＴ
細胞受容体由来ペプチド（Edelson (1998) “Cutaneous T-Cell Lymphoma: A Model For Selective Immunotherapy,” Cancer J Sci Am.4:62-71を参照）；骨髄細胞に見られるＴ5Ａ7；ＴＡＧ‐７２（Yokota et al. (1992) “Rapid Tumor Penetration Of A Single-Chain Fv And Comparison With Other Immunoglobulin Forms,” Cancer Res.52:3402-3408）；ＴＬ５（血液型Ａ）；ＴＮＦ‐受容体（ＴＮＦ‐α受容体、ＴＮＦ‐β受容体）；
ＴＮＦ‐γ受容体（van Horssen, R. et al. 2006 Oncologist. 11(4):397-408; Gardnerova, M. et al. 2000 Curr Drug Targets. 1(4):327-64）；ＴＲＡ‐１‐８５（血液型Ｈ）；トランスフェリン受容体（米国特許第７，５７２，８９５号；ＰＣＴ公開番号第０５／１２１１７９号）；５Ｔ４（ＴＰＢＧ、栄養膜糖タンパク質；Boghaert, E.R. et al. (2008) “The Oncofetal Protein, 5T4, Is A Suitable Target For Antibody-Guided Anti-Cancer Chemotherapy With Calicheamicin,” Int. J. Oncol. 32(1):221-234; Eisen, T. et al. (2014) “Naptumomab Estafenatox: Targeted Immunotherapy with a Novel
Immunotoxin,” Curr. Oncol. Rep. 16:370, pp. 1-6）；T抗原DNA腫瘍ウイルス及びRNA腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原を含むウイルス誘発性腫瘍抗原、並びに結腸のCEA、膀
胱腫瘍癌胎児抗原等の癌胎児性抗原‐α‐フェトプロテインといった、ＴＳＴＡ（腫瘍特異性移植抗原）（Hellstrom et al.(1985) “Monoclonal Antibodies To Cell Surface Antigens Shared By Chemically Induced Mouse Bladder Carcinomas,” Cancer. Res. 45:2210-2188）；ＶＥＧＦ(Pietrantonio, F. et al. (2015) “Bevacizumab-Based Neoadjuvant Chemotherapy For Colorectal Cancer Liver Metastases: Pitfalls And Helpful Tricks In A Review For Clinicians,” Crit. Rev. Oncol. Hematol. 95(3):272-281; Grabowski, J.P. (2015) “Current Management Of Ovarian Cancer,” Minerva Med. 106(3):151-156; Field, K.M. (2015) “Bevacizumab And Glioblastoma: Scientific Revie
w, Newly Reported Updates, And Ongoing Controversies,” Cancer 121(7):997-1007; Suh, D.H. et al. (2015) “Major Clinical Research Advances In Gynecologic Cancer
In 2014,” J. Gynecol. Oncol. 26(2):156-167; Liu, K.J. et al. (2015) “Bevacizumab In Combination With Anticancer Drugs For Previously Treated Advanced Non-Small Cell Lung Cancer,” Tumour Biol. 36(3):1323-1327; Di Bartolomeo, M. et al. (2015) “Bevacizumab treatment in the elderly patient with metastatic colorectal cancer,” Clin. Interv. Aging 10:127-133）；ＶＥＧＦ受容体（O’Dwyer. P.J. 2006 Oncologist. 11(9):992-998）；ＶＥＰ８；ＶＥＰ９；ＶＩＭ‐Ｄ５；並びに胎児性癌腫細胞に見られるＹハプテン、Ｌｅy。
【０３８５】
特定の実施形態では、本発明のこのような抗ＰＤ‐１結合分子は、５Ｔ４、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５１、ＣＤ１２３、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、ＥｐＣａｍ、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＲＯＲ‐１、ＴＡＧ‐７２、ＶＥＧＦ‐Ａ抗体及び／又はＶＥＧＦＲ２に特異的に結合する１つ又は複数の分子と組み合わせて使用される。
【０３８６】
本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、腫瘍ワクチン等の免疫原性作用剤と組み合わせることができる。このようなワクチンは、精製腫瘍抗原（組み換えタンパク質、ペプチド及び炭水化物分子を含む）、自己又は同種異系腫瘍細胞を含んでよい。多数の腫瘍ワクチン戦略が記載されている（例えばPalena, C., et al., (2006) “Cancer vaccines: preclinical studies and novel strategies,” Adv. Cancer Res. 95, 115-145; Mellman, I., et al. (2011) “Cancer immunotherapy comes of age,” Nature 480, 480-489; Zhang, X.
M. et al. (2008) “The Anti-Tumor Immune Response Induced By A Combination of MAGE-3/MAGE-n-Derived Peptides,” Oncol. Rep. 20, 245-252; Disis, M. L. et al. (2002) “Generation of T-cell Immunity to the HER-2/neu Protein After Active Immunization with HER-2/neu Peptide-Based Vaccines,” J. Clin. Oncol. 20:2624-2632; Vermeij, R. et al. (2012) “Potentiation of a p53-SLP Vaccine By Cyclophosphamide
In Ovarian Cancer: A Single-Arm Phase II Study.” Int. J. Cancer 131:E670-E680
参照）。本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、化学療法レジームと組み合わせることができる。これらの例では、投与される化学療法試薬の投与量を削減できる場合がある（Mokyr. M.B. et al. (1998) “Realization Of The Therapeutic Potential Of CTLA‐4 Blockade
In Low‐Dose Chemotherapy‐Treated Tumor‐Bearing Mice,” Cancer Research 58: 5301‐5304）。
【０３８７】
本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、Ｔ細胞活性化のレベルを上昇させるために宿主免疫応答を活性化する抗体といった、他の免疫刺激分子と組み合わせることができる。特に、抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体及び／又は抗ＣＴＬＡ‐４抗体は、免疫系を活性化させることが実証されている（例えばdel Rio, M-L. et al. (2005) “Antibody-Mediated Signaling Through PD-1 Costimulates T Cells And Enhances CD28-Dependent Proliferation,” Eur. J. Immunol 35:3545-3560; Barber, D. L. et al. (2006) “Restoring Function In Exhausted CD8 T Cells During Chronic Viral Infection,” Nature 439, 682-687; Iwai, Y. et al. (2002) “Involvement of PD-L1 On Tumor Cells In The Escape
From Host Immune System And Tumor Immunotherapy by PD-L1 blockade,” Proc. Natl
Acad. Sci. USA 99, 12293-12297; Leach, D. R., et al., (1996) “Enhancement Of Antitumor Immunity By CTLA-4 Blockade,” Science 271, 1734-1736参照）。本発明のＬＡＧ‐３結合分子と組み合わせることができる更なる免疫刺激分子としては：樹状細胞（ＤＣ）機能及び抗原提示を活性化させる、樹状細胞の表面上の分子に対する抗体；Ｔ細胞ヘルパー活性を代替できる抗ＣＤ４０抗体；並びにＰＤ‐Ｌ１、ＣＴＬＡ‐４、ＯＸ‐４０  ４‐１ＢＢ及びＩＣＯＳといった、Ｔ細胞共刺激分子に対する活性化抗体（例えばIto et al. (2000) “Effective Priming Of Cytotoxic T Lymphocyte Precursors By Subcutaneous Administration Of Peptide Antigens In Liposomes Accompanied By Anti-CD4
0 And Anti-CTLA-4 Antibodies,”Immunobiology 201:527-40；米国特許第５，８１１，
０９７号；Weinberg et al. (2000) “Engagement of the OX-40 Receptor In Vivo Enhances Antitumor Immunity,” Immunol 164:2160-2169; Melero et al. (1997) “Monoclonal Antibodies Against The 4-1BB T-Cell Activation Molecule Eradicate Established Tumors,” Nature Medicine 3: 682-685; Hutloff et al. (1999)  “ICOS is An Inducible T-Cell Co-Stimulator Structurally And Functionally Related to CD28,” Nature 397: 263-266;及びMoran, A.E. et al. (2013) “The TNFRs OX40, 4-1BB, and CD40 As Targets For Cancer Immunotherapy,” Curr Opin Immunol. 2013 Apr; 25(2): 10.1016/j.coi.2013.01.004参照）、並びに／又は抗原結合時にＴ細胞を刺激する役割を果たす、様々な共刺激タンパク質受容体（例えばＣＤ２８、４‐１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０等）からの１つ若しくは複数の細胞内シグナリングドメインに融合した疾患抗原を対象とする抗原結合ドメインを備える、刺激キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（例えばTettamanti, S.
et al. (2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer
Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor,” Br. J. Haematol. 161:389-401; Gill, S. et al. (2014) “Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using
Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells,” Blood  123(15): 2343-2354; Mardiros, A. et al. (2013) “T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia,” Blood 122:3138-3148; Pizzitola, I. et al. (2014)
“Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo,” Leukemia 28(8):1596-1605参照）が挙
げられる。
【０３８８】
本発明のＬＡＧ‐３結合分子を阻害キメラ抗原受容体（ｉＣＡＲ）と組み合わせて、標的の免疫療法応答を転向させることができる。ｉＣＡＲとしては：抗原結合時にＴ細胞応答を制限する役割を果たす、様々な阻害タンパク質受容体（例えば、ＣＴＬＡ‐４、ＰＤ‐１等）からの１つ又は複数の細胞内シグナリングドメインに融合した疾患抗原を対象とする抗原結合ドメイン（例えばFedorov V.D. (2013) “PD-1- and CTLA-4-Based Inhibitory Chimeric Antigen Receptors (iCARs) Divert Off-Target Immunotherapy Responses,” Sci Tranl Med. 5(215):215ra172）が挙げられる。
【０３８９】
特に本発明の抗ＬＡＧ‐３抗体は、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＴＩＭ‐３抗体及び／又は癌ワクチンと併用される。
【０３９０】
Ｂ．診断における、及びセラノスティックな有用性
本発明のＰＤ‐１結合分子の一部は、ＰＤ‐１とＰＤ‐１Ｌリガンドとの間の結合をブロックする能力を殆ど又は全く示さない。従って抗体  ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４、そのヒト化誘導体、並びにそのＰＤ‐１結合断片を含む分子（例えば二重特異性ダイアボディ等）又はこのような抗体との結合に関して競合する分子は、（例えば放射性、酵素性、蛍光性、化学発光性、常磁性、反磁性又は他の標識部分によって）着脱可能に標識でき、試料中のＰＤ‐１の検出、又は細胞上のＰＤ‐１の撮像において使用できる。このような分子は、ＰＤ‐１の生体活性に影響を及ぼさないため、被験者（例えばＰＤ‐１の発現又は標的化に関連する癌に関する治療を受けている被験者）におけるＰＤ‐１発現の程度、部位及び変化を決定する方法において、特に有用である。
【０３９１】
ＸＩＩ．医薬組成物
本発明の組成物は、医薬組成物の製造に使用できるバルク薬剤組成物（例えば不純又は非滅菌組成物）、及び単位剤形の調製に使用できる医薬組成物（即ち被験体又は患者への
投与に好適な組成物）を含む。これらの組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明のＰＤ‐１結合分子、又はこのような作用剤と薬学的に許容可能なキャリアとの組み合わせを含む。好ましくは、本発明の組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明のＰＤ‐１結合分子のうちの１つ又は複数と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。本発明は特に、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ
４、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１
ｍＡｂ  ８、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４若しくはＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５；ヒト化ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １；  ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ
６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９、ＰＤ‐１
ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ
１３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４若しくはＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５；いずれのこのような抗体のＰＤ‐１結合断片である、医薬組成物、又はＰＤ‐１結合分子が二重特異性ＰＤ‐１ダイアボディ（例えば、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ）である、医薬組成物を包含する。特に包含されるのは：ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４又はＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５  抗体；ヒト化ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １；  ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４又はＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５の３つのＣＤＲL及び３つのＣＤＲHを含む、分子である。
【０３９２】
本発明はまた、特定の癌抗原に対して特異的である第２の治療用抗体（例えば腫瘍特異性モノクローナル抗体）、及び薬学的に許容可能なキャリアを更に含む、上記医薬組成物も包含する。
【０３９３】
ある具体的実施形態では、用語「薬学的に許容可能な（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」は、動物、より詳細にはヒトにおける使用に関して、連邦規制当局若しくは州政府によって承認されている、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。用語「キャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）」は、希釈剤、アジュバント（例えばフロイントアジュバント（完全及び不完全））、賦形剤、又は治療薬の投与に用いられるビヒクルを指す。これらの薬学的キャリアは、水及び石油、動物油、植物油若しくは合成油を含む油（例えば落花生油、大豆油、鉱物油、胡麻油等）等の、無菌液体とすることができる。医薬組成物を静脈投与する場合、水が好ましいキャリアである。特に注射用溶液のための液体キャリアとして、食塩水、並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液も採用できる。好適な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。必要な場合は、上記組成物は、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、ピル、カプセル、粉体、徐放性製剤等の形態を取ることができる。
【０３９４】
一般に、本発明の組成物の成分は、例えば活性作用剤の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ中の凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、別個に、又は単位剤形にまとめて混合された状態で供給される。組成物を点滴によって投与する場合、組成物は、滅菌
された薬学的グレードの水又は食塩水を内包する点滴ボトルを用いて吐出できる。組成物を注射によって投与する場合、投与前に成分を混合できるように、注射用無菌水又は食塩水のアンプルを提供できる。
【０３９５】
本発明の組成物は、中性又は塩形態として処方できる。薬学的に許容可能な塩としては：塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等由来の陰イオンを有して形成されるもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２‐エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等由来の陽イオンを有して形成されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３９６】
本発明はまた、本発明のＰＤ‐１結合分子（及びより好ましくは、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４若しくはＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５；ヒト化ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４若しくはＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５抗体；いずれのこのような抗体のＰＤ‐１結合断片；又はＰＤ‐１結合分子が二重特異性ＰＤ‐１ダイアボディ（例えばＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ）であるもの））で充填された１つ又は複数のコンテナを備える、医薬パック又はキットも提供する。特に包含されるのは、単独で又は薬学的に許容可能なキャリアと共に：ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１
ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４又はＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５の３つのＣＤＲL 及び３つのＣＤＲHを含む、分子である。更に、疾患の治療に有用な１つ又は複数の他の予防剤又は治療
剤も、上記医薬パック又はキットに含めることができる。本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分のうちの１つ又は複数で充填された１つ又は複数のコンテナを備える、医薬パック又はキットも提供する。任意に、このような１つ又は複数のコンテナは、医薬製品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知と関連するものとすることができ、上記通知は、ヒトへの投与のための製造、使用又は販売の機関による承認を反映したものである。
【０３９７】
本発明は、上述の方法において使用できるキットを提供する。キットは、本発明のＰＤ‐１結合分子のいずれを含むことができる。このキットは更に、癌の治療に有用な１つ若しくは複数の他の予防剤及び／若しくは治療剤を、１つ若しくは複数のコンテナ内に含むことができ；並びに／又はこのキットは更に、癌に関連する１つ若しくは複数の癌抗原に結合する１つ若しくは複数の細胞毒性抗体を含むことができる。特定の実施形態では、他の予防剤又は治療剤は、化学療法剤である。他の実施形態では、予防剤又は治療剤は生物学的治療剤又はホルモン療法剤である。
【０３９８】
ＸＩＩＩ．投与方法
本発明の組成物は、有効量の本発明の融合タンパク質若しくはコンジュゲート分子又は本発明の融合タンパク質若しくはコンジュゲート分子を含む医薬組成物を被験体に投与することによる、疾患、障害又は感染症に関連する１つ又は複数の症状の治療、予防及び改善のために提供できる。好ましい態様では、上記組成物は実質的に精製される（即ち上記組成物の効果を制限する、又は望ましくない副作用を生成する物質を実質的に含まない）
。ある具体的実施形態では、被験体は動物、好ましくは非霊長類（例えばウシ属、ウマ科、ネコ科、イヌ科、げっ歯類等）又は霊長類（例えばカニクイザル等のサル、ヒト等）といった哺乳類である。ある好ましい実施形態では、被験体はヒトである。
【０３９９】
例えば抗体又は融合タンパク質を発現できるリポソーム、微粒子マイクロカプセル、組み換え細胞内へのカプセル化；受容体媒介性エンドサイトーシス（例えばWu et al. (1987) “Receptor‐Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System,” J. Biol. Chem. 262:4429‐4432を参照）；レトロウイルス又は他のベクターの
一部としての核酸の構築等、様々な送達系が公知であり、本発明の組成物の投与に使用できる。
【０４００】
本発明の分子を投与する方法としては：非経口投与（例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）；硬膜外；並びに粘膜（例えば鼻腔内及び経口経路）が挙げられるがこれらに限定されない。ある具体的実施形態では、本発明のＰＤ‐１結合分子は、筋肉内、静脈内又は皮下投与される。組成物は、いずれの便利な経路によって、例えば点滴又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜皮膚層（例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等）を通した吸収によって投与してよく、他の生物学的活性作用剤と共に投与してよい。投与は全身性又は局所性とすることができる。更に、例えば吸入器又は噴霧器の使用及びエアロゾル化剤を用いた処方により、肺投与を採用することもできる。例えば米国特許第６，０１９，９６８号；米国特許第５，９８５，３２０号；米国特許第５，９８５，３０９号；米国特許第５，９３４，２７２号；米国特許第５，８７４，０６４号；米国特許第５，８５５，９１３号；米国特許第５，２９０，５４０号；米国特許第４，８８０，０７８号；国際公開第９２／１９２４４号；国際公開第９７／３２５７２号；国際公開第９７／４４０１３号；国際公開第９８／３１３４６号；国際公開第９９／６６９０３を参照（これらはそれぞれ、参照により本出願に援用される）。
【０４０１】
本発明はまた、本発明のＰＤ‐１結合分子を、この分子の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ内に包装することも提供する。一実施形態では、上記分子は、気密性コンテナ内の滅菌凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として供給され、例えば水又は食塩水を用いて、被験体への投与に適切な濃度へと再構成できる。好ましくは、本発明のＰＤ‐１結合分子は、気密性コンテナ内の滅菌凍結乾燥粉末として供給される。
【０４０２】
凍結乾燥された本発明のＰＤ‐１結合分子は、その元々のコンテナ内において２℃〜８℃で保管するべきであり、またこの分子は、再構成後１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内又は１時間以内に投与するべきである。ある代替実施形態では、このような分子は、この分子、融合タンパク質又はコンジュゲート分子の量及び濃度を示す気密性コンテナ内に、液体形態で供給される。好ましくは、このようなＰＤ‐１結合分子は、液体形態で提供される場合、気密性コンテナ内に供給される。
【０４０３】
障害に関連する１つ又は複数の症状の治療、予防及び改善に効果的な本発明の組成物の量は、標準的な臨床技術によって決定できる。処方において採用するべき正確な用量は、投与経路及び状態の重篤度にも左右され、施術者の判断及び各患者の状況に従って決定するべきである。効果的な用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られた用量‐応答曲線から外挿できる。
【０４０４】
本明細書において使用される場合、医薬組成物の「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」は、一実施形態において：疾患によってもたらされる症状の低減；感染の症状（例えばウイルス負荷、発熱、疼痛、敗血症等）若しくは癌の症状（例えば癌細胞の増殖、腫瘍の存在、腫瘍転移等）を減弱させる疾患に起因する症状の減弱；これによる、疾患に罹患したヒトのＱＯＬの上昇；疾患を治療するために必要な他の投薬量の低減；標的
化及び／若しくは内在化等による別の投薬の効果の増強；疾患の進行の遅延；並びに／又は個体の生存期間の延長を含むがこれらに限定されない、有益な又は所望の結果を得るために十分な量である。
【０４０５】
有効量は、１回又は複数回の投与で投与できる。本発明の目的のために、薬剤、化合物又は医薬組成物の有効量は、直接的又は間接的な、ウイルスの存在（又はその影響）の増殖の低減、並びにウイルス性疾患の進展の低減及び／又は遅延に十分な量である。いくつかの実施形態では、薬剤、化合物又は医薬組成物の有効量は、別の薬剤、化合物又は医薬組成物と組み合わせて達成してもしなくてもよい。従って「有効量」は、１つ又は複数の化学療法剤を投与する文脈で考えることができ、また単一の作用剤が、１つ又は複数の他の作用剤と組み合わせて所望の結果を達成できる又は所望の結果を達成する場合に、有効量で与えられているものと考えることができる。個別の必要量は異なるが、各成分の有効量の最適な範囲の決定は当業者の能力の範囲内である。
【０４０６】
本発明に包含されるＰＤ‐１結合分子に関して、患者に投与される投薬量は好ましくは、レシピエント被験者の体重（ｋｇ）に基づいて決定される。本発明に包含されるＰＤ‐１結合分子に関して、患者に投与される投薬量は典型的には、被験者の体重の少なくとも約０．０１μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０５μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５μｇ／ｋｇ、少なくとも約１μｇ／ｋｇ、少なくとも約２μｇ／ｋｇ、少なくとも約５μｇ／ｋｇ、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ、少なくとも約２０μｇ／ｋｇ、少なくとも約５０μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約７５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１２５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１５０ｍｇ／ｋｇ以上である。
【０４０７】
本発明のＰＤ‐１結合分子の投与の用量及び頻度は、例えば脂質化等の改質によって分子の取り込み及び組織貫通を増強することによって低減又は偏向できる。
【０４０８】
患者に投与される本発明のＰＤ‐１結合分子の投薬量は、単一作用剤による治療としての使用のために計算してよい。あるいは、上記分子は他の治療用組成物と併用され、患者に投与される投薬量は、上記分子を単一作用剤による治療として使用する場合よりも小さくなる。
【０４０９】
本発明の医薬組成物は、治療が必要な領域に局所的に投与してよく、これは、以下に限定されるものではないが、例えば局所的点滴によって、注射によって、又はインプラントを用いて達成してよく、上記インプラントは多孔性、非多孔性又はゼラチン材料製であり、シラスティック膜等の膜又は繊維を含む。好ましくは、本発明の分子を投与する際、この分子が吸収されない材料を使用するよう注意しなければならない。
【０４１０】
本発明の組成物は、小嚢、特にリポソーム中で送達できる（Langer (1990) “New Methods Of Drug Delivery,” Science249:1527-1533); Treat et al., in Liposomes in the
Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp.353-365(1989); Lopez-Berestein,同上、pp.317-327参照）。
【０４１１】
本発明の組成物は、放出制御系又は徐放系中で送達できる。１つ又は複数の本発明のＰＤ‐１結合分子を含む徐放性処方を製造するために、当業者に公知のいずれの技術を使用できる。例えば：米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開第９１／０５５４８号；国際公開第９６／２０６９８号；Ning et al.(1996) “Intratumoral Radioimmunotheraphy
Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,” Radiotherapy
& Oncology39:179-189;Song et al.(1995) “Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397;Cleek et al.(1997) “Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854;及びLam et al. (1997) “Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760を参照（これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に
援用される）。一実施形態では、放出制御系においてポンプを使用してよい（Langer, supra; Sefton,(1987)“Implantable Pumps,” CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240;Buchwald et al.(1980)“Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis,” Surgery 88:507-516;及びSaudek et al.(1989)“A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery,” N. Engl. J.
Med. 321:574-579参照）。別の実施形態では、分子の放出制御を達成するためにポリマ
ー材料を使用できる（例えばMedical Applications of Controlled Release, Langer and
Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984);Levy et al.(1985)“Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate,” Science228:190-192;During et
al.(1989)“Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization,” Ann. Neurol. 25:351-356;Howard et al.(1989)“Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits,” J. Neurosurg. 7(1):105-112)；米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；国際公開第９９／１５１５４号；及び国際公開第９９／２０２５３号参照）。徐放性処方において使用されるポリマーの例としては、ポリ（２‐ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン‐コ‐酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物類、ポリ（Ｎ‐ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド類（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド‐コ‐グリコリド）類（ＰＬＧＡ）及びポリオルトエステル類が挙げられるが、これらに限定されない。放出制御系は、治療標的（例えば肺）の近傍に配置でき、従って全身用量の一部しか必要としない（例えばGoodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol.2, pp.115-138(1984)参照）。放出制御インプラントとして有用なポリマー組成物は、Dunn et al.に従って使用できる（米国特許第5,945,155号参照）。この特定の方法は、ポリマー系からの生物活性材料のインサイチュ放出制御の治療効果に基づく。埋入は一般に、治療的処置を必要とする患者の身体内のいずれの部位において実施できる。非ポリマー徐放系を使用でき、この場合、被験体の身体内の非ポリマーインプラントを、薬剤送達系として使用する。身体内への埋入後、インプラントの有機溶媒が組成物から周辺の組織液中へと放散、分散又は浸出し、非ポリマー材料は徐々に凝集又は沈殿して、固体の微小細孔性マトリクスを形成する（米国特許第５，８８８，５３３号参照）。
【０４１２】
放出制御系については、Langer(1990,“New Methods Of Drug Delivery,” Science 249:1527-1533)による報告中で議論されている。１つ又は複数の本発明の治療剤を含む徐放性処方を製造するために、当業者に公知のいずれの技術を使用できる。例えば：米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開第９１／０５５４８号及び第９６／２０６９８号；Ning et al.(1996)“Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,” Radiotherapy & Oncology39:179-189;Song et al.(1995)“Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology50:372-397;Cleek et al.(1997)“Bio
degradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854;並びにLam et al.(1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local
Delivery,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760参照（こ
れらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【０４１３】
本発明の組成物が、本発明のＰＤ‐１結合分子をエンコードする核酸である場合、この核酸は、この核酸がエンコードするＰＤ‐１結合分子の発現を促進するために、この核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築して、例えばレトロウイルスベクターの使用によって（米国特許第４，９８０，２８６号参照）、又は直接注射によって、又は微粒子衝撃（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用によって、又は脂質若しくは細胞表面受容体若しくは遺伝子導入剤を用いてコーティングすることによって、又は細胞核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドと連鎖させて上記核酸を投与すること（例えばJoliot et al.(1991)“Antennapedia Homeobox Peptide Regulates
Neural Morphogenesis,” Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.)88:1864-1868を参照）等に
よって、上記核酸を投与することにより、インビボ投与できる。あるいは核酸を細胞内に導入して、相同遺伝子組み換えによる発現のためのホスト細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。
【０４１４】
治療的又は予防的有効量の本発明のＰＤ‐１結合分子を用いた被験体の治療は、単回治療を含むことができ、又は好ましくは一連の複数回の治療を含むことができる。ある好ましい例では、被験体は、上述のようなダイアボディを用いて、約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間、更に好ましくは約４、５又は６週間に亘って週１回処置される。本発明の医薬組成物は、１日１回、１日２回又は１日３回投与できる。あるいはこの医薬組成物は、１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、１ヶ月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１年に２回又は１年に１回投与できる。治療に使用される上記分子の有効な用量設定は、特定の治療の期間に亘って増減させてよいことも理解されるだろう。
【実施例】
【０４１５】
以下の実施例は、本発明の診断又は治療方法における組成物に関する様々な方法を例示したものである。これらの実施例は、本発明の範囲を例示することを意図しており、限定を意図したものではない。
【０４１６】
実施例１  抗ヒトＰＤ‐１モノクローナル抗体の特性決定
１５個のマウスモノクローナル抗体を、ヒト及びカニクイザル両方のＰＤ‐１に特異的に結合できるものとして単離し、呼称「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １」、「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２」、「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３」、「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４」、「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５」、「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６」、「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７」、「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８」、「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９」、「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０」、「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１」、「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２」、「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３」、「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４」及び「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５」を与えた。これらの抗体のＣＤＲは異なることが分かり、これらは上述されている。ヒト及びカニクイザルＰＤ‐１の細胞外ドメインへの結合を、以下のようにして評価した。平底ｍａｘｉｓｏｒｂ  ９６ウェルプレートを、それぞれ０．５又は１μｇ／ｍＬの可溶性ヒト又はカニクイザルＰＤ‐１（Ｈｉｓタグ（ｓｈＰＤ‐１  Ｈｉｓ）若しくはヒトＦｃ領域（ｓｈＰＤ‐１  ｈＦｃ）に融合したヒトＰＤ‐１の細胞外ドメイン、又はヒトＦｃ領域に融合したカニクイザルＰＤ‐１の細胞外ドメイン（ｓｃｙｎｏ‐ＰＤ１  Ｆｃ））でコーティングし、これらのプレートを洗浄して、単離されたＰＤ‐１  ｍＡｂ  １〜１５のうちの１つを用いてインキュベートした。これらの研究に関して、抗ＰＤ‐１抗体は、３、１．０、０．３３３３、０．１１１１、０
．０３７０、０．０１２３又は０．００４１μｇ／ｍＬ（３倍連続希釈）で用いた。不動化されたＰＤ‐１（ヒト又はカニクイザル）に結合する抗体の量を、ヤギ抗マウスＩｇＧ‐ＨＲＰ二次抗体を用いて評価した。全ての試料を、プレートリーダ（Ｖｉｃｔｏｒ  ２
Ｗａｌｌａｃ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒｓ）上で分析した。可溶性ヒト及び可溶性カニクイザルＰＤ‐１に関する代表的な結合曲線を、それぞれ図７Ａ〜７Ｄ及び図８Ａ〜８Ｃに示す。
【０４１７】
これらの結合アッセイの結果（図７Ａ〜７Ｄ及び図８Ａ〜８Ｃ）は、全ての抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １〜１５が、可溶性ヒト及び可溶性カニクイザルＰＤ‐１の両方に結合することを示す。
【０４１８】
マウス抗ＰＤ‐１抗体を更に特性決定するために、上記抗体の、可溶性ヒトＰＤ‐１に対する可溶性ヒトＰＤ‐Ｌ１の結合をブロックする能力を、２つの異なるアッセイにおいて評価した。一方のアッセイでは、上記抗体の、ある表面上に不動化されたＰＤ‐Ｌ１に対するヒトＰＤ‐１の結合をブロックする能力を、検査した。このアッセイのために、各抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １〜１５、又は基準抗ＰＤ‐１抗体（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ）を、（２．５μｇ／ｍＬの）ｓｈＰＤ‐１  Ｈｉｓ融合タンパク質と混合し、ストレプトアビジンコーティング済みプレート上に不動化された１μｇ／ｍＬのビオチン標識可溶性ヒトＰＤ‐Ｌ１（ヒトＦｃに融合したＰＤ‐Ｌ１の細胞外ドメイン（ｓＰＤ‐Ｌ１））を用いて、別個にインキュベートした。これらの研究に関して、抗ＰＤ‐１抗体は１０、５．０、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５又は０．１５６３μｇ／ｍＬ（２倍連続希釈）で用いた。不動化されたｓＰＤ‐Ｌ１に結合するｓｈＰＤ‐１  Ｈｉｓの量を、抗Ｈｉｓタグ‐ＨＲＰ二次抗体を用いて、Ｈｉｓタグによって評価した。全ての試料を、プレートリーダ（Ｖｉｃｔｏｒ  ２  Ｗａｌｌａｃ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒｓ）上で分析した。この実験の結果を図９Ａ〜９Ｄに示す。
【０４１９】
この阻害アッセイの結果（図９Ａ〜９Ｄ）は、抗ＰＤ‐抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ
７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５は、可溶性ヒトＰＤ‐１に対する可溶性ヒトＰＤ‐Ｌ１の結合をブロックすることによって程度を変化させることができる一方で、ＰＤ‐１
ｍＡｂ  ２及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４はこのアッセイフォーマットにおいてブロック活性を殆ど又は全く示さなかったことを示す。
【０４２０】
この第２のアッセイでは、マウス抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １〜１５の、ＮＳＯ細胞の表面上に発現したＰＤ‐１に対するＰＤ‐１リガンド（即ちヒトＰＤ‐Ｌ１又はヒトＰＤ‐Ｌ２）の結合をブロックする能力を検査した。このアッセイのために、各抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １〜１５又は抗ＰＤ‐１抗体（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ若しくはＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂ）を、それぞれ０．１μｇ／試験のビオチン化可溶性ヒトＰＤ‐Ｌ１（ｓｈＰＤ‐Ｌ１融合タンパク質）又はビオチン化可溶性ヒトＰＤ‐Ｌ２‐ｍｕＩｇＦｃ融合タンパク質（ｓｈＰＤ‐Ｌ２；Ａｎｃｅｌｌ  Ｃａｔ＃５７３‐０３０）と、別個に混合し、ブロッキングバッファ（ＦＡＣＳ＋１０％ヒト血清アルブミン）中の、ヒトＰＤ‐１を発現するＮＳＯ細胞（〜２５０，０００細胞／ウェル）を用いて、インキュベートした。これらの研究に関して、抗ＰＤ‐１抗体は、４．０、１．０、２．５×１０-1、６．２５×１０-2、１．５６×１０-2、３．９０×１０-3、９．７６×１０-4
、２．４×１０-4、０．６×１０-4μｇ／試験（４倍連続希釈）で用いた。ＮＳＯ細胞の表面に結合するｓｈＰＤ‐Ｌ１（又はｓｈＰＤ‐Ｌ２）の量を、ＰＥコンジュゲートストレプトアビジン二次抗体を用いて、ＦＡＣＳ分析によって決定した。ＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１結合の阻害に関するＩＣ５０値を決定し、少なくとも２回の実験（注記されている箇
所を除く）の試料平均（σ）を表６に提供する。
【０４２１】
【表８】
2019055948.tif 000012
【０４２２】
このｓｈＰＤ‐Ｌ１阻害アッセイの結果（表６）は、抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ
１、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４、ＰＤ‐１
ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１
ｍＡｂ  １３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５が、ＮＳＯ細胞の表面上に発現したヒトＰＤ‐１に対するヒトＰＤ‐Ｌ１の結合をブロックできることを示す。特にＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５は、基準ＰＤ‐１抗体（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂ）と同等以上にｓｈＰＤ‐Ｌ１の結合をブロックしたが、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８は、このアッセイフォーマットにおいては本質的にブロックを示さなかった。ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４はいずれも、このアッセイフォーマットにおいてＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１結合をブロックできた。
【０４２３】
同様に、抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４は、ＮＳＯ細胞の表面上に発現したヒトＰＤ‐１に対するヒトＰＤ‐Ｌ２の結合をブロックできたが、このアッセイフォーマットにおいては本質的にブロックを示さなかった。特にＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０  は、基準ＰＤ‐１抗体（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂ）と同等以上にｓｈＰＤ‐Ｌ２の結合をブロックした。ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５は、このアッセイでは試験されなかった。ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５を含む複数のヒト化抗ＰＤ‐１抗体に関する結果を以下で提供する。
【０４２４】
実施例２  ヒト化及び更なる特性決定
抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５の可変ドメインをヒト化した。ここで抗原性エピトープを更に脱免疫化して、最終的なヒト化可変ドメインを生成した。ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５のヒト化により、ここでは「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １  ＶＨ１」及び「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １  ＶＬ１」；「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２  ＶＨ１」及び「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２  ＶＬ１」；及び
「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５  ＶＨ１」及び「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５  ＶＬ１」と呼ばれる抗体それぞれに関して、１つのヒト化ＶＨドメイン及び１つのヒト化ＶＬドメインが得られた。ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７のヒト化により、ここでは「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７
ＶＨ１」及び「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＨ２」と呼ばれる２つのヒト化ＶＨドメインと、ここでは「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １  ＶＬ１」、「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ２」及び「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ３」と呼ばれる３つのヒト化ＶＬドメインとが得られた。ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９のヒト化により、ここでは「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９  ＶＨ１」及び「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９  ＶＨ２」と呼ばれる２つのヒト化ＶＨドメインと、ここでは「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９  ＶＬ１」及び「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １  ＶＬ２」と呼ばれる２つのヒト化ＶＬドメインとが得られた。複数のヒト化可変ドメインが生成される場合、特定の抗ＰＤ‐１抗体（例えばＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７）のヒト化重鎖及び軽鎖可変ドメインを、いずれの組み合わせで使用してよく、またヒト化鎖の特定の組み合わせを、具体的なＶＨ／ＶＬドメインに対する参照によって呼称する。例えばｈＰＤ‐１
ｍＡｂ  ７  ＶＨ１及びｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ２を備えるヒト化抗体は、具体的に「ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）」と呼ばれる。Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換を含むヒトＩｇＧ１定常領域（ＩｇＧ１（ＡＡ））又はＳ２２８Ｐ置換を含むヒトＩｇＧ４定常領域（ＩｇＧ４（Ｐ））を有する、全長ヒト化抗体を生成した。
【０４２５】
全長ＩｇＧ１ヒト化抗体重鎖を、以下のようにして構成した：ヒト化ＶＨドメインのＣ末端を、（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＡＡ）置換を含む）変異型ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを有するがＣ末端リシン残基を有しないヒトＩｇＧ１定常領域（配列番号２５５）：
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV 
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP 
KSCDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS 
HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 
EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC 
LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW 
QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG
のＮ末端に融合させた。
【０４２６】
配列番号２５５において、アミノ酸残基１〜９８はＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン（配列番号１０）に対応し、アミノ酸残基９９〜１１３はＩｇＧ１ヒンジ領域（配列番号３２）に対応し、アミノ酸残基１１４〜３２９は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換（下線）を含むがＣ末端リシン残基を含まないＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５）に対応する。
【０４２７】
Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を含むがＣ末端リシン残基を含まない、ＩｇＧ１重鎖定常領域を有する例示的なヒト化抗体（（ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２））の重鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２６５）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV 
IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH 
YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD 
YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY 
ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK 
DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS 
TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV 
YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL 
DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPG
である。
【０４２８】
配列番号２６５において、アミノ酸残基１〜１１９はｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＨ１のＶＨドメイン（配列番号１４７）に対応し、アミノ酸残基１２０〜２１７はＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン（配列番号１０）に対応し、残基２１８〜２３２はＩｇＧ１ヒンジ領域（配列番号３２）に対応し、残基２３３〜４４８は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換（下線）を含むがＣ末端リシン残基を含まないＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５）に対応する。
【０４２９】
全長ＩｇＧ４ヒト化抗体重鎖を、以下のようにして構成した：ヒト化ＶＨドメインのＣ末端を、（Ｓ２２８Ｐ置換を含む）安定化ヒンジ領域を有するがＣ末端リシン残基を有しないヒトＩｇＧ４定常領域（配列番号２５６）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV 
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES 
KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED 
PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK 
CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK 
GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG 
NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG
のＮ末端に融合させた。
【０４３０】
配列番号２５６において、アミノ酸残基１〜９８はＩｇＧ４  ＣＨ１ドメイン（配列番号２５４）に対応し、アミノ酸残基９９〜１１０は、Ｓ２２８Ｐ置換（下線）を含む安定化ＩｇＧ４ヒンジ領域（配列番号１３）に対応し、アミノ酸残基１１１〜３２６はＩｇＧ４  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４）に対応するが、Ｃ末端リシン残基を含まない。
【０４３１】
Ｓ２２８Ｐ突然変異を有するがＣ末端リシン残基を有しない、安定化ヒンジ領域を含むＩｇＧ４重鎖定常領域を有する例示的なヒト化抗体（ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２））の重鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２６６）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV 
IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH 
YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APCSRSTSES TAALGCLVKD 
YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTKTY 
TCNVDHKPSN TKVDKRVESK YGPPCPPCPA PEFLGGPSVF LFPPKPKDTL 
MISRTPEVTC VVVDVSQEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQFNSTYR 
VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPSS IEKTISKAKG QPREPQVYTL 
PPSQEEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD 
GSFFLYSRLT VDKSRWQEGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSLG
である。
【０４３２】
配列番号２６６において、アミノ酸残基１〜１１９はｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＨ１のＶＨドメイン（配列番号１４７）に対応し、アミノ酸残基１２０〜２１７はＩｇＧ４  ＣＨ１ドメイン（配列番号２５４）に対応し、アミノ酸残基２１８〜２２９は、Ｓ２２８Ｐ置換（下線）を含む安定化ＩｇＧ４ヒンジ領域（配列番号１３）に対応し、アミノ酸残基２３０〜４４５はＩｇＧ４  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４）に対応するが、Ｃ末端リシン残基を含まない。
【０４３３】
全長ＩｇＧ４ヒト化抗体軽鎖を、以下のようにして構成した：ヒト化ＶＬドメインのＣ末端を、ヒト軽鎖κ領域（配列番号８）のＮ末端に融合させた。同一の軽鎖が、ＩｇＧ１（ＡＡ）及びＩｇＧ４（Ｐ）重鎖と対合する。
【０４３４】
κ定常領域を有する例示的なヒト化ＰＤ‐１抗体（ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２））の軽鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２６４）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV 
QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV 
THQGLSSPVT KSFNRGEC
である。
【０４３５】
配列番号２６４において、アミノ酸残基１〜１１１は、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ２のＶＬドメイン（配列番号１５１）に対応し、アミノ酸残基１１２〜２１８は、軽鎖κ定常領域（配列番号８）に対応する。
【０４３６】
代替的な定常領域、例えば操作済みＦｃ領域を有する抗ＰＤ‐１抗体は、異なる定常領域を導入することによって、及び／又は１つ若しくは複数のアミノ酸置換、追加若しくは欠失を導入することによって、容易に生成される。例えば二重特異性抗体が望ましい場合、ノブ担持及びホール担持ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを用いて、ヘテロ二量体化を促進する。マウス可変ドメイン及びヒト定常領域を備えるキメラ抗ＰＤ‐１抗体は、上述のようにして生成される。
【０４３７】
ヒト化抗体（ＩｇＧ１（ＡＡ）及び／又はＩｇＧ４（Ｐ））を、上述のように、結合及びブロック活性に関して試験した。上記ヒト化抗体の、ヒトＰＤ‐１（ｓｈＰＤ‐１  Ｈｉｓ及びｓｈＰＤ‐１  ｈＦｃ）並びにカニクイザルＰＤ‐１（ｓｈＰＤ‐Ｌ１  ｈＦｃ）に対する結合は、対応するマウス抗体の結合に相当するものであった。更に上記ヒト化抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ヒトＰＤ‐１に対するヒトＰＤ‐Ｌ１の結合をブロックする能力を保持していた。
【０４３８】
マウス抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５、ヒト化抗体  ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９（１．１）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５、並びに基準抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂの結合動態を、Ｂｉａｃｏｒｅ分析を用いて調査した。抗ＰＤ‐１抗体を、不動化されたタンパク質Ａ上で捕捉し、Ｈｉｓタグ付与可溶性ヒトＰＤ‐１（ｓｈＰＤ‐１‐Ｈｉｓ）、又はＦｃ部分を除去するために切断された可溶性ヒト‐カニクイザルＰＤ‐１  Ｆｃ融合（ｓｃｙｎｏ  ＰＤ‐１  ｈＦｃ）を用いてインキュベートして、結合の動態をＢｉａｃｏｒｅ分析によって決定した。更なる研究において、抗ＰＤ‐１抗体ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ１（ＡＡ）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ
９（１．１）ＩｇＧ１（ＡＡ）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９（１．１）ＩｇＧ４（Ｐ）、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ１（ＡＡ）、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４（Ｐ）、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂ  ＩｇＧ１（ＡＡ）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂ  ＩｇＧ４（Ｐ）を、不動化されたＦ（ａｂ）2ヤギ抗ヒトＦｃ上で捕捉し、結合動態を、上述のようにＢｉａ
ｃｏｒｅ分析によって決定した。これらの研究からの、算出されたｋａ、ｋｄ及びＫＤを、表７に提示する。
【０４３９】
【表９】
2019055948.tif 000013
【０４４０】
これらの結果は、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７及びヒト化ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）が、基準抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂに対してより良好な結合動態を示すことを実証している。ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２及びｈＰＤ‐１  ｍＡｂ
２は、基準抗ＰＤ‐１抗体の約２倍以内の結合動態を示し、一方ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９（１．１）、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５及びｈＰＤ‐１  ｍＡｂ
１５は、基準抗ＰＤ‐１抗体の約２〜６倍以内の結合動態を示す。
【０４４１】
抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７の組織特異性を調査した。正常な組織を、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７又はアイソタイプ対照（０．３１３μｇ／ｍＬ）と接触させ、染色の程度を可視化した。Ｂｌｏｘａｌｌを用いて内因性酵素をブロックし、結腸組織内の非特異的ムチン染色を低減した。図１０Ａ、パネルｉ〜ｘｉｉに示すように、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７及びアイソタイプ対照はいずれも、正常な結腸、肝臓、肺、膵臓、腎臓及び心臓組
織の細胞を標識できなかった。更にＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７及びアイソタイプ対照は、正常な皮膚を染色できなかった（図１０Ｂ、パネルｉ〜ｉｉ）。対照的に、ＰＤ‐１  ｍＡｂ
７は、ＰＤ‐１を発現する、正常な扁桃組織に存在するリンパ球、及びＰＤＣＤ１トランスフェクトＮＳＯ細胞を強力に標識し（図１０Ｂ、パネルｉｉｉ及びｖ）、その一方でアイソタイプ対照はこれらのいずれも標識できない（図１０Ｂ、パネルｉｖ及びｖｉ）ことが分かった。従って図１０Ａ〜１０Ｂに提示される結果は、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７が、ＰＤ‐１を発現するリンパ球及び細胞に特異的に結合できたことを示す。
【０４４２】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２  ＩｇＧ１（ＡＡ）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．１）ＩｇＧ１  （ＡＡ）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ１、（ＡＡ）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９（１．１）ＩｇＧ１（ＡＡ）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９（１．１）ＩｇＧ４（Ｐ）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５  ＩｇＧ１（ＡＡ）、並びに基準抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂの結合飽和プロファイルを検査した。簡潔に述べると、抗ＰＤ‐１抗体、ＰＤ‐１
ｍＡｂ  １〜１５、又は基準抗ＰＤ‐１抗体（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂ）をそれぞれ、ブロッキングバッファ（ＦＡＣＳ＋１０％ヒト血清アルブミン）中の、ヒトＰＤ‐１を発現するＮＳＯ細胞（〜２５０，０００細胞／ウェル）と混合した。これらの研究に関して、抗ＰＤ‐１抗体は、５０、１２．５、３．１３、２．０×１０-1、４．９×１０-2、１．２×１０-2、３．０×１０-3、１．９×１０-4、７．６
×１０-4、４．７５×１０-5又は１．１９×１０-5μｇ／試験（４倍連続希釈）で用
いた。ＮＳＯ細胞の表面に結合する抗体の量を、ヤギ抗ヒトＡＰＣ二次抗体を用いて、ＦＡＣＳ分析によって決定した。代表的な飽和曲線を図１１に示す。ＥＣ５０及びＥＣ９０値を決定し、４回の別個の実験からの試料平均（ＳＭ）及び標準偏差（ＳＤσ）を表８に提供する。
【０４４３】
【表１０】
2019055948.tif 000014
【０４４４】
この結合飽和に関する研究は、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５のヒト化バージョンが、細胞表面  ＰＤ‐１への結合に関して好ましいプロファイルを有することを実証している。特に、ヒト化ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（ＩｇＧ１（ＡＡ）又はＩｇＧ４（Ｐ）Ｆｃ領域を有するｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．１）及びｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２））は、検査した全ての抗体のうち最も低いＥＣ９０を有する。
【０４４５】
ヒト化抗ＰＤ‐１抗体ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２  ＩｇＧ１（ＡＡ）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．１）ＩｇＧ１（ＡＡ）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ１（ＡＡ）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９（１．１）ＩｇＧ１（ＡＡ）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９（１．１）ＩｇＧ４（Ｐ）及びｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５  ＩｇＧ１（ＡＡ）を更に特性決定するために、ＮＳＯ細胞の表面上に発現したＰＤ‐１に対するヒトＰＤ‐Ｌ１（ｓｈＰＤ‐Ｌ１）及びヒトＰＤ‐Ｌ２（ｓｈＰＤ‐Ｌ２）の結合をブロックする能力を検査した。これらのアッセイは、基本的に上述のように実施された。ＮＳＯ細胞の表面上に発現したＰＤ‐１に対するｓＰＤ‐Ｌ１及びｓＰＤ‐Ｌ２の結合の阻害に関する代表的な曲線を、それぞれ図１２Ａ及び１２Ｂに示す。ＩＣ５０及びＩＣ９０値を決定し、３回の別個の実験からの試料平均（ＳＭ）及び標準偏差（ＳＤσ）を表９に提供する。
【０４４６】
【表１１】
2019055948.tif 000015
【０４４７】
このリガンド結合阻害に関する研究は、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５のヒト化バージョンが、細胞表面上のＰＤ‐１に対するｓＰＤ‐Ｌ１及びｓＰＤ‐Ｌ２の結合を阻害できることを実証している。特にヒト化ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．１）及びｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２））は、検査した全ての抗体のうち最低のＩＣ９０値を有する。
【０４４８】
実施例３  ヒト化抗ヒトＰＤ‐１抗体による、ＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１のチェックポイントのブロック
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２  ＩｇＧ１（ＡＡ）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．１）ＩｇＧ１（ＡＡ）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ１（ＡＡ）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９（１．１）ＩｇＧ１（ＡＡ）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９（１．１）ＩｇＧ４（Ｐ）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５  ＩｇＧ１（ＡＡ）、並びに基準抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂの、ＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１軸に拮抗する（即ちＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１相互作用をブロックして、Ｔ細胞応答の下方制御を防止する）能力を、Ｊｕｒｋａｔ‐ｌｕｃ‐ＮＦＡＴ／ＣＨＯ‐ＰＤ‐Ｌ１ルシフェラーゼリポータアッセイにおいて検査した。簡潔に述べると、ＰＤ‐Ｌ１（ＣＨＯ／ＰＤ‐Ｌ１）を発現するＣＨＯ細胞を、１００μＬの培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋１００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ＋１００μｇ／ｍＬのＧ４１８）中に４０，０００／ウェルで播種し、一晩インキュベートした。翌日、この培地を除去し、４０μＬのアッセイバッファ（ＲＰＭＩ＋２％ＦＢＳ）中の５０，０００細胞／ウェルのＭＮＦＡＴ‐ｌｕｃ２／ＰＤ‐１  Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）、並びに抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １〜１５、又は基準抗ＰＤ‐１抗体（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂ）（０〜２５μｇ／ｍＬ；アッセイバッファ中で８回の２．５倍連続希釈）を各ウェルに追加し、３７℃で６時間インキュベートした後、周囲温度で５〜１０分インキュベートした。続いて８０μＬのＢｉｏＧｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに追加し、プレートを周囲温度で更に５〜１０分インキュベートし、Ｖｉｃｔｏｒ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒでルミネッセンスを測定した。代表的な飽和曲線を図１３に示す。ＥＣ５０及びＥＣ９０値を決定し、４回の別個の実験からの試料平均（ＳＭ）及び標準偏差（ＳＤσ）を表１０に提供する。
【０４４９】
【表１２】
2019055948.tif 000016
【０４５０】
このレポータシグナリングに関する研究は、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ
７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５のヒト化バージョンがＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１軸をブロックでき、Ｔ細胞応答の下方制御を防止することになることを実証している。特に、ヒト化ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（ＩｇＧ１（ＡＡ）又はＩｇＧ４（Ｐ）Ｆｃ領域を有するｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．１）及びｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）は、最も低いＥＣ５０／ＥＣ９０値を有する。
【０４５１】
実施例４  抗ヒトＰＤ‐１抗体の機能活性
黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢ型（ＳＥＢ）は、ＳＥＢ応答ドナーにおいて、高い
割合のＴ細胞（５〜３０％）を活性化できる、微生物超抗原である。ＳＥＢは、ペプチド結合溝（ｇｒｏｖｅ）の外側でＭＨＣ  ＩＩに結合するため、ＭＨＣ  ＩＩ依存性であるが、制限されておらず、またＴＣＲ仲介性でもない。Ｔ細胞のＳＥＢ刺激により、オリゴクローナルＴ細胞増殖及びサイトカイン産生がもたらされる（ただしドナーによる変動は観察され得、またドナーによっては応答しない）。ＳＥＢ刺激の４８時間以内に、ＰＭＢＣはＰＤ‐１及びＬＡＧ‐３を上方制御し、ＳＥＢ刺激を用いた９６ウェルプレート内での２次培養の５日目には更なる増強が観察される。ＰＢＭＣのＳＥＢ刺激に続く免疫チェックポイントタンパク質ＰＤ‐１及びＬＡＧ‐３の上方制御は、再刺激時のサイトカイン放出を制限する。抗ＰＤ‐１抗体単独での、及びこれを抗ＬＡＧ‐３抗体と組み合わせた場合の、チェックポイント阻害によってサイトカイン放出を増強する能力を検査した。
【０４５２】
簡潔に述べると、ＰＢＭＣを、製造元の指示に従ってＦｉｃｏｌｌ‐Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）密度勾配遠心法を用いて、健康なドナーからインフォームドコンセントのもとで得た全血から精製し、続いて製造元の指示に従ってＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）非接触ヒトＴ細胞キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、Ｔ細胞を精製した。精製したＰＢＭＣを、Ｔ‐２５バルクフラスコ中のＲＰＭＩ培地＋１０％熱不活性化ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン中で、単独で、又は０．１ｎｇ／ｍＬのＳＥＢ（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に（一次刺激）、２〜３日間培養した。ＳＥＢ刺激の第１ラウンドの終了時、ＰＢＳを用いてＰＢＭＣを２回洗浄して、培地単独、対照若しくは抗ＰＤ‐１抗体を含む培地、０．１ｎｇ／ｍＬのＳＥＢを含み抗体を含まない培地（二次刺激）、又はＳＥＢ及び対照ＩｇＧ又は抗ＰＤ‐１抗体±抗ＬＡＧ‐３  ｍＡｂを含む培地中に、１〜５×１０5細胞／ウェルの濃度で９
６ウェル組織培養プレートに播種し、更に２〜３日間培養した。二次刺激の終了時、上清を採取し、製造元の指示に従って、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ‐１０及びＩＬ‐４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）用のヒトＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡキットを用いてサイトカイン分泌を測定した。
【０４５３】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５単独の、又はこれらを独自の抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １と組み合わせた場合の、チェックポイント阻害によってサイトカイン放出を増強する能力を検査した。これらの研究はまた、以下の基準抗ＰＤ‐１抗体：ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ；ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂ；及びＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａのうちの１つ又は複数を、単独で又は組み合わせて含んでいた。図１４は、抗体なし：アイソタイプ対照抗体；ＰＤ‐１  ｍＡｂ
７及び／若しくはＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ７；ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９及び／若しくＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １；ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５及び／若しくはＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １；ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２及び／若しくはＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １；又は基準抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂ及び／若しくはＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａで処置した、代表的な応答ドナー（Ｄ：３８９４１）からの、ＳＥＢ刺激（０．１ｎｇ／ｍＬ）ＰＢＭＣからのＩＦＮγ分泌プロファイルを示す（抗体は１０μｇ／ｍＬで使用した）。
【０４５４】
更なる研究では、（ヒトＩｇＧ１（ＡＡ）又はヒトＩｇＧ４（Ｐ）Ｆｃ領域を含む）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５のヒト化バージョン、並びに基準抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂの、チェックポイント阻害によってサイトカイン放出を増強する能力を検査した。これらの研究に関して、抗体は、０．６２５、２．５及び１０μｇ／ｍＬで使用した。図１５Ａ〜１５Ｂは、抗体なし、又は以下の抗体：アイソタイプ対照；ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２  ＩｇＧ１（ＡＡ）；ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ１（ＡＡ）；ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）；  ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９（１．１）ＩｇＧ１（ＡＡ）；ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９（１．１）ＩｇＧ４（Ｐ）；ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５  ＩｇＧ１（ＡＡ）；又は基準抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ  
ＩｇＧ１（ＡＡ）、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４（Ｐ）、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂ  ＩｇＧ１（ＡＡ）、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂ  ＩｇＧ４（Ｐ）のうちの１つで処置した代表的な応答ドナー（Ｄ：５７７０９）からの、ＳＥＢ刺激（０．２ｎｇ／ｍＬ）ＰＢＭＣからのＩＦＮγ（図１５Ａ）及びＴＮＦα（図１５Ｂ）分泌プロファイルを示す。ＳＥＢ＋Ａｂで処置した試料中のＩＦＮγの合計ｐｇ／ｍｇを、０．６２５、２．５及び１０μｇ／ｍＬの抗ＰＤ‐１で処置した試料に関して決定し、３体の異なる応答ドナー（注記されている箇所を除く）からの試料平均（ＳＭ）及び標準偏差（ＳＤσ）を表１１に提供する。（ヒトＩｇＧ１（ＡＡ）又はヒトＩｇＧ４（Ｐ）Ｆｃ領域を含む）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５のヒト化バージョンで処置した試料中で分泌されたＩＦＮγの、基準抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂ（即ちヒト化抗ＰＤ‐１／ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ及びヒト化抗ＰＤ‐１／ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂ）に対する比率を、それぞれ表１２及び表１３に提示する。
【０４５５】
【表１３】
2019055948.tif 000017
【０４５６】
【表１４】
2019055948.tif 000018
【０４５７】
【表１５】
2019055948.tif 000019
【０４５８】
これらの研究の結果は、ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５が、再刺激時の、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣからのＩＦＮγ（図１４及び１５Ａ並びに表１１〜１３）、並びにＴＮＦα（図１５Ｂ）産生を劇的に増強したことを実証する。更に、抗ＰＤ‐１抗体と抗ＬＡＧ‐３抗体とを組み合わせることにより、再刺激時の、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣからのサイトカイン放出（図１４）が更に増強された。特に、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１
ｍＡｂ  ９又はＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５と、独自の抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １との組み合わせが、最大の増強をもたらした。
【０４５９】
実施例５  ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子の結合に関する研究
３、４及び５鎖並びに二重特異性抗体を含むＦｃ領域含有ダイアボディを含む、多数のＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子を生成した。４鎖を有しかつＥ／Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメインを備える４つのダイアボティを生成し、呼称「ＤＡＲＴ  Ａ」、「ＤＡＲＴ  Ｂ」、「ＤＡＲＴ  Ｃ」及び「ＤＡＲＴ  Ｉ」を与えた。４鎖を有しかつＣＨ１／ＣＬドメインを備える４つのダイアボティを生成し、呼称「ＤＡＲＴ  Ｄ」、「ＤＡＲＴ
Ｅ」、「ＤＡＲＴ  Ｊ」及び「ＤＡＲＴ  １」を与えた。５鎖を有しかつＥ／Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメイン及びＣＨ１／ＣＬドメインを備える２つのダイアボティを生成し、呼称「ＤＡＲＴ  Ｆ」及び「ＤＡＲＴ  Ｇ」を与えた。３鎖を有しかつＥ／Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメインを備える１つのダイアボティを生成し、呼称「ＤＡＲＴ  Ｈ」を与えた。４鎖を有する１つの二重特異性抗体を生成し、呼称「ＢＳＡＢ  Ａ」を与えた。これらのＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子の構造及びアミノ酸配列は既に提供されており、以下の表１４にまとめられている。
【０４６０】
【表１６】
2019055948.tif 000020
【０４６１】
代替的なＰＤ‐１及び／又はＬＡＧ‐３エピトープ結合部位を含む更なるＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子は、異なるＶＨ及びＶＬドメインを組み込むことによって容易に生成できる。同様に、ＬＡＧ‐３以外の抗原に結合する分子は、所望の特異性を有するＶＨ及びＶＬドメインを組み込むことによって生成できる。
【０４６２】
ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ構成物：ＤＡＲＴ  Ａ、ＤＡＲＴ  Ｂ、ＤＡＲＴ  Ｄ、ＤＡＲＴ  Ｅ、ＤＡＲＴ  Ｆ、ＤＡＲＴ  Ｇ、ＤＡＲＴ  Ｈ、ＤＡＲＴ  Ｉ及びＤＡＲＴ  １；抗ＰＤ‐１抗体：ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）  ＩｇＧ１（ＡＡ）、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ１（ＡＡ）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４（Ｐ）；並びに抗ＬＡＧ‐３抗体：ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １（１．４）ＩｇＧ４（Ｐ）、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４（Ｐ）、ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １（１．４）ＩｇＧ１（ＡＡ）及びＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ１（ＡＡ）の結合飽和プロファイルを、基本的に上述のようにして検査した。ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ構成物は、ＰＤ‐１及びＬＡＧ‐３結合の両方に関して試験したが、抗ＰＤ‐１及び抗ＬＡＧ‐３抗体は、それぞれの抗原への結合に関してのみ試験した。これらの研究に関して、ＰＤ‐１又はＬＡＧ‐３を発現するＮＳＯ細胞を使用した。ダイアボディ及び抗体は、１７０．０〜０．０１３μＭ又は８５．０〜０．００２１μＭ（４倍連続希釈）で使用した。ＥＣ５０及びＥＣ９０値を決定し、これらを表１５〜１６に提示する。試料平均（ＳＭ）及び標準偏差（ＳＤσ）を提供する。ここでは２回以上の別個の実験を実施した。
【０４６３】
【表１７】
2019055948.tif 000021
【０４６４】
【表１８】
2019055948.tif 000022
【０４６５】
この結合飽和に関する研究は、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ構造物が、ＰＤ‐１に対する結合を保持し、また親抗ＰＤ‐１抗体の結合プロファイルと同様の結合プロファイルを有することを実証している。同様に、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ構造物はＬＡＧ‐３に対する結合を保持し、またＤＡＲＴ  １を除いて、親抗ＬＡＧ‐３抗体の結合プロファイルと同様の結合プロファイルを有する。
【０４６６】
実施例６  ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子の阻害に関する研究
ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子：ＤＡＲＴ  Ａ、ＤＡＲＴ  Ｂ、ＤＡＲＴ  Ｄ、ＤＡＲＴ  Ｅ、ＤＡＲＴ  Ｆ、ＤＡＲＴ  Ｇ、ＤＡＲＴ  Ｈ、ＤＡＲＴ  Ｉ、ＤＡＲＴ  １及びＢＳＡＢ  Ａ；並びに抗ＰＤ‐１抗体：ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ１（ＡＡ）、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ
ＩｇＧ１（ＡＡ）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４（Ｐ）の、ＮＳＯ細胞の表面上に発現したＰＤ‐１に対するヒトＰＤ‐Ｌ１（ｓｈＰＤ‐Ｌ１）及びヒトＰＤ‐Ｌ２（ｓｈＰＤ‐Ｌ２）の結合をブロックする能力を、基本的に上述のようにして検査した。ダイアボディ及び抗体は、３３．７５〜０．００２μＭ又は１０７．５〜０．０００１μＭ（４倍連続希釈）で使用した。
【０４６７】
ＩＣ５０及びＩＣ９０値を決定し、これらを表１７に提示する。試料平均（ＳＭ）及び標準偏差（ＳＤσ）を提供する。ここでは２回以上の別個の実験を実施した。
【０４６８】
【表１９】
2019055948.tif 000023
【０４６９】
このリガンド結合阻害に関する研究は、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ構成物が、細胞表面上のＰＤ‐１に対するｓＰＤ‐Ｌ１及びｓＰＤ‐Ｌ２の結合を阻害する能力を保持することを実証している。
【０４７０】
更に、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子：ＤＡＲＴ  Ａ、ＤＡＲＴ  Ｂ、ＤＡＲＴ
Ｄ、ＤＡＲＴ  Ｅ、ＤＡＲＴ  Ｆ、ＤＡＲＴ  Ｇ、ＤＡＲＴ  Ｈ、ＤＡＲＴ  Ｉ、ＤＡＲＴ  １及びＢＳＡＢ  Ａ；並びに抗ＬＡＧ‐３抗体：ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １（１．４）ＩｇＧ４（Ｐ）、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４（Ｐ）、ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ
１（１．４）ＩｇＧ１（ＡＡ）及びＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ１（ＡＡ）の、Ｄａｕｄｉ細胞の表面上の天然ＭＨＣクラスＩＩに対するヒトＬＡＧ‐３の結合をブロックする能力を検査した。簡潔に述べると、各ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子及び対照抗ＬＡＧ‐３抗体を、ビオチン化可溶性ヒトＬＡＧ‐３‐Ｆｃ融合タンパク質（ｓｈＬＡＧ‐３）（０．５μｇ／ｍｌ）と混合し、ＭＨＣ  ＩＩ陽性Ｄａｕｄｉ細胞（２．５×１０6細胞）を用いて別個にインキュベートした。Ｄａｕｄｉ細胞の表面に結合したＬＡＧ
‐３の量を、ＦＡＣＳ分析により、ＰＥコンジュゲートストレプトアビジン二次抗体を用いて決定した。ダイアボディ及び抗体は、２７．５〜０．０２６μＭ（２倍連続希釈）又は１０７．５〜０．０００１μＭ（４倍連続希釈）又は３５〜０．００２μＭ（４倍連続希釈）で使用した。
【０４７１】
ＩＣ５０及びＩＣ９０値を決定し、これらを表１８に提示する。試料平均（ＳＭ）及び標準偏差（ＳＤσ）を提供する。ここでは２回以上の別個の実験を実施した。
【０４７２】
【表２０】
2019055948.tif 000024
【０４７３】
このリガンド結合阻害に関する研究は、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ構成物が、細胞表面上のＭＨＣクラスＩＩに対するｓｈＬＡＧ‐３‐Ｆｃ融合タンパク質の結合を阻害する能力を保持することを実証している。ＤＡＲＴ  １を除いて、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子は、親抗ＬＡＧ‐３抗体と同様の阻害プロファイルを有する。
【０４７４】
実施例７  ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子によるＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１チェックポイントのブロック
ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子：ＤＡＲＴ  Ａ、ＤＡＲＴ  Ｂ、ＤＡＲＴ  Ｄ、ＤＡＲＴ  Ｅ、ＤＡＲＴ  Ｆ、ＤＡＲＴ  Ｇ、ＤＡＲＴ  Ｈ、ＤＡＲＴ  Ｉ、ＤＡＲＴ  １及びＢＳＡＢ  Ａ；並びに抗ＰＤ‐１抗体：ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ１（ＡＡ）、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ
ＩｇＧ１（ＡＡ）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４（Ｐ）の、ＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１軸に拮抗する（即ちＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１相互作用をブロックして、Ｔ細胞応答の下方制御を防止する）能力を、基本的に上述のように、（ＣＨＯ／ＰＤ‐Ｌ１細胞及びＭＮＦＡＴ‐ｌｕｃ２／ＰＤ‐１  Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いる）Ｊｕｒｋａｔ‐ｌｕｃ２‐ＮＦＡＴ／ＣＨＯ‐ＰＤ‐Ｌ１ルシフェラーゼリポータアッセイにおいて検査した。ダイアボディ及び抗体は、１００〜０．００６５μＭ（４倍連続希釈）又は１００〜０．００１３μＭ（５倍連続希釈）で使用した。
【０４７５】
ＩＣ５０及びＩＣ９０値を決定し、これらを表１９に提示する。試料平均（ＳＭ）及び
標準偏差（ＳＤσ）を提供する。ここでは２回以上の別個の実験を実施した。
【０４７６】
【表２１】
2019055948.tif 000025
【０４７７】
このレポータシグナリングに関する研究は、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ構成物の大半が、細胞表面上のＰＤ‐１に対するｓＰＤ‐Ｌ１の結合を阻害する能力を保持することを実証している。４価ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ構成物、ＤＡＲＴ  Ａ、ＤＡＲＴ  Ｂ、ＤＡＲＴ  Ｄ、ＤＡＲＴ‐Ｅ、ＤＡＲＴ  Ｆ、ＤＡＲＴ  Ｇ及びＤＡＲＴ  Ｉは、このアッセイにおいて最も強い阻害剤であった。ＰＤ‐Ｌ２レポータアッセイにおいて検査したこれらの二重特異性構成物のうちのいくつかに関して、同様の結果が得られた。
【０４７８】
実施例８  ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子の機能活性
ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子の、チェックポイント阻害によってサイトカイン放出を増強する能力を、注記する部分以外は上述のようにして、再刺激時のＳＥＢ刺激ＰＢＭＣにおいて検査した。
【０４７９】
最初の研究では、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子：ＤＡＲＴ  Ａ、ＤＡＲＴ  Ｄ、ＤＡＲＴ  Ｅ、ＤＡＲＴ  Ｆ、ＤＡＲＴ  Ｇ、ＤＡＲＴ  Ｈ；並びに抗ＰＤ‐１及び抗ＬＡＧ抗体：ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４（Ｐ）及びＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４（Ｐ）（単独又は組み合わせ）の、チェックポイント阻害によってサイトカイン放出を増強する能力を検査した。これらのアッセイでは、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子及び抗体を３．１２５、１２．５又は５０ｎＭの合計濃度で使用し、ＰＢＭＣを、０．２ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで刺激した（以前の研究では０．１ｎｇ／ｍＬを用いていた）。これらの研究に関して、抗体の組み合わせを使用する場合、各抗体は合計濃度の１／２（即ち１．５６３、６．２５又は２５ｎＭ）で提供される。図１６Ａ及び１６Ｂはそれぞれ、
２体の代表的な応答ドナー、Ｄ：３５６４４及びＤ：５９６９７からの、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣからのＩＦＮγ分泌プロファイルを示す。
【０４８０】
上述のように、全てのドナーが０．１又は０．２ｎｇ／ｍＬのＳＥＢに応答するわけではない。より多数のドナーからのＰＢＭＣのＳＥＢ刺激を増強するために、追加の研究では、ＳＥＢを、８５ｎｇ／ｍＬという高濃度、又は０．５ｎｇ／ｍＬという中程度の濃度で使用した。これらの濃度において、ＳＥＢ刺激は、より多くのドナーに亘ってよりロバストであるものの、ドナー間の変動は依然として観察され得る。
【０４８１】
このような１つの研究において、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子：ＤＡＲＴ  Ａ、ＤＡＲＴ  Ｂ；抗ＰＤ‐１抗体：ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）；抗ＬＡＧ‐３抗体：ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １（１．４）ＩｇＧ４（Ｐ）；並びにＰＤ‐１
ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４（Ｐ）及びＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４（Ｐ）の組み合わせの、チェックポイント阻害によってサイトカイン放出を増強する能力を検査した。これらのアッセイでは、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子及び抗体を０．０１９、０．０７８、０．３１２５、１．２５、５又は２０ｎＭの合計濃度で使用し、ＰＢＭＣを、８５ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで刺激した。この研究に関して、抗体の組み合わせを使用する場合、各抗体は、上記濃度で提供され、従って合計抗体濃度は、各抗体に関して使用された濃度の２倍（即ち０．０３８、０．１５６、０．６２５、２．５、１０又は４０ｎＭ）となる。図１７Ａ及び１７Ｂはそれぞれ、２体の代表的な応答ドナー、Ｄ：５５５１５及びＤ：５４０２４からの、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣからのＩＦＮγ分泌プロファイルを示す。
【０４８２】
別の研究では、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子：ＤＡＲＴ  Ａ、ＤＡＲＴ  Ｂ、ＤＡＲＴ  Ｃ；抗ＰＤ‐１抗体：ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）；抗ＬＡＧ‐３抗体：ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １（１．４）ＩｇＧ４（Ｐ）；並びにＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４（Ｐ）及びＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４（Ｐ）の組み合わせの、チェックポイント阻害によってサイトカイン放出を増強する能力を検査した。これらのアッセイでは、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子及び抗体を０．０４８、０．１９５、０．７８、３．１２５、１２．５又は５０ｎＭの合計濃度で使用し、ＰＢＭＣを、０．５ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで刺激した。これらの研究に関して、抗体の組み合わせを使用する場合、各抗体は合計濃度の１／２（即ち０．０２４、０．０９８、０．３９、１．５６３、６．２５又は２５ｎＭ）で提供される。図１８Ａ及び１８Ｂはそれぞれ、２体の代表的な応答ドナー、Ｄ：２０９９０及びＤ：５４９４７からの、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣからのＩＦＮγ分泌プロファイルを示す。
【０４８３】
更なる研究では、サイトカインＩＬ‐２の放出を検査した。具体的には、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子：ＤＡＲＴ  Ｄ、ＤＡＲＴ  Ｈ；抗ＰＤ‐１抗体：ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４（Ｐ）、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）；抗ＬＡＧ‐３抗体：ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４（Ｐ）及びＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １（１．４）ＩｇＧ４（Ｐ）；並びにＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４（Ｐ）及びＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４（Ｐ）の組み合わせ、並びにｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）及びＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １（１．４）ＩｇＧ４（Ｐ）の組み合わせの、チェックポイント阻害によってＩＬ‐２放出を増強する能力を検査した。これらのアッセイでは、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子及び抗体を３．１２５、１２．５又は５０ｎＭの合計濃度で使用し、ＰＢＭＣを、８５ｎｇ／ｍＬという高濃度のＳＥＢで刺激した。これらの研究に関して、抗体の組み合わせを使用する場合、各抗体は合計濃度の１／２（即ち１．５６３、６．２５又は２５ｎＭ）で提供される。図１９は、代表的な応答ドナー（Ｄ：５４０２４）からの、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣからのＩＬ‐２分泌プロファイルを示す。
【０４８４】
追加の研究では、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子：ＤＡＲＴ  Ｂ及びＤＡＲＴ  Ｉ；抗ＰＤ‐１抗体：ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４（Ｐ）及びｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）；抗ＬＡＧ‐３抗体：ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４（Ｐ）、ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １（１．４）ＩｇＧ４（Ｐ）及びｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６（１．１）ＩｇＧ４（Ｐ）；並びにＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４（Ｐ）及びＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４（Ｐ）の組み合わせ、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）及びｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １（１．４）ＩｇＧ４（Ｐ）の組み合わせ、並びにｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）及びｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６（１．１）ＩｇＧ４（Ｐ）の組み合わせの、チェックポイント阻害によってサイトカイン放出を増強する能力を検査した。これらのアッセイでは、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子及び抗体を０．００６１、０．０２４、０．０９、０．３９、１．５６、６．２５又は２５ｎＭの濃度で使用し、ＰＢＭＣを、０．５ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで刺激した。これらの研究に関して、抗体の組み合わせを使用する場合、各抗体は、上記濃度で提供され、従って合計抗体濃度は、各抗体に関して使用された濃度の２倍（即ち０．０１２２、０．０４８、０．１８、０．７８、３．１２、１２．５又は５０ｎＭ）となる。図２０は、代表的な応答ドナー（Ｄ：５６０４１）からの、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣからのＩＦＮγ分泌プロファイルを示す。
【０４８５】
ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子ＤＡＲＴ  Ｉ；抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ
Ａ  ＩｇＧ４及び抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４（Ｐ）の組み合わせ；及び陰性対照抗体の、抗原特異性Ｔ細胞応答を増強する能力を、破傷風トキソイドリコールアッセイを用いて検査した。特に、共培養アッセイ系内でリコール抗原として破傷風トキソイドを用いて、サイトカインの抗原特異的に増強された分泌の応答を測定した。簡潔に述べると、ＣＤ４メモリＴ細胞（０．５〜１．０×１０5細胞／ウェル）を、ヒ
ト末梢血から、陰性選択単離キット（（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（カリフォルニア州サンディエゴ）、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド））を用いて単離し、５μｇ／ｍＬのリコール抗原破傷風トキソイド（ＴＴｄ）及びＤＡＲＴ
Ｉ、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４＋ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４（Ｐ）又はアイソタイプ対照の希釈液（２５ｎＭから開始）の存在下又は不在下で、同一のドナーからの照射済み単球（０．０１〜０．０５×１０5細胞／ウェル、３５００ｒａｄ）と共に
５〜７日間培養した。複数の並列のプレートにおいて、５〜７日目に、トリチウム化チミジンの組み込みによって増殖を測定し、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス））を用いてＩＬ‐２及びＩＦＮγを測定した。図２１Ａ〜Ｄは、２体の代表的なドナー（Ｄ５０７０２及びＤ５４２６７）からの７日目のＩＦＮγ（図２１Ａ、２１Ｃ）及びＩＬ‐２（図２１Ｂ、２１Ｄ）分泌プロファイルを示す。
【０４８６】
これらの研究の結果は、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子が、再刺激時のＳＥＢ刺激ＰＢＭＣからのＩＦＮγ（図１６Ａ〜１６Ｂ、１７Ａ〜１７Ｂ、１８Ａ〜１８Ｂ、２０）、及びＩＬ‐２（図１９）の産生を劇的に増強したことを実証している。ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子は、破傷風トキソイドで刺激されたＣＤ４メモリＴ細胞からのＩＦＮγ産生（図２１Ａ及び２１Ｃ）を劇的に増強した。特に４価ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子抗ＰＤ‐１抗体と抗ＬＡＧ‐３抗体との組み合わせより高い増強をもたらした。
【０４８７】
実施例９  ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子の薬物動態
代表的なＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子ＤＡＲＴ  Ｉ、及び代表的な抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａの薬物動態を、カニクイザルにおいて検査した。簡潔に述べると、２体のカニクイザル（オス１体及びメス１体）に、単回用量のＤＡＲＴ  Ｉ（５ｍｇ／ｋｇ）又はＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ（１０ｍｇ／ｋｇ）を注入し、上記分子の血清濃度を、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用いて経時的に監視した。簡潔に述べると、ｍａｘ
ｉｓｏｒｂ  ９６ウェルアッセイプレートを、可溶性ヒトＰＤ‐１（ｓｈＰＤ‐１）でコーティングし、ウシ胎児血清アルブミンでブロックし、洗浄して、較正標準、品質管理基準及び希釈血清サンプルを用いてインキュベートした。捕捉されたＤＡＲＴ  Ｉ及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａの量を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃビオチン二次抗体及びストレプトアビジンセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ‐ＨＲＰ）の順次添加によって評価した。ＨＲＰ活性を、ＴＭＢ基質を用いて検出した。全ての試料を、マイクロプレートリーダ（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２ｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（カリフォルニア州サニーベール））を用いて分析し、標準キャリブレータによって生成されたＯＤ信号を、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェア（バージョン５．４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、４パラメータ論理モデルで使用した。ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ又はＤＡＲＴ  Ｉの濃度を、標準曲線を記述する式を用いた試料のＯＤ信号データの内挿から決定した。このアッセイに関する定量下限（ＬＬＯＱ）は、９．７７５ｎｇ／ｍＬと推定された。
【０４８８】
図２２は、経時的な血清濃度を示し、複数の線は、ＤＡＲＴ  Ｉ（実線、三角形）又はＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ（破線、円）を注入したオス（黒色の記号）及びメス（白色の記号）のサル両方の平均を表す。これらのデータは、カニクイザルにおいて、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子の薬物動態が、抗ＰＤ‐１抗体の薬物動態に相当することを実証している。
【０４８９】
実施例１０  ＰＤ‐１抗体及びＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子の毒物学的研究
代表的な抗ＰＤ１抗体ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）、及び代表的なＰＤ‐１×ＬＡＧ３二重特異性分子ＤＡＲＴ  Ｉの安全性プロファイルを、カニクイザルにおける非ＧＬＰ（グッド・ラボラトリー・プラクティス（Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ））投薬研究で評価した。
【０４９０】
この研究では、複数回の静脈内注入によって投与した場合の、抗ＰＤ‐１抗体（ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ））の潜在的毒性及び毒物動態を評価した。更に、単回の静脈内注入によって投与した場合の、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３  ＤＡＲＴ分子（ＤＡＲＴ  Ｉ）の潜在的毒性及び毒物動態も評価した。この研究の設計を表２０に提示する。
【０４９１】
【表２２】
2019055948.tif 000026
【０４９２】
この研究では、以下のパラメータ及びエンドポイントを評価した：臨床的兆候、体重、食料消費、体温、臨床病理パラメータ（血液学、凝固及び臨床化学）、生物分析及び毒物動態パラメータ、抗薬物抗体分析、フローサイトメトリー、サイトカイン、剖検所見、臓器重量、並びに組織病理学的検査。
【０４９３】
全ての動物は、１８日目若しくは２２日目における予定された安楽死、又は２９日目の研究からの解放まで生存した。ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）に関して、臨床的兆候、食料消費、体重、体温、血液学、凝固若しくは臨床化学パラメータ、又は剖検所見に、試験物品関連の変化はなかった。１８日目及び２２日目において、脾臓重量の増大、赤色髄の用量依存性の軽度から中程度のリンパ組織球浸潤が、１又は１００ｍｇ／ｋｇのｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）を受けた動物において明らかであった。周囲のリンパ球に比べて、リンパ組織球細胞は、淡色の細胞質及び不規則な核を有していた。希少な有糸分裂像が明らかであった。上記浸潤は、脾臓重量の増大と微視的相関を有していた。
【０４９４】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）を与えられた動物に関する血清濃度‐時間プロファイルは、いくつかの例外を除いて、この種においてある抗体に関して予想されたプロファイルを示す。３回目の投薬後の曲線の傾斜は、１ｍｇ／ｋｇ用量群の２体の動物及び１００ｍｇ／ｋｇ用量群の２体の動物に関して、第１の投薬後よりも急峻に降下し、これは、後のサイクルにおける抗薬物抗体（ａｎｔｉ‐ｄｒｕｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＡＤＡ）の出現の可能性を示している。分析は、１ｍｇ／ｋｇ群の４体中２体の動物がＡＤＡを発現し、また１００ｍｇ／ｋｇ群の４体中１体の動物がＡＤＡを発現したことを示した。
【０４９５】
結論として、１週間に１回の３週間に亘る（１日目、８日目及び１５日目の）静脈内注入によるｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）の投与は、１及び１００ｍｇ／ｋｇのレベルでは、カニクイザルにおいて良好な耐容性を示した。脾臓の赤色髄の、用
量依存性の軽度から中程度のリンパ組織球細胞浸潤が、１及び１００ｍｇ／ｋｇのｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）において存在した。
【０４９６】
ＤＡＲＴ  Ｉに関して、臨床的兆候、食料消費、体重、体温、血液学又は凝固パラメータにおいて、試験物品関連の変化はなかった。臨床化学パラメータの、ＤＡＲＴ  Ｉ関連の変化としては、２日目の、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の無害かつ一時的な上昇が挙げられた。平均ＡＳＴ変化は、３．２×ビヒクル処置済み対照動物、及び７．８×研究前レベルであり、制御基準範囲２より高いレベルであった。平均ＬＤＨ変化は、２．５×ビヒクル処置済み対照動物、及び６．９×研究前レベルであった。これらのパラメータは両方とも、８日目にベースラインレベル付近に戻った。結論として、静脈内注入によるＤＡＲＴ‐Ｉの単回投与は、５ｍｇ／ｋｇのレベルでは、カニクイザルにおいて良好な耐容性を示した。
【０４９７】
実施例１１  抗ＰＤ‐１抗体を用いた単回用量ＰＫ研究
選択された毒物学的エンドポイントを用いた単回用量ＰＫ研究を、カニクイザルにおいて実施した。この研究では、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）を、他の２つの抗ＰＤ１  ＩｇＧ４  （Ｐ）κ  ｍＡｂ：ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４（Ｐ）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂ  ＩｇＧ４（Ｐ）と比較した。各抗体を２体のサル（オス１体、メス１体）に、１時間の静脈内注入によって、１０ｍｇ／ｋｇで投与し、動物を６５日間監視した。
【０４９８】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）又はＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４（Ｐ）の投与に関連する、試験物品関連の臨床的兆候、体重、食料消費、サイトカイン又は免疫表現型判定の変化はなかった。ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂ  ＩｇＧ４（Ｐ）の投与後にＩＬ‐５の上昇が観察されたことを除いて、データはＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂ  ＩｇＧ４（Ｐ）に関しても同様であった。
【０４９９】
Ｔ細胞の表面上のＰＤ‐１に結合する抗ＰＤ‐１抗体を、フローサイトメトリーを用いて決定した。このフローサイトメトリーでは、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４（Ｐ）又はＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂ  ＩｇＧ４（Ｐ）で処置したカニクイザルから回収した血液試料の、過剰量の競合因子（未標識ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ））の不在下（ＰＢＳ対照）及び存在下における、Ｔ細胞に結合した蛍光標識ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、全時間経過に亘って比較した。図２３Ａ〜２３Ｃに示すように、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ｂ  ＩｇＧ４（Ｐ）は、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａ  ＩｇＧ４（Ｐ）（ＰＤ‐１の結合は２１日以下に亘って≧８０％に維持される）（図２３Ｂ）と比較して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＰＤ‐１に対する結合の延長を実証した（ＰＤ‐１の結合は、２８日以上に亘って≧８０％に維持される）（それぞれ図２３Ａ及び２３Ｃ）。各抗ＰＤ‐１抗体に関して、Ｔ細胞‐ＰＤ‐１結合データは、その血清濃度と相関していた。
【０５００】
実施例１２  反復投薬の毒物学的研究
本発明の治療用分子の安全性、毒物動態及び薬力学的プロファイルを評価するために、例示的な分子（ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ））をカニクイザルに投与し、ＧＬＰ（グッド・ラボラトリー・プラクティス（Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒａｃｔｉｃｅ））投薬研究を実施した。この研究では、動物の４つの群（１群あたり１０体、オス５体及びメス５体）を、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）又は対照物品で、３つの用量レベルで週に１回処置した。動物を、４週間の薬物投薬中に、いずれの潜在的毒性に関して評価した後、更に１０週間の薬物を用いない期間中に監視した。この研究の実験の設計を表２１に提示する。動物は、研究１日目、８日目、１５
日目及び２２日目に、較正注入ポンプを用いた１時間の静脈内注入によって、１週間に１回の投薬を受けた。各群から１体のオス及び１体のメスを２５日目に犠死させ、残った動物は９５日目に犠死させた。Ｔリンパ球上のＰＤ‐１受容体の占有率を含む、循環する白血球亜集団に対するｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）投与の効果を評価した。更に、抗薬物抗体（ＡＤＡ）プロファイルを決定した。
【０５０１】
【表２３】
2019055948.tif 000027
【０５０２】
カニクイザルにおける０、１０、４０及び１５０ｍｇ／ｋｇのｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）の週１回の静脈内（ＩＶ）注入は、良好な耐容性を示し、全ての動物が、２５日目又は９５日目における予定された安楽死まで生存した。臨床的兆候、食料消費、体重、身体的・眼科的・神経学的検査、心電図、体温、呼吸数、血圧及び心拍数、凝固、臨床化学、並びに尿検査パラメータ、臓器重量又は剖検所見の、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）関連の変化はなかった。
【０５０３】
血液学的パラメータのｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）関連の変化としては、リンパ球力価の一時的低下があった。リンパ球力価は、１０ｍｇ／ｋｇにおいて、オス及びメスで研究前（１日目の投与前）又は２日目（注入後２３時間）と比べて緩やかに低下した、対照と比べて、１０及び４０ｍｇ／ｋｇのオス並びに４０及び１５０ｍｇ／ｋｇのメスに関して統計的に有意であった。リンパ球力価は、８日目の投与前には研究前のレベルに戻ったが、９日目（注入後２３時間）には、全ての用量レベルにおいて、一部のオス個体及びメス個体に関して緩やかに低下した（０．４７×〜０．６８×研究前）。リンパ球力価は、１５日目及び２２日目の投薬前に上昇したが、１６日目及び２３日目（注入後２３時間）には、一部のオス個体及びメス個体において低下した（０．３６×〜０．５４×研究前）。
【０５０４】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）処置済み動物において、対照群と比べて、全白血球、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞を含む循環免疫細胞集団における用量依存性の一時的な低下が、注入の終了の２３時間後に観察された。最大の変動幅は、１日目の第１の用量の投与後に観察され、最小の変動幅は、後続の８日目、１５日目又は２２日目の用量の後に一時的に観察された。免疫細胞集団は一般に、ＥＯＩの７２時間後及び回復段階全体を通して、ベースライン値又はベースライン値付近まで回復した。ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）処置済み動物において、対照群と比べて循環単球の変化は観察されなかった。
【０５０５】
ＰＤ‐１＋／ＣＤ４＋及びＰＤ‐１＋／ＣＤ８＋細胞に対する最大のｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）の結合は、試験された全ての用量（１０、４０又は１５０ｍｇ／ｋｇ）において、本研究のｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）処置段階中に観察された。抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を発現しなかった回復動物では、血清ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）濃度は２９μｇ／ｍＬより高いままとなり、ＰＤ‐１＋／ＣＤ４＋及びＰＤ‐１＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する最大のｈＰＤ‐１
ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）の結合は、１０週間の回復期間全体の間維持された。これらの動物では、Ｔ細胞に対するＰＤ‐１による変調のエビデンスは存在しなかった。ＡＤＡ応答を発現した回復動物では、ＭＧＤ０１２結合済みＰＤ‐１＋Ｔ細胞の周波数はベースラインレベルまで低下した。ＡＤＡ陽性動物のＰＤ‐１＋／ＣＤ４＋及びＰＤ‐１＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する最大のｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）の結合の低下は一般に、見かけの血清ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）濃度がおよそ２５μｇ／ｍＬ未満に降下した際に発生した。しかしながら、この見かけの閾値の関係がＡＤＡ陰性動物にも当てはまるかどうかは不明である。というのは、ＡＤＡ陽性動物におけるＡＤＡの存在は、ＰＤ‐１に対するＰＤ‐１抗体の結合のブロックに寄与し得るためである。
【０５０６】
ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）の薬物動態学的応答の性別に関連する差異は最小であり、これは、評価された用量範囲（１０〜１５０ｍｇ／ｋｇ）を通して線形であった。１０、４０及び１５０ｍｇ／ｋｇのｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）に関して、両方の性別を合わせたＣmaxは、それぞれ２４０μｇ／ｍＬ（０
．２４０ｍｇ／ｍＬ）、１０７８μｇ／ｍＬ（１．０８ｍｇ／ｍＬ）及び３９３８μｇ／ｍＬ（３．９４ｍｇ／ｍＬ）であり、ＡＵＣは４７３１０ｈ・μｇ／ｍＬ（４７．３ｈ・ｍｇ／ｍＬ）、２０５７２３ｈ・μｇ／ｍＬ（２０６ｈ・ｍｇ／ｍＬ）及び７４５６８１ｈ・μｇ／ｍＬ（７４６ｈ・ｍｇ／ｍＬ）であった。ＡＤＡ発現前のｈＰＤ‐１  ｍＡｂ
７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）の第１のサイクルの、ノンコンパートメント解析（ｎｏｎ‐ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ：ＮＣＡ）による平均クリアランスは、０．２１ｍＬ／ｈ／ｋｇであり、高分子量タンパク質に関して予想されたように、これはカニクイザルの糸球体濾過率より有意に低かった。ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）の第１のサイクルの、ＮＣＡによる平均定常状態分布体積は、６８ｍＬ／ｋｇであり、これは血清体積のおよそ１．５倍であるが、細胞外の水空間未満である。これは、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）が血管内区画から組織の細胞外空間に溢れ出すことを示唆しているが、全ての細胞外空間がこの分子にとってアクセス可能であることを示唆しているわけではない。ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）の第１のサイクルの、ＮＣＡによる平均滞留時間（ｍｅａｎ  ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ
ｔｉｍｅ：ＭＲＴ）の平均値は、３３５時間、即ちおよそ１４日であった。サイクル２及び４では、ＡＤＡの出現により、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）の濃度が低下した。ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）の反復投薬後のｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）血清濃度の低下のエビデンスは、１０、４０及び１５０ｍｇ／ｋｇ用量の群それぞれにおいて、１０体中７体、１０体中４体、及び１０体中３体の動物で観察された。ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）に対するＡＤＡの存在は、１０、４０及び１５０ｍｇ／ｋｇ用量の群それぞれにおいて、４体、２体及び１体の動物で確認され、ＡＤＡが確認されなかった全ての動物は、終了時に剖検を行う群の動物であり、この剖検中、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）血清濃度が、ＡＤＡを検出する能力を妨げている可能性がある。従って、後続のＴＫ分析では、トラフ濃度が前のトラフ濃度より低い場合、この時点以降のデータは削除された。ＡＤＡによる影響を受けた点を除去した、３用量群に関する全てのサイクルに亘るデータの２コンパートメントモデリングからの、２コンパートメントモデリングモデルに関する一次ＴＫパラメータの平均値は、クリアランスに関して０．２２ｍＬ／ｈ／ｋｇ、初
期分布体積（Ｖ1）に関して３８．５ｍＬ／ｋｇ、及びＶ2に関して３３．８ｍＬ／ｋｇであり、これにより、平均定常状態分布体積（Ｖss）７２．３ｍＬ／ｋｇ、及びＭＲＴ３２９時間が得られた。これらの値は、第１の用量のＮＣＡから得られたパラメータと矛盾しなかった。ＡＤＡが存在しない場合、シミュレーションにより、カニクイザルにおいて、週１回の投薬を行う場合に、５回目の投薬後に定常状態が達成され、累積指数は２．４となると予測される。
【０５０７】
２５日目に、≧４０ｍｇ／ｋｇのオス及び≧１０ｍｇ／ｋｇのメスのＩＶ注入部位の表在神秘において、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）関連の最小の多巣性血管周囲単核細胞浸潤が存在し、これは、外来タンパク質（モノクローナル抗体）の反復注入に対する予想される応答であった。９５日目には、ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）関連の注意すべき微視的変化は存在せず、これは、２５日目に存在した試験物品関連の変化の回復を示す。
【０５０８】
要約すると、この研究の結果は、週１回（１日目、８日目、１５日目及び２２日目）の静脈内注入によるｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）の投与が、１０、４０又は１５０ｍｇ／ｋｇで、カニクイザルにおいて臨床的に良好な耐容性を示したことを示している。観察された効果は、循環リンパ球の一時的な減少、及び外来タンパク質の注入に関連する最小の注入部位の変化に限定されていた。これらの結果に基づき、無有害作用量（ｎｏ‐ｏｂｓｅｒｖｅｄ‐ａｄｖｅｒｓｅ‐ｅｆｆｅｃｔ  ｌｅｖｅｌ：ＮＯＡＥＬ）は、１５０ｍｇ／ｋｇ（両方の性別を合わせたＣmax＝３．９４ｍｇ／ｍＬ、及びＡ
ＵＣ＝７４６ｈ・ｍｇ／ｍＬ）であると考えられた。
【０５０９】
本明細書において言及されている全ての公刊物及び特許は、個々の公刊物又は特許出願それぞれの全体が参照により本明細書に援用されていることが具体的かつ独立に指示されている場合と同程度に、参照により本明細書に援用されている。本発明をその具体的実施形態に関して説明したが、更なる修正形態が可能であり、本出願は、本発明が属する分野の公知の方法又は慣例の範囲内であるような、及びこれまでに挙げた必須の特徴に適用できるような、本開示からの逸脱を含む、本発明の原理に概ね従う本発明のいずれの変形、使用又は改変を包含することを意図していることを理解されたい。
【配列表フリーテキスト】
【０５１０】
配列表の数字見出し＜２２３＞の記載は以下のとおりである。
配列番号１：ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、Ｘａａはリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号２：ヒトＩｇＧ２  ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、Ｘａａはリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号３：ヒトＩｇＧ３  ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、Ｘａａはリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号４：ヒトＩｇＧ４  ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、Ｘａａはリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号５：Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、Ｘａａはリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号６：「ノブ担持」ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、Ｘａａはリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号７：「ホール担持」ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、Ｘａａはリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号８：ヒトＩｇＧ  ＣＬκドメイン
配列番号９：ヒトＩｇＧ  ＣＬλドメイン
配列番号１０：ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン
配列番号１１：ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域
配列番号１２：ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域
配列番号１３：安定化されたＩｇＧ４ヒンジ領域
配列番号１４：リンカー１
配列番号１５：システイン含有リンカー２
配列番号１６〜２０：ヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号２１：ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン
配列番号２２：ヘテロ二量体促進「Ｋコイル」ドメイン
配列番号２３：システイン含有ヘテロ二量体促進「Ｅコイル」ドメイン
配列番号２４：システイン含有ヘテロ二量体促進「Ｋコイル」ドメイン
配列番号２５：ストレプトコッカス株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３
配列番号２６〜２８：変異型脱免疫化アルブミン結合ドメイン
配列番号２９、３０、３３、３４：代替的なリンカー２
配列番号３１、３２、３５〜３７：リンカー
配列番号３８：ヒトＬＡＧ‐３（シグナル配列及び成熟タンパク質）
配列番号３９：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  Ａの重鎖可変ドメイン
配列番号４０：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  Ａの軽鎖可変ドメイン
配列番号４１：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  １の重鎖可変ドメイン
配列番号４２：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  １のＣＤＲH１
配列番号４３：ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＣＤＲH２
配列番号４４：ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＣＤＲH３
配列番号４５：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  １のＶＬドメイン
配列番号４６：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  １のＣＤＲL１
配列番号４７：ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＣＤＲL２
配列番号４８：ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＣＤＲL３
配列番号４９：ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＨ１のＶＨドメイン
配列番号５０：ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＨ２のＶＨドメイン
配列番号５１：ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ１のＶＬドメイン
配列番号５２：ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ２のＶＬドメイン
配列番号５３：ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ３のＶＬドメイン
配列番号５４：ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ４のＶＬドメイン
配列番号５５：ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ４のＣＤＲL１
配列番号５６：ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＶＨドメイン
配列番号５７：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ６のＣＤＲH１
配列番号５８：ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＣＤＲH２
配列番号５９：ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＣＤＲH３
配列番号６０：ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＶＬドメイン
配列番号６１：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ６のＣＤＲL１
配列番号６２：ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＣＤＲL２
配列番号６３：ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＣＤＲL３
配列番号６４：ＰＤ−１  ｍＡｂ  Ａの重鎖可変ドメイン
配列番号６５：ＰＤ−１  ｍＡｂ  Ａの軽鎖可変ドメイン
配列番号６６：ＰＤ−１  ｍＡｂ  Ｂの重鎖可変ドメイン
配列番号６７：ＰＤ−１  ｍＡｂ  Ｂの軽鎖可変ドメイン
配列番号６８：ヒトＰＤ‐１ポリペプチド（ＮＣＢＩ配列ＮＰ＿００５００９．２）、ヒトＰＤ−１シグナル配列
配列番号６９：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １のＶＨドメイン
配列番号７０：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １のＶＨドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号７１：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １のＣＤＲH１
配列番号７２：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １のＣＤＲH２
配列番号７３：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １のＣＤＲH３
配列番号７４：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １のＶＬドメイン
配列番号７５：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １のＶＬドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号７６：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １のＣＤＲL１
配列番号７７：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １のＣＤＲL２
配列番号７８：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １のＣＤＲL３
配列番号７９：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  １  ＶＨ１のＶＨドメイン
配列番号８０：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  １  ＶＨ１をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号８１：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  １  ＶＬ１のＶＬドメイン
配列番号８２：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  １  ＶＬ１をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号８３：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ２のＶＨドメイン
配列番号８４：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ２のＶＨドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号８５：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ２のＣＤＲH１
配列番号８６：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ２のＣＤＲH２
配列番号８７：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ２のＣＤＲH３
配列番号８８：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ２のＶＬドメイン
配列番号８９：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ２のＶＬドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号９０：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ２のＣＤＲL１
配列番号９１：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ２のＣＤＲL２
配列番号９２：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ２のＣＤＲL３
配列番号９３：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  ２  ＶＨ１のＶＨドメイン
配列番号９４：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  ２  ＶＨ１をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号９５：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  ２  ＶＬ１のＶＬドメイン
配列番号９６：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  ２  ＶＬ１をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号９７：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ３のＶＨドメイン
配列番号９８：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ３のＶＨドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号９９：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ３のＣＤＲH１
配列番号１００：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ３のＣＤＲH２
配列番号１０１：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ３のＣＤＲH３
配列番号１０２：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ３のＶＬドメイン
配列番号１０３：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ３のＶＬドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１０４：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ３のＣＤＲL１
配列番号１０５：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ３のＣＤＲL２
配列番号１０６：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ３のＣＤＲL３
配列番号１０７：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ４のＶＨドメイン
配列番号１０８：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ４のＶＨドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１０９：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ４のＣＤＲH１
配列番号１１０：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ４のＣＤＲH２
配列番号１１１：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ４のＣＤＲH３
配列番号１１２：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ４のＶＬドメイン
配列番号１１３：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ４のＶＬドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１１４：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ４のＣＤＲL１
配列番号１１５：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ４のＣＤＲL２
配列番号１１６：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ４のＣＤＲL３
配列番号１１７：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ５のＶＨドメイン
配列番号１１８：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ５のＶＨドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１１９：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ５のＣＤＲH１
配列番号１２０：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ５のＣＤＲH２
配列番号１２１：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ５のＣＤＲH３
配列番号１２２：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ５のＶＬドメイン
配列番号１２３：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ５のＶＬドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１２４：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ５のＣＤＲL１
配列番号１２５：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ５のＣＤＲL２
配列番号１２６：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ５のＣＤＲL３
配列番号１２７：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ６のＶＨドメイン
配列番号１２８：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ６のＶＨドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１２９：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ６のＣＤＲH１
配列番号１３０：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ６のＣＤＲH２
配列番号１３１：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ６のＣＤＲH３
配列番号１３２：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ６のＶＬドメイン
配列番号１３３：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ６のＶＬドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１３４：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ６のＣＤＲL１
配列番号１３５：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ６のＣＤＲL２
配列番号１３６：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ６のＣＤＲL３
配列番号１３７：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ７のＶＨドメイン
配列番号１３８：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ７のＶＨドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１３９：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ７のＣＤＲH１
配列番号１４０：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ７のＣＤＲH２
配列番号１４１：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ７のＣＤＲH３
配列番号１４２：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ７のＶＬドメイン
配列番号１４３：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ７のＶＬドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１４４：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ７のＣＤＲL１
配列番号１４５：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ７のＣＤＲL２
配列番号１４６：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ７のＣＤＲL３
配列番号１４７：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  ７  ＶＨ１のＶＨドメイン
配列番号１４８：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  ７  ＶＨ１をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１４９：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  ７  ＶＨ２のＶＨドメイン
配列番号１５０：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  ７  ＶＨ２をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１５１：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ１のＶＬドメイン
配列番号１５２：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ１をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１５３：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ２のＶＬドメイン
配列番号１５４：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ２をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１５５：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ３のＶＬドメイン
配列番号１５６：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ３をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１５７：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ２及びｈＰＤ−１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ
３のＶＬドメインのＣＤＲL１
配列番号１５８：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  ７  ＶＬ３のＶＬドメインのＣＤＲL２
配列番号１５９：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ８のＶＨドメイン
配列番号１６０：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ８のＶＨドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１６１：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ８のＣＤＲH１
配列番号１６２：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ８のＣＤＲH２
配列番号１６３：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ８のＣＤＲH３
配列番号１６４：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ８のＶＬドメイン
配列番号１６５：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ８のＶＬドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１６６：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ８のＣＤＲL１
配列番号１６７：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ８のＣＤＲL２
配列番号１６８：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ８のＣＤＲL３
配列番号１６９：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ９のＶＨドメイン
配列番号１７０：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ９のＶＨドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１７１：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ９のＣＤＲH１
配列番号１７２：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ９のＣＤＲH２
配列番号１７３：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ９のＣＤＲH３
配列番号１７４：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ９のＶＬドメイン
配列番号１７５：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ９のＶＬドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１７６：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ９のＣＤＲL１
配列番号１７７：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ９のＣＤＲL２
配列番号１７８：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ９のＣＤＲL３
配列番号１７９：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  ９  ＶＨ１のＶＨドメイン
配列番号１８０：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  ９  ＶＨ１をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１８１：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  ９  ＶＨ２のＶＨドメイン
配列番号１８２：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  ９  ＶＨ２をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１８３：セリンからグリシンへのアミノ酸置換を含むｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９
ＶＨ２のＶＨドメインのＣＤＲH１
配列番号１８４：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  ９  ＶＬ１のＶＬドメイン
配列番号１８５：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  ９  ＶＬ１をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１８６：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  ９  ＶＬ２のＶＬドメイン
配列番号１８７：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  ９  ＶＬ２をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１８８：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  ９  ＶＬ２のＶＬドメインのＣＤＲL１
配列番号１８９：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  ９  ＶＬ２のＶＬドメインのＣＤＲL２
配列番号１９０：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １０のＶＨドメイン
配列番号１９１：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １０のＶＨドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１９２：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １０のＣＤＲH１
配列番号１９３：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １０のＣＤＲH２
配列番号１９４：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １０のＣＤＲH３
配列番号１９５：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １０のＶＬドメイン
配列番号１９６：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １０のＶＬドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１９７：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １０のＣＤＲL１
配列番号１９８：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １０のＣＤＲL２
配列番号１９９：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １０のＣＤＲL３
配列番号２００：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １１のＶＨドメイン
配列番号２０１：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １１のＶＨドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２０２：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １１のＣＤＲH１
配列番号２０３：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １１のＣＤＲH２
配列番号２０４：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １１のＣＤＲH３
配列番号２０５：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １１のＶＬドメイン
配列番号２０６：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １１のＶＬドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２０７：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １１のＣＤＲL１
配列番号２０８：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １１のＣＤＲL２
配列番号２０９：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １１のＣＤＲL３
配列番号２１０：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １２のＶＨドメイン
配列番号２１１：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １２のＶＨドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２１２：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １２のＣＤＲH１
配列番号２１３：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １２のＣＤＲH２
配列番号２１４：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １２のＣＤＲH３
配列番号２１５：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ４のＶＬドメイン
配列番号２１６：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １２のＶＬドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２１７：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １２のＣＤＲL１
配列番号２１８：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １２のＣＤＲL２
配列番号２１９：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １２のＣＤＲL３
配列番号２２０：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １３のＶＨドメイン
配列番号２２１：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １３のＶＨドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２２２：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １３のＣＤＲH１
配列番号２２３：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １３のＣＤＲH２
配列番号２２４：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １３のＣＤＲH３
配列番号２２５：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １３のＶＬドメイン
配列番号２２６：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １３のＶＬドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２２７：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １３のＣＤＲL１
配列番号２２８：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １３のＣＤＲL２
配列番号２２９：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １３のＣＤＲL３
配列番号２３０：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １４のＶＨドメイン
配列番号２３１：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １４のＶＨドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２３２：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １４のＣＤＲH１
配列番号２３３：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １４のＣＤＲH２
配列番号２３４：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １４のＣＤＲH３
配列番号２３５：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １４のＶＬドメイン
配列番号２３６：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １４のＶＬドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２３７：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １４のＣＤＲL１
配列番号２３８：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １４のＣＤＲL２
配列番号２３９：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １４のＣＤＲL３
配列番号２４０：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １５のＶＨドメイン
配列番号２４１：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １５のＶＨドメインをエンコードするポリヌクレ
オチド
配列番号２４２：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １５のＣＤＲH１
配列番号２４３：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １５のＣＤＲH２
配列番号２４４：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １５のＣＤＲH３
配列番号２４５：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １５のＶＬドメイン
配列番号２４６：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １５のＶＬドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２４７：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １５のＣＤＲL１
配列番号２４８：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １５のＣＤＲL２
配列番号２４９：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １５のＣＤＲL３
配列番号２５０：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  １５  ＶＨ１のＶＨドメイン
配列番号２５１：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  １５  ＶＨ１をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２５２：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  １５  ＶＬ１のＶＬドメイン
配列番号２５３：ｈＰＤ−１  ｍＡｂ  １５  ＶＬ１をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２５４：ヒトＩｇＧ４  ＣＨ１ドメイン
配列番号２５５：ＩｇＧ１ヒト化抗体重鎖
配列番号２５６：安定化ヒンジ領域を有するＩｇＧ４ヒト化抗体重鎖
配列番号２５７：ヒトＩｇＧ２  ＣＨ１ドメイン
配列番号２５８：ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関するＩｇＧ１配列、Ｘａａはリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号２５９：ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関するＩｇＧ４配列、Ｘａａはリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号２６０：野生型及び変異型ＩｇＧ１  ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、Ｘａａ４及びＸａａ５はいずれもＬ（野生型）であるか、又はいずれもＡ（ＦｃγＲ結合低下）、Ｘａａ２２、Ｘａａ２４及びＸａａ２６はそれぞれＭ、Ｓ及びＴ（野生型）であるか、又はＹ、Ｔ及びＥ（半減期延長）、Ｘａａ１３６、Ｘａａ１３８及びＸａａ１７７はそれぞれＴ、Ｌ及びＹ（野生型）であるか、又はＷ、Ｌ及びＹ（ノブ）、若しくはＳ、Ａ及びＶ（ホール）、Ｘａａ２０４及びＸａａ２０５はそれぞれＮ及びＨ（野生型）であるか、又はＮ及びＲ（タンパク質Ａ結合なし）、若しくはＡ及びＫ（タンパク質Ａ結合なし）、Ｘａａ２１１はＫであるか、又は不在である
配列番号２６１：代替的なリンカー２
配列番号２６２、２６３：リンカー３
配列番号２６４：ヒト化ＰＤ‐１抗体（ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２））の軽鎖
配列番号２６５、２６６：ヒト化抗体（ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７（１．２））の重鎖
配列番号２６７：ＤＡＲＴ  Ａの第１及び第３のポリペプチド鎖、Ｘａａ３４はＡ又はＧ、Ｘａａ３０７はＹ又はＭ、Ｘａａ３０９はＴ又はＳ、Ｘａａ３１１はＥ又はＴである
配列番号２６８：ＤＡＲＴ  Ａの第２及び第４のポリペプチド鎖
配列番号２６９：ＤＡＲＴ  Ｄの第１及び第３のポリペプチド鎖
配列番号２７０：ＤＡＲＴ  Ｄの第２及び第４のポリペプチド鎖
配列番号２７１：ＤＡＲＴ  Ｅの第１及び第３のポリペプチド鎖
配列番号２７２：ＤＡＲＴ  Ｅの第２及び第４のポリペプチド鎖
配列番号２７３：ＤＡＲＴ  Ｆの第１のポリペプチド鎖
配列番号２７４：ＤＡＲＴ  Ｆの第２及び第５のポリペプチド鎖
配列番号２７５：ＤＡＲＴ  Ｆの第３のポリペプチド鎖
配列番号２７６：ＤＡＲＴ  Ｆの第４のポリペプチド鎖
配列番号２７７：ＤＡＲＴ  Ｇの第１のポリペプチド鎖
配列番号２７８：ＤＡＲＴ  Ｇの第２及び第５のポリペプチド鎖
配列番号２７９：ＤＡＲＴ  Ｇの第３のポリペプチド鎖
配列番号２８０：ＤＡＲＴ  Ｇの第４のポリペプチド鎖
配列番号２８１：ＤＡＲＴ  Ｈの第１のポリペプチド鎖
配列番号２８２：ＤＡＲＴ  Ｈの第２のポリペプチド鎖
配列番号２８３：ＤＡＲＴ  Ｈの第３のポリペプチド鎖
配列番号２８４：ＤＡＲＴ  １の第１及び第３のポリペプチド鎖
配列番号２８５：ＤＡＲＴ  １の第２及び第４のポリペプチド鎖
配列番号２８６：ＢＳＡＢ  Ａの第１のポリペプチド鎖
配列番号２８７：ＢＳＡＢ  Ａの第２のポリペプチド鎖
配列番号２８８：ＢＳＡＢ  Ａの第３のポリペプチド鎖
配列番号２８９：ＢＳＡＢ  Ａの第４のポリペプチド鎖
配列番号２９０：ＤＡＲＴ  Ｉの第１及び第３のポリペプチド鎖
配列番号２９１：ＤＡＲＴ  Ｉの第２及び第４のポリペプチド鎖
配列番号２９２：ＤＡＲＴ  Ｊの第１及び第３のポリペプチド鎖
配列番号２９３：ＤＡＲＴ  Ｊの第２及び第４のポリペプチド鎖
配列番号２９４：ｈＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ６  ＶＨ１のＶＨドメイン
配列番号２９５：ｈＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ６  ＶＨ２のＶＨドメイン
配列番号２９６：ｈＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ６  ＶＬ１のＶＬドメイン
配列番号２９７：ｈＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ６  ＶＬ２のＶＬドメイン
配列番号２９８：ｈＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ６  ＶＬ１及びＶＬ２のＶＬドメインのＣＤＲL１
【図１】
2019055948.tif 000028
【図２】
2019055948.tif 000029
【図３Ａ】
2019055948.tif 000030
【図３Ｂ】
2019055948.tif 000031
【図３Ｃ】
2019055948.tif 000032
【図４Ａ】
2019055948.tif 000033
【図４Ｂ】
2019055948.tif 000034
【図５】
2019055948.tif 000035
【図６Ａ】
2019055948.tif 000036
【図６Ｂ】
2019055948.tif 000037
【図６Ｃ】
2019055948.tif 000038
【図６Ｄ】
2019055948.tif 000039
【図６Ｅ】
2019055948.tif 000040
【図６Ｆ】
2019055948.tif 000041
【図７Ａ】
2019055948.tif 000042
【図７Ｂ】
2019055948.tif 000043
【図７Ｃ】
2019055948.tif 000044
【図７Ｄ】
2019055948.tif 000045
【図８Ａ】
2019055948.tif 000046
【図８Ｂ】
2019055948.tif 000047
【図８Ｃ】
2019055948.tif 000048
【図９Ａ】
2019055948.tif 000049
【図９Ｂ】
2019055948.tif 000050
【図９Ｃ】
2019055948.tif 000051
【図９Ｄ】
2019055948.tif 000052
【図１０Ａ】
2019055948.tif 000053
【図１０Ｂ】
2019055948.tif 000054
【図１１】
2019055948.tif 000055
【図１２Ａ】
2019055948.tif 000056
【図１２Ｂ】
2019055948.tif 000057
【図１３】
2019055948.tif 000058
【図１４】
2019055948.tif 000059
【図１５Ａ】
2019055948.tif 000060
【図１５Ｂ】
2019055948.tif 000061
【図１６Ａ】
2019055948.tif 000062
【図１６Ｂ】
2019055948.tif 000063
【図１７Ａ】
2019055948.tif 000064
【図１７Ｂ】
2019055948.tif 000065
【図１８Ａ】
2019055948.tif 000066
【図１８Ｂ】
2019055948.tif 000067
【図１９】
2019055948.tif 000068
【図２０】
2019055948.tif 000069
【図２１Ａ】
2019055948.tif 000070
【図２１Ｂ】
2019055948.tif 000071
【図２１Ｃ】
2019055948.tif 000072
【図２１Ｄ】
2019055948.tif 000073
【図２２】
2019055948.tif 000074
【図２３Ａ】
2019055948.tif 000075
【図２３Ｂ】
2019055948.tif 000076
【図２３Ｃ】
2019055948.tif 000077
【配列表】
2019055948000001.app