(57)【要約】本発明は、核酸を不活化する際に使用するための試薬、ならびにその試薬を作製および使用する方法に関する。さらに、本発明は、加工表面上、実験機器上および／もしくは溶液中の核酸を不活化するために有用であるか、または例えば消毒剤として使用され得る本発明の処方物を選択するためのスクリーニング方法を記載する。このような処方物はまた、タンパク質および脂質のような生物学的分子を不活化するためにも有用であり得る。本発明は、さらに、増幅前の適用および増幅後の適用の両方における多くの例示的な処方物の効果を考察する。
2007527243.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腐食阻害剤、湿潤剤、および可溶化剤を含有する処方物であって、該薬剤の各々の量は、該処方物に対して核酸を実質的に不活化するのに十分な量の不活剤と合わせた場合に、該腐食阻害剤が、該不活剤の腐食特性を低減させ、該湿潤剤が、固体表面上での該不活剤の分散特性を改善し、そして／あるいは該不活剤および／または固体表面上もしくは溶液中に存在し得る他の物質の溶解度を増加させ、そして該可溶化剤が、該不活剤、該腐食阻害剤、および該湿潤剤のうちの少なくとも１つの溶解度を増加させるような量である、処方物。
【請求項２】
前記腐食阻害剤および前記湿潤剤が、同じものである、請求項１に記載の処方物。
【請求項３】
前記薬剤の各々が、２２℃の溶液において実質的に残っている、請求項１に記載の処方物。
【請求項４】
前記処方物に対して核酸を実質的に不活化するのに十分な量の前記不活剤をさらに含む、請求項１に記載の処方物。
【請求項５】
前記不活剤が、塩素または臭素を含む、請求項４に記載の処方物。
【請求項６】
前記不活剤が、次亜塩素酸ナトリウムを含む、請求項５に記載の処方物。
【請求項７】
前記処方物中の次亜塩素酸ナトリウムの濃度が、約０．０６％（ｗ／ｖ）〜約３％（ｗ／ｖ）である、請求項６に記載の処方物。
【請求項８】
前記処方物中の次亜塩素酸ナトリウムの濃度が、約０．１８％（ｗ／ｖ）〜約１．８％（ｗ／ｖ）である、請求項６に記載の処方物。
【請求項９】
前記処方物中の次亜塩素酸ナトリウムの濃度が、約０．６％（ｗ／ｖ）〜約１．５％（ｗ／ｖ）である、請求項６に記載の処方物。
【請求項１０】
前記処方物中の次亜塩素酸ナトリウムの濃度が、約０．６％（ｗ／ｖ）〜約１．２％（ｗ／ｖ）である、請求項６に記載の処方物。
【請求項１１】
前記不活剤が、ジクロロイソシアヌレートである、請求項５に記載の処方物。
【請求項１２】
前記処方物中のジクロロシアヌレートの濃度が、約５ｍＭ〜約４００ｍＭである、請求項１１に記載の処方物。
【請求項１３】
前記処方物中のジクロロシアヌレートの濃度が、約１０ｍＭ〜約２００ｍＭである、請求項１１に記載の処方物。
【請求項１４】
前記処方物中のジクロロシアヌレートの濃度が、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭである、請求項１１に記載の処方物。
【請求項１５】
前記処方物中のジクロロシアヌレートの濃度が、約４０ｍＭ〜約８０ｍＭである、請求項１１に記載の処方物。
【請求項１６】
前記腐食阻害剤が、ホスフェート、ホウ酸塩、炭酸水素ナトリウムおよび洗剤からなる群より選択される、請求項４に記載の処方物。
【請求項１７】
前記防腐阻害剤が、炭酸水素ナトリウムである、請求項１６に記載の処方物。
【請求項１８】
前記処方物中の前記防腐阻害剤の濃度が、約１０ｍＭ〜約７５０ｍＭである、請求項１７に記載の処方物。
【請求項１９】
前記湿潤剤が、洗剤または界面活性剤である、請求項４に記載の処方物。
【請求項２０】
前記湿潤剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸リチウム、サポニン、ＣＴＡＢ、Ａｌｃｏｎｏｘ、およびポリオキシエチレン洗剤からなる群より選択される、請求項１６に記載の処方物。
【請求項２１】
前記湿潤剤が、ドデシル硫酸ナトリウムまたはラウリル硫酸リチウムである、請求項２０に記載の処方物。
【請求項２２】
前記処方物中の前記湿潤剤の濃度が、約０．００５％（ｗ／ｖ）〜約１％（ｗ／ｖ）である、請求項２１に記載の処方物。
【請求項２３】
前記可溶化剤が、有機溶媒または乳化剤を含む、請求項４に記載の処方物。
【請求項２４】
前記可溶化剤が、酢酸ベンジル、ＰＳ２０およびイソプロパノールからなる群より選択される有機溶媒である、請求項２３に記載の処方物。
【請求項２５】
前記可溶化剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、レシチン、およびジステアリン酸エチレングリコールからなる群より選択される乳化剤である、請求項２３に記載の処方物。
【請求項２６】
前記可溶化剤が、芳香剤である、請求項４に記載の処方物。
【請求項２７】
前記処方物中の前記可溶化剤の濃度が、約０．００１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）である、請求項２６に記載の処方物。
【請求項２８】
前記腐食阻害剤および前記湿潤剤が、同じものである、請求項４に記載の処方物。
【請求項２９】
前記薬剤の各々が、２２℃の溶液において実質的に残っている、請求項４に記載の処方物。
【請求項３０】
２つ以上の容器の中に、請求項１に記載の処方物を調製するために十分な量の腐食阻害剤、湿潤剤、および可溶化剤を備える、キット。
【請求項３１】
前記腐食阻害剤および前記湿潤剤のうちの少なくとも１つが、乾燥形態で提供される、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
前記乾燥形態が、錠剤である、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
核酸増幅反応を行う際に使用するための１種以上の増幅試薬をさらに備える、請求項３０に記載のキット。
【請求項３４】
２つ以上の容器の中に、請求項１６に記載の処方物を調製するために十分な量の不活剤、腐食阻害剤、湿潤剤、および可溶化剤を備える、キット。
【請求項３５】
前記不活剤、前記腐食阻害剤、および前記湿潤剤のうちの少なくとも１つが、乾燥形態で提供される、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記乾燥形態が、錠剤である、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
核酸増幅反応を行う際に使用するための１種以上の増幅試薬をさらに備える、請求項３４に記載のキット。
【請求項３８】
請求項１に記載の処方物を作製する方法であって、該方法は、以下の順序の工程：
ａ）前記腐食阻害剤および前記湿潤剤の固体形態を別々に溶解する工程；
ｂ）該腐食阻害剤および該湿潤剤の溶解形態を一緒に合わせて混合物を形成する工程；ならびに
ｃ）可溶化剤と該混合物とを一緒に合わせて、該処方物を形成する工程
を包含し、該薬剤の各々が、２２℃の溶液において実質的に残っている、方法。
【請求項３９】
工程ｃ）の前に、前記可溶化剤の固体形態を溶解する工程をさらに包含する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記不活剤と前記処方物とを一緒に合わせる工程をさらに包含する請求項３８に記載の方法であって、ここで該不活剤は、該処方物に対して核酸を実質的に不活化するのに十分な量で存在し、そして該薬剤の各々は、２２℃の溶液において実質的に残っている、方法。
【請求項４１】
前記不活剤と前記処方物とを合わせる工程の前に、該不活剤の固体形態を溶解する工程をさらに包含する、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、表面上または溶液中に存在する核酸を不活化する際に使用するための薬剤を含むか、またはこの薬剤を使用する処方物、方法、およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
試験サンプルにおいて特定の生物もしくはウイルスの存在を定性的または定量的に決定するための手順は、慣例的に、核酸ベースのプローブ試験に依存している。これらの手順の感度を上昇させるために、試験サンプル中に存在する潜在的な核酸標的配列のコピー数を増加させるための増幅工程が、しばしば包含される。増幅の間、標的配列および／またはその相補体を含むポリヌクレオチド鎖は、ポリメラーゼとして公知のヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して、リボヌクレオシド三リン酸またはデオキシヌクレオシド三リン酸から鋳型依存様式で合成される。今日、一般的に使用される多くの増幅手順が存在する。これらの手順としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｑ−βレプリカーゼ、自立的配列複製（３ＳＲ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）およびループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）が挙げられ、これらの各々は、当該分野で周知である。例えば、以下を参照のこと：Ｍｕｌｌｉｓ、「Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」（特許文献１）；Ｅｒｌｉｃｈら、「Ｋｉｔｓ  ｆｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」（特許文献２）；非特許文献１；非特許文献２；Ｋａｃｉａｎら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」（特許文献３）；Ｄａｖｅｙら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ」（特許文献４）；Ｂｉｒｋｅｎｍｅｙｅｒら、「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｇａｐ  Ｆｉｌｌｉｎｇ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（特許文献５）；Ｍａｒｓｈａｌｌら、「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ  ＲＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（特許文献６）；Ｗａｌｋｅｒ、「Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」（特許文献７）；Ｎｏｔｏｍｉら、「Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ」（特許文献８）；Ｄａｔｔａｇｕｐｔａら、「Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」（特許文献９）；および非特許文献３。
【０００３】
増幅手順の間に形成される核酸生成物（すなわち、アンプリコン）は、検出可能なプローブを使用して、その増幅反応の過程の間（リアルタイム）に分析され得るか、またはその増幅反応がほぼ完了したとき（終点）に分析され得る。それらのプローブは標的含有アンプリコンをスクリーニングするために設計されているが、他の生成物（例えば、代表的なＰＣＲ反応において形成されるプライマー−ダイマー）が増幅手順の間に産生され得、これらの生成物は、所望の増幅反応に干渉する可能性を有する。増幅手順が完了し、検出可能なプローブへ曝した後、生じた反応混合物は廃棄される。
【０００４】
アッセイの工程または増幅手順を包含する合成手順の間に、こぼれる、取り扱いミス、エアロゾル形成などによって、アッセイで使用または形成された核酸で加工表面または実験機器を汚染する可能性がある。次いで、この核酸は引き継がれ、同じ実験機器および／または同じ加工表面を使用して行われる将来の増幅アッセイ手順および他の核酸アッセイ手順を汚染し得る。引き継がれた生成物が存在すると、増幅試薬の所望されない消費を招き得るか、または先の増幅手順からの標的含有アンプリコンの場合には、誤った結果を導き得る。なぜならば、増幅手順は、微量の標的核酸の存在でさえ検出し得るからである。合成増幅反応の場合においては、所望の核酸生成物は、引き継がれた生成物によって汚染され得、そして／または合成収率は、低下し得る。
【０００５】
種々の方法が、引き継ぎ汚染を制限するために考案されている。例えば、ＰＣＲ増幅生成物は、ＵＶ光による照射によってさらなる増幅について不活化され得る。非特許文献４；および非特許文献５を参照のこと。ＤＮＡ結合光活性化可能なリガンド（例えば、イソプラレン）の非存在下または存在下でのこのような照射は、その生成物であるＤＮＡを増幅不可能にするが、特異的なハイブリダイゼーション特性は保持する。さらに、ＰＣＲ反応において３’リボースプライマーを使用すると、アルカリ（例えば、ＮａＯＨ）によって容易に破壊され得る核酸が生成される。例えば、非特許文献６を参照のこと。同様に、他の手順を使用して、特異的酵素による処理によって選択的に破壊され得る特異的な改変核酸が生成される。このような改変核酸は、ＰＣＲ反応における基質としてのｄＵＴＰの存在下で増幅することによって生成され得る。デオキシＵ含有生成物であるＤＮＡは、そのＤＮＡを増幅不可能にするＵ特異的酵素によって不活化され得る。非特許文献７；および非特許文献８を参照のこと。これらの方法の多くは、ＤＮＡを用いて十分に機能するが、高価な試薬を必要とし、そして増幅工程の経過に影響する（例えば、より長い時間および特異的試薬を必要とすること）。
【特許文献１】米国特許第４，６８３，２０２号明細書
【特許文献２】米国特許第６，１９７，５６３号明細書
【特許文献３】米国特許第５，３９９，４９１号明細書
【特許文献４】米国特許第５，５５４，５１７号明細書
【特許文献５】米国特許第５，４２７，９３０号明細書
【特許文献６】米国特許第５，６８６，２７２号明細書
【特許文献７】米国特許第５，７１２，１２４号明細書
【特許文献８】米国特許第６，４１０，２７８号明細書
【特許文献９】米国特許第６，２１４，５８７号明細書
【非特許文献１】Ｗａｌｋｅｒら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．」（１９９２）第２０巻：１６９１−１６９６
【非特許文献２】Ｆａｈｙら、「Ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ（３ＳＲ）：Ａｎ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  ＰＣＲ」、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９１）第１巻：２５−３３
【非特許文献３】Ｌｅｅら、「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｏ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ」、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（１９９７）
【非特許文献４】Ｏｕら、「ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」（１９９１）第１０巻：４４２−４４６
【非特許文献５】Ｃｉｍｉｎｏら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  ＡｃｉｄｓＲｅｓ．」（１９９１）第１９巻：９９−１０７
【非特許文献６】Ｗａｌｄｅｒら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．」（１９９３）第２１巻：４３３９−４３４３
【非特許文献７】「Ｔｒｉｐｌｅ  Ｃ  ｐｒｉｍｅｒｓ」、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ（１９９２）
【非特許文献８】Ｌｏｎｇｏら、「Ｇｅｎｅ」（１９９０）第９３巻：１２５−１２８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
好ましい方法において、核酸生成物に曝された加工表面および実験機器は、核酸を不活化するための５０％漂白剤溶液（すなわち、約２．５％（ｗ／ｖ）〜約３．２５％（ｗ／ｖ）の次亜塩素酸ナトリウムを含む漂白剤溶液）によって処理される。ＧＥＮ−ＰＲＯＢＥ（登録商標）ＡＰＴＩＭＡ  ＣＯＭＢＯ  ２（登録商標）アッセイパッケージ挿入物、ＩＮ００３７  Ｒｅｖ．Ａ／２００３−０８を参照のこと。この漂白剤溶液は、処理表面に存在する核酸を不活化するのに有効である一方、換気がよくない領域で有害な蒸気を生じ、長い期間をかけて実験機器を腐食する傾向がある。従って、本発明の目的は、溶液中で安定であり、耐えられるにおいを有し、そして非腐食性であるか、または標準的な５０％漂白剤溶液よりも実質的に腐食性が低い核酸不活剤を含む処方物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（要旨）
本発明は、溶液中または固体表面上で処方物と接触する核酸を不活化するのに十分な量の核酸不活剤（「不活剤」）を含むか、またはこの不活剤と合わせられ得る処方物を提供することによって、この目的を満たす。「不活化する」によって、核酸が、その核酸が不活化される前に機能したようにはもはや機能し得ないように変更されることを意味する。例えば、その核酸は、もはや、増幅反応において鋳型として機能することも、または別の方法で（例えば、プライマー−ダイマー形成を通して）干渉することも、別の核酸もしくはタンパク質へ結合することも、あるいは酵素の基質として機能することもできない可能性がある。用語「不活化する」は、不活剤の処方物が核酸を変更する任意の特定の機構を意味しない。上記処方物の成分としては、腐食阻害剤、湿潤剤、可溶化剤、および必要に応じて不活剤が挙げられる。処方物が４種全ての成分からなる場合、腐食阻害剤は、不活剤の腐食特性を低減させるために十分な量で存在し、湿潤剤は、不活剤の分散特性を改善するため、そして／あるいは不活剤および／または固体表面上もしくは溶液中に存在し得る他の物質の溶解度を増加させるために十分な量で存在し、そして可溶化剤は、不活剤もしくは腐食阻害剤もしくは湿潤剤、または種々のそれらの組み合わせの溶解度を増加させるために十分な量で存在し、そして不活剤は、その処方物に接触された核酸を実質的に不活化するのに十分な量で存在する。上記処方物が不活剤を含まない場合、腐食阻害剤、湿潤剤および可溶化剤の量は、その不活剤と、核酸を不活化し得る最終作業溶液を作製するために使用され得る任意の希釈剤（例えば、水）とが合わされたときに、それらの濃度の減少を計算して濃縮される。
【０００８】
本発明の不活剤は、その不活剤が、表面上または溶液中に存在する核酸を実質的に不活化し、それによってその核酸が増幅反応において意図されない鋳型として作用すること、あるいは作業空間、実験機器もしくは実験材料、または作業溶液を汚染することから防ぐ能力について選択される。特定の適用に対して、本発明の不活剤は、上記で言及された腐食阻害剤、湿潤剤および／または可溶化剤なしで使用され得る。好ましい不活剤としては、以下が挙げられる：漂白剤、次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣＩ）（または次亜塩素酸（ＨＯＣＩ）（これは、塩素イオンが水と合わさったときに生じる））、次亜塩素酸ナトリウムおよび臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）、ジクロロイソシアヌレート（ｄｉｃｈｌｏｒｏｉｓｏｃｙａｎｕｒａｔｅ）（ＤＣＣ）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）および金属イオン（好ましくは、銅イオン（Ｃｕ＋＋）（例えば、硫酸銅（ＣｕＳＯ）４または酢酸銅（Ｃｕ（ＣＨ３ＣＯＯ）２．Ｈ２Ｏ））、金属イオンと組み合わせた過酸化水素およびピペラジンまたはピペラジン含有処方物、アセテートまたはアスコルベート、ペルカーボネート（２Ｎａ２ＣＯ３．３Ｈ２Ｏ２）、ペルオキシモノサルフェート（ＫＨＳＯ５）、ペルオキシモノサルフェートおよび臭化カリウム（ＫＢｒ）、次亜臭素酸イオン（ＯＢｒ−）（例えば、次亜臭素酸（ＨＯＢｒ））およびハロヒダントイン（例えば、１，３−ジハロ−５，５−ジメチルヒダントイン）。次亜塩素酸イオンおよび次亜臭素酸イオンは、塩（例えば、ナトリウム）を使用して溶液に送達され得る。塩素イオン（Ｃｌ＋）を含む不活剤（例えば、家庭用漂白剤の成分である次亜塩素酸ナトリウム）、またはＤＣＣが、特に好ましい。このＤＣＣは、実質的に純粋であってもよいし、ＤＣＣ含有溶液（例えば、ＡＣＴ  ３４０  ＰＬＵＳ  ２０００（登録商標）消毒剤の部分であってもよい。ＤＣＣの利点は、次亜塩素酸塩よりも腐食性が低く、いくつかの場合において、有機物質を汚染することによる不活化に対してより耐性であることである。
【０００９】
本発明の不活剤は、核酸を不活化するのに十分な任意の量で単独または処方物の一部として提供され得るが、上記に記載された不活剤の好ましい濃度は、以下のとおりである：（ｉ）約０．０６％（ｗ／ｖ）〜約３％（ｗ／ｖ）、約０．１８％（ｗ／ｖ）〜約１．８％（ｗ／ｖ）、約０．６％（ｗ／ｖ）〜約１．５％（ｗ／ｖ）、もしくは約０．６％（ｗ／ｖ）〜約１．２％（ｗ／ｖ）の次亜塩素酸ナトリウム、または次亜塩素酸ナトリウムおよび臭化ナトリウム（ここで次亜塩素酸ナトリウム：臭化ナトリウムの比は、約５：１〜約１：５、約２：１〜約１：２、または約１：１である）；（ｉｉ）約５ｍＭ〜約４００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約４０ｍＭ〜約８０ｍＭのＤＣＣ；（ｉｉｉ）約１００ｍＭ〜約８８０ｍＭ、約２００ｍＭ〜約８８０ｍＭ、または約２５０ｍＭ〜約８００ｍＭのペルカーボネート；（ｉｖ）約５０ｍＭ〜約３００ｍＭまたは約１００ｍＭ〜約２００ｍＭのペルオキシモノサルフェート、またはペルオキシモノサルフェートおよび臭化カリウム（ここで、ペルオキシモノサルフェート：臭化カリウムの比は、約２：１〜約１：２または約１：１である）。これらの範囲は、表面上または溶液中に直接使用される最終作業溶液の濃度を反映し、上記処方物が濃縮物である場合に調整され得る。過酸化水素含有処方物の好ましい濃度範囲は、以下に記載される。
【００１０】
塩素が、上記不活剤（例えば、次亜塩素酸ナトリウムまたはＤＣＣ）の成分である場合、その不活剤に曝される表面上または溶液中の有機負荷になる可能性のあるものが、塩素含有成分の濃度を決定する際の因子である。これは、有機物質（特に、一次アミン基およびスルフヒドリル基を含有する化合物）は、塩素イオンと反応し、それらを溶液から効果的に除去するからである。従って、核酸を不活化するための処方物において使用するための塩素含有成分の濃度を選択する場合、処理される表面上または溶液中の予想される核酸の量についてだけでなく、非有機起源の干渉物質の供給源と同様に予想される有機負荷についても考察しなければならない。干渉物質はまた、非塩素ベースの不活剤に影響し得、そしてこの理由のために、不活剤に対するその影響は、表面上または溶液中の核酸を不活化するのに必要とされる不活剤の濃度を決定する場合に評価されるべきである。
【００１１】
上記処方物の腐食阻害剤は、上記不活剤の腐食効果を相殺するために選択される。一例として、漂白剤は、実験機器および備品を長い期間にわたって損傷し得、早期の置き換えが必要とされる腐食性の高い物質である。本発明者らは、予想外にも、腐食阻害剤は、不活剤の活性に干渉しないことを見出した。本発明の腐食阻害剤としては、ホスフェート、ホウ酸塩、炭酸水素ナトリウム、当該分野で公知の洗剤および他の腐食阻害剤が挙げられる。炭酸水素ナトリウムが、特に好ましい。上記処方物中に存在する腐食阻害剤の濃度は、表面上または溶液中に直接使用するために最終作業溶液中で不活剤と合わされる場合、好ましくは約１０ｍＭ〜約７５０ｍＭの範囲である。腐食阻害剤のｐＨは、不活剤の活性のいずれの経時的な喪失も制限し、さらに依然としてその不活剤の腐食性を低減するのに有効であるように選択されるべきである。例として、ホスフェートのナトリウム塩は、ｐＨ６．４およびｐＨ７．５において次亜塩素酸ナトリウムを不安定化するが、ｐＨ９．１およびｐＨ９．５においてはそうではないことが見い出された。逆に、ホスフェートのナトリウム塩は、ｐＨ９．１およびｐＨ９．５においてＤＣＣを不安定化するが、ｐＨ６．４およびｐＨ７．５においてはそうではないことが見い出された。
【００１２】
湿潤剤は、不活剤が処理される表面と十分に接触するのを確実にし、そして／またはその不活剤および／もしくは汚染除去される表面上または溶液中に存在し得る他の物質（例えば、核酸、有機物質、油またはフィルムなど）の溶解度を改善するために処方物中に含まれる。洗剤および界面活性剤は、好ましい湿潤剤である。なぜならば、それらは、表面張力を低下させ、その不活剤によって表面をより完全に湿潤させるからである。さらに、洗剤および界面活性剤は、表面から除去されるか、または溶液中で不活化される物質を可溶化するのを助ける。しかし、洗剤および界面活性剤は泡立つ傾向があるので、洗剤および界面活性剤の型ならびに濃度は、最終作業溶液において良好な湿潤特性および可溶化特性を提供しながら泡立ちを制限するように選択されるべきである。好ましい洗剤および界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、ＰＨＯＴＯ−ＦＬＯ（登録商標）２００溶液、サポニン、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、Ａｌｃｏｎｏｘ、Ｍｉｃｒｏ−９０（登録商標）洗剤およびポリオキシエチレン洗剤（例えば、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）が挙げられる。最も好ましいのは、好ましくは最終作業溶液において約０．００５％（ｗ／ｖ）〜約１％（ｗ／ｖ）、約０．００５％（ｗ／ｖ）〜約０．１％（ｗ／ｖ）、または約０．００５％（ｗ／ｖ）〜約０．０２％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度のＳＤＳおよびＬＬＳである。
【００１３】
上記処方物は、溶液中の処方物の成分の維持を助けるための可溶化剤をさらに含む。この可溶化剤は、例えば、有機溶媒または乳化剤（例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｌａｖｏｒｓ  ａｎｄ  Ｆｒａｇｒａｎｃｅｓ（ＩＦＦ）  ｏｆ  Ｈａｚｌｅｔ，ＮＪから利用可能な柑橘系の芳香剤である、芳香剤番号２１４１−ＢＧで見出されるもの）を含み得る。芳香剤は、不活剤（例えば、次亜塩素酸ナトリウム）のにおいをマスクするというさらなる利点を有し得る。処方物中に含まれ得る有機溶媒としては、酢酸ベンジル、ＰＳ２０およびイソプロパノールが挙げられる。処方物中に含まれ得る乳化剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０）、レシチン、およびジステアリン酸エチレングリコールが挙げられる。いくつかの場合において、本発明者らは、腐食阻害剤と合わせた場合に溶液中の可溶化剤を維持するために湿潤剤が必要とされること、および腐食阻害剤と合わせた場合に溶液中の洗剤を維持するために可溶化剤が必要とされることを見出した。そして、処方物が不活剤も含む場合、溶液中の４種全ての成分は残っていた。可溶化剤が、ＩＦＦ芳香剤番号２４１５−ＢＧまたはＩＦＦ芳香剤番号２１４１−ＢＧのような芳香剤である場合、その不活剤を含む最終作業溶液中の可溶化剤の好ましい濃度は、約０．００１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．００１％（ｖ／ｖ）〜約２％（ｖ／ｖ）、または約０．００２％（ｖ／ｖ）〜約０．２％（ｖ／ｖ）の範囲である。選択される可溶化剤の濃度は、不活剤および腐食阻害剤の活性および安定性に対して実質的な影響を有さないようにされるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の特に好ましい処方物において、以下の処方を有する６．７×濃縮物が調製される：６００ｍＭ  炭酸水素ナトリウム、ｐＨ９．３＋０．１％  ＳＤＳ＋０．０５％  ＩＦＦ芳香剤番号２１４５−ＢＧ。この処方物が不活剤をさらに含む場合、特に好ましい処方は、以下のとおりである：０．６％  次亜塩素酸ナトリウム＋９０ｍＭ  炭酸水素ナトリウム、ｐＨ９．３＋０．０１５％  ＳＤＳ＋０．００７５％  ＩＦＦ芳香剤番号２１４５−ＢＧ。当然、これらの好ましい処方物の成分および濃度は、本明細書中に記載される様式において、過度の実験を行うことなく改変され得、選択される不活剤の腐食効果の可能性を最小限にしながら、安定であり、表面上または溶液中の核酸を不活化し得る代替的な処方物に到達し得る。
【００１５】
沈殿の形成またはさもなければ非均質な処方物の形成を防ぐためには、薬剤を合わせる順番が重要であり得るという本発明者らの知見に基づいて、本発明のさらなる実施形態は、上記に記載された処方物を作製する方法に関する。この方法は、以下の順序の工程を包含する：（ｉ）腐食阻害剤および湿潤剤の固体形態を別々に溶解する工程；（ｉｉ）腐食阻害剤および湿潤剤の溶解形態を一緒に合わせて混合物を形成する工程；ならびに（ｉｉｉ）可溶化剤と混合物とを一緒に合わせて、腐食阻害剤、湿潤剤、および可溶化剤を含む処方物を形成する工程。この方法において、上記処方物の薬剤は、２２℃（おおよそ室温）の溶液において実質的に残っている。上記可溶化剤が固体形態で提供される場合、その可溶化剤は、可溶化剤と混合物と合わせる工程の前に溶解され得る。次いで不活剤が処方物に添加され得る。ここで、その不活剤は、処方物に直接添加されてもよいし、処方物と合わせる工程の前に溶解されてもよい。上記薬剤のいずれかの固体形態を溶解するために水が使用される場合、蒸留水または脱イオン水が好ましい。試験される多くの処方物に対して、薬剤を合わせる工程が上記の順序の工程から逸脱すると（例えば、可溶化剤が、最初に腐食阻害剤または湿潤剤のいずれかと合わされる）、非均質な溶液が形成されることが見出された。
【００１６】
湿潤剤を必要としないこれらの適用に対して、本発明者らは、不活剤が核酸を不活化する能力に実質的に影響することなく、不活剤と腐食阻害剤とが合わされ得ることを見出した。従って、腐食性不活剤を含有する本発明の処方物は、湿潤剤および可溶化剤を含むことは必要とされない。
【００１７】
本発明の別の好ましい不活剤は、過酸化水素および金属イオン（例えば、銅イオン、コバルトイオン、鉄イオン、またはマンガンイオン（例えば、硫酸銅または酢酸銅））を含む。特に、溶液ベースの適用に対して、本発明者らは、金属イオン（例えば、銅イオン）は、上記不活剤が、ピペラジンまたはピペラジン基を含む試薬（例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸））、アセテート、ならびに同様の化合物および試薬）をさらに含む場合に、核酸の不活化において過酸化水素によって活性である化学的構成中で安定化され得ることを見出した。驚いたことに、本発明者らは、ピペラジンが過酸化水素および銅イオンの存在下において核酸の不活化を刺激し得ることをさらに見出した。この不活剤の過酸化水素は、好ましくは、約０．５％（ｗ／ｖ）〜約３０％（ｗ／ｖ）、約１％（ｗ／ｖ）〜約１５％（ｗ／ｖ）、または約１％（ｗ／ｖ）〜約６％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で存在する。例えば、硫酸銅が金属イオンの供給源である場合、硫酸銅の好ましい濃度範囲は、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約２．５ｍＭ、または約１ｍＭ〜約２．５ｍＭである。そして、核酸の不活化を刺激するためにピペラジンが使用される場合、ピペラジンの好ましい濃度の範囲は、約０．５ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約１００ｍＭである。本実施形態の好ましい処方物は、３％  過酸化水素＋２ｍＭ  ＣｕＳＯ４＋５０ｍＭ  ピペラジン（ｐＨ５．５）を含む。この不活剤は、非腐食性であり、かつにおいがないという利点を有する。
【００１８】
さらなる実施形態において、本発明は、表面上に存在していることが疑われる核酸を不活化するための方法に関する。この方法において、不活剤を含む第１の量の第１の試薬が、その表面上に適用される。干渉物質（例えば、有機負荷および／もしくは油状フィルム、またはその表面上の残渣）の存在が予想されることによって正当化され、その表面上に存在する核酸の適切な不活化を確実にする場合、不活剤を含む第２の量の第２の試薬が、その表面上に適用され得る。この方法の第１の試薬と第２の試薬とは、同じものであっても、異なるものであってもよい。そしてこの試薬の一方または両方は、上記に記載された処方物のうちの１つを含み得る。好ましい実施形態において、上記試薬は、例えば、吸収性材料（例えば、ペーパータオルまたはコットンガーゼ）で拭うことによって、その試薬が完全にエバポレートする機会を有する前に、表面から除去される。その試薬が完全にエバポレートする前に拭うことによって、試薬によって化学的に不活化されていない可能性のある核酸が、吸収性材料によって機械的に除去され得る。さらに、第１の適用の後に吸収性材料で拭うことによって、第１の試薬（これは、第２の適用において不活剤の全てまたは一部分を消費し得る）によって可溶化された他の物質が、除去され得る。従って、特定の好ましい様式において、好ましい実施形態の適用工程と除去工程との間には、実質的な「浸漬時間」は存在しない。このことは、表面に対する試薬の適用と、そこからの試薬の除去との間の遅れは、数分に過ぎず、好ましくは１分に過ぎず、そして、より好ましくは、表面からの試薬の除去は、その表面に試薬を適用した直後に行われることを意味する。また、汚染の可能性のある全ての供給源を避けるために、核酸を不活化するための試薬は、手袋をはめて適用され、そしてその試薬の除去は別の手袋をはめて行うことが推奨される。
【００１９】
第１の試薬を適用する前に表面上の有機負荷を減少させるために、その表面は、洗剤を用いて前処理され得る。さらに、表面適用に対して、その表面から第１の試薬または第２の試薬を除去した後に水で洗浄しないことが推奨される。なぜならば、水は、増幅可能な核酸、または増殖反応を干渉し得る核酸もしくは他の化学物質を含み得るからである。
【００２０】
さらに別の実施形態において、本発明は、上記に記載される処方物を使用して１以上の導管中に存在することが疑われる核酸を不活化するための方法に関する。この導管は、例えば、１以上のピペットまたはアスピレーターのマニフォールドにおいて存在し得る。この方法において、上記不活剤を含む処方物は、例えば、吸引によって１以上の導管に引き込まれる。次いで、この処方物は、１以上の導管から分配される。この処方物を分配した後、その１以上の導管は、洗浄溶液を１以上の導管に引き込み、次いでその洗浄溶液を導管から分配することによって、洗浄溶液に曝され得る。この洗浄溶液は、例えば、精製水または試薬溶液であり得、導管からの処方物の残渣量をリンスするために使用される。
【００２１】
さらに別の実施形態において、本発明は、１以上の容器において、核酸を不活化する際に使用するための上記に記載されるような処方物を備えるキットに関する。１つの実施形態において、上記キットは不活剤を含み、この不活剤は、好ましくは、腐食阻害剤、湿潤剤および／または可溶化剤を含む１以上の容器と分かれた容器に含まれる。この処方物の１以上の成分は、特定の容量の最終溶液を作製するために適した事前測定された量で提供されてもよいし、バルク粉末として提供されてもよい。事前測定される場合、成分の粉末形態が、パケットもしくはカプセルで提供されるか、または錠剤として提供されて、処方物の他の成分と合わされる前に水中に溶解され得る。このキットは、不活剤と処方物の他の成分を合わせるための、実体のある形態で記録された指示書（例えば、紙、ディスケット、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、またはビデオカセット）をさらに備える。このキットはまた、核酸増幅反応を行うための１種以上の試薬をさらに備える。このような試薬は、目的の核酸配列を増幅する際に使用するための１種以上の酵素試薬（例えば、ＲＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼ）を含み得る。転写ベースの増幅を行う際に使用するための酵素試薬としては、例えば、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）が挙げられる。他の増幅試薬にはまた、例えば、増幅オリゴヌクレオチド（例えば、プライマー、プロモーター−プライマーおよび／またはスプライシングの鋳型）、ヌクレオチド三リン酸、酵素活性に必要とされる金属イオンおよび補因子が含まれる。
【００２２】
（詳細な説明）
本発明は、一部には、核酸を不活化するために有用な処方物、方法およびキットに関する。これらの処方物、方法およびキットは、上記に記載されており、そして以下の実施例および特許請求の範囲にも記載されている。さらに、実施例は、加工表面上、実験機器上および／もしくは溶液中の核酸を不活化するために有用であるか、または例えば消毒剤として使用され得る本発明の処方物を選択するためのスクリーニング方法を記載する。このような処方物はまた、タンパク質および脂質のような生物学的分子を不活化するためにも有用であり得る。実施例では、増幅前の適用および増幅後の適用の両方における多くの例示的な処方物の効果をさらに考察する。
【実施例】
【００２３】
以下に記載される実施例は、本発明を説明するが、本発明を限定するものではない。
【００２４】
（実施例１）
（ゲル電気泳動によるＤＮＡの可視化に対する種々の濃度の漂白剤の効果）
７１マーのＤＮＡオリゴヌクレオチドを、６．１５％（ｗ／ｖ）の次亜塩素酸ナトリウムの濃度において、種々の濃度のＵｌｔｒａ  Ｃｈｌｏｒｏｘ（登録商標）Ｂｌｅａｃｈ（Ｔｈｅ  Ｃｈｌｏｒｏｘ  Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｏａｋｌａｎｄ，ＣＡ）と反応させて実験を実施し、そしてポリアクリルアミドゲル電気（ＰＡＧＥ）を使用してその反応生成物を分析した。１７３μｇ／ｍＬの濃度の２μＬのＤＮＡオリゴヌクレオチドをサンプルバイアル中の希釈水と混合することによって１０個のサンプルを調製し、その後種々の濃度の漂白剤を添加して各サンプルの総容量を２０μＬとした。このサンプルを約１０秒間ボルテックスによって混合し、次いで１８０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基、１８０ｍＭ  ホウ酸、４ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（ｐＨ８．０）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；カタログ番号ＬＣ  ６８７６）を含む２×ＴＢＥ尿素サンプル２０μＬを提供して、各サンプルの総容量を４０μＬとした。再度、このサンプルを約１０秒間ボルテックスして混合した。サンプル中の漂白剤の最終濃度は、以下の表１に記載されるように０％〜５０％の漂白剤の範囲であった。各サンプルの１０μＬアリコートを、１０％ポリアクリルアミドＴＢＥ尿素ゲルの１０レーンのうちの１つにロードし、そのゲルを、４０分間１８０Ｖで泳動した。泳動を完了させて、ゲルをそのキャストからはずし、蒸留水で１０，０００分の１に希釈したＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉ核酸ゲル染色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲ；カタログ番号Ｓ７５６３）１００ｍＬを接触させ、そして３０分間１０ｒｐｍで混合した。染色の後、ゲルをＣｈｅｍｉＩｍａｇｅｒＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ  ４４００（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）を使用して撮影した。ゲル上で染色した分離した生成物は、通常、バンドといわれる。結果の電気泳動図のコピーを図１に提示する。
【００２５】
【表１】
2007527243.tif 000003
図１の電気泳動図において説明した結果から、目に見える最後のバンドはレーン３に現れることを理解し得る。これらの結果は、０．０３％（０．２５ｍＭ）と０．１％（０．８２ｍＭ）との間の次亜塩素酸ナトリウムが、サンプル中に存在するＤＮＡを実質的に変更するために必要とされることを示唆する。上記に示したＤＮＡオリゴヌクレオチドの濃度から、サンプル中のヌクレオチド濃度が０．５２ｍＭであったことを決定した。従って、ヌクレオチドに対する次亜塩素酸ナトリウムのモル比は、およそ１：１であり、このことは、約１モルの次亜塩素酸ナトリウムが約１モルのヌクレオチドと反応することを示唆する。０分〜２０分のインキュベーション時間を比較する別の同様の実験から、次亜塩素酸塩インキュベーションの時間経過に対してオリゴヌクレオチドバンドの出現に変化がないことが示され、この反応速度が速いことを示唆した。
【００２６】
（実施例２）
（ゲル電気泳動によるＤＮＡ／ＲＮＡキメラの可視化に対する種々の濃度の漂白剤の効果）
実施例１の実験のＤＮＡオリゴヌクレオチドを２００μｇ／ｍｌの濃度の６０マーＤＮＡ／ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドで代用して、実施例１の実験を繰り返した。このキメラのＲＮＡは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドからなった。結果の電気泳動図のコピーを図２に示す。これは、オリゴヌクレオチドバンドの大部分は０．１％の漂白剤で消え、次亜塩素酸ナトリウム対ヌクレオシドの１：１のモル比について再び示す。この実験のゲルの種々のレーンにおいて使用した漂白剤の濃度は、実施例１の実験で記載したものと同じである。
【００２７】
（実施例３）
（ゲル電気泳動によるＤＮＡの可視化に対する種々の濃度の漂白剤の効果）
ジクロロイソシアヌル酸ナトリウム塩（ＤＣＣ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ；Ｐｒｏｄ．番号２１，８９２−８）およびＵｌｔｒａ  Ｃｈｌｏｒｏｘ（登録商標）Ｂｌｅａｃｈ（６．１５％（ｗ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウム）を、この実験において、核酸と反応するその比較能力について、種々の利用可能な塩素濃度で試験した。試験した塩素濃度を以下の表２に記載する。７１マーＤＮＡオリゴヌクレオチドの使用を包含する全ての他の局面において、この実験は、実施例１に詳述した実験と同一であった。
【００２８】
【表２】
2007527243.tif 000004
この実験の結果を図３に示す。これは、純粋なＤＣＣが、同じ塩素濃度の漂白剤溶液よリも低い濃度でＤＮＡバンドを消失させることを示す。
【００２９】
（実施例４）
（ゲル電気泳動によるＤＮＡ可視化に対する種々の濃度の過酸化水素および過酸化水素＋硫酸銅の効果）
この実験において、５３μｇ／ｍＬの濃度で存在する７１マーＤＮＡオリゴヌクレオチドを、種々の濃度の３０％（ｗ／ｖ）過酸化水素（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｔｕｓｔｉｎ，ＣＡ；カタログ番号ＢＰ２６３３−５００）および３０％（ｗ／ｖ）過酸化水素＋硫酸銅（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ；Ｐｒｏｄ．番号４５，１６５−７）と反応させ、その反応生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を使用して分析した。ＤＮＡと水とを合わせた後に３０％（ｗ／ｖ）過酸化水素（８．８Ｍ）および／または１ｍＭ硫酸銅を添加して、１０個のサンプルを以下の表３に示す様式で調製した。この実験の残りの手順の詳細は、実施例１に記載したものと同じである。以下の表４に各レーン中の過酸化物の濃度を記載する。
【００３０】
【表３】
2007527243.tif 000005
【００３１】
【表４】
2007527243.tif 000006
結果の電気泳動図を図４に示す。これは、過酸化物および硫酸銅は、示された濃度においてＤＮＡオリゴヌクレオチドバンドを独立しては消失させないことを示す。しかし、この電気泳動図は、過酸化物および硫酸銅の混合物が試験した全ての濃度においてＤＮＡオリゴヌクレオチドを消失させるのに有効であることを示すようである。このことは、硫酸銅は、核酸の分解において過酸化物に対する触媒として機能し得ることを示唆する。
【００３２】
（実施例５）
（ゲル電気泳動によるＤＮＡの可視化に対する、硫酸銅の存在下での種々の濃度の過酸化水素の効果）
実施例４の実験を、ゲルの全てのレーンでより低い濃度の過酸化水素成分および１００μＭ硫酸銅を使用して繰り返した。ゲルの各レーンの過酸化物の最終濃度を以下の表５に記載する。
【００３３】
【表５】
2007527243.tif 000007
結果の電気泳動図のコピーを図５に示す。これは、０．２％（ｗ／ｖ）過酸化水素ではバンドがなく、０．１％（ｗ／ｖ）過酸化水素においてかすかなバンドのみがあることを示す。
【００３４】
（実施例６）
（漂白剤のＤＮＡとの反応に対するＮＡＬＣの効果）
漂白剤は、種々の有機物質と反応することが公知である。従って、これらの物質は、漂白剤と反応し、その漂白剤を消費することによって、核酸の不活化に干渉し得る。従って、これらの有機物質の存在は、ＤＮＡと有機物質との両方と反応するのに十分な漂白剤の存在によって補償されなければならない「有機負荷」を構成する。この実験において、有機負荷化合物（すなわち、漂白剤を消費することが予想され得る化合物）であるＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）の効果の除去を、種々の濃度のＵｌｔｒａ  Ｃｈｌｏｒｏｘ（登録商標）Ｂｌｅａｃｈの存在下で試験した。ＮＡＬＣは、増幅反応での使用が意図されるいくつかの酵素試薬において見出される還元剤である。この実験において、１０個のサンプルの２つのセットを調製し、各サンプルは、１７３μｇ／ｍＬの濃度で２μＬの７１マーＤＮＡオリゴヌクレオチドを含んだ。第１のセットのサンプルは、ＮＡＬＣを含まなかったが、第２のセットのサンプルの各サンプルは、１１．４μｇ／ｍｌの濃度で１６μＬのＮＡＬＣを含んだ。このサンプルを、まずＤＮＡおよびＮＡＬＣ（存在する場合）をサンプルバイアルに提供し、約１０秒間のボルテックスによりＮＡＬＣを含有するサンプルを混合することによって調製した。次いで、種々の濃度で両方のセットのサンプルに漂白剤を添加し、蒸留水を加えて各サンプルの総容量を２０μＬにした。このサンプルを約１０秒間ボルテックスすることによって混合し、その後２０μＬの２×ＴＢＥ尿素サンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；カタログ番号ＬＣ  ６８７６）を添加して各サンプルの総容量を４０μＬにした。このサンプルを約１０秒間ボルテックスすることによって再度混合した。このサンプル中の漂白剤の最終濃度は、以下の表６に記載するように、０％〜５０％の漂白剤の範囲であった。１０％ポリアクリルアミドＴＢＥ尿素ゲル（２セットのサンプルの各々について提供する分離ゲル）の１０レーンのうちの１つに、各サンプルの１０μＬアリコートをロードし、そしてそのゲルを１８０Ｖで４０分間泳動した。泳動を完了し、ゲルをそのキャストからはずし、蒸留水で１０，０００分の１に希釈したＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉ核酸ゲル染色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；カタログ番号Ｓ７５６３）１００ｍＬと接触させ、そして３０分間１０ｒｐｍで混合した。染色の後、ゲルをＣｈｅｍｉＩｍａｇｅｒＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ  ４４００を使用して撮影した。結果の電気泳動図のコピーを図６に提示する。
【００３５】
【表６】
2007527243.tif 000008
図６の電気泳動図で説明した結果から、はっきりと分かる最後のバンドは、ＮＡＬＣを含まないサンプルを有するゲルのレーン３（０．０３％（ｖ／ｖ）漂白剤）およびＮＡＬＣを含むサンプルを有するゲルのレーン８（１０％（ｖ／ｖ）漂白剤）に現れることを理解し得る。これらの結果は、ＤＮＡバンドを消失させるために必要な漂白剤の濃度は、ＮＡＬＣの存在によって影響され、このことは、漂白剤との反応によってＤＮＡと競合する可能性があることを示す。
【００３６】
（実施例７）
（過酸化水素および硫酸銅の混合物とＤＮＡとの反応に対するＮＡＬＣおよびヒト血清の効果）
この実験において、種々の濃度の過酸化水素および硫酸銅とＤＮＡとの反応に対する、ＮＡＬＣおよびヒト血清の効果を試験した。１１個のサンプルのセットを調製し、各サンプルは、５３μｇ／ｍＬの濃度で２μＬの７１マーＤＮＡオリゴヌクレオチドを含んだ。このサンプルの他の成分は、１００μＭ硫酸銅、３０％（ｗ／ｖ）過酸化水素、および１１．４ｍｇ／ｍＬの濃度のＮＡＬＣを含んだ。サンプルバイアル中の各成分の量を以下の表７に記載する。サンプルバイアル中で過酸化水素を除いた全てのサンプル成分を合わせ、約１０秒間のボルテックスにより混合することによって、サンプルを調製した。混合の後、過酸化水素を種々の濃度でサンプルに添加して、サンプル１の総容量を２０μＬとし、そしてサンプル２〜１１を２２μＬとして、以下の表８に示す最終濃度とした。このサンプルを約１０秒間ボルテックスすることによって再度混合し、その後２０μＬの２×ＴＢＥ尿素サンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；カタログ番号ＬＣ  ６８７６）を添加して、サンプル１の総容量を４０μＬとし、そしてサンプル２〜１１のサンプルを４２μＬとした。この手順の残りおよび試薬の供給源は、上記の実施例６に記載したものと同一である。結果の電気泳動図のコピーを図７に提示する。
【００３７】
【表７】
2007527243.tif 000009
【００３８】
【表８】
2007527243.tif 000010
図７の電気泳動図で説明する結果は、ＮＡＬＣおよび血清が、過酸化水素および硫酸銅の混合物とＤＮＡとの反応に干渉することを示す。従って、これらの結果は、ＤＮＡバンドを消失させるのに必要とされる過酸化水素の量は、ＮＡＬＣおよびヒト血清の存在によって影響され、このことは、漂白剤との反応についてＤＮＡと競合する可能性があることを示す。
【００３９】
（実施例８）
（純粋系における核酸の漂白剤との反応）
この実験を実施して、純粋系において種々の漂白剤濃度がＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（「標的」）に由来する精製リボソームＲＮＡを不活化する能力を評価した。４μＬの標的含有水および表９に示される濃度の４μＬの漂白剤を含むように、８個のサンプルチューブを最初にセットした。サンプルチューブ６および８については、漂白剤の代わりに４μＬの水を使用した。この実験において使用した漂白剤は、Ｕｌｔｒａ  Ｃｈｏｌｏｒｏｘ（登録商標）漂白剤（６．１５％（ｗ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウム）であった。セットした後、サンプルチューブの内容物を室温で５分間インキュベートした。
【００４０】
【表９】
2007527243.tif 000011
室温でのインキュベーション後に、３９２μＬの水（氷上冷却）を各サンプルチューブに添加した。次いでこのサンプルを、リアルタイム転写媒介性増幅（ＴＭＡ）アッセイによって分析した。このアッセイにおいて、各サンプルチューブからの４μＬアリコートと、３００μＬの増幅試薬（４４．１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２．８２％（ｗ／ｖ）トレハロース、３３．０ｍＭ  ＫＣｌ、９．４１ｍＭ  ｒＡＴＰ、１．７６  ｒＣＴＰ、１１．７６  ｒＧＴＰ、１．７６ｍＭ  ＵＴＰ、０．４７ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．４７ｍＭ  ｄＣＴＰ、０．４７ｍＭ  ｄＧＴＰ、０．４７ｍＭ  ｄＴＴＰ、３０．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．３０％（ｖ／ｖ）エタノール、０．１％（ｗ／ｖ）メチルパラベン、０．０２％（ｗ／ｖ）プロピルパラベン、および０．００３％（ｗ／ｖ）フェノールレッド）（ｐＨ７．７）とを合わせることによって、増幅反応混合物を調製し、そして転写媒介性増幅（ＴＭＡ）手順に続いて標的の領域を増幅する（Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号を参照のこと）ための２５．６ｐｍｏｌのＴ７プロモーター−プライマーおよび２０．０ｐｍｏｌの非Ｔ７プライマーと、リアルタイムで生じたアンプリコンを検出する（Ｔｙａｇｉら、「Ｄｅｔｅｃｔａｂｌｙ  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｄｕａｌ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ａｓｓａｙｓ  ａｎｄ  Ｋｉｔｓ」、米国特許第５，９２５，５１７号を参照のこと）ための８０ｐｍｏｌの分子ビーコンプローブとを加えた。この実験のプローブおよびプライマーを、標準的なホスホラミダイト化学を使用してＥｘｐｅｄｉｔｅＴＭ  ８９０９核酸合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で合成した。例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４：２８７（１９８７）を参照のこと。Ｃｙ５−ＣＥホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ；カタログ番号１０−５９１５−９０）および３’−ＢＨＱ−２  Ｇｌｙｃｏｌａｔｅ  ＣＰＧ（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ；カタログ番号ＣＧ５−５０４２Ｇ−１）を使用して、分子ビーコンプローブをＣｙＴＭ５色素およびＢＨＱＴＭ色素との相互作用を包含するように合成した。
【００４１】
次いで、増幅反応混合物を９６ウェルのＭｉｃｒｏｔｉｔｅｒ（登録商標）プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ；カタログ番号９５０２８８７）にセットした。３回の実験において、各ウェルは、７５μＬの軽油および７５μＬの増幅反応混合物を含んだ。ＴｈｅｒｍａｌＳｅａｌシーリングフィルム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；製品番号Ｚ３６，９６７−５）でプレートをカバーし、Ｓｏｌｏ  ＨＴ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅインキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｍｉｌｏｒｄ，ＭＡ）中で６２℃で１５分間インキュベートして、プロモーター−プライマーを標的にハイブリダイゼーションさせ、続いて４２℃で１５分間（２回目）Ｓｏｌｏ  ＨＴ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅインキュベーター中でインキュベートした。プレートの内容物をインキュベートした後、マルチチャネルピペットを使用して２５μＬの酵素試薬（５０ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）、５８ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３．０３％（ｗ／ｖ）トレハロース、１０％  ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００洗剤、１．０４ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１２０ｍＭ  ＫＣＩ、１２０ＲＴＵ／μＬ  モロニーマウス白血病ウイルス（「ＭＭＬＶ」）逆転写酵素、および８０Ｕ／μＬ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）を添加した。ここで、活性の１「ユニット」を、ＭＭＬＶ逆転写酵素に対する、３７℃、１５分間における５．７５フェムトモルのｃＤＮＡの合成および放出として定義し、各サンプルについて、ｐＨ７．０におけるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼに対する３７℃での２０分間における５．０フェムトモルのＲＮＡ逆転写の生成物として定義した。酵素試薬の各セットを添加した直後に、反応ウェルの内容物を、ピペットによって保持された対応するピペットチップで撹拌することによって混合した。リアルタイムでアンプリコンの形成を測定するために、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔマイクロプレート蛍光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；製品番号５２１０４７０）にプレートを移し、４２℃で６０分間インキュベートした。反応ウェルからの蛍光を、６３９ｎｍの励起フィルターおよび６７１ｎｍの発光フィルターを使用して３０秒ごとで測定した。
【００４２】
この実験の結果を図８のグラフに報告する。このグラフは、ｙ軸に相対蛍光ユニット（ＲＦＵ）をプロットし、ｘ軸に時間（分）をプロットする。この結果は、試験した最も低濃度の漂白剤である０．２％漂白剤においてさえも、この純粋系中の標的核酸を不活化し、その結果核酸が検出可能に増幅され得ないことを示す。この実験における検出可能な増幅は、６０分の増幅期間においてバックグラウンドのＲＦＵ値（サンプルチューブ８）の２倍を超えるＲＦＵ値である。
【００４３】
（実施例９）
（純粋漂白剤系における核酸不活化のさらなる特徴付け）
多重アッセイを使用して、核酸を不活化する際の有効性について、数個の処方物を試験した。
【００４４】
（Ａ．リアルタイムＴＭＡ結果）
純粋系においてＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏａｅａ（Ｎｇｏ）リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を、０〜２０％の市販の漂白剤と反応させ（最も低い漂白剤濃度は、０．２％であった）、反応生成物をリアルタイムＴＭＡアッセイによって分析した（実施例８を参照のこと）。最も低い漂白剤濃度においてさえ、リアルタイムアッセイの感度の制限内でｒＲＮＡを不活化した（図９Ａ）。
【００４５】
純粋系において、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（Ｃｔｒ）ｒＲＮＡもまた、０〜２０％漂白剤と反応させ（最も低い漂白剤濃度は、０．０１６％であった）、反応生成物をリアルタイムＴＭＡアッセイによって分析した。この最も低い漂白剤濃度もまた、ｒＲＮＡを不活化した（図９Ｂ）。
【００４６】
（Ｂ．キャピラリー電気泳動の結果）
リボソームＲＮＡを溶液中の漂白剤と反応させ、生成物をキャピラリー電気泳動によって分析した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを利用して、不活化溶液に曝した核酸を特徴付けた。１０μＬの総反応物に、以下のものを（順番に）添加した：（ａ）Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ｈ２Ｏまたは緩衝液、（ｂ）指示された量の試薬（例えば、漂白剤またはＨ２Ｏ２由来の−ＯＣｌ）、および（ｃ）０ｎＭ（ブランク）または１５０ｎＭ（７１８μＭ＝４７０ｎｇ／μＬ  ｎｔ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍｔｂ）ｒＲＮＡまたは１５ｎＭ（７１．８μＭ＝４７．０ｎｇ／μＬ  ｎｔ）Ｍｔｂ  ｒＲＮＡ。この反応物を１０分間室温（約２３℃）でインキュベートし、次いで９０μＬの１ｍＭ  アスコルビン酸ナトリウム（最終９００μＭ）を添加した。ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）プロトコル（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）においてと同様に、ＲＮＡラダーを７０℃で２分間変性し、次いで各反応物の１μＬを、５μＬのサンプル緩衝液を含むＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）またはＰｉｃｏ  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）のウェルにロードした。この成分を混合し、アッセイの原核生物の総ＲＮＡをＢｉｏ  Ｓｉｚｉｎｇプログラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）で泳動した。
【００４７】
キャピラリー電気泳動分析からの結果は、１：１の比の次亜塩素酸塩対ｒＲＮＡヌクレオチドが、ｒＲＮＡピークを実質的に除くことを示した（図９Ｃ〜図９Ｆ）。ｒＲＮＡと漂白剤との間の反応の時間経過をまた実施した（図９Ｇおよび図９Ｈ）。１６Ｓサブユニットおよび２３Ｓサブユニットの両方との反応は、非常に速く、本質的に１分以内で終了する。ｒＲＮＡの崩壊についての擬一次速度定数は、いずれにせよ０．０２ｓ−１に近づく。
【００４８】
（Ｃ．結論）
純粋系における漂白剤（次亜塩素酸塩）と核酸との反応は速く、本質的に１：１の比の次亜塩素酸塩対ヌクレオチドで完了する。これらのデータは、漂白剤を使用して実験室中の核酸の汚染除去が全く観察されないことは、次亜塩素酸塩と核酸とのゆっくりとした反応に起因するのでも、漂白剤が核酸に対して非常にモル過剰であることについての必要性に起因するのでもないことを示唆した。
【００４９】
（実施例１０）
（有機負荷の存在下における漂白剤による核酸不活化のさらなる特徴付け）
漂白剤とオリゴヌクレオチドとの間の反応に対する、有機負荷物質であるＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）の効果を、実施例６のＰＡＧＥによって特徴付けた。この後に提示するのは、ＰＡＧＥおよび他の特徴付け方法を使用した、オリゴヌクレオチドと漂白剤との間の反応に対するＮＡＬＣおよび他の有機負荷物質の効果の特徴である。
【００５０】
（Ａ．リアルタイムＴＭＡ結果）
異なる量の種々の有機負荷物質の存在下において、リボソームＲＮＡを漂白剤と反応させた。次いで、このＲＮＡが増幅する能力をリアルタイムＴＭＡを使用して試験した。有機負荷物質は、以下を含んだ：ＡＰＴＩＭＡ  ＣＯＭＢＯ  ２（登録商標）アッセイキット（カタログ番号１０３２；Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からの増幅試薬、ハイブリダイゼーション試薬、酵素試薬、および選択試薬、ならびにこれらの混合物、尿運搬（ｕｒｉｎｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）培地（ＵＴＭ；カタログ番号１０４０、男性および女性の尿標本のためのＡＰＴＩＭＡ  ＣＯＭＢＯ  ２（登録商標）アッセイ尿標本収集キット；Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、スワブ運搬（ｓｗａｂ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）培地（ＳＴＭ）、ＫＯＶＡ−ＴｒｏｌＴＭ（Ｈｙｃｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．；Ｇａｒｄｅｎ  Ｇｒｏｖｅ，ＣＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）およびヒト血漿。これらの化合物のうち、ＵＴＭおよび酵素試薬は、漂白剤とＲＮＡとの反応を干渉するのに最も有効であった。１つの実験において、２０％の市販の漂白剤が、ＵＴＭの効果を克服するのに必要とされ、これは、有機負荷物質の非存在下におけるｒＲＮＡと０．０１６％の漂白剤との非常に迅速で完全な反応と対照的である（図１０Ａ〜図１０Ｆ）。
【００５１】
（Ｂ．ＰＡＧＥ結果）
実施例１に開示した手順と類似の手順を使用して、ＰＡＧＥを実施した。手短には、既知量の７１マーオリゴヌクレオチドを、既知濃度の候補試薬を含む処方物とインキュベートした。２×ＴＢＥ尿素ローディング緩衝液（１８０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１８０ｍＭ  ホウ酸，４ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）の１×容量を、混合物溶液に添加して１０秒間ボルテックスした。１０％  ポリアクリルアミドＴＢＥ尿素ゲルの各レーンに、１０μＬのサンプルをロードした。このゲルを、オリゴヌクレオチドの長さに依存して、３５〜４０分間１８０Ｖで１×ＴＢＥランニング緩衝液中で泳動した。次いで、このゲルをキャストからはずし、１／１０，０００のＳＹＢｒ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ色素溶液中で２０分間染色した。染色したゲルをＣｈｅｍｉＩｍａｇｅｒＴＭ  ４４００を使用して画像化した。
【００５２】
種々の濃度の有機負荷化合物の存在下において、オリゴヌクレオチドを漂白剤と反応させ、反応混合物をＰＡＧＥによって分析した。血清、増幅試薬および酵素希釈緩衝液中のＮＡＬＣは、漂白剤とオリゴヌクレオチドとの反応に干渉した（図１１Ａ〜図１１Ｄ）。
【００５３】
（Ｃ．ＲＰ−ＨＰＬＣ結果）
逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣを利用して、標準的な手順を使用して不活化溶液に曝された核酸を特徴付けた。ＨＰＬＣ機器についての規格および利用した方法論は、以下の通りであった。４．６ｍｍの内径および１５ｃｍの長さを有するＺＯＲＢＡＸ（登録商標）Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ  Ｃ−８逆相カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を利用した。トリアセチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡ）／アセトニトリルを移動相として利用した。ここで緩衝液Ａは、０．１Ｍ  ＴＥＡＡを含み、緩衝液Ｂは、１００％アセトニトリルを含んだ。１５分の時間間隔で０．５ｍｌ／分の流速において、５％〜１００％の緩衝液Ｂの勾配を利用した。２．０  ＯＤ（オリゴヌクレオチド２６マー＝１０μＭ）の光学密度を有する５０μＬのオリゴヌクレオチドサンプルをカラムに注入し、カラム排出量を２５４ｎｍの波長で検出した。
【００５４】
ＮＡＬＣの存在下における漂白剤の２６マーＤＮＡオリゴマーとの反応と、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用した引き続くクロマトグラフィーとから、ＮＡＬＣが漂白剤のＤＮＡとの反応に干渉することが明らかになった。これらの結果は、実施例６のＰＡＧＥの知見を確認した。
【００５５】
（Ｄ．結論）
漂白剤と核酸との反応に効果的に干渉する物質は、尿運搬培地（ＵＴＭ）および酵素希釈緩衝液（ＥＤＢ）中のＮＡＬＣであった。漂白剤と核酸との反応に適度に干渉する物質は、スワブ運搬培地（ＳＴＭ）、ハイブリダイゼーション試薬、増幅試薬およびヒト血清であった。漂白剤と核酸との反応に弱く干渉する（または全く干渉しない）物質は、選択試薬、ＡＰＴＩＭＡ  ＣＯＭＢＯ  ２（登録商標）アッセイ標的捕捉試薬、ラウリル硫酸リチウムおよびＫＯＶＡ−ＴｒｏｌＴＭであった。このアッセイから、有機負荷物質（特に、一次アミンおよびスルフヒドリル基を含む物質）が、漂白剤と反応して漂白剤を消費し、その結果、核酸を不活化するために全く利用できなくなることが決定された。より低い濃度における漂白剤の汚染除去力の喪失は、反応速度が遅いことに起因してもいないし、ヌクレオチドに対して過剰の次亜塩素酸塩が必要とされることに起因してもいないが、それよりは他の化合物による漂白剤の消費に起因する。
【００５６】
（実施例１１）
（代替的な処方物および条件のさらなるスクリーニング）
漂白剤に対する代替的な処方物（例えば、ジクロロイソシアヌル酸（ＤＣＣ）または過酸化水素および銅イオンを含む溶液）を、ＰＡＧＥによって実施例３および実施例４において特徴付けた。この後に記載されるように、ＰＡＧＥおよび他のアッセイによって、これらの代替的処方物およびさらなる代替的処方物を特徴付けた。
【００５７】
（Ａ．ＰＡＧＥ結果）
７１マーオリゴヌクレオチドを種々の候補化合物と反応させ、その生成物をＰＡＧＥを使用して分析した。他の処方物のなかで、ＤＣＣまたは過酸化水素と硫酸銅とを含む溶液を試験した。実施例３に示すように、漂白剤よりも腐食性が低いＤＣＣは、より有効とはいかないまでも、オリゴヌクレオチドを不活化するための漂白剤と同程度に有効であった。スカベンジャー（酵素希釈緩衝液（ＥＤＢ）および血清を含む）のＤＣＣに対する効果をまた、試験し、そして漂白剤に対する効果と比較した。同様の効果を図１２に示すように観察した（結果は、ＥＤＢについてのもので、血清についての結果は示さず）。実施例４、５、および７に示すように、過酸化水素および硫酸銅を含む溶液（これは、においがなく、かつ腐食性もない）は、（１）オリゴヌクレオチドの移動またはオリゴヌクレオチドのバンドの保持の変化、および（２）有機負荷の効果の克服において合理的に有効であった。
【００５８】
他の候補溶液を、それらをオリゴヌクレオチドとインキュベートし、そして生じた反応生成物をＰＡＧＥによって分析することによって特徴付けた。以下の試薬は、このアッセイにおいて、核酸移動に対してもバンド強度に対してもほとんど変化がないか、または全く変化がなかったことを示した：（１）硫酸銅を含むかまたは含まないペルオキシモノサルフェート（ＫＨＳＯ５）；（２）ペルホウ酸塩；（３）ペルカーボネート；（４）ＫＢｒを含む過酸化水素；および（５）ＮＵＣＬＥＯＣＬＥＡＮＴＭ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．；Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）。
【００５９】
（Ｂ．ＲＰ−ＨＰＬＣ結果）
ＲＰ−ＨＰＬＣ保持シフトアッセイ（前述）を使用して、有機負荷物質（ＮＡＬＣ）の存在下または非存在下において、いくつかの漂白剤の代替的候補をスクリーニングした。以下は、１０％漂白剤と比較した場合の試験した代替的処方物の有効性の要約である。ここで、「＝」は、おおよそ等価なものであり、「＜」は、効果が低いものであり、そして「＞」は、効果が高いものである。
【００６０】
【表１０】
2007527243.tif 000012
上記アッセイによって１０％漂白剤よりも有効であると決定した処方物を太字で示す。従って、（ａ）ＮａＢｒ／ＮａＯＣｌまたは（ｂ）過酸化物／ＣｕＳＯ４を含む処方物は、この実験の条件下において単独の漂白剤と比較した場合、核酸を不活化するために同程度に有効であるか、またはより有効であった。
【００６１】
（Ｃ．キャピラリー電気泳動結果）
リボソームＲＮＡを溶液中で種々の候補処方物と反応させ、その生成物をキャピラリー電気泳動アッセイを使用して分析した。このアッセイにおいて、別々に試験した１ｍＭ  ジクロロイソシアヌレート（ＤＣＣ）および１７．５ｍＭ  ペルオキシモノサルフェート（Ｖｉｒｋｏｎ  Ｓ（登録商標）；ＤｕＰｏｎｔ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）は、０．７２ｍＭ  ｒＲＮＡオリゴヌクレオチドに対応するピークを実質的に消去した。インサイチュで産生されたＣｌ２（１０ｍＭ  ペルオキシモノサルフェート＋２０ｍＭ  ＫＣｌ）は、部分的に７２μＭ  ｒＲＮＡオリゴヌクレオチドを消失した。別々に試験すると、（ａ）インサイチュで産生されたＢｒ２（１０ｍＭ  ペルオキシモノサルフェート＋２０ｍＭ  ＫＢｒ）、（ｂ）１０μＭと１００μＭとの間のジクロロヒダントインまたはジブロモヒダントイン、（ｃ）１０μＭと１００μＭとの間の次亜臭素酸塩、および（ｄ）１０ｍＭ  ペルオキシモノサルフェート＋金属イオン（１ｍＭ  Ｃｕ２＋、１ｍＭ  Ｆｅ２＋または１０ｍＭ  Ｆｅ２＋）は、実質的に７２μＭ  ｒＲＮＡオリゴヌクレオチドを消失した。
【００６２】
（Ｄ．リアルタイムＴＭＡ結果）
リボソームＲＮＡを溶液中で種々の化合物と反応させ、次いで、ＲＮＡが増幅する能力を実施例８に記載したリアルタイムＴＭＡアッセイを使用して試験した。特定の処方物の有効性を以下に記載する。
【００６３】
Ｖｉｒｋｏｎ  Ｓ（登録商標）（ペルオキシモノサルフェート）。核酸を２．５％  Ｖｉｒｋｏｎ  Ｓ（登録商標）溶液（約８．７ｍＭ  ペルオキシモノサルフェート）と反応させた。これは、反応物（ここでは、酵素希釈緩衝液（ＥＤＢ）または尿輸送培地（ＵＴＭ））中に含まれる有機負荷よりも実質的に低い濃度であった。従って、２．５％  Ｖｉｒｋｏｎは、５μＬ  ＥＤＢまたはＵＴＭの存在下において核酸標的を実質的に不活化しなかった。
【００６４】
ＤＣＣ。１０％漂白剤とほぼ等価なものとして決定された８３ｍＭ  ＤＣＣ溶液は、ＥＤＢの存在下において標的を不活化した。
【００６５】
ペルオキシモノサルフェート／ＫＢｒ。ＵＴＭの存在下における標的ｒＲＮＡを、０．２５Ｍ  ペルオキシモノサルフェート／０．２５Ｍ  ＫＢｒで不活化した。試験した他の比は有効ではなく、さらなるアッセイを行って比を変動させることによって、最適な比を決定する。０．２５Ｍの各成分において、集中的な呈色およびにおい（Ｂｒ２に起因する）を観察し、ＵＴＭ／標的混合物を添加した後、残渣を形成した。この残渣を水中に５０×希釈に溶解した。この処方物の安定性は、さらなるアッセイにおいて反応条件を変動することによってさらに特徴付けられ得る。これらの成分を含む処方物が、安定性を限定されることが見出された場合、それらは、乾燥粉末処方物で提供され得、そしてその溶液は、使用の直前に調製され得る。
【００６６】
ペルホウ酸塩およびペルカーボネート。ペルホウ酸塩は、溶液で有用な濃度において十分には可溶性でない。ペルカーボネートは、８８０ｍＭ（３％過酸化物のほぼ等価物）に可溶性であった。銅（ＩＩ）と合わせた場合、この濃度のペルカーボネートは、核酸と反応し、本質的に３％過酸化水素の有効性を有した。しかし、銅（ＩＩ）と混合した場合、ペルカーボネートは、非常に迅速に酸素を発生し、このことは、活性試薬の安定性は、アッセイによるさらなる試験を必要とすることを示す。また、ペルカーボネートを銅（ＩＩ）／ピペラジンと合わせた場合、黄色の残渣が形成された。溶液中で活性の増強を観察した（過酸化水素／銅（ＩＩ）／ピペラジンと同様）が、その溶液特性は、理想的なものではなかった（低い溶解度、泡状）。従って、ペルカーボネート溶液は、有効な核酸不活化因子であるが、その溶液特性は、過酸化水素処方物よりも有望ではなかった。使用の直前に溶液を調製するために乾燥形態で成分を提供することは、これらの欠点のいくつかを克服する。
【００６７】
これらの結果から、（適切な濃度において）特に有効な化合物としては、漂白剤＋過酸化物、ＫＨＳＯ５＋ＫＢｒ、ＤＣＣおよび過酸化物＋ＵＴＭが挙げられた。この実験の特定の条件下で有効でない化合物としては、１５％過酸化物単独；過酸化物＋カリウム、ナトリウムまたは鉄のイオン；５ｍＭ  ブロモヒダントインまたはクロロヒダントインおよびＫＭｎＯ４が挙げられた。過酸化物＋銅の有効性は、対応するコントロール（すなわち、ＴＭＡを阻害するそれ自身の反応混合物）がなかったので、この研究時に決定しなかった。１ｍＭ  ＣｕＳＯ４／３％  Ｈ２Ｏ２が、１ｍＭ  ＣｕＢｒ２／３％  Ｈ２Ｏ２、ＣｕＣｌ２／３％  Ｈ２Ｏ２、またはＣｕ（ＮＯ３）２／３％  Ｈ２Ｏ２よりも高い程度まで、ｒＲＮＡオリゴヌクレオチドを不活化したことをまた、決定した。さらに、１ｍＭ  Ｃｕ（ＯＡｃ）２／３％  Ｈ２Ｏ２は、１ｍＭ  ＣｕＳＯ４／３％Ｈ２Ｏ２よりも高い程度までｒＲＮＡを不活化した。
【００６８】
本明細書において記載される分析方法からの結果を、以下の表に要約する。この表において、「＋」は、化合物が不活化されたことを示し；「−」は、化合物が、その条件下および使用した方法によって実質的に不活化されないことを示し；「＊」は、不確かな結果が得られ、示した条件においてアッセイを繰り返すことによってさらなる結果を得ることができることを示し；表記なしは、その条件を、示したアッセイによって試験しなかったことを示す。
【００６９】
【表１１】
2007527243.tif 000013
【００７０】
【表１２】
2007527243.tif 000014
これらの結果は、漂白剤（低下したレベル）、ジクロロイソシアヌレート（ＤＣＣ）、Ｈ２Ｏ２／Ｃｕ（ＩＩ）、ペルオキシモノサルフェート、ペルオキシモノサルフェート／ＫＢｒ（Ｂｒ２を発生する）および次亜臭素酸塩が、溶液中で特に強力な核酸不活化活性を示すことを示した。
【００７１】
（実施例１２）
（核酸増幅手順における核酸不活化処方物および方法のさらなる特徴付け）
複数の処方物およびそれらを適用する種々の方法を、ＡＰＴＩＭＡ  ＣＯＭＢＯ  ２（登録商標）アッセイ（この後に記載する）における核酸不活化効力および関連する成分について特徴付けた。以下は、このアッセイおよび特徴付けプロセスのために利用した物質のリストである。
【００７２】
増幅試薬
増幅再構成溶液
標的捕捉試薬
標的捕捉試薬Ｂ
ＣＴポジティブコントロール
ＧＣポジティブコントロール
油状試薬
洗浄緩衝液
尿輸送培地（ＵＴＭ）
スワブ輸送培地（ＳＴＭ）
酵素試薬
酵素再構成溶液
ＣＴ  ｒＲＮＡ
ＧＣ  ｒＲＮＡ
ＫＯＶＡ−ＴｒｏｌＴＭ（通常）
プローブ試薬
プローブリコン溶液
選択試薬
検出試薬Ｉ
検出試薬ＩＩ
頚管内スワブ
家庭用液体漂白剤（Ｃｈｌｏｒｏｘ（登録商標））
ジクロロイソシアヌレート（ＤＣＣ）
家庭用過酸化水素、３％  Ｕ．Ｓ．Ｐ．（Ｈ２Ｏ２）
硫酸銅（Ｃｕ（ＩＩ））
ペルオキシモノサルフェート（ＫＨＳＯ５）
以下は、特徴付け手順のために使用したいくつかの分析プロセスの記載である。
【００７３】
（Ａ．ポジティブ増幅反応およびネガティブ増幅反応の調製）
油状試薬（２００μｌ）を８０個の反応チューブ（１２×７５ｍｍ）に添加した。Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（ＣＴ）およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＧＣ）のｒＲＮＡの４．２×１０１０コピーを、３．１５ｍｌの再構成した増幅試薬に加えた。この加えた増幅試薬の７５μｌ（１×１０９コピー（約２．５ｎｇ）を反応チューブのうちの４０個に添加した（ポジティブサンプル）。標的を含まない増幅試薬（ネガティブサンプル）７５μｌを残りの４０個のチューブに添加した。全ての８０個のサンプルを１０分間６２℃でインキュベートし、次いで５分間４２℃でインキュベートした。２５μｌの再構成した酵素試薬を各チューブに添加し、そのラックを水浴から取り出し、ラックを振盪してチューブの内容物を混合し、次いでラックをすばやく水浴に戻した。反応チューブの内容物を６０分間４２℃でインキュベート（増幅）し、次いで１０分間８０℃でインキュベートした（酵素の不活性化）。ポジティブサンプルのうちの３８個とネガティブサンプルのうちの３８個とをプールし、各プールから油を除いた。２個の残ったポジティブサンプルおよびネガティブサンプルを、標準的なＡＰＴＩＭＡ  ＣＯＭＢＯ  ２（登録商標）マニュアルアッセイプロトコル（上記に記載される）に従ってアッセイした。
【００７４】
（Ｂ．ＣＴ＋ＧＣ  ｒＲＮＡサンプルの調製）
標準的な手順によって調製したＣＴおよびＧＣのｒＲＮＡの５×１０８コピーを、１００μｌのＵＴＭ：ＫＯＶＡ−ＴｒｏｌＴＭ（１：１比）に添加した（（以下の表に示した）いくつかの場合において、サンプルを１００μｌのＳＴＭに添加した）。この混合物の所望の数の複製物を、表面上にスポットする前のプールとして調製し得る。
【００７５】
（Ｃ．汚染除去アッセイプロトコル）
表面。汚染除去アッセイを、ＣｈｅｍＳｕｒｆ実験室ベンチの２×４ｆｔ切片上（「表面」）で行った。種々の実験の前、その間、およびその後に、その表面を５０％の漂白剤溶液（水で１：１希釈した家庭用液体漂白剤（例えば、Ｃｈｌｏｒｏｘ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  Ｂｌｅａｃｈ））で洗浄し、その後水でリンスした。ペーパータオルまたは大きなＫｉｍｗｉｐｅで拭った。
【００７６】
サンプル適用。１００μｌの各選択したサンプル（以下を参照のこと）を、直径約１．５インチの円形のスポットの表面に適用した。およそ８個のサンプルを、表面上に均一に空間をあけて適用した。およそ１５〜３０分間サンプルを乾燥させた。
【００７７】
サンプル収集。収集するサンプルの名称の標識をした輸送チューブ中の３ｍｌのスワブ輸送培地（ＳＴＭ）に、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄの頸管内スワブを入れた。このスワブを輸送チューブから除き、円運動を使用してサンプルが適用される各スポットに塗布した。各スワブをその輸送チューブに戻し、スワブの端部をスコアラインにおいて注意深く折り、そしてチューブを、その貫通できる（ｐｅｎｅｔｒａｂｌｅ）キャップを使用して閉め、次いでボルテックスした。
【００７８】
試験した不活化処方物。試験した処方物は、以下であった：
ａ）１０％漂白剤  １回適用
ｂ）１０％漂白剤  ２回適用
ｃ）４０ｍＭ  ＤＣＣ  １回適用
ｄ）４０ｍＭ  ＤＣＣ  ２回適用
ｅ）３％  Ｈ２Ｏ２、１ｍＭ  Ｃｕ（ＩＩ）  １回適用
ｆ）３％  Ｈ２Ｏ２、１ｍＭ  Ｃｕ（ＩＩ）  ２回適用
ｇ）１％  Ｈ２Ｏ２、１ｍＭ  Ｃｕ（ＩＩ）  １回適用
ｈ）１％  Ｈ２Ｏ２、１ｍＭ  Ｃｕ（ＩＩ）  ２回適用
ｉ）２００ｍＭ  ＫＨＳＯ５  １回適用
ｊ）２００ｍＭ  ＫＨＳＯ５  ２回適用。
【００７９】
汚染除去プロトコル。利用した汚染除去プロトコルは、以下の工程を包含した。
１）表面を洗浄した（上記を参照のこと）。
２）ネガティブコントロールのために、直径約１．５インチの円形領域からサンプルを収集し、表面をランダムに選択して、その後任意のポジティブサンプルを表面に適用した。
３）ＵＴＭ：ＫＯＶＡ−ＴｒｏｌＴＭ（１：１）（またはＳＴＭ）サンプル中のおよそ８個の複製物のＣＴ  ｒＲＮＡおよびＧＣ  ｒＲＮＡ（各１００μｌ）をスポットし、表面に均一に空間を空けて配置した。
４）以下のように、スポット１を上記の汚染除去条件「ａ」（１０％漂白剤、１回適用）で処理した：サンプルを含む領域（中心で約７×７インチ平方のサンプル）を、およそ２ｍｌの試薬で湿らせ（（下の表に示すような）いくつかの場合では、およそ３ｍｌを使用した）、次いで乾燥するまでペーパータオルまたは大きなＫｉｍｗｉｐｅで即座に拭った（完全に乾燥させるために必要な場合、プロセスの間そのタオルを時々ひっくり返した）。タオルおよび拭いを行った手にはめたグローブを注意深く廃棄した（汚染をする可能性がある場合、もう一方のグローブも廃棄した）。適用したもとのスポットからのサンプルを、上記に記載した頸管内スワブを使用して収集した。
５）上記「４」で記載したものと同じ一般的方法を使用して、スポット２を条件「ｂ」で処理したが、汚染除去試薬の第２の適用によっても処理した。
６）次いで、表面上の全てのサンプルを処理するまで、上記に列挙した汚染除去条件でサンプルスポットを処理した。
７）上記に記載のように表面を洗浄し、そして十分な数のサンプル複製物を適用して汚染除去条件＋１つのさらなるスポット（ポジティブコントロールとして使用した）の試験を行った。
８）次いで、汚染除去条件の試験を行った。
９）最後に残ったサンプルスポット（ポジティブコントロール）に対して、汚染除去試薬をいずれも適用することなくそのスポットを直接拭った。
１０）ネガティブ増幅サンプルおよびポジティブ増幅サンプルに対して、工程１〜９を行った。
【００８０】
アッセイプロトコル。上記に記載の汚染除去研究で収集したサンプルの各々の複製物（２×４００μＬ）を、以下に記載のＡＰＴＩＭＡ  ＣＯＭＢＯ  ２（登録商標）アッセイ（カタログ番号１０３２；Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用してアッセイした。このアッセイは、標準的な方法論によって調製したＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（本明細書において「ＣＴ」または「Ｃｔｒ」といわれる）およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（本明細書において「ＧＣ」または「Ｎｇｏ」といわれる）の鋳型ｒＲＮＡ（「ポジティブＡｍｐ」）を増幅し、そしてこのアッセイはまた鋳型ｒＲＮＡなし（「ネガティブＡｍｐ」）でも行われる。このアッセイを以下の一般的プロトコルを使用して行った：
１．ドッキングカラー（ｄｏｃｋｉｎｇ  ｃｏｌｌａｒ）を使用して試薬を再構成する。試薬再構成溶液を含む増幅試薬、酵素再構成試薬を含む酵素試薬、およびプローブ再構成試薬を含むプローブ試薬を再構成する。
２．標的捕捉試薬（ＴＣＲ）成分Ｂを標的捕捉試薬に１：１００希釈に希釈し、手で十分に混合する。
３．１００μＬのＴＣＲ：成分Ｂの混合物をＴｅｎ−Ｔｕｂｅ  Ｕｎｉｔ（ＴＴＵ，カタログ番号ＴＵ００２；Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）の各反応チューブに分配する。
４．キャップに穴を開け、以下の順番で４００μＬのコントロールを適切なチューブにピペットで入れる：チューブ１（ＣＴポジティブコントロール）、次いでチューブ２（ＧＣポジティブコントロール）。
５．各サンプルの４００μＬをＴＴＵの適切なチューブに移す。
６．全てのサンプルを適切なラック（カタログ番号４５７９；Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）にロードし、ＴＴＵ上にシーリングカードを配置し、そしてサンプルを手で穏やかに振盪して混合する。ラックをボルテックスしてはならない。
７．６２℃の水浴で３０分間インキュベートする。
８．ラックをベンチに置き、３０分間インキュベートする。
９．Ｔｅｎ−Ｔｉｐカセット（カタログ番号４５７８；Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を含むＴａｒｇｅｔ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴＣＳ、カタログ番号５２１０、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）をロードする。洗浄ボトルが、ポンプに接続されているのを確実にする。
１０．洗浄試薬を２回流して、ポンプラインを満たす。
１１．ＴＣＳ磁気ベース上にラックを配置し、シーリングカードを除いて新しいカードで覆う（下に置いてはならない）。５分間インキュベートする。
１２．アスピレーターのバキュームのスイッチを入れる。真空計は、そのシステムを正しくセットして９インチＨｇと１１インチＨｇの間でなければならない。吸引マニフォールドを低くすることによって、全ての液体をチューブの底からゆっくりと吸引する。チューブの底をチップで軽く叩く。チューブから全ての気泡を除くまで吸引する。
１３．洗浄ボトルを一度ポンピングすることによって、１．０ｍｌの洗浄試薬を各チューブに添加する。
１４．チューブをシーリングカードで覆い、マルチボルテックス（ｍｕｌｔｉ−ｖｏｒｔｅｘｅｒ）でボルテックスする。
１５．ＴＣＳ磁気ベース上に５分間ラックを置く。
１６．全ての液体を吸引する。
１７．７５μＬの再構成した増幅試薬を添加する。
１８．２００μＬの油状試薬を添加する。
１９．チューブをシーリングカードで覆い、マルチボルテックスでボルテックスする。
２０．６２℃の水浴で１０分間ラックをインキュベートする。
２１．４２℃の循環水浴にラックを移し、５分間インキュベートする。
２２．水浴中のラックに関して、シーリングカードを除き、全ての反応物に２５μＬの酵素試薬を添加する。
２３．直ちにシーリングカードで覆い、しばらくの間水浴から出して、手で穏やかに振盪して反応物を混合する。
２４．４２℃で６０分間ラックをインキュベートする。
２５．ラックを水浴から除き、ＨＰＡ領域に移す。１００μＬの再構成したプローブ試薬を添加する。
２６．マルチボステックスでボルテックスする。
２７．６２℃の循環水浴中で２０分間、ラックをインキュベートする。
２８．水浴からラックを出し、ベンチの上部で室温で５分間インキューベートする。
２９．２５０μＬの選択試薬を添加する。
３０．チューブをシーリングカードで覆い、マルチボルテックスでボルテックスする。
３１．６２℃の循環水浴中で１０分間ラックをインキュベートする。
３２．ベンチの上部で室温で１５分間ラックをインキュベートする。
３３．ＬＥＡＤＥＲ（登録商標）ＨＣ＋Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（カタログ番号４７４７；Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）Ｃｏｍｂｏソフトウェアにおいて反応物を明らかにする。
【００８１】
アッセイの前に、Ｎｇｏ／Ｃｔｒ  ｒＲＮＡサンプルを、０．５ｆｇのＣＴ  ｒＲＮＡ（約２×１０２コピー）および５０ｆｇのＧＣ  ｒＲＮＡ（約２×１０４コピー）を含む増幅ネガティブサンプルを加えることによって調製した。さらに、５〜１０回のアッセイコントロール（ＳＴＭのみ）を行った。判定基準は以下のとおりであった。
【００８２】
【表１３】
2007527243.tif 000015
追跡試験。上記の詳述を満たさない任意のサンプルを室温で保存し、そしてその翌日に再度試験した。追跡試験の判定基準は、最初の試験についての判定基準（上記を参照のこと）と同じである。
【００８３】
（Ｄ．種々の処方物および適用方法を使用した核酸不活化の特徴付けの結果）
以下の表は、上記に記載のプロトコルを使用して収集した結果を示す。「ＮＡ供給源」とは、核酸供給源であり、「＃Ａｐｐ」とは試薬適用の回数であり、「ｋＲＬＵ」とは、１０００で割った相対発光単位（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ）であり、そして「ｐｉｐ」とは、ピペラジンである。予想したＣｔｒおよびＮｇｏの結果は、Ｎｇｏ／Ｃｔｒ  ｒＲＮＡについてネガティブであり（Ｎｅｇ）、Ｐｏｓ増幅についてＮｅｇであり、そしてＮｅｇ増幅についてポジティブ（Ｐｏｓ）であった。この試験からのＣｔｒおよびＮｇｏの結果の大部分は、有効であり、無効の結果は、表にふくまない。
【００８４】
【表１４】
2007527243.tif 000016
【００８５】
【表１５】
2007527243.tif 000017
【００８６】
【表１６】
2007527243.tif 000018
【００８７】
【表１７】
2007527243.tif 000019
【００８８】
【表１８】
2007527243.tif 000020
【００８９】
【表１９】
2007527243.tif 000021
表中の結果は、漂白剤含有試薬（腐食インヒビターおよび界面活性剤も含有する試薬を含む）は、表面上のｒＲＮＡならびにポジティブＴＭＡ反応物およびネガティブＴＭＡ反応物を不活化したことを示す。４０ｍＭ  ＤＣＣを含む溶液についても同様であった。過酸化物および銅を含む溶液は、表面上のｒＲＮＡを効果的に不活化し、試験した条件下におけるポジティブＴＭＡ反応またはネガティブＴＭＡ反応の表面を常に汚染除去することについて、漂白剤ほど効果的ではなかった。ピペラジンまたはＨＥＰＥＳを過酸化物／銅溶液に添加しても、試験した条件下で表面上の不活化性能は有意には変更されなかった。ペルオキシモノサルフェートは、表面上のｒＲＮＡを不活化したが、試験した条件下でポジティブＴＭＡ反応物およびネガティブＴＭＡ反応物は不活化しなかった。
【００９０】
（実施例１３）
（核酸不活化処方物の特徴付け）
核酸不活化処方物において、腐食インヒビター、界面活性剤および芳香剤を含むことの効果をアッセイした。漂白剤、および漂白剤ほどではないにせよ依然として顕著な程度のＤＣＣは、金属および他の物質を腐食させる。種々の候補の抗腐食性化合物（リン酸（ＰＢ）、ホウ酸、炭酸水素およびドデシル硫酸（ＳＤＳ）のナトリウム塩が挙げられる）を、リアルタイムＴＭＡおよびＰＡＧＥを使用した分析の前に試験した（例えば、実施例８および実施例１）。候補の腐食インヒビターと一緒に混合した場合の漂白剤およびＤＣＣの活性を試験するための研究を行った。ｐＨ６．４およびｐＨ７．５のリン酸は漂白剤を不安定化したが（活性の喪失が時間とともに増加した）、ｐＨ９．１およびｐＨ９．５のリン酸は漂白剤を不安定化しなかった。ＤＣＣについては、逆が真であり、高いｐＨ（９．１および９．５）のリン酸は不活化される一方、低いｐＨ（６．４および７．５）のリン酸は不安定化されなかった。漂白剤は、ｐＨ７．６またはｐＨ９．１のホウ酸中で安定であり、そしてｐＨ９．３の炭酸水素中で安定であった。ＳＤＳは、漂白剤の活性に対していずれの明らかな効果も有さなかった。
【００９１】
漂白剤を含む抗腐食処方物をまた、実施例１２に記載される表面汚染除去プロトコルによって試験した。試験した全ての処方物を有効であると決定し、従って、抗腐食剤は、漂白剤活性に対する明らかなネガティブ効果を有さないことを実証した。１回適用（「１ａｐｐ」）は、試薬の１回の適用であり、２回適用（「２ａｐｐ」）は、試薬の２回の適用である。この分析からの結果を、以下に提示する。
【００９２】
【表２０】
2007527243.tif 000022
腐食を評価するためのアッセイを考案した。このアッセイは、ステンレス鋼のボルト（長さ１’’、直径１／８’’、標準的なスレッド、６頭のステンレス鋼ボトル）を候補溶液に浸漬する工程、および経時的な腐食性を可視的にスコアリングする工程を包含した。腐食阻害研究からの結果を以下に要約する：
【００９３】
【表２１】
2007527243.tif 000023
＊他の洗剤／界面活性剤（ラウリル硫酸リチウム、ＰＨＯＴＯ−ＦＬＯ（登録商標）、サポニン、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００およびＧｅｎｅｒａｌ  Ｕｓｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ）を含む）を試験し、ＳＤＳについてと類似の結果であった。
【００９４】
洗剤および界面活性剤をまた、表面上の漂白剤溶液の物理的特性に対する効果について試験した。これらの薬剤は、表面張力を減少させ、漂白剤溶液（代表的には、０．６％の次亜塩素酸塩）によって表面をより完全に湿潤することを可能にした。表面に適用したときの溶液の泡立ちを低減するために、洗剤の濃度を、泡立ちは最小限にするが、有効な界面活性剤の性質を保持するレベルまで低下した。この特定の適用において、およそ０．００５％〜０．０２％（ｗ／ｖ）のＳＤＳレベルおよびＬＬＳレベルは、泡立ちを最小限にした。
【００９５】
漂白剤およびＤＣＣの活性と安定性とに対する芳香剤の効果を試験した。試験した芳香剤は、２１４１−ＢＧ、２１４５−ＢＧ、およびＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｌａｖｏｒｓ  ａｎｄ  Ｆｒａｇｒａｎｃｅからの２種の他の注文した芳香剤であった。これらの芳香剤は、ＰＡＧＥ分析によると、１０％漂白剤およびＤＣＣの活性と安定性とに対して検出可能な効果は示さなかった。また、これらの芳香剤は、試験した種々の化合物（例えば、リン酸および炭酸水素）の腐食阻害に対して検出可能な効果を示さなかった。
【００９６】
腐食インヒビター、洗剤／界面活性剤および芳香剤についての結果の極致として、漂白剤を含むこれらの試薬の処方物を開発した。予想外なことに、溶液の物理的な安定性を維持するためには、成分の間のバランスが重要であった。この点において首尾のよい、これらの成分の種々の組み合わせが存在した。１つの処方物は以下のとおりであった：
腐食インヒビター／洗剤／芳香剤（６．７×濃度）：６００ｍＭ炭酸水素塩（ｐＨ９．３）、０．１％  ＳＤＳ、０．０５％  ２１４１−ＢＧ
完成した汚染除去試薬：０．６％次亜塩素酸塩、９０ｍＭ炭酸水素塩（ｐＨ９．３）、０．０１５％  ＳＤＳ、０．００７５％  ２１４１−ＢＧ。
【００９７】
過酸化物および銅を含む溶液を、さらに特徴付けた。ＵＴＭが過酸化物およびＣｕ（ＩＩ）を含む溶液中でｒＲＮＡの不活化を刺激したことが見出された。ＵＴＭ処方物の個々の成分（１５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、，３００ｍＭ  ＬＬＳ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４）の効果を試験し、そしてＨＥＰＥＳがこの刺激の原因であることを見出した。次いで、観察したｒＲＮＡの不活化に対するｐＨおよび濃度の効果を試験した。ＨＥＰＥＳ（エタノール、エタンスルホン酸およびピペラジン）およびＰＩＰＥＳ（ＨＥＰＥＳに類似した緩衝液）の異なる化学的成分の活性をまた、試験した。ピペラジンは、本質的にＨＥＰＥＳと同程度に活性であることを見出し、そしてｐＨ５．５のピペラジンをさらなる特徴付けのために利用した。ピペラジンは、過酸化物による核酸の不活化についての活性を維持する化学的構成において溶液中のＣｕ（ＩＩ）を安定化したことを見出した。
【００９８】
（実施例１４）
（核酸不活化処方物の安定性）
選択した試薬を種々の条件下で保存した。選択した時点で、溶液アッセイを使用して、標的核酸を不活化する能力について、その処方物をアッセイした。この溶液アッセイにおいて、ｒＲＮＡを、溶液中で試薬とインキュベートし、希釈し、そいてリアルタイムＴＭＡ（実施例８）を使用してアリコートをアッセイした。インキュベーション条件は、光から保護せずに、室温だった。結果を以下に提供する。
【００９９】
（Ｉ．４０ｍＭ  ＣｕＳＯ４／１Ｍピペラジン（アセテート）、ｐＨ５．５）
【０１００】
【表２２】
2007527243.tif 000024
（ＩＩ．８０ｍＭ  ＣｕＳＯ４／１Ｍピペラジン（アセテート）、ｐＨ５．５）
【０１０１】
【表２３】
2007527243.tif 000025
（ＩＩＩ．２００ｍＭ  ＣｕＳＯ４（水中））
（Ａ．室温で保存、光からの保護なし）
【０１０２】
【表２４】
2007527243.tif 000026
（ＩＶ．１０％漂白剤／炭酸水素ナトリウム／ＳＤＳ／ＩＦＦ）
（Ａ．１０％漂白剤／０．２Ｍ  炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９．３）／０．０５％  ＳＤＳ）
【０１０３】
【表２５】
2007527243.tif 000027
（Ｂ．１０％漂白剤／０．０８Ｍ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９．３）／０．０２０％  ＳＤＳ／０．０２５％  ２１４１−ＢＧ）
【０１０４】
【表２６】
2007527243.tif 000028
（Ｃ．１０％  漂白剤／０．０９Ｍ  炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９．３）／０．０１５％  ＳＤＳ／０．００７５％  ２１４１−ＢＧ）
【０１０５】
【表２７】
2007527243.tif 000029
（Ｖ．炭酸水素ナトリウム／ＳＤＳ／２１４１−ＢＧ（次いで、「新鮮な（ｆｒｅｓｈ）」漂白剤に添加する）
（Ａ．６００ｍＭ  炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９．３）／０．１％  ＳＤＳ／０．０５％  ２１４１−ＢＧ（６．７×溶液））
【０１０６】
【表２８】
2007527243.tif 000030
（Ｂ．６００ｍＭ  炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９．３）／０．１％  ＳＤＳ／０．０５％  ２１４１−ＢＧ（６．７×溶液））
【０１０７】
【表２９】
2007527243.tif 000031
（実施例１５）
（実験機器の核酸の不活化）
実験機器のいくつかの部品（真空トラップ系、吸引マニフォールド、ラックおよびデッキが挙げられる）の核酸を不活化するための処方物および手順を、有効性について評価した。
【０１０８】
（Ａ．真空トラップ系）
吸引マニフォールド、２つのトラップ、インラインフィルター、および直列でチュービングによって接続した真空ポンプを備える真空系を、増幅アッセイを行うために利用し、その後、複数の標的捕捉を行う（Ｃｔｒ  ｒＲＮＡおよびＮｇｏ  ｒＲＮＡの両方）。第１のトラップに漂白剤を添加せずに、汚染を評価した。この後、スワブサンプルを真空系の種々の位置から採取し、実施例８に提示したリアルタイムＴＭＡアッセイを使用してＣｔｒ  ｒＲＮＡおよびＮｇｏ  ｒＲＮＡの存在についてアッセイした。Ｎｇｏ  ｒＲＮＡによる検出可能な汚染がないことを、第１のトラップの外面で同定した。Ｃｔｒ  ｒＲＮＡによる汚染を、第１のトラップと第２のトラップとの間のチュービング、第２のトラップ、および第２のトラップとインラインフィルターとの間のチュービングで同定し、そしてインラインフィルターの後ろで汚染は検出しなかった。これらの結果は、周囲から漏れた検出可能なＮｇｏ  ｒＲＮＡまたはＣｔｒ  ｒＲＮＡはなく、従って使用する間に、第１のトラップ中に漂白剤を含まないようである。
【０１０９】
（Ｂ．吸引マニフォールド）
ＴＭＡアッセイ（ＡＰＴＩＭＡ  ＣＯＭＢＯ  ２（登録商標）アッセイ、カタログ番号１０３２、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に利用した標的捕捉吸引マニフォールドを汚染除去するための１つのプロトコルは、マニフォールドを５０％漂白剤に１０分間浸漬し、次いで水で完全に洗浄する工程を包含した。この手順により、マニフォールドは腐食し、比較的頻繁にそのマニフォールドを置き換える必要性が生じた。
【０１１０】
他の汚染除去プロトコルおよび薬剤を試験するために、マニフォールドを意図的に汚染して汚染除去を試み、次いで汚染レベルを測定した。標的ネガティブサンプル（１０個の複製物）の各々は、汚染したマニフォールドを使用してネガティブなままであり、このことは、標的捕捉系が、汚染が新しいサンプルに侵入することを防いだことを実証した。１つの汚染除去プロトコルにおいて、マニフォールドをその系に接続しておき、そしてそれを通して核酸不活化処方物を吸引することは、そのマニフォールドを首尾よく汚染除去したことを見出した。このような手順において、０．６％次亜塩素酸塩（１０％漂白剤）または４０ｍＭ  ＤＣＣ（その後に水でリンスする）が、首尾よくマニフォールドを汚染除去したことを決定した。過酸化水素／銅溶液もまた、マニフォールドを首尾よく汚染除去したが、この試薬は、真空系において減圧下にある場合、酸素を激しく放出するような慣例的な使用に適切ではない。およそ５０ｍｌの０．６％次亜塩素酸塩溶液（腐食インヒビター、洗剤および芳香剤）を吸引し、その後およそ５０ｍｌの水を吸引し（ノズル１つにつき約５ｍｌ）、次いで少なくとも１分間真空ポンピングをすることは、十分に吸引マニフォールドを汚染除去したことを決定した。
【０１１１】
（Ｃ．Ｔｅｃａｎデッキ汚染除去）
主要な漂白剤の代替候補を、ＤＴＳＴＭ  ＴＥＣＡＮ  ＧＥＮＥＳＩＳ  Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号５２１６またはカタログ番号５２０３；Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のデッキの汚染除去について試験した。以下の結果を観察した。
【０１１２】
【表３０】
2007527243.tif 000032
従って、複数の処方物および手順は、種々の実験機器を汚染する核酸を効果的に汚染除去した。
【０１１３】
（実施例１６）
（２つの実験部位における核酸不活化の処方物および方法の有効性）
臨床実験の設定において２種の汚染除去の試薬および方法の有効性を、２つの部位において特徴付けた。試薬１（３％  Ｈ２Ｏ２、２ｍＭ  硫酸銅）および試薬２（０．６％次亜塩素酸塩、９０ｍＭ炭酸水素塩、０．０１５％  ＳＤＳ、０．００７５％  ２１４１−ＢＧ）を、各部位に提供された所定のプロトコル（以下を参照のこと）に従って使用した。これらは、ＡＰＴＩＭＡ  ＣＯＭＢＯ  ２（登録商標）アッセイキット（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  カタログ番号１０３２）についてのパッケージ挿入物およびｈｔｔｐアドレスｗｗｗ．ｇｅｎ−ｐｒｏｂｅ．ｃｏｍ／ｐｄｆｓ／ｐｉ／ＩＮ００３７−０４ＲｅｖＡ．ｐｄｆにおいて記載された５０％  漂白剤を使用するプロトコルと等価であり、臨床実験設定における核酸アッセイ手順に対して、有効な核酸の不活化および汚染除去のコントロールをもたらした。
【０１１４】
（Ａ．材料）
以下は、各部位において利用した材料のリストである。
【０１１５】
試薬１Ａ（３％  Ｈ２Ｏ２  ＵＳＰグレード）
試薬１Ｂ（硫酸銅、乾燥粉末）
試薬２Ａ（６００ｍＭ  炭酸水素ナトリウム、０．１％ｗｔ／ｖｏｌ  ドデシル硫酸ナトリウム、０．０５％  ２４１５−ＢＧ芳香剤）
家庭用漂白剤（約６％  次亜塩素酸塩）
脱イオン水（またはより質の高い水）
Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（または等価な質の水）
ＡＰＴＩＭＡ  ＣＯＭＢＯ  ２（登録商標）試験キット
二重のポジティブコントロール（ＣＴ  ｒＲＮＡおよびＧＣ  ｒＲＮＡ）
ネガティブコントロール
通気式の蓋を備える噴出容器（試薬１用）。
【０１１６】
（Ｂ．手順）
各部位において、以下の手順を利用した。ＡＰＴＩＭＡ  ＣＯＭＢＯ  ２（登録商標）アッセイを行った各ラックのサンプル（１０個までのＴｅｎ−Ｔｕｂｅ  Ｕｎｉｔｓ（ＴＴＵｓ；カタログ番号ＴＵ００２２；Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）について、通常のツーラン（ｔｗｏ−ｒｕｎ）コントロール（ポジティブコントロール、ＣＴおよびポジティブコントロール、ＧＣ）、二重ポジティブコントロール（材料を参照のこと）、１６個のネガティブコントロール（材料を参照のこと）、および８０個までの患者標本を含んだ。このアッセイを、標準的なプロトコル（パッケージ挿入物）に従って行った。
【０１１７】
ツーランコントロールがランコントロール基準を満たす場合、そのラン（ｒｕｎ）は有効であった（ＰＡＳＳ）。ランコントロールのうちの一方または両方がランコントロール基準を満たさなかった場合、そのランは無効であり（ＦＡＩＬ）、同じランにおける全ての結果は無効であって、報告しなかった。次いで、ランを繰り返した。また、患者サンプルについては通常であるように、最初の疑わしい結果または無効な結果を繰り返した。
【０１１８】
この研究調査の３相を以下に記載する。各段階を２週と４週との間で行った。なぜならば、２週未満は、汚染除去プロトコルの適切な評価ができないからである。３週が理想的であると決定し、最大期間は４週であった。全体の研究は、９週で完了することが予想され、最大期間は１２週であった。この研究の各相について、上記に記載したとおり適切なコントロールを全てに含めて１５ラックのサンプルをアッセイした。
【０１１９】
第１相：５０％漂白剤を利用する標準的なＡＰＴＩＭＡ  ＣＯＭＢＯ  ２（登録商標）プロトコルを、パッケージ挿入物（ｈｔｔｐアドレスｗｗｗ．ｇｅｎ−ｐｒｏｂｅ．ｃｏｍ／ｐｄｆｓ／ｐｉ／ＩＮ００３７−０４ＲｅｖＡ．ｐｄｆ）に記載されたとおりに汚染除去のために使用した。このアプローチを利用して、結果のベースラインを、試験汚染除去プロトコルを使用した場合に得た結果との比較のために確立した。
【０１２０】
第２相：試験汚染除去プロトコルを利用した（以下を参照のこと）。
【０１２１】
第３相：プロトコルが試薬１の使用を必要とする場合に試薬２を使用する以外は、試験汚染除去プロトコル（以下を参照のこと）を利用した。プロトコルが試薬２の使用を必要とする場合は、やはり試薬２を利用した。
【０１２２】
（１．ラックのセットアップ）
各実験室に、サンプルのラックをセットアップするために以下の手順を利用するように指示した。
【０１２３】
１）パッケージ挿入物に記載される標準的な様式でラックのセットアップを開始する
２）４００μＬのポジティブコントロール、ＣＴを反応チューブ１に添加する
３）４００μＬのポジティブコントロール、ＧＣを反応チューブ２に添加する
４）４００μＬの二重ポジティブコントロールを反応チューブ３〜４に添加する
５）４００μＬのネガティブコントロールを反応チューブ５〜２０に添加する
６）４００μＬの患者標本を反応チューブ２１〜１００までに添加する。
【０１２４】
（２．一般的な汚染除去プロトコル）
各作業スペースを汚染除去しながら実験室における汚染の蔓延に対して注意するために、各実験室に、良好な物理的封じ込め技術を適用するように指示した。洗浄のために使用した手にはめた手袋は汚染されること、およびこの手で清潔な物体を触れることは避けられなければならないことを、各実験実に警告した。一方の手は洗浄のためのみに残しておかれるべきであること、そして他方の手（清潔）は試薬の適用のためのみに残しておかれるべきであることを推奨した。使用したタオルおよび手袋は、十分に封じ込められた容器に廃棄されて、汚染除去を受ける領域とその容器との間に漏れが生じないことを確実にするべきであることもまた推奨した。
【０１２５】
（３．試薬調製）
各実験室に、以下に概要を述べる手順を使用して以下の試薬を調製するように指示した。
【０１２６】
ａ）試薬１Ｂを調製する（２週間ごと）
ｉ）３０ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水（または等価な品質の水）を、試薬１Ｂ（乾燥試薬）の１バイアルに添加する
ｉｉ）きつくキャップし、３０回反転させる。１時間静置する。さらに３０回反転させる。全ての乾燥試薬が溶解するのを確実にする
ｉｉｉ）使用の間（以下の節２ｂを参照のこと）、試薬１Ｂ（液体）を２〜８℃の暗所で保存する（乾燥試薬は、室温で保存することができる）
ｉｖ）２週間保存した後、試薬１Ｂ（液体）を廃棄し、新鮮な溶液を調製する
ｂ）試薬１を調製する（毎日）
ｉ）１５０ｍｌの試薬１Ａを通気式の蓋を備える噴出ボトル（添付）に添加する
ｉｉ）１．５ｍｌの試薬１Ｂを噴出ボトルに添加する
ｉｉｉ）上部を置き換え、１０〜１５秒間内容物を旋回させることによって完全に混合する
ｉｖ）以下に記載のように内容物を使用する。使用の間に噴出ボトルから試薬１が少しでも漏れた場合、上部をゆるめ、次いで使用を再開する前に、再度直ちに締める
ｖ）最後に使用した日または１２時間後に、どれを最優先にするとしても、噴出ボトルに残った試薬１を全て処分する。必要な場合、上記に記載のように新鮮な試薬を調製する
ｃ）試薬２を調製する（２週間ごと）。
【０１２７】
以下に提供した処方は、１リットルの試薬２の調製のためのものである。作製する実際の量は、所定の実験室において予想される試薬の使用に基づいて決定されるべきである。試薬２の調製は、ラックおよび他の機器を洗浄するために使用され、浸漬のために使用する管においても行われ得る。
【０１２８】
ｉ）７５０ｍｌの脱イオン水（またはより高い質の水）を適切な管に添加する。１５０ｍｌの試薬２Ａをその管に添加し、その後１００ｍｌの家庭用漂白剤を添加する（この工程は、漂白剤の蒸気との接触を避けることが所望される場合、換気フードにおいて行われ得る）
ｉｉ）容器を閉めて１５〜２０秒間内容物を旋回させることによって完全に混合する
ｉｉｉ）必要な場合、内容物を使用する
ｉｖ）２週間の最後に、全ての未使用の試薬２を廃棄し、上記に記載のように新鮮は溶液を調製する
（４．前アッセイ手順）
各実験室に、以下の前アッセイ手順を行うように指示した。
【０１２９】
ａ）増幅前（ｐｒｅ−ａｍｐ）領域中の水浴のスイッチを入れるが、増幅後（ｐｏｓｔ−ａｍｐ）領域ではしない（水浴が常に１日のうち２４時間オンのままである場合、この実行を続けてよい；しかし、所定の日にＡＰＴＩＭＡ  ＣＯＭＢＯ  ２（登録商標）アッセイを行う人物は、そのアッセイがその領域で進める準備ができるまで、増幅後領域に入るべきではない（以下を参照のこと））
ｂ）以下の通りに（列挙した順番で）増幅前領域における全ての表面を洗浄する：
Ｔｅｃａｎ。噴出ボトルを使用して、ペーパータオルを試薬１で、タオルが飽和するが浸漬しない程度まで湿らせる。湿らせたタオルでＴｅｃａｎデッキを完全に湿らせて洗浄し（現在の標準的プロトコルにあるような１分のインキュベーション時間を含まない）、全ての表面が乾くまで拭い続ける。一旦表面を洗浄して乾燥させ、試薬１の第２の適用によりこの手順を繰り返す。水でリンスしてはいけない。
【０１３０】
ＴＣＳユニット。噴出ボトルを使用して、ペーパータオルを試薬１で、タオルが飽和するが浸漬しない程度まで湿らせる。湿らせたタオルでＴＣＳ（カタログ番号５２０２；Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を完全に湿らせて洗浄し（現在の標準的プロトコルにあるような１分のインキュベーション時間を含まない）、全ての表面が乾くまで拭い続ける。これは、さらなる湿らせたタオルおよび乾燥タオルを必要とし得る。一旦表面を洗浄して乾燥させ、試薬１の第２の適用によりこの手順を繰り返す。水でリンスしてはいけない。
【０１３１】
ベンチ表面。噴出ボトルを使用して、試薬１をベンチ表面に大量に適用する。ペーパータオルを使用して表面を直ちに洗浄し、必ず、表面全体が汚染除去試薬で完全に湿っているが、その試薬が床の上、周囲の領域などにはねないように注意するようにする。現在の標準的なプロトコルのような１分間のインキュベーション時間は含まない。表面全体が乾くまで拭い続ける。これは、１枚よりも多くのペーパータオルを必要とし得る。試薬１の第２の適用によりこの手順を繰り返す。水でリンスしてはいけない。
【０１３２】
ピペット。噴出ボトルを使用して、ペーパータオルを試薬１で、タオルが飽和するが浸漬しない程度まで湿らせる。湿らせたタオルでピペットの表面を完全に洗浄し（現在の標準的プロトコルにあるような１分のインキュベーション時間を含まない）、全ての表面が乾くまで拭い続ける。試薬１の第２の適用によりこの手順を繰り返す。水でリンスしてはいけない。
【０１３３】
ｃ）増幅前領域を洗浄し終わったときに、注意深く両方の手袋を廃棄する。相互汚染の可能性少しでも疑われる場合、すぐに手袋を代える。
【０１３４】
（５．標本調製後手順）
各実験室に、以下の標本調製後手順を行うように指示した。
【０１３５】
ａ）標本調製手順の間に使用した手袋を注意深く廃棄し、清潔な手袋に取り替える
ｂ）Ｔｅｃａｎ、浸漬するべき品目（以下を参照のこと）、標本処理領域で使用したベンチ表面、および使用した全てのピペットを、以下のように洗浄する：
ｉ）Ｔｅｃａｎ．上記に記載のように試薬１で洗浄し、注意深く両方の手袋を廃棄する。
【０１３６】
ｉｉ）浸漬するべき品目。使用後、ラック、試薬リザーバー、デッキプレート、使い捨てのチップラックおよび廃棄物シュート（および一般的に浸漬する任意の他の品目）を試薬２の中に完全に水没させ、３０〜６０分間浸漬させる。流水で完全にリンスし（リンス水の浴槽に浸漬してはならない）、次いで、ペーパータオルで完全に乾燥させる（空気乾燥が好ましい）。両方の手袋を注意深く廃棄する。
【０１３７】
ｉｉｉ）ベンチ表面。上記に記載のように試薬１で洗浄する。両方の手袋を注意深く廃棄する。
【０１３８】
ｉｖ）ピペット。上記に記載のように試薬１で洗浄する。両方の手袋を注意深く廃棄する。
【０１３９】
（６．標的捕捉後手順）
各実験室に、以下の標的捕捉後手順を使用するように指示した。
【０１４０】
ａ）吸引マニフォールド。ＴＣＳに新しいＴｅｎ−Ｔｉｐカセット（ＴＴＣ；カタログ番号４５７８；Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を配置する。真空ポンプのスイッチを入れる。マニフォールドをＴＴＣのチップに注意深く取り付ける。ＡＰＴＩＭＡ  ＣＯＭＢＯ  ２（登録商標）アッセイを行ったものから残った全ての洗浄溶液を、洗浄溶液分配ステーションの呼び水の槽から注意深く吸引する（洗浄溶液分配マニフォールドは、まずその通路から移動させる必要がある）。その槽に１００ｍｌの試薬２を添加し、次いでその試薬を吸引マニフォールドを通して注意深く吸引する。チップをもともとのＴＴＣに排出する。最後の吸引の後、少なくとも１分間真空ポンプをオンのままにする
ｂ）ＴＣＳ、ベンチ表面およびピペット。上記に記載のように、試薬１で洗浄する。両方の手袋を注意深く廃棄する
ｃ）真空トラップ廃液。必要な場合（以下を参照のこと）、廃棄物ボトル中の液体を汚染除去する。廃棄物ボトルを空のＴＣＳユニットに取り付ける（すなわち、漂白剤を添加しない）。廃棄物ボトルが２５％満たされるまでか（すなわち、利用可能な容量は、２５％を超えない）、または１週間（どちらか早いほう）、廃棄物ボトルを使用する。廃棄物ボトルを系からはずし、４００ｍｌの希釈していない漂白剤を注意深く添加する（所望の場合、この手順は、実験室中に蒸気が放出されるのを避けるために換気フード中で行われ得る）。廃棄物ボトルに蓋をして、完全に混合するまで内容物を穏やかに旋回する。５分間インキュベートし、次いで廃棄物をシンクに注ぐ。空の廃棄物ボトルをＴＣＳユニットに再度接続する。液体廃棄物および固体廃棄物を取り扱う場合および処分する場合の一般的な注意を使用する。地域の規則、州の規則、および連邦政府の規則に従って、液体廃棄物および固体廃棄物を処分する。廃棄物ボトルの内容物は、アッセイを汚染する可能性のある供給源として処理されるべきである。作業表面の汚染を避けるために注意されたい。両方の手袋を注意深く廃棄する。
【０１４１】
（７．増幅反応ｂ手順）
各実験室に、各増幅反応（これは、増幅前領域において行われる最後の工程である）を開始した後に以下の手順を行うように指示した。反応を開始した後、各実験室に、上記に記載の手順に従って試薬１を使用して、水浴の周囲のベンチトップ、水浴の蓋のハンドル、およびピペットを洗浄するように指示した。各実験室に、これらの手順を行った後に両方の手袋を注意深く廃棄するように指示した。
【０１４２】
（８．増幅後領域手順）
各実験室に、増幅後領域手順に関する以下の指示を提供した。増幅後領域における最後の洗浄が完了し、新しい手袋を身につけた（ａｄｏｒｎ）後、各実験室に、増幅前領域に入った後直ちに、６２℃の水浴にスイッチを入れるように指示した。上記に記載の特異的な手順に従って試薬２を使用して、増幅後領域（実験室ベンチ、ピペット、ハンドル、およびその他のもの）の全ての表面を前洗浄し、次いで両方の手袋を注意深く廃棄することもまた指示した。
【０１４３】
（９．増幅後手順）
各実験室に、増幅後手順に関する以下の指示を提供した。清潔な手袋のセットを身に着けた後に、４２℃の水浴からラックを注意深く除くため、および水浴の蓋の汚染を避けるための指示を提供した。
【０１４４】
（１０．検出後手順）
各実験室に、検出後手順に関する以下の指示を提供した。指示は、以下のためのものであった：（ａ）照度計からＴＴＵを除き、製品挿入物中の現在の手順を使用して反応物を不活化する；（ｂ）上記に記載の特異的な手順に従って試薬２を使用して、全ての表面（ベンチ表面、ピペット、水浴の蓋のハンドル、ＬＥＡＤＥＲ（登録商標）ＨＣ＋照度計の外面、および他のもの）を洗浄する；（ｃ）２週間ごとか、または必要な場合、現在操作者のマニュアルに記載されているようにＤＩ水でＨＣ＋の内面を洗浄し、ＨＣ＋カセットを試薬２に３０〜６０分間浸漬する；および（ｄ）両方の手袋を注意深く廃棄する。
【０１４５】
（１１．合格基準）
各実験室に、以下の合格基準を使用するように指示した。
【０１４６】
【表３１】
2007527243.tif 000033
（Ｃ．結果）
所定のプロトコルに従って使用した試薬１および試薬２は、ＡＰＴＩＭＡ  ＣＯＭＢＯ  ２（登録商標）アッセイキットで提供される５０％  漂白剤を使用したプロトコルと等価であり、臨床的設定においてＡＰＴＩＭＡ  ＣＯＭＢＯ  ２（登録商標）アッセイについての有効な汚染除去コントロールをもたらした。
【０１４７】
（ネガティブコントロールおよびポジティブコントロールのデータの分析）
【０１４８】
【表３２】
2007527243.tif 000034
新しい汚染除去試薬およびプロトコルを使用した場合、第ＩＩ相に関して５４０個のコントロールのうちの５４０個（１００％）、および第ＩＩＩ相に関して５５８個のコントロールサンプルのうちの５５４個（９９．３％）が、予想した結果を生じた。標準的なプロトコルによって５０％  漂白剤を使用した場合（第Ｉ相）、５４０個のうちの５３５個（９９．１％）が予想した結果を生じた。フィッシャーの直接確率検定（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔ）（定性的な結果を有する複数の群の間の統計学的な差を実証するための統計学的仮説検定方法；Ｃａｔｅｇｏｒｉｃａｌ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  Ａｌａｎ  Ａｇｒｅｓｔｉ（１９９０）、ｐ５９−ｐ６７、ｐ６８、ｐ７０、ｐ７８、ｐ４８８、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を、ＳＡＳ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８．２ソフトフェアを使用したデータに関して行った。Ｐ＜０．０５は、群の間の有意な差を示唆する一方で、Ｐ＞０．０５は、有意な差がないことを示すことが、広く認められている。フィッシャーの直接確率検定から、実験室Ｉにおけるアッセイの実行に対して０．６２５というｐ値を得、実験室ＩＩにおけるアッセイの実行に対して０．１１０というｐ値を得た。これらの結果は、３相全ての条件の間に統計学的に等しいことを示す。
【０１４９】
各特許、特許出願、刊行物、および本明細書において参照される文書は、本明細書において参考として援用される。上記の特許、特許出願、刊行物、および文書の引用は、任意の前述のものが、適切な先行技術であるということの承認ではなく、これらの刊行物もしくは文書の内容またはデータに関する承認をなすものでもない。これらの文書の参考としての援用は、単独で、任意の文書の内容の任意の部分が、特許出願に対するいずれの国または地域の法定開示要件を満たすために不可欠な材料であることが考慮されるという断定または承認として解釈されるべきではない。それにもかかわらず、適切である場合、審査する当局または法廷によって、特許請求された内容に必要であると判断された材料を提供するために、任意のこのような文書への依存に対して権利が保存される。
【０１５０】
本発明の基本的な局面から逸脱することなく、前述のものに対して改変がなされ得る。本発明は、１以上の具体的な実施形態への参照によって実質的に詳細に記載されているが、当業者は、本出願において具体的に開示された実施形態に対して変更がなされ得、そしてさらにこれらの改変および改善が本発明の範囲および趣旨の範囲内にあることを認識する。本明細書において例示的に記載される本発明は、本明細書において具体的に開示されていない任意の要素の非存在下において実施され得る。従って、例えば、本明細書中の各例において、用語「包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」、および「なる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、他の２つの用語のいずれかによって置き換えられ得る。従って、使用されている用語および表現は、限定の用語としてではなく説明の用語として使用され、示されて説明される特徴の等価物、またはそれらの部分は排除されない。そして、種々の改変が本発明の範囲内で可能であることが認識される。本発明の実施形態は、以下の特許請求の範囲に記載される。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】図１は、固定量の７１マーの一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、種々の濃度の漂白剤と反応させ、その後にポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行った結果を示す電気泳動図である。
【図２】図２は、固定量の６０マーの一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡのキメラオリゴヌクレオチドを、種々の濃度の漂白剤と反応させ、その後にＰＡＧＥを行った結果を示す電気泳動図である。ＲＮＡは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドからなる。
【図３】図３は、固定量の７１マーの一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、種々の濃度のジクロロイソシアヌレートまたは漂白剤とそれぞれ反応させ、その後にＰＡＧＥを行った結果を示す２つの電気泳動図からなる。
【図４】図４は、固定量の７１マーのＤＮＡオリゴヌクレオチドを、種々の濃度の過酸化水素単独か、または固定濃度の硫酸銅と組み合わせて反応させ、その後にＰＡＧＥを行った結果を示す電気泳動図である。
【図５】図５は、固定量の７１マーのＤＮＡオリゴヌクレオチドを、種々の濃度の過酸化水素および固定量の硫酸銅と反応させ、その後にＰＡＧＥを行った結果を示す電気泳動図である。
【図６】図６は、固定量の７１マーの一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、ＮＡＬＣの存在下または非存在下において、種々の濃度の漂白剤と反応させ、その後にＰＡＧＥを行った結果を示す２つの電気泳動図からなる。
【図７】図７は、固定量のＮＡＬＣもしくはヒト血清の存在下または非存在下において、固定量の７１マーの一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、種々の濃度の過酸化水素および固定量の硫酸銅と反応させ、その後にＰＡＧＥを行った結果を示す電気泳動図である。
【図８】図８は、純粋系において標的核酸を種々の濃度の漂白剤と反応させた後のリアルタイム増幅の結果を示すグラフである。
【図９−１】図９Ａ〜図９Ｈは、漂白剤による核酸の不活化に対するアッセイの結果を示す。
【図９−２】図９Ａ〜図９Ｈは、漂白剤による核酸の不活化に対するアッセイの結果を示す。
【図９−３】図９Ａ〜図９Ｈは、漂白剤による核酸の不活化に対するアッセイの結果を示す。
【図９−４】図９Ａ〜図９Ｈは、漂白剤による核酸の不活化に対するアッセイの結果を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜図１０Ｆは、有機負荷の存在下における漂白剤による核酸の不活化に対するリアルタイムの転写媒介性増幅（ＴＭＡ）の結果を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜図１０Ｆは、有機負荷の存在下における漂白剤による核酸の不活化に対するリアルタイムの転写媒介性増幅（ＴＭＡ）の結果を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜図１０Ｆは、有機負荷の存在下における漂白剤による核酸の不活化に対するリアルタイムの転写媒介性増幅（ＴＭＡ）の結果を示す。
【図１０Ｄ】図１０Ａ〜図１０Ｆは、有機負荷の存在下における漂白剤による核酸の不活化に対するリアルタイムの転写媒介性増幅（ＴＭＡ）の結果を示す。
【図１０Ｅ】図１０Ａ〜図１０Ｆは、有機負荷の存在下における漂白剤による核酸の不活化に対するリアルタイムの転写媒介性増幅（ＴＭＡ）の結果を示す。
【図１０Ｆ】図１０Ａ〜図１０Ｆは、有機負荷の存在下における漂白剤による核酸の不活化に対するリアルタイムの転写媒介性増幅（ＴＭＡ）の結果を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜図１１Ｄは、有機負荷の存在下における漂白剤による核酸の不活化に対するＰＡＧＥの結果を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜図１１Ｄは、有機負荷の存在下における漂白剤による核酸の不活化に対するＰＡＧＥの結果を示す。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜図１１Ｄは、有機負荷の存在下における漂白剤による核酸の不活化に対するＰＡＧＥの結果を示す。
【図１１Ｄ】図１１Ａ〜図１１Ｄは、有機負荷の存在下における漂白剤による核酸の不活化に対するＰＡＧＥの結果を示す。
【図１２】図１２は、ＤＣＣおよび漂白剤に対する酵素希釈緩衝液のスカベンジャー効果を説明するＰＡＧＥの結果を示す。
【図１】
2007527243.tif 000035
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
2007527243.tif 000043
【図９−２】
2007527243.tif 000044
【図９−３】
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【図９−４】
2007527243.tif 000046
【図１０Ａ】
2007527243.tif 000047
【図１０Ｂ】
2007527243.tif 000048
【図１０Ｃ】
2007527243.tif 000049
【図１０Ｄ】
2007527243.tif 000050
【図１０Ｅ】
2007527243.tif 000051
【図１０Ｆ】
2007527243.tif 000052
【図１１Ａ】
2007527243.tif 000053
【図１１Ｂ】
2007527243.tif 000054
【図１１Ｃ】
2007527243.tif 000055
【図１１Ｄ】
2007527243.tif 000056
【図１２】
2007527243.tif 000057
【手続補正書】
【提出日】平成18年9月6日(2006.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腐食阻害剤、湿潤剤、および可溶化剤を含有する処方物であって、該薬剤の各々の量は、該処方物に対して核酸を実質的に不活化するのに十分な量の不活剤と合わせた場合に、該腐食阻害剤が、該不活剤の腐食特性を低減させ、該湿潤剤が、固体表面上での該不活剤の分散特性を改善し、そして／あるいは該不活剤および／または固体表面上もしくは溶液中に存在し得る他の物質の溶解度を増加させ、そして該可溶化剤が、該不活剤、該腐食阻害剤、および該湿潤剤のうちの少なくとも１つの溶解度を増加させるような量である、処方物。
【請求項２】
前記処方物に対して核酸を実質的に不活化するのに十分な量の前記不活剤をさらに含む、請求項１に記載の処方物。
【請求項３】
前記不活剤が、塩素または臭素を含む、請求項２に記載の処方物。
【請求項４】
前記不活剤が、次亜塩素酸ナトリウムを含む、請求項３に記載の処方物。
【請求項５】
前記処方物中の次亜塩素酸ナトリウムの濃度が、約０．０６％（ｗ／ｖ）〜約３％（ｗ／ｖ）である、請求項４に記載の処方物。
【請求項６】
前記処方物中の次亜塩素酸ナトリウムの濃度が、約０．１８％（ｗ／ｖ）〜約１．８％（ｗ／ｖ）である、請求項４に記載の処方物。
【請求項７】
前記処方物中の次亜塩素酸ナトリウムの濃度が、約０．６％（ｗ／ｖ）〜約１．５％（ｗ／ｖ）である、請求項４に記載の処方物。
【請求項８】
前記処方物中の次亜塩素酸ナトリウムの濃度が、約０．６％（ｗ／ｖ）〜約１．２％（ｗ／ｖ）である、請求項４に記載の処方物。
【請求項９】
前記不活剤が、ジクロロイソシアヌレートである、請求項３に記載の処方物。
【請求項１０】
前記処方物中のジクロロシアヌレートの濃度が、約５ｍＭ〜約４００ｍＭである、請求項９に記載の処方物。
【請求項１１】
前記処方物中のジクロロシアヌレートの濃度が、約１０ｍＭ〜約２００ｍＭである、請求項９に記載の処方物。
【請求項１２】
前記処方物中のジクロロシアヌレートの濃度が、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭである、請求項９に記載の処方物。
【請求項１３】
前記処方物中のジクロロシアヌレートの濃度が、約４０ｍＭ〜約８０ｍＭである、請求項９に記載の処方物。
【請求項１４】
前記腐食阻害剤が、ホスフェート、ボレート、炭酸水素ナトリウムおよび洗剤からなる群より選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の処方物。
【請求項１５】
前記防腐阻害剤が、炭酸水素ナトリウムである、請求項１４に記載の処方物。
【請求項１６】
前記処方物が、前記不活剤を含み、該処方物中の前記防腐阻害剤の濃度が、約１０ｍＭ〜約７５０ｍＭである、請求項１５に記載の処方物。
【請求項１７】
前記湿潤剤が、洗剤または界面活性剤である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の処方物。
【請求項１８】
前記腐食阻害剤および前記湿潤剤が、同じものである、請求項１７に記載の処方物。
【請求項１９】
前記湿潤剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸リチウム、サポニン、ＣＴＡＢ、Ａｌｃｏｎｏｘ、およびポリオキシエチレン洗剤からなる群より選択される、請求項１７または１８に記載の処方物。
【請求項２０】
前記湿潤剤が、ドデシル硫酸ナトリウムまたはラウリル硫酸リチウムである、請求項１９に記載の処方物。
【請求項２１】
前記処方物が、前記不活剤を含み、該処方物中の前記湿潤剤の濃度が、約０．００５％（ｗ／ｖ）〜約１％（ｗ／ｖ）である、請求項２０に記載の処方物。
【請求項２２】
前記可溶化剤が、有機溶媒または乳化剤を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の処方物。
【請求項２３】
前記可溶化剤が、酢酸ベンジル、ＰＳ２０およびイソプロパノールからなる群より選択される有機溶媒である、請求項２２に記載の処方物。
【請求項２４】
前記可溶化剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、レシチン、およびジステアリン酸エチレングリコールからなる群より選択される乳化剤である、請求項２２に記載の処方物。
【請求項２５】
前記可溶化剤が、芳香剤である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の処方物。
【請求項２６】
前記処方物が、前記不活剤を含み、該処方物中の前記可溶化剤の濃度が、約０．００１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）である、請求項２５に記載の処方物。
【請求項２７】
前記薬剤の各々が、２２℃の溶液において実質的に残っている、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の処方物。
【請求項２８】
２つ以上の容器の中に、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の処方物を調製するために十分な量の腐食阻害剤、湿潤剤、可溶化剤、ならびに必要に応じて不活剤を備える、キット。
【請求項２９】
前記腐食阻害剤および前記湿潤剤のうちの少なくとも１つが、乾燥形態で提供される、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記乾燥形態が、錠剤である、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記キットが、前記不活剤を備える、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３２】
前記不活剤、前記腐食阻害剤、および前記湿潤剤のうちの少なくとも１つが、乾燥形態で提供される、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記乾燥形態が、錠剤である、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
核酸増幅反応を行う際に使用するための１種以上の増幅試薬をさらに備える、請求項２８〜３３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３５】
請求項１〜２７にのいずれか１項に記載の処方物を作製する方法であって、該方法は、以下の順序の工程：
ａ）前記腐食阻害剤および前記湿潤剤の固体形態を別々に溶解する工程；
ｂ）該腐食阻害剤および該湿潤剤の溶解形態を一緒に合わせて混合物を形成する工程；ならびに
ｃ）可溶化剤と該混合物とを一緒に合わせて、該処方物を形成する工程
を包含し、該薬剤の各々が、２２℃の溶液において実質的に残っている、方法。
【請求項３６】
工程ｃ）の前に、前記可溶化剤の固体形態を溶解する工程をさらに包含する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記不活剤と前記処方物とを一緒に合わせる工程をさらに包含する請求項３５または３６に記載の方法であって、ここで該不活剤は、該処方物に対して核酸を実質的に不活化するのに十分な量で存在し、そして該薬剤の各々は、２２℃の溶液において実質的に残っている、方法。
【請求項３８】
前記不活剤と前記処方物とを合わせる工程の前に、該不活剤の固体形態を溶解する工程をさらに包含する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
表面上に存在する核酸を不活化するための方法であって、該方法は、
第１の処方物を表面に適用する工程
を包含し、該第１の処方物は、請求項２〜２７のいずれか１項に記載の処方物であり、ここで該第１の処方物は、前記不活剤を含む、方法。
【請求項４０】
前記表面に前記第１の処方物を適用する工程の後に、
該表面を吸収性物質によって拭い、該第１の処方物が完全に蒸発する前に該第１の処方物を除去する工程
をさらに包含する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記表面を拭って前記第１の処方物を除去する工程の後に、
該表面に第２の処方物を適用する工程
をさらに包含し、該第２の処方物は、請求項２〜２７のいずれか１項に記載の処方物であり、ここで該第２の処方物は、前記不活剤を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記表面に前記第２の処方物を適用する工程の後に、
該表面を吸収性物質によって拭い、該第２の処方物が完全に蒸発する前に該第２の処方物を除去する工程
をさらに包含する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記適用する工程と前記拭う工程との間に、浸漬時間が実質的に存在しない、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記表面に前記第１の処方物を適用する工程の前に、
該表面上に存在する有機負荷を減少させるのに十分な量で、該表面に洗剤を適用する工程をさらに包含する、請求項３９〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記拭う工程の後に、前記表面に水が適用されない、請求項４０〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記適用する工程が、第１の手によって手で行われ、そして拭う工程が、第２の手によって手で行われる、請求項３９〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記吸収性物質が、ペーパータオルまたはコットンガーゼである、請求項４０〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
2007527243.tif 000058
2007527243.tif 000059