(57)【要約】  植物、又はこの器官、組織、又は細胞における葉肉細胞浸透性病原体に対する耐性の向上のための方法であって、前記植物、又はこの器官、組織、又は細胞におけるカロース合成酵素活性が、この対照植物と比較して減少していることを特徴とする、耐性の向上のための方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物、又はこの器官、組織、又は細胞における葉肉細胞浸透性病原体に対する耐性の向上のための方法であって、前記植物、又はこの器官、組織、又は細胞中におけるカロース合成酵素活性が、対照植物と比較して減少していることを特徴とする、耐性の向上のための方法。
【請求項２】
前記病原体が、プクキニア、コタマカビ、及びボタンタケの科から選択されていることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、又は３５に示される配列を含有するカロース合成酵素タンパク質又はこれらのタンパク質に対して少なくとも４０％のホモロジ−を有するタンパク質の活性が減少されていることを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記植物、前記植物の器官、組織、又は細胞に提供されるカロース合成酵素活性が、以下からなるグループ：
ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３又は３５に示された配列を含有するポリペプチドをコードする核酸分子、
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２又は３４中に示される配列のポリヌクレオチド少なくとも１つを含有する核酸分子、
ｃ）配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３又は３５に対して少なくとも４０％の同一性を有する配列のポリペプチドをコードする核酸分子、
ｄ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３又は３５による配列の断片又はエピトープをコードする、（ａ）〜（ｃ）記載の核酸分子、
ｅ）  （ａ）〜（ｃ）記載の核酸分子によりコードされるポリペプチドに対して指向したモノクローナル抗体により認識されるポリペプチドをコードする核酸分子、及び
ｆ）ストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｃ）記載の核酸分子とハイブリダイズするカロース合成酵素をコードする核酸分子、及び
ｇ）ＤＮＡバンクから、（ａ）〜（ｃ）記載の核酸分子又は少なくとも１５ｎｔ、有利には２０ｎｔ、３０ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、２００ｎｔ、又は５００ｎｔのその部分断片のプローブとしての使用下で、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で単離されるカロース合成酵素をコードする核酸分子
から選択されるか、又はこれらの相補的な配列を含有する少なくとも１つの核酸分子を含有する核酸分子によりコードされている少なくとも１つのポリペプチドの活性を減少させるように減少されていることを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
ａ）少なくとも１つのカロース合成酵素の発現の減少、
ｂ）少なくとも１つのカロース合成酵素又は係るカロース合成酵素に相当するｍＲＮＡ分子の安定性の減少、
ｃ）少なくとも１つのカロース合成酵素の活性の減少、
ｄ）内在性又は人工的な転写因子の発現によるカロース合成酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の転写の減少、又は
ｅ）外来性のカロース合成酵素活性を減少させる因子の栄養物又は培地への添加
を特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記カロース合成酵素活性の減少を、以下からなるグループ：
ａ）二本鎖−リボ核酸分子（ｄｓＲＮＡ）の形成に適したリボ核酸分子をコードする核酸分子の導入、その際前記ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖は、請求項４記載の核酸分子に対して少なくとも３０％のホモロジーを有するか、又は請求項４（ａ）又は（ｂ）記載の核酸分子に対して少なくとも５０％のホモロジーを有する少なくとも１７つの塩基対の断片を含有する、
ｂ）アンチセンスリボ核酸分子をコードする核酸分子の導入であって、前記分子は、請求項４記載の核酸分子の非コード鎖に対して少なくとも３０％のホモロジーを有するか、又は請求項４（ａ）又は（ｂ）記載の核酸分子の非コード鎖に対して少なくとも５０％のホモロジーを有する少なくとも１５つの塩基対の断片を含有する、アンチセンスリボ核酸分子をコードする核酸分子の導入、
ｃ）請求項４記載の核酸分子の１つによりコードされるリボ核酸分子を特異的に切断するリボザイム又はその発現を保証する発現カセットの導入、
ｄ）リボザイム又はその発現を保証する発現カセットと組み合わせた請求項６ｂ）記載のアンチセンス核酸分子の導入、
ｅ）請求項４記載の核酸分子によりコードされるポリペプチド、特に配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、及び／又は３５によるタンパク質のポリペプチド又は請求項４記載の核酸分子によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも４０％のホモロジーを有するポリペプチドをコードする、センスリボ核酸分子をコードする核酸分子の導入、
ｆ）カロース合成酵素活性又はこの発現を保証する発現カセットの抑制に適したドミナントネガティブなポリペプチドをコードする核酸分子の導入、
ｇ）特異的に前記カロース合成酵素ポリペプチド又は係るポリペプチドをコードするＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子に結合できる因子又はこの発現を保証する発現カセットの導入、
ｈ）カロース合成酵素をコードするｍＲＮＡ分子の分解を引き起こすウィルス性核酸分子又はこの発現を保証する発現カセットの導入、
ｉ）カロース合成酵素をコードする遺伝子に対する相同組み換えの誘導に適した核酸構築物の導入、及び
ｊ）カロース合成酵素をコードする遺伝子の１つ又は複数への１つ又は複数の不活性化突然変異の挿入
から選択された方法の少なくとも１つの適用により達成することを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
ａ）植物中で活性のあるプロモーターとの機能的な連結において請求項６（ａ−ｉ）記載の核酸配列を含有する組み換え発現カセットの植物細胞中への導入、
ｂ）前記植物細胞からの植物の再生、及び
ｃ）前記植物中で病原体耐性を産生又は向上させるために十分な量又は期間での前記核酸配列の発現
を含む、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
植物中で活性のあるプロモーターが、病原体−誘導可能であるプロモーターであることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
植物中で活性のあるプロモーターが、葉肉特異的なプロモーターであることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記植物、植物の器官、組織、又は細胞中でＢａｘ阻害剤１−タンパク質が発現されることを特徴とする、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｂａｘ阻害剤１が葉肉及び／又は根特異的なプロモーターの制御下で発現することを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記病原体が、種、プクキニア・トリティキナ、プクキニア・ストリホルミス、ミコスファレラ・グラミニコラ、スタゴノスポラ・ノドルム、フザリウム・グラミナルム、フザリウム・クルモルム、フザリウム・アベナセム、フザリウム・ポー、又はミクロドキウム・ニバルから選択されていることを特徴とする、請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記植物は、イネ科の植物科から選択されていることを特徴とする、請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
前記植物は、植物の属、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、コムギ、モロコシ、トウモロコシ、サトウキビ、及びイネから選択されていることを特徴とする、請求項１から１３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記植物は、種、オオムギ（Hordeum vulgare）、コムギ（Triticum aestivum）、スペルト小麦（Triticum aestivum subsp.spelta）、ライコムギ、エンバク（Avena sative）、ライムギ（Secale cereale）、モロコシ（Sorghum bicolor）、サトウキビ（Saccharum officinarum）、トウモロコシ（Zea mays）、及びイネ（Oryza sative）から選択されていることを特徴とする、請求項１から１４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
以下からなるグループ：
ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、６、８、１０、１１、１３、１５、１７、２３、２５、２７、２９、３１、又は３３に示された配列を含有するポリペプチドをコードする核酸分子、
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、５、７、９、１２、１４、１６、２２、２４、２６、２８、３０、又は３２による配列のポリヌクレオチド少なくとも１つを含有する核酸分子、
ｃ）配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、６、８、１０、１１、１３、１５、１７、２３、２５、２７、２９、３１、又は３３に対して少なくとも４０％の同一性を有する配列のポリペプチドをコードする核酸分子、
ｄ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、６、８、１０、１１、１３、１５、１７、２３、２５、２７、２９、３１、又は３３による配列の断片又はエピトープをコードする、（ａ）〜（ｃ）記載の核酸分子、
ｅ）  （ａ）〜（ｃ）記載の核酸分子によりコードされるポリペプチドに対して指向したモノクローナル抗体により認識されるポリペプチドをコードする核酸分子、及び
ｆ）ストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｃ）記載の核酸分子とハイブリダイズするカロース合成酵素をコードする核酸分子、
ｇ）ＤＮＡバンクから、（ａ）〜（ｃ）記載の核酸分子又は少なくとも１５ｎｔ、有利には２０ｎｔ、３０ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、２００ｎｔ、又は５００ｎｔのその部分断片のプローブとしての使用下で、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で単離されるカロース合成酵素をコードする核酸分子
（その際前記核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、１８、２０、又は３４に示された配列からならない）；
から選択されるか、又はこの相補的な配列を含有する核酸分子を含有する核酸分子によりコードされるポリペプチドを含有するポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項１７】
前記タンパク質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、１９、２１、又は３５に示された配列からならない、請求項１６記載の核酸分子によりコードされるタンパク質。
【請求項１８】
二本鎖ＲＮＡ核酸分子（ｄｓＲＮＡ分子）であって、前記ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖が、請求項１６記載の核酸分子に対して少なくとも３０％のホモロジーを有するか、又は請求項１６記載の核酸分子に対して少なくとも５０％のホモロジーを有する少なくとも５０つの塩基対の断片を含有する、二本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項１９】
両方のＲＮＡ鎖が共有結合により相互に結合していることを特徴とする、請求項１８記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項２０】
請求項１６記載の核酸分子と実質的に同一である核酸配列を含有するＤＮＡ発現カセットであって、前記核酸配列がプロモーターに対してセンス方向にあるＤＮＡ発現カセット。
【請求項２１】
請求項１６記載の核酸分子と実質的に同一である核酸配列を含有するＤＮＡ発現カセットであって、前記核酸配列がプロモーターに対してアンチセンス方向にあるＤＮＡ発現カセット。
【請求項２２】
請求項１８又は１９記載のｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含有するＤＮＡ発現カセットであって、前記核酸配列がプロモーターと連結している、ＤＮＡ発現カセット。
【請求項２３】
請求項２０から２２までのいずれか１項記載のＤＮＡ発現カセットであって、発現すべき核酸配列が植物中で機能性であるプロモーターと連結しているＤＮＡ発現カセット。
【請求項２４】
請求項２３記載のＤＮＡ発現カセットであって、植物中で機能性であるプロモーターが病原体−誘導可能であるプロモーターである、ＤＮＡ発現カセット。
【請求項２５】
請求項２０から２４までのいずれか１項記載の発現カセットを含有するベクター。
【請求項２６】
請求項１６記載の核酸配列、請求項１８又は１９記載のｄｓＲＮＡ分子、請求項２０から２４までのいずれか１項記載の発現カセット、又は請求項２５記載のベクターを含有するトランスジェニック細胞。
【請求項２７】
請求項１６記載の核酸配列を含有する単子葉類生物であって、前記核酸配列が、請求項１６記載の核酸分子によりコードされるタンパク質の１つの活性の減少を前記生物又はこの部分において引き起こす突然変異を含有する、単子葉類生物。
【請求項２８】
トランスジェニック単子葉類生物であって、請求項１６記載の核酸配列、請求項１８又は１９記載のｄｓＲＮＡ分子、請求項２０から２４までのいずれか１項記載の発現カセット、又は請求項２５記載のベクターを含有するトランスジェニック単子葉類生物。
【請求項２９】
向上したＢａｘ阻害剤１の活性を提供する、請求項２７又は２８記載の生物。
【請求項３０】
葉肉細胞及び／又は根細胞における向上したＢａｘ阻害剤１の活性を有する、請求項２９記載の生物。
【請求項３１】
植物の科が、イネ科に属する、請求項２７から３０までのいずれか１項記載の生物。
【請求項３２】
植物の属が、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、コムギ、モロコシ、トウモロコシ、サトウキビ、及びイネから選択される、請求項３１記載の生物。
【請求項３３】
種、オオムギ（Hordeum vulgare）、コムギ（Triticum aestivum）、スペルト小麦（Triticum aestivum subsp.spelta）、ライコムギ、エンバク（Avena sative）、ライムギ（Secale cereale）、モロコシ（Sorghum bicolor）、トウモロコシ（Zea mays）、サトウキビ（Saccharum officinarum）、及びイネ（Oryza sative）から選択される、請求項３２記載の生物。
【請求項３４】
請求項２５記載のベクター、請求項２６記載のトランスジェニック細胞、請求項１６記載の核酸配列、請求項１７記載のタンパク質、請求項１８又は１９記載のｄｓＲＮＡ分子、請求項２０から２４までのいずれか１項記載の発現カセットの、葉肉組織浸透性の病原体に対して耐性のある植物の製造のための使用。
【請求項３５】
請求項２６記載のトランスジェニック細胞、又は請求項２５記載のベクター、又は請求項１６記載の核酸配列、又は請求項１７記載のタンパク質、又は請求項１８又は１９記載のｄｓＲＮＡ分子、又は請求項２０から２４までのいずれか１項記載の発現カセットを含有する収穫物又は増殖材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の詳細な説明
本発明は、特に新規ポリペプチド及び植物からの前記ポリペプチドをコードする核酸配列並びに係る配列を含有する発現カセット及びベクターに関する。本発明は更に、係る発現カセット又はベクターで形質転換されたトランスジェニック植物、係る植物から導かれる培養体、部分、又はトランスジェニック増殖物に関する。本発明は更に、少なくとも１つのカロース合成酵素ポリペプチド又は係るポリペプチドの機能的な等価物の発現の減少による植物における病原体耐性の産生又は向上のための方法に関する。
【０００２】
植物に対するバイオテクノロジーによる作業の目的は、有利な新規の特性を有する植物の製造であって、例えば農業の生産性の上昇のための、食品の品質向上のための、又は特定の化学薬品又は医薬品の生産のための製造である(Dunwell JM (2000) J Exp Bot 51 Spec No:487-96)。しばしば前記植物の病原体に対する天然の防御機構は不十分である。菌類疾病のみで年間数十億ＵＳ＄レベルの収穫損失を生じる。植物、動物、又は微生物源からの外来遺伝子の導入は前記防御を増強する可能性がある。例えば、３５Ｓ  ＣａＭＶプロモーターの制御下でのバシラス・ツリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）のエンドトキシンの発現によるタバコにおける昆虫による虫食いに対する保護（Vaeck et al. (1987) Nature 328:33-37）、又はＣａＭＶプロモーターの制御でのマメからのキチナーゼの発現による菌類被害に対するタバコの保護（Broglie et al. (1991) Science 254:1194-1197）である。記載したアプローチの大部分はしかしながら、単独の病原体に対する又は病原体の狭いスペクトルに対する耐性のみを保証する。
【０００３】
病原体、特に菌類の病原体に対する耐性を植物に提供するアプローチはほとんど存在しない。これは、考慮される生物学的な系の複雑さに原因がある。病原体と植物との間の相互作用は非常に複雑でありかつ極めて種又は属に特異的であることが、病原体に対する耐性の達成の障害である。この際、重要な因子として、様々な病原体の多数が、係る生物により展開される様々な感染機構及び植物株、科、及び種により展開される特異的な防御機構を備えているからである。
【０００４】
菌類の病原体は、実質的に２つの全く相違する感染ストラテジーを展開する。多数の菌類は、間隙開口部を介して宿主組織中に侵入（例えばサビキン類、セプトリア種、フザリウム種）し、かつ葉肉組織に浸透し、その一方でその他のものはクチクラを介してこの下にある表皮細胞に浸透する（例えばブルメリア種）。
【０００５】
感染は、植物において様々な防御機構の発達を生じる。係る機構は、考慮される植物／病原体系に依存して非常に相違するものであってよい。従って、表皮浸透性である菌類に対する防御反応はしばしば浸透耐性の発達（乳頭突起形成、細胞壁厚化、カロースを主成分として）を、菌類の浸透菌糸の下方で開始することが示されてよい（Elliott et al. Mol Plant Microbe Interact. 15: 1069-77; 2002）。これまでに、表皮浸透性菌類病原体に対する耐性の産生／向上のために様々なアプローチが記載されてきた。
【０００６】
従って、ｍｌｏ遺伝子の発現の阻害により、数々の種のうどんこ病に対する向上した耐性が達成されるものである（Bueschges R et al. (1997) Cell 88:695-705; Jorgensen JH (1977) Euphytica 26:55-62; Lyngkjaer MF et al. (1995) Plant Pathol 44:786-790）。前記のＭｌｏに条件付けられた耐性は前記病原体の表皮細胞壁の浸透部位の下方で乳頭突起形成により（細胞壁厚化、カロースを主成分として）生じる。係るＭｌｏ条件付けされた病原体耐性の欠点は、−Ｍｌｏ欠損植物は病原体の非存在下でも−防御機構を惹起し、前記機構は例えば葉細胞の自然発生的な枯死を示し（Wolter M et al. (1993) Mol Gen Genet 239:122-128）、これにより致死組織寄生（ｎｅｋｒｏｔｒｏｐｈ）又は半生組織寄生（ｈｅｍｉｂｉｏｔｒｏｐｈ）性の病原体に対する向上した感受性を説明できる。
【０００７】
致死組織寄生又は半生組織寄生性の菌類病原体に対する植物における病原体防御の上昇は、植物の葉肉組織におけるＢａｘ阻害剤−１タンパク質の活性の向上により達成されることが望ましい。
【０００８】
感染機構が表皮細胞の浸透を含む病原体に対する浸透耐性のこのような発達は、可能であれば、特に単子葉類植物のためにことさらの意味を有する。ＧＳＬ−５（カロース合成酵素の１つをコードする）の発現が機能喪失型の突然変異（Nishimura et al. Science.2003 Aug 15;301 (5635):969-72）により又は転写後遺伝子サイレンシング（転写後発現抑制、ＰＴＧＳ）の誘導（Jacobs et al. Plant Cell. 2003 Nov; 15(11):2503-13.）により抑制されたＡ．ｔｈａｌｉａｎａ（シロイヌナズナ）植物の分析は、係る植物が強力に減少した乳頭突起のカロース形成及び表皮浸透性の毒性のうどんこ病種、例えばErysiphe cichoracearumに対する向上した耐性を有することを示した。同時に、係る植物は、同様に表皮浸透性であるうどんこ病（Echte Mehltau）種、ブルメリア・グラミニス（Blumeria graminis）に対する軽度に向上した感染感受性を示した。
【０００９】
従って、単子葉類及び双子葉類植物においては、病原体の被害により誘導された防御反応の際に共通性の他に、根本的な相違も存在する。
【００１０】
表皮浸透性の病原体に対する防御反応から公知である浸透バリアは、葉肉組織浸透性の病原体（例えばサビキン類、セプトリア種、フザリウム種）の際に意味を有しないようである（例えば、Scharen, In Septoria and Stagonospora diseases of wheat, eds. Van Ginkel, McNab, 19-22頁）。
【００１１】
現在、植物の孔辺細胞中への侵入により、葉肉組織の引き続く浸透でもって植物に影響を及ぼす病原体に対する、植物の耐性を産生させることができる方法は公知でない。
【００１２】
従って、本発明の基礎となる課題は、葉肉細胞浸透性の病原体に対して植物の耐性を産生させるための方法を提供することである。
【００１３】
係る課題は、特許請求の範囲において特徴付けられた実施態様により解決される。
【００１４】
従って本発明は、植物、又はこの器官、組織、又は細胞における葉肉細胞浸透性病原体に対する耐性の向上のための方法であって、前記植物、又はこの器官、組織、又は細胞におけるカロース合成酵素活性が、対照植物と比較して減少していることを特徴とする、耐性の向上のための方法に関する。特別な一実施態様において、前記病原体は、プクキニア（Pucciniaceae）、コタマカビ（Mycosphaerellaceae）、及びボタンタケ（Hypocreaceae）の科から選択されている。
【００１５】
本発明により開示されるカロース合成酵素をコードするｃＤＮＡ配列が、例えばｄｓＲＮＡｉを介した遺伝子スライシングにより、菌類病原体であって間隙開口部を介して植物中に侵入し、引き続き葉肉細胞に浸透する菌類病原体に対する、特に、科、プクキニア、コタマカビ、及びボタンタケからの病原体に対する耐性の向上という結果を生じることは意外であった。有利には、前記植物は、単子葉類植物である。
【００１６】
オオムギ（Hordeum vulgare）、コムギ（Triticum aestivum）、及びトウモロコシ（Zea mays）からのカロース合成酵素に関しては、葉肉細胞浸透性の病原体の被害の際に負の制御機能が仮定される。細胞におけるカロース合成酵素発現の、二本鎖カロース合成酵素−ｄｓＲＮＡの使用下での配列特異的なＲＮＡ干渉アプローチ（「遺伝子サイレンシング」）による減少は、植物病原体菌類、特に科、プクキニア、コタマカビ、及びボタンタケによる葉肉組織の感染を減少できる。
【００１７】
一実施態様において、前記カロース合成酵素ポリペプチドの活性の減少は、葉肉組織特異的に、例えば前記カロース合成酵素ポリペプチドをコードする核酸分子の組み換え発現を介して、葉肉組織特異的なプロモーターの制御下の相互抑制効果（Ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｅｆｆｅｋｔ）の誘導のために行われる。
【００１８】
更なる一実施態様において、カロース合成酵素のポリペプチド量、活性又は機能の植物における減少は、Ｂａｘ阻害剤１−タンパク質（Ｂｌ−１）、有利にはオオムギからのＢａｘ阻害剤１−タンパク質（GenBank Acc.-No.: AJ290421, ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）又はタバコからのＢａｘ阻害剤１−タンパク質（GenBank Acc.-No.: AF390556, ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）のポリペプチド量、活性又は機能の向上と組み合わせて行われる。これは例えば、Ｂａｘ阻害剤１−タンパク質のポリペプチドをコードする核酸分子の１つの発現を介して、例えば葉肉組織中でのＢａｘ阻害剤１−タンパク質の活性の組織特異的な向上と組み合わせて行ってよい。葉肉組織中でＢｌ−１を過剰発現するトランスジェニック植物中でのカロース合成酵素活性の減少は、半生組織寄生また同様に致死組織寄生な菌類を成功して防御できるという結果を生じる。この点で、係る組み合わせは、包括的な菌類耐性を前記植物中で産生させるという機会を提供する。Ｂｌ−１の発現に適する核酸分子は、例えばイネ（GenBank Acc.-No.: AB025926）、アラビドプシス（GenBank Acc.-No.: AB025927）、タバコ及びヨウシュナタネ（GenBank Acc.-No.: AF390555, Bolduc N et al. (2003) Planta 216:377-386）からのＢｌ−１遺伝子である。
【００１９】
カロースポリマーは、高等植物の重要な代謝産物であり、かつ花粉管、隔膜形成体、乳頭突起の形成の枠内において、又は細胞壁孔のための閉塞材料として、並びに師要素の師板において合成されるので、植物におけるカロース合成酵素ポリペプチドの広汎な分布を推測することができる。以上の理由から、本発明による方法は原則的に全ての植物種に対して適用できる。
【００２０】
本発明の枠内において開示されるカロース合成酵素配列に対するその他の植物からの相同配列は、例えばサーチ配列又はプローブとしてのカロース合成酵素配列の使用下で遺伝子バンクのデータバンクサーチ又は精査により、容易に見つけ出されてよい。
【００２１】
「植物」は、本発明の枠内において全ての双子葉類又は単子葉類の植物を意味する。有利には、単子葉（単子葉類又は１枚の子葉の植物）の分類に包含される植物である。前記概念に包含されるのは、成熟植物、種子、シュート、及び実生、並びにこれらから導かれる部分、増殖物、植物器官、組織、プロトプラスト、カルス、及びその他の培養体、例えば細胞培養体、並びに機能的又は構造的な単位への植物細胞のグループ分けのその他全ての種類である。成熟植物は、実生を超えたそれぞれの任意の発育段階での植物を意味する。実生は、早期の発達段階における未成熟な幼植物を意味する。
【００２２】
「植物」は、一年生及び多年生の双子葉類又は単子葉類植物をも含み、そして、例えば以下に制限されることはないけれども、属、イヌムギ、アスパラガス、チカラシバ、ライグラス、イネ、トウモロコシ、カラスムギ、オオムギ、ライムギ、パンコムギ、モロコシ、及びサトウキビを包含する。
【００２３】
有利な一実施態様において前記方法は、単子葉類植物、有利にはイネ科からの単子葉類植物、特に有利には属、イネ、トウモロコシ、カラスムギ、オオムギ、ライムギ、パンコムギ、モロコシ、及びサトウキビ、とりわけ有利には農学的に意味を有する植物、例えばオオムギ（Hordeum vulgare）、コムギ（Triticum aestivum）、スペルト小麦（Triticum aestivum subsp.spelta）、ライコムギ、エンバク（Avena sative）、ライムギ（Secale cereale）、モロコシ（Sorghum bicolor）、トウモロコシ（Zea mays）、サトウキビ（Saccharum officinarum）又はイネ（Oryza sative）に適用される。
【００２４】
「葉肉組織」は、表皮層の間に存在する、柵状組織、海綿状組織、及び葉脈からなる葉組織を意味する。
【００２５】
「核酸」は、ヌクレオチドからなる生体高分子であって、ホスホジエステル結合を介して相互に連結している生体高分子を意味する（ポリヌクレオチド、ポリ核酸）。ヌクレオチド中の糖の種類（リボース又はデオキシリボース）に応じて、リボ核酸（ＲＮＡ）とデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の両方の分類が区別される。
【００２６】
概念「収穫物」は、植物の農業栽培により獲得されかつ収穫経過の枠内で集積された植物部分の全てを意味する。
【００２７】
「耐性」は、病原体による被害の結果による植物の疾病症状の減少又は緩和を意味する。前記症状は多様な種類であってよく、しかしながら有利には直接的又は非直接的に、植物の品質、収穫高の量、飼料又は栄養としての使用の適性の損失を生じる症状を含み、又はしかしながら収穫物の播種、栽培、収穫、又は加工を困難にする症状をも含む。
【００２８】
病原体耐性の「提供」、「存在」、「産生」、又は、「向上」は、特定の植物種又は植物品種の防御機構が、本発明による方法の適用により、本発明の方法が適用されていない前記植物の野生型（「対照植物」、「出発植物」）と比較して、その他は同じ条件（例えば、気候条件又は栽培条件、病原体の種類、その他）で、１つ及び複数の病原体に対する向上した耐性を示すことを意味する。この際、前記の向上した耐性は有利には、前記疾病症状の減少した顕著さの形で現れ、その際疾病症状は−上述の損失の他に−、例えば前記植物又は植物細胞中への病原体の浸透効率、又は係る前記植物又は植物細胞中での又はこれらに対する増殖効率をも含む。この際、前記疾病症状は有利には、少なくとも１０％又は少なくとも２０％だけ、特に有利には少なくとも４０％又は６０％だけ、とりわけ有利には少なくとも７０％又は８０％だけ、最も有利には少なくとも９０％又は９５％だけ減少する。
【００２９】
「病原体」は、本発明の枠内において、植物との相互作用が前記疾病症状を生じる生物を意味し、特に菌類界からの病原性の生物を意味する。有利には、病原体とは、葉肉組織浸透性病原体、特に有利には間隙開口部を介して植物に侵入し、引き続き前記葉肉組織に浸透する病原体が理解される。有利にはこの際、株、子嚢菌類及び担子菌類（Basidomycota）の生物が挙げられる。特に有利にはこの際、プクキニア、コタマカビ、及びボタンタケの科である。
【００３０】
特に有利には、プクキニア、フザリウム、又はコタマカビの属に属する科の生物である。
【００３１】
特に有利には、種、プクキニア・トリティキナ（Puccinia triticina）、プクキニア・ストリホルミス（Puccinia striiformis）、ミコスファレラ・グラミニコラ（Mycosphaerella graminicola）、スタゴノスポラ・ノドルム（Stagonospora nodorum）、フザリウム・グラミナルム（Fusarium graminearum）、フザリウム・クルモルム（Fusarium culmorum）、フザリウム・アベナセム（Fusarium avenaceum）、フザリウム・ポー（Fusarium poae）、及びミクロドキウム・ニバル（Microdochium nivale）である。
【００３２】
かしながらカロース合成酵素ペプチドの発現、その活性又は機能の減少もまた更なる病原体に対する耐性を引き起こすことが仮定される。前記細胞壁構造における変更は、前記病原体耐性の基本的な機構を提示する可能性がある。
【００３３】
特に有利には、子嚢菌類、例えばフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）（トマトに対するフザリウム凋萎）、セプトリア・ノドルム（Septoria nodorum）及びセプトリア・トリティキ（Septoria tritici）（コムギに対する殻褐変）、担子菌類、例えばプクキニア・グラミニス（Puccinia graminis）（コムギ、オオムギ、ライムギ、カラスムギに対する黒色サビ）、プクキニア・レコンディタ（Puccinia recondita）（コムギに対する褐色サビ）、プクキニア・ディスペルサ（Puccinia dispersa）（ライムギに対する褐色サビ）、プクキニア・ホルデイ（Puccinia hordei）（オオムギに対する褐色サビ）、プクキニア・コロナータ（Puccinia coronata）（カラスムギに対する冠サビ病）である。
【００３４】
一実施態様において、本発明による方法は以下の場合の耐性を生じる
以下病原体に対するオオムギの場合：
プクキニア・グラミニスｆ．ｓｐ．ホルデイ（Puccinia graminis f.sp. hordei）（オオムギ黒サビ病）（ｂａｒｌｅｙ  ｓｔｅｍ  ｒｕｓｔ）、
以下病原体に対するコムギの場合：
フザリウム・グラミナルム（Fusarium graminearum）、フザリウム・アベナセム（Fusarium avenaceum）、フザリウム・クロモルム（Fusarium culmorum）、プクキニア・グラミニスｆ．ｓｐ．トリティキ（Puccinia graminis f.sp. tritici）、プクキニア・レコンディタｆ．ｓｐ．トリティキ（Puccinia recondita f.sp. tritici）、プクキニア・ストリホルミス（Puccinia striiformis）、セプトリア・ノドルム（Septoria nodorum）、セプトリア・トリティキ（Septoria tritici）、セプトリア・アベナ（Septoria avenae）、又はプクキニア・グラミニスｆ．ｓｐ．トリティキ（Puccinia graminis f.sp. tritici）(コムギ黒サビ病)（Ｗｈｅａｔ  ｓｔｅｍ  ｒｕｓｔ）、
以下病原体に対するトウモロコシの場合：
フザリウム・モンチホルメvar.スブグルチナンス（Fusarium moniliforme var. subglutinans）、プクキニア・ソルギ（Puccinia sorghi）、又はプクキニア・ポリソラ（Puccinia polysora）、
以下病原体に対するモロコシの場合：
プクキニア・プルプレア（Puccinia purpurea）、フザリウム・モニリフォン（Fusarium monilifonne）、フザリウム・グラミナルム、又はフザリウム・オキシスポラム。
【００３５】
「カロース合成酵素ポリペプチド」は、本発明による枠内において、以下に挙げる活性を有するタンパク質を意味する。一実施態様において、本発明は、カロース合成酵素ポリペプチドであって、例えばオオムギからのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８によるカロース合成酵素ポリペプチド及び／又はトウモロコシ（Zea mays）からのそのホモログＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、１１、１３、１５、１７及び／又はイネ（Oryza sative）からのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、２１による及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、２５、２７、２９、３１及び／又は３３によるコムギ（Triticum aestivum）からの及び／又シロイヌナズナはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４からのカロース合成酵素ポリペプチド又はこの断片に関する。一実施態様において、本発明は前記ポリペプチド配列の機能的な等価物に関する。
【００３６】
「ポリペプチド量」は、例えば、生物、組織、細胞、又は細胞区画中のカロース合成酵素ポリペプチドの数を意味する。前記ポリペプチド量の「減少」は、生物、組織、細胞、又は細胞区画中において、−例えば以下に記載の方法の１つにより−、前記方法を適用していない同一の属及び種の野生型（対照植物）と比較して、その他は同じ枠内の条件（例えば培養条件、植物の齢、その他）でカロース合成酵素ポリペプチドの数の量的な減少を意味する。前記減少は、この際少なくとも１０％、有利には少なくとも１０％又は少なくとも２０％、特に有利には少なくとも４０％又は６０％、とりわけ有利には少なくとも７０％又は８０％、最も有利には少なくとも９０％又は９９％である。
【００３７】
カロース合成酵素ポリペプチドの「活性」又は「機能」は、線形のβ−１→３グリコシド結合したグルカンポリマーであって、１→６グリコシド又は１→４グリコシド結合した分枝を有してもよいグルカンポリマーの形成又は合成を意味する（カロースポリマー）。
【００３８】
カロース合成酵素の活性又は機能の「減少」は、例えば細胞、組織、又は器官中でのカロースポリマーの合成又は伸長の能力の、−例えば以下に記載の方法の１つにより−、前記方法を適用していない同一の属及び種の野生型と比較して、その他は同じ枠内の条件（例えば培養条件、植物の齢、その他）での減少を意味する。前記減少は、この際少なくとも１０％、有利には少なくとも１０％又は少なくとも２０％、特に有利には少なくとも４０％又は６０％だけ、とりわけ有利には少なくとも７０％又は８０％だけ、最も有利には少なくとも９０％、９５％だけ又はそれ以上である。減少とは、基質特異性の変更、例えばｋｃａｔ／Ｋｍ値により表現されてよい基質特異性の変更をも理解されたい。前記減少は、この際少なくとも１０％、有利には少なくとも１０％又は少なくとも２０％、特に有利には少なくとも４０％又は６０％だけ、とりわけ有利には少なくとも７０％又は８０％だけ、最も有利には少なくとも９０％、９５％だけ又はそれ以上である。
【００３９】
生物又は非生物によるストレスの結果形成されたカロースポリマーを検出するための方法は、当業者に公知であり、かつ複数回説明されている（特にJacobs et al., The Plant Cell, 第15巻, 2503-13, 2003; Desprez et al.,Plant Physiology, 02. 2002, 第128巻, pp. 482-490）。カロース沈積は、組織片中で例えばアニリン青での染色により可視可能にできる。アニリン青で染色したカロースは、アニリン青の蛍光色素の、黄色のＵＶ光により誘導される蛍光で検出可能である。
【００４０】
本発明の更なる対象は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３及び／又は３５に示される配列を含有するカロース合成酵素ポリペプチド及び／又は又はこれらのポリペプチドに対して少なくとも４０％のホモロジ−を有するポリペプチド及び／又は及び／又は前記ポリペプチドの機能的な等価物の少なくとも１つの機能、活性、又はポリペプチド量の減少による病原体耐性の産生である。
【００４１】
２つの核酸配列の間のホモロジーとは、そのつどの全体の配列長にわたる核酸配列の同一性が理解され、これはプログラムアルゴリズムＧＡＰ（Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389〜）を用いた比較により、次のパラメーターの調整下で計算される：
ギャップウェイト：５０  長さウェイト：３
平均マッチ：１０  平均ミスマッチ：０。
【００４２】
例示的に、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を有する核酸ベースで少なくとも８０％のホモロジーを有する配列とは、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１との比較の際に、前記プログラムアルゴリズムにより前記パラメーターセットを用いて少なくとも８０％のホモロジ−を有する配列が理解される。
【００４３】
２つのポリペプチドの間のホモロジーとは、そのつどの全体の配列長にわたるアミノ酸配列の同一性が理解され、これはプログラムアルゴリズムＧＡＰ（Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA）を用いた比較により、次のパラメーターの調整下で計算される：
ギャップウェイト：８  長さウェイト：２
平均マッチ：２．９１２  平均ミスマッチ：−２．００３。
【００４４】
例示的に、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を有するポリペプチドベースで少なくとも８０％のホモロジーを有する配列とは、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２との比較の際に、前記プログラムアルゴリズムにより前記パラメーターセットを用いて少なくとも８０％のホモロジ−を有する配列が理解される。
【００４５】
本発明の一実施態様において、植物、植物器官、組織、又は細胞に提供されるカロース合成酵素活性は、前記植物、植物器官、組織、又は細胞において以下からなるグループ：
ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３及び／又は３５に示された配列を含有するポリペプチドをコードする核酸分子、
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２及び／又は３４中による配列のポリヌクレオチド少なくとも１つを含有する核酸分子、
ｃ）配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３及び／又は３５に対して少なくとも４０％の同一性を有する配列のポリペプチドをコードする核酸分子、
ｄ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３及び／又は３５による配列の断片又はエピトープをコードする、（ａ）〜（ｃ）までの核酸分子、
ｅ）  （ａ）〜（ｃ）記載の核酸分子によりコードされるポリペプチドに対して指向したモノクローナル抗体により認識されるポリペプチドをコードする核酸分子、及び
ｆ）（ａ）〜（ｃ）記載の核酸分子又は少なくとも１５ヌクレオチド（ｎｔ）、有利には２０ｎｔ、３０ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、２００ｎｔ、又は５００ｎｔからなるその部分断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするカロース合成酵素をコードする核酸分子、
ｇ）ＤＮＡバンクから、（ａ）〜（ｃ）記載の核酸分子又は少なくとも１５ｎｔ、有利には２０ｎｔ、３０ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、２００ｎｔ、又は５００ｎｔのその部分断片のプローブとしての使用下で、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で単離されるカロース合成酵素をコードする核酸分子
から選択されるか、又はこれらの相補的な配列を含有するか、又は機能的な等価物を示す核酸分子を含有する核酸分子によりコードされる少なくとも１つのポリペプチドの活性、機能、ポリペプチド量の減少により減少される。
【００４６】
有利には、前記ポリペプチドの活性は、植物の葉肉細胞中で上記で説明したように減少される。
【００４７】
「エピトープ」とは、抗体の特異性を決定する抗原の領域が理解される（抗原決定基）。
【００４８】
エピトープは従って、実際的に抗原と接触する抗原の一部である。
【００４９】
係る抗原決定基は、Ｔ細胞レセプターが反応しかつ結果として抗体が産生される抗原の領域であり、前記抗体は抗原の抗原決定基／エピトープに特異的に結合する。抗原又はそのエピトープは従って、生物の免疫応答を、特異的な−エピトープに対して指向した−抗体の結合の結果として誘導することができる。エピトープは、例えば、タンパク質の一次構造にある線形のアミノ酸の連続、又は複合体である二次又は三次のタンパク質構造からなっている。ハプテンとは、前記の抗原環境の文脈からは解離するエピトープが理解される。ハプテンは定義によれば抗体に対して指向するが、ハプテンはある状況下では、例えば注射により生物に免疫応答を誘導することはできない。この目的のためにハプテンは担体分子に結合される。例としてジニトロフェノール（ＤＮＰ）が挙げられ、これはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）への結合により、ＤＮＰに対して指向した抗体の製造のために使用される(Bohn, A., Koenig, W. 1982)。
【００５０】
ハプテンは従って（しばしば小分子である）、自体では免疫反応を作動させることができないが、大分子の担体に結合している場合には作動できる物質である。このように産生された抗体とはまた、ハプテンに単独で結合できる抗体でもある。
【００５１】
抗体は本発明の枠内において、本発明により開示された、生物、有利には植物、特に有利には単子葉類植物からのポリペプチドの同定及び単離のために使用されてよい。前記抗体はモノクローナル、ポリクローナル、合成の性質であってよく、又は抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆｖ、又はｓｃＦｖ断片からなってよく、これら断片はタンパク質加水分解により生じる。「単鎖」Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片は、フレキシブルなリンカー配列を介して結合した一本鎖の断片であって、重鎖又は軽鎖の抗体鎖の可変領域のみを含有する。係るｓｃＦｖ断片は、組み換え抗体誘導体として産生されてもよい。フィラメント性のファージの表面での係る抗体断片の提示は、組み換えファージライブラリーからの高親和性に結合するｓｃＦｖ分子の直接的な選択を可能にする。
【００５２】
モノクローナル抗体はKoehler及びMilsteinにより記載された方法により獲得されてよい（Nature 256 (1975), 495）。
【００５３】
カロース合成酵素ポリペプチドの「機能的な等価物」は、特に、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３及び／又は３５により記載されたポリペプチドに対して少なくとも４０％のホモロジーを有し、かつ実質的に同じ特性を示すか、又は機能を有するポリペプチドを意味する。
【００５４】
機能的な等価物の「実質的に同じ特性」は、特に、植物、この植物の器官、組織、部分、又は細胞、特に葉肉細胞における前記機能的なカロース合成酵素の等価物のポリペプチド量、活性、又は機能の減少の際の少なくとも１つの病原体に対する病原体耐性の表現系の提供又は病原体耐性の提供又は上昇を意味する。
【００５５】
この際、前記病原体耐性の効率は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３及び／又は３５によるカロース合成酵素ポリペプチドの１つの減少の際に得られた値に比較して減少方向にも上昇方向にも逸脱してよい。有利には、係る機能的な等価物は、−例えば病原体の浸透効率に関して測定された病原体の効率が−、比較の値から５０％、有利には２５％、特に有利には１０％を上回るだけ逸脱するものであって、前記の比較の値は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３及び／又は３５によるカロース合成酵素ポリペプチドの減少により得られる。特に有利には、この減少の際に病原体耐性の効率が、定量により５０％、有利には１００％、特に有利には５００％、とりわけ有利には１０００％を上回るだけ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３及び／又は３５によるカロース合成酵素ポリペプチドの減少の際に得られる比較の値を上回る配列である。
【００５６】
この比較は有利には類似の条件下で実施される。
【００５７】
「類似の条件」は、全ての枠内の条件、例えば培養条件、又は成長条件、アッセイ条件（例えば、緩衝液、温度、基質、病原体濃度、その他）は、比較すべき試験との間で同一に維持され、このアプローチは、比較すべきカロース合成酵素ポリペプチドの配列、その由来生物、及び場合によりその病原体においてのみ相違する。
【００５８】
「機能的な等価物」は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３及び／又は３５によるカロース合成酵素ポリペプチドの天然又は人工の突然変異体並びにその他の単子葉類植物からの相同ペプチドも意味し、これは更に実質的に同じ特性を有する。有利には、相同ペプチドは上述の有利な植物からである。本発明の枠内において開示されるカロース合成酵素配列に対する、その他の植物（例えばイネ）からの相同配列は、−例えばサーチ配列又はプローブとしてのカロース合成酵素配列の使用下で−遺伝子バンクのデータバンクサーチ又は精査により、容易に見つけ出されてよい。
【００５９】
機能的な等価物はまた、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３及び／又は３５による本発明によるポリペプチドの１つから、置換、挿入、又は欠失により導かれてよく、かつ前記ポリペプチドに対して少なくとも６０％、有利には少なくとも８０％、有利には少なくとも９０％、特に有利には少なくとも９５％、とりわけ有利には少なくとも９８％のホモロジーを有し、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３及び／又は３５によるポリペプチドと実質的に同じ特性において特徴付けられてよい。
【００６０】
機能的な等価物はまた、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２及び／又は３４による本発明による核酸配列から、置換、挿入、又は欠失により導かれた核酸分子であり、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２及び／又は３４による本発明によるポリヌクレオチドに対して少なくとも６０％、有利には少なくとも８０％、有利には少なくとも９０％、特に有利には少なくとも９５％、とりわけ有利には少なくとも９８％のホモロジーを有し、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３又は３５によるポリペプチドと実質的に同じ特性を有するポリペプチドをコードする。
【００６１】
本発明による方法において減少すべき、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３及び／又は３５によるカロース合成酵素の機能的な等価物の例は、例えば遺伝子配列が公知である生物、例えばイネから、データバンクからのホモロジー比較により見出されてよい。
【００６２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２及び／又は３４で記載した核酸配列又はこの部分のプローブとしての使用下での、その他の生物の、有利には更に以下に挙げた宿主として形質転換に適した植物の種類のｃＤＮＡライブラリー又はゲノムライブラリーの精査はまた、その他の種におけるホモロジーを同定するための当業者に公知の方法である。この際、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２及び／又は３４による核酸配列から導かれるプローブは、少なくとも２０ｂｐ、有利には少なくとも５０ｂｐ、特に有利には少なくとも１００ｂｐ、とりわけ有利には少なくとも２００ｂｐ、最も有利には少なくとも４００ｂｐの長さを有する。前記プローブはまた、１又は複数キロベース長、例えば１Ｋｂ、１．５Ｋｂ、又は３Ｋｂであってよい。係るライブラリーの精査のために、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２及び／又は３４において記載された配列に対して相補的なＤＮＡ鎖、又は２０ｂｐ〜複数キロベース長を有するこの断片も使用してよい。
【００６３】
本発明による方法において、標準的な条件下でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２及び／又は３４により記載されかつカロース合成酵素をコードする核酸分子（前記核酸分子の相補的な核酸分子又は部分）とハイブリダイズし、かつ完全な配列として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３及び／又は３５に記載したポリペプチドと同じ特性を提供するポリペプチドをコードするＤＮＡ分子が使用されてよい。
【００６４】
「標準的なハイブリダイゼーション条件」は、幅広く理解されるものであり、そして適用に応じてストリンジェントは低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件をも意味する。係るハイブリダイゼーション条件は特に、Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 9.31-9.57頁) 又は Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.に記載されている。
【００６５】
当業者は、特異的ハイブリダイゼーションから非特異的なハイブリダイゼーションを区別できることを可能にするハイブリダイゼーション条件を選択するであろう。
【００６６】
例示的に、洗浄工程の間の前記条件は、低ストリンジェンシーを有する条件（約２×ＳＳＣ、５０℃で）及び高ストリンジェンシーを有する条件（約０．２×ＳＳＣ、５０℃で、有利には６５℃で）から選択されてよい（２０×ＳＳＣ：０．３Ｍ  クエン酸ナトリウム、３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）。更に前記洗浄工程の間の温度は、室温、約２２℃での低ストリンジェント条件から約６５℃での高ストリンジェント条件に上昇させてよい。塩濃度及び温度の両方のパラメーターは、同時に又は単独で変更させてよく、その際このそのつどのその他のパラメーターは一定に維持される。前記ハイブリダイゼーションの間に、変性剤、例えばホルムアミド又はＳＤＳを使用してもよい。５０％のホルムアミドの存在下では、前記ハイブリダイゼーションは有利には４２℃で実施される。ハイブリダイゼーション及び洗浄工程のための例示的な幾つかの条件を以下に挙げる：
１．ハイブリダイゼーション条件は、例えば以下の条件から選択されてよい：
ａ）４×ＳＳＣ、６５℃で、
ｂ）６×ＳＳＣ、４５℃で、
ｃ）６×ＳＳＣ、１００μｇ／ｍｌの変性した、断片化した魚類精子ＤＮＡ、６８℃で、
ｄ）６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性したサケ精子ＤＮＡ、６８℃で、
ｅ）６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性した、断片化したサケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド、４２℃で、
ｆ）５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、４２℃で、又は
ｇ）５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭ  クエン酸ナトリウム、４２℃で、又は
ｈ）２×又は４×ＳＳＣ、５０℃で（低ストリンジェント条件）、
３０〜４０％ホルムアミド、２×又は４×ＳＳＣ、４２℃で（低ストリンジェント条件）。
５００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ（ｇ／Ｖ）、１ｍＭＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍｌ一本鎖ＤＮＡ、０．５％ＢＳＡ（ｇ／Ｖ）（Church及びGilbert, Genomic sequencing. Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A.81:1991. 1984）。
２．洗浄工程は例えば、以下の条件から選択されてよい：
ａ）０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム／０．１％ＳＤＳ  ５０℃で
ｂ）０．１×ＳＳＣ、６５℃で、
ｃ）０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、６８℃で、
ｄ）０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃で、
ｅ）０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃で、
ｆ）２×ＳＳＣ、６５℃で（低ストリンジェント条件）。
【００６７】
一実施態様において、前記ハイブリダイゼーション条件を以下のように選択する：
ホルムアミド、ＮａＣｌ、及びＰＥＧ６０００を含有するハイブリダイゼーション緩衝液が選択される。ホルムアミドのハイブリダイゼーション緩衝液中での存在は、二本鎖の核酸分子を不安定化し、これによりこのストリンジェンシーを減少させることなく前記ハイブリダイゼーション温度を４２℃に下降できる。塩のハイブリダイゼーション緩衝液中での使用は、二本鎖の再生率又はハイブリダイゼーション効率を向上させる。ＰＥＧはこの溶液の粘性を向上させ、これは再生率に負の影響を有するが、前記ポリマーの溶液中での存在により、残存する媒体中でのこのプローブの濃度を向上させ、これはハイブリダイゼーション率を増加させる。緩衝液の組成は以下のとおりである：
【表１】
2007536918.tif 000002
【００６８】
前記ハイブリダイゼーションを４２℃で一晩実施する。フィルターを翌朝に３回、２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳでそのつど約１０分間洗浄する。
【００６９】
本発明の有利な一実施態様において、本発明による方法における耐性の向上を、
ａ）少なくとも１つのカロース合成酵素の発現の減少、
ｂ）少なくとも１つのカロース合成酵素又は係るカロース合成酵素に相当するｍＲＮＡ分子の安定性の減少、
ｃ）少なくとも１つのカロース合成酵素の活性の減少、
ｄ）内在性又は人工的な転写因子の発現によるカロース合成酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つの転写の減少、又は
ｅ）外来性のカロース合成酵素活性を減少させる因子の栄養物又は培地への添加
により達成する。
【００７０】
遺伝子発現及び発現は同義に使用され、そして核酸分子中に保存されている情報の実現化を意味する。カロース合成酵素遺伝子の発現の減少は従って、カロース合成酵素ポリペプチドのポリペプチド量、カロース合成酵素活性、又はカロース合成酵素機能の減少を包含する。カロース合成酵素の遺伝子発現の減少は、様々な方法で−例えば前記方法の１つにより−実現されてよい。
【００７１】
「減少」又は「減少する」とは、カロース合成酵素ポリペプチド、カロース合成酵素活性、又はカロース合成酵素機能との関連において、広く解釈されるべきであり、かつ部分的に又は実質的に完全な、相違する細胞生物学的な機構に基づく、植物又は係る植物から導かれる部分、組織、器官、細胞、又は種子におけるカロース合成酵素ポリペプチドの機能性の阻害又は遮断を含む。
【００７２】
本発明の意味合いにおける減少はまた、カロース合成酵素ポリペプチドの実質的に完全な欠失までのカロース合成酵素ポリペプチドの量的な減少をも含む（即ち、病原体の被害の結果として、カロース合成酵素活性又はカロース合成酵素機能の欠失する検出能又はカロース合成酵素ポリペプチドの欠失する免疫学的検出能及びまた減少したカロース沈積）。この際、特定のカロース合成酵素ポリペプチドの発現又はカロース合成酵素活性又はカロース合成酵素機能は、細胞又は生物において、有利には５０％を上回るだけ、特に有利には８０％を上回るだけ、特に有利には９０％を上回るだけ、前記方法を適用していない同一の属及び種の野生型（対照植物）と比較して、その他は同じ枠内の条件（例えば培養条件、植物の齢、その他）下で減少される。
【００７３】
本発明により、カロース合成酵素ポリペプチドの発現、カロース合成酵素活性、又はカロース合成酵素機能の減少のための様々なストラテジーが記載される。当業者は、カロース合成酵素ポリペプチドの発現、カロース合成酵素活性、又はカロース合成酵素機能に所望の様式で影響を及ぼすための一連の更なる使用可能である方法を認識する。
【００７４】
一実施態様において、本発明による方法においては、カロース合成酵素活性の減少が、以下から選択されるグループからの少なくとも１つの方法の適用により達成される：
ａ）二本鎖−リボ核酸分子（ｄｓＲＮＡ）の形成に適したリボ核酸分子をコードする核酸分子の導入、その際前記ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖は、本発明による核酸分子、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２及び／又は３４による核酸分子に対して少なくとも３０％のホモロジーを有するか、又は本発明による核酸分子、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２及び／又は３４による核酸分子又はこの機能的な等価物に対して少なくとも５０％のホモロジーを有する少なくとも１７つの塩基対の断片を含有し、又はこの発現を保証する発現カセット又は発現カセットの導入。
【００７５】
ｂ）アンチセンスリボ核酸分子をコードする核酸分子の導入であって、前記分子は、本発明による核酸分子、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２及び／又は３４による核酸分子の非コード鎖に対して少なくとも３０％のホモロジーを有するか、又は本発明による核酸分子、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２及び／又は３４による核酸分子の非コード鎖又はこの機能的な等価物に対して少なくとも５０％のホモロジーを有する少なくとも１５つの塩基対の断片を含有する、アンチセンスリボ核酸分子をコードする核酸分子の導入。含まれるのは、カロース合成酵素遺伝子（つまりゲノムＤＮＡ配列）又はカロース合成酵素遺伝子転写産物（つまりＲＮＡ配列）に対するアンチセンス核酸配列に指向させた方法である。α−アノマー核酸配列も含まれる。
【００７６】
ｃ）本発明による核酸分子、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２及び／又は３４による核酸分子、又はこの機能的な等価物によりコードされるリボ核酸分子を特異的に、例えば触媒により切断するリボザイム又はその発現を保証する発現カセットの導入。
【００７７】
ｄ）リボザイム又はその発現を保証する発現カセットと組み合わせたｂ）記載のアンチセンス核酸分子の導入。
【００７８】
ｅ）本発明によるポリペプチド、例えば配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、及び／又は３５によるポリペプチドのセンスリボ核酸分子、又は、本発明によるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも４０％のホモロジーを有するか、又はこの機能的な等価物であるポリペプチドをコードする核酸分子の導入。
【００７９】
ｆ）カロース合成酵素活性又はこの発現を保証する発現カセットの抑制に適したドミナントネガティブなポリペプチドをコードする核酸配列の導入。
【００８０】
ｇ）特異的にカロース合成酵素ポリペプチド又は係るポリペプチドをコードするＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子に結合できる因子又はこの発現を保証する発現カセットの導入。
【００８１】
ｈ）カロース合成酵素をコードするｍＲＮＡ分子の分解を引き起こすウィルス性核酸分子又はこの発現を保証する発現カセットの導入。
【００８２】
ｉ）カロース合成酵素をコードする遺伝子に対する相同組み換えの誘導に適した核酸構築物の導入。
【００８３】
ｊ）機能喪失を生じさせるための、カロース合成酵素をコードする遺伝子の１つ又は複数への１つ又は複数の突然変異の挿入（例えば、ストップコドンの産生、リーディングフレームシフト、その他）。
【００８４】
個々の係る方法のいずれも、本発明の意味合いにおいて、カロース合成酵素発現、カロース合成酵素活性、又はカロース合成酵素機能の減少を引き起こしてよい。組み合わせた適用もまた考慮できる。更なる方法は当業者に公知であり、そして前記カロース合成酵素ポリペプチドのプロセシング、カロース合成酵素ポリペプチド又はこのｍＲＮＡの輸送の阻止又は阻害、リボソーム付加の阻害、ＲＮＡスプライスングの阻害、カロース合成酵素ＲＮＡを分解する酵素の誘導及び／又は翻訳伸長又は翻訳停止の阻害を含む。
【００８５】
カロース合成酵素活性、機能、又はポリペプチド量の減少が、有利には、内在性カロース合成酵素遺伝子の減少した発現により達成される。
【００８６】
この個々の有利な方法は以下に簡潔に記載される：
ａ）二本鎖のカロース合成酵素のＲＮＡ核酸配列の導入（カロース合成酵素ｄｓＲＮＡ）
二本鎖ＲＮＡ（「二本鎖ＲＮＡ干渉」、ｄｓＲＮＡ）を用いた遺伝子制御の方法は、複数回、動物及び植物の生物において記載されている（例えば、Matzke MA et al. (2000) Plant Mol Biol 43:401-415; Fire A. et al (1998) Nature 391:806-811; WO 99/32619; WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364）。効率的な遺伝子抑圧は、一過的な発現の際に、又は一過的な形質転換の後にも、例えば微粒子銃による形質転換の結果示されてよい（Schweizer P et al. (2000) Plant J 2000 24: 895-903）。ｄｓＲＮＡｉ方法は、遺伝子転写産物の相補鎖及び対となる鎖の同時の導入により、相応する遺伝子の発現の高効率な抑制が引き起こされるとの現象に基づく。この生じる表現型は、相応するノックアウト突然変異体の表現型に非常に類似する(Waterhouse PM et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:13959-64)。
【００８７】
前記ｄｓＲＮＡｉ方法は、カロース合成酵素発現の減少の際にとりわけ効率的でありかつ有利であることが証明されている（WO 99/32619）。
【００８８】
二本鎖ＲＮＡ分子に関して、カロース合成酵素核酸配列は有利には、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２及び／又は３４の１つ、又は係る配列に実質的に同一である配列、有利には少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％、又はそれ以上、例えば約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、又はそれ以上実質的に同一である配列、又は少なくとも１７つの塩基対の長さであるこの断片を意味する。「実質的に同一」とは、前記ｄｓＲＮＡ配列は、このカロース合成酵素の目的配列と比較して挿入、欠失、並びに個々の点突然変異を示してもよく、それにも拘わらず発現の効率的な減少を引き起こすことを意味する。一実施態様において、このホモロジーは、上述の定義によれば少なくとも５０％、例えば約８０％、又は約９０％、又は約１００％、阻害性のｄｓＲＮＡの「センス」鎖とカロース合成酵素核酸配列の部分切片との間にある（又は、「アンチセンス」鎖とカロース合成酵素の核酸配列の相補鎖との間）。係る部分切片の長さは、約１７塩基、又はそれ以上、例えば約２５塩基、又は約５０塩基、又は約１００塩基、約２００塩基、又は約３００塩基である。選択的に、「実施的に同一」なｄｓＲＮＡはまた、核酸配列として定義されてよく、これは、カロース合成酵素の遺伝子転写産物の部分とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションできる。
【００８９】
「アンチセンス」ＲＮＡ鎖もまた、挿入、欠失、並びに個々の点突然変異を、「センス」ＲＮＡ鎖の相補鎖に比較して有してよい。有利にはこのホモロジーは、少なくとも８０％、例えば約９０％、又は約９５％、又は約１００％、前記「アンチセンス」ＲＮＡ鎖及び「センス」ＲＮＡ鎖の相補鎖の間に有する。
【００９０】
カロース合成酵素ポリペプチド又はこの機能的な等価物をコードする核酸分子の「「センス」−ＲＮＡ−転写産物の部分切片」は、カロース合成酵素ポリペプチド又はこの機能的な等価物をコードする核酸分子の１つにより、有利にはカロース合成酵素遺伝子により転写されたＲＮＡ又はｍＲＮＡの断片を意味する。この際、前記断片は有利には、約２０塩基、又はそれ以上、例えば約５０塩基、又は約１００塩基、又は約２００塩基、又は約５００塩基の配列長を有する。この完全に転写されたＲＮＡ又はｍＲＮＡも含まれる。
【００９１】
前記ｄｓＲＮＡは、重合されたリボヌクレオチドの１つ又は複数の鎖からなってよい。糖−リン酸−骨格の、またヌクレオシドの更なる改変も存在してよい。例示的に、この天然のＲＮＡのホスホジエステル結合は、前記結合が少なくとも１つの酸素又は硫黄の異種原子を含有するように改変されていてよい。塩基は、この活性が例えばアデノシンデアミナーゼにより制限されるように改変されていてよい。このような、そして更なる改変は、更に以下に、アンチセンスＲＮＡの安定化のための方法で記載されている。
【００９２】
無論、この同様の目的を達成するために、複数の個々のｄｓＲＮＡ分子をも、これはそのつど上記で定義したリボヌクレオチド配列切片の１つを含有するが、細胞又は生物中に導入してよい。
【００９３】
前記ｄｓＲＮＡは酵素により又は完全に又は部分的に化学合成により製造されてよい。
【００９４】
前記のｄｓＲＮＡの２本の鎖が、細胞又は植物中で一緒に導入することが望ましい場合には、これは様々な手法で行われる：
ａ）細胞又は植物を、両方の発現カセットを含有するベクターで形質転換、
ｂ）細胞又は植物を２つのベクターを用いて同時形質転換、その際葉前記ベクターは、一方で「センス」鎖を有する発現カセット、他方で「アンチセンス」鎖を有する発現カセットを含有する、及び／又は
ｃ）２つの植物の交雑であって、前記植物はそのつどベクターで形質転換されていて、その際一方では「センス」鎖を有する発現カセット、他方では、「アンチセンス」鎖を有する発現カセットを含有する。
【００９５】
ＲＮＡ二本鎖の形成は、細胞の外側又は細胞の内側で開始されてよい。ＷＯ99/53050に記載されているように、前記ｄｓＲＮＡはまた、「センス」鎖及び「アンチセンス」鎖を「リンカー」（例えばイントロン）により結合させることでヘアピン構造を含有してよい。自己相補性ｄｓＲＮＡ構造が有利であり、というのもこれは１つの構築物の発現のみを必要とし、この相補性鎖を常に等モル割合において含むからである。
【００９６】
ｄｓＲＮＡの「アンチセンス」鎖又は「センス」鎖又はｄｓＲＮＡの自己相補性の鎖をコードする発現カセットは、有利にはベクター中に挿入され、そして以下に記載する方法を用いて安定に（例えば、選択的マーカーの使用下で）植物のゲノム中に、ｄｓＲＮＡの持続性の発現を保証するために挿入される。
【００９７】
前記ｄｓＲＮＡは、細胞１つにつき少なくとも１つのコピーを可能にする量の使用下で導入されてよい。より多い量（例えば、１つの細胞につき少なくとも５、１０、１００、５００、又は１０００個のコピー）は場合によりより効率的な減少を生じてよい。
【００９８】
ｄｓＲＮＡとカロース合成酵素遺伝子転写産物又は機能的な等価物の遺伝子の遺伝子転写産物との間での１００％の配列同一性は、カロース合成酵素発現の効率的な減少を引き起こすために必ずしも必要ではない。従って、前記方法は配列の相違、例えば遺伝子の突然変異、多形、又は進化による多様性の結果存在してよい相違に対して許容性であるとの利点が存在する。イネ、トウモロコシ、及びオオムギからのカロース合成酵素配列の間での高い配列ホモロジーは、植物内での係るポリペプチドの高い保存の程度を示唆し、従って配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、又は３４による開示されたカロース合成酵素配列の１つから導かれるｄｓＲＮＡの発現は、その他の植物種においても有利な効果を有するものである。
【００９９】
また、前記の個々のカロース合成酵素ポリペプチドと可能性のあるその機能的な等価物との高いホモロジーに基づいて、生物の特定のカロース合成酵素配列から出発して産生された唯１つのｄｓＲＮＡを用いて、同じ生物の更なる相同性カロース合成酵素ポリペプチド及び／又はその機能的な等価物の発現、また同様にその他の使用した種におけるカロース合成酵素ポリペプチドの発現を減少させることも可能である。この目的に対して、前記ｄｓＲＮＡは有利には、保存された領域に相応するカロース合成酵素遺伝子転写産物の配列領域を含有する。前記の保存された領域は、配列比較から容易に導かれてよい。
【０１００】
ｄｓＲＮＡは化学的に又は酵素により合成されてよい。このために細胞ＲＮＡポリメラーゼ又はバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ）が使用されてよい。ＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現のための相応する方法は、以下に記載されている（WO 97/32016; US 5,593,874; US 5,698,425, US 5,712,135, US 5,789,214, US 5,804,693）。化学的に又は酵素によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成されたｄｓＲＮＡは、細胞、組織、又は生物中への導入前に、この反応混合物から、例えば抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィ、又は係る方法の組み合わせにより、完全に又は部分的に精製されてよい。前記ｄｓＲＮＡは直接的に細胞中に導入されてよく、又は細胞外（例えば、間質空間）に適用されてもよい。
【０１０１】
有利にはしかしながら、前記植物は、ｄｓＲＮＡの発現を実現させる発現構築物でもって安定に形質転換される。相応する方法は更に以下に記載される。
【０１０２】
ｂ）カロース合成酵素アンチセンス−核酸配列の導入
「アンチセンス」技術による特定のポリペプチドのこのｍＲＮＡの蓄積の阻害による抑圧のための方法は、複数回−植物においても−記載されている（Sheehy et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85: 8805-8809; US 4,801,340; Mol JN et al. (1990) FEBS Lett 268(2):427-430）。このアンチセンス核酸分子は、抑圧すべきカロース合成酵素目的ポリペプチドをコードするこの細胞ｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡにハイブリダイズ又は結合する。これにより、目的ポリペプチドの転写及び／又は翻訳は抑制される。前記ハイブリダイゼーションは慣用の手法で、安定な二本鎖の形成を介して、又は−ゲノムＤＮＡの場合には−前記アンチセンス核酸分子の前記ゲノムＤＮＡの二本鎖との結合により、ＤＮＡヘリックスの大溝中での特異的な相互作用を介して生じる。
【０１０３】
カロース合成酵素ポリペプチドの減少に適したアンチセンス核酸分子は、係るポリペプチドをコードする核酸配列、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２及び／又は３４による本発明による核酸分子、又はこの機能的な等価物をコードする核酸分子の使用下で、ワトソン及びクリックによる塩基対則に従って導かれてよい。前記アンチセンス核酸分子は、前記ポリペプチドのこの全体の転写されたｍＲＮＡに対して相補的であってよく、このコード領域に限定されるか又はオリゴヌクレオチドからなってよく、前記オリゴヌクレオチドは、前記ｍＲＮＡのコード配列又は非コード配列の一部に相補的である。従って、前記オリゴヌクレオチドは例えば、前記ポリペプチドに対する翻訳開始点を含有する領域に対して相補的であってよい。アンチセンス核酸分子は、例えば２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０つのヌクレオチドの長さを有してよく、しかしながらより長くてもよく、１００、２００、５００、１０００，２０００、又は５０００つのヌクレオチドを含有してもよい。アンチセンス核酸分子は、組み換えにより発現してよく、又は化学的に又は酵素により当業者に公知の方法を用いて合成されてよい。化学的合成の際には、天然又は改変したヌクレオチドを使用してよい。改変したヌクレオチドは、アンチセンス核酸分子に、向上した生化学的な安定性を提供し、そしてアンチセンス核酸配列及びセンス目的配列から形成された二本鎖の向上した物理的な安定性を生じる。例えばホスホロチオアート誘導体及びアクリジン置換したヌクレオチド、例えば５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシ−ヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン（Galactosylqueosin）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチル−グアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノ−メチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、ケオシン（queosin）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、及び２，６−ジアミノプリンが使用されてよい。
【０１０４】
更なる有利な一実施態様において、カロース合成酵素ポリペプチドの発現は核酸分子により阻害されてよく、前記分子は、カロース合成酵素遺伝子の調節領域（例えば、カロース合成酵素プロモーター及び／又はエンハンサー）に対して相補的であり、かつその場のＤＮＡ二重らせんと三重らせん構造を形成し、従ってカロース合成酵素の転写が減少される。相応する方法は、以下に記載されている（Helene C (1991) Anticancer Drug Res 6(6):569-84; Helene C et al. (1992) Ann NY Acad Sci 660:27-36; Maher LJ (1992) Bioassays 14(12):807-815）。
【０１０５】
更なる一実施態様において、前記アンチセンス核酸分子はα−アノマー核酸であってよい。係るα−アノマー核酸分子は、特異的な二本鎖のハイブリッドを相補的なＲＮＡと形成し、ここでは、−従来のβ−核酸と違って−この両方の鎖が相互に平行に進行する（Gautier C et al. (1987) Nucleic Acids Res 15:6625-6641）。このアンチセンス核酸分子は更に、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res 15:6131-6148）又はキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体を包含してよい（Inoue et al. (1987) FEBS Lett 215:327-330）。
【０１０６】
ｃ）カロース合成酵素をコードするリボ核酸分子を特異的に、例えば触媒により切断するリボザイムの導入
触媒性のＲＮＡ分子又はリボザイムはそれぞれの任意の目的ＲＮＡに適合され、かつこのホスホジエステル骨格を特異的な位置で切断し、これによりこの目的ＲＮＡは機能的に不活性化する（Tanner NK (1999) FEMS Microbiol Rev 23(3):257-275）。前記リボザイムはそれにより自体は改変されないが更なる目的ＲＮＡ分子を類似に切断でき、これにより前記リボザイムは酵素の特性を得る。
【０１０７】
このようにして、リボザイム（例えば「ハンマーヘッド」型リボザイム：Haselhoff及びGerlach (1988) Nature 334:585-591）が、抑圧すべき酵素、−例えばカロース合成酵素−のｍＲＮＡを切断し、かつこの翻訳を減少させるために使用されてよい。特定のポリペプチドの減少のためのリボザイムの発現のための方法は以下に記載されている（EP 0 291 533, EP 0 321 201, EP 0 360 257）。植物細胞において、リボザイム発現は同様に以下に記載されている（Steinecke P et al. (1992) EMBO J 11(4):1525-1530; de Feyter R et al. (1996) Mol Gen Genet. 250(3):329-338）。リボザイムは、選択的手法を介して多様なリボザイムのライブラリーから同定されてよい（Bartel D及びSzostak JW (1993) Science 261:1411-1418）。
【０１０８】
ｄ）リボザイムと組み合わせたカロース合成酵素アンチセンス核酸配列の導入
有利には、上述したアンチセンスストラテジーを、リボザイム方法と連結してよい。リボザイム配列の「アンチセンス」ＲＮＡｓ中への組込は、ちょうどこの「アンチセンス」ＲＮＡｓに係る酵素に類似したＲＮＡ切断性の特性を提供し、前記目的ＲＮＡの不活性化の際の効率を上昇させる。相応するリボザイム「アンチセンス」−ＲＮＡ分子の製造及び使用は例えば、Haseloff et al. (1988) Nature 334: 585-591に記載されている。
【０１０９】
リボザイム技術は、アンチセンスストラテジーの効率を向上させてよい。適した目的配列及びリボザイムは例えば、「Steinecke P, Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al. eds, Academic Press, Inc. (1995),449-460頁」に記載されていて、リボザイムＲＮＡ及び目的ＲＮＡの二次構造の算出により、並びにこの相互作用により決定される（Bayley CC et al. (1992) Plant Mol Biol. 18(2):353-361; Lloyd AM and Davis RW et al. (1994) Mol Gen Genet. 242(6):653-657）。例えば、テトラメヒナＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体を構築してよく、これは抑圧すべきカロース合成酵素ポリペプチドのｍＲＮＡに対して相補的である領域を有する（US 4,987,071 及びUS 5,116,742も参照）。
【０１１０】
ｅ）カロース合成酵素センス−核酸配列の相互抑制効果（Ｋｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）の誘導のための導入
カロース合成酵素核酸のセンス方向（ｓｅｎｓｅ−Ｏｒｉｅｎｔｉｅｒｕｎｇ）における発現は、相応する相同性である内在性遺伝子の相互抑制効果を生じてよい。内在性遺伝子に対するホモロジーを有するセンスＲＮＡの発現は、この発現を減少又は停止させてよく、アンチセンスアプローチに関して記載したのと類似である（Jorgensen et al. (1996) Plant Mol Biol 31(5):957-973; Goring et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:1770-1774; Smith et al. (1990) Mol Gen Genet 224:447-481; Napoli et al. (1990) Plant Cell 2:279-289; Van der Krol et al. (1990) Plant Cell 2:291-99）。この際、導入された構築物は、減少させるべき相同性の遺伝子を完全に又は部分的にのみ提示する。翻訳のための可能性は必要ない。係る技術の植物に対する適用は、例えばNapoli et al. (1990) The Plant Cell 2: 279-289及びUS 5,034,323に記載されている。
【０１１１】
有利には、前記の相互抑制作用は、以下の配列の使用下で実現されてよく、これは、カロース合成酵素ポリペプチド又はこの機能的な等価物をコードする核酸配列、例えば本発明による核酸配列、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２及び／又は３４による核酸配列又は機能的な等価物をコードする核酸配列の少なくとも一部と実質的に同一である。
【０１１２】
ｆ）ドミナントネガティブなカロース合成酵素ポリペプチドをコードする核酸配列の導入
カロース合成酵素ポリペプチドの活性は、おそらく、このカロース合成酵素ポリペプチドのドミナントネガティブな変異体の発現により実現化されてもよい。ドミナントネガティブな形態の同時発現を用いたポリペプチドの機能又は活性の減少のための方法は、当業者に公知である（Lagna G及びHemmati-Brivanlou A (1998) Current Topics in Developmental Biology 36:75-98; Perlmutter RM及びAlberola-Ila J (1996) Current Opinion in Immunology 8(2):285-90; Sheppard D (1994) American Journal of Respiratory Cell & Molecular Biology. 11(1):1-6; Herskowitz I (1987) Nature 329(6136):219-22）。
【０１１３】
ドミナントネガティブなカロース合成酵素の変異体は例えば、アミノ酸残基の変更により行われてよく、これは触媒中心の成分であり、かつこの突然変異の結果、前記ポリペプチドはその活性を変更する。有利には突然変異すべきアミノ酸残基は、様々な生物のカロース合成酵素ポリペプチドにおいて保存されている残基である。係る保存領域は、例えばコンピューター支援された比較（「アラインメント」）を用いて算出されてよい。係る突然変異は、ドミナントネガティブなカロース合成酵素の変異体の達成のために、有利には、カロース合成酵素ポリペプチドをコードする核酸配列のレベルで実施される。相応する突然変異は、例えばＰＣＲ介在ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異形成により、この所望の突然変異を挿入する相応するオリゴヌクレオチドプライマーの使用下で、実現化されてよい。このために、当業者に公知の方法を使用してよい。例えば、この目的のために「LA PCR in vitro Mutagenesis Kit」（Takara Shuzo, Kyoto）を使用してよい。
【０１１４】
ｇ）カロース合成酵素遺伝子、ＲＮＡ、又はポリペプチド結合性因子の導入
カロース合成酵素の遺伝子発現の減少はまた、特異的なＤＮＡ結合性の因子、例えばジンクフィンガー転写因子の型の因子でもって可能である。係る因子は、内在性の目的遺伝子のゲノム配列に、有利にはこの調節領域において取り付けられ、内在性遺伝子のリプレッションを引き起こす。係る方法の使用は、内在性カロース合成酵素遺伝子の発現の減少を、この配列を遺伝子技術的に操作する必要なしに可能にする。相応する因子の製造のための相応する方法は記載されている（Dreier B et al. (2001) J Biol Chem 276(31):29466-78; Dreier B et al. (2000) J Mol Biol 303(4):489-502; Beerli RR et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97 (4):1495-1500; Beerli RR et al. (2000) J Biol Chem 275(42):32617-32627; Segal DJ and Barbas CF 3rd. (2000) Curr Opin Chem Biol 4(1):34-39; Kang JS and Kim JS (2000) J Biol Chem 275(12):8742-8748; Beerli RR et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(25):14628-14633; Kim JS et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(8):3616 -3620; Klug A (1999) J Mol Biol 293(2):215-218; Tsai SY et al. (1998) Adv Drug Deliv Rev 30(1-3):23-31; Mapp AK et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97(8):3930-3935; Sharrocks AD et al. (1997) Int J Biochem Cell Biol 29(12):1371-1387; Zhang L et al. (2000) J Biol Chem 275(43):33850-33860）。
【０１１５】
係る因子の選択は、カロース合成酵素遺伝子の適した一片で行われてよい。有利には、係る切片はプロモーター領域の範囲にある。遺伝子抑制のために、これは、コードするエキソン又はイントロンの領域にあってもよい。この相応する切片は、当業者にとって、遺伝子バンクからのデータバンク問い合わせを用いて、又はデータバンクに存在していないカロース合成酵素ｃＤＮＡから出発して、相応するゲノムクローンのゲノムライブラリーの精査により得られる。このために必要な方法は当業者に公知である。
【０１１６】
更に、カロース合成酵素の目的ポリペプチドを自体で阻害する因子を細胞中に導入してよい。前記ポリペプチド結合性の因子は、例えばアプタマー（Famulok M及びMayer G (1999) Curr Top Microbiol Immunol 243:123-36）又は抗体又は抗体断片であってよい。係る因子の獲得は記載され、かつ当業者に公知である。例えば、フィトクロムＡタンパク質の活性を遺伝子技術的に変更したタバコ植物において調節するために細胞質のｓｃＦｖ抗体を使用する（Owen M et al. (1992) Biotechnology (N Y) 10(7):790-794; Franken E et al. (1997) Curr Opin Biotechnol 8(4):411-416; Whitelam (1996) Trend Plant Sci 1:286-272）。
【０１１７】
この遺伝子発現はまた、テイラーメイドの低分子の合成化合物により、例えばポリアミド型の化合物により抑制されてもよい（Dervan PB及びBuerli RW (1999) Current Opinion in Chemical Biology 3:688-693; Gottesfeld JM et al. (2000) Gene Expr 9(1-2):77-91）。このオリゴマーは、構成要素３−（ジメチルアミノ）プロピルアミン、Ｎ−メチル−３−ヒドロキシピロール、Ｎ−メチルイミダゾール、及びＮ−メチルピロールからなり、かつ二本鎖ＤＮＡのそれぞれの一片に対して、これが配列特異的にこの大溝中へと結合し、かつこの場での遺伝子配列の発現が遮断されるように適合されてよい。相応する方法は記載されている（以下参照のこと、特にBremer RE et al. (2001) Bioorg Med Chem. 9(8):2093-103; Ansari AZ et al. (2001) Chem Biol. 8(6):583-92; Gottesfeld JM et al. (2001) J Mol Biol. 309(3):615-29; Wurtz NR et al. (2001) Org Lett 3(8):1201-3; Wang CC et al. (2001) Bioorg Med Chem 9(3):653-7; Urbach AR及びDervan PB (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98(8):4343-8; Chiang SY et al. (2000) J Biol Chem. 275(32):24246-54）。
【０１１８】
ｈ）カロース合成酵素ＲＮＡ分解を引き起こすウィルス性の核酸分子及び発現構築物の導入
カロース合成酵素発現は効率的に、植物による特異的なカロース合成酵素ＲＮＡ−分解の誘導によりウィルス性の発現系（アンプリコン）（Angell, SM et al. (1999) Plant J. 20(3):357-362）を用いて実現化してもよい。この系−「ＶＩＧＳ」（ウィルス誘導型遺伝子サイレンシング）（viral induced gene silencing）とも呼称される−は、抑圧すべき転写産物に対してホモロジーを有する核酸配列をウィルスベクターを用いて植物中に導入する。この転写は更に、−おそらくウィルスに対する植物の防御機構により媒介されて−停止される。相応する技術及び方法は以下に記載されている（Ratcliff F et al. (2001) Plant J 25(2):237-45; Fagard M及びVaucheret H (2000) Plant Mol Biol 43(2-3):285-93; Anandalakshmi R et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(22):13079-84; Ruiz MT (1998) Plant Cell 10(6): 937-46）。
【０１１９】
ｄｓＲＮＡｉ、センスＲＮＡを用いた相互抑制効果、及び「ＶＩＧＳ」（ウィルス誘導型遺伝子サイレンシング）の方法は、「転写後遺伝子サイレンシング」（post-transcriptional gene silencing）（ＰＴＧＳ）とも呼称される。ＰＴＧＳ方法は、特に有利であり、というのも抑圧すべき内在性遺伝子とトランスジェニックにより発現されたセンス核酸配列又はｄｓＲＮＡ核酸配列との間のホモロジーの必要性は、例えば典型的なアンチセンスアプローチの際よりも少ない。相応するホモロジー尺度は、前記ｄｓＲＮＡＩ方法の記載の際に挙げられ、かつ一般的にＰＴＧＳ方法又はドミナントネガティブアプローチのために適用可能である。トウモロコシ、コムギ、イネ及びオオムギからのカロース合成酵素ポリペプチドの間の高ホモロジーに基づいて、植物での係るポリペプチドの高い保存の程度が推論されてよい。従って、予測によれば、オオムギ、トウモロコシ、又はイネからのカロース合成酵素核酸分子の使用下で、その他の種における相同性のカロース合成酵素ポリペプチドの発現も、その他の種において存在するカロース合成酵素ホモログの単離及び構造明確化を必ずしも必要とすることなしに効率的に抑圧されてよい。これは、作業の費用を著しく軽減する。
【０１２０】
ｉ）カロース合成酵素をコードする遺伝子に対する相同組み換えの誘導に適した核酸構築物の、例えばノックアウト突然変異体の産生のための導入、
減少したカロース合成酵素活性を有する相同性組み換え生物の製造のために、例えば核酸構築物が使用され、前記構築物は、内在性カロース合成酵素遺伝子の少なくとも部分を含有し、これを少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、付加、又は置換により、この機能性が減少するか、又は完全に欠損するように変更させる。この変更はまた、前記遺伝子の制御性の要素（例えばプロモーター）に関係してよく、従ってこのコード性の配列は変更されないままであり、しかしながら発現（転写及び／又は翻訳）は行われず、減少する。
【０１２１】
慣用の相同組み換えの際には、この変更した領域は５’−末端及び３’−末端で更なる核酸配列により隣接していて、これはこの組み換えの容易化のために十分な長さを有しなくてはならない。この長さは通常は、数百又はそれ以上の塩基から数キロベースまでの範囲にある（Thomas KR及びCapecchi MR (1987) Cell 51:503; Strepp et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(8):4368-4373）。前記の相同組み換えのために、前記宿主生物−例えば植物−を、組み換え構築物を用いて以下記載の方法の使用下で形質転換し、そして成功した組み換えクローンを、例えば抗生物質又は除草剤耐性の使用下で選択する。
【０１２２】
ｊ）機能喪失を生じさせるための内在性カロース合成酵素遺伝子への突然変異の挿入（例えば、ストップコドンの産生、リーディングフレームシフト、その他）。
【０１２３】
前記カロース合成酵素活性の減少のための更なる適した方法は、ナンセンス突然変異の内在性カロース合成酵素遺伝子への挿入であり、例えば、Ｔ−ＤＮＡ−突然変異形成（Koncz et al. (1992) Plant Mol Biol 20(5):963-976)、ＥＮＵ−（Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソ尿素）突然変異形成又は相同組み換え（Hohn B及びPuchta (1999) H Proc Natl Acad Sci USA 96:8321-8323）又はＥＭＳ突然変異形成（Birchler JA, Schwartz D. Biochem Genet. 1979 Dec;17(11-12):1173-80; Hoffmann GR. Mutat Res. 1980 Jan;75(1):63-129）によるノックアウト突然変異体の産生である。点突然変異はまた、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドオリゴヌクレオチドを用いて産生されてよく、これは「キメラ形成法」（chimeraplasty）としても公知である（Zhu et al. (2000) Nat Biotechnol 18(5):555-558, Cole-Strauss et al. (1999) Nucl Acids Res 27(5):1323-1330; Kmiec (1999) Gene therapy American Scientist 87(3):240-247）。
【０１２４】
「突然変異」は、本発明の意味合いにおいて、生物のプラスミド又はゲノムにおける遺伝子変異体の核酸配列の連続の変更を意味する。突然変異は、例えば複製の際の間違いの結果として生じるか又は変異原により誘起されてよい。生物の細胞ゲノムにおける自然突然変異の率は非常に少なく、但し当業者には、複数の生物学的、化学的、又は物理的な変異原が公知である。
【０１２５】
突然変異は、１つ又は複数の核酸残基の置換、付加、欠失を含む。置換とは、単独の核酸塩基の交換が理解され、この際転移（プリン塩基の代わりのプリン塩基の、又はピリミジン塩基の代わりのピリミジン塩基の置換）と転換（ピリミジン塩基の代わりのプリン塩基（又はこの反対））とは区別される。
【０１２６】
付加又は挿入とは、付加的な核酸残基のＤＮＡ中への組込が理解され、その際リーディングフレームシフトが生じてよい。係るリーディングフレームシフトの際には、「イン−フレーム」挿入／付加と「フレーム外」挿入とを区別してよい。「イン−フレーム」挿入／付加の際には、読み取り枠は維持され、かつ挿入された核酸によりコードされるアミノ酸の数に関して増加したポリペプチドが生じてよい。「フレーム外」挿入／付加とは、当初の読み取り枠が失われ、かつ完全かつ機能的に能力のあるポリペプチドの形成はもはや可能でない。
【０１２７】
１つ又は複数の塩基対の喪失を説明する欠失は、これは同様に「イン−フレーム」又は「フレーム外」のリーディングフレームシフト及び完全なタンパク質の形成に関してこれに関連する結果を生じる。
【０１２８】
偶然の突然変異又は標的突然変異の産生のために使用可能である突然変異原の剤（突然変異原）及びこの適用可能である方法及び技術は、当業者に公知である。係る方法及び突然変異原は、例えばA.M. van Harten（(1998), 「Mutation breeding: theory and practical applications」, Cambridge University Press, Cambridge, UK）, E Friedberg, G Walker, W Siede （(1995), 「DNA Repair and Mutagenesis」, Blackwell Publishing）、又はK. Sankaranarayanan, J. M. Gentile, L. R. Ferguson（(2000) 「Protocols in Mutagenesis」, Elsevier Health Sciences））により記載されている。
【０１２９】
標的突然変異の挿入のためには、公知の分子生物学的な方法及び手法、例えばビトロ突然変異形成キット、LA PCR in vitro Mutagenesis Kit」(Takara Shuzo, Kyoto)又は適したプライマーの使用下でのＰＣＲ突然変異形成を適用してよい。
【０１３０】
既に上述したように、多数の化学的、物理的、及び生物学的な突然変異原が存在する。
【０１３１】
以下に記載するものは、例示的にであって制限する目的で挙げられるものではない。
【０１３２】
化学的突然変異原は、その作用機構に応じて区分されてよい。従って、塩基類似物（例えば、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン）、一官能性及び二官能性のアルキル化剤（例えば一官能性、例えばエチルメチルスルホナート、ジメチルスルホナート、又は二官能性、例えばジクロロエチルスルフィット、マイトマイシン、ニトロソグアニジン、ジアルキルニトロソアミン、Ｎ−ニトロソグアニジン誘導体）、又は挿入性物質（アクリジン、エチジウムブロミド）が存在する。
【０１３３】
物理的突然変異原は、例えば電離放射線である。電離放射線は、電磁波又は粒子線であり、これは分子をイオン化、即ちこれらの電子から取り除くことができる。この残存するイオンは、大抵は非常に反応性であり、従って前記イオンは生組織に生じる場合には、大きな被害を、例えばＤＮＡに引き起こし、かつ（より低い強度では）これにより突然変異を誘発する。電離放射線は、例えばγ−放射線（約メガ電子ボルトＭｅＶの光子エネルギー）、レントゲン線（数キロ電子ボルトｋｅＶの光子エネルギー）、又は紫外光（ＵＶ光、３．１ｅＶを上回る光子エネルギー）でもある。ＵＶ光は、塩基の間での二量体の形成を引き起こし、最も一般的にはこの際、チミジン二量体がこの突然変異により生じる。
【０１３４】
突然変異性の剤、例えばエチルメチルスルホナート（ＥＭＳ）(Birchler JA, Schwartz D. Biochem Genet. 1979 Dec;17(11-12):1173-80; Hoffmann GR. Mutat Res. 1980 Jan;75(1):63-129)又は電離放射線を用いた種子の処理によるこの突然変異の典型的な産生は、生物学的変異原、例えばトランスポゾン（例えば、Ｔｎ５、Ｔｎ９０３、Ｔｎ９１６、Ｔｎ１０００、Balcells et al.,1991, May BP et al. (2003) Proc Natl Acad Sci U S A. Sep 30;100(20):11541-6）又は分子生物学的な方法、例えばＴ−ＤＮＡ挿入による突然変異形成の使用（Feldman, K.A. Plant J. 1:71-82.1991, Koncz et al. (1992) Plant Mol Biol 20(5):963-976).）により拡張される。
【０１３５】
有利には、突然変異した遺伝子変異体の産生のための化学的又は生物学的な変異原の使用である。化学的な剤では、特に有利にはＥＭＳ（エチルメチルスルホナート）の適用による突然変異形成の突然変異体の産生が挙げられる。生物学的な変異原の使用下での突然変異体の産生では、有利にはＴ−ＤＮＡ突然変異形成又はトランスポゾンによる突然変異形成が挙げられる。
【０１３６】
従って、例えば本発明による方法のために、本発明によるポリペプチド、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３及び／又は３５によるポリペプチドの突然変異の結果得られるポリペプチドが使用されてもよい。
【０１３７】
カロース合成酵素ポリペプチドのポリペプチド量、ＲＮＡ量、遺伝子活性、又はポリペプチド活性の減少を直接的に又は非直接的に引き起こす物質及び化合物の全てが、「抗カロース合成酵素化合物」の呼称のもとに包括される。概念「抗カロース合成酵素化合物」には、明示的に、上記した方法において使用される核酸配列、ペプチド、タンパク質、又はその他の因子が含まれる。
【０１３８】
本発明の更なる有利な一実施態様において、単子葉類植物、又はその器官、組織、又は細胞における、プクキニア、コタマカビ、及びボタンタケの科からの病原体に対する耐性の向上が以下により達成される：
ａ）植物中で活性のあるプロモーターとの機能的な連結において「抗カロース合成酵素化合物」を含有する組み換え発現カセットの植物細胞中への導入、
ｂ）前記植物細胞からの植物の再生、及び
ｃ）前記植物中で病原体耐性を産生又は向上させるために十分な量又は期間での前記「抗カロース合成酵素化合物」の発現。
【０１３９】
「トランスジェニック」は、例えば前記核酸配列を含有する核酸配列、発現カセット、又はベクター、又は前記核酸配列、発現カセット、又はベクターで形質転換した生物に関して、遺伝子工学的な手法により実現された構築物又は生物の全てを意味し、係る構築物又は生物においては、以下のいずれか
ａ）カロース合成酵素核酸配列、又は
ｂ）カロース合成酵素配列と機能的に連結した遺伝子の制御配列、例えばプロモーター、又は
ｃ）  ａ）及びｂ）
が、その天然の遺伝子環境において存在せず、又は遺伝子工学的な方法により改変され、その際、前記改変は例示的に、１つ又は複数のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、又は挿入であってよい。天然の遺伝的な環境とは、この起源生物中のこの天然の染色体の座又はゲノムライブラリー中の存在を意味する。ゲノムライブラリーの場合には、核酸配列の天然の遺伝子環境は、有利には少なくともまだなお部分的に維持されている。この環境は、前記核酸配列に少なくとも１つの側で隣接していて、かつ少なくとも５０ｂｐ、有利には少なくとも５００ｂｐ、特に有利には少なくとも１０００ｂｐ、最も有利には少なくとも５０００ｂｐの配列長を有する。天然に存在する発現カセット−例えばカロース合成酵素プロモーターとこの相応するカロース合成酵素遺伝子との天然に存在する組み合わせ−が、非天然の合成の（人工的な）方法により、例えば突然変異形成により変更される場合に、トランスジェニックな発現カセットを生じる。相応する方法は、記載されている（US 5,565,350; WO 00/15815）。
【０１４０】
「導入」は、本発明の枠内において、「抗カロース合成酵素化合物」の、直接的又は非直接的な、植物又はこの細胞、区画、組織、器官、又は種子中への導入又は係る場での産生に適した全ての方法を含む。直接的及び非直接的な方法が含まれる。前記導入は、「抗カロース合成酵素化合物」（例えばｄｓＲＮＡ）の「一時的な」（一過的な）出現又は持続的な出現（安定）を生じてよい。
【０１４１】
上述のアプローチの相違する性質により、「抗カロース合成酵素化合物」はその機能を直接的に発揮してよい（例えば、内在性カロース合成酵素遺伝子中への挿入により）。前記機能はしかしながら、非直接的に、ＲＮＡへの転写後に（例えば、アンチセンスアプローチの場合に）、又は転写及びタンパク質への翻訳後に（例えば、結合因子の場合に）発揮されてもよい。直接的に、また非直接的に作用する「抗カロース合成酵素化合物」は、本発明により含まれる。
【０１４２】
「導入」は、例えばトランスフェクション、トランスダクション、又は形質転換の方法を含む。
【０１４３】
「抗カロース合成酵素化合物」は従って、例えば組み換え発現構築物をも含み、前記構築物は発現（即ち、転写及び場合により翻訳）を、例えばカロース合成酵素ｄｓRNA又はカロース合成酵素「アンチセンス−ＲＮＡ」の発現を有利には植物、又はその部分、組織、器官、又は種子において引き起こす。
【０１４４】
前記発現構築物／発現カセットにおいては、核酸分子が存在し、その発現（転写及び場合により翻訳）は、「抗カロース合成酵素化合物」を産生し、有利には少なくとも１つの遺伝子の制御要素（例えばプロモーター）との機能的な連結において産生し、前記制御要素は植物中での発現を保証する。前記発現構築物が直接的に植物中へ挿入され、かつ前記「抗カロース合成酵素化合物」（例えばカロース合成酵素ｄｓＲＮＡ）が植物において産生されることが望ましい場合には、植物特異的な遺伝子の制御要素（例えばプロモーター）が有利である。「抗カロース合成酵素化合物」はしかしながら、他の生物において又はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて産生され、次いで前記植物中に導入されてもよい。この場合には、全ての原核生物及び真核生物の遺伝子の制御要素（例えばプロモーター）が有利であり、前記制御要素はそのつどの製造のために選択された植物中での発現を可能にする。
【０１４５】
機能的な連結とは、例えばプロモーターと発現すべき核酸配列（例えば「抗カロース合成酵素化合物」）及び場合により更なる制御性の要素、例えばこのターミネーターとの以下のような配列の配置が理解され、各制御性の要素は、核酸配列のトランスジェニックな発現の際のその機能を、前記核酸配列のセンスＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡに対する配置により充実できる。このためには、絶対的ではないにしろ、化学的な意味合いにおける直接的な連結が必要である。遺伝子の制御配列、例えばエンハンサー配列はその機能を、遠く離れた位置から、又はその他のＤＮＡ分子からであっても前記の目的配列に対して発揮してよい。有利には、トランスジェニックにより発現すべき核酸配列が、プロモーターとして挿入された配列よりも後置に配置され、従って両方の配列が相互に共有結合している配置である。有利にはこの際、前記プロモーター配列とトランスジェニックにより発現すべき発現すべき核酸配列との間隔は、２００塩基対よりも少なく、特に有利には１００塩基対よりも少なく、とりわけ有利には５０塩基対よりも少ない。
【０１４６】
機能的な連結の製造もまた発現カセットの製造も、慣用の組み換え技術及びクローニング技術を用いて実現してよく、例えばこれはManiatis T, Fritsch EF及びSambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), Silhavy TJ, Berman ML及びEnquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), Ausubel FM et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience及びGelvin et al. (1990): Plant Molecular Biology Manualに記載されている。両方の配列の間にしかしながら、更なる配列が配置されていてもよく、前記配列は例えば、特定の制限酵素切断部位とのリンカー又はシグナルペプチドの機能を有する。また、融合タンパク質の発現のための配列の挿入を生じてもよい。有利には、プロモーター及び発現すべき核酸配列との連結からなる発現カセットは、ベクター中で組み込まれて存在してよく、かつ例えば形質転換により植物の組織中に挿入されてよい。
【０１４７】
発現カセットとはしかしながら、プロモーターを−例えば相同組み換えにより−、内在性カロース合成酵素遺伝子の後置に配置し、アンチセンスカロース合成酵素ＲＮＡの発現により本発明によるカロース合成酵素ポリペプチドの減少を引き起こす構築物が理解されてもよい。同様に、「抗カロース合成酵素化合物」（例えばカロース合成酵素ｄｓＲＮＡ又はカロース合成酵素アンチセンスＲＮＡをコードする核酸配列）もまた、同じ効果が生じるように内在性プロモーターの後置に配置してよい。両方のアプローチは本発明の意味合いにおける発現カセットを生じる。
【０１４８】
植物特異的なプロモーターは基本的に、任意のプロモーターを意味し、前記プロモーターは遺伝子、特に外来遺伝子の発現を植物又は植物の部分、植物細胞、植物組織、植物培養体において制御できる。この際、前記発現は例えば構成的、誘導可能又は発達依存的であってよい。
【０１４９】
有利には以下のとおりである：
ａ）構成的プロモーター
有利には、構成的な発現を植物において可能にするベクターである（Benfey et al.(1989) EMBO J 8:2195-2202）。「構成的」プロモーターとは、発現を複数の、有利には全ての組織において植物の発達の長期間にわたり、有利には植物の発達の全ての時間点で保証するプロモーターを意味する。有利には、特に植物のプロモーター又は植物ウィルスに由来するプロモーターが使用される。特に有利には、カリフラワーモザイクウィルスＣａＭＶの３５S転写産物のプロモーター（Franck et al. (1980) Cell 21:285-294; Odell et al. (1985) Nature 313:810-812; Shewmaker et al. (1985) Virology 140:281-288; Gardner et al. (1986) Plant Mol Biol 6:221-228）又は１９Ｓ  ＣａＭＶプロモーター（US 5,352,605; WO 84/02913; Benfey et al. (1989) EMBO J 8:2195-2202）である。更なる適した構成的プロモーターは、「ルビスコ小サブユニット（ＳＳＵ）−プロモーター」（US 4,962,028）、アグロバクテリウムからのノパリン合成酵素のプロモーター、ＴＲ−二重プロモーター、アグロバクテリウムからのＯＣＳ（オクトピン合成酵素）プロモーター、ユビキチンプロモーター（Holtorf S et al. (1995) Plant Mol Biol 29:637-649）、ユビキチン１プロモーター（Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18:675-689; Bruce et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:9692-9696）、Ｓｍａｓプロモーター、シンナミルアルコール脱水素酵素プロモーター（US 5,683,439）、液胞ＡＴＰアーゼサブユニットのプロモーター又はコムギからのプロリンリッチなタンパク質のプロモーター（WO 91/13991）、並びに植物における構成的な発現が当業者に公知である遺伝子の更なるプロモーターである。構成的なプロモーターとして特に有利には、シロイヌナズナからのニトリルアーゼ−１（ｎｉｔ１）遺伝子のプロモーター（GenBank Acc.-No.: Y07648.2, Nukleotide 2456-4340, Hillebrand et al. (1996) Gene 170:197-200）である。
【０１５０】
ｂ）組織特異的なプロモーター
一実施態様において、葯、子房、花、葉、茎、根及び種子に対する特異性を有するプロモーターが使用される。
【０１５１】
種子特異的なプロモーター
例えば、プロモーターであって、ファゼオリン（US 5,504,200; Bustos MM et al. (1989) Plant Cell 1(9):839-53）、２Ｓアルブミン遺伝子（Joseffson LG et al. (1987) J Biol Chem 262:12196-12201）、レグミン（Shirsat A et al. (1989) Mol Gen Genet 215(2): 326-331）、ＵＳＰ（未知の種子タンパク質（Unknown seed protein）：Baeumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225(3):459-67）、ナピン（Ｎａｐｉｎ）遺伝子（US 5,608,152; Stalberg K et al. (1996) L Planta 199:515-519）、サッカロース結合タンパク質（WO 00/26388）のプロモーター又はレグミンＢ４プロモーター（LeB4; Baeumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225: 121-128; Baeumlein et al. (1992) Plant Journal 2(2):233-9; Fiedler U et al. (1995) Biotechnology (NY) 13(10):1090〜）、アラビドプシスからのオレオシンプロモーター（WO 98/45461）、アブラナ属からのＢｃｅ−４プロモーター（WO 91/13980）である。更なる適した種子特異的なプロモーターは、「高分子量グルテニン」（High Molecular Weight Glutenin）（ＨＭＷＧ）、グリアジン、分枝酵素（Verzweigungsenzym）、ＡＤＰグルコースピロホスファターゼ（ＡＧＰアーゼ）又はデンプン合成酵素をコードする遺伝子のプロモーターである。有利には、種子特異的な発現を単子葉類植物、例えばトウモロコシ、オオムギ、コムギ、ライムギ、イネその他において可能にする更なるプロモーターである。有利には、ｌｐｔ２又はｌｐｔ１−遺伝子（WO 95/15389, WO 95/23230）のプロモーター又はWO 99/16890に記載されたプロモーター（ホルデイン遺伝子、グルテリン遺伝子、オリジン（Ｏｒｙｚｉｎ）遺伝子、プロラミン遺伝子、グリアジン遺伝子、ゼイン遺伝子、カシリン（Kasirin）遺伝子、又はセカリン（Ｓｅｃａｌｉｎ）遺伝子のプロモーター）を使用してよい。
【０１５２】
塊茎、貯蔵根又は根に特異的なプロモーター、例えばパタチンプロモーター  クラスＩ（Ｂ３３）及びジャガイモからのカテプシンＤのプロモーター。
【０１５３】
葉特異的なプロモーター
例えばジャガイモからのサイトゾルのＦＢＰアーゼのプロモーター（WO 97/05900）、ルビスコ（リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ）のＳＳＵプロモーター（小サブユニット）又はジャガイモからのＳＴ−ＬＳＩプロモーター（Stockhaus et al. (1989) EMBO J 8:2445-2451）。表皮特異的なプロモーター、例えばＯＸＬＰ（「オキサラート酸化酵素類似タンパク質」（Oxalat-Oxidase like protein）；Wei et al. (1998) Plant Mol. Biol. 36:101-112）遺伝子のプロモーター。
【０１５４】
花特異的なプロモーター
例えば、フィトエン合成酵素プロモーター（WO 92/16635）又はＰ−ｒｒ遺伝子のプロモーター（WO 98/22593）。
【０１５５】
葯特異的なプロモーター
例えば、５１２６−プロモーター（US 5,689,049, US 5,689,051）、ｇｌｏｂ−１プロモーター及びγ−ゼインプロモーター。
【０１５６】
ｃ）化学的に誘導可能であるプロモーター
前記発現カセットはまた、化学的に誘導可能であるプロモーターを含有してよく（総説記事: Gatz et al. (1997) Annu. Rev. Plant Physiol Plant Mol Biol 48:89-108）、前記プロモーターを介してこの外来性遺伝子の植物中での発現は特定の時間点で制御されることが可能である。以下のプロモーター、例えばＰＲＰ１プロモーター（Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22:361-366）、サリチル酸により誘導可能であるプロモーター（WO 95/19443）、ベンゼンスルホンアミドにより誘導可能であるプロモーター（EP 0 388 186）、テトラサイクリンにより誘導可能であるプロモーター（Gatz et al. (1992) Plant J 2:397-404）、アブシジン酸により誘導可能であるプロモーター（EP 0 335 528）又はエタノール又はシクロヘキサノンにより誘導可能であるプロモーター（WO 93/21334が同様に使用されてよい。従って、例えばカロース合成酵素活性を減少又は阻害する分子、例えば上記に列挙したｄｓＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス−核酸分子その他の発現は、適した時間点に誘導されてよい。
【０１５７】
ｄ）ストレス又は病原体誘導−可能であるプロモーター
とりわけ有利には、カロース合成酵素のポリペプチド量、活性、又は機能の減少のために使用されるＲＮＡｉ構築物の発現のために誘導可能であるプロモーターの使用であり、これは例えば、病原体−誘導可能であるプロモーターの使用の際に、必要な場合（即ち病原体の被害）にのみ発現を可能にする。
【０１５８】
本発明による方法において従って、一実施態様において植物中で活性のあるプロモーターが使用され、前記プロモーターは病原体−誘導可能であるプロモーターである。
【０１５９】
病原体−誘導可能であるプロモーターは病原体の被害の結果誘導される遺伝子、例えばＰＲタンパク質、ＳＡＲタンパク質、β−１，３−グルカナーゼ、キチナーゼその他の遺伝子のプロモーター（例えばRedolfi et al. (1983) Neth J Plant Pathol 89:245-254; Uknes, et al. (1992) Plant Cell 4:645-656; Van Loon (1985) Plant Mol Viral 4:111-116; Marineau et al. (1987) Plant Mol Biol 9:335-342; Matton et al. (1987) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-342; Somssich et al. (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83:2427-2430; Somssich et al. (1988) Mol Gen Genetics 2:93-98; Chen et al. (1996) Plant J 10:955-966; Zhang and Sing (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:2507-2511; Warner, et al. (1993) Plant J 3:191-201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1:961-968(1989)）を含む。
【０１６０】
損傷−誘導可能であるプロモーター、例えばｐｉｎＩＩ遺伝子のプロモーター（Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28:425-449; Duan et al. (1996) Nat Biotech 14:494-498）、ｗｕｎ１及びｗｕｎ２遺伝子のプロモーター（US 5,428,148）、ｗｉｎ１及びｗｉｎ２遺伝子のプロモーター（Stanford et al. (1989) Mol Gen Genet 215:200-208)、システミン(McGurl et al. (1992) Science 225:1570-1573）、ＷＩＰ１遺伝子のプロモーター（Rohmeier et al. (1993) Plant Mol Biol 22:783-792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323:73-76)、ＭＰＩ遺伝子のプロモーター(Corderok et al. (1994) Plant J 6(2):141-150）及びこの類似物も含まれる。
【０１６１】
更なる病原体−誘導可能であるプロモーターのための供給源は、ＰＲ遺伝子ファミリーである。係るプロモーター中の一連の要素が有利であることが分かった。このようにして、ＰＲ−２ｄのプロモーター中の領域−３６４〜−２８８はサリチル酸特異性を媒介する（Buchel et al. (1996) Plant Mol Biol 30, 493-504）。配列５’−ＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴ−３’は、オオムギのβ−１，３−グルカナーゼのプロモーター中に、及び３０つを上回る更なるストレス誘導可能である遺伝子中に繰り返して現れる。係る領域はタバコにおいて核タンパク質に結合し、この存在度はサリチル酸により向上する。タバコ及びアラビドプシスからのＰＲ−１−プロモーター（EP-A 0 332 104, WO 98/03536）は同様に病原体−誘導可能であるプロモーターとして適する。有利には、とりわけ特異的に病原体より誘導されるので、オオムギ（Schweizer et al. (1997) Plant Physiol 114:79-88）及びコムギ（Rebmann et al. (1991) Plant Mol Biol 16:329-331）からの「酸性ＰＲ−５（acidic PR-5）」−（ａＰＲ５）−プロモーターである。ａＰＲ５−タンパク質は、病原体被害後約４〜６時間のうちに蓄積し、かつ非常にわずかなバックグラウンド発現のみを示す（WO 99/66057）。向上した病原体−誘導された特異性を達成するためのアプローチは、合成のプロモーターの製造を、公知の病原体−応答性の要素の組み合わせからを形成する（Rushton et al. (2002) Plant Cell 14, 749-762; WO 00/01830; WO 99/66057）。更なる病原体−誘導可能であるプロモーターは、様々な種から当業者に公知である（EP-A 1 165 794; EP-A 1 062 356; EP-A 1 041 148; EP-A 1 032 684）。
【０１６２】
更なる病原体−誘導可能であるプロモーターは、亜麻Ｆｉｓ−１−プロモーター（WO 96/34949）、Ｖｓｔ１−プロモーター（Schubert et al. (1997) Plant Mol Biol 34:417-426）並びにタバコからのＥＡＳ４セスキテルペン−シクラーゼ−プロモーター（US 6,100,451）を含む。
【０１６３】
更に、生物又は非生物のストレスにより誘導されるプロモーターが有利であり、例えばジャガイモからの例えばＰＲＰ１−遺伝子の病原体−誘導可能であるプロモーター（例えばｇｓｔ１プロモーター）（WO 96/28561; Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22:361-366）、トマトからの熱誘導可能であるｈｓｐ７０プロモーター又はｈｓｐ８０プロモーター（US 5,187,267）、ジャガイモからの冷間誘導可能であるα−アミラーゼプロモーター（WO 96/12814）、光誘導可能であるＰＰＤＫプロモーター、又は損傷誘導されたｐｉｎＩＩプロモーター（EP-A 0 375 091）である。
【０１６４】
ｅ）葉肉組織特異的なプロモーター
本発明による方法において、一実施態様において、葉肉組織特異的なプロモーター、例えばコムギのゲルミン９ｆ−３．８遺伝子のプロモーター（GenBank Acc.-No.: M63224）又はオオムギＧｅｒＡプロモーター（WO 02/057412）が使用される。前記プロモーターは特に有利であり、というのもこれは葉肉組織特異的でも、病原体−誘導可能でもあるからである。更に適するのは、葉肉組織特異的なアラビドプシスＣＡＢ−２プロモーター（GenBank Acc.-No.: X15222）、並びにトウモロコシＰＰＣＺｍ１プロモーター（GenBank Acc.-No.: X63869）又はこれらのホモログである。葉肉組織特異的とは、このプロモーター配列中に存在するシスエレメント及びこのエレメントに結合する転写因子のこの特異的な相互作用により誘起される遺伝子の転写の、可能な限り少ない、前記葉肉組織含有性の植物組織への制限を意味し、有利には葉肉組織に制限した転写が意味される。
【０１６５】
ｆ）発達依存性のプロモーター
更なる適したプロモーターは、例えば果実成熟特異的なプロモーターであり、例えばトマトからの果実成熟特異的なプロモーターである（WO 94/21794, EP 409 625）。発達依存性のプロモーターは、部分的に前記の組織特異性のプロモーターを包含し、というのも個々の組織の形成は、自然に即した発達依存性に行われるからである。
【０１６６】
特に有利には、構成的な、並びに葉及び／又は茎特異的な、病原体−誘導可能である、根特異的な、葉肉組織特異的なプロモーターであり、その際構成的な、病原体−誘導可能である葉肉組織特異的であってかつ根特異的であるプロモーターが最も有利である。
【０１６７】
更には、更なるプロモーターが機能的に、発現すべき核酸配列と連結していてよく、これは更なる植物組織又はその他の生物、例えば大腸菌における発現を可能にする。植物のプロモーターとして、原則的に上述の全ての記載したプロモーターが考慮される。
【０１６８】
更なる植物における発現に適したプロモーターは、記載されている（Rogers et al. (1987) Meth in Enzymol 153:253-277; Schardl et al. (1987) Gene 61:1-11; Berger et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:8402-8406）。
【０１６９】
本発明による発現カセット又はベクターを含有する核酸配列は、プロモーターの他に更なる遺伝子の制御配列と、機能的に連結していてよい。遺伝子の制御配列との概念は、幅広く理解されるべきものであり、かつ本発明による発現カセットの実現又は機能に影響を有する全ての配列を意味する。遺伝子の制御配列は、例えば原核生物又は真核生物における転写及び翻訳を変更する。有利には、本発明による発現カセットは、そのつどのトランスジェニックにより発現すべき核酸配列の５’−上流に、前記特異性の１つを有するプロモーター、及び３’−下流にターミネーター配列を付加的な遺伝子の制御配列として、並びに場合により更なる通常の制御性の要素を含み、しかもそのつど機能的に、前記のトランスジェニックにより発現すべき核酸配列と連結している。
【０１７０】
遺伝子の制御配列はまた、更なるプロモーター、プロモーターエレメント又は最小プロモーター（Minimalpromotor）を含み、これは発現調節性の特性を変更してよい。従って、遺伝子の制御配列により例えば前記の組織特異的な発現は付加的に、特定のストレス因子に依存して行われてよい。相応する要素は例えば、水ストレス、アブシジン酸（Lam E及びChua NH, J Biol Chem 1991; 266(26): 17131 -17135）、及び熱ストレス（Schoffl F et al., Molecular & General Genetics 217(2-3):246-53, 1989）のための要素が記載されている。
【０１７１】
原則的に、制御配列、例えば本発明による方法に対して上述した制御配列を有する天然のプロモーター全てが使用されてよい。更に、合成のプロモーターも有利に使用されてよい。
【０１７２】
遺伝子の制御配列は更に、遺伝子の５’−非翻訳領域、イントロン、又は非コード性３’−領域、例えばアクチン−１イントロン、又はＡｄｈ１−Ｓイントロン、１、２、及び６をも含む（一般的に: The Maize Handbook, 第116章, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)）。これらが、遺伝子発現の制御の際に顕著な機能を果たすことできることが示されている。従って、５’−非翻訳配列は、非相同性の遺伝子の一過的な発現を増強してよいことが示された。翻訳増強物に関して例示的に、５’−リーダー配列が、タバコモザイクウィルス（Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15:8693-8711）及びこの類似物から挙げられる。これは更に、組織特異性を必要としてよい（Rouster J et al. (1998) Plant J 15:435-440）。
【０１７３】
前記発現カセットは有利には、１つ又は複数のいわゆる「エンハンサー配列」を、プロモーターと機能的に連結して含有してよく、これは核酸配列の向上したトランスジェニックな発現を可能にする。トランスジェニックにより発現すべき核酸配列の３’−末端にはまた、付加的に有利な配列が挿入されてよく、例えば更なる調節性の要素又はターミネーターである。前記のトランスジェニックにより発現すべき核酸配列は、１つ又は複数のコピーにおいて遺伝子構築物中に含有されていてよい。
【０１７４】
制御配列として適したポリアデニル化シグナルは、植物のポリアデニル化シグナルであり、有利には、実質的に、アグロバクテリウム・チュメファシエンスからのＴ−ＤＮＡポリアデニル化シグナル、特にＴｉ−プラスミドｐＴｉＡＣＨＳのＴ−ＤＮＡ（オクトピン合成酵素）の遺伝子３のＴ−ＤＮＡポリアデニル化シグナル（Gielen et al. (1984) EMBO J 3:835〜）又はその機能的な等価物に相当するＴ−ＤＮＡポリアデニル化シグナルである。特に適したターミネーター配列の例は、ＯＣＳ（オクトピン−合成酵素）−ターミネーター及びＮＯＳ（ノパリン合成酵素）−ターミネーターである。
【０１７５】
制御配列として、更に、相同組み換え又は宿主生物のゲノム中への挿入を可能にするか、又はゲノムからの除去を可能にする制御配列が理解される。相同組み換えの際には、例えば特定の遺伝子の天然のプロモーターを、胚性の表皮及び／又は花に対する特異性を有するプロモーターと交換してよい。
【０１７６】
発現カセット及び前記発現カセットから導かれるベクターは、更なる機能要素を含有してよい。機能要素との概念は幅広く理解されるものであり、かつ本発明による発現カセット、ベクター又はトランスジェニック生物の製造、増殖、又は機能に影響を有する全ての要素を意味する。例示的に、しかしながら制限することなく以下が挙げられる：
ａ）選択マーカーであって、代謝阻害剤、例えば２−デオキシグルコース−６−ホスファート（WO 98/45456）、抗生物質又は殺生剤、有利には除草剤、例えばカナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、又はホスフィノトリシン（Phosphinotricin）その他に対する耐性を提供する選択マーカー。特に有利な選択マーカーは、除草剤に対する耐性を提供する選択マーカーである。例示的に以下が挙げられる：ＤＮＡ配列であって、ホスフィノトリシンアセチル転移酵素（ＰＡＴ）をコードし、かつグルタミン合成酵素阻害剤を不活性化するＤＮＡ配列（ｂａｒ及びｐａｔ遺伝子）、５−エノールピルビルシキミナート−３−ホスファート合成酵素遺伝子（ＥＰＳＰ合成酵素遺伝子）（これは、Ｇｌｙｐｈｏｓａｔ(R)（Ｎ−（ホスホノメチル）グリシン）に対する耐性を提供する）、Ｇｌｙｐｈｏｓａｔ(R)を分解する酵素をコードするｇｏｘ遺伝子（グリホサートオキシド還元酵素）、ｄｅｈ遺伝子（デハロゲナーゼ（Dehalogenase）をコード、ダラポンを不活性化）、スルホニル尿素及びイミダゾリノンを不活性化するアセトラクタート合成酵素並びにｂｘｎ遺伝子（これは、ブロモオキシニルを分解するニトリルアーゼ酵素をコードする）、ａａｓａ遺伝子（これは抗生物質、アペクチノマイシンに対する耐性を提供する）、ストレプトマイシンホスホ転移酵素（ＳＰＴ）遺伝子（これはストレプトマイシンに対する耐性を保証する）、ネオマイシンホスホ転移酵素（ＮＰＴＩＩ）遺伝子（これは、カナマイシン又はジェネティシジン（Geneticidin）に対する耐性を提供する）、ハイグロマイシン転移酵素（ＨＰＴ）遺伝子（これは、ハイグロマイシンに対する耐性を媒介する）、アセトラクタート合成酵素遺伝子（ＡＬＳ）（これはスルホニル尿素除草剤に対する耐性を提供する）（例えば、例えばＳ４及び／又はＨｒａ突然変異を有する突然変異したＡＬＳ変異体）。
【０１７７】
ｂ）リポーター遺伝子であって、容易に定量可能であるタンパク質をコードし、かつ固有の色又は酵素活性を介して、形質転換効率又は発現部位又は発現時間点の評価を保証するリポーター遺伝子。特に有利には、この際リポータータンパク質（Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1):29-44）、例えば「緑色蛍光タンパク質」（ＧＦＰ）(Sheen et al.(1995) Plant Journal 8(5):777-784; Haseloff et al.(1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(6):2122-2127; Reichel et al.(1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(12):5888-5893; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16:267-271; WO 97/41228; Chui WL et al. (1996) Curr Biol 6:325-330; Leffel SM et al. (1997) Biotechniques. 23(5):912-8)、クロラムフェニコール転移酵素、ルシフェラーゼ（Ow et al. (1986) Science 234:856-859; Millar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10:324-414）、エクオリン遺伝子（Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126(3):1259-1268）、β−ガラクトシダーゼ、Ｒ−座遺伝子（アントシアニン顔料（赤色色素）の産生を植物の組織中で制御し、従ってプロモーター活性の直接的な分析を付加的な助剤又はクロモゲンの基質の添加なしに可能にするタンパク質をコードする；Dellaporta et al., : Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11:263-282, 1988））であり、特に有利にはβ−グルコロニダーゼ（Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907）である。
【０１７８】
ｃ）複製起点であって、本発明による発現カセット又はベクターの、例えば大腸菌における増殖を保証する複製起点。例示的に、ｐＢＲ３２２  ｏｒｉ又はＰ１５Ａ  ｏｒｉのＯＲＩ（ＤＮＡ複製起点）が挙げられる（Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 第2版. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989）。
【０１７９】
ｄ）要素であって、アグロバクテリウム媒介した植物の形質転換にとって必要である要素、例えばＴ−ＤＮＡの右側又は左側の境界又はｖｉｒ領域。
【０１８０】
成功して形質転換した細胞の選択のために、通常は、選択可能であるマーカーを付加的に挿入することが必要であり、これは成功して形質転換した細胞に殺生剤（例えば、除草剤）、代謝阻害剤、例えば２−デオキシグルコース−６−ホスファート（WO 98/45456）又は抗生物質に対する耐性を提供する。前記選択マーカーは、非形質転換細胞からの形質転換した細胞の選択を可能にする（McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84）。
【０１８１】
本発明による発現カセットの生物、又はこの細胞、組織、器官、部分、又は種子（有利には植物又は植物の細胞、組織、器官、部分、又は種子）への挿入は、有利には発現カセットを含有するベクターの使用下で実現されてよい。前記発現カセットはベクター（例えばプラスミド）中へ、適した制限酵素切断部位を介して挿入されてよい。この生じるプラスミドは次に大腸菌に挿入される。正確に形質転換した大腸菌は、選択され、培養され、そしてこの組み換えプラスミドは当業者に公知の方法を用いて獲得される。制限分析及び配列決定は、クローニング工程を検査するために用いられてよい。
【０１８２】
ベクターは例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウィルス又はアグロバクテリウムであってよい。有利な一実施態様において、前記発現カセットの挿入はプラスミドベクターを用いて実現される。有利には、宿主ゲノム中への前記発現カセットの安定な統合を可能にするベクターである。
【０１８３】
形質転換生物（又は形質転換細胞）の製造は、この相応するＤＮＡ分子及び従ってこの遺伝子発現の結果形成されるＲＮＡ分子又はタンパク質をこの相応する宿主細胞中導入することを必要とする。
【０１８４】
形質転換（又は形質導入又はトランスフェクション）として呼称されるこの過程のために、多数の方法が使用可能である（Keown et al. (1990) Methods in Enzymology 185:527-537）。従って、ＤＮＡ又はＲＮＡは例示的に、直接的にマイクロインジョクションにより、又はＤＮＡコーティングした微粒子を用いた撃ち込みにより挿入されてよい。また、前記細胞は化学的に、例えばポリエチレングリコールを用いて透過性にしてよく、この結果ＤＮＡは分散により前記細胞中に達する。ＤＮＡはまた、その他のＤＮＡ含有ユニット、例えばミニ細胞、細胞、リソソーム又はリポソームを用いたプロトプラスト融合により生じてよい。電気穿孔法は、前記細胞を可逆的に電気的なインパルスにより透過性にした、ＤＮＡの挿入のために適した更なる方法である。相応する方法は記載されている（例えば、Bilang et al. (1991) Gene 100:247-250; Scheid et al. (1991) Mol Gen Genet 228:104-112; Guerche et al. (1987) Plant Science 52:111-116; Neuhause et al. (1987) Theor Appl Genet 75:30-36; Klein et al. (1987) Nature 327:70-73 ; Howell et al. (1980) Science 208:1265; Horsch et al.(1985) Science 227:1229-1231 ; DeBlock et al. (1989) Plant Physiology 91:694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds.）Academic Press Inc. (1988); and Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press Inc. (1989))。
【０１８５】
植物の場合には、この際形質転換及び植物組織又は植物細胞からの植物の再生のために記載された方法が一過的又は安定な形質転換のために使用される。適した方法は、特に、プロトプラスト形質転換であって、ポリエチレングリコールにより導かれたＤＮＡ取り込み、遺伝子銃を用いた微粒子銃による方法、いわゆる「粒子撃ち込み(particle bombardment)」法、電気穿孔法、乾燥した胚のＤＮＡ含有溶液中へのインキュベーション及びマイクロインジョクションによるものである。
【０１８６】
「直接的な」形質転換技術の他に、形質転換をまた、細菌による感染によりアグロバクテリウム・チュメファシエンス又はアグロバクテリウム・リゾゲネシスを用いて実施してよい。前記方法は例えば、Horsch RB et al. (1985) Science 225: 1229〜に記載されている。
【０１８７】
アグロバクテリウムが使用される場合には、前記発現カセットは特殊なプラスミド、中間ベクター（英語：ｓｈｕｔｔｌｅ又はｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｖｅｃｔｏr）又はバイナリーベクター（binaer vektor）中に組み込むべきである。Ｔｉ又はＲｉプラスミドが形質転換のために使用される場合には、少なくとも右側の境界が、大抵はこのＴｉ又はＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの右側及び左側の境界が隣接領域として挿入すべき発現カセットと結合している。
【０１８８】
有利には、バイナリーベクターが使用される。バイナリーベクターは、大腸菌においても、またアグロバクテリウムにおいても複製できる。前記ベクターは通常は、選択マーカー及び右側及び左側のＴ−ＤＮＡ境界配列により隣接するリンカー又はポリリンカーを含有する。前記ベクターは直接的にアグロバクテリウム中に形質転換されてよい（Holsters et al. (1978) Mol Gen Genet 163:181-187）。前記選択マーカー遺伝子は、形質転換したアグロバクテリウムの選択を可能にし、かつ例えば、カナマイシンに対して耐性を提供するｎｐｔＩＩ遺伝子である。この場合に宿主生物として働くアグロバクテリウムは、既に、ｖｉr領域を有するプラスミドを含有することが望ましい。これは、植物細胞へのＴ−ＤＮＡの移行に必要である。このようにして形質転換されたアグロバクテリウムは、植物細胞の形質転換のために使用されてよい。Ｔ−ＤＮＡの植物細胞の形質転換のための使用は、集中的に試験され、かつ記載されてきた（EP 120 516; Hoekema,: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Chapter V; An et al. (1985) EMBO J 4:277-287）。様々なバイナリーベクターが公知であり、かつ部分的に市販されていて、例えばｐＢＩ１０１．２又はｐＢＩＮ１９（Clontech Laboratories, Inc. USA）である。
【０１８９】
ＤＮＡ又はＲＮＡの植物細胞中への注入又は電気穿孔法の場合には、使用するプラスミドに関してとりわけの要求はない。単純なプラスミド、例えばｐＵＣ系列のプラスミドが使用されてよい。完全な植物体がこの形質転換細胞から再生されることが望ましい場合には、前記プラスミドに付加的な選択可能であるマーカー遺伝子が存在することが必要である。
【０１９０】
安定に形質転換した細胞、即ち宿主細胞のＤＮＡ中に組み込まれた挿入ＤＮＡを含有する前記細胞は、選択可能であるマーカーの成分が、挿入したＤＮＡである場合には、非形質転換体から選択されてよい。マーカーとして例えば、抗生物質又は除草剤(カナマイシン、G４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、又はホスフィノトリシン、その他)に対する耐性を提供することができる任意の遺伝子が機能してよい（上記参照）。係るマーカー遺伝子を発現する形質転換細胞は、非形質転換の野生型を致死させる相応する抗生物質又は除草剤の濃度の存在下で生存できる。例は、上記したものであり、かつ有利には、除草剤ホスフィノトリシンに対する耐性を提供するｂａｒ遺伝子（Rathore KS et al. (1993) Plant Mol Biol 21(5):871-884）、カナマイシンに対する耐性を提供するｎｐｔＩＩ遺伝子、ハイグロマイシンに対する耐性を提供するｈｐｔ遺伝子、又は除草剤グリホサートに対する耐性を提供するＥＰＳＰ遺伝子を含む。前記選択マーカーは、非形質転換細胞からの形質転換細胞の選択を可能にする（McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84）。この得られた植物は通常の様式で生育及び交雑されてよい。２つ又はそれ以上の産生物を、ゲノムの組み込みが安定かつ遺伝性であることを確かめるために培養することが望ましい。
【０１９１】
前記方法は例えば、Jenes B et al.(1993) Techniques for Gene Transfer: Transgenic Plants,第1巻, Engineering and Utilization, SD Kung 及びR Wu編集, Academic Press, 128-143頁並びにPotrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225)に記載されている。有利には、この発現すべき構築物は、アグロバクテリウム・チュメファシエンスを形質転換するために適するベクター、例えばｐＢｉｎ１９（Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12:8711〜）中でクローニングされる。
【０１９２】
形質転換された植物細胞が製造されると、完全な植物が当業者に公知の方法の使用下で得られてよい。この際、例えばカルス培養から出発する。この未分化の細胞体からシュート及び根の形成が公知の様式において誘導されてよい。この得られたシュート体は、移し植えし、かつ生育させてよい。
【０１９３】
当業者には、植物細胞、植物の部分、及び完全な植物体を再生するための方法も公知である。例えばFennell et al. (1992) Plant Cell Rep. 11: 567-570; Stoeger et al (1995) Plant Cell Rep. 14:273-278; Jahne et al. (1994) Theor Appl Genet 89:525-533により記載されたこのための方法が使用される。
【０１９４】
本発明による方法は有利には、病原体耐性（例えば、昆虫、菌類、細菌、線形動物、その他に対して）、ストレス耐性又はその他の植物の特性の改善を引き起こす更なる方法と組み合わせてよい。例えば、特に、Dunwell JM, Transgenic approaches to crop improvement, J Exp Bot. 2000;51 Spec No;487-96頁に挙げられている。
【０１９５】
有利な一実施態様において、カロース合成酵素の活性の植物における減少を、Ｂａｘ阻害剤１−タンパク質の活性の向上と組み合わせて行う。これは例えば、葉肉組織及び／又は根組織中でのＢａｘ阻害剤１−タンパク質をコードする核酸配列の１つの発現により行われてよい。
【０１９６】
本発明による方法において、オオムギ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）又はタバコ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）からのＢａｘ阻害剤１−タンパク質は特に有利である。
【０１９７】
本発明の更なる対象は核酸分子であって、ポリヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、５、７、９、１２、１４、１６、２２、２４、２６、２８、３０、及び／又は３２によるオオムギ、コムギ、及びトウモロコシからのカロース合成酵素ポリペプチドをコードする核酸分子並びに係る核酸分子に相補的である核酸配列、及び遺伝暗号の縮退（縮重）により導かれる配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、６、８、１０、１１、１３、１５、１７、１９、２３、２５、２７、２９、３１、及び／又は３３によるポリペプチドの機能的な等価物をコードする核酸分子を含有する核酸分子に関し、その際前記核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、１８、２０、又は３４からはならない。
【０１９８】
本発明の更なる対象は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、６、８、１０、１１、１３、１５、１７、２３、２５、２７、２９、３１、又は３３によるオオムギ、コムギ、トウモロコシからのカロース合成酵素ポリペプチド又は、係る配列を含有するポリペプチド、並びにこの機能的な等価物に関し、その際前記ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、１９、２１、又は３５からならない。
【０１９９】
本発明の更なる対象は、二本鎖ＲＮＡ核酸分子（ｄｓＲＮＡ分子）であって、植物（又は、この植物から導かれる細胞、組織、器官、又は種子）中への挿入の際に、カロース合成酵素の減少を引き起こす二本鎖ＲＮＡ核酸分子であって、その際前記ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖は少なくとも３０％の、有利には少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％の、特に有利には少なくとも９０％の、とりわけ有利には１００％のホモロジーを、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、５、７、９、１２、１４、１６、２２、２４、２６、２８、３０、及び／又は３２による核酸分子に対して有するか、又は少なくとも１７塩基対、有利には少なくとも１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０塩基対、特に有利には少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、又は９０塩基対、とりわけ有利には少なくとも、１００、２００、３００、又は４００塩基対、最も有利には少なくとも５００、６００、７００、８００、９００、少なくとも１０００塩基対の断片を含有し、かつこれは少なくとも５０％、６０％、７０％、又は８０％、特に有利には少なくとも９０％、とりわけ有利には１００％のホモロジーを、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、５、７、９、１２、１４、１６、２２、２４、２６、２８、３０、及び／又は３２による核酸分子に対して有し、しかしながら配列番号１、１８、２０、及び３４には相応しない。
【０２００】
この二本鎖の構造は、単独の自己相補鎖から出発して、又は２つの相補鎖から出発して形成されてよい。特に有利な一実施態様において、「センス」配列及び「アンチセンス」配列は、結合性の配列（「リンカー」）を介して連結され、かつ例えばヘアピン構造を形成してよい。特に有利には、この結合性の配列はイントロンであってよく、前記イントロンはｄｓＲＮＡの合成後にスプライスングされる。
【０２０１】
ｄｓＲＮＡをコードする前記核酸配列は、更なる要素、例えば転写終結シグナル又はポリアデニル化シグナルを包含してよい。
【０２０２】
本発明の更なる対象は、発明による核酸配列の1つを含有するトランスジェニックな発現カセットに関する。本発明によるトランスジェニックな発現カセットとは、オオムギ、コムギ、及びトウモロコシからのカロース合成酵素ポリペプチドをコードする核酸配列であって、上述の定義による少なくとも１つの遺伝子の制御要素と、任意の生物中での、−有利には単子葉類植物中での−発現（転写及び場合により翻訳）を実現できるように連結している核酸配列である。このために適する遺伝子の制御要素は上記した。前記のトランスジェニックな発現カセットはまた、上述の定義による更なる機能要素を含有してよい。
【０２０３】
係る発現カセットは、例えば、本発明による核酸配列、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、５、７、９、１２、１４、１６、２２、２４、２６、２８、３０、又は３２による核酸分子又はこの本発明による断片と実質的に同一である核酸配列を含有し、その際前記核酸配列は有利には、プロモーターに対してセンス方向又はアンチセンス方向にあり、従って、センスＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡの発現を生じてよく、その際前記プロモーターは、植物中で活性のある、有利には病原体被害により誘導可能であるプロモーターである。本発明によれば、前記トランスジェニックな発現カセットを包含するトランスジェニックなベクターも含まれる。
【０２０４】
本発明の更なる対象は、植物であって、天然の過程により又は人工的に誘導された突然変異を核酸分子中に含有する植物に関し、前記核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、５、７、９、１２、１４、１６、２２、２４、２６、２８、３０、又は３２による核酸配列を含有し、これはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、１８、２０、及び３４からはならず、その際前記突然変異は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、５、７、９、１２、１４、１６、２２、２４、２６、２８、３０、又は３２による核酸分子によりコードされたポリペプチドの１つの活性、機能、又はポリペプチド量の減少を引き起こす。有利には、この際イネ科に属する植物であり、特に有利には、植物の属、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、コムギ、モロコシ、トウモロコシ、サトウキビ、及びイネから選択されている植物であり、特に有利には、種、オオムギ（Hordeum vulgare）、コムギ（Triticum aestivum）、スペルト小麦（Triticum aestivum subsp.spelta）、ライコムギ、エンバク（Avena sative）、ライムギ（Secale cereale）、モロコシ（Sorghum bicolor）、トウモロコシ（Zea mays）、サトウキビ（Saccharum officinarum）、及びイネ（Oryza sative）から選択されている植物である。
【０２０５】
従って、本発明は一実施態様において、本発明による核酸配列を含有する単子葉類の生物に関し、前記核酸配列は突然変異を含有し、前記突然変異は、前記生物又はこの部分中で本発明による核酸分子によりコードされるタンパク質の１つの活性の減少を引き起こす。
【０２０６】
本発明の更なる対象は、トランスジェニック植物であって、以下の少なくとも１つで形質転換されたトランスジェニック植物に関する：
ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、５、７、９、１２、１４、１６、２２、２４、２６、２８、３０、又は３２による核酸分子を含有する核酸配列、その際これは前記配列に相補的である核酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１１、１３、１５、１７、２３、２５、２７、２９、３１、又は３３によるポリペプチドの機能的な等価物をコードする核酸分子を含み、これは有利にはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、１８、２０、及び３４に相応しない、
ｂ）カロース合成酵素の減少を引き起こす二本鎖ＲＮＡ核酸分子二本鎖ＲＮＡ核酸分子（ｄｓＲＮＡ分子）、その際前記ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖は少なくとも３０％の、有利には少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％の、特に有利には少なくとも９０％の、とりわけ有利には１００％のホモロジーを、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、５、７、９、１２、１４、１６、２２、２４、２６、２８、３０、又は３２による核酸分子に対して有するか、又は少なくとも１７塩基対、有利には少なくとも１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０塩基対、特に有利には少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、又は９０塩基対、ととりわけ有利には少なくとも１００、２００、３００、又は４００塩基対、最も有利には少なくとも５００、６００、７００、８００、９００又はそれ以上の塩基対の断片を含有し、これは少なくとも５０％、６０％、７０％、又は８０％、特に有利には少なくとも９０％、とりわけ有利には１００％のホモロジーを、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１２、１４、１６、２２、２４、２６、２８、３０、又は３２による核酸分子に対して有し、しかしながら有利には配列番号１、１８、２０、及び３４には相応しない、
ｃ）トランスジェニックな発現カセットであって、本発明による核酸配列の１つを含有する発現カセット、又は本発明によるベクター、並びに細胞、細胞培養体、組織、部分−例えば植物生物の葉、根、その他−、又は係る生物から導かれる増殖物。
【０２０７】
トランスジェニック生物として、有利な宿主生物又は出発生物は、特に、上述の定義による植物である。例えば、ユリ科に属する高等及び下等植物の全ての属及び種である。一実施態様において、トランスジェニック生物は、成熟植物、種子、シュート、及び実生、並びにこれらから導かれる部分、増殖物及び培養体、例えば細胞培養体である。「成熟植物」は、実生を超えたそれぞれの任意の発育段階での植物を意味する。「実生」は、早期の発達段階における未成熟な幼植物を意味する。特に宿主生物として有利な植物は、前記尺度による病原体耐性の達成のために本発明による方法を適用できる植物である。
【０２０８】
一実施態様において、前記植物は単子葉類植物、例えば、コムギ、カラスムギ、キビ、オオムギ、ライムギ、トウモロコシ、イネ、ソバ、モロコシ、ライコムギ、スペルトコムギ、又はサトウキビ、特に有利には種、オオムギ（Hordeum vulgare）、コムギ（Triticum aestivum）、スペルト小麦（Triticum aestivum subsp.spelta）、ライコムギ、エンバク（Avena sative）、ライムギ（Secale cereale）、モロコシ（Sorghum bicolor）、トウモロコシ（Zea mays）、サトウキビ（Saccharum officinarum）、又はイネ（Oryza sative）から選択されている。
【０２０９】
トランスジェニック生物の製造は、生物の形質転換又はトランスフェクションのための上記した方法を用いて実現されてよい。
【０２１０】
本発明の更なる対象は、本発明により記載されたトランスジェニック植物に関し、前記植物は付加的に、向上したＢａｘ阻害剤１活性を提供可能であり、有利にはこの際、向上したＢａｘ阻害剤１−タンパク活性を葉肉細胞又は根細胞中で有する植物であり、特に有利には、イネ科に属しかつ向上したＢａｘ阻害剤１活性を葉肉細胞又は根細胞中で有するトランスジェニック植物であり、更に有利には、植物の属、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、コムギ、モロコシ、トウモロコシ、サトウキビ、及びイネから選択されているトランスジェニック植物であり、最も有利には、植物の種、オオムギ（Hordeum vulgare）、コムギ（Triticum aestivum）、スペルト小麦（Triticum aestivum subsp.spelta）、ライコムギ、エンバク（Avena sative）、ライムギ（Secale cereale）、モロコシ（Sorghum bicolor）、トウモロコシ（Zea mays）、サトウキビ（Saccharum officinarum）、及びイネ（Oryza sative）から選択されているトランスジェニック植物である。
【０２１１】
本発明の更なる対象は、本発明によるトランスジェニック生物及び、係る生物から導かれる細胞、細胞培養体、部分−例えばトランスジェニック植物の生物の際には、根、葉、その他−、及びトランスジェニック増殖物、例えば、種子又は果実の使用であって、栄養又は飼料、医薬品又はファインケミカルズの製造のための使用に関する。
【０２１２】
一実施態様において、本発明は更に、医薬品又はファインケミカルズの宿主生物における組み換え製造のための方法であって、宿主生物又はこの部分を、上記した核酸分子発現カセットの１つにより形質転換し（この発現カセットは１つ又は複数の構造遺伝子を含有し、前記遺伝子は所望のファインケミカルズをコードするか又は所望のファインケミカルズの生合成を触媒する）、この形質転換された宿主生物を生育させ、かつこの所望のファインケミカルズを生育培地から単離する方法に関する。係る方法は、ファインケミカルズ、例えば酵素、ビタミン、アミノ酸、糖、脂肪酸、天然及び合成の矯味剤、芳香剤、及び着色剤のために幅広く適用可能である。特に有利には、トコフェロール及びトコトリエノール並びにカロチノイドの生産である。前記形質転換宿主生物の生育並びに前記宿主生物からの又は生育培地からの単離は、当業者に公知の方法を用いて行われる。医薬品、例えば抗体又はワクチンの生産は、Hood EE, Jilka JM (1999). Curr Opin Biotechnol.10(4):382-6; Ma JK, Vine ND (1999). Curr Top Microbiol Immunol. 236:275-92に記載されている。
【０２１３】
本発明により、構造遺伝子の発現は天然に、また本発明による方法の実施又は本発明による対象の使用に依存しないで行われるか、又は影響されてよい。
【０２１４】
配列
１．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1  オオムギからのカロース合成酵素ポリペプチド−１（ＨｖＣＳＬ−１）をコードする核酸配列。
【０２１５】
２．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２  オオムギからのカロース合成酵素ポリペプチド−１のアミノ酸配列。
【０２１６】
３．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３  オオムギからのカロース合成酵素ポリペプチド−２（ＨｖＣＳＬ−２）をコードする核酸配列。
【０２１７】
４．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４  オオムギからのカロース合成酵素ポリペプチド−２のアミノ酸配列。
【０２１８】
５．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５  オオムギからのカロース合成酵素ポリペプチド−３（ＨｖＣＳＬ−３）をコードする核酸配列。
【０２１９】
６．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６  オオムギからのカロース合成酵素ポリペプチド−３のアミノ酸配列。
【０２２０】
７．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７  オオムギからのカロース合成酵素ポリペプチド−７（ＨｖＣＳＬ−７）をコードする核酸配列。
【０２２１】
８．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８  オオムギからのカロース合成酵素ポリペプチド−７のアミノ酸配列。
【０２２２】
９．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９  トウモロコシからのカロース合成酵素ポリペプチド−１（ＺｍＣＳＬ−１）をコードする核酸配列。
【０２２３】
１０．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０  トウモロコシ（玉蜀黍）からのカロース合成酵素ポリペプチド−１（リーディングフレーム＋１）のアミノ酸配列。
【０２２４】
１１．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１  トウモロコシ（玉蜀黍）からのカロース合成酵素ポリペプチド−１（リーディングフレーム＋２）のアミノ酸配列。
【０２２５】
１２．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２  トウモロコシからのカロース合成酵素ポリペプチド−１ａ（ＺｍＣＳＬ−１ａ）をコードする核酸配列。
【０２２６】
１３．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３  トウモロコシ（玉蜀黍）からのカロース合成酵素ポリペプチド−１ａのアミノ酸配列。
【０２２７】
１４．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４  トウモロコシからのカロース合成酵素ポリペプチド−２（ＺｍＣＳＬ−２）をコードする核酸配列。
【０２２８】
１５．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５  トウモロコシからのカロース合成酵素ポリペプチド−２のアミノ酸配列。
【０２２９】
１６．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６  トウモロコシからのカロース合成酵素ポリペプチド−３（ＺｍＣＳＬ−３）をコードする核酸配列。
【０２３０】
１７．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７  トウモロコシからのカロース合成酵素ポリペプチド−３のアミノ酸配列。
【０２３１】
１８．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８  イネからのカロース合成酵素ポリペプチド−１（ＯｓＣＳＬ−１）をコードする核酸配列。
【０２３２】
１９．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９  イネからのカロース合成酵素ポリペプチド−１のアミノ酸配列。
【０２３３】
２０．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０  イネからのカロース合成酵素ポリペプチド−２（ＯｓＣＳＬ−２）をコードする核酸配列。
【０２３４】
２１．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１  イネからのカロース合成酵素ポリペプチド−２のアミノ酸配列。
【０２３５】
２２．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２  コムギからのカロース合成酵素ポリペプチド−１（ＴａＣＳＬ−１）をコードする核酸配列。
【０２３６】
２３．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３  コムギからのカロース合成酵素ポリペプチド−１のアミノ酸配列。
【０２３７】
２４．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４  コムギからのカロース合成酵素ポリペプチド−２（ＴａＣＳＬ−２）をコードする核酸配列。
【０２３８】
２５．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５  コムギからのカロース合成酵素ポリペプチド−２のアミノ酸配列。
【０２３９】
２６．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６  コムギからのカロース合成酵素ポリペプチド−４（ＴａＣＳＬ−４）をコードする核酸配列。
【０２４０】
２７．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７  コムギからのカロース合成酵素ポリペプチド−４のアミノ酸配列。
【０２４１】
２８．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８  コムギからのカロース合成酵素ポリペプチド−５（ＴａＣＳＬ−５）をコードする核酸配列。
【０２４２】
２９．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９  コムギからのカロース合成酵素ポリペプチド−５のアミノ酸配列。
【０２４３】
３０．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０  コムギからのカロース合成酵素ポリペプチド−６（ＴａＣＳＬ−６）をコードする核酸配列。
【０２４４】
３１．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１  コムギからのカロース合成酵素ポリペプチド−６のアミノ酸配列。
【０２４５】
３２．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２  コムギからのカロース合成酵素ポリペプチド−７（ＴａＣＳＬ−７）をコードする核酸配列。
【０２４６】
３３．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３  コムギからのカロース合成酵素ポリペプチド−７のアミノ酸配列。
【０２４７】
３４．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４  シロイヌナズナからのグルカン合成酵素類似ポリペプチド−５をコードする核酸配列（アクセッション番号  ＮＭ  １１６５３９）。
【０２４８】
３５．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５  シロイヌナズナからのグルカン合成酵素類似ポリペプチド−５をコードするカロース合成酵素のアミノ酸配列。
【０２４９】
３６．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６  オオムギからのＢａｘ阻害剤１をコードする核酸配列、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：  ＡＪ２９０４２１。
【０２５０】
３７．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７  オオムギからのＢａｘ阻害剤１ポリペプチドのアミノ酸配列。
【０２５１】
３８．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８  タバコからのＢａｘ阻害剤１をコードする核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ３９０５５６）。
【０２５２】
３９．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９  タバコからのＢａｘ阻害剤１ポリペプチドのアミノ酸配列。
【０２５３】
４０．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０  Ｈｅｉ１３１  ５’−ＧＴＴＣＧＣＣＧＴＴＴＣＣＴＣＣＣＧＣＡＡＣＴ−３’。
【０２５４】
４１．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１  Ｇｅｎｅ  Ｒａｃｅｒ  ５’−ネステッドプライマー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
５’−ＧＧＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＡ−３’。
【０２５５】
４２．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２  ＲＡＣＥ−ＨｖＣＳＬ１：５’−ＧＣＣＣＡＡＣＡＴＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＡＣＣＡＡＣＣＴ−３’。
【０２５６】
４３．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３  ＧｅｎｅＲａｃｅｒ(TM)  ５’−プライマー：
５’−ＣＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＡ−３。
【０２５７】
４４．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４  ＲＡＣＥ−５´ネステッド  ＨｖＣＳＬ１：
５’−ＴＣＴＧＧＣＴＴＴＡＴＣＴＧＧＴＧＴＴＧＧＡＧＡＡＴＣ−３’。
【０２５８】
４５．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５  ＧｅｎｅＲａｃｅｒ(TM)  ３’−プライマー：
５’−ＧＣＴＧＴＣＡＡＣＧＡＴＡＣＧＣＴＡＣＧＴＡＡＣＧ−３。
【０２５９】
４６．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６  ＧｅｎｅＲａｃｅｒ(TM)  ３’−ネステッドプライマー：
５’−ＣＧＣＴＡＣＧＴＡＡＣＧＧＣＡＴＧＡＣＡＧＴＧ−３。
【０２６０】
４７．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７  Ｍ１３−ｆｗｄ：５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ−３’。
【０２６１】
４８．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８  Ｍ１３−Ｒｅｖ：５’−ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３’。
【０２６２】
４９．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９  Ｈｅｉ９７  フォワード  ５´−ＴＴＧＧＧＣＴＴＡＡＴＣＡＧＡＴＣＧＣＡＣＴＡ−３´。
【０２６３】
５０．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０  Ｈｅｉ９８  リバース
５´−ＧＴＣＡＡＡＡＡＧＴＴＧＣＣＣＡＡＧＴＣＴＧＴ  −３´。
【０２６４】
実施例
一般的手法：
オリゴヌクレオチドの化学的合成は例えば、公知の様式において、ホスホアミジト（Phosphoamidit）方法（Voet, Voet, 第2.版, Wiley Press New York, 896-897頁）により行われる。本発明の枠内において実施されるクローニング工程は、例えば制限酵素切断、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡ断片の精製、核酸のニトロセルロース及びナイロン膜への転写、ＤＮＡ断片の連結、大腸菌細胞の形質転換、細菌の培養、ファージの増殖、及び組み換えＤＮＡの配列解析が、例えばSambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6に記載されたように実施される。組み換えＤＮＡ分子の配列決定は、サンガー法によりMWG-Licor社のレーザー蛍光ＤＮＡシークエンサーを用いて行われる（Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74:5463-5467）。
【０２６５】
実施例１：植物、病原体、及び接種
オオムギ品種ＩｎｇｒｉｄはPatrick Schweizer, Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung Gaterslebenに由来する。品種Pallas及び戻し交雑した系列BCIngrid-mlo5は、Lisa Munk, Department of Plant Pathology, Royal Veterinary and Agriculturai University, Kopenhagen, Daenemarkから提供された。この製造は記載されている（Kφlster P et al. (1986)Crop Sci 26: 903-907）。
【０２６６】
１２〜３６時間暗所において湿った濾紙上で催芽させた種子を、その他に記載がなければ、それぞれ５つの穀粒を四角のポット（８×８ｃｍ）の縁でＰ型のFruhstorfer土壌に配置し、土で覆い、規則的に水道水で水やりした。全ての植物は、人工気候棚又は人工気候室中で１６〜１８℃で、５０〜６０％の相対空気湿度で、かつ１６時間／８時間の明暗サイクルで、３０００又は５０００ルクス（５０又は６０μｍｏｌ−1ｍ−2光子束密度）を用いて５〜８日間の間生育させ、実生段階において試験において使用した。初生葉に対する適用を実施する実験では、これらを完全に発達させた。
【０２６７】
一過的なトランスフェクション実験の実施前に、前記植物を人工気候棚又は人工気候室中で、日中２４℃、夜間２０℃で、５０〜６０％の相対空気湿度で、かつ１６時間／８時間の明暗サイクルで、３００００ルクスを用いて生育させた。
【０２６８】
オオムギ植物の接種のために、オオムギうどんこ病ブルメリア・グラミニス（ＤＣ）Ｓｐｅｅｒ  ｆ．ｓｐ．ホルデイＥｍ（Blumeria graminis (DC) Speer f.sp. hordei Em）. Marchal品種A6 (Wiberg A (1974) Hereditas 77: 89-148)（ＢｇｈＡ６）を使用した。これはInstitut fuer Biometrie, JLU Gieｓｓenにより提供された。前記接種物の更なる生育を、人工気候室中で、前記植物に対して上記した条件と同じ条件で、被害を受けた植物材料の分生子の、規則的に生育させた７日間齢のオオムギ植物ｃｖ．Golden Promiseに対する移行を介して、１００分生子／ｍｍ2の密度で行った。
【０２６９】
ＢｇｈＡ６を用いた接種を７日間齢の実生の使用下で、既に被害を受けた植物の分生子の振り落としにより、約１００分生子／ｍｍ2を有する接種カラム中で行った（その他に記載がなければ）。
【０２７０】
実施例２：ＲＮＡ抽出
総ＲＮＡを８〜１０つの初生葉片（長さ５ｃｍ）から「ＲＮＡ抽出緩衝液」（ＡＧＳ、Heidelberg, Germany）を用いて抽出した。
【０２７１】
このために、５ｃｍの長さの中心の初生葉片を収穫し、液体窒素中で乳鉢中でホモジェナイズした。前記ホモジェナイズ物をＲＮＡ抽出まで−７０℃で保存した。
【０２７２】
この深冷凍結した葉材料を、ＲＮＡ抽出キット（AGS, Heidelberg）を用いて総ＲＮＡを抽出した。このために、深冷凍結した葉材料２００ｍｇを小遠心管（２ｍＬ）中で、１．７ｍＬのＲＮＡ抽出緩衝液（ＡＧＳ）で覆い、すぐさまよく撹拌した。２００μＬのクロロホルムの添加後、新たによく攪拌し、室温で４５分間水平振盪機で２００ｒｐmで振盪した。引き続き相分離のために１５分間２００００ｇ及び４℃で遠心分離し、この上方の水性を新規の小遠心管中に移し、下相を棄てた。３回１０秒間ホモジェナイズし、かつ新たに遠心分離（上記参照）し、そして取り除くことで、前記水相を新たに９００μLのクロロホルムを用いて洗浄した。このＲＮＡの沈殿のために、次いで８５０μＬの２−プロパノールを添加し、ホモジェナイズし、かつ３０〜６０分間氷上に配置した。これに引き続き、２０分間遠心分離（上記参照）し、注意してこの上清をデカンテーションし、２ｍＬの７０％エタノール（−２０℃）をここにピペット添加し、よく混合し、新たに１０分間遠心分離した。このペレットを清浄空気作業場で清浄空気流中で乾燥させる前に、前記上清を次いで再度デカンテーションし、前記ペレットを注意してピペットを用いて液体の残留物から取り除いた。この後で、このＲＮＡを５０μＬのＤＥＰＣ水中で氷上で溶解させ、よく混合し、５分間遠心分離した（上記参照）。４０μＬのこの上清をＲＮＡ溶液として新規の小遠心管中に移し、−７０℃で保存した。
【０２７３】
前記ＲＮＡの濃度を測光により決定した。このために、前記ＲＮＡ溶液１：９９（ｖ／ｖ）を蒸留水を用いて希釈し、この吸光度(Photometer DU 7400, Beckman)を２６０ｎｍで測定した（Ｅ260nm＝１、４０∝ｇＲＮＡ／ｍＬ）。計算したＲＮＡ含量に応じて、前記ＲＮＡ溶液の濃度を引き続きＤＥＰＣ水を用いて１μｇ／μＬに適合させ、アガロースゲル中で試験した。
【０２７４】
水平のアガロースゲル（１×ＭＯＰＳ緩衝液中の１％アガロース、０．２μｇ／ｍＬのエチジウムブロミドを有する）中の前記ＲＮＡ濃度の試験のために、１μＬのＲＮＡ溶液を１μＬの１０×ＭＯＰＳ、１μＬの染色マーカー、及び７μＬのＤＥＰＣ水と混合し、その規模に応じて１２０Ｖの電圧で、ゲル中で１×ＭＯＰＳ移動緩衝液において、１．５時間分離させ、ＵＶ光下で撮影した。ＲＮＡ抽出物の場合による濃度の相違は、ＤＥＰＣ水を用いて適合させ、この適応を新たにゲル中で試験した。
【０２７５】
実施例３：ＨｖＣＳＬ１  ｃＤＮＡ配列のオオムギからのクローニング
ＨｖＣＳＬ１  ｃＤＮＡの単離、そのクローニング、配列決定、及びプローブの製造のために必要であるｃＤＮＡ断片をＲＴ−ＰＣＲを用いて、「One Step RT-PCR Kit」（Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland又はQiagen, Hilden, Deutschland）の使用下で得た。このためにオオムギ−実生からの総ＲＮＡをテンプレートとして使用した。前記ＲＮＡはｃｖ．Ｉｎｇｒｉｄから発芽７日後に単離した。更に、ｃｖ．ＩｎｇｒｉｄからのＲＮＡ及びｍｌｏ５を用いて戻し交雑した系列をＢｇｈＡ６を用いた接種１、２、５日後、発芽日後に単離した。ＲＴ−ＰＣＲのために、以下のプライマーを使用した。
Ｈｅｉ１３１  ５’−ＧＴＴＣＧＣＣＧＴＴＴＣＣＴＣＣＣＧＣＡＡＣＴ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）
及び
Ｇｅｎｅ  Ｒａｃｅｒ  ５’−ネステッドプライマー，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
５’−ＧＧＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＡ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４１）。
【０２７６】
反応（２５μＬバッチ）のために、１×ＲＴ緩衝液中の、それぞれ１０００ｎｇの総ＲＮＡ、０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、それぞれ０．６ｍＭのＯＰＮ−１及びＯＰＮ−２プライマー、１０μＬのＲＮアーゼ阻害剤及び１μＬの酵素ミックス（one step RT-PCR Kit, Qiagen, Hilden）を使用した。
【０２７７】
以下の温度プログラムを使用した（PTC-100TM 96V型; MJ Research, Inc., Watertown, Massachussetts）：
１サイクル  ５０℃で３０分間
１サイクル  ９４℃で１５０秒間
３０サイクル  ９４℃で４５秒間、５５℃で１分間、及び７２℃で２分間、
１サイクル  ７２℃で７分間。
【０２７８】
このＰＣＲ産物を２％のｗ／ｖアガロースゲル電気泳動を用いて分離した。全体で２４９ｂｐのＲＴ−ＰＣＲ産物が得られた。この相応するｃＤＮＡをアガロースゲルから単離し、ｐＴＯＰＯベクター（Invitrogen Life Technologies社）中でＴオーバーハングライゲーションを用いてクローニングした。前記ｃＤＮＡを、プラスミドＤＮＡから出発して、「Thermo Sequenase Fluorescent Labeled Primer Cycle Sequencing Kit」(Amersham, Freiburg, Deutschland)の使用下で配列決定した。
【０２７９】
ＨｖＣＳＬ１のｃＤＮＡ配列を、ＲＡＣＥ技術を用いて「GeneRacer Kit」(INVITROGENE Life Technologies)の使用下で伸長した。このために１００ｎｇのポリＡ  ｍＲＮＡ、１μＬの１０×ＣＩＰ緩衝液、１０単位のＲＮアーゼ阻害剤、１０単位のＣＩＰ（「calf intestinal phosphatase」）及びＤＥＰＣ処理水を、この総体積１０μＬになるまで１時間５０℃で処理した。前記ＲＮＡの沈殿のために、更なる９０μＬのＤＥＰＣ水及び１００μＬのフェノール：クロロホルムを添加し、強力に約３０秒間混合した。５分間の２００００ｇでの遠心分離後に、この上相を２μＬの１０ｍｇ／ｍｌのイガイ類グリコーゲン、１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を用いて新規な微小反応容器中で混合した。２２０μｌの９５％エタノールを添加し、この混合物を氷上でインキュベーションした。引き続き前記ＲＮＡを遠心分離により２０分間２００００ｇ及び４℃で沈殿させた。この上清を捨て、５００μｌの７５％エタノールを添加し、短くボルテックスをかけ、かつ更に２分間遠心分離（２００００ｇ）した。この上清を再度捨て、この沈殿を２分間室温で空気乾燥させ、引き続き６μｌのＤＥＰＣ水中に懸濁した。ｍＲＮＡキャップ構造を、１μｌの１０×ＴＡＰ緩衝液、１０単位のＲＮＡｓｉｎ及び１単位のＴＡＰ（「tobacco acid pyrophosphatase」）の添加により除去した。この混合物を１時間、３７℃でインキュベーションし、引き続き氷上で冷却した。このＲＮＡを再度−上記したように−沈殿させ、０．２５μｇのＧｅｎｅＲａｃｅｒ  オリゴヌクレオチドプライマーを有する反応容器中に移した。前記オリゴヌクレオチドプライマーをＲＮＡ溶液中に再懸濁し、この混合物を５分間７０℃でインキュベーションし、次いで氷上で冷却した。１μｌの１０×リガーゼ緩衝液、１０ｍＭ  ＡＴＰ、１単位のＲＮＡｓｉｎ及び５単位のＴ４  ＲＮＡリガーゼを添加し、この反応バッチを１時間３７℃でインキュベーションした。このＲＮＡを再度−上記したように−沈殿させ、１３μｌのＤＥＰＣ水中に再懸濁した。１０ｐＭｏｌのオリゴ−ｄＴプライマーを前記ＲＮＡに添加し、すぐさま７０℃に熱し、再度氷上で冷却した。１μＬの各ｄＮＴＰ溶液（２５ｍＭ）、２μＬの１０×ＲＴ緩衝液、５ｕ（１μＬ）のＡＭＶリバース転写酵素及び２０単位のＲＮＡｓｉｎを添加し、この反応溶液を１時間４２℃で、引き続き１５分間８５℃でインキュベーションした。このように製造された第一鎖−ｃＤＮＡを−２０℃で保存した。
【０２８０】
この５’及び３’−ｃＤＮＡ末端の増幅のために以下のプライマーを使用した：
ＲＡＣＥ−ＨｖＣＳＬ１：
５’−ＧＣＣＣＡＡＣＡＴＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＡＣＣＡＡＣＣＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）
ＧｅｎｅＲａｃｅｒ  TM５’−プライマー：
５’−ＣＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＡ−３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）
ＧｅｎｅＲａｃｅｒ  TM５’−ネステッドプライマー：
５’−ＧＧＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＡ−３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）
ＲＡＣＥ−ＨｖＣＳＬ１−ネステッド：
５’−ＴＣＴＧＧＣＴＴＴＡＴＣＴＧＧＴＧＴＴＧＧＡＧＡＡＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）
ＧｅｎｅＲａｃｅｒ  TM３’−プライマー：
５’−ＧＣＴＧＴＣＡＡＣＧＡＴＡＣＧＣＴＡＣＧＴＡＡＣＧ−３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）
ＧｅｎｅＲａｃｅｒ  TM３’−ネステッドプライマー：
５’−ＣＧＣＴＡＣＧＴＡＡＣＧＧＣＡＴＧＡＣＡＧＴＧ−３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）
このバッチ（総体積２５μＬ）は以下の組成を有した：
１μｌ  プライマー  ＲＡＣＥ−ＨｖＣＳＬ１（５ｐｍｏｌ／μＬ）、
０．５μｌ  ＧｅｎｅＲａｃｅｒ  ５’−プライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ）
２．５μｌ  １０ｘ緩衝液（Qiagen）、
２．５μｌ  ｄＮＴＰｓ（２ｍＭ）
０．５μｌ  ｃＤＮＡ
０．２μｌ  ＱｉａｇｅｎＴＡＧ（５ｕ／μＬ）
１７．８μｌ  Ｈ２Ｏ。
【０２８１】
このＰＣＲ条件は以下のとおりである：
９４℃  ５分間  変性
５サイクル  ７０℃  ３０秒間（アニーリング）、
７２℃  １分間（伸長）、
９４℃  ３０秒間（変性）
５サイクル  ６８℃  ３０秒間（アニーリング）、
７２℃  １分間（伸長）、
９４℃  ３０秒間（変性）
２８サイクル  ６６℃  ３０秒間（アニーリング）、
７２℃  １分間（伸長）、
９４℃  ３０秒間（変性）
７２℃  １０分間  引き続く伸長
更なる処置まで４℃の冷却。
【０２８２】
前記ＰＣＲは、約４００ｂｐの生成物の産物を生じた。ここから出発して、「ネステッド」ＰＣＲをＨｖＣＳＬ１特異的なオリゴヌクレオチドプライマー及び「GeneRacerネステッド５’−プライマー」を用いて実施した。
【０２８３】
９４℃  ５分間  変性
３０サイクル  ６４℃  ３０秒間（アニーリング）、
７２℃  １分間（伸長）、
９４℃  ３０秒間（変性）
７２℃  １０分間  引き続く伸長
更なる処置まで４℃の冷却
この得られたＰＣＲ産物をゲルを介して単離し、前記ゲルから抽出し、かつｐＴＯＰＯ中でＴ−オーバーハング−ライゲーションを用いてクローニング及び配列決定した。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のもとで描写された配列はまた、オオムギからのＨｖＣＳＬ１配列と同一であった。
【０２８４】
実施例４：定量的なポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）
オオムギｃｖ．Ｉｎｇｒｉｄの葉材料を発芽後７日間、無毒生のうどんこ病菌類、ブルメリア・グラミニスｆ．ｓｐ．トリティキ（Blumeria graminis f. sp. tritici）並びに毒性のうどんこ病菌類、ブルメリア・グラミニスｆ．ｓｐ．ホルデイ（Blumeria graminis f. sp. hordei）の分生胞子を用いた接種０、２４又は４８時間後に、この相互作用からの葉材料を収穫した。加えて、同じ時間点に非感染材料を対照として収穫した。
【０２８５】
この収穫した葉材料をアルミニウムホイル中に包み、すぐさま液体Ｎ2中で深冷凍結した。この保存を−８０℃で実施した。前記葉材料の破砕後、このＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ(R)（ＱＩＡＧＥＮ社（Ｈｉｌｄｅｎ））を用いて製造者指示に従い単離した。この溶出を１．２ｍｌのＲＮアーゼ不含水を用いて行った。引き続きこのＲＮＡを沈殿させ、相応する体積のＨ2Ｏ中に取り込ませた。このＲＮＡ濃度をEppendorf BioPhotometer 6131を用いて決定した。
【０２８６】
表１：オオムギの総ＲＮＡの濃度 
【表２】
2007536918.tif 000003
【０２８７】
【表３】
2007536918.tif 000004
【０２８８】
定量的なＰＣＲのために表１からのＲＮＡ試料を使用した。この個々のＲＮＡ試料のうち、まず場合によりまだなお存在するＤＮＡを消化させた。前記消化を、AMBION社(Huntingdon, USA)のDNA-free(R)を用いて以下のように設定した：
総体積        ６０μｌ
ＲＮＡ        ５０μｌ
１０×ＤＮアーゼＩ緩衝液        ６μｌ
ＤＮアーゼＩ（２Ｕ／μｌ）        １μｌ
Ｈ2Ｏ  ６０μｌに適合させて        ３μｌ
このバッチを６０分間３７℃でインキュベーションした。引き続き６μｌのＤＮアーゼ不活性化試薬を添加し、このバッチをよく混合した。２分間の更なるインキュベーション時間後に、室温で、この溶液を１００００ｇで１分間、このＤＮアーゼ不活性化試薬をペレット化するために遠心分離した。このＲＮＡを新規の容器中に移し、−２０℃で保存した。
【０２８９】
この消化後に、前記ＲＮＡをＤＮＡに転写させた。このアプローチは、製造者指示から逸脱して、APPLIED BIOSYSTEMS社のTaq Man Reverse Transcription Reagents (Applera Deutschland GmbH, Darmstadt)を用いて行われた：
総体積  ２０μｌ
ＲＮＡ  ３μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2  ４．４μｌ
ｄＮＴＰ−ミックス（１０ｍＭ）  ４μｌ
５０μＭ  ランダムヘキサマー  １μｌ
１０×  ＲＴ緩衝液  ２μｌ
Ｒｎアーゼ阻害剤  ０．４μｌ
Multiscribe  ＲＴ（５０Ｕ／μｌ）  １．５μｌ
Ｈ2Ｏ（ヌクレアーゼ不含）  ３．７μｌ。
【０２９０】
前記バッチを１０分間２５℃でインキュベーションし、引き続きインキュベーションを３７℃で６０分間行った。引き続き、前記バッチを５分間９５℃で加熱不活性化した。
【０２９１】
この転写されたＤＮＡのうち、そのつど３μｌを定量的なＰＣＲのために使用した。内部標標準として１８Ｓ  ｒＲＮＡを共に決定した。全ての試料に、三回の測定を実施した。前記バッチを９６ウェルプレート中にピペット添加した。まず、SYBR Green(R)Master Mixをこのプライマー及びこの相応する量の水と共に装入し、次いで前記ＤＮＡを個々にここにピペット添加し、このバッチを混合した。
【０２９２】
総体積  ２５μｌ
ｃＤＮＡ  ３μｌ
２×SYBR Green(R)Master Mix  １２．５μｌ
フォワードプライマー、２００ｎＭ  ｘμｌ
リバースプライマー、２００ｎＭ  ｘμｌ
Ｈ2Ｏ（ヌクレアーゼ不含）  ２５μｌに適合させて      ｘμｌ
表２：オオムギに対するＱＰＣＲプライマー。
【０２９３】
【表４】
2007536918.tif 000005
【０２９４】
前記プライマーをAPPLIED BIOSYSTEMS (Applera Deutschland GmbH, Darmstadt)によるProgramms Primer Expressを用いてＥＳＴ配列から探索した。
【０２９５】
前記プレートを室温及び２５００ｒｐｍ（遠心機、4K15C, SIGMA, Osterode）で、１分間遠心分離し、この後に前記試料を直接的に測定した。定量的なＰＣＲのために、APPLIED BIOSYSTEMS社の装置ABI PRISM 7000（(Applera Deutschland GmbH, Darmstadt)）を使用した。この評価を、APPLIED BIOSYSTEMS社(Applera Deutschland GmbH, Darmstadt)のプログラムABI PRISM 7000 SDSを用いて行った。
【０２９６】
表３には、ＨｃＣＳＬ１の発現データを示した。この測定を二回実施し、個々の測定値の三回の決定を行った。そのつどの平均値及び前記平均値に属する標準偏差を示した。
【０２９７】
表３：ＨｖＣＳＬ１の発現データ
【表５】
2007536918.tif 000006
【０２９８】
【表６】
2007536918.tif 000007
【０２９９】
そのつど３回の決定を用いた二回の測定から構成されるＨｖＧＳｌ１の発現データを示した。使用したＲＮＡをＤＮＡ消化させ、次いでTaq Man Reverse Transcription Reagentsを用いてＤＮＡに転写させた。内在性の対照として、この測定の際に１８Ｓ  ｒＲＮＡを用いた。比較値又は標準物質として、それぞれの相互作用のために、測定の０時間の値を用いた。
【０３００】
前記データは、ＨｖＣＳＬ１の和合性因子としての役割と合致して、ブルメリア・グラミニスｆ．ｓｐ．ホルデイとの和合性（Ｋｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔａｅｔ）の相互作用における前記発現が、ブルメリア・グラミニスｆ．ｓｐ．トリティキとの非和合性の相互作用と比較して、強力に向上していることを示す。
【０３０１】
実施例５：ノーザンブロット分析
ノーザンブロッティングの準備のために前記ＲＮＡをアガロースゲル中で変性条件下で分離した。ＲＮＡ溶液の部分（５μｇのＲＮＡに相応）をこのために、同じ体積の試料緩衝液（エチジウムブロミドを有する）と混合し、５分間９４℃で変性させ、５分間氷上に配置し、短期間遠心分離し、前記ゲル上に設けた。１×ＭＯＰＳ−ゲル（１．５％  アガロース超純粋）は、５体積％の濃縮したホルムアルデヒド溶液（３６．５％［ｖ／ｖ］）を含有した。前記ＲＮＡを１００Ｖで２時間分離させ、引き続きブロッティングした。
【０３０２】
ノーザンブロッティングを、毛細管流中で上方に指向したＲＮＡ移動として行った。このゲルをこのために、まず３０分間２５ｍＭのリン酸水素／二水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中で振盪し、かつ適した形に切断した。ワットマン紙を、水平なプレート上に置き、かつ２つの側で２２５ｍＭのリン酸水素／二水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を有する水槽中から突出するようにに準備した。この紙に対してゲルを置き、その際ワットマン紙の覆われていない部分はプラスチックシートで覆った。前記ゲルを次いで、正に帯電したナイロン膜（Boehringer-Mannheim）で空気の泡のないように覆い、この後で前記膜を再度、吸収性紙を用いて複数の層において５ｃｍの高さに覆った。前記吸収性紙に再度、ガラスプレート及び１００ｇの重しを負荷した。このブロッティングを一晩室温で行った。前記膜を短期間二回蒸留した水中で振盪させ、ＲＮＡ固定のために光エネルギー１２５ｍＪを用いてCrosslinker (Biorad)ＵＶ光中で放射した。前記膜に対するこの均一なＲＮＡ転写の確認をＵＶ光ベンチで行った。
【０３０３】
オオムギｍＲＮＡの検出のために１０μｇの総ＲＮＡをそれぞれの試料からアガロースゲルを介して分離し、毛細管移行を用いて正に帯電したナイロン膜に対してブロッティングした。この検出をＤＩＧ系を用いて行った。
【０３０４】
プローブの製造：検出すべきｍＲＮＡｓとのハイブリダイゼーションのために、ジゴギゲニン又はフルオレセイン標識したＲＮＡプローブを製造した。これは、標識したＵＴＰｓを用いて、Ｔ７又はＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ産物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を介して作成された。上記したプラスミドベクターをＰＣＲ支持された増幅のためのひな型として用いた。
【０３０５】
挿入の方向に応じて、相違するＲＮＡポリメラーゼがアンチセンス鎖の製造のために考慮され、前記ポリメラーゼはＴ７−ＲＮＡポリメラーゼ又はＳＰ６−ＲＮＡポリメラーゼである。
【０３０６】
個々のベクターの挿入を、ＰＣＲを介して隣接する標準プライマー（Ｍ１３ｆｗｄ及びｒｅｖ）を用いて増幅した。この反応はこの際、以下の終濃度でもって、総体積５０μｌのＰＣＲ緩衝液（Silverstar）中で行われた：
Ｍ１３−ｆｗｄ：５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）
Ｍ１３−Ｒｅｖ：５’−ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）。
【０３０７】
１０％  ジメチルスルホキシド（ｖ／ｖ）
それぞれ２ｎｇ／μｌのプライマー（Ｍ１３フォワード及びリバース）
１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、
４単位  Ｔａｑ−ポリメラーゼ（Silverstar）、
２ｎｇ／μＬ  プラスミドＤＮＡ。
【０３０８】
前記増幅は、Thermocycler (Perkin-Elmar 2400)中で温度制御して進行した：
９４℃  ３分間  変性
３０サイクル  ９４℃  ３０秒間（変性）
５８℃  ３０秒間（アニーリング）、
７２℃  １．２分間（伸長）、
７２℃  ５分間、引き続く伸長
更なる処置まで４℃での冷却。
【０３０９】
前記反応の成功を１％のアガロースゲル中で確かめた。この産物を引き続き「High Pure PCR-Product Purification Kit」(Boehringer-Mannheim)を用いて精製した。約４０μｌのカラム溶出物を得、これを新たにゲル中で検査し、−２０℃で保存した。
【０３１０】
ＲＮＡ重合、ハイブリダイゼーション、及び免疫検出を更に、非放射性ＲＮＡ検出のためにキットの製造者の指示に従い実施した（DIG System User’s Guide, DIG-Luminescence detection Kit, Boehringer-Mannheim, Kogel et al. (1994) Plant Physiol 106:1264-1277）。４μｌの精製ＰＣＲ産物を２μｌの転写緩衝液、２μｌのＮＴＰ標識ミックス、２μｌ−ＮＴＰ−ミックス及び１０μｌのＤＥＰＣ水と混合した。引き続き２μｌのＴ７−ＲＮＡ−ポリメラーゼ溶液をピペット添加した。この反応を次いで、２時間３７℃で実施し、引き続きＤＥＰＣ水で１００μｌに満たした。前記ＲＮＡプローブをエチジウムブロミドゲル中で検出し、−２０℃  で保存した。
【０３１１】
ハイブリダイゼーションの準備のために、膜をまず１時間６８℃で、２×ＳＳＣ（塩、クエン酸ナトリウム）、０．１％のＳＤＳ緩衝液（ドデシル硫酸ナトリウム）中で振盪し、その際前記緩衝液を２〜３回新しくした。前記膜を引き続き、６８℃に予備加熱したハイブリダイゼーション管の内壁に配置し、３０分間１０ｍＬのDig-Easy-ハイブリダイゼーション緩衝液を用いて予備加熱したハイブリダイゼーションオーブン中でインキュベーションした。この間に１０μｌのプローブ溶液を８０μｌのハイブリダイゼーション緩衝液中で９４℃で５分間変性させ、引き続き氷上に配置し、短期間遠心分離した。ハイブリダイゼーションのために、前記プローブを次いで１０ｍｌの６８℃の加温したハイブリダイゼーション緩衝液中に移し、前記緩衝液をハイブリダイゼーション管中で前記プローブ緩衝液により置換した。前記ハイブリダイゼーションを次いで同様に６８℃で一晩実施した。
【０３１２】
ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの免疫検出の前に、このブロットをストリンジェントに二回、そのつど２０分間０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣ中で６８℃で洗浄した。
【０３１３】
免疫検出のために、前記ブロットをまず二回、５分間室温で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で振盪した。引き続き、二回のストリンジェントな洗浄工程を６８℃で、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で、それぞれ１５分間行った。この溶液を引き続きＴｗｅｅｎなしの洗浄緩衝液により置換した。１分間振盪させ、前記溶液をブロッキング試薬により交換した。更なる３０分間の振盪後に、１０μｌの抗−フルオレセイン−抗体溶液を添加し、更なる６０分間振盪した。Ｔｗｅｅｎ有りの洗浄緩衝液中での二回の１５分間の洗浄工程が引き続いた。前記膜を引き続き２分間基質緩衝液中で平衡化させ、水切り後に複写シートに移行させた。前記膜の「ＲＮＡ側」に次いで、２０μｌのＣＤＰ−ＳｔａｒTM及び２ｍｌの基質緩衝液からなる混合物を均質に分配した。引き続き、前記膜を第２の複写シートで覆い、この縁で熱を用いて空気の泡なしにかつ水密に溶接した。前記膜を次いで暗室中で１０分間Ｘ線フィルムを用いて覆い、これを引き続き現像した。このルミネセンス反応の強度に応じて照射時間を変更させた。
【０３１４】
特別に特徴付けられていない場合には、前記溶液はキットの供給範囲に含有されている（DIG-Luminescence detection Kit, Boehringer-Mannheim）。その他全ては、以下のストック溶液から、オートクレーブした蒸留水を用いた希釈を介して製造される。全てのストック溶液は、その他に特定されていない場合には、ＤＥＰＣ（例えばＤＥＰＣ水）を用いて設定され、引き続きオートクレーブされる。
【０３１５】
−ＤＥＰＣ水：蒸留水を一晩３７℃でジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ、０．１％、ｗ／ｖ）を用いて処理及び引き続きオートクレーブ、
−１０×ＭＯＰＳ−緩衝液：０．２Ｍ  ＭＯＰＳ（モルホリン−３−プロパンスルホン酸）、０．０５Ｍ  酢酸ナトリウム、０．０１  ＥＤＴＡ、ｐＨを１０Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨ７．０に調整、
−２０×ＳＳＣ（塩化ナトリウム−クエン酸ナトリウム、Salt-Sodiumcitrate）：３Ｍ  ＮａＣｌｏ、０．３Ｍ  クエン酸三ナトリウム×２Ｈ2Ｏ、ｐＨを４Ｍ  ＨＣｌを用いてｐＨ７．０に調整、
−１％  ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム、Sodiumdodecylsulfate）ドデシル硫酸ナトリウム（ｗ／ｖ）、ＤＥＰＣなし、
−ＲＮＡ試料緩衝液：７６０∝L  ホルムアミド、２６０μｌホルムアルデヒド、１００μｌ  エチジウムブロミド（１０ｍｇ／ｍｌ）、８０μｌ  グリセロール、８０μｌ  ブロモフェノールブルー（飽和）、１６０μｌ  １０×ＭＯＰＳ、１００μｌ  水。
−１０×Ｔｗｅｅｎなし洗浄緩衝液：１．０Ｍ  マレイン酸、１．５Ｍ  ＮａＣｌ；ＤＥＰＣなし、ＮａＯＨ（固体、約７７ｇ）及び１０Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨ７．５に調整。
−Ｔｗｅｅｎ有りの洗浄緩衝液：Ｔｗｅｅｎなしの洗浄緩衝液から、Ｔｗｅｅｎ（０，３％  ｖ／ｖ）を用いて。
−１０×ブロッキング試薬：５０ｇのブロッキング粉末（Boehringer-Mannheim）を５００ｍｌの洗浄緩衝液中に、Ｔｗｅｅｎなしで懸濁。
−基質緩衝液：１００ｍＭ  トリス（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４Ｍ  ＨＣｌを用いてｐＨ９．５に調整。
−１０×染色標識：５０％  グリセロール（ｖ／ｖ）、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、０．２５％ブロモフェノールブルー（ｗ／ｖ）、０．２５％キシレンシアノール（ｗ／ｖ）。
【０３１６】
実施例６：ＨｖＣＳＬ１−ｄｓＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写において使用される全てのプラスミドは、挿入した核酸配列のそのつどの末端にＴ７及びＳＰ６プロモーターを含有し（pGEM-T, Promega）、これはセンスＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡの合成を可能にする。前記プラスミドを適した制限酵素を用いて、挿入した核酸の正確な転写を保証し、かつベクター配列における読み過しを妨げるために線形化した。
【０３１７】
このために、１０μｇのプラスミド−ＤＮＡをそれぞれ、プロモーターから遠位に配置した、挿入の側で切断した。この切断プラスミドを２００μｌの水中で同じ体積のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを用いて抽出し、新規のエッペンドルフ容器（ＲＮアーゼ不含）中に移し、５分間２００００ｇで遠心分離した。１８０μｌのプラスミド溶液を４２０μｌのエタノールと混合し、氷上に配置し、引き続き３０分間の２００００ｇ及び−４℃での遠心により沈殿させた。前記沈殿物を１０μｌのＴＥ緩衝液中に取り込ませた。
【０３１８】
ＨｖＣＳＬ１−ｄｓＲＮＡの製造のためにプラスミドｐＴＯＰＯ−ＨｖＣＳＬ１をＳｐｅｌで消化させ、センスＲＮＡをＴ７−ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写させた。更に、ｐＴＯＰＯ−ＨｖＣＳＬ１をＮｃｏｌを用いて消化させ、アンチセンス−ＲＮＡをＳＰ６−ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写させた。ＲＮＡポリメラーゼをRoche Molecular Biology, Mannheim, Deutschlandから得た。
【０３１９】
それぞれの転写バッチは４０μｌの体積において以下を含んだ：
２μｌ  線形化プラスミドＤＮＡ（１μｇ）
２μｌ  ＮＴＰ’ｓ（２５ｍＭ）（各ＮＴＰ、１．２５ｍＭ）
４μｌ  １０×反応緩衝液（Roche Molecular Biology）
１μｌ  ＲＮＡｓｉｎ  ＲＮＡｓｉｎ（２７単位; Roche Molecular Biology）
２μｌ  ＲＮＡポリメラーゼ（４０単位）
２９μｌ  ＤＥＰＣ水。
【０３２０】
２時間３７℃でのインキュベーション後、「センス」鎖又は「アンチセンス」鎖の転写からの反応バッチの一部をそれぞれ混合し、５分間９５℃で変性させ、引き続き３０分間の終温度３７℃への冷却を介して相互にハイブリダイゼーションさせた（「アニーリング」）。又は、この変性後に、センス鎖及びアンチセンス鎖からの前記混合物を３０分間−２０℃で冷却してよい。変性及びハイブリダイゼーションの間に形成されるこのタンパク質沈殿物を、２０８００ｇの短い遠心により分離させ、この上清を直接的にタングステン粒子の被覆のために使用した（下記参照）。分析のために、そのつど１μｌの各ＲＮＡ鎖及びｄｓＲＮＡの鎖を、非変性性のアガロースゲル上で分離した。成功したハイブリダイゼーションは、単鎖と比較してより高分子量へのバンドシフトにより示される。
【０３２１】
４μｌのｄｓＲＮＡをエタノール沈殿させ（６μｌの水、１μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム溶液、及び２５μｌエタノールの添加、並びに少なくとも５分間、２００００ｇ及び４℃での遠心分離により）、５００μｌの水中に再懸濁した。前記ｄｓＲＮＡの純度及び濃度を決定するために、この吸収スペクトルを２３０ｎｍと３００ｎｍとの間で測定し、又はこの吸収を２８０ｎｍ及び２６０ｎｍで決定した。通常は、８０〜１００μｇのｄｓＲＮＡが、１．８０〜１．９５のＯＤ260／ＯＤ280比でもって得られる。ＤＮアーゼＩを用いた消化は、選択的に実施してよく、しかしながら以下の結果は実質的に影響されない。
【０３２２】
対照ｄｓＲＮＡとして、ヒトの甲状腺レセプターのｄｓＲＮＡ（出発ベクター  ｐＴ７ベータＳａｌ(Norman C et al. (1988) Cell 55(6):989-1003);この挿入の配列はGenBank Acc.-No.: NM_000461に記載）が供される。センスＲＮＡの製造のためにＰｖｕＩＩ、アンチセンスＲＮＡのためにＨｉｎｄＩＩＩでプラスミドを消化し、このＲＮＡを次いでＴ７ＲＮＡポリメラーゼ又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写した。対照−ｄｓＲＮＡの製造のためのこの個々の方法工程は、ＨｖＣＳＬ１−ｄｓＲＮＡに対して上述した方法工程と同様に実施される。
【０３２３】
実施例７：一過的な形質転換、ＲＮＡｉ及び菌類病原体の発達の評価
オオムギｃｖ．Ｉｎｇｒｉｄ葉切片を、ＨｖＣＳＬ１−ｄｓＲＮＡでもってＧＦＰ−発現ベクターを用いて形質転換した。引き続き前記葉をＢｇｈを用いて接種し、この結果を４８時間後に光学顕微鏡及び蛍光顕微鏡を用いて分析した。ＧＦＰ発現性細胞への浸透を生細胞中の吸器の検出を用いて、かつこの細胞中での菌類発達の評価により判断した。全部で６つの実験において、オオムギｃｖ．ＩｎｇｒｉｄのＨｖＣＳＬ１−ｄｓＲＮＡを用いた撃ち込みが、外来性の対照−ｄｓＲＮＡ（ヒトの甲状腺レセプターのｄｓＲＮＡ、ＴＲ）により撃ち込まれた細胞と比較して、成功してＢｇｈにより浸透される細胞の減少した数を生じた。前記ＨｖＣＳＬ１−ｄｓＲＮＡの耐性誘導性の効果は、少なくとも２０％のＢｇｈによる浸透効率の平均的な減少を引き起こした。
【０３２４】
一過的な形質転換のための方法が使用され、前記方法は既に、オオムギ葉の表皮細胞中へのｄｓＲＮＡの微粒子銃による挿入のために記載されている（Schweizer P et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:647-54; Schweizer P et al. (2000) Plant J 2000 24: 895-903）。直径１．１μｍを有するタングステン粒子（粒子密度２５ｍｇ／ｍｌ）を、ｄｓＲＮＡ（上記のとおり製造）で、形質転換標識としてベクターｐＧＦＰ（ｐＵＢＩプロモーターの制御下のＧＦＰ）のプラスミドＤＮＡと共に被覆した。このために、一ショット当たり、以下の量のｄｓＲＮＡ又はリポータープラスミドを被覆のために使用した：１μｇ  ｐＧＦＰ及び２μｇ  ｄｓＲＮＡ。二本鎖ＲＢＡを「センス」ＲＮＡ及び「アンチセンス」ＲＮＡの溶融を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成した（上記参照）。
【０３２５】
ミクロキャリアの調製のために５５ｍｇのタングステン粒子（Ｍ１７、直径１，１μｍ；Bio-Rad, Muenchen）を１ｍｌのオートクレーブした蒸留水で二回及び１ｍｌの無水エタノールで一回洗浄し、乾燥させ、１ｍｌの５０％グリセリン中に取り込ませた（約５０ｍｇ／ｍｌ  ストック溶液）。前記溶液を５０％のグリセリンを用いて２５ｍｇ／ｍｌに希釈し、使用前によく混合し、超音波浴中で懸濁した。ミクロキャリア被覆のために、一ショットにつき１μｇのプラスミド、２μｇのｄｓＲＮＡ（１μｌ）、１２．５μｌのタングステン粒子懸濁液（２５ｍｇ／ｍｌ）、１２．５μｌの１Ｍ  Ｃａ（ＮＯ3）2溶液（ｐＨ１０．０）を滴加により一定の撹拌下で一緒に添加し、１０分間室温で放置し、短期間遠心分離し、２０μｌを上清から除去した。この残留物をタングステン粒子と再懸濁し（超音波浴）、及び実験において使用した。
【０３２６】
オオムギの初生葉の約４ｃｍの長さの切片を使用した。この組織をペトリシャーレ（直径６．５ｃｍ）中の２０μｇ／ｍｌのベンズイミダゾールを有する０．５％のPhytagar(GibcoBRLTM Life TechnologiesTM ,Karlsruhe)に装入し、粒子の砲撃前に直接的に、この縁で２．２ｃｍ×２．３ｃｍの長方形の開口部を有する型紙を用いて覆った。前記シャーレを相次いで真空チャンバー（Schweizer P et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:647-54）の床に配置し、この上にはディフューザーであるナイロンネット（メッシュサイズ０．２ｍｍ、Millipore, Eschborn）を穴あき板（前記床上５ｃｍ、マクロキャリアの１１ｃｍ上方、以下参照）上に、粒子塊を分散させかつ前記粒子流を減速すべく挿入した。前記チャンバーの上部に取り付けたマクロキャリア（プラスチック滅菌フィルタホルダー、１３ｍｍ、Gelman Sciences, Swinney, UK）を、ショット毎に５．８μｌのＤＮＡ被覆したタングステン粒子（ミクロキャリア、以下参照）で負荷した。膜真空ポンプ（Vacuubrand, Wertheim）を用いて、この圧力を０．９バールだけ前記チャンバー中で減少させ、このタングステン粒子を９バールのヘリウム気体圧力を用いて、前記植物組織の表面に撃ち込んだ。この後直ぐに、前記チャンバーを換気した。形質転換した細胞のラベル化のために、前記葉にプラスミド（pGFP;Schweizer P et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:647-54; Dr. P. Schweizer Schweizer P, Institut fuer Pflanzengenetik IPK, Gatersleben, Deutschlandにより提供）と共に撃ち込んだ。その他のプラスミドのショット前に前記マクロキャリアをそのつど念入りに水を用いて洗浄した。ショット後４時間のインキュベーション後に、わずかに開放できるペトリシャーレ、室温及び陽光を用いて、前記葉を真性オオムギうどんこ病菌（品種  Ａ６）の１００つの分生子／ｍｍ2を用いて接種し、更なる４０３６〜４８時間同じ条件下でインキュベーションした。
【０３２７】
葉切片を、被覆した粒子を用いて「particle inflow gun」の使用下で撃ち込んだ。ショット毎に、３１２μｇのタングステン粒子を適用した。前記撃ち込みの４時間後に、ブルメリア・グラミニス  ｆ．ｓｐ．ホルデイうどんこ病（品種Ａ６）を用いた接種で接種し、更なる４０時間、感染前兆に関して評価した。この結果（例えば、浸透効率（攻撃された細胞のパーセント割合として定義され、前記細胞は成熟した吸器及び二次性菌糸「secondary elongating hyphae」を有する））を、蛍光及び光学顕微鏡を用いて分析した。１００つの分生子／ｍｍ2での接種は、約５０％の形質転換細胞の攻撃頻度を生じた。それぞれの個々の実験のために、最低限の数の１００個の相互作用部位を評価した。形質転換（ＧＦＰ発現性）細胞を、青色光での励起下で同定した。形質転換細胞のうち３つの相違する分類が区別されてよい：
１．容易に認識可能である吸器を含む浸透した細胞。１つ以上の吸器を有する細胞は１つの細胞として評価される。
２．真菌−付着器により攻撃されるが、吸器を含まない細胞。複数のＢｇｈにより攻撃されるが吸器を含有しない細胞は、１つの細胞として評価される。
３．Ｂｇｈにより攻撃されない細胞。
【０３２８】
気孔細胞及び気孔助細胞は評価前に除外される。Ｂｇｈの表面構造は、光学顕微鏡又は３０秒間の０．１％のＣａｌｃｏｆｌｕｏｒ（ｗ／ｖ、水中で）を用いた前記菌類の蛍光染色を用いて分析された。前記菌類の発達は容易に、蛍光顕微鏡により、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒでの染色により評価できる。ＨｖＣＳＬ１−ｄｓＲＮＡ形質転換細胞において、前記菌類は確かに一次性及び付着器の発芽管（「Ｇｅｒｍ−Ｔｕｂｅ」）を発達させるが、しかしながら吸器は発達させなかった。吸器形成は、二次性菌糸の形成のための前提条件である。
【０３２９】
相対浸透効率（ＲＰＥ）を、形質転換細胞（ＨｃＣＳＬ１−ｄｓＲＮＡ又は対照−ｄｓＲＮＡを用いた形質転換）での浸透効率及び非形質転換細胞での浸透効率（平均的な浸透効率５０〜６０％）からの差として算出した。パーセントのＲＰＥ（％−ＲＰＥ）を、ＲＰＥ−１から、１００倍して算出した。
【０３３０】
【表７】
2007536918.tif 000008
【０３３１】
この％−ＲＰＥ値（対照の平均の浸透効率からの逸脱）を、ＨｖＣＳＬ１−ｄｓＲＮＡトランスフェクトした細胞の抵抗性の決定に用いた。
【０３３２】
対照−ｄｓＲＮＡでは、５つの独立した試験の際には、対照ｄｓＲＮＡ及び水を用いたトランスフェクションの間には、Ｂｇｈの浸透効率に関して観察されなかった。
【配列表】
2007536918000001.app
【国際調査報告】
2007536918.tif 000009
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