(57)【要約】二重特異性結合剤の生物学的性質および薬学的性質を高める方法が本明細書に記載され、ここでこの二重特異性結合剤は、顕著な生物効果を誘発しない第１の細胞表面マーカーに対する高親和性結合ドメインと、第２の細胞表面マーカーに特異的に結合する低親和性結合ドメインとによって細胞を標的にし、顕著でかつ所望の生物効果を生じることができる。また、このような二重特異性結合剤の組成物、その使用、およびそれを備えるキットも提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重特異性結合剤を用いて標的細胞の生物活性を調節する方法であって、該二重特異性結合剤は、
（ｉ）該細胞の表面の第１の標的分子に対して少なくとも１０−７ＭのＫｄを有する第１の結合ドメインと、該細胞の表面の第２の標的分子に対して親和性を有する第２の結合ドメインとを有し、
（ｉｉ）該第２の標的分子が該第１の標的分子と異なり、
（ｉｉｉ）該第２の標的分子に対する該第２の結合ドメインの親和性が、該第１の標的分子に対する該第１の結合ドメインのＫｄよりも少なくとも１０倍小さく、そして
（ｉｖ）さらに、該第１の結合ドメインの標的分子がＥｒｂＢ２である場合には、該第２の結合ドメインの標的分子がＥｒｂＢ３ではなく、該方法は、
該二重特異性結合剤を標的細胞と、該第１の結合ドメインおよび該第２の結合ドメインがそれぞれ該第１の標的分子および該第２の標的分子に結合することを可能にする条件下で接触させる工程を包含し、
ここで該第２の標的分子に対する該第２の結合ドメインの結合が、該第２の標的分子の生物活性を調節し、それによって該標的細胞の生物活性を調節し、そしてさらに該第１の標的分子に対する該第１の結合ドメインの結合は該標的細胞の生物活性を調節しない、方法。
【請求項２】
前記二重特異性結合剤が２つの抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体がダイアボディ、直接結合されているかまたはリンカーによって結合されている２個の一本鎖Ｆｖ、ジスルフィド安定化Ｆｖ、あるいはこれらの組み合わせである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記標的細胞が癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の標的分子が腫瘍関連抗原、サイトカインレセプター、または増殖因子レセプターである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記腫瘍関連抗原がＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、およびＭＡＧＥ−１からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の標的分子が癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＬｅｗｉｓＹ、ＭＵＣ−１、ＥｐＣＡＭ、ＣＡ１２５、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、およびＴＡＧ７２からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第２の標的分子がＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＦＧＦレセプター１〜ＦＧＦレセプター４のいずれか、ＨＧＦレセプター、ＩＧＦ１−Ｒ、ＰＤＧＦ、レセプターαおよびレセプターβ、ならびにＣ−ＫＩＴからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記標的細胞が乳癌細胞であり、前記標的分子が上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）およびＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）からなる群より選択されるレセプターチロシンキナーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の標的分子に対する前記第１の結合ドメインのＫｄが１０−８〜１０−１２Ｍの間である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の標的分子に対する前記第２の結合ドメインのＫｄが、前記第１の標的分子に対する前記第１の結合ドメインのＫｄよりも少なくとも２０倍小さい、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
標的細胞と非標的細胞とを有する生物中の標的細胞上の標的分子の生物活性を調節する方法であって、ここで、標的細胞がその外面に第１の標的分子を有しかつその外面に第２の標的分子を有し、そして、
（ｉ）該第１の標的分子および該第２の標的分子が共通リガンドを共有せず、
（ｉｉ）該第１の標的分子が、該第２の標的分子も有する非標的細胞よりも標的細胞の表面に少なくとも１０倍以上豊富であり、
（ｉｉｉ）該第２の標的分子が生物活性を有するが、前記第１の標的分子が生物活性を有さず、そして
（ｉｖ）該第１の結合ドメインの標的分子がＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）である場合には、該第２の結合ドメインに対する標的分子がＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）ではなく、該方法は、
該第１の標的分子に対して少なくとも１０−７Ｍの解離定数（Ｋｄ）を有する第１の結合ドメインと、該第２の標的分子に対して該第１の結合ドメインのＫｄよりも少なくとも１０倍小さいＫｄを有する第２の結合ドメインとを有する二重特異性結合剤を使用する工程、ならびに
該二重特異性結合剤を標的細胞と、該第１の結合ドメインおよび該第２の結合ドメインがそれぞれ該第１の標的分子および該第２の標的分子に結合することを可能にする条件下で接触させる工程を包含し、
ここで該第２の結合ドメインの結合が該標的細胞上の該第２の標的分子の生物活性を調節する、方法。
【請求項１３】
前記二重特異性結合剤が２つの抗体を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体がダイアボディ、直接結合されているかまたはリンカーによって結合されている２個の一本鎖Ｆｖ、ジスルフィド安定化Ｆｖ、あるいはこれらの組み合わせである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的細胞が癌細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的分子が腫瘍関連抗原、サイトカインレセプター、または増殖因子レセプターである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍関連抗原がＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、およびＭＡＧＥ−１からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の標的分子が癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＬｅｗｉｓＹ、ＭＵＣ−１、ＥｐＣＡＭ、ＣＡ１２５、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、およびＴＡＧ７２からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の標的分子がＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＦＧＦレセプター１〜ＦＧＦレセプター４のいずれか、ＨＧＦレセプター、ＩＧＦ１−Ｒ、ＰＤＧＦ、レセプターαおよびレセプターβ、ならびにＣ−ＫＩＴからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の標的分子に対する前記第１の結合ドメインのＫｄが１０−８〜１０−１２Ｍの間である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２の標的分子に対する前記第２の結合ドメインのＫｄが、前記第１の標的分子に対する前記第１の結合ドメインのＫｄよりも少なくとも２０倍小さい、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２の標的分子に対する前記第２の結合ドメインのＫｄが、前記第１の標的分子に対する前記第１の結合ドメインのＫｄよりも少なくとも５０倍小さい、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
前記調節がレセプターチロシンキナーゼの活性を低下させることである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２４】
標的細胞上の第１の標的分子に対して少なくとも１０−７Ｍの解離定数（Ｋｄ）を有する第１の結合ドメインと、標的細胞上の第２の標的分子に対して該第１の標的分子に対する該第１の結合ドメインのＫｄよりも少なくとも１０倍小さいＫｄを有する第２の結合ドメインとを含む二重特異性結合剤（ｂｓＢＡ）であって、ここで、
（ｉ）該第１の標的分子および該第２の標的分子が同じ天然リガンドを有さず、
（ｉｉ）該第２の標的分子は生物活性を有するが、該第１の標的分子は生物活性を有さず、そして
（ｉｉｉ）該第１の結合ドメインの標的分子がＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）である場合には、該第２の結合ドメインに対する標的分子がＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）ではなく、
そしてさらに該第２の結合ドメインが、該第２の標的分子に結合された場合に、該第２の標的分子の生物活性を調節する、ｂｓＢＡ。
【請求項２５】
前記第２の結合ドメインのＫｄが前記第１の結合ドメインのＫｄよりも５０倍を超えて小さい、請求項２４に記載のｂｓＢＡ。
【請求項２６】
前記第２の結合ドメインのＫｄが前記第１の結合ドメインのＫｄよりも１００倍以上小さい、請求項２４に記載のｂｓＢＡ。
【請求項２７】
前記ｂｓＢＡが２つの抗体を含む、請求項２４に記載のｂｓＢＡ。
【請求項２８】
前記抗体がダイアボディ、直接結合されているかまたはリンカーによって結合されている２個の一本鎖Ｆｖ、ジスルフィド安定化Ｆｖ、あるいはこれらの組み合わせである、請求項２６に記載のｂｓＢＡ。
【請求項２９】
前記第１の結合ドメインが腫瘍関連抗原、サイトカインレセプター、または増殖因子レセプターに結合する、請求項２４に記載のｂｓＢＡ。
【請求項３０】
前記第１の標的分子が癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＬｅｗｉｓＹ、ＭＵＣ−１、ＥｐＣＡＭ、ＣＡ１２５、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、およびＴＡＧ７２からなる群より選択される、請求項２４に記載のｂｓＢＡ。
【請求項３１】
前記第２の標的分子がＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＦＧＦレセプター１〜ＦＧＦレセプター４のいずれか、ＨＧＦレセプター、ＩＧＦ１−Ｒ、ＰＤＧＦ、レセプターαおよびレセプターβ、ならびにＣ−ＫＩＴからなる群より選択される、請求項２４に記載のｂｓＢＡ。
【請求項３２】
前記第１の結合ドメインのＫｄが１０−８〜１０−１２Ｍの間である、請求項２４に記載のｂｓＢＡ。
【請求項３３】
前記第１の標的分子がその正常細胞での発現に比べて標的細胞では少なくとも１０倍まで過剰発現される、請求項２４に記載のｂｓＢＡ。
【請求項３４】
（ａ）二重特異性結合剤（ｂｓＢＡ）と、
（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア
とを含有する組成物であって、該二重特異性結合剤（ｂｓＢＡ）が、標的細胞上の第１の標的分子に対して少なくとも１０−７Ｍの解離定数（Ｋｄ）を有する第１の結合ドメインと、標的細胞上の第２の標的分子に対して第１の結合ドメインのＫｄよりも少なくとも１０倍小さいＫｄを有する第２の結合ドメインとを含み、そして該第１の標的分子および該第２の標的分子が同じ天然リガンドを有さず、さらに、
（ｉ）該第２の標的分子が生物活性を有するが、該第１の標的分子は活性を有さず、
（ｉｉ）該第２の結合ドメインが、該第２の標的分子に結合された場合に、該第２の標的分子の生物活性を調節する、そして
（ｉｉｉ）該第１の結合ドメインの標的分子がＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）である場合には、該第２の結合ドメインに対する標的分子がＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）ではない、組成物。
【請求項３５】
前記第２の結合ドメインのＫｄが前記第１の結合ドメインのＫｄよりも５０倍を超えて小さい、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記第２の結合ドメインのＫｄが前記第１の結合ドメインのＫｄよりも１００倍以上小さい、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３７】
前記ｂｓＢＡが２つの抗体を含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３８】
前記抗体がダイアボディ、直接結合されているかまたはリンカーによって結合されている２個の一本鎖Ｆｖ、ジスルフィド安定化Ｆｖ、あるいはこれらの組み合わせである、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記第１の結合ドメインが腫瘍関連抗原、サイトカインレセプター、または増殖因子レセプターに結合する、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４０】
前記第１の標的分子が癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＬｅｗｉｓＹ、ＭＵＣ−１、ＥｐＣＡＭ、ＣＡ１２５、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、およびＴＡＧ７２からなる群より選択される、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４１】
前記第２の標的分子がＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＦＧＦレセプター１〜ＦＧＦレセプター４のいずれか、ＨＧＦレセプター、ＩＧＦ１−Ｒ、ＰＤＧＦ、レセプターαおよびレセプターβ、ならびにＣ−ＫＩＴからなる群より選択される、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４２】
前記第１の標的分子が、前記第２の標的分子も有する非標的細胞よりも標的細胞上で少なくとも１０倍まで過剰発現される、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４３】
医薬を製造するための二重特異性結合剤（ｂｓＢＡ）の使用であって、該二重特異性結合剤は、標的細胞上の第１の標的分子に対して少なくとも１０−７Ｍの解離定数（Ｋｄ）を有する第１の結合ドメインと、標的細胞上の第２の標的分子に対して第１の結合ドメインのＫｄよりも少なくとも１０倍小さいＫｄを有する第２の結合ドメインとを含み、ここで
（ｉ）該第１の標的分子および該第２の標的分子が同じ天然リガンドを有さず、
（ｉｉ）該第２の標的分子が生物活性を有するが、該第１の標的分子は活性を有さず、
（ｉｉｉ）該第２の結合ドメインが、該第２の標的分子に結合された場合に、該第２の標的分子の生物活性を調節し、そして
（ｉｖ）該第１の結合ドメインの標的分子がＥｒｂＢ２である場合には、該第２の結合ドメインに対する標的分子がＥｒｂＢ３ではない、使用。
【請求項４４】
前記第２の結合ドメインのＫｄが第１の結合ドメインのＫｄよりも５０倍を超えて小さい、請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
前記第２の結合ドメインのＫｄが第１の結合ドメインのＫｄよりも１００倍以上小さい、請求項４３に記載の使用。
【請求項４６】
前記ｂｓＢＡが２つの抗体を含む、請求項４４に記載の使用。
【請求項４７】
前記抗体がダイアボディ、直接結合されているかまたはリンカーによって結合されている２個の一本鎖Ｆｖ、ジスルフィド安定化Ｆｖ、あるいはこれらの組み合わせである、請求項４６に記載の使用。
【請求項４８】
前記第１の結合ドメインおよび前記第２の結合ドメインによって結合される標的分子が腫瘍関連抗原、サイトカインレセプター、および増殖因子レセプターからなる群から独立して選択されるが、但し、該第１の結合ドメインおよび該第２の結合ドメインが同一の腫瘍関連抗原も、サイトカインレセプターも、増殖因子レセプターも結合しない、請求項４３に記載の使用。
【請求項４９】
前記医薬が癌細胞の増殖を阻害するためである、請求項４３に記載の使用。
【請求項５０】
前記第１の標的分子が前記第２の標的分子も有する非標的細胞よりも標的細胞上で少なくとも１０倍まで過剰発現される、請求項４３に記載の使用。
【請求項５１】
（ａ）容器と、
（ｂ）二重特異性結合剤（ｂｓＢＡ）
とを備えるキットであって、該二重特異性結合剤（ｂｓＢＡ）が、標的細胞上の第１の標的分子に対して少なくとも１０−７Ｍの解離定数（Ｋｄ）を有する第１の結合ドメインと、標的細胞上の第２の標的分子に対して第１の標的分子に対する第１の結合ドメインのＫｄよりも少なくとも１０倍小さいＫｄを有する第２の結合ドメインとを含み、ここで、
（ｉ）該第１の標的分子および該第２の標的分子が同じ天然リガンドを有さず、
（ｉｉ）前記第２の標的分子が生物活性を有するが、該第１の標的分子は生物活性を有さず、
（ｉｉｉ）該第２の結合ドメインが、該第２の標的分子に結合された場合に、該第２の標的分子の生物活性を調節し、そして
（ｉｖ）該第１の結合ドメインの標的分子がＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）である場合には、該第２の結合ドメインに対する標的分子がＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）ではない、キット。
【請求項５２】
前記第２の結合ドメインのＫｄが第１の結合ドメインのＫｄよりも５０倍を超えて小さい、請求項５１に記載のキット。
【請求項５３】
前記第２の結合ドメインのＫｄが前記第１の結合ドメインのＫｄよりも１００倍以上小さい、請求項５１に記載のキット。
【請求項５４】
前記ｂｓＢＡが２つの抗体を含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項５５】
前記抗体がダイアボディ、直接結合されているかまたはリンカーによって結合されている２個の一本鎖Ｆｖ、ジスルフィド安定化Ｆｖ、あるいはこれらの組み合わせである、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
前記第１の結合ドメインが腫瘍関連抗原、サイトカインレセプター、または増殖因子レセプターに結合する、請求項５１に記載のキット。
【請求項５７】
前記第１の標的分子が癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＬｅｗｉｓＹ、ＭＵＣ−１、ＥｐＣＡＭ、ＣＡ１２５、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、およびＴＡＧ７２からなる群より選択される、請求項５１に記載のキット。
【請求項５８】
前記第２の標的分子がＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＦＧＦレセプター１〜ＦＧＦレセプター４のいずれか、ＨＧＦレセプター、ＩＧＦ１−Ｒ、ＰＤＧＦ、レセプターαおよびレセプターβ、ならびにＣ−ＫＩＴからなる群より選択される、請求項５１に記載のキット。
【請求項５９】
前記第１の結合ドメインのＫｄが１０−８〜１０−１２Ｍの間である、請求項５１に記載のキット。
【請求項６０】
前記第１の標的分子が正常細胞でのその発現に比べて標的細胞では少なくとも１０倍まで過剰発現される、請求項５１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００４年５月５日付け出願された米国特許仮出願第６０／５６８，６５６号の利益を請求する。その内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（連邦政府の支援を受けた研究開発のもとでなされた発明に対する権利に関する陳述）
適用されない
（コンパクトディスクで提出された「配列表」、表、またはコンピュータープログラムを掲載した付属書の言及）
適用されない
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
多くの病気および障害は、細胞表面のレセプターの活性化によって、例えばレセプター特異的リガンドの結合によって生じるシグナル伝達経路の不適切な活性化または過度の活性化によって引き起こされる。病気および障害、例えば癌および自己免疫疾患の開始または進行に関係のあるレセプターが、レセプターの活性化を弱めるかまたは防止する治療剤の開発のための主要な標的として明らかになっている。標的レセプターの例としては、例えば、上皮増殖因子レセプター（「ＥＧＦＲ」）、インスリン様増殖因子１レセプター（「ＩＧＦ１−Ｒ」）、および血小板由来増殖因子レセプター（「ＰＤＧＦＲ」）が挙げられ、これらは多数の病態において、例えば最も一般的な固形腫瘍、例えば非小細胞肺癌ならびに乳房、前立腺および結腸の癌において、ならびに多数の自己免疫疾患、例えば重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、および慢性関節リウマチにおいて過剰発現されるかまたは異常に活性化される傾向がある。レセプターの活性化は自己リン酸化をもたらし、病気の進行を招くシグナル伝達経路を駆動する。
【０００４】
レセプターインヒビターを用いた可能性のある研究は、病態と関係があるレセプターの活性化を防止することによって、この病態の進展を変えることができることを明確に実証している。しかし、一般的に、病態の原因である１個のレセプターまたは複数個のレセプターは、疾患細胞または組織の他に、多数の種々の細胞および組織で発現される。レセプターインヒビター、例えばハーセプチン（登録商標）〔これはＥｒｂＢ２（「ＨＥＲ−２」）を標的とする〕が臨床用途に利用できるようになりつつあるが、新しい挑戦は、病気に冒されていない細胞および組織を標的とすることなく、疾患細胞または組織を効果的に標的とするであろう治療剤を確認することを含む。
【０００５】
薬剤を疾患細胞に特異的に標的として向ける１つのアプローチは、二重特異性結合剤（本明細書では時には「ｂｓＢＡ」と呼ぶ）の使用である。二重特異性結合剤は、２つの結合ドメインを含有し、そのそれぞれは、別個の分子（便宜上、それぞれの結合ドメインによって特異的に結合されるこの分子は、その結合ドメインの「リガンド」と呼び得る）を特異的に認識し、それに結合する。二重特異性結合剤は、非特許文献１，非特許文献２および非特許文献３によって例証されているように、しばらくの間試みられていた。ｂｓＢＡは、結合ドメインの１つまたは両方として抗体を使用する場合が多いことから、ｂｓＢＡは時には免疫療法剤と呼ばれる薬剤の群に含まれる。
【０００６】
不運なことに、ｂｓＢＡについて標的として使用することができる分子の領域は限定される。比較的少数の分子だけが、疾患細胞上で発現されるが、正常細胞上では発現されず、従って薬剤をもっぱら疾患細胞に標的として向けるのに使用することができる。さらに別の分子が、正常細胞よりも疾患細胞ではるかに多く発現される。これらの分子は、該分子が正常細胞に比べて疾患細胞で過剰発現される程度に応じて、正常細胞よりも疾患細胞への薬剤のある好ましい送達を可能にすることができる。
【０００７】
しかし、例え標的細胞上で標的分子の実質的な過剰発現を用いたとしても、標的に向けた治療剤の送達は、標的分子を発現する正常細胞に対する薬剤の結合に起因して有害な副作用を伴う場合が多い。例えば、ＦＤＡ承認の免疫療法剤ハーセプチン（登録商標）の標的であるＨＥＲ２（ｅｒｂＢ２）レセプターは、非癌細胞でのＨＥＲ２レセプターの発現よりも数１０〜１００倍高いレベルで過剰発現される。それにもかかわらず、ある割合の患者は、正常細胞に対するハーセプチン（登録商標）の結合に起因して不整脈およびその他の有害な副作用を起こす。
【非特許文献１】Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｍ，ら，「Ａ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔｏｘｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ＥｒｂＢ−２  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ」，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，１９９６年，６５（４），ｐ．５３８−４６
【非特許文献２】Ｌｕ  Ｄ，ら，「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ」，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７９（４），ｐ．２８５６−６５
【非特許文献３】Ｆｒａｎｃｏｉｓ  Ｃ，ら，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｔ  ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−２−Ｒ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｂｅｔａ  ｃｈａｉｎｓ  ａｃｔ  ｉｎ  ｓｙｎｅｒｇｙ  ｔｏ  ａｂｏｌｉｓｈ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｄｅｌａｙｅｄ  ｔｙｐｅ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ」，Ｔｒａｎｓｐｌ  Ｉｎｔ．，１９９６年，９（１），ｐ．４６−５０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、非標的細胞に結合することなく標的細胞に結合する改善された能力を有するｂｓＢＡを開発することによって免疫療法剤の治療窓を増大させることが望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、二重特異性結合剤の新規な組成物、ならびにそれを含有するキットおよびその方法および使用を提供する。
【００１０】
第１の群の実施形態において、本発明は、標的細胞の生物活性を調節する方法であって、（ｉ）前記細胞の表面の第１の標的分子に対して少なくとも１０−７ＭのＫｄを有する第１の結合ドメインと、前記細胞の表面の第２の標的分子に対して親和性を有する第２の結合ドメインとを有し、（ｉｉ）第２の標的分子が前記第１の標的分子と異なる、（ｉｉｉ）前記第２の標的分子に対する前記第２の結合ドメインの前記親和性が、前記第１の標的分子に対する前記第１の結合ドメインのＫｄよりも少なくとも１０倍小さい、かつ（ｉｖ）さらに、前記第１の結合ドメインの標的分子がＥｒｂＢ２である場合には、前記第２の結合ドメインの標的分子がＥｒｂＢ３ではない二重特異性結合剤を使用し、該二重特異性結合剤を標的細胞と、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインが第１の標的分子および第２の標的分子それぞれに結合することを可能にする条件下で接触させる工程を包含し、ここで第２の標的分子に対する第２の結合ドメインの結合が第２の標的分子の生物活性を調節し、それによって標的細胞の生物活性を調節する、かつまたここで第１の標的分子に対する前記第１の結合ドメインの結合が標的細胞の生物活性を調節しない、標的細胞の生物活性を調節する方法を提供する。いくつかの実施形態において、二重特異性結合剤は２つの抗体からなる。いくつかの実施形態において、抗体はダイアボディ、直接結合されているかまたはリンカーによって結合されている２個の一本鎖Ｆｖ、ジスルフィド安定化Ｆｖ、あるいはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、標的細胞は癌細胞である。いくつかの実施形態において、第１の標的分子は、腫瘍関連抗原、サイトカインレセプター、または増殖因子レセプターである。いくつかの実施形態において、腫瘍関連抗原はＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、およびＭＡＧＥ−１からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、第１の標的分子は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＬｅｗｉｓＹ、ＭＵＣ−１、ＥｐＣＡＭ、ＣＡ１２５、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、およびＴＡＧ７２からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、第２の標的分子は、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＦＧＦレセプター１〜ＦＧＦレセプター４のいずれか、ＨＧＦレセプター、ＩＧＦ１−Ｒ、ＰＤＧＦ、レセプターαおよびレセプターβ、ならびにＣ−ＫＩＴからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、標的細胞は乳癌細胞でありかつ標的分子は上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）およびＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）からなる群より選択されるレセプターチロシンキナーゼである。いくつかの実施形態において、第１の標的分子に対する第１の結合ドメインのＫｄは１０−８〜１０−１２Ｍの間である。いくつかの実施形態において、第２の標的分子に対する第２の結合ドメインのＫｄは、第１の標的分子に対する第１の結合ドメインのＫｄよりも少なくとも２０倍小さい。
【００１１】
本発明はさらに、標的細胞がその外面に第１の標的分子を有しかつその外面に第２の標的分子を有する、かつ（ｉ）前記第１の標的分子および第２の標的分子が共通リガンドを共有せず、（ｉｉ）第１の標的分子が、第２の標的分子をも有する非標的細胞よりも標的細胞の表面に少なくとも１０倍またはそれ以上豊富にあり、（ｉｉｉ）第２の標的分子が生物活性を有するが、第１の標的分子が生物活性を有しておらず、かつ（ｉｖ）第１の結合ドメインの標的分子がＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）である場合には、第２の結合ドメインに対する標的分子がＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）ではない標的細胞と非標的細胞とを有する生物中の標的細胞上の標的分子の生物活性を調節する方法であって、第１の標的分子に対して少なくとも１０−７Ｍの解離定数（Ｋｄ）を有する第１の結合ドメインと、第２の標的分子に対して第１の結合ドメインのＫｄよりも少なくとも１０倍小さいＫｄを有する第２の結合ドメインとを有する二重特異性結合剤を使用し、そして該二重特異性結合剤を標的細胞と、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインが第１の標的分子および第２の標的分子それぞれに結合することを可能にする条件下で接触させる工程を包含し、ここで前記第２の結合ドメインの結合が前記標的細胞上の前記第２の標的分子の生物活性を調節する、標的細胞と非標的細胞とを有する生物中の標的細胞上の標的分子の生物活性を調節する方法を提供する。いくつかの実施形態において、二重特異性結合剤は２つの抗体からなる。いくつかの実施形態において、抗体はダイアボディ、直接結合されているかまたはリンカーによって結合されている２個の一本鎖Ｆｖ、ジスルフィド安定化Ｆｖ、あるいはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、標的細胞は癌細胞である。いくつかの実施形態において、標的分子は腫瘍関連抗原、サイトカインレセプター、または増殖因子レセプターである。いくつかの実施形態において、腫瘍関連抗原はＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、およびＭＡＧＥ−１からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、第１の標的分子は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＬｅｗｉｓＹ、ＭＵＣ−１、ＥｐＣＡＭ、ＣＡ１２５、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、およびＴＡＧ７２からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、第２の標的分子は、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＦＧＦレセプター１〜ＦＧＦレセプター４のいずれか、ＨＧＦレセプター、ＩＧＦ１−Ｒ、ＰＤＧＦ、レセプターαおよびレセプターβ、ならびにＣ−ＫＩＴからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、第１の標的分子に対する第１の結合ドメインのＫｄは、１０−８〜１０−１２Ｍの間である。いくつかの実施形態において、第２の標的分子に対する第２の結合ドメインのＫｄは、第１の標的分子に対する第１の結合ドメインのＫｄよりも少なくとも２０倍小さい。いくつかの実施形態において、第２の標的分子に対する第２の結合ドメインのＫｄは、第１の標的分子に対する第１の結合ドメインのＫｄよりも少なくとも５０倍小さい。いくつかの実施形態において、前記の調節は、レセプターチロシンキナーゼの活性の低下である。
【００１２】
別の群の実施形態において、本発明は、標的細胞上の第１の標的分子に対して少なくとも１０−７Ｍの解離定数（Ｋｄ）を有する第１の結合ドメインと、標的細胞上の第２の標的分子に対して第１の標的細胞に対する第１の結合ドメインのＫｄよりも少なくとも１０倍小さいＫｄを有する第２の結合ドメインとを含有する二重特異性結合剤（ｂｓＢＡ）であって、（ｉ）第１の標的分子および第２の標的分子が同じ天然リガンドを有していない、（ｉｉ）第１の標的分子ではなく、第２の標的分子が生物活性を有する、かつ（ｉｉｉ）第１の結合ドメインの標的分子がＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）である場合には、第２の結合ドメインに対する標的分子がＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）ではないかつまた第２の結合ドメインが、第２の標的分子に結合された場合に第２の標的分子の生物活性を調節する、二重特異性結合剤（ｂｓＢＡ）を提供する。いくつかの実施形態において、第２の結合ドメインのＫｄは、第１の結合ドメインのＫｄよりも５０倍を超えて小さい。いくつかの実施形態において、第２の結合ドメインのＫｄは、第１の結合ドメインのＫｄよりも１００倍以上小さい。いくつかの実施形態において、前記ｂｓＢＡは２つの抗体からなる。いくつかの実施形態において、前記抗体は、ダイアボディ、直接結合されているかまたはリンカーによって結合されている２個の一本鎖Ｆｖ、ジスルフィド安定化Ｆｖ、あるいはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、第１の結合ドメインは、腫瘍関連抗原、サイトカインレセプター、または増殖因子レセプターに結合する。いくつかの実施形態において、第１の標的分子は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＬｅｗｉｓＹ、ＭＵＣ−１、ＥｐＣＡＭ、ＣＡ１２５、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、およびＴＡＧ７２からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、第２の標的分子は、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＦＧＦレセプター１〜ＦＧＦレセプター４のいずれか、ＨＧＦレセプター、ＩＧＦ１−Ｒ、ＰＤＧＦ、レセプターαおよびレセプターβ、ならびにＣ−ＫＩＴからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、第１の結合ドメインのＫｄは１０−８〜１０−１２Ｍの間である。いくつかの実施形態において、前記第１の標的分子は、その正常細胞での発現に比べて標的細胞では少なくとも１０倍まで過剰発現される。
【００１３】
さらに別の群の実施形態では、本発明は、（ａ）二重特異性結合剤（ｂｓＢＡ）と、（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアとを含有する組成物であって、前記二重特異性結合剤（ｂｓＢＡ）が、標的細胞上の第１の標的分子に対して少なくとも１０−７Ｍの解離定数（Ｋｄ）を有する第１の結合ドメインと、標的細胞上の第２の標的分子に対して第１の結合ドメインのＫｄよりも少なくとも１０倍小さいＫｄを有する第２の結合ドメインとを含有する、この場合の前記第１の標的分子および第２の標的分子が同じ天然リガンドを有していない、かつまたこの場合の（ｉ）第１の標的分子ではなく、第２の標的分子が生物活性を有する、（ｉｉ）第２の結合ドメインが、第２の標的分子に結合された場合に、第２の標的分子の生物活性を調節する、かつ（ｉｉｉ）第１の結合ドメインの標的分子がＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）である場合には、前記第２の結合ドメインに対する標的分子がＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）ではない組成物を提供する。いくつかの実施形態において、第２の結合ドメインのＫｄは、第１の結合ドメインのＫｄよりも５０倍を超えて小さい。いくつかの実施形態において、第２の結合ドメインのＫｄは第１の結合ドメインのＫｄよりも１００倍以上小さい。いくつかの実施形態において、前記ｂｓＢＡは２つの抗体からなる。いくつかの実施形態において、前記抗体は、ダイアボディ、直接結合されているかまたはリンカーによって結合されている２個の一本鎖Ｆｖ、ジスルフィド安定化Ｆｖ、あるいはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、第１の結合ドメインは、腫瘍関連抗原、サイトカインレセプター、または増殖因子レセプターに結合する。いくつかの実施形態において、第１の標的分子は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＬｅｗｉｓＹ、ＭＵＣ−１、ＥｐＣＡＭ、ＣＡ１２５、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、およびＴＡＧ７２からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、第２の標的分子は、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＦＧＦレセプター１〜ＦＧＦレセプター４のいずれか、ＨＧＦレセプター、ＩＧＦ１−Ｒ、ＰＤＧＦ、レセプターαおよびレセプターβ、ならびにＣ−ＫＩＴからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、前記第１の標的分子は、第２の標的分子も有する非標的細胞よりも標的細胞上で少なくとも１０倍まで過剰発現される。
【００１４】
別の群の実施形態において、本発明は、医薬を製造するための二重特異性結合剤（ｂｓＢＡ）の使用であって、標的細胞上の第１の標的分子に対して少なくとも１０−７Ｍの解離定数（Ｋｄ）を有する第１の結合ドメインと、標的細胞上の第２の標的分子に対して第１の結合ドメインのＫｄよりも少なくとも１０倍小さいＫｄを有する第２の結合ドメインとを含有し、（ｉ）第１の標的分子および第２の標的分子が同じ天然リガンドを有していない、（ｉｉ）第１の標的分子ではなく、第２の標的分子が生物活性を有する、（ｉｉｉ）前記第２の結合ドメインが、前記第２の標的分子に結合された場合に、第２の標的分子の生物活性を調節する、かつ（ｉｖ）前記第１の結合ドメインの標的分子がＥｒｂＢ２である場合には、前記第２の結合ドメインに対する標的分子がＥｒｂＢ３ではない二重特異性結合剤（ｂｓＢＡ）の使用を提供する。いくつかの実施形態において、前記第２の結合ドメインのＫｄは、第１の結合ドメインのＫｄよりも５０倍を超えて小さい。いくつかの実施形態において、前記第２の結合ドメインのＫｄは、第１の結合ドメインのＫｄよりも１００倍以上小さい。いくつかの実施形態において、ｂｓＢＡは２つの抗体からなる。いくつかの実施形態において、前記抗体は、ダイアボディ、直接結合されているかまたはリンカーによって結合されている２個の一本鎖Ｆｖ、ジスルフィド安定化Ｆｖ、あるいはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインによって結合される標的分子は、腫瘍関連抗原、サイトカインレセプター、および増殖因子レセプターからなる群から独立して選択される（但し、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインが同一の腫瘍関連抗原、サイトカインレセプター、または増殖因子レセプターを結合しないことを条件とする）。いくつかの実施形態において、医薬は、癌細胞の増殖を阻害するための。いくつかの実施形態において、第１の標的分子は、第２の標的分子も有する非標的細胞よりも標的細胞上で少なくとも１０倍まで過剰発現される。
【００１５】
さらに、本発明は、（ａ）容器と、（ｂ）二重特異性結合剤（ｂｓＢＡ）とからなるキットであって、前記二重特異性結合剤（ｂｓＢＡ）が標的細胞上の第１の標的分子に対して少なくとも１０−７Ｍの解離定数（Ｋｄ）を有する第１の結合ドメインと、標的細胞上の第２の標的分子に対して第１の標的細胞に対する第１の結合ドメインのＫｄよりも少なくとも１０倍小さいＫｄを有する第２の結合ドメインとを含有する、（ｉ）第１の標的分子および第２の標的分子が同じ天然リガンドを有していない、（ｉｉ）第１の標的分子ではなく、第２の標的分子が生物活性を有する、（ｉｉｉ）第２の結合ドメインが、第２の標的分子に結合された場合に、第２の標的分子の生物活性を調節する、かつ（ｉｖ）第１の結合ドメインの標的分子がＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）である場合には、前記第２の結合ドメインに対する標的分子がＥｒｂＢ３ではないキットを提供する。いくつかの実施形態において、第２の結合ドメインのＫｄは、第１の結合ドメインのＫｄよりも５０倍を超えて小さい。いくつかの実施形態において、前記第２の結合ドメインのＫｄは、第１の結合ドメインのＫｄよりも１００倍以上小さい。いくつかの実施形態において、前記ｂｓＢＡは２つの抗体からなる。いくつかの実施形態において、前記抗体は、ダイアボディ、直接結合されているかまたはリンカーによって結合されている２個の一本鎖Ｆｖ、ジスルフィド安定化Ｆｖ、あるいはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、第１の結合ドメインは、腫瘍関連抗原、サイトカインレセプター、または増殖因子レセプターに結合する。いくつかの実施形態において、第１の標的分子は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＬｅｗｉｓＹ、ＭＵＣ−１、ＥｐＣＡＭ、ＣＡ１２５、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、およびＴＡＧ７２からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、第２の標的分子は、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＦＧＦレセプター１〜ＦＧＦレセプター４のいずれか、ＨＧＦレセプター、ＩＧＦ１−Ｒ、ＰＤＧＦ、レセプターαおよびレセプターβ、ならびにＣ−ＫＩＴからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、第１の結合ドメインのＫｄは、１０−８〜１０−１２Ｍの間である。いくつかの実施形態において、前記第１の標的分子は、正常細胞でのその発現に比べて標的細胞では少なくとも１０倍まで過剰発現される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
（序論）
現在の免疫療法剤に関する１つの問題は、免疫療法剤の正常細胞および疾患細胞に結合する傾向が有害な副作用を生じることであった。従って、科学界の１つの目標は、非標的細胞（すなわち、正常細胞）を結合することなく、高められた標的細胞（例えば、疾患細胞）結合能を有する免疫療法剤を開発することにある。
【００１７】
本発明は、標的細胞を結合するための一群の免疫療法剤の特異性を高めるための組成物および方法を提供する。これらの方法および組成物は、非標的細胞の対応する活性に影響を及ぼすことなく標的細胞の高められた生物活性調節能を提供する。意外にも、今般、二重特異性結合剤（「ｂｓＢＡ」）として知られている免疫療法剤による疾患細胞を標的とする特異性を、ｂｓＢＡの２つの結合ドメインの結合親和性の違いを調節することによって高めることができることが知見された。ここで、本発明のｂｓＢＡは、標的細胞上の標的分子の生物活性を高めるかまたは低下させるために使用することができ、それによって、もしあるとするならば非標的細胞の対応する活性に対する影響を小さくしながら、標的細胞の高められた生物活性調節能を提供することができる。
【００１８】
名称が示すように、ｂｓＢＡは、それぞれが異なる標的分子（便宜上、結合ドメインによって特異的に結合された分子は、結合ドメイン用の「リガンド」と呼び得る）に対して特異的な２個の結合ドメインを有する。第１の結合ドメインは、一般に、ｂｓＢＡをえり抜きの細胞（時には「標的細胞」と呼ばれる）に標的として向けるのに使用される。従って、この結合ドメインはまた、本明細書では「ターゲッティングドメイン」とも呼ばれる。本発明の方法において、ターゲッティングドメインのその標的分子に対する結合は、標的細胞において有意な生物効果を誘導しない。第２の結合ドメインは、標的細胞上の第２の標的分子に結合する。第２の結合ドメインのそのリガンドに対する結合は、特定の生物効果を調節する（すなわち、その生物活性を高めるかまたは抑制する）ことを意図する。種々の方法で生物活性を調節する能力を有する結合ドメインが、当該技術において知られている。
【００１９】
しばしば、生物活性は、結合ドメインがその標的分子に対して結合することによって阻害される。例えば、結合ドメインによって結合された分子がサイトカインレセプターの一部分である場合には、そのレセプターに対する結合ドメインの結合が、レセプターへのサイトカインの接近を妨害し、それによって別の方法でその結合によって誘発される生物活性を阻害することができる。同様に、レセプターに対する結合ドメインの結合は、レセプターがヘテロ二量体を形成する（これはいくつかのサイトカインレセプター、例えばインターロイキン（「ＩＬ」）−２レセプターの完全な活性化に必要とされる）ことを防ぐことができる。あるいは、結合ドメインの結合は、レセプターのコンホメーションを、レセプターがその天然リガンドを結合することができず、それによって活性化されることができないように変化させ得る。反対に、結合ドメインは、レセプターに結合することによってその生物活性を高める能力について選択され得る。例えば、レセプターに対する結合ドメインの結合は、レセプターのための天然リガンドの効果を模倣することができ、その結果、前記結合がレセプターを活性化するかまたは結合ドメインの結合が低親和性レセプターをその天然リガンドに対して高親和性レセプターにならせるコンホメーションの変化を誘発し得る。
【００２０】
述べたように、本発明のｂｓＢＡの第１の結合ドメインは、ｂｓＢＡを標的細胞に対して標的として向かわせる働きをし、これに対して第２の結合ドメインは、主として標的細胞に対して効果を誘発する働きをする。従って、便宜上、２つのドメインの区別において、第１の結合ドメインは、時には本明細書では「ターゲッティングドメイン」と呼ばれ、これに対して第２の結合ドメインは、特には本明細書では「エフェクタードメイン」と呼ばれる。同様に、便宜上、２つの結合ドメインによって結合される分子の区別において、エフェクタードメインの標的分子は、時には「エフェクター標的分子」と呼ばれ、これに対して「標的分子」という用語はそれ自体で、ターゲッティングドメインの標的をさすであろう。
【００２１】
従来のｂｓＢＡは、典型的には個々の標的分子のそれぞれに対して最も高い利用可能な親和性をもつ結合ドメインを使用して組立てられている。当業者には、一方のドメインがそのそれぞれの標的に対して他方のドメインと同じ親和性を厳密に有するとは思われず、従って２つの結合ドメインが、通常は、親和性において違いを有することが認められるであろう。しかし、従来のｂｓＢＡにおいて、親和性の違いは、典型的には大きいものではなく、結合に対する実際の影響の点で有意であるかもしれないしまたは有意でないかもしれない。
【００２２】
しかし、本発明の方法および組成物では、ターゲッティングドメインは、そのリガンドに対して、エフェクタードメインがそのリガンドに対して有する親和性よりも少なくとも大規模な高い結合親和性を有するべく選択される。すなわち、ターゲッティングドメインは、それが認識しかつ結合する分子に対して、エフェクタードメインがそれが認識しかつ結合する分子に対して有する親和性よりも、少なくとも１０倍またはそれよりも大きい親和性を有する。いくつかの実施形態において、ターゲッティングドメインのそのリガンドに対する親和性は、エフェクタードメインのそのリガンドに対する親和性よりも少なくとも１５倍高く、ある場合には２０倍以上高く、別の実施形態では２５倍以上高く、またいくつかの実施形態において、ターゲッティングドメインは、エフェクタードメインのそのリガンドに対する親和性よりも３０倍、４０倍、５０倍または場合によっては１００倍あるいはそれ以上高い親和性を有し、それぞれ個々のより高い親和性がさらに好ましい。本発明のｂｓＢＡの２つの結合ドメインの間には結合親和性において少なくとも大規模な相違があることから、ｂｓＢＡは場合によっては本明細書では「ｈｉ−ｌｏ」ｂｓＢＡと呼ばれる。
【００２３】
標的結合ドメインとエフェクター結合ドメインの間の結合親和性における意図的および実質的な相違は、従来の二重特異性分子よりも優れた意外にもおよびこれまでに認識されていなかった利点を提供する。前述のように、これまで知られている二重特異性薬剤は、標的リガンドに対してできる限り高い親和性をもつ結合部分を有していた。しかし、同様の親和性をもつ結合部分を有する二重特異性分子は、本発明の組成物および方法に比べて、標的とすることができる分子および使用できる状況の点で限定される。本発明の利点のいくつかを、仮定的例を挙げることによって考察することができる。
【００２４】
２つのレセプター、すなわちレセプターＡ（これは、正常細胞に比べて癌細胞上で過剰発現される）およびレセプターＢ（これは、正常細胞上で、癌細胞上に存在するコピーの数とほぼ同じ数で発現される）を有する癌細胞の場合を考察する。両方のレセプターに対してほぼ等しい親和性をもつ結合ドメインを有する二重特異性結合剤は、癌細胞および正常な非癌細胞の両方に対してほぼ等しい影響を及ぼす傾向があるであろう。これは、特にｂｓＢＡの高い濃度が達成される場合である。その理由は、ｂｓＢＡは一価の結合によって両方のレセプターを飽和する傾向があるからである。
【００２５】
対照的に、レセプターＡを標的とする高親和性ターゲッティングドメインと、レセプターＢを標的とする低親和性エフェクタードメインを有し、かつレセプターＢに対する親和性よりもレセプターＡに対して１０倍、２０倍、３０倍またはさらに高い倍数の大きい親和性を有する本発明のｂｓＢＡは、癌細胞に優先的に結合するであろうし、また標準的な動力学的相互作用によって、正常細胞に比べて癌細胞により多く結合するであろう。従って、レセプターＢを有する細胞、例えば相当な数の正常細胞に無差別に結合する代わりに、エフェクタードメインは、癌細胞に選択的に送達されるであろう。従って、本発明は、標的細胞に対するエフェクタードメインのより選択的ターゲッティングを可能にする。
【００２６】
さらに、レセプターＡに対する高親和性結合ドメインの結合は、細胞表面の近くに低親和性のエフェクタードメインを結びつけ、そこでエフェクタードメインは時間と共にレセプターＢと相互作用するのに利用できる。たとえレセプターＢに対するその比較的低い親和性が、「固定されていない」一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）（または「ｕｎｉｖａｌｅｎｔ」）のエンティティーとして提供されるエフェクタードメインであったレセプターに対する親和性を保持するのに普通は十分でないかもしれないとしても、これはエフェクタードメインがレセプターＢに結合することを可能にする。
【００２７】
当業者には、抗体またはその他のリガンドの解離定数（「Ｋｄ」）は、リガンドのｋｏｎおよびｋｏｆｆによって両方で測定されることが認識されるであろう。すなわち、Ｋｄは、抗体またはその他のリガンドが標的分子に結合される時間と、結合されない時間との間の釣り合いを表す。従って、低親和性結合ドメインは、その標的分子から解離する高い傾向をもつことから、まさに低親和性を有する。結合ドメインがその標的分子から解離する間に、結合ドメインは、結合ドメイン分子に働くブラウン運動、流量、またはその他の動力学的な力によって移動することができる。ｂｓＢＡの高親和性ドメインによる低親和性ドメインの結合は、低親和性ドメインが標的とするレセプターの近くに低親和性結合ドメインを維持することを促進し、従って任意の時点で低親和性ドメインがその標的分子に結合することができる可能性を高める傾向がある。この仮説において本発明のｂｓＢＡの低親和性ドメインの標的分子はレセプターキナーゼであることから、これは、ｂｓＢＡの標的レセプターキナーゼ結合能を高める傾向があり、従ってその標的細胞に対する生物効果を高める。
【００２８】
好ましい実施形態では、本発明のｂｓＢＡの２つの結合ドメインは、普通は同じリガンドによって結合されない標的分子を結合する。当業者は、いくつかのリガンド、例えばインターロイキンＩＬ−２が２種類のレセプター鎖によって結合されること、および結合されたＩＬ−２を有する２つの鎖が、次いで相互作用して十分に生物学的に活性な単位を形成することを知っている。従って、２つのレセプター鎖に向けられたｂｓＢＡがこのようなレセプターの十分な活性化を防止することができると同時に、このようなｂｓＢＡの２つの結合ドメインは、勿論、同じレセプターに向けられる。
【００２９】
最後に、ｂｓＢＡと、結合ドメインによって結合された２つの標的分子との間の三量体の形成は、互いの近くに標的分子を結合しかつ細胞膜の脂質二重層を通るその典型的な拡散を防止するというさらなる利点を有する。ｂｓＢＡによる種々のレセプターの架橋は、それ自体、標的細胞に対するｂｓＢＡの細胞障害効果または細胞増殖抑制効果に起因すると考えられる。例えば、シグナル伝達カスケードは、典型的には、ヘテロ二量体を形成するために相互に結合する２種類のタンパク質よるかまたは初期カスケードにおいて次のタンパク質を修飾する（通常はリン酸化することによって）キナーゼによるかいずれかにより活性化される。種々のレセプターの架橋は、レセプターがその正常なヘテロ二量体を形成する能力を妨害するかまたは通常は初期カスケードの次の工程であるタンパク質を修飾する能力を妨害することができる。
【００３０】
一群の実施形態において、ｂｓＢＡのターゲッティングドメインは、病気または疾患と関係がある標的細胞（例えば、乳癌細胞）上で優先的に発現されるかまたは過剰発現される細胞表面レセプターに結合し、またエフェクタードメインは標的細胞および非標的細胞上で無差別にまたは普遍的に発現される細胞表面レセプターに結合する。本発明のｂｓＢＡが標的とすることができる代表的な細胞表面レセプターを、以下に記載する。好ましい実施形態において、ターゲッティングドメインによって結合されるべき分子は、標的細胞上で、エフェクタードメインによって結合されるべき分子の量よりも多い量で発現される。従って、本発明のｂｓＢＡおよび方法は、慣用の抗体または二重特異性薬剤によって、あるいはこの両方によって無差別に結合される標的分子を有する細胞に対するエフェクター分子の特異的な送達を向上させるのに特に有用である。当業者は、種々の癌の細胞が種々の抗原を過剰発現させ得るかまたは異なる癌種の細胞を過剰発現させるよりも同じ抗原を種々の程度まで過剰発現させ得ることを知っているであろう。従って、本発明のｂｓＢＡの設計において、開業医が、特定のｂｓＢＡが標的とする特定の細胞上で過剰発現される細胞表面レセプターを標的とするターゲッティングドメインを選択するであろうということが予期される。
【００３１】
いくつかの実施形態において、ｂｓＢＡのターゲッティングドメインは、病気または疾患と関係がある標的細胞（例えば、癌細胞）上で優先的に発現されるかまたは過剰発現される第１の細胞表面レセプターに結合し、またエフェクタードメインは、正常細胞に比べて疾患細胞（例えば、癌細胞）上で過剰発現されるが、第１の細胞表面レセプターよりも低い水準で発現される第２の細胞表面レセプターに結合する。これらの実施形態においては、第１の細胞表面レセプターと第２の細胞表面レセプターの間の発現レベルの相違が標的分子を有する細胞へのエフェクター分子の特異的な送達を高める。
【００３２】
背景技術で述べたように、例えＨＥＲ２が乳癌細胞において正常細胞でのその発現のレベルの約１０〜１００倍のレベルで過剰発現されるとしても、患者において免疫治療剤、ハーセプチン（登録商標）が正常細胞に結合することによりいくつかの有害な副作用が認められる。従って、標的分子のさらに十分な過剰発現が、高親和性結合剤が正常細胞に結合し、有害な副作用を妨げるのに必ずしも十分であるとは限らない。
【００３３】
対照的に、本発明のｂｓＢＡは、その標的分子に対してエフェクタードメインのその標的分子に対する親和性よりも少なくとも１０倍高い、場合によってはさらに高い親和性を有するべく選択されるターゲッティングドメインを有する。好ましくは、ターゲッティングドメインのその標的分子に対する解離定数は、１０−８〜１０−１２Ｍの範囲にある。標的分子は正常細胞上には存在しないという理由で、または標的分子は正常細胞よりも癌細胞で極めて過剰に発現される、好ましくは正常細胞で発現されるよりも少なくとも２０倍、さらに好ましくは１００倍を越えて極めて過剰に発現されるという理由で、標的分子が選択される。述べたように、ターゲッティングドメインの標的分子に対する高親和性によって、ターゲッティングドメインはｂｓＢＡを標的細胞に優先的に結合する傾向があるであろう。従って、エフェクタードメインが、正常細胞上で発現される標的分子を標的とすることができ、さらに慣用のｂｓＢＡの治療窓よりも大きい治療窓を提供する選択的結合を達成することが予想される。
【００３４】
当業者には、癌細胞が、特に、多数の正常タンパク質、例えば正常細胞においてホメオスタシスを維持する役割をもつ多数の正常タンパク質の発現を上方制御する傾向があることが認められるであろう。従って、通常は癌または腫瘍抗原であるとみなされないタンパク質でさえも、癌細胞で上方制御される傾向がある。例えば、インスリンレセプター（これは、腫瘍抗原とみなされない）は、正常細胞に比べて腫瘍細胞では３〜５倍上方制御される場合が多い（例えば、Ｍｉｌａｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２（１４）：３９２４−３０（１９９２）参照）。
【００３５】
別の例として、ＥｒｂＢ３レセプターは、正常細胞でのその発現と比べてある種の癌細胞では幾分過剰発現される。しかし、ＥｒｂＢ３レセプターは、ターゲッティングドメインがさらにより高度に過剰発現される標的分子に向けられる場合には、ｂｓＢＡのエフェクター標的分子として使用することができる。実施例は、ターゲッティングドメインがＥＧＦＲに向けられかつエフェクタードメインがＥｒｂＢ３に向けられる本発明の典型的ｂｓＢＡを示す。
【００３６】
ターゲッティングドメインは標的細胞上で過剰発現される標的分子（例えば、癌抗原）に向けられ、これに対してエフェクタードメインはターゲッティングドメインの標的分子よりも低いレベルで発現される分子（例えば、レセプターキナーゼ）に向けられることが望ましい。標的分子が、エフェクタードメインが標的とする分子よりも高いレベルで発現されることが必要であるだけであるが、一般的に、エフェクター分子はターゲッティングドメインのＫｄよりも低いｂｓＢＡ濃度で飽和されることができることから、標的分子の発現とエフェクター分子の発現の間の大きな相違が好都合である。
【００３７】
一般的に、ターゲッティングドメインのための標的分子は非標的細胞上の標的分子の発現よりも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上高いレベルで過剰発現されることが好ましく、それぞれ引き続く高いレベルがさらに好ましい。一般的に、エフェクター分子は非標的細胞で発現されるレベルで発現されことがさらに好ましいか、または過剰発現される場合には、非標的細胞のレベルの２〜５倍のレベルで過剰発現されることがさらに好ましい。すなわち、ターゲッティング分子がエフェクタードメインによって結合される分子に比べて高レベルで発現される（または過剰発現される）ことが好ましい。
【００３８】
標的細胞が疾患細胞、例えば癌細胞である場合には、標的分子の発現レベルは、癌細胞が生じる組織型と同じ組織型の正常細胞上の同じ分子の発現に対して測定される。すなわち、疾患細胞が乳癌細胞である場合には、発現レベルは標準的な乳房細胞に対して測定され、これに対して卵巣癌細胞の分子の発現レベルは標準的な卵巣細胞に対して測定される。通常は、細胞の集団が使用され、発現レベルの平均値（例えば、細胞当たりの分子の個数）が測定される。
【００３９】
さらに、いくつかの好ましい実施形態において、エフェクタードメインによって認識され、結合される細胞表面抗原は、ドメインの結合によって調節することができる生物活性を有するべく選択される。例えば、エフェクタードメインが標的とする細胞表面抗原は、サイトカインまたは増殖因子レセプターであることができ、前記ドメインによるその妨害は標的細胞の正常な表現型への回復に寄与するであろう。レセプターの阻止はレセプターによって活性化された経路を下方制御し、細胞の増殖の速度を低下させることをもたらすことが期待される。
【００４０】
前述のように、サイトカインレセプターなどのアゴニストとして作用することができる抗体も知られている；すなわち、抗体は標的分子の活性を高めるために作用する。従って、開業医によって選択される標的分子および結合剤に応じて、本発明のｂｓＢＡのエフェクタードメインは標的分子の活性を阻害し得るか、または標的分子の活性を高め得る。エフェクタードメインの標的分子の活性を高めるかまたは低下させる結合ドメインを選択することができることは、開業医に一連の病気に有効なｂｓＢＡの設計において相当な柔軟性を提供する。標的分子の活性化は、開業医の選択の自由において、結合剤の思慮深い選択によって高めるまたは低下させることができることを示すために、標的分子に対するｂｓＢＡの効果は、時には本明細書では標的分子の活性を「調節する」と呼ばれる。
【００４１】
例えば、いくつかの癌は、チロシンキナーゼとして作用するレセプターをコードする遺伝子の突然変異から生じ、構成的に活性になるかまたは過剰発現されてしまうレセプターをもたらすので、細胞は正常なレセプターを用いてまたは正常な量で発現されるレセプターを用いて増殖するよりもよりいっそう増殖する。レセプターの活性を低下させるために、開業医は、この例では、構成的に活性なレセプターのコンホメーションを変化させてその活性を低下させるまたは、過剰発現されるレセプターの場合には、レセプターがその天然リガンドによって結合されることを簡単に妨害することが知られている結合剤を選択し、このようにして過剰発現が標的細胞内のシグナル伝達において不適切な増大をもたらすことを防止する。逆に、標的分子がその活性が高めることが望まれる標的分子である場合には、開業医はその結合が活性のアゴニストとして作用することが知られている結合剤を選択し得る。
【００４２】
１個の高親和性結合ドメインもつｂｓＢＡの使用は、興味ある細胞に対する特異的結合を提供するのに十分である。種々の研究により、単一の標的分子に向けられた２つの高親和性結合ドメインをもつ結合剤が、標的分子に対して同じ結合ドメインをもつ一価の結合剤に比べて約３倍の親和性を有することが明らかにされている。Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｕ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０（２２）：６４３４−４０（２０００）。従って、一価の結合剤は、典型的には、さらに、ナノモル範囲のＫｄを有するであろう。治療剤は典型的には最大でマイクロモル濃度、すなわち結合剤の１０００倍のＫｄを提供する量で投与されることから、高親和性ターゲッティングドメインのＫｄに比べて高濃度の結合剤が標的分子をもつ標的細胞に対する薬剤の結合を可能にすることが期待される。従って、本発明のｂｓＢＡの高親和性ターゲッティングドメインは、ｂｓＢＡが投与される条件下でｂｓＢＡの特異的結合を提供することが期待される。
【００４３】
開業医がターゲッティングドメインの標的分子とエフェクタードメインの標的分子との適当な組み合わせを選択できることが期待される。多数の好ましい標的分子およびエフェクター標的分子を以下に記載するが、それはいくつかの好ましい標的分子およびエフェクター標的分子を挙げるのに役立ち得る。いくつかの好ましい標的分子は、ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ２である。いくつかの好ましいエフェクター標的分子は：ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）レセプター１−４のいずれか、肝細胞増殖因子レセプター、インスリン様増殖因子１レセプター（ＩＧＦ１−Ｒ）、インスリンレセプター、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）レセプターαおよびレセプターβ、ならびにＣ−ＫＩＴである。これらの分子のそれぞれは、当該技術では公知であり、以下のセクションにおいてＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベースにおける参照番号によって確認される。
【００４４】
最後に、本発明のｂｓＢＡは、ＨＥＲ３を１つの結合ドメインと結合しかつＨＥＲ２／ｎｅｕを第２の結合ドメインと結合するｂｓＢＡを包含しない。
【００４５】
（定義）
単位、接頭辞、および符号は、これらのＳｙｓｔeｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）で受け入れられた形で表す。数値範囲は、その範囲を規定する数を含める。特に明示しない限りは、核酸は左から右に５´から３´の配向で書き表され；アミノ酸配列は左から右にアミノ基からカルボキシ基の配向で書き表される。本明細書において提供される表題は、本発明の種々の態様または実施形態の限定ではなく、全体として明細書を参照にして得ることができる。従って、以下に定義する用語は、明細書を全体として参照することによりさらに詳しく定義される。本明細書において定義されていない用語は、当業者によって理解されるような通常の意味を有する。
【００４６】
結合剤の「親和性」は、典型的にはその解離定数、すなわち「Ｋｄ」に関して記載される。典型的には、有用な結合剤は、ナノモル濃度で記載されるＫｄを有する。当業者には、１０−８ＭのＫｄを有する抗体が１０−７のＫｄを有する抗体の１０倍高い親和性を有しかつ１０−６のＫｄを有する抗体の１００倍高い親和性を有することが認められるであろう。従って、高親和性の薬剤は、低い数字として記載されるＫｄを有する（すなわち、１０−８は１０−６よりも小さい数である）。
【００４７】
参照の便宜上、本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、完全抗体、抗原認識および結合能を保持する抗体フラグメント、文脈によって必要とされない限りは、完全抗体の修飾によって製造されようとまたは組換えＤＮＡ法を使用して新たに合成されようといずれにしろ、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、および抗体ミミックを包含する。抗体はＩｇＭ、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＥであり得る。
【００４８】
「抗体フラグメント」という用語は、完全抗体の部分を意味し、一般には完全抗体の抗原結合部または可変部を含有する分子を意味する。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆｖフラグメント；ヘリックス安定化抗体（例えば、Ａｒｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３１２：２２１−２２８（２００１）参照）；ダイアボディ（以下を参照）；一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」、例えば米国特許第５，８８８，７７３号明細書参照）；ジスルフィド安定化抗体（「ｄｓＦｖ」、例えば米国特許第５，７４７，６５４明細書参照）、およびドメイン抗体（「ｄＡｂ」、例えば、Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２１（１１）：４８４−４９０（２００３），Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４１４：５２１−５２６（１９９７），Ｌａｕｗｅｒｅｙｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  １７：３５１２−３５２０（１９９８），Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２９０：６８５−６９８（１９９９），Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：４７５−４７９（２００１）参照）が挙げられる。
【００４９】
「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体フラグメントをさし、このフラグメントは同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）において可変Ｌ鎖ドメイン（ＶＬ）に結合された可変Ｈ鎖ドメイン（ＶＨ）からなる。短すぎて同じ鎖の２つのドメインの間で対合をさせないリンカーを使用することによって、２つのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合し、２つの抗原結合部位を作製することを強いられる。ダイアボディは、例えば、欧州特許出願公開第４０４，０９７号明細書；国際公開第ＷＯ９３／１１１６１号パンフレット；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）にさらに詳しく記載されている。
【００５０】
典型的には、免疫グロブリンは、Ｈ鎖とＬ鎖を有する。Ｈ鎖およびＬ鎖それぞれは、定常部と可変部を含有する（前記の領域は「ドメイン」としても知られている）。Ｌ鎖およびＨ鎖可変部は、「相補性決定領域」または「ＣＤＳ」とも呼ばれる３つの超可変部によって中断された「フレームワーク」領域を含有する。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は定義されている。Ｋａｂａｔ  ａｎｄ  Ｗｕ，ｉｎｆｒａ、参照。種々のＬ鎖またはＨ鎖のフレームワーク領域の配列は、ある種の範囲内に比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域（構成するＬ鎖およびＨ鎖が組み合わさったフレームワーク領域である）は、三次元空間にＣＤＲを配置し、整列させるのに役立つ。
【００５１】
ＣＤＲは、主として抗原のエピトープに対する結合に関与する。それぞれの鎖のＣＤＲは、Ｎ−末端から出発して連続的に番号を付され、典型的にはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれ、典型的には特定のＣＤＲが配置される鎖で識別される。従って、ＶＨ  ＣＤＲ３はそれが認められる抗体のＨ鎖の可変部ドメインに配置され、これに対しＶＬ  ＣＤＲ１はそれが認められる抗体のＬ鎖の可変部ドメイン由来のＣＤＲ１である。
【００５２】
「ＶＨ」または「ＶＬ」に対する言及は、免疫グロブリンＨ鎖の可変部、例えばＦｖ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、ｄｓＦｖまたはＦａｂをさす。「ＶＬ」または「ＶＬ」に対する言及は、免疫グロブリンＬ鎖の可変部、例えばＦｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄＡｂまたはＦａｂを示す。
【００５３】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」という語句は、従来の２つの鎖の抗体のＨ鎖の可変部ドメインおよびＬ鎖の可変部ドメインが結合して１つの鎖を形成する抗体をさす。場合によっては、リンカー（通常はペプチド）が、適切な折りたたみおよび活性結合部位の作製を可能にさせるために２つの鎖の間に挿入される。
【００５４】
「二重特異性結合剤」、すなわち「ｂｓＢＡ」は、２種類以上の標的分子に対して同時に特異的に結合することができる結合分子である。
【００５５】
「結合剤」は、標的分子を特異的に結合することができる分子であり、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、ペプチド（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６６：５１８２−５１９０（１９９１））、および抗体ミミック、例えば第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインから作製することができるもの（例えば、Ｘｕ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．  ９（８）：９３３−４２（２００２），Ｋｏｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２８４：１１４１−１１５１，Ｓｋｅｒｒａ，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ  １３：１６７−１８７（２０００），Ｍａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，７１：６７１−６７８（１９９２）およびＤｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２３６：１０７９−１０９２（１９９４）参照）、ならびに天然タンパク質および非天然残基を含有させるために修飾または操作されたタンパク質を含有することができるものを包含する。いくつかの実施形態において、「結合剤」は、レセプター用の天然リガンドをさすこともできる。例えば、ＩＬ−１３がＩＬ−１３レセプター用の結合剤として使用することができる。
【００５６】
「アプタマー」とは、一般的に、単一の定義された配列をもつオリゴヌクレオチドまたは前記オリゴヌクレオチドの混合物のいずれかを示し、この場合の混合物は標的分子に特異的に結合する性質を保持する。従って、本明細書で使用される場合、「アプタマー」とは単一または複数の配列のオリゴヌクレオチドを表す。構造的に、本発明のアプタマーは特異的に結合するオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドとしては、慣用の塩基、糖残基およびヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドだけではなく、これらの３つの部分のいずれかまたはその全部の修飾を含むオリゴヌクレオチドオも挙げられる。米国特許第５，７５６，２９１号明細書（参照することにより本明細書に組み込まれる）は、アプタマー、アプタマーの製造および試験方法、ならびにその使用を提供する。
【００５７】
「標的分子」とは、本明細書では本発明の二重特異性結合剤の結合ドメインによって特異的に結合される分子を示すために使用される。「第１の標的分子」および「第２の標的分子」という用語は、本明細書では同じ分子種の２つの分子よりもむしろ２つの異なる分子種の分子を示すのに使用される。このような分子種は、例えば、２種類のレセプターチロシンキナーゼ（例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子レセプター１および肝細胞増殖因子レセプター）であってもよい。いくつかのサイトカインレセプターおよびその他のレセプターは、「鎖」として知られているサブユニットからなり、レセプターは、いくつかの場合には、レセプター用のリガンドが前記の鎖の１つにいったん結合すると、鎖を新しく入れることによって十分に活性化されてしまう。本明細書で使用される場合、特定のレセプター（例えば、ＩＬ−２レセプター）の鎖全部が同じ分子種のとみなされ；従って、所定のレセプターの鎖が本発明のｂｓＢＡの第１の結合ドメインによって結合されるべき「第１の標的分子」であるべきである場合には、「第２の標的分子」は同じレセプターの第２の鎖であることはできない。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「生物活性」とは、標的分子が果たす定義された既知の活性をさす。通常、本発明のｂｓＢＡによって標的とされる分子の生物活性はシグナル伝達である。例えば、本明細書の後のセクションに、標的分子であることができる分子として多数の増殖因子レセプターを記載する。これらのレセプターは、典型的には、細胞の細胞外表面のリガンド結合ドメインと、貫膜ドメインと、チロシンキナーゼ酵素活性を有する細胞質ゾルドメインとを有する。典型的には、チロシンキナーゼ活性は、リガンド結合ドメインに対するリガンドの結合によって活性化される。ここでは、レセプターキナーゼ活性は、シグナルカスケードを開始する。従って、これらの標的分子の生物活性はシグナル伝達である。当業者には、標的分子の生物活性は、究極的には、標的分子が配置されている細胞に対して影響を及ぼすことが認められるであろう。例えば、増殖因子レセプターを、該増殖因子レセプターを過剰発現させる癌細胞中で活性化させることによって開始されるシグナル伝達カスケードは、細胞の成長および増殖を増大させると思われ、これに対してレセプターの活性を阻害すると上記の増殖を阻害するかまたは遅らせると思われる。従って、「生物活性」という用語は、標的分子の活性に比べて、細胞の活性に関連してより広く使用し得る。意味がどちらを意図するかは、文脈で明らかになるであろう。
【００５９】
上記に述べたように、本発明のｂｓＢＡの標的分子として使用できるいくつかの分子が生物活性を有することは知られていない。細胞表面の所定の分子が本発明の目的の生物活性を有するかまたは有していないかの測定は、次の手段によって行なうことができる。細胞表面分子を有するヒト細胞の培養物を分けて、２つの別個の培養物を形成することができる。第１の培養物を、細胞表面分子に特異的に結合しかつ該分子に対する天然リガンドの結合を妨げることが期待される結合ドメインと接触させる。別の群の培養物は接触させない。次いで、前記２つの群の培養物を、断らない限りは同じ条件下で培養する。本発明の目的には、結合剤による分子の結合が細胞増殖、細胞生存、アポトーシス、下流キナーゼの活性化、転写活性、表面への接着、軟寒天でのコロニー増殖能において観察できる相違を引きこさない場合には、標的分子は「生物活性」を有していないとみなされる。これらの特性の相違を観察するためにアッセイは、当該技術で周知であり、いくつかを以下にさらに詳しく論じる。
【００６０】
本明細書で使用される場合、生物活性の「調節」とは、開業医が望むように、標的分子の生物活性を高めるかまたは抑制することを示す。例えば、標的分子が癌細胞の増殖を高めるとみなされるレセプター（例えば、ＥｒｂＢ３レセプター）である場合には、開業医は、レセプターに結合するために結合ドメインを使用し、レセプターの天然リガンドによるレセプターの結合を妨害することによってレセプターの活性を阻害することを望み得る。頻繁には、これらの標的分子は、天然リガンドの結合の際にチロシンキナーゼとして作用するレセプターである。反対に、標的分子の生物活性が、開業医が高めることを望む活性である場合には、開業医は例えば標的分子のアゴニストとして作用することが当該技術で知られている抗体を結合ドメインとして使用することができる。結果は、治療される病気または病態に役立つことを意図する；例えば悪性病変およびある種の自己免疫疾患の治療については、所望の効果は通常は細胞増殖の阻害またはアポトーシスの誘発であるか、あるいはある細胞種の増殖、例えば自己免疫疾患の治療用のＴ−調節Ｔ−細胞の増殖を誘導であることができる。
【００６１】
細胞表面レセプターがこれらのレセプターに特異的に結合するリガンドを有することが理解される。従って、所定のレセプターに関して、「天然リガンド」という用語は、正常な生理学の経過中に所定のレセプターに結合する分子を示す。例えば、インターロイキン（「ＩＬ」）−１３は、ＩＬ−１３レセプターのための天然リガンドであり、ＩＬ−２はＩＬ−２レセプターのための天然リガンドであり、上皮増殖因子はＥＧＦレセプターのための天然リガンドであるなどである。
【００６２】
「有効量」または「に有効な量」または「治療有効量」という用語は、細胞のタンパク質合成を少なくとも５０％まで阻害するか、または細胞を死滅させるなどの所望の結果を得るのに十分な薬剤の用量を示すことを包含する。
【００６３】
「エフェクター分子」は、結合分子、例えば本発明のｂｓＢＡのエフェクタードメインに接触した際に、細胞の挙動を、例えばシグナル伝達、リン酸化、増殖の誘発、または細胞死の誘導によって調節するのに使用し得る細胞表面レセプターとして定義される。
【００６４】
「Ｋｄ」は、次の型の反応：
Ａ＋Ｂ＝ＡＢ
についての逆反応の速度定数と正反応の速度定数の比である。
【００６５】
平衡では、平衡定数（Ｋ）は、生成物の濃度で除した反応剤の濃度の生成物に匹敵し、濃度のディメンションを有する。
Ｋｄ＝（濃度Ａ×濃度Ｂ）／（濃度ＡＢ）
「一価結合剤」および「一価結合組成物」は、例えば２つの結合ドメインを有する完全免疫グロブリンＧ分子とは対照的に、細胞表面マーカーを結合するための単一のドメインを有する結合分子として定義される。一価結合剤は、典型的には二重特性抗体を形成する２つの結合ドメインの１つの単離フラグメント、例えばｓｃＦｖ、Ｆａｂ´、単一ドメイン抗体などである。
【００６６】
「標的細胞」は、本発明の二重特異性抗体結合剤がその高親和性ターゲッティングドメインによって優先的に結合することを意図する細胞である。
【００６７】
「接触する」という用語は、直接的物理的会合における配置に対する言及を含む。
【００６８】
細胞は、一般に当該技術では種々のタンパク質、例えばトランスポーター、イオンチャンネル、およびサイトカインレセプターが置かれている脂質二重層からなる形質膜（普通は「細胞膜」と呼ばれる）によって結合されると理解される。一般的に、Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（３ｒｄ  Ｅｄ．，１９９４），Ｃｈａｐｔｅｒ  １０参照。細胞膜は、細胞質ゾル、または細胞の内面に面した表面と、細胞の外面または細胞外空間に面した表面とを有すると考え得る。貫膜タンパク質は両親媒性であることが多い、すなわち、貫膜タンパク質は疎水性である領域と親水性である領域とを有する。膜の中を通る領域は疎水性であり、二重層からなる脂質分子の疎水性尾部と相互作用する。親水性である領域は、膜の細胞質ゾル側または細胞外側で水に暴露される。貫膜タンパク質の貫膜ドメインは、αヘリックスの状態であるかまたは多重β鎖の状態であるかいずれかである。例えば、Ｌｏｄｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗ．Ｅ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（４ｔｈ  Ｅｄ．，２０００），ｃｈａｐｔｅｒ  ３参照。
【００６９】
「サイトカイン」とは、同じ細胞集団（オートクライン）または別の細胞集団（パラクリン）に対して細胞内メディエーターとして作用する１つの細胞集団によって放出されるタンパク質の一般名を意味する。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインの中には、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）；肝増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−αおよびβ；ミューラ管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；神経増殖因子、例えばＮＧＦ−β；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β；インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、例えばＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン類、例えばインターフェロン−α、−βおよび−γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばマクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；ならびに顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）類、例えばＩＬ−１、ＩＬ−ｌａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２；ならびにその他のポリペプチド因子、例えばＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ、ｓｔｅｅｌ因子としても知られている）が含まれる。
【００７０】
他に示されない限りは、抗体Ｈ鎖またはＬ鎖のアミノ酸位置についての本明細書での言及は、「ＫａｂａｔおよびＷｕ」システムの下でアミノ酸の番号付与をさす。Ｋａｂａｔ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｕ．Ｓ．  Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）参照。これは参照することにより本明細書に組み込まれる（ＫａｂａｔおよびＷｕデータベースおよび番号付与システムはまた、本明細書において「Ｋａｂａｔ」システムおよび番号付与と呼ばれる）。ＫａｂａｔおよびＷｕデータベースは、抗体のアミノ酸残基の番後付与のための技術において最も広く使用されるシステムであり、現在はあまりにも大きすぎで都合よく印刷することができない。それは、現在、購読サービスオンラインとして維持されており、「ｈｔｔｐ：／／」、次いで「ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／」を挿入することによって見出すことができる。「ＫａｂａｔおよびＷｕシステムの下で残基に与えられた番号は、所定のＨ鎖またはＬ鎖の残基についてその鎖のアミノ末端から数えることによって得られる番号に必ずしも対応しない。
【００７１】
「残基」または「アミノ酸残基」または「アミノ酸」という用語は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド（集合的に「ペプチド」）に組み込まれるアミノ酸に対する言及を含む。アミノ酸は、天然産アミノ酸であることができ、特に限定されない限りは、天然産アミノ酸と同様にして機能することができる天然アミノ酸の類縁体を包含することができる。
【００７２】
「保存的置換」とは、タンパク質を説明する場合には、タンパク質の活性を実質的に変化させないタンパク質のアミノ酸組成の変化を示す。従って、特定のアミノ酸配列の「保存的に修飾された変形」とは、タンパク質活性について重要でないこれらのアミノ酸のアミノ酸置換、またはアミノ酸の同様の性質（例えば、酸性、塩基性、正荷電または負荷電、極性または非極性など）をもつ別のアミノ酸による同等の重要なアミノ酸の置換が実質的に活性を変化させないような置換を示す。機能的に類似するアミノ酸を示す保存的置換表は、当該技術では周知である。次の表Ａの６つの群それぞれは、互いについて保存的置換であるアミノ酸を含んでいる：
表Ａ
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００７３】
また、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）も参照のこと。
【００７４】
「選択的に反応性の」および「選択的に結合する」という用語は、抗原に関して、抗体（全体または部分）の、該抗原を欠いている細胞または組織ではなく該抗原を有する細胞または組織との優先的会合を示す。勿論、ある程度の非特異的相互作用が分子と非標的細胞または組織の間で生じ得ることが認められる。それにもかかわらず、選択的反応性は、抗原の特異的認識によって介在されるように区別し得る。選択的反応性抗体は抗原を結合するが、これらの抗体は低親和性のためにそのように結合し得る。他方、特異的結合は、抗体と、抗原を有する細胞の間で、結合抗体と、抗原を欠く細胞の間の会合よりも強い会合をもたらす。特異的結合は、典型的には、標的抗原またはマーカーを有する細胞または組織に結合された抗体の量（単位時間当たり）を、その抗原またはマーカーを欠く細胞または組織に比べて、２倍よりも多い、好ましくは５倍よりも多い、さらに好ましくは１０倍よりも多い、最も好ましくは１００倍よりも多い増加をもたらす。このような条件下でタンパク質に対する特異的結合は、特定のタンパク質に関するその特異性について選択される抗体を必要とする。種々の免疫検定フォーマットが、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択するのに適する。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫検定法が、タンパク質と特異的に免疫反応性のモノクロナール抗体を選択するのに常用される。特異的免疫反応性を調べるのに使用できる免疫検定フォーマットおよび条件の記載については、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照。
【００７５】
「免疫学的に反応性の条件」という用語は、特定のエピトープに対して生じた抗体をそのエピトープに、実質的に全てのその他のエピトープに対する結合よりも検出できるほど多い程度まで、および／または実質的に全てのその他のエピトープに対する結合を実質的に除外してしまうほどに、結合させる条件に対する言及を含む。免疫学的に反応性の条件は、抗体結合反応のフォーマットに依存し、典型的には免疫検定プロトコールで利用される条件または生体内で遭遇する条件である。免疫検定フォーマットおよび条件の記載については、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，ｓｕｐｒａ，を参照。好ましくは、本発明の方法で用いられる免疫学的に反応性の条件は、生きている哺乳動物または哺乳動物細胞の内部に特有の条件（例えば、温度、オスモル濃度、ｐＨ）に対する言及を含む「生理学的条件」である。いくつかの臓器は過酷な条件にさらされることが認められるが、生体内および細胞内環境は、通常は約ｐＨ７（すなわち、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０、さらに典型的にはｐＨ６．５〜７．５）にあり、水を主溶媒として含有し、０℃を超える温度および５０℃よりも低い温度で存在する。オスモル濃度は、細胞の生存および増殖を支える範囲内にある。
【００７６】
（治療剤またはマーカーに対するｂｓＡＳの結合）
ｂｓＢＡのそのリガンドそれ自体に対する結合は、標的細胞の生物活性を、例えばサイトカインがそのレセプターに接近することを妨害することによって調節することを意図するが、ｂｓＢＡの生物活性に対する効果は、治療剤をｂｓＢＡに結合することによって高めることができる。従って、いくつかの実施形態において、ｂｓＢＡは治療剤の付着を可能にする官能基を導入するために誘導される。ＢｓＢＡは、例えば、ヒドラジド、ヒドラジン、一級アミン、または二級アミン基を末端とする側鎖を導入するために誘導することができる。治療剤は、例えばシッフ塩基結合、ヒドラゾンまたはアシルヒドラゾン結合あるいはヒドラジドリンカー（例えば、米国特許第５，４７４，７６５号および第５，７６２，９１８号明細書参照、これらはそれぞれ参照することにより本明細書に具体的に組み込まれる）によって接合することができる。治療剤を本発明のｂｓＡＢに接合するのに適した多数のその他の化学物質は、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９６）によって例示されるように、当該技術で周知である。
【００７７】
治療剤は、例えば抗悪性腫瘍剤、代謝拮抗剤、放射性薬剤、細胞毒性剤、および化学療法剤から選択することができる。
【００７８】
細胞毒性剤としては、抗癌剤、例えば次の抗癌剤：ゲムシタビン；メトトレキセート；５−ＦＵ；ＦＵＤＲ；ＦｄＵＭＰ；ヒドロキシ尿素；ドセタキセル；ディスコデルモライド；エポチロン類；ビンクリスチン；ビンブラスチン；ビノレルビン；ｍｅｔａ−ｐａｃ；イリノテカン；ＳＮ−３８；１０−ＯＨカンプト；トポテカン；エトポシド；アドリアマイシン；フラボピリドール；シスプラチン；カルボプラチン；ブレオマイシン；マイトマイシンＣ；ミトラマイシン；カペシタビン；シタラビン；２−Ｃｌ−２´デオキシアデノシン；ミトキサントロン；ミトゾロミド；ペントスタチン；およびラルチトレキセドが挙げられる。
【００７９】
本発明のｂｓＢＡは、診断または治療使用を促進するためにさらに修飾またはマーカーすることができる。例えば、検出可能なマーカー、例えば放射線、蛍光、重金属、またはその他のマーカーを、本発明のｂｓＢＡに結合し得る。ｂｓＢＡの単一、二重または多重マーカー化が好都合であり得る。例えば、ｂｓＢＡは、１個またはそれ以上の残基の放射性ヨウ素化と、例えばキレート基による９０Ｙのアミン含有側鎖基または反応性基への結合との両方を用いて二重マーカーすることができる。この組み合わせマーカー化は、専門診断ニーズ、例えば広く分散した新生細胞小塊の確認に有用であり得る。
【００８０】
本発明のｂｓＢＡを放射マーカーするための放射性同位体としては、ｂｓＢＡの残基に結合または結合することができる放射性同位元素が挙げられる。放射性同位体は、β線またはγ線のいずれかを放射する放射性同位体から選択することができる、あるいはまた、前記ペプチド剤は、例えば類似体のリシン残基（１個または複数）に共有結合することができるキレート基を含有させるために修飾することができる。次いで、キレート基は、種々の放射性同位体、例えばガリウム、インジウム、テクネチウム、イッテルビウム、レニウム、またはタリウム（例えば、１２５Ｉ、６７Ｇａ、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ、１６９Ｙｂ、１８６Ｒｅ）を含有させるために修飾することができる。
【００８１】
キレート基は、検出可能なマーカーまたはその他の分子を本発明のｂｓＢＡに直接に結合するのに使用し得る。例えば、二官能性の安定なキレート化剤を、１個またはそれ以上の末端または内部アミノ酸反応性基に、イソチオシアネートβ−Ａｌａまたはエドマン分解を防止する適当な非α−アミノ酸リンカーを介して結合し得る。当該技術で知られているキレート化剤の例としては、例えば、イミノカルボン酸およびポリアミノポリカルボン酸反応性基、ＤＴＰＡ（Ｎ，Ｎ−ビス［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］エチル］グリシン）、およびＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）が挙げられる。
【００８２】
癌の診断および治療に関して、本発明のｂｓＢＡは、診断およびイメージング組成物、ならびに診断およびイメージング法（例えば、生体内および生体外診断法）でｂｓＢＡを利用するキットを製造するのに使用できる。例えば、血管新生化腫瘍は、生体内診断用造影剤に結合させた診断有効量のｂｓＢＡであって腫瘍細胞、腫瘍血管系、または腫瘍間質の接近可能要素に結合する少なくとも第１の結合性分子を含有するｂｓＢＡを使用して撮像し得る。
【００８３】
病気または疾患が癌である別の好ましい実施形態では、癌治療前の予備イメージングは、（ａ）高発現レセプター特性の腫瘍細胞あるいは腫瘍血管系または腫瘍間質に高親和性を示して結合する第１の結合性分子と、第２の普遍的に発現されるレセプター（例えば、ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４）に少なくとも大規模な低親和性を示して結合する第２の結合性分子とを有する本発明の検出可能にマーカーされたｂｓＢＡを含有してなる診断有効量の医薬組成物を動物または患者に投与し；そして（ｂ）その後に腫瘍細胞、腫瘍血管または腫瘍間質に結合された、検出可能にマーカーされたｂｓＢＡを検出し；それによって腫瘍、腫瘍血管系および／または腫瘍間質の画像を得ることによって行い得る。
【００８４】
理論によって拘束されることを望むことなく、ｂｓＢＡは、細胞表面レセプターに対する結合について天然リガンドと競争することによって細胞シグナル伝達を低下、抑制または阻害することができる。この状況において、ｂｓＢＡは、リガンドの結合に際して誘発される細胞シグナル伝達を妨害することによって機能する。ＢｓＢＡはまた、細胞表面レセプターの内在化／下方制御を誘導することによって作用することができる。内在化／下方制御によって引き起こされる細胞表面でのレセプターの数の減少は、レセプター活性化の低下をもたらし、これはこれらのレセプターについてのシグナル伝達経路に沿って細胞シグナル伝達を低下または抑制する。最後に、レセプターの二量化がシグナル伝達に必要とされる場合には、ｂｓＢＡは２つの細胞表面レセプターの二量化を防止することによって作用することができる。
【００８５】
（標的として使用するためおよびエフェクターのための細胞マーカーの選択）
ｂｓＢＡを標的とするのに使用される細胞マーカーは、典型的には非標的細胞よりも標的細胞でより高いレベルで発現される、すなわち非標的細胞では発現されない。例えば、標的マーカーは、その非標的細胞における発現に比べて特定の癌で高度に過剰発現される、すなわち癌性でない細胞によって発現され得ない。
【００８６】
エフェクターとして使用される細胞マーカーは、典型的には細胞シグナル伝達、例えば所定の病態において調節するのに有益である増殖因子、サイトカイン、またはケモカインレセプターに関与する。本発明のｈｉ−ｌｏ  ｂｓＢＡによって提供される選択性により、ｂｓＢＡエフェクタードメインによって結合されるマーカーの発現は、標的細胞に限定される必要はなく、生物のその他の細胞で発現され得る。
【００８７】
（Ｋｄの測定）
ｂｓＢＡの結合分子の結合親和性は、例えば米国特許第６，７０３，０２０号明細書（参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載のように、当該技術で知られている方法を使用して測定することができる。ｂｓＢＡの第１の結合分子および第２の結合分子のそれぞれの標的レセプターに対する結合親和性、およびｂｓＢＡ−レセプター複合体の解離速度は、競合結合アッセイによって測定することができる。競合結合アッセイの一例は、例えば３Ｈまたは１２５Ｉでマーカーされた１つまたは２つのレセプターを、関心のｂｓＢＡと、増加量の非マーカーレセプターの存在下でインキュベートし、マーカーされたレセプターに結合されるｂｓＢＡを検出することからなる放射線免疫アッセイである。特定のレセプターに対する関心のｂｓＢＡの親和性および結合解離速度は、データから例えばスカッチャードプロット分析によって測定することができる。Ｋｄはまた、例えばＮｉｅｌｓｅｎらの論文（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０（２２）：６４３４−４０（２０００））に記載のようにしてフローサイトメトリーでも測定することができる。Ｋｄを測定するための代表的なアッセイを実施例に示す。
【００８８】
好ましい方法では、ｂｓＡＢのレセプター結合親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴装置（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して測定される結合速度定数および解離速度定数から決定される。典型的に、リガンド分子に対するｂｓＢＡの親和性は、適当な量（例えば、５００共鳴単位）をバイオセンサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ）上に固定することによって測定される。ｂｓＢＡの結合速度および解離速度は、典型的にはＰＢＳ中で２５μｇ／のｂｓＢＡをチップ表面全体に５分間注入し、次いで緩衝液をチップ全体に流すことによって結合された物質を５分間解離させることによって測定される。結合反応速度は、例えばソフトウエアＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ２．１（ＢＩＡｃｏｒｅ）を使用することによって解析することができる。特定のｂｓＢＡが本発明の範囲に入るか否かを調べるために、ｂｓＢＡの結合ドメインの親和性は、結合ドメインの相対親和性を決定できるようにｂｓＢＡが形成された後に（ｂｓＢＡｂにおけるその配置の前に、ドメインそれぞれの親和性を測定するのとは対照的に）決定される。
【００８９】
（所望の生物効果の測定）
本発明のｂｓＢＡは、最初に所望の治療活性または予防活性について生体外で試験されることが好ましい。例えば、ｂｓＢＡの治療または予防有用性を実証するために使用することができる生体外アッセイは、細胞系または患者組織試料に対するｂｓＢＡの効果を含む。
【００９０】
細胞系および／または組織試料に対するｂｓＢＡの効果は、当業者に知られている技法、例えば数ある中から細胞増殖アッセイ、細胞生存アッセイ、タンパク質リン酸化のアッセイ、プロテインキナーゼ活性、アポトーシスアッセイ、およびタンパク質合成阻害研究を利用することによって調べることができる。抗体マイクロアレイは、タンパク質経路における多数のタンパク質についての効果を調べることができる。このようなアッセイは、例えばＮｉｅｌｓｅｎらの論文（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，１００（１６）：９３３０−５．（２００３））（「Ｎｉｅｌｓｅｎ  ２００３」という）に記載されている。この場合、ＢｓＢＡは、ヒトの臨床試験を実施する前に、ヒト以外の動物での効果について生体内で試験される。
【００９１】
（一価結合組成物の作製）
ｂｓＢＡが化学的架橋によって作製される場合には、非架橋フラグメントはそれ自体一価の結合フラグメントである。遺伝子操作によって結合された（すなわち、組換え発現された）ｂｓＢＡの場合には、一価の結合組成物は、個々の結合タンパク質を一価結合タンパク質の発現および単離を可能にする発現ベクターにクローニングすることによって作製することができる。この場合の個々の一価の結合組成物の親和性は、前記に示したようにして測定することができる。
【００９２】
（等価Ｋｄの試験）
等価Ｋｄは、一価の結合組成物を使用して、前記に示した方法により測定し得る。
【００９３】
（ｂｓＢＡおよび一価結合組成物の結合の比較）
一価結合組成物およびｂｓＢＡは、例えばその治療剤としての効果を評価するためにおよびｂｓＢＡの効果と比較するために、生物活性アッセイに供し得る。このようなアッセイは、当該技術で知られており、標的抗原に依存する。例として、ＥＬＩＳＡによるかまたはヘレグリンまたはその他の増殖因子を用いた活性化の後の免疫ブロット法によるＡＫＴリン酸化の測定、増殖阻止アッセイ（例えば国際公開第ＷＯ８９／０６６９２パンフレットに記載されている）；またはアポトーシスのアッセイが挙げられる。
【００９４】
リン酸化については、例えばエフェクター分子それ自体または下流キナーゼの活性化に対する結合分子の効果を測定するために標準免疫ブロット法を使用し得るし、または抗体アレイをＮｉｅｌｓｅｎ  ２００３（ｓｕｐｒａ）に詳細に記載されているようにして使用し得る。
【００９５】
アポトーシスについては、ＤＮＡフラグメント化を、アポトーシス細胞中のＤＮＡニックを検出する標準的な電気泳動またはＴＵＮＥＬ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニックおよびマーカー）アッセイを使用して生体外で検出することができる。細胞が固定されると、ＤＮＡ鎖の切断は、マーカーされたヌクレオチドをこれらのＤＮＡフラグメントの３´ヒドロキシル末端に鋳型に依存しない方法で共有的に付加する哺乳動物末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を使用してその場で検出することができる。
【００９６】
細胞の生存および増殖は、種々の化学的および生物学的試薬を用いて監視することができる。例えば、細胞周期関連マーカーに対する抗体または蛍光に基づく細胞生存および増殖アッセイ、例えばトリチウム化チミジンアッセイ、トリパンブルー排除アッセイ、ＡＴＣＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ（登録商標）ＭＴＴ細胞増殖アッセイ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、またはＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）細胞生存アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。
【００９７】
（増殖因子レセプターを結合するためのｂｓＢＡの使用）
多数の分子を、本発明のｂｓＢＡのエフェクタードメインによって結合することができる。一連の重要な実施形態において、エフェクタードメインは、細胞表面の増殖因子レセプター、例えばチロシンキナーゼレセプターを結合する。多数の重要な増殖因子レセプターおよびそのリガンド、例えば上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリーに属するレセプターおよびリガンドの過剰発現または不適切な活性化は、病気および障害、例えば癌および自己免疫疾患の開始および進行に関係しているかまたはこれらを招くことが知られている。これらの増殖因子は、疾患細胞の生存、増殖または移動を刺激するためにオートクラインおよび／またはパラクリン様式で作用すると考えられる。増殖因子のそのレセプターに対する結合は、レセプター二量化によるレセプターの活性化であって、例えばレセプター自己リン酸化およびその後の種々のシグナル伝達分子のアレイによるシグナル伝達をもたらす活性化をもたらす。
【００９８】
増殖因子の結合の活性の妨害またはこのような細胞中のチロシンキナーゼレセプターの活性化は、非癌性表現型を保存するかまたは病気に冒された細胞の増殖の速度を低下させることができる。すなわち、レセプターを本発明のｂｓＢＡと接触させると、リガンド、例えば増殖因子のその細胞表面レセプターに対する結合により生じるシグナルを妨害する。ｂｓＢＡは、リガンドがレセプターに結合することを防止するかまたは抑制することによって、あるいはリガンド誘発のレセプター二量化を防止するかまたは抑制することによって、シグナル伝達経路の活性化を防止するかまたは抑制する。
【００９９】
本発明の方法において有用な結果をもたらすためにｂｓＢＡのエフェクタードメインによって結合されることができる代表的なチロシンキナーゼレセプター（括弧内に示した別の名称を有する）としては：
ＡＬＫ（未分化リンパ腫キナーゼ）、すなわち未分化大型細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）でキメラＮＰＭ−ＡＬＫタンパク質の部分として発現されるチロシンキナーゼレセプター；
ジスコイジンドメインレセプター（ＤＤＲ）、すなわちレクチンジスコイジンＩに相同性の独特の細胞外ドメインによって識別されるレセプターチロシンキナーゼ（ジスコイジンレセプターチロシンキナーゼ）（チロシン−プロテインキナーゼＣＡＫ）（細胞接着キナーゼ）（ＴＲＫ  Ｅ）（タンパク質−チロシンキナーゼＲＴＫ６）（ＣＤ１６７ａ抗原）；
ジスコイジンドメインレセプター２前駆物質（レセプタータンパク質−チロシンキナーゼＴＫＴ）（チロシン−プロテインキナーゼＴＹＲＯ１０）（神経栄養性チロシンキナーゼ、レセプター関連３）；
上皮増殖因子レセプター（レセプタータンパク質−チロシンキナーゼＥｒｂＢ−１）；
レセプタータンパク質−チロシンキナーゼＥｒｂＢ−２（ｐ１８５ｅｒｂＢ２）（ＮＥＵプロトオンコジーン）（Ｃ−ｅｒｂＢ−２）；
レセプタータンパク質−チロシンキナーゼｅｒｂＢ−３前駆物質（ｃ−ｅｒｂＢ３）（チロシンキナーゼ型細胞表面レセプター）；
レセプタータンパク質−チロシンキナーゼｅｒｂＢ−４（ｐｌ８０ｅｒｂＢ４）（チロシンキナーゼ型細胞表面レセプター）；
塩基性線維芽細胞増殖因子レセプター１（ＦＧＦＲ−１）（ｂＦＧＦ−Ｒ）（Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−２）（ｃ−ｆｇｒ）；
ＦＬサイトカインレセプター（チロシン−プロテインキナーゼレセプターＦＬＴ３）（幹細胞チロシンキナーゼ１）（ＳＴＫ−１）（ＣＤ１３５抗原）；
マスト／幹細胞増殖因子レセプター（ＳＣＦＲ）（プロトオンコジーンチロシン−プロテインキナーゼＫｉｔ）（ｃ−ｋｉｔ）（ＣＤ１１７抗原）；
白血球チロシンキナーゼレセプター（タンパク質チロシンキナーゼ−１）；
肝細胞増殖因子レセプター（Ｍｅｔプロトオンコジーンチロシンキナーゼ）（ｃ−ｍｅｔ）（ＨＧＦレセプター）（ＨＧＦ−ＳＦレセプター）；
タンパク質−チロシンホスファターゼｅｔａ（Ｒ−ＰＴＰ−ｅｔａ）（ＨＰＴＰ  ｅｔａ）（タンパク質−チロシンホスファターゼレセプターＪ型）（密度増強ホスファターゼ−１）（ＤＥＰ−１）（ＣＤ１４８抗原）；
プロトオンコジーンチロシン−プロテインキナーゼレセプターｒｅｔ（Ｃ−ｒｅｔ）；
チロシン−プロテインキナーゼ貫膜レセプターＲＯＲ１（神経栄養性チロシンキナーゼ、レセプター関連１）；
チロシン−プロテインキナーゼ貫膜レセプターＲＯＲ２（神経栄養性チロシンキナーゼ、レセプター関連２）；
チロシン−プロテインキナーゼレセプターＴｉｅ−１；
アンジオポイエチン１レセプター（チロシン−プロテインキナーゼレセプターＴＩＥ−２）（チロシン−プロテインキナーゼレセプターＴＥＫ）（Ｐ１４０  ＴＥＫ）（内皮内膜細胞キナーゼ）（ＣＤ２０２ｂ抗原）；
高親和性神経増殖因子レセプター（ＴＲＫＩ形質転換チロシンキナーゼタンパク質）（ｐｌ４０−ＴｒｋＡ）（Ｔｒｋ−Ａ）；
ＢＤＮＦ／ＮＴ−３増殖因子レセプター（ＴｒｋＢチロシンキナーゼ）（ＧＰ１４５−ＴｒｋＢ）（Ｔｒｋ−Ｂ）；
ＮＴ−３増殖因子レセプター（ＴｒｋＣチロシンキナーゼ）（ＧＰ１４５−ＴｒｋＣ）（Ｔｒｋ−Ｃ）；
血管内皮増殖因子レセプター１（ＶＥＧＦＲ−１）（血管透過性因子レセプター）（チロシン−プロテインキナーゼレセプターＦＬＴ）（Ｆｌｔ−１）（チロシン−プロテインキナーゼＦＲＴ）（Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１）；
血管内皮増殖因子レセプター２（ＶＥＧＦＲ−２）（キナーゼ挿入ドメインレセプター）（タンパク質−チロシンキナーゼレセプターＦｌｋ−１）；および
血管内皮増殖因子レセプター３前駆物質（ＥＣ２．７．１．１１２）（ＶＥＧＦＲ−３）（チロシン−プロテインキナーゼレセプターＦＬＴ４）
が挙げられる。
【０１００】
以下の議論は、エフェクタードメインと結合するのに特に有用なチロシンキナーゼレセプター、および本発明の方法で有効に調節することができるその他のレセプターファミリーに関してさらに具体的な情報を記載する。
【０１０１】
（上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）／ＥｒｂＢレセプター）
１回貫通（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ）チロシンキナーゼレセプターのＥＧＦＲ／ＥｒｂＢファミリーは、４つのメンバー：すなわち上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）およびＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）からなる。ＥｒｂＢレセプターを結合し、活性化する多数のリガンド（これらは全て、異なる遺伝子産物である）が、確認されている。これらのレセプターおよびリガンドは、正常細胞の増殖および分化において重要な役割を果たす。
【０１０２】
ＥｒｂＢレセプタータンパク質の異常なシグナル伝達および／または調節されない活性化は、多数の癌の発生および進行と関係がある。機能不全ＥｒｂＢレセプター経路が介在する調節されない細胞増殖が、上皮起源の種々様々な固形癌において認めることができ、データは進行性疾患に対する腫瘍ＥｒｂＢレセプター発現、過剰発現および／または異常調節、転移性表現型、化学療法耐性および全体にわたる不十分な予後に関係がある。さらにまた、データはまた、高められた腫瘍浸潤、細胞アポトーシスの阻害、高められた細胞接着および血管新生におけるＥｒｂＢレセプターに関係している。特に、ＥＧＦＲの高められた発現が、乳房、膀胱、肺および胃のより攻撃的な癌で観察されている（Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ  ａｎｄ  Ｄｅａｎ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．４：２７７−２９６，（１９９４））。ヒトＥｒｂＢ２の過剰発現は、乳および卵巣の癌（Ｓｌａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：１７７−１８２（１９８７）およびＳｌａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７０７−７１２（１９８９））ならびに胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸および膀胱の癌と関係づけられている。著しく高められたレベルのＥｒｂＢ３がある種のヒト乳腺腫瘍細胞系と関係付けられており、ＥｒｂＢ３がＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ２のようにヒト悪性腫瘍において役割を果たすことを示している。具体的には、ＥｒｂＢ３が、乳癌（Ｌｅｍｏｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｍｃｅｒ  ６６：１１１６−１１２１，１９９２）、胃腸癌（Ｐｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６８：２７５−２８０，１９９２；  Ｒａｊｋｕｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７０：２７１−２７８，１９９３；およびＳａｎｉｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５４：９３５−９４０，１９９３）、および膵癌（Ｌｅｍｏｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６８：２６９−２７３，１９９２およびＦｒｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １：１４１３−１４２０，１９９５）で過剰発現されることが認められている。最後に、高められたＥｒｂＢ４発現はまた、ヒトの癌、例えば上皮起源の癌、例えば乳腺腺癌と密接に関連している。
【０１０３】
ＥｒｂＢファミリーのタンパク質レセプターが介在するシグナル伝達は、多くの場合、リガンド誘発レセプターへテロ二量化に際して生じる。へテロ二量化の後の「レセプタークロストーク」は、ＥｒｂＢレセプターキナーゼドメインの活性化、および例えばＥＧＦＲとＥｒｂＢ２の間、ＥｒｂＢ２とＥｒｂＢ３の間、およびＥｒｂＢ２とＥｒｂＢ４の間で生じることが知られているＥｒｂＢレセプターの交差リン酸化をもたらす（例えば、Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６１：１３３９−１３４７（１９９０）；  Ｐｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：４７３−４７５（１９９３）；  Ｃａｒｒａｗａｙ  ａｎｄ  Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｃｅｌｌ  ７８：５−８（１９９４）；  Ｒｉｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １２：３４５−３５３（１９９６）；Ｋｏｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５８：２８７−２９２（１９８９）；Ｓｔｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．  ７：９９５−１００１（１９８８）；およびＫｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ４：１３−１８（１９８９）参照）。
【０１０４】
本発明のｂｓＢＡの製造に使用される好ましい結合分子は、例えば米国特許第５，１８３，８８４号、第５，４８０，９６８号、第５，９６８，５１１号、第５，９７７，３２２号および第６，５１２，０９７号明細書；Ｋｒａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９１９３−９１９７（１９８９）；欧州特許出願公開第４４４，９６１Ａ１号明細書；ならびにＫｒａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２９００−２９０４（１９９３）に記載されており、これらのそれぞれは参照することにより本明細書に組み込まれる。治療の方法の実施形態は、癌の他に１つまたは複数の病態、例えば免疫不全、神経疾患、例えば神経線維腫症および末梢神経障害、ならびに心疾患、例えば心臓肥大を包含する。
【０１０５】
（インスリンレセプター（ＩＲ）およびインスリン様増殖因子レセプター（ＩＧＦ−Ｒ））
インスリンレセプターおよびＩＧＦ−１レセプターは、２つの主要な病気、すなわち糖尿病および癌用の新規な治療剤の開発のための重要な標的であるタンパク質に密接に関連している。糖尿病は、重要性を増しつつある世界的規模の健康問題である。糖尿病は、世界保健機構によって流行病として分類されている唯一の非感染症である。世界中で、糖尿病の発生は２〜３％であり、米国および欧州諸国では６％まで上昇する。
【０１０６】
インスリン様増殖因子レセプター（ＩＧＦＲ）がある種の癌および乾癬において重要な役割を果たすという証拠が増えつつある。これらのレセプターにより調節解除されたシグナル伝達は、放射線療法および化学療法に耐性をもつ例えばウイルムス腫瘍形成、胚芽腫、肝臓癌、結腸直腸癌、乳癌、腺癌、多発性骨髄腫、リンパ腫、白血病、前立腺癌、および肺癌の病因と関係がある。インスリンおよびＩＧＦレセプターは、ＥｒｂＢレセプターファミリーと密接な関係がある。
【０１０７】
インスリン様増殖因子レセプター（ＩＧＦＲ）は、体の多くの細胞の正常機能の維持に関与する。ＩＧＦ−ＩＩレセプターは、一般に腫瘍細胞によって発現され、オートクライン増殖因子として作用し得る；場合により標的組織に到達し、腫瘍誘発低血糖症を引き起こすことさえある。ＩＧＦ−Ｉレセプターは一般に多くの癌で過剰発現され、多くの最近の研究は癌細胞の増殖、接着、移動、および細胞死に影響を及ぼすＩＧＦ−Ｉレセプターから発生する新しいシグナル伝達経路；癌細胞の生存および転移に重要な機能を確認している（例えば、ＬｅＲｏｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．１９５：１２７−１３７（２００３）参照）。  Ｔｈｅ  ＩＧＦ−Ｉレセプターは、多くの正常細胞もまたこのレセプターを発現することから癌治療剤の有望な標的とみなされていない。科学的証拠は、ＩＧＦ−Ｉレセプター阻害が細胞増殖または腫瘍成長に関連した多様な細胞内シグナルに強い衝撃を与え、どのようにしてＩＧＦ−Ｉレセプター阻害が腫瘍細胞を慣用の化学療法またはその他の抗癌剤により感受性にすることができるかを説明することができるメカニズムを提供することを示唆している。ＩＧＦ−Ｉレセプターのシグナル伝達の阻害は、腫瘍増殖を抑制し、患者の生存を延ばし、多発性骨髄腫およびその他の血液悪性腫瘍の臨床関連マウスモデルにおいて化学療法の抗腫瘍効果を高めることは、おそらく最も重要である。従って、ｂｓＢＡの低親和性結合分子がＩＧＦ−Ｉレセプターに結合するｂｓＢＡが、ＩＧＦ−Ｉレセプターを優先的に標的とする従来の治療剤の欠陥を克服するであろう（すなわち、非標的、非疾患細胞においてＩＧＦ−Ｉレセプターシグナル伝達の阻害を回避することによって）ことが意図される。ここでは、ｂｓＢＡの高親和性結合分子が、ｂｓＢＡを疾患細胞（例えば、ＩＧＦ−Ｉレセプターの過剰刺激の阻害が望まれる細胞）に特異的に標的に向ける細胞表面レセプターに結合することが好ましい。いったん疾患細胞に優先的に標的に向けられると、ここでｂｓＢＡの低親和性結合分子はＩＧＦ−Ｉに結合し、病状に関連した不適切な細胞シグナル伝達を阻害することができる。
【０１０８】
乳房の進行期腺癌を有する患者に関する治療方針は、細胞障害性化学療法の使用を含む場合が多い。ＩＧＦ−Ｉレセプター（細胞周期の調節の重要因子）は、高悪性度の乳癌では過剰発現される場合が多く、これらの癌の主な標的に相当する。ＥｒｂＢ２を過剰発現する乳癌細胞の増殖を阻止する抗ＨＥＲ２／ｎｅｕレセプターモノクロナール抗体（トラスツズマブ、ハーセプチン（登録商標）としても知られている）を使用して乳癌について治療を受けている患者が、一般に抗体に対する耐性を生じることも認められている。インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）（これは細胞生存シグナルを活性化する）がトラスツズマブの増殖阻止作用を妨げることが観察されている。本発明のｂｓＢＡを使用してＩＧＦ−Ｉレセプターによる細胞シグナル伝達を妨げ、抑制し、または阻止することによって、トラスツズマブ誘発増殖阻止を回復させることができる（例えば、Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃｅｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ９３：１８５２−１８５７、２００１参照）。従って、本発明のｂｓＢＡの１つの可能な使用は、トラスツズマブあるいはその他の現在または将来の抗癌治療剤に対する耐性の発現を防止または遅らせるためにＩＧＦ−Ｉレセプターシグナル伝達を標的とすることにある。
【０１０９】
最も悪い予後および致命的結果を伴う小児悪性腫瘍の中に、中枢神経系（ＣＮＳ）非典型な類奇形／類横紋筋腫瘍（ＡＴＴ／ＲｈＴ）がある。今日まで、その細胞障害抑制剤および放射線療法に対する著しい耐性に関する説明はない。ＩＧＦ−Ｉレセプターは、細胞の生存、増殖、形質転換、およびアポトーシスの調節において重要な役割を果たす。ＩＧＦ−Ｉレセプターは、種々様々な抗癌剤および放射線によって誘発されるアポトーシスから癌細胞を保護するが、インヒビター、例えばアンチセンス戦略、ドミナントネガティブ突然変異体、または三重らせん形成によって傷つけられる場合には、腫瘍細胞は広範なアポトーシスを行い、実験動物モデルにおいて腫瘍形成および転移の阻害をもたらす。ＩＧＦ−Ｉレセプターを標的とする本発明のｂｓＢＡは、ＩＧＦ−Ｉレセプターの活性化によってシグナル伝達を妨げるかまたは抑制し、それによって病気の病態、例えば癌を治療するのに使用ことができる。
【０１１０】
インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）シグナル伝達経路とエストロゲンレセプター（ＥＲ）シグナル伝達経路の間のクロストークは、相乗的増殖をもたらす。エストロゲンは、ＩＧＦ−Ｉレセプターの発現およびその下流シグナル伝達分子、ならびにインスリンレセプター基質（ＩＲＳ）−１およびＩＲＳ−２を誘導することによってＩＧＦシグナル伝達を高める。ＩＧＦ−ＩレセプターおよびＩＲＳ発現のエストロゲン誘導は、ＩＧＦ−Ｉ刺激、次いで高められたマイトジェンによって活性化されたプロテインキナーゼ活性化の後にＩＲＳ−１の高められたチロシンリン酸化をもたらす。これは、ＩＧＦ−Ｉレセプターの活性化がエストロゲン介在の増殖および乳癌発病に関与することを示している（例えば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １３：７８７−７９６，１９９９参照）。従って、ＩＧＦ−Ｉレセプターを標的とすることができる本発明のｂｓＢＡは、ＩＧＦ−Ｉレセプターの活性化によってシグナル伝達を妨げるかまたは抑制し、それによってエストロゲン誘発乳癌病態を治療するのに使用ことができる。
【０１１１】
（血管内皮増殖因子レセプター（ＶＥＧＦＲ））
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、低酸素および発癌突然変異によって誘発される多機能サイトカインである。ＶＥＧＦは、胚形成における血管網の発生および維持の主な刺激剤である。ＶＥＧＦは、効果のある透過性誘発剤、内皮細胞走化性物質、内皮生存因子、および内皮細胞増殖因子として機能する（Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７１：６０３−６０６、１９９６；およびＮｅｕｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１３：９−２２，１９９９）。ＶＥＧＦは、多数の生理学的および病理学的プロセス、例えば創傷治癒（Ｆｒａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｂｕｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、糖尿病性網膜症（Ａｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，、１９９５；Ｍａｌｅｃａｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、乾癬（Ｄｅｔｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、アテローム性動脈硬化症（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、慢性関節リウマチ（Ｈａｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｎａｇａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、および固形腫瘍増殖（Ｐｌａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｃｌａｆｆｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）において血管新生または脈管形成を駆動する重要な因子である。
【０１１２】
種々様々な細胞および組織がＶＥＧＦを生成する。ＶＥＧＦ二量体は、高親和性を示して２つの十分に特定されたレセプター、すなわち内皮細胞で選択的に発現されるＶＥＧＦＲＩ（ＦＬＴ−１）およびＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）に結合する（Ｆｌｔ−１およびＦｌｋ−１はマウス同族体である）。ＶＥＧＦＲＩおよびＶＥＧＦＲ２に結合するＶＥＧＦのＫｄは、それぞれ１５〜１００ｐＭおよび４００〜８００ｐＭである（Ｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。最近確認された第３の細胞表面タンパク質、ニューロピリン−１もまた高親和性を示してＶＥＧＦを結合する（例えば、Ｓｏｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．９２（６）：７３５−４５（１９９８））。
【０１１３】
ＶＥＧＦＲＩおよびＶＥＧＦＲ２は、７個の細胞外ＩｇＧ様反復、一回貫通貫膜ドメイン、および細胞内スプリットチロシンキナーゼドメインによって特定されるＴｙｐｅ  ＩＩＩ型レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ  ＩＩＩ）ファミリーのメンバーである（Ｍｕｓｔｏｎｅｎ  ａｎｄ  Ａｌｉｔａｌｏ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２９：８９５−８９８（１９９５））。ごく最近まで、ＶＥＧＦＲＩおよびＶＥＧＦＲ２は、ほぼ例外なく内皮細胞（ｉｄ．）で発現されると考えられていた。最近の研究により、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲＩ、およびＶＥＧＦＲ２のそれぞれは、脈管形成、血管新生、および胚発生に不可欠であることが明らかにされている。ＶＥＧＦＲ１は、ＶＥＧＦに対してＶＥＧＦＲ２よりも高い親和性を有するが、低いチロシンキナーゼ活性を有する。
【０１１４】
ＶＥＧＦレセプターに対するＶＥＧＦ二量体の結合は、レセプターの二量化を誘発すると考えられる。次いで、レセプターの二量化は、シグナル伝達カスケードを招く特定のチロシン残基の自己リン酸基転移反応を生じる。ＶＥＧＦ誘発シグナル伝達のさらに下流の細胞内事象はあまり明らかではないが、多数の群がＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦ活性化の後に酸化窒素（ＮＯ）が生成することを明らかにしている（Ｋｒｏｌｌ  ａｎｄ  Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２５２（３）：７４３−６（１９９８））。ＶＥＧＦによるＶＥＧＦＲ１ではなくＶＥＧＦＲ２の活性化が、ＳｒｃおよびＲａｓ−ＭＡＰキナーゼカスケード、例えばＭＡＰキナーゼ、ＥＲＫ１および２を活性化することも明らかにされている（Ｋｒｏｌｌ  ａｎｄ  Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７２（５１）：３２５２１−７（１９９７））。
【０１１５】
本発明のｂｓＢＡを調製するのに使用される好ましい結合分子は、例えば米国特許第５，８４０，３０１号、第５，８７４，５４２号、第６，７０３，０２０号明細書、ならびに国際公開第ＷＯ９９／４０１１８号パンフレットに記載されており、これらのそれぞれは参照することにより本明細書に組み込まれる。ｂｓＢＡを調製するのに使用される好ましい結合分子は、モノクロナール抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  １５９５）である。ＶＥＧＦレセプターに対してＲＮＡアプタマー、アンチセンス分子およびリボザイムもまた、ｂｓＢＡにおいて結合分子として使用できる。好ましいＲＮＡアンチセンス分子、アプタマーおよびリボザイムは、例えばＳａｌｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６（２）：３９３−４０１（１９９６）；  Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９３（１６）：８５０２−７（１９９６）；  Ｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ．１２（６）：１３９１−６（１９９８）およびＰａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７（１３）：２５６９−７７（１９９９）に記載されている；これらのそれぞれは、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０１１６】
本発明の組成物および使用方法は、特に任意の型の血管新生腫瘍；黄斑変性症、例えば老化関連黄斑変性症；関節炎、例えば慢性関節リウマチ；アテローム性動脈硬化症およびアテローム硬化型プラーク；糖尿病性網膜症およびその他の網膜症；甲状腺過形成、例えばグレーブス病；血管腫；血管新生緑内障；および乾癬（これらはＶＥＧＦレセプターの不適切なまたは過度の活性化と関連がある）を有するかまたはこれらを患う危険性がある動物および患者（例えば、ヒト患者）に使用することを目的とする。
【０１１７】
本発明の組成物および使用方法は、さらに、動静脈奇形（ＡＶＭ）、髄膜腫および血管再狭窄、例えば血管形成後の再狭窄、ＶＥＧＦレセプターの不適切なまたは過度の活性化と関連がある病気を有するかまたはこれらを患う危険性がある動物および患者の治療を目的とする。治療方法および使用の別の目的とする標的は、下記のＶＥＧＦレセプター関連疾患：血管線維腫、皮膚炎、子宮内膜症、血友病性関節、肥厚性痕跡、炎症性の疾患および障害、化膿性肉芽腫、強皮症、滑膜炎、トラコーマおよび血管接着を有するかまたはこれらを患う危険性がある動物および患者である。
【０１１８】
前記に示した処置群は、本発明のｂｓＢＡで治療することができる病気を網羅するものではない。米国特許第５，７１２，２９１号明細書（参照することにより本明細書に組み込まれる）には、エフェクタードメインをＶＥＧＦレセプターの１つに指向させる場合に、本発明のｂｓＢＡを使用することによって効果的に治療し得る多数のその他の病気を特定する方法が開示されている。また、ＶＥＧＦＲを結合するエフェクタードメインを有する本発明のｂｓＢＡを使用して治療することができる別の病気が、例えば米国特許第６，７０３，０２０号明細書（参照することにより本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。
【０１１９】
（腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ））
腫瘍壊死因（ＴＮＦ）αおよびβは、ＴＮＦレセプターを介して作用して多数の生物学的プロセス、例えば感染ならびにショックおよび炎症性疾患の誘導に対する保護を調節するサイトカインである。ＴＮＦ分子は、「ＴＮＦリガンド」スーパーファミリーに属し、そのレセプターまたはカウンターリガンド、すなわち「ＴＮＦレセプター」スーパーファァミリーと一緒になって作用する。これまで、ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの９個のメンバーが確認されており、ＴＮＦレセプタースーパーファミリーの１０個のメンバーが特定されている。リガンドの中には、ＴＮＦ−β、リンホトキシン−β（ＬＴ−β、ＴＮＦ−βとしても知られている）、ＬＴ−β（複合ヘテロ三量体ＬＴ−２−β中に見出される）、ＦａｓＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌおよび神経増殖因子（ＮＧＦ）が含まれる。ＴＮＦレセプターのスーパーファミリーは、ｐ５５ＴＮＦレセプター、ｐ７５ＴＮＦレセプター、ＴＮＦレセプター関連タンパク質、ＦＡＳ抗原またはＡＰＯ−１、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、低親和性ｐ７５およびＮＧＦ−レセプターを包含する（例えば、Ａ．Ｍｅａｇｅｒ，  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ２２：２９１−２９５，１９９４参照）。
【０１２０】
ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの多数のメンバーは、活性化Ｔ細胞によって発現され、これらが細胞個体発生および機能の基礎となるその他の細胞型とのＴ細胞相互作用に必要であることを暗示する（Ｍｅａｇｅｒ  １９９４，ｓｕｐｒａ）。ＴＮＦレセプターファミリーのいくつかのメンバーの本質的な機能の注目に値する洞察が、これらのタンパク質の発現を止める突然変異体の確認および作製から得られている。例えば、ＦＡＳ抗原およびそのリガンドにおける自然に発生する突然変異体は、リンパ球増殖性疾患を引き起こし（例えば、Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：３１４，１９９２参照）、おそらくはプログラムされた細胞死の失敗をもたらす。ＣＤ４０リガンドの突然変異体は、血漿中の高レベルの免疫グロブリンＭおよび低レベルの免疫グロブリンＧに特徴があるＸ連鎖免疫不全状態を引き起こし、不完全なＴ細胞依存性Ｂ細胞活性化を示す（例えば、Ｒ．Ｃ．Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９９０，１９９３参照）。低親和性神経増殖因子レセプターの標的とされる突然変異は、末梢構造の不完全な感覚革新（ｓｅｎｓｏｒｙ  ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）に特徴がある疾患を生じる（例えば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６９：７３７，１９９２参照）。
【０１２１】
ＴＮＦＲリガンド、すなわちＴＮＦおよびＬＴ−リガンドは、２つのＴＮＦレセプター（５５ｋｄのＴＮＦレセプターおよび７５ｋｄのＴＮＦレセプター）に結合することができる。そのレセプターに作用するＴＮＦおよびＬＴ−リガンドによって誘発される多数の生物効果としては、移植腫瘍の出血性壊死、細胞障害性、内毒素ショックの役割、炎症、免疫調節、増殖および抗ウイルス反応、ならびに電離放射線の悪影響に対する保護が挙げられる。ＴＮＦおよびＬＴ−リガンドは、広範な病気、例えば内毒素ショック、大脳マラリア、腫瘍、自己免疫疾患、ＡＩＤＳおよび移植片宿主拒絶反応の病因に関与する（Ｂｅｕｔｌｅｒ  ａｎｄ  Ｖｏｎ  Ｈｕｆｆｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：６６７−６６８，１９９４）。ｐ５５レセプターにおける突然変異は、微生物感染症に対して高められた感受性を生じる。
【０１２２】
別のＴＮＦＲ、すなわちＴＮＦ関連アポトーシス誘発リガンドすなわち「ＴＲＡＩＬ」は、多数のヒト組織（例えば、脾臓、肺、前立腺、胸腺、卵巣、小腸、結腸、末梢血リンパ球、胎盤、腎臓）で発現される。ＴＲＡＩＬが、ＦＡＳ／Ａｐｏ−ＩＬによる死シグナル伝達に類似するが、ＴＮＦ誘発アポトーシスよりもさらに早い時間枠の中で、ＦＡＳリガンドと無関係に作用し、アポトーシスを迅速に活性化することが明らかにされている。
【０１２３】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーリガンドが、大多数の多面性サイトカインの中で、多数の細胞応答、例えば細胞障害性、抗ウイルス活性、免疫調節活性、および数種の遺伝子の転写調節を誘発することが知られている。ＴＮＦ−ファミリーリガンドに対する細胞応答としては、正常な生理学的応答ばかりではなく、高められたアポトーシスまたはアポトーシスの阻害と関連した病気も挙げられる。アポトーシスがプログラムされた細胞死は、免疫系の末梢Ｔリンパ球の欠失に関与する生理学的メカニズムであり、その異常調節は多数の異なる発病プロセスをもたらすことができる。高められた細胞生存；またはアポトーシスの阻害と関係がある病気としては、癌、自己免疫疾患、ウイルス感染症、炎症、移植片対宿主病、急性移植片拒絶反応、および慢性移植片拒絶反応が挙げられる。高められたアポトーシスと関係がある病気としては、ＡＩＤＳ、神経変性障害、骨髄異形成症候群、虚血性障害、毒素誘発肝疾患、敗血症性ショック、悪液質、および無食欲症が挙げられる。
【０１２４】
本発明のｂｓＢＡは、２つの結合ドメインの少なくとも１つがＴＮＦＲに特異的に結合するように調製することができる。次いで、このようなｂｓＢＡは、ＴＮＦＲを活性化することによって、例えばＴＮＦＲを結合することによって、それによってアポトーシスを促進しおよび不適切な細胞増殖（例えば、癌の場合）を抑制または低下させることによって癌、自己免疫疾患、ウイルス感染症、炎症、移植片対宿主病、急性移植片拒絶反応、および慢性移植片拒絶反応を治療する方法において使用することができる。好ましい実施形態においては、ｂｓＢＡの結合分子の１つはＴＮＦＲを結合しかつ第２の結合分子は標的細胞で発現されることが知られている第２のレセプター（例えば、第２の異なるＴＮＦＲ、または疾患特異的レセプター）に結合する。癌の場合には、好ましい第２のレセプターは、ＥｒｂＢファミリー、例えばＥｒｂＢ２のレセプターである。好ましくは、ＴＮＦＲを結合するｂｓＢＡの結合分子は、第２の結合分子がそのレセプターに対して有する親和性よりも低い親和性を有する。
【０１２５】
あるいは、本発明のｂｓＢＡは、２つの結合分子の少なくとも１つがＴＮＦＲに特異的に結合し、ＴＮＦＲの活性化を、例えばＴＮＦＲに結合するリガンドをブロックすることによって抑制するかまたは低下させるように調製することができる。このようなｂｓＢＡは、ここでは、ＴＮＦＲの活性化を抑制するかまたは低下させることによって、例えばＴＮＦＲに結合するリガンドを抑制するかまたは低下させることによって、それによってアポトーシスを抑制または低下させることによってＡＩＤＳ、神経変性障害、骨髄異形成症候群、虚血性障害、毒素誘発肝疾患、敗血症性ショック、悪液質、および無食欲症を治療する方法において使用することができる。好ましくは、２つの結合分子の少なくとも１つがＴＮＦＲに特異的に結合するｂｓＢＡは、高められたアポトーシスが示す病気（例えば、虚血性障害）を治療するのに使用される。好ましい実施形態において、ｂｓＢＡのターゲッティングドメインは、抗原に指向させられるかまたは標的細胞で発現される第２のレセプター（すなわち、ＴＮＦＲ以外のレセプター）に指向させられ、ｂｓＢＡを標的細胞に向けるのに使用される。
【０１２６】
（線維芽細胞増殖因子レセプター（ＦＧＦＲ））
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）シグナル伝達経路は、正常な発育および創傷治癒の重要な部分である。チロシンキナーゼファミリーのメンバーであるＦＧＦは、その効果を細胞表面レセプターを介して生じる。ヒトでは、４種類の線維芽細胞増殖因子レセプター（ＦＧＦＲ）が確認されている（ＦＧＦＲ１〜ＦＧＦＲ４）。
【０１２７】
ＦＧＦＲは、二量化の後に自己リン酸化によって活性化される。二量化は、ヘパラン硫酸塩の存在下でのリガンド結合後に生じ、ＦＧＦＲの細胞質ドメイン内の数個のチロシン残基のリン酸化をもたらす。ＦＧＦＲのリン酸化は、キナーゼ活性を活性化し、ＭＡＰＫ、ＰＩ３キナーゼおよびＳｔａｔｌ／３経路の活性化を招く。
【０１２８】
ＦＧＦＲ遺伝子における突然変異は、典型的にはレセプターの不適切な活性化による疾患または障害をもたらす機能獲得型突然変異をもたらす。ＦＧＦＲ突然変異は、いくつかの発達障害、例えばプファイファー症候群、ジャクソン−ウェイス症候群、クルゾン症候群、アペール症候群、Ｂｅａｒｅ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  Ｃｕｔｉｓ  Ｇｙｒａｔａ症候群、Ｓａｅｔｈｒｅ−Ｃｈｏｔｚｅｎ症候群、軟骨形成不全、致死性骨異形成症、低軟骨形成症、Ｍｕｅｎｋｅ症候群、および発育遅延を伴う重度の軟骨形成不全症および黒色表皮症（ＳＡＤＤＡＮ）異形成症と関係がある。ＦＧＦＲは、免疫組織化学によって正常組織と比べた場合に多数の腫瘍試料で過剰発現されることも認められる。例えば、ＦＧＦＲ過剰発現は、原発性の結腸直腸癌、膵癌、乳癌、および大腸癌で確認されている。ＦＧＦ分子は、分裂促進因子、血管由来因子、および抗アポトーシス因子として作用し、また発癌に関与すると思われる。
【０１２９】
本発明のｂｓＢＡは、ｂｓＢＡの２つの結合分子の少なくとも１つがＦＧＦＲに特異的に結合し、例えばＦＧＦＲがリガンドに結合するのを妨害することによってまたはＦＧＦＲの二量化を抑制するかまたは低下させることによってＦＧＦＲの活性化を抑制するかまたは低下させるように調製することができる。このようなｂｓＢＡは、ここでは、ＦＧＦＲの活性化を抑制するかまたは低下させることによってプファイファー症候群、ジャクソン−ウェイス症候群、クルゾン症候群、アペール症候群、Ｂｅａｒｅ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  Ｃｕｔｉｓ  Ｇｙｒａｔａ症候群、Ｓａｅｔｈｒｅ−Ｃｈｏｔｚｅｎ症候群、軟骨形成不全、致死性骨異形成症、低軟骨形成症、Ｍｕｅｎｋｅ症候群、発育遅延を伴う重度の軟骨形成不全症および黒色表皮症（ＳＡＤＤＡＮ）異形成症、原発性の結腸直腸癌、膵癌、乳癌、および大腸癌を治療する方法において使用することができる。好ましい実施形態において、ｂｓＢＡのターゲッティングドメインは、標的細胞で発現される第２のレセプター（すなわち、ＦＧＦＲ以外のレセプター）に向けられ、ｂｓＢＡを標的細胞に向けるのに使用される。
【０１３０】
（血小板由来増殖因子レセプター（ＰＤＧＦＲ））
ＰＤＧＦＲファミリーは、結合組織細胞、例えば血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）、乏突起膠細胞（神経線維を包み込む組織の細胞）、および軟骨細胞（軟骨細胞）の増殖および運動性を刺激する下流シグナル伝達酵素を活性化する。ＰＤＧＦβレセプターは、ＶＳＭＣの分化に指向させるために必須である。
【０１３１】
ＰＤＧＦＲ経路の過剰発現は、ＰＤＧＦＲの不適切なまたは高められた活性化と関係がある種々の重度の疾患、例えばアテローム性動脈硬化症および癌と関係がある。あるいはまた、ＰＤＧＦＲ経路の過剰発現は、骨、歯周組織、靭帯、および軟骨の修復を促進するためにＰＤＧＦＲの活性化を促進することが望ましくあり得る。
【０１３２】
本発明のｂｓＢＡは、ｂｓＢＡの２つの結合分子の少なくとも１つがＰＤＧＦＲに特異的に結合し、例えばリガンドがＰＤＧＦＲに結合するのを妨害することによってＰＤＧＦＲの活性化を抑制するかまたは低下させるように調製することができる。このようなｂｓＢＡは、ここでは、ＰＤＧＦＲの活性化を抑制するかまたは低下させることによって、例えばアテローム性動脈硬化症および癌を治療する方法において使用することができる。好ましい実施形態においては、ｂｓＢＡの第２の結合分子は、標的細胞で発現される第２のレセプター（例えば、ＰＤＧＦＲ以外のレセプター）に指向させられ、ｂｓＢＡを標的細胞に向けるのに使用される。好ましくは、ＰＤＧＦＲを結合するｂｓＢＡの結合分子は、第２の結合分子がそのレセプターに対して有する親和性よりも低い親和性を有する。
【０１３３】
あるいは、本発明のｂｓＢＡは、ｂｓＢＡの２つの結合分子の少なくとも１つがＰＤＧＦＲに特異的に結合し、ＰＤＧＦＲを活性化するように調製することができる。このようなｂｓＢＡは、ここでは、ＰＤＧＦＲを活性化することによって骨、歯周組織、靭帯および軟骨の修復を促進する方法において使用することができる。好ましい実施形態においては、ｂｓＢＡのエフェクタードメインはＰＤＧＦＲを結合しかつターゲッティングドメインは抗原に結合するかまたは標的細胞で発現することが知られている第２のレセプター（例えば、第２の異なるＰＤＧＦＲ、あるいは骨、歯周組織、靭帯または軟骨特異的レセプター）に結合する。
【０１３４】
（Ｃ−Ｋｉｔレセプター（Ｓｔｅｅｌ因子レセプターとしても公知である））
ｃ−Ｋｉｔプロトオンコジーンは、メラニン細胞の発育および増殖に重要である貫膜チロシンキナーゼ型レセプターである。プロトオンコジーンｃ−Ｋｉｔは、血小板由来増殖因子ＰＤＧＦ／ＣＳＦ−１（ｃ−ｆｍｓ）レセプターサブファミリーに関連した貫膜チロシンキナーゼレセプターをコードする。Ｃ−Ｋｉｔは、胚メラニン芽細胞の正常な増殖および分化において極めて重要な役割を果たすことが認められている。メラニン細胞の悪性の形質転換およびヒトメラノーマの進行は、ｃ−Ｋｉｔプロトオンコジーンの発現の喪失と関係がある。ｃ−Ｋｉｔプロトオンコジーンによってコードされるチロシンキナーゼレセプターの発現は、腫瘍増殖およびヒトメラノーマの浸潤中に徐々に下降する。
【０１３５】
本発明のｂｓＢＡは、ｂｓＢＡの２つの結合分子の少なくとも１つがｃ−Ｋｉｔレセプターに特異的に結合し、活性化するように調製することができる。このようなｂｓＢＡは、ここでは、例えばメラノーマを治療する方法において使用することができる。好ましい実施形態においては、ｂｓＢＡのターゲッティングドメインは抗原に対して指向させられるかまたは標的細胞で発現される第２のレセプター（すなわち、ｃ−Ｋｉｔレセプター以外のレセプター）に指向させられ、ｂｓＢＡを標的細胞に向けるのに使用される。
Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）
Ｆｃレセプターは、抗原−抗体複合体、または凝集免疫グロブリン分子のＦｃの部位を結合しかつ特定のクラスの免疫グロブリンに対して特異性を示し得る凝集免疫グロブリンに対する特異的細胞表面レセプターである。ＦｃＲは、Ｂ細胞、Ｋ細胞、マクロファージ、好中球、および好酸球上で認められ、またいくつかの発生段階中には、Ｔ細胞上で認められる；Ｋ細胞、マクロファージ、および好中球上のＦｃＲは、抗原に結合されたオプソニン化抗体に結合し、抗原のトリガー食作用を誘発する。
【０１３６】
ヒトＦｃＲは、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス、自己免疫血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、多発性硬化症、ブドウ膜炎、および甲状腺関連眼障害）、およびアレルゲンに対するアレルギー反応の発生または進行と関係があることが知られている。ＦｃＲの自然阻害は、末梢寛容の維持に関与し、それによって自己免疫および自己免疫疾患の発生を防止する。反対に、活性化ＦｃＲの不足は、自己免疫疾患由来の保護表現型、脱自己免疫をもたらす。
【０１３７】
本発明のｂｓＢＡは、ｂｓＢＡの２つの結合分子の少なくとも１つがＦｃＲに特異的に結合し、ＦｃＲの活性化を、例えば免疫細胞上のＩｇ分子に対するその結合を妨害することによって抑制するかまたは低下させるように調製することができる。このようなｂｓＢＡは、ここでは、例えば自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス、自己免疫血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、多発性硬化症、ブドウ膜炎、および甲状腺関連眼障害を治療する方法において使用することができる。典型的には、ｂｓＢＡのターゲッティングドメインは、抗原にまたは標的細胞上で発現される第２のレセプター（すなわち、ＦｃＲ以外のレセプター）に指向させられ、ｂｓＢＡを標的細胞に向けるのに使用される。
【０１３８】
（サイトカインレセプターを結合するためのｂｓＢＡの使用）
重要な一群の実施形態において、ターゲッティングドメインまたはエフェクタードメインは、細胞表面上のサイトカインレセプターを結合するのに使用することができる。幾分好ましさで劣るいくつかの実施形態において、結合剤は、サイトカインレセプター（例えば、ＩＬ−１３はＩＬ−１３レセプターを結合するための結合剤として使用することができる）に対する天然リガンド、またはレセプターに結合することができる能力を保持するこのようなリガンドのフラグメントであることができる。
【０１３９】
ｂｓＢＡのターゲッティングドメインまたはエフェクタードメインによって所望のように結合されて本発明の方法において有用な結果をもたらすことができる典型的なサイトカインレセプター（括弧内に示す別名を有する）としては：
サイトカインレセプター共通γ鎖（γ−Ｃ）（インターロイキン−２レセプターγ鎖）（ＩＬ−２Ｒγ鎖）（Ｐ６４）（ＣＤ１３２抗原）；
インターロイキン−１０レセプターα鎖（ＩＬ−１０Ｒ−Ａ）（ＩＬ−１０Ｒ１）；
インターロイキン−１０レセプターβ鎖（ＩＬ−１０Ｒ−Ｂ）（ＩＬ−１０Ｒ２）（サイトカインレセプタークラス−ＩＩ  ＣＲＦ２−４）；
インターロイキン−１２レセプターβ−１鎖（ＩＬ−１２Ｒ−β１）（インターロイキン−１２レセプターβ）（ＩＬ−１２レセプターβ成分）（ＩＬ−１２ＲＢ１）；
インターロイキン−１２レセプターβ−２鎖（ＩＬ−１２レセプターβ−２）（ＩＬ−１２Ｒ−β２）；
インターロイキン−１３レセプターα−１鎖（ＩＬ−１３Ｒ−α−１）（ＩＬ−１３ＲＡ−１）（ＣＤ２１３ａ１抗原）；
インターロイキン−１３レセプターα−２鎖（インターロイキン−１３結合タンパク質）；
インターロイキン−１７レセプター（ＩＬ−１７レセプター）；
インターロイキン−１７Ｂレセプター（ＩＬ−１７Ｂレセプター）（ＩＬ−１７レセプターホモローグ１）（ＩＬ−１７Ｒｈ１）（ＩＬ１７Ｒｈｌ）（サイトカインレセプターＣＲＬ４）（ＵＮＱ２５０１／ＰＲＯ１９６１２）；
インターロイキン２１レセプター前駆物質（ＩＬ−２１Ｒ）；
インターロイキン−１レセプター、Ｉ型（ＩＬ−１Ｒ−１）（ＩＬ−１Ｒ−α）（Ｐ８０）（抗原ＣＤ１２１ａ）；
インターロイキン−１レセプター、ＩＩ型（ＩＬ−１Ｒ−２）（ＩＬ−１Ｒ−β）（抗原ＣＤｗ１２１ｂ）；
インターロイキン−１レセプターアンタゴニストタンパク質（ＩＬ−Ｉｒａ）（ＩＲＡＰ）（ＩＬ１インヒビター）（ＩＬ−１ＲＮ）（ＩＣＩＬ−１ＲＡ）；
インターロイキン−２レセプターα鎖（ＩＬ−２レセプターαサブユニット）（Ｐ５５）（ＴＡＣ抗原）（ＣＤ２５抗原）；
インターロイキン−２レセプターβ鎖（ＩＬ−２レセプター）（Ｐ７０−７５）（高親和性ＩＬ−２レセプターβサブユニット）（ＣＤ１２２抗原）；
インターロイキン−３レセプターα鎖（ＩＬ−３Ｒ−α）（ＣＤ１２３抗原）；
インターロイキン−４レセプターα鎖（ＩＬ−４Ｒ−α）（ＣＤ１２４抗原）；
インターロイキン−５レセプターα鎖（ＩＬ−５Ｒ−α）（ＣＤ１２５抗原）；
インターロイキン−６レセプターα鎖（ＩＬ−６Ｒ−α）（ＩＬ−６Ｒ１）（ＣＤ１２６抗原）；
インターロイキン−６レセプターβ鎖（ＩＬ−６Ｒ−β）（インターロイキン６シグナル伝達物質）（膜糖タンパク質１３０）（ｇｐ１３０）（オンコスタチンＭレセプター）（ＣＤｗ１３０）（ＣＤ１３０抗原）；
インターロイキン−７レセプターα鎖（ＩＬ−７Ｒ−α）（ＣＤｗ１２７）（ＣＤ１２７抗原）；
高親和性インターロイキン−８レセプターＡ（ＩＬ−８ＲＡ）（ＩＬ−８レセプター１型）（ＣＸＣＲ−１）（ＣＤｗ１２８ａ）；
高親和性インターロイキン−８レセプターＢ（ＩＬ−８ＲＢ）（ＣＸＣＲ−２）（ＧＲＯ／ＭＧＳＡレセプター）（ＩＬ−８レセプター２型）（ＣＤｗ１２８ｂ）；
インターロイキン−９レセプター（ＩＬ−９Ｒ）；
インターロイキン−１８レセプター１（ＩＬ１レセプター関連タンパク質）（ＩＬ−１Ｒｒｐ）；
インターロイキン−１レセプター様１前駆物質（ＳＴ２タンパク質）；
インターロイキン−１レセプター様２（ＩＬ−１Ｒｒｐ２）（インターロイキン−１レセプター関連タンパク質２）（ＩＬ１Ｒ−ｒｐ２）；
Ｔｏｌｌ様レセプター１（Ｔｏｌｌ／インターロイキン−１レセプター様）（ＴＩＬ）；
Ｔｏｌｌ様レセプター２（Ｔｏｌｌ／インターロイキン１レセプター様タンパク質４）；
Ｔｏｌｌ様レセプター５（Ｔｏｌｌ／インターロイキン−１レセプター様タンパク質３）；
ＣＸ３Ｃケモカインレセプター１（Ｃ−Ｘ３−ＣＣＫＲ−１）（ＣＸ３ＣＲ１）（Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅレセプター）（ＧＰＲ１３）（Ｖ２８）（βケモカインレセプター様１）（ＣＭＫ−ＢＲＬ−１）（ＣＭＫＢＬＲ１）；
Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインレセプター３型（ＣＸＣ−Ｒ３）（ＣＸＣＲ−３）（ＣＫＲ−Ｌ２）（ＣＤ１８３抗原）；
Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインレセプター４型（ＣＸＣ−Ｒ４）（ＣＸＣＲ−４）（間質細胞由来因子１レセプター）（ＳＤＦ−１レセプター）（Ｆｕｓｉｎ）（白血球由来７回貫膜ドメインレセプター）（ＬＥＳＴＲ）（ＬＣＲ１）（ＦＢ２２）（ＮＰＹＲＬ）（ＨＭ８９）（ＣＤ１８４抗原）；
Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインレセプター型５（ＣＸＣ−Ｒ５）（ＣＸＣＲ−５）（バーキットＳリンパ腫レセプター１）（単球由来レセプター１５）（ＭＤＲ１５）；
Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインレセプター６型（ＣＸＣ−Ｒ６）（ＣＸＣＲ−６）（Ｇタンパク質結合レセプターｂｏｎｚｏ）（Ｇタンパク質結合レセプターＳＴＲＬ３３）；
ケモカイン結合タンパク質２（ケモカイン−結合タンパク質Ｄ６）（Ｃ−ＣケモカインレセプターＤ６）（ケモカインレセプターＣＣＲ−９）（ＣＣ−ケモカインレセプターＣＣＲ１０）；
Ｃ−Ｃケモカインレセプター１型（Ｃ−Ｃ  ＣＫＲ−１）（ＣＣ−ＣＫＲ−１）（ＣＣＲ−１）（ＣＣＲ１）（マクロファージ炎症性タンパク質−１αレセプター）（ＭＩＰ−１α−Ｒ）（ＲＡＮＴＥＳ−Ｒ）（ＨＭ１４５）（ＬＤ７８レセプター）；
Ｃ−Ｃケモカインレセプター２型（Ｃ−Ｃ  ＣＫＲ−２）（ＣＣ−ＣＫＲ−２）（ＣＣＲ−２）（ＣＣＲ２）（単球化学誘引物質タンパク質１レセプター）（ＭＣＰ−１−Ｒ）；
Ｃ−Ｃケモカインレセプター３型（Ｃ−Ｃ  ＣＫＲ−３）（ＣＣ−ＣＫＲ−３）（ＣＣＲ−３）（ＣＣＲ３）（ＣＫＲ３）（好酸球エオタキシンレセプター）；
Ｃ−Ｃケモカインレセプター４型（Ｃ−Ｃ  ＣＫＲ−４）（ＣＣ−ＣＫＲ−４）（ＣＣＲ−４）（ＣＣＲ４）（Ｋ５−５）；
Ｃ−Ｃケモカインレセプター５型（Ｃ−Ｃ  ＣＫＲ−５）（ＣＣ−ＣＫＲ−５）（ＣＣＲ−５）（ＣＣＲ５）（ＨＩＶ−１融合補助レセプター）（ＣＨＥＭＲ１３）（ＣＤ１９５抗原）；
Ｃ−Ｃケモカインレセプター６型（Ｃ−Ｃ  ＣＫＲ−６）（ＣＣ−ＣＫＲ−６）（ＣＣＲ−６）（ＬＡＲＣレセプター）（ＧＰＲ−ＣＹ４）（ＧＰＲＣＹ４）（ケモカインレセプター様３）（ＣＫＲ−Ｌ３）（ＤＲＹ６）；
Ｃ−Ｃケモカインレセプター７型前駆物質（Ｃ−Ｃ  ＣＫＲ−７）（ＣＣ−ＣＫＲ−７）（ＣＣＲ−７）（ＭＩＰ−３βレセプター）（ＥＢＶ誘発Ｇタンパク質結合レセプター１）（ＥＢＩ１）（ＢＬＲ２）；
Ｃ−Ｃケモカインレセプター８型（Ｃ−Ｃ  ＣＫＲ−８）（ＣＣ−ＣＫＲ−８）（ＣＣＲ−８）（ＧＰＲ−ＣＹ６）（ＧＰＲＣＹ６）（ケモカインレセプター様１）（ＣＫＲ−ＬＩ）（ＴＥＲ１）（ＣＭＫＢＲＬ２）（ＣＣ−ケモカインレセプターＣＨＥＭＲＩ）；
Ｃ−Ｃケモカインレセプター９型（Ｃ−Ｃ  ＣＫＲ−９）（ＣＣ−ＣＫＲ−９）（ＣＣＲ−９）（ＧＰＲ−９−６）；
Ｃ−Ｃケモカインレセプター１０型（Ｃ−Ｃ  ＣＫＲ−１０）（ＣＣ−ＣＫＲ−１０）（ＣＣＲ−１０）（Ｇ−タンパク質結合レセプター２）；
Ｃ−Ｃケモカインレセプター１１型（Ｃ−Ｃ  ＣＫＲ−１１）（ＣＣ−ＣＫＲ−１１）（ＣＣＲ−１１）（ケモカインレセプター様１）（ＣＣＲＬ１）（ＣＣＸＣＫＲ）；
ケモカインレセプター様１（Ｇ−タンパク質結合レセプターＤＥＺ）（Ｇタンパク質結合レセプターＣｈｅｍＲ２３）、
ケモカインレセプター様２（ＩＬ８関連レセプターＤＲＹ１２）（Ｆｌｏｗ誘発内皮Ｇタンパク質結合レセプター）（ＦＥＧ−１）（Ｇタンパク質結合レセプターＧＰＲ３０）（ＧＰＣＲ−ＢＲ）；
ケモカインＸＣレセプター１（ＸＣケモカインレセプター１）（Ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎレセプター）（Ｇタンパク質結合レセプター５）
が挙げられる。
【０１４０】
（腫瘍関連抗原を結合するためのｂｓＢＡの使用）
特に重要な一群の実施形態において、ｂｓＢＡのターゲッティングドメインは、腫瘍関連抗原に結合する。その名称が示すように、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、典型的には、特定の腫瘍の細胞上で発現されるが、典型的には正常細胞上で発現されない抗原である。多くの場合に、ＴＡＡは、生物の発育の特定の時点（例えば、胎児の発育中）でのみ細胞中で正常に発現される抗原およびこの発育の現時点で生物中で不適切に発現されつつある抗原であるか、または抗原を現在発現する器官の正常な組織または細胞では発現されない抗原である。多数のＴＡＡ、例えばＭＡＲＴ−１、癌胎児性抗原（「ＣＥＡ」）、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ−１、ＨＥＲ−２、およびＬｅｗｉｓＹ抗原、ならびに例えば米国特許第５，９２２，５６６号および第６，０２０，４７８号明細書および国際公開第ＷＯ２００４／０１６６４３Ａ２号パンフレットに記載の抗原が、当該技術で知られている。
【０１４１】
本発明のｂｓＢＡを用いて標的とするのに適しているその他の腫瘍関連抗原としては、
−  造血分化抗原−  通常、ｃｌｓｕｓｔｅｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（ＣＤ）分類、例えばＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ４５、ＣＤ５２、およびＣＤ１４７と関連がある糖タンパク質；
−  細胞表面分化抗原、例えば糖タンパク質、例えば癌胎児性抗原（ＣＥＡ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｎｏ．Ｐ０６７３１）、腫瘍関連糖タンパク質（ＴＡＧ−７２、またＣＡ７２−４としても特定されている、例えば、Ｈｏｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１１３（４）：１１６３−７０（１９９７）参照）、多型上皮ムチン（ＰＥＭ）、上皮細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ）、ＭＵＣ−１、Ａ３３、Ｇ２５０、Ｅ−カドヘリン、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｎｏ．Ｑ０４６０９）および前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、糖脂質、例えばガングリオシド、例えば、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２）および糖質、例えば血液型抗原、例えばＬＥＹおよびＬＥｂ（ＬＥＹは「ＬｅｗｉｓＹ」であり、「ＣＤ１７４」としても知られている；これは糖脂質および糖タンパク質の２型血液型オリゴ糖について認められるジフコシル化四糖である）；
−  増殖因子レセプター、例えば上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ，ＥｒｂＢＩ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ００５３３）およびその突然変異体型ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｎｏ．Ｐ０４６２６）、ＥｒｂＢ３（ＨＥＲ−３、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｎｏ．Ｐ２１８６０）およびＩＬ−２レセプター
−  血管新生および間質抗原、例えば線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、血管内皮増殖因子レセプター（ＶＥＧＦＲ）、テネイシンおよびインテグリン；ならびに
−  Ｆｒｉｚｚｌｅｄレセプターファミリー（例えばＦｚ−２）
が挙げられる。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、ｂｓＢＡのターゲッティングドメインはＴＡＡを結合するために向けられるが、これに対してエフェクタードメインは増殖因子レセプターに結合する。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、ターゲッティングドメインは、ＣＥＡ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｎｏ．Ｐ０６７３１）、ＥｒｂＢ２（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｎｏ．Ｐ０４６２６）、ＥＧＦＲ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｎｏ．Ｐ００５３３）、ＬｅｗｉｓＹ、ＭＵＣ−１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｎｏ．Ｐ１５９４１）、ＥｐＣＡＭ（ｍＡｂ１７−ｌＡ（エドレコロマブ、Ｐａｎｏｒｅｘ（登録商標）、Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  ＧｍｂＨ）の標的）、ＣＡ１２５（Ｓｗｉｓｓ−  Ｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｎｏ．Ｑ９６ＲＫ２）、ＰＳＭＡ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｎｏ．Ｑ０４６０９）、ＴＡＧ７２、ＣＤ２０（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｎｏ．Ｐ１１８３６）、ＣＤ１９（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｎｏ．Ｐ１５３９１）、ＣＤ２２（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｎｏ．Ｐ２０２７３）、およびＣＤ３６（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｎｏ．Ｐ１６６７１）から選択される分子を標的とする。ＣＤ抗原が特に正常細胞で頻繁に発現されるが、ある種の癌でまたはある種の癌のマーカーで過剰発現されることが認められるべきである。
【０１４４】
いくつかの好ましい実施形態において、エフェクタードメインは、ＥｒｂＢ３（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｎｏ．Ｐ２１８６０）、ＥｒｂＢ４（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｎｏ．Ｑ１５３０３）、ＦＧＦレセプター１−４（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｎｏｓ．Ｐ２２４５５、Ｐ１１３６２、Ｐ２１８０２、Ｐ２２６０７）、ＨＧＦレセプター（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｎｏ．Ｐ０８５８１）、ＩＧＦ１−Ｒ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｎｏ．Ｐ０８０６９）、インスリンレセプター（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｎｏ．Ｐ０６２１３）、ＰＤＧＦレセプターαおよびレセプターβ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｎｏ．Ｐ１６２３４、およびＰ０９６１９それぞれ）ならびにＣ−ＫＩＴ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｎｏ．ＰＩ０７２１）から選択される分子に結合する。いくつかの特に好ましい実施形態において、ターゲッティングドメインは、前記のパラグラフに記載の分子に結合し、エフェクタードメインはこのパラグラフに記載の分子に結合する。
【０１４５】
（アプタマー）
結合分子の一方または両方がアプタマーであるｂｓＢＡは、米国特許第５，７５６，２９１号明細書（本明細書に参照することにより組み込まれる）に記載のようにして調製することができる。アプタマーは、通常、「ＳＥＬＥＸ」（「ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ」の省略である）法で調製することができる。これは、選択された分子標的に対してアプタマーを確認するため使用される反復法である。まず、核酸分子の大きな「ライブラリー」が作製される。選別段階で、関心の標的に対して最も大きい親和性を有する分子が単離される。ヌクレオチド配列のライブラリーは、細胞表面タンパク質に暴露され、ある時間インキュベートされる。ライブラリー中の標的に対して弱い親和性を有するかまたは全く親和性を有していない分子が洗い落とされ、最も高親和性のアプタマーである分子の中から、標的結合分子が標的から精製され、ＳＥＬＥＸ」プロセスのその後の工程に使用される。
【０１４６】
捕捉され、精製された配列は、標的に結合することができる分子について実質的に富化される分子の新しいライブラリーを生成させるために、酵素的にコピーされるか、または「増幅される」。富化ライブラリーは、選別、分別および増幅の新しいサイクルを開始するのに使用される。全プロセスの５〜１５サイクルの後に、分子のライブラリーを、１０１５のユニーク配列から、関心の細胞表面タンパク質にしっかりと結合する少数にまで減らす。次いで、混合物中の分子が単離され、そのヌクレオチド配列が調べられ、そしてその結合親和性に関する特性が抗体について本質的に測定される。アプタマーは、標的結合またはアプタマー構造に寄与しないヌクレオチドを除外するためにさらに精製される場合が多い。そのコア結合ドメインに切断されたアプタマーは、典型的にはヌクレオチド１５〜６０個の長さの範囲にある。２つのアプタマーは、ヌクレオチドリンカーによって結合されるかまたは化学的に架橋されて二重特異性アプタマーを形成し得るし、あるいは単一のアプタマーは、抗体または抗体フラグメントに同様に結合されてキメラ抗体−ＤＮＡ分子を形成し得る。
【０１４７】
（化学的架橋による二重特異性ＢＡの作製）
二重特異性遮断剤、例えば二重特異性抗体の結合分子は、当業者に知られている慣用の結合方法、例えば上記のＨｅｒｍａｎｓｏｎの論文に記載の方法を使用して結合することができる。いくつかの実施形態において、ｂｓＢＡの２つの結合分子は、化学結合を使用して結合される。化学結合を使用して調製した従来の二重特異性抗体の一例は、Ｂｒｅｎｎａｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５））によって記載されており、本発明のｂｓＢＡを調製するのに使用することもできる。完全抗体は、タンパク質分解切断されてフラグメントＦ（ａｂ´）２を生成する。これらのフラグメントは、近接するジチオール類を安定化させかつ分子内ジスルフィド形成を防ぐために、ジチオール錯形成剤  亜ヒ酸ナトリウムの存在下で小さくされる。生成したフラグメントＦａｂ´は、次いで、チオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に転化される。次いで、Ｆａｂ´−ＴＮＢ誘導体の１つは、メルカプトエチルアミンを用いて還元することによりＦａｂ´−チオールに再転化され、等モル量の別のＦａｂ´−ＴＮＢ誘導体と混合されて二重特異性抗体を形成する。生成した二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【０１４８】
別の好ましい化学的結合は、架橋用にビス−マレイミドヘキサン又ジ−マレイミドエタンを用いる。また、架橋用の−ＳＨ基含有抗体フラグメントは、完全な長さの抗体のタンパク分解切断を避けるために、組換えで調製することもできる（例えば、Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７−２２５（１９９２）参照）。
組換え法または合成法によるｂｓＢＡの作製
ｂｓＢＡは、組換え法によって調製することもできる。ｂｓＢＡをコードする核酸配列は、適当な方法、例えば適切な配列のクローニングによって調製することができる、あるいは種々の方法、例えばＮａｒａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９（１９７９）のリン酸トリエステル法；Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１（１９７９）のリン酸ジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−１８６２（１９８１）のジエチルホスホロアミダイト法；例えばＮｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：６１５９−６１６８（１９８４）に記載のように自動合成装置を使用するＢｅａｕｃａｇｅ  ＆  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２（２０）：１８５９−１８６２に記載の固相ホスホロアミダイトトリエステル法；および米国特許第４，４５８，０６６号明細書の固体支持法による直接化学合成によって調製することもできる。化学合成は、一本鎖オリゴヌクレオチドを生成する。これは、相補的配列を用いるハイブリダイゼーションによって、またはＤＮＡポリメラーゼを用いて一本鎖を鋳型として使用する重合によって二本鎖ＤＮＡに転化し得る。当業者には、ＤＮＡの化学合成が約１００個の塩基の配列に限定されるのに対して、それよりも長い配列は短い配列の結合によって取得し得ることが認められるであろう。
【０１４９】
好ましい実施形態において、ｂｓＢＡをコードする核酸配列は、クローニング法で調製される。適当なクローニング法および配列決定法、ならびに多数のクローニング実行によって当業者を導くのに十分な使用説明書の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕａｌｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（２ＮＤ  ＥＤ．），Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）），Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（ｅｄｓ），ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ（１９８７）），またはＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９８７、１９９５  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ））に見出される。生物試薬および実験装置の製造業者からの製品情報も、有用な情報を提供する。このような製造業者としては、ＳＩＧＭＡ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｃｈｅｍ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐ．，Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａ−  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ  Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＡＧ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ならびに当業者に知られているその他の多くの商業的供給源が挙げられる。
【０１５０】
ｂｓＢＡをコードする核酸はいったんクローンされると、これは所望のタンパク質を組換え操作細胞、例えば細菌、植物、酵母、昆虫および哺乳動物細胞中で発現し得る。当業者がタンパク質の発現に利用できる多数の発現系、例えば大腸菌、その他の細菌宿主、酵母、および種々の高等真核細胞、例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよび骨髄腫細胞株に精通していることが予測される。原核生物または真核生物においてタンパク質の発現について知られている種々の方法を詳細に説明することを試みることは行わないであろう。
【０１５１】
当業者には、ｂｓＢＡをコードする核酸をその生物活性を低下させることなく修飾できることが認められるであろう。いくつかの修飾が、クローニング、発現、またはターゲッティング分子の融合タンパク質への組込みを促進するために行い得る。このような修飾は、当業者には周知であり、かつ例えば終止コドン、開始部位を提供するためのアミノ末端で付加されたメチオニン、および都合よく配置された制限部位を作製するためにいずれかの末端上に配置された追加アミノ酸を含む。
【０１５２】
組換え法の他に、ｂｓＢＡは、標準的なペプチド合成を使用して全体としてまたは一部として組立てることもできる。アミノ酸約５０未満の長さの本発明のポリペプチドの固相合成は、配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に付着させ、次いで該配列に残りのアミノ酸の連続付加によって達成し得る。固相合成に関する技術は、Ｂａｒａｎｙ  ＆  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．２：Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ  Ａ．ｐｐ．３−２８４；  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５６（１９６３）およびＳｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩＩ（１９８４）によって記載されている。さらに大きな長さのタンパク質は、短いフラグメントのアミノ末端とカルボキシル末端との縮合によって合成し得る。カルボキシル末端の活性化による（例えば、カップリング試薬Ｎ，Ｎ´−ジシクロヘキシルカルボジイミドの使用による）ペプチド結合を形成する方法は当業者には知られている。
【０１５３】
いったん発現されると、組換えｂｓＢＡは、当該技術の標準的な方法、例えば硫酸アンモニウム沈降法、親和性カラム法、カラムクロマトグラフィーなど（一般には、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）参照）に従って精製することができる。少なくとも約９０〜９５％の等質性の実質的に純粋な組成物が好ましく、医薬用途には９８〜９９％またはそれ以上の等質性が最も好ましい。治療に使用されるべきである場合には、部分的にまたは所望の等質性までいったん精製されると、ポリペプチドは内毒素を実質的に含有しない。
【０１５４】
大腸菌などの細菌から一本鎖抗体を発現するおよび／または適当な活性体、例えば一本鎖抗体に再び折りたたむ方法は、記載されておりかつ周知であり、また本発明のｂｓＢＡ、特に抗体を用いるｂｓＢＡに適用できる。Ｂｕｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：２６３−２７０（１９９２）；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５４５（１９９１）；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５（１９８９）およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４（１９８９）参照。これらは全て、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０１５５】
度々、大腸菌またはその他の細菌由来の機能的異種ンパク質は、封入体から単離され、強い変性剤を使用する可溶化、およびその後の再生を必要とする。溶解工程中は、当該技術で周知のように、ジスルフィド結合を分離するために還元剤を存在させなければならない。還元剤を有する典型的な緩衝液は、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、６Ｍグアニジン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３Ｍ  ＤＴＥ（ジチオエリトリトール）である。ジスルフィド結合の酸化還元は、Ｓａｘｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９：５０１５−５０２１（１９７０）（参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載のように、特にＢｕｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａに記載のように、還元および酸化された形の低分子量チオール試薬の存在下で生じ得る。
【０１５６】
再生は、典型的には変性および還元タンパク質を再生緩衝液に希釈（例えば１００倍希釈）することによって達成される。典型的な緩衝液は、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ  ｌ−アルギニン、８ｍＭ  酸化されたグルタチオン（ＧＳＳＧ）、および２ｍＭ  ＥＤＴＡである。
【０１５７】
２本鎖抗体精製プロトコールの変更として、Ｈ鎖およびＬ鎖領域は、別々に可溶化され、還元され、次いで再生溶液中で組み合わせられる。好ましい収率は、これらの２つのタンパク質を、一方のタンパク質が他方のタンパク質に対して５倍モル過剰を超えないようなモル比で混合した場合に得られる。酸化還元−シャフリングが完結した後に、過剰酸化グルタチオンまたはその他の酸化性低分子量化合物を再生溶液に加えることが望ましい。
ｂｓＢＡを基材とする治療剤用途
さらにまた、本発明は、１種またはそれ以上の前記の疾患または障害を治療するために、本発明のｂｓＢＡを動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト患者に投与することを伴うｂｓＢＡを基剤とする療法に関する。本発明の治療剤化合物としては、本発明のｂｓＢＡが挙げられるが、これに限定されない。本発明のｂｓＢＡは、細胞表面レセプターの異常発現および／または活性と関係がある本明細書に記載の疾患または障害を治療、抑制または予防するのに使用できる。細胞表面レセプターの異常発現および／または活性と関係がある疾患および障害の治療および／または予防は、これらの疾患および障害と関係がある症状を緩和することを含むが、これに限定されない。本発明のｂｓＢＡは、当該技術では知られているかまたは本明細書に記載の薬学的に受容可能な組成物で提供し得る。本明細書において提供される教示を使用して、当業者にはどのようにして本発明のｂｓＢＡを、過度の実験を行うことなく診断、監視、または治療用途に使用するかについて知るであろう。
【０１５８】
本発明のｂｓＢＡは、単独でまたは別の種類の治療（例えば、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、免疫療法および抗腫瘍剤）と組み合わせて投与し得る。
ｂｓＢＡを基剤とする治療／予防用組成物およびその投与
本発明は、対象に有効量の本発明のｂｓＢＡ、好ましくは本発明の二重特異性抗体を投与することによる治療、阻止および予防方法を提供する。好ましい態様においては、ｂｓＢＡは実質的に精製される（例えば、その効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含有してない）。前記対象は、好ましくは動物、例えばウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコおよびイヌ（これらに限定されない）であり、また好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトである。
【０１５９】
種々の送達システム、例えばリポソームへの封入、微小粒子、マイクロカプセル、ｂｓＢＡを発現することができる組換え細胞、レセプター介在エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕａｎｄ  Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２，１９８７参照）、レトロウイルスまたはその他のベクターの部分として核酸の組立て体などが知られており、本発明のｂｓＢＡを投与するのに使用できる。導入の方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。ｂｓＢＡは、任意の慣用の経路によって、例えば輸液またはボーラス投与によって、上皮または皮膚粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）による吸収によって投与してもよいし、また他の生物学的活性剤と一緒に投与してもよい。投与は、全身または局所であり得る。さらにまた、投与は、本発明のｂｓＢＡを中枢神経系に適当な経路、例えば脳室内および髄膜内注射によって導入することが望ましい得；脳室内注射は、例えばオンマヤ槽のような貯留槽に接続した脳室内カテーテルによって促進し得る。また肺投与も、例えば吸入器または噴霧器を使用することによって、およびエアゾール化剤を用いた製剤を使用することによって使用することができる。
【０１６０】
具体的実施形態においては、本発明のｂｓＢＡを、治療を必要とする部位に局所的に投与することが望ましい得；これは、例えば、限定としてではなく、手術中の局所注入、例えば手術後の創傷包帯と共に局所投与によって、注射によって、カテーテルを用いて、坐薬を用いて、またはインプラントを用いて達成し得る。前記のインプラントは、多孔質、非孔質、またはゼラチン質物質、例えばシラスチック膜などの膜、または線維である。好ましくは、本発明のｂｓＢＡ、例えば抗体を投与する場合には、ｂｓＢＡが吸収しない材料を使用するように注意しなければならない。
【０１６１】
別の実施形態において、ｂｓＢＡは、小胞、特にリポソームで送達させることができる（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３，１９９０；およびＴｒｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５，１９８９参照）。
【０１６２】
さらに別の実施形態においては、ｂｓＢＡは制御放出系で送達することができる。１つの実施形態においては、ポンプを使用し得る（Ｌａｎｇｅｒ，ｓｕｐｒａ；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１，１９８７；  Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７，１９８０；  Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４，１９８９参照）。別の実施形態においては、高分子材料を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）；  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）；  Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，Ｊ．，１９８３，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１参照；またＬｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０；  Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５も参照）。さらに別の実施形態においては、制御放出系は、治療標的、例えば体の病気に冒された器官、例えば脳、肺、腎臓、肝臓、卵巣、精巣、結腸、膵臓、乳房および皮膚の近くに配置することができ、従って全身用量の一部分のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）参照）。その他の制御放出系はＬａｎｇｅｒ（１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３）による概説で論議されている。
【０１６３】
また、本発明は、医薬組成物で提供されるｂｓＢＡを提供する。このような組成物は、治療有効量のｂｓＢＡと薬学的に受容可能なキャリアを含有する。具体的な実施形態において、「薬学的に受容可能な」という用語は、連邦政府または州政府の監督官庁によって承認されているか、あるいは米国薬局方または動物、さらに詳しくはヒトに使用するためのその他の一般的に認められている薬局方に挙げられていることを意味する。「キャリア」という用語は、治療剤と共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを示す。このような製薬キャリアは、滅菌液体、例えば水および油類、例えば石油、動物、植物または合成起源の油、例えば落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などであることができる。医薬組成物が静脈内投与される場合には、水が好ましいキャリアである。食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、特に注射液用の液状キャリアとして使用することができる。適当な製薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、所望ならば、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形をとることができる。組成物は、従来の結合剤およびキャリア、例えばトリグリセリドを用いた坐薬として製剤化することができる。経口製剤は、標準的なキャリア、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含有することができる。適当な製薬キャリアの例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，」Ａ．Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（２０ｔｈ  Ｅｄ．，２００３）に記載されている。このような組成物は、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形で、患者に適切に投与するための形態を提供するように適当な量のキャリアと一緒に含有するであろう。製剤は、投与の様式に適合させるべきである。
【０１６４】
好ましい実施形態において、組成物は、常用の方法に従ってヒトに静脈内投与するのに適した医薬組成物として製剤化することができる。典型的には、静脈内投与用の組成物は、滅菌等張性水性緩衝液の溶液である。必要な場合には、組成物は、可溶化剤および注射の部位の疼痛を和らげるために局所麻酔薬、例えばリグノカインも含有していてもよい。一般に、諸成分は、別々に供給されるか、または単位剤形で、例えば乾燥凍結乾燥粉末または密封容器中の無水濃厚物、例えば有効成分の分量を示すアンプルまたは分包として一緒に混合される。組成物を輸液によって投与すべき場合には、滅菌医薬グレートの水または食塩水を含有する輸液ビンを用いて調合することができる。組成物を注射によって投与する場合には、注射用滅菌水または食塩水のアンプルを、諸成分を投与前に混合物するように、提供することができる。
【０１６５】
ｂｓＢＡは、医薬組成物に製剤化される場合には、中性または塩の形態として製剤化することができる。薬学的に受容可能な塩としては、陰イオンを用いて形成される塩、例えば塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導される塩、および陽イオンを用いて形成されル塩、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第ニ鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノ  エタノール、ヒスチジン、またはプロカインから誘導される塩が挙げられる。
【０１６６】
細胞表面レセプターの異常な発現および／または活性と関係がある病気または疾患の治療、抑制および予防において有効であろう本発明のｂｓＢＡの量は、標準的な臨床技法調べることができる。また、生体外アッセイを、場合により最適用量範囲を確認するのに役立てるために使用し得る。また、製剤化に使用すべき正確な用量は、投与の経路、および病気または疾患の重症度に左右され、開業医の判断およびそれぞれの患者の状況に従って決定されるべきである。有効量は、生体外または動物モデル試験系から誘導される用量応答曲線から推定し得る。
【０１６７】
ｂｓＢＡについて、患者に投与される用量は、典型的には患者の体重について０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。好ましくは、患者に投与すべき用量は、患者の体重について０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの間、さらに好ましくは患者の体重について１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリペプチドに対する免疫応答により、ヒトの体内で他の種由来の抗体よりも長い半減期を有する。従って、ヒト抗体から誘導されるｂｓＢＡは、より少ない量でかつより少ない投与回数を用いて投与することができる。また、本発明のｂｓＢＡの用量および投与回数は、修飾、例えば脂質化によって摂取および抗体の組織浸透を高めることによって減らし得る。
【０１６８】
（キット）
本発明はまた、標的分子生体内でまたは生物学的試料中で発現するかまたは過剰発現する細胞を検出するのに使用されるキットを包含する。いくつかの好ましい実施形態において、キットは二重特異性ｓｃＦｖ抗体によって標的とされるｂｓＢＡを含有する。使用に応じて、抗体は、本明細書に記載のエフェクター（例えば、放射性部分、リポソーム、細胞毒、別の抗体など）に結合するために、リンカーまたはキレーターあるいはその両方を用いて官能化させることができる。キットは、場合によりｂｓＢＡの検出に使用すべき緩衝液および組成物をさらに含有していてもよい。
【０１６９】
キットはまた、例えば癌細胞を検出するための抗体の使用を教示するおよび／または抗体と官能化試薬との組み合わせを教示するかあるいは画像形成および／または治療用途に官能化抗体の使用を教示する教材を含むことができる。ある実施形態においては、２つの成分を別々に投与することができる（例えば、予備ターゲッティングアプローチにおいて）ようにまたは２つの成分を使用直前に投与することができるように、リンカーおよび／またはキレーター（１つの容器中で）を１つまたはそれ以上のエフェクター、例えば細胞毒、放射性マーカー（第２の容器中で）と共に用いて機能化させたｂｓＢＡが提供される。
【０１７０】
ある教材は、推奨される投与計画、カウンターインジケーションなどを提供するであろう。教材は典型的には資料または印刷物からなるが、このような取り扱い説明書を保存しかつこれらをエンドユーザーに知らせることができる媒体が本発明によって熟慮される。このような媒体としては、電子保存媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ  ＲＯＭ）など、または説明書を提供するインターネット・ロケーションが挙げられる。本発明はまた、本発明の医薬組成物の１種またはそれ以上の成分を充填した１つまたはそれ以上の容器からなる医薬パックまたはキットを提供する。医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形の通知が、場合によりこのような容器（１個または複数）と関係付けられる。この通知は、ヒトに投与するための製造、使用または販売のための政府機関による承認を反映する。
【実施例】
【０１７１】
（実施例１）
（ダイアボディおよび（ｓｃＦｖ）２）
ダイアボディの製造は、例えば、欧州特許第４０４，０９７号明細書；国際公開第ＷＯ９３／１１１６１号パンフレット；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒらの論文（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３））に開示されている。ダイアボディは、抗体フラグメントから、通常は２個のｓｃＦｖから、短すぎて同じ鎖上の２つのドメイン同士の間での対合を可能にすることができないリンカーを使用することによって組み立てられる；２つのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合し、２つの抗原−結合部位を作製することを強いられる。あるいは、２つのｓｃＦｖは、２つの分子を共有結合する遺伝子コードリンカーによって結合され、それによって二価抗体である（ｓｃＦｖ）２を形成し得る。
【０１７２】
（実施例２）
異なる種類の「二量化ドメイン」は、２つの抗体フラグメントをヘテロ二量化させるのに使用し得る。例えば、二重特異性／二価ダイアボディを、ヒンジ領域によって、ＩｇＧのＣＨ（３）ドメインのＮ末端に遺伝子融合することによって（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２７９（１−２）：２１９−３２（２００３））、「ジ−ダイアボディ」と呼ばれる組み立て体を作製する。結果は、前記ヒンジ領域とＣＨ（３）ドメインの間の二量化により生じる四価ダイアボディ二量体である。
【０１７３】
抗体の天然ＣＨＩドメインはまた、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を異なる抗原−結合特異性をもつＦａｂフラグメントのＬ鎖またはＨ鎖いずれかのＣ末端に遺伝子融合する（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｆｕｓｉｎｇ）ことによって２つの抗体フラグメントをヘテロ二量化するのに使用し得る（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２６７（２）：２１３−２６（２００２））。また、ＩｇＧのＨ鎖とＬ鎖の間の自然二量化メカニズムも使用し得る。異なる特異性をもつ２つの一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、ヒトκ鎖の定常部（Ｃ（Ｌ））およびヒトＨ鎖の第１の定常部（Ｃ（Ｈ１））に融合させて、２つのポリペプチド、すなわち（ｓｃＦｖ）（１）−Ｃ（Ｌ）および（ｓｃＦｖ）（２）−Ｃ（Ｈ１）−Ｃ（Ｈ２）−Ｃ（Ｈ３）それぞれを形成することができる。哺乳動物細胞で前記２つのポリペプチドの同時発現は、二重特異性を有する共有結合したＩｇＧ様へテロ四量体、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）（４）−ＩｇＧの形成をもたらす（Ｚｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１３（５）：３６１−７（２０００），Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２３；２７９（４）：２８５６−６５（２００４））。
【０１７４】
また、２つの抗体フラグメントのヘテロ二量体形成は、例えばこれらが２つの異なるＦａｂ´フラグメントに別々に融合する場合には二重特異性Ｆ（ａｂ´）２の形成に介在することができるヘテロ二量体形成ロイシンジッパーＦｏｓおよびＪｕｎを用いて二量化ドメイン中で非共有相互作用によって推し進め得る（Ｔｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．４（５）：３８９−９４（１９９５））。
【０１７５】
（実施例３  適当な標的およびエフェクターマーカーの決定）
適当な標的マーカーは、多数の方法で、例えば標的組織で過剰発現される標的分子を確認するために標的および非標的組織のｍＲＮＡプロファイリングによって、またはプロテオーム法、例えばタンパク質発現レベルの比較およびその後の質量分光分析法による確認のための標的および非標的細胞の２Ｄ電気泳動によって決定し得る。例えば、ｍＲＮＡプロファイリングは、典型的にはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイを用い、標的および非標的組織（例えば、腫瘍および隣接正常組織）から調製したｃＲＮＡを、Ｃａｏらの文献（ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２７；５（１）：２６（２００４））に記載のように、比較することによって行う。
【０１７６】
プロテオーム法においては、標的細胞および非標的細胞を、典型的には溶解するかまたはホモジナイズし、次いで二次元で電気泳動に供する。次いで、タンパク質をゲル中で固定し、視覚化のために染色する。標的および非標的細胞由来のゲルの画像分析は、違った形で発現されるよりもタンパク質スポットを明らかにすることができる。次いで、これらのスポットは、タンパク質スポットの切除、ゲル内トリプシン消化、および質量分光光度計による分析によって確認することができる。この方法は、例えば、Ｖａｎ  Ｇｒｅｅｖｅｎｂｒｏｅｋ  ｅｔ  ａｌ．４５，１１４８−１１５４（２００４）に記載されている。
【０１７７】
適当なエフェクターマーカーは、多数の方法で、例えば推定されるリン酸化部位を有するレセプターを確認することによって確認することができる。タンパク質またはＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋまたはその他の公開データベースから入手することができ、可能性のあるリン酸化部位は、利用可能な公開サーチエンジン、例えばＳｃａｎＳｉｔｅ（オンラインで「ｈｔｔｐ：／／」を記入し、次いで「ｓｃａｎｓｉｔｅ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／」を記入することによって見出される）またはＮｅｔＰｈｏｓ（ウェブ上で「ｗｗｗ．」を記入し、次に「ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＰｈｏｓ／」を記入することによって見出される）により予測することができる。リン酸化部位を有するレセプターは、シグナル伝達に関与する場合が多いことから、良好なエフェクターマーカーであると思われる。また、適当なエフェクターマーカーは、標的細胞を、細胞上のマーカーに対する抗体と接触させ、次いで前記のようにして所望の生物活性についてアッセイすることによって確認し得る。
【０１７８】
（実施例４：一価および二価結合ドメインの試験）
結合ドメインまたは二重特異性結合分子の一価親和性を試験するために、ｂｓＢＡを前記のようにして製造した。結合反応速度を表面プラズモン共鳴で測定するために、バイオセンサーチップを、Ｎ−エチル−Ｎ´−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を使用して、製造業者（ＢＩＡｃｏｒｅ）に説明書に従って、レセプターの共有結合のために活性化することができる。次いで、マーカーを、例えば１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に注入することによって結合させて、理想的には固定された物質の４００応答単位（ＲＵ）よりも小さいシグナルを得る。反応速度測定については、一価のまたは二重特異性の結合ドメインの２倍連続希釈液を、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液（リン酸緩衝食塩水中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で抗原チップ上に２５℃で２０μｌ／分の流量を使用して注入する。次いで、解離データをｏｎｅ−ｓｉｔｅモデルに挿入してｋｏｆｆを得、擬似一次速度定数（ｋｓ）をそれぞれの結合曲線について計算し、タンパク質濃度の関数としてプロットしてｋｏｎ＋／−ｓ．ｅ．を得ることができる。次いで、平衡解離定数Ｋｄを、ＳＰＲ測定値からｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出することができる。実験アーチファクト、例えば解離したｂｓＢＡの再結合の不存在は、種々の密度、例えば１００、２００および４００ＲＵのいくつかの表面上で前記測定を行うことによって調べなければならない。
【０１７９】
あるいは、これらの親和性は、例えばＮｉｅｌｓｅｎらの論文（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０（２２）：６４３４−４０（２０００））に記載のようにしてフローサイトメトリーにより決定してもよい。
【０１８０】
（実施例５：細胞中のエフェクター機能の測定）
結合ドメインのエフェクター機能は、培養液中で増殖させた標的細胞を、エフェクター結合ドメインと種々の濃度で、例えば３０分間接触させることによって調べることができる。この時点で、細胞は、ある場合には、外因性増殖因子により刺激されて分子が変わろうとする生物効果を促す。６ウエルまたは１２ウエルの組織培養プレートで増殖させた処理細胞の抽出物を、細胞を２７Ｇ注射針を介して、氷上のプロテアーゼインヒビター（１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｇ／ｍＬ  ロイペプチン、１ｇ／ｍＬ  ペプスタチン）を含有する溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％トリトンＸ−１００、０．５％  ＮＰ４０、１０ｍＭ  β−グリセロホスフェート、１０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４）中に５回通すことによって調製した。溶解前に、細胞を冷ＰＢＳ中で２回洗浄した。次いで、溶解液を、例えばリン特異性抗体を用いて免疫ブロットすることによって分析した：全細胞タンパク質抽出液（５０ｇの全タンパク質／レーン）を、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥプレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して電気泳動により再溶解し、ニトロセルロース濾紙に移し、マーカーまたは下流の会合タンパク質の活性化を検出する抗体と共にインキュベートした。あるいは、溶解液は、Ｎｉｅｌｓｅｎらの論文（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１００（１６）：９３３０−５（２００３））に記載のようにして抗体マイクロアレイにより分析してもよい。
【０１８１】
結合ドメインのエフェクター機能は、所望の生物学的機能の別の読み取り、例えば細胞増殖アッセイによって調べてもよい。標的細胞を、ＤＭＥＭおよび５％ＦＣＳならびに種々の濃度の結合ドメインを含有する９６ウエル皿にウエル当たり５×１０３個で接種することができる。７２時間後に、細胞を溶解し、ＡＴＰの量をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ蛍光細胞生存アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で製造業者のプロトコールに従って測定することができる。
【０１８２】
リン酸化および増殖アッセイの結果は、阻害の程度について、濃度の対数と、次式
【０１８３】
【数１】
2007536254.tif 000002
に当てはめることによってエフェクタードメインおよびターゲッティングドメインについて測定したＩＣ５０との関数としてプロットすることができる。
【０１８４】
（実施例６：ｂｓＢＡの試験）
ＥｒｂＢレセプターが介在する細胞シグナル伝達をｂｓＢＡが抑制、低下または阻害することができる能力についてｂｓＢＡの効果を試験するために、癌細胞、例えばＡ４３１（エストロゲン依存性乳癌細胞系、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＧＤＳ１２１）を、ｂｓＢＡと種々の濃度で３０分間インキュベートし、その後に前記細胞に増殖因子（例えば、ヘレグリンまたはＥＧＦ）を最大２時間感染させた。次いで、細胞をトリトン緩衝液に溶解し、次いで音波粉砕した。次いで、溶解液を、免疫ブロットによるかまたはタンパク質のリン酸化に感受性の抗体マイクロアレイを使用することによりリン酸化の変化について分析した（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，ＰＮＡＳ  １００：９３３０参照）。
【０１８５】
例えば、本発明者らのコンピューターによるモデル化は、細胞当たり１００万コピーで発現される細胞表面抗原に結合するターゲッティングドメインであって１ｎＭの親和性を有するターゲッティングドメインと、ＥｒｂＢ３に結合する（従って、ヘレグリン結合について競争する）エフェクタードメインであって１Ｍの親和性を有するエフェクタードメインとを有するｂｓＢＡが、１ｎＭの親和性を有し、両者が結合するターゲッティングドメインとエフェクタードメインとを有するｂｓＢＡと同じように有効である（ＩＣ５０によって測定されるように）ことを予測する。
【０１８６】
ｂｓＢＡは、適当な抗原を発現する癌の増殖を抑制するために使用することができる。ｂｓＢＡの効果は、小分子薬剤をｂｓＢＡに結合することによって増大させることができる。前記薬剤は、例えば、標準的な細胞障害剤、例えば化学療法剤、またはチロシンキナーゼインヒビター、例えばグリベック（登録商標）（イマチニブメシレート）であることができる。
【０１８７】
（実施例７：  ＥｒｂＢ  ＢｓＢＡ）
Ａ４３１細胞でのヘレグリン（ＨＲＧ）誘発ＥＲＫおよびＡＫＴ活性化のコンピューターシミュレーションは、ｂｓＢＡのＥｒｂＢレセプター結合分子の１つがそのレセプターに対して、別のＥｒｂＢ結合分子がそのレセプターに対して有する親和性よりも低い親和性を有する場合に、ＥｒｂＢ  ｂｓＢＡが最も有効であることを示した。
【０１８８】
本発明のｂｓＢＡの低親和性結合分子がＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４のいずれかに指向させられかつｂｓＢＡの高親和性結合分子が別のＥｒｂＢレセプター（例えば、ＥｒｂＢまたはＥｒｂＢ２）に指向させられる場合には、ｂｓＢＡは、ＥｒｂＢレセプターが介在する細胞シグナル伝達を、ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４をＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４レセプター、ｂｓＢＡ、およびＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ２レセプターからなる四量化複合体（すなわち、ＥｒｂＢ３／４：ｂｓＢＡ：ＥｒｂＢ１／２）中に隔離する（と考えられる）ことによって、低下させるか、抑制するかまたは阻害する。
【０１８９】
ｂｓＢＡの結合分子はまた、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４に指向させられることもできる。このようなｂｓＢＡは、これらのＥｒｂＢレセプターとＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ２との二量化を阻害すると考えられる。ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４と、ＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ２との二量化はシグナル伝達に必要であることから、ｂｓＢＡは二量体の形成を妨害することによって細胞シグナル伝達を効果的に抑制するか、低下させるかまたは阻害する。このｂｓＢＡの低親和性結合分子はＥｒｂＢ３に結合することが好ましい。
【０１９０】
ｂｓＢＡの結合分子は、該分子がＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ２に結合し、それによってこれらの２つのレセプターを架橋するように調製することができる。このｂｓＢＡは、前記で論じたようにシグナル伝達に必要であるＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ２と、ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４との二量化を低下させるか、抑制するかまたは阻害することによって機能する。このｂｓＢＡの低親和性結合分子はＥｒｂＢ１に結合することが好ましい。
【０１９１】
典型的なｂｓＢＡとしては、ＥＧＦＲまたはＥｒｂＢ４に対して高結合性分子を有するＥｒｂＢ３に結合する低親和性結合分子が挙げられる。ＢｓＢＡはまた、細胞毒性剤または化学療法剤を、ＥｒｂＢレセプターを発現する細胞に局在させるのに使用することができる。これらの薬剤は２つの結合分子を有し、そのそれぞれは異なるＥｒｂＢレセプター、およびｂｓＢＡに複合される細胞毒性剤または化学療法剤（例えば、サポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセートまたは放射性同位元素ハプテン）に対して特異的である。ＢｓＢＡは、完全な長さの抗体または抗体フラグメント（例えばＦ（ａｂ´）２または（Ｆｖ）２二重特異性抗体）、ダイアボディとして、あるいは２つの異なる結合分子を有するアプタマーとして調製することができる。
【０１９２】
前記モデルは、ＥｒｂＢファミリーのレセプターを使用して試験されている。ＥＧＦまたはＨＲＧによるＥｒｂＢレセプターの刺激は、ＥＲＫおよびＡＫＴのリン酸化をもたらす経路であって、シグナルカスケード内の種々のレベルでクロストークする経路の同時活性化をもたらす。分析の感度は、本発明者らがモデル出力の不確実さを、モデル入力における不確実さの種々の原因に割り当てることを可能にする。腫瘍細胞は異なるレセプター発現レベルに特徴があるので、本発明者らは、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４をＨＲＧがリガンドある場合に極めて感度のよい標的として確認した。
【０１９３】
一般的に、ｂｓＢＡの結合分子が抗体またはそのフラグメントである場合には、これらの結合分子は、その解離定数または場合によっては結合定数および解離定数が容易に測定することができることから、生化学的に十分に特定することができる。同様に、抗体の作用のメカニズムは、数学的モデルを使用して容易に説明することができ、また公知の抗体をインヒビターとして使用する効果はコンピューター内で試験することができる。本発明者らのコンピューターモデルを使用して、本発明者らは、ＥｒｂＢ細胞シグナル伝達経路を妨害するために二重特異性抗体（すなわち、２つの異なる結合分子を有し、そのそれぞれの結合領域が異なるＥｒｂＢレセプターを結合する抗体）を使用するというアイデアを試験した。コンピューター内での結果は、２種類のＥｒｂＢレセプターに対して結合特異性を有する抗体（その一方のＥｒｂＢレセプターに対する結合親和性は、他方のＥｒｂＢレセプターに対する結合親和性よりも大きい）が、ＥｒｂＢ経路による細胞シグナル伝達を妨害または抑制するのに理想的であることを確認する。
【０１９４】
コンピューター内でのアプローチを使用して、本発明者らは、ＥｒｂＢレセプターの異なる発現を示す３種類の細胞系（表１）においてＥｒｂＢシグナル伝達経路の活性化を妨害または抑制するために２種類のＥｒｂＢレセプターを標的とする二重特異性抗体の能力を、１つのＥｒｂＢレセプターだけを標的とする慣用のインヒビターの能力と比較した。それぞれの細胞系におけるシグナル阻害は、コンピューター内で二重特異性抗体についておよび現在の治療剤単一特異性抗体についてモデル化した。本発明者らのモデルは、２種類のＥｒｂＢレセプターに対する異なる親和性を有する二重特異性抗体による細胞シグナル伝達の阻害が、従来の単一のレセプターインヒビターが介在する細胞シグナル伝達の阻害よりもはるかに大きいであろうということを予測した。本発明者らのコンピューターモデル化によって作製されたデータを表２に示す。腫瘍中に存在するレセプター比率に応じて、高親和性結合分子と低親和性結合分子とを有する異なるｂｓＡｂは、単一特異性抗体よりもまたは２つの結合分子がそのそれぞれの抗原に同じ結合親和性を示して結合する二重特異性抗体よりも実質的により強力なインヒビターであると予測される。
【０１９５】
（表１：種々の細胞系でのＥｒｂＢレセプターのレセプター発現プロフィール）
【０１９６】
【表１】
2007536254.tif 000003
。
【０１９７】
（表２：従来の単一特異性レセプターインヒビターと比較したｂｓＢＡによる阻害）
【０１９８】
【表２】
2007536254.tif 000004
。
【０１９９】
本発明者らは、全ての刺激条件下でＥｒｂＢ経路の活性化により、細胞シグナル伝達を抑制するための最も効果的な遮断剤としてＥｒｂＢ１（高親和性）およびＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４（低親和性）に対する二重特異性抗体を確認した。ＥｒｂＢ１−ＥｒｂＢ２  ｂｓＡｂもまた、全ての刺激条件下でＥｒｂＢ細胞シグナル伝達遮断剤として極めて有効であった。ＨＲＧを活性化剤として使用した場合には、ＥｒｂＢ３−ＥｒｂＢ４  ｂｓＡｂはＥｒｂＢ経路の極めて効果的な遮断剤である。従って、好ましいｂｓＢＡは、遮断剤の少なくとも１つの特徴がＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４レセプター（低親和性結合分子を使用する）を標的とする能力であるｂｓＢＡである。実際に、コンピューター用いたモデルの助けを借りて、本発明者らは、ＥｒｂＢ３／４の強いシグナル伝達性を確認した。ＥｒｂＢ３／４をこれら自体に、またはよりいっそう典型的な癌抗原、例えばＥｒｂＢまたはＥｒｂＢ２に架橋すると、２つのレセプターの同時阻害またはこれらのレセプターの隔離のいずれかによってＥｒｂＢ３／４のシグナル伝達を阻害するメカニズムとして働く。
【０２００】
従来の単一特異性遮断剤、例えば単一特異性抗体よりもむしろｂｓＢＡの使用と関係がある利点の１つは、二重特異性遮断剤が安定な三量体（すなわち、ＥｒｂＢレセプター−二重特異性遮断剤−ＥｒｂＢレセプター）を形成することである。従って、ｂｓＢＡの効果は、表２に示すように、従来の単一レセプターインヒビターの効果よりもはるかに高い。
【０２０１】
２種類のＥｒｂＢレセプターに結合することによって、本発明のｂｓＢＡは、ＥｒｂＢレセプターを同一または異なるＥｒｂＢレセプターと相互作用することから隔離する。ｂｓＢＡは、結合されたＥｒｂＢレセプターの細胞シグナル伝達活性を抑制、低下または阻害する極めて安定な（不可逆性の）三量体複合体を形成する。ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、またはＥｒｂＢ４のいずれかに対するｂｓＢＡの初期結合段階は、可逆的段階であることができ、残りのＥｒｂＢレセプターに対する第２の結合段階は、極めて安定な三量体の形成をもたらす。あるいは、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４のいずれかに対するｂｓＢＡの最初の結合段階は不可逆性であり得、第２の結合段階は可逆的であり、それによってｂｓＢＡが多種の三量体複合体を形成することを可能にする。ＥｒｂＢレセプター：ｂｓＢＡ：ＥｒｂＢレセプター三量体の形成は、細胞シグナル伝達を誘導することができない複合体をもたらす。さらにまた、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、およびＥｒｂＢ４を隔離することによって、ｂｓＢＡはこれらのＥｒｂＢレセプターと同一または異なるＥｒｂＢレセプターとの二量化を抑制、低下または阻害する。ｂｓＢＡは、ＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ２に対してより高い親和性を有しかつＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４に対してより低い親和性を有することが好ましい。但し、ｂｓＢＡの一方の結合ドメインがＥｒｂＢ２対して高親和性を有し、第２の結合ドメインがＥｒｂＢ３に結合しないことを条件とする。
【０２０２】
ｂｓＢＡの２つの結合分子の１つだけが関与する不完全ｂｓＢＡ−ＥｒｂＢレセプター二量体の形成は、細胞シグナル伝達を損なう複合体をもたらさない；三量体複合体（すなわち、ＥｒｂＢレセプター：ｂｓＢＡ：ＥｒｂＢレセプター）の形成のみが、細胞シグナル伝達を抑制する。さらにまた、三量体形成はｂｓＢＡによって結合される２つのＥｒｂＢレセプター同士の間では不可能である。
【０２０３】
ｂｓＢＡのその他の特徴としては、１つの結合ドメインがＥｒｂＢレセプター、例えばＨＲＧに対して天然リガンドと競争することによって細胞シグナル伝達を低下、抑制または阻止する能力が挙げられる。
【０２０４】
本発明者らのコンピューター内でのデータは、ＥｒｂＢ３−ＥｒｂＢ４  ｂｓＢＡが細胞シグナル伝達の妨害において単一特異性ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４インヒビターよりも有効であることを実証する。ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４だけに指向させられる単一特異性インヒビターは、主としてＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４の高い細胞表面発現レベルにより、ＡＫＴリン酸化をＥｒｂＢ３−ＥｒｂＢ４  ｂｓＢＡと同じ程度に有効に阻害しない。ＡＫＴリン酸化は、ＥｒｂＢ３単一特異性インヒビターおよびＥｒｂＢ４単一特異性インヒビターの両方を使用する場合に抑制されるだけである。
【０２０５】
ｂｓＢＡは結合されていない状態ではまたは１つのＥｒｂＢレセプターだけとの二量体複合体としては阻害効果をもたないことから、ＥｒｂＢレセプターがｂｓＢＡで飽和されてしまうようなインヒビター濃度の増大は、ｂｓＢＡの阻害効果の低下をもたらす。この効果は、ｂｓＢＡの結合親和性がＥｒｂＢ４に対するよりもＥｒｂＢ３に対して大きい（すなわち、ＫｄＥｒｂＢ３＞ＥｒｂＢ４）ように、ＥｒｂＢ２に対して高められた親和性を有するｂｓＢＡを提供することによって逆転させることができる。
【０２０６】
前記で論じたｂｓＢＡは、ＨＲＧ抑制療法（ｄｏｍｉｎａｔｅｄ  ｒｅｇｉｍｅ）において特に効果がある。一般的に、ｂｓＢＡは、１つのレセプターだけを標的とするＥｒｂＢレセプターインヒビターに比べてはるかに低い用量で効果がある。
【０２０７】
本発明の別の好ましい実施形態は、ｂｓＢＡの一方の結合分子がＥｒｂＢ１（高親和性結合）に対して結合特異性を有しかつ他方の結合分子がＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４（低親和性結合）に対して結合特異性を有するｂｓＢＡである。一般に、腫瘍細胞は多量のＥｒｂＢ１を発現し（すなわち、１００，０００レセプター／細胞よりも多い場合が多い）、これに対してＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４に対するレセプター発現は５，０００〜２０，０００レセプター／細胞の範囲にある。リガンド結合に拮抗するｂｓＢＡは、たとえレセプター発現レベルが１０倍を超えて異なっていてもレセプターシグナル伝達を首尾よく阻害するであろう。
【０２０８】
本発明者らのコンピューター内での分析は、二重特異性ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ４  ｂｓＢＡの効果を確認している。ＥｒｂＢ３レセプターの阻害は、ＨＲＧ抑制療法においてシグナル伝達を阻害する。
【０２０９】
ＥｒｂＢ細胞シグナル伝達経路についての本発明者らのコンピューター内での分析に基づいて、本発明者らはＥｒｂＢ１結合分子を低い解離定数ＫＤ＜１ｎＭをもつが不可逆性でない高親和性結合部位として確認した。ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４レセプターは、ＥｒｂＢ１レセプターよりもはるかに低いレベルで発現される。ｂｓＢＡがＥｒＢ１およびＥｒｂＢ３／ＥｒｂＢ４レセプターの両方に結合することから、およびｂｓＢＡがより豊富なＥｒｂＢ１レセプターに対して高い親和性を有することから、ｂｓＢＡは、慣用の単一特異性ＥｒｂＢインヒビターよりもはるかに低い濃度で、ＥｒｂＢ１と、ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４のいずれかとの二量化が介在する細胞シグナル伝達を効果的に妨害することができる。ＥｒｂＢ１に対するｂｓＢＡの高親和性は、低いｂｓＢＡ濃度で高い効率をもたらす。
【０２１０】
本発明者らのアプローチは、架橋のため最適なレセプターおよび２つの結合分子の所望の親和性を確認するためにコンピューターによるモデル化の利点を利用する。ｂｓＢＡの２つの結合分子の異なる親和性は、ｂｓＢＡを、癌細胞に特異的であるとは考えられないレセプター、例えばＥｒｂＢ３に効率的に向ける。より典型的な癌抗原、例えばＥｒｂＢ１にＥｒｂＢ３を架橋させると、癌細胞を特異的に標的としかつこれらの細胞においてＥｒｂＢ３レセプター活性を調節するための手段を提供する。
【０２１１】
本発明者らのコンピューターによるモデルを使用して、本発明者らは、ｂｓＢＡの２つの結合分子の異なる親和性の必要性を確認した。この異なる親和性は、ｂｓＢＡ三量体複合体の安定化を促進する。一般的に言って、ｂｓＢＡの活性な結合分子は、不活性なまたはあまり活性でない結合分子に比べて低い親和性を有するべきである。ｂｓＢＡの両方の結合分子が不活性であるかまたはあまり活性でない場合には、高発現されるかまたはより強いシグナル伝達レセプターを標的とする結合分子は、高い親和性を有するべきである。標的とされるレセプターについて異なる親和性を有すると、次のこと：すなわちｂｓＢＡがより高い親和性相互作用（例えば  ＥｒｂＢ１）のＫｄよりも高い濃度で投与されるが、より低い親和性相互作用（例えばＥｒｂＢ３）のＫｄよりも低い濃度で投与される場合には、ｂｓＢＡはより高い親和性相互作用に対して抗原を発現する細胞上に蓄積するだけであるべきであるということをもたらす。ｂｓＢＡの一方の端部は、これらの細胞上の低親和性抗原と相互作用してその生物機能を妨害するのに（例えばＥｒｂＢ３；下流シグナル伝達を抑制するために）利用することができる。どちらのレセプターが低親和性相互作用であるかまたは高親和性相互作用であるかは、レセプターの特異的シグナル伝達強度（標的として重要）およびｂｓＢＡの作用様式に依存する。
【０２１２】
本明細書に記載の実施例および実施形態は説明を目的とするだけのことおよびこれらに照らして種々の改変または変更が当業者に示唆されかつ本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。本明細書で引用した全ての刊行物、特許明細書および特許出願明細書は、全ての目的にその全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。
【国際調査報告】
2007536254.tif 000005