(57)【要約】  本発明は担持相合成法の改善に関し、塩類、特に四級アンモニウム塩を利用する、特に担持相ペプチド合成に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘがカチオン、ｎがカチオンの電荷、ｙがアニオン及びｍがアニオンの電荷を表す塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎの存在下で、少なくとも１回の洗浄ステップを実行することを特徴とする、バイオオリゴマーの固相合成法。
【請求項２】
適切に保護したモノマー又はオリゴマーを、保護基で保護し、担体に結合した別のモノマー又はオリゴマーと結合する方法であって、
ａ）担体に結合した前記モノマー又はオリゴマーから、前記保護基を開裂するステップ、
ｂ）完全な洗浄を行うステップ、次いで
ｃ）適切に保護した前記モノマー又はオリゴマーを添加し、担体に結合した前記モノマー又はオリゴマーとそれをカップリングし、共有結合を形成するステップ、
を含み、前記処理中に、この処理で用いる溶媒に可溶性の塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎを添加し、但し、前記塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎをステップｃ）で添加した場合に、前記溶媒はクロロホルム／フェノール混合物、又はクロロホルム／トリフルオロエタノール混合物のいずれでもないことを特徴とする、方法。
【請求項３】
固相ペプチド合成中に、未保護Ｃ末端を有する、α−アミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドを、α−アミノ保護基で保護し、担体に結合した別のアミノ酸又はペプチドと結合する方法であって、
ａ）担体に結合した前記アミノ酸又はペプチドから、前記α−アミノ保護基を開裂するステップ、
ｂ）完全な洗浄を行うステップ、次いで
ｃ）未保護Ｃ末端を有する、α−アミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドを添加し、担体に結合し、今や未保護のＮ末端を有するアミノ酸又はペプチドとそれをカップリングし、アミド結合を形成するステップ、
を含み、前記処理中に、この処理で用いる溶媒に可溶性の塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎを添加し、但し、前記塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎをステップｃ）で添加した場合に、前記溶媒はクロロホルム／フェノール混合物、又はクロロホルム／トリフルオロエタノール混合物のいずれでもないことを特徴とする、方法。
【請求項４】
さらに、
ｄ）完全な洗浄を行うステップ、
を含み、ステップｄ）をステップｃ）の後に行う、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
固相ペプチド合成中に、未保護Ｃ末端を有する、α−アミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドを、α−アミノ保護基で保護し、担体に結合した別のアミノ酸又はペプチドと結合する方法であって、
ａ）担体に結合した前記アミノ酸又はペプチドから、前記α−アミノ保護基を開裂するステップ、
ｂ）完全な洗浄を行うステップ、
ｃ）未保護Ｃ末端を有する、α−アミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドを添加し、担体に結合し、今や未保護のＮ末端を有するアミノ酸又はペプチドとそれをカップリングし、アミド結合を形成するステップ、及び
ｄ）さらに完全な洗浄を行うステップ、
を含み、少なくともステップａ）で、このステップに用いる溶媒に可溶性の塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎを添加することを特徴とする、方法。
【請求項６】
固相ペプチド合成中に、未保護Ｃ末端を有する、α−アミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドを、α−アミノ保護基で保護し、担体に結合した別のアミノ酸又はペプチドと結合する方法であって、
ａ）担体に結合した前記アミノ酸又はペプチドから、前記α−アミノ保護基を開裂するステップ、
ｂ）完全な洗浄を行うステップ、
ｃ）未保護Ｃ末端を有する、α−アミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドを添加し、担体に結合し、今や未保護のＮ末端を有するアミノ酸又はペプチドとそれをカップリングし、アミド結合を形成するステップ、及び
ｄ）さらに完全な洗浄を行うステップ、
を含み、少なくともステップｂ）で、このステップに用いる溶媒に可溶性の塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎを添加することを特徴とする、方法。
【請求項７】
固相ペプチド合成中に、未保護Ｃ末端を有する、α−アミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドを、α−アミノ保護基で保護し、担体に結合した別のアミノ酸又はペプチドと結合する方法であって、
ａ）担体に結合した前記アミノ酸又はペプチドから、前記α−アミノ保護基を開裂するステップ、
ｂ）完全な洗浄を行うステップ、
ｃ）未保護Ｃ末端を有する、α−アミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドを添加し、担体に結合し、今や未保護のＮ末端を有するアミノ酸又はペプチドとそれをカップリングし、アミド結合を形成するステップ、及び
ｄ）さらに完全な洗浄を行うステップ、
を含み、少なくともステップｃ）で、このステップに用いる溶媒に可溶性の塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎを添加し、前記溶媒がクロロホルム／フェノール混合物、クロロホルム／トリフルオロエタノール混合物のいずれでもないことを特徴とする、方法。
【請求項８】
固相ペプチド合成中に、未保護Ｃ末端を有する、α−アミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドを、α−アミノ保護基で保護し、担体に結合した別のアミノ酸又はペプチドと結合する方法であって、
ａ）担体に結合した前記アミノ酸又はペプチドから、前記α−アミノ保護基を開裂するステップ、
ｂ）完全な洗浄を行うステップ、
ｃ）未保護Ｃ末端を有する、α−アミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドを添加して、前記担体に結合し、今や未保護のＮ末端を有するアミノ酸又はペプチドとそれをカップリングし、アミド結合を形成するステップ、及び
ｄ）さらに完全な洗浄を行うステップ、
を含み、少なくともステップｄ）で、このステップに用いる溶媒に可溶性の塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎを添加することを特徴とする、方法。
【請求項９】
前記塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎは、四級アンモニウム塩、イオン液体、ホスホニウム塩、スルホニウム塩、無機塩、又はそのいずれかの混合物の群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
（Ｙｍ−）ｎは、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、硝酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、テトラフルオロホウ酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、酢酸塩、カルボン酸塩、シアン化物、イソシアン酸塩、テトラ−アルキルホウ酸塩、テトラ−アリールホウ酸塩、トリフルオロ酢酸塩、トシレート、メシレート、又はそのいずれかの混合物の群から選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
四級アンモニウム塩は、ベンジルトリメチルアンモニウムヒドロキシド、ベンジルトリメチルアンモニウムクロリド、又はベンジルトリメチルアンモニウム炭酸塩から選択され、前記ホスホニウム塩はテトラブチルホスホニウムブロミドであり、前記スルホニウム塩はトリエチルスルホニウムテトラフルオロホウ酸塩である、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
ステップａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）で添加する前記塩類は、１つ又は複数の他のステップでも添加される、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記α−アミノ保護基は、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）若しくはＮｓｃ（ｐ−ニトロフェニルスルホニルエトキシカーボネート、又はその他任意の塩基開裂性保護基である、請求項３〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記α−アミノ保護基は、Ｂｏｃ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）、Ｔｒｔ（トリチル）、Ｂｐｏｃ（２−ｐ−ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル）、又はその他任意の酸開裂性保護基である、請求項３〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記α−アミノ保護基は、その開裂に酸処理又は塩基処理のいずれも必要としないように選択される、請求項３〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ペプチドを合成する方法であって、
ａ’）α−アミノ保護基を有する第１のアミノ酸又はペプチドを、そのＣ末端を介して官能化担体に結合するステップ、
ｂ’）配列中の次のアミノ酸又はペプチドを予想して、請求項３〜１５のいずれか一項に記載の処理を行うステップ、
ｃ’）所望の配列が得られるまで、適切なアミノ酸又はペプチドにてステップｂ’）を繰り返すステップ、
ｄ’）形成したペプチドを、適切な方法で担体から開裂するステップ、
を含む、使用。
【請求項１７】
ペプチドレジンの洗浄を改善するための、固相ペプチド合成における塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎの使用。
【請求項１８】
過剰なアミノ酸又は切断試薬の除去を改善するための、請求項１７記載の固相ペプチド合成における塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、担持相（ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  ｐｈａｓｅ）合成法の改善に関する。
【０００２】
担持相合成とも呼ばれる固相合成（ＳＰＳ）では、適切に保護したモノマー又は他のオリゴマーを順次結合させて、担体上でオリゴマーを形成する。これは、カップリング及び脱保護の連続したステップにより行われ、最終的には洗浄サイクルによって分離される。
【０００３】
モノマーは、担体上で形成する分子の構成単位である。例えば、モノマーは、適切に保護したアミノ酸であり、適切に保護したヌクレオチド、適切に保護したペプチド核酸、適切に保護した単糖類、又は同じファミリーの近似した修飾構造であるが、この限りではない。
【０００４】
オリゴマーは、同じファミリーのモノマーが少なくとも２個以上集まった構造、又はそれが組み合わさった構造をしている。オリゴマーの定義では、バイオオリゴマーが含まれる。バイオオリゴマーには、ペプチド、オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ，ＲＮＡ）、オリゴ糖、ペプチド核酸（ＰＮＡ、）又はそれらの混合が含まれるが、この限りではない。オリゴマーは直鎖又は分岐鎖となることができる。
【０００５】
担体（ｓｕｐｐｏｒｔ）は、オリゴマー又は第１モノマーが結合する生成物である。担体に結合したオリゴマーが固体の場合、担体は完全な洗浄の実施を可能にする。担体例は、ポリスチレンビーズ、ゼオライト、微細孔性（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ）ガラスビーズ、セルロース、ＰＥＧレジン、又はポリアミドなどであるが、この限りではない。別の有用な担体例は、溶解状態で存在しうるポリマーで、完全な洗浄を可能とするために適切な溶剤を添加することで沈殿させることができる。
【０００６】
固相合成が行われる担体は、リンカーにより官能基化される（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅ）。
【０００７】
好ましい担体例は、固相ペプチド合成に使用されることの多いポリスチレン−１％ジビニルベンゼン樹脂である。
【０００８】
結合している、又は結合という用語は一般に、共有結合の形成を意味し、以下のいずれかの共有結合に使用される。すなわち、リンカーを介して形成される、第１モノマーと担体との共有結合や、オリゴマー中のいずれかのモノマー同士の共有結合でありうる。第１モノマーと担体との結合はリンカーを介して形成され、オリゴマー中のモノマー同士の結合には、例えば、骨格や側鎖の官能基といったモノマーの官能性を利用することもある。固相ペプチド合成では、第１アミノ酸はベンジル型リンカーを介して担体に結合することもある。リンカーは、担体に共有的に結合し、適正な化学条件下で標的オリゴマーを遊離する適切な分子構造である。ベンジルエステル、モノアルキルオキシベンジルエステルなどのベンジル型リンカーがしばしば用いられるが、他のリンカーを検討することもできる。ベンジル型リンカーは、標的オリゴマーを酸分解性条件下で遊離する。
【０００９】
完全な洗浄下で、残留副産物や、例えば、カップリング試薬又は脱保護試薬など前のステップの残留試薬を除去する技術的方法が知られている。完全な洗浄はバッチ式又は連続式の方法で行うことができる。連続式法の例では、カラム中で溶媒による担体の完全な洗浄、又は遠心分離のような物理的手段による副産物や試薬の除去がある。
【背景技術】
【００１０】
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）では、担体であるポリスチレンビーズ上でペプチドを形成する。溶液中で合成する代わりに担体上でペプチド鎖を構築することには明らかな利点がある。すなわち、ろ過・洗浄するだけで可溶性の試薬や溶媒から中間体ペプチドを分離することができるため、溶液合成法での操作に比べて時間と労力の節約につながる。
【００１１】
固相ペプチド合成の一般原則は以下の通りである（「Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成、実践的手法（Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」，Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００，ｐ．４１−７６、「「固相合成、」実践ガイド（ＳＯＬＩＤ  ＰＨＡＳＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ）」，Ｓｔｅｖｅｎ  Ａ．Ｋａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｆｅｒｎａｎｄｏ  Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，２０００  ｐ．２５−３３０、「固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」，Ｇｒｅｇｇ  Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７，ｐａｇｅｓ  ３−８３参照）。一般に、標的ペプチドのＣ末端残基は担体に結合する。アミノ酸の側鎖は、リンカーとの結合に使用することもできる。ほとんどの、又は好ましくはすべてのアミノ酸側鎖の官能基は、ペプチド鎖形成時の反応条件に影響を受けない恒久的保護基でマスクしなければならない。カップリングする各アミノ酸のα−アミノ基は、一時的に保護する。第１アミノ酸の初回結合後、α−アミノ基をマスクしている一時的な保護基を除去する。その後、洗浄を行う。次に、第２アミノ酸を過剰に導入し、このアミノ酸のカルボキシ基をカップリング試薬と反応させて活性化し、アミド結合を形成する。このカップリングの後、過剰の試薬を洗浄して除く。次に、保護基をジペプチドのＮ末端から除去する。第３アミノ酸残基を付加する前に、さらに完全な洗浄を行う。この処理を所望のペプチド配列が形成されるまで繰り返す。最終ステップでは、ペプチドを担体から遊離する。
【００１２】
十分な洗浄は、各カップリングステップ後、及びα−アミノ保護基の各開裂後、すなわち、各Ｎ末端の脱保護ステップ後に必要であるが、これは、最終ペプチドの配列エラーにつながりかねない有害な化学物質を除去するためである。特に、カップリング後の洗浄が正しく行われなかったために、Ｎ末端の脱保護ステップで活性化したアミノ酸が残留している場合は、このアミノ酸に無用のカップリングが起こり、ペプチド配列に同一アミノ酸の２重付加に付随する不純物が生じる結果になる。同様に、Ｎ末端の脱保護後、及び新規アミノ酸添加前の洗浄が正しく行われないケースでは、切断試薬が溶液中に残留するため、次のカップリングステップで２重のアミノ酸付加が生じることになる。
【００１３】
従来の手法ではこうした２重付加配列を回避するため、各カップリング後に約６〜１０回の洗浄が必要であり、各Ｎ末端脱保護ステップ後に更に約６〜１０回の洗浄が必要となる。これは、従来の手法では、各アミノ酸につき、１回当たり溶媒約１０ｍｌ／ｇｒ乾燥無担持担体を用いる約１２〜２０回の洗浄が必要となることを意味する（「ペプチド合成プロトコル（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｗ．Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｂｅｎ  Ｍ．Ｄｕｎｎ，ｖｏｌ．３５，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １，Ｐａｒａｇｒａｐｈ  ３．２．１、「Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成、実践的手法（Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」，Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００，ｐ．１５  表２並びにｐ．４３参照）。洗浄ステップの回数、及び個々の洗浄ステップに必要な溶媒量の削減は、溶媒及び時間の節約という点で重要な進歩となるであろう。
【００１４】
これは、固相ペプチド合成だけではなく、オリゴマーを担体上で形成するいかなる合成法に関しても同様に当てはまる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明が解決すべき問題は、したがって、従来技術法に比べて、全溶媒量及び処理時間を大幅に削減する改善された方法を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
現在では、担持相合成中に塩類を添加すると、洗浄効率が大幅に向上することがわかっている。さらに、カップリングステップと脱保護ステップ間の洗浄を行わずに処理することも可能である。
【００１７】
したがって、一態様では、本発明は、適切に保護したモノマー又はオリゴマーを、保護基で保護し、担体に結合した別のモノマー又はオリゴマーに結合する方法であって、
ａ）担体に結合したモノマー又はオリゴマーから保護基を開裂するステップと、
ｂ）完全な洗浄を行うステップと、
ｃ）適切に保護した前記モノマー又はオリゴマーを添加し、担体に結合したモノマー又はオリゴマーにそれをカップリングし、共有結合を形成するステップと
を含む方法であり、前記処理中に前記処理で用いる溶媒に可溶性の塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎを添加し、但し、前記塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎをステップｃ）で添加する場合は、溶媒はクロロホルム／フェノール混合物、又はクロロホルム／トリフルオロエタノール混合物のいずれでもないことを特徴とする方法を提供する。
【００１８】
別の一態様では、本発明は、固相ペプチド合成中に、未保護Ｃ末端を有する、α−アミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドを、α−アミノ保護基で保護し、担体に結合した別のアミノ酸又はペプチドと結合する方法で、
ａ）α−アミノ保護基を、担体に結合したアミノ酸又はペプチドから開裂するステップと、
ｂ）完全な洗浄を行うステップと、
ｃ）未保護Ｃ末端を有する、α−アミノ基が保護されたアミノ酸を添加して、担体に結合し、今や未保護のＮ末端を有するアミノ酸又はペプチドとそれをカップリングし、アミド結合を形成するステップと
を含む方法であり、前記処理中に、前記処理に用いる溶媒に可溶性の塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎを添加し、但し、前記塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎをステップｃ）で添加した場合に、前記溶媒はクロロホルム／フェノール混合物、又はクロロホルム／トリフルオロエタノール混合物のいずれでもないことを特徴とする方法を提供する。
【００１９】
好ましくは、本発明による方法は、さらに以下のステップを含む。
ｄ）完全な洗浄を行う。ステップｄ）はステップｃ）の後に行われる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
好ましい一態様では、本発明は、固相ペプチド合成中に、未保護Ｃ末端を有する、α−アミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドを、α−アミノ保護基で保護し、担体に結合した別のアミノ酸又はペプチドと結合する方法で、
ａ）α−アミノ保護基を、担体に結合したアミノ酸又はペプチドから開裂するステップと、
ｂ）完全な洗浄を行うステップと、
ｃ）未保護Ｃ末端を有する、α−アミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドを添加して、担体に結合し、今や未保護のＮ末端を有するアミノ酸又はペプチドとそれをカップリングし、アミド結合を形成するステップと、
ｄ）さらに完全な洗浄を行うステップと
を含み、少なくともステップａ）で、このステップに用いる溶媒に可溶性の塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎを添加することを特徴とする方法を提供する。
【００２１】
固相ペプチド合成では、ステップａ）は脱保護ステップとして知られ、ステップｃ）はカップリングステップとして知られる。
【００２２】
本発明によりステップｃ）で添加されるアミノ酸又はペプチドは、そのアミノ末端で保護されるものの、未保護Ｃ末端を有していることが重要である。
【００２３】
この発明で使われるペプチドという用語には、ジペプチドやトリペプチドといった単鎖オリゴペプチドなど、いかなる長さのペプチドも含まれる。（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎでは、Ｘはカチオン、ｎがカチオンの電荷、ｙがアニオン、ｍがアニオンの電荷を表す。
【００２４】
溶媒中で少なくとも重量０．０１％の溶解度を有する塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎであれば、いずれを使用してもよい。Ｘｎ＋はいかなるカチオンでもよいが、アンモニウム、ホスホニウム、又はスルホニウムが好ましい。Ｙｍ−はいかなるアニオンでもよいが、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩が好ましい。（Ｙｍ−）ｎが、硝酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、テトラフルオロホウ酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、酢酸塩、カルボン酸塩、シアン化物、イソシアン酸塩、テトラ−アルキルホウ酸塩、テトラリール（ｔｅｔｒａｒｙｌ）ホウ酸塩、トリフルオロ酢酸塩、トシレート、又はメシレートから選択される塩類を使用することができる。塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎは、四級アンモニウム塩、イオン液体、ホスホニウム塩、無機カオチン、又はスルホニウム塩から選択されることが好ましい。また、本発明には、これら塩類のいかなる混合物も含まれる。
【００２５】
四級アンモニウム塩が、ベンジルトリメチルアンモニウムヒドロキシド（ＢＴＭＡヒドロキシド）、ベンジルトリメチルアンモニウムクロリド（ＢＴＭＡクロリド）、ベンジルトリメチルアンモニウム炭酸塩（ＢＴＭＡ炭酸塩）から選択され、ホスホニウム塩がテトラブチルホスホニウムブロミドであり、スルホニウム塩がトリエチルスルホニウムテトラフルオロホウ酸塩である場合は特に、洗浄効率の改善が得られる。また、これら塩類のいかなる混合物も本発明に含まれる。
【００２６】
典型的には、塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎは、完全な洗浄中に溶媒容積１〜２ｗ％濃度で使用する。前記濃度は、使用する溶媒中で０．１ｗ％まで低下させる、又はその溶解限界まで上昇させることができる。
【００２７】
α−アミノ保護基の開裂後の完全な洗浄中、又はα−アミノ基が保護されたアミノ酸を担体上でペプチドにカップリングするステップ中、又はこのカップリング後の完全な洗浄中に塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎを添加することによっても、洗浄効率をさらに改善することができる。したがって、塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎは、ステップａ）だけでなく、さらに、その他ｂ）、ｃ）、又はｄ）のいずれか１つ又は複数のステップにおいても添加することが好ましい。
【００２８】
別の好ましい態様では、本発明は、固相ペプチド合成中に、未保護Ｃ末端を有する、α−アミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドを、α−アミノ保護基で保護し、担体に結合した別のアミノ酸又はペプチドと結合させるための方法で、
ａ）担体に結合した前記アミノ酸又はペプチドから、α−アミノ保護基を開裂するステップと、
ｂ）完全な洗浄を行うステップと、
ｃ）未保護Ｃ末端を有する、α−アミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドを添加して、担体に結合し、今や未保護のＮ末端を有するアミノ酸又はペプチドとそれをカップリングし、アミド結合を形成させるステップと、
ｄ）さらに完全な洗浄を行うステップと
を含み、少なくともステップｂ）で、このステップに用いる溶媒に可溶性の塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎを添加することを特徴とする方法を提供する。
【００２９】
前記塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎは、ステップｂ）だけでなく、さらに、その他ａ）、ｃ）、又はｄ）のいずれか１つ又は複数のステップにおいても添加することが好ましい。
【００３０】
別の好ましい態様では、本発明は、固相ペプチド合成中に、未保護Ｃ末端を有する、α−アミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドを、α−アミノ保護基で保護し、担体に結合した別のアミノ酸又はペプチドと結合させるための方法で、
ａ）担体に結合した前記アミノ酸又はペプチドから、前記α−アミノ保護基を開裂するステップと、
ｂ）完全な洗浄を行うステップと、
ｃ）未保護Ｃ末端を有する、α−アミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドを添加して、担体に結合し、今や未保護Ｎ末端を有するアミノ酸又はペプチドとカップリングし、アミド結合を形成させるステップと、
ｄ）さらに完全な洗浄を行うステップと
を含み、少なくともステップｃ）で、このステップに用いる溶媒に可溶性の塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎを添加し、前記溶媒がクロロホルム／フェノール混合物、又はクロロホルム／トリフルオロエタノール混合物のいずれでもないことを特徴とする方法を提供する。
【００３１】
前記塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎは、ステップｃ）だけでなく、さらに、その他ａ）、ｂ）、又はｄ）のいずれか１つ又は複数のステップにおいても添加することが好ましい。
【００３２】
別の好ましい態様では、本発明は、固相ペプチド合成中に、未保護Ｃ末端を有する、α−アミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドを、α−アミノ保護基で保護し、担体に結合した別のアミノ酸又はペプチドと結合させるための方法で、
ａ）担体に結合した前記アミノ酸又はペプチドから、前記α−アミノ保護基を開裂するステップと、
ｂ）完全な洗浄を行うステップと、
ｃ）未保護Ｃ末端を有する、α−アミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドを添加して、担体に結合し、今や未保護のＮ末端を有するアミノ酸又はペプチドとそれをカップリングし、アミド結合を形成させるステップと、
ｄ）さらに完全な洗浄を行うステップと
を含み、少なくともステップｄ）で、このステップに用いる溶媒に可溶性の塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎを添加することを特徴とする方法を提供する。
【００３３】
前記塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎは、ステップｄ）だけでなく、さらに、その他ａ）、ｂ）、又はｃ）のいずれか１つ又は複数のステップにおいても添加することが好ましい。
【００３４】
前記方法のすべてのステップには、さまざまな溶媒が選択される可能性がある。好ましくは、溶媒はＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）、ＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリジノン）、ＤＣＭ（ジクロロメタン）、ＡＣＮ（アセトニトリル）、酢酸エステル、アセトン、ジオキサン、グライム  エーテル、低炭酸アルキル、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ＤＭＥ（ジメトキシ・エチル・エーテル）、ＤＭＥＵ（１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン）、ＤＭＰＵ（１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２（１Ｈ）−ピリミジノン）、１，２−ジクロロエタン、イソプロパノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、メチルエチルケトン、ホルムアミド、スルホラン、ＣＨＣｌ３、ＣＣｌ４、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）、ＤＭＡ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド）、超臨界流体、イオン液体、水、又はこれら溶媒のいずれかの混合物から選択される。最も好ましくは、溶媒はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリジノン、又はその混合物である。
【００３５】
本発明によれば、ペプチドからのα−アミノ保護基の開裂後に行う前記完全な洗浄ｂ）は、好ましくは８回以下、最も好ましくは５回以下の洗浄ステップを含む。これは、切断試薬を正しく除去し２重付加配列を避けるために、約１０回の洗浄を必要とする従来技術の固相ペプチド合成法に比べて大幅な改善である。
【００３６】
本発明によれば、α−アミノ保護アミノ酸のカップリング後に行う可能性のある前記完全な洗浄ｄ）は、好ましくは５回以下の洗浄ステップ、最も好ましくは２回以下の洗浄ステップを含む。又は、完全に省略することができる。これもまた、過剰なアミノ酸を正しく除去し２重付加配列を避けるために、６〜１０回の洗浄を必要とする従来技術の固相ペプチド合成法に比べて大幅な改善である。
【００３７】
本発明による１回ごとの洗浄ステップに使用する溶媒量は、従来技術法の溶媒約１０ｍｌ／ｇｒ乾燥無担持担体に比べ、約１〜９ｍｌ／ｇｒ乾燥担体である。
【００３８】
乾燥担体とは、任意の溶媒を添加する前の乾燥状態にある担体をいう。
【００３９】
一般に、各洗浄ステップは通常約２分間持続し、それぞれ約１分まで短縮することができる。個々の洗浄時間は６０分以上まで拡大することができる。完全な洗浄は、単一の洗浄ステップの代わりに連続流式で行うこともできるが、その場合は、流速を適応させる必要がある。上記に記載の方法は、温度０〜５０℃の間で行なわれ、好ましくは０〜３５℃、最も好ましくは１８〜２２℃で行うことができる。前期方法は通常、常圧下で行われるが、より高圧下又は低圧下でも適用可能である。
【００４０】
前記カップリングステップｃ）では、ＤＩＣ（１，３−ジイソプロピルカルボジイミド）、ＤＣＣ（１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＥＤＣ（Ｎ−エチル，Ｎ’−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸）、又はＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩）など、周知の任意のカップリング剤を添加してもよい。本発明によれば、ＤＩＣを使用するのが好ましい。
【００４１】
固相ペプチド合成に好適なα−アミノ保護基は、従来技術でよく知られている（「Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成、実践的手法（Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」，Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００、「「固相合成、」実践ガイド（ＳＯＬＩＤ  ＰＨＡＳＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ）」，Ｓｔｅｖｅｎ  Ａ．Ｋａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｆｅｒｎａｎｄｏ  Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，２０００、「固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」，Ｇｒｅｇｇ  Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７参照）。
【００４２】
一群の既知のα−アミノ保護基は、塩基性条件下で開裂することができる。このグループには、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）及びＮｓｃ（ｐ−ニトロフェニルスルホニルエトキシカーボネート）が含まれるが、この限りではない。α−アミノ保護基のこの群に好適な切断試薬はピペリジンであるが、モルホリンなどの他の塩基を使用することもできる。場合により、ＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカン−７−エン）を追加の切断試薬として添加することができる。
【００４３】
上記に規定した塩基開裂性のα−アミノ保護基を使用して、洗浄が正しく行われない場合、ピペリジンなどの切断試薬は、次のカップリングステップで溶媒中の残留量に残ることになる。したがって、前記カップリングステップでは、早まったα−アミノ保護基の開裂が起こり、２重付加配列をもたらす可能性がある。上記に規定した完全な洗浄ｂ）で酸を添加すると、ピペリジンなどの残留切断試薬をプロトン化し、これらの切断試薬の除去効率を高めるのに役立つ。
【００４４】
担体上で使用するリンカーに不活性のいかなる酸もステップｂ）で添加することができ、ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）、ＨＯＳｕ（Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド）、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、ＨＯＯＢｔ（３−ヒドロキシ−１，２，３−ゼンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン）、ＨＯＡｔ（７−アザ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）、ＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、ＨＮＯ３、Ｈ３ＰＯ４から選択することが好ましい。前記酸はＨＯＢｔが最も好ましい。完全な洗浄Ｂ）が５回の洗浄ステップからなる場合、第２ステップ、又は第３ステップで前記酸を添加することが好ましい。
【００４５】
別の群のα−アミノ保護基は、酸性条件下で開裂することができる。この群には、Ｂｏｃ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）、Ｔｒｔ（トリチル）、Ｂｐｏｃ（２−ｐ−ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル）が含まれるが、この限りではない。ステップａ）で添加する、α−アミノ保護基のこの群に好適な切断試薬は、ＤＣＭ（ジクロロメタン）中のＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）であり、その後、ＴＥＡ（トリエチルアミン）などの塩基にて処理される。前記塩基はステップＢ）で添加する。
【００４６】
本発明により検討される、別の群のα−アミノ保護基は、酸性条件下及び塩基性条件下で安定である。そのような保護基の例は、ベンジルオキシカルボニル、及びアリルオキシカルボニルであり、接触水素化、又はパラジウム系化学反応によりそれぞれ開裂することができる。
【００４７】
上記に記載した実施形態は全て、１個のアミノ酸又はペプチドを、担体に結合した別のアミノ酸又はペプチドとカップリングする方法に関する。この方法を繰り返して、いくつかのアミノ酸又はペプチドを添加し、より長いペプチドを形成することができる。
【００４８】
したがって、本発明はまた、
ａ’）α−アミノ保護基を有する第１アミノ酸又はペプチドを、官能化した担体上でそのＣ末端を介して結合させることと、
ｂ’）配列中の次のアミノ酸又はペプチドを予想して、上記に記載の処理を行うことと、
ｃ’）所望の配列が得られるまで、適切なアミノ酸又はペプチドにてステップｂ’）を繰り返すことと、
ｄ’）形成したペプチドを、適切な方法で担体から開裂することと
を含む、ペプチド合成法に関する。
【００４９】
本発明はまた、ペプチドレジンの洗浄を改善するための、固相ペプチド合成における塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎの利用に関する。
【００５０】
より具体的には、過剰なアミノ酸又は切断試薬の除去を改善するため、固相ペプチド合成における塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎの利用に関する。
【００５１】
前記方法の利用可能性はスケールに依存しない。例えば、数ミリグラム単位で行うこともできれば、数トン規模で行うこともできる。
【００５２】
以下の実施例は、例示を目的として提供される。
【実施例１】
【００５３】
この比較例では、いずれのステップでも塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎは使用しなかった。
【００５４】
配列Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨを有し、式中Ｔｒｔ（トリチル）、ＯｔＢｕ（ｔｅｒｔ−ブチルエステル）、ｔＢｕ（ｔｅｒｔ−ブチルエーテル）、Ｐｂｆ（２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロ−ベンゾフラン−５−スルホニル）が側鎖保護基であるヘキサペプチドを、以下のプロトコルに従って、２−クロロトリチルポリスチレンレジン上で合成した。
【００５５】
各洗浄ステップにおける溶媒量（ｌ）は、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）を担持した乾燥した出発レジン重量（ｋｇ）の４倍であった。
１）Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨを担持したレジン５．３３ｇを膨張させ、洗浄する。
２）ＤＢＵ  １ｖｏｌ．％及びピペリジン  ５ｖｏｌ．％を含むＮＭＰ溶液を１０分間で３回添加し、α−アミノ保護基のＦｍｏｃを開裂する。
３）ＮＭＰにて１回、２分間洗浄する。
４）ＮＭＰ中でＨＯＢｔ  ５ｗ％にて１回、２分間洗浄する。
５）ＮＭＰにて７回、２分間洗浄する。
６）Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ１．４０９ｇを添加し、それをＮＭＰ中で、ＤＩＣ０．７６ｍｌ、ＨＯＢｔ０．２５ｇにて、レジンに結合したＡｒｇ（Ｐｂｆ）とカップリングさせる。Ｋａｉｓｅｒ試験でモニタリングする。
７）ＮＭＰにて９回、各２分間洗浄する。
８）ＮＭＰ中でピペリジン  ５ｖｏｌ．％／ＤＢＵ  １ｖｏｌ．％にて１０分間で３回処置し、Ｆｍｏｃ保護基を開裂する。
９）ＮＭＰにて１回、２分間洗浄する。
１０）ＮＭＰ中でＨＯＢｔ  ５ｗ％にて１回、２分間洗浄する。
１１）ＮＭＰにて２分間で７回洗浄する。
１２）ステップ６〜１１を繰り返し、次のアミノ酸がＦｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ（１．４３ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ（１．２８ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（１．５３５ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（１．９３ｇ）になるようにする。
１３）ヘキサペプチドをレジンから開裂する。
【００５６】
Ｋａｉｓｅｒ試験でモニタリングすることは、固相ペプチド合成におけるカップリング反応の完全性を評価することができる、迅速な、視覚的、半定量的検査である（Ｋａｉｓｅｒ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＵＳＡ，１９７０  ３４ｎ°  ２，ｐ．５９５−５９８参照）。
【実施例２】
【００５７】
本発明によるこの例では、Ｆｍｏｃ保護基の開裂にＢＴＭＡ塩化物（ＭｅＯＨ中の４０％ｗ／ｗ溶液）を使用した（ステップａ）。
【００５８】
配列Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨを有し、式中Ｔｒｔ、ＯｔＢｕ、ｔＢｕ、Ｐｂｆが側鎖保護基である、実施例１と同じヘキサペプチドを、実施例１で使用した同じ２−クロロトリチルポリスチレンレジン（同じロット番号）上で、以下のプロトコルに従い合成した。
【００５９】
各洗浄ステップにおける溶媒量（ｌ）は、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）を担持した乾燥した出発レジン重量（ｋｇ）の４倍であった。
１）Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨを担持したレジン５．０９ｇを膨張させ、洗浄する。
２）ＤＢＵ  １ｖｏｌ．％、ピペリジン  ５ｖｏｌ．％、及びＢＴＭＡ塩化物２ｗ％を含むＮＭＰ溶液を１０分間で３回添加し、α−アミノ保護基のＦｍｏｃを開裂する。
３）ＮＭＰにて１回、２分間洗浄する。
４）ＮＭＰ中でＨＯＢｔ  ５ｗ％にて１回、２分間洗浄する。
５）ＮＭＰにて２分間で３回洗浄する。
６）Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ１．４８ｇを添加し、それをＮＭＰ中で、ＤＩＣ０．７２ｍｌ、ＨＯＢｔ０．２４ｇにて、レジンに結合したＡｒｇ（Ｐｂｆ）とカップリングさせる。Ｋａｉｓｅｒ試験でモニタリングする。
７）ＮＭＰにて２回、各２分間洗浄する。
８）ＮＭＰ中でピペリジン  ５ｖｏｌ．％／ＤＢＵ  １ｖｏｌ．％、及びＢＴＭＡ塩化物２ｗ％にて１０分間で３回処置し、Ｆｍｏｃ保護基を開裂する。
９）ＮＭＰにて１回、２分間洗浄する。
１０）ＮＭＰ中でＨＯＢｔ  ５ｗ％にて１回、２分間洗浄する。
１１）ＮＭＰにて２分間で３回洗浄する。
１２）ステップ６〜１１を繰り返し、次のアミノ酸がＦｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ（１．４４ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ（１．３０ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（１．５７ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（２．１４ｇ）になるようにする。
１３）ヘキサペプチドをレジンから開裂する。
【００６０】
結果
実施例１及び２により形成した最終ヘキサペプチドについて、純収率及びＨＰＬＣ純度を評価した。
【表１】
2007536199.tif 000002
【００６１】
これらの結果は、α−アミノ保護基の開裂ステップで本発明により規定した塩を添加すると、収率が増加しペプチド純度が高まるため、配列エラーが減少することを示している。こうした改善は、アミノ酸の導入毎の洗浄ステップが、比較例では１８回であるのに比べ、わずか合計７回で得られる。
【実施例３】
【００６２】
この比較例では、いずれのステップでも塩（Ｘｎ＋）ｍ（Ｙｍ−）ｎは使用されなかった。
【００６３】
配列がＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＨで、ｔＢｕ（ｔｅｒｔ−ブチルエーテル）、Ｐｂｆ（２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロ−ベンゾフラン−５−スルホニル）が側鎖保護基であるヘプタペプチドを、以下のプロトコルに従って、２−クロロトリチルポリスチレンレジン上で合成した。
【００６４】
各洗浄ステップにおける溶媒量（ｌ）は、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙを担持した乾燥した出発レジン重量（ｋｇ）の３．５倍であった。
１）Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを担持した出発レジン４．１５ｇを膨張させ、洗浄する。
２）ＤＢＵ  １ｖｏｌ．％及びピペリジン  ５ｖｏｌ．％を含むＮＭＰ溶液を１０分間で３回添加し、α−アミノ保護基のＦｍｏｃを開裂する。
３）ＮＭＰにて１回、２分間洗浄する。
４）ＮＭＰ中でＨＯＢｔ  ５ｗ％にて１回、２分間洗浄する。
５）ＮＭＰにて８回、２分間洗浄する。
６）Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ１．９８ｇを添加し、それをＮＭＰ中で、ＤＩＣ１．０５ｍｌ、ＨＯＢｔ０．３３１ｇにて、レジンに結合したＧｌｙとカップリングさせる。Ｋａｉｓｅｒ試験でモニタリングする。
７）ＮＭＰにて９回、各２分間洗浄する。
８）ＮＭＰ中でピペリジン  ５ｖｏｌ．％／ＤＢＵ  １ｖｏｌ．％にて１０分間で３回処理し、Ｆｍｏｃ保護基を開裂する。
９）ＮＭＰにて１回、２分間洗浄する。
１０）ＮＭＰ中でＨＯＢｔ  ５ｗ％にて１回、２分間洗浄する。
１１）ＮＭＰにて２分間で４回洗浄する。
１２）ステップ６〜１１を繰り返し、次のアミノ酸がＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（１．９１ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（２．４３ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（３３２ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（２．２８ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（１．８４ｇ）になるようにする。
１３）前記ペプチドをレジンから開裂する。
【実施例４】
【００６５】
本発明によるこの例では、カップリング後の洗浄ｄ）でＢＴＭＡ水酸化物塩を使用した。
【００６６】
配列がＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＨで、ｔＢｕ（ｔｅｒｔ−ブチルエーテル）、Ｐｂｆ（２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロ−ベンゾフラン−５−スルホニル）が側鎖保護基である、実施例３と同様のヘプタペプチドを、実施例３で使用したのと同じ２−クロロトリチルポリスチレンレジン（同じロット番号）上で、以下のプロトコルに従い合成した。
【００６７】
各洗浄ステップにおける溶媒量（ｌ）は、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙを担持した乾燥した出発レジン重量（ｋｇ）の４倍であった。
１）レジン４．６７ｇを膨張させ、洗浄し、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを担持する。
２）ＤＢＵ  １ｖｏｌ．％及びピペリジン  ５ｖｏｌ．％を含むＮＭＰ溶液を１０分間で３回添加し、α−アミノ保護基のＦｍｏｃを開裂する。
３）ＮＭＰにて１回、２分間洗浄する。
４）ＮＭＰ中でＨＯＢｔ  ５ｗ％にて１回、２分間洗浄する。
５）ＮＭＰにて３回、２分間洗浄する。
６）Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ２．２３ｇを添加し、それをＮＭＰ中で、ＤＩＣ１．１８ｍｌ、ＨＯＢｔ０．３８６ｇにて、レジンに結合したＧｌｙとカップリングさせる。Ｋａｉｓｅｒ試験でモニタリングする。
７）ＮＭＰにて１回、２分間、及びＢＴＭＡ水酸化物２ｗ％含有ＮＭＰにて１回、１０分間洗浄する。
８）ＮＭＰ中でピペリジン  ５ｖｏｌ．％／ＤＢＵ  １ｖｏｌ．％にて１０分間で３回処理し、Ｆｍｏｃを開裂する。
９）ＮＭＰにて１回、２分間洗浄する。
１０）ＮＭＰ中でＨＯＢｔ  ５ｗ％にて１回、２分間洗浄する。
１１）ＮＭＰにて２分間で３回洗浄する。
１２）ステップ６〜１１を繰り返し、次のアミノ酸がＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（２．１４ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（２．９６ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（４．０９ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（２．９０ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（２．４２ｇ）になるようにする。
１３）前記ペプチドをレジンから開裂する。
【００６８】
結果
実施例３及び４により生成した前記ペプチド合成中の大部分のフラグメントについて、ＨＰＬＣ純度を分析した。
【表２】
2007536199.tif 000003
【００６９】
前記ＨＰＬＣの結果は、カップリング反応後の洗浄で本発明により規定した塩を添加すると、同等又はより高い純度が得られることを示している。比較例では洗浄回数１５回、溶媒量が５２．５ｍｌであるのに比べ、この結果は、わずか合計洗浄ステップ７回、合計溶媒量２８ｍｌで得られる。
【国際調査報告】
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