(57)【要約】  本発明は、実質的に同様のアミノ酸配列の複数のペプチドに結合したナノ粒子を含むナノ粒子コンジュゲート、システイン（Ｃ）残基によって該ナノ粒子に結合したペプチド及び該ペプチドに結合したリガンド及び更なる同定手段をさらに含むナノ粒子コンジュゲートに関する。本発明は、該ナノ粒子コンジュゲートを生産する方法にも関連する。
2007506084.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に類似するアミノ酸配列の複数のペプチドに結合したナノ粒子を含むナノ粒子コンジュゲートであって、該ペプチドは、システイン（Ｃ）残基によって該ナノ粒子に結合し、且つ該ナノ粒子コンジュゲートは、該ペプチドに付着したリガンドを更に含む、ナノ粒子コンジュゲート。
【請求項２】
該システイン（Ｃ）残基がそのチオール及び／又はアミノ基によって該ナノ粒子に結合する、請求項１に記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項３】
該ペプチドの遠位末端がカルボキシル基で終結し、又は該ペプチドがカルボキシル基によって該リガンドに結合する、請求項１又は２のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項４】
該リガンドから独立した該ペプチドが配列ＣＡＬＮＮ又はＣＣＡＬＮＮを有する、請求項１〜３のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項５】
該ペプチドが、ＣＸｎ（リガンド）、ＣＣＸｎ（リガンド）、ＣＸｎ（リガンド）Ｘｎ、又はＣＣＸｎ（リガンド）Ｘｎの一般配列を有する（ここでＸは、任意のアミノ酸残基を表し、ｎは、アミノ酸残基の任意の長さを表す）、請求項１〜４のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項６】
該システイン残基が、該ペプチドの中央領域に位置する、請求項１〜３のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項７】
該ペプチドの中央領域に位置する２つ以上のシステイン残基が存在する、請求項６に記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項８】
該システイン残基のいずれかの側の該ペプチド配列が実質的に対称的である、請求項６又は７のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項９】
該ペプチドが、（リガンド）ＸｎＣＸｎ（リガンド）、Ｘｎ（リガンド）ＸｎＣＸｎ（リガンド）Ｘｎ、（リガンド）ＸｎＣＣＸｎ（リガンド）又はＸｎ（リガンド）ＸｎＣＣＸｎ（リガンド）Ｘｎ（ここでＸは，任意のアミノ酸残基を表し、ｎは、アミノ酸残基の任意の長さを表す）の一般配列を有する、請求項６〜８のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項１０】
該リガンドから独立した該ペプチドが、配列ＮＮＬＡＣＡＣＬＮＮ又はＮＮＬＡＣＣＡＬＮＮを有する、請求項９に記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項１１】
該ナノ粒子コンジュゲートが、該ペプチドまたは該リガンドに結合した同定手段を更に含む、請求項１〜５のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項１２】
該ナノ粒子コンジュゲートが、該ペプチド又はリガンドに結合した官能基を更に含む、請求項１〜１２に記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項１３】
アミノ酸残基のさらなる配列が、該リガンドと該同定手段及び／又は官能基の間、及び／又は該リガンド、若しくは同定手段、若しくは官能基の後に配置される、請求項１１又は１２のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項１４】
該更なる配列が、２つ以上のグリシン残基を含む、請求項１３に記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項１５】
該ナノ粒子コンジュゲートが、ペプチドの異なるサブグループを含む、前記請求項のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項１６】
異なるリガンド及び必要に応じて異なる同定手段／官能基がペプチドの異なるサブグループに結合される、請求項１５に記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項１７】
該ナノ粒子コンジュゲートが、少なくとも１つの他のナノ粒子コンジュゲートに結合することができ、又はナノ粒子コンジュゲートアセンブリを形成するために少なくとも１つの他のナノ粒子コンジュゲートに結合する、前記請求項のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項１８】
該ナノ粒子が、以下の材料；金属材料、磁性材料、または半導体材料の１つから作られる、前記請求項のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項１９】
ナノ粒子が、金、銀、コバルト、ニッケル、プラチナ、カドミウムセレニド又は硫化亜鉛から作られる、請求項１〜１８のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項２０】
該同定手段及び／又は官能基及び／又はリガンドが、以下：ビオチン及び／又はアビジン、ストレプトアビジン、ストレプトアクチン、ヒスチジンタグ、ＮＴＡ、放射性ラベル、抗原、エピトープド、タンパク質、受容体の部分、若しくは目的分子、糖、多糖並びに脂質、の１つ以上から選択される、請求項１１〜１９のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項２１】
薬学的に活性のある塩の化合物又は化合物の一部が、さらに該ナノ粒子に結合される、又は該ペプチドに結合される、前記請求項のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項２２】
該ナノ粒子が、１〜１００ｎｍの範囲の直径を有する、前記請求項のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項２３】
該複数のペプチドが、該ナノ粒子の周りにシェルを提供するために、該ナノ粒子の表面を実質的に覆う、前記請求項のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項２４】
該シェルが、複数のナノ粒子のためのカップリング効果を含む該ナノ粒子の光学的検出を可能にする、前記請求項のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項２５】
ナノ粒子毎に、約５００〜１５００ペプチドの範囲のペプチドが存在する、前記請求項のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項２６】
ｎｍ２毎に約１．０〜３．２のナノ粒子が存在する、請求項１〜２４に記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項２７】
診断アッセイの生産、タンパク質の分離及び／又は精製、又は治療薬剤の生産における使用のための、前記請求項のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項２８】
該ナノ粒子コンジュゲートが、以下の技術：クロマトグラフィー、ＥＬＩＳＡ、凍結乾燥、ＦＩＳＨ、ＩＳＨ、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ、フローサイトメトリー、免疫組織化学、タンパク質精製、ウェスタンプロッティング、細胞遺伝学的分析、分子相互作用アッセイ、固定され且つ生きた細胞／組織上の組織化学及び高スループットスクリーニングのいずれかで使用される、請求項１〜２６に記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項２９】
リン酸緩衝生理食塩水又は溶媒／電解質の他の組合せ中の複数のペプチドを有する安定化溶液中で安定化されたナノ粒子を水中でインキュベートすることによって前記請求項のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲートを製造する方法。
【請求項３０】
該ナノ粒子を用いたインキュベーションの前、又は該インキュベーションの間に、１つ以上のリガンド及び必要に応じて１つ以上の同定手段及び／又は官能基が該ペプチドに結合される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
１つ以上のリガンド及び必要に応じて１つ以上の同定手段及び／又は官能基を含む複数のペプチドを該ナノ粒子の合成時に含むことによって、請求項１〜２１のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲートを製造する方法。
【請求項３２】
該ナノ粒子コンジュゲートが、保存のために凍結乾燥される、請求項２２〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
ここにおいて上記に記載の図面及び実施例を参照して、請求項１〜２８及び２９〜３３に各々記載のナノ粒子コンジュゲート及びナノ粒子コンジュゲートを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノ粒子を安定化し且つ生体分子の化学量論的カップリングを可能にする、ペプチドシェルを形成するための複数のペプチドに結合したナノ粒子を含むナノ粒子コンジュゲートに関する（該ペプチドは、更にリガンドを含む）。
【０００２】
生命科学の分野におけるナノ粒子の使用は、近年に亘るこの技術の発展にもかかわらず、元来予測されたようには広く普及していない。ナノ粒子は、広い潜在的適用範囲を有するが、診断又は治療剤としてのそれらの使用には多くの問題が付随する。例えば、細胞組織及び／又は液体において見られるものと同様の条件においてナノ粒子に付着したコンジュゲートの安定性を維持することは、多様な化学的環境に起因して多くの問題を引き起こす。更に、ナノ粒子を検出することの感度に関する問題も経験されている。
【０００３】
金属ナノ粒子における表面プラズモン（粒子中に閉じ込められた電子の集合的振動）は、粒度に依存して特徴的な共鳴振動数を有する。従って、白い非極性光は、金属ナノ粒子に、共鳴光散乱（ＲＬＳ）として知られる現象においてそれらのサイズに特徴的な波長における光を放出させる（Ｅｌｇｈａｎｉａｎ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９７７）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７７：  １０７８−１０８１及びＳｃｈｕｌｔｚ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９７：９９６−１００１）。散乱された光の波長は、ナノ粒子のサイズ及びそれを囲む媒体に依存する。重要なことに、それらの電子的及び光学的性質の両方は、それらの環境に敏感な様式で依存し、これらの性質は極めて感度のよいプローブとして使用され得る（Ｅｌｇｈａｎｉａｎ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）；  Ｓｃｈｕｌｔｚ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）及びＢａｕｍ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｌａｎｇｍｕｉｒ，  １５：  ８６６−８７１）。３つの技術が、単粒子レベルにおいて金属ナノ粒子を検出するために開発されてきた。金属ナノ粒子における表面プラズモン（粒子中に閉じ込められた電子の集合的振動）は、粒度に依存した特徴的な共鳴振動数を有する。従って、ナノ粒子は、それらのサイズに特徴的な様式で光を吸収、放出及び散乱する。３つの技術は、以下の通りである：（ｉ）単粒子による共鳴光散乱（ＲＬＳ）は、これらが相当大きい（３０〜４０ｎｍ  Ａｇ、５０〜６０ｎｍ  Ａｕ）場合、単純な暗視野顕微鏡によって容易に検出されるが、例えば、細胞などのサンプル、強く散乱するスライドガラスでは極めて困難である（Ｄｏｔｙ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  （６１），  １８４３−１８４９）；（ｉｉ）表面におけるエバネッセント場からのＲＬＳは、検出できる粒度を、４倍まで低下させ、バックグラウンド散乱の問題を低減する；そして（ｉｉｉ）ボルドーのナノフォトニック研究所によって開発された光熱検出は、バックグラウンド散乱の問題なく、２ｎｍまでの小さい粒子を検出できる（Ｂｏｅｒ，  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  （２９７），  １１６０−１１６３及びＣｏｇｎｅｔ，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ  （２００３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  （１００），  １１３５０−１１３５５）。
【０００４】
顕著なことに、モルベースの金属ナノ粒子からのシグナル出力は、生物学において従来使用されるフルオロフォアのもの（これは、Ｑ−ｄｏｔｓを用いて見出されたように、消光を受け、シグナル出力は、ブリンキングの傾向がない（Ｄｏｔｙ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４））よりも遥かに大きい（１０３〜１０６倍）。さらに、このような粒子２つを近隣に持ってくると、ＲＬＳ検出の場合における散乱光の波長のシフト又は他の検出システムにおけるシグナルの振幅における増加としての、（プラズモンカップリングに起因する）シグナル出力における変化を結果的に生じる。従って、ナノ粒子を用いた相補的な生体分子のタギングに単純に基づいた、生体分子相互作用のための検出メカニズムは、容易にアクセス可能である（例えば、Ｅｌｇｈａｎｉａｎ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７））。ナノ粒子は、標準トランスフェクション法を用いて細胞中に導入される。従って、金属ナノ粒子は、単粒子の感度を有する生体分子作用のための単純なプローブへの特有の道筋を与える。
【０００５】
一般的に“Ｑ−ｄｏｔｓ”と呼ばれる半導体ナノ粒子の蛍光特性について同様の検討がなされてきた。これらは、粒度に依存する狭い蛍光発光を示し、“光退色（photobleaching）”の傾向がない。最後に、ナノ粒子の光学的範囲は、高度のマルチプレクシングが可能である程度である。
【０００６】
上記の注目すべき特徴（それは、血液サンプルについて現在実施されるテストのための医師の処方が不要な（ＯＴＣ）家庭用診断法を含む診断法、高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）を含む生体分子研究等の分野を大幅に変化させるだろう）を考慮すると、金属及び半導体のナノ粒子が実際の世界に殆ど影響を及ぼさなかったことは驚きである。金属及び半導体のナノ粒子が今日まで好結果でなかった理由の１つは、シグナル対ノイズ比に起因する。例えば、有機溶媒や純水などの理想的な物理的条件下において、ナノ粒子は、単純な単粒子の検出を許容するが、電解質を含む溶液中で凝集し、実質的に全てのマクロ分子に非特異的に結合するそれらの性質は、ナノ粒子に基づくアッセイの感度を急激に低下させる。ナノ粒子の‘粘着性’（ナノ粒子同士の凝集）を低減する現在のアプローチは、ナノ粒子の周りにリガンドシェルを構築することを必要とする。理想的なリガンドシェルは、ナノ粒子を生物学的システムの複雑な環境から保護し、ナノ粒子が近傍にある場合に観られるカップリング効果を利用したアッセイを可能にするために、所定の厚みの所定の化学量論的作用のある生体分子において特異的に結合する手段を提供する。
【０００７】
チオールは、ナノ粒子と強い共有結合を形成するため、存在するリガンドシェルは、多くの場合、１つ以上のチオールを有し、アルキルチオール及び誘導体、例えば、メルカプトウンデカン酸（ＭＵＡ）、リポエート、チオール化されたデキストランとポリエチレングリコールを含む。薄い自己組織化単分子膜（self-assembled monolayer）（例えば、ＭＵＡ，リポエート、システイン、グルタチオン（ＥＣＧ））を作る単純なリガンドシェルは、それらが所定の化学的環境を提供し、且つリガンドシェルの厚みは単層単位の長さによって制御されるため、魅力的である。しかし、最良の場合においても、これらのリガンドシェルは、水性の生物学的溶液中で部分的な安定化しか提供しない。より複雑なポリマー（例えば、チオール化されたデキストランとポリエチレングリコールは、適度に安定なナノ粒子を作る。しかし、これらリガンドシェルの厚みは、制御することができず、該ポリマーは、生体マクロ分子に吸着し得る局所的ミクロ環境を形成すると知られており、マクロ分子の化学量論的カップリングは、困難であり、多くの場合不可能である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の目的は、ナノ粒子を安定化し、且つ生体分子の化学量論的カップリングを可能にし得るリガンドをキャッピングするペプチドを含むナノ粒子コンジュゲートを提供することである。該ナノ粒子コンジュゲートを製造する方法を提供することも本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に従って、実質的に同様なアミノ酸配列の複数のペプチドに結合したナノ粒子を含むナノ粒子コンジュゲートが提供され、該ペプチドは、システイン（Ｃ）残基によって該ナノ粒子に結合され、且つ該ナノ粒子コンジュゲートは、該ペプチドに付随したリガンドをさらに含む。
【００１０】
従って、本発明は、多くの生物学的及び化学的環境において非常に向上した安定性を有するナノ粒子コンジュゲートを提供する。ナノ粒子コンジュゲートの形態は、タンパク質に類似し、これは、組織化した表面（ペプチドによって提供される）によって隠される“粘着性の”コア（例えば、無機金属または半導体材料を含む）をさらに有し得、従って、これは、特定の用途の必要性に合わせて作られ得る。ペプチドの二次構造（アルファへリックス、ベータストランド、Ｈ−結合）がナノ粒子の安定化を促進すると考えられる。実際、ベータストランドを形成するペプチドは、達成されるナノ粒子へのペプチドの高い充填密度を可能にするストランド形成に好ましい。
【００１１】
好ましくは、システイン（Ｃ）残基は、そのチオール及びアミノ基によってナノ粒子に結合する。さらに、ペプチドの遠位末端がカルボキシル基で終端する、又はペプチドが、カルボキシル基によってリガンドに結合していることが好ましい。アミノ酸配列の的確な選択は、ナノ粒子表面上の密な充填を可能にするアミノ酸によって決定され、これは、次に、とりわけナノ粒子の曲率によって決定される。コアペプチドは、ＣＸｎ（リガンド）、ＣＣＸｎ（リガンド）、ＣＸｎ（リガンド）Ｘｎ又はＣＣＸｎ（リガンド）Ｘｎの一般配列を有し得、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸残基を表し、ｎは、アミノ酸残基の任意の長さを表す。好ましくは、リガンドから独立したペプチド配列は、Ｈ２Ｎ−システイン−アラニン−ロイシン−アスパラギン−アスパラギン−ＣＯＯＨ（ＣＡＬＮＮ）またはＨ２Ｎ−システイン−システイン−アラニン−ロイシン−アスパラギン−アスパラギン−ＣＯＯＨ（ＣＣＡＬＮＮ）の配列を有する。
【００１２】
本発明の他の側面に従って、実質的に類似のアミノ酸配列の複数のペプチドに結合したナノ粒子を含むナノ粒子コンジュゲート（該ペプチドは、該ペプチドの中央領域に位置するシステイン（Ｃ）残基によって該ナノ粒子に結合される）が提供される。
【００１３】
ペプチドが、中央に位置するシステイン残基によってナノ粒子に結合する場合、ペプチドの中央領域に２つ以上のシステイン残基が存在し得る。好ましくは、システイン残基のいずれかの側のペプチド配列は、実質的に対称的である。従って、ペプチドは、（リガンド）ＸｎＣＸｎ（リガンド）、Ｘｎ（リガンド）ＸｎＣＸｎ（リガンド）Ｘｎ、（リガンド）ＸｎＣＣＸｎ（リガンド）またはＸｎ（リガンド）ＸｎＣＣＸｎ（リガンド）Ｘｎの一般配列を有し、ここでＸは、任意のアミノ酸残基を表し、ｎは、アミノ酸残基の任意の長さを表す。好ましくは、リガンドから独立のペプチドは、ＮＮＬＡＣＡＬＮＮまたはＮＮＬＡＣＣＡＬＮＮ配列を有する。
【００１４】
ナノ粒子コンジュゲートは、ペプチド又はリガンドに結合した同定手段を更に含み得る。ナノ粒子コンジュゲートは、ペプチド又はリガンドに結合した官能基（同定手段に追加的又はそうでない）を更に含み得る。“同定手段”は官能基も含むと理解される。アミノ酸残基の更なる配列は、リガンドと同定手段及び／又は官能基及び／又はリガンドまたは同定手段または官能基の間に配置される。従って、“スペーサー”エレメントが、コアペプチド配列とリガンドの間に配置され得、及び／又はリガンドと同定手段／官能基の間に配置され得る。更に、アミノ酸残基の更なる配列は、同定手段／官能基が存在しない場合、リガンドの後に配置され得、又は代替的に、それが存在する場合、該残基は、同定手段の後に配置され得る。更なる配列は、任意の配列を含み得るが、好ましくは、それは、２つ以上のグリシン残基を含む。
【００１５】
ナノ粒子コンジュゲートは、ペプチドの異なるサブグループを含み得る。更に、異なるリガンド及び必要に応じて、異なる同定手段及び／又は官能基がペプチドの異なるサブグループに結合し得る。従って、単一のナノ粒子（または少数のナノ粒子）は、一定範囲のリガンド及び／または同定手段及び／又は官能基で作られ得る。単一のナノ粒子は、次いで、サンプルの複数の試験を実施するために既知の活性のある他のものと併せて使用され得る。実際、ナノ粒子コンジュゲートは、ペプチドの遠位末端に更なるアミノ酸残基を有するリガンドと更なるアミノ酸残基を有さないリガンドを有するペプチドの混合物を有し得る。これが、例えば、サンプル中の２つ以上の蛋白質の共存などの多くの実験に多いに役立つことは明らかである。
【００１６】
ナノ粒子は、当業者に明らかである多くの材料から作られ得る。好ましくは、ナノ粒子は、以下の材料の１つから作られる；金属材料、磁性材料又は半導体材料。このような材料は、金、銀、コバルド、ニッケル、プラチナ、カドミウムセレニド又は硫化亜鉛（或いは、“量子ドット”または同様の粒子を作るために使用される他の材料）であり得る。
【００１７】
磁性ナノ粒子は、磁気共鳴イメージングのためのコントラスト増強剤（contrast enhancement agent）、ガンのための標的治療薬剤送達及び温熱療法などの生体医学における多くの用途を有する（Ｂｅｒｒｙ，Ｃ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｃｕｒｔｉｓ  Ａ．Ｓ．Ｇ．，（２００３）  Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｄ：  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  ３６：  Ｒ１８９−２０６及びＰａｒｋｈｕｒｓｔ，  Ｑ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｄ：  Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．３６：  Ｒ１６７−１８１）。磁気的にラベルされた標的によって生成された磁場が、高感度の磁気計を用いて直接的に検出される磁気的免疫検定技術も、開発されており（Ｃｈｅｍｌａ，  Ｙ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｐ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ９７：  １４２６８−１４２７２）、このような技術は、本発明に従って使用され得る。
【００１８】
磁性ナノ粒子が、本発明に従って使用される場合、そのようなナノ粒子は、それらが小さな外的／かけられた磁場又は磁気センサーのシグナルに強く（敏感に）反応する；しかし重力、ブラウン運動、粘度、ファンデルワールス相互作用等の他の力に弱く反応するように、好ましくは、大きな飽和磁化及び高い磁化率を有することは、当業者に明らかである。さらに、ナノ粒子は、粒子の凝集を回避するために、室温において超常磁性でもあり得る（即ち、磁場がない場合に磁気モーメントが自由に変動し、従ってそれは非磁性的な挙動をする）。磁性ナノ粒子のこれらの性質の完全な利用は、サイズ又は形状の単分散並びに、空気及び水溶液中の安定性を含む生物学的環境における完全又は実質的に完全な安定性を必要とし得る。
【００１９】
同定手段は、リガンドの標的分子への結合を同定する若しくは“標識付けする”ために一般的に使用される多くの分子及び／又は化合物から選択され得る。未だ開発されていない分子及び化合物も、同定手段として使用され得ることが理解される。好ましくは、同定手段及び／又は官能基及び／又はリガンドは、以下の１つ以上から選択される：ビオチン及び／又はアビジン、ストレプトアビジン、ストレプトアクチン、ヒスチジンタグ、ＮＴＡ、放射性ラベル、抗原、エピトープまたはエピトープの一部、抗体、蛍光色素、核酸、認識配列、酵素、抗体、ペプチド、タンパク質、受容体又は標的分子、糖、多糖及び脂質。同定手段及び／又は官能基は、ヘパルニンサルフェート（heparnin sulphate）を含み得、このようなナノ粒子コンジュゲートは、水銀付加物と結合し得る。
【００２０】
リガンドシェルとしての合成ペプチド（そこに付着した同定手段及び／又は官能基を有するペプチド）の使用は、ナノ粒子を、所定比率の天然ペプチド及びエクステンション（それはタグ／シントンとして働く又は組換タンパク質である）を有するペプチドとインキュベートすることによって、化学量論的誘導体化を独特に可能にする。従って、精製は、必要であれば、タグ／シントン又は結合したマクロ分子の標準クロマトグラフィー特性を利用することができる。
【００２１】
従って、自動化され且つ極めて用途の広い合成ペプチド化学が、ペプチド中に同定手段及び／又は官能基（例えば、タグ）を導入するために使用され得る。同定手段及び／又は官能基は、天然である必要はなく、非天然であってもよい（後者は、例えば、特有の化学的反応性を有する合成側鎖を有するアミノ酸及びＤ−アミノ酸を含む）。
【００２２】
ナノ粒子に結合したリガンドは、ナノ粒子を特定のサイトに付着させるために（それは、サンプル内の特定分子の同定のため又は後の精製のために分子を保持するためであり得る）、他の分子と結合することができる多くの異なる分子であり得る。さらに、リガンドは、薬学的化合物を送達するために、特定のサイト（例えば、特定のエピトープを発現する細胞）にナノ粒子を向けるためにも使用され得る。好ましくは、リガンドは、次の１つ以上から選択され得る：核酸、抗体、ペプチド、タンパク質、受容体又は標的分子、糖、多糖及び脂質。
【００２３】
ナノ粒子コンジュゲートはまた、少なくとも１つの他のナノ粒子コンジュゲートに結合することができ、又はナノ粒子コンジュゲートアセンブリを形成するために、少なくとも１つの他のナノ粒子コンジュゲートに結合する。このようなアセンブリは、細胞表面上の多くの異なる抗原などの多くの可変部(variable)を同定するための診断ツール又はプロービングのために、或いは、例えば主なナノ粒子検体相互反応に関係するナノ粒子の数を増加することによりシグナルを増幅するための手段として使用され得る。
【００２４】
ここに記載されるナノ粒子コンジュゲートは、ナノ粒子に結合した、又はペプチドに結合した薬学的活性のある塩の化合物又は化合物の一部をさらに有し得る。従って、治療用化合物の送達は、異なる細胞又は細胞学的成分に向けられ得る。薬学的活性塩の一部の供給は、利用されるプロドラッグ療法の二段階アプローチを可能にし得る。
【００２５】
ナノ粒子は、１〜１００ｎｍの範囲の直径を有し得る。好ましくは、複数のペプチドが、ナノ粒子の周りにシェルを供給するために、ナノ粒子の表面を実質的に覆い得る。従って、このようなシェルが、多くの細胞学的及び生物学的環境を通してナノ粒子コアを“シールド（shield）”し、ナノ粒子が極めて安定なままであることを可能にすることは、当業者に明らかである。シェルは、多数のナノ粒子についてのカップリング効果を含むナノ粒子の光学的検出を可能にする。
【００２６】
１２．３ｎｍの金ナノ粒子は、ナノ粒子毎に約８５５±７０ペプチドまで有し得る（この数値は、潜在的に、ナノ粒子毎５００〜１５００ペプチドの範囲内になり得るが）。これに基づいて、ペプチドの数は、異なる用途のために合わせられ得、それはまた、ナノ粒子の全表面積だけでなくその曲率にも依存するが、１２．３ｎｍの直径を有する実質的に球状のナノ粒子は、約４７５ｎｍ２の表面積を有し、これは、約１．１〜３．２ペプチド／ｎｍ２（ナノ粒子）を可能にすることと等しい。約１〜３．２ペプチド／ｃｍ２（ナノ粒子）の範囲にあることが好ましい。さらに、ナノ粒子上のペプチドの密度は、より大きなナノ粒子について異なり得る。好ましくは、ナノ粒子毎のペプチドの密度は、密に充填したアレンジメントを得るために、可能な限り高い。
【００２７】
ナノ粒子コンジュゲートは、診断アッセイの生成、タンパク質の分離及び／又は精製、或いは治療薬の製造に使用され得る。ナノ粒子コンジュゲートは、生物学及び化学及び応用分野内の幅広い範囲の用途に使用され得ることが明らかである。好ましくは、ナノ粒子コンジュゲートは、次の技術のいずれかと併せて使用され得る：クロマトグラフィー、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、凍結乾燥、蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、in situハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、フローサイトメトリー、免疫組織化学、タンパク質精製、ウェスタンブロッティング、細胞遺伝的分析、分子相互作用アッセイ、固定され且つ生きた細胞／組織上の組織化学、及び高スループットスクリーニング；ナノデバイスの構築用のタグ／リガンドに向けられるナノ粒子の“ボトムアップ”アセンブリ（ペプチドシェル及び／又はタグ／リガンドが後に除去される場合も含む）。
【００２８】
本発明の他の側面に従って、ここにおいて上記に記載されるように、安定化溶液中で安定化されたナノ粒子をリン酸緩衝生理食塩水中の複数のペプチドと水中でインキュベートすることによってナノ粒子コンジュゲートを生産する方法が提供される。このような安定化溶液は、当業者に明らかであり、シトレート、アクリレート、又はオキサレート溶液及び未だ開発されない他のものを含み得る。１つ以上のリガンド及び必要に応じて１つ以上の同定手段及び／又は官能基は、ナノ粒子を用いたインキュベーションの前、又はインキュベーションの過程の間にペプチドに結合され得る。１２．３ｎｍＡｕナノ粒子について、ペプチドは、一般的にＰＢＳ、ｐＨ７．２中に溶解され、ペプチド（１ｍｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ）とシトレート安定化ナノ粒子（６ｎＭ）をインキュベートする（１容量対１容量）。
【００２９】
本発明のさらに他の側面に従って、ここにおいて上記に記載されるように、１つ以上のリガンド及び必要に応じて１つ以上の同定手段を含む複数のペプチドをナノ粒子の合成時に含むことにより、ナノ粒子コンジュゲートを製造する方法が提供される。
【００３０】
ナノ粒子コンジュゲートを製造する両方の方法は、ナノ粒子コンジュゲートが使用前に保存又は輸送され得るように、凍結乾燥の使用をさらに用い得る。経時的に劣化又は変性し得る特定のリガンドのためにこれが必要とされ得ることは明らかである。
【００３１】
ナノ粒子コンジュゲートは、分子相互作用センサーとして使用され得る。ナノ粒子の“色”は、それらのサイズに依存し、ナノ粒子のサイズは、それらの双極子が結合するように、単に２つ以上の粒子を密な会合に持っていくこと（ｎｍスケールにおいて、それは、タンパク質のスケールを示す）によって、変えられ得る。同定手段及び／又は官能基を取り込んだナノ粒子コンジュゲートは、従って、受容体二量化センサー（receptor dimerisation sensor）等の分子相互作用センサーとして使用され得る。このようなセンサーは、その活性が分子相互作用を妨げまたは促進することにより発揮される化合物の探索のための高スループットスクリーニング用途において、、非常に効率的（高感度、バックグラウンドがない、少量のマクロ分子が必要とされる）である。このようなセンサーはまた、“受容体”の二量化またはオリゴマー化を引き起こす分子の非常に効率的な検出を可能にする。
【００３２】
ナノ粒子コンジュゲートは、複雑な二次的遺伝子産物の分析のために使用され得る。例えば、グライコミクス（glycomics）は、合成がテンプレート駆動されない事実を被る分野である。従って、分析ツール及びアッセイは、精製方法及び検出システムの感度程度にだけ優れる。例えば、糖を還元するためのヒドラジド等の糖結合官能基を有するナノ粒子コンジュゲートは、数桁感度を上げる。この方法を使用するユーザーは、スクリーニングアッセイなどを利用する研究所であろう。
【００３３】
ナノ粒子コンジュゲートは、現在まで主として足場としてＤＮＡを使用することに限られた生体電子工学の用途においても使用され得る。任意のバイオアッセイからの相互作用が生体電子工学デバイスアセンブリにおいて使用され得る。さらに、多くのこのような相互作用がスイッチングに役に立つ。１つの例は、アクチュエーターを形成するために、ナノ粒子を酸化還元基又はタンパク質（例えば、アズリン）に結合させることである。さらなる例は、リン酸化−脱リン酸化及びＣａ２＋‐誘導型の構造変化及び結果的な結合反応を含み得る。幾つか場合において、時にペプチドシェル上のタグによって許容されるナノ粒子間の結合または構造を開拓するために、ナノ粒子を融合する手段によって、有機物質が部分的に又は完全に除去され得る。要するに、ペプチドシェル上に配置され得るタグの特異性及び範囲によって、ナノ粒子を一緒にするために利用可能なコンビナトリアルオーダー（combinatorial ordered）のアセンブリの範囲は、生体電子工学における用途を顕著に増加する。
【００３４】
本発明は、ここで以下の実施例及び図面を参照してより詳細に説明される。
【実施例】
【００３５】
実施例１
シトレート及びペプチドでキャップされた１２．３ｎｍの金ナノ粒子のスペクトルを調べるために、実験が行われた。
【００３６】
水中のシトレートナノ粒子は、ＣＡＬＮＮペプチドを有する又は有しない１容量のリン酸緩衝生理食塩水と混合された。１ｍＬのサンプルのスペクトルは、走査型分光計上で分析された。ペプチドの金ナノ粒子（５０％ＰＢＳにおける）への吸着によって起こされたスペクトルのシフトは、水中のシトレートナノ粒子と比較された。
【００３７】
図１において示されるように、シトレートナノ粒子は、（凝集した金ナノ粒子の特徴である）６２２ｎｍにおける吸収バンドの出現によって明らかなように、５０％ＰＢＳ（７０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２）において不安定である。逆に、５０％ＰＢＳ中のペプチドの存在は、金ナノ粒子の凝集を妨げた。５１８ｎｍから５２１．１へプラズモンバンドにおいて２．１ｎｍのシフトがあるため、メカニズムは、ペプチドの金ナノ粒子への吸着に起因するようである。従って、ペプチドのナノ粒子への吸着は、他のチオール化リガンドの金への吸着と比較して、驚くほど迅速である。この独特の実質的に即時のナノ粒子の安定化はまた、広範囲のペプチド濃度に亘って起こるようである。
【００３８】
実施例２
ペプチドでキャップされた１２．３ｎｍの金ナノ粒子のＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラム上のサイズ排除クロマトグラフィーを実施するための実験が行われた。
【００３９】
図２に示されるように、ペプチドで安定化されたナノ粒子は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５サイズ−排除カラム（クロマトグラフィー範囲１０００Ｄａ〜５０００Ｄａ、ボイド容量＞５０００Ｄａ）上のサイズ−排除クロマトグラフィーによって、遊離ペプチド及びシトレートから分離されることが見出された。ナノ粒子は、ボイド容量中に溶出され、一方で遊離ペプチドは、Ｖｔ付近でクロマトグラフされ、シトレートはＶｔ直前の後のピークにおいて溶出した。予測されるように、カップリング反応においてナノ粒子の濃度が減少し、一方でペプチドの濃度が一定に維持されると、ナノ粒子及びシトレートのピークは低下し、一方でより少量がナノ粒子に吸着するため、遊離ペプチドのピークにおいて小さいが有意な増加が存在する。
【００４０】
Ｇ２５上のクロマトグラフィーによって精製されたペプチドでキャップされたナノ粒子は、過剰なペプチド及びシトレートが無く、実施例４及び図４に記載されるもの以外の以下の実験全てにおいて使用される。
【００４１】
実施例３
ペプチドキャップされたナノ粒子のある範囲のｐＨ及びＮａＣｌ濃度に亘る安定性を評価するために実験が行われた。
【００４２】
図３Ａは、ペプチドキャップされた１２．３ｎｍの金ナノ粒子の安定性に対するｐＨの影響を示す。１０％（ｖ／ｖ）ＰＢＳ中のペプチドキャップされたナノ粒子溶液のｐＨが、調整され、スペクトルが５分のインキュベーションの後に記録された。５２２ｎｍ（安定、単一ナノ粒子）及び６２２（ナノ粒子の凝集体）における吸光度の割合がナノ粒子の安定性の測定尺度として使用される。ペプチドキャップされたナノ粒子は、それらがｐＨ４〜ｐＨ１２で安定であるため、ｐＨ媒介された（mediated）凝集に顕著な抵抗性を示した。
【００４３】
図３Ｂは、ＮａＣｌ濃度のナノ粒子の安定性に対する影響を示す。ナノ粒子は、異なる濃度のＮａＣｌ（ｐＨ７．０）において５分間インキュベートされた。１ＭのＮａＣｌにおいて認識できるスペクトルのシフトはないが、１．５Ｍからナノ粒子の安定性は、低下し始める（６２２ｎｍにおける吸光度の上昇によって実証される）。１Ｍ  ＮａＣｌにおいて、ペプチドキャップされたナノ粒子は、数週間安定であることが見出された。
【００４４】
実施例４
ペプチドキャップされた１２．３ｎｍの金ナノ粒子上に吸着したペプチドの量を滴定によって評価するために、実験が行われた。
【００４５】
吸着したペプチドの全量を確立するための滴定が実施され、次いでナノ粒子が遠心によって除去された。上清中の遊離ペプチドの濃度は、上清の１９０ｎｍにおける吸光度を測定することによって測定された。この値は、遊離ペプチドの相対量を定めるため、そして従って、ナノ粒子に結合したペプチドの概算量を決定するために使用された。図４は、直径１２．３ｎｍの粒子毎に約８５５±７０ペプチドが存在することを示す（プロトコールの改良によって直径１２．３ｎｍのナノ粒子に１５００ペプチドまで結合し得ることが考えられるが）。
【００４６】
実施例５
ペプチドキャップされた１２．３ｎｍの金ナノ粒子上のペプチドのオリエンテーション実験が陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上で行われた。
【００４７】
ペプチドキャップされたナノ粒子は、０．１Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）中のＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅファーストフローカラム（０．５ｍｌ）上に載せられた。このカラムは次いで、ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）を次第に上昇することにおいて、溶出された。
【００４８】
図５は、ナノ粒子が０．４Ｍ  ＮａＣｌにおいて溶出されたことを示し、これは、それらが非常に陰イオン性であることを実証する。ペプチド上の唯一の陰イオン基は、Ｃ末端のカルボン酸である。一般的に、このような基は、それらが親和力効果を生み出す高局所濃度にあるのでない限り、ずっとより低い濃度のＮａＣｌにおいて溶出する。従って、もし全てでなければ、ナノ粒子に吸着したペプチドの大部分が、金表面上のＮ−末端方向を向いており、Ｃ末端は溶媒に曝されていることが見出された。
【００４９】
実施例６
キャッピングペプチド上のリガンドによって駆動されるナノ粒子の特別な会合を評価するために、実験が行われた。
【００５０】
ナノ粒子は、１０：１の割合の標準ペプチド（ＣＡＬＮＮ）と３つのアミノ酸Ｃ−末端エクステンション及びビオチンを含む標準ペプチドでキャップされ、コアへのエクステンションを有するペプチドを含むナノ粒子コンジュゲートの構造はＣＡＬＮＮＫ（ビオチン）ＧＧである。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５上の精製に続いて、ビオチン化された１２．３ｎｍのナノ粒子は、アビジンで覆われた５ｎｍのナノ粒子と混合され、これら後者は標準方法によって作られ、ＴＥＭグリッドに送られ、イメージが撮られた。
【００５１】
図６Ａ及び６Ｂは、１２．３ｎｍのビオチン化されたナノ粒子及び５ｎｍのアビジンで覆われたナノ粒子の高い相対比率を示す。低倍率（１００ｎｍのスケールバー、パネルＡ）において、イメージは、ナノ粒子の大きな複合体が明確であることを示す。複合体のより高い倍率において（１０ｎｍスケールバー、パネルＢ）、それが多くの１２．３ｎｍナノ粒子からなることが明らかである。５ｎｍのアビジンで覆われたナノ粒子のブリッジングは、主として不明瞭である。
【００５２】
図６Ｃ及び６Ｄは、コントロール実験の結果を示し、ここで１２．３ｎｍ及び５ｎｍのナノ粒子の比率は図６Ａ及び６Ｂと同一であるが、１２．３ｎｍのナノ粒子は標準のビオチン化されていないペプチドのみでキャップされている。１２．３ｎｍのナノ粒子上にビオチンがない場合、２つのサイズのナノ粒子間の複合体はどちらの倍率においても明確ではなく、１２．３ｎｍのナノ粒子及び５ｎｍのアビジンで覆われたナノ粒子の会合は、ビオチンによって特異的に駆動されることを明らかに実証する。
【００５３】
図６Ｅ及び６Ｆは、混合物中の１２．３ｎｍのナノ粒子の５ｎｍのアビジンで覆われたナノ粒子に対する、図６Ａ〜Ｄよりも５倍低い比率を示す。図６（Ｅ）において、ビオチン化された１２．３ｎｍのナノ粒子は、５ｎｍのアビジンで覆われたナノ粒子と混合され、数個の５ｎｍのアビジンで覆われたナノ粒子によって囲まれたコアの１２．３ｎｍのナノ粒子から成る複合体を明らかに形成した。図６Ｆ標準において、ビオチン化されていないペプチドでキャップされた１２．３ｎｍのナノ粒子は、５ｎｍのアビジンで覆われたナノ粒子と混合された。１２．３ｎｍ及び５ｎｍのアビジンで覆われたナノ粒子間で会合は見られず、再度、それらの会合がビオチン−アビジン相互作用によって駆動されることを示した。
【００５４】
実施例７
前の実施例において概説したように、ナノ粒子コンジュゲートは、リガンド誘導型二量化のためのセンサーのための基礎として使用され得る。図７Ａは、ＨＢＭ（ハイブリッド二層膜）に固定され、且つ特別なタグを介してＮ末端においてナノ粒子に結合されるＦＧＦＲ１−ＧＰＩ（繊維芽細胞増殖因子受容体１の細胞外ドメイン−グリコシルホスファチジリノシトールアンカー）を示す。図７Ｂは、リガンド（ＦＧＦ−２（繊維芽細胞成長因子）、三角）による受容体（ＦＧＦＲ−１）の二量化の誘導を示し、図７Ｃは、ヘパラン硫酸（ＨＳ）共受容体（鎖）を示す。ナノ粒子−オリゴ糖コンジュゲート（オーログリカン（auroglycan））の使用は、図７Ｄに示される複合体におけるＨＳの機能を探索するための手段を提供する。分子の相互作用によって一緒にされるナノ粒子の近接は、結果それらの双極子カップリングを生じ、従って、観測されるプラズモンバンドのレッドシフトを生じ、そしてナノ粒子によって散乱された光の周波数を生じる。原理上、感度は、１ナノ粒子またはナノ粒子の群である。
【００５５】
実施例８
ナノ粒子コンジュゲートを作るために２つの実験が行われ、ここでペプチドが銀ナノ粒子の合成時に取り込まれ、２つの実験は、二相合成及び単相合成を含む。
【００５６】
相間移動触媒ペプチドの２ｍ／ｍｌ溶液の１ｍＬが、次いで混合物に添加され、１５分間撹拌された。７．５ｍＬの０．４Ｍの水素化ホウ酸ナトリウム水溶液が、次いで一滴ずつ添加され、溶液は、２時間撹拌された。相は次いで分離され、接合したペプチドなくＡｇ粒子を除去するために水相は濾過された。
【００５７】
一相合成は、２ｍｇ／ｍＬの水中のペプチド溶液１ｍｌを２５ｍＭの硝酸銀水溶液９ｍＬに添加することによって実施され、混合液は、次いで１５分間撹拌された。混合液に、０．４Ｍの水素化ホウ酸ナトリウム水溶液７．５ｍＬが一滴ずつ添加され、溶液は、２時間の撹拌のため放置された。次いで、接合したペプチドなくを用いる二相合成は、２５ｍＭの硝酸銀水溶液９ｍＬをトルエン中の０．２Ｍのテトラオクチルアンモニウムブロミド溶液７ｍｌに添加することによって実施された。この混合物はついで、室温で１時間激しく撹拌された。ＤＭＦ（又はＤＭＳＯ、水等）中のペプチドの２ｍｇ／ｍｌ溶液の１ｍＬが、次いで混合物に添加され、１５分間撹拌された。７．５ｍＬの０．４Ｍホウ水素化ナトリウム水溶液が、次いで滴下され、溶液は、２時間撹拌された。相は次いで分離され、結合したペプチドではなくＡｇ粒子を除去するために水相は濾過された。
【００５８】
一相合成は、２ｍｇ／ｍＬの水中のペプチド溶液１ｍｌを２５ｍＭの硝酸銀水溶液９ｍＬに添加することによって実施され、混合液は、次いで１５分間撹拌された。混合液に、０．４Ｍのホウ水素化ナトリウム水溶液７．５ｍＬが滴下され、溶液は、２時間の撹拌のため放置された。次いで、結合したペプチドでないＡｇ粒子を除去するために該水が濾過された。
【００５９】
要約すると、二相合成において、ペプチドは水相に含まれ、一方で一相合成においてペプチドは反応混合液に含まれる。ナノ粒子コンジュゲートは、金属塩の還元の後、水相中に現れる。
【００６０】
実施例９
金ナノ粒子に結合した場合のペンタペプチドＣＡＬＮＮのタンパク質の折りたたみ問題及びそのバリエーション／関連する配列を評価するための研究が実施された。金ナノ粒子に結合した５８個の異なるペプチド配列の効果、大部分がナノ粒子への結合のために少なくとも１つのシステイン残基を含んでいた。これらのペプチドによって付与された安定性は、それらの長さ、疎水性、及び電荷に依存することが見出され、幾つかの場合において、ＣＡＬＮＮと比較したさらに向上した安定性を結果生じた。
【００６１】
ペプチド配列の設計は、金に対する強い親和性、実質的に水を排除する密な層に自己組織化する能力及び水中での溶解性及び安定性を確実にする親水性末端を有する必要性が考慮された。前の実施例に記載するように、ペンタペプチドＣＡＬＮＮが最初に開発され、このペンタペプチドは、必要条件を満たすことにおいて成功であった。Ｎ末端のシステインの側鎖におけるチオール基は、金表面への共有結合を作る能力を有する。アミノ基は、金表面と強い相互作用を有するとも知られているため、このような相互作用は、Ｎ末端の第一級アミンのものに対して付加的であり得る。理解され得るように、ＣＡＬＮＮは、５つの天然アミノ酸の３，２００，０００の可能性ある配列の１つである。ペプチド配列のシステマチックなバリエーションは、異なるペプチドによって付与される金ナノ粒子の安定性を評価するために合成された。ＣＡＬＮＮに直接関連性のない９つの配列も試験され、これらは、水素結合及びβ−ストランド形成並びにペプチドの中央または両端におけるチオール（システイン）の存在に基づいた。
【００６２】
以下の表は、合成され、そして分析されたペプチドを列挙する：
【００６３】
【表１】
2007506084.tif 000003
【００６４】
金ナノ粒子の電解質誘導型の凝集に対する、これら５８のペプチドの影響が研究された。ペプチドの幾つかは、非常に疎水性であったため、配列の比較を容易にするために、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が水性金コロイド溶液におけるそれらの取り込みのための共通溶媒として使用された。一時間後、ｐＨは７に調節され、ＮａＣｌ濃度が漸進的に増加し、同時に吸光度スペクトルがモニターされた。
【００６５】
調査された配列のうち１９について、ペプチドの添加は、粒子の即時的凝集を誘導した。これらのペプチドは、共通の構造的特徴としての２つの粒子をくっ付ける能力を共有する。それらの殆どがチオールの遠位にアミノ基（リジン上、Ｋ）又はグアニジノ基（アルギニン上、Ｒ）を有する。これらの基は、金に対する強い親和性を有する。ＮＮＬＡＣ（ＣＡＬＮＮの逆配列）は、同じ理由で凝集を誘導する。方向性は別として、これら２つのペプチド間の唯一の違いは、ＣＡＬＮＮにおいてアミノ末端基は、チオール基を有するシステイン上にあるが、ＮＮＬＡＣにおいてシステインのチオールは、末端のカルボン酸に隣接し、アミノ末端基は、１位におけるアスパラギン（Ｎ）上にあることである。ＣＡＡＬＰＤＧＬＡＡＣ及びＣＶＶＩＴＰＤＧＴＩＶＶＣもまた、凝集を誘導することが見出された。
【００６６】
研究の間、第一アミノ酸（Ａｎｃｈｏｒａｇｅ）及びペプチドの長さの影響も評価され、二つのアミノ酸のペプチド（ＣＡ）について、凝集パラメーターがＮａＣｌ濃度と共に急激に上昇することが見出された。ＣＡからＣＡＬ、ＣＡＬＮ、そして最終的にＣＡＬＮＮにペプチドの長さが増大すると、ＮａＣｌ誘導型凝集は、益々高い濃度のＮａＣｌに置換され、ペプチドの長さとペプチドでキャップされたナノ粒子の安定性の間の正の相関を示す。チオール含有ペプチドＣＡＬＮＮ及びＣＣＡＬＮＮは、ＫＡＬＮＮ及びＡＡＬＮＮよりも遥かに高い安定性を示すため、明らかにチオール基は、安定化において主要な働きをする。興味深い事に、ＡＡＬＮＮでキャップされたナノ粒子の凝集は、ＫＡＬＮＮでキャップされたナノ粒子よりも高い濃度のＮａＣｌにおいて起こる。ＫＡＬＮＮにおける末端アミノ基のより高い密度は、ペプチド間の一定の静電反発を結果生じ得、これは、自己組織化単分子膜の形成を妨げ得る。さらに、ＡＡＬＮＮにおけるアラニンのさらなるメチル側鎖に起因する疎水性相互作用も、ＡＡＬＮＮの増加した安定性を結果として生じ得る。
【００６７】
位置２及び３におけるアミノ酸の影響も評価され、ペンタペプチドの疎水性コア（第二及び第三アミノ酸）は、他の疎水性アミノ酸（表１のコア、疎水性を参照）に変えられた。９つの結果生じたペプチドは、親のＣＡＬＮＮペプチドのものと同様のＮａＣｌ誘導型の凝集に対するナノ粒子の一定の安定化を提供した。フェニルアラニン（Ｆ）等の嵩高い芳香族アミノ酸さえ、ペプチドの自己組織化単分子膜を崩壊させるようには見えない。幾分驚くべき事に、粒子の曲率を考慮するために、ＣＡＬＮＮが位置３においてより嵩高い疎水性基を用いて設計されたことを考慮すると、位置２における嵩高い疎水性側鎖（Ｉ及びＦ）は、位置３に存在する時よりも、ＮａＣｌ誘導型の凝集に対してより良い安定性を提供すると思われる。従って、ＣＩＬＮＮは、ＣＡＩＮＮよりも安定であり、ＣＦＬＮＮは、ＣＡＦＮＮよりも安定である。チャージした（Ｋ及びＤ）及び中性の親水性（Ｔ、Ｓ、及びＮ）アミノ酸は、前の疎水性コアに置換された（表１、コア、親水性）。チャージしたアミノ酸の存在は、凝集に対して一般的に乏しい保護を提供するペプチド配列を結果生じる。例えば、第三位置における負の電荷の存在（ＣＡＤＮＮ）は、第二位置におけるよりも優れた安定性を提供すると思われるが、ＣＤＤＮＮ−、ＣＫＬＮＮ−、及びＣＤＬＮＮ−キャップされたナノ粒子は、低ＮａＣｌ濃度で凝集する。逆に、中性の親水性アミノ酸で置換されたペプチド、ＣＮＬＮＮ，ＣＡＮＮＮ、ＣＴＬＮＮ、ＣＡＴＮＮ、及びＣＴＴＮＮでキャップされたナノ粒子は、疎水性コアを有するペプチドのものに匹敵するＮａＣｌ濃度において一般に凝集する（中性の親水性アミノ酸の幾つかの組合せ（ＣＴＳＮＮ）は、許容されないと見出されたが）。要約すると、位置２及び３におけるアミノ酸は、安定性を提供するために、隣接するペプチド鎖間の幾らかの引力のある相互作用を必要とすると思われる。従って、極性及び疎水性のアミノ酸は、各々水素結合及び疎水性相互作用を介して自己組織化単分子膜の形成を促進する。しかし、コアにおけるチャージしたアミノ酸側鎖の静電反発は、密なペプチド層の形成を妨げ得、従って乏しい安定化に導く。
【００６８】
位置４及び５におけるアミノ酸の影響も評価され、そしてペプチドのカルボン酸末端の役割（表１、端）も取り組まれた。この研究のために選択された配列の殆どは、ペプチドの添加でナノ粒子の即時の凝集を誘導する。７つのペンタペプチド配列は、一定の安定化を提供する。末端の２つのアミノ酸の安定性と同一性の間の明確なパターンは見られなかったが、これらの結果は末端アミノ酸の電荷がペプチドでキャップされたナノ粒子の安定性に顕著に貢献することを示した。第二の末端の陰電荷を導入すること（ＣＡＬＮＤ、ＣＡＬＬＤ、ＣＡＬＳＤ、ＣＡＬＫＤ）は、ペプチドでキャップされたナノ粒子の凝集を誘導するＮａＣｌ濃度を低下する。余分な陰電荷の存在及び末端アミノ酸間の水素結合がないことは、ペプチドのパッキングに影響し得、ＣＡＬＮＮでキャップされたナノ粒子のものと同様の表面電荷密度を有するが、より緻密でない保護ペプチド層を有する粒子へ導く。末位から二番目のＮを水素結合により影響を受けにくい側鎖を有する残基で置換することは（例えば、ＣＡＬＮＤ対ＣＡＬＳＤ）、安定性を低下するため、末端アミノ酸間の水素結合は、重要な役割を担っているようである。
【００６９】
コンビナトリアル分析は、最初の設計基準を確証する。それは、金ナノ粒子へのアンカーとしてのチオール（システイン）の必要性、ペプチドの長さと安定性の間の明らかな相関及び、高い安定性を供給するための疎水相互作用または水素結合による隣接するペプチド鎖間の結合性のある相互作用の必要性を確立する。ペプチドの電荷及び結合性のある相互作用の間のバランスが主要な役割を果たすことが示される。コンビナトリアル分析はまた、金ナノ粒子の即時的凝集へと導くペプチドのための基準の定義を可能にする。
【００７０】
ＣＡＬＮＮに関連のない他の配列（ＣＣＶＶＶＴ、ＣＶＶＩＴ及びＣＴＴＴ）（これも試験された）はそれらの強いβ−ストランド形成特性のために選択された。ＮＮＬＡＣＡＬＮＮ及びＮＮＬＡＣＣＡＬＮＮは、それらの配列の中央に各々１つ及び２つのシステインを有する。結合は、システインにおける中央のチオールにおいて優先的に起こることが期待されるため、これら２つのペプチドは、ペプチド−水界面においてカルボン酸及びアミノ末端基が露出される全体的に中性の表面を有するはずである。第２のシステイン（Ｃ）の存在は、おそらくパッキングにより好ましいペプチド構造を課すことによって、安定性を格段に向上する。２つのβ−ストランド形成ペプチド、ＣＣＶＶＶＴ及びＣＴＴＴＴはまた、５００ｍＭのＮａＣｌにおける凝集パラメーターの小さな値で、非常に見込みある挙動を示す。特に、ＣＣＶＶＶＴは、５００ｍＭのＮａＣｌにおいて凝集を示さず、ＣＡＬＮＮよりも優れた安定性を有する。比較的少数の配列が試験されたことを考慮すると、より大きいライブラリーの使用は、より良い特性を有するキャッピングリガンドの同定を可能にする。
【００７１】
実施例１０
バイオアプリケーションのための多くのペプチドでキャップされた水溶性磁性ナノ粒子を調製及び特徴付けるための実験が行われた。特に、一連のコバルト物質が、他の磁性材料と共に分析された。
【００７２】
コバルトナノ粒子は、サイズの完全制御で合成され（Ｐｕｎｔｅｓ，  Ｖ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１：  ２１１５−２１１７）、所望される高い磁気モーメント及び感受性を有する。しかし、それらは、有機溶媒環境において安定であるだけで；水中で、それらは酸化してＣｏ２＋を与える。これらの種（例えば、水酸化コバルト）は、金属の磁気特性を有さない。水中で溶解性のある磁性粒子を作成するための二つの主なアプローチは、in situ合成及び相間移動である。ペプチド存在下のＣｏナノ粒子のin situ合成は、Ａｕ−シトレートナノ粒子を使用したものに類似する、明らかな置換反応に加え、水溶性のＣｏナノ粒子を作るためのルートとして説明される。密に詰まったリガンドシェルへのペプチドの急速な自己組織化は、他の金属ナノ粒子を安定に保護すると示された（Ｌｅｖｙ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００４）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ。Ｓｏｃ．，  １２６，  １００７６−１００８４）。従って、ナノ粒子の表面上への認識基の導入は、リガンド交換／合成時に、特定のタグを有する所定パーセントの修飾されたペプチドを含むことによって容易に成し遂げられ得る。幾つかの可能性あるプロトコールがある：１つは、Ｐｕｎｔｅｓの文献であるが、有機溶媒中のオレイン酸／ＴＯＰＯリガンドをＤＭＦ又はＤＭＳＯ中に溶解したペプチドで置換する−これは、ＴＥＭ中で該物質を与える。Ａｕはシトレートで安定化され、水中であるが、Ｃｏは、Ｐｕｎｔｅｓの文献に記載される溶媒（例えば、ジクロロベンゼン、トルエン）において開始するため、他の方法は、Ａｕに類似するが、詳細において異なる。例えば、以下である：
１．  過剰なリガンド全てを除去するために、Ｃｏナノ粒子を溶媒で洗浄する。実際、これは、Ｐｕｎｔｅｓの文献に記載されるオレイン酸及びＴＯＰＯであるが、将来に開発される任意の他のものでもあり得る。
２．  ＤＭＡＳＯ又はＤＭＦ中に溶解されるペプチドを添加する。
３．  リガンド交換を可能にするために、混合及び放置する。これは、Ａｕ又はＡｇと比較した相対的な様子である。
４．  溶媒を除去する。
５．  水を添加する。
注：Ｃｏナノ粒子の洗浄は、それらの磁性を利用し得る：マグネットは、チューブの横に配置され得、液相が除去される。
【００７３】
以下の表は異なる材料の磁気特性を列挙し、Ｃｏナノ粒子は小さなサイズと高い磁化飽和を組み合わせることを示し、それは、非常に需要の多い物質である：
【００７４】
【表２】
2007506084.tif 000004
【００７５】
以下のペプチドは、本発明に従った使用のためのコバルトナノ粒子の安定性を試験するために、ナノ粒子合成時にin situでナノ粒子と結合された：
【００７６】
【化１】
2007506084.tif 000005
【００７７】
サンプルは、明視野（ＢＦ）及び暗視野（ＤＦ）透過型電子顕微鏡によって調査され、そのナノ粒子は図８において見られ得る。図８の暗視野の図は、透過電子の代わりに回析電子によって作られたイメージを見ることにより成る。暗視野イメージングは、有機物質内の金属ナノ粒子（ＮＰ）の直接的な観察を提供する。異なるタイプの化合物が基板上に堆積したことが見出された：有機（ペプチド）小滴に埋没した７ｎｍの金属粒子、大きな凝集体及び個別のナノ粒子、並びにこれらの組合せ。疎水性ＮＰが有機溶媒から親水性基板上に蒸発される場合と異なり、自己組織化は、観察されなかった。
【００７８】
図９は、異なる合成についてのＸ線回析パターン（Ｃｏ  ｋａ＝１．７９８）を示し、ここでｈｃｐ及びイプシロンＣｏの結晶構造が現れる（純粋な又はＣｏ酸化物及び水酸化物との混合（＊ピーク））。ピークの広さは、それらのナノメートルサイズに関連する。
【００７９】
ナノ粒子は、ＳＱＵＩＤ［ＳＱＵＩＤ＝機器であり方法ではない］によって分析され、ＺＦＣ／ＦＣ測定（図１０）は、約６ＫにおいてＺＦＣ曲線中にピークを示す。これは、サンプル中のＮＰの直径が数ナノメートルよりも小さい証拠である。これらの小さい粒子のモーメントは低温でブロックされ、そのように観察されたＺＦＣ／ＦＣ曲線に導く。しかし、サンプルはまた、幅広いサイズ分布のより大きなサイズのＮＰを含む。結果として、ＺＦＣ及びＦＣ曲線は、ピーク（６Ｋ）の位置ではなく、非常に高い温度で分離する。室温でさえ、我々は、オープンヒステリシスループ（open hysteresis loop）を観察し（図１０の挿込み）、これは直径約１０ｎｍの幾つかの粒子もサンプル中に存在することを示す。
【００８０】
置換実験において、オレイン酸及びＴＯＰＯを用いて合成された１０ｎｍのＣｏナノ粒子は（前に参照されたＰｕｎｔｅｓのＳｃｉｅｎｃｅの参考文献）、トルエン中で洗浄され、この溶媒中で再懸濁され、次いでペプチドと混合された。ライブラリーからの５８ペプチド全てが、試験された。ナノ粒子の凝集の状態は６日にわたり続いた。この後、それらは、凍結乾燥され、水中に再懸濁された。幾つかのペプチド（そのうちＣＡＬＮＮが最も効果的であった）は、ナノ粒子が磁気特性を保持しつつ水中で再懸濁されることを可能にした。凍結乾燥の代わりに、溶媒は、簡単にＣｏナノ粒子から除去され、水で置換され得る。
【００８１】
実施例１１
多くのペプチドでキャップされた銀（Ａｇ）ナノ粒子をペプチドリガンドのシトレート−Ａｕナノ粒子上への置換によって調製及び特徴付けるために実験が行われた。
【００８２】
Ａｕ粒子と同様に、Ａｇナノ粒子の安定化は、即時的であり、極めて安定なナノ粒子を作る。水性環境において酸化するＡｇの傾向を考慮すると、ペプチドによるＡｇナノ粒子の長期安定化は、ペプチドリガンドの顕著な特性のさらによりストリンジェントな試験を与える。安定性は、ペプチドの添加後、１０〜１５分（以下“短期”）及び２４時間（以下“長期”）で測定される。実際、長期の安定性を示す粒子の調製物は、数ヶ月間安定である。標準のナノ粒子調製物は、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）（別途示されない限り）中であり；ＮａＣｌはこのバッファーに追加的である。実験の結果は、以下の図面を参照して見られ得る：
図１１  Ａｇ−ＣＡＬＮＮ：  ペンタペプチドＣＡＬＮＮは、シトレートＡｇ−ナノ粒子水溶液に添加された。シトレートＡｇナノ粒子は、直径１５．３＋／−６．４ｎｍであった。精製された粒子の溶液は、異なるｐＨ値（Ａ）及びＮａＣｌ濃度（Ｂ）において試験された。パネルＡは、粒子がｐＨ４〜１２で長期安定性を示すことを示す。パネルＢは、粒子が１Ｍ ＮａＣｌ以下で安定であることを示す。これは、短期と長期の両方について当てはまる。
【００８３】
図１２  Ａｇ−ＣＣＡＬＮＮ：  ヘキサペプチドＣＣＡＬＮＮは、シトレート−Ａｇナノ粒子の水溶液に添加された。精製された粒子の溶液は、異なるｐＨ値（Ａ）及びＮａＣｌ濃度（Ｂ）において試験された。パネルＡは、粒子がｐＨ４〜１２で安定であることを示す。これは、短期及び長期の両方について当てはまる。パネルＢは、粒子が１Ｍ ＮａＣｌまでで安定であることを示す。これは、短期及び長期の両方について当てはまる。
【００８４】
図１３  Ａｇ−ＣＶＶＶＴ：  ペンタペプチドＣＶＶＶＴは、シトレートＡｇナノ粒子水溶液に添加された。精製された粒子の溶液は、異なるｐＨ値（Ａ）及び塩濃度（Ｂ）において試験された。パネルＡは、粒子がｐＨ２〜１２で短期の安定性を示し、ｐＨ２〜６でプラズモンピークのシフトを有することを示す。該粒子は、ｐＨ２及び３において長期の安定性を示さない。パネルＢは、該粒子が１ＭのＮａＣｌまでで安定であることを示す。これは、短期及び長期の両方について当てはまる。
【００８５】
図１４  Ａｇ−ＣＣＶＶＶＴ：  ヘキサペプチドＣＣＶＶＶＴがシトレート安定化Ａｇナノ粒子の水溶液に添加された。精製された粒子の溶液は、異なるｐＨ値（Ａ）及びＮａＣｌ濃度（Ｂ）において試験された。パネルＡは、粒子がｐＨ２〜１２で短期の安定性を示し、ｐＨ２〜６でプラズモンピークのシフトを有することを示す。該粒子は、ｐＨ２及び３において長期の安定性を示さない。下のグラフは、該粒子が１Ｍ ＮａＣｌまでで安定であることを示す。これは、短期及び長期の両方について当てはまる。
【００８６】
ＣＡＬＮＮでキャップされたＡｇナノ粒子は、二相の修飾されたＢｒｕｓｔ合成において作られた。簡略に、銀は、トルエン、水及び相間移動触媒の二相混合においてペプチドの存在下で還元される。
【００８７】
図１５  Ａｇ−ＣＡＬＮＮ：精製された粒子の溶液は、異なるｐＨ値（Ａ）及びＮａＣｌ濃度（Ｂ）において試験された。パネルＡは、該粒子がｐＨ３〜１２で短期の安定性を示すことを示す。ｐＨ３において粒子は、長期の安定性を示さない。パネルＢは、粒子が１ＭのＮａＣｌにおいて安定であることを示す。これは、短期及び長期の両方について当てはまる。
【００８８】
図１６  Ａｇ粒子のＴＥＭ：  パネルＡ〜Ｃ  シトレートを用いた置換によって作られるＣＡＬＮＮでキャップされたＡｇナノ粒子。シトレートを用いた置換によって作られるＣＡＬＮＮでキャップされたＡｇナノ粒子のＴＥＭイメージ。大部分の粒子の直径は、１０〜２０ｎｍであり、直径１６．３＋／−４．５ｎｍのサイズ分布（平均±ＳＤ）を有することが見出された。該粒子は、殆どが球形状であり、そのサイズ範囲に亘って優れた形状の均一性を示す。パネルＤ〜Ｆ  ＣＡＬＮＮを用いた二相合成において作られたＡｇナノ粒子。二相合成において作られ、そして前の安定性試験において使用されたＣＡＬＮＮでキャップされたＡｇナノ粒子のＴＥＭイメージ。大部分の粒子の直径は、５〜１５ｎｍであり、直径８．２＋／−２．４ｎｍのサイズ分布（平均±ＳＤ）を有する。該粒子は、殆ど球形状でありそのサイズ範囲に亘って優れた形状の均一性を示す。
【００８９】
図１７  ＣＬ−６Ｂカラム上のＡｇ−ＰＥＧ及びＡｕ−ＣＣＡＬＮＮの分離：  Ａｇナノ粒子の合成は、Ａｕナノ粒子のための合成のような比較的単分散の粒子を結果生じないため、重力駆動のゲルろ過カラム上のサイズ分離がサイズ分布を下げるために使用される。これらは、分離したエンティティーであると目で容易に検出されるため、実験は、Ａｕ及びＡｇナノ粒子を用いた概念実証実験を実証する。１２ｎｍのＣＡＬＮＮでキャップされたＡｕナノ粒子（赤）は、直径３〜７ｎｍのテトラエチレングリコールでキャップされたＡｇナノ粒子（黄色）から分離される。（Ａ〜Ｃ）より小さいＡｇナノ粒子からのより大きいＡｕナノ粒子の漸進的な分離を示すＣＬ−６Ｂのカラム上のクロマトグラフィーの進行。（Ｄ）ＣＬ−６Ｂカラムから集められた１ｍＬの画分は、２つのサイズの粒子の明確な分離を示す。
【００９０】
実施例１２
Ａｕペプチドでキャップされたナノ粒子を官能化するために実験が行われた。
【００９１】
ペプチドリガンドは、２つの特徴的な性質を有する。第一は、ナノ粒子を瞬時に安定化するそれらの能力である。第二は、それらが、所定の原子価を有するナノ粒子を作ることによる制御様式においてナノ粒子を官能化するための特有のルートを提供することである。これらの実験は、ペプチドの官能化の幾つかの例を提供し、ペプチド−ＤＮＡ研究は、官能化の原子価を制御する原理を実証する。実験の結果は、以下の図を参照して見られ得る：
図１８は、安定化のためのマトリクスペプチド（この場合ＣＡＬＮＮ）及び特定の官能性（通常は、認識機能）を付与するエクステンションを有する所定モルパーセントの１つ以上のペプチド種（与えられた例においてＣＡＬＮＮＸＸＸ及びＣＡＬＮＮＹＹＹ）を用いる原理の略図を示す。ナノ粒子毎のペプチドリガンドの数は知られており（１２．３ｎｍのナノ粒子について８５５±７０）、この数は、マトリクスペプチド：官能化ペプチドの比率を選択するために使用される。例えば、比率１０００：１は、１つの官能化されたペプチドを有する大部分のナノ粒子を生じる。一原子価置換は、例えば３０００：１等のより高い比率及び官能化されていないナノ粒子を除去するためのエクステンションの特有の性質に基づくクロマトグラフィー分離（実際は、アフィニティークロマトグラフィー）を使用して達成される。アフィニティークロマトグラフィーにおける溶出勾配及びより低いペプチド比率を使用して、異なる原子価のナノ粒子種が精製され得る（ジ、トリ、などの原子価）。
【００９２】
図１９は、官能化されたペプチドとＣＡＬＮＮ（以下マトリクスペプチド）としてのＣＡＬＮＮ−ＤＮＡ（以下ペプチド−ＤＮＡ）の例を示す。ＨＳＤＮＡは、ナノ粒子をＤＮＡを用いて官能化するために使用される標準のチオール化ＤＮＡである。リンカーＤＮＡは、大きいナノ粒子上の一本鎖ＨＳＤＮＡ及び小さいナノ粒子上のペプチド−ＤＮＡに相補的である。
【００９３】
以下は、ＨＳ−ＤＮＡリガンドを有する４０ｎｍのナノ粒子とマトリクスペプチド及びペプチド−ＤＮＡを有する１２．３ｎｍのナノ粒子間で形成される複合体の例である。１２．３ｎｍのナノ粒子に対する４０ｎｍの比率及びペプチド−ＤＮＡをマトリクスペプチドのパーセントとして単純に制御することによって、ナノ粒子のアセンブリを制御することが可能である。このルートは、このようなナノ粒子アセンブリの状態の制御と極めて容易な調製を兼ね合わせる唯一のものである。
【００９４】
図２０は、０．３％におけるペプチド−ＤＮＡ及びナノ粒子１２．３ｎｍペプチド／ペプチド−ＤＮＡ：４０ｎｍＤＮＡの割合＝１０：１を示す。０．３％のペプチド−ＤＮＡにおいて、ナノ粒子毎に〜３ペプチド−ＤＮＡまで存在する。１つ又はただ数個の１２．３ｎｍペプチド−ＤＮＡナノ粒子が結合した単一の４０ｎｍＨＳ−ＤＮＡナノ粒子からなる単純アセンブリが作られる。
【００９５】
図２１は、１２．３ｎｍのペプチド−ＤＮＡナノ粒子の数を増加する影響を示す。ナノ粒子１２．３ｎｍペプチド／ペプチド−ＤＮＡ：４０ｎｍＤＮＡの比率＝３０：１（図２０、０．３％と同一のパーセントにおけるペプチド−ＤＮＡ）。より多くの小さいナノ粒子を用いると、アセンブリは依然として単純であるが、小さい１２．３ｎｍペプチド−ＤＮＡナノ粒子によって殆ど完全に囲まれた中央の４０ｎｍＨＳ−ＤＮＡナノ粒子から成る。
【００９６】
図２２は、１２．３ｎｍのペプチド−ＤＮＡナノ粒子の数をさらに増加することの影響を示す。ナノ粒子１２．３ｎｍペプチド／ペプチド−ＤＮＡ：４０ｎｍＤＮＡの比率＝１００：１（図２１、０．３％と同一パーセントにおけるペプチド−ＤＮＡ）。さらに多くの小さいナノ粒子を用いると、アセンブリは依然単純であるが、今度は、小さい１２．３ｎｍペプチド−ＤＮＡナノ粒子によって完全に囲まれた中央の４０ｎｍＨＳ−ＤＮＡナノ粒子から成る。
【００９７】
図２３は、１．０％のペプチド−ＤＮＡとナノ粒子１２．３ｎｍペプチド／ペプチド−ＤＮＡ：４０ｎｍＤＮＡの割合＝３：１及び１０：１を示す。１．０％のペプチド−ＤＮＡにおいてナノ粒子毎に〜９ペプチド−ＤＮＡが存在する。１２．３ｎｍペプチド−ＤＮＡナノ粒子のより高い原子価は、３：１及び１０：１の１２．３ｎｍペプチドＤＮＡナノ粒子：４０ｎｍＨＳ−ＤＮＡナノ粒子の粒子比において、アセンブリが図２０〜２２において見られるよりもより複雑である事実によって反映される（１つ以上の大きなＨＳ−ＤＮＡ４０ｎｍナノ粒子の１２．３ｎｍペプチド−ＤＮＡナノ粒子によるブリッジングは明らかであるため）。
【００９８】
図２４は、１２．３ｎｍのペプチド−ＤＮＡナノ粒子の数を増加することの影響を示す。ナノ粒子１２．３ｎｍペプチド／ペプチド−ＤＮＡ：４０ｎｍＤＮＡの割合＝３０：１（図２３、１．０％と同一パーセントにおけるペプチド−ＤＮＡ）。１２．３ｎｍペプチドナノ粒子の濃度が上昇すると、それらは、４０ｎｍＨＳ−ＤＮＡ粒子を殆ど包囲し、ブリッジングを妨げる。
【００９９】
図２５は、１２．３ｎｍペプチド−ＤＮＡナノ粒子の数を増加することの影響を示す。ナノ粒子１２．３ｎｍペプチド／ペプチド−ＤＮＡ：４０ｎｍＤＮＡの割合＝１００：１（図２４、１，０％と同一パーセントのペプチド−ＤＮＡ）。１２．３ｎｍペプチドナノ粒子の濃度が上昇すると、それらは、今度は４０ｎｍＨＳ−ＤＮＡ粒子を完全に、効果的に囲み、ブリッジングを阻止する。
【０１００】
以下の実験は、ＨＳ−ＤＮＡナノ粒子のみが使用された場合に見られるタイプの大きな
凝集体を作る。予想通り、融解温度よりも高くに凝集体を加熱することは、ＤＮＡハイブリダイゼーション駆動型の凝集を逆にする。
【０１０１】
図２６は、１０．０％のペプチド−ＤＮＡ及びナノ粒子１２．３ｎｍペプチド／ペプチド−ＤＮＡ：４０ｎｍＤＮＡの比率＝１：１を示す。今回のペプチド−ＤＮＡナノ粒子は、ほぼ９０の原子価を有し、この点において、それらは、４０ｎｍのＨＳ−ＤＮＡナノ粒子を有する大きな凝集体を形成し、これは、明らかな周期性を有する。
【０１０２】
図２７は、１０．０％のペプチド−ＤＮＡとナノ粒子１２．３ｎｍペプチド／ペプチド−ＤＮＡ：４０ｎｍＤＮＡの比率＝１０：１を示す。１２．３ｎｍのペプチド−ＤＮＡナノ粒子の数を増加することは、凝集体の見かけの“密度”を増加する。
【０１０３】
図２８は、官能化されたエクステンションとしてのＳｔｒｅｐＴａｇＩＩとビオチンの使用を図示する。ビオチンは、アビジン、ストレプトアビジン、ストレプトアクチン等に結合し、一方でＳｔｒｅｐＴａｇＩＩ配列は、ストレプトアビジン及びストレプトアクチンのみに結合する。Ａ、Ｂ，ストレプトアビジンで覆われた小さな５ｎｍナノ粒子及び１０％のＣＡＬＮＮＫ（ビオチン）ＧＧでの１３ｎｍナノ粒子のアセンブリのＴＥＭ（ここでビオチンは、リジン残基の側鎖のεアミノ基上である）及び１２．３ｎｍナノ粒子がＣＡＬＮＮのみを有するコントロール。Ｃ，Ｄ  ストレプトアクチン−ペルオキシダーゼによる１２．３ｎｍナノ粒子上のＳｔｒｅｐｔＴａｇＩＩの認識。ブロット“Ｄ”は、ＣＡＬＮＮのみを有する１２．３ｎｍナノ粒子によるストレプトアクチンペルオキシダーゼの検出可能な非特異的結合がないことを示す。
【０１０４】
図２９は、紫外可視吸光度によって測定されたストレプトアビジンによってビオチン又はＳｔｒｅｐＴａｇＩＩで官能化された１２．３ｎｍナノ粒子の凝集を示す。凝集パラメーターは、Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２００４）に規定される通りである。ビオチンとストレプトアビジンの相互作用は、より高い親和性であり、ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩのものよりも速い反応論で進行する。従って、凝集体を作るナノ粒子：ストレプトアビジンの比率は異なる。
【０１０５】
図３０は、人工的な物質を認識するように選択されたペプチドエクステンションの例を示す。ペプチド“ナノール（nanol）”の配列は、単壁のカーボンナノチューブを特異的に認識すると同定された。１０％のＣＡＬＮＮ−ｎａｎｏｌを有するナノ粒子（１２．３ｎｍ）は、単壁のカーボンナノチューブに特異的に結合する。
【０１０６】
実施例１３
多用途の“グリココンジュゲート（glycoconjugates）”を生成するために水銀付加物の形成を介して、チオール誘導体化タンパク質様金ナノ粒子を調製するための実験が行われた。実験は、本発明に従ったナノ粒子コンジュゲートを生産するための代替的なアプローチを示し、これは、リアーゼを用いたＧＡＧの酵素分解によって得られるオリゴ糖の高収率の誘導化、及び非還元末端のウロン酸中に結果生じる不飽和結合の水銀塩による攻撃、並びに後の安定なグリココンジュゲートを形成するためのキャリア分子又は表面のチオール基への水銀付加物の付着に依存する。該アプローチは、ヘパラン硫酸−金ナノ粒子コンジュゲートの調製によって説明される。
【０１０７】
Ａｕ−ＣＡＬＮＮ−Ｍｅｔの調製のための典型的な反応は、ボルテックスしながら、５０μＬのＥＤＣ（１Ｍ）を４００μＬのＡｕ−ＣＡＬＮＮ（ＯＤ〜０．３２）に添加することを必要とし、反応チューブは、１５分間静置された。次いで、５０μＬのＭＥＴ（０．３３Ｍ）が反応混合物に添加され、１時間放置された。過剰な試薬は、１Ｌのリン酸バッファー中で、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｓｅｒ透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ）における一晩の透析によって除去された。
【０１０８】
このＨＦ（１ｍＬ、１／１（ｖ／ｖ）２時間、４０℃、Ｈｇ（ＯＡｃ）２（１ｍｇ、３μｍｏｌ）を用いて）中で反応された。
【０１０９】
Ａｕ−ＣＡＬＮＮ−Ｍｅｔ−Ｓ...Ｈｇ−糖の調製は、１μｌのＤＰ６−Ｈｇを１００μｌのＡｕ−ＣＡＬＮＮ−Ｍｅｔに加えることにより、反応は３０分の後実施例において、Ｈｇ−糖の調製のために、ヘパリチナーゼ（heparitinase）酵素消化によってヘパラン硫酸から誘導され、非還元末端に不飽和の４，５ウロン酸を有する重合度６（ＤＰ６：０．２５ｍｇ、０．６３μモル）と称されるモデルヘキササッカライド（hexaccharide）が水／ＴＨＦ（１ｍＬ、１／１（ｖ／ｖ）中２時間、４０℃、Ｈｇ（ＯＡｃ）２（１ｍｇ、３μｍｏｌ）を用いて）と反応された。
【０１１０】
Ａｕ−ＣＡＬＮＮ−Ｍｅｔ−Ｓ...Ｈｇ−糖の調製は、１μＬのＤＰ６−Ｈｇを１００μＬのＡｕ−ＣＡＬＮＮ−Ｍｅｔに加えることにより、反応は３０分後にモニターされた。
【０１１１】
実験の結果は、以下の表に列挙される（表３）：
【０１１２】
【表３】
2007506084.tif 000006
【０１１３】
実験の結果は、以下の点に要約され得る。
１．高収率のＨＳ糖の水銀付加物が作られた−構造は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（図６）、１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲによって確認された（これも、付着したＨｇを示す（＞９５％純度）。
２．ＣＡＬＮＮ及びＣＡＬＮＮＭｅｔで覆われたＡｕＮＰの調製。Ｃｙｓも使用され得るが、そのチオールは、ｍｅｔのチオエーテルよりも一般的に反応性がある（どちらもＨｇ２＋と等しく反応するが）。
３．ＡｕＮＰ−ＣＡＬＮＮ−Ｍｅｔ−Ｓ．．．Ｈｇ−ＤＰ６の形成についての証拠が図７に示される。カップリングの前、Ｈｇ−ＤＰ６は、ＥＤＴＡ（１００ｍｌ）の存在下で、キレートフリーのＨｇ２＋イオンに対し２回精製された。ＡｕＮＰ−ＣＡＬＮＮとＡｕＮＰ−ＣＡＬＮＮＭｅｔＳ...Ｈｇ−ＤＰ６のスペクトルの比較は、粒子の凝集の特徴である強度の低下と共に２ｎｍのλｍａｘにおける違い及びより長い波長における増加した吸光度を示す。
４．ＡｕＮＰ又はＡｕＮＰ−ＣＡＬＮＮとＨｇイオン、糖及びＨｇ−糖の全ての他の組合せのコントロール実験は、紫外線−可視スペクトルにおける如何なる変化も示さなかった。表３は、Ｈｇ（ＯＡｃ）２の存在下におけるＡｕ−ＣＡＬＮＮ−Ｍｅｔとヘパリン間の相互作用の存在を示す。これは、Ｈｇイオンとヘパリンの硫酸基との相互作用に起因するのかもしれない。結果として、Ｈｇ−ＤＰ６コンジュゲートから遊離Ｈｇイオンを除去するために、ＥＤＴＡが使用された。これは、光学的特性における変化がＨｇ−ＤＰ６の存在に特異的であり、Ａｕ表面上のＭｅｔを介したそれのペプチドへの付着と一致することを確証する。
５．これらの実験の結果から、多くの用途のためのヘパラン硫酸プロテオグリカンの類似物の生成は可能となる（例えば、成長因子のシグナリング、宿主細胞のヘパラン硫酸への病原微生物の結合の多価インヒビター、及びヘパラン硫酸オリゴ糖のシーケンスのための新規な戦略。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】図１は、実施例１に記載されるシトレートＡｕナノ粒子及びＣＡＬＮＮ  Ａｕナノ粒子の２００〜８００ｎｍにおけるスペクトル分析の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、実施例２に記載される、ペプチド及びシトレートからのＣＡＬＮＮ  Ａｕナノ粒子のＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５サイズ−排除クロマトグラフィー精製の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例３に記載される、ある範囲のｐＨ（Ａ）及びＮａＣｌ濃度（Ｂ）についてのナノ粒子コンジュゲートの安定性実験の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、実施例４に記載される滴定による吸着したペプチドの定量実験の結果を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例５に記載されるＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅファーストフロー上の陰イオン交換クロマトグラフィーによるＡｕナノ粒子上のペプチドのオリエンテーション実験を示すグラフである。
【図６】図６（Ａ−Ｆ）は、実施例６に記載される、リガンドシェルへのビオチン化ペプチドの付加及び、ストレプトアビジンで覆われたナノ粒子へのナノ粒子の後の吸着によるペプチド上のリガンドによって駆動されるナノ粒子の特定の会合を示す顕微鏡写真である。
【図７】図７は、本発明に従ったリガンド誘導型二量化のためのナノ粒子ベースセンサーの例の図である。
【図８】図８は、実施例１０においてペプチドを用いて合成したＣｏナノ粒子の透過型電子顕微鏡画像である（明視野（左）及び暗視野（右））。
【図９】図９は、実施例１０におけるナノ粒子についてのＸ線回折特性データである。
【図１０】図１０は、実施例１０におけるナノ粒子についてのＳＱＵＩＤ特性データを示す。
【図１１】図１１は、実施例１１において作られたＡｇ−ＣＡＬＮＮナノ粒子コンジュゲートの結果を示す。
【図１２】図１２は、実施例１１において作られたＡｇ−ＣＣＡＬＮＮナノ粒子コンジュゲートの結果を示す。
【図１３】図１３は、実施例１１において作られたＡｇ−ＣＶＶＶＴナノ粒子コンジュゲートの結果を示す。
【図１４】図１４は、実施例１１において作られたＡｇ−ＣＣＶＶＶＴナノ粒子コンジュゲートの結果を示す。
【図１５】図１５は、実施例１１において作られたＡｇ−ＣＡＬＮＮナノ粒子コンジュゲートの結果を示す。
【図１６】図１６は、実施例１１において作られたＡｇナノ粒子コンジュゲートの電子顕微鏡イメージを示す。
【図１７】図１７は、実施例１１において作られたＣＬ−６Ｂカラム上のＡｇ−ＰＥＧ及びＡｕ−ＣＣＡＬＮＮの分離の結果の写真である。
【図１８】図１８は、実施例１２において例証される、安定化及び所定モルパーセントの１つ以上のペプチド種についてマトリクスペプチド（この場合ＣＡＬＮＮ）を使用する原理の略図である。
【図１９】図１９は、実施例１２において例証される、官能化されたペプチドとしてＣＡＬＮＮ−ＤＮＡ（以下、ペプチド−ＤＮＡ）及びＣＡＬＮＮ（以下マトリクスペプチド）の例を示す。
【図２０】図２０は、実施例１２において例証されるナノ粒子コンジュゲートの単純アセンブリのイメージを示す。
【図２１】図２１は、実施例１２において例証される１３ｎｍペプチド−ＤＮＡナノ粒子の割合を増加させることの効果のイメージを示す。
【図２２】図２２は、図２１において示されるものよりも１３ｎｍペプチド−ＤＮＡナノ粒子の割合をさらに増加させることの効果のイメージを示す。
【図２３】図２３は、図２２において示されるものよりも１３ｎｍペプチド−ＤＮＡナノ粒子の割合をさらに増加させることの効果のイメージを示す。
【図２４】図２４は、図２３において示されるものよりも１３ｎｍペプチド−ＤＮＡナノ粒子の割合をさらに増加させることの効果のイメージを示す。
【図２５】図２５は、図２４において示されるものよりも１３ｎｍペプチド−ＤＮＡナノ粒子の割合をさらに増加させることの効果のイメージを示す。
【図２６】図２６は、実施例１２において例証される、１０．０％のペプチド−ＤＮＡ及び、ナノ粒子１３ｎｍペプチド／ペプチド−ＤＮＡ：４０ｎｍＤＮＡの割合＝１：１のイメージを示す。
【図２７】図２７は、実施例１２において例証される、１０．０％のペプチド−ＤＮＡ及び、ナノ粒子１３ｎｍペプチド／ペプチド−ＤＮＡ：４０ｎｍＤＮＡの割合＝１０：１のイメージを示す。
【図２８】図２８は、実施例１２に例証される、ビオチン及びＳｔｒｅｐＴａｇＩＩの官能化されたエクステンションとしての使用を示す。
【図２９】図２９は、実施例１２において例証される、紫外可視（uv-vis）吸光度によって測定された、ストレプトアビジンによってビオチン又はＳｔｒｅｐＴａｇＩＩで官能化された１３ｎｍナノ粒子の凝集を示す。
【図３０】図３０は、実施例１２において例証される、人工物質を認識するように選択されたペプチドエクステンションを示す。
【図１】
2007506084.tif 000007
【図２】
2007506084.tif 000008
【図３】
2007506084.tif 000009
【図４】
2007506084.tif 000010
【図５】
2007506084.tif 000011
【図６Ａ−Ｂ】
2007506084.tif 000012
【図６Ｃ−Ｄ】
2007506084.tif 000013
【図６Ｅ−Ｆ】
2007506084.tif 000014
【図７】
2007506084.tif 000015
【図８】
2007506084.tif 000016
【図９】
2007506084.tif 000017
【図１０】
2007506084.tif 000018
【図１１】
2007506084.tif 000019
【図１２】
2007506084.tif 000020
【図１３】
2007506084.tif 000021
【図１４】
2007506084.tif 000022
【図１５】
2007506084.tif 000023
【図１６】
2007506084.tif 000024
【図１７】
2007506084.tif 000025
【図１８】
2007506084.tif 000026
【図１９】
2007506084.tif 000027
【図２０】
2007506084.tif 000028
【図２１】
2007506084.tif 000029
【図２２】
2007506084.tif 000030
【図２３】
2007506084.tif 000031
【図２４】
2007506084.tif 000032
【図２５】
2007506084.tif 000033
【図２６】
2007506084.tif 000034
【図２７】
2007506084.tif 000035
【図２８】
2007506084.tif 000036
【図２９】
2007506084.tif 000037
【図３０】
2007506084.tif 000038
【国際調査報告】
2007506084.tif 000039
2007506084.tif 000040
2007506084.tif 000041
2007506084.tif 000042
2007506084.tif 000043
2007506084.tif 000044