(57)【要約】  本発明は、ＥＣ  ＳＯＤ及び細胞侵透性ＥＣ  ＳＯＤとこれらの用途に関するものである。より具体的には、本発明はＥＣ  ＳＯＤ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）及び細胞浸透能が改善されたＥＣ  ＳＯＤ融合タンパク質とこれらを皮膚疾患の予防または治療に用いる用途に関するものである。
2007536903.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離されたEC  SODタンパク質または上記EC  SODタンパク質と実質的に同質の活性を示し、60％以上の配列相同性を有するタンパク質を有効成分として含む皮膚疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項２】
分離されたEC  SODタンパク質または上記EC  SODタンパク質と実質的に同質の活性を示し、60％以上の配列相同性を有するタンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有効成分として含む皮膚疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項３】
上記EC  SODタンパク質がほ乳動物に由来したものであることを特徴とする請求項1または2に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
上記EC  SODタンパク質が配列番号11で示されるアミノ酸配列を含むものであることを特徴とする請求項3に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
上記皮膚疾患が皮膚癌、色素沈着性疾患、光老化、皮膚炎、表皮増殖疾患、アトピー、じんましん及びアレルギーからなる群から選択されるものであることを特徴とする請求項1または2に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
分離されたEC  SODタンパク質または上記EC  SODタンパク質と実質的に同質の活性を示し、60％以上の配列相同性を有するタンパク質を含む皮膚疾患の予防または改善用化粧料組成物。
【請求項７】
分離されたEC  SODタンパク質、上記EC  SODタンパク質と実質的に同質の活性を示し、60％以上の配列相同性を有するタンパク質及び上記タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む発現ベクターからなる群から選択されたいずれか一つを有効な量で個体に投与することを含む皮膚疾患の予防または治療方法。
【請求項８】
分離されたEC  SODタンパク質、上記EC  SODタンパク質と実質的に同質の活性を示し、60％以上の配列相同性を有するタンパク質及び上記タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む発現ベクターからなる群から選択されたいずれか一つを皮膚疾患の予防及び治療用薬学的組成物の製造に用いる用途。
【請求項９】
分離されたEC  SODタンパク質または上記EC  SODタンパク質と実質的に同質の活性を示し、60％以上の配列相同性を有するタンパク質とタンパク質伝達ドメインが融合された細胞侵透性EC  SOD融合タンパク質を有効成分として含む皮膚疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１０】
分離されたEC  SODタンパク質または上記EC  SODタンパク質と実質的に同質の活性を示し、60％以上の配列相同性を有するタンパク質とタンパク質伝達ドメインが融合された細胞侵透性EC  SOD融合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを有効成分として含む皮膚疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１１】
上記タンパク質伝達ドメインがHIV-1  Tatの形質導入部位、5〜12個のアルギニン残基からなるオリゴペプチド、5〜12個のリシン残基からなるオリゴペプチド、PEP-1ペプチド、ANTP及びVP22タンパク質からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項9または10に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
上記皮膚疾患が皮膚癌、色素沈着性疾患、光老化、皮膚炎、表皮増殖疾患、アトピー、じんましん及びアレルギーからなる群から選択されるものであることを特徴とする請求項9または10に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
分離されたEC  SODタンパク質または上記EC SODタンパク質と実質的に同質の活性を示し、60％以上の配列相同性を有するタンパク質とタンパク質伝達ドメインが融合された細胞侵透性EC  SOD融合タンパク質を有効成分として含む皮膚疾患の予防または改善用化粧料組成物。
【請求項１４】
分離されたEC  SODタンパク質、上記EC  SODタンパク質と実質的に同質の活性を示し、60％以上の配列相同性を有するタンパク質とタンパク質伝達ドメインが融合された細胞侵透性EC  SOD融合タンパク質、及び上記タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む発現ベクターからなる群から選択されたいずれか一つを個体に有効な量で投与することを含む皮膚疾患の予防または治療方法。
【請求項１５】
分離されたEC  SODタンパク質、上記EC  SODタンパク質と実質的に同質の活性を示し、60％以上の配列相同性を有するタンパク質とタンパク質伝達ドメインが融合された分離された細胞侵透性EC  SOD融合タンパク質及び上記タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む発現ベクターからなる群から選択されたいずれか一つを皮膚疾患の予防または治療用薬学的組成物の製造に用いる用途。
【請求項１６】
EC  SODタンパク質または上記EC  SODタンパク質と実質的に同質の活性を示し、60％以上の配列相同性を有するタンパク質のアミノ末端にHIV-1  Tatの形質導入部位(RKKRRQRRR)、5〜12個のアルギニン残基で構成されたオリゴペプチド、5〜12個のリシン残基で構成されたオリゴペプチド及びPEP-1ペプチド(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV)からなる群から選択されたいずれか一つのタンパク質伝達ドメイン(Protein  transduction  domain)が融合された細胞侵透性EC  SOD融合タンパク質。
【請求項１７】
上記EC  SOD融合タンパク質は配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号22及び配列番号23からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むものであることを特徴とする請求項16に記載の細胞侵透性EC  SOD融合タンパク質。
【請求項１８】
請求項17に記載の融合タンパク質をコーディングする分離されたポリヌクレオチド。
【請求項１９】
配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号24及び配列番号25からなる群から選択されるものであることを特徴とする請求項18に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、EC SOD及び細胞侵透性EC  SODとこれらの用途に関するものである。より具体的には、本発明はEC SOD(extracellular superoxide dismutase)及び細胞浸透能が改善されたEC SOD融合タンパク質とこれらを皮膚疾患の予防または治療に用いる用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
SOD(superoxide distmutase)は、人体内に存在する抗酸化酵素であり、活性酸素を除去し、細胞を保護する機能をする。特に、SODは活性酸素を過酸化水素に転換して他の抗酸化酵素が作用するようにする機能をする。SODは、銅と亜鉛原子を有しているCu/Zn SOD、マンガン原子を有しているMn SOD及び細胞表面または細胞の外液に存在するEC SOD(extracellular superoxide dismutase)で区分される。このうち、EC SODは、Cu/Zn SODのように銅及び亜鉛原子を有しているが、C-末端側にヘパリン結合ドメイン(heparin binding domain)が存在するという特徴がある。EC SODは、ヘパリン結合ドメインを有しているため、細胞膜のヘパリンに結合して細胞膜を保護する役割をするものと推定されている。文献によれば、EC SODは、血漿と細胞外基質などで生体防御作用を担当しているものと知られている(Marklund  et al, Biochem. J. 266, 213-219, 1990; Su et al., Am J Respir Cell  Mol Biol., Feb 16(2), 162-70, 1997;  Luoma et  al., Thromb. Vasc. Bio. 18, 157-167,  1998)。他の文献にはEC SODを用いた遺伝子治療がウサギで大動脈挟着症(aorta restenosis)を改善させ、マウスではコラーゲン誘導された関節炎(collagen-induced  arthritis)を緩和させると報告されている(Mikko O et al.,  Circulation, 106,  1999-2003, 2002; Iyama S et al., Arthritis & Rheumatism,  44,9,2160-67,  2001)。最近はEC SODがヒト線維芽細胞(human  fibroblast)で細胞老化現象であるテロメアの短縮(telomere  shortening)を抑制する細胞再生機能があることが報告されている(Serra V  et al., The journal of Biological chemistry, 278, 9,  6824-30,  2003)。また、EC
SODのヘパリン結合ドメインが核位置信号(nuclear localization  signal)として作用し、胸腺(thymus)と皐丸細胞(testis  cell)で核中に位置して酸化的ストレスからゲノムDNAを保護し、酸化還元反応に敏感な転写作用を調節すると報告されている(Ookawara
T et al., BBRC, 296, 54〜61, 2002)。しかし、これまでEC SODの皮膚における分布傾向は知られたことがなく、上記EC SODの皮膚疾患に対する効果は知られたことがない。
【０００３】
一方、最近は特定のタンパク質が効果的に細胞膜を通過して細胞内に入ることができるという事実が明らかになり、このようなタンパク質を運搬手段として細胞内に有用物質を伝達するための研究が活発に進行している。その代表的なタンパク質としては、HIVのTatタンパク質を初めとしてANTP、VP22タンパク質、PEP-1ペプチドなどがある(Lindgren et al., TIPS 21:99, 2001; Green et al., Cell, 55,  1179-1188, 1988)。上記タンパク質の細胞浸透能は、細胞膜燐脂質の二重層を通過する活性を有するタンパク質伝達ドメイン(Protein Transduction Domain, PTD)の特性により付与されると知られている(Fankel A. D. et al., Cell, 55, 1189〜1193,  1988; Green M. et al., Cell, 55, 1179-1188, 1988)。
【０００４】
従って、治療剤として使われる薬物やタンパク質は、概ねの場合、自発的に細胞膜を通過することができないため、上記のように究明されたタンパク質伝達領域を用いて有用なタンパク質を細胞内に導入しようとする研究がなされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これに対し、本発明者はEC SODの活性について研究中、EC SODが生体皮膚、特に、皮膚の表皮層に比べて真皮層により多く存在しながら皮膚細胞内の活性酸素種を除去し、表皮細胞の過増殖、MMP(matrix metalloproteinase)の発現及び肥満細胞の脱顆粒を抑制するという新たな事実を見出すことにより、上記EC SODを皮膚疾患の予防及び治療に用いられることを確認し、EC SODにタンパク質伝達ドメインを融合させて細胞浸透能が付与された細胞侵透性EC SOD融合タンパク質を製造することにより本発明を完成した。
【０００６】
従って、本発明の目的は、分離されたEC  SODタンパク質または上記タンパク質をコーディングする分離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有効成分として含む皮膚疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することである。
【０００７】
本発明の他の目的は、分離されたEC  SODタンパク質を含む皮膚疾患の予防または改善用化粧料組成物を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、分離されたEC  SODタンパク質または上記タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有効な量で個体に投与することを含む皮膚疾患の予防または治療方法を提供するものである。
【０００９】
本発明の他の目的は、分離されたEC  SODタンパク質または上記タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを皮膚疾患の予防または治療用薬学的組成物の製造に用いる用途を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、EC SODタンパク質とタンパク質伝達ドメインが融合された分離された細胞侵透性EC SOD融合タンパク質または上記融合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有効成分として含む皮膚疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、EC SODタンパク質とタンパク質伝達ドメインが融合された分離された細胞侵透性EC SOD融合タンパク質を含む皮膚疾患の予防または改善用化粧料組成物を提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、分離されたEC  SODタンパク質とタンパク質伝達ドメインが融合された分離された細胞侵透性EC SOD融合タンパク質または上記融合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有効な量で個体に投与することを含む皮膚疾患の予防または治療方法を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、EC SODタンパク質とタンパク質伝達ドメインが融合された分離された細胞侵透性EC SOD融合タンパク質または上記融合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを皮膚疾患の予防または治療用薬学的組成物の製造に用いる用途を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、EC SODのアミノ末端にタンパク質伝達ドメイン(Protein transduction domain)が融合された細胞侵透性EC  SOD融合タンパク質を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、上記融合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記のような本発明の目的を達成するために、本発明は分離されたEC SODタンパク質または上記タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有効成分として含む皮膚疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００１７】
また、本発明は分離されたEC SODタンパク質を含む皮膚疾患の予防または改善用化粧料組成物を提供する。
【００１８】
また、本発明は分離されたEC SODタンパク質または上記タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有効な量で個体に投与することを含む皮膚疾患の予防または治療方法を提供する。
【００１９】
また、本発明は分離されたEC SODタンパク質または上記タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを皮膚疾患の予防または治療用薬学的組成物の製造に用いる用途を提供する。
【００２０】
また、本発明はEC SODタンパク質とタンパク質伝達ドメインが融合された分離された細胞侵透性EC SOD融合タンパク質または上記融合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有効成分として含む皮膚疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００２１】
また、本発明はEC SODタンパク質とタンパク質伝達ドメインが融合された分離された細胞侵透性EC SOD融合タンパク質を含む皮膚疾患の予防または改善用化粧料組成物を提供する。
【００２２】
また、本発明はEC SODタンパク質とタンパク質伝達ドメインが融合された分離された細胞侵透性EC SOD融合タンパク質または上記融合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを個体に有効な量で投与することを含む皮膚疾患の予防または治療方法を提供する。
【００２３】
また、本発明はEC SODタンパク質とタンパク質伝達ドメインが融合された分離された細胞侵透性EC SOD融合タンパク質または上記融合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを皮膚疾患の予防または治療用薬学的組成物の製造に用いる用途を提供する。
【００２４】
また、本発明はEC SODのアミノ末端にタンパク質伝達ドメイン(Protein transduction domain)が融合された細胞侵透性EC  SOD融合タンパク質を提供する。
【００２５】
また、本発明は上記融合タンパク質をコーディングするポリニュークレオティー挙げる提供する。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２６】
本発明の一実施例ではマウス皮膚でのEC  SODの分布傾向を免疫組織染色を通じて調査した(実施例1-1)を参照)。その結果、EC SODがマウス皮膚の全般に渡り分布しており、特に、表皮層に比べて真皮層の結合組織に広く分布していることを確認することができた(図1を参照)。また、本発明の他の実施例では皮膚の真皮層と表皮層でEC SOD mRNAの発現様相を調査した結果(実施例1-2)を参照)、EC SODが表皮層より真皮層で非常に高く発現されるという新たな事実を確認することができた(図2)。上記実験結果から、EC SODが皮膚組織、特に、真皮層に存在しながら皮膚を保護する作用を行うものと推定された。
【００２７】
これに対し、本発明者はEC SODの皮膚内での役割を直接的に究明するために、本発明の一実施例においてマウスの皮膚に数種の紫外線(UVA、UVB及びPUVA)を照射した後、これによるEC SODの発現傾向を経時的に比較した(実施例1-3)〜1-5)を参照)。その結果、EC SODが紫外線の照射如何により皮膚での発現が調節されるという事実を確認することができた(図3〜図5を参照)。
【００２８】
上記実験結果から本発明者はEC  SODが皮膚組織、特に、真皮層に全般的に分布しており、紫外線の照射強度及び時間の経過によりその発現が調節されるという新たな事実を確認した。
【００２９】
また、本発明者は、マウスEC SOD過発現細胞株を製造し、上記細胞に紫外線を照射した後、活性酸素の量を測定することにより、EC SODの過発現が紫外線により誘導された細胞内活性酸素の量に及ぼす影響を調査した(実施例2を参照)。その結果、マウスEC SODの過発現が細胞内活性酸素を効果的に減少させることを確認することができた(図6及び図7を参照)。
【００３０】
また、本発明者はヒトEC SODを過発現するヒト皮膚角質細胞株を製造し、上記細胞に紫外線を照射した後、細胞死滅を測定することにより、ヒトEC SODの過発現が紫外線により誘導された細胞死滅に及ぼす影響を調査した(実施例3を参照)。その結果、ヒトEC SODの過発現が紫外線による細胞死滅を効果的に減少させることを確認することができた(図9を参照)。
【００３１】
これに対し、本発明者はEC SODが皮膚組織の保護作用をより容易にするため、EC SODにHIV-1 Tatの形質導入部位(アミノ酸残基49〜57)、5〜12個のアルギニン残基で構成されたオリゴペプチド、5〜12個のリシン残基で構成されたオリゴペプチド及びPEP-1ペプチドから選択されたいずれか一つのタンパク質伝達ドメインを結合させて融合タンパク質を製造することにより細胞侵透性が付与されるようにした(実施例4を参照)。
【００３２】
さらに、本発明者はTPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate)を用いた皮膚疾患モデルでEC SOD及び細胞侵透性EC SOD融合タンパク質の治療効果をより具体的に調査した。
【００３３】
上記TPAは、マウスの皮膚細胞において炎症、免疫細胞の皮膚浸透及び毛嚢内表皮増殖(interfollicular epidermal hyperplasia)を誘導して皮膚炎及び乾癬のような類似の皮膚疾患を誘発する(Segal et al., Cancer Res, 35:2154-2159, 1975; Sawa et al., J Med
Chem,45:930-936, 2002)。また、TPA処理はケラチノサイト(keratinocyte)から遊離する結合組織を分解するMMP(matrix  metalloproteinase)酵素を活性化して老化を促進させることができる。これに、TPAを処理したEC SODが皮膚に過発現されたマウスの皮膚組織でEC SODの発現傾向及び皮膚組織の厚さ変化を調査した。また、EC SOD過発現ケラチノサイト細胞でMMPの発現傾向を調査し、ヒト線維芽細胞にEC SODタンパク質及び細胞侵透性EC SOD融合タンパク質を処理してMMPの発現変化を調査した(実施例5を参照)。その結果、EC SOD及び細胞侵透性EC  SOD融合タンパク質が表皮細胞の過増殖を抑制し(図20及び図21を参照)、MMP(matrix metalloproteinase)酵素活性を抑制することにより(図22及び図23を参照)、皮膚炎、乾癬と類似の表皮増殖疾患及び老化のような皮膚疾患を抑制する効果があることを確認することができた。
【００３４】
また、本発明者は本発明のEC SODタンパク質を肥満細胞に処理し、これによる肥満細胞の脱顆粒抑制如何を調査した(実施例6を参照)。上記肥満細胞が脱顆粒されれば化学物質が遊離してアトピー、接触性アレルギー及びじんましんのようなアレルギー性皮膚疾患などが誘発されると知られている。実験結果、本発明のEC SODタンパク質は、肥満細胞の脱顆粒を抑制し、上記のようなアレルギー性皮膚疾患を効果的に予防及び治療できることを確認した(表3を参照)。
【００３５】
上記のような実験結果から、本発明者はEC  SOD及び細胞侵透性EC SODが皮膚細胞内の活性酸素種を除去し、表皮細胞の過増殖、MMP(matrix metalloproteinase)の発現及び肥満細胞の脱顆粒を抑制することにより、皮膚疾患を効果的に予防したり治療することができる活性を有しているという新たな事実を確認することができた。
【００３６】
従って、本発明はEC SODタンパク質または細胞侵透性EC SOD融合タンパク質を有効成分として含む皮膚疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００３７】
本発明においてEC SODタンパク質は天然型または組換えEC SODタンパク質またはこれらと実質的に同等な生理活性を有するタンパク質を含む。実質的に同等な生理活性を有するタンパク質には、天然型/組換えEC SODタンパク質の機能的同等物(functional  equivalent)及び機能的誘導体(functional derivative)が含まれる。上記EC SODタンパク質は公知となった核酸配列を用いて遺伝工学的方法により製造することができ、上記タンパク質の製造方法に対する例示は本発明の実施例に記載されている。
【００３８】
上記において“機能的同等物”とは、天然型EC SODタンパク質と実質的に同質の生理活性を示し、天然のEC SODタンパク質と少なくとも60％以上の、望ましくは70％、より望ましくは90％以上の配列相同性を有するタンパク質をいう。上記機能的同等物に、例えば、天然型タンパク質アミノ酸のうちの一部または全部が置換されるか、またはアミノ酸の一部が欠失または付加されたアミノ酸配列変形体が含まれる。アミノ酸の置換は、望ましくは保存的置換である。天然に存在するアミノ酸の保存的置換の例は次の通りである;脂肪族アミノ酸(Gly, Ala, Pro)、疎水性アミノ酸(Ile, Leu, Val)、芳香族アミノ酸(Phe, Tyr, Trp)、酸性アミノ酸(Asp, Glu)、塩基性アミノ酸(His, Lys, Arg, Gln, Asn)及び硫黄含有アミノ酸(Cys, Met)。アミノ酸の欠失は望ましくはEC SODタンパク質の生理活性に直接関与しない部分に位置する。
【００３９】
上記において“機能的誘導体”は、EC  SODタンパク質の物理化学的性質を増加または減少させるための物理化学的変形を加えたタンパク質をいう。EC  SODタンパク質の温度安定性、貯蔵性、溶解度、pH安定性などを変更させるための変形を加えた誘導体が本発明の範囲に含まれる。上記のようなタンパク質の機能的誘導体を作る方法は公知となっている。
【００４０】
本発明のEC SODタンパク質のアミノ酸配列は公知となっており、ほ乳動物から由来したものである。望ましくは上記ほ乳動物はヒトを含む。最も望ましくは、本発明のEC SODタンパク質は配列番号11で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をいう。また、上記においてEC SODはヘパリン結合ドメイン以下(アミノ酸残基210番〜222番)が除去されたものであり得る。
【００４１】
本発明の細胞侵透性EC SOD融合タンパク質は、EC SODタンパク質またはの上記タンパク質と同質の生理活性を示し、天然のEC SODタンパク質と少なくとも60％以上の配列相同性を有するタンパク質のアミノ末端にタンパク質伝達ドメインが融合されていることを特徴とする。上記タンパク質伝達ドメインは自身だけでなく、他の種類のオリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質及びオリゴ糖のような高分子有機化合物を別途の受容体やエネルギーを必要とせず、細胞内に導入させることができる数個のアミノ酸残基で構成されているオリゴペプチドを言う。本発明において上記タンパク質伝達ドメインとしては、特別に限定されないが、HIV-1 Tatの形質導入部位、5〜12個のアルギニン残基からなるオリゴペプチド、5〜12個のリシン残基からなるオリゴペプチド、PEP-1ペプチド、ANTP, VP22タンパク質などを用いることができる(Morris et al., Nat Biotechnol, 19:1173-1175, 2001; Schwarze et al.,  Trends Cell Biol, 10:290-295, 2000; Vives et al., J Biol Chem  272:16010-16017, 1997)。望ましくは、HIV-1 Tatのアミノ酸49〜57番に該当する9個のアミノ酸残基(RKKRRQRRR)からなる形質導入部位、9個のアルギニン残基からなるオリゴペプチド、10個のリシン残基からなるオリゴペプチド及びPEP-1ペプチド(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV)からなるグループから選択されたものを用いることができる。
【００４２】
上記HIV-1 Tatの形質導入部位は、浸透しようとする細胞の脂質膜(lipid barrier)を開ける信号を有していることを特徴とする。上記PEP-1ペプチドの疎水性ドメインは、浸透するタンパク質の疎水性部分と結合した後、細胞膜にターゲッティング(targeting)する効率を高め、親水性ドメインは細胞質内への移動を容易にする役割を担当する。
【００４３】
一方、本発明に使われた略字の定義は次の通りである。R(アラニン);Q(グルタミン);E(グルタミン酸);K(リシン);P(プロリン);S(セリン);T(スレオニン);W(トリプトファン);V(バリン)
【００４４】
最も望ましくは、本発明の細胞侵透性EC  SOD融合タンパク質は、TAT-EC SOD融合タンパク質、TAT-ΔHD/EC SOD融合タンパク質、K10-EC SOD融合タンパク質、R9-EC SOD融合タンパク質、PEP1-EC SOD融合タンパク質及びPEP1-ΔHD/EC SOD融合タンパク質であり得、これらはそれぞれ配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号22及び配列番号23で示されるアミノ酸配列を有する。
【００４５】
上記皮膚疾患は活性酸素種、表皮細胞の過増殖、MMP(matrix metalloproteinase)の発現または肥満細胞の脱顆粒により誘発されるものを全て含む。上記皮膚疾患の例としては、これに限定されるものではないが、皮膚癌、色素沈着性疾患、光老化、皮膚炎、アトピー、接触性アレルギー、表皮増殖疾患及びじんましんなどが挙げられる。
【００４６】
本発明の薬学的組成物は、EC SODタンパク質または細胞侵透性EC SOD融合タンパク質と共に薬学的に許容される担体をさらに含むことができる。上記において“薬学的に許容される”とは、生理学的に許容され、ヒトに投与される時、通常、胃腸障害、眩暈などのようなアレルギー反応またはこれと類似の反応を引き起こさない組成物をいう。
【００４７】
薬学的に許容される担体としては、例えば、経口投与用担体または非経口投与用担体をさらに含むことができる。経口投与用担体は、ラクトース、澱粉、セルロース誘導体、マグネシウムステアレート、ステアリン酸などを含むことができる。また、非経口投与用担体は物、適合したオイル、食塩水、水性グルコース及びグリコールなどを含むことができ、安定化剤及び保存剤をさらに含むことができる。適合した安定化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。適合した保存剤としては、ベンズアルコニウムクロリド、メチル-またはプロピル-パラベン及びクロロブタノールがある。その他の薬学的に許容される担体としては、次の文献に記載されているものを参考とすることができる(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing  Company, Easton, PA, 1995)。
【００４８】
本発明の薬学的組成物に含まれるEC  SODタンパク質または細胞侵透性EC SOD融合タンパク質は、上述したような薬学的に許容される担体と混合して公知の方法により多様な非経口または経口投与用形態で製造されることができる。非経口投与用剤形としては、等張性水溶液または懸濁液形態のような注射用剤形及び軟膏剤形態の剤形が望ましい。注射用剤形は、適合した分散剤または湿潤剤及び懸濁化剤を用いて当業界に公知となった技術により製造することができる。例えば、各成分を食塩水または緩衝液に溶解させて注射用に剤形化することができる。また、経口投与用剤形としては、これに限定されないが、粉末、顆粒、錠剤、丸薬及びカプセルなどがあり、これら剤形は、有効成分以外に希釈剤(例:ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及び/又はグリシン)、滑沢剤(例:シリカ、タルク、ステアリン酸及びそのマグネシウムまたはカルシウム塩及び/またはポリエチレングリコール)を含むことができる。錠剤は、また、マグネシウムアルミニウムシリケート、澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及び/又はポリビニルピロリジンのような結合剤を含むことができ、場合によって澱粉、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩のような崩解剤または沸騰混合物及び/又は吸収剤、着色剤、香味剤、及び甘味剤を含むことができる。上記剤形は、通常の混合、顆粒化またはコーティング方法により製造されることができる。
【００４９】
本発明による薬学的組成物の投与経路は、これらに限定されるものではなく、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸が含まれる。
【００５０】
望ましくは、本発明による薬学的組成物は皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、硬膜内、病巣内及び頭蓋骨内への注射または注入のような方法で非経口的に投与することができる。例えば、注射用に剤形化された本発明による薬学的組成物を4〜6mmの細針で皮膚の下層に一定量を注入するか、または30ゲージ(gage)の注射針で皮膚を軽く刺す(prick)方法であるメッソ・セラピー(Messo therapy)法により投与することができる。また、皮膚に適用する場合、軟膏剤のような形態で剤形化して経皮投与することができる。上記において“経皮投与”は、薬学的組成物を局所的に皮膚に投与して薬学的組成物に含まれた有効な量の活性成分が皮膚内に伝達されることを意味する。特に、本発明の細胞侵透性EC SOD融合タンパク質を有効成分とする薬学的組成物の場合には、皮膚に直接塗布する経皮投与方法により投与することが望ましい。さらに、本発明の薬学的組成物はタンパク質伝達方法と関連した生命工学的技法を用いて投与することができる。
【００５１】
上記本発明による薬学的組成物は、予防または治療効果を奏する量で患者に投与することができる。一般的な1日投与量としては、0.0001〜100mg/kgの範囲で投与することができる。望ましくは、0.01〜1mg/kgの範囲で投与することができる。本発明の薬学的組成物は、望ましい投与量の範囲内で1回または数回に分割投与することができる。しかし、本発明による薬学的組成物の投与量は、投与経路、投与対象、年齢、性別体重、個人差及び疾病状態に応じて適切に選択することができる。
【００５２】
また、本発明はEC SODタンパク質をコーディングするポリヌクレオチドまたは細胞侵透性EC SOD融合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有効成分として含む皮膚疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００５３】
EC SODタンパク質をコーディングするポリヌクレオチドは、望ましくは、配列番号11で示されるアミノ酸をコーディングするものであり得る。
【００５４】
細胞侵透性EC SOD融合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドは、EC SODのcDNAの5’末端にタンパク質伝達ドメインをコーディングするDNA配列が結合していることを特徴とする。上記タンパク質伝達ドメインをコーディングするDNA配列としては、これに限定されないが、HIV-1 Tatの形質導入部位、5〜12個のアルギニン残基で構成されたオリゴペプチド、5〜12個のリシン残基で構成されたオリゴペプチド、PEP-1ペプチド、ANTP、VP22タンパク質からなるタンパク質伝達ドメインから選択されたいずれか一つをコーディングするDNA配列であり得る。また、上記本発明のポリヌクレオチドは、EC SODが結合したタンパク質伝達ドメインの5’末端に6個のヒスチジン残基をコーディングするDNA配列が結合していることができる。望ましくは、本発明の上記融合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチド配列は、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号24及び配列番号25に示したものであり得る。
【００５５】
上記ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、上記EC SODタンパク質をコーディングするポリヌクレオチドまたは細胞侵透性EC SOD融合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドと共に発現調節配列を含むことができる。上記において“発現調節配列(expression control sequence)”とは、特定の宿主細胞で作動可能に連結されたコーディング配列の発現に必須のDNA配列を意味する。上記発現調節配列としては、転写を実施するためのプロモータ、上記転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合したmRNAリボソーム結合部位をコーディングする配列及び転写及び解読の終結を調節する配列を含む。例えば、原核生物に適合した調節配列は、プロモータ、オペレーター配列及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞はプロモータ、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーがこれに含まれ得る。
【００５６】
本発明の薬学的組成物に含まれる発現ベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターであり得、上記発現ベクターは当業界に公知となった多様な方法で感染(infection)または形質導入(transduction)により発現型で標的細胞内に導入させることができるものを言う。
【００５７】
プラスミド発現ベクターは、ヒトに用いられるFDAの承認された遺伝子伝達方法でヒト細胞に直接的にプラスミド DNAを伝達する方法である(Nabel, E. G., et al., Science, 249:1285-1288, 1990)。本発明で用いられるプラスミド発現ベクターとしては、当業界に公知となったほ乳動物発現プラスミドが用いられる。例えば、これに限定されないが、pRK5(ヨーロッパ特許第307,247号)、pSV16B(国際特許公開第91/08291号)及びpVL1392(PharMingen)などが代表的である。
【００５８】
上記プラスミド発現ベクターは、当業界に公知となった方法、例えばこれに限定されないが、一時的形質感染(transient transfection)、微細注射、形質導入(transduction)、細胞融合、カルシウムホスフェート沈殿法、リポソーム媒介された形質感染(liposome-mediated transfection)、DEAE  dextrin-媒介された形質感染(DEAE  Dextran-mediated  transfection)、ポリBELEN-媒介された形質感染(polybrene-mediated  transfection)、電気せん孔法(electroporation)、遺伝子銃(gene gun)及び細胞内にDNAを流入させるための他の公知の方法により標的細胞内に導入することができる(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio.  Chem.,  263:14621-14624, 1988)。
【００５９】
また、本発明によるウイルス発現ベクターとしては、これに限定されないが、レトロウイルス(retrovirus)、アデノウイルス(adenovirus)、ペルペスウイルス(herpes virus)及びアビポックスウイルス(avipox virus)などが含まれる。
【００６０】
上記ウイルスベクターは、公知の方法により投与することができる。例えば、局所的に、非経口、経口、鼻腔、静脈、筋肉内、皮下内または他の適切な手段により投与することができる。特に、上記ベクターは、標的細胞に有効量で直接注射することができる。
【００６１】
また、本発明はEC SODタンパク質または細胞侵透性EC SOD融合タンパク質または上記タンパク質をコーディングするそれぞれのポリヌクレオチドを有効な量で個体に投与することを含む皮膚疾患の予防または治療方法を提供する。
【００６２】
本発明において、‘有効量‘とは、皮膚疾患を予防または治療する効果を奏する量を言う。
【００６３】
本発明において、‘個体(subject)’とは、ほ乳動物、特にヒトを含む動物を意味する。上記個体は治療が必要な患者(patient)であり得る。
【００６４】
また、本発明はEC SODタンパク質または細胞侵透性EC SOD融合タンパク質または上記タンパク質をコーディングするそれぞれのポリヌクレオチドを皮膚疾患の予防または治療用薬学的組成物の製造に用いる用途を提供する。
【００６５】
また、本発明は本発明の分離されたEC  SODタンパク質または分離された細胞侵透性EC SOD融合タンパク質を含む化粧料組成物を提供する。上記化粧料組成物は老化またはシミ、そばかすのような色素沈着性皮膚疾患、皮膚炎、乾癬、アトピー、じんましん及びアレルギーに非常に効果的に使われる。上記において老化とは、自然老化及び光老化をいずれも含む。自然老化とは、年齢につれて自然に発生する老化を言い、光老化とは、紫外線などに人為的に露出されて発生する老化を言う。また、本発明の化粧料組成物は、上記のような老化により誘発されるシワの予防及び改善に効果的である。
【００６６】
本発明の機能性化粧料組成物は、通常の方法により製造することができる。本発明によるEC SODタンパク質は、化粧料組成物の乾燥重量に対して0.001〜50重量％、望ましくは0.1〜20重量％の含量で含まれる。
【００６７】
本発明の化粧料組成物は、皮膚に許容可能な賦形剤と共に基礎化粧料組成物(化粧水、クリーム、エッセンス、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、ボディオイル)、色調化粧料組成物(ファンデーション、リップスティック、マスカラ、メーキャップベース)などに適用することができる。賦形剤は、化粧料組成物に適用可能な皮膚軟化剤、皮膚浸透増強剤、着色剤、芳香剤、乳化剤、濃厚剤及び溶媒を含むことができる。
【００６８】
さらに、本発明は上記EC SODにタンパク質伝達ドメインを融合させて細胞侵透性を付与することにより、上記EC SODが皮膚細胞内に浸透するようにしてEC SODの皮膚疾患治療効果を増強させた細胞侵透性EC SOD融合タンパク質を提供する。
【００６９】
また、本発明は上記EC SOD融合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチド配列を提供する。
【００７０】
本発明による細胞侵透性EC SOD融合タンパク質は、(a)細胞侵透性EC SOD融合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターで宿主微生物を形質転換させる段階;
(b)上記(a)段階で製造された形質転換体を上記ポリヌクレオチド配列が発現されるのに適した培地及び条件下で培養する段階;及び
(c)上記(b)段階の培養物から上記ポリヌクレオチド配列によりコーディングされた実質的に純粋な融合タンパク質を回収する段階により製造されることができる。
【００７１】
上記宿主微生物としては、本発明の細胞侵透性EC SOD融合タンパク質を発現させることができるものであれば、特別な制限なしに用いることができる。例えば、大腸菌、バシラス、シュードモナス、ストレプトマイセスのような細菌、真菌、酵母のような周知の真核及び原核宿主細胞、スポドプテラ・フルギペルダ(SF9)のような昆虫細胞、CHO及びマウス細胞のような動物細胞及び組織培養されたヒト細胞及び植物細胞が含まれる。望ましい微生物としては、大腸菌及び枯草菌のような細菌などが含まれる。使用目的に応じては、人体で安全性が立証された食品用微生物、例えば、乳酸菌などを用いることができる。
【実施例】
【００７２】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
ただし、下記実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【００７３】
＜実施例1＞
マウス皮膚でのEC SODの分布様相の調査
1-1)免疫組織染色法を用いたマウス皮膚でのEC SODの分布確認
皮膚組織内のEC SOD分布を確認するために免疫組織染色を行った。BALB/Cマウス(帯電生命工学研究所、8〜10週齢、雌性)など、皮膚組織を取ってホルムアルデヒドで固定させた後、公知の方法を用いてパラフィンブロックを製作した。上記パラフィンブロックにキシレン(xylen)を処理してパラフィンを除去し、次いで、段階的にアルコールを処理して脱水させた後、免疫反応を強化させるためにクエン酸緩衝液(citric acid buffer)を用いて121℃で10分間熱処理した。その後、上記組織試料に3％過酸化水素(H2O2)を処理して過酸化酵素を抑制し、1次抗体であるウサギ抗マウスEC SOD抗体を1:500の濃度で添加して60分間反応させた。上記ウサギ抗マウスEC SOD抗体はマウスEC SODをウサギに免疫源として注射して免疫化させることにより得た。上記抗体で反応させた反応物を0.1M PBSで洗浄し、ビオチンが結合している塩素抗ウサギIgGが含まれた抗体(Universal LSAB 2 kit, Dako, Glostrup, Denmark)200μｌを添加して15分間反応させた。この時、陰性対照群としては、免疫化しない(pre-immune)ウサギ血清を用いた。反応が完了した組織試料をPBSで洗浄した後、パーオキシダーゼが結合したストレプトアビジン(peroxidase-conjugated
streptavidin)と反応させた後、基質液である3-アミノ-9-エチル-カルバゾール(AEC,
chromogen, Utah, USA)で発色させた。発色された組織試料は、通常の方法により標本として製作し、顕微鏡下で400倍の倍率で観察した。
【００７４】
実験の結果、マウスの皮膚組織の全般に渡りEC SODが分布していることを確認することができた。EC SODは、真皮層の結合組織(connective tissue)に広げていることが観察され、特に真皮層の毛嚢(hair  follicle)の周辺と血管の周囲にさらに強く染色されていることが観察された。また、表皮層の細胞内にも強く染色され、皮膚においてEC SODが活性酸素種の調節と関連した活性を有しているものと推定された(図1)。
【００７５】
1-2)ノーザンブロット分析法を用いたマウス皮膚でのEC SOD発現様相の調査
上記実施例1-1）のBALB/Cマウスの耳皮膚の組織を手術はさみで切断して取り、Ca2+, Mg2+-フリーホスフェート緩衝塩水(Ca2+, Mg2+-free phosphate-buffered saline, pH 7.4)で洗浄した。上記皮膚組織を0.5％トリプシン(GIPCO, Invitrogen Corporation,  California, U.S.A)/PBSに真皮層が下方であるようにして50分間37℃で反応させた後、真皮層から上皮層を分離した。
【００７６】
分離した上記上皮層と真皮層からそれぞれ総RNAを抽出した。抽出したRNAを20μgを1.2％ホルムアルデヒドゲル電気泳動法で分離した後、ゲルにあるmRNAをナイロンメンブランへ移動させた後、メンブランについているRNAをUVで交差結合させた。上記メンブランに32Pで標識されたマウスのEC SODのcDNAプローブを65℃で混成化した。上記EC SODのcDNAは、マウス皮膚EC  SOD cDNAを含むpCRII TOPOベクター(翰林大医科大学、ソ・ジュンギョ教授から提供される)(Suh JG et al.,  Mol Cells. 30;7(2), 204-7, 1997)を鋳型として下記のプライマーでPCR増幅することにより製造した。PCR条件は、94℃で1回、94℃で30秒、55℃で30秒、72.5℃で45秒を30回反復した後、72.5℃で5分間1回実施した。
【００７７】
センスプライマー(配列番号1)
5’-ATG TTG GCC TTC TTG TTC-3’
アンチセンスプライマー(配列番号2)
5’-TTA AGT GGT CTT GCA CTC-3’
【００７８】
上記で混成化が完了すれば、これを洗浄した後、上記メンブランをフィルムに露出させた後、現像してmRNAを確認し、分子イメージャー(molecular imager, Image  Master-VDS, Phamacia Biotech)で分析した。実験群間の有意差はスチューデントT-テスト方法で検定した。
【００７９】
実験結果、EC SODのmRNAは表皮層に比べて真皮層での発現が7倍程度強いことに示された(図2)。上記実験結果から、EC SODは真皮層をなしている線維芽細胞及び内皮細胞(endothelial cell)で強く発現されるものと推定することができた。このような結果から、EC SODが皮膚全体で皮膚を保護し、特に、真皮内の結合組織を活性酸素種から保護する活性が高いものと推定された。
【００８０】
1-3)UVAを照射した後、マウス皮膚内のEC SODの発現様相の調査
直接的に生体内皮膚でのEC SODの役割を調査するために、マウスの背膚(dosal skin)にUVAを照射した後、経時的にRNAを分離し、ノーザンブロット分析を実施してUVA照射によるEC SOD発現様相を調査した。
【００８１】
BALB/Cマウス3匹ずつを一つのグループとして各グループのマウスの毛を剃って24時間後に紫外線容量を異にしてUVAを照射した。上記マウスを仕切りがあるケージに入れて9.7mW/cm2のエネルギーを放射する6個のUVAランプ(F24T12/BL/HO,  National Biological corporation, USA)にしたグループには5kJ/m2を照射し、他のグループには25kJ/m2を照射した。対照群にはUVAを照射しなかった。
【００８２】
UVA照射後の時間の経過によって各実験群マウスの皮膚組織を手術用ナイフとはさみで分離し、これから総RNAを抽出した後、上記実施例1-2)と同一の方法でノーザンブロットを実施してEC SOD mRNAの発現様相を調査した。発現されたmRNAの量は分子イメージャーを用いて定量的に分析した。ローディング対照群としてはGAPDHを用いた。
【００８３】
実験結果は、各実験群当り平均±標準偏差で示し、各実験群の発現程度は対照群の発現量を100％とし、これに対する各実験群の発現量を相対的に示した。また、対照群と実験群間の有意差はスチューデントT-テスト方法で検定した。
【００８４】
実験結果、EC SODの発現は5kJ/m2の照射により影響を受けず、25kJ/m2で照射した場合には、初期にその発現が減少したが、紫外線を照射して6時間後に338±7.2％(p＜0.05)で最大点をなした後、紫外線の照射後、96時間以後は減少する傾向を示した(図3)。したがって、EC SODの発現はUVAの強度及び時間に応じて調節されることが分かり、これからEC SODがUVA照射後に過生成される活性酸素種とそれによる変化から組織を保護する機能を遂行するものと推定された。
【００８５】
1-4)UVBを照射した後、マウス皮膚内EC SODの発現様相の調査
マウスの背皮膚にUVBを照射した後、経時的にRNAを分離し、ノーザンブロット分析を実施してUVB照射によるEC SODの発現様相を調査した。上記実施例1-3)と同様の方法でBALB/Cマウス3匹ずつを一つのグループに分けた後、0.6mW/cm2のエネルギーを放射する6個のUVBランプ(FS24T12/UVB/HO, National Biological  corporation, USA)で各グループに2kJ/m2、8kJ/m2及び15kJ/m2ずつを照射した。紫外線照射後、上記実施例1-2)と同様の方法でmRNAの発現様相を調査した。
【００８６】
実験結果、EC SOD mRNAの発現はUVB 2kJ/m2を調査した後、初期に73±3％(p＜0.05)に減少したが、24時間後は対照群の水準に再び回復した。8kJ/m2の強度で照射した場合、48時間後にEC SODの発現量が212±11％(p＜0.05)に増加し、15kJ/m2の強度で照射した場合には、48時間後にEC SODの発現量が322±15％(p＜0.05)に増加して最大値を示した(図4)。したがって、EC SODの発現はUVBの強度及び時間の経過によって影響を受けることが分かった。
【００８７】
1-5)PUVAを処置した後、マウス皮膚内EC SODの発現様相の調査
マウスに臨床治療に広く使われるPUVAを処置した後、経時的にRNAを分離し、ノーザンブロット分析を実施してPUVA処置によるEC SODの発現様相を調査した。
【００８８】
上記実施例1-3)と同様の方法でBALB/Cマウス3匹ずつを一つのグループに分けた後、マウスの背に8-MOP(0.2(w/v)％8-methoxy psolaren, ICN  Pharmaceuticals, Costa Mesa, USA)100μｌを塗って1時間後に上記実施例1-3)と同一のUVAランプを用いてそれぞれ5kJ/m2と25kJ/m2の強度で照射した。この時、対照群には0.2(w/v)％8-MOPのみ処理した。紫外線照射後、上記実施例1-2)と同様の方法でEC SOD mRNAの発現様相を調査した。
【００８９】
実験結果、EC SOD mRNAの発現量は8-MOPのみを処理した対照群及び8-MOP処理後5kJ/m2のUVAを照射した場合は変化がなかった。25kJ/m2のUVAを照射した場合のEC  SOD mRNAの発現量は、紫外線を照射した後、徐々に増加して48時間後に264±4.5％(p＜0.05)で示され、顕著に増加する様相を呈した。
【００９０】
上記実験結果からEC SODの発現様相は、紫外線の強度及び時間の経過によって影響を受けるという事実が分かった。従って、EC SODは紫外線照射後に生成されるか、または紫外線による炎症反応で生成された毒性を有する活性酸素種から皮膚を保護する活性と関連があるものと推定された。
【００９１】
＜実施例2＞
紫外線照射によるマウスEC SOD過発現細胞株内活性酸素の変化
公知となった遺伝子発現システムであるTet  off-MEF/3T3誘導性遺伝子発現システム(Clontech)を用いてマウスはい芽線維芽細胞(mouse embryonic fibroblast)にEC SODを過発現させた後、上記細胞に紫外線を照射して細胞内活性酸素を測定した。
【００９２】
2-1)マウスEC SOD過発現細胞株の構築
TET OFFシステムの調節ベクターであるTRE2ベクター(Clontech)のSal  I座にマウスのEC SOD cDNAを挿入した。上記マウスEC  SODのcDNAはマウスEC SODのcDNAを含むpCRII  TOPOベクター(翰林大学校医科大学、ソ・ジュンギョ教授から提供を受ける)を下記プライマーでPCR増幅することにより製造した。PCRの条件は、94℃で1回、94℃で30秒間、55℃で30秒間、72.5℃で45秒間を30回反復した後、72.5℃で、5分間1回実施した。
【００９３】
センスプライマー(配列番号3)
5’-AGT CTC GAG ATG TTG GCC TTC TTG TTC TAC GGC-3’
アンチセンスプライマー(配列番号4)
5’-GATC CTC GAG TGG TCT TGC ACT CGC TCT-3’
【００９４】
上記で製造したベクターとハイスロマイシン抵抗配列を有するpTG76プラスミドを(University of Geneva Medical  School, Geneva, Switzerland)共にMEF3T3/TET OFF細胞株であるマウスはい芽線維芽細胞(mouse embryonic fibroblast, Clontech)にリポフェクチン(lipofectin, Invitrogen)を用いて形質転換させた後、100μg/mLのハイグロマイシンが含まれた培地で培養して抵抗性があるコロニーのみを選択した。上記コロニーからテトラサイクリンを除去した時、EC SODが過発現される細胞株を構築した。即ち、上記コロニーを10％TETフリーFBS(Clontech)、L-グルタミン、5000UI/Lペニシリンストレプトマイシン、100μg/mLのG418、100μg/mLハイグロマイシン及び2ng/mLテトラサイクリンを含むDMEM培地で培養したが、EC SODを過発現させるためにテトラサイクリンを除去した。テトラサイクリンの除去は、上記細胞をテトラサイクリンを除去した新たな培地に移して培養することにより行った。上記細胞を新たな培地に移して48時間培養することによりEC SODの過発現を誘導し、EC SODの発現程度及び活性を測定した。EC SODの発現程度は、上記実施例1-2)と同一のノーザンブロット分析法で測定し、EC SODの活性は50mM炭酸ナトリウム緩衝液(Sodium carbonate buffer,  0.1mMシトクロムC、0.5mMキサンチン含有、pH 10.0)3mLに測定しようとする培地試料20μｌとキサンチン酸化酵素(Xanthine oxidase, SIGMA)10μｌを添加して混合した後、550nmで吸光度を測定することにより分析した。
【００９５】
実験結果、テトラサイクリンが除去される場合、EC SODのmRNAの発現及び活性が経時的に増加する傾向を示した(図6)。したがって、マウスEC SODを過発現する細胞株を構築することができた。
【００９６】
2-2)紫外線を照射した後、マウスEC SOD過発現細胞株内活性酸素の測定
上記2-1)で構築したマウスEC SOD過発現細胞株に紫外線を照射した後、活性酸素の量を測定した。上記マウスEC  SOD過発現細胞株は、紫外線を照射する前に培地を除去し、PBS(pH 7.4)で2回洗浄した後、PBS存在下で紫外線を照射した。紫外線照射は、上記細胞株に27mW/cm2を放射するUVAランプを用いて10J/cm2のUVAを照射し、1.15mW/cm2を放射する3個のUVBランプを用いて20mJ/cm2のUVBを照射した。PUVA処理は、上記細胞株に0.1％8-MOPを処理し、30分経過後、PBSで2回洗浄した後、2J/cm2のUVAを照射した。
【００９７】
上記のような方法で紫外線を照射した後、経時的に細胞をサンプリングした後、10μM HE(Dihydroethyidium)を添加して37℃で20分間反応させた。これを1％(w/v)BSAと0.1％(w/v)NaN3が含まれたPBSで洗浄した後、流細胞分析器(Flow cytometer)で分析した。流細胞分析器で測定した値は、対照群の活性酸素量を1とした時の相対的な値で示した。対照群としては、紫外線を照射しない細胞株を用いた。
【００９８】
実験結果、マウスEC SOD過発現細胞株に10J/cm2のUVAを照射した場合、紫外線照射後、6時間持続的に活性酸素の量が減少することが分かった(図7A)。EC SODが過発現された細胞株に20mJ/cm2のUVBを照射した場合には、紫外線照射後、1時間目に活性酸素の濃度がEC SODが過発現されない細胞株に比べて約60％減少したものと示された(図7B)。EC SODが過発現された細胞株にPUVAを処理した場合にも、細胞内の活性酸素の量がEC SODが過発現されない細胞株に比べて非常に多く減少することを確認することができた(図7C)。
【００９９】
上記実験結果からEC SODが血漿及び細胞他基質でのみ機能することでなく細胞内でも活性酸素の濃度を効果的に減少する作用を有していることを確認することができた。
【０１００】
＜実施例3＞
紫外線照射によるヒトEC SOD過発現細胞株の細胞死滅に関する影響
3-1)ヒトEC SOD過発現細胞株の構築
ヒトEC SOD過発現細胞株において紫外線照射による活性酸素の変化を調査するために、ヒトEC SOD過発現細胞株を構築した。このために、まず、pcDNA  3.1/myc-His(A)(Invitrogen)のXbaI、EcoRI座にヒトEC SOD cDNAを挿入した。ヒトEC SOD cDNAはヒトEC SOD cDNAを含むpUC 18-hEC SODベクター(スウェーデン、Clinical chemistry, Marklund professorから提供を受ける)を鋳型とし(Karin Hjalmarsson, Proc. Natl. Acad.  Sci. USA Vol.84, 6340〜4, 1987)、下記プライマーを用いてPCR増幅した。PCR増幅は98℃で4分間1回、98℃で30秒、55℃で30秒、72℃で45秒30回及び72℃で5分間1回の条件で行った。
【０１０１】
センスプライマー(配列番号5)
5’-ATC TCT AGA ATG CTG GCG CTA CTG TGT-3’
アンチセンスプライマー(配列番号6)
5’-ATC GAA TCC TCA GGC GGC CTT GCA CTC GCT CTC-3’
【０１０２】
上記で得られたPCR産物をアガロースゲル電気移動(agarose gel electrophoresis)して分離した後、XbaI、EcoRI酵素を処理してpcDNA 3.1/myc-His(A)ベクターに挿入した(図8)。上記プラスミドをヒトケラチノサイト(human keratinocyte)細胞株であるHaCaT細胞(ハイデルベルク大学、N.E. Fusenig教授から提供を受ける、ドイツ)にリポフェクチン(lipofectin, Invitrogen)を用いて形質転換させた後、500μg/mLのネオマイシン(GIB  CO)含まれた培地で培養し、抵抗性があるコロニーのみを選択してEC SODが過発現される細胞株を構築した。
【０１０３】
上記細胞でのEC SOD過発現を確認するためにウェスタンブロットを実施した。上記EC SOD過発現細胞株を1％NP-40、0.1％SDS、プロテアーゼ抑制酵素(protease  inhibitor)が含まれたPBSに入れて反応させた後、遠心分離して上澄液を得ることにより、EC SOD過発現細胞株のタンパク質の抽出した。上記で抽出したタンパク質を15％SDS-PAGE電気泳動し、ニトロセルロースメンブランに移した後、5％非脂肪ミルク(non-fat milk)/TBS-0.1％ツイン20溶液で1時間ブロッキング(blocking)した。その後、HIS抗体(Santa Cruz)を200:1で希釈して1時間反応させた後、TBS-0.1％ツイン20溶液で3回洗浄した。その後、パーオキシダーゼ(peroxidase)が結合している抗ウサギIgGで1時間反応させ、3回洗浄した後、ECLキット(Amersham Bioscience)でEC SODの発現を確認した。この時、陰性対照群としては、形質転換させないHaCaT細胞株のタンパク質を用いた。
【０１０４】
実験結果、陰性対照群であるHaCaT細胞株には、ヒスチジンが結合したEC SODが検出されなかったが、EC SODのcDNAを含むプラスミドに形質転換した細胞株ではヒスチジンが結合したEC SODが検出され、EC SODが過発現されていることを確認した(図9)。
【０１０５】
3-2)紫外線を照射した後、ヒトEC SOD過発現細胞株の細胞死滅測定
上記実施例3-1)で製造したヒトEC SOD過発現細胞株に紫外線を照射した後、活性酸素の量を測定した。紫外線を照射する前に上記ヒトEC SOD過発現細胞株は、培地を除去した後、PBS(pH 7.4)で2回洗浄し、PBS存在下で紫外線を照射した。紫外線照射は、1.15mW/cm2を放射する3個のUVBランプを用いて10、20及び30mJ/cm2のUVBを照射した。24時間後に細胞をサンプリングしてPBS(pH 7.4)で洗浄した後、80％エタノールを添加して固定した。細胞を遠心分離して沈殿させ、PBS(pH7.4)で洗浄した後、1mL PBS(pH 7.4)で浮遊させた後、透過性溶液(pemeabilization solution, 0.5％トリプトンX-100、200μg/mL RNase A、10μg/mlプロピジウムヨード化物)4mLを添加して15分反応させた。流細胞分析器で細胞周期を分析して死滅された細胞(apoptototic  cell, Sub G1)を百分率で示した。この時、対照群としては、EC SODを含むベクターで形質転換しないHaCaT細胞株を用いた。
【０１０６】
実験結果、UVBを10mJ/cm2の強度で照射した場合の死滅された細胞の比率は、対照群細胞株とEC SOD過発現細胞株との間に大きな差が示さなかった。しかし、UVBを20及び30mJ/cm2の強度で照射した場合には、EC SOD過発現細胞株の場合、対照群に比べて死滅された細胞の比率が数等に低く示されることが分かった(図10)。
【０１０７】
上記実験結果からEC SODの過発現がヒトケラチノサイト細胞株で紫外線による細胞死滅を減少させることを確認することができた。従って、EC SODの過発現が紫外線による皮膚細胞の損傷を保護することができることが分かった。
【０１０８】
＜実施例4＞
細胞侵透性ヒトEC SOD融合タンパク質の製造
4-1)TAT-EC SOD融合タンパク質、R9-EC SOD融合タンパク質及びK10-EC SOD融合タンパク質の発現ベクターの製造
ヒトEC SODタンパク質とタンパク質伝達ドメインであるHIV-1 Tat(RKKRRQRRR)、9個のアルギニン残基からなるオリゴペプチド及び10個のリシン残基からなるオリゴペプチドを融合させた融合タンパク質を製造した。また、上記EC  SODでヘパリンドメインが除去されたΔHD/EC SODタンパク質とHIV-1 Tatを融合させた融合タンパク質を製造した。
【０１０９】
このため、まずヒトEC SOD及びヒトΔHD/EC SODのcDNAを製造した。ヒトEC SOD cDNAを含むpUC 18-hEC SOD(スウェーデン、Clinical chemistry, Marklund professorから提供を受ける)ベクターを鋳型とするプライマー(配列番号7及び配列番号8)を用いてPCR増幅することにより、ヒトEC SODのcDNAを製造した。PCR増幅の条件は、98℃で4分間1回、98℃で30秒、55℃で30秒、72℃で45秒間30回、72℃で5分間を1回行った。
【０１１０】
センスプライマー(配列番号7)
5’-GAT CCT CGA GTG GAC GGG CGA GGA CTC GGC-3’
アンチセンスプライマー(配列番号8)
5’-GAT CCT CGA GTC AGG CGG CCT TGC ACT CGC T-3’
【０１１１】
ヘパリンドメインが除去されたΔHD/EC  SODの場合には、上記と同一の条件でPCR増幅を行うが、下記プライマー(配列番号9及び配列番号10)を用いた。
【０１１２】
センスプライマー(配列番号9)
5’-GAT CCT CGA GTG GAC GGG CGA GGA CTC GGC-3’
アンチセンスプライマー(配列番号10)
5’-AAT GCT CGA GTC ACT CTG AGT GCT CCC GCG C-3’
【０１１３】
上記で得たPCR産物をアガロースゲル電気泳動(agarose gel electrophoresis)して分離し、XhoI酵素で処理した。酵素処理した上記成熟EC SOD cDNA及び成熟ΔHD/EC SOD cDNAをそれぞれHIV-1 Tatの基本ドメイン(アミノ酸残基49〜57番RKKRRQRRR)が含まれたpET15(b)-TATベクター(翰林大、遺伝工学科、チェ・スヨン教授から分譲を受ける)(Park et al., J Gen Virol, 83:1173-1181, 2002)のXhoI座に挿入して発現ベクターを製造した。また、酵素処理した上記成熟EC SOD  cDNAを9個のアルギニン残基からなるオリゴペプチドを含むpET15(b)-R9ベクター(翰林大、遺伝工学科、チェ・スヨン教授から提供を受ける)(Ryu et al., Mol Cells, 16:385-391, 2003)及び10個のリシン残基からなるオリゴペプチドを含むpET15(b)-K10ベクター(翰林大、遺伝工学科、チェ・スヨン教授から提供を受ける)のXhoI座にそれぞれ挿入してそれぞれの発現ベクターを製造した(図11)。
【０１１４】
4-2)大腸菌の形質転換及び融合タンパク質の発現
上記実施例4-1)で製造したそれぞれの発現ベクターを大腸菌BL21(DE3)(Novagen)に熱衝撃(heat shock)方法で形質転換させた後、アンピシリンが含まれた250mL LB培地に接種して37℃で200rpmに攪拌しながらA600が0.8になるまで培養した。上記培養液にIPTG(1mM)を添加してさらに3時間培養してEC SOD融合タンパク質の過多発現を誘導した。
【０１１５】
4-3)融合タンパク質の精製
上記実施例4-2)で培養した細胞を遠心分離して集めた後、これを結合緩衝液(binding buffer;5mMイミダゾール、0.5M NaCl,  20mM Tris-HCl, 6M UREA, pH 7.9)に浮遊させた後、超音波処理して破砕した。融合タンパク質はN-末端に6個のヒスチジンを含んでいるため、固定金属-キレート親和クロマトグラフィー(immobilized metal-chelate  affinity chromatography)単一段階で融合タンパク質をほとんど純粋に(純度90％)精製することができる。従って、上記細胞破砕液を遠心分離して上清液を回収し、これを直ちに2.5ml Ni2+-ニトリロ三酢酸セファロースカラム(nitrilotriacetic  acid sepharose column)にローディングし、10倍体積の結合緩衝液と6倍体積の洗浄緩衝液(washing buffer;30mMイミダゾール、0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH7.9)で洗浄した後、溶出緩衝液(elution  buffer;1Mイミダゾール、0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl,  pH7.9)で融合タンパク質を溶出した。次いで、融合タンパク質が含まれた分画を集めてセファデックスG-25カラム(PD 10 column, Amersham Biotech)クロマトグラフィーを行うことにより脱塩した。精製されたTAT-EC  SOD融合タンパク質、TAT-ΔHD/EC  SOD融合タンパク質、K10-EC  SOD融合タンパク質及びR9-EC  SOD融合タンパク質を電気泳動で確認した(図12及び図13)。上記TAT-EC  SOD融合タンパク質、TAT-ΔHD/EC SOD融合タンパク質、K10-EC SOD融合タンパク質及びR9-EC SOD融合タンパク質のアミノ酸配列及び塩基配列は配列番号12〜配列番号19に示した通りである。
【０１１６】
4-4)融合タンパク質の細胞侵透性の調査
本発明によるTAT-EC SOD融合タンパク質、TAT-ΔHD/EC SOD融合タンパク質、K10-EC SOD融合タンパク質及びR9-EC SOD融合タンパク質の細胞侵透性をヒトケラチノサイト(keratinocyte)細胞株を用いて調査した。即ち、HaCaT細胞をスライドチャンバにシーディング(seeding)し、24時間後、本発明により製造したEC SOD融合タンパク質をそれぞれ0、1、2及び4μMの濃度で処理した。3時間後、常温で3.7％ホルムアルデヒド/PBS(pH  7.4)で10分間固定させ、0.1％トリプトンX-100/PBSで10分間反応させて透過性があるようにした。これを2％(v/v)FCS/PBSで常温で1時間ブロッキング(blocking)し、HIS抗体/2％FCS/PBS/PBS(Santacruz, USA)を100:1で希釈して1時間反応させた後、2％FBS/PBSで3回洗浄した。これにFITC-結合したウサギIg G(serotec)を50:1で希釈して1時間2次反応をし、1ug/ml PIを添加して15分間反応させた後、2％FBP/PBSで3回洗浄した。これを封入した後、共焦点顕微鏡(confocal microscopy)で観察した。陰性対照群としては、タンパク質伝達ドメインを結合させないEC SODタンパク質を用いた。
【０１１７】
また、TAT-EC SOD融合タンパク質またはTAT-ΔHD/EC SOD融合タンパク質を処理したHaCaT細胞からタンパク質を抽出した後、上記HIS抗体を用いてウェスタンブロット分析を実施した。分析されたバンドの強度を定量化し、上記伝達ドメインを結合させないEC SODタンパク質に対する百分率で示した。さらに、上記K10-EC SOD融合タンパク質及びR9-EC SOD融合タンパク質の細胞浸透効率を上記ウェスタンブロット分析法で分析した後、TAT-EC SOD融合タンパク質の細胞浸透効率に対する百分率で示した。
【０１１８】
実験結果、陰性対照群は細胞内に浸透できない反面、TAT-EC SOD融合タンパク質の場合には、効率的に細胞内に浸透してTAT-EC SOD融合タンパク質が細胞質に位置しており、TAT-ΔHD/EC SOD融合タンパク質も細胞内に浸透して細胞質に位置していることを確認した(図14)。
【０１１９】
また、細胞透過率を計算した結果、TAT-EC  SOD融合タンパク質とTAT-ΔHD/EC  SOD融合タンパク質の細胞浸透効率は、融合タンパク質の処理濃度が高いほど高く示され、TAT-ΔHD/EC SOD融合タンパク質に比べてTAT-EC SOD融合タンパク質の細胞浸透効率がさらに高いものと示された(図15)。
【０１２０】
また、9個のアルギニン残基からなるオリゴペプチドとEC SODが融合されたR9-hEC SOD融合タンパク質の場合、最も浸透効率が高いものと示され、次いで10個のリシン残基からなるオリゴペプチドとhEC SODが融合されたK10-hEC SOD融合タンパク質及びTAT-EC SOD融合タンパク質の順に浸透効率を示した(表1)。
【０１２１】
【表１】
2007536903.tif 000003
【０１２２】
4-5)PEP-1-EC SOD融合タンパク質の製造
ヒトEC SODタンパク質とタンパク質伝達ドメインであるPEP-1ペプチド(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV)を融合させた融合タンパク質を製造した。また、上記EC SODでヘパリンドメインが除去されたΔHD/EC SODタンパク質とPEP-1ペプチドを融合させた融合タンパク質を製造した。
【０１２３】
このため、上記実施例4-1)で製造したTAT-EC SOD発現ベクターまたはTAT-ΔHD/EC SOD発現ベクターをNdeI-XhoI制限酵素で切り取った後、PEP-1ペプチドを挿入することにより、PEP1-EC SOD及びPEP1-ΔHD/EC SOD発現ベクターを製造した。下記のプライマーセットで人為的に作った二重螺旋オリゴヌクレオチド(double-strand oligonucleotide)を発現ベクターに結紮(ligation)した(図16)。
【０１２４】
センスプライマー(配列番号20)
5’-TATGAAAGAAACCTGGTGGGAAACCTGGTGGACCGAATGGTCTCAGCCGAAAAAAAAACGTAAAGTGC-3’
アンチセンスプライマー(配列番号21)
5’-TCGABCACTTTACGTTTTTTTTTCGGCTGAGACCATTCGGTCCACCAGGTTTCCCACCAGGTTTCTTTCC-3’
【０１２５】
上記のような方法で製造された発現ベクターを上記実施例4-2)及び4-3)と同様の方法で発現させて精製した。PEP-1-EC SOD融合タンパク質及びPEP-1-ΔHD/EC SOD融合タンパク質のアミノ酸配列及び塩基配列は、配列番号22〜配列番号25に示した通りである。
【０１２６】
4-6)PEP-1-EC SOD融合タンパク質の細胞侵透性の調査
本発明による上記実施例4-5)で精製されたPEP-1-EC SOD融合タンパク質の細胞侵透性をヒト乳癌細胞株であるHeLa細胞株(翰林大、遺伝工学科、チェ・スヨン教授から提供を受ける)を用いて調査した。即ち、HeLa細胞をスライドチャンバにシーディング(seeding)し、24時間後、本発明により製造したPEP-1-EC SOD融合タンパク質と、陰性対照群としては、EC SODタンパク質をそれぞれ1μMの濃度で処理した。1時間後、常温で3.7％ホルムアルデヒド/PBS(pH  7.4)で10分間固定させ、0.1％トリプトンX-100/PBSで10分間反応させて透過性があるようにした。これを2％(v/v)FCS/PBSで常温で1時間ブロッキング(blocking)し、HIS抗体/2％FCS/PBS/PBS(Santacruz, USA)を400:1で希釈して1時間反応させた後、2％FBS/PBSで3回洗浄した。これにCy3-結合したウサギIgG(Molecular Probe Co)を100:1で希釈して1時間2次反応させた後、2％FBP/PBSで3回洗浄した。これを封入した後、蛍光顕微鏡で観察した。陰性対照群としては、タンパク質伝達ドメインを結合させないEC SODタンパク質を用いた。
【０１２７】
実験結果、陰性対照群は細胞内に浸透しないない反面(図17のA)、PEP-1-EC SOD融合タンパク質の場合には、細胞内に浸透して上記融合タンパク質が細胞質に位置していることを確認することができた(図17のB)。
【０１２８】
＜実施例5＞
TPAを用いた皮膚疾患モデルでEC SOD及び細胞侵透性EC SOD融合タンパク質の治療効果
5-1)TPAを処理した野生型マウス及びEC SOD過発現マウスの皮膚組織でEC SODの発現調査
野生型(wild type)マウス及びEC SOD過発現マウスにTPAを処理し、上記マウスの皮膚組織でEC SODの発現傾向を免疫組織染色を実施することにより調査した。
【０１２９】
このため、まず、EC SODが過発現される形質転換マウスを製造した。公示動物としては、韓国生命工学研究所から購入した交雑種マウス(C57BL/6 X CBAのF1)を用いた。多排卵誘起のためにPMSG(pregnant mare’s serum gonadotropin)とhCG(human chrionic gonadotropin)を48時間間隔でそれぞれ5IUずつ雌性マウスの腹腔内に注射した後、同一系統の雄性マウスと1:1で合舎させた。翌朝、膣栓を確認し、膣栓がある個体のみ屠殺して卵管を切取した後、卵管膨大部から受精卵を回収した。培養液は0.4％BSAが添加されたM16培養液を用いた。
【０１３０】
皮膚組織に選別的なEC SOD過発現が誘導されたマウスを作るために、上記2-1)で示したマウスEC SODのcDNAを含むpCRII TOPOベクターで制限酵素でマウスEC SODのcDNA部分を切り取ってヒトケラチンK14プロモータを含んでいるpBS KSベクターに挿入した。また、このベクターに鶏のオボアルブミンポリ(A)(ovalbumin  poly(A))を挿入し、試験管内(in vitro)における発現を容易にした。受精卵にDNAを注入するために発現ベクターを制限酵素HindとXhoIで切り取って用いた(図18)。制限酵素で切断したDNAは、1％アガロースゲルに電気泳動した後、透析(dialysis)して回収した後、フェノールクロロホルムで分離精製した。これを10mM  Tris(pH 7.4/0.2mM EDTA)濃度で透析して最終濃度が4ng/μｌになるようにした。外来遺伝子を含むDNA溶液を1細胞期受精卵の前核に注入した。外来遺伝子が注入された受精卵を2細胞期まで培養した後、健康な状態の受精卵のみを選別した。発情した雌のICRを雄と合舎させた後、翌日膣栓を確認して確認されたものを代理母とした。2細胞期までよく育った受精卵を15-20個取って代理母の卵管膨大部に微細管を用いて移植した後、筋肉層と表皮を封合した。移植後、生まれた産子を3週程度育てた後、これらの尻尾を1cm程度を切り取った後、溶解緩衝液(lysis buffer)に入れて55℃で処理した後、フェノール(phenol)添加してゲノムDNA(genomic DNA)を抽出した。上記ゲノムDNAを下記のPCRプライマーセットを用いてPCR増幅することにより、形質転換如何を確認した。PCRの条件は94℃で1回、94℃で30秒間、51℃で30秒間、72.5℃で45秒間を30回反復した後72.5℃で、5分間を1回実施した。
【０１３１】
センスプライマー(配列番号26)
5’-TTG TCT CTA ATA GAG GGT C-3’
アンチセンスプライマー(配列番号27)
5’-TCA AGC CTG TCT ATC TTC T-3’
【０１３２】
上記で形質転換マウスと野生型マウスにTPAを公知の方法で処理した(Zhaorigetu et al., Oncology Rep 10:537-534, 2003)。TPAを処理する二日前に、まず、10週齢の雌性マウスの背部位の毛を動物用電気カミソリで髭そりした。その後、アセトン200μｌにTPA(Sigma Co. U.S.A.)8.1nmolを溶解させて髭そりされた皮膚組織に二日に渡って一日に一回ずつ塗りつけた。この時、対照群にはアセトン200μｌのみを皮膚組織に同一の回数で塗りつけた。TPAを処理して1時間が経過した後に、上記マウスの皮膚組織を採取して4％パラホルムアルデヒドで固定し、エチルアルコールで脱水した後、パラフィンで包埋した。これを微細切断機(microtome)を用いて5μmの間隔で切断した後、皮膚組織サンプルをスライドガラスに付着させた。この組織サンプルにキシレン(xylene)を処理してパラフィンを除去し、エチルアルコールで脱水させた後、0.3％Triton X-100で溶液の浸透度を高め、3％のH2O2を処理して細胞に内在したパーオキシダーゼ(peroxidase)を阻害させた。その後、10％の塩素血清を添加して反応を遮断させ、1:50で希釈したEC SODの多クローン抗体を処理した。反応が完了した組織をDAKO LSABキット(peroxidase universal, DAKO Co.)を用いてDAB(diaminobenzidine)反応で発色させた。発色された組織試料は通常の方法により標本として製作し、顕微鏡下で100倍の倍率で観察した。
【０１３３】
実験結果、野生型マウスにTPAを処理した場合、皮膚組織の全般に渡りEC SODが発現されることを確認することができた。また、形質転換マウスの場合にも皮膚組織全般に渡って発現されることを確認することができた。特に、形質転換マウスの場合に、EC SODが表皮と毛嚢(follicle)で強く発現されるものと観察されることにより、野生型に比べて皮膚組織でEC SODが過発現されることを確認することができた(図19)。
【０１３４】
5-2)TPAを処理した野生型マウス及びEC SOD過発現マウスの皮膚組織の観察及び厚さの測定
上記実施例5-1)と同様の方法で野生型マウス及びEC SOD過発現マウスにTPAを処理して1時間が経過した後、皮膚組織を採取し、組織固定、エチルアルコール脱水及びパラフィン包埋過程を経て後、微細切断機(microtome)を用いて5μm間隔で切断し、皮膚組織サンプルをスライドガラスに付着させた。上記組織のサンプルにキシレン(xylene)を処理してパラフィンを除去し、エチルアルコールで脱水させた後、ヘマトキシリン(hematoxylin)とエオシン(eosin)で染色した後、封入(mounting)して顕微鏡で観察した。
【０１３５】
また、上記TPAを処理した野生型マウス、EC SOD過発現マウス及びアセトンを処理した対照群マウスの表皮と真皮の厚さの和と表皮のみの厚さをイメージキャプチャー装備で無作為的に選別した数地域の表皮をイメージ化した後、定規で厚さを測定した。
【０１３６】
実験結果、TPAを処理した野生型マウスの場合、TPAを処理することなくアセトンのみを処理した対照群の野生型マウスに比べて表皮(epidermis)と真皮(dermis)の厚さが厚くなているものと確認された。また、TPAを処理した形質転換マウスの場合には、アセトンのみを処理した対照群の形質転換マウスに比べて表皮の異常増殖が観察されたが、その程度が非常に軽微であった(図20)。
【０１３７】
TPAを処理した野生型マウスの表皮と真皮の和である表皮層と表皮のみの厚さはそれぞれアセトンを処理した対照群のマウスに比べて2.1倍、1.4倍高く示され、明確な差があることが分かった(図21A)。反面、TPAを処理したEC SOD過発現マウスの表皮と真皮厚さの和と表皮のみの厚さは、アセトンを処理した対照群マウスに比べて1.1倍高く示され、軽微な差があることが分かった(図21B)。
【０１３８】
上記実験結果からTPAによる皮膚組織の厚さの変化は、EC SODにより抑制され得ることが分かった。従って、上皮の増殖を特徴とする慢性炎症性皮膚疾患、特に、表皮増殖疾患の治療に用いられることが分かった。
【０１３９】
5-3)TPAを処理したEC SOD過発現細胞でMMPの発現変化
ヒトEC SOD過発現ベクターが導入されたヒト角質細胞であるHaCaT細胞にTPAを処理し、上記細胞でのMMPの発現をRT-PCR法で分析した。
【０１４０】
上記実施例3-1）のヒトEC SOD過発現ベクターが導入されたHaCaT細胞にTPA 100nMを処理した。TPA処理後、1時間37℃で培養した後、細胞を回収してトリゾール(Trizol)溶液(GibcoBRL)を用いて総RNAを得た。総RNA 10μgを鋳型とし、逆転写システム(Reverse transcription system, Promega Co.)で提示する方法で逆転写を行ってcDNAを得た。上記cDNAを鋳型として表2に示したプライマーセットを用いてPCR増幅した後、最終的に増幅されたDNAを1.5％(w/v)アガロースゲル(0.002％エチジウムブロマイド含有)で15分間展開した。DNAの増幅如何はUV下で観察した後、増幅されたDNAバンドの強度(intensity)を測定した。内部対照群としては、GAPDHを用い、測定されたDNAバンドの強度はGAPDHの強度を1.0とし、これに対して相対的に示した。
【０１４１】
【表２】
2007536903.tif 000004
【０１４２】
実験結果、TPAを処理する前のEC SOD過発現HaCaT細胞でMMP1の発現は、野生型HaCaT細胞に比べて顕著に減少したものと示された。一方、TPAを処理して1時間後、野生型細胞でMMP1の発現は顕著に増加したものと示されたが、EC SOD過発現細胞ではTPAを処理する前と同一の水準で示された。
【０１４３】
MMP2の場合には、TPAを処理する前のEC SOD過発現細胞が野生型細胞に比べてその発現が若干減少したものと示された。TPAを処理した後には、野生型細胞ではMMP2の発現が顕著に増加したものと示されたが、EC SOD過発現細胞ではTPAを処理する前と類似した水準で示された(図22)。
【０１４４】
上記実験結果からEC SODがTPAによねMMPの発現を阻害することにより、皮膚老化を抑制することができるものと思料された。
【０１４５】
5-4)ヒト線維芽細胞にヒトEC SODタンパク質及び細胞侵透性EC SOD融合タンパク質の処理によるMMPの発現の変化
組織で細胞外基質の変化を調節するMMPは大部分が線維芽細胞で発現されることと知られている。従って、ヒト線維芽細胞にEC SODタンパク質及び細胞侵透性EC SOD融合タンパク質をそれぞれ処理し、これによるMMPの発現変化を調査した。
【０１４６】
ヒト線維芽細胞(fibroblast)にヒトEC SODタンパク質または上記実施例4-3)で製造した精製されたTAT-ΔHD/EC SOD融合タンパク質を1μMずつ処理した後、100nM TPAを処理して37℃で1時間培養した。細胞を回収した後、上記5-3)と同様の方法でRT-PCRを行うことにより、MMP1とMMP2の発現程度を測定した。対照群にはTPAを処理しなかった。TPAを処理した実験群のDNAバンドの強度は、上記対照群のDNAバンドの強度を1.0とし、これに対して相対的に示した。
【０１４７】
上記ヒトEC SODタンパク質は、上記実施例3-1)で製造したヒトEC SOD発現ベクターを上記実施例4-2)及び4-3)と同様の方法で大腸菌に形質転換させて発現させた後、精製することにより製造した。
【０１４８】
実験結果、ヒト線維芽細胞にTPAを処理した場合に、MMP1とMMP2の発現が増加するものと示された。反面、上記ヒト線維芽細胞にTAT-ΔHD/EC SOD融合タンパク質またはEC SODタンパク質を処理した後、TPAを処理した場合には、MMP1とMMP2の発現が抑制されるものと示された(図23A及び図23B)。
【０１４９】
上記実験結果からTAT-ΔHD/EC SOD融合タンパク質またはEC SODタンパク質がTPAにより誘導されるMPP酵素の発現を抑制する活性を有していることを確認することができ、上記EC SODタンパク質に細胞侵透性を与えることにより、その活性がより増進することが分かった。
【０１５０】
＜実施例6＞
EC SODタンパク質の処理による肥満細胞の脱顆粒抑制
肥満細胞に本発明のEC SODタンパク質を処理し、これによる肥満細胞の脱顆粒抑制程度を調査した。このため、まず、BALB/Cマウスから採取した骨髄細胞を50％栄養培地(ペニシリン100unit/ml、ストレプトマイシン100mg/ml、ゲンタマイシン10mg/ml、L-グルタミン2mM、非必須アミノ酸0.1mM、牛胎児血清10％を含むRPMI 1640)と50％WEHI-3細胞保存培地を用いて3週以上培養して95％以上の均質なBMMC(Bone Marrow-derived mast cell)を得た。1×106 cells/ml濃度のBMMCにヒトEC-SODタンパク質1μg/mlまたは10μg/mlずつ添加して30分間培養した。これにKL/LPS/IL-1βを添加して30分間反応させた後、培養上澄液及び細胞溶解物を得た。上記上澄液と細胞溶解物25μｌにそれぞれ基質であるρ-ニトロフェニル-2-アセトアミド-2-ジオキシ-b-D-グルコピラノシド(Sigma Co. USA)を添加して反応させた。これに0.2Mグリシン-NaOH(pH 10.7)を加えて反応を終結させ、酵素活性を分光光度計を用いて410nmで測定してβ-ヘキソサミダーゼ(β-hexosamidase)放出の阻害程度を調査した。この時、対照群にはPBSを処理した。酵素活性抑制率はPBSを処理した対照群のβ-ヘキソサミダーゼの放出を100％を基準とした百分率で表示した。
【０１５１】
酵素活性抑制率=(EC SOD処理した実験群のβ-ヘキソサミダーゼの放出/PBSを処理した対照群のβ-ヘキソサミダーゼの放出)×100
【０１５２】
実験結果、EC SODをBMMCに1μg/mlまたは10μg/mlで処理した場合、対照群に比べてそれぞれ9.87％及び11.97％でβ-ヘキソサミダーゼの放出を阻害するものと示された(表3)。したがって、EC SODは肥満細胞の脱顆粒を抑制してアトピーのようなアレルギー性皮膚疾患を治療する効果があることが分かった。
【０１５３】
【表３】
2007536903.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【０１５４】
本発明によるEC SDOは、皮膚組織の全般に渡り分布しながら皮膚細胞内の活性酸素種を除去し、表皮細胞の過増殖、MMPの発現及び肥満細胞の脱顆粒を抑制する効果があるため、皮膚疾患を予防するか、または治療するのに有用に使われる。また、EC SODにタンパク質伝達ドメインを融合させて製造した細胞侵透性EC SOD融合タンパク質は細胞浸透能に優れ、皮膚疾患の予防及び治療に有用に使われる。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】図1は免疫組織染色法を用いてマウスの皮膚組織におけるEC SODの分布様相を調査した結果を示した写真である。左側:ウサギ抗マウスEC SOD抗体で免疫染色した結果を示した写真右側:陰性対照群として免疫化しない(pre-immune)ウサギ血清で免疫染色した結果を示した写真
【図２】図2はマウス皮膚の表皮層及び真皮層でEC SODの発現様相をノーザンブロットで分析した結果を示したものである。GAPDHは、ローディング対照群として用いた。**:p＜0.05で有意な差あり
【図３】図3はマウスにUVAを照射した後、時間の経過によるEC SODの発現様相をノーザンブロットで分析した結果である。GAPDHはローディング対照群として用いた。A:5kJ/cm2照射B:25kJ/cm2照射
【図４】図4は、マウスにUVBを照射した後、時間の経過によるEC SODの発現程度をノーザンブロットで分析した結果である。GAPDHはローディング対照群として用いた。A:2kJ/cm2照射B:8kJ/cm2照射C:15kJ/cm2照射
【図５】図5は、マウスに8-MOPを塗って1時間後にUVAを照射した後、時間の経過によるEC SODの発現程度をノーザンブロットで分析した結果である。GAPDHはローディング対照群として用いた。A:5kJ/cm2照射B:25kJ/cm2照射
【図６】図6はTet off-MEF/3T3誘導性遺伝子発現システムでテトラサイクルリーンを除去して(TET  OFF)EC SODの過発現を誘導し、時間の経過によるEC SODの発現様相をノーザンブロットで分析した結果(A)及びEC SODの活性(B)を示したものである。TET ON:テトラサイクリンが存在する場合TET OFF:テトラサイクリンが除去された場合
【図７Ａ】図7Aは本発明によるマウスEC SOD過発現細胞株に10J/cm2のUVAを照射した後、時間の経過による細胞内活性酸素の量を測定して対照群の値に対する相対的な値で示したグラフである。TET ON:テトラサイクリンが存在する場合TET OFF:テトラサイクリンが除去された場合
【図７Ｂ】図7Bは本発明によるマウスEC SOD過発現細胞株に20mJ/cm2のUVBを照射した後、時間の経過による細胞内活性酸素の量を測定して対照群の値に対する相対的な値で示したグラフである。TET ON:テトラサイクリンが存在する場合TET OFF:テトラサイクリンが除去された場合
【図７Ｃ】図7Cは本発明によるマウスEC SOD過発現細胞株に0.1％8-MOPを処理し、30分後に2J/cm2のUVA照射した後、時間の経過による細胞内活性酸素の量を測定して対照群の値に対する相対的な値で示した結果である。TET ON:テトラサイクリンが存在する場合TET OFF:テトラサイクリンが除去された場合
【図８】図8は本発明によるヒトEC SOD過発現ベクターの開裂地図を示したものである。
【図９】図9はEC SOD過発現HaCaT細胞で発現されたEC SODをウェスタンブロットで確認した結果である。
【図１０】図10はEC SOD過発現HaCaT細胞に紫外線を照射し、これによる死滅した細胞の比率を流細胞分析器で測定した結果である。
【図１１】図11は本発明によるTAT-EC SOD融合タンパク質またはTAT-ΔHD/EC SOD融合タンパク質の発現ベクターの開裂地図を示したものである。
【図１２】図12は精製されたTAT-EC SOD融合タンパク質及びTAT-ΔHD/EC SOD融合タンパク質を電気泳動で確認した写真である。
【図１３】図13は精製されたTAT-EC SOD融合タンパク質、K10-EC SOD融合タンパク質及びR9-EC SOD融合タンパク質を電気泳動で確認した写真である。
【図１４】図14は本発明のTAT-EC SOD融合タンパク質及びTAT-ΔHD/EC SOD融合タンパク質がヒトHaCaT細胞内に浸透し、核内に位置していることを免疫細胞染色法により観察した写真である。
【図１５】図15は本発明のTAT-EC SOD融合タンパク質及びTAT-ΔHD/EC SOD融合タンパク質の細胞浸透効率をウェスタンブロットで分析した結果である。
【図１６】図16は本発明によるPEP1-EC SOD融合タンパク質またはPEP1-ΔHD/EC SOD融合タンパク質の発現ベクターの開裂地図を示したものである。
【図１７】図17は本発明のPEP1-EC SOD融合タンパク質がHeLa細胞内に浸透していることを免疫細胞染色法で観察した写真である。A:EC SODタンパク質処理群(陰性対照群)B:PEP-1-EC SOD融合タンパク質処理群(実験群)
【図１８】図18はEC SOD過発現マウスの製造のために用いたマウスEC SOD過発現ベクターの模式図を示したものである。
【図１９】図19はTPAを処理した野生型マウス及びEC SODが皮膚に過発現されたマウスの皮膚組織でEC SODの発現様相を免疫組織染色で分析した結果である。A:野生型マウスの皮膚組織B:EC SOD過発現マウスの皮膚組織e:表皮層、d:真皮層、矢印:毛嚢細胞サイズバー:100μm、倍率:×100
【図２０】図20はTPAを処理した野生型マウス及びEC SODが皮膚に過発現されたマウスの皮膚組織をhaematoxylinとエオシンで染色して顕微鏡により観察した結果である。A, E:アセトンを処理した野生型マウスの皮膚組織B, F:TPAを処理した野生型マウスの皮膚組織C, G:アセトンを処理したEC SOD過発現マウスの皮膚組織D, H:TPAを処理したEC SOD過発現マウスの皮膚組織e:表皮層、d:真皮層サイズバー:100μm、倍率:A〜D×100倍、E〜H×400倍
【図２１Ａ】図21AはTPAを処理した野生型マウスとEC SODが皮膚に過発現されたマウスの表皮と真皮の厚さの和を示したグラフである。
【図２１Ｂ】図21BはTPAを処理した野生型マウスとEC SODが皮膚に過発現されたマウスの表皮の厚さを示したグラフである。
【図２２】図22はTPAを処理した皮膚角質形質細胞株であるHaCaT細胞及びEC SOD過発現HaCaT細胞でMMP1及びMMP2の発現を分析した結果である。
【図２３Ａ】図23Aは細胞侵透性EC SOD融合タンパク質の処理によるヒト線維芽細胞でMMP1及びMMP2の発現を分析した結果である。
【図２３Ｂ】図23BはEC SODタンパク質の処理によるヒト線維芽細胞でMMP1及びMMP2の発現を分析した結果である。
【図１】
2007536903.tif 000006
【図２】
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【図３】
2007536903.tif 000008
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
2007536903.tif 000012
【図７Ｂ】
2007536903.tif 000013
【図７Ｃ】
2007536903.tif 000014
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
2007536903.tif 000030
【図２３Ａ】
2007536903.tif 000031
【図２３Ｂ】
2007536903.tif 000032
【配列表】
2007536903000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年8月31日(2005.8.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離されたEC  SODタンパク質または上記EC  SODタンパク質と実質的に同質の活性を示し、60％以上の配列相同性を有するタンパク質を有効成分として含む皮膚疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項２】
分離されたEC  SODタンパク質または上記EC  SODタンパク質と実質的に同質の活性を示し、60％以上の配列相同性を有するタンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有効成分として含む皮膚疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項３】
上記EC  SODタンパク質がほ乳動物に由来したものであることを特徴とする請求項1または2に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
上記EC  SODタンパク質が配列番号11で示されるアミノ酸配列を含むものであることを特徴とする請求項3に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
上記皮膚疾患が皮膚癌、色素沈着性疾患、光老化、皮膚炎、乾癬、アトピー、じんましん及びアレルギーからなる群から選択されるものであることを特徴とする請求項1または2に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
分離されたEC  SODタンパク質または上記EC  SODタンパク質と実質的に同質の活性を示し、60％以上の配列相同性を有するタンパク質を含む皮膚疾患の予防または改善用化粧料組成物。
【請求項７】
分離されたEC  SODタンパク質、上記EC  SODタンパク質と実質的に同質の活性を示し、60％以上の配列相同性を有するタンパク質及び上記タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む発現ベクターからなる群から選択されたいずれか一つを有効な量で個体に投与することを含む皮膚疾患の予防または治療方法。
【請求項８】
分離されたEC  SODタンパク質、上記EC  SODタンパク質と実質的に同質の活性を示し、60％以上の配列相同性を有するタンパク質及び上記タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む発現ベクターからなる群から選択されたいずれか一つを皮膚疾患の予防及び治療用薬学的組成物の製造に用いる用途。
【請求項９】
分離されたEC  SODタンパク質または上記EC  SODタンパク質と実質的に同質の活性を示し、60％以上の配列相同性を有するタンパク質とタンパク質伝達ドメインが融合された細胞侵透性EC  SOD融合タンパク質を有効成分として含む皮膚疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１０】
分離されたEC  SODタンパク質または上記EC  SODタンパク質と実質的に同質の活性を示し、60％以上の配列相同性を有するタンパク質とタンパク質伝達ドメインが融合された細胞侵透性EC  SOD融合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを有効成分として含む皮膚疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１１】
上記タンパク質伝達ドメインがHIV-1  Tatの形質導入部位、5〜12個のアルギニン残基からなるオリゴペプチド、5〜12個のリシン残基からなるオリゴペプチド、PEP-1ペプチド、ANTP及びVP22タンパク質からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項9または10に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
上記皮膚疾患が皮膚癌、色素沈着性疾患、光老化、皮膚炎、乾癬、アトピー、じんましん及びアレルギーからなる群から選択されるものであることを特徴とする請求項9または10に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
分離されたEC  SODタンパク質または上記EC  SODタンパク質と実質的に同質の活性を示し、60％以上の配列相同性を有するタンパク質とタンパク質伝達ドメインが融合された細胞侵透性EC  SOD融合タンパク質を有効成分として含む皮膚疾患の予防または改善用化粧料組成物。
【請求項１４】
分離されたEC  SODタンパク質、上記EC  SODタンパク質と実質的に同質の活性を示し、60％以上の配列相同性を有するタンパク質とタンパク質伝達ドメインが融合された細胞侵透性EC  SOD融合タンパク質、及び上記タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む発現ベクターからなる群から選択されたいずれか一つを個体に有効な量で投与することを含む皮膚疾患の予防または治療方法。
【請求項１５】
分離されたEC  SODタンパク質、上記EC  SODタンパク質と実質的に同質の活性を示し、60％以上の配列相同性を有するタンパク質とタンパク質伝達ドメインが融合された分離された細胞侵透性EC  SOD融合タンパク質及び上記タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む発現ベクターからなる群から選択されたいずれか一つを皮膚疾患の予防または治療用薬学的組成物の製造に用いる用途。
【国際調査報告】
2007536903.tif 000033
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