(57)【要約】      （修正有）【課題】疼痛を制御するための組成物及び方法、さらに、疼痛を制御する薬剤を同定する方法を提供する。【解決手段】個体の１次求心性ニューロンへと、オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入することを含み、前記オプシンポリペプチドが、前記オプシンを活性化させる波長の光に応答して前記１次求心性ニューロンの過分極を提供する、疼痛の制御方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における疼痛の制御方法であって、前記個体の１次求心性ニューロンへと、オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入することを含み、前記オプシンポリペプチドが、前記オプシンを活性化させる波長の光に応答して前記１次求心性ニューロンの過分極を提供する、前記方法。
【請求項２】
前記１次求心性ニューロンが、侵害受容器である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記光が、経皮的に送達される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記オプシンが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、６、１５、及び１６のうち１つに対して少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記疼痛が、神経障害性疼痛である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記導入が、神経への注射によるかまたは筋肉注射による、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記導入が、局所、皮内、静脈内、髄腔内、または胸腔内投与による、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記侵害受容器が、熱刺激、機械刺激、または化学刺激によって一般に活性化されるものである、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸が、組換え発現ベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記組換え発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ６ベクターまたはＡＡＶ８ベクターである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヌクレオチド配列が、ニューロンでの選択的発現を提供するプロモーターに機能的に連結されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記プロモーターが、シナプシン−Ｉプロモーター、ヒトシヌクレイン１プロモーター、ヒトＴｈｙ１プロモーター、またはカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩα（ＣＡＭＫＩＩα）プロモーターである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記個体が、哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記個体が、ヒト、ラット、またはマウスである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記オプシンの活性化が、疼痛の少なくとも１０％の低減を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
疼痛の非ヒト動物モデルであって、前記非ヒト動物が、前記動物の１次求心性ニューロンにおいて、オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を発現し、前記オプシンポリペプチドが、前記オプシンを活性化させる波長の光に応答して侵害受容器の脱分極を提供する、前記非ヒト動物モデル。
【請求項１９】
前記１次求心性ニューロンが、侵害受容器である、請求項１８に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項２０】
前記オプシンが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８〜１４及び１９〜２１のうち１つに対して少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項２１】
前記核酸が、組換え発現ベクターである、請求項１８に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項２２】
前記組換え発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１８に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項２３】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項２２に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項２４】
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ６ベクターまたはＡＡＶ８ベクターである、請求項２３に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項２５】
前記ヌクレオチド配列が、ニューロンでの選択的発現を提供するプロモーターに機能的に連結されている、請求項１８に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項２６】
前記プロモーターが、シナプシン−Ｉプロモーター、ヒトシヌクレイン１プロモーター、ヒトＴｈｙ１プロモーター、またはカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩα（ＣＡＭＫＩＩα）プロモーターである、請求項２５に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項２７】
前記動物が、ラットまたはマウスである、請求項１８に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項２８】
疼痛を軽減する薬剤の同定方法であって、
ａ）請求項１８に記載の非ヒト動物に試験薬剤を投与すること；及び
ｂ）脱分極のための光活性化ポリペプチドが光によって活性化される時の疼痛に対する前記試験薬剤の効果を、もしあれば決定すること
を含み、試験薬剤の非存在下で前記脱分極のための光活性化ポリペプチドの光活性化によって誘発される前記疼痛レベルと比較して前記非ヒト動物の疼痛を軽減する前記試験薬剤が、前記試験薬剤が疼痛を軽減するための候補薬剤であることを示す、前記方法。
【請求項２９】
疼痛を軽減する薬剤の同定方法であって、
ａ）請求項１８に記載の非ヒト動物に試験薬剤を投与すること；及び
ｂ）前記試験薬剤の投与後に疼痛を誘発するのに必要な光量に対する前記試験薬剤の効果を、もしあれば決定すること
を含み、
疼痛を誘発するのに必要な前記光量を増加させる試験薬剤が、疼痛を軽減するための候補薬剤である、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１３年８月１４日出願の米国仮特許出願第６１／８６５，９６２号の利益を主張し、この出願は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府資金による研究の記載
本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＮＳ０８０９５４のもとで、政府支援により行われたものである。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
緒言
１次侵害受容器とは、通常の及び病理学的な疼痛を調節する複雑な疼痛処理系における１次ニューロンである。研究及び治療の目的でこれらのニューロンを興奮させる及び阻害する能力は、薬理学的及び電気的刺激の制約によって制限されてきた；従って、自由に移動している動物における侵害受容器の非侵襲的、空間的局在制御は、不可能であった。
【０００４】
文献
Ｌｉｓｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｍｕｓｃｌｅ  ＆  Ｎｅｒｖｅ  ４７：９１６（非特許文献1）；Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  １６：１１６１（非特許文献2）；Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７：ｅ３２６９９（非特許文献3）；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｚｙｌｋａ  （２００９）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２９：１３０２０（非特許文献4）；Ｄａｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｓｏｃ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｃｏｎｆ．  ５７５．０６／ＩＩ１１（非特許文献5）；Ｄａｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ３３：４７（非特許文献6）；Ｍｏｕｒｏｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９：３９６（非特許文献7）；Ｋｏｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｎａｔ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ９：２５７（非特許文献8）；Ｍａｔｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９：１５９（非特許文献9）；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｄｅｎｉｓｏｎ  （２０１３）  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．  ５：１７７ｐｓ６（非特許文献10）；Ｃｈｏｗ  ａｎｄ  Ｂｏｙｄｅｎ  （２０１３）  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．  ５：１７７ｐｓ５（非特許文献11）；Ｔｏｗｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １７：１４１（非特許文献12）；Ｔｏｗｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｍｏｌ．  Ｐａｉｎ  ５：５２（非特許文献13）；Ｉｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ３２：３（非特許文献14）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｌｉｓｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｍｕｓｃｌｅ  ＆  Ｎｅｒｖｅ  ４７：９１６
【非特許文献２】Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  １６：１１６１
【非特許文献３】Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７：ｅ３２６９９
【非特許文献４】Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｚｙｌｋａ  （２００９）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２９：１３０２０
【非特許文献５】Ｄａｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｓｏｃ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｃｏｎｆ．  ５７５．０６／ＩＩ１１
【非特許文献６】Ｄａｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ３３：４７
【非特許文献７】Ｍｏｕｒｏｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９：３９６
【非特許文献８】Ｋｏｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｎａｔ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ９：２５７
【非特許文献９】Ｍａｔｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９：１５９
【非特許文献１０】Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｄｅｎｉｓｏｎ  （２０１３）  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．  ５：１７７ｐｓ６
【非特許文献１１】Ｃｈｏｗ  ａｎｄ  Ｂｏｙｄｅｎ  （２０１３）  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．  ５：１７７ｐｓ５
【非特許文献１２】Ｔｏｗｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １７：１４１
【非特許文献１３】Ｔｏｗｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｍｏｌ．  Ｐａｉｎ  ５：５２
【非特許文献１４】Ｉｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ３２：３
【発明の概要】
【０００６】
概要
本開示は、疼痛を制御するための組成物及び方法を提供する。本開示は、疼痛を制御する薬剤を同定する方法を提供する。
【０００７】
特徴
本開示は、個体における疼痛を制御する方法を特徴とし、この方法は、個体の侵害受容器へと、オプシンを活性化させる波長の光に応答して侵害受容器の過分極を提供するオプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入することを含む。場合によっては、光は、経皮的に送達される。場合によっては、オプシンは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、６、１５、及び１６のうち１つに対して少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、疼痛は、神経障害性疼痛である。場合によっては、オプシンをコードするヌクレオチドを含む核酸は、神経への注射により、筋肉注射により、または静脈注射により個体に投与される。場合によっては、核酸は、処置部位（例えば、疼痛の部位）にまたはその近傍にて個体に投与される。場合によっては、核酸は組換え発現ベクターであり、例えば、組換え発現ベクターはウイルスベクターである。場合によっては、組換え発現ベクターがウイルスベクターである場合、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。場合によっては、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ６ベクターまたはＡＡＶ８ベクターである。ヌクレオチド配列は、ニューロンでの選択的発現を提供するプロモーターに機能的に連結可能である。例えば、プロモーターは、シナプシン−Ｉプロモーター、ヒトシヌクレイン１プロモーター、ヒトＴｈｙ１プロモーター、またはカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩα（ＣＡＭＫＩＩα）プロモーターであり得る。個体は、哺乳動物；例えばヒト、ラット、またはマウスであり得る。場合によっては、オプシンの活性化は、疼痛の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の低減を提供する。場合によっては、オプシンの活性化は、疼痛の１００％の低減を提供する、すなわち、個体は実質的に疼痛を感じなくなる。
【０００８】
本開示は、神経障害性疼痛の非ヒト動物モデルを特徴とし、この非ヒト動物は、動物の侵害受容器において、オプシンを活性化させる波長の光に応答して侵害受容器の脱分極を提供するオプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を発現する。場合によっては、オプシンは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８〜１４及び１９〜２１のうち１つに対して少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、核酸は組換え発現ベクター、例えば、ウイルスベクターである。例えば、場合によっては、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、例えば、ＡＡＶ６ベクターもしくはＡＡＶ８ベクターである。場合によっては、オプシンをコードするヌクレオチド配列は、ニューロンでの選択的発現を提供するプロモーターに機能的に連結されている；例えば、プロモーターは、シナプシン−Ｉプロモーター、ヒトシヌクレイン１プロモーター、ヒトＴｈｙ１プロモーター、またはカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩα（ＣＡＭＫＩＩα）プロモーターであり得る。場合によっては、動物は、ラットである。場合によっては、動物は、マウスである。
【０００９】
本開示は、疼痛を軽減する薬剤を同定する方法を特徴とし、この方法は、ａ）本非ヒト動物に試験薬剤を投与すること；及びｂ）脱分極のための光活性化ポリペプチドが光によって活性化される時の疼痛に対する試験薬剤の効果を、もしあれば決定することを含み、試験薬剤の非存在下で脱分極のための光活性化ポリペプチドの光活性化によって誘発される疼痛レベルと比較して非ヒト動物の疼痛を軽減する試験薬剤は、その試験薬剤が疼痛を軽減するための候補薬剤であることを示す。
【００１０】
本開示は、疼痛を軽減する薬剤を同定する方法を特徴とし、この方法は、ａ）本非ヒト動物に試験薬剤を投与すること；及びｂ）試験薬剤の投与後に、脱分極のための光活性化ポリペプチドの活性化によって疼痛を誘発するのに必要な光量に対する試験薬剤の効果を、もしあれば決定することを含み、試験薬剤の非存在下で疼痛の徴候をもたらすのに必要な光量と比較して疼痛の徴候をもたらすのに必要な光量を増加させる試験薬剤は、その試験薬剤が疼痛を軽減するための候補薬剤であることを示す。
[本発明1001]
個体における疼痛の制御方法であって、前記個体の1次求心性ニューロンへと、オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入することを含み、前記オプシンポリペプチドが、前記オプシンを活性化させる波長の光に応答して前記1次求心性ニューロンの過分極を提供する、前記方法。
[本発明1002]
前記1次求心性ニューロンが、侵害受容器である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記光が、経皮的に送達される、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記オプシンが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1、3、4、6、15、及び16のうち1つに対して少なくとも約75％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記疼痛が、神経障害性疼痛である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記導入が、神経への注射によるかまたは筋肉注射による、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記導入が、局所、皮内、静脈内、髄腔内、または胸腔内投与による、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記侵害受容器が、熱刺激、機械刺激、または化学刺激によって一般に活性化されるものである、本発明1002の方法。
[本発明1009]
前記核酸が、組換え発現ベクターである、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記組換え発現ベクターが、ウイルスベクターである、本発明1007の方法。
[本発明1011]
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ6ベクターまたはＡＡＶ8ベクターである、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記ヌクレオチド配列が、ニューロンでの選択的発現を提供するプロモーターに機能的に連結されている、本発明1001の方法。
[本発明1014]
前記プロモーターが、シナプシン−Ｉプロモーター、ヒトシヌクレイン1プロモーター、ヒトＴｈｙ1プロモーター、またはカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩα（ＣＡＭＫＩＩα）プロモーターである、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記個体が、哺乳動物である、本発明1001の方法。
[本発明1016]
前記個体が、ヒト、ラット、またはマウスである、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記オプシンの活性化が、疼痛の少なくとも10％の低減を提供する、本発明1001の方法。
[本発明1018]
疼痛の非ヒト動物モデルであって、前記非ヒト動物が、前記動物の1次求心性ニューロンにおいて、オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を発現し、前記オプシンポリペプチドが、前記オプシンを活性化させる波長の光に応答して侵害受容器の脱分極を提供する、前記非ヒト動物モデル。
[本発明1019]
前記1次求心性ニューロンが、侵害受容器である、本発明1018の非ヒト動物モデル。
[本発明1020]
前記オプシンが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：8〜14及び19〜21のうち1つに対して少なくとも約75％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1018の非ヒト動物モデル。
[本発明1021]
前記核酸が、組換え発現ベクターである、本発明1018の非ヒト動物モデル。
[本発明1022]
前記組換え発現ベクターが、ウイルスベクターである、本発明1018の非ヒト動物モデル。
[本発明1023]
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、本発明1022の非ヒト動物モデル。
[本発明1024]
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ6ベクターまたはＡＡＶ8ベクターである、本発明1023の非ヒト動物モデル。
[本発明1025]
前記ヌクレオチド配列が、ニューロンでの選択的発現を提供するプロモーターに機能的に連結されている、本発明1018の非ヒト動物モデル。
[本発明1026]
前記プロモーターが、シナプシン−Ｉプロモーター、ヒトシヌクレイン1プロモーター、ヒトＴｈｙ1プロモーター、またはカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩα（ＣＡＭＫＩＩα）プロモーターである、本発明1025の非ヒト動物モデル。
[本発明1027]
前記動物が、ラットまたはマウスである、本発明1018の非ヒト動物モデル。
[本発明1028]
疼痛を軽減する薬剤の同定方法であって、
ａ）本発明1018の非ヒト動物に試験薬剤を投与すること；及び
ｂ）脱分極のための光活性化ポリペプチドが光によって活性化される時の疼痛に対する前記試験薬剤の効果を、もしあれば決定すること
を含み、試験薬剤の非存在下で前記脱分極のための光活性化ポリペプチドの光活性化によって誘発される前記疼痛レベルと比較して前記非ヒト動物の疼痛を軽減する前記試験薬剤が、前記試験薬剤が疼痛を軽減するための候補薬剤であることを示す、前記方法。
[本発明1029]
疼痛を軽減する薬剤の同定方法であって、
ａ）本発明1018の非ヒト動物に試験薬剤を投与すること；及び
ｂ）前記試験薬剤の投与後に疼痛を誘発するのに必要な光量に対する前記試験薬剤の効果を、もしあれば決定すること
を含み、
疼痛を誘発するのに必要な前記光量を増加させる試験薬剤が、疼痛を軽減するための候補薬剤である、前記方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１Ａ〜Ｃは、ｒＡＡＶ２／６−ｈＳｙｎ−ＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ｅＹＦＰの坐骨神経内注入によって、脊髄層に投射した無髄侵害受容器に形質導入したことを示すデータを図示する。
【図２】図２Ａ〜Ｆは、ＣｈＲ２＋マウスの経皮照射によって、調節可能な疼痛様行動が得られたことを示すデータを図示する。
【図３】図３Ａ〜Ｇは、青色光で感作されたＣｈＲ２発現マウス及び黄色光で脱感作されたＮｐＨＲ発現マウスの機械刺激及び熱刺激に対する応答を図示する。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、ＮｐＨＲ＋マウスの黄色光刺激が、慢性絞扼損傷によって引き起こされる機械的異痛及び熱痛覚過敏を逆転させたことを示すデータを図示する。
【図５Ａ】様々な光活性化ポリペプチドのアミノ酸配列を図示する。
【図５Ｂ】様々な光活性化ポリペプチドのアミノ酸配列を図示する。
【図５Ｃ】様々な光活性化ポリペプチドのアミノ酸配列を図示する。
【図５Ｄ】様々な光活性化ポリペプチドのアミノ酸配列を図示する。
【図５Ｅ】様々な光活性化ポリペプチドのアミノ酸配列を図示する。
【図５Ｆ】様々な光活性化ポリペプチドのアミノ酸配列を図示する。
【図５Ｇ】様々な光活性化ポリペプチドのアミノ酸配列を図示する。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、オプシン導入のサイズ分布を図示する。
【図７】図７Ａ〜Ｄは、ＡＡＶ２／６−ｈＳｙｎ−ｅＮｐＨＲ３．０−ｅＹＦＰの坐骨神経内注入後に観察されたＮｐＨＲ導入の代表的な画像を図示する。
【図８】図８Ａ〜Ｆは、ＣｈＲ２＋及びＮｐＨＲ＋  ＤＲＧニューロンからの電気生理学的記録を図示する。
【図９】表１を提供する。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、腰髄及び胸髄におけるＡＡＶ８導入を図示する。
【図１１】神経節へ直接注入後の、三叉神経節の感覚ニューロンにおけるｅＮｐＨＲ３．０の発現を図示する。
【図１２】ＡＡＶ６を使用した侵害受容線維における、ＧＦＰまたはｅＮｐＨＲ３．０を発現するマウスの機械的閾値を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
本明細書で使用する場合、「個体」、「対象」、または「患者」は、動物、例えば、ヒトを含む哺乳動物である。哺乳動物としては、有蹄動物、イヌ科動物、ネコ科動物、ウシ亜科動物、ヒツジ属、非ヒト霊長類、ウサギ目動物、並びにげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、個体はヒトである。別の態様では、個体は非ヒト哺乳動物である。
【００１３】
天然のタンパク質配列におけるアミノ酸置換は、「保存的」または「非保存的」であってよく、このような置換アミノ酸残基は、遺伝子コードによってコードされるものであっても、またはそうでなくともよい。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、化学的に類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることである（すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸を、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸と置換すること）。「非保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、化学的に異なる側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることである（すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸を、芳香族側鎖を有するアミノ酸と置換すること）。標準的な２０種のアミノ酸「アルファベット」は、それらの側鎖の化学的特性に基づいて化学族へと分類される。これらの族としては、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族基を有する側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。
【００１４】
本明細書で使用する場合、組換え発現ベクター、または組換え発現ベクターを含む医薬組成物の「有効投与量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓａｇｅ）」または「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」とは、有利なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量である。予防用途については、有利なまたは所望の結果は、疾患の生化学的症状、組織学的症状及び／または行動症状、その合併症並びに疾患発症中に現れる中間病理学的表現型を含む、疾患のリスクの排除もしくは低減、重篤度の低下、または発症の遅延などの結果を含む。治療用途については、有利なまたは所望の結果は、疾患に起因する１つ以上の症状の低減、疾患に罹患している患者の生活の質の向上、疾患を処置するのに必要なその他の薬剤投与量の低減、標的化によるなどの別の薬剤の効果増大、疾患進行の遅延、及び／または生存期間の延長などの臨床結果を含む。有効投与量は、１回以上の投与において投与され得る。本開示の目的では、組換え発現ベクター、または組換え発現ベクターを含む医薬組成物の有効投与量とは、直接的または間接的のいずれかで予防的または治療的処置を行うのに十分な量である。例えば、組換え発現ベクター、または組換え発現ベクターを含む医薬組成物の有効投与量は、疼痛（例えば、神経障害性疼痛）を軽減するのに十分な量であり得る。臨床状況において理解されるように、組換え発現ベクター、または組換え発現ベクターを含む医薬組成物の有効投与量は、別の薬物、化合物、または医薬組成物と組み合わせて達成されても達成されなくともよい。従って、「有効投与量」は、１種以上の治療剤を投与することに関連すると考えられてよく、単剤は、１種以上のその他薬剤と組み合わせて望ましい結果を得る可能性がある、または得る場合、有効量で投与されていると考えられてよい。
【００１５】
本明細書で使用する場合、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、臨床結果を含む有利なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本開示の目的では、有利なまたは所望の臨床結果としては、以下のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない：疾患に起因する症状の低減、疾患に罹患している患者の生活の質の向上、疾患を処置するのに必要なその他の薬剤投与量の低減、疾患進行の遅延、及び／または個体の生存期間の延長。例えば、「処置」または「処置すること」は、疼痛の軽減を指すことができる。
【００１６】
本発明を更に記載する前に、本発明は当然変更してよいので、記載された特定の実施形態に限定されないことを理解すべきである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のためだけにすぎず、限定することを意図するものではないこともまた理解すべきである。
【００１７】
値の範囲が提供される場合、その間の各々の値は、その内容に別段の明確な指示がない限り、その範囲の上限及び下限の間並びに任意のその他記載されたまたはその記載された範囲内の間の値にて、下限の単位の第１０分の１まで本発明内に包含されることが理解される。これらのより狭い範囲の上限及び下限は、個別により狭い範囲に含まれてよく、本発明内に包含もされ、記載された範囲における任意の具体的に除外された限度に従う。記載された範囲が上限及び下限の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限度のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
【００１８】
他に規定されない限り、本明細書で使用されるすべての専門用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載されたものと類似のまたは同等の任意の方法及び材料が、本発明の実施または試験においても使用できるが、好ましい方法及び材料は以下に記載する。本明細書で言及されたすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれ、引用される刊行物に関連して方法及び／または材料を開示及び記載する。
【００１９】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される時、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、その内容に別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。従って、例えば、「オプシン（ａｎ  ｏｐｓｉｎ）」に対する言及は、複数のこのようなオプシンを含み、「侵害受容器（ｔｈｅ  ｎｏｃｉｃｅｐｔｏｒ）」に対する言及は、１つ以上の侵害受容器及び当業者に公知のそれらの等価物に対する言及を含むなどである。特許請求の範囲は、任意の随意的要素を除外するために立案されてよいと更に留意されたい。従って、本記載は、請求要素の列挙に関連して「単に（ｓｏｌｅｌｙ）」、「のみ（ｏｎｌｙ）」などのような排他的な用語の使用、または「ネガティブな」限定の使用のための先行詞として機能することが意図される。
【００２０】
明確にするために、個別の実施形態との関連において記載された本発明の一定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことが理解される。反対に、簡潔にするために、単一の実施形態との関連において記載された本発明の様々な特徴は、個別にまたは任意の好適なサブコンビネーションで提供されてもよい。本発明に関する実施形態のすべての組み合わせは、あたかも各々及びすべての組み合わせが個別に及び明示的に開示されたかのように、本発明によって具体的に包含され、本明細書にて開示される。加えて、各種実施形態及びそれらの要素のすべてのサブコンビネーションはまた、あたかも各々及びすべてのこのようなサブコンビネーションが個別に及び明示的に本明細書にて開示されたかのように、本発明によって具体的に包含され、本明細書にて開示される。
【００２１】
本明細書で考察した刊行物は、単に、本出願の出願日以前のそれらの開示のために、提供される。本明細書において、本発明は、先行発明によってこのような公開に先立つ権利を付与されないと認められたと、解釈されるべきではない。更に、提供される公開日は実際の公開日と異なる場合があり、個別に確認することを必要とする場合もある。
【００２２】
詳細な説明
本開示は、個体における疼痛を制御するための組成物及び方法を提供する。本開示は、疼痛を制御する薬剤を同定する方法を提供する。
【００２３】
疼痛を軽減する方法
本開示は、個体における疼痛を制御するための組成物及び方法を提供する。場合によっては、本開示による疼痛を制御する方法は概して、個体のニューロンへと、オプシンを活性化させる波長の光に応答して細胞の過分極を提供するオプシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入することを含み；このような方法は、疼痛の軽減を提供する。核酸をニューロン（例えば、小径または大径１次求心性ニューロンなどの１次求心性ニューロン；例えば、侵害受容器）に導入すると、オプシンがニューロンで産生されて、オプシンは細胞膜へと挿入される。「オプシン」、「光応答性タンパク質」、「光応答性ポリペプチド」、「光活性化タンパク質」、及び「光活性化ポリペプチド」という用語は、本明細書では同じ意味で使用される。
【００２４】
場合によっては、オプシンを活性化させる波長の光に応答して細胞の過分極を提供するオプシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、ニューロン（例えば、１次求心性ニューロン；例えば、侵害受容器）におけるオプシンの発現を提供する。場合によっては、オプシンを活性化させる波長の光に応答して細胞の過分極を提供するオプシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、侵害受容器の亜集団におけるオプシンの発現を提供する。侵害受容器の亜集団に対する光活性化ポリペプチドの標的化発現は、ベクター（例えば、ＡＡＶ６；ＡＡＶ１；ＡＡＶ８など）の選択；プロモーターの選択；及び送達手段のうちの１つ以上によって達成することができる。例えば、坐骨神経への注入によって、無髄侵害受容器（推定Ｃ線維）における光活性化ポリペプチドの産生を提供することができる。
【００２５】
本開示は、疼痛、例えば、急性疼痛、慢性疼痛、神経障害性疼痛、侵害受容性疼痛、異痛、炎症性疼痛、炎症性痛覚過敏、神経障害、神経痛、糖尿病性神経障害、ヒト免疫不全ウイルス関連神経障害、神経損傷、関節リウマチ痛、変形性関節症疼痛、火傷、背部疼痛、眼痛、内臓痛、癌性疼痛（例えば、骨癌性疼痛）、歯痛、頭痛、偏頭痛、手根管症候群、線維筋痛症、神経炎、坐骨神経痛、骨盤過敏症、骨盤痛、ヘルペス後神経痛、術後疼痛、脳卒中後疼痛、及び月経痛などの疼痛を軽減する方法を提供する。
【００２６】
疼痛は、急性または慢性に分類され得る。急性疼痛は突然始まり、一時的である（通常、１２週以内）。急性疼痛は通常、特定の傷害などの特定の原因と関連し、多くの場合、鋭い痛みで重篤である。急性疼痛は、外科手術、歯科作業、筋挫傷、または捻挫から生じる特定の傷害後に生じ得る種類の疼痛である。急性疼痛は一般に、持続的な心理的反応は一切もたらさない。対照的に、慢性疼痛は長期間の疼痛であり、典型的には３か月より長く持続し、重大な心理的及び感情的問題をもたらす。慢性疼痛の一般的な例は、神経障害性疼痛（例えば、有痛性の糖尿病性神経障害、ヘルペス後神経痛）、手根管症候群、背部疼痛、頭痛、癌性疼痛、関節痛及び慢性術後疼痛である。場合によっては、本開示の方法は、急性疼痛の軽減に効果的である。場合によっては、本開示の方法は、慢性疼痛の軽減に効果的である。
【００２７】
臨床的疼痛は、不快感及び異常な感受性が、患者の症状の中でも特徴的になる場合に存在する。個体は、様々な疼痛症状を示し得る。このような症状は、１）鈍い、激しい、または鋭い場合がある自発痛；２）有害な刺激に対する過剰な疼痛応答（痛覚過敏）；及び３）正常な無害の刺激により生じる疼痛（異痛−Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｉｎ，  １３−４４）を含む。様々な形態の急性及び慢性疼痛に罹患している患者は、類似の症状を有する場合もあるが、根本的なメカニズムが異なる場合もあるため、異なる処置戦略を必要とする場合がある。従って、疼痛は、侵害受容性疼痛、炎症性疼痛、及び神経障害性疼痛を含む、異なる病態生理学による多数の異なるサブタイプに分割され得る。場合によっては、本開示の方法は、侵害受容性疼痛の軽減に効果的である。場合によっては、本開示の方法は、炎症性疼痛の軽減に効果的である。場合によっては、本開示の方法は、神経障害性疼痛の軽減に効果的である。
【００２８】
侵害受容性疼痛は、組織傷害によりまたは傷害を引き起こす可能性のある激しい刺激により誘発される。中程度から重度の急性侵害受容性疼痛は、中枢神経系外傷、筋挫傷／捻挫、火傷、心筋梗塞及び急性膵炎、術後疼痛（任意の種類の外科的処置後の疼痛）、外傷後疼痛、腎疝痛、癌性疼痛並びに背部疼痛からの目立った疼痛の特徴である。癌性疼痛は、腫瘍関連疼痛（例えば、骨痛、頭痛、顔面痛もしくは内臓痛）または癌治療に関連した疼痛（例えば、化学療法後症候群、慢性術後疼痛症候群もしくは放射線後症候群）などの慢性疼痛である場合がある。癌性疼痛はまた、化学療法、免疫療法、ホルモン療法または放射線療法に応答して生じる場合もある。背部疼痛は、ヘルニアもしくは破断した椎間板、または腰椎椎間関節、仙腸関節、傍脊柱筋群もしくは後縦靭帯の異常による場合がある。背部疼痛は、自然に解決する場合もあるが、一部の患者では１２週間を超えて持続し、特に消耗させ得る慢性状態になる。
【００２９】
神経障害性疼痛は、神経系において原発巣または機能不全により始まるまたは引き起こされる疼痛として規定され得る。神経障害性疼痛の病因としては、例えば、末梢神経障害、糖尿病性神経障害、ヘルペス後神経痛、三叉神経痛、背部疼痛、癌性神経障害、ＨＩＶ神経障害、幻肢痛、手根管症候群、中枢性脳卒中後疼痛、並びに慢性アルコール中毒、甲状腺機能低下症、尿毒症、多発性硬化症、脊髄傷害、パーキンソン病、てんかん、及びビタミン欠乏に関連した疼痛が挙げられる。
【００３０】
炎症プロセスは、複雑な一連の生化学的及び細胞的事象であり、組織傷害または異物の存在に応答して活性化され、腫脹及び疼痛をもたらす。関節痛は、一般的な炎症性疼痛である。
【００３１】
その他の種類の疼痛としては、筋肉痛、線維筋痛症、脊椎炎、血清反応陰性（非リウマチ性）関節症、非関節性リウマチ、ジストロフィン異常症、グリコーゲン分解、多発性筋炎及び化膿性筋炎を含む、筋骨格障害から生じる疼痛；扁桃炎、心筋梗塞、僧房弁狭窄、心膜炎、レイノー現象、強皮症及び骨格筋虚血により引き起こされる疼痛を含む、心臓及び血管痛；偏頭痛（前兆を伴う偏頭痛及び前兆を伴わない偏頭痛を含む）、群発頭痛、緊張型頭痛、混合型頭痛及び血管障害に関連した頭痛などの頭痛；並びに歯痛、耳痛、口腔灼熱症候群、及び顎関節筋膜痛を含む、口腔顔面痛が挙げられる。
【００３２】
場合によっては、疼痛を軽減する本方法は、侵害受容器（脊髄及び脳へと神経シグナルを送ることにより、潜在的な損傷刺激に応答する感覚ニューロン）へと、オプシンを活性化させる波長の光に応答して侵害受容器の過分極を提供するオプシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入し、それによって疼痛を軽減することを含む。侵害受容器は、熱侵害受容器、機械的侵害受容器、化学的侵害受容器、またはその他の種類の侵害受容器であり得る。侵害受容マーカーとしては、ＩＢ４、サブスタンスＰ、ＴＲＰＶ１、及びソマトスタチンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
疼痛が軽減されるか否かは、様々なペインスケールを使用してヒト対象にて決定することができる。患者自己申告を使用して、疼痛が軽減されるか否かを評価することができる；例えば、Ｋａｔｚ  ａｎｄ  Ｍｅｌｚａｃｋ  （１９９９）  Ｓｕｒｇ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．  ７９：２３１を参照。あるいは、観察的ペインスケールを使用することができる。ＬＡＮＳＳペインスケールを使用して、疼痛が軽減されるか否かを評価することができる；例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔ  （２００１）  Ｐａｉｎ  ９２：１４７を参照。視覚的アナログペインスケールを使用することができる；例えば、Ｓｃｈｍａｄｅｒ  （２００２）  Ｃｌｉｎ．  Ｊ．  Ｐａｉｎ  １８：３５０を参照。リッカート（Ｌｉｋｅｒｔ）ペインスケールを使用することができる；例えば、０は痛み無し、５は中程度の痛み、及び１０は考え得る最悪の痛み。小児用の自己申告ペインスケールとしては、例えば、フェイスペインスケール（Ｆａｃｅｓ  Ｐａｉｎ  Ｓｃａｌｅ）；ウォング・ベーカーフェイス疼痛評価スケール（Ｗｏｎｇ−Ｂａｋｅｒ  ＦＡＣＥＳ  Ｐａｉｎ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ）；及びカラーアナログスケール（Ｃｏｌｏｒｅｄ  Ａｎａｌｏｇ  Ｓｃａｌｅ）が挙げられる。成人用の自己申告ペインスケールとしては、例えば、視覚的アナログスケール（Ｖｉｓｕａｌ  Ａｎａｌｏｇ  Ｓｃａｌｅ）；口頭式数値的評価スケール（Ｖｅｒｂａｌ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ）；口頭式ディスクリプタスケール（Ｖｅｒｂａｌ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｓｃａｌｅ）；及び簡易疼痛調査票（Ｂｒｉｅｆ  Ｐａｉｎ  Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ）が挙げられる。疼痛測定スケールとしては、例えば、アルダーヘイトリアージペインスコア（Ａｌｄｅｒ  Ｈｅｙ  Ｔｒｉａｇｅ  Ｐａｉｎ  Ｓｃｏｒｅ）（Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ａｒｃｈ．  Ｄｉｓ．  Ｃｈｉｌｄ．  ８９：６２５）；行動性ペインスケール（Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  Ｐａｉｎ  Ｓｃａｌｅ）（Ｐａｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２９：２２５８）；簡易疼痛調査票（Ｂｒｉｅｆ  Ｐａｉｎ  Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ）（Ｃｌｅｅｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｒｙａｎ  （１９９４）  Ａｎｎ．  Ａｃａｄ．  Ｍｅｄ．  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  ２３：１２９）；非言語的疼痛指標のチェックリスト（Ｃｈｅｃｋｌｉｓｔ  ｏｆ  Ｎｏｎｖｅｒｂａｌ  Ｐａｉｎ  Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ）（Ｆｅｌｄｔ  （２０００）  Ｐａｉｎ  Ｍａｎａｇ．  Ｎｕｒｓ．  １：１３）；クリティカルケア疼痛観察ツール（Ｃｒｉｔｉｃａｌ−Ｃａｒｅ  Ｐａｉｎ  Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｔｏｏｌ）（Ｇｅｌｉｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  １５：４２０）；ＣＯＭＦＯＲＴスケール（Ａｍｂｕｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｊ．  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｐｓｙｃｈｏｌ．  １７：９５）；Ｄａｌｌａｓ疼痛質問票（Ｐａｉｎ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）（Ｏｚｇｕｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｓｐｉｎｅ  ２７：１７８３）；ドロリメーター疼痛指標（Ｄｏｌｏｒｉｍｅｔｅｒ  Ｐａｉｎ  Ｉｎｄｅｘ）（Ｈａｒｄｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９５２）  Ｐａｉｎ  Ｓｅｎｓａｔｉｏｎｓ  ａｎ��  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：Ｔｈｅ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｃｏ．）；改訂版フェイスペインスケール（Ｆａｃｅｓ  Ｐａｉｎ  Ｓｃａｌｅ  −  Ｒｅｖｉｓｅｄ）（Ｈｉｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｐａｉｎ  ９３：１７３）；表情、脚、活動性、泣き声、あやしやすさのスケール（Ｆａｃｅ  Ｌｅｇｓ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｃｒｙ  Ｃｏｎｓｏｌａｂｉｌｉｔｙ  Ｓｃａｌｅ）；マクギル疼痛質問票（ＭｃＧｉｌｌ  Ｐａｉｎ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）（Ｍｅｌｚａｃｋ  （１９７５）  Ｐａｉｎ  １：２７７）；ディスクリプタ差異スケール（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃａｌｅ）（Ｇｒａｃｅｌｙ  ａｎｄ  Ｋｗｉｌｏｓｚ  （１９８８）  Ｐａｉｎ  ３５：２７９）；数値的１１ポイントボックス（Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  １１  ｐｏｉｎｔ  Ｂｏｘ）（Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｃｌｉｎ．  Ｊ．  Ｐａｉｎ  ５：１５３）；数値的評価スケール（Ｎｕｍｅｒｉｃ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ）（Ｈａｒｔｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｐａｉｎ  Ｐｒａｃｔ．  ３：３１０）；ウォング・ベーカーフェイス疼痛評価スケール（Ｗｏｎｇ−Ｂａｋｅｒ  ＦＡＣＥＳ  Ｐａｉｎ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ）；及び視覚的アナログスケール（Ｖｉｓｕａｌ  Ａｎａｌｏｇ  Ｓｃａｌｅ）（Ｈｕｓｋｉｓｓｏｎ  （１９８２）  Ｊ．  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．  ９：７６８）が挙げられる。
【００３４】
場合によっては、ニューロン（例えば、侵害受容器）で発現するオプシンを活性化させるのに使用される光は、約０．０５ｍＷ／ｍｍ２〜約０．１ｍＷ／ｍｍ２、約０．１ｍＷ／ｍｍ２〜約０．２ｍＷ／ｍｍ２、約０．２ｍＷ／ｍｍ２〜約０．３ｍＷ／ｍｍ２、約０．３ｍＷ／ｍｍ２〜約０．４ｍＷ／ｍｍ２、約０．４ｍＷ／ｍｍ２〜約０．５ｍＷ／ｍｍ２、約０．５ｍＷ／ｍｍ２〜約０．６ｍＷ／ｍｍ２、約０．６ｍＷ／ｍｍ２〜約０．７ｍＷ／ｍｍ２、約０．７ｍＷ／ｍｍ２〜約０．８ｍＷ／ｍｍ２、約０．８ｍＷ／ｍｍ２〜約０．９ｍＷ／ｍｍ２、または約０．９ｍＷ／ｍｍ２〜約１．０ｍＷ／ｍｍ２の強度を有する。場合によっては、ニューロン（例えば、侵害受容器）で発現するオプシンを活性化させるのに使用される光は、約１．０ｍＷ／ｍｍ２〜約１．１ｍＷ／ｍｍ２、約１．１ｍＷ／ｍｍ２〜約１．２ｍＷ／ｍｍ２、約１．２ｍＷ／ｍｍ２〜約１．３ｍＷ／ｍｍ２、１．３ｍＷ／ｍｍ２〜約１．４ｍＷ／ｍｍ２、約１．４ｍＷ／ｍｍ２〜約１．５ｍＷ／ｍｍ２、約１．５ｍＷ／ｍｍ２〜約１．６ｍＷ／ｍｍ２、約１．６ｍＷ／ｍｍ２〜約１．７ｍＷ／ｍｍ２、約１．７ｍＷ／ｍｍ２〜約１．８ｍＷ／ｍｍ２、約１．８ｍＷ／ｍｍ２〜約１．９ｍＷ／ｍｍ２、約１．９ｍＷ／ｍｍ２〜約２．０ｍＷ／ｍｍ２、約２．０ｍＷ／ｍｍ２〜約２．５ｍＷ／ｍｍ２、約２．５ｍＷ／ｍｍ２〜約３ｍＷ／ｍｍ２、約３ｍＷ／ｍｍ２〜約３．５ｍＷ／ｍｍ２、約３．５ｍＷ／ｍｍ２〜約４ｍＷ／ｍｍ２、約４ｍＷ／ｍｍ２〜約４．５ｍＷ／ｍｍ２、約４．５ｍＷ／ｍｍ２〜約５ｍＷ／ｍｍ２、約５ｍＷ／ｍｍ２〜約５．５ｍＷ／ｍｍ２、約５．５ｍＷ／ｍｍ２〜約６ｍＷ／ｍｍ２、約６ｍＷ／ｍｍ２〜約７ｍＷ／ｍｍ２、または約７ｍＷ／ｍｍ２〜約１０ｍＷ／ｍｍ２の強度を有する。場合によっては、ニューロン（例えば、侵害受容器）で発現するオプシンを活性化させるのに使用される光は、約０．０５ｍＷ／ｍｍ２〜約０．１ｍＷ／ｍｍ２の強度を有する。場合によっては、ニューロン（例えば、侵害受容器）で発現するオプシンを活性化させるのに使用される光は、約０．２５ｍＷ／ｍｍ２の強度を有する。場合によっては、ニューロン（例えば、侵害受容器）で発現するオプシンを活性化させるのに使用される光は、約１ｍＷ／ｍｍ２の強度を有する。
【００３５】
場合によっては、光は、経皮的に（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｌｙ）または経皮で（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）送達される。場合によっては、埋め込み型光源が使用されて；光は体内の部位へと送達される。場合によっては、光は体内の処置部位へと送達される。場合によっては、光は、頭蓋内に送達される。
【００３６】
オプシンを活性化させる波長の光に応答して細胞の過分極を提供するオプシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、任意の便利な手段によってニューロン（例えば、侵害受容器）内に導入することができる。例えば、オプシンを活性化させる波長の光に応答して細胞の過分極を提供するオプシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、神経束または神経線維内に導入（例えば、注射）することができ、その結果、核酸をニューロン（例えば、侵害受容器）に導入し、オプシンがニューロンで産生されて、細胞膜へと挿入される。オプシンを活性化させる波長の光に応答して細胞の過分極を提供するオプシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、神経の近位に導入（例えば、注射）することができる。定位的注入を使用することができる；例えば、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ，  ７３：３４２４３４２９，  １９９９；Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  ＰＮＡＳ，  ９７：３４２８−３４３２，  ２０００；Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ３：２１９−２２３，  １９９３；及びＡｌｉｓｋｙ  ＆  Ｄａｖｉｄｓｏｎ，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １１：２３１５−２３２９，  ２０００を参照し、各々の内容について、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３７】
オプシンを活性化させる波長の光に応答して細胞の過分極を提供するオプシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、筋肉内に導入（例えば、注射）することができる。オプシンを活性化させる波長の光に応答して細胞の過分極を提供するオプシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、例えば、静脈内、筋肉内、頭蓋内を含む任意の手段によって、神経に、処置部位にまたはその近傍などに投与されることができる。オプシンをコードする核酸の投与は、注射により；光活性化ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物の処置部位での、もしくはその近傍での注入により；カテーテルにより；または任意のその他送達手段により実施することができる。オプシンをコードする核酸の投与は、局所、皮内、静脈内、髄腔内、または胸腔内投与により実施することができる。オプシンをコードする核酸の投与は、皮内投与により実施することができる。
【００３８】
光活性化タンパク質（オプシン）は、多数の異なる方法を使用して、神経にまたは神経の近位に注入することができる。例となる方法としては、ゼラチンカプセル、液体注射剤などの様々な送達デバイスの使用が挙げられるが、これらに限定されない。そのような方法としては、身体部位への注入またはさもなければ到達のための、フレームまたはコンピュータ制御手術ナビゲーションシステムなどの定位手術技術の使用も挙げられる。
【００３９】
場合によっては、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、疼痛に関与するニューロンへと直接送達することが可能で、その送達は、定位的注入またはＸ線透視によるなどの、当該技術分野において公知の神経外科的技術を使用して、針、カテーテル、または関連デバイスで実施することができる。対象となる神経に、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を送達するその他の方法も使用することができ、イオン性脂質もしくはポリマーによるトランスフェクション、エレクトロポレーション、光学的トランスフェクション、インペールフェクション、または遺伝子銃によるなどであるが、これらに限定されない。
【００４０】
過分極のための光応答性ポリペプチド
上述のように、本開示による疼痛を制御する方法は概して、個体のニューロンへと、光活性化ポリペプチドを活性化させる波長の光に応答して細胞の過分極を提供する光活性化ポリペプチド（オプシン）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入することを含む。光活性化ポリペプチドは、該タンパク質が活性化波長の光で照射された時に１つ以上のイオンが標的細胞の原形質膜を通過するのを可能にする、ポリペプチドであり得る。光活性化タンパク質は、光の光子当たり、原形質膜を介した少数のイオンの通過を促進させるイオンポンプタンパク質として、またはチャネルが開いている時にイオン流を原形質膜を介して自由に流れさせるイオンチャネルタンパク質として特徴付けられる場合もある。疼痛を軽減する本方法にて使用するための好適な光活性化タンパク質は、過分極のための光活性化ポリペプチドを含む。
【００４１】
好適な光応答性ポリペプチドの例としては、例えば、光応答性クロライドポンプのハロロドプシン（Ｈａｌｏｒｈｏｄｏｐｓｉｎ）ファミリー（例えば、ＮｐＨＲ、ＮｐＨＲ２．０、ＮｐＨＲ３．０、ＮｐＨＲ３．１）が挙げられる。別の例として、ＧｔＲ３プロトンポンプを使用し、光に応答して神経細胞膜過分極を促進することができる。別の例として、ｅＡｒｃｈ（プロトンポンプ）を使用し、光に応答して神経細胞膜過分極を促進することができる。別の例として、ＡｒｃｈＴオプシンタンパク質またはＭａｃオプシンタンパク質を使用し、光に応答して神経細胞膜過分極を促進することができる。
【００４２】
増強された細胞内輸送アミノ酸モチーフ
いくつかの実施形態では、細胞にて発現する光応答性オプシンタンパク質は、シグナルペプチド、ＥＲ搬出シグナル、膜輸送シグナル、及び／またはＮ末端ゴルジ搬出シグナルから成る群から選択される１つ以上のアミノ酸配列モチーフに融合することができる。哺乳類細胞の原形質膜への光応答性タンパク質輸送を増強する１つ以上のアミノ酸配列モチーフは、光応答性タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方に融合することができる。場合によっては、哺乳類細胞の原形質膜への光応答性タンパク質輸送を増強する１つ以上のアミノ酸配列モチーフは、光活性化ポリペプチド内の内部に融合する。所望により、光応答性タンパク質及び１つ以上のアミノ酸配列モチーフは、リンカーによって分離されてよい。いくつかの実施形態では、光応答性タンパク質は、細胞原形質膜へのタンパク質の輸送を増強する輸送シグナル（ｔｓ）の付加によって修飾されることができる。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来することができる。その他の実施形態では、輸送シグナルは、アミノ酸配列
2019194228.tif 000002
を含むことができる。
【００４３】
使用に好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１
2019194228.tif 000003
の輸送配列のようなアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【００４４】
輸送配列は、約１０アミノ酸〜約５０アミノ酸、例えば、約１０アミノ酸〜約２０アミノ酸、約２０アミノ酸〜約３０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約４０アミノ酸、または約４０アミノ酸〜約５０アミノ酸の長さを有することができる。
【００４５】
使用に好適なシグナル配列は、以下の１つなどのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる：
１）ｈＣｈＲ２のシグナルペプチド
2019194228.tif 000004
２）ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ２サブユニットシグナルペプチド
2019194228.tif 000005
；
３）ニコチン性アセチルコリン受容体シグナル配列
2019194228.tif 000006
；及び
４）ニコチン性アセチルコリン受容体シグナル配列
2019194228.tif 000007
。
【００４６】
シグナル配列は、約１０アミノ酸〜約５０アミノ酸、例えば、約１０アミノ酸〜約２０アミノ酸、約２０アミノ酸〜約３０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約４０アミノ酸、または約４０アミノ酸〜約５０アミノ酸の長さを有することができる。
【００４７】
修飾されたオプシンでの使用に好適なＥＲ搬出配列としては、例えば、
2019194228.tif 000008
などを含む。ＥＲ搬出配列は、約５アミノ酸〜約２５アミノ酸、例えば、約５アミノ酸〜約１０アミノ酸、約１０アミノ酸〜約１５アミノ酸、約１５アミノ酸〜約２０アミノ酸、または約２０アミノ酸〜約２５アミノ酸の長さを有することができる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、タンパク質におけるシグナルペプチド配列は、欠失させることができ、または異なるタンパク質からのシグナルペプチド配列で置換することができる。
【００４９】
Ａｒｃｈ
いくつかの実施形態では、好適な光活性化タンパク質は、細胞が光で照射された時に細胞の原形質膜を越えて１つ以上のプロトンを輸送できる、アーキロドプシン（Ａｒｃｈａｅｒｈｏｄｏｐｓｉｎ）（Ａｒｃｈ）プロトンポンプ（例えば、ハロラブラム・ソドメンセ（Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ  ｓｏｄｏｍｅｎｓｅ）に由来するプロトンポンプ）である。光は、約５３０〜約５９５ｎｍの間の波長を有することができ、または約５６０ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態では、Ａｒｃｈタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（Ａｒｃｈ）に示した配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。Ａｒｃｈタンパク質は、光に対する感受性を増大もしくは減少させるために、特定の光の波長に対する感受性を増大もしくは減少させるために、及び／または標的細胞の原形質膜を越えてイオンを輸送するＡｒｃｈタンパク質の能力を増大もしくは減少させるために、天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び／または挿入を更に含むことができる。加えて、Ａｒｃｈタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含有することができる。天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び／または挿入を含むＡｒｃｈタンパク質は、光に応答して標的細胞の原形質膜を越えてイオンを輸送する能力を適切に保持する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、Ａｒｃｈタンパク質は、シグナルペプチド、ＥＲ搬出シグナル、及び膜輸送シグナルから成る群から選択される、標的細胞の原形質膜への輸送を増強する少なくとも１つの（１、２、３、またはそれ以上などの）アミノ酸配列モチーフを含む。いくつかの実施形態では、Ａｒｃｈタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド及びＣ末端ＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態では、Ａｒｃｈタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド及びＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態では、Ａｒｃｈタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナル、及びＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態では、Ａｒｃｈタンパク質は、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナル及びＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナル及びＣ末端輸送シグナルは、リンカーにより連結されている。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸の長さのいずれかを含むことができる。リンカーは、蛍光タンパク質、例えば、限定されないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質を更に含んでよい。いくつかの実施形態では、ＥＲ搬出シグナルは、輸送シグナルよりもさらにＣ末端側に位置する。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ＥＲ搬出シグナルよりもさらにＣ末端側に位置する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来することができる。その他の実施形態では、輸送シグナルは、アミノ酸配列
2019194228.tif 000009
を含むことができる。使用に好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１
2019194228.tif 000010
の輸送配列のようなアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。場合によっては、ＥＲ搬出シグナルは、例えば、
2019194228.tif 000011
などである。
【００５２】
ＡｒｃｈＴ
いくつかの実施形態では、好適な光活性化タンパク質は、細胞が光で照射された時に細胞の原形質膜を越えて１つ以上のプロトンを輸送できる、アーキロドプシン（ＡｒｃｈＴ）プロトンポンプ（例えば、ハロラブラム（Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ）属ＴＰ００９に由来するプロトンポンプ）である。光は、約５３０〜約５９５ｎｍの間の波長を有することができ、または約５６０ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態では、Ａｒｃｈタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＡｒｃｈＴ）に示した配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。ＡｒｃｈＴタンパク質は、光に対する感受性を増大もしくは減少させるために、特定の光の波長に対する感受性を増大もしくは減少させるために、及び／または標的細胞の原形質膜を越えてイオンを輸送するＡｒｃｈＴタンパク質の能力を増大もしくは減少させるために、天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び／または挿入を更に含むことができる。加えて、ＡｒｃｈＴタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含有することができる。天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び／または挿入を含むＡｒｃｈＴタンパク質は、光に応答して標的細胞の原形質膜を越えてイオンを輸送する能力を適切に保持する。
【００５３】
場合によっては、ＡｒｃｈＴポリペプチドは、膜輸送シグナル及び／またはＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来することができる。その他の実施形態では、輸送シグナルは、アミノ酸配列
2019194228.tif 000012
を含むことができる。使用に好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１
2019194228.tif 000013
の輸送配列のようなアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。場合によっては、ＥＲ搬出シグナルは、例えば、
2019194228.tif 000014
などである。
【００５４】
ＧｔＲ３
いくつかの実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、青色光に応答することができ、ギラルディア・テータ（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ  ｔｈｅｔａ）に由来することが可能で、このプロトンポンプタンパク質は、細胞が青色光で照射された時に、細胞における過分極電流の媒介を可能にすることができる。光は、約４５０〜約４９５ｎｍの間の波長を有することができ、または約４９０ｎｍの波長を有することができる。別の実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４（ＧｔＲ３）に示した配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができる。光応答性プロトンポンプタンパク質は、光に対する感受性を増大もしくは減少させるために、特定の光の波長に対する感受性を増大もしくは減少させるために、及び／または細胞の原形質膜の分極状態を調節する光応答性プロトンポンプタンパク質の能力を増大もしくは減少させるために、天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び／または挿入を更に含むことができる。加えて、光応答性プロトンポンプタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含有することができる。天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び／または挿入を含む光応答性プロトンポンプタンパク質は、光に応答してニューロン細胞の原形質膜を過分極化する能力を適切に保持する。
【００５５】
本明細書で開示された方法のその他の態様では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示した配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列、並びにシグナルペプチド、ＥＲ搬出シグナル、及び膜輸送シグナルから成る群から選択される、哺乳類細胞の原形質膜への輸送を増強する少なくとも１つの（１、２、３、またはそれ以上などの）アミノ酸配列モチーフを含むことができる。いくつかの実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド及びＣ末端ＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド及びＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナル、及びＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナル及びＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナル及びＣ末端輸送シグナルは、リンカーにより連結されている。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸の長さのいずれかを含むことができる。リンカーは、蛍光タンパク質、例えば、限定されないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質を更に含んでよい。いくつかの実施形態では、ＥＲ搬出シグナルは、輸送シグナルよりもさらにＣ末端側に位置するる。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ＥＲ搬出シグナルよりもさらにＣ末端側に位置する。
【００５６】
いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来することができる。その他の実施形態では、輸送シグナルは、アミノ酸配列
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を含むことができる。使用に好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１
2019194228.tif 000016
の輸送配列のようなアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。場合によっては、ＥＲ搬出シグナルは、例えば、
2019194228.tif 000017
などである。
【００５７】
本明細書においては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示した配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列を含む光応答性プロトンポンプタンパク質などの、本明細書に記載された光応答性プロトンポンプタンパク質のいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドもまた提供される。本明細書においては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示した配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列を含む光応答性プロトンポンプタンパク質などの、本明細書に記載されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（本明細書に記載されたウイルスベクターなどの）もまた提供される。
【００５８】
Ｏｘｙ
いくつかの実施形態では、光活性化タンパク質は、細胞が光で照射された時に細胞の原形質膜を越えて１つ以上のプロトンを輸送できる、オキシリス・マリーナ（Ｏｘｙｒｒｈｉｓ  ｍａｒｉｎａ）（Ｏｘｙ）プロトンポンプである。光は、約５００〜約５６０ｎｍの間の波長を有することができ、または約５３０ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態では、Ｏｘｙタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示した配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。Ｏｘｙタンパク質は、光に対する感受性を増大もしくは減少させるために、特定の光の波長に対する感受性を増大もしくは減少させるために、及び／または標的細胞の原形質膜を越えてイオンを輸送するＯｘｙタンパク質の能力を増大もしくは減少させるために、天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び／または挿入を更に含むことができる。加えて、Ｏｘｙタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含有することができる。天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び／または挿入を含むＯｘｙタンパク質は、光に応答して標的細胞の原形質膜を越えてイオンを輸送する能力を適切に保持する。
【００５９】
いくつかの実施形態では、Ｏｘｙタンパク質は、シグナルペプチド、ＥＲ搬出シグナル、及び膜輸送シグナルから成る群から選択される、標的細胞の原形質膜への輸送を増強する少なくとも１つの（１、２、３、またはそれ以上などの）アミノ酸配列モチーフを含む。いくつかの実施形態では、Ｏｘｙタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド及びＣ末端ＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態では、Ｏｘｙタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド及びＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態では、Ｏｘｙタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナル、及びＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態では、Ｏｘｙタンパク質は、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナル及びＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナル及びＣ末端輸送シグナルは、リンカーにより連結されている。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸の長さのいずれかを含むことができる。リンカーは、蛍光タンパク質、例えば、限定されないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質を更に含んでよい。いくつかの実施形態では、ＥＲ搬出シグナルは、輸送シグナルよりもさらにＣ末端側に位置する。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ＥＲ搬出シグナルよりもさらにＣ末端側に位置する。
【００６０】
Ｍａｃ
いくつかの実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、光に応答することができ、レプトスフェリア・マキュランス（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍａｃｕｌａｎｓ）に由来することが可能で、このプロトンポンプタンパク質は、細胞が５２０ｎｍ〜５６０ｎｍの光で照射された時に、細胞膜を越えたプロトンの輸送を可能にすることができる。光は、約５２０ｎｍ〜約５６０ｎｍの間の波長を有することができる。別の実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７（Ｍａｃ；Ｍａｃ３．０）に示した配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができる。光応答性プロトンポンプタンパク質は、光に対する感受性を増大もしくは減少させるために、特定の光の波長に対する感受性を増大もしくは減少させるために、及び／または細胞の原形質膜の分極状態を調節する光応答性プロトンポンプタンパク質の能力を増大もしくは減少させるために、天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び／または挿入を更に含むことができる。加えて、光応答性プロトンポンプタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含有することができる。天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び／または挿入を含む光応答性プロトンポンプタンパク質は、光に応答してニューロン細胞の原形質膜を越えてプロトンを送る能力を適切に保持する。
【００６１】
本明細書で開示された方法のその他の態様では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示した配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列、並びにシグナルペプチド、ＥＲ搬出シグナル、及び膜輸送シグナルから成る群から選択される、哺乳類細胞の原形質膜への輸送を増強する少なくとも１つの（１、２、３、またはそれ以上などの）アミノ酸配列モチーフを含むことができる。いくつかの実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド及びＣ末端ＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド及びＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナル、及びＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナル及びＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナル及びＣ末端輸送シグナルは、リンカーにより連結されている。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸の長さのいずれかを含むことができる。リンカーは、蛍光タンパク質、例えば、限定されないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質を更に含んでよい。いくつかの実施形態では、ＥＲ搬出シグナルは、輸送シグナルよりもさらにＣ末端側に位置する。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ＥＲ搬出シグナルよりもさらにＣ末端側に位置する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来することができる。その他の実施形態では、輸送シグナルは、アミノ酸配列
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を含むことができる。使用に好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１
2019194228.tif 000019
の輸送配列のようなアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。場合によっては、ＥＲ搬出シグナルは、例えば、
2019194228.tif 000020
などである。
【００６３】
本明細書においては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示した配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列を含む光応答性プロトンポンプタンパク質などの、本明細書に記載された光応答性プロトンポンプタンパク質のいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドもまた提供される。本明細書においては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示した配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列を含む光応答性プロトンポンプタンパク質などの、本明細書に記載されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（本明細書に記載されたウイルスベクターなどの）もまた提供される。
【００６４】
光活性化プロトンポンプタンパク質に関する更なる開示は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２８８９３号に見出すことができ、その開示は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６５】
ＮｐＨＲ
場合によっては、上記ニューロンの原形質膜上に発現した好適な光応答性クロライドポンプタンパク質は、ナトロノモナス・ファラオニス（Ｎａｔｒｏｎｏｍｏｎａｓ  ｐｈａｒａｏｎｉｓ）に由来することができる。いくつかの実施形態では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、赤色光のみならず琥珀色光にも応答でき、光応答性クロライドポンプタンパク質が琥珀色光または赤色光で照射された時に、ニューロンにて過分極電流を媒介することができる。光応答性クロライドポンプを活性化することのできる光の波長は、約５８０〜６３０ｎｍの間であり得る。いくつかの実施形態では、光は約５８９ｎｍの波長であり得て、または光は約６３０ｎｍ超（例えば、約７４０ｎｍ未満）の波長を有することができる。別の実施形態では、光は、約６３０ｎｍの波長を有する。いくつかの実施形態では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、光の連続パルスに曝露される時、少なくとも約９０分間神経膜を過分極化することができる。いくつかの実施形態では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示した配列と少なくとも約７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができる。更に、光応答性クロライドポンプタンパク質は、光に対する感受性を増大もしくは減少させるために、特定の光の波長に対する感受性を増大もしくは減少させるために、及び／または細胞の原形質膜の分極状態を調節する光応答性タンパク質の能力を増大もしくは減少させるために、天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び／または挿入を含むことができる。いくつかの実施形態では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含有する。いくつかの実施形態では、光応答性タンパク質は、１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含有する。天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び／または挿入を含む光応答性タンパク質は、光に応答してニューロン細胞の原形質膜を過分極化する能力を適切に保持する。
【００６６】
加えて、その他の態様では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示した配列と少なくとも約７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列及び小胞体（ＥＲ）搬出シグナルを含むことができる。このＥＲ搬出シグナルは、コアアミノ酸配列のＣ末端に融合でき、またはコアアミノ酸配列のＮ末端に融合することができる。いくつかの実施形態では、ＥＲ搬出シグナルは、リンカーによってコアアミノ酸配列に連結されている。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸の長さのいずれかを含むことができる。リンカーは、蛍光タンパク質、例えば、限定されないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質を更に含んでよい。いくつかの実施形態では、ＥＲ搬出シグナルは、アミノ酸配列
2019194228.tif 000021
を含むことができ、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり得る。別の実施形態では、ＥＲ搬出シグナルは、アミノ酸配列
2019194228.tif 000022
を含むことができ、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、ＥＲ搬出シグナルは、アミノ酸配列
2019194228.tif 000023
を含むことができる。
【００６７】
本開示の修飾されたオプシンでの使用に好適な小胞体（ＥＲ）搬出配列としては、例えば、
2019194228.tif 000024
などが挙げられる。ＥＲ搬出配列は、約５アミノ酸〜約２５アミノ酸、例えば、約５アミノ酸〜約１０アミノ酸、約１０アミノ酸〜約１５アミノ酸、約１５アミノ酸〜約２０アミノ酸、または約２０アミノ酸〜約２５アミノ酸の長さを有することができる。
【００６８】
その他の態様では、本明細書に記載された光応答性クロライドポンプタンパク質は、細胞膜上に発現した光応答性タンパク質を含むことができ、このタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示した配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列及び輸送シグナル（例えば、このシグナルにより、光応答性クロライドポンプタンパク質の、原形質膜への輸送を増強することができる）を含む。輸送シグナルは、コアアミノ酸配列のＣ末端に融合してよく、またはコアアミノ酸配列のＮ末端に融合してよい。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸の長さのいずれかを含むことができるリンカーによって、コアアミノ酸配列に連結され得る。リンカーは、蛍光タンパク質、例えば、限定されないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質を更に含んでよい。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来することができる。その他の実施形態では、輸送シグナルは、アミノ酸配列
2019194228.tif 000025
を含むことができる。
【００６９】
いくつかの態様では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示した配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列、並びにＥＲ搬出シグナル、シグナルペプチド、及び膜輸送シグナルから成る群から選択される、哺乳類細胞の原形質膜への輸送を増強する少なくとも１つの（１、２、３、またはそれ以上などの）アミノ酸配列モチーフを含むことができる。いくつかの実施形態では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナル、及びＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナル及びＣ末端輸送シグナルは、リンカーにより連結され得る。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸の長さのいずれかを含むことができる。リンカーは、蛍光タンパク質、例えば、限定されないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質も更に含むことができる。いくつかの実施形態では、ＥＲ搬出シグナルは、輸送シグナルよりもさらにＣ末端側に位置し得る。その他の実施形態では、輸送シグナルは、ＥＲ搬出シグナルよりもさらにＣ末端側に位置する。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、アミノ酸配列
2019194228.tif 000026
を含む。別の実施形態では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。
【００７０】
更に、その他の態様では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示した配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列を含むことができ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のＮ末端シグナルペプチドは、欠失または置換される。いくつかの実施形態では、その他のシグナルペプチド（その他のオプシンからのシグナルペプチドなど）を使用することができる。光応答性タンパク質は、本明細書に記載されたＥＲ輸送シグナル及び／または膜輸送シグナルを更に含むことができる。いくつかの実施形態では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。
【００７１】
いくつかの実施形態では、光応答性オプシンタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示した配列と少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むＮｐＨＲオプシンタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＮｐＨＲオプシンタンパク質は、小胞体（ＥＲ）搬出シグナル及び／または膜輸送シグナルを更に含む。例えば、ＮｐＨＲオプシンタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示した配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列及び小胞体（ＥＲ）搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示した配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列は、リンカーを介してＥＲ搬出シグナルに連結されている。いくつかの実施形態では、ＥＲ搬出シグナルは、アミノ酸配列
2019194228.tif 000027
を含み、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり得る。別の実施形態では、ＥＲ搬出シグナルは、アミノ酸配列ＶＸＸＳＬを含み、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、ＥＲ搬出シグナルは、アミノ酸配列
2019194228.tif 000028
を含む。いくつかの実施形態では、ＮｐＨＲオプシンタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示した配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、ＥＲ搬出シグナル、及び膜輸送シグナルを含む。その他の実施形態では、ＮｐＨＲオプシンタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示した配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、ＥＲ搬出シグナル、及び膜輸送シグナルを含む。その他の実施形態では、ＮｐＨＲオプシンタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示した配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、膜輸送シグナル、及びＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態では、膜輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。いくつかの実施形態では、膜輸送シグナルは、アミノ酸配列
2019194228.tif 000029
を含む。いくつかの実施形態では、膜輸送シグナルは、リンカーにより、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示した配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列に連結されている。いくつかの実施形態では、膜輸送シグナルは、リンカーを介してＥＲ搬出シグナルに連結されている。リンカーは、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸の長さのいずれかを含んでよい。リンカーは、蛍光タンパク質、例えば、限定されないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質を更に含んでよい。いくつかの実施形態では、光応答性オプシンタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、光応答性オプシンタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、光応答性オプシンタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８のアミノ酸配列を含む。
【００７２】
本明細書においては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示した配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列を含む光応答性タンパク質などの、本明細書に記載された光応答性クロライドイオンポンプタンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチド、ＥＲ搬出シグナル、及び膜輸送シグナルもまた提供される。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８と少なくとも９５％同一のアミノ酸をコードする配列を含む。ポリヌクレオチドは、発現ベクター（限定されないが、本明細書に記載されたウイルスベクターなど）中にあってよい。ポリヌクレオチドは、光応答性クロライドイオンポンプタンパク質の発現のために使用してよい。
【００７３】
光応答性クロライドポンプタンパク質に関する更なる開示は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２８８９３号のみならず、米国特許出願公開第２００９／００９３４０３号及び同第２０１０／０１４５４１８号に見出すことができ、各々の開示について、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００７４】
ドナリエラ・サリナ光活性化ポリペプチド
いくつかの実施形態では、好適な光応答性イオンチャネルタンパク質は、４７０ｎｍ〜５１０ｎｍの光に応答することができ、ドナリエラ・サリナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ）に由来することが可能で、このイオンチャネルタンパク質は、細胞が光で照射された時に、細胞における過分極電流の媒介を可能にすることができる。光は、約４７０ｎｍ〜約５１０ｎｍの間の波長を有することができ、または約４９０ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態では、光応答性イオンチャネルタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示した配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができる。光応答性イオンチャネルタンパク質は、光に対する感受性を増大もしくは減少させるために、特定の光の波長に対する感受性を増大もしくは減少させるために、及び／または細胞の原形質膜の分極状態を調節する光応答性イオンチャネルタンパク質の能力を増大もしくは減少させるために、天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び／または挿入を更に含むことができる。加えて、光応答性イオンチャネルタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含有することができる。天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び／または挿入を含む光応答性イオンチャネルタンパク質は、光に応答してニューロン細胞の原形質膜を越えてイオンを輸送する能力を適切に保持する。
【００７５】
本明細書で開示された方法のその他の態様では、光応答性イオンチャネルタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示した配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列、並びにシグナルペプチド、ＥＲ搬出シグナル、及び膜輸送シグナルから成る群から選択される、哺乳類細胞の原形質膜への輸送を増強する少なくとも１つの（１、２、３、またはそれ以上などの）アミノ酸配列モチーフを含むことができる。いくつかの実施形態では、光応答性プロトンイオンチャネルは、Ｎ末端シグナルペプチド及びＣ末端ＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態では、光応答性イオンチャネルタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド及びＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態では、光応答性イオンチャネルタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナル、及びＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態では、光応答性イオンチャネルタンパク質は、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナル及びＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナル及びＣ末端輸送シグナルは、リンカーにより連結されている。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸の長さのいずれかを含むことができる。リンカーは、蛍光タンパク質、例えば、限定されないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質を更に含んでよい。いくつかの実施形態では、ＥＲ搬出シグナルは、輸送シグナルよりもさらにＣ末端側に位置する。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ＥＲ搬出シグナルよりもさらにＣ末端側に位置する。
【００７６】
本明細書においては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示した配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列を含む光応答性イオンチャネルタンパク質などの、本明細書に記載された光応答性チャネルタンパク質のいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドもまた提供される。本明細書においては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示した配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列を含む光応答性チャネルタンパク質などの、本明細書に記載されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（本明細書に記載されたウイルスベクターなどの）もまた提供される。
【００７７】
ポリヌクレオチド及びベクター
上述のように、本開示による疼痛を制御する方法は概して、個体のニューロン（例えば、侵害受容器）へと、オプシンを活性化させる波長の光に応答して細胞の過分極を提供するオプシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入することを含む。好適な核酸は、本明細書に記載された光活性化ポリペプチド（オプシン）（例えば、本明細書に記載されたような１つ以上の光活性化ポリペプチド）のうちの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは発現カセットを含み、この発現カセットは、標的細胞でポリヌクレオチドによってコードされる１つ以上のタンパク質を発現させるのに利用される複数の構成要素（例えば、コード配列；転写制御配列など）を含有する。
【００７８】
いくつかの実施形態では、光活性化ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部分は、プロモーター配列に機能的に連結されている。標的細胞内で機能する任意の好適なプロモーターは、光活性化ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のために使用できる。ある種の実施形態では、プロモーター配列は、特定のニューロンまたは全ニューロンプロモーターなどの、特定の標的細胞タイプにまたは特定の組織タイプに特異的なプロモーターであり得る。プロモーターの開始制御領域は、特定の動物細胞におけるポリヌクレオチドの発現を推進するのに有用であり、数が多く、当業者に周知である。本ポリヌクレオチドの発現を推進できる実質的に任意のプロモーターを使用することができる。いくつかの実施形態では、本タンパク質の発現を推進するのに使用されるプロモーターは、Ｔｈｙ１プロモーターであり得る（例えば、Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，  １６（１０）：１１６１−１１６６を参照）。いくつかの実施形態では、本タンパク質の発現を推進するのに使用されるプロモーターは、ヒトシナプシン（ｈＳｙｎ）プロモーター、ヒト伸長因子１−α（ＥＦ１α）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーター、シナプシン−Ｉプロモーター（例えば、ヒトシナプシン−Ｉプロモーター）、ヒトシヌクレイン１プロモーター、ヒトＴｈｙ１プロモーター、カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩα（ＣＡＭＫＩＩα）プロモーター、または標的細胞において本核酸配列の発現を推進できる任意のその他プロモーターであり得る。
【００７９】
ニューロン特異的プロモーター及びその他の制御エレメント（例えば、エンハンサー）は、当該技術分野において公知であり、オプシンをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結され得る。好適なニューロン特異的制御配列としては、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（例えば、ＥＭＢＬ  ＨＳＥＮＯ２、Ｘ５１９５６を参照；例えば、米国特許第６，６４９，８１１号、米国特許第５，３８７，７４２号も参照）；芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）プロモーター；ニューロフィラメントプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  ＨＵＭＮＦＬ、Ｌ０４１４７を参照）；シナプシンプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  ＨＵＭＳＹＮＩＢ、Ｍ５５３０１を参照）；ｔｈｙ−１プロモーター（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｃｅｌｌ  ５１：７−１９を参照）；セロトニン受容体プロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｓ６２２８３を参照）；チロシンヒドロキシラーゼプロモーター（ＴＨ）（例えば、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．  １５：２３６３−２３８４  （１９８７）及びＮｅｕｒｏｎ  ６：５８３−５９４  （１９９１）を参照）；ＧｎＲＨプロモーター（例えば、Ｒａｄｏｖｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：３４０２−３４０６  （１９９１）を参照）；Ｌ７プロモーター（例えば、Ｏｂｅｒｄｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：２２３−２２６  （１９９０）を参照）；ＤＮＭＴプロモーター（例えば、Ｂａｒｔｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：３６４８−３６５２  （１９８８）を参照）；エンケファリンプロモーター（例えば、Ｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ，  ＥＭＢＯＪ．  １７：３７９３−３８０５  （１９８８）を参照）；ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター；ＣＭＶエンハンサー／血小板由来成長因子−βプロモーター（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１：５２−６０を参照）；運動ニューロン特異的遺伝子Ｈｂ９プロモーター（例えば、米国特許第７，６３２，６７９号；及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１：３２９５−３３０６を参照）；並びにＣａ（２＋）−カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩα）プロモーターのαサブユニット（例えば、Ｍａｙｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：１３２５０を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターであってよい。例えば、プロモーターは、体外から投与された薬物に応答するトランス作用因子によって誘導されてよい。誘導性プロモーターの例としては、テトラサイクリンオンもしくはテトラサイクリンオフプロモーター、またはタモキシフェン誘導性ＣｒｅＥＲが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本ポリヌクレオチドは、同一の転写物から２つの別個のタンパク質を生成するために使用できるリボソームスキップ配列を含んでよい。このような実施形態では、本ポリヌクレオチドは、典型的には応答タンパク質のみならず、光活性化タンパク質もコードするコード配列を含むだろう。これらの実施形態では、リボソームスキップ配列は、同一の転写物から２つの異なるタンパク質（すなわち、光活性化タンパク質及び応答タンパク質）を生成するために、２つのコード配列間に配置されてよい。
【００８２】
上述の通り、場合によっては、核酸は、本明細書に記載されるような光活性化ポリペプチドまたは任意のそれらのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターである。好適な発現ベクターとしては、ベクターのポリヌクレオチドから転写された時に標的細胞の原形質膜上に本タンパク質を蓄積させるでＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含むベクターが挙げられる。使用してよいベクターとしては、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のベクターが挙げられるが、これらに限定されない。レンチウイルスベクターとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）系ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。レンチウイルスベクターは、限定されないが、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、Ｍｏ−マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、バキュロウイルス及びエボラを含む、その他のウイルスの外膜タンパク質で偽型化されてよい。このようなベクターは、当該技術分野における標準的な方法を使用して調製してよい。
【００８３】
いくつかの実施形態では、ベクターは、組換えＡＡＶベクターであってよい。ＡＡＶベクターとは、これらが感染する細胞のゲノムに、安定的かつ部位特異的に組み込むことのできる相対的に小さなサイズのＤＮＡウイルスである。このベクターは、細胞の成長、形態または分化に対して任意の効果を誘導せずに、広範囲の細胞に感染することが可能で、ヒトの病理に関与するようには見えない。ＡＡＶゲノムは、クローニングされ、シーケンスされて、特徴付けられている。このゲノムは約４７００塩基を包含し、各末端に約１４５塩基の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）領域を含有し、これが、ウイルスの複製開始点として機能する。ゲノムの残りは、キャプシド形成機能を保持する２つの必須領域、すなわちウイルス複製及びウイルス遺伝子発現に関与するｒｅｐ遺伝子を含有するゲノム左側部分；並びにウイルスのキャプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含有するゲノム右側部分に分けられる。
【００８４】
ＡＡＶベクターは、当該技術分野における標準的な方法を使用して調製してよい。任意の血清型のアデノ随伴ウイルスが、好適である（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗ，  ｐｐ．  １６５−１７４  ｏｆ  "Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ"  Ｊ．  Ｒ．  Ｐａｔｔｉｓｏｎ，  ｅｄ．  （１９８８）；Ｒｏｓｅ，  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３：１，  １９７４；Ｐ．  Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ  "Ｔｈｅ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ"  Ｉｎ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ  （ＪＲ  Ｋｅｒｒ，  ＳＦ  Ｃｏｔｍｏｒｅ．  ＭＥ  Ｂｌｏｏｍ，  ＲＭ  Ｌｉｎｄｅｎ，  ＣＲ  Ｐａｒｒｉｓｈ，  Ｅｄｓ．）  ｐ５−１４，  Ｈｕｄｄｅｒ  Ａｒｎｏｌｄ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  ＵＫ  （２００６）；及びＤＥ  Ｂｏｗｌｅｓ，  ＪＥ  Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，  ＲＪ  Ｓａｍｕｌｓｋｉ  "Ｔｈｅ  Ｇｅｎｕｓ  Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ"  （ＪＲ  Ｋｅｒｒ，  ＳＦ  Ｃｏｔｍｏｒｅ．  ＭＥ  Ｂｌｏｏｍ，  ＲＭ  Ｌｉｎｄｅｎ，  ＣＲ  Ｐａｒｒｉｓｈ，  Ｅｄｓ．）  ｐｌ５−２３，  Ｈｕｄｄｅｒ  Ａｒｎｏｌｄ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  ＵＫ  （２００６）を参照し、各々の開示について、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。ベクターの精製方法は、例えば、米国特許第６，５６６，１１８号、同第６，９８９，２６４号、及び同第６，９９５，００６号並びに"Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｈｉｇｈ  Ｔｉｔｅｒ  Ｈｅｌｐｅｒ−ｆｒｅｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＡＡＶ  Ｖｅｃｔｏｒｓ"という表題のＷＯ１９９９／０１１７６４に見出されて得、これらの開示は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。バキュロウイルス系におけるＡＡＶベクターの調製方法は、例えば、ＷＯ２００８／０２４９９８に記載されている。ＡＡＶベクターは、自己相補的または一本鎖であり得る。ハイブリッドベクターの調製は、例えば、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２７０９１号に記載され、その開示は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。インビトロ及びインビボで遺伝子を導入するためのＡＡＶに由来するベクターの使用が、記載されてきた（例えば、国際特許出願公開ＷＯ９１／１８０８８号及び同第ＷＯ９３／０９２３９号；米国特許第４，７９７，３６８号、同第６，５９６，５３５号、及び同第５，１３９，９４１号；並びに欧州特許第ＥＰ０４８８５２８号を参照し、これらはすべて、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。これらの刊行物は、ｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子が、欠失されかつ対象となる遺伝子によって置換された様々なＡＡＶ由来構築物、並びにインビトロで（培養細胞へ）またはインビボで（直接生物へ）対象となる遺伝子を導入するためのこれらの構築物の使用について記載している。本開示による複製欠損組換えＡＡＶは、２つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）領域に隣接する対象となる核酸配列を含有するプラスミド、並びにＡＡＶキャプシド形成遺伝子（ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子）を保持するプラスミドを、ヒトヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス）に感染した細胞株に同時トランスフェクト��ることによって調製することができる。次いで、作製されるＡＡＶ組換え体を標準的な技術によって精製する。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本開示の方法に使用するための１つ以上のベクターは、ウイルス粒子（例えば、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６を含むＡＡＶウイルス粒子）にキャプシド形成される。従って、本開示は、本明細書に記載されたベクターのいずれかを含む組換えウイルス粒子（粒子が、組換えポリヌクレオチドを含有するゆえに組換え）を含む。このような粒子を作製する方法は、当該技術分野において公知であり、米国特許第６，５９６，５３５号にて記載され、その開示は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。場合によっては、ＡＡＶ６が使用される。場合によっては、ＡＡＶ１が使用される。
【００８６】
医薬組成物
本開示の態様は、上記のポリヌクレオチド、ベクター、またはそれらの構成要素（を含む）医薬組成物を含む。本医薬組成物は、標的細胞が１つ以上の光活性化タンパク質を発現するよう、標的細胞の遺伝子を組換えるために対象に投与されてよい。本医薬組成物は、いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤を含んでよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、限定されないが、脂質、ポリマーなどのトランスフェクション試薬またはそれらの成分を含む、本ポリヌクレオチドまたはベクターの、標的細胞への送達を促進させる成分を含んでよい。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本医薬組成物は、例えば、無菌であれば、対象への注射に好適であろう。例えば、いくつかの実施形態では、本医薬組成物は、例えば、組成物が無菌であり、検出可能な発熱物質及び／またはその他の毒素を含まない場合、対象への注射に好適であろう。
【００８８】
ビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤などの薬学的に許容される賦形剤は、一般に容易に入手可能である。更に、ｐＨ調整及び緩衝剤、等張化剤、安定化剤、湿潤剤などの薬学的に許容される補助剤は同様に、一般に容易に入手可能であり、これらに限定されることなく、本開示の医薬組成物に組み込まれてよい。
【００８９】
送達デバイス
場合によっては、送達デバイスが、光活性化ポリペプチドをコードする核酸、または光活性化ポリペプチドを含む医薬組成物を標的細胞へと送達するために使用される。送達デバイスは、１つ以上の標的細胞へと核酸または医薬組成物の常用、非常用、プログラムされた、または医師もしくは患者による投与量を提供し、標的細胞が、コードされた光活性化ポリペプチドを引き続き発現することを確実にしてよい。
【００９０】
好適な送達デバイスは概して、個体の標的細胞または組織へと核酸または医薬組成物を送達するための、貯蔵容器、ポンプ、作動装置、配管部品、針、カテーテル、及び任意のその他好適な構成部品などの１つ以上の構成部品を含む。送達デバイスは、電源、メモリを含むプロセッサ、ユーザ入力デバイス、及び／またはグラフィカルユーザインターフェースなどの、コンピュータ制御作業を容易にする構成部品も含んでよい。いくつかの実施形態では、送達デバイスは、患者の体内に完全にまたは部分的に埋め込み可能であってよい。いくつかの実施形態では、送達デバイスは介助人によって操作されてよく、ここでデバイスは、患者の身体の一部分に、例えば患者の脳に導入され、かつ本医薬組成物は、標的組織、例えば患者の脳の一部分へと送達される。いくつかの実施形態では、医薬組成物の送達後、デバイスは除去されてよい。その他の実施形態では、デバイスは、追加の医薬組成物を後で送達するために、所定位置に維持されてよい。
【００９１】
光生成デバイス
疼痛を制御する本方法の実施において、光生成デバイスは、１つ以上の光活性化ポリペプチドを発現する標的細胞へと光を送達するために使用することができる。本開示の方法での使用に好適な光生成デバイスは一般に、デバイス上の１つ以上の光源から様々な異なる波長の光を生成することができる。いくつかの実施形態では、光生成デバイスは、１つ以上の本タンパク質を発現する標的細胞の周囲または近傍に配置することができる光カフまたはスリーブを含んでよい。いくつかの実施形態では、光源の一部分または光源全体が、埋め込み可能であってよい。本光生成デバイスは、本明細書にて開示された光活性化タンパク質を刺激するための、任意の有用な構成であってよい。いくつかの実施形態では、例えば、光生成デバイスは、標的細胞または組織の限定照射を容易にする構成部品を含んでよい。例えば、いくつかの実施形態では、光生成デバイスは、標的細胞、標的細胞の一部分、例えば、神経細胞の特定の軸索、または例えば、神経線維の束、標的組織、もしくは脊髄の一部分などの特定の解剖学的構造へと限定的に光を当ててよい。「限定的に光を当てる」とは、光生成デバイスが、特定の標的構造のみに光を送達し、その他の構造には照射しないことを意味する。例えば、いくつかの実施形態では、光生成デバイスは、神経細胞の軸索には照射するが、神経細胞のその他部分には一切照射しないよう構成されてよい。このように、光生成デバイスからの光は、照射される特定の標的構造における光活性化タンパク質のみに影響を及ぼす。
【００９２】
いくつかの実施形態では、光生成デバイスは、光活性化タンパク質を発現する標的細胞を含む領域を完全に取り囲んでいなくてもよく、むしろＵ型を有し得る。いくつかの実施形態では、光生成デバイスは、光生成デバイスを特定の領域または標的構造、例えば、特定のニューロン領域へと向けるために使用可能な取り付けアームを有することができる。取り付けアームは、光生成デバイスの埋め込み後に除去することができ、または対象となる標的細胞に近接させて光生成デバイスの位置を固定するために所定位置に残すことができる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本光生成デバイスは、本体内部を含んでよく、この本体内部は、電源に接続された、光を生成するための少なくとも１つの手段を有する。いくつかの実施形態では、電源は、光生成デバイスに電力を供給するための内部バッテリーであり得る。いくつかの実施形態では、埋め込み型光生成デバイスは、デバイスに電力を供給するための外部供給源から、ワイヤレスで送信された電磁エネルギーを受信するための外部アンテナを含んでよい。ワイヤレスで送信された電磁エネルギーは、電波、マイクロ波、または光生成デバイスに電力を供給する外部供給源から送信可能な任意のその他電磁エネルギー源であり得る。いくつかの実施形態では、光生成デバイスは、例えば、半導体プロセスまたは当該技術分野において公知のその他プロセスを使用して製造された集積回路によって制御される。
【００９４】
いくつかの実施形態では、光生成デバイスは、発光ダイオード（ＬＥＤ）を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＬＥＤは、青色光及び／または緑色光を生成することができる。その他の実施形態では、ＬＥＤは、琥珀色光及び／または黄色光を生成することができる。いくつかの実施形態では、いくつかのマイクロＬＥＤが、光生成デバイスの本体内部に埋め込まれる。その他の実施形態では、光生成デバイスは、固体レーザダイオードまたは光の生成が可能な任意のその他手段である。光生成デバイスは、本光活性化タンパク質を活性化させるのに十分な波長及び強度を有する光を生成することができる。いくつかの実施形態では、光生成デバイスは、約０．０５ｍＷ／ｍｍ２、０．１ｍＷ／ｍｍ２、０．２ｍＷ／ｍｍ２、０．３ｍＷ／ｍｍ２、０．４ｍＷ／ｍｍ２、０．５ｍＷ／ｍｍ２、約０．６ｍＷ／ｍｍ２、約０．７ｍＷ／ｍｍ２、約０．８ｍＷ／ｍｍ２、約０．９ｍＷ／ｍｍ２、約１．０ｍＷ／ｍｍ２、約１．１ｍＷ／ｍｍ２、約１．２ｍＷ／ｍｍ２、約１．３ｍＷ／ｍｍ２、約１．４ｍＷ／ｍｍ２、約１．５ｍＷ／ｍｍ２、約１．６ｍＷ／ｍｍ２、約１．７ｍＷ／ｍｍ２、約１．８ｍＷ／ｍｍ２、約１．９ｍＷ／ｍｍ２、約２．０ｍＷ／ｍｍ２、約２．１ｍＷ／ｍｍ２、約２．２ｍＷ／ｍｍ２、約２．３ｍＷ／ｍｍ２、約２．４ｍＷ／ｍｍ２、約２．５ｍＷ／ｍｍ２、約３ｍＷ／ｍｍ２、約３．５ｍＷ／ｍｍ２、約４ｍＷ／ｍｍ２、約４．５ｍＷ／ｍｍ２、約５ｍＷ／ｍｍ２、約５．５ｍＷ／ｍｍ２、約６ｍＷ／ｍｍ２、約７ｍＷ／ｍｍ２、約８ｍＷ／ｍｍ２、約９ｍＷ／ｍｍ２、または約１０ｍＷ／ｍｍ２のいずれかの強度を有する光を生成し、包括的に、これらの数の間の値を含む。いくつかの実施形態では、光生成デバイスは、少なくとも約１０Ｈｚ、最大約２５Ｈｚなどの、最大約５０Ｈｚなどの、最大約７５Ｈｚなどの、最大約１００Ｈｚなどの強度を有する光を生成する。
【００９５】
好適な光生成デバイスは一般に、約３５０ｎｍから、最大約３６０ｎｍ、最大約３７０ｎｍ、最大約３８０ｎｍ、最大約３９０ｎｍ、最大約４００ｎｍ、最大約４１０ｎｍ、最大約４２０ｎｍ、最大約４３０ｎｍ、最大約４４０ｎｍ、最大約４５０ｎｍ、最大約４６０ｎｍ、最大約４７０ｎｍ、最大約４８０ｎｍ、最大約４９０ｎｍ、最大約５００ｎｍ、最大約５１０ｎｍ、最大約５２０ｎｍ、最大約５３０ｎｍ、最大約５４０ｎｍ、最大約５５０ｎｍ、最大約５６０ｎｍ、最大約５７０ｎｍ、最大約５８０ｎｍ、最大約５９０ｎｍ、最大約６００ｎｍ、最大約６１０ｎｍ、最大約６２０ｎｍ、最大約６３０ｎｍ、最大約６４０ｎｍ、最大約６５０ｎｍ、最大約６６０ｎｍ、最大約６７０ｎｍ、最大約６８０ｎｍ、最大約６９０ｎｍ、最大約７００ｎｍ、最大約７１０ｎｍ、最大約７２０ｎｍ、最大約７３０ｎｍ、最大約７４０ｎｍ、及び／または最大約７５０ｎｍまでの波長を有する光を生成することが可能である。
【００９６】
いくつかの実施形態では、好適な光生成デバイスは、光源から光を伝送して、標的構造へと光を送達することができる１つ以上の光ファイバーを含んでよい。光ファイバーは、プラスチックまたはガラス材料を含んでよく、いくつかの実施形態では、剛性構造によって適応させることができなかった位置での光生成デバイスの配置を容易にするために適切に柔軟であってよい。例えば、いくつかの実施形態では、光生成デバイスは、患者の身体上または身体内における様々な位置に配置することができる１つ以上の光ファイバーのみならず、光を生成する光源も含んでよい。光源からの光は、光ファイバー内の角部及び湾曲部をあちこち通って光ファイバーを通過し、光ファイバーの末端に出て、標的構造へと光を送達することができる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、好適な光生成デバイスは、異なる光の波長で標的組織を照射するために使用可能な複数の光源を含んでよい。例えば、いくつかの実施形態では、光生成デバイスは、最初の波長の光、例えば赤色光を生成する第１光源、及び２番目の波長の光、例えば緑色光を生成する第２光源を含んでよい。このような光生成デバイスを使用して、両方の波長の光で同一の標的組織を同時に照射してよく、または最初の波長の光及び２番目の波長の光で標的組織を交互に照射してよい。いくつかの実施形態では、このような光生成デバイスを使用して、同一の光源からの光を異なる標的組織へと送達してよい。例えば、いくつかの実施形態では、光生成デバイスは、最初の波長の光を最初の標的組織へと送達してよく、２番目の波長の光を異なる標的組織へと送達してよい。
【００９８】
制御デバイス
場合によっては、光生成デバイスから照射される光量を制御、または調節できる制御デバイスが、本方法にて使用される。いくつかの実施形態では、制御デバイスは、光生成デバイスから標的組織へと送達される光の波長及び／または強度を調節するよう構成されてよい。いくつかの実施形態では、制御デバイスは、光生成デバイスから標的組織へと送達される光の周波数及び／または持続時間を調節するよう構成されてよい。例えば、いくつかの実施形態では、制御デバイスは、光生成デバイスからの光のパルスを標的組織へと送達するよう構成されてよい。制御デバイスは、標的組織が、例えば、ユーザ入力などによる規則的または変則的レートにて光生成デバイスからの光で照射されるように、光パルスの周波数及び／または持続時間を調節することができる。いくつかの実施形態では、制御デバイスは、約１ミリ秒以下から最大約１秒、最大約１０秒、最大約２０秒、最大約３０秒、最大約４０秒、最大約５０秒、最大約６０秒またはそれ以上までの持続時間を有する、光生成デバイスからの光パルスを生成することができる。いくつかの実施形態では、制御デバイスは、ミリ秒当たり１パルス、秒当たり最大約１パルス、分当たり最大約１パルス、１０分当たり最大約１パルス、２０分当たり最大約１パルス、３０分当たり最大約１パルスの周波数を有する、光生成デバイスからの光パルスを生成することができる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、好適な制御デバイスは、ワイヤレス送信機に取り付け可能な電源を含んでよい。いくつかの実施形態では、好適な制御デバイスは、送信コイルに取り付け可能な電源を含んでよい。いくつかの実施形態では、バッテリーは、バッテリーに電力を供給するために、電源に接続することができる。スイッチは、操作者（例えば、患者または介助人）が手動で電源を作動または停止させるために、電源に接続することができる。いくつかの実施形態では、スイッチの作動時に、電源は、制御デバイス上の送信コイルと埋め込み型光生成デバイス（光カフまたはスリーブなど）のアンテナ（外部アンテナまたは内部アンテナであってよい）の間の電磁結合を介して、電力を光生成デバイスへと供給することができる。送信コイルは、光生成デバイスに電力を供給するため及び光生成デバイスに１つ以上の制御シグナルを送信するために、埋め込み型光生成デバイスの外部アンテナと、その近接にある場合に電磁結合を確立することができる。いくつかの実施形態では、制御デバイスの送信コイルと埋め込み型光生成デバイスの外部アンテナの間の電磁結合は、高周波磁気インダクタンス結合であり得る。高周波磁気インダクタンス結合を使用する場合、操作可能な電波の周波数は約１〜２０ＭＨｚの間であり得て、包括的に、これらの数の間の任意の値を含む（例えば、約１ＭＨｚ、約２ＭＨｚ、約３ＭＨｚ、約４ＭＨｚ、約５ＭＨｚ、約６ＭＨｚ、約７ＭＨｚ、約８ＭＨｚ、約９ＭＨｚ、約１０ＭＨｚ、約１１ＭＨｚ、約１２ＭＨｚ、約１３ＭＨｚ、約１４ＭＨｚ、約１５ＭＨｚ、約１６ＭＨｚ、約１７ＭＨｚ、約１８ＭＨｚ、約１９ＭＨｚ、または約２０ＭＨｚ）。場合によっては、操作可能な電波の周波数は、約２０ＭＨｚ〜５ＧＨｚの間、例えば、約２０ＭＨｚ〜約５０ＭＨｚ、約５０ＭＨｚ〜約２５０ＭＨｚ、約２５０ＭＨｚ〜約５００ＭＨｚ、約５００ＭＨｚ〜約７５０ＭＨｚ、約７５０ＭＨｚ〜約１ＧＨｚ、約１ＧＨｚ〜約２ＧＨｚ、約２ＧＨｚ〜約３ＧＨｚ、約３ＧＨｚ〜約４ＧＨｚ、または約４ＧＨｚ〜約５ＧＨｚであり得る。例えば、高周波中域の結合を使用する場合、操作可能な周波数は、６９０ＭＨｚ〜２．２ＧＨｚであり得る。受光器、赤外線、または生物医学的遠隔測定システムなどの、その他の結合技術を使用してよい（例えば、Ｋｉｏｕｒｔｉ，  "Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｌｅｍｅｔｒｙ：  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｉｍｐｌａｎｔｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｅｘｔｅｒｎａｌ  Ｗｏｒｌｄ，  Ｏｐｔｉｃｏｎ１８２６，  （８）：  Ｓｐｒｉｎｇ，  ２０１０を参照）。
【０１００】
疼痛の非ヒト動物モデル
本開示は、侵害受容性疼痛の非ヒト動物モデルを提供し、この非ヒト動物は、動物のニューロン（例えば、小径または大径１次求心性ニューロンなどの１次求心性ニューロン；例えば、侵害受容器）にて、オプシンを活性化させる波長の光に応答して侵害受容器の脱分極を提供するオプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を発現する。非ヒト動物におけるニューロン（例えば、小径または大径１次求心性ニューロンなどの１次求心性ニューロン；例えば、侵害受容器）の膜に発現する、脱分極オプシンの照射によって、動物で疼痛を誘発する。
【０１０１】
本非ヒト動物モデルは、疼痛を制御する薬剤の同定に有用である（以下に記述される通り）。本非ヒト動物モデルは、研究用途、例えば、疼痛（例えば、神経障害性疼痛）の発生における侵害受容器活性の役割を調査するのに有用である。場合によっては、疼痛の本非ヒト動物モデルは、ラットである。場合によっては、疼痛の本非ヒト動物モデルは、マウスである。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、非ヒト動物モデルは、トランスジェニック動物ではなく、例えば、非ヒト動物モデルは、胚細胞のゲノムに組み込まれる光活性化ポリペプチドをコードする核酸を含まない。いくつかの実施形態では、非ヒト動物モデルは、侵害受容器などの１次求心性ニューロンにおいて光活性化ポリペプチドをコードする核酸を含み、核酸は、１次求心性ニューロン（例えば、侵害受容器）のゲノムに組み込まれてよい。いくつかの実施形態では、非ヒト動物モデルは、非ニューロン細胞内ではなく、１次求心性ニューロン（例えば、侵害受容器）において光活性化ポリペプチドをコードする核酸を含み、核酸は、侵害受容器のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、非ヒト動物モデルは、動物の非ニューロン細胞内ではなく、１次求心性ニューロン（例えば、侵害受容器）において光活性化ポリペプチドをコードする核酸を含み、核酸は、侵害受容器のゲノムに組み込まれない。
【０１０３】
場合によっては、脱分極のための光活性化ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＣｒｅ依存的ＤＩＯ−ＡＡＶ６構築物（例えば、Ｓｏｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｎａｔｕｒｅ  ４５９：６９８を参照）は、侵害受容器の亜集団に限られるオプシンの発現を得るために、侵害受容器特異的Ｃｒｅマウス系統で使用することができる。例えば、脱分極のための光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、Ｃｒｅ依存的ＤＩＯ−ＡＡＶ６構築物内に含まれて；この構築物が、侵害受容器特異的Ｃｒｅマウス内の侵害受容器に導入される。
【０１０４】
脱分極のための光活性化タンパク質
上述のように、疼痛の本非ヒト動物モデルは、動物のニューロン（例えば、小径または大径１次求心性ニューロンなどの１次求心性ニューロン；例えば、侵害受容器）にて、オプシンを活性化させる波長の光に応答して侵害受容器の脱分極を提供するオプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を発現する。
【０１０５】
好適な光応答性ポリペプチドの例としては、例えば、クラミドモナス・ラインハーディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｈｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）チャネルロドプシン２（ＣｈＲ２）；階段関数オプシン（ＳＦＯ）；安定化ＳＦＯ（ＳＳＦＯ）；Ｃ１Ｖ１などのキメラオプシン；ボルボックス・カルテリ（Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ）由来のチャネルロドプシン（ＶＣｈＲ１）などの光応答性カチオンチャネルタンパク質のチャネルロドプシン（Ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ）ファミリーメンバーが挙げられる。このような光応答性ポリペプチドを使用し、光刺激に応答して神経細胞膜の脱分極を促進することができる。
【０１０６】
増強された細胞内輸送アミノ酸モチーフ
進化的により単純な生物に由来する構成要素を有する光応答性オプシンタンパク質は、哺乳類細胞によって発現や許容されない可能性があり、または哺乳類細胞にて高レベルで発現する場合、損なわれた細胞内局在を示してよい。結果として、いくつかの実施形態では、細胞にて発現する光応答性オプシンタンパク質は、シグナルペプチド、小胞体（ＥＲ）搬出シグナル、膜輸送シグナル、及び／またはＮ末端ゴルジ搬出シグナルから成る群から選択される１つ以上のアミノ酸配列モチーフに融合することができる。哺乳類細胞の原形質膜への光応答性タンパク質輸送を増強する１つ以上のアミノ酸配列モチーフは、ａ）光応答性タンパク質のＮ末端に；ｂ）光応答性タンパク質のＣ末端に；ｃ）光応答性タンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方に；またはｄ）光応答性タンパク質内の内部に融合することができる。所望により、光応答性タンパク質及び１つ以上のアミノ酸配列モチーフは、リンカーによって分離されてよい。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、光応答性タンパク質は、細胞原形質膜へのタンパク質の輸送を増強する輸送シグナル（ｔｓ）の付加によって修飾されることができる。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来することができる。その他の実施形態では、輸送シグナルは、アミノ酸配列
2019194228.tif 000030
を含むことができる。使用に好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１
2019194228.tif 000031
の輸送配列のようなアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【０１０８】
輸送配列は、約１０アミノ酸〜約５０アミノ酸、例えば、約１０アミノ酸〜約２０アミノ酸、約２０アミノ酸〜約３０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約４０アミノ酸、または約４０アミノ酸〜約５０アミノ酸の長さを有することができる。
【０１０９】
光活性化ポリペプチドでの含有に好適なシグナル配列は、以下の１つなどのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる：
１）ｈＣｈＲ２のシグナルペプチド
2019194228.tif 000032
２）ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ２サブユニットシグナルペプチド
2019194228.tif 000033
；
３）ニコチン性アセチルコリン受容体シグナル配列
2019194228.tif 000034
；及び
４）ニコチン性アセチルコリン受容体シグナル配列
2019194228.tif 000035
。
【０１１０】
シグナル配列は、約１０アミノ酸〜約５０アミノ酸、例えば、約１０アミノ酸〜約２０アミノ酸、約２０アミノ酸〜約３０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約４０アミノ酸、または約４０アミノ酸〜約５０アミノ酸の長さを有することができる。
【０１１１】
光応答性ポリペプチドでの使用に好適な小胞体（ＥＲ）搬出配列としては、例えば、
2019194228.tif 000036
などを含む。ＥＲ搬出配列は、約５アミノ酸〜約２５アミノ酸、例えば、約５アミノ酸〜約１０アミノ酸、約１０アミノ酸〜約１５アミノ酸、約１５アミノ酸〜約２０アミノ酸、または約２０アミノ酸〜約２５アミノ酸の長さを有することができる。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、タンパク質における天然のシグナルペプチド配列は、欠失させることができ、または異なるタンパク質からの異種シグナルペプチド配列で置換することができる。
【０１１３】
ＣｈＲ
いくつかの実施形態では、光応答性カチオンチャネルタンパク質は、クラミドモナス・ラインハーディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）に由来することが可能で、このカチオンチャネルタンパク質は、細胞が光で照射された時に、細胞膜を越えたカチオンの輸送を可能にすることができる。別の実施形態では、光応答性カチオンチャネルタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示した配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができる。クラミドモナス・ラインハーディに由来する光応答性カチオンチャネルタンパク質を活性化させるために使用される光は、約４６０〜約４９５ｎｍの間の波長を有することができ、または約４８０ｎｍの波長を有することができる。更に、約１００Ｈｚの時間周波数を有する光パルスを使用して、光応答性タンパク質を活性化することができる。いくつかの実施形態では、約１００Ｈｚの時間周波数を有する光パルスによる、クラミドモナス・ラインハーディに由来する光応答性カチオンチャネルの活性化によって、光応答性カチオンチャネルを発現するニューロンの脱分極を引き起こすことができる。光応答性カチオンチャネルタンパク質は、光に対する感受性を増大もしくは減少させるために、特定の光の波長に対する感受性を増大もしくは減少させるために、及び／または細胞の原形質膜の分極状態を調節する光応答性カチオンチャネルタンパク質の能力を増大もしくは減少させるために、天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び／または挿入を更に含むことができる。加えて、光応答性カチオンチャネルタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含有することができる。天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び／または挿入を含む光応答性プロトンポンプタンパク質は、細胞膜を越えてカチオンを輸送する能力を適切に保持する。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、光応答性カチオンチャネルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示すアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換を含む。いくつかの実施形態では、光応答性カチオンチャネルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示すアミノ酸配列のＬ１３２Ｃ置換を含む。いくつかの実施形態では、光応答性カチオンチャネルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示すアミノ酸配列のＥ１２３Ｔ置換を含む。いくつかの実施形態では、光応答性カチオンチャネルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示すアミノ酸配列のＥ１２３Ａ置換を含む。いくつかの実施形態では、光応答性カチオンチャネルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示すアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換及びＥ１２３Ｔ置換を含む。いくつかの実施形態では、光応答性カチオンチャネルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示すアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換及びＥ１２３Ａ置換を含む。いくつかの実施形態では、光応答性カチオンチャネルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示すアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換、Ｌ１３２Ｃ置換、及びＥ１２３Ｔ置換を含む。いくつかの実施形態では、光応答性カチオンチャネルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示すアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換、Ｌ１３２Ｃ置換、及びＥ１２３Ａ置換を含む。いくつかの実施形態では、光応答性カチオンチャネルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示すアミノ酸配列のＬ１３２Ｃ置換及びＥ１２３Ｔ置換を含む。いくつかの実施形態では、光応答性カチオンチャネルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示すアミノ酸配列のＬ１３２Ｃ置換及びＥ１２３Ａ置換を含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、ＣｈＲ２タンパク質は、シグナルペプチド、ＥＲ搬出シグナル、及び膜輸送シグナルから成る群から選択される、標的細胞の原形質膜への輸送を増強する少なくとも１つの（１、２、３、またはそれ以上などの）アミノ酸配列モチーフを含む。いくつかの実施形態では、ＣｈＲ２タンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド及びＣ末端ＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態では、ＣｈＲ２タンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド及びＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態では、ＣｈＲ２タンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナル、及びＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態では、ＣｈＲ２タンパク質は、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナル及びＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナル及びＣ末端輸送シグナルは、リンカーにより連結されている。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸の長さのいずれかを含むことができる。リンカーは、蛍光タンパク質、例えば、限定されないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質を更に含んでよい。いくつかの実施形態では、ＥＲ搬出シグナルは、輸送シグナルよりもさらにＣ末端側に位置する。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ＥＲ搬出シグナルよりもさらにＣ末端側に位置する。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来することができる。その他の実施形態では、輸送シグナルは、アミノ酸配列
2019194228.tif 000037
を含むことができる。使用に好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１
2019194228.tif 000038
の輸送配列のようなアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【０１１７】
場合によっては、ＥＲ搬出シグナルは、例えば、
2019194228.tif 000039
などである。
【０１１８】
ＣｈＲ２をベースにした階段関数オプシン及び安定化階段関数オプシン
その他の実施形態では、光応答性ポリペプチドは、タンパク質のレチナール結合ポケットにおける重要な位置に特異的アミノ酸置換を有することができる階段関数オプシン（ＳＦＯ）タンパク質または安定化階段関数オプシン（ＳＳＦＯ）タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸残基Ｃ１２８にて変異を有することができる。その他の実施形態では、ＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８にＣ１２８Ａ変異を有する。その他の実施形態では、ＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８にＣ１２８Ｓ変異を有する。別の実施形態では、ＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８にＣ１２８Ｔ変異を有する。いくつかの実施形態では、ＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示した配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができ、アミノ酸１２８にてアラニン、セリン、またはトレオニンを含む。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、ＳＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸残基Ｄ１５６にて変異を有することができる。その他の実施形態では、ＳＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸残基Ｃ１２８及びＤ１５６の両方にて変異を有することができる。一実施形態では、ＳＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８にＣ１２８Ｓ及びＤ１５６Ａ変異を有する。別の実施形態では、ＳＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に示した配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができ；アミノ酸１２８にてアラニン、セリン、またはトレオニンを含み；アミノ酸１５６にてアラニンを含む。別の実施形態では、ＳＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８にＣ１２８Ｔ変異を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＳＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８にＣ１２８Ｔ及びＤ１５６Ａ変異を含む。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質は、細胞が青色光で照射された時に、細胞における脱分極電流の媒介を可能にすることができる。その他の実施形態では、光は、約４４５ｎｍの波長を有することができる。更に、いくつかの実施形態では、光は、ＳＦＯ及びＳＳＦＯ光電流の長期安定性によって、光の単一パルスとしてまたは光の間隔パルスとして送達されることができる。いくつかの実施形態では、光の単一パルスまたは間隔パルスによるＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質の活性化によって、ＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質を発現するニューロンの脱分極を引き起こすことができる。いくつかの実施形態では、開示された階段関数オプシン及び安定化階段関数オプシンタンパク質の各々は、光に応答してニューロン細胞膜を脱分極化する際に使用するための特異的な特性及び特徴を有することができる。
【０１２１】
ＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質に関する更なる開示は、国際特許出願公開ＷＯ２０１０／０５６９７０号に見出すことができ、その開示は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１２２】
場合によっては、ＣｈＲ２ベースのＳＦＯまたはＳＳＦＯは、膜輸送シグナル及び／またはＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来することができる。その他の実施形態では、輸送シグナルは、アミノ酸配列
2019194228.tif 000040
を含むことができる。使用に好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１
2019194228.tif 000041
の輸送配列のようなアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。場合によっては、ＥＲ搬出シグナルは、例えば、
2019194228.tif 000042
などである。
【０１２３】
Ｃ１Ｖ１キメラカチオンチャネル
その他の実施形態では、光応答性カチオンチャネルタンパク質は、ボルボックス・カルテリのＶＣｈＲ１タンパク質及びクラミドモナス・ラインハーディからのＣｈＲ１タンパク質に由来するＣ１Ｖ１キメラタンパク質であり得て、このタンパク質は、ＣｈＲ１の第１及び第２膜貫通ヘリックスによって置換された第１及び第２膜貫通ヘリックスを少なくとも有するＶＣｈＲ１のアミノ酸配列を含み；光に応答して；細胞が光で照射された時に、細胞における脱分極電流を媒介することができる。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、光応答性キメラタンパク質の第２及び第３膜貫通ヘリックスの間に位置する細胞内ループドメイン内に更に置換を含むことができ、この細胞内ループドメインの少なくとも一部分は、ＣｈＲ１からの対応する部分によって置換される。別の実施形態では、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質の細胞内ループドメインの部分は、ＣｈＲ１のアミノ酸残基Ａ１４５まで広がるＣｈＲ１からの対応する部分で置換することができる。その他の実施形態では、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質は、光応答性キメラタンパク質の第３膜貫通へリックス内に更に置換を含むことができ、この第３膜貫通へリックスの少なくとも一部分は、ＣｈＲ１の対応する配列によって置換される。更に別の実施形態では、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質の細胞内ループドメインの部分は、ＣｈＲ１のアミノ酸残基Ｗ１６３まで広がるＣｈＲ１からの対応する部分で置換することができる。その他の実施形態では、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示した配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができる。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、細胞が緑色光で照射された時に、細胞における脱分極電流を媒介することができる。その他の実施形態では、光は、約５４０ｎｍ〜約５６０ｎｍの間の波長を有することができる。いくつかの実施形態では、光は、約５４２ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質は、細胞が紫色光で照射された時に、細胞における脱分極電流を媒介することができない。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、細胞が約４０５ｎｍの波長を有する光で照射された時に、細胞における脱分極電流を媒介することができない。更に、いくつかの実施形態では、約１００Ｈｚの時間周波数を有する光パルスを使用して、Ｃ１Ｖ１タンパク質を活性化することができる。
【０１２５】
場合によっては、Ｃ１Ｖ１ポリペプチドは、膜輸送シグナル及び／またはＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来することができる。その他の実施形態では、輸送シグナルは、アミノ酸配列
2019194228.tif 000043
を含むことができる。使用に好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１
2019194228.tif 000044
の輸送配列のようなアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。場合によっては、ＥＲ搬出シグナルは、例えば、
2019194228.tif 000045
などである。
【０１２６】
Ｃ１Ｖ１バリアント
いくつかの態様では、好適な光応答性ポリペプチドは、置換または変異したアミノ酸配列を含み、この変異体ポリペプチドは、前駆体Ｃ１Ｖ１キメラポリペプチドの特徴的な光活性化可能な性質を保持するが、いくつかの特定の態様では、変化した特性を有してもよい。例えば、本明細書に記載された変異体光応答性Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質は、動物細胞内もしくは動物細胞原形質膜上の両方で増加した発現レベル；光、特に赤色光の異なる波長に曝露された時の変化した応答性；及び／または形質の組み合わせを示すことができ、それによって、Ｃ１Ｖ１キメラポリペプチドが、低脱感作、急速な不活性化、その他の光応答性カチオンチャネルとの最低限のクロス活性化のための低紫色光活性化、及び／または動物細胞における強力な発現という特性を有する。
【０１２７】
従って、キメラポリペプチドのＶＣｈＲ１部分のレチナール結合ポケット全体にわたる重要な位置にて特異的アミノ酸置換を有することのできるＣ１Ｖ１キメラ光応答性オプシンタンパク質が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸残基Ｅ１２２にてアミノ酸置換を有することができる。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸残基Ｅ１６２にて置換を有することができる。その他の実施形態では、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸残基Ｅ１６２及びＥ１２２の両方にて置換を有することができる。その他の実施形態では、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に示した配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができ、上述のアミノ酸置換のうちの１つ以上を含むことができる。
【０１２８】
いくつかの態様では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２変異体キメラタンパク質は、細胞が光で照射された時に、細胞における脱分極電流を媒介することができる。いくつかの実施形態では、光は、緑色光であり得る。その他の実施形態では、光は、約５４０ｎｍ〜約５６０ｎｍの間の波長を有することができる。いくつかの実施形態では、光は、約５４６ｎｍの波長を有することができる。その他の実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２変異体キメラタンパク質は、細胞が赤色光で照射された時に、細胞における脱分極電流を媒介することができる。いくつかの実施形態では、赤色光は、約６３０ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２変異体キメラタンパク質は、細胞が紫色光で照射された時に、細胞における脱分極電流を媒介しない。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、細胞が約４０５ｎｍの波長を有する光で照射された時に、細胞における脱分極電流を媒介しない。更に、いくつかの実施形態では、約１００Ｈｚの時間周波数を有する光パルスを使用して、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２変異体キメラタンパク質を活性化することができる。いくつかの実施形態では、１００Ｈｚの周波数を有する光パルスによるＣ１Ｖ１−Ｅ１２２変異体キメラタンパク質の活性化によって、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２変異体キメラタンパク質を発現するニューロンの脱分極を引き起こすことができる。
【０１２９】
その他の態様では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２変異体キメラタンパク質は、細胞が光で照射された時に、細胞における脱分極電流を媒介することができる。いくつかの実施形態では、光は、緑色光であり得る。その他の実施形態では、光は、約５３５ｎｍ〜約５４０ｎｍの間の波長を有することができる。いくつかの実施形態では、光は、約５４２ｎｍの波長を有することができる。その他の実施形態では、光は、約５３０ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２変異体キメラタンパク質は、細胞が紫色光で照射された時に、細胞における脱分極電流を媒介しない。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、細胞が約４０５ｎｍの波長を有する光で照射された時に、細胞における脱分極電流を媒介しない。更に、いくつかの実施形態では、約１００Ｈｚの時間周波数を有する光パルスを使用して、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２変異体キメラタンパク質を活性化することができる。いくつかの実施形態では、１００Ｈｚの周波数を有する光パルスによるＣ１Ｖ１−Ｅ１６２変異体キメラタンパク質の活性化によって、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２変異体キメラタンパク質を発現するニューロンの脱分極誘発性シナプスの枯渇を引き起こすことができる。
【０１３０】
更にその他の態様では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異体キメラタンパク質は、細胞が光で照射された時に、細胞における脱分極電流を媒介することができる。いくつかの実施形態では、光は、緑色光であり得る。その他の実施形態では、光は、約５４０ｎｍ〜約５６０ｎｍの間の波長を有することができる。いくつかの実施形態では、光は、約５４６ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異体キメラタンパク質は、細胞が紫色光で照射された時に、細胞における脱分極電流を媒介しない。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、細胞が約４０５ｎｍの波長を有する光で照射された時に、細胞における脱分極電流を媒介しない。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異体キメラタンパク質は、Ｅ１２２／Ｅ１６２の変異が欠如したＣ１Ｖ１キメラタンパク質と比較して、またはその他の光応答性カチオンチャネルタンパク質と比較して、紫色光に曝露された時に、より少ない活性化を示すことができる。更に、いくつかの実施形態では、約１００Ｈｚの時間周波数を有する光パルスを使用して、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異体キメラタンパク質を活性化することができる。いくつかの実施形態では、１００Ｈｚの周波数を有する光パルスによるＣ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異体キメラタンパク質の活性化によって、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異体キメラタンパク質を発現するニューロンの脱分極誘発性シナプスの枯渇を引き起こすことができる。
【０１３１】
場合によっては、Ｃ１Ｖ１バリアントポリペプチドは、膜輸送シグナル及び／またはＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来することができる。その他の実施形態では、輸送シグナルは、アミノ酸配列
2019194228.tif 000046
を含むことができる。使用に好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１
2019194228.tif 000047
の輸送配列のようなアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。場合によっては、ＥＲ搬出シグナルは、例えば、
2019194228.tif 000048
などである。
【０１３２】
ボルボックス・カルテリ光活性化ポリペプチド
いくつかの実施形態では、好適な光応答性ポリペプチドは、ボルボックス・カルテリに由来するカチオンチャネル（ＶＣｈＲ１）であり、約５００ｎｍ〜約６００ｎｍ、例えば、約５２５ｎｍ〜約５５０ｎｍ、例えば、５４５ｎｍの波長の光で照射することによって活性化する。いくつかの実施形態では、光応答性イオンチャネルタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に示した配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができる。光応答性イオンチャネルタンパク質は、光に対する感受性を増大もしくは減少させるために、特定の光の波長に対する感受性を増大もしくは減少させるために、及び／または細胞の原形質膜の分極状態を調節する光応答性イオンチャネルタンパク質の能力を増大もしくは減少させるために、天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び／または挿入を更に含むことができる。加えて、光応答性イオンチャネルタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含有することができる。天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び／または挿入を含む光応答性イオンチャネルタンパク質は、光に応答してニューロン細胞の原形質膜を越えてイオンを輸送する能力を適切に保持する。
【０１３３】
場合によっては、光応答性カチオンチャネルタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に示した配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列、並びにシグナルペプチド、ＥＲ搬出シグナル、及び膜輸送シグナルから成る群から選択される、哺乳類細胞の原形質膜への輸送を増強する少なくとも１つの（１、２、３、またはそれ以上などの）アミノ酸配列モチーフを含むことができる。いくつかの実施形態では、光応答性プロトンイオンチャネルは、Ｎ末端シグナルペプチド及びＣ末端ＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態では、光応答性イオンチャネルタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド及びＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態では、光応答性イオンチャネルタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナル、及びＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態では、光応答性イオンチャネルタンパク質は、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナル及びＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナル及びＣ末端輸送シグナルは、リンカーにより連結されている。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸の長さのいずれかを含むことができる。リンカーは、蛍光タンパク質、例えば、限定されないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質を更に含んでよい。いくつかの実施形態では、ＥＲ搬出シグナルは、輸送シグナルよりもさらにＣ末端側に位置する。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ＥＲ搬出シグナルよりもさらにＣ末端側に位置する。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来することができる。その他の実施形態では、輸送シグナルは、アミノ酸配列
2019194228.tif 000049
を含むことができる。使用に好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１
2019194228.tif 000050
の輸送配列のようなアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含むことができる。場合によっては、ＥＲ搬出シグナルは、例えば、
2019194228.tif 000051
などである。
【０１３５】
本明細書においては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に示した配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列を含む光応答性イオンチャネルタンパク質などの、本明細書に記載された光応答性チャネルタンパク質のいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドもまた提供される。本明細書においては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に示した配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列を含む光応答性チャネルタンパク質などの、本明細書に記載されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（本明細書に記載されたウイルスベクターなどの）もまた提供される。
【０１３６】
ＶＣｈＲ１をベースにした階段関数オプシン及び安定化階段関数オプシン
その他の実施形態では、光応答性ポリペプチドは、ＶＣｈＲ１をベースにしたＳＦＯまたはＳＳＦＯである。いくつかの実施形態では、ＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のアミノ酸残基Ｃ１２３にて変異を有することができる。その他の実施形態では、ＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９にＣ１２３Ａ変異を有する。その他の実施形態では、ＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９にＣ１２３Ｓ変異を有する。別の実施形態では、ＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９にＣ１２３Ｔ変異を有する。いくつかの実施形態では、ＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０に示した配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができ、アミノ酸１２３にてアラニン、セリン、またはトレオニンを含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、ＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のアミノ酸残基Ｄ１５１にて変異を有することができる。その他の実施形態では、ＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のアミノ酸残基Ｃ１２３及びＤ１５１の両方にて変異を有することができる。一実施形態では、ＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９にＣ１２３Ｓ及びＤ１５１Ａ変異を有する。別の実施形態では、ＳＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示した配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができ；アミノ酸１２２にてアラニン、セリン、またはトレオニンを含み；アミノ酸１５１にてアラニンを含む。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質は、細胞が青色光で照射された時に、細胞における脱分極電流の媒介を可能にすることができる。その他の実施形態では、光は、約５６０ｎｍの波長を有することができる。更に、いくつかの実施形態では、光は、ＳＦＯ及びＳＳＦＯ光電流の長期安定性によって、光の単一パルスとしてまたは光の間隔パルスとして送達されることができる。いくつかの実施形態では、光の単一パルスまたは間隔パルスによるＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質の活性化によって、ＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質を発現するニューロンの脱分極を引き起こすことができる。いくつかの実施形態では、開示された階段関数オプシン及び安定化階段関数オプシンタンパク質の各々は、光に応答してニューロン細胞膜を脱分極化する際に使用するための特異的な特性及び特徴を有することができる。
【０１３９】
場合によっては、ＶＣｈＲ１ベースのＳＦＯまたはＳＳＦＯは、膜輸送シグナル及び／またはＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来することができる。その他の実施形態では、輸送シグナルは、アミノ酸配列
2019194228.tif 000052
を含むことができる。使用に好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１
2019194228.tif 000053
の輸送配列のようなアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。場合によっては、ＥＲ搬出シグナルは、例えば、
2019194228.tif 000054
などである。
【０１４０】
スクリーニング方法
本開示は、疼痛の制御における使用に好適な薬剤を同定する方法を提供する。
【０１４１】
疼痛を軽減する薬剤を同定する方法
場合によっては、本方法は、ａ）侵害受容器などの１次求心性ニューロンにおいて脱分極のための光活性化ポリペプチドを発現する本開示の非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどの非ヒト哺乳動物）を、試験薬剤と接触させること；及びｂ）脱分極のための光活性化ポリペプチドが光によって照射（活性化）される時の疼痛に対する試験薬剤の効果を、もしあれば決定することを含む。試験薬剤の非存在下で脱分極のための光活性化ポリペプチドの光活性化によって誘発される疼痛レベルと比較して、非ヒト動物の疼痛を軽減する試験薬剤は、試験薬剤が疼痛を制御（軽減）するための候補薬剤であることを示す。場合によっては、非ヒト動物は、上記の通り、本非ヒト動物モデルである。
【０１４２】
例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、または２５％超（例えば、２５％〜５０％；５０％〜７５％など）で疼痛を軽減する試験薬剤が、疼痛を軽減するための候補薬剤と考えられる。
【０１４３】
本明細書で使用する場合、「決定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）」という用語は、定量的及び定性的決定の両方を指し、従って「決定する」という用語は、本明細書において「分析する（ａｓｓａｙｉｎｇ）」、「測定する（ｍｅａｓｕｒｉｎｇ）」などと同じ意味で使用される。
【０１４４】
「候補薬剤（ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ａｇｅｎｔ）」、「試験薬剤（ｔｅｓｔ  ａｇｅｎｔ）」、「薬剤（ａｇｅｎｔ）」、「物質（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）」及び「化合物（ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」という用語は、本明細書では同じ意味で使用される。候補薬剤は、多数の化学クラス、典型的には合成、半合成、または天然に存在する無機もしくは有機分子を包含する。候補薬剤は、合成または天然化合物の大きなライブラリにて見出されるものを含む。例えば、合成化合物ライブラリは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（トレヴィレット（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ）、コーンウォール、イギリス）、ＣｏｍＧｅｎｅｘ社（サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）、及びＭｉｃｒｏＳｏｕｒｃｅ社（ニューミルフォード、コネチカット州）から市販されている。希少な化合物ライブラリは、Ａｌｄｒｉｃｈ社（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）から入手可能で、使用することもできる。あるいは、細菌、真菌、植物及び動物の抽出物という形態での天然化合物のライブラリは、Ｐａｎ  Ｌａｂｓ社（ボセル、ワシントン州）から入手可能または容易に作製できる。
【０１４５】
候補薬剤は、５０ダルトン超及び約２，５００ダルトン未満の分子量を有する小さな有機または無機化合物であり得る。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、例えば、水素結合に必要な官能基を含むことができ、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基を含んでよく、少なくとも２つの官能性化学基を含有してよい。候補薬剤は、上記官能基の１つ以上で置換された環状炭素もしくは複素環の構造及び／または芳香族もしくは多環芳香族の構造を含んでよい。候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、及び誘導体、構造類似体またはこれらの組み合わせを含む生体分子の中にも見出される。
【０１４６】
本開示のアッセイは対照を含み、好適な対照は、侵害受容器にて脱分極のための光応答性ポリペプチドを発現し、活性化のための光に曝露されているが、試験薬剤は投与されなかった非ヒト動物モデルを含む。
【０１４７】
試験薬剤が、非ヒト動物において疼痛を軽減するか否かは、当該技術分野において公知の様々なアッセイのいずれかを使用して決定することができる。例えば、逃避、舐める、静止、及び発声などの１つ以上の行動によって疼痛を測定する試験を使用することができる。好適な試験としては、例えば、ａ）ホルマリンアッセイ；ｂ）ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験；ｃ）尾引っ込み（ｔａｉｌ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）アッセイ、ホットプレートアッセイ、テールフリック試験などの熱アッセイ（Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ３５：３９３）；ｄ）Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓアッセイなどが挙げられる。例えば、Ｍｏｇｉｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ；及びＣａｒｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｈｉｅｈ  （２０１０）  Ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｏｎ：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ｐｐ  ５１−５２；及びＢａｎｎｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｌｍｂｅｒｇ  （２００７）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｗｉｌｅｙ  Ｏｎｌｉｎｅ  Ｌｉｂｒａｒｙを参照。好適な試験としては、実施例に記載されるものが挙げられる。
【０１４８】
疼痛応答を引き起こすのに必要な光の最小強度を増加させる薬剤を同定する方法
本開示は、疼痛を軽減する薬剤を同定する方法を提供し、この方法は、ａ）侵害受容器などの１次求心性ニューロンにおいて脱分極のための光活性化ポリペプチドを発現する本開示の非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどの非ヒト哺乳動物）を、試験薬剤と接触させること；及びｂ）試験薬剤の投与後、疼痛を誘発するのに必要な最小光量に対する試験薬剤の、もしあればその効果を決定することを含む。
【０１４９】
疼痛を誘発するのに必要な光量を増加させる試験薬剤は、疼痛を軽減するための候補薬剤である。例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％（もしくは２倍）、少なくとも２．５倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または１０倍超で疼痛を誘発するのに必要な光量（ｍＷ／ｍｍ２で表される）を増加させる試験薬剤が、疼痛を軽減するための候補薬剤と考えられる。
【０１５０】
例えば、非ヒト動物にて疼痛応答を引き起こすのに必要な光の最小強度が、０．５ｍＷ／ｍｍ２であり、試験薬剤によって、疼痛を誘発するのに必要な最小光量を０．７５ｍＷ／ｍｍ２へと増加させた場合、その試験薬剤は、疼痛を軽減するための候補薬剤であると考えられるだろう。
【０１５１】
本明細書で使用する場合、「決定する」という用語は、定量的及び定性的決定の両方を指し、従って「決定する」という用語は、本明細書において「分析する」、「測定する」などと同じ意味で使用される。
【０１５２】
「候補薬剤」、「試験薬剤」、「薬剤」、「物質」及び「化合物」という用語は、本明細書では同じ意味で使用される。候補薬剤は、多数の化学クラス、典型的には合成、半合成、または天然に存在する無機もしくは有機分子を包含する。候補薬剤は、合成または天然化合物の大きなライブラリにて見出されるものを含む。例えば、合成化合物ライブラリは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（トレヴィレット（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ）、コーンウォール、イギリス）、ＣｏｍＧｅｎｅｘ社（サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）、及びＭｉｃｒｏＳｏｕｒｃｅ社（ニューミルフォード、コネチカット州）から市販されている。希少な化合物ライブラリは、Ａｌｄｒｉｃｈ社（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）から入手可能で、使用することもできる。あるいは、細菌、真菌、植物及び動物の抽出物という形態での天然化合物のライブラリは、Ｐａｎ  Ｌａｂｓ社（ボセル、ワシントン州）から入手可能または容易に作製できる。
【０１５３】
候補薬剤は、５０ダルトン超及び約２，５００ダルトン未満の分子量を有する小さな有機または無機化合物であり得る。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、例えば、水素結合に必要な官能基を含むことができ、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基を含んでよく、少なくとも２つの官能性化学基を含有してよい。候補薬剤は、上記官能基の１つ以上で置換された環状炭素もしくは複素環の構造及び／または芳香族もしくは多環芳香族の構造を含んでよい。候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、及び誘導体、構造類似体またはこれらの組み合わせを含む生体分子の中にも見出される。
【０１５４】
本開示のアッセイは対照を含み、好適な対照は、侵害受容器にて脱分極のための光応答性ポリペプチドを発現し、活性化のための光に曝露されているが、試験薬剤は投与されなかった非ヒト動物モデルを含む。場合によっては、対照は、疼痛に影響を及ぼさない既知の薬剤を投与された非ヒト動物モデルである。
【０１５５】
試験薬剤が、非ヒト動物において疼痛応答を誘発するのに必要な最小光量を増加させるか否かは、当該技術分野において公知の様々なアッセイのいずれかを使用して決定することができる。例えば、逃避、舐める、静止、及び発声などの１つ以上の行動によって疼痛を測定する試験を使用することができる。好適な試験としては、例えば、ａ）ホルマリンアッセイ；ｂ）ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験；ｃ）尾引っ込み（ｔａｉｌ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）アッセイ、ホットプレートアッセイ、テールフリック試験などの熱アッセイ（Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ３５：３９３）；ｄ）Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓアッセイなどが挙げられる。例えば、Ｍｏｇｉｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ；及びＣａｒｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｈｉｅｈ  （２０１０）  Ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｏｎ：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ｐｐ  ５１−５２；及びＢａｎｎｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｌｍｂｅｒｇ  （２００７）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｗｉｌｅｙ  Ｏｎｌｉｎｅ  Ｌｉｂｒａｒｙを参照。好適な試験としては、実施例に記載されるものが挙げられる。
【実施例】
【０１５６】
実施例
以下の実施例は、本発明を作製及び使用する方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために記述され、発明者が本発明と考えるものの範囲を限定することは意図せず、これらの実施例は、下記の実験が行われるすべての、または唯一の実験であることを表すことも意図しない。使用した数（例えば、量、温度など）に関して精度を保証するために努力したが、若干の実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。特に指示がない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、及び圧力は大気圧またはその近傍である。標準的な略語、例えば、ｂｐ、塩基対；ｋｂ、キロベース；ｐｌ、ピコリットル；ｓまたはｓｅｃ、秒；ｍｉｎ、分；ｈまたはｈｒ、時間；ａａ、アミノ酸；ｋｂ、キロベース；ｂｐ、塩基対；ｎｔ、ヌクレオチド；ｉ．ｍ．、筋肉内；ｉ．ｐ．、腹腔内；ｓ．ｃ．、皮下などを使用してよい。
【実施例１】
【０１５７】
疼痛の二方向制御
光遺伝学を使用して、正常及び病理学的状態の両方で、急性疼痛を二方向に制御できることを本明細書で実証する。適応可能かつ臨床的に関連する遺伝子導入戦略を使用した。アデノ随伴ウイルス血清型６（ＡＡＶ６）を使用した。ＡＡＶ６は、多くの魅力的特徴を有する；ＡＡＶ６は、非ヒト霊長類における遺伝子送達のために使用されてきた、ヒト臨床試験での今後の使用に対する有力な候補である１５。ＡＡＶ６は、逆行性輸送も可能で、神経内送達によって侵害受容器に特異的に形質導入することができ、危険を伴う後根神経節注入の必要性を排除する。
【０１５８】
材料及び方法
動物実験対象及び実験
すべての外科的及び行動的方法は、実験動物飼育に関するスタンフォード大学管理検討会（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  Ｌａｂ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）によって承認された。メスのＣ５７ＢＬ／６マウス（１〜４か月齢）を、１２時間ずつの明暗サイクル下にて１グループ５匹で飼育した。餌及び水は、自由に取れるようにした。
【０１５９】
ＡＡＶ６−ｈＳｙｎ−ＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ｅＹＦＰ及びＡＡＶ６−ｈＳｙｎ−ｅＮｐＨＲ３．０−ｅＹＦＰの神経内注入
マウスを２〜２．５％イソフルランで麻酔し、３７℃に維持した加熱パッド上に置いて、安定した麻酔水準まで反応させ、呼吸速度の検査及びつま先ピンチ（ｔｏｅ−ｐｉｎｃｈ）試験によって定期的に検査した。体毛は、電気カミソリを使用し、注入に応じて、大腿骨の両側または片側から剃った。体毛除去クリーム（Ｎａｉｒ）を使用し、切開部位から残りの毛をすべて除去した。次いで、切開部位は、エタノール及びベタダイン（Ｂｅｔａｄｉｎｅ）溶液を交互に塗布して消毒し、マウスの両脚を手術台にテープで留めた。１ｍｇ／ｍｌリマダイル（Ｒｉｍａｄｙｌ）を１００μｌ注入した。次いで、消毒した鉗子及びスプリング式のハサミ（ｓｐｒｉｎｇ  ｓｃｉｓｓｏｒｓ）を使用して、大腿骨の真上を２ｃｍ切開した。浅臀筋及び大腿二頭筋を特定し、それらの間の結合組織を切断して、坐骨神経腔を露出させた。開創器を使用して腔を開いたままにし、神経に直接到達できるようにした。神経は、先の丸いマイクロマニピュレーター及びスプリング式のハサミを使用して、下にある筋膜から慎重に取り除いた。切開部位に０．２５％ブピバカインを１００μｌ注入して、神経が乾燥するのを防止すると同時に、局所麻酔を導入した。３５Ｇベベル針（Ｎａｎｏｆｉｌ＃ＮＦ３５ＢＶ−２、Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を神経へと慎重に挿入し、Ｈａｒｖａｒｄ社製ＰＨＤシリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ社）に接続した２５μｌシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ社）を使用して、２．５〜４μｌのウイルス溶液を１μｌ／ｍｉｎにて注入した。可能な場合には、坐骨神経の総腓骨枝及び脛骨枝へと別々に２か所注入し、神経を均一に満たすのを確実にした。ＣｈＲ２注入マウスには３×１０１０ｖｇ（ＵＮＣ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅから）を注入し、一方でＮｐＨＲ注入マウスには１×１０１１ｖｇまたは３×１０１１ｖｇ（それぞれ、ＵＮＣ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ及びＶｉｒｏｖｅｋ社から）のいずれかを注入した。マウスに応じて、この方法は、片側または両側のいずれかで実施した。次いで、切開部位は、５−０縫合糸を使用し、縫合して閉じた。
【０１６０】
オプシンを発現するＤＲＧニューロンの単離、培養及び電気生理学
ＤＲＧの単離
後根神経節（ＤＲＧ）の切除、培養及び電気生理学方法は、以前に報告されたプロトコール２３に主に基づいた。神経内注入の３〜４週間後、マウスをイソフルラン５％で深く麻酔し、体毛を背中から剃った。次いで、マウスを４℃の滅菌リン酸緩衝生理食塩水で灌流した。以下の単離ステップを迅速に実施し、灌流後５分以内に完了させた。無菌方法を使用して背中から皮膚を除去した後、脊柱に沿って筋肉を切断し、骨鉗子を使用して、椎骨表面の全ての筋肉または腱を剥がした。骨鉗子を使用し、脊椎の底部で始めて、吻側に移動して脊髄背側の椎骨を直接剥離した。坐骨神経の分岐が目視で確認できるようになるまで脊髄側方の筋肉を剥がし、脊髄側方の骨を折って神経路を解放した。各神経枝は、小型のスプリング式のハサミを使用して切断し、後根神経節が目視で確認できるようになるまで鉗子で近位に引き、ＤＲＧの近位で切断した。次いで、ＤＲＧを、４℃の滅菌ＭＥＭ−ｃｏｍｐｌｅｔｅ溶液（最小必須培地、ＭＥＭビタミン、抗生物質、及び１０％ウシ胎児血清）内に置いた。３か所のＤＲＧを、マウスの各発現面から切除した。
【０１６１】
ＤＲＧの培養
切除したＤＲＧを脱鞘し、ＭＥＭ−コラゲナーゼ溶液（最小必須培地、ビタミン、抗生物質、ウシ胎児血清無し、０．１２５％コラゲナーゼ）へと移した。組織は、水槽内で３７℃にて４５分間インキュベートし、次いで、２．５ｍｌのＴｒｉｐｌｅＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内で粉砕した。トリプシンは、８０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ  Ｉ、ニワトリ卵白からの１００μｇ／ｍｌトリプシン阻害剤及び２．５ｍｇ／ｍｌのＭｇＳＯ４を加えた２．５ｍｌのＭＥＭ−ｃｏｍｐｌｅｔｅで抑制した。細胞を遠心分離し、細胞密度５００，０００細胞／ｍｌにてＭＥＭ−ｃｏｍｐｌｅｔｅ内に再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液を、マトリゲルコーティングしたカバーガラス上に気泡として慎重に置き、次いで、３７℃、３％ＣＯ２、湿度９０％にてインキュベートした。最初のインキュベーションの２時間後、培養したニューロンを１ｍｌのＭＥＭ−ｃｏｍｐｌｅｔｅで浸した。細胞は、電気生理学を実施するまで、必要に応じて取り替えた新鮮な培地での培養下にて２〜７日間維持した。
【０１６２】
電気生理学
Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｘライトエンジン（Ｌｕｍｅｎｃｏｒ社）またはＤＧ４キセノンランプ（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を使用して、蛍光タンパク質の発現を同定し、オプシン活性化のための光パルスを送達した。４７５／２８フィルタを使用して、ＣｈＲ２に対して青色光を当て、５８６／２０フィルタを使用して、ＮｐＨＲに対して黄色光を当てた。顕微鏡対物レンズを介した光の出力密度は、パワーメータ（ＴｈｏｒＬａｂｓ社）で測定した。ホールセル記録は、水平プラー（Ｐ−２０００、Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いてホウケイ酸ガラス毛管（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）から引っ張ったパッチピペット（４〜６ＭΩ）で得た。外部記録溶液は以下を含有した（単位はｍＭ）：１２５ＮａＣｌ、２ＫＣｌ、２ＣａＣｌ２、２ＭｇＣｌ２、３０グルコース、２５ＨＥＰＥＳ、及び、ピーク光電流測定値の逸脱スパイク（ｅｓｃａｐｅ  ｓｐｉｋｅ）を排除するのに必要な場合、１μＭテトロドトキシン。内部記録溶液は、１３０Ｋ−グルコネート、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ＨＥＰＥＳ、１０ＥＧＴＡ、２ＭｇＣｌ２を含有した（単位はｍＭ）。記録は、ＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ７００Ｂ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を使用して作成し、ｐＣｌａｍｐ  １０．３ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を使用してデータを記録し、解析した。シグナルは、ベッセルフィルタを使用して４ｋＨｚにてフィルタリングし、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １４４０Ａアナログ−デジタルインターフェース（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて１０ｋＨｚにてデジタル化した。ピーク及び定常状態光電流は、電位固定モードにて１ｓ光パルスから測定し、細胞は−５０ｍＶで保持した。直列抵抗を慎重に監視し、直列抵抗が大幅に変化（２０％超）または２０ＭΩに到達した場合、記録は使用しなかった。
【０１６３】
光測定に対する潜時
実験プロトコール：
神経内注入の約１〜５週間後、マウスを、薄く透明なプラスチックの床を備えたプラスチックケース内に置き、試験に先立って３０分間試験装置に慣らした。レーザ（ＯＥＭ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、４７３ｎｍ、１ｍＷ／ｍｍ２）に取り付けられたマルチモード光ファイバー（Ｔｈｏｒ  Ｌａｂｓ社、＃ＡＦＳ１０５／１２５Ｙ）を、床を通してフットパッドへと向けた。試験を開始するために、動物は、（１）起きていて、（２）四足すべて床の上に置き、及び（３）静止していて歩き出そうとしない状態にしておく必要があった。潜時は、フットパッドが照射された時から足を引っ込めた時までを計算した。実験者バイアスを避けるため、主観的基準は潜時計算の終点には適用せず、すなわち、正常歩行が試験の終了であるとも考えられた。最大潜時を１分と設定し、データ収集の実用性を確保した。個々の試験は、各々少なくとも２分の間をおき、各マウスで５回試験を行い、合わせて平均化した。すべての試験は、秒当たり３０フレームにて録画し、収集後のビデオ分析によって潜時を計算した。
【０１６４】
統計解析
一元配置分散分析（Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を使用して、１〜５週目に、黄色光に対するＣｈＲ２＋マウスの応答と比較して、青色光に応答するＣｈＲ２＋マウスの潜時の変化を分析した。ダネットの事後多重比較検定を使用して、潜時が、黄色光対照とは有意に異なったことを決定した。効果量は、複数の群に対して、ｇψ、Ｈｅｄｇｅｓのｇの拡張を使用して計算した２４。
【０１６５】
場所嫌悪
２チャンバ場所嫌悪装置の構築
２つの１０ｃｍ×１２ｃｍチャンバを繋げる入口通路を備えた、２チャンバ場所装置を組み立てた。各チャンバの床は、一方が赤、もう一方が青で、１０×１２アレイの発光ダイオード（青色ＬＥＤ：４７５ｎｍ、赤色ＬＥＤ：６２５ｎｍ、Ｃｒｅｅ社）で照射し、光の出力密度が各部屋で等しくなるように（０．１５ｍＷ／ｍｍ２）鏡を向けた。
【０１６６】
実験プロトコール
１匹のマウスに、ＬＥＤアレイ床の電源を切った状態で、試験に先立って１０分間２チャンバ装置を探索させた。次いで、ビデオカメラを使用してマウスの位置を記録し、ＢＩＯＢＳＥＲＶＥ社製Ｖｉｅｗｅｒを使用して分析した２。マウスの位置を、ライトを切ったままで１０分間記録し、次いで、ライトのスイッチを点けて、更に３０分間位置を記録した。
【０１６７】
統計解析
対応のある両側スチューデントｔ検定を使用して、「ライトオフ」及び「ライトオン」条件間でのマウスの位置嗜好性の変化が、統計的に有意であったか否かを調べた。次いで、２つの条件間でのパーセンテージ変化を、ＣｈＲ２＋及びＮｐＨＲ＋マウス各々について計算した。次いで、これらのパーセンテージを、異分散集団に対する、対応のない両側スチューデントｔ検定を使用して比較した。効果量は、Ｈｅｄｇｅｓのｇを使用して計算した。
【０１６８】
機械逃避反応閾値の測定
機械的異痛を、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験によって調査した。マウスを、試験に先立って１時間試験装置に慣らした。様々な強さの毛髪を、上げ下げ法２５、２６を使用して、約２秒間足の底部に当てた。
【０１６９】
以下の行動のいずれかの出現が、逃避反応応答と考えられた：（１）素早く足を振る（ｆｌｉｎｃｈ）もしくは逃避、（２）つま先を伸ばす、または（３）すぐに足を舐める。動物が、２秒経つ前にその他何らかの理由で足を動かした場合、試験は不正確であると考えて繰り返した。次いで、使用したオプシンに応じて、マウスの足へと青色光（４７３ｎｍ、０．１５ｍＷ／ｍｍ２）または黄色光（５９３ｎｍ、０．１５ｍＷ／ｍｍ２）で同時照射を行った。ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験は、収集したすべてのデータについて、試験されるマウスがオプシンを発現したか否かを常に知らない単独の実験者によって実施した。
【０１７０】
統計解析
ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ閾値の変化を、ノンパラメトリック両側ウィルコクソンの符号順位検定を使用して、統計的有意性について試験した。効果量は、Ｈｅｄｇｅｓのｇを使用して計算した。
【０１７１】
熱逃避反応潜時の測定
改良したＨａｒｇｒｅａｖｅｓ足底試験装置を使用して、異なる種類の照射による熱感受性の変化を測定した。標準的なＨａｒｇｒｅａｖｅｓ試験のガラス板をわずかに上げて、赤外線放射体上にＬＥＤリングを配置できるようにした。ＬＥＤリングは、０．１５ｍＷ／ｍｍ２の青色光（４７５ｎｍ、Ｃｒｅｅ社）または黄色光（５９０ｎｍ、ＯＳＲＡＭ  Ｏｐｔｏ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒｓ社）を放射するよう調節した。光誘起性の混同を考慮するために、マウスが関連スペクトル（ｏｎ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ）の照射（ＣｈＲ２注入マウスには青色光、及びＮｐＨＲ注入マウスには黄色光）を受けた時の赤外線加熱に対する逃避反応潜時を、非関連スペクトル（ｏｆｆ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ）の照射と比較した（逆もまた同様）。逃避反応潜時は、赤外光の開始から最初に足を逃避させるまでの間で自動的に測定した。赤外線強度は、すべての試験にわたり一定を維持し、実験者は、試験されるマウスがオプシンを発現したか否かを常に知らなかった。
【０１７２】
統計解析
熱逃避反応潜時の変化を、対応のある両側スチューデントｔ検定を使用して、関連スペクトルと非関連スペクトルの照射条件の間で比較した。効果量は、Ｈｅｄｇｅｓのｇを使用して計算した。
【０１７３】
慢性絞扼損傷
本明細書で使用された慢性絞扼損傷モデルは、既存のプロトコール２７から抜粋した。動物をイソフルランで麻酔し、坐骨神経は、神経内注入に使用した坐骨神経露出方法と同様にして片側を露出させた。１本の７−０プロリーン（ｐｒｏｌｅｎｅ）二重結び結紮糸で、結紮糸を神経に沿って滑らせて動かすことができるように神経の周りを縛り、縫合糸の自由端を短く切断した。非吸収性の５−０縫合糸を使用して、傷を閉じた。神経障害性疼痛の発現を促進させるために、術後鎮痛薬は投与しなかった。
【０１７４】
形質導入の免疫組織化学、イメージング、及び定量化
免疫組織化学
マウスを１００μｌのＢｅｕｔｈａｎａｓｉａ−Ｄで安楽死させ、１０ｍｌの４℃リン酸緩衝生理食塩水（１×ＰＢＳ）及び１０ｍｌの４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で経心腔的灌流を行った。骨鉗子、スプリング式のハサミ及び鉗子を使用して、マウスから坐骨神経、関連する後根神経節及び脊髄を合わせて慎重に切除した。両足は別々に切除した。すべの組織を、４％ＰＦＡ内に一晩置き、４℃にて維持した。その後、サンプルを３０％スクロース（１×ＰＢＳ中）へと移し、異なる時間の長さ（最短１日にて）で維持した。サンプルは、顕微鏡誘導下にて後ほど解剖し、ティシュー・テック（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）Ｏ．Ｃ．Ｔ中で個別に凍結した。サンプルは、クライオスタット（ライカＣＭ３０５０Ｓ）を使用して２０μｍの厚さで切断し、スライド上に載せた。すべてのサンプルは、残留するＯＣＴをすべて除去するために、１×ＰＢＳ中で３×１０分間すすいだ。次いで、ミエリン以外のすべての標的に対して、サンプルを、１時間１×ＰＢＳ中に溶解させた０．３％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘ１００、２％正常ロバ血清（ＮＤＳ）でブロックした。次いで、サンプルを、１×ＰＢＳ中に溶解させた０．３％トリトン−Ｘ１００、５％ＮＤＳを用いた一次抗体溶液で、一晩インキュベートした。翌日、サンプルを１×ＰＢＳで３×１０分間すすぎ、次いで１×ＰＢＳ中に溶解させた二次抗体溶液で１時間インキュベートした。次いで、サンプルを１×ＰＢＳ中で３×１０分間すすぎ、ＰＶＡ  ＤＡＢＣＯを用いてカバーガラスで覆った。使用した一次抗体は、ラット抗サブスタンスＰ（１：５００、＃５５６３１２、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ビオチン−ＩＢ４（１：５０、＃Ｂ−１２０５、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、ウサギ抗ソマトスタチン受容体２（１：２５０、＃ａｂ１３４１５２、Ａｂｃａｍ社）及びウサギ抗ＶＲ１（ＴＲＰＶ１用、１：５００、＃ａｂ３１８９５、Ａｂｃａｍ社）であった。使用した二次抗体は、Ｃｙ５ロバ抗ウサギ（１：５００、＃７１１−１７５−１５２、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、Ｃｙ３ロバ抗ラット（１：５００、＃７１１−１６５−１５２、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）及びストレプトアビジン−テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）（３：１００、＃ＳＡ−５００６、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）であった。ミエリンに対しては、サンプルを、１×ＰＢＳ中に溶解させた０．２％トリトン−Ｘ１００を使用して１時間透過処理した。次いで、サンプルを、フルオロミエリンレッド（ＦｌｕｏｒｏＭｙｅｌｉｎ  Ｒｅｄ）（１：３００、＃Ｆ３４６５２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）で２０分間インキュベートした。その後、サンプルを１×ＰＢＳ中で３×１０分間すすぎ、ＰＶＡ  ＤＡＢＣＯを用いてカバーガラスで覆った。
【０１７５】
共焦点イメージング
サンプルを、２０倍油浸対物レンズを使用したライカＴＣＳ  ＳＰ５共焦点走査型レーザ顕微鏡を使用してイメージングし、ライカＬＡＳ  ＡＦソフトウェアを使用して分析した。画像は、Ｆｉｊｉ２８を使用して後ほど処理し、Ｆｉｊｉを使用してｚスタックを互いに合成し、画像輝度及びコントラストを補正して、色覚異常に対処するため色を修正した。
【０１７６】
定量化
ＡＡＶ６−ＣｈＲ２を注入した３匹の異なるマウスからのＤＲＧを、サブスタンスＰ、ＴＲＰＶ１、ソマトスタチン及びＩＢ４の共発現について調べ、ミエリンの共発現については３匹の異なるマウスからの神経サンプルを調べた。各マーカーについて、ＹＦＰ陽性であったマーカー発現ニューロン／軸索のパーセンテージ、及び所与のマーカーに対して陽性であったＹＦＰ陽性ニューロン／軸索のパーセンテージを定量化した。
【０１７７】
結果
ＡＡＶ６−ｈＳｙｎ−ＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ｅＹＦＰを、マウスの坐骨神経に注入した（図１ａ）。注入の２〜４週間後、後根神経節内の単離されたＣｈＲ２陽性ニューロンからの電気生理学的記録によって、ＣｈＲ２が機能的であることが明らかとなり、発現細胞は、１ｍＷ／ｍｍ２、４７５ｎｍの光で５〜１０Ｈｚにて刺激した場合、活動電位を発火することができた（図１ｂ；図６）。加えて、ＣｈＲ２は、脊髄後角への中枢投射の末端をなすニューロン全体にわたり発現し、より深層または上行の脊髄後索ではほとんど発現が見られず、これにより、形質導入ニューロンは、レクセドの層Ｉ／ＩＩに投射する侵害受容器であったことを示唆した（図１ｃ）。免疫組織化学は、ＣｈＲ２の発現とＩＢ４、サブスタンスＰ、ＴＲＰＶ１、及びソマトスタチンなどの侵害受容マーカーの間のかなりの重複を示した。ＣｈＲ２とミエリンの間では重複が観察されず、自己受容体が坐骨神経内で形質導入されなかったことを示し；その代わり、無髄侵害受容器（推定Ｃ線維）に発現が限定された（表１、図９で提供される）。更に、形質導入した後根神経節ニューロンは、非形質導入ニューロンよりもより小径であり（図６）、Ｃ線維サイズに関する先の組織学的証拠と一致した１７。
【０１７８】
これらの形質導入侵害受容器の光遺伝学的活性化による行動的効果を調べた。マウスに、透明な床を備えたチャンバを自由に探索させた。慣れさせた後、皮膚の侵害受容器神経終末を光遺伝学的に活性化させるため、ＣｈＲ２注入マウスの後足底上に青色光（１ｍＷ／ｍｍ２）を照射し、特徴的な疼痛様行動を観察した（図２ａ）。青色光に応答して、マウスは足を振った、長時間足を舐める行為を行った、または発声した：疼痛に伴うオペラント行動１８。この効果を定量化するために、発光開始からいずれかの足の逃避反応までの間の時間を、このような逃避反応が疼痛または正常な探索行動に起因したか否かにかかわらず、測定した。この潜時は、ＹＦＰ注入マウス、及び非関連スペクトルの黄色光照射を受けたＣｈＲ２注入マウスから記録された潜時と比較して、注入の２週間後、劇的に減少し（Ｐ＝０．０３４、効果量：２．１０）、その後３週間は低下したままであった（３週目：Ｐ＝０．０２７、効果量＝２．１７；４週目：Ｐ＝０．０２６、効果量＝２．１９）（図２ｂ）。潜時は、マウス内のＡＡＶ６で以前に報告されたように１９、可能性として一部の試験マウスにおける導入遺伝子発現の遮断に起因し、注入の５週間後に増加した。完全に経皮での刺激にもかかわらず、ＣｈＲ２注入マウスは光に反応し、低強度の青色光（１ｍＷ／ｍｍ２）に応答して数百ミリ秒以内に逃避した。照射レベルをより低下させると、次第に効果が薄くなることを示したが、１ｍＷ／ｍｍ２を超えて照射強度を増加させても、潜時が更に減少することは一切なかった（図２ｃ）。
【０１７９】
疼痛の光遺伝学的誘発が、調節可能か否かを試験するため、すぐに嫌悪を示さなかったより低強度の照射（０．２５ｍＷ／ｍｍ２）によって、より微細な効果を引き起こす可能性があるか否かを確かめた。場所嫌悪装置を構築し、装置内の各チャンバの床を、非関連スペクトル（赤色、６２５ｎｍ）または関連スペクトル（青色、４７５ｎｍ）光のいずれかを放射するＬＥＤアレイで照射した（図２ｄ）。青色チャンバを探索した時のＣｈＲ２注入マウスは、疼痛の外的徴候を何も示さず、光によって足を舐める行為または振り回すことはなかったが、青色チャンバよりも赤色チャンバに対して８０〜２０％の嗜好性を示した（Ｐ＝０．００１３、効果量＝３．１１）。ＹＦＰ注入マウスは、有意な嗜好性を示さなかった（図２ｅ、ｆ）。このような嫌悪は、反射的逃避反応を誘発するレベルには達しないがなおオペラント行動の変化は引き起こす、低疼痛レベルによって引き起こされる可能性がある。
【０１８０】
このような低い光遺伝学的刺激レベルはまた、その他の無害な刺激に対してＣｈＲ２注入マウスを感作するよう作用する場合もあると、結論付けられた。これを実証するために、機械逃避反応閾値のｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験及び熱逃避反応潜時のＨａｒｇｒｅａｖｅｓ試験を実施したが、低強度の青色光（０．１５ｍＷ／ｍｍ２、図３ａ、ｂ）によって関連する足に同時照射した。このような照射は、すぐに嫌悪を誘発するには不十分であったが（図２ｃ）、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ閾値を、５０％（Ｐ＝０．０２７、効果量＝０．９０４）大幅に低下させ（図３ｂ）、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ潜時を、５５％（Ｐ＝０．０００３８、効果量＝２．７７）大幅に低下させた（図３ｆ、ｇ）。このような感作は、侵害受容器自由神経終末にて誘発される閾値以下での脱分極によって生じる可能性があり、この神経終末をその他の無害な刺激に対して、より過敏な状態にさせる場合がある。野生型マウスは、照射試験と非照射試験の間での行動において有意差を示さなかった。
【０１８１】
光遺伝学的に疼痛を誘発するこの能力を補完するために、侵害受容器における活動電位の発生を、光遺伝学的に阻害する方法を開発した。このような阻害は大きな治療効果を有し得、薬理学または電気刺激では不可能な、活動電位の発生に対する空間的及び時間的に限定した制御の１種を提供することができる。
【０１８２】
マウスの坐骨神経に、ＡＡＶ６−ｈＳｙｎ−ｅＮｐＨＲ３．０−ｅＹＦＰを注入し；本発明者らのＣｈＲ２結果と類似した形質導入プロファイルを観察した（図７）。単離して培養したＮｐＨＲ陽性ＤＲＧニューロンの電気生理学的記録によって、一定の黄色光照射に応答した強い過分極が明らかになり、これは、活動電位の開始をブロックするのに十分であった（図３ｃ；図８）。
【０１８３】
黄色（５９３ｎｍ）光を放射するよう同様に改良したｖｏｎ  Ｆｒｅｙ及びＨａｒｇｒｅａｖｅｓ装置を使用して、ＮｐＨＲ注入マウスを試験した。ＮｐＨＲ注入マウスは、１．１〜１．７ｍＷ／ｍｍ２の光で照射される場合、それらのｖｏｎ  Ｆｒｅｙ逃避反応閾値が６９％増加した（Ｐ＝０．００４３、効果量＝０．８０２）（図３ｄ、ｅ）。低強度の黄色光（０．１５ｍＷ／ｍｍ２）は、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ逃避反応潜時を９７％増加させるのに十分だった（Ｐ＝０．０００１９、効果量＝２．０５）。野生型マウスは、黄色光での照射時に、有意な行動の変化を示さなかった。
【０１８４】
最後に、侵害受容を光遺伝学的に阻害する能力は治療的に妥当であるか否かを、神経障害性疼痛の動物モデルにおける試験によって決定した。ベースラインｖｏｎ  Ｆｒｅｙ及びＨａｒｇｒｅａｖｅｓ試験をＮｐＨＲ注入マウスで実施し、黄色光によって、機械刺激及び熱刺激に対してマウスを脱感作したこの初期の結果を再現した（図４ａ、４ｂ）。慢性絞扼損傷２０を実施して、これらのマウスで神経障害性疼痛の症状を誘発した。予想通り、マウスは、損傷後に熱的及び機械的異痛を示した。次いで、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ及びＨａｒｇｒｅａｖｅｓ試験を実施する間に、マウスを黄色光で照射した。光遺伝学的阻害によって、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ閾値を、損傷前の非照射レベルの３６から９４％まで増加させて（Ｐ＝０．００２０、効果量＝０．９２０、図４ａ）、機械的異痛を逆転することができたことが観察された。同様に、光遺伝学的阻害によって、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ逃避反応潜時を、正常な非照射レベルの５５％から１２８％まで増加させて（Ｐ＝０．０１２、効果量＝１．９１、図４ｂ）、ＮｐＨＲ注入マウスにおける熱痛覚過敏も逆転させた。両方の場合において、ＹＦＰ注入対照は、慢性絞扼損傷前後の両方で、照射による有意な変化を示さなかった。
【０１８５】
従って、データは、遺伝子導入を必要としない比較的単純な注入方法によって、オプシンを、侵害受容器にて高い特異性で成功裏に発現させることができることを示す。更に、非侵襲的な経皮照射によって確かな行動的効果を得るための、十分に強力なオプシンの発現及び輸送が観察された。このことは、皮膚及び皮下の自由神経終末におけるオプシンの発現に起因し、最小光減衰で照射することができると考えられる。興味深いことに、機械的及び熱閾値に対する光遺伝学的照射の効果は、この照射が低強度の場合であっても観察された。このことは、自由神経終末の静止電位及びベースラインの興奮性に起因する可能性があり、これにより、比較的小さな光誘起膜電流が、依然として下流の神経伝達物質放出に影響を与える可能性がある。光遺伝学的効果は、ＡＡＶ６注入後の２〜５週間で、３週間にわたり観察された。
【０１８６】
本明細書で報告された光遺伝学的能力は、侵害受容機能を障害する非侵襲的方法を求める科学者によって広く使用されることができる。特に、オプシンの発現は無髄侵害受容器に特異的なので、光遺伝学を使用して、長期的な二方向光遺伝学的制御により、神経障害性疼痛の発生における侵害受容器活性の役割を理解することができる。より大きな特異性を求める及び各個別のオプシンに対して特注のトランスジェニックマウスの開発を望まない研究者は、代わりに、多くの異なる侵害受容器特異的Ｃｒｅ系統のいずれかと合わせてＣｒｅ依存的ＤＩＯ−ＡＡＶ６２２を使用し、侵害受容器の亜集団に限定されるオプシンの発現を得ることができる。非侵襲的な経皮光遺伝学的阻害は、疼痛、例えば難治性慢性疼痛の処置として使用することができる。
【０１８７】
図１：ｒＡＡＶ２／６−ｈＳｙｎ−ＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ｅＹＦＰの坐骨神経内注入によって、脊髄層Ｉに投射した無髄侵害受容器に形質導入した。ａ）注入概略図、ｂ）分離したＣｈＲ２＋  ＤＲＧニューロンの電気生理学。４７５ｎｍ光（５Ｈｚ、１ｍＷ／ｍｍ２）に応答して光遺伝学的誘発活動電位を示す代表的なホールセル電流固定記録及び光パルス（１ｓ、４７５ｎｍ、１ｍＷ／ｍｍ２）に応答した代表的なホールセル電位固定記録。細胞は、−５０ｍＶで保持する。ｃ）脊髄、ＤＲＧ、神経及び足での発現プロファイル；ＣｈＲ２が緑色、細胞マーカーがマゼンタ、重複部分は白色で示される。ＣｈＲ２は、有髄ニューロンとは共在しなかったが、ＩＢ４、ソマトスタチン、ＴＲＰＶ１及びサブスタンスＰを含む侵害受容マーカーとは共在した。
【０１８８】
図２：ＣｈＲ２＋マウスの経皮照射によって、調節可能な疼痛様行動が得られた。ａ）実験概略図、ｂ）ＣｈＲ２＋マウスにおける光感受性の時間依存性（光：１ｍＷ／ｍｍ２）（ｎ＝４マウス）。青色光に応答する潜時は、注入後の２週目〜４週目では、黄色光潜時と比較して有意により低かった（一元配置ＡＮＯＶＡ：Ｆ（６，２１）＝３．９８；Ｐ＝０．００８２；ダネットの検定：Ｐ（２週目）＝０．０３４、Ｐ（３週目）＝０．０２７、Ｐ（４週目）＝０．０２６；効果量（２週目）＝２．１０、効果量（３週目）＝２．１７、効果量（４週目）＝２．１９）。ＹＦＰ＋対照から並びに１週目及び５週目のＣｈＲ２＋マウスから記録された潜時は、有意ではなかった（Ｐ（１週目）＝０．５５、Ｐ（５週目）＝０．４９、Ｐ（ＹＦＰ＋）＝０．９９）。ｃ）光感受性は、青色光強度の増加に伴い、強度が１ｍＷ／ｍｍ２になるまで急激に減少し、その閾値を超えると安定した。ｄ）場所嫌悪概略図、ｅ）ＹＦＰ＋マウスは、青色点灯領域に対して有意な嗜好性を示さなかった（青色点灯領域にいた時間は１９．９％増加、Ｐ＝０．０６、ｎ＝５）が、ＣｈＲ２＋マウスは、青色点灯領域に対して有意な嫌悪を示した（青色点灯領域にいた時間は５５．６％減少、効果量＝３．１１、Ｐ＝０．００１３、ｎ＝５）。挿入図：これら２つのパーセント変化は、統計上互いに異なっていた。（Ｐ＝０．０００６１）ｆ）場所嫌悪データの各々の記録。グループ分けしたデータはすべて、平均±ｓ．ｅ．ｍとして示す。
【０１８９】
図３：機械刺激及び熱刺激に対して、青色光によってＣｈＲ２発現マウスを感作し、黄色光によってＮｐＨＲ発現マウスを脱感作した。ａ）ＣｈＲ２媒介感作の概略図（０．１５ｍＷ／ｍｍ２青色光強度）、ｂ）ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ閾値は、ＣｈＲ２＋マウスで５０％減少した（効果量＝０．９０４、Ｐ＝０．０２７、ｎ＝１０足）が、野生型では有意な変化を示さなかった（Ｐ＝０．５０、ｎ＝１０足）。ｃ）ｉ）１ｓ、５８６ｎｍ光パルス（黄色のバーで示される）に応答した、ＮｐＨＲ発現ＤＲＧニューロンにおける外向き光電流を示す代表的なホールセル電位固定記録。ｉｉ）ＮｐＨＲ発現ＤＲＧニューロンにおける、電気的誘発スパイク（４００ｐＡ電流注入、５ｍｓパルス幅）の黄色（５８６ｎｍ）光媒介阻害を示す代表的なホールセル電流固定記録。ｄ）ＮｐＨＲ媒介阻害（１．１〜１．７ｍＷ／ｍｍ２光強度）の概略図、ｅ）ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ閾値は、ＮｐＨＲ＋マウスで６９％増加した（効果量＝０．８０２、Ｐ＝０．００４３、ｎ＝２４足）が、野生型マウスでは有意な変化を示さなかった（Ｐ＝０．７１、ｎ＝２０足）。ｆ）熱閾値の光遺伝学的修飾の概略図。青色／黄色光強度（０．１５ｍＷ／ｍｍ２）、ｇ）赤外線刺激に対する逃避反応潜時は、青色光照射中にＣｈＲ２＋マウスで５５％減少し（効果量＝２．７７、Ｐ＝０．０００３８、ｎ＝７足）、黄色光照射中にＮｐＨＲ＋マウスで９７％増加した（効果量＝２．０５、Ｐ＝０．０００１９、ｎ＝１０足）（非関連スペクトル照射と比較して）一方で、野生型の潜時は、有意に変化しなかった（Ｐ＝０．９１、ｎ＝９足、ＣｈＲ２＋マウスの対照、Ｐ＝０．２６、ｎ＝１０足、ＮｐＨＲ＋マウスの対照）。グループ分けしたデータはすべて、平均±ｓ．ｅ．ｍとして示す。
【０１９０】
図４：ＮｐＨＲ＋マウスの黄色光刺激が、慢性絞扼損傷（ＣＣＩ）によって引き起こされる機械的異痛及び熱痛覚過敏を逆転させた。ａ）ＣＣＩ前、黄色光は、ＮｐＨＲ＋マウスのｖｏｎ  Ｆｒｅｙ閾値を有意に増加させた（７８％増加、効果量＝１．４３、Ｐ＝０．００２０、ｎ＝１０足）が、ＹＦＰ＋マウスでは増加しなかった（Ｐ＝０．４１、ｎ＝１２足）。ＣＣＩ後、すべてのマウスのｖｏｎ  Ｆｒｅｙ閾値が有意に減少した（ＮｐＨＲ＋マウス、６４％減少、効果量＝１．６１、Ｐ＝０．００２０、ｎ＝１０足；ＹＦＰ＋マウス、５９％減少、効果量＝１．０３、Ｐ＝０．０００４９、ｎ＝１２足）。黄色光は、ＮｐＨＲ＋マウスのｖｏｎ  Ｆｒｅｙ閾値をＣＣＩ前のレベル近傍まで有意に増加させた（２５８％増加、効果量＝０．９２、Ｐ＝０．００２０、ｎ＝１０足）が、ＹＦＰ＋マウスの閾値は有意に変化させなかった（Ｐ＝０．５７、ｎ＝１２足）。ｂ）ＣＣＩ前、黄色光は、ＮｐＨＲ＋マウスにおける赤外線刺激に対する逃避反応潜時を有意に増加させた（１１２％増加、効果量＝３．９５、Ｐ＝０．０００２５、ｎ＝７足、非関連スペクトル照射と比較して）が、ＹＦＰ＋マウスでは有意な変化を示さなかった（Ｐ＝０．９７、ｎ＝９足）。ＣＣＩ後、すべてのマウスは、非関連スペクトル照射中の赤外線刺激に対する逃避反応潜時の減少を示した（ＮｐＨＲ＋マウス、４５％減少、効果量＝３．７５、Ｐ＝０．０００７７、ｎ＝７足；ＹＦＰ＋マウス、４０％減少、効果量＝２．０６、Ｐ＝０．００３８、ｎ＝９足）。黄色光は、ＮｐＨＲ＋マウスにおけるこの潜時を、最初のＣＣＩ前潜時を超えて有意に増加させた（１３２％増加、効果量＝１．９１、Ｐ＝０．０１２、ｎ＝７足）が、ＹＦＰ＋マウスの潜時は有意に変化させなかった（Ｐ＝０．５３、ｎ＝９足）。グループ分けしたデータはすべて、平均±ｓ．ｅ．ｍとして示す。
【０１９１】
図６：オプシン導入のサイズ分布。ａ）ＡＡＶ６：ＣｈＲ２及びｂ）ＡＡＶ６：ＮｐＨＲの神経内注入によって、より小径の侵害受容器に特異的なオプシン導入をもたらす（ｎ＝２０５のＣｈＲ２＋ニューロン、ｎ＝６６６のＣｈＲ２−ニューロン、ｎ＝２１７のＮｐＨＲ＋ニューロン、ｎ＝３５５のＮｐＨＲ−ニューロン）。ＡＡＶ６：ＣｈＲ２は、１６μｍ未満ニューロンの８０％に形質導入し、ＡＡＶ６：ＮｐＨＲは、１６μｍ未満ニューロンの７５％に形質導入した。
【０１９２】
図７：ＡＡＶ２／６−ｈＳｙｎ−ｅＮｐＨＲ３．０−ｅＹＦＰの坐骨神経内注入後に観察されたＮｐＨＲ導入の代表的画像。
【０１９３】
図８：ＣｈＲ２＋及びＮｐＨＲ＋ＤＲＧニューロンからの電気生理学的記録。ａ）ＣｈＲ２＋ＤＲＧニューロンの画像、スケールバーは２５μｍ。ｂ）ＣｈＲ２＋ＤＲＧニューロンにおける、１０Ｈｚ青色（４７５ｎｍ）光パルス列（５ｍｓパルス幅）によって誘発されたスパイクを示すサンプルホールセル電流固定記録。細胞は−５０ｍＶで保持し、光の出力密度は、１ｍＷ／ｍｍ２である。ｃ）１ｓ、４７５ｎｍ青色光に応答したピーク及び定常状態光電流の概要グラフ。平均±ＳＥＭをグラフ化、ｎ＝７。ｄ）ＮｐＨＲ＋ＤＲＧニューロンの画像、スケールバーは２５μｍ。ｅ）ＮｐＨＲ＋ＤＲＧニューロンにおける、黄色（５８６ｎｍ）光媒介過分極を示すサンプルホールセル電流固定記録。細胞は−４８ｍＶで保持し、光の出力密度は、１ｍＷ／ｍｍ２である。ｆ）１ｓ、５８６ｎｍ黄色光に応答したピーク及び定常状態光電流の概要グラフ。平均±ＳＥＭをグラフ化、ｎ＝１０。
【０１９４】
図９は、表１．オプシン導入プロファイルの分析を示す。異なる３匹のＣｈＲ２＋及びＮｐＨＲ＋マウスの各々からのＤＲＧ分析から計算された共在パーセンテージ。ソマトスタチン＋、ＶＲ１＋及びＩＢ４＋ニューロンは、オプシン＋プールの主な構成要素である。
【０１９５】
参考文献
2019194228.tif 000055
2019194228.tif 000056
2019194228.tif 000057
【実施例２】
【０１９６】
神経内注入ＡＡＶ８によって、脊髄後索及び脊髄深層に投射するニューロンに選択的形質導入する。
大径１次求心性ニューロンは、圧迫、振動、心地よい接触、及び有痛性接触を含む、多様な感覚プロセスの媒介に関与する。疼痛研究との関連において、これらのニューロンは、様々な慢性疼痛疾患で大幅に変化することが知られている。これらのニューロンでの自然（「異所性」）発火は、中枢性感作を誘発するそれらの中枢性疼痛経路の直接的な推進による、または脊髄回路の変化のいずれかによる、炎症性及び神経障害性疼痛発現の主な原因の１つであると考えられている。これら求心性ニューロンの光遺伝学的阻害によって、神経障害性疼痛の症状を軽減する。これら求心性ニューロンの光遺伝学的刺激はまた、「疼痛ゲート（ｐａｉｎ  ｇａｔｅ）」の一部を形成する、脊髄での多段階回路プロセスによって、いくつかの条件にて疼痛を軽減するよう作用する場合もある。以下に示すデータは、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ８）が、触知覚を媒介する大径１次求心性ニューロンへと特異的に感染することができることを示す。
【０１９７】
方法
すべての外科的及び行動的方法は、実験動物飼育に関するスタンフォード大学管理検討会（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  Ｌａｂ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）によって承認された。麻酔下にて、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週）の坐骨神経を露出させ；３〜５μｌのＡＡＶ８−ＣＭＶ−ＧＦＰ（１−２Ｅ１０ウイルスゲノム（ｖｇ））を、露出させた神経に注入した。注入の２〜４週間後、マウスを経心腔的灌流によって安楽死させた。マウスを解剖及び切断して、脊髄、神経及び足からの組織をイメージングした。
【０１９８】
結果
ＡＡＶ８−ＣＭＶ−ＧＦＰによる感染が成功した１次求心性ニューロンは、腰髄内の脊髄深層（図１０Ａ）に投射した。脊髄のより吻側領域において、発現は、脊髄後索の薄束で主に見られた（図１０Ｂ）。この発現は、脳幹まで持続した。
【実施例３】
【０１９９】
三叉神経節の感覚ニューロンへの光遺伝学的タンパク質の送達
神経障害性疼痛は三叉神経節で発生する可能性があり、これは、多くの場合、一時的な、刺すような、誘発性の、多くの場合ショック様の顔面痛によって特徴付けられる。疾患は、感染（例えば、ヘルペスウイルス）、顔面外傷、脳卒中または術後神経損傷から生じ得る。本実施例のデータによって、阻害オプシンであるｅＮｐＨＲ３．０の、ラットにおける三叉神経節の感覚ニューロンへの送達を実証する。本実施例に示すデータによって、光遺伝学を使用して、三叉神経節に関する疼痛を制御することができることを実証する。
【０２００】
方法
麻酔下にて、１０週齢のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに、１×１０１１ｖｇのＡＡＶ５−ｈＳｙｎ−ｅＮｐＨＲ３．０を三叉神経節へと定位的に注入した。動物を４週間後に安楽死させ、三叉神経節を解剖、切断及び共焦点顕微鏡を使用してイメージングした。
【０２０１】
結果
ＡＡＶ５−ｅＮｐＨＲ３．０−ＹＦＰの直接注入の４週間後、三叉神経節の感覚ニューロンにおいて、阻害タンパク質の強力な発現が観察された。これらの結果によって、脊髄後根神経節のニューロン以外の１次感覚ニューロンをオプシンの標的とすることができること、および、これらのニューロンによって伝達される疼痛を制御するために阻害することができることが実証される。データはまた、直接注入を使用したオプシン送達の実現可能性も実証する。データを図１１に示す。
【０２０２】
図１１．神経節へ直接注入後の、三叉神経節の感覚ニューロンにおけるｅＮｐＨＲ３．０の発現。ｅＮｐＨＲ３．０を黄色蛍光タンパク質に融合し、可視化を容易にした（緑色）。ニューロンは、ニッスル（Ｎｉｓｓｌ）（赤色）で染色した。すべての細胞核は、ＤＡＰＩ（青色）でラベルした。
【実施例４】
【０２０３】
神経障害性疼痛を既に有する動物でのオプシンの送達及び疼痛の阻害
以下に示すデータにより、慢性絞扼損傷（ＣＣＩ）及び疼痛の発現後、ＮｐＨＲのＡＡＶ６送達によって疼痛を軽減することができることを実証する。
【０２０４】
方法
ナイーブＣ５７Ｂｌ６マウスを、Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ機械的試験方法に慣れさせ、次いでベースライン機械的閾値を記録した。次いで、マウスをＣＣＩに罹患させ；神経損傷の１０日後に機械的閾値を記録し、神経障害性疼痛を発現したそれらの動物のみ（２５％以上の機械的閾値の減少により決定した）を、この研究で維持した。ヒトシナプシンプロモーター（合計で５×１０１０ｖｇ）の制御下で、ＮｐＨＲまたはＹＦＰのいずれかを発現するＡＡＶ６をマウスの坐骨神経へと送達した。ＮｐＨＲまたはＹＦＰ送達の３０日後、標的とした足への黄色光照射の存在下または不存在下にて、機械的閾値を記録した。
【０２０５】
結果
ＡＡＶ６送達の３０日後、標的とした足への光照射によって、ＮｐＨＲを発現する動物にて、機械的閾値レベルをＣＣＩ前のレベルへと有意に増加させたが、ＹＦＰを発現する動物では増加しなかったことを観察した。データを図１２に示す。
【０２０６】
図１２．ＡＡＶ６を使用した侵害受容線維における、ＧＦＰまたはｅＮｐＨＲ３．０を発現するマウスの機械的閾値。ＣＣＩの４０日後、黄色光の存在下または不存在下にて閾値を記録した。ｅＮｐＨＲ３．０グループの動物は、光の存在下での機械的閾値が有意により高かった（ｐ＜０．０５）。ＹＦＰグループの機械的閾値は、変化しなかった。
【０２０７】
これらの結果によって、本明細書に記載された光遺伝学的アプローチは、神経障害性疼痛に既に罹患している神経に適用することができることを実証する。
【０２０８】
本発明は、その特定の実施形態に関して記載してきたが、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなしに様々な変更を行ってもよいこと、並びに等価物で置換してよいことが、当業者によって理解されるべきである。加えて、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセスステップまたはステップを、本発明の目的、趣旨及び範囲に適合させるために、多くの修正を加えてよい。このような修正のすべては、本明細書に添付の特許請求の範囲内であることを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月1日(2019.8.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における神経障害性疼痛を制御するための組成物であって、オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶ６ベクターを含み、前記オプシンポリペプチドが、前記オプシンを活性化させる波長の光に応答して１次求心性ニューロンの過分極を提供し、かつ核酸が、該個体の侵害受容器に導入され、
前記オプシンが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に対して少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び
前記ヌクレオチド配列が、シナプシン−Ｉプロモーターに機能的に連結されている、
前記組成物。
【請求項２】
前記オプシンポリペプチドが、小胞体（ＥＲ）搬出シグナル、及び／または膜輸送シグナルを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記光が、経皮的に送達される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記オプシンが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に対して少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記導入が、神経への注射によるかまたは筋肉注射による、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記導入が、局所、皮内、静脈内、髄腔内、または胸腔内投与による、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記侵害受容器が、熱刺激、機械刺激、または化学刺激によって一般に活性化されるものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記オプシンの活性化が、疼痛の少なくとも１０％の低減を提供する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
神経障害性疼痛の非ヒト、非トランスジェニック、動物モデルであって、前記非ヒト動物が、前記動物の侵害受容器において、オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶ６ベクターを発現し、前記オプシンポリペプチドが、前記オプシンを活性化させる波長の光に応答して前記侵害受容器の脱分極を提供し、
前記オプシンが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記ヌクレオチド配列が、シナプシン−Ｉプロモーターに機能的に連結されており、並びに
経皮的に送達された光による前記オプシンポリペプチドの活性化が、熱的疼痛知覚及び機械的疼痛知覚の両方を誘発する、
前記非ヒト動物モデル。
【請求項１０】
前記オプシンが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項１１】
前記動物が、ラットまたはマウスである、請求項９に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項１２】
神経障害性疼痛を軽減する薬剤の同定方法であって、
ａ）請求項９に記載の非ヒト動物に試験薬剤を投与すること；及び
ｂ）脱分極のための光活性化ポリペプチドが経皮的に送達された光によって活性化される時の神経障害性疼痛に対する前記試験薬剤の効果を、もしあれば決定すること
を含み、試験薬剤の非存在下で前記脱分極のための光活性化ポリペプチドの光活性化によって誘発される前記疼痛レベルと比較して前記非ヒト動物の神経障害性疼痛を軽減する前記試験薬剤が、前記試験薬剤が神経障害性疼痛を軽減するための候補薬剤であることを示す、前記方法。
【請求項１３】
神経障害性疼痛を軽減する薬剤の同定方法であって、
ａ）請求項９に記載の非ヒト動物に試験薬剤を投与すること；及び
ｂ）前記試験薬剤の投与後に神経障害性疼痛を誘発するのに必要な光量に対する前記試験薬剤の効果を、もしあれば決定すること
を含み、
疼痛を誘発するのに必要な前記光量を増加させる試験薬剤が、神経障害性疼痛を軽減するための候補薬剤である、前記方法。