(57)【要約】本発明は、上皮細胞成長因子受容体(EGFR)遺伝子の多型に関する。いくつかの態様では、本発明は、EGFR発現に影響を及ぼすEGFR遺伝子のプロモーターにおける一塩基多型(SNP)が関与する組成物および方法に向けられる。EGFRの発現または活性に関連する多型が同定されることにより、EGFR標的治療剤の潜在効力および毒性の評価、患者の臨床予後の予測、ならびにEGFR調節不全に関連する疾患を発症する患者のリスクの評価を行うための新規の方法および組成物が可能になる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の一方または両方のEGFR遺伝子における多型の配列を決定する工程を含む、患者の癌を治療するためのEGFR標的治療剤の潜在効力を評価する方法。
【請求項２】
多型が、-1435、-1300、-1249、-1227、-761、-650、-544、-486、-216、-191、169、および2034位のヌクレオチド位置からなる群より選択されるヌクレオチド位置にあるか、またはこれらのヌクレオチド位置と連鎖不平衡にある、請求項1記載の方法。
【請求項３】
多型が、-1435 C>T、-1300 G>A、-1249 G>A、-1227 G>A、-761 C>A、-650 G>A、-544 G>A、-486 C>A、-216 G>T、-191 C>A、169 G>T、および2034 G>Aからなる群より選択される多型であるか、またはこれらの多型と連鎖不平衡にある、請求項2記載の方法。
【請求項４】
患者の一方または両方のEGFR遺伝子における少なくとも2つの多型の配列を決定する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
EGFR標的治療剤がEGFRチロシンキナーゼ阻害剤である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
EGFRチロシンキナーゼ阻害剤がゲフィチニブ（gefitinib）またはエルロチニブ（erlotinib）である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
EGFR標的治療剤がモノクローナル抗体である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
モノクローナル抗体がセツキシマブ（cetuximab）である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
多型が-216 G>Tである、請求項3記載の方法。
【請求項１０】
対立遺伝子上の-216位にあるTがEGFRタンパク質のより高い発現の指標であり、さらに、EGFRタンパク質の高発現がEGFR標的治療剤の低下した効力の指標である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
患者の両方のEGFR遺伝子における多型の配列を決定する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
多型の配列の決定がハイブリダイゼーションアッセイによって行われる、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
多型の配列の決定が対立遺伝子特異的増幅アッセイによって行われる、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
多型の配列の決定がシークエンシングアッセイまたはミクロシークエンシングアッセイによって行われる、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
多型の配列の決定が制限酵素による消化によって行われる、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
試料を入手する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
試料が頬細胞、単核細胞、または癌細胞を含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
EGFR標的治療剤を患者に投与する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
患者の一方または両方のEGFR遺伝子における多型の配列を決定する工程をふくむ、癌患者の臨床予後を予測する方法。
【請求項２０】
患者の両方のEGFR遺伝子における多型の配列を決定する工程をさらに含む、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
多型が、-1435、-1300、-1249、-1227、-761、-650、-544、-486、-216、-191、169、および2034位のヌクレオチド位置からなる群より選択されるヌクレオチド位置にあるか、またはこれらのヌクレオチド位置と連鎖不平衡にある、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
多型が、-1435 C>T、-1300 G>A、-1249 G>A、-1227 G>A、-761 C>A、-650 G>A、-544 G>A、-486 C>A、-216 G>T、-191 C>A、169 G>T、および2034 G>Aからなる群より選択される多型であるか、またはこれらの多型と連鎖不平衡にある、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
多型が-216 G>Tである、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
対立遺伝子上の-216位にあるTがEGFRタンパク質の増大した発現の指標である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
EGFRタンパク質の増大した発現が予後不良を予測する、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
予後不良が、化学療法、ホルモン療法、または放射線療法に対する高い耐性を示す、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
予後不良が、高い転移リスクを示す、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
患者の一方または両方のEGFR遺伝子における多型の配列を決定する工程を含む、EGFR標的治療剤に対する患者の毒性のリスクを評価する方法。
【請求項２９】
多型が、-1435、-1300、-1249、-1227、-761、-650、-544、-486、-216、-191、169、および2034位のヌクレオチド位置からなる群より選択されるヌクレオチド位置にあるか、またはこれらのヌクレオチド位置と連鎖不平衡にある、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
多型が、-1435 C>T、-1300 G>A、-1249 G>A、-1227 G>A、-761 C>A、-650 G>A、-544 G>A、-486 C>A、-216 G>T、-191 C>A、169 G>T、および2034 G>Aからなる群より選択される多型であるか、またはこれらの多型と連鎖不平衡にある、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
多型が-216 G>Tである、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
一方または両方の対立遺伝子上の-216位にあるTがEGFR標的治療剤の低下した毒性の指標である、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
患者の両方のEGFR遺伝子における多型の配列を決定する工程をさらに含む、請求項28記載の方法。
【請求項３４】
細胞のEGFR遺伝子の一方または両方の対立遺伝子の-216位にある配列を決定する工程であって、一方または両方の対立遺伝子の-216位にあるTがより高い発現レベルを示す工程を含む、細胞におけるEGFR発現レベルを予測する方法。
【請求項３５】
患者の一方または両方のEGFR遺伝子における多型の配列を決定する工程をふくむ、患者のEGFR調節不全に関連する疾患を処置するためのEGFR標的治療剤の潜在効力を評価する方法。
【請求項３６】
EGFR遺伝子座における多型の配列を決定するための核酸を含む、患者におけるEGFR標的治療剤の潜在効力を評価するためのキット。
【請求項３７】
核酸が、-1435、-1300、-1249、-1227、-761、-650、-544、-486、-216、-191、169、および2034位からなる群より選択されるヌクレオチド位置にある多型を増幅するためのプライマーである、請求項36記載のキット。
【請求項３８】
核酸が、-1435、-1300、-1249、-1227、-761、-650、-544、-486、-216、-191、169、および2034位からなる群より選択されるヌクレオチド位置にある多型を検出するように設計された特異的ハイブリダイゼーションプローブである、請求項36記載のキット。
【請求項３９】
特異的ハイブリダイゼーションプローブがオリゴヌクレオチドアレイまたはマイクロアレイに含まれる、請求項38記載のキット。
【請求項４０】
EGFR遺伝子座における多型の配列を決定するための制限酵素を含む、患者におけるEGFR標的治療剤の潜在効力を評価するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1.発明の分野
本発明は、一般的に、分子生物学および腫瘍学の分野に関する。より具体的には、本発明は、上皮細胞成長因子受容体(EGFR)の発現および活性に関連するEGFR遺伝子における多型に関する。いくつかの態様では、本発明は、EGFR発現に影響を及ぼすEGFR遺伝子プロモーターにおける一塩基多型(SNP)が関与する組成物および方法に向けられる。なお、本発明は、参照により本明細書に組み入れられる、2004年3月1日に出願された米国特許仮出願第60/549,069号への優先権を主張する。米国政府は、米国国立衛生研究所からの助成金番号U01GM61393により本発明において権利を所有する。
【背景技術】
【０００２】
2.関連技術の説明
ヒト上皮細胞成長因子受容体(EGFR)は、細胞の増殖、分化、および生存のシグナル伝達経路において重要な役割を果たしている。EGFRの過剰発現はヒト原発腫瘍の約30％で見られる。これらの腫瘍におけるEGFRの活性化は、細胞の増殖、運動性、接着、浸潤能を増大させることによって、およびアポトーシスを阻止することによって腫瘍成長を促すように見える(Tysnes et al., 1997)。EGFRの過剰発現および調節不全は、患者の予後不良、ならびに転移、末期疾患、ならびに化学療法、ホルモン療法、および放射線療法に対する耐性と関連付けられている(Salomon et al., 1995; Akimoto et al., 1999; Wosikowski et al., 2000)。
【０００３】
EGFR の5'調節領域は、エキソン1の2kb上流および2kb下流に及ぶ約4kbにまたがっている。調節エレメントには、プロモーター領域および2つの別個のエンハンサー領域が含まれる。EGFRプロモーターおよびエンハンサーの機能は十分に研究されており、記録されている(Ishii et al., 1985; Haley et al., 1987; Johnson et al.,1988; Kageyama et al., 1988; Maekawa et al., 1989)。簡単に述べると、このプロモーターにはTATAボックスもCAATボックスも見られない。その代わりに、複数の転写開始点がある(Ishii et al., 1985; Haley et al., 1987; Johnson et al., 1988; Kageyama et al., 1988)。多数のシス制御因子およびトランス制御因子が発見されている。これらの制御因子としては、EGF応答性DNA結合タンパク質(ERDBP-1)、p53、p63、Sp1、ビタミンD応答配列(VDRE)、およびエストロゲン応答配列が含まれ、これらはEGFRの複雑な調節を反映している。
【０００４】
デオキシリボヌクレアーゼIフットプリント法によって、EGFR遺伝子プロモーターにある4つのCCGCCC配列(-457〜-440、-365〜-286、-214〜-200、および-110〜-84)にSp1が結合することができ、従って、遺伝子調節に重要な役割を果たしている可能性があることが示された(Johnson et al.,1998)。Gebhardtおよび同僚による研究(1999)から、 (下流エンハンサー近傍の)EGFRイントロン1の中にある、14回〜21回の反復であるジヌクレオチド(CA)n反復多型がEGFR発現を調節するように見られることが証明された。21回の反復を有する長い対立遺伝子は、16回の反復を有する短い対立遺伝子と比較して80％の遺伝子発現低下を示した(Gebhardt et al.、1999; Buerger et al., 2000)。多型CA反復の研究からのデータは、この多型部位が癌感受性において役割を果たしている可能性があることを示唆している(Brandt et al., 2004)。
【０００５】
腫瘍生物学におけるEGFRの重要性から、現在、いくつかのEGFR標的癌療法が開発中である。EGFR標的薬剤は、通常、EGFRリン酸化の阻害またはEGF結合の阻止に向けられる。転移性非小細胞肺癌の処置に対して最近認可された薬物の1つがゲフィチニブ（gefitinib）である。ゲフィチニブは、EGFによって刺激されるEGFR自己リン酸化を阻害する選択的EGFRチロシンキナーゼ阻害剤である。
【０００６】
EGFRは多くの抗癌薬の直接の標的であるので、EGFR発現が変動することは薬物の応答および毒性に直接影響を及ぼす可能性がある。従って、遺伝子の発現または活性に関連するEGFR遺伝子多型は、細胞シグナル伝達のさらなる理解および薬物の応答/毒性の解明の両方にとって重要であると考えられる。EGFR遺伝子多型の研究は将来の薬物設計にとっても有用であるかもしれない。
【０００７】
EGFR発現はまた癌以外の疾患と関連付けられている。例えば、EGFRマイクロサテライト多型と常染色体優性多発性嚢胞腎(ADPKD)の進行速度との間の関連性が報告された(Magistroni et al., 2003)。EGFRの機能または発現に影響を及ぼす変異が炎症性腸疾患の素因となり得ることが示唆されている(Martin et al., 2002)。従って、EGFR遺伝子の発現または活性に関連するEGFR遺伝子多型の同定は、EGFR調節不全に関連する様々な疾患の進行をさらに理解するのに重要であると考えられる。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明は、EGFRの 5'調節領域における12個の多型を開示する。より具体的には、本発明者らは、-216 G>T多型がEGFRプロモーター領域からの発現増大と関連していることを示した。EGFRの発現に関連する多型が同定されると、EGFR標的治療剤の潜在効力および/または毒性の評価、患者の臨床予後の予測、ならびにEGFR調節不全に関連する疾患を発症する患者のリスクの評価を行うための新規の方法および組成物が可能になる。
【０００９】
本発明は、-1435、-1300、-1249、-1227、-761、-650、-544、-486、-216、-191、169、および2034位のヌクレオチド位置にある、EGFR遺伝子座内の多型部位を開示する。EGFR遺伝子座の-1435、-1300、-1249、-1227、-761、-650、-544、-486、-216、-191、169、および2034位のヌクレオチド位置は、+1と指定された翻訳開始点を基準としたそれらの位置によって同定された。0と指定されたヌクレオチド位置はない。この命名法に従うと、+1のすぐ5'側にあるヌクレオチドは-1であり、+1のすぐ3'側にあるヌクレオチドは2である。翻訳開始点(+1)は、EGFR遺伝子座(GenBankアクセッション番号AF288738,参照により本明細書に組み入れられる)のヌクレオチド9,385、およびSEQ ID NO:1のヌクレオチド505に対応する。SEQ ID NO:1はAF288738のヌクレオチド8,881〜9,405を含む。
【００１０】
本発明者らが発見した具体的な多型は、-1435 C>T、-1300 G>A、-1249 G>A、-1227 G>A、-761 C>A、-650 G>A、-544 G>A、-486 C>A、-216 G>T、-191 C>A、 169 G>T、および2034 G>Aである。これらの多型はEGFR遺伝子の5'調節領域に位置しているので、遺伝子調節と関連している可能性がある。
【００１１】
従って、1つの態様において、本発明は、1つまたは複数の細胞におけるEGFR発現レベルを予測する方法を提供する。この方法は、細胞の一方または両方のEGFR遺伝子の-1435、-1300、-1249、-1227、-761、-650、-544、-486、-216、-191、169、または2034位のヌクレオチド位置の1つまたは複数にある配列を決定する工程を含む。従って、このような細胞を有する患者は、一般的なEGFR発現レベルを有すると予測することができる。好ましい態様において、本方法は、細胞のEGFR遺伝子の一方または両方の対立遺伝子中の-216位にある配列を決定する工程を含む。一方または両方の対立遺伝子中の-216位におけるTの存在は、より高い発現レベルを示す。「より高い発現レベル」は、EGFR遺伝子の両方の対立遺伝子上の-216位にGを有する細胞における発現レベルより大きな発現レベルである。「決定する」という用語は、その平易かつ通常の意味に従って用いられる。「決定する」という用語は、調査、推論、または計算によって結論を見出すこと、または結論を下すことを意味する。
【００１２】
EGFR遺伝子座の-1435、-1300、-1249、-1227、-761、-650、-544、-486、-216、-191、169、または2034位のヌクレオチド位置にある多型と連鎖不平衡にある多型も本発明の方法と共に使用することができる。「連鎖不平衡」(本明細書では「LD」が用いられるが、当技術分野では「LED」とも言及される)は、その、当業者にとって平易かつ通常である意味に従って用いられる。LDは、2つの遺伝子座にある対立遺伝子(すなわち、所与の遺伝子の変異型)または多型のある特定の組み合わせが予想されるよりも高い頻度で現れる状況を指す。当業者によって決定される連鎖不平衡に関して用いられる「有意な」は、0.25または0.1でもよく、0.1、0.05、0.001、0.00001またはそれ未満でもよい、統計学的なp値またはα値であることが意図される。EGFRハプロタイプとEGFRタンパク質発現レベルとの関係は、遺伝子型(すなわち、生物の遺伝子構成)を表現型(すなわち、生物または細胞が示す身体的形質)に相関付けるのに使用することができる。「ハプロタイプ」は、その、当業者にとって平易かつ通常である意味に従って用いられる。これは、相同染色体の一方にある2つまたはそれ以上の対立遺伝子または多型の遺伝子型を意味する。
【００１３】
EGFR遺伝子座の-1435、-1300、-1249、-1227、-761、-650、-544、-486、-216、-191、169、および2034位のヌクレオチド位置にある配列、またはこれらのヌクレオチド位置と連鎖不平衡にある配列は、当業者に公知の任意の方法によって決定することができる。この配列は直接的または間接的に決定することができる。関心対象のヌクレオチド位置の配列は、例えば、関心対象の位置にある特定の核酸と連鎖不平衡にあることが知られている位置にあるヌクレオチド配列を決定することによって、間接的に決定することができる。ある特定のヌクレオチド位置にある配列を決定する方法としては、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、対立遺伝子特異的増幅アッセイ、シークエンシングアッセイ、ミクロシークエンシングアッセイ、侵入切断アッセイ(invasive cleavage assay)、および制限酵素アッセイが含まれる。ある特定の態様において、-216 G>T多型の存在が制限酵素BseR1による消化によって確かめられる。-216位にTを有する対立遺伝子はBseR1によって切断することができるが、-216位にGを有する対立遺伝子はBseR1によって切断することができない。
【００１４】
他の態様において、本発明は、患者のEGFR調節不全に関連する疾患を処置するためのEGFR標的治療剤の潜在効力を評価する方法を提供する。この方法は、患者の一方または両方のEGFR遺伝子の-1435、-1300、-1249、-1227、-761、-650、-544、-486、-216、-191、169、または2034位のヌクレオチド位置にある配列を決定する工程を含む。
【００１５】
EGFR調節不全に関連する疾患は、EGFRが過剰発現している、過小発現している、または同等の正常細胞における発現と比較して不適切な時に発現している疾患でもよい。EGFR発現の不適当な調節に関連する疾患の例としては、癌、常染色体優性多発性嚢胞腎、および炎症性腸疾患などの炎症性障害が含まれる。
【００１６】
EGFR標的治療剤は、直接的または間接的のいずれかでEGFR活性を調節することができる任意の薬剤でよい。当技術分野において公知のEGFR標的治療剤は、通常、EGFRリン酸化の阻害またはEGF結合の阻止に向けられている。2つのEGFR標的治療剤、Iressa(ゲフィチニブ)およびErbitux(セツキシマブ（cetuximab）)がFDAの認可を受けている。もう1つのEGFR標的治療剤であるTarceva(エルロチニブ（erlotinib）)は第三相試験中である。IressaおよびTarcevaは小分子であるのに対して、Erbituxはモノクローナル抗体である。他のEGFR標的薬剤は、EGFRの転写を調節することによってEGFR活性を調節する。例えば、細胞を、EGF、デキサメタゾン、甲状腺ホルモン、レチノイン酸、インターフェロンα、または野生型p53で処置することによって、EGFR mRNAの産生を直接的または間接的に刺激することができる。
【００１７】
ある特定の局面において、本発明は、患者の癌を処置するためのEGFR標的治療剤の潜在効力を評価する方法を提供する。この方法は、患者の一方または両方のEGFR遺伝子の-1435、-1300、-1249、-1227、-761、-650、-544、-486、-216、-191、169、または2034位のヌクレオチド位置にある配列を決定する工程を含む。いくつかの態様では、EGFR標的治療剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、またはセツキシマブである。好ましくは、-216位にある配列が決定される。いくつかの態様では、EGFR遺伝子の一方または両方の対立遺伝子上の-216位にTを有する患者は、両方の対立遺伝子上の-216位にGを有する患者と比較した、EGFR標的治療剤の低下した効力の指標である。
【００１８】
いくつかの態様において、本発明の方法は、試料を入手する工程をさらに含む。試料は、一方または両方のEGFR遺伝子の-1435、-1300、-1249、-1227、-761、-650、-544、-486、-216、-191、169、または2034位のヌクレオチド位置にある配列を決定することができるゲノムDNAを含む任意の試料でよい。試料は、例えば、生検、静脈穿刺、吸引、またはスワブ(swabbing)によって入手することができる。試料は任意の組織または体液に由来してもよい。ある特定の態様において、試料は、頬細胞、単核細胞、または癌細胞を含む。
【００１９】
ある特定の局面において、本発明の方法は、患者にEGFR標的治療剤を投与する工程をさらに含む。
【００２０】
他の態様において、本発明は、EGFR調節不全に関連する疾患を有する患者の臨床予後を予測する方法を提供する。この方法は、患者の一方または両方のEGFR遺伝子の-1435、-1300、-1249、-1227、-761、-650、-544、-486、-216、-191、169、または2034位のヌクレオチド位置の1つまたは複数にある配列、またはこれらと連鎖不平衡にある配列を決定する工程を含む。いくつかの態様において、多型は-216 G>Tである。対立遺伝子上の-216位におけるTの存在は、EGFRタンパク質の増大した発現の指標である。ある特定の局面において、EGFRタンパク質の増大した発現は予後不良を予測する。いくつかの態様において、EGFR調節不全に関連する疾患は癌である。癌患者の場合、予後不良は、例えば、化学療法、ホルモン療法、または放射線療法に対する増大した耐性を示してもよい。予後不良は、増大した転移リスクまたは減少した生存期間も示し得る。
【００２１】
1つの態様において、本発明は、EGFR標的治療剤に対する患者の毒性のリスクを評価する方法を提供する。この方法は、患者の一方または両方のEGFR遺伝子の-1435、-1300、-1249、-1227、-761、-650、-544、-486、-216、-191、169、または2034位のヌクレオチド位置の1つまたは複数に多型が存在することを決定する工程を含む。1つの局面において、多型は-216 G>Tである。1つの態様において、一方または両方の対立遺伝子上の-216位におけるTの存在は、EGFR標的治療剤の低下した毒性の指標である。
【００２２】
他の態様において、本発明は、患者の癌発症リスクを評価する方法を提供する。この方法は、患者の一方または両方のEGFR遺伝子の-1435、-1300、-1249、-1227、-761、-650、-544、-486、-216、-191、169、または2034位のヌクレオチド位置の1つまたは複数に多型が存在することを決定する工程を含む。1つの態様において、多型は-216 G>Tである。
【００２３】
本発明のある特定の局面において、本方法は、患者の病歴を入手する工程をさらに含む。ここで、患者は、癌を発症するリスクがあるか、またはEGFR標的治療剤を必要とすることが確認される。
【００２４】
本発明はまたキットを提供する。1つの態様において、本発明は、-1435、-1300、-1249、-1227、-761、-650、-544、-486、-216、-191、169、または2034位のヌクレオチド位置の1つまたは複数における多型を検出するためのキットを提供する。いくつかの態様において、キットは、多型の存在を決定するための核酸を含む。核酸はプライマーでもよく、またはプローブでもよい。いくつかの態様において、プローブはオリゴヌクレオチドアレイまたはマイクロアレイに含まれる。他の態様において、キットは、多型の存在を決定するための制限酵素を含む。ある特定の態様において、キットは核酸および制限酵素の両方を含む。対照核酸を本キットに含めてもよい。
【００２５】
いくつかの態様において、キットの核酸は、SEQ ID NO:2の7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500またはそれ以上の連続したヌクレオチドを含む。
【００２６】
ある特定の局面において、本発明は、患者におけるEGFR標的治療剤の潜在効力を評価するためのキットを提供する。このキットは、EGFR遺伝子座における、-1435、-1300、-1249、-1227、-761、-650、-544、-486、-216、-191、169、または2034位のヌクレオチド位置における多型の存在を決定するための核酸を含む。他の局面において、本発明は、患者におけるEGFR標的治療剤の潜在効力を評価するためのキットを提供する。このキットは、EGFR遺伝子座における-1435、-1300、-1249、-1227、-761、-650、-544、-486、-216、-191、169、または2034位のヌクレオチド位置における多型の存在を決定するための制限酵素を含む。
【００２７】
本明細書に記載の任意の方法または組成物が本明細書に記載の他の任意の方法または組成物に関して実施できることが意図される。
【００２８】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、本開示は選択肢および「および/または」のみを意味する定義を指示するが、選択肢のみを意味する、すなわち、選択肢が互いに両立しないことを意味すると明確に示されない限り、「および/または」を意味するように用いられる。
【００２９】
本出願全体を通じて、「約」という用語は、ある値が、この値を決定するために用いられている装置または方法の誤差の標準偏差を含むことを示すために用いられる。
【００３０】
長年にわたる特許法に従って、「ある（a）」および「ある（an）」という語は特許請求の範囲または明細書において「含む(comprising)」という語と共に用いられた場合、特に言及のない限り、1つまたは複数であることを示す。
【００３１】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになると考えられる。しかしながら、詳細な説明および具体的な実施例は本発明の具体的な態様を示すが、この詳細な説明から本発明の精神および範囲の中での様々な変更および修正が当業者に明らかになるので、例示にすぎないことが理解されるはずである。
【００３２】
例示的な態様の説明
A.上皮細胞成長因子受容体
ヒト上皮細胞成長因子受容体(EGFR)は膜貫通タンパク質である。例えば、上皮細胞成長因子およびTGF-αなどのリガンドと、細胞外表面にあるそのN-末端が結合すると、受容体の二量体化が誘導され、細胞内ドメインのチロシンキナーゼ活性が活性化される。EGFRの活性化は、DNA合成、ならびに細胞の増殖、成熟、生存、およびアポトーシスを最終的にもたらす細胞事象のカスケードを導く。
【００３３】
EGFRの発現は主に転写レベルで調節されている(Xu et al., 1984)。EGFR mRNAの産生は、細胞をEGF、デキサメタゾン、甲状腺ホルモン、レチノイン酸、インターフェロンα、または野生型p53で処置することによって、直接的または間接的に刺激できることが示されている(Deb et al., 1994; Grandis et al., 1996; Hudson et al., 1989; Subler et al., 1994; Xu et al., 1993)。
【００３４】
EGFRの5'調節領域は、エキソン1の2kb上流および2kb下流に及ぶ約4kbにまたがっている。調節エレメントには、プロモーター領域および2つの別個のエンハンサー領域が含まれている。EGFRプロモーターおよびエンハンサーの機能は十分に研究されており、記録に残されている(Ishii et al., 1985; Haley et al., 1987; Johnson et al.,1988; Kageyama et al., 1988; Maekawa et al., 1989;これらはそれぞれ参照により組み入れられる)。簡単に述べると、このプロモーターにはTATAボックスもCAATボックスも見られない。その代わりに、複数の転写開始点がある(Ishii et al., 1985; Haley et al., 1987; Johnson et al., 1988; Kageyama et al., 1988)。多数のシス制御因子およびトランス制御因子が発見されている。これらの制御因子には、EGF応答性DNA結合タンパク質(ERDBP-1)、p53、p63、Sp1、ビタミンD応答配列(VDRE)、およびエストロゲン応答配列が含まれ、これはEGFRの複雑な調節を反映している。
【００３５】
デオキシリボヌクレアーゼIフットプリント法によって、EGFR遺伝子プロモーターにある4つのCCGCCC配列(-457〜-440、-365〜-286、-214〜-200、および-110〜-84)にSp1が結合することができ、従って、遺伝子調節に重要な役割を果たしている可能性があることが示された(Johnson et al.,1998)。Gebhardtおよび同僚による研究(1999)から、 (下流エンハンサー近傍の)EGFRのイントロン1の中にある、14回〜21回の反復であるジヌクレオチド(CA)n反復多型がEGFR発現を調節するように見られることが証明された。21の反復を有する長い対立遺伝子は、16の反復を有する短い対立遺伝子と比較して遺伝子発現の80％の低下を示した(Gebhardt et al.,1999; Buerger et al., 2000)。多型CA反復についての研究からのデータは、この多型部位が癌感受性において役割を果たしている可能性があることを示唆している(Brandt et al., 2004)。
【００３６】
EGFRの過剰発現はヒト原発腫瘍の約30％で見られる。これらの腫瘍におけるその活性化は、細胞の増殖、運動性、接着、浸潤能を増大させることによって、およびアポトーシスを阻止することによって、腫瘍成長を促すように見える(Tysnes et al., 1997)。EGFRの過剰発現および調節不全は、患者の予後不良、ならびに転移、末期疾患、ならびに化学療法、ホルモン療法、および放射線療法に対する耐性と関連付けられている(Salomon et al., 1995; Akimoto et al., 1999; Wosikowski et al., 2000)。
【００３７】
EGFRの過剰発現が一部の癌と関連し、腫瘍成長を促進するに見えるという観察に基づいて遺伝子発現に関連するEGFR遺伝子の多型を同定することは、個体の癌発症リスクの予測および癌患者の予後の予測に重要であり得る。さらに、EGFR発現に関連する多型はまた、EGFR標的薬剤の毒性、投与量、および潜在効力を評価するのに使用することもできる。
【００３８】
いくつかのEGFR標的癌療法が現在開発中である。EGFR標的薬剤は、通常、EGFRリン酸化の阻害またはEGF結合の阻止に向けられる。2つのEGFR標的薬、Iressa(ゲフィチニブ)およびErbitux(セツキシマブ)が認可されており、Tarceva(エルロチニブ)は第三相試験中である。EGFRは多くの抗癌薬の直接の標的であるので、EGFR発現が変動することは薬物の応答および毒性に直接影響を及ぼす可能性がある。従って、遺伝子の発現または活性に関連するEGFR遺伝子における多型は、細胞シグナル伝達のさらなる理解および薬物応答/毒性の解明にとって重要であると考えられる。EGFR遺伝子における多型の研究は将来の薬物設計にとっても有用であり得る。
【００３９】
EGFR発現はまた癌以外の疾患とも関連付けられている。EGFRは尿細管増殖における重要な要素である。最近、EGFRマイクロサテライト多型と常染色体優性多発性嚢胞腎(ADPKD)の進行速度が関連していることが報告された(Magistroni et al., 2003)。ADPKDマウスモデルにおいて、ある特定のチロシンキナーゼ阻害剤(EKI-785)を用いてEGFRを阻害すると疾患進行を遅らせることができることも証明された(Sweeney et al., 1999)。
【００４０】
ヒトEGFRは、炎症性腸疾患と関連している領域である染色体7p12に位置する(Satsangi et al., 1996)。さらに、大腸炎の動物モデルにおいて、EGFRの免疫反応性が著しく上昇していることが観察されている(Reinshagen et al., 1993)。EGFRの機能または発現に影響を及ぼす突然変異が炎症性腸疾患の素因となり得ることが示唆されている(Martin et al., 2002)。
【００４１】
細胞増殖の調節におけるEGFRの重要性から、その発現または活性に関連するEGFR遺伝子における多型は、EGFR調節不全に関連する疾患の進行をさらに理解するのに重要であると考えられる。本発明によって、EGFR遺伝子の5'調節領域に12個の多型、-1435 C>T、-1300 G>A、-1249 G>A、-1227 G>A、-761 C>A、-650 G>A、-544 G>A、-486 C>A、-216 G>T、-191 C>A、 169 G>T、および2034 G>Aが同定された。本多型は、+1と指定した翻訳開始点からのそれらの位置を基準にして同定された。この命名法に従うと、+1のすぐ5'側にあるヌクレオチドは-1であり、+1のすぐ3'側にあるヌクレオチドは2である。翻訳開始点(+1)は、EGFR遺伝子座(GenBankアクセッション番号AF288738)のヌクレオチド9,385、およびSEQ ID NO:1のヌクレオチド505に対応する。SEQ ID NO:1はEGFR遺伝子座のヌクレオチド8,881〜9,405を含む。
【００４２】
SNPの1つである-1249 G>Aは上流エンハンサーにあるのに対して、-216 G>Tおよび-191 C>Aはプロモーター領域にある。興味深いことに、-216 G>TはSp1結合部位に位置し、GがTで置換されるとSp1結合が変化する可能性がある。-191 C>Aは転写開始点に近い。従って、これらのSNPはEGFR転写に大きな影響を及ぼす可能性がある。
【００４３】
B.核酸
本発明のある特定の態様は、プロモーター、増幅プライマー、オリゴヌクレオチドプローブ、およびゲノムDNA分析に関与する他の核酸要素を含む、様々な核酸に関する。ある特定の局面において、核酸は、野生型、突然変異体、または多型核酸を含む。
【００４４】
「核酸」という用語は当技術分野において周知である。本明細書で使用する「核酸」は、一般的に、核酸塩基を含む、DNA、RNA、またはその誘導体もしくは類似体の分子(すなわち、鎖)を意味する。核酸塩基には、例えば、DNAで見られる天然のプリン塩基またはピリミジン塩基(例えば、アデニン「A」、グアニン「G」、チミン「T」、もしくはシトシン「C」)、またはRNAで見られる天然のプリン塩基またはピリミジン塩基(例えば、A、G、ウラシル「U」、もしくはC)が含まれる。「核酸」という用語は、それぞれ、「核酸」という用語の亜属である「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語を含む。
【００４５】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、長さが約3〜約100核酸塩基の分子を意味する。「ポリヌクレオチド」という用語は、長さが約100核酸塩基を超える少なくとも1つの分子を意味する。「遺伝子」は、遺伝子産物のコード配列、ならびに遺伝子産物のイントロンおよびプロモーターを意味する。特許請求した組成物および方法と共に使用するための核酸として、EGFR遺伝子の他に、EGFRのプロモーターおよびエンハンサーなどの他の調節領域が意図される。
【００４６】
これらの定義は、一般的に、一本鎖分子を意味するが、特定の態様では、一本鎖分子と部分的に相補的な、実質的に相補的な、または完全に相補的な、さらなる鎖も含む。従って、核酸は、分子を含む特定の配列の1つまたは複数の相補鎖または「相補物」を含む、二本鎖分子または三本鎖分子を含んでもよい。本明細書で使用する場合、一本鎖核酸は接頭辞「ss」で示されることがあり、二本鎖核酸は接頭辞「ds」で示されることがあり、三本鎖核酸は接頭辞「ts」で示されることがある。
【００４７】
「遺伝子」という用語はポリペプチド鎖の産生に関与するDNAセグメントを意味し、コード領域の前後にある領域および個々のコードセグメント(エキソン)の間にある介在配列(イントロン)を含む。「プロモーター」は、転写の開始および速度が制御される核酸配列領域である。これは、核酸配列の特異的な転写を開始するために、RNAポリメラーゼおよび他の転写因子のような調節タンパク質および調節分子が結合することができるエレメントを含むことがある。「エンハンサー」という用語は、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用調節配列を意味する。エンハンサーはどちらの方向でも機能することができ、プロモーターの上流にあってもよく、または下流にあってもよい。
【００４８】
1.核酸の調製
核酸は、例えば、化学合成、酵素的生成、または生物学的生成などの当業者に公知の任意の技法によって作成することができる。合成核酸(例えば、合成オリゴヌクレオチド)の非限定的な例には、参照により本明細書に組み入れられる、欧州特許第266,032号に記載されるようなホスホトリエステル、ホスファイト、またはホスホルアミダイト化学および固相法を使用したインビトロ化学合成によって作製された核酸、またはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられるFroehler et al., 1986および米国特許第5,705,629号に記載されるようなデオキシヌクレオシドH-ホスホネート中間体を介して作成された核酸が含まれる。本発明の方法において、1種類またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを使用することができる。様々な異なるオリゴヌクレオチド合成機構が、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,659,774号、同第4,816,571号、同第5,141,813号、同第5,264,566号、同第4,959,463号、同第5,428,148号、同第5,554,744号、同第5,574,146号、同第5,602,244号に開示されている。
【００４９】
酵素的に生成された核酸の非限定的な例には、PCR(商標)などの増幅反応(例えば、米国特許第4,683,202号および米国特許第4,682,195号参照。それぞれ参照により本明細書に組み入れられる)において、または参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,645,897号に記載のオリゴヌクレオチド合成において、酵素によって生成された核酸が含まれる。生物学的に生成された核酸の非限定的な例として、生細胞において生成(すなわち、複製)された組換え核酸、例えば、細菌において複製された組換えDNAベクターが含まれる(例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Sambrook et al. 2001参照)。
【００５０】
2.核酸の精製
核酸は、ポリアクリルアミドゲル、塩化セシウム勾配遠心分離、クロマトグラフィーカラム、または当業者に公知の他の任意の手段によって精製することができる(例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Sambrook et al. 2001参照)。
【００５１】
ある特定の局面において、本発明は、単離された核酸である核酸に関する。本明細書で使用する場合、「単離された核酸」という用語は、1つもしくは複数の細胞の総ゲノム核酸および転写された核酸の大部分が含まれないように単離されているか、またはこれらを含まない核酸分子(例えば、RNA分子またはDNA分子)を意味する。ある特定の態様において、「単離された核酸」は、例えば、脂質またはタンパク質などの高分子、生物学的小分子などの細胞成分もしくはインビトロ反応成分の大部分が含まれないように単離されているか、またはこれらを含まない核酸を意味する。
【００５２】
3.核酸セグメント
ある特定の態様において、核酸は核酸セグメントである。本明細書で使用する場合、「核酸セグメント」という用語は、核酸の断片、例えば、非限定的な例としては、EGFR遺伝子配列の一部しかコードしない核酸である。従って、「核酸セグメント」は、約2ヌクレオチドから、調節領域からポリアデニル化シグナルを含む完全長遺伝子までを含む遺伝子配列の任意の部分、およびコード領域全体を含む任意の長さを含んでよい。
【００５３】
ある特定の核酸配列に基づいて様々な核酸セグメントを設計することができ、これらは任意の長さでよい。例えば、1番目の残基は1、2番目の残基は2など、配列に数値を割り当てることによって、以下のように、全ての核酸セグメントを規定するアルゴリズムを作成することができる。
n〜n+y
式中、nは、1から配列の最後の数までの整数であり、yは、核酸セグメントの長さ-1であり、n+yは、配列の最後の数を超えない。従って、10塩基長の場合、核酸セグメントは塩基1〜10、2〜11、3〜12...などに対応する。15塩基長の場合、核酸セグメントは塩基1〜15、2〜16、3〜17...などに対応する。20塩基長の場合、核酸セグメントは塩基1〜20、2〜21、3〜22...などに対応する。ある特定の態様において、核酸セグメントはプローブでもよくプライマーでもよい。本明細書で使用する「プローブ」は、一般的に、検出の方法または組成物において用いられる核酸を意味する。本明細書で使用する場合、「プライマー」は、一般的に伸長または増幅の方法または組成物において用いられる核酸を意味する。
【００５４】
4.核酸相補物
本発明はまた核酸に相補的な核酸を含む。標準的なワトソン-クリック型、フーグスティーン型、または逆フーグスティーン型の結合相補規則に従って核酸が別の核酸と塩基対を形成できる場合、核酸は別の核酸と「相補する」か、または「相補的」である。本明細書で使用する場合、「別の核酸」は別個の分子を意味してもよく、同じ分子の空間的に離れている配列を意味してもよい。好ましい態様において、相補物は、核酸多型を検出するためのハイブリダイゼーションプローブまたは増幅プライマーである。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「相補的な」または「相補物」という用語はまた、全てではない核酸塩基が対応する核酸塩基と塩基対を形成しなくても別の核酸鎖または二重鎖とハイブリダイズすることができる、連続した核酸塩基または半連続的な(semiconsecutive)核酸塩基(例えば、1つまたは複数の核酸塩基部分が分子に存在しない)の配列を含む核酸を意味する。しかしながら、診断または検出のいくつかの態様では、完全に相補的な核酸が好ましい。
【００５６】
C.核酸の検出
本発明のいくつかの態様は、EGFRにおける多型を同定し、遺伝子型またはハプロタイプを表現型に相関付け(ここで、表現型はEGFRの活性または発現の低下または変化である)、次いで、EGFR標的薬またはEGFR標的化合物を与えているまたは与えることになる患者において、このような多型を同定することに関する。従って、本発明は、多型を同定するためのアッセイおよび他の核酸検出方法を含む。従って、核酸は、核酸ハイブリダイゼーションを伴う態様の場合、プローブまたはプライマーとして有用である。本発明の診断方法またはスクリーニング方法において、これらを使用することができる。本発明には、EGFRをコードする核酸およびEGFRポリペプチドまたは転写物の発現または安定性に関与する核酸の検出が含まれる。核酸検出の一般的な方法を以下に提供する。その後に、一塩基多型(SNP)を含む多型の同定に使用した具体的な実施例を示す。
【００５７】
1.ハイブリダイゼーション
長さが3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、50、60、70、80、90、もしくは100ヌクレオチド、好ましくは、17〜100ヌクレオチドのプローブもしくはプライマー、または本発明の一部の局面では、長さが1〜2キロ塩基もしくはそれ以上のプローブもしくはプライマーを使用すると、安定かつ選択的な二重鎖分子が形成される。得られるハイブリッド分子の安定性および/または選択性を高めるために、長さが20塩基を超える連続した配列にわたって相補配列を有する分子が一般的に好ましい。ハイブリダイゼーションの場合、20〜30ヌクレオチド、または望ましい場合、さらに長い1つまたは複数の相補配列を有する核酸分子を設計することが一般的に好ましい。このような断片は、例えば、化学的手段によって断片を直接合成することによって、または選択した配列を組換え生成用の組換えベクターに導入することによって、容易に調製することができる。
【００５８】
ある特定の態様において、プローブまたはプライマーは、SEQ ID NO:1の7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、50個、60個、70個、80個、90個、または100個の連続したヌクレオチドを含む。ある態様において、プローブまたはプライマーは、SEQ ID NO:2の7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、50個、60個、70個、80個、90個、または100個の連続したヌクレオチドを含む。
【００５９】
従って、本発明のヌクレオチド配列は、DNAおよび/もしくはRNAの相補配列と二重鎖分子を選択的に形成する能力のために、または試料からDNAもしくはRNAを増幅するためのプライマーを提供するために使用することができる。想定された用途に応じて、標的配列に対するプローブまたはプライマーの様々な程度の選択性を実現するために、様々なハイブリダイゼーション条件を使用することが望ましい。
【００６０】
高い選択性を必要とする用途の場合、ハイブリッドを形成するために比較的高いストリンジェンシー条件を使用することが一般的に望ましい。例えば、比較的低い塩条件および/または高い温度の条件は、例えば、約50℃〜約70℃の温度で、約0.02M〜約0.10M NaClによって得られる。このような高いストリンジェンシー条件は、プローブまたはプライマーとテンプレートまたは標的鎖とのミスマッチがたとえあったにしてもほとんど許容せず、特異的な遺伝子の単離または特異的な多型の検出に特に適している。漸増量のホルムアミドを添加することによって、条件をよりストリンジェントにできることが一般に理解されている。例えば、高度にストリンジェントな条件下では、フィルターに結合したDNAに対するハイブリダイゼーションは、0.5M NaHPO4、7％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1mM EDTAにおいて65℃で行い、洗浄は、0.1xSSC/0.1％SDSにおいて68℃で行うことができる(Ausubel et al., 1996)。
【００６１】
塩濃度を上げることによって、および/または温度を下げることによって、条件のストリンジェンシーを下げることができる。例えば、中程度のストリンジェンシー条件は、約0.1〜0.25M NaCl、約37℃〜約55℃の温度によって得ることができるが、低いストリンジェンシー条件は、約0.15M〜約0.9M塩、約20℃〜約55℃の温度によって得ることができる。中程度にストリンジェントな条件などの低ストリンジェント条件下では、洗浄は、例えば、0.2xSSC/0.1％SDS、42℃で行うことができる(Ausubel et al., 1996)。ハイブリダイゼーション条件は所望の結果に応じて容易に操作することができる。
【００６２】
他の態様において、ハイブリダイゼーションは、例えば、50mM Tris-HCl(pH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、1.0mMジチオスレイトールの条件下で、約20℃〜約37℃の温度で行うことができる。使用される他のハイブリダイゼーション条件として、約10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、約40℃〜約72℃の温度を挙げることができる。
【００６３】
ある特定の態様では、本発明の定義された配列の核酸を、ハイブリダイゼーションを測定するための適切な手段(例えば、標識)と併用することが有利である。蛍光リガンド、放射性リガンド、酵素リガンド、または他の検出可能なリガンド(例えば、アビジン/ビオチン)を含む、多種多様な適切な指示手段が当技術分野において公知である。好ましい態様において、放射性試薬または他の環境に望ましくない試薬の代わりに、蛍光標識または酵素タグ(例えば、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、またはペルオキシダーゼ)を使用することが望ましい場合がある。酵素タグの場合、肉眼で検出可能な、または分光測定で検出可能な検出手段となって、相補核酸を含む試料との特異的ハイブリダイゼーションを同定するのに使用することができる比色分析用指示基質が公知である。他の局面において、ある特定のヌクレアーゼ切断部位が存在してもよく、ある特定のヌクレオチド配列の検出は核酸切断の有無によって測定することができる。
【００６４】
一般的に、本明細書に記載のプローブまたはプライマーは、対応する遺伝子の発現または遺伝子型を検出するためのPCR(商標)のような溶液ハイブリダイゼーション(solution hybridization)の試薬として、ならびに固相を使用する態様の試薬として有用なことが予想される。固相を伴う態様では、選択された基材または表面に試験DNA(またはRNA)が吸着されるか、別の方法で付けられる。次いで、この固定された一本鎖核酸は、望ましい条件下で、選択されたプローブとのハイブリダイゼーションにかけられる。選択される条件は特定の状況に左右される(例えば、G+C含有量、標的核酸の種類、核酸の供給源、ハイブリダイゼーションプローブのサイズなどに左右される)。関心対象の特定の用途のためにハイブリダイゼーション条件を最適化することは当業者に周知である。ハイブリダイズした分子を洗浄して、非特異的に結合したプローブ分子を除去した後に、結合した標識の量を求めることによって、ハイブリダイゼーションが検出および/または定量される。代表的な固相ハイブリダイゼーション法は、米国特許第5,843,663号、同第5,900,481号、および同第5,919,626号に開示される。本発明の実施において使用することができる他のハイブリダイゼーション法は、米国特許第5,849,481号、同第5,849,486号、および同第5,851,772号に開示される。本明細書のこの項において特定される、これらの参考文献および他の参考文献の関連する部分は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００６５】
2.核酸の増幅
増幅用テンプレートとして用いられる核酸は、標準的な方法(Sambrook et al., 2001)に従って細胞、組織、または他の試料から単離することができる。ある特定の態様において、テンプレート核酸の実質的な精製を伴って、またはテンプレート核酸の実質的な精製を伴わずに、細胞全体または組織ホモジネートまたは生物学的液体試料に対して分析が行われる。核酸はゲノムDNAでもよく、分画された細胞RNAでもよく、全細胞RNAでもよい。RNAを使用する場合、まず最初に、RNAを相補的DNAに変換することが望ましい場合がある。
【００６６】
本明細書で使用する「プライマー」という用語は、テンプレート依存プロセスにおいて新生核酸の合成を開始することができる任意の核酸を含むことが意図される。一般的に、プライマーは、長さが10〜20塩基対および/または30塩基対のオリゴヌクレオチドであるが、これより長い配列を使用することができる。プライマーは二本鎖および/または一本鎖の形で提供されてもよいが、一本鎖の形が好ましい。
【００６７】
選択的ハイブリダイゼーションが可能な条件下で、EGFR遺伝子座(GenBankアクセッション番号AF288738)またはその変異体およびその断片に対応する核酸に選択的にハイブリダイズするように設計されたプライマー対と、テンプレート核酸を接触させる。SEQ ID NO:1は、EGFR遺伝子座のヌクレオチド8,881〜9,405を含む。SEQ ID NO:1のヌクレオチド505はEGFR遺伝子の翻訳開始点に対応し、従って、翻訳開始点はAF288738のヌクレオチド9,385に位置する。所望の用途に応じて、プライマーに対して完全に相補的な配列としかハイブリダイズしない高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件が選択されることがある。他の態様では、プライマー配列と1つまたは複数のミスマッチを含む核酸を増幅することができる低いストリンジェンシーで、ハイブリダイゼーションが行われることがある。ハイブリダイズしたら、テンプレートとプライマーの複合体と、テンプレート依存性核酸合成を容易にする1種類またはそれ以上の酵素を接触させる。十分な量の増幅産物が得られるまで、複数回の増幅(「サイクル」とも呼ばれる)が行われる。
【００６８】
増幅産物は、検出、分析、または定量することができる。ある特定の用途では、検出は視覚的な手段によって行われることがある。ある特定の用途では、検出は、化学ルミネセンス、取り込まれた放射性標識の放射性シンチグラフィ(radioactive scintigraphy) または蛍光標識、さらには電気インパルス信号および/または熱インパルス信号を用いたシステム(Affymax technology; Bellus, 1994)による産物の間接的同定を伴うことがある。
【００６９】
ある特定のテンプレート試料に存在するオリゴヌクレオチド配列を増幅するために、多数のテンプレート依存性プロセスを利用することができる。最も良く知られている増幅方法の1つはポリメラーゼ連鎖反応(PCR(商標)と呼ばれる)であり、米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号、および同第4,800,159号、ならびにInnis et al., 1988(それぞれが、その全体が参照により本明細書に組み入れられる)において詳細に説明されている。
【００７０】
もう1つの増幅方法は、全体が参照により本明細書に組み入れられる欧州出願第320,308号に開示される、リガーゼ連鎖反応(「LCR」)である。米国特許第4,883,750号は、プローブ対と標的配列を結合させる、LCRに似た方法について述べている。米国特許第5,912,148号に開示される、PCR(商標)およびオリゴヌクレオチドリガーゼアッセイ(OLA)に基づく方法(以下でさらに詳細に説明する)も使用することができる。
【００７１】
本発明の実施において使用することができる、標的核酸配列を増幅する代替的な方法は、米国特許第5,843,650号、同第5,846,709号、同第5,846,783号、同第5,849,546号、同第5,849,497号、同第5,849,547号、同第5,858,652号、同第5,866,366号、同第5,916,776号、同第5,922,574号、同第5,928,905号、同第5,928,906号、同第5,932,451号、同第5,935,825号、同第5,939,291号、および同第5,942,391号、英国特許出願第2202328号、ならびにPCT出願PCT/US89/01025号(それぞれが、その全体が参照により本明細書に組み入れられる)に開示されている。PCT出願PCT/US87/00880に記載のQbetaレプリカーゼも本発明の増幅方法として使用することができる。
【００７２】
制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼを用いて、制限部位の一方の鎖にヌクレオチド5'-[α-チオ]-三リン酸を含む標的分子の増幅を行う定温増幅(isothermal amplification)法もまた、本発明の核酸増幅において有用であり得る(Walker et al., 1992)。米国特許第5,916,779号に開示されるSDA(Strand Displacement Amplification)は定温核酸増幅を行う別の方法であり、複数回の鎖置換および合成(すなわち、ニックトランスレーション)を伴う。
【００７３】
他の核酸増幅法として、NASBA(nucleic acid sequence based amplification)および3SRを含む、TAS(transcription-based amplification system)が挙げられる(Kwoh et al., 1989;PCT出願WO88/10315,その全体が参照により本明細書に組み入れられる)。欧州出願第329822号は、一本鎖RNA(「ssRNA」)、ssDNA、および二本鎖DNA(dsDNA)の周期的な合成を伴う核酸増幅プロセスを開示し、この核酸増幅プロセスは本発明に従って使用することができる。
【００７４】
PCT出願WO89/06700(その全体が参照により本明細書に組み入れられる)は、プロモーター領域/プライマー配列と標的一本鎖DNA(「ssDNA」)とをハイブリダイズさせ、その後に、その配列の多数のRNAコピーを転写することに基づく核酸配列増幅スキームを開示している。このスキームは繰り返されない。すなわち、結果として生じるRNA転写物から新たなテンプレートは生成されない。他の増幅方法として、「RACE」および「ワンサイディッドPCR(one-sided PCR)」(Frohman, 1994; Ohara et al., 1989)が挙げられる。
【００７５】
3.核酸の検出
どのような増幅の後でも、テンプレートおよび/または過剰なプライマーをから増幅産物を分離することが望ましい場合がある。1つの態様において、増幅産物は、標準的な方法(Sambrook et al., 2001)を用いて、アガロース、アガロース-アクリルアミド、またはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離される。分離された増幅産物は、さらなる操作のためにゲルから切断および溶出することができる。低融点アガロースゲルを使用すると、ゲルを加熱した後に核酸を抽出することによって、分離したバンドを取り出すことができる。
【００７６】
核酸の分離はまた、当技術分野で公知のスピンカラムおよび/またはクロマトグラフィー法によって行うことができる。吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、濾紙クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、およびガスクロマトグラフィー、ならびにHPLCを含む、本発明の実施において使用することができる多くの種類のクロマトグラフィーがある。
【００７７】
ある特定の態様において、増幅産物は分離されて、または分離されずに視覚化される。代表的な視覚化方法は、ゲルを臭化エチジウムで染色し、UV光の下でバンドを視覚化することを伴う。または、増幅産物が放射性標識ヌクレオチドまたは蛍光標識ヌクレオチドと一体化して標識されれば、分離した増幅産物はx線フィルムに暴露することができる、または適切な励起スペクトルの下で視覚化することができる。
【００７８】
1つの態様において、増幅産物の分離後、標識核酸プローブと、増幅されたマーカー配列を接触させる。プローブは、好ましくは、発色団と結合されるが、放射標識されてもよい。別の態様において、プローブは、抗体もしくはビオチンなどの結合パートナー、または検出可能な部分を有する別の結合パートナーと結合される。
【００７９】
特定の態様において、検出は、標識プローブを用いたサザンブロッティングおよびハイブリダイゼーションによる検出である。サザンブロッティングに関与する技法は当業者に周知である(Sambrook et al., 2001参照)。前述の一例が、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,279,721号に記載されている。米国特許第5,279,721号は、核酸の自動電気泳動および転写のための装置および方法を開示している。この装置は、ゲルの外部操作の無い電気泳動およびブロッティングを可能にし、本発明による方法の実施に最適である。
【００８０】
本発明の実施において使用することができる他の核酸検出方法は、米国特許
2007527241.tif 000002
に開示されている。これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。
【００８１】
4.他のアッセイ
例えば、ゲノムDNA、cDNA、および/またはRNA試料における変異を検出するために、他の遺伝子スクリーニング方法を本発明の範囲内で使用することができる。点変異を検出するために用いられる方法として、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(「DGGE」)、制限断片長多型分析(「RFLP」)、化学的切断法または酵素的切断法、PCR(商標)(前記を参照)によって増幅された標的領域の直接配列決定、一本鎖DNA高次構造多型分析(「SSCP」)、および当技術分野において周知の他の方法が挙げられる。
【００８２】
点変異スクリーニング方法の1つは、RNA/DNAまたはRNA/RNAヘテロ二重鎖における塩基対ミスマッチのRNase切断に基づくものである。本明細書で使用する「ミスマッチ」という用語は、二本鎖RNA/RNA、RNA/DNA、またはDNA/DNA分子における1つまたは複数の不対合ヌクレオチドまたは誤対合ヌクレオチドの領域として定義される。従って、この定義は、挿入/欠失変異、ならびに1個または複数の塩基点変異によるミスマッチを含む。
【００８３】
米国特許第4,946,773号は、一本鎖DNAまたはRNAの試験試料とRNAプローブをアニールさせ、その後に、核酸二重鎖をRNaseAで処理することを伴う、RNaseAミスマッチ切断アッセイについて述べている。ミスマッチの検出の場合、サイズに従って電気泳動分離された、RNaseA処理の一本鎖産物は、同様に処理された対照二重鎖と比較される。対照二重鎖に見られない小さな断片(切断産物)を含む試料は陽性とされる。
【００８４】
ミスマッチアッセイにおけるRNaseIの使用が他の研究者らによって述べられている。ミスマッチ検出にRNaseIを使用することは、Promega Biotechからの文献において述べられている。Promegaは、4つの既知のミスマッチのうち3つを切断することが報告されているRNaseIを含むキットを販売している。一塩基ミスマッチの検出のためにMutSタンパク質または他のDNA修復酵素を使用することが他の研究者らによって述べられている。
【００８５】
本発明の実施において使用することができる、欠失、挿入、または置換による変異を検出する別の方法は、米国特許第5,849,483号、同第5,851,770号、同第5,866,337号、同第5,925,525号、および同第5,928,870号に開示されている(これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる)。
【００８６】
5.SNPスクリーニング方法の特定の実施例
生物のゲノムが進化する間に生じる自然突然変異は、多くの場合、その種の全てのメンバーに直ぐに遺伝せず、それによって、その種の集団に共存する複数の多型対立遺伝子が生まれる。多くの場合、多型は遺伝病の原因である。いくつかのクラスの多型が同定されている。例えば、VNTR(variable nucleotide type polymorphism)は、ヌクレオチドのジヌクレオチド反復モチーフまたはトリヌクレオチド反復モチーフの自然縦列重複から生じる。このような変異が、制限エンドヌクレアーゼ切断によって得られるDNA断片の長さを変えれば、制限断片長多型(RFLP)と呼ばれる。RFLPはヒトおよび動物の遺伝子分析において広く用いられている。
【００８７】
別のクラスの多型は1個のヌクレオチドの置換によって生じる。このような一塩基多型(SNP)は、制限エンドヌクレアーゼ部位をまれにしか変えない。従って、SNPは制限断片長分析ではまれにしか検出できない。SNPは、最も一般的な遺伝的変異であり、100〜300塩基に1回現れ、遺伝病を実際に引き起こすのに十分なやり方で、タンパク質コード遺伝子にある1個のヌクレオチドに影響を及ぼす、いくつかのSNP変異が発見されている。SNP疾患の例は、血友病、鎌状赤血球性貧血、遺伝性血色素症、遅発性アルツハイマー病などである。
【００８８】
本発明の文脈において、EGFR遺伝子産物の活性および/またはレベルに影響を及ぼす多型変異は一連のスクリーニング方法によって確かめられる。ある一組のスクリーニング方法は、インビトロアッセイまたはインビボアッセイにおいてEGFR遺伝子産物の誘導能、活性、および/またはレベルに影響を及ぼすSNPの同定を目的としている。次いで、前記で同定されたSNPが発生したかどうか個体をスクリーニングするために、もう一組のスクリーニング方法が行われる。これを行うために、患者から遺伝子型分析用の試料(例えば、血液または他の体液もしくは組織試料)が採取される。SNPの有無によって、EGFRの発現および/または活性のレベルが決まる。本発明によって提供される方法によれば、これらの結果は、薬物の副作用を弱めるために、個体に投与されるEGFR標的治療剤の用量を調節および/または変更するのに用いられる。
【００８９】
SNPは、欠失、点変異、および挿入の結果でもよい。一般的に、どのような原因でも一塩基変異は全てSNPになることができる。SNPの頻度が高いことは、他のクラスの多型より容易に同定できることを意味している。SNPの分布の均一性が高くなるほど、関心対象の特定の形質に「近い」SNPを同定することが可能になる。これらの2つの特性の組み合わせ効果があると、SNPは極めて価値が高くなる。例えば、ある特定の形質(例えば、EGFR過剰発現)が、ある特定の遺伝子座の変異を反映していれば、特定の遺伝子座とつながりのある任意の多型を用いて、個体がその形質を示す確率を予測することができる。場合によっては、SNPは形質の原因であってもよい。例えば、EGFR調節領域のSp1結合部位にあるSNPはSp1結合を変える可能性があり、従って、EGFR転写をもたらす可能性がある。
【００９０】
多型をスクリーニングするために、いくつかの方法が開発されており、いくつかの例を以下に列挙した。Kwok and Chen(2003)およびKwok(2001)の参考文献は、これらの方法の一部の概要を示している。特に、これらの参考文献は両方とも参照により組み入れられる。
【００９１】
EGFR遺伝子発現の調節に関連するSNPは、これらの任意の方法またはその適切な改良を用いることによって特徴付けることができる。このような方法として、部位の直接的もしくは間接的な配列決定、制限酵素の使用(この場合、部位のそれぞれの対立遺伝子が制限部位を作るか、もしくは破壊する)、または対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションプローブの使用が挙げられる。
【００９２】
多型を特定し、その情報を、患者に関する有用な情報を得るやり方で適用する例は、例えば、米国特許第6,472,157号;米国特許出願公報第20020016293号、同第20030099960号、同定20040203034号;WO0180896に見られる。これらは全て参照により本明細書に組み入れられる。
【００９３】
a)DNA配列決定
多型を特徴付ける最も一般的に用いられる方法は、多型に隣接し、多型を含む遺伝子座の直接DNA配列決定である。このような分析は、「Sanger法」とも知られる「ジデオキシ媒介チェーンターミネーション(dideoxy-mediated chain termination)」法(Sanger et al.,1975)、または「Maxam-Gilbert法」とも知られる「化学分解法」(Maxam et al., 1977)のいずれかを用いて行うことができる。配列決定と、ポリメラーゼ連鎖反応などのゲノム配列特異的増幅技術を併用すると、望ましい遺伝子の回収を容易にすることができる(Mullis et al., 1986;欧州特許出願第50,424号;欧州特許出願第84,796号、欧州特許出願第258,017号、欧州特許出願第237,362号;欧州特許出願第201,184号;米国特許第4,683,202号;同第4,582,788号;および同第4,683,194号)(前記は全て参照により本明細書に組み入れられる)。
【００９４】
b)エキソヌクレアーゼ耐性
多型部位に存在するヌクレオチドの正体を求めるために使用することができる他の方法は、特殊なエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体を利用する(米国特許第4,656,127号)。多型部位のすぐ3'側にある対立遺伝子配列に相補的なプライマーと、研究中のDNAをハイブリダイズさせる。DNA上の多型部位が、存在する特定のエキソヌクレオチド(exonucleotide)耐性ヌクレオチド誘導体と相補的なヌクレオチドを含んでいれば、その誘導体は、ポリメラーゼによって、ハイブリダイズしているプライマーの末端に組み込まれる。このような組み込みはプライマーをエキソヌクレアーゼ切断耐性にし、それによって、プライマーの検出を可能にする。エキソヌクレオチド耐性誘導体の正体は分かっているので、DNAの多型部位に存在する特定のヌクレオチドを決定することができる。
【００９５】
c)ミクロシークエンシング方法
DNAにある多型部位をアッセイするための他のいくつかのプライマー誘導ヌクレオチド組み込み法(primer-guided nucleotide incorporation procedure)が述べられている(Komher et al., 1989; Sokolov 1990; Syvanen 1990; Kuppuswamy et al., 1991; Prezant et al., 1992; Ugozzoll et al., 1992; Nyren et al., 1993)。これらの方法は、多型部位にある塩基を区別するのに標識デオキシヌクレオチドの組み込みに頼っている。シグナルは、組み込まれたデオキシヌクレオチドの数に比例するので、同じヌクレオチドの実験(run)において生じる多型は、実験の長さに比例したシグナルをもたらす(Syvanen et al., 1990)。
【００９６】
d)溶液中の伸長
仏国特許第2,650,840号およびPCT出願WO91/02087は、多型部位のヌクレオチドの正体を確かめるための、溶液をベースとする方法について述べている。これらの方法によれば、多型部位のすぐ3'側にある対立遺伝子配列に相補的なプライマーが用いられる。この部位のヌクレオチドの正体は標識ジデオキシヌクレオチド誘導体を用いて確かめられる。標識ジデオキシヌクレオチド誘導体は、多型部位のヌクレオチドに相補的であれば、プライマーの末端に組み込まれる。
【００９７】
e)遺伝子ビット分析(Genetic Bit Analysis)または固相伸長
PCT出願WO92/15712は、標識ターミネーターの混合物および多型部位のすぐ3'側にある配列に相補的なプライマーを使用する方法について述べている。組み込まれる標識ターミネーターは、評価されている標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドに相補的であり、それゆえに同定される。ここで、プライマーまたは標的分子は固相に固定化されている。
【００９８】
f)オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(OLA)
これは、異なる方法論を用いる別の固相法である(Landegren et al., 1988)。一本鎖の標的DNAの隣接配列(abutting sequence)にハイブリダイズすることができる2種類のオリゴヌクレオチドが用いられる。これらのオリゴヌクレオチドの一方はビオチン化されているのに対して、他方は検出可能に標識されている。寸分違わない相補配列が標的分子の中に見出されたら、その末端が隣接し、ライゲーション基質を生み出すように、オリゴヌクレオチドはハイブリダイズする。連結が起こると、アビジンを用いて標識オリゴヌクレオチドを回収することができる。この方法に基づく他の核酸検出アッセイとPCRの組み合わせも述べられている(Nickerson et al., 1990)。ここで、PCRは標的DNAを指数増幅するために用いられ、その後に、標的DNAはOLAを用いて検出される。
【００９９】
g)リガーゼ/ポリメラーゼ媒介遺伝子ビット分析
米国特許第5,952,174号もまた、標的分子の隣接配列とハイブリダイズすることができる2種類のプライマーを伴う方法について述べている。ハイブリダイズ産物は、標的が固定化された固体支持体上に形成される。ここで、1個のヌクレオチドの空間によってプライマーが互いに離れているように、ハイブリダイゼーションが起こる。ポリメラーゼ、リガーゼ、および少なくとも1種類のデオキシヌクレオシド三リン酸を含むヌクレオシド三リン酸混合物の存在下で、このハイブリダイズ産物をインキュベートすると、隣接するハイブリダイズした任意のオリゴヌクレオチド対が連結する。リガーゼを添加すると、シグナルを発生させるのに必要な2つの事象(伸長および連結)が起こる。これにより、伸長または連結しか使用しない方法より特異性が高く、「ノイズ」が少なくなる。この方法は、ポリメラーゼをベースとするアッセイとは異なり、ポリメラーゼ工程と、シグナルを固相に取り付けるための第2のハイブリダイゼーション工程および連結工程を組み合わせることによって、ポリメラーゼ工程の特異性を高めている。
【０１００】
h)侵入切断反応
侵入切断反応は、ある特定の多型があるかどうか細胞DNAを評価するために使用することができる。このような反応を、INVADER(登録商標)と呼ばれる技術が利用している(例えば、de Arruda et al., 2002;Stevens et al., 2003,これは参照により組み入れられる)。一般的に、3種類の核酸分子がある:1)標的部位の上流にあるオリゴヌクレオチド(「上流オリゴ」)、2)標的部位をカバーするプローブオリゴヌクレオチド(「プローブ」)、および3)標的部位を有する一本鎖DNA(「標的」)。上流オリゴおよびプローブは重複しないが、連続した配列を含んでいる。プローブは、ドナーフルオロフォア(例えば、フルオロセイン(fluoroscein))およびアクセプター色素(例えば、Dabcyl)を含んでいる。上流オリゴの3'末端にあるヌクレオチドは、プローブ-標的二重鎖の1番目の塩基対と重複する(プローブ-標的二重鎖の1番目の塩基対に「侵入する」)。次いで、プローブは、フルオロフォア/クエンチャーを分離する構造特異的5'ヌクレアーゼによって切断され、これにより、検出可能な蛍光量が増大する。Lu et al., 2004.参照。
【０１０１】
場合によっては、このアッセイは、固体表面上で、またはアレイの形で行われる。
【０１０２】
h)他のSNP検出方法
他のいくつかの特異的なSNP検出同定方法を以下に示す。本発明におけるEGFR遺伝子の多型の同定と組み合わせて、これらの方法は単独で用いられてもよく、適切な改良を加えて用いられてもよい。参照により本明細書に組み入れられる、NCBIのSNPウェブサイトであるウェブサイトwww.ncbi.nlm.nih.gov/SNPにも、他のいくつかの方法が述べられている。
【０１０３】
ある特定の態様において、集団の中で任意の遺伝子座に、広範囲にわたるハプロタイプが確かめられることがある。これにより、どのSNPが重複しているか、関連解析においてどのSNPが必須であるかを正確に特定することができる。後者は、連鎖不平衡の遺伝子または領域のハプロタイプを捕らえるマーカーである「ハプロタイプタグSNP(htSNP)」と呼ばれる。例示的な方法については、Johnson et al.(2001)およびKe and Cardon(2003)参照(これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる)。
【０１０４】
VDAアッセイでは、TaKaRa LA Taq試薬および他の標準的な反応条件を用いたlong PCR法によるゲノムセグメントのPCR増幅が用いられる。長い増幅(long amplification)は、約2,000〜12,000bpのDNAサイズを増幅することができる。VDA(variant detector array)への産物のハイブリダイゼーションはAffymetrix High Throughput Screening Centerによって行い、コンピュータソフトウェアを用いて分析することができる。
【０１０５】
Chip Assayと呼ばれる方法では、標準的なPCRプロトコールまたはlong PCRプロトコールによるゲノムセグメントのPCR増幅が用いられる。ハイブリダイゼーション産物はVDAによって分析される(参照により本明細書に組み入れられる、Halushka et al., 1999)。SNPは、一般的に、ハイブリダイゼーションパターンのコンピュータ分析に基づいて「確実な(Certain)」または「可能性の高い(Likely)」として分類される。ヌクレオチド配列決定などの別の検出方法と比較することによって、「確実な」SNPは100％の場合で確認されたものであり、「可能性の高い」SNPは、この方法によって73％の場合で確認されたものである。
【０１０６】
他の方法では、関連する制限酵素による消化の後に、単にPCR増幅を伴う。さらに別の方法では、既知のゲノム領域からの精製PCR産物の配列決定を伴う。
【０１０７】
さらに別の方法では、エキソン一つ一つまたは大きなエキソンの重複する断片一つ一つがPCR増幅される。公表された配列またはデータベース配列からプライマーが設計され、以下の条件:200ng DNAテンプレート、0.5μM 各プライマー、80μM dCTP、80μM dATP、80μM dTTPおよび80μM dGTP、5％ホルムアミド、1.5mM MgCl2、0.5U Taqポリメラーゼ、ならびに0.1体積のTaq緩衝液を用いて、ゲノムDNAのPCR増幅が行われる。サーマルサイクリングが行われ、結果として得られるPCR産物は、様々な条件(例えば、15％尿素を含む5％または10％ポリアクリルアミドゲル(5％グリセロールを含む、または5％グリセロールを含まない))の下で、PCR-一本鎖DNA高次構造多型(PCR-SSCP)分析によって分析される。電気泳動が一晩行われる。移動度シフトを示したPCR産物が再増幅され、ヌクレオチド変異を同定するために配列決定される。
【０１０８】
CGAP-GAI(DEMIGLACE)と呼ばれる方法では、配列データおよびアラインメントデータ(PHRAP.aceファイルから)、配列ベースコール(sequence base call)のクオリティスコア(PHREDクオリティファイルから)、距離情報(PHYLIP dnadistおよびneighbourプログラムから)、ならびにベースコーリングデータ(PHRED「-d」switchから)がメモリーにロードされる。配列は整列され、結果として生じる不一致アセンブリの縦のひとまとまり(「スライス(slice)」)それぞれについて調べられる。このようなスライスは全て候補SNPとみなされる(DEMIGLACE)。真の多型である可能性のないスライスを除去するために、多くのフィルターがDEMIGLACEによって用いられる。これらは、(i)隣接配列クオリティスコアが40％以上低下する場合、任意のスライスにある配列をSNP考察から除外するフィルター;(ii)ピーク振幅がそのヌクレオチドタイプの全ベースコールの15パーセンタイル未満であるコールを除外するフィルター;(iii)コンセンサスと多数の不一致を有する配列の領域をSNP計算に入れないようにするフィルター;(iv)ピークが、コールされたピーク(called peak)の面積の25％以上をとる別のコールを有する任意のベースコールを考察から外すフィルター;(v)1つの読み取り方向でしか生じない変異を除外するフィルターを含む。PHREDクオリティスコアは、スライスの中のそれぞれのヌクレオチドについて、誤り確率(probability-of-error)の値に変換された。ある特定の位置にヌクレオチド不均一性の証拠があるという事後確率を計算するために、標準的なベイズ法が用いられる。
【０１０９】
CU-RDF(RESEQ)と呼ばれる方法では、それぞれのSNPの特異的プライマーを用いて、血液から単離されたDNAからPCR増幅が行われ、用いられなかったプライマーおよび遊離ヌクレオチドを除去する一般的な精製プロトコール後に、同じプライマーまたはネスティッドプライマーを用いて、直接配列決定が行われる。
【０１１０】
DEBNICK(METHOD-B)と呼ばれる方法では、クラスター化されたEST配列の比較分析が行われ、蛍光に基づくDNA配列決定によって確認される。DEBNICK(METHOD-C)と呼ばれる関連方法では、クラスター化されたEST配列の比較分析(ミスマッチ部位でのphred qualityが>20、SNPの5'側および3'側の5塩基にわたって平均phred qualityが>=20、SNPの5'側および3'側の5塩基でミスマッチなし、それぞれの対立遺伝子が少なくとも2回出現する)が行われ、トレースを調べることによって確認される。
【０１１１】
ERO(RESEQ)として認識される方法では、電子的に公表されたSTSsに対して新しいプライマーセットが設計され、10種類のマウス系統からDNAを増幅するのに用いられる。次いで、それぞれの系統からの増幅産物はゲル精製され、33P標識ターミネーターを用いた標準的なジデオキシサイクルシークエンシング法を用いて配列決定される。次いで、全てのddATP終結反応物が、シークエンシングゲルの隣接するレーンにロードされ、その後に、全てのddGTP反応物がロードされる(以下同様)。Ｘ線写真を視覚的に走査することによって、SNPが同定される。
【０１１２】
ERO(RESEQ-HT)として認識される別の方法では、電子的に公表されたマウスDNA配列に対して新しいプライマーセットが設計され、10種類のマウス系統からDNAを増幅するのに用いられる。それぞれの系統からの増幅産物は、エキソヌクレアーゼIおよびエビアルカリホスファターゼによる処理によって配列決定用に調製される。配列決定は、ABI Prism Big Dye Terminator Ready Reaction Kit(Perkin-Elmer)を用いて行われ、配列試料は、3700 DNA Analyzer(96 Capillary Sequencer)にかけられる。
【０１１３】
FGU-CBT(SCA2-SNP)は、SNP含有領域がプライマーSCA2-FP3およびSCA2-RP3を用いてPCR増幅される方法を特定する。最終濃度5mM Tris、25mM KCl、0.75mM MgCl2、0.05％ゼラチン、20pmolの各プライマー、および0.5UのTaq DNAポリメラーゼを含む50ml反応体積において、約100ngのゲノムDNAが増幅される。試料は変性され、アニールされ、伸長され、PCR産物は、アガロースゲルから切断されたバンドから(例えば、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen)を用いて)精製され、ダイターミネーター化学を用いて、ABI Prism 377自動DNAシーケンサーとPCRプライマーを使用して配列決定される。
【０１１４】
JBLACK(SEQ/RESTRICT)として識別される方法では、ゲノムDNAを用いて2つの独立したPCR反応が行われる。第1の反応からの産物は配列決定によって分析され、これにより独特のFspI制限部位が示される。この変異は、第2のPCR反応の産物においてFspI消化によって確認される。
【０１１５】
KWOK(1)と呼ばれる方法では、SNPは、ダイターミネーター化学を用いたPCR産物の直接DNA配列決定による無作為に選択された4個体からの高品質ゲノム配列データを比較することによって同定される(Kwok et al., 1996参照)。KWOK(2)と呼ばれる関連方法では、SNPは、重複するラージインサートクローン(例えば、細菌人工染色体(BACs)またはP1人工染色体(PACs))からの高品質ゲノム配列データを比較することによって同定される。次いで、このSNPを含むSTSが開発され、様々な集団におけるSNPの存在が、プールされたDNAの配列決定によって確認される(Taillon-Miller et al.,1998参照)。KWOK(3)と呼ばれる別の類似する方法では、SNPは、重複するラージインサートクローン(BACsまたはPACs)からの高品質ゲノム配列データを比較することによって同定される。このアプローチによって発見されたSNPは、2つのドナー染色体間のDNA配列変異に相当するが、一般集団における対立遺伝子頻度はまだ決定されていない。KWOK(5)の方法では、SNPは、ダイターミネーター化学を用いたPCR産物の直接DNA配列決定による、ホモ接合性DNA試料および1つまたは複数のプールされたDNA試料からの高品質ゲノム配列データを比較することによって同定される。使用されるSTSsは、公的に入手可能なデータベースで見られる配列データから開発される。具体的には、これらのSTSsは、全ての遺伝子座でホモ接合性であることが分かっている全胞状奇胎(complete hydatidiform mole: CHM)および80人のCEPH親からのDNA試料プールに対してPCR増幅される(Kwok et al., 1994参照)。
【０１１６】
別のこのような方法であるKWOK(OverlapSnpDetectionWithPolyBayes)では、SNPは、ラージインサートヒトゲノムクローン配列の重複領域の自動コンピュータ分析によって発見される。データ取得のために、クローン配列は大規模シークエンシングセンターから直接入手する。これは、ベースクオリティ(base quality)配列が存在しないために/GenBankを介して入手できないために必要である。生データ処理は、一貫性のためにクローン配列および付随するベースクオリティ情報の分析を伴う。関連するベースクオリティ配列のない、完成した(「ベースパーフェクト(base perfect)」,誤り率1/10,000bp未満)配列には、一定のベースクオリティ値40(1/10,000bpの誤り率)が割り当てられる。ベースクオリティ値のないドラフト配列は拒否される。処理された配列はローカルデータベースに入力される。既知のヒト反復が隠されている各配列のバージョンも格納される。リピートマスキング(repeat masking)はプログラム「MASKERAID」を用いて行われる。重複検出:推定重複はプログラム「WUBLAST」を用いて検出される。その後に、偽の重複検出結果(すなわち、真の重複と相対するものとして、配列重複のために生じる一対のクローン配列間の類似性)を除去するために、いくつかのフィルタリング工程が行われる。重複の全長、全パーセント類似性、高いベースクオリティ値「高品質ミスマッチ」を有するヌクレオチド間の配列差異の数。結果はまた、Washington University Genome Sequencing Centerのゲノムクローン制限断片地図の結果、完成者の重複に関する報告、およびNCBIの配列コンティグ構築の取り組みの結果とも比較される。SNP検出:重複するクローン配列対は、「POLYBAYES」SNP検出ソフトウェアを用いて、候補SNP部位について分析される。配列対間の配列差異は、配列決定の誤りと相対するものとして、真の配列変異を表す確率についてスコア付けされる。この処理には、両配列のベースクオリティ値が存在することが必要である。ハイスコア候補が抽出される。この検索は置換型一塩基対変異に限定される。候補SNPの信頼スコア(confidence score)はPOLYBAYESソフトウェアによって計算される。
【０１１７】
KWOK(TaqManアッセイ)によって特定される方法では、90人の無作為個体の遺伝子型を決定するために、TaqManアッセイが用いられる。KYUGEN(Q1)によって特定される方法では、指示された集団のDNA試料がプールされ、PLACE-SSCPによって分析される。プールされた分析における各対立遺伝子のピーク高さ(peak height)は、ヘテロ接合体における各対立遺伝子のピーク高さによって補正され、その後に、対立遺伝子頻度の計算に用いられる。10％を超える対立遺伝子頻度は、この方法によって確実に定量される。対立遺伝子頻度=0(ゼロ)は、その対立遺伝子が個体間で見られたが、対応するピークがプールの試験において見られなかったことを意味する。対立遺伝子頻度=0〜0.1は、マイナーアレルがプールにおいて検出されるが、ピークが小さすぎて確実に定量できないことを示している。
【０１１８】
KYUGEN(Method1)として認識されるさらに別の方法では、PCR産物は蛍光色素で後標識され、SSCP条件(PLACE-SSCP)の下で自動キャピラリー電気泳動装置によって分析される。一連の実験において2種類のプールされたDNA(日本人プールおよびCEPH親プール)を使用して、または使用せずに、4個以上の個々のDNAが分析される。対立遺伝子は目視検査によって同定される。異なる遺伝子型を有する個々のDNAが配列決定され、SNPが同定される。ヘテロ接合体におけるピーク高さを用いてシグナルバイアスが補正された後に、プールされた試料のピーク高さから対立遺伝子頻度が概算される。PCRプライマーは、両鎖の後標識のために末端に5'-ATTまたは5'-GTTを有するようにタグがつけられている。緩衝液(10mM Tris-HCl, pH8.3または9.3, 50mM KCl, 2.0mM MgCl2)、0.25μMの各プライマー、200μMの各dNTP、および0.025units/μlのTaq DNAポリメラーゼ(抗Taq抗体と予め混合されている))を含む反応混合物において、DNA試料(10ng/ul)が増幅される。DNAポリメラーゼIのクレノウ断片の交換反応によって、PCR産物の2本の鎖が異なって、R110およびR6Gで修飾されたヌクレオチドで標識される。この反応はEDTAの添加によって止まり、取り込まれなかったヌクレオチドは仔ウシ腸アルカリホスファターゼの添加によって脱リン酸される。SSCPの場合、蛍光標識PCR産物およびTAMRA標識内部マーカーのアリコートが脱イオン化ホルムアミドに添加され、変性される。ABI Prism 310 Genetic Analyzerを用いて、電気泳動がキャピラリー内で行われる。データ収集およびデータ処理のためにGenescanソフトウェア(P-E Biosystems)が用いられる。SSCPにおいて異なる遺伝子型を示した個体を含む個体のDNAは、ビックダイターミネーター化学を用いた直接配列決定のために、ABI Prism 310シーケンサーにかけられる。ABI Prism 310から得られた複数の配列トレースファイルがPhred/Phrapによって処理および整列され、Consedビューアを用いて閲覧される。SNPはPolyPhredソフトウェアおよび目視検査によって同定される。
【０１１９】
KYUGEN(Method2)として認識されるさらに別の方法では、変性HPLC(denaturing HPLC)(DHPLC)またはPLACE-SSCP(Inazuka et al., 1997)によって、異なる遺伝子型を有する個体が調べられ、SNPを同定するために、これらの配列が決定される。PCRは、両鎖の後標識のために末端に5'-ATTまたは5'-GTTのタグが付けられたプライマーを用いて行われる。DHPLC分析は、WAVE DNA断片分析装置(Transgenomic)を用いて行われる。PCR産物はDNASepカラムに注入され、WAVEMakerプログラム(Transgenomic)を用いて決められた条件下で分離される。DNAポリメラーゼIのクレノウ断片の交換反応によって、PCR産物の2本の鎖が異なって、R110およびR6Gで修飾されたヌクレオチドで標識される。この反応はEDTAの添加によって止まり、取り込まれなかったヌクレオチドは仔ウシ腸アルカリホスファターゼの添加によって脱リン酸される。電気泳動によって追跡されるSSCPは、ABI Prism 310 Genetic Analyzerを用いてキャピラリー内で行われる。Genescanソフトウェア(P-E Biosystems)。個体(DHPLCまたはSSCPにおいて異なる遺伝子型を示した個体を含む)のDNAは、ビックダイターミネーター化学を用いた直接配列決定のために、ABI Prism 310シーケンサーにかけられる。ABI Prism 310から得られた複数の配列トレースファイルがPhred/Phrapによって処理および整列され、Consedビューアを用いて閲覧される。SNPはPolyPhredソフトウェアおよび目視検査によって同定される。UnigeneにおけるEST配列のトレースクロマトグラムデータはPHREDで処理される。可能性のあるSNPを同定するために、プログラムPHRAP、BRO、およびPOAによって作成された、各Unigeneクラスターの多重配列アラインメントから、一塩基ミスマッチが報告される。BROは、可能性のある、誤って報告されたEST方向を修正したのに対して、POAは、偽のSNPを生じることがある遺伝子の混合/キメラを示す非直線アラインメント構造を同定および分析した。未処理のクロマトグラムの高さ、鋭さ、重複、および間隔;配列決定の誤り率;文脈依存性(context-sensitivity);cDNAライブラリーの由来などのデータを評価しながら、配列決定の誤り、ミスアラインメント、またはあいまい性(ambiguity)、ミスクラスタリングまたはキメラEST配列と比べて、真の多型の証拠を評価するのに、ベイズ推論が用いられる。
【０１２０】
MARSHFIELD(Method-B)として認識される方法では、公的データベースの検索によって、推定挿入/欠失多型を含む重複ヒトDNA配列が同定される。それぞれの多型部位に隣接するPCRプライマーがコンセンサス配列から選択される。個体のヒトゲノムDNAまたはプールされたヒトゲノムDNAを増幅するために、プライマーが用いられる。結果として生じるPCR産物は変性ポリアクリルアミドゲルで分離され、DNAプールから対立遺伝子頻度を概算するためにPhosphorImagerが用いられる。
【０１２１】
6.連鎖不平衡
EGFR遺伝子座の-1435、-1300、-1249、-1227、-761、-650、-544、-486、-216、-191、169、または2034にある多型と連鎖不平衡にある多型も本発明の方法と共に使用することができる。「連鎖不平衡」(「LD」が本明細書で用いられるが、当技術分野では「LED」とも呼ばれる)は、2つの遺伝子座にある対立遺伝子(すなわち、ある特定の遺伝子の変異型)または多型のある特定の組み合わせが、偶然で期待されるものより高い頻度で現れる状況を指す。当業者によって求められる連鎖不平衡に関して用いられる「有意な」は、統計値pまたはα値(0.25または0.1でもよく、0.1、0.05、0.001、0.00001またはそれ以下でもよい)であることが意図される。EGFRハプロタイプとEGFRタンパク質発現レベルとの関係は、遺伝子型(すなわち、生物の遺伝子構成)と表現型(すなわち、生物または細胞が示す物理的形質)を相関付けるのに使用することができる。「ハプロタイプ」は、当業者にとってその平易かつ通常の意味に従って用いられる。これは、相同染色体の一方にある2つ以上の対立遺伝子または多型の集合遺伝子型(collective genotype)を意味する。
【０１２２】
D.キット
本明細書に記載のどの組成物もキットに含めることができる。非限定的な例において、一方または両方のEGFR遺伝子の遺伝子型を決定する試薬がキットに含められる。さらに、キットは、EGFR遺伝子の特定の核酸配列を増幅および/または検出することができる個々の核酸を含んでもよい。特定の態様において、キットは、1種類またはそれ以上のプライマーおよび/またはプローブを含む。核酸分子は、標識、色素、または核酸分子に取り付けられる他のシグナリング分子(例えば、フルオロフォア)を有してもよい。キットはまた、1種類またはそれ以上の緩衝液(例えば、DNA単離用緩衝液、増幅用緩衝液、またはハイブリダイゼーション用緩衝液)を含んでもよい。キットはまた、DNAテンプレートを調製するための化合物および試薬ならびにDNAを試料から単離するための化合物および試薬を含んでもよい。キットはまた、様々な標識用の試薬および化合物を含んでもよい。
【０１２３】
キットの成分は、水性媒体に溶解されて、または凍結乾燥された形で包装されてもよい。キットの容器手段は、一般的に、少なくとも1つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、注射器、または他の容器手段を備える。バイアル、試験管、フラスコ、瓶、注射器、または他の容器手段には、成分が入れられてもよく、好ましくは、適切に分注される。キットに2種類以上の成分がある場合(標識用試薬と標識が一緒に包装されてもよい)、キットは、一般的に、第2の容器、第3の容器、または他のさらなる容器も含む。これらの容器には、さらなる成分が別々に入れられてもよい。しかしながら、成分の様々な組み合わせがバイアルに入れられてもよい。本発明のキットはまた、一般的に、核酸を入れるための手段および他の任意の試薬容器を、市販のために密に閉じ込めて備える。このような容器は、望ましいバイアルが保持される、射出成形または吹き込み成形により製造されたプラスチック容器を備えてもよい。
【０１２４】
キットの成分が1つおよび/またはそれ以上の液体溶液に溶解されて提供される場合、液体溶液は水溶液であり、滅菌水溶液が特に好ましい。しかしながら、キットの成分は、1種類または複数のの乾燥した粉末として提供されてもよい。試薬および/または成分が乾燥粉末として提供される場合、粉末は適切な溶媒を添加することによって再構成することができる。溶媒はまた別の容器手段に入れて提供されてもよいことが考えられる。
【０１２５】
キットはまたキット成分を使用するための説明書を備え、同様に、キットに入っていない他の任意の試薬を使用すための説明書を備える。説明書は、実施可能なバリエーションを含んでもよい。
【０１２６】
このような試薬は本発明のキットの態様であることが意図される。しかしながら、このようなキットは、前記で特定される特定の品物に限定されず、EGFR遺伝子の多型またはEGFR遺伝子の発現レベルの検出に直接的または間接的に用いられる任意の試薬を含んでもよい。
【０１２７】
E.実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を証明するために含まれる。以下の実施例に開示される技法が、本発明の実施において良好に機能することが本発明者らによって発見された技法であり、従って、本発明を実施するための好ましい態様を構成するとみなすことができると当業者に理解されるはずである。しかしながら、本開示を考慮すれば、開示された特定の態様に多くの変更を加えることができ、なおさらに、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、同様のまたは類似の結果が得られることが当業者に理解されるはずである。
【０１２８】
実施例1
EGFR調節領域における一塩基多型(SNP)の発見
Coriell Cell RepositoryからのDNA試料を再配列決定に使用した。試料には、22人の白人、23人のアフリカ系アメリカ人、および23人のアジア人が含まれる。SNP発見のために、PCRと表1のプライマーを使用して、上流エンハンサーおよび下流エンハンサー、プロモーター、エキソン1、およびイントロン1の一部を含む約4.5kb断片を増幅した。精製されたPCR産物を両端から直接配列決定した。ABI-3700キャピラリーシーケンサーおよびphred/phrap/polyphred/consedパイプライン(phrap.org/にあるワールドワイドウェブ)を用いて、多型を同定した。
【０１２９】
（表１）
2007527241.tif 000003
【０１３０】
プロモーターおよびエンハンサーを含む、EGFR 5'調節領域のうちの4kbを再配列決定することによって、22人の白人、23人のアフリカ系アメリカ人、および23人のアジア人からなる68個のDNA試料から12個の一塩基多型が同定された(図1および表2)。5個のSNPは、他の7個のまれなSNPと比較して、少なくとも1つの集団において比較的高い頻度(レアアレル頻度(rare allele frequency)>10％)を示した。9個のSNPはプロモーター領域またはエンハンサー領域において観察され、これらのうち3個は頻度が高かった。-1249 G>AのSNP(アフリカ系アメリカ人において10％)は上流エンハンサーにあるのに対して、-216 G>T(アフリカ系アメリカ人において29％、白人において34％)および-191 C>Aはプロモーター領域にある(白人では18％)(図1および表2)。興味深いことに、-216 G>TはSp1結合部位(-216)に位置し、GがTで置換されるとSp1結合が変化する可能性がある。一方、-191 C>Aは転写開始点の近くにある(図2)(Ishii et al., 1985; Haley et al., 1987; Johnson et al., 1988; Kageyama et al.,1988)。従って、これらのSNPはEGFR転写に重大な影響を及ぼす可能性がある。
【０１３１】
（表２）EGFR調節領域から発見されたSNPのレアアレルの数および頻度
アフリカ系アメリカ人(AA)、白人(CA)、アジア人(AA)
2007527241.tif 000004
【０１３２】
実施例2
2個のプロモーターSNP(-216 G>Tおよび-191 C>A)の機能の特徴付け
インビトロ一過性トランスフェクションアッセイおよび電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)によって、EGFRプロモーター領域における2個のSNP(-216 G>Tおよび-191 C>A)の潜在的な機能を特徴付けた。
【０１３３】
ハプロタイプ
異なる人種集団に由来する68個の試料を本発明者らが配列決定した時に、SNP -216 G>Tは、アフリカ系アメリカ人(29％)および白人(34％)において頻度が高いが、アジア人(9％)では比較的まれであることが見出されたのに対して、-191 C>Aは白人(18％)でしか見出されなかった(表3)。連鎖不平衡分析およびハプロタイプ分析から、-216 G>Tおよび-191 C>Aは強い連鎖不平衡になく(D'=0.5562,p>0.05,)、3種類のハプロタイプ:G-C、G-A、およびT-Cが試料において観察された。以下の表3参照。これらの3種類のハプロタイプを含むDNA断片を増幅し、クローニングするのと同時に、DraIIIで消化したG-AハプロタイプおよびT-CハプロタイプからのT断片およびA断片を連結することによってT-Aハプロタイプを構築した(図3)。
【０１３４】
（表３）白人集団、アフリカ系アメリカ人集団、およびアジア人集団における-216 G>Tおよび-191 C>Aのハプロタイプ頻度
2007527241.tif 000005
【０１３５】
ベクターおよび検出系
ルシフェラーゼ遺伝子の相対発現を比較するために、PGL3-luc+基本レポーターベクター(Promega)(4種類の標的DNA断片をそれぞれ有する)と、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-TK)プロモーターによって駆動されるrenilla遺伝子を含むpRL-TKレポーターベクター(Promega)をMDA-MB-231細胞にコトランスフェクトした。デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム(Promega)を用いて、ルシフェラーゼの発現レベルを検出した。PGL3-luc+基本ベクターを負の対照として、PGL3-luc+SV40-プロモーターベクターを正の対照として使用した。
【０１３６】
欠失マッピング研究から、エキソン1の上流にある、これら2つのSNPを含む384bp断片に、必須のプロモーター機能があることが分かっている(図2)(Johnson et al.,1988)。従って、この断片を、特定のハプロタイプを有する個体から、正確性の高いDNA増幅用に改良されたProofstart DNAポリメラーゼ(Qiagen)を用いたPCRによって増幅した。図2に示した515bpアンプリコンを増幅するようにプライマーを設計した。プライマー配列は、フォワードプライマー:
2007527241.tif 000006
およびリバースプライマー:
2007527241.tif 000007
であった。この515bpアンプリコンは3'末端にSacI切断部位を含んでいる(図2)。サブクローニングを容易にするために、フォワードプライマーはKpnI部位を含むように設計された。この断片をKpnIおよびSacIで消化し、次いで、405bp産物を、pGL3-luc+基本ベクターのKpnI/SacI部位にクローニングした。挿入されたDNA断片を確認するために、全てのプラスミドを配列決定して、PCRエラーを排除し、断片の方向を調べ、トランスフェクション前のハプロタイプを確実なものにした。
【０１３７】
一過性トランスフェクション
MDA-MB-231細胞株を、10％FBSおよび2mM L-グルタミンを含むRPMI1640培地(Invitrogen)において維持した。一過性トランスフェクションは、Transfectamine2000(Invitrogen)によって、製造業者の説明書に従って行った。トランスフェクションは全て三通り行い、3回繰り返した。トランスフェクション効率を標準化するために、細胞にpRL-TKベクターをコトランスフェクトした。トランスフェクション後に、細胞を24時間培養し、洗浄し、溶解し、デュアルルシフェラーゼキット(Promega)を用いて製造業者の説明書に従って分析した。
【０１３８】
4種類のハプロタイプによって駆動されるルシフェラーゼのインビトロ転写効率を比較した。T-Cハプロタイプベクターにおいて、G-Cハプロタイプベクターより有意に高いルシフェラーゼ活性が観察された(図4,p<0.01)。T-CハプロタイプおよびG-Cハプロタイプは、白人集団、アフリカ系アメリカ人集団、およびアジア人集団において最も頻度の高いハプロタイプである(表3)。さらに、-216 G>T多型は、-191 C>A多型よりルシフェラーゼ活性に強く寄与した(図4;図6A全ての比較についてp<0.04)。この効果は、細胞のEGFR発現レベルとは独立していた(図6B)。平均して、G対立遺伝子からT対立遺伝子への置換は、ルシフェラーゼ遺伝子発現の約30％増加を示した。
【０１３９】
プロモーター活性に対するDNA変化およびSp1の潜在的な共同効果をさらに確かめるために、Sp1が欠損しているキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)Schneider細胞株2(SL-2)(Courey et al., 1988)においても、一過性トランスフェクションを行った。結果として、pGL3EGFRlucとSp1発現ベクターのコトランスフェクションは、pGL3EGFRlucのみのトランスフェクションと比較して、約100倍のプロモーター活性を誘導した。pPac-Sp1と4種類のpGL3EGFRluc構築物それぞれとのコトランスフェクションによって、G-Cハプロタイプにより駆動されるプロモーター活性はT-Cハプロタイプと比較して有意に低いことが証明された(p<0.03.図6A)。
【０１４０】
電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)
-216 G>T多型部位での核タンパク質結合を評価するために、EMSAを使用した。核タンパク質は、NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagentsを用いて、製造業者のプロトコール(Pierce, Rockford, USA)に従って、MDA-MB-231細胞から抽出した。G対立遺伝子、T対立遺伝子、およびSp1結合コンセンサス配列に対応するプローブおよび競合配列(competitor)を表4に列挙した。
【０１４１】
（表４）EMSAに使用したプローブおよび競合配列
多型ヌクレオチドの位置を太字および下線で示した。
2007527241.tif 000008
プローブは一本鎖として合成し、ビオチンを用いて末端標識した。同じ配列を有する非標識オリゴヌクレオチドを、競合配列として使用した。二本鎖DNAは、2つの相補的なオリゴヌクレオチドをアニールすることによって作成した。EMSAは、LightShift Chemiluminescent EMSA Kit(Pierce, Rockford, USA)を用いて、製造業者の説明書に従って行った。
【０１４２】
簡単に述べると、核抽出物を、結合用緩衝液(100mM Tris-HCl,pH7.5;500mM NaCl、25mM MgCl2、および5mMジチオスレイトール)、1μgポリ(dI-dC)、ならびに0.2pmol(200,000cpm)標識プローブと室温で20分間インキュベートすることによって、結合反応を行った。競合アッセイのために、100倍モル過剰の非標識オリゴヌクレオチド(特異的、非特異的、またはSp1特異的)を結合反応に含めた。結合後、試料を、0.5xTBEの中に入っている5％非変性ポリアクリルアミドゲルにおいて4℃で2時間分離した。次いで、0.5xTBEの中で、100Vで、40分間の電気泳動によって、結合反応物をナイロン膜(Amersham Pharmacia Biotech)に転写した。転写後、254nm UV光の下で120mJ/cm2で、DNAを架橋した。ビオチン標識DNAを検出し、化学発光に基づく検出法を用いてChemiDocシステム(Bio-Rad)において視覚化した。
【０１４３】
EMSAは、核タンパク質と、それぞれの対立遺伝子特異的プローブとの結合効率を試験するために行った。Sp1コンセンサスプローブは、結合および移動位置を示す対照として使用した。MDA-MB-231細胞に由来する核タンパク質とT対立遺伝子プローブの結合効率は、G対立遺伝子プローブと比較して有意に高かった(図5)。
【０１４４】
-216 G/T-191 C/AハプロタイプはインビボでEGFR mRNAの発現と関連があった。-216 G/T-191 C/AハプロタイプとEGFR転写との関連を評価するために、(EGFRを発現する)ヒト線維芽細胞細胞を選択した。以前の報告によれば、EGFRプロモーターには複数の転写開始点があったが(Johnson et al., 1988; Kageyama et al.,1988)、インビボ転写のための主要な部位は位置-260にあった(Kageyama et al.,1988)。従って、-216位および-191は、ほとんどのEGFR mRNA配列に存在した。同じ細胞内におけるT-Cハプロタイプを有するmRNAとG-Cハプロタイプを有するmRNAとの間の発現レベルの差を検出できるように、この2つの多型のディプロタイプG-C/T-Cを有する10種類の細胞株を選択した。結果として、平均相対比が理論比1:1から有意に逸脱していることが観察された(Rの平均=1.39±0.12, 95％ CI 1.11〜1.67, p<0.02)。このことは、T-Cハプロタイプに由来するEGFR mRNAは、G-Cハプロタイプに由来するEGFR mRNAより約40％多かったことを証明している。この発見は、-216G/T変異体もインビボでEGFR転写に強い影響を及ぼすことを示している。
【０１４５】
アレル不均衡(allelic imbalance)に加えて、上記の3種類のヒト細胞株間でのEGFR相対発現をリアルタイムPCRによって評価した。興味深いことに、これらの細胞間でのEGFRレベルは細胞のディプロタイプと一致し、MDA-MBA-231細胞では著しく高かったが、HEK293では約1/6、MCF-7では最も低かった (図6B)。
【０１４６】
本明細書において開示および請求される組成物および方法は全て、本開示を考慮すれば過度の実験なく製造および実施することができる。本発明の組成物および方法は好ましい態様の点から説明されたが、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物および方法ならびに方法の工程または工程の順序に変更を加えることができることは当業者に明らかであろう。さらに具体的には、本明細書に記載の薬剤の代わりに、化学的および生理学的に関連しているある特定の薬剤を使用することができ、同時に、同じ結果または類似する結果が得られることは明らかであろう。当業者に明らかな、このような全ての類似の代用および修正は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神、範囲、および概念の範囲内と考えられる。
【０１４７】
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載のものを補足する例示的な手順の詳細または他の詳細を示す程度まで、参照として本明細書に特に組み入れられる。
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【図面の簡単な説明】
【０１４８】
以下の図面は本明細書の一部をなし、本発明のある特定の局面をさらに説明するために含まれる。これらの図面の1つまたは複数を、本明細書において示された具体的な態様の詳細な説明と組み合わせて参照することによって、本発明をさらに深く理解することができる。
【０１４９】
【図１】EGFR遺伝子座の地図である。プロモーター、エンハンサー、およびエキソン1を示すために、EGFR調節領域が拡大されている。調節領域において発見された12個の一塩基多型の位置を矢印で示した。
【図２】EGFRプロモーター領域のヌクレオチド配列を示す。ヌクレオチド配列は-504〜+21であり、+1は翻訳開始コドンの最初のヌクレオチドを示し、0で示されるヌクレオチドはない。-216 G>T多型、-191 C>A多型、Sp1結合部位、転写開始点、SacI切断部位の位置、およびフォワードプライマーの位置も示した。
【図３】ルシフェラーゼ活性アッセイ用に構築されたベクター地図を示す。EGFRプロモーターの405bp KpnI-SacI断片を、ルシフェラーゼ遺伝子の上流にあるポリクローナル部位にクローニングした。クローニングされた断片を配列決定するのに使用したプライマーRVP3およびGLP2の位置も示した。
【図４】ルシフェラーゼレポーター構築物を用いた一過性トランスフェクションアッセイにおける、EGFR多型-216 G>Tおよび-191 C>Aの4つのハプロタイプの発現活性を示す。ルシフェラーゼ遺伝子の相対発現は、pRL-TKベクターのrenilla遺伝子レベルによって標準化した。
【図５】核タンパク質と-216G対立遺伝子および-216T対立遺伝子との結合効率を試験した電気泳動移動度シフトアッセイを示す。Sp1コンセンサスプローブを対照として使用した。EMSAにおいて使用したプローブおよび競合配列を表4に列挙した。-216T対立遺伝子を用いて観察された核タンパク質の結合効率(レーン3)は、-216G対立遺伝子(レーン1)と比較して有意に高かった。
【図６】MDA-MB-231細胞、MCF-7細胞、HEK-293細胞、およびSL-2細胞におけるpGL3EGFRluc(＊1〜＊4)の一過性トランスフェクション(A)。ヒト細胞株の場合、pGL3EGFRluc 1.6μgをpRL-TKベクター160ngと共にコトランスフェクトした。SL-2細胞の場合、pGL3EGFRluc 300ngをpPac-Sp1ベクター100ngと共にコトランスフェクトし、200 light unitルシフェラーゼ活性/μg総タンパク質/mlの相対発現を1とした。-216 G/T-191 C/AのG-CハプロタイプとT-Cハプロタイプとの間で、プロモーター活性の有意な差が観察された(p値は全て0.04未満である)。データを平均±SEMで示した。MDA-MB-231細胞株、MCF-7細胞株、およびHEK293細胞株の間のEGFR相対発現と、-216G/Tおよび-191C/A多型の対応する遺伝子型を(B)に示した。EGFR mRNAレベルは、1000コピーのβ-アクチン遺伝子と比較して標準化した。実験を3回繰り返し、データを平均±SEMで示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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