(57)【要約】      （修正有）【課題】関心領域内の対象物の蛍光発現率を正確に求めることができる蛍光測定装置および蛍光測定方法を提供する。【解決手段】蛍光測定装置１Ａは、対象物を含む蛍光画像を取得する蛍光画像取得部３、対象物を含む干渉画像を取得する干渉画像取得部２、および、演算部４を備える。演算部は、干渉画像取得部により取得された干渉画像に基づいて光学的厚さ画像を求め、蛍光画像取得部により取得された蛍光画像および光学的厚さ画像の双方に共通に設定した関心領域において、蛍光画像の蛍光強度の積分値と光学的厚さ画像の光学的厚さの積分値とに基づいて対象物の蛍光発現率を求める。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象物を含む蛍光画像を取得する蛍光画像取得部と、
前記対象物を含む干渉画像を取得する干渉画像取得部と、
前記干渉画像取得部により取得された干渉画像に基づいて光学的厚さ画像を求め、前記蛍光画像取得部により取得された蛍光画像および前記光学的厚さ画像の双方に共通に設定した関心領域において、前記蛍光画像の蛍光強度の積分値と前記光学的厚さ画像の光学的厚さの積分値とに基づいて前記対象物の蛍光発現率を求める演算部と、
を備える蛍光測定装置。
【請求項２】
前記演算部は、前記関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値を、前記関心領域内の前記対象物の蛍光発現率の指標として求める、
請求項１に記載の蛍光測定装置。
【請求項３】
前記演算部は、第１閾値以下である蛍光発現率を有する第１対象物のみを含む第１関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値、第２閾値以上である蛍光発現率を有する第２対象物のみを含む第２関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値、および、測定対象の関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値に基づいて、前記測定対象の関心領域内における前記第１対象物および前記第２対象物の混合割合を求める、
請求項２に記載の蛍光測定装置。
【請求項４】
前記演算部は、前記光学的厚さ画像に基づいて関心領域を設定する、
請求項１〜３の何れか１項に記載の蛍光測定装置。
【請求項５】
前記演算部は、前記光学的厚さ画像の情報を用いて前記蛍光画像に対して背景補正およびシェーディング補正を行い、当該補正後の蛍光画像の蛍光強度の積分値を求める、
請求項１〜４の何れか１項に記載の蛍光測定装置。
【請求項６】
前記干渉画像取得部は、インコヒーレント光を用いて干渉画像を取得する、
請求項１〜５の何れか１項に記載の蛍光測定装置。
【請求項７】
前記干渉画像取得部および前記蛍光画像取得部それぞれの光学系の少なくとも一部が共通である、
請求項１〜６の何れか１項に記載の蛍光測定装置。
【請求項８】
前記蛍光画像取得部は、対象物の集合体を含む蛍光画像を取得し、
前記干渉画像取得部は、前記集合体を含む干渉画像を取得し、
前記演算部は、前記蛍光画像取得部により取得された蛍光画像のうちの前記集合体の蛍光の積分値と、前記干渉画像取得部により取得された干渉画像から求められた光学的厚さ画像のうちの前記集合体の光学的厚さの積分値とに基づいて、前記集合体の蛍光発現率を求める、
請求項１〜７の何れか１項に記載の蛍光測定装置。
【請求項９】
対象物を含む蛍光画像を蛍光画像取得部により取得する蛍光画像取得ステップと、
前記対象物を含む光学的厚さ画像を干渉画像取得部により取得する干渉画像取得ステップと、
前記干渉画像取得部により取得された干渉画像に基づいて光学的厚さ画像を求め、前記蛍光画像取得部により取得された蛍光画像および前記光学的厚さ画像の双方に共通に設定した関心領域において、前記蛍光画像の蛍光強度の積分値と前記光学的厚さ画像の光学的厚さの積分値とに基づいて前記対象物の蛍光発現率を求める演算ステップと、
を備える蛍光測定方法。
【請求項１０】
前記演算ステップにおいて、前記関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値を、前記関心領域内の前記対象物の蛍光発現率の指標として求める、
請求項９に記載の蛍光測定方法。
【請求項１１】
前記演算ステップにおいて、第１閾値以下である蛍光発現率を有する第１対象物のみを含む第１関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値、第２閾値以上である蛍光発現率を有する第２対象物のみを含む第２関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値、および、測定対象の関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値に基づいて、前記測定対象の関心領域内における前記第１対象物および前記第２対象物の混合割合を求める、
請求項１０に記載の蛍光測定方法。
【請求項１２】
前記演算ステップにおいて、前記光学的厚さ画像に基づいて関心領域を設定する、
請求項９〜１１の何れか１項に記載の蛍光測定方法。
【請求項１３】
前記演算ステップにおいて、前記光学的厚さ画像の情報を用いて前記蛍光画像に対して背景補正およびシェーディング補正を行い、当該補正後の蛍光画像の蛍光強度の積分値を求める、
請求項９〜１２の何れか１項に記載の蛍光測定方法。
【請求項１４】
前記干渉画像取得ステップにおいて、前記干渉画像取得部がインコヒーレント光を用いて干渉画像を取得する、
請求項９〜１３の何れか１項に記載の蛍光測定方法。
【請求項１５】
前記干渉画像取得部および前記蛍光画像取得部それぞれの光学系の少なくとも一部が共通である、
請求項９〜１４の何れか１項に記載の蛍光測定方法。
【請求項１６】
前記蛍光画像取得ステップにおいて、対象物の集合体を含む蛍光画像を前記蛍光画像取得部により取得し、
前記干渉画像取得ステップにおいて、前記集合体を含む干渉画像を前記干渉画像取得部により取得し、
前記演算ステップにおいて、前記蛍光画像取得部により取得された蛍光画像のうちの前記集合体の蛍光の積分値と、前記干渉画像取得部により取得された干渉画像から求められた光学的厚さ画像のうちの前記集合体の光学的厚さの積分値とに基づいて、前記集合体の蛍光発現率を求める、
請求項９〜１５の何れか１項に記載の蛍光測定方法。
【請求項１７】
前記対象物が細胞である、
請求項９〜１６の何れか１項に記載の蛍光測定方法。
【請求項１８】
前記蛍光画像取得ステップにおいて、前記対象物としての細胞を各ウェルに入れたマルチウェルプレートを前記蛍光画像取得部によりタイリング撮影して蛍光画像を取得し、
前記干渉画像取得ステップにおいて、前記マルチウェルプレートを前記干渉画像取得部によりタイリング撮影して干渉画像を取得し、
前記演算ステップにおいて、前記蛍光画像および前記光学的厚さ画像それぞれにおいて前記マルチウェルプレートの各ウェルに関心領域を設定する、
請求項１７に記載の蛍光測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光測定装置および蛍光測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
蛍光顕微鏡により取得した細胞集団の蛍光画像において蛍光輝度が高い細胞と蛍光輝度が低い細胞とを分類して統計解析する手法が知られている。例えば、非特許文献１に記載された技術は、血液サンプル中に含まれる免疫染色に対しポジティブな細胞とネガティブな細胞とを含む蛍光画像をデジタルカメラにより取得し、この蛍光画像に基づいて分類・統計解析を行っている。この従来技術では、蛍光画像における蛍光強度に基づいて、蛍光を強く発しているポジティブ細胞と、蛍光を発していない（または蛍光が弱い）ネガティブ細胞とを弁別する。
【０００３】
すなわち、免疫染色等の手法により細胞集団を染色した際に、蛍光強度が閾値以上である細胞（ポジティブ細胞）は所望の抗原抗体反応を呈示していると判定し、蛍光強度が閾値以下である細胞（ネガティブ細胞）は所望の抗原抗体反応を呈示していないと判定する。この判定結果に基づいて、細胞集団のうち所望の抗原抗体反応を呈示した細胞の割合を計算することができる。このような蛍光強度を指標として細胞または細胞集団を弁別する技術が特許文献１に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−２０４２２号公報
【特許文献２】国際公開第２０１６／１２１２５０号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Benjamin R. Lee, et. al, “ADigital Image Microscopy System for Rare-Event Detection Using Fluorescent Probes,”Cytometry 10:256-262 (1989).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、従来の弁別技術が次のような問題を有していることを見出した。すなわち、従来の弁別技術では、蛍光画像における蛍光強度のみを指標としていることから、正確な弁別が困難である。厚さが大きい細胞または細胞集団は、蛍光色素の発現率が低いネガティブ細胞であっても、観察光学系の光軸に沿った厚さ分だけ蛍光が積算されて観察されることから、蛍光強度が大きいポジティブ細胞であると誤判定される場合がある。逆に、厚さが小さい細胞または細胞集団は、蛍光色素の発現率が高いポジティブ細胞であっても、観察光学系の光軸に沿った蛍光の積算量が少ないことから、蛍光強度が小さいネガティブ細胞であると誤判定される場合がある。
【０００７】
例えば、図１に示されるように、蛍光色素の発現率が高いポジティブ細胞７３ｐの厚さが小さく、蛍光色素の発現率が低いネガティブ細胞７３ｎの厚さが大きいと、観察光学系の光軸に沿ったポジティブ細胞７３ｐの蛍光の積算量が少なく、観察光学系の光軸に沿ったネガティブ細胞７３ｎの蛍光の積算量が多い場合があり、このような場合に誤判定となる。
【０００８】
また、図２に示されるように、マルチウェルプレートの或るウェルに多数のネガティブ細胞７３ｎのみが存在し、他のウェルに少数のポジティブ細胞７３ｐのみが存在し、更に他のウェルにネガティブ細胞７３ｎおよびポジティブ細胞７３ｐが混在する場合も、誤判定となる。すなわち、各ウェルの蛍光積算量のみからは、該ウェルにおけるネガティブ細胞７３ｎおよびポジティブ細胞７３ｐの混合割合を判定することはできない。
【０００９】
このような問題は、蛍光強度により細胞を弁別する場合だけでなく、蛍光強度により他の対象物を弁別する場合にも存在する。
【００１０】
本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、関心領域内の対象物の蛍光発現率を正確に求めることができる蛍光測定装置および蛍光測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の蛍光測定装置は、(1) 対象物を含む蛍光画像を取得する蛍光画像取得部と、(2) 対象物を含む干渉画像を取得する干渉画像取得部と、(3) 干渉画像取得部により取得された干渉画像に基づいて光学的厚さ画像を求め、蛍光画像取得部により取得された蛍光画像および光学的厚さ画像の双方に共通に設定した関心領域において、蛍光画像の蛍光強度の積分値と光学的厚さ画像の光学的厚さの積分値とに基づいて対象物の蛍光発現率を求める演算部と、を備える。
【００１２】
本発明の一側面による蛍光測定装置では、演算部は、関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値を、関心領域内の対象物の蛍光発現率の指標として求める。
【００１３】
本発明の他の一側面による蛍光測定装置では、演算部は、第１閾値以下である蛍光発現率を有する第１対象物のみを含む第１関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値、第２閾値以上である蛍光発現率を有する第２対象物のみを含む第２関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値、および、測定対象の関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値に基づいて、測定対象の関心領域内における第１対象物および第２対象物の混合割合を求める。
【００１４】
本発明の更に他の一側面による蛍光測定装置では、演算部は、光学的厚さ画像に基づいて関心領域を設定する。
【００１５】
本発明の更に他の一側面による蛍光測定装置では、演算部は、光学的厚さ画像の情報を用いて蛍光画像に対して背景補正およびシェーディング補正を行い、当該補正後の蛍光画像の蛍光強度の積分値を求める。
【００１６】
本発明の更に他の一側面による蛍光測定装置では、干渉画像取得部は、インコヒーレント光を用いて干渉画像を取得する。
【００１７】
本発明の更に他の一側面による蛍光測定装置では、干渉画像取得部および蛍光画像取得部それぞれの光学系の少なくとも一部が共通である。
【００１８】
本発明の更に他の一側面による蛍光測定装置では、蛍光画像取得部は、対象物の集合体を含む蛍光画像を取得し、干渉画像取得部は、集合体を含む干渉画像を取得し、演算部は、蛍光画像取得部により取得された蛍光画像のうちの集合体の蛍光の積分値と、干渉画像取得部により取得された干渉画像から求められた光学的厚さ画像のうちの集合体の光学的厚さの積分値とに基づいて、集合体の蛍光発現率を求める。
【００１９】
本発明の蛍光測定方法は、(1) 対象物を含む蛍光画像を蛍光画像取得部により取得する蛍光画像取得ステップと、(2) 対象物を含む光学的厚さ画像を干渉画像取得部により取得する干渉画像取得ステップと、(3)干渉画像取得部により取得された干渉画像に基づいて光学的厚さ画像を求め、蛍光画像取得部により取得された蛍光画像および光学的厚さ画像の双方に共通に設定した関心領域において、蛍光画像の蛍光強度の積分値と光学的厚さ画像の光学的厚さの積分値とに基づいて対象物の蛍光発現率を求める演算ステップと、を備える。
【００２０】
本発明の一側面による蛍光測定方法では、演算ステップにおいて、関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値を、関心領域内の対象物の蛍光発現率の指標として求める。
【００２１】
本発明の他の一側面による蛍光測定方法では、演算ステップにおいて、第１閾値以下である蛍光発現率を有する第１対象物のみを含む第１関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値、第２閾値以上である蛍光発現率を有する第２対象物のみを含む第２関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値、および、測定対象の関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値に基づいて、測定対象の関心領域内における第１対象物および第２対象物の混合割合を求める。
【００２２】
本発明の更に他の一側面による蛍光測定方法では、演算ステップにおいて、光学的厚さ画像に基づいて関心領域を設定する。
【００２３】
本発明の更に他の一側面による蛍光測定方法では、演算ステップにおいて、光学的厚さ画像の情報を用いて蛍光画像に対して背景補正およびシェーディング補正を行い、当該補正後の蛍光画像の蛍光強度の積分値を求める。
【００２４】
本発明の更に他の一側面による蛍光測定方法では、干渉画像取得ステップにおいて、干渉画像取得部がインコヒーレント光を用いて干渉画像を取得する。
【００２５】
本発明の更に他の一側面による蛍光測定方法では、干渉画像取得部および蛍光画像取得部それぞれの光学系の少なくとも一部が共通である。
【００２６】
本発明の更に他の一側面による蛍光測定方法では、蛍光画像取得ステップにおいて、対象物の集合体を含む蛍光画像を蛍光画像取得部により取得し、干渉画像取得ステップにおいて、集合体を含む干渉画像を干渉画像取得部により取得し、演算ステップにおいて、蛍光画像取得部により取得された蛍光画像のうちの集合体の蛍光の積分値と、干渉画像取得部により取得された干渉画像から求められた光学的厚さ画像のうちの集合体の光学的厚さの積分値とに基づいて、集合体の蛍光発現率を求める。
【００２７】
本発明の更に他の一側面による蛍光測定方法では、対象物は細胞である。本発明の更に他の一側面による蛍光測定方法では、蛍光画像取得ステップにおいて、対象物としての細胞を各ウェルに入れたマルチウェルプレートを蛍光画像取得部によりタイリング撮影して蛍光画像を取得し、干渉画像取得ステップにおいて、マルチウェルプレートを干渉画像取得部によりタイリング撮影して干渉画像を取得し、演算ステップにおいて、蛍光画像および光学的厚さ画像それぞれにおいてマルチウェルプレートの各ウェルに関心領域を設定する。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、関心領域内の対象物の蛍光発現率を正確に求めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、細胞の厚さ及び蛍光積算量について説明する図である。
【図２】図２は、細胞の個数、蛍光積算量および混合割合について説明する図である。
【図３】図３は、蛍光測定装置１Ａの構成を示す図である。
【図４】図４は、サンプルの構成を示す図である。
【図５】図５は、第１変形例の蛍光測定装置１Ｂの構成を示す図である。
【図６】図６は、第２変形例の蛍光測定装置１Ｃの構成を示す図である。
【図７】図７は、第３変形例の蛍光測定装置１Ｄの構成を示す図である。
【図８】図８は、干渉観察用光、励起光および蛍光それぞれの波長帯域の間の関係の例を示す図である。図８（ａ）は干渉観察用光の波長帯域が蛍光波長帯域より長い場合を示す。図８（ｂ）は干渉観察用光の波長帯域が蛍光波長帯域と一部が重なっている場合を示す。図８（ｃ）は干渉観察用光の波長帯域が励起光波長帯域より短い場合を示す。図８（ｄ）は干渉観察用光の波長帯域が励起光波長帯域と一部が重なっている場合を示す。
【図９】図９は、本実施形態の蛍光測定装置の動作および本実施形態の蛍光測定方法を説明するタイミングチャートである。
【図１０】図１０は、干渉画像取得部２により取得された５つの干渉画像Ｉ１〜Ｉ５を示す図である。
【図１１】図１１は、図１０の干渉画像Ｉ１〜Ｉ５に基づいて演算部４により（２）式で求められた位相画像Φを示す図である。
【図１２】図１２は、図１１の位相画像Φに基づいて演算部４により（３）式で求められた光学的厚さ画像ＯＴを示す図である。
【図１３】図１３は、蛍光画像取得部３により取得された蛍光画像ＦＬを示す図である。
【図１４】図１４は、図１２の光学的厚さ画像ＯＴにおいて細胞領域についてセグメンテーション処理した後の光学的厚さ画像を示す図である。
【図１５】図１５は、各細胞（各ＲＯＩ）について、面積、平均光学的厚さ、平均蛍光強度および“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”を纏めた表である。
【図１６】図１６は、各ＲＯＩの平均蛍光強度を示すグラフである。
【図１７】図１７は、各ＲＯＩの“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”を示すグラフである。
【図１８】図１８は、セグメンテーション後の画像において、１０００×“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”が８０以上であるＲＯＩを灰色で示し、１０００×“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”が８０以下であるＲＯＩを白色で示した図である。
【図１９】図１９は、細胞集団について光学的厚さ画像および蛍光画像を模式的に示す図である。図１９（ａ）は光学的厚さ画像を示す。図１９（ｂ）は蛍光画像を示す。
【図２０】図２０は、ポジティブ細胞７３ｐのみからなる細胞集団およびネガティブ細胞７３ｎのみからなる細胞集団を模式的に示す図である。
【図２１】図２１は、ポジティブ細胞およびネガティブ細胞が混在する視野の像を模式的に示す図である。
【図２２】図２２は、ポジティブ細胞およびネガティブ細胞の何れであるかを判定する手順を説明するフローチャートである。
【図２３】図２３は、ポジティブ細胞およびネガティブ細胞の混合割合を評価する手順を説明するフローチャートである。
【図２４】図２４は、第１変形例のＲＯＩ設定方法について説明する図である。
【図２５】図２５は、第２変形例のＲＯＩ設定方法について説明する図である。
【図２６】図２６は、第３変形例のＲＯＩ設定方法について説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。本発明は、これらの例示に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【００３１】
図３は、蛍光測定装置１Ａの構成を示す図である。蛍光測定装置１Ａは、干渉画像取得部２、蛍光画像取得部３、演算部４およびタイミング制御回路５を備える。干渉画像取得部２および蛍光画像取得部３それぞれの光学系の一部は共通である。干渉画像取得部２は、光源１１、ビームスプリッタ１２、対物レンズ１３、対物レンズ１４、参照ミラー１５、チューブレンズ１６、ビームスプリッタ１７、撮像器１８、ピエゾ素子２１、光検出器２２および位相制御回路２３を含む。蛍光画像取得部３は、励起光源３１、ビームスプリッタ３２、チューブレンズ１６、励起光カットフィルタ３３および撮像器１８を含む。
【００３２】
干渉画像取得部２は、二光束干渉計としてマイケルソン干渉計を有し、１または複数の対象物の干渉画像を取得する。蛍光画像取得部３は、対象物の蛍光画像を取得する。演算部４は、干渉画像取得部２により取得された干渉画像に基づいて光学的厚さ画像を求める。さらに、演算部４は、蛍光画像取得部３により取得された蛍光画像および光学的厚さ画像の双方に共通に設定した関心領域において、蛍光画像の蛍光強度の積分値と光学的厚さ画像の光学的厚さの積分値とに基づいて対象物の蛍光発現率を求める。タイミング制御回路５は、光源１１および励起光源３１それぞれの光出力タイミングならびに撮像器１８の露光タイミングを制御することで、干渉画像取得部２による干渉画像取得および蛍光画像取得部３による蛍光画像取得それぞれのタイミングを制御する。
【００３３】
対象物は、特定の細胞や生体サンプルに限定されるものではない。例えば、対象物として、培養細胞、不死化細胞、初代培養細胞、がん細胞、脂肪細胞、肝臓細胞、心筋細胞、神経細胞、グリア細胞、体性幹細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、ｉＰＳ細胞、および前記細胞をもとに作られた細胞塊（コロニーまたはスフェロイド）などが挙げられる。また、対象物として、生体に限らず、工業サンプル、たとえば金属表面、半導体表面、ガラス表面、半導体素子の内部、樹脂素材表面、液晶、高分子化合物なども挙げられる。
【００３４】
本実施形態の以下の説明では、図４にサンプルの構成例が示されるように、対象物は、容器７０に入れられた培養液７２中の細胞７３であるとする。容器７０の底部の内側には反射増強コーティング７１が設けられている。
【００３５】
光源１１は干渉観察用の光を出力する。好適には光源１１はインコヒーレント光を出力する。光源１１は、例えばハロゲンランプなどのランプ系光源、ＬＥＤ（Light emitting diode）光源、ＳＬＤ（Superluminescent diode）光源、ＡＳＥ（Amplified spontaneous emission）光源等である。
【００３６】
ビームスプリッタ１２は、光源１１と光学的に結合され、二光束干渉計であるマイケルソン干渉計を構成する。ビームスプリッタ１２は、例えば、反射率と透過率との比が５０：５０であるハーフミラーであってもよい。ビームスプリッタ１２は、光源１１から出力された光を二光束に分岐して第１分岐光および第２分岐光とする。ビームスプリッタ１２は、第１分岐光を対物レンズ１３へ出力し、第２分岐光を対物レンズ１４へ出力する。
【００３７】
また、ビームスプリッタ１２は、反射増強コーティング７１で反射されて対物レンズ１３を経た第１分岐光を入力するとともに、参照ミラー１５で反射されて対物レンズ１４を経た第２分岐光を入力する。そして、ビームスプリッタ１２は、これら入力した第１分岐光と第２分岐光とを合波して、干渉光をチューブレンズ１６へ出力する。
【００３８】
対物レンズ１３は、ビームスプリッタ１２と光学的に結合され、ビームスプリッタ１２から出力された第１分岐光を容器７０内の細胞７３に集光する。また、対物レンズ１３は、反射増強コーティング７１で反射された第１分岐光を入力してビームスプリッタ１２へ出力する。
【００３９】
ビームスプリッタ１２と対物レンズ１３との間の第１分岐光の光路上にビームスプリッタ３２が挿入されている。ビームスプリッタ３２は、励起光源３１と光学的に接続されている。ビームスプリッタ３２は、励起光源３１から出力された励起光、光源１１から出力された光のうちの第１分岐光、および、励起光が照射された細胞７３で発生した蛍光のうち、一部を反射させ、残部を透過させる。
【００４０】
対物レンズ１３は、ビームスプリッタ３２から到達した励起光を容器７０内の細胞７３に集光する。また、対物レンズ１３は、細胞７３で発生した蛍光を入力してビームスプリッタ１２へ出力する。ビームスプリッタ１２は、この蛍光をチューブレンズ１６へ出力する。
【００４１】
対物レンズ１４は、ビームスプリッタ１２と光学的に結合され、ビームスプリッタ１２から出力された第２分岐光を参照ミラー１５の反射面に集光する。また、対物レンズ１４は、参照ミラー１５の反射面で反射された第２分岐光を入力してビームスプリッタ１２へ出力する。
【００４２】
チューブレンズ１６は、干渉光学系を構成するビームスプリッタ１２と光学的に結合され、ビームスプリッタ１２から出力された干渉光および蛍光を、ビームスプリッタ１７を経て撮像器１８の撮像面に結像する。ビームスプリッタ１７は、干渉光および蛍光それぞれの一部を反射させ残部を透過させる。ビームスプリッタ１７の反射率と透過率との比は例えば２０：８０である。
【００４３】
撮像器１８は、ビームスプリッタ１７と光学的に結合され、ビームスプリッタ１７から到達した干渉光を受光して干渉画像を取得し、また、ビームスプリッタ１７から到達した蛍光を受光して蛍光画像を取得する。撮像器１８は、例えば、ＣＣＤエリアイメージセンサおよびＣＭＯＳエリアイメージセンサなどのイメージセンサである。撮像器１８の受光面の前に設けられている励起光カットフィルタ３３は、干渉光および蛍光を選択的に透過させ、励起光を選択的に遮断する。
【００４４】
ピエゾ素子２１は、参照ミラー１５の反射面に垂直な方向に該反射面を移動させる。ピエゾ素子２１は、この反射面の移動により、二光束干渉計における二光束の間の光路長差（すなわち位相差）を調整することができる。ピエゾ素子２１は、波長未満の分解能で、参照ミラー１５の反射面の位置を決めることができる。二光束干渉計において二光束の間の光路長差は可変である。
【００４５】
なお、ビームスプリッタ１２から反射増強コーティング７１までの光学的距離をＬ１とし、ビームスプリッタ１２から参照ミラー１５の反射面までの光学的距離をＬ２とすると、二光束干渉計における二光束の間の光路長差は２（Ｌ１−Ｌ２）である。この光路長差が光源１１の出力光のコヒーレント長以下であれば、撮像器１８は明瞭な干渉画像を取得することができる。光源１１の出力光の中心波長をλ０としたとき、二光束干渉計における二光束の間の位相差Δφは次式で表されるものとする。
【００４６】
【数１】
2019120570.tif 000003
【００４７】
光検出器２２は、ビームスプリッタ１７と光学的に結合され、ビームスプリッタ１７から到達した干渉光を受光して検出信号を出力する。光検出器２２は、例えば、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管であり、また、ラインセンサ（リニアセンサ）、ＣＣＤエリアイメージセンサ、ＣＭＯＳエリアイメージセンサなどであってもよい。
【００４８】
位相制御回路２３は、光検出器２２と電気的に接続され、光検出器２２から出力される検出信号を入力する。また、位相制御回路２３は、ピエゾ素子２１と電気的に接続され、ピエゾ素子２１による光路長差の調整動作を制御する。位相制御回路２３は、入力した検出信号に基づいて、二光束干渉計における二光束の間の光路長差を検出する。そして、位相制御回路２３は、この検出結果に基づくフィードバック制御により、ピエゾ素子２１による光路長差の調整動作を制御する。これにより、二光束干渉計における二光束の間の光路長差を設定値で安定化した状態（ロック状態）とすることができる。
【００４９】
干渉画像取得部２は、ロック状態において対象物（細胞７３）の干渉画像を撮像器１８により撮像して取得することができる。蛍光画像取得部３は、対象物（細胞７３）の蛍光画像を撮像器１８により撮像して取得することができる。演算部４は、干渉画像取得部２の撮像器１８により取得された干渉画像に基づいて対象物の光学的厚さ画像を求め、この光学的厚さ画像および蛍光画像に基づいて関心領域内の対象物の蛍光発現率を求める。
【００５０】
演算部４は、パーソナルコンピュータおよびタブレット端末などのコンピュータであってもよい。また、演算部４は、操作者からの入力を受け付ける入力部（キーボード、マウス、タブレット端末など）、ならびに、干渉画像および光学的厚さ画像等を表示する表示部（ディスプレイ、タブレット端末など）を備えていてもよい。また、演算部４は、画面に画像等を表示するとともに、その画面において操作者による領域の指定を受け付ける機能を有するのが好適である。
【００５１】
干渉画像取得部２の動作は次のとおりである。光源１１から出力された光はビームスプリッタ１２により二光束に分岐されて第１分岐光および第２分岐光とされ、ビームスプリッタ１２から第１分岐光および第２分岐光が出力される。ビームスプリッタ１２から出力された第１分岐光は、ビームスプリッタ３２を経て、対物レンズ１３により容器７０内の細胞７３に集光され、容器７０の底部の内側に設けられた反射増強コーティング７１で反射される。反射増強コーティング７１で反射された第１分岐光は、対物レンズ１３およびビームスプリッタ３２を経て、ビームスプリッタ１２に入力される。ビームスプリッタ１２から出力された第２分岐光は、対物レンズ１４により参照ミラー１５の反射面に集光され、その反射面で反射される。参照ミラー１５の反射面で反射された第２分岐光は、対物レンズ１４を経てビームスプリッタ１２に入力される。
【００５２】
対物レンズ１３からビームスプリッタ１２に入力された第１分岐光、および、対物レンズ１４からビームスプリッタ１２に入力された第２分岐光は、ビームスプリッタ１２により合波されて、ビームスプリッタ１２から干渉光が出力される。この干渉光は、チューブレンズ１６を経た後にビームスプリッタ１７により２分岐されて、撮像器１８および光検出器２２それぞれにより受光される。干渉光を受光した光検出器２２から検出信号が出力され、この検出信号に基づいて位相制御回路２３により二光束干渉計における二光束の間の光路長差が検出される。そして、位相制御回路２３によるピエゾ素子２１に対するフィードバック制御により、二光束干渉計における二光束の間の光路長差が設定値で安定化した状態（ロック状態）とされる。ロック状態において干渉光を受光した撮像器１８により干渉画像が取得され、その干渉画像は演算部４へ出力される。そして、演算部４により、干渉画像に基づいて対象物（細胞７３）の光学的厚さ画像が求められる。
【００５３】
演算部４は、位相シフト法により、複数の干渉画像から光学的厚さ画像を求める。すなわち、干渉画像取得部２は、二光束干渉計の光路長差を互いに異なる複数の設定値それぞれで安定化した状態とし各状態において干渉画像を取得する。演算部４は、干渉画像取得部２により取得された複数の干渉画像に基づいて位相画像を求めることができる（特許文献２参照）。更に、演算部４は、この位相画像から光学的厚さ画像を求めることができる。
【００５４】
例えば、干渉画像取得部２は、ピエゾ素子２１、光検出器２２および位相制御回路２３を用いたフィードバック制御により干渉光の位相差を或る初期位相で安定化させて、位相差を安定化させた状態で干渉画像Ｉ１を撮像器１８により取得する。次に、干渉画像取得部２は、ピエゾ素子２１、光検出器２２および位相制御回路２３を用いて干渉光の位相差を“初期位相＋π／２”で安定化させ、位相差を安定化させた状態で干渉画像Ｉ２を撮像器１８により取得する。同様にして、干渉画像取得部２は、干渉光の位相差を“初期位相＋π”で安定化させた状態で干渉画像Ｉ３を撮像器１８により取得し、干渉光の位相差を“初期位相＋３π／２”で安定化させた状態で干渉画像Ｉ４を撮像器１８により取得し、干渉光の位相差を“初期位相＋２π”で安定化させた状態で干渉画像Ｉ５を撮像器１８により取得する。
【００５５】
演算部４は、これら５つの干渉画像Ｉ１〜Ｉ５を用いて、下記（２）式の演算を行って位相画像Φを求める。argは複素数の変換を取得する演算子である。ｉは虚数単位である。演算部４は、この位相画像Φに対して位相アンラップ処理および背景歪み補正処理をした後、光学的厚さＯＴを下記（３）式で求めて光学的厚さ画像を求める。なお、これらの式に現れる各パラメータは画素位置（ｘ，ｙ）の関数であり、これらの式の演算は画素毎に行われる。
【００５６】
【数２】
2019120570.tif 000004
【００５７】
【数３】
2019120570.tif 000005
【００５８】
背景補正については、ｘ，ｙを変数とする多項式関数（たとえばゼルニケ多項式）を用いることで良好な（フラットな）バックグラウンドを得ることができる。また、背景における歪み成分の空間周波数が個々のサンプルの空間周波数よりも十分に低い場合には、ハイパスフィルタリング処理をすることもできる。光学的厚さ画像の背景における平坦性は、光学的厚さの標準偏差にして５ｎｍ未満であるのが好ましい。
【００５９】
この光学的厚さＯＴは、サンプルを透過した光に与えられた位相変化量を表したものである。細胞７３の厚さをｄとし、細胞７３の平均的な屈折率をｎｃとし、培養液７２の屈折率をｎｍとすると、光学的厚さＯＴは次式で与えられる。
【００６０】
【数４】
2019120570.tif 000006
【００６１】
蛍光画像取得部３の動作は次のとおりである。励起光源３１から出力された励起光は、ビームスプリッタ３２で反射され、対物レンズ１３により容器７０内の細胞７３に集光照射される。この励起光の照射により細胞７３で発生した蛍光は、対物レンズ１３、ビームスプリッタ３２、ビームスプリッタ１２、チューブレンズ１６、ビームスプリッタ１７および励起光カットフィルタ３３を経て、撮像器１８により受光される。この蛍光を受光した撮像器１８は蛍光画像を取得することができる。演算部４は、この蛍光画像を入力する。
【００６２】
次に、図５〜図７を用いて、蛍光測定装置の変形例の構成について説明する。蛍光測定装置の構成（特に干渉画像取得部および蛍光画像取得部の構成）は、他に様々な態様が可能である。なお、変形例の構成を示す図５〜図７では、演算部およびタイミング制御回路の図示が省略されており、また、干渉画像取得部のビームスプリッタ１７、光検出器２２および位相制御回路２３の図示も省略されている。
【００６３】
図５に示される第１変形例の蛍光測定装置１Ｂは、図３に示された蛍光測定装置１Ａの構成と比較すると、干渉画像取得部２および蛍光画像取得部３の各構成については略同様であるが、ビームスプリッタ３２が挿入されている位置の点で相違する。ビームスプリッタ３２は、図３に示された蛍光測定装置１Ａでは二光束干渉計の中に設けられていたのに対して、図５に示される第１変形例の蛍光測定装置１Ｂでは、二光束干渉計の外であって、ビームスプリッタ１２とチューブレンズ１６との間の光路上に設けられている。
【００６４】
図６に示される第２変形例の蛍光測定装置１Ｃは、図３に示された蛍光測定装置１Ａの構成と比較すると、ダイクロイックミラー３４および蛍光透過フィルタ３５を更に備える点で相違し、干渉画像取得用の撮像器１８とは別に蛍光画像取得用の撮像器３６を更に備える点で相違する。ダイクロイックミラー３４は、ビームスプリッタ１２と光学的に結合されており、ビームスプリッタ１２から出力した干渉光および蛍光を入力する。ダイクロイックミラー３４は、入力した干渉光および蛍光のうち、干渉光を選択的に反射させ、蛍光を選択的に透過させる。干渉画像取得用の撮像器１８は、ダイクロイックミラー３４で反射された干渉光を受光して干渉画像を取得する。蛍光画像取得用の撮像器３６は、ダイクロイックミラー３４で透過した蛍光を受光して蛍光画像を取得する。撮像器３６の受光面の前に設けられている蛍光透過フィルタ３５は、蛍光を選択的に透過させる。
【００６５】
図７に示される第３変形例の蛍光測定装置１Ｄは、これまでの蛍光測定装置１Ａ〜１Ｃの構成と比較すると、二光束干渉計としてマッハツェンダ干渉計を有する点で相違する。第３変形例の蛍光測定装置１Ｄでは、光源１１から出力された干渉観察用の光はビームスプリッタ１２により二光束に分岐されて第１分岐光および第２分岐光とされ、ビームスプリッタ１２から第１分岐光および第２分岐光が出力される。ビームスプリッタ１２から出力された第１分岐光は、ミラー４１で反射され、細胞７３を透過し、対物レンズ１３を経て、ビームスプリッタ４２に入力される。ビームスプリッタ１２から出力された第２分岐光は、参照ミラー１５で反射され、対物レンズ１４を経て、ビームスプリッタ４２に入力される。
【００６６】
対物レンズ１３からビームスプリッタ１２に入力された第１分岐光、および、対物レンズ１４からビームスプリッタ１２に入力された第２分岐光は、ビームスプリッタ１２により合波されて、ビームスプリッタ１２から干渉光が出力される。この干渉光は、チューブレンズ１６を経て、撮像器１８により受光される。二光束干渉計における二光束の間の光路長差が設定値で安定化した状態（ロック状態）において干渉光を受光した撮像器１８により干渉画像が取得され、その干渉画像は演算部４へ出力される。そして、演算部４により、干渉画像に基づいて対象物（細胞７３）の光学的厚さ画像が求められる。
【００６７】
励起光源３１から出力された励起光は、ビームスプリッタ４２で反射され、対物レンズ１３により細胞７３に集光照射される。この励起光の照射により細胞７３で発生した蛍光は、対物レンズ１３、ビームスプリッタ４２、チューブレンズ１６および励起光カットフィルタ３３を経て、撮像器１８により受光される。この蛍光を受光した撮像器１８は蛍光画像を取得することができる。演算部４は、この蛍光画像を入力する。
【００６８】
なお、図３，図５，図６および図７の構成例において、ダイクロイックミラーに替えてビームスプリッタを用いることができる場合があり、逆に、ビームスプリッタに替えてダイクロイックミラー用いることができる場合がある。ビームスプリッタの場合、反射率と透過率との比は例えば２０：８０である。
【００６９】
これら蛍光測定装置１Ａ〜１Ｄの何れの構成においても、光源１１から出力された干渉観察用の光は、二光束干渉計（マイケルソン干渉計またはマッハツェンダ干渉計）を経るとともに、二光束干渉計の途中に置かれた細胞をも経て、撮像器の受光面上に干渉画像を形成する。また、励起光源３１から出力された励起光の照射によって細胞で発生した蛍光は、撮像器の受光面上に蛍光画像を形成する。蛍光測定装置１Ａ〜１Ｄでは、干渉画像取得部２および蛍光画像取得部３それぞれの光学系の一部（特に対物レンズ１３）は共通であり、略同一視野に対して干渉画像および蛍光画像を取得することができる。
【００７０】
蛍光測定装置１Ａ〜１Ｄそれぞれは、干渉画像および蛍光画像を略同時に取得することができる。第２変形例の蛍光測定装置１Ｃは、干渉画像取得用の撮像器１８と蛍光画像取得用の撮像器３６とを互いに別個に備えているので、干渉画像および蛍光画像を同時に取得することができる。第２変形例の蛍光測定装置１Ｃは、タイミング制御回路を備えていなくてもよい。
【００７１】
蛍光測定装置１Ａ，１Ｂ，１Ｄそれぞれは、１つの撮像器１８を用いて干渉画像および蛍光画像を時分割で交互に取得することができる。干渉画像および蛍光画像それぞれの撮像の為の露光時間が短いので、蛍光測定装置１Ａ，１Ｂ，１Ｄそれぞれは、干渉画像および蛍光画像を略同時に取得することができる。例えば、蛍光撮像に要する露光時間は数百ミリ秒〜数秒程度であるのに対し、干渉撮像に要する露光時間は１００ミリ秒未満とすることが可能である。蛍光撮像直後に干渉撮像を行う又は干渉撮像直後に蛍光撮像を行うとすれば、蛍光の露光時間と比べて大きなモーションアーチファクトが発生することはないと考えられ、時分割撮像であっても実質的には略同時撮像と見なしうる。
【００７２】
本実施形態の蛍光測定装置は、略同一視野に対して干渉画像および蛍光画像を略同時に取得することができる構成であればよい。すなわち、干渉画像取得部２における二光束干渉計は、マイケルソン干渉計およびマッハツェンダ干渉計の何れであってもよい。励起光を導入する位置は、二光束干渉計の中であってもよいし外であってもよい。１つの撮像器により干渉画像および蛍光画像を交互に撮像してもよいし、干渉画像取得用の撮像器と蛍光画像取得用の撮像器とが互いに別個に備えられていてもよい。
【００７３】
また、略同一視野に対して干渉画像および蛍光画像を取得するためには、干渉画像取得部および蛍光画像取得部それぞれの光学系の一部が共通であるのが好適であるが、干渉画像取得部と蛍光画像取得部とは光学系の共通部分を備えていなくてもよい。干渉画像取得部と蛍光画像取得部とが別個の光学系であっても、略同一視野に対して干渉画像および蛍光画像を取得することができればよい。
【００７４】
次に、図８を用いて、光源１１から出力される干渉観察用の光の波長帯域、励起光源３１から出力される励起光の波長帯域、および、励起光照射により細胞７３で発生する蛍光の波長帯域の間の関係について説明する。図８は、干渉観察用光、励起光および蛍光それぞれの波長帯域の間の関係の例を示す図である。一般に、蛍光波長帯域は励起光波長帯域より長波長側にある。
【００７５】
図８（ａ）に示される例では、干渉観察用光の波長帯域は、蛍光波長帯域より長く、分光的手法により蛍光と分離し得る程度に蛍光波長帯域から離れている。この場合、１つの撮像器を用いて干渉画像および蛍光画像を時分割で交互に取得することもできるし、２つの撮像器を用いて干渉画像および蛍光画像を同時に取得するのも好適である。
【００７６】
図８（ｂ）に示される例では、干渉観察用光の波長帯域は、蛍光波長帯域と一部が重なっている。この場合、１つの撮像器を用いて干渉画像および蛍光画像を時分割で交互に取得することはできる。干渉画像と蛍光画像との間の色収差を最小にすることができるので好ましい。ただし、２つの撮像器を用いて干渉画像および蛍光画像を同時に取得することはできない。
【００７７】
図８（ｃ）に示される例では、干渉観察用光の波長帯域は、励起光波長帯域より短く、分光的手法により励起光と分離し得る程度に励起光波長帯域から離れている。この場合、１つの撮像器を用いて干渉画像および蛍光画像を時分割で交互に取得することもできるし、２つの撮像器を用いて干渉画像および蛍光画像を同時に取得することもできる。ただし、干渉画像と蛍光画像との間の色収差が問題となる場合があり、その場合には、高精度に色収差を補正した光学系を用いることが望ましい。
【００７８】
図８（ｄ）に示される例では、干渉観察用光の波長帯域は、励起光波長帯域と一部が重なっている。この場合、１つの撮像器を用いて干渉画像および蛍光画像を時分割で交互に取得することはできるが、２つの撮像器を用いて干渉画像および蛍光画像を同時に取得することはできない。
【００７９】
次に、図９を用いて、本実施形態の蛍光測定装置の動作および本実施形態の蛍光測定方法の手順について説明する。図９は、本実施形態の蛍光測定装置の動作および本実施形態の蛍光測定方法を説明するタイミングチャートである。この図は、光源１１の光出力期間、励起光源３１の励起光出力期間、撮像器の露光期間、および、干渉光の位相差（二光束干渉計における二光束の間の位相差）の時間変化の例を示している。蛍光測定方法は、干渉画像取得ステップ、蛍光画像取得ステップおよび演算ステップを有する。この図は、１つの撮像器を用いて干渉画像取得ステップおよび蛍光画像取得ステップを時分割で交互に行う場合の動作例を示している。
【００８０】
干渉画像取得ステップにおいては、光源１１は干渉観察用の光を出力し、励起光源３１は励起光を出力しない。干渉画像取得部２は、ピエゾ素子２１、光検出器２２および位相制御回路２３を用いたフィードバック制御により干渉光の位相差を初期位相からπ／２ずつ段階的に設定し、各々の段階において位相差を設定値に安定化させた状態で干渉画像Ｉ１〜Ｉ５を撮像器１８により撮像する。
【００８１】
蛍光画像取得ステップにおいては、光源１１は干渉観察用の光を出力せず、励起光源３１は励起光を出力する。この期間の位相差は、安定してないフリー状態にある。蛍光画像取得部３は蛍光画像ＦＬを撮像器１８により撮像する。
【００８２】
干渉画像取得ステップと蛍光画像取得ステップとを交互に繰り返すことで、干渉画像Ｉ１〜Ｉ５および蛍光画像ＦＬを次々と取得することができる。また、必要に応じて、或る視野に対して干渉画像取得ステップおよび蛍光画像取得ステップを行って干渉画像および蛍光画像を取得した後、例えば電動ステージによりサンプルを移動させて、他の視野に対して干渉画像取得ステップおよび蛍光画像取得ステップを行って干渉画像および蛍光画像を取得してもよい。このようにすることで、複数の視野それぞれに対して干渉画像および蛍光画像を取得することができる。
【００８３】
演算ステップにおいて、演算部４は、干渉画像取得部２により取得された干渉画像Ｉ１〜Ｉ５に基づいて、前述した手法により光学的厚さ画像を求める。そして、演算部４は、蛍光画像および光学的厚さ画像の双方に共通に設定した関心領域において、蛍光画像の蛍光強度の積分値と光学的厚さ画像の光学的厚さの積分値とに基づいて細胞の蛍光発現率を求める。
【００８４】
演算ステップにおいて、演算部４は、干渉画像取得ステップおよびこれに続く蛍光画像取得ステップで取得された干渉画像および蛍光画像を用いて、または、蛍光画像取得ステップおよびこれに続く干渉画像取得ステップで取得された蛍光画像および干渉画像を用いて、光学的厚さ画像の算出、関心領域の設定および蛍光発現率の算出の各処理を行う。演算ステップは、干渉画像取得ステップおよび蛍光画像取得ステップの双方または何れか一方と並列的に行ってもよい。
【００８５】
以下では、具体的な実施例の構成および画像例を示しつつ、より詳細に実施形態について説明する。図３に示された蛍光測定装置１Ａの構成のものを用いた。光源１１として中心波長５２５ｎｍのＬＥＤを用いた。励起光源３１として、中心波長４７５ｎｍのＬＥＤと中心波長４７５ｎｍで半値全幅２５ｎｍの光学フィルタとを組み合わせた構成を用い、出力光に対して帯域制限した。ビームスプリッタ１２の反射率と透過率との比は５０：５０であった。ビームスプリッタ１７の反射率と透過率との比は２０：８０であった。ビームスプリッタ３２の反射率と透過率との比は２０：８０であった。励起光カットフィルタ３３として、カットオフ波長５００ｎｍの長波長透過フィルタを用いた。
【００８６】
対物レンズ１３および対物レンズ１４それぞれの焦点距離は９ｍｍであった。チューブレンズ１６の焦点距離は１２５ｍｍであった。撮像器１８の撮像素子サイズは４.８ｍｍ×３.６ｍｍであった。サンプル面での視野サイズは３４５.６μｍ×２５９.２μｍであった。サンプルの細胞７３として、緑色蛍光色素（green  fluorescent  protein、ＧＦＰ）によって蛍光染色した子宮頚部がん由来の培養細胞を播種して用いた。干渉画像Ｉ１〜Ｉ５を取得する際の時間間隔は６７ミリ秒であった。各干渉画像を取得する際の露光時間は０.５ミリ秒であった。蛍光画像ＦＬを取得する際の露光時間は１５００ミリ秒であった。
【００８７】
図１０は、干渉画像取得部２により取得された５つの干渉画像Ｉ１〜Ｉ５を示す図である。図１１は、図１０の干渉画像Ｉ１〜Ｉ５に基づいて演算部４により（２）式で求められた位相画像Φを示す図である。図１２は、図１１の位相画像Φに基づいて演算部４により（３）式で求められた光学的厚さ画像ＯＴを示す図である。図１３は、蛍光画像取得部３により取得された蛍光画像ＦＬを示す図である。図１４は、図１２の光学的厚さ画像ＯＴにおいて細胞領域についてセグメンテーション処理した後の光学的厚さ画像を示す図である。これらの画像は同一視野のものである。図１４のセグメンテーション処理後の光学的厚さ画像から、個々の細胞の領域を明確に識別することができ、この画像の視野内に２６個の細胞の存在が認められる。図１４では、個々の細胞に番号（＃１〜＃２６）を付している。
【００８８】
演算部４は、個々の対象物の領域を関心領域（Region  of  Interest、ＲＯＩ）とする。演算部４は、光学的厚さ画像および蛍光画像の双方に共通に設定した各ＲＯＩにおいて、蛍光画像の蛍光強度の積分値と光学的厚さ画像の光学的厚さの積分値とに基づいて対象物の蛍光発現率を求める。
【００８９】
ＲＯＩ内の平均光学的厚さは、ＲＯＩ内の光学的厚さ積分値をＲＯＩのピクセル数で除算した値であり、下記（５）式で表される。ＲＯＩ内の平均蛍光強度は、ＲＯＩ内の蛍光強度積分値をＲＯＩのピクセル数で除算した値であり、下記（６）式で表される。ＲＯＩ内の“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”は下記（７）式で表される。ＲＯＩ内の“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”は、ＲＯＩ内の蛍光強度積分値と光学的厚さ積分値との比として表される。演算部４は、この（７）式で表されるＲＯＩ内の蛍光強度積分値を光学的厚さ積分値で除算した値を、ＲＯＩ内の対象物の蛍光発現率の指標として求める。
【００９０】
【数５】
2019120570.tif 000007
【００９１】
【数６】
2019120570.tif 000008
【００９２】
【数７】
2019120570.tif 000009
【００９３】
図１５は、各細胞（各ＲＯＩ）について、面積、平均光学的厚さ、平均蛍光強度および“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”を纏めた表である。図１６は、各ＲＯＩの平均蛍光強度を示すグラフである。図１７は、各ＲＯＩの“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”を示すグラフである。図１６および図１７において、横軸は細胞の番号である。
【００９４】
ここで、例えば、＃１７の細胞は、単なる平均蛍光強度による評価では、２６個の細胞の中で２番目に蛍光が強く、ＧＦＰの発現が大きいと判定される。しかし、＃１７の細胞は、“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”の評価では、２６個の細胞の中で１２番目の大きさでしかない。
【００９５】
細胞の光学的厚さは細胞の厚さに概ね比例するので、光学的厚さが大きい細胞は物理的にも厚いことが示唆される。厚い細胞では、その厚みの分だけ蛍光フォトンの量が積算されるため、単なる平均蛍光強度による評価では、実際の蛍光色素の発現率よりも相対的に高い発現率が見積もられてしまうおそれがある。これに対して、“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”による評価を行えば、光学的厚さによって蛍光強度を規格化することで、より正確に蛍光色素の発現率を見積もることが可能となる。
【００９６】
図１８は、セグメンテーション後の画像において、１０００×“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”が８０以上であるＲＯＩを灰色で示し、１０００×“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”が８０以下であるＲＯＩを白色で示した図である。このように、適切な閾値を設定して、各ＲＯＩの“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”と閾値との大小比較をすることで、そのＲＯＩがポジティブ細胞およびネガティブ細胞の何れであるかを高精度に判定することができる。
【００９７】
本実施形態の蛍光測定装置および蛍光測定方法は、個々に分離している細胞だけでなく、複数の細胞の集合体である細胞集団をＲＯＩとすれば、そのＲＯＩの“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”に基づいて細胞集団の蛍光発現率を正確に求めることができる。細胞集団は、コロニー様またはスフェロイド様に複数の細胞の集合したものである。コロニーとは、典型的には複数個の細胞が空間的にひとまとまりの集団を形成したものである。スフェロイドとは、典型的には厚さ１００μm以上に細胞が積み重なり、球体状になった細胞集団である。１個のスフェロイドには典型的には１０００個〜数万個の細胞が含まれる。
【００９８】
細胞集団において細胞が積み重なっていても、同一視野について光学的厚さ画像（図１９（ａ））および蛍光画像（図１９（ｂ））を取得し、これらの画像において細胞集団の領域にＲＯＩ１〜ＲＯＩ３を設定する。そして、各ＲＯＩの“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”に基づいて蛍光発現率を求めることで、各ＲＯＩの細胞集団に含まれる各細胞がポジティブ細胞７３ｐおよびネガティブ細胞７３ｎの何れであるかを判定することができ（図２０）、また、各ＲＯＩの細胞集団におけるポジティブ細胞およびネガティブ細胞の混合割合を評価することができる。
【００９９】
なお、スフェロイド様の細胞集団のように厚みのある対象物では、その対象物内において励起光または蛍光が減衰することにより、蛍光強度が厚さに比例しない場合がある。そのような場合には、厚さによって蛍光強度を補正するのが好適である。
【０１００】
また、本実施形態の蛍光測定装置および蛍光測定方法は、容器内の細胞の全体を含むようにＲＯＩを設定すれば、そのＲＯＩの“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”に基づいて該容器内の細胞の全体の蛍光発現率を正確に求めることができる。例えば、マルチウェルプレートの個々のウェルをＲＯＩとすれば、各ウェルに存在する細胞の個数に拘わらず、各ＲＯＩの“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”に基づいて蛍光発現率を求めることで、各ＲＯＩの細胞がポジティブ細胞およびネガティブ細胞の何れであるかを判定することができ、また、各ＲＯＩにおけるポジティブ細胞およびネガティブ細胞の混合割合を評価することができる。なお、マルチウェルプレートの複数のウェルについて光学的厚さ画像および蛍光画像を取得するには、タイリング撮影するのが好適である。
【０１０１】
次に、ＲＯＩにおけるポジティブ細胞およびネガティブ細胞の混合割合を評価する手法について説明する。本実施形態では、例えば抗原抗体反応などの所望の反応について陽性（ポジティブ）の細胞および陰性（ネガティブ）の細胞が混在していても、細胞を個々にセグメンテーションすることなく、ポジティブ細胞およびネガティブ細胞の混合割合を評価することができる。
【０１０２】
所望の反応を呈示していないネガティブ細胞であっても、自家蛍光やまたは特異的な蛍光色素の局在の影響により、ある程度の蛍光が観察されることがある。この自家蛍光または非特異的な蛍光色素の局在の影響により、たとえ視野内の細胞が全てネガティブ細胞であっても、蛍光によるフォトンが観測されてしまう。したがって、ポジティブ細胞およびネガティブ細胞の混合割合は蛍光強度に必ずしも比例しない。しかし、本実施形態では、次のようにして、ポジティブ細胞およびネガティブ細胞の混合割合を求めることができる。
【０１０３】
図２１は、ポジティブ細胞およびネガティブ細胞が混在する視野の像を模式的に示す図である。この図では、ポジティブ細胞は灰色領域で示され、ネガティブ細胞が白色領域で示されている。ポジティブ細胞およびネガティブ細胞それぞれは、個々に分離されていてもよいし、積み重ねられていてもよい。この図に示される例では、ＲＯＩ１にはポジティブ細胞のみが存在する。ＲＯＩ２にはネガティブ細胞のみが存在する。ＲＯＩ３には、ポジティブ細胞およびネガティブ細胞が混在しており、また、細胞が積み重ねられている。ＲＯＩ１〜ＲＯＩ３の全てを含むＲＯＩ０には、ポジティブ細胞およびネガティブ細胞が混在している。このような視野について光学的厚さ画像および蛍光画像を取得する。なお、この視野は、複数の撮像領域の視野をタイリングしてつなぎ合わせた複合視野であっても構わない。
【０１０４】
第１閾値以下である蛍光発現率を有する第１対象物（ポジティブ細胞）のみを含む第１関心領域（ＲＯＩ１）を設定し、このＲＯＩ１内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値Ｒｐを求める（下記（８）式）。ＲＯＩ１内に複数のポジティブ細胞が含まれているのが好ましい。また、第２閾値以上である蛍光発現率を有する第２対象物（ネガティブ細胞）のみを含む第２関心領域（ＲＯＩ２）を設定し、このＲＯＩ２内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値Ｒｎを求める（下記（９）式）。ＲＯＩ２内に複数のネガティブ細胞が含まれているのが好ましい。なお、明確にネガティブ細胞群であっても、自家蛍光等の影響により、Ｒｎがゼロでない何らかの値を持つ可能性があるが、以下に示す方法によりこの自家蛍光等の影響を補正することができるので、問題にはならない。
【０１０５】
【数８】
2019120570.tif 000010
【０１０６】
【数９】
2019120570.tif 000011
【０１０７】
測定対象の関心領域（ＲＯＩ０）を設定し、このＲＯＩ０内の蛍光強度の積分値ＦＬtotalを光学的厚さの積分値ＯＴtotalで除算した値Ｒmixを求める（下記（１０）式）。ＲＯＩ０内におけるポジティブ細胞およびネガティブ細胞の混合割合をｘ：(１−ｘ) とすると、ＲＯＩ０内の蛍光強度の積分値ＦＬtotalは下記（１１）式で表される。これらの式から、ｘは下記（１２）式で表される。この（１２）式から分かるように、ｘはＲmixに対して線形の関係を有する。ＲＯＩ０内の全ての細胞がポジティブ細胞であれば、Ｒmix＝Ｒｐであり、ｘ＝１である。ＲＯＩ０内の全ての細胞がネガティブ細胞であれば、Ｒmix＝Ｒｎであり、ｘ＝０である。
【０１０８】
【数１０】
2019120570.tif 000012
【０１０９】
【数１１】
2019120570.tif 000013
【０１１０】
【数１２】
2019120570.tif 000014
【０１１１】
このように、測定対象の関心領域（ＲＯＩ０）におけるポジティブ細胞およびネガティブ細胞の混合割合は、ポジティブ細胞のみを含むＲＯＩ１の“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”を表すＲｐ、ネガティブ細胞のみを含むＲＯＩ２の“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”を表すＲｎ、および、ＲＯＩ０の“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”を表すＲmixから求められる。
【０１１２】
従来、ポジティブ細胞およびネガティブが混合されているサンプルにおいて混合割合を求めるには、細胞を個々にセグメンテーションすることが必要であり、そのセグメンテーション処理における誤差が計数結果における大きな不確定要因となっていた。これに対して、本実施形態では、細胞を個々にセグメンテーションしなくとも、混合割合を見積もることが可能となる。このような利点は、特に、ＲＯＩ０（またはＲＯＩ３）のようにポジティブ細胞およびネガティブ細胞が混合して集合した細胞集団における混合割合を見積もる際に有用である。なぜなら、このように細胞が集合化した細胞集団においては、細胞同士が上下に重なり合っていることが多いので、細胞を個々にセグメンテーションすることが困難であるからである。
【０１１３】
本実施形態では、このような細胞集団について関心領域を設定するに際して、細胞集団を過不足なく囲むように設定する必要は無い。なぜなら、本実施形態では、必要なＲmixの値は（１０）式で表され、ＲＯＩを厳密に取ろうとも、また、ＲＯＩが実際の細胞集団からはみ出ていようとも、（１０）式の分母および分子ともにゼロが加算されるか否かの違いしかないからである。
【０１１４】
本実施形態において、混合割合の算出に際しては、細胞１個当たりの“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”が、ポジティブ細胞とネガティブ細胞との間で明確に異なっていることが好ましい。したがって、反応途中で蛍光強度が時間的に変化しているような実験系への適用は望ましくない。逆に、本実施形態は、蛍光色素を発現していないにも拘わらず自家蛍光を発している細胞群と、蛍光色素が発現している細胞群とが混合しているサンプルに対しては、有用に適用できる。
【０１１５】
また、本実施形態では、ポジティブ細胞とネガティブ細胞との間で光学的体積の差異が無視できない場合には、ポジティブ細胞およびネガティブ細胞それぞれについて、１個当たりの光学的厚さの積分値である光学的体積を予め見積もっておいて、次のような演算をするのが好ましい。ポジティブ細胞の光学的体積平均値ＯＶｐは下記（１３）式で表される。ネガティブ細胞の光学的体積平均値ＯＶｎは下記（１４）式で表される。
【０１１６】
【数１３】
2019120570.tif 000015
【０１１７】
【数１４】
2019120570.tif 000016
【０１１８】
ＲＯＩ０に含まれる細胞の個数をｎとすると、ＲＯＩ０内の蛍光強度の積分値ＦＬtotalは、ポジティブ細胞による蛍光強度積分値とネガティブ細胞による蛍光強度積分値との和として、下記（１５）式で表される。また、ＲＯＩ０内の光学的厚さの積分値ＯＴtotalは、ポジティブ細胞による光学的体積とネガティブ細胞による光学的体積との和として、下記（１６）式で表される。
【０１１９】
【数１５】
2019120570.tif 000017
【０１２０】
【数１６】
2019120570.tif 000018
【０１２１】
ポジティブ細胞の光学的体積平均値ＯＶｐとネガティブ細胞の光学的体積平均値ＯＶｎとの比をαとする（下記（１７）式）。このとき、Ｒmixは下記（１８）式で表される。この式から、ｘは下記（１９）式で表される。ここで、α＝１とすると、この（１９）式は（１２）式と一致する。
【０１２２】
【数１７】
2019120570.tif 000019
【０１２３】
【数１８】
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【０１２４】
【数１９】
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【０１２５】
次に、図２２および図２３のフローチャートを用いて、本実施形態の蛍光測定装置の動作および蛍光測定方法の手順について説明する。図２２は、ポジティブ細胞およびネガティブ細胞の何れであるかを判定する手順を説明するフローチャートである。ステップＳ１１では、干渉画像取得部により取得された干渉画像に基づいて光学的厚さ画像を取得する。ステップＳ１２では、蛍光画像取得部により蛍光画像を取得する。必要に応じて、ステップＳ１３では、光学的厚さ画像および蛍光画像それぞれについて、複数の視野をタイリングしてもよい。ステップＳ１４では、ＲＯＩを設定する。ＲＯＩの設定は、手動で行われてもよく、演算部４に自動的に行われてもよい。ＲＯＩの形状は任意でよい、ＲＯＩの設定は、視野全体、マルチウェルプレートの各ウェル、個々の細胞、および、細胞集団の何れであってもよい。ステップＳ１５では各ＲＯＩの光学的厚さ積分値を求め、ステップＳ１６では各ＲＯＩの蛍光強度積分値を求める。ステップＳ１６では、各ＲＯＩについて、“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”を求め、これを蛍光発現率の指標として、ポジティブ細胞およびネガティブ細胞の何れであるかを判定する。そして、ステップＳ１７では、各ＲＯＩについて、“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”を数値として表示してもよいし、“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”によって色分けされた画像を表示してもよい。
【０１２６】
図２３は、ポジティブ細胞およびネガティブ細胞の混合割合を評価する手順を説明するフローチャートである。ステップＳ２１では、干渉画像取得部により取得された干渉画像に基づいて光学的厚さ画像を取得する。ステップＳ２２では、蛍光画像取得部により蛍光画像を取得する。必要に応じて、ステップＳ２３では、光学的厚さ画像および蛍光画像それぞれについて、複数の視野をタイリングしてもよい。ステップＳ２４では、ポジティブ細胞のみを含むＲＯＩ１を設定し、ネガティブ細胞のみを含むＲＯＩ２を設定し、また、測定対象の関心領域（ＲＯＩ０）を設定する。ステップＳ２５では、ＲＯＩ１についてＲｐ（（８）式）を計算する。ステップＳ２６では、ＲＯＩ２についてＲｎ（（９）式）を計算する。ステップＳ２７では、ＲＯＩ０についてＲmix（（１０）式）を計算する。そいて、ステップＳ２８では、混合割合ｘ（（１２）式）を計算する。この混合割合を数値として表示してもよいし、混合割合に応じた擬似カラーで画像を表示してもよい。
【０１２７】
次に様々な変形例について説明する。本発明は、上記実施形態に限定されるものではなく、種々の変形が可能である。
【０１２８】
図２４は、第１変形例のＲＯＩ設定方法について説明する図である。この例では、マルチウェルプレートの６個のウェルそれぞれに細胞が入れられており、各ウェルにＲＯＩが設定される。ＲＯＩ１のウェルには、ネガティブ細胞７３ｎのみが入れられている。ＲＯＩ２のウェルには、ポジティブ細胞７３ｐのみが入れられている。測定対象のＲＯＩ３-１〜４それぞれのウェルには、ネガティブ細胞およびポジティブ細胞の双方が入れられている。ネガティブ細胞およびポジティブ細胞の混合割合は、４個のＲＯＩ３-１〜４それぞれについて個別に求められてもよいし、４個のＲＯＩ３-１〜４を統合した１つのＲＯＩについて求められてもよい。
【０１２９】
図２５は、第２変形例のＲＯＩ設定方法について説明する図である。この例では、互いに独立した６個の容器（Dish１〜２）それぞれに細胞が入れられており、各容器にＲＯＩが設定される。ＲＯＩ１の容器（Dish１）には、ネガティブ細胞７３ｎのみが入れられている。ＲＯＩ２の容器（Dish２）には、ポジティブ細胞７３ｐのみが入れられている。測定対象のＲＯＩ３-１〜４それぞれの容器（Disｈ３〜６）には、ネガティブ細胞およびポジティブ細胞の双方が入れられている。この例でも、ネガティブ細胞およびポジティブ細胞の混合割合は、４個のＲＯＩ３-１〜４それぞれについて個別に求められてもよいし、４個のＲＯＩ３-１〜４を統合した１つのＲＯＩについて求められてもよい。
【０１３０】
図２６は、第３変形例のＲＯＩ設定方法について説明する図である。この例では、マルチウェルプレートの１２個のウェルそれぞれに細胞が入れられており、各ウェルにＲＯＩが設定される。３個のＲＯＩ１-１〜３のウェルにはネガティブ細胞７３ｎのみが入れられており、これらのＲＯＩ１-１〜３を統合した１つのＲＯＩについてＲｎが求められてもよい。３個のＲＯＩ２-１〜３のウェルにはポジティブ細胞７３ｐのみが入れられており、これらのＲＯＩ２-１〜３を統合した１つのＲＯＩについてＲｐが求められてもよい。その他の６個の測定対象のＲＯＩそれぞれのウェルには、ネガティブ細胞およびポジティブ細胞の双方が入れられている。ネガティブ細胞およびポジティブ細胞の混合割合は、これら６個のＲＯＩそれぞれについて個別に求められてもよいし、これら６個のＲＯＩを統合した１つのＲＯＩについて求められてもよい。
【０１３１】
干渉画像取得部において干渉画像を取得するために用いられる光源１１は、レーザ光源であってもよいが、インコヒーレント光源であることが望ましい。光源１１としてレーザ光源を用いた場合、レーザ光の高い干渉性によって、取得される光学的厚さ画像のバックグラウンドに不規則なスペックルノイズが発生する場合があり、ＲＯＩ内の光学的厚さ積分値の誤差の要因となる可能性がある。これに対して、光源１１としてインコヒーレント光源を用いた場合には、スペックルノイズの発生が抑制され、ＲＯＩ内の光学的厚さ積分値の誤差が小さいので、好ましい。
【０１３２】
また、そもそも細胞が存在しない領域で観察されるようなバックグラウンド蛍光については、できる限りゼロであることが望ましい。そのような条件を実現するために、光学的厚さ画像の情報を用いて、光学的厚さ画像において光学的厚さがほぼゼロである領域を、蛍光画像において蛍光のバックグラウンドの領域であるとみなして、背景補正やシェーディング補正を行うことが望ましい。
【０１３３】
バックグラウンド蛍光分の補正に関しては、画像に対するシェーディング補正に代えて、蛍光強度の積分値を用いた補正を行ってもよい。蛍光強度の積分値を用いる場合には、細胞が存在しない関心領域ＲＯＩ０を設け、ＲＯＩ０の形状、面積および撮像時の条件を計測対象のＲＯＩ１〜ＲＯＩｎ（このＲＯＩには、ポジティブ細胞７３ｐおよびネガティブ細胞７３ｎの何れか一方のみが入っていてもよいし、双方が混在していてもよい）と同一にしたうえで、ＲＯＩ０における蛍光強度の積分値を予め求めておく。ＲＯＩ０には細胞を含まないが、培養液および試薬に関しては計測対象のＲＯＩと同様に添加することが望ましい。この条件において、計測対象のＲＯＩ１〜ＲＯＩｎにおいて計算された蛍光強度のＲＯＩ内積分値に関しては、ＲＯＩ０において計算された蛍光強度のＲＯＩ内積分値をバックグラウンド蛍光として減算してから、後段の処理に用いるようにすれば、バックグラウンド蛍光の補正が可能となる。
【０１３４】
また、蛍光強度のＲＯＩ内積分値を求めるにあたって、ＲＯＩの大きさが干渉撮像と蛍光撮像とで共用する撮像器１８または蛍光撮像専用の撮像器３６の受光エリア全体に略対応している場合は、蛍光撮像時に撮像器１８または撮像器３６の画素全体をアナログ的またはデジタル的に予めビニングして、実質的に受光エリア全体を受光面とする単一素子の受光器と同様に用い、得られた値を蛍光強度のＲＯＩ内積分値としてもよい。この場合、画像を基にした背景補正やシェーディング補正ができないので、細胞が存在しないＲＯＩとしての前記ＲＯＩ０を用いたバックグラウンド蛍光補正を行うことが望ましい。
【０１３５】
また、蛍光強度のＲＯＩ内積分値を求めるにあたって、図６に示した第２変形例の蛍光測定装置１Ｃのように、干渉画像取得用の撮像器１８とは別に蛍光撮像面に設置された蛍光画像取得用の撮像器３６を更に備える場合は、蛍光画像取得用の撮像器３６を単一素子の受光器に置き換えてもよい。この単一素子の受光器における受光面の位置及び大きさは、蛍光撮像面に投影されたＲＯＩの位置及び大きさに略一致するようにすることが望ましい。この単一素子の受光器とは、例えばフォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、あるいは光電子増倍管等である。
【０１３６】
当該単一素子における受光器の受光面の位置及び大きさを、蛍光撮像面に投影されたＲＯＩの位置及び大きさに略一致させるにあたっては、サンプル面と蛍光撮像面との間に縮小光学系または拡大光学系を設けて、サンプル面と蛍光撮像面との間の拡大倍率または縮小倍率を適切に調整してもよい。また、ＲＯＩの形状と前記単一素子の受光器における受光面の形状が互いに異なる場合（例えばＲＯＩが円形であり、当該受光器の受光面が矩形であるような場合）は、物理的な遮光部を持つマスクを前記単一素子の受光器における受光面の前に設けることで、実質的に当該単一素子の受光器における受光面の位置及び大きさを、蛍光撮像面に投影されたＲＯＩの位置及び大きさに略一致させてもよい。
【符号の説明】
【０１３７】
１Ａ〜１Ｄ…蛍光測定装置、２…干渉画像取得部、３…蛍光画像取得部、４…演算部、５…タイミング制御回路、１１…光源、１２…ビームスプリッタ、１３，１４…対物レンズ、１５…参照ミラー、１６…チューブレンズ、１７…ビームスプリッタ、１８…撮像器、２１…ピエゾ素子、２２…光検出器、２３…位相制御回路、３１…励起光源、３２…ビームスプリッタ、３３…励起光カットフィルタ、３４…ダイクロイックミラー、３５…蛍光透過フィルタ、３６…撮像器、４１…ミラー、４２…ビームスプリッタ、７０…容器、７１…反射増強コーティング、７２…培養液、７３…細胞。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2019120570.tif 000031
【図１１】
2019120570.tif 000032
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2019120570.tif 000035
【図１５】
2019120570.tif 000036
【図１６】
2019120570.tif 000037
【図１７】
2019120570.tif 000038
【図１８】
2019120570.tif 000039
【図１９】
2019120570.tif 000040
【図２０】
2019120570.tif 000041
【図２１】
2019120570.tif 000042
【図２２】
2019120570.tif 000043
【図２３】
2019120570.tif 000044
【図２４】
2019120570.tif 000045
【図２５】
2019120570.tif 000046
【図２６】
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