(57)【要約】本発明はヒドロキシアルキルデンプン（ヒドロキシエチルデンプンが好ましい）とタンパク質とのコンジュゲートに関し、ここで、これらのコンジュゲートはヒドロキシアルキルデンプンまたはヒドロキシアルキルデンプンの誘導体の少なくとも１個のアルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基と、該タンパク質の少なくとも１個のアミノ基との間の還元的アミノ化反応によって形成され、その結果、該ヒドロキシアルキルデンプンまたはその誘導体は、アゾメチン結合またはアミノ結合を介して該タンパク質と共有結合する。本発明はまた、これらのコンジュゲートを製造する方法、および該コンジュゲートの具体的な使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質およびポリマーを含有するコンジュゲートの製造方法であって、ここで、ポリマーはヒドロキシアルキルデンプンであり、
該方法は、
（ａ）（１）該ポリマー中に、開環酸化反応によって少なくとも１つのアルデヒド基を導入し、または、
（ａ）（２）該ポリマーを少なくとも二官能性である化合物と反応させ、ここで、該化合物は２個の官能基ＭおよびＱを含有し、１つの官能基Ｍは該ポリマーと反応し、１つの官能基Ｑは、
（ｉ）アルデヒド基、ケト基、もしくはヘミアセタール基であるか；または、
（ｉｉ）化学的に修飾されて、アルデヒド基、ケト基、もしくはヘミアセタール基で官能化されたポリマー誘導体を与える官能基であり；そして、
（ｂ）還元的アミノ化によって、該ポリマーもしくはその誘導体の少なくとも１つのアルデヒド基、ケト基、もしくはヘミアセタール基で、該タンパク質の少なくとも１個のアミノ基と共有結合する、
ことを含む、該方法。
【請求項２】
ヒドロキシアルキルデンプンはヒドロキシエチルデンプンである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該ヒドロキシエチルデンプンは分子量が２〜２００ＫＤを有し、４〜１３０ＫＤが好ましく、４〜７０ＫＤがより好ましい、請求項２記載の方法。
【請求項４】
該還元的アミノ化は水性媒質中で行なう、請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
該還元的アミノ化はＮａＣＮＢＨ３の存在下で行なう、請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
該還元的アミノ化はｐＨが７．５で、好ましくは７以下で行なう、請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
ｐＨは６以下である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
該還元的アミノ化は温度が０〜２５℃で行なう、請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
（ａ）（１）において、該ポリマーは過ヨウ素酸を用いる開環酸化反応を行なって、少なくとも１個のアルデヒド基を有するポリマー誘導体を与える、請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
該開環酸化反応は水性媒質中で行なう、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
該開環酸化反応は温度が０〜５℃で行なう、請求項９または１０のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
該ポリマーは非酸化型形態の還元末端について使用する、請求項９〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）（２）（ｉ）において、官能基Ｍは、カルボキシ基または反応性カルボキシ基であり、そして官能基Ｑはアルデヒド基、ケト基、またはヘミアセタール基である、請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
ＭおよびＱを含有する該二官能性化合物は、ホルミル安息香酸、４−ホルミル安息香酸ペンタフルオロフェニルエステル、４−ホルミル安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、および４−(４−ホルミル−３,５−ジメトキシフェノキシ)酪酸からなる群から選ばれる、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
(ａ)(２)(ｉｉ)において、該官能基Ｍはアミノ基であり、そして該官能基Ｑはアミノ基である、請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
２個のアミノ基ＭおよびＱを含有する該化合物は、炭素数が２〜２０個の場合により置換されたジアミノアルカンである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
該ジアミノアルカンは、１,２−ジアミノエタン、１,３−ジアミノプロパン、および１,４−ジアミノブタンからなる群から選ばれる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
更に、該ポリマー誘導体（該ポリマーと、２個のアミノ基ＭおよびＱを含有する少なくとも二官能性である化合物とを、アミノ基Ｑにおいて、反応させることから得られる）と、カルボキシ基または反応性カルボキシ基、およびアルデヒド基、ケト基、またはヘミアセタール基を含有する更なる二官能性化合物とを反応させて、アルデヒド基、ケト基、またはヘミアセタール基を有するポリマー誘導体を得ることを含む、請求項１５〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
更なる二官能性化合物は、ホルミル安息香酸、４−ホルミル安息香酸ペンタフルオロフェニルエステル、４−ホルミル安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、および４−(４−ホルミル−３,５−ジメトキシフェノキシ)酪酸からなる群から選ばれる、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
２個のアミノ基ＭおよびＱを含有する該化合物のアミノ基Ｑはベータヒドロキシアミノ基である、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
該ベータヒドロキシアミノ基は酸化されてアルデヒド基を与える、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
Ｑはベータヒドロキシアミノ基である、２個のアミノ基ＭおよびＱを含有する該化合物は、１,３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンである、請求項２０または２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
酸化反応は過ヨウ素酸を用いて行なう、請求項２１または２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
該タンパク質は、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＡＴ ＩＩＩ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ミオグロビン、ＳＯＤ、およびＢＳＡからなる群から選ばれ、好ましくはｒｈＥＰＯ、ｒｈＧ−ＣＳＦ、ｒｈＩＦＮアルファ、ｒｈＩＦＮベータ、ｒｈＡＴ ＩＩＩ、ｒｈＩＬ−２、ｒｈＩＬ−３、ミオグロビン、ＳＯＤ、およびＢＳＡからなる群から選ばれるか、またはＡ１ＡＴ、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、ｔＰＡ、およびＡＰＣからなる群から選ばれる、請求項１〜２３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか１つに記載の方法によって得ることができるものである、タンパク質およびポリマーを含有するコンジュゲート。
【請求項２６】
該ポリマーまたはその誘導体は、アゾメチンおよび／またはアミノ結合によって該タンパク質のＮ−末端アミノ基と優先的にカップリングして、該反応に使用するタンパク質はＮ−末端アミノ基、および少なくとも１つの更なるアミノ基、好ましくは更なるリシン基を含有する、請求項２５記載のコンジュゲート。
【請求項２７】
開環酸化反応によって、該ポリマー中に導入される少なくとも１個のアルデヒド基を含有する使用ポリマーは、式：
【化１】
2007527892.tif 000049
［式中、
Ｒ１は、水素、または炭素数が２〜１０個であるヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基、またはヒドロキシアルカリール基である］
で記載する少なくとも１個の構造式を含む、請求項２５または２６のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項２８】
該タンパク質は、アゾメチンおよび／またはアミノ結合によって該ポリマー誘導体と共有結合し、ここで、該誘導体は、該ポリマーと、２個のアミノ基ＭおよびＱを含有する化合物との官能基Ｍを介する反応から得られ、
該得られる化合物は更に、カルボキシ基または反応性カルボキシ基、およびアルデヒド基、ケト基、またはヘミアセタール基を含有する更なる二官能性化合物とＱを介して更に反応し、
該カルボキシ基または反応性カルボキシ基は、アミノ基Ｑとアミド結合を形成し、
該アルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基は還元的アミノ化によって、該タンパク質のアミノ基と反応する、
請求項２５または２６のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項２９】
カルボキシ基もしくは反応性カルボキシ基、およびアルデヒド基、ケト基、またはヘミアセタール基を含有する更なる二官能性化合物は、ホルミル安息香酸、４−ホルミル安息香酸ペンタフルオロフェニルエステル、４−ホルミル安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、および４−(４−ホルミル−３,５−ジメトキシフェノキシ)酪酸からなる群から選ばれる、請求項２８記載のコンジュゲート。
【請求項３０】
構造式：
【化２】
2007527892.tif 000050
［式中、
該ポリマーはその酸化型還元末端を介して反応し、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立して水素またはヒドロキシアルキル基であり、ｎは２、３または４であり、Ｒ４は独立して水素またはメトキシ基であり、そしてＲ４が水素である場合にはｍは０であり、そしてＲ４がメトキシである場合にはｍは１である］
を有する、請求項２９記載のコンジュゲート。
【請求項３１】
該タンパク質は、該ポリマー誘導体とアゾメチンおよび／またはアミノ結合を介して共有結合し、
該誘導体は、該ポリマーと、Ｑがベータヒドロキシアミノ基である２個のアミノ基ＭおよびＱを含有する化合物との反応、並びにアルデヒド基を与える該ベータヒドロキシアミノ基Ｑの酸化、から得られる、請求項２５または２６のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項３２】
Ｑはベータヒドロキシアミノ基である２個のアミノ基ＭおよびＱを含有する化合物は、１,３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンである、請求項３１記載のコンジュゲート。
【請求項３３】
構造式：
【化３】
2007527892.tif 000051
［式中、
該ポリマーはその酸化型還元末端で反応し、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立して水素またはヒドロキシアルキル基である］
を有する、請求項３２記載のコンジュゲート。
【請求項３４】
該タンパク質は、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＡＴ ＩＩＩ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ミオグロビン、ＳＯＤ、およびＢＳＡからなる群から選ばれる、請求項２５〜３３のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
【請求項３５】
該タンパク質は、ｒｈＥＰＯ、ｒｈＧ−ＣＳＦ、ｒｈＩＦＮアルファ、ｒｈＩＦＮベータ、ｒｈＡＴ ＩＩＩ、ｒｈＩＬ−２、ｒｈＩＬ−３、ミオグロビン、ＳＯＤ、およびＢＳＡからなる群から選ばれる、請求項２５〜３３のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
【請求項３６】
該タンパク質は、Ａ１ＡＴ、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、ｔＰＡ、およびＡＰＣからなる群から選ばれる、請求項２５〜３３のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
【請求項３７】
ヒトもしくは動物の身体の処置方法に使用するための、請求項２５〜３６もしくは４９〜５８のいずれか１つに記載のコンジュゲート、または請求項１〜２４のいずれか１つに記載の方法によって得ることができるものであるコンジュゲート。
【請求項３８】
請求項２５〜３６もしくは４９〜５８のいずれか１つに記載のコンジュゲート、または請求項１〜２４のいずれか１つに記載の方法によって得ることができるものであるコンジュゲート、の治療学的に有効な量を含有する、医薬組成物。
【請求項３９】
更に、少なくとも１つの医薬的に許容し得る希釈剤、アジュバント、または担体を含有する、請求項３８記載の医薬組成物。
【請求項４０】
貧血性障害もしくは造血性機能不全障害、またはそれらの関連疾患の処置のための医薬の製造における、請求項２５〜３６もしくは４９〜５８のいずれか１つに記載のコンジュゲート、または請求項１〜２４のいずれか１つに記載の方法によって得ることができるものであるコンジュゲートの使用であって、
該タンパク質はＥＰＯであり、そして該ポリマーはＨＡＳ、好ましくはＨＥＳである、該使用。
【請求項４１】
造血性機能または免疫機能の低下を特徴とする障害（該障害は、化学療法もしくは放射線療法の結果、感染性疾患、重度の慢性好中球減少症、または白血病であることが好ましい）の処置のための医薬の製造における、請求項２５〜３６もしくは４９〜５８のいずれか１つに記載のコンジュゲート、または請求項１〜２４のいずれか１つに記載の方法によって得ることができるものであるコンジュゲートの使用であって、
該タンパク質はＧ−ＣＳＦであり、そして該ポリマーはＨＡＳ、好ましくはＨＥＳである、該使用。
【請求項４２】
遺伝性欠損症、静脈閉塞症、冠動脈バイパス手術（ＣＡＢＧ）における火傷およびヘパリン耐性、呼吸療法に関連するマイクロクロット形成の予防、外傷もしくは消化器系手術が原因の腸穿孔の処置；汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）および／または敗血症の処置のための医薬の製造における、請求項２５〜３６もしくは４９〜５８のいずれか１つに記載のコンジュゲート、または請求項１〜２４のいずれか１つに記載の方法によって得ることができるものであるコンジュゲートの使用であって、
該タンパク質はＡＴ ＩＩＩであり、そして該ポリマーはＨＡＳ、好ましくはＨＥＳである、該使用。
【請求項４３】
血友病Ａの処置のための医薬の製造における、請求項２５〜３６もしくは４９〜５８のいずれか１つに記載のコンジュゲート、または請求項１〜２４のいずれか１つに記載の方法によって得ることができるものであるコンジュゲートの使用であって、
該タンパク質はＶＩＩＩ因子であり、そして該ポリマーはＨＡＳ、好ましくはＨＥＳである、該使用。
【請求項４４】
肺気腫、嚢胞性線維症、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および／または気管支炎の処置のための医薬の製造における、請求項２５〜３６もしくは４９〜５８のいずれか１つに記載のコンジュゲート、または請求項１〜２４のいずれか１つに記載の方法によって得ることができるものであるコンジュゲートの使用であって、
該タンパク質はＡＩＡＴであり、そして該ポリマーはＨＡＳ、好ましくはＨＥＳである、該使用。
【請求項４５】
心筋梗塞（心発作）、血栓症、血栓塞栓症、または閉塞性疾患（特に、閉塞性動脈性疾患）の処置のための医薬の製造における、請求項２５〜３６もしくは４９〜５８のいずれか１つに記載のコンジュゲート、または請求項１〜２４のいずれか１つに記載の方法によって得ることができるものであるコンジュゲートの使用であって、
該タンパク質はｔＰＡであり、そして該ポリマーはＨＡＳ、好ましくはＨＥＳである、該使用。
【請求項４６】
重度の敗血症、血栓症、血栓塞栓症、または閉塞性疾患（特に、閉塞性動脈性疾患）の処置のための医薬の製造における、請求項２５〜３６もしくは４９〜５８のいずれか１つに記載のコンジュゲート、または請求項１〜２４のいずれか１つに記載の方法によって得ることができるものであるコンジュゲートの使用であって、ここで、
該タンパク質はＡＰＣであり、そして該ポリマーはＨＡＳ、好ましくはＨＥＳである、該使用。
【請求項４７】
白血病（例えば、有毛細胞白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫）、癌（例えば、カルチノイド腫瘍、悪性黒色腫）、および肝炎（例えば、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎）の処置のための医薬の製造における、請求項２５〜３６もしくは４９〜５８のいずれか１つに記載のコンジュゲート、または請求項１〜２４のいずれか１つに記載の方法によって得ることができるものであるコンジュゲートの使用であって、ここで、
該タンパク質はＩＦＮアルファであり、そして該ポリマーはＨＡＳ、好ましくはＨＥＳである、該使用。
【請求項４８】
多発性硬化症、好ましくは多発性硬化症の再発性形態の処置のための医薬の製造における、請求項２５〜３６もしくは４９〜５４のいずれか１つに記載のコンジュゲート、または請求項１〜２４のいずれか１つに記載の方法によって得ることができるものであるコンジュゲートの使用であって、ここで、
該タンパク質はＩＦＮベータであり、そして該ポリマーはＨＡＳ、好ましくはＨＥＳである、該使用。
【請求項４９】
ヒドロキシアルキルデンプンおよびタンパク質を含有するコンジュゲートであって、ここで、該ヒドロキシアルキルデンプンは、第１の架橋化合物とアミド結合を介して、その酸化型還元末端とカップリングし、該架橋化合物は更に第２の架橋化合物とアミド結合を介して結合し、ここで、該第２架橋化合物はアゾメチンおよび／またはアミノ結合を介してタンパク質と結合し、ここで、該１架橋化合物はジアミノ官能化化合物として使用することが好ましく、そして該第２架橋化合物はカルボキシおよびアルデヒド、ケト、またはヘミアセタールとして使用することが好ましく、カルボキシおよびアルデヒド官能化化合物として使用することがより好ましい、該コンジュゲート。
【請求項５０】
タンパク質、およびポリマーまたはその誘導体を含有するコンジュゲートであって、ここで、
該ポリマーは、式：
【化４】
2007527892.tif 000052
［式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、水素、または炭素数が１（２〜１０が好ましい）であるヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基、またはヒドロキシアルカリール基であり、水素またはヒドロキシアルキル基が好ましく、水素またはヒドロキシエチル基がより好ましく、そして、
Ｌが、場合により少なくとも１個のヘテロ原子、１〜６０個の炭素原子（１〜４０個が好ましく、１〜２０個がより好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜６個がより好ましく、１〜２個がより好ましく、特に１個が好ましい（Ｌは、特にＣＨ２である））を有する、場合により置換された直鎖、分枝および／または環状の炭化水素残基である］
で記載する構造式を有するヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）である、該コンジュゲート。
【請求項５１】
タンパク質、およびポリマーまたはその誘導体を含有するコンジュゲートであって、ここで、
該ポリマーは、式：
【化５】
2007527892.tif 000053
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は独立して、水素、または炭素数が１（２〜１０個が好ましい）であるヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基、またはヒドロキシアルカリール基であり（水素またはヒドロキシアルキル基が好ましく、水素またはヒドロキシエチル基がより好ましい）、
Ｌ１およびＬ２は独立して、少なくとも１個のヘテロ原子、アルキル、アリール、アラルキルヘテロアルキル、および／またはヘテロアラルキル分子を含有する、場合により置換された直鎖、分枝および／または環状の炭化水素残基であり、該残基は炭素数が１〜６０個（１〜４０個が好ましく、１〜２０個がより好ましく、１〜１０個がより好ましい）を有し、そして、
Ｄは、結合（Ｌ１と結合した適当な官能基Ｆ２、およびＬ２と結合した適当な官能基Ｆ３によって形成する共有結合が好ましい）である］
で記載する構造式を有する、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）である、該コンジュゲート。
【請求項５２】
Ｌ１は−(ＣＨ２)ｎ−であり、ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０であり（２、３、４、５、６が好ましく、２、３、４がより好ましく、４が特に好ましい）である、請求項５１に記載のコンジュゲート。
【請求項５３】
Ｌ２は、場合により適当に置換されたアリール分子（炭素数が６であるアリール分子が好ましい）であり、Ｌ２はＣ６Ｈ４が特に好ましい、請求項５１または５２のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項５４】
Ｆ２は、
Ｃ−Ｃ二重結合、Ｃ−Ｃ三重結合、もしくは芳香族性Ｃ−Ｃ結合；
チオ基もしくはヒドロキシ基；
アルキルスルホン酸ヒドラジド、アリールスルホン酸ヒドラジド；
１,２−ジオール；
１,２−アミノ−チオアルコール；
アジド；
１,２−アミノアルコール；
アミノ基−ＮＨ２、もしくは構造単位−ＮＨ−を含有するアミノ基の誘導体（例えば、アミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリールアミノ基）；
ヒドロキシアミノ基−Ｏ−ＮＨ２、もしくは構造単位−Ｏ−ＮＨ−を含有するヒドロキシアミノ基の誘導体（例えば、ヒドロキシアルキルアミノ基、ヒドロキシアリールアミノ基、ヒドロキシアラルキルアミノ基、またはヒドロキシアルカリールアミノ基）；
各々構造単位−ＮＨ−Ｏ−を含有する、アルコキシアミノ基、アリールオキシアミノ基、アラルキルオキシアミノ基、もしくはアルカアリールオキシアミノ基）；
カルボニル基を有する残基、−Ｑ−Ｃ(＝Ｇ)−Ｍ
［ここで、
ＧはＯまたはＳであり、そしてＭは例えば、
−ＯＨもしくは−ＳＨ；
アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、もしくはアルカリールオキシ基；
アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルチオ基、もしくはアルカリールチオ基；
アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、アラルキルカルボニルオキシ基、アルカリールカルボニルオキシ基；
活性化エステル、例えばイミド構造を持つヒドロキシルアミン（例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド）のエステル、もしくは構造単位Ｏ−Ｎを持ち、Ｎがヘテロアリール化合物の一部であるヒドロキシルアミンのエステル、またはＧ＝ＯでありかつＱが存在しない場合に、例えばペンタフルオロフェニル、パラニトロフェニルもしくはトリクロロフェニルなどの置換アリール残基を持つアリールオキシ化合物；
であり、Ｑは存在しないか、ＮＨまたはＳもしくはＯなどのヘテロ原子である］；
−ＮＨ−ＮＨ２もしくは−ＮＨ−ＮＨ−；
−ＮＯ２；
ニトリル基；
カルボニル基（例えば、アルデヒド基またはケト基）；
カルボキシ基；
−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ基もしくは−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基；
ビニルハライド基（例えば、ヨウ化ビニル基または臭化ビニル基）もしくはトリフレート；
−Ｃ≡Ｃ−Ｈ；
−(Ｃ＝ＮＨ２Ｃｌ)−Ｏ−アルキル；
−(Ｃ＝Ｏ)−ＣＨ２−Ｈａｌ（ここで、ＨａｌはＣｌ、ＢｒまたはＩである）；
−ＣＨ＝ＣＨ−ＳＯ２−；
構造式−Ｓ−Ｓ−を含有するジスルフィド基；
【化６】
2007527892.tif 000054
［式中、
Ｆ３はＦ２との化学結合を形成することができる官能基であり、上記の群から選ばれることが好ましく、
Ｆ２は、分子−ＮＨ−を含有することが好ましく、アミノ基を含有することがより好ましく、
Ｆ３は、分子−(Ｃ＝Ｇ)−（−Ｃ(＝Ｏ)−がより好ましく、−(Ｃ＝Ｇ)−Ｇ−がより好ましく、−(Ｃ＝Ｏ)−Ｇ−がより好ましく、−(Ｃ＝Ｏ)−Ｏが特に好ましい）を含有することが好ましく、Ｄはアミド結合であることが特に好ましい］
からなる群から選ばれる、請求項５１〜５３のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
【請求項５５】
構造式：
【化７】
2007527892.tif 000055
（式中、
ｎは２、３または４であり、Ｒ４は独立して水素またはメトキシ基であり、そしてＲ４が水素である場合には、ｍは０であり、そしてＲ４がメトキシである場合には、ｍは１である）
を有する、請求項５４記載のコンジュゲート。
【請求項５６】
タンパク質、およびポリマーまたはその誘導体を含有するコンジュゲートであり、ここで、該ポリマーは式：
【化８】
2007527892.tif 000056
で記載する構造式を有するヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）であり、分子−ＣＨ２−ＮＨ−の炭素原子は、開環酸化反応によって該ポリマー中に導入されるアルデヒド基から誘導され、そして該窒素原子は該タンパク質のアミノ基から誘導される、該コンジュゲート。
【請求項５７】
ヒドロキシアルキルデンプンはヒドロキシエチルデンプンである、請求項５４〜７１のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
【請求項５８】
ヒドロキシエチルデンプンは、分子量が２〜２００ｋＤ、好ましくは４〜１３０ｋＤ、より好ましくは４〜７０ｋＤである、請求項５７記載のコンジュゲート。
【請求項５９】
該タンパク質は、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＡＴ ＩＩＩ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ミオグロビン、ＳＯＤ、およびＢＳＡからなる群（ｒｈＥＰＯ、ｒｈＧ−ＣＳＦ、ｒｈＩＦＮアルファ、ｒｈＩＦＮベータ、ｒｈＡＴ ＩＩＩ、ｒｈＩＬ−２、ｒｈＩＬ−３、ミオグロビン、ＳＯＤ、およびＢＳＡからなる群が好ましい）および／またはＡ１ＡＴ、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、ｔＰＡおよびＡＰＣからなる群、から選ばれる、請求項４９〜５８のいずれか１つに記載するコンジュゲート。
【請求項６０】
ＶＩＩＩ因子またはＩＸ因子についての阻害因子を有する血友病ＡまたはＢにおけるエピソードの処置のための医薬の製造における、請求項２５〜３６もしくは４９〜５８のいずれか１つに記載のコンジュゲート、または請求項１〜２４のいずれか１つに記載の方法によって得ることができるものであるコンジュゲートの使用であって、ここで、タンパク質はＶＩＩ因子であり、そしてポリマーはＨＡＳであり、ＨＥＳが好ましい、該使用。
【請求項６１】
血友病Ｂを有する患者における出血性エピソード（先天性ＩＸ因子欠損症またはクリスマス疾患が好ましい）の制御および予防（外科的な状況における出血の制御および予防を含む）のための医薬の製造のための、請求項２５〜３６もしくは４９〜５８のいずれか１つに記載のコンジュゲート、または請求項１〜２４のいずれか１つに記載する方法によって得ることができるものであるコンジュゲートの使用であって、ここで、タンパク質はＶＩＩ因子であり、そしてポリマーはＨＡＳであり、ＨＥＳが好ましい、該使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒドロキシアルキルデンプン（ヒドロキシエチルデンプンが好ましい）およびタンパク質のコンジュゲートに関する。ここで、これらのコンジュゲートは、該ヒドロキシアルキルデンプンまたは該ヒドロキシアルキルデンプンの誘導体の少なくとも１個のアルデヒド基と、該タンパク質の少なくとも１個のアミノ基との間の還元的アミノ化によって得られ、その結果、該ヒドロキシアルキルデンプンまたはその誘導体は、アゾメチン結合またはアミノメチレン結合を介してタンパク質と共有結合する。本発明はまた、これらのコンジュゲートを製造する方法およびこれらのコンジュゲートの具体的な使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質をポリマー分子に結合させると、そのタンパク質の安定性を改善することができ、そのタンパク質に対する免疫応答が減少することは、広く一般に受け入れられている。WO 94/28024は、ポリエチレングリコール（PEG）で修飾された生理活性タンパク質が、低下した免疫原性および抗原性を示し、非コンジュゲート化タンパク質よりもかなり長く血流中を循環する（すなわち、より長い血漿中半減期を持つ）ことを開示している。
【０００３】
WO 03/074087は、タンパク質をデンプン由来の修飾多糖に結合させる方法に関する。タンパク質と多糖ヒドロキシアルキルデンプンとの間の結合作用は、ヒドロキシアルキルデンプン分子の末端アルデヒド基または前記末端アルデヒド基の化学修飾によって得られる官能基と、タンパク質の官能基との間に形成される共有結合である。タンパク質の反応性基として、アミノ基、チオ基およびカルボキシル基が開示されている。しかも、極めて多種多様な結合の可能性が、種々の官能基、理論上適切な種々のリンカー分子、および種々の化学手法を含めて、数多くの一覧という形で記載されているが、実施例には二つの選択肢しか記載されていない。すなわち第一に、酸化型ヒドロキシエチルデンプンを使用し、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（EDC）活性化を利用してそれをタンパク質に直接結合させるか、非酸化型ヒドロキシエチルデンプンを使用し、それをタンパク質に直接結合させて（すなわち、化合物と結合しない）シッフ塩基を形成させ、次にそれを個々のアミンに還元する。したがって、WO 03/074087の実施例には、ヒドロキシエチルデンプン、タンパク質、および１つ以上のリンカー分子を含むコンジュゲートが一つも開示されていない。加えて、還元的アミノ化によって得られるコンジュゲートに関する限り、WO 03/074087は、該還元的アミノ化を実行する該タンパク質の好ましいアミノ基に関するいずれの情報をも含まない。
【発明の開示】
【０００４】
従って、本発明の目的は、ヒドロキシアルキルデンプン（ヒドロキシエチルデンプンが好ましい）とタンパク質との新規なコンジュゲートを提供することであり、該コンジュゲートは、投与が必要な被験者に投与する場合に有利な治療学的な効果を有する。
【０００５】
更なる本発明の目的は、ヒドロキシアルキルデンプン（ヒドロキシエチルデンプンが好ましい）と、タンパク質（これは、オリゴペプチドまたはポリペプチドのアミノ基を、ヒドロキシアルキルデンプン（ヒドロキシエチルデンプンが好ましい）のアルデヒド基、ケト基、もしくはヘミアセタール基と、またはそれらのアルデヒド官能化誘導体と反応させることによる還元的アミノ化によって得られる）との新規なコンジュゲートを提供することであった。
【０００６】
本発明の更なる別の目的は、該新規なコンジュゲートの製造方法を提供することであり、ここで、該方法は、特異的で且つ選ばれた反応条件を用いて使用する。
【０００７】
従って、本発明は、タンパク質、およびポリマー（ここで、該ポリマーはヒドロキシアルキルデンプンである）またはポリマー誘導体を含有するコンジュゲートの製造方法に関する。ここで、該方法は、該ポリマーまたは該ポリマー誘導体の少なくとも１個のアルデヒド基、ケト基、またはヘミアセタール基と、該タンパク質の少なくとも１個のアミノ基とを還元的アミノ化によって共有結合することを含み；該方法は更に、該ポリマー中に少なくとも２個のアルデヒド基をリングオープン酸化反応によって導入し、そして該ポリマーの該アルデヒド基の少なくとも１個を該タンパク質のアミノ基と反応させるか、あるいは、該ポリマーを少なくとも二官能性化合物（該化合物は、２個の官能基ＭおよびＱを含有し、１官能基Ｍは該ポリマーと反応し、そして１官能基Ｑは化学的に修飾される）と反応させるかのいずれかにより、アルデヒド、ケト、またはヘミアセタール官能化ポリマー誘導体（これは、該タンパク質のアミノ基と還元的アミノ化によって反応する）を得ることを含む。
【０００８】
従って、本発明はまた、タンパク質、およびポリマー（該ポリマーは、コンジュゲートの製造方法によって入手可能な、ヒドロキシアルキルデンプンである）またはポリマー誘導体を含有するコンジュゲートにも関し；ここで、該方法は、該ポリマーまたは該ポリマー誘導体の少なくとも１個のアルデヒド基、ケト基もしくはヘミアセタール基を、該タンパク質の少なくとも１個のアミノ基と還元的アミノ化によって共有結合することを含み；該方法は更に、該ポリマー中に少なくとも２個のアルデヒド基をリング−オープン酸化反応によって導入し、そして該ポリマーの該アルデヒド基の少なくとも１個を該タンパク質のアミノ基と反応させるか、あるいは、該ポリマーを少なくとも二官能性化合物（該化合物は、２個の官能基ＭおよびＱを含有し、１官能基Ｍは該ポリマーと反応し、そして１官能基Ｑは化学的に修飾れる）と反応させるかのいずれかにより、アルデヒド、ケト、またはヘミアセタール官能化ポリマー誘導体（これは、該タンパク質のアミノ基と還元的アミノ化によって反応する）を得ることを含む。
【０００９】
本明細書中で使用する用語「タンパク質」とは、少なくとも２個（少なくとも５個が好ましく、少なくとも１０個がより好ましく、少なくとも１５個がより好ましく、少なくとも２０個がより好ましく、少なくとも２５個がより好ましく、少なくとも３０個がより好ましく、少なくとも３５個がより好ましく、少なくとも４０個がより好ましく、少なくとも４５個がより好ましく、少なくとも５０個がより好ましく、少なくとも１００個が一層より好ましい）を有するいずれかのアミノ酸配列に関する。
【００１０】
該タンパク質は、化学的な合成方法によって製造することができ、あるいは、ヒトまたは別の哺乳動物の供給源のいずれかのものであり得て、そして天然の供給源からの精製によって得ることができる。
【００１１】
本発明によれば、該タンパク質は、成長因子、サイトカイン、アクチベーター、インヒビター、酵素、抗体、抗原、輸送タンパク質、生体接着タンパク質、ホルモン、受容体、抑制因子、機能性誘導体、またはそれらのフラグメントであり得る。本明細書中で使用する用語「機能性誘導体またはフラグメント」とは、元の分子の所望する生物学的な性質または活性を全部または一部（例えば、元の分子の所望する生物学的な性質または活性の少なくとも１０％であり、少なくとも２０％がより好ましく、少なくとも３０％がより好ましく、少なくとも４０％がより好ましく、少なくとも５０％がより好ましく、少なくとも６０％がより好ましく、少なくとも７０％がより好ましく、少なくとも８０％がより好ましく、少なくとも９０％がより好ましい）維持する誘導体またはフラグメントに関する。該フラグメントの特に好ましい例は、抗体フラグメントである。
【００１２】
タンパク質の例は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）（例えば、組み換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ)、コロニー刺激因子（ＣＳＦ)、（例えば、Ｇ−ＣＳＦ様組み換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）、アルファ−インターフェロン（ＩＦＮアルファ）、ベータ−インターフェロン（ＩＦＮベータ）またはガンマ−インターフェロン（ＩＦＮガンマ）（例えば、ＩＦＮアルファおよびＩＦＮベータ様組み換えヒトＩＦＮアルファまたはＩＦＮベータ（ｒｈＩＦＮアルファまたはｒｈＩＦＮベータ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１８（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−３様組み換えヒトＩＬ−２またはＩＬ−３（ｒｈＩＬ−２またはｒｈＩＬ−３）、血清タンパク質（例えば、凝固因子ＩＩ−ＸＩＩＩ様因子ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、アルファ１−抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）、活性プロテインＣ（ＡＰＣ）、プラスミノーゲンアクチベーター（例えば、組織タイププラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）（例えば、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｈＴＰＡ）、ＡＴ ＩＩＩ（例えば、組み換えヒトＡＴ ＩＩＩ（ｒｈＡＴ ＩＩＩ）、ミオグロビン、アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、成長因子（例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、脳由来成長因子（ＢＤＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、Ｂ−細胞成長因子（ＢＣＧＦ）、脳由来神経栄養成長因子（ＢＤＮＦ）、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、トランスフォーミング成長因子（例えば、ＴＧＦアルファまたはＴＧＦベータ）、ＢＭＰ（骨形態形成タンパク質）、成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦアルファまたはＴＮＦベータ）、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、ヘモグロビン、ホルモンまたはプロホルモン（例えば、インスリン、ゴナドトロピン、メラニン細胞刺激ホルモン（アルファ−ＭＳＨ）、トリプトレリン、視床下部(hypthalamic)ホルモン（例えば、抗利尿ホルモン（ＡＤＨおよびオキシトシン、並びに放出ホルモンおよび放出抑制ホルモン、副甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモン（例えば、チロキシン、チロトロピン、チロリベリン、プロラクチン、カルシトニン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２など）、エキセンディン（例えば、エキセンディン−４、レプチン、バゾプレッシン、ガストリン、セクレチン、インテグリン、糖タンパク質ホルモン（例えば、ＬＨ、ＦＳＨなど）、メラノシド(melanoside)−刺激ホルモン、リポタンパク質およびアポリポタンパク質（例えば、アポ−Ｂ、アポ−Ｅ、アポ−Ｌａ、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそれらのフラグメント、ヒルジン、組織経路(tissue-pathway)インヒビター、植物性タンパク質（例えば、レクチンまたはリシン、ハチ毒、ヘビ毒、免疫毒素、抗原Ｅ、アルファ−プロテイナーゼインヒビター、ブタクサ(ragweed)アレルゲン、メラニン、オリゴリシンタンパク質、ＲＧＤタンパク質、またはこれらのタンパク質の１つに対する任意の対応する受容体；または、これらのタンパク質または受容体のいずれかの機能性誘導体またはフラグメント。
【００１３】
好ましい酵素は例えば、炭水化物−特異的酵素、タンパク質分解酵素、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、およびリガーゼを挙げられる。具体的な非限定的な例は、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グルタミナーゼ、グルタミナーゼ−アスパラギナーゼ、フェニルアラニン、トリプトファナーゼ、チロシナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、エンドトキシナーゼ(endotoxinase)、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、カリクレイン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、サーモリシン、リパーゼ、ウリカーゼ、アデノシンジホスファターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコダーゼ(glucodase)、グルコン酸オキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、組織因子、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、ＭＡＰ−キナーゼ、ＤＮＡｓｅｓ、ＲＮＡｓｅｓ、ラクトフェリン、およびそれらの機能性誘導体またはフラグメントを挙げられる。
【００１４】
本発明の好ましい実施態様によれば、該タンパク質は、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＡＴ ＩＩＩ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ミオグロビン、ＳＯＤ、Ａ１ＡＴ、およびＢＳＡからなる群から選ばれる。
【００１５】
本発明の特に好ましい実施態様によれば、該タンパク質は、ｒｈＥＰＯ、ｒｈＧ−ＣＳＦ、ｒｈＩＦＮアルファ、ｒｈＩＦＮベータ、ｒｈＡＴ ＩＩＩ、ｒｈＩＬ−２、ｒｈＩＬ−３、ミオグロビン、ＳＯＤ、Ａ１ＡＴ、およびＢＳＡからなる群から選ばれる。
【００１６】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、赤血球前駆細胞の赤血球への成熟に必要な糖タンパク質ホルモンである。ヒト成人において、そのものは腎臓中で産生される。ＥＰＯは、循環において赤血球のレベルを調節するのに必須である。組織酸素の低レベルを特徴とする病気は、ＥＰＯの生合成の増大を誘発し、これにより、赤血球新生を刺激する。慢性的な腎不全において見られる、腎臓機能の低下は例えば典型的に、ＥＰＯの生合成の低下および赤血球の同時低下を生じる。エリスロポエチンは、約３４,０００Ｄａの酸性糖タンパク質ホルモンである。ヒトエリスロポエチンは、単量体として天然に存在する１６６アミノ酸 ポリペプチドである（Linらによる, 1985, PNAS 82, 7580-7584, EP 148 605 B2, EP 411 678 B2）。エリスロポエチンをコードする遺伝子の同定、クローニングおよび発現は例えば、米国特許第4,703,008号に記載されている。組み換えエリスロポエチンプラスミドを含有する哺乳動物細胞の増殖を支える細胞培地からの組み換えエリスロポエチンの精製は例えば、米国特許第4,667,016号に記載されている。本技術分野において、インビボでのＥＰＯの生物学的な活性はＥＰＯと結合するシアル酸の程度に主に依存すると、通常考えられている（例えば、EP 428 267 B1を参照）。理論的には、シアル酸の１４分子は、Ｎ−およびＯ−グリコシル化部位と結合した炭水化物の側鎖の末端部分で１個の分子のＥＰＯと結合することができる。非常に洗練された精製工程は、非常にシアル化されたＥＰＯ製品を得るのに必要である。エリスロポエチンに関する更なる詳細な情報については、Krantzによる, Erythropoietin, 1991, Blood, 77(3): 419-34（総説)、およびCeramiによる, Beyond erythropoiesis: novel applications for recombinant human erythropoietin, 2001, Semin Hematol., (3 Suppl 7): 33-9（総説）を参照。
【００１７】
Ｇ−ＣＳＦは、２個の鎖内ジスルフィド結合によって安定化され、そして１個のＯ−結合炭水化物分子を含有する、２１ｋＤａの糖タンパク質である。成熟Ｇ−ＣＳＦは、１７４アミノ酸を有する。動物の体内において、Ｇ−ＣＳＦは、骨髄間質細胞、マクロファージ、および線維芽細胞によって合成される。その主な機能は、好中球およびそれらの前駆細胞にとっての成長および分化の因子であるべきことである。しかしながら、そのものは、Ｇ−ＣＳＦは成熟好中球を活性化すると当該分野においても知られる。加えて、そのものは、様々な他の造血性前駆細胞の成長／分化を刺激し（別の造血性成長因子との相乗作用において）、そして内皮細胞の増殖および移入を促進する。臨床的には、Ｇ−ＣＳＦは、好中球レベルの不足の処置（例えば、再生不良性貧血(aplastic anaemia)、骨髄異形成症候群、ＡＩＤＳ、または化学療法によって生じる）のために投与する。
【００１８】
該Ｇ−ＣＳＦは、化学的な合成方法によって製造することができ、あるいはヒト（例えば、Burgess, A. W.らによる. 1977, Stimulation by human placental conditioned medium of hemopoietic colony formation by human marrow cell, Blood 49 (1977), 573-583; Shah, R. G.らによる, 1977, Characterization of colony-stimulating activity produced by human monocytes and phytohemagglutinin-stimulated lymphocytes, Blood 50 (1977), 811を参照）、または別の哺乳動物源のいずれかのものであり得て、そしてこのものは天然供給源（例えば、ヒト胎盤、ヒト血液、またはヒト尿など）からの精製によって得ることができる。加えて、多数の上皮癌腫、急性骨髄性白血病細胞、および様々な腫瘍セルライン（膀胱癌腫、髄芽腫）は、この因子を発現することができる。
【００１９】
その上、Ｇ−ＣＳＦの発現はまた、１個以上のアミノ酸（例えば、１〜２５個、１〜１０個が好ましく、１〜５個がより好ましく、１または２個が最も好ましい）が別のアミノ酸によって交換され、そしてＧ−ＣＳＦ活性を示す、Ｇ−ＣＳＦ変異体を包含する（例えば、Riedhaar-Olson, J. F.らによる，1996, Identification of residues critical to the activity of human granulocyte colony-stimulating factor, Biochemistry 35: 9034-9041 1996; 米国特許第5,581,476号; 第5,214,132号; 第5,362,853号; 第4,904,584号を参照）。Ｇ−ＣＳＦ活性の測定は、当該分野において記載されている（インビトロでの該Ｇ−ＣＳＦ活性の測定については例えば、Shirafuji, N.らによる，1989, A new bioassay for human granulocyte colony-stimulating factor (hG-CSF) using murine myeloblastic NFS-60 cell as targets and estimation of its levels in sera from normal healthy persons and patients with infectious and hematological disorders, Exp. Hematol. 1989, 17, 116-119；インビボでのＧ−ＣＳＦ活性の測定については例えば、Tanaka, H.らによる，1991, Pharmacokinetics of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor conjugated to polyethylene glycol in rats, Cancer Research 51, 3710-3714, 1991を参照）。Ｇ−ＣＳＦの活性の測定について試験する更なる刊行物は、米国特許第6,555,660号; Nohynek, G. J.らによる，1997, Comparison of the potency of glycosylated and nonglycosylated recombinant human granulocyte colony-stimulating factor in neutropenic and nonneutropenic CD rats, Cancer Chemother Pharmacol (1997) 39; 259-266中に開示されている。
【００２０】
該Ｇ−ＣＳＦは、組み換え的に産生されることが好ましい。このものは、ゲノムもしくはｃＤＮＡクローニングまたはＤＮＡ合成によって得られる、外因性ＤＮＡ配列の原核生物または真核生物の宿主発現を含む。適当な原核生物宿主としては、様々な細菌（例えば、大腸菌）を含む。適当な真核生物の宿主としては、酵母菌（例えば、S. cerevisiae）および哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞、およびサル細胞）を含む。
【００２１】
タンパク質の組み換え産生は、当該分野において知られる。通常、このものは、宿主細胞の適当な発現ベクターとの形質移入、タンパク質の産生および宿主細胞からの該タンパク質の精製が可能である条件下での該宿主細胞の培養を含む。詳細な情報については、例えばSouza, L. M.らによる，1986, recombinant human granulocyte colony-stimulating factor: effects on normal and leukemic myeloid cells, Science 1986 232:61-65,1986; Nagata, S.らによる，1986, Molecular cloning and expression of cDNA for human granulocyte colony-stimulating factor, Nature 319: 415-418, 1986; Komatsu, Y. らによる，1987, Cloning of granulocyte colony-stimulating factor cDNA from human macrophages and its expression in Escherichia coli, Jpn J Cancer Res. 1987 78 (11): 1179-1181を参照。
【００２２】
好ましい実施態様において、該Ｇ−ＣＳＦは、ヒト成熟Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸配列を有し（例えば、Nagata, S.らによる，1986, Molecular cloning and expression of cDNA for human granulocyte colony-stimulating factor, Nature 319: 415-418, 1986を参照）、そして更に、そのアミノ末端でメチオニンを含み得て、これにより次いで、１７５アミノ酸のタンパク質を生じる。その上、メチオニンの代わりに、Ｇ−ＣＳＦは、セリンまたはトレオニン残基を含み得る。
【００２３】
本発明の方法に使用されるＧ−ＣＳＦおよび本発明に記載のコンジュゲートは、位置Ｔｈｒ １３３でのＯ−結合グリコシル化によって該Ｇ−ＣＳＦと結合する（すなわち、該Ｇ−ＣＳＦはグリコシル化する）１個の炭水化物側鎖を含み得る（V. Gervaisらによる，Eur. J. Biochem. 1997, 247, 386-395）。該炭水化物側鎖の構造は、NeuNAc(アルファ2-3)Gal(ベータ1-3)[NeuNAc(アルファ2-6)]GalNAc、および(アルファ2-3)Gal(ベータ1-3)GalNAc(NeuNAc＝Ｎ−アセチルノイラミン酸、GalNAc＝Ｎ−アセチルガラクトサミン）であり得る。
【００２４】
天然のポリペプチドと比較して、少なくとも１個の別の炭水化物鎖を導入するための、Ｇ−ＣＳＦおよび他のポリペプチドの修飾が、示唆されている（米国特許第5,218,092号）。使用する宿主に依存して、該Ｇ−ＣＳＦ発現生成物は、哺乳動物または他の真核生物の炭水化物とグリコシル化され得る。通常、Ｇ−ＣＳＦが真核生物中で産生する場合には、該タンパク質は翻訳後にグリコシル化される。結果として、該炭水化物側鎖は、哺乳動物（特に、ヒト、昆虫、または酵母菌の細胞）中での生合成の間、該Ｇ−ＣＳＦと結合し得る。
【００２５】
組み換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）は、様々な形態の白血球減少症を処置するのに通常使用される。従って、ｒｈＧ−ＣＳＦの商業的な製品は、命名：フィルグラスチム(filgrastim)（グラン(Gran)（登録商標）およびニューポジェン(Neupogen)（登録商標））、レノグラスチム(lenograstim)（ノイトロジン(Neutrogin)（登録商標）およびグラノサイト(Granocyte)（登録商標））およびナルトグラスチム(nartograstim)（Neu-up（登録商標））で入手可能である。グラン（登録商標）およびニューポジェン（登録商標）は非グリコシル化され、そして組み換え大腸菌細胞中で産生する。ノイトロジン(Neutrogin)（登録商標）およびグラノサイトグラノサイト（登録商標）はグリコシル化され、そして組み換えＣＨＯ細胞中で産生され、そしてＮｅｕ−ｕｐ（登録商標）は組み換え大腸菌細胞中で産生される無傷のｒｈＧ−ＣＳＦのＮ−末端領域で置換された５個のアミノ酸で非グリコシル化される。
【００２６】
インターフェロンは、サイトカイン（これは、ウイルス感染症への応答の際に抗ウイルス性、抗増殖性、および免疫調節性の活性を媒介する）、および他の生物学的な誘導因子を挙げられる。ＩＦＮアルファと対比して、ＩＦＮベータは非常に種特異的である。ＩＦＮベータの２個のサブタイプ、ＩＦＮベータ１ａおよびＩＦＮベータ１ｂが存在する。工業的に製造する場合には、ＩＦＮベータ１ａおよび１ＦＮベータ１ｂとの間の主な相違は、それらの産生に使用されるそれぞれの細胞系である。ＩＦＮベータ１ａは哺乳動物細胞によって産生され、そして、そのアミノ酸配列は天然に存在するインターフェロンベータのものと同じであるという理由で、命名１ａを与える。ＩＦＮベータ１ｂは、細菌によって産生される。インターフェロン（ほとんどの他の哺乳動物と同様に）は、グリコシル化によって翻訳後に修飾される。しかしながら、細菌は、タンパク質をグリコシル化する能力を欠き、従ってＩＦＮベータ１ｂは、天然物質中に見られる炭水化物側鎖を含まない。ＩＦＮベータ１ａは１６６アミノ酸および分子量が約２２,５００Ｄを有し、ＩＦＮベータ１ｂは１６５アミノ酸および分子量が約１８,５００Ｄａを有する。その理由は、Ｎ−末端メチオニンは、細菌産生方法のためのグリコシル化と同様に、ＩＦＮベータ１ｂ中にないからである。ヒトインターフェロンベータのアミノ酸配列は、例えば EP 0218 825 A1中に示されている。インターフェロンベータの結晶構造は、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) pp 11813-11818, Biochemistry, Karpusas M, Nolte M, Benton CB, Meier W, Lipscomb WN, Goelz S. Commercial preparations of interferon beta are Betaseron（登録商標）（ＩＦＮベータ１ｂ)、Avonex（登録商標）、およびRebif（登録商標）（ＩＦＮベータ１ａ）中で報告されている。インターフェロンベータ１ｂは、大腸菌の菌株（このものは、ヒトインターフェロンベータｓｅｒ１７についての遺伝子を含有する遺伝子工学的に操作されたプラスミドを有する）の細菌発酵によって製造される。該未変性遺伝子はヒト繊維芽細胞から得ることができ、そして１７位に見られるシステイン残基をセリンで置き代えるような様式で修飾した。インターフェロンベータ１ａは、遺伝子工学的に操作されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ヒトインターフェロンベータ遺伝子を導入する）を用いる組み換えＤＮＡ技術によって産生する。ＩＦＮベータ１ａのアミノ酸配列は、天然の繊維芽細胞由来ヒトインターフェロンベータのものと同一である。天然のインターフェロンベータおよびインターフェロンベータ１ａはグリコシル化され、各々、Ａｓｎ８０に１個のＮ−結合複合体炭水化物分子を含有する。該インターフェロンベータ薬物は、再発寛解型多発性硬化症の処置について示されている。しかしながら、インターフェロンベータ薬製品の投与に関連する多数の重大な副作用が存在する。その上、それらは注射（筋肉内または皮下）によって投与され、これにより、別の危険を招く。副作用の低減および早期（例えば、回数が少ない）の投与は、多数の開発中の研究がＩＦＮベータの性質を改善するのに実施される理由である。タンパク質のポリマー修飾は、該タンパク質の性質を改善するのに使用される技術である。主に使用される技術は、ポリエチレン���リコールを用いるインターフェロンの修飾（ペグ化(PEGylation)と知られる）である。
【００２７】
IFNアルファ型は、自然界では、ウイルス、核酸、グルココルチコイドホルモン、および他の誘導因子による誘導後に、単球／マクロファージ、リンパ芽球様細胞、線維芽細胞およびいくつかの異なる細胞タイプによって産生される。IFNアルファには少なくとも23種類の変種が知られている。個々のタンパク質は19〜26kDの分子量を持ち、156〜166または172アミノ酸の長さを持つタンパク質からなる。全てのIFNアルファサブタイプはアミノ酸位置115〜151に共通する保存された配列領域を有し、アミノ末端は不定である。多くのIFNアルファサブタイプは、その配列が一つまたは二つの位置で異なるだけである。位置1/98および29/138のシステイン間にジスルフィド結合が形成される。ジスルフィド結合29/138は生物活性には必須であるが、1/98結合は生物活性に影響を及ぼさずに還元することができる。全てのIFNアルファ型は潜在的グリコシル化部位を含有するが、ほとんどのサブタイプはグリコシル化されない。IFNガンマとは対照的に、IFNアルファタンパク質はpH2で安定である。IFNアルファの工業生産は遺伝子改変大腸菌を使って行なわれる。細菌はタンパク質をグリコシル化する能力を欠くので、承認された製剤に用いられるINFアルファの二つの変種（IFNアルファ2aおよびIFNアルファ2b）は、どちらもグリコシル化されていない。従来のIFNアルファの主な短所は副作用である。C型肝炎の処置に適応を持つインターフェロンアルファ薬の改善に対して多くの研究がなされてきた。タンパク質のポリマー修飾は、タンパク質の性質を改善するために応用される技法である。主に用いられる技法は、ポリエチレングリコールによるインターフェロンの修飾であり、これはPEG化と呼ばれている。PEGIntron（SP）（登録商標）とPegasys（登録商標）（Roche）の二つは、IFNアルファの市販のPEG化変種である。
【００２８】
アンチトロンビンIII（AT III）は、トロンビンおよび第Xa因子を阻害するセリンプロテアーゼ阻害因子である（Travis, Annu. Rev. Biochem. 52: 655, 1983）。程度は下がるものの、第IXa因子、第XIIa因子、tPA、ウロキナーゼ、トリプシン、プラスミンおよびカリクレインも阻害される（Menache, Semin. Hematol. 28:1, 1991；Menache, Transfusion 32:580, 1992；Lahiri, Arch. Biochem. Biophys. 175:737, 1976）。ヒトAT IIIは、約58,000Dの分子量（MW）を持つ432アミノ酸の一本鎖糖タンパク質として、肝臓で合成される。その血漿濃度は14〜20mg/dLの範囲にある（Rosenberg, Rev. Hematol. 2:351, 1986；Murano, Thromb. Res. 18:259, 1980）。このタンパク質は三つのジスルフィド橋（Cys 8-128、Cys 21-95、Cys 247-430）および全質量の15％を占める四つのN結合型炭水化物鎖（Asn 96、-135、-155、-192）を有する（Franzen, J. Biol. Chem. 255:5090, 1980；Peterson「The Physiological Inhibitions of Blood Coagulation and Fibrinolysis」Elsevier/North-Holland Biomedical Press 1979, p.43）。アンチトロンビンは、血液凝固の制御にとても重要なセルピンタイプのセリンプロテアーゼ阻害因子である。AT IIIはヒト血漿中を循環する最も豊富な内在性抗凝固因子であり、生理的状態および病的状態の両方で凝固の調節に関与する（Opal, Crit. Care Med. 2002, 30:325）。これは、低いトロンビン阻害能力を持つ二つの形態で循環する（Pike, J. Biol. Chem. 272:19562, 1997；Ersdal-Badju, Fed. Proc. 44:404, 1985）（85-95％は四つの二側鎖型モノ-およびジ-シアリル化オリゴ糖鎖を持つアルファ・アイソフォームであり、5〜15％は、Asn135のグリコシル化、2〜6個の末端シアル酸結合を欠く、高ヘパリン親和性ベータ・アイソフォームである）。循環AT IIIのごく一部は通常、血管内皮細胞表面上のプロテオグリカンに結合する。これらのプロテオグリカンは主にヘパラン硫酸である。ヘパラン硫酸はヘパリンと類似する構造を持つ分子であり、ヘパリンと同じようにトロンビンの阻害を触媒することができる。明確に定義されたヘパリンの五糖単位にAT IIIが結合すると、タンパク質のコンフォメーション変化が起こる（Choay, Ann. NY Acad. Sci. 370:644, 1981；Choay, Biochem. Biophys. Res. Commun. 116:492, 1983；Olson, J. Biol. Chem. 266:6353, 1991；Bauer, Semin. Hematol. 28:10, 1991；Carell, Thromb. Haemost. 78:516, 1997）。この結合は、トロンビンおよび第Xa因子に対するAT III阻害活性の1000倍増を触媒する（Rosenberg, Fed. Proc. 44:404, 1985；Bjork著「Antithrombin and related inhibitors of coagulation proteinases（アンチトロンビンおよび凝固プロテイナーゼの関連阻害因子）」［Barett, Salvesen編「Proteinase Inhibitor」第17巻（オランダ・アムステルダム，Elsevier Science Publishers (Biomedical Division), 1986）の489頁］；Olson, J. Biol. Chem. 267:12528, 1992）。内因系凝固カスケードの酵素が共通して生成する内皮表面上でATの一部が起こすこの局在化により、AT IIIはこれらの止血酵素を迅速に中和し、天然の表面を血栓形成から保護することができる。したがって、血栓事象の予防におけるAT IIIの重要な性質は、触媒ヘパリンを結合して、その阻害特性を変化させるコンフォメーション変化を起こし、トロンビンまたは第Xa因子に不可逆的に結合することによって、それらの活性を阻害するというその能力である。AT IIIは著しい抗炎症性も持ち、そのうちのいくつは凝固カスケードにおけるその作用によってもたらされる（Roemisch, Blood Coagul Fibrinolysis. 2002, 13:657）。活性化第X因子および活性化トロンビ���のような活性化凝固プロテアーゼは、例えば炎症促進性媒介物質の放出などにより、炎症の一因となる。これらのプロテアーゼがAT IIIによって阻害されると、それらと細胞との特異的相互作用および後続の反応が妨げられる（Roemisch, Blood Coagul Fibrinolysis. 2002, 13:657）。凝固とは無関係なAT IIIの抗炎症性は、例えばプロスタサイクリンなどの放出につながる細胞との直接相互作用を伴う。最近同定された細胞受容体シンデカン4へのAT IIIの結合は、リポ多糖のような媒介物質によって誘導される細胞内シグナルの妨害につながり、その結果として、炎症応答の下方調整につながる（Roemisch, Blood Coagul Fibrinolysis. 2002, 13:657）。AT IIIの生理機能にとってはヘパリン-AT III複合体が重要であることから、遊離AT III構造の解析に加えて、ヘパリンのオリゴ糖単位に対する複合体化部位を評価する研究が、数多く行なわれている（Choay, Ann. NY Acad. Sci. 370:644, 1981；Choay, Biochem. Biophys. Res. Commun. 116:492, 1983；Olson, J. Biol. Chem. 266:6353, 1991；Bauer, Semin. Hematol. 28:10, 1991；Carell, Thromb. Haemost. 78:516, 1997）。AT IIIは古典的なヒト血漿分画技法に従って生産することができる。AT IIIに対するリガンドとしてヘパリンの高い親和性を利用するアフィニティークロマトグラフィー（ヘパリン-セファロース）と、それに続くウイルス不活化のための熱処理が、血漿からの分離に用いられる。血漿からの分画に加えて、この重要な治療タンパク質をより安全に入手することができる組換え生産技法に続く、AT III生産のための最近の代替法を入手することができる（Levi, Semin Thromb Hemost 27:405, 2001）。ATryn（登録商標）は、GTC Biotherapeuticsがトランスジェニックヤギで生産した組換えヒトAT III（rhAT III）である。血漿由来AT III（phAT III）とrhAT IIIの構造的および機能的性質を比較する詳細な研究が行なわれている（Edmunds, Blood, 91:4561, 1998）。この実験によれば、rhAT IIIはグリコシル化を除けばphAT IIIと構造的に同一である。遺伝子導入によって生産された物質のAsn155上にはオリゴマンノース構造が見いだされたのに対して、血漿由来タンパク質の場合は複合型構造が検出される。pdAT IIIのガラクトース単位の一部は、rhAT IIIにおいてはGalNac単位で置換される。rhAT IIIの方がフコシル化度が高いことは、もう一つの相違である。最後に、両タンパク質のシアリル化パターンは二つの点で異なる。すなわち、rhAT IIIはシアリル化度が低く、N-アセチルノイラミン酸およびN-グリコリルノイラミン酸を含有する。両分子のこれら二つの糖質部分間に見られるこの構造上の相違は、生化学的性質の相違ももたらす。欧州の病院市場では以下のAT III薬を入手することができる。（出典：IMS-ATCグループ2001）：Kybernin（登録商標）（Aventis Behring）、AT III（Baxter, Grifols）、Atenativ（登録商標）（Pharmacia）、Aclotine（登録商標）（LFB）、Anbin（登録商標）（Grifols）。
【００２９】
第VIII因子はプロテイナーゼの内因系凝固カスケードに関与し、第IXa因子が第X因子を活性型である第Xa因子に変換する反応（これは最終的にフィブリン塊の形成につながる）において補因子として役立つ。第VIII因子の欠如または不安定性は、よく見られる劣性x連鎖凝固障害である血友病Aにつながる。血友病Aの頻度は、全ての民族で、男児の出生10,000件あたり1〜2件である。患者は、正常レベルをかなり下回るレベルの第VIII因子を発現させるか、または血漿中にかなりの量（正常値の少なくとも30％）の第VIII因子を持つが、そのタンパク質が非機能的であるという、いわゆるcrm（交差反応性物質）陽性患者群（患者の約5％）に属する。全患者の約50％は、第VIII活性が正常値の1％未満である重症血友病Aを持ち、彼らは関節、筋および内臓への特発出血を頻繁に起こす。患者の30〜40％に見いだされる軽度血友病Aは、正常値の5〜30％の活性を伴う。出血は著しい外傷または外科手術後だけに起こる。中等度の血友病Aは患者の約10％に見いだされ、この場合、第VIII因子活性は正常値の2〜5％であり、出血はわずかな外傷後でも起こる。第VIII因子のヒトインビボ半減期は通常10〜15時間であるが、その放出、安定性および分解動態はもう一つの因子フォンウィルブランド因子の影響も受けることに注意する必要がある。第VIII因子は、献血されたヒト血漿から従来の抽出法によって生産されるか、あるいは最近では組換え系を使って生産される。例えば、ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞がKogenate（登録商標）（Bayer）の生産に使用され、一方、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞が別の製品Recombinate（登録商標）（Baxter）に使用される。267kDの公称分子量を持つ2351アミノ酸の完全な一本鎖タンパク質として（Tooleら, 1984, Nature 312:342）、または製品の安定性を増し生産収率を向上させる目的でBドメイン全体もしくはその一部が削除された異なる形態で（Bhattacharyyaら 2003, CRIPS 4/3:2-8）である。前駆体生成物はゴルジで200kDaと80kDaの二本のポリペプチド鎖に加工され、金属イオンによって一つにつなぎ止められたそれら二本の鎖が血中に発現される（Kaufmanら, 1988, J. Biol. Chem., 263:6352）。凝血促進活性には、トロンビン切断による重鎖の54kDaおよび44kDa断片と72kDa軽鎖断片との生成が、さらに必要である（Alyら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA:4933）。したがって、ヒト血漿由来の第VIII因子濃縮物には、断片化された完全に活性な第VIII因子の形態がいくつか記述されている（Andersonら, 1986, Proc. Natl. Acad, Sci. 83:2979）。血漿第VIII因子投与または組換え第VIII因子投与の一般的な副作用は、極めて多数の患者（最高30％）に見られる免疫反応であり、これにより治療価値が失われる。これまで、認容性の経口誘導によって患者の認容性を増すために、さまざまな試みが着手されたが、その結果はあまり期待できるものではなかった。認容性を誘導する新しい遺伝学的手段が提案されているが、まだ広く応用されてはいない。HES化タンパク質はより低い程度の免疫原性を有すると予想され、それゆえにこの合併症を低減することができるだろうと、本発明によって企図される。第VIII因子はリジン残基に極めて富んでおり（全部で2350アミノ酸のうち220を超える）、それらは還元的アミノ化アプローチに使用することができるだろう。
【００３０】
アルファ1-アンチトリプシン（A1AT、アルファ1-プロテイナーゼ阻害因子ともいう）は、好中球エラスターゼ、トロンビン、第Xa因子および第XIa因子を含む事実上全ての哺乳動物セリンプロテアーゼを阻害することが示されているプロテイナーゼ阻害因子である（Travis Ann. Rev. Biochem. 52 (1983) p.655）。A1ATは、肝臓で合成される一本鎖糖タンパク質であり、394個のアミノ酸および53kDの分子量を持つ。血漿濃度は1〜1.3g/lの範囲にある。タンパク質全体にシステインが一つしか存在しないので、分子内ジスルフィド橋を形成することはできない。この分子は、分子量の12％に相当する三つの糖側鎖を有する（Asn 46、83、247）（Mega J. Biol. Chem. 255 (1980) p.4057；Mega J. Biol. Chem. 255 (1980) p.4053；Carell FEBS Letters 135 (1981) p.301；Hodges Biochemistry 21 (1982) p.2805）。それぞれ二側鎖型構造または三側鎖型構造を持つ似つ2タイプの糖鎖が見いだされた（Hodges J. Biol. Chem. 254 (1979) p.8208）。ヒトA1ATは一般集団に少なくとも20の異なる形態で見いだされる。この微小不均一性は、2タイプの糖鎖がさまざまな量で存在する結果である。重要な機能は好中球エラスターゼの活性制御である（Travis Ann. Rev. Biochem. 52 (1983) p.655）。無制御なエラスターゼ活性は上皮組織への攻撃を引き起こして、回復不能な損傷をもたらす。不活化の過程において、A1ATはエラスターゼの基質として作用して、このプロテーゼの活性中心に結合し、次にこの複合体形成によってプロテアーゼを不活化する。A1ATが不足すると、例えば肺上皮の損傷に関係する肺気腫が起こる。A1ATの三つのN-グリコシル化部位に対するA1ATの2タイプの糖側鎖の分布は、A1ATの各アイソタイプごとに異なる。A1ATの古典的生産はヒト血漿からのさまざまなアフィニティークロマトグラフィー段階を用いる血漿分画法で行なわれる。しかし、最近のA1AT生産法では組換え技術が使用される。PPL Therapeuticsは、トランスジェニックヒツジの乳汁からの組換えヒトA1AT（rHA1AT）の回収を可能にする方法を開発した（Olman Biochem. Soc. Symp. 63 (1998) p.141；Tebbutt Curr. Opin. Mol. Ther. 2 (2000) p.199；Carver Cytotechnology 9 (1992) p.77；Wright Biotechnology (NY) 9 (1991) p.830）。分子のタンパク質部分に関して、rhA1ATはpdA1ATと比較して同じ構造を示す。しかし、組換え生産された他のヒトタンパク質がそうであるように、糖側鎖に（特にシアル酸残基の量に関して）相違が存在する。
【００３１】
組織型プラスミノゲン活性化因子（tPA）は、クロット溶解に重要なトリプシン様セリンプロテアーゼである。フィブリンクロットの存在下で、tPAはプラスミノゲンをプラスミンに変換し、それがフィブリンを分解する。tPAはフィブリンの存在下では増大した活性を示し、その結果として、フィブリン特異的なプラスミノゲン活性化を引き起こす（M.W.Spellman, L.J.Basa, C.K.Leonard, J.A.Chakel, J.V.O'Connor, The Journal of Biological Chemistry 264 (1989) p.14100）。プラスミンはフィブリンを可溶化してフィブリン分解産物を生じる。正のフィードバック機構により、フィブリンは、tPAによるプラスミノゲン活性化を刺激することによって、自分自身の分解を増進する（R.J. Stewartら The Journal of Biological Chemistry 275 (2000) pp.10112-10120）。htPAはさまざまなタイプの組織に存在する線維素溶解の生理的活性化因子である。これは約68kDの分子量を持つ糖タンパク質である。ネイティブ型の場合、tPAは単鎖型（一本鎖組織型プラスミノゲン活性化因子，sctPA）として存在し、これはペプチド結合Arg275-Ile276におけるプラスミンの切断により、二本鎖構造（二本鎖組織型プラスミノゲン活性化因子，tctPA）に変換されうる。これは、線維素溶解治療のために、rtPA（組換え組織型プラスミノゲン活性化因子）として組換え生産される。異なるタイプのtPAが存在し、糖質構造の構造的相違を示す。I型tPAはAsn117、Asn184およびAsn448にN結合型オリゴ糖を持つ。II型tPAはAsn117およびAsn448がグリコシル化される。どちらの型もThr61にO結合型フコース残基を含有する（K. Moriら The Journal of Biological Chemistry 270 (1995) pp.3261-3267）。CHO細胞で発現させたtPAの糖質構造が調べられ、多種多様な二側鎖型、三側鎖型および四側鎖型糖鎖構造が示された（M.W.Spellman, L.J.Basa, C.K.Leonard, J.A.Chakel, J.V.O'Connor, The Journal of Biological Chemistry 264 (1989) p.14100）。tPAの一次構造は数個のシステインを含有する。これらは架橋されると共に、部位83には遊離のシステイン残基を持ち、これがもう一つのtPAと相互作用することで二量体を形成しうる。tPAのインビボクリアランスは糖質構造の影響（特にAsn117に結合した高マンノース型オリゴ糖の影響）を受けることを、いくつかの結果が示している。提案されたもう一つのクリアランス機序には、肝細胞上の高親和性受容体によるThr61のO結合型フコース残基の認識が関与する。この残基はCys83に近い。半減期を延ばすために、生物工学を適用したtPA（TNK-tPA）が開発された。117位のグリコシル化部位が103位に移された。部位117のアスパラギンはグルタミンで置換し、部位103のスレオニンはアスパラギンで置換する。TNK-tPAは、プロテアーゼドメイン中にテトラアラニン置換を持つため、プラスミノゲン活性化因子阻害因子1による不活化に対して耐性である（R.J.Stewartら The Journal of Biological Chemistry 275 (2000) pp.10112-10120）。TNK-tpAはTenecteplase（登録商標）（Boehringer Ingelheim）として販売されている。tPAがボーラスとそれに続く注入という形で投与する必要があるのに対して、TNK-tpAは単回静脈内ボーラスとして投与することができる。
【００３２】
活性化プロテインC（APC）は、凝固および重症敗血症に関連する炎症の調整物質である。活性化プロテインCはトロンボモジュリンに結合したトロンビンによってその不活性前駆体（プロテインC）から変換される。この複合体はプロテインCの重鎖から短いN末端活性化ペプチドを切り落として、活性化プロテインCをもたらす。ドロトレコギン・アルファ（活性型）は、組換えヒト活性化プロテインC（rhAPC）である。そのアミノ酸配列は血漿由来の活性化プロテインCと同じであり、そしてそのものは類似する性質を有する。活性化プロテインCはEli LillyによりXigris（登録商標）として販売されている。これは、プロテインC発現ベクターが導入されたヒト細胞株（HEK293）で生産される。該細胞株が特に使用されたのは、この細胞株が機能的活性に必要な一連の複雑な翻訳後修飾を正しく行なう能力を持つからである。組換えヒト活性化プロテインCは、四つのN-グリコシル化部位と12個のジスルフィド結合を含有する二本鎖糖タンパク質である。重鎖は250アミノ酸を含有する。この鎖のうち、7残基がシステインであり、三つはN結合型グリコシル化部位である（Asn-248、Asn-313およびAsn-329）。7個のシステイン残基は、重鎖内で三つのジスルフィド結合を形成すると共に、鎖間に一つのジスルフィド結合を形成する。軽鎖は一つのN結合型グリコシル化部位（Asn-97）を含有すると共に、17個のシステイン残基を含有し、それらは軽鎖内に八つのジスルフィド結合を形成すると共に、該鎖間にジスルフィド結合を一つ形成する。軽鎖上の最初の9個のグルタミン酸はガンマ-カルボキシル化され（Gla）、アスパラギン酸71はベータ-ヒドロキシル化される。rhAPCはヒト血漿由来活性化プロテインCと同じアミノ酸配列を持つが、後者とはそのグリコシル化パターンが異なる。活性化プロテインCはセリンプロテアーゼファミリーに属するプロテアーゼである。そのものは、凝固の調節に主要な役割を果たす。活性化プロテインCが持つ抗血栓機能の根拠は、トロンビン機能を阻害するというその能力である。加えて、活性化プロテインCは、重症敗血症に関連する炎症の重要な調節物質でもある。内在性セリンプロテアーゼ阻害因子は活性化プロテインCの天然阻害因子であり、インビボにおける活性化プロテインCの循環活性半減期を著しく短縮する（30分未満）。循環からの活性化プロテインCのクリアランスは、内在性プロテアーゼ阻害因子による活性化プロテインCの酵素活性の阻害、肝臓および腎臓などの臓器による活性化プロテインCおよび/または活性化プロテインC-セリンプロテアーゼ阻害因子複合体のクリアランス、ならびに循環プロテーゼまたは組織プロテアーゼによる活性化プロテインCおよび/または活性化プロテインC-セリンプロテアーゼ阻害因子複合体の分解を含む少なくとも三つの過程の組み合わせによって媒介される。24μg/kg/時間の24時間注入による第I相臨床試験では、70ng/mlの定常状態血漿濃度が得られた。注入終了時に測定したrhAPCの半減期は0.5〜1.9時間だった。血漿rhAPC濃度は注入終了後2時間以内に10ng/mlの検出限界未満に低下した。活性化プロテインCは、その生理的半減期および薬物動態的半減期が短いため、敗血症治療で臨床的に使用する場合には、望ましい血漿濃度を維持するために、ある速度で持続注入される。活性化プロテインCの薬物動態プロファイルを改善するための努力がいくつかなされている。例えばD.T.Bergら Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 (2003) pp.4423-4428には、血漿半減期が長くなった活性化プロテインCの改変変種が記載されている。
【００３３】
第VII因子はプロテイナーゼの内因系血液凝固カスケードに関与し、凝固カスケードの内因系経路を活性化することによって止血を促進する。第VII因子は、第Xa因子、第XIIa因子、第IXa因子、またはトロンビンにより、小タンパク質分解によって第VIIa因子に変換される。次に、第VIIa因子は、組織因子およびカルシウムイオンの存在下で、限定的タンパク質分解により、第X因子を第Xa因子に変換する。第VIIa因子は、組織因子およびカルシウムの存在下で、第IX因子を第IXa因子にも変換する。第VII因子は、406個のアミノ酸残基からなるビタミンK依存性糖タンパク質（MW 50Kダルトン）である。第VII因子は、献血されたヒト血漿から従来の抽出法によって生産されるか、あるいは最近では組換え系を使って生産される。Novo Nordiskは、NovoSeven（登録商標）の生産に、ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞を使用する。55KDaの公称分子量を持つ406アミノ酸の一本鎖タンパク質として発現される（Thim,L.ら, Biochemistry 27:7785-7793 (1988)）。この分子は四つの糖側鎖を有する。Ser 52、60のO結合型糖側鎖二つと、Asn 145、322のN結合型糖側鎖二つである（Thim,L.ら, Biochemistry 27:7785-7793 (1988)）。
【００３４】
VII因子は、VIII因子またはIX因子に対するインヒビターを用いて、血友病ＡまたはＢ患者における出血発症の処置について示されている。従って、本発明はまた、VIII因子またはIX因子に対するインヒビターを用いて、血友病ＡまたはＢ患者における発症の処置のための薬物の製造における、ＨＡＳ−VII因子コンジュゲートの使用にも関する。
【００３５】
第IX因子は、Ca(2+)イオン、リン脂質および第VIIIa因子の存在下で第X因子をその活性型に変換することによって内因系血液凝固経路に関与するビタミンK依存性血漿タンパク質である。第IX因子は一本鎖中の415アミノ酸からなる分子量約55,000Daの糖タンパク質である（Yoshitake S.ら, Biochemistry 24:3736-3750(1985)）。第IX因子は献血されたヒト血漿から従来の抽出法によって生産されるか、あるいは最近では組換え系を使って生産される。Wyethでは、BeneFIX（登録商標）の生産に、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を使用している。これは、血漿由来第IX因子のAla148対立遺伝子型と同じ一次アミノ酸配列を持ち、内在性第IX因子に似た構造上および機能上の特徴を持つ。このタンパク質は八つの糖側鎖を有する。Ser 53、61およびスレオニン159、169、172、179の六つのO結合型糖側鎖ならびにAsn 157、167の二つのN結合型糖側鎖である（Yoshitake S.ら, Biochemistry 24:3736-3750(1985)；Balland A.ら, Eur J Biochem. 1988;172(3):565-72）。
【００３６】
IX因子は、血友病Ｂ（先天的な因子ＩＸ欠損症、またはクリスマス病）を有する患者における出血性発症の制御および予防（外科的な設定における出血の制御および予防を含む）について示されている。従って、本発明はまた、血友病Ｂ（例えば、先天的なIX因子欠損症またはクリスマス病）を有する患者における出血発症の制御および予防（外科的な環境における出血の制御および予防を含む）のための薬物の製造における、ＨＡＳ−IX因子コンジュゲートの使用にも関する。
【００３７】
本発明に関して、用語「ヒドロキシアルキルデンプン」（HAS）は、少なくとも一つのヒドロキシアルキル基によって置換されているデンプン誘導体を指す。本発明の好ましいヒドロキシアルキルデンプンは、式（I）の構成を持つ：
【化１】
2007527892.tif 000002
［式中、デンプン分子の還元末端は非酸化型で示され、末端糖単位はアセタール型で示されているが、このアセタール型は溶媒などに依存してアルデヒド型との平衡状態にあることができる］。
【００３８】
本発明で使用する用語ヒドロキシアルキルデンプンは、式（I）に簡略化して描いたように末端糖質部分がヒドロキシアルキル基R1、R2、および/またはR3を含む化合物に限定されるわけではなく、末端糖質部分中および/またはそのデンプン分子の残りの部分HAS'中のどこかに存在する少なくとも一つのヒドロキシ基がヒドロキシアルキル基R1、R2、またはR3で置換されている化合物も指す。
【００３９】
二つ以上の異なるヒドロキシアルキル基を含むヒドロキシアルキルデンプンも考えられる。
【００４０】
HASに含まれる少なくとも一つのヒドロキシアルキル基は、二つ以上のヒドロキシ基を含有しうる。好ましい実施形態によれば、HASに含まれる少なくとも一つのヒドロキシアルキル基は一つのヒドロキシル基を含有する。
【００４１】
「ヒドロキシアルキルデンプン」という表現は、アルキル基が一置換または多置換される誘導体も包含する。これに関連して、アルキル基はハロゲン、特にフッ素で置換されるか、アリール基で置換されることが好ましい。さらに、ヒドロキシアルキル基のヒドロキシ基を、エステル化またはエーテル化することもできる。
【００４２】
さらにまた、アルキルの代わりに、直鎖状または分岐鎖状の置換または無置換アルケン基も使用することができる。
【００４３】
ヒドロキシアルキルデンプンはデンプンのエーテル誘導体である。前記エーテル誘導体の他に、他のデンプン誘導体も、本発明に関連して使用することができる。例えばエステル化されたヒドロキシ基を含む誘導体は有用である。これらの誘導体は、例えば2〜12個の炭素原子を持つ無置換モノカルボン酸もしくは無置換ジカルボン酸またはその置換誘導体の誘導体であることができる。2〜6個の炭素原子を持つ無置換モノカルボン酸の誘導体、特に酢酸の誘導体は、とりわけ有用である。これに関連して、アセチルデンプン、ブチリルデンプンおよびプロピオニルデンプンは好ましい。
【００４４】
さらにまた、2〜6個の炭素原子を持つ無置換ジカルボン酸の誘導体も好ましい。
【００４５】
ジカルボン酸の誘導体の場合、ジカルボン酸の第2のカルボキシ基もエステル化することが有用である。さらにまた、本発明との関連では、ジカルボン酸のモノアルキルエステルの誘導体も適切である。
【００４６】
置換モノカルボン酸または置換ジカルボン酸の場合、置換基は好ましくは置換アルキル残基について上述したものと同じであることができる。
【００４７】
デンプンをエステル化する技法は当技術分野では知られている（例えばKlemm D.ら「Comprehensive Cellulose Chemistry」Vol.2（1998, Whiley-VCH, ワインハイム, ニューヨーク）、特に4.4章「Esterification of Cellulose（セルロースのエステル化）」（ISBN 3-527-29489-9）を参照されたい）。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記式（I）のヒドロキシアルキルデンプンが使用される。式（I）では、明示的に記載された糖環と、HAS'と表示された残基とが、全体として、好ましいヒドロキシアルキルデンプン分子を表す。HAS'に含まれる他の糖環構造は、明示的に記載された糖環と同じであってもよいし、異なってもよい。
【００４９】
式（I）の残基R1、R2およびR3に関する限り、特別な制約はない。好ましい実施形態によれば、R1、R2およびR3は、独立して、水素であるか、各アルキル残基中に2〜10個の炭素原子を持つヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基またはヒドロキシアルカリール基であるか、基：(CH2CH2O)n-H［式中、nは整数、好ましくは1、2、3、4、5または6である］である。水素および2〜10個の炭素原子を持つヒドロキシアルキル基は好ましい。より好ましくは、ヒドロキシアルキル基は2〜6個の炭素原子、さらに好ましくは2〜4個の炭素原子、より一層好ましくは2〜3個の炭素原子を持つ。したがって、「ヒドロキシアルキルデンプン」は、好ましくは、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプンおよびヒドロキシブチルデンプンを含み、ヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプンは特に好ましく、ヒドロキシエチルデンプンは最も好ましい。
【００５０】
アルキル、アリール、アラルキルおよび/またはアルカリール基は直鎖または分枝鎖であることができ、適切に置換されていてもよい。
【００５１】
したがって本発明は、R1、R2およびR3が独立して水素または2〜6個の炭素原子を持つ直鎖もしくは分枝鎖ヒドロキシアルキル基である上述の方法にも関する。
【００５２】
したがってR1、R2およびR3は、好ましくは、ヒドロキシヘキシル、ヒドロキシペンチル、ヒドロキシブチル、ヒドロキシプロピル、例えば2-ヒドロキシプロピル、3-ヒドロキシプロピル、2-ヒドロキシイソプロピル、ヒドロキシエチル、例えば2-ヒドロキシエチル、水素であることができ、2-ヒドロキシエチル基はとりわけ好ましい。
【００５３】
したがって本発明は、R1、R2およびR3が独立して水素または2-ヒドロキシエチル基である上述の方法およびコンジュゲートにも関し、少なくとも一つの残基R1、R2およびR3が2-ヒドロキシエチルである実施形態はとりわけ好ましい。
【００５４】
ヒドロキシエチルデンプン（HES）は本発明の全ての実施形態にとって最も好ましい。
【００５５】
したがって本発明は、ポリマーがヒドロキシエチルデンプンであり、ポリマー誘導体がヒドロキシエチルデンプン誘導体である、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【００５６】
ヒドロキシエチルデンプン（HES）は天然アミロペクチンの誘導体であり、体内ではアルファ-アミラーゼによって分解される。HESは、トウモロコシデンプン中に最高95重量％の濃度で存在する糖質ポリマー・アミロペクチンの置換誘導体である。HESは有利な生物学的性質を示し、血液用補液剤として、診療所における血液希釈療法に使用されている（(Sommermeyerら, 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278；Weidlerら, 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, 494-498）。
【００５７】
アミロペクチンはグルコース部分からなり、主鎖にはアルファ-1,4-グリコシド結合が存在し、分岐部位にはアルファ-1,6-グリコシド結合が見いだされる。この分子の物理的化学的性質は主にグリコシド結合のタイプによって決まる。アルファ-1,4-グリコシド結合にニックが入ることにより、一巻きにつきグルコースモノマー約6個のらせん構造が生成する。ポリマーの物理化学的性質および生化学的性質は置換によって修飾することができる。ヒドロキシエチル基の導入はアルカリヒドロキシエチル化によって達成することができる。反応条件を適合させることにより、ヒドロキシエチル化に関して無置換グルコースモノマー中の各ヒドロキシル基が持つ異なる反応性を、利用することができる。この事実のおかげで、当業者は置換パターンにある程度の影響を及ぼすことができる。
【００５８】
HESは主として分子量分布および置換度によって特徴づけられる。置換度を記述する方法は二つ考えられる。すなわち、
1．置換度は、全グルコース部分に対する置換グルコースモノマーの割合に関して記述することができる。
2．置換度は、モル置換度として記述することができ、この場合は1グルコース部分あたりのヒドロキシエチル基の数が記述される。
本発明に関して、DSと表記される置換度は、上述のモル置換度に関する（上に引用したSommermeyerら, 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278（特に273頁）も参照されたい）。
【００５９】
HES溶液は、各分子が重合度、分岐部位の数およびパターン、ならびに置換パターンに関して他の分子とは異なっている多分散組成物として存在する。それゆえHESは異なる分子量を持つ化合物の混合物である。したがって個々のHES溶液は統計的手段を活用して平均分子量によって決定される。これに関連して、Mnは、分子数に依存する算術平均として計算される。もう一つの選択肢として、重量平均MW（またはMW）は、HESの質量に依存する単位を表す。
【００６０】
本発明に関して、ヒドロキシエチルデンプンは、好ましくは、1〜300kDの平均分子量（重量平均）を持つことができる。ヒドロキシエチルデンプンはさらに、0.1〜3（好ましくは0.1〜2、より好ましくは0.1〜0.9、好ましくは0.1〜0.8）という好ましいモル置換度と、ヒドロキシエチル基に関して2〜20の範囲の好ましいC2：C6置換比とを示すことができる。
【００６１】
本発明に関して使用する用語「平均分子量」は、Sommermeyerら, 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278およびWeidlerら, 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, 494-498に記載のLALLS（低角レーザー光散乱）-GPC法によって決定される分子量をいう。10kD以下の平均分子量については、さらに、LALLS-GPCによって予め検定された標準を使って較正を行なった。
【００６２】
本発明の好ましい実施形態によれば、使用されるヒドロキシエチルデンプンの平均分子量は、1〜300kD、好ましくは2〜200kD、より好ましくは3〜100kD、より好ましくは4〜70kDである。
【００６３】
約130kDの平均分子量を持つHESの一例は、0.1〜0.9、好ましくは0.2〜0.8（例えば0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、または0.8）の置換度、好ましくは0.4〜0.7（例えば0.4、0.5、0.6、または0.7）の置換度を持つHESである。
【００６４】
約130kDの平均分子量を持つHESの一例はFreseniusのVoluven（登録商標）である。Voluven（登録商標）は、例えば血液量減少の治療および予防の治療的適応に補液として使用される人工コロイドである。Voluven（登録商標）は平均分子量130,000±20,000D、モル置換度0.4、およびC2：C6比約9：1である。
【００６５】
したがって本発明は、ヒドロキシアルキルデンプンが4〜100kD（好ましくは4〜70kD）の平均分子量を持つヒドロキシエチルデンプンである上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【００６６】
好ましい平均分子量の範囲は、例えば4〜70kDまたは10〜70kDまたは12〜70kDまたは18〜70kDまたは50〜70kDまたは4〜50kDまたは10〜50kDまたは12〜50kDまたは18〜50kDまたは4〜18kDまたは10〜18kDまたは12〜18kDまたは4〜12kDまたは10〜12kDまたは4〜10kDである。
【００６７】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、使用されるヒドロキシエチルデンプンの平均分子量は、4kD超〜70kD未満の範囲、例えば約10kD、または9〜10kDもしくは10〜11kDもしくは9〜11kDの範囲、または約12kD、または11〜12kDもしくは12〜13kDもしくは11〜13kDの範囲、または約18kD、または17〜18kDもしくは18〜19kDもしくは17〜19kDの範囲、または約50kD、または49〜50kDもしくは50〜51kDもしくは49〜51kDの範囲にある。
【００６８】
モル置換度（DS）の上限については、3.0までの値、例えば0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9または2.0も考えられ、2.0未満の値は好ましく、1.5未満の値はより好ましく、1.0未満の値、例えば0.7、0.8または0.9はさらに好ましい。
【００６９】
したがって、好ましいモル置換度の範囲は、0.1〜2または0.1〜1.5または0.1〜1.0または0.1〜0.9または0.1〜0.8である。より好ましいモル置換度の範囲は、0.2〜2または0.2〜1.5または0.2〜1.0または0.2〜0.9または0.2〜0.8である。さらに好ましいモル置換度の範囲は、0.3〜2または0.3〜1.5または0.3〜1.0または0.3〜0.9または0.3〜0.8である。より一層好ましいモル置換度の範囲は、0.4〜2または0.4〜1.5または0.4〜1.0または0.4〜0.9または0.4〜0.8である。
【００７０】
置換度（DS）に関する限り、DSは、好ましくは少なくとも0.1、より好ましくは少なくとも0.2、より好ましくは少なくとも0.4、より好ましくは少なくとも0.4である。好ましいDSの範囲は0.1〜3、より好ましくは0.1〜2、より好ましくは0.1〜0.9、より好ましくは0.1〜0.8、より好ましくは0.2〜0.9、より好ましくは0.3〜0.9、さらに好ましくは0.4〜0.8、より一層好ましくは0.1〜0.7、より好ましくは0.2〜0.7、より好ましくは0.3〜0.7、より好ましくは0.4〜0.7である。特に好ましいDSの値は、例えば0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8または0.9であり、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7または0.8はより好ましく、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7または0.8はさらに好ましく、0.4、0.5、0.6、0.7または0.8はより一層好ましく、例えば0.4および0.7は特に好ましい。
【００７１】
本発明に関して、与えられたモル置換度の値、例えば0.9は、正確な値であってもよいし、0.85〜0.94の範囲にあると理解することもでき、あるいは0.8は、正確な値であってもよいし、0.75〜0.84の範囲にあると理解することもできる。したがって、例えば0.1という与えられた値は、0.1という正確な値であるか、0.05〜0.14の範囲にあることができ、0.4という与えられた値は、0.4という正確な値であるか、0.35〜0.44の範囲にあることができ、0.7という与えられた値は、0.7という正確な値であるか、0.65〜0.74の範囲にあることができる。
【００７２】
ヒドロキシアルキルデンプン（好ましくはヒドロキシエチルデンプン）の分子量とその置換度DSとの特に好ましい組み合わせは、例えば10kDと0.4または10kDと0.7または12kDと0.4または12kDと0.7または18kDと0.4または18kDと0.7または50kDと0.4または50kDと0.7または100kDと0.7である。
【００７３】
C2：C6置換比に関する限り、前記置換は、好ましくは2〜20の範囲、より好ましくは2〜15の範囲、さらに好ましくは3〜12の範囲にある。
【００７４】
本発明のさらなる実施形態によれば、異なる平均分子量および/または異なる置換度および/または異なるC2：C6置換比を持つヒドロキシエチルデンプンの混合物も使用することができる。したがって、異なる平均分子量および異なる置換度および異なるC2：C6置換比を持つヒドロキシエチルデンプンの混合物、または異なる平均分子量および異なる置換度および同じもしくはほぼ同じC2：C6置換比を持つヒドロキシエチルデンプンの混合物、または異なる平均分子量および同じもしくはほぼ同じ置換度および異なるC2：C6置換比を持つヒドロキシエチルデンプンの混合物、または同じもしくはほぼ同じ平均分子量および異なる置換度および異なるC2：C6置換比を持つヒドロキシエチルデンプンの混合物、または異なる平均分子量および同じもしくはほぼ同じ置換度および同じもしくはほぼ同じC2：C6置換比を持つヒドロキシエチルデンプンの混合物、または同じもしくはほぼ同じ平均分子量および異なる置換度および同じもしくはほぼ同じC2：C6置換比を持つヒドロキシエチルデンプンの混合物、または同じもしくはほぼ同じ平均分子量および同じもしくはほぼ同じ置換度および異なるC2：C6置換比を持つヒドロキシエチルデンプンの混合物、またはほぼ同じ平均分子量およびほぼ同じ置換度およびほぼ同じC2：C6置換比を持つヒドロキシエチルデンプンの混合物を使用することができる。
【００７５】
本発明の異なるコンジュゲートおよび/または異なる方法では、異なるヒドロキシアルキルデンプン（好ましくは異なるヒドロキシエチルデンプン）および/または異なるヒドロキシアルキルデンプン混合物（好ましくは異なるヒドロキシエチルデンプン混合物）を使用することができる。
【００７６】
ポリマーまたはポリマー誘導体が少なくとも一つのアルデヒド基を介して還元的アミノ化によってタンパク質の少なくとも一つのアミノ基に共有結合される本発明の還元的アミノ化反応は、好ましくは0〜40℃、より好ましくは0〜37℃、より好ましくは0〜25℃、特に4〜21℃（ただしとりわけ好ましくは0〜21℃）の温度で行なわれる。反応時間は好ましくは0.5〜72時間、より好ましくは2〜48時間、特に好ましくは4〜7時間の範囲である。反応の溶媒としては水性媒質が好ましい。
【００７７】
したがって本発明は、還元的アミノ化が4〜21℃（ただしとりわけ好ましくは0〜21℃）で行なわれる、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【００７８】
したがって本発明は、還元的アミノ化が水性媒質で行なわれる、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【００７９】
したがって本発明は、還元的アミノ化が水性媒質中、4〜21℃（ただしとりわけ好ましくは0〜21℃）の温度で行なわれる、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【００８０】
本発明に関して使用する用語「水性媒質」は、関与する溶媒の重量を基準にして、少なくとも10重量％、より好ましくは少なくとも20重量％、より好ましくは少なくとも30重量％、より好ましくは少なくとも40重量％、より好ましくは少なくとも50重量％、より好ましくは少なくとも60重量％、より好ましくは少なくとも70重量％、より好ましくは少なくとも80重量％、さらに好ましくは少なくとも90重量％、または100重量％までの範囲の水を含む溶媒または溶媒の混合物をいう。好ましい反応媒質は水である。
【００８１】
反応媒質のpH値は一般に4〜9または4〜8または4〜7.5または4〜7.3の範囲にある。
【００８２】
本発明の好ましい実施形態によれば、還元的アミノ化反応を行なうpHは、10未満、好ましくは7.5未満、好ましくは7.3未満、より好ましくは7以下、最も好ましくは7未満（すなわち酸性領域）である。したがって好ましい範囲は3〜7未満、より好ましくは3.5〜6.5、さらに好ましくは4〜6、さらに好ましくは4.5〜5.5、特に好ましくは約5.0、すなわち4.6または4.7または4.8または4.9または5.0.または5.1または5.2または5.3または5.4である。好ましい範囲は、なかんずく、3〜6.9または3〜6.5または3〜6または3〜5.5または3〜5または3〜4.5または3〜4または3〜3.5または3.5〜6.9または3.5〜6.5または3.5〜6または3.5〜5.5または3.5〜5または3.5〜4.5または3. 5〜4または4〜6.9または4〜6.5または4〜6.または4〜5.5または4〜5または4〜4.5または4.5〜6.9または4.5〜6.5または4.5〜6または4.5〜5.5または4.5〜5または5〜6.9または5〜6.5または5〜6または5〜5.5または5.5〜6.9または5.5〜6.5または5.5〜6または6〜6.9または6〜6.5または6.5〜6.9である。
【００８３】
したがって本発明は、還元的アミノ化が7以下のpH、より好ましくは6以下のpHで行なわれる、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【００８４】
したがって本発明は、還元的アミノ化が0〜21℃、好ましくは4〜21℃の温度、および7.5以下、好ましくは7以下、好ましくは6以下のpHで行なわれる、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【００８５】
したがって本発明は、還元的アミノ化がpH7以下、好ましくはpH6以下の水性媒質中で行なわれる、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【００８６】
したがって本発明は、還元的アミノ化がpH7以下、好ましくはpH6以下の水性媒質中、4〜21℃の温度で行なわれる、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【００８７】
反応に使用するポリマー誘導体：タンパク質のモル比は、好ましくは、200：1〜5：1、より好ましくは100：1〜10：1、特に好ましくは75：1〜20：1の範囲にある。
【００８８】
驚くべきことに、特に上述の好ましいpH範囲（特にpH7未満かつ4以上）では、ポリマー誘導体を主としてタンパク質のN末端に位置するアミノ基と反応させうることがわかった。本発明に関連して用いられる用語「主として」は、利用可能なN末端アミノ基の少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％を、還元的アミノ化によって反応させる実施形態をいう。利用可能なN末端アミノ基の少なくとも90％または少なくとも95％または少なくとも96％または少なくとも97％または少なくとも98％または少なくとも99％を反応させることもできる。N末端アミノ基以外のアミノ基への結合を完全に排除できたわけではないが、7未満（好ましくは6未満）のpHにおける本発明の還元的アミノ化による結合は、基本的にN末端アミノ基で選択的に起こった。特にこれらの反応条件は、これらの条件で安定なタンパク質にとって好ましい。タンパク質が酸不安定性である場合（例えばアルファ1-アンチトリプシン）は、適当な反応条件（特に7.5未満〜5超のpH）を選択することが好ましい。
【００８９】
したがって本発明は、タンパク質がN末端アミノ基および少なくとも一つのさらなるアミノ基を含み、前記コンジュゲートが主としてN末端アミノ基に結合されたポリマーを含む、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【００９０】
特に好ましい実施形態によれば、本発明は、アルデヒドもしくはケトもしくはヘミアセタール官能化ヒドロキシアルキルデンプンまたはアルデヒドもしくはケトもしくはヘミアセタール官能化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、主としてタンパク質のN末端アミノ基に連結する方法であって、前記ヒドロキシアルキルデンプンまたはその誘導体を、7以下のpH、好ましくは6以下のpHで還元的アミノ化反応に付すことを含み、前記還元的アミノ化反応が好ましくは水性媒質中で行なわれる方法に関する。
【００９１】
本発明によれば、アルデヒド官能化ヒドロキシアルキルデンプンまたはアルデヒド官能化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体が好ましい。
【００９２】
さらにもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、アルデヒドもしくはケトもしくはヘミアセタール官能化ヒドロキシエチルデンプンまたはアルデヒドもしくはケトもしくはヘミアセタール官能化ヒドロキシエチルデンプン誘導体を、タンパク質のN末端アミノ基に選択的に連結する方法であって、前記ヒドロキシアルキルデンプンまたはその誘導体を7以下のpH、好ましくは6以下のpHで還元的アミノ化反応に付すことを含み、前記還元的アミノ化反応が好ましくは水性媒質中で行なわれる方法に関する。また、ここで使用される使用されるヒドロキシエチルデンプンは、好ましくは、約10kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約10kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約100kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプンである。
【００９３】
アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基とアミノ基との間で起こるポリマー誘導体とタンパク質との反応は、シッフ塩基が生成する還元的アミノ化である。次いでその反応後に、少なくとも一つの還元剤でこの塩基を還元することにより、ポリマー誘導体とタンパク質の間に安定な結合を得ることができる。少なくとも一つの還元剤の存在下で反応を行なうこともできる。好ましい実施形態によれば、還元的アミノ化反応は、少なくとも一つの還元剤の存在下で行なわれる。
【００９４】
好ましい還元剤は水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、有機ボラン錯体、例えば4-(ジメチルアミノ)ピリジンボラン錯体、N-エチルジイソプロピルアミンボラン錯体、N-エチルモルホリンボラン錯体、N-メチルモルホリンボラン錯体、N-フェニルモルホリンボラン錯体、ルチジンボラン錯体、トリエチルアミンボラン錯体、またはトリメチルアミンボラン錯体である。特に好ましいのはシアノ水素化ホウ素ナトリウムである。
【００９５】
したがって本発明は、還元的アミノ化がNaCNBH3の存在下で行なわれる、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【００９６】
したがって本発明は、還元的アミノ化が還元剤（好ましくはNaCNBH3）の存在下にpH7以下、好ましくはpH6以下の水性媒質中で行なわれる、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【００９７】
したがって本発明は、還元的アミノ化が還元剤（好ましくはNaCNBH3）の存在下にpH7以下、好ましくはpH6以下の水性媒質中、４〜21℃の温度で行なわれる、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【００９８】
反応に使用するポリマー誘導体：タンパク質のモル比は、好ましくは、200：1〜10：1、より好ましくは100：1〜10：1、特に好ましくは75：1〜20：1の範囲にある。
【００９９】
したがって本発明は、コンジュゲートを製造する方法であって、アルデヒド基を含むポリマーまたはポリマー誘導体を、水性媒質中で、還元剤（好ましくはNaCNBH3）の存在下にタンパク質のアミノ基と反応させることを含む方法にも関する。
【０１００】
開環酸化反応によってポリマーに導入される少なくとも二つのアルデヒド基をポリマーが含む、本発明の第1の好ましい実施形態によれば、ポリマーは、好ましくは、式
【化２】
2007527892.tif 000003
の構造を少なくとも一つは含む。
【０１０１】
本発明のこの実施形態によれば、少なくとも一つの糖環を酸化することによって少なくとも一つ（好ましくは少なくとも二つ）のアルデヒド基を持つ開いた糖環を生成させることができる各酸化剤または酸化剤の組み合わせを使用することができる。この反応は以下の反応式によって図解される。以下の反応式では、酸化されて二つのアルデヒド基を持つ開いた環を与えるポリマーの糖環が示されている。
【化３】
2007527892.tif 000004
【０１０２】
適切な酸化剤は、なかんずく、過ヨウ素酸アルカリ金属などの過ヨウ素酸塩、またはそれらの二つ以上の混合物であり、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウムは好ましい。
【０１０３】
したがって本発明は、ポリマーが過ヨウ素酸塩を使った開環酸化反応に付されて少なくとも一つ（好ましくは少なくとも二つ）のアルデヒド基を持つポリマー誘導体を与える、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０１０４】
この酸化反応には、酸化型の還元末端または非酸化型の還元末端を持つポリマーを使用することができ、非酸化型が好ましい。
【０１０５】
したがって本発明は、非酸化型の還元末端を持つポリマーが使用される、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０１０６】
反応温度は好ましくは0〜40℃の好ましい範囲（より好ましくは0〜25℃、特に好ましくは0〜5℃）にある。反応時間は1分〜5時間の好ましい範囲（特に好ましくは10分〜4時間）にある。所望する酸化度（すなわち酸化反応の結果として得られるアルデヒド基の数）に応じて、過ヨウ素酸塩：ポリマーのモル比は適宜選択することができる。
【０１０７】
したがって本発明は、開環酸化反応が0〜5℃の温度で行なわれる、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０１０８】
過ヨウ素酸塩によるポリマーの酸化反応は、好ましくは水性媒質中、最も好ましくは水中で行なわれる。
【０１０９】
したがって本発明は、開環酸化反応が水性媒質中で行なわれる、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。反応混合物の適切なpH値は、少なくとも一つの適切な緩衝液を加えることによって調節することができる。好ましい緩衝液のうち、酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液またはホウ酸緩衝液を挙げることができる。
【０１１０】
前記開環酸化反応に付されるヒドロキシエチルデンプンは、好ましくは、約10kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約10kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または12kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または18kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または50kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約100kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプンである。
【０１１１】
得られたポリマー誘導体は、少なくとも一つの適切な方法によって、反応混合物から精製することができる。必要であれば、少なくとも一つの適切な方法により、単離に先だってポリマー誘導体を沈殿させてもよい。
【０１１２】
ポリマー誘導体をまず沈殿させる場合は、例えば反応混合物を、反応混合物中に存在する溶媒または溶媒混合物以外の少なくとも一つの溶媒または溶媒混合物と、適切な温度で接触させることができる。水性媒質（好ましくは水）を溶媒として使用する本発明の特に好ましい実施形態によれば、反応混合物を2-プロパノールまたはアセトンとエタノールの混合物（好ましくは1：1（v/v）混合物、すなわち等体積の前記化合物）と、好ましくは-20〜＋50℃の範囲の温度、特に好ましくは-20〜25℃の範囲の温度で接触させる。
【０１１３】
ポリマー誘導体の単離は、一段階以上を含みうる適切な工程によって行なうことができる。本発明の好ましい実施形態によれば、ポリマー誘導体をまず反応混合物または反応混合物と例えば水性2-プロパノール混合物との混合物から、遠心分離または濾過などの適切な方法によって分離する。第2段階では、分離したポリマー誘導体をさらなる処理、例えば透析、遠心濾過もしくは加圧濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、HPLC、MPLC、ゲル濾過および/または凍結乾燥のような後処理に付すことができる。さらに好ましい実施形態によれば、分離したポリマー誘導体をまず（好ましくは水に対して）透析し、次に、所望する生成物の仕様に応じて反応生成物の溶媒含量が十分に低くなるまで、凍結乾燥する。凍結乾燥は20〜35℃、好ましくは20〜30℃の温度で行なうことができる。
【０１１４】
好ましい実施形態によれば、例えば望ましくない低分子量の塩類およびポリマー成分を除去するために、またそれによって酸化型ポリマーの分子量範囲を制御する手段とするために、酸化反応によってもたらされる酸化型ポリマーを、少なくとも一つの適切な方法、例えば限外濾過および/または透析などを使って精製する。
【０１１５】
酸化型ポリマーは、タンパク質との反応に直接使用することができるか、または第1段階として例えば凍結乾燥などによって適切に回収し、水に再溶解してから、第2段階としてタンパク質へのコンジュゲーションを行なう。タンパク質の少なくとも一つのアミノ基をポリマーの少なくとも一つのアルデヒド基と還元的アミノ化によって結合させる反応については、還元的アミノ化反応の具体的反応パラメータ（例えばpHまたは温度）に関する上記の詳細な開示を参照されたい。本発明の特に好ましい実施形態によれば、ｒｈＩＬ ２、ｒｈＩＬ ３、ｒｈＩＦＮアルファ、ｒｈＩＦＮベータ、ｒｈＥＰＯ、ｒｈＡＴ ＩＩＩ、ＢＳＡ、ミオグロビンおよびＳＯＤをタンパク質として使用する場合によれば、還元的アミノ化が、好ましくは、0〜5℃の温度（例えば約4℃）、約4.5〜5.5のpH（例えば約5.0）で、約20〜30時間の反応時間（例えば約24時間）にわたって行なわれる。
【０１１６】
第2の好ましい実施形態によれば、ポリマーと反応させることができる少なくとも一つの官能基Mを含み、かつアルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基である少なくとも一つの官能基Q（タンパク質のアミノ基と還元的アミノ化によって反応させるもの）を含む少なくとも二官能性である化合物と、ポリマーを反応させる。
【０１１７】
アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基の他に少なくとも一つのカルボキシ基または少なくとも一つの反応性カルボキシ基、好ましくは一つのカルボキシ基または一つの反応性カルボキシ基を持つ化合物を使用することが好ましい。アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基およびカルボキシ基または反応性カルボキシ基は、任意の適切なスペーサーによって分離することができる。なかんずく、スペーサーは置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状および/または環状炭化水素残基であることができる。一般に、この炭化水素残基は1〜60個、好ましくは1〜40個、より好ましくは1〜20個、より好ましくは2〜10個、より好ましくは2〜6個、特に好ましくは2〜4個の炭素原子を持つ。ヘテロ原子が存在する場合、分離基は一般に1〜20個、好ましくは1〜8個、特に好ましくは1〜4個のヘテロ原子を含む。炭化水素残基は、例えば5〜7個の炭素原子を持つ分岐していてもよいアルキル鎖またはアリール基またはシクロアルキル基を含むか、アラルキル基、アルカリール基（アルキル部分は直鎖状および/または環状アルキル基であることができる）であることができる。さらに好ましい実施形態によれば、炭化水素残基は5〜7個（好ましくは6個）の炭素原子を持つアリール残基である。最も好ましくは、炭化水素残基はベンゼン残基である。この好ましい実施形態によれば、カルボキシ基およびアルデヒド基はベンゼン環の1,4位、1,3位または1,2位に位置することができ、1,4位は好ましい。
【０１１８】
反応性カルボキシ基としては、反応性エステル、イソチオシアネートまたはイソシアネートを挙げることができる。好ましい反応性エステルは、N-ヒドロキシスクシンイミド類、例えばN-ヒドロキシスクシンイミドもしくはスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド、適切に置換されたフェノール類、例えばp-ニトロフェノール、o,p-ジニトロフェノール、o,o'-ジニトロフェノール、トリクロロフェノール、例えば2,4,6-トリクロロフェノールもしくは2,4,5-トリクロロフェノール、トリフルオロフェノール、例えば2,4,6-トリフルオロフェノールもしくは2,4,5-トリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、ペンタフルオロフェノール、またはヒドロキシアゾール類、例えばヒドロキシベンゾトリアゾールから誘導される。特に好ましいのはN-ヒドロキシスクシンイミド類であり、N-ヒドロキシスクシンイミドおよびスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミドはとりわけ好ましい。アルコール類は全て単独で、またはその二つ以上の適切な組み合わせとして、使用することができる。反応性エステルとして、ペンタフルオロフェニルエステルおよびN-ヒドロキシスクシンイミドエステルは、特に好ましい。
【０１１９】
したがって、好ましい実施形態によれば、本発明は、ポリマーをホルミル安息香酸と反応させる、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０１２０】
もう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、ポリマーをホルミル安息香酸ペンタフルオロフェニルエステルと反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０１２１】
さらにもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、ポリマーをホルミル安息香酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０１２２】
さらにもう一つの実施形態によれば、本発明は、ポリマーを4-(4-ホルミル-3,5-ジメトキシフェノキシ)酪酸と反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０１２３】
もう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、ポリマーを、アルファ-ケトカルボン酸、シアル酸またはその誘導体およびピリドキサールリン酸からなる群より選択される生体適合性化合物である二官能性化合物と反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０１２４】
アルファ-ケトカルボン酸について述べると、これらは好ましくはアミノ酸から誘導されるアルファ-ケトカルボン酸であり、ほとんどの場合、人体にも見いだすことができる。アミノ酸から誘導される好ましいアルファ-ケトカルボン酸は、ケト-バリン、ケト-ロイシン、ケト-イソロイシンおよびケト-アラニンからなる群より選択される。アルファ-ケトカルボン酸のカルボキシ基を、アミノ基であるポリマーの基Qと反応させる。それによってアミド基が形成される。次に、アルファ-ケトカルボン酸の残りの遊離ケト基を、タンパク質の官能基（特にアミノ基）と反応させることができる。それによってイミノ基が形成され、それを水素添加することができる。
【０１２５】
したがって本発明は、ポリマーをアルファ-ケトカルボン酸と反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０１２６】
シアル酸またはその誘導体について述べると、それらは好ましくは生体適合性であり、特にそれらは人体に見いだされる糖類であって、N-および/またはO-アセチル化されている。好ましい実施形態では、シアル酸はN-アセチルノイラミン酸である。これらの化合物は、そのピラノース構造ゆえに、スペーサーとしての機能を満たすために、望ましい剛性を持つ。一方、これらの化合物には選択的酸化によってアルデヒド基を導入することが可能であるだろう。シアル酸は人体に、例えばグリコシル化タンパク質のグリカン鎖中の末端単糖などとして見いだされる。
【０１２７】
好ましい実施形態では、シアル酸をアルデヒド基に選択的に酸化することができる。
【０１２８】
シアル酸またはノイラミン酸を選択的に酸化する方法は、当技術分野においては、例えばL.W.Jaques, B.F.Riesco, W.Weltner, Carbohydrate Research, 83(1980), 21-32、およびT.Masuda, S.Shibuya, M.Arai, S.Yoshida, T.Tomozawa, A.Ohno, M.Yamashita, T.Honda, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 13(2003), 669-673などから知られている。好ましくは、ポリマーのアミノ基との反応に先だって、シアル酸の酸化を行なうことができる。
【０１２９】
酸化されていてもよいシアル酸を、次に、そのカルボン酸基を介して、ポリマーのアミノ基と反応させることができる。
【０１３０】
結果として得られる化合物はアルデヒド基を含有し、それは次に、タンパク質のアミノ基と還元的アミノ化によってさらに反応させることができる。
【０１３１】
したがって本発明は、ポリマーを酸化されていてもよいシアル酸と反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０１３２】
ピリドキサールリン酸（PyP）について述べると、これは高い生体適合性を持つ二官能性化合物であり、ビタミンB6とも呼ばれる。PyPはアミノ基転移、脱炭酸、ラセミ化、およびアミノ酸側鎖の数多くの修飾に関与する補酵素である。PyP要求酵素は全て、アミノ酸と補酵素の間のシッフ塩基の形成を介して作用する。
【０１３３】
PyPのリン酸基を、ポリマー（好ましくはヒドロキシアルキルデンプン、特にヒドロキシエチルデンプン）のアミノ基と反応させて、ホルホルアミドを形成させることができる。次に、PyPのアルデヒド基をタンパク質のアミノ基と反応させて、シッフ塩基を形成させ、次にそれを還元することができる。好ましい実施形態では、コンジュゲートの構造が、HES-NH-P(O)2-O-(ピリドキサール)-CH-NH-タンパク質である。
【０１３４】
PyPの場合、ポリマーの官能基Qは、好ましくは、上述のジアミノ化合物を使ってポリマーに導入される。
【０１３５】
したがって本発明は、ポリマーをピリドキサールリン酸と反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０１３６】
M（Mは好ましくはカルボキシ基または反応性カルボキシ基であり、Qはアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基である）を含む化合物との反応に付されるヒドロキシエチルデンプンは、最も好ましくは、約10kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプンである。また、約10kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約100kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプンも考えられる。特に好ましくは、酸化型の還元末端を持つヒドロキシアルキルデンプン（さらに好ましくはヒドロキシエチルデンプン）を使用する。
【０１３７】
アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を持つ得られたポリマー誘導体を、次に、還元的アミノ化によってタンパク質のアミノ基と反応させる。タンパク質の少なくとも一つのアミノ基をポリマーの少なくとも一つのアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基と還元的アミノ化によって結合させる反応については、還元的アミノ化反応の具体的反応パラメータ（例えばpHまたは温度）に関する上記の詳細な開示を参照されたい。本発明の特に好ましい実施形態によれば、Ｇ−ＣＳＦをタンパク質として使用する場合によれば、タンパク質のアミノ基との反応は、好ましくは、0〜40℃、より好ましくは0〜25℃、特に好ましくは4〜21℃の温度で行なわれる。反応時間は好ましくは30分〜72時間、より好ましくは2〜48時間、特に好ましくは4時間〜17時間の範囲である。反応の溶媒としては水性媒質が好ましい。反応媒質のpH値は好ましくは4〜9の範囲、より好ましくは4〜8の範囲、特に好ましくは4.5〜5.5の範囲にある。
【０１３８】
第3の好ましい実施形態によれば、ポリマーを、その酸化されていてもよい還元末端で、アミノ基Mおよび官能基Qを含む少なくとも二官能性である化合物と反応させる。この場合、前記アミノ基Mを、ポリマーの酸化されていてもよい還元末端と反応させ、官能基Qを化学修飾してアルデヒド官能化ポリマー誘導体とし、それをタンパク質のアミノ基と還元的アミノ化によって反応させる。
【０１３９】
本発明に関して使用する用語「ポリマーを還元末端を介して反応させる」または「ポリマーを酸化された還元末端を介して反応させる」は、ヒドロキシアルキルデンプンを主としてその（選択的に酸化された）還元末端を介して反応させる過程をいう。該ポリマーはヒドロキシアルキルデンプンであり、特にヒドロキシエチルデンプンであることが好ましい。
【０１４０】
この用語「主としてその（選択的に酸化された）還元末端を介して」は、与えられた反応に使用されるポリマー分子のうち統計的に50％を超える量、好ましくは少なくとも55％、より好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも65％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、およびさらにより好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％、または99％を、1ポリマー分子あたり少なくとも一つの（選択的に酸化された）還元末端を介して反応させる過程をいい、この場合、少なくとも一つの還元末端を介して反応させる与えられたポリマー分子は、上記と同じ与えられた反応において、前記ポリマー分子に含まれかつ還元末端ではない少なくとも一つのさらなる適切な官能基を介して反応させることができる。1分子以上のポリマー分子を、少なくとも一つの還元末端を介して反応させると同時に、この（これらの）ポリマー分子に含まれかつ還元末端ではない少なくとも一つのさらなる適切な官能基を介して反応させる場合は、これらのポリマー分子の反応させる全官能基（還元末端を含む）のうち、統計的に好ましくは50％を超える量、好ましくは少なくとも55％、より好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも65％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも 85％、より好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％、または99％が、還元末端である。
【０１４１】
本発明に関連して使用する用語「還元末端」は、ポリマー分子の末端アルデヒド基をいい、これはアルデヒド基として、そして/または対応するアセタール型として存在することができる。還元末端が酸化されると、アルデヒド基またはアセタール基は、カルボキシ基の形態および/または対応するラクトンの形態をとる。
【０１４２】
官能基Qについては、なかんずく、以下の官能基が挙げられる。
・C-C二重結合またはC-C三重結合または芳香族C-C結合；
・チオ基またはヒドロキシ基；
・アルキルスルホン酸ヒドラジド、アリールスルホン酸ヒドラジド；
・1,2-ジオール；
・1,2-アミノ-チオアルコール；
・アジド；
・1,2-アミノアルコール；
・アミノ基-NH2、または構造単位-NH-を含むアミノ基の誘導体、例えばアミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリールアミノ基；
・ヒドロキシルアミノ基-O-NH2、または構造単位-O-NH-を含むヒドロキシルアミノ基の誘導体、例えばヒドロキシルアルキルアミノ基、ヒドロキシルアリールアミノ基、ヒドロキシルアラルキルアミノ基、またはヒドロキシルアルカリールアミノ基；
・それぞれに構造単位-NH-O-を含む、アルコキシアミノ基、アリールオキシアミノ基、アラルキルオキシアミノ基、またはアルカリールオキシアミノ基；
・カルボニル基を持つ残基-Q-C(=G)-M
［式中、GはOまたはSであり、Mは例えば
・・-OHまたは-SH；
・・アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、またはアルカリールオキシ基；
・・アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルチオ基、またはアルカリールチオ基；
・・アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、アラルキルカルボニルオキシ基、アルカリールカルボニルオキシ基；
・・活性化エステル、例えばイミド構造を持つヒドロキシルアミン（例えばN-ヒドロキシスクシンイミド）のエステル、もしくは構造単位O-Nを持ち、Nがヘテロアリール化合物の一部であるヒドロキシルアミンのエステル、またはG＝OでありかつQが存在しない場合に、例えばペンタフルオロフェニル、パラニトロフェニルもしくはトリクロロフェニルなどの置換アリール残基を持つアリールオキシ化合物；
であり、Qは存在しないか、NHまたはSもしくはOなどのヘテロ原子である］；
・-NH-NH2、または-NH-NH-；
・-NO2；
・ニトリル基；
・カルボニル基、例えばアルデヒド基またはケト基；
・カルボキシ基；
・-N=C=O基または-N=C=S基；
・ハロゲン化ビニル基、例えばヨウ化ビニル基もしくは臭化ビニル基、またはトリフラート；
・-C≡C-H；
・-(C=NH2Cl)-Oアルキル
・基-(C=O)-CH2-Hal［式中、HalはCl、Br、またはIである］；
・-CH=CH-SO2-；
・構造-S-S-を含むジスルフィド基；
【化４】
2007527892.tif 000005
【０１４３】
本発明の好ましい実施形態によれば、用語「官能基Q」は、化学構造-NH-（例えば、-NH2）または構造単位-NH-を含有する該アミノ基の誘導体（例えば、アミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリールアミノ基）を含む官能基Qをいう。
【０１４４】
本発明の好ましい一実施形態によれば、官能基Mは構造R'-NH-を持つ基であって、R'は水素であるか、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリールまたはシクロアルキルアリール残基であり、そのシクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリールまたはシクロアルキルアリール残基はNH基に直接連結されていてもよいし、あるいはもう一つの実施形態として、NH基に酸素橋によって連結されていてもよい。アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリール、またはシクロアルキルアリール残基は適切に置換されていてもよい。好ましい置換基として、F、ClまたはBrなどのハロゲンを挙げることができる。特に好ましい残基R'は水素、アルキル基およびアルコキシ基であり、さらに好ましいものは水素ならびに無置換アルキル基および無置換アルコキシ基である。
【０１４５】
アルキル基およびアルコキシ基のなかでは、1、2、3、4、5、または6個のC原子を持つ基が好ましい。より好ましいのはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、およびイソプロポキシ基である。特に好ましいのはメチル、エチル、メトキシ、エトキシであり、メチルまたはメトキシはとりわけ好ましい。
【０１４６】
本発明のもう一つの実施形態によれば、官能基Mは構造R'-NH-R''を持ち、ここにR''は好ましくは構造単位-NH-および/または構造単位-(C=G)-［式中、GはOまたはSである］および/または構造単位-SO2-を含む。官能基R''の具体例は
【化５】
2007527892.tif 000006
［Gが二つ存在する場合、それらは独立してOまたはSである］
である。
【０１４７】
したがって本発明は、官能基Mが
【化６】
2007527892.tif 000007
［式中、GはOまたS（二つ存在する場合は、独立してOまたはS）であり、R'はメチルである］
からなる群より選択される、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０１４８】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、官能基Mはアミノ基-NH2である。
【０１４９】
第1の選択肢によれば、アミノ基NH2である官能基Mをポリマーの酸化型還元末端と反応させて、ポリマーとMおよびQを含む化合物とを連結するアミド基を得る。
【０１５０】
第2の選択肢によれば、アミノ基NH2である官能基Mをポリマーの非酸化型還元末端と還元的アミノ化によって反応させてイミノ基を形成させ、好ましくはそれを次に水素添加してアミノ基を得る（それぞれイミノ基およびアミノ基は、ポリマーとMおよびQを含む化合物とを連結する）。この場合、官能基Qはアミノ基であることができる。得られたポリマー誘導体を、後述するようにカルボキシ基もしくは反応性カルボキシ基を介して、またはアミノ基と反応させるべき少なくとも二官能性である化合物の別の基を介して、少なくとも二官能性である化合物との後続の反応に付す場合、MおよびQを含む化合物は、官能基としてアミノ基を一つだけ含有する1級アミンであることが好ましい。この具体例では、化合物は官能基を一つしか含有しないが、これはMおよびQを含む二官能性化合物とみなされ、この場合、Mはポリマーの還元末端との還元的アミノ化に付される化合物に含有されるアミノ基であり、Qは還元的アミノ化とそれに続く水素添加の結果として得られる2級アミノ基である。
【０１５１】
第3の選択肢によれば、ポリマーの非酸化型還元末端を還元的アミノ化によってアンモニアと反応させて、ポリマーの末端イミノ基を生成させ、好ましくはそれを次に水素添加してポリマーの末端アミノ基、したがって末端1級アミノ基とする。この具体例では、アンモニアがMおよびQを含む二官能性化合物とみなされ、この場合、Mは使用するアンモニアに含まれるNH2であり、Qは還元的アミノ化とそれに続く水素添加の結果として得られる1級アミノ基である。
【０１５２】
用語「アミノ基Q」は、化学構造-NH-（例えば、-NH2）または構造単位-NH-を含有する該アミノ基の誘導体（例えば、アミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリールアミノ基）を含む官能基Qをいう。
【０１５３】
本発明の好ましい実施形態によれば、官能基Qは構造R'-NH-を持つ基であって、R'は水素であるか、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリールまたはシクロアルキルアリール残基であり、そのシクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリールまたはシクロアルキルアリール残基はNH基に直接連結されていてもよいし、あるいはもう一つの実施形態として、NH基に酸素橋によって連結されていてもよい。アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリール、またはシクロアルキルアリール残基は、適切に置換されていてもよい。好ましい置換基として、F、ClまたはBrなどのハロゲンを挙げることができる。特に好ましい残基R'は水素、アルキル基およびアルコキシ基であり、さらに好ましくは水素ならびに無置換アルキル基および無置換アルコキシ基である。
【０１５４】
アルキル基およびアルコキシ基のなかでは、1、2、3、4、5、または6個のC原子を持つ基が好ましい。より好ましいのはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、およびイソプロポキシ基である。特に好ましいのはメチル、エチル、メトキシ、エトキシであり、メチルまたはメトキシはとりわけ好ましい。
【０１５５】
本発明のもう一つの実施形態によれば、官能基Qは構造R'-NH-R''を持ち、R''は好ましくは構造単位-NH-および/または構造単位-(C=G)-［GはOまたはSである］および/または構造単位-SO2-を含む。より好ましい実施形態によれば、官能基R''は
【化７】
2007527892.tif 000008
［Gが二つ存在する場合、それらは独立してOまたはSである］
からなる群より選択される。
【０１５６】
したがって、本発明は、官能基Qが
【化８】
2007527892.tif 000009
［式中、GはOまたはS（二つ存在する場合は、独立してOまたはS）であり、R'はメチルである］
からなる群より選択される、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０１５７】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、官能基Qはアミノ基-NH2である。
【０１５８】
本発明のさらにもう一つの好ましい実施形態によれば、MおよびQはどちらもアミノ基-NH-を含む。特に好ましい実施形態によれば、MおよびQはどちらもアミノ基-NH2である。
【０１５９】
本発明の好ましい実施形態によれば、MおよびQを含む化合物はホモ二官能性化合物であり、より好ましくは官能基MおよびQとしてアミノ基-NH2を含むホモ二官能性化合物であるか、別の実施形態によれば、ヒドロキシアミノ基-O-NH2または基
【化９】
2007527892.tif 000010
［Gは好ましくはOである］
を持つホモ二官能性化合物である。MおよびQを含むこれらの化合物の具体例は、
【化１０】
2007527892.tif 000011
である。
【０１６０】
Mを含む化合物（Mは好ましくはアミノ基-NH-であり、より好ましくはアミノ基-NH2であり、さらに好ましくはMおよびQはどちらもアミノ基-NH-を含み、特に好ましくはMおよびQがどちらもアミノ基-NH2を含む）との反応に付されるヒドロキシエチルデンプンは、好ましくは、約10kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約10kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプンである。また、約12kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約12kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約18kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.4のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約50kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプン、または約100kDの平均分子量および約0.7のDSを持つヒドロキシエチルデンプンも考えられる。
【０１６１】
MおよびQがどちらもアミノ基-NH2である場合、MおよびQは任意の適切なスペーサーによって分離することができる。なかんずく、スペーサーは置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状および/または環状炭化水素残基であることができる。一般に、この炭化水素残基は1〜60個、好ましくは1〜40個、より好ましくは1〜20個、より好ましくは2〜10個、より好ましくは2〜6個、特に好ましくは2〜4個の炭素原子を持つ。ヘテロ原子が存在する場合、分離基は一般に1〜20個、好ましくは1〜8個、特に好ましくは1〜4個のヘテロ原子を含む。炭化水素残基は、例えば5〜7個の炭素原子を持つ分岐していてもよいアルキル鎖またはアリール基またはシクロアルキル基を含むか、アラルキル基、アルカリール基（アルキル部分は直鎖状および/または環状アルキル基であることができる）であることができる。さらに好ましい実施形態によれば、炭化水素残基は炭素原子数1〜20、好ましくは2〜10、より好ましくは2〜6、特に好ましくは2〜4のアルキル鎖である。
【０１６２】
したがって本発明は、ポリマーを1,4-ジアミノブタン、1,3-ジアミノプロパンまたは1,2-ジアミノエタンと反応させてポリマー誘導体を得る、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０１６３】
MおよびQを含む少なくとも二官能性である化合物とポリマーとの反応は、好ましくは、0〜100℃、より好ましくは4〜80℃、特に好ましくは20〜80℃の温度で行なわれ、反応時間は好ましくは4時間〜7日間、より好ましくは10時間〜5日間、特に好ましくは17〜4時間の範囲である。少なくとも二官能性である化合物：ポリマーのモル比は、好ましくは10〜200、具体的には50〜100の範囲にある。
【０１６４】
少なくとも二官能性である化合物とポリマーとの反応の溶媒としては、少なくとも一つの非プロトン性溶媒、特に好ましくは、0.5重量パーセントを超えない（好ましくは0.1重量％を超えない）含水率を持つ無水非プロトン性溶媒が好ましい。適切な溶媒は、なかんずく、ジメチルスルホキシド（DMSO）、N-メチルピロリドン、ジメチルアセトアミド（DMA）、ジメチルホルムアミド（DMF）およびそれらの二つ以上の混合物である。
【０１６５】
少なくとも二官能性である化合物とポリマーとの反応の溶媒としては、水性媒質も使用することができる。
【０１６６】
好ましい実施形態によれば、ポリマーと少なくとも二官能性である化合物とを含むポリマー誘導体を、遊離の官能基Qで化学修飾して、アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を含むポリマー誘導体を得る。この実施形態によれば、官能基Qと反応させることができる官能基と、アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基とを含む少なくとも一つの少なくとも二官能性である化合物と、ポリマー誘導体を反応させることが好ましい。
【０１６７】
少なくとも二官能性である化合物としては、アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基と、ポリマー誘導体の官能基Qとの結合を形成する能力を持つ少なくとも一つの官能基とを持つ各化合物が、適切である。少なくとも一つの官能基は、Qと同じ官能基群から選択され、Qと反応させることができるように選ばれる。Qがアミノ基-NH2、または構造単位-NH-を含有する該アミノ基の誘導体（例えば、アミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリールアミノ基）である好ましい例では、アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基の他に少なくとも一つのカルボキシ基または少なくとも一つの反応性カルボキシ基（好ましくは一つのカルボキシ基または一つの反応性カルボキシ基）を持つ化合物を使用することが好ましい。アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基とカルボキシ基または反応性カルボキシ基は、任意の適切なスペーサーによって分離することができる。なかんずく、スペーサーは置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状および/または環状の炭化水素残基であることができる。一般に、この炭化水素残基は1〜60個、好ましくは1〜40個、より好ましくは1〜20個、より好ましくは2〜10個、より好ましくは2〜6個、特に好ましくは2〜4個の炭素原子を持つ。ヘテロ原子が存在する場合、分離基は一般に1〜20個、好ましくは1〜8個、特に好ましくは1〜4個のヘテロ原子を含む。炭化水素残基は、例えば5〜7個の炭素原子を持つ分岐していてもよいアルキル鎖またはアリール基またはシクロアルキル基を含むか、アラルキル基、アルカリール基（アルキル部分は直鎖状および/または環状アルキル基であることができる）であることができる。
【０１６８】
好ましい実施形態によれば、炭化水素残基は2〜6個（好ましくは2〜4個）の炭素原子を持つアルキル基である。アルデヒド基またはケト基とカルボキシ基の間には炭素原子が存在しなくてもよい。あるいは、炭化水素残基は3〜11個（好ましくは3〜6個または3〜5個）の炭素原子を持つ置換または無置換環状炭化水素基であることができる。環状炭化水素基が置換される場合、置換基は、置換もしくは無置換アミノ基または置換もしくは無置換アルコキシ基からなる群より選択することができる。置換基が存在する場合、置換基の数は好ましくは1〜3個である。さらに、アルキル基および/または環状炭化水素基は、OまたはSなどの一つ以上のヘテロ原子（特にO）を含有することができる。その場合は、好ましくは1〜3個、特に1〜2個のヘテロ原子が存在する。これに関連して好ましい化合物は、以下の化合物群から選択される。
【化１１】
2007527892.tif 000012
【０１６９】
さらに好ましい実施形態によれば、炭化水素残基は5〜7個（好ましくは6個）の炭素原子を持つアリール残基である。最も好ましくは、炭化水素残基はベンゼン残基である。この好ましい実施形態によれば、カルボキシ基およびアルデヒド基はベンゼン環の1,4位、1,3位または1,2位に位置することができ、1,4位は好ましい。
【０１７０】
反応性カルボキシ基としては、反応性エステル、イソチオシアネートまたはイソシアネートを挙げることができる。好ましい反応性エステルは、N-ヒドロキシスクシンイミド類、例えばN-ヒドロキシスクシンイミドもしくはスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド、適切に置換されたフェノール類、例えばp-ニトロフェノール、o,p-ジニトロフェノール、o,o'-ジニトロフェノール、トリクロロフェノール、例えば2,4,6-トリクロロフェノールもしくは2,4,5-トリクロロフェノール、トリフルオロフェノール、例えば2,4,6-トリフルオロフェノールもしくは2,4,5-トリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、ペンタフルオロフェノール、またはヒドロキシアゾール類、例えばヒドロキシベンゾトリアゾールから誘導される。特に好ましいのはN-ヒドロキシスクシンイミド類であり、N-ヒドロキシスクシンイミドおよびスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミドはとりわけ好ましい。アルコール類は全て単独で、またはその二つ以上の適切な組み合わせとして、使用することができる。反応性エステルとして、ペンタフルオロフェニルエステルおよびN-ヒドロキシスクシンイミドエステルは、特に好ましい。
【０１７１】
具体的一実施形態によれば、官能基Q（Qは好ましくはNH2または構造単位-NH-を含むアミノ基の誘導体、例えばアミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリールアミノ基であり、特にNH2である）と化学結合を形成することができる官能基は、反応性カルボキシ基である。
【０１７２】
この場合は、官能基Qと化学結合を形成する能力を持ちかつカルボキシ基である官能基を適切に反応させて、上述の反応性カルボキシ基を得る。したがって、カルボキシ基およびアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を含む少なくとも一つの少なくとも二官能性である化合物を、カルボキシ基が反応性カルボキシ基に変換される反応に付すことが好ましく、その結果得られる少なくとも二官能性である化合物を精製し、ポリマー誘導体の官能基Qと反応させる。
【０１７３】
反応性カルボキシ基を得るために反応させることができるカルボキシ基を含む少なくとも二官能性である化合物の具体例は、上の一覧の化合物1〜11である。この文脈において用語「カルボキシ基」はラクトンおよびジカルボン酸化合物の分子内無水物をもいう。
【０１７４】
したがって好ましい実施形態によれば、本発明は、Qを含むポリマー誘導体（Qはアミノ基-NH2または構造単位-NH-を含有する該アミノ基の誘導体（例えば、アミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリールアミノ基）である）をさらにホルミル安息香酸と反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０１７５】
もう一つの実施形態によれば、本発明は、Qを含むポリマー誘導体（Qはアミノ基である）をさらにホルミル安息香酸ペンタフルオロフェニルエステルと反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０１７６】
さらにもう一つの実施形態によれば、本発明は、Qを含むポリマー誘導体（Qはアミノ基である）をさらにホルミル安息香酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０１７７】
さらにもう一つの実施形態によれば、本発明は、Qを含むポリマー誘導体（Qはアミノ基である）をさらに4-(4-ホルミル-3,5-ジメトキシフェノキシ)酪酸と反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０１７８】
もう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、ポリマーを、アルファ-ケトカルボン酸、シアル酸またはその誘導体およびピリドキサールリン酸からなる群より選択される生体適合性化合物である二官能性化合物と反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０１７９】
アルファ-ケトカルボン酸について述べると、これらは好ましくはアミノ酸から誘導されるアルファ-ケトカルボン酸であり、ほとんどの場合、人体にも見いだすことができる。アミノ酸から誘導される好ましいアルファ-ケトカルボン酸は、ケト-バリン、ケト-ロイシン、ケト-イソロイシンおよびケト-アラニンからなる群より選択される。アルファ-ケトカルボン酸のカルボキシ基を、アミノ基であるポリマーの基Qと反応させる。それによってアミド基が形成される。次に、アルファ-ケトカルボン酸の残りの遊離ケト基を、タンパク質の官能基（特にアミノ基）と反応させることができる。それによってイミノ基が形成され、それを水素添加することができる。
【０１８０】
したがって本発明は、ポリマーをアルファ-ケトカルボン酸と反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０１８１】
シアル酸またはその誘導体について述べると、それらは好ましくは生体適合性であり、特にそれらは人体に見いだされる糖類であって、N-および/またはO-アセチル化されている。好ましい実施形態では、シアル酸はN-アセチルノイラミン酸である。これらの化合物は、そのピラノース構造ゆえに、スペーサーとしての機能を満たすために、望ましい剛性を持つ。一方、これらの化合物には選択的酸化によってアルデヒド基を導入することが可能であるだろう。シアル酸は人体に、例えばグリコシル化タンパク質のグリカン鎖中の末端単糖などとして見いだされる。
【０１８２】
好ましい実施形態では、シアル酸をアルデヒド基に選択的に酸化することができる。
【０１８３】
シアル酸またはノイラミン酸を選択的に酸化する方法は、当技術分野においては、例えばL.W.Jaques, B.F.Riesco, W.Weltner, Carbohydrate Research, 83(1980), 21-32、およびT.Masuda, S.Shibuya, M.Arai, S.Yoshida, T.Tomozawa, A.Ohno, M.Yamashita, T.Honda, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 13(2003), 669-673などから知られている。好ましくは、ポリマーのアミノ基との反応に先だって、シアル酸の酸化を行なうことができる。
【０１８４】
酸化されていてもよいシアル酸を、次に、そのカルボン酸基を介して、ポリマーのアミノ基と反応させることができる。
【０１８５】
結果として得られる化合物はアルデヒド基を含有し、それは次に、タンパク質のアミノ基と還元的アミノ化によってさらに反応させることができる。
【０１８６】
したがって本発明は、ポリマーを酸化されていてもよいシアル酸と反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０１８７】
ピリドキサールリン酸（PyP）について述べると、これは高い生体適合性を持つ二官能性化合物であり、ビタミンB6とも呼ばれる。PyPはアミノ基転移、脱炭酸、ラセミ化、およびアミノ酸側鎖の数多くの修飾に関与する補酵素である。PyP要求酵素は全て、アミノ酸と補酵素の間のシッフ塩基の形成を介して作用する。
【０１８８】
PyPのリン酸基を、ポリマー（好ましくはヒドロキシアルキルデンプン、特にヒドロキシエチルデンプン）のアミノ基と反応させて、ホルホルアミドを形成させることができる。次に、PyPのアルデヒド基をタンパク質のアミノ基と反応させて、シッフ塩基を形成させ、次にそれを還元することができる。好ましい実施形態では、コンジュゲートの構造が、HES-NH-P(O)2-O-(ピリドキサール)-CH-NH-タンパク質である。
【０１８９】
PyPの場合、ポリマーの官能基Qは、好ましくは、上述のジアミノ化合物を使ってポリマーに導入される。
【０１９０】
したがって本発明は、ポリマーをピリドキサールリン酸と反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０１９１】
アミノ基を含むポリマー誘導体と例えばホルミル安息香酸との反応の溶媒としては、少なくとも一つの非プロトン性溶媒または少なくとも一つの極性溶媒が好ましい。適切な溶媒は、なかんずく、水、ジメチルスルホキシド（DMSO）、N-メチルピロリドン、ジメチルアセトアミド（DMA）、ジメチルホルムアミド（DMF）およびそれらの二つ以上の混合物である。
【０１９２】
アミノ基を含むポリマー誘導体とカルボキシ基をふくむ少なくとも二官能性である化合物との反応の溶媒としては、水性媒質を使用することもできる。本発明のこの文脈で使用する用語「水性媒質」は、関与する溶媒の重量を基準にして、少なくとも10重量％または少なくとも20重量％または少なくとも30重量％または少なくとも40重量％または少なくと50重量％または少なくとも60重量％または少なくとも70重量％または少なくとも80重量％または少なくとも90重量％または100重量％までの範囲の水を含む溶媒または溶媒の混合物をいう。
【０１９３】
反応は、好ましくは、0〜40℃、より好ましくは0〜25℃、特に好ましくは15〜25℃の温度で、好ましくは0.5〜24時間、特に好ましくは1〜17時間の反応時間にわたって行なわれる。
【０１９４】
好ましい実施形態によれば、反応は活性化剤の存在下で行なわれる。適切な活性化剤は、なかんずく、カルボジイミド類、例えばジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、ジシクロヘキシルカルボジイミド類（DCC）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）などであり、ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）は特に好ましい。
【０１９５】
得られたポリマー誘導体は、少なくとも一つの適切な方法によって、反応混合物から精製することができる。必要であれば、少なくとも一つの適切な方法により、単離に先だってポリマー誘導体を沈殿させてもよい。
【０１９６】
ポリマー誘導体をまず沈殿させる場合は、例えば反応混合物を、反応混合物中に存在する溶媒または溶媒混合物以外の少なくとも一つの溶媒または溶媒混合物と、適切な温度で接触させることができる。水性媒質（好ましくは水）を溶媒として使用する本発明の特に好ましい実施形態によれば、反応混合物を2-プロパノールまたはアセトンとエタノールの混合物（好ましくは1：1（v/v）混合物、すなわち等体積の前記化合物）と、好ましくは-20〜＋50℃の範囲の温度、特に好ましくは-20〜25℃の範囲の温度で接触させる。
【０１９７】
ポリマー誘導体の単離は、一段階以上を含みうる適切な工程によって行なうことができる。本発明の好ましい実施形態によれば、ポリマー誘導体をまず反応混合物または反応混合物と例えば水性2-プロパノール混合物との混合物から、遠心分離または濾過などの適切な方法によって分離する。第2段階では、分離したポリマー誘導体をさらなる処理、例えば透析、遠心濾過もしくは加圧濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、HPLC、MPLC、ゲル濾過および/または凍結乾燥のような後処理に付すことができる。さらに好ましい実施形態によれば、分離したポリマー誘導体をまず（好ましくは水に対して）透析し、次に、所望する生成物の仕様に応じて反応生成物の溶媒含量が十分に低くなるまで、凍結乾燥する。凍結乾燥は20〜35℃、好ましくは20〜30℃の温度で行なうことができる。
【０１９８】
次に、アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を持つ得られたポリマー誘導体を、タンパク質のアミノ基と、還元的アミノ化によって反応させる。タンパク質の少なくとも一つのアミノ基をポリマーの少なくとも一つのアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基と還元的アミノ化によって結合させる反応については、還元的アミノ化反応の具体的反応パラメータ（例えばpHまたは温度）に関する上記の詳細な開示を参照されたい。本発明の特に好ましい実施形態によれば、Ｇ−ＣＳＦをタンパク質として使用する場合によれば、還元的アミノ化が、好ましくは、温度0〜10℃、例えば1〜8℃または2〜6℃、例えば約4℃の温度、および約4.5〜5.5、例えば約5.0のpHで行なわれる。反応時間は約10〜20時間、例えば12〜19時間もしくは14〜18時間、例えば約17時間、または約20〜30時間、例えば約24時間である。本発明の特に好ましい実施態様によれば、ｒｈＩＬ ２、ｒｈＩＬ ３、ｒｈＩＦＮアルファ、ｒｈＩＦＮベータ、ｒｈＥＰＯ、ｒｈＡＴ ＩＩＩ、ＢＳＡ、ミオグロビンおよびＳＯＤをタンパク質として使用する場合によれば、該還元的アミノ化は、温度が０℃〜５℃（例えば、約４℃）、ｐＨが約４．５〜５．５（例えば、約５．０）、および反応時間が約２０〜３０時間（例えば、約２４時間）で実施することが好ましい。
【０１９９】
したがって上述の好ましい実施形態によれば、本発明は、ポリマーをその酸化型還元末端を介して反応させた場合に、式
【化１２】
2007527892.tif 000013
のコンジュゲートに関する。
【０２００】
特に好ましい実施形態によれば、上述のように、ポリマーはヒドロキシエチルデンプン（すなわちHAS'はHES'）であり、n＝2、3、または4（最も好ましくは4）である。したがって、ポリマーをその酸化型還元末端を介して反応させた場合、本発明は、式
【化１３】
2007527892.tif 000014
のコンジュゲートにも関する。
【０２０１】
もう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、ポリマーをその酸化型還元末端を介して反応させた場合に、式
【化１４】
2007527892.tif 000015
［式中、n＝2、3、または4であり、R4は、独立して、水素またはメトキシ基であり、R4が水素である場合はm＝0であり、R4がメトキシである場合はm＝1であり、HASは好ましくはHES'である］
のコンジュゲートにも関する。
【０２０２】
上式のそれぞれにおいて、タンパク質に結合している窒素は、ポリマー誘導体がアルデヒド基を介して連結されるタンパク質のアミノ基に由来する。
【０２０３】
官能基MおよびQがアミノ基-NH2を含む上述の実施形態については、Mがアミノ基-NH2であり、Qがベータヒドロキシアミノ基-CH(OH)-CH2-NH2を含む（好ましくはベータヒドロキシアミノ基である）こともできる。
【０２０４】
したがって本発明は、二つのアミノ基MおよびQを含む化合物のアミノ基Qがベータヒドロキシアミノ基-CH(OH)-CH2-NH2である、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０２０５】
この場合、MおよびQは、任意の適切なスペーサーによって分離することができる。なかんずく、スペーサーは置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状および/または環状の炭化水素残基であることができる。一般に、この炭化水素残基は1〜60個、好ましくは1〜40個、より好ましくは1〜20個、より好ましくは2〜10個、より好ましくは1〜6個、特に好ましくは1〜2個の炭素原子を持つ。ヘテロ原子が存在する場合、分離基は一般に1〜20個、好ましくは1〜8個、特に好ましくは1〜4個のヘテロ原子を含む。炭化水素残基は、例えば5〜7個の炭素原子を持つ分岐していてもよいアルキル鎖またはアリール基またはシクロアルキル基を含むか、アラルキル基、アルカリール基（アルキル部分は直鎖状および/または環状アルキル基であることができる）であることができる。さらに好ましい実施形態によれば、炭化水素残基は炭素原子数1〜20、好ましくは1〜10、より好ましくは1〜6、より好ましくは1〜4、特に好ましくは炭素原子数1〜2のアルキル鎖である。さらに好ましくは、MおよびQはメチレン基によって分離される。
【０２０６】
したがって本発明は、ポリマーを1,3-ジアミノ-2-ヒドロキシプロパンと反応させる、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０２０７】
ポリマーをその酸化型還元末端を介して反応させると、式
【化１５】
2007527892.tif 000016
［特に好ましくはHAS'＝HES'である］
のポリマー誘導体が得られる。
【０２０８】
MおよびQを含む少なくとも二官能性である化合物（特に好ましくは1,3-ジアミノ-2-ヒドロキシプロパン）とポリマーとの反応は、好ましくは、40〜120℃、より好ましくは40〜90℃、特に好ましくは60〜80℃の温度で行なわれる。反応時間は、好ましくは、17〜168時間、より好ましくは17〜96時間、特に好ましくは48〜96時間の範囲である。少なくとも二官能性である化合物：ポリマーのモル比は、好ましくは200：1〜10：1、具体的には50：1〜100：1の範囲にある。
【０２０９】
少なくとも二官能性である化合物とポリマーとの反応の溶媒としては、少なくとも一つの非プロトン性溶媒（好ましくは、0.5重量パーセントを超えない（好ましくは0.1重量％を超えない）含水率を持つ無水非プロトン性溶媒）が好ましい。適切な溶媒は、なかんずく、ジメチルスルホキシド（DMSO）、N-メチルピロリドン、ジメチルアセトアミド（DMA）、ジメチルホルムアミド（DMF）およびそれらの二つ以上の混合物である。
【０２１０】
ポリマー誘導体のベータヒドロキシアミノ基Qは、一般に、Qと反応させることができる少なくとも一つの官能基を含みかつアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基である少なくとも一つの官能基またはアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基が生じるように修飾することができる官能基を含む少なくとも二官能性である化合物と、反応させることができる。本発明のもう一つの実施形態によれば、化学的酸化によってアルデヒド基を生じるように、ベータヒドロキシアミノ基を直接化学修飾する。
【０２１１】
この酸化は、ベータヒドロキシアミノ基をアルデヒド基に変換する能力を持つ適切な酸化剤のどれを使っても行なうことができる。好ましい酸化試薬は過ヨウ素酸アルカリ金属などの過ヨウ素酸塩である。特に好ましいのは過ヨウ素酸ナトリウムであり、好ましくはこれを水溶液として使用する。この溶液は、1〜50mMの好ましいヨウ素酸塩濃度（より好ましくは1〜25mM、特に好ましくは1〜10mM）を持つ。酸化は0〜40℃、好ましくは0〜25℃、特に好ましくは4〜20℃の温度で行なわれる。
【０２１２】
得られたポリマー誘導体は、少なくとも一つの適切な方法によって、反応混合物から精製することができる。必要であれば、少なくとも一つの適切な方法により、単離に先だってポリマー誘導体を沈殿させてもよい。
【０２１３】
ポリマー誘導体をまず沈殿させる場合は、例えば反応混合物を、反応混合物中に存在する溶媒または溶媒混合物以外の少なくとも一つの溶媒または溶媒混合物と、適切な温度で接触させることができる。水性媒質（好ましくは水）を溶媒として使用する本発明の特に好ましい実施形態によれば、反応混合物を2-プロパノールまたはアセトンとエタノールの混合物（好ましくは1：1（v/v）混合物、すなわち等体積の前記化合物）と、好ましくは-20〜＋50℃の範囲の温度、特に好ましくは-20〜25℃の範囲の温度で接触させる。
【０２１４】
ポリマー誘導体の単離は、一段階以上を含みうる適切な工程によって行なうことができる。本発明の好ましい実施形態によれば、ポリマー誘導体をまず反応混合物または反応混合物と例えば水性2-プロパノール混合物との混合物から、遠心分離または濾過などの適切な方法によって分離する。第2段階では、分離したポリマー誘導体をさらなる処理、例えば透析、遠心濾過もしくは加圧濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、HPLC、MPLC、ゲル濾過および/または凍結乾燥のような後処理に付すことができる。さらに好ましい実施形態によれば、分離したポリマー誘導体をまず（好ましくは水に対して）透析し、次に、所望する生成物の仕様に応じて反応生成物の溶媒含量が十分に低くなるまで、凍結乾燥する。凍結乾燥は20〜35℃、好ましくは20〜30℃の温度で行なうことができる。
【０２１５】
したがって本発明は、過ヨウ素酸塩を使ってベータヒドロキシアミノ基Qの酸化を行なう、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０２１６】
したがって本発明は、酸化型還元末端を持つポリマーを使用する場合に、ベータヒドロキシアミノ基を持つポリマー誘導体、特に好ましくは
【化１６】
2007527892.tif 000017
［特にHAS'＝HES'］
を、好ましくは過ヨウ素酸塩を使って、アルデヒド基を持つポリマー誘導体、特に好ましくは
【化１７】
2007527892.tif 000018
［特にHAS'＝HES'］
に酸化する、コンジュゲートの製造方法にも関する。
【０２１７】
本発明によれば、上記の1-アミノ2-ヒドロキシ構造を含む化合物を、カルボキシ基または反応性カルボキシ基およびアルデヒド基、ケト基またはアセタール基を含む上述の少なくとも二官能性である化合物と反応させてポリマー誘導体を取得し、それをタンパク質のアミノ基との還元的アミノ化に付すこともできる。
【０２１８】
その結果得られるアルデヒド基Aを持つポリマー誘導体を、次に、タンパク質と反応させる。したがって本発明は、コンジュゲートの製造方法であって、ベータヒドロキシアミノ基を持つポリマー誘導体（酸化型還元末端を持つポリマーを使用した場合、特に好ましくは式
【化１８】
2007527892.tif 000019
［特にHAS'＝HES'］
のポリマー誘導体）を、タンパク質のアミノ基と反応させることを含む方法にも関する。
【０２１９】
アルデヒド基を持つ得られたポリマー誘導体を、次に、タンパク質のアミノ基と還元的アミノ化によって反応させる。タンパク質の少なくとも一つのアミノ基をポリマーの少なくとも一つのアルデヒド基と還元的アミノ化によって結合させる反応については、上記の詳細な開示を参照されたい。
【０２２０】
したがって上述の好ましい実施形態によれば、本発明は、式
【化１９】
2007527892.tif 000020
［特にHAS'＝HES'］
のコンジュゲートにも関する（酸化型還元末端を持つポリマーを使用した場合）。上式において、タンパク質に結合している窒素は、ポリマー誘導体がアルデヒド基を介して連結されるタンパク質のアミノ基に由来する。
【０２２１】
本発明のさらなる実施形態によれば、ポリマーをまず適切な化合物と反応させて、少なくとも一つの反応性カルボキシ基を含む第1ポリマー誘導体を得る。次に、この第1ポリマー誘導体を、さらなる少なくとも二官能性である化合物と反応させる。ここでは、このさらなる化合物の少なくとも一つの官能基を、ポリマー誘導体の少なくとも一つの反応性カルボキシ基と反応させ、そのさらなる化合物の少なくとも一つの他の官能基はアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基であるか、化学修飾を受けてアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を与える官能基であり、前記アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を含む得られたポリマー誘導体を、上述のように、還元的アミノ化によってタンパク質の少なくとも一つのアミノ基と反応させる。各化合物を互いに反応させる順序は変更することもできる。
【０２２２】
前記さらなる実施形態の第1の選択肢によれば、少なくとも一つの反応性カルボキシ基を含むポリマーは、ポリマーをその還元末端で選択的に酸化し、次に、ラクトン
【化２０】
2007527892.tif 000021
および/またはカルボン酸
【化２１】
2007527892.tif 000022
またはカルボン酸の適切な塩（例えばアルカリ金属塩、好ましくはナトリウム塩および/またはカリウム塩）である酸化型ポリマー（HAS'は好ましくはHES'である）を、少なくとも一つの反応性カルボキシ基を含むポリマーが得られるように適切な化合物と反応させることによって製造される。
【０２２３】
ポリマー（好ましくはヒドロキシエチルデンプン）の酸化は、上述の構造（IIa）および/または（IIb）を持つ化合物をもたらす各方法またはそれらの方法の組み合わせに従って行なうことができる。
【０２２４】
酸化はヒドロキシアルキルデンプンの酸化型還元末端をもたらす適切な方法のどれに従って行なってもよいが、好ましくは、例えばDE 196 28 705 A1（その内容のそれぞれ（実施例A、第9欄6〜24行）は参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているように、アルカリ性ヨウ素溶液を使って行なわれる。
【０２２５】
還元末端で選択的に酸化されるポリマーへの反応性カルボキシ基の導入は、全ての考えうる方法および全ての適切な化合物によって行なうことができる。
【０２２６】
本発明の具体的一方法によれば、還元末端で選択的に酸化されるポリマーを、その酸化型還元末端で、少なくとも一つのアルコール、好ましくは少なくとも一つの酸性アルコール、例えば6〜12の範囲または7〜11の範囲のpHA値を持つ酸性アルコールと、25℃で反応させる。酸性アルコールの分子量は80〜500g/モルの範囲、例えば90〜300g/モルの範囲、または100〜200g/モルの範囲にあることができる。
【０２２７】
適切な酸性アルコールは酸性プロトンを持つ全てのアルコールH-O-RAであり、酸化型ポリマーと反応させると、好ましくは式
【化２２】
2007527892.tif 000023
さらに好ましくは式
【化２３】
2007527892.tif 000024
の各反応性ポリマーエステルを生成することができる。
【０２２８】
好ましいアルコールはN-ヒドロキシスクシンイミド類、例えばN-ヒドロキシスクシンイミドまたはスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド、適切に置換されたフェノール類、例えばp-ニトロフェノール、o,p-ジニトロフェノール、o,o'-ジニトロフェノール、トリクロロフェノール、例えば2,4,6-トリクロロフェノールもしくは2,4,5-トリクロロフェノール、トリフルオロフェノール、例えば2,4,6-トリフルオロフェノールもしくは2,4,5-トリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、ペンタフルオロフェノール、またはヒドロキシアゾール類、例えばヒドロキシベンゾトリアゾールである。特に好ましいのはN-ヒドロキシスクシンイミド類であり、N-ヒドロキシスクシンイミドおよびスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミドはとりわけ好ましい。全てのアルコールは単独で使用するか、それらの二つ以上を適切に組み合わせて使用することができる。本発明においては、例えば炭酸のジエステルを加えることなどによって各アルコールを放出する化合物を使用することもできる。
【０２２９】
したがって本発明は、還元末端を選択的に酸化されるポリマーが、酸化型ポリマーを酸性アルコール（好ましくはN-ヒドロキシスクシンイミドおよび/またはスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド）と反応させることによって活性化される、上述の方法にも関する。
【０２３０】
本発明の好ましい実施形態によれば、還元末端で選択的に酸化されるポリマーを、その酸化型還元末端で、少なくとも一つの炭酸ジエステルRB-O-(C=O)-O-RC［式中、RBおよびRCは同じであっても異なってもよい］と反応させる。好ましくは、この方法により、式
【化２４】
2007527892.tif 000025
［式中、HAS'は好ましくはHES'である］
の反応性ポリマーが得られる。
【０２３１】
適切な炭酸ジエステル化合物としては、アルコール成分が、独立して、N-ヒドロキシスクシンイミド類、例えばN-ヒドロキシスクシンイミドもしくはスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド、適切に置換されたフェノール類、例えばp-ニトロフェノール、o,p-ジニトロフェノール、o,o'-ジニトロフェノール、トリクロロフェノール、例えば2,4,6-トリクロロフェノールもしくは2,4,5-トリクロロフェノール、トリフルオロフェノール、例えば2,4,6-トリフルオロフェノールもしくは2,4,5-トリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、ペンタフルオロフェノール、またはヒドロキシアゾール類、例えばヒドロキシベンゾトリアゾールである化合物を使用することができる。特に好ましいのは炭酸N,N'-ジスクシンイミジルおよび炭酸スルホ-N,N'-ジスルクシンイミジルであり、炭酸N,N'-ジスクシンイミジルはとりわけ好ましい。
【０２３２】
したがって本発明は、還元末端で選択的に酸化されるポリマーが、酸化型ポリマーを炭酸N,N'-ジスクシンイミジルと反応させることによって活性化される、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０２３３】
酸性アルコールは、酸化型ポリマーまたは酸化型ポリマーの塩と、酸性アルコール：ポリマーのモル比を好ましくは5：1〜50：1、より好ましくは8：1〜20：1にして、2〜40℃の好ましい反応温度（より好ましくは10〜30℃、特に好ましくは15〜25℃）で反応させる。反応時間は好ましくは1〜10時間、より好ましくは2〜5時間、より好ましくは2〜4時間、特に2〜3時間の範囲にある。
【０２３４】
炭酸ジエステル化合物は、酸化型ポリマーまたは酸化型ポリマーの塩と、ジエステル化合物：ポリマーのモル比を一般的には1：1〜3：1、例えば1：1〜1.5：1にして反応させる。反応時間は一般に0.1〜12時間、例えば0.2〜6時間、または0.5〜2時間、または0.75〜1.25時間の範囲にある。
【０２３５】
本発明の好ましい実施形態によれば、酸化型ポリマーと酸性アルコールおよび/または炭酸ジエステルとの反応は、少なくとも一つの非プロトン性溶媒中で、例えば0.5重量％を超えない（好ましくは0.1重量％を超えない）含水率を持つ無水非プロトン性溶媒中で行なわれる。適切な溶媒は、なかんずく、ジメチルスルホキシド（DMSO）、N-メチルピロリドン、ジメチルアセトアミド（DMA）、ジメチルホルムアミド（DMF）およびそれらの二つ以上の混合物である。反応温度は好ましくは2〜40℃、より好ましくは10〜30℃の範囲にある。
【０２３６】
酸化型ポリマーを少なくとも一つの酸性アルコールと反応させるために、少なくとも一つのさらなる活性化剤を使用する。
【０２３７】
適切な活性化剤は、なかんずく、カルボニルジイミダゾール、カルボジイミド類、例えばジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、ジシクロヘキシルカルボジイミド類（DCC）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）であり、ジシクロヘキシルカルボジイミド類（DCC）および1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）はとりわけ好ましい。
【０２３８】
したがって本発明は、還元末端で酸化されるポリマーをさらなる活性化剤の存在下で酸性アルコールと反応させて反応性ポリマーエステルを得る、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０２３９】
本発明の一実施形態によれば、酸化型ポリマーと炭酸ジエステルおよび/または酸性アルコールとの反応は、反応混合物を水に水対反応混合物の体積比を10：1にして加えることによって決定することができる低い塩基活量で行なわれる。添加前に、基本的に緩衝液を含まない水は25℃で7のpH値を持つ。反応混合物の添加後は、pH値を測定することにより、好ましくは9.0を超えない値、より好ましくは8.0を超えない値、特に好ましくは7.5を超えない値を持つ反応混合物の塩基活量が得られる。
【０２４０】
本発明の別の実施形態によれば、酸化型ポリマーを、EDCを使って、水の不在下に、乾燥DMA中でN-ヒドロキシスクシンイミドと反応させることにより、式
【化２５】
2007527892.tif 000026
［より好ましくはHAS'はHES'である］
のポリマーN-ヒドロキシスクシンイミドエステルを選択的に得る。
【０２４１】
驚くべきことに、この反応では、EDCとHESのOH基との反応に由来する副生成物が生成せず、EDCと酸化型ポリマーとによって形成されるO-アシルイソ尿素から各N-アシル尿素への転位反応は、驚くほど抑制される。
【０２４２】
本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、酸化型ポリマーを、炭酸N,N'-ジスクシンイミジルと、無水DMF中、活性化剤の不在下で反応させることにより、式
【化２６】
2007527892.tif 000027
［より好ましくはHAS'はHES'である］
のポリマーN-ヒドロキシスクシンイミドエステルを選択的に得る。
【０２４３】
本発明のもう一つの実施形態によれば、還元末端で選択的に酸化されるポリマーを、その酸化型還元末端で、カルボニルジイミダゾールまたはカルボニルジベンゾイミダゾールなどのアゾリドと反応させて、反応性カルボキシ基を持つポリマーを得る。カルボニルジイミダゾールの場合、式
【化２７】
2007527892.tif 000028
［HAS'は好ましくはHES'である］
の反応性イミダゾリドポリマー誘導体が得られる。
【０２４４】
ポリマーへの少なくとも一つの反応性カルボキシ基の導入に関する本発明の前記さらなる実施形態の第2の選択肢によれば、還元末端が酸化されていないポリマーに、ポリマーの少なくとも一つのヒドロキシ基を炭酸ジエステルと反応させることによって、反応性カルボキシ基が導入される。
【０２４５】
したがって本発明は、還元末端が酸化されていないポリマーに、ポリマーの少なくとも一つのヒドロキシ基を少なくとも一つの炭酸ジエステルRB-O-(C=O)-O-RC［式中、RBおよびRCは同じであっても異なってもよい］と反応させることによって、反応性カルボキシ基が導入される、上述の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０２４６】
本発明のもう一つの実施形態によれば、還元末端が酸化されていないポリマーを、少なくとも一つのヒドロキシ基で、カルボニルジイミダゾール、カルボニル-ジ-(1,2,4-トリアゾール)またはカルボニルジベンゾイミダゾールなどのアゾリドと反応させて、反応性カルボキシ基を持つポリマーを得る。
【０２４７】
適切な炭酸ジエステル化合物として、アルコール成分が、独立して、N-ヒドロキシスクシンイミド類、例えばN-ヒドロキシスクシンイミドもしくはスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド、適切に置換されたフェノール類、例えばp-ニトロフェノール、o,p-ジニトロフェノール、o,o'-ジニトロフェノール、トリクロロフェノール、例えば2,4,6-トリクロロフェノールもしくは2,4,5-トリクロロフェノール、トリフルオロフェノール、例えば2,4,6-トリフルオロフェノールもしくは2,4,5-トリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、ペンタフルオロフェノール、またはヒドロキシアゾール類、例えばヒドロキシベンゾトリアゾールである化合物を使用することができる。
【０２４８】
特に好ましいのは対称炭酸ジエステル化合物であり、したがってRBとRCとが同じである。炭酸ジエステルのアルコール成分は、好ましくは、N-ヒドロキシスクシンイミド、スルホン化N-ヒドロキシスクシンイミド、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール、ならびにニトロ置換フェノールおよびハロゲン置換フェノールからなる群より選択される。なかんずく、ニトロフェノール、ジニトロフェノール、トリクロロフェノール、トリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、およびペンタフルオロフェノールは好ましい。特に好ましいのは、炭酸N,N'-ジスクシンイミジルおよび炭酸スルホ-N,N'-ジスクシンイミジルであり、炭酸N,N'-ジスクシンイミジルはとりわけ好ましい。
【０２４９】
したがって本発明は、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体（好ましくはヒドロキシエチルデンプン誘導体）であって、そのデンプンの少なくとも一つのヒドロキシ基（好ましくは少なくとも二つのヒドロキシ基）が炭酸ジエステル化合物との反応により各反応性エステルになっているものにも関する。
【０２５０】
本発明の一実施形態によれば、還元末端が酸化されていないポリマーと、少なくとも一つの炭酸ジエステル化合物との反応は、2〜40℃、より好ましくは10〜30℃、特に15〜25℃の温度で行なわれる。好ましい反応時間は0.5〜5時間、より好ましくは1〜3時間、特に好ましくは2〜3時間の範囲である。
【０２５１】
炭酸ジエステル化合物：ポリマーのモル比は、未反応ポリマー中に存在するヒドロキシ基の数に対する炭酸ジエステル化合物と反応させるヒドロキシ基の数に関するポリマーの置換度に依存する。
【０２５２】
本発明の一実施形態によれば、炭酸ジエステル化合物：ポリマーの無水グルコース単位のモル比は、0.5〜0.001、好ましくは0.33〜0.01、特に好ましくは0.1〜0.02の範囲の置換度が得られるように、1：2〜1：1000、より好ましくは1：3〜1：100、特に好ましくは1：10〜1：50の範囲にある。
【０２５３】
本発明の一実施形態によれば、還元末端が酸化されていないポリマーと炭酸ジエステルとの反応は、少なくとも一つの非プロトン性溶媒中で、特に好ましくは0.5重量％を超えない（好ましくは0.1重量％を超えない）含水率を持つ無水非プロトン性溶媒中で行なわれる。適切な溶媒は、なかんずく、ジメチルスルホキシド（DMSO）、N-メチルピロリドン、ジメチルアセトアミド（DMA）、ジメチルホルムアミド（DMF）およびそれらの二つ以上の混合物である。
【０２５４】
したがって本発明は、還元末端が酸化されていないポリマーの少なくとも一つのヒドロキシ基と炭酸ジエステルとの反応による反応性カルボキシ基の生成が、無水非プロトン性極性溶媒中で行なわれ、その溶媒が好ましくはジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミドまたはその混合物である、上述の方法にも関する。
【０２５５】
少なくとも一つの反応性カルボキシ基を含む反応性ポリマー誘導体（好ましくはポリマーと上述の酸性アルコール、カーボネートおよび/またはアゾリドとの反応によって生じるもの）を、さらなる少なくとも二官能性である化合物と、さらに反応させる。ここでは、このさらなる化合物の少なくとも一つの官能基F1を、ポリマー誘導体の少なくとも一つの反応性カルボキシ基と反応させる。上記さらなる化合物の少なくとも一つの官能基F1としては、ポリマーの少なくとも一つの反応性カルボキシ基との反応が可能である限り、特に制限はない。好ましい官能基F1は、例えばアミノ基またはヒドロキシ基またはチオ基またはカルボキシ基である。
【０２５６】
上記さらなる少なくとも二官能性である化合物は、アルデヒド基である少なくとも一つの他の官能基F2または化学修飾を受けてアルデヒド基を生じることができる官能基F2を含む。化学修飾は、例えば官能基F2とさらなるリンカー化合物の官能基F3との反応、または適切な官能基F2の酸化もしくは還元であることができる。
【０２５７】
F2をさらなる化合物の官能基F3と反応させる場合、官能基F2は、なかんずく、
・C-C二重結合またはC-C三重結合または芳香族C-C結合；
・チオ基またはヒドロキシ基；
・アルキルスルホン酸ヒドラジド、アリールスルホン酸ヒドラジド；
・1,2-ジオール；
・1,2-アミノアルコール；
・1,2-アミノ-チオアルコール；
・アジド；
・アミノ基-NH2、または構造単位-NH-を含むアミノ基の誘導体、例えばアミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリールアミノ基；
・ヒドロキシルアミノ基-O-NH2、または構造単位-O-NH-を含むヒドロキシルアミノ基の誘導体、例えばヒドロキシルアルキルアミノ基、ヒドロキシルアリールアミノ基、ヒドロキシルアラルキルアミノ基、またはヒドロキシルアルカリールアミノ基；
・それぞれに構造単位-NH-O-を含む、アルコキシアミノ基、アリールオキシアミノ基、アラルキルオキシアミノ基、またはアルカリールオキシアミノ基；
・カルボニル基を持つ残基-Q-C(=G)-M
［式中、GはOまたはSであり、Mは例えば
・・-OHまたは-SH；
・・アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、またはアルカリールオキシ基；
・・アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルチオ基、またはアルカリールチオ基；
・・アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、アラルキルカルボニルオキシ基、アルカリールカルボニルオキシ基；
・・活性化エステル、例えばイミド構造を持つヒドロキシルアミン（例えばN-ヒドロキシスクシンイミド）のエステル、もしくは構造単位O-Nを持ち、Nがヘテロアリール化合物の一部であるヒドロキシルアミンのエステル、またはG＝OでありかつQが存在しない場合に、例えばペンタフルオロフェニル、パラニトロフェニルもしくはトリクロロフェニルなどの置換アリール残基を持つアリールオキシ化合物；
であり、Qは存在しないか、NHまたはSもしくはOなどのヘテロ原子である］；
・-NH-NH2、または-NH-NH-；
・-NO2；
・ニトリル基；
・カルボニル基、例えばアルデヒド基またはケト基；
・カルボキシ基；
・-N=C=O基または-N=C=S基；
・ハロゲン化ビニル基、例えばヨウ化ビニル基もしくは臭化ビニル基、またはトリフラート；
・-C≡C-H；
・-(C=NH2Cl)-Oアルキル
・基-(C=O)-CH2-Hal［式中、HalはCl、Br、またはIである］；
・-CH=CH-SO2-；
・構造-S-S-を含むジスルフィド基；
【化２８】
2007527892.tif 000029
から選択することができる。この場合、F3は上述の基の一つと化学結合を形成する能力を持つ基であり、好ましくは上述の基から選択される。さらにまた、第2リンカー化合物は、好ましくは、タンパク質のアミノ基と還元的アミノ化によって反応させることができる少なくとも一つのアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を持つ。
【０２５８】
ポリマーと反応させる少なくとも二官能性である連結化合物の官能基F1とアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基、および/またはポリマーと反応させる少なくとも二官能性である化合物の官能基F1とF2、および/またはさらなる少なくとも二官能性である連結化合物の官能基F3とアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基は、独立して、任意の適切なスペーサーによって分離することができる。なかんずく、スペーサーは置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状および/または環状の炭化水素残基であることができる。一般に、この炭化水素残基は60個まで、好ましくは40個まで、より好ましくは20個まで、より好ましくは10個までの炭素原子を持つ。ヘテロ原子が存在する場合、分離基は一般に1〜20個、好ましくは1〜8個、より好ましくは1〜6個、より好ましくは1〜4個、特に好ましくは1〜2個のヘテロ原子を含む。ヘテロ原子としてはOが好ましい。炭化水素残基は、例えば5〜7個の炭素原子を持つ分岐していてもよいアルキル鎖またはアリール基またはシクロアルキル基を含むか、アラルキル基、アルカリール基（アルキル部分は直鎖状および/または環状アルキル基であることができる）であることができる。
【０２５９】
官能基F1およびF2を持つ化合物の例は、例えば2〜20個の炭素原子を持つ置換されていてもよいジアミノアルカン、特に好ましくは1,2-ジアミノエタン、1,3-ジアミノプロパン、および1,4-ジアミノブタンである。官能基F3およびアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を持つ化合物の好ましい例は、例えばホルミル安息香酸、4-ホルミル安息香酸ペンタフルオロフェニルエステル、4-ホルミル安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルおよび4-(4-ホルミル-3,5-ジメトキシフェノキシ)酪酸、または生体適合性化合物（アルファ−ケトカルボン酸、ノイラミン酸、またはその誘導体、およびピリドキサールリン酸からなる群から選ばれる）である。
【０２６０】
もう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、ポリマーを、アルファ-ケトカルボン酸、ノイラミン酸、シアル酸またはその誘導体およびピリドキサールリン酸からなる群より選択される生体適合性化合物である二官能性化合物と反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０２６１】
アルファ-ケトカルボン酸について述べると、これらは好ましくはアミノ酸から誘導されるアルファ-ケトカルボン酸であり、ほとんどの場合、人体にも見いだすことができる。アミノ酸から誘導される好ましいアルファ-ケトカルボン酸は、ケト-バリン、ケト-ロイシン、ケト-イソロイシンおよびケト-アラニンからなる群より選択される。アルファ-ケトカルボン酸のカルボキシ基を、アミノ基であるポリマーの基Qと反応させる。それによってアミド基が形成される。次に、アルファ-ケトカルボン酸の残りの遊離ケト基を、タンパク質の官能基（特にアミノ基）と反応させることができる。それによってイミノ基が形成され、それを水素添加することができる。
【０２６２】
したがって本発明は、ポリマーをアルファ-ケトカルボン酸と反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０２６３】
シアル酸またはその誘導体について述べると、それらは好ましくは生体適合性であり、特にそれらは人体に見いだされる糖類であって、N-および/またはO-アセチル化されている。好ましい実施形態では、シアル酸はN-アセチルノイラミン酸である。これらの化合物は、そのピラノース構造ゆえに、スペーサーとしての機能を満たすために、望ましい剛性を持つ。一方、これらの化合物には選択的酸化によってアルデヒド基を導入することが可能であるだろう。シアル酸は人体に、例えばグリコシル化タンパク質のグリカン鎖中の末端単糖などとして見いだされる。
【０２６４】
好ましい実施形態では、シアル酸をアルデヒド基に選択的に酸化することができる。
【０２６５】
シアル酸を選択的に酸化する方法は、当技術分野においては、例えばL.W.Jaques, B.F.Riesco, W.Weltner, Carbohydrate Research, 83(1980), 21-32、およびT.Masuda, S.Shibuya, M.Arai, S.Yoshida, T.Tomozawa, A.Ohno, M.Yamashita, T.Honda, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 13(2003), 669-673などから知られている。好ましくは、ポリマーのアミノ基との反応に先だって、シアル酸の酸化を行なうことができる。
【０２６６】
酸化されていてもよいシアル酸を、次に、そのカルボン酸基を介して、ポリマーのアミノ基と反応させることができる。
【０２６７】
結果として得られる化合物はアルデヒド基を含有し、それは次に、タンパク質のアミノ基と還元的アミノ化によってさらに反応させることができる。
【０２６８】
したがって本発明は、ポリマーを酸化されていてもよいシアル酸と反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０２６９】
ピリドキサールリン酸（PyP）について述べると、これは高い生体適合性を持つ二官能性化合物であり、ビタミンB6とも呼ばれる。PyPはアミノ基転移、脱炭酸、ラセミ化、およびアミノ酸側鎖の数多くの修飾に関与する補酵素である。PyP要求酵素は全て、アミノ酸と補酵素の間のシッフ塩基の形成を介して作用する。
【０２７０】
PyPのリン酸基を、ポリマー（好ましくはヒドロキシアルキルデンプン、特にヒドロキシエチルデンプン）のアミノ基と反応させて、ホルホルアミドを形成させることができる。次に、PyPのアルデヒド基をタンパク質のアミノ基と反応させて、シッフ塩基を形成させ、次にそれを還元することができる。好ましい実施形態では、コンジュゲートの構造が、HES-NH-P(O)2-O-(ピリドキサール)-CH-NH-タンパク質である。
【０２７１】
PyPの場合、ポリマーの官能基Qは、好ましくは、上述のジアミノ化合物を使ってポリマーに導入される。
【０２７２】
したがって本発明は、ポリマーをピリドキサールリン酸と反応させる、上述の方法およびコンジュゲートに関する。
【０２７３】
したがって本発明は、コンジュゲートの製造方法であって、ポリマー（好ましくはヒドロキシエチルデンプン）を、その酸化されていてもよい還元末端で、酸性アルコール、炭酸ジエステルおよびアゾリドからなる群より選択される化合物と反応させて、少なくとも一つの反応性カルボキシ基を含むポリマー誘導体とし、前記ポリマー誘導体を少なくとも一つの少なくとも二官能性である化合物と反応させて、アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を含むか、あるいは化学修飾を受けてアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を与えることができる官能基を含むポリマー誘導体とし、要すれば、前記官能基を化学修飾して、アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を含むポリマー誘導体とし、アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を含むポリマー誘導体を還元的アミノ化によってタンパク質のアミノ基と反応させることを含む方法にも関する。
【０２７４】
したがって本発明は、互いに共有結合したポリマー（好ましくはヒドロキシエチルデンプン）とタンパク質とを含むコンジュゲートであって、ポリマーを、その酸化されていてもよい還元末端で、酸性アルコール、炭酸ジエステルおよびアゾリドからなる群より選択される化合物と反応させて、少なくとも一つの反応性カルボキシ基を含むポリマー誘導体とし、前記ポリマー誘導体を少なくとも一つの少なくとも二官能性である化合物と反応させて、アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を含むか、あるいは化学修飾を受けてアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を与えることができる官能基を含むポリマー誘導体とし、要すれば、前記官能基を化学修飾して、アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を含むポリマー誘導体とし、アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を含むポリマー誘導体を還元的アミノ化によってタンパク質のアミノ基と反応させることを含むコンジュゲートの製造方法によって得ることができるコンジュゲートにも関する。
【０２７５】
官能基F1および酸化されてアルデヒド基を与える官能基F2を持つ化合物の具体例は、例えばF1としてアミノ基を持ち、F2としてベータヒドロキシアミノ基を持つ化合物である。特に好ましい例は、1,3-ジアミノ-2-ヒドロキシプロパンである。この酸化は、ベータヒドロキシアミノ基をアルデヒド基に変換する能力を持つ適切な酸化剤のどれを使っても行なうことができる。好ましい酸化試薬は過ヨウ素酸アルカリ金属などの過ヨウ素酸塩である。特に好ましいのは過ヨウ素酸ナトリウムであり、好ましくはこれを水溶液として使用する。この溶液は、1〜50mMの好ましいヨウ素酸塩濃度（より好ましくは1〜25mM、特に好ましくは1〜10mM）を持つ。酸化は0〜40℃、好ましくは0〜25℃、特に好ましくは4〜20℃の温度で行なわれる。
【０２７６】
得られたポリマー誘導体は、少なくとも一つの適切な方法によって、反応混合物から精製することができる。必要であれば、少なくとも一つの適切な方法により、単離に先だってポリマー誘導体を沈殿させてもよい。
【０２７７】
ポリマー誘導体をまず沈殿させる場合は、例えば反応混合物を、反応混合物中に存在する溶媒または溶媒混合物以外の少なくとも一つの溶媒または溶媒混合物と、適切な温度で接触させることができる。水性媒質（好ましくは水）を溶媒として使用する本発明の特に好ましい実施形態によれば、反応混合物を2-プロパノールまたはアセトンとエタノールの混合物（好ましくは1：1（v/v）混合物、すなわち等体積の前記化合物）と、好ましくは-20〜＋50℃の範囲の温度、特に好ましくは-20〜25℃の範囲の温度で接触させる。
【０２７８】
ポリマー誘導体の単離は、一段階以上を含みうる適切な工程によって行なうことができる。本発明の好ましい実施形態によれば、ポリマー誘導体をまず反応混合物または反応混合物と例えば水性2-プロパノール混合物との混合物から、遠心分離または濾過などの適切な方法によって分離する。第2段階では、分離したポリマー誘導体をさらなる処理、例えば透析、遠心濾過もしくは加圧濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、HPLC、MPLC、ゲル濾過および/または凍結乾燥のような後処理に付すことができる。さらに好ましい実施形態によれば、分離したポリマー誘導体をまず（好ましくは水に対して）透析し、次に、所望する生成物の仕様に応じて反応生成物の溶媒含量が十分に低くなるまで、凍結乾燥する。凍結乾燥は20〜35℃、好ましくは20〜30℃の温度で行なうことができる。
【０２７９】
本発明はまた、ヒドロキシアルキルデンプンおよびタンパク質を含有するコンジュゲートに関し、ここで、ヒドロキシアルキルデンプンはその酸化型還元末端と第１架橋化合物へのアミド結合を介してカップリングして、該架橋化合物は、第２架橋化合物へのアミド結合を介して更に結合し、該第２架橋化合物はアゾメチンおよび／またはアミノ結合を介してタンパク質と結合し、ここで、第１架橋化合物はジアミノ官能化の化合物として使用するのが好ましく、そして該第２架端化合物はカルボキシおよびアルデヒド、またはケトまたはヘミアセタールとして使用することが好ましい（カルボキシおよびアルデヒド官能化の化合物として使用することがより好ましい）。
【０２８０】
本発明は、タンパク質とポリマーまたはその誘導体とを含むコンジュゲートであって、ポリマーがヒドロキシアルキルデンプン（HAS）であり、前記コンジュゲートが式
【化２９】
2007527892.tif 000030
［式中、R1、R2およびR3は、独立して、水素、または1〜10個の炭素原子を持つヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基もしくはヒドロキシアルカリール基、好ましくは水素またはヒドロキシアルキル基、より好ましくは水素またはヒドロキシエチル基であり、
Lは置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状および/または環状炭化水素残基であって、少なくとも一つのヘテロ原子を含んでもよく、1〜60個、好ましくは1〜40個、より好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜6個、より好ましくは1〜2個の炭素原子、特に好ましくは1個の炭素原子を持ち、Lは特にCH2である］
の構造を持つコンジュゲートにも関する。
【０２８１】
本発明はまた、タンパク質、およびポリマーまたはそれらの誘導体を含有するコンジュゲートにも関し、ここで、該ポリマーは、以下の構造式：
【化３０】
2007527892.tif 000031
［式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、水素、炭素数が１〜１０個のヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基、ヒドロキシアルカリール基（水素またはヒドロキシアルキル基が好ましく、水素またはヒドロキシエチル基がより好ましい）であり、そして、ここで、
Ｌ１およびＬ２は独立して、場合により置換された直鎖、分枝および／または環状の炭化水素残基であり、場合により少なくとも１個のヘテロ原子を含有し、アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、および／またはへテロアラルキル分子を含有し、該残基は１〜６０個（１〜４０個が好ましく、１〜２０個がより好ましく、１〜１０個がより好ましい）の炭素原子を有し、そして、
Ｄは、結合（Ｌ１と結合した適当な官能基Ｆ２、Ｌ２と結合した適当な官能基Ｆ３によって形成される共有結合が好ましい）である］
を有するヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）である。
【０２８２】
本発明は、L1が-(CH2)n-であり、n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10、好ましくは2、3、4、5、6、より好ましくは2、3、4、特に好ましくは4である、上述のコンジュゲートにも関する。
【０２８３】
本発明は、L2が適切に置換されていてもよいアリール部分、好ましくは6個の炭素原子を含有するアリール部分、特に好ましくはC6H4である、上述のコンジュゲートにも関する。
【０２８４】
本発明は、 が、
・C-C二重結合またはC-C三重結合または芳香族C-C結合；
・チオ基またはヒドロキシ基；
・アルキルスルホン酸ヒドラジド、アリールスルホン酸ヒドラジド；
・1,2-ジオール；
・1,2-アミノ-チオアルコール；
・アジド；
・1,2-アミノアルコール；
・アミノ基-NH2、または構造単位-NH-を含むアミノ基の誘導体、例えばアミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリールアミノ基；
・ヒドロキシルアミノ基-O-NH2、または構造単位-O-NH-を含むヒドロキシルアミノ基の誘導体、例えばヒドロキシルアルキルアミノ基、ヒドロキシルアリールアミノ基、ヒドロキシルアラルキルアミノ基、またはヒドロキシルアルカリールアミノ基；
・それぞれに構造単位-NH-O-を含む、アルコキシアミノ基、アリールオキシアミノ基、アラルキルオキシアミノ基、またはアルカリールオキシアミノ基；
・カルボニル基を持つ残基-Q-C(=G)-M
［式中、GはOまたはSであり、Mは例えば
・・-OHまたは-SH；
・・アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、またはアルカリールオキシ基；
・・アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルチオ基、またはアルカリールチオ基；
・・アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、アラルキルカルボニルオキシ基、アルカリールカルボニルオキシ基；
・・活性化エステル、例えばイミド構造を持つヒドロキシルアミン（例えばN-ヒドロキシスクシンイミド）のエステル、もしくは構造単位O-Nを持ち、Nがヘテロアリール化合物の一部であるヒドロキシルアミンのエステル、またはG＝OでありかつQが存在しない場合に、例えばペンタフルオロフェニル、パラニトロフェニルもしくはトリクロロフェニルなどの置換アリール残基を持つアリールオキシ化合物；
であり、Qは存在しないか、NHまたはSもしくはOなどのヘテロ原子である］；
・-NH-NH2、または-NH-NH-；
・-NO2；
・ニトリル基；
・カルボニル基、例えばアルデヒド基またはケト基；
・カルボキシ基；
・-N=C=O基または-N=C=S基；
・ハロゲン化ビニル基、例えばヨウ化ビニル基もしくは臭化ビニル基、またはトリフラート；
・-C≡C-H；
・-(C=NH2Cl)-Oアルキル
・基-(C=O)-CH2-Hal［式中、HalはCl、Br、またはIである］；
・-CH=CH-SO2-；
・構造-S-S-を含むジスルフィド基；
【化３１】
2007527892.tif 000032
からなる群より選択され、F3はF2と化学結合を形成する能力を持つ官能基であって、好ましくは上記の群から選択され、F2は好ましくは部分-NH-、より好ましくはアミノ基を含み、F3は好ましくは部分-(C=G)-、より好ましくは-(C=O)-、より好ましくは部分-(C=G)-G-、さらに好ましくは-(C=O)-G-、特に好ましくは-(C=O)-Oを含み、Dは特に好ましくはアミド結合である、上述のコンジュゲートにも関する。
【０２８５】
本発明はまた、構造式：
【化３２】
2007527892.tif 000033
［式中、
ｎは、２、３、または４であり、Ｒ４は独立して水素またはメトキシ基であり、そしてＲ４が水素である場合にはｍは０であり、そしてＲ４がメトキシである場合にはｍは１である］
を有する、上記のコンジュゲートにも関する。
【０２８６】
本発明は、タンパク質とポリマーまたはその誘導体とを含むコンジュゲートであって、ポリマーがヒドロキシアルキルデンプン（HAS）であり、タンパク質が顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）であり、前記コンジュゲートが式
【化３３】
2007527892.tif 000034
［式中、部分-CH2-NH-の炭素原子は開環酸化反応によってポリマーに導入されたアルデヒド基に由来し、窒素原子はタンパク質のアミノ基に由来する］
の構造を持つコンジュゲートにも関する。
【０２８７】
本発明は、ヒドロキシアルキルデンプンがヒドロキシエチルデンプンである、上述のコンジュゲートにも関する。
【０２８８】
本発明は、ヒドロキシエチルデンプンが2〜200kD、好ましくは4〜130kD、より好ましくは4〜70kDの分子量を持つ、上述のコンジュゲートのいずれかにも関する。
【０２８９】
本発明はまた、該タンパク質がＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＡＴ ＩＩＩ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ミオグロビン、ＳＯＤ、およびＢＳＡからなる群（ｒｈＥＰＯ、ｒｈＧ−ＣＳＦ、ｒｈＩＦＮアルファ、ｒｈＩＦＮベータ、ｒｈＡＴ ＩＩＩ、ｒｈＩＬ−２、ｒｈＩＬ−３、ミオグロビン、ＳＯＤ、およびＢＳＡからなる群が好ましい）、および／またはＡ１ＡＴ、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、ｔＰＡ、およびＡＰＣからなる群から選ばれる、上記のコンジュゲートにも関する。
【０２９０】
本発明のコンジュゲートを製造するための方法において、上述の方法における変換率は、少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、さらに好ましくは少なくとも80％、特に95％以上、例えば少なくとも98％または99％になりうる。
【０２９１】
本発明のコンジュゲートは、少なくとも純度50％、さらに好ましくは少なくとも純度70％、さらに好ましくは少なくとも純度90％、特に少なくとも純度95％または少なくとも純度99％であることができる。最も好ましい実施形態では、コンジュゲートは純度100％であることができる。すなわち他の副生成物は存在しない。
【０２９２】
したがって、もう一つの態様によれば、本発明は、本発明のコンジュゲートを含みうる組成物であって、コンジュゲートの量が少なくとも50重量％、より好ましくは少なくとも70重量％、さらに好ましくは少なくとも90重量％、特に少なくとも95重量％または少なくとも99重量％でありうる組成物にも関する。最も好ましい実施形態では、組成物がコンジュゲートからなりうる。すなわちコンジュゲートの量は100重量％である。
【０２９３】
もう一つの態様によれば、本発明は、ヒトまたは動物の身体を処置する方法に用いられる、上述のコンジュゲートまたは上述の方法によって得ることができるコンジュゲートに関する。
【０２９４】
したがって本発明は、上述のコンジュゲートまたは上述の方法によって得ることができるコンジュゲートを治療有効量で含む医薬組成物に関する。
【０２９５】
本明細書中で使用する用語「治療学的に有効な量」とは、ある病気および投与レジメについて治療学的な効果を供する量に関する。
【０２９６】
従って、好ましい実施態様において、該医薬組成物は更に、少なくとも１個の医薬的に許容し得る希釈物、アジュバント、および／または担体を含む。この医薬的に許容し得る希釈物、アジュバントおよび／または担体は、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＥＰＯ、ＡＴ ＩＩＩ、Ｇ−ＣＳＦ、ＡＰＣ、Ａ１ＡＴ、ｔＰＡ、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、または因子ＩＸの療法において特に有用であることが好ましい。
【０２９７】
本発明のタンパク質-HASコンジュゲートは全て、i.v.、s.c.またはi.m経路によって投与される。選択される具体的経路は処置される病態に依存する。好ましくはコンジュゲートを、例えば当技術分野で知られているような適切な担体（例えば第1世代/無修飾バイオ医薬品に使用されるものであって、アルブミンを含まないもの、または賦形剤としてアルブミンを含むもの）、適切な希釈剤、例えばi.v.、i.m.、またはs.c.用の滅菌溶液などと一緒に投与する。必要量は処置される病態の重症度、患者の個別的応答、使用する投与方法などに依存する。当業者は正しい投薬量をその一般知識に基づいて確定することができる。
【０２９８】
もう一つの態様によれば、本発明は、貧血性障害、もしくは造血性機能不全障害、またはそれらの関連疾患を処置するための医薬品の製造を目的とする、タンパク質がEPOである、上述のHAS-（好ましくはHES-）タンパク質コンジュゲートまたは上述の方法によって得ることができるHAS-（好ましくはHES-）タンパク質コンジュゲートの使用にも関する。
【０２９９】
エリスロポエチンイソ型の投与は、非経口経路によるのが好ましい。該選択される具体的な経路は、処置する病気に依存する。エリスロポエチンイソ型の投与は、適当な担体（例えば、ヒト血清アルブミン）、適当な希釈物（例えば、緩衝化生理食塩水）、および／または適当なアジュバントを含有する製剤の一部として行なうのが好ましい。必要な用量は、患者のヘマトクリットを増大するのに十分な量であり、そして処置する病気の激しさ、使用する投与の方法などに依存して変わる。本発明の医薬組成物を用いる処置の目的は、血液中のヘモグロビン値を６．８ｍｍｏｌ／Ｌ以上、増大することが好ましい。このために、該医薬組成物は、ヘモグロビン値を毎週、０．６ｍｍｏｌ／Ｌおよび１．６ｍｍｏｌ／Ｌの間で増大する様式で投与し得る。該ヘモグロビンが８．７ｍｍｏｌ／Ｌを超える場合には、該療法は、ヘモグロビン値が8.1mmol/L以下となるまで中断すべきことが好ましい。本発明の組成物は、皮下、静脈内、または非経口の注射に適当な製剤で使用することが好ましい。このために、適当な賦形剤および担体は例えば、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、塩素酸ナトリウム、ポリソルベート８０、ＨＳＡ、および注射用の水を挙げられる。該組成物は、週に３回（週に２回が好ましく、週に１回がより好ましく、そして２週間毎が最も好ましい）で投与することができる。該医薬組成物は、量が０．０１〜１０μｇ／患者の体重ｋｇ（０．１〜５μｇ/体重ｋｇ、０．１〜１μｇ／体重ｋｇ、または０．２〜０．９μｇ／体重ｋｇがより好ましく、０．３〜０．７μｇ／ｋｇ、０．４〜０．６μｇ／体重ｋｇが最も好ましい）で投与することが好ましい。通常、１０μｇ〜２００μｇとの間（１５μｇ〜１００μｇとの間が好ましい）で用量当たり投与することが好ましい。
【０３００】
もう一つの態様によれば、本発明は、造血性機能または免疫機能の低下を特徴とする障害（ここで、該障害は、化学療法、放射線療法、感染症、重度の慢性好中球減少症、または白血病の結果であることが好ましい）を処置するための医薬品の製造を目的とする、タンパク質がG-CSFである、上述のHAS-（好ましくはHES-）タンパク質コンジュゲートまたは上述の方法によって得ることができるHAS-（好ましくはHES-）タンパク質コンジュゲートの使用にも関する。
【０３０１】
もう一つの態様によれば、本発明は、血友病Aを処置するための医薬品の製造を目的とする、タンパク質が第VIII因子である、上述のHAS-（好ましくはHES-）タンパク質コンジュゲートまたは上述の方法によって得ることができるHAS-（好ましくはHES-）タンパク質コンジュゲートの使用にも関する。
【０３０２】
もう一つの態様によれば、本発明は、遺伝性AT III欠損症、静脈閉塞性疾患、熱傷および冠動脈バイパス移植（CABG）術におけるヘパリン抵抗性、外傷または胃腸手術に起因する腸穿孔、播種性血管内血液凝固（DIC）および/または敗血症を処置するための医薬品ならびに換気療法に付随する微小血塊形成を予防するための医薬品の製造を目的とする、上述のHAS-AT IIIコンジュゲートまたは上述の方法によって得ることができるHAS-タンパク質コンジュゲートの使用にも関する。したがって、本発明のHAS-AT IIIコンジュゲートを含む医薬組成物は、これらの目的に使用することができる。
【０３０３】
もう一つの態様によれば、本発明は、肺気腫、嚢胞性線維症、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、および/または気管支炎を処置するための医薬品の製造を目的とする、タンパク質がA1ATである、上述のHAS-（好ましくはHES-）タンパク質コンジュゲートまたは上述の方法によって得ることができるHAS-（好ましくはHES-）タンパク質コンジュゲートの使用にも関する。本発明のHAS-A1ATコンジュゲートを含む本発明の医薬組成物も、これらの目的に使用することができる。
【０３０４】
もう一つの態様によれば、本発明は、心筋梗塞（心臓発作）、血栓症、血栓塞栓症または閉塞性疾患、特に閉塞性動脈疾患を処置するための医薬品の製造を目的とする、タンパク質がtPAである、上述のHAS-（好ましくはHES-）タンパク質コンジュゲートまたは上述の方法によって得ることができるHAS-（好ましくはHES-）タンパク質コンジュゲートの使用にも関する。
【０３０５】
もう一つの態様によれば、本発明は、重症敗血症、血栓症、血栓塞栓症または閉塞性疾患、特に閉塞性動脈疾患を処置するための医薬品の製造を目的とする、タンパク質がAPCである、上述のHAS-（好ましくはHES-）タンパク質コンジュゲートまたは上述の方法によって得ることができるHAS-（好ましくはHES-）タンパク質コンジュゲートの使用にも関する。
【０３０６】
もう一つの態様によれば、本発明は、白血病、例えばヘアリー細胞白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、癌、例えばカルチノイド腫瘍、悪性黒色腫ならびに肝炎、例えば慢性B型肝炎および慢性C型肝炎を処置するための医薬品の製造を目的とする、タンパク質がIFNアルファである、上述のHAS-（好ましくはHES-）タンパク質コンジュゲートまたは上述の方法によって得ることができるHAS-（好ましくはHES-）タンパク質コンジュゲートの使用にも関する。
【０３０７】
もう一つの態様によれば、本発明は、多発性硬化症、好ましくは再発型多発性硬化症を処置するための医薬品の製造を目的とする、タンパク質がIFNベータである、上述のHAS-（好ましくはHES-）タンパク質コンジュゲートまたは上述の方法によって得ることができるHAS-（好ましくはHES-）タンパク質コンジュゲートの使用にも関する。
【０３０８】
本発明は、第VIII因子または第IX因子に対する阻害因子を持つ血友病AまたはB患者におけるエピソードを処置するための医薬品の製造を目的とする、HAS-第VII因子コンジュゲートの使用にも関する。
【０３０９】
本発明は、血友病B（例えば先天性第IX因子欠損症またはクリスマス病）を持つ患者における出血エピソードを管理および予防（手術状況下での出血の管理および予防を含む）するための医薬品の製造を目的とする、HAS-第IX因子コンジュゲートの使用にも関する。
【０３１０】
以下に図、表および実施例を挙げて本発明をさらに例証するが、これらは決して本発明の範囲を制限しようとするものではない。
【０３１１】
実施例
実施例１：アルデヒド官能化ヒドロキシエチルデンプンの製造
実施例１．１（ａ）：
その還元末端で選択的に酸化したヒドロキシエチルデンプンの過ヨウ素酸酸化および０℃でのインキュベートションによる製造
オキソ−ＨＥＳ１０／０．４（Ｍｗ＝１０ｋＤ、ＤＳ＝０．４、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Dによって製造；DE 196 28 705 A1に記載）（１００ｍｇ）を２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．２、５ｍＬ）中に溶解し、そしてこのものを０℃まで冷却した。過ヨウ素酸ナトリウム（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（２１．４ｍｇ）を同じ緩衝液（５ｍＬ）中に溶解し、そして０℃まで冷却した。両方の溶液を混合し、そして０℃で１０分間、インキュベート後に、グリセロール（０．７３ｍＬ）を加え、そして該反応混合物を２１℃で１０分間インキュベートした。該反応混合物を水に対して２４時間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。
【０３１２】
ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣを用いて測定する場合の該ＨＥＳ１０／０．４の分子量は１０．５ｋＤであり、そして該ＤＳは０．４１であった。
【０３１３】
実施例１．１（ｂ）：
その還元末端で選択的に酸化したヒドロキシエチルデンプンの過ヨウ素酸酸化および２１℃でのインキュベートションによる製造
オキソ−ＨＥＳ１０／０．４（Ｍｗ＝１０ｋＤ、ＤＳ＝０．４、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Dによって製造；DE 196 28 705 A1に記載）（１００ｍｇ）を２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．２、５ｍＬ）中に溶解した。過ヨウ素酸ナトリウム（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（２１．４ｍｇ）を同じ緩衝液（５ｍＬ）中に溶解した。両方の溶液を混合し、そして２１℃で１０分間、インキュベート後に、グリセロール（０．７３ｍＬ）を加え、そして該反応混合物を２１℃で１０分間インキュベートした。該反応混合物を水に対して２４時間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。
【０３１４】
ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣを用いて測定する場合の該ＨＥＳ１０／０．４の分子量は１０．５ｋＤであり、そして該ＤＳは０．４１であった。
【０３１５】
実施例１．２（ａ）：
非酸化型還元末端を有するヒドロキシエチルデンプンの過ヨウ素酸酸化および０℃でのインキュベートションによる、アルデヒド官能化ヒドロキシエチルデンプンの製造
ＨＥＳ１０／０．４（Ｍｗ＝１０ｋＤ、ＤＳ＝０．４、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D）（１００ｍｇ）を、２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．５ｍＬ）中に溶解し、そして０℃まで冷却した。過ヨウ素酸ナトリウム（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（２１．４ｍｇ）を同じ緩衝液（５ｍＬ）中に溶解し、そして０℃まで冷却した。両方の溶液を混合し、そして０℃で１０分間インキュベート後に、グリセロール（０．７３ｍＬ）を加え、そして該反応混合物を２１℃で１０分間インキュベートした。該反応混合物を水に対して２４時間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。
【０３１６】
ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣを用いて測定する場合の該ＨＥＳ１０／０．４の分子量は８．５ｋＤであり、そして該ＤＳは０．４１であった。
【０３１７】
実施例１．２（ｂ）：
非酸化型還元末端を有するヒドロキシエチルデンプンの過ヨウ素酸酸化および２１℃でのインキュベートションによる、アルデヒド官能化ヒドロキシエチルデンプンの製造
ＨＥＳ１０／０．４（Ｍｗ＝１０ｋＤ、ＤＳ＝０．４、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D）（１００ｍｇ）を、２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．５ｍＬ）中に溶解した。過ヨウ素酸ナトリウム（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（２１．４ｍｇ）を同じ緩衝液（５ｍＬ）中に溶解した。両方の溶液を混合し、そして２１℃で１０分間インキュベート後に、グリセロール（０．７３ｍＬ）を加え、そして該反応混合物を２１℃で１０分間インキュベートした。該反応混合物を水に対して２４時間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。
【０３１８】
ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣを用いて測定する場合の該ＨＥＳ１０／０．４の分子量は８．５ｋＤであり、そして該ＤＳは０．４１であった。
【０３１９】
実施例１．３：
アミノ官能化ヒドロキシエチルデンプンおよびホルミル安息香酸からのアルデヒド官能化ヒドロキシエチルデンプンの製造
オキソ−ＨＥＳ１０／０．４（Ｍｗ＝１０ｋＤ、ＤＳ＝０．４）は、DE 196 28 705 A1に従って、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Dによって製造した。
【０３２０】
ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣを用いて測定する場合の該ＨＥＳ１０／０．４の分子量は１４．５ｋＤであり、そして該ＤＳは０．４１であった。
【０３２１】
オキソ−ＨＥＳ１０／０．４（５．１ｇ、０．５１ｍｍｏｌ）を無水ジメチルスルホキシド（DMSO, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（１５ｍＬ）中に溶解し、そしてこのものを窒素下で、無水ジメチルスルホキシド（１０ｍＬ）中の１,４−ジアミノブタン（５．１ｍＬ、５１ｍｍｏｌ）の溶液に滴下し、そして４０℃で１９時間撹拌した。該反応混合物を、エタノール（８０ｍＬ）およびアセトン（８０ｍＬ）の混合物に加えた。該得られた沈降物を遠心分離によって分離し、エタノール（２０ｍＬ）およびアセトン（２０ｍＬ）の混合物を用いて洗浄し、そして水（８０ｍＬ）中に再溶解した。該溶液を水に対して４日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5kDカットオフ, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D）、引き続いて、凍結乾燥した。アミノ−ＨＥＳ１０／０．４の収率は６７％（３．４ｇ）であった。
【０３２２】
４−ホルミル安息香酸（１５０ｍｇ）および１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（２３０ｍｇ）（共に、Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）を、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（Peptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswaard, NL）（１０ｍＬ）中に溶解し、そしてＮ,Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２０４μＬ）を加えた。２１℃で３０分間インキュベート後に、該アミノ−ＨＥＳ１０／０．４（１ｇ）を加えた。２２℃で１９時間振り混ぜた後に、該反応混合物を、氷冷のアセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（８４ｍＬ）に加えた。該沈降生成物を４℃での遠心分離によって集め、水（５０ｍＬ）中に再溶解し、水に対して２日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。
【０３２３】
実施例１．４：
ヒドロキシエチルデンプンおよびホルミル安息香酸からのアルデヒド官能化ヒドロキシエチルデンプンの製造
オキソ−ＨＥＳ１０／０．７（Ｍｗ＝１０ｋＤ、ＤＳ＝０．７）を、DE 196 28 705 A1に従って、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Dによって製造した。
【０３２４】
ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣを用いて測定する場合の該ＨＥＳ１０／０．７の分子量は１４．５ｋＤであり、そして該ＤＳは０．７６であった。
【０３２５】
４−ホルミル安息香酸（８３ｍｇ）および１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（１８０ｍｇ）（共に、Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）を、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、Peptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswaard, NL）（５ｍＬ）中に溶解し、そしてＮ,Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（７８μＬ）を加えた。２１℃で３０分間インキュベート後に、オキソ−ＨＥＳ１０／０．７（０．５ｇ）を加えた。２２℃で１９時間振り混ぜた後に、該反応混合物を氷冷のアセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（３７．５ｍＬ）に加えた。該沈降生成物を４℃で遠心分離によって集め、水（２．５ｍＬ）およびＤＭＦ（２．５ｍＬ）の混合物中に再溶解し、そして上記の通り再び沈降させた。該反応生成物を上記の通り遠心分離によって集め、水（１０ｍＬ）中に再溶解し、水に対して２日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。
【０３２６】
実施例１．５：
ヒドロキシエチルデンプンおよびホルミル安息香酸からのアルデヒド官能化ヒドロキシエチルデンプンの製造
ＨＥＳ１０／０．７（Ｍｗ＝１０ｋＤ、ＤＳ＝０．７）は、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Dによって製造した。
【０３２７】
ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣを用いて測定する場合の該ＨＥＳ１０／０．７の分子量は１０．５ｋＤであり、そして該ＤＳは０．７６であった。
【０３２８】
４−ホルミル安息香酸（５０ｍｇ）および１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（１０８ｍｇ）（共に、Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）を、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（Peptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswaard, NL）（３ｍＬ）中に溶解し、そしてＮ,Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（４７μＬ）を加えた。２１℃で３０分間インキュベートした後に、ＨＥＳ１０／０．７（０．３ｇ）を加えた。２２℃で１９時間振り混ぜた後に、該反応混合物を氷冷のアセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（２３ｍＬ）に加えた。該沈降生成物を４℃で遠心分離によって集め、水（１．５ｍＬ）およびＤＭＦ（１．５ｍＬ）の混合物中に再溶解し、そして上記の通り再び沈降させた。該反応生成物を上記の通り遠心分離によって集め、水（１０ｍＬ）中に再溶解し、水に対して２日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。
【０３２９】
実施例１．６：
アミノ官能化ヒドロキシエチルデンプンおよびホルミル安息香酸ペンタフルオロフェニルエステルからのアルデヒド官能化ヒドロキシエチルデンプンの製造
オキソ−ＨＥＳ１０／０．７（Ｍｗ＝１０ｋＤ、ＤＳ＝０．７）は、DE 196 28 705 A1に従って、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Dによって製造した。
【０３３０】
ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣを用いて測定する場合の該ＨＥＳ１０／０．７の分子量は１４．５ｋＤであり、そして該ＤＳは０．７６であった。
【０３３１】
オキソ−ＨＥＳ１０／０．７（６．０ｇ、０．６ｍｍｏｌ）を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（２０ｍＬ）中に溶解し、そして窒素下で、無水ジメチルスルホキシド（１１ｍＬ）中の１,４−ジアミノブタン（６ｍＬ、６０ｍｍｏｌ）の溶液に滴下し、そしてこのものを４０℃で１９時間撹拌した。該反応混合物を、エタノール（８０ｍＬ）およびアセトン（８０ｍＬ）の混合物に加えた。該得られた沈降物を遠心分離によって分離し、エタノール（２０ｍＬ）およびアセトン（２０ｍＬ）の混合物を用いて洗浄し、そして水（８０ｍＬ）中に再溶解した。該溶液を水に対して４日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5kDカットオフ, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D）、引き続いて凍結乾燥した。アミノ−ＨＥＳ１０／０．７の収率は、５２％（３．１５ｇ）であった。
【０３３２】
４−ホルミル安息香酸ペンタフルオロフェニルエステルは、J. S. Lindseyらによる，Tetrahedron 50 (1994) 頁8941-68（特に、頁8956）中に記載する通り製造した。アミノ−ＨＥＳ１０／０．７（５０ｍｇ）を、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（Peptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswaard, NL）（０．５ｍＬ）中に溶解し、そして４−ホルミル安息香酸ペンタフルオロフェニルエステル（１５．３ｍｇ）を加えた。２２℃で２２時間振り混ぜた後に、該反応混合物を氷冷２−プロパノール（３．５ｍＬ）に加えた。該沈降生成物を４℃で遠心分離によって集め、氷冷２−プロパノール（４ｍＬ）を用いて洗浄し、水（５０ｍＬ）中に再溶解し、水に対して２日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。
【０３３３】
実施例１．７：
ヒドロキシエチルデンプンおよびホルミル安息香酸ペンタフルオロフェニルエステルからのアルデヒド官能化ヒドロキシエチルデンプンの製造
オキソ−ＨＥＳ１０／０．７（Ｍｗ＝１０ｋＤ、ＤＳ＝０．７）は、DE 196 28 705 A1に従って、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Dによって製造した。
【０３３４】
ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣを用いて測定する場合の該ＨＥＳ１０／０．７の分子量は１４．５ｋＤであり、そして該ＤＳは０．７６であった。
【０３３５】
４−ホルミル安息香酸ペンタフルオロフェニルエステルは、J. S. Lindsey らによる, Tetrahedron 50 (1994) 頁8941-68, 特に頁8956中に記載されている通り、製造した。オキソ−ＨＥＳ１０／０．７（２００ｍｇ）を、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（Peptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswaard, NL）（２ｍＬ）中に溶解し、そして４−ホルミル安息香酸ペンタフルオロフェニルエステル（６１．２ｍｇ）を加えた。２２℃で２２時間振り混ぜた後に、該反応混合物を、氷冷のアセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（１５ｍＬ）に加えた。該沈降物を遠心分離によって４℃で集め、水（１．４ｍＬ）およびＤＭＦ（０．７ｍＬ）の混合物中に再溶解し、そして上記の通り再び沈降させた。該反応生成物を上記の通り遠心分離によって集め、水（１０ｍＬ）中に再溶解し、水に対して２日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。
【０３３６】
実施例１．８：
アミノ官能化ヒドロキシエチルデンプンおよび４−(４−ホルミル−３,５−ジメトキシフェノキシ)酪酸からのアルデヒド官能化ヒドロキシエチルデンプンの製造
オキソ−ＨＥＳ１０／０．４（Ｍｗ＝１０ｋＤ、ＤＳ＝０．４）は、DE 196 28 705 A1に従って、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Dによって製造した。
【０３３７】
ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣを用いて測定する場合の該ＨＥＳ１０／０．４の分子量は１４．５ｋＤであり、そして該ＤＳは０．４１であった。
【０３３８】
オキソ−ＨＥＳ１０／０．４（５．１ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ）を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（１５ｍＬ）中に溶解し、そして無水ジメチルスルホキシド（１０ｍＬ）中の１,４−ジアミノブタン（５．１ｍＬ、５１ｍｍｏｌ）の溶液に窒素下で滴下し、そして４０℃で１９時間撹拌した。該反応混合物を、エタノール（８０ｍＬ）およびアセトン（８０ｍＬ）の混合物に加えた。該得られた沈降物を遠心分離によって分離し、エタノール（２０ｍＬ）およびアセトン（２０ｍＬ）の混合物を用いて洗浄し、そして水（８０ｍＬ）中に再溶解した。該溶液を水に対して４日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5kDカットオフ, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D）、引き続いて凍結乾燥した。アミノＨＥＳ１０／０．４の収率は、６７％（３．４ｇ）であった。
【０３３９】
４−(４−ホルミル−３,５−ジメトキシフェノキシ)酪酸（Calbiochem-Novabiochem, Laufelfingen, CH）（８０．５ｍｇ）および１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（６１ｍｇ）を、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（Peptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswaard, NL）（３ｍＬ）中に溶解し、そしてＮ,Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（４５．４μＬ）を加えた。２１℃で３０分間インキュベート後に、アミノ−ＨＥＳ１０／０．４（０．３ｇ）を加えた。２２℃で２２時間振り混ぜた後に、該反応混合物を、氷冷のアセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（２３ｍＬ）に加えた。該沈降生成物を遠心分離によって４℃で集め、水（２ｍＬ）およびＤＭＦ（１ｍＬ）の混合物中に再溶解し、そして上記の通り再度沈降させた。該反応生成物を上記の通りに遠心分離によって集め、水（１０ｍＬ）中に再溶解し、水に対して１日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。
【０３４０】
実施例１．９：
アミノ官能化ヒドロキシエチルデンプンおよび４−ホルミル安息香酸からのアルデヒド官能化ヒドロキシエチルデンプンの製造
オキソ−ＨＥＳ１０／０．４（Ｍｗ＝１０ｋＤ、ＤＳ＝０．４）を、DE 196 28 705 A1に従って、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Dによって製造した。
【０３４１】
ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣを用いて測定する場合の該ＨＥＳ１０／０．４の分子量は１４．５ｋＤであり、そして該ＤＳは０．４１であった。
【０３４２】
オキソ−ＨＥＳ１０／０．４の５．１ｇ（０．５１ｍｍｏｌ）を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（１５ｍＬ）中に溶解し、そしてこのものを窒素下で、無水ジメチルスルホキシド（１０ｍＬ）中の１,４−ジアミノブタン（５．１ｍＬ、５１ｍｍｏｌ）の溶液に滴下し、そして４０℃で１９時間撹拌した。該反応混合物を、エタノール（８０ｍＬ）およびアセトン（８０ｍＬ）の混合物に加えた。該得られた沈降物を遠心分離によって分離し、エタノール（２０ｍＬ）およびアセトン（２０ｍＬ）の混合物を用いて洗浄し、そして水（８０ｍＬ）中に再溶解した。該溶液を水に対して４日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5kDカットオフ, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D）、引き続いて凍結乾燥した。アミノ−ＨＥＳ１０／０．４の収率は、６７％（３．４ｇ）であった。
【０３４３】
４−ホルミル安息香酸（１５ｍｇ）および１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（２３０ｍｇ）（共に、Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）を、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（peptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswaard, NL）（１０ｍＬ）中に溶解し、そしてＮ,Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２４０μＬ）を加えた。２１℃で３０分間インキュベート後に、該アミノ−ＨＥＳ１０／０．４（１ｇ）を加えた。２２℃で１９時間振り混ぜた後に、該反応混合物を、氷冷のアセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（８４ｍＬ）に加えた。該沈降生成物を遠心分離によって４℃で集め、水（５０ｍＬ）中に再溶解し、水に対して２日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。
【０３４４】
実施例１．１０：
その還元末端で選択的に酸化するヒドロキシエチルデンプンの過ヨウ素酸酸化による、アルデヒド官能化ヒドロキシルエチルデンプンの製造
オキソ−ＨＥＳ１０／０．４（Ｍｗ＝１０ｋＤ、ＤＳ＝０．４）を、DE 196 28 705 A1に従って、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Dによって製造した。
【０３４５】
ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣを用いて測定する場合の該ＨＥＳ１０／０．４の分子量は１０．５ｋＤであり、そして該ＤＳは０．４１であった。
【０３４６】
オキソ−ＨＥＳ１０／０．４（３００ｍｇ）を、２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．２、１５ｍＬ）中に溶解した。過ヨウ素酸ナトリウム（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（６４．２ｍｇ）を、同じ緩衝液（１５ｍＬ）中に溶解した。両方の溶液を混合し、そして２１℃で３０分間インキュベート後に、グリセロール（２ｍＬ）を加え、そして該反応混合物を２１℃で１０分間インキュベートした。該反応混合物を水に対して２４時間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。
【０３４７】
実施例２：
還元的アミノ化によるＧ−ＣＳＦコンジュゲートの製造
Ｇ−ＣＳＦは、商業的に入手可能な製品、ニューポジェン（登録商標）（Amgen, Munchen, D）と本質的に同じ性質を有する精製Ｇ−ＣＳＦである。
【０３４８】
実施例２．１（ａ）：
非酸化型還元末端を有するヒドロキシエチルデンプンについての、ｐＨ＝７．４での還元的アミノ化によるＧ−ＣＳＦ−コンジュゲートの製造
（比較例）
実施例２．１において、そのものを、ＨＥＳ−Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートの製造のために、WO 03/074087の製造方法（実施例１２、頁２２〜２３）を使用することを試みた。
【０３４９】
０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．４）中のＧ−ＣＳＦ（ニューポジェン（登録商標）（Amgen, Munchen, D製）、またはグラノサイト（登録商標）（Aventis Pharma AG, Zurich, CH製）、それぞれ３ｍｇ／ｍＬ）の水溶液（３．３３μＬ）に、同じ緩衝液中のＨＥＳ１０／０．４（Ｍｗ＝１０kＤ、ＤＳ＝０．４、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D、７９ｍｇ／ｍＬ）の溶液（３．３３μＬ）を加えた。この混合物に、同じ緩衝液中の６０ｍＭ 水素化シアノホウ素ナトリウム溶液（３．３３μＬ）を加え、そして該得られた混合物を２２℃で４時間インキュベートした。引き続いて、新しく調製した６０ｍＭ 水素化シアノホウ素ナトリウムの別の溶液（３．３３μＬ）を加えた。３０時間のインキュベート時間の間、該新しく調製した６０ｍＭ 水素化シアノホウ素ナトリウム溶液（３．３３μＬ）の５部を加えた。該反応混合物は、ゲル電気泳動によって分析した。反応は全く観察されなかった。
【０３５０】
実施例２．１（ｂ）：
非酸化型還元末端を有するヒドロキシエチルデンプンについての、ｐＨ＝５．０〜９．２での還元的アミノ化によるＧ−ＣＳＦ−コンジュゲートの製造
（比較例）
ある緩衝液中のＧ−ＣＳＦ（３ｍｇ／ｍＬ）の水溶液（３．３３μＬ）に、同じ緩衝液中のＨＥＳ（３００ｍｇ／ｍＬ）の溶液（３．３３μＬ）を加えた。該混合物を４℃まで冷却し、そして同じ緩衝液中の６０ｍＭ 水素化シアノホウ素ナトリウム溶液（３．３３μＬ）を４℃で加え、そして該得られた混合物を４℃で２０時間インキュベートした。
【０３５１】
以下のＨＥＳ製造物および緩衝液を使用した。
ａ）緩衝液：０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ ５．０
ＨＥＳ１０／０．４（Ｍｗ＝１０ｋＤ、ＤＳ＝０．４、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D）。ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣを用いて測定する場合の該ＨＥＳ１０／０．４の分子量は８．５ｋＤであり、そして該ＤＳは０．４１であった。
【０３５２】
ＨＥＳ１０／０．７（Ｍｗ＝１０ｋＤ、ＤＳ＝０．７、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)。ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣを用いて測定する場合の該ＨＥＳ１０／０．７の分子量は１０．５ｋＤであり、そして該ＤＳは０．７６であった。
【０３５３】
ＨＥＳ５０／０．４（Ｍｗ＝５０ｋＤ、ＤＳ＝０．４、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D）。ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣを用いて測定する場合の該ＨＥＳ５０／０．４の分子量は５７ｋＤであり、そして該ＤＳは０．４１であった。
【０３５４】
ＨＥＳ５０／０．７（Ｍｗ＝５０ｋＤ、ＤＳ＝０．７、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D）。ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣを用いて測定する場合の該ＨＥＳ５０／０．７の分子量は４７ｋＤであり、そして該ＤＳは０．７６であった。
【０３５５】
ｂ）緩衝液：０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ ７．２
ＨＥＳ１０／０．７（Ｍｗ＝１０ｋＤ、ＤＳ＝０．７、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D）。ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣを用いて測定する場合の該ＨＥＳ１０／０．７の分子量は１０．５ｋＤであり、そして該ＤＳは０．７６であった。
【０３５６】
ｃ）緩衝液：０．１Ｍ ホウ酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ ８．３
ＨＥＳ１０／０．７（Ｍｗ＝１０ｋＤ、ＤＳ＝０．７、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D）。ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣを用いて測定する場合の該ＨＥＳ１０／０．７の分子量は０．５ｋＤであり、そして該ＤＳは０．７６であった。
【０３５７】
ｄ）緩衝液：０．２Ｍ ホウ酸カリウム緩衝液 ｐＨ ９．２
ＨＥＳ１０／０．７（Ｍｗ＝１０ｋＤ、ＤＳ＝０．７、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D）。ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣを用いて測定する場合の該ＨＥＳ１０／０．７の分子量は１０．５ｋＤであり、そして該ＤＳは０．７６であった。
【０３５８】
各反応混合物は、ゲル電気泳動によって分析した。接合は観察されないか、または無視できた（示さないが、反応ｂ）〜ｄ）についてのゲルスキャン）。
【０３５９】
実施例２．２：
酸化型還元末端を有するヒドロキシエチルデンプンについての、ｐＨ＝５．０〜９．２での還元的アミノ化による、Ｇ−ＣＳＦ−コンジュゲートの製造
（比較例）
ある緩衝液中のＧ−ＣＳＦ（３ｍｇ／ｍＬ）の水溶液（３．３３μＬ）に、同じ緩衝液中のオキソ−ＨＥＳ（３００ｍｇ／ｍＬ）の溶液（３．３３μＬ）を加えた。該混合物を４℃まで冷却し、そして同じ緩衝液中の６０ｍＭ 水素化シアノホウ素ナトリウム溶液（３．３３μＬ）を４℃で加え、そして該混合物を４℃で１７時間インキュベートした。
【０３６０】
以下のＨＥＳ製造物および緩衝液を使用した。
ａ）緩衝液：０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ ５．０
オキソ−ＨＥＳ１０／０．７（Ｍｗ＝１０ｋＤ、ＤＳ＝０．７、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D）。ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣを用いて測定する場合の該ＨＥＳ１０／０．７の分子量は１４．５ｋＤであり、そして該ＤＳは０．７６であった。
【０３６１】
オキソ−ＨＥＳ５０／０．４（Ｍｗ＝５０ｋＤ、ＤＳ＝０．４、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D）。ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣを用いて測定する場合の該ＨＥＳ５０／０．４の分子量は４２ｋＤであり、そして該ＤＳは０．４１であった。
【０３６２】
オキソ−ＨＥＳ５０／０．７（Ｍｗ＝５０ｋＤ、ＤＳ＝０．７、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D）。ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣを用いて測定する場合の該ＨＥＳ５０／０．７の分子量は５７ｋＤであり、そして該ＤＳは０．７６であった。
【０３６３】
ｂ）緩衝液：０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ ７．２
ＨＥＳ１０／０．７（Ｍｗ＝１０ｋＤ、ＤＳ＝０．７、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D）。ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣを用いて測定する場合の該ＨＥＳ１０／０．７の分子量は１０．５ｋＤであり、そして該ＤＳは０．７６であった。
【０３６４】
ｃ）緩衝液：０．１Ｍ ホウ酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ ８．３
ＨＥＳ１０／０．７（Ｍｗ＝１０ｋＤ、ＤＳ＝０．７、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D）。ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣを用いて測定する場合の該ＨＥＳ１０／０．７の分子量は１０．５ｋＤであり、そして該ＤＳは０．７６であった。
【０３６５】
ｄ）緩衝液：０．２Ｍ ホウ酸カリウム緩衝液 ｐＨ ９．２
ＨＥＳ１０／０．７（Ｍｗ＝１０ｋＤ、ＤＳ＝０．７、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D）。ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣを用いて測定する場合の該ＨＥＳ１０／０．７の分子量は１０．５ｋＤであり、そして該ＤＳは０．７６であった。
【０３６６】
各反応混合物は、ゲル電気泳動によって分析した。接合は全く観察されないか、あるいは無視できた（示さないが、反応ｂ）〜ｄ）についてのゲルスキャン）。
【０３６７】
ＨＥＳ１０／０．４（Ｍｗ＝８．４ｋＤ、ＤＳ＝０．４１）の酸化は、DE 196 28 705 A1に従って、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Dによって実行した。
【０３６８】
実施例２．３：
過ヨウ素酸酸化によって製造したアルデヒド官能化ヒドロキシエチルデンプンについての、還元的アミノ化によるＧ−ＣＳＦ−コンジュゲートの製造
０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ５．０）中のＧ−ＣＳＦ（グラノサイト（登録商標）（Aventis Pharma AG, Zurich, CH製）およびニューポジェン（登録商標）（Amgen, Munchen, D製）、それぞれ３ｍｇ／ｍＬ）の水溶液（３．３３μＬ）に、同じ緩衝液中のアルデヒド−ＨＥＳ（７９ｍｇ／ｍＬ）の溶液（３．３３μＬ）を加えた。該混合物に、同じ緩衝液中の６０ｍＭ 水素化シアノホウ素ナトリウム溶液（３．３３μＬ）を加え、そして該混合物を２１℃で２５時間インキュベートした。該反応混合物は、ゲル電気泳動によって分析した。
【０３６９】
以下のアルデヒド官能化のＨＥＳコンジュゲートを使用した。
（ｉ−Ｎ）本明細書中に上記する実施例１．１（ａ）に従って、ニューポジェン（登録商標）を用いて製造する；
（ｉｉ−Ｎ）本明細書中に上記する実施例１．１（ｂ）に従って、ニューポジェン（登録商標）を用いて製造する；
（ｉｉｉ−Ｎ）本明細書中に上記する実施例１．２（ａ）に従って、ニューポジェン（登録商標）を用いて製造する；
（ｉｖ−Ｎ）本明細書中に上記する実施例１．２（ｂ）に従って、ニューポジェン（登録商標）を用いて製造する；
（ｉ−Ｇ）本明細書中に上記する実施例１．１（ａ）に従って、グラノサイト（登録商標）を用いて製造する；
（ｉｉ−Ｇ）本明細書中に上記する実施例１．１（ｂ）に従って、グラノサイト（登録商標）を用いて製造する；
（ｉｉｉ−Ｇ）本明細書中に上記する実施例１．２（ａ）に従って、グラノサイト（登録商標）を用いて製造する；
（ｉｖ−Ｇ）本明細書中に上記する実施例１．２（ｂ）に従って、グラノサイト（登録商標）を用いて製造する。
【０３７０】
実施例２．４：
ヒドロキシエチルデンプンとホルミルカルボン酸との接合によって製造した、アルデヒド官能化ヒドロキシエチルデンプンについての、還元的アミノ化によるＧ−ＣＳＦ−コンジュゲートの製造
０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ５．０）中のＧ−ＣＳＦ（３ｍｇ／ｍＬ）の水溶液（３．３３μＬ）に、同じ緩衝液中のアルデヒド−ＨＥＳ（１１８．５ｍｇ／ｍＬ）の溶液（３．３３μＬ）を加え、そして４℃まで冷却した。該混合物に、同じ緩衝液中の６０ｍＭ 水素化シアノホウ素ナトリウム溶液（３．３３μＬ）を４℃で加え、そして該混合物を４℃で１７時間インキュベートした。該反応混合物は、ゲル電気泳動によって分析した。
【０３７１】
以下のアルデヒド官能化ＨＥＳコンジュゲートを使用した：
（ｖ）本明細書中に上記する実施例１．４に従って製造する；
（ｖｉ）本明細書中に上記する実施例１．５に従って製造する；
（ｖｉｉ）本明細書中に上記する実施例１．６に従って製造する：
（ｖｉｉｉ）本明細書中に上記する実施例１．７に従って製造する；
（ｉｘ）本明細書中に上記する実施例１．８に従って製造する。
【０３７２】
実施例２．５：
ヒドロキシエチルデンプンとホルミルカルボン酸との接合によって製造される、アルデヒド官能化ヒドロキシエチルデンプンについての、還元的アミノ化によるＧ−ＣＳＦ−コンジュゲートの製造
０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ５．０）中のＧ−ＣＳＦ（２．２７ｍｇ／ｍＬ）の水溶液（２．５ｍＬ）に、アルデヒド−ＨＥＳ１０／０．４（これは、本明細書中に上記する実施例１．３に記載する通り製造する）（１３６ｍｇ）を加え、そして該溶液を０℃まで冷却した。同じ緩衝液中の氷冷４０ｍＭ 水素化シアノホウ素ナトリウムの溶液（２．５ｍＬ）を加え、そして該混合物を４℃で１７時間インキュベートした。該反応混合物は、ゲル電気泳動によって分析した。
【０３７３】
実施例２．６：
それぞれ実施例１．９および１．１０に従って製造した、アルデヒド官能化ヒドロキシエチルデンプンについての還元的アミノ化による、様々なタンパク質コンジュゲートの製造
0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.0）溶液（xmg/ml；）（本明細書中の表Ｉ）中のプロテインＰ（本明細書中の表Ｉ）溶液wμlに、同じ緩衝液中のHES誘導体（実施例1.9または1.10で述べるように合成したもの）の溶液（200mg/mL）yμlを加えた。その混合物を4℃に冷却し、同じ緩衝液中の120mMシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液zμlを加え、その混合物を4℃で24時間インキュベートした。粗製反応混合物をゲル電気泳動によって分析した。タンパク質バンドの高分子量側への移動によって示されるとおり、全てのタンパク質についてコンジュゲーションの成功が観察された（図７〜１１を参照）。バンド幅の増加は使用したHES誘導体の分子量分布およびタンパク質に連結されたHES誘導体の数によるものである。
【表１】
2007527892.tif 000035
【０３７４】
使用する該ＩＦＮベータは、二および三本鎖(antennary)炭水化物の側鎖およびＮ−アセチルラクトサミン繰り返しを含有する、ＣＨＯ細胞中で産生するｒｈＩＦＮベータ１ａであった。
【０３７５】
使用する該ＥＰＯは、ヒトＥＰＯのアミノ酸配列、および商業的に入手可能なエリポ(Erypo)（登録商標）（ORTHO BIOTECH, Jansen-Cilag）またはネオレコルモン(NeoRecormon)（登録商標）（Roche）（EP 0 148 605、EP 0 205 564、EP 0 411 678を参照）と本質的に同じ性質を有する、組み換え産生するＥＰＯであった。
【０３７６】
実施例３：
実施例２．５で得られるＧ−ＣＳＦ−コンジュゲートの分析
Ａ．精製
Ｇ−ＣＳＦ（これは、商業的な製品ニューポジェン（登録商標）と本質的に同じ性質を有する、精製ｈＧ−ＣＳＦである）を得て、そして１個のアリコートをコントロールとして未修飾のままとした。
【０３７７】
１．アニオン交換クロマトグラフィーによる精製前の、Ｇ−ＣＳＦ試料およびＧ−ＣＳＦ−コンジュゲート試料の緩衝液の交換
該ＨＥＳ−修飾のＧ−ＣＳＦ試料または非修飾Ｇ−ＣＳＦ（コントロールとして）（０．５〜５ｍｇのタンパク質）を、Vivaspin 6 Concentrator units（10.000 MWCO PES, Vivascience, Cat. Nr. VS0602）を用いて緩衝液交換を行なった。試料を０．５〜０．７ｍＬにまで濃縮し、そして１０ｍＭ リン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ ７．２）を用いて５ｍＬまで希釈した。各試料を、この濃縮／緩衝液の交換サイクルについて３回行なった。
【０３７８】
２．ＤＥＡＥ−セファロースカラムを用いる、Ｇ−ＣＳＦおよびそのＨＥＳ−修飾形態のアニオン交換クロマトグラフィー
ＨＥＳ−修飾後の該Ｇ−ＣＳＦ試料、および比較のための非修飾Ｇ−ＣＳＦの試料を精製し、そして上記の通り、AKTA explorer 10 systemを用いることによって、室温でのアニオン交換クロマトグラフィーによって分析した。ＨＥＳ化の前後いずれかのＧ−ＣＳＦのアリコートを、該緩衝液Ａ（１０ｍＭ リン酸Ｎａ、ｐＨ ７．２）に対して限外ろ過によって透析し、あるいは約１３容量の緩衝液Ａを用いて希釈した。ＤＥＡＥ−セファロース（DEAE-Sepharose CL-6B, Pharmacia Kat. Nr. 17-0710-01）（２ｍＬ）を含有するカラムを、５．０カラム容量（ＣＶ）の６．５Ｍ グアニジン／ＨＣｌ、５．０ＣＶの緩衝液Ａ、５．０ＣＶの緩衝液Ｃ（１０ｍＭ リン酸Ｎａ（ｐＨ ７．２）中の１．５ｍＭ ＮａＣｌ）、および次いで１０ＣＶの緩衝液Ａを用いることによって再生した。次いで、試料（１０ｍＭ リン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ ７．２）中の０．８〜４．５ｍＬ）を、流速０．６ｍＬ／分を用いることによって注入した。該試料ループを、使用する試料に応じて緩衝液Ａ（１０ｍＬ（２ｍＬ試料ループの場合）または２０ｍＬ（５ｍＬ試料ループの場合））を用いて洗浄後に、該カラムを更に、０〜２２ＣＶの緩衝液Ａを用いて洗浄した（流速＝０．８ｍＬ／分）。溶出は、０〜１００％ 緩衝液Ｂの直線勾配を５ＣＶ以上で、および２．５ＣＶの１００％ 緩衝液Ｂを用いるイソクラチック操作を用いることによって行なった（流速は、０．６ｍＬ／分を用いる）。該カラムは、５ＣＶの緩衝液Ａを用いて再平衡とし、そして流速が１ｍＬ／分を用いて上記の通り再生した。
【０３７９】
必要な場合には、試料をVivaspin concentratorを用いて濃縮し、そして緩衝液の交換を上記の通り行なった。試料を、０．２μｍ filtrations unit, Corning, Cat. No. 431215を用いる減菌ろ過の前後に、１０ｍＭ 酢酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ ４．０）中、０〜８℃で保存した。以下の試料を、インビトロバイオアッセイおよび更なる分析のために調製した。タンパク質濃度を、以下の項目Ｂ１に記載する通り測定した。
Ｉ．0401-15/A33、0.44 mg/ml、容量＝500μL
Ｇ−ＣＳＦ（大腸菌）
ＩＩ．0401-13/A32、0.28 mg/ml、容量＝900μL
Ｇ−ＣＳＦ（大腸菌）ＨＥＳ−修飾
ＩＩＩ．0401-28/A58、0.60 mg/ml、容量＝350μL
ニューポジェン
ＩＶ．0401-28/A57、0.50 mg/ml、容量＝400μL
ユーラスタ
【０３８０】
Ｂ．分析
該試料のアリコートを、それらのタンパク質含有量および修飾について分析した。
【０３８１】
１．ＲＰ−ＨＰＬＣによる、Ｇ−ＣＳＦタンパク質の定量
該試料のＧ−ＣＳＦタンパク質の含有量を、標準として非修飾タンパク質製品（濃度：０．４５３ｍｇ／ｍＬ）を用いて定量化した。
【０３８２】
Dionex HPLCシステム（これは、pump P 680 A HPG、degassing unit Degasys DG 1210、オートサンプラー、およびインジェクターASI-100、試料ループ 250μL、サーモスタッドカラムデパートメント(thermostated column department)TCC 100、およびUV/Vis-Detektor UVD170U（これは、Software Chromeleon Chromatography Management Systemを備える）から構成される）を使用した。
【０３８３】
プレカラムCC 8/4 Nucleosil 120-5 C4, Macherey-Nagel, Cat. No. 721889、および分離カラム 40 C-4 Nucleosil MPN、5μm、125×4mm RP-column（Macherey-Nagel, 注文No.7200 45.40）を使用した。溶媒ＡはＨ２Ｏおよび０．０６％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸であり、そして溶媒Ｂは０．０６％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含有する９０％アセトニトリル／Ｈ２Ｏであった；流速は、１ｍＬ／分であった。
【０３８４】
ＵＶ検出は、２１４、２２１、２６０および２８０ｎｍの波長とした。
【０３８５】
約１０〜２０μｇの試料をＲＰ−ＨＰＬＣカラムに注入した。以下の勾配を使用した：
０〜５分間：  ０〜１０％Ｂ;
１７分間：  １０〜４５％Ｂ;
３５分間：  ４５〜８０％Ｂ;
３６分間：  ８０〜１００％Ｂ;
３８分間：  １００％Ｂ;
３９分間：  １０％Ｂ;
４５分間：  １０％Ｂ。
【０３８６】
標準的なＧ−ＣＳＦ製品の溶出位置での得られるピーク面積を使用し、そしてこのものを約２８０ｎｍ波長での約２９分に出現するピークと比較することによって、参照標準と比較した。
【０３８７】
２．Ｇ−ＣＳＦタンパク質の還元＋カルボキサミドメチル化
該Ｇ−ＣＳＦタンパク質試料由来のアリコートを、以下の他で記載する通り還元し、そしてカルボキサミドメチル化した（Guillermina Forno, Mariela Bollati Fogolin, Marcos Oggero, Ricardo Kratje, Marina Etcheverrigaray, Harald S. Conradt, Manfred Nimtz (2004) N- and O-linked carbohydrates and glycosylation site occupancy in recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor secreted by a Chinese hamster ovary cell line; European J. Biochem, 273(5), 907-919）。カルボキサミドメチル化により、修飾システイン残基を得る。該カルボキサミドメチル化タンパク質のエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ消化は、２５ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３（１Ｍ 尿素を含有；ｐＨ ７．８）中、酵素／基質の比率を０．２：１０で用いて、１８〜２４時間行なった。
【０３８８】
３．ＲＰ−ＨＰＬＣによる、エンド−Ｇｌｕ−Ｃペプチドの分離
エンド−Ｇｌｕ−Ｃ消化によって得られるペプチドは、Dionex HPLC system（これは、pump P 680 A HPG、degassing unit Degasys DG 1210、オートサンプラー、およびインジェクターASI-100、試料ループ250μL、サーモスタッドカラムデパートメント(thermostated column department)TCC 100、およびUV/Vis-Detektor UVD170U（これは、Software Chromeleon Chromatography Management Systemを備える）から構成される）を用いて分離した。
【０３８９】
プレカラムCC 8/4 Nucleosil 120-5 C4, Macherey-Nagel, Cat. No. 721889、および分離カラム(40 C-4 Nucleosil MPN、5μm、125×4mm RP-column（Macherey-Nagel, ordering No.7200 45.40））を使用した。溶媒ＡはＨ２Ｏおよび０．０６％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸であり、そして溶媒Ｂは０．０６％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含有する９０％アセトニトリル／Ｈ２Ｏであった；流速は、１ｍＬ／分であった。以下の勾配を使用した：
０〜５分間：  １０％Ｂ；
１７分間：  ４５％Ｂ；
６５分間：  １００％Ｂ；
６７分間：  １００％Ｂ；
６９分間：  １０％Ｂ；
７５分間：  １０％Ｂ。
【０３９０】
ＵＶ検出は、２１４、２２１、２６０、および２８０ｎｍ波長とした。エンド−Ｇｌｕ−Ｃ消化によって得られるペプチドは、分離可能であった（データを示さない）。
【０３９１】
４．マトリックス−支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ／ＴＯＦ−ＭＳ）による、タンパク質分解性ペプチドの分析
質量分析を用いて、調製する異なる標本中のＧ−ＣＳＦの無傷のＮ−末端を検出した。還元し且つカルボキシアミドメチル化タンパク質標本のエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ消化から得られる標本（３〜５μｇ）を、ＭＳ−分析（工程３のＲＰ−ＨＰＬＣなし）において直接に使用し、そしてこのものを製造主の指示に従って、Ｃ１８逆相物質を含有するZipTipピペットチップを用いて精製した。０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸を用いて洗浄後に、ペプチドの溶出を、６０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル中の０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸（１０μＬ）を用いて行った。
【０３９２】
タンパク質分解性（エンド−Ｇｌｕ−Ｃ）ペプチドフラグメントは、アセトニトリル（４００μＬ）および０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（６００μＬ）／Ｈ２Ｏ中の３,５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ−桂皮酸（２２．４ｍｇ）のマトリックスを使用する、直線正イオンモード(linear positive ion mode)で、Bruker ULTRAFLEX時間飛行型（TOF／TOF）装置を用いて分析した。(グリコ)−ペプチドは、分解能増大のためのリフレクション(reflectron)を用いる、同じ溶媒混合物中のα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（１９ｍｇ）のマトリックスを用いて測定した。標本溶液（１μＬ、および１〜１０ｐｍｏｌμＬ−１の適当な濃度）を、等量の個々のマトリックスと混合した。この混合物をステンレススチール標的中にスポットし、分析前に室温で乾燥した。スペクトルは、マスレンジが９００〜５０００ダルトンで記録した。以下の表は、予想される質量と個々のＧ−ＣＳＦペプチドとを相関する。
【表２】
2007527892.tif 000036
【０３９３】
システイン残基をカルボキシアミドメチル化した；脂肪として標識化するペプチドは、非修飾Ｇ−ＣＳＦのＭＡＬＤＩ／ＴＯＦスペクトルにおいて検出した。
【０３９４】
該タンパク質の１〜２０位を含有するＮ−末端エンド−ＧＬｕ−Ｃペプチド（MTPLGPASSLPQSFLLKCLE; m/z 2189.1）は、上記の通りＧ−ＣＳＦをエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃを用いてタンパク質分解処置後に、試料のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトルにおいて検出した。
【０３９５】
結果：
Ｉ．Ｇ−ＣＳＦおよびＨＥＳ−修飾変異体の精製
ＨＥＳ−修飾Ｇ−ＣＳＦおよび非修飾Ｇ−ＣＳＦについて、Ａ４で記載する通り、ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂカラムを用いる精製を行なった。
【０３９６】
非修飾試料０４０１−１５／Ａ３３の場合には、２８０ｎｍでの有意な吸収はフロースルーにおいては検出されず、そして該タンパク質は、容量が６ｍＬで濃度が４０〜５０％緩衝液Ｂ（０．１６〜０．２０Ｍ ＮａＣｌ）で溶出し、２８０ｎｍでの特異的なピーク面積は６６０ｍＡＵ×ｍＬ×ｍｇ−１であった。
【０３９７】
該試料は（ＨＥＳ修飾Ｇ−ＣＳＦ）は、緩衝液Ｂの濃度が２０〜８０％（０．０８〜０．３２Ｍ ＮａＣｌ）の大きな範囲の勾配で容量が１２ｍＬで溶出した。２８０ｎｍで検出した総ピーク面積の約９０％はフロー−スルーにおいて見出され、これは、総タンパク質の約５０％を含有し、溶出するタンパク質と比較して明らかにわずかにより大きな分子量を有し、これは、図１３において示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって検出した。
【０３９８】
タンパク質の回収は、非修飾Ｇ−ＣＳＦタンパク質と比較した溶出分画のピーク面積（Ａ２８０ｎｍ）に基づいて算出した。
【表３】
2007527892.tif 000037
【０３９９】
ＩＩ．エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃを用いて処置後の、ペプチドマッピングおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによるタンパク質の分析
カルボキサミドメチル化非修飾Ｇ−ＣＳＦ（図１４）および市販品ニューポジェン（データは示さない）の両方のエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ消化から生じるＮ−末端ペプチドは、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳによって明らかに検出された（MTPLGPASSLPQSFLLKC*LE, m/z 2189.1；システインカルボキサミドメチル化）。このシグナルは、ＨＥＳ−修飾（図１５）およびユーラスタ（データは示さない）について行なった（これは、このペプチドの修飾を示唆する）。
【０４００】
ＨＥＳ−修飾Ｇ−ＣＳＦのＮ−末端配列決定はブロックされたＮ−末端を示し、これは、このタンパク質誘導体のＮ−末端メチオニン残基がＨＡＳ誘導体によって修飾されるという事実を示唆する。
【表４】
2007527892.tif 000038
【０４０１】
引用文献：
Guillermina Forno, Mariela Bollati Fogolin, Marcos Oggero, Ricardo Kratje, Marina Etcheverrigaray, Harald S. Conradt, Manfred Nimtzによる (2004) N- and O-linked carbohydrates and glycosylation site occupancy in recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor secreted by a Chinese hamster ovary cell line. Eur. J. Biochem, 271 (5), 907-919.
Nimtz, M., Grabenhorst, E., Conradt, H. S., Sanz, L. & Calvete, J. J.による (1999) Structural characterization of the oligosaccharide chains of native and crystallized boar seminal plasma spermadhesin PSP-I and PSP-II glycoforms. Eur. J. Biochem. 265, 703-718.
Nimtz, M., Martin, W., Wray, V., Kloppel, K.-D., Agustin, J. & Conradt, H. S. による (1993) Structural characterization of the oligosaccharide chains of native and crystallized boar seminal plasma spermadhesin PSP-I and PSP-II glycoforms. Eur. J. Biochem. 265, 703-718.
Nimtz, M., Noll G., Paques, E. & Conradt, H. S.による (1990) Carbohydrate structures of human tissue plasminogen activator variant expressed in recombinant Chinese hamster ovary cells. FEBS Lett. 271, 14-18.
Schroter, S., Derr, P., Conradt, H. S., Nimtz, M., Hale, G. & Kirchhoff, C.による (1999) Male-specific modification of human CD52. J. Biol. Chem. 274, 29862-29873.
E. GrabenhorstおよびH. S. Conradtによる (1999) The Cytoplasmic, Transmembrane and the Stem Regions of Glycosyltransferases specify their in vivo functional sublocalization and stability in the Golgi. J. Biol. Chem., 274, 36107-36116.
E. Grabenhorst, A. Hoffmann, M. Nimtz, G. ZettlmeiβlおよびH. S. Conradtによる (1995) Construction of stable BHK-21 cells coexpressing human secretory glycoproteins and human Galβ1-4GlcNAc-R 2,6-sialyltransferase: 2,6-linked NeuAc is preferably attached to the Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manβ1-3-branch of biantennary oligosaccharides from secreted recombinant -trace protein. Eur. J. Biochem., 232, 718-725.
【０４０２】
実施例４：実施例２．５において得られそして実施例３に従って精製した、該Ｇ−ＣＳＦ−コンジュゲートのインビトロ結果：マウスＮＦＳ−６０細胞におけるＧ−ＣＳＦ変異体の分裂促進性
Ｇ−ＣＳＦは、好中球顆粒球系統の造血細胞の増殖、分化、および活性化においてその特異的な効果が知られる。Ｇ−ＣＳＦ変異体の分裂促進能力を、マウスＮＦＳ−６０細胞を用いて試験した（N. Shirafujiらによる，Exp. Hematol. 1989, 17, 116-119）。外因性ＩＬ−３の供給源としての条件培地、５〜１０％ ＷＥＨＩ−３Ｂ（DSMZ, Braunschweig, D；DSMZによって記載されている通り培養する）を含有する１０％ウシ胎児血清（Gibco INVITROGEN GmbH, Karlsruhe, D）と一緒にＲＰＭＩ培地中で培養した細胞を、遠心分離によって集め、洗浄し、そして２４ウェルプレート中、ウェル当たり１００,０００細胞でアリコートした。同じ培地中に希釈したＧ−ＣＳＦ増殖因子試料を加える前に、細胞を、ＷＥＨＩ−３Ｂ条件培地なしのＲＰＭＩ培地中、３７℃で１時間、適合させた。ＮＦＳ−６０細胞を、３７℃で３日間、精製Ｇ−ＣＳＦ変異体に曝露し、そして次いで、該細胞を電子工学的にカウントした（Casy TT Cell Counter, Scharfe System, Reutlingen, D）。該結果を、図１２にまとめる。図１２に示す通り、異なるＧ−ＣＳＦ変異体（０．５〜５０ｐｇ／ｍＬ）は、加える成長因子を含まない培地と比較して、３日後に細胞の数の増大を刺激し得た。
【０４０３】
非修飾コントロールタンパク質のＧ−ＣＳＦ／Ａ３３およびＧ−ＣＳＦ／Ａ５８は、非常に同程度で細胞を刺激し（ＥＤ５０＝５〜１０ｐｇ／ｍＬ）、一方でＧ−ＣＳＦコンジュゲートＧ−ＣＳＦ／Ａ３２およびＧ−ＣＳＦ／Ａ５７は、非修飾変異体と比べた場合には、活性のほんの小さな低下を示した（ＥＤ５０＝１０〜２５ｐｇ／ｍ）。
【０４０４】
実施例５：還元的アミノ化によって製造したＡ１ＡＴ（α１ＡＴ、アルファ１ａＴ）コンジュゲート
実施例５．１：酸化ＨＥＳからのアミノ−ＨＥＳ（Ａ）の製造
オキソ−ＨＥＳ（Ｍｗ＝５７,０００Ｄ、ＤＳ＝０．７６、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D, DE 196 28 705 A1に従って製造）（６．０９ｇ）を真空下、８０℃で終夜加熱し、乾燥ジメチルスルホキシド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（３２ｍＬ）中、窒素下で溶解し、そして１,４−ジアミノブタン（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（１．２２ｍＬ）を加えた。４０℃で１７時間撹拌後に、該反応混合物を、氷冷のアセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（１５０ｍＬ）に加えた。該沈降した生成物を４℃での遠心分離によって集め、氷冷のアセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（４０ｍＬ）を用いて洗浄し、そして遠心分離によって集めた。該粗生成物を水（８０ｍＬ）中に溶解し、水に対して４日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。単離生成物の収率は、８２％であった。
【０４０５】
実施例５．２：実施例５．１のアミノ−ＨＥＳ（Ａ）からのアルデヒド−ＨＥＳ（Ａ）の製造
４−ホルミル安息香酸（１２５ｍｇ）および１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（１７４ｍｇ）（共に、Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）を、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（Peptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswaard, NL）（３８ｍＬ）中に溶解し、そしてＮ,Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（１５５μＬ）を加えた。２１℃で３０分間インキュベート後に、アミノ−ＨＥＳ（Ａ）（実施例５．１に記載する通り製造）（３．８ｇ）を加えた。２２℃で１９時間振り混ぜた後に、該反応混合物を、氷冷のアセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（１６０ｍＬ）に加えた。該沈降生成物を４℃での遠心分離によって集め、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）中に再溶解し、そして実施例５．１中に上記する通り、氷冷のアセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（８０ｍＬ）を用いて沈降させた。遠心分離後に、該沈降物を水（５０ｍＬ）中に溶解し、水に対して２日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。単離生成物の収率は７７％であった。
【０４０６】
実施例５．３：酸化ＨＥＳからのアミノ−ＨＥＳ（Ｂ）の製造
オキソ−ＨＥＳ（Ｍｗ＝５７,０００Ｄ、ＤＳ＝０．７６、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D、DE 196 28 705 A1に従って製造）（１０ｇ）を真空下、８０℃で終夜加熱し、窒素下で乾燥ジメチルスルホキシド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（５２ｍＬ）中に溶解し、そして１,４−ジアミノブタン（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（２ｍＬ）を加えた。４０℃で１７時間撹拌後に、該反応混合物を、氷冷２−プロパノール（Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D）（３５０ｍＬ）に加えた。該沈降生成物を４℃での遠心分離によって集め、氷冷２−プロパノール（８０ｍＬ）を用いて洗浄し、そして遠心分離によって集めた。該粗生成物を水（８０ｍＬ）中に溶解し、水に対して２日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。単離生成物の収率は、８５％であった。
【０４０７】
実施例５．４：実施例５．３のアミノ−ＨＥＳ（Ｂ）からのアルデヒド−ＨＥＳ（Ｂ）の製造
４−ホルミル安息香酸（１５３ｍｇ）および１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（２４１ｍｇ）（共に、Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）を、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（Peptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswaard, NL）（５１ｍＬ）中に溶解し、そしてＮ,Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（１７０μＬ）を加えた。２１℃で３０分間インキュベート後に、アミノ−ＨＥＳ（Ｂ）（実施例５．３に記載する通りで製造）（５．１ｇ）を加えた。２２℃で１６時間振り混ぜた後に、該反応混合物を、氷冷のアセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（３６０ｍＬ）に加えた。該沈降生成物を４℃での遠心分離によって集め、そして水（５０ｍＬ）中に再溶解し、そして実施例５．１中に上記の通り、氷冷のアセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（３６０ｍＬ）を用いて沈降させた。遠心分離後に、該沈降物を水（５０ｍＬ）中に溶解し、水に対して２日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。単離生成物の収率は、８７％であった。
【０４０８】
実施例５．５：還元的アミノ化による、アルデヒド−ＨＥＳ（Ａ）および（Ｂ）のＡ１ＡＴとの接合
アルデヒド−ＨＥＳ（Ｂ）（実施例５．４に記載する通り製造）（１８９ｍｇ）およびアルデヒド−ＨＥＳ（Ａ）（実施例５．２に記載する通り製造）（１７２ｍｇ）の混合物を、反応緩衝液（０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ ７．２）（２．８８ｍＬ）中に溶解した。２０℃で、同じ緩衝液中の６０ｍＭ 水素化シアノホウ素ナトリウム溶液（１．６７ｍＬ）を加え、続いてＡ１ＡＴ溶液（２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ ７．２中のｃ（Ａ１ＡＴ）＝１１．０ｍｇ／ｍＬ、Ａ１ＡＴ＝ｒｈ Ａ１ＡＴ（GTC Biotherapeutics Inc.（Framingham, MA, ロット番号080604A）によって供給））（０．４５５ｍＬ）を加えた。該混合物を２０℃でインキュベートした。１７時間後に、該反応緩衝液（２００μＬ）中に溶解した更なる水素化シアノホウ素ナトリウム（６．７ｍｇ）を加え、そして該混合物を同じ温度で更に２４時間インキュベートした。総インキュベート時間が２５時間後に、この溶液（１０μＬ）を、ゲル電気泳動によって分析した（図１６を参照）。
【０４０９】
実施例５．６：還元的アミノ化による、ＨＥＳとＡ１ＡＴとの接合（反応コントロール）
ＨＥＳ（Ｍｗ＝５６,０００Ｄ、ＤＳ＝０．４１、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D）（３６２ｍｇ）を、反応緩衝液（０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ ７．２）（２．８８ｍＬ）中に溶解した。２０℃で、同じ緩衝液中の６０ｍＭ 水素化シアノホウ素ナトリウム溶液（１．６７ｍＬ）を加え、続いてＡ１ＡＴ溶液（２００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ ７．２、α１ＡＴ＝ｒｈ α１ＡＴ（GTC Biotherapeutics Inc.（Framingham, MA, ロット番号080604A）によって供給）中のｃ(Ａ１ＡＴ)＝１１．０ｍｇ／ｍＬ）（０．４５５ｍＬ）を加えた。該混合物を２０℃でインキュベートした。１７時間後に、該反応緩衝液（２００μＬ）中に溶解した更なる水素化シアノホウ素ナトリウム（６．７ｍｇ）を加え、そして該混合物を同じ温度で更に２４時間インキュベートした。総インキュベート時間が２５時間後に、この溶液（１０μＬ）をゲル電気泳動によって分析した（図１７を参照）。
【０４１０】
実施例５．７：イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）による、ＨＥＳ−Ａ１ＡＴコンジュゲートの精製
Ａ１ＡＴのコンジュゲートは、AKTA-Explorerクロマトグラフィーシステムを用いるHiTrap Q HPカラムを用いるイオン交換クロマトグラフィー（共に、Amersham Biosciences製）によって精製した。該精製は、「Chen, Hammond, LangおよびLebing, Purification of α1Proteinase Inhibitor from Human Plasma Fraction IV-1 by Ion Exchange Chromatography, VoxSanguinis 1998, 74, 232-241」中に記載する通り、ヒト血清からのＡ１ＡＴの単離に従って行なった。
【０４１１】
試料調製：溶出液として２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ ８を用いるAKTA-Expolrerクロマトグラフィーと組み合わせた、HiPrep 26/10脱塩カラム(Desalting column)（Amersham Biosciences）を用いる、緩衝液交換
緩衝液交換は、該粗反応混合物（実施例５．５中に記載する通り製造、約５ｍＬ）を脱塩水を用いて最終的な容量が１０ｍＬにまで希釈後に、以下のパラメータを使用して行なった。
カラム：                HiPrep 26/10脱塩；
流速：                  １０ｍＬ／分
溶出液：                ２０ｍＭ リン酸ナトリウム
２０ｍＭ 塩化ナトリウム
ｐＨ ８
試料容量：              １０ｍＬ
溶出液分画：            ２．５ｍＬ
平衡化：                ５カラム容量
溶出の長さ：            ２カラム容量
【０４１２】
溶出液の最初の１４ｍＬを貯蔵し、そして結合性緩衝を加えて最終的な容量が２０ｍＬを得た。タンパク質（約５ｍｇ）を含有するこの溶液を、以下のパラメータを使用するＩＥＣによって精製した。
カラム：                HiTrap Q HP  １ｍＬ
流速：                  １ｍＬ／分
結合性緩衝液（ＢＢ）：  ２０ｍＭ リン酸ナトリウム
２０ｍＭ 塩化ナトリウム
ｐＨ ８
溶出緩衝液（ＥＢ）：    ２０ｍＭ リン酸ナトリウム
１ｍＭ 塩化ナトリウム
ｐＨ ８
試料容量：              ２０ｍＬ
フロースルー分画：      ２ｍＬ
溶出分画：              １ｍＬ
開始濃度ＥＢ：          ０％
平衡化：                ５カラム容量
未結合試料の洗い出し：  １５ｍＬ
標的濃度 ＥＢ：         １５％
勾配の長さ：            ２０ｍＬ
【０４１３】
クロマトグラフィー後に集めた分画を、ＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。ＨＥＳ−Ａ１ＡＴコンジュゲートを含有する分画を貯蔵した（分画Ｂ１〜Ｃ６に対応して、溶出容量は４０〜４７ｍＬ、図１７を参照）。該貯蔵した分画のいくつかにおいて、少量の未反応Ａ１ＡＴが検出可能であった。参照標準物質としてＡ１ＡＴ（GTC Biotherapeutics Inc.（Framingham, MA, ロット番号080604A）によって供給）を用いて、ＢＣＡ（Pierce Cat. No. 23225）によって測定されるクロマトグラフィー後の、該貯蔵分画の最初の濃度は、１７０μｇ／ｍＬであった。２０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ ７．２中での希釈および緩衝液交換後に、得られたタンパク質濃度は、５４．５μｇ／ｍＬ（ＢＣＡ（pierce with Ａ１ＡＴ from GTC Biothearpeutics Inc., Framingham, MA, lot No. 080604A（参照標準として））であった。この最終的な溶液を用いて、該コンジュゲートの阻害力価を測定した。
【０４１４】
実施例５．８：ヒト顆粒球エラスターゼについての、ＨＥＳ−Ａ１ＡＴコンジュゲートのインビトロ阻害能力の測定
該コンジュゲートのエラスターゼ阻害活性試験は、Tecan UV-VIS-Platereader Model Sunriseを用いるCastilloらによる，Anal. Biochem. 1979, 99, 53-64に従って行なった。
【０４１５】
このアッセイは、エラスターゼによって触媒される、Ｎ−Ｍｅｔ−Ｏ−スクシニル−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐ−Ｎｏ２−アニリンからのｐ−ニトロアニリンの放出に基づく。この加水分解は、４０５ｎｍでの吸収の増大後に行なうことができる。初期加水分解速度は、酵素の活性と密に相関する。該アッセイは、異なる濃度の被験するインヒビターのあるなしで行なった。被験物質の阻害活性に従う酵素活性の低下は、時間対のＡ４０５プロットの傾きの低下で表される。ある阻害濃度の存在下での残留エラスターゼ活性は、非阻害曲線の傾きによって割った該阻害曲線の傾きによって示される。該残留酵素活性および該阻害濃度との間の直線的な相関が存在する。直線回帰を用いることによって、直線的な滑らかな線を得ることができ、そして示すインヒビター濃度についての残留酵素活性を算出することができる。この方法によって、同じ濃度の異なるインヒビターの阻害活性（＝１−残留酵素活性）を比較することができる（図１８を参照）。
【０４１６】
以下のパラメータを使用した。
基質濃度                  １．５ｍＭ
エラスターゼ活性：        ７．５ｍＵ
波長：                    ４０５ｎｍ
温度：                    ２０℃
時間間隔：                １５秒
動力学的なサイクル：      ２５
測定モード：              中心
【０４１７】
該アッセイ溶液は、緩衝液（０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％(ｍ／ｖ） トリトン(Triton)Ｘ−１００、ｐＨ ７．５）（３００μＬ）（１０％ ＤＭＳＯ、１．５ｍＭ Ｎ−Ｍｅｔ−Ｏ−スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐ−ＮＯ２−アニリン、７．５ｍＵ エラスターゼ、および様々な量のインヒビターを含有する）から構成した。
【０４１８】
エラスターゼは、Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg社から購入した。全ての他の物質は、Sigma Aldrich, Taufkirchen社から購入した。
【０４１９】
実施例５．５中に記載する通り製造する該コンジュゲートの阻害活性は、参照物質としてのプロラスチン(Prolastin)（登録商標）ＨＳ（Bayer Vital GmbH, Leverkusen, 独国ロット番号PR4HA43）および接合のための出発物質としてのＡ１ＡＴ（GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, ロット番号080604A）と比較して比較した。残留酵素活性対濃度プロットを、図１８に示す。全ての曲線の直線性は、Ｒ２＞０．９８であった。以下において、ＩＣ５０値およびｃ（インヒビター）＝１μｇ／ｍＬの場合のエラスターゼ阻害を、引用文献に関する出発物質およびコンジュゲートの阻害活性とあわせて示す。以下の表中に概説するデータは、Ａ１ＡＴ活性の大部分がＨＥＳとの接合後に残ることを明らかに実証する。
【表５】
2007527892.tif 000039
【０４２０】
実施例５．９
ｒｈアルファ１ＡＴおよび血漿由来ｈアルファ１ＡＴと比較した、ＨＥＳ−ｒｈアルファ１ＡＴコンジュゲートのインビボ半減期の測定
８〜１０週齢の雌性マウス（BALB/cOlaHsd, Harlan GmbH, Borchen, 独国）を被験静物（４２マウス、標本毎に１４）として使用した。各動物の「体重」は、異なる標本溶液の投与の直前に検出した。緩衝液（ｐＨ＝７．２）（２０ｍｍｏｌ リン酸ナトリウム、１５０ｍｍｏｌ 塩化ナトリウム）中、以下に概説する標本の５０μｇ／ｍＬ溶液（１００μＬ）を、該マウスの尾静脈中に静脈内注射した。
標本１：ｒｈアルファ１ＡＴ（GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, ロット番号080604A）、
標本２：実施例５．５で製造する、ｒｈアルファ１ＡＴ−ＨＥＳコンジュゲート、
標本３：血漿由来ｈアルファ１ＡＴ（SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, 独国）。
【０４２１】
注射の１、２、４、１０、２４、３１．５および４８時間後に、各群の２マウスを殺し、そして全血液標本（〜５００μＬ）を該動物の心臓から取り出した。血清は、Microvette（登録商標）500 Z-Gel（Sarstedt, Numbrecht, 独国）を用いて調製した。該血清標本を、アルファ１ＡＴ濃度測定の開始まで、−８０℃で保存した。
【０４２２】
アルファ１ＡＴ濃度を、商業的に入手可能なアルファ１ＡＴ−ＥＬＩＳＡ（Immundiagnostik, Bensheim, 独国）を用いて、製造主の指示に従って検出した。
【０４２３】
得られる結果は、非修飾のｒｈアルファ１ＡＴ出発物質と比較して、ｒｈアルファ１ＡＴ−ＨＥＳコンジュゲートについての有意な血清中半減期の増大を示す。該コンジュゲートの測定する半減期は、以下の表に記載する血漿由来のｈアルファ１ＡＴのものよりも同じ範囲である。
【表６】
2007527892.tif 000040
【０４２４】
実施例６：Ｇ−ＣＳＦ−コンジュゲートの製造
実施例６．１：アルデヒド−ＨＥＳ誘導体の製造
実施例６．１（ａ）：アミノＨＥＳ１０／０．４の製造
オキソ−ＨＥＳ１０／０．４（Ｍｗ＝１４，５００Ｄ、ＤＳ＝０．４１、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D、DE 196 28 705 A1に従って製造）（５．１２ｇ）を、真空下、８０℃で終夜加熱し、そして窒素下、乾燥ジメチルスルホキシド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（２５ｍＬ）中に溶解し、そして１,４−ジアミノブタン（５．１３ｍＬ）を加えた。４０℃で１７時間撹拌後に、該反応混合物を、氷冷のアセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（１５０ｍＬ）に加えた。該沈降生成物を４℃の遠心分離によって集め、氷冷のアセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（４０ｍＬ）を用いて洗浄し、そして遠心分離によって集めた。該粗生成物を水（８０ｍＬ）中に溶解し、水に対して４日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。単離生成物の収率は６７％であった。
【０４２５】
実施例６．１（ｂ）：アルデヒドＨＥＳ１０／０．４の製造
４−ホルミル安息香酸（１０５ｍｇ）および１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（１３５ｍｇ）（共に、Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）を、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（peptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswaard, NL）（７ｍＬ）中に溶解し、そしてＮ,Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（１３５μＬ）を加えた。２１℃で３０分間インキュベートした後に、アミノＨＥＳ１０／０．４（実施例６．１（ａ）中に記載する通り製造）（０．７ｇ）を加えた。２２℃で１８時間振り混ぜた後に、該反応混合物を、氷冷のアセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（４２ｍＬ）に加えた。該沈降生成物を４℃の遠心分離によって集め、ＤＭＦ（５ｍＬ）中に再溶解し、そして上記の通りエタノール／アセトン（４２ｍＬ）を用いて沈降させた。遠心分離後に、該集めた沈降生成物を水を用いて溶解し、水に対して１日透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。単離生成物の収率は９５％であった。
【０４２６】
実施例６．１（ｃ）アミノＨＥＳ１０／０．７の製造
オキソ−HES10／0.7（MW＝15,000D，DS＝0.76，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム, D, DE 196 28 705に従って製造したもの）6.02gを窒素下で乾燥ジメチルスルホキシド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，タウフキルヒェン, D）32mLに溶解し、1,4-ジアミノブタン6.03mlを加えた。40℃で17時間撹拌した後、反応混合物をアセトンとエタノールの氷冷1：1混合物（v/v）150mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、アセトンとエタノールの氷冷1：1混合物（v/v）40mLで洗浄し、遠心分離によって集めた。粗生成物を水80mlに溶解し、水に対して4日間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Science Deutschland GmbH，ボン, D）、凍結乾燥した。単離生成物収率は52％だった。
【０４２７】
実施例６．１（ｄ）アルデヒドＨＥＳ１０／０．７の製造
4-ホルミル安息香酸150mgおよび1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾール230mg（どちらもAldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）をN,N-ジメチルホルムアミド（ペプチド合成用，Biosolve，オランダ・ファルケンスワルト）10mlに溶解し、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）204μLを加えた。21℃で30分間インキュベートした後、アミノHES10/0.7（6.1(c)で述べたように合成したもの）1gを加えた。22℃で19時間振とうした後、反応混合物を氷冷2-プロパノール84mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、水50mlに再溶解し、水に対して2日間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。単離生成物の収率は83％だった。
【０４２８】
実施例６．１（ｅ）アミノＨＥＳ３０／０．４の製造
オキソ-HES30/0.4（MW＝28,000D，DS＝0.41，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム、DE 196 28 705 A1に従う成分のモル比を使用したもの）5gを真空下、80℃で終夜加熱し、次いで窒素下で乾燥ジメチルスルホキシド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）28mLに溶解し、1,4-ジアミノブタン1.67mlを加えた。40℃で17時間撹拌した後、反応混合物をアセトンとエタノールの氷冷1：1混合物（v/v）175mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集めた。粗生成物を水40mlに溶解し、水に対して2日間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Science Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。単離生成物収率は測定しなかった。
【０４２９】
実施例６．１（ｆ）アルデヒドＨＥＳ３０／０．４の製造
4-ホルミル安息香酸130mgおよび1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾール153mg（どちらもAldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）をN,N-ジメチルホルムアミド（ペプチド合成用，Biosolve，オランダ・ファルケンスワルト）36mlに溶解し、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）110μLを加えた。21℃で30分間インキュベートした後、アミノHES30/0.4（6.1(e)で述べたように合成したもの）2.61gを加えた。22℃で22.5時間振とうした後、反応混合物をアセトンとエタノールの氷冷1:1混合物（v/v）160mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、アセトンとエタノールの氷冷1：1混合物（v/v）で洗浄した。遠心分離した後、沈殿物を水30mLに溶解し、水に対して1日間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。単離生成物収率は81％だった。
【０４３０】
実施例６．１（ｇ）アミノＨＥＳ３０／０．７の製造
オキソ-HES30/0.7（MW＝31,000D，DS＝0.76，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム、DE 196 28 705 A1に従う成分のモル比を使用したもの）5gを真空下、80℃で終夜加熱し、次いで窒素下で乾燥ジメチルスルホキシド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）28mLに溶解し、1,4-ジアミノブタン1.67mlを加えた。40℃で17時間撹拌した後、反応混合物をアセトンとエタノールの氷冷1：1混合物（v/v）175mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集めた。粗生成物を水40mlに溶解し、水に対して2日間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Science Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。単離生成物収率は測定しなかった。
【０４３１】
実施例６．１（ｈ）アルデヒドＨＥＳ３０／０．７の製造
4-ホルミル安息香酸122mgおよび1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾール144mg（どちらもAldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）をN,N-ジメチルホルムアミド（ペプチド合成用，Biosolve，オランダ・ファルケンスワルト）34mlに溶解し、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）103μLを加えた。21℃で30分間インキュベートした後、アミノHES30/0.7（6.1(g)で述べたように合成したもの）2.46gを加えた。22℃で22.5時間振とうした後、反応混合物をアセトンとエタノールの氷冷1:1混合物（v/v）160mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、アセトンとエタノールの氷冷1：1混合物（v/v）で洗浄した。遠心分離した後、沈殿物を水30mLに溶解し、水に対して1日間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。単離生成物収率は87％だった。
【０４３２】
実施例６．１（ｉ）アミノＨＥＳ５０／０．７の製造
オキソ-HES50/0.7（MW＝57,000D，DS＝0.76，Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム、DE 196 28 705 A1に従う成分のモル比を使用したもの）6/09gを真空下、80℃で終夜加熱し、次いで窒素下で乾燥ジメチルスルホキシド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）32mLに溶解し、1,4-ジアミノブタン1.22mlを加えた。40℃で17時間撹拌した後、反応混合物をアセトンとエタノールの氷冷1：1混合物（v/v）150mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、アセトンとエタノールの氷冷1：1混合物（v/v）40mLで洗浄し、遠心分離することによって集めた。粗生成物を水80mlに溶解し、水に対して4日間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Science Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。単離生成物収率は82％だった。
【０４３３】
実施例６．１（ｊ）アルデヒドＨＥＳ５０／０．７の製造
4-ホルミル安息香酸125mgおよび1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾール174mg（どちらもAldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）をN,N-ジメチルホルムアミド（ペプチド合成用，Biosolve，オランダ・ファルケンスワルト）38mlに溶解し、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）155μLを加えた。21℃で30分間インキュベートした後、アミノHES50/0.7（6.1(i)で述べたように合成したもの）3.8gを加えた。22℃で19時間振とうした後、反応混合物をアセトンとエタノールの氷冷1:1混合物（v/v）160mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、N,N-ジメチルホルムアミド20mlに再溶解し、アセトンとエタノールの氷冷1：1混合物（v/v）80mLで上述のように沈殿させた。遠心分離した後、沈殿物を水50mLに溶解し、水に対して2日間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。単離生成物収率は77％だった。
【０４３４】
実施例６．２：還元的アミノ化による、ＨＥＳ−Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートの製造
実施例６．２（ａ）：緩衝液交換Ａ
１０ｍＭ 酢酸ナトリウム中の０．４５４ｍｇ／ｍＬ ｈＧ−ＣＳＦ（商業的な製品ニューポジェンと本質的に同じ性質を有する、精製ｈＧ−ＣＳＦ）（３３ｍＬ）、５０ｍｇ／ｍＬ ソルビトールおよび０．００４％ トゥイーン(Tween)８０（ｐＨ ４．０）を、Vivaspin 15R concentrator（VS15RH11, 5KD MWCO, Vivascience AG, Hannover, D）を用いて４ｍＬまで０℃でのダイアフィルトレーションによって濃縮し、そして０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ５．０）を用いて１５ｍＬまで再希釈した。このダイアフィルトレーションを２回繰り返した。最後のダイアフィルトレーション工程における最後の濃度は、３ｍｇ／ｍＬとした。
【０４３５】
実施例６．２（ｂ）  ｈＧ−ＧＳＦと実施例６．１（ｂ）、６．１（ｄ）および６．１（ｊ）のアルデヒドＨＥＳ誘導体との反応
0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）への緩衝液交換後のhG-GSFの溶液1.67mL（上記実施例6.2(a)に記載）に、HES誘導体の溶液1.67mLおよび60mMシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液1.67mL（共に同じ緩衝液中）を加え、その溶液を4℃で15.5時間インキュベートした。混合前に全ての溶液を0℃に冷却した。
【０４３６】
以下の最終HES濃度を使用した。
・実施例6.1(b)および6.1(d)に従って製造したHES誘導体については39.4mg/mL、
・実施例6.1(j)に従って製造したHES誘導体については197mg/mL、
・反応対照として197mg/mLのHES50/0.7（MW＝47,000D，DS＝0.76, Supramol Parenteral Colloids GmbH，ドイツ・ロスバッハ-ロドハイム）。
該反応混合物をゲル電気泳動によって分析した（図１９を参照）
【０４３７】
実施例６．２（ｃ）：緩衝液交換Ｂ
１０ｍＭ 酢酸ナトリウム中の０．４５４ｍｇ／ｍＬ ｈＧ−ＣＳＦ（商業的な製品ニューポジェン（登録商標）と本質的に同じ性質を有する、精製ｈＧ−ＣＳＦ）（２０ｍＬ）、５０ｍｇ／ｍＬ ソルビトールおよび０．００４％ トゥイーン８０（ｐＨ ４．０）を、Vivaspin 15R concentrator（VS15RH11, 5KD MWCO, Vivascience AG, Hannover, D）を用いて４ｍＬまで１５℃でのダイアフィルトレーションによって濃縮し、そして０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ５．０）を用いて１５ｍＬまで再希釈した。このダイアフィルトレーションを２回繰り返した。最後のダイアフィルトレーション工程における最後の濃度は、１．５ｍｇ／ｍＬとした。
【０４３８】
実施例６．２（ｄ）  ｈＧ−ＧＳＦと実施例６．１（ｆ）および６．１（ｈ）のアルデヒドＨＥＳ誘導体との反応
0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）への緩衝液交換後のhG-GSFの溶液3.3mL（上記実施例6.2(c)に記載）に、HES誘導体789mgの溶液3.3mLおよび60mMシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液3.3mL（共に同じ緩衝液中）を加え、その溶液を4℃で30時間インキュベートした。混合前に全ての溶液を0℃に冷却した。
【０４３９】
１７時間後に、標本を反応コントールのために除去した。該反応混合物をゲル電気泳動によって分析した（図２０を参照）。
【０４４０】
実施例６．３：インビトロアッセイ
マウスＮＦＳ−６０細胞についてのＧ−ＣＳＦ変異体の分裂促進性(Mitogenicity)
Ｇ−ＣＳＦは、好中球顆粒球系統の造血細胞の増殖、分化、および活性化における特有の効果について知られる。Ｇ−ＣＳＦ変異体の分裂促進性の能力は、マウスＮＦＳ−６０細胞を用いて試験されている（N. Shirafuji らによる、Exp. Hematol. 1989, 17, 116-119）。外因性ＩＬ−３の供給源としての、５〜１０％ ＷＥＨＩ−３Ｂ（DSMZ, Braunschweig, D；DSMZによって記載されている通り培養）条件培地を含有する１０％ 胎児ウシ血清を有するＲＰＭＩ培中で増殖する細胞を、遠心分離によって収集し、洗浄し、そして２４ウェルプレート中のウェル当たり１００,０００細胞でアリコートした。同じ培地中に希釈したＧ−ＣＳＦ成長因子標本を加える前に、細胞を、ＷＥＨＩ−３Ｂ条件培地なしのＲＰＭＩ培地中、３７℃で１時間適合させた。ＮＦＳ−６０細胞を、精製Ｇ−ＣＳＦ変異体（実施例３Ａ１および２に従って精製、実施例３Ｂ１に従ってタンパク質定量化）に曝露させた。
ニューポジェン（登録商標）、ユーラスタ（登録商標）（共に、Amgen社製）；
実施例６．２（ｂ）に製造する、「ＨＥＳ−ＧＳＦＳ１０／０．４コンジュゲート」；
実施例６．２（ｂ）に製造する、「ＨＥＳ−ＧＳＦＳ１０／０．７コンジュゲート」；
実施例６．２（ｄ）に製造する、「ＨＥＳ−ＧＳＦＳ３０／０．４コンジュゲート」；
実施例６．２（ｄ）に製造する、「ＨＥＳ−ＧＳＦＳ３０／０．７コンジュゲート」；
実施例６．２（ｂ）に製造する、「ＨＥＳ−ＧＳＦＳ５０／０．７コンジュゲート」；
「偽インキュベーション」（＝反応コントロール、１９７ｍｇ／ｍＬ ＨＥＳ５０／０．７、ＭＷ ４７,０００Ｄ、ＤＳ ０．７６、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach Rodheim, 独国）を、３７℃で３日間インキュベートし、そして細胞を電子工学的にカウントした（Casy TT Cell Counter, Scharfe System, Reutlingen, D）。
【０４４１】
該結果を、以下の表および図２１中にまとめる。全ての場合に、以下の表および図２１中に示すタンパク質の量は、コンジュゲートのＧ−ＣＳＦ含有量のみを示す。図２１に知ることができる通り、異なるＧ−ＣＳＦ変異体の全ては（２．５〜２５０ｐｇ／ｍ）は、加えた成長因子を含まない培地と比較して、３日後の細胞の数の増大を刺激することができた。全ての変異体が、２５０ｐｇ／ｍＬの濃度で同じ最大刺激レベルに達した。
【表７】
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【０４４２】
実施例６．４：ラットにおける、ｈＧ−ＣＳＦコンジュゲートのインビボ生物学的効果
到着後に、該ラット［雄性CRL:CD（登録商標）ラット（７週齢）、Charles River Deutschland GmbH, Sanghofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld)］を、５つの群にランダムに選別した。７日間順化させた後に、状態が乏しいラットを除き、そして予備の動物で置き換えた。到着時の該ラットの体重は、１８１〜２０３ｇであった。
【０４４３】
次いで、５つのランダムに選別したラットの各群を、以下の非コンジュゲートまたはコンジュゲートのＧ−ＣＳＦ標本（実施例３Ａ１および２に従って精製、実施例３Ｂ１に従ってタンパク質の定量化）の体重ｋｇ当たりのタンパク質の１００μｇを静脈内投与した（注射速度は１５秒／投与、ビヒクル；５ｍＬ ＰＢＳ／体重ｋｇ）。
ニューポジェン（登録商標）およびユーラスタ（登録商標）（共に、Amgen社製）、
実施例６.２(ｂ)で製造した「HESG-CSF10/0.4コンジュゲート」、
実施例６.２(ｂ)で製造した「HESG-CSF10/0.7コンジュゲート」、
実施例６.２(ｄ)で製造した「HESG-CSF30/0.4コンジュゲート」、
実施例６.２(ｄ)で製造した「HESG-CSF30/0.7コンジュゲート」（30/0.7)、
実施例６.２(ｂ)で製造した「HESG-CSF50/0.7コンジュゲート」（50/0.7)、
「偽インキュベーション」（＝反応コントロール、197mg/mL HES50/0.7、MW 47,000D、DS 0.76、Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach Rodheim, Germany）、およびビヒクルコントール（PBS、適用容量 5mL/kg b.w.）。
【０４４４】
約２００μＬ ＥＤＴＡの全血の全ての動物由来の血液標本を、軽いエーテル麻酔下で延髄後方の静脈そう(retrobulbar venous plexus)から採取した。−５試験日に、血液を、終夜絶食後の全ての動物から、朝に１度に採取した。１〜８試験日に、血液を、１２時間の間隔で１日に２回採取した。第１日の最初の血液標本を、Ｇ−ＣＳＦ／Ｇ−ＣＳＦ−ＨＥＳ−コンジュゲートの投与前に採取した。
【０４４５】
白血球細胞（ＷＢＣ）のカウントは、Bayer ADVIA（登録商標）120（Fernwald, Germany）を用いて行なった。該結果を、図２２に示す。
【０４４６】
実施例６．５：ニューポジェン（登録商標）およびユーラスタ（登録商標）（Amgen）と比較した、還元的アミノ化を介してＨＥＳ５０／０．７およびＧ−ＣＳＦから製造したコンジュゲート（実施例６.２(ｂ)）のインビボ半減期の測定
雌性マウスBALB/cOlaHsd（Harlan GmbH/Borchen）を使用した。投与の日に、該動物の体重を測定した（１９〜２２ｇ）。実施例６.２(ｂ)で製造した化学的に修飾したｒｈＧ−ＣＳＦ標本（１００μｇ／体重ｋｇ）、並びにニューポジェン（登録商標）およびユーラスタ（登録商標）（Amgen）標本を各々、９マウスの尾静脈中に静脈内注射した。注射の１、３、６、１１、２２、３０、４９、７２時間後に（以下の表を参照）、約１５０μＬの全血の標本を、個々の群の３マウスの尾静脈または延髄後方の静脈そうから、ナトリウム−ヘパリン（Hirschmann, Eberstadt）を含有するキャピラリーを用いて採取し、そしてこのものを血漿の調製まで氷上に保存した。
【表８】
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【０４４７】
全血を、２０００ｇで１０分間遠心分離した。血漿を別のチューブに移し、そして３５００ｇで５分間再遠心分離した。分析の日まで、アリコートを−８０℃で保存した。血漿標本中のＧ−ＣＳＦの量を、製造主の指示に従って、ＥＬＩＳＡ（R&D GmbH, Wiesbaden）方法を用いることによって定量化した。
【０４４８】
該結果は図３６に示し、これから、ニューポジェンと比較して、本発明に記載するＨＥＳ−Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートが、非常に増大した半減期（１．２時間と比較して５．１時間）を有し、そしてユーラスタと比較して、ほとんど同じである（５．２時間と比較して５．１時間）半減期を有することが明らかである。
【０４４９】
実施例７：還元的アミノ化による、ＨＥＳと組み換えｈＥＰＯとのコンジュゲーション
組み換えヒトＥＰＯ（これは、ヒトＥＰＯのアミノ酸配列、および商業的に入手可能なErypo（登録商標）（Orhto Biotech, Jansen-Cilag）またはNeoRecormon（登録商標）（Roche）（EP 0 148 605、EP 0 205 564、EP 0 411 678を参照）と本質的に同じ性質を有する）を使用した。
【０４５０】
実施例７．１：アミノ−ＨＥＳの製造
実施例８．１のオキソ−ＨＥＳ（MW = 57,000 D, DS = 0.76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D、DE 196 28 705 A1に従って製造）（１０ｇ）を、真空下、８０℃で終夜加熱し、そして窒素下、乾燥ジメチルスルホキシド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（５３ｍＬ）中に溶解し、そして１,４−ジアミノブタン（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（２ｍＬ）を加えた。４０℃で１７時間撹拌後に、該反応混合物を、氷冷2-プロパノール（Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D）350mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、氷冷2-プロパノール80mlを用いて洗浄し、そして遠心分離によって集めた。該粗生成物を水（８０ｍＬ）中に溶解し、水に対して２日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。単離生成物の収率は、８５％であった。
【０４５１】
実施例７．２：アルデヒドＨＥＳの製造
4-ホルミル安息香酸153mgおよび1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾール241mg（どちらもAldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）をN,N-ジメチルホルムアミド（ペプチド合成用，Biosolve，オランダ・ファルケンスワルト）51mlに溶解し、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH，ドイツ・タウフキルヒェン）170μLを加えた。21℃で30分間インキュベートした後、実施例7.1に記載する製造するアミノHES 5.1gを加えた。22℃で16時間振とうした後、反応混合物をアセトンとエタノールの氷冷1:1混合物（v/v）360mLに加えた。沈殿した生成物を4℃で遠心分離することによって集め、水（50mL)中に再溶解し、上記の通りアセトンとエタノールの氷冷1：1混合物（v/v）（360mL)で洗浄した。遠心分離した後、沈殿物を水50mLに溶解し、水に対して2日間透析し（SnakeSkin透析チューブ，3.5kDカットオフ，Perbio Sciences Deutschland GmbH，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。単離生成物収率は87％だった。
【０４５２】
実施例７．３：還元的アミノ化による、アルデヒド−ＨＥＳとＥＰＯとの反応
アルデヒド−ＨＥＳ（実施例７.２に従って製造）（６２５ｍｇ）を、反応緩衝液（０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ５．０）中に１．６７ｍＬまで溶解し、そして０℃まで冷却した。該ＥＰＯ溶液（３ｍｇ／ｍＬ）（１．６７ｍＬ）および６０ｍＭ シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液（１．６７ｍＬ）（共に、同じ緩衝液中であり、０℃まで冷却する）を加え、そして該混合物を０℃でインキュベートした。１７時間後に、該反応混合物をゲル電気泳動による分析後に精製した（図２３、レーンＢを参照）。
【０４５３】
実施例７.４
反応コントロールＡ：シアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用しない、アルデヒド−ＨＥＳとＥＰＯとの反応
アルデヒド−ＨＥＳ（実施例７.２に従って製造）（３１３ｍｇ）を、反応緩衝液（０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ５．０）中に０．８３ｍＬまで溶解し、そして０℃まで冷却した。同じ緩衝液中の該ＥＰＯ溶液（３ｍｇ／ｍＬ）（０．８３ｍＬ）および反応緩衝液（０．８３ｍＬ）（共に、０℃まで冷却する）を加え、そして該混合物を０℃でインキュベートした。１７時間後に、該反応混合物をゲル電気泳動による分析後に精製した（図２３、レーンＣを参照）。
【０４５４】
実施例７.５
反応コントロールＢ：シアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用する、ＥＰＯの反応
反応緩衝液（０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ ５．０）中の該ＥＰＯ溶液（３ｍｇ／ｍＬ）（０．８３ｍＬ）を０℃まで冷却し、同じ緩衝液中の６０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液（０．８３ｍＬ）および反応緩衝液（０．８３ｍＬ）（共に、０℃まで冷却した）を加え、そして該混合物を０℃でインキュベートした。１７時間後に、該反応混合物をゲル電気泳動による分析後に精製した（図２３、レーンＤを参照）。
【０４５５】
実施例７．６：ＥＰＯおよびＥＰＯ誘導体の精製のためのイオン交換クロマトグラフィー
ＥＰＯ標本の精製は、AKTA explorer10システム（Amersham Pharmacia Biotech）（これは、ポンプP-903、ミキサーM-925、チャンバー0.6mL、モニターUV-900、10mmフローセル、モニターpH/C-900、分画コレクターFrac-900、試料ループ2mL、ユニコーンソフトウェア(Unicorn software)バージョン3.2.1から構成される）を用いて、室温で行なった。５ｍＬ Q-Sepharose Fast Flowを含有するカラムは、１０ＣＶの緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｎ−モルホリノ−プロパンスルホン酸／ＮａＯＨ、ｐＨ ８．０）を備えた。該ＥＰＯ標本は緩衝液Ａを用いて１：１０に希釈し（そして、最後にｐＨ ７．８〜８．２にまで調節した）、そして流速１ｍＬ／分で標本ポンプを用いることによって適用した。該標本ポンプを緩衝液Ａ（１０ｍＬ）を用いて洗浄後に、該カラムを更に流速１．０ｍＬ／分で、６ＣＶの緩衝液Ａを用いて洗浄した。引き続いて、４容量の２０ｍＭ リン酸Ｎａ、ｐＨ ６．５；緩衝液Ｂ（流速は０．８ｍＬ／分）およびＥＰＯを、０〜４０％の逐次勾配の緩衝液Ｃ（２０ｍＭ リン酸Ｎａ、ｐＨ ６．５中の０．５Ｍ ＮａＣｌ）を用いて３７分以内に溶出した。溶出プロファイルを、２０６、２６０、および２８０ｎｍ吸光度で記録した。溶出の完結後に、該カラムを、緩衝液Ｃ（２５ｍＬ）によって、流速１ｍＬ／分で再生した。最後に、該カラムを１Ｍ ＮａＯＨを用いて６０分間動かし、緩衝液Ｃを用いて再条件付けし(reconditioned)、そして更なる使用まで保存した。
【０４５６】
実施例７．７：ＥＰＯタンパク質測定
ＥＰＯタンパク質の定量的な測定は、１ｃｍ経路長を有するキュベット中でEur. Phar.（European Pharmacopeia 4, Monography 01/2002：1316: erythropoietin concentrated solution）に従って、２８０ｎｍでＵＶ吸収を測定することによって行なった。加えて、ＥＰＯは、ＲＰ−Ｃ４カラム（Vydac Protein C4, カタログ番号214TP5410, Grace Vydac, Ca, US）を用いるＲＰ−ＨＰＬＣ方法を用いて定量化し；該ＨＰＬＣ方法は、エリスロポエチンＢＲＰ１標準品（European Pharmacopeia, Conseil de l'Europe B.P. 907-F67029, Strasbourg Cedex 1）を用いて較正した。
【０４５７】
実施例７.８：ＨＥＳ−修飾ＥＰＯの生物学的活性のインビトロアッセイ
正赤血球(normocythaemic)マウス系におけるＥＰＯ−バイオアッセイは、European Pharmacopeia 4, Monography 01/2002: 1316：Erythropoietin concentrated solution、およびPh. Eur. Chapter 5.3：「Statistical Analysis of Results of Biological Assays and Tests」に記載する方法に従って行ない；実施例７.３に記載するＨＥＳ−修飾ＥＰＯについて、タンパク質のＥＰＯ（ｍｇ）当たり比活性４１８５００の値が測定され、これは、ＥＰＯ出発物質と比較して約４〜５倍の高い比活性を示す。
【０４５８】
該研究の結果を、以下の表中にまとめる。
【表９】
2007527892.tif 000043
【０４５９】
実施例８：還元的アミノ化による、ＨＥＳ−ＩＦＮ−アルファコンジュゲートの製造
使用するＩＦＮ−αは、エシェリキア・コリ（大腸菌）を使用する組み換えＤＮＡ技術によって製造される組み換えヒトインターフェロンアルファ−２ｂとした。そのものは、１６５アミノ酸から構成され、そして天然のヒトインターフェロンアルファ２ｂ（ｈＩＦＮ−アルファ２ｂ）と同一であるアミノ酸配列を供する。
【０４６０】
実施例８．１：オキソ−ＨＥＳの製造
本明細書中以下に記載するその還元末端で酸化されたＨＥＳ（オキソ−ＨＥＳ）は、DE 196 28 705 A1（その個々の内容の全て（実施例Ａ、カラム９、ライン６〜２４）は本明細書の一部を構成する）中に記載する通りヨウ化アルカリ溶液を用いて、ＨＥＳから製造した。
【０４６１】
実施例８．２：ＨＥＳ誘導体の製造
２工程方法において、実施例８．１のオキソ−ＨＥＳはその還元末端でアミンで修飾し、そしてアルデヒド基を第２反応において導入した。得られたアルデヒド−ＨＥＳを、実施例８．３に記載する還元的アミノ化を介してＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳコンジュゲートを製造するのに使用した。
【０４６２】
実施例８．２．１：実施例８．１のオキソ−ＨＥＳからのアミノ−ＨＥＳの製造
実施例８．１のオキソ−ＨＥＳ（MW = 14.5 kD, DS = 0.41, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D）（５．１２ｇ）を、真空下、８０℃で終夜加熱し、そして窒素下、乾燥ジメチルスルホキシド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（２５ｍＬ）中に溶解し、そして１,４−ジアミノブタン（５．１３ｍＬ）を加えた。４０℃で１７時間撹拌後に、該反応混合物を、氷冷アセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（１５０ｍＬ）に加えた。該沈降生成物を４℃で遠心分離によって集め、氷冷アセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（４０ｍＬ）を用いて洗浄し、そして遠心分離によって集めた。該粗生成物を水（８０ｍＬ）中に溶解し、水に対して４日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。単離生成物の収率は、６７％であった。
【０４６３】
実施例８．２．２：実施例８．２．１のアミノ−ＨＥＳからのアルデヒド−ＨＥＳの製造
４−ホルミル安息香酸（１０５ｍｇ）および１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（１３５ｍｇ）（共に、Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）を、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（Peptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswaard, NL）（７ｍＬ）中に溶解し、そしてＮ,Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（１３５μＬ）を加えた。２１℃で３０分間インキュベート後に、アミノ−ＨＥＳ（実施例８．２．１に記載する通り製造する）（０．７ｇ）を加えた。２２℃で１８時間振り混ぜた後に、該反応混合物を、氷冷アセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（４２ｍＬ）に加えた。該沈降生成物を４℃で遠心分離によって集め、ＤＭＦ（５ｍＬ）中に再溶解し、そして上記のエタノール／アセトン（４２ｍＬ）を用いて沈降した。遠心分離後に、該集めた沈降物を水を用いて溶解し、水に対して４日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。単離生成物の収率は９５％であった。
【０４６４】
実施例８．２．３：実施例８．１のオキソ−ＨＥＳからのアミノ−ＨＥＳの製造
実施例８．１のオキソ−ＨＥＳ（MW = 14.7 kD, DS = 0.76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D）（６．０２ｇ）を、真空下、８０℃で終夜加熱し、乾燥ジメチルスルホキシド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（３２ｍＬ）中に窒素下で溶解し、そして１,４−ジアミノブタン（６．０３ｍＬ）を加えた。４０℃で１７時間撹拌後に、該反応混合物を、氷冷アセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（１５０ｍＬ）に加えた。該沈降物を４℃で遠心分離によって集め、氷冷アセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（４０ｍＬ）を用いて洗浄し、そして遠心分離によって集めた。該粗生成物を水（８０ｍＬ）中に溶解し、水に対して４日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。単離生成物の収率は５２％であった。
【０４６５】
実施例８．２．４：実施例８．２．３のアミノ−ＨＥＳからのアルデヒド−ＨＥＳの製造
４−ホルミル安息香酸（１５０ｍｇ）および１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（２３０ｍｇ）（共に、Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）を、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）中に溶解し、そしてＮ,Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（２０４μＬ）を加えた。２１℃で３０分間インキュベート後に、アミノ−ＨＥＳ（実施例８．２．３に記載する通り製造）（１ｇ）を加えた。２２℃で１９時間振り混ぜた後に、該反応混合物を氷冷２−プロパノール（８４ｍＬ）に加えた。該沈降生成物を４℃で遠心分離によって集め、水（５０ｍＬ）中に再溶解し、水に対して２日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。単離生成物の収率は８３％であった。
【０４６６】
実施例８．２．５：実施例８．１のオキソ−ＨＥＳからのアミノ−ＨＥＳの製造
実施例８．１のオキソ−ＨＥＳ（MW = 28 kD, DS = 0.41, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D）（５ｇ）を、真空下、８０℃で終夜加熱し、次いでこのものを窒素下、乾燥ジメチルスルホキシド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（２８ｍＬ）中に溶解し、そして１,４−ジアミノブタン（１．６７ｍＬ）を加えた。４０℃で１７時間撹拌後に、該反応混合物を、氷冷アセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（１７５ｍＬ）に加えた。該沈降生成物を４℃で遠心分離によって集めた。該粗生成物を水（４０ｍＬ）中に溶解し、水に対して２日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。単離生成物の収率は測定しなかった。
【０４６７】
実施例８．２．６：実施例８．２．５のアミノ−ＨＥＳからのアルデヒド−ＨＥＳの製造
４−ホルミル安息香酸（１３０ｍｇ）および１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（１５３ｍｇ）（共に、Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）を、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（Peptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswaard, NL）（３６ｍＬ）中に溶解し、そしてＮ,Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（１１０μＬ）を加えた。２１℃で３０分間インキュベート後に、アミノ−ＨＥＳ（実施例８．２．５に記載する通り製造）（２．６１ｇ）を加えた。２２℃で２２．５時間振り混ぜた後に、該反応混合物を、氷冷アセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（１６０ｍＬ）に加えた。該沈降生成物を４℃で遠心分離によって集め、そして氷冷アセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物を用いて洗浄した。遠心分離後に、該沈降生成物を水（３０ｍＬ）中に溶解し、水に対して１日透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。単離生成物の収率は８１％であった。
【０４６８】
実施例８．２．７：実施例８．１のオキソ−ＨＥＳからのアミノ−ＨＥＳの製造
実施例８．１のオキソ−ＨＥＳ（MW = 30.8 kD, DS = 0.76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D）（５ｇ）を、真空下、８０℃で終夜加熱し、次いで窒素下、乾燥ジメチルスルホキシド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（２８ｍＬ）中に溶解し、そして１,４−ジアミノブタン（１．６７ｍＬ）を加えた。４０℃で１７時間撹拌後に、該反応混合物を、氷冷アセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（１７５ｍＬ）に加えた。該沈降生成物を４℃で遠心分離によって集めた。該粗生成物を水（４０ｍＬ）中に溶解し、水に対して２日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。単離生成物の収率は測定しなかった。
【０４６９】
実施例８．２．８：実施例８．２．７のアミノ−ＨＥＳからのアルデヒド−ＨＥＳの製造
４−ホルミル安息香酸（１２２ｍｇ）および１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（１４４ｍｇ）（共に、Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）を、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（Peptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswaard, NL）（３４ｍＬ）中に溶解し、そしてＮ,Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（１０３μＬ）を加えた。２１℃で３０分間インキュベート後に、アミノ−ＨＥＳ（実施例８．２．７に記載する通り製造）（２．４６ｇ）を加えた。２２℃で２２．５時間振り混ぜた後に、該反応混合物を氷冷アセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（１６０ｍＬ）に加えた。該沈降生成物を４℃での遠心分離によって集め、そして氷冷アセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物を用いて洗浄した。遠心分離後に、該沈降物を水（３０ｍＬ）中に溶解し、そして水に対して４日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。単離生成物の収率は８７％であった。
【０４７０】
実施例８．２．９：実施例８．１のオキソ−ＨＥＳからのアミノ−ＨＥＳの製造
オキソ−ＨＥＳ（MW = 42.1 kD, DS = 0.41, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D）（１０ｇ）を、真空下、８０℃で２日間加熱し、次いで窒素下、乾燥ジメチルスルホキシド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（５３ｍＬ）中に溶解し、そして１,４−ジアミノブタン（２．０１ｍＬ）を加えた。４０℃で１７時間撹拌後に、該反応混合物を氷冷２−プロパノール（Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D）（３５０ｍＬ）に加えた。該沈降生成物を４℃で遠心分離によって集め、氷冷２−プロパノール（８０ｍＬ）を用いて洗浄し、そして遠心分離によって集めた。該粗生成物を水（８０ｍＬ）中に溶解し、水に対して２日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。単離生成物の収率は７６％であった。
【０４７１】
実施例８．２．１０：実施例８．２．９のアミノ−ＨＥＳからのアルデヒド−ＨＥＳの製造
４−ホルミル安息香酸（９００ｍｇ）および１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（１０５３ｍｇ）（共に、Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）を、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（Peptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswaard, NL）（３０ｍＬ）中に溶解し、そしてＮ,Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（９３０μＬ）を加えた。２１℃で３０分間インキュベート後に、アミノ−ＨＥＳ（実施例８．２．９に記載する通り製造し、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）中に溶解する）（３ｇ）を加えた。２２℃で２２．５時間振り混ぜた後に、該反応混合物を氷冷アセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（２１０ｍＬ）に加えた。該沈降生成物を４℃での遠心分離によって集め、そして氷冷アセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物を用いて洗浄した。遠心分離後に、該沈降物を水（３０ｍＬ）中に溶解し、水に対して２日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。単離生成物の収率は９７％であった。
【０４７２】
実施例８．２．１１：実施例８．１（Ａ）のオキソ−ＨＥＳからのアミノ−ＨＥＳの製造
オキソ−ＨＥＳ（MW = 56.8 kD, DS = 0.76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D）（６．０９ｇ）を真空下、８０℃で終夜加熱し、次いで窒素下、乾燥ジメチルスルホキシド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（３２ｍＬ）中に溶解し、そして１,４−ジアミノブタン（１．２２ｍＬ）を加えた。４０℃で１７時間撹拌後に、該反応混合物を氷冷アセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（１５０ｍＬ）に加えた。該沈降生成物を４℃での遠心分離によって集め、氷冷アセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（４０ｍＬ）を用いて洗浄し、そして遠心分離によって集めた。該粗生成物を水（８０ｍＬ）中に溶解し、水に対して４日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。単離生成物の収率は８２％であった。
【０４７３】
実施例８．２．１２：実施例８．２．１１のアミノ−ＨＥＳからのアルデヒド−ＨＥＳの製造
４−ホルミル安息香酸（１２５ｍｇ）および１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（１７４ｍｇ）（共に、Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）を、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（Peptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswaard, NL）（３８ｍＬ）中に溶解し、そしてＮ,Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（１５５μＬ）を加えた。２１℃で３０分間インキュベート後に、アミノ−ＨＥＳ（実施例８．２．１１に記載する通り製造）（３．８ｇ）を加えた。２２℃で１９時間振り混ぜた後に、該反応混合物を氷冷アセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（１６０ｍＬ）に加えた。該沈降生成物を４℃での遠心分離によって集め、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）中に再溶解し、そして上記の通り氷冷アセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（８０ｍＬ）を用いて沈降させた。遠心分離後に、該沈降物を水（５０ｍＬ）中に溶解し、水に対して２日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。単離生成物の収率は７７％であった。
【０４７４】
実施例８．２．１３：実施例８．１（Ｂ）のオキソ−ＨＥＳからのアミノ−ＨＥＳの製造
オキソ−ＨＥＳ（MW = 56.8 kD, DS = 0.76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D）（１０ｇ）を真空下、８０℃で終夜加熱し、次いで窒素下、乾燥ジメチルスルホキシド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（５３ｍＬ）中に溶解し、そして１,４−ジアミノブタン（２ｍＬ）を加えた。４０℃で１７時間撹拌後に、該反応混合物を氷冷２−プロパノール（Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D)）（３５０ｍＬ）に加えた。該沈降生成物を４℃での遠心分離によって集め、氷冷２−プロパノール（８０ｍＬ）を用いて洗浄し、そして遠心分離によって集めた。該粗生成物を水（８０ｍＬ）中に溶解し、水に対して２日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。単離生成物の収率は８５％であった。
【０４７５】
実施例８．２．１４：実施例８．２．１３のアミノ−ＨＥＳからのアルデヒド−ＨＥＳの製造
４−ホルミル安息香酸（１５３ｍｇ）および１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（２４１ｍｇ）（共に、Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）を、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（Peptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswaard, NL）（５１ｍＬ）中に溶解し、そしてＮ,Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（１７０μＬ）を加えた。２１℃で３０分間インキュベート後に、アミノ−ＨＥＳ（実施例８．２．１３に記載する通り製造）（５．１ｇ）を加えた。２２℃で１６時間振り混ぜた後に、該反応混合物を、氷冷アセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（３６０ｍＬ）に加えた。該沈降生成物を４℃での遠心分離によって集め、水（５０ｍＬ）中に再溶解し、そして上記の通り氷冷アセトンおよびエタノールの１：１（ｖ／ｖ）混合物（３６０ｍＬ）を用いて沈降させた。遠心分離後に、該沈降物を水（５０ｍＬ）中に溶解し、水に対して透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。単離生成物の収率は８７％であった。
【０４７６】
実施例８．２．１５：実施例８．１のオキソ−ＨＥＳからのアミノ−ＨＥＳの製造
オキソ−ＨＥＳ（MW = 29.3 kD, DS = 0.86, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D）（５．０ｇ）を、真空下、８０℃で終夜加熱し、窒素下、乾燥ジメチルスルホキシド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（２０ｍＬ）中に溶解し、そして１,４−ジアミノブタン（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（１．６７ｍＬ）を加えた。４０℃で３０．５時間撹拌後に、該反応混合物を、氷冷アセトン（Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D）およびエタノール（Sonnenberg, DAB, Braunschweig, D）の１：１（ｖ／ｖ）混合物（１７５ｍＬ）に加えた。該沈降生成物を４℃で１２０分間の遠心分離によって集め、水（４０ｍＬ）に溶解し、水に対して２日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 10 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。単離生成物の収率は８７％であった。
【０４７７】
実施例８．２．１６：実施例８．２．１５のアミノ−ＨＥＳからのアルデヒド−ＨＥＳの製造
４−ホルミル安息香酸（１５０ｍｇ）および１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（２３０ｍｇ）（共に、Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）を、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（Peptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswaard, NL）（１０ｍＬ）中に溶解し、そしてＮ,Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（１６６μＬ）を加えた。２１℃で３０分間インキュベート後に、ＤＭＦ（２０ｍＬ）中のアミノＨＥＳ（実施例８．２．１５に記載する通り製造）（３．０２ｇ）溶液を加えた。２２℃で１６時間振り混ぜた後に、該反応混合物を、氷冷アセトン（Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D）およびエタノール（Sonnenberg, DAB, Braunschweig, D）の１：１（ｖ／ｖ）混合物（２１５ｍＬ）に加えた。該沈降生成物を４℃での遠心分離によって集め、水（２０ｍＬ）に再溶解し、そして上記の通りアセトン／エタノールを用いて沈降した。遠心分離後に、該沈降生成物を水（３０ｍＬ）に溶解し、水に対して２．５日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 10 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。単離生成物の収率は８７％であった。
【０４７８】
実施例８．２．１７：実施例８．１のオキソ−ＨＥＳからのアミノ−ＨＥＳの製造
オキソ−ＨＥＳ（MW = 97.9 kD, DS = 0.76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D）（５．０ｇ）を真空下、８０℃で終夜加熱し、窒素下、乾燥ジメチルスルホキシド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（２０ｍＬ）中に溶解し、そして１,４−ジアミノブタン（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（０．５０ｍＬ）を加えた。４０℃で３０．５時間撹拌後に、該反応混合物を氷冷アセトン（arl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D）およびエタノール（Sonnenberg, DAB, Braunschweig, D）の１：１（ｖ／ｖ）混合物（１７５ｍＬ）に加えた。該沈降生成物を４℃で１２０分間遠心分離によって集め、水（４０ｍＬ）中に溶解し、水に対して２日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 10 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。単離生成物の収率は９０％であった。
【０４７９】
実施例８．２．１８：実施例８．２．１７のアミノ−ＨＥＳからのアルデヒド−ＨＥＳの製造
４−ホルミル安息香酸（７３ｍｇ）および１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（１１２ｍｇ）（共に、Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）を、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（Peptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswaard, NL）（１０ｍＬ）中に溶解し、そしてＮ,Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）（８１．３μＬ）を加えた。２１℃で３０分間インキュベート後に、ＤＭＦ（２０ｍＬ）中のアミノＨＥＳ（実施例８．２．１７に記載する通り製造）（３．０９ｇ）溶液を加えた。２２℃で１６時間振り混ぜた後に、該反応混合物を、氷冷アセトン（Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D)）およびエタノール（Sonnenberg, DAB, Braunschweig, D）の１：１（ｖ／ｖ）混合物（２１５ｍＬ）に加えた。該沈降生成物を４℃の遠心分離によって集め、水（２０ｍＬ）中に再溶解し、そして上記の通りアセトン／エタノールを用いて沈降させた。遠心分離後に、該沈殿物を水（３０ｍＬ）中に溶解し、水に対して２．５日間透析し（SnakeSkin dialysis tubing, 10 kDカットオフ, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、そして凍結乾燥した。単離生成物の収率は９６％であった。
【０４８０】
実施例８．３：還元的アミノ化を介する、ＩＦＮ−アルファコンジュゲートの製造
実施例８.３.１：２０μｇスケールでのＩＦＮ−アルファへのコンジュゲーション
２５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ ７．５（１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．３ｍＭ ＥＤＴＡを含有する）（０．３７５ｍＬ）中に溶解したＩＦＮ−アルファ（０．６７５ｍｇ）に、反応緩衝液（０．１ｍＭ 酢酸緩衝液 ｐＨ ５．０）（４ｍＬ）を加え、そして該溶液をVivaspin 6濃縮機(concentrator)（Viva Science, 5 kD MWCO, Hannover, Germany）中、３９３９×ｇで３０分間遠心分離した。該洗浄操作は、該残留溶液を反応緩衝液を用いて６ｍＬまで希釈し、および上記の通り遠心分離することによって２回繰り返した。最終的なＩＦＮ−アルファ溶液の容量は０．２３６ｍＬであり、これは、算出された最終的な濃度である２．８６ｍｇ／ｍＬのＩＦＮ−アルファに相当する。該タンパク質濃度は、実験的に調べなかった。
【０４８１】
上記の通り製造しおよび０℃まで冷却したＩＦＮ−アルファ溶液（７μＬ）に、個々のアルデヒド−ＨＥＳ（以下の表を参照）溶液（１０μＬ、５０当量）および６０ｍＭ シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液（１１．３μＬ）（共に、同じ緩衝液（酢酸ナトリウム、ｐＨ ５．０）中であり、そして０℃まで冷却する）を加え、そして該混合物を０℃で１７時間インキュベートした。該反応混合物は、ゲル電気泳動によって分析した。該アルデヒド−ＨＥＳ溶液の以下の濃度を使用した。
【表１０】
2007527892.tif 000044
【０４８２】
該コンジュゲートのＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析を、図２４に示す。
【０４８３】
実施例８.３.２：３ｍｇスケールでのＩＦＮ−アルファへのコンジュゲーション
２５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ ７．５（１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．３ｍＭ ＥＤＴＡを含有する）中に溶解したＩＦＮ−アルファ（２０ｍｇ）に、反応緩衝液（０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ ５．０）（８ｍＬ）を加え、そして該溶液をVivaspin 15R concentrator（Viva Science, 5 kD MWCO, Hannover, Germany）中、３９３９×ｇで３９分間遠心分離した。該洗浄操作は、残留溶液を該反応緩衝液を用いて１８ｍＬまで希釈し、そして上記の通り遠心分離することによって２回繰り返した。最終的なＩＦＮ−アルファ溶液を反応緩衝液を用いて６．６６ｍＬまで希釈し、これにより、最終的な算出された濃度が３ｍｇ／ｍＬのＩＦＮ−アルファを得た。該タンパク質濃度は、実験的に調べなかった。
【０４８４】
該ＩＦＮ−アルファ溶液（上記の通り製造し、そして０℃まで冷却する）（１ｍＬ）に、アルデヒドＨＥＳ溶液（１ｍＬ）（７５当量）および６０ｍＭ シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液（１ｍＬ）（共に、同じ緩衝液（酢酸ナトリウム、ｐＨ ５．０）中であり、０℃まで冷却する）を加え、そして該混合物を０℃で２２時間インキュベートした。該反応混合物を、ゲル電気泳動による分析後に精製した。エントリーＧに記載する反応において、対応する溶液（わずか０．６６６μＬ）を使用した。以下の濃度のアルデヒドＨＥＳ溶液を使用した。
【表１１】
2007527892.tif 000045
【０４８５】
該コンジュゲートのＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析を、図２５に示す。
【０４８６】
実施例８.３.３：３ｍｇスケールでのＩＦＮ−アルファへのコンジュゲーション
８.３.３.１：還元的アミノ化による、実施例８.２.１６で製造したアルデヒドＨＥＳとＩＦＮαとのコンジュゲーション
２５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ ７．５（１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．３ｍＭ ＥＤＴＡを含有する）中に溶解したＩＦＮα（１０ｍｇ）に、反応緩衝液（０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ ５．０）（８ｍＬ）に加え、そして該溶液をVivaspin 15R concentrator（Viva Science, 5 kD MWCO, Hannover, Germany）中で３９３９×ｇで３０分間遠心分離した。該洗浄操作は、残留溶液を反応緩衝液を用いて１８ｍＬまで希釈し、そして上記の通り遠心分離することによって、２回繰り返した。最終的なＩＦＮα溶液を反応緩衝液を用いて３．３３ｍＬまで希釈して、これにより、最終的な算出された濃度が３ｍｇ／ｍＬのＩＦＮαを得た。該タンパク質濃度は、実験的に調べなかった。
【０４８７】
該ＩＦＮα溶液（上記の通り製造し、そして０℃まで冷却する）（１ｍＬ）に、実施例８.２.１６で製造するアルデヒドＨＥＳ溶液（１ｍＬ）（７５当量、３５２ｍｇ／ｍＬ）および６０ｍＭ シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液（１ｍＬ）（共に、同じ緩衝液中であり、０℃まで冷却する）を加え、そして該混合物を０℃で２２時間インキュベートした。該反応混合物は、ゲル電気泳動による分析後に精製した。ゲル電気泳動の場合、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D）およびConsort E143電源（CONSORTnv, Turnhout, B）を使用した。１２％ビス−Ｔｒｉｓゲルおよび還元条件でのＭＯＰＳ ＳＤＳランニング緩衝液（共に、Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D）を、製造主の指示に従って使用した。
【０４８８】
８.３.３.２：還元的アミノ化による、実施例８.２.１８において製造するアルデヒドＨＥＳと、ＩＦＮαとコンジュゲーション
ＩＦＮα溶液（８.３.３.１において記載する通り製造し、そして０℃まで冷却する）（１ｍＬ）に、実施例８.２.１８において製造するアルデヒドＨＥＳ溶液（２ｍＬ）（７５当量、３６９ｍｇ／ｍＬ）および６０ｍＭ シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液（１．５ｍＬ）（共に、同じ緩衝液中であり、０℃まで冷却する）を加え、そして該混合物を０℃で２２時間インキュベートした。該反応混合物はゲル電気泳動による分析後に精製した。ゲル電気泳動について、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D）およびConsort E143電源（CONSORTnv, Turnhout, B）を使用した。１２％ビス−Ｔｒｉｓゲルおよび還元条件でのＭＯＰＳ ＳＤＳランニング緩衝液（共に、Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D）を、製造主の指示に従って使用した。
【０４８９】
反応対照：還元的アミノ化による、ＨＥＳ１０／０．４（Mw 7.6 kD DS = 0.41）のＩＦＮαとのコンジュゲーション
ＩＦＮα溶液（８.３.３.１に記載する通り製造し、０℃まで冷却する）（１ｍＬ）に、ＨＥＳ１０／０．４溶液（１ｍＬ）（７５当量、１１７ｍｇ／ｍＬ）および６０ｍＭ シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液（１ｍＬ）（共に、同じ緩衝液中であり、０℃まで冷却する）を加え、そして該混合物を０℃で２２時間インキュベートした。該反応混合物は、ゲル泳動による分析後に精製した。ゲル泳動について、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D）およびConsort E143電源（CONSORTnv, Turnhout, B）を使用した。１２％ビス−Ｔｒｉｓゲルおよび還元条件でのＭＯＰＳ ＳＤＳランニング緩衝液（共に、Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D）を、製造主の指示に従って使用した。
【０４９０】
該コンジュゲートのＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析を、図２６に示す。
【０４９１】
実施例８.３.４：１６ｍｇスケールでのＩＦＮ−アルファへのコンジュゲーション
ＩＦＮ−アルファ溶液（２０ｍｇ）の緩衝液を、実施例８.３.２に記載する通り交換した。最終的なＩＦＮ−アルファ溶液を反応緩衝液を用いて６．３７ｍＬまで希釈し、これにより、最終的な算出濃度が３．１４ｍｇ／ｍＬのＩＦＮ−アルファを得た。該溶液（１００μＬ）を反応緩衝液（９００μＬ）を用いて希釈し、そして該タンパク質濃度を２７９ｎｍで分光学的に測定して３．０１ｍｇ／ｍＬ（モル吸光係数１８０００を基準とする）を得た。タンパク質の濃度測定に使用する物質と組み合わせた後に、最終的な容量は７．０ｍＬとし、タンパク質濃度は２．７４ｍｇ／ｍＬとした。
【０４９２】
このＩＦＮ−アルファ溶液（１６．２ｍｇ）（上記の通り製造し、０℃まで冷却する）（５．９１ｍＬ）に、反応緩衝液（５ｍＬ）中の実施例８.２.１４のアルデヒド−ＨＥＳ（３．１５２ｇ）（７５当量）および６０ｍＭ シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液（６ｍＬ）（共に、同じ緩衝液（酢酸ナトリウム、ｐＨ ５．０）中であり、０℃まで冷却する）を加え、そして該混合物を０℃で２２時間インキュベートした（図２７のラインＡを参照）。
【０４９３】
反応対照として、予め冷却したＩＦＮ−アルファ溶液（３ｍｇ）（１．０９ｍＬ）を、反応緩衝液（１ｍＬ）中の非酸化型ＨＥＳ１０／０．４（Mw 7.6 kD DS = 0.41）（１２２ｍｇ）の溶液（１ｍＬ）、および６０ｍＭ シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液（１ｍＬ）（共に、同じ緩衝液中にあり、０℃まで冷却する）と一緒に混合した（図２７、ラインＢを参照）。
【０４９４】
該コンジュゲートのＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析を、図２７に示す。
【０４９５】
実施例８.４：ＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳコンジュゲートの精製
８.４.１：還元的アミノ化タンパク質と、活性化ＨＥＳ誘導体とのインキュベーションからのＨＥＳ−ＩＦＮ−αの精製（ＨＥＳ誘導体からの修飾型および非修飾型のタンパク質の分離）
全ての標本の精製は、AKTA explorer 10装置を用いて室温で行った。３ｍＬ Q-Sepharose Fast Flowを含有するカラムは、１０ＣＶの緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ ８．０）を備えた。該標本は緩衝液Ａを用いて１：１０に希釈し、そして流速１ｍＬ／分で標本ポンプを用いることによって適用した。該標本ポンプを緩衝液Ａ（１０ｍＬ）を用いて洗浄後に、該カラムを更に流速１．０ｍＬ／分で、６ＣＶの緩衝液Ａを用いて洗浄した。溶出を、緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ ８．０中の０．３Ｍ ＮａＣｌ）の０〜１００％の直線勾配を２ＣＶ以上で、および０．５ＣＶの緩衝液Ｂを用いるアイソクラチックのランを、流速が０．８ｍＬ／分で使用することによって行なった。該カラムを、２ＣＶの緩衝液Ｃ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ ８．０中の１．５Ｍ ＮａＣｌ）、続いて０．５ＣＶの緩衝液Ｂを、流速が０．８ｍＬ／分で使用することによって再生した。次のランのための再平衡化は、６ＣＶの緩衝液Ａを流速が１．０ｍＬ／分で使用することによって行なった。
【０４９６】
８.４.２：物質および方法
装置：AKTA explorer 10（Amersham Pharmacia Biotech）（以下のものを有する）
ポンプ(Pump)P-903；
ミキサー(Mixer)M-925（0.6mL チャンバーを有する）；
モニター(Monitor)UV-900（10mm フローセルを有する）；
モニター(Monitor)pH/C-900；
ポンプ(Pump)P-950（標本ポンプ）；
ソフトウェア(Software) Unicorn Version 3.21。
カラム：Amersham Biosciences C 10/10；
カラム物質：Q-セファロース(Sepharose) Fast Flow, コード番号17-0510-01, ロット番号OD 06453；
カラム容量：3mL。
緩衝液Ａ：20 mM Tris/HCl, pH 8.0, ロット番号PL0746；
緩衝液Ｂ：20 mM Tris/HCl中の0.3 M NaCl, pH 8.0, ロット番号PL0747
緩衝液Ｃ：20 mM Tris/HCl中の1.5 M NaCl, pH 8.0, ロット番号PL0748。
方法
容量        工程                      緩衝液                  流速
1CV        平衡化                  100％緩衝液A              1.0mL/分
5〜28mL    ロード標本          緩衝液A中1：10の標本          1.0mL/分
10mL      標本ポンプの洗浄         100％緩衝液A              1.0mL/分
5CV       未結合標本の洗い出し     100％緩衝液A              1.0mL/分
分画の開始               100％緩衝液A              1.0mL/分
6CV        溶出、直線勾配        0〜100％緩衝液B             0.8mL/分
2CV        溶出、アイソクラチック 100％緩衝液B               0.8mL/分
2CV        再生                   100％緩衝液C               0.8mL/分
0.5CV      再生                   100％緩衝液B               0.8mL/分
分画の停止              100％緩衝液B               0.8mL/分
5CV       再平衡化                100％緩衝液A               1.0mL/分。
検出：280 nm, 260 nm, 220 nm
pH
伝導率
分画：1mL 画分。
【０４９７】
８.４.３：結果
８.４.３.１：実施例８に記載の標本
標本組成：25 mM リン酸Na, 0.13 M NaClおよび0.3 mM EDTA, pH 7.5±0.2中の1 mg EP2001 (rhIFN-a2b)
開始容量：0.5 mL, 緩衝液A中で1:10に希釈 =5 mL
フロースルー(flow-through)／洗浄：9.3 mL
ラン日付：2004-09-29
ラン番号：QS24 D39（実施例8.4.4.1についての表を参照）。
【０４９８】
８.４.３.２：実施例８.３.２に記載の標本（エントリーA)
標本組成：0.1 M 酢酸Na, 20 mM シアノ水素化ホウ素Na, pH 5.0中の2.5 mg EP2001 + 97.5 mg アルデヒドHES10/0.4 (NZA256)
開始容量：2.5 mL, 緩衝液A中で1:10に希釈 =25 mL
フロースルー／洗浄：44 mL
ラン日付：2004-09-29
ラン番号：QS25 D56（実施例8.4.4.1についての表を参照）。
【０４９９】
８.４.３.３：実施例８.３.２に記載の標本（エントリーB)
標本組成：0.1 M 酢酸Na, 20 mM シアノ水素化ホウ素Na, pH 5.0中の2.5 mg EP2001 + 97.5 mg アルデヒドHES10/0.7 (NZA235A)
開始容量：2.5 mL, 緩衝液A中で1:10に希釈 =25 mL
フロースルー／洗浄：41 mL
ラン日付：2004-09-30
ラン番号：QS26 D57（実施例8.4.4.1についての表を参照）。
【０５００】
８.４.３.４：実施例８.３.２に記載の標本（エントリーC)
標本組成：0.1 M 酢酸Na, 20 mM シアノ水素化ホウ素Na, pH 5.0中の2.5 mg EP2001 + 292 mg アルデヒドHES30/0.4 (NZA328)
開始容量：2.5 mL, 緩衝液A中で1:10に希釈 =25 mL
フロースルー／洗浄：42 mL
ラン日付：2004-09-30
ラン番号：QS27 D58（実施例8.4.4.1についての表を参照）。
【０５０１】
８.４.３.５：実施例８.３.２に記載の標本（エントリーD)
標本組成：0.1 M 酢酸Na, 20 mM シアノ水素化ホウ素Na, pH 5.0中の2.5 mg EP2001 + 292 mg アルデヒドHES30/0.7 (NZA329)
開始容量：2.5 mL, 緩衝液A中で1:10に希釈 =25 mL
フロースルー／洗浄：40 mL
ラン日付：2004-09-30
ラン番号：QS28 D59（実施例8.4.4.1についての表を参照）。
【０５０２】
８.４.３.６：実施例８.３.２に記載の標本（エントリーE)
標本組成：0.1 M 酢酸Na, 20 mM シアノ水素化ホウ素Na, pH 5.0中の2.5 mg EP2001 + 487 mg アルデヒドHES50/0.4 (NZA303)
開始容量：2.7 mL, 緩衝液A中で1:10に希釈 =27 mL
フロースルー／洗浄：50 mL
ラン日付：2004-09-30
ラン番号：QS29 D60（実施例8.4.4.1についての表を参照）。
【０５０３】
８.４.３.７：実施例８.３.２に記載の標本（エントリーF)
標本組成：0.1 M 酢酸Na, 20 mM シアノ水素化ホウ素Na, pH 5.0中の2.5 mg EP2001 + 487 mg アルデヒドHES50/0.7 (NZA309)
開始容量：2.6 mL, 緩衝液A中で1:10に希釈 =26 mL
フロースルー／洗浄：50 mL
ラン日付：2004-09-30
ラン番号：QS30 D61（実施例8.4.4.1についての表を参照）。
【０５０４】
８.４.３.８：実施例８.３.２に記載の標本（エントリーG)
標本組成：0.1 M 酢酸Na, 20 mM シアノ水素化ホウ素Na, pH 5.0中の1.7 mg EP2001 + 98 mg アルデヒドHES10/0.4 (Supramol ロット番号407B)
開始容量：2.5 mL, 緩衝液A中で1:10に希釈 =25 mL
フロースルー／洗浄：42 mL
ラン日付：2004-10-01
ラン番号：QS31 D62（実施例8.4.4.1についての表を参照）。
【０５０５】
８.４.４：結果の比較
８.４.１.１：ＩＦＮ−アルファ溶出ピークのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
【表１２】
2007527892.tif 000046
【０５０６】
実施例９：ＩＦＮアルファ抗ウイルス活性のバイオアッセイの説明
試験方法の説明：インターフェロン−アルファの抗ウイルス活性
細胞培地中で試験品を予め希釈した後に、連続的な２倍希釈を調製した。９６ウェルマイクロタイタープレート中で、希釈インターフェロンを、新たにトリプシン処理したＭＤＢＫ細胞に希釈毎に４倍反復で加えた（ウェル当たり４０,０００細胞）。該アッセイを、３７℃で２４時間インキュベートし（ウェル当たり総容量：１５０μＬ（実施例９．１）または１７５μＬ（実施例９．２、９．３、９．４、１０））。
【０５０７】
引き続いて、５０μＬ 希釈したＶＳＶストック溶液を各ウェルに加え（正の対照ウェルを除いて）、それにより、感染効率(multiplicity of infection）の０．１を得た。
【０５０８】
以下の対照を、各アッセイ中に含んだ：インターフェロンの代わりにウイルス＋細胞培地を与えた１２ウェル（負の対照）、およびインターフェロンおよびウイルスの代わりに細胞培地を与えた１２ウェル（正の対照）。
【０５０９】
該アッセイは、３７℃で４２時間インキュベートした。
【０５１０】
インキュベート期間の最後に、各ウェルの細胞培養上清を、ＭＴＴ溶液（細胞培地中、少なくとも２ｍｇ／ｍＬ）（５０μＬ）で置き換えた。該細胞を３時間インキュベートした。増殖細胞によって得られる紫色ホルマザン色素を、イソプロパノール／ＨＣｌの溶液（４０ｍＭ ＨＣｌを有するイソプロパノール）（１００μＬ）を各ウェルに加えることによって溶解した。引き続いて、該溶液の吸光度を、マイクロタイタープレートリーダーで５７０／６３０ｎｍで測定した。
【０５１１】
インターフェロンおよびＶＳＶの存在下で増殖したＭＤＢＫ細胞の増殖活性は、インターフェロンの各希釈について、以下の通りに算出する。
【数１】
2007527892.tif 000047
【０５１２】
インターフェロン−アルファの抗ウイルス活性は、各試験品についての４個の別個のアッセイで測定した。
【０５１３】
実施例９．１：ＮＩＨ標準に対するイントロンＡの抗ウイルス活性
全ての実験において、イントロンＡ（IFN-アルファ2b, Schering-Plough）（これは、NIH-標準rhIFN-アルファ2a（NIAID, NIH, Bethesda, USA, Gxa01-901-535）について較正する）を、内部実験基準として使用した。該ＮＩＨ−標準は、比活性が９,０００ ＩＵ／ｍＬを有した。該内部実験基準イントロンＡは、実験９に記載する試験において、比活性８,４８７,０００ ＩＵ／ｍＬを有した。
【０５１４】
ＮＩＨ標準ｒｈＩＦＮ−アルファ２ａと比較したイントロンＡの増殖活性は、図２８に示す。
【０５１５】
実施例９.２：非修飾型出発物質に対する偽インキュベートしたＩＦＮα−ＨＥＳの抗ウイルス活性
実施例８.３.４に記載する通り、偽インキュベートしたＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳ（実施例８.３.２、エントリーＧに記載）を、反応対照として使用した。該物質の抗ウイルス活性は非修飾型出発物質のものと比較して、生理活性に及ぼす該カップリングおよび精製プロセスの影響を調査した。偽インキュベーションは、ＩＦＮ−アルファのインビトロ生理活性には影響を及ぼさなかった。
【０５１６】
非修飾型ＩＦＮ−アルファ出発物質と比較した偽インキュベートしたＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳの相対的なインビトロ活性を、図２９に示す。
【０５１７】
実施例９．３：イントロンＡに対する、ＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳ−コンジュゲートの抗ウイルス活性
実施例９に記載するアッセイシステムにおいて、該コンジュゲート（実施例８．４に従って精製した実施例８.３.２からのエントリーＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）を、非修飾型ＩＦＮ−アルファ出発物質、イントロンＡおよびペガシス(Pegasys)（Roche）と比較して試験した。該物質のＣＰＥ５０濃度を算出した。全てのＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳコンジュゲートは抗ウイルス活性を保持し、これは、Pegasysの活性よりも実質的に高かった。
【０５１８】
非修飾型ＩＦＮ−アルファ出発物質、イントロンＡおよびPegasysと比較した、ＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳコンジュゲートの相対的なインビトロ活性を、図３０に示す。
【０５１９】
実施例９．４：イントロンＡと比較した、ＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳコンジュゲートの抗ウイルス活性
実施例９に記載するアッセイシステムにおいて、実施例８.４に従って精製した実施例８.３.４のＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳコンジュゲートを、イントロンＡと比較して試験した。該物質のＣＰＥ５０濃度を算出した。該ＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳコンジュゲートは、イントロンＡと比較して２５％以上の高い抗ウイルス活性を保持した。
【０５２０】
イントロンＡと比較したＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳコンジュゲートの相対的なインビトロ活性を、図３１に示す。
【０５２１】
実施例９.５：イントロンＡと比較した、ＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳコンジュゲートの抗ウイルス活性
実施例９に記載するアッセイシステムにおいて、実施例８.４に従って精製した実施例８.３.３のＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳコンジュゲートは、イントロンＡおよびペグイントロン(PegIntron)と比較して試験した。該物質のＣＰＥ５０濃度を算出した。該ＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳコンジュゲートは、イントロンＡと比較して約２５％の抗ウイルス活性を保持し、これは、PegIntronのインビトロ活性と同じレベルである。
【０５２２】
イントロンＡと比較した、ＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳコンジュゲートの相対的なインビトロ活性を、図３８に示す。
【０５２３】
実施例１０：ＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳコンジュゲートのインビボ生理活性（マウスにおけるＰＫ研究）
実施例１０．１：実施例９に記載するアッセイシステムに及ぼすマウス血清の影響
インターフェロン−アルファの希釈は、細胞培地（対照）およびマウス血清（１：４０の希釈、および１：８０の希釈）中で調製した。該アッセイは、実施例９に記載する通り実施した。
【０５２４】
インターフェロン−アルファの抗ウイルス活性は、対照、１：４０に希釈したマウス血清、並びに１：８０に希釈したマウス血清について、２個の別個のアッセイで決定した。該結果は、１：４０の希釈および１：８０の希釈でのマウス血清がインターフェロン−アルファの抗ウイルス活性についてのバイオアッセイに影響を及ぼさないことを示した。
【０５２５】
実施例１０.２：マウスにおけるインビボ研究（Ｉ）
貯蔵血清の抗ウイルス活性を、抗ウイルスアッセイにおいて試験した。血清を２匹のマウス（雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス、８週齢）から各時間に集め、このものをＩＦＮ−アルファまたはＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳコンジュゲート（３０μｇ／ｋｇ（タンパク質含有量の基準で）の静脈内注射の２時間、４時間、１２時間、および２４時間後に殺した。
【０５２６】
血清標本を解凍し、そして渦巻くことによって十分にホモジナイズした（そして、希釈した）。連続的な２倍希釈を、細胞培地中で調製した。イントロンＡ（希釈）のバイアルを解凍し、そして渦巻くことによって十分にホモジナイズした。連続的な２倍希釈を、細胞培地中で調製した。
【０５２７】
該ＣＰＥ−アッセイにおけるＥＣ５０−希釈は、実施例９に記載する通り、１：２希釈群の用量応答曲線から測定した。
【０５２８】
該物質の半減期は、非修飾型出発物質およびPegasysと比較して測定した。該半減期は、注射後の時間に対する、ＥＣ５０−希釈の半対数的なプロットから算出した。
【０５２９】
抗ウイルス活性を、（ｉ）ＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳ（表の実施例８.３.２、エントリーＢ）、（ｉｉ）ＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳ（表の実施例８.３.２のエントリーＤ）、（ｉｉｉ）ＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳ（実施例８.３.４）について２４時間まで検出した。図３２から知ることができる通り、半減期は、（ｉ）（約３時間）から、（ｉｉ）（約５時間）から（ｉｉｉ）（約７時間）まで増大した。
【０５３０】
非修飾型ＩＦＮ−アルファについて、血清の抗ウイルス活性は、血清半減期を算出するのにはあまりにも低い。K.R. Reddyらによる, Advaced Drug Delivery Reviews 54 (2002) 571-586において、ラット（静脈内）におけるＩＦＮ−アルファの血清半減期は２時間であると測定された。
【０５３１】
実施例１０.３：マウスにおけるインビボ研究（ＩＩ）
貯蔵血清の抗ウイルス活性を、抗ウイルスアッセイにおいて試験した。血清を２匹のマウス（雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス、８週齢）から各時間に集め、このものをＩＦＮ−アルファまたはＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳコンジュゲート（３０μｇ／ｋｇ（タンパク質含有量の基準で）の静脈内注射の２時間、４時間、１２時間、および２４時間後に殺した。
【０５３２】
血清標本を解凍し、そして渦巻くことによって十分にホモジナイズした（そして、希釈した）。連続的な２倍希釈を、細胞培地中で調製した。イントロンＡ（希釈）のバイアルを解凍し、そして渦巻くことによって十分にホモジナイズした。連続的な２倍希釈を、細胞培地中で調製した。
【０５３３】
該ＣＰＥ−アッセイにおけるＥＣ５０−希釈は、実施例９に記載する通り、１：２希釈群の用量応答曲線から測定した。
【０５３４】
該物質の半減期は、非修飾型出発物質およびPegasysと比較して測定した。該半減期は、注射後の時間に対する、ＥＣ５０−希釈の半対数的なプロットから算出した。
【０５３５】
抗ウイルス活性を、（ｉ）ペグイントロン、（ｉｉ）ＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳ３０／０．８（実施例８.３.１.１）、および（ｉｉｉ）ＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳ１００／０．７（実施例８.３.３.２）について２４時間まで検出した。図３７から知ることができる通り、半減期は、（ｉ）（約３．６時間）から、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）（約６．５および６．８時間）まで増大した。
【０５３６】
実施例１１：ＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳコンジュゲートのインビボ生理活性（ウサギにおけるＰＫ研究）
実施例１１.１：ＩＦＮ−アルファおよびＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳコンジュゲートの放射性標識
該ＰＫ研究に使用する標本を、クロラミンＴ方法を用いる、１２５Ｉで標識した。クロラミンＴはヨードと反応し、そして内部ハロゲン(interhalogen)種（Ｉ−Ｃｌ）を形成する。該内部ハロゲンは、トリプシンの芳香環上で反応し、そしてｏ−位でそれを置換する。
【０５３７】
実施例１１.２：基準実験：オキソ−ＨＥＳ５０／０．４の１２５Ｉによる標識
示す反応条件下での第１実験群において、微量のヨウ素が例えば、ＨＥＳと複合体を形成する、ヨウ素、ポリヨウ素(polyiodine)、またはポリヨード(polyiodide)によって検出することができるかどうかを調べた。比較として、オキソ−ＨＥＳ（MW 42.1 kD DS = 0.41）およびＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳ（表の実施例８.３.２のエントリーＥ）を、同じ条件下で標識し、そして精製プロセス後に、該標本中の放射活性を測定した。文献に従って、アミロペクチンは、ヘリカル構造が少なくとも１１個のアンヒドログルコース(anhydroglucose)単位を有する場合に、ヨウ素、ポリヨウ素およびポリヨードとの複合体を形成し得る。
【０５３８】
ＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳ標本中においてのみ、放射活性を検出した。この結果は、放射活性が、潜在的に物理学的に結合するヨウ素によってではなく、ＩＦＮ−アルファのトリプシン残基の共有的な修飾によっては専ら生じるものであり、これは、精製プロセス中には除去されないことを証明した。オキソ−ＨＥＳ５０／０．４（MW = 42,1 kD, DS = 0,41）を、負の対照と見なすことができる。このオキソ−ＨＥＳ種における高い分子量および低い置換の程度により、存在する場合には最長のヘリカル構造が期待され、従って、この場合に、ヨウ素の複合化の最大の危険が存在するであろう。
【０５３９】
実施例１１.３：インターフェロン−アルファの、非放射性ヨウ素（「冷ヨウ素化(cold iodination)」を用いる標識
インターフェロンアルファは、ＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳ−コンジュゲート５０／０．４と同じ標識および精製プロセスにおいて、非放射性ヨウ素を用いて標識した。抗ウイルスアッセイにおいて、抗ウイルス活性は保持された。しかしながら、標識および精製のプロセスにおいて濃度は変化しないという理由で定量化はまったく行なわず、そしてこれは入手可能な物質の少量という理由で測定することはできなかった。
【０５４０】
実施例１１.４：ＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳ−コンジュゲートの放射性標識
標本を、放射性１２５Ｉを用いて実施例１１.１に従って標識した。標本は、ＩＦＮ−アルファ出発物質、ＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳ（表の実施例８.３.２のエントリーＤ）であった。該標本は、比活性が３８μＣｉ／μｇ（ＩＦＮ−アルファ出発物質）、および４１μＣｉ／μｇ（ＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳ３０／０．７）を有した。
【０５４１】
実施例１１.５：ウサギにおけるインビボＰＫ研究
実施例１１.５.１：実験方法
試験品は希釈物として使用した。４μＣｉ／ｍＬの溶液を調製した。希釈緩衝液はＰＢＳとした。
【０５４２】
４匹のニュージーランドホワイトラビットHsdIf:NZW. Source Harlan Winkelmann GmbH, D-33178 Borchen（性別：雌性；研究の開始での体重：＞２．５ｋｇ）を使用する。全ての動物は、放射標識被験物質を静脈内で適用させ、１ｍＬ／体重ｋｇの容量を与え、これは、用量が４μＣｉ／体重ｋｇと等価である。血液標本を、決まった時点で採取した。各サンプリング時点で、該動物の耳介静脈から約６００μＬを更なる研究のために採取した。
【０５４３】
血液サンプリングについて、静脈内留置カテーテルを、通常の麻酔（ケタミン／ロムプン(Rompun)）下、耳介静脈中に置いた。使用前の血液サンプリング時点、使用そのもの、および使用後の最初の３血液サンプリング（０．５時間、１時間、および２時間）のために、麻酔を休めた。動物自らによって切除するまで、カテーテルを更なるサンプリング時点のために動物中に置いた。更なる血液サンプリングは、耳介静脈の異なる領域を通るカニューレを用いて測定した。
【０５４４】
該血液標本の更なる加工処理は、血液サンプリング後に行なった。該血液中の該放射標識試験品を測定するために、該集めた血液標本を、特別な可溶化プロトコールに従って加工処理した。このために、血液標本の２５０μＬを新しいバイアルに移し、そして等量のSolvable（登録商標）を加えた。該標本を、振とう用水浴中、５０℃で１時間インキュベートした。該インキュベート時間後に、該標本を室温まで冷却し、そしてＥＤＴＡ−溶液［１００ｍＭ］（１００μＬ）を加えた。続いて、Ｈ２Ｏ２［３０％］（３００μＬ）を加え、そして再び振り混ぜた後に、該標本を振とう用水浴中、５０℃で１時間インキュベートした。更なる加工処理の前に、標本を集めた。
【０５４５】
血液の収集および可溶化の最後に、該標本を２０ｍＬ シンチレーションバイアルに移し、そしてシンチレーションカクテル Ultima Gold（登録商標）（１０ｍＬ）を加えた。シンチレーション−カウンター中での同位体１２５Ｉの測定まで（カクテル添加の約７２時間後）、該標本を暗中、２〜８℃で保存した。
【０５４６】
加工処理および該データの統計学的な分析の前に、特別な実験条件下での活性の検出の失活を測定した。回帰係数（ｒ２＝０．９９７０）は、ラインへのフィットの測定値である。該失活因子［ｐＣｉ／ｃｐｍ］は、３．３１５９３８であることが分かった。
【０５４７】
結果（図３３を参照）：
ＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳは、出発物質と比較した半減期の顕著な延長を示した。２４時間を越えると（約＜１０００ｐＣｉ／ｍＬ）、該非修飾型物質の曲線はレベルオフし、そして活性の低下はほとんど全く観察されなかった。全ての標本についての測定される放射活性の小さい標準偏差は、実験の質を証明する。
【０５４８】
半減期は、血液標本中のＩＦＮ−アルファの濃度から算出した。図３４に示す評価について、４および２４時間の間で採取される血液標本からのデータのみを考慮した。非修飾型物質の場合に、半減期は７時間であると算出された。ＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳの場合に、半減期の実質的な増大が観察された（約３３時間）。
【０５４９】
データは、図面３５ａおよびｂのグラフに示す通り異なるコンパートメントモデルに従って、統計学的に評価した（０〜１２時間をカットアウトする）。１コンパートメントモデルにおいて、ＩＦＮ−アルファの濃度は、注射後の最初の２時間の間に急激に低下することが明らかである。ＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳの場合、半減期は明らかに延長される。統計学的に算出される半減期は、ＩＦＮ−アルファの場合に０．２６時間、ＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳの場合に７．７時間であった。非コンパートメントモデルに従って、統計学的な評価により、半減期が非修飾型ＩＦＮ−アルファの場合に１４７時間（２４〜１２０時間のデータに基づく）、ＩＦＮ−アルファ−ＨＥＳの場合に４２．７時間（３６〜１２０時間のデータに基づく）を得る。上記の通り、該非修飾型ＩＦＮ−アルファの半減期は、曲線が２４時間を越えてレベルオフするので、実質的に延長される。
【０５５０】
計算のための記載するモデルに基づく該２個の標本の半減期を、以下の表にまとめる。
【表１３】
2007527892.tif 000048
【図面の簡単な説明】
【０５５１】
【図１ａ】図１ａは、実施例2.1(a)に従って製造したHES−G-CSFコンジュゲート、ニューポジェン（登録商標）のSDSpage分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。12％Bis-Trisゲルを、還元条件のMOPS SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。レーンA：タンパク質マーカーSeeBlue（登録商標）Plus2（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。レーンB：G-CSF（ニューポジェン（登録商標））と実施例2.1(a)に記載するHESとのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンC：G-CSF出発物質。
【図１ｂ】図１ｂは、実施例2.1(a)に従って製造したHES−G-CSFコンジュゲート、グラノサイト（登録商標）のSDSpage分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。12％Bis-Trisゲルを、還元条件のMOPS SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。レーンA：タンパク質マーカーSeeBlue（登録商標）Plus2（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。レーンB：G-CSF（グラノサイト（登録商標））と実施例2.1(a)に記載するHESとのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンC：G-CSF出発物質。
【図２】図２は、実施例2.1(b)に従って製造したHES−G-CSFコンジュゲート（G-CSFは、商業的な製品ニューポジェン（登録商標）と本質的に同じ性質を有する精製hG-CSFである）のSDSpage分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。12％Bis-Trisゲルを、還元条件のMOPS SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。レーンA：タンパク質マーカーSeeBlue（登録商標）Plus2（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。レーンB：G-CSFと、0.1M NaOAcバッファーpH 5.0中のHES10/0.4とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンC：G-CSFと、0.1M NaOAcバッファーpH 5.0中のHES10/0.7とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンD：G-CSFと、0.1M NaOAcバッファーpH 5.0中のHES50/0.4とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンE：G-CSFと、0.1M NaOAcバッファーpH 5.0中のHES50/0.7とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンF：G-CSF出発物質。
【図３】図３は、実施例2.2に従って製造したHES−G-CSFコンジュゲート（G-CSFは、商業的な製品ニューポジェン（登録商標）と本質的に同じ性質を有する精製hG-CSFである）のSDSpage分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。12％Bis-Trisゲルを、還元条件のMOPS SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。レーンA：タンパク質マーカーSeeBlue（登録商標）Plus2（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。レーンB：G-CSFと、0.1M NaOAcバッファーpH 5.0中の酸化型HES10/0.7とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンC：G-CSFと、0.1M NaOAcバッファーpH 5.0中の酸化型HES50/0.4とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンD：G-CSFと、0.1M NaOAcバッファーpH 5.0中の酸化型HES50/0.7とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンE：G-CSF出発物質。
【図４】図４は、実施例2.3に従って製造したHES−G-CSFコンジュゲート（G-CSFは、ニューポジェン（登録商標）またはグラノサイト（登録商標）である）のSDSpage分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。12％Bis-Trisゲルを、還元条件のMOPS SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。レーンA：タンパク質マーカーSeeBlue（登録商標）Plus2（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。レーンB：実施例2.3に記載の粗生成物（i-N）。レーンC：実施例2.3に記載の粗生成物（ii-N）。レーンD：実施例2.3に記載の粗生成物（iii-N）。レーンE：実施例2.3に記載の粗生成物（iv-N）。レーンF：実施例2.3に記載の粗生成物（i-G）。レーンG：実施例2.3に記載の粗生成物（ii-G）。レーンH：実施例2.3に記載の粗生成物（iii-G）。レーンI：実施例2.3に記載の粗生成物（iv-G）。レーンJ：ニューポジェン（登録商標）。
【図５】図５は、実施例2.4に従って製造したHES−G-CSFコンジュゲート（G-CSFは、商業的な製品ニューポジェン（登録商標）と本質的に同じ性質を有する精製hG-CSFである）のSDSpage分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。12％Bis-Trisゲルを、還元条件のMOPS SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。レーンA：タンパク質マーカーSeeBlue（登録商標）Plus2（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。レーンB：実施例2.4に記載の粗生成物（vi）。レーンC：実施例2.4に記載の粗生成物（v）。レーンD：G-CSF出発物質。レーンE：タンパク質マーカーSeeBlue（登録商標）Plus2（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。レーンF：実施例2.4に記載の粗生成物（ix）。レーンG：実施例2.4に記載の粗生成物（viii）。レーンH：実施例2.4に記載の粗生成物（vii）。レーンI：G-CSF出発物質。
【図６】図６は、実施例2.5に従って製造したHES−G-CSFコンジュゲート（G-CSFは、商業的な製品ニューポジェン（登録商標）と本質的に同じ性質を有する精製hG-CSFである）のSDSpage分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。12％Bis-Trisゲルを、還元条件のMOPS SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。レーンA：タンパク質マーカーSeeBlue（登録商標）Plus2（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。レーンB：実施例2.5に記載の粗生成物。レーンC：G-CSF出発物質。
【図７】図７は、実施例2.6に従って製造したHES−タンパク質コンジュゲートのSDSpage分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。12％Bis-Trisゲルを、還元条件のMOPS SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。体積が15μlを超える標本は、減圧下でこの体積まで濃縮した。レーンA：タンパク質マーカーSeeBlue（登録商標）Plus2（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。レーンB：IL-2と実施例1.9で述べたように合成したアルデヒド-HESとのコンジュゲーション。レーンC：IL-2と実施例1.10で述べたように合成したアルデヒド-HESとのコンジュゲーション。レーンD：対照：アルデヒド-HESなしで水素化ホウ素ナトリウムで処理したIL-2。レーンE：IFN-アルファと実施例1.9で述べたように合成したアルデヒド-HESとのコンジュゲーション。レーンF：IFN-アルファと実施例1.10で述べたように合成したアルデヒド-HESとのコンジュゲーション。レーンG：対照：アルデヒド-HESなしで水素化ホウ素ナトリウムで処理したIFN-アルファ。
【図８】図８は、実施例2.6に従って製造したHES−タンパク質コンジュゲートのSDSpage分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。12％Bis-Trisゲルを、還元条件のMOPS SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。体積が15μlを超える標本は、減圧下でこの体積まで濃縮した。レーンA：タンパク質マーカーSeeBlue（登録商標）Plus2（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。レーンB：IL-3と実施例1.9で述べたように合成したアルデヒド-HESとのコンジュゲーション。レーンC：IL-3と実施例1.10で述べたように合成したアルデヒド-HESとのコンジュゲーション。レーンD：対照：アルデヒド-HESなしで水素化ホウ素ナトリウムで処理したIL-3。レーンE：ミオグロビンと実施例1.9で述べたように合成したアルデヒド-HESとのコンジュゲーション。レーンF：ミオグロビンと実施例1.10で述べたように合成したアルデヒド-HESとのコンジュゲーション。レーンG：対照：アルデヒド-HESなしで水素化ホウ素ナトリウムで処理したミオグロビン。
【図９】図９は、実施例2.6に従って製造したHES−タンパク質コンジュゲートのSDSpage分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。3〜8％Tris-アセテートゲルを、還元条件のTris-アセテート SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。レーンA：タンパク質マーカーSeeBlue（登録商標）Plus2（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。レーンB：BSAと実施例1.9で述べたように合成したアルデヒド-HESとのコンジュゲーション。レーンC：BSAと実施例1.10で述べたように合成したアルデヒド-HESとのコンジュゲーション。レーンD：対照：アルデヒド-HESなしで水素化ホウ素ナトリウムで処理したBSA。
【図１０】図１０は、実施例2.6に従って製造したHES−タンパク質コンジュゲートのSDSpage分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。12％ビス-Trisゲルを、還元条件のMOPS SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。体積が15μlを超える標本は、減圧下でこの体積まで濃縮した。レーンA：タンパク質マーカーSeeBlue（登録商標）Plus2（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。レーンB：SODと実施例1.9で述べたように合成したアルデヒド-HESとのコンジュゲーション。レーンC：SODと実施例1.10で述べたように合成したアルデヒド-HESとのコンジュゲーション。レーンD：対照：アルデヒド-HESなしで水素化ホウ素ナトリウムで処理したSOD。レーンE：対照：アルデヒド-HESなしで水素化ホウ素ナトリウムで処理したEPO。レーンF：EPOと実施例1.9で述べたように合成したアルデヒド-HESとのコンジュゲーション。レーンG：EPOと実施例1.10で述べたように合成したアルデヒド-HESとのコンジュゲーション。レーンH：IFN-アルファと実施例1.9で述べたように合成したアルデヒド-HESとのコンジュゲーション。レーンI：IFN-アルファと実施例1.10で述べたように合成したアルデヒド-HESとのコンジュゲーション。レーンJ：対照：アルデヒド-HESなしで水素化ホウ素ナトリウムで処理したIFN-アルファ。
【図１１】図１１は、実施例2.6に従って製造したHES−タンパク質コンジュゲートのSDSpage分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。3〜8％Tris-アセテートゲルを、還元条件のTris-アセテート SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。レーンA：タンパク質マーカーSeeBlue（登録商標）Plus2（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。レーンB：AT IIIと実施例1.9で述べたように合成したアルデヒド-HESとのコンジュゲーション。レーンC：AT IIIと実施例1.10で述べたように合成したアルデヒド-HESとのコンジュゲーション。レーンD：対照：アルデヒド-HESなしで水素化ホウ素ナトリウムで処理したAT III。
【図１２】図１２は、実施例4のインビトロ結果を表す図である。該図中、x軸は濃度(単位pg/mL）を示し、該y軸は細胞数/100,000を示す。該図中、以下の略号は以下のものを意味する。G-CSF/A32：実施例2.5で述べたように合成したG-CSFコンジュゲート。G-CSF/A33：実施例2.5のコンジュゲートについて使用する、G-CSF出発物質。G-CSF/A57：非修飾型ユーラスタ（登録商標）。G-CSF/A58：非修飾型ニューポジェン（登録商標）。
【図１３】図１３は、DEAE-セファロースCL-6Bを用いるクロマトグラフィー精製（実施例3を参照）後の、実施例2.5に記載のHES-修飾G-CSFのフロースルーおよび溶出液のSDS-PAGEを表す図である。該示す画分の1.5％を、限外ろ過によって透析し、SpeedVac中において乾燥し、そして12.5％ポリアクリルアミドゲル上に適用した。
【図１４】図１４は、G-CSFのMALDI/TOFスペクトル（実施例3を参照）を表す図である。
【図１５】図１５は、HES-修飾G-CSFのMALDI/TOFスペクトル（実施例3を参照）を表す図である。
【図１６】図１６は、実施例5の結果（ゲル電気泳動による、実施例5.5で述べたように合成する粗α1AT-HESコンジュゲートの分析）を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびPower Pac 200電源（Bio-Rad，ドイツ・ミュンヘン）を使用した。3〜8％Tris-アセテートゲルを、還元条件のTris-アセテート SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。レーンA：未着色SDS Pageタンパク質マーカー6.5〜200KDa（SERVA Elektrophoresis GmbH, Heidelberg, D）分子量マーカー（上から下に）：200kD、116kD、67kD、45kD、29kD、21kD、14.3kD、6.5kD。レーンB：実施例5.5に記載するアルデヒド-HESとのコンジュゲーション。レーンC：実施例5.6に記載するHESとのコンジュゲーション。
【図１７】図１７は、実施例5の結果（イオン交換クロマトグラフィー精製後に集める画分B1-C6の分析（実施例5.7を参照）を表す図である。ゲル電気泳動の条件は、図１６を参照。レーンA：未着色SDS Pageタンパク質マーカー6.5〜200KDa（SERVA Elektrophoresis GmbH, Heidelberg, D）分子量マーカー（上から下に）：200kD、116kD、67kD、45kD、29kD、21kD、14.3kD、6.5kD。レーンB：画分B1。レーンC：画分C1。レーンD：画分C2。レーンE：画分C3。レーンF：画分C4。レーンG：画分C5。レーンH：画分C6。レーンI：A1AT（GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, ロット番号080604A）。
【図１８】図１８は、プロラスチン（登録商標）HS（Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany, ロット番号PR4HA43）、A1AT（GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, ロット番号080604A）、および実施例5.5で述べたように合成するHES-A1AT-コンジュゲートの、濃度プロットに対する残留酵素活性を表す図である。
【図１９】図１９は、実施例6.2(b)の反応混合物のゲル電気泳動を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。12％ビス-Trisゲルを、還元条件のMOPS SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。該ゲルは、製造者の指示に従って、Roti-Blue（Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, D）を用いて着色した。レーンA：タンパク質マーカーRoti-Mark STANDARD（Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, D）分子量マーカー（上から下に）：200kD、119kD、66kD、43kD、29kD、20kD、14.3kD。レーンB：hG-CSFと実施例6.1(d)で製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンC：hG-CSFと実施例6.1(b)で製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンD：hG-CSFと実施例6.1(j)で製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンE：反応対照: HES 50/0.7（Mw 47,000, DS = 0.76）。
【図２０】図２０は、実施例6.2(d)の反応混合物のゲル電気泳動を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。12％ビス-Trisゲルを、還元条件のMOPS SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。該ゲルは、製造者の指示に従って、Roti-Blue（Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, D）を用いて着色した。レーンA：タンパク質マーカーRoti-Mark STANDARD（Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, D）分子量マーカー（上から下に）：200kD、119kD、66kD、43kD、29kD、20kD、14.3kD。レーンB：実施例6.2(c)に記載するバッファー交換後のhG-CSF。レーンC：hG-CSFと実施例6.1(f)で述べたように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。レーンD：hG-CSFと実施例6.1(h)で述べたように製造したHES誘導体とのコンジュゲーション後の粗生成物。
【図２１】図２１は、実施例6.3の分裂促進性アッセイの結果を表す図である。該Y軸はNSS-60-細胞の数/mLを示し、そして該X-軸は濃度（単位pg/mL）を示す。
【図２２】図２２は、実施例6.4のインビボアッセイの結果を表す図である。
【図２３】図２３は、ゲル電気泳動による、実施例７の粗EPO-HESコンジュゲートの分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。10％ビス-Trisゲルを、還元条件のMOPS SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。レーンA：Roti（登録商標）-Mark STANDARD（Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, D）分子量マーカー（上から下に）：200kD、119kD、66kD、43kD、29kD、20kD、14.3kD。レーンB：EPOと実施例7.3に記載するアルデヒド-HESとのコンジュゲーション。レーンC：EPOと実施例7.4に記載する水素化ホウ素ナトリウムなしのアルデヒド-HES（反応対照A）との反応。レーンD：EPOと実施例7.5に記載する水素化ホウ素ナトリウムなしのアルデヒド-HES（反応対照B）との反応。  図２３から明らかなとおり、アルデヒド-HESなしまたは水素化シアノホウ素ナトリウムなしのいずれかの反応対照AおよびBの場合、反応は認められなかった。
【図２４】図２４は、ゲル電気泳動による、実施例8.3.1のIFN-α-HESの分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。10％ビス-Trisゲルを、還元条件のMOPS SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。レーンX：Roti（登録商標）-Mark STANDARD（Carl Roth GmbH + Co. KG，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：200KD、119KD、88KD、43KD、29KD、20KD、14.3KD；レーンA：実施例8.3.1エントリーAに記載のアルデヒドHES10/0.4へのコンジュゲーション；レーンB：実施例8.3.1エントリーBに記載のアルデヒドHES10/0.7へのコンジュゲーション；レーンC：実施例8.3.1エントリーCに記載のアルデヒドHES30/0.4へのコンジュゲーション；レーンD：実施例8.3.1エントリーDに記載のアルデヒドHES30/0.7へのコンジュゲーション；レーンE：実施例8.3.1エントリーEに記載のアルデヒドHES50/0.4へのコンジュゲーション；レーンF：実施例8.3.1エントリーFに記載のアルデヒドHES50/0.7へのコンジュゲーション；レーンG：実施例8.3.1エントリーGに記載のアルデヒドHESなしの反応対照；レーンI：実施例8.3.1エントリーIに記載のアルデヒドHESなしおよびNaCNBH3なしの反応対照；レーンJ：実施例8.3.1エントリーJに記載のHES10/0.4を含む反応対照；レーンK：実施例8.3.1エントリーKに記載のHES10/0.4を含むがNaCNBH3は含まない反応対照。
【図２５】図２５は、実施例8.3.2のIFN-アルファ-HESコンジュゲートのゲル電気泳動による分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。10％Bis-Trisゲルを、還元条件のMOPS SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。レーンX：Roti（登録商標）-Mark STANDARD（Carl Roth GmbH & Co. KG，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：200KD、119KD、88KD、43KD、29KD、20KD、14.3KD；レーンA：実施例8.3.2エントリーAに記載のアルデヒド-HESへのコンジュゲーション；レーンB：実施例8.3.2エントリーBに記載のアルデヒド-HESへのコンジュゲーション：レーンC：実施例8.3.2エントリーCに記載のアルデヒド-HESへのコンジュゲーション；レーンD：実施例8.3.2エントリーDに記載のアルデヒド-HESへのコンジュゲーション；レーンE：実施例8.3.2エントリーEに記載のアルデヒド-HESへのコンジュゲーション；レーンF：実施例8.3.2エントリーFに記載のアルデヒド-HESへのコンジュゲーション；レーンG：実施例8.3.2エントリーGに記載のHESを含む反応対照。  図２５から明らかになるように、反応対照Gの場合、反応は認められなかった。
【図２６】図２６は、実施例8.3.3のIFN-アルファ-HESコンジュゲートのゲル電気泳動による分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。10％Bis-Trisゲルを、還元条件のMOPS SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。粗製IFNα-HESコンジュゲートのゲル電気泳動による分析。レーンA：Roti（登録商標）-Mark STANDARD（Carl Roth GmbH + Co. KG，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：200KD、119KD、66KD、43KD、29KD、20KD、14.3KD；レーンB：8.3.3.1に記載のアルデヒドHES30/0.8へのIFNαのコンジュゲーション；レーンC：8.3.3.2に記載のアルデヒドHES130/0.7へのIFNαのコンジュゲーション；レーンD：8.3.3.3に記載のHES10/0.4（反応対照）へのIFNαのコンジュゲーション。
【図２７】図２７は、実施例8.3.4のIFN-アルファ-HESコンジュゲートのゲル電気泳動による分析を表す図である。ゲル電気泳動には、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）およびConsort E143電源（CONSORTnv，ベルギー・トゥルンホウト）を使用した。10％Bis-Trisゲルを、還元条件のMOPS SDSランニング緩衝液と共に（どちらもInvitrogen GmbH，ドイツ・カールスルーエ）、製造者の指示に従って使用した。レーンX：Roti（登録商標）-Mark STANDARD（Carl Roth GmbH + Co. KG，ドイツ・カールスルーエ）分子量マーカー（上から下に）：200KD、119KD、88KD、43KD、29KD、20KD、14.3KDレーンA：実施例8.3.4に記載のアルデヒドHESへのコンジュゲーション；レーンB：反応対照；実施例8.3.4に記載のHES（MW =7.6 kD, DS = 0.41）へのコンジュゲーション。  図２７から明らかになるように、反応対照Bの場合、反応は認められなかった。
【図２８】図２８は、実施例9.1に従って、NIH標準rhIFN-α2aと比較した、イントロンAの増殖活性を表す図である。
【図２９】実施例9.2に従って非修飾IFN-アルファ出発物質と比較した、偽インキュベートしたIFN-アルファ-HESの相対的インビトロ活性を表す図である。
【図３０】実施例9.3に従って非修飾IFN-アルファ出発物質、イントロンA、およびPegasysとそれぞれ比較した、IFN-アルファ-HESコンジュゲートの相対的インビトロ活性を表す図である。
【図３１】実施例9.4に従ってイントロンAと比較したIFN-アルファ-HESコンジュゲートの相対的インビトロ活性を表す図である。
【図３２】ウイルス感染に対するMDBK細胞の50％保護を達成するのに必要な血清試料の希釈度をマウスにおける30μg/kgのi.v.注射後の時間に対して表した図である。非修飾出発物質で処置したマウスの血清が持つ抗ウイルス効果は極めて低かった。HESによるIFN-アルファの修飾は、血清の抗ウイルス効果を実質的に延長する。半減期は、IFN-アルファの修飾に使用したHESの分子量と共に増加する(実施例10参照）。
【図３３】実施例11によるウサギにおけるPK研究で得たデータを表す図である。IFN-アルファ-HESは、IFN-アルファ出発物質と比較して、半減期の明確な延長を示す。24時間以降（約1000pCi/ml未満）は、非修飾物質の曲線が横ばい状態になり、活性のさらなる減少はほとんど観察することができない。
【図３４】実施例11によるウサギにおけるPK研究を表す図である。4時間から24時間までデータを評価した。IFN-アルファ-HESは、非修飾IFN-アルファ出発物質と比較して、半減期の明確な延長を示す。
【図３５】実施例11によるPK研究（12時間までの期間を図示）の統計的評価を表す図である。非修飾出発物質の場合（図35(a)参照）、濃度は最初の2時間でほとんどゼロまで低下したのに対し、IFNアルファ-HESは明確に延長された半減期を示す（図35(b)）。
【図３６】実施例6.5の結果（本発明のHES-G-CSFコンジュゲート、ユーラスタ（登録商標）、およびニューポジェン（登録商標）の半減期の測定の比較）を表す図である。
【図３７】グラフ中の実施例10.3の結果（IFN-アルファ-HESコンジュゲートの抗ウイルス活性）を表す図である。
【図３８】グラフ中の実施例9.5の結果（IFN-アルファ-HESコンジュゲートの抗ウイルス活性）を表す図である。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【国際調査報告】
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