(57)【要約】  本発明は、生体化合物の三次元構造が例えばＮＭＲ分光分析により分析できるように、安定同位体による生体化合物の標識に関する。本発明は、安定同位体で一様に標識されているバイオマスを生成するために、安定同位体を含む炭素及び窒素源を含んでいる無機栄養培地で増殖させる微生物を使用する。このバイオマスを自己消化させて自己消化物を生成してもよい。バイオマスを有機溶媒で更に抽出して脂質を生成することができる。この脱脂されたバイオマスは加水分解されて標識されたアミノ酸及び他の栄養素を生成し、これらは自己消化物、抽出脂質及び他の成分と一緒に使用されて、安定同位体で一様に標識された生体化合物の生産のための哺乳動物又は昆虫の宿主細胞用の培地を構成する。生体化合物は、好ましくは哺乳動物の膜タンパク質などの生体高分子である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈ、Ｃ又はＮの少なくとも１つについて、栄養培地内での生体分子の合成のために細胞によって使用される基質内の実質的に全ての原子が同位体標識されている、培養中の哺乳動物又は昆虫の細胞を増殖させるための栄養培地を作製する方法であって、
（ａ）Ｈ、Ｃ又はＮの少なくとも１つについて実質的に全ての同化性原子が同位体標識された、生物の増殖を支える無機栄養培地でその生物を増殖させ、標識されたバイオマスを生成するステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）において増殖させた生物のバイオマスを自己消化させて自己消化物を生成するステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた自己消化物を前記哺乳動物又は昆虫の細胞の増殖に必要な更なる成分と組み合わせることによって栄養培地を構成するステップとを含む方法。
【請求項２】
前記生物は真菌、酵母又は藻類である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物はサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ブレタノミセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、トルロプシス（Ｔｏｌｒｕｌｏｐｓｉｓ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ガルジエリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ）、シアニジウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ）、ポルフィリジウム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）、シストクロニウム（Ｃｙｓｔｏｃｌｏｎｉｕｍ）、オードウイネラ（Ａｕｄｏｕｉｎｅｌｌａ）、シアニジオシゾン（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ）から選択される属の生物である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
更に：
（ａ）Ｈ、Ｃ又はＮの少なくとも１つについて実質的に全ての同化性原子を同位体標識された、生物の増殖を支える無機栄養培地でその生物を増殖させ、標識バイオマスを生成するステップと；
（ｂ）有機溶媒で生物のバイオマスを抽出して脂質を含んでいる抽出物を生成するステップ（前記生物はステップ（ａ）のように増殖させたものであるか、又は、同位体で置換されていない培地でステップ（ａ）のように増殖させたものである）と；
（ｃ）ステップ（ａ）において増殖させた生物のバイオマスを非アルカリｐＨで加水分解させてアミノ酸を含む加水分解物を生成するステップと；
（ｄ）請求項１から３までのいずれか一項で得られた自己消化物をステップ（ｃ）で得られたアミノ酸と組み合わせ、哺乳動物又は昆虫の細胞の増殖に必要な更なる成分を加えることによって栄養培地を構成するステップとを含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｄ）において、前記栄養培地は、請求項１から３までのいずれか一項で得られた自己消化物をステップ（ｃ）で得られたアミノ酸及びステップ（ｂ）で得られた脂質と組み合わせ、哺乳動物又は昆虫の細胞の増殖に必要な更なる成分を加えることによって構成される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記栄養培地は少なくとも２つの異なる生物から得られた自己消化産物、脂質及びアミノ酸で構成される、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｃ）における加水分解の前に有機溶媒を使用して脂質及び色素をバイオマスから抽出する、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記脂質が抽出される生物は紅藻類（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、シアニジオフィセア（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、緑藻類（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、藍藻類（Ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ）、珪藻類（Ｄｉａｔｏｍｓ）、褐藻類（Ｐｈａｅｏｐｈｙｃｅａｅ）、渦鞭毛藻類（Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌａｔｅ）、渦鞭毛植物（Ｄｉｎｏｐｈｙｔａ）及びガルジエリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ）からなる群から選択される属に属している、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
アミノ酸を含む加水分解産物を生成する前記生物は、藻類、真菌類、酵母及びメチロトローフ細菌からなる群から選択される生物である、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物はピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、シアニジウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ）、ガルジエリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ）、ポルフィリジウム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）及びメチロバシラス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）からなる群から選択される属に属している、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物又は昆虫の細胞の増殖に必要な更なる成分は、
（ａ）グルコース、果糖及びショ糖の１つ又は複数；
（ｂ）クエン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、シュウ酸及びリンゴ酸からなる群から選択される１つ又は複数のクレブス回路中間体；
（ｃ）ピルビン酸；並びに
（ｄ）チアミン、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンＢ６、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、パントテン酸、コリン、パラアミノ安息香酸及びα−トコフェロールからなる群から選択される１つ又は複数のビタミン
の１つ又は複数を含んでいる、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記栄養培地内での生体分子の合成のために前記哺乳動物又は昆虫の細胞によって使用される基質内の実質的に全ての原子が、１５Ｎ；１３Ｃ；２Ｈ；１５Ｎ及び１３Ｃ；１５Ｎ及び２Ｈ；１３Ｃ及び２Ｈ；又は１５Ｎ、１３Ｃ及び２Ｈから選択される同位体で同位体標識されている、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
その生体分子内の実質的に全ての原子が同位体標識されている生体分子を作製するための方法であって、
（ａ）前記生体分子を産生することができる哺乳動物又は昆虫の細胞を、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法で作製された栄養培地内で、その生体分子の産生を導く条件下で増殖させるステップと、
（ｂ）前記生体分子を回収するステップとを含む方法。
【請求項１４】
前記生体分子は可溶タンパク質又は膜タンパク質である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質を産生することができる哺乳動物又は昆虫の細胞は前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでいる発現ベクターを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質は哺乳動物のタンパク質である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
生体分子に関する構造情報を得るための方法であって、
（ａ）その生体分子内の実質的に全ての原子が請求項１３から１５までのいずれか一項に記載の方法で同位体標識されている生体分子を作製するステップと；
（ｂ）任意選択に、前記生体分子を精製するステップと；
（ｃ）その構造について情報を得るために前記生体分子を分光分析するステップとを含む方法。
【請求項１８】
前記分光分析はＮＭＲ分光法を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記生体分子に関する構造情報は前記生体分子の三次元構造についての情報である、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記生体分子は第２の生体分子と複合しているタンパク質である、請求項１７から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２の生体分子は請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法で生成され、前記第２の生体分子内の水素原子の２０〜１００％は同位体２Ｈで均一に置換されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２の生体分子はタンパク質である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
哺乳動物又は昆虫の細胞から同位体標識生体分子を生成するための、前記生体分子の産生を導く条件下での哺乳動物又は昆虫の細胞の増殖を支える栄養培地であって、
（ａ）無機塩混合物；
（ｂ）アミノ酸源；
（ｃ）炭水化物エネルギー源；
（ｄ）脂質源；
（ｅ）任意選択に、保護剤；
（ｆ）任意選択に、ビタミン類及び／又は有機化合物；
（ｇ）任意選択に、有機酸；並びに
（ｈ）任意選択に、微量元素を含み；
Ｈ、Ｃ又はＮの少なくとも１つについて（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）、並びに任意選択に（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）内の実質的に全ての原子が同位体標識されているか、又は、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）、並びに任意選択に（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）内の水素原子の２０〜１００％が同位体２Ｈで均一に置換されている栄養培地。
【請求項２４】
前記アミノ酸源が酵母バイオマスから生成されたアミノ酸含有加水分解産物を含み、前記バイオマスの加水分解は自己加水分解を含む、請求項２３に記載の栄養培地。
【請求項２５】
脂質源は、脂肪酸、ステロイド及び脂溶性ビタミンを含む、請求項２３又は２４に記載の栄養培地。
【請求項２６】
前記炭水化物エネルギー源はグルコース、果糖及びショ糖の１つ又は複数であり、前記有機酸はピルビン酸、並びにクエン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、シュウ酸及びリンゴ酸からなる群から選択されるクレブス回路中間体の１つ又は複数であり、前記ビタミン類は、チアミン、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンＢ６、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、パントテン酸、コリン、パラアミノ安息香酸及びα−トコフェロールからなる群から選択される１つ又は複数のビタミンである、請求項２３から２５までのいずれか一項に記載の栄養培地。
【請求項２７】
（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）、並びに任意選択に（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）内の実質的に全ての原子が１５Ｎ；１３Ｃ；２Ｈ；１５Ｎ及び１３Ｃ；１５Ｎ及び２Ｈ；１３Ｃ及び２Ｈ；又は１５Ｎ、１３Ｃ及び２Ｈから選択される同位体で同位体標識されている、請求項２３から２６までのいずれか一項に記載の栄養培地。
【請求項２８】
そのタンパク質内の実質的に全ての原子が、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ、１５Ｎ及び１３Ｃ、１５Ｎ及び２Ｈ、１３Ｃ及び２Ｈ又は１５Ｎ、１３Ｃ及び２Ｈから選択される同位体で同位体標識されている、哺乳動物の膜タンパク質。
【請求項２９】
そのタンパク質内の水素原子の２０〜１００％が同位体２Ｈで均一に置換されている哺乳動物の膜タンパク質。
【請求項３０】
前記タンパク質はヒトタンパク質である、請求項２８又は２９に記載の哺乳動物膜タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安定同位体による生体化合物の標識に関する。本発明の方法では、微生物を、安定同位体を含む炭素及び窒素源を含んでいる無機栄養培地で増殖させて、安定同位体で一様に標識されているバイオマスを生成する。バイオマスを有機溶媒で抽出して、脂質を生成する。次に、脱脂されたバイオマスの残りを加水分解して、標識されたアミノ酸及び他の栄養素を生成し、これらを使用して、安定同位体で一様に標識された生体化合物を生成するための好適な宿主細胞用の培地を調製する。安定同位体による均一な標識は、ＮＭＲ分光法による生体化合物の三次元構造の決定を可能にする。生体化合物は、好ましくは哺乳動物の膜貫通タンパク質などの生体高分子である。
【背景技術】
【０００２】
「合理的な薬物設計」の概念は、生体高分子、特にタンパク質の三次元（３Ｄ）構造についての詳細な知識を必要とする。合理的な薬物設計は、ある疾患の病因に関係していることが疑われる特定の生体分子の「活性部位」の三次元構造の決定を含む。生体分子は、例えば受容体、酵素、ホルモン又は他の生物学的活性分子である。一旦生体分子又は少なくともその活性部位の三次元構造が分かると、科学者はコンピュータモデリングを使用して、分子の本来の生物活性を阻止、模倣、又は強化する分子を設計することが可能になる。生体分子の三次元構造についての知識は、したがって、実用上及び商業上非常に重要である。
【０００３】
タンパク質及び他の大きな生体分子の三次元構造の決定に利用できる最初の技術は、Ｘ線回折であった。ヘモグロビン及びＤＮＡの構造は、この技術、Ｘ線回折を使用して決定された最初のものの１つであったが、三次元構造は結晶内の整然とした分子の原子により屈折するＸ線のパターンから計算されるので、調査する分子は結晶の形で利用できることが必要である。それにより、三次元決定のためのＸ線回折の使用は、結晶化することが可能な分子に限られている。結果として、大多数の膜タンパク質に対しＸ線回折を実施することができず、また結晶化は科学よりむしろ経験的な技術であるので、多くの可溶タンパク質の結晶化の試みは失敗した。現在、タンパク質データベースには、Ｘ線結晶学で分析された一体膜領域では１００項目（０．７％）だけしか含まれず（その内１１は単離された単一のαヘリカル膜貫通領域にすぎない）、可溶タンパク質は１３６００の項目があるのと対照的である。構造ジェノミックスのために最近適用された技術及び方策は、Ｅｓｓｅｎ（２００２年、Ｇｅｎｅ  Ｆｕｎｃｔ．Ｄｉｓ．３：３９頁；及びＪａｃｋ、２００２年  ＤＤＴ  ７：３５頁も参照）によって詳述されている。
【０００４】
より最近、他の技術の核磁気共鳴（「ＮＭＲ」）分光法が生体分子、特にタンパク質の三次元構造を決定するために開発された。ＮＭＲ分光法は、分析する分子の結晶化が必要ではなく、したがって原則として、結晶化が困難な膜貫通タンパク質及び他の分子を含む関心の任意の生体分子に適合するはずである。ＮＭＲ分光法の更なる利点は、タンパク質とそのリガンドとの相互作用の動力学の詳細な像を提供することのできる能力である（Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｇ．Ｃ．Ｋ．、（２０００年）ＤＤＴ．５：２３０頁）。
【０００５】
ＮＭＲ分光法は、分析する分子（通常適当な溶媒中の）を強力な磁場に置き、強い無線信号で照射する。様々な原子の核は磁場により整列し、ついにはラジオシグナルによってエネルギーが付与される。次にそれらはこのエネルギーを吸収して、ｉ）核の種類及びｉｉ）主に核の結合で決定する化学的環境によって決まる周波数でそれを再放射（共鳴）する。更に、共鳴は結合を通して、又は三次元空間を通して、ある核から他の核に伝えられ、したがってその近くの特定の核の環境に関する情報を提供する。
【０００６】
しかし、全ての核がＮＭＲ活性であるというわけではなく、特に、同じ元素の全ての同位体が活性であるというわけではない。高分子ＮＭＲのために最も一般に使用される安定同位体は、１３Ｃ、１５Ｎ及び２Ｈである。３１Ｐ、１９Ｆ及び１Ｈなどの、天然のＮＭＲ活性の核もある。タンパク質などのより大きな分子のためには、ＮＭＲスペクトルの十分に強いシグナルには、ＮＭＲ活性安定同位体による濃縮が必要である。使用されるＮＭＲプローブに従い、例えば「普通の」水素、１Ｈ、はＮＭＲ活性であるのに対し、重水素（ジューテリウム）、即ち２Ｈはそうでない。したがって、任意の水素含有分子は、全ての１Ｈ水素原子を２Ｈで置換することによって、水素ＮＭＲスペクトルで「不可視」にすることが可能である。この理由のために、水溶性物質のＮＭＲスペクトルは、水のシグナルを避けるために２Ｈ２Ｏ（重水）溶液内で決定される。逆に、「普通の」炭素、１２ＣはＮＭＲ不活性であるが、安定同位体の１３Ｃ（自然界では全炭素の約１％）は活性である。同様に、「普通の」窒素、１４ＮはＮＭＲ不活性であるが、安定同位体１５Ｎ（自然界では全窒素の約１％）は活性である。したがって、生体分子ＮＭＲのために最も一般に使用される安定同位体は、１３Ｃ、１５Ｎ及び２Ｈである。
【０００７】
小分子、即ち約１０００ダルトン未満の分子量を有する分子では、ＮＭＲ活性同位体の自然界での低い濃度は、ＮＭＲスペクトルで必要なシグナルを生成するのに十分であることがわかった。しかし、タンパク質などのより大きな分子のためには、ＮＭＲスペクトルの十分に強いシグナルには、ＮＭＲ活性安定同位体による濃縮が必要である。同位体濃縮は、感度及び分解能の増加、及びＮＭＲスペクトルの複雑性の低下をもたらす。同位体濃縮は、異核多次元的ＮＭＲ実験の効率的利用を可能にし、スペクトルの帰属過程、更にスピン−スピンカップリングの構造上の制約に対する代替手法を提供した。
【０００８】
同位体濃縮又は生体分子における置換を達成する方法は、これらの同位体で標識された増殖培地でタンパク質を産生することができる微生物を増殖させることであった。このために、選択された特定のタンパク質、例えば医学上重要な哺乳動物のタンパク質を産生するように遺伝子操作によって形質転換された細菌又は酵母を、１３Ｃ及び／又は１５Ｎで標識された基質を含んでいる培地で増殖させた。実際には、これらの培地は、通常、１３Ｃで標識されたグルコース及び／又は１５Ｎで標識されたアンモニウム塩からなる（例えばＫａｙら、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：４１１頁、及びその中の参照文献を参照）。国際公開９０／１５５２５は、増殖及びタンパク質産生を改善するための、標識されたタンパク質加水分解産物を含んでいる細菌及び酵母の栄養培地を開示している。
【０００９】
しかし、この方法は、定義上哺乳動物、好ましくはヒトが起源である合理的なヒト用薬物設計における大部分の関心タンパク質にとって、満足できるものではない。細菌又は酵母などの微生物で発現される多くの哺乳動物タンパク質は、生来のタンパク質と同一であるか、そうでなくとも似ている形態では産生されない。このことは特に、かなりの翻訳後修飾、例えば適当な折畳み、ジスルフィド架橋を通しての分子間及び分子内の鎖の架橋、グリコシル化、アシル化、リン酸化及び他の化学修飾、並びに活性型へのタンパク質分解などを受ける、哺乳動物の膜タンパク質及び分泌タンパク質において事実である。これらの修飾の多くは、細菌及び酵母の宿主細胞によって確実に実行されるとは限らない。結果として、細菌又は酵母によって産生されたタンパク質は関連する生来の構造を有せず、似てもいないので、構造機能研究のために使用することはできない。しばしば、それらのタンパク質は生来のタンパク質の生物活性を有さず、場合によっては、哺乳動物のタンパク質を細菌で産生することは全く不可能である。これらの理由のために、哺乳動物細胞及び昆虫細胞の両方を利用する宿主−ベクター系が開発された。哺乳動物細胞系、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、コス細胞及び昆虫細胞系、例えばＳｐａｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞系Ｓｆ９及びＳｆ２１（Ｌｕｃｋｏｗ及びＳｕｍｍｅｒｓ、１９８８年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：４７〜５５頁）は、天然のタンパク質のそれらと類似の翻訳後修飾で、組換え哺乳動物タンパク質を産生することが分かった。
【００１０】
しかし、タンパク質を１３Ｃ又は１５Ｎなどの安定同位体で標識するために哺乳動物又は昆虫の細胞を使用する際の問題点は、細菌が単純無機栄養培地で増殖が可能であるのに対して、哺乳動物及び昆虫の細胞は、少なくともアミノ酸を含む栄養素の複雑な混合物を必要とすることである。この問題は、当技術分野では、標識アミノ酸の供与源としてタンパク質含有の標識バイオマスの加水分解産物を使用することにより対処された。好ましくは、標識バイオマスの作製のためには、単純な（したがって、安い）標識炭素源及び窒素源、例えば１５ＮＨ３、１５ＮＯ３−、１５ＮＯ２−、Ｈ１３ＣＯ３−、１５Ｎ２、１３ＣＯ２、又は２Ｈ２Ｏだけで増殖し、それにより光合成を通して標識原子をタンパク質、炭水化物、脂質及び核酸などの複雑な生体分子に取り込むことが可能な緑藻類又は藍藻類などの微生物が使用される。哺乳動物細胞における組換えタンパク質の均一な同位体標識のための実際の方法は、Ｈａｎｓｅｎら（１９９２年、Ｂｉｏｃｈｅｍ、３１；１２７１３頁）によって記載されている。これらの著者は、ＮＭＲ構造研究のために哺乳動物細胞から同位体標識されたタンパク質を生成するための、同位体標識された藻類及び細菌のタンパク質の加水分解を開示している。加水分解をトリプタミン及びイミダゾールの存在下でメタンスルホン酸により実施し、その後、アミノ酸をイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。しかし、使用した加水分解の条件は、アスパラギン、グルタミン及びシステイン残基を破壊し、わずかなトリプトファンを残す。したがって、哺乳動物の培地は市販のシステイン、及び酵素処理で合成され、Ｎ及びＣ原子だけが標識されたグルタミンを補う必要があった。培地は、更に５％の熱処理血清を補充し、したがって、タンパク合成のために使用される非標識の物質を含んでいた。
【００１１】
国際公開９４／１８３３９は、哺乳動物及び昆虫の細胞で発現される標識タンパク質のための栄養培地を開示している。この栄養培地は、緑藻類クロレラの加水分解されたバイオマスから精製した標識アミノ酸からなり、また、標識された合成アミノ酸のシステイン、グルタミン及びアスパラギン、並びに標識されたグルコース及びピルビン酸で補充された。哺乳動物又は昆虫の細胞において同位体標識のタンパク質及び高分子、例えば糖タンパク質を産生するための類似の技術は、例えば米国特許第５３９３６６９号及び第５６２７０４４号、Ｗｅｌｌｅｒ（１９９６年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３５：８８１５〜２３頁）及びＬｕｓｔｂａｄｅｒ（１９９６年、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ  ７；２９５〜３０４頁）で記載されている。
【００１２】
国際公開９９／１１５８９は、アミノ酸の側鎖ではなく骨格構造が同位体標識されているタンパク質を標識する方法を開示する。このようなタンパク質は、二重に保護されたグリシン誘導アミノ酸から化学的に合成された骨格標識アミノ酸からなる、細胞培養培地で産生される。
【００１３】
昆虫又は哺乳動物の細胞で標識タンパク質を産生するための栄養培地を提供するために、当技術分野ではこれまで主に加水分解されたバイオマスから同位体標識されたアミノ酸を得ることに集中してきた。グルコース又はピルビン酸などの他の栄養素と同様に加水分解産物中に十分な量が存在しなかったアミノ酸は、単に市販製品を入手して培地に補った。哺乳動物の（膜貫通）タンパク質に関するＮＭＲ構造研究の必要性が長い間当技術分野であったにもかかわらず、また、そのような栄養培地は１９９４年以降開示されてきたにもかかわらず、これらの培地で増殖した哺乳動物又は昆虫の細胞から産生された同位体標識タンパク質に関するＮＭＲ構造研究の報告は皆無である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって本発明の目的は、ＮＭＲ分析のための同位体標識タンパク質の生成のために、昆虫又は哺乳動物の細胞を増殖させる培地を改良することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
第１の態様において、本発明は、培養中の哺乳動物又は昆虫の細胞を増殖させるための栄養培地を作製する方法に関するものである。栄養培地において、Ｈ、Ｃ又はＮの少なくとも１つについて、生体分子の合成のために細胞によって使用される基質内の実質的に全ての原子が同位体標識されている。好ましくは、本方法は、（ａ）Ｈ、Ｃ又はＮの少なくとも１つについて、実質的に全ての同化性原子が同位体標識された、生物の増殖を支える無機栄養培地でその生物を増殖させ、標識バイオマスを生成するステップと；（ｂ）ステップ（ａ）において増殖させた生物のバイオマスを自己消化させて自己消化物を生成するステップと；（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた自己消化物を哺乳動物又は昆虫の細胞の増殖に必要な更なる構成要素と組み合わせることによって栄養培地を構成するステップとを含む。前記生物は、好ましくは真菌、酵母又は藻類である。好ましい酵母としては、パン酵母、メチロトローフ酵母があり、好ましい藻類としては紅藻類がある。好ましくは、前記生物はサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ブレタノミセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、トルロプシス（Ｔｏｌｒｕｌｏｐｓｉｓ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ガルジエリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ）、シアニジウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ）、ポルフィリジウム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）、シストクロニウム（Ｃｙｓｔｏｃｌｏｎｉｕｍ）、オードウイネラ（Ａｕｄｏｕｉｎｅｌｌａ）、シアニジオシゾン（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ）から選択される属の生物である。
【００１６】
本明細書では、自己消化物は、自己消化的に可溶化された細胞構成要素、例えばアミノ酸、ポリペプチド、核酸、タンパク質、グリコーゲン、糖、ビタミンＢ群、有機酸、脂質及び他の構成要素を含んでいる組成物であると理解されている。生物の自己消化は、通常、原形質分離剤、例えばＮａＣｌ、エタノール、酢酸エチル、クロロホルム又はデキストロースの存在下で、高温（３０〜５０℃）で長時間（３〜１８時間）生物の細胞をインキュベートすることを含む。インキュベーションの間、細胞構成要素は細胞内因性の加水分解酵素によって加水分解され、細胞壁は破壊されて崩壊し、タンパク質成分は水環境中に放出される。不溶解性の細胞断片は遠心分離及び／又は濾過によって除去され、上述の可溶性構成要素を含んでいる自己消化物が得られる。通常必要ではないけれども、本発明における自己消化物は外来性の加水分解酵素の使用を排除しない。
【００１７】
好ましくは、本方法は更に、（ａ）生物の増殖を支える無機栄養培地でその生物を増殖させ、Ｈ、Ｃ又はＮの少なくとも１つについて、培地内で実質的に全ての同化性原子を同位体標識して標識バイオマスを生成するステップと；（ｂ）有機溶媒で生物のバイオマスを抽出して脂質を含んでいる抽出物を生成するステップ（前記生物はステップ（ａ）のように増殖させたものであるか、又は、同位体で置換されていない培地でステップ（ａ）のように増殖させたものである）と；（ｃ）ステップ（ａ）のように増殖させた生物のバイオマスを非アルカリｐＨで加水分解させてアミノ酸を含む加水分解物を生成するステップと；（ｄ）上で得られた自己消化物をステップ（ｂ）で得られた脂質及び／又はステップ（ｃ）で得られたアミノ酸と組み合わせ、哺乳動物又は昆虫の細胞の増殖に必要な更なる構成要素を加えることによって栄養培地を構成するステップとを含む。好ましくは、栄養培地は、培地内で哺乳動物又は昆虫の細胞によってタンパク質を産生するのに適する培地である。好ましくは、哺乳動物又は昆虫の細胞でタンパク質を産生するために必要な更なる構成要素が、栄養培地に加えられる。好ましくは、Ｈ、Ｃ又はＮの少なくとも１つについて、前記更なる構成要素内の実質的に全ての同化性原子を同位体標識する。非アルカリｐＨは、好ましくはｐＨ約８．０以下である。
【００１８】
本明細書で使用されるように、分子が「実質的に標識される」、又は、分子内又は組成物内の特定の元素の「実質的に全ての」原子が「同位体標識される」若しくは「所定の同位体形態である」という用語は、その分子又はその分子を含んでいる組成物は、意味があるＮＭＲスペクトル情報が得られるように所望の同位体が十分に濃縮されることを意味する。１３Ｃ及び１５ＮなどのＮＭＲ活性同位体の場合、濃縮の程度は、三次元構造情報がＮＭＲスペクトルから導かれる程度である。一般に、本発明との関連で、このことはある元素の原子の約９５％以上が所望の同位体形態であることを意味し、好ましくは約９８、９９、９９．５、又は９９．９％以上である。２Ｈ単独による濃縮の場合、濃縮の程度は、標識分子が、それと複合体化しているか又はＮＭＲで分析する試料中に存在しているＮＭＲ活性種の分析を妨害するのに十分な量のＮＭＲシグナルを生じない程度である。この場合、濃縮のレベルは好ましくは約７０％、より好ましくは約８０、９０、９５又は９８％を超える。或いは、２Ｈ濃縮のレベルは、ＮＭＲ活性核、１Ｈ、１３Ｃ及び１５Ｎからのシグナルが強化されるか又はより良く分解されるようなレベルである。一般に、この濃縮レベルは、約２０％から約４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００％の範囲である。本発明との関連で用語「同位体標識の」又は「所定の同位体形態の」は、通常、ＮＭＲスペクトルを得る際に有用な同位体を指すことは、当業者には理解されよう。しかし、本発明は必ずしもそれに限定されるものではなく、例えば非安定放射性同位体などの他の同位体にも関係する。
【００１９】
本発明において、分子は通常一様に標識されているが、このことは、ある分子内の特定の元素の実質的に全ての原子が特定された程度に同位体標識されるか、又は所定の同位体形態であることを意味する。或いは、本発明において、分子は特異的に標識することができるが、このことは、分子内の１つ又は複数の特異的な位置にある特定の元素の実質的に全ての原子だけが同位体標識されるか、又は所定の同位体形態であることを意味する。特異的に標識されたアミノ酸及びそれからなるタンパク質の例は、アミノ酸側鎖ではなく骨格構造が同位体標識されているタンパク質を生成するために使用される化学合成アミノ酸を開示している、国際公開９９／１１５８９で提供されている。
【００２０】
哺乳動物又は昆虫の細胞によって合成される生体分子は、そのような細胞によって合成される任意の分子でよく、例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ポリデオキシヌクレオチド及びポリリボヌクレオチドなどの核酸、炭水化物、脂質、それらの代謝産物及び組み合わせでよい。生体分子は哺乳動物又は昆虫の細胞によって自然に合成される分子でよく、又は、遺伝子操作の結果としてそれらの細胞によって合成される分子でもよい。後者の場合、分子は通常ポリペプチド又は核酸となるが、遺伝子操作の結果、例えば特定の酵素活性をコードする１つ又は複数の遺伝子を導入することによって生成する代謝産物も含まれる。
【００２１】
同位体標識バイオマスの作製
本発明の方法のステップ（ａ）で増殖させる生物は、好ましくは無機培地又は合成培地で増殖させる。同位体標識する元素（Ｃ、Ｎ及び／又はＨ）に従い、培地は好ましくは当の同位体で一様に標識されている唯一の炭素源及び／又は窒素源を含み、より好ましくは前記唯一の炭素源及び／又は窒素源内の実質的に全ての原子は同位体標識されている。炭素及び／又は窒素を含有する様々な化合物、例えばグルコース及び他の糖類、小有機酸、尿素などをこのために使用することができる。しかし、好ましくは、無機基質ＣＯ２、Ｎ２、ＮＨ３、ＮＯ３−、ＮＯ２−、ＨＣＯ３−、又はメタノール、メタン、メチルアミン、ホルムアルデヒド及びギ酸などの有機Ｃ１−化合物を含む単一の炭素原子又は窒素原子だけを含む炭素源及び／又は窒素源が使用される。
【００２２】
結果として、ステップ（ａ）で増殖させた生物は、好ましくは光合成、化学合成無機栄養、又はメチロトローフの生物である。生物はしたがって、好ましくは微生物であるが、植物は排除されない。植物はｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養などで植物細胞として培養することができ、この場合にはそれらは標識二酸化炭素を含んでいる限定空間で、無機栄養培地が供給される基質上で増殖させることができる。生物は、好ましくは独立栄養的に増殖させる。増殖させる場合、好ましくは、生物は、好ましくは一般に当技術分野で公知なように適宜ｐＨ、温度、光及び酸素、並びに二酸化炭素、炭素／窒素源及び他の栄養素の供給を調節した撹拌発酵槽内で液内培養により増殖させる。
【００２３】
本方法のステップ（ａ）で増殖させる適当な生物としては、シアノバクテリア（藍藻類）及び他の光合成細菌、例えば、嫌気的紅色硫黄細菌及び非硫黄細菌、窒素固定細菌、真核の藻類、例えば緑藻類、紅藻類、褐藻類、珪藻類及び他の黄金色藻類、並びに渦鞭毛藻類、地中植物、及びミドリムシ類、メチロトローフ細菌、及び酵母を含む真菌類がある。好ましい生物としては以下がある：多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、脂溶性ビタミン及びステロールを含む脂質の供給源としては、Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ（紅藻類）、Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ（ほとんどの場合紅藻類に属すと言われる）、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ（緑藻類）、Ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ（藍藻類）、Ｄｉａｔｏｍｓ（珪藻類）、Ｐｈａｅｏｐｈｙｃｅａｅ（褐藻類）及びＤｉｎｏｆｌａｇｅｌａｔｅ（渦鞭毛藻類）；タンパク質（更にアミノ酸生成のため）の供与源としてのメチロトローフ細菌；タンパク質（更にアミノ酸生成のため）及びビタミンの供与源としてメチロトローフ酵母；グルコース、ショ糖、果糖などの炭水化物及びビタミンの供与源としてのＣｙａｎｏｐｈｙｔａ（藍藻類）；培地に放出されるグリセリン及び有機酸の供与源としてのＣｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ（緑藻類）、Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌａｔｅ（渦鞭毛藻類）；暗条件で培地に排出される有機酸の供与源としてのＣｈｌｏｒｏｂｉａｃｅａｅ（緑色硫黄）及びＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ（紅色非硫黄）細菌。
【００２４】
以下に示す例は、本発明の方法での使用が好まれるこれらの生物の綱に属する適当な属である。
【００２５】
Ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ（藍藻類；Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）：Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｃｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ又はＭｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ。Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ（緑藻類）：Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ。Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ（紅藻類）：Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ、Ｃｙｓｔｏｃｌｏｎｉｕｍ又はＡｕｄｏｕｉｎｅｌｌａ。Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ（好熱性のＲｈｏｄｏｐｈｙｃｅａｅ）；Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ、Ｇａｌｄｉｅｒａ、Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ。Ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ（褐藻類）；Ｅｃｔｏｃａｒｐｕｓ又はＳｔｒｅｂｌｏｎｅｍａ。ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔｏｐｈｙｔａ（ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔ  ｃｈｒｏｍｏｐｈｙｔｅｓ）、ｐｒｙｍｎｅｓｉｏｐｈｙｔａ（ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ）、ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ（ｄｉａｔｏｍｓ（珪藻類））、ｃｈｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ、ｄｉｎｏｐｈｙｔａ（ｐｙｒｒｈｏｐｈｙｔａ、ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌｅｔｅｓ（渦鞭毛藻類））、ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｔｅ（ミドリムシ類）、ｃｉｌｉａｔｅｓ（繊毛虫）及び絶対従属栄養鞭毛虫の群の藻類。Ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔｏｐｈｙｔａ：Ｒｈｉｎｏｍｏｎａｓ、Ｓｙｎｃｒｉｐｔａ又はＨｅｔｅｒｏｃｃｕｓ。Ｐｒｙｍｎｅｓｉｏｐｈｙｔａ（ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ）；Ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ、Ｐｈａｅｏｃｙｓｔｉｓ、Ｐｒｙｍｎｅｓｉｕｍ又はＥｍｉｌｉａｎｉａ。Ｂａｃｉｌａａｒｉｏｐｈｙｔａ門Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ綱（珪藻類）を含むＣｈｒｙｓｏｐｈｙｔａ群：Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ、Ｎａｖｉｃｕｌａ、Ｎｉｔｚｃｈｉａ、Ａｍｐｈｏｒａ，Ｃｅｎｔｒｏｎｅｌｌａ、Ｅｕｃａｍｐｉａ、Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ、Ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔａ門Ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｃｅａｅ綱（黄金色藻類）、Ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ門Ｈａｐｔｏｐｈｙｃｅａｅ綱。Ｃｈｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ：Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ又はＲｈｏｄｏｍｏｎａｓ。Ｄｉｎｏｐｈｙｔａ：Ｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ、Ｏｘｙｒｒｈｉｓ又はＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ。Ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｔａ：Ｅｕｇｌｅｎａ（ミドリムシ）又はＡｓｔａｓｉａ。Ｃｉｌｉａｔｅｓ（繊毛虫）：Ｍｅｔｏｐｕｓ、Ｃｙｃｌｉｄｉｕｍ。光合成細菌（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｅａｅ）は、紅色細菌（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｉｎｅａｅ）及び緑色細菌（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｉｎｅａｅ）の２亜目に分けられる。緑色硫黄細菌（Ｃｈｌｏｒｏｂｉａｃｅａｅ）：Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ又はＰｅｌｏｄｉｃｔｙｏｎ。緑色非硫黄細菌（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘａｃｅａｅ）：Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ。紅色硫黄細菌（Ｃｈｒｏｍａｔｉａｃｅａｅ）：Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ａｍｏｅｂｏｂａｃｔｅｒ又はＴｈｉｏｄｉｃｔｙｏｎ。紅色非硫黄細菌（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）：Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｐｈｉｌａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ又はＲｈｏｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ。Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉａ（Ｈｅｌｉｏｂ���ｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）：Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ又はＨｅｌｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ。好気的光合成細菌：Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ。メチロトローフ微生物は以下を含む：絶対メチロトローフ細菌：Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ又はＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、条件的メチロトローフ細菌：Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ：並びに酵母一般、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ（例えば標識グルコース又はエタノール上で増殖する）、好ましくはメチロトローフ酵母：Ｐｉｃｈｉａ又はＨａｎｓｅｎｕｌａ。化学合成無機栄養細菌：Ｒａｌｓｔｏｎｉａ又はＮｏｃａｒｄｉａ。
【００２６】
標識バイオマスを生成する方法は当技術分野で公知であり、このことは、標識炭水化物及び塩の存在下での細菌の増殖に関する刊行物（Ｋａｙら、上記）、藻類の溶解物中での細菌の増殖に関する刊行物（Ｃｈｕｂｂ、Ｒ．Ｔ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０、７７１８頁（１９９１年）、藻類の溶解物中での酵母の増殖に関する刊行物（Ｐｏｗｅｒｓ、Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１、４３３４頁（１９９２年）、標識メタノール中での細菌及び酵母の増殖に関する刊行物（Ｍｏａｔ、Ａ．Ｇ．及びＦｏｓｔｅｒ、Ｊ．Ｗ．、微生物の生理学（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（１９８８年）、２１８頁を参照）、及び同位体標識ＣＯ２及び／又はＮ塩の存在下での藻類の光合成培養に関する刊行物（Ｃｏｘ、Ｊ．ら、小児栄養及び代謝研究における安定同位体（Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ  ｉｎ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、Ｃｈａｐｍａｎ、Ｔ．Ｅ．ら編、Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ社、Ａｕｄｏｖｅｒ  Ｈｏｕｓｅ、イングランド（１９９０年）、１６１５頁）から明らかである。
【００２７】
脂質の抽出
本発明の方法のステップ（ｂ）において、ステップ（ａ）で得られたバイオマスは有機溶媒で抽出されて脂質を含んでいる抽出物が生成される。この脂質抽出物は、（三、二及び／又は一）グリセリド、ステロール、リン脂質、スフィンゴ脂質、脂溶性ビタミン及び／又は遊離脂肪酸を含んでもよい。脂質、脂肪酸、その他は、本明細書ではＣｈｒｉｓｔｉｅ（２００３年：「脂質分析（Ｌｉｐｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）」３版、Ｔｈｅ  Ｏｉｌｙ  Ｐｒｅｓｓ）を参考にして、脂肪酸及びその誘導体、並びにこれらの化合物と生合成的に又は機能的に関連する物質と定義される。本発明との関連で、用語脂質は、クロロホルム、ベンゼン、エーテル及びアルコール類などの有機溶媒への易溶性を共通して有する一群の天然化合物と定義され、その例としては脂肪酸及びそれらの誘導体、ステロイド、カロチノイド、テルペン、胆汁酸及び脂溶性ビタミンなどの多様な化合物が含まれる。
【００２８】
抽出の前に、バイオマスは当技術分野で公知の手段、例えば遠心分離又は何らかの形式の濾過によって培地から回収してもよい。任意選択に、バイオマスはその後、例えば水又は所定の浸透強度の緩衝剤及び／若しくは水溶液を使用して洗浄することができる。抽出の前に、バイオマスは、例えば噴霧乾燥又は凍結乾燥を使用して乾燥してもよい。乾燥バイオマスは、便利にも抽出の前まで保存することができる。バイオマスが除去された使用済み培地は、有用な標識化合物、例えばアミノ酸、分泌タンパク質及び炭水化物を含んでいる可能性がある。使用済み培地は、したがって、好ましくは噴霧乾燥又は凍結乾燥法によって乾燥する。乾燥残留物は、その後下記のように、バイオマスのために抽出及び／又は加水分解してもよい。或いは、バイオマス及び培地は分離されない。そのような例においては、バイオマス及び培地は、好ましくは下記のように濃縮及び／又は貯蔵、また以降の抽出及び／又は加水分解のために一緒に凍結乾燥される。
【００２９】
好ましい抽出法において、バイオマス内の細胞は、当技術分野で公知の任意の適当な技術によって粉砕される。これらの技術には例えば音波破砕が含まれるが、より好ましくは、機械的作用、例えばバイオマスの粉砕又は磨砕が使用される。或いは、バイオマス内の細胞は、それらの細胞壁を例えば酵素処理によって弱めるために処理することもできる。粉砕は抽出の前に行ってもよいが、より好ましくは、抽出の間に溶媒媒体内で適用される。これにより、抽出効率が高められる。バイオマス内の細胞を崩壊させるために各種の公知の抽出器具、又はむしろ粉砕器具を使用することが可能であり、例としては湿式法微粉砕機械、例えばボールミル、摩擦ディスクミル、ヘンシェル（Ｈｅｎｓｈｅｌ）ミキサー、フレンチプレスなどがある。好ましくは、バイオマス内の細胞は、粉砕器具内の圧縮性又は摩擦性の機械的な力によって少なくとも部分的に破壊又は分解される。しかし、細胞は、粒子が細かくなりすぎて溶媒混合物から容易に分離することができなくなるほど過剰に崩壊させるべきではないことに注意する。
【００３０】
いかなる抽出法の基本は、バイオマスを適当な抽出培地と暫くの間接触させ、その後、バイオマス及び抽出培地の混合物を、（１）混合物の未溶解の構成要素（即ち抽出されたバイオマス）、及び（２）溶解抽出物（即ち、バイオマスから抽出された溶存成分を含む抽出培地）に分離することである。理想的な抽出条件下では、固形物は、溶媒に速やかに溶け、短時間で完全に溶けるはずである。しかし、物質の複雑な混合物を扱う場合はこのことが決まって起こるとは限らず、ましてや膜結合してタンパク質複合体と結合した藻類細胞内の物質は言うまでもない。より効率的な抽出のために、バイオマス及び抽出培地は、上述した機械的手段を含む何らかの方式の振盪、撹拌、混合又は均質化によって混合される。混合物の分離は当技術分野で一般に知られている、沈降、遠心分離及び濾過を含む様々な手段で実施してもよい。抽出され、分離されたバイオマスは、その後再び同じか異なる抽出培地で抽出してもよい。様々な溶解抽出物を混合して、抽出成分は当技術分野で公知の様々な手段、例えば抽出培地の溶媒の蒸留又は（フラッシュ）蒸発によって溶解抽出物から回収することができる。
【００３１】
バイオマスからの脂質の抽出のための適当な溶媒は低級脂肪族アルコール又は低級脂肪族炭化水素であり、低級脂肪族とはＣ１〜Ｃ８を意味する。しかし、原則として、アセトン、ハロゲン化低級脂肪族アルコール又は炭化水素、並びに低級脂肪族エーテルなど他のいかなる有機溶媒も等しく適用することができる。同様に、有機溶媒の混合物も適用することができる。適当な方法は、通常、不飽和脂質の酸化を阻止する条件下、例えば抽出を減圧下又は窒素、アルゴンその他などの不活性ガスの下で実施することにより、適当な溶媒を使用することを含む。アルコール類は、アセトンよりも抽出のための溶媒として好まれる。しかし、アルコール類はクロロフィルのアロマーの形成を促進することが知られ、またクロロフィルは商品価値を有するため、クロロフィル含有バイオマス（例えば緑藻バイオマス）は、好ましくはアセトンを溶媒として抽出される。
【００３２】
重要ではないが、本発明で使用される溶媒の量は、乾燥重量換算でバイオマス１部に対して約２から７重量部、好ましくは約３から６重量部の範囲にあるのがよい。抽出の間、水が溶媒と共に存在することが好ましい。溶媒と共に使用される水量は、無水物換算で溶媒１重量部に対して約０．２から０．７重量部、好ましくは０．３から０．６重量部の範囲にあるのがよい。バイオマスが完全に乾燥している場合はそのような水量は計算された重量で別に供給することができるが、培地の除去のための遠心分離又は濾過によって得られるようなバイオマス体の湿った塊が使用される場合のように、バイオマスが水を含む場合は、別個に加える水の量を減少させる必要がある。微生物の水性懸濁液を抽出する場合は、使用される水性懸濁液の量と使用される抽出用溶媒の量との間の比率自体は重要でない。１：１から１：１００の重量比が通常使用される。１：２から１：５０の比率が普通使用され、最後に、好ましくは１：５から１：２０の作用比率が使用される。
【００３３】
バイオマス（微生物）から脂質を抽出するためのいくつかの方法は、当技術分野で公知である。従来の技術の１つは、例えばクロロホルム及びメタノールの溶媒混合物中でバイオマスを均質にすることを含む。バイオマスから脂質を抽出するための他の適当な方法は、この目的のために本明細書で参照により組み込まれている米国特許第４８５７３２９号で記載されている。この特許は、先ず熱いアルコール溶媒が存在するか存在しない条件下で細胞を磨砕し、次に、アルコール処理した磨砕細胞を好ましくは超臨界状態の溶媒、又は超臨界状態の溶媒と低級脂肪族アルコール若しくは低級脂肪族炭化水素との混合物で抽出することによる、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ属の真菌の細胞からの脂質の抽出を記載している。低級脂肪族アルコールは、好ましくは約４０℃から約１２０℃の沸点を有すものである（例えばエタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール及びイソブタノール）。好ましい低級脂肪族炭化水素としては、ブタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン及びシクロヘキサンがある。好ましい処理条件としては、約３５℃から９０℃の温度、及び約２００から６００ｋｇ／ｃｍ２の圧力が含まれる。他の適当な方法は、この目的のために本明細書で参照により組み込まれている米国特許第４８７００１１号で開示されている。この方法は、２ステップからなる機械的な崩壊を含み、第１はアルコール／水混合液を用いて極性脂質が豊富な分画を提供し、次に、炭化水素溶媒、例えばヘキサンを用いて極性脂質が乏しい分画を提供する。特に好ましい溶媒システムは、ヘキサンとイソプロパノールとの体積比が約３から２の混合物である。脂質及び脂肪酸の抽出のための好ましい抽出法では、クロロホルム及びメタノールの混合物を使用する。好ましくは、クロロホルムは毒性のより低いジクロロメタンで置換され、後者は蒸発によって除去することがより簡単である。
【００３４】
脂質は、酸化、光、熱、酸及びアルカリに感受性が高いことがある。したがって抽出の間、脂質は、例えば酸化又は異性化反応のために望ましくない構造変化を経る可能性がある。当業者は、抽出過程の間のそのような望ましくない変化を減らすために必要な予防措置をとる方法を知っているであろう。
【００３５】
脂質は通常、細胞内で見られる水不溶性有機物であり、非極性溶媒によって抽出することができる。脂質の主要なクラス及びサブクラスはいくつかあるが、そのほとんどはその脂肪酸構成要素の構造に従い異なる分子種で見られ、また、それぞれは好ましい抽出法を有する。アシルグリセロール（中性脂肪又はグリセリドとも称される）は、好ましくはエーテル、クロロホルム、ベンゼン又はエタノールで抽出される。ホスホグリセリド類（例えばＰＥＡ＝ケファリン、ＰＣ＝レシチン）は、好ましくはクロロホルム／メタノールの混合物で抽出される。ステロイド、特にステロールは、好ましくはクロロホルム、エーテル、ベンゼン又は熱アルコールで抽出される。カロチノイドを含むテルペン類（細胞のマイナーな脂質構成要素）は、好ましくは水溶性溶媒、例えばアセトン、メタノール又はエタノールを使用して抽出される。脂溶性ビタミンエキスは、通常有機溶媒で抽出することができる。スフィンゴ脂質（セレブロシド）、糖脂質（グリコシルジアシルグリセロール、セレブロシド、ガングリオシド）、プロスタグランジン及びコレステロールは、Ｃｈｒｉｓｔｉｅ（上記）が記載しているように抽出することができる。
【００３６】
クロロフィル及びカロチノイドなどの色素は、好ましくは水溶性有機溶媒（上記参照）を使用して抽出される。
【００３７】
脂質抽出物の生成のための生物は、好ましくは高い脂質含量及び／又はその特有の脂質組成に基づいて選択される。Ｎａｇａｓｈｉｍａは、様々な藻類綱における主要な脂肪酸の分布をレビューしている（１９９４年：「進化経路及びＥｎｉｇｍａｔｉｃ藻類：Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍ（紅藻類）及び関連した細胞（Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  ａｎｄ  Ｅｎｉｇｍａｔｉｃ  ａｌｇａｅ：Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍ  （Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃｅｌｌｓ）」、Ｊ．Ｓｅｃｋｂａｃｈ編、Ｋｌｕｗｅｒ  ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、２０１〜２１４頁）。大部分の藻類は、Ｃ１６及びＣ１８系列の脂肪酸、並びにＣ１８不飽和脂肪酸の供与源の役目を果たす。Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ、Ｃｈｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ、Ｃｈｒｏｍｏｐｈｙｔａ及びＨａｐｔｏｐｈｙｔａは、Ｃ２０：４及びＣ２０：５の供与源の役目を果たすことができる。
【００３８】
不飽和脂肪酸の分布パターンは、個々の藻類綱内で異なる。Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ（緑藻類）は、Ｃ１６：３（ｎ−３）、Ｃ１６：４（ｎ−３）の好ましい供与源であり、Ｒｈｏｄｏｐｈｙｃｅａｅ（紅藻類）はＣ２０：４（ｎ−６）、Ｃ２０：５（ｎ−３）の好ましい供与源であり、Ｐｈａｅｏｐｈｙｃｅａｅ（褐藻類）はＣ１８：３（ｎ−３）、Ｃ１８：４（ｎ−３）、Ｃ２０：４（ｎ−６）、Ｃ２０：５（ｎ−３）の好ましい供与源である（Ｔａｋａｇｉら、（１９８５年）Ｙｕｋａｇａｋｕ、３４、１００８〜１０１２頁、また、Ｂａｎａｉｇｓら（１９８４年、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：２９５１〜２９５２頁も参照）。
【００３９】
一般に紅藻類（例えばＣｙｓｔｏｃｌｏｎｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）は、長鎖多価不飽和脂肪酸（即ちＣ１８以上の長さ）及びそれらの誘導体の好ましい供与源である（Ｈｏｐｐｅ、Ｈ．Ａ．、Ｌｅｖｒｉｎｇ、Ｔ．、Ｔａｎａｋａ、Ｙ．編、薬学における海藻（Ｍａｒｉｎｅ  Ａｌｇａｅ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）。Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ、ベルリン、４３７〜５２３頁のＰｏｈｌ及びＺｕｒｈｅｉｄｅ、（１９７９年））。Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ種、例えばＰ．ａｅｒｒｕｇｅｎｉｕｍ（淡水）及びＰ．ｒｕｅｎｔｕｍ（塩水）は、アラキドン酸Ｃ２０：４（ｎ−６）（全脂肪酸の３６％）の好ましい供与源である（Ａｒａｄ、１９８６年、Ｉｎｔ．Ｉｎｄｕｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：２８１〜２８３頁；「作動中の生体塩：塩水による生体生産（Ｂｉｏｓａｌｉｎｉｔｙ  ｉｎ  Ａｃｔｉｏｎ：  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓａｌｉｎｅ  ｗａｔｅｒ）」、Ｐａｓｔｅｒｎａｋ、Ｄ．、Ｓａｎ  Ｐｉｅｔｒｏ  Ａ編、Ｎｉｊｈｏｆｆ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１１７〜１２８頁中のＡｒａｄら、１９８５年；「藻類のバイオテクノロジー。機会の海（Ａｌｇａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ａ  ｓｅａ  ｏｆ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ）」、要旨集、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ  ｄｅ  Ａｌｍｅｒｉａ、Ｓｅｒｖｉｃｉｏ  ｄｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｃｉｏｎｅｓ中のＧｕｄｉｎ、２００２年）。
【００４０】
Ｄｉｎｏｐｈｙｔａ、例えばＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉは、ＤＨＡ−Ｃ２２：６（ｎ−３）などの長鎖不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の好ましい供与源である（例えば、Ｂｏｒｏｗｉｔｚｋａ、１９９９年、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７０：３１３頁；米国特許第５７１１９８３号；米国特許第４６７０２８５号；国際公開ＷＯ９１／１４４２７；「バイオテクノロジー及び栄養（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）」、Ｂｉｌｌｓ、Ｄ．Ｄ．、Ｋｕｎｇ、Ｓ．Ｄ．編、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ、ボストン、４５１〜４６８頁中のＫｙｌｅら（１９９２年）；「藻類のバイオテクノロジー。機会の海。（Ａｌｇａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ａ  ｓｅａ  ｏｆ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ．）」要旨集。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ  ｄｅ  Ａｌｍｅｒｉａ、Ｓｅｒｖｉｃｉｏ  ｄｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｃｉｏｎｅｓ中のＧｕｄｉｎ、Ｓｉｊｔｓｍａら及びＭｅｎｄｏｚａ、２００２年を参照）。
【００４１】
従属栄養珪藻類、例えばＮｉｔｚｓｃｈｉａ、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ、Ｎａｖｉｃｕｌａは、ＥＰＡ−Ｃ２０：５（ｎ−３）のための好ましい供与源である（国際公開９１／１４４２７を参照）。ＥＰＡのための他の供与源は、海洋性珪藻Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ（藻類のバイオテクノロジー。機会の海。（Ａｌｇａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ａ  ｓｅａ  ｏｆ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ．）要旨集。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ  ｄｅ  Ａｌｍｅｒｉａ、Ｓｅｒｖｉｃｉｏ  ｄｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｃｉｏｎｅｓ内のＢｅｌａｒｂｉ、Ｅ．Ｈ．ら、Ａｃｉｅｎ、Ｆ．Ｇ．ら、Ｓａｎｃｈｅｚ、Ｍ．ら及びＣｉｎｉ  Ｚｉｔｔｅｌｉ、Ｇ．を参照）及び海洋性珪藻Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ（Ｃｅｒｏｎ、Ｍ．Ｃ．ら、２００２年、同じ本内）である。
【００４２】
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ、ＰａｒｉｅｔｏｃｈｌｏｒｉｓなどのＣｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ（緑藻類）はＰＵＦＡのための供与源である（「藻類のバイオテクノロジー。機会の海。（Ａｌｇａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ａ  ｓｅａ  ｏｆ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ．）」、要旨集。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ  ｄｅ  Ａｌｍｅｒｉａ、Ｓｅｒｖｉｏｉｏ  ｄｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｃｉｏｎｅｓ内のＣｏｈｅｎら、Ｇｕｄｉｎ、２００２年を参照）。Ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ  ＳｐｉｒｕｌｌｉｎａはＰＵＦＡの供与源として使用することができる。
【００４３】
緑藻類Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａはグリセリン（藻類の有機重量の２０〜４０％）の供与源であり、細胞内グリセリン濃度は細胞外の塩濃度に正比例し、且つ培養条件によって決まる。２５℃未満では、培地内でグリセリンはほとんど又は全く見られなかった。２５℃以上では、培地中へのグリセリン放出速度は徐々に増加し、４０℃以上では劇的に増加するので、５０℃までには藻類は２、３分以内にそのグリセリンを培地内に失う（Ｗｅｇｍａｎｎら、１９８０年）。
【００４４】
したがって、藍藻植物はＣ１６脂肪酸の、緑藻類はＣ１８脂肪酸の、紅藻類及び珪藻類はＣ１６〜Ｃ２０脂肪酸のための好ましい供与源である。高等藻類一般、即ち真核生物の藻類は、フォスファチジルコリン（レシチン）のための好ましい供与源である。
【００４５】
当業者は、増殖条件を変えることによって、与えられた生物が産生する脂質の実際の組成に影響を及ぼすことができることを知っている。例えば温度を上昇させると、それに対応して不飽和脂肪酸の量が減少することは、よく知られている。脂質組成に及ぼす温度の影響の更なる例は、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍである（Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ及びＭｃＭａｈｏｎ、１９７０年、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４６：２９０〜２９３頁を参照）。２０℃で増殖させたＣ．ｃａｌｄａｒｉｕｍ細胞は、５５℃で増殖させた細胞と比較して相当多くの量の糖脂質（一及び二ガラクトシルジグリセリド）及びリン脂質（フォスファチジルコリン及びフォスファチジルエタノールアミン）を含んでいた。同様に、２０℃で増殖させた細胞は、５５℃で増殖させた細胞よりも不飽和度が３倍高い極性脂質成分を含んでいた。Ｃ．ｃａｌｄａｒｉｕｍは、好ましくは２５℃で増殖させる。
【００４６】
一般に、藻類からの天然物の生成及び単離のためには、Ｃｒｅｓｓｗｅｌｌ、Ｒｅｅｓ及びＳｈａｈ（１９８９年、藻類とシアノバクテリアのバイオテクノロジー（Ａｌｇａｌ  ａｎｄ  Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。Ｌｏｎｇｍａｎｎ  ＆Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ）、Ｃｏｈｅｎ（１９９９年、微小藻類からの化学物質（Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ）。Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ）、及び要旨集「藻類のバイオテクノロジー。機会の海（Ａｌｇａｌ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ａ  ｓｅａ  ｏｆ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ）」（２００２年、上記）が参考になる。
【００４７】
藻類は、通常、広範囲のステロールを産生する。藻類におけるステロールの分布は、例えばＰａｔｔｅｒｓｏｎ（１９９１年：「ステロールの生理学及び生化学（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｏｌｓ）」、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、Ｇ．Ｗ．及びＮｅｓ、Ｗ．Ｄ．編、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’  Ｓｏｃｉｅｔｙ、イリノイ州シャンペーン、３５１〜３５４頁）によってレビューされている。エルゴステロール及びシトステロールは、例えば大部分の藻類の門並びに高等植物から得ることができる。紅藻、例えばＲｈｏｄｏｐｈｙｔａ（紅藻類）はコレステロールのための好ましい供与源であり、Ｃ２７、Ｃ２８、Ｃ２９ステロール（Ｃ２８が支配的である）に加えて、シトステロール、メチレン−２４コレステロール及びカンペステロール（２４−メチルコレステロール）の供与源としての働きをする。Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ（緑藻類）は、シトステロール、（クロレラ）、カンペステロール、ポリフェラステロール（２４−エチルコレスタ−５，２２−ジエノール）、エルゴステロール（２４−メチルコレスタ−５，７，２２−トリエノール）及び他のステロールの好ましい供与源である。シアノバクテリア（藍藻類）は、コレステロール、エルゴステロール、コンドリラステロール、シトステロール、カンペステロール及び他の２４−アルキルステロールを含む広い範囲のステロールの好ましい供与源である。褐藻は、フコステロール（２４（Ｅ）−エチリデンコレステロール）の好ましい供与源である。Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ）は、エルゴステロール、β−シトステロール及びカンペステロールの好ましい供与源である。したがって、藻類は、脂質抽出物から一様に標識されたステロールを得るための供与源と考えることができた。それらの単離のための標準手法は、一般に当技術分野で公知である。植物又は藻類の抽出物からのステロールの単離のために、２つの方法がしばしば使用されてきた。一晩−１０℃に置いた石油溶液から相当量のステロールを沈殿させることができるが、より効率的な方法はステロールをそれらのジギトニドとして沈殿させることを含む（Ｖｏｌｋｍａｎ、Ｊ．Ｋ．微生物におけるステロール（Ｓｔｅｒｏｌｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００３年）６０：４９５〜５０６頁、ステロールの生理学及び生化学（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｏｌｓ）（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、Ｇ．Ｗ．及びＮｅｓ、Ｗ．Ｄ．編）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、イリノイ州シャンペーン、１１８〜１５７頁内のＰａｔｔｅｒｓｏｎ、Ｇ．Ｗ．（１９９１年）も参照）。
【００４８】
アミノ酸加水分解物
本発明の方法のステップ（ｃ）では、ステップ（ａ）のように増殖させた生物のバイオマスを加水分解してアミノ酸を含む加水分解物を生成する。バイオマスは好ましくは非アルカリｐＨ、好ましくは８．０以下のｐＨで加水分解される。バイオマス内のタンパク物質は、酵素、酸処理、又は両方の組み合わせによって加水分解することができる。タンパク質の加水分解のために、塩酸、メタンスルホン酸による加水分解及び酵素加水分解を含め、多くの方法が発表されている。
【００４９】
酵素加水分解の場合には、好ましくは、タンパク質分解酵素は、それらが例えば沈降、遠心分離又は濾過によって、好ましくは他の不溶解性成分と共に都合よく加水分解産物から取り除かれるように固体担体上で固定される。或いは、酵素反応の後に加水分解産物を酸性化することが便利かもしれない。このことは、酵素を変性及び沈殿させた後、例えば遠心分離又は濾過によって加水分解産物から除去することができる点が有利である。バイオマス内のタンパク質又はタンパク物質の酵素加水分解のための方法は、Ｍｉｌｌｉｇａｎ及びＨｏｌｔ（１９７７年、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．８６Ｂ：２７７〜２８４頁）、及びＢｅｒｇｍｅｙｅｒ（１９８４年：「酵素分析の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ）：酵素（Ｅｎｚｙｍｅｓ）３：ペプチダーゼ、タンパク分解酵素及びそれらの阻害剤（ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ，ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）」、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、３版）によって記載されている。本発明で酵素加水分解のために使用されることが可能なエンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼの市販混合物は、例えばＳｕｍｉｚｙｍｅ（商標）ＦＰ、Ｓｕｍｉｚｙｍｅ（商標）ＬＰプロテアーゼ（両方とも、Ｓｈｉｎ  Ｎｉｈｏｎ、日本）、Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（商標）プロテアーゼ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ、デンマーク）及びＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｍ（商標）Ａｍａｎｏ（Ａｍａｎｏ、日本）である。類似した特性を有する他の同等の酵素も、同様に使用することが可能である。糸状菌酵素の酸性の最適ｐＨ条件から見れば、エンド及びエキソプロテアーゼ混合物は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、特にＡ．ｏｒｙｚａｅ又はＡ．ｓｏｊａｅなどの種から得られるのが好ましいが、他のアスペルギルス種、又は実際、他の真菌の種からの酵素も同じように使用することができる。これらのプロテアーゼと、例えば他のプロテアーゼ、例えば細菌性のエンドプロテアーゼであるＰｅｓｃａｌａｓｅ（商標）（ＤＳＭ、オランダ）プロテアーゼとの混合物も、使用することができる。バイオマス内のタンパク質又はタンパク物質の酵素加水分解のための好ましい酵素は、Ｆｌｕｋａ（Ｂｕｃｈｓ  ＳＧ、スイス）から入手できるＰｒｏｎａｓｅである。
【００５０】
本方法では、しかし、酸加水分解が好まれる。標識アミノ酸を得るためのバイオマスの酸加水分解の方法は、国際公開９４／１８３３９で広範囲に記載されている。基本的には、これらの方法は、強い鉱酸、例えば塩酸、硝酸又は硫酸の使用を含む。ｐ−トルエンスルホン酸又はメタンスルホン酸などのスルホン酸がより好まれ、後者は最も好まれている。酸濃度はタンパク質基質の性質によって異なってもよいが、一般に完全な加水分解の実行に十分な濃度である。一般的に、酸濃度は約１Ｎから約８Ｎの範囲であり、好ましくは約４Ｎから約７Ｎ、より好ましくは約５Ｎから約６Ｎの範囲である。酸加水分解は、好ましくは非酸化条件下で実行される。これらの条件は、真空内で反応を行うことによって、又は、窒素、アルゴンその他の不活性ガスによるパージによって達成される。加水分解されるタンパク質は、約５０ｇ／ｌから５００ｇ／ｌの間の濃度で、好ましくは約１００ｇ／ｌから２５０ｇ／ｌの間の濃度で加水分解培地に加えることができる。加水分解は、実質的に完全な加水分解を実行し、同時に不安定なアミノ酸のラセミ化又は損失を最小にするのに十分な温度及び時間で実行する。加水分解の温度は、通常、約９０から１４０℃の範囲であるが、アミノ酸のラセミ化を最小にするためには、温度は好ましくは１００から１３０℃、より好ましくは１１０から１２０℃の範囲であり、特に好まれるのは１１５℃である。加水分解の時間は、加水分解するタンパク質に従い、１０から７２時間の範囲でよい。好ましくは、約２２時間の加水分解時間が使用される。加水分解反応の間、酸化に影響されやすいアミノ酸は、好ましくは還元剤の存在によって保護される。好ましくは、チオグリコール酸などの強いスルフヒドリル含有還元剤が使用される（Ｆａｓｍａｎ、Ｇ．Ｄ．編、生化学及び分子生物学の実用ハンドブック（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ＣＲＣ、ニューヨーク（１９８９年）、１０６頁）。その還元剤の目的は、脆弱なトリプトファン及びヒスチジン残基を単に保護することではない。チオグリコール酸が使用されると、それは本発明の方法によってその後容易に除去することが可能である。還元剤は、加水分解混合液中の濃度がトリプトファン及びヒスチジンの実質的な破壊を予防するのに十分な濃度で使用される。チオグリコール酸では、そのような濃度は、通常、約１から約７ｖ／ｖ％、好ましくは約３から約１５ｖ／ｖ％の範囲である。より好ましくは、又は更に、トリプトファン及びヒスチジンの破壊は、トリプタミン及びイミダゾールなどの「自殺塩基」を含めることによって減少又は予防することができる（例えば、Ｈａｎｓｅｎら、１９９２年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１：１２７１３頁を参照）。トリプタミン及びイミダゾールのそれぞれは、好ましくは酸加水分解混合物１リットルにつき１０〜１５ｇの割合で加えられる。好ましい加水分解条件は、例えば好ましくは脂質及び色素（下記参照）を含まない１０ｇのバイオマスの加水分解の場合、１５０ｍｌの４Ｍメタンスルホン酸内で、２ｇのトリプタミン及び２ｇのイミダゾール存在下、減圧下の１１５℃で２２時間である。
【００５１】
グルタミン及びアスパラギンは上記の加水分解条件下ではかなり脱アミノ化される可能性があるので、それらは好ましくは他の供給源、例えば化学合成若しくは酵素的合成、同位体標識され、グルタミン酸及び／又はアスパラギン酸が豊富なバイオマス又はタンパク質の酵素加水分解から加えるか、或いは、それらは直接過剰生産株の発酵から得てもよい（例えば、Ｒ．Ｆａｕｒｉｅ、Ｊ．Ｔｈｏｒｎｍｅｌ、２００３年、Ｌ−アミノ酸の微生物生産（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇを参照）。
【００５２】
好ましい一実施形態において、バイオマス内のタンパク物質は、先ず酵素加水分解をして、タンパク物質を部分的に加水分解する。タンパク質分解酵素の除去後、その物質を先に述べたように酸で更に完全に加水分解する。酵素及び酸による加水分解を組み合わせるときは、好ましくは、比較的純粋で経済的な製品として容易に入手可能なエンドプロテアーゼを少なくとも含む、タンパク質分解酵素の混合物が使用される。好ましくは非特異的エンドプロテアーゼが使用される。エンドプロテアーゼを含んでいる適当な市販組成物は、上で指摘されている。
【００５３】
好ましくは本方法では、その加水分解の前にバイオマスから脂質及び色素を除去するために、バイオマスは有機溶媒で抽出される。加水分解の前に脂質特に色素をバイオマスから抽出する利点は、これらの化合物は昆虫又は哺乳動物に有毒であるか、又は加水分解の間に毒性化合物に変換されるか、又はそれらは加水分解を妨げる可能性があることである。脂質及び色素は、先に本明細書で記載されているようにバイオマスから抽出することができる。好ましくは、抽出は、少なくとも効率的な色素抽出のために最適化される。バイオマスは好ましくは２回以上抽出され、それにより別々の抽出工程が、脂質の抽出のため、また色素の抽出のために最適化される。色素の抽出のための好ましい条件は、上で記載されている。
【００５４】
好ましくは、不溶物は遠心分離又は濾過によって加水分解産物から除去される。アミノ酸は、とりわけＥｇｏｒｏｖａら（１９９５年、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．６６５：５３〜６２頁）及び国際公開９４／１８３３９で記載されているように、例えば逆相又はイオン交換クロマトグラフィーによって、加水分解産物から単離することができる。
【００５５】
最後に、本発明の方法では、ステップ（ｂ）で得られた脂質をステップ（ｃ）で得られたアミノ酸と組み合わせ、哺乳動物又は昆虫の細胞の増殖に必要な更なる構成要素を加えることによって、栄養培地を構成する。栄養培地は、同じ１つの生物、又は少なくとも２つの異なる生物から得られた脂質及びアミノ酸で構成することができる。好ましくは、アミノ酸加水分解物及び脂質抽出物のそれぞれは、少なくとも２つの異なる生物から得られる。したがって、１つ又は複数の生物をアミノ酸加水分解物の生成のために選択し、１つ又は複数の異なる生物を脂質抽出物の生成のために選択することができる。
【００５６】
アミノ酸加水分解物の生成のための生物は、好ましくは高いタンパク含量及び／又はそのアミノ酸組成に基づいて選択される。この目的に合う適当な生物は上で指摘されており、例えばタンパク含量が乾燥重量で７０％のＳｐｉｒｕｌｉｎａなどの緑藻類、又はＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓなどのメチロトローフ細菌が含まれる。ロシア特許ＳＵ９８９８６７は、タンパク含量が乾燥重量で８０％のＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ種の菌株（ＶＳＢ−９３２）を開示している。
【００５７】
アミノ酸加水分解物の生成のための更に好ましい生物としては、酵母一般、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ及びＴｏｌｒｕｌｏｐｓｉｓがある。好ましい属には、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｓｅｓが含まれる。特に好ましいのは、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ及びＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａなどのメチロトローフ酵母であり、これらはグルコース、ショ糖、トレハロース、マルトース、グリセリン、エリトリトール、キシリトール、マンニトールトール、メタノール及びエタノールを含む広い範囲の炭素源上で増殖することが可能である。酵母からアミノ酸加水分解産物を生成する好ましい方法としては、例えば米国特許第４１６５３９１号及びＬｕｋｏｎｄｅｈら（２００３年、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｏｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０：５２頁）で記載されているような、酵母バイオマスの自己加水分解を挙げることができる。酵母の安定同位体標識及びそれからの抽出物の調製は、日本特許第６２６１７４３号（１９９４年）で開示されている。
【００５８】
酵母自己消化物は、自己消化的に可溶化された細胞構成要素、例えばアミノ酸、ポリペプチド、核酸、タンパク質、グリコーゲン、糖、ビタミンＢ群、有機酸及び他の構成要素を含んでいる濃縮生成物である。酵母の自己消化は、通常、原形質分離剤、例えばＮａＣｌ、エタノール、酢酸エチル、クロロホルム又はデキストロースの存在下で、昇温状態（３０〜５０℃）で長時間（３〜１８時間）の間、酵母細胞をインキュベートすることを含む。ＮａＣｌは５〜２０ｗ／ｖ％、好ましくは２から１０ｗ／ｖ％の濃度で使用され、溶媒は約１から１０ｖ／ｖ％の濃度で使用される。インキュベーションの間、細胞構成要素は酵母内因性の加水分解酵素によって加水分解され、細胞壁は破壊されて崩壊し、タンパク質成分は水環境中に放出される。不溶解性の細胞断片は遠心分離及び／又は濾過によって除去され、上述の可溶性構成要素を含んでいる自己消化物が得られる。
【００５９】
本発明において、好ましくは上で示された酵母種を炭素源及び窒素源（１３Ｃ及び／又は１５Ｎ安定同位体標識）、無機塩、その他を含んでいる栄養培地で培養し、細胞を遠心分離で収穫して水で適切に洗浄し、得られた酵母生菌を抽出物生成のために使用する。水分は、純水、希釈塩を含んでいる水又は発酵槽／培養物の自然の溶液が可能である。酵母細胞は、好ましくは乾燥重量換算で約５％から１５％の濃度で水に懸濁し、５０〜７５℃、好ましくは６５〜７０℃の温熱ショックで約３０秒間処理して細胞壁の亀裂及び自己消化を誘発する。自己消化に関係するプロテアーゼ及び他の加水分解酵素の活性を維持するために、より長い時間の処理及び６５℃より上の温度は好ましくなく、温熱ショックの後に急速に冷却することが好ましい。その後、酵母細胞は６．５〜１０．０、好ましくは７．５〜８．０のｐＨ、１０ｗ／ｖ％のＮａＣｌで自己消化させられる。ｐＨは、温熱ショックの前か後に調節することができる。ｐＨを調節するために、希釈した１５Ｎの標識水酸化アンモニウム又は水酸化ナトリウム、水酸化カリウムを使用することが可能である。水中の温熱ショック処理された酵母細胞の懸濁液は、次に酵素自己消化を可能にするために、約３０〜５０℃、好ましくは４０〜４５℃で約３〜１２時間保たれる。可溶性成分を次に遠心分離又は濾過によって回収して酵母自己消化物を生成し、長期貯蔵のために凍結乾燥することができる。
【００６０】
本発明との関連で、用語「酵母抽出物」、「ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ」、酵母加水分解産物及び／又は「アミノ酸を含んでいる加水分解産物」（酵母から作製）は、化学的加水分解、及び、後者は自己消化とも称されるが、外因性及び内因性の酵素による酵素的加水分解のそれぞれを含んでもよい加水分解法によって生成するアミノ酸含有加水分解産物を含むものと理解される。
【００６１】
更なる栄養素
同位体標識グルコースはシアノバクテリアから単離するか、又は市販品を入手することができる。例えばＳｐｉｒｕｌｉｎａのバイオマスの炭水化物含量を増やすために、塩ストレス条件（例えば０．５ＭのＮａＣｌにおける増殖）を与えてもよい。
【００６２】
有機酸は、最高６９％の有機酸を産生する渦鞭毛藻類から十分に得ることができる。渦鞭毛藻類（Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ属）は、恒久的に濃縮された染色体という独特な特徴を有する運動性の単細胞藻類である。渦鞭毛藻類は、グリセリン及び有機酸の供与源である。大部分の共生関係において、渦鞭毛藻類は胃真皮層の細胞内に位置し、宿主起源の膜によって囲まれている。放出される主要な化合物は、グリセリン（２１〜９５％）、有機酸（０〜６９％）、グルコース（０．５〜２１％）及びアラニン（１〜９％）である。異なる宿主から単離されるＳｙｍｂｉｏｎｉｄｉｕｍの間の相違は、Ｚｏａｎｔｈｕｓ  ｐａｃｉｆｉｃａ及びＳｃｙｐｈｏｚｏａｎ  Ｒｈｉｚｏｓｔｏｍａによって例示される。Ｚｏａｎｔｈｕｓからの共生生物はその光合成物の４２％を放出し、その９５％はグリセリンで３％は有機酸であるのに対して、Ｒｈｉｚｏｓｔｏｍａの共生生物はその光合成物の２０％を放出し、その２１％はグリセリンで６９％は有機酸である（Ｔｒｅｎｃｈ、１９７１年  Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．１７７：２５１〜２６４頁）。
【００６３】
緑色硫黄細菌Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍは、暗所でインキュベートすると、酢酸、プロピオン酸、カプロン酸及びコハク酸などの有機酸を排出する（「嫌気的光合成細菌（Ａｎｏｘｉｇｅｎｉｃ  ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ）」、Ｂｌａｎｋｅｎｓｈｉｐ、Ｒ．Ｅ．ら編、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、８７９頁のＳｉｒｅｖａｇ、１９９５年を参照）。有機酸は、微生物の従属栄養又は混合栄養増殖のための炭素源としても与えることができ、炭素源として酢酸塩又はグルコースを使用した従属栄養培養が暫く使用された。しかし、従属栄養培養は全ての微小藻類にとって可能であるというわけではなく、従属栄養条件では藻類の化学組成はしばしば変化する（Ｂｏｒｏｗｉｔｚｋａ、１９９９年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７０：３１３〜３２１頁）。
【００６４】
紅色非硫黄細菌は、自然界で見られる最も代謝的に多様な生物である。Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍによる有機酸の発酵は、Ｇｏｒｅｌｌ及びＵｆｆｅｎ（１９７７年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３１：５３３〜５４３頁）によって、また、Ｋｏｈｌｍｉｒｒｅｒ及びＧｅｓｔ（１９５１年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．６１：２６９〜２８２頁）によって議論されている。
【００６５】
有機酸、特にフマル酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、リンゴ酸などのクレブス回路の酸は、液−液及び液−固抽出、抽出物の精製、誘導体化及び前分画によって単離することができる（Ｌｉｅｂｉｃｈ、Ｈ．Ｍ．１９９０年。Ａｎａｌｙｔｉｃａ−Ｃｈｉｍｉｃａ−Ａｃｔａ。２３６（１）、１２１〜１３０頁、米国特許第３８７５２２２号）。それらは、もし分泌されている場合は有機溶媒によって培養液から抽出することが可能であり、又は、脂質と共にバイオマスから抽出することができる（Ｌｉａｎら、１９９９年。Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌｙｓｉｓ．１９：６２１〜６２５頁）。有機酸は、例えば８０％（ｖ／ｖ）沸騰エタノールを使用して遊離アミノ酸と共に抽出することができる。
【００６６】
或いは、安定同位体標識された植物は、標識された培地成分の供与源として使用してもよい。植物の一様な（９８％を超える１５Ｎ）安定同位体標識は、例えばＩｐｐｅｌら（２００４年、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ４：２２６〜２３４頁及びその中の参照）で記載されている。同位体標識植物は、（アミノ酸含んでいる）加水分解産物、自己消化物、脂質及び炭水化物の供与源として、主に下記のように使用することができる。
【００６７】
昆虫又は哺乳動物の細胞を増殖させるための栄養培地の組成
更なる態様において、本発明は昆虫又は哺乳動物の細胞の増殖を支える栄養培地と関連する。好ましくは、栄養素はタンパク質、好ましくは組換えタンパク質、及びウイルス生成物の生成を支える。栄養培地は、好ましくはＨ、Ｃ又はＮの少なくとも１つについて、生体分子の合成のために昆虫細胞によって同化される基質内の実質的に全ての原子が同位体標識されている培地である。栄養培地は、ＮＭＲ組織分析のために、タンパク質のような生体分子の同位体標識のために使用してもよい。培地は、好ましくは血清、血清由来の成分及び動物由来の成分を含まない。
【００６８】
栄養培地は、好ましくは、先に述べたように微生物培養物から得ることができる様々なアミノ酸加水分解物、脂質抽出物、炭水化物及び有機酸で構成される。培地には更に、必要に応じて化学合成又は市販の成分を補うことができる。最終的な菌体濃度及び／又はタンパク質生成レベルに対する培地成分及びそれらの濃度の最も重要な影響を見つけるために、様々な加水分解産物、脂質抽出物及び炭水化物及び有機酸製剤がスクリーニングされ、試験された。
【００６９】
本発明に従って昆虫又は哺乳動物の細胞で生成した生体分子の同位体標識のための好ましい栄養培地は、以下を含む：
（ａ）無機塩の混合物；
（ｂ）同位体標識アミノ酸の供与源；
（ｃ）同位体標識されたエネルギー源、通常グルコースのような炭水化物の形
（ｄ）脂質の供与源
（ｅ）保護剤
（ｆ）（任意選択に）ビタミン及び／又は低濃度の有機化合物
（ｇ）（任意選択に）有機酸
（ｈ）（任意選択に）微量要素。
【００７０】
細胞培地への取り込みのための無機塩混合物は、当技術分野で公知である。無機塩混合物は、好ましくは生理学的イオン強度及びｐＨ緩衝能力を提供する。昆虫細胞のための適当な無機塩混合物は、例えばグレース培地又はシュナイダー培地からわかる塩混合物である。哺乳動物細胞のための適当な無機塩混合物は、例えばダルベッコの修正イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（Ｐｒｉｃｅ、Ｐ．Ｊ．ら、１９９５年、Ｆｏｃｕｓ  １７：７５頁）、ＢＭＥ（基礎イーグル培地、Ｅａｇｌｅ、Ｈ．（１９６５年）Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．８９：３６２頁を参照）、Ｆ−１０、Ｆ１２栄養素混合物（Ｈａｍ、１９６３年、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２９：５１５頁）、及びそれらの修正版、又はＣＨＯ−ＳＳＦＭ１培地（Ｇｉｂｃｏ）からわかる塩混合物である。好ましくは、混合物がＨ、Ｃ又はＮの元素の１つを含んでいる無機塩を含む場合は、塩の実質的に全ての原子は、アミノ酸など他の成分の同位体標識の種類に従って同位体標識される。例えば、ＮａＨＣＯ３はＢＭＥでは２．２ｇ／ｌの濃度で、Ｄ−ＭＥＭでは３．７ｇ／ｌの濃度で存在する。更に、Ｄ−ＭＥＭは０．０５ｍｇ／ｌ又は０．１ｍｇ／ｌの濃度のＦｅ（ＮＯ３）ｘ９Ｈ２Ｏを含む。全てではないにしてもほとんどの昆虫細胞培地は、グレースの処方（Ｇｒａｃｅ、１９６２年、Ｎａｔｕｒｅ  １９５：７８８頁）に基づき、更に、０．３５〜０．７ｍｇ／ｌの濃度のＮａＨＣＯ３を含む。ＩＰＬ−４１は、０．０４ｍｇ／ｌの濃度の（ＮＨ４）６（Ｍｏ７Ｏ２４ｘ４Ｈ２Ｏ）を含む。
【００７１】
同様に、栄養培地への任意選択の取り込みのための微量要素（一般に非常に低い濃度、通常マイクロモル濃度の範囲で必要な無機化合物又は天然の要素として定義される）の組成、及び培地におけるそれらの最終濃度は、昆虫及び哺乳動物両方の細胞に関して当技術分野で公知である（例えば「哺乳動物細胞技術（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、１０９頁、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ内のＴｈｉｌｌｙ、１９８６年；「昆虫細胞培養（Ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ）：基本的及び応用的側面（ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｅｄ  ａｓｐｅｃｔｓ）」２巻、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ内のＶｌａｋら、１９９６年；及び、「工業的細胞培養ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ）：哺乳動物、微生物及び植物細胞（ｍａｍｍａｌｉａｎ，ｍｉｃｒｏｂｉａｌ，ａｎｄ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ）」、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ内のＰｅｒｅｋｈ及びＶｉｎｃｉ、２００３年を参照）。
【００７２】
培養中の昆虫又は哺乳動物の細胞のためのエネルギー源は、通常炭水化物、好ましくはグルコースを含む。同位体標識されたグルコース又は他の糖類、例えば単糖又は二糖は、市販製品を入手するか、又は藻類のバイオマスから単離することができた。グルコースのような炭水化物の供与源として好ましいバイオマスは、好ましくは塩ストレス条件下で増殖させた緑藻類のバイオマスである。
【００７３】
アミノ酸の供与源
本発明の栄養培地のための同位体標識アミノ酸の供与源は、好ましくはバイオマス又はタンパク質生成物の多種多様な加水分解産物から選択されるが、その加水分解産物は単独で又は組み合わせて使用することができる。好ましい加水分解産物は、先に述べたように得られた、脱脂又は溶媒抽出された藻類、細菌又は真菌（酵母）バイオマスから得られる。これらの加水分解産物は、高価な同位体標識されたアミノ酸及び（ある程度は）ビタミンの代わりとなる。アミノ酸の供与源は、化学的若しくは酵素的合成又は発酵など他の供与源から得られる加水分解産物には十分存在しない、個々のアミノ酸で補うことができる。そのようなアミノ酸は、特に、グルタミン、アルギニン、システイン、ヒスチジン及びトリプトファンである可能性がある。しかし、昆虫及び哺乳動物の細胞の増殖には、微量のトリプトファン（酸加水分解の後）で十分かもしれない（上記Ｈａｎｓｅｎらが示している）。好ましくは、アミノ酸の供与源は、酵母一般から、或いはより好ましくはメチロトローフの酵母（例えばＰｉｃｈｉａ又はＨａｎｓｅｎｕｌａ）、同位体標識藻類の加水分解産物（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）及び／又はメチロトローフ細菌のバイオマス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）から得られた同位体標識加水分解産物から得られた同位体標識のｙｅａｓｔｏｌａｔｅを含んでいる。
【００７４】
昆虫（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｄｒａ）細胞の大量規模培養のための無血清培地が、Ｍａｉｏｒｅｌｌａら（１９８８年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１４０６〜１４１０頁）で報告された。基礎培地に加えて、その培地は酵母エキス、たら肝油ＰＵＦＡメチルエステル、コレステロール及びトゥイーンを含んでいた。本発明において、たら肝油は好ましくは同位体標識されている藻類及び細菌の脂質抽出物で代用してもよい。
【００７５】
国際公開９２／０５２４７は、昆虫細胞の培養のための、酵母加水分解産物及びアルブミン又はデキストランを加えた基礎培地を含んでいる、無血清培地を開示している。したがって、本発明において、酵母加水分解産物を１から１０ｇ／ｌの量で加えてもよい。
【００７６】
本発明の培地内のアミノ酸供与源の濃度は、個々の加水分解産物の最も高い許容濃度の合計でよく、ここで各加水分解産物の最も高い許容濃度とは、その加水分解産物が細胞増殖に対して非毒性及び非阻害的である濃度のことである。加水分解産物の最も高い許容濃度は、使用する特定の加水分解産物製剤だけでなく、培地で培養する特定の細胞系によって異なってもよい。当業者ならば、例えば通常の培地で増殖させている細胞系に対して所定の加水分解産物製剤の量を次第に高くして加えることによって、最も高い許容濃度を容易に決定することができる。
【００７７】
一般的に、本発明の培地内のアミノ酸供与源の好ましい最終濃度は、培地１リットルにつきアミノ酸供与源（乾燥重量）が約１から１５グラムであり、より好ましくは約２から１０ｇ／ｌの最終濃度である。
【００７８】
昆虫細胞、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞系Ｓｆ９のための本発明の栄養培地のための好ましいアミノ酸供与源は、０〜７ｇ／ｌ、好ましくは、２．５〜４ｇ／ｌの同位体標識藻類の加水分解産物、及び／又は０〜７ｇ／ｌ、好ましくは１．５〜３ｇ／ｌの同位体標識細菌の加水分解産物、及び／又は０〜８ｇ／ｌ、好ましくは５〜７ｇ／ｌの同位体標識菌類／酵母の加水分解産物を含む。
【００７９】
哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞のための本発明の栄養培地のための好ましいアミノ酸供与源は、０から１０ｇ／ｌ、好ましくは、４〜６ｇ／ｌの同位体標識藻類の加水分解産物、及び／又は０から１０ｇ／ｌ、好ましくは４〜６ｇ／ｌの同位体標識細菌の加水分解産物、及び／又は０から１２ｇ／ｌ、好ましくは７〜９ｇ／ｌの同位体標識菌類／酵母の加水分解産物を含む。
【００８０】
好ましくは、本発明の栄養培地のためのアミノ酸供与源を構成する加水分解産物は、限外濾過によって精製して、ペプトン生成工程で使用されるプロテアーゼの残留物、エンドトキシン、及び宿主細胞によって発現される（組換え）タンパク質の生成及び／又は精製を妨げる可能性のある他の高分子成分を除去する。ペプトン分画は好ましくは前濾過され、その後、後の精製を容易にするために、組換え生成物又はウイルス生成物の分子量より小さくなるように選択された分子量カットオフを有する膜、好ましくは２０００〜１５０００の分子量カットオフ膜、より好ましくはＰＭ１０膜（Ａｍｉｃｏｎ）などの１０，０００の分子量カットオフ膜を通して限外濾過される。限外濾過過程は、好ましくはクロスフロー濾過器具内、例えば小規模の場合は加圧撹拌セル内で、大規模の場合は中空糸カートリッジ又はプレート内で実行される。限外濾過液は、本発明の他の培地成分も加えられる基礎培地を加える前に、濾過殺菌してもよい。
【００８１】
同位体標識された加水分解産物の保存溶液は、好ましくは藻類加水分解産物については１０〜１５％（乾燥重量／ｖ）の濃度で、菌類／酵母加水分解物については１５〜２０％、細菌加水分解産物については１５〜１８％の濃度で調製する。
【００８２】
各溶解物のいくつかのロットについて、例えばＳｆ９又はＣＨＯ細胞に対する増殖促進特性が試験される。
【００８３】
使用される加水分解産物、特に自己消化物は、遊離アミノ酸に加えてオリゴペプチドを未だに含んでいる可能性があることを理解されたい。一部の加水分解産物において、総アミノ酸含量の最高で約２０％はオリゴペプチドの形で存在する。培地内の遊離アミノ酸濃度は細胞培養の間に変動する可能性があり、また例えば細胞によって放出されるペプチダーゼ／プロテアーゼに依存することがある。アミノ酸消費量（培地内の初期含量の百分率で表される）を決定するときには、このことを考慮に入れなければならない。培地に加えるアミノ酸供与源の濃度は、使用する特定のアミノ酸供与源分画、培養する細胞系の性質、与えられたペプトンが細胞増殖に有害又は抑制的になる濃度などの因子によって決まる。細胞系及びアミノ酸供与源の各組み合わせのための最適濃度は、経験的に決定することができる。
【００８４】
通常、栄養培地におけるアミノ酸供与源の総量は、約８から３０ｇ／ｌ、より好ましくは約１２から２４ｇ／ｌの範囲である。
【００８５】
個々のアミノ酸及びビタミンの相対濃度は、特定の細胞系の必要性に合わせることができる。例えば、グルタミンは一部の昆虫細胞系に必須であるけれども、他の細胞系はグルタミンなしで増殖することができ、また前駆体からこのアミノ酸を合成することができる可能性があることは、当技術分野で公知である（例えばＭｉｔｓｕｈａｓｈｉ、１９８７年、Ａｐｐｌ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．Ｚｏｏｌ．２２：５３３〜５３６頁を参照）。培地の意図された用途に従い、個々の遊離アミノ酸及びビタミン類の濃度は、様々な昆虫又は哺乳動物の細胞系の公知の特性に合わせて調節することが可能である。
【００８６】
脂質供与源
昆虫細胞の脂質所要量は、昆虫細胞がコレステロール源を必要とする以外は、通常、哺乳動物脊椎動物のそれらと類似している。本発明の栄養培地への取り込みのための脂質供給源は、好ましくは、昆虫又は哺乳動物の細胞の増殖に必須のものを含む。好ましくは、これらの脂質は同位体標識された脂質であるが、このことは本発明に必須でない。脂質供与源は、好ましくは少なくとも（１）脂肪酸、（２）ステロイド及び（３）脂溶性ビタミンを含む。
【００８７】
脂質供与源内の脂肪酸は、様々な形態、例えばトリグリセリド、遊離脂肪酸、又は脂肪酸のアルキルエステル（好ましくはＣ１〜Ｃ４アルキル）で存在してもよく、その中ではメチルエステルが好ましい。脂肪酸は好ましくは、Ｃ１２からＣ２２、好ましくはＣ１３からＣ１９の鎖長を有する多価不飽和脂肪酸を含む。
【００８８】
本発明の培地のための（同位体標識された）多価不飽和脂肪酸の好ましい混合物は、Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ（紅藻類）、Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ（ほとんどの場合紅藻類に属すと言われる）、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ（緑藻類）、Ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ（藍藻類）、Ｄｉａｔｏｍｓ（珪藻類）、Ｐｈａｅｏｐｈｙｃｅａｅ（褐藻類）及びＤｉｎｏｆｌａｇｅｌａｔｅ（渦鞭毛藻類）、Ｄｉｎｏｐｈｙｔａ（渦鞭毛植物）の同位体標識バイオマスから得られる脂質抽出物中に存在する。
【００８９】
栄養培地における（同位体標識された多価不飽和）脂肪酸及び／又はそれらの（メチル）エステルの最終濃度は、好ましくは２ｍｇ／ｌから約１００ｍｇ／ｌ、より好ましくは１０から３０ｍｇ／ｌ、最も好ましくは１８から２２ｍｇ／ｌである。
【００９０】
脂質供与源内のステロイドは、好ましくはラノステロール、スチグマステロール、シトステロール及びコレステロールなどのステロールであるが、特にコレステロールが好ましい。ステロイドは、Ｙｏｕｎｇ及びＢｒｉｔｔｏｎ（１９９３年、光合成におけるカロチノイド（Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ  ｉｎ  Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）。Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ）並びにＶｏｌｋｍａｎ（２００３年、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０（５）：４９５〜５０６頁）によって記載されているように、沈殿によって脂質抽出物から得ることができる。栄養培地における（同位体標識された）ステロイドの最終濃度は、好ましくは２から１０ｍｇ／ｌ、より好ましくは５から７ｍｇ／ｌである。
【００９１】
脂質供与源内の脂溶性ビタミンは、好ましくは少なくともビタミンＥ（α−トコフェロール）を含み、更に例えばビタミンＡを含んでもよい。栄養培地における（同位体標識された）α−トコフェロールの最終濃度は、好ましくは約０．５ｍｇ／ｌから約４ｍｇ／ｌ、より好ましくは１．５から３ｍｇ／ｌである。十分な量のビタミンＡが脂質抽出物内に存在する。
【００９２】
本発明の水性培地への脂質の直接添加は、それらの低い水溶解度のために非実用的である。脂質供与源はしたがって、好ましくは適当な脂質乳濁液、例えばＭａｏｉｅｌｌａら（１９８８年、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．６：１４０６頁）によって記載されているマイクロエマルジョンの形で提供される。そのようなマイクロエマルジョンは、少量の乳化剤を含んでいる脂質／有機溶媒溶液を含む。好ましい乳化剤としては、陰イオン界面活性剤、通常はレシチンなどのリン脂質、又はポリソルベート２０若しくは８０などの非毒性、非イオン性ポリマーデタージェントがある。更に可能なことは、水溶性有機溶媒、例えばジメチルホルムアミド及び様々なアルコール類（Ｃ１〜Ｃ６アルコール類）に溶かした脂質を加えることであり、その中ではエタノールが好ましい。水溶性有機溶媒に溶かした脂質の保存溶液は、好ましくは昆虫又は哺乳動物の細胞に対する溶媒の毒性を避けるために、栄養培地内の有機溶媒の最終濃度が０．１％（ｖ／ｖ）未満、より好ましくは０．０５又は０．０１％未満となるように調製される。当業者は、選択された溶媒、増殖させる細胞の種類などに従い、経験的に有機溶媒の最終濃度を決定する。
【００９３】
本発明の栄養培地のための好ましい同位体標識脂質供与源は、培地１リットルにつき、２０ｍｇの同位体標識脂質抽出物と６ｍｇの同位体標識コレステロールを１ｍｌのエタノールに共に溶かしたものを含む。
【００９４】
任意選択に、保護剤を本発明の栄養培地に取り込ませてもよい。保護剤は通常当技術分野で公知であり、撹拌及び散布される昆虫細胞培養物の昆虫又は哺乳動物の細胞を傷害及び死から保護するために機能的に作用する、非毒性の水溶性成分と定義される。それらの濃度（重量−容積）は非常に低く（０．０１から約１％）、また、それらは通常培養細胞によって直ちに代謝されないので、それらは非標識の形態で加えてもよい。保護剤は別に加えてもよく、又は脂質供与源と合わせてもよい。保護成分は、好ましくはプロピレンオキシド及びエチレンオキシドのブロックポリマー、より好ましくはＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８及びＦ８８（ＢＡＳＦ  Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ  Ｃｏｒｐ．）などのＰｌｕｒｏｎｉｃポリオールを含む。保護剤の役目を果たすことができる他の適当な化合物としては、例えばヒドロキシ−エチルスターチ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸デキストラン、ポリプロピレングリコール、アルギン酸、フィコール及びポリビニルピロリドンがある。
【００９５】
任意選択に濾過／殺菌された１ｍｌの脂質成分溶液（上述）に、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８の１０％水溶液（任意選択に濾過／殺菌された）の１０ｍｌを、ボルテキシングにより撹拌しながら徐々に加える。Ｐｌｕｒｏｎｉｃポリオールは、ＢＡＳＦ  Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ  ｃｏｒｐ．（１０１  Ｃｈｅｒｒｙ  Ｈｉｌｌ  ｒｏａｄ、私書箱１８１、ニュージャージー州Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、０７０５４、米国）から市販されている。これにより脂質成分マイクロエマルジョンが形成される。次に、この脂質乳濁液を培地に加えることができる。脂質乳濁液の調製が成功するかは好ましくは温度によって決まり、したがって乳濁液は、３５〜４０℃の範囲で調製される。調製を促進するために、高速ボルテキシングを行ってもよい。好ましくは、脂質供与源は、濾過及び（濾過）殺菌する。或いは、培地は調製後濾過殺菌してもよい。ステロールは、他のクラスの脂質と共に有機抽出物から供給される。
【００９６】
適当なステロール供与源は、Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ、紅藻類、他の藻類である。遊離の水溶性同位体標識ビタミンの大部分は、同位体標識ペプトン成分を通して、一般的には同位体標識のｙｅａｓｔｏｌａｔｅ及び同位体標識のメチロトローフによって供給される。脂溶性ビタミンは、他のクラスの脂質と共に有機抽出物から供給される。
【００９７】
更に、昆虫血液は、異常に高い濃度の遊離の有機酸、例えばクエン酸、コハク酸、シュウ酸又はリンゴ酸を、１昆虫につき０．１〜３５ｍｍｏｌ含んでいる（Ｇｒａｃｅ、（１９６２年）、Ｎａｔｕｒｅ、１９５：７８８頁、Ｖａｕｇｈｎ、Ｊ．Ｌ．、（１９６８年）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２：１０３頁）。クレブス回路中間体は良いキレート剤であって、したがって、血リンパ液のカチオンバランスで重要な役割を演ずる。本発明の細胞培養培地には、１つ又は複数のクレブス回路中間体及び／又はピルビン酸を、好ましくは別々の有機酸の最大５０ｍｇ／ｌの濃度で補ってもよい。これらの成分を低い濃度で含んでいるか又は全く含んでいなくても、培地のいくつかは昆虫細胞の増殖を支える。（ＧａｒｄｉｎｅｒとＳｔｏｃｋｄａｌｅ、１９７５年）。例えば、国際公開０１／９８５１７は、最も高価な遊離の有機酸、例えばフマル酸、リンゴ酸、コハク酸、ケトグルタル酸及びヒドロキシプロリンは、害を与えることなく昆虫細胞培地から完全に除くことが可能であり、また、それらはより多くの量（ビタミンそれぞれが最高２５０ｍｇ／ｌ）のビタミン類、例えばチアミン、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンＢ６、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、パントテン酸、コリン、パラアミノ安息香酸、イノシトール、グルコースなどの糖類及びペプトンで置換することができることを開示している。
【００９８】
適当な有機酸供与源は上で記載され、Ｓｃｙｐｈｏｚｏａｎ  ｒｈｉｚｏｓｔｏｍａ（有機酸を培地中に放出する）、緑色硫黄細菌、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ（暗所でインキュベートすると有機酸を放出）、紅色非硫黄細菌Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ（暗所で嫌気的に増殖する間）などが含まれる。有機酸は、バイオマスの有機抽出物から、又は培地ブイヨンの抽出物として別個に供給される。
【００９９】
培地は、更に、例えばＩｓｏｔｅｃ社から入手できる６０〜９０ｍｇ／ｌの標識ピルビン酸を補ってもよい。
【０１００】
任意選択に、上記アミノ酸供与源に加えて、遊離の精製された同位体標識アミノ酸を本発明の培地に加えてもよい。遊離アミノ酸、有機酸及びビタミン標品は、同位体標識された天然供給源から精製してもよいし又は市販品を入手してもよく、これらは従来から、完全培地の加水分解産物又はｙｅａｓｔｏｌａｔｅ成分に由来するアミノ酸及び／又はビタミンのいずれとも無関係に、ベースとなる基礎培地に加えられている。
【０１０１】
同位体標識生体分子の作製方法
他の態様では、本発明は同位体標識生体分子の作製方法に関する。好ましくは、本方法は、その生体分子内の実質的に全ての原子が同位体標識される生体分子を作製するための方法である。本方法は、好ましくは（ａ）生体分子を産生することができる哺乳動物又は昆虫の細胞を、本発明に従う方法で作製された栄養培地内でその生体分子の産生を導く条件下で増殖させるステップと、（ｂ）その生体分子を回収するステップとを含む。好ましくは、前記生体分子はポリペプチド又はタンパク質である（両用語は、本明細書では互換的に使用される）。本発明の方法は、同位体標識された膜タンパク質、例えば膜貫通外因性の膜タンパク質の生成に特に適している。しかし、本発明の方法は、可溶タンパク質又は他の非膜タンパク質の生成のために等しく適当である。タンパク質は、好ましくは哺乳動物のタンパク質、より好ましくはヒトタンパク質である。
【０１０２】
本発明の方法では、タンパク質は栄養培地でタンパク質を産生することができる哺乳動物又は昆虫の細胞を増殖させることによって生成され、Ｈ、Ｃ又はＮの少なくとも１つについて、栄養培地内で生体分子、即ちタンパク質の合成のために細胞によって使用される基質内の実質的に全ての原子が同位体標識される。タンパク質は、培養細胞によって自然に産生される内因性のタンパク質でもよい。しかし、一般的に、タンパク質は組換え手段によって生成される。
【０１０３】
この目的のために、関心のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を、例えば本明細書で参照により完全に組み込まれている、Ａｕｓｕｂｅｌら、「分子生物学における現行のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク（１９８７年）、及びＳａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年）「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験室マニュアル（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（第３版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｔｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨークで記載されているような適当な哺乳動物又は宿主の細胞で発現させる。
【０１０４】
関心のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列は、発現ベクターを通して宿主細胞に導入する必要がある。このベクターは、そのベクターに適する宿主でのそのベクターの複製を確実にする複製起点（又は、自主複製配列）を含む複製可能なベクターであってもよい。或いは、このベクターは宿主細胞のゲノムと、例えば相同組換え又はその他により融合することができる。哺乳動物細胞のための適当な発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年、上記）から公知である。昆虫細胞のための適当なベクターは、公知のバキュロウイルスに基づいている（Ｍｅｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９９７年、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：２８３〜９７頁）。用語「発現ベクター」は、通常、そのヌクレオチド配列と適合する宿主での関心のコード配列の発現に影響を及ぼすことができる、ヌクレオチド配列を指す。これらの発現ベクターは、一般的に、ポリペプチドをコードしているセグメントに作動可能的に結合している適当な転写調節配列（プロモーター）及び翻訳開始及び終止調節配列を少なくとも含む。ＤＮＡセグメントが「作動可能的に結合」するのは、それが他のＤＮＡセグメントと機能的関係に置かれている場合である。発現ベクターにおいて、関心のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列は、そのコード配列の宿主細胞での発現を誘導することができるプロモーターに作動可能的に結合される。
【０１０５】
本明細書で使用されるように、用語「プロモーター」は、１つ又は複数の遺伝子の転写を調節する機能を有し、遺伝子の転写開始点の転写の方向に関して上流に位置し、また、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始点及び他のいかなるＤＮＡ配列、例えばそれには限定されないが、転写因子結合部位、リプレッサー及びアクチベータータンパク結合部位、並びに直接又は間接的に作用してプロモーターからの転写の量を調節することが当業者に公知の他のいかなるヌクレオチド配列の存在によって構造的に特定される核酸フラグメントを指す。「構成」プロモーターは、大部分の生理学的及び発達条件下で活性であるプロモーターである。「誘導」プロモーターは、生理学的又は発達条件に従い調節されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特定の種類の分化細胞／組織のみで活性である。
【０１０６】
適当なプロモーター配列の選択は、通常、ＤＮＡセグメントの発現のために選択される宿主細胞に依存する。適当な哺乳動物のプロモーター配列の例は、当技術分野で公知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年、上記を参照）。同様に、昆虫細胞で用いられる適当なプロモーター配列は、当技術分野で公知である（Ｍｅｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９９７年、上記）。細胞系及び発現ベクターの有効な組み合わせの例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年、上記）で記載され、哺乳動物細胞に関してはＷｕｒｍ及びＢａｒｎａｒｄ（１９９９年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１５６〜１５９頁）で、昆虫細胞に関してはＭａｓｓｏｔｔｅ（２００３年、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１６１０：７７〜８９頁）及びＩｋｏｎｏｍｏｕら（２００１年、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．ＢｉｏＬ−Ａｎｉｍａｌ．３７：５４９〜５５９頁）で、酵母に関してはＭｅｔｚｇｅｒら（１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：３１〜３６頁）で記載されている。
【０１０７】
したがって本発明の標識ポリペプチドの生成方法は、上で定義された宿主細胞をポリペプチドの発現に促進的な条件下で増殖させるステップを含む。任意選択に、この方法はポリペプチドを回収するステップを含んでもよい。ポリペプチドは、例えば標準のタンパク質精製技術、例えばそれ自体当技術分野で公知の様々なクロマトグラフィー法（下記参照）によって、培地から回収することができる。
【０１０８】
細胞／培養物からの標識タンパク質の精製
細胞又は培地からの（標識された）タンパク質の精製は、当技術分野で公知である。可溶タンパク質の精製に関しては、例えばＤｅｕｔｓｃｈｅｒ（１９９０年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８２巻）及びＹｏｋｏｙａｍａ（２００３年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｎ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．７：３９〜４３頁、及びその中の参照）を参照。ドメイン構造分析のための十分に純度が高い所定のタンパク質を大量に調製するための方法は、一般に当業者に知られている。タンパク質精製のための全ての方法が与えられた関心のタンパク質に適用できるというわけではないが、通常、以下の方法が好ましい実施形態を代表すると考えられている：アフィニティークロマトグラフィー、硫安沈殿、透析、ＦＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、超遠心分離法、その他。タンパク質精製の全般的レビューについては、Ｂｕｒｇｅｓｓ（１９８７年、「タンパク質精製（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、Ｏｘｅｎｄｅｒら編、タンパク質工学（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、７１〜８２頁、Ｌｉｓｓ内）、Ｊａｃｏｂｙ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０４：Ｐａｒｔ  Ｃ（１９８４年）；Ｓｃｏｐｅｓ、タンパク質精製（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）：原理及び実際（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）（第２版）、Ｓｐｒｉｎｇｌｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９８７年）を参照。
【０１０９】
膜タンパク質の精製は、例えばＢｏｓｍａｎら（２００３年、：「分子生物学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、２２８巻：７３頁、Ｓｅｌｉｎｓｋｙ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）、Ｒｅｅｖｅｓら（２００２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１３４１３〜１３４１８頁）、及びＥｉｌｅｒｓら（１９９９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：４８７〜４９２頁）によって開示されている。
【０１１０】
国際公開９９／２２０１９は、ＮＭＲのためのタンパク質試料調製を開示している。タンパク質の生物物理学的な特性を決定するために適当な溶媒条件は、国際公開９９／３０１６５で開示されている。ＮＭＲのための膜タンパク質の試料調製は、Ｓａｎｄｅｒｓ及びＯｘｅｎｏｉｄ（２０００、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １５０８  １２９〜１４５頁、及びその中の参照）によってレビューされている。ＮＭＲ研究のための脂質バイセル（ｂｉｃｅｌｌｅ）への膜タンパク質の再構成は、Ｓａｎｄｅｒｓら（１９９５年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４：４０３０〜４０４０頁）によって記載されている。巨大タンパク質のＮＭＲ分光法は、米国特許第６１９８２８１号で記載されている。
【０１１１】
更なる態様において、本発明は、そのタンパク質内の実質的に全ての原子が、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ、１５Ｎ及び１３Ｃ、１５Ｎ及び２Ｈ、１３Ｃ及び２Ｈ又は１５Ｎ、１３Ｃ及び２Ｈから選択される同位体で同位体標識されている、哺乳動物の膜タンパク質に関する。タンパク質内の実質的に全ての原子の同位体標識とは、ある元素の原子の少なくとも約９５％以上が所望の同位体形態であることを意味し、好ましくは約９８、９９、９９．５、又は９９．９％以上である。好ましくは、哺乳動物の膜タンパク質は、そのタンパク質内の水素原子の２０〜１００％が同位体２Ｈで均一に置換されているタンパク質である。好ましくは、この膜タンパク質はヒトタンパク質である。膜タンパク質は、本明細書では、少なくとも３０、４０、５０、７０又は１００アミノ酸の長さを有するポリペプチド鎖を含むタンパク質と理解され、そのタンパク質は完全長タンパク質に由来しているかもしれないペプチドから区別される。
【０１１２】
三次元構造を決定するための方法
他の態様において、本発明は、生体分子の構造情報及び／又は構造機能関係に関する情報を得るための方法に関するものである。好ましくは、本方法は生体分子の三次元構造（３Ｄ構造）を決定するための方法である。この方法は、先に述べたように本発明の栄養培地で増殖させた昆虫又は哺乳動物の細胞内で、同位体標識生体分子を産生することを含む。同位体標識生体分子、好ましくは（膜貫通）タンパク質は、その後回収し、任意選択に培養細胞及び／又は培地から精製し、任意選択に更に精製してスペクトル分析をする。そのような分光分析は、生体分子の構造、構造機能関係、及び好ましくは三次元構造に関する情報を決定するための、核磁気共鳴（「ＮＭＲ」）分光分析、フーリエ変換赤外外分光分析及び／又はラマン分光分析でよい。
【０１１３】
好ましい方法では、生体分子は第２の生体分子に結合したタンパク質である。第２の生体分子は本発明に従う方法で生成してもよく、好ましくは第２の生体分子内の水素原子の２０〜１００％は、同位体２Ｈで均一に置換されている。第２の生体分子は、タンパク質であってもよい。
【０１１４】
Ｆｅｌｉｘ  Ｂｌｏｃｈ及びＥｄｗａｒｄ  Ｐｕｒｃｅｌｌによって１９４６年に発見された核磁気共鳴（「ＮＭＲ」分光学は、タンパク質及び核酸などの生体分子の構造解析を含め、化学、ライフサイエンス及び分子診断に公知の応用を有する重要な技術に進化した（Ｗｕｔｒｉｃｈ、Ｋ．、（１９８６年）タンパク質及び核酸のＮＭＲ（ＮＭＲ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、Ｗｉｌｅｙ、ニューヨーク）。ＮＭＲにおける更なる技術的進歩、例えばパルス系列及び方法論の進歩は、タンパク質−リガンド相互作用の研究におけるＮＭＲの応用範囲を広げ、構造に基づく薬物設計のための基礎を形成した（Ｍａｒｒａｓｉ及びＯｐｅｌｌａ、１９９３年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．８：６４０頁：Ｗａｔｔｓら、１９９５年、Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１２：２３３頁）。薬物設計に対するＮＭＲの応用の多様性及び創薬過程へのＮＭＲの可能な貢献は、Ｒｏｂｅｒｔｓ（２０００年；ＤＤＴ、５：２３０頁）によってレビューされている。今日、ＮＭＲ技術によるＳＡＲ（核磁気共鳴による構造活性相関）（Ｓｈｕｋｅｒら、１９９６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：１５３１頁）、「形状スクリーニング（ｓｈａｐｅｓ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）」（Ｂｅｍｉｓ、１９９６年、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：２８８７頁）、及びＮＭＲ−Ｓｏｌｖｅ（構造に基づくライブラリー結合価工学（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｖａｌｅｎｃｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）のような方策は、創薬における広い応用を有する（Ｐｅｌｌｅｃｃｈｉａら、２００２年、Ｎａｔｕｒｅ、１：２１８頁）。
【０１１５】
均一な同位体標識、選択的標識及びセグメント標識は、ＮＭＲに適用される公知の標識技術である。タンパク質の均一な同位体標識は、多次元的三重共鳴実験による逐次的な帰属を通した帰属過程を可能にし、タンパク質構造のデノボ決定における高次構造の制約の収集を支援する（Ｋａｙら、１９９７年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：７２２頁）。
【０１１６】
個々のアミノ酸又はタンパク質内のある種のアミノ酸の選択的標識は、一般的にスペクトルの著しい簡略化をもたらす（Ｐｅｌｌｅｃｉａら、２００２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．ＮＭＲ  ２２：１６５頁；Ｓｔｒａｕｓｓら，２００３年、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ  ２６：３６７〜３７２頁）。選択的標識は、完全なアミノ酸補体を有する培地を使用して、選択された非標識のアミノ酸を所望の安定同位体で標識されたものによって置換することによって達成することが可能である。典型的条件下で、酵母と藻類の自己消化物の総量は、増殖及びタンパク質産生に重大な影響を及ぼさずに０．１％（ｗ／ｖ）に減らすことができ、これにより最大５％標識取り込みが希釈される。しかし、一部のアミノ酸、特にＧｌｕ及びＧｌｎの置換は、他の（非必須）アミノ酸への標識の混入をもたらす。
【０１１７】
変形方法は、ポリペプチド鎖の別々のセグメントが一様に標識されているが他はそうでない、「セグメント標識」である（Ｘｕら、１９９９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６：３８８頁）。
【０１１８】
膜タンパク質のＮＭＲ分析については、固体ＮＭＲ（ＳＳ  ＮＭＲ）（Ｅｒｎｓｔ、Ｒ．Ｒ．ら、１９８７年：一次元及び二次元における核磁気共鳴の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｎ  Ｏｎｅ  ａｎｄ  Ｔｗｏ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ）、オックスフォード、Ｃｌａｒｅｄｏｎ  ｐｒｅｓｓ内；Ｍｅｈｒｉｎｇ、Ｍ．、１９８３年：固体における高分解能ＮＭＲの原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＮＭＲ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄｓ）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ内）が、最も適当な技術である。とりわけＳＳ  ＮＭＲが、膜内の受容体標的と結合しているときのリガンドに関する、リガンド−タンパク相互作用の日常的アッセイの実施を可能にする（ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ、２０００年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：５９３頁）。全ての処方薬の６０％が膜タンパク質を標的にし、Ｇタンパク質結合結合受容体ファミリーが際立っている事実が示しているように、これは医薬産業、必須膜タンパク質にとって特に興味がある（Ｅｓｓｅｎ、Ｌ−Ｏ．、（２００２年）Ｇｅｎｅ  Ｆｕｎｃｔ．Ｄｉｓ．、３、３９頁）。ＳＳ  ＮＭＲ技術において、ＮＭＲスペクトルの拡幅をもたらし、分子構造情報の抽出を可能にする、異方性の相互作用を扱うために使用することが可能な２つの方法がある。１つは、配向試料内のスペクトルの異方性を利用して静止試料で分子配向を提供することであり（Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｒ．Ｇ．、（１９９８年）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５、５０８頁、Ｏｐｅｌｌａ、Ｓ．Ｊ．ら（１９９９年）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６、３７４頁）、また、第２はマグネチックアングルスピニング（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｎｇｌｅ  ｓｐｉｎｎｉｎｇ）（ＭＡＳ）ＮＭＲでランダムな分散を使用することであり（Ａｎｄｒｅｗ、Ｅ．Ｒ．ら、（１９５８年）Ｎａｔｕｒｅ  １８２、１６５９頁）、そこでは配向情報は失われるかもしれないが、スピニング側帯波の分析から復帰させることが可能である。更に、双極子カップリングを再び集中させて正確な距離制約を与えること、並びに化学シフト情報を提供して局所の環境特性を明確にすることが可能である。
【０１１９】
ＭＡＳに基づく方法を都合よく適用して、Ｘ線結晶学で可能な分解能を大きく超えて核間距離又はねじれ角を決定することができる（Ｔｈｏｍｓｏｎ、Ｌ．Ｋ．（２００２年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１２、６６１頁）。一様に標識されたペプチド及びタンパク質の構造決定の必要条件は、異核及び等核帰属技術である。両方の態様のために、様々なパルススキームが当技術分野で利用できる（Ｂａｌｄｕｓら、（１９９８年）Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓ．、９５、１１９７頁；及び、Ｂｅｎｎｅｔｔ、（１９９４年）：「ＮＭＲ基本原則及び進歩（ＮＭＲ  Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ）」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ、３３：１頁）。ＭＡＳ  ＮＭＲで測定したタンパク質構造の最近の例（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉら、（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ、４２０（７）９８頁；及び、Ｐａｕｌｉら（２０００年）Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓ．１４３；４１１頁）は、６２のアミノ酸残基を含んでいるα−スペクトリンＳｒｃ−相同性３（ＳＨ３）ドメインであり、そこではタンパク質の微晶質標品のためのほとんど完全な１３Ｃ及び１５Ｎ共鳴の帰属が、一組の距離制約の抽出の基礎となっていた。紅色非硫黄光合成菌Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌａ  １００５０からの光収穫複合体ＬＨ２の膜貫通部の共鳴の多くが報告された（Ｅｇｏｒｏｖａ−Ｚａｃｈｅｍｙｕｋら（２００１年）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ、１９、２４３頁）。部分的な帰属もユビキチン（Ｈｏｎｇ、（１９９９年）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ、１５：１頁；Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ、Ｍ．（１９９９年）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、５１、２０８頁）及びＢＰＴＩ（ＭｃＤｅｒｍｏｔｔら、（２０００年）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ．、１６、２０９頁）について報告された。これらのペプチド内の残基数も、配向脂質二重層で最近研究された膜貫通又は表面結合のペプチドに都合よく匹敵する（Ｏｐｅｌｌａ、Ｓ．Ｊ．ら、（１９９９年）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６、３７４頁）。したがって、ＭＡＳに基づく相関法は、膜タンパク質トポロジー全体又はそのサブセクションの研究にも使用することができることが推測される。
【０１２０】
通常、洗練された同位体標識スキームとＮＭＲ計測における更なる改善との組み合わせにより、ＮＭＲで対処可能な受容体／リガンド系の大きさ及び複雑度は広がる。更に、並行して膜タンパク質の発現が進歩することにより、ＮＭＲの将来性はかなり高い。固体ＮＭＲは、非晶性環境におけるタンパク質の直接検査、（定義された脂質内で再構成された）単一の種としての、又は他のタンパク質及び脂質の異質環境（天然の膜）内で、しかし、重要なことは不安定化していない条件下での膜内タンパク質の直接検査、解像する膜に関しての配向制約の詳述、特に活性リガンド結合部位にあるタンパク質の特定部分の識別及び解像、分子量限界のないタンパク質の研究（この場合、帰属方策は更に開発されなければならない）、結合リガンドのための化学シフトデータから定義すべき膜結合受容体のリガンドのためのファルマコフォアの定義を可能にする。しかし現在まで、極少数の膜タンパク質又はペプチドがＳＳ  ＮＭＲを使用して研究されてきたに過ぎない。３Ｄ結晶化などの構造学的方法、及びＸ線結晶解析又は代わりにＮＭＲ分光法は、少なくとも約１０ｍｇの高度に精製された膜タンパク質を必要とする。
【実施例】
【０１２１】
（実施例１）
安定同位体標識されたバイオマス、加水分解産物及びそれからの抽出物の生成（供与源として酵母）
１．１  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから得られたアミノ酸及び糖の供与源を含んでいる酵母抽出物
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＡＴＣＣ  １３０５７）は、下記を含んでいる培地で増殖させた（ｇ／１）：１３Ｃで一様に標識されたグルコース−１５ｇ／ｌ、標識ＫＨ２ＰＯ４−２ｇ、１５ＮＨ４Ｃｌ−１．５ｇ、ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ−０．５ｇ、ＣａＣｌ２×６Ｈ２Ｏ−０．２５ｇ、ＦｅＳＯ４×６Ｈ２Ｏ−０．０３６、ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ−０．００１ｇ、ＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ−０．００１ｇ、ＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ−０．００１ｇ。ビタミン類は、Ｈｅｉｎｅ、Ｗ．らによって小児栄養及び代謝の研究における安定同位体（Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ  ｉｎ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（１９９０年）（Ｔ．Ｅ．Ｃｈａｐｍａｎ、Ｒ．Ｂｅｒｇｅｒ、Ｄ．Ｊ．Ｒｅｉｊｎｇｏｕｄ及びＡ．Ｏｋｋｅｎ編、Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ  Ｌｔｄ．８４頁）で記載されているのと同じ濃度で加えられた。酵母は、１２０℃で２０分殺菌され、ＮａＯＨでｐＨ４．５に調節された培地２．５ｌを含んでいる１０ｌのコニカルフラスコで、振盪培養により培養した。このフラスコに、１００ｍｌの種培養を移した。種培養は、フラスコ内で２７℃で１８時間振盪培養して得られた。酵母は、２７℃で２０時間、８００ｒｐｍで増殖させた。酵母細胞は、４℃において５，０００ｇで１０分間の遠心分離によって収集し、二回水洗した。洗浄した細胞に水を加えて、乾燥重量換算で約１００ｍｇ／ｍｌの濃度の酵母スラリーを５００ｍｌ調製した。
【０１２２】
スラリーの容積の半分を凍結乾燥して、酵母加水分解産物の調製のために使用した。酵母加水分解産物は、実施例５．１で記載されているように調製した。
【０１２３】
スラリーの他の半分は、自己消化のために使用された。移行時間を２０秒以下に保ちながら６５℃に保った曲がった注射器（内径２〜３ｍｍ）を通してわずかな圧力の下で圧搾し、それを氷上のフラスコで収集した。その後、スラリーを油サーモスタット内で４５℃で４時間保ち、その間、２０％ＮａＯＨを１滴ずつ追加してｐＨを８．０に調節した。自己消化後、ｐＨを２ＮＨＣｌで６．５に調節し、自己消化物は８０℃に暖めた。その後、自己消化物を遠心分離して、沈殿物を２回水洗した。自己消化物を含む上清を合わせた４００ｍｌを次に１０，０００のカットオフフィルタを通して濾過して凍結乾燥し、１５ｇの酵母抽出物を得た。
【０１２４】
酵母抽出物の化学分析は、Ｔ．Ｈｅｒｎａｗａｎ、Ｇ．Ｆｌｅｅｔ、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５年）１４、４４０頁で記載されているように実施した。一般的に始原細胞乾燥重量に換算すると、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの可溶性自己消化物は、炭水化物（４〜８％）、タンパク質（１２〜１５％）、有機酸（３〜５％）、遊離アミノ酸（１０〜１２％）、オリゴペプチド（３０〜３４％）、核酸生成物（３〜５％）、脂質（２〜３％）及び他の生理活性化合物からなっていた。
【０１２５】
１．２  酵母自己消化のための代替プロトコル
実施例１．１で記載されているように得られた酵母スラリーに対して、２容量パーセントのエタノールを加えて、自己消化を５０℃で１２時間実施した。次に、酵母自己消化物を６分間、超音波チップ超音波処理器で処理し、その後５０００ｇで１０分間遠心分離を行った。残留物を２回蒸留水で洗浄して１５分間遠心分離した。合わせた上清を１０，０００カットオフのメンブランフィルタを通して濾過して凍結乾燥した。その結果、アミノ酸、ペプチド、炭水化物、核成分、有機酸及び他の成分の混合物が得られた。この方法は、遊離アミノ酸含量の８０％までの増加を可能にする。
【０１２６】
１．３  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの酵母抽出物
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＮＲＲＬ−Ｙ−１１４３０は、Ｍ．Ｊ．Ｗｏｏｄ及びＥ．Ａ．Ｋｏｍｉｖｅｓ、（１９９９年）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ  １３、１４９頁で記載されているように１３Ｃ標識グリセリン及びグルコースを炭素エネルギー基質として、また（１５ＮＨ４）２ＳＯ４を窒素源として、又は、１３Ｃメタノールを炭素及びエネルギー源として増殖させた。酵母抽出物（酸加水分解物及び自己消化物）は、実施例１．１、１．２及び５．１で記載されているのと同じ方法を使用して得られた。
【０１２７】
１．４  Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの酵母抽出物
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ  ＣＢＳ  ４７３２（別名、ＡＴＣＣ  ３４４３８、ＮＲＲＬ  Ｙ−５４４５）は、１５Ｎ標識塩が窒素源として使用され、一様に１３Ｃで標識されたグルコース及び１３Ｃで標識されたメタノールが炭素及びエネルギー源として使用された、Ｙ．Ｌａｒｏｃｈｅら（１９９４年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：１１１９頁、Ｔｈ．Ｅｇｌｉら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９８２年）１３１、８頁、及びＶａｎ  Ｄｉｊｋｅｎら、（１９７６年）Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１１：１３７頁で記載されたものと類似の培地で、メタノール制限流量調整連続培養により増殖させた。培養は、３５℃、ｐＨ５．０で実施した。酵母抽出物（酸加水分解物及び自己消化物）は、実施例１．１、１．２及び５．１で記載されているのと同じ方法を使用して得られた。
【０１２８】
１．５  酵母バイオマスの大規模作製
系全体（温度、ｐＨ、酸素、窒素、空気の供給、溶存酸素）を完全に制御するために、３リットルの発酵槽（ＢｉｏＦｌｏ３０００、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を酵母培養のために使用した。最適な酵母増殖は、酸素２５％及び窒素７５％の通気により、３５％の溶存酸素レベルで達成された。酵母は、修正Ｈｅｉｎｅの培地、又はグリセリンがグルコースによって置換された修正インビトロゲン培地の２リットルを使用して、３０℃で増殖させた。撹拌速度は、５００ｒｐｍであった。両方のケースでは、全ての炭素及び窒素源は、同位体標識類似体で置換された。グルコースはバッチで加えたか、又はフェドバッチ培養を適用した。
【０１２９】
（実施例２）
安定同位体標識されたバイオマス、加水分解産物及びそれからの脂質抽出物の生成（供与源として藻類）
２．１  安定同位体標識されたＣｙａｎｉｄｉｕｍバイオマスの作製
Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍ（ＳＡＧ  １６．９１）及びＧａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（ＳＡＧ  １７．９１）は、それぞれ恒温水槽内の磁気撹拌子を有する５１のフラスコで２５℃、定常ｐＨ２で独立栄養的に増殖させ、指数増殖期に収穫した。Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍ及びＧａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａの１３Ｃ及び１５Ｎで二重標識された培養物のための培地組成は、１リットルにつき１．５ｇの（１５ＮＨ４）２ＳＯ４、０．３ｇのＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．３ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．０２ｇのＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、１．５ｍｌのＦｅ−ＥＤＴＡ溶液（Ｆｅ−ＥＤＴＡ溶液は、０．６９０ｇのＦｅＳＯ４及び０．９３０ｇのＥＤＴＡを１００ｍｌまでの蒸留水に加えて溶液を煮沸することにより調製した）、及び別に調製した（下記参照）微量元素溶液の２ｍｌを含む。培地のｐＨは、１ＮＨ２ＳＯ４でｐＨ１．８の値に調節した。微量元素溶液は１リットルにつき以下を含む：２．８６ｇのＨ３ＢＯ３、１．８２ｇのＭｎＣｌ２、０．２２ｇのＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．１３０ｇのＮａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ、８０ｍｇのＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ、４０ｍｇのＮａＶＯ３×４Ｈ２Ｏ、及び４０ｍｇのＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ。
【０１３０】
８０００ルクスの連続スペクトル光源が１５Ｗの蛍光ランプによって、最大５％の１３ＣＯ２濃度の下で供給された。藻類懸濁液の増殖は、５５０ｎｍにおける吸光度測定によって分析した。増殖が指数増殖期（通常５日）（０．６４ＯＤ）に到達したとき、ベックマン遠心分離機を５０００ｒｐｍで１０分間使用して細胞を収穫し、ペレットは蒸留水で洗浄して微量の可溶性栄養素を除去した。得られたペーストを凍らせ、凍結乾燥した。凍結乾燥された細胞は、脂質抽出物及び加水分解産物の調製のために使用された。
【０１３１】
２．３  安定同位体標識された緑藻類バイオマスの作製（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓ）
Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓの１３Ｃ及び１５Ｎで二重標識された藻類バイオマスは、Ｐａｔｚｅｌｔ、Ｈ．ら、１９９９年  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５０：２１５〜２１７頁に記載されているように生産された。Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓ系統２７６／３Ｃ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ（ＣＣＡＰ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ  ｅｃｏｌｏｇｙ、Ａｍｂｌｅｓｉｄｅ、英国から得る）をｐＨ６．５、３０℃で独立栄養的に増殖させて、指数増殖期に収穫した。Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓの系統の１３Ｃ及び１５Ｎで二重標識された培養物のための培地組成は、１リットルにつき０．１８ｇのＮａ２ＨＰＯ４×２Ｈ２Ｏ、０．４８ｇのＮａＨ２ＰＯ４、０．４６のＮａＣｌ、０．２５ｇのＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、６ｍｇのＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、６．５ｇのＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、８ｍｇのＥＤＴＡ、２．９ｍｇのＨ３ＢＯ３、１．８ｍｇのＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ、０．２２ｇのＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．２５ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ、０．０８ｍｇのＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ、０．０８ｍｇのＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ及び０．８１ｇのＫ１５ＮＯ３を含む。培地のｐＨは、６．５であった。培地は、溶存ＣＯ２を全て除去するために、大規模に脱ガスした蒸留水で調製した。１３ＣＯ２は、ＮａＨ１３ＣＯ３の炭酸緩衝液溶液として培養系に供給した。
【０１３２】
予備培養のために、２つの貯蔵器を使用した。下部貯蔵器は、２Ｍ炭酸（Ｎａ２１３ＣＯ３／ＮａＨ１３ＣＯ）緩衝液、ｐＨ７．５（１００ｍｌ）を含み、上部フラスコは接種源を含む。接種後、フラスコを密封して３０℃の連続照明下で１０日間、６０ｒｐｍで振盪した。２０００ルクスの連続光源が１５Ｗの蛍光ランプ（冷白色）によって供給された。緩衝液の調製のために、ｐＨが９．３になるまで１ｌの１．２ＭＮａＯＨを１６ｌの１３ＣＯ２と共に発泡させ、５０ｍｇのフェノールフタレインをｐＨのモニタリングのために加えた。
【０１３３】
調製用発酵のためには、１０個の２．５ｌファーンバックフラスコ（フラスコに１ｌの培地と５ｍｌの接種源を含む）、炭酸緩衝液及び気体ポンプからなる閉鎖系が使用された。空気は円内を循環しているので、細胞培養は１３ＣＯ２に富む空気で追跡することができる。藻類は１０〜１４日間生育していた。圧縮空気内の５％の１３ＣＯ２の定常流が、ファーンバックフラスコの上に吹きつけられた。藻類懸濁液の増殖は、６８５ｎｍにおける吸光度測定によって分析した。増殖が１７日で指数増殖期（１．０ＯＤ）に到達したとき、ベックマン遠心分離機を５０００ｒｐｍで１０分間使用して４℃で細胞を収穫し、ペレットは蒸留水で洗浄して微量の可溶性栄養素を除去した。培養液は、更なる生育環（濾過後）のために使用された。得られたペーストを凍らせ、凍結乾燥した。水が存在するとクロロフィラーゼがクロロフィルを破壊する可能性があるので、凍結乾燥は必須である。バイオマスの収率は、１培養物につき２ｇの凍結乾燥細胞であった。凍結乾燥された細胞は、脂質抽出物及び加水分解産物の調製のために使用された。
【０１３４】
２０１のバイオリアクターへの藻類の増殖のアップスケーリングは、類似した結果を与えた。
【０１３５】
（実施例３）
安定同位体標識されたバイオマス、加水分解産物及びそれからの抽出物の生成（供与源としてメチロトローフ細菌）
３．１  メチロトローフ細菌からのバイオマスの作製
絶対メチロトローフ性のＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ（ＡＴＣＣ  ５１４８４、ＶＫＭ  Ｂ−１６１０、ＤＳＭ  ６８７５）を、１３Ｃ標識メタノールを炭素源として、１５ＮＨ４Ｃｌを窒素源として、寒天を含まないＡＴＣＣ培地７８４  ＡＭＳ上で３０℃、ｐＨ６．８で増殖させた。標識された１３Ｃメタノールの濃度は、１％であった。細胞は、１０ｌの発酵槽で増殖させ、３日後に収穫した。バイオマスの収率は、１３Ｃ−メタノール換算で５３％であった。バイオマスは、凍結乾燥された。タンパク質の収率は、乾燥バイオマス換算で７５％であった。凍結乾燥された細胞は、脂質抽出物及び加水分解産物の調製のために使用された。
【０１３６】
（実施例４）
安定同位体標識された脂質の抽出
４．１  藻類バイオマスの抽出（方法１）
Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄｒｉｕｍの凍結乾燥細胞（１０ｇ）を、３０秒間５０％の力を交互に加えることにより、氷上（冷却は氷に塩を加えて達成された）のジクロロメタン内で音波破砕により３０分間ホモジナイズし、ソックスレー抽出器に移した。抽出を３０時間継続し、次に、抽出物が無色になるまで更に２４時間９０％のメタノール水で続けた。合わせた抽出物を窒素下で、回転乾燥機上で蒸発させ、セファデックスクロマトグラフィーにより非脂質分画及び脂質分画に分離した。Ｗｕｔｈｉｅｒ、Ｒ．Ｅ．、（１９６６年）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．７：５５８〜５６１頁。Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ  Ｍ．Ｇ．及びＭｃＭａｈｏｎ、Ｖ．Ａ．（１９７０年、Ｐｌａｎｔ  ｐｈｙｓｉｏｌ、４６：２８６〜２８９頁）によって記載されているように、脂質分画を蒸発させてｎ−ヘキサンジエチルエーテルに溶かし、次にケイ酸カラムによるクロマトグラフィーで分析した。典型的脂質は、ワックス、炭化水素、ステロールエステル、トリグリセリド、ステロール、遊離脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、糖脂質、スルホリピド及びリン脂質であった。全体で、１５０ｍｇの脂質が、１ｇのバイオマスから単離することができた。Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍの主な脂質は、モノ−及びジガラクトシルジグリセリド及びスルホリピド、レシチン、フォスファチジルグリセリン、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルエタノールアミンである。
【０１３７】
或いは、Ｉｋａｎ、Ｒ．、Ｓｅｃｋｂａｃｈ、Ｊ．（１９７２年）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１１：１０７７〜１０８２頁によって記載されているように、脂肪酸及びステロールの精製は、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍの１ｇの乾燥バイオマスから得たソックスレー抽出物の混合物（総量が１６０ｍｇの脂質抽出物）から行うこともできた。その結果、３２ｍｇの遊離脂肪酸及び中性分画の鹸化からの３９ｍｇの脂肪成分が得られた。ステロールは非鹸化分画から単離され（Ｉｋａｈ、上記）、それらの量は２ｍｇであった。
【０１３８】
この方法は、藍藻類、紅藻類及びｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅからの脂質抽出のために使用された。
【０１３９】
４．２  藻類バイオマスの抽出（方法２）
Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓの凍結乾燥１３Ｃ、１５Ｎ標識バイオマス１０グラムの量に１００ｍｌのヘキサンを加え、試料をチップソニケーターで−４℃（冷却は氷に塩を加えて達成した）で少なくとも６０分間、超音波処理した。溶媒を濾過で除去し、バイオマスの残分を１００ｍｌのアセトンで抽出し、次に、ヘキサン抽出の場合に上で記載したのと同じ方法を実施した。最後に、残りのバイオマスを１００ｍｌのジクロロメタン／メタノール混合物（２：１、ｖ／ｖ）で抽出した。濾液を窒素の下で別々に蒸発乾固し、−８０℃で保存した。アセトン抽出物は、更に純粋な形態で単離することができ、且つ例えば光合成における色素−タンパク相互作用の構造−機能研究のために使用することができる、均一標識色素の供与源を含む。藍藻類、紅藻類及びｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅの場合には、９０％ＭｅＯＨ水による抽出を含む追加のステップを使用した。抽出物は、先に述べたように扱った。脱脂したバイオマス（乾燥重８ｇ）を次に加水分解産物の調製のために使用した。
【０１４０】
この方法は、全ての供与源からの脂質抽出のために使用された。
【０１４１】
４．４  紅藻類バイオマスの抽出（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）
Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ（＝Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）（ＡＴＣＣ  ５０１６１）をＡＴＣＣ  １４９５  ＡＳＷ培地で２５℃及びｐＨ７．６で増殖させたが、ＫＮＯ３及びＮａＨＣＯ３の代わりにＫ１５ＮＯ３及びＮａＨ１３ＣＯ３を用い、また培地１リットルにつき５４ｇのＮａＣｌを用いた。藻類の培養物は、蛍光ランプを用いて２５Ｗ／ｍ２の光強度で連続的に照射した。脂質は、方法１（実施例４．２）に従って抽出し、太田ら、１９９３年、Ｂｏｔａｎｉｃａ  ｍａｒｉｎａ、３６：１０４３〜１０７頁で記載されている方法により測定した。そのような培養条件を使用して、高濃度のＣ２０：４（ｎ−６）及びＣ２０：５（ｎ−３）、即ち、１ｇ乾燥重のバイオマスにつき８．２ｍｇの乾燥重量及び１４．３ｍｇの乾燥重量が達成された。
【０１４２】
４．５  メチロトローフバイオマスの抽出（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）
Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ（１０ｇ）のバイオマスは、４．３で記載されているように抽出された。脱脂したバイオマス（８．５ｇ）を、次に実施例５．１及び５．２で記載されているように加水分解産物の調製のために使用した。
【０１４３】
４．６  分析のための脂質のエステル交換
Ｌｅｗｉｓら（２０００年、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈ．４３：１０７〜１１６頁）によって記載されているように、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａから抽出された脂質をエステル交換して脂肪酸メチルエステルを形成し、ガスクロマトグラフ技術を使用しての脂肪酸の同定及び定量化を可能にする。記載されているように、凍結乾燥させた細胞を計量し（５ｇ）、それにエステル交換反応混合液（１０／１／１、ｖ／ｖ／ｖ）の新鮮溶液を加えた。細胞をボルテックスミキシングによってこの溶液に懸濁し、エステル交換のために直ちに９０℃に６０分間置いた。次に、エステル交換反応チューブを冷却し、水（１ｍｌ）をそれぞれのチューブに加え、脂肪酸ジメチルエーテルを抽出した（ヘキサン／クロロホルム、４／１、ｖ／ｖ、３×４ｍｌ）。有機溶媒抽出物の化学的同一性は、ＴＬＣ（例えばシリカゲル、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、５：１）及びＨＰＬＣ（Ｃ１８、ｇｒａｄ．Ｍｅ２ＣＯ−Ｈ２Ｏ（１：４）Ｍｅ２ＣＯ）によって監視した。同位体組成は、ＥＩ−ＭＳ（７０  ｅＶ）及び／又は赤外分光分析で測定した。
【０１４４】
（実施例５）
バイオマスの加水分解
５．１  同位体標識バイオマスの酸加水分解
このようにして得られて２４０ｍｌのフラスコに置かれた脂質及び色素を含まないバイオマス（実施例４．２）の１グラムの量に対して、還元剤（ヒスチジン及びトリプトファンの破壊を予防するために）として１５ｍｌの６ＮＨＣｌ及び０．６ｍｌのチオグリコール酸を加えた。加水分解は、アルゴン下及び１１０℃（油浴上）で２４時間実施された。氷上で冷やした加水分解産物に１５ｍｌの蒸留水を加え、次にガラスＰ３フィルタで濾過した。この後、加水分解産物を２つの部分に分け、２つの丸底フラスコ内で凍結乾燥した。１０ｍｌの蒸留水を次に各加水分解産物に加え、それらの１つは３０％ＮａＯＨで中和し、他は３０％１５ＮＨ４ＯＨで中和した。各部分の半量を、ガラスＰ３フィルタで調製した２０〜１００Åの粗い目の活性炭に通過させた（高さ２ｃｍのカラム）。その結果、４つの加水分解産物を得、それらは更に凍結乾燥した。凍結乾燥により、活性炭を通した加水分解産物では白色固体粉末（アミノ酸／糖混合物）が、活性炭で処理しない加水分解産物ではハシバミ色の粉末が得られた。加水分解産物（４種類）を更に磨砕して均一な粉体を調製した。
【０１４５】
或いは、加水分解産物は「活性炭工程」なしで調製され、例えばＳｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓ（並びにＣｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍ）の場合には、１５ＮＨ４ＯＨで中和された加水分解産物の０．６ｇ及びＮａＯＨで中和された加水分解産物の０．７ｇを、１ｇの脱脂バイオマスから得た。２０ｇの脱脂バイオマスの加水分解のためには、ほとんどの場合アップスケール方法を使用した。１５ＮＨ４ＯＨで中和された加水分解産物は、優先して昆虫及び哺乳動物細胞の培地の調製のために使用された（実施例６を参照）。
【０１４６】
例えば１５ＮＨ４ＯＨで中和したＣｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍの加水分解産物のアミノ酸組成（ＲＰ  ＨＰＬＣ  ＦＭＯＣ誘導体化方法に基づき測定）は、Ａｌａ−８．８％、Ａｒｇ−５．１％、Ａｓｐ−５．２％、Ｇｌｕ−９．５％、Ｇｌｙ−７．３％、Ｈｉｓ−０．８％、Ｉｌｅ−６．７％、Ｌｅｕ−６．５％、Ｌｙｓ−５．６％、Ｍｅｔ−３．２％、Ｐｈｅ−６．３％、Ｐｒｏ−７．６％、Ｃｙｓ−０．８％、Ｓｅｒ−１１％、Ｔｒｐ−０．８％、Ｔｈｒ−６．１％、Ｔｙｒ−１．２％、Ｖａｌ−７．５％であった。
【０１４７】
加水分解産物は、昆虫及び哺乳動物の細胞培地の直接組成のために、又は、イオン交換クロマトグラフィー（ＣｒｅｓｐｉとＫａｔｚ、１９７２年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６、６２７頁）若しくは逆相クロマトグラフィー（Ｅｇｏｒｏｖａら、Ｔ．Ａ．、（１９９５年）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ６６５：５３〜６２頁）による純粋アミノ酸の調製のために更に使用された。
【０１４８】
或いは、加水分解産物は、カットオフ８Ｋのカセット膜及び０．２ミクロン滅菌Ｄｕｒａｐｏｒｅフィルタを通して限外濾過されるだろう。殺菌された加水分解産物は、４℃で６ヵ月の間保存することができた。
【０１４９】
酸加水分解法の改良の目的は、低塩分の加水分解産物を調製することである。この改良方法において、凍結乾燥工程は２回実施された。１回目は加水分解（大部分のＨＣｌも除去するため）直後に、２回目は、水酸化ナトリウム又は１５Ｎ標識水酸化アンモニウムによる中和の後である。
【０１５０】
５．２  安定同位体標識されたバイオマスの酵素加水分解
Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓの脱脂バイオマスを、Ｔｒｏｘｌｅｒら（１９７５年）１４（２）：２６８〜２７４頁によって記載されたのと同様に酵素で加水分解した。固定化プロナーゼ（Ｆｌｕｋａ、スイス）をピアスの説明書に従って調製し、酵素加水分解のために使用した。消化物を凍結乾燥して哺乳動物及び昆虫の細胞の培地の成分として使用した。
【０１５１】
５．３  安定同位体標識された藻類バイオマスの自己消化
上の実施例１．１及び１．２で記載した酵母自己消化抽出物の作製方法を、藻類バイオマスから自己消化物を得るために応用した。様々な藻類、例えばＣｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍ及びＧａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａからの安定同位体標識バイオマスは、このように都合よく自己消化させた。自己消化物の収率は、乾燥バイオマス換算で３５〜４５％であった。残りのバイオマス物質は、藻類の加水分解産物を得、且つ標識バイオマスを有効利用するために、（実施例５．１で記載されているように）酸加水分解された。
【０１５２】
（実施例６）
同位体標識栄養培地の組成
６．１．１  昆虫細胞のための安定同位体標識栄養培地の組成Ｉ
微量元素、塩及びビタミン類に関する培地の組成は、ＮａＨ１３ＣＯ３及びモリブデン酸ナトリウムが使用されたのを除いてＩＰＬ−４１処方（Ｗｅｉｓｓら、１９８１年、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ（１７）：４９５〜５０２頁）に基づいた。培地の他の成分は、下記の表で示した濃度で加えた。
【表１】
2007527212.tif 000002
【０１５３】
脂質抽出物は、１ｍｌのエタノールにつき５０ｍｇの脂質抽出物の濃度（例）で調製されたエタノール溶液として、培地に加えた。エタノール脂質溶液は、５ｍｌ／培地１ｌの濃度で加えた。
【０１５４】
加水分解産物はアミノ酸分析（ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＦＭＯＣ誘導体として）によって分析し、欠失したアミノ酸（ＩＰＬ処方による）、例えば１３Ｃ、１５Ｎ標識システインは８０ｍｇ／ｌの濃度で別に培地に加えた。
【０１５５】
ｐＨは６．２に調節し、モル浸透圧濃度は３４０ｍＯｓｍｏｌ  ｋｇ−１（ＮａＣｌ）に調節する。完全培地は０．２２ミクロンフィルタを通して殺菌し、４℃で保存した。
【０１５６】
５〜１０の継代培養でＳｆ９細胞系は、Ｂｏｓｍａｎら、（Ｍｅｔｈｏｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖ．２２８、Ｓｅｌｉｎｓｋｙ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ）に従う同位体標識培地での増殖に適応した。昆虫細胞は２７℃の温度で増殖させ、ＣＯ２の補充を必要としない。適応細胞の倍加時間は、他の市販の無血清培地（Ｓ３７７７、Ｓｉｇｍａ、Ｘ−Ｃｅｌｌ  ４２０  ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＨｙＱ  ＳＦＸ−Ｉｎｓｅｃｔ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）と同等の２６〜２８時間であった。達成された最大の細胞密度は、４〜６×１０６細胞数／ｍｌであった。
【０１５７】
６．１．２  昆虫細胞のための安定同位体標識栄養培地の組成ＩＩ
微量元素、塩及びビタミン類に関する培地の組成は、ＮａＨ１３ＣＯ３及びモリブデン酸ナトリウムが使用されたのを除いてＩＰＬ−４１処方（Ｗｅｉｓｓら、１９８１年、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ、１７：４９５〜５０２頁）に基づいた。培地の他の成分は、下記の表で示した濃度で加えた。
【表２】
2007527212.tif 000003
【０１５８】
脂質抽出物は、１ｍｌのエタノールにつき５０ｍｇの脂質抽出物の濃度で調製されたエタノール溶液として、培地に加えた。エタノール脂質溶液は、５ｍｌ／培地１ｌの濃度で加えた。この例の脂質抽出物の添加は任意選択であり、使用した濃度では最高１０％程度しか細胞増殖を増やさなかったことに注意されたい。脂質抽出物無添加でも細胞は増殖してタンパク質を産生した。
【０１５９】
加水分解産物はアミノ酸分析（ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＦＭＯＣ誘導体として）によって分析し、（標準のＩＰＬ−４１処方に関して）欠失したアミノ酸、例えば１３Ｃ、１５Ｎ標識システイン及びグルタミンは、８０ｍｇ／ｌの濃度で別々に培地に加えた。ｐＨは６．２に調節し、モル浸透圧濃度は３４０ｍＯｓｍｏｌ  ｋｇ−１（ＮａＣｌ）に調節する。完全培地は０．２２ミクロンフィルタを通して殺菌し、４℃で保存した。５〜１０継代培養でＳｆ９細胞系は、Ｂｏｓｍａｎら、（Ｍｅｔｈｏｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖ．２２８、Ｓｅｌｉｎｓｋｙ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ）に従う同位体標識培地での増殖に適応した。昆虫細胞は２７℃の温度で培養し、ＣＯ２の補充を必要としない。適応細胞の倍加時間は、他の市販の無血清培地（Ｓ３７７７、Ｓｉｇｍａ、Ｘ−Ｃｅｌｌ  ４２０  ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＨｙＱ  ＳＦＸ−Ｉｎｓｅｃｔ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）と同等の２６〜２８時間であった。達成された最大の細胞密度は、４〜６×１０６細胞数／ｍｌであった。
【０１６０】
６．１．３  昆虫培地に及ぼす様々な成分の濃度の影響
合計で１０を超える異なる微生物からのバイオマスを試験し、１００を超える異なる加水分解産物及び自己消化物がこれらのバイオマス標品から調製し、微生物バイオマスそれぞれにつき１０を超える異なる脂質抽出物を試験した。これらの試験から、以下の一般観察が得られた。
【０１６１】
全般に、酵母自己消化物は０．１〜１．６（ｗ／ｖ）％の濃度範囲で取り込まれる。グリセリンがグルコースによって置換されている市販のインビトロゲン培地で育てたＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓバイオマスに基づく自己消化物は、昆虫細胞増殖の維持に関して最高の再現性及び効率を示し、自己消化物のための最適濃度範囲は０．１〜０．３％で、０．２％が最適であった（ｗ／ｖ）。修正ハイネの培地（乳酸が省かれる）上で育てたＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａバイオマスに基づく自己消化物は、昆虫細胞増殖に関して最高の再現性、効率を示し、最適濃度範囲は０．４〜０．８（ｗ／ｖ）％であった。酵母自己消化物は、通常少量の加水分解産物（更なるアミノ酸のために）の添加により、又は、少数の選択されたアミノ酸を加えただけでも有効である。発明者らのＩＰＬ−４１に基づく培地及び細胞系を用いると、酵母自己消化物に加えてグルタミンが必要であった。
【０１６２】
全般に、藻類自己消化物は０．１〜０．８（ｗ／ｖ）％の濃度範囲で取り込まれる。最適濃度は藻類の供与源によって決まる可能性があり、例えば、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａについては最も有効な濃度は０．１％であったが、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍについては０．４（ｗ／ｖ）％であった。藻類自己消化物も同じく、通常少量の加水分解産物（更なるアミノ酸のために）の添加により、又は、少数の選択されたアミノ酸を加えただけでも有効である。ここではグルタミンだけが藻類の自己消化物に加えて必要であった。対照的に、藻類の加水分解産物は、単一成分（０．１〜０．８（ｗ／ｖ）％の濃度範囲が試験された）ほど有効ではなく、少なからぬ数の選択されたアミノ酸を補う必要がある。
【０１６３】
全般に、細菌加水分解物は０．１〜０．４（ｗ／ｖ）％の濃度範囲で取り込まれる。全般に、細菌自己消化物は０．１〜０．６（ｗ／ｖ）％の濃度範囲で取り込まれる。
【０１６４】
昆虫細胞増殖及びタンパク質産生の維持における最も有効なものは、紅藻類、好ましくはＣｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍ又はＧａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａに基づく自己消化物と酵母、好ましくはＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの自己消化物との組み合わせである（実施例６．１．２を参照）。例えば、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａのバイオマスから得られた自己消化物に基づく培地の有効性は、０．８％のＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ自己消化物が培地に添加された場合に７０％を超えて高くすることができ、且つ／又はＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａバイオマスから得られた自己消化物に基づく培地の効果は、０．１％のＧａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ自己消化物が添加された場合に６０％を超えて高くすることができた。
【０１６５】
６．２．１  哺乳動物細胞のための同位体標識栄養培地の組成
微量元素、塩及びビタミン類に関する培地の組成は、炭素及び窒素を含有する塩が安定同位体で標識されたものに置換されたことを除いて、ＤＭＥＭ処方（例えばＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、細胞培養及びサービス（Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｅｒｖｉｃｅｓ）を参照）に基づいた。培地の他の成分は、下記の表で示した濃度で加えた。
【表３】
2007527212.tif 000004
【０１６６】
脂質抽出物は、１ｍｌのエタノールにつき１５０ｍｇの脂質抽出物の濃度（例）で調製されたエタノール溶液として、培地に加えた。エタノール脂質溶液は、１ｍｌ／培地１ｌの濃度で加えた。加水分解産物はアミノ酸分析（ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＦＭＯＣ誘導体として）によって分析し、欠失したアミノ酸（ＤＭＥＭ処方による）、例えば１３Ｃ、１５Ｎ標識システイン及び１３Ｃ、１５Ｎ標識グルタミンはそれぞれ７０ｍｇ／ｌ及び１０００ｍｇ／ｌの濃度で別々に培地に加えた。ｐＨは７．２に調節し、モル浸透圧濃度は３１０ｍＯｓｍｏｌ  ｋｇ−１（ＮａＣｌ）に調節する。完全培地は０．２２ミクロンフィルタを通して殺菌し、４℃で保存した。５〜１０の継代培養でＣＨＯ細胞系は、Ｂｏｓｍａｎら、（Ｍｅｔｈｏｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖ．２２８、Ｓｅｌｉｎｓｋｙ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ）に従う同位体標識培地での増殖に適応した。ＣＨＯ細胞は３７℃の温度で培養し、１３ＣＯ２の補充を必要とする。適応細胞の倍加時間は、他の市販の無血清培地（Ｃ４７２６、Ｓｉｇｍａ、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ  ３０２、ＪＲＨ、ＣＤ  ＣＨＯ  ＡＧＴ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と同等の２８〜３０時間であった。達成された最大の細胞密度は、４〜６×１０６細胞数／ｍｌであった。
【０１６７】
６．２．２  ＨＥＫ  ２９３細胞に適する安定同位体標識栄養培地の組成
微量元素、塩及びビタミン類に関する培地の組成は、炭素及び窒素を含有する塩が安定同位体で標識されたものに置換されたことを除いて、ＤＭＥＭ処方（例えばＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、細胞培養及びサービス（Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｅｒｖｉｃｅｓ）を参照）に基づいた。培地の他の成分は、下記の表で示した濃度で加えた。
【表４】
2007527212.tif 000005
【０１６８】
脂質抽出物は、１ｍｌのエタノールにつき１５０ｍｇの脂質抽出物の濃度（例）で調製されたエタノール溶液として、培地に加えた。エタノール脂質溶液は、１ｍｌ／培地１ｌの濃度で加えた。加水分解産物はアミノ酸分析（ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＦＭＯＣ誘導体として）によって分析し、欠失したアミノ酸（ＤＭＥＭ処方による）、例えば１３Ｃ、１５Ｎ標識システイン及び１３Ｃ、１５Ｎ標識グルタミンはそれぞれ７０ｍｇ／ｌ及び１０００ｍｇ／ｌの濃度で別々に培地に加えた。ｐＨは７．２に調節し、モル浸透圧濃度は３１０ｍＯｓｍｏｌ  ｋｇ−１（ＮａＣｌ）に調節する。完全培地は０．２２ミクロンフィルタを通して殺菌し、４℃で保存した。５〜１０の継代培養でＨＥＫ−２９３細胞系は、Ｂｏｓｍａｎら、（Ｍｅｔｈｏｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖ．２２８、Ｓｅｌｉｎｓｋｙ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ）に従う同位体標識培地での増殖に適応した。ＨＥＫ−２９３細胞は３７℃の温度で培養し、１３ＣＯ２の補充を必要とする。適応細胞の倍加時間は、他の市販の無血清培地（Ｃ４７２６、Ｓｉｇｍａ、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ  ３０２、ＪＲＨ、ＣＤ  ＣＨＯ  ＡＧＴ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と同等の２６〜３０時間であった。達成された最大の細胞密度は、３〜５×１０６細胞数／ｍｌであった。
【０１６９】
６．２．３  ＣＨＯ細胞に適する安定同位体標識栄養培地の組成
微量元素、塩及びビタミン類に関する培地の組成は、炭素及び窒素を含有する塩が安定同位体で標識されたものに置換されたことを除いて、ＤＭＥＭ処方（例えばＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、細胞培養及びサービス（Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｅｒｖｉｃｅｓ）を参照）に基づいた。培地の他の成分は、下記の表で示した濃度で加えた。
【表５】
2007527212.tif 000006
【０１７０】
脂質抽出物は、１ｍｌのエタノールにつき１５０ｍｇの脂質抽出物の濃度（例）で調製されたエタノール溶液として、培地に加えた。エタノール脂質溶液は、１ｍｌ／培地１ｌの濃度で加えた。加水分解産物はアミノ酸分析（ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＦＭＯＣ誘導体として）によって分析し、欠失したアミノ酸（ＤＭＥＭ処方による）、例えば１５Ｎ標識システイン及び１５Ｎ標識グルタミンはそれぞれ７０ｍｇ／ｌ及び１０００ｍｇ／ｌの濃度で別々に培地に加えた。ｐＨは７．２に調節し、モル浸透圧濃度は３１０ｍＯｓｍｏｌ  ｋｇ−１（ＮａＣｌ）に調節する。完全培地は０．２２ミクロンフィルタを通して殺菌し、４℃で保存した。５〜１０の継代培養でＣＨＯ細胞系は、Ｂｏｓｍａｎら、（Ｍｅｔｈｏｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖ．２２８、Ｓｅｌｉｎｓｋｙ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ）に従う同位体標識培地での増殖に適応した。ＣＨＯ細胞は３７℃の温度で培養し、ＣＯ２の補充を必要とする。適応細胞の倍加時間は、他の市販の無血清培地（Ｃ４７２６、Ｓｉｇｍａ、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ  ３０２、ＪＲＨ、ＣＤ  ＣＨＯ  ＡＧＴ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と同等の２６〜３０時間であった。達成された最大の細胞密度は、４〜６×１０６細胞数／ｍｌであった。
【０１７１】
（実施例７）
同位体標識組換えタンパク質の生成
７．１．１  昆虫細胞で産生される同位体標識組換えアクアポリン−２
Ｓｆ９細胞を、１００ｍｌの培地を含んでいる５００ｍｌのスピナー瓶で培養した。培地は、実施例６．１．２で示すように調製する。Ｓｆ９細胞をＡＴＣＣ（ＣＲＬ−１７１１）から得、上記Ｂｏｓｍａｎらによって記載されているように、調製した培地に段階適応により適応させた。Ｓｆ９細胞を３×１０５細胞数／ｍｌの密度で接種し、２×１０６細胞数／ｍｌの密度まで増殖させた。次に、細胞を、Ｗｅｒｔｅｎら（２００１年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５０４：２００頁）で記載されているように構築されたＨｉｓ標識アクアポリン−２（ＡＱＰ２）をコードしている、組換えバキュロウイルスに感染させた。バキュロウイルスは、１．０のＭＯＩで加えた。培養物の試料１０μｌを毎日採取し、ドットブロッティングによってＨＴ−ＡＱＰ２の発現を追跡した。発現量は、約３ｄｐｉ（感染後日数）で最大であった。細胞を４℃における５０００ｇ、１０分の遠心分離によって収穫した。組換えＨＴ−ＡＱＰ２は、Ｗｅｒｔｅｎら（２００１年、上記）で記載されているように、尿素ストリッピングの後にＮｉ−ＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）による固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製されたＨｔ−ＡＱＰを１００ｍＭのＬ−ヒスチジンで溶出し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）脂質との混合、及び２０ｍＭリン酸塩、５０ｍＭのＮａＣｌを含んでいるｐＨ７．２の緩衝液に対して４℃で一晩透析することにより、タンパクリポソームに再構成した。最後に、６０μｇの精製タンパク質を得た。安定同位体標識の取り込みを（Ｔａｌｖｅｎｈｅｉｍｏら、２００２年、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ６７（１）：１０〜１９頁）で記載されているのと同様のＦＴＩＲ分光学で検査し、９８％（１３Ｃ）及び９９％（１５Ｎ）であることが判明した。
【０１７２】
７．１．２  昆虫細胞で産生される同位体標識組換えヒスタミンＨ１受容体
Ｒａｔｎａｌａら（２００４年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７１：２６３６〜４６頁）によって記載されているように、Ｈｉｓ標識ヒトヒスタミン１受容体（Ｈｔ−Ｈ１）をコードしているｃＤＮＡを、Ｓｆ９細胞内の組換えバキュロウイルスからの発現のために調製した。組換えウイルスはプラークアッセイで精製した後、増幅した（Ｋｌａａｓｅｎ及びｄｅ  Ｇｒｉｐ、２０００年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ３１５：１２〜２９頁）。Ｓｆ９細胞を、実施例６．１．２で示したように調製した１００ｍｌの培地を含んでいる５００ｍｌのスピナー瓶で培養した。Ｓｆ９細胞をＡＴＣＣ（ＣＲＬ−１７１１）から得、上記Ｂｏｓｍａｎらによって記載されているように、調製した培地に段階適応により適応させた。Ｓｆ９細胞を３×１０５細胞数／ｍｌの密度で接種し、３×１０６細胞数／ｍｌの密度まで増殖させた。次に、細胞を、上記したように構築されたＨｉｓ標識ヒスタミンＨ１受容体（ＨＴ−Ｈ１）をコードしている、組換えバキュロウイルスに感染させた。バキュロウイルスは、１．０のＭＯＩで加えた。培養物の試料１０μｌを毎日採取し、ドットブロッティングによってＨＴ−Ｈ１の発現を追跡した。発現量は、約４ｄｐｉ（感染後日数）で最大だった。細胞を４℃における５０００ｇ、１０分の遠心分離によって収穫した。官能性は、Ｒａｔｎａｌａら（２００４年、上記）によって記載されたように放射性リガンド結合アッセイによって試験した。
【０１７３】
組換えＨＴ−Ｈ１は、Ｒａｔｎａｌａら（２００４年、上記）で記載されているように、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）による固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製されたＨＴ−Ｈ１は、ｄｅ  Ｇｒｉｐら（１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３０：６６７〜６７４頁）によって記載されているように、１５０ｍＭのイミダゾールで溶出し、アソレクチン（ａｓｏｌｅｃｔｉｎ）と混合した後の洗浄剤のシクロデキストリン抽出によりタンパクリポソームに再構成した。最後に、２５０μｇの精製機能性タンパク質を得た。
【０１７４】
安定同位体標識取り込みはＦＴＩＲ分光分析（Ｍａｔｔｓｏｎ  Ｃｙｇｎｕｓ  １００  ＦＴＩＲスペクトロメータ、Ｍａｄｉｓｉｏｎ、ＷＩ）による、安定同位体標識によって誘発された振動シフトの定量化によって調査し、１３Ｃ及び１５Ｎの両核で９５％を超えることが判明した（下記実施例８を参照）。
【０１７５】
更に、フォローアップ構造研究のためにサンプリング条件を最適化するために、Ｂｒｕｋｅｒ  ７５０スペクトロメータにより２００Ｋ及びスピン速度８〜１２ｋＨｚで１５Ｎ  ＳＳＮＭＲデータを収集した（図１を参照）。その後この方法は、１リットルにつき少なくとも４ｍｇの機能性安定同位体標識ＨＴ−Ｈ１受容体の容積収率を有するバイオリアクター（４リットル）にスケールアップされた。
【０１７６】
７．１．３  ＣＨＯ細胞で産生された同位体標識組換えヒスタミンＨ１Ｒ受容体
ヒトヒスタミン１受容体をコードしているｃＤＮＡを、Ｊ．Ｌａｎｇｅｒ教授、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｗｏｏｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、米国から得たｐｃＤＥＦベクターにクローニングした。ＣＨＯ細胞を、実施例６．２．３で示したように調製した１００ｍｌの培地を含んでいる５００ｍｌのスピナー瓶で培養した。ＣＨＯ細胞を、上記Ｂｏｓｍａｎらによって記載されているように、調製した培地に段階適応により適応させた。ＣＨＯ細胞を６×１０５細胞数／ｍｌの密度で接種し、３×１０６細胞数／ｍｌの密度まで増殖させた。次に、細胞を、上記したように構築されたＨｉｓ標識ヒスタミンＨ１受容体をコードしているプラスミドでトランスフェクションさせた。培養物の試料１０μｌを毎日採取し、ドットブロッティングによってＨＴ−Ｈ１の発現を追跡した。発現量は、約３から４ｄｐｔ（トランスフェクション後日数）で最大であった。細胞を４℃における５０００ｇ、１０分の遠心分離によって収穫した。官能性は、（Ｒａｔｎａｌａら、上記）によって記載されたように放射性リガンド結合アッセイによって試験した。組換えＨＴ−Ｈ１は実施例７．１．２で記載されているように精製及び再構成をし、１５０μｇの精製された機能性タンパク質を得た。安定同位体標識取り込みは、下記実施例８で記載されているように、ＦＴＩＲ分光分析（Ｍａｔｔｓｏｎ  Ｃｙｇｎｕｓ  １００  ＦＴＩＲスペクトロメータ、Ｍａｄｉｓｉｏｎ、ＷＩ）による安定同位体標識によって誘発された振動シフトの定量化によって調査し、核（１５Ｎ）については９５％を超えることが判明した。この方法は、機能性受容体の類似の容積収率、即ち１リットルにつき少なくとも２．５ｍｇの機能性安定同位体標識受容体を有するバイオリアクターレベルにスケールアップすることができた。
【０１７７】
（実施例８）
バイオマスの構成分析及び安定同位体標識のモニタリングのためのフーリエ変換赤外分光
８．１  ＦＴＩＲ方法のバックグラウンド
主要な生体分子クラス（タンパク質、脂質、炭水化物）はフーリエ変換赤外分光（ＦＴＩＲ）によって簡単に特定することが可能であるが、その理由は典型的な生体分子クラスは以下のように異なる周波数範囲で吸収を示すからである：タンパク質ペプチドアミド基１５００〜１７００ｃｍ−１、脂質エステル基及びＣ−Ｈ結合それぞれ１７００〜１７５０ｃｍ−１及び２８００〜３０００ｃｍ−１、並びに炭水化物Ｃ−ＯＨ及びＣ−Ｏ−Ｃ基１０００〜１２００ｃｍ−１。これらの振動転移のモル吸光度はかなり異なることから、バイオマス組成の定量的推定は簡単には達成されないが、定性的構成分析は可能であり、これは図２で示すように異なるバイオマスバッチを比較する際に非常に有用である。
【０１７８】
振動周波数は関係する原子の質量によって決まり、それ故にＦＴＩＲは同位体標識の取り込みを測定するためにも同様に都合よく適用することが可能である。１５Ｎ標識は、１５２０〜１５５０ｃｍ−１の範囲内で吸収し且つＣＮ−Ｈ変角振動によって支配されるペプチド結合のアミドＩＩ振動を、１０〜２０ｃｍ−１シフトさせる。１３Ｃ標識は、１６２０〜１６７０ｃｍ−１の範囲内で吸収し且つＣ＝Ｏ伸縮振動によって支配されるペプチド結合のアミドＩ振動を４０〜６０ｃｍ−１シフトさせ、更に炭水化物部分のＣ−ＯＨ及びＣ−Ｏ−Ｃ振動を３０〜５０ｃｍ−１シフトさせる。最後に、２Ｈ標識は脂質基のＣ−Ｈ振動を約７００ｃｍ−１、タンパク質のアミドＩＩ振動を約１００ｃｍ−１シフトさせる。ピーク分離手法（デコンボリューション、二次誘導体）を使用することにより、標識取り込みによるピークシフトは約５％の精度で量的に推定することが可能である。したがって、この技術はバイオマス及びバイオマス由来の生体分子の迅速な構成分析、並びに安定同位体標識のモニタリングの両方を可能にする。図３で示すように、例えば１５Ｎ標識効率の測定は、アミドＩＩ領域のＡ１５４２／Ａ１５３４及びＡ１５１８／１５３４の吸光度比を監視することによって達成することができる。主にタンパク質骨格内のＮ−Ｈ変角振動を表しているアミドＩＩバンドは、１５Ｎ標識によって約１５４２から１５３０ｃｍ−１にシフトする。しかし、１６５８ｃｍ−１（主にＣ＝Ｏ伸縮振動）辺りの隣接アミドＩバンド及び１５１８ｃｍ−１辺りのＴｙｒ残基側鎖の振動バンドは、同位体置換により影響されない。実際は、１５１８ｃｍ−１辺りの吸光は同位体置換により変化する（他のアミドＩＩの約１５３０ｃｍ−１へのシフトダウン）。
【０１７９】
８．２  ＦＴＩＲ材料及び方法
ＦＴＩＲスペクトルは、Ｍａｔｔｓｏｎ  Ｃｙｇｎｕｓ  １００  ＩＲスペクトロメータにより、ＡＴＲ（減衰全反射）モード又は透過モードのいずれかで、分解能８ｃｍ−１及びスペクトル範囲４０００〜８００ｃｍ−１の周囲温度で調べた。ＡＴＲ分析については、バイオマスを浴槽超音波処理器内で脱イオン水で懸濁し（約２０ｍｇ／ｍｌ）、約５ｍｇのバイオマスを含んでいる容量をＳｐｅｃａｃ  ＡＴＲアクセサリのゲルマニウムプレート表面に均一に塗布した。空気中で一晩脱水後、バイオマスの薄膜がゲルマニウムプレート上に形成していた。その後、ＡＴＲアクセサリをスペクトロメータ内に設置し、バイオマスフィルムをスペクトロメータの窒素ガスパージ内で水蒸気が検出されなくなるまで更に脱水するか、又はスピン乾燥した（Ｃｌａｒｋら、（１９８０年）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．３１、６５〜９６頁）。透過分析については、０．５〜１．０ｍｇを含んでいる懸濁バイオマスの容量をＡｇＣｌウィンドウに加え（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、直径１．６ｃｍ）、空気中で一晩脱水した。次にこのウィンドウをコンピュータ管理の自家製の試料交換器に挿入し、スペクトロメータ内に設置し、窒素ガスパージで更に脱水した。最後に、水蒸気が検出されなくなった後にスペクトルを測定した。二次誘導体スペクトルは、スペクトロメータを管理しているコンピュータにインストールしたＭａｔｔｓｏｎソフトウェアを使用して、吸光度スペクトルから計算した。
【０１８０】
８．３  安定同位体標識された成分の分析
安定同位体標識された培地成分のバッチ間再現性は、ＦＴＩＲ分光を通して調べた。バイオマス内のタンパク量は、ＦＭＯＣ誘導体化を使用して完全加水分解後の窒素測定及びアミノ酸分析による元素分析から推定した。ウサギ筋（ＥＣ２．７．３．２、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、マンハイム）からのクレアチンホスホキナーゼを、ＦＴＩＲを使用したバイオマス標品内のタンパク質の定量のための標準として使用した。
【０１８１】
加水分解物及び自己消化物内のアミノ基含有成分を全て決定するために、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）による誘導体化を使用した。しかし、このＴＮＢＳ方法は、アンモニアとの反応のために、１５Ｎ水酸化アンモニウムで中和された加水分解産物へ適用することはできなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１Ａ】１０ｋＨｚのＭＡＳ周波数、２００Ｋの温度により７５０ＭＨｚで記録されたＳｆ９細胞から精製された安定同位体標識膜標品の１５Ｎ  １Ｄ  ＭＡＳ  ＳＳＮＭＲスペクトルを示す図である。このスペクトルは、５０００スキャン後に得られた。獲得の間、８０ｋＨｚ  ｒｆ磁界強度においてＴＰＰＭ（Ｂｅｎｎｅｔｔ、Ａ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．、１９５５年、１０３、６９５１頁）プロトンデカップリングを適用した。２ｍｓの交差分極（ＣＰ）１Ｈ−１５Ｎ混合時間を適用した。１２０ｐｐｍにおける主要な共鳴は、骨格ペプチド基の窒素を表す。他のより小さな共鳴は、タンパク質のアミノ酸残基側鎖を表す。３４．３ｐｐｍにおけるＧｌｙ窒素共鳴は、参照として使用された。
【図１Ｂ】ＳＦ９細胞膜内の１５Ｎ取り込みを示しているＦＴＩＲ差スペクトルを示す図である。１５８０／１５３５（１６２０ピークの傾斜の端）における正／負のピークの組み合わせは、骨格ペプチド結合の標識上のアミドＩＩ振動のシフトを表す。
【図２】透過フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光法によるバイオマスの迅速構成分析を示す図である。タンパク質（１７００〜１５００ｃｍ−１）及び炭水化物（１２００〜１０００ｃｍ−１）の振動バンドは、（標識された）バイオマス組成物の再現性について、容易に監視することができる。Ｍｅ−Ｍｅｔｙａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｃｃ−Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍ、Ｃｖ−Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｕｓ、Ｓｐ−Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｇｓ−Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ、Ｓｏ−Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓ。
【図３】アミドＩＩ振動（１５４２ｃｍ−１）のシフトからのＦＴＩＲによる１５Ｎ安定同位体標識のモニタリングを示す図である。図は、非標識培地（Ａ）上、及び１５Ｎ安定同位体標識培地（Ｂ）上で増殖させたＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ酵母バイオマスの赤外スペクトルの拡大部分を示す。スペクトルは、参照として最も強いピーク（１６５８ｃｍ−１）を使用してベースライン補正及びスケーリングの後にグラフ表示されている。１５Ｎ標識の取り込みは、９９％であった。
【図１Ａ】
2007527212.tif 000007
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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