(57)【要約】  本発明は、ＢＬｙＳシグナル伝達をブロックするポリペプチドと、そのポリペプチドをコードする核酸分子と、そのポリペプチドを含有する組成物に関する。本発明はまた本発明のポリペプチド及び組成物を使用して免疫関連疾患又は癌を治療するための方法にも関する。本発明はまたＢＬｙＳシグナル伝達の阻害剤を同定するための方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
Ｘ１-ＣＮ-Ｘ３-Ｄ-Ｘ５-Ｌ-Ｘ７-Ｘ８-Ｘ９-Ｘ１０-Ｘ１１-Ｘ１２-ＣＴ-Ｘ１４-Ｘ１５-Ｘ１６-Ｘ１７（式Ｉ）（配列番号１）の配列を含んでなるポリペプチドであって、
ここで、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１５及びＸ１７はシステイン以外の任意のアミノ酸であり；
Ｘ１６はＬ、Ｆ、Ｉ及びＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
ポリペプチドは式ＩのＮ末端からＣＮ（システインＮ末端）及びＣ末端からＣＴ（システインＣ末端）の７個のアミノ酸残基内にシステインを含まず；
ここでＣＮとＣＴはジスルフィド結合によって結合されており；
ここでＸ５ＬＸ７Ｘ８の高次構造はＬとＸ７の間にターンの中心を持つＩ型βターン構造を形成し；
ここでＸ８が二面角φに対して正の値を持つ、ポリペプチド。
【請求項２】
Ｘ１０が、Ｗ、Ｆ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｙ、Ｍ及び非極性アミノ酸からなる群から選択される（配列番号２）、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
Ｘ１０がＷである（配列番号３）、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
Ｘ３が、Ｍ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｙ、Ｆ、Ｗ及び非極性アミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸である（配列番号４）、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
Ｘ５が、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｉ、Ａ及びＲからなる群から選択される（配列番号５）、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
Ｘ７が、Ｖ、Ｔ、Ｉ及びＬからなる群から選択される（配列番号６）、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
Ｘ７がＴ又はＩではない（配列番号７）、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
Ｘ８が、任意のＲ、Ｋ、Ｇ、Ｎ、Ｈ及び全てのＤ-アミノ酸からなる群から選択される（配列番号８）、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
Ｘ９が、Ｈ、Ｋ、Ａ、Ｒ及びＱからなる群から選択される（配列番号９）、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
Ｘ１１が、Ｉ及びＶからなる群から選択される（配列番号１０）、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
Ｘ１２が、Ｐ、Ａ、Ｄ、Ｅ及びＳからなる群から選択される（配列番号１１）、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
Ｘ１６がＬである（配列番号１２）、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
式ＩＩ：
Ｘ１-ＣＮ-Ｘ３-Ｄ-Ｘ５-Ｌ-Ｖ-Ｘ８-Ｘ９-Ｗ-Ｘ１１-Ｘ１２-ＣＴ-Ｘ１４-Ｘ１５-Ｌ-Ｘ１７（式ＩＩ）（配列番号１８）の配列を含んでなるポリペプチドであって、
ここで、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１５及びＸ１７はシステイン以外の任意のアミノ酸であり；
ポリペプチドは式ＩＩのＮ末端からＣＮ（システインＮ末端）及びＣ末端からＣＴ（システインＣ末端）の７個のアミノ酸残基内にシステインを含まず；
ここでＣＮとＣＴはジスルフィド結合によって結合されている、ポリペプチド。
【請求項１４】
Ｘ５-Ｌ-Ｖ-Ｘ８の高次構造はＬとＶの間にターンの中心を持つＩ型βターン構造を形成し；ここでＸ８が二面角φに対して正の値を持つ、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
Ｘ１、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１４、Ｘ１５及びＸ１７が、Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｖ、Ａ、Ｄ、及びＧからなるアミノ酸の群から選択される（配列番号１９）、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
Ｘ３が、ノルロイシン、Ｍ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、及び非極性アミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸である（配列番号２０）、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
Ｘ５が、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｉ、Ａ及びＲからなる群から選択される（配列番号２１）、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
Ｘ８が、Ｒ、Ｋ、Ｇ、Ｎ、Ｈ及び全てのＤ-アミノ酸からなる群から選択される（配列番号２２）、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
Ｘ９が、Ｈ、Ｋ、Ａ、Ｒ及びＱからなる群から選択される（配列番号２３）、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
Ｘ１１が、Ｉ及びＶからなる群から選択される（配列番号２４）、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
Ｘ１２が、Ｐ、Ａ、Ｄ、Ｅ及びＳからなる群から選択される(配列番号２５）、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
式ＩＩＩ：
Ｅ-ＣＮ-Ｆ-Ｄ-Ｘ５-Ｌ-Ｖ-Ｘ８-Ｘ９-Ｗ-Ｖ-Ｘ１２-ＣＴ-Ｘ１４-Ｘ１５-Ｘ１６-Ｘ１７（式ＩＩＩ）（配列番号２６）の配列を含んでなるポリペプチドであって、
ここで、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１５及びＸ１７はシステイン以外の任意のアミノ酸であり；
ここで、Ｘ１６はＬ、Ｆ、Ｉ及びＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
ポリペプチドは式ＩＩＩのＮ末端からＣＮ（システインＮ末端）及びＣ末端からＣＴ（システインＣ末端）の７個のアミノ酸残基内にシステインを含まず；
ここで、ＣＮとＣＴはジスルフィド結合によって結合されている、ポリペプチド。 
【請求項２３】
高次構造はＬとＶの間にターンの中心を持つＩ型βターン構造を形成し；ここでＶが二面角φに対して正の値を持つ、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１５及びＸ１７が、Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｖ、Ａ、Ｄ、及びＧからなる群から選択される（配列番号２７）、請求項２２に記載のポリペプチド。  
【請求項２５】
Ｘ５がＬであり、Ｘ８がＲである（配列番号２８）、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
Ｘ９が、Ｈ、Ｋ、Ａ、Ｓ、Ｒ及びＱからなる群から選択される(配列番号２９）、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
Ｘ１２が、Ｐ、Ａ、Ｄ、Ｅ及びＳからなる群から選択される（配列番号３０）、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
Ｘ１２がＰである（配列番号３１）、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
Ｘ１６がＬである（配列番号３２）、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
式ＩＩＩの配列が、ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号１３）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号１４）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号１５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号１６）及びＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号１７）からなる群から選択される、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
配列番号１３から配列番号１７及び配列番号６２から配列番号１３７からなる群から選択されるポリペプチド配列を含んでなるポリペプチド。
【請求項３２】
ポリペプチドが式Ｉ又は式ＩＩ又は式ＩＩＩのポリペプチド配列のＮ末端、Ｃ末端又はＮ末端とＣ末端の双方の更なる配列を含み、該更なる配列がＢＲ３ポリペプチドに異種性である、請求項１ないし３１の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
式Ｉ又は式ＩＩ又は式ＩＩＩの配列がイムノアドヘシンタンパク質に融合又は抱合した配列である、請求項１ないし３１の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
式Ｉ又は式ＩＩ又は式ＩＩＩの配列が抗体に融合又は抱合した配列である、請求項１ないし３１の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
抗体がＦ（ａｂ）抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体及びｓｃＦｖ抗体からなる群から選択される、請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
抗体がヒト化抗体及び多重特異的抗体からなる群から選択される、請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
ポリペプチドが、成長阻害剤、細胞傷害剤、検出剤、ポリペプチドの生物学的利用能を改善する薬剤及びポリペプチドの半減期を改善する薬剤からなる群から選択される薬剤に抱合した、請求項１ないし３１の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
上記細胞傷害剤が、毒素、抗生物質及び放射性同位元素からなる群から選択される、請求項３７に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
請求項１ないし３１の何れか一項に記載のポリペプチドをコードしている核酸分子。
【請求項４０】
請求項３９に記載の核酸分子を含んでなるベクター。
【請求項４１】
請求項３９に記載の核酸分子を含んでなる宿主細胞。
【請求項４２】
請求項４０に記載のベクターを含んでなる宿主細胞を、ベクターからポリペプチドを発現するのに適した条件下で培養することを含む、ポリペプチドを製造する方法。
【請求項４３】
上記ポリペプチドが細菌中で産生される、請求項１ないし３１の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
上記ポリペプチドがＣＨＯ細胞中で産生される、請求項１ないし３１の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
請求項１ないし３１の何れか一項に記載のポリペプチドを含有し、更に生理学的に許容可能な担体を含んでいてもよい組成物。
【請求項４６】
請求項１ないし３１の何れか一項に記載のポリペプチドがＢＬｙＳに結合するのを防止する阻害剤を検出することを含んでなる、インビトロでのＢＲ３へのＢＬｙＳの結合の阻害剤を検出する方法。
【請求項４７】
哺乳動物におけるＢＲ３へのＢＬｙＳの結合を阻害する方法において、請求項１ないし３１の何れか一項に記載のポリペプチドを、哺乳動物中におけるＢＬｙＳとＢＲ３の間の結合を阻害するのに有効な量で投与することを含む方法。
【請求項４８】
哺乳動物におけるＢＬｙＳシグナル伝達を阻害する方法において、請求項１ないし３１の何れか一項に記載のポリペプチドを、哺乳動物中におけるＢＬｙＳとＢＲ３の間の結合を阻害するのに有効な量で投与することを含む方法。
【請求項４９】
治療を必要とする哺乳動物における免疫関連症状を治療する方法において、請求項１ないし３１の何れか一項に記載のポリペプチドの治療的有効量で哺乳動物を治療することを含む方法。
【請求項５０】
免疫関連疾患が関節リウマチ、多発性硬化症及び全身性エリテマトーデスからなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
治療を必要とする哺乳動物における癌を治療する方法において、請求項１ないし３１の何れか一項に記載のポリペプチドの治療的有効量で哺乳動物を治療することを含む方法。
【請求項５２】
上記癌が、白血病、リンパ腫及び骨髄腫からなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
抗ＣＤ２０抗体の治療的有効量がまた哺乳動物に投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
抗ＣＤ２０抗体がリツキサン(登録商標)抗体である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
ポリペプチドが少なくとも一種の非タンパク質性ポリマーに結合されている、請求項１ないし３１の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５６】
非タンパク質性ポリマーが親水性合成ポリマーである、請求項５５に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
非タンパク質性ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項５５に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
非タンパク質性ポリマーが２Ｋ-ＰＥＧ、５Ｋ-ＰＥＧ、及び２０Ｋ-ＰＥＧからなる群から選択される、請求項５５に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
配列番号１３から配列番号１７及び配列番号６２から配列番号１３７からなる群から選択される少なくとも二種のペプチドを含んでなるポリペプチド。
【請求項６０】
ペプチドが同じ配列であり、ペプチドがリンカーによって結合されている、請求項５９に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
ペプチドが異なった配列であり、ペプチドがリンカーによって結合されている、請求項５９に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
互いに結合されたペプチドが式：ＰＰ１-Ｌ１-ＰＰ１-Ｌ２-ＰＰ１を有し、ここで、ＰＰ１は請求項５９に記載の群から選択されるペプチドであり、Ｌ１とＬ２が、配列が異なるリンカー配列である、請求項５９に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（クロスリファレンス）
この出願は、２００３年６月５日に出願された米国仮出願第６０／４７６４１４号；２００３年６月６日に出願された米国仮出願第６０／４７６５３１号；及び２００３年６月５日に出願された米国仮出願第６０／４７６４８１号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ＢＬｙＳシグナル伝達をブロックするポリペプチドと、ポリペプチドをコードする核酸分子と、それらを含有する組成物に関する。本発明はまた本発明の組成物を使用して免疫関連疾患及び癌を予防し治療するための方法にも関する。本発明はまた本発明のポリペプチドを使用してＢＬｙＳシグナル伝達の阻害剤を選択するための方法にも関する。
【０００３】
（発明の背景及び序）
ＢＬｙＳ（ＢＡＦＦ、ＴＡＬＬ-ｌ、ＴＨＡＮＫ、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、又はｚＴＮＦ４としても知られる)はリガンドの腫瘍壊死因子ファミリー（ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバーであり、Ｂ細胞の重要な生存因子である。トランスジェニックマウスでのＢＬｙＳ過剰発現によりＢ細胞過形成及び深刻な自己免疫疾患が進行する(Mackay等(1999) J. Exp. Med. 190, 1697-1710；Gross等(2000) Nature 404, 995-999；Khare等(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97,3370-33752-4)。ＢＬｙＳレベルは多様な自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス、関節リウマチ及びシェーグレン症候群のヒト患者において亢進している(Cheema, G. S等 (2001) Arthritis Rheum. 44, 1313-1319；Groom, J.等 (2002) J. Clin. Invest. 109, 59-68；Zhang, J.等 (2001) J. Immunol. 166, 6-10)。更に、ＢＬｙＳレベルは疾患の重症度に相関していることから、ＢＬｙＳはこれらの疾患の病理に直接的な役割を担いうることが示唆される。
ＢＬｙＳはＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ及びＢＲ３の三種のレセプターに結合し、ＢＲ３を通してのシグナル伝達がＢ細胞機能の促進に必須である。ＢＬｙＳが結合する三種のレセプターのうち、ＢＲ３のみがＢＬｙＳ特異的であり；他の２つも関連のＴＮＦファミリーメンバーのＡＰＲＩＬに結合する。ＢＬｙＳ及びレセプターノックアウト又は突然変異体マウスの表現型を比較すると、ＢＲ３を介するシグナル伝達がＢＬｙＳのＢ細胞生存機能を媒介することが示される(Thompson, J.S.等 (2001) Science 293, 2108-2111；Yan, M等 (2002) Nat. Immunol. 1, 37-41；Schiemann, B.等 (2001) Science 293, 2111-2114)。これに対して、ＴＡＣＩは阻害レセプターとして働くようである(Yan, M. (2001) Nat. Immunol. 2, 638-643)一方で、ＢＣＭＡの役割は不明である(上掲のSchiemann)。
【０００４】
ＢＲ３はＢ細胞表面上に発現する１８４残基のタイプＩＩＩ膜貫通タンパク質である(上掲のThompson等；上掲のYan  (2002))。細胞内領域は既知の構造的ドメイン又はタンパク質-タンパク質相互作用モチーフに対して配列類似性を持たない。ＢＲ３を介したＢＬｙＳ誘導性シグナル伝達により転写因子ＮＦ-Ｂ２／ｐ１００がｐ５２へプロセシングされる(Claudio, E等 (2002) Nat. Immunol. 3, 958-965；Kayagaki, N等 (2002) Immunity 10, 515-524)。また、ＢＲ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は多岐にわたる。ＴＮＦＲファミリーメンバーは、通常、その細胞外領域の多数のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）の存在により特徴づけられる；各々のＣＲＤは一典型的には３つのジスルフィド結合中の６のシステインによって安定化された〜４０の残基からなる。このファミリーの一般的なメンバーは、リガンド表面の２の異なった部分（パッチ）と相互作用する２つのＣＲＤを介してリガンドと接触する(Bodmer, J.-L.等(2002) Trends Biochem. Sci. 27, 19-26に概説)。しかしながら、ＢＲ３のＥＣＤ（配列番号６０）は、最大でもＣＲＤの一部を形成可能な４個のシステイン残基のみを含み、このような小さなレセプターがどのようにして高い親和性リガンド結合を与えているのかという疑問が生じる。
【０００５】
ＢＲ３の部分ＣＲＤはこれまでに記載されている他の分子とはシステイン間隔の差がある。１９残基のみのコア領域は溶液中で安定な構造を採る。ＢＲ３折り畳みは限界ＴＮＦＲ ＣＲＤの最初の半分と類似しているが、更なる非限界ジスルフィド結合によって安定化されている。幾つかのＢＬｙＳ結合決定基が、ファージ上に発現されたＢＲ３のＥＣＤ（配列番号６０）のショットガンアラニンスキャニング突然変異誘発によって同定されている。重要なＢＬｙＳ結合残基の幾つかは、構造化βヘアピンスカフォールドに移したときにリガンド結合に十分であることを我々が過去に示したβターンから提示されている[Kayagaki, N.等, (2002) Immunity 17, 515-524]。ターンの外側に、変異誘発により、ＢＬｙＳ-ＢＲ３相互作用を高める更なる疎水性接触が同定された。ＢＬｙＳとの複合体における最小のβヘアピンペプチドｂｈｐＢＲ３の結晶構造は６残基のＢＲ３ターンのリガンド表面上のキャビティ中への密な充填を明らかにした。よって、ＢＲ３はＴＮＦＲファミリーには前例のない高度に集中した相互作用部位を通してＢＬｙＳに結合する。
【０００６】
既に、ＢＲ３のＢＬｙＳ結合ドメインが２６残基のコア領域内にあることが示されている(上掲のKayagaki等)。６個のＢＲ３残基は、ヘアピンペプチド（ｂｈｐＢＲ３）内に構造化される場合、ＢＬｙＳ結合を与え、ＢＲ３媒介性シグナル伝達をブロックするのに十分であった。他の研究者により、ＢＬｙＳと相互作用することを意図したポリペプチドが報告されている(例えば、国際公開第０２／２４９０９号、国際公開第０３／０３５８４６号、国際公開第０２／１６３１２号、国際公開第０２／０２６４１号)。しかしながら、これらの報告にもかかわらず、ＢＬｙＳ結合ポリペプチドを使用する疾患の治療及び診断とＢＬｙＳシグナル伝達経路の小分子阻害剤の開発を含む、研究及び医療目的のために、ＢＬｙＳアッセイを阻害する代替の、及び／又はより良いペプチド分子に対する必要性が存在する。よって、これらがこの発明の目的である。とりわけ、非細胞方法によって容易に合成することができる小ペプチド、有意なＢＬｙＳ結合親和性を有するポリペプチド、及び良好な安定性を有するポリペプチドを開発することがまたこの発明の目的である。
【０００７】
（発明の概要）
本発明は、式Ｉ：
Ｘ１-ＣＮ-Ｘ３-Ｄ-Ｘ５-Ｌ-Ｘ７-Ｘ８-Ｘ９-Ｘ１０-Ｘ１１-Ｘ１２-ＣＴ-Ｘ１４-Ｘ１５-Ｘ１６-Ｘ１７（式Ｉ）（配列番号１）の配列を含んでなるポリペプチドであって、
ここで、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１５及びＸ１７はシステイン以外の任意のアミノ酸であり；
Ｘ１６はＬ、Ｆ、Ｉ及びＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
ポリペプチドは式ＩのＮ末端からＣＮ（システインＮ末端）及びＣ末端からＣＴ（システインＣ末端）の７個のアミノ酸残基内にシステインを含まない、ポリペプチドに関する。
ある実施態様では、式Ｉの配列を含むポリペプチドは、ジスルフィド結合によって結合されたＣＮとＣＴを有し；Ｘ５ＬＸ７Ｘ８はＬとＸ７の間にターンの中心を持つＩ型βターン構造の高次構造（コンホメーション）を形成し；Ｘ８の二面角φ（ファイ）に対して正の値を持つ。図１３を参照のこと。
【０００８】
ある実施態様では、Ｘ１０はＷ、Ｆ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｙ、Ｍ及び非極性アミノ酸からなる群から選択される（配列番号２）。ある実施態様では、Ｘ１０はＷである（配列番号３）。ある実施態様では、Ｘ３はＭ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｙ、Ｆ、Ｗ及び非極性アミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸である（配列番号４）。ある実施態様では、Ｘ５はＶ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｉ、Ａ及びＲからなる群から選択される（配列番号５）。ある実施態様では、Ｘ７はＶ、Ｔ、Ｉ及びＬからなる群から選択される（配列番号６）。ある実施態様では、Ｘ７はＴ又はＩではない（配列番号７）。
ある実施態様では、Ｘ８は、Ｒ、Ｋ、Ｇ、Ｎ、Ｈと全てのＤ-アミノ酸からなる群から選択される（配列番号８）。ある実施態様では、Ｘ９はＨ、Ｋ、Ａ、Ｒ及びＱからなる群から選択される（配列番号９）。ある実施態様では、Ｘ１１は、Ｉ又はＶである（配列番号１０）。ある実施態様では、Ｘ１２は、Ｐ、Ａ、Ｄ、Ｅ及びＳからなる群から選択される（配列番号１１）。ある実施態様では、Ｘ１６はＬである（配列番号１２）。特定の実施態様では、式Ｉの配列は、ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号１３）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号１４）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号１５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号１６）及びＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号１７）からなる群から選択される配列である。
【０００９】
本発明はまた式ＩＩ：
Ｘ１-ＣＮ-Ｘ３-Ｄ-Ｘ５-Ｌ-Ｖ-Ｘ８-Ｘ９-Ｗ-Ｘ１１-Ｘ１２-ＣＴ-Ｘ１４-Ｘ１５-Ｌ-Ｘ１７（式ＩＩ）（配列番号１８）の配列を含んでなるポリペプチドであって、
ここで、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１５及びＸ１７はシステイン以外の任意のアミノ酸であり；
ポリペプチドは式ＩＩのＮ末端からＣＮ（システインＮ末端）及びＣ末端からＣＴ（システインＣ末端）の７個のアミノ酸残基内にシステインを含まず；
ここでＣＮとＣＴはジスルフィド結合によって結合されている、ポリペプチドに関する。
ある実施態様では、式ＩＩの配列を含むポリペプチドは、ＬとＶの間にターンの中心を持つＩ型βターン構造を形成するＸ５ＬＶＸ８の高次構造を有し；Ｘ８が二面角φに対して正の値を持つ。
【００１０】
ある実施態様では、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１５及びＸ１７は、Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｖ、Ａ、Ｄ、及びＧからなるアミノ酸群から選択される（配列番号１９）。
式ＩＩのある実施態様では、Ｘ３は、ノルロイシン、Ｍ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、及び非極性アミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸である（配列番号２０）。式ＩＩのある実施態様では、Ｘ５は、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｉ、Ａ及びＲからなる群から選択される（配列番号２１）。式ＩＩのある実施態様では、Ｘ８は、Ｒ、Ｋ、Ｇ、Ｎ、Ｈ及び全てのＤ-アミノ酸からなる群から選択される（配列番号２２）。式ＩＩのある実施態様では、Ｘ９は、Ｈ、Ｋ、Ａ、Ｒ及びＱからなる群から選択される（配列番号２３）。ある実施態様では、Ｘ１１は、Ｉ及びＶからなる群から選択される（配列番号２４）。ある実施態様では、Ｘ１２は、Ｐ、Ａ、Ｄ、Ｅ及びＳからなる群から選択される(配列番号２５）。
【００１１】
本発明はまた式ＩＩＩ：
Ｅ-ＣＮ-Ｆ-Ｄ-Ｘ５-Ｌ-Ｖ-Ｘ８-Ｘ９-Ｗ-Ｖ-Ｘ１２-ＣＴ-Ｘ１４-Ｘ１５-Ｘ１６-Ｘ１７（式ＩＩＩ）（配列番号２６）の配列を含んでなるポリペプチドであって、
ここで、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１５及びＸ１７はシステイン以外の任意のアミノ酸であり；
ここで、Ｘ１６はＬ、Ｆ、Ｉ及びＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
ポリペプチドは式ＩＩＩのＮ末端からＣＮ（システインＮ末端）及びＣ末端からＣＴ（システインＣ末端）の７個のアミノ酸残基内にシステインを含まず；
ここで、ＣＮとＣＴはジスルフィド結合によって結合されている、ポリペプチドにも関する。
式ＩＩＩのある実施態様では、式ＩＩＩの近接配列を含むポリペプチドは、ＣＮとＣＴの間にジスルフィド結合を有し、Ｘ５ＬＶＸ８で、ＬとＶの間にターンの中心を持つＩ型βターン構造を形成し；Ｘ８の二面角φが正の値である。
【００１２】
式ＩＩＩのある実施態様では、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１５及びＸ１７は、Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｖ、Ａ、Ｄ、及びＧからなる群から選択される（配列番号２７）。式ＩＩＩのある実施態様では、Ｘ５がＬであり、Ｘ８がＲである（配列番号２８）。式ＩＩＩのある実施態様では、Ｘ９は、Ｈ、Ｋ、Ａ、Ｓ、Ｒ及びＱからなる群から選択される(配列番号２９）。式ＩＩＩのある実施態様では、Ｘ１２は、Ｐ、Ａ、Ｄ、Ｅ及びＳからなる群から選択される(配列番号３０）。式ＩＩＩのある実施態様では、Ｘ１２はＰである(配列番号３１）。式ＩＩＩのある実施態様では、Ｘ１６はＬである（配列番号３２）。
特定の実施態様では、式ＩＩＩの配列は、ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号１３）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号１４）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号１５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号１６）及びＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号１７）からなる群から選択される。
【００１３】
本発明はまたＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号１３）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号１４）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号１５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号１６）及びＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号１７）からなる群から選択される近接ポリペプチド配列に関する。
本発明はまたＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号１３）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号１４）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号１５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号１６）及びＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号１７）からなる群から選択される近接ポリペプチド配列と少なくとも８８％の配列同一性を有するポリペプチドにも関する。
【００１４】
本発明はまた図１２Ａ−Ｃに記載された配列の何れか一から選択される配列を含んでなるポリペプチドにも関する。図１２Ａ−Ｃに記載された配列の何れか一を含んでなるポリペプチドは、配列のシステインがジスルフィド結合によって結合しているもの、配列の第５残基と第８の残基の間の配列がＬとＸ７の間にターンの中心を持つＩ型βターン構造の高次構造を形成し、第８残基が二面角φに対して正の値を持つものが考えられる。
ある実施態様では、この発明のポリペプチドは、天然配列ＢＲ３ポリペプチドに異種性である式Ｉ（配列番号１）又は式ＩＩ（配列番号１８）又は式ＩＩＩ（配列番号２６）の配列のＮ末端、Ｃ末端又はＮ末端とＣ末端の双方の配列を含む。ある実施態様では、式Ｉ（配列番号１）、式ＩＩ（配列番号１８）、式ＩＩＩ（配列番号２６）、図１２Ａ−Ｃ又はＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号１３）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号１４）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号１５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号１６）又はＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号１７）からなる群から選択されるＢＬｙＳ結合配列はイムノアドヘシンタンパク質に融合又は抱合される。ある実施態様では、ＢＬｙＳ結合配列は抗体に融合又は抱合される。更なる実施態様では、抗体はＦ（ａｂ）抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体及びｓｃＦｖ抗体からなる群から選択される。他の又は更なる実施態様では、抗体はヒト化抗体及び多重特異的抗体からなる群から選択される。
【００１５】
ある実施態様では、この発明のポリペプチドは、成長阻害剤、細胞傷害剤、検出剤（detection agent）、ポリペプチドの生物学的利用能を改善する薬剤及びポリペプチドの半減期を改善する薬剤からなる群から選択される薬剤に抱合させられ、又はそれと組み合わせて使用される。この発明の更なる実施態様では、細胞傷害剤は、毒素、抗生物質及び放射性同位元素からなる群から選択される。この発明のある実施態様では、ポリペプチドは５０アミノ酸長未満、２５アミノ酸長未満であり、又は１７アミノ酸長（１７-ｍｅｒ）である。
本発明の他の態様は、式Ｉ（配列番号１）、式ＩＩ（配列番号１８）、式ＩＩＩ（配列番号２６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号１３）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号１４）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号１５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号１６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号１７）の配列、又は図１２Ａ−Ｃに挙げられた配列を含むポリペプチドの少なくとも一つ、より好ましくは一つより多いポリペプチドを含むポリペプチドに関する。互いに結合しているポリペプチドは同じ配列を有することができるし又は異なった配列を有する。ある実施態様では、これらのポリペプチドは、場合によってはリンカーを使用して、互いに結合させることができる。
【００１６】
この発明のポリペプチドは、ある実施態様では、細菌中で生産される。ある実施態様では、この発明のポリペプチドは、ＣＨＯ細胞中で生産される。本発明はまたこの発明のポリペプチドをコードしている核酸分子にも関する。本発明はまたこの発明の核酸分子を含んでなるベクターにも関する。このベクターは、例えば精製タンパク質の生産及び／又は遺伝子療法のためにポリペプチドを発現させるのに有用である。本発明は、この発明の核酸分子又はベクターを含んでなる宿主細胞に関する。本発明はこの発明のベクター又は核酸分子を含んでなる宿主細胞を、ベクターからポリペプチドを発現するのに適した条件下で培養することを含むポリペプチドを製造する方法に関する。
本発明は本発明のポリペプチドを含有し、場合によっては更に生理学的に許容可能な担体を含んでいてもよい組成物に関する。ある実施態様では、この発明の組成物は更なる治療剤を更に含有する。ある実施態様によれば、更なる治療剤は、免疫関連疾患及び癌からなる群から選択される疾患を治療するための薬剤である。ある実施態様によれば、更なる治療剤は、免疫関連疾患及び癌からなる群から選択される疾患の徴候を治療するために使用される薬剤である。ある実施態様によれば、その薬剤は抗ＣＤ２０抗体、例えばリツキサン（RITUXAN(登録商標)）抗体である。
【００１７】
本発明はこの発明に係るポリペプチドにＢＬｙＳが結合するのを阻害する分子を同定することを含むＢＬｙＳアンタゴニストを選択する方法に関する。ある実施態様によれば、分子は小分子である。
本発明はこの発明のポリペプチドにＢＬｙＳを接触させることを含むＢＲ３へのＢＬｙＳの結合を阻害する方法に関する。本発明はまた哺乳動物におけるＢＲ３へのＢＬｙＳの結合を阻害する方法において、この発明のポリペプチドを哺乳動物に投与することを含む方法にも関する。本発明はまた哺乳動物におけるＢＬｙＳシグナル伝達を阻害する方法において、この発明のポリペプチドを、哺乳動物におけるＢ細胞の数を減少させるのに有効な量で投与することを含む方法にも関する。
本発明はまたこの発明のポリペプチドで動物を免疫することを含む抗体の製造方法にも関する。
本発明は、治療を必要とする哺乳動物における免疫関連症状を予防又は治療する方法において、この発明に係る組成物の治療的有効量で哺乳動物を治療することを含む方法に関する。ある実施態様では、免疫関連疾患は関節リウマチ、多発性硬化症及び全身性エリテマトーデスからなる群から選択される。
【００１８】
本発明は、治療を必要とする哺乳動物における癌を予防又は治療する方法において、この発明の組成物の治療的有効量で哺乳動物を治療することを含む方法に関する。ある実施態様では、癌は、白血病、リンパ腫又は骨髄腫からなる群から選択される。ある実施態様では、本方法は更に抗ＣＤ２０抗体の治療的有効量を哺乳動物に投与することを含む。特定の実施態様では、抗ＣＤ２０抗体はリツキサン(登録商標)抗体である。
本発明は、治療を必要とする哺乳動物における癌を予防又は治療する方法において、この発明の組成物の治療的有効量で哺乳動物を治療することを含む方法に関する。ある実施態様では、癌は、白血病、リンパ腫又は骨髄腫からなる群から選択される。ある実施態様では、本方法は更にＣＤ２０結合抗体の治療的有効量を哺乳動物に投与することを含む。特定の実施態様では、抗ＣＤ２０抗体はリツキサン(登録商標)抗体である。本発明はまた細胞の混合集団からＢ細胞を枯渇させる方法において、混合された細胞集団をＢＬｙＳアンタゴニストとＣＤ２０結合抗体と接触させることを含む方法にも関する。
本発明は患者におけるＢＬｙＳのレベルを診断する方法において、患者のＢＬｙＳにこの発明のポリペプチドを接触させ、ポリペプチドに結合したＢＬｙＳの量を評価する工程を含む方法に関する。
本発明はこの発明のポリペプチドの非タンパク質性ポリマーへの抱合体（コンジュゲート）に関する。ある実施態様では、非タンパク質性ポリマーは親水性の合成ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ある実施態様では、非タンパク質性ポリマーは２ｋのＰＥＧ、５ｋのＰＥＧ、及び２０ｋのＰＥＧからなる群から選択される。
【００１９】
（詳細な説明）
本発明のポリペプチドはここに開示した配列を含む抗体、イムノアドヘシン、ペプチド融合体及び抱合体を含む。本発明のポリペプチドは単独で又は他のタンパク質と組み合わせて、天然配列ＢＬｙＳに結合する。ある実施態様では、ポリペプチドはＢＬｙＳアンタゴニストである。ある実施態様によれば、本発明のポリペプチドは標識（検出可能な化合物又は組成物又は検出を促進する薬剤）、治療剤、保護基、及びポリペプチドの生物学的利用能又は半減期を促進する薬剤への抱合（コンジュゲーション）によって修飾することができる。ここに開示した配列にヘアピンループ構造を含むポリペプチドが考慮される。
【００２０】
定義
ここで用いられる「ＢＬｙＳ」、「ＢＬｙＳポリペプチド」、「ＴＡＬＬ-１」又は「ＴＡＬＬ-１ポリペプチド」、「ＢＡＦＦ」なる用語は、「天然配列ＢＬｙＳポリペプチド」及び「ＢＬｙＳ変異体」を包含する。「ＢＬｙＳ」は以下：
ヒトＢＬｙＳ配列（図３；配列番号３４）
1 MDDSTEREQS RLTSCLKKRE EMKLKECVSI LPRKESPSVR SSKDGKLLAA TLLLALLSCC
61 LTVVSFYQVA ALQGDLASLR AELQGHHAEK LPAGAGAPKA GLEEAPAVTA GLKIFEPPAP
121 GEGNSSQNSR NKRAVQGPEE TVTQDCLQLI ADSETPTIQK GSYTFVPWLL SFKRGSALEE
181 KENKILVKET GYFFIYGQVL YTDKTYAMGH LIQRKKVHVF GDELSLVTLF RCIQNMPETL
241 PNNSCYSAGI AKLEEGDELQ LAIPRENAQI SLDGDVTFFG ALKLL
マウスＢＬｙＳ配列（配列番号５３）
1 MDESAKTLPP PCLCFCSEKG EDMKVGYDPI TPQKEEGAWF GICRDGRLLA ATLLLALLSS
61 SFTAMSLYQL AALQADLMNL RMELQSYRGS ATPAAAGAPE LTAGVKLLTP AAPRPHNSSR
121 GHRNRRAFQG PEETEQDVDL SAPPAPCLPG CRHSQHDDNG MNLRNIIQDC LQLIADSDTP
181 TIRKGTYTFV PWLLSFKRGN ALEEKENKIV VRQTGYFFIY SQVLYTDPIF AMGHVIQRKK
241 VHVFGDELSL VTLFRCIQNM PKTLPNNSCY SAGIARLEEG DEIQLAIPRE NAQISRNGDD
301 TFFGALKLL
及び図１に示すアミノ酸配列の何れか一によりコードされるポリペプチドと、天然配列のＢＬｙＳの生物学的活性を有するそれらの相同体（ホモログ）及び断片及び変異体に対して与えられる名称である。ＢＬｙＳの生物学的活性は、Ｂ細胞生存の促進、Ｂ細胞成熟の促進、及びＢＲ３への結合からなる群から選択されうる。ＢＬｙＳの変異体は、天然配列のＢＬｙＳポリペプチドと好ましくは少なくとも８０％又は任意の連続整数増大して１００％までで、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。「天然配列」ＢＬｙＳポリペプチドは、天然由来の対応するＢＬｙＳポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。例えば、ＢＬｙＳはフューリン型のプロテアーゼにより細胞表面から切断された後の可溶型で存在する。そのような天然配列のＢＬｙＳポリペプチドは天然から単離するか、あるいは組換え及び／又は合成方法により産生することができる。
【００２１】
「天然配列ＢＬｙＳポリペプチド」なる用語は、ポリペプチドの天然に生じる切断型又は分泌型（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に生じる変異型（例えば、選択的スプライシング型）及び天然に生じる対立変異型を特に包含する。「ＢＬｙＳ」なる用語は、Shu 等 J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999)；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１３６２９３；１９９８年５月７日公開の国際公開第９８／１８９２１号；１９９８年１０月７日公開の欧州特許出願公開第８６９１８０号；１９９８年６月２５日公開の国際公開第９８／２７１１４号；１９９９年３月１８日公開の国際公開第９９／１２９６４号；１９９９年７月８日公開の国際公開第９９／３３９８０号；Moore等 Science, 285:260-263 (1999)；Schneider等 J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999)；Mukhopadhyay等 J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)に記載のポリペプチドを含む。
ここで用いられる「ＢＬｙＳアンタゴニスト」なる用語は、最も広義に用いられ、（１）天然配列ＢＬｙＳポリペプチドに結合し又は天然配列ＢＲ３ポリペプチドに結合してＢＬｙＳポリペプチドとのＢＲ３の相互作用を部分的又は完全にブロックし、及び（２）天然配列ＢＬｙＳシグナル伝達を部分的又は完全にブロック、阻害又は中和（無効化）する任意の分子を含む。とりわけ、天然配列ＢＬｙＳポリペプチドシグナル伝達はＢ細胞生存及びＢ細胞成熟を促進する。とりわけ、ＢＬｙＳシグナル伝達の阻害、ブロック又は中和によりＢ細胞数が減少する。本発明によるＢＬｙＳアンタゴニストはインビトロ又はインビボのＢＬｙＳポリペプチドの一又は複数の生物学的活性を部分的又は完全にブロック、阻害又は中和するであろう。ある実施態様では、生物学的活性なＢＬｙＳはインビトロ又はインビボで以下の事象の何れか一又はそれらの幾つかを増強する：Ｂ細胞の生存促進、ＩｇＧ及び／又はＩｇＭレベルの増加、血漿細胞数の増加、及び脾臓Ｂ細胞でのＮＦ-κｂ２／ｐ１００からｐ５２ＮＦ-κｂへのプロセシング(例えば、Batten, M等 (2000) J. Exp. Med. 192:1453-1465；Moore等 (1999) Science 285:260-263；Kayagaki等 (2002) 10:515-524)。本発明に係るＢＬｙＳアンタゴニストを試験するのに有用な様々なアッセイをここに記載する。
【００２２】
上記のように、ＢＬｙＳアンタゴニストは直接的又は間接的な方法で、インビトロ又はインビボのＢＬｙＳシグナル伝達を部分的ないし完全にブロック、阻害又は中和するように機能し得る。例えば、ＢＬｙＳアンタゴニストは直接ＢＬｙＳに結合し得る。例えば、抗体がＢＬｙＳのＢＲ３への結合を立体的に妨げるようにヒトＢＬｙＳの残基１６２−２７５及び／又は１６２、１６３、２０６、２１１、２３１、２３３、２６４及び２６５からなる群から選択した残基の近傍残基を含んでなる、ヒトＢＬｙＳの領域内に結合する抗ＢＬｙＳ抗体が考えられる。他の実施例では、直接結合するものは、ＴＡＣＩ、ＢＲ３及びＢＣＭＡなどのＢＬｙＳレセプターの細胞外ドメインを含んでなるポリペプチドである。他の例では、ＢＬｙＳアンタゴニストには、ここに記載のような、式Ｉ（配列番号１）、式ＩＩ（配列番号１８）、式ＩＩＩ（配列番号２６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号１３）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号１４）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号１５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号１６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号１７）の配列、又は図１２Ａ−Ｃに挙げる配列を有するポリペプチドが含まれる。
ある実施態様では、本発明のＢＬｙＳアンタゴニストには、抗ＢＬｙＳ抗体、イムノアドヘシン及び小分子が含まれる。更なる実施態様では、イムノアドヘシンはＢＬｙＳレセプターのＢＬｙＳ結合領域（例えば、ＢＲ３、ＢＣＭＡ又はＴＡＣＩの細胞外ドメイン）を含む。更なる実施態様では、イムノアドヘシンはＢＲ３-Ｆｃ、又は式Ｉ（配列番号１）、式ＩＩ（配列番号１８）、式ＩＩＩ（配列番号２６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号１３）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号１４）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号１５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号１６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号１７）の配列、又は図１２Ａ−Ｃに挙げる配列を有するポリペプチドで、場合によってはイムノグロブリンのＦｃ部分に融合又は抱合しているポリペプチドである。
【００２３】
ある実施態様によると、ＢＬｙＳアンタゴニストは１００ｎＭ以下の結合親和性をもってＢＬｙＳポリペプチドに結合する。他の実施態様によると、ＢＬｙＳアンタゴニストは１０ｎＭ以下の結合親和性をもってＢＬｙＳポリペプチドに結合する。更に他の実施態様によると、ＢＬｙＳアンタゴニストは１ｎＭ以下の結合親和性をもってＢＬｙＳポリペプチドに結合する。
ここで用いられる「ＢＲ３」、「ＢＲ３ポリペプチド」又は「ＢＲ３レセプター」なる用語は、「天然配列ＢＲ３ポリペプチド」を包含する。「ＢＲ３」は以下のポリヌクレオチド配列及びその相同体の何れか一を含むポリペプチドに与える名称である：
（ａ）ヒトＢＲ３配列（配列番号：３６）
1 MRRGPRSLRG RDAPAPTPCV PAECFDLLVR HCVACGLLRT PRPKPAGASS PAPRTALQPQ
61 ESVGAGAGEA ALPLPGLLFG APALLGLALV LALVLVGLVS WRRRQRRLRG ASSAEAPDGD
121 KDAPEPLDKV IILSPGISDA TAPAWPPPGE DPGTTPPGHS VPVPATELGS TELVTTKTAG
181 PEQQ
（ｂ）選択的ヒトＢＲ３配列（配列番号：５４）
1 MRRGPRSLRG RDAPAPTPCV PAECFDLLVR HCVACGLLRT PRPKPAGAAS SPAPRTALQP
61 QESVGAGAGE AALPLPGLLF GAPALLGLAL VLALVLVGLV SWRRRQRRLR GASSAEAPDG
121 DKDAPEPLDK VIILSPGISD ATAPAWPPPG EDPGTTPPGH SVPVPATELG STELVTTKTA
181 GPEQQ
（ｃ）マウスＢＲ３配列（配列番号：３８）
1 MGARRLRVRS QRSRDSSVPT QCNQTECFDP LVRNCVSCEL FHTPDTGHTS SLEPGTALQP
61 QEGSALRPDV ALLVGAPALL GLILALTLVG LVSLVSWRWR QQLRTASPDT SEGVQQESLE
121 NVFVPSSETP HASAPTWPPL KEDADSALPR HSVPVPATEL GSTELVTTKT AGPEQ
（ｄ）ラットＢＲ３配列（配列番号：５５）
1 MGVRRLRVRS RRSRDSPVST QCNQTECFDP LVRNCVSCEL FYTPETRHAS SLEPGTALQP
61 QEGSGLRPDV ALLFGAPALL GLVLALTLVG LVSLVGWRWR QQRRTASLDT SEGVQQESLE
121 NVFVPPSETL HASAPNWPPF KEDADNILSC HSIPVPATEL GSTELVTTKT AGPEQ
【００２４】
「天然配列」ＢＲ３ポリペプチドは、天然由来の対応するＢＲ３ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列のＢＲ３ポリペプチドは天然から単離するか、組換え及び／又は合成方法により生成することができる。「天然配列ＢＲ３ポリペプチド」なる用語は、ポリペプチドの天然に生じる切断型、可溶型又は分泌型（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に生じる変異体型（例えば、選択的スプライシング型）及び天然に生じる対立変異体を特に包含する。
ＢＲ３「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを実質的に含まないＢＲ３ポリペプチド型を意味する。ＢＲ３のＥＣＤ型には、ＢＲ３のアミノ酸１−７７、２−６２、２−７１、１−６１、及び２−６３の何れか一を含んでなるものが含まれる。アミノ酸１−６１を含むＢＲ３のＥＣＤは配列番号６０に提供される。
ミニ-ＢＲ３はＢＲ３のＢＬｙＳ結合ドメインの２６残基のコア領域である。ミニ-ＢＲ３（配列番号５９）：TPCVPAECFD LLVRHCVACG LLRTPR。
【００２５】
「アミノ酸」という用語は、その最も広い意味で使用され、自然に生じるＬα-アミノ酸又は残基を含むことを意味する。自然に生じるアミノ酸に対して一般的に使用されている１文字及び３文字略号がここでも使用される(Lehninger, A.L., Biochemistry, 第2版, pp.71-92,(1975) Worth Publishers, New York)。この用語には、全てのＤ-アミノ酸、並びに化学的に修飾されたアミノ酸、例えばアミノ酸アナログ(類似体)、ノルロイシン等のタンパク質に通常導入されない自然に生じるアミノ酸、及びアミノ酸に特徴的な当該分野において公知の特性を有する化学的に合成された化合物が含まれる。例えば、天然Ｐｈｅ又はＰｒｏと同じペプチド化合物のコンホメーション制限を許容するフェニルアラニン又はプロリンのアナログ又は模倣物が、アミノ酸の定義に含まれる。このようなアナログ及び模倣物はここではアミノ酸の「機能的等価物」と称する。アミノ酸の他の例は、出典を明示してここに取り込まれるRoberts及びVellaccio（The Peptides：Analysis, Synthesis, Biology,）Gross及びMeiehofer編, Vol.5 p341, Academic Press, Inc, N.Y. 1983に列挙されている。
アミノ酸はその側鎖の性質の類似性に応じて分類できる(A. L. Lehninger, in Biochemistry, 第2版, pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975))：
（１）非極性：Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M) （２）荷電のない極性：Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q) 
（３）酸性：Asp (D), Glu (E)
（４）塩基性：Lys (K), Arg (R), His(H)
あるいは、天然に生じる残基は共通の側鎖性質に基づきグループ分けされうる：
（１）疎水性：ノルロイシン, Met, Ala, Val, Leu, Ile；
（２）中性親水性：Cys, Ser, Thr, Asn, Gln；
（３）酸性：Asp, Glu；
（４）塩基性：His, Lys, Arg；
（５）鎖配向に影響する残基：Gly, Pro；
（６）芳香族：Trp, Tyr, Phe。
【００２６】
本発明内で用いる「保存的」アミノ酸置換という用語は、機能的に均等なアミノ酸に置換するアミノ酸置換を指すことを意味する。保存的アミノ酸変化により、結果として生じるペプチドのアミノ酸配列にサイレント変化が生じる。例えば、一又は複数の同様な極性のアミノ酸は機能的等価物として作用し、ペプチドのアミノ酸配列内にサイレント変化を生じる。一般的に、グループ内の置換は構造及び機能に関して保存されているとみなされる。しかしながら、当業者であれば、特定の残基の役割が生じた分子の三次元構造内の内容によって決定されることが分かるであろう。例えば、Ｃｙｓ残基は酸化（ジスルフィド）型に生じ得、それは還元（チオール）型より極性が小さい。Ａｒｇ側鎖の長鎖脂肪族部分は構造的又は機能的役割の重要な特徴を構成しており、これは、他の塩基性残基よりもむしろ非極性の置換によって最も保存されうる。また、芳香族基（Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＰｈｅ）を含む側鎖はイオン性芳香族又は「陽イオン-パイ」相互作用に関与しうる。これらの場合、酸性又は非荷電性の極性基のメンバーを有するこれら側鎖の一の置換は構造及び機能に関して保存されうる。Ｐｒｏ、Ｇｌｙ及びＣｙｓ（ジスルフィド型）などの残基は主鎖コンホメーションに直接影響し得、しばしば構造的歪みを伴なわないで置換され得ない。
タンパク質の機能又は免疫学的同一性における実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋コンホメーション、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持するそれらの効果において有意に異なる置換を選択することにより達成される。非保存的アミノ酸置換は、例えば上述のアミノ酸の一群のメンバーを他の群のメンバーと交換することによって機能的に非等価なアミノ酸に置換するアミノ酸置換を意味する。
【００２７】
突然変異誘発の好ましい位置であるタンパク質中におけるある残基又は領域の特定のために有用な方法は、Cunningham及びWells, Science 244: 1081-1085 (1989)に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。残基又は標的残基群が同定され（例えば、Ａｒｇ、Aｓｐ、Hｉｓ、Lｙｓ、及びGｌｕ等の荷電残基）、中性又は負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）に置換され、アミノ酸と結合標的との相互作用に影響を及ぼす。ついで置換に対する機能的感受性を証明するこれらのアミノ酸の位置は、置換部位において又はそれに対して更なる又は他の変異体を導入することにより精製される。よって、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における変異の性能を分析するために、Ａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現された変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
「二面角」なる用語は、一結合についての回旋度を意味する。例えば、Creighton, T.E. (1993) Protein: Structures and Molecular Properties, 2版 W. H. Freeman and Company, New York, NYを参照。
「ファイ(phi)」なる用語は、アミノ酸のＮ-Ｃα結合の回りの回旋度を示す二面角である。例えば、Creighton, T.E., (1993) Protein:Structures and Molecular Properties, 2 版, W. H. Freeman and Company, New York, NYを参照。全てのＤアミノ酸及びグリシンは正のファイ角を有する骨格高次構造を直ぐに採る。典型的には、残りのＬアミノ酸は負のファイ角を持つ高次構造を好み、そのような骨格高次構造を支持する三次元環境（三次）構造に配される場合のみ、正のファイ角を直ぐに採る。
タイプＩβターンは、Hutchinson, E. G.及びThornton, J. M. (1994) A revised set of potentials for beta turn formation in proteins. Protein Science 3, 2207-2216に記載されている。
【００２８】
「融合タンパク質」及び「融合ポリペプチド」は、互いに共有結合した２つの部位を有するポリペプチドを意味し、それぞれの部位は異なる性質を有するポリペプチドである。その性質はインビトロ又はインビボなどの生物学的性質でありうる。また、その特性は標的分子への結合、反応の触媒などの単一の化学的又は物理学的性質でありうる。２つの部位は、単一のペプチド結合によって直接的に、あるいは一又は複数のアミノ酸残基を含むペプチドリンカーを介して連結されうる。一般的に、２つの部位とリンカーは互いに読み枠内にあるであろう。
「抱合体（コンジュゲート）」は、融合タンパク質、並びにアミノ酸又はタンパク質部位と非タンパク質部位の両方を含む分子を含む任意のハイブリッド分子を意味する。抱合体は、例えば組換えＤＮＡ技術、固相合成法、液相合成法、有機化学的合成技術又はこれら技術の組み合わせを含む、当該分野で既知の様々な技術により合成することができる。合成法の選択は生成され特定の分子に依存する。例えば、性質が必ずしも「タンパク質」ではないハイブリッド分子は、組換え技術と液相法を組み合わせて合成することができる。
「ＣＤ２０」抗原は、末梢血又はリンパ系器官の９０％を越えるＢ細胞の表面で見出される分子量およそ３５ｋＤの非グルコシル化膜貫通型リンタンパク質である。ＣＤ２０は初期のプレＢ細胞発生中に発現し、形質細胞分化まで残る；ヒトの幹細胞、リンパ球前駆細胞又は正常血漿細胞には見出されない。ＣＤ２０は正常なＢ細胞並びに悪性のＢ細胞の双方に存在する。文献におけるＣＤ２０の他の名称には「Ｂリンパ球制限分化抗原」及び「Ｂｐ３５」がある。ＣＤ２０抗原は、例えば、Clark及びLedbetter, Adv. Can. Res. 52:81-149 (1989)、及びValentine等 J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989)に記載されている。ヒトＣＤ２０のｃＤＮＡ配列は図５に示す。そのアミノ酸配列は、膜貫通領域をボックスで囲み細胞外領域に下線を付して図６に示す。推定ドメインは１−６３：細胞質；６４−８４：膜貫通；８５−１０５：膜貫通；１０６−１２０：細胞質；１２１−１４１：膜貫通；１４２−１８８：細胞外；１８９−２０９：膜貫通；２１０−２９７：細胞質；８１−１６７：ジスルフィド結合である。
【００２９】
「ＣＤ２０結合抗体」と「抗ＣＤ２０抗体」はここで交換可能に用いられ、抗体が抗原を発現する細胞を標的とした治療剤として有効な程度に親和性をもってＣＤ２０に結合し、以下に記載のアッセイにおけるネガティブ対照タンパク質などの他のタンパク質と顕著には交差反応を示さない全ての抗体を包含する。また、抗体の一アームがＣＤ２０に結合する二重特異性抗体も考慮される。このＣＤ２０結合抗体の定義には前述の抗体の機能的断片（フラグメント）も含まれる。ＣＤ２０結合抗体は＜１０ｎＭのＫｄでＣＤ２０に結合するであろう。好ましい実施態様では、該結合は＜７．５ｎＭ、より好ましくは＜５ｎＭ、更により好ましくは１−５ｎＭの間、最も好ましくは＜１ｎＭのＫｄのものである。
【００３０】
特定の実施態様では、抗ＣＤ２０抗体はヒト及び霊長類ＣＤ２０に結合する。特定の実施態様では、ＣＤ２０に結合する抗体はヒト化され又はキメラである。ＣＤ２０結合抗体には、リツキシマブ（リツキサン（登録商標））、ｍ２Ｈ７（マウス２Ｈ７）、ｈｕ２Ｈ７（ヒト化２Ｈ７）、及び、限定するものではないがｈｕ２Ｈ７．ｖ１６（ｖは型(バージョン)を表す）、ｖ３１、ｖ７３、ｖ７５を含むそのすべての機能的変異体、並びにフコース欠乏性変異体が含まれる。２Ｈ７、ｈｕ２Ｈ７．ｖ１６及びｈｕｍκＩに対する軽鎖ドメインの可変領域の配列アラインメントは図７に示す。２Ｈ７、ｈｕ２Ｈ７．ｖ１６及びｈｕｍＩＩＩに対する重鎖ドメインの可変領域の配列アラインメントは図８に示す。幾つかのｈｕ２Ｈ７変異体抗体の配列を以下に示す：
hu2H7.v16 Ｌ鎖[232 aa]（配列番号５６）
MGWSCIILFLVATATGVHSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGK
APKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGT
KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES
VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
hu2H7.v16 H 鎖[471 aa]（配列番号５７）
MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAP
GKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVY
YSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV
SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE
PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI
SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
hu2H7.v31 H 鎖[471 aa]（ 配列番号５８）。Ｌ鎖は上のｖ１６のものと同一である。
MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAP
GKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVY
YSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV
SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE
PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATI
SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【００３１】
ＣＤ２０抗体に関する特許及び特許文献には、米国特許第５７７６４５６号、同第５７３６１３７号、同第６３９９０６１号、及び同第５８４３４３９号、並びに米国特許出願第２００２／０１９７２５５Ａｌ号及び米国特許出願第２００３／００２１７８１Ａ１号（Anderson等）；米国特許第６４５５０４３Ｂ１号及び国際公開第００／０９１６０号（Grillo-Lopez,A.）；国際公開第００／２７４２８号（Grillo-Lopez及びWhite）；国際公開第００／２７４３３号（Grillo-Lopez及びLeonard）；国際公開第００／４４７８８号（Braslawsky等）；国際公開第０１／１０４６２号（Rastetter,W.）；国際公開第０１／１０４６１号（Rastetter及びWhite）；国際公開第０１／１０４６０号（White及びGrillo-Lopez）；米国特許出願第２００２／０００６４０４号及び国際公開第０２／０４０２１号（Hanna及びHariharan）；米国出願第２００２／００１２６６５Ａｌ号及び国際公開第０１／７４３８８号（Hanna,N.）；米国出願第２００２／０００９４４４Ａ１号及び国際公開第０１／８０８８４号（Grillo-Lopez,A.）；国際公開第０１／９７８５８号（White,C.）；米国出願第２００２／０１２８４８８Ａ１号及び国際公開第０２／３４７９０号（Reff,M.）；国際公開第０２／０６０９５５号（Braslawsky等）；国際公開第０２／０９６９４８号（Braslawsky等）；国際公開第０２／０７９２５５号（Reff及びDavies）；米国特許第６１７１５８６Ｂ１号及び国際公開第９８／５６４１８号（Lam等）；国際公開第９８／５８９６４号（Raju,S.）；国際公開第９９／２２７６４号（Raju,S.）；国際公開第９９／５１６４２号、米国特許第６１９４５５１Ｂ１号、米国特許第６２４２１９５Ｂ１号、米国特許第６５２８６２４Ｂ１号及び米国特許第６５３８１２４号（Idusogie等）；国際公開第００／４２０７２号（Presta,L.）；国際公開第００／６７７９６号（Curd等）；国際公開第０１／０３７３４号（Grillo-Lopez等）；米国出願第２００２／０００４５８７Ａ１号及び国際公開第０１／７７３４２号（Miller及びPresta）；米国出願第２００２／０１９７２５６号（Grewal,I.）；米国特許第６０９０３６５Ｂ１号、第６２８７５３７Ｂ１号、第６０１５５４２号、第５８４３３９８号及び第５５９５７２１号（Kaminski等）；米国特許第５５００３６２号、第５６７７１８０号、第５７２１１０８号、及び第６１２０７６７号（Robinson等）；米国特許第６４１０３９１Ｂ１号（Raubitschek等）；米国特許第６２２４８６６Ｂ１号及び国際公開第００／２０８６４号（Barbera-Guillem,E.）；国際公開第０１／１３９４５号（Barbera-Guillem,E.）；国際公開第００／６７７９５号（Goldenberg）；国際公開第００／７４７１８号（Goldenberg及びHansen）；国際公開第００／７６５４２号（Golay等）；国際公開第０１／７２３３３号（Wolin及びRosenblatt）；米国特許第６３６８５９６Ｂ１号（Ghetie等）；米国出願第２００２／００４１８４７Ａｌ号（Goldenberg,D.）；米国出願第２００３／００２６８０１Ａ１号（Weiner及びHartmann）；国際公開第０２／１０２３１２号（Engleman,E.）が含まれ、その各々が出典明示によりここに取り込まれる。また、米国特許第５８４９８９８号及び欧州特許出願第３３０１９１号（Seed等）；米国特許第４８６１５７９号及び欧州特許出願第３３２８６５Ａ２号（Meyer及びWeiss）；及び国際公開第９５／０３７７０号（Bhat等）を参照のこと。
【００３２】
ＣＤ２０抗体は、そのままの抗体又は細胞傷害化合物、例えば放射性同位元素又は毒素などに抱合したものでありうる。このような抗体には、放射性同位元素のイットリウム-９０に結合させた抗体ZEVALIN(登録商標)(IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA)とＩ-１３１を抱合したBEXXAR(登録商標)(Corixa, WA)が含まれる。ヒト化２Ｈ７変異体には、ＦＲのアミノ酸置換と移植されたＣＤＲに変化を持つ親和性成熟変異体を有するものが含まれる。ＣＤＲ又はＦＲの置換アミノ酸は、ドナー又はアクセプター抗体にあるとは限らない。他の実施態様では、本発明の抗ＣＤ２０抗体は、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ機能及びＢ細胞殺傷（またここではＢ細胞枯渇とも称する）の亢進を含むエフェクター機能の改善を導くＦｅ領域のアミノ酸残基変化を更に含む。記載のように(上掲のIdusogie等(2001)；上掲のShields等）、特に、３つの突然変異がＣＤＣ及びＡＤＣＣ活性を改善することが同定された：Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ（またここでは３つのＡｌａ突然変異体又は変異体と称される；Ｆｃ領域の番号付けはＥＵ番号付け系に従う；上掲のKabat等)。
本発明での使用に適した他の抗ＣＤ２０抗体には、安定性を改善する特定の変化を有するものが含まれる。ある実施態様では、キメラ抗ＣＤ２０抗体はマウスＶ領域及びヒトＣ領域を有する。そのようなある特定のキメラ抗ＣＤ２０抗体はリツキサン（登録商標）(リツキシマブ（登録商標）；ジェネンテック・インク)である。リツキシマブ及びｈｕ２Ｈ７は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の両方を介してＢ細胞の溶解を媒介しうる。改変したＦｃ領域アミノ酸配列及び亢進又は減弱したＣ１ｑ結合能を有する抗体変異体は、米国特許第６１９４５５１Ｂ１号及び国際公開第９９／５１６４２号に記載されている。それら特許文献の内容は出典明示によって特にここに取り込まれる。また、Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)も参照のこと。
国際公開第００／４２０７２号(Presta)にはＦｃＲへの結合を改善又は減弱させたポリペプチド変異体が記載されている。この特許文献の内容はここに出典明示により特に取り込まれる。Shields等 Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)もまた参照のこと。
【００３３】
ＩｇＧのＮグリコシル化部位はＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７である。Ｆｃ領域を有するヒト化ＣＤ２０結合抗体もまたここに包含され、それは組成物中約８０−１００％（好ましくは約９０−９９％）の抗体がフコースを欠損し、糖タンパク質のＦｃ領域に結合した成熟コア炭水化物構造を含む。このような抗体は、ヒトＩｇＧと相互作用する際にＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）ほど効果的ではないが、ＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）への結合において改善を示す。
本発明のＣＤ２０結合抗体の「機能的断片」は、それ自体が由来する無傷の完全鎖分子と実質的に同じ親和性でＣＤ２０への結合を維持する断片であり、ここで開示するようなインビトロ又はインビボアッセイにより測定してＢ細胞を枯渇することができるものである。
「抗体」なる用語は、最も広義の意味で用いられ、例えばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多エピトープ特異性を有する抗体、一本鎖抗体及び抗体断片を特に包含する。ある実施態様によると、本発明のポリペプチド配列（例えば１７-ｍｅｒ）は抗体配列内に挿入することができ、例えば可変領域内又はＣＤＲ内に挿入されて、抗体がBLｙSに結合してＢＬｙＳのＢＲ３への結合又はＢＬｙＳシグナル伝達を阻害する。本発明のポリペプチドを含む抗体は、キメラ、ヒト化又はヒトのものでありうる。本発明のポリペプチドを含む抗体は抗体断片でありうる。そのような抗体及びそれらを生成する方法は以下に詳細に記載する。あるいは、本発明の抗体は動物を本発明のポリペプチドで免疫化して生成することができる。よって、本発明のポリペプチドに対する抗体が考慮される。
【００３４】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体はハイブリドーマ培養により合成され、他のイムノグロブリンによって汚染されない点で利点がある。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を表すものであり、抗体が何か特定の方法による生成を必要とすることを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature, 256:495(1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作ることができる（例えば米国特許第４８１６５６７号を参照のこと）。また「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson等,Nature, 352：624-628 (1991)及びMarks等 J.Mol.Biol., 222:581-597(1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから作成することもできる。
ここでのモノクローナル抗体は、特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ配列に一致する又は類似する重鎖及び／又は軽鎖の一部を含むものであり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片のように他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ配列に一致する又は類似するものである「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を特に含む（米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。キメラ抗体の作成方法は当業者に公知である。
【００３５】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体の他の抗原結合サブ配列）である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、マウス、ラット又はウサギなどの所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種のＣＤＲの残基（ドナー抗体）によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくは導入したＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練する及び最大にするために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、一般的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。更なる詳細については、Jones等, Nature, 321:522-525(1986);Reichmann等, Nature 332:323-329(1988);及びPresta, Curr.Op.Struct.Biol., 2:593-596(1992)を参照のこと。ヒト化抗体には、抗体の抗原結合領域が、対象の抗原でマカクザルを免疫化することによって産生した抗体由来のものであるPRIMATIZED（登録商標）抗体が含まれる。ヒト化抗体の作製方法は当分野において公知である。
また、「ヒト化抗体」は、ファージディスプレイライブラリーを含む当分野に公知の様々な技術を用いて生成することができる。Hoogenboom及びWinter, J.Mol.Biol., 227:381(1991)；Marks等, J.Mol.Biol., 222:581(1991)。また、Cole等及びBoerner等の技術はまたヒトモノクローナル抗体の調製に有用である。Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77(1985)；Boerner等, J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)。
【００３６】
本発明の「組成物」は、場合によっては生理学的に許容可能な担体と組み合わせて、本発明のポリペプチドを含有する。組成物は意図された徴候を治療するための更なる治療剤を更に含有しうる。ある実施態様によれば、組成物は免疫関連疾患の治療薬及び癌の治療薬から選択される第二の治療剤を含有する。ある実施態様では、癌の治療薬は細胞傷害剤、化学療法剤、成長阻害剤及び化学療法剤からなる群から選択される。
ここで用いられる「担体」は、用いられる服用量及び濃度でそれらに曝露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含む。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸のようなバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、TWEEN（登録商標)、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びPLURONICS(登録商標)を含む。
「標識」という語は、ここで用いられる場合、ポリペプチド、抗体、アンタゴニスト又は組成物に直接的又は間接的に結合して「標識化」ポリペプチド、抗体、アンタゴニスト又は組成物を生成する検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識はそれ自身によって検出可能でもよく（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）、あるいは、酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的変換を触媒してもよい（ＦＲＥＴによる）。
【００３７】
様々なタグポリペプチドとその各抗体は当該分野で良く知られている。本発明のタグポリペプチド及び抗体が考慮される。例には、ポリ-ヒスチジン（poly-His)又はポリ-ヒスチジン-グリシン(poly-His-gly)タグ；ｆｌｕＨＡタグポリペプチドとその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165(1988)］；ｃ-ｍｙｃタグとそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)）；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパクＤ(ｇＤ)タグとその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553(1990)］が含まれる。ＦＬＡＧ-ペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210(1988)］は抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体（Eastman Kodak Co., New Haven, CT）によって認識される。ＦＬＡＧペプチドを含むタンパク質の精製は、アガロースに供給結合した抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体（Eastman Kodak Co., New Haven, CT）を含むアフィニティーマトリックスを使用する免疫親和性クロマトグラフィーによって実施することができる。他のタグポリペプチドには、ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194(1992)］；αチューブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパクペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］が含まれる。
ここで用いられる「細胞傷害剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を意味する。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド類（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤、酵素及びその断片、例えば核溶解性酵素、抗生物質、及び毒素、例えば小分子毒素又はその断片及び／又は変異体を含む細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そして以下に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞障害性薬が以下に記載される。
【００３８】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類、；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カリケアマイシン(calicheamicin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン、マルセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolicacid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)などの抗生物質；メトトレキセート及び５−フルオロウラシル(５−ＦＵ）のような抗代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似物；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)、５−ＦＵ；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinicacid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)：ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリン酸(podophyllinicacid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＫＳ(登録商標)；ラゾキサン(razoxane)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonicacid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２"-トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカーバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（タキソール(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）及びドキセタキセル（タキソテア(登録商標)、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン、カルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン(navelbine)；ノバントロン(novantron)；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＴＰ-１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸；エスペラマイシン；カペシタビン(capecitabine)；並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は類似体が含まれる。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働くホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン(raloxifene)、４(５)-イミダゾール類を阻害するアロマターゼ、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、トレミフェン(Fareston)；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)及びニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド(bicalutamide)、リュープリン(leuprolide)、及びゴセレリン；上記のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は類似体が含まれる。
【００３９】
ここで用いられる際の「成長阻害剤」は、細胞の成長をインビトロ又はインビボの何れかで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、成長阻害剤は、Ｓ期でそのような遺伝子を過剰発現する細胞の割合を有意に減少させるものである。成長阻害剤の例は、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）ブロックする薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキソール、及びトポＩＩイソメラーゼ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael編, Chapter1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等 (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
「単離された」とは、ここに開示される様々なタンパク質を記述するために使用される場合、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたタンパク質を意味する。その自然環境の汚染成分は、典型的にはタンパク質の診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、タンパク質は、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように充分な程度まで精製される。タンパク質の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離されたタンパク質には、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたタンパク質は少なくとも一つの精製工程により調製される。
【００４０】
「異種（ヘテロロガス）」成分は参照成分とは異なる成分を意味する（例えば、参照成分が天然に生じるヒトＢＲ３配列と称されるならば、異種成分は天然に生じるＢＲ３配列とは異なる）。一例では、一生物から得られたポリヌクレオチドが第二の生物のポリヌクレオチド配列と異なり、第二の生物のポリヌクレオチド配列（参照成分）中に遺伝子工学技術によって導入されるならば、第一の生物由来のポリヌクレオチドは第二の生物のポリヌクレオチドに対して異種であり、もし発現されたならば、第二の生物の各ポリペプチドに対して異種であるポリペプチドをコードし得る。同様に、ある実施態様では、第一のペプチドとは異なる機能又は配列を有する第二のポリペプチドに融合しているポリペプチドは第二のペプチドに対して異種である。異種成分はまた化学的に合成された成分、例えば合成ポリペプチドを意味する場合がある。
治療又は療法の目的での「哺乳動物」は、哺乳動物に分類される任意の動物を意味し、ヒト、家畜用及び農場用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
「治療的有効量」という用語は、患者又は哺乳動物の疾患又は障害を「寛解」又は「治療」するのに効果的な本発明の組成物の量を意味する。一般に、疾患又は障害の寛解又は治療はその疾患又は障害に関連する一又は複数の徴候又は医療課題の軽減を含む。ある実施態様では、それは哺乳動物においてＢ細胞数の減少を生じる量である。癌の場合、治療的有効量の薬は癌細胞の数を減じ；腫瘍の大きさを減じ；末梢器官への癌細胞の浸潤を阻害（すなわち、ある程度まで減速、好ましくは停止）し；腫瘍転移を阻害（すなわち、ある程度まで減速及び好ましくは停止）し；腫瘍成長をある程度まで阻害し；及び／又は癌に付随する一又は複数の徴候をある程度まで緩和することができる。薬剤が成長を防止し及び／又は存在している癌細胞を殺すことができる程度までは、それは細胞分裂阻害性及び／又は細胞毒性である。ある実施態様では、本発明の組成物は患者又は哺乳動物において疾患又は障害の発生又は再発を防止するために使用することができる。例えば、自己免疫疾患の患者では、本発明の組成物を、突発を防止又は寛解するために使用することができる。
【００４１】
「癌」、「癌性」及び「悪性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病を含む癌腫が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌腫(hepatic carcinoma)及び肝癌(hepatoma)等の肝臓癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎細胞癌及びウィルムス腫瘍等の腎臓癌、基底細胞癌、黒色腫、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、及び様々な種類の頭部及び頸部の癌が含まれる。場合によっては、癌はＢＬｙＳを発現し又は癌細胞に付随させる。ある実施態様では、ここで治療される癌には、リンパ腫、白血病及び骨髄腫、及びそのサブタイプ、例えばバーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性又はリンパ球性白血病、非ホジキン及びホジキンリンパ腫、及び急性骨髄性白血病が含まれる。
「免疫関連疾患」という用語は、哺乳動物の免疫系の成分が、哺乳動物の病的状態の原因であるか、媒介又は寄与するものである疾患を意味する。また、免疫反応の刺激又は介在により疾患の進行に改善された効果が付与される疾患も含まれる。この用語に含まれるものは、自己免疫疾患、免疫媒介炎症疾患、非免疫媒介炎症疾患、感染症、免疫欠損症が含まれる。本発明で治療可能で、その幾つかは免疫又はＴ細胞媒介性である免疫関連及び炎症疾患の例には、リウマチ様関節炎、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症(強皮症)、特発性炎症ミオパシー(皮膚筋炎、多発性筋炎)、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血(免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿)、自己免疫性血小板減少(特発性血小板減少性紫斑病、免疫仲介血小板減少)、甲状腺炎(グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎)、真性糖尿病、免疫仲介腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎)、中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、例えば多発性硬化症、特発性脱随性多発神経障害、又はギラン-バレー症候群、及び慢性炎症脱随性多発神経障害、肝胆汁性疾患、例えば感染性肝炎(Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎及び他の非肝親和性(non-hepatotropic)ウィルス)、自己免疫慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎；クローン病)、グルテン過敏性腸疾患、及びウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、乾癬、アレルギー性疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹、肺の免疫疾患、例えば好球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎、拒絶反応及び移植片対宿主疾患を含む移植関連疾患が含まれる。ウイルス性疾患、例えばＡＩＤＳ(ＨＩＶ感染)、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型及びＥ型肝炎、ヘルペス等、細菌感染、真菌感染、原生動物感染及び寄生虫感染等の感染症も含まれる。
【００４２】
本明細書の「自己免疫疾患」という語は広義で使用され、一般的な意味で、自己の組織成分に対する個体の体液又は細胞の免疫反応から正常又は健康な組織の破壊が生じる、哺乳動物の障害、又は状態を指す。例として、これらに限定するものではないが、エリテマトーデス、甲状腺炎、リウマチ様関節炎、乾癬、多発性硬化症、自己免疫糖尿病、及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）が挙げられる。
ここで用いる「Ｂ細胞枯渇」は、処置前のレベルと比較して薬剤又は抗体処置後に動物又はヒトにおいてＢ細胞レベルが減少することを表す。Ｂ細胞レベルは、全血球計算値を求める、公知のＢ細胞マーカーに対するＦＡＣＳ分析スキャニング及び実験的実施例に示した方法などの公知のアッセイを用いて測定する。Ｂ細胞枯渇は完全又は部分的なものであり得る。Ｂ細胞枯渇薬剤を投与されている患者では、一般的にＢ細胞は、薬剤が患者体内を循環し、Ｂ細胞が回復する持続時間の間枯渇される。
【００４３】
１．ポリペプチドＢＬｙＳアンタゴニスト
本発明はＢＬｙＳのアンタゴニストとして有用なポリペプチドを記述する。幾つかの実施態様では、１７ｍｅｒのペプチドは可溶性であり（好ましくは膜結合性でない）、コア配列として用いられるか、さもなければ以下に記載の多様な構造と結合又は抱合されうる。１７ｍｅｒポリペプチド内の幾つかのアミノ酸は、保存的置換及び非保存的置換について無作為化してスクリーニングした。当業者には理解されまたここに記載されているように、付加及び置換は、結果として生じる１７ｍｅｒのペプチドのＢＬｙＳ結合及び１７ｍｅｒのペプチドを含む構造を損なうことなく達成されうる。ＢＬｙＳ結合機能を生じる許容される置換についての指針は以下と実施例に提供する。幾つかの実施態様では、構造的又は結合的親和性関係に関わる残基が保存され、このことは式と以下の説明に記載のようにアミノ酸同一性が維持されるか又は保存的置換がなされていることを意味する。
本発明のポリペプチドは、式Ｉ（配列番号１）、式ＩＩ（配列番号１８）、式ＩＩＩ（配列番号２６）、図１２Ａ−Ｃに記載の配列、ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号１３）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号１４）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号１５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号１６）及びＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号１７）及びそれらの混合物からなる群から選択される配列を含む。
【００４４】
本発明の一態様では、ポリペプチドは、式Ｉ：
Ｘ１-ＣＮ-Ｘ３-Ｄ-Ｘ５-Ｌ-Ｘ７-Ｘ８-Ｘ９-Ｘ１０-Ｘ１１-Ｘ１２-ＣＴ-Ｘ１４-Ｘ１５-Ｘ１６-Ｘ１７（式Ｉ）（配列番号１）の配列を含み、
ここで、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１５及びＸ１７はシステイン以外の任意のアミノ酸であり；
Ｘ１６はＬ、Ｆ、Ｉ及びＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
ポリペプチドは式ＩのＮ末端からＣＮ（システインＮ末端）及びＣ末端からＣＴ（システインＣ末端）の７個のアミノ酸残基内にシステインを含まない。
ある実施態様では、式Ｉの配列を含むポリペプチドは、ジスルフィド結合によって結合されたＣＮとＣＴを有し；Ｘ５ＬＸ７Ｘ８はＬとＸ７の間にターンの中心を持つＩ型βターン構造の高次構造（コンホメーション）を形成し；Ｘ８の二面角φ（ファイ）に対して正の値を持つ。図１３及び以下の説明を参照のこと。
【００４５】
ある実施態様では、Ｘ１０はＷ、Ｆ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｙ、Ｍ及び非極性アミノ酸からなる群から選択される（配列番号２）。ある実施態様では、Ｘ１０はＷである（配列番号３）。ある実施態様では、Ｘ３はＭ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｙ、Ｆ、Ｗ及び非極性アミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸である（配列番号４）。ある実施態様では、Ｘ５はＶ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｉ、Ａ及びＲからなる群から選択される（配列番号５）。ある実施態様では、Ｘ７はＶ、Ｔ、Ｉ及びＬからなる群から選択される（配列番号６）。ある実施態様では、Ｘ７はＴ又はＩではない（配列番号７）。ある実施態様では、Ｘ８は、Ｒ、Ｋ、Ｇ、Ｎ、Ｈと全てのＤ-アミノ酸からなる群から選択される（配列番号８）。ある実施態様では、Ｘ９はＨ、Ｋ、Ａ、Ｒ及びＱからなる群から選択される（配列番号９）。ある実施態様では、Ｘ１１は、Ｉ又はＶである（配列番号１０）。ある実施態様では、Ｘ１２は、Ｐ、Ａ、Ｄ、Ｅ及びＳからなる群から選択される（配列番号１１）。ある実施態様では、Ｘ１６はＬである（配列番号１２）。
特定の実施態様では、式Ｉの配列は、ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号１３）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号１４）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号１５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号１６）及びＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号１７）からなる群から選択される配列である。
【００４６】
本発明の他の態様は、式ＩＩ：
Ｘ１-ＣＮ-Ｘ３-Ｄ-Ｘ５-Ｌ-Ｖ-Ｘ８-Ｘ９-Ｗ-Ｘ１１-Ｘ１２-ＣＴ-Ｘ１４-Ｘ１５-Ｌ-Ｘ１７（式ＩＩ）（配列番号１８）
の配列を含んでなるポリペプチドを含み、
ここで、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１５及びＸ１７はシステイン以外の任意のアミノ酸であり；ポリペプチドは式ＩＩのＮ末端からＣＮ（システインＮ末端）及びＣ末端からＣＴ（システインＣ末端）の７個のアミノ酸残基内にシステインを含まない。
ある実施態様では、式ＩＩの配列を含むポリペプチドは、ジスルフィド結合によって結合されるＣＮとＣＴを有し；Ｘ５ＬＶＸ８はＬとＶの間にターンの中心を持つＩ型βターン構造の高次構造を形成し；Ｘ８が二面角φに対して正の値を持つ。図１３を参照のこと。
【００４７】
ある実施態様では、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１５及びＸ１７は、Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｖ、Ａ、Ｄ、及びＧからなる群から選択される（配列番号１９）。
式ＩＩのある実施態様では、Ｘ３は、ノルロイシン、Ｍ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、及び非極性アミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸である（配列番号２０）。式ＩＩのある実施態様では、Ｘ５は、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｉ、Ａ及びＲからなる群から選択される（配列番号２１）。式ＩＩのある実施態様では、Ｘ８は、Ｒ、Ｋ、Ｇ、Ｎ、Ｈ及び全てのＤ-アミノ酸からなる群から選択される（配列番号２２）。式ＩＩのある実施態様では、Ｘ９は、Ｈ、Ｋ、Ａ、Ｒ及びＱからなる群から選択される（配列番号２３）。式ＩＩのある実施態様では、Ｘ１１は、Ｉ及びＶからなる群から選択される（配列番号２４）。式ＩＩのある実施態様では、Ｘ１２は、Ｐ、Ａ、Ｄ、Ｅ及びＳからなる群から選択される(配列番号２５）。
本発明はまた図１２Ａ−Ｃに記載された配列の何れか一（配列番号１３、１５、１６、及び６３−１３７）から選択される配列を含むポリペプチドに関する。
【００４８】
本発明の他の態様は、式ＩＩＩ：
Ｅ-ＣＮ-Ｆ-Ｄ-Ｘ５-Ｌ-Ｖ-Ｘ８-Ｘ９-Ｗ-Ｖ-Ｘ１２-ＣＴ-Ｘ１４-Ｘ１５-Ｘ１６-Ｘ１７（式ＩＩＩ）（配列番号２６）
の配列を含んでなるポリペプチドを含み、
ここで、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１５及びＸ１７はシステイン以外の任意のアミノ酸であり；
ここで、Ｘ１６はＬ、Ｆ、Ｉ及びＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
ポリペプチドは式ＩＩＩのＮ末端からＣＮ（システインＮ末端）及びＣ末端からＣＴ（システインＣ末端）の７個のアミノ酸残基内にシステインを含まず；
ここで、ＣＮとＣＴはジスルフィド結合によって結合される。
式ＩＩＩのある実施態様では、式ＩＩＩの近接配列を含むポリペプチドは、ＣＮとＣＴの間にジスルフィド結合を有し、Ｘ５ＬＶＸ８で、ＬとＶの間にターンの中心を持つＩ型βターン構造を形成し；Ｘ８の二面角φが正の値である。図１３を参照のこと。
【００４９】
式ＩＩＩのある実施態様では、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１５及びＸ１７は、Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｖ、Ａ、Ｄ、及びＧからなる群から選択される（配列番号２７）。式ＩＩＩのある実施態様では、Ｘ５がＬであり、Ｘ８がＲである（配列番号２８）。式ＩＩＩのある実施態様では、Ｘ９は、Ｈ、Ｋ、Ａ、Ｓ、Ｒ及びＱからなる群から選択される。式ＩＩＩのある実施態様では、Ｘ１２は、Ｐ、Ａ、Ｄ、Ｅ及びＳからなる群から選択される(配列番号３０）。式ＩＩＩのある実施態様では、Ｘ１２はＰである(配列番号３１）。式ＩＩＩのある実施態様では、Ｘ１６はＬである（配列番号３２）。
特定の実施態様では、式ＩＩＩの配列は、ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号１３）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号１４）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号１５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号１６）及びＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号１７）からなる群から選択される。
【００５０】
本発明はまたＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号１３）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号１４）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号１５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号１６）及びＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号１７）からなる群から選択される近接ポリペプチド配列に関する。本発明はまた図１２Ａ−Ｃに記載された配列の何れか一から選択される配列を含んでなるポリペプチドにも関する。図１２Ａ−Ｃに記載された配列の何れか一から選択される配列を含んでなるポリペプチドは、好ましくは、配列のシステインをジスルフィド結合によって結合させる。ある実施態様では、配列の第５残基と第８の残基の間の配列がＬとＸ７の間にターンの中心を持つＩ型βターン構造を形成し、第８残基が二面角φに対して正の値を持つ。
【００５１】
本発明はまたＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号１３）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号１４）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号１５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号１６）及びＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号１７）からなる群から選択される近接１７アミノ酸長（１７ｍｅｒ）ポリペプチド配列と少なくとも８８％の配列同一性を有するポリペプチドにも関する。他の実施態様では、配列同一性は、最大の相同性を得られるように配列した後に少なくとも６４％から１００％までの連続した整数である。最大の相同性が得られるように配列した後に配列間隙と本発明の１７アミノ酸長より少ない配列を入れることで相同性が低くなる。Ｎ末端又はＣ末端の伸展も挿入も相同性を低くするとはみなさない。
本発明のある実施態様によると、ポリペプチドは５０アミノ酸長以下、２５アミノ酸長以下、又は１７ｍｅｒ(１７アミノ酸長)である。
幾つかの実施態様では、本発明のポリペプチドは、式Ｉ（配列番号１）、式ＩＩ（配列番号１８）、式ＩＩＩ（配列番号２６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号１３）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号１４）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号１５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号１６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号１７）、又は図１２Ａ−Ｃに挙げる配列に、Ｎ末端、Ｃ末端又はその両方に付加的ポリペプチドを含む。付加的ポリペプチド配列は、天然配列ＢＲ３ポリペプチドに非相同で、例としてイムノグロブリンのＦｃ部位を含む。
【００５２】
本発明の他の態様は、式Ｉ（配列番号１）、式ＩＩ（配列番号１８）、式ＩＩＩ（配列番号２６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号１３）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号１４）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号１５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号１６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号１７）、又は図１２Ａ−Ｃに挙げる配列を含むポリペプチドの少なくとも一及び好ましくは一以上を含むポリペプチドを含む。互いに連結するポリペプチドは同じ配列又は異なる配列を持ちうる。幾つかの実施態様では、これらのポリペプチドは互いに、場合によってはリンカーを介して結合しうる。リンカーはスペーサーとして機能し、多種の化学的化合物からなりうる。幾つかの実施態様では、リンカーは、約１から５０アミノ酸、より好ましくは１から３０アミノ酸を含むポリペプチドである。リンカー配列は当分野の技術者に公知である。例えば、リンカー配列は、ＧＧＧＫＧＧＧＧ及びＧＧＧＮＳＳＧＧなどを含む。特定の実施態様では、互いに連結したポリペプチドは同じ配列を持ち、式：ＰＰ１-Ｌ１-ＰＰ１-Ｌ２-ＰＰ１を含むもので、ここでＰＰ１は式Ｉ（配列番号１）、式ＩＩ（配列番号１８）、式ＩＩＩ（配列番号２６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号１３）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号１４）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号１５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号１６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号１７）、又は図１２Ａ−Ｃに挙げる配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、Ｌ１及びＬ２は配列が異なるリンカー配列である。
ここに記載したポリペプチドなどのＢＬｙＳのＢＲ３への結合のアンタゴニストは、好ましくは（配列番号６０）のＢＲ３のＥＣＤ又は（配列番号５９）のミニＢＲ３などの天然のＢＲ３配列と同じかそれよりも大きい親和性でもってＢＬｙＳに結合する。幾つかの実施態様では、式Ｉ（配列番号１）、式ＩＩ（配列番号１８）、式ＩＩＩ（配列番号２６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号１３）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号１４）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号１５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号１６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号１７）、又は図１２Ａ−Ｃに挙げる配列を有するポリペプチドはＢＬｙＳに対して、約１００ｎＭ以下、好ましくは１０ｎＭ以下、又は１ｎＭ以下の結合親和性を持つ。結合親和性を測定する一方法は実施例に示す。
【００５３】
ＢＬｙＳアンタゴニストを見つけるために本発明に使用される方法は、１７残基のコア配列を同定すること、修飾すること、及び選択的に無作為化することを含む。用いた特定の技術は更に以下及び実施例で記載する。
本発明の１７ｍｅｒＢＬｙＳアンタゴニストの構造的な考慮には次のことを含む：幾つかの実施態様では、部位Ｘ２でのＮ末端システイン残基（ＣＮ）及び部位Ｘ１３でのＣ末端システイン（ＣＴ）は保存されており、好ましくはジスルフィド架橋を形成する。幾つかの実施態様では、ＣＮ及びＣＴは１０の近接するアミノ酸により分離されている。好ましくは、１７ｍｅｒ配列は部位Ｘ２及びＸ１３以外に全くシステインを含まない。加えて、１７ｍｅｒが大きな構造に包含される場合、好ましくは１７ｍｅｒに隣接する配列はＣＮ又はＣＴの７アミノ酸内に全くシステイン残基を含まない。Ｘ１０はシステインを除く任意の非極性アミノ酸；例えば：Ｗ、Ｆ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｙ又はＭに置換される。幾つかの実施態様では、Ｘ１０はＷである。
ある実施態様では、モチーフＤ-Ｘ５-Ｌ-Ｘ７は立証されたＢＬｙＳ結合への寄与に応じて保存される。ある実施態様では、ＣＮとＣＴ間に位置するβターンはＸ４とＸ９の間に形成される。ある実施態様では、βターンの中心はＬ-Ｘ７間に位置する。幾つかの実施態様では、本発明の１７ｍｅｒペプチドの構造は一般的に、ＣＮとＣＴ間のジスルフィド結合により連結されるβヘアピンを形成するタイプＩβターンにより連結される２つのβ鎖である。ある実施態様では、Ｘ７はＶ、Ｔ、Ｉ及びＬからなる群から選択してよい。幾つかの実施態様では、好ましくはＸ７はＶである。幾つかの実施態様では、Ｘ４からＸ７のモチーフはＤＬＬＶである。
【００５４】
更に、ある実施態様では、Ｘ８の残基はβヘアピン構造にＩ型βターンを収容するためにＸ８の二面角ファイが正の値を採る。この発明のペプチドの三次元構造モデルの立体図を図１３に示す。このモデルは二つの代表的なペプチドＢＬｙｓ００２７（配列番号１７）及びＢＬｙＳ００４８（配列番号１４）について獲得した溶液ＮＭＲデータに基づいている。そのペプチドはβヘアピン構造を採る；Ｘ１-Ａｓｐ及びＸ９-Ｘ１２がＬｅｕ-Ｘ７に中心を置くＩ型βターンによって連結されているβストランドを形成し、Ｘ８は正のファイ値を採る。残基Ｘ１４-Ｘ１７は溶液中で無秩序状態にあり、一つより多い高次構造を採りうる。骨格はリボン模式図で示されており、側鎖は式ＩのＣＮ、ＣＴ、Ａｓｐ、及びＬｅｕについてのみ示してある；他の位置は側鎖が位置しているであろう方向を示すCalpha-Cbeta結合ベクトルを棒標示で示している。図１３に示すβヘアピン高次構造はＮＭＲ分光計によって測定された様々なパラメータによって定義することができる。簡単に測定される一つのパラメータは３結合バックボーン結合定数３ＪＨＮ-Ｈαである。ある実施態様では、本発明のペプチドの３ＪＨＮ-Ｈα値は、水溶液中で２０℃にて測定して、位置Ｘ１、ＣＮ、Ｄ及びＸ１１の残基に対して＞８、残基Ｘ７に対して＞９Ｈｚ、残基ＣＴに対して＜７Ｈｚであり、ペプチドが、図１３に示される構造に一致して、安定な構造を採っていることを示している。より好ましいペプチドは、３ＪＨＮ-Ｈα値が、水溶液中で２０℃にて測定して、位置Ｄ及びＸ１１、の残基に対して＞８．５、Ｘ１及びＣＮの残基に対しては＞９、Ｘ７の残基に対して＞１０、残基ＣＴに対して＜６Ｈｚであり、図１３に示される構造に一致して、高度に安定な構造を採っていることを示している。ＮＭＲ法を使用して結合定数を決定するための方法は当該分野において知られており、実施例に記載されている。
【００５５】
全てのＤ-アミノ酸とグリシンはバックボーン二面角ファイに対して容易に正の値を採る。これに対して、Ｌ-アミノ酸は、高分解能結晶構造で可視化されている大半のタンパク質及び統一されていないペプチドを含み、殆どの状況において負のファイ値を好む。しかしながら、ある種の三次元構造環境はバックボーン二面角ファイが正の値のこの希な高次構造を安定化させる。すなわち、βヘアピン構造内に埋め込まれたＩ型βターンにおいて、１７ｍｅｒペプチドにおいてＸ８のものに類似の位置における正のファイ値は安定なβヘアピン高次構造を維持するのに必要とされる[Nakamura, G.R., Starovasnik, M.A., Reynolds, M.E.,及びLowman, H.B. (2001) Biochemistry 40, 9828-9835]。ある実施態様では、Ｘ８はＬ-アミノ酸Ｒ、Ｋ、Ｇ、Ｎ、Ｈ及び全てのＤ-アミノ酸からなる群から選択される。
幾つかの実施態様では、ＢＬｙＳアンタゴニストの結合領域の長さは１７アミノ酸である。幾つかの実施態様では、ポリペプチドＢＬｙＳアンタゴニストは１７アミノ酸である。幾つかの実施態様では、４つのアミノ酸、Ｘ１４-Ｘ１７は、Ｃ末端のＣＴに続く。幾つかの実施態様では、１７ｍｅｒが結合し保存されている場合、Ｘ１６はＢＬｙＳと疎水性作用を形成する。幾つかの実施態様では、Ｘ１６はＬである。
更なる実施態様では、１７ｍｅｒＢＬｙＳアンタゴニストは天然のヒトＢＲ３の近接の１７アミノ酸領域に対応するＥＣＦＤＬＬＶＲＨＣＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号２１６）である。
【００５６】
２．ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞
幾つかの実施態様によると、本発明のポリペプチドは、ここに示す１７ｍｅｒのペプチド、一以上の１７ｍｅｒのペプチドをコア領域として組み込んでいるポリペプチド、及び１７ｍｅｒのペプチドとポリペプチドの共有結合的に修飾した型（例えば、イムノアドヘシン、標識したポリペプチド、保護したポリペプチド、抱合したポリペプチド、融合タンパク質など）からなる群から選択される。これらの型のポリペプチドを作製するために用いる多種の技術をここに記載する。ポリペプチドを標識する方法及びポリペプチドに分子を抱合する方法は当分野に公知である。
ペプチド及びポリペプチド又はその部分はペプチド合成法を使用して合成的に製造することができる。合成調製方法はＤアミノ酸を含む位置に非天然発生アミノ酸を導入するのに特に有用である。
本発明の組成物は、当分野に公知の組み換え技術を用いて調製することができる。以下の記載は、コード化核酸を包含するベクターを形質移入又は形質転換した宿主細胞を培養し、細胞培養物からポリペプチドを回収することによってそのようなポリペプチドを生成する方法に関する。（例えばSambrook等,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)；Dieffenbach等, PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)を参照）。
【００５７】
所望のポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）を更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能なベクター内に挿入してもよい。多種のベクターが公然に市販されている。一般的にベクター成分は、限定するものではないが、一以上の以下：シグナル配列、複製起点、一以上のマーカ遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモータ、及び転写終末配列を含み、その各々については以下に記載する。用いる選択的なシグナル配列、複製起点、マーカ遺伝子、エンハンサーエレメント及び転写終末配列は当分野に公知であり、国際公開第９７／２５４２８号に更に詳述されている。
通常、発現及びクローニングベクターは宿主生物によって認識されるプロモーターを含み、コード化核酸配列に作用可能に結合している。プロモータは、特定の核酸配列の転写と翻訳を制御する構造的遺伝子（一般的に約１００から１０００ｂｐ内）の開始コドンの上流（５’）に位置して、作用可能に結合している非翻訳領域である。一般的にそのようなプロモータは２つのクラス、誘発性と恒常性に分類される。誘発性プロモータは、培養条件、例えば栄養の有無や温度の変化などの幾つかの変化に応じて制御下でＤＮＡからの転写レベル亢進を惹起するプロモータである。現在、様々な潜在的宿主細胞によって認識されるプロモータの多くが公知である。これらのプロモータは、制限酵素消化によって元のＤＮＡからプロモータを除去して単離したプロモータをベクター内に挿入することによってコード化ＤＮＡに作用可能に結合している。
原核生物宿主での使用に好適なプロモーターには、ＰｈｏＡプロモーター、βガラクトシダーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系、Ｔ７プロモーター、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃ、ｔａｃＩＩ又はｔｒｃプロモーターが含まれる。しかし、細菌中で機能性である他のプロモーター（例えば他の既知の細菌又はファージプロモーター）も好適である。例えば、そのヌクレオチド配列は発表されている。標的軽鎖及び重鎖にプロモーターを作用可能に結合させる方法は当該分野で知られている（Siebenlist等 (1980) Cell 20: 269）。
【００５８】
一以上の上に列挙した成分を含む適切なベクターの作成には標準的なライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミド又は、必要とされるプラスミドの生成のためにＤＮＡ断片を切断し、整え、そして望ましい型に再ライゲーションする。構築されたプラスミド中において正しい配列であることを確認する解析のために、ライゲーション混合物を用いて、大腸菌Ｋ１２菌株２９４(ATCC31446)に形質転換し、適当な場合にはアンピシリン又はテトラサイクリン耐性によって、成功した形質転換細胞を選択する。形質転換細胞からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により解析し、及び／又は当分野に公知の標準的な技術を用いて解析する。[例えばMessing等, Nucleic Acids Res., 9:309 (1981); Maxam等, Methods in Enzymology, 65:499 (1980)を参照]。
哺乳動物細胞でコード化ＤＮＡを一過的に発現するために提供される発現ベクターを用いてもよい。一般的に、一過性発現は宿主細胞内で効率よく複製することができる発現ベクターを用いることを含み、そうして宿主細胞は発現ベクターをたくさんコピーして順に、発現ベクターによってコードされる所望のポリペプチドを高レベルに合成する（上掲のSambrook等）。好適な発現ベクター及び宿主細胞を含む一過性の発現系により、クローンしたＤＮＡによってコードされるポリペプチドを簡便にポジティブ同定するだけでなく、所望の生物学的又は生理学的性質についてポリペプチドを素速くスクリーニングすることができる。
組換え脊椎動物細胞培養での所望のポリペプチドの合成に適用するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981)；Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979)；欧州特許出願公開第１１７０６０号；及び欧州特許出願公開第１１７０５８号に記載されている。
【００５９】
ここでベクターにＤＮＡをクローニング又は発現するのに適した宿主細胞は、原核生物、酵母又は高次の真核生物を含む。本発明の目的に適した原核生物には、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例として、エシェリキア属などの腸内細菌科、例えば大腸菌（E.coli）、エンテロバクター、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャン(marcescans)、及び赤痢菌属、並びに枯草菌（B.subtilis）やＢ.リチェニフォルミス(licheniformis)等の桿菌（例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６７１０に開示されたB.licheniformis 41P）、緑膿菌等のシュードモナス属、及びストレプトマイシンが挙げられる。好ましくは、宿主細胞は最小限量のタンパク質分解性酵素を分泌する。
原核生物に加えて、線状の菌類又は酵母菌のような真核生物微生物は、ベクターのための好適なクローニング又は発現宿主である。グリコシル化ポリペプチドの発現に適切な宿主細胞は多細胞生物体から得られる。すべてのこのような宿主細胞の例は更に国際公開第９７／２５４２８号に記載されている。
宿主細胞は、上記の発現又はクローニングベクターを形質移入及び好ましくは形質転換して、プロモータの誘導に適するように変更した栄養培地で培養して、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコード化している遺伝子を増幅する。
【００６０】
形質転換（トランスフェクション）とは、任意のコード配列を実施的に発現するかどうかにかかわらず、宿主細胞に発現ベクターが取り込まれることを意味する。膨大な数の形質転換方法が通常の当分野の技術者に公知であり、例えばＣａＰＯ４や電気穿孔法などである。宿主細胞内でこのベクターの何らかの働きが生じたときに、一般的に形質転換が成功していると認識する。
形質転換（トランスフォーメーション）とは、ＤＮＡが複製するように、染色体外成分として又は染色体成分によって生物体内にＤＮＡを導入することを意味する。用いる宿主細胞に応じて、その細胞に適する標準的技術を用いて形質転換を行う。一般的に、Sambrook等,上掲に記載のような塩化カルシウムを用いたカルシウム処理ないし電気穿孔法が原核生物又は実質的に細胞壁バリアを持つ他の細胞に用いられる。 Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び１９８９年６月２９日公開の国際公開第８９／０５８５９号に記載されているように、ある種の植物細胞の形質転換にはアグロバクテリウム腫大物での感染を用いる。加えて、植物は、１９９１年１月１０日に公開の国際公開第９１／００３５８号に記載のように、超音波処理を用いて形質転換してもよい。
そのような細胞壁のない哺乳動物細胞には、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法を用いてもよい。哺乳動物細胞宿主系形質転換の一般的な態様は、米国特許第4,399,216号に記載されている。一般には、Van Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)の方法に従って、酵母菌内への形質転換を行う。しかしながら、細胞へのＤＮＡ導入のための他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、電気穿孔法、完全細胞とのバクテリアプロトプラスト融合、ないしポリブレンやポリオルニチンなどのポリカチオンもまた用いてもよい。哺乳動物細胞の形質転換のための多種の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及びMansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００６１】
上掲のSambrook等に一般的に記載されているように、原核細胞は好適な培養培地で培養することができる。市販の培養培地の例としては、ハム(Ham)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地(「ＭＥＭ」,シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地(「ＤＭＥＭ」,シグマ)がある。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン)、微量元素(マイクロモル範囲の最終濃度で通常は存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
一般に、哺乳動物細胞培養の生産性を最大にするための原則、プロトコール及び実質的技術は、Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler編(IRL Press,1991)に見出すことができる。
【００６２】
発現したポリペプチドは、分泌シグナルを持たずに直接精製された場合には宿主細胞溶解物から回収するが、分泌したポリペプチドとして培養培地から回収してもよい。ポリペプチドが膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)を用いて膜から切り離すか、又は酵素的切断によりその細胞外領域を切り離すことができる。
ポリペプチドがヒト起源のもの以外の組み換え細胞内で生成される場合、ヒトのタンパク質ないしポリペプチドは含まない。しかしながら、通常は実質的に均一な調製物を得るために組み換え細胞タンパク質ないしポリペプチドからポリペプチドを回収ないし精製することが必要である。第一工程として、培養培養液ないし溶解物を遠心分離して粒子状の細胞破壊物を取り除く。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックス(登録商標)Ｇ-７５を用いるゲル濾過；ＩｇＧのような汚染物を除くためのプロテインＡセファロース(登録商標)カラムである。
【００６３】
３．ファージディスプレイ
一実施態様によると、式Ｉ（配列番号１）、式ＩＩ（配列番号１８）、式ＩＩＩ（配列番号２６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号１３）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号１４）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号１５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号１６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号１７）、又は図１２Ａ−Ｃに挙げる配列からなる群から選択される本発明のポリペプチドは、ファージディスプレイに用いてもよい。
ファージディスプレイ技術の使用により、高い親和性で標的分子に結合する配列について迅速に分類することができるタンパク質変異体の大きなライブラリーを作製することができる。変異体ポリペプチドをコードしている核酸をウイルス性コートタンパク質、例えば遺伝子ＩＩＩタンパク質又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質をコードしている核酸配列に融合する。タンパク質ないしポリペプチドをコードしている核酸配列を遺伝子ＩＩＩタンパク質の一部をコードする核酸配列に融合した一価ファージディスプレイ系が開発された。(Bass, S., Proteins, 8:309 (1990)；Lowmanand Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991))。一価ファージディスプレイ系では、遺伝子融合が低レベルで発現し、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質も粒子の感染性が維持されるように発現している。ペプチドライブラリーを作製してそのライブラリーをスクリーニングする方法は多くの特許で開示されている(例として、米国特許第５７２３２８６号、米国特許第５４３２０１８号、米国特許第５５８０７１７号、米国特許第５４２７９０８号及び米国特許第５４９８５３０号)。
【００６４】
幾つかの実施態様では、式Ｉ（配列番号１）、式ＩＩ（配列番号１８）、又は式ＩＩＩ（配列番号２６）はファージ上でペプチドライブラリーとして発現する。ついで、式Ｉ、式ＩＩないし式ＩＩＩのポリペプチドのライブラリーを発現するファージはＢＬｙＳ結合に基づいて選択することを目的としている。幾つかの実施態様では、選択の過程はニュートラビジン(NEUTRAVIDIN(登録商標))プレートに続いて結合させたビオチニル化ＢＬｙＳへ幾つかのファージが結合することを伴う。ＢＬｙＳ-ビオチン-ニュートラビジン結合を介するプレートへのファージ結合が回復し、増殖する。幾つかの実施態様では、ファージは何段階かの選別を目的としている。幾つかの実施態様では、ファージはＢＬｙＳ-ビオチンと共にインキュベートし、ついで競合的結合体として非ビオチニル化ＢＬｙＳを付加する。本発明の内容におけるファージディスプレイの使用については実施例で付加的に解説する。
【００６５】
４．融合タンパク質及び抱合ポリペプチド
本発明のポリペプチドを含むイムノアドヘシン分子のここでいう方法への使用を更に包含する。幾つかの実施態様では、分子はイムノグロブリンないしイムノグロブリンの特定領域と本発明のポリペプチドとの融合を含む。イムノアドヘシンの一価型について、そのような融合はＩｇＧ分子のＦｃ領域を有効に含む。更なる実施態様では、Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ１分子由来である。幾つかの実施態様では、イムノグロブリン融合は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。イムノグロブリン融合の作製については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第５４２８１３０号及びChamow等, TIBTECH, 14:52-60(1996)も参照のこと。
最も簡単で複雑でないイムノアドヘシンのデザインは、アドヘシンの結合ドメイン（例えば、本発明のポリペプチド）とイムノグロブリン重鎖のＦｃ領域に結合しているものがある。例えば、式Ｉ（配列番号１）、式ＩＩ（配列番号１８）、式ＩＩＩ（配列番号２６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号１３）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号１４）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号１５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号１６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号１７）、又は図１２Ａ−Ｃに挙げる配列を含むポリペプチドは、イムノグロブリンのＦｃ部位に共有結合しうる。加えて、これらポリペプチドの一以上は互いに連結し、イムノグロブリンのＦｃ部位に連結している。
通常、本発明のイムノアドヘシンを調製するとき、アドヘシンの結合ドメインをコードする核酸を、免疫グロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸のフレーム３'に、アドヘシンと定常ドメインを含む融合タンパク質が発現の際に産生されるように結合させるが。しかし、Ｎ末端の融合もまた可能である。
【００６６】
典型的には、そのような融合体では、コードされたキメラポリペプチドは、少なくともイムノグロブリン重鎖の定常領域の機能的活性化ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを保持するであろう。また、定常ドメインのＦｃ部位のＣ末端、又は重鎖のＣＨ１ないし軽鎖の対応する領域へのＮ末端に接して融合体が作製される。融合体が作製される正確な部位は重要でなく；特定の部位がよく知られており、イムノアドヘシンの生物学的活性、分泌又は結合特性を最適化するために選択してよい。
好ましい実施態様では、アドヘシン配列はイムノグロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のＦｃ領域のＮ末端に融合させる。重鎖定常領域の全体をアドヘシン配列に融合させることができる。しかしながら、より好ましくは、ＩｇＧＦｃを化学的に定義する（すなわち、残基２１６、重鎖定常領域の最初の残基と１１４とする）パパイン切断部位に接したヒンジ領域上流で始まる配列、又は他のイムノグロブリンの類似体部位が融合に用いられる。特定の好ましい実施態様では、アドヘシンアミノ酸配列は、ＩｇＧ重鎖の（ａ）ヒンジ領域及びＣＨ２及びＣＨ３、又は（ｂ）ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに融合させる。
二重特異性イムノアドヘシンについて、イムノアドヘシンは、多量体として、及び特にヘテロ二量体ないしヘテロ四量体として集合している。一般的に、集合したイムノグロブリンは公知の単位体構造であろう。基本的な４鎖構造単位は、ＩｇＧ、ＩｇＤ及びＩｇＥに存在する形態である。４鎖単位は高次の分子量イムノグロブリンに反復しており；一般的にＩｇＭはジスルフィド結合でまとまった４基本単位の五量体として存在する。ＩｇＡグロブリン、時にはＩｇＧグロブリンもまた血清中で多量体形態で存在する。多量体の場合、４つの単位体の各々は同じないし異なっていてもよい。
【００６７】
ここでいう範囲内の様々な例示的集合イムノアドヘシンは、以下に概略的に図示する：
（ａ）ＡＣＬ-ＡＣＬ；
（ｂ）ＡＣＨ-(ＡＣＨ、ＡＣＬ-ＡＣＨ、ＡＣＬ-ＶＨＣＨ、又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；
（ｃ）ＡＣＬ-ＡＣＨ-(ＡＣＬ-ＡＣＨ、ＡＣＬ-ＶＨＣＨ、ＶＬＣＬ-ＡＣＨ、又はＶＬＣＬ-ＶＨＣＨ)
（ｄ）ＡＣＬ-ＶＨＣＨ-(ＡＣＨ、又はＡＣＬ-ＶＨＣＨ、又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；
（ｅ）ＶＬＣＬ-ＡＣＨ-(ＡＣＬ-ＶＨＣＨ、又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；及び
（ｆ）(Ａ-Ｙ)ｎ-(ＶＬＣＬ-ＶＨＣＨ)２
ここで、各々のＡは、式Ｉ（配列番号１）、式ＩＩ（配列番号１８）、式ＩＩＩ（配列番号２６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号１３）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号１４）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号１５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号１６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号１７）、又は図１２Ａ−Ｃに挙げる配列、ないしその組み合わせのアミノ酸配列を含む同一のないし異なるポリペプチドを表し；
ＶＬはイムノグロブリン軽鎖可変ドメイン；
ＶＨはイムノグロブリン重鎖可変ドメイン；
ＣＬはイムノグロブリン軽鎖定常ドメイン；
ＣＨはイムノグロブリン重鎖定常ドメイン；
ｎは１以上の整数であり；
Ｙは共有結合架橋剤の残基を表す。
【００６８】
簡潔化のため、先の構造はキーとなる特徴を示しているのみである；これらは、免疫グロブリンの結合する(Ｊ)又は他のドメインを示していないしジスルフィド結合も示していない。しかし、そのようなドメインが結合活性に対して必要である場合は、それらを構築して、免疫グロブリン分子にそれらが占める通常の位置に存在させることができる。
あるいは、アドヘシン配列は、キメラ重鎖を含んでなる免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリン重鎖と軽鎖配列の間に挿入することができる。この実施態様では、アドヘシン配列は免疫グロブリンの各アームの免疫グロブリンの重鎖の3'末端に、ヒンジとＣＨ２ドメインの間、又はＣＨ２とＣＨ３ドメインの間の何れかで融合される。同様な作成物がHoogenboom等,Mol.Immunol.28:1027-1037(1991)によって報告されている。
免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明のイムノアドヘシンにおいて必要ではないけれども、免疫グロブリン軽鎖はアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合的に結合するか、アドヘシンに直接的に融合されるかもしれない。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAは典型的にはアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするDNAと同時発現される。分泌時に雑種重鎖及び軽鎖が共有結合的に結合されて、二つのジスルフィド結合免疫グロブリン重鎖-軽鎖対を含んでなる免疫グロブリン様構造を提供する。そのような構造の調製に好適な方法は、例えば１９８９年３月２８日に発行された米国特許第４８１６５６７号に開示されている。
【００６９】
イムノアドヘシンは最も簡便には免疫グロブリンｃＤＮＡ配列にインフレームでアドヘシン部分をコードするｃＤＮＡ配列を融合させることにより構築される。しかし、ゲノム免疫グロブリン断片への融合もまた使用することができる(例えば、Aruffo等,Cell61:1303-1313(1990)；及びStamenkovic等,Cell66:1133-1144(1991)を参照されたい)。融合の後者のタイプは、発現に対してＩｇ調節配列の存在を必要とする。ＩｇＧ重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡは、脾臓又は抹消血リンパ球から取り出されたｃＤＮＡライブラリーからの刊行された配列に基づいて、ハイブリダイゼーションにより、又はポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）法により単離することができる。「アドヘシン」をコードするｃＤＮＡとイムノアドヘシンの免疫グロブリンが、選ばれた宿主細胞において効率的な発現を指示するプラスミドベクター内にタンデムに挿入される。
また、これらの分子のロイシンジッパー形態も本発明によって考慮される。「ロイシンジッパー」は当該技術分野において、その融合相手（例えば、ロイシンジッパーが融合するか、又は連結する配列又は分子）の二量体化又は三量体化を増強し、促進し、又は引き起こすロイシンに富む配列のことを意味するために使用される語句である。様々なロイシンジッパーポリペプチドは当該分野において記述されている。例えば、Landschulz等, Science 240:1759 (1988)；米国特許第５７１６８０５号；国際公開第９４／１０３０８号；Hoppe等, FEBS Letters 344:1991 (1994)；Maniateis等, Nature, 341:24 (1989)；Maniatis等, Nature 341:24 (1989)を参照されたい。当業者であれば、ロイシンジッパー配列を本発明のポリペプチドの５'末端又は３'末端に融合しうることは理解するであろう。
【００７０】
また、本発明のポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に該ポリペプチドを融合することによりキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。幾つかの実施態様によると、そのような異種性ポリペプチド又はアミノ酸配列は、キメラ分子をオリゴマー化するように作用するものである。幾つかの実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドと本ポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的には本発明のポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（poly-his）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-His-gly）タグ；ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；ｃ-ｍｙｃタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体[Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体[Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553(1990)]を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド[Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]；ＫＴ３エピトープペプチド[Martin等, Science, 255:192-194 (1992)]；α-チューブリンエピトープペプチド[Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ[Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397(1990)]を含む。
【００７１】
本発明のポリペプチドは、成長阻害剤、細胞傷害剤、検出剤、ポリペプチドの生物学的利用能を改善する薬剤及びポリペプチドの半減期を改善する薬剤あらなる群から選択される薬剤にコンジュゲートさせることもできる。ある実施態様では、細胞傷害剤は毒素、抗生物質及び放射性同位元素である。更なる実施態様では、本発明のポリペプチドは化学療法剤にコンジュゲートされる。
本発明のイムノアドヘシン、抗体又は他のポリペプチドの半減期を増加させるために、例えば米国特許第５７３９２７７号に記載されているようにして、本発明の抗体（特に抗体断片）、イムノアドヘシン又はポリペプチドにサルベージレセプター結合エピトープに結合させることができる（例えば、サルベージレセプター結合エピトープをコードする核酸を、核酸分子によって発現される融合タンパク質がエピトープと本発明のポリペプチド配列を有するように本発明の核酸コードポリペプチド配列に読み枠を一致させて結合させることができる）。ここで使用される「サルベージレセプター結合エピトープ」なる用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させる原因であるＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを意味する。そのＦｃ領域に置換を持ち血清半減期が増加した抗体はまたＷＯ００／４２０７２（Presta, L.）にも記載されている。他の実施態様では、血清半減期は、例えば、本発明のイムノアドヘシン、抗体又はポリペプチドに血清アルブミン又はＦｃＲｎレセプターに結合する血清アルブミンの一部又はＷＯ０１／４５７４６に記載された血清アルブミン結合ペプチドを結合させることによって増加させることもできる。また血清アルブミン結合ペプチド配列についてはDennis, M.S.等 (2002) JBC 277(38):35035-35043を参照のこと。
【００７２】
５．ペプチド-ポリマー抱合体の構築
幾つかの実施態様では、合成ペプチドのポリマーの抱合（例えば、ペグ化(PEGylation))の方法は、溶液中で抱合連結を形成することによって、各々が他方に対して相互に反応する特別な官能基を担持するペプチドとＰＥＧ部分を結合させることからなる。ペプチド-ポリマー抱合体はとりわけペプチドの半減期を増加させ、吸入用の製剤において送達されるペプチドの量を増加させ、ペプチドの有効サイズを増加させ、溶解性を増加させ、タンパク分解性攻撃からペプチドを安定化し、免疫原性を減少させるのに有用でありうる。
ペプチドは従来の固相合成法を用いて簡単に調製することができる。ペプチドは特定の部位の適する機能的な基に「前活性化」される。前駆体はＰＥＧ部分と反応する前に精製して、完全に分類する。通常、ペプチドとＰＥＧとのライゲーションは液体中で起こり、逆相分析用ＨＰＬＣによってモニターすることができる。ペグ化ペプチドは、分離用ＨＰＬＣによって簡単に精製し、分析用ＨＰＬＣ、アミノ酸分析及びレーザー脱離質量分析法によって分類することができる。
【００７３】
ａ．ペプチド反応部位
幾つかの実施態様では、ペプチドは、主に反応条件、ポリマーの分子量などに応じてペプチドの一又は複数のアミノ酸残基を介してポリマー上の末端反応基に共有的に結合（抱合）する。ある実施態様では、複数のペプチドが二又はそれ以上の末端反応基を持つポリマーに抱合させられる。反応基を持つポリマーはここでは活性化ポリマーと称する。反応基は、ペプチド上の遊離アミノ酸ないし他の反応基と選択的に反応する。潜在的反応部位には、Ｎ末端アミノ基、リジン残基上のεアミノ基、並びに他のアミノ、イミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、水酸基及び他の親水基が含まれる。しかしながら、最適な結果を得るために選択した反応基のタイプや量、並びに用いるポリマーのタイプは、反応基がペプチド上のとても多くの特定の活性基と反応するのを防ぐために用いる特的のペプチドに依存するであろうことが理解されるであろう。幾つかの実施態様では、反応基（例えば、リジン（Ｋ）、修飾した非中性のアミノ酸、ないし他の小分子）は抱合に適する位置で置換してよい。
幾つかの実施態様では、式Ｉ（配列番号１）、式ＩＩ（配列番号１８）、式ＩＩＩ（配列番号２６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号１３）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号１４）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号１５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号１６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号１７）、又は図１２Ａ−Ｃに挙げる配列を含むペプチドは末端の反応基を有する。幾つかの実施態様では、ペプチドは、少なくとも一、より好ましくは一以上の式Ｉ（配列番号１）、式ＩＩ（配列番号１８）、式ＩＩＩ（配列番号２６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号１３）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号１４）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号１５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号１６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号１７）、又は図１２Ａ−Ｃに挙げる配列を含むポリペプチドを含んでなる。互いに連結しているポリペプチドは同じ配列を持つか、異なる配列ないし末端反応基を有しうる。幾つかの実施態様では、これらのポリペプチドは互いに、場合によってはリンカーを介して接合することができる。
【００７４】
抱合がポリペプチド上の任意の反応アミノ酸で起こる一方で、幾つかの実施態様では、反応アミノ酸は、その遊離εアミノ基を介して活性化ポリマーの反応基に連結するリジンであり、又はアミド結合を介してポリマーに連結するグルタミン酸ないしアスパラギン酸である。幾つかの実施態様では、ペプチドの反応アミノ酸は位置Ｘ２及びＸ１２のシステイン残基ではない。
各ペプチドとのポリマー抱合の程度は、ペプチド上の反応部位の数、ポリマーの分子量、親水性及び他の性質、及び選択した特定のペプチド誘導体化部位によって異なるであろう。幾つかの実施態様では、抱合体は、ペプチド分子当たり最終モル比１から１０ポリマー分子であるが、本発明のペプチドに接着するポリマー分子がより多いものも考慮される。他の実施態様では、抱合体はポリマー分子当たり１から１０ペプチド分子の最終モル比を有するが、ポリマー分子に結合するより多くの数のペプチドも考慮される。幾つかの実施態様では、各抱合体は一ポリマー分子を含む。所望の量を誘導体化するには、サイズ排斥クロマトグラフィや当分野の他の方法によって抱合体のポリマー置換のレベルを決定した後、時間、温度及び他の反応条件を変えて置換の程度を変化させるといった実験的マトリクスを用いて容易に達成される。
【００７５】
ｂ．活性化ポリマー
幾つかの実施態様では、ポリマーは反応性がある単一の基しか含まない。これによってタンパク質分子の架橋を防ぐ。しかしながら、架橋を減らすために反応条件を最大にすることや、実質的に均一な誘導体を回収するためにゲル濾過やイオン交換クロマトグラフィーを用いて反応生成物を精製することは本発明の範囲内である。ある実施態様では、多官能性（通常は二官能性）架橋剤を使用しないでペプチドにポリマーを直接共有結合させる。
他の実施態様では、ポリマーはポリマー骨格に複数のペプチドを結合させる目的で二以上の反応性基を含む。例えば、ホモ二官能性ＰＥＧ分子は、ペプチドが各末端に共有結合されるように線形ＰＥＧの各末端に反応性基を有する。ある実施態様では、分枝状ＰＥＧ分子を用いてペプチド抱合のための複数の反応性部位を提供する。再び、ゲル濾過やイオン交換クロマトグラフィーを用いて実質的に均一な形で所望の誘導体を回収することができる。ポリマー分子への二以上のペプチドの抱合は、例えば本発明の抱合ペプチドを細胞表面に発現されたＢＬｙＳと結合させる場合、アビディティー効果を通して見かけの親和性を押し上げうる。
【００７６】
共有結合修飾反応は、ペプチド上の反応基がリジン基の場合、好ましくは約ｐＨ５−９、より好ましくはｐＨ７−９で不活性なポリマーと生物学的に活性な物質を反応させるために一般に使用される任意の適切な方法によって起こりうる。一般に、この過程には、活性化ポリマー（典型的には活性化される少なくとも一の末端ヒドロキシル基を有するポリマー）を調製し、該ポリマーから活性な基質を調製し、その後に製剤に適するペプチドを生成するためにペプチドを活性基質と反応させることを含む。上記の修飾反応は、一以上の工程を含みうる様々な方法によって行うことができる。一工程反応で活性化ポリマーを生成するために用いることができる修飾剤の例には、塩化シアヌル酸（２,４,６-トリクロロ-Ｓ-トリアジン）及びシアヌル酸フルオライドが含まれる。
幾つかの実施態様では、修飾反応は二工程で行い、その工程は、初めにカルボキシル酸を形成させるためにコハク酸無水物ないしグルタル無水物などの酸性無水物とポリマーを反応させ、ついで、ペプチドと反応可能な反応性エステル基を有する活性かポリマーを形成させるためにカルボキシル酸と反応可能な化合物とカルボキシル酸を反応させる。そのような化合物の例には、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド、４-水酸基-３-ニトロベンゼンスルホン酸などが含まれ、そして好ましくはＮ-ヒドロキシスクシンイミド又は４-水酸基-３-ニトロベンゼンスルホン酸が用いられる。例として、モノメチル置換ＰＥＧは、高い温度、好ましくは約１００−１１０℃で４時間で、グルタル無水物と反応するであろう。ついで、それによって生成したモノメチルＰＥＧグルタル酸は、ＧＨと反応する活性化ポリマー、すなわちメトキシポリエチレングリコリル-Ｎ-スクシンイミジルグルタラートを生成するために、ジシクロヘキシル又はイソプロピルカルボジイミドのようなカルボジイミド試薬の存在下でＮ-ヒドロキシスクシンイミドと反応させる。この方法は、Abuchowski等,CancerBiochem.Biophys.,7:175-186(1984)に詳しく記載されている。他の実施例では、モノメチル置換ＰＥＧは、活性化ポリマーを生成するために、ジシクロヘキシルカルボジイミド存在下で、グルタル酸無水物と反応させて、続いて４-ヒドロキシ-３-ニトロベンジンスルホン酸（ＨＮＳＡ）と反応させてもよい。ＨＮＳＡは、Bhatnagar等, Peptides: Synthesis-Structure-Function. Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium, Rich等編(Pierce Chemical Co., Rockford Ill., 1981), p.97-100,及びNitecki等, High-Technology Route to Virus Vaccines (American Society for Microbiology: 1986)、表題"Novel Agent for Coupling Synthetic Peptides to Carriers and Its Applications."に記載されている。
【００７７】
幾つかの実施態様では、アミノ基への共有結合は、シアヌル酸塩化物、カルボニルジイミダゾール、アルデヒド反応基（ブロモアセトアルデヒドのジエチルアセタールを加えたＰＥＧアルコキシド；ＤＭＳＯ及び無水酢酸を加えたＰＥＧ又は４―ヒドロキシベンズアルデヒドのフェノキシドを加えたＰＥＧ塩化物、活性化スクシンイミジルエステル類、活性化ジチオ炭酸塩ＰＥＧ、２,４,５-トリクロロフェニルクロロホルメート又はＰ-ニトロフェニルクロロホルメート活性化ＰＥＧ）に基づく公知の成分によって達成される。カルボキシル基は、カルボジイミドを用いてＰＥＧ-アミンを結合することによって誘導体化される。スルフヒドリル基は、１９９７年３月２７日公開の国際公開第９７１０８４７号に記載されているように、マレイミド置換ＰＥＧ（例えばスルホスクシンイミジル４-（Ｎマレイミドメチル）シクロヘキサン-１-カルボキシレートを加えたアルコキシＰＥＧアミン）に、又はNektar Technologies, San Carlos, CA(前のShearwater Polymers, Inc.)から市販されているＰＥＧ-マレイミドに結合することによって誘導体化される。あるいは、ペプチド上の遊離アミノ基（例えばリジン残基上のεアミノ基）は、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミジル置換ＰＥＧ（NektarTechnologiesから入手可能なＰＥＧ-ＮＨＳ；）に結合させるか、又は２-イミノ-チオラン（トラウト試薬）にてチオレート化してから、Pedley等, Br. J. Cancer, 70: 1126-1130 (1994)に記載のように、ＰＥＧのマレイミド含有誘導体に結合させてもよい。
【００７８】
限定するものではないが、ＰＥＧを含む多くの挿入ポリマーは薬剤への使用に適している。例として、Davis等,Biomedical Polymers: Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use, pp.441-451 (1980)を参照のこと。本発明の幾つかの実施態様では、非タンパク質性のポリマーが用いられる。一般的に、非タンパク質性ポリマーは親水性の合成ポリマー、すなわち天然では特に存在しないポリマーである。しかしながら、天然に存在するポリマー及び組み換えないしインビトロ法によって生成したポリマーも、天然源から単離したポリマー同様有用である。例えばポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドンなどの親水性のポリビニルポリマーは本発明の範囲内である。特に有用なのは、ポリアルキレンエーテル、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ポリオキシアルキレン、例えばポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、及びポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンのブロックコポリマー（PLURONIC(登録商標)）；ポリメタクリレート；カルボマ；ホモ多糖及びヘテロ多糖、例えば酸性のムコ多糖（例えばヒアルロン酸）のラクトース、アミロペクチン、澱粉、ヒドロキシエチル澱粉、アミロース、硫酸デキストラン、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン又は多糖類サブユニットを含有する、糖類単量体Ｄ-マンノース、Ｄ-及びＬ-ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ-キシロース、Ｌ-アラビノース、Ｄ-グルクロン酸、シアル酸、Ｄ-ガラクツロン酸、Ｄ-マンヌロン酸（例えばポリマンヌロン酸又はアルギン酸）、Ｄ-グルコサミン、Ｄ-ガラクトサミン、Ｄ‐グルコース、及びノイラミン酸を含んでなる分岐又は枝状に分かれていない多糖類；ポリソルビトール及びポリマンニトールなどの糖質アルコール類のポリマー；ヘパリン又はヘパロン(heparon)である。
抱合前のポリマーは、必要ではないが好ましくは水溶性であるが、好ましくは最終的な抱合体は水溶性である。好ましくは、抱合体は、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも約０．１ｍｇ／ｍｌ、更により好ましくは少なくとも約１ｍｇ／ｍｌの水溶解度である。加えて、ポリマーは抱合体形態で高度に免疫原性でなくても、静脈内注入、注射又は吸入によって抱合体を投与するつもりがある場合に、それらの投与経路に適合しない粘性をもっていてもよい。
【００７９】
ポリマーの分子量は、約１０００００Ｄ以下の範囲、好ましくは少なくとも約５００Ｄ、又は少なくとも約１０００Ｄ、又は少なくとも約５０００Ｄである。幾つかの実施態様では、ＰＥＧ又は他のポリマーは５０００（５ｋ）から２００００（２０ｋ）Ｄの範囲の分子量である。選択した分子量は、作製する抱合体の効果的な大きさ、ポリマーの性質（例えば、線状や分枝状などの構造）、及び誘導体化の程度、すなわちペプチド当たりのポリマー分子の数やポリマー接着部位ないしペプチド状の部位に依存する。幾つかの実施態様では、分枝状ＰＥＧはペプチドの効果的大きさを大幅に増加するために用いてよい。ＰＥＧ又は他のポリマー抱合体は、半減期の増加、溶解性の増加、タンパク質分解性作用に対する安定化、及び免疫原性の減少に有用であろう。ある実施態様では、５ｋから４０ｋの範囲の分子量を持つ単一のＰＥＧ分子は例えば吸入による投与には適している。
本発明のペプチドを修飾するための機能的ＰＥＧポリマーはNektar Technologies of San Carlos, CA(以前はShearwater Polymers, Inc.)より入手可能である。そのような市販のＰＥＧ誘導体には、限定するものではないが、アミノＰＥＧ、ＰＥＧアミノ酸エステル類、ＰＥＧ―Ｎヒドロキシスクシンアミド化合物（ＮＨＳ）、ＰＥＧ-ヒドラジド、ＰＥＧ-チオール、ＰＥＧ-琥珀酸塩、カルボキシメチル化ＰＥＧ、ＰＥＧ-プロピオン酸、ＰＥＧアミノ酸、ＰＥＧスクシンイミジル琥珀酸塩、ＰＥＧスクシンイミジルプロピオン酸塩、カルボキシメチル化ＰＥＧのスクシンイミジルエステル、ＰＥＧのスクシンイミジル炭酸塩、アミノ酸ＰＥＧのスクシンイミジルエステル類、ＰＥＧ-キシカルボニルイミダゾール、ＰＥＧ-ニトロフェニル炭酸塩、ＰＥＧトレシレート(tresylate)、ＰＥＧ-グリシジルエーテル、ＰＥＧ-アルデヒド、ＰＥＧビニルスルホン、ＰＥＧ-マレイミド、ＰＥＧ-オルソピリジル-ジスルフィド、異種機能的ＰＥＧ、ＰＥＧビニル誘導体、ＰＥＧシラン、及びＰＥＧホスホリドが含まれる。これらＰＥＧ誘導体を連結する反応条件は、タンパク質、所望するペギレーションの程度、及び用いるＰＥＧ類似性に依存して異なるであろう。ＰＥＧ誘導体の選択に伴う幾つかの要因には、所望する接着の位置（例としてリジン又はシステインＲ基）、加水分解安定性と誘導体の反応性、連結の安定性、毒性及び抗原性、分析の適性などが含まれる。特定の誘導体の使用についての特別な注意書きは製造者より入手する。
【００８０】
ｃ．抱合体の性質決定
抱合体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲル濾過、ＮＭＲ、トリプシンのマッピング、液性クロマトグラフィ-質量分析法、及びインビボ生物学的アッセイによって性質決定してもよい。例えば、ＰＥＧ抱合体の大きさは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥやゲル濾過によって示され、ついでＰＥＧのメチレン水素に特定の共振ピークを持つＮＭＲで分析してもよい。各分子のＰＥＧ基の数はＮＭＲスペクトル又は質量分析から算出することができる。溶出緩衝液として１０ｍＭトリス-ＨＣｌｐＨ８．０、１００ｍＭＮａＣｌにて１０％ＳＤＳを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動を適切に行う。残基がペグ化されたかどうかを確認するために、トリプシンのマッピングを行うことができる。したがって、ペグ化したペプチドは、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭトリス-ＨＣＩ、１ｍＭ塩化カルシウム,ｐＨ８．３中で、タンパク質／酵素をｍｇ単位で１００対１の比にして３７℃で４時間、トリプシンにて消化し、ｐＨ４より小さく酸性化して消化を停止させ、ＨＰＬＣ ＮＵＣＬＥＯＳＩＬ(登録商標)Ｃ-１８（４．６ｍｍｘ１５０ｍｍ、５ｍｕ.、１００Ａ）にて分離する。クロマトグラムを非ペグ化の開始物質のものと比較する。ついで、各ピークを質量分析法にて分析してピークにある断片の大きさを確認することができる。通常、ＰＥＧ基を持つ断片は注入後ＨＰＬＣカラム上に残らず、クロマトグラムから消失する。このようなクロマトグラムからの消失は、少なくとも一リジン残基を含む特定の断片上がペグ化されたことを示す。ついで、ペグ化ペプチドは、従来の方法によってＢＬｙＳへの結合能について分析してもよい。
【００８１】
幾つかの実施態様では、抱合体は、イオン交換クロマトグラフィ（例えばイオン交換ＨＰＬＣ）によって精製する。多くの求電子性活性化ＰＥＧの化合物は、ペグ化された生成物のアミノ基荷電が減少する。したがって、高分解能イオン交換クロマトグラフィは、遊離したタンパク質と抱合したタンパク質を分離するため、及びペグ化の程度に応じて化学種を分離するために用いることができる。実際、異なる化学種（例えば１又は２のＰＥＧ残基を含む）の分離もまた、反応しないアミノ酸のイオン特性の違いに応じて可能となる。一実施態様では、ペグ化の程度が異なる化学種はＷＯ９６／３４０１５に記載の方法に従って分離する（１９９６年１０月３１日に公開の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５５５０号）。抱合体の異種性化学種は同じ融合体中のそれぞれから精製される。
幾つかの実施態様では、ＰＥＧ-Ｎ-ヒドロキシスクシンアミド（ＮＨＳ）は第一アミン（例えばリジン及びＮ末端）と反応する。幾つかの実施態様では、ＰＥＧ-ＮＨＳはポリペプチドのＣ末端のリジン（Ｋ）と反応する。幾つかの実施態様では、リジン残基は１７ｍｅｒのポリペプチドのＣ末端に付加される一方、他の実施態様では、Ｘ１７はリジンに置換される。幾つかの実施態様では、ポリマーはＮ末端と反応する。好ましい実施態様では、抱合体は、以下の実施例に記載の誘導体化と精製方法を用いて生成される。
一態様では、本発明は、抱合体の構成成分によって形成される上述の何れかの抱合体、すなわち抱合体の共有分子構造内に異質の物質を全く含むことなく一以上のポリマー分子に共有的に接着した一以上のペプチドを提供する。
【００８２】
６．抗体
本発明のポリペプチド、例えば式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号１３）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号１４）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号１５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号１６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号１７）、又は図１２Ａ−Ｃに記載した配列を、抗体を作成するために使用することが考えられる。
【００８３】
(ｉ)ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)注射することにより動物に産生される。免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに関連抗原を、二官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基による抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基による)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲとＲ１が異なったアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲにより抱合させることが有用である。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫化する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なった架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまたタンパク融合として組換え細胞培養中で調製することもできる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【００８４】
(ｉｉ)モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、わずかながら存在する起こりうる天然に生じる突然変異体を除いて同一である。よって、「モノクローナル」との修飾詞は、別個の抗体の混合物ではなく、抗体の特性を示すものである。
例えば、モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作製することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記したようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press,1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【００８５】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫系、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡから入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックヴィル、メリーランド、ＵＳＡから入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されたものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson等, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【００８６】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が包含される。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、常法を用いて(例えば、マウスの重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、そうしないと免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する概説論文には、Skerra等, Curr. Opinionin Immunol., 5:256-262 (1993)及びPlueckthum, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)がある。
【００８７】
更なる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリーから単離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及びMarks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリーを使用したマウス及びヒト抗体の単離を記述している。続く刊行物は、鎖混合による高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生産(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783 (1992))、並びに非常に大きなファージライブラリーを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993))を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を、相同的マウス配列に代えて置換することにより(米国特許第４８１６５６７号；Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:6851 (1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることで修飾できる。
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに置換され、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【００８８】
(ｉｉｉ)ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法は従来からよく知られている。好ましくは、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくらかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域(ＦＲ)として受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901 (1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285(1992)；Presta等,  J. Immunol., 151:2623(1993))。
【００８９】
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【００９０】
（ｉｖ）ヒト抗体
ヒト化のための別法により、ヒト抗体を生産することができる。例えば、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993)；Bruggerman等, Year in Immuno., 7:33(1993)；米国特許第５５９１６６９号、同５５８９３６９号及び同５５４５８０７号を参照されたい。
【００９１】
別に、ファージディスプレイ技術(McCaffertyt等, Nature 348：552-553 (1990))を、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させるために使用することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３の大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のいずれかにおいてイン-フレームをクローンする。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖のＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択により、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がなされる。よって、ファージはＢ細胞の特性の幾つかを模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S.及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571 (1993)を参照のこと。Ｖ-遺伝子セグメントの幾つかの供給源がファージディスプレイのために使用可能である。Clackson等 Nature, 352：624-628 (1991)は、免疫化されたマウス脾臓から得られたＶ遺伝子の小ランダム組合せライブラリーからの抗オキサゾロン抗体の異なった配列を単離した。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構成可能で、抗原(自己抗原を含む)とは異なる配列の抗体を、Marks等 J. Mol. Biol.222：581-597 (1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12：725-734 (1993)に記載の技術に本質的に従って単離することができる。また、米国特許第５５６５３３２号及び同５５７３９０５号を参照のこと。
またヒト抗体は、活性化Ｂ細胞によりインビトロで生産してもよい(例えば米国特許第５５６７６１０号及び同５２２９２７５号を参照)。
【００９２】
(ｖ)抗体断片
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、完全な抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto等 Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992)及びBrennan等 Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等 Bio/Technology 10:163-167 (1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。
【００９３】
(ｖｉ)二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、Ｂ細胞表面上のマーカーの２つの異なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体では一方のＢ細胞マーカーと更に他方のＢ細胞表面上のマーカーが結合しうる。あるいは、抗Ｂ細胞マーカー結合アームは、Ｂ細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、ＦｃＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃＲ)に対するＦｃレセプター、又はＴ細胞レセプター分子(例えばＣＤ２又はＣＤ３)等の白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体はＢ細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はＢ細胞マーカー結合アーム及び細胞障害剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
【００９４】
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等 Nature, 305:537-539 (1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker等、EMBO J. 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
異なるアプローチ法に従って、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、コンストラクトに使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【００９５】
このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、ＷＯ９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等 Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
米国特許第５７３１１６８号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【００９６】
二特異性抗体とは架橋抗体や「ヘテロ抱合抗体」を含む。例えば、ヘテロ抱合体の一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合していても良い。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせること（米国特許第４，６７６，９８０号）及びＨＩＶ感染の治療（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３及びＥＰ０３０８９）等の用途が提案されてる。ヘテロ抱合抗体は適当な架橋方法によって生成できる。当技術分野においては、適切な架橋剤は周知であり、それらは複数の架橋法と共に米国特許第４６７６９８０号に記されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等 Science, 229:81 (1985)は完全な抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【００９７】
最近の進歩により、大腸菌からＦａｂ'-ＳＨ断片の直接の回収が容易になり、これは科学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等 J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役させて二重特異性抗体を形成する。従って、形成された二重特異性抗体は、ヒト乳腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解活性を誘発すると同時に、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞及び正常ヒトＴ細胞へ結合することが可能であった。組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産された。Kostelny等  J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させられた。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinger等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片製造方策もまた報告されている。Gruber等 J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J. Immunol. 147:60 (1991)。
【００９８】
抗体は、当業者に知られた方法を使用して、ここに記載されたポリペプチド、ＢＬｙＳ又は式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号１３）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号１４）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号１５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号１６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号１７）の配列、又は図１２Ａ−Ｃに挙げる配列を含むポリペプチドに対する結合親和性についてスクリーニングすることができる。ここで産生される抗体はここに記載されたＢＬｙＳの機能的活性を評価するための様々なアッセイにおいてＢＬｙＳアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることができる。当該分野で知られた方法を使用して、他のＢＬｙＳアンタゴニストと比較した場合の抗体の相対結合親和性をアッセイするために競合結合アッセイを利用することができる。
【００９９】
７．ポリペプチドにおける変異とＣＤ２０アンタゴニスト及び抗体における変異
本発明の１７-ｍｅｒにおける変異は上のセクション１に記載されている通りである。しかしながら、１７-ｍｅｒに抱合し、融合し又はその他隣接するタンパク質領域、並びに本発明のＢＬｙＳアンタゴニストと併用される薬剤における更なる変異がここに記載されるように可能である。加えて、ここに記載のＣＤ２０アンタゴニスト又は抗体のアミノ酸配列の修飾が考慮される。例えば、ＣＤ２０結合抗体又はアンタゴニストの結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい。
アミノ酸配列変異体は、適当なヌクレオチド変化を核酸に導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、例えば、ＣＤ２０抗体又はアンタゴニストのアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、その最終構築物が所望の特徴を有するならば、最終構築物に達するまでなされる。また、アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数又は位置の変化など、ＣＤ２０アンタゴニストの翻訳後過程を改変しうる。突然変異の位置の同定のための有用な技術は、上に記載のような「アラニンスキャンニング突然変異誘発」である。
【０１００】
アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノ-及び／又はカルボキシル末端融合体を含む。末端挿入物の例は、Ｎ-末端メチオニル残基を持つアンタゴニスト又は細胞傷害性ポリペプチドに融合したアンタゴニストを含む。アンタゴニスト分子の他の挿入変異体は、アンタゴニストの血清半減期を向上させる酵素又はポリペプチド又は他の抱合分子のアンタゴニストのＮ-又はＣ末端への融合体を含む。
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、アンタゴニスト分子において少なくとも一つのアミノ酸残基が異なる残基によって置き換えられている。抗ＣＤ２０抗体のような抗体アンタゴニストの置換突然変異について最も関心ある部位は高頻度可変領域を含むが、ＦＲ交互変化も考慮される。保存的置換は、「好適な置換」と題して表１に示す。これらの置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表１に「置換例」と名前を付けた又はアミノ酸の分類を参照して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてよい。
【０１０１】
2007536896.tif 000002
【０１０２】
８．アッセイ方法とＢＬｙＳの阻害方法
一般に、哺乳動物におけるＢＬｙＳシグナル伝達を阻害するための本発明の方法は、ＢＬｙＳとのＢＲ３の相互作用を完全に又は部分的にブロックする所望量のアンタゴニストに細胞を暴露することを含む。ある実施態様では、用いられるアンタゴニストの量は、治療効果を達成するためにＢＬｙＳ又はＢＲ３の結合及び／又は活性に影響を及ぼすのに有効な量であろう。これは、例えば以下に記載されまた実施例に記載された方法に従って、インビトロ又はインビボで達成することができる。このようなＢＬｙＳアンタゴニストを用いて治療される症状又は障害の例には、限定するものではないが、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、及び狼瘡を含む臨床的に自己免疫疾患と称される哺乳動物における症状又は哺乳動物においてＢ細胞応答が異常のアップレギュレートされる癌のような他の病理症状が含まれる。以下の実施例に示すように、ＢＬｙＳアンタゴニストはＢＬｙＳへのＢＲ３の結合を阻害した。これらの結果は、本発明のポリペプチドが、Ｂ細胞の生存及び成熟に対する効果を含むＢＬｙＳシグナル伝達を阻害することができること、本発明のＢＬｙＳアンタゴニストを使用してＢＬｙＳをブロックし又は阻害することがＲＡのような自己免疫疾患に対して治療的有用性を有しうることを示している。ＢＣＭＡアンタゴニストによって治療される症状又は障害の例は免疫関連疾患と癌である。
診断方法もまたここで提供される。例えば、本発明のポリペプチドは、ＢＬｙＳ-関連病理症状を持ち、又は異常量のＢＬｙＳを発現していることが知られ又は疑われている哺乳動物（例えば狼瘡の患者又はＮＺＦ／ＷＦ１マウス）における検出を含む、哺乳動物において又はインビトロアッセイにおいてＢＬｙＳを検出するために使用することができる。ある実施態様によれば、本発明のポリペプチドは、例えば試料中のＢＬｙＳを検出又は定量するイムノアッセイにおいて使用される。ある実施態様によれば、哺乳動物から得られた細胞のような試料を、本発明の標識ポリペプチドの存在下でインキュベートすることができ、標識ポリペプチドの検出が実施される。様々な臨床アッセイ手順を含むそのようなアッセイは、例えばVoller等, Immunoassays, University Park, 1981に記載されているように、当該分野において知られている。
【０１０３】
ある実施態様によれば、ＢＬｙＳ／ＢＲ３結合の研究は、競合的結合アッセイ、直接及び間接サンドウィッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイなどの既知のアッセイ法で実施することができる。ある実施態様によれば、ＢＬｙＳ／ＢＲ３結合アッセイは、天然配列ＢＲ３の代わりに本発明のポリペプチドを使用して、ここに記載したようにして実施される。細胞ベースアッセイ及び動物モデルは、ＢＬｙＳ及びＢＲ３とここで言及された症状及び疾患の進行及び病因間の相互作用を更に理解するために用いることができる。
一アプローチでは、哺乳類細胞はここで記述される本発明のポリペプチド及び／又はＢＬｙＳによって形質移入され、ＢＬｙＳの結合又は活性を刺激又は阻害するためのＢＬｙＳアンタゴニストの能力が解析される。適切な細胞は、本発明のポリペプチドによって形質移入され、活性に関してモニターされる。その後、このような形質移入された細胞株は、例えば、Ｂ細胞シグナル伝達（例えばＢ細胞増殖、Ｉｇ分泌等）を阻害するＢＬｙＳアンタゴニスト（例えば薬剤候補）の能力を試験するために使用することができる。
また、トランスジェニック動物に由来する初代培養は、細胞ベースアッセイに使用できる。トランスジェニック動物から連続株化細胞を誘導する技術はこの分野で良く知られている[Small等, Mol. Cell. Biol. 5, 642-648 (1985)参照]。
一つの適切な細胞ベースアッセイは、エピトープタグ化ＢＬｙＳ（例えば、ＡＰ又はＦｌａｇ）を本発明のポリペプチドを有するか又は発現させる細胞へ添加することであり、抗タグ抗体を用いてＦＡＣＳ染色することによる結合（予想されるＢＬｙＳアンタゴニストの存在又は非存在下において）の分析である。他のアッセイでは、Ｂ細胞のＢＬｙＳ誘導性増殖を阻害するＢＬｙＳアンタゴニストの能力がアッセイされる。Ｂ細胞又は細胞株はＢＬｙＳと共に予想されるＢＬｙＳアンタゴニストの存在又は非存在下において培養され、Ｂ細胞の増殖が３Ｈ-チミジンの取込み又はＦＡＣＳ分析によって測定され得る。
【０１０４】
更に、インビトロにおける細胞ベースアッセイの結果は、インビボ動物モデルを使用し、証明することができる。種々の良く知られた動物モデルは、例えば、免疫関連疾患又は癌又はＢ細胞枯渇の進行及び病因におけるここに同定されるＢＬｙＳアンタゴニストの役割を更に理解するために、そして候補治療薬の有効性を試験するために、使用できる。これらのモデルのインビボの性質により、特にヒト患者における反応を予測できる。免疫関連疾患の動物モデルは、非組換え及び組換え(トランスジェニック)動物の両方を含む。非組換え動物モデルは、例えば、齧歯類、例えばマウスモデルを含む。このようなモデルは、標準的な技術、例えば、皮下注射、尾部静脈注射、脾臓移植、腹膜内移植、腎被膜下移植等により、細胞を同系マウスに導入することにより作成される。
遅発型過敏症の動物モデルは、細胞媒介免疫機能のアッセイをまた提供する。遅発型過敏反応は、抗原投与後にある時間が経過するまで、ピークに達しない炎症により特徴付けられるＴ細胞媒介インビボ免疫反応である。これらの反応はまた組織特異的自己免疫疾患、例えば多発性硬化症(ＭＳ)及び実験的自己免疫脳脊髄炎(ＥＡＥ、ＭＳ用のモデル)で生じる。適切な手順はCurrent Protocols in Immunology, unit 4.5.に詳細に記載されている。
関節炎の動物モデルは、コラーゲン誘発性関節炎である。このモデルはヒト自己免疫慢性関節リウマチの臨床的、組織的及び免疫学的特徴を共有し、ヒト自己免疫関節炎の許容可能なモデルである。マウス及びラットモデルは滑膜炎、軟骨の腐食及び軟骨下(subchondral)骨により特徴付けられる。本発明の化合物は上掲のCurrent Protocols in Immunology, unit 15.5.に記載されているプロトコールを使用し、自己免疫関節炎に対する活性を試験することができる。また、Issekutz, A.C.等, Immunology (1996) 88：569に記載されているＣＤ１８及びＶＬＡ-４インテグリンに対するモノクローナル抗体を使用するモデルも参照のこと。
【０１０５】
更に、本発明の組成物は乾癬様疾患の動物モデルにおいて試験することができる。本発明の化合物は、Schon. M.P.等, Nat. Med.(1997)3：183により記載されているscid／scidマウスモデルにおいて試験することができ、そのモデルではマウスは乾癬に類似した組織病理学的皮膚病巣を示す。他の適切なモデルはNickoloff, B.J.等, Am. J. Path.(1995)146：580に記載されているようにして調製されたヒトskin／scidマウスキメラである。
候補治療組成物の抗癌活性を試験するために、種々の動物が周知である。これらには、胸腺欠損ヌードマウス又はskin／scidマウス、又はｐ５３ノックアウトマウスなどの遺伝学的マウス腫瘍モデルへのヒト腫瘍の異種移植が含まれる。
組換え(トランスジェニック)動物モデルは、ここで同定された分子のコード部分を、トランスジェニック動物作成のための標準的技術を用いて、対象の動物のゲノムに導入することにより操作することができる。遺伝子導入操作の標的となりうる動物は、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、及び非-ヒト霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー及びサルを含む。これらの動物に導入遺伝子を導入するのにこの分野で知られた技術は、前核マイクロインジェクション(Hoppe及びWanger, 米国特許第４８７３１９１号)；生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子転移(例えば、Van der Putten等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-615 [1985])；胚性肝細胞での遺伝子標的化(Thompson等, Cell 56, 313-321 [1989])；胚のエレクトロポレーション(Lo, Mol. Cel. Biol. 3, 1803-1814 [1983])；精子媒介遺伝子転移(Lavitrano等, Cell 57, 717-73 [1989])を含む。概説には、例えば、米国特許第４７３６８６６号を参照のこと。
本発明の目的のために、トランスジェニック動物は、それらの細胞の一部にのみ導入遺伝子を有するもの(「モザイク動物」)を含む。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、又はコンカテマー、例えば頭部と頭部又は頭部と尾部の直列型として組み込まれる。特定の細胞型への導入遺伝子の選択的導入も、例えば、Lasko等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232-636 (1992)の技術に従って可能である。
【０１０６】
トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は、標準的技術によってモニターできる。例えば、導入遺伝子の組み込みの確認にサザンブロット分析又はＰＣＲ増幅が用いられる。ついで、ｍＲＮＡ発現のレベルは、インサイツハイブリッド形成、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ、又は免疫組織化学等の技術を用いて分析できる。動物は、更に、免疫疾患の病原の徴候、例えば組織学的検査により特定の組織中への免疫細胞の湿潤について、又は癌性もしくは悪性組織の存在について測定するために、検査してもよい。
あるいは、動物の胚性細胞に導入されたポリペプチドをコードする変更ゲノムＤＮＡと、その同じポリペプチドをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えの結果、ここに同定するポリペプチドをコードする欠陥又は変更遺伝子を有する「ノックアウト」動物を作成することができる。例えば、特定のポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従って当該ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。特定のポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みをモニターするために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは変更が加えられていないフランキングＤＮＡ(５'と３'末端の両方)数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターの記述についてはThomas及びCapecchi, Cell, 51: 503 (1987)を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞に(例えばエレクトロポレーションによって)導入され、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する［例えば、Li等, Cell,69:915 (1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入され、凝集キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp.113-152参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、「ノックアウト」動物を出産させてつくる。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを使用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ポリペプチドが存在しないことによるある種の病理的状態及び病理的状態の進行に対して防御する能力によって特徴付けられる。
【０１０７】
９．組成物と製剤
ここで記述されるポリペプチド及び組成物は、好ましくは担体中で用いられる。適切な担体とそれらの製剤は、Oslo等により編集されたRemington's Pharmaceutical Sciences, 16版, 1980, Mack Publishing Co.に記載されている。典型的には、適量の製薬的に許容可能な塩が、製剤を等浸透圧にするために製剤において使用される。担体の例には、生理食塩水、リンガー液及びデキストロース液が含まれる。溶液のｐＨは、好ましくは約５から約８、更に好ましくは約７．４から約７．８である。例えば投与される薬剤の投与経路及び濃度によっては、ある種の担体がより好ましくなることは、当業者には明らかである。担体は凍結乾燥又は水溶液の形態であってもよい。
許容できる担体、賦形剤又は安定剤は、好ましくは、用いる投与量及び濃度では細胞及び／又はレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存料(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(残基数１０個未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、ヒスチジン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮ(登録商標)、ＰＬＵＲＯＮＩＣ(登録商標)又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１０８】
また、製剤は、治療される特定の効能に必要な一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有し得る。またアンタゴニストは、例えばコアセルベーション法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルに、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションに捕捉することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol,A.編(1980)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。
徐放性調製物を調製することができる。徐放性調製物の適切な例には、抗体を含む固体疎水性重合体の半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスはフィルム又はマイクロカプセル等の成形品の形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えばポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性の乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT(登録商標)(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニルや乳酸-グリコール酸等のポリマーは１００日以上分子を放出できるが、特定のヒドロゲルはより短い時間タンパク質を放出する。
【０１０９】
１０．治療の形態
ここに記述されるポリペプチドは、免疫関連疾患又は癌などの種々の病理症状を治療することにおいて有用である。これらの症状は、本発明の一又は複数のポリペプチドの投与を通じて、哺乳動物において、ＢＬｙＳに関連する選択された活性を刺激し又は阻害することにより治療することができる。
ここに記載の種々の病理学的状態の哺乳動物の診断は、熟練した実務者によって行うことが可能である。例えば、哺乳動物の癌又は免疫関連疾患の診断と検知を考慮する診断技術は、当該分野において利用可能である。例えば、癌は、限定されるものではないが、触診、血液分析、Ｘ線、ＮＭＲ等を包含する技術を通して同定され得る。また、免疫関連疾患は容易に同定できる。全身性エリテマトーデスでは、疾患の中心媒介物は自己タンパク質／組織に対する自己反応性抗体、及び引き続き起こる免疫媒介炎症である。腎臓、肺、骨格筋系、粘膜皮膚、眼、中枢神経系、心臓血管系、胃腸管、骨髄及び血液を含む複数の臓器と系が、臨床的に影響を受ける。
【０１１０】
リウマチ様関節炎(ＲＡ)は、主に複数の関節の滑膜に係る慢性全身性自己免疫疾患であり、結果として関節軟骨に傷害が生じる。病原はＴリンパ球依存性であり、リウマチ因子、自己ＩｇＧに対する自己抗体の生成に関連し、結果として関節体液及び血液において高レベルに達する免疫複合体が形成される。関節におけるこれらの複合体は、滑膜へのリンパ球及び単球の顕著な浸潤と、続いての顕著な滑膜変化を誘発しうる；多数の好中球の添加により同様の細胞で浸潤されるならば関節空間／体液でもある。影響を受けている組織は、多くの場合対称的なパターンで主に関節である。しかしながら、２つの主な形態の関節外疾患も生じる。一方の形態は進行中の進行性関節疾患及び肺線維症の典型的な病巣、血管炎、及び皮膚潰瘍を伴う関節外障害の発達である。関節外疾患の第２の形態はいわゆるフェルティー症候群であり、ＲＡ疾患経路の末期、しばしば関節疾患が鎮静した後に生じ、好中球減少、血小板減少及び脾肥大の存在に関与する。これには、梗塞、皮膚潰瘍及び壊疽の形成を伴う多数の器官及び血管炎が付随する。多くの場合、患者では、発病している関節上にある皮下組織にリウマチ様小結節が発達し；後期の小結節は、混合炎症細胞浸潤に包囲された壊死性中心を有する。ＲＡで生じる可能性のある他の徴候には：心外膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、及びリウマチ様小結節が含まれる。
【０１１１】
若年性慢性関節炎は、多くの場合１６才未満で発症する慢性特発性炎症疾患である。その表現型はＲＡと幾つかの類似点があり；リウマチ因子がポジティブである患者の中には若年性リウマチ様関節炎に分類される者もいる。この疾患は主な３つのカテゴリー：小関節(pauciarticular)、多関節(polyarticular)及び全身性のものに亜分類される。関節炎は重度で典型的には破壊を生じ、関節強直症及び遅延成長に至るおそれもある。他の徴候には慢性前ブドウ膜炎及び全身性アミロイド症が含まれる。  
脊椎関節症は、幾つかの共通した臨床的特徴とＨＬＡ-Ｂ２７遺伝子産物の発現との共通した関連性を有する疾患のグループである。疾患には：強直性脊椎炎、ライター症候群(反応性関節炎)、炎症性大腸疾患に関連した関節炎、乾癬に関連した脊椎炎、若年発生脊椎関節症及び未分化脊椎関節症が含まれる。区別する特徴には、脊椎炎を伴うか伴わない仙腸関節炎；ＨＬＡ-Ｂ２７(クラスＩ ＭＨＣのＨＬＡ-Ｂ座位にある血清学的に定義された対立遺伝子)を伴う炎症非対称性関節炎；眼の炎症、及び他のリウマチ疾患に関連した自己抗体の不在が含まれる。疾患の誘導における鍵として関わる殆どの細胞はＣＤ８＋Ｔリンパ球であり、クラスＩ ＭＨＣ分子により提示される抗原を標的としている細胞である。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子により発現した外来ペプチドであるかのように、クラスＩ ＭＨＣ対立遺伝子ＨＬＡ-Ｂ２７と反応する。ＨＬＡ-Ｂ２７のエピトープが細菌性又は他の微生物の抗原エピトープを模倣し、よってＣＤ８＋Ｔ細胞の反応が誘発されると仮定されている。
【０１１２】
全身性硬化症(強皮症)は病因がよく知られていない。その疾患の特徴は皮膚の硬化であり；これは活性化炎症プロセスにより誘発されると思われる。強皮症は局部的又は全身的であり得：血管障害が一般的で、微小血管系における内皮細胞傷害が全身性硬化症の発生における初期の重要な事象であり；血管傷害は免疫媒介されうる。免疫学的基準では、皮膚病巣における単核細胞浸潤の存在、多くの患者における抗細胞核抗体の存在を意味する。多くの場合、ＩＣＡＭ-１は皮膚病巣における線維芽細胞の細胞表面でアップレギュレーションし、これらの細胞とのＴ細胞相互作用が疾患の病因に役割を担っていることが示唆される。関連する他の器官には：胃腸管：萎縮症及び線維症があり、結果として異常なぜん動／運動性となっている平滑筋；腎臓：小弓形及び小葉間動脈に影響を及ぼし、結果として腎皮質の血流が低下し、タンパク尿、高窒素血尿及び高血圧になる同心性内皮下内膜増殖；骨格筋：萎縮、間質性線維症；炎症；肺：間質性肺炎及び間質性線維症；及び心臓：収縮バンド壊死、瘢痕／線維症が含まれる。
皮膚筋炎、多発性筋炎及び他のものを含む特発性炎症ミオパシーは病因がよく知られていない慢性筋肉炎症疾患であり、筋肉の弱化に至る。筋肉損傷／炎症は多くの場合対称的で進行性である。自己抗体は多くの形態と関連している。これらの筋炎特異的自己抗体は、タンパク質合成に関与する成分、タンパク質及びＲＮＡに対して産生されてその機能を阻害する。
シェーグレン症候群は、免疫媒介炎症と、続く涙腺及び唾液腺の機能破壊によるものである。この疾患は炎症結合組織疾患に関連するか又は伴いうる。この疾患は、双方ともが小ＲＮＡ-タンパク質複合体であるＲｏ及びＬａ抗原に対する抗体産出に関連している。障害により、結果として乾性角結膜炎、バイラリー(bilary)硬変を含む他の徴候又は会合を伴う口内乾燥、末梢又は感覚ニューロパシー、及び触診可能な紫斑病に至る。
【０１１３】
全身性血管炎症症は主な障害が炎症で、続いて血管にダメージを受け、結果として影響を受けた脈管により供給される組織に虚血／壊死／変性が生じ、最終的な末端器官では幾つかの場合には機能障害になるといった疾患である。また、第２の障害として血管炎(vasculitides)、又は他の免疫炎症媒介疾患、例えばリウマチ様関節炎、全身性硬化症等、特に免疫複合体の形成に関連した疾患等の続発症が生じるおそれがある。主な全身性血管炎症症グループの疾患には：全身壊死性血管炎：多動脈炎結節(polyarteritis nodosa)、アレルギー性脈管炎及び肉芽腫症、多脈管炎：ヴェゲナー肉芽腫症；リンパ腫様肉芽腫症：及び巨細胞動脈炎が含まれる。種々の血管炎には：粘膜皮膚リンパ節症候群(ＭＬＮＳ又は川崎病)、孤立性ＣＮＳ血管炎、ベヘット(Behet's)病、閉塞性血栓性血管炎(バージャー病)及び皮膚壊死性細静脈炎(venulitis)が含まれる。列挙した血管炎の殆どの種類の病原メカニズムは、主に脈管壁に免疫グロブリン複合体が付着し、続いてＡＤＣＣ、補体活性又は双方を介して炎症反応が誘発されることによると考えられている。
サルコイドーシスは、体内の殆ど任意の組織中に類上皮細胞肉芽腫が存在していることにより特徴付けられる、病因がよく知られていない病状であり、肺の関与が最も一般的である。病原には疾患部位に活性マクロファージ及びリンパ球が残留していることに関連しており、続いてこれらの細胞型より放出される局部的又は全身的活性物質の放出の結果として慢性続発症が生じる。
【０１１４】
自己免疫性溶血性貧血、免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿を含む自己免疫性溶血性貧血は、赤血球細胞(幾つかの場合には、血小板を含む他の血球)表面に発現する抗原と反応する抗体が産出される結果によるものであり、補体媒介溶解及び／又はＡＤＣＣ／Ｆｃ-レセプター-媒介メカニズムを介して、その抗体被覆細胞の除去に反映される。
他の臨床的セッティング(setting)における血小板減少性紫斑病及び免疫仲介血小板減少を含む自己免疫性血小板減少では、抗体又は補体が血小板に接合し、続いて補体溶解、ＡＤＣＣ又はＦｃ-レセプター-媒介メカニズムによる除去の結果として生じる。
グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎を含む甲状腺炎は、甲状腺内に多くの場合特異的に存在するタンパク質と反応する抗体の産出を伴う、甲状腺抗原に対する自己免疫反応の結果によるものである。実験用モデルには：内在的モデルラット(ＢＵＦ及びＢＢラット)及びニワトリ(肥満ニワトリ系統）；誘導性モデル：チログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原(甲状腺ペルオキシダーゼ)を用いた動物の免疫化が含まれる。
Ｉ型真性糖尿病又はインシュリン依存性糖尿病は膵臓小島β細胞の自己免疫破壊であり；この破壊は自己抗体及び自己反応性Ｔ細胞により媒介される。また、インシュリン又はインシュリンレセプターに対する抗体は、インシュリン-非-反応性の表現型を産出することができる。  
【０１１５】
糸球体腎炎及び尿細管間質性腎炎を含む免疫仲介腎疾患は、腎抗原に対する自己反応性抗体又はＴ細胞が産出される結果により直接的に、又は他の非腎抗原に対して反応する、腎臓における抗体及び／又は免疫複合体の沈着の結果により間接的に、腎組織に抗体又はＴ細胞媒介傷害が生じることによるものである。よって、免疫複合体の形成の結果生じる他の免疫媒介疾患により、間接的続発症等の免疫媒介腎疾患が誘発される。直接的及び間接的免疫メカニズムの双方により、結果として腎組織における病巣発生を産出／誘発する炎症反応が生じ、器官機能が損なわれ、幾つかの場合では腎臓機能不全に進行する。体液及び細胞免疫メカニズムの双方が障害の病原に関与している。
多発性硬化症を含む中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、特発性脱髄性多発神経障害、又はギラン-バレー症候群；及び慢性炎症脱髄性多発神経障害は、自己免疫ベースであり、オリゴデンドロサイト又は直接的にミエリンに生じた損傷の結果として神経脱髄が生じると考えられている。ＭＳにおいて、疾患の誘発及び進行はＴリンパ球に依存すると示唆される証拠がある。多発性硬化症は、Ｔリンパ球依存性であり、再発性弛緩経路又は慢性進行経路の何れかを有する脱髄疾患である。病因は知られていないが、ウイルス感染、遺伝的素因、環境及び自己免疫性の全てが寄与している。障害はＴ細胞媒介小膠細胞の優先的湿潤、及びマクロファージの浸潤を含み；ＣＤ４＋Ｔリンパ球は病巣における支配的な細胞型であった。オリゴデンドロサイトの細胞死及び続く脱髄のメカニズムはよく知られていないが、Ｔリンパ球の駆動によると思われる。
【０１１６】
好球性肺炎；特発性肺線維症及び過敏性肺炎のような炎症及び線維症の肺疾患には、調節されない免疫炎症反応が関連している。その反応の阻害は治療的に有益なことである。
水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患は自己抗体により媒介され、その発生はＴリンパ球依存性である。
乾癬はＴリンパ球媒介炎症疾患である。病巣はＴリンパ球、マクロファージ及び抗原プロセシング細胞及びある種の好中球の浸潤を含む。
喘息；アレルギー性鼻炎；アトピー性皮膚炎；食物過敏症及び蕁麻疹等を含むアレルギー性疾患はＴ細胞依存性である。これらの疾患は炎症により誘発されるＴリンパ球、及びＩｇＥ媒介炎症、又は双方の組合せにより主に媒介される。
移植拒絶反応及び移植片対宿主疾患(ＧＶＨＤ)を含む移植関連疾患は、Ｔリンパ球依存性であり；Ｔリンパ球の機能を阻害することで改善される。
免疫及び／又は炎症反応への介在が有益である他の疾患には、限定するものではないがウイルス感染(限定するものではないがエイズ、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎)、細菌感染、真菌感染、原生動物感染及び寄生虫感染(ＭＬＲを刺激する分子(又は誘導体／アゴニスト)を治療に利用し、感染要因に対する免疫反応性を増強することができる)、ＭＬＲを刺激する(分子／誘導体／アゴニスト)を治療に利用し、受け継ぎ、獲得し、感染誘発された(例えばＨＩＶ感染)又は医原性(例えば化学療法)免疫欠損疾患の病状に対する免疫反応増強することができる免疫不全疾患、及び異常増殖が含まれる。
【０１１７】
この発明のポリペプチドは、既知の方法に従い、ボーラスとしての静脈内投与、又は一定期間にわたる連続的な注入、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、骨液内、くも膜腔内、経口、局所的、又は吸入経路により投与され得る。場合によっては、投与は、様々な市販の装置を使用するミニポンプ注入によって実施することもできる。また、この発明のポリペプチドは当該分野において記述された遺伝子療法技術を用いて利用することもできる。
この発明のポリペプチドの投与の有効な用量とスケジュールは、経験的に決定することができ、そのような決定を行うことは当業者の技量の範囲にある。単一又は複数用量を用いることができる。単独に使用される本発明のポリペプチドの効果的な用量又は量は一日当り約１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重あるいはそれ以上までの範囲であると現在は考えられる。用量の種間スケーリングは、例えば、Mordenti等, Pharmaceut. Res., 8:1351(1991)に開示されているような当該分野で知られている方法で実施することができる。
【０１１８】
本発明のポリペプチドのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第４６５７７６０号、第５２０６３４４号、又は第５２２５２１２号参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又は組織を標的とする投与には、他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することが必要であることが予想される。当業者であれば、投与されなければならないポリペプチドの用量が、例えば、アンタゴニストを受入れる哺乳動物、投与経路、及び哺乳動物に投与されている他の薬剤又は治療に依存して変わりうることは理解できるであろう。
細胞の型及び／又は病気の重症度に応じて、例えば一又は複数の別個の投与又は連続注入の何れであれ、約１ｍｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１−２０ｍｇ／ｋｇ)の抗体が患者への最初の候補用量である。上述した要因に応じて、典型的な一日の投与量は約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇあるいはそれ以上の範囲である。数日間又はそれ以上の繰り返し投与の場合、状態によっては、病気の徴候の望ましい抑制が生じるまで処置を維持する。しかしながら、他の投薬レジメンも有効であろう。
場合によっては、任意のポリペプチドの投与に先立ち、哺乳動物又は患者をＢＬｙＳのレベル又は活性を決定するために試験することができる。そのような試験は、血清試料又は末梢血の白血球のＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳによって実施することができる。
【０１１９】
更なる治療法を本方法において使用することも考えられる。一又は複数の他の治療法には、これらに限定されるものではないが、当該技術分野において既知であり、前述のセクションＩにおいて更に詳細に定義された、放射線療法、サイトカイン、成長阻害剤、化学治療剤、細胞傷害剤、チロシンキナーゼ阻害因子、ラスファルネシルトランスフェラーゼ阻害因子、血管形成阻害因子、及びサイクリン依存性キナーゼ阻害因子の投与が含まれる。更に、治療法は、リツキサン(登録商標)又はハーセプチン(登録商標)などの腫瘍抗原を標的とする治療用抗体並びに抗ＶＥＧＦなどの抗血管形成抗体に基づく。
化学治療剤に対する調製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に従って使用され得るか、熟練した実務家により経験的に決定される。そのような化学療法に対する調製法及び用量スケジュールはまたChemotherapy Service, M.C.Perry編, Williams & Wilkins, Baltimore, MD(1992)にも記載されている。また、化学療法剤は、例えば本発明のポリペプチドの投与に先行し、又はその後に行い、又はそれらと共に与えられてもよい。また、アンタゴニストは、タモキシフェンなどの抗エストロジェン化合物、又はオナプリストン(onapristone)(欧州特許６１６８１２号を参照)などの抗プロゲステロンと、このような分子に対して既知の用量で組合せてることもできる。
【０１２０】
また、ＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ４０、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、又は血管内皮因子(ＶＥＧＦ)に結合する抗体などの他の抗原に対する抗体を投与することも好ましい。他の方法として、又は付加的に、同一の抗原又はここに開示した二又はそれ以上の異なる抗原に結合する二又はそれ以上の抗体を患者に同時投与してもよい。しばしば、患者に一又は複数のサイトカインを投与することも有益である。ある実施態様では、ここにおけるアンタゴニストは、成長阻害剤と同時投与される。例えば、先ず成長阻害剤を投与し、続いて本発明のポリペプチドを投与する。  
本発明のポリペプチド（及び一又は複数の他の治療剤）は同時に又は逐次的に投与される。アンタゴニストの投与の後、インビトロにおいて処理された細胞を分析することができる。インビボでの治療の場合、治療された哺乳動物は熟練した実務家にとって周知の様々な方法によりモニターすることができる。例えば、Ｉｇ生産（非特異的又は抗原特異的）などのＢ細胞活性のマーカーをアッセイすることができる。
【０１２１】
１１．スクリーニング方法
また、本発明は、ＢＬｙＳアンタゴニストを同定するための方法も包含する。そのような分子には、抗体を含む小分子又はポリペプチドが含まれる。小分子の例には、限定はしないが、小ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチジル有機又は無機化合物が含まれる。薬剤候補に対するスクリーニングアッセイは、ここで同定されるポリペプチドと結合又は複合体を形成し、又はそうでなければこれらのポリペプチドと他の細胞内タンパク質との結合を妨害する化合物又は分子を同定するために計画される。このようなスクリーニングアッセイは、化学ライブラリーの高スループットスクリーニングに適用可能であり、小分子候補薬剤の同定のために特に適したものにするアッセイを含む。
アッセイは、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ及び細胞ベースのアッセイを含む種々の形式で実施することができ、それらは当該技術分野で十分に特徴付けされている。
例えば、アンタゴニストのアッセイは、２つの成分を結合可能にするために十分な条件及び時間の下で、薬剤候補とここで同定されるポリペプチドとを接触させることが必要である点において共通する。
【０１２２】
結合アッセイにおいて、相互作用とは結合のことであり、形成される複合体は、反応混合物中で単離され検出される。特定の実施態様では、ここで同定されるポリペプチド、又は薬剤候補は、固体相上、例えばマイクロプレート上に、共有結合又は非共有結合によって固定化される。一般に、非共有結合はポリペプチド溶液で固体表面をコートし、乾燥させることによって達成される。あるいは、固定化されるべきポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を使用して、固体表面にそれをアンカーすることもできる。アッセイは検出可能な標識で標識されうる非固定化成分を、アンカー成分を含有する被覆表面等の固定化成分に添加することにより行われる。反応が完了した時に、非反応成分を、例えば洗浄することにより除去し、固体表面にアンカーされた複合体を検出する。当初は非固定化の成分が検出可能な標識を担持している場合、表面に固定された標識の検出は複合化が生じたことを示している。元々、非固定化の成分が標識を担持していない場合、複合体形成は、例えば固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体を使用することにより検出することができる。
ＢＬｙＳ及びＢＲ３と他の細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物又は分子は、次のように試験することができる：通常は、遺伝子の生成物及び細胞内又は外成分を含む反応混合物を、２つの生成物が相互作用及び結合する条件及び時間にわたって調製する。試験化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物有りと無しで実施する。更に、第３の反応混合物にプラシーボを添加してポジティブ対照としてもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合(複合体形成)は上記のようにしてモニターする。コントロール反応において複合体が形成され、試験化合物を含む反応混合物では形成されないことは、試験化合物が試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を妨害することを示す。
【０１２３】
本発明のポリペプチド又は他のＢＬｙＳアンタゴニストをまた当該分野で知られているアッセイを使用して評価してそのＢＬｙＳアンタゴニスト活性の強さを定量することができる。例えば、ＢＬｙＳアンタゴニストは、初代ヒト又は初代マウスＢ細胞でのＢＬｙＳ依存性Ｂ細胞増殖及び生存アッセイによって評価することができる。Ｂ細胞増殖及び生存アッセイのための好適なアッセイ形式は、Do等, (2000) J. Exp. Med. 192, 953-964；Khare等, (2000) PNAS, 97, 3370-3375；及びMoore等, (1999) Science 285, 260-263に記載されている。
他のアッセイでは、ＢＲ３-ＤＲ４キメラレセプター（ヒトＤＲ４の細胞外ドメインをＢＲ３のもので置き換えたもの）をアポトーシスアッセイで使用する。ＨｅＬａ細胞をＢＲ３-ＤＲ４の安定な発現のために使用することができる。ＢＬｙＳの添加はＢＲ３-ＤＲ４キメラレセプターの活性化によりアポトーシスを誘導する。細胞ベーススクリーニングは、ＢＬｙＳアンタゴニストがこれらの形質移入細胞のＢＬｙＳ誘導細胞死を防止しなければならないという事実に基づく。ＢＲ３-ＤＲ４を発現するＨｅＬａ細胞をアッセイの１６時間前に１２ウェルプレートに播種した。精製した組換えＢＬｙＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を、試験される薬剤（例えば本発明のポリペプチド）と共に室温で３０分、最初にプレインキュベートする。ＢＬｙＳの添加後８から１６時間経過したところで、トリパン-ブルーアッセイによって細胞死を定量する。
【０１２４】
１２．製造品
本発明のある実施態様では、上述した疾患の治療に有用な物質を含む製造品が提供される。この製造品は容器とラベルとを具備する。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの材料から形成することができる。容器は、症状を診断し治療するのに有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の活性剤はこの発明のポリペプチドを単独に又は更なる治療剤と組み合わせて含む。更なる治療剤の例には、化学療法剤、細胞傷害剤等々が含まれる。容器上の又は容器に付随させられるラベルは、組成物が選択した症状の治療のために使用されることを示す。製造品はリン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液などの生理学的に許容されるバッファーを含む第二の容器を更に具備してもよい。他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用上の指示書を付けたパッケージ挿入物を含む商業的及び使用者の見地から望まれる他の材料を更に含んでもよい。
【０１２５】
この明細書全体と特許請求の範囲を通して、「含む(comprise)」という語句又は「含む(comprises)」又は「含んでいる(comprising)」のような変化例は記載された整数又は整数の群を含むことを意味し任意の他の整数又は整数群の排除を意味するものではないことが理解される。
前記の文書による説明は当業者が本発明を実施するのに十分であると考えられる。次の実施例は、例示目的のためのみに提供するものであり、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。確かに、ここに示し記載したものに加えて本発明の様々な変形は上の記載に照らして当業者には明らかであり添付の特許請求の範囲に含まれる。
【０１２６】
実施例において言及されている市販試薬は別段の記載がない限り製造者の指示に従って使用した。次の実施例及び明細書全体を通してＡＴＣＣ(登録商標)によって特定されている細胞の入手源はバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションである。別段の記載がない限り、本発明は組換えＤＮＡ技術の標準的な手順、例えばこれまで記載したもの及び次の書物に記載のものである：上掲のSambrook等; Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989); Innis等, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc.: N.Y., 1990); Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press: Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan等, Current Protocols in Immunology, 1991。
２００４年６月５日に出願した「Ｂ細胞疾患に対する併用療法」と題した米国特許出願第 号（第一発明者，Andrew C. Chan）は出典明示によりここに取り込む。ここで引用される全ての他の刊行物（特許及び特許出願を含む）はその全体を出典明示によりここに取り込む。
【実施例】
【０１２７】
実施例１−材料
ＢＬｙＳ８２−２８５生成。  ヒトＢＡＦＦ（残基８２−２８５）をコードするＤＮＡ断片をｐＥＴ１５ｂ(Novagen)発現ベクターにクローニングし、Ｎ末端基Ｈｉｓ-タグの後ろにトロンビン切断部位を有する融合体を作製した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Novagen）培養物を、５０ｍｇ／Ｌカルベニシリンを含有するＬＢ培地にて３７℃で対数中間期(mid-log phase)まで生育し、ついで１．０ｍＭのＩＰＴＧでの誘導前に、１６℃に冷却した。更に１２時間生育した後細胞を遠心分離によって回収し、−８０℃に保存した。細胞ペレットを５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０及び５００ｍＭのＮａＣｌ中に再懸濁して、氷上で超音波破壊した。遠心分離後、上清を、Ｎｉ-ＮＴＡアガロースカラム（Qiagen）に流した。カラムを、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ及び２０ｍＭイミダゾールにて洗浄し、ついで、２５０ｍＭイミダゾールを含有する同じ緩衝液にて段階希釈して溶出した。ＢＡＦＦを含有する分画を貯留し、トロンビンを添加して、試料を２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０及び５ｍＭのＣａＣｌ２にて４℃で終夜透析した。更に、タンパク質を、ｍｏｎｏＱ(Pharmacia)カラムにて、最後に２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び５ｍＭのＭｇＣｌ２のＳ-２００サイズ排斥カラムにて精製した。得られたＢＬｙＳタンパク質を以下に記載したようにして用いた。
【０１２８】
ＢＲ３細胞外ドメイン生成。  ヒトＢＲ３（残基１〜６１）（配列番号６０）の細胞外ドメインをｐＥＴ３２ａ発現ベクター（Novagen）にサブクローニングして、Ｎ末端チオレドキシン（ＴＲＸ）-Ｈｉｓ-タグの後にエンテロキナーゼプロテアーゼ部位を有する融合体を作製した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Novagen）を３０℃で生育し、ＩＰＴＧによってタンパク質発現を誘発した。ＴＲＸ-ＢＲ３は、Ｎｉ-ＮＴＡカラム（Qiagen）を通じて精製し、イミダゾール勾配にて溶出し、エンテロキナーゼ（Novagen）によって切断した。ついで、ＢＲ３をＳ-セファロースカラムで精製し、３ｍＭの酸化グルタチオンと１ｍＭの還元グルタチオンを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．８にて終夜リフォールドさせ、ＰＢＳに対して透析し、ＭｏｎｏＳカラムにて再精製し、濃縮してＰＢＳに透析した。
【０１２９】
ペプチド合成。  標準のＦｍｏｃ化学法を用いてPERSEPTIVE BIOSYSTEM(登録商標)パイオニアTMペピチド合成機(Applied Biosystems Inc.)にて、ミニＢＲ３をＣ末端のアミドとして合成した。システイン１９及び３２の側鎖チオールをトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）-安定アセトアミドメチル（Ａｃｍ）誘導体として保護した。ペプチドを、５％トリイソプロピルシランを含むＴＦＡで１．５−４時間室温にて処理することによって、樹脂から切断した。回転式蒸発によってＴＦＡを除去した後、ペプチドをエチルエーテルの添加によって沈殿させ、ついで逆相ＨＰＬＣ（アセトニトリル／Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ）にて精製した。エレクトロスプレー質量分析によってペプチド同一性を確認した。凍結乾燥後、酸化型ペプチドをＨＰＬＣにて精製した。還元型ミニＢＲ３を含むＨＰＬＣ分画を、ＮＨ４ＯＨにてｐＨ９以下に調整した；ついで、Ｋ３Ｆｅ(ＣＮ)６を少し過剰に添加することによってシステイン２４とシステイン３５の間をジスルフィド結合し、酸化型ペプチドをＨＰＬＣによって精製した。少し過剰なＩ２を用いて〜４時間にわたってＨＰＬＣ溶出処理をすることによってＡｃｍ基を除去した（第２のジスルフィドが同時に形成される）。分析的ＨＰＬＣによって酸化の進行をモニターし、最終産物をＨＰＬＣによって再び精製した。１０倍モル過剰のスルホ-ＮＨＳ-ビオチン(Pierce Chemical, Co.)を用いた反応によって樹脂上でミニＢＲ３のアミノ末端をビオチン化した。ついで、ビオチン化したミニＢＲ３を樹脂から切断して、ビオチン化されなかったミニＢＲ３に対して上記した通りに精製した。
【０１３０】
以下のペプチドＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（ＢＬｙＳ００２７）（配列番号：１７）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（ＢＬｙＳ００４８）（配列番号：１４）及びＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（ＢＬｙＳ００５１）（配列番号：１３）を、以下の通りに一般的に合成した。Ｒｉｎｋアミド樹脂を用いたＲＡＩＮＩＮ(登録商標)Symphonyペプチド合成機システムと、５倍の過剰量のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）の存在下で２-(１Ｈ-ベンゾトリアゾン-１-イル)-１,１,３,３-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）で活性化した３倍過剰量の９-フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）被保護アミノ酸でペプチドを合成した。アミノ酸を各部位で２回結合させ、ピペリジンを２０％含むジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液によって脱保護し、次の残基へ移った。各結合工程の間にジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）にて洗浄した。ペプチド上に最終アミノ酸を結合させて２０％ピペリジンを含むＤＭＦにて脱保護した後、３当量の無水酢酸と５当量のＤＩＰＥＡを含むＤＭＡを用いてペプチドのアミノ末端をアシル化した。あるいは、アミノ末端を、５-カルボキシフルオレセインにて、(＋)-ビオチンにて、あるいは、他のフルオロフォア又はリポーター分子にてアシル化することによって修飾した。ついで、２．５％水と２．５％トリイソプロピルシランを含む９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液にて９０分間処理することによって樹脂から切断した。圧力を下げることによって揮発性物質を除去し、ジエチルエーテルを加え、固形物を濾過した。得られた沈殿物をジエチルエーテルにて再度洗浄し、結合した有機物質を除いた。ついで、洗浄した固形物を酢酸、酢酸及びアセトニトリルの１：１混合液、酢酸、アセトニトリル及び水の１：１：１混合液、酢酸、アセトニトリル及び水の１：１：８混合液で連続的に洗浄して、最後に水で洗浄した。結合した洗浄物を凍結乾燥し、毎分１５ｍｌの流速で、各々の溶媒液中に０．１％のトリフルオロ酢酸を含有する水で１０％から７０％の勾配を付けたアセトニトリルにて３０分間のＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィーを行うことによって、得られた粗ペプチドを精製した。所望のペプチドを含む分画に、溶液が着色されるまで酢酸のヨウ素飽和溶液を添加して、酸化した。ついでこの溶液を凍結乾燥した。最後に、凍結乾燥された粗酸化型ペプチドを同一条件で２度精製し、所望のペプチドを含む分画を凍結乾燥した。４倍の過剰量のアミノ酸を用いたPERSEPTIVE BIOSYSTEMS(登録商標)PIONEER? Peptide Synthesizer(Applied Biosystems, Inc.)自動合成機での合成を除き、同じ条件で残基当たり一度しか結合していない幾つかのペプチドを合成した。
【０１３１】
実施例２−１７ｍｅｒのファージディスプレイ
ライブラリーの構築。  ＳＴＩＩ分泌シグナル配列（「STII ss」）、リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧ、配列番号６１）、及びＭ１３ファージの微量タンパク質ＩＩＩのＣ末端残基をコードする配列（例えば残基２６７−４２１）（以下、「ｃＰ３」）をコードするファージミドをライブラリー構築の鋳型として用いた。Kunkel突然変異誘発法と、「１７ｍｅｒＣ３２Ｗ」としても知られているＣ３２Ｗ変異を持つヒトＢＲ３の残基２３−３９に対応する断片を導入し、１７ｍｅｒＣ３２Ｗ領域内に更に変異をコードしたオリゴヌクレオチドを用いて、二組のライブラリーを構築した。すなわち、ライブラリー１は ３１、３４及び３６−３９（置換コドン：ＮＮＳ＝任意のコドン）の番号の残基をコードし、ライブラリー２は 置換コドン残基２７、３０、３１、３４及び３６−３９（置換コドン：ＶＮＣ＝アミノ酸Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｖ、Ａ、Ｄ及びＧをコード）をコードしていた。置換コドンにおいて：Ｎは２５％Ａ、２５％Ｃ、２５％Ｇ、２５％Ｔ；Ｓは５０％Ｇ／５０％Ｃ；Ｖは３３％Ｇ／３３％Ａ／３３％Ｃ；及びＣは１００％Ｃである。ライブラリー１は１．１ｘ１０９メンバーをコードし、ライブラリー２は４．３ｘ１０８メンバーをコードしていた。図９を参照のこと。
【０１３２】
ライブラリー選別。  そのファージを４ラウンドの選別（図１０、概要）にかけた。一般に、１ラウンド当たりのファージインプットは第一回ラウンド（固相選別）に対して１０１４ファージ、更なるラウンド（液相選別）に対して３ｘ１０１２ファージであった。
ファージ選別。  第一選別ラウンドは固相選別法であった。マキシソープ(Maxisorp)イムノプレート（９６ウェル）を４℃にて一晩かけて上述のようにして調製したＢＬｙＳ８２−２８５（５０ｍＭの炭酸塩バッファー（ｐＨ９．６）中２μｇ／ｍｌで１００μｌ）で被覆した。ついで、ウェルを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中０．２％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを用いて１時間ブロックし、３−５回、ＰＢＳ、０．０５％のＴＷＥＥＮ(登録商標)２０で洗浄した。ファージ粒子（（ＥＬＩＳＡバッファー（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．０５％ＴＷＥＥＮ(登録商標)２０）中１００μｌ／ウェル）をウェルに添加した。２時間後、ウェルをＰＢＳ、０．０５％のＴＷＥＥＮ(登録商標)２０で数回洗浄した。ウェルに結合したファージを室温（ＲＴ）で１０分間０．１ＮのＨＣｌを用いて溶出させた。溶出させたファージを、１／２０容量の２Ｍトリス（ｐＨ１１．０）を加えることによって中和した。
ファージをタイターするために、対数期ＸＬ-１（ＯＤ６００ｎｍ〜０．３）を３７℃で３０分、溶出したファージに感染させた。ついで、感染した細胞を１０倍の増分で２ＹＴによって段階希釈した。感染した細胞の１０ｍｌのアリコートをカルベニシリンプレート毎に播種した。各ライブラリーから〜１０８のファージを第一ラウンドの選別から取得した。
【０１３３】
ファージを増殖させるために、溶出したファージを用いて３７℃で３０分間、対数期ＸＬ-１（ＯＤ６００ｎｍ〜０．３）を感染させた。ヘルパーファージＫＯ７とカルベニシリンを１ｘ１０１０ｐｆｕ／ｍｌＫＯ７及び５０ｕｇ／ｍｌカルベニシリンの最終濃度で３７℃にて更に３０分間、感染体に加えた。その培養をカルベニシリン５０ｕｇ／ｍｌ及び２５ｕｇ／ｍｌカナマイシンを有する２ＹＴ培地中で最終容積２５ｍｌまで３７℃で一晩成長させた。
そのファージを１００００ｒｐｍで１０分間細胞をスピンすることによって精製した。上清を集めた。２０％のＰＥＧ／２．５ＭのＮａＣｌを上清容積の１／５まで加えて、混合し、室温で５時間静置させた。そのファージを１００００ｒｐｍで１０分間スピンさせてペレットにした。上清を捨て、ファージペレットを５０００ｒｐｍで５分間再びスピンさせた。そのペレットを０．７ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させ、１３０００ｒｐｍで１０分間スピンさせて、細胞片を破棄した。再懸濁されたファージペレットのＯＤを２６８ｎｍで読み取った。
第２−第４選択ラウンドは溶液選別法を利用した。第２ラウンドでは、ＮＵＮＣ(登録商標)マキシソープの９６-ウェルプレートを、４℃で一晩かけて５ｕｇ／ｍｌのニュートラアビジン(登録商標)（Pierce Biotechnology, Inc.）で被覆した。次に、プレートをＰＢＳ中２００μｌ／ｍｌのＳＵＰＥＲＢＬＯＣＫ(登録商標)（Pierce Biotechnology, Inc.）を用いて室温で３０分間、ブロックした。ＴＷＥＥＮ(登録商標)２０を０．２％（ｖ／ｗ）の最終濃度まで各ウェルに添加し、室温で更に３０分間ブロックした。第１選択ラウンドからの増幅した精製ファージを、室温で１時間、ＳＵＰＥＲＢＬＯＣＫ(登録商標)０．５％及び０．１％ＴＷＥＥＮ(登録商標)２０を含む１５０ｕｌバッファー中の５０ｎＭのビオチン化ＢＬｙＳ（最終濃度）と共にインキュベートした。ついで、混合物をＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ(登録商標)で５−１０Ｘに希釈し、ニュートラアビジン(登録商標)被覆プレートに１００μｌ／ウェルで塗布した。そのプレートを室温で５分間穏やかに振とうして、ビオチン化ＢＬｙＳに結合したファージをウェル中に捕捉させた。ついで、ウェルをＰＢＳ／０．０５％のＴＷＥＥＮ(登録商標)２０で数回洗浄した。結合したファージを０．１ＮのＨＣｌで１０分間溶出させ、中和し、滴定し、増殖させ、上述のようにして精製した。各ライブラリーから〜３ｘ１０６ファージが第２選択ラウンドから得られた。
【０１３４】
第３選択ラウンドは、２ｎＭの濃度のビオチン化ＢＬｙＳを希釈と各ウェルへの添加の前にファージと共にインキュベートした点を除いて、第２ラウンドと同様である。結合ファージを１０分間、０．１ＮのＨＣｌで溶出させ、中和し、滴定し、上述のようにして増殖させた。各ライブラリーから〜１０４ファージを第３選択ラウンドから得た。
第３選択ラウンドからのファージを、ついで第４ラウンドの二種の異なる選択方法にかけた。方法４ａは、０．５ｎＭのビオチン化ＢＬｙＳの存在下で室温で１時間インキュベートした点を除いて第２及び第３選択ラウンドと同様であった。ついで、混合物を、希釈及び被覆ウェルへの添加の前に１０００倍過剰（５００ｎＭ）の未ビオチン化ＢＬｙＳの存在下で室温で更に１５分間インキュベートした。方法４ｂは、０．２ｎＭのＢＬｙＳを希釈と各ウェルへの添加の前にファージと共にインキュベートした点を除いて第２及び第３選択ラウンドと同様である。第４ラウンドの選択からの結合ファージを１０分間、０．１ＮのＨＣｌで溶出させ、中和し、滴定し、上述のようにして増殖させた。〜１０３ファージが第４ラウンド（４ａ及び４ｂ）の選択のそれぞれから各ライブラリーに対して得られた。
【０１３５】
クローン分析。  第４ラウンドの選別後、個々のクローンを、カルベニシリン及びＫＯ７ヘルパーファージを補填した４００μＬの２ＹＴ培地中、９６ウェル形式で成長させた。これらの培養物の上清をファージＥＬＩＳＡにおいて使用した。ファージＥＬＩＳＡに対して、ＮＵＮＣ(登録商標)マキシソープ９６-ウェルプレートを炭酸塩バッファー、ｐＨ９．６中のＢＬｙＳの２μｇ／ｍｌ溶液１００μｌで一晩かけて４℃で被覆した。プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡで２時間の間ブロックした。ファージ上清を５０ｎＭのＢＬｙＳの不存在又は存在下でＥＬＩＳＡ結合バッファー（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ＴＷＥＥＮ(登録商標)２０）で１：４に希釈し、室温で１時間インキュベートした。１００ｕｌの希釈したファージ上清をついで被覆プレートに移し、ファージを捕捉するために２０分間穏やかに振とうした。ついで、プレートをＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ(登録商標)２０を用いて数回洗浄した。ＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ(登録商標)２０（１：５０００）中ＨＲＰ結合抗Ｍ１３抗体のウェル当たり１００μｌをプレートに移し、２０分インキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ(登録商標)の後ＰＢＳによって洗浄した後、プレートを、０．８ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ（シグマ）と０．０１％のＨ２Ｏ２を含む１００μｌのＰＢＳ基質溶液と共に５分インキュベートした。反応を１００ｍｌ／ウェルの１ＭのＨ３ＰＯ４で停止させ、プレートを４９０ｎｍで読み取った。図１１は５０ｎＭのＢＬｙＳの不存在及び存在下でのファージＥＬＩＳＡの結果、並びに９６ファージクローンのそれぞれに対してこのＢＬｙＳ濃度に対して計算した阻害％の計算を報告している。ついで、クローンの配列を先に記載されているようにして(Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A.及びSidhu, S. S. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 8950-8954)決定した。許容できる品質の配列を翻訳し整列させた。１７ｍｅｒの配列を図１２Ａ−Ｃに示す。とりわけ１７塩基長の配列をコードしている核酸配列は図１４Ａ−Ｃに与える。図１４Ａ−Ｃに含めた各配列の核酸配列は次のアミノ酸配列に翻訳することができる：上述の１７塩基長配列のＳｔＩＩ分泌シグナルＮＡＹＡからのリーダー配列の一部（図１２Ａ−Ｃ）、及びリンカー配列の一部（ＧＧＧＳ）。
１４のクローンを更にＢＬｙＳ結合アッセイにおいて分析してＩＣ５０値を決定した。クローン２及び７は第４ラウンドで多い数の同胞（同一配列のクローン）を有していた。ファージＥＬＩＳＡアッセイによれば、クローン１３、１９、２２、２６、３２、３９及び４４は５０ｎＭのＢＬｙＳによってプレートへの結合が大きく阻害された（図１１）。クローン３５、４５、６８、８２及び９０の結合もまたファージＥＬＩＳＡアッセイにおいて大きく阻害された（図１１）。これらの１４クローンのファージ上清を、上述のようにして増殖させ精製した対数期ＸＬ-１を感染させるために用いた。
【０１３６】
ディスプレイ及びファージ収量を正規化し、ＩＣ５０測定のためのファージの適切な希釈度を決定するために、各クローンからの精製ファージの段階希釈物を室温で１時間ＥＬＩＳＡ結合バッファー（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ＴＷＥＥＮ(登録商標)２０）中でインキュベートした。１００μｌの各希釈物をＢＬｙＳ被覆プレートに移し、上述のようにして２０分間ファージを捕捉するために穏やかに振とうした。結合したファージをＨＲＰ結合抗Ｍ１３抗体とついでＯＰＤ／Ｈ２Ｏ２基質反応によって検出し、急冷し、上述のように４９０ｎｍで読み取った。このプロセスによって、４９０ｎｍで〜１Ｏ.Ｄ.を示した各クローンの希釈を決定し、ＩＣ５０アッセイにおいて使用した。
１４クローンのそれぞれのＩＣ５０値を決定するために、ＮＵＮＣ(登録商標)マキシソープ９６-ウェルプレートを炭酸塩バッファー、ｐＨ９．６に入れたＢＬｙＳの２μｇ／ｍｌの溶液を１００μｌ用いて４℃で一晩被覆し、上述のようにして洗浄しブロックした。１４クローンのそれぞれに対して増幅し精製したファージの希釈物を１３０ｕｌのＥＬＩＳＡ結合バッファー（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ＴＷＥＥＮ(登録商標)２０）中０．００３−１０００ｎＭの範囲のＢＬｙＳの濃度列の存在下で室温にて１時間インキュベートした。これらの濃度列のそれぞれ１００μｌをＢＬｙＳ被覆プレートに移し、捕捉し、洗浄し、ＨＲＰ結合抗Ｍ１３抗体で検出し、上述のようにしてプロセシングした。結果を図１５に示す。ＩＣ５０値は１４クローンのそれぞれに対して置換ＥＬＩＳＡシグナルの４変数フィットによって決定した。ＩＣ５０値は０．４（クローン４４）から１１ｎＭ（クローン２２）の範囲であった。  
【０１３７】
競合置換ＥＬＩＳＡ。  次の１７-ｍｅｒ、Ａｃ-ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ-ＮＨ２（配列番号１７）（「ＢＬｙＳ００２７」）、Ａｃ-ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ-ＮＨ２（配列番号１４）（「ＢＬｙＳ００４８」）、Ａｃ-ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ-ＮＨ２（配列番号１３）（「ＢＬｙＳ００５１」）を上述のようにして合成した。ＮＵＮＣ(登録商標)マキシソープ９６-ウェルプレートを、炭酸塩バッファー（ｐＨ９．６）中ＢＬｙＳの２ｍｇ／ｍｌ溶液を１００ｍｌ用いて４℃で一晩かけて被覆した。プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１％の脱脂乳でブロックした。ＢＲ３ ＥＣＤ（残基１−６１）（配列番号６０）と上記の１７-ｍｅｒペプチドの段階希釈物を、３ｎｇ／ｍｌのビオチン化ミニＢＲ３を含むＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ(登録商標)２０で調製した。ＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ(登録商標)での洗浄後、１００ｍｌ／ウェルの各希釈物を移し、室温で１時間インキュベートした。そのプレートをＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ(登録商標)で洗浄し、１００ｍｌ／ウェルの０．１Ｕ／ｍｌのＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ(登録商標)中ストレプトアビジン-ＰＯＤ（ベーリンガー・マンハイム）と共に１５分インキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ(登録商標)と次のＰＢＳでの洗浄後、プレートを、０．８ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ（シグマ）と０．０１％のＨ２Ｏ２を含む１００μｌのＰＢＳ基質溶液と共に５分インキュベートした。反応を１００ｍｌ／ウェルの１Ｍ、Ｈ３ＰＯ４で停止させ、４９０ｎｍでプレートを読み取った。ＩＣ５０値は競合置換ＥＬＩＳＡシグナルの４変数フィットによって決定した。ミニＢＲ３及びＢＲ３細胞外（配列番号６０）ドメインの初期原液の濃度は定量アミノ酸分析によって決定した。
図１６はこのアッセイを使用するＢＲ３ ＥＣＤ（配列番号６０）、ＢＬｙＳ００２７（配列番号１７）、ＢＬｙＳ００４８（配列番号１４）及びＢＬｙＳ００５１（配列番号１３）のＩＣ５０値を示す。１７-ｍｅｒペプチドは全て６１-ｍｅｒＢＲ３ ＥＣＤ（配列番号６０）よりもＢＬｙＳに対してより大なる親和性を有していた。
【０１３８】
実施例３
次のペプチド：Ａｃ-ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ-ＮＨ２（ＢＬｙＳ００２７）（配列番号１７）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（ＢＬｙＳ００４８）（配列番号１４）を２Ｄ ＮＭＲ分光法によって分析した。バックボーンＨＮ-Ｈアルファ結合定数を以下の表２に与える。バックボーン３ＪＨＮ−Ｈａ結合定数は開示されているようにして[Starovasnik, M.A., Skelton, N.J., O'Connell,M.P., Kelley,R.F., Reilly,D., 及びFairbrother, W.J. (1996) Biochemistry 35, 15558-15569]、２０℃にて５００ＭＨｚ(ＢＬｙＳ０４８)又は６００ＭＨｚ(ＢＬｙＳ０２７)の分光計で獲得した２ＤＣＯＳＹスペクトルから測定した。ｏｖは、関連ピークが重なるので、結合定数の精確な値を得ることができなかったことを示す。ｎａはこのスペクトルで値を測定できなかったことを示す。ＮＭＲ試料は〜３ｍｇ／ｍｌのペプチドの濃度で９２％Ｈ２Ｏ／８％Ｄ２Ｏ中に凍結乾燥ペプチドを溶解させることによって調製した。２ＤＮＯＥＳＹ、ＴＯＣＳＹ、及びＣＯＳＹスペクトルを集め、標準的な２ＤＮＭＲ法[Wuthrich, K. (1986)NMR of Proteins and Nucleic Acids (New York, J. Wiley and Sons)]を使用して全ての１Ｈ共鳴を割り当てるために使用した。
３結合バックボーン結合定数は与えられたポリペプチドの三次元構造及び安定性の高度に感度の高い指標である。ＢＬｙＳ００２７（配列番号１７）及びＢＬｙＳ００４８（配列番号１４）に対して示した値は、これらのペプチドの各々が溶液中で高度に安定な構造を採り、ペプチドがｂｈｐＢＲ３(Kayagaki等,2002)、ＢＲ３ＮＭＲ構造(Gordon等, Biochemistry 42, 5977-5983 2003)及びＢＬｙＳ／ＢＲ３共結晶構造のＢＲ３(Liu等,Nature 423, 49-56, 2003;Kim等, 2003 Nature Structual Biology, 10, 342-348)に見られるものに非常に類似したターン高次構造を採ることを示している。
2007536896.tif 000003
【０１３９】
実施例４
この実施例は、Ｂ細胞変調／枯渇のための抗ＣＤ２０ｍＡｂ及びＢＲ３アンタゴニスト治療の間での相乗効果を試験する。
材料及び方法：
ヒトＣＤ２０をコードする細菌人工染色体を発現するＦＶＢマウス（ｈＣＤ２０＋マウスと呼称）を、抗ＣＤ２０ｍＡｂ（第９日目に１００μｇを単回注射）、ＢＲ３-Ｆｃ（第１日目から１２日目まで隔日１００μｇ）、又は抗ＣＤ２０ｍＡｂとＢＲ３-Ｆｃの組合せを腹腔内注射して処置した。各グループは４匹のマウスとした。最後の注射後２日目に、マウスを屠殺し、ｈＣＤ２０＋Ｂ細胞について分析した。脾臓、血液、リンパ節及びパイエル板のＦＡＣＳ分析により、Ｂ細胞マーカー（ＣＤ２１＋ＣＤ２３＋）について分析した。
【０１４０】
結果：
１．抗ＣＤ２０ｍＡｂ治療により、血液及びリンパ節の成熟循環Ｂ細胞の９９％未満が枯渇する。
２．ＢＲ３-Ｆｃは、血液及びリンパ節の成熟循環Ｂ細胞を減少させる。
３．抗ＣＤ２０ｍＡｂ治療は、脾臓の辺縁帯Ｂ細胞でなく、Ｔ２及び濾胞性Ｂ細胞を枯渇する。
４．ＢＲ３-Ｆｃは、脾臓のＴ２／濾胞性及び辺縁帯Ｂ細胞を減少させる。
５．抗ＣＤ２０ｍＡｂとＢＲ３-Ｆｃの併用は相乗的に作用して脾臓の全てのＢ細胞集団を枯渇する。
これらの結果と他の結果は本願と同日に出願した「Ｂ細胞疾患の併用療法」と題した米国特許出願（第一発明者：AndrewC.Chan）に示されており、それを出典明示によりここに取り込む。
カニクイザルで実施される同様な実験が進行中である。この実験と他の実験は、抗ＣＤ２０ｍＡｂとＢＲ３-Ｆｃの併用がＢ細胞の全てのサブセットを枯渇させる際に大なる相乗効果を生じるという驚くべき結果を裏付けている。
【０１４１】
実施例５−ペプチド-ＰＥＧ抱合体
ＢＬｙＳ８２−２８５生成。  ヒトＢＡＦＦ（残基８２−２８５）をコードするＤＮＡ断片をｐＥＴ１５ｂ(Novagen)発現ベクターにクローニングし、Ｎ末端基Ｈｉｓ-タグの後ろにトロンビン切断部位を有する融合体を作製した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Novagen）培養物を、５０ｍｇ／Ｌカルベニシリンを含有するＬＢ培地にて３７℃で対数中間期まで生育し、ついで１．０ｍＭのＩＰＴＧでの誘導前に、１６℃に冷却した。更に１２時間生育した後細胞を遠心分離によって回収し、−８０℃に保存した。細胞ペレットを５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０及び５００ｍＭのＮａＣｌ中に再懸濁して、氷上で超音波破壊した。遠心分離後、上清を、Ｎｉ-ＮＴＡアガロースカラム（Qiagen）に流した。カラムを、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ及び２０ｍＭイミダゾールにて洗浄し、ついで、２５０ｍＭイミダゾールを含有する同様の緩衝液にて段階的に希釈して溶出した。ＢＡＦＦを含有する分画を貯留し、トロンビンを添加して、試料を２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０及び５ｍＭのＣａＣｌ２にて４℃で終夜透析した。更に、タンパク質を、ｍｏｎｏＱ(Pharmacia)カラムにて、最後に２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び５ｍＭのＭｇＣｌ２のＳ−２００サイズ排斥カラムにて精製した。結果として生じるＢＬｙＳタンパク質を後述するように用いた。
【０１４２】
ペプチド合成。  標準のＦｍｏｃ化学法を用いてPERSEPTIVE BIOSYSTEM(登録商標)パイオニアTMペプチド合成機(Applied Biosystems Inc.)にて、ミニＢＲ３（配列番号５９）をＣ末端のアミドとして合成した。システイン１９及び３２の側鎖チオールをトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）-安定アセトアミドメチル（Ａｃｍ）誘導体として保護された。ペプチドを、５％トリイソプロピルシランを含むＴＦＡで１．５−４時間室温にて処理することによって、樹脂から切断した。回転式蒸発によってＴＦＡを除去した後、ペプチドをエチルエーテルの添加によって沈殿させ、次いで逆相ＨＰＬＣ（アセトニトリル／Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ）にて精製した。エレクトロスプレー質量分析によって確実にペプチドを同定した。凍結乾燥の後、酸化型ペプチドをＨＰＬＣにて精製した。還元型ミニＢＲ3を含むＨＰＬＣ分画を、ＮＨ４ＯＨにてｐＨ９以下に調整した；ついで、Ｋ３Ｆｅ(ＣＮ)６を少し過剰に添加することによってシステイン２４と３５間をジスルフィド結合し、酸化型ペプチドをＨＰＬＣによって精製した。少し過剰なＩ２を用いて４時間以下にわたってＨＰＬＣ溶出処理をすることによってＡｃｍ基を除去した（第２のジスルフィドが付随的に形成される）。分析的ＨＰＬＣによって酸化経過をモニタし、終末産物をＨＰＬＣによって再び精製した。１０倍モルの過剰なスルホ-ＮＨＳ-ビオチン(Pierce Chemical, Co.)を用いた反応によって樹脂上でミニＢＲ３のアミノ末端をビオチン化した。ついで、ビオチン化したミニＢＲ３を樹脂から切断して、ビオチン化されなかったミニＢＲ３のために上記の通りに精製した。
【０１４３】
以下のペプチド、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（ＢＬｙＳ００４８）（配列番号１４）及びＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＫ（ＢＬｙＳ００９５）（配列番号６２）を、以下の通りに一般的に合成した。Ｒｉｎｋアミド樹脂を用いたRAININ(登録商標)Symphonyペピチド合成機システムと、５倍の過剰量のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）含有の２-(１Ｈ-ベンゾトリアゾン-1-イル)-１,１,３,３-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）で活性化した３倍の過剰量の９-フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）被保護アミノ酸でペプチドを合成した。アミノ酸を各部位で２回結合させ、ピペリジンを２０％含むジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液によって非保護し、次の残基へ移動した。各結合工程の間にジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）にて洗浄した。ペプチド上に最終アミノ酸を結合させて２０％ピペリジンを含むＤＭＦにて脱保護した後、３等価量の無水酢酸と５等価量のＤＩＰＥＡを含むＤＭＡを用いてペプチドのアミノ末端をアシル化した。あるいは、アミノ末端を、５-カルボキシフルオレセインにて、(＋)-ビオチンにて、あるいは、他のフルオロフォア又はリポーター分子にてアシル化することによって修飾した。ついで、２．５％水と２．５％トリイソプロピルシランを含む９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液にて９０分間処理することによって樹脂から切断した。圧力を下げることによって揮発性物質を除去し、ジエチルエーテルを加え、固形物を濾過した。結果として生じた沈殿物をジエチルエーテルにて再度洗浄し、結合した有機物質を除いた。ついで、洗浄した固形物を酢酸、酢酸及びアセトニトリル１：１混合液、酢酸、アセトニトリル及び水１：１：１混合液、酢酸、アセトニトリル及び水１：１：８混合液で連続的に洗浄して、最後に水で洗浄した。結合した洗浄物を凍結乾燥し、毎分１５ｍｌの流速で、各々の溶媒液中に０．１％のトリフルオロ酢酸を含有する水で１０％から７０％の勾配を付けたアセトニトリルにて３０分間のＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィを行うことによって結果として生じた粗ペプチドを精製した。所望のペプチドを含む分画に、溶液が着色されるまで酢酸のヨウ素飽和溶液を添加して酸化した。次いでこの溶液を凍結乾燥した。最後に、凍結乾燥された粗酸化型ペプチドを同様の条件で２度精製し、所望のペプチドを含む分画を凍結乾燥した。４倍の過剰量のアミノ酸を用いたPERSEPTIVE BIOSYSTEMS(登録商標)PIONEERTMペプチド合成機(Applied Biosystems Inc.) での合成を除き、同じ条件で残基当たり一度しか結合していない幾つかのペプチドを合成した。
【０１４４】
ペプチドへのポリマーの抱合。  第一アミン（リジンとＮ末端）と反応させるためにＮ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で修飾した線状ＰＥＧを用いてペグ化した１７ｍｅｒのペプチドを生成した。すべてのＰＥＧ-ＮＨＳ（ＰＥＧ-ＳＰＡ）試薬をNektar Therapeutics, San Carlos, CAから購入し、−７０℃の窒素下で保存した。ペプチド１ｍｇ／ｍｌをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解した。０．４ｍｌのペプチド溶液に固形のｋｅｇ-ＳＰＡ、ｋｅｇ-ＳＰＡ又は２０ｋＰＥＧ-ＳＰＡを添加した。ＰＥＧ-ＳＰＡとペプチドを３：１のモル比となるように十分な固形を加えた。これらの溶液を室温で１時間インキュベートして、反応の過程を溶液５０μｌを用いた逆相分析用ＨＰＬＣによって分析した。全てのペプチドがＨＰＬＣによって示されるように修飾されるまでＰＥＧの添加とインキュベートを２度繰り返した（図１７Ａ及び１７Ｂ）。更なる精製をしないでペグ化したペプチドをＢＬｙＳ結合について試験した。
２ｋのＰＥＧ-抱合体及び５ｋのＰＥＧ-抱合体に対するＨＰＬＣクロマトグラフを図１７Ａ及び図１７Ｂにそれぞれ記載する。図１７Ａにおいて、未抱合のペプチドは１．７８分のピークに対応し、２ＫのＰＥＧ-ペプチド抱合体は２．０８分のピークに対応する。図１７Ｂにおいて、未抱合のペプチドは１．７８分のピークに対応し、５ＫのＰＥＧ-ペプチド抱合体は２．１７分のピークに対応する。２０ＫのＰＥＧ-抱合体もまた同様の方法によって精製する。精製された抱合体におけるＰＥＧ：ペプチドの比はおよそ１：１である。
【０１４５】
競合的置換ＥＬＩＳＡ。１７ｍｅｒのＡｃ-ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ-ＮＨ２（配列番号：１４）（「ＢＬｙＳ００４８」）を前述のように合成した。ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＫ（ＢＬｙＳ００９５）（配列番号：６２）を前述のように合成して、２Ｋ、５Ｋ及び２０ＫのＰＥＧ-ＮＨＳ各々と結合させた。Ｎｕｎｃ(登録商標)マキシソープ９６ウェルプレートを、２μｇ／ｍｌのＢＬｙＳ溶液１００μｌを含む炭酸塩緩衝液,ｐＨ９．６にて終夜４℃でコートした。プレートをＰＢＳにて洗浄して、１％スキムミルク含有のＰＢＳにてブロックした。３ｎｇ／ｍｌのビオチン化ミニＢＲ３含有のＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ(登録商標)２０にて、ミニＢＲ３（配列番号：５９）と上記の１７ｍｅｒペプチドとＰＥＧ-ペプチド抱合体の連続的希釈液を調製した。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ(登録商標)にて洗浄した後、各希釈液１００μｌをウェルに移し、室温にて１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ(登録商標)にて洗浄し、１ウェル当たり１００μｌの０．１Ｕ／ｍｌストレプトアビジン-ＰＯＤ(Boehringer Mannheim)含有ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ(登録商標)と共に１５分インキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ(登録商標)、ついでＰＢＳにて洗浄した後、プレートを０．８ｍｇ／ｍｌＯＰＤ(シグマ)と０．０１％Ｈ２Ｏ２含有の１００μｌＰＢＳ基質溶液と共に５分間インキュベートした。反応液を１ウェル当たり１ＭのＨ３ＰＯ４にて冷却し、４９０ｎｍで読み込みを行った。競合的置換ＥＬＩＳＡシグナルの４つのパラメータに当てはめてＩＣ５０値を測定した。方程式は以下の通りである：ｙ＝ｍ１＋（ｍ２−ｍ１）／（１＋ｍ０／ｍ４）＾ｍ３、ここでｍ１は無限の競合体濃度での吸光度、ｍ２は競合体がないときの吸光度、ｍ３は中間値付近のカーブの傾き、ｍ４はＩＣ５０値、ｍ０は競合体、この場合はペプチドの濃度である。ビオチン化したミニＢＲ３の濃度は約１０ｐＭである。ミニＢＲ３の初期保存用溶液の濃度は定量アミノ酸分析法にて決定した。
【０１４６】
結果
競合的置換ＥＬＩＳＡ信号の４パラメータへ当てはめることにより、ＩＣ５０値：ＢＬｙＳ００９５（配列番号６２）は１９ｎＭ、ＢＬｙＳ００４８（配列番号１４）は１４ｎＭ、及びＢＬｙＳ００９５−２ｋＰＥＧ抱合体は４３ｎＭ、及びＢＬｙＳ００９５−５ｋＰＥＧ抱合体は５１ｎＭが得られた。同様に、各図１９の競合的置換ＥＬＩＳＡ信号の４パラメータへの当てはめにより、ＢＬｙＳ００９５−２０ｋＰＥＧ抱合体に対して９９ｎＭ、ＢＬｙＳ００４８（配列番号１４）に対して１５ｎＭのＩＣ５０値が得られた。
１７ｍｅｒペプチド-ＰＥＧ抱合体（２ｋ、５ｋ及び２０ｋ）のＢＬｙＳへの結合能を試験した。ＰＥＧのＢＬｙＳ００９５（配列番号６２）への抱合により抱合していない同じペプチドと比較してその結合能に有意な減少はなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】ヒトＢＬｙＳの天然配列をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号３３）とそのアミノ酸配列（配列番号３４）を示す。
【図２】図２ＡはヒトＢＲ３の天然配列をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号３５）（開始コドンと停止コドンに下線を付す）を示し、図２Ｂはそのアミノ酸配列（配列番号３６）を示す。
【図３】マウスＢＲ３をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号３７）（開始コドンと停止コドンに下線を付す）を示す。
【図４】ヒト（配列番号３４）とマウスＢＲ３（配列番号３８）の配列アラインメントを示し、同一アミノ酸を文字で、保存されたアミノ酸を＋記号でその下に示す。
【図５】ヒトＣＤ２０のｃＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号３９）を示す。
【図６】予測される膜貫通領域（ボックス標示）と細胞外（下線）領域を示すヒトＣＤ２０のアミノ酸配列（配列番号：４０）を示す。
【図７】マウス２Ｈ７（配列番号４１）、ヒト化２Ｈ７ｖ１６変異体（配列番号４２）、及びヒトκ軽鎖サブグループＩ（配列番号４３）の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のアミノ酸配列を比較する配列アラインメントである。
【図８】マウス２Ｈ７（配列番号４７）、ヒト化２Ｈ７ｖ１６変異体（配列番号４８）、及びヒトκ重鎖サブグループＩＩＩ（配列番号４９）の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のアミノ酸配列を比較する配列アラインメントである。
【図９】ファージディスプレイ１７ｍｅｒライブラリーを示し、「Ｘ」で示された位置は縮重コドンＮＮＳコドン（ライブラリー１）又はＶＮＣ（ライブラリー２）を使用して各ライブラリーで無作為化した。
【図１０】ファージ選択の概観である。
【図１１Ａ】５０ｎＭのＢＬｙＳの不存在又は存在下でのＥＬＩＳＡデータを示し、阻害はそれぞれからバックグラウンドを引いて参照ウェルに対して５０ｎＭのＢＬｙＳを含むウェルのシグナルにおける減少パーセントとして計算されている。
【図１１Ｂ】５０ｎＭのＢＬｙＳの不存在又は存在下でのＥＬＩＳＡデータを示し、阻害はそれぞれからバックグラウンドを引いて参照ウェルに対して５０ｎＭのＢＬｙＳを含むウェルのシグナルにおける減少パーセントとして計算されている。
【図１２Ａ】高親和性ＢＬｙＳ結合のファージディスプレイライブラリーから選択した１７ｍｅｒのアミノ酸配列を示す。
【図１２Ｂ】高親和性ＢＬｙＳ結合のファージディスプレイライブラリーから選択した１７ｍｅｒのアミノ酸配列を示す。
【図１２Ｃ】高親和性ＢＬｙＳ結合のファージディスプレイライブラリーから選択した１７ｍｅｒのアミノ酸配列を示す。
【図１３】本発明のペプチドの三次元構造の立体視モデルである。
【図１４Ａ】高親和性ＢＬｙＳ結合のファージディスプレイライブラリーから選択した１７ｍｅｒのＤＮＡ酸配列を示す。
【図１４Ｂ】高親和性ＢＬｙＳ結合のファージディスプレイライブラリーから選択した１７ｍｅｒのＤＮＡ酸配列を示す。
【図１４Ｃ】高親和性ＢＬｙＳ結合のファージディスプレイライブラリーから選択した１７ｍｅｒのＤＮＡ酸配列を示す。
【図１５】ファージにディスプレイされた１７ｍｅｒの対するＢＬｙＳのＥＬＩＳＡ競合データを表し、ＩＣ５０値は０．４ｎＭ（クローン４４）から１１ｎＭ（クローン２２）の範囲である。
【図１６】ＢＲ３細胞外ドメイン（配列番号６０）（白抜きの円と白抜きの四角）、ＢＬｙＳ００２７（配列番号１７）（ダイアモンド形及び「ｘ」）、ＢＬｙＳ００４８（配列番号１４）（「＋」及び三角形）及びＢＬｙＳ００５１（配列番号１３）（塗りつぶした円及び塗りつぶした四角）に対するＥＬＩＳＡによって測定したビオチン化ミニ-ＢＲ３（配列番号５９）の競合置換を示す。
【図１７】ＰＥＧ-ポリペプチド抱合体のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１８】１７ｍｅｒ及び１７ｍｅｒ-ＰＥＧ抱合体に対するＢＬｙＳのＥＬＩＳＡ競合データを示す。
【図１９】１７ｍｅｒ及び１７ｍｅｒ-２０ｋＰＥＧ抱合体に対するＢＬｙＳのＥＬＩＳＡ競合データを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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