(57)【要約】ジスルフィド結合を、特にタンパク質、ペプチドおよびアミノ酸において形成するための方法および試薬に関する。本発明の方法および試薬は、タンパク質、ペプチドおよびアミノ酸の制御されたグリコシル化に特に有用となる。本方法は、試薬または中間体としてチオスルフォネートまたはセレネニルスルフィドの化合物を使用する。セレネニルスルフィド基を含むタンパク質およびペプチドのあるものもまた、本発明の一部を形成する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１個のチオール基を含む有機化合物と式Ｉの化合物：
Ｒ−Ｓ−Ｘ−Ｒ1       （Ｉ）
（式中、ＸはＳＯ2またはＳｅを表し、Ｒは有機部分であり、Ｒ1は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいピリジル基、または置換されていてもよいナフチル基であり、かつ、ＸがＳＯ2であるときＲ1は置換されていてもよいアルキル基でない。）との反応を含む、ジスルフィド結合を形成する方法。
【請求項２】
前記の少なくとも１つのチオール基を含む有機化合物は、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１個のチオール基を含むタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸を化学修飾する方法であり、そうしたタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸と式Ｉの化合物：
Ｒ−Ｓ−Ｘ−Ｒ1       （Ｉ）
（式中、ＸはＳＯ2 または Ｓｅを表し、 Ｒは 有機部分であり、Ｒ1は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいピリジル基、または置換されていてもよいナフチル基であり、かつ、ＸがＳＯ2 であるとき、Ｒ1は置
換されていてもよいアルキル基でない。）との反応を含む方法。
【請求項４】
Ｒが炭水化物の基である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
Ｒ1がフェニル基である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＸがＳｅである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＸがＳＯ2である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
下記式Ｉ：
Ｒ−Ｓ−Ｘ−Ｒ1       （Ｉ）
（式中、ＸはＳＯ2またはＳｅを表し、Ｒは炭水化物部分であり、Ｒ1は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいピリジル基、または置換されていてもよいナフチル基であり、かつ、ＸがＳＯ2であるとき、Ｒ1は置換されていてもよいアルキル基でない。）で表される化合物。
【請求項９】
Ｒ1がフェニル基である請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
ＸがＳｅである請求項８または請求項９に記載の化合物 。
【請求項１１】
ＸがＳＯ2である請求項８または請求項９に記載の化合物 。
【請求項１２】
式IIの化合物：
Ｍ(ＳＳＯ2Ｒl)k        （II）
（式中、Ｍは金属であり、例えば Li、Na、K、Ca、 Cs、 Zn、 Mgまたは Alである。ｋは１〜３の整数である。）
と、式IIIの化合物：
Ｒ−Ｌ               （III）
（式中、Ｌは脱離基である。）とを反応させることを含む、請求項１１に記載された式Ｉの化合物を調製する方法。
【請求項１３】
式VIIIのジスルフィド化合物：
Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ       （VIII）
を銀イオンの存在下、スルフィニートアニオン：Ｒ1ＳＯ2-
に反応させることを含む、請求項１１に記載された式Ｉの化合物を調製する方法。
【請求項１４】
式Ｖの化合物と、式VIaの化合物または式VIbの化合物と
Ｒ−ＳＨ            （Ｖ）
Ｒ1ＳｅＬ2          （VIa）
Ｒ1Ｓｅ(ＯＨ)2      （VIb）
（式中、Ｌ2は Br、 Cl、 CN、または Iである。）
を反応させることを含む、請求項１０に記載された式Ｉの化合物を調製する方法。
【請求項１５】
ジスフィルド結合の形成において請求項１〜７のいずれかに記載の式Ｉの化合物の使用。
【請求項１６】
少なくとも１個のチオール基を含むタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸を修飾するための、請求項１〜７のいずれかに記載の式Ｉの化合物の使用。
【請求項１７】
少なくとも１個のチオール基を含むタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸をグリコシル化するための、請求項８〜１１のいずれかに記載の式Ｉの化合物の使用。
【請求項１８】
チオール基をセレニルスフィド基に変換することを含む、少なくとも１個のチオール基を含むタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸を化学修飾する方法。
【請求項１９】
少なくとも１個のチオール基を含むタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸と式Ｘａまたは式Ｘｂに表される化合物：
Ｒ2ＳｅＬ2         Ｘａ
Ｒ2Ｓｅ（ＯＨ）2    Ｘb
（式中、Ｌ2は脱離基であり、Ｒ2は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいベンジル基、置換されていてもよいピリジル基、または置換されていてもよいナフチル基である。Ｒ2は固体支持体の一部を構成するか、
または結合している。）とを反応させることを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｒ2がフェニル基による、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
式Ｘａまたは式Ｘｂで表される化合物がPhSeBrである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸中のセレネニルスルフィド基と、チオール基を含む有機化合物とをさらに反応させる、請求項１８〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１つのセレネニルスルフィド基を含むタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸を、チオール基を含む有機化合物とを反応させることにより、そうしたタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸を化学修飾する方法。
【請求項２４】
前記有機化合物が炭水化物であるの化合物である、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記有機化合物がタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸である、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２６】
セレネニルスルフィド基が、下記式：
−Ｓ−Ｓｅ−Ｒ2
（式中、Ｒ2は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいフェニル基、置
換されていてもよいベンジル基、置換されていてもよいピリジル基または置換されていてもよいナフチル基である。）
で表される基である、セレネニルスルフィド基を少なくとも１つ含むタンパク質、ペプチド、アミノ酸。
【請求項２７】
請求項１８〜２１のいずれかに記載された方法により得ることができる、少なくとも１つのセレネニルスルフィド基を含むタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸。
【請求項２８】
請求項１８〜２１のいずれかに記載された方法により得ることができる、少なくとも１個のジスルフィド結合を含むタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質のジスルフィド結合形成の方法および/または化学修飾方法とそれ
に用いられる試薬に関する。特にタンパク質のグリコシル化に使用される試薬または方法である。
【０００２】
タンパク質の翻訳時および翻訳後のグリコシル化は、これらの生体活動や安定化において重要な役割を演じる(R. Dwek, Chem. Rev., 96: 683-720 (1996))。
例えば、グリコシル化反応は、細胞のシグナル伝達および制御、発生と免疫といった必須の生物的諸過程において主要な役割を果たす。これらの事象の研究は、糖タンパク質が同じペプチド骨格を有するものの、グリコシル化の性質もその部位も異なる、いわゆる糖型物混合物として自然界に生じるという事実により困難なこととなる。
【０００３】
さらに、タンパク質のグリコシル化は遺伝により直接に制御されるものではないため、哺乳類細胞培養における治療用の糖タンパク質の発現は、雑多な糖型の混合物を生じる。均質な糖タンパク質の糖型を合成する能力は、正確な研究目的の前提条件であるだけでなく、現在、多型の糖型混合物として市販されている治療用の糖タンパク質（例えば、エリスロポエチンおよびインターロイキン）の調製においても重要性が増している。リン酸化およびメチル化といった、タンパク質の他の翻訳後修飾もまた重要性を有している。このようなタンパク質の修飾の度合いや性質を制御することは、生体系におけるその作用を研究しまたは制御する可能性をもたらす。（B. G. Davis, Science, Vol 303, p 480-482, 2004）。
【０００４】
タンパク質をグリコシル化する数々の方法が化学合成も含め、知られている。糖タンパク質の化学合成は、ある有用性、少なからず純粋な糖タンパク質糖型に近づく可能性を与える。既知の合成方法の一つは、チオール基選択的な炭水化物試薬である、グリコシルメタンチオスルフォネート試薬（グリコ（glyco）−ＭＴＳ）を利用する。前記グリコシル
メタンチオスルフォネート試薬はタンパク質のチオール基と反応し、ジスフィルド結合によりタンパク質と結合するグリコシル残基が導入される（例えば WO00/01712参照）。
【０００５】
しかし、glyco−ＭＴＳ試薬は多くの欠点があり、例えば往々にして並みの反応収率、
その調製における困難さ、ならびにしばしば使用される塩基性条件下での安定性の問題をはらんでいる。そのため、容易に調製できて、安定性があり、および高収率でグリコシル化タンパク質を生成することができるタンパク質グリコシル化用試薬が望まれてきた。
【０００６】
また、多種多様のタンパク質において、単一部位でも複数の部位でもグリコシル化ができ、高収率でグリコシル化タンパク質産物を生成し、位置選択的である他のタンパク質グリコシル化の方法も望まれている。
【０００７】
驚くべきことに本発明者らは、ある種の硫黄およびセレンを含有したグリコシル化試薬が、比較的簡単に調製することができ、対応するglyco−ＭＴＳ試薬よりも一般的に安定
性があり、高収率でタンパク質も含め、広範囲のチオールを含有する化合物のグリコシル化に使用できることを見出した。
【０００８】
第１の方法として、本発明はジスルフィド結合 (−Ｓ−Ｓ−)を形成する方法を提供す
る。この方法は、少なくとも１個のチオール基（−ＳＨ）を含む有機化合物と式Ｉの化合物とを反応させることを含む。
【０００９】
Ｒ−Ｓ−Ｘ−Ｒ1       （Ｉ）
（式Ｉ中、ＸはＳＯ2またはＳｅであり、好ましくはＳｅである。Ｒは有機部分であり、
例えばアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、または炭水化物部分である。Ｒ1は置
換されていてもよいアルキル基であり、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいピリジル基、または置換されていてもよいナフチル基であり、かつ、ＸがＳＯ2
のときＲ1はアルキル基（置換されていてもよい）ではないという条件である。）
少なくとも１つのチオール基を含む有機化合物は、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質であることが好ましい。
【００１０】
第２の方法として、本発明は少なくとも１個のチオール基（−ＳＨ）を含むタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸を化学修飾する方法であり、先に定義した式Ｉの化合物と、前記のタンパク質、ペプチド、またはアミノ酸とを反応させることを含む方法を提供する。
【００１１】
Ｒ−Ｓ−Ｘ−Ｒ1       （Ｉ）
さらに、別の態様として、本発明はＲが炭水化物部分を表す式Ｉの化合物を提供する。
Ｒがアルケニルまたはアルケニル基であるとき、式Ｉの化合物との反応によって生成したジスフィルド化合物がＲ基内のＣ＝Ｃ結合、またはＣ≡Ｃ結合での反応によってさらに変更される可能性がある。
【００１２】
本発明者らは驚くべきことにさらに、チオール基含有タンパク質が対応するセレネニルスルフィドに変換され、このように形成されたＳ−Ｓｅ結合における硫黄の求電子性が、炭水化物を含むチオール基含有化合物による求核置換を受けやすくするということを見出した。
【００１３】
第３の方法として、本発明は少なくとも１個のチオール基（−ＳＨ）を含むタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸を化学修飾する方法を提供する。その方法は、そのチオール基をセレネニルスルフィド基（−Ｓ−Ｓｅ−Ｒ2）に変換することを含む。したがって本発
明により少なくとも１つのセレネニルスルフィド基を含むタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸を調製することが可能となる。少なくとも１つのセレネニルスルフィド基を含む、そうしたタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸は、本発明のさらなる特徴を構成する。特に好ましくは、少なくとも１つのセレネニルスルフィド基を含むタンパク質またはペプチドである。
【００１４】
タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸中のセレネニルスルフィド基は、さらにチオール基を含む有機化合物と反応する可能性があり、化学修飾されたタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸を与えるであろう。その場合、その有機基はジスフィルド結合によってタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸に結合している。好ましくはチオール基を含むその有機化合物は、炭水化物化合物であり、これによりアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質のグリコシル化の方法を提供する。本明細書において「グリコシル化」とは、別の部分と共有結合によってグリコシル単位が付加する一般的過程を意味する。
【００１５】
第４の方法として、本発明は少なくとも１つのチオール基（−Ｓ−Ｈ−）を含むタンパク質、ペプチド またはアミノ酸を化学修飾する方法を提供する。該方法は以下を含む。
（ａ）該チオール基をセレネニルスルフィド基（−Ｓ−Ｓｅ−Ｒ2）へ変換すること
（ｂ）チオール基を含む有機化合物とそのセレネニルスルフィド基とを反応させること
本発明の第１、２、３、４の態様を、以下、第１、第２、第３、第４の方法として、各々を言及する。特記しない限り、本明細書にある好ましい構成および定義はこれらのすべての方法と関係している。さらに、本発明はここに述べられる、好ましいいずれかの構成のすべての可能な組み合わせを含む。そうした組み合わせが明らかに開示されているか、
いないかにかかわらずである。
【００１６】
第1の方法および第2の方法によるジスフィルド結合形成の一般化された反応スキームは、スキーム１に表される。
【００１７】
【数１】
2007527376.tif 000002
【００１８】
好ましくはスキーム１に示される有機部分は、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸である。
第３の方法および第４の方法によるタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸のセレネニルスルフィド基導入の一般化されたスキームは、スキーム２で表される。
【００１９】
【数２】
2007527376.tif 000003
【００２０】
スキーム２の方法により、Ｒ2基はタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸とセレネニル
スルフィド（−Ｓ−Ｓｅ−）結合を介して共有結合することとなる。このようなタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸は本発明のさらなる局面を形成する。
【００２１】
セレネニルスルフィド基を含むタンパク質およびペプチドは、Ｘ線回折技術によるタンパク質構造の決定において有用であるかもしれない。現在のところ、ＭＡＤ技術（多波長異常分散）は、タンパク質中のすべてのメニオニン残基をセレノメチオニン基に変換する反応を伴う。修飾タンパク質および非修飾タンパク質のＸ線回折パターンの比較によって、その非修飾タンパク質の構造決定を行なうことが可能となる。本発明の方法により、そのような技術に使用できそうな、セレニウムを含む代替のタンパク質またはペプチドの便利かつ容易な利用を可能とする。本発明の方法は、重金属をタンパク質の構造に導入するための簡易な方法を提供し、これによりＸ線回折データの解析が容易になる。
【００２２】
セレネニルスルフィドを含むタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸は、スキーム３の一
般化された反応図式に表される第４の方法により、チオール基を含む有機化合物とさらに反応することができる。
【００２３】
【数３】
2007527376.tif 000004
【００２４】
スキーム３の方法により、該有機部分がジスフィルド結合（−Ｓ−Ｓ−）を介してタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸と共有結合することとなる。この方法において、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸は、求電子試薬として働き、他方、チオール基を含む有機化合物は求核試薬として働く。対照的にグリコ−ＭＴＳ試薬を用いる既知の反応は、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸中の求核性チオール基と求電子試薬のグリコ−ＭＴＳ試薬との反応を含む。本発明による方法は、グリコ−ＭＴＳ試薬を用いる公知のタンパク質化学修飾方法に対して相補的関係にある方法を提供する。
【００２５】
本明細書でアルキル基は、好ましくは1〜１０個の炭素原子を含む直鎖または分岐のア
ルキル基であり、より好ましくは１〜６個の炭素原子を含む直鎖または分岐のアルキル基である。好ましいアルキル基としては、メチル基およびエチル基が挙げられる。本明細書で好ましいアルケニル基は、少なくとも１個のＣ−Ｃ二重結合を含む直鎖または分岐の炭化水素であり、２〜２０個の炭素原子を有し、好ましくは２〜１０個の炭素原子を有し、より好ましくは２〜６個の炭素原子を含む。好ましいアルケニル基として以下のものが挙げられる。
【００２６】
−（ＣＨ2）ＣＨ＝ＣＨ2，−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2，
プレニル基（（ＣＨ3）2Ｃ＝ＣＨＣＨ2−）
ファルネシル基（（ＣＨ3）2Ｃ＝ＣＨ［ＣＨ2ＣＨ2Ｃ（ＣＨ3）＝ＣＨ］2ＣＨ2−）
本明細書で好ましいアルキニル基は、少なくとも１個のＣ−Ｃ三重結合を含む直鎖または分岐の炭化水素であり、２〜１０個の炭素原子を有し、好ましくは２〜６個の炭素原子を含む。好ましいアルキニル基には以下のものが含まれる。
【００２７】
−ＣＨ2Ｃ≡ＣＨ，−ＣＨ2ＣＨ2Ｃ≡ＣＨ
Ｒ1が任意に置換された基を表す場合、適切な置換基として、式Ｉの化合物の生成を妨
げないか、あるいは第１の方法または第２の方法によるジスフィルド結合の形成反応を妨げない任意の置換基が挙げられる。例えば、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＯ2Ｈ、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＭｅであり、ｎは１〜１００の整数であり、好まし
くは１〜５０の整数であり、より好ましくは１〜２０の整数であり、特に好ましくは１〜１０の整数である。Ｒ1基は１〜５個、好ましくは１〜２個の置換基で別個に置換されて
もよい。Ｒ1基は任意に、例えばポリスチレン樹脂のような樹脂である固体担体に結合し
てもよく、またはその一部を構成してもよい。
【００２８】
Ｒ1基は、フェニル基が好ましい。式Ｉの化合物のＲ1基がフェニル基または他の芳香族基である場合、第１の方法または第２の方法によるチオール基含有化合物との反応の進行を、ＵＶ分光法を使ってモニターすることができるという利点がある。したがって、例えばＰｈＳＯ2‐発色団は、約２６５ｎｍでＵＶスペクトル極大を示す。ＰｈＳＯ2−部分は、式Ｉの化合物にも、またジスフィルド結合生成反応の副生物であるＰｈＳＯ2-にも存在する。しかし関係する吸光係数は、ＵＶを使って反応の進歩を追跡できるほど充分に異なる。同様に、本発明の第3、第4の方法も、Ｒ2がフェニル基または他の芳香族基である場
合に、ＵＶ分光法によってモニタリングされる。
【００２９】
式Ｉの化合物において、Ｒ基はいかなる有機部分であってもよく、とりわけタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸と結合するのに適した有機部分である。Ｒの種類に特に制限はないが、例えば、−S−X−基は、第1級、第2級、または第3級である。Ｒは芳香族基また
は脂肪族基であってもよい。Ｒ基は必要に応じて置換することができ、例えばフォスホリル基またはスルフォニル基によって置換されてもよい。ＸがＳｅのとき、他のタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸とジスフィルド結合を介して結合ができるように、Ｒはタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸であってもよい。
【００３０】
Ｒ基として好ましいものにファルネシル（farnesyl）基が挙げられる。ファルネシル化は多くのタンパク質（腫瘍原性タンパク質Ｒａｓを含む）に関係している自然の翻訳後修飾である。本発明の方法により、タンパク質、ペプチドおよびアミノ酸をファルネシル化することができる。
【００３１】
またＲは、リンカーを介してＳ−X−基と結合してもよい、炭水化物部分であることも
好ましい。そのリンカーは炭水化物部分とＳ−X−基との間に１〜１０の原子を含むこと
ができる。例えばそのリンカーは、アルキレン基（例えば、−（ＣＨ2）t−基であり、ｔは1〜１０の整数）またはアルケニレン基（例えば、−（ＣＨ2）ＣＨ＝ＣＨ−または−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ−基）である。Ｓ−X−基が糖残基のアノマー位に存在するか、ある
いはリンカーを介してそのアノマー炭素と結合している化合物が好ましい。
【００３２】
好ましい炭水化物部分には、単糖類、オリゴ糖類および多糖類が挙げられ、天然の糖タンパク質にあるか、または生体系に存在するすべての糖部分が含まれる。好ましくは保護されていてもよいグリコシル誘導体またはグリコシド誘導体であり、例えば保護されてていもよいグルコシル、グルコシド、ガラクトシルおよびガラクトシド誘導体である。グリコシルおよびグリコシドは、αおよびβの基を含んでいる。好ましい炭水化物部分には、グルコース、ガラクトース、フコース、 ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、 シアル酸、マンノース、ならびに少なくとも１個のグルコース、ガラクトース、フコース、ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、 シアル酸および/またはマンノースの残基を含むオリゴ糖または多糖類が挙げられる。
【００３３】
炭水化物の官能基は、いずれも当該技術分野において知られている保護基を使用して必要に応じ保護してもよい（ 例えばグリーンら "有機合成における保護基"、 第2版、 Wiley、 New York、1991年。その開示は参照によってここに取り込まれる。）。炭水化物部
分の任意の−OH基のための適切な保護基として、アセチル（Ａｃ）、ベンジル（Ｂｎ）、ピボリル（ｐｉｖ）、シリル（例えば、tert-ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳｉ）お
よびtert-ブチルジフェニルシリル（ＴＭＤＰＳｉ））、アセタール、ケタールおよびメ
トキシメチル（ＭＯＭ）が挙げられる。該保護基は、炭水化物部分がアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質へ付着する前後に取り除くことができる。
【００３４】
好ましい炭水化物部分には、Ｇｌｃ（Ａｃ）4β−、Ｇｌｃ（Ｂｎ）4β−、Ｇａｌ（Ａｃ）4β−、Ｇａｌ（Ｂｎ）4β−、Ｇｌｃ（Ａｃ）4α（１，４）Ｇｌｃ（Ａｃ）3α（１，４）Ｇｌｃ（Ａｃ）4β−、β−Ｇｌｃ、β−Ｇａｌ、α−Ｍａｎ、α−Ｍａｎ（Ａｃ
）4、Ｍａｎ（１，６）Ｍａｎα−、Ｍａｎ（１−６）Ｍａｎ（１−３）Ｍａｎα−、（
Ａｃ）4Ｍａｎ（１−６）（Ａｃ）4Ｍａｎ（１−３）（Ａｃ）2Ｍａｎα−、−Ｅｔ−β
−Ｇａｌ、−Ｅｔ−β−Ｇｌｃ、Ｅｔ−α−Ｇｌｃ、−Ｅｔ−α−Ｍａｎ、−Ｅｔ−Ｌａｃ、−β−Ｇｌｃ（Ａｃ）2、−β−Ｇｌｃ（Ａｃ）3、−Ｅｔ−α−Ｇｌｃ（Ａｃ）2、
−Ｅｔ−α−Ｇｌｃ（Ａｃ）3、−Ｅｔ−α−Ｇｌｃ（Ａｃ）4、−Ｅｔ−β−Ｇｌｃ（Ａｃ）2、−Ｅｔ−β−Ｇｌｃ（Ａｃ）3、−Ｅｔ−β−Ｇｌｃ（Ａｃ）4、−Ｅｔ−α−Ｍ
ａｎ（Ａｃ）3、−Ｅｔ−α−Ｍａｎ（Ａｃ）4、−Ｅｔ−β−Ｇａｌ（Ａｃ）3、−Ｅｔ
−β−Ｇａｌ（Ａｃ）4、−Ｅｔ−Ｌａｃ（Ａｃ）5、−Ｅｔ−Ｌａｃ（Ａｃ）6、−Ｅｔ
−Ｌａｃ（Ａｃ）7、またはその脱保護された等価物である。
【００３５】
自然界の糖類から生じる炭水化物部分を構成する好ましい単糖の単位は、 互いに天然
の鏡像体（enantiomeric form）となり得て、これらはＤ−型（例えばＤ−グルコースま
たはＤ−ガラクトース）か、あるいはＬ−型（例えばＬ−ラムノースまたはＬ−フコース）のいずれでもよい。いずれのアノマー結合はα−またはβ−の結合である。
【００３６】
第1の方法または第2の方法で用いるチオール基を含む化合物は、少なくとも１個のチオール基を含む任意の有機化合物である。チオール基は第１級、第２級、または第３級であってもよい。該化合物は芳香族または脂肪族であってもよい。もし該化合物が１個より多いチオール基を含む場合、このような各々のチオール基部分でジスルフィド結合が形成される可能性がある。 
【００３７】
前記化合物は、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質が好ましい。本明細書では、ペプチドは、互いにアミド結合を介して結合した少なくとも2個のアミノ酸残基を有している
。タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸に含まれるアミノ酸は、α‐アミノ酸であることが望ましい。アミノ酸はＤ−型でもＬ−型でもよいが、好ましくはL−型である。そうし
たアミノ酸、 ペプチドまたはタンパク質は、チオール基を含む天然のアミノ酸、 ペプチドまたはタンパク質でもよく、例えば１個以上のシステイン残基の存在によるものが挙げられる。あるいはそうしたアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質が、前駆体であってチオールを含まないアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の化学修飾によって調製されてもよい。あるいはチオール基を含むペプチドまたはタンパク質は、部位特異的突然変異によってシステイン残基を導入して調製し得る。部位特異的突然変異は当該技術分野において公知の技術である。（ 例えば WO00/01712 および J. Sambrookら、 分子クローニング：研究室マニュアル第3版、 Cold Springs Harbour Laboratory Press、2001年、参照。その
開示は参照によってここに取り込まれる。）
【００３８】
好ましいタンパク質として酵素を含み、その特異性は、本発明の方法および試薬を用いてグリコシル化の制御をすることによって修飾されるであろう。他の好ましいタンパク質には、治療用のタンパク質、すなわち血清アルブミンおよび血液タンパク質、ホルモン、インターフェロン、レセプター、抗体、インターロイキンおよびエリスロポエチンが挙げられる。
【００３９】
式Iの化合物は通常チオール選択性であり、このために通常、チオール基を含む有機化
合物に他の官能基が存在しても、そのことがその反応を妨げないことが見出されている。しかしながら他の官能基は、いずれも必要に応じて反応条件下で安定である、当該技術分野で公知の保護基を用いて保護してもよい。
【００４０】
第1の方法または第2の方法におけるジスルフィド結合の形成反応は、一般には中性または塩基性（ｐＨ約７〜約９．５）の緩衝液中にて行われ、わずかに塩基性（ｐＨ約８〜約９）の緩衝液が特に好ましい。適した緩衝液は、ＨＥＰＥＳ、ＣＨＥＳ、ＭＥＳおよびトリスである。チオール基含有化合物がタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸である場合、このようなｐＨであれば、反応中に望ましくない変性は僅かであるかまたはまったく起こらない。同様に温度に敏感な化合物に対し、重大な損害を避けるために反応温度を選択しなければならない。例えば、タンパク質またはペプチドとの反応では、変性を避けるために室温またはそれより低い温度で行うのが好ましい。水性の溶媒系または有機溶媒系を用いることができるが、タンパク質、 アミノ酸またはペプチドを確実に溶解するには水性
の溶媒系が好ましい。その反応は一般的にかなり迅速であり、例えばしばしば1時間未満
で起こる。
【００４１】
一般に式Ｉの化合物は過剰に用いられ、例えばチオール基含有化合物に関して１０〜２０当量用いられる。これに対して、グリコ−ＭＴＳ試薬試薬を用いる反応では、多くの場合、およそ３０当量の使用が必要となり、それは試薬費用に加わる。
【００４２】
式Ｉの化合物においてＲが炭水化物部分であり、ＸがＳＯ2であり、Ｒ1がフェニル基である場合、対応するグリコ-MTS化合物の場合よりも塩基性条件下で安定であることが見出されている。それゆえ未反応または過剰である式Ｉの化合物は多くの場合、該反応から再利用のために回収することができる。このことは、Ｒが炭水化物部分を表している場合、そうした化合物が比較的高価でありおよび／または調製に多くの時間を要するために特に好都合である。さらに式Ｉの化合物がフェニルチオスルフォネート化合物である場合、対応するＭＴＳ化合物よりも一般に安価であり容易に調製できる。
【００４３】
式Ｉの化合物はいくつかの異なる方法で調製することができる。ＸがＳＯ2を表わす化
合物である場合、式IIの化合物と式IIIの化合物とを反応させることにより調製してもよ
い。
【００４４】
Ｍ（ＳＳＯ2Ｒ1）k            II
（式中、M は金属であり、例えばＬｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｃｓ、Ｃａ、Ｍｇ、ＺｎまたはＡｌを示すが、Ｎａ、Ｋが好ましい。ｋは１〜３の整数である。）
Ｒ−Ｌ                      III
（式中、Ｒは式Ｉについて定義されたとおりであり、Ｌは脱離基である。）
脱離基Ｌは、生成したアニオンL−が、何ら甚だしく反応を妨げることがない、例えば
生成物と反応することにより妨げられることはない限り使用することができる。好ましい脱離基として、Ｌはトルエンスルフォネート（トシレート）、メタンスルフォネート（メシレート）およびトリフルオロメタンスルフォネート（トリフレート）のようなハロゲンおよびスルフォネートを含むものである。特にクロロまたはブロモである場合が好ましい。
【００４５】
式IIIの化合物は市販のもの、または当該技術分野における公知の方法により調製する
ことができ、例えば一般にはハロゲン化糖、より好ましくは１−ハロゲン糖を生成する方法がある。式IIIの化合物はハロゲン化グリコシル（glycosyl halide）が好ましい。式IIIの化合物として適したものは、例えば一般的に下記に示されるようなグルコースまたは
ガラクトースに基づくものが挙げられる。
【００４６】
【化１】
2007527376.tif 000005
【００４７】
（式中、各Ｒ5 は独立にＨまたは糖部分であり、または例えばＡｃまたはＢｎのような適切な保護基であるが、各Ｒ5 はＨが好ましい。Ｒ3とＲ4は一方がＨであり、他方はＯＨ、Ｏ−保護基またはＯ−糖部分であるが、ＨまたはＯ−糖部分であるのが好ましい。ｔは１〜１０の整数であり、好ましくは１〜６、より好ましくは２または３である。）
【００４８】
式IIIの化合物が可溶である溶媒系であればいかなる溶媒系で反応を進行させることが
できる。式IIの化合物もまた少なくとも部分的に可溶である溶媒系が好ましい。適切な溶媒としてエタノール、メタノールのようなアルコールまたはＮ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）およびアセトニトリルが挙げられる。中でもアセトニトリルが好ましい。式IIの化合物は、スキーム４に示すように硫黄と対応するスルフィニート（sulfinite）
塩（式VII）との反応によって調製することができる。
【００４９】
Ｍ（ＳＯ2Ｒ1）k＋Ｓ→Ｍ（ＳＳＯ2Ｒ1）k
VII                  II
スキーム４
【００５０】
結晶である式IIの化合物は、精製、特に大規模な精製を容易とするためには望ましい。
式VIIのスルフィニート（sulfinite）塩は市販のもの（例えばナトリウムベンゼンスルフィニート）、または当該技術分野において公知の方法により調製することができるもの（例えばJP 61205249, および M. UchinoらChemical & Pharmaceutical  Bulletin, 1978, 26 (6), 1837-45参照。その開示は参照によってここに取り込まれる。）である。
【００５１】
例えば対応するチオレート塩Ｒ1Ｓ−は、リチウムメチルのような適切な塩基を使用し
て、対応するチオール化合物Ｒ1ＳＨの脱プロトン化によって生成することができる。そ
のチオレート塩は、次いで適切な酸化剤、例えば２−（フェニルスルフォニル）−３−フェニルオキサジリジン（"Davis試薬", Sandrinelliら、 Organic  Letters  (1999), 1 (8), 1177-1180, その開示は参照によってここに取り込まれる。）を用いて対応するスル
フィニート塩に酸化することができる。
【００５２】
もう一つの方法としてＸがＳＯ2である式Ｉの化合物は、スキーム５に示すように、銀
イオンの存在下でスルフィニートアニオンＲ1ＳＯ2-と式VIIIのジスルフィドとを反応さ
せることによって調製することができる。
【００５３】
【数４】
2007527376.tif 000006
【００５４】
式VIIIのジスルフィド化合物は、市販のものが得られ、または当該技術分野において公知の方法により調製できるものである。
XがＳｅである式Ｉの化合物は、式Ｖの化合物の反応によって生成できる。
【００５５】
Ｒ−ＳＨ        Ｖ
式中、Ｒは式Ｉの化合物に定義されたとおりであり、式VIａまたは式VIｂの化合物である。
【００５６】
Ｒ1ＳｅＬ2              Ｒ1Ｓｅ（ＯＨ）2
VIａ                      VIｂ
（式中、Ｒ1は式Ｉによって定義されたとおりで、Ｌ2は脱離基であり、例えばＯＨ、Ｂｒ、Ｃｌ、ＣＮまたはＩが挙げられるが、Ｂｒが好ましい。）
該反応は無水ジクロロメタン中で行なわれ、次いでトリエチルアミンを加えて抑止させることができる。式VIａの好ましい化合物はＰｈＳｅＢｒであり、式VIｂの好ましい化合物はＰｈＳｅ（ＯＨ）2である。
【００５７】
式VIの化合物は、市販のもの（例えばＰｈＳｅＢｒ、ＰｈＳｅＣｌ、ＰｈＳｅＣＮ、２−ニトロフェニルセレノシアネート）であり、または当該技術分野における公知の方法により調製できるものである。例えばＭｅＳｅＢｒは、次の方法を参照することにより生成される；Hope, Eric G.; Kemmitt, Tim; および Levason, William, in Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 2：Physical Organic Chemistry (1972-1999) (1987), (4), 487-90。その開示は参照によってここに取り込まれる。）
少なくとも１つのチオール基を含む有機化合物（式Ｖの化合物を含む）は市販のものでもよく、または当該技術分野における公知の方法により調製してもよい。例えばそれらの方法は一般にチオール化合物、特にチオ−糖の調製方法である。
【００５８】
例えばチオ糖は、対応するハロ糖から調製してもよい。ハロ糖とチオウレアとを処理して対応するイソチオウロニウム塩を与えることによる(W. A. Bonner, J. E. Kahn, J. Am. Crew. Soc. 1951，73)。続いてナトリウムメタビスルフィートを用いる穏やかな加水分解により対応するチオールが生じる。もし必要であれば、チオ糖を合成する間、適切な保護基を用いることができる。式Ｖの化合物におけるＲが炭水化物部分である場合、チオール基は該部分のどの部分であってもよい。好ましくは糖のアノマー位にあるか、またはリンカーを介してアノマー炭素に結合してもよい。
グルコースおよびガラクトースに基づく式Ｖの化合物の適切例は、一般には下記のように示される。
【００５９】
【化２】
2007527376.tif 000007
【００６０】
（図中、各Ｒ5 は独立にＨまたは糖部分であり、または例えばＡｃまたはＢｎのような適切な保護基であるが、各Ｒ5 はＨが好ましい。Ｒ3とＲ4の一方がＨであり、他方はＯＨ、Ｏ−保護基またはＯ−糖部分であるが、好ましくはＨまたはＯ−糖部分である。ｒは２〜１０の整数であり、好ましくは２〜６、より好ましくは２または３である。 ）
本発明の第４の方法において式Ｖの化合物は、チオールを含む化合物として用いるのにも最適である。
【００６１】
式Ｖの化合物と式VIの化合物との反応において、式Ｖの化合物の他の官能基はいずれも保護されなくてもよいが、当該技術分野で公知の保護基によって保護することもできる。
第３の方法または第４の方法により、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸中の少なくとも１個のチオール基をセレネニルスルフィド基へ変換することは高度に選択的である。さらにセレネニルスルフィド基とチオールを含む有機化合物との反応は、高度に部位選択的である。そのため、本発明の方法を実施す際、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸または他のチオールを含む有機化合物にある他の官能基を保護することは通常、必要ではない。このことは、生成物にその後の脱保護工程を実施する必要性を回避できるためにかなり好都合である。
【００６２】
タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸が1個を超えるチオール基を含む場合、このよう
な各チオール基は対応するセレネニルスルフィド基に変換される可能性がある。前記セレネニツスルフィド基の各々はチオール基を含む有機化合物と反応させてもよく、ジスルフィド結合を介してタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸の複数の部位で該有機化合物を結合する可能性がある。したがって本発明の方法は、複数部位でタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸を化学修飾する都合のよい方法を提供する。特に本発明の方法は、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸の複数部位でのグリコシル化を可能にする。
【００６３】
第3または第4の方法においてタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸のチオール基のセレネニルスルフィド基への変換は、式ＸａまたはＸｂの化合物と該タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸とを反応させることにより都合よく実施できる。
【００６４】
Ｒ2−Ｓｅ−Ｌ2      または        Ｒ2−Ｓｅ（ＯＨ）2
Ｘａ                              Ｘｂ
（式中、Ｌは脱離基であり、例えばＯＨ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣｌまたはＩであり、Ｂｒが好ましい。Ｒ2は、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいフェニル基、置
換されていてもよいベンジル基、置換されていてもよいピリジル基、置換されていてもよ
いナフチル基である。好ましいＲ2はフェニル基であり、式Ｘａの好ましい化合物はＰｈ
ＳｅＢｒであり、式Ｘｂの好ましい化合物はＰｈＳｅ（ＯＨ）2である。
【００６５】
Ｒ2が置換されていてもよい部分を表す場合、適した置換基としてはチオール基を含む
タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸との反応を妨げないすべての置換基を含むものであり、好ましくはタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸のその後の反応、例えばチオールを含む有機化合物との反応を妨げない置換基である。適した置換基としては、−ＮＯ2、−
ＳＯ3Ｈ、 −ＣＯ2Ｈ、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨおよび−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＭｅが挙げら
れ、ｎは好ましくは１〜１００であり、より好ましくは１〜２０であり、さらに好ましくは１〜１０の整数である。Ｒ2基は独立に１−５の置換基、好ましくは１または２の置換
基で独立に置換されることができる。
【００６６】
Ｒ2基は必要に応じて、固体保持体に固定化され、またはその一部を形成する。例えば
、 式Ｘａまたは式Ｘｂの化合物は、以下に示すようなポリスチレン樹脂のような樹脂か
ら生じる。
【００６７】
【化３】
2007527376.tif 000008
【００６８】
式Ｘａおよび式Ｘｂの化合物は、前記の化合物VIａおよび化合物VIｂのように、市販のものまたは当該技術分野における公知の方法により調製することができるものである。
各チオール基を対応するセレネニルスルフィド基に確実に変換させるためには、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸中のチオール基当り、少なくとも1モル当量の式Ｘａまた
は式Ｘｂの化合物を用いなければならない。該反応は、緩衝液（例えばＭＥＳ、ｐＨ９．５）の存在下、水性溶媒（水とアセトニトリルの混合物のような）中において進行させるのが好ましい。該反応のｐＨおよび温度は、タンパク質またはペプチドの望ましくない変性を避けるように選択しなければならない。該反応はわずかに塩基性のｐH（約ｐＨ８〜
約ｐH９）において、室温またはそれ以下の温度で進行させるのが好ましい。
【００６９】
チオール基を含む有機化合物は、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸と結合するのに適当であるすべての有機化合物であり、そのチオール基の硫黄原子は、求核試薬として作用し、セレネニルスルフィド基と反応することができる。天然の有機化合物であれば特に制限はない。例えば、チオール基は第一級、第二級または第三級であってもよい。該化合物は芳香族または脂肪族でもよい。例えば、アルキル、アルケニル（例えばファルネシル）またはアルキニルのチオール基が挙げられる。好ましくは、該化合物がチオール基を１つだけ含有していることである。
【００７０】
タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸と結合するのに適した有機部分は、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸の物理的もしくは化学的な諸性質を修飾するのに有用な任意の置換基を含有している。適した部分には、タンパク質、 ペプチドまたはアミノ酸の安定性
、加工処理または溶解性の助けとなる標識（例えば蛍光標識）または基が含まれる。そうした有機化合物は、本発明の方法を用いてジスフィルド結合を介して一つのタンパク質、
ペプチドまたはアミノ酸と他のタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸とを結合させる可
能性を与えることができる第二のタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸であってもよい。
【００７１】
好ましくは少なくとも１個のチオール基を含む有機化合物が、ファルネシル誘導体であるか、または前述した炭水化物部分であり、これらは必要に応じリンカーによってチオール基（−Ｓ−Ｈ−）に結合されている。そのリンカーは炭水化物部分と−ＳＨ基との間に１〜１０原子を含むことができる。例えば、アルキレン基（例えば−（ＣＨ2）t、ｔは１〜１０である）、またはアルケニレン基（例えば−（ＣＨ2）ＣＨ＝ＣＨ−、または−Ｃ
Ｈ2ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ−）が挙げられる。チオール基を含む化合物は、チオール基が糖残基のアノマー位にあるか、またはリンカーによりアノマー炭素と結合する化合物が好ましい。
【００７２】
炭水化物部分にあるいずれの官能基は、前述のとおり、当該技術分野で公知の保護基を用いて保護することもできる。その保護基は炭水化物部分がアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質と結合する前または後において、取り除くことができる。これらは、結合後の不必要な脱保護工程を避けるためにも、セレネニルスルフィド化合物と反応させる前に取り除くのが好ましい。本発明のグリコシル化方法のさらなる有利な点は、保護されていない炭水化物部分がアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質と結合することを可能にする点である。
【００７３】
第４の方法によりセレネニルスルフィド基とチオール基を含む有機化合物との反応（すなわちジスフィルド結合形成反応）は、一般に中性または塩基性（例えば約ｐＨ７〜約ｐH９．５）での緩衝液の存在下で実施されるが、僅かに塩基性（例えば約ｐＨ８〜約ｐH９）が好ましい。適した緩衝液には、ＨＥＰＥＳ、ＣＨＥＳ、ＭＥＳまたはトリスが挙げられる。ｐHは反応中にタンパク質またはペプチドの望まない変性がほとんどないまたは全
くないｐＨでなければならない。同様に、温度に敏感な化合物の重大な損害を避けるように反応温度を選択しなければならない。 例えば、 タンパク質またはペプチドの反応は、これらの変性を避けるためには室温またはそれ以下の温度で進行させるのが好ましい。水性溶媒系または有機溶媒系を用いることができる。水性溶媒の系が好ましく、水性溶媒系はタンパク質, アミノ酸 またはペプチドの溶解を確実にすることができるからである。
水性溶媒系がまた、有機化合物として保護されていない炭水化物化合物の使用を可能とすることからも好ましい。該反応は一般に非常に早く、しばしば１時間未満である。
【００７４】
一般に少なくとも１個のチオール基を含む有機化合物は過剰に用いられ、例えばタンパク質、アミノ酸またはペプチドを基準として１０〜２０当量用いられる。しかし、場合によっては１モル当量の少なさで用いることができる。
【００７５】
炭水化物の化合物を大量に得る場合、高価であり、多くの時間を要する。そのため、少なくとも１つのチオール基を含む有機化合物が炭水化物の化合物である場合、節約のためにも最低数の当量だけ用いるのが好ましい。タンパク質グリコシル化方法についての先行技術の方法では、しばしば炭水化物化合物の大量過剰の使用を要する。例えば、１０００当量のオーダーである (B. G. Davis, Curr.Ope71. Biotechnol. 2003, 14, 379)。 したがって、本発明による方法では、先行技術方法よりもグリコシル化合物のより少量当量の使用を可能とすることであるという有利な点がある。
本発明をさらに次の実施例により説明するが、これにより限定されるものではない。
【００７６】
実験の一般的事項
融点は、Kofler加熱ブロックで測定し、補正はしなかった。プロトン核磁気共鳴(δH)
スペクトルの400 MHzスペクトルは、COSYを利用して帰属した。炭素核磁気共鳴(δc)スペクトルは、HMQCを使用して帰属した。多重性は、DEPTシーケンスを使用して帰属した。化
学シフトはすべて、内部標準として残留溶媒を使用して、ppmでδスケール上に引用した
。
【００７７】
赤外スペクトルの吸収極大は、波数(cm-l)で記録し、s(強)および br(広)として分類した。低分解能マススペクトルは、イオン化法(ESI)または化学イオン化(MH3, CI)技術を使用して測定した。
【００７８】
高分解能マススペクトルは、化学イオン化(MH3,CI)技術を使用して、あるいはエレクトロスプレーイオン化法(ESI)またはフィールドイオン化法(FI+)を使用して測定した。M/z
値はダルトン（Dalton）で示され、その後に括弧内にそれらのパーセント存在率（percentage abundance）を付した。旋光度は、1 dmの光路長で旋光計により測定した。濃度は、g/100 mLで与えられる。
【００７９】
薄層クロマトグラフィー(t.l.c)は、メルクKieselgel 60F254、背面がガラスのプレコ
ートプレート上で実施した。プレートの可視化は、紫外線ランプ（λmax＝254または365nm)および/またはモリブデン酸アンモニウム(5%、2Ｍ硫酸中)または硫酸(5% EtOH中)を用
いて行なった。フラッシュ（Flash）カラムクロマトグラフィーは、Sorbsil C60 40/60 
シリカを用いて行なった。ジクロロメタン(DCM)は、水素化カルシウムから蒸留した。ア
セトンは、無水硫酸カルシウムから蒸留した。残りの無水溶媒は、Fluka社から購入した
。「ペトロール（Petrol）」とは、40〜60℃範囲で蒸留される石油エーテルの画分をいう。
【００８０】
タンパク質の質量分析スペクトロメトリー:液体クロマトグラフィー/マススペクトロメトリーは、Phenomenex Jupiter C5 カラム(150 x 2.1 mm x 5 μm)を使用するWaters Alliance 2790 HPLCに接続させたMicromass LCT(ESI-TOF-MS)で行なった。水(溶媒Ａ)およびアセトニトリル(溶媒Ｂ)は、それぞれ0.5% 蟻酸を含み、流速が毎分0.2mlである移動相として使用した。濃度勾配は次のように設計された: 95%Ａ(3分アイソクラチック（isocratic）)から100%Ｂへ、次いで16分後に2分間、isocratic。LCTのエレクトロスプレー（electrospray）電源は、毛細管電圧、3 kVおよびコーン（cone）電圧30 Vで作動させた。窒素をネブライザーおよび溶媒除去ガスとして毎時400リットルの全体流速で使用した。ミオ
グロビン（ウマ心臓）を検量の標準として、ならびに系の感度を試験するために用いた。
【００８１】
実施例１：（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−D−グルコピラノシル）−１
−イソチオウロニウムブロミド
【００８２】
【化４】
2007527376.tif 000009
【００８３】
２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−D−グルコピラノシルブロミド(11.0 g, 26. 4 mmol)とチオ尿素(3.10 g, 41.9 mmol)をアルゴン雰囲気下で無水アセトン(30 mL)
に溶解させ、６０℃まで加熱した。２０分後、白色固体が沈殿した。該沈殿物を濾過により取り除き、濾液を還流し、白色固体が沈殿しなくなるまでこの処理を繰り返した。白色がかった結晶が結合し、アセトン／ペトロールから再結晶することにより、標記の化合物(11.4 g, 76%)が白色結晶として得られた：融点194-196℃ [Lit. 191°C (H. Beyer, U. Schultz, Chem. Ber. 1954, 87, 78)] ; [α] D25-5. 6 (c, 1. 0 in H2O) [Lit. [α] D
25-7. 6 (c, 1.4 in H2O) (W. A. Bonner, J. E. Kahn, J Am Chem Soc, 1951, 73, 2241) ]; δH (400 MHz, DMSO-d6) 1.97, 2.00, 2.02, 2.06 (12H, 4 x s, 4 x CH3), 4.06-4.25 (3H, m, H-5, H-6, H-6'), 5.07-5.12 (2H, m, H-2, H-4), 5.31 (1H, at, J9. 5 Hz, H-3), 5.77 (1H, d, J1,2 9.9 Hz, H-1), 9.13 (2H, brs, NH2), 9.29 (2H, brs, NH2)。
【００８４】
実施例２：１−チオ−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノース
【００８５】
【化５】
2007527376.tif 000010
【００８６】
（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−１−イソチオウロニウムブロミド(9.0 g, 18.8 mmol)とＮａ2Ｓ2Ｏ5(4.93 g, 26.0 mmol)をDCM (150
mL) と水 (70 mL)との攪拌された混合物に加えた。該混合物をアルゴン雰囲気下、加熱
還流した。 1.5 時間後、室温(RT)まで冷却し、相を分離させた。水溶性相はDCM (3 x 50
mL)で再抽出した。これらの混合有機相を、水(50 mL)で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、濾過し、真空中で溶媒を除去することにより、標記の化合物(6.14 g, 90%)が白色固体とし
て得られた：融点112-114℃ [Lit. 113-114°C (R. J. Ferrier, R. H. Furneaux, Carbohydr. Res. 1977, 57, 73) ]; [α] D24 +6. 3 (c, 1. 2 in CHCl3) [Lit. [α] D20 +5.
0 (c, 1.1 in CHCl3) (R. J. Ferrer, R. H. Furneaux, Carbohydr. Res. 1977, 57, 73)]; δH (400 MHz, CDCl3) 1.99, 2.00, 2.05, 2.06 (12H, 4 xs, 4xCH3), 2.30 (1H, d,
J1,SH, 10.2 Hz, SH), 3.71 (1H, ddd, J4, 5 10.0 Hz, J5,6 2.4 Hz, J5,6, 4. 7 Hz, H-5), 4. 10 (1H, dd, J6,6, 12.3 Hz, H-6), 4. 22 (1H, dd, H-6'), 4.53 (1H, at, J9.9 Hz, H-1), 4. 95 (1H, at, J9.5 Hz, H-2), 5. 08 (1H, at, J 9. 8 Hz, H-4), 5.17 (1H, at, J 9. 4 Hz, H-3)。
【００８７】
実施例３：（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−１−イソチオウロニウムブロミド
【００８８】
【化６】
2007527376.tif 000011
【００８９】
２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−β−ガラクトピラノシルブロミド (5.4 g, 13.0 mmol)とチオウレア (1.25 g, 16.8 mmol) をアルゴン雰囲気下で無水アセトン (40 mL) に溶解させ、60°Cまで加熱した。1時間後、室温まで冷却し、生じた残留物を濾
過して分離し、さらにアセトン／ペトロールから再結晶させることにより、標記の化合物(4.6 g, 70%, 2 段階)が白色結晶固体として得られた：融点134-137℃ [Lit. 170°C from isopropanol (W. A. Bonner, J. E. Kahn, J Am Chem Soc 1951, 73, 2241)] ; [α] D25 +40. 4 (c, 1.0 in H2O) [Lit. [α] D25 +16. 0 (c, 1.6 in EtOH, (W. A. Bonner, 
J. E. Kahn, J Am Chem Soc 1951,73, 2241)) ; δH (500 MHz, DMSO-d6) 1.96, 2.02, 2.09, 2.15 (12H, 4 xs, 4xCH3) 4.06-4. 13 (2H, m, H-6, H-6'), 4.45 (1H, t, J6. 2 Hz, H-5), 5.12 (1H, at, J9.9 Hz, H-2), 5.24 (1H, dd, J2, 3 10.0 Hz, J3,4 3. 6 Hz,
H-3), 5. 39 (1H, d, J3,4 3.1 Hz, H-4), 5.71 (1H, d, J1,2 10.2 Hz, H-1), 9.12, 9.36 (2 x 2H, 2 x brs, 2 x NH2)。
【００９０】
実施例４：１−チオ−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−３−Ｄ−ガラクトピラノース
【００９１】
【化７】
2007527376.tif 000012
【００９２】
（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−３−Ｄ−ガラクトピラノシル）−１−イソチオウロニウムブロミド (4.4 g, 8.8 mmol) とＮａ2Ｓ2Ｏ5(2.02 g, 10.6 mmol)をDCM (60 mL)と水 (30 mL)との攪拌された混合物に加えた。該混合物をアルゴン雰囲気下、加熱還流した。2.5 時間後、RTまで冷却し、相を分離させた。水溶性相はDCM (3 x 50 mL)で
再抽出した。 これらの混合有機相を、水(100 mL)で洗浄し、塩水 (100 mL)につけ、MgS04で乾燥し、濾過し、真空中で溶媒を除去することにより、標題の化合物 (2.65 g, 81%)
が白色固体として得られた：融点83−84℃[Lit. 86. 5-88°C (J. Frgala, M. Cerny, J.
Stanek, Collect. Czech. Chem. Commun. 1975, 40, 1411) ];
[α] D24+30. 1 (c, 1. 0 in CHCl3) [Lit. [α] D19 +32.0 (c, 3.5 in CHCl3) (J. Frgala, M. Cerny, J. Stanek, Collect. Czech. Chem. Commun. 1975, 40, 1411) ];δH (400 MHz, CDCl3) 1.99, 2.06, 2.10, 2.17 (12H, 4 xs, 4 x CH3), 2. 38 (1H, d, J1,SH 10.3 Hz, SH), 3.95 (1H, dt, J4, 5 1. 2 Hz, J5,6 6. 6 Hz, J5,6' 6.6 Hz, H-5), 4.09-4. 14 (2H, m, H-6, H-6'), 4.53 (1H, at, J9,9 Hz, H-1), 5.02 (1H, dd, J2,3 10. 1, J3, 4 3.4 Hz, H-3), 5.19 (1H, at, J 10.0 Hz, H-2), 5.44 (1H, at, dd, J3,4 3.7
Hz, J4,5 1.2 Hz, H-4)。
【００９３】
実施例５：（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−１−イソチオウロニウムクロリド
【００９４】
【化８】
2007527376.tif 000013
【００９５】
３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシルクロリド(3.0 g, 8.2 mmol) とチオ尿素 (1.21 g, 14.6 mmol)をアルゴン雰囲気下で無水アセトン(25 mL)に溶解させ、６０℃まで加熱した。2時間後、白色固体が沈殿した。該沈殿物を濾過により取り除き、濾液を還流し、白色固体が沈殿しなくなるまでこの処理を繰り返した。白色がかった結晶が結合し、アセトン／ペトロールから再結晶することにより、標記の化合物(2.19 g9 61%)が白色結晶として得られた：融点134−137℃ [L
it. 179-181℃from EtOH (D. Horton, M. L. Wolfrom, J. Org. Chem. 1962, 27, 1794)];
[α] D25-25. 2 (c, 1. 0 in H2O) [Lit. [α] D25-29. 3 (c, 1. 1 in MeOH) (D. Horton, M. L. Wolfrom, J. Org. Chem. 1962, 27,1794)] ; δH (400 MHz, DMSO-d6) 1. 80 (3H, s, NHCOCH3), 1.94, 1. 98, 2. 08 (9H, 3 xs, 3 x CH3), 4.05 (1H, dd, J5,6 2.4 Hz, J6,6, 12.4 Hz, H-6), 4.17 (1H, dd, J5,6, 5.0 Hz, J6,6, 12.3 Hz, H-6'), 4. 26
(1H, ddd, J4,5 10.2 Hz, J5,6 2. 3 Hz, J5,6, 4. 7 Hz, H-5), 4. 93 (1H, at, J9.9Hz, H-4), 5.12 (1H, at, J9.9 Hz, H-3), 5.73 (1H, d, J1,2 10.4 Hz, H-1), 8.48 (1H,
d, J4.7 Hz, NHAc), 9.13 (2H, brs, NH2), 9.29 (2H, brs, NH2)。
【００９６】
実施例６：１−チオ−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース
【００９７】
【化９】
2007527376.tif 000014
【００９８】
（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−１−イソチオウロニウムクロリド(1.75 g, 39.8 mmol)とＮａ2Ｓ2Ｏ5 (0.91 g, 4.8 mmol) をDCM (30 mL)と水 (15 mL)との攪拌された混合物に加えた。該混合
物をアルゴン雰囲気下において加熱還流した。2時間後、RTまで冷却し、相を分離させた
。 水溶性相はDCM (2 x 50 mL)で再抽出した。これらの混合有機相を、水 (50 mL)で洗浄し、塩水(50 mL)につけ、MgS04で乾燥し、真空中で溶媒を除去した。EtOAc／ペトロール
から再結晶することにより、標記の化合物(1.00 g, 68%)が白色固体として得られた：融
点165-167℃ [Lit. 167-168°C (W. M. zu Reckendorf, W. A. Bonner, J. Org. Chem. 1961, 26, 4596) ];
[α] D25 -24.8 (c, 1.0 in CHCl3) [Lit. [α] D25-14. 5 (c, 0.9 in CHC13) (W. M. zu Reckendorf, W. A. Bonner, J. Org. Chem. 1961, 26, 4596) ];δH (400 MHz, CDC13)
1.99, 2.03, 2.05, 2.10 (12H, 4 xs, 4 x CH3), 2.57 (1H, d, J1,SH 9.2 Hz, SH), 3.67 (1H, ddd, J4,5 9.7 Hz, J5,6 4. 8 Hz, J5,6' 2. 3 Hz, H-5), 4.09-4. 17 (2H, m, H-2, H-3), 4.24 (1H dd, J5,6 4. 8 Hz, J6,6'12. 4 Hz, H-6), 4.59 (1H, at, J 9.8 Hz, H-1), 5.06-5.15 (2H, m, H-4, H-6'), 5.72 (1H, d, J 9. 2 Hz, NH)。
【００９９】
実施例７：１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノース
【０１００】
【化１０】
2007527376.tif 000015
【０１０１】
１−チオ−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノース (3.00 g, 7.3 mmol) とNaOMe (40 mg, 0.73 mmol)を攪拌されたメタノール (40 mol)溶液に
加えた。２時間後薄層クロマトグラフィー(EtOAc：ペトロール １：１)は、出発原料(Rf0. 5)が完全に消費されるとともに生成物(Rf 0.0) が得られたことを示した。該反応物はD
owex(R)-50イオン交換樹脂を加えることによって中和され、この後に濾過し、真空中で濃縮した。MeOH/EtOAcからの再結晶により、標記の化合物(1.41 g, 98%)が下記のような白
色結晶固体として得られた：融点100-102℃; 
[α] D22+47.6 (c, 1.0 in MeOH ;δH (400 MHz, CD3OD), 2. 62 (1H, d, J1,SH 8.3 Hz,
SH), 3.47- 3.49 (2H, m, H-2, H-3), 3.57 (1H, at, J 5.9 Hz, H-5), 3. 68 (1H, dd,
J5,6 5. 0 Hz, J6,6, 11.4 Hz, H-6), 3.75 (1H, dd, J5,6' 6. 9 Hz, J6,6, 11. 5 Hz,
H-6'), 3.91 (1H, bs, H-4), 4.37 (1H, bd, J 7.7 Hz, H-1) ; δc (100 MHz, CD3OD),
61.6 (t, C-6), 69.6 (d, C-4), 74.4, 74. 8 (2 xd, C-2, C-3), 80.1 (d, C-5), 81. 4 (d, C-1) ; m/z (ES-) 196 (100%, M-H+) ; m/z HRMS (ES-) Calcd. for C6H12O5S (M-H+) 195.0327. Found 195.0323 。
【０１０２】
実施例８：１−チオ−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース
【０１０３】
【化１１】
2007527376.tif 000016
【０１０４】
３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−アセチルアミノ−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシルチオール (400 mg, 0.98 mmol) とナトリウムメトキシド (18 mg, 0.3 mmol)を攪拌されたメタノール(lOml)溶液に加えた。３０分後、薄層クロマトグラフィー (酢
酸エチル)は、出発原料(Rf 0. 2)が完全に消費されるとともに生成物(Rf 0. 0) が得られたことを示した。 該反応物はDowex（R）-50イオン交換樹脂を加えることによって中和され、その後に濾過し、真空中で濃縮した。メタノール／酢酸エチルからの再結晶により、標記の化合物(230mg, 98%)が下記のような白色結晶固体として得られた：融点85-88℃ [Lit. 86-88°C]18 ;
[α] D22-10. 4 (c, 1.0 in MeOH) [Lit. [α] D25+177.1 (c, 1.45 in CHCl3) ]18;δH (400 MHz, MeOH), 2.00 (3H, s, CH3), 3.27-3. 37 (2H, m, H-4, H-5), 3.42 (1H, at J9.1 Hz, H-3), 3. 64-3. 73 (2H, m, H2, H-6), 3.87 (1H, dd, J5,6 2.1 Hz, J6,6, 12.0 Hz, H-6'), 4.56 (1H, d, J1,2 10.0 Hz, H-1), 8.11 (1H, bd, JNH,2 9.1 Hz, NH)。
【０１０５】
実施例９：１，２，３，６−テトラ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｄ−グルコピラノース
【０１０６】
【化１２】
2007527376.tif 000017
【０１０７】
酢酸ナトリウム (700 mg, 8. 3 mmol) を無水酢酸 (50 mL) に加え、加熱還流し、そこでマルトトリオース (3.00 g, 6.0 mmol) を加え、激しく攪拌した。９０分後、薄層クロマトグラフィー(ペトロール：酢酸エチル，１：２)は、出発原料(Rf 0. 0)が完全に消費さ
れるとともに、生成物(Rf 0. 3) が得られたことを示した。該反応物はRTまで冷却し、DCM (50 mL)で希釈、 水 (100 mL)と分離させた。相を分離させ、水溶性相はDCM (2 x 50 mL)で再抽出した。これらの混合有機相を、ｐＨが８になるまで炭酸水素ナトリウム(飽和
水溶液400 mL) で洗浄し、塩水(200 mL)につけ、MgS04で乾燥、濾過し、真空中において
濃縮することにより、標記の化合物(1.00 g, 68%)がアモルファスの白色固体であるアノ
マー混合物(α/s, 2/11)として得られた;
β化合物:δH (500 MHz, CDCl3) 2.05, 2.07, 2.10, 2.14, 2.15, 2.19, 2. 21, 2.27 (30H, 8 xs, 10 x OAc), 3.92 (1H, ddd, J4, 5 9.5 Hz, J5, 6 2. 9 Hz, J6,6 4.1 Hz, H-5a), 3.95-4. 01 (3H, m, H-4b, H-5b, H-5c), 4.05 (1H, at, J 9. 1 Hz, H-4a), 4.09 (1H, dd, J5, 6 2.5 Hz, J6,6, 12.7 Hz, H-6c), 4.21 (1H, dd, J5, 6 3. 4 Hz, J6,6, 12.6 Hz, H-6b), 4.29 (1H, dd, J5, 6 3.4 Hz, J6,6, 12. 4 Hz, H-6'c), 4.35 (1H, dd, J5, 6 4. 3 Hz, J6,6, 12.3 Hz, H-6a), 4. 48-4. 52 (2H, m, H-6'a, H-6'b), 4.78 (1H, dd, J1,2 4.1 Hz, J2, 3 10.3 Hz, H-2b), 4.90 (1H, dd, J1,2 4.1 Hz, J2, 3 10.6
Hz, H-2c), 5.01 (1H, dd, J1,2 8.0 Hz, J2, 3 9.0 Hz, H-2a), 5.11 (1H, at, J 10.1
Hz, H-4c), 5.31 (1H, d, J1,2 3.9 Hz, H-1b), 5.32-5. 44 (3H, m, H-3a, H-3b, H-3c), 5.45 (1H, d, J1,2 4.1 Hz, H-1c), 5.79 (1H, d, J1,2 8. 2 Hz, H-1a) ;
α化合物は選択したデータだけ:δH (500 MHz, CDCl3) 2. 08, 2. 09, 2.12, 2. 18, 2. 21, 2. 23,2. 26 (30H, 8 xs, 10 x OAc), 5.07 (1H, at, J 9.9 Hz), 6.28 (1H, d, J1,2 3. 8 Hz, H-1a)。
残りのシグナルは次の多重線に位置する。3. 85-3. 89, 3.90-3. 98,3. 99-4. 07,4. 15-4. 18,4. 23-4. 27, 4. 29-4.32, 4. 43-4. 49, 4. 74-4. 76, 4. 84-4. 87, 4. 98-4. 94, 5. 25-5. 54; m/z (ES+) 984 (MNH4+, 30%), 989 (MNa+, 100%) ; m/z HRMS (ES+) Calcd. For C40H58O27N(MNH4+) 984. 3196 Found 984. 3199。
【０１０８】
実施例１０：２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−グリコピラノシル）−α−Ｄ−グリコピラノシル）−α−Ｄ−グリコピラノシルブロミド
【０１０９】
【化１３】
2007527376.tif 000018
【０１１０】
１，２，３，６−テトラ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−グリコピラノシル）−α−Ｄ−グリコピラノシル）−Ｄ−グリコピラノース (200 mg, 0.21 mmol) を無水DCM (5 mL)に溶解した。 これに臭化水素 (33% 酢酸中2 mL)を加えた。 該混合物をアルゴン雰囲気下、RTにて放置した。３０分後、薄層クロマトグラフィー (ペトロール: 酢酸エチル, 1: 2)は、出発原料(Rf 0.3)が完全に消費されるとともに、生成物 (Rf 0.6) が得られた
ことを示した。該反応混合物はDCM (10 mL) と水 (10 mL)に分離し、水溶性相はDCM (3 x
10 mL)で再抽出した。これらの混合有機相は、ｐＨが８になるまで炭酸水素ナトリウム (飽和水溶液20 mL) で洗浄し、塩水 (20 mL)につけ、MgSO4で乾燥、濾過し、真空中で濃
縮した。標記の化合物が下記のように白色体(203 mg, 98%)として得られた;
[α] D22+152. 2 (c, 1.0 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3) 2. 03, 2. 05, 2. 06, 2.
08, 2. 10, 2. 13, 2. 18,2. 21 (30H, 10 x COCH3), 3.93-3. 99 (3H, m, H-4b, H-5a,
H-5b), 4.05-4. 10 (2H, m, H-4c, H-6a), 4.20 (1H, dd, J5,6 1,8 Hz, J6,6, 12. 2 Hz, H-6b), 4.26-4. 34 (2H, m, H-5c, H-6a'), 4. 35 (1H, dd,J5,6 3. 5 Hz, J6,6, 12.7 Hz, H-6c), 4.52 (1H, dd, J5,6  0.6 Hz, J6,6, 12.2 Hz, H-6b'), 4. 57 (1H, dd, J5,62. 1 Hz, J6,6, 12. 4 Hz , H-6c''), 4.74 (1H, dd, J1,24.1 Hz, J2,39. 9 Hz, H-2c), 4. 78 (1H, dd, J1,24. 2 Hz, J2,310. 2 Hz, H-2b), 4,88 (1H, dd, J1,24.0 Hz, J2,310. 5 Hz, H-2a), 5.10 (1H, at, J9. 7 Hz, H-4a), 5.32 (1H, d, J1,24.0 Hz, H-1b), 5. 39 (1H, at, J 9.9 Hz, H-3q), 5.43-5. 46 (1H, m, H-3b), 5,45 (1H, d, J1,23.8 Hz, H-la), 5.64 (1H, at, J9. 5 Hz, H-3c), 6.53 (1H, d, J1,23.9 Hz, H-lc)。
【０１１１】
実施例１１：１−チオ−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノース
【０１１２】
【化１４】
2007527376.tif 000019
【０１１３】
２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシルブロミド (2.10 g, 2.10 mmol) を無水
アセトン (60 mL)内に溶解させた。これに無水チオ尿素 (315 mg, 4.2 mmol)を加え、ア
ルゴン雰囲気中加熱還流した。６．５時間後、薄層クロマトグラフィー  (ペトロール:酢酸エチル, 1: 2)は、出発原料(Rf 0.3)が完全に消費されるとともに、生成物 (Rf 0. 0) が得られたことを示した。該反応物を真空中で濃縮し、DCMで滴定し、過剰チオ尿素から
有機物を除去した。濾液を真空中で濃縮し、残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール、９：１）によって精製することにより、特性のない中間物、２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル−１−イソチオウロニウムブロミド(1.14g, 50%)を得た。該中間物 (100 mg, 0.09 mmol) とNa2S205 (22 mg, 0.11 mmol) を DCM
(30 mL) と水 (15 mL)との攪拌された混合物に加えた。該混合物をアルゴン雰囲気下加
熱還流した。２．５時間後、薄層クロマトグラフィー (ペトロール: 酢酸エチル, 1: 2)
は、出発原料(Rf0.0) が完全に消費されるとともに生成物(Rf 0.4) が得られたことを示
し、この時点で反応温度をRTまで冷却し、相を分離させた。水溶性相はDCM (2 x 20 mL)
で再抽出した。これらの混合有機相を塩水(20 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥、濾過し、真空中で溶媒を除去した。標記の化合物が下記のような白色アモルファス固体(74 mg, 84%)として得られた；
[α] D22+99. 5 (c, 1.0 in CHC13) ;δH (400 MHz, CDCl3) 1.99, 2.00, 2.01, 2.02, 2.03, 2.05, 2.10, 2.15, 2. 18 (30H, 9 x s, 10 x COCH3), 3.72-3. 76 (1H, m, H-5a),
3. 90-4. 00 (4H, m, H-4a, H-4b, H-5b, H-5c), 4.05 (1H, dd, J5,62.2 Hz, J6,6, 12.3 Hz, H-6c), 4.17 (1H, dd, J5,63. 3 Hz, J6,6, 12.3 Hz, H-6b), 4.25 (1H, dd, J5,63. 6 Hz, J6,6'12.5 Hz, H-6c'), 4.30 (1H, J5,64.3 Hz, J6,6, 12. 2 Hz, H-6c), 4.44 (1H, dd, J5,62. 2 Hz, J6,6, 12. 1 Hz, H-6a'), 4.46 (1H, dd, J5,62. 2 Hz, J6,6,
12.2 Hz, H-6b'), 4.59 (1H, d, J1,29.7 Hz, H-1a), 4.74 (1H, dd, J1,24.1 Hz, J2,3 10.6 Hz, H-2b), 4. 80 (1H, at, J9.0 Hz, H-2a), 4. 85 (1H, dd, J1,24. 1 Hz, J2,310. 6 Hz, H-2c), 5.07 (1H, at, J9. 9 Hz, H-4c), 5.25 (1H, at, J 9.0 Hz, H-3a), 5.26 (1H, d, J1,24. 1 Hz, H-lb), 5.35 (1H, at, J 10.0 Hz, H-3b), 5.37-5. 41 (2H, m, H-1c, H-3c)。
【０１１４】
実施例１２：１−チオアセチル−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノース
【０１１５】
【化１５】
2007527376.tif 000020
【０１１６】
２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシルブロミド(11.2 g, 11.6 mmol)とチオ酢酸
カリウム(3.96 g, 34. 8 mmol)を無水THF (40 ml)中に懸濁させ、不活性アルゴン雰囲気
下加熱還流した。 １２時間後、薄層クロマトグラフィー(ペトロール：EtOAc, 1: 2)は、出発原料(Rf 0.45)が完全に消費されるとともに主生成物(Rf 0.4) が得られたことを示した。該反応物を水 (80 mL)で希釈し、RTまで冷却した。相を分離させ、水溶性相はDCM (3
x 40 mL)で再抽出した。これらの混合有機相はpH 8 まで飽和NaHCO3 (50 mL)で洗浄し、塩水 (50 mL)につけ、MgSO4で乾燥、濾過し、真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッ
シュクロマトグラフィー(ペトロール/EtOAc, 1: 4)によって精製することにより、標記の化合物(8. 08 g, 71%)が白色体として得られた;
[α] D25+86. 4 (c, 1.0 in CHC13) ;δH (400 MHz, CDCl3) 2.01, 2.02, 2.05, 2.08, 2.11, 2.17 (27H, 6 x s, 9 x OAc), 2.40 (3H, s, SAc), 3. 88 (1H, ddd, J4,59. 8 Hz,
J5,64.0 Hz, J5,6, 2. 7 Hz, H-5a), 3.92-4. 01 (4H, m, H-4a, H-4b, H-5b, H-5c), 4.07 (1H, dd, J5,62.4 Hz, J6,6, 12. 3 Hz, H-6c), 4.19 (1H, dd, J5,63.5 Hz, J6,6, 12.2 Hz, H-6b), 4.27 (1H, dd, J5,6, 3.8 Hz, J6,6,12.3 Hz, H-6'c), 4.30 (1H, dd, J5,64.2 Hz, J6,6, 12. 4 Hz, H-6a), 4.46 (1H, dd, J5,6, 2.6 Hz, J6,6, 12.3 Hz, H-6'b), 4.47 (1H, dd, J5,6, 2. 2 Hz, J6,6, 12.2 Hz, H-6'a), 4.76 (1H, dd, J1,23.9 Hz, J2,310. 0 Hz, H-2b), 4.87 (1H, dd, J1,23. 8 Hz, J2,310. 6 Hz, H-2c), 5.99 (1H, dd, J1,210.3 Hz, J2,39. 1 Hz, H-2a), 5.08 (1H, at, J9.9 Hz, H-4c), 5.27 (1H, d, J1,24. 0 Hz, H-1b), 5.31 (1H, d, J1,210. 0 Hz, H-1a), 5.33-5. 43 (4H, m, H-1c, H-3a, H-3b, H-3c) ; δc (125 MHz, CDCl3) 20.7, 20. 8, 20.9, 21.0, 21.1 (5 x q,
10 x COCH3, SCOCH3), 31. 0 (q, SCOCH3) 61.9 (t, C-6c), 62.7 (t, C-6b), 63.3 (t,
C-6a), 68.4 (d, C-4c), 69.0 (d, C-5b), 69.5 (d, C-5c), 69.8 (d, C-3c), 70.3 (d,
C-2a), 70.5 (d, C-2c), 70.9 (d, C-2a), 72.1 (d, C-3b), 73.0 (d, C-4b), 74.1 (d,
C-4a), 76.6 (d, C-3a), 76.9 (d, C-5a), 80.2 (d, C-1a), 96.1 (d, C-1c), 96.4 (d,
C-1b), 169.4, 169.6, 169. 8, 169.9, 170.3, 170.5, 170.6 (7 x s, 10 x COCH3), 196.0 (s, SCOCH3) ; m/z (ES+) 1000 (MNH4+, 60%), 1003 (MNa+, 100%)。
【０１１７】
実施例１３：１−チオ−β−Ｄ−マルトトリオース
【０１１８】
【化１６】
2007527376.tif 000021
【０１１９】
１−チオアセチル−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノース (600 mg, 0.6 mmol) とNaOAc (18 mg, 0. 18 mmol) を攪拌されたメタノール (10 ml)溶液に加えた。１０分後、薄層クロマトグラフィー(酢酸エチル：メタノール, 9 : 1)は、出発原料(Rf
0. 9)が完全に消費されるとともに生成物(Rf 0. 0) が得られたことを示した。該反応物はDowex(R)-50イオン交換樹脂を加えることによって中和され、その後に濾過し、真空中
で濃縮することにより、標記の化合物がアモルファス固体(305 mg, 98%)として得られた
；
[α] D25+123 (c, 1.0 in MeOH) ;δH (400 MHz, D20), 3.15 (1H, at, J9. 2 Hz, H-2a), 3.26 (1H, at, J9. 3 Hz), 3.41-3. 82 (16H, m, H-2b, H-2c, H-3a, H-3b, H-3c, H-4a, H-4b, H-4c, H-5a, H-5b, H-5c, H-6a, H-6b, H-6c, H-6'a, H-6'b, H-6'c), 4.42 (1H, d, J1,29. 6 Hz, H-1a), 5.23 (1H, d, J1,21.7 Hz, H-1), 5.24 (1H, d, J1,21. 8 Hz, H-1) ; δc (100 MHz, D2O), 60. 8, 70.0 (2 x t, C-6a, C-6b, C-6c), 69.6, 71.5,
71.8, 72.1, 73.0, 73.2, 73.6, 76.0, 77.1, 77.6, 79.0 (11 x d, C-2a, C-2b, C-2c,
C-3a, C-3b, C-3c, C-4a, C-4b, C-4c, C-5a, C-5b, C-5c), 80. 2 (d, C-1a), 99.8, 100.1 (2 x d, C-1b, C-1c) ; m/z (ES-) 519 (100%, M-H+) ; m/z HRMS (ES-) calcd. for C18H31O15S (M-H+) 519. 1384. Found 519.1389。
【０１２０】
実施例１４：１，２，３，６−テトラ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｄ−グルコピラノース
【０１２１】
【化１７】
2007527376.tif 000022
【０１２２】
酢酸ナトリウム (420 mg, 5.2 mmol) を無水酢酸 (30 mL)に加え、加熱還流し、その時点でマルトヘプトース (1.00 g, 0. 86 mmol) を加え、激しく攪拌した。９０分後、薄層クロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチル1: 3) は、出発原料(Rf 0.0)が完全に消費さ
れるとともに生成物(Rf 0. 3) が得られたことを示した。該反応物をRTまで冷却し、DCM (50 mL)で希釈し、水(100 mL)と分離させた。 相を分離させ、水溶性相はDCM (2 x 40 mL)で再抽出した。これらの混合有機相はpH 8まで炭酸水素ナトリウム(飽和水溶液200 mL)
で洗浄し、蒸留、塩水(100 mL)につけ、MgSO4で乾燥し、真空中で濾過して濃縮した。残
留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチル 1: 3)によって精
製することにより、標記の化合物がアモルファスの白色固体であるアノマー混合物(α/β, 15/85)として得られた;
δH (500 MHz, CDCl3)2.02, 2.03, 2.04, 2.05, 2.06, 2.07, 2.08, 2.10, 2.13, 2.19, 2.22, 2.24 (66H, 12 x s, 22 x OAc), 3. 89-4. 14 (13H, m, H-4a, H-4b, H-4c, H-4d,
H-4e, H-4f, H-5a, H-5b, H-5c, H-5d, H-5e, H-5f, H-5g), 4.25-4. 34,4. 39 (1H, dd, J4. 0 Hz, J 12.3 Hz), 4.52-4. 56 (13H, m, H-6a, H-6a', H-6b, H-6b', H-6c, H-6c', H-6d, H-6d', H-6e, H-6e', H-6f, H-6f', H-6d, H-6g'), 4. 75-4.79 (5H, m, H-2b,
H-2c, H-2d, H-2e, H-2e, H-2f), 4.90 (1H, dd, J1,23. 7 Hz, J2,310.5 Hz, H-2g), 5.00 (1H, at, J9. 4 Hz, H-4g), 5.31-5. 45 (13H, m, H-3a, H-3b, H-3c, H-3d, H-3e, H-3f, H-3g, H-1b, H-1c, H-1d, H-1e, H-1f, H-1g), 5.79 (0.85H, d, J1,2 8. 1 Hz, H-1a β), 6.28 (0.15H, d, J1,24. 0 Hz, H-1aα)。
【０１２３】
実施例１５：２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ− （２，３，６−トリ−Ｏ−ア
セチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシルブロミド
【０１２４】
【化１８】
2007527376.tif 000023
【０１２５】
１，２，３，６−テトラ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ− （２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル
−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｄ−グルコピラノース (100 mg, 0.05 mmol)を無水DCM (5 mL)に溶解させた。これに臭化水素(33% 酢酸
中, 0.5 mL) を加えた。該混合物をアルゴン雰囲気下、RTで攪拌し続けた。４０分後、薄層クロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチル,1:3)は、出発原料(Rf0.3)が完全に消費
されるとともに生成物(Rf0.7)が得られたことを示した。該反応混合物をDCM(10mL)と水(10mL)に分離させ、水溶性相はDCM(3x10mL)で再抽出した。これらの混合有機相は、pH 7ま
で炭酸水素ナトリウム (飽和水溶液150mL)で洗浄し、蒸留、塩水(20mL)につけ、MgSO4で
乾燥し、濾過し、真空中で濃縮することにより、標記の化合物(98mg,96%)が白色固体として得られた;
[α] D22+162.0 (c, 1.0 in CHCl3) ;δH (400 MHz, CDCl3) 2.02, 2.03, 2.04, 2.06, 2. 08, 2.10, 2.11, 2.14, 2.19, 2.23, 2.24, 2.25 (66H, 12 x s, 22 x OAc), 3.94-4. 04 (12H, m, H-4b, H-4c, H-4d, H-4e, H-4f, H-5b, H-5c, H-5d, H-5e, H-5f, H-5g), 4. 08 (1H, dd, J5,6 2.2 Hz, J6,6, 12. 6 Hz, H-6), 4.19-4. 33,4. 53-4.60 (12H, m, H-5a, H-6b, H-6b', H-6c, H-6c', H-6d, H-6d', H-6e, H-6e', H-6f, H-6f', H-6g, H-6g'), 4.12 (1H, at, J 9.5 Hz, H-4a), 4.40 (1H, dd, J5,63.1 Hz, J6,6, 12. 7 Hz, H-6a), 4.64 (1H, dd, J5,62. 3 Hz, J6,6'12. 5 Hz, H-6a'), 4.74 (1H, dd, J1,23.9 Hz,
J2,39. 7 Hz, H-2a), 4.75-4. 97 (5H, m, H-2b, H-2c, H-2d, H-2e, H-2f), 4. 89 (1H, d, J1,24. 0 Hz, J2,310.6 Hz, H-2g), 5.11 (1H, at, J 9.9 Hz, H-4g), 5.32-5. 47 (12H, m, H-1b, H-1c, H-1d, H-1e, H-1f, H-1g, H-3b, H-3c, H-3d, H-3e, H-3f, H-3g), 5.65 (1H, at, J 9.4 Hz, H-3a), 6.54 (1H, d, J1,24. 3 Hz, H-1a) 。
【０１２６】
実施例１６：１−チオ−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノース
【０１２７】
【化１９】
2007527376.tif 000024
【０１２８】
２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシルブロミド (1. 08 g, 0.5 mmol) とヨウ化テトラブチルアンモニウム (19 mg, 0. 05 mmol) を無水アセトン (50 mL)に溶解した。これに乾燥チオ尿素(52 mg, 0.7 mmol)を加え
、該反応物をアルゴン雰囲気下加熱還流した。８時間後、薄層クロマトグラフィー (ペトロール: 酢酸エチル 1: 4) は、出発原料(Rf 0. 6)が完全に消費されるとともに副生成物(Rf 0.0) が得られたことを示した。該反応物を真空中で濃縮し、過剰チオ尿素から有機
物を除去するためにDCMで滴定した。濾液を真空中で濃縮し、残留物をカラムフラッシュ
クロマトグラフィー(酢酸エチル/メタノール, 9: 1)によって精製することにより、特性
のない中間物、２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル−１−イソチオウロニウムブロミド(212 mg, 19%)を得た。該中間物(210 mg, 0.09 mmol)とNa2S2O5 (22 mg, 0.11 mmol) をDCM (10 mL) と水 (5 mL)との撹拌された混合物に加えた。該混合物をアルゴン雰囲気下加熱還流した。 ４．５時間後、薄層
クロマトグラフィー (ペトロール: 酢酸エチル, 1: 2)は、出発原料(RfO. 0)が完全に消
費されるとともに生成物(Rf 0.2) が得られたことを示した。そこで該反応物をRT まで冷却し、相を分離させた。水溶性相はDCM (2 x 10 mL)で再抽出した。これらの混合有機相
を塩水 (20 mL)で洗浄し、乾燥 (MgSO4)、真空中で濾過し、溶媒を除去した。標記の化合物(185 mg, 90%)が書きのような非晶性固体として得られた; 
[α] D24+128. 1 (c, 1. 0 in CHCl3);δH (500 MHz, CDCl3), 2.00, 2.01, 2.02, 2.03,
2.04, 2.05, 2.07, 2. 08, 2. 12, 2. 17, 2. 19, 2. 21, 2. 22, 2. 23 (66H, 14 x s,
22 x COCH3), 2.27 (1H, d, J1,SH 9. 8 Hz, SH), 3. 76 (1H, dat, J4,59.7 Hz, J3. 5
Hz, H-5a), 3. 92-4. 08 (12H, m, H-4a H-4b, H-4c, H-4d, H-4e, H-4f, H-5b, H-5c, H-5d, H-5e, H-5f, H-5g), 4. 17- 4.36, 4.49-4. 56 (12H, m, H-6b, H-6b', H-6c, H-6c', H-6d, H-6d', H-6e, H-6e', H-6f, H-6f', H-6g, H-6g'), 4.39 (1H, dd, J5,6 3.6 Hz, J6,6, 12. 2 Hz, H-6a), 4. 48 (1H, dd, J5,63.2 Hz,J6,6'12.3 Hz, H-6a), 4.62 (1H at, J 9. 5 Hz, H-1a), 4.73-4. 78 (5H, m, H-2b, H-2c, H-2d, H-2e, H-2f), 4. 82
(1H, at, J 9. 5 Hz, H-2a), 4. 88 (1H, dd, J1,24.0 Hz, J2,310.4 Hz, H-2g), 5.09 
(1H, at, J9. 9 Hz, H-4g), 5.27 (1H, at, J9. 1 Hz, H-3a), 5. 30- 5.44 (12H, m,-1b, H-1c, H-1d, H-1e, H-1f, H-1g, H-3b, H-3c, H-3d, H-3e, H-3f, H-3g)。
【０１２９】
実施例１７：ＳＢＬＣｙｓ１５６−Ｓ−ＳｅＰｈの調製
単一修飾は規範的システイン含有タンパク質、セリンプロテアーゼスブチリシン、バチルスレンタス変異株S156C (SBLCysl56) を用いて研究されている。SBLCysl56 (10 mg)を脱
気水性バッファー溶液(1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5)へ溶解させた。PhSeBr (5 mg, 0.02 mmol) をアセトニトリル (200 μL)に溶解し、このうちの150 μL
(40 eq)をタンパク質溶液に加え、逆回転子に置いた。３０分後、エルマン分析(G. L. Ellman, K. D. Courtney, V. Andres, R. M. Featherstone, Biochem. Pharmacol. 1961,7, 88)により、遊離型のチオールは存在しないことが示された。さらに３０分、該反応物
を逆回転子に置き、その段階で反応混合物をPD10 Sephadex(R)G25カラムに流し、pH 7.0
で 70 mM HEPESと 2 mM CaCl2を溶出した。分留タンパク質を集め、水と接触して透析(MWCO 12-14 KDa)し(1 x 4L １時間, 2 x 2L ３０分)、SBLS156C-S-SePhを得たa;
m/z (ES+) found 26864 clcd. 26870。
【０１３０】
実施例１８：ＳＳβＧＣｙｓ３４４Ｃｙｓ４３２−（Ｓ−ＳｅＰｈ）2の調整
多重修飾は、２つのシステイン残留物(SSβG-Cys344Cys432)を含有した古細菌Sulfolobus
solfataricus由来の好熱性β−グルコシダーゼ変異体を用いて、研究が行われた。SSβG-Cys344Cys432 (1 mg)を水溶性バッファー中に溶解させた (1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9. 5)。PhSeBr (2 mg, 0. 02 mmol)はアセトニトリル (200 μL)中に
溶解し、そのうちの20 μL (74 eq) をタンパク質溶液に加え、逆回転子に置いた。１時
間後、該混合反応物をPD10 Sephadex(R) G25 カラムに流し、溶出して (70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0) SSβGCys344Cys432-(S-SePh)2を得た;
m/z (ES+) found 57700 calcd. 57697 。
【０１３１】
実施例１９：代表的なタンパク質のチオール糖とのグリコシル化、および他のチオールとの反応
SBLCys156-S-SePh (1 mg)を水溶性バッファー中(1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5)に溶解した。チオール糖または他のチオールを水の中に溶解し、規定量のタ
ンパク質溶液(下記表の当量参照)の中に溶解し、混合物を逆回転子に置いた。１時間後、該反応物を質量スペクトルで分析した。
【０１３２】
【表１】
2007527376.tif 000025
【０１３３】
Conv. = ＥＳＩ−ＭＳによって決定された変換
1チオールの添加に先立ち、フェニルセレニウムブロミドとの反応により活性化され、対
応するタンパク質-S-Se-Phまたはタンパク質-(S-Se-Ph) 2が与えられた
2タンパク質分解活性によるタンパク質分解を防ぐために、グリコシレーションに先立ちP
MSF(フェニルメチルスルフォニルフルオライド)と反応させた
上記表の結果は、本発明の方法によるとわずか１当量のチオール化合物を用いることで、所望の生成物に高率で変換されることを実証している。さらに、該結果は本発明の方法は、単一または多重の位置でのタンパク質グリコシル化に利用できることを実証している。SBL-Cys 156とSSβGCys344Cys432 の３箇所でのグリコシル化は、大変多様なタンパク質
構造および露出程度の異なる環境において見られ、本発明の方法が幅広い応用性があることを示している。
【０１３４】
実施例２０： GlcGlcGlcGlcGlcGlcGlc-SHを用いたSBLCysl56の代表的なタンパク質グリコシル化
１−チオ−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノース (15 mg, 0.007 mmol) とナトリウムメトキシド (2 mg, 0.007 mmol)を撹拌されたメタノール (2 ml) 溶液に加えた。２時間後、薄層クロマトグラフィー(ペトロー
ル: 酢酸エチル, 1: 2) は、出発原料(Rf 0. 2)が完全に消費されるとともに生成物(Rf 0.0) が得られたことを示した。該反応物はDowex(R)-50イオン交換樹脂を加えることによ
って中和され、その後真空中で濾過し、濃縮した。
１−チオ−β−Ｄ−マルトヘプトースの原料は、未精製の１−チオ−β−Ｄ−マルトヘプトースを水(5 mL)に投入し、そのうちの300μL (11 eq)を、500μLの水溶性バッファー液(70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5)にSBLCys 156-S-SePh (1 mg)が溶解した溶液に添加した。結果として生じた溶液を逆回転子に置いた。１時間後、該混合反応物をPD10 Sephadex(R)G25 カラムに流し、70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0において溶出した
。分留タンパク質を収集してGlcGlcGLcGlcGlcGlcGlc-SBLCysl56を得た; 
m/z (ES+) found 27878 calcd. 27881。
【０１３５】
実施例２１： SBLCys156-S-GlcNAcの酵素拡張機能
A. GIcNAc-SBLCysl56 (3 mg) を1 mLの水溶性バッファー液に溶解した。 フェニルメチ
ルスルフォニルフルオライド (PMSF)を加えた (100 mg/mLの アセトニトリル溶液50μL; 500-当量)。該混合反応は３０分間室温で温置し、 Sephadex(R)G25 (PD-10)脱塩カラムで精製した。非活性化したタンパク質の純度をESI-質量分光分析で評価した (観測値 : 27100,計算値27104)。タンパク質分留は凍結乾燥し、0. 1Mカコジル酸ナトリウムバッファー液 (pH 7.52)の1.0 mL中に再溶解した。MnCl2. 4H2O (3.2 mg; 16 μmol) とウリジン二
リン酸-ガラクトース(UDP-galactose, 2.3 mg; 3.4 p. mol, Kyowa Hakko ; 30-当量) を加えた。Spodoptera Frugiperda 由来の組換えウシ β−１，４−ガラクトシルトランス
フェラーゼ (EC 2. 4. 1. 229 100 mU, Calbiochem)を加え、反応混合物を４０分間室温
で温置し、Galβ1,4GlcNAc-S-SBL-Cys156 (ESI-MS, 観測値 27265, 計算値 27266)を得た。
【０１３６】
B. GDP-フコース(3mg, Kyowa Hakku) とSpodoptera Frugiperda由来のヒトα−１，３−
フコシルトランスフェラーゼ(EC 2.4. 1. 65, 10 mU, Calbiochem)を加え、該混合反応物を一晩室温で温置し、LewisX-S- SBL-Cys 156 (ESI-MS,観測値27410,計算値 27412)を得
た。
この実施例では、本発明の方法により調製されたグリコシル化タンパク質が、適した糖修飾酵素、例えば、選択的にGalβ1, 4GlcNAc結合を形成するβ-1, 4-ガラクトシルトラン
スフェラーゼのようなグリコシルトランスフェラーゼとの反応によりさらに修飾されることを実証した。
【０１３７】
実施例２２：ソディウムフェニルチオスルフォネート (NaPTS)  
【０１３８】
【化２０】
2007527376.tif 000026
【０１３９】
ソディウムベンゼンスルフィネート (10 g, 61 mmol) と硫黄 (1.95 g, 61 mmol)を無水
ピリジン (60 mL) に溶解し、黄色溶液を得た。該反応物はアルゴン雰囲気下攪拌し、１
時間後白色懸濁液を得た。 該反応物を濾過し、無水ジエチルエーテルで洗浄した。無水
エタノールからの再結晶により、白色結晶固体として標記の化合物(10.5 g, 88%)を得た;
融点305-306℃[Lit. 287°C, Sato, R.; Goto, T.; Takikawa, Y.; Takizawa, S. Synthesis 1980,615] ;
δH (200 MHz, DMSO-d6) 7.28-7. 76 (5H, m, Ar-H) 。
【０１４０】
実施例２３：２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルフェニルチオスルフォネート
【０１４１】
【化２１】
2007527376.tif 000027
【０１４２】
２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシルブロミド (207 mg, 0.5 mmol)を無水アセトニトリル (5 mL)に溶解した。これにソディウムフェニルチオスルフォネート (201 mg, 1 mmol) とテトラブチルアンモニウムブロミド(61 mg, 0. 05 mmol)を加えた。該混合物をアルゴン雰囲気下70° Cで攪拌した。４．５時間後、薄層グロマ
トグラフィー (ペトロール : 酢酸エチル, 1 : 1) は、出発原料(Rf 0. 3)が完全に消費
されるとともに生成物(Rf 0.5) が得られたことを示した。該溶液を真空中で濃縮した。
未精製固形物をジクロロメタン(DCM, 20 mL)と水(20 mL)に分離し、水溶性相はDCM (2 x 20 mL)で再抽出した。 これらの混合有機相は塩水(20 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥、濾過
して真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー (ペトロール: 酢酸エチル, 1: 1)によって精製することにより、標記の化合物(225 mg, 88%)を白色結晶固体として得た; 
融点 129-130℃;
[α] D25 +51. 2 (c, 1. 0 in CHCl3) ; umax (KBr) 1754 (s, C=O), 1376 (s, C=C) cm-1 ; δH (400 MHz, C6D6) 1.68, 1.72, 1.73, 1.75 (4 x 3H, 4 x s, 4 x OAc), 3.09 (1H, ddd, J4,510. 2 Hz, J5,62.4 Hz, J5,6' 4. 2 Hz, H-5), 3.83 (1H, dd, J5,62. 4 Hz, J6,6' 12. 7 Hz, H-6), 4. 08 (1H, dd, J5,6'4.2 Hz, J6,6'12. 6 Hz, H-6'), 5.17-5. 23 (2H, m, H-2, H-4), 5.40 (1H, d, J1,210.2 Hz, H-1), 5.44 (1H, at, J9.4 Hz, H-3), 6. 98-7. 03 (3H, m, Ar-H), 7.90-7. 92 (2H, m, Ar-H)。
生成物の構造は、さらに単結晶Ｘ線回折によって確認された。
【０１４３】
実施例２４：２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルフェニルチオスルフォネート
【０１４４】
【化２２】
2007527376.tif 000028
【０１４５】
２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルブロミド (2.0 g,
5 mmol)を無水アセトニトリル(80 mL)に溶解した。これにソディウムフェニルチオスル
フォネート (2.02 g, 10.3 mmol) とテトラブチルアンモニウムブロミド(160 mg, 0.5 mmol)を加えた。該混合物をアルゴン雰囲気下70° Cで攪拌した。５時間後、薄層クロマト
グラフィー(ペトロール: 酢酸エチル, 1: 1) は、出発原料(Rf 0. 6)が完全に消費されるとともに生成物(Rf 0.4) が得られたことを示した。該溶液を真空中で濃縮した。未精製
油分をDCM (50 mL)と水(50 mL)で分離し、水溶性相はDCM (2 x 50 mL)で再抽出した。こ
れらの混合有機相は塩水(100 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥、濾過し、真空中で濃縮した。
残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロール : 酢酸エチル, 2 : 1)によって精製することにより、標記の化合物(1.7 g9 65%, 2 段階)を白色結晶固体として得た融点 53-54℃ ;
[α] D27+24. 2 (c, 1.0 in CHCl3) ; δH (400MHz, CDCl3) 1.98, 2.03, 2.06, 2.11 (4
x 3H, 4 x s, 4 x OAc), 3. 85 (1H, dd, J5,6 8.8 Hz, J6,6' 14.0 Hz, H-6), 3.95-4.
00 (2H, m, H-5, H-6), 5.11 (1H, dd, J2,39.7 Hz, J3,43. 3 Hz, H-3), 5.23 (1H, at, J 10.3 Hz, H-2), 5.25 (1H, d, J1,210. 2 Hz, H-1), 5.43 (1H, dd, J3,43.6 Hz, J4,51. 0 Hz, H-4), 7.54-7. 68 (3H, m, Ar-H), 7.93-7. 97 (2H, m, Ar-H)。
【０１４６】
実施例２５：エチル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−ジチオ−β−Ｄ−グルコピラノシルジスルフィド
【０１４７】
【化２３】
2007527376.tif 000029
【０１４８】
方法１：２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルフェニルチオスルフォネート(100 mg, 0.2 mmol) とトリエチルアミン (0. 03 mL, 0.2 mmol) を無
水DCM (10 mL)に溶解し、アルゴン雰囲気下室温(RT)で攪拌した。エタンチオール(0. 016
mL, 0.2 mmol)の無水DCM(10 mL)溶液を、シリンジ・ポンプを通して３０分以上かけてゆっくりと液滴にて加えた。４０分後、薄層クロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチル,
1: 1) は、出発原料(Rf 0.3)が完全に消費されるとともに主生成物(Rf 0.5) が得られたことを示し、該溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチル, 1: 1)によって精製することにより、標記の化合物(70 mg, 82%)を白色結晶固体として得た; 
融点 95-96℃ [Lit. 100-102°C, (Davis, B. G.; Ward, S. J.; Rendle, P. M. Chem. Commun. 2001,189)] ; 
[α] D22-164. 9 (c, 0.2 in CHCl3) [Lit. [α] D24-178. 0 (c, 1.0 in MeOH) (Davis,
B. G.; Ward, S. J.; Rendle, P. M. Chem. Commun. 2001, 189)] ; δH (400 MHz, CDCl3) 1.30 (1H, t, J 7. 4 Hz, CH3), 2.00, 2.02, 2.03, 2.06 (4 x 3H, 4 x s, 4 x CH3
), 2. 79 (2H, dq, JCH3-H 7. 5 Hz, JHH 2. 7 Hz), 3.73 (1H, ddd, J4,5 10. 2 Hz, J5,6 2. 5 Hz, J5, 6' 4.8 Hz, H-5), 4. 14 (1H, dd, J5, 6 2. 4 Hz, J6,6' 12.4 Hz, H-6), 4.22 (1H, dd, J5,6' 4. 7 Hz, J6,6' 12. 4 Hz, H-6'), 4.52 (1H, d, J1,2 9. 8 Hz, H-1), 5.10 (1H, at, J 9.8 Hz, H-4), 5.21-5. 26 (2H, m, H-2, H-3)。
方法２: フェニル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−セレネニルスルフィド−Ｄ−β−グルコピラノシド(75 mg, 0.15 mmol)とトリエチルアミン(30 μL, 0.15 mmol)
を新たに蒸留したDCM (10 mL)に溶解した。該溶液をアルゴン雰囲気下RTで撹拌した。エ
タンチオール(11μL, 0.15 mmol)の無水DCM(10 mL)溶液を液滴にて２．５時間以上かけて加えた。３時間後、薄層クロマトグラフィー(ペトロール:酢酸エチル 1: 1) は、出発原
料(Rf 0.5)が完全に消費されるとともに主生成物(Rf 0.5) が得られたことを示した。該
溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロール: EtOAc, 5: 3)によって精製することにより、標記の化合物(50 mg, 82%)を白色結晶固体と
して得た。
【０１４９】
実施例２６：エチル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−ジチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルジスルフィド
【０１５０】
【化２４】
2007527376.tif 000030
【０１５１】
方法１：２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルフェニルチオスルフォネート(100 mg, 0.2 mmol)とトリエチルアミン(0.03 mL, 0.2 mmol)を無水DCM (10 mL)中に溶解し、アルゴン雰囲気下RTで撹拌した。エタンチオール(0.016 mL, 0.2
mmol)の無水DCM (10 mL)溶液をシリンジ・ポンプを通して３０分以上かけてゆっくりと
液滴により加えた。４０分後、薄層クロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチル, 1: 1)
は、出発原料(Rf 0.3)が完全に消費されるとともに主生成物(Rf 0.4) が得られたことを示した。該溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペ
トロール: 酢酸エチル, 1: 1)によって精製することにより、標記の化合物(78 mg, 91%)
を白色結晶固体として得た;
融点65-66℃ ;
[α] D25 -52. 1 (c, 1.4 in CHCl3) ;
umax (KBr) 1746 (s, C=O) cm-1; δH (400 MHz, CDCl3) 1.30 (1H, t, J7.4 Hz, CH3), 1.95, 2.01, 2.02, 2.13 (4 x 3H, 4 x s, 4 x CH3), 2.79 (2H, dq, JCH3-H 7.2 Hz, JHH 1.7 Hz), 3.94 (1H, td, J4,5 0.9 Hz, J5, 6 6. 3 Hz, J5, 6' 7. 0 Hz, H-5), 4. 06
(1H, dd, J5,6 6.3 Hz, J6,6'11.3 Hz, H-6), 4.12 (1H, dd, J5,6' 7.0 Hz, J6,6' 11.2 Hz, H-6'), 4.51 (1H, d, J1,2 9.9 Hz, H-1), 5.05 (1H, dd, J2,3 9.9 Hz, J3,43.6 Hz, H-3), 5. 35-5. 40 (2H, m, H-2, H-4)。
【０１５２】
方法２：フェニル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−セレネニルスルフィド−Ｄ−β−ガラクトピラノシド(75 mg, 0.15 mmol)とトリエチルアミン(30 μL 0.15 mol)
を新たに蒸留したDCM (10 mL)に溶解した。該溶液をアルゴン雰囲気下RTで撹拌した。エ
タンチオール(11μL, 0.15 mmol)の無水DCM (10 mL)溶液を２．５時間以上かけてゆっく
りと液滴により加えた。３時間後、薄層クロマトグラフィー(ペトロール:酢酸エチル 1: 1) は、出発原料(Rf 0.5)が完全に消費されるとともに主生成物(Rf 0.5) が得られたことを示した。該溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(
ペトロール: EtOAc, 5 : 3)によって精製し、標記の化合物(50 mg, 82%)を白色結晶固体
として得た。
【０１５３】
実施例２７：エチル３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシルジスルフィド
【０１５４】
【化２５】
2007527376.tif 000031
【０１５５】
フェニル３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−アセトアミド２−デオキシ−１−セレネニルスルフィド−Ｄ−β−グルコピラノシド(100 mg, 0.19 mmol)とトリエチルアミン(0.03 mL, 0.19 mmol) を新たに蒸留したDCM (20 mL)に溶解した。該溶液をアルゴン雰囲気
下RTで撹拌した。エタンチオール (0.014 mL, 0.19 mmol)の無水DCM (10 mL)溶液を１時
間以上かけて液滴により加えた。3時間後、薄層クロマトグラフィー(EtOAc) は、出発原
料(Rf 0.5)が完全に消費されるとともに主生成物(Rf 0.4) が得られたことを示した。該
溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(EtOAc)によっ
て精製することにより、標記の化合物(75 mg, 93%)をアモルファス固体として得た；
[α] D25-70. 1 (c, 2.5 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3), 1. 32 (3H, d, JCH, CH3 6.6 Hz, CHCH3), 1.96, 2.04, 2.05, 2.08 (12H, 4 x s, 4 x COCH3), 2.82 (2H, q, J 7.4 Hz, CH2), 3.75 (1H, ddd, J4,5 10.1 Hz, J5,6 2. 5 Hz, J5, 6, 4.7 Hz, H-5), 4.12-4. 25 (3H, m, H-2, H-6, H-6'), 4.73 (1H, at, J1,2 10. 4 Hz, H-1), 5.10 (1H, at, J 9. 8 Hz, H-4), 5.30 (1H, at, J 9. 9 Hz, H-3), 5.70 (1H, d, JNH,2 9. 1 Hz, NH)。
【０１５６】
実施例２８：ビス−Ｎ−アセチル−Ｌ−システイニル−Ｌ−セリンメチルエステル
【０１５７】
【化２６】
2007527376.tif 000032
【０１５８】
ビス−Ｌ−システイニル−Ｌ−セリンメチルエステル(100 mg, 0.23 mmol)をメタノール
中(5 mL)に溶解した。この溶液に無水酢酸(0.09 mL, 0.92 mmol)とピリジン(0.075 mL, 0.92 mmol)を加えた。15分後、薄層クロマトグラフィー(酢酸エチル: メタノール5: 1) は、出発原料(Rf 0.1)が完全に消費されるとともに主生成物(Rf 0.5) が得られたことを示
した。該反応物を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(酢
酸エチル: メタノール 5: 1)によって精製することにより、標記の化合物(60 mg, 50%)を白色結晶固体として得た;
融点 145-147℃ ;
[α] D25-33. 4 (c, 1.0 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3) 2.04 (3H, s, COCH3), 2.96 (1H, dd, JCH, H 13.9 Hz, JCH,αH 4. 7 Hz, CysCHH), 3. 23 (1H, dd, JCH,H 13. 9 
Hz, JCH,αH 4.7 Hz, CysCHH), 3.76 (3H, s, OMe), 3.83 (1H, dd, JCH,H 11.4 Hz, JCH,αH4.1 Hz, SerCHH), 3.93 (1H, dd, JCH,H 11.3 Hz, JCH,αH 4.9 Hz, SerCHH), 4.55 (1H, t, J 4.3 Hz,αHSer), 4.87 (1H, t, J4.8,αHCys)。
【０１５９】
実施例２９：Ｎ−アセチル−Ｌ−システイニル−Ｌ−セリンメチルエステル
【０１６０】
【化２７】
2007527376.tif 000033
【０１６１】
ビス−Ｎ−アセチル−Ｌ−システイニル−Ｌ−セリンメチルエステル(1.92 g, 3.96 mmol)を液体のクロロホルム(100 mL)とメタノール(10 mL)に溶解し、撹拌した。この撹拌溶液にトリブチルフォスフィン(1.1 mL, 4.36 mmol)を加えた。2時間後、薄層クロマトグラフィー(酢酸エチル: メタノール 10: 1) は、出発原料(Rf 0.3)が完全に消費されるととも
に主生成物(Rf 0.6) が得られたことを示した。該反応物を真空中で濃縮した。酢酸エチ
ル／メタノールから再結晶させることにより、標記の化合物(1.77 g, 93%)を白色結晶固
体として得た;
融点 127-128℃; 
[α] D25-32. 0 (c, 1.0 in MeOH) ; δH (400 MHz, CDCl3) 1. 89 (1H, at, J 8.9 Hz, SH), 2.06 (3H, s, COCH3), 2. 84-2. 93 (1H, m, CysCHH), 2. 97-3. 04 (1H, m, CysCHH), 3. 79 (3H, s, OMe), 3. 91 (1H, dd, JCH,H 11.4 Hz, JCH,αH 3.1 Hz, SerCHH, 4.03 (1H, dd, JCH,H 11. 7 Hz, JCH,αH4. 2 Hz, SerCHH), 4. 61-4. 65 (1H, m,αHSer),
4.71-4. 76 (1H, m, αHCys), 6.93 (1H, d, JαH,NH 7.8 Hz, NHCys), 7.73 (1H, d, JαH,NH 7.4 Hz, NHSer).
【０１６２】
実施例３０：Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−ジチオ−β−Ｄ−グルコピラノシルジスルフィド）−Ｌ−セリンメチルエステル
【０１６３】
【化２８】
2007527376.tif 000034
【０１６４】
２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルフェニルチオスルフォネート(61 mg, 0. 12 mmol)を無水DCM (5 mL)中に溶解し、アルゴン雰囲気下RTで撹拌
した。これにＮ−アセチル−Ｌ−システイン−Ｌ−セリンメチルエステル(32 mg, 0.12 mmol)およびトリエチルアミン(0.015 mL, 0. 1 lmmol)を無水DCM (10 mL)および無水メタ
ノール(0.5 mL)に溶解させた溶液をシリンジ・ポンプを通して４時間以上かけてゆっくりと液滴により加えた。５時間後、薄層クロマトグラフィー (酢酸エチル: メタノール, 10: 1) は、出発原料(Rf 0. 3, (薄層クロマトグラフィー装置 (ぺトロール: 酢酸エチル, 1: 1) )が完全に消費されるとともに主生成物(Rf 0.5) が得られたことを示した。該溶液
を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル: メタ
ノール 10: 1)によって精製することにより、標記の化合物(75 mg, 99%)を白色結晶固体
として得た;
融点126−128℃ [Lit. 125-128°C (Davis, B. G. ; Ward, S. J.; Rendle, P. M. Chem.
Commun. 2001, 189)] ;
[α] D25-47. 9 (c, 0.7 in CHCl3) [Lit. [α] D24-178. 0 (c, 1.0 in MeOH) (Davis, B. G.; Ward, S. J.; Rendle, P. M. Chem. Commun. 2001, 189)] ;
δH (400 MHz, CDCl3) 2.03, 2.06, 2.07, 2.11 (5 x 3H, 4 x s, 5 x CH3), 3.05 (1H, dd, JCH,H 13. 9 Hz, JCH,αH8. 8 Hz, CysCHH), 3.28 (1H, dd, JCH,H 13.9 Hz, JCH,αH 4.8 Hz, CysCHH), 3.80 (3H, s, OMe), 3. 89 (1H, ddd, J4,5 10. 0 Hz, J5, 6 2. 2 Hz, J5, 6' 4. 1 Hz, H-5), 3. 94 (1H, dd, JCH, H 11.7 Hz, JCH,αH 3.0 Hz, SerCHH), 4.00 (1H, dd, JCH, H 13. 8 Hz, JCH,αH 3. 7 Hz, SerCHH), 4.23 (1H, dd, J5,6 4.2 Hz, J6,6' 12. 4 Hz, H-6), 4. 38 (1H, dd, J5,6' 2.0 Hz, J6,6' 12.5 Hz, H-6'), 4. 62-4. 65 (1H, m, αHSer), 4. 64 (1H, d, J1,2 9.5 Hz, H-1), 4.90-4. 94 (1H, m, αHCys), 5. 18 (1H, at, J 10. 1 Hz, H-4), 5. 24-5. 29 (2H, m, H-2, H-3), 6.94 (1H, d, JNH,H 7.9 Hz, NHAc), 7.52 (1H, d, JNH,H 7.6 Hz, NHSer)。
【０１６５】
実施例３１：Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−ジチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルジスルフィド）−Ｌ−セリンメチルエステル
【０１６６】
【化２９】
2007527376.tif 000035
【０１６７】
２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルフェニルチオスルフォネート(50 mg, 0.1 mmol)を無水DCM (5 mL)中で溶解し、アルゴン雰囲気下RTで撹拌
した。Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン−Ｌ−セリンメチルエステル(31 mg, 0. 12 mmol)
およびトリエチルアミン(0. 015 mL, 0. 1 lmmol)を無水DCM (10 mL)および無水メタノール(0.5 mL)に溶解させた溶液をシリンジ・ポンプを通して２時間以上かけて液滴により加えた。２時間後、薄層クロマトグラフィー(酢酸エチル: メタノール, 10: 1) は出発原料(Rf 0. 5, t.1.cシステム ペトロール: 酢酸エチル, 1: 1 )を完全に消費するとともに主生成物(Rf 0.5)が得られたことを示した。該溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル: メタノール 10: 1)によって精製することにより、標記の化合物(59 mg, 95%)を白色アモルファス固体として得た; 
[α] D25-48. 8 (c, 0.25 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3) 1.99, 2.04, 2.05, 2. 08, 2. 18 (5 x 3H, 4 x s, 5 x CH3), 2. 80 (1H, bs, OH), 2.99 (1H, dd, JCH,H 14.1 Hz, JCH,αH 9.2 Hz, CysCHH), 3.32, 3.77 (3H, s, OMe), 3.92 (1H, dd, JCH,H 11. 7 Hz, JCH,αH 3. 0 Hz, SerCHH), 4.01 (1H, dd, JCH,H 11.7 Hz, JCH,αH 3.7 Hz, SerCHH), 4.06-4. 14 (2H, m, H-5, H-6), 4.20-4. 26 (1H, m, H-6'), 4.61-4. 63 (1H, m,αHSer), 4.65 (1H, d, J1,2 9. 8 Hz, H-1), 4.88-4. 93 (1H, m, αHCys), 5.11 (1H, dd,
J2,3 9.8 Hz, J3,4 3.3 Hz, H-3), 5.42-5. 47 (2H, m, H-2, H-4), 6. 68 (1H, d, JNH,H 7. 8 Hz, NHAc), 7.28 (1H, d, JNH,H 8.1 Hz, NHSer)。
【０１６８】
実施例３２：２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−グルコピラノシルブロミド
【０１６９】
【化３０】
2007527376.tif 000036
【０１７０】
２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−Ｄ−グルコピラノース(1.0 g, 1.9 mmol)をア
ルゴン雰囲気下無水DCM (6 mL)と無水DMF (0. 4 mL)に溶解した。結果物の溶液を０℃で
撹拌した。オキサリルブロミド(4 mL, 2M in DCM, 24 mmol)を５分以上かけて液滴により加えた。該反応物をRTで撹拌した。４０分後、薄層クロマトグラフィー(ペトロール: 酢
酸エチル, 2: 1) は主生成物(Rf 0.7)が得られたことを示した。該反応物は０℃まで冷却し、５分以上氷冷水(30 mL)を加えて急冷した。該反応物はDCM (20 mL)と水に分離した。水溶性相はDCM (3 x 20 mL)で再抽出し、これらの混合有機相を塩水(40 mL)で洗浄し、MgS04で乾燥、濾過し、真空中で濃縮することにより標記の化合物(1. 10 g, 95%)を粗製黄
色オイルとして得た; 
δH (400 MHz, CDCl3), 3.57 (1H, dd, J1, 23. 5 Hz, J2, 3 9.1 Hz, H-2), 3.68 (1H, dd, J5, 6 2.1 Hz, J6,6'11. 0 Hz, H-6), 3.79-3. 84 (2H, m, H-4, H-6'), 4.07 (1H, at, J 9. 1 Hz, H-3), 4.07-4. 11 (1H, m, H-5), 4.47-4. 62 (3H, m, PhCH2), 4.74 (s, 2H, PhCH2), 4.84- 4.89 (2H, m, PhCH2), 5.10 (1H, d, J 11.1 Hz, PhCH2), 6.46 (1H, d, H-1), 7.15-7. 41 (20H, m, Ar-H)。
【０１７１】
実施例３３：２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシルフェニルチオスルフォネート
【０１７２】
【化３１】
2007527376.tif 000037
【０１７３】
２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−Ｄ−α−グルコピラノシルブロミド(3.55 g, 5.88 mmol)とソディウムフェニルチオスルフォネート(4.76 g, 24.3 mmol)を無水1,4ジオ
キサン(90 mL)に溶解した。該反応物をアルゴン雰囲気下７０℃まで加熱した。２０時間
後、薄層クロマトグラフィー(ペトロール:酢酸エチル, 2: 1)は、出発原料(Rf 0. 7)が完全に消費されるとともに主生成物(Rf 0.6)が得られたことを示した。該反応物はRTまで冷却して濾過し、沈殿物をペトロール/酢酸エチルで洗浄し、濾液を真空中で濃縮した。残
留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチル, 4 : 1)によって
精製することにより、２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−Ｄ−グルコピラノシルフェニルチオスルフォネート(3. 18 g, 78%)をβ：α比が３：１のα、β化合物混合物である白色粘性ゴムとして得た。酢酸エチル／ペトロールからの選択的な再結晶により、純粋な２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシルフェニルチオスルフォネートを白色結晶固体として得た;
融点 106-108℃;
[α] D22+21. 4 (c, 0. 35 in CHCl3) ; δH (500 MHz, C6D6) 3.21 (1H, ddd, J4, 5 9.
7 Hz, J5, 6 1. 4 Hz, J5, 6' 3.8 Hz, H-5), 3.29 (1H, dd, J5, 61. 4 Hz, J6,6' 11.
1 Hz, H-6), 3.34 (1H, dd, J1, 2 9.9 Hz, J2, 3 8.7 Hz, H-2), 3.49 (1H, dd, J5, 6
3.8 Hz, J6, 6' 11.1 Hz, H-6'), 3.51 (1H, at, J9. 4 Hz, H-3), 3.60 (1H, at, J9. 4 Hz, H-4), 4.15, 4.25 (2H, ABq, J 12.1 Hz, PhCH2), 4.52, 4.58 (2H, ABq, J 11.0 Hz, PhCH2), 4.72, 4.76 (2H, ABq, J 11.3 Hz, PhCH2), 4.78, 4.52 (2H, ABq, J 11.3 Hz, PhCH2), 5.25 (1H, d, J1,2 10. 2 Hz, H-1), 6.82-6. 88 (3H, m, Ar-H), 7.05-7. 26 (20H, m, Ar-H), 7.96-7. 98 (2H, m, Ar-H)。
【０１７４】
実施例３４：エチル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−１−ジチオ−β−Ｄ−グルコピラノシルジスルフィド
【０１７５】
【化３２】
2007527376.tif 000038
【０１７６】
２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルフェニルチオスルフォネート(100 mg, 0.14 mmol)とトリエチルアミン(0.02 mL, 0.14 mmol)を無水DCM (10 mL)中に溶解し、アルゴン雰囲気下RTで撹拌した。これにエタンチオール(11 μL, 0.14 mmol)の無水DCM (10 mL)溶液をシリンジ・ポンプを通して９０分以上かけてゆっくりと液滴状により加えた。９０分後、薄層クロマトグラフィー(ペトロール:酢酸エチル, 6: 1)は
出発原料(Rf 0. 2)を完全に消費するとともに主生成物(Rf 0.4)が得られたことを示した
。該溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロー
ル: 酢酸エチル, 7: 1)によって精製することにより、標記の化合物を澄んだオイル(83 mg, 95%)として得た; 
[α] D22-164. 9 (c, 0.2 in CHCl3) [Lit. [α] D25-80. 0 (c, 3.0 in MeOH) (Davis, B. G.; Ward, S. J.; Rendle, P. M. Chem. Commun. 2001, 189)] ; δH (400 MHz, CDCl3) 1.22 (1H, t, J 7. 3 Hz, CH3), 2.68-2. 86 (2H, m, CH2), 3.24 (1H, ddd, J4, 5 9.7 Hz, J5,6 3.3 Hz, J5,6' 2. 1 Hz, H-5), 3. 56-3. 60 (2H, m, H-6, H-6'), 3. 61 (1H, at, J 9.1 Hz, H-3), 3.72 (1H, at, J9. 4 Hz, H-4), 3. 89 (1H, at, J 9. 1 Hz, H-2), 4. 34 (1H, d, J1,2 9.7 Hz, H-1), 4. 37, 4. 31 (2H, Abq, J 12.2 Hz, PhCH2),
4.56, 4. 83 (2H, Abq, J 11.3 Hz, PhCH2), 4. 77-4. 83 (2H, m, PhCH2), 4. 90 (1H,
d, J 11.1 Hz, PhCHH), 4. 97 (1H, d, J 10.7 Hz, PhCHH), 7. 07-7. 21 (14H, m, Ar-H), 7.25-7. 27 (2H, m, Ar-H), 7. 29-7. 31 (2H, m, Ar-H), 7. 36-7.38 (2H, m, Ar-H)。
【０１７７】
実施例３５：Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−１−ジチオ−β−Ｄ−グルコピラノシルジスルフィド）−Ｌ−セリンメチルエステル
【０１７８】
【化３３】
2007527376.tif 000039
【０１７９】
２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシルフェニルチオスルフォネート(50 mg, 0.07 mmol)を無水DCM (5 mL)中で溶解し、アルゴン雰囲気下RTで撹拌した。これにＮ−アセチル−Ｌ−システイン−Ｌ−セリンメチルエステル(19 mg, 0.07 mmol) およびトリエチルアミン(11 μL, 0. 08 mmol)を無水DCM (5 mL)およびメタノール(0.5 mL)に溶解させた溶液を５時間以上シリンジ・ポンプを通して液滴によりゆっくり加え
た。５時間後、薄層クロマトグラフィー(酢酸エチル)は出発原料(Rf 0. 9)を完全に消費
するとともに主生成物(Rf 0.6)が得られたことを示した。該溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル)によって精製することにより、標記の化合物(48 mg, 82%)を白色結晶固体として得た;
融点 96-97℃ ;
[α] D22+56. 2 (c, 1 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3) 2.03 (3H, s, COCH3), 3.19 (1H, dd, JCH,H 14.0 Hz, JCH,αH 8.3 Hz, CysCHH), 3. 37 (1H, dd, JCH,H 14.3 Hz, JCH,αH 6.0 Hz, CysCHH), 3.64 (1H, ddd, J4,5 9.6 Hz, J5,6 1.8 Hz, J5,6' 3.9 Hz, H-5), 3.72 (1H, at, J 9.2 Hz, H-4), 3.77 (1H, at, J 8. 8 Hz, H-3), 3.82 (3H, s, OMe), 3.84-3. 90 (4H, m, SerCHH, H-2, H-6, H-6'), 3.96 (1H, dd, JCH,H 11.7 Hz, JCH,αH 3.3 Hz, SerCHH), 4.50 (1H, d, J1, 2 9.6 Hz, H-1), 4.51, 4.70 (2H, ABq, J 11.6 Hz, PhCH2), 4.55, 4. 85 (2H, ABq, J 10.4 Hz, PhCH2), 4.59-4. 62 (1H, m, αHSer), 4.81, 4.87 (2H, ABq, J 10.6 Hz, PhCH2), 4.91, 4.97 (2H, ABq, J 11.0 Hz, PhCH2), 4. 93-4. 98 (1H, m,αHCys), 6.88 (1H, bd, JNH,H 7. 9 Hz, NHAc), 7.13-7. 39 (20H, m, 20 x Ar-C), 7. 48 (1H, d, JNH,H 7.6 Hz, NHSer)。
【０１８０】
実施例３６：２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシルフェニルチオスルフォネート
【０１８１】
【化３４】
2007527376.tif 000040
【０１８２】
２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシルブロミド(200 mg, 0.21 mmol)を無水アセ
トニトリル中(10 mL)に溶解した。これにソディウムベンゼンチオスルフォネート(80 mg,
0.41 mmol)とテトラブチルアンモニウムイオダイド(10 mg, 0.02 mmol)を加えた。結果
物混合物をアルゴン雰囲気下７０℃で撹拌した。２時間後、薄層クロマトグラフィー(ペ
トロール: 酢酸エチル, 1: 2)は出発原料(Rf 0. 5)を完全に消費するとともにUV活性の生成物(Rf 0.5)が得られたことを示した。ここで該溶液をRTまで冷却して濾過し、濾液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチ
ル, 1: 2)によって精製することにより、標記の化合物(140 mg, 62%)を白色アモルファス固体として得た;
[α] D22+69. 9 (c, 0.75 in CHCl3) ; δH (500 MHz, CDCl3) 2.03, 2.04, 2.06, 2.08,
2.11, 2.15, 2.19, (30H, 10 x COCH3), 3.77-3. 79 (1H, m, H-5a), 3.94-4. 00 (4H, m, H-4a, H-4c, H-5b, H-5c), 4.10 (1H, dd, J5, 6 2.1 Hz, J6,6' 12. 4 Hz, H-6b), 4
.17-4. 22 (3H, m, H-6a, H-6c, H-6a'), 4.29 (1H, dd, J5, 6 3.3 Hz, J6, 6' 12. 6 Hz, H-6b'), 4.46 (1H, dd, J5, 6 1. 9 Hz, J6,6' 12.4 Hz, H-6c'), 4.76 (1H, dd, J1,23. 9 Hz, J2, 3 10.4 Hz, H-2a), 4.89-4. 94 (2H, m, H-2b, H-2c), 5.12 (1H, at, J 9.9 Hz, H-4b), 5.28 (1H, d, J1, 2 3. 8 Hz, H-1a), 5.34 (1H, d, J1, 29. 7 Hz, H-1c), 5.37 (1H, at, J9.1 Hz, H-3c), 5.41 (1H, at, J 10.1 Hz, H-3b), 5.41-5. 45 (2H, m, H-1b, H-3a), 7.62-7. 65 (2H, m, Ar-H), 7.71 (1H, m, Ar-H), 8.00-8. 02 (2H, m, Ar-H)。
【０１８３】
実施例３７：エチル２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−１−ジチオ−β−Ｄ−グルコピラノシルジスルフィド
【０１８４】
【化３５】
2007527376.tif 000041
【０１８５】
２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシルフェニルチオスルフォネート(50 mg, 0.05 mmol)を無水DCM (10 mL)に溶解し、アルゴン雰囲気下RT
で撹拌した。トリエチルアミン(7 μL, 0.05 mmol)とエタンチオール(3μL, 0.05 mmol)
と無水DCM (10 mL)との溶液をシリンジ・ポンプを通して１時間以上かけてゆっくりと液
滴により加えた。１時間後、薄層クロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチル, 1: 2)は出発原料(Rf 0. 4)を完全に消費するとともに主生成物(Rf 0.6)が得られたことを示した
。該溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロー
ル: 酢酸エチル, 1: 2)によって精製することにより、標記の化合物(43 mg, 93 %)を澄んだオイルとして得た；
[α] D24 +26.4 (c, 1.5 in CHCl3) ; δH (500 MHz, CDCI3) 1.30 (1H, t, J7. 2 Hz, CH3), 2.04, 2.05, 2.06, 2.07, 2.10, 2. 14, 2.19, 2.20 (30H, 8 x s, 10 x COCH3), 2.75-2. 87 (2H, m, CH2CH3), 3.77-3. 81 (1H, m, H-5a), 3.96-4. 00 (3H, m, H-4b, H-5c, H-5b), 4.03 (1H, at, J 9.3 Hz, H-4a), 4.10 (1H, dd, J5,6 2. 3 Hz, J6,6' 12. 6 Hz, H-6c), 4.22 (1H, dd, J5,6 2.9 Hz, J6, 6' 12.4 Hz, H-6b), 4.29 (1H, dd, J5,
6 3.7 Hz, J6, 6' 12. 4 Hz, H-6'c), 4.33 (1H, dd, J5, 6 4.4 Hz, J6, 6'12. 4 Hz, H-6a), 4.51 (1H, dd, J5, 6' 1.8 Hz, J6,6' 12.4 Hz, H- 6b', 4.57 (1H, dd, J5, 6 2.3 Hz, J6,6' 12.4 Hz, H-6a'), 4. 58 (1H, d, J1,2 9. 9 Hz, H-1a), 4.79 (1H, dd, J1,2 4.1 Hz, J2,3 10. 6 Hz, H-2b), 4.90 (1H, dd, J1, 2 4.3 Hz, J2, 3 10.4 Hz, H-2c), 5.11 (1H, at, J 9. 9 Hz, H-4c), 5.16 (1H, at, J 9. 5 Hz, H-2a), 5.33 (1H, d,
J1,2 4.1 Hz, H-1b), 5.37 (1H, at, J8. 9 Hz, H-3a), 5. 38-5. 44 (2H, m, H-3b, H-3c), 5.45 (1H, d, J1,2 4.1 Hz, H-1c)。
【０１８６】
実施例３８：Ｎ−ブトキシカルボニル−Ｌ−システイン（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−１−ジチオ
−β−Ｄ−グルコピラノシルジスルフィド）−Ｌ−セリンメチルエステル
【０１８７】
【化３６】
2007527376.tif 000042
【０１８８】
２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシルフェニルチオスルフォネート(89 mg, 0.08
mmol)を無水DCM (5 mL)に溶解し、アルゴン雰囲気下RTで撹拌した。トリエチルアミン(0. 014 mL, 0.2 mmol)およびＮ−ブトキシカルボニル−Ｌ−システイニル−Ｌ−セリンメ
チルエステル(30 mg, 0.09 mmol)を無水DCM (10 mL)および無水メタノール(1 mL)に溶解
させた溶液をシリンジ・ポンプを通して３時間以上かけてゆっくりと液滴により加えた。３時間後、薄層クロマトグラフィー(酢酸エチル)は出発原料(Rf 0. 7)を完全に消費する
とともに主生成物(Rf 0.6)が得られたことを示した。該溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル)によって精製することにより、標記の化合物(66 mg, 74%)をアモルファス固体として得た;
[α] D24 +25.1 (c, 1.25 in CHCl3) ; δH (500 MHz, CDCl3) 1.47 (9H, s, C (CH3) 3), 2.00, 2.01, 2.02, 2.03, 2.06, 2.09, 2.15, 2.18 (30H, 8 x s, 10 x COCH3), 2.75-2. 87 (1H, m, CHHCys), 3.16- 3.19 (1H, m, CHHCys), 3.27 (1H, t, J 6.2 Hz, OH), 3.81 (3H, s, OMe), 3.83-3. 85 (1H, m, H-5a), 3.92-4. 01 (6H, m, H-4b, H-5b, H-5c,
H6a, H-6a', CHHSer), 4.06 (1H, dd, J5, 6 2.2 Hz, J6, 6' 12.2 Hz, H-6c), 4.09-4.
16 (2H, m, H-4a, H-6b), 4.25 (1H, dd, J5, 6 3.2 Hz, J6, 6' 12. 3 Hz, H-6c'), 4.39-4. 41 (1H, m, CHHSer), 4. 52-4. 67 (4H, m,αHSer, αHCys, H-1a, H-6'b), 4.74 (1H, dd, J1,2 4.1 Hz, J2, 3 10.3 Hz, H-2b), 4.85 (1H, dd, J1,2 3.7 Hz, J2,3 10.5
Hz, H-2c), 5.07 (1H, at, J 9. 9 HZ, H-4c), 5.11-5. 13 (1H, m, H-2a), 5.28 (1H, d, J1, 2 4.1 Hz, H-1b), 5.32-5. 41 (4H, m, H-3a, H-3b, H-3c, NHCys), 5.42 (1H, d, J1, 2 3.9 Hz, H-1c), 7.25 (1H, bd, JNH,αH 6.7 Hz, NHSer)。
【０１８９】
実施例３９：フェニル２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−１−セレネニルスルフィド−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド
【０１９０】
【化３７】
2007527376.tif 000043
【０１９１】
２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシルチオール(500 mg, 0.53 mmol)とフェニル
セレニウムブロミド(200 mg, 0.9 mmol)を無水DCM (20 ml)中に溶解した。５時間後、薄
層クロマトグラフィー(ペトロール:酢酸エチル 1: 2)は出発原料(Rf 0. 3)を完全に消費
するとともに主生成物(Rf 0.4)が得られたことを示した。該反応物をトリエチルアミン(5
ml)を加えて急冷し、真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロール:酢酸エチル 1: 2)によって精製することにより、標記の化合物(527 mg, 91%)を白色がかったアモルファス固体として得た；
[α] D25-2. 6 (c, 1.0 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3), 1.99, 2.01, 2.02, 2.04, 2.06, 2.10, 2.14 (30H, 9 x s, 10 x OAc), 3.79 (1H, dat, J4, 5 9.7 Hz, J3. 4 Hz, H-5a), 3.92 (3H, m, H4b, H-5b, H-5c), 4.00 (1H, at, J 9. 3 Hz, H-4a), 4.05 (1H, dd, J5,6 2.8 Hz, J6,6' 12. 8 Hz, H-6c), 4.15 (1H, dd, J5,6 2. 8 Hz, J6,6' 12.6 Hz, H-6b), 4.22 (1H, dd, J5,6 3. 7 Hz, J6, 6' 12.0 Hz, H-6a), 4.25 (1H, dd, J5, 6
3.3 Hz, J6,6' 12. 0 Hz, H-6c'), 4.42-4. 46 (2H, m, H-6a', H-6b'), 4.66 (1H, d, J1,2 9.9 Hz, H-1a), 4.74 (1H, dd, J1, 2 4.1 Hz, J2,3 10.4 Hz, H-2b), 4.86 (1H, dd, J1, 2 4.1 Hz, J2, 310. 5 Hz, H-2c), 5.06 (1H, at, J 9. 6 Hz, H-4c), 5.07 (1H,
at, J 9.8 Hz, H-2a), 5.27 (1H, d, J1, 2 4.4 Hz, H-1b), 5.32-5. 39 (3H, m, H-3a,
H-3b, H-3c), 5.41 (1H, d, J1, 2 4.2 Hz, H-1c), 7.27-7. 29 (3H, m, Ar-H), 7.64-7. 67 (2H, m, Ar-H)。
【０１９２】
実施例４０：ビス−Ｎ−ブトキシカルボニル−Ｌ−システイニル−Ｌ−トレオニンメチルエステル
【０１９３】
【化３８】
2007527376.tif 000044
【０１９４】
ビス−Ｎ−ブトキシカルボニル−Ｌ−システイン(4.0 g, 9.1 mmol)、Ｌ−トレオニンメ
チルエステル(2.42 g, 18.2 mmol)、DCC (3.75 g, 18.2 mmol)、HOBt (2.46 g, 18.2 mmol)およびDIPEA (2.5 ml, 18.2 mmol)を新たに蒸留したDCM (150 mL)中に溶解した。１８
時間後、薄層クロマトグラフィー (酢酸エチル: メタノール 9: 1)は出発原料(Rf 0. 0)
を完全に消費するとともに主生成物(Rf 0.5)が得られたことを示した。該反応物を水(2 x
100 ml)で希釈し、相を分離させた。有機相を塩(100 ml)水で洗浄し、MgSO4で乾燥、濾
過し、真空中で溶媒を除去した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(酢酸エ
チル: メタノール9: 1)によって精製し、メタノール／ジエチルエステルから再結晶させ
ることにより、標記の化合物 (3.26 g, 60%)を白色結晶固体として得た;
融点145-147℃ ;
[α] D25 +20.8 (c, 1.0 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3), 1.23 (3H, d, JCH,CH3 6.6 Hz, CHCH3), 1.44 (9H, s, C (CH3) 3), 3.11-3. 12 (2H, m, CH2Cys), 3.26 (1H, bs,
OH), 3.75 (3H, s, OMe), 4.32-4. 36 (1H, m, CHCH3), 4.61 (dd, JNH, αThr 8. 7 Hz, JαH,CHCH3 2. 15 Hz, CHCH3), 4.63-4. 68 (1H, m,αCys), 5.75 (1H, d, JNH,αHCys
7. 4 Hz, NHCys), 7.56 (1H, d, JNH,αThr 8. 6 Hz, NHThr)。
【０１９５】
実施例４１：Ｎ−ブトキシカルボニル−Ｌ−システイニル−Ｌ−トレオニンメチルエステル
【０１９６】
【化３９】
2007527376.tif 000045
【０１９７】
ビス−Ｎ−ブトキシカルボニル−Ｌ−システイニル−Ｌ−トレオニンメチルエステル(2.0
g, 3.3 mmol)を液体クロロフォルム(100 mL)とメタノール(10 mL)中で溶解し、撹拌した。この攪拌溶液にトリエチルフォスフィン (1.0 mL, 4.0 mmol)を加えた。２時間後、薄
層クロマトグラフィー (酢酸エチル: メタノール 9: 1)は出発原料(Rf 0. 7)を完全に消
費するとともに生成物(Rf 0.8)が得られたことを示した。該溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル)によって精製することにより、標記の化合物(2.0 g, 99%)を白色体として得た;
[α] D25-11. 4 (c, 1.0 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3) 1.09 (3H, d, JCH, CH3 6.4 Hz, CH3), 1.34 (9H, s, C (CH3) 3), 1.65 (1H, at, J 8. 7 Hz, SH), 2.72-2. 89 (2H, m, CH2), 3.66 (3H, s, OMe), 3.96 (1H, m, OH), 4.24-4. 28 (1H, m, CHCH3), 4.34-4. 36 (1H, m, αHCys), 4.49 (1H, dd, JαHThr,NH 8.5 Hz, JαHThr,CHCH3 2.7 Hz, 
αHThr), 5.82 (1H, d, JαHCys, NH 8. 2 Hz, NHCys), 7. 38 (1H, d, JαHThr,NH 8. 5
Hz, NHThr)。
【０１９８】
実施例４２：Ｎ−ブトキシカルボニル−Ｌ−システイン（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−ジチオ−β−Ｄ−グルコピラノシルジスルフィド）−Ｌ−トレオニンメチルエステル
【０１９９】
【化４０】
2007527376.tif 000046
【０２００】
フェニル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−セレネニルスルフィド−Ｄ−β−グルコピラノシド(130 mg, 0.25 mmol)とトリエチルアミン(0.02 mL, 0. 18 mmol)を新たに蒸留したDCM (10 mL)に溶解した。該結果物溶液をRTで撹拌した。Ｎ−ブトキシカルボ
ニル−Ｌ−システイン−Ｌ−トレオニンメチルエステル(30 mg, 0. 089 mmol)の無水メタノール(4 mL)溶液を上記溶液にゆっくりと加えた。１０分後、薄層クロマトグラフィー (ペトロール: 酢酸エチル, 1: 2)は出発原料(Rf 0. 5)を完全に消費するとともに生成物(Rf 0.2)が得られたことを示した。該溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチル, 1: 2)によって精製することにより、標記の化合物(32 mg, 51 %)を白色アモルファス固体として得た;
[α] D25-81. 2 (c, 0.25 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3) 1.28 (3H, d, JCHCH3 6.7
Hz, CHCH3), 1.51 (9H, s, C (CH3) 3), 2.06, 2. 08, 2.10 2.14 (12H, 4 x s, 4 x OAc), 2.86 (1H, bs, OH), 3.06 (1H, dd, JCHαH 8. 8 Hz, JCHCH 13.4 Hz, CHHCys), 3.3
1 (1H, dd, JCHαH 4. 2 Hz, JCHCH 13.1 Hz, CHHCys), 3.82 (3H, s, OCH3), 3. 87- 3.89 (1H, m, H-5), 4.32-4. 38 (2H, m, H-6, H-6'), 4.39 (1H, dd, JCHCH3 6.4 Hz, JCHαH 2.5 Hz, CHOH), 4.60-4. 65 (3H, m, H-1, αHThr, αHCys), 5.20-5. 32 (3H, m, H-2, H-3, H-4), 5.42 (1H, d, JNHαH 8. 0 Hz, NHCys), 7.12 (1H, d, JNHαH 8.9 Hz, NHThr)。
【０２０１】
実施例４３：Ｎ−ブトキシカルボニル−Ｌ−システイン（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−ジチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルジスルフィド）−Ｌ−トレオニンメチルエステル
【０２０２】
【化４１】
2007527376.tif 000047
【０２０３】
フェニル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−セレネニルスルフィド−Ｄ−β−ガラクトピラノシド(140 mg, 0.27 mmol)とトリエチルアミン(0.01 mL, 0.089 mmol)を新たに蒸留したDCM (5 mL)に溶解した。該結果物溶液をRTで撹拌した。Ｎ−ブトキシカルボニル−Ｌ−システイン−Ｌ−トレオニンメチルエステル(26 mg, 0.077 mmol)を無水DCM (5 mL)および無水メタノール(4 mL)に溶解させた溶液を上記溶液にゆっくりと加えた。１
０分後、薄層クロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチル, 1: 2)は出発原料(Rf 0. 6)
を完全に消費するとともに生成物(Rf 0.2)が得られたことを示した。該溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチル, 1: 2)によって精製することにより、標記の化合物(49 mg, 93%)を白色アモルファス固体として得た;
[α] D25-81. 2 (c, 0.25 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3) 1.24 (3H, d, JCHCH3 6.4
Hz, CH3), 1.46 (9H, s, C (CH3) 3), 2.01, 2.06, 2.08, 2.20 (12H, 4 x s, 4 x OAc), 2.79 (1H, bd, JCH,OH 4.1 Hz, OH), 2.99 (1H, dd, JαH,CH2 8.8 Hz, JCH,H 13.9 Hz, CHHCys), 3.32-3. 35 (1H, m, CHHCys), 3.76 (3H, s, OCH3), 4.04 (1H, at, J6.2 Hz, H-5), 4.10-4. 16 (1H, m, H-6), 4.19 (1H, dd, J5,6' 6.1 Hz, J6,6' 10. 8 Hz, H-6'), 4. 36-4. 46 (1H, m, CHOH), 4.56 (1H, dd, JαHThr,CH 2.4 Hz, JαH,NH 8. 9 Hz,
αHThr), 4.57-4. 64 (1H, m, αHCys), 4.65 (1H, d, J1,2 9.0 Hz, H-1), 5.13 (1H, dd, J2, 3 9. 8 Hz, J2,3 9. 8 Hz, H-3), 5. 3 1 (1 H, d, JαHCys,NH 8. 3 Hz, NHCys), 5.47 (1H, d, J3,4 3.2 Hz, H-4), 5.52 (1H, at, J9. 6 Hz, H-2), 6.91 (1H, d, J
αHThr,NH 9.0 Hz, NHThr)。
【０２０４】
実施例４４：ブトキシカルボニル−Ｌ−システイニル−（Ｓ−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシルジスルフィド）−Ｌ−トレオニンメチルエステル
【０２０５】
【化４２】
2007527376.tif 000048
【０２０６】
出発物質としてフェニル３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−アセトアミド−２−デオキシ−１−セレネニルスルフィド−Ｄ−β−を利用した実施例４３の類似の方法によって、標記の化合物を白色アモルファス固体(55mg, 88%)として得た。
[α] D25 -47. 1 (c, 0. 1 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3) 1.17 (3H, d, JCH, CH3 6.4 Hz, CH3), 1.49 (9H, s, C (CH3) 3), 1.91, 2. 00, 2.02, 2.07 (12H, 4 x s, 4 x,
COCH3), 2.99 (1H, dd, JCHH,CHH 13.5 Hz, JαH,CH 10.0 Hz, CHH), 3.38 (1H, dd, J
αH,CH 4.8 Hz, JCHH,CHH 13. 5 Hz, CHH), 3. 88-3. 91 (1H, m, H-5), 4. 16-4. 32 (4H, m, H-2, H-6, H-6', CHCH3), 4. 45 (1H, d, JαH,CH 2.7 Hz, αHThr), 4. 54 (1H, dd, JαH,CH,H9.7 Hz, JαH,CHH4.7 Hz, αHCys), 4. 79 (1H, d, J1, 2 10.1 Hz, H-1),
5. 06 (1H, at, J 9. 7 Hz, H-4), 5. 28 (1H, at, J 9.7 Hz, H-3)。
【０２０７】
実施例４５：Ｎ−ブトキシカルボニル−Ｌ−システイニル−(Ｓ−1−β−Ｄ−グルコピラノシルジスルフィド)−Ｌ−トレオニンメチルエステル
【０２０８】
【化４３】
2007527376.tif 000049
【０２０９】
フェニル１−セレネニルスルフィド−Ｄ−β−グルコピラノシド(70 mg, 0.2 mmol)とト
リエチルアミン(0.01 mL, 0.1 mmol)をメタノール中(8 mL)に溶解した。該結果物溶液をRTで撹拌した。Ｎ−ブトキシカルボニル−Ｌ−システイン−Ｌ−トレオニンメチルエステ
ル (22 mg, 0.07 mmol)のメタノール(5 mL) 溶液を上記溶液にゆっくりと加えた。10分後、薄層クロマトグラフィー(酢酸エチル:メタノール, 9: 1)は主生成物(Rf 0.4)が形成さ
れたことを示した。該溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル:メタノール, 9: 1)によって精製することにより、標記の化合物(32 mg, 91%)を白色アモルファス固体として得た；
[α] D25-139. 5 (c, 0.6 in MeOH) ; δH (500 MHz, CD30D) 1.19 (3H, d, JCH,CH3 6.2
Hz, CHCH3), 1.49 (9H, s, C (CH3) 3), 2.93 (1H,dd,JCHH,CHH13.5Hz, JCH,αH9. 5 Hz, CH2Cys), 3.32-3. 46 (4H, m, H-3, H-4, H-5, CHH), 3.60-3. 63 (1H, m, H-2), 3.73-3. 77 (1H, m, H-6), 3.78 (3H, s, OMe), 3.92-3. 94 (1H, m, H-6'), 4. 31-4. 36 (1H, m, CHCH3), 4.39 (1H, d, J1, 2 9.3 Hz, H-1), 4. 48 (1H, d, JαH,CH 2. 9 Hz, αHThr), 4.69 (1H, dd, JαH,CHH9. 0 Hz, JαH,CHH5.2 Hz, αHCys)。
【０２１０】
実施例４６：Ｎ−ブトキシカルボニル−Ｌ−システイニル−(Ｓ−２−アセトアミド−２
−デオキシ−１−β−Ｄ−グルコピラノシルジスルフィド）−Ｌ−トレオニンメチルエステル
【０２１１】
【化４４】
2007527376.tif 000050
【０２１２】
出発物質としてフェニル２−アセトアミド−２−デオキシ−１−セレネニルスルフィド−β−Ｄ−グルコピラノシドを利用した実施例４５の類似の方法によって、標記の化合物を白色アモルファス固体(32 mg, 91 %)として得た。
[α] D25+6.21 (c, 0.45 in MeOH) ; δH  (500 MHz, CD3OD) 1.19 (3H, d, JCHCH3 6.7 Hz, CHCH3), 1.49 (9H, s, C (CH3) 3), 1.99 (3H, s, COCH3), 2.97 (1H, dd, JCH, H 13. 8 Hz, JCH,αH 9.6 Hz, CHHCys), 3.31-3. 33 (1H, m, CHH), 3.38-3. 41 (1H, m, H-5), 3.45 (1H, at, J9. 3 Hz, H-4), 3.54 (1H, dd, J2, 3 8. 6 Hz, J3,4 9.8 Hz, H-3), 3.76-3. 77 (1H, m, H-6), 3.78 (3H, s, OMe), 3.79-4. 01 (2H, m, H-2, H-6'), 4.33 (1H, dq, JCHCH3 6.3 Hz, JCH,αH3.0 Hz, CHCH3), 4.48 (1H, d, JαH,CH 3.0 Hz, αHThr), 4.59 (1H, d, J1,2 10. 3 Hz, H-1), 4.63- 4.67 (1H, m, αHcys)。
【０２１３】
実施例４７：フェニル−１−セレネニルスルフィド−β−Ｄ−グルコピラノシド
【０２１４】
【化４５】
2007527376.tif 000051
【０２１５】
１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド(200 mg, 0.9 mmol)とフェニルセレネニルブロミド(230 mg, 1. 0 mmol)を無水１，４−ジオキサン(5mL)に加え、アルゴン雰囲気下撹拌した。１分後、薄層クロマトグラフィー(酢酸エチル)は主生成物(Rf 0.2)が得られたことを示した。該反応物はトリエチルアミン(2 mL)を加えて急冷した。該溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル: メタノール, 9: 1)によって精製することにより、標記の化合物(165 mg, 57%)を白色アモルファス固体として得た;[α] D22+56. 2 (c, 1 in CHCl3) ; δH  (400 MHz, MeOD) 3.31-3. 33 (2H, m, H-3, H-5), 3.39-3. 45 (2H, m, H-2, H-4), 3.62 (1H, dd, J5,6 5.3 Hz, J6, 6' 12.1 Hz, H-6), 3.83 (1H, dd, J5, 6' 1.9 Hz, J6, 6' 12.2 Hz, H-6), 4.47 (1H, d, J1, 2 9.4 Hz,
H-1), 7. 27- 7. 34 (3H, m, Ar-H), 7.75-7. 78 (2H, m, Ar-H)。
【０２１６】
実施例４８：フェニル−１−セレネニルスルフィド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
【０２１７】
【化４６】
2007527376.tif 000052
【０２１８】
出発物質として１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを利用した実施例４７の類似の方法によって、標記の化合物を白色がかったアモルファス固体(193mg, 20%)として得た；
[α] D25-111. 4 (c, 1 in MeOH) ; δH  (400 MHz, CD3OD) 3.52 (1H, dd, J2, 3 9. 4 Hz, J3,4 3.3 Hz, H-3), 3.56 (1H, at, J4,5 0.9 Hz, J6. 5 Hz, H-5), 3.67-3. 69 (2H, d, J 6. 0 Hz, H-6, H-6'), 3.74 (1H, at, J 9.3 Hz, H-2), 3.91 (1H, dd, J3,4 3. 2 Hz, J4, 5 0. 7 Hz, H-4), 4.45 (1H, d, J1, 2 9.7 Hz, H-1), 7.27-7. 30 (3H, m, Ar-H), 7.76-7. 79 (2H, m, Ar-H)。
【０２１９】
実施例４９：フェニル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−セレネニルスルフィド−β−Ｄ−グルコピラノシド
【０２２０】
【化４７】
2007527376.tif 000053
【０２２１】
１−チオ−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノース(200 mg,
0.6 mmol)とフェニルセレネニルブロミド(150 mg, 0.6 mmol)を新たに蒸留したDCM (5 mL)に加え、アルゴン雰囲気下RTで撹拌した。５分後、薄層クロマトグラフィー (ペトロール: 酢酸エチル, 1: 1)は出発原料(Rf 0. 4)を完全に消費するとともに生成物(Rf 0.5)が得られたことを示した。該反応物はトリエチルアミン(2 mL)を加えて急冷し、５分間撹拌した。残留物はDCM (5 mL)と水(10 mL)に分離し、水溶性相はDCM (3 x 5 mL)で再抽出し
た。これらの混合有機相は塩水(10 mL)で洗浄し、MgS04で乾燥、濾過し、溶媒を真空中で除去した。結果物である残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロール: 酢
酸エチル, 2: 1)によって精製することにより、標記の化合物(260 mg, 93%)を黄色結晶固体として得た；
融点111-112 ℃; 
[α] D25 -250. 1 (c, 1.0 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3) 2.02, 2.01, 2.00 (12H,
4 x s, 4 x CH3), 3.75 (1H, ddd, J4,5 9.9 Hz, J5,6 2.4 Hz, J5, 6' 4. 6 Hz, H-5),
4.08 (1H, dd, J5, 6 2.6 Hz, J6, 6' 12.4 Hz, H-6), 4.16 (1H, dd, J5 6' 4.5 Hz, J6, 6' 12. 4 Hz, H-6'), 4. 62 (1H, d, J1, 2 9. 8 Hz, H-1),5.12 (1H, at, J 9. 7 Hz, H-4), 5.20-5. 30 (2H, m, H-2, H-3), 7.25-7.28 (3H, m, Ar-H), 7.67-7. 70 (2H, m, Ar-H)。
【０２２２】
実施例５０：フェニル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−セレネニルスルフィド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
【０２２３】
【化４８】
2007527376.tif 000054
【０２２４】
出発物質として１−チオ−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノースを利用した実施例４９の類似の方法によって、標記の化合物を黄色結晶固体(402
mg, 95%)として得た；
融点 123-125 ℃ ;
[α] D25 -172. 4 (c, 1.0 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3) 1.99, 2.02, 2.16 (12H,
4 x s, 4 x CH3), 3.94-4. 03 (3H, m, H-5, H-6, H-6'), 4.64 (1H, d, J1, 2 10.1 Hz, H-1), 5.04 (1H, dd, J2, 3 10.2 Hz, J3, 4 3.3 Hz, H-3), 5.40-5. 45 (2H, m, H-2,
H-4), 7.27-7. 30 (3H, m, Ar-H), 7.69-7. 71 (2H, m, Ar-H)。
【０２２５】
実施例５１：フェニル３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−アセトアミド−２−デオキシ−１−セレネニルスルフィド−β−Ｄ−グルコピラノシド
【０２２６】
【化４９】
2007527376.tif 000055
【０２２７】
出発物質として１−チオ−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノースを利用した実施例４９の類似の方法によって、標記の化合物を白色結晶固体(300 mg, 66%)として得た；
融点177-179 ℃;
[α] D25 - 134. 0 (c, 1.0 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3) 1.90 (3H, s, NHCOCH3), 1.99, 2.00, 2.03 (9H, 3 x s, 3 x CH3), 3.76 (1H, ddd, J4, 510. 1 Hz, J5,6 2.3 Hz, J5,6' 4.7 Hz, H-5), 4.07 (1H, dd, J5, 6 2.3 Hz, J6, 6' 12.3 Hz, H-6), 4.15 (1H, dd, J5,6' 4.6 Hz, J6, 6' 12.2 Hz, H-6'), 4.19-4. 24 (1H, m, H-2), 4.78 (1H, d, J1,2 10.1 Hz, H-1), 5.09 (1H, at, J 9. 7 Hz, H-4), 5.28 (1H, at, J 9.5 Hz, H-3), 5.79 (1H, d, J 9. 1 Hz, NHAc), 7.24-7. 28 (3H, m, Ar-H), 7. 68-7. 70 (2H, m,
Ar-H)。
【０２２８】
実施例５２：フェニル２−アセチルアミノ−２−デオキシ−１−セレネニルスルフィド−β−Ｄ−グルコピラノシド
【０２２９】
【化５０】
2007527376.tif 000056
【０２３０】
１−チオ−２−アセチルアミノ−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド(230 mg, 0.98 mmol)とフェニルセレネニルブロミドをアルゴン雰囲気下で攪拌された無水1,4-ジオキ
サン(5 mL)と無水メタノール(3 ml)に加えた。１分後、薄層クロマトグラフィー(酢酸エ
チル: メタノール, 9: 1)は生成物(Rf 0.4)が得られたことを示した。該反応物はトリエ
チルアミン(5 mL)を加えて急冷した。該溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル: メタノール, 9: 1)によって精製することにより、標記の化合物 (270 mg, 70%)を白色アモルファス固体として得た; 
[α] D22-174. 0 (c, 1 in MeOH) ; δH  (400 MHz, MeOD), 1.96 (3H, s, CH3), 3.31-3. 39 (2H, m, H-4, H-5), 3.51 (1H, at, J 8.1 Hz, H-3), 3.65 (1H, dd, J5,6 5.0 Hz,
J6, 6' 11.7 Hz, H-6), 3.82-3. 90 (2H, m, H-2, H-6'), 4.65 (1H, d, J1,2 10.2 Hz,
H-1), 7.27-7. 34 (3H, m, ArH), 7.72-7. 74 (2H, m, ArH)。
【０２３１】
実施例５３：エチル１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシルジスルフィド
【０２３２】
【化５１】
2007527376.tif 000057
【０２３３】
フェニル１−セレネニルスルフィド−β−Ｄ−グルコピラノシド(140 mg, 0.4 mmol)をメタノール中(10 mL)に溶解し、RTで撹拌した。この溶液にメタノール(5 mL)に溶解させた
エタンチオール(10 μL, 0.1 mmol)およびトリエチルアミン(60 μL, 0.4 mmol)を1時間
以上液滴により加えた。１時間後、薄層クロマトグラフィー(酢酸エチル: メタノール, 9: 1)は出発原料(Rf 0. 5)を完全に消費するとともに主生成物(Rf 0.4)が得られたことを
示した。該溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(酢
酸エチル: メタノール, 5: 1)によって精製することにより、標記の化合物(165 mg, 57%)を白色アモルファス固体として得た; 
[α] D22-65. 3 (c, 0.4 in CHCl3) ; δH  (500 MHz, CD3OD) 1.33 (3H, t, J 7. 4 Hz,
CH3), 2. 86 (2H, q, J 7. 4 Hz, CH2), 3.30-3. 34 (2H, m, H-4, H-5), 3.41 (1H, at, J 9. 0 Hz, H-3), 3. 49 (1H, at, JHz, H-2), 3.67 (1H, dd, J5, 6 5.3 Hz, J6,6' 12.0 Hz, H-6), 3.88 (1H, dd, J5,6' 2.1 Hz, J6,6' 12.0 Hz, H-6'), 4. 35 (1H, d, J1,2 9. 1 Hz, H-1)。
【０２３４】
実施例５４：エチル２−アセトアミド−２−デオキシ−１−ジスルフィド−β−Ｄ−グルコピラノシド
【０２３５】
【化５２】
2007527376.tif 000058
【０２３６】
フェニル２−アセトアミド−２−デオキシ−１−セレネニルスルフィド−β−Ｄ−グルコピラノシド(140 mg, 0.4 mmol)をメタノール中(10 mL)に溶解し、RTで撹拌した。この溶
液にメタノール (5 mL)に溶解させたエタンチオール(10 μL, 0.13 mmol)およびトリエチルアミン(55 μL, 0. 4 mmol)を１時間以上かけて液滴により加えた。１時間後、薄層ク
ロマトグラフィー(酢酸エチル: メタノール, 9: 1)は主生成物(Rf 0.2)が得られたことを示した。該溶液を真空中で濃縮した。該結果物である残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル: メタノール, 5: 1)によって精製することにより、標記の化合物(38 mg, 99%)を白色アモルファス固体として得た;
[α] D25-7. 9 (c, 1.0 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CD30D) 1. 30 (3H, t, J 7. 3 Hz, CH3), 2. 01 (3H, s, OAc), 2.83-2. 86 (2H, m, CH2), 3.31-3. 39 (2H, m, H-4, H-5),
3.51-3. 56 (1H, m, H-3), 3. 68-3. 72 (1H, m, H-6), 3.84-3. 91 (2H, m, H-2, H-6'), 4.57 (1H, d, J1, 2 10. 3 Hz, H-1)。
【０２３７】
実施例５５：チオスルフォネート試薬を用いたタンパク質グリコシル化の手順
A. SBLS 156C 変異体(24 mg, 0. 89 μmol)を水溶性バッファー液 (2.4 mL, 70 mM HEPES
, 2 mM CaCl2, pH 6.9)に溶解した。２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−
グルコピラノシルフェニルチオスルフォネート (50mg, 0.1 mmol)を水／アセトニトリル (1.6 mL, 9/7 v/v)に溶解した。糖溶液(50 μL)の一部をタンパク質溶液に加え、 逆回転子に置いた。２５分後、エルマン分析(Ellman, G. L. Arch. Biochem. Biophys. 1959, 82, 70)により遊離型のチオールは存在しないことが示され、ここで糖溶液(50 μL) の残
りの部分を加えた。該反応物をさらに５分間逆回転子に置き、該反応混合物をPD10 Sephadex(R)G25 カラムに流し、HEPES 70 mM、CaCl2 2 mM、pH 7. 0で溶出した。タンパク質留分を収集し、MWCO 12-14 KDaで透析して(10 mM MES, 1 mM CaCl2, pH 5. 8, (1 x 4L を
１時間, 2 x 2Lを３０分間))、グリコシル化された生成物を得た（m/z (ES)観測値 27072
計算値27078）。
【０２３８】
B. SBLS156C 変異体(24 mg, 0.89 jjmol) を水溶性バッファー液 (2.4 mL, 70 mM HEPES,
2 mM CaCl2, pH 6.9)に溶解した。２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトコピラノシルフェニルチオスルフォネート (50mg, 0.1 mmol) を水／アセトニトリル (1.0 mL, 1/1 比) に溶解した。糖溶液(50 μL) をタンパク質溶液に加え、 逆回転子に置いた。２５分後、エルマン分析により遊離型のチオールは存在しないことが示され、ここで糖溶液(50 μL) の残りの部分を加えた。該反応物をさらに５分間逆回転子に置き
、該反応混合物をPD10 SephadexRG25 カラムに流し、HEPES 70 mM、CaCl2 2 mM、pH 7. 0で溶出した。タンパク質留分を収集し、MWCO 12-14 KDaで透析して（10 mM MES, 1 mM CaCl2, pH 5. 8, (1 x 4L を１時間, 2 x 2L ３０分間)）、グリコシル化された生成物を得た（ m/z (ES) 観測値27072 計算値 27078）。
【０２３９】
C. SBLS 156C 変異体(10 mg, 0. 37 mol) を脱気水溶性バッファー液(1 mL, 70 mM CHES,
5mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5) に溶解した。２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシルフェニルチオスルフォネート (30mg, 0.03 mmol)をアセトニトリル (150 μL)に溶解した。糖溶液(75 μL) をタンパク質溶液に加え、逆回転子に置いた。３０分後、 エルマン分析により遊離型のチオールは存在しないことが示され、ここで該反応混合物をPD10 Sephadex(R) G25 カラムに流し、HEPES 70 mM、CaCl2 2 mM、pH 7. 0で溶出した。タンパ
ク質留分を収集し、MWCO 12-14 KDaで透析して（10 mM MES, 1 mM CaCl2, pH 5. 8, (1 x
4L を１時間, 2 x 2L ３０分間)）、グリコシル化された生成物を得た（ m/z (ES) 観測値27654 計算値 27653）。
【０２４０】
D. BSA (10 mg, 0. 14 μmol) を水溶性バッファー液 (1 mL, 50 mM Tris, pH 7.7) に溶解した。２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルフェニルチオスルフォネート(lOmg, 0.02 mmol)を水／アセトニトリル(1.0 mL, 8/2比)中に溶解した。糖溶液(150 μ1) をタンパク質溶液に加え、逆回転子に置いた。３０分後、エルマン分析により遊離型のチオールは存在しないことが示され、ここで該反応混合物をPD10 Sephadex(R)G25 カラムに流し、HEPES 70 mM、CaCl2 2 mM、pH 7. 0で溶出した。タンパク質留分を収集し、MWCO 12-14 KDaで透析して（純水, (1 x 4L を１時間, 2 x 2L ３０分間)）、グリコシル化された生成物を得た（ m/z (ES) 観測値66798 計算値66794）。
【０２４１】
E. BSA (10 mg, 0.14 llmol) を水溶性バッファー液(1 mL, 50 mM Tris, pH 7.7) に溶解した。２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルフェニルチオスルフォネート (25mg, 0.05 mmol)をアセトニトリル(0.5 mL)に溶解した。糖溶液(75μL) をタンパク質溶液に加え、逆回転子に置いた。３０分後、エルマン分析により遊離型のチオールが存在しないことが示され、ここで該反応混合物をPD10 Sephadex(R)G25 カラムに流し、HEPES 70 mM、CaCl2 2 mM、pH 7. 0で溶出した。タンパク質留分を収集し、MWCO
12-14 KDaで透析して（純水, (1 x 4L を１時間, 2 x 2Lを３０分間)）、グリコシル化
された生成物を得た（ m/z (ES) 観測値66792 計算値66794）。
【０２４２】
実施例５６：セレネニルスルフィド試薬を用いたタンパク質グリコシル化の手順
A. SBLS 156C 変異体(5 mg) を脱気水溶性バッファー液(1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2
mM CaCl2, pH 9.5) に溶解した。フェニル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β
−Ｄ−セレネニルスルフィドグルコピラノシド (10 mg, 0.02 mmol)をアセトニトリル(500 μl)に溶解した。糖溶液(500 μl)をタンパク質溶液に加え、逆回転子に置いた。１時
間後、エルマン分析により遊離型のチオールは存在しないことが示され、ここで該反応混合物をPD10 Sephadex(R)G25 カラムに流し、HEPES 70 mM、CaCl2 2 mM、pH 7. 0で溶出した。タンパク質留分を収集し、MWCO 12-14 KDaで透析して（純水, (1 x 4L を１時間, 2 x 2Lを３０分間)）、グリコシル化された生成物を得た（ m/z (ES) 観測値27074 計算値27077）。
【０２４３】
B.BSA (5 mg) を脱気水溶性バッファー液(1 mL, 70 mM CES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5) に溶解した。フェニル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−セレネニ
ルスルフィドグルコピラノシド (10 mg, 0.02 mmol)をアセトニトリル(800 μl)に溶解した。糖溶液(800 μl) をタンパク質溶液に加え、 逆回転子に置いた。 １時間後、エルマン分析により遊離型のチオールは存在しないことが示され、ここで該反応混合物をPD10 Sephadex(R)G25 カラムに流し、HEPES 70 mM、CaCl2 2 mM、pH 7. 0で溶出した。タンパク質留分を収集し、MWCO 12-14 KDaで透析して（純水, (1 x 4L を１時間, 2 x 2Lを３０分間)）、グリコシル化された生成物を得た（ m/z (ES) 観測値66792 計算値 66794）。
【０２４４】
C. SBLS 156C 変異体(5 mg) を脱気水溶性バッファー液 (1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5) に溶解した。フェニル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−セレネニルスルフィドガラクトピラノシド (10 mg, 0.02 mmol) をアセトニトリル(500 μl)に溶解した。糖溶液(500 μl) をタンパク質溶液に加え、 逆回転子に置いた。１時間後、エルマン分析により遊離型のチオールは存在しないことが示され、ここで該反応混合物をPD10 Sephadex(R)G25 カラムに流し、HEPES 70 mM、CaCl2 2 mM、pH 7. 0で溶出した。タンパク質留分を収集し、MWCO 12-14 KDaで透析して（水, (1 x 4L を１時間, 2 x 2Lを３０分間)）、Glc (Ac) 4SBLS156Cを得た（ m/z (ES) 観測値27074 計算値 27077）。
【０２４５】
D. SBLS 156C 変異体(10 mg) を脱気水溶性バッファー液 (1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES,
2 mM CaCl2, pH 9.5) に溶解した。フェニル−１−セレネニルスルフィド−β−Ｄ−グ
ルコピラノシド (15 mg, 0.02 mmol)を水／アセトニトリル(0.8 mL, 1/1 比)に溶解した
。糖溶液(500 μl) をタンパク質溶液に加え、 逆回転子に置いた。３０分後、エルマン
分析により遊離型のチオールが存在しないことが示され、該反応物をさらに３０分逆回転子に置き、ここで該反応混合物をPD10 Sephadex(R)G25 カラムに流し、HEPES 70 mM、CaCl2 2 mM、pH 7. 0で溶出した。タンパク質留分を収集し、MWCO 12-14 KDaで透析して（水, (1 x 4L を１時間, 2 x 2Lを３０分間)）、AcGlcSBLS156Cを得た（ m/z (ES) 観測値27072 計算値 26911）。
【０２４６】
E. SBLS 156C 変異体(5 mg) を脱気水溶性バッファー液 (2.4 mL, 70 mM HERPES, 2 mM CaCl2, pH 6.9) に溶解した。フェニル２−アセチルアミノ−２−デオキシ−１−セレネニルスルフィド−β−Ｄ−グルコピラノシド (5 mg, 0.01 mmol)をアセトニトリル(200 μu, 1/1 比)に溶解した。糖溶液(100μl) をタンパク質溶液に加え、 逆回転子に置いた。
３０分後、エルマン分析により遊離型のチオールは存在しないことが示され、ここで糖溶液(100 μL) の残りの部分を加えた。該反応物をさらに３０分逆回転子に置き、ここで該反応混合物をPD10 Sephadex(R)G25 カラムに流し、HEPES 70 mM、CaCl2 2 mM、pH 7. 0で溶出した。タンパク質留分を収集し、MWCO 12-14 KDaで透析して（10 mM MES, 1 mM CaCl
2, pH 5. 8, (1 x 4L を１時間, 2 x 2Lを３０分間)）、HOGlcNAcSBLS156Cを得た（ m/z (ES) 観測値26950 計算値 26950）。
【０２４７】
F. SBLS 156C 変異体 (5 mg) を脱気水溶性バッファー液 (1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES,
2 mM CaCl2, pH 9.5) に溶解した。フェニル３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−ア
セチルアミノ−２−デオキシ−１−セレネニルスルフィド−β−Ｄ−グルコピラノシド (10 mg, 0.02 mmol) をアセトニトリル(500 μl)に溶解した。糖溶液 (500μl) をタンパ
ク質溶液に加え、逆回転子に置いた。１時間後、エルマン分析により遊離型のチオールが存在しないことが示され、ここで該反応混合物をPD10 Sephadex(R)G25 カラムに流し、HEPES 70 mM、CaCl2 2 mM、pH 7. 0で溶出した。タンパク質留分を収集し、MWCO 12-14 KDaで透析して（水, (1 x 4L を１時間, 2 x 2Lを３０分間)）、AcGlcNAcSBLS156Cを得た（ m/z (ES) 観測値27074 計算値 27078）。
【０２４８】
G. SBLCysl56 (5 mg) を脱気水溶性バッファー液 (500 μL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5) に溶解した。フェニル２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−１−セレネ
ニルスルフィド−４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド (15 mg, 0.015 mmol) をアセトニトリル (300 μL, 75 eq)
に溶解し、この溶液をタンパク質溶液に加え、逆回転子に置いた。３０分後、エルマン
分析により遊離型のチオールは存在しないことが示された。該反応物をさらに３０分間逆回転子に置き、ここで該反応混合物をPD10 Sephadex(R)G25 カラムに流し、HEPES 70 mM
、CaCl2 2 mM、pH 7. 0で溶出した。タンパク質留分を収集し、MWCO 12-14 KDaで透析し
て（水, (1 x 4L を１時間, 2 x 2Lを３０分間)）、Glc (Ac)4Glc (Ac)3Glc (Ac)3- SBLCysl56を得た（ m/z (ES+) 観測値27644 計算値 27653）。
【０２４９】
H. SBLCys 156 (5 mg) を脱気水溶性バッファー液 (500μL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5)に溶解した。フェニル１−セレネニルスルフィド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド (15 mg, 0.04 mmol) を水／アセトニトリル (600 μL, 1/3 比)に溶解した。糖溶液(600 μL, 230 eq) をタンパク質溶液に加え、 逆回転子に置いた。３０分後、エル
マン分析により遊離型のチオールは存在しないことが示され、該反応物をさらに３０分間回転子に置き、ここで該反応混合物をPD10 Sephadex(R)G25カラムに流し、HEPES 70 mM、CaCl2 2 mM、pH 7. 0で溶出した。タンパク質留分を収集し、MWCO 12-14 KDaで透析して
（水, (1 x 4L を１時間, 2 x 2Lを３０分間)）、Gal-SBLCysl56を得た（ m/z (ES+) 観
測値26908 計算値 26909）。
【０２５０】
I. １−チオ−β−Ｄ−マルトトリオース (104 mg, 0.2 mmol) をメタノール メタノール
(5 mL)中に溶解し、酢酸エチル(2 mL)中のフェニルセレネニルブロミド(70 mg, 0.3 mmol)溶液に加えた。２分後、トリエチルアミン (2 mL)を加え、該反応を水(10 mL)とエタノール(5 mL)で希釈した。相は分離し、水溶性相をペトロール(3 x 10 mL)で洗浄し、凍結
乾燥した。未精製のフェニル１−セレネニルスルフィド−マルトトリオース (m/z 755,757 (M+Br, 100%))を水(10 mL)に投入し、その50 μL(25 eq) を500μlのバッファー液中(70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5)のSBLCys156 (1 mg)溶液に加えた。結果物溶液を逆回転子に置いた。２．５時間後、該反応混合物をPD10 Sephadex(R)G25 カラムに流し、HEPES 70 mM、CaCl2 2 mM、pH 7. 0で溶出した。タンパク質留分を収集し、GlcGlcGlc- SBLCysを得た（ m/z (ES+) 観測値27226 計算値 27233）。
【０２５１】
J. BSA (5 mg) を脱気水溶性バッファー液 (1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9. 5)に溶解した。フェニル１−セレネニルスルフィド−β−Ｄ−グルコピラノシド (6 mg, 0. 02 mmol) を水／アセトニトリル (0. 7 mL, 2/5 比)に溶解した。糖溶液(700 
μL, 225 eq) をタンパク質溶液に加え、 逆回転子に置いた。１時間後、エルマン分析に
より遊離型のチオールは存在しないことが示され、ここで該反応混合物をPD10 Sephadex(R)G25 カラムに流しHEPES 70 mM、CaCl2 2 mM、pH 7. 0で溶出した。タンパク質留分を収集し、MWCO 12-14 KDaで透析して（水, (1 x 4L を１時間, 2 x 2Lを３０分間)）、Glc-BSAを得た（ m/z (ES+) 観測値66620 計算値 66625）。
【０２５２】
【表２】
2007527376.tif 000059
【０２５３】
実施例５７：glyco-MTS試薬を用いた式Ｉの化合物との比較
表１および２において、MTSはCH3-S02-S-を表し、PTSはPh-S02-S-を表す。
【０２５４】
【表３】
2007527376.tif 000060
【０２５５】
1.対応する親炭水化物 D-グルコース(Glc)、 D-ガラクトース(Gal) または Glcα (1, 4)
Glcα(1, 4) Glcに由来する。
2. B. G. Davis, R. C. Lloyd and J. B. Jones, J. Org. Cliem., 1998, 63, 9614, and
B. G. Davis, M. A. T. Maughan, M. P. Green, A. Ullman and J. B. Jones, Tetrahedron Asymmetry, 2000, 11, 245から抜粋。
3. B. G. Davis, S. J. Ward and P. M. Randle, Chem. Commun., 2001, 189. から抜粋
。
【０２５６】
表１に見られるように、本発明によるglyco-PTS試薬は、対応するglyco-MTS試薬よりも優れた収率で合成される。さらには、glyco-PTS試薬の合成に用いる出発材料の費用は、
対応するglyco-MTS試薬のおよそ１０倍低い（２００３年の換算）。
表2において、SBL-Cys156はスブチリシン Bacillus lentus 変異体S156Cであり、BSA-Cys58はウシ血清アルブミンである。
【０２５７】
【表４】
2007527376.tif 000061
【０２５８】
1. Et3N, DCM, RT, 1 当量(eq.) のチオスルフォネート
2. Et3N, DCM/MeOH (20: 1), RT, 1 当量(eq.) のチオスルフォネート ; ペプチド[P]-Cys-Ser-OMe, Glc (Ac) 4α(1, 4) Glc (Ac) 3α(1, 4) Glc (Ac) 3 β-PTSとの反応においては[P] = Boc であり、これを除き[P] = Ac
3.70mM CHES, 5mM MES, 2mM CaCl2 pH 9.5 または50mM Tris. HCl, pH 7.7, RT, glyco-MTSでは〜30 eq、SBL- Cys156のGlc (Ac) 4 s-PTSおよび Gal(Ac)4s-PTS では〜10 eq、BSA-Cys58の Glc (Ac) 4s-PTSおよび Gal (Ac) 4s-PTS では〜20 eq、SBL-Cys156 のGlc (Ac) 4α(1, 4) Glc (Ac) 3α(1, 4) Glc (Ac) 3s-PTS では〜40 eq。
【０２５９】
4. B. G. Davis, R. C. Lloyd and J. B. Jones, J. Org. Chem., 1998, 63, 9614, およびB. G. Davis, M. A. T. Maughan, M. P. Green, A. Ullman and J. B. Jones, Tetrahedron Asymmetry, 2000, 11, 245から抜粋。
5. B. G. Davis, S. J. Ward and P. M. Randle, Chem. Commun., 2001, 189から抜粋。
表2から見られるように、本発明のglyco-PTS試薬は対応するglyco-MTS 化合物よりも一般的に高収率のグリコシル化反応を示すことがわかる。
【０２６０】
実施例５８：GlcGlcGlc-S-SePhを用いた異なるpHにおけるSBLCys156のグリコシル化
【０２６１】
【表５】
2007527376.tif 000062
【０２６２】
反応条件: SBLCysl 56 を１時間、GlcGlcGlc-S-SePh (20 eq.)とともに、[a]10 mM Tris pH 7.5 ; [b]70 mM CHES, 5mM MES, 2 mM CaCl2, pH 8.5 ; [c]70 mM CHES, 5mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5中に温置した。
【０２６３】
実施例５９：代表的タンパク質のファルネシル化
SBLCysl56 (10 mg) を水溶性バッファー液(1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5)に溶解した。PMSF (100 mg/mLのアセトニトリル溶液140 μL)を加えた。１０分後
、反応混合物を ビバスピン遠心濾過機で濃縮した。 (10 kDa MWCO, Sartorius社製); この工程は300 μL のミリ Qウォーターを加えて３回繰り返した。次に、得られた非活性化されたSBLCysl56 の一部(1 mg) を200 μL のバッファー液に溶解した (1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5) 。ファルネシルフェニルチオスルフォネート (5 mg/mLのTHF 溶液56 μL ,20 当量) を加えた。該混合物を逆回転子に置いた。１時間後、 該反応物をビバスピン遠心濾過機(ミリ Qウォーターを加えて4 回濾過)で脱塩し、質量分析法で分析した。
【０２６４】
この実施例は、本発明がファルネシル基をタンパク質に付着させるための手段となることを示している。ファルネシル化は多くのタンパク質にとって自然な翻訳後修飾である。実施例６０：Ｄ−マンノースペンタアセテート
【０２６５】
【化５３】
2007527376.tif 000063
【０２６６】
マンノース(50 g, 280 mmol)を無水酢酸(200 mL)とピリジン(200 mL)の撹拌溶液に懸濁させた。２４時間後、薄層クロマトグラフィー  (ペトロール:酢酸エチル, 1: 1) は、出発原料(Rf 0.0)が完全に消費されるとともに生成物(Rf 0.3) が得られたことを示した。該
反応物を水(400 mL)で希釈し、酢酸エチル(300 mL)と分離させた。相は分離し、水溶性相は酢酸エチル(2 x 200 mL)で再抽出した。これらの混合有機相は希塩酸(2 L, 1M)、ソデ
ィウムハイドロゲンカルボネート(飽和水溶液の500 mL)で洗浄し、塩水(300 mL)につけ、MgS04で乾燥、濾過し、真空中で濃縮して標記の化合物(107.3 g, 98%)をアノマーの混合
オイル(α/β 2: 1)として得た;
δH (400 MHz, CDCl3) 1.95, 1.99, 2.05, 2.16 (15 H, 4 x s, COCH3β), 1.96, 2.00, 
2.04, 2.12, 2.13 (15 H, 5 x s, COCH3α), 3. 78 (1H, ddd, J4,5 9.9 Hz, J5, 6 2. 3
Hz, J5, 6' 5.4 Hz, H-5β), 3.99-4. 03 (m, H-5α), 4.05-4. 10 (2H, m, H-6α, H-6β), 4.23 (1H, dd, J5, 6' 5.0 Hz, J6,6' 12. 1 Hz, H-6α), 4.26 (1H, dd, J5, 6' 5.3 Hz, J6,6' 12. 4 Hz, H-6'b), 5.10 (1H, dd, J2, 3 3.3 Hz, J3, 4 10.3 Hz, H-3β), 5.20-5. 21 (1H, dd, J1,2 2.1 Hz, J2, 3 2.5 Hz, H-2α), 5.24-5. 30 (3H, m, H-3
α, H-4α, H-4β), 5.43 (1H, dd, J1,2 1.2 Hz, J2, 3 3.2 Hz, H-2β), 5. 83 (1H, d, J1,2 0.9 Hz, H-1β), 6.03 (1H, d, J1,2 2.1 Hz, H-1α)。
【０２６７】
実施例６１：２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシルブロミド
【０２６８】
【化５４】
2007527376.tif 000064
【０２６９】
Ｄ−マンノースペンタアセテート(103 g, 264 mmol)を無水DCM中(200 mL)に溶解した。これに臭化水素(酢酸中33%, 200 mL)を加えた。混合物をアルゴン雰囲気下RTで放置した。
２時間後、薄層クロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチル, 2: 1) は、出発原料(Rf 0.2)が完全に消費されるとともに生成物(Rf 0.3) が得られたことを示した。該反応混合物はDCM (100 mL)と冷水(200 mL)に分離し、水溶性相をDCM (3 x 200 mL)で再抽出した。これらの混合有機相はpH 8まで得られたソディウムハイドロゲンカルボネートで洗浄し、塩水(300 mL)につけ、MgS04で乾燥、濾過し、真空中で濃縮した。結果物の標記の化合物で
ある澄んだオイル(106.6 g)は、精製することなく使用できた;
δH (400 MHz, CDCl3) 1.96, 2.03, 2.06, 2.13 (12H, 4 x s, 4 x OAc), 4.09 (1H, dd,
J5,6 2. 2 Hz, J6, 6' 12.5 Hz, H-6), 4.18 (1H, dd, J4,5 10.1 Hz, J5,6 2.2 Hz, J5,6' 4. 8 Hz, H-5), 4.28 (1H, dd, J5, 6 4.9 Hz, J6, 6' 12. 5 Hz, H-6'), 5. 32 (1H, at, J 10.1 Hz, H-4), 5. 39 (1H, dd, J1, 2 1.6 Hz, J2, 3 3.5 Hz, H-2), 5.66 (1H, dd, J2, 3 3.5 Hz, J3, 4 10. 1 Hz, H-3), 6.26 (1H, bs, H-1)。
【０２７０】
実施例６２：（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシル）−１−イソチオウロニウムブロミド
【０２７１】
【化５５】
2007527376.tif 000065
【０２７２】
出発物質として２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−Ｄ−α−マンノピラノシルブロミドを利用した実施例３の類似の方法によって、標記の化合物を白色結晶固体(80.6 g, 60%, 2段階)として得た。
融点 123-126 ℃ [Lit. 125-128 ℃(H20) ];
[α] D26+119. 0 (c, 1.0 in MeOH) [Lit. [α] D27+103 (c, 1. 0 in Acetone)] ; δH (400 MHz, DMSO-d6) 1.95, 2.02, 2.03, 2.14 (12H, 4 x s, 4 x OAc), 4.08 (1H dd, J5
, 6 2.4 Hz, J6,6' 12. 3 Hz, H-6), 4.22 (1H, dd, J5,6' 2. 4 Hz, J6,6' 12. 5 Hz, H-6'), 4.32 (1H, ddd, J4,5 10. 0 Hz, J5,6 2.2 Hz, J5,6' 5.2 Hz, H-5), 5.05 (1H, dd, J2,3 3.4 Hz, J3,4 10.0 Hz, H-3), 5.17 (1H, at, J 10.0 Hz, H-4), 5. 36 (1H, dd, J1,2 1.5 Hz, J2, 3 3.4 Hz, H-2), 6. 36 (1H, d, J1,2 1.2 Hz, H-1), 9.40 (4H, bs, 2 x NH2)。
【０２７３】
実施例６３：２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシルチオール
【０２７４】
【化５６】
2007527376.tif 000066
【０２７５】
出発物質として（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシル）−１−イソチオウロニウムブロミドを利用した実施例２の類似の方法によって、標記の化合物を無色のオイル(14. 5 g, 98%)として得た。
【０２７６】
[α] D24+68. 7 (c, 1.5 in CHCl3) [Lit. [α] D20+78. 6 (c, 0.8 in CHCl3)] ; δH (400 MHz, CDCl3) 1.98, 2.04, 2.08, 2.14 (12H, 4 x s, 4 x OAc), 2.28 (1H, d, J1,SH 6. 7 Hz, SH), 4.10 (1H, dd, J5,6 2. 4 Hz, J6,6' 12.5 Hz, H-6), 4.28 (1H, dd, J5, 6' 5.1 Hz, J6,6' 12.0 Hz, H-6'), 4.32- 4.36 (1H, m, H-5), 5. 26-5.34 (3H, m, H-2, H-3, H-4), 5.54 (1H, d, J1, SH 6.9 Hz, H-1)。
【０２７７】
実施例６４：フェニル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−セレネニルスルフィド−α−Ｄ−マンノピラノシド
【０２７８】
【化５７】
2007527376.tif 000067
【０２７９】
出発物質として２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシルチオールを利用した実施例４９の類似の方法によって、標記の化合物(590 mg, 83%)を黄色の
オイルとして得た。
[α] D25+13.4 (c, 1.0 in CHCl3 ; δH (400 MHz, CDCl3) 1.94, 1.94, 2.02, 2.10 (12H, 4 x s, 4 x OAc), 3.52 (1H, dd, J5,6 2.4 Hz, J6, 6' 12. 4 Hz, H-6), 3.94 (1H ddd, J4,5 9.6 Hz, J5, 6 2.5 Hz, J5,6' 3. 9 Hz, H-5), 4.07 (1H, dd, J5, 6'3.9 Hz, J6,6' 12. 4 Hz, H-6'), 5.23 (1H, dd, J2,3 3.2 Hz, J3,4 9. 9 Hz, H-3), 5.28 (1H, at, J9. 7 Hz, H-4), 5. 38 (1H, d, J1,2 1. 6 Hz, H-1), 5.40 (1H, dd, J1,2 1.5 Hz,
J2,3 3.1 Hz, H-2), 7.26-7. 28 (3H, m ArH), 7.62-7. 65 (2H, m, ArH)。
【０２８０】
実施例６５：２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシド
【０２８１】
【化５８】
2007527376.tif 000068
【０２８２】
Ｄ−マンノースペンタアセテートを新たに蒸留したTHE (150 mL)に溶解し、ベンジルアミン(11.1 mL, 01. 5 mmol)をこの攪拌された溶液に加えた。２４時間後、薄層クロマトグ
ラフィー (ペトロール: 酢酸エチル, 1: 1) は、出発原料(Rf 0.5)が完全に消費されるとともに生成物(Rf 0.3) が得られたことを示した。該反応物は新たに蒸留した塩酸(100 mL, 1Ｍ)を加えて急冷し、１０分間撹拌した。該反応物はDCM (100 mL)を加えて分別し、相は分離した。水溶性相はDCM (3 x 100 mL)で再抽出した。これらの混合有機相は希塩酸(100 mL, 1M)で洗浄し、塩水(100 mL)につけ、MgS04で乾燥、真空中で濃縮した。結果物の
オレンジ色のオイルはカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチル, 1: 1)で精製した。白色がかった結晶はペトロール/酢酸エチルから結合し、再結晶するこ
とにより、標記の化合物(12.4 g, 53%)を白色固体として得た。
融点92-94 ℃ [Lit. 92℃] ;
[α] D25+17.8 (c, 1. 0 in CHCl3) ; [Lit. [α] D25+21. 0 (c, 1.0 in CHCl3)] ; δH
(400 MHz, CDCl3) 1.98, 2.04, 2.08, 2.14 (12H, 4 x s, 4 x OAc), 4.09-4. 14 (1H, m, H-6), 4.20-4. 26 (2H, m, H-5, H-6'), 4.59-5. 00 (1H, m, OH), 5.20-5. 23 (2H, m, H-1, H-2), 5.27 (1H, at, J 9. 9 Hz, H-4), 5. 39 (1H, dd, J2,3 2.7 Hz, J3,4 9.6 Hz, H-3)。
【０２８３】
実施例６６：１'，１’，１'−トリクロロアセチミデート２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシド
【０２８４】
【化５９】
2007527376.tif 000069
【０２８５】
２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシド(1.01 g, 2.87 mmol)、１，１，１−トリクロロアセトニトリル(2.9 mL, 28.7 mmol)および活性化した4Åモ
レキュラーシーブ(ca. 500 mg)を無水DCM (20 mL)に懸濁させ、０℃で１時間撹拌した。
そこで、DBU (0. 085 mL, 0.57 mmol)を加えた。１．５時間後、薄層クロマトグラフィー
(ペトロール: 酢酸エチル, 1: 1) は、出発原料(Rf 0.2)が完全に消費されるとともに生成物(Rf 0.5) が得られたことを示した。該反応物をセリット(R)を通して濾過し、真空中で濃縮した。結果物である残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロール: 
酢酸エチル, 1: 1)で精製することにより、標記の化合物(1.42 g, 99%)を澄んだオイルとして得た。; 
[α] D25+42. 7 (c, 1.0 in CHCl3) [Lit. [α] D21 +50.0 (c, 1.0 in CHCl3)] ; δH (400 MHz, CDCl3) 2.20, 2.07, 2.09, 2.29 (12H 4 x s, 4 x OAc), 4.15-4. 22 (2H, m, 
H-5, H-6), 4.28 (1H dd, J5,6'4. 3 Hz, J6,6' 11.8 Hz, H-6'), 5.40-5. 42 (2H, m, H-3, H-4), 5.48 (1H, at, J2.1 Hz, H-2), 6.29 (1H, d, J1,2 1. 9 Hz, H-1), 8. 80 (1H, s, NH) 
【０２８６】
実施例６７：ベンジル−α−Ｄ−マンノピラノシド
【０２８７】
【化６０】
2007527376.tif 000070
【０２８８】
Ｄ−マンノース(30 g, 167 mmol)とアセチルクロリドをベンジルアルコール中(250 mL)に溶解し、１時間50 ℃で暖めた。結果物の溶液を低圧蒸留で濃縮した。残留物をカラムフ
ラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル: メタノール, 9: 1)で精製し、イソプロパノール/ペトロールから再結晶することにより、標記の化合物(29.34 g, 70%)を白色結晶固体
として得た。
融点 126-127 ℃ [Lit 128-129 ℃];
[α] D26+102. 0 (c, 1.1 in MeOH) ; [Lit. [α] D18 +73.1 (c, 1.4 in H2O)] ; δH (400 MHz, CD30D) 3.62 (1H, ddd, J4, 5 9.5 Hz, J5, 6 2.3 Hz, J5,6' 5. 5 Hz, H-5), 3.68 (1H, at, J 9. 3 Hz, H-4), 3.733. 78 (2H, m, H-3, H-6), 3.85-3. 88 (2H, m, H-2, H-6'), 4.75, 4.52 (2H, ABq, J 11.6 Hz, CH2), 4.86 (1H, d, J1,2 1.8 Hz, H-1),
7.28-7. 38 (5H, m, ArH)。
【０２８９】
実施例６８：ベンジル４，６−ジ−Ｏ−ピボリル−α−Ｄ−マンノピラノシド
【０２９０】
【化６１】
2007527376.tif 000071
【０２９１】
ベンジル−α−Ｄ−マンノピラノシド(30.0 g, 111. 0 mmol)を不活性アルゴン雰囲気下
、無水ピジリン中(200 mL)に懸濁させた。結果物である懸濁液を0 ℃まで冷却し、クロロトリフェニルメタン(35 mL, 280 mmol)を液滴により加えた。クロロトリフェニルメタン
を加えた後、薄層クロマトグラフィー(酢酸エチル)は、出発原料(Rf 0.0)が完全に消費されるとともに主生成物(Rf 0.7)が得られたことを示した。該反応物は水(50 mL)と酢酸エ
チル(100 mL)に分離した。相は分離し、水溶性相は酢酸エチル(3 x 50 mL)で再抽出した
。これらの混合有機相は希塩酸(1L, 1M)で洗浄し、ソディウムハイドロゲンカーボネート(飽和溶液中の800 mL)でpH 7まで調整し、塩水(200 mL)につけ、MgS04で乾燥し、真空中
で濃縮した。残留物を酢酸エチル/ペトロールから再結晶し、標記の化合物(27.07 g, 56%)を白色結晶固体として得た。
融点133-135℃ ;
[α] D25 +64. 7 (c, 1.0 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3) 1.251, 1.254 (18H, 2 x s, 2 x C (CH3) 3), 3. 85 (1H, at, J 9. 8 Hz, H-4), 3.92 (1H, ddd, J4,5 9.7 Hz, J5,6 5. 6 Hz, J5,6' 2.5 Hz, H-5), 4.05 (1H, dd, J1,2 1. 9 Hz, J2,3 2.1 Hz, H-2), 
4. 37 (1H, dd, J5,6 5.6 Hz, J6,6' 11.8 Hz, H-6), 4.42 (1H, dd, J5,6' 2. 7 Hz, J6,6' 12.0 Hz, H-6'), 4.53, 4.76 (2H, Abq, J 11.9 Hz, CH2), 4.90 (1H, d, J1,2 1. 8
Hz, H-1), 5.14 (1H, dd, J2,3 3.2 Hz, J3,4 9. 7 Hz, H-3), 7. 33-7. 36 (5H, m, ArH)。
【０２９２】
実施例６９：ベンジル２，４−ジ−Ｏ−ベンジル−３，６−ジ−Ｏ−ピボリル−α−Ｄ−マンノピラノシド
【０２９３】
【化６２】
2007527376.tif 000072
【０２９４】
ベンジル４，６−ジ−Ｏ−ピボリル−α−Ｄ−マンノピラノシド(15.0 g, 34.2 mmol)お
よびベンゼントリクロロアセチミデート(17 mL, 91.4 mmol)を無水DCM (100 mL)および無水シクロヘキサン(100 mL)とに溶解させ、不活性アルゴン雰囲気下、１時間以上かけて4
Åモレキュラーシーブ(ca 5 g)で撹拌した。１時間後、トリメチルシリルトリフレート(0.31 mL, 1.71 mmol)を加えた。１８時間後、薄層クロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸
エチル, 5: 1)は、出発原料(Rf 0.0)が完全に消費されるとともに主生成物(Rf 0.4)が得
られたことを示した。該反応物はトリエチルアミン(ca 30 mL)で急冷し、該溶液をセリット(R)を通して濾過し、真空中で濃縮した。結果物である残留物をカラムフラッシュクロ
マトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチル, 5: 1)で精製することにより、標記の化合物(14. 4 g, 70%)を無色のオイルとして得た; 
[α] D25+29. 0 (c, 2.0 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3) 1.24, 1.25 (18H,2 x s, 2
x C (CH3) 3), 3.97-4. 04 (3H, m, H-2, H-4, H-5), 4.25 (1H,dd, J5,6 4.8 Hz, J5,6' 11.6 Hz, H-6), 4. 44 (1H, dd, J5,6' 1. 6 Hz, J6,6' 11.7 Hz, H-6'), 4.51, 4.74 (2H, ABq, J 12. 0 Hz, BnCH2), 4. 55, 4. 61 (2H, ABq, J 11.7 Hz, BnCH2), 4.57, 4.
80 (2H, ABq, J 10.7 Hz, BnCH2), 4. 92 (1H, d, J1,2 1.8 Hz, H-1), 5.37 (1H, dd, J2,3 3.1 Hz, J3,4 8. 8 Hz, H-3), 7. 28-7. 35 (15H, m, ArH)。
【０２９５】
実施例７０：ベンジル２，４−ジ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノピラノシド
【０２９６】
【化６３】
2007527376.tif 000073
【０２９７】
ベンジル２，４−ジ−Ｏ−ベンジル−３，６−ジ−Ｏ−ピボリル−α−Ｄ−マンノピラノシド(8.0 g, 12.9 mmol)とソディウムメトキシド(1.75 g, 32.4 mmol)をメタノール中(100 mL)に溶解し、加熱還流した。２０時間後、薄層クロマトグラフィー (ペトロール/酢酸エチル, 2: 1)は、出発原料(Rf 0.8)が完全に消費されるとともに主生成物(Rf 0.2)が得
られたことを示した。該反応物はDowex(R)-50イオン交換樹脂を加えることによって中和
され、この後に濾過し、真空中において濃縮した。結果物である残留物をカラムフラッシ
ュクロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチル, 2: 1)で精製することにより、標記の化合物(4.50 g, 78%)を純粋オイルとして得た;
[α] D25+45.2 (c, 1.0 in CHCl3) ; δH (500 MHz, CDCl3) 2. 83 (2H, bs, 2 x OH), 3. 83-3. 86 (1H, m, H-5), 3.90-4. 00 (4H, m, H-2), H-4), H-6, H-6'), 4. 21-4. 28
(1H, m, H-3), 4. 58 (1H, d, J 12.1 Hz, CHH), 4.72-4. 83 (4H, m, 4 x CH2Ar), 5.04 (1H, d, J 11.1 Hz, CHH), 5.09 (1H, bs, H-1), 7.43-7. 51 (15H, m, 15 x ArH)。
【０２９８】
実施例７１：ベンジル２，４−ジ−Ｏ−ベンジル−３，６−ビス−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシド）−α−Ｄ−マンノピラノシド
【０２９９】
【化６４】
2007527376.tif 000074
【０３００】
DCM (10 mL)に溶解させたベンジル２，４−ジ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノピラノシ
ド(255 mg, 0.57 mmol)およびDCM (10 mL)に溶解させた１'，１’，１'−トリクロロアセチミデート−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシド(1.12 g, 2.27 mmol)を、カニューレを通して活性4Åモレキュラーシーブを入れた乾燥フラスコに加えた。該溶液を１時間撹拌し、その後ボロントリフルオロエチレート(90 μL, 0. 85
mmol)を加えた。１６時間後、薄層クロマトグラフィー (ペトロール:酢酸エチル, 2: 1)は、出発原料(Rf 0.1)が完全に消費されるとともに主生成物(Rf 0.3)が得られたことを示した。該反応物をトリエチルアミン(ca 5 mL)で急冷し、該溶液をセリット(R)を通して濾過し、真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロール: 
酢酸エチル, 4: 3)で精製することにより、標記の化合物(472 mg, 75%)を白色アモルファス固体として得た; 
[α] D25+81. 5 (c, 1.0 in CHCl3) ; δH (500 MHz, CDCl3) 1.98, 2.02, 2.05, 2.07, 2.09, 2.10, 2.11, 2.19 (24H, 8 x s, 8 x OAc), 3.74-3. 76 (1H, m, H-6a), 3.81-3. 87 (3H, m, H-2a, H-5a, H-6'a), 3.92-3. 97 (3H, m, H-4a, H-5b, H-6b), 4.03-4. 22 (4H, m, H-3a, H-5c, H-6'b, H-6c), 4.27 (1H, dd, J5,6' 5. 5 Hz, J6, 6' 12.3 Hz, H-6'c), 4.54, 4.75 (2H, Abq, J 11.9 Hz, CH2), 4.64, 4.81 (2H, Abq, J 12. 2 Hz, CH2), 4.65, 4.91 (2H, Abq, J 11. 4 Hz, CH2), 4.97 (1H, d, J1,2 1. 7 Hz, H-1c), 5.00 (1H, d, J1,2 1.6 Hz, H-1a), 5.19 (lH, d, J1,2 1.7 Hz, H-1b), 5.25 (1H, at, J 10.0 Hz, H-4b), 5.33 (1H, at, J 10.1 Hz, H-4c), 5.36 (1H, dd, J1,2 1.8 Hz, J2, 3 3.3 Hz, H-2c), 5.42 (1H, dd, J1, 2 1. 5 Hz, J2, 3 3.5 Hz, H-2b), 5.44-5. 47 (2H,
m, H-3b, H3c), 7.32-7. 42 (15H, m, ArH)。
【０３０１】
実施例７２：アセチル２，４−ジ−Ｏ−アセチル−３，６−ビス−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシド）−α／β−Ｄ−マンノピラノシド
【０３０２】
【化６５】
2007527376.tif 000075
【０３０３】
ベンジル２，４−ジ−Ｏ−ベンジル−３，６−ビス−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシド）−α−Ｄ−マンノピラノシド(100 mg, 0.09 mmol)とパールマン触媒(Pd (OH)2,湿性, 35 mg)を無水エタノール(5 mL)に溶解した。該溶
液を脱気し、水素ガスでパージし、水素雰囲気下で撹拌した。４日後、薄層クロマトグラフィー (酢酸エチル)は、出発原料(Rf 0.9)が完全に消費されるとともに主生成物(Rf 0.4)が得られたことを示した。該溶液をセリット(R)を通して濾過し、真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル)で精製することにより、中間生成物である３，６−ビス−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシド）−α／β−Ｄ−マンノピラノシド(74 mg, 98%)を白色アモルファス固体として得た; 
m/z HRMS (ES+) C34H48034Na (MNa+)としての計算値 863. 2433.観測値863. 2440. この
中間生成物(74 mg, 0. 088 mmol) は無水酢酸(5 mL)とピリジン(5 mL)中に再懸濁させた
。２４時間後、薄層クロマトグラフィー (ペトロール:酢酸エチル, 2: 3)は、出発原料(Rf 0.0)が完全に消費されるとともに生成物(Rf 0.4)が得られたことを示した。該反応物は水(20 mL)で希釈し、酢酸エチル(20 mL)で分別して相を分離した。水溶性相は酢酸エチル(2 x 20 mL)で再抽出した。これらの混合有機相は希塩酸(500 mL, 1M)で洗浄し、ソディ
ウムアイドロゲンカルボネート(飽和溶液中の50 mL)で調整、塩水(30 mL)につけ、MgS04
で乾燥、濾過し、真空中で濃縮することにより、標記の化合物(83 mg, 98%)をアノマー混合物(α/β 5: 1)のアモルファス体として得た; 
δH (500 MHz, CDCl3)  α化合物, 2.00, 2.02, 2.08, 2.12, 2.17, 2.18, 2.19, 2.26 (33H, 8 x s, 11 x OAc), 3.59 (1H, dd, J5, 6 3.0 Hz, J6,6' 11.1 Hz, H-6a), 3.76 (1H, dd, J5,6' 5. 2 Hz, J6,6' 11. 2 Hz, H-6'a), 3.92 (1H, ddd, J4,5 10.2 Hz, J5, 6
3.0 Hz, J5, 6' 5.2 Hz, H-5a), 4.04-4. 16 (4H, m, H-5b, H-5c, H-6b, H-6c), 4.21 (1H, dd, J2,3 3.4 Hz, J3, 4 9.9 Hz, H-3a), 4.28 (1H, dd, J5,6' 5.5 Hz, J6,6' 12.2 Hz, H-6'b/c), 4.31 (1H, dd, J5,6' 4.7 Hz, J6,6' 12.3 Hz, H-6'b/c), 4. 81 (1H, d, J1,2 1.5 Hz, H-1c), 5.06-5. 07 (2H, m, H-1b, H-?), 5.20-5. 35 (8H, m, H-2a, H-2b, H-2c, H-3b, H-3c, H-4a, H-4b, H-4c), 6.07 (1H, d, J1,2 1. 8 Hz, H-1a). β化合物はデータを下記のみに選択した。3.64 (1H, dd, J5,6 3.7 Hz, J6,6' 10. 8 Hz, H-6a), 3.69-3. 73 (1H, m, H-5a), 3.76 (1H, dd, J5,6' 5.2 Hz, J6, 6' 11.2 Hz, H-6'a), 4.01 (1H, dd, J2,3 3.2 Hz, J3,4 9. 7 Hz, H-3a), 5.50 (1H, dd, J1,2 0.9 Hz, J2,3 3.2 Hz, H-2a), 5.83 (1H, d, J1,2 0.9 Hz, H-1a)。
【０３０４】
実施例７３：２，４−ジ−Ｏ−アセチル−ビス−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−マンノピラノシル）−α−Ｄ−マンノピラノシルブロミド
【０３０５】
【化６６】
2007527376.tif 000076
【０３０６】
アセチル２，４−ジ−Ｏ−アセチル−３，６−ビス−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシド）−α／β−Ｄ−マンノピラノシド(87 mg, 0.09
mmol)を無水DCM (5 mL)中に溶解した。これに臭化水素(酢酸中33%, 1 mL)を加えた。該
混合物をアルゴン雰囲気下RTで撹拌した。２時間後、薄層クロマトグラフィー (ペトロール:酢酸エチル, 1: 4)は、出発原料(Rf 0.4)が完全に消費されるとともに生成物(Rf 0.6)が得られたことを示した。該反応混合物をDCM (10 mL)と水(10 mL)に分離し、水溶性相をDCM (3 x 10 mL)で再抽出した。これらの混合有機相をソディウムハイドロゲンカルボネ
ート(飽和水溶液の20 mL)でpH 8まで調整し、塩水(20 mL)につけ、MgS04で乾燥、濾過し
、真空中で濃縮して、標記の化合物(80 mg, 90%)をなんら精製の必要がない白色体として得た;
δH (400 MHz, CDCl3) 1.97, 1.99, 2. 05,2. 06,2. 10,2. 12,2. 17,2. 24 (30H, 9 x s, 10 x OAc), 3.60 (1H, dd, J5, 6 3.0 Hz, J6, 6' 11.4 Hz, H-6a), 3.77 (1H, dd, J5,6' 4.5 Hz, J6,6' 11. 4 Hz, H-6'a), 4.02-4. 09 (5H, m, H-5a, H-5b, H-5c, H-6b, H-6c), 4.24 (1H, dd, J5,6' 6. 8 Hz, J6, 6' 12.2 Hz, H-6'), 4.29 (1H, dd, J5, 6' 5.0 Hz, J6,6' 12.6 Hz, H-6'), 4.62 (1H, dd, J2, 3 3.4 Hz, J3, 4 10. 0 Hz, H-3a), 4.79 (1H, bs, H-1c), 5. 02-5. 04 (2H, m, H-1b, H-3b), 5.17-5. 30 (5H, m, H-2b, H-2c, H-3c, H-4b, H-4c), 5. 39 (1H, at, J 10. 1 Hz, H-4a), 5.43 (1H, dd, J1, 2 1.5 Hz, J2, 3 3.2 Hz, H-2a), 6. 34 (1H, bs, H-1a)。
【０３０７】
実施例７４：１−チオ−２，４−テトラ−Ｏ−アセチル−３，６−Ｏ−ビス−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−マンノピラノシル）−α−Ｄ−マンノピラノース
【０３０８】
【化６７】
2007527376.tif 000077
【０３０９】
２，４−テトラ−Ｏ−アセチル−３，６−Ｏ−ビス−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−マンノピラノシル）−α−Ｄ−マンノピラノシルブロミド(850 mg, 0. 85 mmol)を無水アセトン中(20 mL)に溶解した。無水チオウレア(115 mg, 1.56 mmol)を加え、該混合物をアルゴン雰囲気下、加熱還流した。１８時間後、薄層クロマトグラフィー
(ペトロール:酢酸エチル, 1: 3)は、出発原料(Rf 0.4)が完全に消費されるとともに生成物(Rf 0.0)が得られたことを示した。該反応物を真空中で濃縮し、結果物である残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル：メタノール, 9: 1)で精製することにより、中間生成物２，４−テトラ−Ｏ−アセチル−３，６−Ｏ−ビス−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−マンノピラノシル）−α−Ｄ−マンノピラノシル−１−イソチオウロニウムブロミド (550 mg, 60%)を得た。この中間生成物(550 mg, 0.51 mmol)とNa2S2O5(122 mg, 0.62 mmol)をDCM (20 mL)と水(10 mL)の混合物に加えた。該混合
物をアルゴン雰囲気下、加熱還流した。２．５時間後、薄層クロマトグラフィー (ペトロール:酢酸エチル, 1: 3)は、出発原料(Rf 0.0)が完全に消費されるとともに生成物(Rf 0.3)が得られたことを示し、ここで該反応物をRTまで冷却し、相は分離した。水溶性相はDCM (2 x 20 mL)で再抽出した。これらの混合有機相はソディウムハイドロゲンカルボネー
ト(飽和水溶液の20 mL)で洗浄し、塩水(20 mL)につけ、MgS04で乾燥、濾過して真空中で
溶媒を除去した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロール:酢酸エチル, 1: 3)で精製することにより、標記の化合物(350 mg, 73%)を白色アモルファス固体として得た; 
[α] D23 +58.1 (c, 1.2 in CHCl3 ; δH (500 MHz, C6D6) 1. 74,1.75, 1.78, 1. 82, 1. 91, 2.03, 2.06, 2.26 (24H, 8 x s, 10 x Oac), 2. 07 (1H,bs, SH), 3. 65 (1H, dd,
J5,6 3. 2 Hz, J6,6' 11.0 Hz, H-6a), 3.93 (1H, dd, J5, 6' 5.3 Hz, J6, 6' 11.1 Hz, H-6'a), 4.31-4.38 (4H, m, H-3a, H-5a, H-5b/c, H-6), 4. 43-4. 45 (1H, m, H-6), 4. 51 (1H, dd, J5, 6' 5.6 Hz, J6,6' 12. 6 Hz, H-6'), 4. 56- 4.60 (2H, m, H-5b/c,
H-6'), 4. 91 (1H, d, J1,2 1.5 Hz, H-1c), 5. 20 (1H, d, J1,2 1.8 Hz, H-1b), 5.43
(1H, dd, J1,2 1.8 Hz, J2, 3 3.1 Hz, H-2b), 5.45 (1H, bs, H-1), 5.65 (1H, dd, J1, 21. 5 Hz, J2, 3 3.1 Hz, H-2a), 5.70-5. 82 (5H, m, H-2c, H-3b, H-4a, H-4b, H-4c), 5. 85 (1H, dd, J2, 3 3.2 Hz, J3,4 10.2 Hz, H-3c)。
【０３１０】
実施例７５：Man (1-6) Man (l-3) ManSHを使ったSBLCys156における代表的なタンパク質グリコシル化手順
１−チオ−２，４−テトラ−Ｏ−アセチル−３，６−Ｏ−ビス−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｏ−マンノピラノシル）−α−Ｄ−マンノピラノース(20 mg, 0.02 mmol)とソディウムメトキシド(2 mg, 0. 02mmol)をメタノール撹拌溶液(5 mL)に加え
た。１２時間後、(ペトロール:酢酸エチル, 1: 2)出発原料(Rf 0.2)が完全に消費される
とともに生成物(Rf 0.0)が得られたことが示された。該反応はDowex(R)-50イオン交換樹
脂を加えることによって中和され、この中和点で濾過し、真空中において濃縮した。粗糖チオールを水(5 mL)に投入し、そのうちの38 μLをSBL156CysSePh (1 mg)を含有した水溶性バッファー液(500 μL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCL2, pH9.5)に添加した。結果物溶液を逆回転子に置いた。１時間後、該混合反応をPD10 Sephadex(R)G25 カラムに流し、70 mM HEPES、 2 mM CaCl2、pH 7.0で溶出した。タンパク質画分を採取し、Man (Man) Man-S- SBLCysl56が得られた; 
m/z (ES+) 観測値 27878, 計算値 27881。
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月20日(2007.6.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１個のチオール基を含む有機化合物と式Ｉの化合物：
Ｒ−Ｓ−Ｘ−Ｒ1       （Ｉ）
（式中、ＸはＳＯ2またはＳｅを表し、Ｒは有機部分であり、Ｒ1は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいピリジル基、または置換されていてもよいナフチル基であり、かつ、ＸがＳＯ2であるときＲ1は置換されていてもよいアルキル基でない。）との反応を含む、ジスルフィド結合を形成する方法。
【請求項２】
前記の少なくとも１つのチオール基を含む有機化合物は、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１個のチオール基を含むタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸を化学修飾する方法であり、そうしたタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸と式Ｉの化合物：
Ｒ−Ｓ−Ｘ−Ｒ1       （Ｉ）
（式中、ＸはＳＯ2 または Ｓｅを表し、 Ｒは 有機部分であり、Ｒ1は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいピリジル基、または置換されていてもよいナフチル基であり、かつ、ＸがＳＯ2 であるとき、Ｒ1は置
換されていてもよいアルキル基でない。）との反応を含む方法。
【請求項４】
Ｒが炭水化物の基である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記炭水化物がオリゴ糖類である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｒがファルネシル基である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
Ｒ1がフェニル基である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ＸがＳｅである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＸがＳＯ2である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
下記式Ｉ：
Ｒ−Ｓ−Ｘ−Ｒ1       （Ｉ）
（式中、ＸはＳＯ2またはＳｅを表し、Ｒは炭水化物部分であり、Ｒ1は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいピリジル基、または置換されていてもよいナフチル基であり、かつ、ＸがＳＯ2であるとき、Ｒ1は置換されていてもよいアルキル基でない。）で表される化合物。
【請求項１１】
Ｒ1がフェニル基である請求項10に記載の化合物。
【請求項１２】
ＸがＳｅである請求項10または請求項11に記載の化合物。
【請求項１３】
ＸがＳＯ2である請求項10または請求項11に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒがオリゴ糖類の基またはファルネシル基である、請求項10〜13のいずれかに記載の化合物。
【請求項１５】
式IIの化合物：
Ｍ(ＳＳＯ2Ｒl)k        （II）
（式中、Ｍは金属であり、例えば Li、Na、K、Ca、 Cs、 Zn、 Mgまたは Alである。ｋは１〜３の整数である。）
と、式IIIの化合物：
Ｒ−Ｌ               （III）
（式中、Ｌは脱離基である。）とを反応させることを含む、請求項13に記載された式Ｉの化合物を調製する方法。
【請求項１６】
式ＶIIIのジスルフィド化合物：
Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ       （ＶIII）
を銀イオンの存在下、スルフィニートアニオン：Ｒ1ＳＯ2-
に反応させることを含む、請求項13に記載された式Ｉの化合物を調製する方法。
【請求項１７】
式Ｖの化合物と、式VIaの化合物または式ＶIbの化合物と
Ｒ−ＳＨ            （Ｖ）
Ｒ1ＳｅＬ2          （ＶＩa）
Ｒ1Ｓｅ(ＯＨ)2      （ＶＩb）
（式中、Ｌ2は Br、 Cl、 CN、または Iである。）
を反応させることを含む、請求項12に記載された式Ｉの化合物を調製する方法。
【請求項１８】
ジスフィルド結合の形成において請求項１〜９のいずれかに記載の式Ｉの化合物の使用。
【請求項１９】
少なくとも１個のチオール基を含むタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸を修飾するための、請求項１〜９のいずれかに記載の式Ｉの化合物の使用。
【請求項２０】
少なくとも１個のチオール基を含むタンパク質、ペプチド またはアミノ酸をグリコシ
ル化するための、請求項10〜14のいずれかに記載の式Ｉの化合物の使用。
【請求項２１】
チオール基をセレニルスフィド基に変換することを含む、少なくとも１個のチオール基を含むタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸を化学修飾する方法。
【請求項２２】
少なくとも１個のチオール基を含むタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸と式Ｘａまたは式Ｘｂに表される化合物：
Ｒ2ＳｅＬ2        Ｘａ
Ｒ2Ｓｅ（ＯＨ）2    Ｘb
（式中、Ｌ2は脱離基であり、Ｒ2は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいベンジル基、置換されていてもよいピリジル基、または置換されていてもよいナフチル基である。Ｒ2は固体支持体の一部を構成するか、
または結合している。）とを反応させることを含む、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
Ｒ2がフェニル基による、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
式Ｘａで表される化合物がPhSeBrである、請求項22に記載の方法。
【請求項２５】
タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸中のセレネニルスルフィド基と、チオール基を含む有機化合物とをさらに反応させる、請求項21〜24のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも１つのセレネニルスルフィド基を含むタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸を、チオール基を含む有機化合物とを反応させることにより、そうしたタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸を化学修飾する方法。
【請求項２７】
前記有機化合物が炭水化物である、請求項25または26に記載の方法。
【請求項２８】
前記有機化合物がタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸である、請求項25または26に記載の方法。
【請求項２９】
セレネニルスルフィド基が、下記式：
−Ｓ−Ｓｅ−Ｒ2
（式中、Ｒ2は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいフェニル基、置
換されていてもよいベンジル基、置換されていてもよいピリジル基または置換されていてもよいナフチル基である。）
で表される基である、セレネニルスルフィド基を少なくとも１つ含むタンパク質、ペプチド、アミノ酸。
【請求項３０】
請求項21〜24のいずれかに記載された方法により得ることができる、少なくとも１つのセレネニルスルフィド基を含むタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸。
【請求項３１】
請求項25〜28のいずれかに記載された方法により得ることができる、少なくとも１個のジスルフィド結合を含むタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸。
【請求項３２】
Ｘ線回折法によりタンパク質の構造を決定する際に、請求項29〜31のいずれかに記載のタンパク質またはペプチドの使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
Ｒ−Ｓ−Ｘ−Ｒ1       （Ｉ）
さらに、別の態様として、本発明はＲが炭水化物部分を表す式Ｉの化合物を提供する。
Ｒがアルケニルまたはアルキニル基であるとき、式Ｉの化合物との反応によって生成したジスフィルド化合物がＲ基内のＣ＝Ｃ結合、またはＣ≡Ｃ結合での反応によってさらに
変更される可能性がある。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０６】
出発物質としてフェニル３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−アセトアミド−２−デオキシ−１−セレネニルスルフィド−Ｄ−β−グルコピラノシドを利用し、実施例４３の類似の方法によって、標記の化合物を白色アモルファス固体(55mg, 88%)として得た。
[α] D25 -47. 1 (c, 0. 1 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3) 1.17 (3H, d, JCH, CH3 6.4 Hz, CH3), 1.49 (9H, s, C (CH3) 3), 1.91, 2. 00, 2.02, 2.07 (12H, 4 x s, 4 x, COCH3), 2.99 (1H, dd, JCHH,CHH 13.5 Hz, JαH,CH 10.0 Hz, CHH), 3.38 (1H, dd, JαH,CH 4.8 Hz, JCHH,CHH 13. 5 Hz, CHH), 3. 88-3. 91 (1H, m, H-5), 4. 16-4. 32 (4H, m, H-2, H-6, H-6', CHCH3), 4. 45 (1H, d, JαH,CH 2.7 Hz, αHThr), 4. 54 (1H,
dd, JαH,CH,H9.7 Hz, JαH,CHH4.7 Hz, αHCys), 4. 79 (1H, d, J1, 2 10.1 Hz, H-1), 5. 06 (1H, at, J 9. 7 Hz, H-4), 5. 28 (1H, at, J 9.7 Hz, H-3)。
【国際調査報告】
2007527376.tif 000078
2007527376.tif 000079
2007527376.tif 000080
2007527376.tif 000081
2007527376.tif 000082
2007527376.tif 000083