(57)【要約】本発明は、細胞、特にWnt2を過剰発現する癌細胞の増殖を阻害する方法に関する。本方法は、Wnt2 mRNAまたはWnt2タンパク質に結合し、Wnt2シグナル伝達を妨害し、または別のタンパク質、例えば、フリッツルド（Frizzled）受容体などへのWnt2タンパク質の結合を阻害する因子と細胞を接触させる工程を含む。2007536938.tif 000036
2007536938.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の増殖を阻害するために有効である量のWnt2シグナル伝達を阻害する因子と細胞を接触させる工程を含む、Wnt2を過剰発現する細胞の増殖を妨害する方法。
【請求項２】
因子がsiRNAである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
因子が抗Wnt2抗体である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
抗Wnt2抗体がモノクローナル抗体である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
抗Wnt2抗体が以下を含む、請求項3に記載の方法：
（i）SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:104またはSEQ ID NO:125に示されるようなVLCDR1アミノ酸配列；
（ii）SEQ ID NO:58に示されるようなVLCDR2アミノ酸配列；
（iii）SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:126またはSEQ ID NO:138に示されるようなVLCDR3アミノ酸配列；
（iv）SEQ ID NO:63またはSEQ ID NO:87に示されるようなVHCDR1アミノ酸配列；
（v）SEQ ID NO:65またはSEQ ID NO:89に示されるようなVHCDR2アミノ酸配列；および
（vi）SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:91またはSEQ ID NO:110に示されるようなVHCDR3アミノ酸配列。
【請求項６】
抗Wnt2抗体がヒトWnt2のアミノ酸残基49〜63（SEQ ID NO:2）に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを特異的に結合する、請求項3に記載の方法。
【請求項７】
抗Wnt2抗体が
2007536938.tif 000032
を含むポリペプチドを特異的に結合する、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
抗Wnt2抗体が、ヒトWnt2のアミノ酸残基49〜63（SEQ ID NO:2）に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを特異的に結合する第2の抗Wnt2抗体と、Wnt2を結合することについて競合する、請求項3に記載の方法。
【請求項９】
抗Wnt2抗体が、Wnt2を結合することについて、
2007536938.tif 000033
を含むポリペプチドを特異的に結合する第2の抗Wnt2抗体と競合する、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
インビトロで実施される、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
インビボで実施される、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
細胞が癌細胞である、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
癌細胞が、乳癌、卵巣癌、直腸結腸癌、胃癌、肺癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、甲状腺癌、膵臓癌、子宮頸部癌、食道癌、中皮腫、頭頚部癌、肝細胞癌、黒色腫、脳腫瘍、外陰癌、精巣癌、肉腫、腸癌、皮膚癌、白血病、およびリンパ腫の癌細胞からなる群より選択される、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
細胞のアポトーシスを誘導するために有効である量のWnt2シグナル伝達を阻害する因子と細胞を接触させる工程を含む、Wnt2を過剰発現する細胞のアポトーシスを誘導する方法。
【請求項１５】
Wnt2シグナル伝達を阻害するために有効である量の抗Wnt2抗体と、Wnt2を過剰発現する細胞を接触させる工程を含む、細胞内でWnt2シグナル伝達を阻害する方法。
【請求項１６】
疾患を治療するために有効である量のWnt2シグナル伝達を阻害する因子を、そのような治療の必要がある被験体に投与する工程を含む、Wnt2シグナル伝達に関連する疾患を治療する方法。
【請求項１７】
因子が抗Wnt2抗体である、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
疾患が癌である、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
癌が、乳癌、卵巣癌、直腸結腸癌、胃癌、肺癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、甲状腺癌、膵臓癌、子宮頸部癌、食道癌、中皮腫、頭頚部癌、肝細胞癌、黒色腫、脳腫瘍、外陰癌、精巣癌、肉腫、腸癌、皮膚癌、白血病、およびリンパ腫の癌細胞からなる群より選択される、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
癌を治療するために有効な量の抗Wnt2抗体を被験体に投与する工程を含む、Wnt2を過剰発現する癌を治療する方法。
【請求項２１】
抗Wnt2抗体がモノクローナル抗体である、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
抗Wnt2抗体が以下を含む、請求項20に記載の方法：
（i）SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:104またはSEQ ID NO:125に示されるようなVLCDR1アミノ酸配列；
（ii）SEQ ID NO:58に示されるようなVLCDR2アミノ酸配列；
（iii）SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:126またはSEQ ID NO:138に示されるようなVLCDR3アミノ酸配列；
（iv）SEQ ID NO:63またはSEQ ID NO:87に示されるようなVHCDR1アミノ酸配列；
（v）SEQ ID NO:65またはSEQ ID NO:89に示されるようなVHCDR2アミノ酸配列；および
（vi）SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:91またはSEQ ID NO:110に示されるようなVHCDR3アミノ酸配列。
【請求項２３】
抗Wnt2抗体がヒトWnt2のアミノ酸残基49〜63（SEQ ID NO:2）に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを特異的に結合する、請求項20に記載の方法。
【請求項２４】
抗Wnt2抗体が
2007536938.tif 000034
を含むポリペプチドを特異的に結合する、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
抗Wnt2抗体が、ヒトWnt2のアミノ酸残基49〜63（SEQ ID NO:2）に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを特異的に結合する第2の抗Wnt2抗体と、Wnt2を結合することについて競合する、請求項20に記載の方法。
【請求項２６】
抗Wnt2抗体が、Wnt2を結合することについて、
2007536938.tif 000035
を含むポリペプチドを特異的に結合する第2の抗Wnt2抗体と競合する、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
抗Wnt2抗体ならびに薬学的に許容される賦形剤、担体、および/または希釈剤を含む薬学的組成物。
【請求項２８】
抗Wnt2抗体がポリクローナル抗体である、請求項27に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
抗Wnt2抗体がモノクローナル抗体である、請求項27に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
ヒトWnt2のアミノ酸残基49〜63に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを特異的に結合する抗Wnt2モノクローナル抗体。
【請求項３１】
ヒトWnt2のアミノ酸残基49〜63に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを特異的に結合する第2のWnt2抗体と、Wnt2への結合について競合する、請求項30に記載の抗Wnt2モノクローナル抗体。
【請求項３２】
以下を含む、請求項30に記載のモノクローナル抗体：
（i）SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:104またはSEQ ID NO:125に示されるようなVLCDR1アミノ酸配列；
（ii）SEQ ID NO:58に示されるようなVLCDR2アミノ酸配列；
（iii）SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:126またはSEQ ID NO:138に示されるようなVLCDR3アミノ酸配列；
（iv）SEQ ID NO:63またはSEQ ID NO:87に示されるようなVHCDR1アミノ酸配列；
（v）SEQ ID NO:65またはSEQ ID NO:89に示されるようなVHCDR2アミノ酸配列；および
（vi）SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:91またはSEQ ID NO:110に示されるようなVHCDR3アミノ酸配列。
【請求項３３】
請求項32に記載のモノクローナル抗体をコードする核酸。
【請求項３４】
以下を含む、請求項33に記載の核酸：
（i）SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:113およびSEQ ID NO:131に示される核酸配列からなる群より選択されるVLCDR1をコードする核酸；
（ii）SEQ ID NO:72およびSEQ ID NO:115に示される核酸配列からなる群より選択されるVLCDR2をコードする核酸；
（iii）SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:134およびSEQ ID NO:143に示される核酸配列の群より選択されるVLCDR3をコードする核酸；
（iv）SEQ ID NO:77およびSEQ ID NO:97に示される核酸配列の群より選択されるVHCDR1をコードする核酸；
（v）SEQ ID NO:79およびSEQ ID NO:99に示される核酸配列の群より選択されるVHCDR2をコードする核酸；ならびに
（vi）SEQ ID NO:101およびSEQ ID NO:120に示される核酸配列の群より選択されるVHCDR3をコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、Wnt2タンパク質を過剰発現する癌細胞の増殖を阻害する方法に関する。本方法は、Wnt2 mRNAまたはWnt2タンパク質に結合し、Wnt2シグナル伝達を妨害し、または別のタンパク質、例えば、フリッツルド（Frizzled）受容体などへのWnt2タンパク質の結合を阻害する因子と細胞を接触させる工程を含む。
【０００２】
関連出願の相互参照
本願は、2004年5月14日に出願された米国特許仮出願第60/571,323号の恩典を主張し、この開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
肺癌は、米国および世界規模での癌による死亡の主要な原因であり、米国において毎年>170,000例が、世界規模ではほぼ百万例が新規に診断されている（Minna et al. Cancer Cell. 1(1):49-52 (2002)）。過去数十年における肺癌の治療でなされた積極的なアプローチにも関わらず、肺癌の5年間の生存割合は、15%より下のままである（Minna et al. Cancer Cell. 1(1):49-52 (2002)）。肺癌は、2つのグループ：非小細胞肺癌（NSCLC）および小細胞肺癌（SCLC）に分けられる。NSCLC（すべての癌の75〜80%）は、3つの主要な型：腺癌、扁平上皮癌、および大細胞癌からなる（Minna (2002)）。肺癌種および扁平上皮癌は、すべての肺癌の6〜70%を表す。外科手術、化学療法、および放射線治療は、進行した疾患においては一般的には不満足な結果を伴って使用されてきた。肺癌治療の効力の改善が、主要な公衆衛生の目的である。
【０００４】
悪性胸膜中皮腫（MPM）は、肺の胸膜線から原発的に生じる高度に攻撃的かつ挑戦的な癌である。年間約3,000人の患者が米国においてMPMであると診断され、この腫瘍の発生は、短期的に劇的に増加し、2020年頃にピークを迎えると予測されている（Thatcher、Lung Cancer 45 Suppl 1: S1-2 (2004)）。MPMは通常進行した状態で現れるので、治癒的切除が可能であることはまれである。放射線治療は、単独治療様式として臨床的利点を示すことに失敗し、化学療法の投与は、進行した段階には限られた効力で、大部分限定されている（Kindler、Lung Cancer 45 Suppl 1: S125-7 (2004)）。組換えサイトカインの胸膜注射に基づく代替的なストラテジーは、同様に不満足であることが判明した（Bard et al. Lung Cancer 45 Suppl 1:S 129-31 (2004)）。現在の下位ニューブラスチンが限られた恩典のみを提供し、全体的な生存は低いので、MPMの根底にある分子機構のより深い理解に基づいて新規な治療剤を開発する危急の必要性が存在している。
【０００５】
肺癌およびMPMの分子病理的起源には、優勢な発癌遺伝子および劣勢の腫瘍抑制遺伝子を含む複数の遺伝子の発現および機能の変化、ならびに細胞シグナル伝達経路の異常が含まれる。肺癌およびMPMの病理的起源についてのより良好な理解は、肺癌を有する患者の治療を改善するはずである。
【０００６】
分泌糖タンパク質のウィングレス（Wingless）型（Wnt）ファミリーは、発生プロセスおよび発現に広く関与するシグナル伝達分子の群である（Polakis、Genes Dev. 14: 1837-51 (2000) ; Lustig et al. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 129:199-221 (2003)）。このように19種のヒトWntタンパク質が同定されてきた。Wntシグナルの伝達は、細胞表面受容体の2つの別個のファミリー：フリッツルド（frizzled）（Fz）受容体ファミリーおよびLDL-受容体関連タンパク質（LRP）ファミリーへのWntシグナルの結合によって引き起こされる（Akiyama、Cytokine Growth Factor Rev.11:273-82 (2000)）。細胞内で、Wntシグナル伝達はディシェベルド（dishevelled）（Dvl）タンパク質を活性化し、これは、β-カテニンのグリコーゲンシンターゼキナーゼ3β（GSK-3β）リン酸化を阻害し、その細胞質安定化をもたらす。次いで、安定化されたβ-カテニンは細胞核に入り、LEF/TCF転写因子と結合する。β-カテニン-Tcf/Lefは、重要な下流の標的遺伝子の転写を誘導し、それらの多くは癌に関係している。Wntシグナルの非存在下では、遊離の細胞質β-カテニンが、Axin、大腸腺腫様ポリポーシス（APC）遺伝子産物、およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ（GSK）-3βからなる複合体に取り込まれる。GSK-3βによる、Axin、APC、およびβ-カテニンの結合体的なリン酸化は、ユビキチン経路およびプロテアソームによる分解のためのβ-カテニンを意味する（Uthoff et al. 、Int J Oncol 19 (4):803-10（2001）; Matsuzawa et al.、Mol Cell 7(5):915-26 2001)）。
【０００７】
ディシェベルド(Dvl）は、フリッツルド受容体の上流かつβ-カテニンの下流に位置するWntシグナル伝達のポジティブメディエーターである。GSK-3はWnt経路においていくつかのタンパク質をリン酸化し、β-カテニンの下流の調節の手段となる。遺伝子APCにおける変異は、散発性と遺伝性の両方の直腸結腸腫瘍形成のための起因事象である。異常なタンパク質がWntシグナル伝達カスケードの不可欠な部分であるので、APC変異体は腫瘍形成に関与している。このタンパク質産物はβ-カテニンのための結合および分化の部位として作用するいくつかの機能的ドメインを含む。β-カテニンのアミノ末端セグメントに存在する変異は、通常、リン酸化依存性のユビキチン媒介性分解に関与し、従って、β-カテニンを安定化する。安定化された細胞質カテニンが蓄積する場合、これは、核に移行して、c-mycなどの発癌遺伝子の発現を媒介する、Tcf/Lef高移動度グループの転写因子と相互作用する。
【０００８】
Wnt/β-カテニンシグナル伝達が、種々の細胞型において細胞の生存を促進することが知られている（Orford et al.、J Cell Biol 146(4):855-68 (1999); Cox et al.、Genetics 155(4):1725-40 (2000); Reya et al.、Immunity 13(1):15-24 (2000); Satoh et al.、Nat_Genet 24 (3):245-50 (2000); Shih et al.、Cancer Res 60(6):1671-6 (2000); Chen et al.、J Cell Biol 152(1):87-96 (2001); Ioannidis et al.、Nat_Immunol 2(8):691-7 (2001)）。Wntシグナル伝達経路はまた、腫瘍の発生および/または進行と関連すると考えられている（Bienz et al.、Cell 103(2):311-20 (2000); Cox et al.、Genetics 155 (4):1725-40 (2000)；(Polakis、Genes Dev 14(15):1837-51 (2000); You t al.、J Cell Biol 157(3): 429-40 (2002)）。Wntシグナル伝達経路の異常な活性化は、種々の癌と関連し、c-Mycの過剰増殖および増幅と相関する（He et al.、Science 281 (5382):1509-12 (1998); Miller et al.、Oncogene 18 (55):7860-72 (1999); Bienz et al.、Cell 103(2):311-20 (2000); (Polakis、Genes Dev 14(15):1837-51 (2000); Brown、Breast Cancer Res 3(6):351-5(2001)）。加えて、c-Mycは、結腸直腸癌細胞におけるβ-カテニン/Tcfの転写標的の1つとして同定された（He et al.、Science 281 (5382):1509-12 (1998); Miller et al.、Oncogene 18(55):7860-72 (1999); You et al.、J Cell Biol 157(3): 429-40 (2002)）。
【０００９】
Wntリガンドに加えて、分泌性フリッツルド関連タンパク質のファミリー（sFRP）もまた単離されてきた。sFRPは、分泌性Wntリガンドの結合について膜貫通フリッツルド受容体と競合することによって、Wntシグナル伝達の可溶性内因性モジュレーターとして機能すると考えられる（Melkonyan et al.、Proc Natl Acad Sci U S A 94 (25):13636-41 (1997)）。sFRPは、タンパク質を結合し、およびその細胞表面シグナル伝達受容体への接近をブロックすることによって、Wnt機能と拮抗できるか、またはフリッツルド受容体へのリガンドの提示を容易にすることによって、Wnt活性を増強するかのいずれかができる（Uthoff et al.、Int J Oncol 19(4):803-10 (2001)）。sFRPは、アポトーシス感受性を調節すると考えられ、プログラムされた細胞死に対して拮抗効果を働かせる。今日まで、sFRPは、癌に対しての原因としてまだ関連付けられていない。しかし、sFRPは、結腸直腸癌細胞株において高頻度で過度にメチル化されていると報告されており、この過度のメチル化は基礎的なsFRP発現の欠如と関連する（Suzuki et al.、Nat Genet 31(2):141-9 (2002)）。
【００１０】
別のディッコフ（Dickkopf）（Dkk）と呼ばれるタンパク質もまた、Wntシグナル伝達と干渉し、および細胞質β-カテニンの蓄積を減少することが見い出されている（Moon et al.、Cell 88 (6):725-8 (1997); Fedi et al.、J Biol Chem 274(27):19465-72 (1999)）。DKK-1は、フリッツルド受容体に隣接するLDL受容体関連タンパク質6（LRP6）に結合することによってWnt誘導性シグナルと拮抗する（Nusse,. Nature 411 (6835):255-6 (2001)）。Dkk-1の過剰発現は、アポトーシスに対して腫瘍細胞を感受性にすることが見い出されている（Shou et al.、Oncogene 21 (6):878-89 (2002)）。
【００１１】
細胞増殖および腫瘍成長に対するWntタンパク質の効果は、それらの同種の細胞表面受容体と相互作用し、続いて下流のシグナル伝達を誘導するWntタンパク質に依存すると考えられる。Wntタンパク質が分泌されると、抗体は、その細胞表面受容体へのWntの結合に干渉するかまたはそれを阻害するために使用されてもよく、従って、下流のシグナル伝達に影響を与える。Wntタンパク質に対するいくつかの抗体が生成されてきた。例えば、抗Wnt-1（G-19）（sc-6280; Santa Cruz Biotechnology, Inc.）および抗Wnt-2（H-20)(sc-5208; Santa Cruz Biotechnology, Inc.）は、それぞれ、ヒトのWnt-1タンパク質およびWnt2タンパク質のN末端の近傍にマッピングされるペプチドに対して産生されたヤギポリクローナル抗体である。Wnt2（V-16）は、ヒト起源のWnt2の内部領域中にマッピングされるペプチドに対して産生されたヤギポリクローナル抗体である（sc-5207; Santa Cruz Biotechnology, Inc.）。
【００１２】
しかし、ヒトにおけるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の使用は、ポリクローナル抗体が非ヒト動物において産生される場合には厳しく制限されている。マウス抗体のような「外来性の」抗体のヒトにおける反復使用は、有害な超過敏反応、すなわち、ヒト抗マウス抗体（HAMA）応答、すなわち抗イディオタイプ応答に導く可能性がある。HAMA応答は、患者の血清からのクリアランスの速度の増加および／または患者によるアレルギー反応に起因して、反復投与を有効でなくする。
【００１３】
ヒトハイブリドーマを使用してヒト由来のモノクローナル抗体を作製するための試みが行われてきた。不運にも、ヒトハイブリドーマ細胞株からのモノクローナル抗体の収量は、マウスハイブリドーマと比較して相対的に低い。加えて、免疫グロブリンを発現するヒト細胞株は、マウス細胞株と比較して相対的に不安定であり、これらのヒト細胞株の抗体産生能力は一過性である。従って、ヒト免疫グロブリンが高度に所望されているが、ヒトハイブリドーマ技術は、必要とされる抗原特異性を有するヒトモノクローナル抗体が容易に入手可能である段階にまだ達していない。従って、非ヒト起源の抗体が、キメラ抗体またはヒト化抗体を作製するために遺伝子操作されててきた。このような遺伝子操作は、マウス抗体を用いるヒト患者の注射後に予測されるものと比較して、HAMA応答のリスクが減少した抗体を生じる。例えば、キメラ抗体は、ヒト定常流域に非ヒト可変領域を移植することによって形成することができる（Khazaeli et al. (1991)、J. Immunotherapy 15: 42-52）。一般的に、ヒト化された抗体は、ヒトフレームワーク領域（FR）に、非ヒト相補性決定領域（CDR）を移植することによって形成される（Jones et al. (1986)、Nature 321: 522-525; およびReichman et al. (1988)、Nature 332: 323-327を参照されたい）。典型的には、ヒト化抗体は、6つすべて（3つは軽鎖であり、3つは重鎖である）のCDR型の非ヒト抗体をヒト抗体のフレームワーク領域（FR）に移植することによって形成される（例えば、米国特許第6,407,213号を参照されたい）。代替として、Fv抗体（米国特許第4,642,334号を参照されたい）または単鎖Fv（SCFV）抗体（米国特許第4,946,778号を参照されたい）が、HAMA応答のリスクを減少するために用いることができる。
【００１４】
Wnt2シグナル伝達の理解における最近の進歩にも関わらず、発癌におけるこの経路の役割は知られていない。従って、先行技術は、Wnt2経路を調節する化合物が、例えば、癌の治療のために有用であり得ることの明確な証拠を提供し損なっている。本発明は、これらおよび他の必要性に取り組む。
【発明の開示】
【００１５】
発明の概要
本発明は、Wnt2を過剰発現する癌細胞の増殖を阻害する方法に関する。本方法は、細胞の増殖を阻害するために有効である量のWnt2シグナル伝達を阻害する因子と細胞を接触させる工程を含む。
【００１６】
ある態様において、細胞は癌細胞である。癌細胞は、乳癌、卵巣癌、直腸結腸癌、胃癌、肺癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、甲状腺癌、膵臓癌、子宮頸部癌、食道癌、中皮腫、頭頚部癌、肝細胞癌、黒色腫、脳腫瘍、外陰癌、精巣癌、肉腫、腸癌、皮膚癌、白血病、およびリンパ腫の癌細胞からなる群より選択される。
【００１７】
1つの態様において、因子はsiRNAである。ある態様において、因子は、抗Wnt2モノクローナル抗体、例えば、Wnt2タンパク質、好ましくはヒトWnt2タンパク質に特異的に結合する抗体である。
【００１８】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。好ましいものは、抗Wnt2モノクローナル抗体である。好ましいモノクローナル抗体は以下を含む：（i）SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:104またはSEQ ID NO:125に示されるようなVLCDR1アミノ酸配列；（ii）SEQ ID NO:58に示されるようなVLCDR2アミノ酸配列；（iii）SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:126またはSEQ ID NO:138に示されるようなVLCDR3アミノ酸配列；（iv）SEQ ID NO:63またはSEQ ID NO:87に示されるようなVHCDR1アミノ酸配列；（v）SEQ ID NO:65またはSEQ ID NO:89に示されるようなVHCDR2アミノ酸配列；および（vi）SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:91またはSEQ ID NO:110に示されるようなVHCDR3アミノ酸配列。
【００１９】
本発明はさらに、ヒトWnt2のアミノ酸残基49〜63（SEQ ID NO:2）に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを特異的に結合する抗Wnt2抗体を提供する。別の抗Wnt2抗体は、SSQRQLCHRPDVMR（SEQ ID NO:2）を含むポリペプチドを特異的に結合する。
【００２０】
本発明はまた、ヒトWnt2のアミノ酸残基49〜63（SEQ ID NO:2）に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを特異的に結合する第2の抗Wnt2抗体と、Wnt2タンパク質を結合することについて競合する抗Wnt2抗体を提供する。別の抗Wnt2抗体は、SSQRQLCHRPDVMR（SEQ ID NO:2）を含むポリペプチドを特異的に結合する第2の抗Wnt2抗体と、Wnt2タンパク質を結合することについて競合する。
【００２１】
本発明はさらに、Wnt2を過剰発現する細胞のアポトーシスを誘導する方法を提供する。本方法は、細胞のアポトーシスを誘導するために有効である量のWnt2シグナル伝達を阻害する因子と、細胞を接触させる工程を含む。別の局面において、細胞内のWnt2シグナル伝達を阻害する方法が提供される。本方法は、Wnt2シグナル伝達を阻害するために有効である量の抗Wnt2抗体と、Wnt2を過剰発現する細胞を接触させる工程を含む。
【００２２】
本発明の好ましい態様において、Wnt2シグナル伝達と関連する疾患を治療する方法が提供される。本方法は、疾患を治療するために有効である量のWnt2シグナル伝達を阻害する因子を、そのような治療の必要がある被験体に投与する工程を含む。この因子は抗Wnt2抗体またはsiRNAであり得る。この疾患は癌であり得、好ましくは、乳癌、卵巣癌、直腸結腸癌、胃癌、肺癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、甲状腺癌、膵臓癌、子宮頸部癌、食道癌、中皮腫、頭頚部癌、肝細胞癌、黒色腫、脳腫瘍、外陰癌、精巣癌、肉腫、腸癌、皮膚癌、白血病、およびリンパ腫の癌細胞から選択される癌であり得る。
【００２３】
別の本発明の態様において、Wnt2を過剰発現する癌を治療する方法が提供される。本方法は、癌を治療するために有効である量の、本明細書に記載されるような抗Wnt2抗体を被験体に投与する工程を含む。好ましくは、この抗Wnt2抗体はモノクローナル抗体である、好ましい態様において、この抗Wnt2抗体は以下を含む：（i）SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:104またはSEQ ID NO:125に示されるようなVLCDR1アミノ酸配列；（ii）SEQ ID NO:58に示されるようなVLCDR2アミノ酸配列；（iii）SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:126またはSEQ ID NO:138に示されるようなVLCDR3アミノ酸配列；（iv）SEQ ID NO:63またはSEQ ID NO:87に示されるようなVHCDR1アミノ酸配列；（v）SEQ ID NO:65またはSEQ ID NO:89に示されるようなVHCDR2アミノ酸配列；および（vi）SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:91またはSEQ ID NO:110に示されるようなVHCDR3アミノ酸配列。
【００２４】
本発明はさらに、ヒトWnt2のアミノ酸残基49〜63に対応するアミノ酸配列（SEQ ID NO:2）を含むポリペプチドを特異的に結合する抗Wnt2モノクローナル抗体を提供する。本発明の好ましい態様において、この抗Wnt2モノクローナル抗体は、ヒトWnt2のアミノ酸残基49〜63に対応するアミノ酸配列（SEQ ID NO:2）を含むポリペプチドを特異的に結合する第2の抗Wnt2抗体と、Wnt2タンパク質への結合について競合する。
【００２５】
本発明はさらに、抗Wnt2抗体およびその断片をコードする核酸を提供する。好ましい態様において、抗Wnt2抗体をコードする核酸は以下を含む：（i）SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:113およびSEQ ID NO:131に示される核酸配列からなる群より選択されるVLCDR1をコードする核酸；（ii）SEQ ID NO:72およびSEQ ID NO:115に示される核酸配列からなる群より選択されるVLCDR2をコードする核酸；（iii）SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:134およびSEQ ID NO:143に示される核酸配列の群より選択されるVLCDR3をコードする核酸；（iv）SEQ ID NO:77およびSEQ ID NO:97に示される核酸配列の群より選択されるVHCDR1をコードする核酸；（v）SEQ ID NO:79およびSEQ ID NO:99に示される核酸配列の群より選択されるVHCDR2をコードする核酸；ならびに（vi）SEQ ID NO:101およびSEQ ID NO:120に示される核酸配列の群より選択されるVHCDR3をコードする核酸。
【００２６】
さらに、本発明は、抗Wnt2抗体またはsiRNA、ならびに薬学的に許容される賦形剤、担体、および/または希釈剤を含む薬学的組成物を提供する。
【００２７】
本発明の方法は、インビトロおよび/またはインビボで実施することができる。本発明の方法、抗体、薬学的組成物、およびキットは、本明細書に記載されるような詳細を包含する。
【００２８】
定義
「Wntタンパク質」または「Wntリガンド」という用語は、ショウジョウバエ（Drosophila）セグメントポラリティー遺伝子、winglessに関連する哺乳動物タンパク質のファミリーをいう。ヒトにおいては、Wntファミリーの遺伝子は、典型的には、疎水性シグナル配列、および保存性アスパラギン連結オリゴサッカリド共通配列（Shimizu et al.、Cell Growth Differ 8(12):1349-58 (1997)）を有する38〜43kDaのシステインリッチな糖タンパク質をコードする。Wntファミリーは、少なくとも19個の哺乳動物メンバーを含む。例示的なWntタンパク質には、Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8A、Wnt8B、WNT10A、Wnt10B、Wnt11、Wnt12、Wnt13、Wnt14、Wnt15、およびWnt16が含まれる。好ましい本発明のWntタンパク質は、Wnt2、好ましくはヒトWnt2タンパク質である。
【００２９】
「フリッツルドタンパク質」または「フリッツルド受容体」という用語は、組織極性の発生において役割を果たす、ショウジョウバエフリッツルド遺伝子に関連する哺乳動物タンパク質のファミリーをいう。このフリッツルドファミリーは、少なくとも10個の哺乳動物遺伝子を含む。例示的なヒトフリッツルド受容体には、フリッツルド1、フリッツルド2、フリッツルド3、フリッツルド4、フリッツルド5、フリッツルド6、フリッツルド7、フリッツルド8、フリッツルド9およびフリッツルド10が含まれる。ショウジョウバエフリッツルドタンパク質の哺乳動物ホモログは、多数の共通の構造的モチーフを共有する。細胞外膜表面に位置するN末端に、シグナル配列、10個のシステイン残基の不変パターンを有する120アミノ酸のドメイン、および40〜100個の大部分は可変の親水性アミノ酸の高度に分岐した領域が続く。推定の疎水性セグメントは、疎水性ループによって連結される7個の膜貫通へリックスを形成し、膜の細胞内表面に位置するC末端で終わる。システインリッチドメイン（CRD）および膜貫通セグメントは強く保存されており、細胞外CRDが可変性リンカー領域によって7個の膜貫通へリックスの束につながれているワーキングモデルを示す。それゆえに、フリッツルドタンパク質受容体は、アミノ末端リガンド結合ドメインを有するGタンパク質共役受容体に類似する膜貫通シグナル伝達の動的モデルに含まれる。例えば、フリッツルド1、フリッツルド2、およびフリッツルド7は、肺癌および結腸直腸癌に含まれ（Sagara et al.、Biochem Biophys Res Commun 252(1):117-22 (1998)）；フリッツルド3は、肺癌、子宮頸部癌および結腸直腸癌を含むヒトの癌細胞に含まれ（Kirikoshi et al.、Int J Oncol 19(4):767-71(2001)）；フリッツルド7は胃癌に含まれ（Kirikoshi et al.,Int J Oncol 19(4):767-71 (2001)）；フリッツルド10は胃癌および結腸直腸癌に含まれる（Kirikoshi et al.、Int J Oncol 19(4):767-71 (2001); Terasaki et al.、Int J Mol Med 9(2):107-12 (2002)）。
【００３０】
「ディシェベルド」または「Dvl」という用語は、ディシェベルドタンパク質のファミリーのメンバーをいい、その全長配列は、典型的には、3つの保存性ドメイン、Wnt拮抗タンパク質Axinに存在するDIXドメイン；タンパク質-タンパク質相互作用に関与するPDZドメイン、およびRho GTPaseを調節するタンパク質に見い出されるDEPドメインを保有する。Dvlタンパク質には、例えば、Dvl-l、Dvl-2、およびDvl-3が含まれる。Dvlの核酸配列およびタンパク質配列は、マウスおよびヒトを含む様々な種から知られている。例示的なヒトDvl-l、Dvl-2、およびDvl-3のタンパク質配列は、それぞれ、参照配列NP_004412、NP_004413、およびNM_004414の下で使用可能である。
【００３１】
Wntシグナル伝達および特にWnt2シグナル伝達の「阻害剤」とは、例えば、Wntもしくはフリッツルドタンパク質に結合するか、またはWntシグナル伝達についての公知のアッセイ法（例えば、β-カテニンの測定、またはTcfおよびLefの転写因子によって制御される発癌遺伝子発現の測定）において測定されるようなWntシグナル伝達を部分的もしくは全体的にブロックする、化合物または因子をいう。阻害剤には、修飾されたバージョンのWntまたはフリッツルドタンパク質、ならびに天然に存在する、および合成の、リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、抗体、低分子化学物質などが含まれる。本発明の阻害剤を検出するためのアッセイ法は、以下により詳細に記載される。
【００３２】
「Wnt2タンパク質を過剰発現する細胞」「Wnt2 mRNAを過剰発現する細胞」「Wnt2タンパク質を過剰発現する癌細胞」または「Wnt2 mRNAを過剰発現する癌細胞」という語句、またはその文法的な等価物は、Wnt2タンパク質またはWnt2 mRNAの発現が、同じ組織からの正常な細胞における発現のレベルの、少なくとも約2倍、通常少なくとも約5倍である細胞または癌細胞をいう。特定の遺伝子の発現のレベルを決定するための方法は、当技術分野で周知である。このような方法には、RT-PCR、遺伝子産物に対する抗体の使用などが含まれる。
【００３３】
本明細書で使用されるように、「抗体」は、特定の抗原と免疫学的に反応性である免疫グロブリン分子に対する言及を含み、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を含む。この用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）およびヘテロ結合体抗体（例えば、二特異性抗体）のような遺伝子操作された形態を含む。用語「抗体」はまた、抗原結合能力を有する断片（例えば、Fab'、F(ab')2、Fab、FvおよびrIgG。Pierce Catalog and Handbook、1994-1995 (Pierce Chemical Co.、Rockford、ILもまた参照されたい）を含む、抗体の抗原結合型を含む。例えば、Kuby, J.、Immunology、第3版、W.H. Freeman & Co. 、New York (1998)もまた参照されたい。この用語はまた、組換え単鎖Fv断片（scFv）をいう。この用語の抗体はまた、二価または二特異性抗体、ジアボディー、トリアボディー、およびテトラボディーを含む。二価および二特異性分子は、例えば、Kostelny et al.. (1992) J Immunol 148: 1547、Pack and Pluckthun (1992) Biochemistry 31:1579、Hollinger et al.、1993、前出、Gruber et al. (1994) J Immunol :5368、Zhu et al.、(1997) Protein Sci 6:781、Hu et al.、(1996) Cancer Res. 56:3055、Adams et al.、(1993) Cancer Res. 53:4026、およびMcCartney et al.、(1995) Protein Eng. 8:301において記載されている。
【００３４】
特定の抗原と免疫学的に反応性である抗体は、ファージまたは同様のベクター中の組換え抗体のライブラリーの選択のような組換え方法、例えば、Huse et al.、Science 246: 1275-1281 (1989) ; Ward et al.、Nature 341:544-546 (1989); およびVaughan et al.、Nature Biotech. 14:309-314 (1996)を参照されたい、または抗原もしくは抗原をコードするDNAで動物を免疫することによって、生成することができる。
【００３５】
典型的には、免疫グロブリンは重鎖および軽鎖を有する。各重鎖および軽鎖は、定常領域および可変領域を含む（これらの領域は「ドメイン」としても知られる）。軽鎖および重鎖の可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」とも呼ばれる、3つの超可変領域によって割り込まれた4つの「フレームワーク」領域を含む。フレームワーク領域およびCDRの含量が定義されてきた。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種の中で比較的保存されている。構成成分である軽鎖および重鎖の合わせたフレームワーク領域である、抗体のフレームワーク領域は、三次元空間にCDRを配置および整列させるように働く。
【００３６】
CDRは、抗原のエピトープへの結合のために主要な原因である。各鎖のCDRは、典型的には、N末端から開始して連続的に番号付けされたCDR1、CDR2、およびCDR3と呼ばれ、特定のCDRが位置する鎖によって典型的には同定される。従って、VH CDR3が、それが見い出される抗体の重鎖の可変ドメインに位置するのに対して、VL CDR1は、それが見い出される抗体の軽鎖の可変ドメインからのCDR1である。
【００３７】
「VH」または「VH」との言及は、抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域を指し、これは、Fv、scFv、dsFv（ジスルフィド安定化Fv）またはFabを含む。「VL」または「VL」との言及は、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指し、これは、Fv、scFv、dsFvまたはFabを含む。
【００３８】
「単鎖Fv」または「scFv」という語句は、伝統的な2つの鎖の抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインが1つの鎖を形成するように結合されている抗体をいう。典型的には、リンカーペプチドが2つの鎖の間に挿入され、適切な折りたたみおよび活性結合部位の生成を可能にする。
【００３９】
「キメラ抗体」は、（a）抗原結合部位（可変領域）が、異なるもしくは変化したクラス、エフェクター機能、および/もしくは種の定常領域、またはそのキメラ抗体に新たな特性を付与する全体的に異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物などに連結されるように、定常領域、またはその一部が変化、置き換え、または交換されている；あるいは（b）可変領域、またはその一部が、異なるまたは変化した抗原特異性を有する可変領域で変化、置き換え、または変化されている、免疫グロブリン分子である。
【００４０】
「ヒト化抗体」は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む免疫グロブリン分子である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（CDR）からの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギなどの非ヒト種のCDRからの残基（ドナー抗体）によって置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。ある場合において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、移入されたCDR配列またはフレームワーク配列においても見い出されない残基を含んでもよい。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、および典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここで、CDR領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのそれであり、フレームワーク（FR）領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン共通配列である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれを含む（Jones et al.、Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al.、Nature 332:323-329 (1988); およびPresta,Curr. Op.Struct. Biol. 2:593-596 (1992)）。ヒト化は、Winterおよび共同研究者の方法に従って（Jones et al.、Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al.、Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al.、Science 239:1534-1536 (1988)）、ヒト抗体の対応する配列の代わりに、齧歯類のCDRまたはCDR配列で置換することによって本質的に実施することができる。従って、このようなヒト化抗体はキメラ抗体であり（米国特許第4,816,567号）、ここでは、インタクトなヒト可変ドメインに実質的に満たないものが、非ヒト種からの対応する配列によって置換されている。
【００４１】
「完全なヒト抗体」という用語は、ヒトフレームワークおよび定常領域に加えて、ヒト可変領域を含む免疫グロブリンをいう。このような抗体は、当技術分野において公知である種々の技術を使用して産生することができる。例えば、インビトロ方法は、バクテリオファージ（例えば、McCafferty et al.、1990、Nature 348: 552-554; HoogenboomおよびWinter、J. Mol. Biol. 227: 381 (1991); およびMarks et al.、J. Mol. Biol. 222: 581 (1991)）、酵母細胞（Boder and Wittrup、1997、Nat Biotechnol 15:553-557）、またはリボソーム（Hanes and Pluckthun、1997、Proc Natl Acad Sci U S A 94:4937-4942）上で提示されるヒト抗体断片の組換えライブラリーの使用を含む。同様に、ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているトランスジェニック動物、例えば、マウスへのヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入によって作製することができる。曝露（challenge）の際に、ヒト抗体産生が観察され、これは、遺伝子の再配列、アセンブリー、および抗体レパートリーを含む、すべての面においてヒトにおいて観察されるものと密接に類似する。このアプローチは、例えば、米国特許第6,150,584号、同第5,545,807号; 同第5,545,806号; 同第5,569,825号; 同第5,625,126号; 同第5,633,425号; 同第5,661,016号、および以下の科学文献（例えば、Jakobavits、Adv Drug Deliv Rev. 31:33-42 (1998)、Marks et al.、Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al.、Nature 368: 856-859 (1994); Morrison、Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al.、Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger、Nature Biotechnology 14: 826 (1996); LonbergおよびHuszar、Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)）において記載されている。
【００４２】
「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗体が結合する抗原上の部位をいう。エピトープは、タンパク質の三次元折りたたみによって並列された連続するアミノ酸または非連続アミノ酸の両方から形成することができる。連続するアミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露に対して保持されるのに対して、三次元折りたたみによって形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒に対して失われる。エピトープは、独特な空間的コンホメーションにおいて、代表的には、少なくとも3つ、より通常には、少なくとも5つまたは8個〜10個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的コンホメーションを決定する方法には、例えば、x線結晶解析および二次元核磁気共鳴が含まれる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology、Vol. 66、Glenn E. Morris、Ed (1996)を参照されたい。
【００４３】
「生物学的試料」は、本明細書で使用されるように、例えば、Wntのタンパク質、ポリヌクレオチドまたは転写物の、核酸またはポリペプチドを含む生物学的組織または液体の試料である。このような試料には、霊長類、例えば、ヒト、または齧歯類、例えば、マウスおよびラットから単離された組織が含まれるがこれらに限定されない。生物学的試料はまた、生検および剖検の試料のような組織の切片、組織学的目的のために採取された凍結切片、血液、血漿、血清、痰、糞便、涙液、粘液、毛髪、皮膚などを含んでもよい。生物学的試料はまた、患者の組織に由来する移植片および一次細胞培養および/または形質転換細胞培養を含む。生物学的試料は、典型的には、真核生物、最も好ましくは、例えば、チンパンジーまたはヒト；ウシ；イヌ；ネコ；齧歯類、例えば、モルモット、ラット、マウス；ウサギなどの哺乳動物；または鳥類；爬虫類；または魚類から得られる。
【００４４】
「生物学的試料を提供する」とは、本発明において記載される方法における使用のために生物学的試料を得ることを意味する。ほとんどの場合、これは、動物、好ましくはヒトからの細胞の試料を取り出すことによって行われるが、しかしまた、事前に単離された（例えば、別のヒトによって、別の時間に、および/もしくは別の目的で単離された）細胞を使用することによって、またはインビボで本発明の方法を実施することによって達成することができる。治療または結果の履歴を有するアーカイブ（archival）組織が特に有用である。
【００４５】
生物学的試料における「Wnt2 mRNAのレベル」とは、細胞または生物学的試料中に存在するWnt2遺伝子から転写されるmRNAの量をいう。mRNAは、一般的に、機能的Wnt2タンパク質をコードするが、コードされたタンパク質の機能を変化または除去する変異が存在してもよい。「Wnt2 mRNAのレベル」は定量される必要はないが、対照試料からのレベルまたは対照試料の予測されるレベルに対する比較を伴って、または伴わずに、単に、例えば、主観的な、ヒトによる目視的な検出で検出することができる。
【００４６】
生物学的試料における「Wnt2タンパク質またはポリペプチドのレベル」とは、細胞または生物学的試料中に存在するWnt2 mRNAから翻訳されたポリペプチドの量をいう。このポリペプチドは、Wnt2タンパク質機能を有してもよいし、または有さなくてもよい。「Wnt2タンパク質のレベル」は定量される必要はないが、対照試料からのレベルまたは対照試料の予測されるレベルに対する比較を伴って、または伴わずに、単に、例えば、主観的な、ヒトによる目視的な検出で検出することができる。
【００４７】
「同一である」または「同一性」パーセントという用語は、2つまたはそれ以上の酢酸またはポリペプチドの配列の状況において、以下に記載されるデフォルトパラメーターを用いるBLASTもしくはBLAST2.0配列比較アルゴリズムを使用して、または手動のアライメントおよび目視の検査によって測定されるような、同じであるか、または特定のパーセンテージの同じアミノ酸残基またはヌクレオチド（すなわち、比較ウィンドウまたは所定の領域にわたって最大の一致のために比較および整列化された場合の、特定の領域にわたる約60%の同一性、好ましくは、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上の同一性）を有する2つまたはそれ以上の配列またはサブ配列をいう（例えば、Altschul et al.、Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) およびAltschul et al.、J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)を参照されたい）。次いで、このような配列は、「実質的に同一である」といわれる。この定義はまた、試験配列の相補体をいい、またはそれに適用されてもよい。この定義はまた、欠失および/または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列、ならびに天然に存在する、例えば、多型変異体または対立遺伝子変異体、および人工の改変体を含む。以下に記載されるように、好ましいアルゴリズムは、ギャップおよび同様のものを考慮することができる。好ましくは、同一性は、少なくとも約25アミノ酸またはヌクレオチドの長さである領域にわたって存在し、またはより好ましくは、50〜100アミノ酸またはヌクレオチドの長さである領域にわたって存在する。
【００４８】
配列比較のために、典型的には、1つの配列は参照配列として働き、試験配列がそれに対して比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列がコンピュータに入力され、必要な場合、サブ配列座標が指定され、および配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。好ましくは、デフォルトパラメーターが使用可能であり、または代替的なパラメーターが指定可能である。次いで、配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較した、試験配列についての配列同一性パーセントを計算する。
【００４９】
「比較ウィンドウ」は、本明細書で使用されるように、代表的には、20〜600、通常約50〜約200、より通常には約100〜約150からなる群より選択される連続する位置の数の1つのセグメントに対する言及を含み、ここで、1つの配列は、2つの配列が最適に整列化された後で、同じ数の連続する位置の参照配列に対して比較されてもよい。比較のための配列のアライメントの方法は当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、SmithおよびWaterman、Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所的相同性アルゴリズムによって、NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アライメントアルゴリズムによって、PearsonおよびLipman、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性についての検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行によって（Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group、575 Science Dr.、Madison、WIにおけるGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）、または手動のアライメントおよび目視の検査（例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. 、eds. 1995 supplement)を参照されたい）実施することができる。
【００５０】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するために適切であるアルゴリズムの好ましい例には、BLASTおよびBLAST2.0アルゴリズムが含まれ、これは、Altschul et al.、Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) および Altschul et al.、J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されている。BLASTおよびBLAST2.0は、本発明の核酸およびタンパク質についての配列同一性パーセントを決定するために、本明細書に記載されるパラメーターを用いて使用される。BLAST分析を使用するためのソフトウェアは、the National Center for Biotechnology Informationを通して公的に使用可能である。このアルゴリズムは、問い合わせ配列における長さWの短いワードを同定することによって、高い得点の配列対（HSP）を最初に同定することを含み、これは、データベース中の同じ長さのワードと整列化された場合に、いくつかのポジティブ値の閾値スコアTに一致するか、またはそれを満足するかのいずれかである。Tは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul et al.、前出）。これらの初期の隣接ワードのヒットがそれらを含むより長いHSPを見い出すための検索を開始するための種子として働く。このワードヒットは、累積アライメントスコアが増加可能である限り、各配列が沿っている両方の方向において伸長される。累積スコアは、例えば、ヌクレオチド配列については、パラメーターM（適合する残基の対についてのリワードスコア；常に>0）およびN（ミスマッチ残基についてのペナルティースコア；常に<0）を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスが、累積スコアを計算するために使用される。各方向におけるワードヒットの伸長は、以下の場合に中断される：累積アライメントスコアがその最大の達成された値から量Xだけ落ちる場合；累積スコアが、1つもしくは複数のネガティブスコア残基アライメントの蓄積に起因して、0以下になる場合；またはいずれかの配列の末端に達する場合。BLASTアルゴリズムパラメーターW、T、およびXは、アライメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、11のワード長（W）、10の予測値（E）、M=5、N=-4、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、3のワード長、10の予測値（E）、および50のBLOSUM62スコアリングマトリックス（HenikoffおよびHenikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)を参照されたい）アライメント（B）、10の予測値（E）、M=5、N=-4、および両方の鎖の比較を使用する。
【００５１】
BLASTアルゴリズムはまた、2つの配列間の類似性の統計学的分析を実施する（例えば、KarlinおよびAltschul、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)を参照されたい）。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの尺度は最小合計確率（P(N)）であり、これは、2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の適合性が偶然に起こる可能性の指標を提供する。例えば、核酸は、最小合計確率が、参照核酸に対する試験核酸の比較において、約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、および最も好ましくは約0.001未満である場合には、参照配列に対して類似であると見なされる。対数値は大きな負の数、例えば、5、10、20、30、40、40、70、90、110、150、170などであるかもしれない。
【００５２】
2つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるという指標は、以下に記載されるように、第1の核酸によってコードされるポリペプチドが、第2の核酸によってコードされるポリペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に交差反応性であることである。従って、ポリペプチドは、代表的には、例えば、2つのペプチドが保存性置換によってのみ異なる場合に、第2のポリペプチドに対して実質的に同一である。2つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、以下に記載されるように、2つの分子またはそれらの相補体が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。2つの核酸配列が実質的に同一であることのなお別の指標は、同じプライマーがそれらの配列を増幅するために使用可能であることである。
【００５３】
「単離された」「精製された」または「生物学的に純粋である」という用語は、その天然の状態において見い出される場合に、通常それに付随する成分を、本質的にまたは実質的に含まない物質をいう。純度および均質性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーのような分析科学技術を使用して決定される。調製物中に存在する優勢な種であるタンパク質または核酸は実質的に精製されている。特に、単離された核酸は、天然に遺伝子と隣接し、および目的の遺伝子によってコードされるタンパク質以外のタンパク質をコードするいくつかのオープンリーディングフレームから分離されている。「精製された」という用語は、ある態様において、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に1つのバンドを生じることを意味する。好ましくは、これは、核酸またはタンパク質が、少なくとも85%純粋、より好ましくは少なくとも95%純粋、および最も好ましくは、少なくとも99%純粋であることを意味する。「純度」または「精製」は、他の態様において、精製されるために組成物から少なくとも1つの夾雑物を取り除くことを意味する。この意味において、精製は、精製された物質が均質、例えば、100%純粋であることを必要としない。
【００５４】
「ポリペプチド」「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーをいうために、本明細書で交換可能に使用される。この用語は、1つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するポリマー、修飾した残基を含むもの、および天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。
【００５５】
「アミノ酸」という用語は、天然および合成のアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸に類似して機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣体をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによってコードされるもの、ならびに後に修飾されたもの、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン、およびO-ホスホセリンである。アミノ酸アナログは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、例えば、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基に結合されるα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムをいう。このようなアナログは、修飾されたR基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチドバックボーンを有してもよいが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する構造を有する化学化合物をいう。
【００５６】
アミノ酸は、それらの共通して知られている3文字記号、またはIUPAC-IUB生化学命名法委員会（Biochemical Nomenclature Commission）によって推奨される1文字記号のいずれかによって、本明細書で言及されてもよい。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般的に受容されている1文字記号によって言及されてもよい。
【００５７】
「保存的修飾改変体」は、アミノ酸配列と核酸配列の両方に適用される。特定のアミノ酸配列に関して、保存性修飾改変体とは、同一であるかまたは本質的に同一であるアミノ酸をコードする核酸をいい、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一でありまたは関連する、例えば、天然に隣接する配列をいう。遺伝コードの縮重のために、機能的に同一である多数の核酸が大部分のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCGおよびGCUは、すべてアミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドンによって特定されるすべての位置において、コドンは、コードされるポリペプチドを変化させることなく、記載された対応する別のコドンに変化させることができる。このような核酸のバリエーションは「サイレント変異」であり、これは、保存的に修飾されるバリエーションの1つの種である。ポリペプチドをコードする本明細書のすべての核酸配列はまた、核酸のサイレントバリエーションを記載する。当業者は、特定の状況において、核酸中の各コドン（通常はメチオニンについての唯一のコドンであるであるAUG、および通常はトリプトファンについての唯一のコドンであるTGGを除く）が、機能的に同一である分子を産生するために修飾することができることを認識する。従って、しばしば、ポリペプチドをコードする核酸のサイレント変異は、発現産物に関して記載された配列において暗黙的であるが、実際のプローブ配列に関してはそうではない。
【００５８】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コード配列中の単一のアミノ酸またはアミノ酸の少ないパーセンテージを変化、付加、または欠失させる核酸、ペプチド、またはタンパク質の配列への個々の置換、欠失または付加が、変化が化学的に類似するアミノ酸とのアミノ酸の置換を生じる「保存性修飾改変体」であることを認識する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存性修飾の表は、当技術分野において周知である。このような保存性修飾改変体は、本発明の多型改変体、種間ホモログ、および対立遺伝子に加えてであり、およびこれらを除外しない。典型的には、互いに対する保存性置換は、1）アラニン（A）、グリシン（G）；2）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；4）アルギニン（R）、リジン（K）；5）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）；7）セリン（S）、スレオニン（T）；および8）システイン（C）、メチオニン（M）である（例えば、Creighton、Proteins (1984)を参照されたい）。
【００５９】
ポリペプチド構造のような高分子構造は、種々のレベルの組織化の点から記載することができる。この組織化の一般的な議論については、例えば、Alberts et al.、Molecular Biology of the Cell (3rd ed.、1994) およびCantorおよびSchimmel、Biophysical Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules (1980)を参照されたい。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列をいう。「二次構造」とは、ポリペプチド中の局所的に秩序立てられた三次元構造をいう。これらの構造は、一般的にはドメインとして知られている。ドメインは、ポリペプチドの密な単位をしばしば形成し、かつ代表的には、25〜約500アミノ酸長までであるポリペプチドの部分である。代表的なドメインは、β-シートおよびα-へリックスのストレッチなどのより低い組織化のセクションで作られる。「三次構造」とは、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造をいう。「四次構造」とは、通常、三次構造単位とは独立した非共有結合による会合によって形成される三次元構造をいう。
【００６０】
「標識」または「検出可能部分」は、分光光度法的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、または他の物理的手段によって検出可能である組成物である。例えば、有用な標識には、蛍光色素、電子密度試薬、酵素（例えば、ELISAにおいて一般的に使用されるようなもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、および例えば、ペプチドに放射性標識を取り込むことによって検出可能に作製することができるか、またはペプチドと特異的に反応性である抗体を検出するために使用されるタンパク質または他の実体が含まれる。放射性同位元素は、例えば、3H、14C、32P、35S、または125Iであってもよい。ある場合において、特に、本発明のタンパク質に対する抗体を使用して、放射性同位元素は、以下に記載するように、毒性部分として使用される。標識は、任意の位置において、核酸、タンパク質、および抗体に取り込まれてもよい。標識に抗体を結合体化するための、当技術分野において公知である任意の方法が使用されてもよく、これには、Hunter et al.、Nature、144: 945 (1962); David et al.、Biochemistry、13: 1014 (1974); Pain et al.、J. Immunol. Meth.、40: 219 (1981); およびNygren、J. Histochem. and Cytochem.、30: 407 (1982)によって記載された方法が含まれる。放射性標識されたペプチドまたは放射性標識された抗体組成物の寿命は、放射性標識されたペプチドまたは抗体を安定化し、およびそれを分解から保護する物質の付加によって延長されてもよい。放射性標識されたペプチドまたは抗体を安定化する任意の物質および物質の組み合わせが使用されてもよく、これには米国特許第5,961,955号に開示されるような物質が含まれる。
【００６１】
「エフェクター」または「エフェクター部分」または「エフェクター成分」は、リンカーもしくは化学結合を通して共有結合により、またはイオン結合、ファンデルワールス結合、静電的結合、もしくは水素結合を通した非共有結合によるいずれかで、抗体に結合される（または連結される、または結合体化される）分子である。「エフェクター」は、例えば、放射活性化合物、蛍光化合物、酵素または基質、エピトープタグのようなタグ、毒素；活性化可能な部分、化学療法剤；リパーゼ；抗生物質；または放射性同位元素放射「ハード」、例えば、β照射を含む、検出部分を含む種々の分子であり得る。
【００６２】
「組換え」という用語は、例えば、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターへの言及とともに使用される場合、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入、または天然型の核酸もしくはタンパク質の変化によって修飾されたこと、あるいは細胞がそのように修飾された細胞に由来することを示す。従って、例えば、組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）型中には見い出されない遺伝子を発現し、またはさもなくば異常に発現され、少なく発現され、もしくは全く発現されない天然型遺伝子を発現する。「組換え核酸」は、本明細書では、一般的に、核酸の操作によって、例えば、通常天然には見い出されない形態で、ポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを使用して、インビトロでもともと形成された核酸を意味する。この様式で、異なる配列の作動可能な連結が達成される。従って、直鎖型の単離された核酸、または通常連結されていないDNA分子をライゲーションすることによってインビトロで形成された発現ベクターは、両方とも、本発明の目的のための組換えと見なされる。一旦組換え核酸が作製され、宿主細胞または生物に再導入されると、これは非組換えにより、すなわち、インビトロ操作以外の宿主細胞のインビボ細胞機構を使用して複製する；しかし、一旦組換え的に産生されるが、引き続いて非組換えにより複製されるこのような組換え核酸は、なお、本発明の目的のための組換えと見なされることが理解される。同様に、「組換えタンパク質」は、組換え技術を使用して、すなわち、上記に示すような組換え核酸の発現を通して作製されるタンパク質である。
【００６３】
「異種」という用語は、核酸の部分に対する言及とともに使用される場合、核酸が、天然において互いに同じ関連性において通常は見い出されない2つまたはそれ以上のサブ配列を含むことを意味する。例えば、核酸は、代表的には、組換え的に産生され、2つまたはそれ以上の配列を有し、例えば、新たな機能的核酸を作製するために配列された関連性のない遺伝子、例えば、1つの供給源からのプロモーターおよび別の供給源からのコード領域からである。同様に、異種タンパク質は、しばしば、天然には互いに同じ関連性において見い出されない2つまたはそれ以上のサブ配列（例えば、融合タンパク質）をいう。
【００６４】
抗体または抗原、例えば、タンパク質、好ましくはWnt2タンパク質に「特異的に（もしくは選択的に）結合する」、または「〜と特異的に（もしくは選択的に）免疫反応性である」という語句は、タンパク質またはペプチドまたは抗体に言及する場合には、タンパク質および他の生物物質の異種集団における、タンパク質の存在に決定的である結合反応をいう。従って、指定された免疫アッセイ条件下で、特定の抗体が、特定のタンパク質に、バックグラウンドの少なくとも2倍、より典型的にはバックグラウンドの10倍から100倍より多く結合する。
【００６５】
このような条件下での抗体への特異的結合は、特定のタンパク質についてのその特異性について選択される抗体を必要とする。例えば、特定のタンパク質、多型改変体、対立遺伝子、オルトログ、および保存性修飾改変体、またはスプライシング改変体、またはそれらの一部に対して産生された抗体が、Wnt2タンパク質と特異的に免疫反応性であり、かつ他のタンパク質とは免疫反応性でない抗体のみを得るために選択することができる。この選択は、他の分子と交差反応する抗体を除外することによって達成されてもよい。種々のイムノアッセイ形式が、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために使用されてもよい。例えば、固相ELISAイムノアッセイ法が、タンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために日常的に使用される（例えば、特定の免疫反応性を決定するために使用することができるイムノアッセイ法の形式および条件の説明については、HarlowおよびLane、Antibodies、A Laboratory Manual (1988)を参照されたい）。
【００６６】
「腫瘍細胞」は、腫瘍における前癌性細胞、癌性細胞、および正常細胞をいう。
【００６７】
「癌細胞」「形質転換」細胞または組織培養における「形質転換」とは、新たな遺伝物質の取り込みを必ずしも含まない、自発的または誘導された表現型の変化をいう。形質転換は、形質転換ウイルスでの感染、および新規なゲノムDNAの取り込み、または外来性DNAの取り込みから生じ得るが、これはまた、自発的にまたは発癌物質への曝露後に生じることができ、それによって、内因性遺伝子を変異させる。本発明において、形質転換は、典型的には、Wntおよび/またはフリッツルドタンパク質の過剰発現と関連する。形質転換は、細胞の不死化、異常な増殖制御、非形態学的な変化、および/または悪性度などの他の表現型の変化と関連する（Freshney、Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)）。
【００６８】
「低分子干渉RNA」または「siRNA」は、好ましくは、10ヌクレオチド長より長く、より好ましくは15ヌクレオチド長より長く、および最も好ましくは18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個のヌクレオチド長である、配列特異的なRNA分解を誘発する鍵となる中間体として機能することが示されている、単離されたRNA分子を意味する。19〜25ヌクレオチドの範囲が、siRNAにとって最も好ましいサイズである。siRNAはまた、短いヘアピンRNA（shRNA）を含むことができ、ここでは、siRNA二重鎖の両方の鎖は、単一のRNA分子内に含まれる。二本鎖siRNAは、一般的に、センス鎖およびアンチセンス鎖からなる。一本鎖siRNAは、一般的に、標的遺伝子またはmRNAに相補的であるアンチセンス鎖のみからなる。siRNAは、任意の種類のRNA、好ましくは、dsRNA（より大きなdsRNAのタンパク質分解的に切断された生成物、部分精製されたRNA、本質的に純粋なRNA、合成RNA、組換え産生されたRNA）、ならびに1つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換、および/または変化によって天然に存在するRNAとは異なる修飾RNAを含む。
【００６９】
詳細な説明
発癌におけるWnt-Fzシグナル伝達経路の役割は、WO 04/032838においてある程度記載されている。本発明は、Wnt2を過剰発現する多数の癌細胞においてアポトーシスを誘導することができるWnt2シグナル伝達の阻害剤を提供する。本発明は、Wnt2シグナル伝達に関連する疾患、特に、Wnt2シグナル伝達が癌細胞の増殖または生存に影響を与える癌の治療のために有用である。本発明は特に、乳癌、卵巣癌、直腸結腸癌、胃癌、肺癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、甲状腺癌、膵臓癌、子宮頸部癌、食道癌、中皮腫、頭頚部癌、肝細胞癌、黒色腫、脳腫瘍、外陰癌、精巣癌、肉腫、腸癌、皮膚癌、白血病、およびリンパ腫のような癌を治療するために特に有用である。
【００７０】
Wnt2シグナル伝達をブロックすることは、本発明において、Wnt-Fz経路の下流成分、特に、ディシェベルド（Dvl）およびβ-カテニンの下方制御に導くことが示される。本発明はまた、抗体誘導性のアポトーシスがJNKの活性化を通して起こり、ミトコンドリアから細胞質にSmac/DiabloおよびシトクロムCの放出することを示す。シトクロムCは、アポトーシスの阻害剤であるサバイビンを不活性化し、これはカスパーゼの活性化をもたらす。本発明はさらに、インビボで腫瘍の増殖を抑制する抗Wnt2モノクローナル抗体を提供する。
【００７１】
I. 抗Wnt2抗体
上記に記述したように、本発明は、Wnt2を過剰発現する細胞、好ましくは癌細胞におけるWnt2シグナル伝達を阻害する方法を提供する。本発明のある態様において、抗体が、Wnt2リガンドとフリッツルド受容体の間の結合をブロックするために使用される。抗体は、Wnt2タンパク質またはフリッツルドタンパク質のいずれかに対して産生させることができる。
【００７２】
A. 抗Wnt2モノクローナル抗体の生成
本発明の方法、薬学的組成物およびキットにおいて使用され得る抗体は、ポリクローナル抗Wnt2抗体または抗Wnt2モノクローナル抗体であってもよい。好ましくは、抗体は抗Wnt2モノクローナル抗体である。本発明のモノクローナル抗体は、種々の方法で調製されてもよい。好ましい方法は、KohlerおよびMilstein、Nature 256: 495 (1975)によって記載されるもののようなハイブリドーマ法を使用する。ハイブリドーマ法においては、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物が、代表的には、免疫因子に特異的に結合する抗体を産生し、またはそれに産生可能であるリンパ球を誘発するために、免疫因子で免疫される。代替として、リンパ球は、インビトロで免疫されてもよい。
【００７３】
免疫因子は、SEQ ID NO:1〜15およびSEQ ID NO:30〜53に示されるようなWnt2ポリペプチドを含んでもよい。抗Wnt2モノクローナル抗体を生成するための好ましいヒトWnt2ペプチド配列は、SEQ ID NO:1に示されるようなヒトWnt2のアミノ酸残基49〜63からなるペプチド、
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または成熟ヒトWnt2、すなわち、シグナルペプチドの切断後のアミノ酸24〜38（SEQ ID NO:1のアミノ酸残基1〜25）からなるペプチドである。
【００７４】
一般的に、ヒト起源の細胞が所望される場合には、末梢血リンパ球（「PBL」）が使用され、または非ヒト哺乳動物の供給源が所望される場合には、リンパ節細胞が使用される。次いで、リンパ球は、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を使用して、不死化細胞株と融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding、Monoclonal Antibodies: Principles and Practice、pp. 59-103 (1986)）。不死化細胞株は、通常、形質転換哺乳動物株、特に、齧歯類、ウシ、およびヒト起源のミエローマ細胞である。通常、ラットまたはマウスのミエローマ細胞が使用される。このハイブリドーマ細胞は、好ましくは、融合していない、不死化細胞の増殖または生存を阻害する1種または複数の物質を含む、適切な培地中で培養されてもよい。例えば、親の細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRTまたはHPRT）を欠く場合、ハイブリドーマのための培地は、代表的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み（「HAT培地」）、これらの物質は、HGPRT-欠損細胞の増殖を妨害する。
【００７５】
いくつかの抗Wnt2モノクローナル抗体が、本明細書に記載される方法を使用して生成することができる。本発明の好ましい態様において、Wnt2モノクローナル抗体は、（i）SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:104またはSEQ ID NO:125に示されるようなVLCDR1アミノ酸配列；（ii）SEQ ID NO:58に示されるようなVLCDR2アミノ酸配列；（iii）SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:126またはSEQ ID NO:138に示されるようなVLCDR3アミノ酸配列；（iv）SEQ ID NO:63またはSEQ ID NO:87に示されるようなVHCDR1アミノ酸配列；（v）SEQ ID NO:65またはSEQ ID NO:89に示されるようなVHCDR2アミノ酸配列；あるいは（vi）SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:91またはSEQ ID NO:110に示されるようなVHCDR3アミノ酸配列を含む。
【００７６】
本発明の別の好ましい態様において、Wnt2モノクローナル抗体は、（i）SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:104またはSEQ ID NO:125に示されるようなVLCDR1アミノ酸配列；（ii）SEQ ID NO:58に示されるようなVLCDR2アミノ酸配列；（iii）SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:126またはSEQ ID NO:138に示されるようなVLCDR3アミノ酸配列；（iv）SEQ ID NO:63またはSEQ ID NO:87に示されるようなVHCDR1アミノ酸配列；（v）SEQ ID NO:65またはSEQ ID NO:89に示されるようなVHCDR2アミノ酸配列；および（vi）SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:91またはSEQ ID NO:110に示されるようなVHCDR3アミノ酸配列を含む。
【００７７】
本発明のなお別の好ましい態様において、抗Wnt2モノクローナル抗体17F7.G7（サブクローンB、鎖1、図18）および8B11.H6（鎖1、図17）によって例示されるように、Wnt2モノクローナル抗体は、（i）SEQ ID NO:56に示されるようなVLCDR1アミノ酸配列；（ii）SEQ ID NO:58に示されるようなVLCDR2アミノ酸配列；および（iii）SEQ ID NO:84に示されるようなVLCDR3アミノ酸配列を含む。17F7.G7（サブクローンB、鎖2、図18）によって例示されるように、Wnt2モノクローナル抗体は、（i）SEQ ID NO:104に示されるようなVLCDR1アミノ酸配列；（ii）SEQ ID NO:58に示されるようなVLCDR2アミノ酸配列；および（iii）SEQ ID NO:138に示されるようなVLCDR3アミノ酸配列を含む。17F7.G7（サブクローンB、図18）によって例示されるように、Wnt2モノクローナル抗体はまた、（i）SEQ ID NO:63に示されるようなVHCDR1アミノ酸配列；（ii）SEQ ID NO:65に示されるようなVHCDR2アミノ酸配列；および（iii）SEQ ID NO:110に示されるようなVHCDR3アミノ酸配列を含んでもよい。17F7.G7（サブクローンB、図18）によって例示されるように、抗Wnt2モノクローナル抗体は、（i）SEQ ID NO:56に示されるようなVLCDR1アミノ酸配列；（ii）SEQ ID NO:58に示されるようなVLCDR2アミノ酸配列；（iii）SEQ ID NO:84に示されるようなVLCDR3アミノ酸配列；（iv）SEQ ID NO:63に示されるようなVHCDR1アミノ酸配列；（v）SEQ ID NO:65に示されるようなVHCDR2アミノ酸配列；および（vi）SEQ ID NO:110に示されるようなVHCDR3アミノ酸配列を含んでもよい。別の抗Wnt2モノクローナル抗体は、（i）SEQ ID NO:104に示されるようなVLCDR1アミノ酸配列；（ii）SEQ ID NO:58に示されるようなVLCDR2アミノ酸配列；（iii）SEQ ID NO:138に示されるようなVLCDR3アミノ酸配列；（iv）SEQ ID NO:63に示されるようなVHCDR1アミノ酸配列；（v）SEQ ID NO:65に示されるようなVHCDR2アミノ酸配列；および（vi）SEQ ID NO:110に示されるようなVHCDR3アミノ酸配列を含む。
【００７８】
別の好ましい抗Wnt2モノクローナル抗体は、抗Wnt2モノクローナル抗体17F7.E5（図16）によって例示されるように、（i）SEQ ID NO:104に示されるようなVLCDR1アミノ酸配列；（ii）SEQ ID NO:58に示されるようなVLCDR2アミノ酸配列；および（iii）SEQ ID NO:107に示されるようなVLCDR3アミノ酸配列を含む。本発明の別の態様において、抗Wnt2モノクローナル抗体は、（i）SEQ ID NO:104に示されるようなVLCDR1アミノ酸配列；（ii）SEQ ID NO:58に示されるようなVLCDR2アミノ酸配列；（iii）SEQ ID NO:107に示されるようなVLCDR3アミノ酸配列；（iv）SEQ ID NO:63に示されるようなVHCDR1アミノ酸配列；（v）SEQ ID NO:65に示されるようなVHCDR2アミノ酸配列；および（vi）SEQ ID NO:110に示されるようなVHCDR3アミノ酸配列を含む。
【００７９】
別の好ましい抗Wnt2モノクローナル抗体は、抗Wnt2モノクローナル抗体8B11.D2（図15）によって例示されるように、（i）SEQ ID NO:56に示されるようなVLCDR1アミノ酸配列；（ii）SEQ ID NO:58に示されるようなVLCDR2アミノ酸配列；および（iii）SEQ ID NO:84に示されるようなVLCDR3アミノ酸配列を含む。抗Wnt2モノクローナル抗体8B11.D2（図15）および8B11.H6（鎖1、図17）によって例示されるように、抗Wnt2モノクローナル抗体はまた、（i）SEQ ID NO:87に示されるようなVHCDR1アミノ酸配列；（ii）SEQ ID NO:89に示されるようなVHCDR2アミノ酸配列；および（iii）SEQ ID NO:91に示されるようなVHCDR3アミノ酸配列を含んでもよい。本発明のなお別の態様において、抗Wnt2モノクローナル抗体は、（i）SEQ ID NO:56に示されるようなVLCDR1アミノ酸配列；（ii）SEQ ID NO:58に示されるようなVLCDR2アミノ酸配列；（iii）SEQ ID NO:84に示されるようなVLCDR3アミノ酸配列；（iv）SEQ ID NO:87に示されるようなVHCDR1アミノ酸配列；（v）SEQ ID NO:89に示されるようなVHCDR2アミノ酸配列；および（vi）SEQ ID NO:91に示されるようなVHCDR3アミノ酸配列を含む。
【００８０】
本発明のなお別の好ましい態様において、抗Wnt2モノクローナル抗体8B11.H6（鎖1、図17）によって例示されるように、抗Wnt2モノクローナル抗体は、（i）SEQ ID NO:56に示されるようなVLCDR1アミノ酸配列；（ii）SEQ ID NO:58に示されるようなVLCDR2アミノ酸配列；（iii）SEQ ID NO:84に示されるようなVLCDR3アミノ酸配列；（iv）SEQ ID NO:87に示されるようなVHCDR1アミノ酸配列；（v）SEQ ID NO:89に示されるようなVHCDR2アミノ酸配列；および（vi）SEQ ID NO:91に示されるようなVHCDR3アミノ酸配列を含む。別の好ましい抗Wnt2モノクローナル抗体は、8B11.H6（鎖2、図17）によって例示されるように、（i）SEQ ID NO:125に示されるようなVLCDR1アミノ酸配列；（ii）SEQ ID NO:58に示されるようなVLCDR2アミノ酸配列；および（iii）SEQ ID NO:126に示されるようなVLCDR3アミノ酸配列を含む。別のWnt2モノクローナル抗体は、（i）SEQ ID NO:125に示されるようなVLCDR1アミノ酸配列；（ii）SEQ ID NO:58に示されるようなVLCDR2アミノ酸配列；（iii）SEQ ID NO:126に示されるようなVLCDR3アミノ酸配列；（iv）SEQ ID NO:87に示されるようなVHCDR1アミノ酸配列；（v）SEQ ID NO:89に示されるようなVHCDR2アミノ酸配列；および（vi）SEQ ID NO:91に示されるようなVHCDR3アミノ酸配列を含む。
【００８１】
本明細書に開示されるように、抗Wnt2抗体は、SEQ ID NO:1〜15および30〜53のアミノ酸配列のいずれかを含むWnt2ペプチドを使用して生成することができる。好ましい抗Wnt2抗体は、ヒトWnt2のアミノ酸残基49〜63（SEQ ID NO:2）に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体である。「ヒトWnt2のアミノ酸残基49〜63（SEQ ID NO:2）に対応する」という語句は、非ヒトWnt2タンパク質または別のWntタンパク質のアミノ酸配列をいい、ここで、それぞれのアミノ酸配列は、ヒトWnt2のアミノ酸残基49〜63（SEQ ID NO:2）に対応する。これらのアミノ酸配列は、ヒトWnt2のアミノ酸残基49〜63（SEQ ID NO:2）と比較した場合に、1つまたは複数のアミノ酸の違いを有してもよい。本発明の好ましい態様において、抗Wnt2抗体は、
2007536938.tif 000004
を含むポリペプチドを特異的に結合し、および特に、
2007536938.tif 000005
ポリペプチドのエピトープに結合する。
【００８２】
B. 抗Wnt2抗体をコードする核酸
本発明の抗Wnt2抗体は、種々の方法において調製することができる。本発明の1つの局面において、抗Wnt2抗体は組換え的に産生される。本方法において、抗Wnt2抗体は、発現ベクターに挿入される核酸によってコードされ、当技術分野において公知である適切な宿主中で発現される。
【００８３】
本発明の好ましい態様において、抗Wnt2モノクローナル抗体をコードする核酸は、（i）SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:113およびSEQ ID NO:131に示される核酸配列からなる群より選択されるVLCDR1をコードする核酸；（ii）SEQ ID NO:72およびSEQ ID NO:115に示される核酸配列からなる群より選択されるVLCDR2をコードする核酸；（iii）SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:134およびSEQ ID NO:143に示される核酸配列の群より選択されるVLCDR3をコードする核酸；（iv）SEQ ID NO:77およびSEQ ID NO:97に示される核酸配列の群より選択されるVHCDR1をコードする核酸；（v）SEQ ID NO:79およびSEQ ID NO:99に示される核酸配列の群より選択されるVHCDR2をコードする核酸；ならびに（vi）SEQ ID NO:101およびSEQ ID NO:120に示される核酸配列からなる群より選択されるVHCDR3をコードする核酸を含む核酸を含む。
【００８４】
本発明のなお別の好ましい態様において、抗Wnt2モノクローナル抗体8B11.D2および8B11.H6（軽鎖κ、鎖1）によって例示されるように、抗Wnt2モノクローナル抗体をコードする核酸は、（i）SEQ ID NO:70に示されるようなVLCDR1をコードする核酸；（ii）SEQ ID NO:72に示されるようなVLCDR2をコードする核酸；および（iii）SEQ ID NO:94に示されるようなVLCDR3をコードする核酸を含む核酸を含む。抗Wnt2モノクローナル抗体をコードする核酸はまた、（i）SEQ ID NO:97に示されるようなVHCDR1をコードする核酸；（ii）SEQ ID NO:99に示されるようなVHCDR2をコードする核酸；および（iii）SEQ ID NO:101に示されるようなVHCDR3をコードする核酸を含んでもよい。本発明の好ましい態様において、抗Wnt2モノクローナル抗体をコードする核酸は、（i）SEQ ID NO:70に示されるようなVLCDR1をコードする核酸；（ii）SEQ ID NO:72に示されるようなVLCDR2をコードする核酸；（iii）SEQ ID NO:94に示されるようなVLCDR3をコードする核酸；（ivSEQ ID NO:97に示されるようなVHCDR1をコードする核酸；（v）SEQ ID NO:99に示されるようなVHCDR2をコードする核酸；および（vi）SEQ ID NO:101に示されるようなVHCDR3をコードする核酸を含む核酸を含む。
【００８５】
抗Wnt2モノクローナル抗体をコードする別の好ましい核酸では、抗Wnt2モノクローナル抗体8B11.H6（軽鎖κ、鎖2）によって例示されるように、抗Wnt2モノクローナル抗体をコードする核酸は、（i）SEQ ID NO:131に示されるようなVLCDR1をコードする核酸；（ii）SEQ ID NO:115に示されるようなVLCDR2をコードする核酸；および（iii）SEQ ID NO:134に示されるようなVLCDR3をコードする核酸を含む核酸を含む。本発明の好ましい態様において、抗Wnt2モノクローナル抗体をコードする核酸は、（i）SEQ ID NO:131に示されるようなVLCDR1をコードする核酸；（ii）SEQ ID NO:115に示されるようなVLCDR2をコードする核酸；（iii）SEQ ID NO:134に示されるようなVLCDR3をコードする核酸；（iv）SEQ ID NO:97に示されるようなVHCDR1をコードする核酸；（v）SEQ ID NO:99に示されるようなVHCDR2をコードする核酸；および（vi）SEQ ID NO:101に示されるようなVHCDR3をコードする核酸を含む核酸を含む。
【００８６】
本発明のなお別の好ましい態様において、抗Wnt2モノクローナル抗体17F7.G7（サブクローンB、鎖1）によって例示されるように、抗Wnt2モノクローナル抗体をコードする核酸は、（i）SEQ ID NO:70に示されるようなVLCDR1をコードする核酸；（ii）SEQ ID NO:72に示されるようなVLCDR2をコードする核酸；および（iii）SEQ ID NO:94に示されるようなVLCDR3をコードする核酸を含む核酸を含む。抗Wnt2モノクローナル抗体17F7.G7（サブクローンB、鎖2）によって例示されるように、抗Wnt2モノクローナル抗体をコードする核酸は、（i）SEQ ID NO:113に示されるようなVLCDR1をコードする核酸；（ii）SEQ ID NO:115に示されるようなVLCDR2をコードする核酸；および（iii）SEQ ID NO:143に示されるようなVLCDR3をコードする核酸を含む核酸を含む。抗Wnt2モノクローナル抗体をコードする核酸はまた、（i）SEQ ID NO:77に示されるようなVHCDR1をコードする核酸；（ii）SEQ ID NO:79に示されるようなVHCDR2をコードする核酸；および（iii）SEQ ID NO:120に示されるようなVHCDR3をコードする核酸を含む。本発明の好ましい態様において、抗Wnt2モノクローナル抗体をコードする核酸は、（i）SEQ ID NO:70に示されるようなVLCDR1をコードする核酸；（ii）SEQ ID NO:72に示されるようなVLCDR2をコードする核酸；（iii）SEQ ID NO:94に示されるようなVLCDR3をコードする核酸；（iv）SEQ ID NO:77に示されるようなVHCDR1をコードする核酸；（v）SEQ ID NO:79に示されるようなVHCDR2をコードする核酸；および（vi）SEQ ID NO:120に示されるようなVHCDR3をコードする核酸を含む核酸を含む。抗Wnt2モノクローナル抗体をコードする別の好ましい核酸は、（i）SEQ ID NO:113に示されるようなVLCDR1をコードする核酸；（ii）SEQ ID NO:115に示されるようなVLCDR2をコードする核酸；（iii）SEQ ID NO:143に示されるようなVLCDR3をコードする核酸；（iv）SEQ ID NO:77に示されるようなVHCDR1をコードする核酸；（v）SEQ ID NO:79に示されるようなVHCDR2をコードする核酸；および（vi）SEQ ID NO:120に示されるようなVHCDR3をコードする核酸を含む核酸を含む。
【００８７】
本発明のなお別の好ましい態様において、抗Wnt2抗体17F7.E5によって例示されるように、抗Wnt2モノクローナル抗体をコードする核酸は、（i）SEQ ID NO:113に示されるようなVLCDR1をコードする核酸；（ii）SEQ ID NO:115に示されるようなVLCDR2をコードする核酸；および（iii）SEQ ID NO:117に示されるようなVLCDR3をコードする核酸を含む核酸を含む。抗Wnt2モノクローナル抗体をコードする核酸はまた、（i）SEQ ID NO:77に示されるようなVHCDR1をコードする核酸；（ii）SEQ ID NO:79に示されるようなVHCDR2をコードする核酸；および（iii）SEQ ID NO:120に示されるようなVHCDR3をコードする核酸を含む。本発明の好ましい態様において、抗Wnt2モノクローナル抗体をコードする核酸は、（i）SEQ ID NO:113に示されるようなVLCDR1をコードする核酸；（ii）SEQ ID NO:115に示されるようなVLCDR2をコードする核酸；（iii）SEQ ID NO:117に示されるようなVLCDR3をコードする核酸；（iv）SEQ ID NO:77に示されるようなVHCDR1をコードする核酸；（v）SEQ ID NO:79に示されるようなVHCDR2をコードする核酸；および（vi）SEQ ID NO:120に示されるようなVHCDR3をコードする核酸を含む核酸を含む。
【００８８】
C. 組換え抗Wnt2抗体の生成
本発明の核酸を使用して、抗Wnt2モノクローナル抗体は組換え的に産生することができる。好ましい態様において、キメラまたはヒト化抗Wnt2モノクローナル抗体が組換え的に産生することができる。組換えDNA技術が使用されてもよく、ここでは、1つまたは複数のCDR配列のような、抗Wnt2モノクローナル抗体またはその断片をコードするヌクレオチド配列が、発現ベクターに挿入され、適切な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトされ、および発現のために適切な条件下で培養される。これらの手順は、参照により本明細書に組み入れられる、Sambrook et al.、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、N.Y. (1982)において一般的に記載されるように、当技術分野において一般的に公知である。「ベクター」とは、細胞中で転写されることが可能である核酸を含む任意の種類の遺伝子構築物をいう。ヌクレオチド配列（コード配列と非コード配列の両方）の増幅のために使用されるベクターもまた、この定義に含まれる。コード配列に加えて、ベクターは、一般的に、制限酵素切断部位、ならびに、それらの構築および使用を容易にするためにベクター内で通常使用される、他の冒頭の、末端の、および中間のDNA配列を含む。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸断片の一部であり得る。「核酸」とは、一本鎖または二本鎖のいずれかの型である、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーをいう。この用語は、既知のヌクレオチドアナログまたは修飾バックボーン残基もしくは連結を含む核酸を含み、これらは、合成であり、天然に存在し、および天然に存在せず、これらは、参照核酸と同じ結合特性を有し、ならびにこれらは、参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される。このようなアナログの例には、非限定的に、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル-メチホスホネート、2-O-メチルリボヌクレオチドおよびペプチド-核酸（PNA）が含まれる。
【００８９】
本発明の抗Wnt2モノクローナル抗体またはその断片およびCDR配列についてのコード配列は、化学技術、例えば、Matteucci et al. (J Am Chem Soc. 1981、103:3185)のホスホトリエステル法によって合成されてもよい。「コード配列」という用語は、核酸配列との関連において、コドンと呼ばれる3つのヌクレオチドの複数の連続セットをいい、各コドンは、汎用遺伝コードに従って生化学的因子によって翻訳されるようなアミノ酸に対応し、その全体の配列が発現されるタンパク質、またはタンパク質の発現を阻害するアンチセンス鎖をコードする。「遺伝コード配列」は、連続するコドンが、非コード介入配列、または「イントロン」によって断続的に中断されるコード配列である。mRNAプロセシングの間に、イントロン配列は除去され、タンパク質をコードする連続するコドン配列が回復する。
【００９０】
DNAまたはRNA配列中での任意の修飾が、適切な塩基を、所望のアミノ酸配列をコードする塩基で単に置換することによって作製することができる。次いで、コード配列が、適切なリンカーとともに提供することができ、当技術分野において一般的に使用可能である発現ベクターに連結することができ、およびこのベクターは、免疫刺激ペプチドまたはタンパク質を産生するために適切な宿主を形質転換するために使用することができる。多数のこのようなベクターおよび適切な宿主系が市販されている。発現のために、コード配列は、作動可能に連結された開始コドンおよび終止コドン、プロモーターおよびターミネーター領域、ならびに、所望の細胞宿主における発現のために発現ベクターを提供するために通常は複製系を伴って提供される。例えば、細菌宿主と適合性であるプロモーター配列は、所望のコード配列の挿入のための便利な制限部位を含むプラスミド中で提供される。得られる発現ベクターは、適切な細菌宿主に形質転換される。当然、酵母または哺乳動物の細胞宿主もまた使用されてもよく、当業者に公知であるように、適切なベクターおよび制御配列を使用する。
【００９１】
D. キメラおよびヒト化抗Wnt2抗体
本発明のある態様において、抗Wnt2抗体は、キメラまたはヒト化抗体である。上記に記述したように、ヒト化型の抗体はキメラ免疫グロブリンであり、ここでは、ヒト抗体の相補性決定領域（CDR）が、所望の特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種のCDRからの残基によって置き換えられている。好ましいマウスVLCDRおよびVHCDR配列は表2に示す。
【００９２】
本発明の好ましい態様において、キメラまたはヒト化抗Wnt2抗体は、（i）SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:104またはSEQ ID NO:125に示されるようなVLCDR1アミノ酸配列；（ii）SEQ ID NO:58に示されるようなVLCDR2アミノ酸配列；（iii）SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:126またはSEQ ID NO:138に示されるようなVLCDR3アミノ酸配列；（iv）SEQ ID NO:63またはSEQ ID NO:87に示されるようなVHCDR1アミノ酸配列；（v）SEQ ID NO:65またはSEQ ID NO:89に示されるようなVHCDR2アミノ酸配列；あるいは（vi）SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:91またはSEQ ID NO:110に示されるようなVHCDR3アミノ酸配列を含む。
【００９３】
本発明の別の好ましい態様において、キメラまたはヒト化抗Wnt2抗体は、（i）SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:104またはSEQ ID NO:125に示されるようなVLCDR1アミノ酸配列；（ii）SEQ ID NO:58に示されるようなVLCDR2アミノ酸配列；（iii）SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:126またはSEQ ID NO:138に示されるようなVLCDR3アミノ酸配列；（iv）SEQ ID NO:63またはSEQ ID NO:87に示されるようなVHCDR1アミノ酸配列；（v）SEQ ID NO:65またはSEQ ID NO:89に示されるようなVHCDR2アミノ酸配列；および（vi）SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:91またはSEQ ID NO:110に示されるようなVHCDR3アミノ酸配列を含む。
【００９４】
キメラまたはヒト化抗Wnt2抗体の他の好ましい態様は、本明細書に記載されるような、ならびに抗Wnt2モノクローナル抗体17F7.G7（サブクローンB、鎖1および2、図18）、8B11.H6（鎖1および2、図17）、17F7.E5（図16）、および8B11.D2（図15）によって例示されるような、VLCDRおよびVHCDRの組み合わせを含む。
【００９５】
ヒト抗体は、当技術分野において公知である種々の技術を使用して産生することができ、これらには、ファージディスプレイライブラリー（HoogenboomおよびWinter、J. Mol. Biol. 227: 381 (1991); Marks et al.、J. Mol. Biol. 222: 581 (1991)）が含まれる。ColeらおよびBoernerらの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のために使用可能である（Cole et al.、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、p. 77 (1985) およびBoerner et al.、J. Immunol. 147(1):86-95 (1991)）。同様に、ヒト抗体は、トランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているマウスに、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによって作製することができる。曝露の際に、ヒト抗体産生が観察され、これは、遺伝子の再配列、アセンブリー、および抗体レパートリーを含むすべての点で、ヒトにおいて見られるものと密接に類似する。このアプローチは、例えば、米国特許第5,545,807号; 同第5,545,806号; 同第5,569,825号; 同第5,625,126号; 同第5,633,425号; 同第5,661,016号、および以下の科学刊行物：Marks et al.、Bio/Technology 10:779- 783 (1992) ; Lonberg et al.、Nature 368: 856-859 (1994); Morrison、Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al.、Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger、Nature Biotechnology 14: 826 (1996); LonbergおよびHuszar、Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)において記載されている。
【００９６】
E. Wnt2を結合する単鎖Fv抗体
ある態様において、抗体は単鎖Fv（scFv）である。scFv抗体のVHおよびVL領域は、2つの鎖の抗体において見い出されるものと類似の抗原結合部位を作るように折りたたまれる単鎖を含む。一旦折りたたまれると、非共有結合による相互作用が単鎖抗体を安定化する。ある抗体のVHおよびVL領域は直接的に一緒に連結することができるのに対して、当業者は、これらの領域が、1つまたは複数のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって分離されてもよいことを認識する。ペプチドリンカーおよびそれらの使用は、当技術分野において周知である。例えば、Huston et al.、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 8: 5879 (1988); Bird et al.、Science 242: 4236 (1988); Glockshuber et al.、Biochemistry 29: 1362 (1990); 米国特許第4,946,778号、同第5,132,405号およびStemmer et al.、Biotechniques 14: 256-265 (1993)を参照されたい。一般的に、ペプチドリンカーは、領域を結合させるか、またはVHとVLの間のある程度の最小距離もしくは他の空間的な関連性を保存するため以外の特異的生物学的活性を有さない。しかし、ペプチドリンカーの構成アミノ酸は、折りたたみ、正味の電荷、または疎水性のような分子のある特性に影響を与えるように選択されてもよい。単鎖Fv（scFv）抗体は、任意に、50アミノ酸を超えない、一般的に40アミノ酸を超えない、好ましくは30アミノ酸を超えない、およびより好ましくは20アミノ酸を超えない長さのペプチドリンカーを含む。ある態様において、ペプチドリンカーは、配列Gly-Gly-Gly-Gly-Serのコンカテマー、好ましくは、2、3、4、5、または6個のこのような配列である。しかし、リンカー内にある程度のアミノ酸置換を作製することができることが理解される。例えば、バリンは、グリシンの代わりに置換され得る。
【００９７】
本発明の好ましい態様において、scFvのVL領域は、（i）SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:104またはSEQ ID NO:125に示されるようなVLCDR1アミノ酸配列；（ii）SEQ ID NO:58に示されるようなVLCDR2アミノ酸配列；（iii）SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:126またはSEQ ID NO:138に示されるようなVLCDR3アミノ酸配列を含む。scFvのVH領域は、（i）SEQ ID NO:63またはSEQ ID NO:87に示されるようなVHCDR1アミノ酸配列；（ii）SEQ ID NO:65またはSEQ ID NO:89に示されるようなVHCDR2アミノ酸配列；あるいは（iii）SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:91またはSEQ ID NO:110に示されるようなVHCDR3アミノ酸配列
を含んでもよい。
【００９８】
scFv抗体を作製するための方法は記載されてきた。例えば、Huse et al.、前出; Ward et al. 前出; およびVaughan et al.、前出を参照されたい。手短に述べると、免疫した動物からのB細胞からのmRNAを単離し、cDNAを調製する。このcDNAを、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域に特異的なプライマーを使用して増幅する。このPCR産物を精製し、核酸配列を結合する。リンカーペプチドが所望される場合、そのペプチドをコードする核酸配列を、重鎖の核酸配列と軽鎖の核酸配列の間に挿入する。scFvをコードする核酸をベクターに挿入し、適切な宿主細胞中で発現する。所望の抗原に特異的に結合するscFvは、代表的には、ファージディスプレイライブラリーのパニングによって見い出される。パニングは、任意のいくつかの方法によって実行することができる。パニングは、それらの表面上で所望の抗原を発現する細胞を使用して、または所望の抗原でコートされた固体表面を使用して便利に実行することができる。簡便には、この表面は磁気ビーズであり得る。未結合ファージは固体表面から洗い流され、結合したファージは溶出される。
【００９９】
選択されたパニングの方法に関わらず、ファージディスプレイによって提供される遺伝子型と表現型の間の物理的な関連付けは、大きなクローンのライブラリーを用いてでさえ、抗原への結合のためにcDNAライブラリーのあらゆるメンバーを試験することを可能にする。
【０１００】
F. 二特異性および結合体化された抗Wnt2抗体
ある態様において、抗体は二特異性抗体である。二特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原についての結合特異性を有するか、または同じ抗原上の2つのエピトープについて結合特異性を有する、モノクローナル、好ましくは、ヒトまたはヒト化抗体である。1つの態様において、結合特異性の1つはWnt2タンパク質についてであり、他の1つは別の癌抗原についてである。代替として、四量体型技術が、多価試薬を作製してもよい。
【０１０１】
ある態様において、抗体はエフェクター部分に結合体化される。エフェクター部分は、放射活性標識もしくは蛍光標識のような標識部分を含む、任意の数の分子であり得、または治療部分であり得る。エフェクター部分が治療部分である場合、これは、代表的には、細胞毒性薬剤である。本方法において、細胞毒性因子を癌細胞に標的化することは、標的細胞の直接的な殺傷を生じる。この態様は、代表的には、フリッツルド受容体に対する抗体を使用して実行される。細胞毒性因子は多くかつ様々であり、細胞毒性薬物または毒素またはこのような毒素の活性断片が含まれるがこれらに限定されない。適切な毒素およびそれらの対応する断片には、ジフテリアA鎖、エキソトキシンA鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、クルシン（curcin）、クロチン、フェノマイシン、エノマイシン、オーリスタチン（auristatin）などが含まれる。細胞毒性因子はまた、Wnt2タンパク質に対して産生された抗体に放射性同位元素を結合体化すること、または抗体に共有結合されたキレート剤への放射性核種の結合によって作製された放射性化学物質を含む。
【０１０２】
G. 本発明の抗体の結合親和性
標的抗原についての結合親和性は、典型的には、Biacore競合アッセイ法、飽和アッセイ法などの標準的な抗体-抗原アッセイ法、またはELISAもしくはRIAなどのようなイムノアッセイ法によって測定または決定される。
【０１０３】
このようなアッセイ法は、抗体の解離定数を決定するために使用することができる。「解離定数」という語句は、抗原についての抗体の親和性をいう。抗体と抗原の間の結合の特異性は、抗体の解離定数（KD=1/K、ここでKは親和性定数）が<1μM、好ましくは<100nM、および最も好ましくは<0.1nMである場合に存在する。抗体分子は、代表的には、より低い範囲のKDを有する。KD=[Ab-Ag]/[Ab] [Ag] ここで [Ab] は抗体の平衡状態の濃度であり、[Ag] は抗原の平衡状態の濃度であり、および [Ab-Ag] は抗体-抗原複合体の平衡状態の濃度である。代表的には、抗原と抗体の間の結合相互作用には、静電的結合、ファンデルワールス結合および水素結合のような、可逆的な非共有結合による結合が含まれる。
【０１０４】
本発明の抗体は、Wnt2タンパク質に特異的に結合する。「特異的に結合する」は、本明細書では、抗体が、少なくとも約0.1mM、より通常には少なくとも約1μM、好ましくは少なくとも約0.1μM以下、および最も好ましくは0.01μM以下のKDで、Wnt2タンパク質に結合することを意味する。
【０１０５】
H. 抗Wnt2モノクローナル抗体の競合的結合
ある態様において、抗Wnt2モノクローナル抗体が使用される。好ましい態様は、第2の抗Wnt2抗体と同じエピトープを結合する抗Wnt2モノクローナル抗体である。別の抗体と同じエピトープを認識する特定の抗体の能力は、代表的には、抗原への第2の抗体の結合を競合的に阻害する1つの抗体の能力によって決定される。任意の多数の競合的結合アッセイ法を、同じ抗原への2つの抗体間の競合を測定するために使用することができる。例えば、サンドイッチELISAアッセイ法を、この目的のために使用することができる。これは、ウェルの表面をコートするために捕捉抗体を使用することによって実行される。次いで、飽和以下の濃度のタグ化抗原を捕捉表面に加える。このタンパク質は、特異的抗体：エピトープ相互作用を通して抗体に結合される。洗浄後、検出可能な部分に共有結合された二次抗体（例えば、検出抗体として定義される標識された抗体を伴うHRP）をELISAに加える。この抗体が捕捉抗体と同じエピトープを認識する場合、特定のエピトープがもはや結合のために使用できなくなるのにつれて、標的タンパク質に結合することが不可能になる。しかし、この二次抗体が標的タンパク質上の異なるエピトープを認識する場合には、これは結合することが可能であり、およびこの結合は、関連する基質を使用して活性のレベル（およびそれゆえに結合した抗体）を定量することによって検出することができる。バックグラウンドは、捕捉抗体と検出抗体の両方として単一の抗体を使用することによって定義されるのに対して、最大シグナルは、抗原特異的抗体を用いて捕捉すること、および抗原上のタグに対する抗体を用いて検出することによって確立することができる。参照としてのバックグラウンドおよび最大活性を使用することによって、抗体は、エピトープ特異性を決定するために、対の様式で評価することができる。
【０１０６】
上記のアッセイ法のいずれかを使用して、一次抗体の存在下で、抗原への二次抗体の結合が、少なくとも30%、通常少なくとも約40%、50%、60%、または75%、およびしばしば少なくとも約90%減少する場合に、一次抗体は、二次抗体の結合を競合的に阻害すると見なされる。
【０１０７】
II. Wnt2発現のレベルを検出するためのアッセイ法
本発明はまた、Wnt2を検出するための診断的アッセイ法を提供する。好ましい態様において、Wnt2遺伝子の活性は、遺伝子転写物（例えば、mRNA）の測定によって、翻訳されたタンパク質の量の測定によって、または遺伝子産物の活性の測定によって決定される。
【０１０８】
核酸ハイブリダイゼーションを使用して遺伝子転写物（mRNAまたはcDNA）を検出および/または定量する方法は、当業者に公知である。例えば、mRNAの存在、非存在、または量を評価するための1つの方法は、ノーザンブロット転写を含む。
【０１０９】
プローブは、Wnt2タンパク質をコードする核酸配列の全長または全長未満であり得る。プローブは、通常、例えば、ポリヌクレオチドまたはビオチンで標識され、当技術分野において公知であるようなニックトランスレーション、ランダムまたは特異的プライミングによって生成することができる。ハイブリダイゼーション条件もまた、当技術分野に記載されている。これらの手順は、Sambrook et al.、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、N.Y. (1982) において一般的に記載されているように、当技術分野において一般的に公知である。より短いプローブは、経験的に、特異性について試験される。好ましくは、核酸プローブは、20塩基またはそれ以上の長さである。ハイブリダイズした部分の可視化は、mRNAの存在または非存在の定性的決定を可能にする。
【０１１０】
別の好ましい態様において、転写物（例えば、mRNA）は、DNAまたはmRNAのコピー数を直接的に評価するために、上記のように増幅（例えば、PCR）に基づく方法を使用して測定することができる。好ましい態様において、転写レベルは、逆転写PCR（RT-PCR）を使用することによって評価される。このような方法において有用なプライマー対は、SEQ ID NO:16〜29において開示されている。
【０１１１】
Wnt2遺伝子の「活性」はまた、発現されたポリペプチドを検出または定量することによって、検出および/または定量することができる。ポリペプチドは、当業者に周知である任意の多数の手段によって検出および定量することができる。これらには、分析用生化学的方法、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、薄層クロマトグラフィー（TLC）、超拡散クロマトグラフィーなどが含まれ得る。単離されたタンパク質はまた、多型を同定するために、標準的な技術に従って配列決定することができる。
【０１１２】
本発明の抗体は、任意の多数の十分に認識されている免疫学的結合アッセイ法を使用して、Wnt2タンパク質またはそれらを発現する細胞を検出するために使用することができる（例えば、米国特許第4,366,241号; 同第4,376,110号; 同第4,517,288号; および同第4,837,168号を参照されたい）。一般的なイムノアッセイ法の概説については、Methods in Cell Biology、Vol. 37、Asai, ed. Academic Press, Inc. New York (1993); Basic and Clinical Immunology 7th Edition、StitesおよびTerr, eds. (1991)もまた参照されたい。
【０１１３】
従って、本発明は、Wnt2を過剰発現する細胞、特に癌細胞を検出する方法を提供する。代表的には、Wnt2発現は、生物学的試料中で分析される。1つの方法において、生検が被験体上で実施され、収集された組織はインビトロで試験される。次いで、組織または組織からの細胞は、本発明の抗Wnt2抗体と接触される。生じる免疫複合体は、生検試料中のWnt2タンパク質の存在を示す。このような検出を容易にするために、抗体は、放射性標識されるか、または放射性標識などの検出可能な標識であるエフェクター分子にカップリングされ得る。
【０１１４】
別の方法において、Wnt2を過剰発現する細胞または癌細胞は、例えば、典型的な画像化システムを使用して、インビボで検出される。次いで、標識の局在は、標識を検出するための任意の公知の方法によって決定される。診断的画像化を可視化するための従来的な方法を使用することができる。例えば、常磁性同位元素は、MRIのために使用することができる。抗体の内在化は、循環クリアランスと共役した細胞外酵素的環境によるクリアランスに対して感受性である、細胞外結合によって提供されるものを超えて、生物内での寿命を延長するために重要であり得る。
【０１１５】
上記に記載した方法はまた、予後アッセイ法において、または薬物応答を予測するために、すなわち、薬理ゲノミクスマーカーとして使用することができる。特に、本発明の方法は、本明細書に記載される治療法に対する応答を予測するために使用することができる。例えば、このような方法は、本発明の抗Wnt2抗体を使用する治療方法に対する応答を予測するために使用することができる。
【０１１６】
III. 抗Wnt2抗体およびsiRNAを使用する方法
A. 細胞増殖の阻害
Wnt2シグナル伝達を阻害する因子、例えば、本発明の抗Wnt2抗体およびsiRNAは、様々な方法における使用を見い出す可能性がある。本発明の好ましい態様において、Wnt2を過剰発現する細胞の増殖を紫外する方法が提供される。過剰発現されるWnt2は、Wnt2タンパク質またはWnt2 mRNAのいずれかであり得る。本方法は、細胞の増殖を阻害するために有効であるWnt2シグナル伝達を阻害する量の因子と、細胞を接触させる工程を含む。「増殖」は、細胞の成長、細胞または病的な嚢腫の再生または増大をいう。
【０１１７】
本発明の好ましい態様において、本方法はインビトロで実施される。本明細書でさらに説明されるように、本発明の方法はまた、インビボで実施することができる。
【０１１８】
本発明の好ましい態様において、因子と接触される細胞は癌細胞である。本発明の因子は、乳癌、卵巣癌、直腸結腸癌、胃癌、肺癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、甲状腺癌、膵臓癌、子宮頸部癌、食道癌、中皮腫、頭頚部癌、肝細胞癌、黒色腫、脳腫瘍、外陰癌、精巣癌、肉腫、腸癌、皮膚癌、白血病、およびリンパ腫の癌細胞からなる群より選択される癌細胞の増殖を阻害するために有用である。好ましい癌細胞は、乳癌細胞、黒色腫細胞、肺癌細胞、中皮腫細胞、甲状腺癌細胞、結腸癌細胞、または肝癌細胞である。
【０１１９】
B. アポトーシスの誘導
Wnt2シグナル伝達を阻害する因子、例えば、本発明の抗Wnt2抗体およびsiRNAは、種々の方法における使用を見い出す可能性がある。本発明の好ましい態様において、Wnt2を過剰発現する細胞のアポトーシスを誘導する方法が提供される。本方法は、細胞のアポトーシスを誘導するために有効である量のWnt2シグナル伝達を阻害する因子と、細胞を接触させる工程を含む。本方法における使用のための因子、例えば、抗Wnt2抗体またはsiRNAが本明細書で開示される。
【０１２０】
C. Wnt2シグナル伝達の阻害
本発明の因子、例えば、本発明の抗Wnt2抗体およびsiRNAは、種々の方法における使用を見い出す可能性がある。本発明の別の好ましい態様において、細胞内でWnt2シグナル伝達を阻害する方法が提供される。本方法は、Wnt2シグナル伝達を阻害するために有効である量の因子と、Wnt2を過剰発現する細胞を接触させる工程を含む。本方法における使用のための因子、例えば、抗Wnt2抗体またはsiRNAが本明細書で開示される。
【０１２１】
D. 疾患の治療
本発明の因子、例えば、本発明の抗Wnt2抗体およびsiRNAは、種々の方法における使用を見い出す可能性がある。本発明の別の好ましい態様において、Wnt2シグナル伝達と関連する疾患を治療する方法が提供される。本方法は、疾患を治療するために有効である量のWnt2シグナル伝達を阻害する因子を、被験体、好ましくは、そのような治療の必要がある被験体に投与する工程を含む。本方法における使用のための因子、例えば、抗Wnt2抗体またはsiRNAが本明細書で開示される。
【０１２２】
好ましい態様において、疾患は癌である。本発明の因子は、乳癌、卵巣癌、直腸結腸癌、胃癌、肺癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、甲状腺癌、膵臓癌、子宮頸部癌、食道癌、中皮腫、頭頚部癌、肝細胞癌、黒色腫、脳腫瘍、外陰癌、精巣癌、肉腫、腸癌、皮膚癌、白血病、およびリンパ腫の癌からなる群より選択される癌を治療するために有用である。好ましい癌は、乳癌、黒色腫、肺癌、中皮腫、甲状腺癌、結腸癌、または肝癌である。
【０１２３】
本明細書で使用されるように、「治療する」「治療すること」および「治療」という用語は：（1）癌のような疾患を予防すること、すなわち、疾患に対して素因がある可能性があるが、まだその疾患の任意の徴候を経験していない被験体において、その疾患の臨床的徴候が発症しないようにすること；（2）疾患を阻害すること、すなわち、疾患もしくはその臨床的徴候の発症を停止もしくは減少すること；または（3）疾患を軽減すること、すなわち、疾患もしくはその臨床的徴候の後退を引き起こすことを含む。好ましくは、このような治療の必要がある被験体は、哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【０１２４】
本発明はまた、Wnt2を過剰発現する癌を治療する方法を提供する。本方法は、癌を治療するために有効である量の因子を、そのような治療の必要がある被験体に投与する工程を含む。本方法における使用のための因子、例えば、抗Wnt2抗体またはsiRNAが本明細書で開示される。
【０１２５】
E. 被験体における癌細胞の検出
本発明の因子、例えば、本発明の抗Wnt2抗体およびsiRNAは、種々の方法における使用を見い出す可能性がある。本発明の別の好ましい態様において、被験体における癌細胞を検出する方法が提供される。本方法は、生物学的試料が癌細胞であることが疑われる細胞を含む、被験体からの生物学的試料を提供する工程、および細胞中でWnt2発現のレベルを検出する工程を含む。任意に、本方法は、細胞中のWnt2発現のレベルを、1例もしくは複数の健常な被験体からの細胞中のWnt2発現のレベルと、またはWnt2発現のレベルについての所定の参照範囲と比較する工程を含む。本発明の1つの態様において、Wnt2発現のレベルを検出する工程は、Wnt2 mRNAのレベルを決定することによって実行される。本発明の別の態様において、Wnt2発現のレベルを決定する工程は、Wnt2タンパク質のレベルを検出することによって実行される。本方法における使用のための因子、例えば、抗Wnt2抗体またはsiRNAが本明細書で開示される。
【０１２６】
Wnt2発現のレベルの検出は、種々の理由のために決定されてもよい。Wnt2発現のレベルの検出は、（i）被験体における癌のスクリーニング、診断または予後診断の一部；（ii）癌に対する被験体の感受性を決定することの一部；（iii）被験体における癌の段階もしくは重篤度を決定することの一部；（iv）被験体にとって癌を発症することのリスクを同定することの一部；または（v）癌であると診断された被験体に投与される抗癌薬物もしくは治療の効果をモニターすることの一部であり得る。被験体に投与される抗癌薬物または治療は、本発明の抗Wnt2抗体またはsiRNAを含んでもよい。
【０１２７】
本発明の好ましい態様において、被験体における癌の段階または重篤度を同定するための方法が提供される。本明細書に示されるように、Wnt2発現は、種々の癌細胞において過剰発現される（例えば、表3〜5）。本明細書にさらに示されるように、抗Wnt2抗体およびsiRNAは、これらの細胞において用量依存的な様式でアポトーシスを誘導する。従って、Wnt2の量は、種々の癌のリスクの状態、例えば、高い、中程度、または低い状態に特徴的である。癌の段階または重篤度は、Wnt2を測定すること、次いで、それらを分類アルゴリズムに供するか、またはそれらを、癌の特定の段階もしくは重篤度と関連するWnt2の参照の量および/またはパターンと比較するかのいずれかによって決定されてもよい。
【０１２８】
本発明の方法を使用して、Wnt2レベルは、癌を発症するリスクが決定される被験体からの生物学的試料において決定される。正常なもしくは健常な被験体からの比較可能な生物学的試料において検出されるWnt2レベルよりも高いか、または所定の基礎レベルよりも低い、癌を発症するリスクが決定される被験体からの生物学的試料において検出されたWnt2レベルは、癌を発症するリスクが決定される被験体が、癌を発症するリスクを有することを示す。
【０１２９】
本発明の別の好ましい態様において、被験体における癌は、被験体における癌のスクリーニング、診断または予後診断の一環として決定される。本発明の方法を使用して、Wnt2レベルは、癌についてスクリーニングされる被験体からの生物学的試料において決定される。正常なもしくは健常な被験体からの比較可能な生物学的試料において検出されるWnt2レベルよりも高いか、または所定の基礎レベルよりも低い、癌についてスクリーニングされる被験体からの生物学的試料において検出されたWnt2レベルは、癌についてスクリーニング被験体が、癌を有するか、または癌を有する可能性があることを示す。
【０１３０】
上記のように、Wnt2組成物は、Wnt2発現が過剰発現している癌の治療のために有用である。しかし、他の薬物、例えば、本明細書に記載するようなWnt2の阻害剤を含む組成物もまた、Wnt2が過剰発現している患者における癌を治療するために有用である。従って、本発明の好ましい態様において、癌の状態は、外科手術（例えば、腫瘍の除去）の効果、Wnt2発現が過剰発現されている癌であると診断された被験体への抗癌薬物または治療の効果をモニターすることの一環として決定される。外科手術または被験体に投与される抗癌薬物もしくは治療の効果は、癌の再発、癌の進行（悪化）および癌の後退（改善）を含み得る。
【０１３１】
本発明の組成物、方法およびキットを使用して、Wnt2レベルは、外科手術後の種々の時点で、または抗癌薬物もしくは治療が与えられた種々の時点で、被験体からの生物学的試料中で決定される。2回目に採取された同じ被験体からの比較可能な生物学的試料において検出されたWnt2レベル（t2；例えば、抗癌薬物または治療を与えた後）よりも高い、1回目の被験体からの生物学的試料中で検出されたWnt2レベル（t1；例えば、抗癌薬物または治療を与える前）は、被験体における癌が後退しつつあることを示す。同じく、1回目のWnt2レベルと比較して、高い2回目のWnt2レベルは、被験体における癌が進行しつつあることを示す。同様に、2回目に採取された同じ被験体からの比較可能な生物学的試料において検出されたWnt2レベル（t2；例えば、外科手術の数週間または数ヶ月後）よりも高い、1回目の被験体からの生物学的試料中で検出されたWnt2レベル（t1；例えば、外科手術の直後）は、被験体における癌が再発していないことを示す可能性がある。同じく、1回目のWnt2レベルと比較して、高い2回目のWnt2レベルは、被験体における癌が再発しつつあることを示す。
【０１３２】
F. 本発明の方法における使用のためのsiRNA
本発明の方法を実施するために有用である本発明の因子には、抗Wnt2抗体およびWnt2のsiRNAが含まれるがこれらに限定されない。代表的には、このような因子は、（i）Wnt2 mRNAまたはWnt2タンパク質に結合すること、（ii）Wnt2シグナル伝達と干渉すること、および/または（iii）他のタンパク質、例えば、フリッツルド受容体へのWnt2タンパク質の結合を阻害することが可能である。好ましい態様において、細胞増殖を阻害する因子は、Wnt2のsiRNAである。本発明は、Wnt2発現を調節するためにRNA干渉を使用する組成物および方法を提供する。これらの方法および組成物は、疾患、特に癌の治療のため、アポトーシスの誘導のため、およびWnt2シグナル伝達と干渉するために有用である。
【０１３３】
多くの種において、代替的には低分子干渉RNA（siRNA）として本明細書に言及され得る二本鎖RNA（dsRNA）の導入は、強力かつ特異的な遺伝子サイレンシングを誘導し、これは、RNA干渉またはRNAiと呼ばれている現象である。この現象は、線虫C.エレガンス（C. elegans）において広範に実証されてきたが（Fire et al.、Nature、391、806- 811、1998）、トリパノソーマからマウスまでの範囲にわたって、他の生物において広範囲に及んでいる。議論される生物に依存して、RNA干渉は、「同時抑制」「転写後遺伝子サイレンシング」「センス抑制」および「クエリング（quelling）」と呼ばれてきた。RNAiは、これが特定の遺伝子の活性をノックアウトするための手段を提供するので、魅力的な生物工学技術である。これは、遺伝子分析または操作に対して受け入れ可能であると以前には考えられていなかった種における遺伝子発現をノックアウトするために特に有用である。
【０１３４】
RNAiは、通常は、dsRNAが、細胞質における相同mRNAの分解を誘発する、転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）として記載されている。基本的プロセスは、相同メッセンジャーRNA（mRNA）の認識および標的化切断を導く短い単位（低分子干渉RNA（siRNA）と呼ばれる）にプロセシンングされるdsRNAを含む。（プロセシング後に）RNAi/PTGSを誘発するdsRNAは、多数の方法で、核または細胞質において作られ得る。次にはmRNAを分解する、siRNAへのdsRNAのプロセシングは、2段階のRNA分解プロセスである。第1段階は、dsRNAを、21〜25ヌクレオチド（nt）長であるセンスおよびアンチセンスRNA（すなわち、siRNA）にプロセシンングする、dsRNAエンドヌクレアーゼ（リボヌクレアーゼIII-様；RNaseIII-様）活性を含む、ショウジョウバエにおいては、このRNaseIII-型タンパク質はダイサーと呼ばれる。第2段階において、生成されたアンチセンスsiRNAは、RNA-誘導性サイレンシング複合体（RISC）と呼ばれる異なるリボヌクレアーゼ複合体と合わされ、およびそのためのガイドとして働き、この複合体が相同一本鎖mRNAを切断する。RISCは、アンチセンスsiRNAと対合した領域のほぼ中央でmRNAを切断し、その後、mRNAがさらに分解される。異なる供給源からのdsRNAは、RNAi/PTGSに導くプロセシング経路に入ることができる。
【０１３５】
従って、本発明の好ましい態様において、本発明の方法における使用のための因子は、Wnt2のsiRNAである。siRNAは、Wnt2の発現レベルを減少するために使用することができる。Wnt2のsiRNAは、Wnt2 mRNAにハイブリダイズし、それによって、Wnt2タンパク質の産生を減少または阻害する。
【０１３６】
RNAi実験を設計する際に、siRNAの性質、サイレンシング効果の永続性、および送達系の選択のような考慮する必要があるいくつかの因子が存在する。RNAi効果を生成するために、生物に導入されるsiRNAは、エキソン配列を含むべきである。さらに、RNAiプロセシンングは相同性依存性であり、それゆえに、配列は、相同であるが、遺伝子特異的ではない配列の間の交差性干渉の可能性を最小化しながら、遺伝子の特異性を最大化するために注意深く選択されなければならない。好ましくは、siRNAは、siRNAと遺伝子の間の配列の、90%より多く、または100%の同一性さえもが阻害されることを示す。標的遺伝子に対して約80%未満の同一性は、実質的に効果が低い。従って、Wnt2のsiRNAと、その発現が阻害されるWnt2遺伝子との間の相同性がより高いと、関連性のない遺伝子の発現が影響を受ける可能性がより低くなる。
【０１３７】
加えて、siRNAのサイズが重要である。一般的に、本発明は、Wnt2のsiRNA分子に関連し、これは、二本鎖または一本鎖であり、少なくとも約19〜25ヌクレオチドを含み、Wnt2の遺伝子発現を調節することが可能である。本発明の状況において、siRNAは、好ましくは、500、200、100、50または25ヌクレオチド長未満である。より好ましくは、siRNAは、約19ヌクレオチド〜約25ヌクレオチド長である。
【０１３８】
1つの局面において、本発明は、一般的には、少なくとも10個、しかし30個を超えない連続したWnt2のヌクレオチドに対して実質的に相補的である少なくとも1つの鎖を有し、かつWnt2遺伝子またはタンパク質の発現を減少する、少なくとも19ヌクレオチドの単離されたsiRNA分子を特徴とする。本発明の好ましい態様において、siRNA分子は、少なくとも10個、しかし30個を超えない連続したヒトWnt2（GenBank No.NM_0003391、SEQ ID NO:152）のヌクレオチドに対して実質的に相補的である少なくとも1本の鎖を有する。より望ましくは、単離されたsiRNAは、ヒトWnt2（GenBank No.NM_0003391、SEQ ID NO:152）のヌクレオチド714〜732を含む19〜25個のヌクレオチドに対して実質的に相補的である少なくとも1本の鎖を有する。本発明の好ましい態様において、siRNA核酸配列は、
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である。
【０１３９】
別の好ましい態様において、Wnt2のsiRNA分子は、SEQ ID NO:152に示される核酸配列に対して、少なくとも90%相同、好ましくは95%、99%、または100%相同である配列を含む。過度の実験を伴うことなく、および本発明の開示を使用して、Wnt2発現を調節するWnt2のさらなるsiRNAを、本発明の方法を実施するために、設計および使用することができる。
【０１４０】
siRNAはまた、1つまたは複数のヌクレオチドの変化を含んでもよい。このような変化は、例えば、19〜25ヌクレオチドRNAの末端、または内部（RNAの1つまたは複数のヌクレオチドにおける）への非ヌクレオチド物質の付加を含むことができる。好ましい態様において、RNA分子は3'-ヒドロキシル基を含む。本発明のRNA分子中のヌクレオチドはまた、天然には存在しないヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む、標準的ではないヌクレオチドを含むことができる。二本鎖オリゴヌクレオチドは、修飾されたバックボーン、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、もしくは当技術分野において公知である他の修飾されたバックボーンを含んでもよく、または天然ではないヌクレオシド間連結を含んでもよい。さらなるsiRNAの修飾（例えば、2'-O-メチルリボヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロリボヌクレオチド、「汎用塩基」ヌクレオチド、5-C-メチルヌクレオチド、1つまたは複数のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、および逆方向デオキシ無塩基残基の取り込み）が、米国出願公報番号20040019001および米国特許第6.673,611号（参照により組み入れられる）において見い出すことができる。集合的に、上記のすべてのこのような変化したRNAを修飾siRNAと呼ぶ。
【０１４１】
好ましくは、RNAiは、10%、20%、30%、または40%、より好ましくは少なくとも50%、60%、または70%、および最も好ましくは、少なくとも75%、80%、90%、95%またはそれ以上、細胞中のWnt2の発現を減少することが可能である。
【０１４２】
細胞へのsiRNAの導入は、当技術分野において公知である方法によって達成することができ、これには、例えば、siRNAがそこから転写され得る核酸を含むベクターのマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、またはトランスフェクションが含まれる。代替として、Wnt2についてのsiRNAは、Wnt2 mRNAへの結合が可能である形態で、細胞に直接的に導入することができる。永続性および膜透過性を増大させるために、siRNAは、リポソーム、ポリ-L-リジン、脂質、コレステロール、リポフェクチン、またはこれらの誘導体と合わされるか、またはこれらで修飾される。好ましいものは、コレステロール結合体化されたWnt2についてのsiRNAである（Song et al.、Nature Med. 9: 347-351 (2003) を参照されたい）。
【０１４３】
G. 本発明の方法における使用のための抗Wnt2抗体
本発明の別の好ましい態様において、本発明の方法において使用される因子は、本明細書において十分に記載されるような抗Wnt2抗体である。抗Wnt2抗体は、ポリクローナル抗体、または抗Wnt2モノクローナル抗体であり得る。好ましくは、本発明の方法は、抗Wnt2モノクローナル抗体を使用する。
【０１４４】
IV. Wntシグナル伝達の阻害剤の同定
Wnt2タンパク質（またはそれらを発現する細胞）またはWntシグナル伝達経路のメンバー、例えば、dvlはまた、Wntシグナル伝達を阻害する因子を同定するための薬物スクリーニングアッセイ法において使用することができる。従って、本発明は、癌を阻害する組成物についてのスクリーニングのための新規な方法を提供する。
【０１４５】
Wnt2シグナル伝達についてのアッセイ法は、Wnt2シグナル伝達経路の任意の一部を検出および/または定量するために設計することができる。例えば、細胞内β-カテニンレベルに影響を与えるか、または標的細胞中でアポトーシスを誘導する薬剤の能力を測定することができる。これらの目的のために適切なアッセイ法は本明細書に記載される。
【０１４６】
アッセイ法は、Wnt2リガンド、フリッツルド受容体、またはWnt2シグナル伝達カスケードの別のメンバー、例えば、dvlのいずれかへの阻害剤の結合活性を試験するように設計されたものを含む。これらのアッセイ法は、Wnt2活性を調節する因子を同定する際に特に有用である。実質的に任意の因子が、このようなアッセイ法において試験することができる。このような因子には、天然または合成のポリペプチド、抗体、天然または合成の有機低分子、核酸などが含まれるがこれらに限定されない。
【０１４７】
上述のように、分泌されたフリッツルド関連タンパク質（sFRP）は、分泌されたWntリガンドの結合についてフリッツルド受容体と競合することによって、Wntシグナル伝達の可溶性内因性モジュレーターとして機能する。従って、ある形式において、試験薬剤は、フリッツルド受容体の天然のリガンド（例えば、WntリガンドまたはsFRP）に基づく。
【０１４８】
Wnt2シグナル伝達を検出するための任意のアッセイ法は、ハイスループットスクリーニングに対して受け入れ可能である。ハイスループットアッセイ法、結合アッセイ法およびレポーター遺伝子アッセイ法は、同様に周知である。従って、例えば、米国特許第5,559,410号は、タンパク質についてのハイスループットスクリーニング法を開示し、米国特許第5,585,639号は核酸結合（すなわち、アレイにおいて）についてのハイスループットスクリーニング法を開示するのに対して、米国特許第5,576,220号および同第5,541,061号は、リガンド/抗体結合についてのスクリーニングのハイスループット法を開示する。
【０１４９】
加えて、ハイスループットスクリーニング系が市販されている（例えば、Zymark Corp.、Hopkinton、MA; Air Technical Industries、Mentor、OH; Beckman Instruments, Inc. Fullerton、CA; Precision Systems, Inc.、Natick、MAなどを参照されたい）。これらの系は、典型的には、すべての試料および試薬のピペッティング、液体の分注、時間設定したインキュベーション、およびアッセイ法のために適切である検出器中でのマイクロプレートの最終的な読み取りを含む、全体の手順を自動化している。これらの設定可能な系は、ハイスループットおよび迅速な開始、ならびに高い程度の柔軟性およびカスタマイズを提供する。このような系の製造業者は、種々のハイスループット系のための詳細なプロトコールを提供する。従って、例えば、Zymark Corp.は、遺伝子転写、リガンド結合などの調節を検出するためのスクリーニング系を説明する技術告示を提供する。
【０１５０】
本発明において有用である他のアッセイ法は、癌細胞の新生物表現型を試験するように設計されたものである。これらのアッセイ法には、軟寒天上での細胞増殖；足場依存性；増殖の接触阻害および密度制限；細胞増殖；細胞死（アポトーシス）；細胞形質転換；増殖因子または血清依存性；腫瘍特異的マーカーレベル；Matrigelへの侵襲性；インビボでの腫瘍増殖および転移；転移を受けた細胞中のmRNAおよびタンパク質の発現、ならびに癌細胞の他の特徴が含まれる。
【０１５１】
試験化合物が細胞増殖を阻害する能力はまた、疾患の動物モデルに試験を導入すること、およびインビボで癌細胞の増殖を評価することによって評価することができる。例えば、ヒト腫瘍細胞は、「ヌードマウス」のような免疫無防備状態の動物に導入することができる。試験因子（例えば、低分子または抗体）は、動物に投与され、--動物において形成された腫瘍の数および/またはサイズによって評価されるような--腫瘍を形成する腫瘍細胞の能力が、因子なしでの対照動物における腫瘍増殖と比較される。
【０１５２】
A. 遺伝子発現の阻害剤
本発明の1つの局面において、Wnt2シグナル伝達経路の阻害剤、例えば、Dvl阻害剤が、その経路における標的タンパク質の発現を阻害する核酸分子を含むことができる。従来的な、ウイルスまたは非ウイルスを用いた遺伝子移入方法が、操作されたポリペプチド、例えば、ドミナントネガティブ型のタンパク質をコードする核酸を、または代替的に、核酸、例えば、siRNAもしくはアンチセンスRNAなどの標的タンパク質発現の阻害剤を、哺乳動物細胞もしくは標的組織に導入するために使用することができる。非ウイルスベクター送達系には、DNAプラスミド、裸の核酸、およびリポソームのような送達媒体と複合体化された核酸が含まれる。ウイルスベクター送達系には、DNAおよびRNAウイルスが含まれ、これは、細胞への送達後に、エピソームまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有する。遺伝子治療手順の概説としては、Anderson、Science 256: 808-813 (1992); NabelおよびFelgner、TIBTECH 11:211-217 (1993); MitaniおよびCaskey、TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon、TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller、Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt、Biotechnology 6 (10):1149-1154 (1988); Vigne、Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); KremerおよびPerricaudet、British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al.、Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (eds) (1995); および Yu et al.、Gene Therapy 1:13-26 (1994)を参照されたい。
【０１５３】
ある態様において、低分子干渉RNAが投与される。哺乳動物細胞において、長いdsRNA（>30nt）の導入は、しばしば、抗ウイルス性応答を開始し、これは、タンパク質合成およびRNA分解の非特異的阻害によって例示される。RNA干渉の現象は、例えば、Bass、Nature 411:428-29 (2001); Elbahir et al.、Nature 411: 494-98 (2001); および Fire et al.、Nature 391:806-11 (1998) において記載および議論されており、ここでは、干渉RNAを作製する方法もまた議論されている。siRNA阻害剤は、100塩基対未満であり、代表的には30bpsまたはそれより短く、および当技術分野において公知であるアプローチによって作製される。本発明に従う例示的なsiRNAは、29ヌクレオチドまで、25ヌクレオチド、22ヌクレオチド、21ヌクレオチド、20ヌクレオチド、15ヌクレオチド、10ヌクレオチド、5ヌクレオチド、またはその周辺またはその間の任意の整数を有することができる。
【０１５４】
V. 薬学的組成物
上述のように、Wnt2発現の阻害剤および本発明の因子は、Wnt2シグナル伝達に関連する疾患、例えば、Wnt2シグナル伝達に関連する癌を治療するために使用することができる。投与のための組成物は、一般に、薬学的に許容される担体、好ましくは、水性担体に溶解した、本明細書で十分に記載された因子を含む。種々の水性担体、例えば、緩衝化生理食塩水などが、使用することができる。これらの溶液は滅菌性であり、一般的に、望ましくない物質は含まない。これらの組成物は、従来的な、周知の滅菌技術によって滅菌されてもよい。これらの組成物は、適切な生理学的条件まで、必要とされるように、薬学的に許容される補助物質、例えば、pH調節剤および緩衝剤、毒性調節剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含んでもよい。これらの製剤中の活性因子の濃度は広範に変化することができ、選択される投与の特定の様式および患者の必要性に従って、主として、液体の体積、粘度、体重などに基づいて選択される。
【０１５５】
従って、静脈内投与のための代表的な薬学的組成物は、患者あたり1日あたり約0.1〜10mgである。薬物が隔離された部位に投与され、および血流中ではなく、例えば、体腔または器官の内腔には投与される場合、患者あたり1日あたり約0.1〜約100mgの投薬量が使用されてもよい。実質的により高い投薬量が、局所投与において可能である。非経口投与可能な組成物を投与するための実際の方法は、当業者に公知であるかまたは明らかであり、Remington's Pharmaceutical Science、15th ed.、Mack Publishing Company、Easton、Pennsylvania (1980) のような刊行物においてより詳細に記載されている。
【０１５６】
薬学的組成物は、投与の方法に依存して、種々の単位投薬量で投与することができる。例えば、経口投与のために適切な単位投薬量形態には、散剤、錠剤、丸薬、カプセル、およびロゼンジが含まれるがこれらに限定されない。経口的に投与される場合に、抗体は、消化から保護されるべきであることが認識される。このことは、これらを酸性および酵素的加水分解に対して抵抗性にするための組成物と分子を複合体化することによって、またはリポソームもしくは保護バリアなどの適切に抵抗性である担体中に分子をパッケージすることのいずれかによって達成される。消化から因子を保護する手段は、当技術分野において周知である。
【０１５７】
本発明の阻害剤および因子（例えば、抗体）を含む組成物は、治療的または予防的な処置のために投与することができる。治療的適用において、組成物は、疾患およびその合併症を治療するため、または少なくとも部分的にそれらを停止するために十分な量で、疾患（例えば、乳癌）に苦しむ患者に投与される。これを達成するために十分な量は、「治療有効用量」として定義される。この使用のために有効な量は、疾患の重篤度および患者の健康の一般的状態に依存する。単回または複数回の組成物の投与が、必要とされ、かつ患者によって許容されるような投薬量および頻度に依存して投与されてもよい。任意の事象において、組成物は、患者を有効に治療するために十分な量の本発明の因子を提供するべきである。患者における癌の発症を予防または遅延させることが可能である阻害剤の量は、「予防有効量」といわれる。予防的処置のために必要とされる特定の用量は、患者の医学的状態および病歴、予防される特定の癌、ならびに、年齢、体重、性別、投与の経路、有効性などの他の因子に依存する。このような予防的処置は、癌の再発を予防するために、例えば、以前に癌であった患者において、または癌を発症する有意な可能性を有すると疑われる患者において使用されてもよい。
【０１５８】
本発明の目的のための「患者」または「被験体」は、ヒトと他の動物の両方、特にヒトを含む。従って、本発明の方法は、ヒトの治療と獣医学的な適用の両方に適用可能である。好ましい態様において、患者は、哺乳動物、好ましくは霊長類、および最も好ましい態様において、患者はヒトである。
【０１５９】
他の公知の癌治療が、本発明の方法と組み合わせて使用することができる。例えば、Wntシグナル伝達の阻害剤はまた、他の癌治療剤、例えば、5FU、ビンブラスチン、アクチノマイシンD、シスプラチン、メトトレキサートなどを細胞に標的化および感作させるために使用されてもよい。他の態様において、本発明の方法は、放射線治療などとともに使用することができる。
【０１６０】
ある例において、抗体は、膜貫通タンパク質を複合体化された場合に、血清補体を活性化し、それによって細胞毒性または抗原依存性細胞毒性（ADCC）を媒介するサブタイプに属する。従って、癌は、癌細胞の表面上のフリッツルドタンパク質に対して指向される抗体を患者に投与することによって治療することができる。抗体標識は、共毒素を活性化し、毒素の負荷を局在化し、またはさもなくば局所的に細胞を除去するための手段を提供することができる。これらの態様において、抗体は、エフェクター部分に結合体化される。エフェクター部分は、放射活性標識もしくは蛍光標識のような標識部分を含む、任意の数の部分であり得、または細胞毒性因子などの治療部分であり得る。
【０１６１】
A. ワクチンとしてのWnt2ポリペプチドの使用
Wnt2シグナル伝達の阻害剤の投与に加えて、Wnt2タンパク質またはそれらの免疫学的断片は、HTL、CTL、および内因性タンパク質に対する抗体応答を刺激するためのワクチン組成物として投与することができる。このようなワクチン組成物は、例えば、脂質化ペプチド（例えば、Vitiello et al. (1995) J. Clin. Invest. 95: 341-349を参照されたい）、ポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド、「PLG」)ミクロスフェアにカプセル化されたペプチド組成物（例えば、Eldridge et al. (1991) Molec. Immunol. 28: 287-294; Alonso et al. (1994) Vaccine 12:299-306; Jones et al. (1995) Vaccine 13: 675-681を参照されたい）、免疫刺激複合体中に含まれるペプチド組成物（ISCOMS; 例えば、Takahashi, et al. (1990) Nature 344:873-875; Hu et al. (1998) Clin. Exp. Immunol. 113:235-243を参照されたい）、複数の抗原ペプチド系（MAP; 例えば、Tam (1988) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85: 5409- 5413; Tam (1996) J. Immunol. Methods 196: 17-32)を参照されたい）；ウイルス送達ベクター（Perkus et al. 、p. 379、Kaufmann (ed. 1996) Concepts in Vaccine Development de Gruyter; Chakrabarti, et al.、(1986) Nature 320: 535-537; Hu et al. (1986) Nature 320:537-540; Kieny et al.、(1986) AIDS Bio/Technology 4: 790-795; Top et al.、(1971) J. Infect. Dis. 124:148-154; Chanda et al.、(1990) Virology 175:535-547)、ウイルスまたは合成起源の粒子（例えば、Kofler et al.、(1996) J.Immunol. Methods 192:25-35; Eldridge et al.、(1993) Sem.Hematol、30: 16-24; Falo et al.、(1995) Nature Med. 7:649-653を参照されたい）を含むことができる。
【０１６２】
ワクチンは、しばしば、アジュバントを含む。多くのアジュバントは、迅速な異化から抗原を保護するように設計された物質、例えば、水酸化アルミニウムまたはミネラルオイル、および免疫応答の刺激剤、例えば、リピドA、百日咳菌（Bortadella pertussis）、またはヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）由来のタンパク質などを含む。特定のアジュバントは、例えば、フロイント不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Difco Laboratories、Detroit、MI）；Merck Adjuvant 65（Merck and Company, Inc.、Rahway、NJ）; AS-2（SmithKline Beecham、Philadelphia、PA）；水酸化アルミニウムゲルなどのアルミニウム塩（ミョウバン）またはリン酸アルミニウム；カルシウム、鉄、または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁物；アシル化糖；カチオン性またはアニオン性誘導体化多糖類；ポリホスファゼン；生物分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリピドAおよびクイル（quil）Aとして市販されている。サイトカイン、例えば、GM-CSF、インターロイキン-2、-7、-12、および他の同様の成長因子もまた、アジュバントとして使用されてもよい。
【０１６３】
ワクチンは、Wnt2ポリペプチドまたはその断片をコードするDNAまたはRNAが患者に投与される核酸組成物として投与することができる。例えば、Wolff et. al. (1990) Science 247:1465-1468; 米国特許第5,580,859号; 同第5,589,466号; 同第5,804,566号; 同第5,739,118号; 同第5,736,524号; 同第5,679,647号; および WO 98/04720を参照されたい。DNAを用いた送達技術の例には、「裸のDNA」、促進化（ブピビカイン、ポリマー、ペプチド-媒介）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介（「遺伝子銃」）または圧力媒介送達（例えば、米国特許第5,922,687号を参照されたい）が含まれる。
【０１６４】
DNAワクチンとしての遺伝子の使用のための方法は周知であり、患者における発現のために、調節可能なプロモーターまたは組織特異的プロモーターの制御下に、所望の遺伝子またはその一部を配置する工程を含む。DNAワクチンのために使用される遺伝子は、全長Wnt2タンパク質をコードすることができ、またはタンパク質の一部をコードしてもよい。
【０１６５】
ある態様において、DNAワクチンは、DNAワクチンとともにアジュバント分子をコードする遺伝子を含む。このようなアジュバント分子は、DNAワクチンによってコードされるポリペプチドに対する免疫学的応答を増大させるサイトカインを含む。
【０１６６】
治療的または予防的な免疫目的のために、本発明のペプチドは、ウイルスベクターまたは細菌ベクターによって発現され得る。発現ベクターの例には、ワクシニアまたは鶏痘のような弱毒化ウイルス宿主が含まれる。このアプローチは、例えば、Wnt2ポリペプチドまたはポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとしての、ワクシニアウイルスの使用を含む。宿主への導入の際に、組換えワクシニアウイルスは、免疫原性ペプチドを発現し、それによって、免疫応答を誘発する。免疫プロトコールにおいて有用であるワクシニアウイルスおよび方法は、例えば、米国特許第4,722,848号において記載されている。別のベクターはBCG（カルメット-ゲラン杆菌(Bacille Calmette Guerin)）である。BCGベクターは、Stover et al.、(1991) Nature 351:456-460において記載されている。治療的投与または免疫のために有用である広範な種々の他のベクター、例えば、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Salmonella typhi）ベクター、無毒化炭疽菌毒素ベクターなどが明らかである。例えば、Shata et al.、(2000) Mol. Med. Today 6:66-71; Shedlock et al.、(2000) J. Leukoc. Biol. 68: 793-806; および Hipp et al.、(2000) In Vivo 14:571-85を参照されたい。
【０１６７】
IV. 阻害剤の投与
Wnt2シグナル伝達（例えば、抗Wnt2抗体およびsiRNA）を阻害する因子は、種々の治療法において使用することができる。例えば、この因子は、非経口的（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、および皮下の経路）、局所的（topical）、経口、局部的（local）、または経皮的な経路を含むがこれらに限定されない方法において使用することができる。これらの方法は、予防的および/または治療的な処置のために使用することができる。
【０１６８】
A. 非ウイルス送達方法
本発明の操作されたポリペプチドをコードする核酸の非ウイルス送達の方法には、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸結合体、裸のDNA、人工ビリオン、および因子増強性のDNAの取り込みが含まれる。リポフェクションは、例えば、US 5,049,386、US 4,946,787、および US 4,897,355に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Transfectam（商標）およびLipofectin（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体-認識リポフェクションのために適切なカチオン性脂質および中性脂質には、Felgner、WO 91/17424、WO 91/16024のそれが含まれる。送達は、細胞（エクスビボ投与）または標的組織（インビボ投与）にであり得る。
【０１６９】
免疫脂質複合体のような標的化リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Crystal、Science 270:404-410 (1995); Blaese et al.、Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al.、Bioconjugate Chem. 5: 382-389 (1994); Remy et al.、Bioconjugate Chem. 5: 647-654 (1994); Gao et al.、Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al.、Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); 米国特許第4,186,183号、同第4,217,344号、同第4,235,871号、同第4,261,975号、同第4,485,054号、同第4,501,728号、同第4,774,085号、同第4,837,028号、および 同第4,946,787号を参照されたい）。
【０１７０】
B. ウイルス送達方法
標的Wnt経路タンパク質、例えば、Dvlの阻害剤の送達のための、RNAまたはDNAウイルスに基づく系の使用は、当技術分野において公知である。このような核酸阻害剤の送達のための従来的なウイルスに基づく系は、遺伝子移入のための、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ関連ウイルス、および単純ヘルペスウイルスのベクターを含み得る。
【０１７１】
多くの遺伝子治療適用において、遺伝子治療ベクターが、特定の組織型、例えば、肺癌への高い程度の特異性を伴って送達されることが所望される。ウイルスベクターは、典型的には、ウイルス外表面上のウイルスコートタンパク質との融合タンパク質として、リガンドを発現することによって、所定の細胞型についての特異性を有するように修飾される。このリガンドは、関心対象の細胞型上に存在することが知られている受容体についての親和性を有するように選択される。例えば、Han et al.、PNAS 92: 9747-9751 (1995) は、モロニーマウス白血病ウイルスが、gp70に融合されたヒトヘレグリンを発現するように修飾でき、組換えウイルスが、ヒト上皮成長因子受容体を発現する特定のヒト乳癌細胞に感染することを報告した。この原理は、リガンド融合タンパク質を発現するウイルスおよび受容体を発現する標的細胞の別の対に拡張することができる。例えば、糸状ファージは、実質的に任意の選択された細胞受容体について特異的な結合親和性を有する抗体断片（例えば、FABまたはFv）を提示するように操作することができる。上記の説明は主としてウイルスベクターに適用されるが、同じ原理は、非ウイルスベクターに適用することができる。このようなベクターは、特異的な標的細胞による取り込みを優先するように考えられている特異的取り込み配列を含むように操作することができる。
【０１７２】
遺伝子治療ベクターは、以下に説明されるように、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内の注入）または局所的適用によって、個々の患者への投与によって、インビボで送達することができる。代替として、ベクターは、個々の患者から移植された細胞のように、エクスビボで細胞に送達することができる。
【０１７３】
診断、調査研究、または遺伝子治療のためのエクスビボ細胞トランスフェクション（例えば、宿主生物へのトランスフェクト細胞への再注入を介する）は、当業者に周知である。ある態様において、細胞は対象の生物から単離され、阻害剤核酸でトランスフェクトされ、および対象の生物（例えば、患者）に再注入される。エクスビボトランスフェクションのために適切な種々の細胞型が当業者に周知である（例えば、Freshney et al.、Culture of Animal Cells、A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)、ならびにいかにして患者から細胞を単離および培養するかの議論については、そこに引用されている参考文献を参照されたい）。
【０１７４】
治療核酸を含むベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）はまた、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接的に投与することができる。代替として、裸のDNAを投与することができる。投与は、分子を、血液または組織細胞との最終的な接触に導入することのために通常使用される任意の経路による。このような核酸を投与するための適切な方法が使用可能であり、かつ当業者に周知であるが、1つより多くの経路が特定の組成物を投与するために使用可能であり、特定の経路は、別の経路よりもより即時性かつより有効である反応をしばしば提供することができる。
【０１７５】
薬学的に許容される担体は、投与される筒底の組成物、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって、部分的に決定される。従って、以下に説明されるように、本発明の薬学的組成物の広範な種々の適切な製剤が存在する（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、17th ed.,1989を参照されたい）。
【０１７６】
VII. 診断的、調査研究的、および治療的適用における使用のためのキット
本発明はまた、本明細書に開示するWnt2核酸またはタンパク質の検出のために使用することができるキットを提供する。さらに、本発明の方法を実施することをユーザーに可能にする、本明細書に記載される組成物を含むキットが提供される。診断的および調査研究的適用において、このようなキットは、以下のいずれかまたはすべてを含んでもよい：アッセイ試薬、緩衝剤、Wnt2特異的またはフリッツルド特異的核酸または抗体、ハイブリダイゼーションプローブおよび/またはプライマーなど。治療用製品は、滅菌生理食塩水または別の薬学的に許容される乳化液および懸濁液基剤を含んでもよい。
【０１７７】
好ましい態様において、このキットは、本明細書に概略されるような詳細を包含する因子を含み、ここで、この因子は、Wnt2タンパク質またはWnt2核酸、例えば、mRNAを結合し、Wnt2シグナル伝達と干渉し、またはWnt2タンパク質の他のタンパク質、例えば、フリッツルド受容体への結合を阻害する。このキットはさらに、本発明の因子および組成物のための1つまたは複数の容器、ならびに、Wnt2を過剰発現する細胞の増殖を阻害するために、Wnt2を過剰発現する癌のような疾患を治療するために、Wnt2を過剰発現する細胞におけるアポトーシスを誘導するために、Wnt2を過剰発現する癌細胞を検出するために、または本明細書に記載の任意の方法を実施するために、本発明の因子を使用するための説明書を含んでもよい。
【０１７８】
本発明の好ましい態様において、キットは、SEQ ID NO:150に示されるようなsiRNA、またはSEQ ID NO:152の約19〜25個の連続するヌクレオチドの核酸を含むsiRNAを含み、ここで、siRNAは、Wnt2 mRNAに結合し、Wnt2 mRNAの翻訳を阻害する。このキットはさらに、本発明の因子および組成物のための1つまたは複数の容器、ならびに、Wnt2を過剰発現する細胞の増殖を阻害するために、Wnt2を過剰発現する癌のような疾患を治療するために、Wnt2を過剰発現する細胞におけるアポトーシスを誘導するために、Wnt2を過剰発現する癌細胞を検出するために、または本明細書に記載の任意の方法を実施するために、本発明のsiRNAを使用するための説明書を含む。任意に、このキットは、対照siRNA、例えば、SEQ ID NO:151に示されるような核酸配列を含むsiRNAを含む。
【０１７９】
上記に示したように、このキットは、本発明の方法の実施のための指示書（すなわち、プロトコール）を含む教材を含んでもよい。この教材は、代表的には、書かれたものまたは印刷されたものを含むが、これらがこのようなものに限定されない。このような指示を保存すること、およびそれらをエンドユーザーに連絡することが可能である任意の媒体が本発明によって意図される。このような媒体には、電子保存媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学的媒体（例えば、CD ROM）などが含まれるがこれらに限定されない。このような媒体は、このような教材を提供するインターネットサイトへのアドレスを含んでもよい。
【０１８０】
本発明はまた、Wnt2シグナル伝達の阻害剤をスクリーニングするためのキットを提供する。このようなキットは、容易に使用可能である材料および試薬から調製することができる。例えば、このようなキットは以下の材料の1つまたは複数を含む：Wnt2ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、反応管および所望のWnt2シグナル伝達機能（例えば、β-カテニンレベル）を試験するための指示書。
【０１８１】
本発明の薬学的組成物およびキットは、本明細書に概説したような詳細を包含する。
【０１８２】
前述の発明は、明確化および理解のために例証および例示によっていくぶん詳細に記載してきたが、特定のバリエーション、変更、修飾、および等価物の置換が、本発明の精神および範囲から必ずしも逸脱することなく、本発明になされ得ることは、本発明の開示に鑑みて当業者には容易に明らかである。結果として、本明細書に記載される態様は、種々の修飾、変更などに供され、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲への言及によってのみ、決定される。
【０１８３】
本発明の構成要素の各々は、複数の態様を含むとして本明細書で記載されてきたが、他に言及されない限りは、本発明の所定の構成要素の各々の態様は、本発明の他の構成要素の各々の態様とともに使用することが可能であり、かつ各々のこのような使用は、本発明の別個の態様を形成することが意図されることが理解されるべきである。
【０１８４】
本発明は、例示のみであって、いかなる場合においても、本発明の定義および範囲を限定することを意図しない、以下の実施例によってさらに例証される。
【０１８５】
VIII. 実施例
実施例1：材料および方法
1. 細胞株および組織試料
ヒト非小細胞肺癌（NSCLC）細胞株（A549、NCI-H1703、H460、およびH1299）、中皮腫癌細胞株（NCI-H2052、H28およびH513）、黒色腫細胞株（LOX、FEM、FEMX、およびSK-Mel-2）、乳癌細胞株（MCF-7およびHuL100）ならびに結腸癌細胞株（HCT116およびSW480）は、American Type Culture Collections（ATCC、Manassas、Virginia）からであった。中皮腫癌細胞株は以下の供給源から入手した：LRK1AおよびRENは、Steven Albelda博士（University of Pennsylvania、Philadelphia、PA）から贈与され、NCI-H2052、H28およびH513はAmerican Type Culture Collections（ATCC、Manassas、VA）から、MS-1およびNCI-H290はNIH（Frederick、MD）から、ならびにLP9はthe Cell Culture Core Facility at Harvard University（Boston、MA）からであった。LP9以外のすべての細胞株を、10%ウシ胎仔血清、ペニシリン（100 IU/ml）およびストレプトマイシン（100μg/ml）で補充したRPMI 1640中で培養した。LP9は、15%培地に加えて10ng/ml EGFおよび0.4μg/ml HCを含むM199中で培養した。正常ヒト小気道上皮細胞（SAEC）および気管支上皮細胞（NHBE）は、Clonetics（Walkersville、Maryland）から入手し、Clonetics SAGM（商標）Bulletキット中で培養した。すべての細胞を、37℃で、5%CO2を有する加湿インキュベーター中で培養した。腫瘍の治療的一次切除を受けている患者からの、新鮮な肺癌組織および隣接する正常肺組織および新鮮な中皮腫組織および隣接する正常胸膜組織を、外科手術の時点で収集し、すぐに液体窒素（IRB#H8714-22942-01）に投入して凍結させた。これらの組織試料を、使用前に液体窒素フリーザー中で-170℃に保持した。
【０１８６】
2. ウェスタンブロッティング
標準的なプロトコールを使用した。抗Dvl3、および抗サバイビンはSanta Cruz Biotechnology（Santa Cruz、California）からであった。抗カスパーゼ3抗体はOncogene（Cambridge、Massachusetts）からであった。抗β-アクチン抗体は、Cell Signaling Technology, Inc.（Beverly、Massachusetts）から入手した。抗β-カテニン抗体は、Transduction Laboratories（Lexington、Kentucky）から購入した。抗シトクロムc抗体はBD Biosciences（San Diego、California）からであった。β-カテニンおよびシトクロムcの変化を検出するために、細胞質抽出物を調製し、以前に記載されたように試験した（Wang et al.、Mol Cell Biol 19(9):5923-9(1999)）。
【０１８７】
3. Tcf-依存性転写活性のTOPFLASHアッセイ法
抗Wnt2モノクローナル抗体とのインキュベーション後の種々の細胞株におけるTcf-依存性転写活性のTOPFLASHアッセイ法は、You et al. Oncogene (2004) 23: 6170-4において記載されるように実施した。手短に述べると、細胞を6ウェルプレートに蒔いた。対照および抗Wnt2モノクローナル抗体（10μg/ml）との48時間のインキュベーション後、TOPFLASHまたはFOPFLASHレポータープラスミドを、以前に記載されたように（Uematsu et al.、Cancer Res. (2003) 63:4547-51）細胞に一過性にトランスフェクトした。Tcf-媒介性遺伝子転写を、一定量のpTOPFLASH: pFOPFLASHルシフェラーゼ活性によって決定した。各々を、pRL-TKレポーター（同時トランスフェクトした内部対照）のルシフェラーゼ活性に対して標準化した。実験を3連で実施した。
【０１８８】
4. アポトーシス分析
細胞をトリプシン処理によって収集し、細胞表面アネキシン-Vおよびヨウ化プロピジウム（propodium）（PI）含量の決定のために、製造業者のプロトコールに従って処理した（Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit (Oncogene、Cambridge、Massachusetts); Apotarget (BioSource International)）。Annexin-V-PI二重線食レジメの使用に伴って、細胞の3つの集団が、2色フローサイトメトリーにおいて区別可能である：（a）非アポトーシス細胞：アネキシン-VおよびPI陰性；（b）露出したホスファチジルセリンを有するが、アネキシンV-FITCに結合し、しかしヨウ化プロピジウムを排除している初期のアポトーシス細胞；および（c）壊死性または後期アポトーシス段階にある細胞が、アネキシンV-FITCとヨウ化プロピジウムの両方で標識された。次いで、染色された細胞をフローサイトメトリー（FACScan; Decton Dickinson、Franklin Lake、New Jersey）によってすぐに分析した。インビボ実験から収集した腫瘍組織試料のTUNEL染色を、製造業者のプロトコールに従って、ApopTag Peroxidase In Situ Oligo Ligation Apoptosis Detection Kit（Chemicon International、Temecula、CA）を使用して実施した。
【０１８９】
5. インビボ腫瘍抑制研究
5〜6週齢の雌性ヌードマウスに、背部領域にて100μl量で1×107LOXでs.c.注射した。3日後、腫瘍が均一に形成し、次いで、すべての動物に、抗Wnt2モノクローナル抗体、対照モノクローナル抗体、またはPBS緩衝液を、100μlの量で、同様に腹腔内（i.p.）注射した。抗Wnt2モノクローナル抗体と対照抗体の両方を、250μgの用量で注射した。各注射を週に2回行った。各群は8匹のマウスからなった。腫瘍サイズを一週間間隔で決定し、腫瘍体積を幅（x）および長さ（y）（x2y/2、ここで、x<y）を使用して計算した（Sonoda et al.、Cancer Res 61(13):4956-60(2001)）。
【０１９０】
6. 増殖アッセイ法
Alimta（登録商標）(MTA) は、Eli Lilly（Indianapolis、IN）によって供給された。Alimta（登録商標）を、滅菌生理学的溶液中で10mg/mlの濃度に希釈した。ストックをアリコートに分け、-80℃で保存し、かつ各実験の前に培地で希釈した。Wnt2抗体は4℃で保存し、以前に記載したように使用した。細胞増殖を、テトラゾリウム転換の代謝活性を測定すること（Cell Titer 96 assay、Promega、Madison、WI）によって決定した。手短に述べると、5,000個の細胞を96ウェルプレート中のウェルあたりに蒔き、増加濃度の両方の薬物を含む培地を加えた。プレートを、CO2インキュベーター中で、37℃で72時間インキュベートした。次いで、可溶化/停止溶液を加え、吸光度を、蛍光プレートリーダーを用いて、570nmの波長において記録した。各実験を少なくとも3回、3連で反復した。
【０１９１】
7. 抗Wnt2モノクローナル抗体のDNA配列分析
ハイブリドーマ細胞株17F7.G7、17F7.E5、8B11.D2および8B11.H6によって産生されたモノクローナル抗体のCDR配列を、標準的なDNA配列決定技術を使用して並列決定した。手短に述べると、PCRを使用して、第1鎖cDNAからV領域を増幅した。プライマーセットは、定常領域におけるリバースプライマー、およびシグナルペプチド領域にハイブリダイズする上流プライマーを含んだ。VHとVLの両方についての複数の上流プライマーを使用した。抗Wnt2モノクローナル抗体の可変領域についてのDNA配列を、図14〜18に、および例えば、SEQ ID NOS:68、75、92、95、111、118、129、135、141 および 144に示す。
【０１９２】
8. 抗Wnt2抗体のタンパク質配列分析
抗Wnt2モノクローナル抗体はまた、タンパク質配列決定によって直接的に配列決定した。手短に述べると、タンパク質試料を還元し、Cysをヨードアセトアミドでアルキル化し、Cys (CAM) を生じた。次に、試料を、還元条件下でSDS-PAGEによって電気泳動し、PVDFメンブレンに電気的にブロットし、各々が、アミドブラックを用いる染色の際に、軽鎖および重鎖を生じた。標準的なタンパク質配列決定技術を使用した。サブクローンMG7のN末端配列は、例えば、SEQ ID NO:146に示す。
【０１９３】
9. 遺伝子発現アレイ
ある実験において、遺伝子発現プロファイリングを、Wntシグナル伝達に関与する遺伝子、およびその下流に含まれる遺伝子の発現をプロファイリングするように設計された特別注文のアレイを使用して、AmpoLabelling-LPR Kit protocol（GEArray Q Human Wnt Signaling Pathway Gene Array、SuperArray、Frederick、MD）を用いて分析した。手短に述べると、選択された組織から単離された全RNAをRT反応に供し、引き続いてcDNAプローブをビオチン-16-dUTP（Roche）で標識し、変性させ、およびWnt特異的アレイを含むハイブリダイゼーション管中で一晩ハイブリダイズさせた。検出は、化学発光反応を用いて、CDDカメラを使用することによって行った。スポットの画像を、製造業者から提供されたソフトウェアを使用して数値データに転換した。発現データを、製造業者によって提供された遺伝子リストに対して適合させた。代表的な遺伝子発現アレイ分析を図9に示す。
【０１９４】
10. RNA干渉
細胞を、試験の24時間前に、抗生物質を含まない培地を有する6ウェルプレートに蒔いた。イオン交換HPLCで精製したsiRNA（Wnt2 siRNAおよび非サイレンシングsiRNA対照）は、Qiagen-Xeragon（Germantown、MD）から購入した。凍結乾燥されたsiRNAをアニーリング緩衝液に溶解し、95℃で1分間再加熱し、続いて37℃で1時間のインキュベーションを行った。本発明者らは、Elbashir（Elbashir et al.、Methods 26 (2):199-213 (2002)）によって記載されたプロトコールに従った。siRNAトランスフェクション後、プレートを、さらなる分析の前に、37℃で3時間インキュベートした。ヒトWnt2に特異的であるsiRNAは、ヒトWnt2のmRNA配列
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に由来した。対照（非サイレンシング）siRNAは、任意の既知の哺乳動物遺伝子
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を標的としなかった。
【０１９５】
11. 統計学的分析
示されるデータは平均値（±S.E.M.）を表す。Excelにおける対応のないt検定を使用して、異なる処置および細胞株を比較するために使用した。他の統計学的比較は、両側スチューデントt検定（P<0.01）を用いて行った。
【０１９６】
実施例2：抗原性Wnt2ペプチドの同定
ヒトWnt2タンパク質の抗原性ペプチドは、種々の方法を使用して決定した。例えば、EMBOSS（Parker et al.、Biochemistry 25: 5425-5432(1986)）は、タンパク質中の抗原性部位を見い出す。抗原性ペプチドはまた、KolaskarおよびTangaonkar（KおよびT; FEBS Lett. (1990) 276(1-2):172-4）の方法を使用して決定した。両方の方法が、ヒトWnt2の類似の抗原性ペプチドの同定をもたらした（表1）。同定された抗原性ペプチド配列の大部分は、ヒトWnt2に特異的に結合する抗体を生成するために使用することが可能であるのに対して、いくつかの抗体はまた、種々のWntタンパク質の間の、ヒトWnt2とのアミノ酸配列相同性に起因して、他のWntタンパク質に結合することができる。例えば、SEQ ID NO:42およびSEQ ID NO:44のアミノ酸配列はWnt2B（Wnt13）に対する相同性を有し；SEQ ID NO:43のアミノ酸配列はWnt2B（Wnt13）、Wnt3、Wnt3A、Wnt5B、およびWnt10Aに対する相同性を有し；SEQ ID NO:45のアミノ酸配列はWnt2B（Wnt13）およびWnt4に対する相同性を有し；SEQ ID NO:47のアミノ酸配列はWnt1およびWnt2B（Wnt13）に対する相同性を有し；ならびにSEQ ID NO:53のアミノ酸配列はWnt-2B（Wnt13）、Wnt3、およびWnt8Bに対する相同性を有する。
【０１９７】
（表１）ヒトWnt2の抗原性ペプチド
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【０１９８】
実施例3：抗Wnt2モノクローナル抗体の生成および細胞との抗体のインキュベーション
抗Wnt2モノクローナル抗体を産生するために使用した抗原は、ヒトWnt2のアミノ酸酸基49〜63に対応する合成ペプチド（Ac-SSQRQLCHRHPDVMR-アミド、SEQ ID NO:2）であった。この抗原は、その疎水性（Parker et al.、(1986) Biochemistry 25 (19):5425-32）、抗原性（Welling et al.、(1985) FEBS Lett. 188 (2):215-8）、接近可能性（Janin、Nature 277:491-2 (1979)）、配列相同性（BLAST検索）、およびN末端近傍に基づいて生物情報学的に選択した。
【０１９９】
抗Wnt2マウスモノクローナル抗体（IgG1）は、Rockland Inc.（Gilbertsville、Pennsylvania）において特別注文製造された。いくつかのハイブリドーマ細胞株が生成され、このうち5つを詳細に特徴付けした：(1) 17F7.G7 (サブクローン A; 図14); (2) 17F7.G7 (サブクローン B; 図18); (3) 17F7.E5 (図16); (4) 8B11.D2 (図15); および (5) 8B11.H6 (図17)。2つの異なる軽鎖は8B11.H6において見い出され、8B11.H6 (鎖l) および 8B11.H6 (鎖2) と名付けた。また、2つの異なる軽鎖、鎖1および鎖2は、17F7.G7 (サブクローン B) においても見い出された。これらの抗Wnt2モノクローナル抗体のVLCDRおよびVHCDR配列を表2に示す。CDR配列、FR配列、およびそれらをコードする核酸配列の位置を図14〜18に示す。試験出血を、ELISAによって、ペプチドを使用して2回スクリーニングし、親のクローンおよびサブクローンをウェスタンブロット分析によってスクリーニングした。
【０２００】
（表２）抗Wnt2モノクローナル抗体のVLCDRおよびVHCDR配列
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*17F7.G7（サブクローンA、図14）は再配列決定され、CDR3配列ARWGDSFAY（SEQ ID NO:110）を得た。
【０２０１】
これらの抗体の分析から、特定のCDR配列が好ましいことが明白である（表2を参照されたい）。例えば、本実施例で分析した各抗Wnt2モノクローナル抗体は、VLCDR2についてのアミノ酸配列LVS（SEQ ID NO:58）を含む。他のCDR配列もまた非常に類似しており、例えば、VHCDR1の配列は
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であり、1つのアミノ酸残基が異なっている。
【０２０２】
モノクローナル抗体は、プロテインGを使用することによってアフィニティー精製され、-80℃に維持した。Seize X mammalian Immunoprecipitation Kit（Pierce Biotechnology、Rockford、Illinois）を、製造業者のプロトコールに従って使用して、細胞株抽出物からWnt2タンパク質を沈殿し、続いてウェスタンブロッティングを行った。細胞を、実験の1日前に、6ウェルプレートまたは10cmディッシュに蒔いた。次いで、通常培地を、種々の濃度の抗体を含む培地で置き換え、細胞を、5%CO2の加湿インキュベーター中で37℃でインキュベートした。種々の時点で、さらなる分析のために、標準的なプロトコールを使用して細胞を収集した。対照抗体は、Sigma-Aldrich Co.（St Louis、MO）からのマウスIgG1MOPC21である。抗Wnt2モノクローナル抗体17F7.G7を、記載される実験において使用した。
【０２０３】
実施例4. 正常組織および癌組織におけるWnt2 mRNA発現
正常組織および癌組織におけるWnt2 mRNA発現を、cDNAアレイを使用して研究した。手短に述べると、正常（76）、ならびに腫瘍-正常適合（19）ヒトRNAパネルからの複数のRNAマイクロアレイ（Clontech）を、Wnt2 cDNAプローブを使用して、Wnt2 mRNA発現の検出のために使用した。全長Wnt2 cDNAプローブを放射性標識し、RNAマイクロアレイにハイブリダイズした。正常ヒト器官において、Wnt2 mRNAは、胎盤、および弱く胎児肺および正常肺において発現された（You et al. Cancer Res. 64:5385-89 (2004)）。最小限の発現または発現なしが、すべての他の正常ヒト組織において、ヒトRNAマスターブロットにおいて注目された（You et al.、Cancer Res. 64:5385-89 (2004)）。適合したヒト非癌性組織および癌性組織において、Wnt2 mRNAは、種々のヒト癌組織において頻繁に過剰発現され、これには、10個の結腸癌のうちの10個、10個の直腸癌のうちの10個、7個の腸癌のうちの6個、10個の胃癌のうちの8個、および10個の甲状腺癌のうちの4個が含まれた（表3）。加えて、Wnt2 mRNAレベルの増加が、中皮腫（図9）、黒色腫、肉腫、子宮内膜癌、白血病、神経膠芽腫、食道癌、鼻咽腔癌、頭頚部癌、および肺癌の転移において観察された。例えば、中皮腫細胞におけるWnt関連遺伝子発現プロファイルは、図9に示される。
【０２０４】
（表３）ヒトの癌におけるWnt2 mRNA過剰発現（mRNAマイクロアレイ分析
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【０２０５】
実施例5：抗Wnt2モノクローナル抗体は、細胞抽出物中のヒトWnt2タンパク質を沈殿させる
Wnt2 N末端ペプチドに対するモノクローナル抗体を生成した（実施例1を参照されたい）。抗Wnt2モノクローナル抗体が、培養細胞中の天然型のWnt2タンパク質に特異的に結合することができるか否かを試験するために、3つの細胞株からの細胞抽出物中のモノクローナル抗体との、単独で、またはブロッキングペプチド（抗体の30倍量）とのプレインキュベーション後での免疫沈殿を実施した。C57Wnt2細胞株は陽性対照として働いた。NSCLC（A549）および黒色腫（LOX）細胞もまた試験した。C57Wnt2、A549およびLOX細胞において、Wnt2タンパク質は、抗Wnt2モノクローナル抗体によって沈殿された。抗Wnt2モノクローナル抗体がブロッキングペプチドとプレインキュベートされた場合、Wnt2タンパク質を沈殿するその能力は、3つすべての細胞株においてブロックされた。Wnt2タンパク質は、ブロッキングペプチドとのプレインキュベーション後に、モノクローナル抗体によって沈殿されなかった。これらのデータは、抗Wnt2モノクローナル抗体が、天然型のWnt2タンパク質に特異的に結合することができることを示す。
【０２０６】
実施例6：正常組織および癌性組織におけるヒトWnt2タンパク質発現
多数のヒト癌細胞株におけるWnt2タンパク質発現（表3）をこのモノクローナル抗体を使用して試験した。これらの株には以下が含まれた：4つのNSCLC細胞株（A549、H1299、H1703、およびH460）、1つの正常中皮細胞株（LP9；図10）および8つの悪性中皮腫細胞株（Met5a、LARklA、REN、H290、H2052、MS-1、H513、およびH28、図10）、4つのヒト黒色腫細胞株（LOX、FEM、FEMX、およびSK-Mel-2）、2つの乳癌細胞株（HuL100およびMCF-7）、ならびに2つの結腸癌細胞株（HCT116およびSW480）。小気道上皮細胞（SAEC）および正常初代ヒト気管支上皮細胞（NHBE）を正常対照として使用した。Wnt2タンパク質発現は、試験したすべての癌細胞株において見い出された。Wnt2発現は、2つの初代正常肺細胞（SAECおよびNHBE）においては観察されなかった。加えて、直前に切除された8つのNSCLC組織のうちの7つが、自系の適合した正常肺組織対照と比較して、Wnt2タンパク質の発現を増加しなかった（データ示さず）。さらに、患者から直前に切除した5つの胸膜中皮腫のうちの5つがWnt2タンパク質発現を示したのに対して、Wnt2タンパク質は、自系の適合した正常胸膜においては検出されなかった（図10）。
【０２０７】
実施例7：抗Wnt2モノクローナル抗体は、癌患者からの初代細胞培養において細胞毒性/アポトーシスを媒介する
患者から得られた癌組織から作製された新鮮な初代培養を樹立した。分析した癌の大部分が、高レベルのWnt2タンパク質の発現を示した。癌患者（例えば、甲状腺癌、結腸癌、または悪性黒色腫）から直前に作製されたこれらの初代培養物が抗Wnt2モノクローナル抗体（約10μg/ml）とともにインキュベートされる場合、細胞毒性/アポトーシスが観察された（「++++」；表4）。
【０２０８】
（表４）癌患者の初代培養物中での抗Wnt2 mAb媒介性細胞毒性/アポトーシス
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以下の細胞毒性/アポトーシスが示される：+/-、約40%；++、約70%、および++++、90%より高い。
【０２０９】
実施例8：抗Wnt2抗体誘導性アポトーシスはWnt2発現と相関する
抗Wnt2モノクローナル抗体は、4つのNSCLC細胞株（A549、H1299、H1703、およびH460）、5つの胸膜悪性中皮腫細胞株（H290、H2052、MS-1、H513、およびH28）、4つのヒト黒色腫細胞株（LOX、FEM、FEMX、およびSK-Mel-2）、2つの乳癌細胞株（HuL100およびMCF-7）、ならびに2つの結腸癌細胞株（HCT116およびSW480）を含む多数のヒト癌細胞株を処理するために使用した。インキュベーションの3〜5日後に、これらの細胞株中で有意な細胞死（10.0μg/mlの抗体において90%を超える細胞死、P<0.005）を観察した（表5）。これらの細胞株において、モノクローナル抗体がブロッキングペプチドとプレインキュベートされた場合、または対照モノクローナル抗体処理後には、注目すべき細胞変性効果は観察されなかった。同じ抗Wnt2モノクローナル抗体で処理されたNHBE細胞においてもまた、効果が認められなかった。細胞の殺傷は、大部分がアポトーシスの誘導によるものであった（72時間の誘導後に43.6〜79.2%のアポトーシス細胞）。このモノクローナル抗体によるアポトーシスの誘導は、用量および時間依存性であった（データ示さず）。NSCLC細胞株を使用するこの分析の代表的な例を図1に示す。黒色腫細胞におけるアポトーシスの誘導を図6に示し、中皮腫癌細胞におけるアポトーシスの誘導を図11に示す。加えて、肝臓癌細胞株HepG2およびHep3Bにおける抗Wnt2モノクローナル抗体の細胞毒性効果を観察した（データ示さず）。
【０２１０】
特異性の対照として、アポトーシスの誘導は、A549、LOXおよびFEMXにおいて、ブロッキングペプチド（抗体の30倍量）との前もってのインキュベーションによってブロックされたモノクローナルWnt2抗体を使用することによって試験した。72時間のインキュベーション後、アポトーシスを誘導する抗Wnt2抗体は、ブロッキングペプチドによって有意に阻害することができた（P<0.003）。同じ用量のブロッキングペプチド単独（300μg/ml、72時間）は、細胞生存度に効果を有さなかった。モノクローナル抗体単独（10μg/ml）、またはブロッキングペプチド（抗体の30倍量）との前もってのインキュベーションによってブロックされたモノクローナル抗体のいずれかとの約72時間のインキュベーション後には、有意なアポトーシス誘導は検出されなかった。A549を使用するこの分析の代表的な例を図1に示す。メラノーマ細胞における同様の実験を図6に示す。
【０２１１】
加えて、黒色腫患者および甲状腺癌患者から直前に作製した2つの初代培養物を、抗Wnt2モノクローナル抗体で処理し、抗体処理後に両方の患者の初代培養物において有意な細胞溶解を観察した。さらに、A549細胞が、低用量抗Wnt2抗体（2.0μg/ml）に加えて低用量化学療法剤（0.01nMドセタキセル）で処理した場合に、相乗作用が観察された（図5）。
【０２１２】
（表５）Wnt2を標的とするモノクローナル抗体はヒト癌細胞株においてアポトーシスを誘導する
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【０２１３】
実施例9：抗Wnt2モノクローナル抗体は、シトクロムcの放出、サバイビンの下方制御、およびカスパーゼ-3の活性化を通して、Wntシグナル伝達を阻害し、かつアポトーシスを誘導する
NSCLCおよび中皮腫におけるDvl-3の過剰発現が報告されてきた（Uematsu et al.、Oncogene 22 (46):7218-21 (2003); Uematsu et al.、Cancer Res 63(15):4547-51(2003)）。本発明者らは、細胞質β-カテニンとDvl-3の両方が、NSCLC細胞株A549（図2）、黒色腫細胞株FEMXおよびLOX（図6）ならびに中皮腫細胞株MS1、H28およびLRK1A（データ示さず）を含む癌細胞において、抗Wnt2モノクローナル抗体処理後に下方制御されることを見い出した。抗Wnt2モノクローナル抗体がアポトーシスを誘導したA549、FEMXおよびLOX細胞において、切断（活性）型のカスパーゼ-3が上方制御された（A549については図2；FEMXおよびLOXについては図6を参照されたい）。このカスパーゼ-3活性と一致して、抗Wnt2モノクローナル抗体処理後にこれらの細胞におけるシトクロムcの増加レベルが検出された（図6）。加えて、アポトーシスの阻害剤タンパク質（IAP）、サバイビンもまた、抗体処理後にこれらの細胞中で下方制御された（図6）。さらに、抗Wnt2モノクローナル抗体処理後のA549細胞におけるTCF依存性転写活性の有意な減少（TOPFLASHアッセイ法）（P<0.01）が観察された（図2）。β-カテニン-TCF標的化遺伝子、c-Mycおよびフィブロネクチンもまた、LOX細胞｛図？｝および悪性黒色腫を有する患者から直前に作製された初代腫瘍培養物の抗Wnt2モノクローナル抗体処理後に下方制御された（図6）。
【０２１４】
実施例10：Wnt2 siRNAは癌細胞中でアポトーシスを誘導する
RNA干渉を、Elbashirら（Elbashir et al.、Methods 26(2):199-213 (2002)）によって記載されるプロトコールに従って実行し、Wnt2を標的とする低分子干渉RNA（siRNA）を、Wnt2 mRNAサイレンシングの効果を研究するために使用した。抗Wnt2モノクローナル抗体と同様に、3〜5日間のWnt2 siRNAを用いる処理は、Wnt2を発現するすべての癌細胞株においてアポトーシスを誘導した（A549細胞については図3；LOXおよびFEMX細胞については図7；ならびにMS1、H28およびLRK1A細胞については図12を参照されたい）。有意なアポトーシスは100nM Wnt2 siRNAによって誘導され、アポトーシスは非サイレンシングsiRNA対照（100nM）によっては誘導されなかった（P<0.01）（図3）。Wnt2 siRNA処理（100nM、72時間）後のWnt2発現のサイレンシングを、ウェスタンブロット分析によって確認した（A549細胞については図3；LOXおよびFEMX細胞については図7；ならびにMS1、H28およびLRK1A細胞については図12を参照されたい）。非サイレンシングsiRNAは対照として働いた（100nM、72時間）。アポトーシス効果がWnt2シグナル伝達の阻害と相関するか否かを決定するために、Dvl-3、細胞質β-カテニン、およびサバイビンについての下方制御された発現を、Wnt2 siRNA処理とに観察した（A549細胞については図3；LOXおよびFEMX細胞については図7；ならびにMS1、H28およびLRK1A細胞については図12を参照されたい）。β-カテニン-TCF標的化遺伝子、c-Mycおよびフィブロネクチンもまた、siRNA Wnt2処理されたLOX細胞中で下方制御されることが見い出された（図7）。
【０２１５】
実施例11：抗Wnt2モノクローナル抗体抗体はインビボで腫瘍増殖を抑制する
インビボ研究を、肺における腫瘍発生について特異的であるマウスモデルを使用して実行した。1つの実験において、悪性黒色腫細胞株LOXを、1匹のマウスあたり300万細胞で、胸腺欠損ヌードマウスの尾静脈を通して接種した。次いで、10匹のマウスを、250μgの抗Wnt2モノクローナル抗体またはPBS対照を用いて、4週間の間、週に2回の腹腔内（i.p.）注射を介して処理した。マウスを1週間後に屠殺した。肺を外科的に収集し、重量を測定した。結果をスチューデントt検定を用いて分析した。抗Wnt2モノクローナル抗体処理マウスと未処理対照マウスの間で、肺重量の違いを観察した（P<0.0418；図4）。
【０２１６】
別の実験において、悪性黒色腫LOX細胞を、ヌードマウスにs.c.注射した。次いで、動物を、250μgの抗Wnt2モノクローナル抗体、対照抗体、または100μl PBS対照を用いて、1週間に2回、i.p.注射を介して処理した。抗Wnt2モノクローナル抗体は、対照に対して、腫瘍増殖を有意に阻害した（図8）。腫瘍増殖の抑制は、腫瘍がすでに樹立された後で（腫瘍細胞接種の3日後）、抗Wnt2モノクローナル抗体注射を開始した場合に見られた（P<0.005；図8aおよび8b）。腫瘍組織を収穫し、TUNEL染色を介して分析し、かつアポトーシス細胞を、抗Wnt2モノクローナル抗体で処理した腫瘍組織において認めた。
【０２１７】
実施例12：抗Wnt2モノクローナル抗体の投与はマウス組織において認知可能な毒性を示さない
可能性がある細胞毒性効果が、抗Wnt2モノクローナル抗体の投与によって引き起こされるか否かに取り組むために、抗Wnt2モノクローナル抗体で処理されたマウスの脳、肺、腎臓、心臓、小腸、大腸、胃、卵巣、皮膚、筋肉、肝臓、および骨を含むいくつかの組織試料を顕微鏡的に調べた。経験のある病理学者による盲検分析は、Wnt2モノクローナル抗体処理マウスの間で認知可能な毒性または異常性を実証することに失敗した。最後に、Wnt2抗体処理マウスは、処理の4週間後には完全に正常に見えた。組織試料を外科的に切除し、パラフィンブロック中に包埋した。組織解剖体（5μm）をエオシンで組織学的に染色し、認証されたマウス病理学者によって光学顕微鏡下で調べられた。
【０２１８】
実施例13：抗Wnt2抗体誘導性アポトーシスは、速いプロセスでありかつ用量依存性である
2つのNSCLC細胞株、H838およびA549に対する投薬量および時間経過実験を実施した。抗Wnt2抗体の約32時間のインキュベーション後のフローサイトメトリーは、1μg/ml抗体がアポトーシスを誘導することができることを示した。20μg/mlの濃度の抗Wnt2抗体は、劇的なアポトーシス性細胞死を引き起こした。抗Wnt2抗体（8μg/mlの濃度において）誘導性アポトーシスは、6時間のインキュベーションの後というほどの初期において検出することができ、および50時間のインキュベーション後では、ほとんどすべての細胞が、アポトーシスまたはネクローシスを受けることが見い出された。対照的に、対照抗-SOCS3抗体は、並行実験においてこれらの癌細胞に対して効果を有さなかった。正常肺細胞株（CCL-75）との抗Wnt2抗体インキュベーションもまた、いずれの時間または投薬量においても感受性ではなかった。
【０２１９】
実施例14：抗Wnt2抗体誘導性アポトーシスは、ミトコンドリアから細胞質ゾルへのSmac/Diabloおよびシトクロムcの放出ならびにJNK活性化と関連する
アポトーシスの間、Smac/Diablo（カスパーゼ/IAP結合タンパク質の第2のミトコンドリア由来のアクチベーター、低pIを有する）は、IAP-媒介性カスパーゼ阻害を除去するように機能する。アポトーシスの刺激は、シトクロムcと一緒に、Smac/Diabloの、ミトコンドリアの膜間スペースから細胞質ゾルへの放出を引き起こす。シトクロムcはApaf-1およびカスパーゼ-9を直接活性化し、Smac/Diabloは複数のIAPと相互作用して、イニシエーターとエフェクターの両方のカスパーゼのIAP媒介阻害を除去する。カスパーゼ-3活性が癌細胞中で増大しているが、正常細胞では増大していないという上記の結果と一致して、抗Wnt2抗体処理後の癌細胞の細胞質ゾル中でのSmac/Diabloとシトクロムcの両方の増加レベルが観察されたが、しかし正常細胞では増加レベルが観察されない。これらの結果は、Smac/Diabloとシトクロムcの両方が、それぞれ、サバイビンおよび/または他のIAP媒介阻害を取り除くことによって、抗Wnt2抗体誘導性アポトーシスに関与する可能性があり、およびカスパーゼの活性化を方向付けることを示す。
【０２２０】
実施例15：非小細胞肺癌におけるDvl活性化の役割
非小細胞肺癌（NSCLC）におけるDvl活性化の役割もまた調べた。本実施例は、Dvl-3が、直前に切除したNSCLCにおいて過剰発現されることを実証し、およびNSCLC細胞株を樹立した。従って、規範的なβ-カテニン経路を通してのWnt2シグナル伝達が、Dvl発現のような上流の事象に起因することのさらなる証拠が提供される。
【０２２１】
Dvl発現および機能は、NSCLCにおけるWnt2シグナル伝達の機能を評価するために分析される。8つのNSCLCの新鮮な腫瘍（4つの扁平上皮細胞および4つの腺癌）ならびにそれらの自系の適合した肺組織を、初期段階IのNSCLCのためのそれらの治療の一環として、それらの腫瘍の切除を受ける患者から入手した。患者は、任意の事前の治療、例えば、化学療法を受けていなかった。これらの試料のウェスタンブロット分析は、試験されたすべての癌細胞の75%（扁平上皮癌細胞の4つのうちの3つ、および4つの腺癌のうちの3つ）において、Dvl-3が過剰発現されたのに対して、対応する適合した正常な顕微解剖肺組織は、Dvl-3の発現を示すことに失敗した。さらに、Dvl-3過剰発現を有する8つのNSCLCのうちの7つは、ウェスタンブロット分析によって、より高いWnt2の発現を示した。Dvl-1またはDvl-2の発現は検出されなかった。
【０２２２】
実施例16：単独でまたは組み合わせた、細胞増殖に対する抗Wnt2モノクローナル抗体、Alimta（登録商標）の効果
細胞増殖に対する抗Wnt2モノクローナル抗体の効果を評価し、Alimta（登録商標）の効果と比較した。Alimta（登録商標）（LY231514、MTA、ペメトレキセド）は、新規な多機能葉酸拮抗物質である（Hanauske Lung Cancer 45 Suppl 1: S121-4 (2004)）。最近、フェーズIII試験は、シスプラチンとのAlimta（登録商標）の組み合わせが、シスプラチン単独と比較して、有意に増加した効力を生じることを示した（Vogelzang et al. J. Clin. Oncol. 21:2636-44 (2003)）。Alimta（登録商標）は、現在、外科的に適さない中皮腫の治療における標準と見なされている。MS1中皮腫細胞を96ウェルプレートに蒔き、増加濃度のWnt2抗体、Alimta（登録商標）、または両方で処理した。3日後、細胞増殖を、細胞酵素の代謝活性を測定すること（ここでは、テトラゾリウム転換）によって評価した。抗Wnt2抗体を10μg/mlの濃度で使用した場合に、細胞増殖における約30%（SD+/-7%）の減少を観察した。Alimta（登録商標）処理は、1μg/mlの濃度において、約41.9%（SD+/-4%）、および10μg/mlの濃度において、約42.9%（SD+/-2%)の細胞増殖の減少を誘導した。抗Wnt2モノクローナル抗体およびAlimta（登録商標）を10μg/mlの濃度で一緒に使用した場合には、細胞増殖は、約51.2%（SD+/-5%、p<0.005）阻害された。
【０２２３】
考察
上述のように、wntリガンドがヒトの発癌において果たす役割に関してはほとんど知られていない。本明細書で提示したデータは、wntシグナルが、ヒト癌細胞における原因となる役割を果たし、従って、癌の治療標的であることを実証する。
【０２２４】
上記に提示されたデータは、抗Wnt2抗体がヒト癌細胞においてアポトーシスを誘導できることを実証する。さらに、本発明者らのデータは、この抗腫瘍効果が、wntシグナル伝達経路の遮断に起因したことを示す。抗Wnt抗体によって誘導されたアポトーシス性細胞死は、Wntタンパク質発現と相関するのみならず、試験されたヒト腫瘍細胞における減少したdvlおよび細胞質β-カテニンタンパク質発現ともまた相関した。逆に言えば、Dvlタンパク質と細胞質β-カテニンタンパク質の両方は、抗Wnt抗体処理後に正常細胞株において同じレベルのままである。抗体は、正常な細胞株に対して検出可能な効果を示さず、このことは、抗Wnt2抗体が、癌細胞においてアポトーシスを特異的に誘導することができるが、しかし正常細胞においては誘導できないことを示唆する。ポリクローナル抗体は非特異的効果を生成するかもしれない可能性がるので、本発明者らは、抗Wnt2抗体の効果の特異性をさらに研究するために、抗Wnt2モノクローナル抗体を使用した。この抗Wnt2モノクローナル抗体は、Wnt2タンパク質を過剰発現するヒト癌細胞、例えば、ヒト肺癌細胞株においてアポトーシスを誘導可能であった。ポリクローナルの研究から得られた結果と同様に、dvlと細胞質βカテニンタンパク質の両方は、これらの腫瘍細胞週での抗Wnt2モノクローナル抗体処理の後で減少した。しかし、抗Wnt2モノクローナル抗体は、抗Wnt2ポリクローナル抗体よりもはるかに高い特異性を示し、例えば、抗Wnt2モノクローナルは、Wnt2タンパク質を過剰発現する腫瘍細胞（A549、LOX、およびFEMX）においてのみアポトーシスを誘導し、およびWnt2タンパク質を発現する腫瘍細胞において検出可能な効果を有し；抗Wnt1ポリクローナル抗体は、Wnt2を過剰発現する腫瘍細胞におけるアポトーシス性細胞死を誘導する。まとめると、これらのデータは、抗Wnt2抗体処理は、腫瘍特異的アポトーシスを誘導し、およびヒト癌細胞中のWnt-dvl-βカテニンシグナル伝達経路を下方制御することができることを示す。
【０２２５】
フリッツルド受容体およびディシェベルドタンパク質を通して、Wntシグナルは、2つの別個の経路：規範的経路（すなわち、βカテニン経路）およびJNK経路を活性化する。ディシェベルドタンパク質は、3つの高度に保存性であるドメイン、DIX、PDZ、およびDEPを有する。これらの中で、DIXドメインおよびPDZドメインが、規範的シグナル伝達経路のために必要であるのに対して、DEPドメインは、JNK経路の活性化のために重要である。ことが示唆される。JNKの活性化は、アポトーシスを開始する際に決定的な役割を果たすことが示唆されている（Wang, C. Y. et al.、Mol Cell Biol 19 (9):5923-9 (1999)）。最近、Chenらは、Wnt-1がβカテニンおよびTCF転写を活性化することによってアポトーシスを阻害することを実証した（Chen, S. et al.、J Cell Biol 152(1):87-96(2001)）。本研究において、β-カテニンの過剰発現とJNK活性の増加の両方が、抗Wnt抗体処理の後で観察され、このことは、規範的経路とJNK経路の両方が、抗Wnt抗体によって誘導されるアポトーシスに関与していることを示唆する。加えて、正常中皮細胞株中のDvlの過剰発現は、JNK活性を下方制御し、かつCK-2活性をブロックするアピゲニンを使用することによるDvlの阻害は、JNK活性を増大した。最も可能性が高いことは、抗Wnt抗体処理後のJNKの活性化は、Dvlを通してであることである。
【０２２６】
さらに、NSCLC細胞中でのDvl発現のsiRNA媒介性阻害は、β-カテニン媒介Tcf転写を減少し、このことは、Dvl過剰発現が、ある肺癌細胞において規範的Wnt/B-カテニン経路に対して重要であることをさらに支持する。Dvlの阻害はまた、NSCLC細胞における細胞増殖およびコロニー形成を抑制し、このことは、Wntシグナル伝達における異常な上流事象が、NSCLCにおける腫瘍形成に関連することを示す。
【０２２７】
siRNAによるDvlの分解は、H1703の増殖抑制を生じたが、A549細胞ではそうではなかった。これらは、両方とも、扁平上皮細胞肺癌細胞株であるが、H1703はp53の変異による不活性化を有するのに対して、A549は野生型p53を有する。それゆえに、p53の状態が、少なくとも部分的に、処理された2つの扁平上皮細胞肺癌細胞株の間でのDvl機能の違いを説明する可能性がある。
【０２２８】
抗Wnt抗体がをそれを通してヒト癌細胞においてアポトーシスを誘導するメカニズムをさらに説明するために、本発明者らは、アポトーシス経路の他の可能性がある成分を試験した。例えば、細胞質へのSmac/Diabloの放出は、wnt抗体で処理されたこれらの腫瘍細胞において検出された。Smac/Diablo（カスパーゼの第2のミトコンドリア由来のアクチベーター/低pIを有する直接的IAP結合タンパク質(second mitochondria-derived activator of caspase/direct IAP-binding protein with low pI)）(Du, C. et al.、Cell 102(1):33-42 (2000); Verhagen, A. M. et al.、Cell 102(1):43-53 (2000)) は、IAP媒介カスパーゼ阻害を開放することによって機能する。アポトーシスの刺激は、シトクロムcと一緒に、ミトコンドリアの膜間スペースから細胞質へのSmac/Diabloの放出を引き起こす。シトクロムcはApaf-1およびカスパーゼ-9を直接的に活性化し、Smac/Diabloは複数のIAPと相互作用し、イニシエーターとエフェクターの両方のカスパーゼのIAP-媒介阻害を解除する（Chai, J. et al.、Nature 406 (6798):855-62 (2000); Srinivasula, S. M. et al.、J_Biol_Chem 275(46):36152-7 (2000)）。カスパーゼ-3活性が癌細胞において増大するが、正常細胞において増大しない上記の結果と一致して、本発明者らは、抗Wnt抗体処理後に、癌細胞の細胞質に増加レベルのSmac/Diabloとシトクロムcの両方を見い出したが、正常細胞では見い出さなかった。本発明者らの結果は、Smac/Diabloとシトクロムcの両方が、それぞれ、サバイビンを除去すること、および/または他のIAP-媒介阻害およびカスパーゼの直接的活性化による、この抗Wnt抗体誘導性アポトーシスに関与する可能性があることを示す。
【０２２９】
上記の知見は、wnt抗体が、wntタンパク質を過剰発現する癌細胞においてアポトーシスを直接的に誘導する可能性があるのみならず、また、正常なアポトーシス機構を回復してこれらの腫瘍細胞に戻すことによって潜在的な薬物耐性を解除する可能性もあることを示唆する。腫瘍細胞における薬物耐性についての基礎は、アポトーシスの破壊が最も可能性が高い。アポトーシスの阻害剤であるサバイビンの発現は、大部分のヒトの癌の共通の特徴である。サバイビンを標的とすることは、細胞毒性薬物に対する腫瘍細胞の感受性を増大することが示された（Grossman, D. et al.、Proc Natl Acad Sci USA 98(2):635-40 (2001)）。アンチセンスサバイビンは、ヒト中皮腫細胞においてアポトーシスを引き起こすために十分であることが示された。さらに、アンチセンスサバイビンと化学療法の間の相乗効果もまた報告された。
【０２３０】
本発明者らは、抗体処理が、サバイビンのタンパク質発現レベルを劇的に減少することを示した。まとめると、Wnt抗体は、ヒト癌細胞において標準的な化学療法の効果を強化しかつ相乗作用を与えるはずである。
【０２３１】
Wntシグナルまたはフリッツルド受容体の他のアンタゴニストもまた、ディシェベルドを通してアポトーシスを誘導するはずである。例えば、sFRPは、分泌されたWntリガンドの結合について、フリッツルド受容体と競合することによって、Wntシグナル伝達の可溶性モジュレーターとして機能する（Melkonyan, H. S. et al.、Proc Natl Acad Sci U S A 94(25):13636-41 (1997)）。具体的には、sFRPは、タンパク質を結合し、およびその細胞表面シグナル伝達受容体への接近をブロックすることによってWnt機能と拮抗することできるか、またはそれらはフリッツルド受容体へのリガンドの提示を容易にすることによってWnt活性を増強することができるかのいずれかである（Uthoff, S. M. et al.、Mol Carcinog 31(1):56-62 (2001)）。フリッツルド受容体アンタゴニスト（例えば、細胞外ドメインに特異的な抗体または細胞内ドメインに特異的な低分子）は、wnt/フリッツルドタンパク質を過剰発現するヒト癌細胞においてアポトーシスを誘導するはずである。
【０２３２】
要約すると、本発明者らの結果は、wntモノクローナル抗体が、おそらく規範的な経路とJNK経路の両方を通して、ヒト癌細胞において腫瘍特異的なアポトーシスを誘導することができることを示す。本発明者らのデータは、Wnt/フリッツルドが癌の治療のための有用な治療標的であることを実証し、および異種移植片マウスモデルからの結果は、Wntモノクローナル抗体が腫瘍を標的とする癌治療剤の良好な候補であることを暗示する。
【０２３３】
本実施例において、本発明者らは、フリッツルド（fz）遺伝子および/またはLRP（LDL-関連タンパク質）遺伝子における遺伝子の変化が、癌において、すべてのFz受容体および/またはLRPコ-レセプター（細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および/または細胞内ドメイン）の変異体および/または短縮型を生じることを示す。本発明者らが試験した癌の種類には、乳癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌、中皮腫、および肉腫が含まれる。上述した遺伝的変化には、染色体欠失（ホモ接合性またはヘテロ接合性）、染色体転位、染色体破壊、染色体反転、内部の小さな欠失、挿入、および点変異が含まれる。Fz受容体および/またはLRPコ-レセプターのこれらの変異体および/または短縮型は、Wntリガンドの存在に関わらず構成的なシグナル伝達を生じ、これは、次には、癌における構成的な下流の転写活性を生じる。対照的に、正常細胞/組織においては、変異型のFz受容体および/またはLRPコ-レセプターは存在しない。
【０２３４】
本発明は、Wntシグナル伝達経路のためのFz受容体および/またはLRPコ-レセプターの変異体および/または短縮型が癌特異的であることを実証する。これらは、治療薬物（例えば、上記に議論したような低分子、化学化合物、抗体、アンチセンスオリゴ、またはRNAi）を開発するために標的として使用されるために非常に強力な潜在能力を有する。これらの薬物は、癌細胞のみを標的とすることが可能であり、正常細胞はできない。従って、本発明は、結腸癌、乳癌、肺癌、例えば、NSCLC、中皮腫および肉腫などを含む、上述のような多数の癌の治療のための治療戦略において、大きな助けとなる。
【０２３５】
本明細書に記載された実施例および態様は例示目的のみのためであること、ならびにそれらに鑑みて種々の修飾または変更が当業者に示唆され、かつ本願の精神および範囲、ならびに添付の特許請求の範囲の範囲に含まれることが理解される。本明細書で引用されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、すべての目的のために、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２３６】
配列表
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【図面の簡単な説明】
【０２３７】
【図１】抗Wnt2モノクローナル抗体は癌細胞においてアポトーシスを誘導する。（a）このパネルは、抗Wnt2抗体処理後のNHBE細胞および4つのNSCLC細胞株（A549、H460、H1703、およびH1299）の0.5%クリスタルバイオレット染色を示す。（b）このパネルは、フローサイトメトリーによるアポトーシス分析の例を示す。上端から下端に、A549、H460、およびH1703 NSCLC細胞を、対照抗体および抗Wnt2モノクローナル抗体でそれぞれ処理した。（c）NSCLC細胞株A549における抗Wnt2モノクローナル抗体による特異的な細胞の殺傷。このパネルは、モノクローナル抗体単独、およびブロッキングペプチドとのプレインキュベーションによってブロックされたモノクローナル抗体を用いる約72時間処理後の死滅A549細胞のパーセンテージを示す。対照は、ブロッキングペプチド単独および対照mAbである。インキュベーション後、細胞をフローサイトメトリー分析のために収集した。結果を平均±標準偏差（エラーバー）で示す。
【図２】抗Wnt2モノクローナル抗体はWntシグナル伝達を減少し、NSCLC細胞株A549におけるアポトーシスシグナル伝達を増加する。（a）抗Wnt2抗体処理の前後でのNSCLC a549のβ-カテニン、サバイビン（Survivin）、シトクロムc、プロ-および切断型カスパーゼ-3のウェスタン分析。（b）対照または抗Wnt2モノクローナル抗体とのインキュベーション後のNSCLC細胞型A549におけるTcf依存性転写活性のTOPFLASHアッセイ法。
【図３】Wnt2 siRNAは、NSCLC細胞型A549におけるアポトーシスを誘導し、Wntシグナル伝達をブロックする。（a）Wnt2 siRNAによって誘導されたアポトーシスのアネキシンV分析。右から左に、A549は、非サイレンシング対照siRNAおよびWnt2 siRNAでそれぞれ処理した。（b）Wnt2 siRNA処理後のA549細胞におけるWnt2、β-カテニン、サバイビンのウェスタン分析。非サイレンシングsiRNAは対照として働いた。
【図４】肺転移に対する抗Wnt2モノクローナル抗体のインビボ研究。
【図５】化学療法との相乗効果。A549細胞における相乗効果は、低用量の化学療法（ドセタキセル）が低用量の抗Wnt2モノクローナル抗体と組み合わされた場合に観察される。
【図６】抗Wnt2モノクローナル抗体は、メラノーマ細胞株および初代培養においてアポトーシスを誘導する。（a）このパネルは、抗Wnt2抗体処理後の正常なヒト上皮ケラチノサイト（NHEK）および4つのヒト黒色腫細胞株（LOX、FEMX、FEM、およびSK-Mel-2）0.5%クリスタルバイオレット染色を示す。（b）このパネルは、フローサイトメトリーによるアポトーシス分析の例を示す。FEMXおよびLOX癌細胞を、対照抗体および抗Wnt2モノクローナル抗体でそれぞれ処理した。FL1-HはアネキシンV-FITC染色を表す。（c）FEMXおよびLOX癌細胞における抗Wnt2モノクローナル抗体による特異的な細胞の殺傷。このパネルは、モノクローナル抗体単独、およびブロッキングペプチドとのプレインキュベーションによってブロックされたモノクローナル抗体を用いる約72時間処理後の死滅FEMXおよびLOX細胞のパーセンテージを示す。対照は、ブロッキングペプチド単独および対照mAbである。インキュベーション後、細胞をフローサイトメトリー分析のために収集した。結果を平均±標準偏差（エラーバー）で示す。（d）抗Wnt2抗体処理の前後でのウェスタン分析。2つの黒色腫細胞株、FEMXおよびLOX細胞を抗Wnt2抗体で処理した。Dvl-3、β-カテニン、サバイビン（surviving）、サイクリンD1、シトクロムc、プロ-カスパーゼ-3、および切断型カスパーゼ-3を評価した。アクチンはローディング対照として働いた。（e）c-Mycおよびフィブロネクチン遺伝子は、抗Wnt2モノクローナル抗体処理後にLOX黒色腫細胞株中で下方制御される。全RNAをハイブリダイゼーションのために使用した。（f）このパネルは、抗Wnt2抗体処理後の悪性黒色腫を有する患者からの直前に作製した初代腫瘍培養の0.5%クリスタルバイオレット染色を示す。
【図７】Wnt2 siRNAは、FEMXおよびLOX癌細胞株においてアポトーシスを誘導し、かつWntシグナル伝達をブロックする。（a）Wnt2 siRNAによって誘導されるアポトーシスのアネキシンV分析。LOXおよびFEMX癌細胞を、非サイレンシング対照siRNAおよびWnt2 siRNAでそれぞれ処理した。（b）Wnt2 siRNA処理後のLOXおよびFEMX細胞におけるWnt2、β-カテニン、サバイビンのウェスタン分析。アクチンはローディング対照として働いた。非サイレンシングsiRNAは対照として働いた。（c）c-Mycおよびフィブロネクチン遺伝子は、LOX細胞において、Wnt2 siRNA処理後に下方制御された。全RNAをハイブリダイゼーションのために使用した。
【図８】抗Wnt2モノクローナル抗体はインビボで腫瘍増殖を抑制する。（a）抗Wnt2モノクローナル抗体処理（および対照mAbおよびPBS処理）を、LOX腫瘍細胞接種の3日後に開始し、腫瘍体積（mm3）が処理後の種々の時点で示される。結果は、8匹の動物についての平均±標準偏差（エラーバー）である。（b）PBS、対照モノクローナル抗体、または抗Wnt2モノクローナル抗体を用いる処理後の腫瘍重量変化。結果を、8匹の動物についての平均±標準偏差（エラーバー）である。
【図９】中皮腫組織におけるWnt関連遺伝子発現プロファイル。（A）RNAを、16個の適合した悪性中皮腫および隣接する正常な胸膜から抽出した。抽出後、RNAを逆転写反応に供し、cDNAプローブをビオチン-16-dUTPで標識し、Wnt特異的アレイでハイブリダイズした。検出を化学発光反応を使用して行い、メンブレンをX線フィルムに露光した。ここでは例として2つの適合したサンプルを示す。Wnt2を黒い円で囲んでいる。（B）次いで、データを、製造業者によって提供されるGEArrayQシリーズヒトWntシグナル伝達経路アレイの遺伝子リストに対して適合させた。正常組織と比較して、悪性組織において上方制御された遺伝子は灰色で示す（Wnt2については明灰色）。（C）すべての研究された試料（8対）における上方制御された遺伝子および下方制御された遺伝子の詳細を述べる。
【図１０】正常および中皮腫の細胞ならびに組織におけるWnt2発現。（A）正常中皮細胞株（LP9）およびいくつかの悪性中皮腫細胞株におけるWnt2発現のウェスタンブロット分析。（B）組織におけるWnt2発現のウェスタンブロット分析。全細胞抽出物を直前に切除した腫瘍（T）および自己適合した正常胸膜（N）から調製した。アクチンを対照として使用した。
【図１１】抗Wnt2モノクローナル抗体は中皮腫癌細胞株においてアポトーシスを誘導する。（A）処理していないか、または対照抗体（対照Ab）もしくは10μg/mlの濃度の特異的抗Wnt2モノクローナル抗体（Wnt2 mAb）で処理したかのいずれかの4つの悪性胸膜中皮腫細胞株の0.5%クリスタルバイオレットでの染色。（B）Wnt2抗体を用いる処理後のH28細胞の形態の例。（C）処理なし（白いカラム）、対照抗体処理（明灰色カラム）、または10μg/mlのWnt2モノクローナル抗体処理（暗灰色カラム）の3日後にフローサイトメトリーによって測定されるようなアポトーシス細胞のパーセンテージの要約。結果は平均±SD（エラーバー）である。（D）フローサイトメトリーによるアポトーシス分析。H28および513細胞は、それぞれ、10.0μg/mlの対照抗体、および10.0μg/mlの抗Wnt2抗体を用いて、約72時間処理した。FL1-HはアネキシンV-FITC染色を表し、FL3-Hはヨウ化プロピオジウム染色（PI）を表す。
【図１２】Wnt2 siRNAは、中皮腫癌細胞株においてアポトーシスを誘導し、およびWntシグナル伝達をブロックする。（A）リポフェクタミン単独（未処理）、非サイレンシングsiRNA（対照siRNA）または100nMの特定のWnt2 siRNA（Wnt2 siRNA）を用いるトランスフェクションの35日後に現実化された3つの悪性胸膜中皮腫の0.5%クリスタルバイオレット染色。（B）Wnt2 siRNAによって誘導されるアポトーシスのアネキシンV分析。中皮腫細胞はAに記載されるようにトランスフェクトした。（C）Wnt2 siRNA処理（100nMで72時間）後のウェスタンブロット、処理なし、および非サイレンシングsiRNAは対照として働いた。Wnt2、Dvl-3、β-カテニンは一次抗体として使用した。β-アクチンはローディング対照として働いた。
【図１３】細胞増殖に対するWnt2抗体およびAlimta（登録商標）の効果。MS1中皮腫細胞株を96ウェルプレート中に蒔き、増加濃度のWnt2抗体（点線）、Alimta（登録商標）（実線）、または両方（断続線）で処理した。細胞増殖を、3日後に、細胞の酵素の代謝活性（ここではテトラゾリウム転換）を測定することによって評価した。結果は平均±SD（エラーバー）である。
【図１４】抗Wnt2モノクローナル抗体17F7.G7（サブクローンA）の相補性決定領域（CDR）およびフレームワーク領域（FR）のアミノ酸配列および核酸配列。軽鎖κおよび重鎖IgG1についての配列を示す。番号付けは、マウスモノクローナル抗体（IMGT、Immunogen Genetics）とのアライメントに基づくアミノ酸残基の位置をいう。FR領域は破線によって、CDRは実線によって示す。
【図１５】抗Wnt2モノクローナル抗体8B11.D2の相補性決定領域（CDR）およびフレームワーク領域（FR）のアミノ酸配列および核酸配列。A. 軽鎖κについての配列。B. 重鎖IgG1についての配列。番号付けは図14に記載されるのと同様である。FR領域は破線によって、CDRは実線によって示す。
【図１６】抗Wnt2モノクローナル抗体17F7.E5の相補性決定領域（CDR）およびフレームワーク領域（FR）のアミノ酸配列および核酸配列。A. 軽鎖κについての配列。B. 重鎖IgG1についての配列。番号付けは図14に記載されるのと同様である。FR領域は破線によって、CDRは実線によって示す。
【図１７】抗Wnt2モノクローナル抗体8B11.H6の相補性決定領域（CDR）およびフレームワーク領域（FR）のアミノ酸配列および核酸配列。A. 軽鎖κ（鎖1）についての配列。B. 軽鎖κ（鎖2）についての配列。C. 重鎖IgG1についての配列。番号付けは、図14に記載されるのと同様である。FR領域は破線によって、CDRは実線によって示す。
【図１８】抗Wnt2モノクローナル抗体17F7.G7（サブクローンB）の相補性決定領域（CDR）およびフレームワーク領域（FR）のアミノ酸配列および核酸配列。A. 軽鎖κ（鎖1）についての配列。B. 軽鎖κ（鎖2）についての配列。C. 重鎖IgG1についての配列。番号付けは、図14に記載されるのと同様である。FR領域は破線によって、CDRは実線によって示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年5月18日(2007.5.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007536938000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月31日(2007.5.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の増殖を阻害するために有効である量のWnt2シグナル伝達を阻害する因子と細胞を接触させる工程を含む、Wnt2を過剰発現する細胞の増殖を妨害する方法。
【請求項２】
因子がsiRNAである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
因子が抗Wnt2抗体である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
抗Wnt2抗体がモノクローナル抗体である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
抗Wnt2抗体が以下を含む、請求項3に記載の方法：
（i）SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:104またはSEQ ID NO:125に示されるようなVLCDR1アミノ酸配列；
（ii）SEQ ID NO:58に示されるようなVLCDR2アミノ酸配列；
（iii）SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:126またはSEQ ID NO:138に示されるようなVLCDR3アミノ酸配列；
（iv）SEQ ID NO:63またはSEQ ID NO:87に示されるようなVHCDR1アミノ酸配列；
（v）SEQ ID NO:65またはSEQ ID NO:89に示されるようなVHCDR2アミノ酸配列；および
（vi）SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:91またはSEQ ID NO:110に示されるようなVHCDR3アミノ酸配列。
【請求項６】
抗Wnt2抗体がヒトWnt2のアミノ酸残基49〜63（SEQ ID NO:2）に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを特異的に結合する、請求項3に記載の方法。
【請求項７】
抗Wnt2抗体がSSQRQLCHRHPDVMR（SEQ ID NO:2）を含むポリペプチドを特異的に結合する、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
抗Wnt2抗体が、ヒトWnt2のアミノ酸残基49〜63（SEQ ID NO:2）に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを特異的に結合する第2の抗Wnt2抗体と、Wnt2を結合することについて競合する、請求項3に記載の方法。
【請求項９】
抗Wnt2抗体が、Wnt2を結合することについて、
2007536938.tif 000077
を含むポリペプチドを特異的に結合する第2の抗Wnt2抗体と競合する、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
インビトロで実施される、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
インビボで実施される、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
細胞が癌細胞である、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
癌細胞が、乳癌、卵巣癌、直腸結腸癌、胃癌、肺癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、甲状腺癌、膵臓癌、子宮頸部癌、食道癌、中皮腫、頭頚部癌、肝細胞癌、黒色腫、脳腫瘍、外陰癌、精巣癌、肉腫、腸癌、皮膚癌、白血病、およびリンパ腫の癌細胞からなる群より選択される、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
細胞のアポトーシスを誘導するために有効である量のWnt2シグナル伝達を阻害する因子と細胞を接触させる工程を含む、Wnt2を過剰発現する細胞のアポトーシスを誘導する方法。
【請求項１５】
Wnt2シグナル伝達を阻害するために有効である量の抗Wnt2抗体と、Wnt2を過剰発現する細胞を接触させる工程を含む、細胞内でWnt2シグナル伝達を阻害する方法。
【請求項１６】
疾患を治療するために有効である量のWnt2シグナル伝達を阻害する因子を、そのような治療の必要がある被験体に投与する工程を含む、Wnt2シグナル伝達に関連する疾患を治療する方法。
【請求項１７】
因子が抗Wnt2抗体である、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
疾患が癌である、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
癌が、乳癌、卵巣癌、直腸結腸癌、胃癌、肺癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、甲状腺癌、膵臓癌、子宮頸部癌、食道癌、中皮腫、頭頚部癌、肝細胞癌、黒色腫、脳腫瘍、外陰癌、精巣癌、肉腫、腸癌、皮膚癌、白血病、およびリンパ腫の癌細胞からなる群より選択される、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
癌を治療するために有効な量の抗Wnt2抗体を被験体に投与する工程を含む、Wnt2を過剰発現する癌を治療する方法。
【請求項２１】
抗Wnt2抗体がモノクローナル抗体である、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
抗Wnt2抗体が以下を含む、請求項20に記載の方法：
（i）SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:104またはSEQ ID NO:125に示されるようなVLCDR1アミノ酸配列；
（ii）SEQ ID NO:58に示されるようなVLCDR2アミノ酸配列；
（iii）SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:126またはSEQ ID NO:138に示されるようなVLCDR3アミノ酸配列；
（iv）SEQ ID NO:63またはSEQ ID NO:87に示されるようなVHCDR1アミノ酸配列；
（v）SEQ ID NO:65またはSEQ ID NO:89に示されるようなVHCDR2アミノ酸配列；および
（vi）SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:91またはSEQ ID NO:110に示されるようなVHCDR3アミノ酸配列。
【請求項２３】
抗Wnt2抗体がヒトWnt2のアミノ酸残基49〜63（SEQ ID NO:2）に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを特異的に結合する、請求項20に記載の方法。
【請求項２４】
抗Wnt2抗体がSSQRQLCHRHPDVMR（SEQ ID NO:2）を含むポリペプチドを特異的に結合する、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
抗Wnt2抗体が、ヒトWnt2のアミノ酸残基49〜63（SEQ ID NO:2）に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを特異的に結合する第2の抗Wnt2抗体と、Wnt2を結合することについて競合する、請求項20に記載の方法。
【請求項２６】
抗Wnt2抗体が、Wnt2を結合することについて、
2007536938.tif 000078
を含むポリペプチドを特異的に結合する第2の抗Wnt2抗体と競合する、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
抗Wnt2抗体ならびに薬学的に許容される賦形剤、担体、および/または希釈剤を含む薬学的組成物。
【請求項２８】
抗Wnt2抗体がポリクローナル抗体である、請求項27に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
抗Wnt2抗体がモノクローナル抗体である、請求項27に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
ヒトWnt2のアミノ酸残基49〜63に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを特異的に結合する抗Wnt2モノクローナル抗体。
【請求項３１】
ヒトWnt2のアミノ酸残基49〜63に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを特異的に結合する第2のWnt2抗体と、Wnt2への結合について競合する、請求項30に記載の抗Wnt2モノクローナル抗体。
【請求項３２】
以下を含む、請求項30に記載のモノクローナル抗体：
（i）SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:104またはSEQ ID NO:125に示されるようなVLCDR1アミノ酸配列；
（ii）SEQ ID NO:58に示されるようなVLCDR2アミノ酸配列；
（iii）SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:126またはSEQ ID NO:138に示されるようなVLCDR3アミノ酸配列；
（iv）SEQ ID NO:63またはSEQ ID NO:87に示されるようなVHCDR1アミノ酸配列；
（v）SEQ ID NO:65またはSEQ ID NO:89に示されるようなVHCDR2アミノ酸配列；および
（vi）SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:91またはSEQ ID NO:110に示されるようなVHCDR3アミノ酸配列。
【請求項３３】
請求項32に記載のモノクローナル抗体をコードする核酸。
【請求項３４】
以下を含む、請求項33に記載の核酸：
（i）SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:113およびSEQ ID NO:131に示される核酸配列からなる群より選択されるVLCDR1をコードする核酸；
（ii）SEQ ID NO:72およびSEQ ID NO:115に示される核酸配列からなる群より選択されるVLCDR2をコードする核酸；
（iii）SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:134およびSEQ ID NO:143に示される核酸配列の群より選択されるVLCDR3をコードする核酸；
（iv）SEQ ID NO:77およびSEQ ID NO:97に示される核酸配列の群より選択されるVHCDR1をコードする核酸；
（v）SEQ ID NO:79およびSEQ ID NO:99に示される核酸配列の群より選択されるVHCDR2をコードする核酸；ならびに
（vi）SEQ ID NO:101およびSEQ ID NO:120に示される核酸配列の群より選択されるVHCDR3をコードする核酸。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本発明はさらに、ヒトWnt2のアミノ酸残基49〜63（SEQ ID NO:2）に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを特異的に結合する抗Wnt2抗体を提供する。別の抗Wnt2抗体は、SSQRQLCHRHPDVMR（SEQ ID NO:2）を含むポリペプチドを特異的に結合する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
本発明はまた、ヒトWnt2のアミノ酸残基49〜63（SEQ ID NO:2）に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを特異的に結合する第2の抗Wnt2抗体と、Wnt2タンパク質を結合することについて競合する抗Wnt2抗体を提供する。別の抗Wnt2抗体は、SSQRQLCHRHPDVMR（SEQ ID NO:2）を含むポリペプチドを特異的に結合する第2の抗Wnt2抗体と、Wnt2タンパク質を結合することについて競合する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
本明細書に開示されるように、抗Wnt2抗体は、SEQ ID NO:1〜15および30〜53のアミノ酸配列のいずれかを含むWnt2ペプチドを使用して生成することができる。好ましい抗Wnt2抗体は、ヒトWnt2のアミノ酸残基49〜63（SEQ ID NO:2）に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体である。「ヒトWnt2のアミノ酸残基49〜63（SEQ ID NO:2）に対応する」という語句は、非ヒトWnt2タンパク質または別のWntタンパク質のアミノ酸配列をいい、ここで、それぞれのアミノ酸配列は、ヒトWnt2のアミノ酸残基49〜63（SEQ ID NO:2）に対応する。これらのアミノ酸配列は、ヒトWnt2のアミノ酸残基49〜63（SEQ ID NO:2）と比較した場合に、1つまたは複数のアミノ酸の違いを有してもよい。本発明の好ましい態様において、抗Wnt2抗体は、SSQRQLCHRHPDVMR（SEQ ID NO:2）を含むポリペプチドを特異的に結合し、および特に、SSQRQLCHRHPDVMR（SEQ ID NO:2）ポリペプチドのエピトープに結合する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
E. Wnt2を結合する単鎖Fv抗体
ある態様において、抗体は単鎖Fv（scFv）である。scFv抗体のVHおよびVL領域は、2つの鎖の抗体において見い出されるものと類似の抗原結合部位を作るように折りたたまれる単鎖を含む。一旦折りたたまれると、非共有結合による相互作用が単鎖抗体を安定化する。ある抗体のVHおよびVL領域は直接的に一緒に連結することができるのに対して、当業者は、これらの領域が、1つまたは複数のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって分離されてもよいことを認識する。ペプチドリンカーおよびそれらの使用は、当技術分野において周知である。例えば、Huston et al.、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 8: 5879 (1988); Bird et al.、Science 242: 4236 (1988); Glockshuber et al.、Biochemistry 29: 1362 (1990); 米国特許第4,946,778号、同第5,132,405号およびStemmer et al.、Biotechniques 14: 256-265 (1993)を参照されたい。一般的に、ペプチドリンカーは、領域を結合させるか、またはVHとVLの間のある程度の最小距離もしくは他の空間的な関連性を保存するため以外の特異的生物学的活性を有さない。しかし、ペプチドリンカーの構成アミノ酸は、折りたたみ、正味の電荷、または疎水性のような分子のある特性に影響を与えるように選択されてもよい。単鎖Fv（scFv）抗体は、任意に、50アミノ酸を超えない、一般的に40アミノ酸を超えない、好ましくは30アミノ酸を超えない、およびより好ましくは20アミノ酸を超えない長さのペプチドリンカーを含む。ある態様において、ペプチドリンカーは、配列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（SEQ ID NO:161）のコンカテマー、好ましくは、2、3、4、5、または6個のこのような配列である。しかし、リンカー内にある程度のアミノ酸置換を作製することができることが理解される。例えば、バリンは、グリシンの代わりに置換され得る。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９８】
実施例3：抗Wnt2モノクローナル抗体の生成および細胞との抗体のインキュベーション
抗Wnt2モノクローナル抗体を産生するために使用した抗原は、ヒトWnt2のアミノ酸酸基49〜63に対応する合成ペプチド（Ac-SSQRQLCHRHPDVMR-アミド、SEQ ID NO:162）であった。この抗原は、その疎水性（Parker et al.、(1986) Biochemistry 25 (19):5425-32）、抗原性（Welling et al.、(1985) FEBS Lett. 188 (2):215-8）、接近可能性（Janin、Nature 277:491-2 (1979)）、配列相同性（BLAST検索）、およびN末端近傍に基づいて生物情報学的に選択した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３５】
本明細書に記載された実施例および態様は例示目的のみのためであること、ならびにそれらに鑑みて種々の修飾または変更が当業者に示唆され、かつ本願の精神および範囲、ならびに添付の特許請求の範囲の範囲に含まれることが理解される。本明細書で引用されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、すべての目的のために、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
材料の寄託
以下のハイブリドーマ細胞株は、American Type Culture Collection（ATCC）、10801 University Boulevard、Manassas VA. 20110-2209 USAにより寄託されている：ATCC 番号：PTA-6956と割り当てられたハイブリドーマ細胞株17F7.G7（サブクローンA）、寄託日：2005年8月31日；およびATCC 番号：PTA-6957と割り当てられたハイブリドーマ細胞株17F7.G7（サブクローンB）、寄託日：2005年8月31日。この寄託は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定およびそれ（ブタペスト条約）に従う規則の元でなされた。これは、寄託日から30年間、または寄託の最終請求後の5年間、または米国特許もしくは外国特許の実施可能な期間のいずれか長い方で生存培養物の維持を保証する。寄託はブタペスト条約の合意の元でATCCにより入手可能であり、この条約が、関連する米国特許の保証に基づいてまたは任意の米国または外国の特許出願に対して公開させることに基づいて、どちらか先に来る方で、一般の人々に培養物の子孫の半永久的なおよび制限のない入手可能性を保証し、ならびに米国特許法122条およびそれに準ずる長官規則（特に886 OG 638に関する米国特許法施行規則1.14条を含む）に従ってそれに対して権利を与えられることが特許および商標の米国長官によって決定された人々に対してその子孫の入手可能性を確実にする。
本出願の指定代理人は、寄託されている培養物が適切な条件下で培養された場合に死滅するまたは失われるもしくは破壊されるならば、それが通知有り次第同培養物の生存標本に即座に交換されるであろうことに同意している。寄託された株の入手可能性は、その特許法に従って任意の政府の権限下で付与された権利に違反して本発明を実施するためのライセンスとして解釈されるべきではない。
前記の明細書は、当業者が本発明を十分実施可能であると考えられる。寄託された態様が本発明の1つの局面の説明として意図され、かつ機能的に等価である任意の培養物が本発明の範囲内であるため、本発明は、寄託された培養物によって範囲を限定されるべきではない。本明細書中の材料の寄託は、その最良の形態を含む本発明の任意の局面の実施を可能にする不十分であるということを認めることとなるのではなく、またそれが示す具体的説明に対する特許請求項の範囲を限定すると解釈されるべきではない。実際、本発明の様々な改変、さらに本明細書で示されるかつ記載されるものが、前記の説明から当業者には明らかであり、かつ添付の特許請求項の範囲内に入ると考えられる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３６】
非公式の配列表
2007536938.tif 000079
2007536938.tif 000080
2007536938.tif 000081
2007536938.tif 000082
2007536938.tif 000083
2007536938.tif 000084
2007536938.tif 000085
2007536938.tif 000086
2007536938.tif 000087
2007536938.tif 000088
2007536938.tif 000089
2007536938.tif 000090
2007536938.tif 000091
2007536938.tif 000092
2007536938.tif 000093
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３７】
【図１】抗Wnt2モノクローナル抗体は癌細胞においてアポトーシスを誘導する。（a）このパネルは、抗Wnt2抗体処理後のNHBE細胞および4つのNSCLC細胞株（A549、H460、H1703、およびH1299）の0.5%クリスタルバイオレット染色を示す。（b）このパネルは、フローサイトメトリーによるアポトーシス分析の例を示す。上端から下端に、A549、H460、およびH1703 NSCLC細胞を、対照抗体および抗Wnt2モノクローナル抗体でそれぞれ処理した。（c）NSCLC細胞株A549における抗Wnt2モノクローナル抗体による特異的な細胞の殺傷。このパネルは、モノクローナル抗体単独、およびブロッキングペプチドとのプレインキュベーションによってブロックされたモノクローナル抗体を用いる約72時間処理後の死滅A549細胞のパーセンテージを示す。対照は、ブロッキングペプチド単独および対照mAbである。インキュベーション後、細胞をフローサイトメトリー分析のために収集した。結果を平均±標準偏差（エラーバー）で示す。
【図２】抗Wnt2モノクローナル抗体はWntシグナル伝達を減少し、NSCLC細胞株A549におけるアポトーシスシグナル伝達を増加する。（a）抗Wnt2抗体処理の前後でのNSCLC a549のβ-カテニン、サバイビン（Survivin）、シトクロムc、プロ-および切断型カスパーゼ-3のウェスタン分析。（b）対照または抗Wnt2モノクローナル抗体とのインキュベーション後のNSCLC細胞型A549におけるTcf依存性転写活性のTOPFLASHアッセイ法。
【図３】Wnt2 siRNAは、NSCLC細胞型A549におけるアポトーシスを誘導し、Wntシグナル伝達をブロックする。（a）Wnt2 siRNAによって誘導されたアポトーシスのアネキシンV分析。右から左に、A549は、非サイレンシング対照siRNAおよびWnt2 siRNAでそれぞれ処理した。（b）Wnt2 siRNA処理後のA549細胞におけるWnt2、β-カテニン、サバイビンのウェスタン分析。非サイレンシングsiRNAは対照として働いた。
【図４】肺転移に対する抗Wnt2モノクローナル抗体のインビボ研究。
【図５】化学療法との相乗効果。A549細胞における相乗効果は、低用量の化学療法（ドセタキセル）が低用量の抗Wnt2モノクローナル抗体と組み合わされた場合に観察される。
【図６】抗Wnt2モノクローナル抗体は、メラノーマ細胞株および初代培養においてアポトーシスを誘導する。（a）このパネルは、抗Wnt2抗体処理後の正常なヒト上皮ケラチノサイト（NHEK）および4つのヒト黒色腫細胞株（LOX、FEMX、FEM、およびSK-Mel-2）0.5%クリスタルバイオレット染色を示す。（b）このパネルは、フローサイトメトリーによるアポトーシス分析の例を示す。FEMXおよびLOX癌細胞を、対照抗体および抗Wnt2モノクローナル抗体でそれぞれ処理した。FL1-HはアネキシンV-FITC染色を表す。（c）FEMXおよびLOX癌細胞における抗Wnt2モノクローナル抗体による特異的な細胞の殺傷。このパネルは、モノクローナル抗体単独、およびブロッキングペプチドとのプレインキュベーションによってブロックされたモノクローナル抗体を用いる約72時間処理後の死滅FEMXおよびLOX細胞のパーセンテージを示す。対照は、ブロッキングペプチド単独および対照mAbである。インキュベーション後、細胞をフローサイトメトリー分析のために収集した。結果を平均±標準偏差（エラーバー）で示す。（d）抗Wnt2抗体処理の前後でのウェスタン分析。2つの黒色腫細胞株、FEMXおよびLOX細胞を抗Wnt2抗体で処理した。Dvl-3、β-カテニン、サバイビン（surviving）、サイクリンD1、シトクロムc、プロ-カスパーゼ-3、および切断型カスパーゼ-3を評価した。アクチンはローディング対照として働いた。（e）c-Mycおよびフィブロネクチン遺伝子は、抗Wnt2モノクローナル抗体処理後にLOX黒色腫細胞株中で下方制御される。全RNAをハイブリダイゼーションのために使用した。（f）このパネルは、抗Wnt2抗体処理後の悪性黒色腫を有する患者からの直前に作製した初代腫瘍培養の0.5%クリスタルバイオレット染色を示す。
【図７】Wnt2 siRNAは、FEMXおよびLOX癌細胞株においてアポトーシスを誘導し、かつWntシグナル伝達をブロックする。（a）Wnt2 siRNAによって誘導されるアポトーシスのアネキシンV分析。LOXおよびFEMX癌細胞を、非サイレンシング対照siRNAおよびWnt2 siRNAでそれぞれ処理した。（b）Wnt2 siRNA処理後のLOXおよびFEMX細胞におけるWnt2、β-カテニン、サバイビンのウェスタン分析。アクチンはローディング対照として働いた。非サイレンシングsiRNAは対照として働いた。（c）c-Mycおよびフィブロネクチン遺伝子は、LOX細胞において、Wnt2 siRNA処理後に下方制御された。全RNAをハイブリダイゼーションのために使用した。
【図８】抗Wnt2モノクローナル抗体はインビボで腫瘍増殖を抑制する。（a）抗Wnt2モノクローナル抗体処理（および対照mAbおよびPBS処理）を、LOX腫瘍細胞接種の3日後に開始し、腫瘍体積（mm3）が処理後の種々の時点で示される。結果は、8匹の動物についての平均±標準偏差（エラーバー）である。（b）PBS、対照モノクローナル抗体、または抗Wnt2モノクローナル抗体を用いる処理後の腫瘍重量変化。結果を、8匹の動物についての平均±標準偏差（エラーバー）である。
【図９】中皮腫組織におけるWnt関連遺伝子発現プロファイル。（A）RNAを、16個の適合した悪性中皮腫および隣接する正常な胸膜から抽出した。抽出後、RNAを逆転写反応に供し、cDNAプローブをビオチン-16-dUTPで標識し、Wnt特異的アレイでハイブリダイズした。検出を化学発光反応を使用して行い、メンブレンをX線フィルムに露光した。ここでは例として2つの適合したサンプルを示す。Wnt2を黒い円で囲んでいる。（B）次いで、データを、製造業者によって提供されるGEArrayQシリーズヒトWntシグナル伝達経路アレイの遺伝子リストに対して適合させた。正常組織と比較して、悪性組織において上方制御された遺伝子は灰色で示す（Wnt2については明灰色）。（C）すべての研究された試料（8対）における上方制御された遺伝子および下方制御された遺伝子の詳細を述べる。
【図１０】正常および中皮腫の細胞ならびに組織におけるWnt2発現。（A）正常中皮細胞株（LP9）およびいくつかの悪性中皮腫細胞株におけるWnt2発現のウェスタンブロット分析。（B）組織におけるWnt2発現のウェスタンブロット分析。全細胞抽出物を直前に切除した腫瘍（T）および自己適合した正常胸膜（N）から調製した。アクチンを対照として使用した。
【図１１】抗Wnt2モノクローナル抗体は中皮腫癌細胞株においてアポトーシスを誘導する。（A）処理していないか、または対照抗体（対照Ab）もしくは10μg/mlの濃度の特異的抗Wnt2モノクローナル抗体（Wnt2 mAb）で処理したかのいずれかの4つの悪性胸膜中皮腫細胞株の0.5%クリスタルバイオレットでの染色。（B）Wnt2抗体を用いる処理後のH28細胞の形態の例。（C）処理なし（白いカラム）、対照抗体処理（明灰色カラム）、または10μg/mlのWnt2モノクローナル抗体処理（暗灰色カラム）の3日後にフローサイトメトリーによって測定されるようなアポトーシス細胞のパーセンテージの要約。結果は平均±SD（エラーバー）である。（D）フローサイトメトリーによるアポトーシス分析。H28および513細胞は、それぞれ、10.0μg/mlの対照抗体、および10.0μg/mlの抗Wnt2抗体を用いて、約72時間処理した。FL1-HはアネキシンV-FITC染色を表し、FL3-Hはヨウ化プロピオジウム染色（PI）を表す。
【図１２】Wnt2 siRNAは、中皮腫癌細胞株においてアポトーシスを誘導し、およびWntシグナル伝達をブロックする。（A）リポフェクタミン単独（未処理）、非サイレンシングsiRNA（対照siRNA）または100nMの特定のWnt2 siRNA（Wnt2 siRNA）を用いるトランスフェクションの35日後に現実化された3つの悪性胸膜中皮腫の0.5%クリスタルバイオレット染色。（B）Wnt2 siRNAによって誘導されるアポトーシスのアネキシンV分析。中皮腫細胞はAに記載されるようにトランスフェクトした。（C）Wnt2 siRNA処理（100nMで72時間）後のウェスタンブロット、処理なし、および非サイレンシングsiRNAは対照として働いた。Wnt2、Dvl-3、β-カテニンは一次抗体として使用した。β-アクチンはローディング対照として働いた。
【図１３】細胞増殖に対するWnt2抗体およびAlimta（登録商標）の効果。MS1中皮腫細胞株を96ウェルプレート中に蒔き、増加濃度のWnt2抗体（点線）、Alimta（登録商標）（実線）、または両方（断続線）で処理した。細胞増殖を、3日後に、細胞の酵素の代謝活性（ここではテトラゾリウム転換）を測定することによって評価した。結果は平均±SD（エラーバー）である。
【図１４】抗Wnt2モノクローナル抗体17F7.G7（サブクローンA）の相補性決定領域（CDR）およびフレームワーク領域（FR）のアミノ酸配列および核酸配列。軽鎖κ（SEQ ID NO:153およびSEQ ID NO:54）および重鎖IgG1（SEQ ID NO:75およびSEQ ID NO:154）についての配列を示す。番号付けは、マウスモノクローナル抗体（IMGT、Immunogen Genetics）とのアライメントに基づくアミノ酸残基の位置をいう。FR領域は破線によって、CDRは実線によって示す。
【図１５】抗Wnt2モノクローナル抗体8B11.D2の相補性決定領域（CDR）およびフレームワーク領域（FR）のアミノ酸配列および核酸配列。A. 軽鎖κ（SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:82およびSEQ ID NO:156）についての配列。B. 重鎖IgG1（SEQ ID NO:95およびSEQ ID NO:85）についての配列。番号付けは図14に記載されるのと同様である。FR領域は破線によって、CDRは実線によって示す。
【図１６】抗Wnt2モノクローナル抗体17F7.E5の相補性決定領域（CDR）およびフレームワーク領域（FR）のアミノ酸配列および核酸配列。A. 軽鎖κ（SEQ ID NO:111およびSEQ ID NO:102）についての配列。B. 重鎖IgG1（SEQ ID NO:118およびSEQ ID NO:157）についての配列。番号付けは図14に記載されるのと同様である。FR領域は破線によって、CDRは実線によって示す。
【図１７】抗Wnt2モノクローナル抗体8B11.H6の相補性決定領域（CDR）およびフレームワーク領域（FR）のアミノ酸配列および核酸配列。A. 軽鎖κ（鎖1）（SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:121およびSEQ ID NO:156）についての配列。B. 軽鎖κ（鎖2）（SEQ ID NO:129およびSEQ ID NO:123）についての配列。C. 重鎖IgG1（SEQ ID NO:135およびSEQ ID NO:127）についての配列。番号付けは、図14に記載されるのと同様である。FR領域は破線によって、CDRは実線によって示す。
【図１８】抗Wnt2モノクローナル抗体17F7.G7（サブクローンB）の相補性決定領域（CDR）およびフレームワーク領域（FR）のアミノ酸配列および核酸配列。A. 軽鎖κ（鎖1）（SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:82およびSEQ ID NO:160）についての配列。B. 軽鎖κ（鎖2）（SEQ ID NO:141およびSEQ ID NO:137）についての配列。C. 重鎖IgG1（SEQ ID NO:144およびSEQ ID NO:139）についての配列。番号付けは、図14に記載されるのと同様である。FR領域は破線によって、CDRは実線によって示す。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2007536938.tif 000094
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2007536938.tif 000095
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2007536938.tif 000096
【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2007536938.tif 000097
【手続補正１４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
2007536938.tif 000098
【手続補正１５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６】
2007536938.tif 000099
【手続補正１６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７】
2007536938.tif 000100
【手続補正１７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８】
2007536938.tif 000101
【手続補正１８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９】
2007536938.tif 000102
【手続補正１９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１１】
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【手続補正２０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１２】
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【国際調査報告】
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