(57)【要約】【解決課題】  本発明は、Seneca Valleyウイルス（「ＳＶＶ」）と称される新規ＲＮＡピコルナウイルス、及び、単離されたＳＶＶ核酸およびこれらの核酸によってエンコードされるタンパク質と該ＳＶＶタンパク質に対して産生される抗体を提供する。【解決手段】ＳＶＶはいくつかのタイプの腫瘍を選択的に死滅させる能力を有するため、癌の処置にＳＶＶおよびＳＶＶポリペプチドを使用する方法と、ＳＶＶは特定の腫瘍を特異的に標的にするため、癌の検出にＳＶＶ核酸およびタンパク質を使用する方法、さらに、ＳＶＶの腫瘍特異的機構によって提供される情報に基づいて、新規腫瘍溶解性ウイルス誘導体を作成する方法および腫瘍特異的親和性を有するようにウイルスを改変する方法を提供する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、または少なくとも２０ヌクレオチド長のいずれか１つの前記配列の連続部分と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む単離された核酸。
【請求項２】
高ストリンジェンシーの条件下で請求項１の核酸にハイブリダイズする単離された核酸。
【請求項３】
中ストリンジェンシーの条件下で請求項１の核酸にハイブリダイズする単離された核酸。
【請求項４】
低ストリンジェンシーの条件下で請求項１の核酸にハイブリダイズする単離された核酸。
【請求項５】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、または少なくとも２０ヌクレオチド長のいずれか１つの前記配列の連続部分と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含むベクター。
【請求項６】
核酸がＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項１の単離された核酸。
【請求項７】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、または少なくとも１０ヌクレオチド長のいずれか１つの前記配列の連続部分を含む核酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸によってエンコードされる単離されたポリペプチド。
【請求項８】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、または少なくとも１０アミノ酸長のいずれか１つの前記配列の連続部分と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項９】
請求項８のポリペプチドまたは請求項１１の単離されたウイルスに特異的に結合する単離された抗体。
【請求項１０】
抗体がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはキメラ抗体である、請求項９の抗体。
【請求項１１】
ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−５３４３の識別特性を含む、単離されたSeneca Valleyウイルスまたはその誘導体。
【請求項１２】
配列番号１と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％または６５％同一の配列を含むゲノムを有する、単離されたSeneca Valleyウイルスまたはその誘導体または類縁体。
【請求項１３】
以下の特徴を含む、単離されたSeneca Valleyウイルスまたはその誘導体または類縁体：約７．５ｋｂの一本鎖ＲＮＡゲノム；直径〜２７ｎｍ；約３１ｋＤａ、約３６ｋＤａ、および約２７ｋＤａの概算の分子量を有する少なくとも３種のタンパク質を含むキャプシド；ＣｓＣｌ勾配上の浮遊密度約１．３４ｇ／ｍｌ；および腫瘍細胞での複製能。
【請求項１４】
以下の特徴を含む、単離されたSeneca Valleyウイルスまたはその誘導体または類縁体：腫瘍細胞での複製能、腫瘍細胞親和性、および正常細胞での細胞溶解の欠如。
【請求項１５】
ウイルスが、神経内分泌特性を有する腫瘍細胞型において複製能を有する、請求項１２または１３のウイルス。
【請求項１６】
３１ｋＤａタンパク質が、配列番号８と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１２のウイルス。
【請求項１７】
３６ｋＤａタンパク質が、配列番号４と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１２のウイルス。
【請求項１８】
２７ｋＤａタンパク質が、配列番号６と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１２のウイルス。
【請求項１９】
請求項１１〜１８のいずれか一項の有効量のウイルスおよび製薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１１〜１８のいずれか一項のウイルスを含む細胞。
【請求項２１】
請求項１１〜１８のいずれか一項のウイルスの抗原を含有するウイルスライセート。
【請求項２２】
請求項１１〜１８のいずれか一項のウイルスから取得される単離されたウイルス抗原。
【請求項２３】
癌の処置方法であって、該癌を処置するために有効量のウイルスまたはその誘導体を投与することを含み、この場合、該ウイルスは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９または２１と少なくとも９５％同一の配列を含むゲノム配列を有する、方法。
【請求項２４】
癌の処置方法であって、配列番号３、５または７と少なくとも９５％同一の配列を含むキャプシドエンコード領域を有するウイルスの有効量を投与することを含む方法。
【請求項２５】
癌の進行を阻害するための方法であって、癌細胞をウイルスまたはその誘導体と接触させることを含み、この場合、該ウイルスは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９または２１と少なくとも９５％同一の配列を含むゲノムを有する、方法。
【請求項２６】
癌細胞を死滅させるための方法であって、癌細胞を有効量のウイルスまたはその誘導体と接触させることを含み、この場合、該ウイルスは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９または２１と少なくとも９５％同一の配列を含むゲノムを有する、方法。
【請求項２７】
ウイルスがピコルナウイルスである、請求項２３、２４、２５または２６の方法。
【請求項２８】
ピコルナウイルスがカルジオウイルスである、請求項２７の方法。
【請求項２９】
カルジオウイルスが以下からなる群から選択される、請求項２８の方法：vilyuiskヒト脳脊髄炎ウイルス、Theilerのマウス脳脊髄炎ウイルス、脳心筋炎ウイルスおよびSeneca Valleyウイルス。
【請求項３０】
脳心筋炎ウイルスが以下からなる単離体の群から選択される、請求項２９の方法：ＣＡ−１３１３９５、ＬＡ−９７−１２７８、ＩＬ−９２−４８９６３、ＩＡ−８９−４７７５２、ＮＪ−９０−１０３２４、ＭＮ−８８−３６６９５、およびＮＣ−８８−２３６２６。
【請求項３１】
Seneca ValleyウイルスがＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５３４３を有する、請求項２９の方法。
【請求項３２】
請求項１１〜１８のいずれか一項のウイルスを精製する方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ．請求項１１〜１８のいずれか一項のウイルスを細胞に感染させる段階；
ｂ．細胞ライセートを回収する段階；
ｃ．細胞ライセートを少なくとも１ラウンドの勾配遠心分離に付する段階；および
ｄ．勾配から該ウイルスを単離する段階。
【請求項３３】
異常増殖性細胞を死滅させる方法であって、該細胞を請求項１１〜１８のいずれか一項のウイルスと接触させることを含む方法。
【請求項３４】
異常増殖性細胞が腫瘍細胞である、請求項３３の方法。
【請求項３５】
腫瘍細胞が以下からなる群から選択される、請求項３４の方法：ヒト小細胞肺癌、ヒト網膜芽細胞腫、ヒト神経芽細胞腫、ヒト髄芽腫、マウス神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、およびヒト非小細胞肺癌。
【請求項３６】
対象における新生物症状を処置する方法であって、該対象に請求項１１〜１８のいずれか一項のウイルスの有効量を投与することを含む方法。
【請求項３７】
新生物症状が神経内分泌癌である、請求項３６の方法。
【請求項３８】
対象がヒトである、請求項３６の方法。
【請求項３９】
請求項１１〜１８のいずれか一項のウイルスを製造する方法であって、以下の段階を含む方法：請求項１１〜１８のいずれか一項のウイルスを感染させた細胞を、該ウイルスの複製を許容する条件下で培養する段階および該細胞または上清から該ウイルスを回収する段階。
【請求項４０】
細胞がＰＥＲ．Ｃ６細胞である、請求項３９の方法。
【請求項４１】
細胞がＨ４４６細胞である、請求項３９の方法。
【請求項４２】
細胞が２００，０００を超えるウイルス粒子／細胞を生産する、請求項３９の方法。
【請求項４３】
請求項１１〜１８のいずれか一項のウイルスを検出する方法であって、以下の段階を含む方法：請求項１１〜１８のいずれか一項のウイルスを含有すると考えられる試験材料からＲＮＡを単離する段階；配列番号１の少なくとも１５連続ヌクレオチドに対応するＲＮＡを標識する段階；標識済みＲＮＡを用いて試験材料を検査（プローブ）する段階；および標識済みＲＮＡと試験材料から単離されたＲＮＡの結合を検出する段階、この場合、結合は該ウイルスの存在を示す。
【請求項４４】
配列番号１の少なくとも１５連続ヌクレオチドに対応するヌクレオチド配列を含む核酸プローブ。
【請求項４５】
腫瘍溶解性ウイルスの作成方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）Seneca Valleyウイルスのゲノム配列を試験ウイルスのゲノム配列と比較する段階；
（ｂ）Seneca Valleyウイルスのゲノム配列によってエンコードされるポリペプチドおよび試験ウイルスのゲノム配列によってエンコードされるポリペプチド間の少なくとも第一のアミノ酸の差異を同定する段階；
（ｃ）試験ウイルスのゲノム配列を変異させて、試験ウイルスのゲノム配列によってエンコードされるポリペプチドが有する、Seneca Valleyウイルスのゲノム配列によってエンコードされるポリペプチドに対するアミノ酸の差異が、少なくとも１つ少ないようにする段階；
（ｄ）変異した試験ウイルスのゲノム配列を腫瘍細胞内にトランスフェクトする段階；および
（ｅ）該変異した試験ウイルスのゲノム配列が該腫瘍細胞に溶菌的に感染したかどうかを判定する段階。
【請求項４６】
Seneca Valleyウイルスのゲノムが配列番号１と少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項４５の方法。
【請求項４７】
試験ウイルスがピコルナウイルスである、請求項４５の方法。
【請求項４８】
試験ウイルスがカルジオウイルスである、請求項４５の方法。
【請求項４９】
アミノ酸の差異がSeneca Valleyウイルスのキャプシドタンパク質および試験ウイルスのキャプシドタンパク質間に存在する、請求項４５の方法。
【請求項５０】
試験ウイルスのゲノム配列を変異させる段階が、試験ウイルスのゲノム配列を有するｃＤＮＡを変異させることを含む、請求項４５の方法。
【請求項５１】
変異した試験ウイルスのゲノム配列をトランスフェクトする段階がＲＮＡをトランスフェクトすることを含み、この場合、該ＲＮＡは該変異した試験ウイルスのゲノム配列を有するｃＤＮＡから作成される、請求項５１の方法。
【請求項５２】
カルジオウイルスのゲノム配列が以下からなる群から選択される、請求項４８の方法：vilyuiskヒト脳脊髄炎ウイルス、Theilerのマウス脳脊髄炎ウイルス、および脳心筋炎ウイルス。
【請求項５３】
カルジオウイルスのゲノム配列が脳心筋炎ウイルスから選択される、請求項５２の方法。
【請求項５４】
脳心筋炎ウイルスが以下からなる単離体の群から選択される、請求項５３の方法：ＣＡ−１３１３９５、ＬＡ−９７−１２７８、ＩＬ−９２−４８９６３、ＩＡ−８９−４７７５２、ＮＪ−９０−１０３２４、ＭＮ−８８−３６６９５、およびＮＣ−８８−２３６２６。
【請求項５５】
カルジオウイルスが、配列番号１と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％同一の配列を含むゲノムを有する単離体から選択される、請求項５２の方法。
【請求項５６】
アミノ酸の差異が、配列番号４、６、８、または少なくとも１０アミノ酸長のいずれか１つの前記配列の連続部分と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％同一の配列を含むポリペプチド内に存在する、請求項４５の方法。
【請求項５７】
改変された細胞型親和性を有する変異ウイルスの作成方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）多数の核酸配列を含むウイルス変異体のライブラリーを作成する段階；
（ｂ）ウイルス変異体のライブラリーを許容細胞内にトランスフェクトし、多数の変異ウイルスを生産させる段階；
（ｃ）多数の変異ウイルスを単離する段階；
（ｄ）単離された多数の変異ウイルスと非許容細胞をインキュベートする段階；および
（ｅ）非許容細胞で生産された変異ウイルスを回収し、それにより、改変された親和性を有する変異ウイルスを作成する段階。
【請求項５８】
ウイルス変異体のライブラリーが、配列番号１と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％同一の配列を含む親配列から作成される、請求項５７の方法。
【請求項５９】
さらに以下の段階を含む、請求項５７の方法：
（ｆ）回収された変異ウイルスを非許容細胞においてインキュベートする段階；および
（ｇ）非許容細胞で生産された変異ウイルスを回収する段階。
【請求項６０】
段階（ｆ）および（ｇ）を反復して繰り返すことをさらに含む、請求項５９の方法。
【請求項６１】
マルチウェルハイスループットプラットフォームにおいてインキュベーションを行い、この場合、該プラットフォームは各ウェルに異なる非許容細胞型を含む、請求項５７または５９の方法。
【請求項６２】
プラットフォームをスクリーニングして、どのウェルが細胞を死滅させる変異ウイルスを含有するかを同定することをさらに含む、請求項６１の方法。
【請求項６３】
各ウェルの吸光度を分析することによってスクリーニングを行う、請求項６２の方法。
【請求項６４】
非許容細胞が腫瘍細胞である、請求項５７の方法。
【請求項６５】
ウイルス変異体のライブラリーの作成段階が以下の段階を含む、請求項５７の方法：
（ｉ）ウイルスのゲノム配列の部分と同一の配列を有するポリヌクレオチドを提供する段階；
（ｉｉ）該ポリヌクレオチドを変異させて、多数の種々の変異ポリヌクレオチド配列を作成する段階；および
（ｉｉｉ）段階（ｉ）のポリヌクレオチドが含有するウイルスのゲノム配列の部分を除くウイルスのゲノム配列を有するベクターに、多数の変異したポリヌクレオチドをライゲートし、それによりウイルス変異体のライブラリーを作成する段階。
【請求項６６】
ウイルスのゲノム配列がピコルナウイルス由来である、請求項６５の方法。
【請求項６７】
ウイルスのゲノム配列が、配列番号１と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％同一の配列を含む、請求項６５の方法。
【請求項６８】
ピコルナウイルスがカルジオウイルスである、請求項６６の方法。
【請求項６９】
カルジオウイルスが以下からなる群から選択される、請求項６８の方法：vilyuiskヒト脳脊髄炎ウイルス、Theilerのマウス脳脊髄炎ウイルス、脳心筋炎ウイルスおよびＳＶＶ。
【請求項７０】
脳心筋炎ウイルスが以下からなる単離体の群から選択される、請求項６９の方法：ＣＡ−１３１３９５、ＬＡ−９７−１２７８、ＩＬ−９２−４８９６３、ＩＡ−８９−４７７５２、ＮＪ−９０−１０３２４、ＭＮ−８８−３６６９５、およびＮＣ−８８−２３６２６。
【請求項７１】
ポリヌクレオチド内にヌクレオチドをランダムに挿入することによって段階（ｉｉ）の変異を行う、請求項５７の方法。
【請求項７２】
ポリヌクレオチドのキャプシドエンコード領域において段階（ｉｉ）の変異を行う、請求項５７の方法。
【請求項７３】
トリヌクレオチド変異誘発（ＴＲＩＭ）によってヌクレオチドのランダムな挿入を行う、請求項７１の方法。
【請求項７４】
ポリヌクレオチド内に挿入されるヌクレオチドの少なくとも部分がエピトープタグをエンコードする、請求項７１の方法。
【請求項７５】
改変された細胞型親和性を有する変異カルジオウイルスの作成方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）カルジオウイルスの変異ポリヌクレオチド配列のライブラリーを作成する段階、この場合、該作成段階は以下の段階を含む：
−カルジオウイルスのキャプシド領域をエンコードするポリヌクレオチドを提供する段階；
−該ポリヌクレオチドを変異させて、多数の種々の変異キャプシドエンコードポリヌクレオチド配列を作成する段階；および
−キャプシドエンコード領域を除く該カルジオウイルスのゲノム配列を有するベクターに、多数の変異したキャプシドエンコードポリヌクレオチドをライゲートし、それにより該カルジオウイルスの変異ポリヌクレオチド配列のライブラリーを作成する段階；
（ｂ）変異ポリヌクレオチド配列のライブラリーを許容細胞内にトランスフェクトし、多数の変異ウイルスを生産させる段階；
（ｃ）多数の変異ウイルスを単離する段階；
（ｄ）単離された多数の変異ウイルスと非許容細胞をインキュベートする段階；および
（ｅ）非許容細胞で生産された変異ウイルスを回収し、それにより、改変された親和性を有する変異カルジオウイルスを作成する段階。
【請求項７６】
さらに以下の段階を含む、請求項７５の方法：
（ｆ）回収された変異ウイルスを非許容細胞においてインキュベートする段階；および
（ｇ）非許容細胞で生産された変異ウイルスを回収する段階。
【請求項７７】
段階（ｆ）および（ｇ）を反復して繰り返すことをさらに含む、請求項７６の方法。
【請求項７８】
カルジオウイルスが、配列番号１と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％または６５％同一の配列を含むゲノムを有する、請求項７５の方法。
【請求項７９】
キャプシドエンコードポリヌクレオチド内にヌクレオチドをランダムに挿入することによって変異を行う、請求項７５の方法。
【請求項８０】
キャプシドエンコードポリヌクレオチド内にランダムに挿入されるヌクレオチドの少なくとも部分がエピトープタグをエンコードする、請求項８０の方法。
【請求項８１】
トリヌクレオチド変異誘発（ＴＲＩＭ）によってヌクレオチドのランダムな挿入を行う、請求項８０の方法。
【請求項８２】
多数の種々の変異キャプシドエンコードポリヌクレオチド配列が１０8を超える種々のキャプシドエンコードポリヌクレオチド配列を含む、請求項７５の方法。
【請求項８３】
多数の種々の変異キャプシドエンコードポリヌクレオチド配列が１０9を超える種々のキャプシドエンコードポリヌクレオチド配列を含む、請求項７５の方法。
【請求項８４】
改変された細胞型親和性を有する変異Seneca Valleyウイルスの作成方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）Seneca Valleyウイルス変異体のｃＤＮＡライブラリーを作成する段階；
（ｂ）Seneca Valleyウイルス変異体のｃＤＮＡライブラリーからSeneca ValleyウイルスのＲＮＡを作成する段階；
（ｃ）Seneca ValleyウイルスのＲＮＡを許容細胞内にトランスフェクトし、多数の変異Seneca Valleyウイルスを生産させる段階；
（ｄ）多数の変異Seneca Valleyウイルスを単離する段階；
（ｅ）単離された多数の変異Seneca Valleyウイルスと非許容腫瘍細胞をインキュベートする段階；および
（ｆ）非許容腫瘍細胞に溶菌的に感染する変異Seneca Valleyウイルスを回収し、それにより、改変された親和性を有する変異Seneca Valleyウイルスを作成する段階。
【請求項８５】
以下の段階をさらに含む、請求項８４の方法：
（ｇ）回収された変異Seneca Valleyウイルスを非許容細胞においてインキュベートする段階；および
（ｈ）非許容腫瘍細胞に溶菌的に感染する変異Seneca Valleyウイルスを回収する段階。
【請求項８６】
段階（ｇ）および（ｈ）を反復して繰り返すことをさらに含む、請求項８５の方法。
【請求項８７】
マルチウェルハイスループットプラットフォームにおいてインキュベーションを行い、この場合、該プラットフォームは各ウェルに異なる非許容腫瘍細胞型を含む、請求項８５の方法。
【請求項８８】
プラットフォームをスクリーニングして、どのウェルが細胞に溶菌的を感染する変異Seneca Valleyウイルスを含有するかを同定することをさらに含む、請求項８７の方法。
【請求項８９】
各ウェルの吸光度を分析することによってスクリーニングを行う、請求項８８の方法。
【請求項９０】
Seneca Valleyウイルス変異体のｃＤＮＡライブラリーが多数の変異Seneca Valleyウイルスキャプシドポリヌクレオチド配列を含む、請求項８４の方法。
【請求項９１】
配列番号３、５または７と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％または６５％の配列同一性を有する配列を含むキャプシドエンコード領域内にヌクレオチドをランダムに挿入することによって多数の変異Seneca Valleyウイルスキャプシドポリヌクレオチド配列を作成する、請求項９０の方法。
【請求項９２】
ランダムに挿入されるヌクレオチドの配列の少なくとも部分がエピトープタグをエンコードする、請求項９１の方法。
【請求項９３】
トリヌクレオチド変異誘発（ＴＲＩＭ）によってヌクレオチドのランダムな挿入を行う、請求項９１の方法。
【請求項９４】
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５３４３のSeneca Valleyウイルスまたは、配列番号１と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％または６５％の配列同一性を有する配列を含むゲノムを有するウイルスからSeneca Valleyウイルス変異体のｃＤＮＡライブラリーを作成する、請求項８４の方法。
【請求項９５】
非許容腫瘍細胞が腫瘍セルラインまたは患者から単離された腫瘍細胞型である、請求項８４の方法。
【請求項９６】
非許容腫瘍セルラインが以下からなる群から選択される、請求項９５の方法：Ｍ０５９Ｋ、ＫＫ、Ｕ１１８ＭＧ、ＤＭＳ７９、Ｈ６９、ＤＭＳ１１４、ＤＭＳ５３、Ｈ４６０、Ａ３７５−Ｓ２、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、ＰＣ３、ＰＣ３Ｍ２ＡＣ６、ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｅｐ２Ｇ、ＳＷ６２０、ＳＷ８３９、５６３７、ＨｅＬａＳ３、Ｓ８、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＥＣ、Ｗ１３８、ＭＲＣ−５、ＩＭＲ９０、ＨＭＶＥＣ、ＨＣＮ−１Ａ、ＨＲＣＥ、ＣＭＴ−６４、ＬＬＣ−１、ＲＭ−１、ＲＭ−２、ＲＭ−９、ＭＬＴＣ−１、ＫＬＮ−２０５、ＣＭＴ−９３、Ｂ１６Ｆ０、Ｎｅｕｒｏ−２Ａ、Ｃ８Ｄ３０、ＰＫ１５、ＦＢＲＣ、ＭＤＢＫ、ＣＳＬ５０３、およびＯＦＲＣ。
【請求項９７】
患者から単離された非許容腫瘍細胞型が以下からなる癌の群から選択される、請求項９５の方法：グリア芽細胞腫、リンパ腫、小細胞肺癌、大細胞肺癌、黒色腫、前立腺癌、肝癌、結腸癌、腎臓癌、結腸癌、膀胱癌、直腸癌および扁平細胞肺癌。
【請求項９８】
インビボにおいて腫瘍細胞型親和性を有する変異ウイルスの作成方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）多数の核酸配列を含むウイルス変異体のライブラリーを作成する段階；
（ｂ）ウイルス変異体のライブラリーを許容細胞内にトランスフェクトし、多数の変異ウイルスを生産させる段階；
（ｃ）多数の変異ウイルスを単離する段階；
（ｄ）腫瘍を有する哺乳類に、単離された多数の変異ウイルスを投与する段階、この場合、該哺乳類は該変異ウイルスの未変異型の天然の宿主ではない；および
（ｅ）腫瘍中で複製したウイルスを回収し、それにより、インビボで腫瘍細胞型親和性を有する変異ウイルスを作成する段階。
【請求項９９】
ウイルス変異体のライブラリーの作成段階が以下の段階を含む、請求項９８の方法：
−ウイルスのキャプシド領域をエンコードするポリヌクレオチドを提供する段階；
−該ポリヌクレオチドを変異させて、多数の種々の変異キャプシドエンコードポリヌクレオチド配列を作成する段階；および
−キャプシドエンコード領域を除く該ウイルスのゲノム配列を有するベクターに、多数の変異したキャプシドエンコードポリヌクレオチドをライゲートし、それによりウイルス変異体のライブラリーを作成する段階。
【請求項１００】
段階（ｅ）で回収されたウイルスが腫瘍の細胞に溶菌的に感染する、請求項９８の方法。
【請求項１０１】
腫瘍が異種移植片、同系腫瘍、正所性腫瘍または遺伝子組換え腫瘍である、請求項９８の方法。
【請求項１０２】
哺乳類がマウスである、請求項９８の方法。
【請求項１０３】
ウイルス変異体がピコルナウイルスである、請求項９８の方法。
【請求項１０４】
ピコルナウイルスがカルジオウイルスである、請求項９８の方法。
【請求項１０５】
ピコルナウイルスがSeneca Valleyウイルスまたはその類縁体または誘導体である、請求項１０４の方法。
【請求項１０６】
Seneca ValleyウイルスがＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５３４３を有するSeneca Valleyウイルスであるか、あるいは配列番号１と少なくとも９５％同一の配列を含むゲノム配列を有する、請求項１０９の方法。
【請求項１０７】
請求項４５、５７、７５、８４または９８に記載の方法によって作成される腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１０８】
腫瘍溶解性ウイルスを用いて患者を処置するための方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）請求項１０７の腫瘍溶解性ウイルスを、該腫瘍溶解性ウイルスが非感染性になり、該腫瘍溶解性ウイルスの親和性は影響を受けないように不活性化する段階；および
（ｂ）腫瘍を患う患者に該不活性化された腫瘍溶解性ウイルスを投与する段階。
【請求項１０９】
不活性化された腫瘍溶解性ウイルスに毒素を結合させることをさらに含む、請求項１０８の方法。
【請求項１１０】
Seneca Valleyウイルスを用いて腫瘍を有する患者を処置するための方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）Seneca Valleyウイルスを、該ウイルスが非感染性になり、該ウイルスの親和性は影響を受けないように不活性化する段階；および
（ｂ）腫瘍を患う患者に該不活性化されたSeneca Valleyウイルスを投与する段階。
【請求項１１１】
不活性化されたSeneca Valleyウイルスに毒素を結合させることをさらに含む、請求項１１０の方法。
【請求項１１２】
不活性化されたSeneca Valleyウイルスを含むSeneca Valleyウイルス組成物。
【請求項１１３】
キャプシド領域に組み込まれたエピトープタグを含むSeneca Valleyウイルス。
【請求項１１４】
Seneca Valleyウイルスを用いて腫瘍を有する対象を処置するための方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）キャプシド中においてエンコードされるエピトープタグを含む変異Seneca Valleyウイルスを作成する段階；
（ｂ）該エピトープタグに毒素を結合させる段階；および
（ｃ）腫瘍を患う対象に該結合毒素を伴う変異Seneca Valleyウイルスを投与する段階。
【請求項１１５】
作成段階が以下の段階を含む、請求項１１４の方法：
−エピトープタグをエンコードするオリゴヌクレオチドをSeneca Valleyウイルスのキャプシドエンコード領域ポリヌクレオチド内に挿入する段階。
【請求項１１６】
変異Seneca Valleyウイルスが、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５３４３のSeneca Valleyウイルスと比べて改変された細胞型親和性を有さない、請求項１１５の方法。
【請求項１１７】
変異Seneca Valleyウイルスを、該変異Seneca Valleyウイルスが感染性ではなくなるように不活性化することをさらに含む、請求項１１６の方法。
【請求項１１８】
サンプル中の腫瘍細胞の検出方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）患者から腫瘍サンプルを単離する段階；
（ｂ）該腫瘍サンプルをエピトープタグ付きSeneca Valleyウイルスとインキュベートする段階；および
（ｃ）エピトープタグの検出により結合型Seneca Valleyウイルスに関して腫瘍サンプルをスクリーニングする段階。
【請求項１１９】
インビボでの腫瘍細胞の検出方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）放射線照射されたエピトープタグ付きSeneca Valleyウイルスを患者に投与する段階、この場合、該エピトープタグに標識をコンジュゲートする；および
（ｂ）患者において該標識を検出する段階。
【請求項１２０】
Seneca Valleyウイルスが変異体、誘導体または類縁体である、請求項１１８または１１９の方法。
【請求項１２１】
ＳＶＶを用いる癌の処置方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）欠失したパッケージングシグナル配列を含むＳＶＶ変異体を作成する段階；および
（ｂ）該ＳＶＶ変異体を腫瘍細胞に感染させ、それにより、ＳＶＶ媒介性の宿主細胞のシャットオフによって該腫瘍細胞の死滅を引き起こす段階。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
いくつかのタイプの腫瘍を選択的に死滅させる能力を有する新規ＲＮＡピコルナウイルス（Seneca Valleyウイルス（「ＳＶＶ」）と称する）の組成物および疾患の処置方法に関わる。
【０００２】
本開示内容は、著作権保護の対象である材料を含有する。著作権の所有者は、米国特許商標局の特許ファイルまたは記録に記載されている特許文書または特許開示内容の第三者による複製に異論はないが、それ以外の場合は任意およびすべての著作権を留保する。
【０００３】
ここに本明細書中で引用されるすべての特許出願、公開された特許出願、発行および付与された特許、テキスト、および参考文献は、参照によりその開示内容全体が本明細書中に包含される。これらの文献は本発明が属する分野の技術水準をより完全に説明するためのものである。
【０００４】
本出願は、２００３年９月２６日に提出された米国第６０／５０６，１８２号の優先権を主張する。ここに該文献はその開示内容全体が包含される。
【背景技術】
【０００５】
ウイルス療法（Virotherapy）は癌の処置に関して非常に有望である。癌細胞に特異的に結合し、それらを死滅させることを目的とする腫瘍溶解性ウイルスは、ネイティブおよび／または遺伝子操作されたウイルスのいずれであれ、代替の処置、例えば化学療法および放射線照射より効果的かつ低毒性である可能性がある。さらに腫瘍溶解性ウイルス療法は、薬理学的に所望の部位で治療性を増幅することができる既知の唯一の治療法である。
【０００６】
癌治療の重要な側面は、正常細胞と比較して高い割合の癌細胞の死滅を達成することである。この目標の達成は多数の理由のために困難であった。該理由には、関与する細胞型が多様であること、転移によって癌細胞が全身に分布すること、および正常細胞および癌細胞間の生物学的差異が小さいことが含まれる。進歩はあったが、現在の癌治療に関しては依然大部分に改善がなされる必要がある。
【０００７】
従来、外科医は、実質的に患者を傷つけることなく外科的に腫瘍を除去しようとしてきた。原発腫瘍の除去が完了したとしても、生存は保証されない。その理由は、身体の未知の部位への早期転移が未検出のままであるからである。また、血管形成阻害剤を産生する腫瘍細胞が外科的介入によって除去されると、遠隔転移の成長を増進させるかもしれないことを示唆する研究もある。最終的に、多数の症例において、外科的除去後に腫瘍は元の部位で再び成長する。放射線照射は、最も急速に増殖する細胞を、他を犠牲にして選択的に破壊することを目的とする。しかし腫瘍細胞は、耐性になることによって、あるいは処置期間に非分裂状態であることによって放射線療法から逃避することができる。さらに、多数の正常細胞が活発に分裂しつつあり、該処置によって死滅する（胃腸管系の細胞、毛包、等）点において、放射線照射は常に選択的であるわけではない。
【０００８】
放射線照射と同様に、化学療法は完全に選択的なわけではなく、それゆえ多数の正常細胞を破壊し、また、すべての腫瘍細胞を死滅させるわけではない。これは細胞の薬剤耐性および／または分裂状態に基づく。ゆえに、化学療法および放射線療法は正常細胞および癌細胞間に存在するわずかな感受性の差異を利用する。これによりその治療係数は限定される。治療係数が小さいことは、癌を処置する任意の様式の望ましくない特性であることが明らかである。したがって、これらの制限を克服する新規癌治療アプローチが求められる。
【０００９】
このような新規アプローチの１つは腫瘍溶解性ウイルス療法である。初期には、癌を処置する試みにおいて細胞障害性導入遺伝子を保持する複製欠損ウイルスが利用された。しかし、それらは腫瘍の形質導入に関して非効率的であり、また、癌に対して十分に選択的ではないことがわかった。該制限を克服するために、腫瘍細胞で選択的に複製するようにウイルスを修飾するか、あるいは天然の腫瘍選択的特性を有するウイルスを発見した。ゆえにこれらの腫瘍溶解性ウイルスは、該ウイルスを局所注射することによって腫瘤を介して、あるいは該ウイルスを全身に送達することによって、複製し、伝播し、そして腫瘍細胞を選択的に死滅させる特性を有するものであった（図１）。
【００１０】
この新しく規定されたクラスの抗癌治療法は早期に見込まれていたにもかかわらず、癌治療法としてのその使用を制限するであろういくつかの制限が残されている。したがって、癌治療に利用することができる新規腫瘍溶解性ウイルスに関する必要性が依然として存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
新規ＲＮＡピコルナウイルスが発見された（以後、Seneca Valleyウイルス（「ＳＶＶ」）と称する）。そのネイティブの特性には、いくつかのタイプの腫瘍を選択的に死滅させる能力が含まれる。以下の実施例において実証されるように、ＳＶＶは向神経性を有する腫瘍系統を選択的に死滅させる。ほとんどの場合、正常細胞と比較して、腫瘍細胞の５０％を死滅させるのに必要なウイルスの量（すなわちＥＣ50値）が１０，０００倍を超える差異を有する。またこの結果をインビボに移せば、マウスにおいて腫瘍外植片が選択的に排除される。さらにインビボの結果は、免疫欠損または免疫能を有する（immune competent）マウスにおいて、全身投与された１ｘ１０14ｖｐ／ｋｇ（ベクターまたはウイルス粒子／ｋｇ）までのＳＶＶが死亡および観察できる臨床症状を全く引き起こさなかった点において、ＳＶＶが正常細胞に対して有毒でないことを示す。
【００１２】
ＳＶＶは１ｘ１０8ｖｐ／ｋｇ程の低用量で効果を誘発する；したがって、＞１００，０００の非常に高い治療係数を達成する。効果は非常に強く、マウスにおいてあらかじめ大きく確立された腫瘍の１００％を完全に根絶することができる（実施例１１を参照のこと）。この効果は、補助治療を全く行わずに、ＳＶＶを全身性に１回注射することによって媒介される可能性がある。さらにまた、ＳＶＶ注射を受けたマウスは、注射後少なくとも２００日間、臨床症状も腫瘍の再発も示さない。また、ＳＶＶを精製して高力価にすることができ、許容セルラインにおいて＞２００，０００ウイルス粒子／細胞で生産することができる。したがってＳＶＶベースのウイルス療法は、選択されたタイプの癌に関して、安全で、効果的で、ならびに新型の処置としてかなりの見込みを示す。さらにＳＶＶは、小さくて容易に操作可能なゲノム、単純かつ高速なライフサイクル、および汎用的な（well-understood）キャプシドを有し、ゆえに修飾しやすい。これらの特性は、少なくとも部分的に、新規の細胞または組織特異的親和性（tropisms）を有する修飾型ＳＶＶを作成する方法を許容し、したがって元来のＳＶＶ単離体による感染に耐性の新規腫瘍型に対してＳＶＶベースの治療を行うことができる。
【００１３】
したがって本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、またはいずれか１つの前記配列の少なくとも５０ヌクレオチド長の連続部分と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％配列同一性を有する核酸配列、またはいずれか１つの前記配列の少なくとも１０、１５または２０ヌクレオチド長の連続部分と９５％同一の核酸配列を含む単離された核酸を提供する。本発明の単離された核酸はＲＮＡまたはＤＮＡであってよい。
【００１４】
他の側面では、本発明は、高、中ストリンジェンシーまたは低ストリンジェンシーの条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、またはいずれか１つの前記配列の少なくとも５０ヌクレオチド長の連続部分にハイブリダイズする単離された核酸を提供する。
【００１５】
別の側面では、本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、またはいずれか１つの前記配列の少なくとも５０ヌクレオチド長の連続部分と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％配列同一性を有する核酸配列を含むベクターを提供する。
【００１６】
また本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１を含む核酸配列、またはいずれか１つの前記配列の少なくとも５０ヌクレオチド長の連続部分と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％配列同一性を有する核酸によってエンコードされる単離されたポリペプチドを提供する。
【００１７】
一側面では、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、またはいずれか１つの前記配列の少なくとも１０アミノ酸長の連続部分と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００１８】
別の側面では、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、またはいずれか１つの前記配列の少なくとも１０アミノ酸長の連続部分と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを特異的に結合する単離された抗体を提供する。該単離された抗体は、配列番号２の任意のタンパク質エピトープまたは抗原に結合するように作成することができる。さらに、該抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはキメラ抗体であってよい。
【００１９】
一側面では、本発明は、配列番号１と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一の配列を含むゲノム配列を有する単離されたＳＶＶまたはその誘導体または類縁体を提供する。
【００２０】
別の側面では、本発明は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）特許寄託番号ＰＴＡ−５３４３の全識別特性および核酸配列を有する単離されたウイルスを提供する。本発明のいくつかのウイルスは、ＰＴＡ−５３４３単離体、ＰＴＡ−５３４３単離体の変種（variants）、相同体、類縁体、誘導体および変異体、およびＳＶＶ（野生型および変異体の両者）の、その腫瘍溶解特性を担うことが決定されている配列に関して修飾された他のウイルスの変種、相同体、誘導体および変異体に関する。
【００２１】
さらに本発明は、以下の特徴を含む単離されたＳＶＶを提供する：〜７．５キロベース（ｋｂ）の一本鎖ＲＮＡゲノム（プラス（＋）センス鎖）；直径〜２７ナノメートル（ｎｍ）；約３１ｋＤａ、３６ｋＤａおよび２７ｋＤａの概算の分子量を有する少なくとも３種のタンパク質を含むキャプシド；塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配上の浮遊密度約１．３４ｇ／ｍＬ；および腫瘍細胞での複製能。本側面では、３１ｋＤａキャプシドタンパク質（ＶＰ１）は、配列番号８と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一のアミノ酸配列を含んでよく；３６ｋＤａキャプシドタンパク質（ＶＰ２）は、配列番号４と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一のアミノ酸配列を含んでよく；ならびに、２７ｋＤａキャプシドタンパク質（ＶＰ３）は、配列番号６と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一のアミノ酸配列を含んでよい。
【００２２】
別の側面では、本発明は、以下の特徴を含む単離されたＳＶＶ誘導体または類縁体を提供する：腫瘍細胞での複製能、腫瘍細胞親和性、および正常細胞での細胞溶解の欠如。別の側面では、該ウイルスは神経内分泌特性を有する腫瘍細胞型において複製能を有する。
【００２３】
他の側面では、本発明は以下を提供する：有効量の本発明のウイルスおよび製薬的に許容される担体を含む医薬組成物；本発明のウイルスを含む細胞；本発明のウイルスの抗原を含有するウイルスライセート；および本発明のウイルスから取得される単離および精製済みのウイルス抗原。
【００２４】
さらに別の側面では、本発明は、本発明のウイルスの精製方法であって、以下の段階を含む方法を提供する：細胞にウイルスを感染させる段階；細胞ライセートを回収する段階；細胞ライセートを少なくとも１ラウンドの勾配遠心分離に付する段階；および勾配からウイルスを単離する段階。
【００２５】
別の側面では、本発明は、癌の処置方法であって、癌を処置するために有効量のウイルスまたはその誘導体を投与することを含み、この場合、該ウイルスは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または配列番号１の部分と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一の配列を含むゲノム配列を有する、方法を提供する。
【００２６】
別の側面では、本発明は、癌の処置方法であって、配列番号３、５、７またはその連続部分（contiguous portion）と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一の配列を含むキャプシドエンコード領域を含む有効量のウイルスを投与することを含む方法を提供する。また本発明は、癌の処置方法であって、配列番号４、６、８またはその連続部分と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一のアミノ酸配列を含むキャプシドを含む有効量のウイルスを投与することを含む方法を提供する。
【００２７】
一側面では、本発明は、癌の進行を阻害するための方法であって、癌細胞をウイルスまたはその誘導体と接触させることを含み、この場合、該ウイルスまたはその誘導体は癌性細胞に特異的に結合し、該ウイルスは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９または２１と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一の配列を含むゲノム配列を有する、方法を提供する。
【００２８】
別の側面では、本発明は、癌細胞を死滅させるための方法であって、癌細胞を有効量のウイルスまたはその誘導体と接触させることを含み、この場合、該ウイルスは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９または２１と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一の配列を含むゲノム配列を有する、方法を提供する。
【００２９】
これらの癌を対象とする方法では、ウイルスはピコルナウイルスであってよい。ピコルナウイルスは、カルジオウイルス、エルボウイルス（erbovirus）、アフトウイルス、コブウイルス、ヘパトウイルス、パレコウイルス、テシオウイルス、エンテロウイルスまたはライノウイルス属であってよい。カルジオウイルスは以下からなる群から選択されるものであってよい：vilyuiskヒト脳脊髄炎ウイルス、Theilerのマウス脳脊髄炎ウイルス、脳心筋炎ウイルスおよびＳＶＶ。脳心筋炎ウイルスは以下からなる単離体の群から選択されるものであってよい：ＣＡ−１３１３９５、ＬＡ−９７−１２７８、ＩＬ−９２−４８９６３、ＩＡ−８９−４７７５２、ＮＪ−９０−１０３２４、ＭＮ−８８−３６６９５、およびＮＣ−８８−２３６２６。ＳＶＶは、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５３４３を有するウイルスまたは、配列番号１またはその連続部分と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一の核酸配列を含むウイルスであってよい。
【００３０】
また本発明は、異常に増殖性の細胞を死滅させる方法であって、該細胞を本発明のウイルスと接触させることを含む方法を提供する。一側面では、異常に増殖性の細胞は腫瘍細胞である。本方法の種々の側面では、腫瘍細胞は以下からなる群から選択される：ヒト小細胞肺癌、ヒト網膜芽細胞腫、ヒト神経芽細胞腫、ヒト髄芽腫、マウス神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、およびヒト非小細胞肺癌。
【００３１】
また本発明は、対象における新生物症状の処置方法であって、該対象に、該哺乳類に対する本発明のウイルスの有効量を投与することを含む方法を提供する。一側面では、新生物症状は神経内分泌癌である。別の側面では、対象は哺乳類である。別の側面では、哺乳類はヒトである。
【００３２】
また本発明は、本発明のウイルスを製造する方法であって、以下の段階を含む方法を提供する：ウイルスを感染させた細胞を、該ウイルスの複製を許容する条件下で培養する段階および該細胞または上清から該ウイルスを回収する段階。本方法の一側面では、細胞はＰＥＲ．Ｃ６細胞である。本方法の別の側面では、細胞はＨ４４６細胞である。本方法の種々の側面では、細胞は、細胞あたり２００，０００を超えるウイルス粒子を生産してよい。
【００３３】
別の側面では、本発明は、本発明のウイルスを検出するための方法であって、以下の段階を含む方法を提供する：本発明のウイルスを含有すると考えられる試験材料からＲＮＡを単離する段階；配列番号１の少なくとも１５連続ヌクレオチドに対応するＲＮＡを標識する段階；標識済みＲＮＡを用いて試験材料を検査（プローブ）する段階；および標識済みＲＮＡと試験材料から単離されたＲＮＡの結合を検出する段階、この場合、結合は該ウイルスの存在を示す。別の側面では、本発明は、配列番号１またはその相補配列の少なくとも１５連続ヌクレオチドに対応するヌクレオチド配列を含む核酸プローブを提供する。
【００３４】
また本発明は、腫瘍溶解性カルジオウイルスを作成するための方法であって、以下の段階を含む方法を提供する：（ａ）ＳＶＶのゲノム配列を試験ウイルスのゲノム配列と比較する段階；（ｂ）ＳＶＶのゲノム配列によってエンコードされるポリペプチドおよび試験ウイルスのゲノム配列によってエンコードされるポリペプチド間の少なくとも第一のアミノ酸の差異を同定する段階；（ｃ）試験ウイルスのゲノム配列を変異させて、試験ウイルスのゲノム配列によってエンコードされるポリペプチドが有する、ＳＶＶのゲノム配列によってエンコードされるポリペプチドに対するアミノ酸の差異が、少なくとも１つ少ないようにする段階；（ｄ）変異した試験ウイルスのゲノム配列を腫瘍細胞内にトランスフェクトする段階；および（ｅ）該変異した試験ウイルスのゲノム配列が該腫瘍細胞に溶菌的に感染したかどうかを判定する段階。一側面では、試験ウイルス中の変異したアミノ酸（群）は、構造領域、例えばキャプシドエンコード領域中のアミノ酸である。別の側面では、試験ウイルス中の変異したアミノ酸は非構造領域中のアミノ酸である。
【課題を解決するための手段】
【００３５】
腫瘍溶解性ウイルスの作成方法の一側面では、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５３４３を有する単離されたＳＶＶまたは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１またはその連続部分と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一の配列を含むウイルスからＳＶＶのゲノム配列を取得する。本方法の別の側面では、試験ウイルスのゲノム配列を変異させる段階は、該試験ウイルスのゲノム配列を有するｃＤＮＡを変異させることを含む。本方法の別の側面では、変異した試験ウイルスのゲノム配列をトランスフェクトする段階は、ＲＮＡをトランスフェクトすることを含み、この場合、該ＲＮＡは該変異した試験ウイルスのゲノム配列を有するｃＤＮＡから作成される。
【００３６】
腫瘍溶解性カルジオウイルスの作成方法の別の側面では、試験ウイルスはピコルナウイルスである。試験ピコルナウイルスは、テシオウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、カルジオウイルス、エルボウイルス、アフトウイルス（apthovirus）、コブウイルス、ヘパトウイルス、パレコウイルスまたはテシオウイルス属であってよい。別の側面では、試験ウイルスはカルジオウイルス属である。別の側面では、腫瘍溶解性ウイルスの作成方法において同定されるアミノ酸の差異は、ＳＶＶのキャプシドタンパク質および試験ウイルスのキャプシドタンパク質配列間に存在する。腫瘍溶解性ウイルスの作成に関する別の側面では、試験ウイルスのゲノム配列は以下からなる群から選択される：Vilyuiskヒト脳脊髄炎ウイルス、Theilerのマウス脳脊髄炎ウイルス、および脳心筋炎ウイルス。別の側面では、試験ウイルスのゲノム配列は脳心筋炎ウイルスから選択される。脳心筋炎ウイルスは以下からなる単離体の群から選択されるものであってよい：ＣＡ−１３１３９５、ＬＡ−９７−１２７８、ＩＬ−９２−４８９６３、ＩＡ−８９−４７７５２、ＮＪ−９０−１０３２４、ＭＮ−８８−３６６９５、およびＮＣ−８８−２３６２６。さらに別の側面では、脳心筋炎ウイルスまたは任意の他の試験ウイルスは、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５３４３のＳＶＶまたは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１またはその連続部分と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を含む核酸配列を有する単離体から選択されるものであってよい。
【００３７】
腫瘍溶解性カルジオウイルスの作成方法の別の側面では、試験ウイルスおよびＳＶＶ間のアミノ酸の差異はＳＶＶのキャプシドタンパク質領域内に存在し、この場合、該アミノ酸の差異はＳＶＶ配列番号４、６または８内に並ぶ。
【００３８】
また本発明は、改変された細胞型親和性を有する変異ウイルスの作成方法であって、以下の段階を含む方法を提供する：（ａ）多数の（複数の（a plurality of））核酸配列を含むウイルス変異体のライブラリーを作成する段階；（ｂ）ウイルス変異体のライブラリーを許容細胞内にトランスフェクトし、多数の変異ウイルスを生産させる段階；（ｃ）多数の変異ウイルスを単離する段階；（ｄ）単離された多数の変異ウイルスと非許容細胞をインキュベートする段階；および（ｅ）非許容細胞で生産された変異ウイルスを回収し、それにより、改変された親和性を有する変異ウイルスを作成する段階。一側面では、本方法は（ｆ）回収された変異ウイルスを非許容細胞においてインキュベートする段階；および（ｇ）非許容細胞で生産された変異ウイルスを回収する段階をさらに含む。別の側面では、本方法は段階（ｆ）および（ｇ）を反復して繰り返すことをさらに含む。別の側面では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１またはその連続部分を含む親配列からウイルス変異体のライブラリーを作成する。
【００３９】
改変された細胞型親和性を有する変異ウイルスの作成方法の一側面では、マルチウェルハイスループット（高処理）プラットフォームでインキュベーションを行う。この場合、該プラットフォームは各ウェルに異なる非許容細胞型を含む。この側面では、本方法は、プラットフォームをスクリーニングして、どのウェルが細胞を死滅させる変異ウイルスを含有するかを同定することをさらに含むことができる。別の側面では、各ウェルの吸光度を分析することによってスクリーニングを行う。
【００４０】
改変された細胞型親和性を有する変異ウイルスの作成方法の別の側面では、非許容細胞は腫瘍細胞である。
【００４１】
改変された細胞型親和性を有する変異ウイルスの作成方法の別の側面では、ウイルス変異体のライブラリーを作成する段階は以下の段階を含む：（ｉ）ウイルスのゲノム配列の部分と同一の配列を有するポリヌクレオチドを提供する段階；（ｉｉ）該ポリヌクレオチドを変異させて、多数の種々の変異ポリヌクレオチド配列を作成する段階；および（ｉｉｉ）段階（ｉ）のポリヌクレオチドが含有するウイルスのゲノム配列の部分を除くウイルスのゲノム配列を有するベクターに、多数の変異したポリヌクレオチドをライゲートし、それによりウイルス変異体のライブラリーを作成する段階。一側面では、ウイルスのゲノム配列はピコルナウイルス由来である。別の側面では、ウイルスのゲノム配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１またはその連続部分と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一の配列を含む。別の側面では、ウイルス変異体のライブラリーを作成する段階において、ポリヌクレオチド内にヌクレオチドをランダムに挿入することによって段階（ｉｉ）の変異を行う。一側面では、トリヌクレオチド変異誘発（ＴＲＩＭ）によってヌクレオチドのランダムな挿入を行う。別の側面では、ポリヌクレオチド内に挿入されるヌクレオチドの少なくとも部分はエピトープタグをエンコードする。別の側面では、ウイルス変異体のライブラリーを作成する段階において、段階（ｉｉ）の変異をポリヌクレオチドのキャプシドエンコード領域において行う。
【００４２】
また本発明は、改変された細胞型親和性を有する変異カルジオウイルスの作成方法であって、以下の段階を含む方法を提供する：（ａ）カルジオウイルスの変異ポリヌクレオチド配列のライブラリーを作成する段階、この場合、該作成段階は以下の段階を含む：カルジオウイルスのキャプシド領域をエンコードするポリヌクレオチドを提供する段階；該ポリヌクレオチドを変異させて、多数の種々の変異キャプシドエンコードポリヌクレオチド配列を作成する段階；および、キャプシドエンコード領域を除く該カルジオウイルスのゲノム配列を有するベクターに、多数の変異したキャプシドエンコードポリヌクレオチドをライゲートし、それにより該カルジオウイルスの変異ポリヌクレオチド配列のライブラリーを作成する段階；（ｂ）変異ポリヌクレオチド配列のライブラリーを許容細胞内にトランスフェクトし、多数の変異ウイルスを生産させる段階；（ｃ）多数の変異ウイルスを単離する段階；（ｄ）単離された多数の変異ウイルスと非許容細胞をインキュベートする段階；および（ｅ）非許容細胞で生産された変異ウイルスを回収し、それにより、改変された親和性を有する変異カルジオウイルスを作成する段階。一側面では、本方法は（ｆ）回収された変異ウイルスを非許容細胞においてインキュベートする段階；および（ｇ）非許容細胞で生産された変異ウイルスを回収する段階をさらに含む。別の側面では、本方法は段階（ｆ）および（ｇ）を反復して繰り返すことをさらに含む。別の側面では、キャプシドエンコードポリヌクレオチド内にヌクレオチドをランダムに挿入することによって変異を行う。別の側面では、キャプシドエンコードポリヌクレオチド内にランダムに挿入されるヌクレオチドの少なくとも部分はエピトープタグをエンコードする。別の側面では、ヌクレオチドのランダムな挿入はＴＲＩＭによって行う。別の側面では、多数の種々の変異キャプシドエンコードポリヌクレオチド配列は１０8または１０9を超える種々のキャプシドエンコードポリヌクレオチド配列を含む。
【００４３】
一側面では、改変された細胞型親和性を有する変異ＳＶＶの作成方法は以下の段階を含む：（ａ）ＳＶＶ変異体のｃＤＮＡライブラリーを作成する段階；（ｂ）ＳＶＶ変異体のｃＤＮＡライブラリーからＳＶＶのＲＮＡを作成する段階；（ｃ）ＳＶＶのＲＮＡを許容細胞内にトランスフェクトし、多数の変異ＳＶＶを生産させる段階；（ｄ）多数の変異ＳＶＶを単離する段階；（ｅ）単離された多数の変異ＳＶＶと非許容腫瘍細胞をインキュベートする段階；および（ｆ）非許容腫瘍細胞に溶菌的に感染する変異ＳＶＶを回収し、それにより、改変された親和性を有する変異ＳＶＶを作成する段階。別の側面では、本方法は以下の段階をさらに含む：（ｇ）回収された変異ＳＶＶを非許容細胞においてインキュベートする段階；および（ｈ）非許容腫瘍細胞に溶菌的に感染する変異ＳＶＶを回収する段階。別の側面では、本方法は段階（ｇ）および（ｈ）を反復して繰り返すことをさらに含む。一側面では、マルチウェルハイスループットプラットフォームにおいてインキュベーションを行う。この場合、該プラットフォームは各ウェルに異なる非許容腫瘍細胞型を含む。別の側面では、本方法は、プラットフォームをスクリーニングして、どのウェルが細胞に溶菌的に感染する変異ＳＶＶを含有するかを同定することをさらに含む。別の側面では、各ウェルの吸光度を分析することによってスクリーニングを行う。一側面では、ＳＶＶ変異体のｃＤＮＡライブラリーは多数の変異ＳＶＶキャプシドポリヌクレオチド配列を含む。別の側面では、ヌクレオチドをランダムに挿入することによって多数の変異ＳＶＶキャプシドポリヌクレオチド配列を作成する。別の側面では、ランダムに挿入されるヌクレオチドの配列の少なくとも部分はエピトープタグをエンコードする。別の側面では、ヌクレオチドのランダムな挿入をＴＲＩＭによって行う。別の側面では、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５３４３のＳＶＶからＳＶＶ変異体のｃＤＮＡライブラリーを作成する。別の側面では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９または２１と少なくとも９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有する配列を含むＳＶＶからＳＶＶ変異体のｃＤＮＡライブラリーを作成する。別の側面では、非許容腫瘍細胞は腫瘍セルラインまたは患者から単離された腫瘍細胞型である。
【００４４】
また本発明は、インビボで腫瘍細胞型親和性を有する変異ウイルスの作成方法であって、以下の段階を含む方法を提供する：（ａ）多数の核酸配列を含むウイルス変異体のライブラリーを作成する段階；（ｂ）ウイルス変異体のライブラリーを許容細胞内にトランスフェクトし、多数の変異ウイルスを生産させる段階；（ｃ）多数の変異ウイルスを単離する段階；（ｄ）腫瘍を有する哺乳類に、単離された多数の変異ウイルスを投与する段階、この場合、該哺乳類は該変異ウイルスの未変異型の天然の宿主ではない；および（ｅ）腫瘍中で複製したウイルスを回収し、それにより、インビボで腫瘍細胞型親和性を有する変異ウイルスを作成する段階。一側面では、ウイルス変異体のライブラリーを作成する段階は以下の段階を含む：ウイルスのキャプシド領域をエンコードするポリヌクレオチドを提供する段階；該ポリヌクレオチドを変異させて、多数の種々の変異キャプシドエンコードポリヌクレオチド配列を作成する段階；および、キャプシドエンコード領域を除く該ウイルスのゲノム配列を有するベクターに、多数の変異したキャプシドエンコードポリヌクレオチドをライゲートし、それによりウイルス変異体のライブラリーを作成する段階。別の側面では、段階（ｅ）で回収されたウイルスは腫瘍の細胞に溶菌的に感染する。インビボで腫瘍細胞型親和性を有する変異ウイルスの作成方法に関する別の側面では、腫瘍は異種移植片、同系腫瘍、正所性腫瘍または遺伝子組換え腫瘍である。別の側面では、哺乳類はマウスである。
【００４５】
本発明のすべての方法に関して、ウイルスはピコルナウイルスであってよい。ピコルナウイルスは、カルジオウイルス、エルボウイルス、アフトウイルス、コブウイルス、ヘパトウイルス、パレコウイルス、テシオウイルス、エンテロウイルス、またはライノウイルス属であってよい。カルジオウイルスはＳＶＶであってよい。ＳＶＶは、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−５３４３を有するＳＶＶまたは、配列番号１、３、６、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１またはその連続部分と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一の配列を含むＳＶＶであってよい。さらに、カルジオウイルスは以下からなる群から選択されるものであってよい：vilyuiskヒト脳脊髄炎ウイルス、Theilerのマウス脳脊髄炎ウイルス、および脳心筋炎ウイルス。一側面では、脳心筋炎ウイルスは以下からなる単離体の群から選択される：ＣＡ−１３１３９５、ＬＡ−９７−１２７８、ＩＬ−９２−４８９６３、ＩＡ−８９−４７７５２、ＮＪ−９０−１０３２４、ＭＮ−８８−３６６９５、およびＮＣ−８８−２３６２６。別の側面では、本発明は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５３４３のＳＶＶまたは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１またはその連続部分と少なくとも９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有する単離体から選択されるか、あるいは別の様式で配列ホモロジーによってＳＶＶに関連するとみなされる任意のウイルスを包含する。
【００４６】
また本発明は、本明細書中で開示される変異ウイルスを作成するためのいずれかの方法によって作成される腫瘍溶解性ウイルスを提供する。一側面では、本発明は、腫瘍溶解性ウイルスを用いて患者を処置するための方法であって、以下の段階を含む方法を提供する：（ａ）本明細書中で開示される変異ウイルスを作成するためのいずれかの方法によって作成された腫瘍溶解性ウイルスを不活性化し、該腫瘍溶解性ウイルスを非感染性にし、該腫瘍溶解性ウイルスの親和性には影響しないようにする段階；および（ｂ）腫瘍を患う患者に放射線照射済みの腫瘍溶解性ウイルスを投与する段階。別の側面では、患者の処置方法は不活性化型腫瘍溶解性ウイルスに毒素を結合させることをさらに含む。
【００４７】
別の側面では、本発明は、ＳＶＶを用いて腫瘍を有する患者を処置するための方法であって、以下の段階を含む方法を提供する：（ａ）ＳＶＶを不活性化して、該ウイルスを非感染性にし、その親和性には影響しないようにする段階；および（ｂ）腫瘍を患う患者において該不活性化型ＳＶＶを投与する段階。別の側面では、ＳＶＶを用いて腫瘍を有する患者を処置するための方法は、不活性化型ＳＶＶに毒素を結合させることをさらに含む。
【００４８】
別の側面では、本発明は、不活性化型ＳＶＶを含むＳＶＶ組成物を提供する。別の側面では、本発明は、キャプシド領域に取り込まれたエピトープタグを含むＳＶＶを提供する。
【００４９】
また本発明は、ＳＶＶを用いて腫瘍を有する患者を処置するための方法であって、以下の段階を含む方法を提供する：（ａ）キャプシド中においてエンコードされるエピトープタグを含む変異ＳＶＶを作成する段階；（ｂ）該エピトープタグに毒素を結合させる段階；および（ｃ）腫瘍を患う患者に該結合毒素を伴う変異ＳＶＶを投与する段階。一側面では、上記作成段階は以下の段階を含む：エピトープタグをエンコードするオリゴヌクレオチドをＳＶＶのキャプシドエンコード領域ポリヌクレオチド内に挿入する段階。一側面では、変異ＳＶＶは改変された細胞型親和性を有さない。別の側面では、本方法は、変異ＳＶＶを不活性化して、該変異ＳＶＶを非感染性にすることをさらに含む。
【００５０】
また本発明は、サンプル中の腫瘍細胞を検出するための方法であって、以下の段階を含む方法を提供する：（ａ）患者から腫瘍サンプルを単離する段階；（ｂ）該腫瘍サンプルをエピトープタグ付きＳＶＶとインキュベートする段階；および（ｃ）エピトープタグの検出により結合型ＳＶＶに関して腫瘍サンプルをスクリーニングする段階。
【００５１】
一側面では、本発明は、インビボで腫瘍細胞を検出するための方法であって、以下の段階を含む方法を提供する：（ａ）不活性化型エピトープタグ付きＳＶＶを患者に投与する段階、この場合、該エピトープタグに標識をコンジュゲートする；および（ｂ）患者において該標識を検出する段階。本発明の腫瘍細胞の検出方法では、ＳＶＶは、本明細書中で開示される方法によって作成される変異ＳＶＶであってよい。
【００５２】
さらに、新生物症状の処置、新生物症状の検出、およびＳＶＶの生産に関する本方法は、野生型ＳＶＶ、変異（修飾型または変種を含む）ＳＶＶ、ＳＶＶの類縁体、および本発明の他の腫瘍特異的ウイルスに適用される。
【００５３】
本発明のウイルスおよびその組成物を使用して、本明細書中で記載される疾患を処置するための薬物を製造することができる。さらに、本発明のウイルスおよびその組成物を使用して、本明細書中で記載される疾患を処置することができる。ゆえに、本発明の一側面では、本発明は、癌の処置に関するか、あるいは癌を処置するための薬物の製造に関するＳＶＶ（または変異体、誘導体、類縁体、およびその組成物）の使用を提供する。
寄託情報
【００５４】
以下の材料は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約（the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure）の条項にしたがって、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）、10801 University Blvd., Manassas, Virginia, 20110-2209, U.S.A.に寄託されている。寄託されている材料の入手に関するすべての制限は特許の付与時に除かれる。材料：Seneca Valleyウイルス（ＳＶＶ）。ＡＴＣＣ特許寄託番号：ＰＴＡ−５３４３。寄託日：２００３年７月２５日。
【００５５】
用語「ウイルス」、「ウイルス粒子（"viral particle," "virus particle"）」、「ベクター粒子」、「ウイルスベクター粒子」、および「ビリオン」は交換可能に使用され、該用語は広く理解されるべきであり、例えば本発明のウイルスベクターを感染性粒子の作成に関して適切な細胞またはセルライン内に形質導入またはトランスフェクトした場合に形成される感染性ウイルス粒子を例えば意味する。
【００５６】
用語「誘導体」、「変異体」、「変種」および「修飾型」は交換可能に使用され、概して、誘導体、変異体、変種または修飾型ウイルスは、鋳型ウイルス核酸またはアミノ酸配列に関して核酸またはアミノ酸配列の差異を有し得ることを示す。例えば、ＳＶＶ誘導体、変異体、変種または修飾型ＳＶＶは、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−５３４３の野生型ＳＶＶの核酸またはアミノ酸配列に関して核酸またはアミノ酸配列の差異を有するＳＶＶを表してよい。
【００５７】
本明細書中で使用される用語「癌」、「癌細胞」、「新生物細胞」、「新形成（neoplasia）」、「腫瘍」、および「腫瘍細胞」は交換可能に使用され、該用語は、比較的自律的な成長を示して、細胞増殖のコントロールの有意な喪失を特徴とする異常な成長表現型を示す細胞を表す。新生物細胞は悪性または良性であり得る。本発明では、好ましい１タイプの腫瘍細胞は向神経性を有する腫瘍細胞である。
【００５８】
２種またはそれ以上の核酸またはタンパク質配列に関する用語「同一の」または「同一性」パーセントとは、配列比較アルゴリズム、例えばProtein-Protein BLAST（GenBankデータベースのProtein-Protein BLAST（Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215: 403-410））を使用して、あるいは目視検査によって測定される、最大一致に関して比較およびアライメントされた場合に、同一であるか、あるいは指定のパーセンテージの同一アミノ酸残基またはヌクレオチドを有する２種またはそれ以上の配列または連続物を表す。BLASTアルゴリズムはAltschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410（1990）に記載され、National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）によって公的に利用可能なBLASTソフトウェアが提供されている。
【００５９】
例えば、本明細書中で使用される用語「少なくとも９０％同一の」とは、参照ポリペプチド（またはポリヌクレオチド）に対して９０〜１００の同一性パーセントを表す。９０％またはそれ以上のレベルの同一性は、例証目的で１００アミノ酸の試験および参照ポリペプチド長を比較すると仮定すると、試験ポリペプチド中のわずか１０％（すなわち１００個のうち１０個）のアミノ酸が参照ポリペプチドのアミノ酸と異なることを示す。試験および参照ポリヌクレオチド間で同様の比較を行うことができる。このような差異は、アミノ酸配列の全長にわたってランダムに分布する点変異として表すことができ、あるいは該差異は、許容される最大の、例えば１００個のうち１０個のアミノ酸の差異（９０％同一性）までの種々の長さの１個またはそれ以上の位置でクラスター形成することができる。差異は核酸またはアミノ酸の置換、挿入または欠失として規定される。約８５〜９０％を超える同一性のレベルでは、結果はプログラムおよびギャップパラメータセットに無関係であろう；このような高レベルの同一性は容易に評価することができ、ソフトウェアに依存しないことが多い。
【００６０】
本発明の関連では、用語「単離された（単離型）」とは、人の手によって、そのネイティブ環境から離れて存在する核酸分子、ポリペプチド、ウイルスまたは細胞を表す。単離された核酸分子またはポリペプチドは、精製型で存在してよく、あるいは非ネイティブ環境、例えば組換え宿主細胞中に存在してよい。単離されたウイルスまたは細胞は、精製型で、例えば細胞培養中に存在してよく、あるいは非ネイティブ環境、例えば組換え型または異種生物中に存在してよい。
用語「天然に存在する」または「野生型」とは、人によって人工的に生産されたものと異なって天然に見出すことができる要素を説明するのに使用される。例えば、天然の供給源から単離することができ、実験室で人によって意図的に修飾されていない、生物（ウイルスを含む）中に存在するタンパク質またはヌクレオチド配列は、天然に存在するものである。
【００６１】
「高ストリンジェンシー」、「中（間）ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー」の概念は、核酸ハイブリダイゼーション条件を表す。高ストリンジェンシー条件とは、標的およびプローブ間でアニーリングまたはハイブリダイゼーションを生じさせるために標的の核酸配列およびプローブの核酸配列間の高い同一性を必要とする条件を表す。低ストリンジェンシー条件とは、標的およびプローブ間でアニーリングまたはハイブリダイゼーションを生じさせるために標的の核酸配列およびプローブの核酸配列間の低い同一性を必要とする条件を表す。ストリンジェンシー条件は、バッファーの塩濃度またはハイブリダイゼーションが行われる温度によってコントロールすることができ、この場合、塩濃度が高いほど低ストリンジェントな条件になり、温度が高いほどよりストリンジェントな条件になる。ストリンジェンシー条件はハイブリダイゼーションを受ける配列の長さおよび核酸の内容に応じて変動するが、高、中間および低ストリンジェンシーの代表的な条件は以下の典型例の条件において記載されるものである。一般に使用されるハイブリダイゼーションバッファーは、０．３Ｍクエン酸三ナトリウムおよび３Ｍ ＮａＣｌに対応する２０Ｘ保存濃度のＳＳＣ（塩化ナトリウムクエン酸ナトリウム）である。高ストリンジェンシー条件では、ＳＳＣの作業濃度は０．１Ｘ〜０．５Ｘ（１．５〜７．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５〜７５ｍＭ ＮａＣｌ）であってよく、ハイブリダイゼーション温度は６５℃に設定する。中間条件では、５５〜６２℃の温度で０．５Ｘ〜２Ｘ ＳＳＣ濃度（７．５〜３０ｍＭクエン酸三ナトリウム、７５〜３００ｍＭ ＮａＣｌ）を典型的に利用する。低ストリンジェンシー条件下で行われるハイブリダイゼーションでは、５０〜５５℃の温度で２Ｘ〜５Ｘ ＳＳＣ濃度（３０〜７５ｍＭクエン酸三ナトリウム、３００〜７５０ｍＭ ＮａＣｌ）を使用することができる。留意すべきは、これらの条件は単に典型例であり、限定的とみなされるべきではないことである。
【００６２】
Seneca Valleyウイルス（ＳＶＶ）：
ＳＶＶは新規の、これまで未発見であったＲＮＡウイルスであり、ピコルナウイルス科（Picornaviridae）ファミリーのカルジオウイルス（Cardiovirus）属由来のメンバーに最も密接に関連付けられる。ゆえに、本発明の目的では、ＳＶＶはカルジオウイルス属およびピコルナウイルス科ファミリーのメンバーであるとみなす。カルジオウイルスは、そのゲノム構成の特殊な特徴、共通の病理学的特性、および０．１Ｍ ＮａＣｌ中の５〜７の範囲のｐＨでそのビリオンが解離性であることによって、他のピコルナウイルスと区別される（Scraba, D. et al.,「カルジオウイルス（ピコルナウイルス科）（Cardioviruses（Picornaviridae））」, Encyclopedia of Virology, 2nd Edition, R.G. Webseter and A. Granoff, Editors, 1999）。ＳＶＶおよび他のカルジオウイルス間の配列解析の結果は本明細書中以下で考察する。
【００６３】
ＳＶＶのゲノムは、約７．５ｋｂの予想サイズを有する１個の一本鎖プラス（＋）センス鎖ＲＮＡ分子からなる（図４Ａを参照のこと）。ＳＶＶはピコルナウイルスであるため、すべてのピコルナウイルスで保存されているいくつかの特徴を有する：（ｉ）ゲノムＲＮＡは感染性であり、ゆえに細胞内にトランスフェクトして、ウイルスのライフサイクルのウイルス−受容体結合および侵入段階をバイパスすることができる；（ｉｉ）ゲノムの５’末端の長い（約６００〜１２００ｂｐ）非翻訳領域（ＵＴＲ）および短い３’非翻訳領域（約５０〜１００ｂｐ）；（ｉｉｉ）５’ＵＴＲは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）として既知のクローバーリーフの二次構造を含有する；（ｉｖ）ゲノムの残りは単一ポリタンパク質をエンコードする、ならびに（ｖ）ゲノムの両端は修飾されていて、５’末端は共有結合型の小さい塩基性タンパク質「Ｖｐｇ」によって修飾され、３’末端はポリアデニル化されている。
【００６４】
本発明は、単離されたＳＶＶウイルス（ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−５３４３）およびそれに由来するＳＶＶの完全ゲノムの内容を提供する。現在、シークエンシングされている最大のＳＶＶゲノム断片は、ＰＴＡ−５３４３単離体由来の単離されたＳＶＶ核酸であり、これはＳＶＶゲノム配列の大部分を含み、図５Ａ−５Ｅおよび図６Ａ−６Ｄにリストされ、本明細書における配列番号１の指定を有する。このヌクレオチド配列の翻訳物は、配列番号１によってエンコードされるＳＶＶの単一ポリタンパク質の大部分を示す。配列番号１のヌクレオチド１〜５６７３によってエンコードされるアミノ酸配列は図５Ａ−Ｅにリストされ、図７Ａ−７Ｂは本明細書における配列番号２の指定を有する。したがって本発明は、配列番号１の単離された部分、例えば配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９および２１を提供する。該部分を発現ベクターにサブクローニングすることができ、そして配列番号１のこれらの部分によってエンコードされるポリペプチドを単離することができる。本発明は、高、中または低ストリンジェンシー条件下で、配列番号１、またはその任意の部分にハイブリダイズすることができる単離された核酸をさらに包含する。
【００６５】
また本発明は、図９にリストされる配列番号４のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２〜１４３に相当する）を有する単離された部分的ＳＶＶ ＶＰ２（１Ｂ）タンパク質を提供する。部分的ＳＶＶ ＶＰ２タンパク質のアミノ酸配列は、図８にリストされる配列番号３の核酸配列（配列番号１のヌクレオチド４〜４２９に相当する）によってエンコードされる。
【００６６】
また本発明は、図１１にリストされる配列番号６のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１４４〜３８２に相当する）を有する単離されたＳＶＶ ＶＰ３（１Ｃ）タンパク質を提供する。ＳＶＶ ＶＰ３タンパク質のアミノ酸配列は、図１０にリストされる配列番号５の核酸配列（配列番号１のヌクレオチド４３０〜１１４６に相当する）によってエンコードされる。
【００６７】
また本発明は、図１３にリストされる配列番号８のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸３８３〜６４１に相当する）を有する単離されたＳＶＶ ＶＰ１（１Ｄ）タンパク質を提供する。ＳＶＶ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列は、図１２にリストされる配列番号７の核酸配列（配列番号１のヌクレオチド１１４７〜１９２３に相当する）によってエンコードされる。
【００６８】
また本発明は、図１５にリストされる配列番号１０のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸６４２〜６５５に相当する）を有する単離されたＳＶＶ ２Ａタンパク質を提供する。ＳＶＶ ２Ａタンパク質のアミノ酸配列は、図１４にリストされる配列番号９の核酸配列（配列番号１のヌクレオチド１９２４〜１９６５に相当する）によってエンコードされる。
【００６９】
また本発明は、図１７にリストされる配列番号１２のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸６５６〜７８３に相当する）を有する単離されたＳＶＶ ２Ｂタンパク質を提供する。ＳＶＶ ２Ｂタンパク質のアミノ酸配列は、図１６にリストされる配列番号１１の核酸配列（配列番号１のヌクレオチド１９６６〜２３４９に相当する）によってエンコードされる。
【００７０】
また本発明は、図１９にリストされる配列番号１４のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸７８４〜１１０５に相当する）を有する単離されたＳＶＶ ２Ｃタンパク質を提供する。ＳＶＶ ２Ｂタンパク質のアミノ酸配列は、図１８にリストされる配列番号１３の核酸配列（配列番号１のヌクレオチド２３５０〜３３１５に相当する）によってエンコードされる。
【００７１】
また本発明は、図２１にリストされる配列番号１６のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１１０６〜１１９５に相当する）を有する単離されたＳＶＶ ３Ａタンパク質を提供する。ＳＶＶ ３Ａタンパク質のアミノ酸配列は、図２０にリストされる配列番号１５の核酸配列（配列番号１のヌクレオチド３３１６〜３５８５に相当する）によってエンコードされる。
【００７２】
また本発明は、図２３にリストされる配列番号１８のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１１９６〜１２１７に相当する）を有する単離されたＳＶＶ ３Ｂ（ＶＰｇ）タンパク質を提供する。ＳＶＶ ３Ｂタンパク質のアミノ酸配列は、図２２にリストされる配列番号１７の核酸配列（配列番号１のヌクレオチド３５８６〜３６５１に相当する）によってエンコードされる。
【００７３】
また本発明は、図２５にリストされる配列番号２０のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１２１８〜１４２８に相当する）を有する単離されたＳＶＶ ３Ｃ（「ｐｒｏ」または「プロテアーゼ」）タンパク質を提供する。ＳＶＶ ３Ｃタンパク質のアミノ酸配列は、図２４にリストされる配列番号１９の核酸配列（配列番号１のヌクレオチド３６５２〜４２８４に相当する）によってエンコードされる。
【００７４】
また本発明は、図２７にリストされる配列番号２２のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１４２９〜１８９０に相当する）を有する単離されたＳＶＶ ３Ｄ（「ｐｏｌ」または「ポリメラーゼ」）タンパク質を提供する。ＳＶＶ ３Ｃタンパク質のアミノ酸配列は、図２４にリストされる配列番号１９の核酸配列（配列番号１のヌクレオチド４２８５〜５６７３に相当する）によってエンコードされる（配列番号１のヌクレオチド５６７１〜５６７３「ｔｇａ」は停止コドンをコードし、これはアミノ酸配列表中ではアスタリスク「＊」として表される）。
【００７５】
本発明の核酸には、ＲＮＡおよびＤＮＡ型がともに含まれ、また暗黙的に、添付の配列表の相補的配列が含まれる。
【００７６】
ゆえに、配列番号１によって表される単離されたＳＶＶ核酸は、配列番号２によって表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをエンコードする５，７５２ヌクレオチド長を有する。このＳＶＶゲノム配列は単一のポリタンパク質として翻訳され、下流の諸「翻訳産物」に切断される。本発明は、配列番号１のすべての核酸断片および該断片によってエンコードされるすべてのポリペプチドを包含する。
【００７７】
完全長ＳＶＶポリタンパク質のアミノ酸配列の大部分は配列番号１のヌクレオチド１〜５６７３によってエンコードされる。このポリタンパク質は切断されて３種の前駆タンパク質、Ｐ１、Ｐ２およびＰ３になる（図４Ｂを参照のこと）。Ｐ１、Ｐ２およびＰ３はさらに切断されて、より小さい生成物になる。構造領域Ｐ１（１ＡＢＣＤ；すなわちキャプシド領域）の切断産物は、１ＡＢＣ、ＶＰ０、ＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ１である。非構造タンパク質Ｐ２（２ＡＢＣ）の切断産物は、２Ａ、２ＢＣ、２Ｂおよび２Ｃである。非構造領域Ｐ３ポリタンパク質（３ＡＢＣＤ）の切断産物は、３ＡＢ、３ＣＤ、３Ａ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｃ’、および３Ｄ’である。特定の実施態様では、本発明は、以下を含む単離された核酸を提供する：（ｉ）２ＡＢＣの配列（配列番号１のヌクレオチド１９２４〜３３１５）およびそのエンコード対象のタンパク質；（ｉｉ）２ＢＣの配列（配列番号１のヌクレオチド１９６６〜３３１５）およびそのエンコード対象のタンパク質；（ｉｉｉ）３ＡＢＣＤの配列（配列番号１のヌクレオチド３３１６〜５６７３）およびそのエンコード対象のタンパク質；（ｉｖ）３ＡＢの配列（配列番号１のヌクレオチド３３１６〜３６５１）およびそのエンコード対象のタンパク質；および（ｖ）３ＣＤの配列（配列番号１のヌクレオチド３６５２〜５６７３）およびそのエンコード対象のタンパク質。
【００７８】
ピコルナウイルスの基本キャプシド構造は、６０プロトマーが高密度にパッキングされた正二十面体の配置からなり、各プロトマーは４ポリペプチド、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４からなり、これらの全ポリペプチドは元のプロトマーであるＶＰ０の切断から生じる。ＳＶＶウイルス粒子は直径約２７ｎｍであり（図２を参照のこと）、直径約２７〜３０ｎｍの他のピコルナウイルス粒子のサイズと一致する。
【００７９】
ピコルナウイルスの複製についての速度論は高速であり、そのサイクルは約５〜１０時間のうちに（典型的に約８時間で）完了する（ピコルナウイルス複製サイクルの概略図に関しては図６８を参照のこと）。受容体結合時に、ゲノムＲＮＡは粒子から細胞質内に放出される。そしてゲノムＲＮＡはポリソームによって直接翻訳されるが、感染後約３０分のうちに、細胞のタンパク質合成は急激に減衰し、ほぼゼロになる。この現象は「シャットオフ（shutoff）」と称され、細胞変性作用（ｃｐｅ）の主原因である。シャットオフは、翻訳開始時に、すべての真核生物のｍＲＮＡの５’末端におけるｍ７Ｇキャップ構造の結合に関与する宿主細胞の２２０ｋＤａキャップ結合複合体（ＣＢＣ）の切断に起因すると考えられる。ＣＢＣの切断は２Ａプロテアーゼに起因すると考えられる。
【００８０】
５’ＵＴＲはＩＲＥＳを含有する。通常、真核生物の翻訳は、リボソームが５’メチル化キャップに結合し、そしてｍＲＮＡに沿って走査し、最初のＡＵＧ開始コドンを発見した時点で開始される。ＩＲＥＳはこの過程を克服し、ＣＢＣの分解後にピコルナウイルスＲＮＡが翻訳され続けるようにする。
【００８１】
ウイルスポリタンパク質は初期に２Ａプロテアーゼによって切断され、ポリタンパク質Ｐ１、Ｐ２およびＰ３になる（図４Ｂを参照のこと）。その後、主要ピコルナウイルスプロテアーゼである３Ｃによってさらに切断イベントが生じる。３Ｃによって作成される切断産物の１つはウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（３Ｄ）であり、これはゲノムＲＮＡをコピーして、マイナス（−）センス鎖を生産する。この（−）センス鎖は、（＋）鎖（ゲノム）ＲＮＡ合成用の鋳型を形成する。いくつかの（＋）鎖は翻訳されて追加のウイルスタンパク質を生産し、またいくつかの（＋）鎖はキャプシド内にパッケージされて新規ウイルス粒子を形成する。
【００８２】
（＋）鎖ＲＮＡゲノムはあらかじめ形成されたキャプシド内にパッケージされると考えられるが、該ゲノムおよびキャプシド間の分子的相互作用は不明である。空のキャプシドはすべてのピコルナウイルス感染において共通である。キャプシドの集合は、Ｐ１ポリタンパク質前駆体が、ＶＰ０、ＶＰ３、およびＶＰ１からなるプロトマーに切断されることによって生じ、これらはともに結合してゲノムを封入する。ウイルス粒子の成熟および感染力は、ＶＰ０が内部で自己触媒的にＶＰ２およびＶＰ４に切断されることに依存する。新しく形成されたウイルス粒子の放出は細胞溶解時に生じる。
【００８３】
また本発明は、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−５３４３のすべての識別特性および核酸配列を有する単離されたウイルスを提供する。本発明のウイルスは、ＰＴＡ−５３４３単離体、ＰＴＡ−５３４３単離体の変種、相同体、誘導体および変異体、およびＳＶＶ（本明細書中で開示される野生型および変異体の両者）の、その腫瘍溶解性を担うことが決定されている配列に関して修飾された他のピコルナウイルスの変種、相同体、誘導体および変異体を対象にし得る。
【００８４】
さらに本発明は、ＡＴＴＣ特許寄託番号ＰＴＡ−５３４３を有する単離されたＳＶＶ、およびアミノ酸配列配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０および２２を有する単離されたＳＶＶタンパク質由来のエピトープを特異的に標的にする抗体を提供する。また本発明は、配列番号１の断片または部分によってエンコードされるタンパク質由来のエピトープを特異的に標的にする抗体を含む。
【００８５】
種々のカルジオウイルス単離体由来のＲＮＡ配列の比較解析では、ゲノム間で＞４５％のヌクレオチド同一性が示された。カルジオウイルスは、ＥＭＣ様ウイルス（「ＥＭＣＶ」−、例えばＭｅｎｇｏ、Ｂ、Ｒ；およびさらにＭＭ、ＭＥ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ−ＳＫ）、Theiler様ウイルス（「ＴＭＥＶ」−、例えばＢｅＡｎ、ＤＡおよびＧＤ ＶＩＩ系統）、およびVilyuiskウイルスに亜分類することができる。
【００８６】
他のウイルスと比較したＳＶＶ配列の解析では、ＳＶＶはカルジオウイルスの一種であると考えられる（実施例４および該実施例で参照される図を参照のこと）。ＥＭＣＶおよびＴＭＥＶが標準カルジオウイルスであるとすれば、ＳＶＶは明らかに典型的カルジオウイルスではない。しかし、これらの２ウイルスでさえ差異を有し、この差異は５’ＵＴＲにおいて著しい（Pevear et al., 1987, J. Virol., 61: 1507-1516）。系統学的にＳＶＶはそのポリタンパク質の大半（Ｐ１、２Ｃ、３Ｃproおよび３Ｄpol領域；図３１−３７を参照のこと）においてＥＭＣＶおよびＴＭＥＶとクラスター形成し、この結果はＳＶＶがカルジオウイルスである可能性が非常に高いことを示す。
癌の処置方法：
【００８７】
本発明は、ＳＶＶの腫瘍溶解性を考慮して修飾されたウイルス、例えばピコルナウイルス、その誘導体、変種、変異体または相同体を使用して癌を治療するための方法を提供する。本発明は、野生型ＳＶＶ（すなわちＡＴＴＣ特許寄託番号ＰＴＡ−５３４３）がいくつかのタイプの腫瘍を選択的に死滅させる能力を有することを示す。例えば、ＳＶＶは、向神経性または神経内分泌性を有する腫瘍細胞、例えば小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および神経芽細胞腫を選択的に死滅させることができる。本発明のウイルスによる処置対象として考慮される神経内分泌腫瘍の他の例には、非限定的に以下のものが含まれる：副腎クロム親和細胞腫、ガストリノーマ（Zollinger-Ellison症候群を発症させる）、グルカゴノーマ、膵島細胞腺腫、髄様癌（例えば髄様甲状腺癌腫）、多発性内分泌腫瘍症候群、膵内分泌腫瘍、傍神経節腫、ＶＩＰｏｍａ（血管活性腸ポリペプチド腫瘍）、島細胞腫瘍、およびクロム親和細胞腫。
【００８８】
また本発明は、４タイプの神経内分泌肺腫瘍を包含する。最も深刻なタイプの小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）は、すべての癌のうちで最も高速に増殖し、拡大するものに含まれる。大細胞神経内分泌癌腫はまれな癌であり、癌を形成する細胞のサイズを除き、その予後および患者の処置方法に関してＳＣＬＣに非常に類似している。カルチノイドとしても知られるカルチノイド腫瘍は、他の２タイプの肺神経内分泌癌を含む。これらの２タイプは定型カルチノイドおよび異型カルチノイドである。
【００８９】
理論に拘束されることなく、腫瘍細胞を特異的に死滅させるＳＶＶの能力には、非限定的に以下に挙げる能力が含まれるであろう：選択的複製、アポトーシス、腫瘍選択的細胞侵入を介する溶解、腫瘍選択的翻訳、腫瘍選択的タンパク質分解、腫瘍選択的ＲＮＡ複製、およびその組み合わせ。
【００９０】
他の腫瘍溶解性ウイルス、例えば修飾型アデノウイルスと比較して、ＳＶＶは多数の有益な特徴を有する。その例を以下に挙げる：（ｉ）ＳＶＶは神経特性を有する癌、例えばＳＣＬＣ、ウィルムス腫瘍、網膜芽細胞腫、および神経芽細胞腫に関して非常に高い選択性を有する−例えば、ＳＶＶは神経内分泌腫瘍細胞に対して１０，０００倍を超える選択性を示す；（ｉｉ）ＳＶＶは化学療法による処置より１，０００倍良好な殺細胞特異性を有することが示されている；（ｉｉｉ）ＳＶＶは、１０14ウイルス粒子／ｋｇ程の高濃度で全身投与を受けたマウスにおいて顕性の毒性を全く示さない；（ｉｖ）ＳＶＶの効果は非常に強く、マウスにおいてあらかじめ大きく確立された腫瘍の１００％を根絶することができ、腫瘍増殖の再発はない；（ｖ）ＳＶＶを精製して高力価にすることができ、許容セルライン中で２００，０００粒子／細胞を超える濃度で生産させることができる；（ｖｉ）ＳＶＶはサイズが小さく（ＳＶＶウイルス粒子は直径３０ｎｍ未満である）、したがって他の腫瘍溶解性ウイルスより良好に腫瘍に浸透および伝播することができる、（ｖｉｉ）ＳＶＶは高速に複製する（１２時間未満）、ならびに（ｖｉｉｉ）特異的抗腫瘍物質としての使用に関してＳＶＶの修飾は不要である。
【００９１】
さらに、初期研究（実施例６を参照のこと）では、ＳＶＶを腫瘍溶解性ウイルス療法に有益なツールにする、以下の追加要因が示される：（ｉ）ヒト血清サンプルはＳＶＶを標的にする中和抗体を含有しない；（ｉｉ）ＳＶＶは補体によって阻害されない；ならびに（ｉｉｉ）ＳＶＶは赤血球凝集によって阻害されない。これらの全要因は、ＳＶＶが他の腫瘍溶解性ウイルスより長いインビボでの循環時間を示す（例えば、実施例７を参照のこと）ことに寄与する。
【００９２】
本発明は、細胞集団中の新生物細胞を選択的に死滅させるための方法であって、ウイルスが細胞集団中の新生物細胞に形質導入し、複製し、該新生物細胞を死滅させることができる条件下で、有効量のＳＶＶを該細胞集団と接触させることを含む方法を提供する。ＳＶＶがインビボで腫瘍細胞を死滅させる方法に加えて、本方法は以下に挙げる実施態様を包含する：（１）ＳＶＶによる感染時に腫瘍細胞をインビトロで培養することができ；（２）非腫瘍細胞の存在下で腫瘍細胞を培養することができ；ならびに（３）細胞は哺乳類細胞（腫瘍および非腫瘍細胞の両者）であり、細胞がヒト細胞である場合を含む。細胞のインビトロ培養およびＳＶＶによる感染は種々の適用性を有し得る。例えば、インビトロ感染は、大量のＳＶＶを生産する方法、新生物細胞が細胞集団中に存在するかどうかを判定または検出するための方法、または変異ＳＶＶが諸腫瘍細胞または組織型を特異的に標的にし、それらを死滅させることができるかどうかをスクリーニングするための方法として使用される。
【００９３】
さらに本発明は、エクスビボでの癌の処置方法であって、ヒト癌患者から細胞を単離し、インビトロで培養し、該癌細胞を選択的に死滅させるＳＶＶを感染させ、そして非腫瘍細胞を該患者に再導入する方法を提供する。あるいは、ＳＶＶを患者に投与するための方法として、患者から単離された細胞にＳＶＶを感染させて、すぐに該患者に再導入することができる。一実施態様では、癌細胞は造血性起源である。場合により、患者の腫瘍細胞をインビボで破壊する処置（例えば化学療法または放射線照射）を患者に受けさせた後に、培養細胞を該患者に再導入してよい。一実施態様では、該処置の使用により、患者の骨髄細胞を破壊してよい。
【００９４】
ＳＶＶは、神経特性を有する腫瘍細胞型に対する強力な抗腫瘍活性を有する。ＳＶＶは、正常なヒト、ラット マウス、ウシまたはヒツジのセルラインまたは非神経系の腫瘍セルラインに対する細胞溶解活性を示さない。さらにＳＶＶは初代ヒト肝細胞に対して細胞障害性ではない。以下の表１では、選択された腫瘍細胞型に対するＳＶＶのインビトロ細胞溶解効果を測定するために行われた研究をまとめる。
【００９５】
表１：選択された腫瘍細胞型に対するＳＶＶの細胞溶解効果
【表１】
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【００９６】
マウスでの研究（実施例を参照のこと）では、ＳＶＶがインビボで非常に高い効果および特異性で腫瘍を特異的に死滅させることができることが示される。これらのインビボでの研究では、他の腫瘍溶解性ウイルスと比べてＳＶＶが多数の利点を有することが示される。例えば、確立された腫瘍を根絶する腫瘍溶解性腫瘍ウイルスの能力に影響する重要な一要因は、ウイルスの浸透性（penetration）である。アデノウイルスベクターを用いる研究では、Ａｄ５ベースのベクターは胸腺欠損マウスのＳＣＬＣ腫瘍の発達に対する影響を有さなかった。免疫組織化学の結果によれば、アデノウイルスは確立された腫瘍に浸透しないと考えられた。対照的に、ＳＶＶは単一の全身投与にしたがって胸腺欠損ヌードマウスのＨ４４６ ＳＣＬＣ腫瘍を排除することができた。ＳＶＶはサイズが小さく（直径＜３０ｎｍ）、したがって他のウイルスより良好に腫瘍組織に浸透および伝播することが可能であり、ゆえに、ＳＶＶのサイズが小さいことは、確立された腫瘍に首尾良く浸透し、それらを根絶するその能力に寄与するであろう。
【００９７】
化学抵抗性（chemoresistance）は、癌治療の一様相である化学療法を受けるすべての患者が直面する主要な問題である。化学抵抗性になる患者は、常にではなくとも、非常に不良な予後を有することが多く、代替療法がない状態になるであろう。化学抵抗性の主要な原因の１つは、多剤耐性タンパク質（ＭＲＰ）と称されるファミリーのタンパク質の発現、過剰発現、または活性増加であることが周知である。発明者（出願人）らは、ＳＶＶに関する特定の腫瘍細胞の感受性も癌細胞の化学抵抗性状態およびＭＲＰ発現と相関することを発見した。Ｈ６９はインビトロでＳＶＶに耐性の化学感受性（アドリアマイシン）セルラインであり、Ｈ６９ＡＲは、ＭＲＰを過剰発現し、ＳＶＶに感受性の化学抵抗性セルラインである（表１を参照のこと）。ＭＲＰ、例えばＭＤＲの過剰発現はＳＶＶの殺細胞性に対する細胞の感受性と相関することを示す証拠である。ゆえに、一実施態様では、本発明はＳＶＶがＭＲＰ過剰発現性細胞を死滅させる癌の処置方法を提供する。
【００９８】
また本発明は、異常細胞、例えば異常増殖性細胞に起因する疾患の処置方法を提供する。本方法は、異常細胞の部分またはすべての破壊を導く様式で該異常細胞をＳＶＶと接触させることを含む。ＳＶＶを使用して、異常細胞に起因する種々の疾患を処置することができる。これらの疾患の例には、非限定的に、腫瘍細胞が神経内分泌性の特徴を示す癌および神経線維腫症が含まれる。
【００９９】
神経内分泌腫瘍は種々の方法によって同定することができる。例えば、神経内分泌腫瘍は多数のペプチドホルモンおよびアミンを生産および分泌する。これらの物質のいくつかは以下のような特定の臨床症候群の原因になる：カルチノイド、Zollinger-Ellison、高血糖、グルカゴノーマおよびＷＤＨＡ症候群。これらの症候群に関する特異的マーカーは、それぞれ、尿５−ＨＩＡＡ、血清または血漿ガストリン、インスリン、グルカゴンおよび血管活性腸ポリペプチドの基底および／または刺激レベルである。いくつかのカルチノイド腫瘍および約１／３の内分泌膵腫瘍は臨床症状を全く示さず、「非機能性」腫瘍と称される。したがって、一般的腫瘍マーカー、例えばクロモグラニンＡ、膵ポリペプチド、血清ニューロン特異的エノラーゼおよび糖タンパク質ホルモンのサブユニットが、明確な臨床のホルモン関連症状を有さない患者のスクリーニングのために使用されている。これらの一般的腫瘍マーカーのうち、クロモグラニンＡは、その正確な機能は未だ確立されていないが、種々のタイプの神経内分泌腫瘍に関する非常に高感度かつ特異的な血清マーカーであることが示されている。これは、既知のホルモンを分泌しない、分化の程度が低い神経内分泌起源の腫瘍の多数の症例においても上昇する可能性があることに基づく。現在、クロモグラニンＡは、診断および治療上の評価の両方に関して利用可能な最良の一般的な神経内分泌性の血清または血漿マーカーであると考えられ、種々の神経内分泌腫瘍を有する患者の５０〜１００％において増加する。クロモグラニンＡの血清または血漿レベルは腫瘍負荷（tumor load）を反映し、中腸カルチノイドを有する患者の予後についての非依存的マーカーであろう。
【０１００】
また本発明は、ＳＶＶおよび製薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。製薬的に許容される担体中に有効量のＳＶＶを含ませることができる上記組成物は、単位投与剤形、滅菌非経口溶液または懸濁液、滅菌非腸管外（non-parenteral）溶液または経口（oral）溶液または懸濁液、水中油または油中水エマルジョン、等として個体に局所または全身投与するのに適している。非経口および非腸管外（経口）薬物送達用の製剤は当技術分野において既知である。組成物には、凍結乾燥および／または再組成型のＳＶＶも含まれる。許容される医薬用担体は、例えば生理食塩水溶液、硫酸プロタミン（Elkins-Sinn, Inc., Cherry Hill, NJ）、水、水性バッファー、例えばリン酸バッファーおよびトリスバッファー、またはポリブレン（Sigma Chemical, St. Louis, MO）およびリン酸緩衝生理食塩水およびショ糖である。適切な医薬用担体の選択は本明細書中に含まれる教示内容から当業者に自明であると考えられる。これらの溶液は滅菌性であり、概してＳＶＶ以外の粒子状物質を含まない。本組成物は、生理的条件に近づけるために必要な製薬的に許容される補助物質、例えばｐＨ調節および緩衝剤、毒性調節剤等、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム、等を含有してよい。ＳＶＶによる細胞の感染を増強する賦形剤を含ませてよい。
【０１０１】
ＳＶＶは、腫瘍細胞の増殖を該腫瘍細胞におけるウイルスの複製によって阻害、予防または破壊するのに有効な量で、宿主または対象に投与する。ＳＶＶを癌治療に利用する方法には、治療的に有用な腫瘍細胞の破壊を誘発するための、安全で、発展性で（developable）、かつ許容される用量のウイルスを全身、領域または局所送達することが含まれる。全身投与を採用した場合でさえ、ＳＶＶに関する治療係数は少なくとも１０、好ましくは少なくとも１００またはさらに好ましくは少なくとも１０００である。一般に、ＳＶＶは１ｘ１０8〜１ｘ１０14ｖｐ／ｋｇの範囲の量で投与する。正確な投与用量は種々の要因、例えば患者の年齢、体重、および性別、および処置対象の腫瘍のサイズおよび重篤度に依存する。このウイルスは１回またはそれ以上の回数で投与してよく、その回数は宿主の免疫応答能に依存するであろう。担当医によって選択される用量レベルおよびパターンで組成物の単一または複数回投与を行うことができる。必要であれば、種々の免疫抑制剤を使用して免疫応答を低下させてよい。その目的は、本ウイルスに対する免疫応答を減少させることによって反復投与を可能にし、ならびに／あるいは複製を増強することである。本発明の抗新生物性ウイルス療法を他の抗新生物性プロトコルと組み合わせてよい。送達は、リポソーム、直接注射、カテーテル、局所適用、吸入、等を使用して種々の方法で達成することができる。さらに、ＳＶＶゲノムＲＮＡのＤＮＡコピーまたはその部分もまた送達の手法であり得る。この場合、ＤＮＡはその後に細胞によって転写されて、ＳＶＶウイルス粒子または特定のＳＶＶポリペプチドが生産される。
【０１０２】
治療有効（用）量とは、患者において症状を改善させ、あるいは生存を延長させるウイルスの量を表す。ウイルスの毒性および治療効果は、細胞培養または実験動物における、例えばＬＤ50（動物または細胞の集団の５０％に対して致死の用量；ウイルスに関しては、用量はｖｐ／ｋｇ単位である）およびＥＤ50（動物または細胞の集団の５０％において治療上有効な用量−ｖｐ／ｋｇ−）またはＥＣ50（動物または細胞の集団の５０％における有効濃度−ｖｐ／細胞（例えば表１を参照のこと）−）の測定に関する標準的手順によって決定することができる。有毒な影響および治療効果の間の用量比は治療係数であり、ＬＤ50およびＥＤ50またはＥＣ50間の比として表すことができる。高い治療係数を示すウイルスが好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータを、ヒトでの使用に関する一定範囲の用量を製剤化する際に使用することができる。ウイルスの用量は、好ましくは、ＥＤ50またはＥＣ50を含む、毒性をほとんど有さないか、あるいは全く有さない一定範囲の循環濃度の範囲内である。上記用量は、使用される剤形および利用される投与経路に依存して、本範囲内で変動させてよい。
【０１０３】
さらに別の側面では、新生物症状を有する宿主生物の処置方法であって、治療有効量の本発明のウイルス組成物を該宿主生物に投与することを含む方法を提供する。一実施態様では、新生物組織は異常増殖性であり、また、新生物組織は悪性腫瘍組織であり得る。好ましくは、ウイルスは腫瘍組織において選択的に複製するその能力に起因して組織または腫瘤全体にわたって分配される。潜在的に本発明の方法を用いて処置しやすい新生物症状には、向神経性を有する症状が含まれる。
本発明のウイルスの製造方法：
【０１０４】
本発明のウイルスを非常に高い力価および収量（率）で製造するための方法は本発明の追加の側面である。前述のように、ＳＶＶを精製して高力価にすることができ、許容セルラインにおいて２００，０００粒子／細胞を超える量で生産させることができる。大量のウイルスを生産可能な細胞には、非限定的に、ＰＥＲ．Ｃ６（Fallaux et al., Human Gene Therapy, 9: 1909-1917, 1998）、Ｈ４４６（ＡＴＣＣ＃ ＨＴＢ−１７１）および表１にリストされる他のセルラインが含まれ、この場合、ＥＣ50値は１０未満である。
【０１０５】
例えば、ピコルナウイルスの培養は以下のように行うことができる。目的のウイルスを１回プラーク精製し、十分に単離されたプラークをつつき、許容セルライン、例えばＰＥＲ．Ｃ６中で増幅させる。複数サイクルの凍結および解凍によって感染細胞由来の粗製のウイルスライセート（ＣＶＬ）を作成することができ、それを使用して多数の許容細胞を感染させる。この許容細胞を種々の組織培養フラスコ、例えば５０ｘ１５０ｃｍ2フラスコで培養することができる。培養には、種々の培地、例えば１０％ウシ胎児血清（Biowhitaker, Walkersvile, MD）および１０ｍＭ塩化マグネシウム（Sigma, St Louis, MO）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Invitrogen, Carlsbad, CA））を使用する。感染２４〜４８時間後または完全な細胞変性作用（ＣＰＥ）が認められた時点で感染細胞を回収することができ、４℃で１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって収集する。細胞ペレットを細胞培養上清中に再懸濁し、複数サイクルの凍結および解凍に付する。得られたＣＶＬを４℃で１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって浄化する。ウイルスを勾配遠心分離によって精製することができる。例えば、ＳＶＶの精製には２ラウンドのＣｓＣｌ勾配で十分であり得る：１段階勾配（ＣｓＣｌ密度１．２４ｇ／ｍｌおよび１．４ｇ／ｍｌ）、その後の１連続勾配遠心分離（ＣｓＣｌ密度１．３３ｇ／ｍｌ）。精製ウイルスの濃度を分光光度法で測定する。この場合、１Ａ２６０＝９．５ｘ１０12粒子を仮定する（Scraba D.G., and Palmenberg, A.C. 1999. カルジオウイルス（ピコルナウイルス科）（Cardioviruses（Picornaviridae））. In: Encyclopedia of Virology, Second edition, R.G. Webster and A Granoff Eds）。また精製ウイルスの力価を、ＰＥＲ．Ｃ６細胞を使用する標準プラークアッセイによって測定する。ＰＥＲ．Ｃ６細胞由来のＳＶＶの収量は２００，０００粒子／細胞を超え、粒子対ＰＦＵ比は約１００である。他の許容細胞（Ｈ４４６−ＡＴＣＣ＃ ＨＴＢ−１７１）由来のＳＶＶの収量は少なくとも上記と同程度に多く、あるいはより多いであろう。
【０１０６】
さらに、商業的に魅力的な大規模優良製造工程（Good Manufacturing Processes）（ＧＭＰ）における複数の段階をＳＶＶの精製に適用可能である。また本発明では、アデノウイルスの精製方法に基づくＳＶＶの精製方法が考慮される。これらの方法には、ＳＶＶをその密度に基づいて単離することが含まれる。その理由は、ＳＶＶがアデノウイルスと非常に類似した密度を有し、アデノウイルスと同時精製することができるからである。
腫瘍の検出および研究方法：
【０１０７】
本発明は、本発明のウイルスを使用して患者の腫瘍または新生物細胞を検出するための方法を提供する。患者から細胞サンプルを取得し、該サンプルをエピトープタグ付きＳＶＶ（または本発明によって提供される他の腫瘍特異的ウイルス、すなわち腫瘍特異的変異カルジオウイルス）とインキュベートし、次いで該エピトープタグを検出することによって結合型ＳＶＶに関して該サンプルをスクリーニングすることによってスクリーニングすることができる。あるいは、ＳＶＶがいずれかの細胞溶解を生じさせるかどうかを検出することによってサンプルをスクリーニングすることができる。ＳＶＶが実際に細胞溶解を生じさせるか、あるいはＳＶＶがサンプル中の細胞に特異的に結合することができれば、ＳＶＶが結合および／または感染可能であることが既知の新生物または腫瘍細胞を該サンプルが含有する可能性を示す。
【０１０８】
さらに、インビボでの腫瘍細胞の検出方法においてＳＶＶを使用することができる。そのような方法では、エピトープタグ付きＳＶＶを、最初に、ＳＶＶが依然として腫瘍細胞に特異的に結合できるが、複製できない様式で不活性化することができる。エピトープタグに関してアッセイすることによって結合型ＳＶＶを有する腫瘍細胞を検出することができる。エピトープタグの検出は、該エピトープを特異的に結合する抗体によって達成することができ、この場合、該抗体を（例えば蛍光で）標識するか、あるいは標識された二次抗体によって該抗体を後に検出することができる。
【０１０９】
本検出方法は、本発明の任意のウイルスの特異的な標的である任意のタイプの腫瘍または新生物細胞を検出することを包含する。特定の腫瘍型には、例えば、神経内分泌型腫瘍、例えば網膜芽細胞腫、ＳＣＬＣ、神経芽細胞腫 グリア芽細胞腫および髄芽腫が含まれる。
【０１１０】
また本発明は、腫瘍細胞を研究するツールとしてのＳＶＶの使用を提供する。ＳＶＶはいくつかの腫瘍細胞型を選択的に破壊し、非腫瘍細胞に対する有毒な影響は、たとえあったにしても、非常に少ない。これらの特徴に基づき、ＳＶＶを使用して、腫瘍を研究し、新規腫瘍特異的遺伝子および／または経路を発見することができるであろう。換言すれば、ＳＶＶの複製を許容する腫瘍細胞には何らかの特徴が存在し、この場合、正常細胞は該特徴を示さない。新規腫瘍特異的遺伝子および／または経路を同定すると、治療用抗体または小分子を設計し、あるいはスクリーニングして、これらの試薬が抗腫瘍物質であるかどうかを判定することができる。
【０１１１】
また本発明は、ＳＶＶと反応するすべてのタイプの癌を同定するための方法を提供する。一実施態様では、ＳＶＶ応答細胞の同定方法は、細胞を取得する段階、該細胞をＳＶＶと接触させる段階および細胞の死滅を検出するか、あるいはウイルスの複製を検出する段階を含む。細胞の死滅は、当業者に既知の種々の方法（例えばＭＴＳアッセイ、本明細書中のハイスループットの節を参照のこと）を使用して検出することができる。ウイルスの複製を検出する方法も当業者に既知である（例えばＣＰＥの観察、プラークアッセイ、ＤＮＡ定量法、ＦＡＣＳによって、腫瘍細胞中のウイルスの量を検出、ＲＴ−ＰＣＲアッセイによって、ウイルスのＲＮＡを検出、等）。一実施態様では、細胞は癌細胞である。癌細胞の例には、非限定的に、哺乳類から取得される確立された腫瘍セルラインおよび腫瘍細胞が含まれる。一実施態様では、哺乳類はヒトである。別の実施態様では、細胞はヒト癌患者から取得される癌細胞である。
【０１１２】
ＳＶＶ応答性癌細胞の同定方法を使用して、ＳＶＶの複製を許容する腫瘍セルラインまたは腫瘍組織を発見してよい。また、許容腫瘍細胞の特徴を決定することによって、ＳＶＶによって細胞が選択的に死滅する原因である腫瘍細胞の特徴を同定することができるであろう。これらの特徴を発見すれば、制癌剤の新規標的が得られるであろう。また、ＳＶＶ応答性癌細胞の同定方法を使用して、ＳＶＶでの処置から恩恵を受けるであろうヒト癌患者をスクリーニングすることができよう。
【０１１３】
ＳＶＶの天然宿主は未だ決定されていないので、ＳＶＶを検出するアッセイに関する必要性が存在する。ゆえに、本発明はＳＶＶの検出方法を提供する。一実施態様では、検出アッセイはＳＶＶポリペプチドエピトープに対して特異的な抗体に基づく。別の実施態様では、検出アッセイは核酸のハイブリダイゼーションに基づく。一実施態様では、ＳＶＶからＲＮＡを単離し、標識（例えば放射性、化学発光、蛍光、等）して、プローブを作成する。その後試験材料からＲＮＡを単離し、ニトロセルロース（または同様の基質または機能的に等価の基質）に結合させ、標識型ＳＶＶ ＲＮＡでプローブし、結合型プローブの量を検出する。また、ウイルスのＲＮＡを直接または間接的にシークエンシングしてよく、その配列に基づいてＰＣＲアッセイを開発してよい。一実施態様では、ＰＣＲアッセイはリアルタイムＰＣＲアッセイである。
【０１１４】
改変された親和性を有するウイルスの作成方法：
本発明はＳＶＶ変異体（または変種または誘導体）の構築方法を提供し、この場合、これらの変異体は改変された細胞型親和性を有する。具体的には、野生型ＳＶＶの結合に耐性であることが既知の腫瘍または新生物細胞に特異的に結合し、ならびに／あるいはそれらを特異的に死滅させる能力に関してＳＶＶ変異体を選択する。
【０１１５】
ネイティブまたは野生型ＳＶＶは単純なゲノムおよび構造を有し、それによりネイティブのウイルスを修飾して他の癌の徴候を標的にすることが許容される。これらの新規誘導体は非神経系の癌に対して拡大された親和性を有し、かつネイティブのＳＶＶに認められる高い治療係数を依然として維持する。ターゲティング手段の１候補は、組織特異的ペプチドまたはリガンドをウイルス上に含ませることである。
【０１１６】
癌ターゲティングウイルス候補を選択するために、本発明は、ネイティブのＳＶＶのキャプシド領域中にランダムなペプチド配列をエンコードする遺伝子挿入を有する腫瘍溶解性ウイルスライブラリーを構築およびスクリーニングする方法を提供する。ランダムなペプチドライブラリーは１０8の種類で十分であると考えられ、該ウイルスを特異的に腫瘍組織に向けるペプチドが得られるであろう。
【０１１７】
諸研究により、腫瘍細胞が正常細胞とは異なる以下のような特徴を示すことが示されている：（１）腫瘍細胞はより浸透性の細胞膜を有する；（２）腫瘍は特定の間質細胞型、例えば血管原性内皮細胞を有し、これは細胞型特異的受容体を発現することが以前に示されている；ならびに（３）腫瘍細胞では、特定の受容体、抗原および細胞外基質タンパク質の発現に差異がある（Arap, W. et al., Nat. Med., 2002, 8(2): 121-127; Kolonin, M.et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2001, 5(3): 308-313; St. Croix, B. et al., Science, 2000, 289(5482): 1997-1202）。これらの研究では、腫瘍および正常組織が分子レベルで異なっていて、ターゲティングされた薬物送達および癌の処置が可能であることが実証された。具体的には、マウスモデルにおける血管へのホーミングによって選択された複数のペプチドが、細胞障害性薬物（Arap, W. et al., Science, 1998, 279(5349): 377-380）、プロアポトーシスペプチド（Ellerby, H.M. et al., Nat. Med., 1999, 17(8): 768-774）、メタロプロテアーゼ阻害剤（Koivunen, E. et al., Nat. Biotechnol, 1999, 17(8): 768-774）、サイトカイン（Curnis, F. et al., Nat. Biotechnol., 2000, 18(11): 1185-1190）、フルオロフォア（Hong. F.D. and Clayman, G.L., Cancer Res., 2000, 60(23): 6551-6556）および遺伝子（Trepel, M. et al., Hum. Gene Ther., 2000, 11(14): 1971-1981）のターゲティングされた送達に使用されている。腫瘍ターゲティングペプチドは親薬物の効果を増加させ、その毒性を低下させることが証明されている。
【０１１８】
ＳＶＶ誘導体のライブラリーは、ウイルスのキャプシド領域内にランダムなペプチド配列を挿入することによって作成することができる。図５７に示されるように、まずＳＶＶキャプシド領域を含有するベクター、すなわち「ｐＳＶＶキャプシド」を作成する。そして、例えばＤＮＡをランダムな位置で切断する制限酵素、すなわちＣｖｉＪＩ（平滑末端化カッター）でベクターを切断することによって、このキャプシドベクターに変異を生じさせることができる。ベクターを多数の位置で切断し、ＣｖｉＪＩによって一度だけ切断されたＤＮＡをゲル精製によって単離することができる（図５７を参照のこと）。この単離されたＤＮＡ集団は、キャプシド領域中の種々の位置で切断された多数の種類を含有する。そしてこの集団をオリゴヌクレオチドおよびリガーゼとインキュベートして、一定の割合のオリゴヌクレオチドを多数の異なる位置でベクターのキャプシド領域内にライゲートする。この様式で、変異ＳＶＶキャプシドのライブラリーを作成することができる。
【０１１９】
キャプシドエンコード領域内に挿入されるオリゴヌクレオチドは、ランダムなオリゴヌクレオチド、非ランダムのオリゴヌクレオチド（すなわち、このオリゴヌクレオチドの配列はあらかじめ決定されている）、または半ランダム（すなわち、このオリゴヌクレオチドのある部分はあらかじめ決定されていて、ある部分はランダムな配列を有する）であってよい。非ランダムの側面で考慮されるオリゴヌクレオチドはエピトープエンコード領域を含み得る。考慮されるエピトープには、非限定的に、ｃ−ｍｙｃ−ヒトプロトオンコジーンｍｙｃの１０アミノ酸セグメント（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号３５）；ＨＡ−ヒトインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来の（赤）血球凝集素タンパク質（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号３６））；およびＨｉｓ6（配列番号１１６）−６個の連続するヒスチジンをエンコードする配列−が含まれる。
【０１２０】
そして変異キャプシドポリヌクレオチドのライブラリー（例えば図５７の「ｐＳＶＶキャプシドライブラリー」）を制限酵素で消化して、変異キャプシドエンコード領域のみを切り出すことができる。次いでこの変異キャプシドエンコード領域を、キャプシドエンコード領域を除いた完全長ゲノム配列を含有するベクターにライゲートする（例えば図５８を参照のこと）。このライゲーションにより完全長ゲノム配列を有するベクターが生成し、この場合、ベクターの集団（またはライブラリー）は多数の変異キャプシドを含む。図５８では、種々のキャプシドを含むこのＳＶＶ変異体のライブラリーを「ｐＳＶＶＦＬキャプシド」と表す。そしてｐＳＶＶＦＬキャプシドベクターのライブラリーを直線化および逆転写して、変異ＳＶＶ ＲＮＡを作成する（図５９を参照のこと）。次いで変異ＳＶＶ ＲＮＡを許容セルライン内にトランスフェクトして、キャプシド中に脱療育性（dehabilitating）変異を有さないＳＶＶ配列が宿主細胞によって翻訳され、多数の変異ＳＶＶ粒子が生産されるようにする。図５９では、多数の変異ＳＶＶ粒子を「ＳＶＶキャプシドライブラリー」と表す。
【０１２１】
キャプシドエンコード領域内に挿入されるオリゴヌクレオチドによってエンコードされるペプチドは、特異的ウイルス感染に関するターゲティング部分として働くことができる。特定タイプの癌を標的にするウイルスならば、上記ペプチドに対する受容体を有する癌細胞のみに選択的に感染し、その細胞中で複製し、細胞を死滅させ、そして同一タイプの細胞にのみ伝播するであろう。本方法論により、新規腫瘍ターゲティングペプチドおよびリガンド、腫瘍選択的受容体、治療用ＳＶＶ誘導体および他のウイルス誘導体、例えばピコルナウイルス誘導体の同定が可能になる。
【０１２２】
ＳＶＶ変異体ライブラリーのインビトロおよびインビボスクリーニングは、他の技術、例えばペプチドビーズライブラリーおよびファージディスプレイと比べていくつかの利点を有する。これらの他の技術と違って、本件で望ましい候補、すなわち癌細胞に選択的に結合するＳＶＶ誘導体はインサイチュで複製する。この複製ベースのライブラリーアプローチは、新規細胞結合部分を発見する従来の方法、例えばファージディスプレイと比べて多数の利点を有する。第一に、ＳＶＶライブラリーのスクリーニングは複製に基づく。標的組織、本事例では特定の癌細胞で複製することができるのは、所望のウイルス誘導体だけである。スクリーニング／選択工程によって、ターゲティングペプチド部分を有し、かつ自身が癌治療薬であってよい非常に特異的なウイルス候補が得られる。一方、ファージディスプレイによるスクリーニングは結合イベントのみに帰着し、ターゲティングペプチド候補しか得られない。ゆえに、ＳＶＶライブラリーのスクリーニングはずっと高速かつ選択的なアプローチを提供する。第二に、インビトロまたはインビボでのファージディスプレイによるスクリーニング時には、標的細胞から回収されたファージを細菌中で増幅する必要があるが、ＳＶＶ誘導体は感染細胞から（または溶菌的な感染を受けた細胞の培養上清から）直接回収および精製することができる。第三に、ＳＶＶはゲノムのサイズが小さく、したがって操作が容易である；ゆえに、最適な挿入を保証して、キャプシド領域内にランダムに遺伝情報を挿入することが可能である。したがって、ＳＶＶライブラリーの構築およびスクリーニングは、非常に有効なウイルス誘導体を生産する高い可能性を有する。これらの誘導体を設計およびスクリーニングして、非神経特性を有する癌に特異的に感染するようにする。
【０１２３】
キャプシドエンコード領域内にオリゴヌクレオチドを挿入すると、いくつかの欠損変異体が生じる。変異体は、オリゴヌクレオチド配列の挿入によって停止コドンが生じ、したがってウイルスのポリタンパク質が生産されなくなり得るという意味で欠損性であってよい。また変異体は、オリゴヌクレオチド配列の挿入によってキャプシドがもはや会合できなくなるようにキャプシド構造が変化してよいという意味で欠損性であってよい。オリゴヌクレオチド配列の挿入によって停止コドンが生じるか、あるいはキャプシド構造が成り立たなくなる可能性を減らすために、ＴＲＩＭのような方法を使用して、停止コドンまたは特定のアミノ酸をエンコードしないようにランダムなオリゴヌクレオチドを設計することができる。
【０１２４】
キャプシド領域中にオリゴヌクレオチド用の最適な挿入ポイントが存在するかどうかを判定するために、ＲＧＤ−ＳＶＶライブラリーを作成することができる（実施例１６を参照のこと）。例えばＣｖｉＪＩを用いて、ＳＶＶキャプシドをエンコードするポリヌクレオチドをランダムに切断する。そしてランダムに直線化されたキャプシドポリヌクレオチドを、少なくともＲＧＤアミノ酸配列（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）をエンコードするオリゴヌクレオチドにライゲートする。次いでこれらのＲＧＤ−キャプシド配列を、キャプシド配列を欠いているＳＶＶ完全長配列ベクターにライゲートする。ＲＧＤ−ＳＶＶ誘導体ウイルスを製造し、特定のインテグリン発現性セルラインにおいて感染および複製するその能力に関して試験する（ＲＧＤペプチドは要素をインテグリン受容体に向けることが示されているため）。そしてインテグリン発現性セルラインへの感染に成功したＲＧＤ−ＳＶＶ誘導体を解析して、ＲＧＤオリゴヌクレオチドに関する主要な挿入部位が存在するかどうかを判定する。次いでこの部位を使用して、ランダム、非ランダムまたは半ランダムのオリゴヌクレオチドを部位特異的に挿入することができる。
【０１２５】
さらに、ＳＶＶおよび他のピコルナウイルス間のキャプシドエンコード領域の部分を比較すると（図２８を参照のこと）、ウイルス間において種々の非ボックス（non-boxed）領域が存在し、この領域では配列類似性がその最低である。これらの領域はウイルス間で異なる親和性への寄与において重要であるかもしれない。ゆえに、これらの領域は、ＳＶＶキャプシドの（および他のウイルスのキャプシドに関する）オリゴヌクレオチド挿入変異誘発に関する候補位置であろう。
【０１２６】
腫瘍特異的治療薬としての不活性化型ＳＶＶ：
ＳＶＶおよびＳＶＶキャプシド誘導体は特定の腫瘍細胞型および／または組織を標的にすることができるため、ＳＶＶ粒子そのものを治療薬用の送達ビヒクルとして使用することができる。上記方法では、ＳＶＶの腫瘍溶解能に関しての必要性は必須ではなくなる。その理由は、送達される治療薬が標的の腫瘍細胞を死滅させることができるからである。
【０１２７】
例えば、野生型ＳＶＶを不活性化して、ウイルスがもはや感染細胞を溶解しないが、この場合、該ウイルスは依然として標的の腫瘍細胞型に特異的に結合および侵入することが可能であるようにできる。ウイルスの複製機能を不活性化する、当技術分野において既知の多数の標準的方法が存在する。例えば、ホルマリンまたはβ−プロピオラクトンによって全ウイルスワクチンを不活性化して、ウイルスが複製できないようにする。野生型ＳＶＶそのものに、細胞のアポトーシスを引き起こすペプチドを含有させてよい。あるいは、ＳＶＶに放射線を照射することができる。しかし、放射線を照射されたウイルスは、依然として腫瘍細胞を特異的にターゲティング可能であることを保証するために最初に試験すべきであろう。その理由は、特定の照射条件により、タンパク質、ゆえにキャプシドの変化が生じる可能性があるからである。さらに、パッケージングシグナル配列が欠失した変異ＳＶＶを作成することができる。これらのＳＶＶ変異体は標的細胞に特異的に結合および侵入することができるが、複製されたＳＶＶゲノムＲＮＡはパッケージされず、キャプシド内に組み立てられない。しかし、本方法は有用であることが判明するであろう。その理由は、これらの変異ＳＶＶの初期侵入により宿主タンパク質合成のシャットオフが生じて、依然として腫瘍細胞死が達成されるからである。
【０１２８】
また、変異キャプシドを有する誘導体ＳＶＶを不活性化して、その使用により癌細胞を死滅させることができる。キャプシド領域内に挿入されたエピトープタグをエンコードするオリゴヌクレオチドを有する誘導体ＳＶＶをビヒクルとして使用し、腫瘍細胞に毒素を送達することができる。本明細書中で記載されるように、誘導体ＳＶＶにランダムに変異を生じさせ、腫瘍特異的親和性に関してスクリーニングすることができる。エピトープタグに毒素を結合させて、ウイルスが腫瘍細胞に毒素を送達するようにできる。あるいは、エピトープタグに特異的に結合する治療用抗体を使用して、ウイルスが腫瘍細胞に該治療用抗体を送達するようにできる。
【０１２９】
ハイスループットスクリーニング：
本発明は、種々のセルラインに特異的に感染する能力を有するウイルスをスクリーニングするためのハイスループット法を包含する。感染の特異性は細胞変性作用に関してアッセイすることによって検出することができる。例えば、ハイスループットスクリーニングに適したマルチウェルプレート、例えば３８４ウェルプレートの各ウェルで多数の諸腫瘍セルラインを培養することができる。各ウェルにウイルスのサンプルを加えて、ウイルス媒介性の溶解によって細胞が死滅するかどうかを試験する。細胞変性作用を示すウェルから培地を収集し、フラスコまたは大規模な組織培養プレート中で許容セルラインを感染させることによって培地中の任意のウイルスを増幅することができる。ウイルスを培養して、ＲＮＡを単離し、配列を解析して、ウイルスへの腫瘍細胞型特異的親和性の提供を担う可能性がある配列変異を決定することができる。
【０１３０】
種々の比色および蛍光定量法で細胞変性作用を高速にアッセイすることができる。これには蛍光色素ベースのアッセイ、ＡＴＰベースのアッセイ、ＭＴＳアッセイおよびＬＤＨアッセイが含まれる。蛍光色素ベースのアッセイは、死細胞集団を検出するための核酸染色剤を含み得る。その理由は、細胞不浸透性（cell-impermeant）の核酸染色剤は死細胞集団を特異的に検出することができるからである。生細胞および死細胞集団の両者を同時に検出することが望ましければ、生細胞集団を検出するための細胞内エステラーゼ基質、膜透過性（membrane-permeant）核酸染色剤、膜電位感受性プローブ、細胞小器官プローブまたは他の細胞浸透性（cell-permeant）の指示薬と組み合わせて核酸染色剤を使用することができる。例えば、Invitrogen（Carlsbad, CA）は、損傷した原形質膜を有する細胞にのみ浸透する種々のSYTOXTM核酸染色剤を提供する。また臭化エチジウムおよびヨウ化プロピジウムを使用して、死細胞または瀕死の細胞を検出することができる。これらの染色剤は、任意の吸光度読み取り装置によって検出することができる高親和性の核酸染色剤である。
【０１３１】
例えば、溶解は、損傷した細胞のサイトゾルから上清に放出される乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性の測定を基準にすることができる。細胞培養上清中のＬＤＨの存在を検出するために、基質混合物を加えて、共役型酵素反応によってＬＤＨがテトラゾリウム塩ＩＮＴをホルマザンに還元するようにできる。次いでこのホルマザン色素を吸光度読み取り装置によって検出することができる。あるいはまた、フェナジンメトサルフェート（phenzine methosulfate）（ＰＭＳ）を電子カップリング試薬として使用するＭＴＳアッセイ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内部塩］を使用して、細胞障害性を検出することができる。Promega（Madison, WI）はCellTiter 96（登録商標）AQueous One Solution Cell Proliferation Assayキットを提供する。このキットでは、溶液試薬を培養ウェルに直接加え、１〜４時間インキュベートし、次いで４９０ｎｍで吸光度を記録する。４９０ｎｍでの吸光度の量によって測定されるホルマザン生成物の量は培養中の生細胞数に正比例する。
【０１３２】
吸光度の読み取りに関する多数のハイスループットデバイスが存在する。例えばSpectraMax Plus 384 Absorbance Platereader（Molecular Devices）では、１９０〜１０００ｎｍの波長を１ｎｍ刻みで検出することができる。このデバイスの超高速サンプル処理能力では、９６ウェルマイクロプレートを５秒で読み取ることができ、３８４ウェルマイクロプレートを１６秒で読み取ることができる。
【０１３３】
またウイルスの複製は良好な感染の徴候としてアッセイすることができ、そのような検出方法をハイスループット様式で使用することができる。例えば、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を使用して、細胞培養上清中のウイルス転写物の存在を検出することができる。ウイルスのＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した後、二本鎖ＤＮＡ結合色素（例えばSYBR（登録商標）Green、Qiagen GmbH, Germany）を使用するＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅および検出することができる。そして蛍光定量装置を使用してＰＣＲ産物の量を直接測定することができる。
【０１３４】
細胞変性作用を示すウェル由来のウイルスを成熟させ、さらにインビトロ（腫瘍および正常セルラインの再試験）およびインビボモデル（マウスにおいて外植された腫瘍を該ウイルスが死滅させることができるかどうかを試験）で試験する。
【０１３５】
抗体：
また本発明は、本発明のウイルス、例えば該ウイルスのタンパク質に特異的に結合する抗体に関する。本発明の抗体には、天然に存在する抗体ならびに非天然に存在する抗体、例えば単鎖抗体、キメラ抗体、二機能性抗体およびヒト化抗体、ならびにその抗原結合フラグメントが含まれる。このような非天然に存在する抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築することができ、組換え生産させることができ、あるいは、例えば、可変重鎖および可変軽鎖からなる組み合わせライブラリーのスクリーニングによって取得することができる（Huse et al., Science 246: 1275-1281, 1989）。例えばキメラ、ヒト化、ＣＤＲ移植型、単鎖、および二機能性抗体のこれらおよび他の作成方法は当業者に周知である（Winter and Harris, Immunol. Today 14: 243-246, 1993; Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989; Harlow and Lane, Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); Hilyard et al., Protein Engineering: A practical approach, IRL Press 1992; Borrabeck, Antibody Engineering, 2d ed., Oxford University Press 1995）。本発明の抗体には、無傷の分子ならびにそのフラグメント、例えば本発明のポリペプチド中に存在するエピトープ決定基に結合可能なＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖが含まれる。
【０１３６】
免疫原として抗体産生に使用される本発明のＳＶＶポリペプチドのペプチド部分（すなわち、配列番号２由来の任意のペプチド断片）または本発明の別のウイルスポリペプチドのペプチド部分が非免疫原性である場合、ハプテンを担体分子、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にカップリングさせることによって、あるいは該ヘプチド部分を融合タンパク質として発現させることによって免疫原性にすることができる。種々の他の担体分子および、ハプテンを担体分子にカップリングさせるための方法は当技術分野において周知である（例えばHarlow and Lane, 上記, 1988）。例えばウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳類においてポリクローナル抗体を産生させるための方法は当技術分野において周知である（例えばGreen et al.,「ポリクローナル抗血清の製造（Production of Polyclonal Antisera）」, Immunochemical Protocols, Manson, ed., Humana Press 1992, pages 1-5; Coligan et al.,「ウサギ、ラット、マウスおよびハムスターでのポリクローナル抗血清の製造（Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters）」, Curr. Protocols Immunol. (1992), section 2.4.1を参照のこと）。
【０１３７】
モノクローナル抗体もまた、当技術分野において周知かつ通常の方法を使用して取得することができる（Kohler and Milstein, Nature 256: 495, 1975; Coligan et al., 上記, 1992, sections 2.5.1-2.6.7; Harlow and Lane, 上記, 1988）。例えば、ウイルス、ウイルスポリペプチドまたはその断片を用いて免疫化されたマウス由来の脾臓細胞を適切な骨髄腫セルラインに融合させてハイブリドーマ細胞を得ることができる。クローニングされたハイブリドーマセルラインを、例えば標識されたＳＶＶポリペプチドを使用してスクリーニングし、適切な特異性を有するモノクローナル抗体を分泌するクローンを同定することができ、また、望ましい特異性および親和性を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離し、該抗体の継続的供給源として利用することができる。同様に、例えば免疫化動物の血清からポリクローナル抗体を単離することができる。そのような抗体は、本発明の方法の実施に有用であることに加えて、例えば標準化キットの製造にも有用である。例えば単鎖抗体を発現する組換えファージもまた、標準化キットの製造に使用することができる抗体を提供する。例えば、種々の十分に確立された技術、例えばタンパク質Ａセファロースゲルを用いるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーによってハイブリドーマ培養からモノクローナル抗体を単離し、精製することができる（Barnes et al., Meth. Mol. Biol. 10: 79-104, Humana Press 1992); Coligan et al., 上記, 1992, sections 2.7.1-2.7.12 and sections 2.9.1-2.9.3を参照のこと）。
【０１３８】
タンパク質分解によって特定の抗体を加水分解するか、あるいはフラグメントをエンコードするＤＮＡを発現させることによって抗体の抗原結合フラグメントを製造することができる。慣用の方法によって全抗体をペプシンまたはパパイン消化することによって抗体フラグメントを得ることができる。例えば、抗体をペプシンで酵素的に切断して、Ｆ（ａｂ’）２と表される５Ｓフラグメントを提供することによって抗体フラグメントを製造することができる。チオール還元剤および、適宜、ジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基に関する保護基を使用して、本フラグメントをさらに切断して、３．５Ｓ Ｆａｂ’一価フラグメントを得ることができる。あるいは、ペプシンを使用する酵素的切断により、２個の一価Ｆａｂ’フラグメントおよびＦｃフラグメントを直接製造する（例えばGoldenberg, 米国特許第4,036,945号および第4,331,647号; Nisonhoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89: 230. 1960; Porter, Biochem. J. 73: 119, 1959; Edelman et al., Meth. Enzymol., 1: 422 (Academic Press 1967); Coligan et al., 上記, 1992, sections 2.8.1-2.8.10 and 2.10.1-2.10.4を参照のこと）。
抗体の抗原結合フラグメントの別の例は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチドは、目的の抗体のＣＤＲをエンコードするポリヌクレオチドを構築することによって取得することができる。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、抗体産生細胞から取得されるＲＮＡによってエンコードされる可変領域を合成することによって製造することができる（例えばLarrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106, 1991）。
【０１３９】
本発明の抗体は、例えば免疫検定での使用に適している。この場合、本抗体は液相中で、あるいは固相担体に結合させて利用することができる。さらに、これらの免疫検定における抗体は種々の方法で検出可能に標識することができる。本発明の抗体を利用することができる免疫検定のタイプの例は、直接または間接形式の競合的および非競合的免疫検定である。そのような免疫検定の例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）およびサンドイッチ（免疫測定）アッセイである。本発明の抗体を使用する抗原の検出は、フォワード、リバース、または同時様式で実行される免疫検定、例えば生理学的サンプルに関する免疫組織化学的アッセイを利用して行うことができる。当業者は、過度の実験をすることなく、他の免疫検定形式を認識するか、あるいは容易に判別することができる。
【０１４０】
通常の当業者に既知の多数の種々の標識および抗体標識法が存在する。本発明で使用することができる標識のタイプの例には、酵素、放射性同位元素、蛍光化合物、コロイド金属、化学発光化合物、リン光化合物、および生物発光化合物が含まれる。通常の当業者は、通常の実験法を使用して、抗体、または別法では抗原への結合に適切な他の標識を認識するか、あるいはそのような標識を見定めることができる。
【０１４１】
上記方法および組成物には、記載される本発明の範囲および思想から逸脱することなく、種々の変更を施すことができる。したがって、上記説明中に含まれ、添付の図面に示され、あるいは特許請求の範囲で規定されるすべての対象は例示的であるとみなされ、限定の意味では解釈されないものとする。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１４２】
以下に記載される実施例は、本発明を説明するために提供されるものであり、本発明を限定する目的で含まれるものではない。
【実施例１】
【０１４３】
ウイルスの増幅および精製
ＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるＳＶＶの培養：ＳＶＶを１回プラーク精製し、十分に単離されたプラークをつつき、ＰＥＲ．Ｃ６細胞中で増幅する（Fallaux et al., 1998）。３サイクルの凍結および解凍によってＳＶＶ感染ＰＥＲ．Ｃ６細胞由来の粗製のウイルスライセート（ＣＶＬ）を作成し、ＰＥＲ．Ｃ６細胞の感染に使用する。ＰＥＲ．Ｃ６細胞を５０ｘ１５０ｃｍ2のＴ．Ｃ．フラスコ中で培養する。培養には、１０％ウシ胎児血清（Biowhitaker, Walkersvile, MD, USA）および１０ｍＭ塩化マグネシウム（Sigma, St Louis, MO, USA）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Invitrogen, Carlsbad, CA, USA））を使用する。感染３０時間後に完全なＣＰＥが認められた時点で感染細胞を回収し、４℃で１５００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって収集する。細胞ペレットを細胞培養上清（３０ｍｌ）中に再懸濁し、３サイクルの凍結および解凍に付する。得られたＣＶＬを４℃で１５００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって浄化する。２ラウンドのＣｓＣｌ勾配によってウイルスを精製する：１段階勾配（ＣｓＣｌ密度１．２４ｇ／ｍｌおよび１．４ｇ／ｍｌ）、その後の１連続勾配遠心分離（ＣｓＣｌ密度１．３３ｇ／ｍｌ）。精製ウイルスの濃度を分光光度法で測定する。この場合、１Ａ260＝９．５ｘ１０12粒子を仮定する（Scraba D.G., and Palmenberg, A.C. 1999. カルジオウイルス（ピコルナウイルス科）（Cardioviruses（Picornaviridae））. In: Encyclopedia of Virology, Second edition, R.G. Webster and A Granoff Eds）。また精製ウイルスの力価を、ＰＥＲ．Ｃ６細胞を使用する標準プラークアッセイによって測定する。ＰＥＲ．Ｃ６細胞由来のＳＶＶの収量は２００，０００粒子／細胞を超え、粒子対ＰＦＵ比は約１００である。他の許容細胞（Ｈ４４６−ＡＴＣＣ＃ ＨＴＢ−１７１）由来のＳＶＶの収量は少なくとも上記と同程度に多く、あるいはより多いであろう。
【実施例２】
【０１４４】
電子顕微鏡観察
formvar炭素コーティンググリッド上に直接適用法を使用してＳＶＶをマウントし、酢酸ウラニルで染色し、透過型電子顕微鏡で検査する。ウイルスの典型的な顕微鏡写真を高倍率で撮影する。透過型電子顕微鏡では、包埋ブロックからＳＶＶ感染ＰＥＲ．Ｃ６細胞の超薄切片を切り出し、得られた切片を透過型電子顕微鏡で検査する。
精製ＳＶＶ粒子は球状で、直径約２７ｎｍであり、格子上、単独で、あるいは小凝集物中で観察される。ＳＶＶの典型的な写真を図２に示す。いくつかの場所では、染色剤の浸透を伴う、壊れたウイルス粒子および空のキャプシドも観察される。感染ＰＥＲ．Ｃ６細胞の超微細構造の研究では、細胞質に結晶性封入体が認められた。ＳＶＶに感染したＰＥＲ．Ｃ６細胞の典型的な写真を図３に示す。ウイルス感染細胞には数個の大きな小胞体（空の小胞）が認められた。
【実施例３】
【０１４５】
ＳＶＶの核酸単離
ＲＮＡ単離：チオシアン酸グアニジウムおよび、トリゾール（Trizol）（Invitrogen）を使用するフェノール抽出法を使用してＳＶＶゲノムＲＮＡを抽出した。供給元の推奨にしたがって単離を実施した。簡単には、精製ＳＶＶ２５０μｌを３容量のトリゾールおよびクロロホルム２４０μｌと混合した。ＲＮＡを含有する水相をイソプロパノール６００μｌで沈殿させた。ＲＮＡペレットを７０％エタノールで２回洗浄し、乾燥し、ＤＥＰＣ処理水に溶解した。抽出されたＲＮＡの量を２６０ｎｍでの光学濃度測定によって見積もった。一定量のＲＮＡを１．２５％変性アガロースゲル（Cambrex Bio Sciences Rockland Inc., Rockland, ME USA）に通して分離し、臭化エチジウム染色によってバンドを可視化し、写真撮影した（図４）。
ｃＤＮＡ合成：ＲＴ−ＰＣＲによってＳＶＶゲノムのｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡの合成は、ＲＮＡ １μｇ、ＡＭＶ逆転写酵素、およびランダムな１４量体オリゴヌクレオチドまたはオリゴｄＴを使用して標準条件下で実施した。ｃＤＮＡの断片を増幅し、プラスミドにクローニングし、クローンをシークエンシングする。
【実施例４】
【０１４６】
ＳＶＶ配列解析：
ＳＶＶ配列番号１のヌクレオチド配列を解析して、他のウイルスとの進化的関連性を決定した。このＯＲＦの翻訳産物（配列番号２）はピコルナウイルス様であり、ＶＰ２の中間から３Ｄポリメラーゼの末端の終止コドンに達し、１８９０アミノ酸長であった（図５Ａ−５Ｅおよび７Ａ−７Ｂ）。このＯＲＦの後に続く３’非翻訳領域（ＵＴＲ）であるヌクレオチド５６７１〜５７３４は６４ヌクレオチド（ｎｔ）長であり、終止コドンを含み、１８残基が提供されるポリ（Ａ）尾部を含まない（図５Ｅ）。
【０１４７】
ＳＶＶの３種の部分的ゲノムセグメントについての予備的比較（示していない）では、ＳＶＶがCardiovirus（カルジオウイルス）属（Picornaviridae（ピコルナウイルス科）ファミリー）のメンバーに最も密接に関連することが示されていた。したがって、ＳＶＶ、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ；Encephalomyocarditis virus種、Theilerのマウス脳脊髄炎ウイルス（ＴＭＥＶ；Theilovirus種）、Vilyuiskヒト脳脊髄炎ウイルス（ＶＨＥＶ；Theilovirus種）およびラットＴＭＥＶ様物質（ＴＬＶ；Theilovirus種）のポリタンパク質配列のアライメントを構築した（図２８）。本アライメントから、ＳＶＶポリタンパク質プロセシングを、最も近縁のカルジオウイルス属のメンバーのポリタンパク質プロセシングと比較した。図２８では、個々のポリペプチド間の切断部分は「／」文字で区切られる。
【０１４８】
ピコルナウイルスでは、ほとんどのポリタンパク質切断は、ウイルスによってエンコードされる１種またはそれ以上のプロテアーゼによって行われるが、カルジオ−、アフト−、エルボ−およびテシオウイルスにおいて、Ｐ１−２Ａおよび２Ｂ間の切断は、不十分にしか理解されていないシス作動性機構によって行われ、この機構は２Ａ配列そのものに関連し、また配列「ＮＰＧ／Ｐ」が決定的に関与する。この場合、「／」は２Ａおよび２Ｂポリペプチド間の分解を表す（Donnelly et al., 1997, J. Gen. Virol. 78: 13-21）。パレコウイルスの１種であるLjunganウイルスは、典型的なパレコウイルス２Ａの上流に存在するこの配列（ＮＰＧＰ 配列番号１１１）を有し、これは追加の２Ａであるか、あるいはＰ１キャプシド領域のＣ末端である。全９種の現在認められているピコルナウイルス属では、３Ｃproはシス作動性自己切断反応以外のすべてを実行する（すなわちエンテロ−およびライノウイルスでは２ＡはそのＮ末端で分解し、アフトウイルスおよびエルボウイルスではＬはそのＣ末端で分解する）。組み立て後のキャプシドポリペプチドＶＰ０からＶＰ４およびＶＰ２への切断は、３Ｃproによってではなく、ウイルスのＲＮＡが関与するかもしれない未知の機構によって行われる。パレコウイルスおよびコブウイルスではＶＰ０の切断は生じない。正常なカルジオウイルスの３Ｃpro切断部位は、−１位にグルタミン（Ｑ）またはグルタミン酸（Ｅ）を有し、＋１位にグリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アデニン（Ａ）またはアスパラギン（Ｎ）を有する（表２）。ＳＶＶポリタンパク質の切断は、ヒスチジン（Ｈ）／セリン（Ｓ）であるＶＰ３／ＶＰ１部位を除き、このパターンに一致する（表２）；しかし、少なくとも１系統のウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ；Aphthovirus属）においてＨ／Ｓはおそらく３Ａおよび３ＢVPg間の切断部位として存在する（Wutz et al., 1996, J. Gen. Virol. 77: 1719-1730）。
【０１４９】
表２．ＳＶＶおよびカルジオウイルスの切断部位
【表２】
2007506434.tif 000004
【０１５０】
ＳＶＶの初期切断（Ｐ１／Ｐ２およびＰ２／Ｐ３）：これらの初期切断イベントはカルジオ−、アフト−、エルボ−およびテシオウイルスと同様の様式で生じると予測され、配列ＮＰＧ／Ｐが関与する新規機構によってＰ１−２Ａが２Ｂから分離されること、および３Ｃproによる２ＢＣおよびＰ３間の従来の切断イベントが関与する（表２）。
Ｐ１切断：ＳＶＶ Ｐ１キャプシドコード領域内の切断は、ＥＭＣＶおよびＴＭＥＶとの配列のアライメントによって比較的容易に予測することができた（表２）。
Ｐ２切断：２Ｃタンパク質はＲＮＡ合成に関与する。ＳＶＶの２Ｃポリペプチドは、推定ヘリカーゼおよびすべてのピコルナウイルス２Ｃに存在するＮＴＰ結合モチーフＧｘｘＧｘＧＫＳ／Ｔ（ドメインＡ）およびｈｙｈｙｈｙｘｘＤ（この場合、ｈｙは任意の疎水性残基である；ドメインＢ）を含有する（図２９）。
Ｐ３切断：Ｐ３切断部位の予測もまた比較的簡単であった。３Ａポリペプチドの機能についてはほとんど知られていない。しかし、すべてのピコルナウイルス３Ａタンパク質は推定の膜貫通アルファ−ヘリックスを含有する。ＳＶＶおよびカルジオウイルス間でこのタンパク質の一次配列の同一性は低い（図２８の位置１６１２〜１７０１間を参照のこと）。
【０１５１】
３Ｂ領域によってエンコードされる、ゲノム結合型ポリペプチドＶＰｇは、他のカルジオウイルスと共通のアミノ酸を少数しか共有しないが、３番目の残基はチロシンであり、これはウイルスゲノムの５’末端へのその結合に適合性である（Rothberg et al., 1978）。図２８の位置１７０３〜１７２４間を参照のこと。
４種のピコルナウイルスの３Ｃシステインプロテアーゼの三次元構造が解明され、活性部位残基が同定されている（HAV, Allaire et al., 1994, Nature, 369: 72-76; Bergmann et al., 1997, J. Virol., 71: 2436-2448; PV-1, Mosimann et al., 1997, J. Mol. Biol., 273: 1032-1047; HRV-14, Matthews et al., 1994, Cell, 77: 761-771; and HRV-2, Matthews et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 11000-11007）。図２９において太字のシステインは求核基であり、一方、第一の太字のヒスチジンは一般的塩基であり、グルタミン残基の特異性は主に第二の太字のヒスチジンによって規定される；全３残基はＳＶＶ配列（図２９）およびすべての他の既知のピコルナウイルスで保存されている（図２８；３Ｃ配列の比較に関しては、位置１７２６〜１９４６間を参照のこと）。
【０１５２】
３ＤポリペプチドはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの主要コンポーネントであり、ＳＶＶはピコルナ様ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼで保存されるモチーフ、すなわちＫＤＥＬ／ＩＲ（配列番号１１３）、ＰＳＧ、ＹＧＤＤ（配列番号１１４）およびＦＬＫＲ（配列番号１１５）を含有する（図３；図２８の位置１９４８〜２４１０間）。
Ｐ１のＮ末端のミリストイル化：ほとんどのピコルナウイルスでは、Ｐ１前駆ポリペプチドはそのＮ末端グリシン残基（Ｎ末端メチオニンが除去されている場合に存在）によってアミド結合を介してミリスチン酸の分子に共有結合している（Chow et al., 1987, Nature, 327: 482-486）。結果的に、Ｐ１のＮ末端を含有する切断産物ＶＰ０およびＶＰ４もまたミリストイル化される。このミリストイル化は、グリシンで始まる８アミノ酸シグナルを認識するミリストイルトランスフェラーゼによって行われる。ピコルナウイルスでは、５残基の共通配列モチーフＧ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｔ／Ｓが同定されている（Palmenberg, 1989, ピコルナウイルス感染および検出の分子的側面において（In Molecular Aspects of Picornavirus Infection and Detection）, pp. 211-241, Ed. Semler & Ehrenfeld, Washington D.C., Amer. Soc. for Micro.）。パレコウイルス（Human parechovirusおよびLjungan virus）ならびにＶＰ０の成熟切断段階を有さないものは明らかにミリストイル化されないが、これらのウイルスではＶＰ０のＮ末端をブロックする何らかのタイプの分子が存在すると考えられる。
【０１５３】
個々のＳＶＶポリペプチドと公共の配列データベースの比較
各ＳＶＶポリペプチド（配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０および２２）を公共のタンパク質配列データベースと比較した。この比較では、European Bioinformatics Institute（ＥＢＩ；http://www.ebi.ac.uk/）のFASTAオンラインプログラムを使用した。これらの比較の結果（最大一致）を表３に示す。２Ｃ、３Ｃproおよび３Ｄpolに沿って、全体として見ると、キャプシドポリペプチド（ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ１）はカルジオウイルス属のメンバーと最も密接に関連するが、短い予測の２Ａ配列はLjunganウイルス（Parechovirus属）の配列により近い。ＳＶＶ ２Ａヌクレオチド配列と類似の配列のさらに詳細な比較を図２８に示す（また、２Ａ様ＮＰＧ／Ｐ（配列番号１１１）タンパク質の比較に関しては図７０を参照のこと）。
【０１５４】
表３．Seneca Valleyウイルスの個々の予測ポリペプチドのデータベース一致
【表３】
2007506434.tif 000005
【０１５５】
ＳＶＶの２ＢとUreaplasma urealyticum（ウレアプラズマ・ウレアリチカム）の複数バンドの抗原または３ＡとChlorobium tepidumエンドラーゼ２の一致についての重要性は明らかではないが、これらの関連性はさらに研究する価値があるかもしれない。
ＳＶＶポリペプチドと他のピコルナウイルスの系統発生的比較
カルジオウイルスとアライメントすることができるＳＶＶポリペプチド（ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１、２Ｃ、３Ｃおよび３Ｄ）を各ピコルナウイルス種の代表的なメンバーの同一のタンパク質と比較した（表４）。プログラムBioEdit v5.0.9（Hall, 1999, Nucl. Acids. Symp. Ser., 41: 95-98）およびClustal X v1.83（Thompson et al., 1997, Nucl. Acids Res., 25: 4876-4882）を使用してアライメントを作成し、距離マトリックスおよび無根近隣結合ツリーをSaitouおよびNei（Satiou and Nei, 1987, Mol. Biol. Evol., 4: 406-425）のアルゴリズムにしたがって構築した。ブートストラップリサンプリング（１０００疑似反復（pseudo-replicates））によって分岐に関する信頼限界に近づけた。TreeView 1.6.6（Page, 1996）を使用してツリーを描いた（図３１〜３７）。ツリーを構築するために使用された距離マトリックスでは、複数の置換に関して補正された値を使用したが、図３８〜４４は実際のアミノ酸同一性パーセントを示す。表４は、これらの比較において使用されたPicornaviridaeファミリーの現在の分類および代表的なウイルス配列を示す。
【０１５６】
表４．ＳＶＶとの比較において使用されるピコルナウイルスの分類学的分類
【表４】
2007506434.tif 000006
【０１５７】
個々のキャプシドタンパク質についてのツリー（図３１〜３３）は、すべてのツリーのポリペプチド由来のデータを組み合わせた場合に作成されるツリー（図３４）のすべてを表すものではない。おそらくこれは、キャプシドポリペプチドのアライメントが、特にＶＰ２の場合のようにそれらが完全長でない場合には困難であることに起因する（図３１）。しかし、Ｐ１、２Ｃ、３Ｃproおよび３Ｄpolのツリーはすべて調和し、ＳＶＶがＥＭＣＶおよびＴＭＥＶとクラスター形成することを示す。
【０１５８】
カルジオウイルス属のメンバーであるSeneca Valleyウイルス
明らかにＳＶＶの３Ｄpolはカルジオウイルスに関連し、この関連性はＥＭＣＶおよびＴＭＥＶが互いに関連するのとほぼ同程度に密接である（図３７；図４４）。ピコルナウイルスで比較的保存されていると一般に考えられる他のポリペプチド、２Ｃおよび３Ｃでは、同様にＳＶＶはカルジオウイルスに最も密接に関連するが、ＥＭＣＶおよびＴＭＥＶが互いに密接に関連するほど、それらに密接に関連するわけではない（それぞれ図４２および図４３）。外側キャプシドタンパク質では（全体として見ると）、同様にＳＶＶはカルジオウイルスに最も密接に関連し、２種のアフトウイルス種、Foot-and-mouth disease virus（口蹄疫ウイルス）およびEquine rhinitis A virusとほぼ同一の関連性（〜３３％）を有する。ＳＶＶは、２Ｂおよび３Ａポリペプチドがカルジオウイルスと非常に異なり、任意の既知のピコルナウイルスと検出可能な関連性を有さない。しかし、これは前例がないわけではない；トリ脳脊髄炎ウイルスは２Ａ、２Ｂおよび３ＡがＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）とはかなり異なる（Marvil et al., 1999, J. Gen.Virol., 80: 653-662）が、ＨＡＶとともにHepatovirus属内に仮分類される。
【０１５９】
ＥＭＣＶおよびＴＭＥＶが標準であるとすると、Seneca Valleyウイルスは明らかに典型的なカルジオウイルスではない。しかし、これらの２ウイルスでさえ差異を有し、この差異は５’ＵＴＲにおいて著しい （Pevear et al., 1987, J. Gen. Virol., 61: 1507-1516）。しかし、系統学的にＳＶＶはそのポリタンパク質の大半（Ｐ１、２Ｃ、３Ｃproおよび３Ｄpol領域）においてＥＭＣＶおよびＴＭＥＶとクラスター形成する。最終的に、ピコルナウイルス科内のＳＶＶの分類学的位置は、国際ウイルス分類委員会（International Committee for the Taxonomy of Viruses）（ＩＣＴＶ）の実行委員会（Executive Committee）（ＥＣ）によって決定される。この決定は、Picornaviridae研究グループ（Picornaviridae Study Group）の推奨および立証用の公開されている材料にしたがって行われる。２つの選択肢が存在する：ｉ）ＳＶＶをカルジオウイルス属の新規種として含む；あるいはｉｉ）ＳＶＶを新規属に割り当てる。現段階では、ならびに本発明の目的では、ＳＶＶはカルジオウイルス属に含まれる。
[実施例４]
【０１６０】
ＳＶＶキャプシドタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＮ末端配列解析
精製済みＳＶＶを電気泳動に付する。泳動には、NuPAGEプレキャストビス−トリスポリアクリルアミドミニゲル電気泳動システム（Novex, San Diego, Ca, USA）を使用する。ゲルの半分を銀染色によって可視化し、他の半分を使用して、キャプシドタンパク質のＮ末端のアミノ酸をシークエンシングするためのサンプルを調製する。タンパク質をメンブレンにトランスファーする前に、ゲルを１０ｍＭ ＣＡＰＳバッファー、ｐＨ１１、に１時間浸し、ＰＶＤＦ膜（Amersham）をメタノール中で湿らせる。タンパク質をＰＶＤＦ膜にトランスファーする。トランスファー後、タンパク質をアミドブラックで約１分間染色することによって可視化し、目的のバンドをメスで切り出し、空気乾燥する。このタンパク質を、エドマン分解に基づく自動化Ｎ末端配列決定に付することができる。この配列決定ではパルスフェーズ（pulsed phase）シーケンサーを使用する。
【０１６１】
精製ＳＶＶの３種の主要構造タンパク質を図４５に示す（約３６ｋＤａ、３１ｋＤａ、および２７ｋＤａ）。
【実施例５】
【０１６２】
ヒト血清サンプル中のＳＶＶに対する中和抗体に関するアッセイ
特定のウイルスベクターに対する既存の抗体は、全身送達による適用、例えば転移性癌の処置に関して該ベクターの使用を制限する可能性がある。その理由は、ベクターが標的組織または器官に形質導入する機会を得る前に、既存の抗体が全身送達されたベクターに結合し、それらを中和する可能性があるからである。したがって望ましいのは、全身送達用に選択されるウイルスベクターに対する中和抗体をヒトが保持しないことを保証することである。ヒト血清サンプルがＳＶＶ特異的中和抗体を含有するかどうかを判定するために、ランダムに収集されたヒト血清サンプルを使用して中和アッセイを行う。
組織培養感染価５０：実験の１日前に、１ｘ１０4細胞を含有するＰＥＲ．Ｃ６細胞懸濁液１８０μｌを９６ウェル組織培養皿にプレートする。ＳＶＶの粗製のウイルスライセート（ＣＶＬ）をＤＭＥＭ培地（ダルベッコ変法イーグル培地）中で１０-0〜１０-11の対数段階で希釈し、ＰＥＲ．Ｃ６細胞を含有するFalcon９６ウェル組織培養プレートの３ウェルに各希釈物２０μｌを移す。このプレートを３７℃で５％ＣＯ2中でインキュベートし、３日目に細胞変性作用（ＣＰＥ）についての微視的な証拠を読み取り、組織培養感染価５０（ＴＣＩＤ50）を算出する。
【０１６３】
中和アッセイ：まず、すべてのウェルに培地４０μｌを入れ、次いで非働化血清４０μｌを第一のウェルに加え、ピペッティングによって混合し、スクリーニング目的で使用される１：４希釈物を作成する。次いで４０μｌを次のウェルに移し、血清サンプルの２倍希釈を実施する。１００ＴＣＩＤ50を含有するＳＶＶウイルス４０μｌを、希釈血清サンプルを含有するウェルに加える。プレートを３７℃で１時間インキュベートする。混合物４０μｌを採取し、ＰＥＲ．Ｃ６細胞を含有するプレート（１ｘ１０4細胞／１６０μｌ／ウェル）に移す。このプレートを３７℃で３日間インキュベートする。この期間の後、ＣＰＥに関して培養を顕微鏡で読み取る。
【０１６４】
上記のように実施される代表的な中和アッセイでは、米国、欧州および日本からランダムに収集された２２種のヒト血清サンプルをＳＶＶ特異的中和抗体に関して検査した。血清サンプルを連続希釈し、１００ＴＣＩＤ50を含有する固定量のＳＶＶと混合した。次いで血清−ウイルス混合物を使用してＰＥＲ．Ｃ６細胞を感染させ、２４時間インキュベートした。ＣＰＥ形成をブロックすることができる血清の最大希釈の逆数として中和抗体価を決定した。この実験では、血清の希釈物はいずれもＣＰＥ形成をブロックしなかった。これはヒト血清サンプルがＳＶＶ中和抗体を含有しなかったことを示す。
さらに、ヒト血液とのインキュベーションによってＰＥＲ．Ｃ６のＳＶＶ感染が阻害されなかった（実施例６を参照のこと）。これはＳＶＶ感染が補体によって、あるいは赤血球凝集によって阻害されなかったことを示す。結果として、ＳＶＶは他の腫瘍溶解性ウイルスより長いインビボの循環期間を示す。この点は腫瘍溶解性アデノウイルスの使用に伴う重大な問題である。
【実施例６】
【０１６５】
ＳＶＶとヒト赤血球の結合および赤血球凝集
種々のウイルス血清型は、種々の動物種の血液から単離された赤血球のインビトロ赤血球凝集を生じさせることが示されている。赤血球凝集または赤血球への結合はインビボで毒性を生じさせる可能性があり、またインビボでのウイルスベクターの体内分布および効果に影響する可能性がある。したがって、転移性癌を処置する全身投与に関して選択されるウイルスベクターの赤血球凝集特性を分析することが望ましい。
赤血球凝集アッセイ：ＳＶＶがヒト赤血球の凝集を生じさせるかどうかを判定するために、Ｕ底９６ウェルプレートで赤血球凝集アッセイを行う。精製ＳＶＶをＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）２５μｌ中で２通りに連続希釈し、等しい容量の１％赤血球懸濁液を各ウェルに加える。ヘパリンを抗凝固剤として用いて、赤血球の単離に使用される血液サンプルを健康な個体から取得する。冷ＰＢＳ中で血液を３回洗浄することによって赤血球を調製し、血漿および白血球を除去する。最終洗浄後、赤血球をＰＢＳに懸濁し、１％（Ｖ／Ｖ）細胞懸濁液を作成する。ウイルスおよび赤血球を穏やかに混合し、プレートを室温で１時間インキュベートし、赤血球凝集パターンに関してモニターする。
全血不活性化アッセイ：血液成分によってＳＶＶが直接不活性化されるのを排除するために、一定量のウイルスをＡ、Ｂ、ＡＢおよびＯ血液型に属するヘパリン添加ヒト血液またはＰＢＳと室温で３０分間または１時間インキュベートした後、血漿を分離し、その後ＰＥＲ．Ｃ６細胞を感染させ、力価を算出する。
上記のように実施される代表的なアッセイでは、ＳＶＶの任意の試験希釈物で種々の血液型（Ａ、Ｂ、ＡＢおよびＯ）のヒト赤血球の赤血球凝集が全く観察されなかった。ＳＶＶを血液ヒトサンプルと混合し、３０分間および１時間インキュベートした場合にウイルス力価の軽微な増加が認められる。これはウイルスが血液成分によって不活性化されないが、試験条件下でより感染性になることを示す。
【実施例７】
【０１６６】
インビボクリアランス
血液循環期間：血液循環期間および腫瘍中のウイルスの量を測定するために、Ｈ４４６腫瘍を保持するヌードマウスをＳＶＶで処置した。この処置は、１ｘ１０12ｖｐ／ｋｇの用量で尾静脈注射によって行った。注射後０、１、３、６、２４、４８、７２時間および７日（１８９時間）の時点でマウスから採血し、収集直後に血液から血漿を分離し、感染培地中で希釈し、ＰＥＲ．Ｃ６細胞の感染に使用した。注射を受けたマウスを注射後６、２４、４８、７２時間および７日の時点で犠牲にし、腫瘍を収集した。この腫瘍をカットして小切片にし、培地１ｍｌに懸濁し、３サイクルの凍結および解凍に付して、感染細胞からウイルスを放出させた。上清の連続対数希釈物を作成し、ＰＥＲ．Ｃ６細胞に対する力価に関してアッセイした。ＳＶＶ力価をｐｆｕ／ｍｌで表した。またこの腫瘍切片をＨ＆Ｅ染色および免疫組織化学に付して、腫瘍中のウイルスキャプシドタンパク質を検出した。
マウス体重の７．３％が血液であるという仮定に基づいて血液中のウイルス粒子の循環レベルを測定した。本質的に上記のように実施される代表的なアッセイでは、ウイルス投与後６時間のうちに、ＳＶＶの循環レベルはゼロ粒子に減少し、後の時点ではＳＶＶは検出できなかった（図４６Ａ）。腫瘍では、ＳＶＶは注射後６時間の時点で検出可能であり、その後ウイルスの量は２対数まで安定して増加した（図４６Ｂ）。このウイルスは、腫瘍中、注射７日後になっても検出可能であった（図４６Ｂ）。免疫組織化学に付すると、この腫瘍切片では腫瘍細胞中のＳＶＶタンパク質が認められた（図４７、上パネル）。Ｈ＆Ｅによって染色すると、この腫瘍切片ではいくつかの丸い腫瘍細胞が認められた（図４７、下パネル）。
またＳＶＶは、同様の用量の静脈内アデノウイルスと比較して実質的に長期の血液中の存在期間を示す。１回のｉ．ｖ．投与後、ＳＶＶは６時間まで血液中に存在し続ける（図４６Ｃ；図４６Ｃは図４６Ｄと比較するための図４６Ａの複製である）が、アデノウイルスは約１時間のうちに血液から排除される（図４６Ｄ）。
【実施例８】
【０１６７】
腫瘍細胞選択性
ＳＶＶのインビトロ殺細胞活性：ヒト、ウシ、ブタ、およびマウス細胞の感受性を測定するために、種々の供給源から正常および腫瘍細胞を取得し、ＳＶＶを感染させた。培地中で、供給元が推奨する条件下で、すべての細胞型を培養した。初代ヒト肝細胞は、In Vitro Technologies（Baltimore, MD）から購入し、Hepatocye Culture Media（HCMTM、BioWhittaker/Clonetics Inc., San Diego, CA）中で培養してよい。
インビトロ細胞変性アッセイ：どの型の細胞がＳＶＶ感染に感受性であるかを判定するために、単層の増殖性正常細胞および腫瘍細胞に精製ＳＶＶの連続希釈物を感染させた。この細胞をＣＰＥに関してモニターし、非感染細胞と比較した。感染３日後、ＭＴＳ細胞障害性アッセイを実施し、細胞当たりの粒子中の５０％致死量（ＬＤ50）値を算出する。以下の表５および６を参照のこと。
【０１６８】
表５．１００未満のＥＣ50値を有するセルライン
【表５】
2007506434.tif 000007
【０１６９】
表６．１０００を超えるＥＣ50値を有するセルライン
【表６】
2007506434.tif 000008
【０１７０】
製造元の指示書にしたがってＭＴＳアッセイを実施した（CellTiter 96（登録商標）AQueous Assay、Promega, Madison, WI）。CellTiter 96（登録商標）AQueous Assayでは、好ましくは、テトラゾリウム化合物（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内部塩；ＭＴＳ）および電子カップリング試薬、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）を使用する。本研究で評価された接触阻害型正常ヒト細胞には、以下に挙げるものが含まれる：ＨＵＶＥＣ（ヒト臍静脈内皮細胞）、ＨＡＥＣ（ヒト大動脈内皮細胞、Clonetics/BioWhittaker ＃ＣＣ−２５３５）、Ｗｉ３８（正常ヒト胚肺線維芽細胞、ＡＴＣＣ ＃ＣＣＬ−７５）、ＩＭＲ９０（ヒト正常肺線維芽細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８６）、ＭＲＣ−５（ヒト正常肺線維芽細胞、ＡＴＣＣ，＃ＣＣＬ−１７１）およびＨＲＣＥ（ヒト腎皮質上皮細胞、Clonetics/BioWhittaker ＃ＣＣ−２５５４）。
【０１７１】
ＳＶＶは任意の上記接触阻害型正常細胞においてＣＰＥを示さない。以下のヒト腫瘍セルラインにおいてウイルス誘発性ＣＰＥは観察されなかった：Ｈｅｐ３Ｂ（ＡＴＣＣ ＃ＨＢ−８０６４）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝細胞癌、ＡＴＣＣ ＃ＨＢ−８０６５）、ＬＮＣａＰ（ヒト前立腺癌腫、ＡＴＣＣ ＃ＣＲＬ−１０９９５）、ＰＣ３Ｍ−２ＡＣ６、ＳＷ６２０（ヒト結腸直腸腺癌、ＡＴＣＣ ＃ＣＣＬ−２２７）、ＳＷ８３９（ヒト腎臓腺癌、ＡＴＣＣ ＃ＨＴＢ−４９）、５６３７（ヒト膀胱癌腫、ＡＴＣＣ ＃ＨＴＢ−９）、ＤＭＳ−１１４（小細胞肺癌、ＡＴＣＣ ＃ＣＲＬ−２０６６）、ＤＭＳ１５３（ヒト小細胞肺癌、ＡＴＣＣ ＃ＣＲＬ−２０６４）、Ａ５４９（ヒト肺癌腫、ＡＴＣＣ ＃ＣＣＬ−１８５）、ＨｅＬａ Ｓ３（ヒト（子宮）頚部腺癌、ＡＴＣＣ ＃ＣＣＬ−２．２）、ＮＣＩ−Ｈ４６０（ヒト大細胞肺癌、ＡＴＣＣ ＃ＨＴＢ−１７７）、ＫＫ（グリア芽細胞腫）、およびＵ−１１８ＭＧ（ヒトグリア芽細胞腫、ＡＴＣＣ ＃ＨＴＢ−１５）。注−表６中の１０００を超えるＥＣ50値を有するセルラインはＳＶＶの複製および／またはビリオン生産を許容しない可能性が高い；しかし、ＳＶＶはこれらの細胞に結合および侵入することができるが、細胞の内部でＳＶＶの複製が生じ得ないためにＣＰＥが観察されないか、あるいは複製は実際に生じるが、なんらかの他の侵入後のブロック段階が存在するためにＣＰＥが観察されない（すなわち、複製されたＳＶＶゲノムがビリオン内にパッケージされない）可能性が残る。しかし、これらのセルラインにおいてＣＰＥが存在しないことを考慮すると、これらのセルラインおよびその潜在的な腫瘍型は、どの細胞および腫瘍型がＳＶＶの複製に許容的または非許容的であるかを試験する良好な候補である。野生型ＳＶＶは腫瘍特異的であり、神経内分泌腫瘍、例えば小細胞肺癌および神経芽細胞腫を標的にすることが示されているが、ＳＶＶがその神経内分泌腫瘍型において許容的ではないタイプの病因を有する個別の患者が存在する可能性がある。したがって本発明は、腫瘍が野生型ＳＶＶに対して非許容的である場合の個別の患者から単離される腫瘍細胞型を死滅させることができるＳＶＶ誘導体の作成を実際に考慮し、これらの個体から単離される腫瘍型には、例えば、グリア芽細胞腫、リンパ腫、小細胞肺癌、大細胞肺癌、黒色腫、前立腺癌、肝癌、結腸癌、腎臓癌、結腸癌、膀胱癌、直腸癌および扁平細胞肺癌が含まれ得る。
【０１７２】
初代ヒト肝細胞（In Vitro Technologies）に対するＳＶＶ媒介性の細胞障害性をＬＤＨ放出アッセイによって測定した（CytoTox（登録商標）96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay、Promega, # G1780）。コラーゲンでコーティングされた１２ウェルプレートにプレートされた初代ヒト肝細胞に、１、１０および１００および１０００粒子／細胞（ｐｐｃ）でＳＶＶを感染させた。３時間の感染後、感染培地を増殖培地２ｍｌに取り替えて、ＣＯ2インキュベーターで３日間インキュベートした。細胞結合型の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）および培養上清中のＬＤＨを別々に測定した。最大の細胞性ＬＤＨ＋上清ＬＤＨに対する上清中のＬＤＨ単位の割合として細胞障害性パーセントを決定する。
％細胞障害性＝（培養上清中のＬＤＨ単位 Ｘ １００）／（上清および細胞ライセート中のＬＤＨ単位の合計）
図４８に示されるデータは、すべての試験感染多重度でＳＶＶ媒介性の肝毒性が存在しないことを示す。
【実施例９】
【０１７３】
ウイルス生産のアッセイ
ＳＶＶの複製能を評価するために、複数の選択された接触阻害型正常細胞および活発に分裂する腫瘍細胞に１ウイルス粒子／細胞（ｐｐｃ）でＳＶＶを感染させた。７２時間後、細胞および培地を３回の凍結−解凍サイクルに付し、遠心分離して上清を収集した。上清の連続対数希釈物を作成し、ＰＥＲ．Ｃ６細胞に対する力価に関してアッセイした。各セルラインに関して、ＳＶＶの複製効率をｐｆｕ／ｍｌで表した（図４９）。
【実施例１０】
【０１７４】
毒性
最大許容投与量（ＭＴＤ）は、ＳＶＶでの処置後に動物（例えばマウス）が用量規定毒性（ＤＬＴ）を示す用量の直前の用量として規定する。ＤＬＴは、研究の全期間中でＳＶＶ投与に起因して動物が体重減、症状、および死亡を示す用量として規定する。ＳＶＶに対する中和抗体を、ベースライン、１５日目、および２１日目に評価した。前記のように中和アッセイを行った。
増加用量（１ｘ１０8〜１ｘ１０14ｖｐ／ｋｇ）のＳＶＶを、Harlan Sprague Dawley（Indianapolis, IN, USA）から購入した免疫欠損ヌードおよび帝王切開由来１（ＣＤ−１）非近交系免疫適格性マウスの両者に静脈内投与し、１０マウス／用量レベルでＭＴＤを測定した。このウイルスはすべての試験用量レベルで十分に許容され、臨床症状を全く示さず、体重の喪失はなかった（図５０）。１５および２１日目にマウスから採血し、中和アッセイにおいてＳＶＶ特異的中和抗体の存在に関して血清をモニターした。ＳＶＶを注射されたＣＤ１マウスは中和抗体を産生し、その力価は１／１０２４〜１／４０９６超の範囲である。
免疫適格性マウス系統（Ａ／Ｊ）に対して別の毒性研究を行った。ＳＶＶはＮ１Ｅ−１１５細胞において殺細胞活性および複製を示すことが実証されている（表１を参照のこと）。マウスセルラインＮ１Ｅ−１１５（神経芽細胞腫セルライン、すなわち神経内分泌癌）はＡ／Ｊマウス系統に由来する。ゆえに、Ａ／ＪマウスにＮ１Ｅ−１１５細胞を皮下移植して腫瘍を形成させた同系マウスモデルを確立し、そしてこのマウスをＳＶＶで処置して、その効果および毒性を研究した。
Ａ／Ｊの研究では、マウスにＳＶＶをｉ．ｖ．注射して、Ａ／ＪマウスがＳＶＶの全身投与を許容できるかどうかを判定した。毒性の徴候を調査するために血液の血液学的結果を取得した。また血清化学的結果を取得することができる。この研究デザインを以下の表７に示す：
【０１７５】
表７：Ａ／Ｊ研究デザイン
【表７】
2007506434.tif 000009
【０１７６】
Ａ／Ｊマウスは、The Jackson Laboratory（Bar Harbor, Maine）から取得された８〜１０週齡のメスであった。単離されたビリオンを使用時まで−８０℃で保存することによってＳＶＶを調製した。ＳＶＶを氷上で解凍し、ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液）で希釈することによって新たに調製した。ＳＶＶを、群２では１０7粒子／ｍＬ、群３では１０10粒子／ｍＬ、群４では１０13粒子／ｍＬの濃度に希釈した。群１ではビヒクルコントロールとしてＨＢＳＳを使用した。すべての投与用溶液を投与時までウェットアイス上で維持した。
ＳＶＶを動物に投与した。この投与は、尾静脈を介する静脈内注射により、１０ｍＬ／体重ｋｇの投与容量で行った。投与日に動物の体重を測定し、体重に基づいて投与容量を調節した（すなわち０．０２００ｋｇマウスは投与用溶液０．２００ｍＬを受ける）。罹患率および死亡率に関してマウスを１日２回モニターした。毎週２回マウスの体重を測定した。瀕死の動物および任意の（肉体的または行動的に) 異常な症状を示す動物に関する情報を即時に記録する。
死後観察および測定では、標準血液学および血清化学（ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＢＵＮ、ＣＫ、ＬＤＨ）のために、最終的に犠牲を払ってすべての生存動物から血液を収集することが必要である。犠牲を払って以下に挙げる器官を収集すべきであろう：脳、心臓、肺、腎臓、肝臓、および生殖腺。各器官サンプルの半分をドライアイス上でスナップフリーズし、他の半分をホルマリン中に入れる。
ＳＶＶ注射の２週間後に初期の血液の血液学的結果（ＣＢＣ、ディファレンシャル）を得た。その結果を以下の表８にまとめる。各試験群（表７を参照のこと）から５マウスを試験した：
【０１７７】
表８：Ａ／Ｊ毒性結果−血液の血液学
【表８】
2007506434.tif 000010
【０１７８】
これらの結果は、未処理マウスから得られた血液の血液学プロファイルと比べて、低、中および高用量のＳＶＶで処置されたマウスから得られた血液の血液学プロファイルには異常性が存在しないことを示す。本研究から、ＳＶＶの全身投与後に毒性の測定可能な徴候は存在しないと結論することができ、これはｉ．ｖ．注射を受けたＡ／ＪマウスによってＳＶＶが許容されることを示す。
【実施例１１】
【０１７９】
効果
Harlan Sprague Dawley（Indianapolis, IN）から購入した６〜７週齢の胸腺欠損雌性ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）を使用して、効果の研究を行った。手動拘束を使用して、マウスの右側腹部内に５ｘ１０6のＨ４４６細胞を皮下注射した。腫瘍サイズを定期的に測定し、式：π／６ ｘ Ｗ ｘ Ｌ2、式中Ｌ＝腫瘍の長さおよびＷ＝腫瘍の幅、を使用してその容量を算出した。腫瘍が約１００〜１５０ｍｍ3に達した時点で、マウス（ｎ＝１０）をランダムに群に分けた。マウスに増加用量のＳＶＶを注射した。この注射は尾静脈注射により１０ｍｌ／ｋｇの投与容量で行った。コントロール群のマウスには等容量のＨＢＳＳを注射した。用量増加は１ｘ１０7から１ｘ１０13粒子／体重ｋｇまで進める。ＳＶＶ投与後に毎週２回腫瘍容量を測定することによって抗腫瘍効果を決定した。完全寛解は異種移植片の完全消失と規定し；部分的寛解は５０％に等しいか、あるいはそれ以上の腫瘍容量の退行と規定し；ならびに無応答（無寛解）はコントロール群と同様の腫瘍の継続的増殖と規定した。
【０１８０】
ＨＢＳＳで処置されたマウス由来の腫瘍は急速に増殖し、研究２０日までに腫瘍容量は２０００ｍｍ3以上に達した（図５１；白ダイアモンド形のラインを参照のこと）。対照的に、ＳＶＶの１回の全身性注射を受けたマウスは、すべての試験用量（最低用量を除く）で研究２０日までに腫瘍を含有しなくなった。最低用量群では、研究３１日までに、８マウスは腫瘍を含有しなくなり、１マウスは非常に大きい腫瘍を有し、他のマウスは小さい触知可能の腫瘍（２５ｍｍ3）を有した。大きいサイズの腫瘍に対するＳＶＶの抗腫瘍活性を評価するために、研究２０日目に、＞２０００ｍｍ3の腫瘍を保持するＨＢＳＳ群由来の５マウスに１ｘ１０11ｖｐ／ｋｇの単一用量を全身性注射した。追跡期間（ＳＶＶ注射後の１１日間）中では、腫瘍容量の劇的な退行が認められた（図５１）。
図５２は、ＳＶＶで「未処置」の（すなわちＨＢＳＳで処置された）マウスまたはＳＶＶで「処置された」マウスの写真を示す。図に示されるように、未処置マウスは非常に大きい腫瘍を有し、処置マウスは腫瘍の観察可能な徴候を示さなかった。さらに、犠牲にされなかったＳＶＶ処置マウスでは、２００日間の研究期間中に腫瘍の再増殖は観察されなかった。
【０１８１】
特定の腫瘍セルラインに関するインビトロでのＳＶＶの効果データを表１および５に示す。このデータは、ＳＶＶが特定の腫瘍細胞型に特異的に感染し、正常な成熟細胞に感染しないことを示し、この点は任意の他の既知の腫瘍溶解性ウイルスと比べて重大な利点である。ＳＶＶは、化学療法による処置より１，０００倍良好な殺細胞特異性を有することが示されている（ＳＶＶの殺細胞特異性の値は１０，０００を超えることが示されているが、化学療法の殺細胞特異性の値は１０付近である）。
ＳＶＶの特異的細胞障害活性を、Ｈ４４６ヒトＳＣＬＣ細胞において実証した。増加濃度のＳＶＶと２日間のインキュベーション後、細胞生存度を測定した。この結果を図５３に示す。図５３は、ＳＶＶをＨ４４６ＳＣＬＣ腫瘍細胞（上グラフ）または正常ヒトＨ４６０細胞（下グラフ）とインキュベートした後の細胞生存性を示す。ＳＶＶは約１０-3粒子／細胞のＥＣ50で腫瘍細胞を特異的に死滅させた。対照的に、正常なヒト細胞はいずれのＳＶＶ濃度でも死滅しなかった。さらに、表１〜３にまとめるように、ＳＶＶは多数の他の腫瘍セルライン、例えばＳＣＬＣ−多剤耐性腫瘍細胞に対しても細胞障害性であった。他の腫瘍セルラインに関するＳＶＶの細胞障害性のＥＣ50値は、１０-3〜２０，０００粒子／細胞を超える範囲であった。種々の他の非神経系の腫瘍および正常なヒト組織に対してＳＶＶは非細胞障害性であった。さらに、１０００粒子／細胞までのＬＤＨ放出によって測定したところ、ＳＶＶは初代ヒト肝細胞に対して細胞障害性ではなかった（図４８を参照のこと）。
【実施例１２】
【０１８２】
げっ歯類における体内分布および薬物動態学的研究
正常なマウスおよびＨ４４６ ＳＣＬＣ腫瘍を保持する免疫無防備の胸腺欠損ヌードマウスにおいてＳＶＶの薬物動態学的および体内分布研究を実施する。本研究では、正常および免疫無防備の腫瘍保持マウスの両者に単一静脈内投与を行った後のＳＶＶの体内分布、排除および持続性を評価する。各マウス群に、コントロールバッファーまたは３種のうち１種のＳＶＶ用量（１０8、１０10、または１０12ｖｐ／ｋｇ）の単一ｉ．ｖ．投与を施し、臨床徴候に関してモニターする。投与後１、６、２４および４８時間の時点、および投与後１、２、４、および１２週間の時点で５マウスの群から血液サンプルを取得する。用量レベルには、既知の低い有効用量および２種のより高い用量レベルが含まれる。これはウイルス排除の線形性を決定するためである。投与後２４時間、および２、４および１２週間の時点でマウス群を犠牲にする。選択される組織、例えば肝臓、心臓、肺、脾臓、腎臓、リンパ節、骨髄、脳および脊髄組織を無菌的に収集し、有効なＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用してＳＶＶ ＲＮＡの存在に関して試験する。
投与後２４時間の時点、および２、４および１２週間の時点で犠牲を払って尿および糞便のサンプルを取得し、感染性ウイルスの存在に関して検査する。本実施例の実験デザインを以下の表９に示す：
【０１８３】
表９：ＣＤ−１マウスおよびＳＣＬＣ腫瘍を保持する胸腺欠損ヌードマウスにおけるＳＶＶの体内分布
【表９】
2007506434.tif 000011
【０１８４】
また、正常および、Ｈ４４６ ＳＣＬＣ腫瘍を保持する免疫無防備の胸腺欠損ヌードマウスの両者において急性ｉ．ｖ．毒物学的研究を実施した。正常およびＳＣＬＣ腫瘍保持マウスでの予備的ｉ．ｖ．研究では、１０14ｖｐ／ｋｇまでの用量でＳＶＶの安全性が示される。有害な臨床徴候は観察されず、１０14ｖｐ／ｋｇの単一ｉ．ｖ．投与後２週間まで体重の喪失はなかった。
【実施例１３】
【０１８５】
正常な成体および妊娠中のマウスにおけるウイルス伝播（transmission）の研究
本実施例の目的は、非感染の正常マウスと高濃度のＳＶＶを注射したマウスを共存させた後に、ＳＶＶが伝播性であるかどうかを決定することである。ＳＶＶは正常な非腫瘍保持マウスでは複製しないため、腫瘍保持マウスに高濃度のＳＶＶを注射し、その後正常な健康な動物に曝露して、臨床シナリオをより良好にシミュレートすることもできる。第二の目的は、感染したメスから非感染の妊娠中のＤＡＭ、およびさらにその発生中の胎児へのＳＶＶの伝播能力を評価することである。
３群の５未処置雄性および雌性ＣＤ−１マウスを、１０8、１０10または１０12ｖｐ／ｋｇで感染させた同じ性別の単一のマウスに曝露し、血液サンプリングによってＳＶＶの存在に関してモニターする。
同様に、ＳＶＶに曝露されたメスをいくつかの時期の妊娠中のメスと混合し、感染したメスから非感染の妊娠中のメス、およびさらにその発生中の胎児にウイルスが伝播する能力を決定する。
【実施例１４】
【０１８６】
非ヒト霊長類での研究
また非ヒト霊長類においてＳＶＶの安全性、毒性およびトキシコキネティクスを決定する。用量範囲−検出相では、個々のサルに１０8ｖｐ／ｋｇでＳＶＶの単一ｉ．ｖ．投与を施し、感染または毒性の臨床徴候に関して詳細にモニターする。この用量が十分に許容されれば、１０12ｖｐ／ｋｇの用量が達成されるまで追加の動物をより多量のｉ．ｖ．用量で処置する。その後、主研究は３雄性および雌性サルの群からなり、ビヒクルを単独で、あるいは３種のうち１種の用量のＳＶＶを各サルに毎週１回で６週間投与し、毒性の徴候をモニターする。さらに２サル／性別に、ビヒクルを単独で、ならびに高用量レベルのＳＶＶを６週間投与し、犠牲にする前に追加の４週間の回復期間を提供する。
１週および６週中の投与後に、血液サンプルを取得する。初回投与前および犠牲にする前に、臨床病理学および血液学上の血液サンプルを取得する。ＳＶＶの中和抗体の存在を評価するために各投与後には追加の血液サンプルを取得する。
生存するサルを安楽死させ、全肉眼剖検に付し、主研究および回復期間のサルから全組織リストを収集する。コントロールおよび高用量群由来の組織を組織病理学的に評価する。１および６週の時点の投与後に尿および糞便のサンプルを収集し、感染性ＳＶＶの存在に関して評価する。本実施例の全体のデザインを以下の表１０に示す。
【０１８７】
表１０：霊長類におけるＳＶＶの複数用量の毒性学的研究
【表１０】
2007506434.tif 000012
【実施例１５】
【０１８８】
完全長および機能的ゲノムＳＶＶプラスミドの構築
現在に至るまで、ＳＶＶの約１．５〜２Ｋｂの５’ゲノム配列だけが未だ配列決定されていない。これは５’ＵＴＲ、１Ａ（ＶＰ４）および１Ｂ（ＶＰ２）の部分をカバーするヌクレオチド領域を表す。ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５３４３の単離されたＳＶＶから追加のＳＶＶ ｃＤＮＡを調製する。ＳＶＶ粒子を許容セルライン、例えばＰＥＲ．Ｃ６内に感染させ、ウイルスを単離する。その後ウイルス粒子からウイルスのＲＮＡを回収して、そのＲＮＡからｃＤＮＡコピーを作成する。個々のｃＤＮＡクローンをシークエンシングして、選択されたｃＤＮＡクローンを、ＳＶＶ配列の５’末端の上流にＴ７プロモーターを有するプラスミド中の１完全長クローン内に組み込む。Ｔ７ポリメラーゼおよびインビトロ転写系を利用することによってこのプラスミド由来の完全長ＳＶＶを逆転写し、完全長ＲＮＡを作成する（図５５を参照のこと）。そして完全長ＲＮＡを許容セルライン内にトランスフェクトして、完全長クローンの感染力を試験する（図５５を参照のこと）。
方法論は以下の通りである。
ＲＮＡ単離：チオシアン酸グアニジウムおよび、トリゾール（Invitrogen）を使用するフェノール抽出法を使用してＳＶＶゲノムＲＮＡを抽出する。簡単には、精製ＳＶＶ２５０μｌを３容量のトリゾールおよびクロロホルム２４０μｌと混合する。ＲＮＡを含有する水相をイソプロパノール６００μｌで沈殿させる。ＲＮＡペレットを７０％エタノールで２回洗浄し、乾燥し、ＤＥＰＣ処理水に溶解する。抽出されたＲＮＡの量を２６０ｎｍでの光学濃度測定によって見積もる。一定量のＲＮＡを１．２５％変性アガロースゲル（Cambrex Bio Sciences Rockland Inc., Rockland, ME USA）に通して分離し、臭化エチジウム染色によってバンドを可視化し、写真撮影する。
【０１８９】
ｃＤＮＡ合成：ＲＴ−ＰＣＲによってＳＶＶゲノムのｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＲＮＡ １μｇ、ＡＭＶ逆転写酵素、およびランダムな１４量体オリゴヌクレオチドまたはオリゴｄＴを使用して標準条件下で実施する。ｃＤＮＡの断片を増幅し、プラスミドにクローニングし、クローンをシークエンシングする。ゲノムの５’最終末端をシークエンシングするためにはより広範囲の測定が必要である可能性がある。
完全長ゲノムのクローニング：配列が既知になれば、通常の分子生物学によってＴ７ポリメラーゼプロモーターの下流にＳＶＶの完全長クローンを構築することが可能である（例えば、図５４を参照のこと）。
【０１９０】
ＳＶＶの回収：ＳＶＶの完全長ゲノムを有するプラスミドを標準プロトコルにしたがって逆転写する。ウイルスのＲＮＡ（１００ｎｇ）を、ネイティブのＳＶＶに許容的であることが既知のセルライン、Ｈ４４６細胞のトランスフェクトに使用するが、ウイルスのＲＮＡのトランスフェクションに関して最も効率的なセルラインは、種々のセルラインのうちから実験によって決定することができる。
【実施例１６】
【０１９１】
ＲＧＤ表示ＳＶＶライブラリーの構築
ランダムなペプチド配列をエンコードするオリゴヌクレオチドを用いてランダムに作成されるＳＶＶキャプシド変異体の構築に最適な挿入位置を見出すために、単純なモデル系（ＲＧＤ）を使用する。ＲＧＤ（アルギニン、グリシン、アスパラギン酸）は、インテグリンに結合する短いペプチドリガンドである。良好なＲＧＤ−ＳＶＶ誘導体は以下に挙げる特徴を含むべきであろう：（１）遺伝的挿入はＳＶＶ特有の望ましい任意の特性を変化させないべきであろう；ならびに（２）良好なＲＧＤ誘導体ウイルスはＶｂ５インテグリン含有細胞に対する親和性を有するべきであろう。
連続キャプシド領域のみを含有するＳＶＶプラスミドをランダムな位置で１回切断し、ＲＧＤと称される短いモデルペプチド配列を各位置で挿入する。このプラスミドライブラリーから、図５６および５７に記載される一般的技術を利用してウイルスＳＶＶ−ＲＧＤライブラリーを構築する。
【０１９２】
ｃＲＧＤオリゴヌクレオチドをキャプシド領域内にランダムに挿入する。簡単には、ＳＶＶの連続２．１Ｋｂキャプシド領域のみをエンコードするプラスミドを構築する（図５６の「ｐＳＶＶキャプシド」を参照のこと）。以下に記載のようにＣｖｉＪＩまたはエンドヌクレアーゼＶ法を利用してこのプラスミドを部分的に消化することによって、ｐＳＶＶキャプシドに単一のランダムな切断を施す（図５７を参照のこと）。単一切断プラスミドを単離した後、ＲＧＤオリゴヌクレオチドを挿入してｐＳＶＶキャプシド−ＲＧＤライブラリーを作成する。
制限酵素ＣｖｉＪＩは他のランダムな切断方法、例えば超音波処理または剪断と比べていくつかの利点を有する。第一に、ＣｖｉＪＩは平滑末端化カッターであるため、修復は必要ない。第二に、ＣｖｉＪＩはランダムな位置で切断し、したがってホットスポットが生じないことが実証されている。この手順は単純かつ高速でもある。簡単には、切断されたＤＮＡの大多数が直線化されたプラスミド、すなわち単一切断物であるようになるまで、ＣｖｉＪＩの濃度および／または消化時間を次第に低下させる。これは図５７に表されるように標準アガロースゲル電気泳動によって観察することができる。そしてバンドを単離し、精製し、ＲＧＤオリゴとライゲートする。
【０１９３】
ＤＮＡのランダムな切断に利用してよい別の方法はエンドヌクレアーゼＶ法である（Kiyazaki, K., Nucleic Acids Res., 2002, 30(24): e139）。エンドヌクレアーゼＶは、ウラシル含有ＤＮＡにウラシル部位の３’側の２番目または３番目のリン酸ジエステル結合でニックを入れる。またこの方法はＤＮＡをランダムに切断すると予測され、その頻度は、ポリメラーゼ連鎖反応中のｄＵＴＰの濃度を調節することよって単純に決定される。その切断部位は常に（ウラシルによって置換される）チミジン部位の下流の２または３塩基であるが、この方法では、他の方法論よりずっと少ないホットおよびコールドスポットしか生じないと予測される。
ランダムに直線化されたプラスミドをｃＲＧＤオリゴヌクレオチドとライゲートする。そして得られたｐＳＶＶキャプシドライブラリーを増幅して、ランダムに挿入されたｃＲＧＤ領域を有するキャプシド領域をエンコードするポリヌクレオチド集団を精製することができる（図５７および５８を参照のこと）。次いでこのキャプシドポリヌクレオチド集団を、キャプシド領域を除く完全長ＳＶＶ配列を含有するベクターにサブクローニングして、完全長ＳＶＶ配列のライブラリーを作成する（この場合、ｃＲＧＤ配列はランダムに挿入されるため、このライブラリーはキャプシド領域中に配列の多様性を顕在化する）。次いでこのライブラリーをＲＮＡに逆転写し、このＲＮＡを許容セルライン内にトランスフェクトして、種々のキャプシドを有するＳＶＶ粒子集団を作成する（図５９を参照のこと）。このＲＧＤ−ＳＶＶ集団のウイルス粒子を回収した後（「ＲＧＤ−ＳＶＶライブラリー」）、ＲＧＤ配列の挿入および挿入部位の多様性を確認するためのシークエンシング用にいくつかのウイルス（すなわち１０またはそれ以上）をランダムに選ぶ。
ＲＧＤ表示ＳＶＶライブラリーのインビトロ選択。ＳＶＶ−ＲＧＤライブラリーをスクリーニングして、どの挿入部位がＳＶＶの拡大された親和性を可能にしたかを決定する。ＲＧＤ−ＳＶＶライブラリーをαVβ5インテグリン発現性ＮＳＣＬＣ系統（非小細胞肺癌セルライン、すなわちαVβ5発現性Ａ５４９）に感染させる。機能的かつ適正に表示されたＲＧＤモチーフを含有するＳＶＶ誘導体のみがこれらの細胞に感染し、複製することができる。
【０１９４】
液状物の取扱い、２０セルラインの同時インキュベーションおよび３８４ウェルプレート中での測定が可能なハイスループット自動化システム（ＴＥＣＡＮ）によってインビトロスクリーニングを行う（図６２および図６３を参照のこと）。感染３０時間後に完全なＣＰＥが認められた時点で細胞を回収し、次いで細胞を４℃で１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって収集する。そしてこの細胞ペレットを細胞培養上清中に再懸濁し、３サイクルの凍結および解凍に付する。得られた懸濁物を４℃で１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって浄化する。２ラウンドのＣｓＣｌ勾配によってウイルスを精製する：１段階勾配（ＣｓＣｌ密度１．２４ｇ／ｍｌおよび１．４ｇ／ｍｌ）、その後の１連続勾配遠心分離（ＣｓＣｌ密度１．３３ｇ／ｍｌ）。精製ウイルス濃度を分光光度法によって測定する。この場合１Ａ260＝９．５ｘ１０12粒子を仮定する（Scraba, D.G. and Palmenberg, A.C., 1999）。αVβ5細胞から十分な量のウイルスが回収されるまで、この工程を複数回繰り返してよい。
回収されたＲＧＤ−ＳＶＶ誘導体の分析。個々のＲＧＤ表示ＳＶＶ誘導体の小プール（約１０〜５０の種々の誘導体）を分析する。このウイルス混合物を希釈し、単一ウイルス粒子を分析用にエクスパンドする。各誘導体を試験して、αVβ5発現性細胞に効率的かつ特異的に感染する能力を取得しているかどうかを判定する。そしてこの特性を有する各誘導体のキャプシド領域をシークエンシングして、ＲＧＤ挿入の部位を決定する。回収されたｃＲＧＤ表示ＳＶＶ誘導体は以下に挙げる特性を有するべきであろう：（１）ウイルスの元の特性が無傷のままである；ならびに（２）誘導体が、ＲＧＤに結合する高レベルのインテグリンを発現する細胞に感染する能力を取得している。このアプローチは、ＲＧＤ挿入を用いて親和性の拡大を可能にする１個またはそれ以上の部位を同定し、これらの部位内にランダムなオリゴヌクレオチドを挿入して、改変された親和性を有するＳＶＶ誘導体を作成することができるようにすることを目的にする。
【０１９５】
配列決定されたｃＲＧＤ−ＳＶＶ誘導体に番号を付し、インテグリンに対するその結合能力によって分類する。結合活性を試験するために、組換え型β2インテグリンをＰＢＳ中で９６ウェルマイクロタイタープレート上に固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡでブロックした後、唯一のＲＧＤ表示ウイルスとインキュベートする。ペプチド挿入を伴わないネイティブのウイルスをネガティブコントロールとして使用する。１〜５時間のインキュベーション後、ウェルをＰＢＳで少なくとも３回洗浄する。次いで、プレートに結合しているウイルスを抗ＳＶＶ抗体によって検出する。ＲＧＤペプチドまたは、インテグリンを標的にする抗体は、ＲＧＤ−ＳＶＶ誘導体とインテグリン結合型プレートの結合と競合することができるであろう。
インテグリンに対して最強の結合を有するｃＲＧＤ−ＳＶＶ誘導体（２０）を分析して、ｃＲＧＤオリゴヌクレオチド挿入の「成功している」位置（群）を決定する。この挿入部位によって、ＳＶＶの親和性に関する洞察が提供される。この挿入部位および他の既知の構造の分析に基づくと、ランダムなペプチドライブラリーを配置する理想的な位置を決定することができる（この方法は、ＳＶＶ誘導体の作成に関する代替法であり、この場合、オリゴヌクレオチド（既知の配列またはランダムな配列）をキャプシド中のランダムな位置に挿入する）。ランダムな配列オリゴヌクレオチドを用いて作成されるＳＶＶ誘導体は、２つの追加および新規の方法論を除き、ＲＧＤ−ＳＶＶライブラリーに関して上に記載される様式と本質的に同一の様式で構築する。所望のコード領域内の不必要な停止コドンおよび有害なアミノ酸挿入（例えばシステインまたはプロリン）を回避するために、Morphosys（Munich, Germany）によって開発されたＴＲＩＭ（トリヌクレオチド変異誘発）技術を使用して、キャプシド挿入用のランダムなオリゴヌクレオチドを作成することができる。ＴＲＩＭでは、アミノ酸を所望の位置でコードするトリ−ヌクレオチドしか利用しない（Virnekas, B. et al., Nucleic Acids Res, 1994, 22(25): 5600-5607）。ランダムペプチド表示ＳＶＶは１０8の種類で十分であると考えられ、ウイルスを特異的に標的腫瘍組織に向けるペプチドが得られると予測される。ランダムペプチド表示ＳＶＶを、上記のようにインビトロで、あるいは腫瘍保持マウスを使用してインビボで試験する。
【図面の簡単な説明】
【０１９６】
【図１】図１は、腫瘍溶解性ウイルスを使用するウイルス療法の概略図を示す。腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルスを局所注射することによって腫瘤を介して、あるいはウイルスを全身に送達することによって、選択的に複製し、腫瘍細胞に伝播し、腫瘍細胞を死滅させる特性を有する。
【図２】図２は、酢酸ウラニルで染色され、透過型電子顕微鏡で検査された精製済みＳＶＶを示す。球状ウイルス粒子は直径約２７ｎｍである。
【図３】図３は、大きな結晶性封入体および大きな小胞体（vesicular bodies）を有するＳＶＶ感染性ＰＥＲ．Ｃ６細胞の電子顕微鏡写真である。
【図４Ａ】図４ＡはＳＶＶ ＲＮＡの解析を示す。チオシアン酸グアニジウムおよび、トリゾール（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）を使用するフェノール抽出法を使用して、ＳＶＶのゲノムＲＮＡを抽出する。１．２５％変性アガロースゲルを通してＲＮＡを分離する。臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）染色によってバンドを可視化し、写真撮影する。レーン２では、ＳＶＶのゲノムＲＮＡの主要バンドが観察され、この結果は完全長ＳＶＶゲノムのサイズが約７．５キロベースであることを示す［確認］。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＳＶＶを含むピコルナウイルスに関するポリタンパク質プロセシングから得られるゲノム構造およびタンパク質産物を示す概略図である。
【図５】図５Ａ−５Ｅは、ＳＶＶのヌクレオチド配列（配列番号１）およびエンコードされるアミノ酸配列（配列番号２）を示す。停止コドンは５６７１〜３位の「＊」によって記載する。一般注記として、正確なヌクレオチドが確認中である位置を含む配列の開示では、これらの位置を「ｎ」によって表す。したがって、「ｎ」を有するコドンでは、対応アミノ酸を「ｘ」によって記載する。
【図６】図６Ａ−６Ｄは、ＳＶＶの完全長ゲノムの大部分についてのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。該ヌクレオチド配列はＡＴＣＣ特許寄託番号：ＰＴＡ−５３４３（寄託日：２００３年７月２５日）を有するＳＶＶ単離体に由来する。
【図７】図７Ａ−７Ｂは、配列番号１によってエンコードされるアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図８】図８は、ＳＶＶの部分的１ＢまたはＶＰ２エンコード領域のヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。この配列は配列番号１のヌクレオチド４〜４２９と同一である。
【図９】図９は、配列番号３によってエンコードされる部分的ＳＶＶ ＶＰ２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。配列番号４にリストされる配列は配列番号２のアミノ酸２〜１４３と同一である。
【図１０】図１０は、ＳＶＶの１ＣまたはＶＰ３エンコード領域のヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。この配列は配列番号１のヌクレオチド４３０〜１１４６と同一である。
【図１１】図１１は、配列番号５によってエンコードされるＳＶＶ ＶＰ３タンパク質のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。配列番号６にリストされる配列は配列番号２のアミノ酸１４４〜３８２と同一である。
【図１２】図１２は、ＳＶＶの１ＤまたはＶＰ１エンコード領域のヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。この配列は配列番号１のヌクレオチド１１４７〜１９２３と同一である。
【図１３】図１３は、配列番号７によってエンコードされるＳＶＶ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号８）を示す。配列番号８にリストされる配列は配列番号２のアミノ酸３８３〜６４１と同一である。
【図１４】図１４は、ＳＶＶの２Ａエンコード領域のヌクレオチド配列（配列番号９）を示す。この配列は配列番号１のヌクレオチド１９２４〜１９６５と同一である。
【図１５】図１５は、配列番号９によってエンコードされるＳＶＶ ２Ａタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。配列番号１０にリストされる配列は配列番号２のアミノ酸６４２〜６５５と同一である。
【図１６】図１６は、ＳＶＶの２Ｂエンコード領域のヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す。この配列は配列番号１のヌクレオチド１９６６〜２３４９と同一である。
【図１７】図１７は、配列番号１１によってエンコードされるＳＶＶ ２Ｂタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。配列番号１２にリストされる配列は配列番号２のアミノ酸６５６〜７８３と同一である。
【図１８】図１８は、ＳＶＶの２Ｃエンコード領域のヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す。この配列は配列番号１のヌクレオチド２３５０〜３３１５と同一である。
【図１９】図１９は、配列番号１３によってエンコードされるＳＶＶ ２Ｃタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。配列番号１４にリストされる配列は配列番号２のアミノ酸７８４〜１１０５と同一である。
【図２０】図２０は、ＳＶＶの３Ａエンコード領域のヌクレオチド配列（配列番号１５）を示す。この配列は配列番号１のヌクレオチド３３１６〜３５８５と同一である。
【図２１】図２１は、配列番号１５によってエンコードされるＳＶＶ ３Ａタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１６）を示す。配列番号１６にリストされる配列は配列番号２のアミノ酸１１０６〜１１９５と同一である。
【図２２】図２２は、ＳＶＶの３Ｂエンコード領域のヌクレオチド配列（配列番号１７）を示す。この配列は配列番号１のヌクレオチド３５８６〜３６５１と同一である。
【図２３】図２３は、配列番号１７によってエンコードされるＳＶＶ ３Ｂタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１８）を示す。配列番号１８にリストされる配列は配列番号２のアミノ酸１１９６〜１２１７と同一である。
【図２４】図２４は、ＳＶＶの３Ｃエンコード領域のヌクレオチド配列（配列番号１９）を示す。この配列は配列番号１のヌクレオチド３６５２〜４２８４と同一である。
【図２５】図２５は、配列番号１９によってエンコードされるＳＶＶ ３Ｃタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。配列番号２０にリストされる配列は配列番号２のアミノ酸１２１８〜１４２８と同一である。
【図２６】図２６は、ＳＶＶの３Ｄエンコード領域のヌクレオチド配列（配列番号２１）を示す。この配列は配列番号１のヌクレオチド４２８５〜５６７３と同一である。
【図２７】図２７は、配列番号２１によってエンコードされるＳＶＶ ３Ｄタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２２）を示す。配列番号２２にリストされる配列は配列番号２のアミノ酸１４２９〜１８９０と同一である。
【図２８】図２８Ａ−２８Ｈは、ＳＶＶ配列番号２およびカルジオウイルス属の諸メンバー、例えば脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ；Encephalomyocarditis virus種）、Theilerのマウス脳心筋炎ウイルス（ＴＭＥＶ；Theilovirus種）、ラットＴＭＥＶ様物質（ＴＬＶ；Theilovirus種）、およびVilyuiskヒト脳脊髄炎ウイルス（ＶＨＥＶ；Theilovirus種）間のアミノ酸配列アライメントを示す。以下の配列において諸カルジオウイルスの特定配列を示す：配列番号：２３（ＥＭＣＶ−Ｒ）、２４（ＥＭＣＶ−ＰＶ２１）、２５（ＥＭＣＶ−Ｂ）、２６（ＥＭＣＶ−Ｄａ）、２７（ＥＭＣＶ−Ｄｂ）、２８（ＥＭＣＶ−ＰＶ２）、２９（ＥＭＣＶ−Ｍｅｎｇｏ）、３０（ＴＭＥＶ／ＤＡ）、３１（ＴＭＥＶ／ＧＤＶＩＩ）、３２（ＴＭＥＶ／ＢｅＡｎ８３８６）、３３（ＴＬＶ−ＮＧＳ９１０）および３４（ＶＨＥＶ／Ｓｉｂｅｒｉａ−５５）。  図２８中の番号位置は配列表の番号付けに対応しない。記号「／」は、ポリタンパク質が切断されてその最終機能性生成物になる切断部位を示す。例えば、位置１および１５７間のアライメントは１Ａ（ＶＰ４）領域中に存在する。位置：１５９および４２８間のアライメントは１Ｂ（ＶＰ２）領域中に存在し；４３０および６６８は１Ｃ（ＶＰ３）領域中に存在し；６７０および９６７は１Ｄ（ＶＰ１）領域中に存在し；９６９および１１１１は２Ａ領域中に存在し；１１１２および１２７６は２Ｂ領域中に存在し；１２７８および１６０９は２Ｃ領域中に存在し；１６１１および１７００は３Ａ領域中に存在し；１７０２および１７２３は３Ｂ領域中に存在し；１７２５および１９４６は３Ｃ領域中に存在し；１９４８および２４１０は３Ｄ領域中に存在する。またこのアライメントは、標準的配列解析プログラムによって決定することができるウイルス配列間の保存または類似領域の候補を示す。このアライメントはBioEdit 5.0.9およびClustal W 1.81を使用して作成した。
【図２９】図２９は、ＳＶＶの最終ポリペプチド産物をリストする（登場順にそれぞれ配列番号３５〜４４）。いくつかの保存されているモチーフは太字にし、下線を引く：２Ａ／２Ｂ「切断」（ＮＰＧＰ 配列番号１１１）；２Ｃ ＡＴＰ結合（ＧｘｘＧｘＧＫＳ／Ｔ 配列番号１１２およびｈｙｈｙｈｙｘｘＤ）；３Ｂ（ＶＰｇ）／ＲＮＡ結合残基（Ｙ）；３Ｃ（ｐｒｏ）活性部位残基（Ｈ、Ｃ、Ｈ）；３Ｄ（ｐｏｌ）モチーフ（ＫＤＥＬ／ＩＲ 配列番号１１３、ＰＳＧ、ＹＧＤＤ 配列番号１１４、ＦＬＫＲ 配列番号１１５）。
【図３０】図３０は、ＳＶＶおよびこれらのピコルナウイルス間の系統発生上の関連性を決定する配列解析において使用されたピコルナウイルス種をリストする（実施例４を参照のこと）。
【図３１】図３１は、ＶＰ２配列解析を考慮して、ＳＶＶ（配列番号４）および他のピコルナウイルス間の系統発生上の関連性を示す。この図はブートストラップ近隣結合ツリー（bootstrapped neighbor-joining tree）を示す（実施例４を参照のこと）。
【図３２】図３２は、ＳＶＶ（配列番号６）および他のピコルナウイルス間のＶＰ３に関するブートストラップ近隣結合ツリーを示す（実施例４を参照のこと）。
【図３３】図３３は、ＳＶＶ（配列番号８）および他のピコルナウイルス間のＶＰ１に関するブートストラップ近隣結合ツリーを示す（実施例４を参照のこと）。
【図３４】図３４は、ＳＶＶ（すなわち部分的Ｐ１−配列番号２のアミノ酸２〜６４１）および他のピコルナウイルス間のＰ１（すわわち１Ａ、１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄ）に関するブートストラップ近隣結合ツリーを示す（実施例４を参照のこと）。
【図３５】図３５は、ＳＶＶ（配列番号１４）および他のピコルナウイルス間の２Ｃに関するブートストラップ近隣結合ツリーを示す（実施例４を参照のこと）。
【図３６】図３６は、ＳＶＶ（配列番号２０）および他のピコルナウイルス間の３Ｃ（ｐｒｏ）に関するブートストラップ近隣結合ツリーを示す（実施例４を参照のこと）。
【図３７】図３７は、ＳＶＶ（配列番号２２）および他のピコルナウイルス間の３Ｄ（ｐｏｌ）に関するブートストラップ近隣結合ツリーを示す（実施例４を参照のこと）。
【図３８】図３８は、ＳＶＶ（配列番号４）および他のピコルナウイルス間のＶＰ２の実際のアミノ酸の同一性パーセントを示す（実施例４を参照のこと）。
【図３９】図３９は、ＳＶＶ（配列番号６）および他のピコルナウイルス間のＶＰ３の実際のアミノ酸の同一性パーセントを示す（実施例４を参照のこと）。
【図４０】図４０は、ＳＶＶ（配列番号８）および他のピコルナウイルス間のＶＰ１の実際のアミノ酸の同一性パーセントを示す（実施例４を参照のこと）。
【図４１】図４１は、ＳＶＶ（部分的キャプシドまたはＰ１−配列番号２のアミノ酸２〜６４１）および他のピコルナウイルス間のＰ１の実際のアミノ酸の同一性パーセントを示す（実施例４を参照のこと）。
【図４２】図４２は、ＳＶＶ（配列番号１４）および他のピコルナウイルス間の２Ｃの実際のアミノ酸の同一性パーセントを示す（実施例４を参照のこと）。
【図４３】図４３は、ＳＶＶ（配列番号２０）および他のピコルナウイルス間の３Ｃ（ｐｒｏ）の実際のアミノ酸の同一性パーセントを示す（実施例４を参照のこと）。
【図４４】図４４は、ＳＶＶ（配列番号２２）および他のピコルナウイルス間の３Ｄ（ｐｏｌ）の実際のアミノ酸の同一性パーセントを示す（実施例４を参照のこと）。
【図４５】図４５は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析されたＳＶＶのＶＰ２（〜３６ｋＤａ）、ＶＰ１（〜３１ｋＤａ）およびＶＰ３（〜２７ｋＤａ）タンパク質を示す。精製済みＳＶＶをＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、銀染色によってタンパク質を可視化した。レーン「ＭＷｔ」は分子量マーカーであり；レーン「ＳＶＶ」はＳＶＶの構造タンパク質を含有する。さらに、３種の分子量マーカーのサイズおよびウイルスタンパク質の名称を挙げる。
【図４６】図４６Ａ−４６Ｂは、全身投与後の血液および腫瘍中のＳＶＶの量を示す（実施例７）。Ｈ４４６腫瘍を保持するヌードマウスをＳＶＶで処置した。この処置は、１ｘ１０12ｖｐ／ｋｇの用量で尾静脈注射により行った。注射後０、１、３、６、２４、４８、７２時間および７日の時点でマウスから採血し、収集直後に血液から血漿を分離し、感染培地中で希釈し、ＰＥＲ．Ｃ６細胞の感染に使用した。注射後６、２４、４８、７２時間および７日の時点で腫瘍を回収した。この腫瘍を小切片にカットし、培地１ｍＬ中に懸濁し、ＣＶＬを作成した。  図４６Ｃ−４６Ｄは、インビボでのＳＶＶクリアランスに関するデータを示す。この図は、同様の用量の静脈内（i.v.）アデノウイルスと比較して、ＳＶＶが実質的に長期の血液中の存在期間を示すことを示し（実施例７）、したがってＳＶＶはアデノウイルスより緩徐なインビボのクリアランス速度を有する。１回の静脈内（ｉ．ｖ．）投与後、ＳＶＶは６時間まで血液中に存在し続ける（図４６Ｃ；図４６Ｃは図４６Ｄと比較するための図４６Ａの複製である）が、アデノウイルスは約１時間のうちに血液から排除され、あるいは枯渇する（図４６Ｄ）。
【図４７】図４７は、Ｈ４４６異種移植切片の免疫組織化学およびヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を示す（実施例７）。Ｈ４４６腫瘍を保持するヌードマウスをハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）またはＳＶＶで処置した。この処置は、１ｘ１０12ｖｐ／ｋｇの用量で尾静脈注射により行った。注射後３日目にマウスを犠牲にし、腫瘍を収集した。ＳＶＶ特異的マウス抗体を使用する免疫組織化学によって腫瘍細胞中のウイルスタンパク質を可視化する（上部パネル）。ＨＢＳＳまたはＳＶＶ処置マウスから収集されたＨ４４６腫瘍細胞の全体的形態をＨ＆Ｅ染色によって染色した（下部パネル）。
【図４８】図４８は、初代ヒト肝細胞におけるＳＶＶ媒介性の細胞障害性を示す（実施例９）。コラーゲンでコーティングされた１２ウェルプレートにプレートされた初代ヒト肝細胞に、１、１０および１００および１０００粒子／細胞（ｐｐｃ）でＳＶＶを感染させた。感染３日後、細胞に結合した乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）および培養上清中のＬＤＨを別々に測定した。最大の細胞性ＬＤＨ＋上清ＬＤＨに対する上清中のＬＤＨ単位の割合として細胞障害性パーセントを決定した。
【図４９】図４９は、選択されたセルラインでのＳＶＶによるウイルス生産を示す。ＳＶＶの複製能を評価するために、選択された正常細胞および腫瘍細胞に１ウイルス粒子／細胞（ｐｐｃ）でＳＶＶを感染させた（実施例９）。７２時間後、細胞を回収し、ＰＥＲ．Ｃ６細胞上の力価に関してＣＶＬをアッセイした。各セルラインに関して、ＳＶＶ複製の効率をプラーク形成単位／ミリリットル（ｐｆｕ／ｍｌ）として表した。
【図５０】図５０は、体重に基づく、ヌードおよびＣＤ１マウスにおける毒性を示す（実施例１０）。ウイルス投与後、種々の日数において、各処置群のマウスの平均体重を測定した。マウスには、１日目に単一用量のＳＶＶまたはＰＢＳを尾静脈注射した。
【図５１】図５１は、Ｈ４４６異種移植モデルにおける効果を示す。ヌードマウスにおいてＨ４４６腫瘍を確立させ、該マウスを群（ｎ＝１０）に分類し、ＨＢＳＳまたは６種の諸用量のＳＶＶを尾静脈注射することによって処置する（実施例１１）。研究２０日目に、大きな腫瘍（平均腫瘍容量＝２０００ｍｍ3）を保持するＨＢＳＳ群由来の５マウスに１ｘ１０11ｖｐ／ｋｇを注射した（矢印で示す）。データは平均腫瘍容量＋標準偏差（ＳＤ）として表す。
【図５２】図５２は、未処置またはＳＶＶで処置されたＨ４４６異種移植ヌードマウスの写真を示す（実施例１１）。ＳＶＶの効果は非常に強く、あらかじめ大きく確立された腫瘍の１００％を完全に根絶した。ＳＶＶ処置マウスは、注射後少なくとも２００日間、臨床症状も腫瘍の再発も示さない。
【図５３】図５３は、インビトロでのＳＶＶ腫瘍特異性および効果に関するデータを示す（実施例１１）。このグラフは、Ｈ４４６ヒト小細胞肺癌腫（ＳＣＬＣ）腫瘍細胞（上のグラフ）または正常なヒトＨ４６０細胞（下のグラフ）のインキュベーション後の細胞生存率を示す。ＳＶＶは約１０-3粒子／細胞のＥＣ50で腫瘍細胞を特異的に死滅させた。対照的に、正常なヒト細胞はいずれのＳＶＶ濃度でも死滅しなかった。
【図５４】図５４は、ＳＶＶの完全ゲノムを含有する代表的なプラスミドを表す（実施例１５）。ベクター上のＳＶＶ配列の上流にＴ７プロモーターが存在することにより、ＳＶＶ配列のインビトロ転写が可能であり、したがってＳＶＶ ＲＮＡ分子を作成することができる。
【図５５】図５５は、完全長および機能性ゲノムＳＶＶプラスミドの構築およびその後のＳＶＶウイルス生産に関する概略図を表す（実施例１６）。機能性ゲノムＳＶＶクローンを取得するために、Ｔ７プロモーターを有するベクターにＳＶＶの完全ゲノムをクローニングすることができる。この操作は、ウイルスのｃＤＮＡクローンを作成し、それらをシークエンシングし、そして連続片を１プラスミドにクローニングすることによって達成することができ、「ｐＳＶＶ」と表されるプラスミドを得る。次いでＳＶＶの完全ゲノムを有するプラスミドを逆転写して、ＳＶＶ ＲＮＡを作成することができる。そしてこのＳＶＶ ＲＮＡを許容哺乳類細胞内にトランスフェクトした後、ＳＶＶウイルス粒子を回収し、精製することができる。
【図５６】図５６は、ＳＶＶのキャプシドに関するコード配列（すなわち１Ａ−１Ｄに関するコード領域）を含有するベクター（「ｐＳＶＶキャプシド」）の構築に関する概略図を表す（実施例１６）。そしてｐＳＶＶキャプシドを使用して、ＳＶＶキャプシド変異体のライブラリーを作成することができる。
【図５７】図５７は、ＳＶＶキャプシド変異体のライブラリーを作成するためにＳＶＶキャプシドを変異させる１方法を示す（実施例１６）。この図は、プラスミドのランダムな部位でオリゴヌクレオチド配列を挿入することを説明する。該オリゴヌクレオチドは、ランダムなオリゴヌクレオチド、既知の配列を有するオリゴヌクレオチド、またはエピトープタグをエンコードするオリゴヌクレオチドであってよい。図中、制限酵素ＣｖｉＪＩによってｐＳＶＶキャプシドＤＮＡをランダムに切断する。単一部位で切断された直線状ｐＳＶＶキャプシドＤＮＡを単離し、ゲルから精製し、オリゴヌクレオチドとライゲートする。
【図５８】図５８は、キャプシドエンコード領域中に配列変異を含む完全長ＳＶＶ変異体のライブラリーを作成するスキームを示す（実施例１６）。例えば、（例えば、図５７に記載されるスキームにしたがって作成された）ｐＳＶＶキャプシド変異体ライブラリー由来のキャプシドエンコード領域を制限消化およびゲル精製によって単離する。また、完全長ＳＶＶ配列を含有するベクターを消化して、キャプシドエンコード領域を切除する。そしてｐＳＶＶキャプシド変異体ライブラリー由来のキャプシドエンコード領域を、その野生型キャプシド配列を欠いているｐＳＶＶベクターにライゲートし、それにより、キャプシドエンコード領域中に多数の変異を有する完全長ＳＶＶ変異体のライブラリー（「ｐＳＶＶＦＬ」ベクター）を作成する。
【図５９】図５９は、キャプシド変異のライブラリーを含むＳＶＶウイルス粒子を生産するための一般的方法を示す（実施例１６）。ｐＳＶＶＦＬベクターを逆転写して、ＳＶＶ ＲＮＡを作成する。このＳＶＶ ＲＮＡを許容細胞内にトランスフェクトすると、細胞においてＳＶＶ変異ウイルス粒子が生産される。このウイルス粒子は細胞を溶解し、多数のキャプシド変種を含むＳＶＶウイルス粒子の集団、「ＳＶＶキャプシドライブラリー」が単離される。
【図６０】図６０は、腫瘍細胞に特異的に感染することができるが、非腫瘍細胞には感染することができないＳＶＶキャプシド変異体をスクリーニングするための一般的方法を示す。ＳＶＶキャプシドライブラリーを目的の腫瘍セルラインまたは組織とインキュベートする。初期インキュベーション期間後、細胞を洗浄し、細胞内に侵入することができなかったＳＶＶウイルス粒子を排除する。次いでウイルスによる溶解が観察されるまで細胞を培養中で維持する。次いで培養上清を収集し、腫瘍細胞に溶菌的に感染することができたＳＶＶキャプシド変異体を単離する。次いでカウンタースクリーニング（counter-screen）前にこれらのウイルスを既知の許容セルラインに感染させることによって成熟させることができる。腫瘍細胞に感染することができたＳＶＶキャプシド変異ウイルスを正常細胞とインキュベートすることによってカウンタースクリーニングを実施する。上清中の未結合のままであるウイルスのみを収集し、それにより、腫瘍特異性を有する変異ＳＶＶウイルスを単離する。この工程を繰り返して、ＳＶＶ腫瘍特異的ウイルスの単離をさらに精密化することができる。
【図６１】図６１は、ウイルス変異体がセルラインに結合および／または感染することができるかどうかを試験するための従来の方法を示す。従来の方法は、セルラインを培養するための非効率的であることが多い方法、すなわちフラスコ培養を必要とし、したがって多数の諸セルラインに関してウイルス変異体のライブラリーをマススクリーニングすることは負担になる。
【図６２】図６２は、諸セルラインに特異的に感染する能力を有するウイルス変異体をスクリーニングするための本発明のハイスループット法を示す（実施例１６）。この図では、多数の諸腫瘍セルラインを３８４ウェルプレートで培養する。各ウェルにウイルスのサンプルを加える（例えば、ＳＶＶキャプシドライブラリーのサンプル）。細胞変性作用を示すウェルから培地を収集し、フラスコまたは大規模な組織培養プレート中で許容セルライン（例えば、ＳＶＶに関しては、Ｈ４４６またはＰＥＲ．Ｃ６）を感染させることによって培地中の任意のウイルスを増幅することができる。このウイルスを培養し、そしてＲＮＡを単離し、その配列を解析して、キャプシドのオリゴヌクレオチド挿入変異誘発によって挿入されたエンコード対象のペプチド配列を決定することができる。次いでペプチドそのものを試験して、腫瘍細胞型に特異的に結合することができるかどうかを判定することができる。
【図６３】図６３は、別のハイスループットスクリーニングの概略図を示す（実施例１６）。腫瘍および正常セルラインをマルチウェルプレートで培養する。各ウェルにウイルスを加え、ウイルス媒介性の溶解によって細胞が死滅するかどうかを試験する。細胞変性作用は、各ウェルの吸光度を読み取ることによって高速にアッセイすることができる。細胞変性作用を示すウェル由来のウイルスを成熟させ、さらにインビトロ（腫瘍および正常セルラインの再試験）およびインビボモデル（マウスにおいて外植された腫瘍を該ウイルスが死滅させることができるかどうかを試験）で試験する。
【図６４】図６４は、新規腫瘍特異的親和性を有するＳＶＶキャプシド変異体（登場順にそれぞれ配列番号４５〜４８）を解析して、腫瘍選択的ペプチドを作成することができることを示す。腫瘍セルラインの特異的感染を可能にするＳＶＶキャプシド変異体をシークエンシングして、オリゴヌクレオチド挿入によってエンコードされるペプチドを決定する。それにより、好結果のキャプシド変異体からアミノ酸共通配列を決定することができる。次いで該共通配列を有するペプチドを試験して、問題の腫瘍細胞型に特異的に結合することができるかどうかを判定することができる。そして腫瘍選択的ペプチドを腫瘍特異的ターゲティングビヒクルとして利用するために、毒素または薬物に結合させることができる。
【図６５】図６５は、ＳＶＶキャプシドライブラリーを最初にインビボで試験することができることを図解する。マウス（正常、胸腺欠損、ヌード、ＣＤ−１トランスジェニック、等を含む）に特定の腫瘍を外植することができる。そしてこれらのマウスにＳＶＶ誘導体ライブラリー、例えばＳＶＶキャプシドライブラリーを注射する。一定時点で、マウスから腫瘍細胞を回収して、腫瘍の排除を示すマウスにおいて初期腫瘍サンプルからウイルスを単離し、許容セルライン中で成熟させる。
【図６６】図６６は、本発明のＳＶＶ誘導体に関する臨床試験計画を示す。
【図６７】図６７は、キャプシド中にエピトープタグをエンコードする（新規腫瘍親和性を有する）ＳＶＶ誘導体を種々の目的で使用することができることを図解する。スクリーニング試薬としてのその使用により、該エピトープの存在をアッセイすることによって組織サンプル中に特定の腫瘍細胞が存在するかどうかを検出することができる。あるいは、毒素または他の治療薬を該エピトープタグに結合させることができ、そして該ウイルスを患者に投与することができる。さらに、野生型または誘導体ＳＶＶに放射線を照射し、あるいは不活性化して、該ウイルス粒子そのものを治療用デバイスとして使用することができる。該ウイルス粒子は、アポトーシス誘発ペプチドの存在に基づいて細胞のアポトーシスを誘発し、あるいは該粒子に毒素または何らかの他の治療薬を結合させて、該ウイルスを特異的ターゲティング送達デバイスとして使用することができる。
【図６８】図６８はピコルナウイルスの基本的ライフサイクルを示す。
【図６９】図６９は、他のピコルナウイルスと比べたＳＶＶのポリペプチド長の比較を示す。
【図７０】図７０は、ピコルナウイルス２Ａ様ＮＰＧ／Ｐタンパク質のアミノ酸比較をリストする（登場順にそれぞれ配列番号４９〜１１０）。このＳＶＶに関する配列は配列番号２の残基６３５〜６５６にリストされる。
【図７１】図７１は、ＥＭＣＶ−Ｒに関するアミノ酸配列（配列番号２３）をリストする。
【図７２】図７２は、ＥＭＣＶ−ＰＶ２１（アクセッションＣＡＡ５２３６１）に関するアミノ酸配列（配列番号２４）をリストする。
【図７３】図７３は、ＥＭＣＶ−Ｂ（アクセッションＰ１７５９３）に関するアミノ酸配列（配列番号２５）をリストする。
【図７４】図７４は、ＥＭＣＶ−Ｄａ（アクセッションＰ１７５９４）に関するアミノ酸配列（配列番号２６）をリストする。
【図７５】図７５は、ＥＭＣＶ−Ｄｂに関するアミノ酸配列（配列番号２７）をリストする。
【図７６】図７６は、ＥＭＣＶ−ＰＶ２（アクセッションＣＡＡ６０７７６）に関するアミノ酸配列（配列番号２８）をリストする。
【図７７】図７７は、ＥＭＣＶ−ｍｅｎｇｏ（アクセッションＡＡＡ４６５４７）に関するアミノ酸配列（配列番号２９）をリストする。
【図７８】図７８は、ＴＭＥＶ／ＤＡ（アクセッションＡＡＡ４７９２８）に関するアミノ酸配列（配列番号３０）をリストする。
【図７９】図７９は、ＴＭＥＶ／ＧＤＶＩＩ（アクセッションＡＡＡ４７９２９）に関するアミノ酸配列（配列番号３１）をリストする。
【図８０】図８０は、ＴＭＥＶ／ＢｅＡｎ８３８６（アクセッションＡＡＡ４７９３０）に関するアミノ酸配列（配列番号３２）をリストする。
【図８１】図８１は、ＴＬＶ−ＮＧＳ９１０（アクセッションＢＡＣ５８０３５）に関するアミノ酸配列（配列番号３３）をリストする。
【図８２】図８２は、ＶＨＥＶ／Ｓｉｂｅｒｉａ−５５（アクセッションＡＡＡ４７９３１）に関するアミノ酸配列（配列番号３４）をリストする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２８Ｄ】
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【図２８Ｅ】
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【図２８Ｆ】
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【図２８Ｇ】
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【図２８Ｈ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４６Ｄ】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１Ａ】
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【図７１Ｂ】
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【図７２Ａ】
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【図７２Ｂ】
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【図７３Ａ】
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【図７３Ｂ】
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【図７４Ａ】
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【図７４Ｂ】
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【図７５Ａ】
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【図７５Ｂ】
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【図７６Ａ】
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【図７６Ｂ】
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【図７７Ａ】
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【図７７Ｂ】
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【図７８Ａ】
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【図７８Ｂ】
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【図７９Ａ】
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【図７９Ｂ】
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【図８０Ａ】
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【図８０Ｂ】
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【図８１Ａ】
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【図８１Ｂ】
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【図８２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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