(57)【要約】  本発明は、ＡＮ受容体またはそれらの機能的な変異体及び、ＧαqもしくはＧα1タンパク質、または、ＧαqまたはＧα1タンパク質のような異なるＧタンパク質をの部分から構築されたハイブリッドタンパク質を含むアンジオテンシン受容体様−１（ＡＰＪ受容体）のリガンドを同定するための試験システム、本試験システムを持ちいたＡＰＪ受容体リガンドのスクリーニング方法、医薬品の製造方法、心疾患の診断および予後方法、並びに、心疾患の検出または予後に使用できるキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＡＰＪ受容体またはその機能的な変異体、および、
（ｂ）ＧαΔ6qi4myrタンパク質、Ｇαi4qi4タンパク質、Ｇα16タンパク質から選択されるＧαタンパク質、
を含み、ここにおいて、ＡＰＪ受容体リガンドの該ＡＰＪ受容体またはその機能的な変異体への結合は、測定可能なシグナルまたは検出可能なシグナルに作用する、ＡＰＪ受容体リガンドを同定するための試験システム。
【請求項２】
リガンドは、アゴニストである、請求項１に記載の試験システム。
【請求項３】
アゴニストは、完全、部分またはインバースアゴニストである、請求項２に記載の試験システム。
【請求項４】
リガンドは、アンタゴニストである、請求項１に記載の試験システム。
【請求項５】
ＡＰＪ受容体は、哺乳動物のＡＰＪ受容体またはその変異体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の試験システム。
【請求項６】
ＡＰＪ受容体は、ヒト、マウスまたはラットのＡＰＪ受容体またはその変異体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の試験システム。
【請求項７】
ＡＰＪ受容体は、ヒトのＡＰＪ受容体またはその変異体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の試験システム。
【請求項８】
シグナルは、Ｃａ2+濃度の変化である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の試験システム。
【請求項９】
遺伝操作された細胞内に存在しており、成分（ａ）または（ｂ）の少なくとも一方が、該細胞に導入されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の試験システム。
【請求項１０】
一過性の、または安定なトランスフェクションされた細胞系またはそれらの膜に存在する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の試験システム。
【請求項１１】
（ａ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の試験システムを提供する工程、
（ｂ）試験化合物を提供する工程、
（ｃ）場合により、既知のＡＰＪ受容体リガンドを提供する工程、および、
（ｄ）ＡＰＪ受容体介在シグナル伝達経路に対する上記試験化合物の作用を測定または検出する工程、
を含む、ＡＰＪ受容体リガンドのスクリーニング方法。
【請求項１２】
リガンドは、アゴニストである、請求項１１に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
アゴニストは、完全、部分またはインバースアゴニストである、請求項１２に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
リガンドは、アンタゴニストである、請求項１１に記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
試験化合物は、化合物ライブラリーの形態で提供される、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
細胞全体を用いて行われる、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ロボットシステムで行われる、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＡＰＪ受容体リガンドのハイスループットスクリーニング方法である、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の方法を行うことによって、ＡＰＪ受容体リガンドを同定する工程、
（ｂ）十分な量のリガンドを提供する工程、および、
（ｃ）１種またはそれ以上の製薬上許容できるキャリアーまたは補助剤を用いて上記リガンドを製剤化する工程、
を含む、医薬品の製造方法。
【請求項２０】
（ａ）試験されるサンプル中におけるＡＰＪ受容体遺伝子および／またはアペリン遺伝子の発現レベルを決定する工程、
（ｂ）工程（ａ）で決定された試験されるサンプル中におけるＡＰＪ受容体および／またはアペリンの発現レベルを、コントロールプローブ中におけるＡＰＪ受容体および／またはアペリンの発現レベルと比較する工程、および、
（ｃ）ＡＰＪ受容体および／またはアペリン遺伝子発現が増加したサンプルを同定する工程
を含む、心疾患の診断または予後の方法。
【請求項２１】
ＡＰＪ受容体遺伝子および／またはアペリン遺伝子の発現レベルは、該遺伝子から転写されたｍＲＮＡのレベル、または、該遺伝子から翻訳されたポリペプチドのレベルに基づき決定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ｍＲＮＡのレベルは、ハイブリダイゼーション法、または、核酸増幅法によって決定される、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
ポリペプチドのレベルは、ポリペプチドまたはそれらのフラグメントに特異的に結合することができる結合タンパク質を用いることによって決定される、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２４】
ＡＰＪ受容体遺伝子および／またはアペリン遺伝子の発現レベルを決定することに使用できるプライマーおよび／またはプローブを含む、心疾患の発見または予後に使用できるキット。
【請求項２５】
ＡＰＪ受容体遺伝子および／またはアペリン遺伝子によってコードされたポリペプチドに特異的に結合することができる抗体を含む、心疾患の発見または予後に使用できるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンジオテンシン受容体様−１（ＡＰＪ受容体）のリガンドを同定するための試験システムに関し、本システムは、ＡＰＪ受容体またはそれらの機能的な変異体、および、ＧαqもしくはＧα1タンパク質、または、ＧαqもしくはＧα1タンパク質のような異なるＧタンパク質の部分から構築されたハイブリッドタンパク質を含み、さらに、本試験システムを用いたＡＰＪ受容体リガンドのスクリーニング方法、医薬品の製造方法、心疾患の診断および予後方法、および、心疾患の検出または予後に使用できるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
多細胞生物において、生物そのものが存在できるようにするには、細胞が互いに連絡しあうことが必要である。それぞれの細胞の特殊化により、それぞれの細胞の特徴的な機能が、生物そのものの構造および活性に寄与している。これらの機能は一般的に、ホルモン、神経伝達物質、局所ホルモンなどの細胞外シグナルの制御下である。ほとんど全ての細胞外シグナルは、細胞の環境における所定のタイプの分子の濃度変化からなる。一般的に、細胞外シグナルは、細胞内シグナルに翻訳されなければならない。
【０００３】
細胞が細胞外シグナルを受信する様々なメカニズムがある。多くのシグナル物質は、細胞膜を通過して細胞に侵入することができない。それゆえに、これらの細胞外シグナルは、細胞内シグナルに変換されなければならない。極めてうまく作動するシグナル伝達のための系は、３種の成分、すなわちＧタンパク質共役受容体、Ｇタンパク質およびエフェクタータンパク質からなる。
【０００４】
Ｇタンパク質共役受容体
Ｇタンパク質共役受容体ファミリーは、内在性膜タンパク質の大規模なスーパーファミリーである。現在のところ、公共データベースより入手可能なＧタンパク質共役受容体の配列は、約２,０００種ある。以前から、このような受容体の数種とそれらの内因性のリガンド、同様に、外因性アゴニストおよびアンタゴニストが知られている（例えばβ2−アドレナリン受容体）。その他のものとしては、いずれの既知の内因性のリガンドとも結合しないため、いわゆるオーファンＧタンパク質共役受容体というものがある。
【０００５】
Ｇタンパク質共役受容体（また、７回膜貫通、７重らせん、または、ヘビ状受容体（ｓｅｒｐｅｎｔｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）としても知られている）は、アミノ酸配列の類似性、同様に構造的な類似性を示す。上記受容体は、細胞膜を７回貫通する単一のポリペプチド鎖で構成されており、細胞外アミノ末端、細胞膜を貫通する７個のほとんど疎水性のαへリックスドメイン（約２０〜３０個のアミノ酸からなる）、約２０個のよく保存されたアミノ酸、および、細胞質内カルボキシ末端からなる。
【０００６】
上記受容体へのアゴニストの結合には、受容体のコンフォメーション変化が介在しており、それにより上記受容体は活性型に移行する。活性型の受容体はＧタンパク質を活性化し、ＧＴＰのＧＤＰへの交換を媒介する。アンタゴニスト（ブロッカー）は、不活性型の受容体を安定化するため、一般的な下流のシグナル伝達経路をブロッキングする。
【０００７】
Ｇタンパク質
Ｇタンパク質共役受容体は、ヘテロ三量体のグアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）を介してシグナルを変換する。ヘテロ三量体のＧタンパク質は、α（３９〜４２ｋＤａ）、β（３５〜３６ｋＤａ）、および、γサブユニット（７〜１０ｋＤａ）からなる。αサブユニットは、ＧＴＰ／ＧＤＰのための結合部位を包含する。Ｇタンパク質は、細胞質膜の細胞質内側に天然に存在する。
【０００８】
細胞外リガンドの結合により、受容体タンパク質においてコンフォメーション変化が生じ、それによりグアニン−ヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）と接触するようになる。活性化Ｇタンパク質共役受容体はαサブユニットのコンフォメーションを改変し、ＧＴＰのＧＤＰへの交換を増強する。不活性状態では、βγ二量体はαサブユニットに結合する。交換の際に、αサブユニットからβγ二量体が解離する。活性化αサブユニットとβγ二量体はいずれも、細胞内エフェクタータンパク質に影響を与えることができる。次にαサブユニットは、ＧＴＰのＧＤＰとＰiへの加水分解を触媒し、それによりαサブユニットの不活性化が起こり、続いてβγ二量体がαサブユニットに結合する。
【０００９】
目下、Ｇタンパク質のαサブユニットファミリーは、４種の異なるクラス、すなわちＧαs、Ｇαi、ＧαqおよびＧα12に分類される。ＧαsクラスとＧαiクラスはそれぞれ、アデニリルシクラーゼ活性を刺激するか、または、阻害する。Ｇαqクラスは、ホスホリパーゼＣβを刺激するものであり、Ｇαq、Ｇα11、Ｇα14およびＧα15/16が含まれる。Ｇα12は、Ｇαqと類似しているが、さらに別個のクラスである。
【００１０】
一般的に、Ｇタンパク質共役受容体は、特定のＧタンパク質αサブユニットファミリーを特異的に活性化し、それにより、特定のシグナル伝達経路の活性化または不活性化が起こる。
【００１１】
エフェクタータンパク質
Ｇタンパク質は、様々な細胞内酵素、イオンチャンネルおよび輸送体にわたる広範囲の生物活性に作用する。
【００１２】
活性化Ｇタンパク質は、様々なシグナル経路を活性化または不活性化し、それによって、さらなるタンパク質、例えば酵素、および、イオンチャンネル（エフェクタータンパク質と呼ばれる）を活性化または不活性化する。典型的なエフェクタータンパク質は、イオンチャンネル、例えばＮ型のＣａ2+チャンネル、および、内向き整流性Ｋ+チャンネル（ＧＩＲＫ）をカップリングしたＧタンパク質、並びに、酵素（例えばアデニリルシクラーゼやホスホリパーゼＣ）である。
【００１３】
ＡＰＪ受容体
最も初期のオーファン受容体の１種は、ＡＰＪ受容体（アンギオテンシン受容体様−１）であり、これはもともと、Ｏ’Ｄｏｗｄ等によって同定された（Ｏ’Ｄｏｗｄ等，１９９３年，Ｇｅｎｅ  １３６：３５５〜３６０）。近年、ＡＰＪ受容体の内因性のリガンドであるアペリン−３６が同定された（Ｔａｔｅｍｏｔｏ等，１９９８年，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２５１：４７１〜４７６）。アペリン−３６は、３６個のアミノ酸からなるペプチドアゴニストであるが、アペリン−３６のより短い変異体（１３〜１９個のアミノ酸からなるＣ末端ペプチド）もまた、ＡＰＪ受容体においてアゴニスト特性を示す。アペリンは、７７個のアミノ酸残基からなるプレプロタンパク質のＣ末端部分からプロセシングによって生産され、複数の分子形態で存在する。
【００１４】
アペリンおよびＡＰＪ受容体のｍＲＮＡは、末梢組織、同様に、様々な中枢神経系領域、加えて、特に末梢血液の単核細胞で普遍的に発現されることがわかっている。免疫系において、ＡＰＪ受容体は、ＣＤ−４との共受容体としてＨＩＶ−１の侵入を補助することが報告されている（Ｃａｙａｂｙａｂ等，２０００年，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７４：１１９７２〜１１９７６）。加えて、近年、ＡＰＪ受容体は、心臓で高レベルのｍＲＮＡ発現を示すことが発見された（Ｌｅｅ等，２０００年，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ７４：３４〜４１）。内因性のリガンドの活性が、ウシ脳、胃腸組織の抽出物、同様に、心臓の抽出物で見出されている。
【００１５】
アペリンは、マウス脾臓からのサイトカイン生産の抑制、細胞外の酸性化の促進、および、チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるｃＡＭＰ生産の阻害、ならびに、血圧および血流の調節に関与することが示されている（Ｄｅ  Ｆａｌｃｏ等，２００２年，Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ２００２  １６：３３３〜３３６）。心臓において、アペリンは、ホスホリパーゼＣおよびプロテンキナーゼＣによって媒介されると考えられている用量依存性の陽性変力作用を誘導することが示されている（Ｓｚｏｋｏｄｉ等，２００２年，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ９１：４３４〜４４０）。その上、Ｎａ+／Ｈ+交換アイソフォーム−１（ＮＨＥ）、および、逆モードのＮａ+／Ｃａ2+交換（ＮＣＸ）の選択的阻害剤がアペリン応答を著しく抑制し、これは、それらのシグナル伝達経路への関与ことを示す（上記のＳｚｏｋｏｄｉ等）。
【００１６】
驚くべきことに、目下、心臓血管疾患には、ＡＰＪ受容体遺伝子の発現の増加が付随し、それにより、ＡＰＪ受容体のｍＲＮＡのレベルの増加、同様に、ＡＰＪ受容体タンパク質のレベルの増加が起こることが発見されたが、これは、ＷＯ０３／０１３５７６における発見に反している。その上、アペリン発現も高められる。このような発現の増加が付随する心疾患は、特に、うっ血性拡張型心筋症、肥大性心筋症および冠動脈疾患である。
【００１７】
冠動脈疾患
冠状動脈疾患は、最も一般的な心疾患の形態である。その症状としては、狭心症、心筋梗塞、息切れ、不規則な心拍または早い心拍などが挙げられる。これらは、ほとんどの場合、コレステロール、脂肪族化合物、カルシウムおよびフィブリンからなるプラークによって引き起こされるアテローム性動脈硬化症が原因で起こる。冠状動脈のアテローム性動脈硬化症により、冠状動脈の血管内腔が狭くなる。内腔が狭くなるため、血流に対する抵抗が増加し、心筋血流が障害を起こし、十分な酸素供給が保障されなくなる。血小板凝集によって生じる血栓形成に加えて、心筋は、その他のメカニズムのいずれかによる冠動脈疾患のために損傷を受ける可能性もある。冠動脈疾患の治療は、心臓への十分な血流を確保することに焦点が当てられており、薬物療法（βブロッカー、カルシウムチャンネルブロッカー、アスピリン、スタチンおよびニトレート）、血管形成術およびバイパス手術などがある。
【００１８】
心筋症
この心筋の病気（冠状動脈アテローム性動脈硬化症によって引き起こされるものではない）は、循環において、程度の差はあるが末梢における抵抗を増加させる。いくつかの例において、心臓リズムに障害が発生し、それにより、不規則な心拍または不整脈が起こる。通常、このような筋肉のダメージの正確な原因はわかっていないが、心臓移植の主要な理由である。心筋症には、４つのタイプ（非虚血性心筋症、うっ血性拡張型心筋症、肥大性心筋症および収縮性心筋症）がある。
【００１９】
うっ血性拡張型心筋症
この病気は、心臓のポンプ能力の低下を引き起こす少なくとも１つの心室の拡張が関連している。その結果として、心臓は、さらなる拡張と伸張（補うための）によってポンプ性能の制限に対応しようとする。うっ血性拡張型心筋症を患う患者は、一般的に、疲労、脱力感、息切れおよび脚部および足のむくみを示し、これらは体液の蓄積が原因で生じるものであり、さらに肺（うっ血）およびその他の身体各部に影響を与える場合もある。ほとんどの場合、病気の具体的な理由は同定されていない。しかしながら、いくつかの因子（例えばアルコール、ウイルス感染および特定の薬物）が、病気の発症に関連付けされている。この病気は、複雑な因子を回避し、症状コントロールすることによって治療される。治療は、明らかな危険因子（例えばアルコール摂取）を取り除くことから始められる。加えて、体重の減少や食事の変更も効果的であり得る。
【００２０】
肥大性心筋症
肥大性心筋症においては、左心室壁が肥大し硬化する。最も大きい肥大は、隔壁で起こる傾向がある。肥大による、心臓を通過する血液の流れが減少する。肥大性心筋症の症例のほとんどは遺伝性である。その他の症例において、明確な原因はない。肥大性心筋症を患う患者が症状を示す場合（多くは示さない）、患者は、息切れと胸部の不快感に苦しむ。その他の兆候は、身体活動中の失神、強く速い心拍および疲労である。病気の進行期では、患者は、重度の心不全を有する可能性があり、それに関連する症状としては、体液の蓄積またはうっ血が挙げられる。肥大性心筋症の治療は様々であるが、例えば、身体活動の減少、薬物（βブロッカー、カルシウムチャンネルブロッカー、抗不整脈薬による薬物療法および利尿薬）、ペースメーカーおよび外科手術が挙げられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
ＡＰＪ受容体およびアペリンは心疾患に関連するという事実から、ＡＰＪ受容体およびアペリンは興味深い薬理学的な標的となる。これは、特に、上記で詳述したような心疾患の治療における困難に関して適応される。多くの場合においてうまくいく治療および／または長期の治療、さらに予防法も、未だ見出されていない。
【００２２】
それゆえに、本発明の目的の一つは、例えば心疾患の予防または治療で用いることができるＡＰＪ受容体リガンドを同定および特徴付けするための試験システムを開発することである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
驚くべきことに、ＡＰＪ受容体リガンドを同定するための試験システムが発明され、本システムは、
（ａ）ＡＰＪ受容体またはそれらの機能的な変異体、および、
（ｂ）ＧαqもしくはＧαiタンパク質、または、ＧαqもしくはＧαiタンパク質のような異なるＧタンパク質の部分から構築されたハイブリッドタンパク質（例えばＧαΔ6qi4myrタンパク質）、
を含み、ここにおいて、前記ＡＰＪ受容体リガンドの前記ＡＰＪ受容体またはそれらの機能的な変異体への結合は、測定可能なシグナルまたは検出可能なシグナルに作用する。
【００２４】
ＡＰＪ受容体リガンドは、ＡＰＪ受容体に特異的に結合するあらゆる化合物である。本発明に係るＡＰＪ受容体への特異的な結合としては、これらに限定されないが、解離定数Ｋｄが１０-4モル／ｌを超過しない結合、好ましくは１０-5モル／ｌを超過しない結合が挙げられる。解離定数Ｋｄは、ヒトの心室の膜、および、放射性リガンドとして［125Ｉ］−Ｐｙｒ1）アペリン−１３を用いた競合結合実験で、以下の方程式に従って決定することができる（Ｋａｔｕｇａｍｐｏｌａ等，２００１年，Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １３２：１２５５〜１２６０）：
Ｂ［Ｌ］＝［Ｌ］／｛［Ｌ］＋ＫDL（１＋［Ｌ*］／ＫDL*｝
式中、［Ｌ］および［Ｌ*］はそれぞれ、ＡＰＪ受容体リガンドの濃度と、放射性リガンドの濃度を示す。ＫDLおよびＫDL*はそれぞれ、ＡＰＪ受容体リガンドの解離定数と、放射性リガンドの解離定数であり、Ｂ［Ｌ］は、特定のＡＰＪ受容体リガンド濃度での結合（％）である。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態において、同定しようとするリガンドは、アゴニストまたはアンタゴニストである。アゴニストはＡＰＪ受容体に結合して、それらのコンフォメーション変化を誘導し、それぞれのシグナル伝達経路を活性化することによって、測定可能なシグナルまたは検出可能なシグナルを発生させる。また、アンタゴニストまたはブロッカーも受容体に結合するが、通常はシグナル伝達を誘導しない。
【００２６】
より好ましい本発明の実施形態において、アゴニストは、完全、部分またはインバースアゴニストである。完全アゴニストは受容体を最大限活性化する。完全アゴニストより低い作用を有する化合物は、シグナル伝達を刺激するが、その程度は完全アゴニストより低いことから、部分アゴニストと呼ばれる。インバースアゴニストは、同受容体を占有することによってアゴニストとは逆の作用を生産するリガンドである。特に、Ｇタンパク質共役受容体が過剰発現される系において、インバースアゴニストを同定することができる。これらは、受容体に結合する際の測定可能なシグナルまたは検出可能なシグナルの基底レベルを減少させる。
【００２７】
同定されたリガンドは、ＡＰＪ受容体の特徴と機能を解明するのに用いることができる。その上、このようなリガンドは、ＡＰＪ受容体関連の障害または病気、好ましくは心疾患、最も好ましくはうっ血性拡張型心筋症、肥大性心筋症および冠動脈疾患の治療および予防において有用である可能性がある薬物である。
【００２８】
用語「ＡＰＪ受容体」は、アペリンに関する受容体を意味する。本発明に係るＡＰＪ受容体は、天然に存在するあらゆるＡＰＪ受容体である。ＡＰＪ受容体には、異なる種、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物のＡＰＪ受容体およびそれらの変異体、同様に、スプライス変異体、または、他の受容体（例えばβ2−アドレナリン受容体）に関して既知の受容体の多型によって生じるＡＰＪ受容体が含まれる。好ましい哺乳動物のＡＰＪ受容体またはそれらの変異体としては、ヒト（図２）、マウス（ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ），ＷＯ００／６８２４４）、および、ラット（ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ），ＷＯ００／６８２５０）のＡＰＪ受容体が挙げられる。もっとも好ましいＡＰＪ受容体は、ヒトのＡＰＪ受容体またはそれらの変異体である。いずれの場合においても、上記受容体は、シグナルの導入が可能でなければならず、すなわち、リガンド結合の際に、ＧαqもしくはＧαiタンパク質、または、ＧαqもしくはＧαiタンパク質のような異なるＧタンパク質の部分から構築されたハイブリッドタンパク質を改変する。本発明に係る「〜を改変する」とは、ＧαqもしくはＧαiタンパク質、または、ＧαqもしくはＧαiタンパク質のような異なるＧタンパク質の部分から構築されたハイブリッドタンパク質を活性化または不活性化することを意味する。一般的に、上記受容体は、アゴニストと結合する際に、ＧαqもしくはＧαiタンパク質、または、ＧαqもしくはＧαiタンパク質のような異なるＧタンパク質の部分から構築されたハイブリッドタンパク質を活性化する。活性化された受容体、例えば構成的に活性なＡＰＪ受容体の変異体の場合、上記受容体は、アンタゴニストと結合する際に、ＧαqもしくはＧαiタンパク質、または、ＧαqもしくはＧαiタンパク質のような異なるＧタンパク質の部分から構築されたハイブリッドタンパク質を不活性化する。
【００２９】
本発明に係るＡＰＪ受容体の変異体は、アペリンと結合するが、天然には存在しないＡＰＪ受容体である。アペリンの、ＡＰＪ受容体の変異体への結合は、放射性リガンドとしてアペリン類似体［125Ｉ］−Ｐｙｒ1）アペリン−１３を用いて、放射性リガンドとの結合実験を行うことによって試験することができ、これは、Ｋａｔｕｇａｍｐｏｌａのチームにより説明されている（Ｋａｔｕｇａｍｐｏｌａ等，２００１年，Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １３２：１２５５〜１２６０）。用語「変異体」は、天然に存在するＡＰＪ受容体配列とは１個またはそれ以上のヌクレオチドが異なるオリゴヌクレオチド配列を意味するものとして用いられる。このような変異オリゴヌクレオチドは、本明細書で用いられるように、野生型ポリペプチド（ＡＰＪ受容体）とは１個またはそれ以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失において異なるポリペプチド配列を示すタンパク質変異体として発現される。好ましくは、ある残基が類似の特徴を有する他の残基で置換されるような保存的アミノ酸置換である。典型的な置換は、脂肪族アミノ酸間、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸間、酸性残基を有するアミノ酸間、アミド誘導体間、塩基性残基を有するアミノ酸間、または、芳香族残基を有するアミノ酸間での置換である。変異ポリペプチドは、一次構造（アミノ酸配列）の点で異なるが、野生型と比較して二次構造もしくは三次構造または機能の点では、著しく異なっている場合もあるし、または、それほど相違ない場合もある。また、上記変異体は、アペリンに十分に結合することができるＡＰＪ受容体の部分、または、第二のＧタンパク質共役受容体部分に融合したＡＰＪ受容体部分を含む受容体キメラであってもよく、ここにおいて、上記キメラは、アペリンへの結合が可能なままであり、上記第二のＧタンパク質共役受容体部分は、その他のあらゆるＧタンパク質共役受容体の部分である。あらゆる場合において、上記受容体は、シグナルの導入が可能でなければならなず、すなわち、リガンド結合の際に、ＧαqもしくはＧαiタンパク質、または、ＧαqもしくはＧαiタンパク質のような異なるＧタンパク質の部分から構築されたハイブリッドタンパク質（例えばＧαΔ6qi4myrタンパク質）を改変する。
【００３０】
ＡＰＪ分析では、３種のＧタンパク質が試験されており、ＡＰＪリガンド（ＧαΔ6qi4myr、Ｇα16、および、Ｇαi4qi4）の検出に用いることができる。ＧαΔ6qi4myrタンパク質（図１）は、ＷＯ０２／０４６６５（Ｇα-6qi4myr，配列番号２）で開示されている。このＧタンパク質は、さらなる改変を含む異なるＧタンパク質の部分から構築されたハイブリッドＧタンパク質であり、１つのタンパク質内に様々なサブユニットの配列が組み合わされている。この異なるＧタンパク質からなる融合タンパク質は、１種のＧタンパク質のＧα受容体認識領域を、その他の種のＧタンパク質のＧαエフェクター活性化領域に融合することによって設計された。この目的は、Ｇタンパク質共役受容体からのシグナルを受け取るが、上記受容体が通常は結合しないシグナル伝達経路でスイッチされるＧタンパク質ハイブリッドを提供することであった。このような受容体の「再結合」は、測定方法で分析の評価項目（アデニリルシクラーゼ阻害と比較した、細胞内でのＣａ2+濃度の増加）をより簡単に得ることができ、ハイスループットスクリーニングで用いることができるという利点がある。ＧαΔ6qi4myrタンパク質を構築するために、Ｇαqタンパク質の６種の高度に保存されたＮ末端アミノ酸を欠失させた。加えて、アミノ末端の６個の高度に保存されたアミノ酸の欠失部分に、ハイブリッドは、Ｃ末端においてＧαiタンパク質配列を有している。最終的に、Ｇ-6qi4myrタンパク質（すなわちＧαΔ6qi4myrタンパク質）が生産させるように、追加のミリストイル化／パルミトイル化認識配列をＧαサブユニットのアミノ末端領域に挿入した。アミノ末端における−６ｑｉ４ｍｙｒのタンパク質配列は、−６ｑ変異体の元の配列におけるＭＡＣＣに対して、ＭＧＣＣである。
【００３１】
また、Ｇαi4qi4タンパク質も、ＷＯ０２／０４６６５に記載されている。このＧタンパク質は、さらなる改変を含む異なるＧタンパク質の部分から構築されたハイブリッドＧタンパク質であり、１つのタンパク質内に様々なＧαタンパク質サブユニットの配列が組み合わされている。Ｇαi4qi4タンパク質を構築するために、Ｇαqタンパク質の６個の高度に保存されたアミノ酸を欠失させた。加えて、アミノ末端の６個の高度に保存されたアミノ酸の欠失部分に、最初の４つのアミノ酸（ＭＡＣＣ）が、Ｇαiタンパク質の最初の４個のアミノ酸（ＭＧＣＴ）で置換された。さらに、Ｇαi4qi4タンパク質は、Ｃ末端においてＧαiタンパク質配列（ＣＧＬＦ）を有する。Ｇα16タンパク質は、Ｏｆｆｅｒｍａｎｎ等（１９９５年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７０，１５１７５〜１５１８０（Ｇａ１５およびＧａ１６が、多種多様の受容体をホスホリパーゼＣに結合させる）で開示されている。
【００３２】
測定可能なシグナルまたは検出可能なシグナルは、ハイブリッドＧタンパク質（ＧαΔ6qi4myr，Ｇαi4qi4）より下流の分子であるエフェクターと、シグナル伝達経路におけるＧα16タンパク質によって生産される。本発明に係る測定可能なシグナルまたは検出可能なシグナルは、リガンドがＡＰＪ受容体に結合する際に介在する物質の濃度または帯電のあらゆる変化である。このようなシグナルは、細胞内化合物、例えば、ジアシルグリセロールもしくはイノシトール１，４，５−三リン酸のような第２メッセンジャー、または、Ｃａ2+のようなイオンの濃度変化であり得る。このようなシグナルは、選択電極、抗体、放射標識、蛍光マーカー、酵素などを用いた既知の方法のいずれかによって測定することができる。
【００３３】
一般的に、ハイブリッドＧタンパク質（ＧαΔ6qi4myr，Ｇαi4qi4）、および、Ｇα16タンパク質は、様々なホスホリパーゼＣβアイソフォームに結合し、それにより膜結合型ホスファチジルイノシトール４，５−ビスリン酸の加水分解が起こり、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびイノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ3）が生産される。ＩＰ3は、細胞内の貯蔵部からＣａ2+を放出する。それゆえに、測定可能なシグナルまたは検出可能なシグナルとしては、ＤＡＧ、ＩＰ3およびＣａ2+の変化が挙げられる。
【００３４】
ＤＡＧを検出および定量化する方法は、当業者既知である。未精製の脂質抽出物中のＤＡＧは、Ｐｒｅｉｓｓ等の方法で測定することができる（Ｐｒｅｉｓｓ等，１９８６年，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６１：８５９７〜８６００）。細胞は、推定のＡＰＪアゴニストで刺激され、可溶化される。生産されたＤＡＧは、ＤＡＧキナーゼの存在下で放射標識されたＡＴＰと反応し、クロマトグラフィーで単離され、β−またはγ−カウンターでカウントすることによって定量される。ＡＴＰに適したマーカーとしては、3Ｈ、32Ｐ、33Ｐ、35Ｓ（例えばアデノシンチオ三リン酸を用いた場合）、および、14Ｃが挙げられる。
【００３５】
ＩＰ3を検出および定量化する方法は、当業者既知である。ＩＰ3は、市販の放射免疫分析（例えばアマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ），イリノイ州，米国）を製造元の説明書に従って用いて測定することができる。ＩＰ3を測定するその他の方法としては、細胞と標識されたイノシトールとをインキュベートすること、推定のＡＰＪ受容体アゴニストで細胞を刺激すること、細胞の溶解、陰イオン交換カラムでの分離、および、生産された標識されたＩＰ3の定量化（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ，１９８３年，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２１２：８４９〜８５８）が挙げられる。イノシトールに適したマーカーとしては、3Ｈおよび14Ｃが挙げられる。
【００３６】
より好ましい実施形態において、測定または検出しようとするシグナルは、Ｃａ2+濃度の変化、最も好ましくは細胞内Ｃａ2+濃度の変化であり、これらは、容易に測定または検出することができ、さらに、サンプルのハイスループットを用いたスクリーニング分析で利用可能である。
【００３７】
Ｃａ2+を検出および定量化する適切な方法は、当業者既知であり（Ｔａｋａｈａｓｈｉ等，１９９９年，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ７９：１０８９〜１１２５）、例えば、これらに限定されないが、カルシウム感受性プローブを用いた方法が挙げられる。一般的に、Ｃａ2+は、蛍光色素を用いて測定される。数種の周知のタンパク質ベースの、および非タンパク質ベースのＣａ2+指標があり、例えば、エクオリン、改変された緑色蛍光タンパク質−カルモジュリンキメラ、Ｑｕｉｎ、Ｉｎｄｏ、Ｆｕｒａ、ＢＴＣ、ＢＡＰＴＡなどが挙げられる。これらの全ての方法および蛍光色素は当業者周知である。
【００３８】
一般的に、細胞を成長させ、蛍光マーカーを添加し、次に、推定のＡＰＪアゴニストで刺激する。その後、蛍光光度計を用いて、用いられるマーカーに応じて特定の励起波長および発光波長でＣａ2+を測定する。
【００３９】
もっとも好ましい実施形態において、Ｃａ2+は、ＦＬＩＰＲ（蛍光イメージングプレートリーダー）装置（モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ），カリフォルニア州，米国）によって測定され、一般的には、９６ウェルおよび３８４ウェル様式で細胞内のＣａ2+レベルが測定される。この分析は製造元の説明書に従って行われる。このＣａ2+を測定する方法は、ハイスループット分析に非常に適している。
【００４０】
本発明の一実施形態において、本試験システムは遺伝操作された細胞に存在しており、その細胞内に、成分（ａ）または（ｂ）の少なくとも一方（ＡＰＪ受容体またはそれらの機能的な変異体、ＧαΔ6qi4myrタンパク質）が導入されている。導入された成分はトランスジーンと称される。
【００４１】
これらの細胞としては、これらに限定されないが、ＨＥＫ２９３、７４５−Ａ、Ａ−４３１、心房筋細胞、ＢｘＰＣ３、Ｃ５Ｎ、Ｃａｃｏ−２、Ｃａｐａｎ−１、ＣＣ５３１、ＣＦＰＡＣ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＣＶ−１、ＥＡＨＹ、ＥＡＨＹ９２６、Ｆ９８、ＧＨ３、ＧＰ＆ｅｎｖＡＭ１２、Ｈ−２９５Ｒ、Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ、ＨＡＣＡＴ、ＨＡＣＡＴＡ１３１、ＨＥＫ、ＨＥＬ、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ハイファイブ（Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ）、Ｈｓ７６６Ｔ、ＨＴ２９、ＨＵＶ−ＥＣＲ２４、ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ、ＩＥＣ１７、ＩＥＣ１８、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋ５６２、ＫＡＲＰＡＳ−２９９、Ｌ９２９、ＬＩＮ１７５、ＭＡｔ−ＬＹＬＵ、ＭＣＦ−７、ＭＮＥＬ、ＭＲＣ−５、ＭＴ４、Ｎ６４、ＮＣＴＣ２５４４、ＮＤＣＫＩＩ、Ｎｅｕｒｏ２Ａ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＮＴ２／Ｄ１、Ｐ１９、一次ニューロン性細胞、一次樹状細胞、一次ヒト筋原細胞、一次ケラチノサイト、ＳＦ９、ＳＫ−ＵＴ−１、ＳＴ、ＳＷ４８０、ＳＷＵ−２ＯＳ、Ｕ−３７３、Ｕ−９３７、および、Ｙ−１が挙げられる。その他の適切な細胞としては、当業者既知のものが挙げられる。
【００４２】
好ましい細胞系は、ＨＥＫ２９３細胞（一次ヒト胎児腎臓）、３Ｔ３細胞（マウス胎児線維芽細胞）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）、ＣＯＳ−７細胞（アフリカミドリザル細胞系）、ＨｅＬａ細胞（ヒト頚部の類上皮細胞ガン）、ＪＵＲＫＡＴ細胞（ヒトＴ細胞白血病）、ＢＨＫ２１細胞（ハムスターの正常な腎臓、線維芽細胞）、および、ＭＣＦ−７細胞（ヒト乳ガン）である。
【００４３】
その他の本発明の実施形態において、本試験システムは、一過性の、または安定なトランスフェクションされた細胞系またはそれらの膜に位置する。トランスジーンをレシピエント細胞に導入する手順は、トランスフェクションと呼ばれる。ＤＮＡでのトランスフェクションは、安定な細胞系、同様に、不安定な（一過性の）細胞系を生じる。一過性の細胞系は、トランスフェクションされたＤＮＡの生存を染色体外の形態で反映する；安定な細胞系は、ゲノムへの統合によって生じる。シグナルの測定および検出が細胞全体に限定されない場合において、このような細胞系の単離された膜を用いてもよい。単離された膜は、例えば、細胞を回収し、場合によりそれらをホモジネートし、それらを遠心分離で回収することによって提供される。
【００４４】
トランスジーンは、当業者既知で、それぞれの細胞型に適した多種多様な手段で細胞に導入することができる。トランスジーンを導入し、発現するために、核酸分子を導入し発現するための当業界周知の組換えＤＮＡクローニング技術を用いることができる。細胞は、ウイルスベクター、化学的な形質転換体、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈殿、および、直接的なＤＮＡの拡散などのあらゆる適切な手段を用いてトランスフェクションされ得る。
【００４５】
本明細書で用いられるように、ベクターは、トランスジーンを細胞に輸送する物質であり、例えば、適切な転写および翻訳制御シグナル、例えばプロモーターが挙げられる。ベクターとしては、プラスミド、ウイルス性プラスミドまたは当業界既知のその他のものが挙げられる。プロモーターとしては、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーター、一般的な、または細胞特異的、核の、または細胞質内の特異的プロモーターが挙げられる。プロモーター、ベクターおよびその他の要素の選択は、当業者のレベルの範囲内で慣例的な設計事項である。このような要素の多くは文献で説明されており、商業的な供給元から入手可能である。通常、トランスファー方法は、細胞へ選択マーカーを移入させることを含む。
【００４６】
一般的に、細胞系は、上述の手段のいずれかによってトランスフェクションされ、ここにおいて、トランスジーンは、選択マーカーに機能するように結合する。トランスフェクションに続いて、細胞を、例えば数日間強化培地で成長させ、続いて選択培地に交換する。トランスフェクションされた細胞は、選択に対して耐性を示し、生存可能であるが、それに対して、トランスフェクションされていない細胞は通常死滅する。選択マーカーの例としては、ピューロマイシン、ゼオシン、ネオマイシン（ｎｅｏ）、および、ハイグロマイシンＢ（ピューロマイシンに耐性を付与する）、ゼオシン、アミノグリコシドＧ−４１８、および、ハイグロマイシンがそれぞれ挙げられる。
【００４７】
本発明のその他の目的は、ＡＰＪ受容体リガンドのスクリーニング方法であり、本方法は、以下の工程を含む：
（ａ）本発明に係る試験システムを提供する工程、
（ｂ）試験化合物を提供する工程、
（ｃ）場合により、既知のＡＰＪ受容体リガンドを提供する工程、および、
（ｄ）ＡＰＪ受容体が介在するシグナル伝達経路への前記試験化合物の作用を測定または検出する工程。
【００４８】
本スクリーニング方法の目的は、試験化合物をＡＰＪ受容体リガンドとして同定すること、および、その特徴付けである。試験化合物は、あらゆる試験化合物が可能であり、天然に存在するものでも、化学合成されたものでもよい。天然に存在する試験化合物としては、特にペプチド、好ましくは内因性のリガンドのアペリンとの類似性を示すペプチドが挙げられる。この例としては、アペリンフラグメント、同様に、特定の配列相同性を有するペプチド（相同性が高ければ、ＡＰＪ受容体アゴニストが同定される可能性も上昇する）が挙げられる。しかしながら、試験化合物は非タンパク質性リガンドでもよい。Ｇタンパク質共役受容体の７回膜貫通ドメインは、結合ポケットを形成するという事実がある。カテコールアミン（エピネフリン、ノルエピネフリン）のような非ペプチド性のリガンドは、結合ポケット中で、ペプチドの結合部位よりさらに内部で結合する（ペプチドの結合部位はより外側である）ということは、周知の事実である。その結果として、適切な標的としては、より小さい（ペプチドリガンドと比較して）非ペプチド化合物も可能である。このようなより小さい化合物は、受容体に結合する際に、好ましくは、アンギオテンシン受容体（ロサルタン，カンデサルタン）に関して知られているアンタゴニストの特性を示すと予想される。
【００４９】
アゴニスト、好ましくは、完全、部分またはインバースアゴニストおよびアンタゴニストは、分析設計に応じて同定が可能である。
【００５０】
完全、部分およびインバースアゴニストの同定に関して、本スクリーニング方法は、工程（ａ）、（ｂ）および（ｄ）を行うことによって実施することができる。これに関して、本試験システムは、適切な環境下で（緩衝液、温度、基質など）、および、シグナルを検出または測定するのに十分な期間、試験化合物とインキュベートされる。試験化合物がアゴニスト種のいずれかである場合、その濃度は、シグナルを誘導するのに十分な高い濃度であると予想される。その濃度は、毒性レベルを超過しないと予想され、一般的に０.１〜１モル／ｌである。
【００５１】
アゴニストが同定された場合、本試験システムを用いることによってそれをさらに特徴付けることができる。完全および部分アゴニストは、用量反応曲線で特徴付けることができる。ここにおいて、本試験システムは、試験化合物濃度を増加させながらインキュベートされる。シグナルは、アゴニスト濃度に対してプロットされる。得られた曲線は、以下の方程式を用いて解析することができる：
Ｓ([Ｃ])＝Ｓmin＋(Ｓmax−Ｓmin)・[Ｃ]／([Ｃ]＋ＥＣ50)
［Ｃ］＝試験化合物Ｃの濃度、
Ｓ（［Ｃ］）＝特定の試験化合物Ｃの濃度におけるシグナル、
Ｓmin＝基本の、または最小のシグナル、
Ｓmax＝最大のシグナル、
ＥＣ50＝最大シグナルの半分を仲介する試験化合物Ｃの濃度。
【００５２】
次に、試験化合物をＥＣ50とＳmaxによって特徴付ける。Ｓmaxが、完全アゴニストを用いて誘導されたＳmaxと同じ高さの場合、その試験化合物も完全アゴニストである。それより低い場合、その試験化合物は部分アゴニストである。一般的に、低いＥＣ50値を有する薬物が好ましく、これは、同じ作用を達成するために、より高いＥＣ50値を有する薬物と比較してより少ない量の物質でよいためである。
【００５３】
アンタゴニストを同定するために、本スクリーニング方法は、工程（ａ）〜（ｄ）を行うことによって実施することができる。アンタゴニストは一般的に測定可能なシグナルまたは検出可能なシグナルの生産を媒介しないため、アンタゴニストは直接同定することはできない。それゆえに、アゴニストの作用をブロックすることによってアンタゴニストの結合が同定される（（ｃ）既知のＡＰＪ受容体リガンド）。本試験システムを、適切な環境下で（緩衝液、温度、基質など）、シグナルを検出または測定するのに十分な期間、試験化合物およびアゴニストとインキュベートする。試験化合物がアンタゴニスト種のいずれかである場合、その濃度は、アゴニストによって媒介されるシグナルを阻害するのに十分に高い濃度と予想される。試験化合物およびアゴニストの濃度は、毒性レベルを超過しないと予想され、一般的に０.１〜１モル／ｌである。
【００５４】
アンタゴニストが同定された場合、本試験システムを用いることによってそれをさらに特徴付けることができる。ここにおいて、本試験システムは、所定濃度のアゴニストの存在下で、試験化合物の濃度を増加させながらインキュベートされる。シグナルは、アンタゴニストの濃度に対してプロットされる。得られた曲線は、以下の方程式を用いて解析することができる：
Ｓ([Ｂ])＝Ｓmin＋(Ｓmax−Ｓmin)｛１−[Ｂ]／([Ｂ]＋ＩＣ50)｝
［Ｂ］＝試験化合物Ｂの濃度（ブロッカー＝アンタゴニスト）、
Ｓ（[Ｂ]）＝特定の試験化合物Ｂの濃度におけるシグナル、
Ｓmin＝基本の、または最小のシグナル、
Ｓmax＝最大のシグナル、
ＩＣ50＝最大阻害の半分を仲介する試験化合物Ｂの濃度。
【００５５】
ブロッカーの定数Ｋｂは、以下に従って計算することができる：
ＫB＝ＩＣ50｛１＋[Ａ]／ＥＣ50｝
［Ａ］＝アゴニストの濃度、
ＥＣ50＝最大シグナルの半分を仲介するアゴニストの濃度。
【００５６】
次に、試験化合物をＫBによって特徴付ける。一般的に、低いＫB値を有する薬物が好ましく、これは、同じシグナルをブロックまたは阻害するために、より少ない量の物質でよいためである。
【００５７】
本発明の好ましい一実施形態において、試験化合物は、化学物質ライブラリーの形態で提供される。化学物質ライブラリーは、複数の化学物質を含み、化学合成された分子や天然産物などの複数の源のいずれかから構築したものか、または、コンビナトリアルケミストリー技術で生成したものである。これらは特に、ハイスループットスクリーニングに適している。これらは、特定の構造を有する化学物質、または、特定の生物（例えば植物）由来の化合物で構成されていてもよい。本発明に関して、化学物質ライブラリーは、好ましくは、Ｇタンパク質共役受容体に関するタンパク質およびポリペプチドまたはリガンドを含むライブラリーである。
【００５８】
本発明の好ましいその他の一実施形態において、リガンドをスクリーニングする方法は、細胞全体を用いて行われる。細胞は、当業界既知の細胞のいずれも可能である。有用な細胞の例は上述した通りである。通常、細胞は、使用するまでマルチウェルプレートで成長させる。細胞は、場合により標識され（必要に応じて）、その後ＡＰＬ受容体リガンドで刺激される。細胞全体を用いることは、膜に比べて、細胞内基質、酵素などを本試験システムに添加する必要がないため、有利である。その上、マルチウェルプレート中の細胞全体は特に、ハイスループットスクリーニング試験および自動化試験システムに適している。
【００５９】
本発明の方法は、ロボットシステムで行われることが有利であり、このようなシステムとしては、例えば、ロボット式プレーティング、および、例えば微量流体を用いた（すなわち流体を導く構造の）ロボット式液体移送システムを含むシステムが挙げられる。
【００６０】
その他の本発明の実施形態において、本方法は、ハイスループットスクリーニング系の形態で行われる。このような系において、スクリーニング方法は自動化かつ小型化されていることが有利である；特に、小型化されたウェルを用い、ロボットにより制御される微量流体を用いる。
【００６１】
本発明のその他の目的は、医薬品の生産方法であり、本方法は、以下の工程を含む：
（ａ）本発明に係るスクリーニング方法を行うことによってＡＰＪ受容体リガンドを同定する工程、
（ｂ）十分な量の前記リガンドを提供する工程、および、
（ｃ）１種またはそれ以上の製薬上許容できる担体または補助剤を用いて測定または検出された試験化合物を製剤化する工程。
【００６２】
好ましくは、本医薬品は、ＡＰＪ受容体関連の病気または障害の予防、治療または診断のために用いられる。ＡＰＪ受容体関連の病気または障害は、上記受容体の発現レベル、その内因性のリガンド、そのシグナル伝達、そのシグナル伝達経路、または、下流エフェクター分子の作用が変化することを特徴とする状態である。あるいは、ＡＰＪ受容体は、病気または障害の発症または進行に関与する。
このような病気の例としては、これらに限定されないが、心臓血管疾患、心疾患、血圧調節の機能不全、神経系および免疫系の病気、例えばＨＩＶが挙げられる。
【００６３】
より好ましくは、上記病気は、心疾患、最も好ましくはうっ血性拡張型心筋症、肥大性心筋症および冠動脈疾患である。
【００６４】
薬物療法のためには、単離された試験化合物またはその製薬上許容できる塩は、製剤の形態でなければならず、これは、一般的に、望ましい特徴が提供されるように組み合わされた製薬上許容できるキャリアーまたは補助剤のような成分の混合物からなる。
【００６５】
製剤は、少なくとも１種の適切な製薬上許容できるキャリアー、または、補助剤を含む。このような物質の例としては、脱塩水、等張塩類溶液、リンゲル液、緩衝液、有機または無機酸および有機または無機塩基ならびにそれらの塩、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸ナトリウムまたは二リン酸カルシウム、グリコール、例えばプロピレングリコール、エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル、糖類例えばグルコース、スクロースおよびラクトース、スターチ、例えばコーンスターチおよびポテトスターチ、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油類、例えば落花生油、綿実油、トウモロコシ油、ダイズ油、ヒマシ油、合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、高分子の補助剤、例えばゼラチン、デキストラン、セルロースおよびその誘導体、アルブミン、有機溶媒、錯化剤、例えばクエン酸塩および尿素、安定剤、例えばプロテアーゼまたはヌクレアーゼ阻害剤、好ましくはアプロチニン、ε−アミノカプロン酸またはペプスタチンＡ、保存剤、例えばベンジルアルコール、酸化阻害剤、例えば亜硫酸ナトリウム、ワックスおよび安定剤、例えばＥＤＴＡが挙げられる。また、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、矯味矯臭薬剤および芳香剤、保存剤および抗酸化剤が組成物に含まれていてもよい。生理緩衝溶液のｐＨは、好ましくは、約６.０〜８.０、特に約６.８〜７.８、特に約７.４であり、および／または、浸透圧モル濃度は、約２００〜４００ミリオスモル／リットル、好ましくは約２９０〜３１０ミリオスモル／リットルである。このような医薬品のｐＨは、一般的に、例えば適切な有機または無機緩衝液を用いて調節され、好ましくは、リン酸緩衝液、トリス緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジノ］メタンスルホン酸）、または、ＭＯＰＳ緩衝液（３−モルホリノ−１−プロパンスルホン酸）を用いて調節される。それぞれの緩衝液の選択は一般的に、望ましい緩衝液のモル濃度に依存する。例えば注射および輸液には、リン酸緩衝液が適切である。医薬品を製剤化する方法、同様に、適切な製薬上許容できる担体または補助剤は当業者周知である。製薬上許容できる担体および補助剤は、最も一般的な投薬形態および同定された化合物に従って、適宜（ａ．ｏ．）選択される。
【００６６】
本医薬組成物は、経口、鼻、直腸、非経口、膣、局部または膣への投与に適するように製造することができる。非経口投与としては、皮下の、皮内、筋肉内、静脈内または腹膜内投与が挙げられる。
【００６７】
本医薬品は、例えば、経口投与のための固形製剤、例えばカプセル、錠剤、丸剤、粉末および顆粒、経口投与のための液状製剤、例えば製薬上許容できる乳濁液、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル、注射用製剤、例えば、滅菌注射用水性または油性懸濁液、直腸または膣投与のための組成物、好ましくは坐剤、および、局所または経皮投与のための製剤、例えば軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ジェル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤またはパッチのような様々な投薬形態に応じて製剤化することができる。
【００６８】
あらゆる特定の患者に対応する具体的な治療上有効な用量レベルは、多種多様な要素、例えば、同定された化合物の活性、投薬形態、患者の年齢、体重および性別、治療の継続時間など、医療分野で周知の要素に応じて決定されると予想される。
【００６９】
ヒトまたはその他の哺乳動物に投与される本発明の化合物の、１回または数回に分けた用量での１日用量の総量は、例えば、約０.０１〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、または、より好ましくは約０.１〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。単回投与の組成物には、上記の量またはそれらの約数を１日用量になるように含ませることができる。一般的に、本発明に係る治療計画は、このような治療が必要な患者への、本発明の化合物を、１回または複数回の用量に、１日あたり化合物約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇの投与を含む。
【００７０】
本発明のさらにその他の目的は、心疾患の診断または予後の方法であって、本方法は、以下の工程を含む：
（ａ）試験されるサンプル中における、ＡＰＪ受容体遺伝子および／またはアペリン遺伝子の発現レベルを決定する工程、
（ｂ）工程（ａ）で決定された試験されるサンプル中におけるＡＰＪ受容体遺伝子および／またはアペリン遺伝子の発現レベルを、コントロールプローブ中におけるＡＰＪ受容体遺伝子および／またはアペリン遺伝子の発現レベルと比較する工程、および、
（ｃ）ＡＰＪ受容体および／またはアペリン遺伝子発現が増加したサンプルを同定する工程。
【００７１】
ＡＰＪ受容体およびアペリンは、心疾患、好ましくはうっ血性拡張型心筋症、肥大性心筋症および冠動脈疾患の指標として用いることができる。驚くべきことに、発明者等は、罹患した心臓において、ＡＰＪ受容体の発現、同様に、アペリンの発現が増加することを発見した（表１）。それゆえに、ＡＰＪ受容体およびアペリンの発現の増加は、明らかに、心疾患、例えばうっ血性拡張型心筋症、肥大性心筋症および冠動脈疾患の指標である。
【００７２】
本発明に係る診断または予後の方法において、ＡＰＪ受容体遺伝子またはアペリン遺伝子の発現は、核酸増幅法、ハイブリダイゼーション法、酵素免疫検査法、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、または、タンパク質の生物学的分析（例えば、膜、溶液、または、核酸またはタンパク質の検出および／または定量化のためのチップに基づく技術など）によって分析することができる。
【００７３】
好ましい実施形態において、 診断および予後の方法 は、前記遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子から転写されたｍＲＮＡのレベルまたは前記遺伝子から翻訳されたポリペプチドのレベルに基づき決定することによって行われる。
【００７４】
多種多様の標識および結合技術が当業者既知であり、様々な核酸およびアミノ酸分析で用いることができる。ＡＰＪ受容体またはアペリンをコードするポリヌクレオチドに関する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを生産するための手段としては、オリゴ標識、ニックトランスレーション、エンドラベリング、または、標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅が挙げられる。あるいは、ＡＰＪ受容体またはアペリンをコードする配列を、ｍＲＮＡプローブを生産するためのベクターにクローニングしてもよい。このようなベクターは当業界既知であり、市販されており、インビトロで、標識ヌクレオチドの付加と適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７、Ｔ３またはＳＰ６）によりＲＮＡプローブを合成するのに用いることができる。これらの手法は、多種多様な市販のキット（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、および  ＵＳバイオケミストリー（ＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ））を用いて行うことができる。検出を簡易化するためにを用いることができる適切なレポーター分子または標識としては、放射性核種、酵素、および  蛍光性物質、化学発光物質またはクロモジェニック物質、同様に、基質、補因子、阻害剤、磁気粒子などが挙げられる。
【００７５】
多種多様な当業界既知の技術を用いて、所定のポリペプチドまたはタンパク質が発現されるレベルを定量することができる。このような技術としては、これらに限定されないが、免疫学的技術、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡまたはウェスタンブロット、または、定量分析技術、例えば分光分析もしくはフレームクロマトグラフィーが挙げられる。
【００７６】
より好ましい実施形態において、診断および予後の方法は、ハイブリダイゼーション法または核酸増幅法でｍＲＮＡのレベルを決定することによって行われる。このような方法は当業者既知であり、例えば、ドットブロットハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、または、ＲＴ−ＰＣＲ方法が挙げられる。
【００７７】
その他のより好ましい実施形態において、診断および予後の方法は、ポリペプチドまたはそれらのフラグメントに特異的に結合することができる結合タンパク質、例えば抗体またはアンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）を用いてポリペプチドのレベルを決定することによって行われる。
【００７８】
所定のポリペプチドに特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかを用いてそのポリペプチドを検出し、測定するための多種多様なプロトコールが当業界既知である。例としては、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および  蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【００７９】
この方法に関して、一般的な試験（上記参照）を行うために、ＡＰＪ受容体遺伝子および／またはアペリン遺伝子によってコードされたポリペプチドに特異的に結合することができる抗体が用いられる。抗体または抗体フラグメントを製造する手順は、当業者周知の方法に従って、例えば、哺乳動物（例えばウサギ）を、必要に応じて例えばフロインドアジュバントおよび／または水酸化アルミニウムゲルの存在下でＡＰＪ受容体またはアペリンで免疫化することによって実行される（例えば、Ｄｉａｍｏｎｄ，Ｂ．Ａ．等．（１９８１年）Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：１３４４〜１３４９を参照）。免疫反応の結果として動物内で形成されるポリクローナル抗体は、その後、周知の方法を用いて血液から単離することができ、さらに、例えばカラムクロマトグラフィーという手段によって精製することができる。モノクローナル抗体は、例えば、ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの既知の方法（Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ，３４９，２９３〜２９９）に従って製造することができる。
【００８０】
本発明のその他の目的は、心疾患の検出または予後に使用できるキットであり、本キットは、ＡＰＪ受容体遺伝子および／またはアペリン遺伝子の発現レベルを決定することに使用できるプライマーおよび／またはプローブを含む。
【００８１】
心疾患の検出および予後に使用できるキットは、試験されるサンプル中におけるＡＰＪ受容体および／またはアペリン遺伝子の発現レベルの変化を試験するためのキットを含む。本発明のキットは、上記の遺伝子から転写されたｍＲＮＡのレベルを定量することができるキットである。発現を試験するために、本キットは、上記遺伝子からのｍＲＮＡのレベルを決定するのに使用できるプライマーおよび／またはプローブを含む。
【００８２】
本発明のキットは、心疾患に罹っている患者、特にうっ血性拡張型心筋症、肥大性心筋症および冠動脈疾患に罹っている患者の心臓において、ＡＰＪ受容体およびアペリン遺伝子発現が増加するという驚くべき発見に基づいている。
【００８３】
上記プライマーは、上記の遺伝子に対応する核酸に特異的に結合するように設計される。このようなプライマーとしては、従来の核酸増幅法のいずれか（例えばＲＴ−ＰＣＲ）で用いられる反応条件下で、上記の遺伝子から転写されたｍＲＮＡから誘導された核酸配列を特異的に増幅することができるあらゆるプライマーが挙げられる。例えば、プライマーは、これらの遺伝子のヌクレオチド配列に基づき設計し、合成することができる。好ましい実施形態において、本キットは、上記の遺伝子から転写されたｍＲＮＡから誘導された核酸配列を特異的に増幅することができるプライマー対を含む。さらに本キットは、ｍＲＮＡの増幅および遺伝子発現の定量化を行うのに適した試薬を含んでもよい。
【００８４】
本発明のその他の目的は、心疾患の検出または予後に使用できるキットであり、本キットは、ＡＰＪ受容体遺伝子および／またはアペリン遺伝子によってコードされたポリペプチドに特異的に結合することができる抗体を含む。
【００８５】
当業界既知の多種多様な技術を用いて、所定のタンパク質が発現されるレベルを定量することができる。さらなる詳細は、上記を参照。
【００８６】
【表１】
2007527229.tif 000002
【００８７】
図面の説明
図１は、ｐＣＤＮＡ１に挿入されたマウスＧαΔ6qi4myrタンパク質のコード領域のポリヌクレオチド配列を示す（配列番号１に対応する）。
ＧαΔ6qi4myrタンパク質の遺伝子は、ｐＣＤＮＡ１の５’および３’にそれぞれＢａｍＨＩとＮｓｉＩ部位を介してに挿入された。
図２は、ヒトアペリン受容体の発現プラスミドと、その受容体タンパク質のアミノ酸配列を示す（配列番号２に対応する）。
ヒトアペリン受容体遺伝子をＡＶＥＭ１１３９４００から切断し、ＥｃｏＲＩで切断されたｐＥＡＫ８に挿入した。
図３は、一過性にコトランスフェクションされたＣＨＯ細胞における、様々なアペリンペプチドのＡＰＪ受容体に対する作用を示す。
【００８８】
当業者既知の方法に従って、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）で、ＡＰＪ受容体を、コントロール（白い柱）、その他のＧタンパク質αサブユニットα１６（黒い柱）、および、αΔ６ｑｉ４ｍｙｒ（縞模様の柱）としてベクターＤＮＡで一過性にコトランスフェクションした。細胞を、１μモル／ｌの以下の各ペプチド：
１  アペリン様ペプチド／Ｊｅｒｉｎｉペプチド、
２  アペリン１２、
３  アペリン１３、
４  アペリン３６、
５  ｐｙｒ−アペリン、
を用いて処理し、機能的なＦＬＩＰＲカルシウム分析で細胞内Ｃａ2+濃度を決定した。ペプチド２〜５は、ＡＰＪ受容体を介した細胞内カルシウム放出を誘導した。これは、機能的なカルシウム応答は、キメラ／プロミスカスなＧタンパク質αサブユニットの存在を必要とすることを示す。示されたデータは、二連で行われた二回の独立した実験の平均値（蛍光強度単位，ＦＩＵ）である。
【００８９】
図４は、Ｇαi4qi4およびＡＰＪ受容体を過剰発現する、安定してトランスフェクショ
ンされたＨＥＫ２９３細胞における、アペリンのＡＰＪ受容体に対する用量依存性の作用を示す。
【００９０】
ＨＥＫ２９３細胞を、上述した通りに、ＧαΔ6qi4myr単独で安定してトランスフェクションし（Ａ）、または、ＧαΔ6qi4myrとＡＰＪでコトランスフェクションし（Ｂ）、
１  なし、
２  ５０ｎモル／ｌ、
３  ２００ｎモル／ｌ、
４  １μモル／ｌ、
のｐｙｒ−アペリン−１３（上部）、または、アペリン−３６（下部）とインキュベートした。両方のペプチドが、用量依存性のＡＰＪ受容体を介した細胞内カルシウム放出を誘導した。これは、機能的なカルシウム応答は、ＡＰＪ受容体の存在を必要とすることを示す。示されたデータは、二連で行われた二回の独立した実験の平均値である（蛍光強度単位，ＦＩＵ）。
【００９１】
図５は、ＧαΔ6qi4myrタンパク質のアミノ酸の配列を示す（配列番号３に対応する）。
図６は、Ｇαi4qi4遺伝子のコード領域のポリヌクレオチド配列を示す（配列番号４に対応する）
図７は、Ｇαi4qi4タンパク質のアミノ酸の配列を示す（配列番号５に対応する）。
図８は、ヒトアペリン−１２のアミノ酸の配列を示す（配列番号６に対応する）。
図９は、ヒトアペリン−１３のアミノ酸の配列を示す（配列番号７に対応する）。
図１０は、アペリン−３６のアミノ酸の配列を示す（配列番号８に対応する）。
【００９２】
配列番号の説明：
配列番号１：ｐＣＤＮＡ１に挿入されたマウスＧαΔ6qi4myrタンパク質のコード領域のポリヌクレオチド配列である。
配列番号２：ヒトアペリン受容体の発現プラスミドのポリヌクレオチド配列（ヒトアペリン受容体遺伝子は、ＡＶＥＭ１１３９４００から切断し、ＥｃｏＲＩで切断したｐＥＡＫ８に挿入した）、および、受容体タンパク質のアミノ酸の配列である。
配列番号３：マウスＧαΔ6qi4myrタンパク質のアミノ酸の配列である。
配列番号４：マウスＧαi4qi4遺伝子のコード領域のポリヌクレオチドの配列である。
配列番号５：マウスＧαi4qi4タンパク質のアミノ酸の配列である。
配列番号６：ヒトアペリン−１２のアミノ酸の配列である。
配列番号７：ヒトアペリン−１３のアミノ酸の配列である。
配列番号８：ヒトアペリン−３６のアミノ酸の配列である。
【実施例】
【００９３】
１：機能的なＡＰＪ受容体／Ｇαi4qi4タンパク質細胞系
１．１．細胞培養
ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胚腎臓細胞）を、１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含むＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）中で、３７℃（５％ＣＯ2）で成長させた。第二のトランスフェクションの後に、抗生物質ゼオシンおよびピューロマイシンを細胞に添加した。細胞を２または３日のインターバルで継代させた。
【００９４】
１．２．ＨＥＫ２９３細胞系のＧαi4qi4タンパク質でのトランスフェクション
トランスフェクションのために、細胞を１００ｍｍプレートに植えた。約２４時間後に、細胞を、Ｇαi4qi4を含むｐＨＯＯＫ３ベクター（インビトロジェン，メリーランド州，米国）でトランスフェクションした（図６）。安定した細胞系を使用まで凍結保存した。
【００９５】
１．３．細胞系のＡＰＪ受容体でのトランスフェクション
安定してトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞系（Ｇαi4qi4遺伝子を過剰発現する）を、ＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）１０ｍｌを含む１００ｍｍプレートで成長させた。２４時間後、培地を除去し、新しいＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）８ｍｌを添加した。ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ），ドイツ）１２μｌ、および、ＯｐｔｉＭＥＭ４００μｌを混合し、５分間インキュベートした。その後、内毒素非含有プラスミドＤＮＡ（ＡＰＪ／ｐＥＡＫ８；図２を参照）４μｇを添加し、サンプルをさらに１０分間インキュベートした。このトランスフェクション混合物を細胞に添加した。２４時間後、培地を、ゼオシン（２５０μｇ／ｍｌ）、および、ピューロマイシン（５００ｎｇ／ｍｌ）を含む新しい培地で交換した。安定な細胞系を選択するために、機能性の試験で使用する前に細胞を６週間培養した。約２週間後、抗生物質耐性がない細胞は死滅した。
【００９６】
２．ＦＬＩＰＲカルシウム分析
ＦＬＩＰＲカルシウム分析により、細胞内カルシウム濃度の変化を検出するための適切な方法が提供される。これは、蛍光に基づく分析であり、製造元（モレキュラーデバイス，カリフォルニア州，米国）の説明書に従って行われた。簡単に要約すると、細胞を９６または３８４ウェルプレートに植え、ローディング緩衝液を細胞に添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、細胞を最も一般的なＡＰＪ受容体リガンドで刺激するか、または、刺激を行わなかった。その後、ＦＬＩＰＲシステムのマニュアルに従って、細胞内カルシウム濃度をＦＬＩＰＲで測定した。
【００９７】
２.１：化学物質および器具
【表２】
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【００９８】
【表３】
2007527229.tif 000004
【００９９】
【表４】
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【０１００】
２．２：細胞系：ＨＥＫ２９３−ＰＳＣｉ４ｑｉ４−ＡＰＪ
ＨＥＫ２９３−ＰＳＣｉ４ｑｉ４細胞を、ｐＥＡＫ８−ＡＰＪで安定してトランスフェクションした。細胞を、ゼオシン（２５０μｇ／ｍｌ）、および、ピューロマイシン（５００ｎｇ／ｍｌ）が追加された１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で成長させた。
【０１０１】
２．３：ＦＬＩＰＲ分析の手順（９６ウェルフォーマット用に確立された）
初期カルシウム変化を測定するために、細胞を平底の黒い壁の９６ウェルのポリ−Ｄ−リシンプレートで成長させた。細胞を、２００μｌで、密度６０,０００細胞／ウェルで植え、一晩培養した（約１８時間）。
【０１０２】
色素をローディングするために、培地を慎重に除去し、１００μｌ／ウェルの色素ローディング緩衝液で置き換えた。細胞を３７℃で１時間インキュベートし、次に分析緩衝液で３回洗浄した。洗浄の後に、９０μｌの緩衝液／ウェルを残した。
【０１０３】
９０μlの分析緩衝液にアペリンペプチドを添加した（２倍濃縮）。
【表５】
2007527229.tif 000006
【０１０４】
２．４：アペリンペプチドのＥＣ50の決定
２回の独立した測定でアペリンペプチドのＥＣ50値を決定した：
【表６】
2007527229.tif 000007
【０１０５】
２．５：Ｚ’因子の決定
Ｚ’因子は、以下のように定義される：
【数１】
2007527229.tif 000008
【０１０６】
これは、ハイスループットスクリーニングに対する分析の適性を判断するための尺度として用いられる。Ｚ’因子の解釈は、示されるような分類スキームで補助される。
【０１０７】
２回の独立した測定で、９６ウェルプレートの半分に５００ｎＭアペリン−１３、残りの半分に分析緩衝液を用いてＺ’因子を決定した。計算された平均Ｚ’因子は０.９１であった。
【０１０８】
（分類：
理想的な分析は、ｚ＝１であり、
優れた分析は、１＞ｚ＞０.５であり、
±許容できる分析は、０.５＞ｚ＞０１であり、
「ｙｅｓ／ｎｏ」型は、ｚ＝０であり、
スクリーニング不可能は、ｚ＜０である）。
【０１０９】
２．６：ＤＭＳＯ依存状態の決定
アペリン−１３のＥＣ50値を、ＤＭＳＯ濃度を高めながら（０〜１０％）決定した。分析において、アペリン−１３のＥＣ50値に影響を与えることなく許容できるＤＭＳＯの最大の最終濃度は、２％であった。
【０１１０】
２．７：アペリンペプチドの安定性の決定
製造元の説明書に従って、アペリンペプチドを滅菌水に溶解させ、＋４℃で保存した。それによりアペリンペプチドは安定であり、再現可能なＥＣ50値を示した。室温で５時間放置された場合（分析緩衝液中、最終濃度で）、アペリンペプチドのＥＣ50値は少なくとも２倍低下し、これは、ペプチドはこのような条件下では安定ではないことを示す。
【０１１１】
３．正常な心臓および罹患した心臓におけるＡＰＪ受容体およびアペリンの遺伝子発現レベル
総数５１４の明確な正常な心臓および罹患した心臓サンプルに関する発現の特徴（患者の臨床的な情報を伴う）を示す遺伝子発現ライブラリーを、当業者既知の標準的な方法に従って得た。正常な心臓および罹患した心臓における遺伝子発現を、ＨＧ−Ｕ９５Ａ−Ｅジーンチップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ）（アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ），サンタクララ，カリフォルニア州）を用いて比較した。罹患した心臓において、ＡＰＪ受容体遺伝子は６倍を超えてアップレギュレートされた（表１）。より詳細な解析によれば、うっ血性拡張型心筋症を有する患者（ｎ＝１２４）、冠動脈疾患を有する患者（ｎ＝３０１）、および、肥大性心筋症を有する患者（ｎ＝３７）からの心臓サンプルにおいて、ＡＰＪ受容体は、コントロールとして正常な欠陥のない心臓（ｎ＝５２）に比べて著しくアップレギュレートされることが示された。類似の発現パターンを、アペリン、ＡＰＪ受容体に関する内因性ペプチドリガンドから得ることができ、それにおいて、遺伝子は、罹患した心臓において２倍を超えてアップレギュレートされた。心房と心室、または、左心と右心を比較したところ、両方の遺伝子の発現パターンにおいて有意差は観察されなかった（データ示さず）。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】ｐＣＤＮＡ１に挿入されたマウスＧαΔ6qi4myrタンパク質のコード領域のポリヌクレオチド配列を示す（配列番号１に対応する）。
【図２】ヒトアペリン受容体の発現プラスミドと、その受容体タンパク質のアミノ酸配列を示す（配列番号２に対応する）。
【図３】一過性にコトランスフェクションされたＣＨＯ細胞における、様々なアペリンペプチドのＡＰＪ受容体に対する作用を示す。
【図４】Ｇαi4qi4およびＡＰＪ受容体を過剰発現する、安定してトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞における、アペリンのＡＰＪ受容体に対する用量依存性の作用を示す。
【図５】ＧαΔ6qi4myrタンパク質のアミノ酸の配列を示す（配列番号３に対応する）。
【図６】Ｇαi4qi4遺伝子のコード領域のポリヌクレオチド配列を示す（配列番号４に対応する）
【図７】Ｇαi4qi4タンパク質のアミノ酸の配列を示す（配列番号５に対応する）。
【図８】ヒトアペリン−１２のアミノ酸の配列を示す（配列番号６に対応する）。
【図９】ヒトアペリン−１３のアミノ酸の配列を示す（配列番号７に対応する）。
【図１０】アペリン−３６のアミノ酸の配列を示す（配列番号８に対応する）。
【配列表】
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【国際調査報告】
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2007527229.tif 000010
2007527229.tif 000011
2007527229.tif 000012
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