(57)【要約】      （修正有）【課題】患者におけるＫＩＴ＋関連疾患、特に消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）を治療するのに有用であるキメラ免疫受容体（ＣＩＲ）をコードする核酸構築物の提供。【解決手段】ＫＩＴリガンド（幹細胞因子、ＳＣＦ）の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及びＴ細胞の活性化を媒介するための細胞質ドメイン（ＣＤ３ゼータ及び／又はＣＤ２８のドメイン）を含むＫＩＴ＋腫瘍と相互作用してこれを破壊するＣＩＲをコードする核酸構築物及び／又はＣＩＲを発現する宿主細胞の提供。【選択図】図１
2019110911.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．ＫＩＴリガンド（ＫＬ）の細胞外ドメイン、又はその断片、
ｂ．膜貫通ドメイン、及び
ｃ．細胞質ドメイン
（ここで、当該膜貫通ドメインはＣＤ３ゼータ鎖のドメイン、又はその断片を含んでいて、当該細胞質ドメインはＣＤ３ゼータ鎖のドメイン、又はその断片を含んでいる）
を含んでなる、キメラ免疫受容体（ＣＩＲ）タンパク質をコードする核酸構築物。
【請求項２】
ａ．ＫＩＴリガンドの細胞外ドメイン、又はその断片、
ｂ．膜貫通ドメイン、及び
ｃ．細胞質ドメイン
（ここで、当該膜貫通ドメインはＣＤ２８のドメインを、又はその断片を含んでいて、当該細胞質ドメインはＣＤ３ゼータ鎖のドメイン及びＣＤ２８のドメイン、又はそれらの断片を含んでいる）
を含んでなる、ＣＩＲタンパク質をコードする核酸構築物。
【請求項３】
当該細胞外ドメインがＣＤ２８のドメイン、又はその断片をさらに含んでいる、請求項２に記載の核酸構築物。
【請求項４】
当該ＣＩＲタンパク質が、Ｔ細胞中で発現されると、チロシン−プロテインキナーゼＫＩＴ＋（ＫＩＴ＋）腫瘍細胞の存在下で当該Ｔ細胞を活性化できる、請求項１〜３の何れか一項に記載の核酸構築物。
【請求項５】
当該ＣＩＲタンパク質の当該細胞外ドメインがＴ細胞中で発現されると腫瘍細胞の表面でＫＩＴと相互作用できる、請求項１〜４の何れか一項に記載の核酸構築物。
【請求項６】
前記請求項の何れかに記載の核酸構築物を含んでなる、ベクター。
【請求項７】
請求項１〜５の何れかに記載の核酸構築物又は請求項６に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項８】
当該宿主細胞が、Ｔ細胞、造血幹細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞、及び単核系統の細胞よりなる群から選ばれる、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
当該方法が、請求項１〜５に記載の核酸構築物又は請求項６に記載のベクターを含んでいる組成物を投与することを含んでなる、ＫＩＴ＋細胞を破壊する方法。
【請求項１０】
当該方法が、当該ＫＩＴ＋細胞を、請求項７又は８に記載の宿主細胞を含んでいる組成物と接触させることを含んでなる、ＫＩＴ＋細胞を破壊する方法。
【請求項１１】
当該ＫＩＴ＋細胞に第２薬剤を投与することをさらに含んでなる、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
当該第２薬剤がチロシンキナーゼ阻害剤である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
当該方法が、請求項１〜６の何れか一項に記載の核酸構築物を含んでいる組成物を投与することを含んでなる、ＫＩＴ＋関連疾患の対象を治療する方法。
【請求項１４】
当該方法が、請求項７又は８に記載の宿主細胞を含んでいる組成物を投与することを含んでなる、ＫＩＴ＋関連疾患の対象を治療する方法。
【請求項１５】
当該ＫＩＴ＋関連疾患がＫＩＴ＋腫瘍細胞の存在によって特徴付けられる、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
当該ＫＩＴ＋関連疾患が、消化管間質腫瘍、急性骨髄性白血病、小細胞肺癌、卵巣癌、乳癌、メラノーマ、神経芽細胞腫、及び神経外胚葉起源の軟組織腫瘍よりなる群から選ばれる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
当該ＫＩＴ＋関連疾患が、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
当該ＧＩＳＴが、イマチニブメシル酸塩に耐性を示す、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
当該宿主細胞が当該対象に自家性である、請求項１３〜１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
当該宿主細胞が当該対象に自家性ではない、請求項１３〜１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
第２薬剤を投与することをさらに含んでなる、請求項１３〜２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２】
当該第２薬剤がチロシンキナーゼ阻害剤である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
当該チロシンキナーゼ阻害剤がイマチニブである、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は２０１３年２月４日に出願された、米国仮特許出願第６１／７６０，４６４号の優先権を主張し、この出願は参照により本明細書に取り込まれている。
【背景技術】
【０００２】
消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）は最も一般的なＧＩの間葉性腫瘍である。イマチニブメシル酸塩は、補助療法としてそして播種性ＧＩＳＴ患者に対して無病生存期間を延長することを実証している。残念なことに、イマチニブで治療されている転移性ＧＩＳＴ患者の大多数が、耐性及び続いて進行性疾患を生じる。イマチニブのようなチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）治療に反応を示さない進行性ＧＩＳＴを発症している患者に対しては治療選択肢が限られている。それ故、当該技術分野において、ＧＩＳＴを治療するための代替治療、特に従来の治療に耐性を示す形態、の必要性が存在している。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、ａ）ＫＩＴリガンド（ＫＬ）の細胞外ドメイン、又はその断片、又はＫＩＴの二量化を阻害するのに特異的な部分（例えば、抗体又は抗体断片）、ｂ）膜貫通ドメイン、及びｃ）細胞質ドメイン（ここで、膜貫通ドメインはＣＤ３ゼータ鎖のドメイン、又はその断片を包含し、そして細胞質ドメインはＣＤ３ゼータ鎖のドメイン、又はその断片を包含する）を包含しているキメラ免疫受容体（ＣＩＲ）タンパク質をコードする核酸構築物を特徴としている。本発明は、ａ）ＫＩＴリガンドの細胞外ドメイン、又はその断片、又はＫＩＴの二量化を阻害するのに特異的な部分（例えば、抗体又は抗体断片）、ｂ）膜貫通ドメイン、及びｃ）細胞質ドメイン（ここで、膜貫通ドメインはＣＤ２８のドメイン、又はその断片を包含し、そして細胞質ドメインはＣＤ３ゼータ鎖のドメイン及びＣＤ２８のドメイン、又はその断片を包含する）を包含しているＣＩＲタンパク質をコードする核酸構築物も特徴としている。
【０００４】
ある特定の実施態様では、細胞外ドメインはＣＤ２８のドメイン又はその断片をさらに包含している。一実施態様では、ＣＩＲタンパク質は、Ｔ細胞内で発現されると、チロシン−プロテインキナーゼＫＩＴ陽性（ＫＩＴ＋）腫瘍細胞の存在下でＴ細胞を活性化できる。別の実施態様では、ＣＩＲタンパク質の細胞外ドメインは、Ｔ細胞内で発現されると、腫瘍細胞の表面でＫＩＴと相互作用できる。
【０００５】
本発明は、上記の核酸構築物を含んでいるベクター及び核酸構築物及びベクターを含んでいる宿主細胞も特徴としている。一態様では、宿主細胞は：Ｔ細胞、造血幹細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞、及び単球系統の細胞よりなる群から選ばれる。ある特定の態様では、宿主細胞は対象の自家細胞である。別の態様では、宿主細胞は対象の自家細胞ではない。
【０００６】
本発明はＫＩＴ＋細胞を破壊する方法を特徴とし、方法は上記の核酸構築物を含んでいる組成物を投与することを含んでいる。いくつかの実施態様では、方法はＫＩＴ＋細胞を上記のような宿主細胞を含んでいる組成物と接触させることを含んでいる。本発明はＫＩＴ＋関連疾患がある対象を治療する方法も特徴とし、方法は上記の核酸構築物又は宿主細胞を含んでいる組成物を投与することを含んでいる。
【０００７】
本発明のある特定の態様は、ＫＩＴ＋関連疾患の対象を治療するため、又はＫＩＴ＋細胞を破壊するために第２の薬剤を投与することを含んでいる。ある特定の実施態様では、第２薬剤はチロシンキナーゼ阻害剤である。好ましい実施態様では、チロシンキナーゼ阻害剤はイマチニブである。
【０００８】
本発明の全ての実施態様では、ＫＩＴ＋関連疾患はＫＩＴ＋腫瘍細胞の存在によって特徴付けられる。いくつかの実施態様では、ＫＩＴ＋関連疾患は、消化管間質腫瘍、急性骨髄性白血病、小細胞肺癌、卵巣癌、乳癌、メラノーマ、神経芽細胞腫、及び神経外胚葉起源の軟組織肉腫よりなる群から選ばれる。好ましい実施態様では、ＫＩＴ＋関連疾患は消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）である。別の実施態様では、ＧＩＳＴはイマチニブメシル酸塩に耐性を示す。
【０００９】
（定義）
「ＫＩＴと相互作用することができる」とは、チロシン−プロテインキナーゼＫＩＴを認識して結合するが、サンプル、例えばヒトの血液サンプル中の他の分子を実質的に認識して結合しない細胞外ドメインを意味する。
【００１０】
「治療すること」とは、疾患又は疾患の症状（例えば、消化管間質腫瘍、急性骨髄性白血病、小細胞肺癌、卵巣腫瘍、乳癌、メラノーマ、神経芽細胞腫、及び神経外胚葉起源の軟組織肉腫の症状）を改善することを意味する。「ＫＩＴ＋関連疾患（例えば、消化管間質腫瘍、急性骨髄性白血病、小細胞肺癌、卵巣腫瘍、乳癌、メラノーマ、神経芽細胞腫、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、侵襲的全身性肥満細胞症（ＡＳＭ）、好酸球増加症候群（ＨＥＳ）、隆起性皮膚線維肉腫（ＤＥＳＰ）、神経外胚葉起源の軟組織肉腫、肝細胞癌、及び全てのＫＩＴ＋幹細胞由来の腫瘍）を治療する」とは、ＫＩＴ＋関連疾患の対象を治療して対象の疾患を改善することを示す。相当する非治療コントロールと比較して、治療の改善又は程度は、疾患状態の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の改善である。
【００１１】
「ベクター」とは、その中にＤＮＡの断片を挿入又はクローンできる、通常はプラスミド又はバクテリオファージから生じるＤＮＡ分子を意味する。組み換えベクターは１つ又はそれ以上の特異的な制限酵素認識部位を含有でき、そしてクローン配列が再現できるように明確な宿主又は媒介生物中で自己複製できる。ベクターは、受容細胞内へトランスフェクションして、ＲＮＡ又はコードされたタンパク質が発現されるように、遺伝子又はコード領域に操作可能にリンクしているプロモータを含有している。
【００１２】
「宿主細胞」とは、その中に１つ又はそれ以上の核酸構築物が取り込まれている細胞を意味する。宿主細胞は対象から単離でき、そして／又は外部の提供者から単離できる。宿主細胞の例は、限定されないが、Ｔ細胞（例えば、ヒト末梢血単核細胞、骨髄、及び／又は胸腺から単離された）、造血幹細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞、及び単球系統の細胞（例えば、血中単球及びマクロファージ）を包含する。
【００１３】
「キメラ免疫受容体」又は「ＣＩＲ」とは、宿主細胞内で発現されたときに、標的タンパク質に特異的に結合する細胞外ドメイン及び宿主細胞の活性を調節する細胞質ドメインを含有している融合タンパク質を意味する。
【００１４】
「ＫＩＴリガンド」とは、チロシン−プロテインキナーゼＫＩＴ（ＫＩＴ）、ｃ−ＫＩＴ受容体、又はＣＤ１１７に結合するサイトカインを意味する。ＫＩＴと結合しているＫＩＴリガンドは、タンパク質の内因性チロシンキナーゼ活性を活性化する二量体を、ＫＩＴに形成させる。ＫＩＴリガンドは当該技術分野において造血幹細胞因子又は幹細胞因子（ＳＣＦ）としても知られている。「ＫＩＴリガンド」は、少なくともヒトＫＩＴリガンド（配列番号１）の１〜２７３に対応している残基、又は、例えば、ｃＫＩＴリガンド（配列番号２、３（イタリック体のヌクレオチドは、それぞれＮｃｏｌ及びＢａｍＨＩ制限部位を示す）でコードされた）の細胞外ドメインの配列と実質的に同一性を有している配列を包含している。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
【表２】
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【００１７】
「ＣＤ２８細胞質ドメイン」とは、Ｔ細胞中で発現されたときに細胞質内に位置しているＣＤ２８のＣ末端領域を有しているポリペプチド、例えば、配列番号４のアミノ酸１２７〜２３４アミノ酸配列を有しているポリペプチドを意味する。用語「ＣＤ２８細胞質ドメイン」はＴ細胞の活性を調節する能力を保持していて、ポリペプチド断片の長さにわたって配列番号４のアミノ酸１２７〜２３４と実質的に同一であるＣＤ２８の何れかを包含していることを意味している。
【００１８】
【表３】
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【００１９】
「ＣＤ３ゼータ」とは、配列番号５のアミノ酸配列を有しているポリペプチドを有しているポリペプチドを意味している。用語「ＣＤ３ゼータ」はＴ細胞の活性を調節する能力を保持していて、タンパク質断片の長さにわたって配列番号５と実質的に同一であるポリペプチドも包含している。
【００２０】
【表４】
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【００２１】
「Ｔ細胞を活性化すること」とは、本発明のＣＩＲを発現して自己分泌法でＴ細胞に作用するインターロイキン２（ＩＬ−２）を放出するようにＴ細胞を誘導することを意味している。活性化されたＴ細胞は、ＩＬ−２に結合する受容体を完全に機能化できるＩＬ−２受容体（ＣＤ２５又はＩＬ−２Ｒ）のアルファサブユニットも産生し、これは次にＴ細胞の増殖経路を活性化する。
【００２２】
用語「腫瘍細胞」とは、組織内への不適切な蓄積によって特徴付けられる細胞集団の成分を意味している。この不適切な蓄積は、細胞集団の１つ又はそれ以上の細胞に生じる遺伝的又は後成的変異の結果であろう。この遺伝的又は後成的変異は細胞集団の細胞を、周囲の正常組織より、速く成長させ、遅く死滅させ、或はゆっくり分化させる。本明細書で用いられる用語「腫瘍細胞」は、悪性細胞の生育又は生存を支持する細胞も包含する。このような支持細胞は、線維芽細胞、血管又はリンパ内皮細胞、炎症細胞、又は悪性細胞の生育又は生存を促進する共拡大非腫瘍細胞を包含する。用語「腫瘍細胞」は、造血、上皮、内皮、又は固形組織の癌を含むことを意味している。用語「腫瘍細胞」は癌幹細胞を含むことも意味している。
【００２３】
「ＫＩＴ＋腫瘍細胞」とは、腫瘍に関連しているＫＩＴを発現している細胞を意味している。
【００２４】
「ＫＩＴ＋関連疾患」とは、これに限定されないが、マスト細胞、造血前駆細胞、メラニン細胞、生殖細胞、及び／又は消化管ペースメーカー細胞を含んでいる、多種の細胞型における増大したＫＩＴ発現又は異常なＫＩＴ活性（例えば、ＫＩＴ活性化）によって特徴付けられる疾患を意味している。ＫＩＴ＋関連疾患はＫＩＴ＋幹細胞にも起因している。ＫＩＴ＋関連疾患の例は、これに限定されないが、消化管間質腫瘍、急性骨髄性白血病、小細胞肺癌、卵巣癌、乳癌、メラノーマ、神経芽細胞腫、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、侵襲的全身性肥満細胞症（ＡＳＭ）、好酸球増加症候群（ＨＥＳ）、隆起性皮膚線維肉腫（ＤＦＳＰ）、神経外胚葉起源の軟組織腫瘍、肺細胞癌、及びＫＩＴ＋幹細胞由来の全ての腫瘍を包含する。
【００２５】
「実質的に同一」とは、例えば、下記の方法を用いて、最適に並べたときに、第二の核酸又はアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を共有している核酸又はアミノ酸配列を意味している。２つのポリペプチド又は核酸配列間の同一性パーセントは、当該技術分野の技術範囲内にある多種の方法、例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（Smith, T. F. and M. S. Waterman (1981) J Mol Biol 147:195-7)；ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ Ｐｌｕｓ（登録商標）、Schwarz and Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof, M.O., Ed pp 353-358 に組み込まれているような“ＢｅｓｔＦｉｔ”（Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489 (1981))；ＢＬＡＳＴ プログラム（Basic Local Alignment Search Tool；(Altschul, S. F., W. Gish, et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10)、ＢＬＡＳＴ−２、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、ＢＬＡＳＴ−Ｎ、ＢＬＡＳＴ−Ｘ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、ＣＬＵＳＴＡＬ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（DNASTAR）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて決定される。さらに、当業者は、比較している配列の全長に渡る最大アライメントを得るのに必要ないくつかのアルゴリズムを含んでいる、アルゴリズムを測定するための適切なパラメータを確認できる。一般に、タンパク質又は核酸については、比較する長さは、全長を含んで全長までの、任意の長さ（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％）であってよい。同類置換は通常、以下のグループ内の置換を含んでいる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。
【００２６】
「対象」とは、哺乳動物（例えば、ヒト又は非ヒト）を意味している。
【００２７】
本発明のその他の特徴及び利点は以下の詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲から明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１Ａ−１Ｂは、抗ＫＩＴキメラ免疫受容体の構造の描写である。図１Ａは、第一及び第二世代ＣＩＲ遺伝子構造の概要図を示す。図１Ｂは第一及び第二世代ＣＩＲの構造を示す。抗ＫＩＴ ＣＩＲは抗ＣＥＡレトロウィルスベクター構築物から再設計して、ＫＩＴリガンド（ＫＬ）の細胞外ドメインを増幅し、クローン化して抗ＣＥＡ細胞外ドメインを置き換えた。
【図２】図２Ａ−２Ｂは、ヒト抗ＫＩＴデザイナーＴ細胞の導入効率及び表現型を示すグラフである。図２Ａは、単離されたＰＢＭＣ及びレトロウィルス発現ＫＩＴ特異的ＣＩＲで活性化して形質導入した初代Ｔ細胞のグラフを示す。陰影のあるヒストグラムはデザイナーＴ細胞を表して、開曲線は形質導入していない細胞を表す。図２Ｂは、第一及び第二世代の形質導入されたデザイナーＴ細胞の表現型のフローサイトメトリー分析を示して、セントラルメモリー表現型のＴ細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２ＬＣＣＲ７＋）が多数を占めていることを明らかにしている。データは３回又はそれ以上の反復実験の代表である。
【図３】図３Ａ−３Ｇは、ヒト抗ＫＩＴデザイナーＴ細胞がインビトロにおいて増殖能を保持していることを示しているグラフである。第一及び第二世代のデザイナーＴ細胞をヒトＫＩＴ＋ＣＩＳＴ細胞株である、ＧＩＳＴ８８２（図３Ａ−３Ｂ及び３Ｅ）及びＧＩＳＴ４８（図３Ｃ−３Ｄ及び３Ｆ）と共培養した。デザイナーＴ細胞と形質導入していないＣＴＲ Ｔ細胞をＣＦＳＥで染色して、ＣＤ３＋細胞上のゲイティングによって増殖を評価しＣＦＳＥ希釈を測定した。ＫＩＴ＋ＧＩＳＴ細胞株で活性化したデザイナーＴ細胞を確認するために、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定して４６２〜４７５ｐｇ／ｍＬの範囲内であることを見出したのに対して、改変しなかったＴ細胞（ＣＴＲＬ）は僅かであった（Ｇ）。データは３回又はそれ以上の反復実験の代表である。
【図４】図４Ａ−４Ｅは、ヒト抗ＫＩＴデザイナーＴ細胞のＫＩＴ＋腫瘍細胞を効率的に溶解する能力を示しているグラフである。図４Ａは、第一及び第二世代のデザイナーＴ細胞の照射したＧＩＳＴ８８２細胞との共培養由来の上澄液で行った腫瘍細胞溶解後の酵素放出を評価するＬＤＨアッセイの結果を示す。最大放出を最高実験値によって定義した。図４Ｂ−４Ｃは、ＣＦＳＥで標識して、非標識化Ｔ細胞と培養してデザイナーＴ細胞の細胞毒性能を確認した標識化ＧＩＳＴ−８８ｓ又はＧＩＳＴ４８細胞のグラフを示す。ＣＦＳＥフルオレセンスの減少を残余の生存細胞上でゲイティングして測定して腫瘍細胞死を定量化した。図４Ｄ−４Ｅは、ＭＦＩデータを修正していない細胞（ＣＴＲＬ）に正常化することによる第一及び第二世代のデザイナーＴ細胞の死亡パーセントの定量結果を示す。データは３回又はそれ以上の反復実験の代表である。
【図５】図５Ａ−５Ｅは、ヒト抗ＫＩＴデザイナーＴ細胞のインビボ試験の結果を示す。図５Ａは、ヒト抗ＫＩＴデザイナーＴ細胞で処置する前に、ＧＩＳＴ８８２細胞を免疫不全マウスに皮下注射することによる皮下異種移植モデルの単独代表の実験からの結果を示して、図５Ｂは、３回の実験からの保存データの結果を示す。図５Ｃは、個々のデータ時点で示した腫瘍サイズと共に水平バーで表示した注入後第５日、第１０日、及び第１５日における平均腫瘍サイズのプロットを示す。図５Ｄは、腫瘍浸潤ＣＤ３＋Ｔ細胞（矢印）を検出している免疫組織化学ブロット（上段は１０倍、下段は４０倍）を示す。図５Ｅは、第一又は第二世代のデザイナーＴ細胞で処置したマウス（両者は補足のＩＬ２で処置したか処置していない）における腫瘍壊死（星印）の程度を評価するために用いられた通常の組織ブロットを示す（左側は１０倍、右側は４０倍）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
一般的に、本発明はＫＩＴリガンド（ＫＬ）又は幹細胞因子（ＳＣＦ）を含んでいるキメラ免疫受容体（ＣＩＲ）をコードする核酸構築物を特徴としている。これらの核酸構築物は、細胞（例えば、対象のＴ細胞）中で発現すると、増大したＫＩＴ発現又は異常なＫＩＴ活性に関連している疾患の治療に有用である。このような疾患の例は消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、特にイマチニブ及びその他の従来の治療に抵抗するものを含んでいる。ある特定の実施態様は、ＫＩＴに対する天然のリガンド（例えば、ＫＩＴリガンド（ＫＬ）又は幹細胞因子（ＳＣＦ））を含有している組み換えＣＩＲを含んでいる。例えば、ＫＩＴリガンド（ＫＬ）又は幹細胞因子（ＳＣＦ）はＴ細胞受容体のＣＤ３ζ鎖成分（第一世代、１ｓｔｇｅｎ）又はＣＤ３ζ＋ＣＤ２８共刺激分子（第二世代、２ｎｄｇｅｎ）に融合できる。第二世代のＴ細胞はＫＩＴ＋腫瘍を標的とする構築物を発現するが、同時に、ＣＤ２８＋共刺激シグナルを組み込む。下記の実施例において、このような第一及び第二世代のＴ細胞が産生されて、ＫＩＴ＋腫瘍細胞を破壊するそれらの効果を明らかにするためにインビトロ及びインビボで試験された。
【００３０】
（細胞外ドメイン）
本発明のＣＩＲは、チロシンタンパク質キナーゼＫＩＴ（ＫＩＴ）に特異的に結合でき、そして本発明のＣＩＲをＫＩＴ＋発現腫瘍細胞へ向かわせることができる細胞外ドメインを特徴としている。従って、本発明のＣＩＲの細胞外ドメインは、例えば、全長の幹細胞因子（ＳＣＦ）又はＫＩＴリガンド（ＫＬ）、或はこれらの断片を含むことができる。また、細胞外ドメインはＫＩＴの二量化を抑制することに、チロシンキナーゼ活性を抑制することに、そして／又はＫＩＴリン酸化に特異的ないくつかの結合部位、及び／又は抗ＫＩＴ抗体断片（例えば、抗ｃＫＩＴ抗体、例えば、Abcam、Biolegend、Genway Biotech などで市販しているもの）を含むことができる。
【００３１】
細胞外ドメインは、発現されたＣＩＲの精製に有用な、さらなるタンパク質タグ、例えば、ヒト由来のｃ−ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）をＮ末端に、ゼータドメイン、ＨＡ−タグ、ＦＬＡＧタグ、及び／又はＧＳＴタグを任意に包含できる。ＫＬのＫＩＴとの相互作用をタグが妨害しないようにタンパク質タグを選択することが好ましい。細胞外ドメインは画像化に有用なさらなるタンパク質、例えば、蛍光タンパク質も任意に包含できる。これらのタンパク質の包含は構築物のさらなる研究及びより効果的な構築物の創生を促進する。
【００３２】
（膜貫通ドメイン）
本発明のＣＩＲは、膜貫通ドメイン、例えば、ＣＤ２８又はＣＤ３ゼータ由来のもの、を特徴としている。ゼータ鎖の膜貫通領域又はＣＤ２８の膜貫通及び部分的細胞外ドメインの包含は分子間ジスルフィド結合の機能をもたらす。これらの膜貫通ドメインを含有しているＣＩＲはゼータの膜貫通内に位置しているシステイン残基又はＣＤ２８の部分細胞外ドメイン内に位置している隣接システイン（ＣＤ２８の１２３位）を介してジスルフィド結合した二量体を、天然のゼータ及びＣＤ２８の二量体配置をまねて、形成することが予測される。
【００３３】
（細胞質ドメイン）
本発明のＣＩＲは、ＫＩＴ＋腫瘍細胞に結合したとき宿主Ｔ細胞の活性化を調節し、そしてＴ細胞によるＫＩＴ＋腫瘍細胞を攻撃する細胞傷害反応を活性化するための細胞質ドメインを特徴としている。ある特定の実施態様では、本発明のＣＩＲ中で用いるための細胞質ドメインはＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、又はこれらの断片を含んでいる。本発明は、ＫＩＴ＋腫瘍細胞と結合したときにＴ細胞の活性を増強するための多数の細胞外ドメイン（例えば、ＣＤ３ゼータ及びＣＤ２８の両方の活性断片を含んでいる細胞質ドメイン、又はＣＤ３ゼータのみを含んでいる細胞質ドメイン）由来のポリペプチドの融合も特徴としている。
【００３４】
（核酸構築物）
本発明の核酸構築物は宿主細胞（例えば、対象から単離されたＴ細胞）中でＣＩＲ構築物を発現するために有用である。ＣＩＲ構築物は単一の核酸構築物、又は複数の核酸構築物中に包含されることができる。ＣＩＲをコードする核酸配列は、発現ベクター又はＣＩＲを産生するために用いられる宿主細胞により適合しているコドンに変えることができる。制限酵素認識部位を取り除くため、或は不活性化された制限酵素認識部位を包含するためにコドンを置き換えることができ、これは発現ベクターにおける核酸のクローニング及び選択された宿主細胞における核酸の処理に役立つ。宿主細胞のトランスフェクションを促進するために、核酸構築物をウィルスベクター（例えば、レトロウィルスベクター又はアデノウィルスベクター）内に包含させるか、或は電気穿孔法又は化学的方法（例えば、脂質トランスフェクション試薬を用いる）によって宿主細胞内へトランスフェクトするように設計することができる。
【００３５】
（宿主細胞）
本発明の宿主細胞は、Ｔ細胞（例えば、ヒト末梢血単核細胞、骨髄、及び／又は胸腺であって、対象自身の細胞から又は他の提供者起源から単離される）、造血幹細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞、及び単球系列の細胞（例えば、血中単球及びマクロファージ）を含んでいる何れかの哺乳動物起源から得られる。宿主細胞は本発明の核酸構築物（例えば、ＣＩＲをコードする核酸構築物）でトランスフェクト又は感染される。患者に投与する前に、細胞培養によって宿主細胞を増殖できる。一実施態様では、改変された宿主細胞を、これらが最初に単離された患者に投与される。別の実施態様では、改変された宿主細胞を、それらが単離された起源とは異なる患者に投与する。
【００３６】
（疾患及び障害）
組織学的研究が、静脈内注射後に、本発明のＣＩＲがＫＩＴ＋腫瘍に局在して腫瘍壊死を介在することを裏付けた。ある実施態様では、確立された腫瘍の完全縮小を達成するのに単回又は複数回の注射が必要であろう。特定の実施態様では、エフェクター表現型を促進するＩＬ１５及びＩＬ２１の追加は本発明のＣＩＲの有効性を増大する可能性をもたらす。具体的な実施態様では、インビボモデルにおける腫瘍生育の有意な遅れが、ＧＩＳＴの治療に対する本発明のＣＩＲの潜在的な有用性を支持している。別の実施態様では、本発明のＣＩＲはＫＩＴ＋関連疾患の治療に対しても有用であろう。ＫＩＴ＋関連疾患の例は、これに限定されないが、急性骨髄性白血病、小細胞肺癌、卵巣癌、乳癌、メラノーマ、神経芽細胞腫、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、侵襲的全身性肥満細胞症（ＡＳＭ）、好酸球増加症候群（ＨＥＳ）、隆起性皮膚繊維肉腫（ＤＦＳＰ）、神経外胚葉起源の軟部組織肉腫、及び／又はＫＩＴの過剰発現及び／又は過剰活性で特徴付けられるその他の疾患の何れかを包含する。
【００３７】
（追加の薬剤及び併用療法）
本発明のＣＩＲは、単独で用いられるか又は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩｓ）及びその他の免疫調節薬及び／又は療法を含んでいる、その他の治療薬と併用して用いられるＧＩＳＴ治療にそしてその他のＫＩＴ＋関連疾患の治療に有用である。イマチニブは制御的Ｔ細胞アポトーシスを誘発してその効果は併用免疫療法で増強されたと報告されている。抗ＫＩＴデザイナーＴ細胞液にイマチニブを加えることは、腫瘍の微小環境内の望ましい免疫調節を介して、ＣＩＲが増強した細胞溶解を介在できるようにして、効果を増大する。本発明のＣＩＲと共に使用できるその他のＴＫＩは、これらに限定されないが、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、ニロチニブ、ボスチニブ、ネラチニブ、及びバタラニブを包含する。本発明のＣＩＲは、抗ＰＤ１及び抗ＣＴＬＡ４抗体のような免疫調節剤と併用投与することもできる。本発明の治療法の何れにおいても、本発明のＣＩＲは Dudley et al., J Clin Oncol. 26:5233-5239, 2008 に記載のように骨髄破壊的前処理と併用投与してもよい。
【実施例】
【００３８】
ヒトＴ細胞を再プログラム化してＫＩＴ＋ＧＩＳＴ腫瘍を認識して破壊するために利用できる抗ＫＩＴ ＣＩＲを構築した。ＫＩＴに対する天然リガンドである、ＳＣＦは抗腫瘍特異性をもたらす。マウスとヒトのＴ細胞を高い効率で形質導入して、抗ＫＩＴデザイナーＴ細胞が増殖して、ＫＩＴ＋ＧＩＳＴ細胞に応答してＩＦＮγを分泌したことをインビトロ研究で確認した。デザイナーＴ細胞は２つのＫＩＴ＋細胞株を溶解することもできた。異種移植モデルを用いて、第一及び第二世代の抗ＫＩＴデザイナーＴ細胞の全身注入が腫瘍生育速度の有意な減少をもたらしたことを明らかにした。纏めると、抗ＫＩＴデザイナーＴ細胞の研究がＫＩＴ＋腫瘍の将来性のある新規な治療としてさらなる開発をサポートしている。
【００３９】
（材料及び方法）
レトロウィルスベクター構築物
第一及び第二世代の抗ＫＩＴ ＣＩＲを、Emtage et al., Clin Cancer Res 14:8112-8122, 2008 に既に記載されている抗ＣＥＡレトロウィルスベクター発現構築物から再設計した。Ｎ末端開始コドンから膜貫通開始にわたるｃＫＩＴリガンド（Genebank BC069733.1, cDNA clone MGC:97379）の細胞外ドメインを、Ｎｃｏｌ（配列番号中のイタリック体ヌクレオチド）及びＢａｍＨＩ（配列番号３中のイタリック体ヌクレオチド）制限酵素認識部位を含んでいるプライマーを用いてＡＴＣＣクローン０１０５６０３７１からＰＣＲ増幅して、インフレームでクローン化し抗ＣＥＡ細胞外ドメインを置き換えた。
【００４０】
【表５】
2019110911.tif 000007
【００４１】
デザイナーＴ細胞産生
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を無作為に選択した提供者の全血濾液（Rhode Island Blood Center, Providence, RI）から得た。血液濾液を無菌ＰＢＳ（Cellgro, Manassas, VA）で洗浄して、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を用い製造会社の説明書に従って密度勾配分離によってＰＢＭＣを単離した。ＰＢＭＣを２×１０６細胞／ｍｌの密度で播種して、抗ＣＤ３でコーティングした（ＯＫＴ３、eBioscience, San Diego, CA）７５０ｍｌのフラスコ上で２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（ＣＤ２８．２、eBioscience）及び５％の熱不活化無菌ヒト血清（Valley Biomedical, Winchester, VA）で補完したＡＩＭ Ｖ培地中の３００Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２（Invitrogen, Grand Island, NY）で活性化した。２９３Ｔ−ＨＥＸフェニックス両種性細胞（Orbigen, Allele Biotechnology, San Diego, CA）を、ＬｉｐｏＤ２８３（SignaGen Laboratories, Rockville, MD）を用いて、５０μｇの第一及び第二世代ｃＫＩＴリガンドＣＩＲレトロウィルスプラスミドでトランスフェクトした。集密度８０％に達したＮＩＨ−３Ｔ３ ＰＧ１３レトロウィルスパッケージング細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１０６８６）の形質導入のためにウィルス上澄液を採取した。ＰＧ１３細胞を３７℃で培養し、細胞が集密度８０％に達したとき、上澄液を採取して０．４５μｍのフィルター（Corning、Corning NY）で濾過した。培養の２４〜４８時間後に、レトロネクチンでコーティングした６ウェルプレートのウェルにＰＢＭＣを播種して（２０μｇ／ｍｌ、Yakara Bio、Otsu, Shiga, Japan）、Emtage et al., Clin Cancer Res 14:8112-8122, 2008 に記載されているように抗ＫＩＴ ＣＩＲベクターで形質導入してデザイナーＴ細胞を作り出した。抗ＫＩＴ ＣＩＲベクター（第一世代）又はさらにＣＤ２８部分を有する抗ＫＩＴ ＣＩＲベクター（第二世代）の何れかを含有している上澄液で細胞を形質導入した。形質導入したＴ細胞を５％の熱不活化無菌ヒト血清及び１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２で補完したＡＩＭ Ｖ培地中で維持した。デザイナーＴ細胞上でのＫＩＴ特異的ＣＩＲの発現を、アロヒコシアニン−ＸＬ（Chromaprobe, Maryland Hts, MO）と共役しているレプロカイン抗ＳＣＦｍＡｂ（Ｆ×２）で染色するフローサイトメリー分析で評価した。細胞を抗ヒトＣＤ３（Ｓｋ７）、ＣＤ４（ＲＰＡ−Ｔ４）、ＣＤ８（ＳＫ１）、ＣＤ＆２Ｌ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ１９７（ＣＣＲ７，１５０５０３）、及びＣＤ２５（Ｍ−Ａ２５１）でも染色した、これらはＦＩＴＣ、ＰＥ、ＰｅｒＰ、アロヒコシアニン、アロヒコシアニン−Ｃｙ７、又はＰｅ−Ｃｙ７（BD Biosciences, Franklin Lakes NJ）と共役している。ＦｏｘＰ３細胞内染色のために、サンプルを固定し、透過処理して、製造会社のプロトコール（ＢＤ）のようにＰＥと共役しているＦｏｘＰ３で染色した。
【００４２】
細胞増殖アッセイ
フローサイトメリーに基づく境界アッセイを行ってＫＩＴ＋ヒトＧＩＳＴ細胞株による刺激に応答する第一及び第二世代のデザイナーのＴ細胞の増殖を分析した。デザイナーＴ細胞を１μＭのカルボキシフルオレセイン二酢酸のスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Invitrogen）で標識して、４：１の比でＫＩＴ＋ＧＩＳＴ８８２及びＧＩＳＴ４８細胞を、ウェル当り１×１０５デザイナーＴ細胞（ｄＴｃ）と共に９６ウェルの丸底プレートに加えた。ＫＩＴ表面発現がない、ＧＩＳＴ４８ｂをネガティブコントロールとして用いた。腫瘍細胞を５０００ラドで照射した。共培養物を５日間培養し、その時点で上澄液を単離して細胞をフローサイトメリーで分析した。上澄液をＩＦＮ−γ濃度に関してサイトメトリー法にビーズアレイを用いて分析した（ＢＤ Biosciences）。確認のために、サイトカインの生産結果もヒトＩＦＮ−γＥＬＩＺＡアッセイで定量した（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。
【００４３】
細胞毒性アッセイ
第一及び第二世代のデザイナーＴ細胞を、それらの細胞毒性力をＬＤＨアッセイ（Ｒｏｃｈｅ、Indianapolic, IN）で評価するために（製造業者のプロトコールに従って実施した）ＫＩＴ＋ＧＩＳＴ８８２又はＧＩＳＴ４８と培養した。腫瘍細胞を５０００Ｇで５０分間照射した。細胞毒性力を第一世代のデザイナーＴ細胞、第二世代のデザイナーＴ細胞、及び形質導入していないヒトＴ細胞について評価した。これらは各種のエフェクター対標的の比で添加した。ＬＤＨアッセイによる細胞毒性を腫瘍細胞死のフローサイトメトリー分析でさらに確認した。ＧＩＳＴ細胞を前記のように照射してＣＦＳＥで標識し一方のデザイナーＴ細胞は染色しない。ＣＦＳＥ＋細胞の損失をフローサイトメトリーで分析して細胞毒性を以下の式を用いて算出した：平均蛍光インデックス（ＭＦＩ）は、形質導入していないＴ細胞のＭＦＩで割った、第一又は第二世代のデザイナーＴ細胞である。腫瘍細胞をアネキシンＶ（ＢＤ  Biosciences）で染色した。
【００４４】
インビボの腫瘍研究
６週齢の雄性免疫不全マウス（ＮＵ／Ｊ）をJackson Laboratories (Bar Harbor, ME)から入手して、実験はRoger Williams Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee のガイドラインに従って行われた。ＧＩＳＴ細胞株を１５％のＦＢＳ、及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン／アンホマイシン（Ｃｅｌｌｇｒｏ）で補完した１％のグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有するＩＭＤＭ中、３７℃で保持した。２００μｌ無菌ＰＢＳ中の３×１０７個のＫＩＴ＋ＧＩＳＴ８８２の皮下側腹注射を両側腹に投与した。デザイナーＴ細胞又は形質導入していないヒトＴ細胞を尾静脈から投与した（２００μｌのＰＢＳ中１×１０７個）。ＩＬ−２を用いる実験群に対して、Ａｌｚｅｔ７日間微小浸透ポンプ（Ducet, Cupertino CA）を製造会社のプロトコールに従ってＩＬ２で満たして、皮下に移植した。１０，０００ＩＵ／ｈ（５５０ｐｇ／ｈ）で送達するようにポンプをセットした。カリパスを用いて腫瘍を二次元で測定して、Ｔ細胞の注入から研究の収量まで毎日測定値を得た。右側腹及び左側腹腫瘍の平均値をそれぞれのマウス対して用いて、測定値を初期の腫瘍サイズに対して正規化した。屠殺後、腫瘍を摘出して、組織切片及び染色のために、the University of Massachusetts, Worchester Medical Center Experimental Pathology Service Core へ送付した。通常のＨ＆Ｅ及び抗ＣＤ３免疫組織化学のために染色した。切片を the Pathology department at Roger Williams Medical Center で分析して、１０倍及び４０倍で写真を撮った。
【００４５】
統計
GraphPad Prism V5.00 for Windows (GraphPad Software, San Diego, CA) を用いて統計値を計算した。増殖及び細胞毒性アッセイについての統計学的有意性は両則スチューデントｔ−検定を用いて確認して、ｐ≦０．０５を統計学的に有意であると分類した。腫瘍サイズの中央値を示した。そして群間の生育曲線の勾配及び仰角を比較するためにロジスティック回帰を用いた。分裂頂点の計算を用いる増殖分析を FlowJo （Treestar, Ashland, OR）ソフトウエアを用いて実施した。
【００４６】
実施例１：抗ＫＩＴキメラ免疫受容体の組み換え及びＴ細胞の産生
本研究の目的は前臨床開発のために、ヒト末梢血Ｔ細胞によって発現されたＫＩＴ特異的ＣＩＲを構築すること及び機能を試験することである。抗ＫＩＴＣＩＲ構築物は、Emtage et al., Clin Cancer Res 14:8112-8122, 2008 に記載されている既存の抗ＣＥＡフォーマットに基づいていた。抗ＣＥＡｓＦｖ断片をＫＬの細胞外ドメインと置き換えた。第一及び第二世代の構築物を製造した（図１Ａ）。第二世代の構築物は同時刺激をもたらすためにＣＤ２８を含んでいる。ＫＬ成分は標的の腫瘍細胞上でＫＩＴと相互作用できるようにＣＩＲの細胞外側面上で発現される（図１Ｂ）。活性化リンパ球の形質導入前に直接ＤＮＡ配列決定によって構築物を確認した。
【００４７】
活性化及び形質導入の後に、抗ＫＬ抗体を用いるフローサイトメトリーでＣＩＲ発現を確認した。予備評価として用いられた活性化したマウス脾細胞のレトロウィルス形質導入が、第一及び第二世代ＣＩＲの２７％発現比（１６〜４１の範囲）をもたらした。プロトコールの最適化に続いて、活性化合物ヒトＰＢＭＣ（図２Ａ）の形質導入は、第一及び第二世代ヒトデザイナーＴ細胞それぞれに対して、２つのＣＩＲバージョンの間に有意差がない、５０％（３３〜７４の範囲）及び４２％（２４〜６２の範囲）の平均形質導入率を生じた。抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、及びＩＬ２によるＰＢＭＣの刺激後に、細胞の＞７０％でＣＤ３＋及びセントラルメモリー表現型（ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋）が顕著であった（図２Ｂ）。細胞の３０％未満が未感作（ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ６２Ｌ＋）又はエフェクターメモリー（ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７−）表現型であって、両世代由来の形質導入されたＴ細胞の１０％未満は群間で差異がない制御Ｔ細胞表現型（ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）を有していた。第一世代デザイナーＴ細胞（１ｓｔｇｅｎ ｄＴｃ）に関しては、Ｔ細胞の３３．４％がＣＤ４＋ＣＤ８−であって５２．７％がＣＤ８＋ＣＤ４−であったのに対して、２ｎｄｇｅｎ ｄＴｃに関する対応する値は３５．５％及び５２．６％であった。ＣＤ４：ＣＤ８の比は形質導入又はＫＩＴ＋腫瘍への暴露の後に変化しなかった。後続の全ての実験については、デザイナーＴ細胞は、ＣＤ４又はＣＤ８による分画をせずに、最新の臨床試験実施基準を遵守して、バルクで用いた。
【００４８】
実施例２：ＫＩＴ＋腫瘍細胞の存在下における抗ＫＩＴデザイナーＴ細胞の増殖
抗ＫＩＴ ＣＩＲを発現しているヒトＴ細胞の増殖能力を試験するために、２つのヒトＫＩＴ＋ＧＩＳＴ細胞株、ＧＩＳＴ８８２及びＧＩＳＴ４８の存在下でｄＴｃを培養した。ＧＩＳＴ８８２及びＧＩＳＴ４８の存在下で、第一又は第二世代の抗ＫＩＴ ＣＩＲの何れかを発現しているｄＴｃは、ＣＦＳＥ希釈で測定して、形質導入していないＴ細胞（ＣＴＲＬ）と比較するとより広範に増殖した。ＧＩＳＴ８８２と培養すると、１ｓｔｇｅｎ ｄＴｃの３９％及び２ｎｄｇｅｎ ｄＴｃの４７％が分割して（ＣＴＲＬと比較してｐ＜０．００１）、２つのＣＩＲフォーマットの間に有意の差はなかった（ｐ＝０．２３、図３Ｂ）。同様に、イマチニブ耐性ＧＩＳＴ４８細胞の存在下で、培養３日後に、３３〜３８％のｄＴｃが分割して、これはＣＴＲ細胞より有意に高く（ＣＴＲＬと比較してｐ≦０．０３）、２つのＣＩＲフォーマットの間に有意な差を有していなかった（ｐ＝０．５８６、図３Ｃ）。ｄＴｃを増殖するためのＫＩＴ＋腫瘍細胞の必要量を、示したようにＫＩＴ−ＧＩＳＴ４８Ｂ細胞の存在下でｄＴｃを培養したときに生じた最小増殖によって確認して、ＣＩＲ活性化Ｔ細胞はＫＩＴ＋腫瘍の存在下で増殖しなかった。ＩＦＮγの産生がＫＩＴ＋腫瘍によるｄＴｃ活性化を確認して、４６２〜４７５ｐｇ／ｍｌの範囲であることが見出されたに対して、ＣＩＲ−Ｔ細胞による産生はごく僅かであった（ｐ＜０．００１、図３Ｄ）。抗ＫＩＴｄＴｃのＫＩＴ−制御腫瘍細胞との共培養は有意なＩＦＮγ産生をもたらさなかった。
【００４９】
実施例３：抗ＫＩＴデザイナーＴ細胞によるＫＩＴ＋腫瘍細胞の溶解
効果的な養子細胞免疫療法の特徴は産物の特異的に腫瘍細胞を溶解する能力である。この目的を達成するために、抗ＫＩＴ ＣＩＲを発現しているデザイナーＴ細胞がＧＩＳＴ細胞を破壊することができるか否かを確定するためにインビトロアッセイを実施した。第二世代のデザイナーＴ細胞はＫＩＴ＋腫瘍細胞を効果的に溶解して第一世代のフォーマットより効果的で有ったことがＬＤＨ放出試験によって明らかになった（図４Ａ）。これらの知見を確認するために、ＣＦＳＥで標識した照射腫瘍細胞標識していないデザイナー細胞と混合した。残存生細胞由来ＣＦＳＥ蛍光の減少を測定して腫瘍細胞の損失を測定した。ＣＴＲＬ細胞と比較すると、第一世代及び第二世代のデザイナーＴ細胞は、ＣＦＳＥ蛍光のレベル及びそれによる生存腫瘍細胞の数の有意な減少をもたらした（図４Ｂ〜Ｃ）。抗ＫＩＴデザイナーＴ細胞はインビトロでＫＩＴ＋腫瘍に応答して刺激され分割してＫＩＴ＋標的を溶解するということを立証して、次にインビボの効果を測定した。
【００５０】
実施例４：抗ＫＩＴデザイナーＴ細胞のインビボ評価
抗ＫＩＴデザイナーＴ細胞の、確立された腫瘍へアクセスする、浸透する、及び生育を制限する能力を確認するために、皮下異種移植モデルを用いた。ヒトＫＩＴ＋ＧＩＳＴ細胞を免疫不全マウスに皮下注射した７日後、これに第一世代、第二世代、又は非改変の抗ＫＩＴデザイナーＴ細胞を尾静脈に注射して治療した。腫瘍測定は二次元（ｍｍ２）で実施して治療初日における腫瘍細胞と比較した平均パーセント変化で表した。幾つかの群についてデザイナーＴ細胞と共にＩＬ２療法を行った。腫瘍生育の有意な減少が、ＩＬ２なしの第一世代Ｔ細胞（ｐ＝０．０５）及びＩＬ２との第二世代のデザイナーＴ細胞（ｐ＜０．００１）によってもたらされた（図５Ａ）。全てのデータを集めると、第一及び第二世代のデザイナーＴ細胞はＩＬ２治療なしで腫瘍の生育に有意に影響を及ぼす。ＩＬ２のサポートによって、第一世代のデザイナーＴ細胞は有意な効果（ｐ＝０．０５）を有したのに対して、第二世代のデザイナーＴ細胞（ｐ＝０．１３）は有利な蛍光を示した（図５Ｂ）。構築物のＣＤ２８部分を介する共刺激シグナルの存在が２ｎｄ ｇｅｎ ｄＴｃのＩＬ２のようなサイトカインへの依存度を減少するので、１ｓｔ ｇｅｎ ｄＴｃは２ｎｄ ｇｅｎ ｄＴｃよりＩＬ２により依存している。データはさらに、個々のサンプルに関して値の範囲を明示して腫瘍の生育を表している（図５Ｃ）。屠殺に続いて、腫瘍を採取して、１ｓｔ又は２ｎｄ ｇｅｎ ｄＴｃで処置した動物における養子導入されたｄＴｃ及び腫瘍の存在を確認した（図５Ｄ及び５Ｅ）。
【００５１】
（その他の実施態様）
記載されている本発明の方法及び組成物の各種改良及び変更は、本発明の範囲及び精神から外れることなく当業者には明瞭であろう。本発明は具体的な望ましい実施態様に関連して記載されているが、特許請求されている発明はこのような具体的な実施態様によって不当に限定されることはないことを理解しなければならない。実際、医薬、免疫学、薬理学、内分泌学の分野、又は関連する分野の当業者にとって明白である本発明を実施するために記載されている方法の各種改良は本発明の範囲内であることが意図されている。
【００５２】
本明細書に記載された全ての公表文献は、それぞれの公表文献が参照により具体的に独立して取り込まれているのと同じ範囲まで、参照により本明細書に取り込まれている。
【図１】
2019110911.tif 000008
【図２】
2019110911.tif 000009
【図３−１】
2019110911.tif 000010
【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
2019110911.tif 000014
【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
2019110911.tif 000018
【図５−３】
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【配列表】
2019110911000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月22日(2019.3.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ免疫受容体（ＣＩＲ）タンパク質をコードする核酸構築物を含む宿主細胞を含んでなる、ＫＩＴ＋細胞を破壊する方法に使用するための組成物であって、当該ＫＩＴ＋細胞はイマチニブメシル酸塩に耐性を示し、前記核酸構築物が、下記の
（Ｉ）
ａ．ＫＩＴリガンド（ＫＬ）の細胞外ドメイン、又はその断片、
ｂ．膜貫通ドメイン、及び
ｃ．細胞質ドメイン
を含んでなるＣＩＲタンパク質、ここで、当該膜貫通ドメインはＣＤ３ゼータ鎖のドメイン、又はその断片を含んでいて、当該細胞質ドメインはＣＤ３ゼータ鎖のドメイン、又はその断片を含んでいる；又は
（ＩＩ）
ａ．ＫＩＴリガンドの細胞外ドメイン、又はその断片、
ｂ．膜貫通ドメイン、及び
ｃ．細胞質ドメイン
を含んでなるＣＩＲタンパク質、ここで、当該膜貫通ドメインはＣＤ２８のドメインを、又はその断片を含んでいて、当該細胞質ドメインはＣＤ３ゼータ鎖のドメイン及びＣＤ２８のドメイン、又はそれらの断片を含んでいる；
のいずれかをコードする核酸構築物である、組成物。
【請求項２】
キメラ免疫受容体（ＣＩＲ）タンパク質をコードする核酸構築物を含む宿主細胞を含んでなる、ＫＩＴ＋消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）のヒトの対象を治療する方法に使用するための組成物であって、前記核酸構築物が、下記の
（Ｉ）
ａ．ＫＩＴリガンド（ＫＬ）の細胞外ドメイン、又はその断片、
ｂ．膜貫通ドメイン、及び
ｃ．細胞質ドメイン
を含んでなるＣＩＲタンパク質、ここで当該膜貫通ドメインはＣＤ３ゼータ鎖の膜貫通ドメイン、又はその断片を含んでいて、当該細胞質ドメインはＣＤ３ゼータ鎖の細胞質ドメイン、又はその断片を含んでいる；又は
（ＩＩ）
ａ．ＫＩＴリガンドの細胞外ドメイン、又はその断片、
ｂ．膜貫通ドメイン、及び
ｃ．細胞質ドメイン
を含んでなるＣＩＲタンパク質、ここで、当該膜貫通ドメインはＣＤ２８の膜貫通ドメインを、又はその断片を含んでいて、当該細胞質ドメインはＣＤ３ゼータ鎖の細胞質ドメイン及びＣＤ２８の細胞質ドメイン、又はそれらの断片を含んでいる；
のいずれかをコードする核酸構築物であり、
前記ＫＩＴ＋ＧＩＳＴがイマチニブメシル酸塩に耐性を示すＫＩＴ＋腫瘍細胞の存在によって特徴付けられる、組成物。
【請求項３】
当該宿主細胞が当該対象に自家性である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
当該宿主細胞が当該対象に自家性ではない、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項５】
第２薬剤と併用するための、請求項１〜４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項６】
当該宿主細胞がＴ細胞、造血幹細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞、及び単核系統の細胞からなる群より選ばれる、請求項１〜５の何れか一項に記載の組成物。
【外国語明細書】
2019110911000001.pdf