(57)【要約】  本発明は、特定の遺伝子マーカーを用いた、哺乳動物における細胞増殖性疾患のインビトロ診断法、細胞増殖性疾患を有する哺乳動物の少なくとも１個のＰＤＧＦ受容体アンタゴニストを用いる薬物療法に応答した行動の予測法、および細胞増殖性疾患を有し、かつ少なくとも１個のＰＤＧＦ受容体アンタゴニストを用いる薬物療法に応答性であると予測される哺乳動物の選択法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における細胞増殖性疾患をインビトロで診断するための方法であって、
ａ)該哺乳動物から生物学的試料を得る工程；
ｂ)表３から選択される少なくとも２個から４０個の遺伝子マーカーの、該試料における発現および／またはリン酸化プロフィールを決定する工程；
ｃ)患者の遺伝子発現プロフィールと表３に示される平均非応答性発現プロフィールとを比較する工程；
ｄ)(ｂ)の比較から得られた２個の遺伝子発現プロフィール間の類似性を決定する工程；
ｅ)(ｃ)で決定された類似度を用いて、ＧＢＭ病状を有する患者が薬剤に応答する可能性を決定する工程
を少なくとも含む方法。
【請求項２】
表３から選択される少なくとも３個から５個の遺伝子マーカーの発現および／またはリン酸化プロフィールを、工程ｂ)で決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１個のＰＤＧＦ受容体アンタゴニストを用いる薬物療法に応答した、細胞増殖性疾患を有する哺乳動物の行動を予測するための方法であって、
ａ)該哺乳動物から生物学的試料を得る工程；
ｂ)表３から選択される少なくとも２個から４０個の遺伝子マーカーの、該試料における発現および／またはリン酸化プロフィールを決定する工程；
ｃ)工程ｂ)で得られた発現および／またはリン酸化プロフィールと、応答性および非応答性発現および／またはリン酸化プロフィールについて表３から計算された平均±標準偏差とを比較する工程；そして
ｄ)該哺乳動物の行動を下記の通りに予測する工程：
−ｂ)で得られた発現および／またはリン酸化プロフィールが、応答性発現および／またはリン酸化プロフィールについて計算される平均±標準偏差内であるならば、該哺乳動物を該処置に応答性であると予測する
−ｂ)で得られた発現および／またはリン酸化プロフィールが、非応答性発現および／またはリン酸化プロフィールについて計算される平均±標準偏差内であるならば、該哺乳動物を該処置に非応答であると予測する；および
−ｂ)で得られた発現および／またはリン酸化プロフィールが、応答性および非応答性発現および／またはリン酸化プロフィールについて計算される平均±標準偏差外であるならば、該処置に応答した該哺乳動物の行動は不明である
を少なくとも含む方法。
【請求項４】
表３から選択される少なくとも３個から５個の遺伝子マーカーの発現および／またはリン酸化プロフィールを、工程ｂ)で決定する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１個のＰＤＧＦ受容体アンタゴニストを用いる薬物療法に応答性であると予測される、細胞増殖性疾患を有する哺乳動物を選択する方法であって、
ａ)請求項３または４に記載の方法を用いて該哺乳動物の行動を予測する工程；および
ｂ)該哺乳動物が応答性であると予測されるならば、該哺乳動物を選択する工程
を少なくとも含む方法。
【請求項６】
該哺乳動物がヒトである、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
表３から選択される少なくとも２個から４０個の遺伝子マーカーのｃＤＮＡおよび／または抗体を含む、哺乳動物における遺伝子マーカーの発現および／またはリン酸化プロフィールをインビトロで分析するためのキット。
【請求項８】
表３から選択される少なくとも３個から５個の遺伝子マーカーのｃＤＮＡおよび／または抗体を含む、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
該哺乳動物がヒトである、請求項７または８に記載のキット。
【請求項１０】
表３から選択される少なくとも２個から４０個の遺伝子マーカーのｃＤＮＡおよび／または抗体を含む、哺乳動物における遺伝子マーカーの発現および／またはリン酸化プロフィールをインビトロで分析するためのマイクロアレイまたはバイオチップ。
【請求項１１】
表３から選択される少なくとも３個から５個の遺伝子マーカーのｃＤＮＡおよび／または抗体を含む、請求項１０に記載のマイクロアレイまたはバイオチップ。
【請求項１２】
該哺乳動物がヒトである、請求項１０または１１に記載のマイクロアレイまたはバイオチップ。
【請求項１３】
−哺乳動物における細胞増殖性疾患のインビトロ診断；および／または
−細胞増殖性疾患を有する哺乳動物の少なくとも１個のＰＤＧＦ受容体アンタゴニストを用いる薬物療法に応答した行動の予測；および／または
−少なくとも１個のＰＤＧＦ受容体アンタゴニストを用いる薬物療法に応答性であると予測される、細胞増殖性疾患を有する哺乳動物の選択
のための遺伝子マーカーとしての、表３から選択される少なくとも１個の遺伝子および／または少なくとも１個の遺伝子産物の使用。
【請求項１４】
該遺伝子に対応するｃＤＮＡおよび／または該遺伝子産物に特異的な抗体(複数可)を用いる、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
−哺乳動物の細胞増殖性疾患のインビトロ診断；および／または
−細胞増殖性疾患を有する哺乳動物の少なくとも１個のＰＤＧＦ受容体アンタゴニストを用いる薬物療法に応答した行動の予測；および／または
−少なくとも１個のＰＤＧＦ受容体アンタゴニストを用いる薬物療法に応答性であると予測される、細胞増殖性疾患を有する哺乳動物の選択
のための、請求項７から９のいずれか一項に記載キットの使用。
【請求項１６】
−哺乳動物における細胞増殖疾患のインビトロ診断；および／または
−細胞増殖性疾患を有する哺乳動物の少なくとも１個のＰＤＧＦ受容体アンタゴニストを用いる薬物療法に応答した行動の予測；および／または
−少なくとも１個のＰＤＧＦ受容体アンタゴニストを用いる薬物療法に応答性であると予測される、細胞増殖性疾患を有する哺乳動物の選択
のための、請求項１０から１２のいずれか一項に記載のマイクロアレイまたはバイオチップの使用。
【請求項１７】
請求項５に記載の方法を用いて選択される、細胞増殖性疾患を有する応答性哺乳動物を処置するための薬剤の製造を目的とした、少なくとも１個のＰＤＧＦ受容体アンタゴニストの使用。
【請求項１８】
該哺乳動物がヒトである、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の遺伝子マーカーを用いることによる、哺乳動物における細胞増殖性疾患のインビトロ診断方法、細胞増殖性疾患を有する哺乳動物の少なくとも１個の血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)受容体アンタゴニストを用いる薬物療法に応答した行動の予測方法、および細胞増殖性疾患を有し、かつ少なくとも１個のＰＤＧＦ受容体アンタゴニストを用いる薬物療法に応答性であると予測される哺乳動物の選択方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経膠腫は、世界保健機関基準に従うと、グレードＩＶの悪性度である。悪性度は、核異型、有糸分裂活性、血管血栓症、毛細血管増殖および壊死のような組織学的基準に基づく。グレードＩＩ腫瘍は、一般的に、細胞型起源に依存して星状細胞腫、乏突起神経膠腫および混合性乏星状細胞腫に分けられる。グレードＩＩＩは、未分化星状細胞腫および未分化乏突起神経膠腫に分けられる。最高度であるグレードＩＶは、一般に多形性膠芽腫(ＧＢＭ)として公知である。
【０００３】
従って、膠芽腫(ＧＢＭ)は、最も一般的な成人の悪性脳腫瘍である。処置は現在、外科手術、放射線療法および化学療法に基づく。しかしながら、これらの処置モダリティでは、応答は非常に悪い。ＧＢＭ患者の２年生存率は、７．５％以下である(Maher et al., 2001)。それ故、新規の処置法の同定が極めて望まれている。
【０００４】
前記疾患の臨床経過および遺伝子変化特性を基に、ＧＢＭは、原発性および続発性ＧＢＭに大まかに分けられている(Maher et al., 2002に概説される)。原発性ＧＢＭは、変異により変化したＥＧＦ受容体の増幅と関係し、一方、続発性ＧＢＭは、ｐ５３変異ならびにＰＤＧＦおよびＰＤＧＦ受容体の過剰発現により特徴付けられる。原発性ＧＢＭと比較して、続発性ＧＢＭは、より若い患者に起こる。最近の研究により、染色体１２ｑ１３−１４上の遺伝子の過剰発現により特徴付けられる続発性ＧＢＭの新規小集団も同定された(Mischel et al., 2003)。
【０００５】
ＧＢＭ小集団におけるＰＤＧＦおよびＰＤＧＦ受容体の合わせた発現は、ＧＢＭ増殖における自己分泌性ＰＤＧＦ受容体シグナル伝達の機能的役割と一致する。この概念は、実験的方法により支持されている。第一に、ＧＢＭ様腫瘍は、マウス脳におけるＰＤＧＦの過剰発現後にマウスにおいて誘導され得る(Dai et al., 2001; Uhrbom et al., 1998)。第二に、様々な種類のＰＤＧＦ受容体阻害剤を用いる実験的治療研究は、ＧＢＭ由来細胞株の増殖が、ＰＤＧＦ受容体シグナル伝達を妨害することにより阻害され得ることを実証した(Kilic et al., 2000; Shamah et al., 1993; Strawn et al., 1994)。
【０００６】
化合物Ｉのような、臨床的に有用なＰＤＧＦ受容体アンタゴニストの利用可能性は、腫瘍におけるＰＤＧＦ受容体シグナル伝達を妨害することにより治療効果を得る可能性を実証している(Pietras et al., 2003に概説される)。化合物Ｉは、ＰＤＧＦ受容体に加えて、ｃ−Ｋｉｔ、ｃ−Ａｂｌ、Ｂｃｒ−ＡｂｌおよびＡｒｇのチロシンキナーゼ活性も阻害する、経口的に利用できるチロシンキナーゼ阻害剤である(Capdeville et al., 2002に概説される)。化合物Ｉの臨床的有用性は、それぞれＢｃｒ−Ａｂｌおよびｃ−Ｋｉｔの異常と関係する、ＣＭＬおよびＧＩＳＴを有する患者の試験において十分に実証されている(Demetri et al., 2002; O’Brien et al., 2003)。
【発明の開示】
【０００７】
上記の通り、ＧＢＭの満足できる処置が現在まで存在しないため、ＧＢＭ、およびより一般的には、細胞増殖性疾患を有する哺乳動物、好ましくはヒトを成功裏に処置する新規治療法を発見する必要がある。
【０００８】
本明細書に用いる“哺乳動物”は、ヒトを含む温血動物である。
本発明の“生物学的試料”は、組織、細胞、血漿、血清、細胞または組織溶解物、ならびに好ましくは腫瘍組織を含む哺乳動物体から単離された何らかの生物学的材料から得られた哺乳動物の試料である。そのような試料は、例えば生検により得られる。
【０００９】
本明細書中の表現“血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)受容体アンタゴニスト”は、例えば、ＰＤＧＦリガンドまたは受容体を標的とする抗体、ＰＤＧＦの受容体への結合を阻害する可溶性受容体またはアプタマーの組換え形態、ならびに化合物Ｉ(下記に示す)および同様の作用機序を有する他の物質のようなＰＤＧＦ受容体キナーゼ活性を直接妨害するＬＭＷ化合物、ならびにそれらの薬学的に許容される塩を含む、ＰＤＧＦ受容体シグナル伝達を阻害する全ての物質を示す。好ましくは、本発明の実施に有用なＰＤＧＦ受容体アンタゴニストは、下記の化合物Ｉ、またはその薬学的に許容される塩である。
【００１０】
表現“薬学的に許容される”は、一般的に安全であり、非毒性であり、そして生物学的にも他にも望ましくないものでない、医薬組成物を製造するのに有用なものを意味し、そして哺乳動物、好ましくはヒトへの、医薬的使用に適用可能なものが含まれる。
【００１１】
“薬学的に許容される塩”は、特定の化合物(例えば、化合物Ｉまたは他のＰＤＧＦ受容体アンタゴニスト)の遊離酸および塩基の生物学的有効性を保持し、そして生物学的にも他にも望ましくないものではない塩を意味することを意図する。薬学的に許容される塩の例には、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、リン酸一水素、リン酸二水素、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物塩、臭化物塩、ヨウ化物塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプロン酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオール酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−ジオエート、ヘキシン−１，６−ジオエート、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、γ−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタン−スルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩およびマンデル酸塩が含まれる。
【００１２】
望ましい塩は、化合物ＩのようなＰＤＧＦ受容体アンタゴニストの遊離塩基と塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などのような無機酸との処理、または酢酸、マレイン酸、コハク酸、マンデル酸、フマル酸、マロン酸、ピルビン酸、シュウ酸、グリコール酸、サリチル酸、グルクロン酸またはガラクツロン酸のようなピラノシジル酸(pyranosidyl acid)、クエン酸または酒石酸のようなα−ヒドロキシ酸、アスパラギン酸またはグルタミン酸のようなアミノ酸、安息香酸または桂皮酸のような芳香族性酸、ｐ−トルエンスルホン酸またはエタンスルホン酸のようなスルホン酸などのような有機酸との処理を含む、当技術分野で公知の全ての適する方法により製造され得る。
【００１３】
化合物、塩または溶媒和物が固体である場合、化合物、塩および溶媒和物は、異なる結晶形態で存在し得、それらの全ては、本発明の範囲内および特定の式の範囲内であると意図されることが、当業者に理解される。
【００１４】
“医薬組成物”はまた、本明細書中、同義語“医薬製剤”または“薬剤”で示される。
【００１５】
化合物Ｉ、およびその薬学的に許容される塩または溶媒和物を含むＰＤＧＦ受容体アンタゴニストは、当業者に適していると認識され得る全ての医薬形態で医薬組成物として投与され得る。適する医薬形態には、錠剤、粉剤、カプセル剤、坐剤、懸濁液、リポソーム剤およびエアロゾルのような固体、半固体、液体、または凍結乾燥製剤が含まれる。医薬組成物にはまた、使用目的または投与方法に依存して、適する賦形剤、希釈剤、ビヒクル、および担体、ならびに他の薬学的活性剤が含まれ得る。
【００１６】
医薬組成物の適する医薬形態を製造するための許容される方法は、当業者により通常どおりに決定され得る。例えば、医薬品を、経口、非経腸、局所、膣内、鼻内、気管支内、眼内、耳内、および／または経直腸投与のための所望の製品を得るために、混合、造粒、および錠剤形について必要なとき圧縮する工程、または必要に応じて成分を混合、充填、および溶解する工程を含む薬化学の常套技術に従い製造することができる。
【００１７】
固体または液体の薬学的に許容される担体、希釈剤、ビヒクル、または賦形剤を、医薬組成物中に用いることができる。固体担体の例には、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム二水和物、石こう(terra alba)、ショ糖、タルク、ゼラチン、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウムおよびステアリン酸が含まれる。液体担体の例には、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、食塩水および水が含まれる。担体および希釈剤は、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンのような適する持続放出性物質を、単独でかまたは蝋と共に含み得る。液体担体を用いるとき、前記製剤は、シロップ剤、エリキシル剤、エマルジョン剤、軟ゼラチンカプセル、無菌注射液(例えば、溶液)、または非水性または水性液体懸濁液の形態であり得る。
【００１８】
ＰＤＧＦ受容体アンタゴニスト、とりわけ化合物Ｉ、ならびにその薬学的に許容される塩および溶媒和物の投与は、当業者に利用可能な一般的に許容される投与方法の全てにより行われ得る。適する投与方法の具体例には、経口、経鼻、非経腸、局所、経皮、および経直腸が含まれる。
【００１９】
一回用量の医薬組成物は、少なくとも１個の治療的有効量の活性化合物(例えば、化合物Ｉまたはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物)を含み、そして好ましくは１個またはそれ以上の薬学的投与量単位で構成される。選択された用量を、例えば軟膏もしくはクリームとしての局所投与；経口投与、例えば坐剤として経直腸投与；注射による非経腸投与；または、膣内、鼻内、気管支内、耳内、または眼内注入による連続投与を含む、前記用量の任意の公知かまたは適する投与方法により、処置の必要な哺乳動物、好ましくはヒト患者に投与することができる。
【００２０】
“治療的有効量”は、活性薬剤を必要とする哺乳動物に投与したとき、細胞増殖性疾患の効果的な処置に十分なその量を意味するものとする。治療的に有効である所定の化合物の量は、特定の化合物、疾患状態およびその重症度、それを必要とする哺乳動物の特性のような因子に依存して変化し、その量は通常、当業者により決定され得る。
【００２１】
疾患状態を“処置する”またはその“処置”には、
(１)障害を予防すること、すなわち、疾患状態に暴露され得るかまたは疾患状態の素因を有するが、未だその疾患状態の症状を経験または示していない、哺乳動物対象、好ましくはヒト対象に疾患状態の臨床症状を生じさせないこと；
(２)疾患状態を阻害すること、すなわち、疾患状態またはその臨床症状の進行を阻止すること；または
(３)疾患状態を緩和すること、すなわち、疾患状態またはその臨床症状の一時的または永続的緩解をもたらすこと
が含まれる。
【００２２】
上記で用いる“疾患”は、所定の細胞型の蓄積を含む細胞増殖性疾患を示し、全ての腫瘍、癌、癌腫、肉腫、リンパ腫、芽腫などを含む。好ましくは、前記細胞増殖性疾患は、膠芽腫である。
【００２３】
用語“遺伝子マーカー”、“バイオマーカー”、“マーカー”および“特徴(feature)”は、同義語であり、本明細書中互換的に用いられる。
【００２４】
化合物Ｉは、下記の式
【化１】
2007536920.tif 000002
を有する、４−(４−メチルピペラジン−１−イルメチル)−Ｎ−［４−メチル−３−(４−ピリジン−３−イル)ピリミジン−２−イルアミノ)フェニル］−ベンズアミドである。
【００２５】
化合物Ｉの遊離塩基、その薬学的に許容される塩、ならびにその製造は、参照により本明細書中に包含される欧州特許ＥＰ０５６４４０９に開示される。化合物Ｉの遊離塩基は、活性部分に相当する。化合物Ｉは、血小板由来増殖因子受容体αおよびβ(ＰＤＧＦＲαおよびβ)、Ｂｃｒ−Ａｂｌおよびｃ−ｋｉｔチロシンキナーゼの阻害剤である。
【００２６】
化合物Ｉのモノメタンスルホン酸付加塩(下記に“塩Ｉ”と称する)、およびその好ましい結晶型、例えばβ結晶型は、参照により本明細書中に包含される欧州特許ＥＰ０９９８４７３に記載される。
【００２７】
従って、本発明の第一の局面は、哺乳動物における細胞増殖性疾患をインビトロで診断するための方法であって、
ａ)該哺乳動物から生物学的試料を得る工程；および
ｂ)表３から選択される少なくとも２個から４０個の遺伝子マーカーの、該試料における発現および／またはリン酸化プロフィールを決定する工程；
ｃ)患者の遺伝子発現プロフィールと表３に示される平均非応答性発現プロフィールとを比較する工程
を少なくとも含む方法に関する。
有利には、表３から選択される該マーカーのうち、少なくとも３個から５個の遺伝子マーカーのみの発現および／またはリン酸化プロフィールが、工程ｂ)で決定される。
【００２８】
遺伝子マーカーの発現および／またはリン酸化状態のレベルを、例えばＲＴ−ＰＣＲ技術を用いる、例えばＲＮＡ発現に基づくか、または、例えば免疫測定法、免疫沈殿法および電気泳動法を含む、ウエスタンブロッティング、免疫組織化学またはＥＬＩＳＡ(酵素免疫測定法)の中のいずれかの技術を用いる、例えばタンパク質発現に基づく任意の常套技術により生物学的試料において分析することができる。好ましくは、当業者は、試料における遺伝子マーカーの発現レベルおよび／またはそのリン酸化レベルを決定し得る。
【００２９】
例えば、非リン酸化形態またはリン酸化形態の遺伝子マーカー、または非リン酸化形態およびリン酸化形態の両方に特異的な抗体を、該マーカーの発現および／またはリン酸化レベルを測定するための標準的免疫学的分析において用いることができる。例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡタイプ分析、免疫沈降タイプ分析、常套的ウエスタンブロッティング分析、および免疫組織化学的分析を、マーカーの発現および／またはリン酸化レベルを決定するためにも用いることができる。
【００３０】
第二の局面に従い、本発明は、少なくとも１個のＰＤＧＦ受容体アンタゴニストを用いる薬物療法に応答した、細胞増殖性疾患を有する哺乳動物の行動を予測するための方法であって、
ａ)該哺乳動物から生物学的試料を得る工程；
ｂ)表３から選択される少なくとも２個から４０個の遺伝子マーカーの、該試料における発現および／またはリン酸化プロフィールを決定する工程；
ｃ)工程ｂ)で得られた発現および／またはリン酸化プロフィールと、応答性および非応答性発現および／またはリン酸化プロフィールについて表３から計算された平均±標準偏差とを比較する工程；そして
ｄ)該哺乳動物の行動を下記の通りに予測する工程：
−ｂ)で得られた発現および／またはリン酸化プロフィールが、応答性発現および／またはリン酸化プロフィールについて計算される平均±標準偏差内であるならば、該哺乳動物を該処置に応答性であると予測する
−ｂ)で得られた発現および／またはリン酸化プロフィールが、非応答性発現および／またはリン酸化プロフィールについて計算される平均±標準偏差内であるならば、該哺乳動物を該処置に非応答であると予測する；および
−ｂ)で得られた発現および／またはリン酸化プロフィールが、応答性および非応答性発現および／またはリン酸化プロフィールについて計算される平均±標準偏差外であるならば、該処置に応答した該哺乳動物の行動は不明である
を少なくとも含む方法に関する。
【００３１】
特定の態様において、表３から選択される少なくとも３個から５個の遺伝子マーカーのみの発現および／またはリン酸化プロフィールを、工程ｂ)で決定する。
【００３２】
第三の局面に従い、本発明は、少なくとも１個のＰＤＧＦ受容体アンタゴニストを用いる薬物療法に応答性であると予測される、細胞増殖性疾患を有する哺乳動物を選択するための方法であって、
ａ)上記の方法を用いて該哺乳動物の行動を予測する工程；および
ｂ)該哺乳動物が応答性であると予測されるならば、該哺乳動物を選択する工程
を少なくとも含む方法に関する。
この哺乳動物は、少なくとも１個のＰＤＧＦ受容体アンタゴニストまたはその薬学的に許容される塩を用いる臨床試験に参加させるため、または薬物療法を施すためのような様々な目的に関して選択され得る。
【００３３】
本発明の第四の局面は、哺乳動物における遺伝子マーカーの発現および／またはリン酸化プロフィールをインビトロで分析するためのキットであって、少なくとも２個から４０個、好ましくは３個から５個の、表３から選択される遺伝子マーカーのｃＤＮＡおよび／または抗体を含むキットに関する。
【００３４】
第五の局面において、本発明は、少なくとも２個から４０個、好ましくは３個から５個の、表３から選択される遺伝子マーカーのｃＤＮＡおよび／または抗体を含む、哺乳動物における遺伝子マーカーの発現および／またはリン酸化プロフィールをインビトロで分析するためのマイクロアレイまたはバイオチップに関する。
【００３５】
本発明の第六の局面は、
−哺乳動物における細胞増殖性疾患のインビトロ診断；および／または
−細胞増殖性疾患を有する哺乳動物の少なくとも１個のＰＤＧＦ受容体アンタゴニストを用いる薬物療法に応答した行動の予測；および／または
−少なくとも１個のＰＤＧＦ受容体アンタゴニストを用いる薬物療法に応答性であると予測される、細胞増殖性疾患を有する哺乳動物の選択
のための、表３から選択される少なくとも１個の遺伝子および／または少なくとも１個の遺伝子産物の遺伝子マーカーとしての使用に関する。
【００３６】
この観点において、該遺伝子に対応するｃＤＮＡおよび／または該遺伝子産物(そのリン酸化型、またはその非リン酸化型、または両方)に特異的な抗体(複数可)が、有利に用いられる。
【００３７】
第七の局面に従い、本発明は、
−哺乳動物における細胞増殖性疾患のインビトロ診断；および／または
−細胞増殖性疾患を有する哺乳動物の少なくとも１個のＰＤＧＦ受容体アンタゴニストを用いる薬物療法に応答した行動の予測；および／または
−少なくとも１個のＰＤＧＦ受容体アンタゴニストを用いる薬物療法に応答性であると予測される、細胞増殖性疾患を有する哺乳動物の選択
のための、上記のキット、マイクロアレイまたはバイオチップの使用に関する。
【００３８】
第八の局面に従い、本発明は、上記の方法を用いて選択される細胞増殖性疾患を有する応答性哺乳動物を処置するための薬剤の製造を目的とした少なくとも１個のＰＤＧＦ受容体アンタゴニストの使用に関する。
【００３９】
本発明はまた、上記の方法を用いて選択された細胞増殖性疾患の処置を必要とする応答性哺乳動物における、治療的有効量のＰＤＧＦ受容体アンタゴニストをそれに投与することを含む処置方法を開示する。
【００４０】
特定の態様において、該ＰＤＧＦ受容体アンタゴニストは、医薬組成物中に含まれる。
【００４１】
本発明を下記の図面により説明するが、それらに限定されない：
図１、ＧＢＭ培養の増殖速度および化合物Ｉ感受性。
(Ａ)２３個のＧＢＭ培養の増殖速度を、２４ウェルプレート中、４０００細胞／ウェルで播き、培養４日後の細胞数を測定することにより決定した。値は、培養期間中の増殖倍数であり、２個の独立した実験からの平均値を示す。(Ｂ)化合物Ｉに対する感受性を決定するため、７個の最も遅い増殖速度の培養を除く１６個のＧＢＭ培養の各４０００細胞を、９６ウェルプレートのウェルに播き、１μＭの化合物Ｉの存在または不存在下で４日間増殖させた。培養終了時の細胞数を、クリスタルバイオレット染色および光度測定により決定した。化合物Ｉ感受性を、化合物Ｉ処理により誘導される増殖阻害の割合(％)として示す。標準偏差と共に示す結果は、各々クアドルプリケート(quadruplicate)で分析した３個の独立した実験から導かれる。(Ｃ)増殖速度と化合物Ｉ感受性の相関関係を、０．３９のピアソンの相関係数を示す散布図に結果を示すことにより説明する。
【００４２】
図２、ＧＢＭ培養におけるＰＤＧＦ受容体発現および活性化。
異なる細胞培養におけるＰＤＧＦαおよびβ受容体の発現レベルおよび活性状態を、ＧＢＭ培養からのＷＧＡ画分をＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβおよびホスホチロシンを認識する抗体で連続的に免疫ブロッティングすることにより決定した。どちらかの受容体を発現する細胞からの試料を、特異的対照として、および異なるフィルター間の標準化に用いた。(Ａ)ＧＢＭ培養および対照細胞の免疫ブロッティング分析の代表例。ＧＢＭ培養における(Ｂ)ＰＤＧＦα受容体および(Ｃ)ＰＤＧＦβ受容体の発現。細胞株を、ＰＤＧＦα−受容体発現レベルに従い順に並べる。ＧＢＭ培養２１の発現レベルを、任意に１とした。挿入図は、免疫ブロッティングおよびｍＲＮＡ発現分析により決定したＰＤＧＦα受容体の発現とＰＤＧＦβ受容体の発現の相関関係を示す(ピアソン相関、ＰＤＧＦα受容体 ｒ＝０．８６、ＰＤＧＦβ受容体 ｒ＝０．５２)。(Ｄ)ホスホチロシン免疫ブロッティングにより決定されたＰＤＧＦＲのチロシンリン酸化。ＰＤＧＦαおよびβ受容体の合わせた移動位置に相当するフィルターの面積を、分析した。細胞株を、ＢおよびＣにおける通りに並べる。ＧＢＭ培養２１における総ＰＤＧＦ受容体リン酸化を、任意に１とした。
【００４３】
図３、化合物Ｉ感受性とＰＤＧＦＲ状態との相関関係。
化合物Ｉ感受性と、ＰＤＧＦα受容体発現(左上パネル)、ＰＤＧＦβ受容体発現(右上パネル)、合わせたＰＤＧＦαおよびβ受容体発現(左下パネル)および全ＰＤＧＦ受容体チロシンリン酸化(右下パネル)との相関関係を示す。分析を、化合物Ｉ感受性実験で最大の実験間のばらつきを示した５個のＧＢＭ培養を除いて１１個のＧＢＭ培養にて行った。
【００４４】
図４、ＧＢＭ培養におけるＥＲＫおよびＡｋｔリン酸化レベル、ならびにこれらのパラメーターと化合物Ｉ感受性またはＰＤＧＦ受容体状態との相関関係。
ＥＲＫおよびＡｋｔの特異的リン酸化を、ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ、ホスホ−ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２Ｏ４、Ａｋｔおよびホスホ−Ａｋｔ Ｓｅｒ４７３を認識する抗体を用いる免疫ブロッティングにより決定した。ＥＣＬシグナルを定量し、対照溶解物を用いてフィルター間の移動効率における相違を標準化した。１０個のＧＢＭ培養における(Ａ)ＥＲＫおよび(Ｃ)Ａｋｔの相対的リン酸化、ならびにＥＲＫ、Ａｋｔのリン酸化と、化合物Ｉ感受性(Ｂ、Ｄ、左上パネル)、ＰＤＧＦ受容体発現(Ｂ、Ｄ、右上パネル)およびＰＤＧＦ受容体リン酸化(Ｂ、Ｄ、下パネル)との相関関係。
【００４５】
図５、ＡｋｔおよびＥＲＫのリン酸化における化合物Ｉの効果の分析、およびこれらのパラメーターと化合物Ｉ感受性およびＰＤＧＦ受容体状態との相関関係。
ＥＲＫおよびＡｋｔの化合物Ｉにより誘導される変化を、非処理細胞と１μＭの化合物Ｉと共に予め１時間インキュベートした細胞におけるＥＲＫおよびＡｋｔのリン酸化を比較することにより観察した。１０個のＧＢＭ培養における(Ａ)ＥＲＫおよび(Ｃ)Ａｋｔのリン酸化の化合物Ｉにより誘導される変化、ならびにこれらのパラメーターと、化合物Ｉ感受性(Ｂ、Ｄ、左上パネル)、ＰＤＧＦ受容体発現(Ｂ、Ｄ、右上パネル)およびＰＤＧＦ受容体リン酸化(Ｂ、Ｄ、下パネル)との相関関係。
【００４６】
図６、クラスタリングに用いる特徴の選択のための３個の異なる基準を用いる２３個の膠芽腫細胞培養の階層的クラスタリング。
(Ａ)ＡＮＯＶＡ検定で０．０５未満のｐ値を有する８８エレメントを含み、また、少なくとも３個のＧＢＭ培養の２倍以上の上方制御および少なくとも３個の他のＧＢＭ培養の２倍の下方制御が示された遺伝子リストを用いるピアソン相関による階層的クラスタリング。(Ｂ)ＡＮＯＶＡ検定で０．０５を有意レベルと設定することにより得られる、２７９５個の特徴リストを用いるＧＢＭ培養のクラスタリング。(Ｃ)Ｂの通りであるが、ＡＮＯＶＡ検定でｐ＜０．００００００００１を有意と設定して得られた、３１１個の特徴リストの作製後のクラスタリング。色分けを、特徴リストの選択に用いた基準に関わらず、全ての場合に２３個のＧＢＭ培養のうち１７個が同じ分布を示す(例えばＧＢＭ培養５、７、８および１１は、常に一緒のクラスターになる)３個の主要なクラスターが形成されるという説明のために用いる。
【００４７】
図７、ＧＢＭ培養の３個の小集団を定義する遺伝子のクラスタリング。
図６Ａに示されるＧＢＭ細胞クラスターに使用される特徴を、特徴に関する相関樹を与えるピアソン相関により階層的にクラスタリングした。このクラスタリングにより、２３個のＧＢＭ培養全体の発現パターンにおける類似性に従い遺伝子がグループ分けされる。赤および緑は、個々のＧＢＭ培養における遺伝子の高いおよび低い発現をそれぞれ示す。
【００４８】
図８、２３個のＧＢＭ培養の生化学的特性化後に得られる結果の比較、および発現プロファイリング。
ＡＮＯＶＡ検定で０．０５未満のｐ値を示し、また、少なくとも３個のＧＢＭ培養で２倍以上の上方制御および少なくとも３個の他のＧＢＭ培養で２倍の下方制御を示す(図６Ａ)、特徴の選択後に得られるクラスタリングを示す。増殖速度の記載は、４日間培養後の細胞数の増加倍数を示す数字を用い、図１Ａの通りである。化合物Ｉ感受性について、１６個の分析したＧＢＭ培養を、６個のレスポンダー(＋、４０％以上の増殖阻害を示す)、７個のノンレスポンダー(−；２０％未満の増殖阻害を示す)および３個の中間レスポンダー(＊；２０−４０％の増殖阻害)に分けた。ＰＤＧＦ受容体発現およびリン酸化について、２１個の分析したＧＢＭ培養を、高い(＋；１０個のＧＢＭ培養)または低い(−；１１個のＧＢＭ培養)ＰＤＧＦ受容体発現またはリン酸化の２個の群に分けた。
【００４９】
図９、leave-one-out試験における化合物Ｉレスポンダーおよびノンレスポンダーの加重投票(weight voting)分類の性能。
分類のため、細胞株６、７、９および３１をレスポンダーとして選択し、細胞株５、１８、２１、３０、３５および３８をノンレスポンダーとして選択した。ｘ軸には、分類に用いた特徴の数(１−２５０)を記載し、ｙ軸には、leave-one-out試験において分類を誤った培養画分を記載する。
【００５０】
図１０、トレーニングセットから外された５個のＧＢＭ培養での分類子の性能。
１０個の膠芽腫細胞からのシグナル対ノイズで整列した遺伝子リストで上位の特徴から作成された３−５個の特徴からなる分類子を、５個のさらなるＧＢＭ培養の応答を予測するために用いた。棒グラフは、図１Ｂで決定された培養の化合物Ｉ感受性を示す。各棒の下に、３、４または５個の特徴からなる特徴リストで得られた、５個のＧＢＭ培養の分類を示す。それぞれの細胞培養についての、異なる分類子を用いる予測の強さを、信頼値として示す。
【００５１】
本発明は、実施例を含む、下記の実験の詳細な説明に照らしてより理解され得る。それにも関わらず、当業者は、この実施例の記載が限定的でなく、様々な修飾、置換、削除および変更が、本発明の範囲を逸脱せずに行われ得ることを理解する。
【実施例】
【００５２】
Ｉ−材料および方法
Ｉ−１−  組織培養、ならびにＧＢＭ培養の増殖速度および化合物Ｉ感受性の決定
ＧＢＭの初代培養の確立を、標準的方法(Ponten and Westermark, 1978)に従い行った。膠芽腫由来の初代細胞培養を、１０％ＦＢＳ、１０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＭＥＭ中、５％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃で増殖させた。
増殖速度の決定のため、２４ウェルプレート(Sarstedt)中、４０００細胞／ウェルの密度で細胞を播いた。培養４日後、細胞をトリプシン消化により集め、Ｃｏｕｌｔｅｒ細胞計測器で計数した。増殖速度を、培養期間中の細胞数の増殖倍数として表した。示したデータは２個の独立した実験に由来し、それぞれの分析をデュプリケートで行った。
【００５３】
Ｉ−２−  化合物Ｉによりもたらされる増殖阻害
化合物Ｉを、Novartis Pharmaceuticalsから入手した。各実験のため、新鮮な１ｍＭの化合物Ｉ原液を、ＰＢＳ１０ｍｌ中に化合物Ｉを６ｍｇ溶解し、次いで、４５μｍフィルターで滅菌ろ過することにより製造した。４日間かけて１．２倍を超えない増殖速度を有する細胞培養は、化合物Ｉにより誘導される増殖阻害について試験しなかった。細胞増殖における化合物Ｉの効果を決定するために、細胞を、９６ウェルプレート(Sarstedt)中、４０００細胞／ウェルの密度で播いた。翌日、培地を、１μＭ化合物Ｉ含有または不含有の培地と交換した。２日後の培地交換を含む、インキュベーションの４日後、細胞をＰＢＳ中冷４％パラホルムアルデヒド(ＰＦＡ)中で３０分間固定し、４％エタノール中０．０１％クリスタルバイオレットで３０分間染色した。試料を水道水で３回洗浄し、そして少なくとも３０分間空気乾燥させた。染色した細胞を１００μｌの１％ＳＤＳ中に溶解し、吸光度を、Ｂｉｏｍｅｋ１０００(Beckman)光学ツールで６００ｎｍフィルターを用いて定量した。
化合物Ｉの効果を、４日間処理中の細胞数増加の減少％として表し、故に、１００％増殖減少は、培養期間の最後および最初で細胞数が等しい状態に相当する。陽性対照として、各実験には、化合物Ｉ感受性増殖を示すことが既に示されている細胞が含まれた(Sjoeblom et al., 2001)。示したデータは、デュプリケート／クアドルプリケートで行った、各ＧＢＭ培養における化合物Ｉの効果の、２個または３個の独立した分析に由来する。
【００５４】
Ｉ−３−  ＰＤＧＦ受容体、ＥＲＫおよびＡｋｔの発現およびリン酸化状態の分析のための対照細胞溶解物の調製
ＰＤＧＦαまたはβ受容体で安定にトランスフェクトされたブタ大動脈血管内皮細胞(それぞれ、ＰＡＥ／ＲαおよびＰＡＥ／Ｒβ細胞(Claesson-Welsh et al., 1988; Claesson-Welsh et al., 1989))を、標準的培養条件を用いて１０ｃｍ皿(Sarstedt)中に高密度で播いた。１６時間後、細胞を、０．１％ＦＢＳを含む培地に交換して２４時間で血清飢餓状態にした。その後、細胞を、０．１％ＦＢＳを含む培地中、１００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢの存在または不存在下で、３７℃で５分間処理した。氷冷ＰＢＳで洗浄後、細胞を、氷上で、０．５％トライトンＸ−１００、０．５％デオキシコール酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  トリス ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、３０ｍＭ  二リン酸四ナトリウム十水和物、１％トラジロール、０．５％フッ化フェニルメチルスルホニル(ＰＭＳＦ)および０．５％ＮａＶＯ３からなる溶解緩衝液１ｍｌ中、１０分間溶解させた。１５０００×ｇで１５分間遠心分離後、細胞溶解物を集め、そしてタンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質分析試薬Ａキット(Pierce)を用いて測定した。タンパク質濃度を標準化後、糖タンパク質を、小麦胚芽凝集素(ＷＧＡ)−セファロースと共に４℃で１６時間インキュベーションすることにより単離した。試料を、１５０００×ｇで１５分間遠心分離し、ＷＧＡ−セファロースビーズをペレットとした。上清を取り出し、ＥＲＫおよびＡｋｔ分析のための対照とした。前記ＷＧＡビーズを、０．５％トライトンＸ−１００、０．５％デオキシコール酸、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  トリス ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、３０ｍＭ  二リン酸四ナトリウム十水和物、１％トラジロール、０．５％ＰＭＳＦおよび０．５％ＮａＶＯ３からなる高塩濃度溶解緩衝液１ｍｌで３回洗浄した。細胞溶解上清または糖タンパク質のＷＧＡ−セファロース画分を、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液(０．０６２５Ｍ  トリス−ＨＣｌ、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、５％  β−メルカプトエタノール、０．０１２５％ブロモフェノールブルー)と混合し、９５℃で５分間加熱し、そして−２０℃で保存した。
【００５５】
Ｉ−４−  ＰＤＧＦ受容体発現およびリン酸化の分析
１０％ＦＣＳ添加培地中で維持されたサブコンフルエントな培養由来の約５０万のＧＢＭ細胞からの細胞溶解物を、上記の通りに調製した。標準化されたタンパク質含有量の細胞溶解物からのＷＧＡ画分を、上記の通りに単離した。
【００５６】
試料を、７％ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。各ゲル上に、非刺激またはＰＤＧＦ−ＢＢ刺激したＰＡＥ／ＲαおよびＰＡＥ／Ｒβ細胞からの対照試料を負荷した。その後、タンパク質を、Ｈｙｄｒｏｂｏｎｄ−Ｃ−Ｅｘｔｒａフィルター(Amersham Life Science)に電気泳動的に移した。ＰＤＧＦＲβの検出のため、フィルターを、５％ＢＳＡを含むＴＢＳ中で１時間ブロッキングし、次いで、ＴＴＢＳ(１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％トゥイーン２０)中、１μｇ／ｍｌの９５８(Santa Cruz Biotechnologies)のＰＤＧＦＲβ一次抗体溶液と共に一晩インキュベートした。３回１０分間の洗浄後、前記フィルターを、１：２５０００希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ロバ抗ウサギ抗体(Amersham Life Science)と共に１時間インキュベートし、そしてＴＴＢＳで３回洗浄した。抗原を、Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ  Ｐｌｕｓ  ウエスタンブロッティング基質(Roche)を製造者の説明書に従い、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｄａｒｋｂｏｘ  ＩＩデジタルスキャナー(FUJIFILM)と共に用いて増強した化学発光により検出した。検出後、前記フィルターを、剥離緩衝液(２％ＳＤＳ、６２．５ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ６．７および１００ｍＭ  β−メルカプトエタノール)中、５０℃にて３０分間で剥離させ、ＴＴＢＳで１回洗浄し、そして５％ＢＳＡを含むＴＢＳ中で１時間ブロッキングした。ＰＤＧＦＲαの検出のため、前記フィルターを、ＴＴＢＳ中１μｇ／ｍｌのＰＤＧＦＲα抗体３３８(Santa Cruz Biotechnologies)で再プローブし、一晩インキュベートした。現像および検出を、上記の通りに行った。リン酸化ＰＤＧＦＲの検出のために、前記フィルターを、ＴＴＢＳ中１μｇ／ｍｌのリン酸化チロシン特異的抗体ＰＹ９９(Santa Cruz Biotechnologies)で３回再プローブし、一晩インキュベートした。現像および検出を、ＴＴＢＳで１：５００００に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウス抗体(Amersham Life Science)を二次抗体として用いること以外は上記の通り行った。
【００５７】
受容体発現およびリン酸化を、ＡＩＤＡソフトウェアバージョン３．１０．０３９(FUJIFILM)を用いて定量した。移動効率におけるフィルター間の相違を、ＧＢＭ培養の値と対照試料の値を相関させることにより標準化した。ＧＢＭ培養２１におけるＰＤＧＦＲαおよびＰＤＧＦＲβ発現レベル、ならびに受容体リン酸化を、任意に値１とした。
【００５８】
Ｉ−５−  化合物Ｉの不存在または存在下で増殖させたＧＢＭ培養のＡｋｔおよびＥＲＫ発現およびリン酸化の分析
膠芽腫細胞培養を、１２ウェルプレートのウェル(Falcon)中にコンフルエントに播いた。翌日、細胞を非処理のままにするか、または１μＭの化合物Ｉで１時間処理した。細胞溶解物を上記の通りに調製した。
【００５９】
タンパク質含有量を標準化した試料を、１２％ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥした。非刺激およびＰＤＧＦ−ＢＢ刺激したＰＡＥ／Ｒβ細胞からの対照溶解物を、各ゲルに負荷した。試料を、Ｈｙｄｒｏｂｏｎｄ−Ｃ−Ｅｘｔｒａフィルター(Amersham Life Science)に電気泳動的に移動させた。ＥＲＫおよびＡｋｔのリン酸化型を検出するため、フィルターを、５％ＢＳＡを含むトリス緩衝食塩水、ｐＨ７．６(ＴＢＳ)、０．１３７Ｍ  ＮａＣｌおよび０．００３５Ｍ  トリス−ＨＣｌ中で１時間ブロッキングし、０．００１％トゥイーン２０含有ＴＢＳ(ＴＴＢＳ)中、１μｇ／ｍｌの抗ホスホ−ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ  Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２Ｏ４(Cell Signaling Technology)または１μｇ／ｍｌの抗ホスホ−Ａｋｔ  Ｓｅｒ４７３(Cell Signaling Technology)と共に一晩インキュベートした。ＴＴＢＳ中で３回１０分間洗浄後、前記フィルターを、１：２５０００希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗ウサギ抗体(Amersham Life Science)と共に１時間インキュベートし、ＴＴＢＳ中で３回１０分間洗浄した。抗原を、Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ  ｐｌｕｓウエスタンブロッティング基質(Roche)を製造者の説明書に従い、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｄａｒｋｂｏｘ  ＩＩデジタルスキャナー(FUJIFILM)と共に用いて検出した。検出後、前記フィルターを、０．４Ｍ  ＮａＯＨ中１０分間で剥がし、ＴＴＢＳで１回洗浄し、そして５％ＢＳＡを含むＴＢＳ中で１時間ブロッキングした。ＥＲＫおよびＡｋｔ発現の決定のため、前記フィルターを、ＴＴＢＳ中、１μｇ／ｍｌの抗ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ(Cell Signaling Technology)および１μｇ／ｍｌの抗Ａｋｔ(Cell Signaling Technology)で一晩再プローブした。現像および検出を上記の通りに行った。値を、ＡＩＤＡソフトウェアバージョン３．１０．０３９(FUJIFILM)を用いて定量した。
【００６０】
異なるＧＢＭ培養におけるＥＲＫおよびＡｋｔの相対的発現およびリン酸化を、ＰＡＥ／Ｒβ細胞由来の参照試料を用いて決定した。化合物Ｉ処理への応答を、ＥＲＫおよびＡｋｔの特異的リン酸化の変化倍率として表した。
【００６１】
Ｉ−６−  遺伝子発現の分析のためのＲＮＡ抽出
２３個のＧＢＭ培養それぞれのサブコンフルエントな７５ｃｍ２培養皿から、製造者の説明書に従いＲＮＡｅａｓｙキット(Qiagen)を用いてＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ量を、分光学的に判断し、異なる培養からの１０−１００μｇのＲＮＡ収量が示された。ＲＮＡの構造的完全性を、アガロースゲル電気泳動法により確かめた。
【００６２】
Ｉ−７−  競合的ハイブリダイゼーションのためのＲＮＡの増幅および標識化
各細胞株からの５μｇのＲＮＡを、幾分変更した線形増幅(Van Gelder et al., 1990)に用いた。簡単には、ｃＤＮＡを、５μｇのＲＮＡ、１μｌの細菌ＲＮＡカクテル、１μｌのｄＴ−Ｔ７プライマー(１μｇ／ｍｌ、配列番号１：AAA CGA CGG CCA GTG AAT TGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG CGC TTT TTT TTT TTT TTT)、４μｌの５×Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ反応緩衝液(Invitrogen)、２μｌのＤＴＴ(Invitrogen)、１μｌのＵｌｔｒａｐｕｒｅ  ｄＮＴＰ混合物(Clontech)、１μｌのＲＮＡｓｉｎ(Ambion)、１μｌのテンプレート・スイッチ・オリゴプライマー(１μｇ／ｍｌ、配列番号２：AAA CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA CGC GGG)および２μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ(Invitrogen)の混合物中、４２℃で１時間逆転写した。第二の鎖合成のため、１０６μｌの水、１５μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ  １０×ＰＣＲ緩衝液(Clontech)、３μｌのＵｌｔｒａｐｕｒｅ  ｄＮＴＰ混合物、１μｌのＲＮａｓｅＨ(Promega)および３μｌのｃＤＮＡポリメラーゼ(Clontech)を添加した。その後、ＲＮａｓｅＨ分解のため、試料をＰＣＲ機(Applied Biosystems)中、３７℃で２分間インキュベートした。その後、変性のために試料を９４℃で３分間インキュベートし、プライマーアニーリングのために６５℃で３分間インキュベートし、そしてｃＤＮＡポリメラーゼによる伸張のために７５℃でインキュベートした。反応を、７．５μｌの１Ｍ  ＮａＯＨおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを添加して停止させ、６５℃で１０分間インキュベートした。反応混合物を３５０μｌの水および５００μｌのフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール  ２５：２４：１(Sigma)を用いてフェノール抽出により浄化し、５００μｌ水を用いてＭｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−１００遠心ろ過機で３回洗浄し、そして１６μｌの用量に最終的に濃縮した。アンチセンスＲＮＡを、インビトロ転写キット(Ambion)を用いてインビトロで転写することにより作製した。アンチセンスＲＮＡから、ｃＤＮＡを、上記の通りＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ反応において再び逆転写し、次いで、ＤＮＡポリメラーゼ反応において二本鎖ＤＮＡを作製した。増幅の第二工程において、ＵＴＰヌクレオチド混合を、１：３混合のＵＴＰ  Ｃｙ−色素−ＵＴＰ(Ambion)で部分的に置換した。並行して、全ての培養からの等量のＲＮＡから構成されるプールを、下記のハイブリダイゼーション実験に参照として用いるために増幅した。
【００６３】
Ｉ−８−  Ｃｙ色素標識したアンチセンスＲＮＡとセンスｃＤＮＡチップのハイブリダイゼーション
各細胞培養を、デュプリケートの色素交換(dye-swap)としてクアドルプリケートで、集めた培養の参照試料と共にハイブリダイズした。それぞれのハイブリダイゼーションのため、６６μｌの容量中、４μｇの標識試料および４μｇの標識集合物を、４μｌのｃｏｔＤＮＡ(１ｍｇ／ｍｌ、Invitrogen)、４μｌのポリアデニル酸(２μｇ／ｍｌ、Sigma)、８μｌの７０％エタノールおよび７μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２と混合した。−７０℃での３０分間のインキュベーションによる沈殿後、試料を、４℃にて２０分間、１５０００×ｇで遠心した。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、６０分間空気乾燥させ、８μｌの水および４０μｌのハイブリダイゼーション溶液(５×ＳＳＣ、６×デンハルト溶液、６０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、０．１２％サルコシル、４８％ホルムアミド、滅菌ろ過)中に溶解し、１００℃で５分間加熱し、そして室温まで冷却した。試料を、予め冷却したマイクロアレイチップ(The Welcome Trust Sanger Institute、Human version 1.2.1、約10000要素を含む、約6000個体の遺伝子に対応する、http://www.sanger.ac.uk/Projects/Microarrays/)上に置き、カバーガラスで覆い、そしてＣｏｒｎｉｎｇのハイブリダイゼーションチャンバー中、４７℃で４０μｌの４０％ホルムアミドおよび２×ＳＳＣを用いて、４７℃で１６時間インキュベートした。そのチップを、２×ＳＳＣ中１回５分間洗浄し、０．１×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳ中３回３０分間洗浄し、そして０．１×ＳＳＣ中１回１０分間洗浄した。そのチップを１０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、最終的に乾燥させた。
【００６４】
Ｉ−９−  チップのアレイ走査およびデータ抽出
チップを、ＳｃａｎＡｒｒａｙ５０００(GSI Lumonics)でＳｃａｎｎＡｒｒａｙソフトウェアバージョン３．１(Packard BioChip Technologies)を用いて走査した。発現強度を、ＱｕａｎｔＡｒｒａｙソフトウェアバージョン３．０．０．０(Packard BioChip Technologies)を用いて定量した。信頼できないスポットに手動で印をつけ、シグナルをヒストグラム法で定量した。
【００６５】
Ｉ−１０−  階層的クラスタリング
データをＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇに入力し、その後ＬＯＷＥＳＳ標準化を行った。異なって発現される遺伝子を含むリストを、分散分析、ＡＮＯＶＡ、または任意に設定したカットオフ値により作成した。ＧｅｎｅＳｐｉｎｇでの分散分析のため、試料が同じ分散を有すると仮定されないので包括的誤差モデル(global error model)を止め、そしてボンフェローニモデルを、複数の試験補正のために用いた。特徴リストを、いくつかの異なる方法で作成したが、３個のバージョンを最終的な発表のために選択した。第一の遺伝子リストにおいて、特徴は、ＡＮＯＶＡ検定において０．０５未満のｐ値を有し、また、少なくとも３個の試料において２倍以上の上方制御および少なくとも３個の試料において２倍以上の下方制御を行う基準を満たすべきであり、これは８８個の特徴をもたらした。第二および第三の遺伝子リストには、２７９５個および３１１個の特徴が含まれ、それぞれ０．０５未満または０．００００００００１未満のＡＮＯＶＡ ｐ値の基準で作成された。その後、前記３個の遺伝子リストを、ピアソン相関に従い細胞培養の階層的クラスタリングに用いた。
【００６６】
Ｉ−１１−  化合物Ｉ応答に関するマーカー遺伝子を同定するための管理下分析(supervised analysis)
加重投票法(Golub et al., 1999)を、増殖阻害実験値において最小の実験間変化を有する１０個の細胞培養に適用した。１０個の細胞培養からの発現データを、ＧｅｎｅＣｌｕｓｔｅｒバージョン２．１．３ベータに入力した(http://www-genome.wi.mit.edu/cancer/software/genecluster2/gc2.html)(Golub et al., 1999; Tamayo et al., 1999)。異なる長さの特徴リストを用いる分類性能を、leave-one-out交差確認により試験した。分類特徴の選択は、最も高い中央シグナル対ノイズ値を有する許容される数の特徴の使用に基づく。ＧｅｎｅＣｌｕｓｔｅｒを、最高の絶対的シグナル対ノイズ値を有する候補特徴を選択するために設定し、前記リストは、シグナル対ノイズで並べた遺伝子リストの陽性および陰性側からの同数の特徴を含む必要はなかった。
【００６７】
ＧＢＭ培養の独立集合における分類子の評価のために、３−５個の特徴を有する分類子を構築した。特徴選択は、トレーニングセット中のレスポンダーおよびノンレスポンダーの中の特徴の最高のシグナル対ノイズ比に基づいた。その後、これらの分類子を、化合物Ｉ感受性が実験的に決定されている５個の独立したＧＢＭ培養の、加重投票法を基にした分類に用いた。
【００６８】
ＩＩ−  結果
ＩＩ−１−  ＧＢＭ培養の化合物Ｉ感受性の特性化
化合物Ｉ感受性について２３個の異なる培養を特性化する前に、個々の培養の増殖特性を、１０％ＦＣＳ含有培地中で４日間の増殖での細胞数の増加を測定することにより分析した。図１Ａに示した通り、増殖速度の大きな変化が観察された。最も増殖の遅い培養は４日間で細胞数の１．２倍の増加しか示さず、一方、最速で増殖する培養は、１８倍の細胞数増加を示した。
【００６９】
化合物Ｉ処理により誘導される増殖阻害を、化合物Ｉの非存在または存在下における増殖４日後の細胞数を比較することにより分析した。化合物Ｉの効果を、処置後４日間の細胞数の増加の減少％として表した。７個の最も増殖の遅い培養を、この分析から除いた。残りの１６培養の３個の独立した実験の結果を、図１Ｂに示す。化合物Ｉ処理に対する応答の大きな違いが、培養間で観察された。細胞培養５、１８、２１、３０、３４、３５および３８は全て、１５％未満の増殖阻害を示した。対照的に、培養６、７、９、１１、３１および４５の増殖は、４０％以上減少した。培養８、１３および２７は、２０−４０％の増殖阻害の中間応答を示した。
【００７０】
増殖阻害が、増殖速度と関係するかどうかを分析するため、これらの２個のパラメーター間の相関関係を、計算した。図１Ｃに示す通り、この分析は、増殖速度と化合物Ｉ処理への応答の強い相関関係についていかなる証拠も提供しなかった。
【００７１】
ＩＩ−２−  ＧＢＭ培養のＰＤＧＦ受容体発現および活性化と化合物Ｉ感受性との相関関係
ＰＤＧＦ受容体は、ＧＢＭ培養の化合物Ｉにより誘導される増殖阻害の増殖阻害作用を仲介する最も有力な標的である。故に、ＰＤＧＦ受容体発現および活性化を分析し、これらのパラメーターを増殖阻害と相関させた(図２および３)。
【００７２】
ＰＤＧＦ受容体活性化および発現を、ＰＤＧＦαおよびβ受容体に対する抗体およびホスホチロシン抗体を用いて培養したＧＢＭ細胞からのＷＧＡ画分を免疫ブロッティングして分析した。陽性対照として、ＰＤＧＦαまたはβ受容体でトランスフェクトされた、リガンド刺激したかまたは非刺激のブタ大動脈内皮細胞を用いた(図２Ａ)。受容体発現、および全ＰＤＧＦ受容体リン酸化の値を、培養２１において任意に１とした。
【００７３】
図２ＢおよびＣに示す通り、ＰＤＧＦαおよびβ受容体発現における１００倍以上の変化が、培養間で観察された。ＰＤＧＦ受容体タンパク質発現の概算を、遺伝子発現分析からのデータ(下記を参照のこと)と比較し、そしてＰＤＧＦα−およびβ−受容体のそれぞれ０．８６および０．５２のｒ値がもたらされた(図２ＢおよびＣ、挿入図)。さらに、ＰＤＧＦ受容体リン酸化を、ＰＤＧＦαおよびβ受容体の合わせた移動位置でのホスホ−チロシンシグナルを定量することにより決定した(図２Ａ、Ｄ)。概して、この分析により、ＰＤＧＦαおよびβ受容体発現を合わせて得られるのと非常に類似したパターンを得た。従って、この分析は、受容体ごとに同様のリン酸化を示すことを示唆した。
【００７４】
これらのデータと１６個の分析した培養のうち１１個の化合物Ｉ感受性の相関関係の結果を、図３に示す。培養１１、４５、８、２７および３４を、これらの培養の増殖阻害実験における大きな変化のため、この分析から除いた。全４個の分析したＰＤＧＦ受容体関連パラメーターは、０．８５(ＰＤＧＦβ−受容体発現)から０．７３(ＰＤＧＦα−受容体発現)のｒ値範囲であって、化合物Ｉ感受性との高い相関関係を示した。
【００７５】
従って、これらの分析は、一群のＧＢＭ培養内のＰＤＧＦ受容体発現に関して広範な変化を明らかにし、また、ＰＤＧＦ受容体発現と化合物Ｉ感受性および全ＰＤＧＦ受容体リン酸化と化合物Ｉ感受性の強い相関関係を明らかにした。
【００７６】
ＩＩ−３−  化合物Ｉの非存在および存在下におけるＥＲＫおよびＡｋｔの活性化状態
タンパク質キナーゼＥＲＫおよびＡｋｔは、ＰＤＧＦ受容体シグナル伝達の重要な媒介物質であるだけでなく、他の型の細胞表面受容体、例えばインテグリンにより誘発される下流のシグナル伝達に関与する。両酵素は、リン酸化により活性化され、従って、活性化されたリン酸化型に特異的な抗体での免疫ブロッティングが、これらの酵素の活性化状態の決定に用いられた。これらの酵素の活性化状態を、増殖阻害実験で確固とした結果の１１個の培養において決定した。ＥＲＫおよびＡｋｔの両方の活性化状態は、細胞培養間で大きな変化を示した(図４ＡおよびＣ)。活性化状態が化合物Ｉ応答と相関するとき(図４ＢおよびＤ、左上パネル)、全ＰＤＧＦ受容体発現(図４ＢおよびＤ、右上パネル)またはＰＤＧＦ受容体リン酸化(図４ＢおよびＤ、下パネル)には相関関係が観察されなかった。
【００７７】
化合物Ｉでの処理の１時間後までに誘導されるＥＲＫおよびＡｋｔの特異的リン酸化の変化を、これらの経路の薬剤により誘導される変化が、化合物Ｉ応答または受容体発現と相関するかどうかを調査するために分析した。概して、ＥＲＫおよびＡｋｔリン酸化の中程度の変化のみが、薬剤処理後に観察された(図５ＡおよびＣ)。化合物Ｉにより誘導されるＡｋｔリン酸化の変化と化合物Ｉ応答性またはＰＤＧＦ受容体状態に相関関係は観察されなかった(図５Ｄ)。しかしながら、化合物Ｉにより誘導される増殖阻害とＥＲＫリン酸化の減少との相関関係が観察された(ｒ＝−０．４７)。
【００７８】
故に、これらの分析は、細胞培養間でＥＲＫおよびＡｋｔ活性化の大きな変化が起こったことを示し、これらの経路の活性化の基礎レベルが、ＰＤＧＦ受容体状態または化合物Ｉ感受性と相関しないことを示す。それらはまた、化合物Ｉ処理が、これらのシグナル伝達分子の正味の活性化状態の強い変化に関係しないことを証明する。しかしながら、増殖応答と化合物Ｉにより誘導されるＥＲＫリン酸化の変化における変化の幾分かの相関関係が記載された。
【００７９】
ＩＩ−４−  ２１個のＧＢＭ由来の初代培養の遺伝子発現に基づくクラスタリング
２３個のＧＢＭ由来の初代培養間の遺伝子発現に基づく相違および類似を説明するため、遺伝子発現プロファイリングを行った。ＲＮＡを、１０％ＦＣＳ中で増殖した継代の少ない培養から単離した。マイクロアレイ分析用に十分量のＲＮＡを得るために、ＲＮＡを２回増幅した。蛍光色素を、２回目の増幅期間中にＲＮＡ中に挿入した。各培養を、約１００００個のヒトｃＤＮＡを含むｃＤＮＡアレイ(http://www.sanger.ac.uk/Projects/Microarrays/)を用いて、クアドルプリケートで分析した。参照ＲＮＡは、全ての培養由来のＲＮＡのプールを含む。
【００８０】
階層的クラスタリングからの結果を、図６に示す。示した通り、異なる統計基準を、どの遺伝子をクラスタリングに用いるべきかを決定するために用いた。どの基準を用いたかに関わらず、いくつかの一致パターンが観察でき、それは２３個の試料のうち１７個が関与した。培養１８、２１、３５および３８は、全ての分析において一緒のクラスターであった(クラスター１)。また、培養５、７、８および１１は、全ての分析において一緒のクラスターであった(クラスター２)。最後に、培養９、１０、１５、１６、３１、３４、３７、４３および４５を含む群(クラスター３)が、遺伝子の選択のための統計的基準に関係なく、見られた。
【００８１】
図７は、３個の試料において少なくとも２倍の調節を示す遺伝子を用いる分析後に導かれるクラスタリング図を示し、それはまた表１および表２に列記されるクラスターを定義する遺伝子を含む。
【００８２】
表１において、異なって発現される遺伝子を、遺伝子オントロジープログラムにより記載されるそれらの分子機序により群に分ける。細胞のクラスタリングのために用いる８８個のハイブリダイゼーションシグナルは、７５個の独特な遺伝子を示す。これらの遺伝子のうち、４７個は、遺伝子オントロジープログラムにおける機能に帰した：ほとんどの遺伝子は、シグナル伝達タンパク質、転写のレギュレーターおよび接着または増殖に関係するタンパク質の範疇に発見された。
【００８３】
表２において、前記遺伝子を、３個の培養クラスターを定義する遺伝子クラスターにおいてどの程度発現されるかによって系統立てる。３個の培養クラスターにおけるそれらの平均的発現を、３個の培養クラスターに関してそれらの発現パターンを説明するために強調して示す。一般的に、遺伝子クラスター群ＩＩＩおよびＶＩは、培養クラスター２および３にてそれぞれ上方制御される遺伝子から構成される。遺伝子クラスター群Ｉは、いくつかを除き、ほとんどの場合培養クラスター群１にて高い。反対に、遺伝子クラスターＩＶおよびＶは、培養クラスター１において下方制御される遺伝子を含み、そして遺伝子クラスターＩＩは、培養クラスター３において低い発現の遺伝子から構成される。
【００８４】
ＩＩ−５−  遺伝子発現に基づくＧＢＭ培養のクラスタリングを用いる増殖特性とＰＤＧＦ受容体状態の比較
ＧＢＭ培養の増殖速度、およびそれらの化合物Ｉ感受性の分析結果を、前記培養の遺伝子発現に基づく階層的クラスタリングの結果と合わせた(図８)。いくつかの興味のある傾向が観察された。７個の最も遅く増殖する培養(太字で示す)のうち６個が、クラスター３に生じた。６個のレスポンダーは、クラスター２および３に集中していた。クラスター２内では、それらは全てサブクラスター２ｂ内に生じていた。７個のノンレスポンダーのうち４個の培養(１８、２１、３５、３８)は、完全なサブクラスター１ｂを構成した。
【００８５】
また、ＰＤＧＦ受容体状態からの結果を、遺伝子発現に基づく培養の群分けと比較した(図８)。培養をＰＤＧＦ受容体発現およびリン酸化に関して２個のクラスに分類し、高い発現またはリン酸化を示す１０個の培養および低い発現またはリン酸化の１１個の培養をもたらした。クラスター１は、明らかに、低い受容体発現およびリン酸化の培養が多く、一方、クラスター２および３は両方とも、２個の範疇の混合から構成されていた。このデータのまとめは、全６個の確固たる化合物Ｉノンレスポンダーが低い受容体発現およびリン酸化を示し、反対に、全ての明確なレスポンダーが高い受容体発現およびリン酸化により特徴付けられたことを強調する。
【００８６】
ＩＩ−６−  化合物Ｉ反応性と関係する遺伝子発現パターンの管理下同定
遺伝子発現パターンと化合物Ｉ応答性の間に相関関係が存在するという徴候を考慮して、管理下分析を、化合物Ｉ反応性と最良に相関する遺伝子発現パターンを同定する目的で行った。この目的に関して、化合物Ｉ感受性の分析で最も明らかな結果をもたらす１０個の培養を、レスポンダー(培養６、７、９および３１)およびノンレスポンダー(培養５、１８、２１、３０、３５および３８)に分けた(図１Ｂ)。
【００８７】
管理下分析を、“leave-one-out”確認を含む、加重投票法を用いて行った。図９に示す通り、２−４０個の特徴が分類に用いられるとき、１０個の培養全てが、leave-one-out確認で正確に分類された。全体で、８および１６個の遺伝子を、それぞれ４および１０個の特徴からなるリストを用いる分類に用いた。leave-one-out検定に用いた遺伝子を、表３に一覧とする。
【００８８】
１０個の培養全てからの発現データを用いて、３−５個の特徴の分類子を作製した(表４)。この分類子を用いて、分類子の確立に用いた１０個の培養全てが、正確にレスポンダーおよびノンレスポンダーと記載された。この分析を拡大するため、前記分類子を、トレーニングセットに含まれない５個の培養(培養８、１１、２７、３４および４５)の予備試験に用いた(図１０)。この予備試験セットへのこれらの分類子の適用の結果を、図１０に示す。興味深いことに、培養１１、４５は、増殖阻害実験の結果と一致して、レスポンダーとして特徴付けられた３個の分類子全てを有した。また、増殖阻害結果と一致して、培養３４は、常にノンレスポンダーと分類された。中間応答を示す培養８および２７は、ノンレスポンダーおよびレスポンダーとしてそれぞれ示される３個の分類子全てを有していた。
【００８９】
上記に示す通り、ＧＢＭの初代培養は、化合物Ｉ感受性に関して大幅に変化した。ＰＤＧＦ受容体状態の特性化により、化合物Ｉ感受性とＰＤＧＦ受容体発現およびリン酸化との明確な相関関係が示された(図１−３、８)。化合物Ｉ感受性とＥＲＫおよびＡｋｔの基底リン酸化の相関関係は観察されなかった(図４)。化合物Ｉ感受性は、ＥＲＫリン酸化の化合物Ｉにより誘導される減少といくらか関係することが示された(図５)。遺伝子発現プロファイリングは、化合物Ｉ感受性、増殖速度およびＰＤＧＦ受容体リン酸化に関して異なる、別のＧＢＭ小集団の存在を示した(図６−８)。最後に、遺伝子発現データの管理下分析を用いて、化合物Ｉ応答を予測する短い遺伝子リストを作製することができた(図９、１０)。
【００９０】
従前の研究がＧＢＭ細胞株の阻害を報告しているが、ＧＢＭ増殖に対するＰＤＧＦ受容体阻害の効果の系統的分析は、本明細書で最初に記載される。
【００９１】
ＰＤＧＦ受容体状態と化合物Ｉ応答の相関関係(図３)は、顕著であった。ＰＤＧＦ受容体発現およびリン酸化の分析はこれらのパラメーター間の強い共変化を示し、リガンド産生が培養間で顕著に相違しないことを示す。
【００９２】
下流のシグナル伝達分子であるＡｋｔおよびＥＲＫの定常活性化状態とＰＤＧＦ受容体状態に相関関係がないこと(図４)が、これらのＧＢＭ培養におけるＡｋｔおよびＥＲＫの活性化が、複数のシグナル伝達経路の制御下に起こることを示唆する。これに関連して、増殖阻害実験ならびにＡｋｔおよびＥＲＫ活性化の分析の両方を、１０％ＦＣＳの存在下で維持した細胞で行ったことに注意すべきである。故に、これらの経路でのＰＤＧＦ受容体シグナル伝達の潜在的な影響が、他の培養条件下でより明確に検出できる可能性がある。
【００９３】
ＡｋｔおよびＥＲＫリン酸化の化合物Ｉにより誘導される変化の分析は、確固たる増殖阻害応答(培養６、７、９および３１)を示したＧＢＭ培養および６個のノンレスポンダーの１０個の選択されたＧＢＭ培養に集中した。ＰＤＧＦ受容体シグナル伝達におけるＡｋｔシグナル伝達の重要性を考慮すると、ＰＤＧＦ受容体阻害を介して達成されると推定される増殖阻害効果が、Ａｋｔの活性化の一貫した減少の不存在下に観察できることは、幾分驚くべき事である(図５)。これらの発見の１つの可能性のある説明は、ＰＤＧＦ受容体依存性ｐＡｋｔの存在であり、それはＰＤＧＦ受容体阻害により影響されるが、血清成分がＰＤＧＦ非依存的経路を介するＡｋｔの高活性化を提供する培養条件下での細胞の維持において検出されない。シグナル伝達において化合物Ｉにより誘導される変化について分析した細胞溶解物が、化合物Ｉに１時間しか暴露されていない細胞から誘導されたことも注意すべき事である。故に、この長さの時間が、ＥＲＫおよびＡｋｔのＰＤＧＦ受容体依存的リン酸化における検出可能な変化を誘導するのに十分であることは、よく特徴付けられているＰＤＧＦ依存的制御系において確認すべきである。
【００９４】
遺伝子発現プロフィールおよび生化学的特徴の合わせた分析は、一連の興味のある関係を明らかにした(図６および８)。簡単には、クラスター１は、低いＰＤＧＦ受容体発現および化合物Ｉに対して低い感受性を示す培養が多く、クラスター２は、高いＰＤＧＦ受容体発現の化合物Ｉレスポンダーが多く、そしてクラスター３は、ＰＤＧＦ受容体発現が一貫しない低増殖速度の培養から主に構成される。化合物Ｉレスポンダーが多いＧＢＭクラスター２において過剰発現される遺伝子クラスターＩＩＩ、ＩＶおよびＶを含む(図７、表２)遺伝子の予備的分析は、未だこのＧＢＭ小集団の特定の発生起源、または特定の生物学的特性を示していない。
【００９５】
化合物Ｉ感受性の特性化およびこのＧＢＭパネルの遺伝子発現分析に基づく管理下分析を用いて、レスポンダーおよびノンレスポンダーを記載する分類子が作成された(図９、表３)。そのような分類子は、一般的に、少なくとも２つの目的を果たすことができる。第一に、それらを診断または予後ツールの開発のための出発点として用いることができる。分類子の性能が良好であれば、分類子のこの機能を、分類子を作製している遺伝子の生物学的意義に何ら注意を払わなくとも開発できる。第二に、分類子は分類子で区別される２個の表現型、この場合化合物Ｉ感受性または耐性をもたらす生物学的関係に向けることができる。
【００９６】
参考文献
【表１】
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【表２】
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【００９７】
【表３】
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【表４】
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【００９８】
【表５】
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【００９９】
【表６】
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【０１００】
【表７】
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【０１０１】
【表８】
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【０１０２】
【表９】
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【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】ＧＢＭ培養の増殖速度および化合物Ｉ感受性。(Ａ)２３個のＧＢＭ培養の増殖速度を、２４ウェルプレート中、４０００細胞／ウェルで播き、培養４日後の細胞数を測定することにより決定した。値は、培養期間中の増殖倍数であり、２個の独立した実験からの平均値を示す。(Ｂ)化合物Ｉに対する感受性を決定するため、７個の最も遅い増殖速度の培養を除く１６個のＧＢＭ培養の各４０００細胞を、９６ウェルプレートのウェルに播き、１μＭの化合物Ｉの存在または不存在下で４日間増殖させた。培養終了時の細胞数を、クリスタルバイオレット染色および光度測定により決定した。化合物Ｉ感受性を、化合物Ｉ処理により誘導される増殖阻害の割合(％)として示す。標準偏差と共に示す結果は、各々クアドルプリケートで分析した３個の独立した実験から導かれる。(Ｃ)増殖速度と化合物Ｉ感受性の相関関係を、０．３９のピアソンの相関係数を示す散布図に結果を示すことにより説明する。
【図２】ＧＢＭ培養におけるＰＤＧＦ受容体発現および活性化。異なる細胞培養におけるＰＤＧＦαおよびβ受容体の発現レベルおよび活性状態を、ＧＢＭ培養からのＷＧＡ画分をＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβおよびホスホチロシンを認識する抗体で連続的に免疫ブロッティングすることにより決定した。どちらかの受容体を発現する細胞からの試料を、特異的対照として、および異なるフィルター間の標準化に用いた。(Ａ)ＧＢＭ培養および対照細胞の免疫ブロッティング分析の代表例。ＧＢＭ培養における(Ｂ)ＰＤＧＦα受容体および(Ｃ)ＰＤＧＦβ受容体の発現。細胞株を、ＰＤＧＦα−受容体発現レベルに従い順に並べる。ＧＢＭ培養２１の発現レベルを、任意に１とした。挿入図は、免疫ブロッティングおよびｍＲＮＡ発現分析により決定したＰＤＧＦα受容体の発現とＰＤＧＦβ受容体の発現の相関関係を示す(ピアソン相関、ＰＤＧＦα受容体 ｒ＝０．８６、ＰＤＧＦβ受容体 ｒ＝０．５２)。(Ｄ)ホスホチロシン免疫ブロッティングにより決定されたＰＤＧＦＲのチロシンリン酸化。ＰＤＧＦαおよびβ受容体の合わせた移動位置に相当するフィルターの面積を、分析した。細胞株を、ＢおよびＣにおける通りに並べる。ＧＢＭ培養２１における総ＰＤＧＦ受容体リン酸化を、任意に１とした。
【図３】化合物Ｉ感受性とＰＤＧＦＲ状態との相関関係。化合物Ｉ感受性と、ＰＤＧＦα受容体発現(左上パネル)、ＰＤＧＦβ受容体発現(右上パネル)、合わせたＰＤＧＦαおよびβ受容体発現(左下パネル)および全ＰＤＧＦ受容体チロシンリン酸化(右下パネル)との相関関係を示す。分析を、化合物Ｉ感受性実験で最大の実験間のばらつきを示した５個のＧＢＭ培養を除いて１１個のＧＢＭ培養にて行った。
【図４】ＧＢＭ培養におけるＥＲＫおよびＡｋｔリン酸化レベル、ならびにこれらのパラメーターと化合物Ｉ感受性またはＰＤＧＦ受容体状態との相関関係。ＥＲＫおよびＡｋｔの特異的リン酸化を、ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ、ホスホ−ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２Ｏ４、Ａｋｔおよびホスホ−Ａｋｔ Ｓｅｒ４７３を認識する抗体を用いる免疫ブロッティングにより決定した。ＥＣＬシグナルを定量し、対照溶解物を用いてフィルター間の移動効率における相違を標準化した。１０個のＧＢＭ培養におけるＥＲＫ(Ａ)およびＡｋｔ(Ｃ)の相対的リン酸化、ならびにＥＲＫ、Ａｋｔのリン酸化と、化合物Ｉ感受性(Ｂ、Ｄ、左上パネル)、ＰＤＧＦ受容体発現(Ｂ、Ｄ、右上パネル)およびＰＤＧＦ受容体リン酸化(Ｂ、Ｄ、下パネル)との相関関係。
【図５】ＡｋｔおよびＥＲＫのリン酸化における化合物Ｉの効果の分析、およびこれらのパラメーターと化合物Ｉ感受性およびＰＤＧＦ受容体状態との相関関係。ＥＲＫおよびＡｋｔの化合物Ｉにより誘導される変化を、非処理細胞と１μＭの化合物Ｉと共に予め１時間インキュベートした細胞におけるＥＲＫおよびＡｋｔのリン酸化を比較することにより観察した。１０個のＧＢＭ培養におけるＥＲＫ(Ａ)およびＡｋｔ(Ｃ)のリン酸化の化合物Ｉにより誘導される変化、ならびにこれらのパラメーターと、化合物Ｉ感受性(Ｂ、Ｄ、左上パネル)、ＰＤＧＦ受容体発現(Ｂ、Ｄ、右上パネル)およびＰＤＧＦ受容体リン酸化(Ｂ、Ｄ、下パネル)との相関関係。
【図６】クラスタリングに用いる特徴の選択のための３個の異なる基準を用いる２３個の膠芽腫細胞培養の階層的クラスタリング。(Ａ)ＡＮＯＶＡ検定で０．０５未満のｐ値を有する８８エレメントを含み、また、少なくとも３個のＧＢＭ培養の２倍以上の上方制御および少なくとも３個の他のＧＢＭ培養の２倍の下方制御が示された遺伝子リストを用いるピアソン相関による階層的クラスタリング。(Ｂ)ＡＮＯＶＡ検定で０．０５を有意レベルと設定することにより得られた、２７９５個の特徴リストを用いるＧＢＭ培養のクラスタリング。(Ｃ)Ｂの通りであるが、ＡＮＯＶＡ検定でｐ＜０．００００００００１を有意と設定して得られた、３１１個の特徴リストの作製後のクラスタリング。色分けを、特徴リストの選択に用いた基準に関わらず、全ての場合に２３個のＧＢＭ培養のうち１７個が同じ分布を示す(例えばＧＢＭ培養５、７、８および１１は、常に一緒のクラスターになる)３個の主要なクラスターが形成されるという説明のために用いる。
【図７】ＧＢＭ培養の３個の小集団を定義する遺伝子のクラスタリング。図６Ａに示されるＧＢＭ細胞クラスターに使用される特徴を、特徴に関する相関樹を与えるピアソン相関により階層的にクラスタリングした。このクラスタリングにより、２３個のＧＢＭ培養全体の発現パターンにおける類似性に従い遺伝子がグループ分けされる。赤および緑は、個々のＧＢＭ培養における遺伝子の高および低発現をそれぞれ示す。
【図８】２３個のＧＢＭ培養の生化学的特性化後に得られる結果の比較、および発現プロファイリング。ＡＮＯＶＡ検定で０．０５未満のｐ値を示し、また、少なくとも３個のＧＢＭ培養で２倍以上の上方制御および少なくとも３個の他のＧＢＭ培養で２倍の下方制御を示す(図６Ａ)、特徴の選択後に得られるクラスタリングを示す。増殖速度の記載は、４日間の培養後の細胞数の増加倍数を示す数字を用い、図１Ａの通りである。化合物Ｉ感受性について、１６個の分析したＧＢＭ培養を、６個のレスポンダー(＋、４０％以上の増殖阻害を示す)、７個のノンレスポンダー(−；２０％未満の増殖阻害を示す)および３個の中間レスポンダー(＊；２０−４０％の増殖阻害)に分けた。ＰＤＧＦ受容体発現およびリン酸化について、２１個の分析したＧＢＭ培養を、高い(＋；１０個のＧＢＭ培養)または低い(−；１１個のＧＢＭ培養)ＰＤＧＦ受容体発現またはリン酸化の２個の群に分けた。
【図９】leave-one-out試験における化合物Ｉレスポンダーおよびノンレスポンダーの加重投票分類の性能。分類のため、細胞株６、７、９および３１をレスポンダーとして選択し、細胞株５、１８、２１、３０、３５および３８をノンレスポンダーとして選択した。ｘ軸には、分類に用いた特徴の数(１−２５０)を記載し、ｙ軸には、leave-one-out試験において分類を誤った培養画分を記載する。
【図１０】トレーニングセットから外された５個のＧＢＭ培養での分類子の性能。１０個の膠芽腫細胞からのシグナル対ノイズで整列した遺伝子リストで上位の特徴から作成された３−５個の特徴からなる分類子を、５個のさらなるＧＢＭ培養の応答を予測するために用いた。棒グラフは、図１Ｂで決定された培養の化合物Ｉ感受性を示す。各棒の下に、３、４または５個の特徴からなる特徴リストで得られた、５個のＧＢＭ培養の分類の分類を示す。それぞれの細胞培養についての、異なる分類子を用いる予測の強さを、信頼値として示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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