(57)【要約】本発明は、マクロライド（例えば、エリスロマイシルアミンおよび関連化合物）を検出するための逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）方法に関する。本発明はまた、マクロライド（例えば、エリスロマイシルアミンおよび関連化合物）を検出するための逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）システムに関する。本発明は、約１８０ｎｍ〜約２２０ｎｍにおける紫外〜可視範囲において最大吸収を有するマクロライドを検出するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
約１８０ｎｍ〜約２２０ｎｍにおいて紫外〜可視範囲における最大吸収を有するマクロライドを検出するための方法であって、該方法は、
ａ）該マクロライドを含むサンプルを、約１８０ｎｍ〜約２２０ｎｍの間の検出波長を有する紫外線（ＵＶ）検出器を備える逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに対して適用する工程；
ｂ）該サンプルを、イオン対試薬を含む移動相を用いて溶離させる工程；および
ｃ）カラム流出物を、該ＵＶ検出器を用いてモニターして、該検出波長における吸収ピークまたは透過ピークを検出する工程であって、該ピークは、該マクロライドに対応する、工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記マクロライドは、約１８０ｎｍ〜約２００ｎｍにおいて紫外〜可視範囲における最大吸収を有する、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記マクロライドは、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンである、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記検出波長は、約１９０ｎｍ〜約２１０ｎｍである、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記検出波長は、約１９７ｎｍ〜約２０５ｎｍである、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記イオン対試薬は、（Ｃ４〜Ｃ１２アルキル）スルホン酸塩を含む、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記イオン対試薬は、１−オクタンスルホン酸ナトリウムを含む、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記移動相は、緩衝液をさらに含む、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記緩衝液は、リン酸緩衝液または硫酸緩衝液である、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、前記移動相は、ｐＨ約１〜ｐＨ約４を有する、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、前記移動相は、前記マクロライドの溶離の時間経過の間に前記ＵＶ検出器の検出波長において実質的に一定の吸光度を維持する、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記移動相は、約２０５ｎｍより上では無視できる吸光度しか有さない、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、該方法は、
前記ピークの面積を標準物と比較することによって前記マクロライドを定量する工程；
をさらに包含する、方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、該方法は、
カラム流出物を前記ＵＶ検出器を用いてモニターして前記検出波長における１つ以上のさらなる吸収ピークまたは透過ピークを検出することによって、前記サンプル中に存在する不純物を検出する工程であって、該１つ以上のさらなるピークは、前記マクロライドについてのピーク面積のうちの約０．０５％よりも大きなピーク面積を有し、かつ該１つ以上のさらなるピークは、１つ以上の不純物に対応する、工程；
をさらに包含する、方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法であって、該方法は、
前記サンプルの純度を、
ｉ）前記ＵＶ検出器を用いてカラム流出物をモニターして前記検出波長における１つ以上のさらなる吸収ピークまたは透過ピークを検出する工程であって、該１つ以上のさらなるピークは１つ以上の不純物に対応する、工程；および
ｉｉ）該検出器によって検出されたピークの特徴を測定して前記サンプル中の不純物含有量を算出する工程；
によって決定する工程；
をさらに包含する、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記特徴は、ピーク面積またはピークの高さである、方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法であって、前記測定する工程は、
ｉ）検出された各々の不純物および前記マクロライドについてのピーク面積を決定する工程；および
ｉｉ）該マクロライドに起因する総ピーク面積の割合を算出する工程；
によって実行される、方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載の方法であって、前記１つ以上のさらなる吸収ピークまたは透過ピークの各々は、前記マクロライドについてのピーク面積のうちの約０．０５％よりも大きなピーク面積を有する、方法。
【請求項１９】
９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンを検出するための方法であって、該方法は、
ａ）該９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンを含むサンプルを、約２００ｎｍの検出波長を有する紫外線（ＵＶ）検出器を備えるＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに対して適用する工程；
ｂ）該サンプルを、水とアセトニトリルと１−オクタンスルホン酸ナトリウムと硫酸緩衝液とを含む移動相を用いて溶離させる工程；および
ｃ）該ＵＶ検出器を用いてカラム流出物をモニターして該検出波長における吸収ピークまたは透過ピークを検出する工程であって、該ピークは、該９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンに対応する、工程；
を包含する、方法。
【請求項２０】
マクロライドを検出するためのシステムであって、該システムは、
ａ）逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラム；および
ｂ）紫外線（ＵＶ）検出器；
を備え、該逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムは、
ｉ）逆相固体支持体を含む固定相；および
ｉｉ）移動相；
を含み、該移動相は、
１）イオン対試薬；
２）緩衝液；
３）水；および
４）アセトニトリル；
を含み、該移動相は、２００ｎｍにおいて約０．５未満の吸光度を有する、
システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互援用）
本願は、２００４年５月６日に出願された米国特許出願第６０／５６８，６３９号（その開示は、本明細書においてその全体が参考として援用される）の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、マクロライド（例えば、エリスロマイシルアミンおよび関連化合物）を検出および定量するための分析方法およびシステムに関し、これは、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）および光度測定検出を含む。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
マクロライドとは、種々の細菌感染を処置するために使用される抗生物質ファミリーを表わす。マクロライドは、１４個〜１６個の原子からなる大環状ラクトン環と、通常は少なくとも１つの糖部分、アミノ糖部分、または関連部分とによって、化学的に特徴付けられる。マクロライドは、細菌の５０Ｓリボソーム上の２つの部位での結合の結果として細菌タンパク質合成を阻害し、転移ＲＮＡの解離およびペプチド結合の終結を引き起こすと考えられる。エリスロマイシン（最初のマクロライド抗生物質である）は、１９５２年に発見され、その後すぐに臨床使用の段階に入った。エリスロマイシンおよびその初期誘導体（例えば、種々の塩およびエステル）は、代表的には、ほとんどのグラム陽性細菌（特に、連鎖球菌）についての静菌活性または殺菌活性と、呼吸病原体に対する良好な活性とによって特徴付けられる。マクロライドは、安全でありかつ多くの呼吸感染について有効であることが示されており、ペニシリンアレルギーを有する患者において有用である。
【０００４】
マクロライドは、代表的には、非常に低い波長範囲（例えば、＜２２０ｎｍ）における紫外（ＵＶ）吸光度を有する。この範囲は、光度測定検出法の限界に近い。エリスロマイシン（下記の構造を参照のこと）についてのＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（ＵＳＰ−ＮＦ）のアッセイ方法は、２１５ｎｍにおけるＵＶ検出を使用する、Ｌ２１固定相を備えるＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相の剛性球状スチレン−ジビニルベンゼンコポリマー、５μｍ〜１０μｍ粒径）を含む（例えば、２０００１年１月１日に刊行されたＵＳＰ−ＮＦのｐｐ６６３〜６６５を参照のこと）。実際、多くの還元型エリスロマイシン誘導体および関連分子（例えば、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミン（またはＰＡ２７９４；下記の構造を参照のこと）は、２１５ｎｍよりも十分に低いＵＶ最大吸収バンド（ＵＶｍａｘ）を有する。例えば、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンについてのＵＶｍａｘは、約１９１ｎｍに存在し、これは、標準的な光度測定検出方法の短波長限界に近い。従って、代替的検出方法（例えば、電気化学的検出）が、魅力的であることが知られている（例えば、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；および非特許文献６）。しかし、これらの代替方法は、品質管理環境において実行されなければならないアッセイ（例えば、薬物放出研究に関連するアッセイおよび薬物安定性研究に関連するアッセイ）のためには通常は適さない。光度測定検出は、アッセイされる化合物（例えば、活性薬剤成分）を検出および定量する目的のためには、優れた方法のままであり、かつ最も普遍的に受容された方法のままである。
【０００５】
【化１】
2007536524.tif 000002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
光度測定検出は、ＨＰＬＣ分析と組み合わせた場合に、他の検出方法を超える多数の明らかな利点を有するので、ＵＶ検出方法を使用して低波長吸収分子（例えば、マクロライド抗生物質）を検出および定量するために適切に設計されたアッセイについて、現在必要性が存在する。本明細書中に記載される方法およびシステムは、この必要性および他の必要性を満たすのを助ける。
【非特許文献１】Ｗｈｉｔａｋｅｒら、Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．（１９８８）、１１（１４）、３０１１〜２０
【非特許文献２】Ｐａｐｐａ−Ｌｏｕｉｓｉら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ｂ：Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．（２００１），７５５（１−２），５７〜６４
【非特許文献３】Ｋｅｅｓら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ａ（１９９８），８１２（１＋２），２８７〜２９３
【非特許文献４】Ｈｅｄｅｎｍｏら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ａ（１９９５），６９２（１＋２），１６１〜６
【非特許文献５】Ｄａｓｚｋｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｒｅｌａｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９），２２（５），６４１〜６５７
【非特許文献６】Ｄｕｂｏｉｓら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ｂ：Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．（２００１），７５３（２），１８９〜２０２
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、約１８０ｎｍ〜約２２０ｎｍにおいて紫外〜可視範囲における最大吸収を有するマクロライドを検出するための方法であって、上記方法は、
ａ）上記マクロライドを含むサンプルを、約１８０ｎｍ〜約２２０ｎｍの間の検出波長を有する紫外線（ＵＶ）検出器を備える逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに対して適用する工程；
ｂ）上記サンプルを、イオン対試薬を含む移動相を用いて溶離させる工程；および
ｃ）カラム流出物を、上記ＵＶ検出器を用いてモニターして、上記検出波長における吸収ピークまたは透過ピークを検出する工程であって、上記ピークは、上記マクロライドに対応する、工程；
を包含する、方法。
【０００８】
いくつかの実施形態において、上記マクロライドは、約１８０ｎｍ〜約２００ｎｍにおいて紫外〜可視範囲における最大吸収を有する。さらなる実施形態において、上記マクロライドは、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンである。
【０００９】
いくつかの実施形態において、上記検出波長は、約１９０ｎｍ〜約２１０ｎｍ、約１９７ｎｍ〜約２０５ｎｍ、または約２００ｎｍである。
【００１０】
いくつかの実施形態において、上記イオン対試薬は、Ｃ４〜Ｃ１２アルキルスルホン酸塩（例えば、１−オクタンスルホン酸ナトリウム）を含む。さらなる実施形態において、上記移動相におけるイオン対試薬の濃度は、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭである。
【００１１】
いくつかの実施形態において、上記移動相は、緩衝液（例えば、硫酸緩衝液またはリン酸緩衝液）をさらに含む。さらなる実施形態において、上記移動相は、ｐＨ約１〜ｐＨ約４（例えば、ｐＨ約３）を有する。
【００１２】
いくつかの実施形態において、上記移動相は、上記マクロライドの溶離の時間経過の間に可変量の水、有機溶媒、および緩衝液を含む。さらなる実施形態において、上記移動相は、溶離の時間経過の間に、上記検出波長において実質的に一定の吸光度を維持する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、上記移動相は、約２０５ｎｍより上では無視できる吸光度しか有さない。さらなる実施形態において、上記移動相は、２００ｎｍにおいて約０．５未満の吸光度を有する。なおさらなる実施形態において、上記移動相は、２００ｎｍにおいて約０．１未満の吸光度を有する。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、
上記マクロライドに対応するピークの面積を標準物と比較することによって上記マクロライドを定量する工程；
をさらに包含する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、
上記ＵＶ検出器を用いてカラム流出物をモニターして上記検出波長における１つ以上のさらなる吸収ピークまたは透過ピークを検出することによって、上記サンプル中に存在する不純物を検出する工程であって、上記１つ以上のさらなるピークは、上記マクロライドについてのピーク面積のうちの約０．０５％よりも大きなピーク面積を有し、かつ上記１つ以上のさらなるピークは、１つ以上の不純物に対応する、工程；
をさらに包含する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本発明は、
サンプルの純度を決定するための方法をさらに提供し、この決定は、
ｉ）上記ＵＶ検出器を用いてカラム流出物をモニターして上記検出波長における１つ以上のさらなる吸収ピークまたは透過ピークを検出する工程であって、上記１つ以上のさらなるピークは１つ以上の不純物に対応する、工程；および
ｉｉ）上記検出器によって検出されたピークの特徴を測定して、上記サンプル中の不純物含有量を算出する工程；
による。
【００１７】
本発明は、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンを検出するための方法をさらに提供する。上記方法は、
ａ）上記９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンを含むサンプルを、約２００ｎｍの検出波長を有する紫外線（ＵＶ）検出器を備えるＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに対して適用する工程；
ｂ）上記サンプルを、水とアセトニトリルと１−オクタンスルホン酸ナトリウムと硫酸緩衝液とを含む移動相を用いて溶離させる工程；および
ｃ）上記ＵＶ検出器を用いてカラム流出物をモニターして、上記検出波長における吸収ピークまたは透過ピークを検出する工程であって、上記ピークは、上記９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンに対応する、工程；
を包含する。
【００１８】
本発明は、マクロライドを検出するためのシステムをさらに提供する。上記システムは、
ａ）逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラム；および
ｂ）紫外線（ＵＶ）検出器；
を備え、上記逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムは、
ｉ）逆相固体支持体を含む固定相；および
ｉｉ）移動相；
を含み、上記移動相は、
１）イオン対試薬；
２）緩衝液；
３）水；および
４）アセトニトリル；
を含み、上記移動相は、２００ｎｍにおいて約０．５未満の吸光度を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（詳細な説明）
本発明は、とりわけ、ＵＶ領域において主要な分光光度的吸収を有するマクロライドおよび／または関連分子を検出および定量するための方法およびシステムを提供する。いくつかの実施形態において、上記方法は、逆粗高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムにおいて、上記のマクロライドまたは関連化合物を含むサンプルを流す工程を包含する。上記サンプルは、低ＵＶ吸収移動相を用いて溶離されて、短波長における上記マクロライドおよび／またはあらゆる分離された不純物の検出が可能になる。上記移動相はまた、その逆相カラムにおいて、しばしば極性であるマクロライドを保持することを改善するために、イオン対試薬を含み得る。
【００２０】
本発明に従うマクロライドは、公知の抗生物質マクロライドまたは他のマクロライド、およびそれらの誘導体のうちのいずれかを含む。代表的なマクロライドは、１２員、１４員、または１６員の、大環状ラクトンコア構造によって特徴付けられる。マクロライドは、当該分野において広範に公知であり、例えば、Ｍａｃｒｏｌｉｄｅ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，Ｓａｔｏｓｈｉ  Ｏｍｕｒａ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９８４（これは、その全体が本明細書中で参考として援用される）において十分に記載されている。いくつかの実施形態において、上記マクロライドは、比較的少ない紫外〜可視（ＵＶ−ＶＩＳ）吸収プロフィールを有し、例えば、約１８０ｎｍ〜約２２０ｎｍ、約１８０ｎｍ〜約２００ｎｍ、または約１８０ｎｍ〜約１９５ｎｍの波長にて、ＵＶ−ＶＩＳ範囲（約１００ｎｍ〜約９００ｎｍ）における最大吸収を示す。さらなる実施形態において、上記マクロライドは、約１８８ｎｍ、約１８９ｎｍ、約１９０ｎｍ、約１９１ｎｍ、約１９２ｎｍ、約１９３ｎｍ、約１９４ｎｍ、約１９５ｎｍ、約１９６ｎｍ、約１９７ｎｍ、約１９８ｎｍ、約１９９ｎｍ、約２００ｎｍ、約２０１ｎｍ、約２０２ｎｍ、約２０３ｎｍ、約２０４ｎｍ、または約２０５ｎｍの波長にて、ＵＶ−ＶＩＳ範囲における最大吸収を有する。
【００２１】
本明細書中に記載される方法およびシステムによる検出のために適切なマクロライドは、容易にプロトン化または脱プロトン化されてイオン対試薬と対を形成可能な荷電マクロライドを形成し得る、少なくとも１つの部分をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記マクロライドは、中性の塩基性部分を含み得、対応する遊離部分（Ｈが上記マクロライド分子の残りの代わりをする）は、約１０未満、約８未満、約５未満、または約４未満のｐＫｂを有する。いくつかの例示的な中性の塩基性部分としては、ＮＨ２、アルキルアミン（例えば、ＮＨＭｅ、ＮＨＥｔなど）、ジアルキルアミン（例えば、ＮＭｅ２、ＮＥｔ２など）、環状アミン（例えば、ピペリジニル、モルホリノなど）などが挙げられる。
【００２２】
本明細書において提供される方法およびシステムによって検出され得る代表的なマクロライドとしては、例えば、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミン、９−（Ｒ）−エリスロマイシルアミン、エリスロマイシン、エリスロマイシンヒドラゾン、エリスロマイシン、９−イミノエリスロマイシン、エリスロマイシンオキシム、エリスロマイシンＢ、エリスロマイシンヒドラゾンＢ、９−イミノエリスロマイシンＢ、エリスロマイシルアミンＢ、エリスロマイシンヒドラゾンアセトン付加物、９−ヒドロキシイミノエリスロマイシン、エリスロマイシルアミンヒドロキシド、９−ヒドロキシイミノエリスロマイシンＢ、エリスロマイシルアミンＢヒドロキシド、エリスロマイシルアミンＣ、エリスロマイシルアミンＤ、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、トロレアンドマイシン、それらの誘導体などが挙げられる。
【００２３】
さらなる適切なマクロライドは、１つ以下のｓｐ混成炭素原子もしくはｓｐ２混成炭素原子またはｓｐ混成窒素原子もしくはｓｐ２混成窒素原子を含む。そのように特徴付けられるマクロライドの例としては、エリスロマイシルアミン、エリスロマイシルアミンＢ、エリスロマイシルアミンヒドロキシド、エリスロマイシルアミンＢヒドロキシド、エリスロマイシルアミンＣ、エリスロマイシルアミンＣヒドロキシド、エリスロマイシルアミンＤ、エリスロマイシルアミンＤヒドロキシドなどが挙げられる。
【００２４】
いくつかの実施形態において、上記マクロライドは、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンである。
【００２５】
本発明に従う移動相は、望ましいマクロライドを効果的に溶離する液体成分の任意の組み合わせであり得、この移動相は、潜在的不純物からの上記マクロライドの分離を可能にし、そして上記検出波長における上記マクロライドの光度測定検出を可能にする。いくつかの実施形態において、上記移動相は、約２０５ｎｍよりも上では（例えば、１ｃｍ経路長にわたって分光光度計で測定した場合に）無視できる吸光度しか有さない。「無視できる」によって、約０．０２以下の吸光度が意味される。さらなる実施形態において、上記移動相は、上記検出波長において、約０．５未満、約０．３未満、または約０．１未満の（例えば、１ｃｍ経路長にわたって分光光度計で測定した場合の）吸光度を有する。
【００２６】
上記移動相は、水、有機溶媒、またはそれらの混合物を含み得る。水と混和可能であり上記検出波長における上記マクロライドの検出を妨害しない、任意の適切な有機溶媒が、使用され得る。いくつかの実施形態において、上記有機溶媒は、アセトニトリルである。上記移動相は、０％（ｖ／ｖ）〜１００％（ｖ／ｖ）の水、および０％〜１００％（ｖ／ｖ）有機溶媒を含み得る。いくつかの実施形態において、上記移動相は、約５％（ｖ／ｖ）〜約７５％（ｖ／ｖ）、約１０％（ｖ／ｖ）〜約６０％（ｖ／ｖ）、または約２０％（ｖ／ｖ）〜約５０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態において、上記移動相は、望ましいｐＨにて上記溶液を安定化させるための緩衝液をさらに含む。上記検出波長における上記マクロライドの検出を妨害しない任意の緩衝液が、使用され得る。いくつかの実施形態において、上記緩衝液は、リン酸緩衝液または硫酸緩衝液である。さらなる実施形態において、上記緩衝液は、硫酸緩衝液である。緩衝液濃度は、例えば、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、緩衝液濃度は、約１ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約３０ｍＭである。
【００２８】
上記移動相は、上記マクロライドが本発明の方法およびシステムによって検出され得るのに十分に安定である、任意のｐＨを有し得る。いくつかの実施形態において、上記ｐＨは、約１〜約４である。さらなる実施形態において、上記ｐＨは、約３である。
【００２９】
いくつかの実施形態において、上記移動相は、イオン対試薬（例えば、逆相カラムにおける上記マクロライドの保持を助長する塩）を含む。上記移動相溶液中で適度に安定であり、上記マクロライドの荷電形態（例えば、プロトン化形態または脱プロトン化形態）とイオン対を形成可能であり、かつ上記マクロライドの溶離も検出も妨害しない、任意のイオン対試薬が適切である。種々の適切なイオン対試薬が、市販されており、それらのイオン対試薬を使用するＨＰＬＣ技術は、当該分野で周知である。いくつかの例示的なイオン対試薬としては、アルキルスルホン酸塩（例えば、（Ｃ４〜Ｃ１２アルキル）スルホン酸塩（１−オクタンスルホン酸ナトリウムが挙げられる））が挙げられる。上記移動相におけるイオン対試薬の濃度は、約０．１ｍＭ〜〜約１００ｍＭであり得る。いくつかのさらなる実施形態において、イオン対濃度は、約１ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約３０ｍＭである。いくつかの実施形態において、上記イオン対濃度は、約１２ｍＭ〜約１５ｍＭである。
【００３０】
上記移動相は、イソクラティック溶離物として、または勾配溶離物として、ＨＰＬＣカラムを通され得る。勾配移動相が適用される実施形態において、上記移動相は、２種以上の異なる溶離剤溶液の混合物から構成され得る。これらの溶離剤の比率は、その溶離の時間経過の間に変化する。例えば、上記移動相は、溶離の間に可変量の水、有機溶媒、緩衝液、およびイオン対試薬を含み得る。成分量の変化は、その勾配移動相が溶離過程の間に上記検出波長において実質的に一定の吸光度を維持するように調節され得る。成分量の変化はまた、ピークの形状、溶離時間、不純物からのマクロライドの分離、および他のパラメーターを最適化するように調節され得る。
【００３１】
いくつかの実施形態において、上記移動相の組成は、２種の溶離剤溶液のうちの１種または混合物（各々が、種々の量の水、有機溶媒、緩衝液、およびイオン対試薬を含む）を用いて溶離することによって変化される。いくつかの実施形態において、第一溶離剤溶液は、約１０％（ｖ／ｖ）〜約３０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒、約７０％（ｖ／ｖ）〜約９０％（ｖ／ｖ）の水、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭのイオン対試薬、および約１０ｍＭ〜約１５ｍＭの緩衝液を含み、第二溶離剤溶液は、約４０％（ｖ／ｖ）〜約６０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒、約４０％（ｖ／ｖ）〜約６０％（ｖ／ｖ）の水、約８ｍＭ〜約１５ｍＭのイオン対試薬、および約８ｍＭ〜約１２ｍＭの緩衝液を含む。さらなる実施形態において、第一溶離剤溶液は、約２０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒、約８０％（ｖ／ｖ）の水、約１５ｍＭのイオン対試薬、および約１３ｍＭの緩衝液を含み、第二溶離剤溶液は、約５０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒、約５０％（ｖ／ｖ）の水、約１２ｍＭのイオン対試薬、および約１０．５ｍＭの緩衝液を含む。溶離の間の任意の点において、上記移動相は、１００％の上記の２種の溶離剤溶液のうちの１種またはその２種の混合物から構成され得る。
【００３２】
上記固定相は、上記移動相と組み合わせると上記マクロライドの検出および潜在的不純物からのそのマクロライドの分離を可能にする、任意の逆相固体支持媒体から構成され得る。いくつかの実施形態において、上記固定相は、Ｃ８マトリックス〜Ｃ１８マトリックスを含む。さらなる実施形態において、上記固定相は、Ｃ１８マトリックスである。
【００３３】
上記サンプルは、上記カラム中に導入するための希釈サンプルを形成するように希釈され得る。上記希釈サンプルは、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬのマクロライド濃度を有し得る。サンプル希釈剤は、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（例えば、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ，約３０ｍＭ〜約７０ｍＭ、または約５０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ）によって緩衝化されかつｐＨ約６〜ｐＨ約８またはｐＨ約７を有する、水から構成され得る。
【００３４】
上記カラムからの流出液をモニターするＵＶ検出器は、液体サンプルを通るＵＶ波長の吸収または透過を検出可能な任意の分光光度計を備え得る。上記検出器は、溶離期間の間は一定であり得る検出波長に対して調整され得る。いくつかの実施形態において、流出物は、約１９０ｎｍ〜約２１０ｎｍ、約１９７ｎｍ〜約２０５ｎｍ、または約２００ｎｍの波長にてモニターされる。いくつかの実施形態において、上記検出波長は、約２００ｎｍである。
【００３５】
本発明の方法およびシステムに従う上記マクロライドの溶離は、種々の温度および圧力（周囲温度および雰囲気圧が挙げられる）の下で実行され得る。いくつかの実施形態において、溶離は、約１０℃〜約４５℃、約１０℃〜約３０℃、約１５℃〜約２５℃、または約２０℃という一定温度にて実行される。温度は、例えば、上記カラムに冷却装置を取り付けることによって、室温より下で維持され得る。溶離はまた、大気または不活性雰囲気の下で実行され得る。
【００３６】
上記マクロライドの検出は、上記マクロライドに対応するピークを含むと考えられるクロマトグラムを、上記マクロライドの既知サンプルについてのピークを示す同じ条件下で実行されたクロマトグラムと比較することによって、確認され得る。例えば、参照ピークから約０．２分以内に出現するサンプルピークは、「確認された」ものとみなされ得る。サンプル中のマクロライドの量はまた、そのマクロライドに対応するピークの面積を、既知量のそのマクロライドを含む参照サンプル（標準物）について得られたクロマトグラムにおけるピーク面積と比較することによって、定量され得る。
【００３７】
本発明は、マクロライドを含むサンプルの純度を決定するための方法をさらに提供する。この決定は、本明細書中に記載される検出方法に従ってそのマクロライドを検出する工程；および上記ＵＶ検出器を用いてカラム流出物をモニターして、上記検出波長における１つ以上のさらなる吸収ピークまたは透過ピークを検出する工程；による。このさらなるピークは、そのサンプル中に存在する、検出されるマクロライド以外の化合物（例えば、不純物（例えば、他のマクロライド））に対応する。いくつかの実施形態において、不純物に対応するピークは、検出されるマクロライドについてのピーク面積のうちの約０．０５％よりも大きなピーク面積を有するものとして認識され得る。さらに、サンプル純度は、ピーク特徴（例えば、ピークの高さおよび／またはピーク面積が挙げられる）を測定することによって、評価され得る。例えば、純度は、検出される各不純物について、総ピーク面積（例えば、「マクロライドのピーク面積」＋「不純物のピーク面積」）の割合を決定することによって、評価され得る。
【００３８】
また、本発明によって包含されるのは、上記の成分のアセンブリを含むシステムである。例えば、本発明のシステムは、ａ）逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラム；およびｂ）紫外線（ＵＶ）検出器；を備え得る。この逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムは、ｉ）逆相固体支持体マトリックスを含む固定相と；ｉｉ）上記の移動相；とを含む。
【００３９】
本発明に従うＨＰＬＣアッセイを実行して最適化するためのさらなるパラメーターは、文献（例えば、Ｓｎｙｄｅｒら、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ＨＰＬＣ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔ，第２版，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７）（この開示は、その全体が参考として本明細書中で援用される）において示されるように、十分に当業者の知識の範囲内にある。
【００４０】
本発明は、具体的な実施例によって、より詳細に記載される。以下の実施例は、例示目的のために提供される。以下の実施例は、本発明をいかなる方法でも限定することを意図するものではない。当業者は、基本的に同じ結果をもたらすように変更または改変され得る種々の重要ではないパラメーターを、容易に認識する。
【実施例】
【００４１】
（実施例１）
（エリスロマイシルアミンの検出および純度決定のためのＨＰＬＣアッセイ）
（一般的説明）
試験サンプルを、５０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液中に９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミン（Ａｌｅｍｂｉｃ  Ｌｔｃ（Ｉｎｄｉａ）によって製造された）を溶解することによって、ＨＰＬＣ分析のために調製した。Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓを使用して、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンのサンプル中において一般的に見出される不純物を安定化させた。逆相カラムにおけるこのサンプル溶液のＨＰＬＣ分析を、移動相において１−オクタンスルホン酸ナトリウムをイオン対試薬として使用することによって、達成した。成分を、２００ｎｍにおけるＵＶ吸収によって検出した。そのサンプルにおける９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンの存在が、参照標準物のクロマトグラムにおいて観察される主要ピークから±０．２分以内に、そのサンプルのクロマトグラムにおいてピークが観察される場合に、確認された。９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンが存在しないことが、参照標準物のクロマトグラムにおいて観察される主要ピークから±０．２分以内に、そのサンプルのクロマトグラムにおいてピークが観察されない場合に、確認された。上記サンプルのクロマトグラム中の９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンのピーク面積を、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミン参照溶液のクロマトグラムからの９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンのピーク面積と比較して、その９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンのアッセイ値（重量／重量）％を決定した。不純物を、このクロマトグラムにおける保持時間および総面積％によって記録した。
【００４２】
（器具）
製造業者の指示に従って操作した以下の器具を、ＨＰＬＣクロマトグラムを得るために使用した。同等の性能を有する器具が、代わりになり得る。
【００４３】
真空デガッサー（ｄｅｇａｓｓｅｒ）：Ｗａｔｅｒｓ  ２６９０
ポンプ：Ｗａｔｅｒｓ  ２６９０
インジェクター：Ｗａｔｅｒｓ  ２６９０
・ニードル洗浄物として、アセトニトリルと水との５０：５０（体積比）混合物
・１００μＬインジェクションループ
プレカラム：ＯＤＳカートリッジを備えるＰｈａｎｏｍｅｎｅｘ  Ｓｅｃｕｒｉｔｙ  Ｇｕａｒｄ（Ｐ／Ｎ  ＡＪＯ−４２８７）
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｃｏｌｕｍｎ，Ｃ１８（２），１５０ｎｍ×４．６ｍｍ，５μｍ（Ｐ／Ｎ  ００Ｆ−４２５２−Ｅ０）
・カラムを、そのカラムの標識において指示されるとおりに溶離剤フローの方向に設置し、２０±１℃にて維持されたＪｏｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙカラム冷却装置／加熱装置中に配置した。
・カラムを、使用中でない場合には、７０：３０（ｖ／ｖ）アセトニトリル：水中にて保存した
検出器：Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  Ｄｕａｌ  Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ
・波長＝２００ｎｍ
カラム冷却装置：Ｊｏｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙモデル７９５５
・温度を２０±１℃に設定した
データシステム：Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｎｅｌｓｏｎ  Ｔｕｒｂｏｃｈｒｏｍデータシステム（バージョン６．２．１）。
【００４４】
（試験サンプルおよび参照溶液の調製）
試験サンプルおよび参照溶液は、３６時間よりも長くは保存しなかった。
【００４５】
試験サンプル：９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンＡＰＩ（活性薬剤成分）試験サンプル溶液を、６０±６ｍｇの試験サンプルを二連で２５ｍＬメスフラスコ中に秤量することによって調製した。重量は、最も近い０．０１ｍｇ単位まで記録した。２０ｍＬのサンプル希釈剤Ｂ（下記を参照のこと）を、各フラスコに添加した。上記サンプルを、完全に溶解するまで超音波処理した。氷をこの超音波処理浴に添加して、その温度を１５℃未満に維持した。この溶液を、サンプル希釈剤Ｂ（下記を参照のこと）の添加によって２５ｍＬの容積にした。
【００４６】
参照標準物溶液：９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミン参照標準物を、６０±６ｍｇの９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミン参照標準物を二連で２５ｍＬメスフラスコ中に秤量することによって調製した。重量は、最も近い０．０１ｍｇ単位まで記録した。２０ｍＬのサンプル希釈剤Ｂ（下記を参照のこと）を、各フラスコに添加した。上記サンプルを、完全に溶解するまで超音波処理した。氷をこの超音波処理浴に添加して、その温度を１５℃未満に維持した。この溶液を、サンプル希釈剤Ｂ（下記を参照のこと）の添加によって２５ｍＬの容積にした。一方のフラスコを＃１と呼び、もう一方のフラスコを＃２と呼んだ。
【００４７】
感度標準物溶液：この感度標準物溶液は、１００．０μＬの上記の参照標準物溶液＃１を１００ｍＬメスフラスコ中にピペッティングしてサンプル希釈剤Ａで体積調整することによって調製した。
【００４８】
（作業溶液）
（サンプル希釈剤Ａ）
５０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ）
ｐＨ７．４
（サンプル希釈剤Ｂ）
５０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ）
ｐＨ７．０
（溶離剤Ａ）
２０％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード，Ｆｉｓｈｅｒ）
１５ｍＭ  １−オクタンスルホン酸ナトリウム（Ｆｌｕｋａ）
１３ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４（Ｓｉｇｍａ）
ｐＨ３．１
（溶離剤Ｂ）
５０％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード、Ｆｉｓｈｅｒ）
１２ｍＭ  １−オクタンスルホン酸ナトリウム（Ｆｌｕｋａ）
１０．５ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４（Ｓｉｇｍａ）
ｐＨ３．１。
【００４９】
（ＨＰＬＣ分析）
サンプル分析は、以下のパラメーターの下で実行した：
流量：１．０ｍＬ／分
注入容積：２０μＬ
ランタイム（ｒｕｎ  ｔｉｍｅ）：４０分
波長：２００ｎｍ。
【００５０】
このデータシステムは、４０分間の収集時間で１ポイント／秒を収集するように設定した。
【００５１】
ブランク、参照標準物、および試験サンプルを、下記の表Ｉに従う順序で注入した。
【００５２】
（表Ｉ）
【００５３】
【表１】
2007536524.tif 000003
2007536524.tif 000004
勾配移動相を、下記の表ＩＩに従って各ラン（ｒｕｎ）のために適用した。
【００５４】
（表ＩＩ）
【００５５】
【表２】
2007536524.tif 000005
（サンプル中の９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンの存在確認）
９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンの存在を、クロマトグラムの主要ピークが参照標準物溶液のクロマトグラム中の主要ピークから０．２分以内に存在することの決定によって、確認した。
【００５６】
（不純物含有量の算出）
二連の調製物のクロマトグラムを、試験し、ピーク面積を、積分して平均した。不純物含有量（純度）を、以下のようにして算出した：
不純物含有量＝（Ａｉ×１００）／（Σ[Ａｉ]＋Ａｐ）
この式において、Ａｉは、不純物ピークの面積である；
Ａｐは、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンピークの面積である；そして
Σ[Ａｉ]は、０．０５％よりも大きなすべての不純物ピークの面積の合計である。
【００５７】
（実施例２）
（９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンのＨＰＬＣ分析についてのピーク面積％に対する検出波長の変化の影響）
表ＩＩＩａ〜表ＩＩＩｃは、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンサンプルについて、１９７ｎｍ、２００ｎｍ、および２０３ｎｍというＵＶ検出波長におけるＨＰＬＣデータを比較する。これらのアッセイは、種々の検出波長（表ＩＩＩａおよび表ＩＩＩｃ）以外は、実施例１の手順に従って実行した。０．９４および１．２４という相対保持時間が、二重ピークを有するものとして観察された。９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンの相対保持時間（Ｒｅｌ．Ｒ．Ｔ．）を、１．００に設定した。
【００５８】
（表ＩＩＩａ）
（検出波長１９７ｎｍにおける相対保持時間によるピーク面積％）
【００５９】
【表３−１】
2007536524.tif 000006
（表ＩＩＩｂ）
検出波長２００ｎｍにおける相対保持時間によるピーク面積％）
【００６０】
【表３−２】
2007536524.tif 000007
（表ＩＩＩｃ）
検出波長２０３ｎｍにおける相対保持時間によるピーク面積％）
【００６１】
【表３−３】
2007536524.tif 000008
相対保持時間０．９４および１．２４である不純物ピークの面積％は、いくらかの波長依存性を示した。しかし、この検出波長の変化は、ほとんどの不純物の評価に対してほとんど影響を有さなかった。
【００６２】
（実施例３）
（９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンのＨＰＬＣ分析についてのピーク面積％に対するイオン対試薬濃度の影響）
表ＩＶａ〜表ＩＶｅは、１５ｍＭ／１２ｍＭ、１４ｍＭ／１１ｍＭ、１６ｍＭ／１３ｍＭ、１６ｍＭ／１１ｍＭ、１４ｍＭ／１３ｍＭ（溶離剤Ａ／溶離剤Ｂ）の１−オクタンスルホン酸ナトリウム濃度におけるＨＰＬＣデータを比較する。これらのアッセイは、種々のイオン対試薬濃度以外は、実施例１の手順に従って実行した。９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンの相対保持時間（Ｒｅｌ．Ｒ．Ｔ．）を、１．００に設定した。記号「ｄｐ」とは、二重ピークの観察を指し、「ｓｈ」とは、ショルダーの観察を指す。
【００６３】
（表ＩＶａ）
（１５ｍＭ／１２ｍＭというイオン対濃度における相対保持時間によるピーク面積％）
【００６４】
【表４−１】
2007536524.tif 000009
（表ＩＶｂ）
（１４ｍＭ／１１ｍＭというイオン対濃度における相対保持時間によるピーク面積％）
【００６５】
【表４−２】
2007536524.tif 000010
（表ＩＶｃ）
（１６ｍＭ／１３ｍＭというイオン対濃度における相対保持時間によるピーク面積％）
【００６６】
【表４−３】
2007536524.tif 000011
（表ＩＶｄ）
（１６ｍＭ／１１ｍＭというイオン対濃度における相対保持時間によるピーク面積％）
【００６７】
【表４−４】
2007536524.tif 000012
（表ＩＶｅ）
（１４ｍＭ／１３ｍＭというイオン対濃度における相対保持時間によるピーク面積％）
【００６８】
【表４−５】
2007536524.tif 000013
一般的に、保持時間は、そのラン（ｒｕｎ）の間の平均イオン対試薬濃度が増加または減少した場合には、増加または減少した。イオン対試薬濃度を増減の両方の方向で変化させると、ベースラインの上向き傾斜または下向き傾斜を引き起こした。移動相濃度が１６ｍＭ／１３ｍＭという組み合わせである場合、最も遅く溶離する不純物ピークの保持時間は、非常に大きく広がったので、信頼できるようには検出できなかった。他の点では、相対保持時間およびピーク面積は、試験したすべての条件下で一貫していた。いくつかの場合において、移動相組成が変化するにつれ、部分的に融合したピークが分離または合体するのが観察された。
【００６９】
（実施例４）
（エリスロマイシルアミンのＨＰＬＣ分析についてのピーク面積％に対するｐＨの影響）
表Ｖａ〜表Ｖｃは、ｐＨ２．９、ｐＨ３．１、およびｐＨ３．３におけるＨＰＬＣデータを比較する。これらのアッセイは、種々のｐＨ以外は実施例１の手順に従って実行した。９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンの相対保持時間（Ｒｅｌ．Ｒ．Ｔ．）を、１．００に設定した。記号「ｄｐ」とは、二重ピークの観察を指し、「ｓｈ」とは、ショルダー部の観察を指す。ピーク面積に対するｐＨの影響は、観察されなかった。
【００７０】
（表Ｖａ）
（ｐＨ２．９における相対保持時間によるピーク面積％）
【００７１】
【表５−１】
2007536524.tif 000014
（表Ｖｂ）
（ｐＨ３．１における相対保持時間によるピーク面積％）
【００７２】
【表５−２】
2007536524.tif 000015
（表Ｖｃ）
（ｐＨ３．３における相対保持時間によるピーク面積％）
【００７３】
【表５−３】
2007536524.tif 000016
（実施例５）
９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンのＨＰＬＣ分析についてのピーク面積％に対するカラム温度の影響）
９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンの試験アッセイを、種々のカラム温度（１８℃、２０℃、および２２℃）以外は実施例１の手順に従って実行した。この温度範囲の間では、ピーク面積について顕著な温度の影響は観察されなかった。しかし、カラム温度を低下させると、ピークの分離が良くなり、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンピークが狭くなった。
【００７４】
（実施例６）
９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンのＨＰＬＣ分析についてのピーク面積％に対する溶液濃度の影響）
９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンの試験アッセイを、種々のサンプル９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミン濃度（０．９ｍｇ／ｍＬ、１．２ｍｇ／ｍＬ、および１．４ｍｇ／ｍＬ）以外は実施例１の手順に従って実行した。この範囲の間では、サンプル濃度は、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンの定量的評価に対して顕著な効果は有さなかった。
【００７５】
明確にするために別の実施形態に関して記載されている本発明の特定の特徴はまた、１つの実施形態において組み合わせても提供され得ることが、認識される。逆に、短くするために１つの実施形態に関して記載されている本発明の種々の特徴はまた、別個にも、または適切な任意の部分的組み合わせの状態でも提供され得る。
【００７６】
本発明の種々の改変形が、本明細書中に記載されるものに加えて、上記の説明から当業者にとって明らかである。そのような改変形はまた、添付される特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。本願において引用される各参考文献は、その全体が参考として本明細書中で援用される。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、実施例１において記載される条件下で実行された、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンのＲＰ−ＨＰＬＣアッセイのついての例示的クロマトグラムを示す。
【図２】図２は、本発明に従う９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンのＲＰ−ＨＰＬＣアッセイに対する、移動相中のイオン対試薬（１−オクタンスルホン酸ナトリウム）の濃度の影響を示す。そのクロマトグラムの中央部分は、例えば、主要成分のピーク分離に対するアッセイ条件の影響を示すことが示されている。
【図３】図３は、本発明に従う９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンのＲＰ−ＨＰＬＣアッセイに対する、移動相のｐＨの影響を示す。
【図１】
2007536524.tif 000017
【図２】
2007536524.tif 000018
【図３】
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【国際調査報告】
2007536524.tif 000020
2007536524.tif 000021
2007536524.tif 000022