(57)【要約】  本発明は、関節リウマチ（ＲＡ）の、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく遺伝子治療、詳細にはインビボ遺伝子治療の分野に関する。本発明は、関節炎の関節への治療タンパク質をコードする遺伝子の送達において非常に効果的である組換えＡＡＶビリオン、およびインビボ遺伝子治療においてこのようなビリオンを使用するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用タンパク質をコードする核酸配列を滑膜細胞に送達するための方法であって、以下の工程：
ａ）ＡＡＶ血清型５のカプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶビリオン（ｒＡＡＶ）を提供する工程であって、該ｒＡＡＶビリオンがｒＡＡＶＸベクターを含み、ｒＡＡＶＸベクターが核酸配列に作動可能に連結される発現エレメントを含む工程；および、
ｂ）ｒＡＡＶビリオンを滑膜細胞と接触させる工程であって、それによってｒＡＡＶＸベクターの形質導入が、形質導入された滑膜細胞における核酸配列の発現を生じる工程、
を含む、方法。
【請求項２】
被験体のリウマチ様関節へのｒＡＡＶビリオンの局所的な投与によって、核酸配列がインビボで滑膜細胞に送達される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｒＡＡＶビリオンの投与が、関節への注入によって、好ましくは滑膜区分への注入によってである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ｒＡＡＶビリオンを、滑膜細胞またはエキソビボで滑膜細胞を含有する細胞培養物と接触させ、それによって必要に応じて形質導入細胞を選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
被験体のリウマチ様関節に形質導入細胞を投与する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
形質導入細胞の投与が、関節への注入によって、好ましくは滑膜区分への注入によってである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
形質導入された滑膜細胞における核酸配列の発現が、関節における関節炎の症状の軽減を生じる、請求項２〜３および５〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
核酸配列が以下：ＩＬ−１インヒビター、ＴＮＦαインヒビター、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、ＩＬ−１８結合タンパク質、ｓＴＮＦα受容体ｐ５５またはｓＴＮＦαｐ７５、ｄｎ−ＩＫＫ−β、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−β、およびＶＩＰの１つまたは複数から選択される治療用タンパク質をコードする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ｒＡＡＶＸベクターがｒＡＡＶ５またはｒＡＡＶ２ベクターである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＡＡＶ血清型５またはＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンであって、それによってｒＡＡＶビリオンはｒＡＡＶＸベクターを含み、該ｒＡＡＶＸベクターは関節リウマチに対して効果的な治療用タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結される発現エレメントを含む、ビリオン。
【請求項１１】
ｒＡＡＶビリオンがｒＡＡＶ５ビリオンであり、ｒＡＡＶＸベクターがｒＡＡＶ５またはｒＡＡＶ２ベクターである、請求項１０に記載ビリオン。
【請求項１２】
核酸配列が以下：ＩＬ−１インヒビター、ＴＮＦαインヒビター、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、ＩＬ−１８結合タンパク質、ｓＴＮＦα受容体ｐ５５またはｓＴＮＦαｐ７５、ｄｎ−ＩＫＫ−β、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−β、およびＶＩＰの１つまたは複数から選択される治療用タンパク質をコードする、請求項１０または１１に記載のビリオン。
【請求項１３】
薬学的に許容される腑形剤および請求項１０〜１２のいずれか１項において規定されるｒＡＡＶビリオンを含む薬学的組成物の治療的に有効な量を使用して、インビボで関節のリウマチ様滑膜細胞を形質導入する工程、ならびに必要に応じて一定期間後に形質導入を反復する工程、を含む、リウマチ様関節を処置するための方法。
【請求項１４】
請求項１０〜１２のいずれか１項において規定されるｒＡＡＶビリオンを使用してエキソビボでリウマチ様滑膜細胞を形質導入する工程、必要に応じて形質導入細胞を選択する工程、被験体のリウマチ様関節に形質導入細胞を投与する工程、および必要に応じて一定期間後に投与を反復する工程を包含する、リウマチ様関節を処置するための方法。
【請求項１５】
リウマチ様関節の処置のための薬剤の製造のための、請求項１０〜１２のいずれか１項において規定されるビリオンの使用。
【請求項１６】
処置は、薬学的に許容される腑形剤および請求項１０〜１２のいずれか１項において規定されるｒＡＡＶビリオンを含む薬学的組成物の治療的に有効な量を使用して、インビボで関節のリウマチ様滑膜細胞を形質導入する工程、および必要に応じて一定期間後に形質導入を反復する工程を含む、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
処置は、請求項１０〜１２のいずれか１項において規定されるｒＡＡＶビリオンを使用してエキソビボでリウマチ様滑膜細胞を形質導入する工程、必要に応じて形質導入細胞を選択する工程、被験体のリウマチ様関節に形質導入細胞を投与する工程、および必要に応じて一定期間後に投与を反復する工程を包含する、請求項１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節リウマチ（ＲＡ）の、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースの遺伝子治療、詳細にはインビボ（in vivo）遺伝子治療の分野に関する。本発明は、抗炎症性タンパク質またはＮＦ−κＢ活性を阻害するタンパク質のような治療用タンパク質をコードする遺伝子の関節への送達において非常に効果的である組換えＡＡＶビリオン、およびインビボまたはエクスビボ（ex vivo）遺伝子治療でこのようなビリオンを使用するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（ＲＡ）は、主に関節を標的とする進行性の破壊的な異常であり、および滑膜組織の過剰増殖および血液由来の細胞の浸潤によって特徴付けられ、軟骨および骨の進行性の侵食を生じる。ＲＡの罹患率は、１００，０００人の集団あたり約３０人であることが報告され、およびこれは、子供から老人までの任意の年齢群に影響を与え得る。疾患の有病率は、世界中で約１％である。したがって、オランダにおいてのみで約１５，０００人のＲＡ患者が存在する。発病のピークは、３０歳と５５歳との間であり、女性における一貫したより高い割合のために、６５歳を超える女性におけるＲＡの罹患率は５％までのぼる。
【０００３】
ＲＡは、高い程度の経済的損失、病的状態、および早死を伴う。例えば、あるセンターにおいて、ほぼ８０％の患者が２０年間の追跡調査後に重篤な身体障害者であり；さらに３分の１が死亡した。入院治療を要求するＲＡを伴う患者は、健常者に比較される場合、少なくとも２倍増加される死亡率であり、そしてより重篤なＲＡは、より高い死亡率と関連される。重篤なＲＡにおける過剰な死亡率は、三枝冠動脈疾患または第４期ホジキン病の死亡率と比較されてきた。
【０００４】
ＲＡの発病メカニズムの理解、および従来の治療での不十分な回復は、進行的な炎症を抑制するための、および関節傷害を防ぐための、新しく診断されるかまたは初期の疾患の積極的な処置についての近年の概念に導いた。薬物治療は、臨床的寛解期における患者以外の全ての患者についての処置の中軸である。このような治療は十分にこのような患者を処置して寛解を誘導し、そして日常的な活動における関節の組織または機能のさらなる喪失を防止する目的を伴って、開始されるべきである。疾患を緩和する抗リウマチ薬物での従来の治療に加えて、ＴＮＦ−α阻害を目的とする新規なアプローチが首尾よく臨床に取り入れられた。現在、このアプローチを使用することにより、約７０％のＲＡ患者において２０％の改善を達することが可能である。しかしながら、これらの米国リウマチ学会の大多数の２０％の応答者は、いくらか活発な炎症性の関節をなお有した。患者の約３０％は、関節炎活性に関して、ＴＮＦα阻害に応答しなかった。
【０００５】
関節内コルチコステロイドは、ＲＡ患者における兆候性滑膜炎の処置における重要な中軸である、特に、ほとんどの患者において生じ得るように、全身性の抗リウマチ治療の下で分離された関節炎活性がある場合、局所治療についての指標がある。しかし、全ての患者がコルチコステロイドの使用に応答するわけではなく、その使用は副作用によって制限される。
【０００６】
ＲＡの病変は、滑膜関節を通して広がる。正常な滑膜液の無細胞性の性質とは対照的に、ＲＡ滑膜液は好中球で優先的に富化されるが、マクロファージ、Ｔ−リンパ球、および樹状細胞もまた存在する（非特許文献１）。細胞充実度における増加は、滑膜において最も明白であり、これは血液から補充される細胞によって浸潤されるようになる。関節の内層は、１〜２細胞から６〜８細胞厚に増加し、主に活性化血管内膜マクロファージおよび線維芽細胞様滑膜細胞からなる。滑膜細胞の正常な生態の変化は、ＲＡと関連する病理学的プロセスの発生および維持において重要であり、関節軟骨および骨の侵襲および破壊を含む。エラスターゼおよびコラゲナーゼのような可溶性の媒介物の生成に加えて、滑膜液は細胞表面のタンパク質の発現によりこの病理生理学的なプロセスを媒介し、これはリウマチ様滑膜内のリンパ球およびマクロファージの補充および活性化に関与する。滑膜細胞は、関節空間内を介して容易に到達し、比較的長期間生存し、このことにより遺伝子治療戦略のための理想的な標的を示す（非特許文献２）。
【０００７】
さらに、関節の限局性であるという性質は、インビボ遺伝子治療を非常に魅力的なものとする。リウマチ様滑膜における多くの細胞性および分子性の相互作用は、サイトカインによって維持および調節される。ＲＡにおける一貫した知見は、リウマチ様滑膜におけるＩＬ−１、ＴＮＦα、およびＩＬ−１８のような線維芽細胞およびマクロファージ由来の炎症反応を促進するサイトカインの豊富さである。天然に存在するＩＬ−１およびＴＮＦαインヒビターの、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ）、ならびに可溶性ＴＮＦα受容体ｐ５５およびｐ７５は、それらの対応物とともに平衡して産生される。ＩＬ−１８およびＩＬ−１８結合タンパク質は精製される。過剰の組換えサイトカインインヒビターを提供する治療は、ＲＡにおける均衡を抗炎症性状態に移行させる。抗ＴＮＦ−αおよび抗ＩＬ−１指向性のアプローチは、あるサイトカインを遺伝子治療のための適切な標的とする。別のアプローチは、炎症性カスケードを阻害するための滑膜細胞による生物学的に活性な抗炎症性タンパク質（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、およびＩＦＮ−β）の指向性の過剰発現であり得た（非特許文献３）。
【０００８】
ＮＦ−κＢは、明らかに、炎症反応を促進する遺伝子発現の最も重要な調節因子の一つである（非特許文献４）。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、およびＩＬ−８のようなサイトカインの合成は、Ｃｏｘ−２の発現のように、ＮＦ−κＢによって媒介される。Ａｕｐｐｅｒｌｅら（非特許文献５）は近年、ＲＡおよび変質性関節炎を伴う患者から単離された初代線維芽細胞様滑膜細胞におけるＩＫＫの役割を研究した。両方の患者群において、免疫反応性のＩＫＫタンパク質は、これらの細胞において豊富であり、そしてＩＫＫ−αおよびＩＫＫ−βはｍＲＮＡレベルで構成的に発現される。これらの細胞におけるＩＫＫ機能は、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１によって非常に増強され得、内因性ＩκＢ−αの分解、およびＮＦκＢの核への転移を誘導する。この経路の活性化およびＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＣＡＭ−１、およびコラゲナーゼ−１の発現の結果として生じる誘導は、ＩＫＫ−βに明確に依存する（非特許文献６）。したがって、ＩＫＫ−βドミナントネガティブ変異体をコードするアデノウイルス構築物のトランスフェクションは、滑膜細胞におけるＴＮＦ−α媒介性のＮＦκＢ核転移および炎症反応を促進する遺伝子発現を防ぐが、ＩＫＫ−αドミナントネガティブ変異体は何の効果も有しない（非特許文献７）。炎症性関節炎の動物モデルは、ＮＦ−κＢ活性化はインビボで病原性役割を有するという知見を支持した。例えば、滑膜性ＮＦ−κＢ結合の増加は、マウスコラーゲン誘導性関節炎における臨床的な関節症状の発達を進行させ、疾患が発症している間徐々に増加する（非特許文献８）。この結合活性の多くは、ｐ５０に起因するようであり、これはコラゲナーゼ−３転写に関与され、そして局所的に活性化されるＡＰ−１とともに、細胞外マトリックス吸収に寄与し得た。滑膜性ＮＦ−κＢ活性化はまた、ラットアジュバント関節炎における免疫後数日以内に生じる（非特許文献９）。機能的なＩＫＫ−β遺伝子の関節内移送によるＮＦ−κＢの選択的な活性化は、滑膜性炎症および関節炎の臨床的兆候に導く（非特許文献１０）。反対に、ＮＦ−κＢ核転移の減少および臨床的な滑膜炎がラットにおけるアジュバント関節炎において、ドミナントネガティブなアデノウイルスＩＫＫ−β構築物の関節内注入後に観察された（非特許文献１１）。炎症におけるＮＦ−κＢの中心的な役割はまた、連鎖球菌の細胞壁誘導性の関節炎を伴うラットにおいて（非特許文献１２）、およびコラーゲン誘導性の関節炎（ＣＩＡ）を伴うマウスにおいて（非特許文献１３）、観察された。
【０００９】
したがって、インビボ遺伝子治療によって、滑膜区分において抗炎症性タンパク質の局所的産生を増加させることを目的とする、またはＮＦ−κＢ活性の阻害を目的とする種々の戦略は、ＲＡの処置のために非常に有望である。
【００１０】
関節において、特にリウマチ様滑膜において、治療用タンパク質の有効量の持続性の局所的産生を可能にするために、効果的な遺伝子デリバリーシステムの開発が必要とされている。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、リポソーム、ＤＮＡ予防接種などといった、一連の様々なウイルスおよび非ウイルスベクターが存在する（非特許文献１４を参照のこと）。今日までに、主にアデノウイルスベクターが、遺伝子送達のためのベクターとして試験されている。しかし、それらのエピソーム性の性質は遺伝子発現の持続性を制限し、それによってそれらを長期間の遺伝子発現が要求される関節炎の治療にそれほど適切でないものとする。アデノウイルスベクターの別の欠点は、ウイルスタンパク質の存在であり、これは宿主における免疫応答を誘発し得る。
【００１１】
他方、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）は、標的細胞のゲノムに取り込まれることが（いくつかの組織において）示され（非特許文献１５）、形質導入細胞における長期間の導入遺伝子発現を可能にする。アデノ随伴ウイルスは、ヘルパー依存性ＤＮＡパルボウイルスであり、これはヒトおよび哺乳動物における疾患と関連していない（概説に関して、非特許文献１６を参照のこと）。組換えＡＡＶベクターは、造血幹細胞、呼吸上皮細胞、およびニューロンのような異なる一連の細胞型にトランスフェクトし得ることが示された。しかし、多くの細胞型（例えば、滑膜細胞であるが、また多くの他の細胞など）について、ＡＡＶベクターによってそれらの全てがまたは効果的にトランスフェクトされ得るか否かは不明のままである。Ｐａｎら（非特許文献１７）は、ｒＡＡＶベクターを使用して、リポ多糖誘導性の関節炎の症状を示すラット滑膜細胞をトランスフェクトし得たが、炎症性が消退した場合、導入遺伝子の発現が減少することを見出した。さらに、文献は、ＡＡＶベースのベクターでの関節へのインビボ遺伝子送達を試みる実験から、非常に不一致な結果を報告している（非特許文献１８）。
【００１２】
複雑な要素は、ＡＡＶ血清型が向細胞性において異なることである。特許文献１は、例えば、ＡＡＶ５ベースのベクターがある細胞型（培養気道上皮細胞、培養横紋筋細胞、および培養ヒト臍帯静脈内皮細胞）をＡＡＶ２よりも高い効率にて形質導入したことを示す。他方、ＡＡＶ５は培養されたｃｏｓ細胞、２９３、ＨｅＬａ、ＩＢ３細胞、およびＭＣＦ７細胞株において非常に非効率的であり、ＡＡＶ２およびＡＡＶ５はともに、ＮＩＨ３Ｔ３、ｓｋｂｒ３、およびｔ−４７Ｄ細胞株について不十分な形質導入効率を示した。
【特許文献１】国際公開第９９／６１６０１号パンフレット
【非特許文献１】Ｔａｋ、Ｐ．Ｐ．滑膜および滑膜液の実験。Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ  ＧＳ、Ｐａｎａｙｉ  ＧＳ、Ｗｏｌｌｈｅｉｍ  ＦＡ、編集者。関節リウマチ。発病および処置における最先端。Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、２０００：５５〜６８
【非特許文献２】Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ、Ｙら、１９９８、Ｄｒｕｇ  Ａｇｉｎｇ  １２：２９〜４１；Ｒｏｂｂｉｎｓ、Ｐ．Ｄ．ら、１９９８、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ、Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２０：１９７〜２０９
【非特許文献３】Ｂｏｙｌｅ、Ｄ．Ｌ．ら、１９９９、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：１９１１〜１９１８
【非特許文献４】Ｔａｋ、Ｐ．Ｐ．およびＦｉｒｅｓｔｅｉｎ、Ｇ．Ｓ．、２００１、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０７（１）：７〜１１
【非特許文献５】１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：４２７〜４３３
【非特許文献６】Ａｕｐｐｅｒｌｅ、Ｋ．Ｒ．ら、１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：４２７〜４３３
【非特許文献７】Ａｕｐｐｅｒｌｅ、Ｋ．Ｒ．ら、１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：４２７〜４３３
【非特許文献８】Ｈａｎ，Ｚ．Ｎ．ら、１９９８、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２８：１９７〜２０８
【非特許文献９】Ｔｓａｏ、Ｐ．Ｗ．ら  １９９７、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．８３、１７３〜１７８
【非特許文献１０】Ｔａｋ，Ｐ．Ｐ．ら、２００１、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４４（８）：１８９７〜９０７
【非特許文献１１】Ｔａｋ，Ｐ．Ｐ．ら、２００１、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４４（８）：１８９７〜９０７
【非特許文献１２】Ｍｉａｇｋｏｖ、Ａ．Ｖ．ら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１３８５９〜１３８６４
【非特許文献１３】ＧＥｒｌａｇ、Ｄ．Ｍ．ら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：１６５２〜１６５８；Ｈａｎ、Ｚ．Ｎ．ら１９９８Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２８：１９７〜２０８
【非特許文献１４】Ｖｅｒｖｏｏｒｄｅｌｄｏｎｋ  Ｍ．Ｊ．Ｂ．Ｍ．およびＴａｋ  Ｐ．Ｐ．２００１、Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ＆  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  第１５巻（５）：７７１〜７８８
【非特許文献１５】Ｈｉｒａｔａら、２０００、Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４：４６１２〜４６２０
【非特許文献１６】ＢｅｒｎｓおよびＢｏｈｅｎｓｋｙ、１９８７、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．３２：２４３〜３０７
【非特許文献１７】Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９９、第７３巻、４：３４１０〜３４１７
【非特許文献１８】Ｇｈｉｖｉｚａｎｎｉら、２０００、ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ  ６：２５９〜２６７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上述のウイルスおよび非ウイルス遺伝子デリバリーシステムの利用可能性にもかかわらず、今日、関節リウマチを被る被験体のリウマチ様滑膜への遺伝子（治療用タンパク質をコードする）の効率的な送達に適したベクターは何ら存在しない。それゆえ、効果的な処置を可能にするために、滑膜への適切なインビボおよびエクスビボ遺伝子デリバリーシステムを作製する必要性が依然としてある。本発明はこのような遺伝子デリバリーシステムを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、１つの実施態様において、リウマチ様滑膜細胞にインビボで核酸分子を送達するための方法を提供し、該方法は、（ａ）ＡＡＶ血清型５またはＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶビリオン（ｒＡＡＶ）を提供する工程であって、ここでｒＡＡＶビリオンがｒＡＡＶＸベクターを含み、ｒＡＡＶＸベクターが核酸配列に作動可能に連結される発現エレメントを含む、工程；および、（ｂ）ｒＡＡＶビリオンを滑膜細胞と接触させる工程であって、それによってｒＡＡＶＸベクターの形質導入が、形質導入された滑膜細胞における核酸配列の発現を生じる、工程を包含する。
【００１５】
本発明の別の実施態様において、本発明は、本発明のｒＡＡＶビリオンを使用してリウマチ様関節を処置するための方法を提供する。該方法は好ましくは、（ａ）関節の関節リウマチの診断を確立する工程；（ｂ）薬学的に許容される腑形剤、およびＡＡＶ血清型５またはＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質を含有するｒＡＡＶビリオンを含む薬学的組成物の治療的に有効な量を使用して、関節のリウマチ様滑膜細胞を形質導入する工程であって、ここでｒＡＡＶビリオンは少なくとも１つの治療用タンパク質（またはペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶＸベクターを含む、工程、ならびに（ｃ）必要に応じて一定期間後に工程（ｂ）を反復する工程、を包含する。
【００１６】
処置の代替の実施態様において、前記方法は、本発明のｒＡＡＶビリオンを使用してエクスビボでリウマチ様滑膜細胞を形質導入する工程、必要に応じて形質導入細胞を選択する工程、被験体のリウマチ様関節に形質導入細胞を投与する工程、および必要に応じて一定期間後に投与を反復する工程を包含する。
【００１７】
本発明の別の実施態様において、組換えＡＡＶビリオンが提供され、それによってビリオンはＡＡＶ血清型５またはＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質を含み、それによってｒＡＡＶビリオンはｒＡＡＶＸベクターを含み、ここでｒＡＡＶＸベクターは関節リウマチに対して有効な治療用タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結される発現エレメントを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
一般的な定義
「遺伝子」または「コード配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ領域（転写される領域）をいい、これは特定のタンパク質を「コードする」。コード配列は転写され（ＤＮＡ）、そしてプロモーターのような適切な調節領域の制御下に置かれる場合、ポリペプチドに翻訳される（ＲＮＡ）。遺伝子は、プロモーター、５’リーダー配列、コード配列、およびポリアデニル化部位を含む３’非翻訳配列のような、いくつかの作動可能に連結されるフラグメントを含み得る。キメラまたは組換え遺伝子は、通常天然において見出されない遺伝子であり、例えばプロモーターが天然と関連していないものであり、転写されるＤＮＡ領域の部分または全てをともなう遺伝子である。「遺伝子の発現」は、遺伝子がＲＮＡに転写され、および／または活性なタンパク質に翻訳されるプロセスをいう。
【００１９】
本明細書中で使用されるように、用語「プロモーター」は、１つまたは複数の遺伝子の転写を制御するために機能し、遺伝子の転写開始部位の転写される方向に関して上流に位置され、そしてＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、および転写因子結合部位、リプレッサーまたはアクチベータータンパク質結合部位、およびプロモーターからの転写の量を直接的または間接的に調節することが当業者に公知の任意の他のヌクレオチドの配列を含むがこれらに制限されない、任意の他のＤＮＡ配列の存在によって構造的に同定される。「構成的」プロモーターは、ほとんどの生理学的および発生的条件下、ほとんどの組織において活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、生理学的にまたは発生的に調節されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特異的タイプの組織または細胞においてのみ活性である。
【００２０】
本明細書中で使用されるように、「作動可能に連結される」とは、互いに機能的な関係にあるように物理的に連結される、２つ以上の核酸またはアミノ酸の配列エレメントをいう。例えば、プロモーターはプロモーターがコード配列の転写および／または発現を開始し得る、またはそうでなければ制御／調節し得る場合、コード配列に作動可能に連結され、この場合、コード配列は、プロモーターの「制御下」にあると理解されるべきである。一般に、２つの核酸配列が作動可能に連結される場合、これらは同じ方向にあり、そしてまた、通常同じリーディングフレーム内にある。それらはまた、これは必要とされないかもしれないが、通常本質的に連続的である。
【００２１】
用語「シグナル配列」、「シグナルペプチド」、および「分泌リーダー」は交換可能に使用され、そして分泌性のおよび膜結合性のポリペプチドに通常存在する短い（通常約１５〜６０アミノ酸）、連続的なアミノ酸のストレッチをいい、これは細胞質の外側の様々な位置へのそれらの送達を指向する。したがって、特異的な分類化または標的化シグナルは、シグナル配列を含み、核、ＥＲ、ミトコンドリア、ペルオキソームなどへのポリペプチドの送達を指向し得る。シグナル配列は通常、約４〜１５アミノ酸の疎水性コアを含み、これはしばしば、塩基性アミノ酸によって直接に先行される。シグナルペプチドのカルボキシル末端にて、シグナルペプチド切断部位を規定するシグナルを介入するアミノ酸によって分離される小さな、非荷電のアミノ酸の対が存在する。ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ、Ｇ．（１９９０）Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌ．１１５：１９５〜２０１。それらの重複する構造的および機能的な類似性にもかかわらず、ネイティブのシグナルペプチドはコンセンサス配列を有しない。
【００２２】
「遺伝子送達」または「遺伝子移送」は、宿主への組換えまたは外来ＤＮＡの信頼性のある導入のための方法をいう。移送されたＤＮＡは、宿主細胞のゲノムへ取り込まれないままであり得るか、好ましくは宿主細胞のゲノムに取り込まれ得る。遺伝子送達は、ウイルスベクターを使用する形質導入によって、またはエレクトロポレーション、細胞照射などのような公知の方法を使用する、細胞の形質転換によって行われ得る。
【００２３】
「ベクター」は一般に、ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現に適切な核酸構築物をいう。ベクターはまた時折、ウイルスまたはビリオンのようなベクターを含む輸送媒体をいい、これは、宿主細胞中に、および宿主細胞間で、ベクターを移入し得る。
【００２４】
本明細書中で使用されるように「ｒＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５などのようなアデノ随伴ウイルス血清型に由来する組換えベクターをいう。ｒＡＡＶベクターは、１つの、好ましくは全ての野生型ＡＡＶ遺伝子が欠失されるが、機能的なＩＴＲ核酸配列をなお含む。機能的なＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンの複製、レスキュー、およびパッケージングのために必要である。ＩＴＲ配列は、野生型配列であり得るか、または実質的に同一な配列（以下の定義のように）であり得るか、または例えば、それらが機能的なままである限り、ヌクレオチドの挿入、変異、欠失、または置換によって変化され得る。
【００２５】
本明細書中で使用されるように「ｒＡＡＶベクター」は、任意のＡＡＶ血清型のＩＴＲ核酸配列、またはそれが機能的なままである限り、特定のＡＡＶ血清型野生型ＩＴＲ配列に実質的に同一である核酸配列を含む組換えＡＡＶベクターをいう。選択のヌクレオチド配列は、ＡＡＶ  ＩＴＲ配列間に挿入され、例えば発現コンストラクトは、コード配列および３’末端配列に作動可能に連結される発現調節エレメントを含む。本明細書中で使用されるように用語「ｒＡＡＶＸベクター」は、ＡＡＶＸ血清型のＩＴＲ核酸配列、またはそれらが機能的なままである限り、ＡＡＶＸ血清型の野生型ＩＴＲ配列に実質的に同一である核酸配列を含む組換えＡＡＶベクターをいう。したがって、用語「ｒＡＡＶ５ベクター」または「ｒＡＡＶ２ベクター」は、ＡＡＶ血清型５もしくは２のＩＴＲ核酸配列、またはそれらに実質的に同一な核酸配列をそれぞれ含む、ｒＡＡＶ５もしくはｒＡＡＶ２ベクターを示すために使用される。
【００２６】
「ＡＡＶビリオン」は、例えば野生型ＡＡＶビリオン粒子のような完全なウイルス粒子をいい、これはＡＡＶカプシドタンパク質にパックされる１本鎖ゲノムＤＮＡを含む。１本鎖核酸分子は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかであり、両方の鎖は等しく感染性である。「ｒＡＡＶビリオン」は組換えＡＡＶウイルス粒子、すなわち、感染性であるが複製欠陥である粒子をいう。これはＡＡＶタンパク質の殻から構成され、そしてｒＡＡＶベクターを含む。本発明において、タンパク質の殻はｒＡＡＶベクターとは異なる血清型のものであり得る。したがって本発明のＡＡＶビリオンはタンパク質の殻、すなわち、２０面体のカプシドから構成され得、これは１つのＡＡＶ血清型、例えばＡＡＶ血清型５のカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３）を含み、一方そのＡＡＶ５ビリオンを含むｒＡＡＶベクターは、上記の任意のｒＡＡＶＸベクターであり得、ｒＡＡＶ５ベクターを含む。したがって「ｒＡＡＶ５ビリオン」はＡＡＶ血清型５のカプシドタンパク質を含み、一方例えばｒＡＡＶ２ビリオンはＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質を含み、それによりいずれも本発明の任意のｒＡＡＶＸベクターを含み得る。
【００２７】
「ＡＡＶヘルパー機能」は一般に、ｒＡＡＶ複製、またはｒＡＡＶビリオンもしくはｒＡＡＶベクターにトランス（ｉｎ ｔｒａｎｓ）で供給されるパッケージングのために必要とされる対応するＡＡＶ機能をいう。ＡＡＶヘルパー機能は、ｒＡＡＶベクターにおいて欠損するＡＡＶ機能を相補するが、それらはＡＡＶ  ＩＴＲを欠損する（これはｒＡＡＶベクターによって提供される）。ＡＡＶヘルパー機能はＡＡＶの２つの主要なＯＲＦ、すなわちｒｅｐコード領域およびｃａｐコード領域、または機能的に実質的に同一なそれらの配列を含む。ＲｅｐおよびＣａｐ領域は当該分野において周知であり、例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９９、Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第７３巻（２）：１３０９〜１３１９）または米国特許第５，１３９，９４１号を参照のこと。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶヘルパー構築物において供給され得る。宿主細胞へのヘルパー構築物の導入は、例えば、ｒＡＡＶベクターの導入の前のまたはそれと同時の形質転換または形質導入によって生じ得る。したがって本発明のＡＡＶヘルパー構築物は、それらが、一方でｒＡＡＶビリオンのカプシドタンパク質についての、他方でｒＡＡＶＸベクターの複製およびパッケージングについての、血清型の所望される組合せを生成するように、選択され得る。
【００２８】
「ＡＡＶヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ複製およびパッケージングに必要とされるさらなる機能を提供する。適切なＡＡＶヘルパーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ  １型および２型）、ならびにワクシニアウイルスを包含する。ヘルパーウイルスによって提供されるさらなる機能はまた、本明細書中で参考として援用される、米国特許第６，５３１，４５６号において記載されるように、ベクターを介して宿主細胞に導入され得る。
【００２９】
本明細書において「導入遺伝子」は、細胞に新規に導入された遺伝子、すなわち、細胞において通常存在しない遺伝子として規定される。導入遺伝子は、細胞に対してネイティブである配列、細胞において天然には存在しない配列を含み得、そしてこれは両方の組合せを含み得る。導入遺伝子は、細胞におけるコード配列の発現に適切な調節配列に作動可能に連結され得る１つまたは複数のタンパク質をコードする配列を含み得る。好ましくは、導入遺伝子は宿主細胞のゲノムに取り込まれる。
【００３０】
「形質導入」は、ＡＡＶビリオンによる受容宿主細胞へのＤＮＡ分子の送達をいう。例えば、本発明のｒＡＡＶビリオンによる標的細胞の形質導入は、そのビリオン中に含まれるｒＡＡＶＸベクターを形質導入細胞への移送に導く。「宿主細胞」または「標的細胞」は、ＤＮＡ送達が行われる細胞、例えば、被験体の滑膜細胞をいう。ＡＡＶビリオンは、分裂または非分裂細胞の両方を形質導入し得る。
【００３１】
「被験体」は、任意のメンバーのクラスの哺乳動物を意味し、ヒト、非ヒト霊長類、畜産動物、家畜動物、および実験室動物を含むが、これらに制限されない。
【００３２】
用語「関節内」は、例えば、膝、肘、肩、足首、手首などの関節の内部をいう。したがって、関節内注入は、関節の骨の間における空間への注入である。膝において、「関節内」は、膝蓋骨の背後および周囲の大腿と脛骨との間の空間をいう。
【００３３】
用語「実質的な同一性」は、２つのペプチドまたは２つのヌクレオチド配列が、例えばデフォルトパラメーターを使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴにより、必要に応じてアラインされる場合、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、またはそれ以上（例えば、９９％の配列同一性）を共有することを意味する。ＧＡＰは、２つの配列をそれらの全体の長さにわたってアラインするためにＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのグローバルアラインメントアルゴリズムを使用し、適合の数を最大にし、およびギャップの数を最小にする。一般に、ＧＡＰデフォルトパラメーターが、ギャップ作製ペナルティー＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）およびギャップ伸張ペナルティー＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）を伴って使用される。ヌクレオチドについて、使用されるデフォルトスコアマトリクスは、ｎｗｓｇａｐｄｎａであり、およびタンパク質について、デフォルトスコアマトリクスはＢｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２）。
【００３４】
用語「含む」は、記載される部分、工程、または成分の存在を特定するように解釈されるが、１つまたは複数のさらなる部分、工程、または成分の存在を排除しない。したがって、領域Ｘを含む核酸配列はさらなる領域を含み得、すなわち領域Ｘはより大きな核酸領域内に組込まれ得る。
【００３５】
Ｂ．発明の実施態様
ＡＡＶはエンベロープを持たないＤＮＡウイルスであり、これは複製のためにヘルパーウイルスを必要とする。組換えＡＡＶベクターは、それらがヒトにおいて非病原性であり、免疫学的に不活性であり、そして長期間の遺伝子発現をインビボで可能にするので、他のベクターよりも多くの重要な利点を有する。治療に関連する遺伝子の発現を媒介するこれらの能力は、いくつかの関節炎の実験的モデルにおいて、現在十分に確立される。増大する数のＡＡＶ血清型が同定されているが、これまでのところ全ての研究は血清型２（ＡＡＶ２）を用いて行われた。異なる血清型は異なるビリオン殻タンパク質を有し、その結果それらの指向性が異なる。
【００３６】
本発明者らは、驚くべきことに、異なる血清型のＡＡＶビリオンを、関節炎の関節、特に滑膜への遺伝子のインビボ送達のためにＡＡＶベクターとして使用する場合、それらの形質導入効率がかなり異なることを見出した。レポーター遺伝子のマウス分泌性アルカリホスファターゼ（ｍＳＥＡＰ）またはＥ，ｃｏｌｉ  βガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）をコードする５つの異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１〜ＡＡＶ５）に基づくｒＡＡＶベクターを含む組換えビリオンの形質導入効率が、関節炎の２つの異なる動物モデル（マウスおよびラット）において比較される場合、驚くべきことに、インビボ遺伝子移送は、血清型ＡＡＶ１〜ＡＡＶ４に基づくビリオンを用いるよりも、ＡＡＶ５を用いることにより、より効率的であることが見出された。かくして、本発明者らは滑膜細胞への効率的な遺伝子デリバリーシステムを提供し得た。それゆえ本発明は、リウマチ様滑膜のインビボ遺伝子治療に基づき、関節リウマチ、特にリウマチ様関節の処置のための治療方法を開示する。
【００３７】
本発明の１つの実施態様は、関節炎の関節、特にリウマチ様滑膜に、核酸分子を局所的に送達するための方法を提供することである。特に、提供される方法は、治療的に有効な量において、および治療的に有効な期間、リウマチ様滑膜細胞および組織への、治療用タンパク質をコードする核酸分子の効率的な形質導入を可能にする。本発明の方法は、標的細胞における治療用タンパク質の、改善された持続性の（長期間）高レベルな発現を提供する。本発明の範囲は制限されないが、本発明のｒＡＡＶベクターと組み合わせて、ｒＡＡＶ５の形質導入効率は特に高く、そしてＡＡＶ２ビリオンの形質導入効率はより少ない程度であり、これは効率的なビボ遺伝子送達を可能にする。ＡＡＶ血清型５および２の両方のカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンは本発明において有利に使用され得るが、ＡＡＶ血清型５のカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオン（ｒＡＡＶ５ビリオン）は、このように本発明の方法および組成物における使用に最も好ましい。
【００３８】
本発明の方法は、以下の工程：（ａ）ＡＡＶ血清型５またはＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶビリオン（ｒＡＡＶ）を提供する工程であって、ここでｒＡＡＶビリオンがｒＡＡＶＸベクターを含み、ｒＡＡＶＸベクターが核酸配列に作動可能に連結される発現エレメントを含む、工程；および、（ｂ）ｒＡＡＶビリオンを滑膜細胞と接触させる工程であって、それによってｒＡＡＶＸベクターの形質導入が、形質導入された滑膜細胞における核酸配列の発現を生じる、工程を包含する。好ましくは該方法において、被験体のリウマチ様関節への、ｒＡＡＶビリオンの局所的な投与によって、核酸配列がインビボで滑膜細胞に送達される。好ましくは、ｒＡＡＶビリオンの投与は、関節への注入によって、より好ましくは滑膜区分への注入によってである。あるいは、方法において、ｒＡＡＶビリオンを、滑膜細胞またはエキソビボで滑膜細胞を含有する細胞培養物と接触させ、それによって必要に応じて形質導入細胞を選択する。代替の方法はさらに、被験体のリウマチ様関節に形質導入細胞を投与する工程を包含し、このことにより好ましくは形質導入細胞の投与は関節への注入、好ましくは滑膜区分への注入によってである。好ましくはこれらの方法において、インビボまたはエクスビボで形質導入された滑膜細胞における核酸配列の発現は、関節の関節炎の症状の軽減を生じる。
【００３９】
組換えＡＡＶビリオンは、ｒＡＡＶＸベクターの１つを含み、本明細書中で参考として援用される、Ｐａｎら（Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９９、第７３巻（４）：３４１０〜３４１７）、およびＣｌａｒｋら（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９９、１０：１０３１〜１０３９）において記載されるように、当該分野において公知の方法を使用して生成される。簡潔には、方法は概して、（ａ）宿主細胞へのｒＡＡＶベクターの導入、（ｂ）宿主細胞へのＡＡＶヘルパー構築物の導入であって、ここでヘルパー構築物はｒＡＡＶベクターから欠損するウイルス機能を含み、そして（ｃ）宿主細胞にヘルパーウイルスを導入することを包含する。ｒＡＡＶビリオンへのｒＡＡＶベクターの複製およびパッケージングを達成するために、ｒＡＡＶビリオン複製およびパッケージングについての全ての機能が存在することが必要とされる。宿主細胞への導入は、標準的なウイルス学的技術を使用して行われ得、そして同時または連続的であり得る。最後に宿主細胞は、ｒＡＡＶビリオンを生成するために培養され、そしてＣｓＣｌ勾配のような標準的な技術を使用して精製される（Ｘｉａｏら、１９９６、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：８０９８〜８１０８）。残余のヘルパーウイルス活性は、例えば熱不活性化のような、公知の方法を使用して不活性化され得る。次いで、精製されたｒＡＡＶビリオンは前記方法における使用のために備えられる。  １ｍｌ当たり１０１２を超える高い力価、および高純度（検出可能なヘルパーおよび野生型ウイルスが存在しない）が達成され得る（Ｃｌａｒｋら、前出、およびＦｌｏｔｔｅら、１９９５、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２９〜３７）。
【００４０】
ｒＡＡＶＸベクターはＡＡＶ血清型の１つが逆位である末端反復領域のヌクレオチド配列、またはそれに実質的に同一なヌクレオチド配列、および２つのＩＴＲ間に挿入された（適切な調節エレメントの制御下で）治療用タンパク質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を少なくとも含む。
【００４１】
ＡＡＶ５および他のＡＡＶ血清型の完全なゲノムが配列決定され（Ｃｈｉｏｒｉｎｉら、１９９９、Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  第７３巻、２号、１３０９〜１３１９頁）、そしてヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて利用可能である（アクセス番号ＡＦ０８５７１６）。したがって、ＡＡＶ５のＩＴＲヌクレオチド配列は当業者に容易に利用可能である。これらは、当該分野において公知であるように、クローン化され得るか、または例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって、または標準的な分子生物学技術によって提供されるような、例えばオリゴヌクレオチド合成器を使用して化学的合成により作製され得るかのいずれかであり得る。ＩＴＲは、ＡＡＶウイルスゲノムからクローン化され得るか、またはＡＡＶ  ＩＴＲを含むベクターから切り出され得る。ＩＴＲヌクレオチド配列は、標準的な分子生物学技術を使用して１つまたは複数の治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列のいずれかの末端にて連結され得るか、またはＩＴＲ間の野生型ＡＡＶ配列が所望されるヌクレオチド配列で置換され得るかのいずれかである。
【００４２】
好ましくは、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶのｒｅｐ（複製）またはｃａｐ（カプシド）遺伝子のような、ウイルスタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列を含まない。ｒＡＡＶベクターはさらに、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質（例えば、ｇｆｐ）をコードする遺伝子のようなマーカーもしくはレポーター遺伝子を、または化学的に、酵素学的に、もしくはそうでなければ、当該分野において公知の検出可能なおよび／若しくは選択可能な産物（例えば、ＬａｃＺ、ａｐｈなど）をコードする遺伝子を含み得る。
【００４３】
ｒＡＡＶベクターはさらに、治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されるプロモーター配列を含む。適切なプロモーター配列は、リウマチ様滑膜、例えば血管内膜マクロファージにおいて、ならびに／または線維芽細胞様滑膜細胞および／もしくはこれに制限されないがＴ細胞のようなその他の滑膜細胞において、発現を付与するプロモーターである。適切なプロモーター配列は、例えば、当業者によって容易に決定されるように、ＣＭＶプロモーター（サイトメガロウイルス）、ＩＬ−６遺伝子のプロモーター、またはＳＶ４０プロモーターなどのような、滑膜細胞において発現することが知られる遺伝子のプロモーターである。
【００４４】
適切な３’非翻訳配列はまた、治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。適切な３’非翻訳領域は、ヌクレオチド配列と天然に結合される領域であり得るか、または例えばウシ成長ホルモン３’非翻訳領域（ＢＧＨポリＡ）配列のような、異なる遺伝子に由来し得る。
【００４５】
ＩＴＲ領域間でｒＡＡＶベクターに導入されるＤＮＡ分子の全体の大きさは一般に５キロ塩基（ｋｂ）よりも小さい大きさである。ｒＡＡＶベクターは、２つの治療用タンパク質（例えば相乗的効果を有する治療用タンパク質）をコードするヌクレオチド配列を含むことがまた想定される。これらは、適切なプロモーターおよび適切な３’非翻訳領域をそれぞれ有し得るか、またはこれらはＩＲＥＳ（内部リボソーム介入部位）エレメントによって連結され得、単一プロモーターの制御下に２シストロン性の転写物を提供するかのいずれかである。適切なＩＲＥＳエレメントは、Ｈｓｉｅｈら（１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１４：９１０〜９１７）において記載される。
【００４６】
必要に応じて、シグナルペプチド（例えば、細胞外空間へのペプチドの輸送を標的化するために）、核局在化シグナル、発現エンハンサーなどのような、さらなる核酸配列が、治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。
【００４７】
本明細書中で使用されるように「治療用タンパク質」は、有効量（または投薬量）においてリウマチ様関節に（特に滑膜に）局所的に投与される場合、関節リウマチに対して治療効果を有するタンパク質をいう。適切な治療用タンパク質は、例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１、Ｍａｒｃｈら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：６４１〜６４７）またはＴＮＦαインヒビターのようなサイトカインインヒビター、例えば、インターロイキン−１受容体アンタゴニストＩＬ−Ｒａ（Ｃｏｍｉｎｅｌｌｉら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（９）：６９６２〜６９７１）のようなサイトカイン受容体アンタゴニスト、ＩＬ−１８結合タンパク質（Ｉｍら、２００２、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．２２（３）：３２１〜３２８）のようなサイトカイン結合タンパク質、またはｓＴＮＦα受容体ｐ５５またはｐ７５（Ｃｒｏｘｆｏｒｄら、２０００、Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６４：２７７６〜２７１８）のような可溶性のサイトカイン受容体、または可溶性ＩＬ−１受容体である。また適切なのは、例えば、米国特許第６，２７７，９６９号において、当該分野において公知であるように、ＴＮＦα抗体をコードする配列、および例えば米国特許第６，０４６，３１９号においてそれ自体が当該分野において公知であるＴＮＦαのアンチセンスまたはＲＮＡ干渉配列をコードする配列である。また適切なのは、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−β、またはＶＩＰ（血管活性腸管ペプチド；Ｄｅｌｇａｄｏ、２００３、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２２１〜４）のような抗炎症活性を伴うタンパク質である。さらに、ｄｎ−ＩＫＫ−β（優勢ネガティブＩκＢ−キナーゼ）は、ＮＦ−κＢを阻害する、使用に適切なタンパク質である。適切なタンパク質の列挙が、ＶｅｒｖｏｏｒｄｅｌｄｏｎｋおよびＴａｋ、２００１（前出）において提供される：
【００４８】
【表１】
2007504219.tif 000002
ａＩＬ−ＲＡ＝インターロイキン−Ｉ受容体アンタゴニスト；ＩＬ−ＩｓＲ＝可溶性ＩＬ-Ｉ受容体；ＴＮＦｓＲ＝可溶性腫瘍壊死因子受容体；ｖＩＬ−１０＝ウイルスＩＬ-１０；ＩＦＮ−β＝インターフェロンβ；ＴＧＦ−β＝トランスフォーミング増殖因子β;ｄｎ−ＩＫＫ−β＝ドミナントネガティブＩκＢ−キナーゼβ；ＮＦ−κB＝核因子κＢ；ＦＡＤＤ＝Ｆａｓ関連性死ドメインタンパク質
【００４９】
これらのタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、当業者に容易に利用可能である。配列（ヌクレオチドおよびタンパク質の両方）は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔなどのようなデータベースにおいて見出され得、そして配列を含むクローンは、ほとんどがアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）のような寄託機関から得ることができる。好ましい実施態様において、ヌクレオチド配列はヒト起源であるが、これらはまた他の種に由来し得る。これらはｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ配列であり得る。治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、天然に存在する配列、またはデノボ合成配列、ならびに治療に活性なフラグメント、突然変異型、または修飾されたポリペプチド（「変異体（Ｖａｒｉａｎｔ）」という）をコードするヌクレオチド配列を包含する。変異体は、これらに制限されないが、アミノ酸置換または欠失、ペプチドのデノボ化学合成、または突然変異誘発もしくは遺伝子シャッフリング技術、ハイブリダイゼーション技術のような当該分野において公知の方法を使用して容易に作製され得、そして機能性の保持について試験され得る。治療的ペプチドの変異体は、天然に存在するタンパク質に対して少なくとも、８０、９０、９５または９９％の「実質的な配列同一性」を伴うアミノ酸配列を有し、その治療的有効性、すなわち被験体における関節リウマチの症状を軽減、または根絶する能力を保持するペプチドを包含する。
【００５０】
必要であると見なされる場合、本発明のｒＡＡＶベクターは、治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列に加えて、ｒＡＡＶベクターからまたはそれで形質導入細胞から被験体を治療する事を可能にするフェイル−セーフ機構を提供するタンパク質をコードする、第２のまたはさらなるヌクレオチド配列を含む。このようなヌクレオチドは、しばしば自殺遺伝子といわれ、タンパク質が発現されるトランスジェニック細胞を殺傷し得る毒性物質にプロドラックを変換し得るタンパク質をコードする。このような自殺遺伝子の適切な例として、Ｅ．ｃｏｌｉシトシンジアミナーゼ遺伝子または単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、および水疱瘡ウイルスからのチミジンキナーゼ遺伝子の１つが挙げられ、この場合において、ガンシクロビルは被験体においてＩＬ−１０トランスジェニック細胞を殺傷するためのプロドラッグとして使用され得る（例えば、Ｃｌａｉｒら、１９８７、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３１：８４４〜８４９を参照のこと）。
【００５１】
投与は好ましくは、本明細書中の他の場所に記載されるように、ｒＡＡＶベクターによって生じる。関節リウマチ、特にリウマチ様滑膜に対する「治療効果」は、滑膜組織の炎症の減少といった典型的な症状の減少、ならびに／または関節の軟骨および／もしくは骨の破壊の減少をいう。減少はまた、症状の発症における進行の減速、または症状の完全な消滅を意味し得る。症状、したがってまた症状における減少は、多様な方法、臨床的な実験および日常的な実験室の試験といった、関節リウマチの診断において使用されるのと大体同じ方法を使用して評価され得る。このような方法は、巨視的、および微視的方法の両方、ならびに分子法、Ｘ線、生化学、免疫組織化学などを含む。該方法は、全関節の分析（例えば、Ｘ線）、または抽出された滑膜液もしくは滑膜組織の生検と言ったその部分の分析を包含し得る。リウマチ様滑膜液は、滑膜および関節軟骨と直接的に接触され、高い診断価値を有し、および吸引に容易に利用可能である（Ｔａｋ  Ｐ．Ｐ．、Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ２０００：５５〜６８、前出）。
【００５２】
治療効果を達成するために必要とされる治療上の有効量は、処置される被験体（例えば非ヒト哺乳動物またはヒト）、コードされる治療用タンパク質（プロモーター、取り込み部位などの強度および特異性を含む）に、ならびに関節の関節リウマチの発達段階および重篤度に依存して変化し得る。個体間、関節間、さらに関節内で滑膜炎症の大きな多様性がある（Ｔａｋら、１９９７、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４０：２１７〜２２５）。同様に、治療的に有効な期間（治療効果が検出可能になるまでにかかる時間）は、個体間で、および関節間で変化し得、そして導入遺伝子により異なる。また、処置は有効性のために、後期に反復されなくてはならないかもしれない。当業者は容易に、日常的な試行錯誤によって、および例えば用量−応答曲線を描くことによって、治療的な有効量を容易に決定し得る。少なくとも１０３〜１０５ｒＡＡＶビリオンの、好ましくは少なくとも１０７〜１０８ビリオンの、より好ましくは１０９〜１０１１またはそれ以上のビリオンの投与が、適切な用量である。
【００５３】
好ましくは、ｒＡＡＶベクターは、形質導入細胞のゲノムに安定に取り込まれ、そして長期間（少なくとも４〜８週間、好ましくは少なくとも８〜１２週間、より好ましくは少なくとも６ヶ月間、または生涯）の治療用タンパク質の発現を提供する。
【００５４】
関節炎の関節への局所（全身と対照的に）投与は特に、リウマチ様滑膜、とりわけ滑膜細胞へのｒＡＡＶビリオンの局所的なインビボまたはエクスビボ投与をいう。本明細書中で使用されるインビボ投与は、例えば関節内注入による、被験体の関節へのｒＡＡＶビリオンの直接的投与を言う。エクスビボ投与は、ｒＡＡＶビリオンの単離、培養された細胞への投与がその後に続く、被験体からのリウマチ様細胞の単離をいう。次いで治療用タンパク質を発現する形質導入細胞は、例えば、注入、被験体の関節に戻した細胞の再培養または再輸液によって被験体に投与される。局所的投与は、必要であれば、多くの週または月の後に反復され得る。
【００５５】
さらなる実施態様において、本発明は、リウマチ様滑膜細胞にエクスビボで核酸分子を送達するための方法を提供し、該方法は、（ａ）ＡＡＶ血清型２、またはより好ましくはＡＡＶ血清型５のカプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶビリオン（ｒＡＡＶ）を提供する工程であって、ここでｒＡＡＶビリオンがｒＡＡＶＸベクターを含み、ｒＡＡＶＸベクターが核酸配列に作動可能に連結される発現エレメントを含む、工程；（ｂ）ｒＡＡＶビリオンを滑膜細胞、または滑膜細胞を含む細胞培養物に投与する工程であって、それによって形質導入が形質導入細胞において核酸分子の発現を生じ；（ｃ）必要に応じて、形質導入細胞が選択され；そして（ｄ）形質導入細胞または形質導入細胞を含む細胞を、被験体のリウマチ様関節に投与する工程を包含する。
【００５６】
細胞が由来する関節への再投与前における形質導入細胞の選択または富化は、公知の方法を使用して行われ得る。工程（ｂ）において細胞または細胞培養物が得られる被験体は、形質導入細胞が工程（ｄ）において再投与されるのと同じ被験体である必要はなく、すなわち細胞は自己（同じ被験体から）または非自己（異なる被験体から）であり得る。
【００５７】
ｒＡＡＶビリオンを関節に直接的に投与する代わりに、例えば、注入またはマイクロインジェクションによって、薬学的組成物がインビボで局所的に投与されるように、本発明のｒＡＡＶ５ビリオンはまた、薬学的組成物中に処方され得る。薬学的組成物は、十分なｒＡＡＶビリオン、およびこれらに限定されないが、水、生理食塩水、グリセロール、またはエタノールのようなさらなる薬学的に許容される腑形剤を含む。乳化剤、湿潤剤、緩衝液などのような、さらなる物質が存在し得る。
【００５８】
本発明の１つの実施態様において、本発明のｒＡＡＶビリオンを使用してリウマチ様関節を処置するための方法が提供される。方法は好ましくは、（ａ）関節の関節リウマチの診断を確立する工程；（ｂ）薬学的に許容される腑形剤およびｒＡＡＶビリオンを含む薬学的組成物の治療的に有効な量を使用して、関節のリウマチ様滑膜細胞を形質導入する工程であって、ここでｒＡＡＶビリオンは少なくとも１つの治療用タンパク質（またはペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶＸベクターを含む工程、ならびに（ｃ）必要に応じて一定期間後に工程（ｂ）を反復する工程、を包含する。
【００５９】
処置の方法において、滑膜細胞の形質導入は、インビボまたはエクスビボのいずれかであり得る。エクスビボ形質導入の場合において、形質導入されたおよび（再）投与された細胞は、自己または非自己のいずれかであり得る。
【００６０】
代替の処置において、前記方法は、上記のｒＡＡＶビリオンを使用してエクスビボでリウマチ様滑膜細胞を形質導入する工程、必要に応じて形質導入細胞を選択する工程、被験体のリウマチ様関節に形質導入細胞を投与する工程、および必要に応じて一定期間後に投与を反復する工程を包含する。
【００６１】
さらなる局面において、本発明は、リウマチ様関節の処置のための医薬を製造するための、上述で規定されるようなビリオンの使用に関する。好ましくは、該処置は、薬学的に許容される腑形剤および上述で規定されるようなｒＡＡＶビリオンを含む治療的に有効な量の薬学的組成物を使用して、インビボで関節のリウマチ様滑膜細胞を形質導入する工程、ならびに必要に応じて一定期間後に形質導入を反復する工程を包含する。あるいは、処置は、ｒＡＡＶビリオンを使用してエクスビボでリウマチ様細胞を形質導入する工程、必要に応じて形質導入細胞を選択する工程、被験体のリウマチ様関節に形質導入細胞を投与する工程、および必要に応じて一定期間後に投与を反復する工程を包含する。
【００６２】
本明細書中で使用されるように「滑膜」または「滑膜組織」または「滑膜細胞」は、Ｔａｋ（２０００、滑膜および滑膜液の実験。Ｉｎ：Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ  ＧＳ、Ｐａｎｙａｎｉ  ＧＳ、Ｗｏｌｌｈｅｉｍ  ＦＡ編、Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．５５〜６８）においてさらに記載され、そして本明細書中で参考として援用されるように、滑膜関節の非軟骨性表面を覆う細胞内層をいう。滑膜は血管内層（または滑膜内層）およびサブ滑膜内層（サブ滑膜（ｓｕｂｓｙｎｏｖｉｕｍ））からなり、これは関節包と結合される。血管内層は血管内膜マクロファージ（またはマクロファージ様滑膜細胞またはＡ型滑膜細胞）および線維芽細胞様滑膜細胞（またはＢ型滑膜細胞）を含む。用語「リウマチ様滑膜」、または「リウマチ様滑膜細胞」、または「リウマチ様滑膜組織」は、関節リウマチを患う被験体の関節の炎症性の滑膜をいう。リウマチ様滑膜は、血管内層過形成によって、ならびにサブ滑膜内層における、Ｔ細胞、血漿細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、および樹状細胞の集積によって特徴づけられる。これらの集積される細胞は、リウマチ様滑膜細胞の規定において含まれる。
【００６３】
本発明の別の実施態様において、本発明はＡＡＶ血清型５またはＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンに関し、それによってｒＡＡＶビリオンはｒＡＡＶＸベクターを含み、ここでｒＡＡＶＸベクターは関節リウマチに対して有効な治療用タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結される発現エレメントを含む。より好ましくは、ｒＡＡＶビリオンはｒＡＡＶ５ビリオンであり、ＡＡＶ５カプシドタンパク質を含み、ここでｒＡＡＶＸベクターはｒＡＡＶ５またはｒＡＡＶ２ベクターであり、そのうち、ｒＡＡＶ２ベクターが最も好ましい。関節リウマチに対して有効な治療用タンパク質をコードする核酸配列は好ましくは上記されるようであり、ベクターはさらに、上記のような自殺遺伝子を含み得る。
【００６４】
本発明の別の実施態様において、ｒＡＡＶＸベクターを含有するｒＡＡＶ５ビリオンが提供され、ここでｒＡＡＶＸベクターは関節リウマチに対して有効な治療用タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結される発現調節エレメントを含み、ここでｒＡＡＶ５ビリオンはｒＡＡＶ２ビリオンよりも滑膜細胞への高い形質導入効力を有する。該形質導入効力は好ましくは、少なくとも約２倍の高さであり、より好ましくは少なくとも約２．５倍の高さであり、またはさらに約３倍の高さである。形質導入効力は、インビボまたはインビトロ（培養された滑膜細胞）で、細胞を形質導入し、そして標準的な方法を使用して形質導入を評価することによって試験され得る。形質導入効力は、例えば実施例において示されるように評価され得る。好ましくは形質導入効力を評価する場合に、検出可能なレポーターまたはマーカー遺伝子がｒＡＡＶベクターに存在する。
【００６５】
また想定されるのは、例えば、１つまたは複数のｒＡＡＶＸベクター、ｒＡＡＶビリオン、プロトコール、試薬などを含むキットのような、本発明の方法を行うために必要とされる１つまたは複数の成分を含むキットである。
【００６６】
そうでないと記載されない限り、本発明の実施は、分子生物学、ウイルス学、微生物学、または生化学の標準的な従来の方法を用いる。このような技術は、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹにおいて、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ＵＳＡの第１巻および第２巻において、ならびにＢｒｏｗｎ（１９９８）のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＬａｂＦａｘ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（ＵＫ）の第Ｉ巻および第ＩＩ巻において、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ  ｅｄｉｔｏｒ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編）、ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ  第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｐ．Ｔｉｊｅｓｓｅｎ編）、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第２版、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（ＦｉｅｌｄｓおよびＫｎｉｐｅ編）において記載され、これら全ては本明細書中で参考として援用される。
【００６７】
以下の制限されない実施例は、本発明の方法およびベクターの同定を記載する。
【実施例】
【００６８】
実施例１−組換えＡＡＶビリオンの産生
ｒＡＡＶ１〜ｒＡＡＶ５ビリオンは、基本的に本明細書の表２および図２においてまとめられるような方法に特に参照して、Ｇｒｉｍｍら（２００２；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８：１４６〜１５７）によって記載されるように生成した（本発明者らは、Ｇｒｉｍｍｒａ、２００２、前出における参考文献２１は現在Ｇｒｉｍｍら、２００３、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：８３９〜８５０として刊行されていることを注記する）。ｒＡＡＶビリオンの生成のために、これらのＧｒｉｍｍらの論文において記載されるいわゆる２プラスミド法を使用した。ヘルパーおよび発現プラスミドは、基本的にＧｒｉｍｍら（２００２、２００３、前出）によりこれらの２つの論文において記載されるようであり、それによってヘルパープラスミドは、ビリオンの血清型を決定するカプシドタンパク質を含むウイルス骨格を含む。本発明において使用される特定の発現プラスミドはｐＶＤ１１であり、この中でｌａｃＺ発現カセットはＡＡＶ２  ＩＴＲによって隣接される。
【００６９】
ｐＶＤ１１は、ｐＴＲＵＦ−２から開始して構築し、これはＺｏｌｏｔｕｋｈｉｎら（１９９６、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：４６４６〜４６５４）に記載され、その中にウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を、レポーター遺伝子の発現を増強するために挿入し（Ｘｕら、２００３、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１１；１６２１：２６６〜７１）、その中でＧＦＰレポーター遺伝子を、レポーター遺伝子としてＥ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子によって置換した。例として、ｐＶＤ１１を含むＡＡＶ５ビリオンの生成は以下のようであった：ローラーボトル中で増殖させた２９３細胞を、リン酸カルシウム法（リン酸カルシウムトランスフェクションについて、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１、前出を参照のこと）を使用して、ｐＤＰ５  ＡＡＶヘルパープラスミドおよびプラスミドｐＶＤ１１でトランスフェクトした。細胞は３日後に回収した。細胞を溶解し、ビリオンを、Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら（１９９９、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：９７３〜８５）によって記載されるように、イオジキサノール勾配を使用して細胞溶解物から精製した。イオジキサノールをその後除去し、そしてビリオンをさらにダイアフィルトレーションを使用して濃縮した。Ｇｒｉｍｍら（２００２、前出）において記載されるように、適切な血清決定ヘルパープラスミドを用いて、同じ手順をＡＡＶ−１、−２、−３、および−４ビリオンの生成のために使用した。
【００７０】
実施例２−ラットおよびマウスへのインビボ遺伝子送達
Ａ．ラット
β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子を含むｐＶＤ１１ベクター（または他のｒＡＡＶ１〜ｒＡＡＶ５ベクター、示されず）を含む、ｒＡＡＶ１〜ｒＡＡＶ５ビリオンを、アジュバント免疫化の１２日後に、アジュバント関節炎（ＡＡ）を伴うラットの右足関節に注入した。関節を２週間後に採集し、凍結切片の直接的なインサイチュー（ｉｎ ｓｉｔｕ）染色（図２）、デジタル画像解析による定量（図１）、そしてＲＴ−ＰＣＲにより、β−ガラクトシダーゼ発現について分析した。
【００７１】
ＡＡＶ−β−Ｇａｌベクターを注入した２週間後に、滑膜組織においてβ−ガラクトシダーゼを発現する細胞数を評価した。ｒＡＡＶ５ビリオンを注入された関節炎の関節において、非常に多くの細胞がβ−ガラクトシダーゼを発現し（１１１，４４１  ＩＯＤ／ｍｍ２）、一方ｒＡＡＶ２ビリオンが注入された関節炎の関節においては、わずか３８，２１２  ＩＯＤ／ｍｍ２細胞が計数された（図１）。バックグラウンド染色を上回る発現は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、およびＡＡＶ４に由来するベクターについて何も観察されなかった。導入遺伝子の発現は、半定量ＰＣＲにより関節を分析することによって確認した（データは示していない）。
【００７２】
Ｂ．マウス
マウスコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）において、ｍＳＥＡＰ遺伝子を含むｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、およびｒＡＡＶ５ベクターを含むｒＡＡＶビリオンを、関節炎誘導の３２日後に、左膝関節に局所的に注入した。導入遺伝子の発現を、生体分布について種々の器官において、ＲＴ−ＰＣＲによって分析し、そして血清、および異なる時点にて関節組織により馴化される培養培地において、Ｅｌｉｓａにより分析した。
【００７３】
ＣＩＡマウスにおいて、ｒＡＡＶ５ビリオンはまた、非常に高い形質導入効率を提供した。形質導入発現は、関節注入の１週間後、血清および膝蓋おいて検出可能であり、経時的に増加され、そして少なくとも１ヶ月間横ばい状態であった（それぞれ、５．３１±１．５９および１．９４±１．９７ｎｇ／ｍｌ）。血清型ＡＡＶ１およびＡＡＶ２に基づくベクターについて、検出可能な発現は何も見出されなかった。
【００７４】
結論
驚くべきことに、関節リウマチの実験モデルにおいて、異なるＡＡＶ血清型ビリオンに基づくベクターの形質導入効果は顕著に変化し、完全に無効な状態から非常に高い形質導入効率を有する（ＡＡＶ５ビリオン中に含まれたベクターについて）状態にまでに及んだ。実施例は明らかに、ＡＡＶ５ビリオンでのインビボ遺伝子移送は、他の血清型を用いるよりも非常に効率的であること、およびｒＡＡＶ５ビリオンが関節リウマチのインビボ遺伝子治療について特に適切であることを、実証した。
【００７５】
実施例３−マウスにおけるコラーゲン誘導性の関節炎
材料および方法
組換えＡＡＶ−２／２およびＡＡＶ−２／５ベクター
偽型ｒＡＡＶ（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、またはＡＡＶ５カプシド中にパッケージングされる２型ＩＴＲベースの組換えＡＡＶゲノム）の生成は、以下の改変を伴い、Ａｌｌｅｎ、Ｊ．Ｍら（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ、２０００、１、８８）によって記載されるように一過性のトランスフェクションによって達成した。ヒト胎児腎臓２９３細胞にアデノウイルスヘルパープラスミドｐＸＸ６、ＩＥ  ＣＭＶプロモーターの転写制御下でマウスアルカリホスファターゼの分泌された形態をコードするｐＡＡＶ２ベクタープラスミドｐＧＧ２−ＣＭＶ−ｍｕＳＥＡＰ、ならびにｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現する適切なＡＡＶパッケージングプラスミドをトランスフェクトした。パッケージングプラスミドはｒＡＡＶ２についてｐＡＣＧ２．１、およびｒＡＡＶ−１／２についてｐＬＴ−ＲＣ０２であり、ここでＡＡＶ２  ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ１  ｃａｐ遺伝子（Ｒ．Ｍｕｌｌｉｇａｎからの提供）と融合される。パッケージングプラスミドは、ｒＡＡＶ−２／５の生成のために、２つに分割され（ＡＡＶ２  Ｒｅｐタンパク質をコードするｐＭＴＲｅｐ２、Ｄ．Ｍｉｌｌｅｒからの提供、およびＡＡＶ５  ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質を発現するｐＡＡＶ５ｓｖｏｒｉ、Ｊ．Ｃｈｉｏｒｉｎｉからの提供）、４部分からなるトランスフェクション工程を必要とした。組換えベクターは、二重ＣｓＣｌ２超遠心分離勾配、続く滅菌ＰＢＳに対する徹底的な透析によって精製された。物理的粒子が、標準的なプラスミド範囲に対するドットブロットハイブリダイゼーションによって定量された。力価は、１ｍｌ当たりのウイルスゲノム（ｖｇ／ｍｌ）として表される。ｒＡＡＶ−２／１−ｍＳＥＡＰ、ｒＡＡＶ−２／２−ｍＳＥＡＰ、およびｒＡＡＶ−２／５−ｍＳＥＡＰ力価は、それぞれ、１，６×１０１２、２，９×１０１２、および２，７×１０１１ｖｇ／ｍｌであった。ＣＭＶプロモーターの下でβ−Ｇａｌ導入遺伝子を発現するｒＡＡＶ−２／２および−２／５プラスミドは、ＡＡＶ−２  ＩＴＲにより隣接され、そしてそれぞれ、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−５殻中にカプシドで包まれた。ウイルス粒子は、Ｇｒｉｍｍ、Ｄ．（Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、１９９８、９、２７４５）によって以前に記載されるように、２９３細胞に対する二重トランスフェクションによって生成し、それぞれヨードキシノールヘパリンカラムまたは二重ＣｓＣｌカラムを使用して精製し、そしてＶｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  ＮａｎｔｅｓによってＰＢＳに対して透析した。ｒＡＡＶ力価は、ドットブロットによって決定し、１ｍｌ当たりのベクターゲノムとして発現させた（ｖｇ／ｍｌ）。それらは、ｒＡＡＶ−２／２および−２／５について、それぞれ、１，８×１０１１および３×１０１２ｖｇ／ｍｌであった。
【００７６】
動物研究
雄性ＤＢＡ／１マウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｆｒａｎｃｅ）を、本発明者らの施設において飼育し、そして８〜１０週齢にて使用した。を用いて、０日目に尾部の付け根において１μｇ／μｌのコラーゲン溶液１００μｌを皮内注入することにより、コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）を誘導した。ウシＩＩ型コラーゲン（ｂＣＩＩ）を、使用前に、酢酸５０ｍＭで２ｍｇ／ｍｌに希釈し（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）、そして等容量のフロイント完全アジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｂｅｚｏｎｓ、Ｆｒａｎｃｅ）で乳化した。２１日目に、動物を、等容量のフロイント不完全アジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｂｅｚｏｎｓ、Ｆｒａｎｃｅ）で使用前に乳化された、１００μｌ  ｂＣＩＩ溶液の皮内注入で追加免疫した。関節炎誘導後、肢の厚さを経時的にマイクロメーターＭｉｔｕｔｏｙｏ（Ｓｉｇｍａ）で測定した。２８日目に、マウスを４０μｇ  ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）の腹膜内注入で同期化した。関節炎についての臨床的兆候が出現した場合、マウスをケタミン（３０ｍｇ／Ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／Ｋｇ）溶液の腹膜内注入によって麻酔した。膝上部の皮膚を剃り、そして示された用量のＡＡＶ血清型を５μｌの０．９％ＮａＣｌ中で、３０ゲージ針を備えるＨａｍｉｌｔｏｎシリンジ（ＮＨ−ＢＩＯ、Ｍａｓｓｙ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用することにより、左側膝関節において関節内に注入した。屠殺の日に、全膝関節を回収し、凍結切片におけるβ−ｇａｌ染色のインサイチュー定量のために液体窒素中に凍結した。ｍＳＥＡＰレポーター遺伝子を使用する実験において、ベクター注入の前および後の種々の時間にて血液サンプルを採取し、試験されるまで−２０℃にて保存した。屠殺の日に、左側および右側の膝蓋を回収し、ＲＰＭＩ（２００μｌ）中で２４時間インキュベートした。上清を−２０℃にて保存し、試験するまで膝蓋を液体窒素中に保存した。
【００７７】
β−ガラクトシダーゼ導入遺伝子発現についてのインサイチュー染色
膝蓋を至適な切断温度（ＯＣＴ）化合物中に静置し、ドライアイス上で即座に凍結した。サンプルを低温保持装置上で切断し、組織切片を１，２５％グルタルアルデヒド中で１０分間固定され、ＰＢＳ中で３回リンスし、Ｘ−Ｇａｌ溶液中に３７℃にて一晩静置した。次いで、スライドはＰＢＳ中で３回洗浄し、ＨＥで対比染色した。
【００７８】
血清ｍｕＳｅＡＰ定量化
ベクター投与後、血液サンプルを示した時点で回収した。化学発光検出は、酵素活性の定量化を可能にした。簡潔には、サンプルを５分間２５００ｇにて遠心分離して血清を回収し、内因性アルカリホスファターゼを５分間６５℃にて熱不活性化し、そして製造業者（Ｔｒｏｐｉｘ）の指示に従い、熱耐性ｍｕＳｅＡＰを反応緩衝液およびＣＰＳＤ化学発光基質の添加により測定した。化学発光は、ルミノメーター（Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ）において定量化した。発現レベルは、精製されたヒト胎盤アルカリホスファターゼの標準曲線に従い、血清１ｍｌ当たりのｍｕＳｅＡｐをｎｇで表す。
【００７９】
結果
マウス関節におけるｒＡＡＶ血清型の関節内送達
関節におけるＡＡＶ血清型の形質導入効率を比較するために、本発明者らは、関節炎の発症後、β−ｇａｌまたはｍＳＥＡＰを発現する５×１０８粒子のＡＡＶ−２／１、ＡＡＶ−２／２、およびＡＡＶ−２／５を、ＤＢＡ／１マウスの関節への直接的な注入により、送達した。Ｘ−ｇａｌ染色および免疫組織化学、または関節組織により馴化した培養培地中のｍＳＥＡＰの化学発光検出のために、４週間にて膝蓋を採集した。
【００８０】
ベクター注入の４週間後、ＡＡＶ−２／２およびＡＡＶ−２／５−ＬａｃＺの両方を注入したマウスの関節において有意なＬａｃＺ発現が検出され、ＡＡＶ−２／５で有意に高い形質導入効率が観察された。ＡＡＶ−１／５を注入した膝からの膝蓋凍結切片においても、および対側の未注入の膝においても染色は観察され得なかった。発現のパターンは、以前に報告されたパターンに類似していたが、軽度の染色が滑膜内層組織において観察され、強力な染色が膝蓋上嚢において示された。染色をデジタル画像解析によって定量化したところ、ＡＡＶ−２／５−ＬａｃＺの形質導入効率は、ＡＡＶ−２／２−ＬａｃＺよりも３倍高かった。ｍＳＥＡＰのような分泌性のレポーター遺伝子を使用した場合、局所的な導入遺伝子発現は、非関節炎マウスと比較すると、ＡＡＶ−２／１またはＡＡＶ−２／２でよりも、ＡＡＶ−２／５で２倍高く、関節炎の関節において増加した。したがって、血清型５からのＡＡＶカプシドは、血清型１または２よりも、関節内組織の形質導入のためにより効率的である。
【００８１】
ＡＡＶ−２／５の用量応答
本発明者らは次に、ＡＡＶ−２／５で観察されるより良好な効率が、関節炎の関節へのより高い用量を使用しても当てはまるか否かを決定するために、β−ｇａｌまたはｍＳＥＡＰを発現する漸増用量のＡＡＶ−２／２またはＡＡＶ−２／５（５×１０８、１，５×１０９、および５×１０９粒子）を送達した。Ｘ−ｇａｌ染色および免疫組織化学、または関節組織により馴化された培養培地中での、または血清中でのｍＳＥＡＰの化学発光検出のために、遺伝子送達の４週間後に膝蓋を採集した。漸増用量のＡＡＶ−２／５は、マウスの関節においてＬａｃＺ発現レベルの増加を生じた。ｍＳＥＡＰをレポーター遺伝子として使用した場合、局所的な導入遺伝子分泌は、注入した３倍多くの粒子で、２，６倍高かったが、試験された他のカプシドでは改変しなかった。驚くべきことではないが、分泌された導入遺伝子はまた血清中で検出され得、発現レベルにおける同じ範囲の増加が、漸増用量のウイルスを使用して観察された。試験されたＡＡＶ−２／５−ｍＳＥＡＰベクターの最も高い用量は、ウイルス調製物の力価、およびマウス関節において注入され得る最大の用量（５μｌ）によって制限された。ＡＡＶ−２／５の用量が高いほど（＞５×１０９粒子）、関節炎の関節においてさらにより多くのレベルの導入遺伝子発現を生じるようである。
【００８２】
ＡＡＶ−２／５についての発現の動態
次いで、本発明者らは、ＡＡＶ−２／２と比較してＡＡＶ−２／５の最も高い効率がより遅延した導入遺伝子の発現に起因したのか否かを調査した。したがって、本発明者らは、分泌性のレポーター遺伝子ｍＳＥＡＰを発現するＡＡＶ−２／１、ＡＡＶ−２／２、およびＡＡＶ−２／５の１，５×１０９粒子を、関節炎ＤＢＡ／１マウスの関節に注入し、そして示した時点にて血液サンプルを回収した。ＡＡＶ−２／５−ｍＳＥＡＰ注入された動物において、導入遺伝子発現は、投与後７日間から叙々に増加し、３週間で最大のレベルに達した。対照的に、ＡＡＶ−２／１−、およびＡＡＶ−２／２−ｍＳＥＡＰは、それぞれ、３および４週間にて弱く検出された。第２の実験において、本発明者らは導入遺伝子の発現は、ＡＡＶ−２／５−ｍＳＥＡＰを使用して少なくとも１９週間安定なままであったが、ＡＡＶ−２／１−ｍＳＥＡＰは６週間にわたって導入遺伝子の一過性の発現を与え、そしてＡＡＶ−２／２−ｍＳＥＡＰは検出可能な全身性の導入遺伝子発現を示さなかった。
【００８３】
実施例４−ラットにおけるアジュバント誘導性の関節炎
材料および方法
組換えＡＡＶの構築
全てのｒＡＡＶ構築物は、ＡＡＶ２に由来し、そしてサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動される。組換えＡＡＶは、リン酸カルシウム法により、パッケージングプラスミド（ＡＡＶ２についてｐＤＧ、ならびにＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、およびＡＡＶ５についてそれぞれ、ｐＤＰ１、ｐＤＰ３、ｐＤＰ４、およびｐＤＰ５）ならびにベクタープラスミド（ｐＶＤ１１）での、２９３  ＨＥＫ細胞の同時トランスフェクションによって生成した。パッケージングプラスミドには、全てのトランス作用性エレメント：Ｃａｐ遺伝子、Ｒｅｐ遺伝子、およびアデノウイルスヘルパー遺伝子を含有させた。ベクタープラスミドには、全てのシス作用性エレメント：ＩＴＲ、導入遺伝子、およびＣＭＶプロモーターを含有させた。
【００８４】
細胞は、８５０ｃｍ２ローターボトルにおけるトランスフェクションの４日前に、３×１０４細胞／ｃｍ２の密度にて播種し、３７℃にて、５０ｍｌダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、グルタマックス−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（ＪＲＨ）、６０Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＳ）インビトロゲンと共に増殖させた。トランスフェクションの前に、培地をイスコブ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で置換し、トランスフェクションの１６時間後に、培地を５０ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ／ＦＢＳ／ＰＳで置換した。トランスフェクションの７２時間後、細胞を、１０ｍｌ  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ、ＭｇＣｌ２、０．１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中に採取した。最後に、ベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ）を７５Ｕ／ｍｌの最終濃度で、溶解物中に添加した。粗細胞溶解物をさらに、イオジキサノール勾配で精製した。イオジキサノールの段階勾配は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｑｕｉｃｋ−Ｓｅａｌ  ｔｕｂｅｓ（２５×８９ｍｍ、Ｂｅｃｋｍａｎ）において行った。段階勾配は、チューブにパスツールピペットを置くことによって、負荷した。上部から底部まで：１５ｍｌの粗細胞溶解物、９ｍｌ  １５％イオジキサノール、ＰＢＳ−ＭＫ（ＰＢＳ＋１ｍＭ  ＭｇＣｌ２＋２．５ｍＭ  ＫＣｌ）中の１Ｍ  ＮａＣｌ、６ｍｌ  ＰＢＳ−ＭＫ中の２５％イオジキサノール、５ｍｌ  ＰＢＳ−ＭＫ中の４０％イオジキサノール、５ｍｌ  ６０％純粋なイオジキサノール。その後、チューブを密閉し、６９．０００ｒｐｍ１６℃にて１時間遠心分離した。遠心分離後、勾配からの４０％イオジキサノール段階を抽出した。ウイルス溶液を含有する４０％のイオジキサノールを、ＰＢＳ−ＭＫで１０倍希釈し、ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ装置（ＹＭ−１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて約２ｍｌに濃縮した。１０１１〜１０１２ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍｌに及ぶストックの力価を達成した。
【００８５】
局所的遺伝子移送
病原体非含有Ｌｅｗｉｓラット（１５０〜２００ｇ）を、Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ  Ｉｎｃ．（Ｈｏｒｓｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から得て、本発明者らの中央動物施設において維持した。全てのラットを０日目に０．１ｍｌ精油中の１ｍｇのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７ＲＡ（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｉｏｔ、ＭＩ）で、尾部の付け根にて免疫化した。通常、肢の膨れが１０〜１２日目に観察され、水置換プレチスモメトリーにて毎日測定された。イソフルランで麻酔された動物において、免疫化の１２日後に右側足首関節を注入した。皮膚を、エタノールで調整し、ＬａｃＺについての遺伝子を含むｒＡＡＶ１〜５（ｒＡＡＶ１〜５としてさらに言及される）を、ガラスシリンジにおいて３１ゲージ針を使用し、５０μｌ生理食塩水の総容量中、右足首関節へ前外側に注入した。動物には６．１×１０１０ＧＣで注入した（ｎ＝６／群）。ＬａｃＺ（６．１×１０１０ＧＣ／動物に調節された）を含有するアデノウイルスは、ポジティブコントロールとして作用され、一方生理食塩水はネガティブコントロールとして使用された。ＡＡＶおよび生理食塩水を注入したラットは、ＣＯ２吸入により関節内注入の２週間後に屠殺し、アデノウイルスを注入したラットは、注入の２日後に屠殺した。血清サンプルは大静脈を出血することによって採取した。
【００８６】
異なる時点での導入遺伝子の発現を調査するために、ｒＡＡＶの異なるバッチを使用して第２の実験を行った。動物に１．１４×１０１０ＧＣ  ｒＡＡＶ２またはｒＡＡＶ５の関節内注入し、注入の１、２、３、および４週間後に記載されるように屠殺した（ｎ＝３）。血清サンプルはＡＡＶ注入の前に尾部を出血させることによって、および屠殺の間の大静脈パンクション（ｐｕｎｃｔｉｏｎ）によって全ての群から得た。
【００８７】
導入遺伝子産物の検出
βｇａｌのインサイチュー染色
関節をＥＤＴＡおよび液体窒素中のスナップ凍結を使用して石灰除去した。１０μｍ切片を切断し、ガラススライド上にマウントした。β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）の検出が、Ｘ−ｇａｌ染色によって行われた。簡潔には、組織を０．２５％グルタルアルデヒド／４％パラホルムアルデヒド中、１０分間、４℃にて固定化した。その後、サンプルをＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ  Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、５ｍＭ  Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６、および０．１％トリトン  ｘ−１００を含有する染色領域中で、一晩、３７℃にて染色した。ＰＢＳでの洗浄後、核レッドで切片を対比染色した。β−ｇａｌポジティブ細胞について、デジタル画像解析によって切片を分析した。
【００８８】
デジタル画像解析
各切片内の５つのランダムに選択された領域を、ポジティブシグナルの量をデジタル化するために選択した。これらの画像は、Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）において捕捉し、Ｃｈａｒｇｅｄ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ  ビデオカメラ（Ｓｏｎｙ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して捕捉し、そしてＰＶ１００マルチメディア、１６ビットカラービデオデジタイザーカードでデジタル化した。得られたカラー画像において、ポジティブな染色の面積および平均光学密度（ＭＯＤ）をマクロプログラムによって測定した。ＭＯＤはタンパク質の細胞濃度に比例する。取り込まれた光学密度（ＩＯＤ）は、ポジティブ染色の面積により乗じられたＭＯＤに等しい。
【００８９】
ＬａｃＺのリアルタイムＰＣＲ検出
足首関節（皮膚は除去される）および器官を、液体窒素中でスナップ凍結し、モルタルを使用して粉砕し、そして組織ホモジナイザーを使用して、１ｍｌのＴＲＩｚｏｌ試薬（ＧｉｂｃｏＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中にホモジナイズした。製造業者の指示に従って、全ＲＮＡを水相から単離し、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）をフェノール−クロロホルム相から抽出した。ｇＤＮＡはＱ−ＰＣＲ解析のために保存した。ＲＮＡはＤＥＰＣ−水中に溶解し、そして分光光度計によって定量化した。ｃＤＮＡは、１μｇ  ＲＮＡおよび０．５μｇオリゴ（ｄＴ）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、５×第１ストランド緩衝液、０．１Ｍ  ＤＴＴ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（各１０ｍＭ）、および１μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して合成した。ＲＴ−ＰＣＲについて、１０μｌのｃＤＮＡ溶液を、５０μｌの総容量中２５μｌのＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  ＳｕｐｅｒＭｉｘＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２１５ｍＭのＬａｃＺ１プライマー（フォワード、５’−ＧＣＡ−ＴＣＧ−ＡＧＣ−ＴＧＧ−ＧＴＡ−ＡＴＡ−ＡＧＣ−ＧＴＴ−ＧＧＣ−ＡＡＴ−３’）および２１５ｍＭのＬａｃＺ２プライマー（リバース、５’−ＧＡＣ−ＡＣＣ−ＡＧＡ−ＣＣＡ−ＡＣＴ−ＧＧＴ−ＡＡＴ−ＧＧＴ−ＡＧＣ−ＧＡＣ−３’）を使用して、増幅した。次いで、増幅をサーモサイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ．）において、以下のように行った：９５℃にて３分間、続いて９４℃  １分間、５８℃  ９０秒間、および７２℃  １分間をそれぞれ３５サイクル、続いて７２℃にて１０分間の最終的な伸張相。ＰＣＲ産物は、６２２ｂｐ産物をＵＶで補助して可視化するためにエチジウムブロミドを含有する０．９％アガロースゲル中において、標準的なアガロースゲル電気泳動により分析した。
【００９０】
定量的ＰＣＲによるウイルスゲノムコピーの検出
ゲノムコピー（完全なウイルス粒子）に関してウイルス力価を決定するために、まずＡＡＶサンプルをＰＢＳ中で１０倍に希釈した。続いて、５μｌのこれらの希釈物を二連で、４５μｌの０．２５ｍｇ／ｍｌ  ＤＮＡＳｅＩ、ＰＢＳに添加した。その後、混合物を、２０分間３７℃にてインキュベートし、７５μｌの２．７５ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ、８．６ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ  ｐＨ８．０、８６ｍＭ  ＮａＣｌ、８．６ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．４３％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを添加した。６０分間、３７℃でのインキュベーション後、ウェル当たり１１５μｌの１４μｇ／ｍｌポリＡ、ＳＶ  ＲＮＡ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。サンプルを１０μｌのＭａｇｎｅＳｉｌ  Ｂｌｕｅ懸濁液（Ｐｒｏｍｅｇａ）とともにインキュベートし、ウイルスＤＮＡを、供給者の指示に従ってＭａｇｎａＢｏｔ９６Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して単離した。精製されたウイルスＤＮＡまたは関節および器官から単離されたｇＤＮＡの希釈物は、ＰＣＲミックス（０．５μＭ  ＣＭＶフォワードプロモーター（５’ＡＡＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡ３’）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．５μＭ  ＣＭＶリバースプロモーター（５’ＡＧＧＣＧＡＴＣＴＧＡＣＧＧＴＴＣＡＣＴＡＡ３’）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に添加した。使用されたＤＮＡスタンダードは、ｐＶＤ２３の１０Ｅ＋１〜１０Ｅ＋８コピーの１０倍連続希釈物であった。ＰＣＲ反応は、ＡｂｉプリズムＳＤＳ７０００配列検出系（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。
【００９１】
血清におけるｒＡＡＶに対する中和化抗体の検出
中和化抗体力価は、ＣＯＳ細胞へのＡＡＶの形質導入を阻害する血清抗体の能力を評価することによって分析した。血清の種々の希釈物（１：２００〜１：５２００）は、ｒＡＡＶとともに、３７℃にて１時間、予めインキュベートし、次いで８０％コンフルエント細胞に添加した。その後、細胞培養物を、血清の存在下、２０時間、ＡＡＶとともにインキュベートし、ＬａｃＺ発現を、Ｘ−ｇａｌ染色によって測定した。抗体力価は、ＡＡＶ単独でインキュベートした細胞と比較して、β−ｇａｌ発現の阻害を何ら与えない最も高い希釈によって示した。
【００９２】
ヒトＦＬＳの細胞培養物
小口径の関節鏡検査（２．７ｍｍ関節鏡、Ｓｔｏｒｚ、Ｔｕｔｔｌｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、確立されたＲＡを伴う患者において局所麻酔の下で行った。
【００９３】
得られた生検を、酵素学的に分散させた。簡潔には、滑膜を細分化し、血清非含有ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中、３時間３７℃にて、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＶＩＩＩ型（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートした。その後細胞を徹底的に洗浄し、そして加湿した５％  ＣＯ２大気中、ＤＭＥＭ／１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）中で培養した。細胞を、一晩接着させ、非接着細胞を除去した。接着ＦＬＳを、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で増殖し、８０〜９０％コンフルエンスにて１：３に分割した。ヒトＦＬＳは、３〜１０継代から使用した。
【００９４】
ＦＬＳにおけるインビトロ遺伝子形質導入
ＦＬＳを、８×１０３／ウェルにて、９６ウェルディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ）上にプレートした。１０時間のインキュベーション後、ＬａｃＺまたは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）についての遺伝子を含む、８×１０７ＧＣのｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ５を、１０％を含有する培地中、各ウェルに添加した。細胞を４８時間培養し、そしてマーカー遺伝子発現を酵素的染色または蛍光顕微鏡によって評価した。３つの独立したＦＬＳ細胞株をこれらの実験について使用した。
【００９５】
結果
５つのＡＡＶ血清型の比較効率
関節におけるＡＡＶ血清型の形質導入効率を比較するために、ｒＡＡＶ１〜ｒＡＡＶ５を、アジュバント免疫化１２日後にラットの右足首関節において注入した。関節は、注入の２週間後に回収し、β−ｇａｌ発現についてインサイチューで染色した。導入遺伝子発現は、デジタル画像解析によって定量化した。最も豊富なβ−Ｇａｌ発現は、ｒＡＡＶ５を注入した関節炎の関節において観察された。ＡＡＶ形質導入は、アデノウイルスに比較して滑膜組織へのより優れた浸透を顕著に生じ、まさに内層におけるβ−ｇａｌ発現を示した。対側の未注入のおよびコントロールの関節において、染色は何ら観察され得なかった。デジタル画像解析を使用して、滑膜組織においてβ−Ｇａｌを発現する最も高い数の細胞がＡＡＶ５を注入した関節炎の関節において検出され、ＡＡＶ２を使用して非常に低い発現が続いた（それぞれ、１１１４４１および３８２１２  ＩＯＤ／ｍｍ２）。バックグラウンド染色を上回る発現は、血清型１、３、および４について何ら観察されなかった。
【００９６】
導入遺伝子発現の持続時間
経時的な導入遺伝子発現を研究するために、ｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ５をラットの関節炎の関節において注入し、ベクターを注入した１、２、３、および４週間後に屠殺した。両方の血清型は、４週間までの有意な発現を実証し、これは注入の１週間後に既に存在した。しかし、ｒＡＡＶ５は、デジタル画像解析によって定量化されるように、初期および全ての時点で、より高いβ−ｇａｌ発現を示した（図４）。注入された関節を、スナップ凍結し、低温切開片をβ−ｇａｌ活性についてインサイチューで染色した。切片当たりの青色染色の量をデジタル画像解析によって解析し、累積ＩＯＤ／ｍｍ２として表した（ＩＯＤ：取り込まれた光学密度）。これは、Ｑ−ＰＣＲ解析によって確認された。ｒＡＡＶ２を注入した関節と比較して、ｒＡＡＶ５注入後の全ての時点において、より高量のゲノムコピーが検出された。
【００９７】
【表２】
2007504219.tif 000003
【００９８】
ＡＡＶ２またはＡＡＶ５の関節内注入後の注入された関節におけるウイルスゲノムコピーの検出。ゲノムＤＮＡは、ＡＡＶ注入の１、２、３、および４週間後、粉砕された足首関節から単離した。ｑＰＣＲはＣＭＶプロモーターに特異的なプライマーを用いて行った。値は、ＧＣ／μｇ ｇＤＮＡ±標準偏差として表す。
【００９９】
関節におけるＬａｃＺ転写を検出するために、特異的なプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。本発明者らは、全ての時点で、ｒＡＡＶ５を注入した関節における導入遺伝子の転写を見出し、強度において最小の差異を示したが、ＬａｃＺ  ｍＲＮＡは、ｒＡＡＶ２を注入した関節における本発明者らのアッセイの検出限界を下回った。
【０１００】
ｒＡＡＶ抗体の形成
ｒＡＡＶカプシドタンパク質に対する潜在的な体液性免疫応答を検出するために、局所的な関節内注入後、本発明者らは方法の節において記載したように特定のアッセイを行った。ｒＡＡＶ注入の前および後の中和化抗体の存在をｒＡＡＶ２および５を注入したラットの血清において測定した。結果を図５において示す。関節炎ラットは１．１４×１０１０ＧＣ  ｒＡＡＶ２（Ａ）またはｒＡＡＶ５（Ｂ）を、右側足首関節に注入した。血清サンプルを、注入の１、２、３、および４週間後に得た。力価は、ｒＡＡＶＬａｃＺ単独とともにインキュベートしたウェルと比較して、Ｘ−ｇａｌポジティブ細胞の阻害を何ら示さない最も高い希釈として算定した。
【０１０１】
注入の前において、抗体は任意のサンプルで何ら見出されなかった。注入の１週間後、中和化抗体が検出され、２週間後にピークとなり、そして３週間後ゆっくりと減少した。この傾向は両方の血清型について見られたが、バックグラウンドを僅かに上回るレベルのみを示したｒＡＡＶ５よりも、ｒＡＡＶ２注入は明らかに高い中和化抗体力価を血清中に誘導する。重要なことに、２つの血清型について、交差反応性は何ら観察されなかった。
【０１０２】
実施例５−ｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ５でのヒトＦＬＳの形質導入
ｒＡＡＶ２および５はラット滑膜をトランスフェクトし得ることが示されたので、本発明者らは、ＲＡを伴う患者から得られた一次ヒトＦＬＳを形質導入する、両方の血清型の可能性を調べたいと考えた。この目的のために、本発明者らは、ＬａｃＺまたはＧＦＰのいずれかを発現するｒＡＡＶベクターを使用した。導入遺伝子の発現は、酵素的β−ｇａｌ染色または蛍光顕微鏡によって４８時間後に可視化された。両方の血清型がヒトＦＬＳを形質導入し得、ｒＡＡＶ５は全ての実験においてより高い発現を示した。図６において代表的な実験が示される。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】ＬａｃＺ遺伝子を発現するｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ｒＡＡＶ４、ｒＡＡＶ５、コントロールベクター、およびアデノウイルスで形質導入され処置されたラット関節の凍結切片の直接的なインサイチュー染色のＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）染色（定量的なデジタル画像解析の結果）。
【図２】ｒＡＡＶ１〜ｒＡＡＶ５を注入されたラット関節の凍結切片のＸ−ｇａｌ（青色）の直接的なインサイチュー染色。
【図３】ＣＭＶプロモーターによって駆動されるＥ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＺコード配列を含む発現カセットがＡＡＶ２  ＩＴＲ配列に隣接しているｒＡＡＶ２ベクターを含有する、プラスミドｐＶＤ１１の物理的地図。
【図４】デジタル画像解析によって定量化される、ｒＡＡＶ２および５の関節内注射の１、２、３、および４週間後のラット滑膜組織におけるβ−ｇａｌ発現。
【図５】ｒＡＡＶ２またはｒＡＡＶ５の関節内注入後の血清における中和化抗体の発達。
【図６】ｒＡＡＶ５はインビトロでヒト線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）への遺伝子移送を媒介する。ＲＡ患者からの滑膜生検から単離されたヒトＦＬＳがＡＡＶ５．ＧＦＰで形質導入された。トランスフェクションの４８時間後、細胞は蛍光顕微鏡に固定化された。Ａ：蛍光細胞、Ｂ：位相差顕微鏡写真。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図２】
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【図６】
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【国際調査報告】
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