(57)【要約】【課題】３次元的な環境下で生体組織から線維芽細胞を単離する方法及びそれに適したキットの提供を目的とする。【解決手段】生体組織をコラーゲンゲル内に包埋するステップと、前記生体組織から線維芽細胞を前記コラーゲンゲル内に遊走させるステップと、前記線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを回収するステップと、前記回収した線維芽細胞を含むコラーゲンゲルをコラゲナーゼで処理するステップと、を有することを特徴とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体組織をコラーゲンゲル内に包埋するステップと、
前記生体組織から線維芽細胞を前記コラーゲンゲル内に遊走させるステップと、
前記線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを回収するステップと、
前記回収した線維芽細胞を含むコラーゲンゲルをコラゲナーゼで処理するステップと、を有することを特徴とする生体組織から線維芽細胞を単離する方法。
【請求項２】
前記生体組織をコラーゲンゲル内に包埋するステップは、生体組織をメッシュ容器に入れてコラーゲンゲル内に包埋することを特徴とする請求項１記載の生体組織から線維芽細胞を単離する方法。
【請求項３】
前記請求項２記載の線維芽細胞を単離する方法に用いるキットであって、
生体組織を収容するメッシュ容器と、前記メッシュ容器に生体組織を収容した状態で、コラーゲンゲル内に包埋及び培養するための培養容器とを備えたことを特徴とする線維芽細胞の３次元単離培養キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織から線維芽細胞を単離回収する方法及びそれに適したキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの増殖、浸潤・転移や薬剤耐性に線維芽細胞が深い関わりを有していることが知られている。
近年、がんの治療には、がん細胞そのものがターゲットであり、がん細胞を取り巻く環境（がん微小環境）を連関精査することが重要となっている。
このがん微小環境の構築には線維芽細胞は不可欠であり、この線維芽細胞の機能を評価するには生体組織中の線維芽細胞の性質、特性が喪失しないようにしつつ、高純度に単離回収できることが必要となる。
これまでに提案されている線維芽細胞の単離方法には次のようなものがある。
非特許文献１には培養皿に培地を滴下し、その中に組織片を入れ、その上に滅菌処理したカバーガラスをのせ、次に培地を静かに加える。
毎日培地を交換し、組織周縁部から線維芽細胞が遊走してきたら、カバーガラスと組織片を取り除き、さらに培養するものである。
このような単離方法は、カバーガラスの下にある組織片から周縁部に遊走してきた線維芽細胞を培養するものであって、２次元的な培養になっている。
また、非特許文献２には組織片を酵素処理した後に、遠心分離し培養皿で単層培養する方法が開示されている。
しかし、このような２次元的な培養にあっては、生体組織中に有していた線維芽細胞の性質、特性がそのまま維持されているか否かの課題が残されていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】MF-start 初代細胞スターティング培地（Code:TMMFS-001）取扱説明書、東洋紡績株式会社  ライフサイエンス事業部
【非特許文献２】Higuchi Y, Kojima M, Ishii G, Aoyagi K, Sasaki H, Ochiai A.PLoS One. 2015 Jun 5;10(6):e0129241. doi: 10.1371/journal.pone.0129241. eCollection 2015.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、３次元的な環境下で生体組織から線維芽細胞を単離する方法及びそれに適したキットの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明に係る生体組織から線維芽細胞を単離する方法は、生体組織をコラーゲンゲル内に包埋するステップと、前記生体組織から線維芽細胞を前記コラーゲンゲル内に遊走させるステップと、前記線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを回収するステップと、前記回収した線維芽細胞を含むコラーゲンゲルをコラゲナーゼで処理するステップと、を有することを特徴とする。
このように生体組織をコラーゲンゲル内に包埋することで、この生体組織が３次元的環境下に置かれ、周囲のコラーゲンゲル内に線維芽細胞が遊走することになる。
【０００６】
本発明において、線維芽細胞をコラーゲンゲル内に遊走培養した後に、生体組織をコラーゲンゲル内から取り出すことになる。
この生体組織を除去する方法に制限はないが、容易に除去できる方法として、前記生体組織をコラーゲンゲル内に包埋するステップは、生体組織をメッシュ容器に入れてコラーゲンゲル内に包埋する方法が例として挙げられる。
生体組織をメッシュ容器に入れてコラーゲンゲル内に包埋することで、線維芽細胞をコラーゲンゲル内に遊走させた後にメッシュ容器を取り出すだけで、この生体組織をコラーゲンゲル内から除去することができる。
よって、本発明においてメッシュ容器とは線維芽細胞は通過遊走できるが、生体組織はそのまま保持できるものをいう。
【０００７】
本発明において、線維芽細胞の３次元単離培養キットは、前記請求項２記載の線維芽細胞を単離する方法に用いるキットであって、生体組織を収容するメッシュ容器と、前記メッシュ容器に生体組織を収容した状態で、コラーゲンゲル内に包埋及び培養するための培養容器とを備えたことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に係る線維芽細胞の単離方法を用いると、２次元培養を経ることなく３次元環境下で患者由来の線維芽細胞を単離することができ、生体組織中に有していた線維芽細胞の性質、特性等がそのまま維持されている。
これにより、例えばがん細胞と線維芽細胞の相互作用の解析に用いることができる。
例えば、がん微小環境における線維芽細胞の役割の解明、がんの進展や治療抵抗性機構の解明、がん関連線維芽細胞を標的とした治療薬の開発等に貢献できることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】（ａ）〜（ｄ）に本発明に係る線維芽細胞の単離方法の流れを示す。
【図２】本発明に係る組織線維芽細胞単離用チャンバー［Isolating Chamber for Tissue Fiboblasts(iCTF)］を用いた線維芽細胞の単離方法の流れを（ａ）〜（ｆ）に示す。
【図３】本発明に係る線維芽細胞の単離方法と従来のカバーガラス（カバーグラス）を用いた単離方法の比較結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明に係る生体組織から線維芽細胞を単離する方法の流れを図１に示す。
また、図２は本発明に係るキットとして組織線維芽細胞単離用チャンバー［Isolating Chamber for Tissue Fibroblasts(iCTF)と称する。］を用いた単離ステップの流れを示す。
本発明に係る線維芽細胞の単離方法は図１に示すように組織片をコラーゲン内に包埋する（ａ）。
この場合に培養容器（ディッシュ）にコラーゲン溶液を入れてゲル化した後に、そのゲルの上に組織片を静置し、さらにコラーゲン溶液を加えてゲル化することで組織片をコラーゲンゲル内に包埋することができる。
また、この場合に図２に示すようにメッシュ容器を用いると、このメッシュ容器に組織片を収容することで洗浄しやすくなり、そのまま培養容器内でコラーゲンゲル内に包埋することもできる［図２（ａ），（ｂ）］。
図１（ｂ），図２（ｃ）に示すように培地を加えて培養し、線維芽細胞のコラーゲンゲル内への遊走・拡散がみとめられると、図１（ｃ），図２（ｄ）に示すように組織片を除去し、線維芽細胞を単離培養する。
この場合に、図２（ｄ）に示すようにメッシュ容器（チャンバー）を用いると、メッシュ容器を取り出すことで組織片を除去することができる。
メッシュ容器は、例えばナイロンメッシュ材等で製作することができる。
この場合に、メッシュサイズは１０〜１００μｍ程度、好ましくは３０〜８０μｍの範囲が好ましい。
次に、図１（ｄ），図２（ｆ）に示すようにコラーゲン分解酵素（コラゲナーゼ）を加え、コラーゲンゲルを分解することで線維芽細胞を単離することができる。
また、単離した線維芽細胞を培養、増殖することもできる。
＜実施例１＞
【００１１】
次に、本発明に係る単離方法を従来のカバーガラスを用いた２次元培養法と比較したので説明する。
本発明に係る方法は、次のステップにて実施した。
１．消化器外科の手術材料を医師ががん部と非がん部に分ける
２．各組織を培養皿内で数ミリ各に細分化
３．ディッシュに０．２％Ｉ型コラーゲン溶液を加えて、３７℃で３０分間放置（ゲル化）
４．組織片をゲル上に静置し、Ｉ型コラーゲン溶液を加えて、３７℃で３０分間放置（ゲル化）
５．１０％血清含むダルベッコ培地を加えて培養
６．線維芽細胞が遊走・増殖した時点で、組織片を除去し、さらに培養
７．線維芽細胞／ゲルをコラーゲン分解酵素で３７℃、１時間処理
８．細胞を洗浄して細胞を継代培養・保存
なお、コラーゲンとしては、Cellmatrix TypeI-A（新田ゼラチン株式会社製）を用いた。
また、培養皿に培地と組織片を入れ、組織片の上にカバーガラスをのせ培養した従来の方法と比較した。
その結果を図３に示す。
因子  ＭＭＰ−２［Ｌ：潜在型，Ａ：活性型］及びＭＭＰ−９の発現を比較した結果も含めて示す。
この結果、本発明に係る方法を用いると、従来法に比較して高純度に線維芽細胞を単離回収でき、回収された線維芽細胞の機能が保持されていることが確認できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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