(57)【要約】  ＮＳ患者において天然に生産されるアルブミンよりも半減期の長い薬剤であって、第二のポリペプチドと結合したアルブミン様の第一のポリペプチドを含んでなり、第二のポリペプチドが、アルブミン様の第一のポリペプチドと結合しているときは治療上不活性であり、かつ、この薬剤が２つのアルブミン分子からなる場合には、それらが１以上のシステイン−システインジスルフィド架橋のみによる結合以外の手段により互いに共有結合している、薬剤。
2007527369.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネフローゼ症候群患者において天然に生産されるアルブミンよりも半減期の長い薬剤であって、第二のポリペプチドと結合したアルブミン様の第一のポリペプチドを含んでなり、第二のポリペプチドが、アルブミン様の第一のポリペプチドと結合しているときは治療上不活性であり、かつ、この薬剤が２つのアルブミン分子からなる場合には、それらが１以上のシステイン−システインジスルフィド架橋のみによる結合以外の手段により互いに共有結合している、薬剤。
【請求項２】
医薬上許容される担体または希釈剤と、ネフローゼ症候群患者において天然に生産されるアルブミンよりも半減期の長い薬剤とを含んでなる医薬組成物であって、該薬剤が第二のポリペプチドと結合したアルブミン様の第一のポリペプチドを含んでなり、第二のポリペプチドが、アルブミン様の第一のポリペプチドと結合しているときは治療上不活性であり、かつ、この薬剤がアルブミン様ポリペプチドの二量体である場合には、医薬組成物中に存在するアルブミン様の第一のポリペプチドの３０％を超えるものが第二のポリペプチドと結合している、医薬組成物。
【請求項３】
前記薬剤が少なくとも８０ｋＤａの大きさを有する、請求項１または２に記載の薬剤または組成物。
【請求項４】
前記薬剤が約１３０〜１３５ｋＤａの大きさを有する、請求項３に記載の薬剤または組成物。
【請求項５】
前記第二のポリペプチドがアルブミン様ポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の薬剤または組成物。
【請求項６】
アルブミン様の第一のポリペプチドがペプチド結合を介して第二のポリペプチドと結合している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の薬剤または組成物。
【請求項７】
アルブミンと特異的に結合することができるアルブミン結合領域を含んでなり、かつ、（ａ）１４〜２００ｋＤａの大きさを有するか、または（ｂ）第二のポリペプチドと特異的に結合することができる第二の結合部位を有する、アルブミンリガンド。
【請求項８】
アルブミンと特異的に結合する領域および／または増量用結合パートナーと特異的に結合することができる第二の結合部位が、抗体またはＦａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖもしくはｄＡｂなどのそのフラグメントである、請求項７に記載のアルブミンリガンド。
【請求項９】
抗体がＩｇＧである、請求項８に記載のアルブミンリガンド。
【請求項１０】
アルブミン結合領域と結合した第二のポリペプチドをさらに含んでなる、請求項７〜９のいずれか一項に記載のアルブミンリガンド。
【請求項１１】
前記薬剤またはアルブミンリガンドが融合タンパク質である、請求項６または１０に記載の薬剤、組成物またはアルブミンリガンド。
【請求項１２】
アルブミン様の第一のポリペプチドまたはアルブミン結合領域と第二のポリペプチドとの間の結合がペプチド結合ではない、請求項１〜５または７〜１０のいずれか一項に記載の薬剤、組成物またはアルブミンリガンド。
【請求項１３】
（ａ）請求項１１で定義された融合タンパク質をコードする配列、または
（ｂ）非天然エピトープまたは第二のポリペプチド配列を相同組換えによりアルブミン遺伝子中に導入するのに好適な配列
から選択される配列を含んでなる、ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１１で定義された融合タンパク質をコードする配列を含んでなり、このコード配列と作動可能なように連結された調節領域をさらに含んでなる、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１３または１４で定義されたポリヌクレオチドを含んでなる、ベクター。
【請求項１６】
請求項１３もしくは１４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１５に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１１で定義された薬剤またはアルブミンリガンドを製造する方法であって、
請求項１６で定義された細胞を増殖させる工程、および該細胞によって生産された薬剤を回収する工程を含んでなる、方法。
【請求項１８】
細胞を増殖させる工程が該細胞を培養培地中で培養することを含み、薬剤を回収する工程が該細胞または該培地から薬剤を単離することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ネフローゼ症候群患者において天然に生産されるアルブミンよりも半減期の長い薬剤を製造する方法であって、薬剤が第二のポリペプチドと結合したアルブミン様の第一のポリペプチドを含んでなり、該第二のポリペプチドが治療上不活性であり、
（ａ）第一の成分としてアルブミン様の第一のポリペプチドを準備する工程、
（ｂ）第二の成分として第二のポリペプチドを準備する工程、および
（ｃ）薬剤を形成させるのに好適な条件下で第一の成分を第二の成分と接触させる工程
を含んでなる、方法。
【請求項２０】
アルブミンと結合してネフローゼ症候群患者において天然に生産されるアルブミンよりも半減期の長い分子を産生することができるアルブミンリガンドを製造する方法であって、該アルブミンリガンドが第二のポリペプチドと結合したアルブミン結合領域を含んでなり、該第二のポリペプチドが治療上不活性であり、
（ａ）第一の成分としてアルブミン結合領域を含んでなる分子を準備する工程、
（ｂ）第二の成分として第二のポリペプチドを準備する工程、および
（ｃ）アルブミンリガンドを形成させるのに好適な条件下で第一の成分を第二の成分と接触させる工程
を含んでなる、方法。
【請求項２１】
請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法によって薬剤またはアルブミンリガンドを製造すること、およびその薬剤またはアルブミンリガンドと医薬上許容される担体または希釈剤とを配合することを含んでなる、組成物の製造方法。
【請求項２２】
ヒトまたは動物体の治療または診断による処置の方法に用いるための、請求項１〜１１のいずれか一項で定義された薬剤、組成物もしくはアルブミンリガンド、もしくは請求項１７〜２１のいずれか一項の方法によって得られる薬剤、組成物もしくはアルブミンリガンド、または請求項１３もしくは１４に記載のポリヌクレオチド、請求項１５に記載のベクター、もしくは請求項１６に記載の細胞。
【請求項２３】
腎疾患またはそれに関連する症状の処置用薬品の製造における、第二のポリペプチドと結合したアルブミン様の第一のポリペプチドを含んでなる薬剤（この第二のポリペプチドは、アルブミン様の第一のポリペプチドと結合しているときは治療上不活性である）、または請求項７〜１１のいずれか一項で定義されたアルブミンリガンド、もしくは請求項１７、１８、２０もしくは２１のいずれか一項の方法によって得られるアルブミンリガンド、該薬剤もしくは該アルブミンリガンドをコードするポリヌクレオチド、もしくは非天然エピトープもしくは第二のポリペプチドである増量用結合パートナーを相同組換えによりアルブミン遺伝子中に導入するのに好適な配列を含んでなるポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含んでなるベクター、または該ポリヌクレオチドもしくは該ベクターを含んでなる細胞の使用。
【請求項２４】
腎疾患またはそれに関連する症状を有する患者を処置する方法であって、第二のポリペプチドと結合したアルブミン様の第一のポリペプチドを含んでなる薬剤（この第二のポリペプチドは、アルブミン様の第一のポリペプチドと結合しているときは治療上不活性である）、または請求項７〜１１のいずれか一項で定義されたアルブミンリガンド、もしくは請求項１７、１８、２０もしくは２１のいずれか一項の方法によって得られるアルブミンリガンド、該薬剤もしくは該アルブミンリガンドをコードするポリヌクレオチド、もしくは非天然エピトープもしくは第二のポリペプチドである増量用結合パートナーを相同組換えによりアルブミン遺伝子中に導入するのに好適な配列を含んでなるポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含んでなるベクター、または該ポリヌクレオチドもしくは該ベクターを含んでなる細胞を、医薬上有効な量および濃度で患者に投与することを含んでなる、方法。
【請求項２５】
前記薬剤が請求項１〜６、１１もしくは１２のいずれか一項で定義された薬剤、または請求項１７〜１９もしくは２１のいずれか一項に記載の方法によって得られる薬剤であるか、または前記ポリヌクレオチドが請求項１３または１４に記載のポリヌクレオチドであるか、または前記ベクターが請求項１５に記載のベクターであるか、または前記細胞が請求項１６に記載の細胞である、請求項２３または２４に記載の使用または方法。
【請求項２６】
腎疾患がネフローゼ症候群または尿毒症である、請求項２４、２５または２６に記載の使用または方法。
【請求項２７】
（ａ）第一の成分としての、非天然エピトープを含んでなる修飾アルブミン、および
（ｂ）第二の成分としての、前記修飾アルブミンの非天然リガンドと特異的に結合するアルブミンリガンド
を含んでなる、系。
【請求項２８】
第一および／または第二の成分が、医薬上許容される担体または希釈剤とともに配合された組成物の形態で提供される、請求項２７に記載の系。
【請求項２９】
非天然エピトープがアルブミン分子のＣ末端またはＮ末端延長部である、請求項２７または２８に記載の系。
【請求項３０】
ヒトまたは動物体の治療または診断による処置方法に用いるための、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の系。
【請求項３１】
腎疾患またはそれに関連する症状の処置用薬品の製造における、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の系の使用。
【請求項３２】
腎疾患またはそれに関連する症状を有する患者を処置する方法であって、請求項２７〜２９のいずれか一項で定義された系の第一および第二の成分を患者に投与することを含んでなり、該第一および第二の成分の投与が同時、個別または逐次である、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、腎疾患および関連症状の処置のための薬剤、その薬剤を製造するための方法および手段、ならびにその薬剤の腎疾患および関連症状の処置における使用に関する。より詳しくは、本発明は、天然に生産されるアルブミンよりもネフローゼ症候群患者の血液からの排泄速度が遅い修飾アルブミンに関する。
【０００２】
ネフローゼは、低アルブミン血症、高コレステロール血症および浮腫を特徴とする腎臓の疾患である。ネフローゼ症候群（ＮＳ）は糸球体濾過系の著しい漏出を特徴とし、血漿タンパク質の大きな損失をもたらす(Peters, 1996, All About Albumin: Biochemistry, Genetics and Medical Applications, Academic Press, Inc., San Diego, California)。
【０００３】
正常な糸球体バリアは電荷選択特性とサイズ選択特性の組合せによりアルブミン尿（尿中にアルブミンが存在）を防ぐこと、また、検討したネフローゼ患者における観察可能なレベルのタンパク尿を説明するには、これら両特性の欠陥が必要であることが示されている(Blouch et al, 1997, Am J. Physiol., 273 (3 Pt 2): P430-437)。７８ｋＤａより小さいタンパク質はＮＳ患者のタンパク尿に特に影響されやすい(Peters, 1996, 前掲)。
【０００４】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は一般に約６６ｋＤａの大きさである。ＮＳ患者では、アルブミンの日々の損失は一般に約１０ｍｇから１〜８ｇに上昇するが、１７ｇといった高い値になる場合もある(Peters, 1996,前掲)。ＮＳにおける偶発的所見は、冷凍保存した尿サンプルにおける高い割合のアルブミンＳ−Ｓ結合二量体である(Birtwhistle and Hardwicke, 1985, Clin. Chim. Acta, 151, 41-48)。このアルブミンの損失に腎尿細管内の高い異化作用が加わり(Kaysen and Bander, 1990, Am. J. Nephrol., 10 (Suppl. 1), 36-42)、その結果、血漿中のアルブミンの半減期は１９日から約４日に短縮される(Jensen et al, 1967, Clin. Sci., 33, 445-457)。
【０００５】
低い血清アルブミンレベルは、血中脂質含量の上昇につながる可能性がある。低アルブミン血症は血清リポタンパク質（ａ）レベルの上昇における重要な誘因であり、これは特にＮＳ患者においてアテローム性動脈硬化心血管疾患を誘発し得ることが示されている(Yang et al, 1997, Am. J. Kidney Dis., 30(4): 507-513)。高脂血症はＮＳの特徴であり、アルブミンの損失量と並行しているので、リポタンパク質リパーゼ作用からの長鎖脂肪酸のアクセプターとしてのアルブミンの不足は、高脂血症においてある役割を果たしている可能性があることが示唆されている(Peters, 1996, 前掲)。
【０００６】
一般に３０〜５０％の患者がアルブミン合成の上昇（通常、１３〜１４ｇ／日の標準速度から３０〜４０％）という応答を示すが、２７ｇ／日という高い上昇を示す場合もある  (Peters, 1996, 前掲)。アミノ酸供給に対するアルブミン合成の依存性が維持されていることから、ＮＳの処置として高タンパク質摂取が示唆された(Peters, 1996, 前掲)。逆に、ＮＳの処置において低タンパクの食事も考えられており(Palmer, 1993, Am J Med Sci, 306(1): 53-67; Kaysen, 1998, Miner. Electrolyte Metab., 24: 55-63)、最近では、ネフローゼ患者におけるタンパク尿の軽減および血清アルブミンレベルの上昇が示されている(Giordano et al, 2001, Kidney Int., 60(1): 235-242)。
【０００７】
ＮＳに関して他の処置も提案されている。アルブミン注入は重篤なネフローゼ患者で血漿量を高めることが示されているが、その作用は短期的なものであり、アルブミンは急速に腎排泄される(Kuhn et al, 1998, Kidney Int. Suppl., 64: S50-53)。一方、アルブミンとループ利尿薬であるフロセミドを同時投与すると、ネフローゼ性の浮腫の処置に、より有効となることが示されている(Bircan et al, 2001, Pediatr. Nephrol., 16(6): 497-499)。ＮＳ患者においてヒトアルブミンを同時投与すると、フロセミドの作用が増進するが、これはわずかなものでしかないと結論付けられている(Fliser et al, 1999, Kidney Iit., 55(2): 629-634)。さらに、フロセミド耐性ＮＳの治療において、組換えＨＳＡ（ｒＨＳＡ）はヒト血漿から調製されたＨＳＡと同等に使用することができることが示されている(Tsulcada et al, 1998, Gen. Pharmacol., 31(2): 209-214)。
【０００８】
示唆されている他の治療としては、ＮＳにおけるタンパク尿を軽減するためのアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤(Bakris, 1993, Postgrad. Med., 93(5):89-100)の使用、ＮＳに関連する原発性糸球体疾患の処置(Kuhn et al, 1998, Kidney Int. Suppl., 64: S50-53) および通常の凝固により２０ｇ／ｌを下回る血清アルブミンレベルを有するネフローゼ患者の処置(Kuhn et al, 1998, 前掲)のためのプレドニゾロン、シクロホスファミド、クロラムブシルおよびヒドロクロロチアジドの使用が挙げられる。また、重篤なＮＳの場合の著しい高脂血症はＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤で処置することができることも示唆されている(Kuhn et al, 1998, 前掲)。
【発明の開示】
【０００９】
こういったことを背景に、本発明の目的は、天然に生産されるアルブミンよりも半減期が改良された（すなわち、長い）修飾アルブミンを提供することにより、ＮＳなどの腎症状の処置のための薬剤を提供することである。
【００１０】
アルブミンの融合は先行技術において知られている。実際、アルブミンは、その長い半減期と生物活性が比較的低いために、他のタンパク質の担体としての使用に適していることが周知である。よって、先行技術では、アルブミンと治療上有効なタンパク質との融合が開示されており、この場合、融合は、アルブミンの半減期ではなく、治療上有効なタンパク質の半減期を改良する効果を有する。例えば、ＷＯ０１／０５８２６公報では、血清アルブミンのセグメントと生物学的に活性な異種ペプチドの断片を含有するキメラポリペプチドが提供され、この生物学的に活性な異種ペプチドは、例えば、受容体アクチベーター、抗原、または膜もしくはイオンチャネルと相互作用することができ、それが融合するアルブミンと４０％未満の同一性を有するペプチドである。さらに、ＷＯ０１／０５８２６公報では、そこに示されたキメラポリペプチドが非融合血清アルブミンの半減期を超えることなく、単にそれに近い半減期を有することが教示されている。
【００１１】
米国特許第６，１６５，４７０号明細書では、ウイルスに対する受容体の活性ドメインか、またはウイルスと結合し得る分子の活性ドメインか、またはウイルスと結合した免疫グロブリンのＦｃフラグメントを認識し得る分子の活性ドメインか、またはアルブミンもしくはアルブミン変異体と結びついた、病理過程に介在するリガンドと結合し得る分子の活性ドメインを有することを特徴とするハイブリッド高分子が提供されている。これらのハイブリッドは活性ドメインの半減期を延長させるために形成されたものである。
【００１２】
ＷＯ９９／６６０５４公報では、エリスロポエチン生物活性を有するエリスロポエチン類似体−ＨＳＡ融合タンパク質が提供されている。ＷＯ００／６９９００公報では、治療ペプチドの半減期を延長させるための血中成分との結合により、内在する治療ペプチドの、ペプチダーゼ活性からの保護が提供されている。ＷＯ００／６９９００公報では、治療ペプチドの担体としてのアルブミンの使用に言及されている。
【００１３】
よって、本発明の第一の態様によれば、ネフローゼ症候群患者において天然に生産されるアルブミンよりも半減期の長い薬剤であって、第二のポリペプチドと結合したアルブミン様のポリペプチドを含んでなり、第二のポリペプチドが、少なくともアルブミン様の第一のポリペプチドと結合しているときは治療上不活性であり、かつ、この薬剤が２つのアルブミン分子からなる場合には、それらが１以上のシステイン−システインジスルフィド架橋のみによる結合以外の手段により互いに共有結合している薬剤が提供される。言い換えれば、本発明の第一の態様による薬剤は、Birtwhistle and Hardwicke, 1985（前掲）に記載されているようなアルブミンＳ−Ｓ結合二量体ではない。
【００１４】
本発明の第二の態様によれば、医薬上許容される担体または希釈剤と、ＮＳ患者において天然に生産されるアルブミンよりも半減期の長い薬剤とを含んでなる組成物であって、該薬剤が第二のポリペプチドと結合したアルブミン様のポリペプチドを含んでなり、第二のポリペプチドが、アルブミン様のポリペプチドと結合しているときは治療上不活性であり、かつ、この薬剤がアルブミン様ポリペプチドの二量体である場合には、医薬組成物中に存在するアルブミン様の第一のポリペプチドの２％を超えるものが第二のポリペプチドと結合している組成物が提供される。
【００１５】
担体または希釈剤は、それが本発明の第一または第二の態様による薬剤と適合する場合、かつ、それがそのレシピエントに害をおよぼさない場合に「医薬上許容される」。通常、担体または希釈剤は無菌またはパイロジェンフリーの水または生理食塩水である。
【００１６】
薬剤が２つのアルブミンポリペプチドの二量体である場合、本発明の第二の態様による組成物の総アルブミンポリペプチド含量の少なくとも３０％、４０％、５０％またはそれ以上が第二のポリペプチドと結合している。薬剤がアルブミン−アルブミン二量体ではない場合には、もっと低い割合（３％、５％、９％、１０％、１５％または２０％など）のアルブミン様の第一のポリペプチドしか第二のポリペプチドと結合していないかもしれないが、やはり、上記のように少なくとも３０％等がこのような結合をしていることが好ましい。本発明の第二の態様による医薬組成物中のアルブミン様の第一のポリペプチドの、好ましくは６０％、７０％、８０％または９０％、より好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％、さらに好ましくは９９％、最も好ましくは実質的に１００％のものが第二のポリペプチドと結合している。
【００１７】
好ましくは、本発明の第二の態様による組成物では、この薬剤は、Eur. Pharmacopoeia (3rd Ed, 1997-0255)の単行本“Albumin solution, human”に記載のような酢酸セルロース電気泳動またはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）−ＨＰＬＣにより測定した場合に、主要なタンパク質成分として、より好ましくはその組成物の全タンパク質含量の少なくとも８０％として存在し、この場合、薬剤に相当するバンドまたはピークは全電気泳動図またはクロマトグラムのそれぞれ＞８０％を示す。
【００１８】
本発明の第一の態様による薬剤および本発明の第二による態様の組成物で用いる薬剤は、ＮＳ患者において天然に生産されるアルブミンよりも長い半減期を有する。ＮＳ患者における薬剤の半減期に関して「長い」とは、その薬剤がＮＳ患者において天然に生産されるアルブミンよりも少なくとも１日、より好ましくは少なくとも３日、より好ましくは少なくとも５日、さらに好ましくは少なくとも１０日長い半減期を有するという意味が含まれる。通常、ＮＳ患者における本発明の第一および／または第二の態様で定義された薬剤の半減期は、ＮＳ患者において天然に生産されるアルブミンの少なくとも２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍またはそれ以上である。患者の身体におけるタンパク質の半減期は当技術分野で周知の技術によって判定することができる。例えば、本発明による薬剤（「試験薬剤」）の半減期は次のようにして野生型の非修飾アルブミン（「通常アルブミン」）と臨床的に比較することができる：ネフローゼ症候群患者を「通常」アルブミンまたは「試験」アルブミンに不作為に割り付ける。各１回量１．４ｇ／ｋｇを静脈点滴する。これは「通常」の血漿アルブミン濃度約３５ｇ／Ｌ（ヒトの血漿量は４０ｍＬ／Ｋｇ）に相当する。投与前にアルブミンの血漿濃度を測定し、血液循環中のこの生成物の生存時間に従い、１２時間ごとに繰り返す。生成物濃度が２０ｇ／Ｌを下回ったらすぐに上記のように点滴を繰り返す。アルブミンの測定は、例えばEur. Pharmacopoeia (3rd Ed, 1997-0255)の単行本“Albumin solution, human”に記載のような酢酸セルロース電気泳動アッセイを、同書に記載のタンパク質窒素アッセイのような全タンパク質アッセイと併用して行うことができる。この方法は特定の「試験」薬剤に合うように適合させることができる。また、薬剤の生理学的作用は血圧、心拍数、または血清リポタンパク質（ａ）レベルなど、半減期の向上を評価するためのマーカーにより追跡することもできる。
【００１９】
あるいは、半減期の評価にin vitro試験を用いてもよい。例えば、Millipore Corp.などの公知の実験器具業者から提供されている攪拌デッドエンド型限外濾過セルまたは再循環型限外濾過セルに取り付けた限外濾過膜を用いてもよい。「通常」アルブミンおよび「試験薬剤」の溶液は、血漿を模倣すべくリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．２〜７．４（ＰＢＳ）中３５ｇ／Ｌとなるよう調整する。通常、ミリポアの、分子量カットオフ１０，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａおよび１００，０００Ｄａの標準的なポリスルホン膜を用いる。アルブミンの限外濾過の際、最初の溶液のアルブミン濃度を限外濾過溶液の濃度と比べる。限外濾過の操作条件は室温、膜間差圧０．５〜２．０バールである。タンパク質の測定は、例えば、Eur. Pharmacopoeia (3rd Ed, 1997-0255)の単行本“Albumin solution, human”に記載の全タンパク質アッセイ（タンパク質窒素）などのタンパク質アッセイを用いて行う。１０，０００Ｄａおよび３０，０００Ｄａカットオフによる限外濾過を対照として用いるが、これは同じ条件下で行った場合、「通常」アルブミンと「試験薬剤」の間に差がないと予測されるからである。限外濾過物中のアルブミンの濃度は最初の溶液の約１０％未満、すなわち＜３．５ｇ／Ｌであるものと予測される。５０，０００Ｄａカットオフ膜による限外濾過では、「通常」アルブミンの透過量が約１０％を超え、「試験薬剤」の透過量が約１０％より少ないと思われる。１００，０００Ｄａカットオフ膜による限外濾過では、「通常」アルブミンの透過量が約１０％を超えるか、または５０％を超えるなど、いっそう高いと考えられる。「試験薬剤」の透過量は約１０％より少ないであろう。
【００２０】
好ましい実施態様では、本発明の第一および／または第二の態様による薬剤は天然に生産されるＨＳＡよりも大きい。通常、この薬剤は８０〜２５０ｋＤａ、より一般には８０〜２００ｋＤａの大きさであり、好ましくは少なくとも１００ｋＤａの大きさである。これは１５０ＫＤａを超えないのが好ましい。１３０〜１３５ＫＤａ前後が理想的である。分子量の値は「平均」分子量としてとらえ、Eur. Pharmacopoeia (3rd Ed, 1997-0255)の単行本“Albumin solution, human”に記載のような（サイズ排除クロマトグラフィー）ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて測定する。主要ピークの頂点が平均分子量を定義するものと考えられる。カラムの較正は、分子量（ＭＷ）４４，０００Ｄａのオボアルブミン（ニワトリ）、ＭＷ６７，０００Ｄａのアルブミン（ウシ血清）、ＭＷ８１，０００Ｄａのトランスフェリン、ＭＷ１５８，０００Ｄａのアルドラーゼ（ウサギ筋肉）、およびＭＷ２３２，０００Ｄａのカタラーゼ（ウシ肝臓）などの市販の較正タンパク質と、５０，０００Ｄａ〜２５０，０００Ｄａの間の分子量を測定するのに適したＳＥＣ−ＨＰＬＣ  ＴＳＫ  Ｇ４０００  ＳＷｘｌカラム(“Current Protocols in Protein Science”, 2002, John Wiley & Sons Ed参照)を用いて行う。６５，０００Ｄａ〜８０，０００Ｄａの間の分子量を有する試験薬剤の場合、分子量は、代わりにエレクトロスプレー質量分析ＥＳ−ＭＳ法を用いて測定すればよい。この目的で、揮発性溶媒中、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）にて試験薬剤を脱塩する。タンパク質を回収し、そのまま、ウマ心臓ミオグロビンを用いて較正したエレクトロスプレー質量分析計に注入する。この質量分析計では、試験薬剤分子は大気圧でイオン化され、生じたイオンを四極子分析装置に送り、そこで質量／電荷比が測定される。このデータを処理して、タンパク質の真の分子量を示す単一質量ピークを得る。この技術の精度はアルブミンの予測値の０．０１％内（すなわち、７Ｄａ内）である。
【００２１】
本発明の第一および／または第二の態様による薬剤はアルブミン様の第一のポリペプチドを含んでなる。通常、アルブミン様ポリペプチドはアルブミンである。一般に、アルブミンは血清から抽出されたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、または生物もしくは細胞株をヒト血清アルブミンのアミノ酸配列をコードするヌクレオチドコード配列で形質転換もしくはトランスフェクトすることにより生産される組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）である。本明細書では、「アルブミン」とは、一般にＨＳＡおよび／またはｒＨＡをさす。一つの実施態様では、「アルブミン様ポリペプチド」とは、その意味の中に変異体アルブミンを含む。「変異体アルブミン」とは、１以上の位置にアミノ酸の挿入、欠失、または置換（保存的または非保存的）を有しているアルブミンタンパク質をさすが、ただし、このような変異は、少なくとも１つの基本的特性、例えば、結合活性（例えばビリルビンに対する結合のタイプおよび特異的活性）、浸透圧（膨張圧、コロイド浸透圧）、特定のｐＨ域での挙動（ｐＨ安定性）が有意に変化していないアルブミンタンパク質を生じる。この文脈における「有意に」とは、当業者が、変異体の特性がもとのタンパク質の特性と異なりはするが、明瞭なものではないとするであろうことを意味する。
【００２２】
「保存的置換」とは、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ，Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組合せを意図する。このような変異体は、引用することにより本明細書の一部とされる、１９８１年１１月２４日Stevensに対して発行された米国特許第４，３０２，３８６号明細書に開示されているものなど、当技術分野で公知のタンパク質工学および位置指定突然変異誘発の方法を用いて作出することができる。
【００２３】
一般に、アルブミン変異体は、天然に存在するアルブミンに対して４０％を超える、通常は少なくとも５０％、より一般には少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、なおさらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％またはそれ以上の配列同一性を有する。２つのポリペプチド間の配列同一性％は、例えばウイスコンシン州立大学ジェネティックコンピューティンググループのＧＡＰプログラムなどの好適なコンピュータープログラムを用いて決定することができ、当然のことながら、同一性％はその配列が最適に並べられたポリペプチドに関して計算される。あるいは、このアライメントはＣｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラム(Thompson et al., 1994)を用いて行ってもよい。用いるパラメーターは次の通りである。
【００２４】
ファースト・ペアワイズ・アライメント・パラメーター：Ｋ−タプル（ワード）サイズ；１、ウインドウサイズ；５、ギャップペナルティー；３、トップダイアゴナル数；５。スコアリング法：ｘ％。マルチプル・アライメント・パラメーター：ギャップ・オープン・ペナルティー；１０、ギャップ・エクステンション・ペナルティー；０．０５。スコアリングマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ。
【００２５】
本発明の第一および第二の態様による薬剤はアルブミン様ポリペプチドと結合した第二のポリペプチドを有する。第二のポリペプチドは、上記で定義したようなアルブミン様の第一のポリペプチドと結合することができ、かつ、結合しているときには、そのような結合をしたアルブミン様の第一のポリペプチドをＮＳ患者において天然に生産されるアルブミンよりも半減期を長くする量まで、アルブミン様の第一のポリペプチドの分子量（ＭＷ）を高めるポリペプチドである。一般に、この第二のポリペプチドは１４〜１３４ｋＤａ、好ましくは２０〜１００ｋＤａ、より好ましくは３５〜６６ｋＤａの分子量を有する。
【００２６】
本発明の第一および第二の態様による薬剤の第二のポリペプチドは、少なくともアルブミン様の第一のポリペプチドと結合しているときには治療上不活性である。「治療上不活性」とは、第二のポリペプチドがアルブミンにより提供されるものを超えて薬剤にさらなる治療上有益な特性（もちろん、その半減期の延長以外）を実質的に付加せず、かつ、害もないことを意味する。「さらなる治療上有益な特性を実質的に付加しない」とは、第二のポリペプチドが、アルブミンが持っていない生物学的に有意な受容体アクチベーター活性、抗原性、または膜またはイオンチャネルと相互作用する能力を持たないという意味を含む。「さらなる治療上有益な特性を実質的に付加しない」とは、さらに、第二のポリペプチドが、ウイルスに対する受容体の活性ドメインか、ウイルスと結合し得る分子の活性ドメインか、ウイルスと結合した免疫グロブリンのＦｃフラグメントを認識し得る分子の活性ドメインか、または病理過程に介在するリガンドと結合し得る分子の活性ドメインとしてアルブミンよりも有効な作用ができないという意味を含む。「さらなる治療上有益な特性を実質的に付加しない」とは、さらに、第二のポリペプチドがエリスロポエチン生物活性またはＷＯ００／６９９００公報に記載の治療ペプチドのいずれの活性も持たないという意味を含む。第二のポリペプチドは有害であってはならない。特に、それは有害な薬理作用を持ってはならないし、免疫原性があってはならず、または、特にヒトにおいては少なくとも臨床上許容される低レベルの免疫原性しか持ってはならない。
【００２７】
よって、一般に、この薬剤はアルブミンと実質的に同じ生物特性を有する。例えば、この薬剤はアルブミンと実質的に同じ膨張圧および／または輸送機能（解毒作用を含む）を有し得る。「治療上不活性」とは、アルブミンが持っている治療特性と同じ、または少なくともそのいくらかを有する第二のポリペプチドを排除するものではない。よって、アルブミン様ポリペプチドまたはその断片を第二のポリペプチドとして使用してもよい。好ましい実施態様では、この第二のポリペプチドは、１つ、２つ、またはそれ以上のアルブミン完全ドメインから本質的になるアルブミン様タンパク質の断片であり得る。アルブミンは、各々、１つの短いループにより分離された２つの長いループとを含む３つの完全ドメインを有する。ドメインは、通常、アミノ末端からはじめてＩ、ＩＩおよびＩＩＩという番号が付けられている。ＨＳＡおよびＢＳＡをはじめとするアルブミンの構造はPeters (1996, 前掲)に示されている。第二のポリペプチドとしてアルブミン様ポリペプチドまたはその断片を含んでなる本発明の薬剤は、以下「アルブミン二量体」と呼ぶ。
【００２８】
このように当業者には、本発明による「アルブミン二量体」薬剤は、そのＣ末端により第二のポリペプチドのＮ末端と結合しているアルブミン様の第一のポリペプチド、またはそのＣ末端によりアルブミン様の第一のポリペプチドのＮ末端と結合している第二のポリペプチドを含み得る。よって、このアルブミン二量体はＨ２Ｎ−［ポリペプチド１］−Ｘ−［ポリペプチド２］−ＣＯＯＨまたはＨ２Ｎ−［ポリペプチド２］−Ｘ−［ポリペプチド１］−ＣＯＯＨ（ここで、ポリペプチド１はアルブミン様の第一のポリペプチドであり、ポリペプチド２は、アルブミン様タンパク質またはその断片でもある第二のポリペプチドである）の形をとり得る。よって、この「二量体」は同じ方向に読む２つの連続するアルブミン様配列を有し得る。Ｘは好適な形態のいずれの結合であってもよい。一つの実施態様では、それはペプチド結合であり得る。Ｘはまた、下記のようなリンカー分子であってもよい。好ましいリンカー分子は、１〜２０個のアミノ酸残基を有し得るオリゴペプチドである。このリンカーがオリゴペプチドであるとき、ポリペプチド１および／またはポリペプチド２のいずれか、または好ましくは双方はペプチド結合を介してこのリンカーと連結するのが通常である。
【００２９】
あるいは、本発明による「アルブミン二量体」は、そのＮ末端により第二のポリペプチドのＮ末端と結合しているアルブミン様の第一のポリペプチド、またはそのＣ末端により第二のポリペプチドのＣ末端と結合しているアルブミン様の第一のポリペプチドを含んでもよい。これらはそれぞれ「ヘッド・トゥ・ヘッド」および「テール・トゥ・テール」二量体と呼ぶことができる。よって、この「二量体」は、反対方向に読む２つの連続するアルブミン様配列を有し得る。所望により、上記のようにリンカーを含んでもよい。このような二量体は、以下でより詳しく記載するように、２つのアルブミン様ポリペプチドの結合により作製することができる。
【００３０】
このペプチド結合は、アミノ酸残基のＣα原子間に空間を保持する適当なリンカー部分を用いる限り、全く存在しなくてもよく、リンカー部分がペプチド結合と実質的に同じ電荷分布および実質的に同じ平面性を有するならば特に好ましい。
【００３１】
しかしながら、本発明はアルブミン二量体に限定されるものではなく、上記で示された判定基準を満たす第二のポリペプチドならばいずれでも使用できる。一般に、第二のポリペプチドは薬剤の意図されるレシピエントによって天然に生産されるポリペプチドの全配列または部分配列を含んでなる。好ましい一つの実施態様では、第二のポリペプチドはアルブミンまたはその変異体の全配列または部分配列を含んでなる。第二のポリペプチドについての「部分配列」および「変異体」は、通常、それらが由来する配列のアミノ酸の少なくとも５％、１０％、３０％、５０％、７０％、９０％、９５％または１００％を含んでなる。第二のポリペプチドについての「部分配列」および「変異体」がそれが由来する配列のアミノ酸の１００％未満を含んでなる場合、その「部分配列」および「変異体」はそれが由来する配列のＮ末端断片、Ｃ末端断片または内部断片であり得る。一般に、第二のポリペプチドに関して「部分配列」および「変異体」は、それらが由来する配列と少なくとも５％、１０％、３０％、５０％、７０％、９０％、９５％または１００％の配列同一性を有する。長さに関してより高いパーセンテージ、および特に配列同一性が好ましく、これは、このようにして作出された部分配列または変異体の免疫原性が軽減される傾向があるためである。
【００３２】
第二のポリペプチドである増量用結合パートナー(bulking partner)は、当技術分野で公知のいずれかの方法により作出することができる。それらは天然タンパク質であってもよいし、天然源から精製してもよい。それらは組換え発現させることもできる。それらは合成法により製造することもできる。これらの生産手段の総てを達成するのに好適な技術は当業者ならば容易に利用できる。これらの技術により得られたポリペプチドは、例えば当技術分野で公知の方法により化学的および／または酵素的にさらに修飾することができる。
【００３３】
好ましい一実施態様では、第二のポリペプチドはアルブミンまたはその変異体の全配列または部分配列を含んでなる。よって、この第二のポリペプチドは全長アルブミンまたは１つもしくは２つのそのドメイン、例えばアルブミン断片であり得る。この第二のポリペプチドはアルブミンの部分配列を含んでなることができる。後者の場合、第二のポリペプチドは、全長アルブミンにより天然に提示されるものではないいずれのエピトープ（例えば、非天然ＮまたはＣ末端）の提示も避けるような方法でアルブミンの配列を含む第一のポリペプチドと結合されているのが好ましい。
【００３４】
このアルブミン様の第一のポリペプチドは、当技術分野で公知のいずれの好適な方法によって第二のポリペプチドに結合させてもよい。一般に、この結合は共有結合であるが、非共有結合であってもよい（例えば、以下の本発明の第三の作用の記載を参照）。この目的で、アルブミン様ポリペプチドおよび／または第二のポリペプチドに修飾または合成アミノ酸を含めてもよい。第二のポリペプチドとアルブミン様の第一のポリペプチドとを連結させるには、リンカー分子、例えば短いアルキル基（Ｃ１−３０）、オリゴペプチドなどが提案される。好適な結合としては、ペプチド結合、ジスルフィド結合、ホスホジエステル結合、エステル結合、エーテル結合、チオエステル結合、イミン結合、アミン結合などの生物学的に誘導された高分子で一般に見られる結合が挙げられる。第二のポリペプチドとアルブミン様ポリペプチドとを連結させるのに二官能性架橋基を提供することもできる。例えば、第二のポリペプチドがシステイン含有タンパク質であれば、アルブミン様の第一のポリペプチド（例えば、Ｃｙｓ３４を介して）とタンパク質性の増量用結合パートナーとを連結させるには、１，４−ビス−マレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，４−ビス−マレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ）、ビス−マレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ビス−マレイミドエタン（ＢＭＯＥ）、１，８−ビス−マレイミドトリエチレングリコール（ＢＭ［ＰＯＥ］３）、１，１１−ビス−マレイミドテトラ−エチレングリコール（ＢＭ［ＰＯＥ］４）、１，４−ジ［３’−（２’−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］−ブタン（ＤＰＤＰＢ）、ジチオ−ビス−マレイミドエタン（ＤＴＭＥ）または１，６−ヘキサン−ビス−ビニルスルホン（ＨＢＶＳ）など、遊離のスルヒドリル基と反応する二官能性架橋基を用いることができる。同様に、トリス［２−マレイミドエチル］アミン（ＴＭＥＡ）などの三官能性架橋基を用いてアルブミン様の第一のポリペプチドと２つのタンパク質性の増量用結合パートナーとを連結することもできる。
【００３５】
一般には、この結合はＮＳ患者の循環系で安定である。「安定」とは、結合の解離による薬剤の損失速度が腎臓による血流からの完全な形の薬剤のクリアランスによる薬剤の損失速度よりも遅いことを意味する。本発明の第一および／または第二の態様による薬剤の複数の分子が提供される場合、一般に、このような分子の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％または実質的に１００％のものが、アルブミン様の第一のポリペプチドと第二のポリペプチドとの間の完全な形の結合を含む。より高い値が好ましい。
【００３６】
一つの実施態様では、本発明の第一および／または第二の態様による薬剤は、ペプチド結合ではない、アルブミン様の第一のポリペプチドと第二のポリペプチドの間の結合を含んでなる。好適ないずれの非ペプチド結合を用いてもよい。一般に、この非ペプチド結合は上述のような結合である。
【００３７】
しかしながら、好ましい一つの実施態様では、本発明の第一および／または第二の態様による薬剤は、ペプチド結合を介して第二のポリペプチドと結合したアルブミン様の第一のポリペプチドを含んでなる。例えば、この薬剤は融合タンパク質であってもよい。一般に、融合タンパク質は、そのＮ末端またはＣ末端を介して直接、または間接的に（すなわち、ポリペプチドリンカーを介して）第二のポリペプチドと融合したアルブミン様の第一のポリペプチドの配列を含んでなる。融合タンパク質は、アルブミン二量体に関して上記したように、ヘッド・トゥ・ヘッドまたはテール・トゥ・テール融合タンパク質であってよいが、当業者ならば、この原理はアルブミン二量体に限定されるものではなく、上記で示した判定基準を満たす限り、他のいずれのタイプのポリペプチド配列を第二のポリペプチドとして用いてもよいことが分かるであろう。また、「融合タンパク質」とは、その意味に、アルブミン様の第一のポリペプチドの配列を含むポリペプチドの内部における第二のポリペプチドの包摂、または第二のポリペプチドの内部におけるアルブミン様の第一のポリペプチドの配列の包摂も含む。特に好ましい一つの実施態様では、融合タンパク質は、そのＮ末端またはＣ末端を介して第二のポリペプチド（この増量用結合パートナーはアルブミン様ポリペプチドの部分配列または全配列を含む）のＮ末端またはＣ末端と直接または間接的に融合したアルブミン様の第一のポリペプチドを含んでなる。
【００３８】
本発明は、アルブミン様分子が大きくなると、ＮＳなどの腎症状を有する患者においてその分子の半減期が長くなるという理解に基づくものである。
【００３９】
上記のように大きなアルブミン様分子を提供する他、患者を直接、または患者から採取したex vivoアルブミン含有サンプルを、アルブミンと結合するアルブミンリガンドで、アルブミンの大きさを増すような用量で処置することにより、個体により天然に生産されるアルブミン分子を修飾することもできる。
【００４０】
アルブミンリガンドは一般にアルブミンと非共有結合する。アルブミンと特異的に結合し、かつ、上記のように、そのような結合しているときには治療上不活性である限り、適当ないずれのリガンドを用いてもよい。「アルブミンと特異的に結合する」とは、患者においてアルブミン分子の半減期を長くし、それにより、患者において腎疾患またはそれに関連する症状の作用を緩和するのに治療上有効な量で用いた場合に、そのアルブミンリガンドと非アルブミン分子との結合の結果として患者が示す望ましくない顕著な副作用がないように、リガンドが十分高いアルブミン親和性を持っていなければならないことを意味する。
【００４１】
アルブミンリガンドは、例えば、ある抗体の配列を含み得る。よって、例えばそれはＩｇＧ分子であってもよい。ここで、抗体という用語は、結合にかかわる配列を保持するフラグメントまたはその一部も含む。
【００４２】
初期のプロテアーゼ消化実験によって最初に認識された事実として、抗体の重鎖可変（ＶＨ）および軽鎖可変（ＶＬ）ドメインは抗原認識および結合に関与する。齧歯類抗体の「ヒト化」によりさらなる確信が得られている。
【００４３】
よって、フラグメントは１以上の重鎖可変（ＶＨ）または軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含み得る。例えば、抗体フラグメントとは、Ｆａｂ様分子(Better et al (1988) Science 240, 1041)；Ｆｖ分子(Skerra et al (1988) Science 240, 1038)；ＶＨとＶＬパートナードメインが柔軟なオリゴペプチドを介して連結されている単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子(Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85,5879)および単離されたＶドメインを含んでなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）(Ward et al (1989) Nature 341, 544)が挙げられる。
【００４４】
用いる可変ドメインが処置を意図する個体と同じ種に由来するものではない場合、その抗体はその可変ドメインと処置を意図する個体由来の定常ドメインとを融合させることにより改変することができる。よって、治療を意図するものがヒトである場合、その抗体は、組換え抗体が親抗体の抗原特異性を保持するように、その可変ドメインとヒト起源の定常ドメインとを融合させることにより「ヒト化」することができる（例えば、Morrison et al(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855参照）。
【００４５】
それらの特異的結合部位を保持する抗体フラグメントの合成に関与する技術の総説は、Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299に見出せる。
【００４６】
完全抗体ではなく、抗体フラグメントを用いると数倍有利である。フラグメントの大きさが小さいと、固形組織の浸透が良くなるなど、薬理特性の向上につながることがある。補体結合などの完全抗原のエフェクター機能は除去される。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体フラグメントは総て、組換えにより発現および分泌させることができ（例えば、大腸菌または酵母から）、従って、このようなフラグメントが容易に大量生産できる。
【００４７】
当業者ならば抗体の使用に代わるものに気づくであろう。例えば、アルブミンリガンドは、高い特異性でアルブミンと結合することが知られているペプチド配列である、アミノ酸配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ(Dennis et al, 2002, J. Biol. Chem., 277: 35035)、または実質的に同じアルブミン結合特性を保持するその変異体を含んでもよい。
【００４８】
アルブミン結合領域を含むことに加え、アルブミンリガンドは一般に、アルブミン分子と結合した際に、アルブミン−アルブミンリガンド複合体が上記のように天然に生産されるアルブミンよりも長い半減期を持つような十分な大きさを有する。
【００４９】
この助けとなるよう、アルブミンリガンドは第二のポリペプチドと結合したアルブミン結合領域を含んでなるのが好適であり得る。第二のポリペプチドは上記で定義されたものであり得る。例えば、アルブミンリガンドは、アルブミンまたはその変異体の全配列または部分配列と融合した上記のような抗体を含み得る。
【００５０】
よって、本発明の第三の態様によれば、１４〜２００ｋＤａ、より一般には１４〜１５０ｋＤａの大きさ、好ましくは少なくとも３０ｋＤａの大きさを有するアルブミンリガンドが提供される。これは１００ｋＤａを超えないのが好ましい。６０〜７０ｋＤａ前後が理想的であり得る。分子量の値は「平均」分子量としてとらえ、上記のように（サイズ排除クロマトグラフィー）ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて測定する。
【００５１】
上記で定義されたようなサイズ要求を有するアルブミンリガンドの代わりとして、アルブミンリガンドは第二の結合部位をさらに含み、すなわち、アルブミンリガンドは二重特異的である。よって、このアルブミンリガンドはアルブミン二量体の形成を容易にするよう、同じであっても異なっていてもよい２つのアルブミン結合領域を含み得る。あるいは、このアルブミンリガンドは、そのアルブミン結合領域の他、別のタンパク質またはその他の分子と結合し得る第二の結合部位を含んでもよく、このタンパク質またはその他の分子は治療上不活性な増量用結合パートナーとして機能して半減期の長いアルブミン−アルブミンリガンド−増量用結合パートナーの複合体をもたらす。
【００５２】
また、本発明の第三の態様によれば、医薬において用いられる上記で定義したようなアルブミンリガンド、および腎疾患またはそれに関連する症状の処置用の薬品の製造における、上記で定義したようなアルブミンリガンドの使用が提供される。
【００５３】
また、組換え法または化学的方法による、非天然エピトープを含む修飾アルブミンの製造も可能である。非天然エピトープは、例えば、Ｃ末端延長部であってもＮ末端延長部であってもよい。次に、アルブミンの天然エピトープではなく、非天然エピトープに対して結合特異性を有する上記で定義したようなアルブミンリガンドを選択することができる。アルブミンリガンドと修飾アルブミンとの結合は、次に、本発明の第一の態様による薬剤の製造を可能とする。
【００５４】
よって、本発明の第三の態様によれば、第一の成分として、非天然エピトープを含んでなる修飾アルブミンと、第二の成分として、その修飾アルブミンの非天然リガンドと特異的に結合するアルブミンリガンドとを含んでなる系も提供される。第一および第二の成分の一方または双方は、上記で定義したような医薬上許容される担体または希釈剤とともに配合された組成物の形で提供することができる。この系は医薬として使用できる。例えば、この系は腎疾患またはそれに関連する症状の処置に使用できる。
【００５５】
本発明の第四の態様によれば、上記で定義したように、融合タンパク質の形態の薬剤またはアルブミンリガンドをコードするコード配列を含んでなるポリヌクレオチドが提供される。
【００５６】
さらに、例えば相同組換えにより外来のポリヌクレオチド配列を染色体ＤＮＡに導入することにより細胞内の内在遺伝子を改変する技術は先行技術として既知である。例えば、読者はＷＯ０１／６８８８２公報に記載されているようなTranskaryotic Therapies, Inc.が提供しているＴＫＴシステムに着目するであろう。このシステムを用いれば、相同組換えを促進する薬剤（例えば、Ｒａｄ５２）と標的配列近傍での非相同末端連結を阻害する薬剤（例えば、Ｋｕ不活剤）を提供することで、相同組換えにより二本鎖ＤＮＡが選択された標的ＤＮＡ中に導入される。
【００５７】
このタイプの組換え技術は、本発明においては、所定の細胞に内在するアルブミン遺伝子を改変するために使用できる。例えば、本発明の第四の態様によるポリヌクレオチドは、非天然エピトープをアルブミン遺伝子発現産物に導入し、それにより、本発明の第三の態様に記載したような修飾アルブミンを発現する細胞を作出するのに好適な配列を含んでなる、ＷＯ０１／６８８８２公報に記載のＴＫＴシステムで用いるのに好適な二本鎖ＤＮＡであり得る。
【００５８】
本発明の第四の態様によるポリヌクレオチドは、上記で定義したような第二の増量用結合パートナーをアルブミン遺伝子発現産物に導入し、それにより、本発明による薬剤を融合タンパク質として発現する細胞を作出するのに好適な配列を含んでなる、ＷＯ０１／６８８８２公報に記載のＴＫＴシステムで用いるのに好適な二本鎖ＤＮＡであり得る。
【００５９】
以下の段は本発明の第四の態様によるポリヌクレオチドに関するものであるが、当業者ならばまた、融合した第二のポリペプチドの不在下にアルブミン配列を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが同等の技術を用いて生産および発現可能であることが分かるであろう（このようにして生産されたアルブミンタンパク質は本発明の非融合タンパク質薬剤の製造に有用である）。このポリヌクレオチドは一般にＤＮＡまたはＲＮＡである。本発明によるポリヌクレオチドは、組換え法または合成法によるなど、当技術分野で公知のいずれかの方法により作製することができる(Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (3rd Ed)  Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。例えば、本発明の第四の態様によるポリヌクレオチドは当技術分野で公知の合成方法により、通常は細孔性ガラスまたはポリスチレンなどの固相支持体を用いて製造すればよい（総説としては、Sambrook and Russell (2001) 前掲およびその中の参照文献を参照）。この目的で自動合成装置が利用でき、いくつかの業者から受注合成された所定の配列のポリヌクレオチドが商業的に入手できる。合成ポリヌクレオチドは、短いオリゴヌクレオチドを作製し、それらを組み合わせて、ライゲーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるなど、当技術分野で公知の技術を用いて本発明の第四の態様による全長ポリヌクレオチドを製造することにより合成することができる。さらに、および／またはあるいは、本発明の第四の態様によるポリヌクレオチドは、当技術分野で周知の技術により天然源から直接または間接的に誘導可能なＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。よって、本発明の第四の態様によるポリヌクレオチドは、天然由来のポリヌクレオチド配列と合成ポリヌクレオチド配列の組合せを含み得る。さらに、天然由来のポリヌクレオチドの配列を、例えば選択された宿主細胞またはin vitro発現系に適するように意図する発現手段に従うコドン利用を至適化すべく改変してもよい。例えば本発明の第四の態様によるポリヌクレオチドの発現タンパク産物の分泌を起こし得るシグナル配列またはリーダー配列など、本発明の第四の態様によるポリヌクレオチドにさらなる配列を含めてもよい。分泌は、本発明の第四の態様によるポリペプチドを発現する組換え細胞の培養物などの発現系からタンパク質を回収する目的に特に望ましいが、これは、培養培地から分泌したポリペプチドを回収するほうが組換え細胞内から非分泌型ポリペプチドを回収するよりも効率がよいからである。
【００６０】
このようにして生産されたポリヌクレオチドの配列は、シーケンシングなど、好適ないずれかの方法によって確認することができる。当業者ならば、例えばこのようにして生産されたポリヌクレオチドの安定性を高める（in vitroまたはin vivo分解を軽減する）ために、または二次構造を改変する（これは例えばそのポリヌクレオチドのin vitroまたはin vivo発現の改変を可能とする）ために、本発明の第四の態様によるポリヌクレオチドに合成または改変ヌクレオチドを導入することができることが分かるであろう。
【００６１】
通常、本発明の第四の態様によるポリヌクレオチドは、コード配列に作動可能なように連結された調節領域をさらに含む。「調節領域」とは、作動可能なように連結されているコード領域、この場合、本発明の第一および／または第二の態様による融合タンパク質をコードするコード領域または本発明の第三の態様によるアルブミンリガンドをコードするコード領域の発現（すなわち、転写および／または翻訳）を調整する（すなわち、増強または低下させる）配列をさす。調節領域は、一般にプロモーター、ターミネーター、リボソーム結合部位などを含む。当業者ならば、調節領域の選択が意図する発現系によって異なることが分かるであろう。例えば、プロモーターは構成型であっても誘導型であってもよく、細胞種または組織種特異的であっても非特異的であってもよい。本発明の第四の態様によるポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、翻訳の読み過ごしを最小にし、それにより伸張した非天然融合タンパク質の生産を避けるため、ＵＡＡ、ＵＡＧまたはＵＧＡなどの翻訳停止コドンをコードする１を超えるＤＮＡ配列を組み込むのが有益であり得る。翻訳停止コドンＵＡＡをコードするＤＮＡ配列が好ましい。当業者ならば、ＲＮＡポリヌクレオチドにも同等の配列を組み込むことができることが分かるであろう。
【００６２】
「作動可能なように連結される」とは、その意味の範囲内に、調節領域を意図した様式で機能させるよう、融合タンパク質をコードする配列などのコード配列との関連性を形成するように本発明の第四の態様によるポリヌクレオチド内に置くことを含む。よって、融合タンパク質コード配列と「作動可能なように連結された」調節領域は、その調節領域が、その調節領域に適合する条件下で、意図した様式でコード配列の転写および／または翻訳に影響を及ぼし得るように配置される。
【００６３】
本発明の第四の態様によるポリヌクレオチドをベクターに導入してもよい。当業者ならば、異なる用途に用いるには異なるタイプのベクターが適していることが分かるであろう。このベクターは、例えば、細菌または酵母細胞における発現に好適なプラスミドであってもよい。ベクターはウイルスベクターであってもよい。一般的なベクターとしては、クローニングベクターおよび発現ベクターが挙げられる。ベクターを宿主細胞に導入する場合、ベクターは染色体外ポリヌクレオチドのままであるか、または宿主細胞の染色体に組み込まれる。
【００６４】
よって、ベクターは標準的な技術によって宿主に導入した後、形質転換された宿主細胞を選択すればよい。このように形質転換された宿主細胞を、次に、本発明の第四の態様によるポリヌクレオチドのコード配列の発現を可能とするのに十分な時間、当業者に公知の、また、本明細書で開示した技術に照らして既知の適当な条件下で培養し、その後、これを回収することができる。
【００６５】
細菌（例えば、大腸菌(E. coli)および枯草菌(Bacillus subtilis)、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)およびクルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)）、糸状真菌（例えば、アスペルギルス(Aspergillus)）、植物細胞、完全植物体、動物細胞および昆虫細胞をはじめ、多くの発現系が知られている。
【００６６】
一つの実施態様では、好ましい宿主細胞は酵母サッカロミセス・セレビシエ、クルイベロミセス・ラクチスおよびピキア・パストリスである。例えば、遺伝子コード配列の破壊により、タンパク質のＯ−グリコシル化に関与する１以上のタンパク質マンノシルトランスフェラーゼが欠損している酵母を用いるのが特に有利である。
【００６７】
アルブミンタンパク質配列はＮ結合グリコシル化部位を含まず、自然界ではＯ結合グリコシル化による修飾は報告されていない。しかしながら、いくつかの酵母種で生産されたｒＨＡは一般にマンノースに関与するＯ結合グリコシル化によって修飾できることが分かっている。このマンノシル化アルブミンはレクチンコンカナバリンＡと結合することができる。酵母が生産するマンノシル化アルブミンの量は、１以上のＰＭＴ遺伝子が欠損した酵母株を用いることで低下させることができる（ＷＯ９４／０４６８７公報）。これを達成する最も便宜な方法は、Ｐｍｔタンパク質の１つの産生レベルが低くなるようにそのゲノムに欠損を有する酵母を作出することである。例えば、Ｐｍｔタンパク質がほとんど、または全く生産されないような、コード配列または調節領域における（またはＰＭＴ遺伝子の１つの発現を調節する別の遺伝子における）欠失、挿入、または転位があり得る。あるいは、抗Ｐｍｔ抗体などの抗Ｐｍｔ剤を生産するように酵母を形質転換させてもよい。
【００６８】
Ｓ．セレビシエ以外の酵母を用いる場合、例えばピキア・パストリスまたはクルイベロミセス・ラクチスにおいては、Ｓ．セレビシエのＰＭＴ遺伝子と同等な１以上の遺伝子を破壊することも有益である。Ｓ．セレビシエから単離されたＰＭＴ１（または他のいずれかのＰＭＴ遺伝子）の配列を、他の真菌種において同様の酵素活性をコードする遺伝子の同定または破壊に用いてもよい。クルイベロミセス・ラクチスのＰＭＴ１ホモログのクローニングはＷＯ９４／０４６８７公報に記載されている。
【００６９】
酵母はそれぞれＷＯ９５／３３８３３およびＷＯ９５／２３８５７に教示されているようなＨＳＰ１５０および／またはＹＡＰ３遺伝子の欠損を有することが有利である。
【００７０】
好ましい一つの実施態様では、酵母をサッカロミセス・セレビシエ２μｍプラスミドに基づく発現プラスミドで形質転換させる。酵母を形質転換する際には、プラスミドは細菌複製配列および選択配列を含み、これを形質転換後、ＥＰ２８６４２４公報の教示に従って内部組換え事象により切り出す。このプラスミドはまた、ＥＰ４３１８８０公報に教示されているような酵母プロモーター（例えば、サッカロミセス・セレビシエＰＲＢ１プロモーター）；ＷＯ９０／０１０６３公報に教示されているように、例えば天然ＨＳＡ分泌リーダーの大部分およびＳ．セレビシエα−交配因子分泌リーダーの小部分を含んでなる分泌リーダーをコードする配列；ヒト遺伝子に相当するｃＤＮＡを単離するための既知の方法により得られる、例えばＥＰ７３６４６公報およびＥＰ２８６４２４公報に開示されているＨＳＡコード配列；および転写ターミネーター、好ましくはＥＰ６００５７公報に教示されているようなサッカロミセスＡＤＨ１に由来するターミネーターを含んでなる発現カセットも含む。このベクターは少なくとも２つの翻訳停止コドンを組み込んでいるのが好ましい。
【００７１】
上記プラスミドの種々のエレメントの選択は得られるアルブミン産物の純度には直接関係があるとは考えられないが、これらのエレメントは産物の収率の改善に関与するかもしれない。
【００７２】
もう１つの実施態様では、宿主細胞は動物細胞である。一般に、動物細胞は哺乳類細胞、好ましくは哺乳類肝細胞である。この実施態様では、好ましい細胞種はヒト細胞種である。
【００７３】
よって、本発明の第五の態様によれば、本発明の第四の態様によるポリヌクレオチド、または本発明の第四の態様によるポリヌクレオチドを含有するベクターを含んでなる上記のような宿主細胞が提供される。
【００７４】
この宿主細胞はそのまま治療薬となり得る（すなわち、レシピエントと接触した際に治療作用をもたらし得る）。例えば、この宿主細胞は、本発明による薬剤である融合タンパク質を必要とするレシピエントへの移植に好適なものであり得る。レシピエントはヒトであり得る。このレシピエントはネフローゼ症候群を有していてもよい。さらに、および／またはあるいは、この宿主細胞は本発明において有用なポリペプチドを発現および取得する手段を提供することができ、例えば、この宿主細胞は、本発明の第一または第二の態様による非融合タンパク質薬剤または本発明の第三の態様によるアルブミンリガンドの製造のための、融合タンパク質または成分などのポリペプチドの組換え生産に使用できる。この様式で得られたポリペプチドは所望によりさらに修飾してもよく（例えば第二のポリペプチドと結合させることによる）、かつ／または所望により本明細書で述べるようにさらに精製してもよい。
【００７５】
よって、本発明の第六の態様によれば、本発明の第一、第二または第三の態様により定義したような薬剤またはアルブミンリガンドを製造するための方法であって、本発明の第五の態様による細胞を得る工程、およびそれから第二のポリペプチドの配列と融合したアルブミン様の第一のポリペプチドの配列を含んでなるポリペプチドを含んでなる融合タンパク質を単離する工程を含んでなる方法が提供される。
【００７６】
ｒＨＡの精製技術は、ＷＯ９２／０４３６７公報、マトリックス由来色素の除去；ＥＰ４６４５９０公報、酵母由来着色剤の除去；およびＥＰ３１９０６７公報、アルカリ沈殿法およびその後のアルブミンに対して特異的親和性を有する親油相へのｒＨＡの適用に開示されている。当業者ならば、これらの方法が本発明の第一、第二または第三の態様による融合タンパク質またはアルブミンリガンドの単離に適用できることが分かるであろう。好ましい一つの実施態様では、本発明の第六の態様は、ＷＯ００／４４７７２公報またはＷＯ９６／３７５１５公報（両者とも引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されている方法による融合タンパク質の単離を含む。
【００７７】
精製に関して以下で用いる「アルブミン溶液」および「アルブミン」とは、それぞれ、本発明の第五の態様による細胞から得られるものなどのアルブミン／融合タンパク質溶液およびアルブミン／融合タンパク質を含むものとする。
【００７８】
本発明の第六の態様による方法で用いる精製過程は、例えば、比較的不純なアルブミン溶液をそのアルブミンが特異的親和性を持たないクロマトグラフィー材料に適用してアルブミンをその材料に結合させる工程、およびアルブミンに対して特異的親和性を有する化合物の溶液を適用することにより、結合したアルブミンをその材料から溶出させる工程を含み得る。好ましくは、このクロマトグラフィー材料は、ＳＰ−セファロースＦＦ、ＳＰ−スフェロシルなどのような陽イオン交換体である。アルブミンに対して特異的親和性を有する化合物としては、オクタン酸塩（例えば、オクタン酸ナトリウム）、その他の長鎖（Ｃ６〜Ｃ２２）脂肪酸、サリチル酸塩、オクチルコハク酸塩、Ｎ−アセチルトリプトファンまたはこれらの２種以上の混合物が挙げられる。
【００７９】
最終産物は付加的安定性を与えるように調剤することができる。好ましくは、本発明によるアルブミン融合タンパク質または本発明による非融合タンパク質薬剤の製造に用いられるアルブミンタンパク質などの高純度アルブミンは、少なくとも１００ｇ、より好ましくは１ｋｇまたは１０ｋｇのアルブミン融合タンパク質またはアルブミンを含み得るものであり、複数のバイアルに分割することができる。
【００８０】
しかしながら、精製アルブミンが最終産物でなく、単に最終産物の前駆体である場合、本発明の第一、第二または第三の態様による薬剤またはアルブミンリガンドを得るためにはさらなる修飾が必要である。よって、本発明の第七の態様によれば、ＮＳ患者において天然に生産されるアルブミンよりも半減期の長い薬剤を製造する方法であって、薬剤が第二のポリペプチドと結合した第一のアルブミン様ポリペプチドを含んでなり、第二のポリペプチドが治療上不活性であり、
（ａ）第一の成分としてアルブミン様の第一のポリペプチドを準備する工程；
（ｂ）第二の成分として第二のポリペプチドを準備する工程；および
（ｃ）薬剤を形成させるのに好適な条件下で第一の成分を第二の成分と接触させる工程
を含んでなる方法が提供される。
【００８１】
「薬剤を形成させるのに好適な条件」とは、第二のポリペプチドが、不可逆的変化が変化した分子をレシピエントに対して有毒とするか、またはレシピエントで無効とするような第二のポリペプチドまたは第一のアルブミン様のポリペプチドのいずれかの不可逆的変化を起こさずに、アルブミン様配列を含んでなる第一のポリペプチドと結合するいずれの条件も含むものとする。当業者ならば、条件は第一および第二の成分の特性を考慮して、望ましいタイプの結合の形成に合うようにすることができることが分かるであろう。
【００８２】
当業者ならば、アルブミンリガンドを形成させるに好適な条件下でアルブミン結合分子を第二のポリペプチドと接触させることにより、上記で定義したようなアルブミンリガンドを製造するための同等の方法を使用できることが分かるであろう。
【００８３】
あるポリペプチドを別のポリペプチドと結合させる方法は当技術分野で周知のものである。例えば、タンパク質−ＬａｂＦａｘ(N. C. Price, 1996, Academic Press)には、４，４’−ジマレイミドスチルベンなどの同質二官能性架橋試薬を用いて遊離ＳＨ基を介しての、またはＮ−スクシンイミジル６−マレイミドカプロエートなどの異質二官能性架橋試薬を用いて−ＳＨ基および−ＮＨ２基を介しての、またはジスクシンイミジルスベレートなどの同質二官能性架橋試薬を用いて−ＮＨ２基を介してのポリペプチド架橋プロトコールが記載されている。米国特許第４，１３６，０９３号明細書には、グルタルアルデヒドを用いた−ＮＨ２基を介してのポリペプチドの架橋が記載されている。その他の二官能性および三官能性架橋基も上記に述べられている。
【００８４】
本発明の第八の態様によれば、本発明の第二の態様による組成物、または本発明の第三の態様で定義されたアルブミンリガンドを含んでなる組成物を製造する方法であって、本発明の第六または第七の態様による方法により薬剤またはアルブミンリガンドを製造すること、およびその薬剤またはアルブミンリガンドと医薬上許容される担体または希釈剤とを配合することを含んでなる方法が提供される。
【００８５】
以下の例は、有効成分が本発明の第一、第二または第三の態様による薬剤またはアルブミンリガンドである、本発明による医薬処方物を例示するものである。
【００８６】
注射用処方物
有効成分                                                    １０ｇ
無菌パイロジェンフリーリン酸バッファー（ｐＨ７．０）        ５０ｍｌまで
【００８７】
有効成分を大部分のリン酸バッファーに溶解し（２０〜４０℃）、一定量とし、無菌０．２μｍフィルターで無菌の５０ｍｌガラスバイアル（Ｉ型またはII型）中へ濾過し、無菌の栓およびオーバーシールで密閉する。読者は、処理する条件に合わせて有効成分の量を増やしたり減らしたりできることが分かるであろう。例えば、用いる有効成分の量は１０ｇを超えてよく、例えば２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００ｇまたはそれ以上とすることができる。処方物の量は、有効成分が確実に生理学上許容される濃度で提供されるように調整することができる。
【００８８】
非経口投与に好適な処方物としては、抗酸化剤、バッファー、アルブミン安定剤、および処方物を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る水性無菌注射溶液が挙げられる。これらの処方物は単位用量で提供してもよいし、または例えば密閉アンプルおよびバイアルなどの多回用量容器で提供してもよく、使用直前に例えば注射用水などの無菌液体担体を添加するだけの凍結乾燥状態で保存してもよい。即時調合注射溶液は従来の各種無菌粉末から調製し得る。
【００８９】
本発明による薬剤の濃度、ナトリウムの濃度、およびオクタン酸塩の濃度を決定するため、好適な注射用処方物を分析すればよい。これらの量を考慮し、処方物の仕様を達成するために必要なさらなる量の塩化ナトリウムおよびオクタン酸ナトリウム賦形剤原液と適当な等級の水を加える。最終的な薬剤濃度は１５０〜２５０ｇＬ−1または２３５〜２６５ｇＬ−１であってよく、ナトリウム濃度は１３０〜１６０ｍＭである。他の実現可能な薬剤濃度とすることもでき、例えば最小濃度は少なくとも４％（ｗ／ｖ）、好ましくは４〜２５％（ｗ／ｖ）である。処方物は、ポリソルベート８０、またはヒトアルブミンに関して米国薬局方に明示されているもの、および希釈水などの、適当な通常の医薬上許容される賦形剤も含み得る。
【００９０】
好ましい単位投与形処方物は、一日量または単位、有効成分の一日部分用量またはその適当な画分を含有するものである。
【００９１】
特に上述した成分の他、本発明による処方物は対象とする処方物種に対して含まれる当技術分野で通常の他の成分を含んでもよいと理解すべきである。
【００９２】
よって、本発明の第一、第二または第三の態様による薬剤、組成物またはアルブミンリガンド、また、本発明の第六、第七または第八の態様のいずれか１つの方法によって得られる薬剤、組成物またはアルブミンリガンド、あるいは本発明の第四の態様によるポリヌクレオチドまたはベクター、あるいは本発明の第五の態様による細胞は、レシピエントに治療上有益な作用をもたらすように投与することができる。「治療上有益な」とは、ネフローゼ症候群（ＮＳ）もしくは尿毒症、またはそれに関連する症状などの腎疾患の作用が緩和されるという意味を含む。腎疾患に関連する症状とは、その症候または腎疾患に関連する症状を含む。このような症候としては、低アルブミン血症、タンパク尿、アルブミン尿、浮腫、低血漿量および高脂血症が挙げられる。よって、腎疾患に関連する症状の例としては、高脂血症に関連することが知られているアテローム性動脈硬化心血管疾患がある。
【００９３】
一般に、本発明による薬剤、アルブミンリガンド、組成物、ポリヌクレオチド、ベクターおよび細胞またはその処方物は、レシピエントが腎疾患を有する場合に本明細書に記載の方法において使用される。１つの好ましい実施態様では、レシピエントはネフローゼ症候群を有し得る。もう１つの好ましい実施態様では、レシピエントは尿毒症を有し得る。さらに、および／またはあるいは、レシピエントは浮腫またはアテローム性動脈硬化心血管疾患などの腎疾患に関連する症状を有し得る。よって、上記の方法における本発明による薬剤、アルブミンリガンド、組成物、ポリヌクレオチド、ベクターおよび細胞、またはその処方物の使用は、低タンパク質血症、低アルブミン血症、タンパク尿、高脂血症、浮腫の処置を提供し、かつ、血漿コロイド圧を維持し、組織への酸素分布を改善する手段を提供する。
【００９４】
ネフローゼ症候群は糸球体濾過系の著しい漏出を特徴とする。本発明による既知分子量の薬剤またはアルブミンリガンドを個体に投与し、その個体の糸球体濾過系の漏出の分子量閾値を判定することができる。本発明による薬剤またはアルブミンリガンドは当技術分野で周知の技術を用いて標識することができる。本発明による標識薬剤またはアルブミンリガンドを個体に投与した後、次に、例えばその個体の尿を分析することで、標識薬剤またはアルブミンリガンドの排泄の検出を試みる工程を行えばよい。投与した薬剤またはアルブミンリガンドは互いに同じ分子量を有してもよい。あるいは、大きさの異なる薬剤またはアルブミンリガンドを、所望により各々異なる大きさに対応する異なる標識を有するようにして同時に投与してもよい。例えば、個体の尿中の薬剤またはアルブミンリガンドの検出は、個体の糸球体濾過系の排泄に関する分子量閾値を示唆し得る。もちろん、アルブミンリガンドの大きさがそれ自体患者の糸球体濾過系の分子量閾値を下回る場合は、アルブミンと結合している場合にのみ排泄されるのであれば「漏れのある」糸球体濾過系の指標となるので、排泄されるアルブミンリガンドが遊離のリガンドとして排泄されるのか、アルブミンと結合した場合に排泄されるのかを判定する必要がある。よって、本発明による薬剤およびアルブミンリガンドはＮＳなどの異常な糸球体濾過系に関連する症状を診断する方法において用いることができる。
【００９５】
よって、本発明の第九の態様によれば、ヒトまたは動物体の外科術、治療または診断による処置方法に用いるための、本発明の第一、第二または第三の態様による薬剤、組成物またはアルブミンリガンド、または本発明の第六、第七または第八の態様のいずれか１つの方法によって得られる薬剤、組成物またはアルブミンリガンド、あるいは本発明の第四の態様によるポリヌクレオチドまたはベクター、あるいは本発明の第五の態様による細胞が提供される。
【００９６】
上述のように、薬剤、アルブミンリガンド、その組成物、ポリヌクレオチド、ベクターおよび細胞は、レシピエントに投与するのに好適な様式で調剤することができる。よって、本発明の第十の態様によれば、腎疾患またはそれに関連する症状の処置用薬品の製造における、本発明の第一、第二または第三の態様による薬剤、組成物またはアルブミンリガンド、または本発明の第六、第七または第八の態様のいずれか１つの方法によって得られる薬剤、組成物またはアルブミンリガンド、あるいは本発明の第四の態様によるポリヌクレオチドまたはベクター、あるいは本発明の第五の態様による細胞の使用が提供される。
【００９７】
このようにして調剤された薬剤は、次に、レシピエントに投与することができる。よって、本発明の第１１の態様によれば、腎疾患またはそれに関連する症状を有する患者を処置する方法であって、本発明の第一、第二もしくは第三の態様による薬剤、組成物またはアルブミンリガンド、または本発明の第六、第七もしくは第八の態様のいずれか１つの方法によって得られる薬剤、組成物またはアルブミンリガンド、あるいは本発明の第四の態様によるポリヌクレオチドまたはベクター、あるいは本発明の第五の態様による細胞を、医薬上有効な量および濃度で患者に投与することを含んでなる方法が提供される。
【００９８】
上述の本発明による薬剤、アルブミンリガンド、組成物、ポリヌクレオチド、ベクターおよび細胞またはその処方物は、経口および非経口（例えば、皮下または筋肉内）注射をはじめとする便宜ないずれかの方法によって投与することができる。この処置は単回投与または一定の期間にわたる複数回の投与からなってよい。本発明による薬剤、アルブミンリガンド、ポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞は単独で投与することもできるが、１種以上の許容される担体とともに医薬処方物として提供することが好ましい。
【００９９】
本明細書において「医薬上有効な量」とは、その意味の範囲内に、個体に投与される本発明による薬剤、アルブミンリガンドまたは組成物の最適な量を含む。これは、当業者ならば、患者または被験体の種、大きさ、齢および健康状態を考慮して決定することができる。最適な量とは、細胞傷害作用または免疫応答などの許容されないレベルの望ましくない副作用を生じることなく、腎疾患またはそれに関連する症状の作用を最適に緩和することができる量である。当業者ならば、ある用量が許容されない副作用を持つかどうかを決定することができる。単回用量で投与される薬剤または組成物の量は一般に１ｇ〜２００ｇ、より一般には５ｇ〜１５０ｇ、好ましくは１０ｇ〜１００ｇである。一般的な提案として、非経口投与する薬剤の、投与１回当たりの医薬上有効な総量は０．５ｇ／ｋｇ〜５ｇ／ｋｇ患者体重の範囲である。一般に、患者においてアルブミンの正常量を効果的に維持するためには、１日、または３日もしくは７日に１回投与する。
【０１００】
以下、本発明を以下の図面および実施例を参照しながらより詳細に説明する。
【０１０１】
実施例１
配列番号５は、サッカロミセス・セレビシエＰＲＢ１プロモーター由来の５’ＵＴＲを含む非コード領域（配列番号１）；ＷＯ９０／０１０６３に定義されているＨＳＡ／ＭＦα−１融合リーダー配列をコードするポリヌクレオチド領域（配列番号２）；成熟ヒトアルブミンの第二のコドン最適化コード領域と融合した、成熟ヒトアルブミンの第一のコドン最適化コード領域（双方とも配列番号３）および翻訳終結部位（配列番号４）を含んでなる本発明の薬剤をコードするＤＮＡ配列を示す。
【０１０２】
このようなＤＮＡ配列は重複一本鎖オリゴヌクレオチドの形でGenosys, Inc (Cambridge, UK)から入手することができる。
配列番号５はＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡ断片として合成し、プラスミドＡとしてのプラスミドｐＢＳＳＫ−(Stratagene Europe, P. O. Box 12085, Amsterdam, The Netherlands)のＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングする（図１）。
【０１０３】
サッカロミセス・セレビシエＰＲＢ１プロモーターは、２つの標準的な一本鎖オリゴヌクレオチドＰＲＢＪＭ１（配列番号６）およびＰＲＢＪＭ３（配列番号７）を用いてＰＣＲにより酵母ゲノムＤＮＡから単離する。
【０１０４】
ＰＣＲ条件は、９４℃３０秒、５０℃４０秒、７２℃１２０秒を４０回の後、７２℃６０秒、その後４℃で保持する。０．８１ｋｂ  ＤＮＡ断片をＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの両者で消化し、同様にＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したＷＯ９７／２４４４５に記載のｐＢＳＴ＋に連結し、プラスミドＢを作出する（図２）。プラスミドＢをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、従前にＷＯ００／４４７７２に開示されているｐＡＹＥ４４０由来の０．４８ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ  ＡＤＨ１ターミネーターＤＮＡ断片と連結し、プラスミドＣを作出する（図３）。
【０１０５】
配列番号５の３．６ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡ断片をプラスミドＣのユニークなＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングしてプラスミドＤを作出し、これはＰＲＢ１プロモーターとＡＤＨ１ターミネーターの間に、ＰＲＢ１プロモーターからの発現に関して適正な配向で、適切な大きさの配列番号５のＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡ断片を含むことを示すことができる（図４）。
【０１０６】
プラスミドＤをＮｏｔＩで完全に消化し、配列番号５のＮｏｔＩ  ＰＲＢ１プロモーター／ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡ断片遺伝子／ＡＤＨ１ターミネーター発現カセットを精製する。プラスミドＤ由来のＮｏｔＩ発現カセットを、予めウシ腸管ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理した、ＮｏｔＩで線状化したｐＳＡＣ３５  (Sleep et al.(1991), Bio/technology 9: 183-187)へ連結し、プラスミドＥを作出する（図５）。プラスミドＥは、ｐＳＡＣ３５のＮｏｔＩ部位に挿入され、かつ、融合遺伝子の発現がＬＥＵ２栄養要求マーカーから２μｍ複製起点へと向かうように配向されているＮｏｔＩ発現カセットを含むことを示すことができる。
【０１０７】
酵母株は、Hinnen et al, (1978) P. N. A. S. 75,1929に記載の方法により、プラスミドＥでロイシン原栄養性へと形質転換させる。この形質転換体を、２％（ｗ／ｖ）グルコースを含有する緩衝最小培地(Buffered Minimal Medium(BMM、Kerry-Williams, S. M. et al. (1998) Yeast 14, 161-169により記載) （ＢＭＭＤ）に貼り付け、さらなる分析のために十分増殖するまで３０℃で培養する。２％（ｗ／ｖ）グルコースを含有する１０ｍＬ  ＹＥＰ（１％（ｗ／ｖ）酵母抽出物；２％（ｗ／ｖ）バクトペプトン）（ＹＥＰＤ）およびＢＭＭＤ振盪フラスコ培養物（３０℃、２００ｒｐｍ、７２時間）から、無細胞培養上清のロケット免疫電気泳動により、形質転換体によるアルブミン融合タンパク質の生産性を分析する。
【０１０８】
許容レベルのアルブミン融合タンパク質生産を示す形質転換体の保存株培養物を用い、２０％（ｗ／ｖ）トレハロースの存在下で培養物のアリコートを冷凍することにより、振盪フラスコ培養物の調製に好適な処理酵母の実施保存株（研究用細胞バンク）を作製する。
【０１０９】
発酵法は、引用することにより本明細書の一部とするＷＯ００／４４７７２に記載のものと本質的に同じである。
【０１１０】
ＷＯ００／４４７７２に記載のものと本質的に同様に陽イオン交換体でのクロマトグラフィーのため、発酵から濃縮物を調製、またはコンディショニングする。精製プロセスは本質的にＷＯ００／４４７７２に記載のように、次のような工程：陽イオン交換クロマトグラフィー；陰イオン交換クロマトグラフィー；アフィニティークロマトグラフィー；限外濾過とダイアフィルトレーション；第二のアフィニティークロマトグラフィー工程；限外濾過とダイアフィルトレーション；第二の陽イオン交換クロマトグラフィー工程；および第二の陰イオン交換クロマトグラフィーを含む。好ましくは、これらの精製プロセスの後に最終の限外濾過／ダイアフィルトレーション、その後、所望のタンパク質濃度、例えば２００ｇ／Ｌとするために、インジェクション用水の添加、オクタン酸ナトリウムおよび／またはポリソルベート８０のような既知のアルブミン安定剤の添加、レシピエントの血液と等張にするための溶質（例えば、ＮａＣｌ）の添加、および生理学的に適合するようにするためのｐＨ調整、例えばｐＨ７．０、および／またはその溶液の最終容器への充填を含む調製工程を行う。
【０１１１】
実施例２
配列番号８は、サッカロミセス・セレビシエＰＲＢ１プロモーター由来の５’ＵＴＲを含む非コード領域；ＨＳＡ／ＭＦα−１融合リーダー配列をコードするポリヌクレオチド領域；成熟ヒトアルブミンのコドン最適化コード領域および翻訳終結部位を含んでなるＤＮＡ配列を示す。
【０１１２】
このＤＮＡ配列は、Genosys, Inc (Cambridge, UK)が重複一本鎖オリゴヌクレオチドから、プラスミドｐＡＹＥ６３９としてのプラスミドｐＢＳＳＫ−(Stratagene Europe, P.O. Box 12085, Amsterdam, The Netherlands)のＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングされた１．８６５ｋｂ  ＳａｃＩ−ＨｉｆｚｄＩＩＩ  ＤＮＡ断片として合成されたものである（図６）。
【０１１３】
サッカロミセス・セレビシエＰＲＢ１プロモーターは、２つの標準的な一本鎖オリゴヌクレオチドＰＲＢＪＭ１（配列番号９）およびＰＲＢＪＭ３（配列番号１０）を用いＰＣＲにより酵母ゲノムＤＮＡから単離した。
【０１１４】
ＰＣＲ条件は、９４℃３０秒、５０℃４０秒、７２℃１２０秒を４０回の後、７２℃６０秒、その後４℃で保持する。０．８１ｋｂ  ＤＮＡ断片をＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの両者で消化し、同様にＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したＷＯ９７／２４４４５に記載のｐＢＳＴ＋に連結し、プラスミドｐＡＹＥ４３９作出した（図７）。プラスミドｐＡＹＥ４３９をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、従前にＷＯ００／４４７７２に開示されているｐＡＹＥ４４０由来の０．４８ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ  ＡＤＨ１ターミネーターＤＮＡ断片と連結し、プラスミドｐＡＹＥ４６６作出した（図８）。
【０１１５】
配列番号７の１．８６５ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡ断片をプラスミドｐＡＹＥ４６６のユニークなＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングしてプラスミドｐＡＹＥ６４０を作出したところ、これはＰＲＢ１プロモーターとＡＤＨ１ターミネーターの間に、ＰＲＢ１プロモーターからの発現に関して適正な配向で、配列番号２６の１．８６５ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡ断片を含むことが示された（図９）。
【０１１６】
プラスミドｐＡＹＥ６４０は、適当な転写プロモーターと転写ターミネーター配列を提供する酵母ＲＡＢ１プロモーターと酵母ＡＤＨ１ターミネーターを含む。プラスミドｐＡＹＥ６４０を制限酵素ＡｆＺＩＩで完全に消化し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで部分的に消化し、酵母ＰＥＢ１プロモーターの３’末端とｒＨＡ  コード配列を含む１．９０ｋｂ  ＤＮＡ断片を単離した。特許出願ＷＯ００／４４７７２に記載されているようなプラスミドｐＤＢ２２４１をＡｆＺＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、酵母ＰＲＢ１プロモーターの５’末端と酵母ＡＤＨ１ターミネーターを含む４．３１ｋｂ  ＤＮＡ断片を単離した。このｐＡＹＥ６４０由来のＡｆＺＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡ断片を次にＡｆＺＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  ｐＤＢ２２４１ベクターＤＮＡ断片にクローニングし、プラスミドＦを作出した。プラスミドＦをＰａｃＩ／ＸｈｏＩで完全に消化し、６．１９ｋｂ断片を単離し、この凹末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰで平滑末端とし、細連結してプラスミドＧを作出した。プラスミドＧをＣｌａＩで線状化し、凹末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰで平滑末端とし、細連結してプラスミドＨを作出した。プラスミドＨをＢｌｎＩで線状化し、凹末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰで平滑末端とし、細連結してプラスミドＩを作出した。プラスミドＩをＢｍｇＢＩ／ＢｇｌＩＩで完全に消化し、６．９６ｋｂ  ＤＮＡ断片を単離し、２つの二本鎖オリゴヌクレオチドリンカーＶＣ０５３（配列番号１１）／ＶＣ０５４（配列番号１２）およびＶＣ０５７（配列番号１３）／ＶＣ０５８（配列番号１４）のうちの１つと連結してプラスミドＪを作出した。
【０１１７】
組換えアルブミン発現ベクターｐＤＢ２２４３を従前に特許出願ＷＯ００／４４７７２に記載されている。プラスミドｐＤＢ２２４３をＳｐｈＩおよびＢｓｕ３６Ｉで完全に消化し、酵母ＰＲＢ１プロモーター、大部分のヒトアルブミンｃＤＮＡおよび酵母ＡＤＨ１ターミネーターの一部を含む６．００ｋｂ  ＤＮＡ断片を単離した。プラスミドＪをＳｐｈＩおよびＡｇｅＩで完全に消化し、合成アルブミン遺伝子と酵母ＡＤＨ１ターミネーターの一部を含む１．９３ｋｂ  ＤＮＡ断片を単離した。配列番号１５および配列番号１６の配列を有する２つの合成オリゴヌクレオチドをアニーリングすることで、二本鎖Ｂｓｕ３６Ｉ−ＡｇｅＩ  ＤＮＡリンカーを形成した。
【０１１８】
ｐＤＢ２２４３由来の６．００ｋｂ  ＳｐｈＩ／Ｂｓｕ３６Ｉ  ＤＮＡ断片を、二本鎖Ｂｓｕ３６Ｉ−ＡｇｅＩ  ＤＮＡリンカーとプラスミドＪ由来の１．９３ｋｂ  ＳｐｈＩ／ＡｇｅＩ  ＤＮＡ断片と連結することで、アルブミン二量体遺伝子を含んだプラスミドＫを作出した。
【０１１９】
プラスミドＫをＮｏｔＩで完全に消化し、ＮｏｔＩ  ＰＲＢ１プロモーター／アルブミン二量体遺伝子／ＡＤＨ１ターミネーター発現カセットを精製する。プラスミドＫ由来のこのＮｏｔＩアルブミン二量体発現カセットを、予めウシ腸管ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理した、ＮｏｔＩで線状化したｐＳＡＣ３５(Sleep et al. (1991), Bio/technology 9:183-187)に連結してプラスミドＬを作出する。プラスミドＬは、ｐＳＡＣ３５のＮｏｔＩ部位に挿入され、かつ、その融合遺伝子の発現がＬＥＵ２栄養要求マーカーから２μｍ複製起点に向かうように配向されたＮｏｔＩ発現カセットを含むことを示すことができる。プラスミドＬの融合遺伝子の配列は配列番号１７に示されている。
【０１２０】
酵母株をプラスミドＬで形質転換し、その形質転換体を発酵させてアルブミン二量体を生産し、上記実施例１に記載したようにアルブミン二量体を精製した。
【０１２１】
配列表
配列番号１：サッカロミセス・セレビシエ由来の５’ＵＴＲ
【化１】
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【０１２２】
配列番号２：ＨＳＡ／ＭＦα１融合リーダー配列
【化２】
2007527369.tif 000004
【０１２３】
配列番号３：成熟ヒトアルブミンのコドン最適化コード領域
【化３】
2007527369.tif 000005
2007527369.tif 000006
【０１２４】
配列番号４：翻訳終結部位
【化４】
2007527369.tif 000007
【０１２５】
配列番号５：実施例１の融合構築物
【化５】
2007527369.tif 000008
2007527369.tif 000009
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凡例：サッカロミセス・セレビシエ由来の５’ＵＴＲ−一重線
ＨＳＡ／ＭＦα−１融合リーダー配列−太字
第一のコドン最適化ＨＳＡコード領域−破線
第二のコドン最適化ＨＳＡコード領域−文字飾りなし
翻訳終結部位−二重線
【０１２６】
配列番号６：ＰＲＢＪＭ１
【化６】
2007527369.tif 000012
【０１２７】
配列番号７：ＰＲＢＪＭ３
【化７】
2007527369.tif 000013
【０１２８】
配列番号８
【化８】
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【０１２９】
配列番号９：ＰＲＢＪＭ１
【化９】
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【０１３０】
配列番号１０：ＰＲＢＪＭ３
【化１０】
2007527369.tif 000018
【０１３１】
配列番号１１：ＶＣ０５３
【化１１】
2007527369.tif 000019
【０１３２】
配列番号１２：ＶＣ０５４
【化１２】
2007527369.tif 000020
【０１３３】
配列番号１３：ＶＣ０５７
【化１３】
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【０１３４】
配列番号１４：ＶＣ０５８
【化１４】
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【０１３５】
配列番号１５
【化１５】
2007527369.tif 000023
【０１３６】
配列番号１６
【化１６】
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【０１３７】
配列番号１７：実施例２の融合構築物
【化１７】
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凡例：サッカロミセス・セレビシエ由来の５’ＵＴＲ−一重線
ＨＳＡ／ＭＦα−１融合リーダー配列−太字
天然ＨＳＡ  ｃＤＮＡコード領域−破線
第一のコドン最適化ＨＳＡコード領域−文字飾りなし
翻訳終結部位−二重線
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】プラスミドＡのプラスミド地図を示す。
【図２】プラスミドＢのプラスミド地図を示す。
【図３】プラスミドＣのプラスミド地図を示す。
【図４】プラスミドＤのプラスミド地図を示す。
【図５】プラスミドＥのプラスミド地図を示す。
【図６】プラスミドｐＡＹＥ６３９のプラスミド地図を示す。
【図７】プラスミドｐＡＹＥ４３９のプラスミド地図を示す。
【図８】プラスミドｐＡＹＥ４６６のプラスミド地図を示す。
【図９】プラスミドｐＡＹＥ６４０のプラスミド地図を示す。
【図１０】プラスミドＦのプラスミド地図を示す。
【図１１】プラスミドＧのプラスミド地図を示す。
【図１２】プラスミドＨのプラスミド地図を示す。
【図１３】プラスミドＩのプラスミド地図を示す。
【図１４】プラスミドＪのプラスミド地図を示す。
【図１５】プラスミドＫのプラスミド地図を示す。
【図１６】プラスミドＬのプラスミド地図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2007527369.tif 000057
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