(57)【要約】本発明は、患者の癌を治療または予防するためのワクチンとしての腫瘍関連HLA制限抗原、特に、HLA-A2制限抗原を提供する。特定の局面において、プロテイナーゼ3ペプチドを提供する。このようなペプチドを使用して、標的タンパク質細胞の過剰発現に基づいて骨髄性白血病を優先的に攻撃する特異的CTLを誘発することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
PR1以外のプロテイナーゼ-3ペプチドを含むワクチン。
【請求項２】
プロテイナーゼ-3ペプチドが、
2007504149.tif 000040
またはそのフラグメントからなる群より選択される、請求項1記載のワクチン。
【請求項３】
プロテイナーゼ-3ペプチドが、
2007504149.tif 000041
またはそのフラグメントからなる群より選択される修飾ペプチドである、請求項1記載のワクチン。
【請求項４】
アジュバントをさらに含む、請求項1記載のワクチン。
【請求項５】
アジュバントが、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ミョウバン、カルメット-ゲラン桿菌、接着分子のアゴニストおよび修飾因子、破傷風トキソイド、イミキモド（imiquinod）、モンタニド（montanide）、MPL、ならびにQS21からなる群より選択される、請求項4記載のワクチン。
【請求項６】
免疫賦活薬をさらに含む、請求項1記載のワクチン。
【請求項７】
複数のペプチドを含む、請求項1記載のワクチン。
【請求項８】
ペプチドが治療すべき腫瘍に依存する、請求項7記載のワクチン。
【請求項９】
ペプチドが患者のHLA型に依存する、請求項7記載のワクチン。
【請求項１０】
抗原提示細胞をさらに含む、請求項1記載のワクチン。
【請求項１１】
抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項10記載のワクチン。
【請求項１２】
樹状細胞をペプチドでパルスまたは負荷し、かつペプチドに対するおよびそれにより腫瘍に対するＴ細胞免疫を刺激するための細胞ワクチンとして使用する、請求項11記載のワクチン。
【請求項１３】
第2の腫瘍関連HLA制限ペプチドをさらに含む、請求項1記載のワクチン。
【請求項１４】
第2の腫瘍関連HLA制限ペプチドが、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11、HLA-B7、HLA-B27、またはHLA-B35制限ペプチドである、請求項13記載のワクチン。
【請求項１５】
患者に治療有効量のPR1以外のプロテイナーゼ-3ペプチドを含むワクチンを投与する工程を含む、患者の癌を治療または予防する方法。
【請求項１６】
方法が、複数回ワクチンを投与する工程を含む、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
治療有効量が0.20mg〜5.0mgの範囲である、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
治療有効量が0.025mg〜1.0mgの範囲である、請求項15記載の方法。
【請求項１９】
治療有効量が2.0mg〜5.0mgの範囲である、請求項15記載の方法。
【請求項２０】
癌細胞が白血病細胞である、請求項15記載の方法。
【請求項２１】
白血病細胞が、血液癌細胞、骨髄性白血病細胞、単球性白血病細胞、骨髄球性白血病細胞、前骨髄球性白血病細胞、骨髄芽球性白血病細胞、リンパ球性白血病細胞、急性骨髄形成白血病細胞、慢性骨髄形成白血病細胞、リンパ芽球性白血病細胞、有毛状細胞性白血病細胞、骨髄異形成細胞、またはT-LGL（Ｔ大顆粒リンパ球性）白血病細胞である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
癌細胞が充実性腫瘍細胞である、請求項15記載の方法。
【請求項２３】
充実性腫瘍細胞が、膀胱癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、前立腺癌細胞、肝臓癌細胞、膵臓癌細胞、胃癌細胞、精巣癌細胞、脳腫瘍細胞、卵巣癌細胞、リンパ腺癌細胞、皮膚癌細胞、脳腫瘍細胞、骨癌細胞、軟組織癌細胞である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
ワクチンを全身投与する、請求項15記載の方法。
【請求項２５】
ワクチンを、吸入または局所投与によって、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内、腫瘍内、経口、経皮的、鼻腔内、口腔内、直腸内、膣内に投与する、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
ワクチンを局所（locally）投与する、請求項15記載の方法。
【請求項２７】
ワクチンを直接腫瘍内注射によって投与する、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
ワクチンを腫瘍脈管構造への注射によって投与する、請求項26記載の方法。
【請求項２９】
ワクチンを、ペプチドをパルスまたは負荷した抗原提示細胞によって投与する、請求項26記載の方法。
【請求項３０】
抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
ワクチンが細胞ワクチンである、請求項29記載の方法。
【請求項３２】
抗原提示細胞が一つまたは複数のペプチドを含む、請求項29記載の方法。
【請求項３３】
治療ポリペプチド、治療ポリペプチドをコードする核酸、化学療法薬、免疫療法薬、または放射線治療薬である第2の抗癌薬で患者を治療する工程をさらに含む、請求項15記載の方法。
【請求項３４】
第2の抗癌薬をワクチンと同時投与する、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
第2の抗癌薬をワクチンとは異なる時間に投与する、請求項33記載の方法。
【請求項３６】
化学療法薬が、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ミトキサントロン、シスプラチン、プロカルバジン、マイトマイシン、カルボプラチン、ブレオマイシン、エトポシド、テニポシド、メクロレタミン（mechlroethamine）、 シクロホスファミド、イフォスファミド、メルファラン、クロラムブシル、イフォスファミド、メルファラン、ヘキサメチルメラミン、チオペタ（thiopeta）、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾトシン、ダカルバジン、アドリアマイシン、5-フルオロウラシル (5FU)、カンプトセシン、アクチノマイシン-D、過酸化水素、ニトロソ尿素（nitrosurea）、プリコマイシン（plicomycin）、 タモキシフェン、タキソール、トランスプラチナ（transplatinum）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、TRAIL R1およびR2受容体抗体またはアゴニスト、ドラスタチン-10、ブリオスタチン、アナマイシン（annamycin）、 ミロターグ（mylotarg）、フェニル酢酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、メトトレキセート、ダシタビン（dacitabine）、イマチナブ（imatinab）メシレート(Gleevec)、インターフェロン-α、ベバシズマブ、セツキシマブ、サリドマイド、ボルテゾミブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アザシチジン、5-AZA-2'デオキシシチジン、Revlimid、2C4、抗血管新生因子、シグナルトランスデューサーターゲティング薬、インターフェロン-γ、IL-2、ならびにIL-12からなる群由来である、請求項33記載の方法。
【請求項３７】
免疫療法薬が、GM-CSF、CD40リガンド、抗CD28mAb、抗CTL-4mAb、抗4-lBB(CD137)mAb、およびオリゴヌクレオチドからなる群より選択される、請求項33記載の方法。
【請求項３８】
以下の段階を含む、患者の癌を治療または予防する方法：
（a）患者のCTLをPR1以外のプロテイナーゼ3ペプチドと接触させる工程；および
（b）治療有効量の工程（b）のCTLを該患者に投与する工程。
【請求項３９】
エクスビボ法またはインビボ法によって投与前にCTLを拡大する工程をさらに含む、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
接触が、ペプチドを負荷されているか、発現構築物からペプチドを発現する抗原提示細胞を提供する工程を含む、請求項38記載の方法。
【請求項４１】
ペプチドに特異的なT細胞受容体でトランスフェクトしたCTLを提供する工程をさらに含む、請求項38記載の方法。
【請求項４２】
治療による利点を提供するために必要なCTL細胞の治療有効量は、対象の体重1kgあたり約0.1×105〜約5×107細胞である、請求項38記載の方法。
【請求項４３】
患者に、PR1以外のプロテイナーゼ-3ペプチドをコードする発現構築物を含む、治療有効量のワクチンを投与する工程を含む、患者の癌を治療または予防する方法。
【請求項４４】
発現構築物が非ウイルス発現構築物である、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
発現構築物がウイルス発現構築物である、請求項43記載の方法。
【請求項４６】
発現構築物が第2の腫瘍関連ペプチドをコードする、請求項43記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1.発明の分野
本発明は、一般に、癌および免疫療法の分野に関する。より詳細には、本発明は、免疫治療ペプチドの同定および癌の治療および予防のためのペプチドワクチンの開発に関する。
【０００２】
本出願は、2003年8月26日提出の米国特許仮出願第60/489,238号（その全内容が参照により本明細書に組み入れられる）の優先権の恩典を主張する。
【０００３】
政府は、国立衛生研究所の助成金番号RO1 CA81247-02およびRO1 CA49639-11によって本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
2.関連分野の説明
免疫系は、長い間、癌の制御に関連すると考えられていたが、ヒト癌における特異的かつ有効な免疫応答の証拠を欠いていた。慢性骨髄形成白血病（CML）では、同種骨髄移植（BMT）またはインターフェロン-α2b（IFN-α2b）療法により完全に寛解されるが、疾病制御機構は知られておらず、免疫抗白血病応答に関与し得る。
【０００５】
当技術分野における証拠に基づいて、白血球は抗白血病効果の媒介で役割を果たすと考えられる。研究により、同種ドナーのリンパ球注入（DLI）を使用して同種BMT後の再発した骨髄性白血病が治療されることが証明されている（Giralt and Kolb, 1996; Kolb and Holler, 1997 ; Kolb et al., 1995; Kolb et al.,1996 ; Antin, 1993）。元の骨髄（BM）ドナー由来のリンパ球の輸注により、慢性期（CP）の慢性骨髄形成白血病（CML）患者の約70％〜80％で血液学的応答および細胞遺伝学的応答の両方が誘導される（Kolb et al., 1996, Holler, 1997）。AMLのためのDLI後の寛解は、一般に、慢性期CMLで得た寛解ほど永続的ではなく、免疫応答の発生速度をしのぐ急速な腫瘍成長速度を反映し得る。さらに、骨髄性形態の白血病を罹患したほとんどの患者は、関連する移植片対白血病（GVL）効果により患者が治癒する同種骨髄移植で治療することができない限り、この疾患で死亡する。しかしながら、移植片対宿主病（GVHD）および移植関連毒性によってこの治療が制限される。GVLはGHVDと分離可能であり、白血病関連抗原への免疫応答のターゲティングにより、GVHDを発症することなくGVLを患者に導入することが可能であると考えられる。
【０００６】
したがって、より多くの抗原（すなわち、白血病抗原または他の癌に対する抗原）を測定することができる場合、および多数の最も強力な抗原特異的細胞毒性Tリンパ球（CTL）を得ることができる場合、ワクチンの標的または養子免疫療法で使用するための特異的T細胞の生成のための標的としての抗原を使用して、白血病特異的療法、乳癌特異的療法などを開発可能であろう。
【０００７】
白血病特異的抗原などのGVL効果の標的抗原の性質を決定するために、当技術分野において種々の方法が使用されている。例えば、レシピエントの造血組織のみで発現するタンパク質に由来する組織制限副組織適合抗原（mHA）は、同種ドナーT細胞の標的であることが示されている。異なるmHAに対する同種反応性を証明する異種T細胞クローンが、HLA適合ドナーを使用したBMT後に重症GVHDを罹患した患者から確立されている（Faber et al., 1995a; Faber et al., 1995b; Faber et al., 1996; van der Harst et al., 1994; Molldrem et al., 2000; Gao et al., 2000; den Haan et al., 1998; Clark et al., 2001）。これらのmHA特異的CTLクローンのいくつかは、造血器由来細胞のみと反応し、組織特異性が示唆され（Faber et al., 1996; den Haan et al.,1998）、それにより白血病の潜在的に共有する抗原が示唆される。HA-1およびHA-2として同定された2つのヒトmHAの発現は、造血組織に限定される。HA-2は、MHCクラスI分子から溶離されたペプチド画分をスクリーニングするためのmHA反応性CTLクローンの使用によって非フィラメント形成クラスIミオシンファミリー由来のペプチドとして同定された（den Haan et al., 1995; Faber et al., 1995a）。
【０００８】
したがって、種々の方法によっていくつかのCTL同種抗原が首尾よく定義されているが、非常に手間がかかり、このようにして同定された任意の副抗原（minor antigen）に特異的なCTLが同時に起こるGVHDを伴うことなく白血病特異的免疫を遠くへ送達するかどうかは明確ではない。ある研究では、GVHDは、HLA同一同胞移植片中の副抗原HA-1の相違と密接に相関した（Goulmy et al., 1996;Dolstra et al., 1997）。さらに、これらのmHAをターゲティングする任意の免疫療法アプローチの実際的な限度は、わずか10％の個体が関連HA-1代替対立遺伝子を有し、1％未満の個体がHA-2代替対立遺伝子を有すると予想されるという点であり、これによりドナーの利用可能性が非常に制限される。
【０００９】
白血病特異的CTLエピトープを決定するための別の免疫学的方法または演繹的方法は、BCR-ABL融合領域ペプチドがCML特異的T細胞応答を誘発することができるかどうかを決定するために適用されている。どのタンパク質が選択的抗白血病CTL応答についての潜在的な標的抗原であるかの「経験に基づく推測」に基づいて、ペプチドを合成する。次いで、タンパク質を、アミノ酸配列に基づいて最も一般的なHLA対立遺伝子の結合モチーフに適合する短いペプチドについて試験する。次いで、この方法を使用して、これらのペプチドを合成し、HLA対立遺伝子への結合について試験し、これを使用してインビトロでペプチド特異的CTL応答を誘発する。BCR-ABLがほぼ全て（92％）のフィラデルフィア染色体陽性CML患者に存在するため、潜在的に固有の白血病抗原を示すと考えられる。第9染色体上のエクソンIIの上流（5'）のABLコード配列を、第22染色体に転位置し、インフレームでエクソンIIIの下流（3'）のBCR遺伝子と融合してキメラmRNA（b3a2）（最も一般的な転写物）が得られ、これがキメラタンパク質（p210BCR-ABL）に翻訳される。b3a2 mRNAの翻訳により、融合領域内に固有のアミノ酸（リジン）のコード配列が得られる。このリジンを含むいくつかのHLA-B8制限重複ペプチドは、HLA-B8に結合することができ、これを使用してペプチドがHLA適合正常抗原提示細胞またはHLA-B8陽性CML細胞のいずれかでパルスされた場合のT細胞増殖応答を誘発することができる（Dermime et al., 1995; Bocchia et al., 1995; Bocchia et al., 1996; Faber et al., 1995b; Faber et al., 1996; van der Harst et al., 1994）。しかしながら、b3a2ペプチドを使用してb3a2特異的Tリンパ球株をインビトロで誘発する場合、得られたT細胞は、予めペプチドでパルスしていない新鮮なCML細胞を特異的に溶解することができなかった（Bocchia et al., 1996; van der Harst et al., 1994）。これは、ペプチド特異的CTLの親和性が低いことに起因し得るか、ペプチドをプロセシングするかCML細胞上に提示することができないことに起因し得る。つい最近、可溶性b3a2ペプチド/MHC四量体を使用して、CML患者の末梢血中でb3a2特異的CTLが同定された（Clark et al., 2001）。患者由来の四量体陽性CTLをCML標的細胞を死滅させることができるかどうかを決定するために試験しなかったにもかかわらず、健常なドナーからインビトロで誘発されたb3a2特異的CTLはCML細胞を死滅させることができた（den Haan et al., 1995）。これにより、bcr-abl融合ペプチドはGVL反応の標的であり得ることが示唆される。CML患者に対するワクチンとして与えられたb3a2融合領域由来のペプチドによって12人の患者のうち3人にCTL免疫が誘発されたにもかかわらず、臨床的利点は認められなかった（Pinilla-Ibarz et al., 2000）。
【００１０】
黒色腫および乳癌などの白血病以外の腫瘍では、腫瘍特異的CTLの標的として多数のペプチド抗原が同定されている。これらの研究から明らかなことは、同定されたほぼ全ての腫瘍抗原が正常組織のタンパク質に由来するという点である（Nanda and Sercarz, 1995; Boon et al., 1997）。多くの自己抗原決定基は自己寛容を誘導しないことおよびこれらのペプチド決定基が自己免疫攻撃の標的構造を提供することが現在受け入れられている（Nanda and Sercarz, 1995; Rosenberg and White, 1996; Goulmy et al., 1996;Dermime et al., 1995）。これらのタンパク質は腫瘍中で異常に発現または過剰発現されるため、これらのエピトープを認識するCTLによる相対的腫瘍特異性が存在する（Pardoll, 2002; Pardoll, 1994; Bocchia et al., 1996;Pinilla-Ibarz et al., 2000）。同様に、白血病では、種々の白血病形態で異常に発現するウィルムス腫瘍抗原WT-1に対するCTL免疫は、CML CD34+前駆細胞を死滅させることが証明されている（Gao et al., 2000）。
【００１１】
MAGE-3タンパク質由来の黒色腫ペプチド抗原は、例えば、HLA-A1およびHLA-A2によって黒色腫特異的CTLに提示される（Nanda and Sercarz, 1995; Boon et al., 1997; Rosenberg and White, 1996）。このタンパク質は、黒色腫細胞および正常精巣中に発現されるタンパク質ファミリーに属する。MAGE-3由来ペプチドは、異なる技術（一方は免疫学的方法（Pardoll, 2002）を使用し、他方は腫瘍抗原欠損変異体を使用する遺伝的方法（Nanda and Sercarz, 1995）を使用する）を使用した個別の群によって免疫原性を示すことが判断された。最近、黒色腫患者にワクチン接種するためにMAGE-3を使用した第I相臨床試験によって、いくつかの臨床反応が得られた（Pardoll, 1994）。さらに、チロシナーゼ（gp100）およびMelan-A-MART-1もまた、メラノサイト細胞系譜に特異的な正常な自己タンパク質であり、これらの各抗原上の決定基に特異的T細胞を大多数の黒色腫患者で見出すことができる（Sturrock et al., 1992; Chen et al., 1994）。2つの最近の第II相ワクチン試験により、ペプチドワクチンまたは抗原パルス樹状細胞ワクチンとしてこれらの標的抗原を使用した能動免疫療法の臨床有効性が証明されている。
【００１２】
白血病関連抗原としてPR1（プロテイナーゼ3（P3）由来のHLAA2.1制限9量体）が同定された（Molldrem et al., 2000; Molldrem et al., 1996; Molldrem et al., 1997; Molldrem et al., 1999; Molldrem et al., 2003（それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる））。PR1が白血病関連抗原であるという所見は、Burchert et al. (2002)およびScheibenbogen et al. (2002)によって個別に確認された。したがって、これらの研究により、ヒト白血病関連抗原としてPR1が確立され、PR1特異的CTLがCMLの消失に寄与することが確立された。
【００１３】
いくつかの腫瘍特異的抗原が推定免疫療法標的として同定されているにもかかわらず、より多数の抗原を同定して異なる癌をターゲティングする免疫療法を開発することが当技術分野において以前として非常に必要とされている。したがって、癌治療のための新規のアプローチが必要である。なぜ免疫療法がしばしば失敗するという問題が生じるのかということについての洞察は、白血病および潜在的に他の癌のための免疫療法に対する耐性を修正または克服し、改良するのに役立つ。
【発明の開示】
【００１４】
発明の概要
本発明は、第1の腫瘍関連HLA制限ペプチドを含むワクチンを提供する。HLA制限ペプチドは、PR1以外のプロテイナーゼ-3ペプチドなどのHLA-A2制限ペプチドであり得る。このようなペプチドには、
2007504149.tif 000002
またはそのフラグメントからなる群より選択されるプロテイナーゼ-3ペプチドが含まれる。プロテイナーゼ-3ペプチドは、
2007504149.tif 000003
またはそのフラグメントからなる群より選択される修飾ペプチドであり得る。
【００１５】
ワクチンは、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ミョウバン、カルメット-ゲラン桿菌、接着分子のアゴニストおよび修飾因子、破傷風トキソイド、イミキモド（imiquinod）、モンタニド（montanide）、MPL、ならびにQS21などのアジュバントをさらに含み得る。ワクチンは免疫賦活薬をさらに含み得る。
【００１６】
ワクチンは複数のペプチドを含むことができ、複数のペプチドは、治療すべき腫瘍および/または患者のHLA型に依存し得る。ワクチンは、樹状細胞、より詳細にはペプチドをパルスまたは負荷した樹状細胞などの抗原提示細胞をさらに含むことができ、ペプチド、それによる腫瘍に対するT細胞免疫を刺激するための細胞ワクチンとして使用することができる。
【００１７】
ワクチンは、第2の腫瘍関連HLA制限ペプチドをさらに含み得る。ワクチンは、第3、第4、または第5の腫瘍関連HLA制限ペプチドをさらに含み得る。第2、第3、第4、または第5の腫瘍関連HLA制限ペプチドは、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11、HLA-B7、HLA-B27、またはHLA-B35制限ペプチドであり得る。
【００１８】
別の態様において、患者に治療有効量のPR1以外のプロテイナーゼ-3ペプチドを含むワクチンを投与する工程を含む、患者の癌を治療または予防する方法を提供する。複数回ワクチンを投与することができる。治療有効量が0.20mg〜5.0mgのペプチド範囲、0.025mg〜1.0mgのペプチド範囲、または2.0mg〜5.0mgのペプチド範囲であり得る。
【００１９】
癌細胞は、血液癌細胞、骨髄性白血病細胞、単球性白血病細胞、骨髄球性白血病細胞、前骨髄球性白血病細胞、骨髄芽球性白血病細胞、リンパ球性白血病細胞、急性骨髄形成白血病細胞、慢性骨髄形成白血病細胞、リンパ芽球性白血病細胞、有毛状細胞性白血病細胞、骨髄異形成細胞、またはT-LGL（Ｔ大顆粒リンパ球性）白血病細胞などの白血病細胞であり得る。
【００２０】
癌細胞は、膀胱癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、前立腺癌細胞、肝臓癌細胞、膵臓癌細胞、胃癌細胞、精巣癌細胞、脳腫瘍細胞、卵巣癌細胞、リンパ腺癌細胞、皮膚癌細胞、脳腫瘍細胞、骨癌細胞、軟組織癌細胞などの充実性腫瘍細胞であり得る。
【００２１】
本方法は、吸入または局所投与によって、全身、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内、腫瘍内、経口、経皮的、鼻腔内、口腔内、直腸内、膣内に投与するワクチンを使用することができる。ワクチンを、局所に投与するか直接腫瘍内注射、腫瘍脈管構造への注射、またはペプチドをパルスまたは負荷した抗原提示細胞によって投与することができ、抗原提示細胞は樹状細胞であり得る。抗原提示細胞は、一つまたは複数の異なるペプチドを含むことができる。本方法は細胞ワクチンを使用することができる。
【００２２】
本方法は、治療ポリペプチド、治療ポリペプチドをコードする核酸、化学療法薬、免疫療法薬、または放射線治療薬である第2の抗癌薬で患者を治療する工程をさらに含み得る。第2の抗癌薬をワクチンと同時投与するか、ワクチンとは別に投与することができる。免疫療法薬は、GM-CSF、CD40リガンド、抗CD28mAb、抗CTL-4mAb、抗4-lBB(CD137)mAb、およびオリゴヌクレオチドであり得る。化学療法薬は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ミトキサントロン、シスプラチン、プロカルバジン、マイトマイシン、カルボプラチン、ブレオマイシン、エトポシド、テニポシド、メクロレタミン（mechlroethamine）、 シクロホスファミド、イフォスファミド、メルファラン、クロラムブシル、イフォスファミド、メルファラン、ヘキサメチルメラミン、チオペタ（thiopeta）、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾトシン、ダカルバジン、アドリアマイシン、5-フルオロウラシル (5FU)、カンプトセシン、アクチノマイシン-D、過酸化水素、ニトロソ尿素（nitrosurea）、プリコマイシン（plicomycin）、 タモキシフェン、タキソール、トランスプラチナ（transplatinum）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、TRAIL R1およびR2受容体抗体またはアゴニスト、ドラスタチン-10、ブリオスタチン、アナマイシン（annamycin）、 ミロターグ（mylotarg）、フェニル酢酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、メトトレキセート、ダシタビン（dacitabine）、イマチナブ（imatinab）メシレート(Gleevec)、インターフェロン-α、ベバシズマブ、セツキシマブ、サリドマイド、ボルテゾミブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アザシチジン、5-AZA-2'デオキシシチジン、Revlimid、2C4、抗血管新生因子、シグナルトランスデューサーターゲティング薬、インターフェロン-γ、IL-2、ならびにIL-12であり得る。
【００２３】
さらに別の態様において、（a）患者のCTLをPR1以外のプロテイナーゼ3ペプチドと接触させる工程；および（b）治療有効量の工程（b）のCTLを前記患者に投与する工程を含む、患者の癌を治療または予防する方法を提供する。本方法は、エクスビボ法またはインビボ法によって投与前にCTLを拡大する工程をさらに含み得る。接触は、ペプチドを負荷されているか、発現構築物から前記ペプチドを発現する抗原提示細胞を提供する工程を含む。本方法は、ペプチドに特異的なT細胞受容体でトランスフェクトしたCTLを提供する工程をさらに含み得る。治療による利点を提供するために必要なCTL細胞の治療有効量は、対象の体重1kgあたり約0.1×105〜約5×107細胞であり得る。
【００２４】
なおさらに別の態様において、患者に、PR1以外のプロテイナーゼ-3ペプチドをコードする発現構築物を含む、治療有効量のワクチンを投与する工程を含む、患者の癌を治療または予防する方法を提供する。発現構築物は、非ウイルス発現構築物またはウイルス発現構築物であり得る。発現構築物は、第2の腫瘍関連ペプチドをコードすることもできる。
【００２５】
本明細書中で使用される、用語「a」または「an」は、一つまたは複数を意味する。本明細書中の特許請求の範囲で使用されるように、用語「含む（comprising）」と組み合わせて使用される場合、用語「a」または「an」は、1つまたは複数のことを意味し得る。本明細書中で使用される、「別の」は、少なくとも第2またはそれ以上を意味し得る。
【００２６】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなる。しかしながら、この詳細な説明から本発明の精神および範囲内で種々の変更形態および修正形態が当業者に明らかとなるため、本発明の好ましい態様を示す一方で、詳細な説明および特定の実施例を、例示のみを目的として示す。
【００２７】
実施形態の説明
I.本発明
本発明は、骨髄性白血病を優先的にターゲティングするペプチド反応性CTLを誘発するために使用することができる骨髄性自己タンパク質由来のHLA制限ペプチドの提供によって当技術分野の欠如を克服するのに役立つ。これらのペプチドおよびペプチド反応性CTLを、ワクチンで使用するか養子細胞免疫療法として使用して骨髄性白血病の患者を治療する。
【００２８】
本発明の所見により、PR1ペプチドがこの白血病形態に対するCTL免疫応答に重要な腫瘍抗原であり、抗原特異的T細胞応答がその制御に寄与するという第1の直接的証拠を提供することが示唆される。PR1特異的CTLは、IFN-α2b療法または同種BMT（免疫機構を介して潜在的に作用すると考えられる治療法）を使用して寛解する大部分の患者で見出される。本発明者らは、正常な健常ドナーがPR1に対する既存のCTL免疫を有し、インターフェロン治療後に細胞遺伝学的寛解を示すCML患者はその白血病細胞に対して有効なPR1特異的CTL免疫も有する一方で、細胞遺伝学的応答を示さない患者は有さず、したがって第1の白血病関連腫瘍抗原としてPR1を確立することを示した。本発明はまた、PR1でのワクチン接種が白血病に対する免疫を増強することができるかどうか、応答するTリンパ球が記憶またはナイーブであるかどうか、およびPR1特異的CTLが健常個体と比較してPR1/HLA-A2に対して、高いまたは低い親和性を示すT細胞受容体（TCR）を示すかどうかを決定することを模索する。
【００２９】
本発明の他の局面において、ペプチドがインビトロ技術を使用して同定されていたため、白血病抗原としてのMY2およびMY4のインビボでの関連性を試験する。白血病患者およびそのHLA適合骨髄ドナーにおけるCTLによる先在するMY2およびMY4反応性も試験する。本発明は、MY2およびMY4特異的CTLを、正常ドナーと類似の応答の確立された誘発方法を使用して白血病患者からインビトロで誘発することができるかどうかを決定する。本発明では、GVLを増強させながらGVHDを無効にする方法として、NST後にMY4特異的CTLを急性骨髄性白血病患者に養子免疫伝達させる第I相臨床試験も提供する。インビトロでのMY4応答を増強するための方法も評価し、高MHC結合が予想されるMPO由来の残りのHLA-A2.1制限ペプチド、HLA-A3制限ペプチド、およびHLA-B7制限ペプチドを、MY4およびPR1に類似する骨髄性白血病反応性CTL応答を誘発する能力について試験する。
【００３０】
II.定義
句「単離された」または「生物学的に純粋な」は、その天然の状態で見出される通常物質に付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない物質をいう。したがって、本発明の単離ペプチドは、好ましくは、そのインサイチュー環境で通常ペプチドと会合した物質を含まない。
【００３１】
「主要組織適合遺伝子複合体」または「MHC」は、生理学的免疫応答を担う細胞相互作用の制御で役割を果たす遺伝子のクラスターである。ヒトでは、MHC複合体は、HLA複合体としても公知である。MHC複合体およびHLA複合体の詳細な説明については、Paul, 1993を参照されたい。
【００３２】
「ヒト白血球抗原」または「HLA」は、ヒトクラスIまたはクラスII主要組織適合遺伝子複合体（MHC）タンパク質である（例えば、Stites, 1994を参照されたい）。
【００３３】
本明細書中で使用される、「HLAスーパータイプ（supertype）ファミリーまたはファミリー」は、共有するペプチド結合特異性に基づいて分類されたHLA分子組を説明する。一定のアミノ酸モチーフを保有するペプチドに対していくらか類似の結合親和性を共有するHLAクラスI分子を、HLAスーパータイプに分類する。用語「HLAスーパーファミリー」、「HLAスーパータイプファミリー」、「HLAファミリー」、および「HLA xx様スーパータイプ分子」（xxは、特定のHLA型を示す）は、同義語である。
【００３４】
用語「モチーフ」は、特定のHLA分子によって認識される、定義された長さのペプチド、通常、クラスI HLAモチーフについては約8〜13個のアミノ酸およびクラスII HLAモチーフについては約6〜約25個のアミノ酸のペプチド中の残基パターンをいう。ペプチドモチーフは、典型的には、各ヒトHLA対立遺伝子によってコードされる各タンパク質で異なり、一次および二次アンカー残基のパターンが異なる。
【００３５】
「スーパーモチーフ」は、2つ以上のHLA対立遺伝子によってコードされるHLA分子で共有されるペプチド結合特異性である。したがって、好ましくは、2つ以上のHLA抗原によって高親和性または中程度の親和性（本明細書中で定義される）を有すると認識される。
【００３６】
「交差反応性結合」は、ペプチドが複数のHLA分子によって結合されることを示し、同義語は、「縮重結合」である。
【００３７】
「防御免疫応答」は、疾患の症状または進行を防止するか少なくとも部分的に停止させる感染因子由来の抗原または腫瘍抗原に対するCTLおよび/またはHTL応答をいう。免疫応答には、ヘルパーT細胞の刺激によって促進された抗体応答も含まれ得る。
【００３８】
III.HLA制限ペプチド
本発明は、腫瘍関連HLA制限ペプチドを含むワクチンを提供する。「ヒト白血球抗原」または「HLA」は、ヒトクラスIまたはクラスII主要組織適合遺伝子複合体（MHC）タンパク質である（例えば、Stites, 1994を参照されたい）。本明細書中で使用される、「HLAスーパータイプまたはファミリー」は、共有するペプチド結合特異性に基づいて分類されたHLA分子組を説明する。一定のアミノ酸モチーフを保有するペプチドに対していくらか類似の結合親和性を共有するHLAクラスI分子を、HLAスーパータイプに分類する。用語「HLAスーパーファミリー」、「HLAスーパータイプファミリー」、「HLAファミリー」、および「HLA xx様スーパータイプ分子」（xxは、特定のHLA型を示す）は、同義語である。本発明のHLA制限分子には、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11、HLA-B7、HLA-B27、またはHLA-B35が含まれるが、これらに限定されない。
【００３９】
HLA制限抗原/ペプチドには、以下が含まれるが、これらに限定されない:707アラニンプロリン(707-AP);アルファ(α)-フェトプロテイン(AFP);T細胞4によって認識される腺癌抗原(ART-4);B抗原(BAGE);β-カテニン/m、β-カテニン/変異;切断点クラスター領域-Abelson(Bcr-abl);黒色腫上のCTL認識抗原(CAMEL);癌胎児性抗原ペプチド-1(CAP-1);カスパーゼ-8(CASP-8);変異細胞分裂周期27(CDC27m);変異サイクリン依存性キナーゼ4(CDK4/m);癌胎児性抗原(CEA);癌/精巣(抗原)(CT);シクロフィリンB(Cyp-B);分化抗原黒色腫(DAM-6およびDAM-10のエピトープは等価であるが、遺伝子配列は異なる。DAM-6はMAGE-B2とも呼ばれ、DAM-10はMAGE-B1とも呼ばれる) (DAM);変異伸長因子2 (ELF2M) ; Ets変異遺伝子6/急性骨髄性白血病1遺伝子ETS(ETV6-AM1);糖タンパク質250(G250);G抗原 (GAGE);N-アセチルグルコサミルトランスフェラーゼV(GnT-V) ;糖タンパク質100 Kd(GplOO);ヘリカーゼ（helicose）抗原(HAGE);ヒト上皮受容体-2/神経(HER-2/neu);HLA-A2遺伝子中のα2-ドメインのα-ヘリックスの残基170でのアルギニン（R）からイソロイシン（I）への交換(HLA-A*0201-R1701);ヒト乳頭腫ウイルスE7(HPV-E7);変異熱ショックタンパク質70-2(HSP70-2M);ヒト印環細胞腫瘍-2(HST-2);ヒトテロメラーゼ逆転写酵素 (hTERTまたはhTRT);腸カルボキシルエステラーゼ(iCE);データベース中に出現する遺伝子名(KIAA0205);L抗原(LAGE);低密度脂質受容体/GDP-L-フコース(LDLR/FUT);β-D- ガラクトシダーゼ2-α-L-フコシルトランスフェラーゼ;黒色腫抗原(MAGE);T細胞-1によって認識される黒色腫抗原/黒色腫抗原A(MART-1/Melan-A);メラノコルチン1受容体(MC1R);変異ミオシン(Myosin/m);ムチン1(MUC1);黒色腫(MUM-1、-2、-3);遍在変異1、2、3; 患者M88のNA cDNAクローン(NA88-A);ニューヨーク食道1（New York-esophageous 1）(NY- ESO-1);タンパク質15(P15);190のタンパク質(p190 minor bcr-abl);KD bcr-abl;前骨髄球性白血病/レチノイン酸受容体α(Pml/RARα);優先的に発現される黒色腫抗原(PRAME);前立腺特異的抗原(PSA);前立腺特異的膜抗原(PSM);腎臓抗原(RAGE);腎臓遍在1または2(RU1またはRU2);肉腫抗原(SAGE);扁平上皮抗原拒絶腫瘍1または3(SART-1またはSART-3);転位置Etsファミリー白血病/急性骨髄性白血病1(TEL/AML1);変異トリオースリン酸イソメラーゼ(TPI/m);チロシナーゼ関連タンパク質1またはgp75(TRP-1); チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2);TRP-2/イントロン2(TRP-2/INT2) ;ウィルムス腫瘍遺伝子(WT1)または当業者に公知の任意のこのようなHLA制限抗原もしくはペプチド。
【００４０】
特定の態様において、本発明は、癌治療のためのHLA制限ペプチドの使用を意図する。
【００４１】
IV.骨髄制限抗原
黒色腫抗原に対する免疫についての研究事項を骨髄性白血病抗原研究に適合させるために、白血病で高度に発現される骨髄制限正常タンパク質を研究する。骨髄性白血病は、顆粒形成に関連する多数の分化抗原を発現する。これらの抗原には、プロテイナーゼ-3（Pr3またはP3）、好中球エラスターゼ、ミエロペルオキシダーゼ、サイクリンE1、サイクリンD、またはサイクリンE2が含まれ得るが、これらに限定されない。Pr3およびミエロペルオキシダーゼなどの骨髄制限ペプチドの特定の例を本明細書において記載する。
【００４２】
P3および2つの他のアズール親和性顆粒タンパク質（好中球エラスターゼおよびアズロシジン（azurocidin））は調和して調節されており、幹細胞から単球または顆粒球への正常な骨髄分化を担う転写因子PU.1およびC/EBPαはその発現の媒介で重要である（Lewin et al., 2002）。これらの転写因子は、白血病誘発に関与しており（Behre et al., 1999）、P3アンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞分裂を停止させてHL-60前骨髄球性白血病細胞株の成熟を誘導するため、P3自体も白血病表現型の維持において重要であり得る（Bories et al., 1989）。P3がヴェゲナー肉芽腫症における自己抗原攻撃の標的であるという所見は、これらのタンパク質におけるT細胞抗原の同定に不可欠である（Franssen et al., 1994）。
【００４３】
A.プロテイナーゼ3ペプチドおよびワクチン
Pr3は、一次アズール親和性顆粒で保存され、骨髄分化の前骨髄球期で最大限に発現される26kDa中性セリンプロテアーゼである（Sturrock et al., 1992; Chen et al., 1994; Muller-Berat et al., 1994; Lewin et al., 2002 ; Behre et al., 1999）。ヒト遺伝子は5つのエクソンを含み、第19p染色体に局在し、クローン化されている（Sturrock et al., 1992）。Pr3は、種々の骨髄性白血病細胞（75％のCML患者、約50％の急性骨髄性白血病患者、および約30％の骨髄異形成症候群患者が含まれる）で過剰発現する（Dengler et al., 1995）。
【００４４】
Pr3はまた、ワクチンおよびT細胞指向療法のための魅力的な標的にするいくつかの特徴を有する。Pr3は、ヒト骨髄性白血病で過剰発現し、一般に、全白血病で一様である。抗原に対して得られた免疫応答により、白血病が完全に根絶する。Pr3は白血病表現型の維持に重要であり得るため、免疫療法後にPr3喪失変異体が得られる任意の選択圧により、「腫瘍エスケープ」に至ることができない。プレプロペプチドリーダー配列による小胞体にターゲティングされたタンパク質として、このタンパク質はMHCクラスI抗原プロセシング経路で依然として利用可能であるため、任意のTAP欠損腫瘍変異体は、抗白血病免疫応答に感受性を示すままであり得る。さらに、白血病ワクチンにおける免疫化抗原としてのPr3由来の合成ペプチドの使用により、以下の実用上の利点が提供される：比較的容易な構築および産生、化学的安定性、ならびに感染性または発癌性の欠如。
【００４５】
PR1と呼ばれる小ペプチド（骨髄性白血病細胞で見出されたプロテイナーゼ3（P3）の巨大分子の一部）を使用して、免疫細胞、特に細胞毒性T細胞（CTL）を生成することができることが示されている。PR1は、HLA-A2.1に結合し、それによってインビトロでHLA-A2.1+正常ドナーからCTLを誘発するアミノ酸169〜177を含む9アミノ酸ペプチドである。これらのPR1特異的CTLは、HLA同一正常ドナー骨髄を超える同種HLA-A2.1+骨髄性白血病細胞に対する優先的細胞毒性を示す（Molldrem et al., 1996）。PR1特異的CTLはまた、CML患者の骨髄由来のコロニー形成単位顆粒球-マクロファージ（CFU-GM）を阻害するが、正常HLA適合ドナー由来のCFU-GMを阻害しない（Molldrem et al., 1997）。正常な健常ドナーから生成されたこれらのCTLは優先的に白血病細胞を死滅させる一方で、正常な骨髄細胞は無傷のままである。つい最近、BMTまたはインターフェロンのいずれかでの治療後に寛解し始めたCML患者は、その白血病細胞を死滅させる非常に有効なPR1特異的CTLの数が非常に増加することが見出された。したがって、PR1は、新鮮なヒト骨髄性白血病細胞の特異的CTL溶解を誘発することができる同定された第1のペプチド抗原である。
【００４６】
B.ミエロペルオキシダーゼ（MPO）ペプチドおよびワクチン
本発明はまた、好中球アズール親和性顆粒の主要成分を構成する初期骨髄分化時に合成されるヘムタンパク質であるミエロペルオキシダーゼ（MPO）（別の骨髄制限タンパク質）のペプチドを提供する。ミエロペルオキシダーゼは一本鎖前駆体として産生され、その後軽鎖および重鎖に切断される。成熟ミエロペルオキシダーゼは、2つの軽鎖および2つの重鎖から構成される四量体である（Franssen et al., 1996）。この酵素は、好中球の殺菌活性の中核をなす次亜ハロゲン酸を産生する。重要なことには、MPO（Pr3など）は、種々の骨髄性白血病細胞（75％のCML患者、約50％の急性骨髄性白血病患者、および約30％の骨髄異形成症候群患者が含まれる）で過剰発現する（Williams et al., 1994）。Pr3がヴェゲナー肉芽腫症における自己免疫攻撃の標的である一方で、MPOは小血管脈管炎における標的抗原であり（Franssen et al., 1996; Brouwer et al., 1994; Molldrem et al., 1996）、これらの疾患を罹患した患者におけるT細胞および抗体免疫の両方でそれぞれ証明されている。ヴェゲナー肉芽腫症は、Pr3に対する特異性を有する細胞質抗好中球細胞質抗体（cANCA）の産生に関連する一方で（Molldrem et al., 1997）、微視的多発性血管炎およびチャーグ-ストラウス症候群はMPOに対する特異性を有する核周囲ANCA（pANCA）に関連する（Molldrem et al., 1999; Savage et al., 1999）。このような白血病患者から採取したT細胞は、好中性顆粒由来の粗抽出物および精製タンパク質に応答して増殖する（Brouwer et al., 1994; Yee et al., 1999）。これらの所見（表1にまとめている）は、これらのタンパク質に対するT細胞応答は比較的容易に誘発され得ることを示す。
【００４７】
（表１）T細胞はミエロペルオキシダーゼ（MPO）に応答する
2007504149.tif 000004
【００４８】
V.腫瘍関連HLA制限ペプチドおよびワクチン
一定の態様において、本発明は、癌治療でワクチンとして使用するためのプロテイナーゼ3（P3またはPr3）またはミエロペルオキシダーゼ（MYO）などの腫瘍関連HLA制限ペプチドまたは少なくとも1つのHLA制限ペプチドを含む抗原組成物に関する。
【００４９】
本明細書中で使用される、「抗原性組成物」は、抗原（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）、抗原をコードする核酸（例えば、抗原発現ベクター）、または抗原を発現または提示する細胞を含み得る。ワクチンとして有用な本発明の腫瘍関連HLA制限ペプチドまたは抗原などの抗原性組成物について、抗原性組成物は、細胞、組織、または動物（例えば、ヒト）において抗原に対して免疫応答を誘導しなければならない。特定の態様において、抗原性組成物は、
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に示す配列またはその免疫学的に機能的な等価物の全部または一部を含むかコードする。
【００５０】
本明細書中で使用される、「アミノ酸分子」または「アミノ酸残基」は、任意の天然に存在するアミノ酸、任意のアミノ酸誘導体、または当技術分野において公知の任意のアミノ酸模倣物（修飾アミノ酸または異常アミノ酸が含まれる）をいう。一定の態様において、タンパク質またはペプチドの残基は連続的であり、アミノ酸残基配列を妨害する任意の非アミノ酸を含まない。他の態様において、配列は、一つまたは複数の非アミノ酸部分を含み得る。特定の態様において、タンパク質またはペプチド残基の配列に一つまたは複数の非アミノ酸部分を割り込ませることができる。特定の局面において、本発明の組成物は、約5〜約100アミノ酸またはそれ以上の長さのペプチドを使用する。
【００５１】
タンパク質またはペプチドを、当業者に公知の任意の技術（標準的な分子生物学的技術によるタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドの発現、天然供給源からのタンパク質もしくはペプチドの単離、またはタンパク質もしくはペプチドの化学合成が含まれる）によって作製することができる。種々の遺伝子に対応するヌクレオチド配列ならびにタンパク質配列、ポリペプチド配列、およびペプチド配列は以前に開示されており、当業者に公知のコンピュータ化データベースで見出すことができる。このようなデータベースの1つは、National Center for Biotechnology InformationのGenbankおよび国立衛生研究所ウェブサイトにあるGenPeptデータベースである。公知の遺伝子のコード領域を、本明細書において開示され、かつ当業者に公知の技術を使用して増幅および/または発現することができる。または、種々の市販のタンパク質調製物、ポリペプチド調製物、およびペプチド調製物が当業者に公知である。
【００５２】
用語「ペプチド」を、典型的には、隣接アミノ酸のαアミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合によって互いに連結した一連の残基（典型的にはL-アミノ酸）を示すために、本明細書において「オリゴペプチド」と交換可能に使用する。本発明の好ましいCTL誘導オリゴペプチドは、13残基長以下であり、通常、約8残基と約11残基、好ましくは9残基または10残基との間からなる。好ましいHTL誘導オリゴペプチドは、約50残基長未満であり、通常には約6残基〜約30残基の間、より通常には約12残基〜25残基の間、しばしば約15残基〜20残基の間からなる。
【００５３】
一定の態様において、少なくとも1つのペプチド分子のサイズは、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約36、約37、約38、約39、約40、約41、約42、約43、約44、約45、約46、約47、約48、約49、約50、約60またはそれ以上のアミノ分子残基、およびこれらから導き出される任意の範囲を含み得るが、これらに限定されない。
【００５４】
「免疫原性ペプチド」または「ペプチドエピトープ」は、ペプチドがHLA分子に結合し、CTLおよび/またはHTL応答を誘導するような対立遺伝子特異的モチーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドである。したがって、本発明の免疫原性ペプチドは、適切なHLA分子に結合し、その後に免疫原性ペプチドが由来する抗原に対して細胞毒性T細胞応答またはヘルパーT細胞応答を誘導することができる。
【００５５】
したがって、用語「タンパク質性組成物」は、天然に合成されたタンパク質中に20種の一般的なアミノ酸の少なくとも1つまたは少なくとも1つの修飾アミノ酸もしくは異常アミノ酸（以下の表2に示すものが含まれるがこれらに限定されない）を含むアミノ分子配列を含む。
【００５６】
（表２）修飾アミノ酸および異常アミノ酸
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【００５７】
一定の態様において、タンパク質性組成物は、少なくとも1つのタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを含む。さらなる態様において、タンパク質性組成物は、生体適合性のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを含む。本明細書中で使用される、用語「生体適合性」は、本明細書において記載の方法および量にしたがって、所与の生物に適用または投与した場合に有意に不利な効果を生じない物質をいう。このような不利または望ましくない効果は、有意な毒性または不都合な免疫反応などの効果である。好ましい態様において、組成物を含む生体適合性のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、一般に、毒素、病原体、および有害免疫原をそれぞれ本質的に含まない哺乳動物のタンパク質もしくはペプチドまたは合成タンパク質である。
【００５８】
一定の態様において、タンパク質性化合物を精製することができる。一般に、「精製された」は、種々の他のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを除去するために分画に供し、例えば、当業者に公知の特定のまたは所望のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドについてタンパク質アッセイによって評価したところ、組成物がその活性を実質的に保持している特定のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド組成物をいう。
【００５９】
一定の態様において、タンパク質性組成物は、少なくとも1つの抗体（例えば、PR1またはミエロペルオキシダーゼに対する抗体）を含み得る。本明細書中で使用される、用語「抗体」は、IgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEなどの任意の免疫学的結合因子を広範にいうことを意図する。IgGおよび/またはIgMは生理学的状況で最も一般的な抗体であり、かつ研究所で最も容易に作製されるため、一般に、IgGおよび/またはIgMが好ましい。
【００６０】
用語「抗体」を、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子をいうために使用し、これらには、Fab'、Fab、F(ab')2、単一ドメイン抗体(DABs)、Fv、およびscFv(単鎖抗体Fv)などの抗体フラグメントが含まれる。種々の抗体ベースの構築物およびフラグメントの調製技術および使用技術は当技術分野において周知である。抗体の調製手段および特徴づけ手段も当技術分野において周知である（例えば、Harlow et al., 1988（参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい）。
【００６１】
実質的に任意のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド含有成分を本明細書において開示の組成物および方法で使用することができることが意図される。しかしながら、タンパク質性物質が生体適合性であることが好ましい。一定の態様において、組成物をより正確または容易に組織に適用可能であり、手順を通して組織と接触させて保持可能であるという点で、より粘性の高い組成物の形成が有利であることが想定される。このような場合、ペプチド組成物、より好ましくはポリペプチド組成物またはタンパク質組成物の使用が意図される。粘性範囲には、約40〜約100ポアズが含まれるが、これらに限定されない。一定の局面において、約80〜約100ポアズの粘度が好ましい。
【００６２】
A.HLA制限ペプチドの融合タンパク質
特定の種類の挿入異種は融合タンパク質である。この分子は、一般に、N末端またはC末端で第2のポリペプチドの全部または一部に連結した天然分子の全部または実質的に一部を有する。例えば、融合物は、典型的には、異種宿主におけるタンパク質の組換え発現を可能にするための他の種由来のリーダー配列を使用する。別の有用な融合物は、融合タンパク質の精製を容易にするための抗体エピトープなどの免疫学的に活性なドメインが付加されている。融合物の接合部または接合部付近に切断部位を含めることにより、精製後の外来ポリペプチドの除去が容易になる。他の有用な融合物には、加水分解酵素などの酵素由来の活性部位などの機能的ドメイン、グリコシル化ドメイン、細胞ターゲティングシグナル、または膜貫通領域の連結が含まれる。
【００６３】
B.HLA制限ペプチドの異種
本発明のペプチドが置換異種、挿入異種、または欠失異種などのアミノ酸配列異種をさらに使用することができることが意図される。欠失異種は、天然タンパク質の一つまたは複数の残基を欠く。挿入変異体は、典型的には、ポリペプチド中の非末端点に物質が付加されている。置換は、既存のアミノ酸への変更である。これらの配列異種により、短縮、点変異、およびフレームシフト変異が起こり得る。当業者に公知のように、これらの変異によって合成ペプチドを生成することができる。
【００６４】
アミノ酸配列異種は、配列が上記基準（生物活性の維持が含まれる）を満たす限り、さらなるN末端またはC末端アミノ酸などのさらなる残基を含み得るが、本質的に依然として本明細書において開示の配列の1つに記載されていることも理解される。
【００６５】
以下は、変異、短縮、または修飾されたタンパク質を作製するための本発明のHLA制限ペプチドまたはタンパク質などのタンパク質のアミノ酸の変更に基づいた考察である。例えば、一定のアミノ酸を、Pr3またはMYOタンパク質などの腫瘍関連HLA制限ペプチドまたはタンパク質中の他のアミノ酸と置換して、骨髄細胞などの細胞中でより高いCTL免疫応答を得ることができる。タンパク質の生物学的機能活性を定義するタンパク質の相互作用能力および性質であるため、タンパク質配列中およびその基礎をなす核酸コード配列中に一定のアミノ酸置換を行い、それにより変異、短縮、または修飾されたタンパク質を産生することができる。
【００６６】
このような変化の作製では、アミノ酸のハイドロパシックインデックスを考慮することができる。タンパク質上の相互作用的生物学的機能の付与におけるアミノ酸のハイドロパシックインデックスの重要性は当技術分野において一般に理解されている（Kyte and Doolittle, 1982）。アミノ酸の相対ハイドロパシー性が得られたタンパク質の二次構造に寄与し、言い換えると、タンパク質の他の分子（例えば、酵素、基質、受容体、DNA、抗体、および抗原など）との相互作用を定義することが認められている。
【００６７】
親水性に基づいて類似のアミノ酸を有効に置換することができることも当技術分野において理解されている。米国特許第4554,101号（参照により本明細書に組み入れられる）は、タンパク質の最も高い局所平均親水性は、その隣接アミノ酸の親水性に支配されているため、タンパク質の生物学的性質と相関すると述べている。米国特許第4554,101号に詳述するように、アミノ酸残基に以下の親水性値が割り当てられている。塩基性アミノ酸:アルギニン(+3.0)、リジン(+3.0)、およびヒスチジン(-0.5);酸性アミノ酸:アスパラギン酸(+3.0±1)、グルタミン酸(+3.0±1)、アスパラギン(+0.2)、およびグルタミン(+0.2);親水性非イオン性アミノ酸:セリン(+0.3)、アスパラギン(+0.2)、グルタミン(+0.2)、およびトレオニン(-0.4)、硫黄含有アミノ酸:システイン(-1.0)およびメチオニン(-1.3);疎水性非芳香族アミノ酸:バリン(-1.5)、ロイシン(-1.8)、イソロイシン(-1.8)、プロリン(- 0.5±1)、アラニン(-0.5)、およびグリシン(0);疎水性芳香族アミノ酸:トリプトファン(-3.4)、フェニルアラニン(-2.5)、およびチロシン(-2.3)。
【００６８】
アミノ酸を類似の親水性を有する別のアミノ酸に置換して、生物学的または免疫学的に修飾されたタンパク質を産生することができることが理解される。このような変更では、親水性値が±2以内のアミノ酸置換が好ましく、±1以内のアミノ酸置換が特に好ましく、±0.5以内のアミノ酸置換がさらにより好ましい。
【００６９】
上記概説のように、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性(例えば、疎水性、親水性、電荷、およびサイズなど)に基づく。上記の種々の特徴を考慮した置換の例は当業者に周知であり、アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシンが含まれる。
【００７０】
本発明はまた、Pr3またはMYOタンパク質などの腫瘍関連HLA制限ペプチドの多数の天然の性質を有するが、特徴が変化および/または改良されたポリペプチドの調製のためのペプチド模倣物を使用することができる（例えば、Johnson, 1993を参照されたい）。ペプチド模倣物の使用の背後にある基礎となる論理的根拠は、タンパク質のペプチド骨格が主に抗体および抗原の分子相互作用などの分子相互作用を容易にするような方法でアミノ酸側鎖に方向を合わせて存在することである。これらの原理を、上記概説の原理と組み合わせて使用して、腫瘍関連HLA制限ペプチドの多数の天然の性質を有するが、特徴が変化し、さらに改良された第2世代の分子を操作することができる。
【００７１】
C.腫瘍関連HLA制限ペプチドの精製
一定の態様において、本発明のタンパク質を精製することができる。腫瘍関連HLA制限ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質またはこれらの異種を精製することが望ましいかもしれない。本明細書中で使用される、用語「精製タンパク質またはペプチド」を、他の成分から単離可能であり、このタンパク質またはペプチドをその天然に得ることができる状態と比較して任意の程度で精製される組成物をいうことを意図する。したがって、精製タンパク質またはペプチドはまた、天然に存在し得る環境から遊離されたタンパク質またはペプチドをいう。
【００７２】
一般に、「精製された」は、種々の他の成分を除去するために分画に供され、かつ実質的にその発現した生物活性を保持するタンパク質またはペプチド組成物をいう。用語「実質的に精製された」を使用する場合、この用語は、タンパク質またはペプチドが組成物の主成分を形成する（例えば、組成物中のタンパク質の約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％以上を構成する）組成物をいう。
【００７３】
タンパク質精製技術は、当業者に周知である。これらの技術は、ポリペプチド画分および非ポリペプチド画分への細胞環境のあるレベルの粗分画を含む。他のタンパク質からポリペプチドが分離されると、対象となるポリペプチドを、部分的または完全な精製（または均一になるまでの精製）を達成するためのクロマトグラフィ技術および電気泳動技術を使用してさらに精製することができる。純粋なペプチド調製物に特に適合した分析方法は、イオン交換クロマトグラフィ、排除クロマトグラフィ；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；等電点電気泳動である。他のタンパク質精製方法には、硫酸アンモニウム、PEG、および抗体または熱変性などを使用した沈殿およびその後の遠心分離；ゲル濾過、逆相、ハイドロキシアパタイト、およびアフィニティクロマトグラフィ；ならびにこのような技術と他の技術との組み合わせが含まれる。
【００７４】
本発明の腫瘍関連HLA制限ペプチドの精製では、原核生物または真核生物の発現系でポリペプチドを発現させ、変性条件を使用してタンパク質を抽出することが望ましいかもしれない。ポリペプチドを、ポリペプチドのタグ化部分に結合するアフィニティカラムを使用して他の細胞成分から精製することができる。この調製物は不活性形態で精製されるが、変性物質を依然として細胞に形質導入することができる。一旦標的細胞または組織内に入ると、一般に、ポリペプチドは全生物活性を回復することが認められている。
【００７５】
当技術分野において一般に公知であるように、種々の精製工程の実施順序を変更するか、一定の工程を省略して、依然として実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの調製に適切な方法を得ることができると考えられる。
【００７６】
本開示に照らして、タンパク質またはペプチドの精製度の種々の定量方法が当業者に公知である。これらには、例えば、活性画分の比活性の決定、またはSDS/PAGE分析による画分内のポリペプチド量の評価が含まれる。画分の純度の別の評価方法は、画分の比活性を計算し、これを最初の抽出物の比活性と比較し、それにより本明細書において「-倍精製数」によって評価される純度を計算することである。活性量を示すために使用される実際の単位は、勿論、精製を追跡するために選択された特定のアッセイ技術および発現されたタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すかどうかに依存する。
【００７７】
ポリペプチドの移動は、SDS/PAGE条件が異なれば時折有意に変化し得ることが公知である（Capaldi et al., 1977）。したがって、異なる電気泳動条件下では、精製または部分精製された発現産物の見かけ上の分子量が変化し得ることが認識される。
【００７８】
VI.HLA制限抗原配列
腫瘍関連HLA制限ペプチドまたはポリペプチドの一つまたは複数の抗原決定基に対応するペプチドを、Pr3またはMYOなどの腫瘍関連HLA制限ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に対する免疫応答が惹起されるように調製することができることも本発明で意図される。したがって、腫瘍関連HLA制限ペプチドまたはポリペプチドでのワクチン接種により、動物の内因性腫瘍関連HLA制限タンパク質を特異的に認識する自己抗体が得られるように免疫化動物中で自己免疫応答を生じることができることが意図される。このワクチン接種技術は、米国特許第6,027,727号;同第5,785,970号、および同第5,609,870号（参照により本明細書に組み入れられる）に示されている。
【００７９】
このようなペプチドは、一般に、少なくとも5または6アミノ酸残基長であるべきであり、好ましくは、約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、または約30アミノ酸残基長であり、約35〜50残基までを含むことができる。例えば、これらのペプチドは、
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由来の5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、および50個以上の連続アミノ酸などのアミノ酸配列を含み得る。合成ペプチドは、一般に、約35残基長であり、これはApplied Biosystems (Foster City, CA)などから市販されている自動化ペプチド合成機の長さのほぼ上限である。より長いペプチドを、例えば、組換え手段によって調製することもできる。
【００８０】
米国特許第4,554,101号（参照により本明細書に組み入れられる）は、疎水性に基づいた一次アミノ酸配列からのエピトープの同定および調製を教示している。Hoppに開示の方法によって、当業者は、本明細書において、
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に開示の腫瘍関連HLA制限ペプチド配列などのアミノ酸配列からエピトープを同定することができる。
【００８１】
多数の科学論文もまた、アミノ酸配列分析由来の二次構造の予想およびエピトープの同定を扱っている（Chou and Fasman, 1974a, b; 1978a, b; 1979）。所望ならば、米国特許第4,554,101号におけるHoppの教示を補足するために、任意のこれらを使用することができる。
【００８２】
さらに、現在、タンパク質の抗原性部分およびエピトープコア領域の推定を補助するためのコンピュータプログラムを利用可能である。例には、Jameson-Wolf分析（Jameson and Wolf,1988;Wolf et al., 1988）に基づくプログラム、プログラムPepPlot（登録商標）（Brutlag et al., 1990;Weinberger et al., 1985）、およびタンパク質の三次構造推定用の新規の他のプログラム（Fetrow and Bryant、1993)が含まれる。このような分析を実行可能な別の市販のソフトウェアは、MacVector（IBI, New Haven, CT)である。
【００８３】
さらなる態様において、腫瘍関連HLA制限ペプチドの主要な抗原決定基を、腫瘍関連HLA制限ペプチドをコードする遺伝子の一部が組換え宿主中で発現し、得られたタンパク質を免疫応答惹起能力について試験する経験的アプローチによって同定することができる。例えば、PCR（商標）を使用して、タンパク質のC末端の連続するより長いフラグメントを欠くペプチド範囲を調製することができる。これらの各ペプチドの免疫反応性を決定して、免疫優性であるポリペプチドのフラグメントまたはドメインを同定する。少数のアミノ酸のみを各反復で取り除くことにより、ポリペプチドの抗原決定基の位置をより正確に決定することが可能である。
【００８４】
ポリペプチドの主要な抗原決定基の別の決定方法は、SPOTsシステム（Genosys Biotechnologies,Inc., The Woodlands, TX）である。この方法では、細胞膜上で重複ペプチドを合成し、合成および脱保護後に、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用してスクリーニングする。最初に同定されたペプチドの抗原決定基を、より大きな重複物を使用したより小さなペプチドのその後の合成の実施および免疫反応性ペプチドに沿った各位置での各アミノ酸の最終的な置換によってさらに局在化することができる。
【００８５】
一旦一つまたは複数のこのような分析を完了すると、一つまたは複数の抗原決定基の少なくとも不可欠な特徴を含むポリペプチドを調製する。次いで、ポリペプチドに対する抗血清の生成でポリペプチドを使用する。これらの決定基をコードするミニ遺伝子または遺伝子融合物を構築し、例えば、PCR（商標）クローニング法を使用した標準的方法によって発現ベクターに挿入することもできる。
【００８６】
抗体の生成またはワクチン接種のためのこのような小ペプチドの使用には、典型的には、B型肝炎表面抗原、キーホールリンペットヘモシアニン、またはウシ血清アルブミンなどの免疫原性キャリアタンパク質または上記で考察された他のアジュバントへのペプチドの抱合（アジュバント化（adjuvenated）ペプチド）が必要である。ミョウバンは、ヒトへの使用で十分に非毒性であることが証明されたアジュバントである。この抱合の実施方法は当技術分野において周知である。多糖類（キトサンが含まれる）などの本発明の組成物と共に使用するための他の免疫増強化合物も意図され、これは米国特許第5,980,912号（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。複数の（1つより多い）腫瘍関連HLA制限エピトープを、互いに架橋（例えば、重合）することができる。または、腫瘍関連HLA制限ペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸配列を、免疫応答を高める核酸配列と組み合わせることができる。このような融合タンパク質は、例えば、細菌配列などの外来（非自己）タンパク質の一部または全部を含み得る。
【００８７】
内因性腫瘍関連HLA制限ペプチドまたはポリペプチドに対する応答を達成するのに有効な抗体力価は、ワクチン接種した動物の種ならびに投与したペプチドの配列によって変化する。しかしながら、有効力価を、例えば、種々の用量の特異的抗原を使用した動物パネルの試験およびELISAアッセイなどの公知の技術による自己抗体（または抗自己抗体）の誘導された力価の測定、およびその後の力価と関連する癌の特徴（例えば、腫瘍の成長またはサイズ）との相関によって容易に決定することができる。
【００８８】
当業者は、腫瘍関連HLA制限ペプチドに対する免疫応答が生じるかどうかを決定するための種々のアッセイを理解している。句「免疫応答」には、細胞性および体液性免疫応答の両方が含まれる。ELISA、細胞毒性Tリンパ球（CTL）アッセイ（クロム放出アッセイなど）、末梢血リンパ球（PBL）を使用した増殖アッセイ、四量体アッセイ、およびサイトカイン産生アッセイなどの種々のBリンパ球アッセイおよびTリンパ球アッセイが周知である。Benjamini et al. (1991)（参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。
【００８９】
VII.ワクチン成分
本発明の他の態様において、腫瘍関連HLA制限ペプチドまたは抗原のような抗原性組成物は、さらなる免疫賦活剤またはこのような薬剤をコードする核酸を含み得る。免疫賦活剤には、さらなる抗原、免疫調節薬、抗原提示細胞、またはアジュバントが含まれるが、これらに限定されない。他の態様において、一つまたは複数のさらなる薬剤を、任意の組み合わせで抗原または免疫賦活剤に共有結合させる。一定の態様において、抗原性組成物を、HLAアンカーモチーフアミノ酸に抱合するかこれを含む。
【００９０】
A.アジュバント
当技術分野において周知であるように、特定の免疫原組成物の免疫原性を、アジュバントとして公知の免疫応答の非特異的刺激薬の使用によって増強することができる。未知の抗原に対する免疫の全身的増加を促進するためにアジュバントが試験的に使用されている（例えば、米国特許第4,877,611号）。免疫化プロトコールは、応答を刺激するために長年アジュバントを使用しており、そのようなものとしてアジュバントは当業者に周知である。いくつかのアジュバントは、抗原が提示される方法に影響を及ぼす。例えば、タンパク質抗原をミョウバンによって沈殿させた場合に、免疫応答が増加する。抗原の乳化により、抗原提示の持続時間が延長される。多くの癌では、免疫系が腫瘍細胞に対する宿主防御に関与するが、今日まででおそらく全腫瘍特異的抗原の一部のみしか同定されていないと考えられるという説得力のある証拠が存在する。適切なアジュバントを含む本発明の腫瘍関連HLA制限抗原の使用により、抗原の抗腫瘍応答が増加する可能性が高い。適切な分子アジュバントには、サイトカイン、毒素、または合成組成物などの全ての許容される免疫賦活化合物が含まれる。
【００９１】
例えば、しばしば好ましいアジュバントには、フロイント完全アジュバント（死滅した結核菌を含む免疫応答の非特異的刺激薬）、フロイント不完全アジュバント、および水酸化アルミニウムアジュバントが含まれる。使用することもできる他のアジュバントには、IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、-インターフェロン、GMCSP、BCG、水酸化アルミニウム、MDP化合物（thur-MDPおよびnor-MDPなど）、CGP(MTP-PE)、脂質A、モノホスホリル脂質A(MPL)が含まれる。2％スクアレン/Tween 80乳濁液中に細菌から抽出した3つの成分（MPL、トレハロースジミコレート（TDM）、および細胞壁骨格(CWS)）を含むRIBIも意図する。MHC抗原も使用することができる。
【００９２】
1つの局面において、アジュバント効果は、リン酸緩衝化生理食塩水中に約0.05％〜約0.1％溶液で使用したミョウバンなどの薬剤の使用によって達成される。または、抗原を、約0.25％溶液として使用した糖類の合成ポリマー（Carbopol（登録商標））との混合物として作製する。約70℃〜約101℃の範囲の温度で30秒間〜2分間それぞれの熱処理によるワクチン中の抗原の凝集によってアジュバント効果を得ることもできる。アルブミンに対するペプシン処理（Fab）抗体、C.パルバムなどの細菌細胞との混合物、グラム陰性細菌の内毒素もしくはリポ多糖成分、乳濁液を含む生理学的に許容されるオイル賦形剤（モノオレイン酸マンイド（mannide）（Aracel A））、または遮断代替物（block substitute）として使用されるペルフルオロカーボン（Flusol-DA（登録商標））の20％溶液を含む乳濁液での再活性化による凝集も使用することができる。
【００９３】
いくつかのアジュバント（例えば、細菌から得た一定の有機分子）は、抗原よりもむしろ宿主に対して作用する。例は、ムラミルジペプチド（N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン（MDP））（細菌ペプチドグリカン）である。ほとんどのアジュバントと同様に、MDPの効果も完全に理解されていない。MDPはマクロファージを刺激するが、B細胞を直接刺激するようでもある。したがって、アジュバントの効果は抗原特異的ではない。しかしながら、アジュバントを精製抗原と共に投与した場合、アジュバントを使用して抗原に対する応答を選択的に促進することができる。
【００９４】
一定の態様において、ヘモシアニンおよびヘモエリトリンを本発明で使用することもできる。キーホールリンペット由来のヘモシアニン（KLH）の使用が一定の態様で好ましいが、他の軟体動物および節足動物のヘモシアニンおよびヘモエリトリンを使用することができる。
【００９５】
種々の多糖アジュバントも使用することができる。例えば、マウスの抗体応答における種々の肺炎球菌多糖アジュバントの使用が記載されている（Yin et al., 1989）。表示の至適応答が得られるか、抑制されない用量を使用すべきである（Yin et al., 1989）。キチンおよびキトサンなどの多糖のポリアミン変種（脱アセチル化キチンが含まれる）が特に好ましい。
【００９６】
別のアジュバント群は、細菌ペプチドグリカンのムラミルジペプチド（MDP、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン）群である。アミノ酸誘導体であるトレオニル-MDPなどムラミルジペプチドの誘導体および脂肪酸誘導体であるMTPPEも意図される。
【００９７】
米国特許第4,950,645号は、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロールから形成された人工リポソームについて記載したムラミルジペプチドの親油性二糖類-トリペプチド誘導体を記載している。これはヒト単球の活性化および腫瘍細胞の破壊で有効であるが、一般に高用量で非毒性である。細胞キャリアおよび本発明の他の態様と共に使用するための米国特許第4,950,645号およびPCT特許出願 WO 91/16347の化合物が意図される。
【００９８】
BCG（カルメット-ゲラン菌（マイコバクテリウムの弱毒化株））およびBCG-細胞壁骨格（CWS）を、トレハロースジミコレートを使用するかまたは使用しないアジュバントとして使用することもできる。トレハロースジミコレート自体を使用することができる。トレハロースジミコレート投与は、マウスにおいてインフルエンザウイルス感染に対する耐性の増加に相関することが示されている（Azuma et al., 1988）。トレハロースジミコレートを、米国特許第4,579,945号に記載のように調製することができる。BCGは、その免疫賦活特性のために重要な臨床ツールである。BCGは、細網内皮系を刺激し、ナチュラルキラー細胞を活性化し、造血幹細胞の増殖を増加させるように作用する。BCGの細胞壁抽出物は、優れた免疫アジュバント活性を有することが証明されている。マイコバクテリウムのための分子遺伝学的ツールおよび方法により、BCGへの外来遺伝子の移入手段が提供されている（Jacobs et al., 1987;Snapper et al., 1988;Husson et al., 1990;Martin et al., 1990）。生BCGは、結核を予防するための世界的に使用されている有効かつ安全なワクチンである。BCGおよび他のマイコバクテリウムは非常に有効なアジュバントであり、マイコバクテリウムに対する免疫応答が広く研究されている。ほぼ20億回の免疫化により、BCGは、ヒトにおける安全な使用歴が長い（Luelmo, 1982; Lotte et al., 1984）。これは出生時に投与することができる数少ないワクチンの1つであり、たった1回の投与で寿命の長い免疫応答が得られ、BCGワクチン接種の経験が蓄積した世界規模で普及したネットワークが存在する。例示的なBCGワクチンは、TICE BCG (Organon Inc., West Orange, NJ)として販売されている。
【００９９】
両親媒性界面活性剤（例えば、サポニン）およびQS21 (Cambridge Biotech)などの誘導体は、本発明の免疫原と共に使用するためのさらに別のアジュバント群を形成する。非イオン性遮断コポリマー界面活性剤（Rabinovich et al., 1994）も使用することができる。オリゴヌクレオチドは、別の有用なアジュバント群である（Yamamoto et al., 1988）。Quil Aおよびレンチネン（lentinen）は、本発明の一定の態様で使用することができる他のアジュバントである。
【０１００】
別のアジュバント群は、米国特許第4,866,034号の精製解毒内毒素などの解毒内毒素である。これらの精製内毒素は、哺乳動物におけるアジュバント応答の発生に有効である。勿論、多アジュバント組み込み細胞を調製するために、解毒内毒素を他のアジュバントと組み合わせることができる。例えば、米国特許第4,435,386号に記載のように、解毒内毒素とトレハロースジミコレートとの組み合わせが特に意図される。米国特許第4,436,727号、同第4,436,728号、および同第4,505,900号に記載のように、解毒内毒素と細胞壁骨格（CWS）（すなわちCWS）およびトレハロースジミコレートとの組み合わせなどの、解毒内毒素とトレハロースジミコレートおよび内毒素糖脂質との組み合わせも意図される（米国特許第4,505,899号）。米国特許第4,520,019号に記載のように、解毒内毒素を使用しないCWSとトレハロースジミコレートのみの組み合わせも有用であると予測される。
【０１０１】
当業者は、本発明の細胞ワクチンに抱合することができる異なる種のアジュバントを理解しており、これらのアジュバントには、特に、アルキルリゾリン脂質（alkyl lysophosphilipid）（ALP）；BCG；およびビオチン（ビオチン化誘導体が含まれる）が含まれる。使用が特に意図される一定のアジュバントは、グラム細胞由来のテイコ酸である。これらには、リポテイコ酸（LTA）、リビトールテイコ酸（RTA）、およびグリセロールテイコ酸（GTA）が含まれる。その合成対応物の活性形態を、本発明に関連して使用することもできる（Takada et al., 1995）。
【０１０２】
例えば、抗体を惹起するかその後活性化T細胞を得ることを所望する場合、ヒトで一般に使用されてないとしても、種々のアジュバントを、依然として動物に使用することができる。アジュバントまたは細胞のいずれかに起因し得る毒性または他の副作用は、例えば、非照射腫瘍細胞を使用して起こり得るため、このような環境下では無関係である。
【０１０３】
アジュバントを、核酸（例えば、DNAまたはRNA）によってコードすることができる。このようなアジュバントを、抗原をコードする核酸（例えば、発現ベクター）、個別のベクター、または他の構築物中でコードすることもできることが意図される。アジュバントをコードする核酸を、例えば、脂質またはリポソームなどを使用して直接送達させることができる。
【０１０４】
B.生物学的応答調節物質
アジュバントに加えて、T細胞免疫を上方制御するかサプレッサー細胞活性を下方制御することが示されている生物学的応答調節物質（BRM）を同時投与することが望ましいかもしれない。このようなBRMには、シメチジン（CIM;1200mg/d）（Smith/Kline, PA）；低用量シクロホスファミド（CYP; 300mg/m2）（Johnson/Mead, NJ）、-インターフェロン、IL-2、またはIL-12などのサイトカイン、または免疫ヘルパー機能に関与するタンパク質をコードする遺伝子（B-7など）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０５】
C.ケモカイン
ケモカイン、ケモカインをコードする核酸、および/またはケモカインを発現する細胞もワクチン成分として使用することができる。ケモカインは、一般に、免疫エフェクター細胞をケモカイン発現部位に補充するための化学誘引物質として作用する。他の免疫系成分の治療部位への補充を増強するための、例えば、サイトカインコード配列と組み合わせた特定のケモカインコード配列を発現することが有利であり得る。このようなケモカインには、例えば、RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β、IP-10、およびこれらの組み合わせが含まれる。当業者は、一定のサイトカインも化学誘引物質効果を有することが公知であり、用語「ケモカイン」に分類することもできることを認識する。
【０１０６】
D.免疫原性キャリアタンパク質
一定の態様において、免疫反応を増強するために、抗原性組成物をキャリアに化学結合するか、免疫原性キャリアペプチドまたはポリペプチド（例えば、抗原-キャリア融合ペプチドまたはポリペプチド）を使用して組換え発現することができる。例示的および好ましい免疫原性キャリアアミノ酸配列には、B型肝炎表面抗原、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、またはウシ血清アルブミン（BSA）が含まれる。オボアルブミン、マウス血清アルブミン、またはウサギ血清アルブミンなどの他のアルブミンを、免疫原性キャリアタンパク質として使用することができる。免疫原性キャリアタンパク質へのポリペプチドまたはペプチドの抱合手段は当技術分野において周知であり、例えば、グルタルアルデヒド、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド、およびビス-ジアゾ化ベンジジンが含まれる。
【０１０７】
VIII.抗体および抗体生成
本発明の別の態様は、抗体、いくつかの場合、
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を含む本発明の腫瘍関連HLA制限ペプチドの、ポリペプチド配列に免疫反応性を示すヒトモノクローナル抗体である。この抗体は、サンプル中に存在する特定の腫瘍関連HLA制限ペプチドの検出のためのヒト患者由来のサンプルのスクリーニングに有用であることも理解される。抗体はまた、関連抗原配列の発見のための発現したDNAセグメントまたはペプチド、およびタンパク質のスクリーニングで有用であり得る。さらに、抗体は、癌の受動免疫療法で有用であり得る。このようにして発見された抗体および任意の抗原またはエピトープ配列の全てのこのような使用は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１０８】
本発明で使用することができる他の抗体の例には、CD1、CD2、CD3、CD5、CD7、CD4、CD6、CD8、およびCD27などのT細胞と反応する抗体が含まれ得る。骨髄細胞と反応する抗体を使用することもでき、CDllb、CDllc、 CD13、 CD14、 CD15、 CD16、 CD33、 CD48、 CD63、 CD74、 CD65、 CD66、 CD67、およびCD68が含まれる。未分化細胞と反応する抗体には、HLA-DR、CD34、およびCD38が含まれ得る。上記抗体から選択された抗体の複数の組み合わせが可能であると認識すべきである。したがって、抗体組み合わせが変化し得ることが当業者に明らかである。
【０１０９】
一定の態様において、本発明は、抗体を含む。例えば、モノクローナル抗体、単鎖抗体、またはヒト化抗体の全てまたは一部は、癌のためのワクチンとして機能することができる。本発明の他の局面は、腫瘍関連HLA制限ポリペプチド（例えば、Pr3またはMYOポリペプチド）などの特定のポリペプチドを同定または定量するために四量体の形態または診断薬の形態として抗体を投与する工程を含む。上記で詳述するように、全長タンパク質に対して生成された抗体に加えて、エピトープコア領域（野生型エピトープおよび変異エピトープが含まれる）を含むより小さな構築物に応答して抗体を生成することもできる。
【０１１０】
本明細書中で使用される、用語「抗体」は、IgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEなどの任意の免疫学的結合因子を広範にいうことを意図する。IgGおよび/またはIgMは生理学的状況で最も一般的な抗体であり、かつ研究所で最も容易に作製されるため、一般に、IgGおよび/またはIgMが好ましい。
【０１１１】
用語「抗体」を、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子をいうために使用することもでき、これらには、Fab'、Fab、F(ab')2、単一ドメイン抗体(DABs)、Fv、およびscFv(単鎖抗体Fv)などの抗体フラグメントが含まれる。種々の抗体ベースの構築物およびフラグメントの調製技術および使用技術は当技術分野において周知である。抗体の調製手段および特徴づけ手段も当技術分野において周知である（例えば、Harlow and Lane, 1988（参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい）。
【０１１２】
モノクローナル抗体（mAb）は、一定の利点（例えば、再現性および大量産生）を有することが認識され、一般に、その使用が好ましい。したがって、本発明は、ヒト、マウス、サル、ラット、ハムスター、ウサギ、およびさらにニワトリを起源とするモノクローナル抗体を提供する。
【０１１３】
モノクローナル抗体（mAb）の生成方法は、一般に、ポリクローナル抗体の調製手順と同一の手順に沿って開始する。簡単に述べれば、ポリクローナル抗体を、本発明の免疫原性ポリペプチド組成物での動物の免疫化、および免疫化された動物からの抗血清の回収によって調製することができる。または、本発明のいくつかの態様において、血清を、特定の抗原に曝露することができるヒトから回収する。特定の抗原への曝露は、ヒトが特定の抗原に職業被爆してペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に対するポリクローナル抗体を発生するような作業環境を生じ得る。本発明のいくつかの態様において、職業被爆した人由来のポリクローナル血清を使用して、免疫検出方法の使用によってゲロニン（gelonin）毒素中の抗原性領域を同定する。
【０１１４】
広範な種々の動物種を、抗血清産生に使用することができる。典型的には、抗血清の産生のために使用される動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、またはヤギである。ウサギは比較的血液容量が多いため、ウサギはポリクローナル抗体の産生に好ましい選択である。
【０１１５】
当技術分野において周知であるように、所与の組成物はその免疫原性が変化し得る。したがって、キャリアへのペプチド免疫原またはポリペプチド免疫原のカップリングによって達成することができる場合、宿主免疫系を追加免疫することがしばしば必要である。例示的および好ましいキャリアは、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）およびウシ血清アルブミン（BSA）である。オボアルブミン、マウス血清アルブミン、またはウサギ血清アルブミンなどの他のアルブミンをキャリアとして使用することもできる。キャリアタンパク質へのポリペプチドの抱合手段は当技術分野において周知であり、例えば、グルタルアルデヒド、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド、およびビス-ジアゾ化ベンジジンが含まれる。
【０１１６】
ポリクローナル抗体産生での免疫原組成物の使用量は、免疫原の性質および免疫化に使用される動物によって変化する。種々の経路を使用して、免疫原を投与することができる（皮下、筋肉内、皮内、静脈内、および腹腔内）。ポリクローナル抗体の産生を、免疫後の種々の時点での免役化動物からの採血によってモニタリングすることができる。
【０１１７】
第2の追加免疫注射を行うこともできる。追加免疫および力価測定過程を、適切な力価を達成するまで繰り返す。所望の免疫原性レベルが得られた場合、免役化動物から採血して血清を単離および保存することができ、および/またはこの動物を使用してmAbを生成することができる。
【０１１８】
mAbを、米国特許第4,196,265号（参照により本明細書に組み入れられる）に例示の技術などの周知の技術の使用によって容易に調製することができる。典型的には、この技術は、野生型組成物または変異組成物である選択された免疫原組成物（例えば精製または部分精製されたポリペプチド、ペプチド、またはドメイン）での適切な動物の免疫化を含む。免疫化組成物を、抗体産生細胞の刺激に有効な様式で投与する。
【０１１９】
mAbを、所望ならば、濾過、遠心分離、およびHPLCまたはアフィニティクロマトグラフィなどの種々のクロマトグラフィ法を使用してさらに精製することができる。本発明のモノクローナル抗体のフラグメントを、ペプシンもしくはパパインなどの酵素での消化を含む方法、および/または化学的還元によるジスルフィド結合の切断によって産生されたモノクローナル抗体から得ることができる。または、本発明に含まれるモノクローナル抗体フラグメントを、自動化ペプチド合成機を使用して合成することができる。
【０１２０】
分子クローニングアプローチを使用してmAbを生成することができることも意図される。このために、組み合わせ免疫グロブリンファージミドライブラリーを免疫化動物の脾臓から単離したRNAから調製し、適切な抗体を発現するファージミドを、抗原およびコントロール細胞を発現する細胞を使用したパニングによって選択する。従来のハイブリドーマ技術を超えるこのアプローチの利点は、1ラウンドで約104倍の抗体を産生およびスクリーニングすることができること、ならびにH鎖およびL鎖状結合によって新規の特異性が得られ、適切な抗体を発見する機会がさらに増加することである。
【０１２１】
ヒト化モノクローナル抗体は、遺伝子操作技術を使用して定常領域、および/または可変領域のフレームワーク配列をヒト配列に置換する一方で、元の抗原特異性を保持するように改変された動物起源の抗体である。このような抗体は、一般に、ヒト抗原に特異性を有するげっ歯類抗体に由来する。このような抗体は、一般に、インビボ治療適用に有用である。このストラテジーにより、外来抗体への宿主応答が減少し、ヒトエフェクター機能を選択可能である。
【０１２２】
「ヒト化」抗体は、ヒト定常領域ドメインおよび/または可変領域ドメインを有するマウス、ラット、または他の種由来のキメラ抗体、二重特異性抗体、組換え抗体、および操作抗体、ならびにそのフラグメントなども意図する。ヒト化免疫グロブリンの産生技術は当業者に周知である。例えば、米国特許第5,693,762号は、一つまたは複数の相補性決定領域（CDR）を有するヒト化免疫グロブリンの産生方法およびその組成物を開示する。インタクトな抗体と組み合わせた場合、ヒト化免疫グロブリンはヒトで実質的に免疫原性を示さず、ドナー免疫グロブリンと実質的に同一の抗原（タンパク質またはエピトープを含む他の化合物など）に対する親和性を保持する。この領域における他の技術の例には、米国特許第6,054,297号;同第5,861,155号;および同第6,020,192号（全て特に参照により組み入れられる）が含まれる。患者の疾患に対して「オーダーメイド（custom-tailored）」の抗体の開発方法は同様に公知であり、このようなオーダーメイド抗体も意図される。
【０１２３】
IX.HLA制限タンパク質、ペプチド、およびポリペプチドをコードする核酸
腫瘍関連HLA制限ペプチドまたはポリペプチドを核酸配列によってコードすることができることが本発明で意図される。核酸は、ゲノムDNA、相補DNA（cDNA）、または合成DNAに由来し得る。発現ベクターへの組み込みが望ましい場合、核酸は、天然のイントロンまたは別の遺伝子由来のイントロンも含み得る。
【０１２４】
本明細書中で使用される、用語「cDNA」は、テンプレートとして伝令RNA（mRNA）を使用して調製したDNAをいうことを意図する。ゲノムDNAまたはゲノムの非プロセシングまたは部分プロセシングRNAテンプレートから重合したDNAと対照的なcDNA使用の利点は、cDNAは主に対応するタンパク質のコード配列を含むという点である。全長または部分的ゲノム配列が好ましい場合（至適な発現のために非コード領域が必要な場合またはアンチセンスストラテジーにおいてイントロンなどの非コード領域をターゲティングすべきである場合など）もしばしば生じ得る。本明細書中で使用するためのPr3 cDNAまたはMYO cDNAなどの腫瘍関連HLA制限ペプチドまたはポリペプチドのcDNAは、ヒトcDNAに由来し得るが、これに限定されない。
【０１２５】
本明細書中で使用される、用語「核酸セグメント」は、特定の種の全ゲノムDNAを含まない単離された核酸分子をいう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸セグメントは、全哺乳動物またはヒトゲノムDNAからさらに単離されているか、これらから精製された野生型、多型、または変異ポリペプチドのコード配列を含む核酸セグメントをいう。ポリペプチド、ポリペプチドより小さなDNAセグメント、および組換えベクター（プラスミドおよび他の非ウイルスベクターなど）は、用語「核酸セグメント」の範囲内に含まれる。
【０１２６】
用語「組換え」を、ポリペプチドまたは特定のポリペプチド名と共に使用することができ、一般に、インビトロで操作されているかこのような分子の複製産物である核酸分子から産生されたポリペプチドをいう。組換えベクターおよび単離核酸セグメントには、PR1またはミエロペルオキシダーゼのコード領域自体、基本的コード領域が選択的に変化しているか修飾されたコード領域が多様に含まれ得るか、これらは、PR1またはミエロペルオキシダーゼのコード領域が含まれるより大きなポリペプチドをコードすることができるか、変異アミノ酸配列を有する生物学的機能が等価なタンパク質またはペプチドをコードすることができる。
【０１２７】
本明細書中で使用される、「核酸」には、一本鎖および二本鎖分子、ならびにDNA、RNA、化学修飾された核酸、および核酸アナログが含まれる。本発明の範囲内に含まれる核酸が、約10、約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90、約100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180、約190、約200、約210、約220、約230、約240、約250、約275、約300、約325、約350、約375、約400、約425、約450、約475、約500、約525、約550、約575、約600、約625、約650、約675、約700、約725、約750、約775、約800、約825、約850、約875、約900、約925、約950、約975、約1000、約1100、約1200、約1300、約1400、約1500、約1750、約2000、約2250、約2500またはそれ以上のヌクレオチド残基長であり得ることが意図される。当業者は、核酸領域が腫瘍関連HLA制限ペプチドまたはポリペプチドをコードする場合、核酸領域は、融合タンパク質中のアミノ酸数に依存して非常に長くなり得ることを認識する。
【０１２８】
腫瘍関連HLA制限ペプチドまたはポリペプチドを適切なアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列によってコードすることができることが意図される。標準化されたコドン表（表3）を使用した所望のアミノ酸をコードする核酸のデザインおよび産生は当業者に周知である。好ましい態様において、各アミノ酸のコードのために選択されたコドンを、対象となる宿主細胞中の核酸発現を至適にするように修飾することができる。用語「機能的に等価なコドン」は、本明細書中で、アルギニンまたはセリンについての6つのコドンなどの同一アミノ酸をコードするコドンをいい、生物学的に等価なアミノ酸をコードするコドンをいうためにも使用される。宿主細胞の様々な種についてのコドン使用頻度は当技術分野において周知である。ヒドでの使用が好ましいコドンは、当業者に周知である（Wada et al., 1990）。他の生物についてのコドン使用頻度も当業者に周知である（Wada et al., 1990（その全体が参照により本明細書に組み入れられる））。
【０１２９】
（表３）コドン表
2007504149.tif 000010
【０１３０】
原核生物および/または真核生物ベースの系を使用して、核酸配列またはその同族ポリペプチド、タンパク質、およびペプチドを産生することができる。本発明は、腫瘍関連HLA制限ペプチドまたはポリペプチドを産生するためのこのような発現系の使用を意図する。より詳細には、本発明は、昆虫細胞系および/またはバキュロウイルス系を使用する。米国特許第5,871,986号および同第4,879,236号（共に参照により本明細書に組み入れられる）などに記載され、例えば、INVITROGEN（登録商標）のMAxBAc2. 0およびCLONTECH（登録商標）のBACPACK（商標）BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEMという商品名で購入することができる昆虫細胞系/バキュロウイルス系は、異種核酸セグメントからタンパク質を高レベルで発現することができる。
【０１３１】
本発明に開示の発現系に加えて、市販され、広く一般に利用可能な多数の発現系が存在する。このような系の一例は、合成エクジソン誘導受容体またはそのpET発現系、大腸菌発現系を含むSTRATAGENE（登録商標）のCOMPLETE CONTROL Inducible Mammalian Expression Systemである。誘導発現系の別の例は、INVITROGEN（登録商標）から市販されているT-REX（商標）（テトラサイクリン調節発現）系を含む誘導発現系（全長CMVプロモーターを使用する哺乳動物誘導発現系）である。INVITROGEN（登録商標）はまた、メチロトーフ酵母であるピチアメタノリカ（Pichia methanolica）中での組換えタンパク質の高レベル産生のためにデザインされたピチアメタノリカ発現系と呼ばれる酵母発現系を提供する。当業者は、核酸配列またはその同族ポリペプチド、タンパク質、またはペプチドを産生するために発現構築物などのベクターをどのようにして発現させるかを理解している。
【０１３２】
A.ウイルスベクター
発現ベクターを細胞に移入することができる多数の方法が存在する。本発明の一定の態様において、発現ベクターは、ウイルスまたはウイルスゲノム由来の操作ベクターを含む。受容体媒介エンドサイトーシスを介して細胞に侵入し、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、ウイルス遺伝子を安定かつ有効に発現する一定のウイルスの能力のために、ウイルスは外来遺伝子を哺乳動物細胞に導入するための魅力的な候補となっている（Ridgeway, 1988; Nicolas and Rubenstein, 1988; Baichwal and Sugden, 1986 ; Temin, 1986）。遺伝子ベクターとして使用された最初のウイルスは、DNAウイルス（パポバウイルス（サルウイルス40、ウシ乳頭腫ウイルス、およびポリオーマ）(Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden,1986)およびアデノウイルス(Ridgeway,1988 ; Baichwal and Sugden,1986)が含まれる）であった。
【０１３３】
1.アデノウイルスベクター
核酸の特定の送達方法は、アデノウイルス発現ベクターの使用を含む。アデノウイルスベクターはゲノムDNAへの組み込み能力が低いことが公知であるにも関わらず、この特徴はこれらのベクターによって提供される遺伝子導入効率の高さによって相殺される。「アデノウイルス発現ベクター」は、(a)構築物のパッケージングを補助し、(b)クローン化された組織または細胞特異的構築物を最終的に発現するのに十分なアデノウイルス配列を含む構築物が含まれることを意味する。遺伝子の組織化またはアデノウイルス（36kbの線状二本鎖DNAウイルス）の知識により、アデノウイルスDNAの大片を7kbまでの外来配列に置換することが可能である（Grunhaus and Horwitz, 1992）。
【０１３４】
2.AAVベクター
アデノウイルスを補助したトランスフェクションを使用して、核酸を細胞に移入することができる。アデノウイルス連結系を使用した細胞系でトランスフェクション効率の増加が報告されている（Kelleher and Vos, 1994;Cotten et al., 1992; Curiel, 1994）。アデノ随伴ウイルス（AAV）は、本発明のワクチンで使用するための魅力的なベクター系である（Muzyczka, 1992）。AAVは、宿主への感染範囲が広い（Tratschin et al., 1984; Laughlin et al., 1986 ; Lebkowski et al., 1988 ; McLaughlin et al., 1988）。rAAVベクターの生成および使用に関する詳細は、米国特許第5,139,941号および同第4,797,368号（それぞれ参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。
【０１３５】
3.レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、その遺伝子を宿主ゲノムに組み込み、大量の外来遺伝物質を移入し、広範な種および細胞型に感染し、特定の細胞株にパッケージングされる能力により、ワクチンにおける遺伝子送達ベクターとして有望である（Miller, 1992）。
【０１３６】
レトロウイルスベクターを構築するために、核酸（例えば、対象となる抗原をコードする核酸）を、一定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入して複製欠損ウイルスを産生する。ビリオンを産生させるために、gag、pol、およびenv遺伝子を含むがLTRおよびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株を構築する（Mann et al., 1983）。レトロウイルスLTRおよびパッケージング配列と共にcDNAを含む組換えプラスミドを（例えば、リン酸カルシウム沈殿などによって）特定の細胞株に導入した場合、パッケージング配列により組換えプラスミドのRNA転写物がウイルス粒子にパッケージングされ、その後培養培地に分泌される（Nicolas and Rubenstein, 1988;Temin, 1986;Mann et al., 1983）。次いで、組換えレトロウイルスを含む培地を回収し、任意選択的に濃縮して遺伝子導入に使用する。レトロウイルスベクターは、広範な種々の細胞型に感染することができる。しかしながら、組み込みおよび安定な発現には、宿主細胞の分裂を必要とする（Paskind et al., 1975)。
【０１３７】
レンチウイルスは、一般的なレトロウイルス遺伝子（gag、pol、およびenv）に加えて、調節機能または構造機能を有する他の遺伝子を含む複雑なレトロウイルスである。レンチウイルスベクターは、当技術分野において周知である（例えば、Naldini et al., 1996; Zufferey et al., 1997; Blomer et al., 1997;米国特許第6,013,516号および同第5,994,136号を参照されたい）。レンチウイルスのいくつかの例には、ヒト免疫不全ウイルス（HIV-1、HIV-2）およびサル免疫不全ウイルス（SIV）が含まれる。レンチウイルスベクターを、HIVビルレンス遺伝子の弱毒化を増強してベクターを生物学的に安全にすること（例えば、env、vif、vpr、vpu、およびnefを欠失させる）によって生成した。
【０１３８】
組換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染することができ、インビボおよびエクスビボでの遺伝子導入ならびに核酸配列の発現の両方に使用することができる。例えば、非分裂細胞に感染することができる組換えレンチウイルスであって、適切な宿主細胞をパッケージング機能（すなわち、gag、pol、およびenv、ならびにrevおよびtat）を有する2つ以上のベクターでトランスフェクトするレンチウイルスは、米国特許第5,994,136号（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。特定の細胞型の受容体のターゲティングのための抗体または特定のリガンドとのエンベロープタンパク質の結合によって組換えウイルスをターゲティングすることができる。ウイルスベクターへ対象となる配列（調節領域を含む）を特定の標的細胞上の受容体のリガンドをコードする別の遺伝子と共に挿入することにより、例えば、ベクターは、この時点で標的特異的である。
【０１３９】
4.他のウイルスベクター
他のウイルスベクターを、本発明においてワクチン構築物として使用することができる。ワクシニアウイルス（Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986 ;Coupar et al., 1988）、シンドビスウイルス、サイトメガロウイルス、および単純ヘルペスウイルスなどのウイルス由来のベクターを使用することができる。これらは、種々の哺乳動物細胞に魅力的ないくつかの特徴を付与する（Friedmann, 1989 ; Ridgeway, 1988 ; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990）。
【０１４０】
5.修飾ウイルスを使用した送達
送達すべき核酸を、特定の結合リガンドを発現するように操作した感染性ウイルス内に格納することができる。したがって、ウイルス粒子は、標的細胞の同族受容体に特異的に結合し、細胞に内容物を送達する。ウイルスエンベロープへのラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学修飾に基づいて、レトロウイルスベクターが特異的にターゲティングされるようにデザインされた新規のアプローチを開発した。この修飾により、シアロ糖タンパク質受容体を介して肝細胞に特異的に感染させることができる。
【０１４１】
レトロウイルスエンベロープタンパク質および特定の細胞受容体に対するビオチン化抗体を使用した組換えレトロウイルスの別のターゲティングアプローチをデザインした。抗体を、ストレプトアビジンの使用によってビオチン成分を介してカップリングした（Roux et al., 1989）。主要組織適合遺伝子複合体クラスI抗原およびクラスII抗原に対する抗体を使用して、表面抗原を有する種々のヒト細胞のインビトロでのエコトロピックウイルスでの感染が証明された（Roux et al., 1989）。
【０１４２】
B.核酸の送達
本発明の組成物を発現させるための適切な核酸送達方法は、本明細書に記載されているか当業者公知である、核酸（例えば、DNA（ウイルスおよび非ウイルスベクターが含まれる））をオルガネラ、細胞、組織、または生物に移入することができる事実上任意の方法が含まれると考えられる。このような方法には、注射（米国特許第5,994,624号、同第5,981,274号、同第5,945,100号、同第5,780,448号、同第5,736,524号、同第5,702,932号、同第5,656,610号、同第5,589,466号、および同第5,580,859号（参照により本明細書に組み入れられる））（微量注入（(Harlan and Weintraub, 1985;米国特許第5,789,215号（参照により本明細書に組み入れられる））が含まれる）；エレクトロポレーション(米国特許第5,384,253号（参照により本明細書に組み入れられる）);リン酸カルシウム沈殿(Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990); DEAE-デキストラン使用後のポリエチレングリコールの使用(Gopal, 1985);直接超音波負荷(Fechheimer et al., 1987);リポソーム媒介トランスフェクション(Nicolau and Sene, 1982;Fraley et al., 1979;Nicolau et al., 1987 ;Wong et al., 1980 ;Kaneda et al., 1989;Kato et al., 1991); 微粒子銃(PCT出願番号WO 94/09699およびWO95/06128;米国特許第5,610,042号;同第5,322,783号、同第5,563,055号、同第5,550,318号、同第5,538,877号、および同第5,538,880号（それぞれ参照により本明細書に組み入れられる）;炭化ケイ素繊維との撹拌(Kaeppler et al., 1990;米国特許第5,302,523号および同第5,464,765号（それぞれ参照により本明細書に組み入れられる）;またはプロトプラストのPEG媒介トランスフェクション(Omirulleh et al., 1993; 米国特許第4,684,611号および同第4,952,500号（それぞれ参照により本明細書に組み入れられる）;乾燥/阻害媒介DNA取り込み(Potrykus et al., 1985)などによるDNAの直接送達が含まれるが、これらに限定されない。これらなどの技術の適用によって、オルガネラ、細胞、組織、または器官を、安定または一過性に形質転換することができる。
【０１４３】
X.薬学的ワクチン組成物、送達、および治療計画
本発明の1つの態様において、腫瘍関連HLA制限ペプチドもしくはポリペプチドまたは発現構築物の送達による白血病などの癌の治療および防止方法を意図する。治療を意図する癌の例には、肺癌、頭頸部癌、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、骨肉種、精巣癌、子宮頸癌、消化管癌、リンパ腫、肺の前癌病変、結腸癌、黒色腫、膀胱癌、および本発明の腫瘍関連HLA制限ペプチドまたはポリペプチドによって治療または防止することができる任意の他の新生物疾患が含まれる。
【０１４４】
薬学的ワクチン組成物の有効量を、疾患もしくは病態またはその症状の範囲を検出可能または反復して改善、軽減、最小にするか、制限するのに十分な量と定義する。より厳格な定義（疾患の消失、根絶、または治癒が含まれる）を適用することができる。
【０１４５】
好ましくは、患者は、適切な骨髄機能（2,000個/mm3を超える末梢絶対顆粒球数および100,000個/mm3の血小板数と定義する）、適切な肝機能（1.5mg/dl未満のビリルビン）、および適切な腎機能（1.5mg/dl未満のクレアチニン）を有する。
【０１４６】
A.HLA制限ワクチンの投与
本発明の方法および組成物を使用して細胞を死滅させ、細胞成長を阻害し、転移を阻害し、腫瘍または組織サイズを減少させ、さもなければ腫瘍細胞の悪性疾患表現型を逆転または減少させるために、一般に、癌細胞をポリペプチドまたはポリペプチドをコードする発現構築物などの治療化合物と接触させる。投与経路は、病変の位置および性質によって自然に変化し、例えば、皮内、経皮、非経口、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、経皮、気管内、腹腔内、腫瘍内、灌流、洗浄、直接注射、および経口投与ならびに処方物が含まれる。癌の治療または診断に関して考察された任意の処方物および投与経路を、新生物疾患および病態に使用することもできる。
【０１４７】
孤立性腫瘍、充実性腫瘍、接触可能な（accessible）腫瘍のための腫瘍内注射または腫瘍脈管構造への注射が特に意図される。局部投与、局所投与、または全身投与も適切であり得る。4cmを超える腫瘍について、投与すべき体積は、約4〜10ml（好ましくは10ml）である一方で、4cm未満の腫瘍について、約1〜3mlの体積を使用する（好ましくは3ml）。単回用量として送達される複数の注射は、約0.1〜約0.5mlの体積を含む。ウイルス粒子を、約1cm間隔での腫瘍への複数の注射での投与によって有利に接触させることができる。
【０１４８】
外科的介入の場合、本発明を手術前に使用して、手術不可能な腫瘍対象を切除することができる。または、本発明を手術時および/または手術後に使用して、残存病変または転移性病変を治療することができる。例えば、切除した腫瘍床（tumor bed）に、腫瘍関連HLA制限ペプチドまたはこれをコードする構築物を含む処方物を注射または灌流することができる。例えば、手術部位に挿入されたカテーテルをそのままにすることによって、切除後に灌流を継続することができる。定期的手術後治療も想定する。
【０１４９】
必要に応じて、例えば、腫瘍を切除して微視的残存病変を消失させるために腫瘍床を治療する場合、継続投与を適用することもできる。シリンジまたはカテーテル法（catherization）を介した送達が好ましい。このような継続灌流を、治療開始後から約1〜2時間、約2〜6時間、約6〜12時間、約12〜24時間、約1〜2日間、約1〜2週間、またはそれ以上行うことができる。一般に、継続灌流を介した治療組成物の用量は、単回または複数回の注射によって投与される用量と等価であり、灌流期間にわたって調整される。四肢灌流を使用して、特に黒色腫および肉腫の治療において本発明の治療組成物を投与することができることがさらに意図される。
【０１５０】
治療計画も同様に変更することができ、しばしば、腫瘍型、腫瘍の位置、疾患の進行状態、ならびに患者の健康状態および年齢に依存する。明らかに、一定の腫瘍型にはより積極的な治療が必要であると同時に、一定の患者はよりひどく骨の折れるプロトコールに耐えることができない。臨床医は、治療処方物の公知の有効性および毒性（存在する場合）に基づいて最良に適合するようにこのような決断を下す。
【０１５１】
一定の態様において、治療される腫瘍は、少なくとも最初は切除不可能であり得る。治療ウイルス構築物での治療により、周囲の収縮または一定の特定の浸潤性部分の消失によって腫瘍の切除可能性を増大させることができる。治療後、切除可能である。切除後のさらなる治療は、腫瘍部位での微視的残存病変の排除に役立つ。
【０１５２】
原発性腫瘍または切除後腫瘍床のための典型的な治療単位は、複数回投与を含む。典型的な原発性腫瘍治療は、2週間にわたる6回の投与を含む。2週間の投与計画を、1回、2回、3回、4回、5回、6回以上繰り返すことができる。治療過程中、計画した投与を完了する必要性を再評価することができる。
【０１５３】
治療は、種々の「単位用量」を含み得る。単位用量を、所定量を含む治療組成物と定義する。投与量ならびに特定の経路および処方物は、臨床分野の当業者の範囲内である。単位用量を単回注射として投与する必要はないが、一連の期間にわたる継続的注入を含み得る。本発明の単位用量を、ウイルス構築物のプラーク形成単位（pfu）で都合良く記載することができる。単位用量は、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013pfuまたはそれ以上の範囲である。または、ウイルスの種類および達成可能な力価に依存して、1〜100、10〜50、100〜1000、または1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、もしくはそれ以上の感染性ウイルス粒子（vp）を患者または患者の細胞に送達させる。
【０１５４】
B.注射可能な組成物および処方物
本発明の製剤の1つの送達方法は全身性である。しかしながら、あるいは、米国特許第5,543,158号;同第5,641,515号、および同第5,399,363号（それぞれ特に参照により本明細書に組み入れられる）に記載のように、本明細書中において開示の薬学的組成物を、非経口、静脈内、皮内、筋肉内、経皮、またはさらに腹腔内に投与することができる。
【０１５５】
製剤の注射を、薬剤が注射に必要なニードルの特定のゲージを通過することができる限り、シリンジまたは溶液の注射のために使用される任意の他の方法によって行うことができる。溶液保持のためのアンプルチャンバーを画定するノズルおよび溶液をノズルから送達部位に押し出すためのエネルギーデバイスを有する新規のニードルレス注射システムが記載されている（米国特許第5,846,233号）。所定量の溶液の任意の深さへの正確な複数の注射が可能な遺伝子治療で使用するためのシリンジシステムも記載されている（米国特許第5,846,225号）。
【０１５６】
遊離基剤または薬学的に許容される塩としての活性化合物の溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水中に調製することができる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物ならびにオイル中に分散液を調製することもできる。通常の保存および使用条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための防腐剤を含む。注射用に適切な薬学的形態には、滅菌水溶液または分散液および滅菌注射溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる（米国特許第5,466,468号（特にその全体が参照により本明細書に組み入れられる））。全ての場合において、形態は、無菌であるべきであり、シリンジでの使用が容易な範囲までの流動物でなければならない。製造および保存条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの夾雑微生物作用に対して保存されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、および/または植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって適切な流動性を維持することができる。種々の抗菌薬および抗真菌薬（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、およびチロメサールなど）によって微生物作用を予防することができる。多くの場合、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含めることが好ましい。吸収遅延剤組成物（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の使用によって注射用組成物を長期間吸収することができる。
【０１５７】
水溶液での非経口投与のために、例えば、必要に応じて溶液を適切に緩衝化し、最初に液体希釈物を十分な生理食塩水またはグルコースで等張にする。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内、および腹腔内投与に特に適切である。これに関して、使用することができる滅菌水溶液媒体は、本開示に照らして当業者に公知である。例えば、1投薬量を1mlの等張NaCl溶液に溶解し、1000mlの皮下注入液に添加するか提案された注入部位に注射することができる（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」15版, ページ 1035-1038および1570-1580を参照されたい）。治療を受ける対象の病状に依存して、いくつかの投薬量のバリエーションが必然的に存在する。投与を行う者は、任意の事象で、それぞれの対象に適切な用量を決定する。さらに、ヒトへの投与のために、調製物は、FDA Office of Biologics standardsによって要求されている無菌性、発熱性、一般的安全性、および純度の基準を満たすべきである。
【０１５８】
上記の種々の他の成分と共に適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、必要に応じてその後濾過滅菌を行うことによって滅菌注射液を調製する。一般に、基剤となる分散媒および上記由来の必要な他の成分を含む滅菌賦形剤への種々の滅菌有効成分の組み込みによって分散液を調製する。滅菌注射液調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分の粉末＋予め濾過滅菌したその溶液由来の任意の更なる所望の成分が得られる真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０１５９】
本明細書において開示の組成物を、中性または塩形態で処方することができる。薬学的に許容される塩には、酸添加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成）および無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）または有機酸（酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）で形成された酸添加塩が含まれる。遊離のカルボキシル基で形成された塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄など）および有機塩基（イソプロピルアミン、トリエチルアミン、ヒスチジン、およびプロカインなど）に由来し得る。処方の際、溶液を、投薬処方物に適合する様式および治療有効量などで投与する。処方物を、注射液および薬物放出カプセルなどの種々の投薬形態で容易に投与する。
【０１６０】
本明細書中で使用される、「キャリア」には、任意かつ全ての溶媒、分散媒、溶剤、コーティング、希釈剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、キャリア溶液、懸濁液、ならびにコロイドが含まれる。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当技術分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が有効成分に適合しない範囲を除いて、治療組成物におけるその使用が意図される。補助的有効成分を、組成物に組み込むこともできる。
【０１６１】
句「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」は、ヒトに投与した場合にアレルギー反応または類似の望ましくない反応を起こさない分子構成要素および組成物をいう。有効成分としてタンパク質を含む水性組成物の調製は、当技術分野において十分に理解されている。典型的には、このような組成物を、注射可能形態（液体溶液または懸濁液のいずれか）として調製し、注射前に液体にて溶液または懸濁液にするのに適切な固体形態を調製することもできる。
【０１６２】
XI.併用療法
本発明の化合物および方法を、新生物疾患/癌を含む病態の状況で使用することができる。本発明のペプチドを使用して治療すべき疾患/病態の型には、AML、MDS、およびCMLなどの白血病が含まれ得るが、これらに限定されない。他の癌型には、肺癌、頭頸部癌、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、骨肉種、精巣癌、子宮頸癌、消化管癌、リンパ腫、肺の前癌病変、結腸癌、黒色腫、膀胱癌、および任意の他の新生物疾患が含まれる。本発明の腫瘍関連HLA制限組成物（Pr3またはMYOのペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはその発現構築物コーディングなど）を使用した治療の有効性を増大させるために、これらの組成物をこのような疾患および病態の治療に有効な他の薬剤と組み合わせることが望ましいかもしれない。例えば、本発明の治療化合物および抗癌薬または手術などの他の抗癌療法を使用して、癌治療を実施することができる。
【０１６３】
種々の組み合わせを使用することができ、例えば、腫瘍関連HLA制限ペプチドは「A」であり、二次抗癌薬は「B」である。
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B 
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A 
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
【０１６４】
本発明の治療薬の患者への投与は、存在する場合に腫瘍関連HLA制限ペプチド治療の毒性を考慮して、特定の二次療法薬の投与のための一般的プロトコールに従う。必要に応じて治療サイクルを繰り返すと予想される。外科的介入と同様に、種々の標準的療法を記載の癌細胞と組み合わせて適用することができることも意図される。
【０１６５】
A.隣接抗癌療法
「抗癌」薬は、例えば、癌細胞の死滅、癌細胞のアポトーシスの誘導、癌細胞の成長速度の減少、転移の発生率または数の減少、腫瘍サイズの減少、腫瘍成長の阻害、腫瘍もしくは癌細胞への血液供給の減少、癌細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答の促進、癌進行の防止もしくは阻害、または癌対象の寿命の延長によって、対象の癌に負の影響を与えることができる。抗癌薬には、生物剤（生物療法）、化学療法薬、および放射線療法薬が含まれる。より一般に、これらの他の組成物を、細胞の死滅または細胞増殖の阻害に有効な組み合わせた量で提供するであろう。この過程は、細胞を発現構築物および薬剤または多因子（multiple factor）と同時に接触させる工程を含み得る。細胞を両薬剤を含む単一の組成物または薬学的処方物と接触させること、または細胞を一方の組成物が発現構築物を含み、他方が第2の薬剤を含む2つの異なる組成物もしくは処方物と同時に接触させることによってこれを行うことができる。
【０１６６】
化学療法薬および放射線療法薬に対する腫瘍細胞耐性は、臨床腫瘍学における主な問題である。現在の癌研究の1つの目的は、遺伝子治療との組み合わせによって化学療法および放射線療法の有効性を改良する方法を見出すことである。例えば、単純ヘルペス-チミジンキナーゼ（HS-tK）遺伝子は、レトロウイルスベクター系によって脳腫瘍に送達させた場合に、抗ウイルス薬である癌シクロビルに対する感受性を首尾よく誘導した（Culver et al., 1992）。本発明の文脈では、腫瘍関連HLA制限ペプチド療法を、他のアポトーシス調節薬または細胞周期調節薬に加えて、同様に、化学療法、放射線療法、免疫療法、または他の生物学的介入と組み合わせて使用することができることが意図される。
【０１６７】
または、遺伝子療法を、数分から数週間の範囲の間隔で他の薬剤治療の前または後に行うことができる。他の薬剤および発現構築物を個別に細胞に適用する態様において、一般に、薬物および発現構築物が細胞に対して依然として有利な組み合わせ効果を発揮することができるように、確実に各送達時間の間で有意な期間途切れないようにする。このような例では、細胞を、両様式と互いに約12〜24時間以内、より好ましくは約6〜12時間以内接触させることができることが意図される。しかしながら、いくつかの状況では、各投与の間に数日（2、3、4、5、6、または7日)から数週間（1、2、3、4、5、6、7、または8週間)が経過する場合、治療期間を有意に延長することが望ましいかもしれない。
【０１６８】
1.化学療法
癌療法には、化学物質および照射ベースの治療を使用した種々の併用療法も含まれる。併用化学療法薬には、例えば、シスプラチン (CDDP)、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトセシン、イフォスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソ尿素（nitrosurea）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン（plicomycin）、マイトマイシン、エトポシド (VP16)、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合因子、タキソール、ゲムシタビエン（gemcitabien）、ナベルビン、ファルネシル-タンパク質トランスフェラーゼ阻害因子、トランスプラチナ（transplatinum）、5-フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびメトトレキセート、テモゾロミド（Temazolomide）(DTICの水性形態)、または上記の任意のアナログもしくは誘導異種が含まれる。化学療法と生物療法との組み合わせは、生化学療法（biochemotherapy）として公知である。本発明は、癌の治療または予防のために使用することができるか癌の治療または予防で当技術分野において公知の任意の化学療法薬を意図する。
【０１６９】
2.放射線療法
DNA損傷を引き起こし、かつ広範に使用することができる他の因子には、γ線、X線、および/または腫瘍細胞への放射性同位体の定方向送達として一般的に知られているものが含まれる。マイクロ波およびUV照射などの他の形態のDNA損傷因子も意図される。全てのこれらの因子は、DNA、DNAの前駆体、DNAの複製および修復、および染色体のアセンブリおよび維持に対して広範な損傷を与える可能性が最も高い。X線の線量範囲は、長期間（3〜4週間）のための50〜200レントゲンの日々線量から2000〜6000レントゲンの単回線量の範囲である。放射性同位体の投薬範囲は、広範に変化し、同位体の半減期、放出した照射の強度および型、ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。
【０１７０】
用語「接触」および「曝露」を、細胞に適用する場合、治療構築物および化学療法薬または放射性療法薬を標的細胞に送達させ、標的細胞と直接並置する過程を説明するために本明細書中で使用する。細胞の死滅または静止を達成するために、両薬剤を、細胞を死滅させるか細胞の分裂を防止するのに有効な組み合せ量で細胞に送達させる。
【０１７１】
3.免疫療法
一般に、免疫療法は、癌細胞をターゲティングして破壊するための免疫エフェクター細胞および分子の使用に依存する。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体単独で治療のエフェクターとして役立ち得るか、抗体は実質的に細胞を死滅させるために他の細胞を補充することができる。抗体を、薬物または毒素（化学療法薬、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）に抱合することができ、抗体はターゲティング薬のみとして役立ち得る。または、エフェクターは、直接または間接的に腫瘍細胞標的と相互作用する表面分子を有するリンパ球であり得る。種々のエフェクター細胞には、細胞毒性T細胞およびNK細胞が含まれる。治療方法の組み合わせ（すなわち、直接細胞傷害活性およびホルチリン（Fortilin）の阻害または減少）により、癌治療において治療上の利点が得られるであろう。
【０１７２】
免疫療法を、組み合わせ療法の一部として使用することもできる。組み合わせ療法の一般的アプローチを以下で考察する。免疫療法の1つの局面において、腫瘍細胞は、ターゲティングの影響を受けやすい（すなわち、大多数の他の細胞上に存在しない）いくつかのマーカーを保有しなければならない。多数の腫瘍マーカーが存在し、任意のこれらは、本発明の状況でのターゲティングに適切であり得る。一般的な腫瘍マーカーには、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、泌尿器腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ（p97）、gp68、TAG-72、HMFG、シアリルルイス抗原、MucA、MucB、PLAP、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、erbB、およびp155が含まれる。免疫療法の別の局面は、免疫刺激効果を有する抗癌効果である。免疫刺激分子も存在し、IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFNなどのサイトカイン、MIP-1、MCP-1、IL-8などのケモカイン、ならびにFLT3リガンドなどの成長因子が含まれる。タンパク質としての免疫刺激分子の組み合わせまたはmda-7などの腫瘍サプレッサーと組み合わせた遺伝子送達の使用により、抗腫瘍効果の増強が示されている（Ju et al., 2000）。
【０１７３】
以前に考察しているように、現在研究中または使用されている免疫療法の例は、免疫アジュバント (例えば、マイコバクテリウム・ボビス、熱帯熱マラリア原虫、ジニトロクロロベンゼン、および芳香族化合物) (米国特許第 5,801,005号;同第5,739,169号;Hui and Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998)、サイトカイン療法(例えば、インターフェロンおよび；IL-1、GM-CSF、およびTNF)(Bukowski et al., 1998;Davidson et al., 1998;Hellstrand et al., 1998)、遺伝子療法(例えば、TNF、IL-1、IL-2、p53)(Qin et al., 1998; Austin-Ward and Villaseca,1998;米国特許5,830,880および同第5,846,945号)、およびモノクローナル抗体(例えば、抗癌グリオシドGM2、抗HER-2、抗pl85) (Pietras et al., 1998;Hanibuchi et al.,1998;米国特許第5,824,311号)である。ヘルセプチン (トラスツズマブ)は、HER2-neu受容体を遮断するキメラ（マウス-ヒト）モノクローナル抗体である。これは、抗腫瘍活性を有し、悪性腫瘍の治療での使用が証明されている(Dillman, 1999)。ハーセプチンおよび化学療法を使用した癌の併用療法は、個別の療法よりも有効であることが示されている。したがって、一つまたは複数の抗癌療法を、本明細書中に記載の腫瘍関連HLA制限ペプチド療法とともに使用することができることが意図される。
【０１７４】
i)養子免疫療法
養子免疫療法では、患者の循環リンパ球または腫瘍浸潤リンパ球をインビトロで単離し、IL-2などのリンホカインで活性化し、腫瘍壊死遺伝子を形質導入し、再投与する（Rosenberg et al., 1988;1989）。これを達成するために、免疫学的有効量の活性化リンパ球を本明細書中に記載のアジュバント組み込み抗原性ペプチド組成物と組み合わせて、動物またはヒト患者に投与する。活性化リンパ球は、血液または腫瘍サンプルからより早く単離し、インビトロで活性化（または「拡大」）した患者自身の細胞であることが最も好ましい。この免疫療法形態により数例で黒色腫および腎癌が寛解されているが、反応者の比率は反応しない者と比較して少なかった。
【０１７５】
ii)受動免疫療法
癌の受動免疫療法のための多数の異なるアプローチが存在する。これらは、概して以下のように分類される。抗体のみの注射：毒素または化学療法薬とカップリングした抗体の注射：放射性同位体とカップリングした抗体の注射：抗イディオタイプ抗体の注射：および、最後に、骨髄中の腫瘍細胞のパージング。
【０１７６】
好ましくは、ヒトモノクローナル抗体は患者が副作用をほとんど起こさないか全く起こさないため、受動免疫療法で使用する。しかしながら、その適用は希少性によりいくらか制限され、これまでのところ病変内のみに投与されている。癌グリオシド抗原に対するヒトモノクローナル抗体が、皮膚再発性黒色腫患者に病変内投与されている（Irie & Morton, 1986）。毎日または毎週の病変内注射後に10人の患者のうち6人で寛解が認められた。別の研究では、2種のヒトモノクローナル抗体の病変内注射では中程度の成果があった（Irie et al., 1989）。
【０１７７】
2つの異なる抗原に対して指向する複数のモノクローナル抗体、またはさらに複数の抗原特異性を有する抗体を投与することが好ましいかもしれない。治療プロトコールは、Bajorin et al. (1988)に記載のリンホカインまたは他の免疫エンハンサーの投与も含み得る。ヒトモノクローナル抗体の開発は、本明細書中の他の場所にさらに詳述されている。
【０１７８】
iii)能動免疫療法
能動免疫療法では、抗原性ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質、または自己もしくは同種腫瘍細胞組成物（すなわち、「ワクチン」）を、一般に、異なる細菌アジュバントと共に投与する（Ravindranath and Mitchell et al., 1990; Mitchell et al., 1993）。黒色腫免疫療法では、高IgM応答を誘発する患者は、しばしば低IgM抗体を全く誘発しないかあまり誘発しない患者よりも生存する（Morton et al., 1992）。IgM抗体は、しばしば、一過性抗体であり、この原則の例外は、抗癌グリオシドまたは抗炭水化物抗体のようである。
【０１７９】
4.遺伝子
さらに別の態様において、二次治療は、腫瘍関連HLA制限ペプチドの投与前、投与後、または同時に治療ポリヌクレオチドを投与する遺伝子療法である。以下の遺伝子産物の1つをコードする第2のベクターと併せた腫瘍関連HLA制限ペプチドをコードするベクターの送達により、標的組織に対して組み合わせ抗過剰増殖効果が得られる。または、両遺伝子をコードする単一のベクターを使用することができる。種々のタンパク質が本発明に含まれ、そのうちのいくつかを以下に記載する。本発明と組み合わせたいくつかの形態の遺伝子療法のためにターゲティングすることができる種々の遺伝子が当業者に公知であり、癌に関与する任意の遺伝子を含み得る。
【０１８０】
i)細胞増殖の誘発因子
細胞増殖を誘導するタンパク質は、機能に依存して種々のカテゴリーにさらに分類される。これらの全タンパク質の共通点は、細胞増殖を調節する能力である。例えば、PDGFの一形態であるsis癌遺伝子は、分泌成長因子である。癌遺伝子は成長因子をコードする遺伝子から稀に惹起し、現在、sisは唯一公知の天然に存在する発癌性成長因子である。本発明の1つの態様において、細胞増殖の特定の誘発因子に指向する抗センスmRNAを使用して細胞増殖の誘発因子の発現を防止することが意図される。
【０１８１】
タンパク質FMS、ErbA、ErbB、およびneuは、成長因子受容体である。これらの受容体の変異により、調製可能な機能が喪失する。例えば、Neu受容体タンパク質の膜貫通ドメインに影響を与える点変異により、neu癌遺伝子が得られる。erbA癌遺伝子は、甲状腺ホルモンの細胞内受容体に由来する。修飾発癌性ErbA受容体は、内因性甲状腺ホルモン受容体と競合して無制御成長を引き起こすと考えられている。
【０１８２】
最も大きな癌遺伝子クラスは、シグナル伝達タンパク質（例えば、Src、Abl、およびRas）を含む。タンパク質Srcは細胞質タンパク質-チロシンキナーゼであり、ある場合には、癌原遺伝子から癌遺伝子へのその形質転換はチロシン残基527の変異を介して起こる。対照的に、GTPアーゼタンパク質rasの癌原遺伝子から癌遺伝子への形質転換は、1つの例では、配列中のアミノ酸12でのバリンからグリシンへの変異に起因し、これによりGTPアーゼ活性が減少する。
【０１８３】
タンパク質Jun、Fos、およびMycは、転写因子として核機能に対してその効果を直接発揮するタンパク質である。
【０１８４】
ii)細胞増殖の阻害因子
腫瘍抑制癌遺伝子は、過剰な細胞増殖を阻害する働きをする。これらの遺伝子の不活化によってその阻害活性が破壊され、無秩序に増殖する。腫瘍サプレッサーp53、p16、およびC-CAMを以下に記載する。
【０１８５】
上記のp53に加えて、別の細胞増殖阻害因子はp16である。真核細胞周期の主な移行は、サイクリン依存性キナーゼ（すなわち、CDK）によって誘発される。1つのCDK（サイクリン依存性キナーゼ4）（CDK4）は、G1を介した進行を調節する。この酵素活性は、G1後期にRbをリン酸化することであり得る。CDK4の活性は、活性化サブユニットであるD型サイクリンおよび阻害サブユニットであるp16INK4によって制御され、p16INK4は、CDK4に特異的に結合して阻害し、それによりRbリン酸化を調節することができるタンパク質として生物学的に特徴づけられている（Serrano et al., 1993; Serrano et al., 1995）。p16INK4タンパク質はCDK4阻害因子であり（Serrano, 1993）、この遺伝子の欠失により、CDK4活性が増加し、Rbタンパク質を高リン酸化することができる。p16は、CDK6機能を調節することが公知である。
【０１８６】
p16INK4は、新規に記載されたCDK阻害タンパク質クラスに属し、pl6B、pl9、p21WAF1、およびp27KIP1も含まれる。p16INK4遺伝子は、9p21（多数の腫瘍型で頻繁に欠失している染色体領域）にマッピングされる。p16INK4遺伝子のホモ接合性欠失および変異は、ヒト腫瘍細胞株で頻繁に起こる。この証拠より、p16INK4遺伝子が腫瘍抑制遺伝子であることが示唆される。しかしながら、この解釈は、p16INK4遺伝子の変化の頻度が培養細胞株よりも初代非培養腫瘍で低いという所見によって疑われている(Caldas et al., 1994; Cheng et al., 1994; Hussussian et al., 1994; Kamb et al., 1994; Kamb et al., 1994; Mori et al., 1994; Okamoto et al., 1994; Nobori et al., 1995; Orlow et al., 1994; Arap et al., 1995)。プラスミド発現ベクターでのトランスフェクションによる野生型p16INK4機能の修復により、いくつかのヒト癌細胞株によるコロニー形成を減少させた(Okamoto, 1994; Arap, 1995)。
【０１８７】
本発明で使用することができる他の遺伝子には、Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zacl、p73、VHL、MMAC1/PTEN、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27、p27/pl6融合物、p21/p27融合物、抗血栓遺伝子(例えば、COX-1、TFPI)、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、ElA、p300、血管形成に関与する遺伝子(例えば、VEGF、FGF、トロンボスポンジン、BAI-1、GDAIF、またはその受容体) 、およびMCCが含まれる。
【０１８８】
iii)プログラム細胞死の制御因子
アポトーシス（すなわち、プログラム細胞死）は、正常な胚発生、成体組織の恒常性の維持、および発癌の抑制に不可欠な過程である（Kerr et al., 1972）。タンパク質のBcl-2ファミリーおよびICE様プロテアーゼは、他の系における重要な制御因子およびエフェクターであることが証明されている。濾胞性リンパ腫に関連して発見されたBcl-2タンパク質は、アポトーシスの制御および種々のアポトーシス刺激に応答した細胞生存の増強で重要な役割を果たす（Bakhshi et al., 1985; Cleary and Sklar, 1985; Cleary et al., 1986; Tsujimoto et al., 1985; Tsujimoto and Croce, 1986）。進化的に保存されたBcl-2タンパク質は、現在、死亡アゴニストまたは死亡アンタゴニストとして分類することができる関連タンパク質ファミリーのメンバーであると認識されている。
【０１８９】
その発見に続き、Bcl-2は種々の刺激によって誘発される細胞死を抑制するように作用することが示された。また、現在、構造および配列の相同性を共有するBcl-2細胞死調節タンパク質ファミリーが存在することが明らかである。これらの異なるファミリーメンバーは、Bcl-2に対する類似の機能(例えば、BclXL、BcIW、BclS、Mcl-1、A1、Bfl-1)を有するか、Bcl-2機能に反作用して細胞死を促進する（例えば、Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri)ことが示されている。
【０１９０】
5.手術
癌患者の約60％がいくつかの手術型を受けており、予防手術、診断または病期分類のための手術、根治目的の手術、および症状緩和を目的とした手術が含まれる。根治目的の手術は、本発明の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、および/または代替療法などの他の療法と併せて使用することができる癌治療である。
【０１９１】
根治目的の手術は、癌組織の全部または一部を物理的に除去、摘出、および/または破壊する切除を含む。腫瘍切除は、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去をいう。腫瘍切除に加えて、手術による治療には、レーザー手術、凍結手術、電気外科手術、および顕微鏡制御手術（モーズ手術）が含まれる。表在癌、前癌、または付随する正常組織量の除去と併せて本発明を使用することができることがさらに意図される。
【０１９２】
全ての癌細胞、癌組織、または腫瘍の一部の切除の際、体内に空洞が形成され得る。さらなる抗癌療法を使用したこの領域の灌流、直接注射、または局所投与によって治療を行うことができる。このような治療を、例えば、1、2、3、4、5、6、または7日毎、1、2、3、4、および5週間毎、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12ヶ月毎に繰り返すことができる。これらの治療は、投薬量も変化させることができる。
【０１９３】
XII.実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を証明するために含まれる。以下の実施例に開示の技術は本発明の実施において十分に機能することが本発明者によって発見された技術を示すため、その実施のための好ましい形態を構成すると見なすことができると当業者に認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示を考慮して、開示の特定の態様の多くの変更形態を得ることができ、本発明の精神および範囲を逸脱することなく依然として同様または類似の結果が得られることを認識する。
【０１９４】
実施例1
方法
患者およびドナー。ドナーおよび患者を、Institutional Review Boardによって承認されたプロトコールによってUniversity of Texas M. D. Anderson Cancer Centerで治療した。インフォームドコンセント後、CML患者由来の細胞およびそのHLA適合骨髄（BM）移植ドナーを得た。非治療CML患者またはIFNを投与された患者由来のPBMCを回収し、その後の分析のために低温保存した。標準的なプロトコールにしたがって、Ficoll-Hypaque勾配密度(Organon Teknika Corp. , Durham, North Carolina, USA)を使用して細胞を分離し、20％加熱不活化プールヒトAB血清(AB;Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA)および10％DMSOを補足したRPMI-1640完全培地(CM)(25 mM HEPES緩衝、2 mM L-グルタミン、100 U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン;Life Technologies Inc., Gaithersburg, Maryland, USA)中で凍結させた。使用前に、細胞を解凍し、洗浄し、CM＋10%AB中に懸濁した。M. D. Anderson Cancer CenterのHLA Laboratoryによって、高分解能HLA試験を行った。
【０１９５】
ペプチド合成。PR1 (aa 169-177)ペプチド(VLQELNVTV (SEQ ID NO：1))をBio-Synthesis (Lewisville, Texas, USA)によって合成し、HLA-A2制限CMV pp65ペプチド(NLVPMVATV (SEQ ID NO：2))を、M. D. Anderson Protein and Nucleic Acid Facilityで合成し、共に最低純度は95％であった。
【０１９６】
細胞株およびペプチド結合。T2細胞(American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA)を、CM＋10％FBS (Atlanta Biologicals Inc., Norcross, Georgia, USA)での培養において維持した。PR1ペプチドを、100μg/ml β2m(Sigma-Aldrich)を含む1ml CM中で106個のT2細胞と共に漸増濃度にて37℃で18時間インキュベートした。細胞をCMで2回洗浄し、BB7.2 Abで染色し、再度洗浄し、FITC標識二次Ab(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, California, USA)で染色した。HLA-A*0201発現を、FACSによって測定した。
【０１９７】
ペプチド特異的CTLを、以前に記載の方法を使用して培養において拡大した（Molldrem et al., 1996; Molldrem et al., 1997）。簡単に述べれば、健常ドナーまたはCML患者由来のPBMCを、インビトロでPR1、pp65、またはfluペプチドで刺激した。T2細胞を無血清CMで3回洗浄し、CM中で表示のペプチド濃度で2時間ペプチドとインキュベートした。次いで、ペプチド負荷T2細胞を、7,500cGyで照射し、1回洗浄し、新たに単離したPBMCと1:1〜1:2の比で10％ABを補足したCM中に懸濁した。培養7日後、第2の刺激を行い、翌日に、60IU/mlの組換えヒトインターロイキン-2（rhIL-2）（BioSource International, Camarillo, California, USA）を添加した。培養14日後、第3の刺激を行い、その後15日目にrhIL-2を添加した。21日目に第4の刺激を行い、その後22日目にrhIL-2を添加した。全部で27〜28日間の培養後、ペプチド刺激T細胞を得て、ペプチド特異的細胞毒性および白血病特異的細胞毒性ならびに表現型分析について試験した。
【０１９８】
四量体合成。MHC/ペプチド四量体の産生は、他で詳述されている(Altman et al., 1996; Molldrem, 2000)。簡単に述べれば、BirA依存性ビオチン化についての15アミノ酸基質ペプチド(BSP)を、HLA-A2のCOOH末端上で操作した。A2-BSP融合タンパク質およびヒトβ2mを、大腸菌中で発現させ、特定のペプチドリガンドを使用してインビトロで折り畳んだ。適切に折り畳まれたMHC-ペプチド複合体を、FPLCおよび陰イオン交換を使用して十分に精製し、BirA酵素(Avidity, Denver, Colorado, USA)を使用してBSP内の1つのリジンをビオチン化した。ビオチン化MHC-ペプチド複合体とフィコエリトリン抱合(PE抱合)ニュートラアビジン（Neutravidin）(Molecular Probes Inc. , Eugene, Oregon, USA)との4:1のモル比での混合によって四量体を産生した。PR1四量体を、PR1に特異的なCTL株に対する染色によって確認した。CMV四量体を、CMV免疫個体由来のPBMCの染色によって確認した。
【０１９９】
Abおよびフローサイトメトリー。日常的な表面-抗原染色のために、106個のPBMCを、Abと共に4℃でインキュベートした。洗浄後、細胞を、氷上で30分間FITC標識CD8(Caltag Laboratories Inc., Burlingame, California, USA)とインキュベートした。TCRの表面発現を、FITC標識TCR-αβ(PharMingen, San Diego, California, USA)を使用して決定し、FITC-標識Ab(Caltag Laboratories)を使用してアネキシンVを決定した。プロテイナーゼ3発現を、マウス一次Ab(Accurate Chemical & Scientific Corp. , Westbury, New York, USA)を使用して決定した。マウスモノクローナル抗HLA-A2.1 Ab BB7.2および抗HLA-ABC w6/32は、ハイブリドーマ細胞株の培養上清に由来した(American Tissue Culture Collection)。細胞を洗浄し、2％パラホルムアミド中で固定し、FACScan(Becton Dickinson Immunocytometry Systems)で分析し、データを、CELLQuest(Becton Dickinson Immunocytometry Systems)ソフトウェアを使用して分析した。明らかに異なる活性を示すために必要な四量体の最小濃度を、適定試験で決定した。各四量体試薬を個別に適定し、至適濃度で使用した。CTL集団の蛍光強度の最大分離を示す四量体濃度は、一般に、10〜20μg/mlであった。死細胞を排除するために、製造者の説明書にしたがって、ヨウ化プロピジウム(PI)(Becton Dickinson Immunocytometry Systems)染色(1μg/ml)を行った。PerCP-標識CD14およびCD19(共にBecton Dickinson Immunocytometry Systems)での染色によってHLA-A2重鎖に非特異的に結合する単球およびBリンパ球を排除するために、四量体染色と共に「ダンプ（dump）」チャネルを使用した。
【０２００】
四量体解離のt1/2の詳細な検出方法は他で記載されている（Savage et al., 1999）。簡単に述べれば、T細胞を、PR1/HLA-A2四量体で45分間染色し、洗浄し、4℃に冷却した。四量体の再結合を防止するために、細胞を、飽和量のBB7.2Abと共にPI（1μg/ml）の存在下でインキュベートし、フローサイトメトリーを使用して、10分間隔で蛍光減衰を測定した。各測定点でCD8+事象の定数を得た。CD8+細胞あたりの四量体陽性ゲート内の全蛍光を正規化し、ペプチド刺激後のリンパ球集団の認められた全蛍光から対照健常ドナーリンパ球の全蛍光を引くことによって抗原特異的蛍光を決定した。この抗原特異的蛍光を、最初の測定点における全蛍光の比率に対して正規化し、対数尺でプロットした。四量体の解離t1/2を、時間に対するln（正規化蛍光）のプロッティングによって決定し、t1/2＝0.693/k（kは線形最小二乗法によって決定された正規化蛍光減衰曲線の勾配である）を得た。
【０２０１】
CTL細胞毒性アッセイ。以前に記載のように、半自動化ミニ細胞毒性（minicytotoxicity）アッセイを使用して、特異的溶解を決定した(Molldrem, 2000; Molldrem et al., 1996)。簡単に述べれば、エフェクター細胞を、6×103〜25×103細胞/ウェルの2倍希釈物中で調製し、40μlの60ウェルTerasakiトレイ(Robbins Scientific, Sunnyvale, California, USA)中にプレートし、希釈物あたり6つの複製物を得た。2×106細胞/mlの濃度の標的細胞(T2細胞、骨髄由来白血病細胞、または健常ドナー由来のBM)を、10μg/mlのカルセイン-AM(Molecular Probes Inc.)にて37℃で60分間染色した。CM＋10％ABで3回洗浄後、標的細胞を105細胞/mlで再懸濁し、103個の標的細胞を含む10μlの培地をエフェクター細胞を含む各ウェルに添加した。標的細胞のみおよび培地のみを含むウェルを、それぞれ最大（max）および最小（min.）蛍光放射のために使用した。5％C02中での37℃で4時間のインキュベーション後、5μl FluoroQuench(One Lambda Inc. , Canoga Park, California, USA)を各ウェルに添加し、トレイを60gで1分間遠心分離し、その後自動化CytoFluor IIプレートリーダー(PerSeptive Biosystems, Framingham, Massachusetts, USA)を使用して蛍光を測定した。溶解率を、以下のように計算した：溶解率={1-[(平均実験放射-平均最小値)/ (平均最大値-平均最小値)]×100％。
【０２０２】
実施例2
臨床試験
前臨床研究に基づいて、不応性または再発性骨髄性白血病患者のPR1ペプチドワクチン接種の毒性および有効性を調査した。この研究を以下の2相で行う：第I相（初期毒性相）（初期ワクチン安全性を決定するため）および第II相（有効性および毒性相）。第I相で9人の患者を研究し、第II相で60人の患者を研究する。これまで、第I相に4人の患者が参加した。プロトコールの詳細を以下に記載した。
【０２０３】
骨髄性白血病に対するPR1特異的宿主応答を誘導するために、フロイント不完全アジュバントを含むPR1ペプチドを3週間毎に3回皮下注射する。第I相および第II相の両方において、免疫反応性の徴候についても患者を評価する。9週間のワクチン接種前、接種中、および接種後、患者由来の末梢血単核細胞（PBMC）を、PR1負荷標的細胞および患者自体の白血病に対する細胞毒性Tリンパ球前駆体頻度（CTLPf）アッセイ（有効性の測定）、PR1/HLA-A2四量体染色、表面表現型についての8色フローサイトメトリー（記憶/ナイーブ、活性化）、および患者由来のバルクPR1刺激PBMCの細胞融解アッセイを使用して、インビトロでのPR1免疫反応性の発生について試験する。白血病細胞中でのプロテイナーゼ3発現量を、細胞質フローサイトメトリー分析によって研究する。任意の臨床応答（標準的な基準によって血液応答および/または細胞遺伝学的応答として定義）を、インビトロ試験と相関させる。固定量のIFAを使用した3用量レベルのペプチドでのワクチン接種を行い、確立された毒性基準によって停止基準を導く。
【０２０４】
第I相。本研究の第I相では、患者を、用量レベル1から始まる3つの漸増ペプチド用量レベルに割り当てる。患者を、用量制限毒性の徴候についてサイズ3の用量コホートに従わせる。常に3人の患者のうちの1人だけが任意の用量レベルでグレード3以上の非血液毒性または自己免疫現象（すなわち、用量制限毒性）を有する場合に限り、患者を次に最も高い用量レベルコホートに割り当てる。各用量レベルで、参加した第1の患者は、この用量レベルでのコホートで第2の患者の開始前に3回のワクチン接種のうちの2回を完了していなければならない。第3の患者が参加する前に、各用量コホート中の第1の患者は全てのワクチン接種を完了していなければならず、第2の患者は第3の患者のワクチン接種の開始前に少なくとも2回のワクチン接種を完了していなければならない。さらに、第1の3人の患者でグレード3未満の非血液毒性が認められ、かつ自己免疫現象が認められない場合、類似の様式で患者に次の用量レベルを与える。常に任意の用量レベルに参加している患者の1/3がグレードIIIまたはIVの非血液毒性を有する場合、最大耐量（MTD）を超えており、このペプチド用量レベルおよび全てのより高いペプチド用量レベルを、第II相研究から排除する。第3の患者が第3のワクチン接種から3週間が経過し、かつ用量制限毒性が示さない場合に限り、次の用量への用量増加を行う。
【０２０５】
グレード2以上のアレルギー反応が任意の患者で生じた場合、この患者にさらなるワクチン接種を行わず、この患者を研究からはずす。アレルギー反応を、ソルメドロール1mg/kg IVボーラス、ベナドリル50mg IVボーラス、およびエピネフリン0.5mg S.C.で治療する。
【０２０６】
第II相。研究の第II相を、連続再評価統計モデルにしたがって行う。60人までの患者を、3つの用量レベルに無作為に選択し、各用量レベルで最大20人の患者を有する。本研究の第I相で決定された用量制限毒性を含まないこれらの用量レベルのみを、第II相で試験する。毒性および有効性を一次エンドポイントとして決定する。患者をサイズ4のコホートでモニタリングし、任意のコホート中の全患者を、次のコホートを続ける前にグレードIIIまたはIV非血液毒性の非存在下で群中の最後の患者の第1の投与から少なくとも2週間観察する。確立された方法（established）を使用して、毒性情報を慎重に獲得する。9週間の研究中に任意の3つの用量群で第1の4人患者のうちの2人（第1のコホート）、第1の8人患者のうちの3人、第1の12人患者のうちの4人、または第1の16人患者のうちの5人でグレードIIIまたはIV非血液毒性が認められた場合、この用量レベルを終了し、患者を残りの用量レベルのみで治療する。用量制限毒性が各コホートについて上記で定義した患者数に到達しない場合に限り、次のコホートに移行する。
【０２０７】
用量制限毒性未満のグレードII非血液毒性を経験する任意の患者に次のワクチン接種を行う前に、2週間の観察期間が存在する。この2週間以内に毒性がグレードI以下に減少する場合、患者に次のワクチン接種を行う。2週間以内に毒性がグレードI以下に減少しない場合、患者をプロトコールからはずす（研究から取り除く）。
【０２０８】
自己免疫反応の明確な証拠が得られる任意のグレードの毒性を、用量制限毒性と見なす。このような反応によりこのプロトコール下でのペプチドのさらなる投与が不可能となり、研究を終了する。ワクチン投与によってヴェゲナー様脈管炎または炎症疾患が発症するという証拠が存在する場合、研究を終了する。
【０２０９】
PR1ワクチンに対する免疫応答として定義した有効性を、研究の一次エンドポイントと決定することができる。第1の12人の患者において誰も特定の用量レベルで免疫応答を示さない場合、この用量レベルを終了する。必須の3回の免疫化後にこのプロトコールで患者を再治療することも、1.0mgを超えてPR1ペプチドの用量を増加させることもない。
【０２１０】
最大耐量（MTD）を、各用量レベルのコホートでの各相について述べた許容患者数を超える用量制限非血液毒性（用量制限毒性）を生じない最も高いペプチド用量と定義する。以下の場合にこの研究の第I相または第II相におけるMTDを決定する。(1)第I相における各用量レベルコホートの3人の患者のうちの1人より多い患者が用量制限毒性に達した場合、または(2)第II相における任意の3つの用量群の第1の8人の患者のうちの3人、第1の12人患者のうちの4人、または第1の16人患者のうちの5人で用量制限非血液毒性を超えた場合。
【０２１１】
実施例3
PR1-CTLの生成およびエクスビボ研究
実験および臨床による証拠は、HLA適合同種正常ドナー由来のリンパ球が、骨髄性白血病患者を治療するために使用した場合、強力な移植片対白血病（GVL）効果を発揮することを示す（Drobyski et al., 1994; Horowitz et al., 1996）。ドナーリンパ球注入（DLI）のみを同種骨髄移植（BMT）後に再発した患者に投与した場合、骨髄性白血病患者が治癒することができる（Collins et al., 1997 ; Kolb and Holler, 1997）。しかしながら、移植片対宿主病（GVHD）は、患者のほぼ50％で起こるDLI治療の望ましくなく、しばしば死に至る合併症である。これらのリンパ球のGVLおよびGVHD標的抗原はほとんど知られていない。以下の場合にDLI後にGVLが増強されて、かつGVHDが消失し得る。(1)GVLの好ましい標的である抗原が公知である場合、および(2)抗原特異性に基づいたGVLの原因となるリンパ球の有効なエクスビボでの富化過程が確立された場合。
【０２１２】
この研究では、高親和性および低親和性のPR1特異的CTLをエクスビボで正常なドナーから拡大し、GVHDを発症することなくGVLを送達させるために従来のDLIの代わりに骨髄性白血病患者に導入するための抗原コーティングマイクロビーズを使用して富化することができるかどうかを決定した。より有効にPR1-CTLを生成し、マイクロビーズを使用して高親和性PR1-CTLを富化し、養子免疫療法のために選択されたPR1-CTLをエクスビボで拡大する方法も調査した。
【０２１３】
手順。PR1ペプチドをHLA-A2重鎖の結合領域に組み合わせ、得られたタンパク質をβ2-ミクログロブリンを使用して折り畳み、得られたPR1/HLA-A2単量体を50nm磁性マイクロビーズ(Miltenyi Co.)に結合させた (Wang et al., 2000)。これを行うために、使用したテクノロジーを、重鎖単量体のC末端をビオチン化して4:1のモル比でストレプトアビジンと組み合わせ、その後フィコエリトリン（PE）に抱合したPR1/HLA-A2四量体をアセンブリするように適合させる。次いで、PR1単量体抱合マイクロビーズを、マイクロビーズ接着T細胞を捕捉する磁石で覆われた滅菌カラムを通過させることができる。非接着細胞がカラムを通過した後、カラムを磁石から取り出し、マイクロビーズに結合したPR1特異的T細胞を回収することができる。この方法により、PR1特異的T細胞を選択可能であり、これをさらに拡大してGVHDを発症することなくGVLを促進するために骨髄性白血病患者に投与することができる。
【０２１４】
PR1抗原特異的Tリンパ球の短期拡大のための最も有効なインビトロ方法の決定。結果は、PR1特異的細胞毒性Tリンパ球（CTL）が正常ドナーに1/15,000〜1/300,000の頻度で存在することを示す。したがって、PR1特異的CTLは、最初に拡大されるため、十分な細胞が磁性ビーズ分離によるその後の富化に利用可能である。短期ポリクローナルPR1特異的CTLを拡大するための異なる方法によって得られた抗原提示細胞（APC）の有効性を比較する。APCとしての末梢血単核球（PBMC）を、2時間の接着工程後の末梢血単球由来の樹状細胞（DC）と比較する。同一の健常HLA-A2＋ドナー由来の接着細胞と10 ng/ml IL-4＋1000 U/ml GM-CSFまたは1000 U/ml IFN-α＋1000 U/ml GM-CSFのいずれかとのインキュベーション後に1週齢のDCが誘導される(Verdijk et al., 1999 ; Santini et al., 2000)。得られたAPCを、10μg/mlのPR1＋20 U/mlのIL-2で毎週パルスし、反応者のPBMCと1:1〜1:20の比で組み合わせる。これらのAPCを、標準的なT2細胞（TAP1/2欠損によって内因性抗原を提示することができず、かつ細胞表面上にパルスしたペプチドのみを提示することができる細胞株）と比較する(Salter and Cresswell, 1986)。ペプチドパルスAPCとしてT2細胞を使用した予備研究により、28日目までに全リンパ球培養物の2％と8％との間にPR1特異的CTLが拡大された(Molldrem et al., 2000)。
【０２１５】
さらに、上記のAPC法を、PR1ペプチドでパルスしたキイロショウジョウバエS2細胞から得た結果とも比較する(Janetzki et al., 2000)。S2細胞は、HLA-A2.1重鎖、β-2M、ICAM-1、および同時刺激分子B7.1でトランスフェクトされていた。トランスフェクトされたS2の表面上のペプチドのパルシングにより、これらの細胞は、インビトロでのCTLの重要な第1のペプチド抗原刺激ラウンド中に有効なAPCとして作用する能力が証明された。APC集団としてのS2細胞使用の利点は、室温で増殖することができ、その後にあまり手間がかからず、最終的な臨床応用のための重要な要素であるという点である。
【０２１６】
培養3〜4週間後、得られたPR1特異的CTLを、異なる蛍光色素を抱合したCD8、CD69、HLA-DR、CD25、LFA-1、CD54、CD2、細胞内γ-インターフェロン、およびCD45(RO)に対する抗体と組み合わせてPR1/HLA-A2四量体を使用して定量および特徴づけを行う(Molldrem et al., 1999; Molldrem et al., 2000)。次いで、細胞を、同時に10色の細胞蛍光比色分析を行うことができるMoFlo血球計算器を使用して分析する。種々のAPC条件の効率を、四量体を使用したPR1特異的CTLの定量によって直接比較することができ、他のマーカーで活性化状態、機能状態、および記憶表現型を比較することが可能である。
【０２１７】
PR1/HLA-A2単量体コーティングマイクロビーズを使用して高親和性および低親和性抗原特異的細胞毒性Tリンパ球を分離して富化することができるかどうかの決定。予備研究から、低用量の四量体試薬の使用により、FACSによって評価した高いおよび低い四量体染色に基づいて高親和性および低親和性のT細胞受容体（TCR）を有するCTLを区別することができることが示された(Molldrem et al., 1998)。四量体結合のT1/2は染色強度と相関することが示されており、CML標的細胞の特異的溶解はTCR親和性と相関する。高親和性PR1-CTLを、低用量PR1（2μg/ml）の存在下で正常ドナーから誘発し、低親和性PR1-CTLを高用量PR1（200μg/ml）を使用して誘発した(Molldrem et al., 1998)。
【０２１８】
PR1抗原特異的T細胞を優先的に選択するために、ストレプトアビジンコーティングマイクロビーズ(Miltenyi,Inc.製)を使用する。ビーズを、重鎖のビオチン標識C末端を介してPR1＋HLA-A2と抱合する(Wang et al., 2000)。PR1パルス短期CTL株を、PR1/HLA-A2コーティングマイクロビーズと30分間インキュベートし、MACS磁性カラムを使用して選択する。ビーズ選択CTLおよびビーズ非選択CTLを、PR1/HLA-A2四量体を使用したフローサイトメトリーによって定量し、出発ポリクローナルCTL株と比較する。PR1特異的CTLを誘発するためのPR1パルスT2細胞を使用した予備研究に基づいて、選択過程後の収率は85％〜100%の範囲であり、PRl特異的CTL純度は11％〜21％の範囲である(すなわち、抗原特異的CTLの純度の3〜5倍)(Molldrem et al.,1999 ; Wang et al., 2000)と推定される。
【０２１９】
選択されたPRl特異的CTLを、機能活性について試験する。PRlコーティングT2細胞、CMLおよびAML骨髄細胞、ならびに正常HLA-A2骨髄の特異的溶解を、PRl特異的CTLを使用して評価し、非選択CTLによる溶解と比較する。最も高い親和性のPRl特異的CTLの選択方法を、最も高い収率を達成するための異なる比のPR1/HLA-A2単量体、マイクロビーズ、および出発細胞集団、ならびに最も高い純度の高親和性PR1特異的CTLを使用して至適化する。
【０２２０】
PR1/HLA-A2単量体コーティングマイクロビーズを使用して分離したリンパ球を骨髄性白血病の養子免疫療法で使用するのに十分な数に拡大することができるかどうかの決定。BMT後に白血病が再発した患者を治療するために1〜5×106個のCTLが必要であり得る と評価されている(Mackinnon et al., 1995)。ビーズ富化と組み合わせたCTL拡大技術の至適化により、白血球搬出産物の必要条件を100mlの末梢血ほどに減少させることができる。この目的を達成するために、ビーズ富化PR1特異的CTLを短期培養でさらに拡大することができるかどうかを決定する。以下の2つの方法を直接比較する。非特異的方法に対して前に決定された至適化された技術を使用して、PR1コーティングAPCでの毎週の再刺激によってPR1-CTLを拡大する。抗CD3＋抗CD28コーティングDynalビーズを、種々の用量のIL-2を含む培養培地中でビーズ富化PRl特異的CTLと同時インキュベートする(Garlie et al., 1999; Levine et al., 1998)。制御された実験において、PR1-CTL数を最適にするためにIL-12およびインターフェロンなどの他のサイトカインを補足する (Fallarino et al., 1996)。PR1/HLA-A2四量体を使用してPR1特異性を培養後に確認し、CTL機能活性をPRlコーティングT2細胞およびHLA-A2＋白血病細胞標的に対する標準的な細胞毒性実験を使用して確認する。
【０２２１】
CTLの非特異的拡大（抗CD3および抗CD28を有する）が有効であることが見出され、PR1特異的CTLを維持することができる場合、この方法でPR1またはビーズ選択を試験し、上記のPR1特異的拡大方法と比較する。これにより、ビーズ富化後のさらなるCTL拡大の必要性を排除することができる。
【０２２２】
一般至適化されると、これらの方法を、臨床で使用するために、骨髄ドナーからCD34+前駆細胞を選択するためのMiltenyi MACS（商標）磁性ビーズ系を使用して骨髄性白血病患者を治療するために、臨床に容易に移行することができる。さらに、これらの方法を使用して、他の腫瘍抗原、副抗原、およびウイルス抗原に対して異なる特異性を有するCTLを選択することができる。本明細書中に記載の方法を使用して、このようなCTLを1工程で誘発および選択し、養子免疫伝達を行うことができる。
【０２２３】
本明細書中に記載の技術に基づいて、有効な臨床拡大手順を、抗原特異的Tリンパ球の養子免疫伝達のために決定する。
【０２２４】
実施例4
予備研究
ペプチド選択および結合アッセイ。骨髄性白血病の養子免疫療法のために使用することができるT細胞の第1の生成工程では、公開されたアルゴリズム(Parker et al., 1994)を使用してHLA-A*0201に結合することが予想されたPr3の公開された配列由来のいくつかのペプチドを同定した。US集団における高い頻度（49％の個体）によって任意の最終的免疫治療ストラテジーの治療妥当性が最大となるため、この対立遺伝子を選択した。公知のHLA-A2.1結合モチーフに基づいて十分に高い結合親和性を有することが予想される9つのペプチドのうち、予想される結合が最も高い2つをその後合成した(PR1およびPR2と呼ぶ) (表4)。Biosynthesis(Lewisville, TX)によって、最低で95％の純度でペプチドを合成した。
【０２２５】
（表４）HLA-A*0201制限Pr3ペプチドの推定結合半減期
2007504149.tif 000011
【０２２６】
HLA-A2.1へのペプチドの結合を、2つのアッセイを使用して確認した。第1に、直接的フローサイトメトリーを使用して、ペプチドでコーティングされたA2＋T2細胞株上でのHLA-A2.1表面発現を測定した。T2細胞は、TAP1およびTAP2遺伝子を欠き、それにより内因性MHCクラスI制限抗原を提示することができないヒトリンパ球株である。ペプチドがHLA-A2.1に有効に結合した場合、ペプチドはβ2-ミクログロブリンとの複合体を安定化し、HLA-A2.1表面発現を増加させ、フローサイトメトリーを使用して測定することができる。HLA-A2.1特異的モノクローナル抗体(BB7.2, ATCC, Rockville, MD)、その後にFITC標識二次抗体(CalTag Laboratories,Burlingame, CA)を使用して、HLA-A2.1の表面発現を測定した。
【０２２７】
第2のアッセイでは、HLA-A2.1重鎖、ペプチド、およびβ2-ミクログロブリンのヘテロ三量体複合体由来のI125標識β2-マイクログロブリンの解離速度を測定し、結合半減期（T1/2）を計算した。標識ヘテロ三量体複合体を、高速液体クロマトグラフィによるゲル濾過によって組み込まれていないβ2-ミクログロブリンから分離し、β2-ミクログロブリンの解離半減期を、第2ラウンドにゲル濾過への複合体アリコートを供することによって決定した。
【０２２８】
PR1およびPR2は、HLA-A2.1発現のバックグラウンドとしてペプチドを付加していないT2細胞と比較して表面HLA-A2.1発現の増加が認められた（表5）。対照インフルエンザペプチドは、インフルエンザB核タンパク質(aa 85-94; Flu)であり、TaxはHTLV-1ペプチドであり(aa 11-19)、共にHLA-A2.1に対する公知の結合親和性を有する。β2-ミクログロブリン解離を使用して測定した長期測定T1/2により、HLA-A2.1へのPR1およびPR2の結合を確認した。
【０２２９】
（表５）HLA-A2.1へのPR1およびPR2の結合の測定
2007504149.tif 000012
【０２３０】
ペプチドに対する一次CTL応答の誘導。次にこれらのペプチドを使用して、ペプチドコーティング標的に特異的なT細胞を刺激した。HL-A2.1についてヘテロ接合性を示す正常な健常ドナー由来のPBMCを、ペプチドパルスT2細胞で刺激した。他の者によってペプチド特異的CTLの生成のための抗原提示細胞としてT2細胞株が使用されている。簡単に述べれば、T2細胞（同時刺激分子B7.1を同時発現する）を、ペニシリン/ストレプトマイシンおよびグルタミン（CM）を補足した無血清RPMI培養培地で3回洗浄し、20μg/mLのペプチドと共にCM中で2時間インキュベートした。次いで、ペプチド負荷T2細胞を、7500cGyで照射し、1回洗浄し、1:1の比の新たに単離したPBMCと共に10％ヒト血清(HS)(Sigma, St. Louis, MO)を補足したCM中に懸濁した。培養7日後、第2の刺激を行い、翌日に、60IU/mLの組換えヒトインターロイキン-2(rhIL2)(Biosource International, Camarillo, CA)を添加した。培養14日後、第3の刺激を行い、その後15日目にrhIL-2を添加した。21日目に第4の刺激を行い、その後22日目にrhIL2を添加した。全部で27日間の培養後、ペプチド刺激T細胞を採取し、カルセインAM標識T2細胞、白血病細胞株、および新鮮なヒト白血病細胞に対するペプチド特異的細胞毒性について試験した。
【０２３１】
図1は、種々のエフェクター：標的（E:T）比で1.0μg/mLのPR1もしくはPR-2を付加したT2細胞またはペプチドを添加しないT2細胞に対するCTL株のペプチド特異的溶解を示す。PR1ペプチドに対して生成されたCTL株は、PR1付加標的細胞に対する高特異的溶解を示すのに対して、PR-2に対して生成されたCTL株は有意な細胞毒性を示すことができない（Molldrem et al., 1996）。HTLV-1 tax(aa 11-19)（HLA-A2.1に対して高い結合親和性を有する無関係のペプチド）を付加したT2細胞に対する細胞毒性も測定し（データ示さず）、50:1のE:T比でPR1またはPR-2のいずれかに特異的なCTLによって20％未満の特異的溶解が得られた。
【０２３２】
PR1に対するCTL応答は、HLA- A2.1分子を発現する標的細胞に特異的であることが示された。このことおよび認められた細胞毒性は、HLA-A2.1制限であった。
【０２３３】
PR1特異的CTLは、ヒト骨髄性白血病細胞を優先的に溶解する。次に、PRl特異的CTL株がHLA-A2.1陽性個体由来の同種ヒト骨髄性白血病細胞を溶解することができるかどうかを決定した。表6は、使用した標的細胞のHLA型および白血病型を列挙する。対照として、低レベルのPr3を発現する以下の2つの細胞株を使用した：HLA-A2.1をトランスフェクトしたK562細胞およびHLA-A2.1を欠き、それによってHLA-A2.1制限様式でペプチドを提示することができないU937細胞。低温保存した患者P1〜P4由来の骨髄細胞および健常な正常ボランティア（D2、患者P3に行った同種骨髄移植の骨髄ドナー）由来の骨髄細胞を解凍し、PRl特異的CTL株の標的として使用した。
【０２３４】
図2は、3つのPRl特異的CTL株由来の3つの個別の実験の結果の組み合わせを示す。図2Ａでは、U937細胞、HLA-A2.1トランスフェクトK562細胞、または1.0μg/mLのPR1ペプチドを外因的に添加しているか添加していないT2細胞のいずれかの種々のE:T比でのPR1特異的CTLによる特異的溶解を示す。PRl特異的CTLによるU937細胞およびHLA-A2.1陽性K562細胞の特異的溶解は、ペプチドを添加しないT2細胞に対して認められたバックグラウンド溶解よりも低かった(Molldrem et al., 1996)。
【０２３５】
図2Bは、HLA-A2.1陽性ヒト骨髄性白血病細胞に対するCTL細胞の細胞毒性を示す。3人のCML患者（P1、P2、およびP3）および1人のAML M4患者（P4）由来の骨髄細胞は、P1（慢性期のCML患者）では、たった6:1のE:T比で53％の特異的溶解で容易に溶解した (Molldrem et al., 1996)。正常な健常ドナー（D2）から採取した骨髄細胞は、バックグラウンド溶解（20％未満の溶解）しか示さず、これはPR1ペプチドを添加しない対照T2細胞の溶解に類似している。
【０２３６】
（表６）細胞毒性試験のために使用した患者およびドナー細胞のHLA型
2007504149.tif 000013
略語：PBMC＝末梢血単核細胞；
CML-CP＝慢性骨髄形成白血病、慢性期；
CML-AP＝慢性骨髄形成白血病、急性期；
CML-BC＝慢性骨髄形成白血病、芽細胞発症型；
MDS(RAEB−脊髄形成異常性症候群、芽細胞の過剰を伴う不応性貧血。
【０２３７】
以前の研究では、Pr1特異的CTLは、白血病患者サンプルにおいてコロニー形成単位を優先的に阻害するが、正常ドナーサンプルではそうではないことが見出された（Molldrem et al., 19997）。細胞接触がCFU-GMの阻害に必要であることが見出され、CTL1エフェクター細胞によって上清に作製された阻害因子は、コロニー阻害を担わなかった(Molldrem et al., 1997)。
【０２３８】
CML CFU-GMの阻害は、標的細胞中のPr3過剰発現に相関する。標的細胞を、フローサイトメトリーによって細胞質Pr3発現について試験した。細胞膜の透過処理後、Pr3に対する抗体および第2のFITC標識抗体を使用した間接的染色およびその後のフローサイトメトリーを行った。表7は、サンプル集団中のPr3に陽性染色された細胞の比率および細胞内Pr3染色蛍光強度の中央値を列挙する。白血病サンプルの蛍光強度の中央値は、正常サンプルの蛍光強度の中央値のほぼ5倍であった（298に対して1339、p=0.009）。
【０２３９】
（表７）コロニー阻害研究で使用した正常(D1〜D5)および白血病(P1〜P5)の骨髄標的細胞におけるプロテイナーゼ3発現
2007504149.tif 000014
【０２４０】
Pr3は、白血病で高度に発現するが、正常CD34細胞で発現しない。Pr3が初期CD34陽性CML細胞で発現することを確認するために、患者から骨髄を採取した。急性転化のCML患者（P3）から骨髄を獲得し、比較のための正常CD34細胞を、正常ドナー（D3）由来のG-CSF動員末梢血単核球から得た。最初に細胞をPE抱合抗CD34抗体（Becton Dickinson, San Jose, CA）で標識し、その後Pr3について細胞質間接染色を行った。本発明者らは、CD34陽性であるCML芽細胞がCD34陰性芽細胞および正常なCD34陽性細胞と比較してPr3を高度に発現することを示した。これは、非常に初期の前駆細胞がPr3を過剰発現するのに対して、少数の正常な前駆細胞ではPr3の発現はほんのわずかであることを示す。
【０２４１】
トランスフェクション後のプロテイナーゼ3のHMy2.CIRおよびHMy2. CIR-A2細胞での発現。PR1ペプチドがプロセシングされて細胞表面上に提示されるというさらなる証拠を得るために、ヒトB細胞株（Pr3を発現しない）をPr3でトランスフェクトし、PR1特異的CTLがトランスフェクトした細胞を溶解することができるかどうかを試験した。HLA-Aおよび-B発現を喪失した親HMy2.CIR細胞株ならびにHLA-A2.1トランスフェクションHMy2. CIR細胞(HMy2.CIR-A2と呼ばれる)の両方を、下記のようにPr3でトランスフェクトした。
【０２４２】
以前に公開されたPr3をコードするDNA配列を使用して、正常骨髄サンプルからcDNAをクローニングするためのプライマーをデザインした(Sturrick et al., 1992)。RNA STAT溶液(Teltest)を使用して、正常ドナー骨髄細胞からRNAを抽出した。1μgのRNAを、RT PCRキット(Perkin-Elmer, Norwalk, CT)を使用してcDNAに逆転写した。次いで、全cDNAの半分を、ATG開始コドンを含むプライマー
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、および信頼性の高いポリメラーゼ(Takara, Madison, WI)を製造者の説明にしたがって使用して増幅した。PCR産物を、TAクローニングキット(Invitrogen, Carlsbad, CA)を使用してpCR2ベクターにクローン化し、その後、CMVプロモーターおよびZeocin耐性マーカーを含む哺乳動物発現ベクターpCDNA3.1(Invitrogen)にサブクローン化した。得られたプラスミドDNAをpRTZ.2と名付けた。
【０２４３】
1000万個のHMy2.CIR細胞(ATCC, Rockville, MD)または1000万個のHMy2.CIR-A2細胞を、それぞれリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗浄し、0.8 mLの氷冷PBSに再懸濁し、20μgの環状プラスミドDNAと共にエレクトロポレーションキュベットに入れた。混合物を、320ボルトで960μFの電気パルスに曝露し、氷上で10分間インキュベートした。次いで、細胞を、10mLの予備加温CMに添加した。翌日、CMを交換した。2日目に、細胞を200μg/mL Zeocinを使用した選択条件下で成長させた。選択から1週間後、細胞を、Zeocin選択下での限界希釈によってサブクローン化し、6クローンを単離した。
【０２４４】
Pr3含有ベクターpRTZ.2またはレポーター遺伝子を含む空のベクター（CAT）でトランスフェクトしたヒトB細胞株HMy2.CIR-A2を、前に記載のフローサイトメトリー分析によって細胞内Pr3発現について試験した。最も高く発現する2つのクローンを、図3に示す。
【０２４５】
Pr3でトランスフェクトしたHMy.2.CIR-A2細胞は、PR1特異的CTLによる溶解に感受性を示す。次に、トランスフェクトしたHMy2.CIR-A2細胞をPR1特異的CTLによって溶解することができるかどうかを決定した。PR1特異的CTLを前述の様式で誘発し、培養22日後に25:1のE:T比でPr3含有ベクターpRTZ.2またはレポーター遺伝子を含む空のベクター（CAT）のいずれかでトランスフェクトしたHMy2.CIR-A2と組み合わせた。PR1特異的CTLを、急性転化のCML患者（P3）由来の対照骨髄細胞（HL-60細胞）（Pr3を発現するが、HLA-A2.1を欠く）および正常ドナー（D3）由来の骨髄細胞とも組み合わせた。PR1特異的CTLは、Pr3トランスフェクト細胞（クローン1.4）の36％を特異的に溶解したが、空のベクター（CAT）でトランスフェクトした正常な骨髄細胞、HL-60細胞、HMy2.CIR細胞、ならびに非トランスフェクト親B細胞株HMy2.CIR(HMY A2;図4)ではバックグラウンド溶解しか示さなかった。これらの結果により、PR1ペプチドがプロセシングされてPr3トランスフェクトHMy2. CIR細胞表面上に提示されることが示唆される。Pr3の発現レベルは、白血病細胞で見出されたレベルよりも低く、B細胞株はプロセシングおよび提示時により有効となり、それによってより低いレベルのPr3発現を補うことができる。
【０２４６】
限界希釈分析およびPR1-HLA-A2重鎖四量体の使用によって正常ドナー由来のPBMCから同定されたPR1特異的CTL。2人のHLA-A2+正常ドナー(ドナー2および3)および1人の慢性期CML患者（ドナー1）のPBMC中のPR1特異的CTLの頻度を決定するために、一定限度の量の患者由来の物質を使用した低頻度リンパ球前駆体（CTLP）の検出のためにデザインされた修正限界希釈アッセイ（LDA）を使用した。このアッセイを使用して、バルク培養における0日目およびPR1刺激拡大から20日後にCTLP頻度(CTLPf)を決定した。このアッセイの詳細を本明細書中に記載する。PR1特異性を有するCTLをフローサイトメトリーによって分析することができる試薬を使用して、これらの結果を個別のアッセイの結果と比較した。このアッセイでは、HLA-A2.1重鎖(A2重鎖のC末端付近のビオチン結合部位を含むように修飾されている)＋β2-ミクログロブリンを、PR1ペプチドと比較し、次いで、フィコエリトリン（PE）に抱合したストレプトアビジンと組み合わせる(Altman et al., 1996)。したがって、この「PR1四量体」を使用して、HLA-A2.1結合PR1に特異的なTCRでCTLを直接標識した。図5は、PR1四量体を使用して、PR1刺激PBMCの17日間のバルク培養中にHLA-A2.1結合PR1に対する特異性を有する個別のCTL集団を同定することができることを示す。
【０２４７】
PR1-HLA-A2重鎖四量体を使用してバルク培養からの精製されたPR1特異的CTL集団の選択が可能である。精製されたPR1特異的CTL集団をPR1で刺激したバルク培養CTLから得ることができるかどうかを決定するために、PRl特異的TCRを発現したCTLをFACS選別するためのPR1四量体を使用した。この方法では、限界希釈およびその後の拡大による通常のクローニング（数週間から数ヵ月を要し得る過程）を必要とせずにCTLの富化集団を迅速に得ることができる。
【０２４８】
前に記載の方法を使用して、32日目のPR1刺激CTL培養物をHLA-A2.1+正常ドナー由来のPBMCの出発集団から得た。細胞を抗CD8およびPR1四量体で二重標識した場合、バルク培養CTLの4.3％が二重陽性であった。5×106CTLのアリコートをPBSで3回洗浄し、FITCに抱合した抗CD8(Caltag Laboratories, Burlingame, CA)にて4℃で2時間標識した。次いで、細胞をPBSで3回洗浄し、PE抱合PR1四量体にて4℃で2時間標識した。これの後に、抗CD4およびPIの両方で第3の標識を行い、選別中のダンプとして使用した。次いで、細胞を、二重染色解析CellQuestおよびCloneCytソフトウェアのために選別した。95％を超える生存度で（収率は全集団の2.2％またはPR1特異的集団の55％）1.1×105個のCTLが回収され、選別集団を6に示す。
【０２４９】
次いで、選別した1×106細胞/mLのCTLを、10％ヒト血清(Sigma)および100IU/mL IL-2(Biosource International)を補足したCMの培養物に戻した。24時間後、細胞を回収し、新鮮な白血病標的細胞を溶解する能力について試験した。次いで、PR1選別CTLを、4時間の細胞傷害アッセイにおいて非選別バルク培養CTLと比較した。エフェクター細胞をPBSで3回洗浄し、加速期CMLのHLA- A2.1+患者由来の標的骨髄細胞およびHLA適合正常ドナー由来の骨髄細胞と20:1〜2.5:1のE:T比で4時間の同時インキュベートを行った。予備試験と同様に、同時インキュベーション前に、標的細胞（1000細胞/ウェル）をCalcein AMで90分間標識した。
【０２５０】
図7は、Rl選別CTLによるCML骨髄の特異的溶解が全E:T比で非選別CTLよりも有意に高く、正常骨髄のバックグラウンド溶解がほぼゼロに減少したことを示す。FACS選別後にPR1特異的CTLが枯渇したCTL集団をCML骨髄の特異的溶解についても試験し、任意のE:T比で特異的溶解は認められなかった。これらの結果は、PR1四量体を使用して、バルク培養PR1刺激CTLよりも白血病に対する特異性が高い同質CTL集団を選択することができることを示す。黒色腫抗原を研究した他の研究者は、類似の結果を得ている。ポリクローナルCTL株を選別するためにMelanA/MART-1-四量体を使用して、Dunbar et al. (1998)は、非選別CTLと比較してペプチドコーティングT2細胞がより高く溶解し、バックグラウンドを消さないことを見出した。PR1四量体を使用して、白血病患者を治療するための養子免疫療法で使用するためのPR1選別CTLの同質集団を得ることができる。
【０２５１】
Pr3のエクソン3内でDNA多型が見出される。白血病に指向する同種CTL応答はドナーとレシピエントとの間で副抗原（mH）も異なるため、潜在的多型についてPr3コード領域を検索した。BMTを受けた28のHLA同一ドナー-レシピエント対を研究した。Wizard Genomic DNA Preparation Kit (Promega)を使用して、凍結サンプルからDNAを調製した。特定のプライマー（表8）を使用して、Pr3の5つの各エクソンを増幅し、PCR-SSCP (配列特異的高次構造多型)によって分析した。次いで、PCR混合物を、反応あたり0.5mCiの[32P] dATPのみを使用して分析した。表8にまとめた条件下での「タッチダウン（touchdown）」プロトコールにしたがって増幅を行った。
【０２５２】
PCR産物を、M13配列決定プライマーテール（フォワードプライマーについては
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およびリバースプライマーについては
2007504149.tif 000018
）を付加した同一のプライマーを使用して再増幅した。新規のPCR産物を、M13-21および逆配列決定プライマーを使用したABI Dye primer Cycle配列決定キットを使用して直接配列決定を行った。それぞれの選択された個体のいくつかの独立した配列を整列させ、比較した。
【０２５３】
（表８）PR3エクソンの増幅のために使用したオリゴヌクレオチドプライマーおよびPCR（商標）条件
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a（Sturrock, et al）に従う。
【０２５４】
ドナーおよびレシピエントの遺伝子型を、配列特異的プライマー（SSP）PCRを使用して決定した。PCR（商標）産物を、2％アガロースゲルで泳動し、臭化エチジウムで染色した。図8に示すように、エクソン1〜4において個体間で異なるパターンが示されたが、エクソン1〜3のみが同一対のドナーとレシピエントとの間で相違を示した。増幅DNA産物は隣接イントロン領域の一部も含んでおり、かつコード領域中の全ての塩基の相違によってアミノ酸が異なり得ないため、ドナー特異的バンドを示すドナー-レシピエント対由来の増幅産物を配列決定した。これらの結果は、以下の理由のためにPr3遺伝子が多型であることを示す：(1)イントロン領域から決定された配列は公開されたゲノム配列と数回矛盾すること；(2)2つの異なる多型部位がエクソン1、2、および3で見出され、これによりオートラジオグラフィで認められた複数のパターンが説明されること；(3)エクソン3中のたった1つのDNA多型が推定アミノ酸配列中のアミノ酸多型をコードすることが見出されたこと（表9）。この多型は、アミノ酸配列の119位でイソロイシン(ATT)またはバリン(GTT)のいずれかをコードする。
【０２５５】
（表９）直接遺伝子配列決定によって決定されたPr3遺伝子中の多型
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最初の4つのエクソンの配列は、GenBankに提出されている（アクセッション番号：AF015446；AF0515447；AF015448およびAF015449）。Aa：アミノ酸；Ile：イソロイシン；Val：バリン；UT；非翻訳。
【０２５６】
Pr3多型部位に及ぶペプチドはHLA-A2.1に結合する。次に、上記で考察した多型によりHLA分子に結合することができる異なるペプチドを発現することができるかどうかを決定した。次いで、HLA-A1、-A*0201、-A*0205、-A3、-All、および-A24を含むいくつかのHLAクラスI分子に結合することができるエクソン3の多型領域に及ぶペプチド中に含まれるアンカーモチーフを模索した。HLA-A2に結合することができるアンカーモチーフを有する多型部位に及ぶ2つの10アミノ酸ペプチド(それぞれPR7IおよびPR7Vと呼ばれるKLNDILLIQL(SEQ ID NO：8))またはKLNDVLLIQL(SEQ ID NO：9))がアミノ酸115〜124に存在する。両ペプチドは、それぞれHLA-A*0201および-A*0205について705mnおよび126mnの同一の推定結合半減期を有する。
【０２５７】
次いで、表面HLA発現の測定によって、T2細胞中でこれらのペプチドがHLA-A*0201に結合する能力を試験した。ペプチドPR7IおよびPR7Vを、対照インフルエンザペプチドと共に、T2細胞にそれぞれ18時間パルスし、フローサイトメトリーによってその後のHLA-A2.1発現を測定した。PR7IまたはPR7VのいずれかでパルスしたT2細胞は、陽性対照ペプチド（インフルエンザB核タンパク質；図9）よりも高い蛍光強度を有する強力なペプチド結合を示した。低バックグラウンドMHCクラスI発現を、ペプチドを付加していない細胞の低蛍光強度によって証明した。
【０２５８】
Pr3由来のPR1自己ペプチドが免疫原性であることが以前に示され、その上これらのデータによりT細胞応答をPr3における多型の相違に対しても誘発することができることが示唆された。これらの相違を、骨髄性白血病の白血病特異的養子T細胞療法のデザインの基本として使用することができる。
【０２５９】
実施例5
PR1はプロテイナーゼ3および好中球エラスターゼタンパク質に由来する
白血病関連抗原PR1は、プロテイナーゼ3および好中球エラスターゼタンパク質の両方に由来する。本発明者らは、PR1特異的CTLによる白血病細胞の死滅がP3過剰発現に相関することを示した。しかしながら、好中球エラスターゼ（NE）内にPR1配列も含まれ、この配列も白血病細胞中で異常に発現する。PR1がプロセシングされていずれかのタンパク質から提示されるかどうかを決定するために、P3およびNEトランスフェクトB細胞を、PR1特異的T細胞を使用した増殖アッセイでの標的細胞として使用した。全長P3 cDNAおよびNE cDNAを、公開された配列に基づいて前骨髄球HL-60細胞株からクローン化した。配列を、構成性発現を駆動するためのCMVプロモーターを有するEGFP含有ベクター(pCMS-EGFP)にサブクローン化した。HLA-A*0201遺伝子で予め安定にトランスフェクトしたB細胞株（HMy-CIR）を、24時間のエレクトロポレーションによってP3-pCMS-EGFPおよびNE-pCMS-EGFPでトランスフェクトした。GFP発現細胞(それぞれP3-HMy.CIR-A2およびNE-HMy.CIR-A2)をFACSortingによって選択し、高トランスフェクションレベルを蛍光顕微鏡によって確認した。定量的実時間PCRは、2つの選択されたP3トランスフェクトクローンの1つ由来のmRNA転写物がHL-60細胞のよりわずか2.6倍少なく（p=0.07）、第2のクローンのよりわずか1.5倍少ない（p=0.3）ことを示した。それに反して、トランスフェクトしたクローン由来のNE転写物数は、HL-60細胞より7倍少なかった。ウェスタンブロッティングによってNE-HMy.CIR-A2トランスフェクト細胞におけるタンパク質発現が確認されたにもかかわらず、発現は同様にHL-60より低かった。2人の健常ドナーから誘発したPRl特異的CTL株は、BrDU組み込み中にP3-HMy.CIR-A2標的細胞と同時インキュベートした場合に1.3および2.4の刺激指数（SI）を示し、PR1-CTLがプロセシングされてP3から提示されたPR1ペプチドを認識することが確認された。興味深いことに、PR1-CTLはまた、1.5および2.1のSIでNEトランスフェクト細胞を認識した。非トランスフェクタントまたは親HMy.CIR(A2-)は認識されなかった。これらの結果は、P3に加えて、PR1もプロセシングされてNEによって提示され、これによって単一タンパク質由来のペプチドと比較してペプチドの免疫原性が増強され得ることを示した。過剰なタンパク質は、PR1ベースの免疫療法後の腫瘍喪失変異体の影響を減少させることもできる。
【０２６０】
実施例6
PR1に対するCTL免疫について試験した骨髄性白血病のBMT患者
本研究のデータは、PR1を、能動および受動白血病特異的免疫の両方を刺激するための標的抗原として使用することができることを支持する。本研究では、PR1を、白血病免疫を追加免疫するための不完全アジュバントと共にワクチンとして投与し、さらなる臨床試験でPR1特異的CTLを選択し、白血病反応性CTLの産生のためのPR1抗原を使用してエクスビボで拡大する。PR1特異的CTLを単独で使用するか、GVL効果を得るために同種BMTなどの既存の治療と組み合わせて使用する。予めCD3 T細胞を枯渇させた移植片に加えたPR1特異的ドナー由来CTLにより、例えば、GVHDを発症せずに選択的GVL反応性を得ることが可能である。本研究では、正常ドナーがプロテイナーゼ3（Pr3）由来のPR1（HLA-A2制限された9アミノ酸残基(aa 169〜177)に対する既存のCTL免疫を有することが示された。Pr3は、骨髄系列細胞のアズール親和性顆粒内に含まれるタンパク質であり、多数の骨髄性白血病患者で過剰発現される。
【０２６１】
PR1に対するCTL応答を、マイクロタイター限界希釈分析を使用したCTL前駆体（CTLP）頻度の決定によって試験する。PR1に対するCTL応答の臨床的有意性を決定するための第1の工程として、移植前、ならびに移植から3ヶ月後、6ヶ月後、および9ヶ月後に、患者およびその骨髄ドナー由来の血液サンプルおよび骨髄サンプルを試験する。最近、同種BMT後の分子的に再発した（molecular relapse）患者によっては存在する宿主由来の造血前駆体のPh+集団およびPh-集団の両方を有し、DLIのみを患者に投与した後に宿主由来のPh-前駆体が正常な造血を再構成することが見出された。これにより、寛解させる同種DLIはドナーとレシピエントとの間の小さな抗原の相違と無関係にCMLをターゲティングすることができることが示唆される。PR1に対するCTL応答がGVL応答内に含まれる場合、CTLPfはドナーで低く、レシピエントではさらに低いが、BMT後に増加することが予想される。または、BMT前にレシピエントに存在するPR1に対する高CTLPfは、白血病免疫エスケープを示すことができ、これを以下に詳述するように個別に取り組むことができる。患者由来の物質（特に、骨髄）の利用可能性が制限されているため、Terasakiトレイを使用した限界希釈分析（LDA）によってCTLPfを決定するための本明細書中に記載のマイクロタイター技術を使用することが重要である。
【０２６２】
HLA-A2.1+患者サンプル由来のPBMCおよびBMを使用して、限界希釈CTLPfアッセイの使用によってPR1に対する既存のT細胞反応性を試験する(Hensel et al., 1999)。PBMCおよび骨髄単核球(BMC)をFicoll Hypaque分離によって獲得し、そのまま使用するか、さらなる使用のために液体窒素中で凍結する。HLA-A2.1陽性のCML、AML、およびMDS患者由来のサンプルを回収する。これらの患者に対するHLA適合正常BMTドナー由来のPBMCおよびBMも同様に回収し、低温保存し、アッセイする。予め凍結したサンプルを解凍し、無血清CMで3回洗浄し、計数する。アッセイのために、全部で1950万個の細胞を調製する（750万個の刺激者細胞（stimulator cell）および1200万個の応答者細胞（responder cells)）。100万個のさらなるPBMCを使用して、アッセイ10日目に標的細胞として使用すべきフィトヘムアルグチニン(PHA-P ; Sigma Chemical, St. Louis, MO)刺激芽細胞を生成する。100万個の無関係のHLA異種PBMC（第三者）を、陽性対照として使用し、総数の半分を刺激者細胞として使用し、残りの半分を応答者細胞として使用する。
【０２６３】
PHA芽細胞を、25cm2フラスコ中の10％ウシ胎児血清(FBS; Sigma Chemical)を補足した1.0mLのCM中に106個の細胞を入れることによって生成する。5μL/mLのPHA-Pを添加し、細胞を、5％CO2中にて37℃で培養する。培養4、6、および8日目に、さらなるCM + 5μL/mL PHA-Pおよび500IU/mL rhIL-2を含む10％FBSを添加する。細胞を計数し、培養物を、106細胞/mLに維持する。これらの細胞を、CTLPfアッセイの10日目に標的細胞として使用する。
【０２６４】
PBMC応答者細胞（患者サンプル由来）を、CM＋10％ヒトAB血清(AB; Sigma Chemical)での各希釈での24個の複製物を使用した6種の希釈物(5×104〜5×105 PBMC/ウェル)として高プロフィールTerasakiトレイ(Robbins Scientific, Sunnyvale, CA)にプレートする。第三者の応答者（responder）（正常ドナー由来）を1種の希釈物（5×104 PBMC/ウェル）としてプレートする。患者のPBMC刺激者細胞を、37℃で90分間20μg/mLのペプチド(PR1またはFLU、陽性対照ペプチドとして前述のインフルエンザ核タンパク質)を使用するか、ペプチドを使用しないでパルスし、無血清CMで1回洗浄し、2500 cGyで照射した。次いで、これらの細胞を、応答者細胞を含むウェルおよび刺激者（stimulator）のみの24個のさらなるウェルにプレートする。3日目および7日目に、60 IU/mLのIL-2を、各ウェルに添加する。10日目に、同一患者由来の予め調製したPHA芽細胞（標的細胞として）を、20 mg/mLのPR1またはペプチドを使用しないで37℃で90分間パルスし、無血清CMで1回洗浄し、上記の細胞毒性実験に記載のようにCalcein AM (Molecular Probes, Eugene, OR)で標識する。ウェルあたり1000個の標的細胞をプレートし、800rpmで1分間軽く遠心分離し、5％CO2中にて37℃で4時間培養する。5μlのFluoroquench EB Stain-Quench Reagent (One Lambda, Canoga Park, CA)を各ウェルに添加し、プレートを、自動化Lambda Scan(One Lambda, Canoga Park, CA)を使用して蛍光放射について分析する。
【０２６５】
刺激者のみを含む24ウェルの平均＋3標準偏差を、バックグラウンド蛍光のカットオフ値として決定する。カットオフ値未満の任意の実験ウェルを溶解について陽性と見なし、種々の応答者細胞希釈での陰性ウェルの画分から、ポアソン確率に基づいた最尤法を使用してCTLP頻度を計算する。次いで、以前の研究（Molldrem et al., 1996）において正常ドナーにおけるPR1特異的CTLの特異的溶解量が標的白血病細胞中のPr3過剰発現量と相関したため、計算したCTLP頻度を患者の芽細胞集団中のPr3発現量に関して分析する。
【０２６６】
PR1ペプチドに特異的なPBMCおよびBMの比率の決定。フィコエリトリン（PE）に連結した特異的PR1-HLA-A2四量体(PR1四量体)を使用したFACS分析によってPR1に対するCTL応答を試験して、HLA-A2.1結合PR1ペプチドに特異的な末梢血単核球（PBMC）および骨髄細胞（BM）の比率を決定する。PR1四量体を使用して、移植前および移植6ヶ月後に患者およびドナーのPBMCおよびBM中でHLA-A2結合PR1を認識するCTLの画分を同定する。より多くの患者由来の材料がPR1特異的CTLの比率のフローサイトメトリーによる決定に必要な多数のリンパ球に利用可能であるため、これは末梢血移植片を投与された患者を使用して研究することがより容易である。
【０２６７】
PR1四量体＋CD8の組み合わせを使用して決定したPRl特異的CTLを、PR1特異的CTLの表現型を同時に分析するための3色および4色のFACS分析の使用によって分析する。細胞を、CD28、CD69、およびCD25を使用して活性化状態を分析する。記憶CTLを、CD45RO抗体を使用して評価する。白血病患者で見出される任意のPR1特異的CTLが活性化状態で記憶細胞であるかどうかを決定することが重要であり、白血病が強力な免疫原ではないことまたはおそらくCTLは応答することができないことが示唆されるであろう。Pr3発現および白血病細胞の表面表現型(MHC IおよびII、-CD40、CD54、CD80、および CD86が含まれる)の決定により、免疫原性の潜在性をより良好に評価することもできる。
【０２６８】
PR1特異的CTLの前駆体頻度が前に試験した正常ドナーでさえも非常に低いため、患者サンプル中で利用可能な総細胞数の少なさにより、PRl特異的CTLはFACSによって検出不可能であり得る。さらに、患者のリンパ球は、寛容またはアネルギーによってPR1ペプチドに応答することができない。PR1ペプチドでパルスしたT2細胞を使用したインビトロでのPR1特異的CTL株の拡大により、この可能性を調査する。低温保存した患者のPBMCおよびBMから出発して、1000万個の単核球を解凍し、PBSで3回洗浄する。これらの細胞を、CM＋10％HS中に500万個〜1000万個のT2細胞(予め10μg/mLのPR1にて37℃で90分間パルスした)を含む培養物に37℃および5％C02で1週間入れ、7日目にPRlパルスT2細胞で再刺激する。8日目に、20IU/mLのIL-2を培養物に添加し、このプロセスを2週間および3週間の細胞培養期間で繰り返す。培養3週間後の細胞を回収し、標的としてCalcein AM標識T2細胞を使用した微小細胞毒性アッセイで使用する。細胞傷害アッセイのために、T2標的細胞を、10μg/mLのPR1、対照Fluペプチド、またはペプチドなしでパルスする。これは確立された方法であるため、同一の方法を使用したHLA適合正常ドナーから確立したCTL株を、細胞毒性アッセイの陽性対照として使用する。
【０２６９】
ELISPOTアッセイを使用してPR1に対するCTL応答を試験して、PR1ペプチド認識に応答するサイトカインを分泌する細胞の頻度を決定する。ELISPOTアッセイの使用によってPR1コーティング標的に応答するサイトカイン分泌細胞を測定する。最近の臨床試験は、細胞毒性に基づいた限界希釈（51Cr）、リンパ球増殖(3Hチミジン取り込み)による前駆体頻度分析、および単一細胞のインターフェロンγまたはTNF-α分泌の測定によるサイトカイン応答(市販のELISpotアッセイ、Mabtech, Nacka, Swedenを使用)などの方法を使用している。これらの各方法により、異なるリンパ球機能応答を測定し、腫瘍ワクチンに対する臨床応答は常にインビトロ測定に相関するわけではない(Nelson et al., 166; Rosenberg et al., 1998)。
【０２７０】
Lalvani et al. (1997)は、酵素結合免疫スポット(ELISPOT)アッセイを使用して、サイトカインの非存在下での同族ペプチドへの曝露によって誘発した場合、記憶CD8+Tリンパ球が迅速に（すなわち、24時間）エフェクター機能を果たすことができると判断した。ELISPOTによって測定したCTLの頻度は、FACSアッセイでペプチド特異的四量体を染色したCTL数と密接に相関することが示されたが(Dunbar et al., 1998)、限界希釈アッセイ（LDA）ではしばしば頻度がかなり低い。他の者は、ペプチドコーティング標的細胞に対するPBMCの14日間の拡大によりLDAはELISPOTアッセイとより密接に相関することを見出している(Scheibenbogen et al., 1997)。これらの結果により、培養条件に非常に依存し、かつ増殖細胞の存在に依存するLDAがペプチド特異的CTLの実際の存在数を過小評価し得ることが示唆される。
【０２７１】
ELISPOTアッセイを、96ウェルのポリビニリデンジフルオリドを裏打ちしたプレート (MAIP S 45; Millipore, Bedford, MA)で行う。これらのウェルを、15μg/mLの抗IFN-γ mAb 1-DIK(Mabtech, Stockholm, Sweden)にて4℃で一晩コーティングする。プレートをCMで6回洗浄し、CM＋10％HSで1時間ブロッキングする。PBMCを解凍し、PBSで3回洗浄し、CM＋10％HSに懸濁する。PBMCを、2連のウェルに100μL CM＋10％HS/ウェルを含む5×105/ウェルでプレコーティングしたプレートに添加する。LDAによるCTLPfを使用して並行して実施するアッセイのために、5×105および2.5×105 PBMC/ウェルを含む2連のウェルを使用する。
【０２７２】
PR1ペプチドを提示するために自己PBMC自体を使用して、新たに単離したPBMC由来のペプチド特異的T細胞の検出を行う。これにより、異種B細胞株（EBV形質転換リンパ球）をペプチド提示の標的細胞として使用した場合に、他の特異性を有するT細胞から誘発される応答が回避される。10μg/mLのペプチドを添加する。T2細胞をいくつかのアッセイで標的細胞として使用し、自己PBMCと比較する。この場合、T2細胞を、10μg/mLのPR1ペプチドで90分間パルスし、応答PBMCのプレーティング前に3回洗浄する。
【０２７３】
次いで、プレートを5％CO2にて37℃で6時間インキュベートし、内容物の振り落としおよび0.05％ Tween 20 (Sigma Chemical, St. Louis, MO)を含むPBSでの6回の洗浄によって停止させる。次に、100μLの1μg/mLのビオチン化抗IFN-γ mAb 7-B6-1ビオチン(Mabtech, Stockholm, Sweden)を添加する。3時間のインキュベーション後、プレートを6回以上洗浄し、1000倍希釈のストレプトアビジンアルカリホスファターゼ抱合体 (Mabtech)をウェルに添加し、プレートを室温でさらに2時間インキュベートする。次に、ウェルを再度6回洗浄し、脱イオン水で25倍希釈した100μLの発色性アルカリホスファターゼ基質(Bio Rad Labs, Hercules, CA)を添加する。30分後、水道水での洗浄によって比色反応を停止させ、プレートを風乾する。
【０２７４】
IFN-γ産生スポット形成細胞(SFC)の計数を、20倍の立体顕微鏡を使用して行う。境界がぼやけた巨大なスポットのみを、慣習にしたがってSFCとしてスコアリングする (Klinman, 1994)。ウェルあたり最低で5つのSFCが存在する場合、応答を有意であるとみなし、さらに、この数は陰性対照ウェルの数の少なくとも2倍である（ペプチドを加えない）。SFCの計数により、応答したCTLの頻度をさらに有利に評価可能である。
【０２７５】
SFCが認められない場合、経時実験で48時間までペプチドへの曝露時間を増加させる。SFCが依然として産生されない場合、これは、二次応答が得られないことを示し得るため、一次応答を調査する。この場合、PBMCにPR1ペプチドをパルスし、刺激者として自己PBMCに1:1の応答者:刺激者比で2つの場合7〜10日間にわたり各ウェルに添加した60IU/mLの低用量IL-2を曝露し、その後ELISPOTを行う。
【０２７６】
さらに、他の者が、より多数のペプチド特異的CTLによってTNF-αが時折γ-IFNよりも産生されることを証明しているため、類似の条件下でのTNF-aアッセイでSFC数を定量するためにELISPOT技術も使用する (Herr et al., 1996)。この提案の予算で要求したPerseptive Biosystems Cytofluor 4000プレートリーダーの使用により、LDAによるCTLP頻度、細胞毒性実験、およびELISPOTアッセイの全てを、この同一の装置を使用して実施することができる(Herr et al.,1997)。
【０２７７】
骨髄性白血病標的細胞のPr3発現および表面表現型の評価。細胞質Pr3発現を、以前に記載されている方法を使用した細胞質染色およびその後のフローサイトメトリーを使用した分析に基づいて、これらの各患者サンプル由来のBMCで決定する(Molldrem et al., 1996)。芽細胞集団の発生段階をPr3発現と相関させるために、細胞を、抗CD33、CD34、およびCD14モノクローナル抗体(Becton-Dickinson, San Jose, CA)でも表面染色する。さらに、適切なCTL標的としての芽細胞の可能性を評価するために、細胞を、MHCクラスIおよびII、CD80(B7.1)(ImmunoTech S. A. , Marceilles Cedex, France)、CD86(B7.2)(ImmunoTech)、およびCD54(ICAM-1)(Becton Dickinson)について標識する。3色染色により、細胞サブセット分析が可能である。各抗体の組み合わせについて100万個の細胞を研究する。細胞を、無血清CMで洗浄し、Ortho PermeaFixを使用して室温で30分間透過処理し、無血清CMで2回洗浄し、Pr3に対する抗体(Accurate Chemicals, Westbury, NY)および二次FITC抱合抗体で直接染色する。これの後に無血清CMでさらに洗浄し、4℃でのPEまたはAPC抱合抗体での直接染色を使用して他のマーカーを表面に標識する。
【０２７８】
前に考察するように、レシピエント前BMT中の高CTLPfは、白血病免疫エスケープを示し得る。これは、MHC 1発現の減少 (Dermime et al., 1997）、同時刺激分子の減少(Matulonis et al., 1995; Boussiotis et al., 1995)、白血病におけるPr3発現の減少(Molldrem et al., 1996)、またはおそらくCTLにおけるTCRシグナル伝達の欠損(Boussiotis et al., 1996)に起因し得る。さらに、BMT後のCTLPf増加の失敗も、任意のこれらの機構に起因し得る。これらの分子の発現およびPR1四量体標識によるCTLPfとPR1特異的CTLの存在数との相関の試験により、PR1に対するCTL免疫応答が失敗する可能性がより洞察される。例えば、フローサイトメトリーによるCTLPfは低いがPR1特異的CTLの比率が高いことは、CTL標的認識の欠損を示す可能性があり、これをウェスタンブロット分析によるTCR〜鎖チロシンリン酸化の試験によってさらに調査することができる。
【０２７９】
Pr3に対する体液性免疫応答を、抗好中球細胞質抗体（ANCA）力価によって試験する。ヴェゲナー肉芽腫症では、ANCA IgG力価は、疾患活性と密接に相関する。これらの患者の能動的（active）脈管炎の生検部位から採取したTリンパ球がPr3に応答した増殖を示し、IgG産生にT細胞の補助が必要であるため、ANCA力価の測定は、Tリンパ球のPr3指向活動の直接測定であり得るかもしれない。
【０２８０】
ANCA力価は、骨髄性白血病患者で正式に試験されていない。安価で信頼性のあるアッセイが市販されており、これを使用して臨床検査室でANCA力価を評価する。第I/II相臨床ワクチン試験に参加した全骨髄性白血病患者のANCA力価を決定し、細胞性免疫を測定するために上記アッセイを使用して移植患者およびそのドナーを調査する。全HLA型の患者を、ANCA陽性について評価する。
【０２８１】
実施例7
PR1が骨髄性白血病患者において特異的抗白血病免疫を誘発することができるかどうかの決定
次に、PR1を使用して骨髄性白血病患者で特異的抗白血病免疫を誘発することができるかどうかを決定した。白血病は、ワクチンの開発および評価のモデル疾患としていくつかの利点を提供する。第1に、白血病細胞は末梢血中を循環するため、浸潤性生検を繰り返すことなく腫瘍細胞を研究に容易に利用することができ、腫瘍表現型の任意の変化を周到にモニタリングすることが可能である。さらに、研究中のリンパ球はまた、悪性細胞と継続的に接触させた末梢血中に存在する。これらは、充実性腫瘍の治療における免疫応答研究に明らかに有利である。
【０２８２】
PR1によるCTL反応性の増強。フロイント不完全アジュバント（IFA）と組み合わせたPR1ペプチドを使用した3週間毎に3回注射する皮下ワクチン接種によってPR1ペプチドに対するCTL反応性を増強することができるかどうかを決定するために、フロイント不完全アジュバント（IFA）と組み合わせたPR1ペプチドを使用した第I/II相臨床プロトコールを使用して、骨髄性白血病患者にワクチン接種を行う。マイクロタイター限界希釈分析を使用したワクチン接種の前後にPBMCおよびBMにおけるCTLP頻度を測定する。黒色腫患者をワクチン接種するために、gp100を使用した1つの首尾に良い臨床試験でIFAを使用した（Rosenberg et al., 1998）。
【０２８３】
60人までのCML、AML、およびMDSを罹患したHLA-A2+患者(BB7.2抗体標識によって確認)に、深部皮下注射（deep subcutaneous injection）を3週間毎に9週間行う。患者を固定量のIFAを含む3つの用量レベルのPR1ペプチド（0.25 mg、0.5 mg、および1.0 mg)に無作為に分類し、LDAによるCTLPfを使用してインビトロで測定したPR1に対する免疫応答の毒性および証拠について4つのコホートに従わせる。用量の増加によってより高い抗腫瘍応答が得られることが明らかでないため、患者を3つの異なるワクチン用量に無作為に分類する。実際、ワクチンの毒性が免疫応答の増加に関連する場合、増加は免役化抗原の用量の増加よりもむしろ免疫化の繰り返しによって誘発され得る。ワクチンの「用量増加」はペプチドの送達量にあるわけではなく、むしろ抗原への曝露数（すなわち、免疫化数）にある。実際、多発性硬化症を治療するためのTCR由来のペプチドでの免疫化研究では、ペプチドの注射量が1000μgを超えた場合にペプチド特異的T細胞免疫応答が抑制されることが示された(Bourdette et al., 1994)。
【０２８４】
さらに、PR1四量体を使用して免疫応答を調査する。CTLPfの1log増加（研究開始時と比較して）または9週間にわたって常に測定したFACS分析によるPR1特異的CTLの比率の任意の増加を、PR1に対する免疫応答の証拠と見なす。このプロトコールに参加した患者由来の骨髄サンプルおよび末梢血サンプルを使用してこれらのアッセイを行う。完全および部分的な寛解の基準を使用して臨床応答を判断する。
【０２８５】
記載の方法を使用して、PR1四量体を使用して測定したCTLPf（LDAによる）およびPR1特異的CTL率を使用して、患者の免疫応答をアッセイする。約2000万個のPBMCを、ワクチン接種前および最後のワクチン接種から3週間後の100mlの末梢血サンプル由来の両アッセイにおいて使用する。これらの両アッセイを使用して見出された任意の非応答性を評価するためにさらなる実験を行う。
【０２８６】
自己腫瘍抗原をターゲティングする任意の第I/II相癌ワクチンデザインにおける重要な局面は、免疫化すべき患者の選択である。脈管炎などの毒性の可能性があるため、進行期の白血病患者がこの初期研究にふさわしい。しかしながら、安全性の決定には免疫応答を起こす必要があり、極期患者はしばしば免疫応答能力を欠く。したがって、種々の病期の全骨髄性白血病型の患者（安定な低白血病負荷（low-leukemia burden）および正常な白血球数を有する慢性期CML患者が含まれる）を試験する。慢性期CML患者は、化学療法を併用するか併用しないインターフェロンなどの他の療法形態を行うことができず、それにより末期症状である同種BMTの選択肢がない患者であることが予想される。CML患者は、Ph染色体量の分子研究を使用して全身腫瘍組織量が少ない慢性期患者における応答を判断することができるという充実性腫瘍を超えるさらなる利点を提供する。疾患経過を追跡するために全CML患者に対して日常的に行うPCR分析を、研究時に3週間間隔で行い、最後のワクチン接種から1ヶ月後に再度行う。
【０２８７】
白血病に対する免疫応答を得る可能性を増大させるために、75μgのGM-CSFを各ワクチン注射部位に投与してアジュバント効果を増強する。アジュバントとしてのGM-CSFは、他の血液悪性疾患の動物モデルでより高い免疫応答が得られている(Kwak et al., 1996)。
【０２８８】
CML患者にワクチン接種するためにbcr-abl接合領域を使用した第I相試験が他の研究者によって行われている。これらの研究者は、10μgのペプチドから出発する用量漸増試験デザインでのb3a2転位置領域由来の5つのHLA-A3および HLA-Al1制限ペプチドとアジュバントQS-21との組み合わせを使用している。これまで、10μgで治療した5人の患者および30μgで治療した5人の患者（次の用量レベル）は、ワクチンに対していかなる臨床応答も示さなかった。従来の51Cr放出細胞傷害アッセイの使用により、これらの研究者は、これまでのところペプチドに対する免疫応答のインビトロでの証拠を見出していない。
【０２８９】
したがって、本発明で提供されるように、PR1ペプチドワクチンは、いくつかの理由でbcr-abl接合領域と比較して免疫応答を誘発する能力が高い。第1に、bcr-abl接合領域ペプチドに関する前臨床データは、これらのペプチドに対してインビトロで誘発されたCTLが新鮮な白血病標的細胞に対する細胞毒性を示さず、標的ペプチドで予めパルスした白血病細胞に対してのみ細胞毒性を示すことを示す。対照的に、PR1特異的CTLは、標的細胞に事前にペプチド標識しない新鮮な白血病細胞の細胞毒性および白血病前駆体の阻害を示す（図2）。第2に、黒色腫ペプチドワクチンに対する応答を示す臨床試験は、b3a2ペプチドワクチン試験で使用するペプチド用量と比較して患者にワクチン接種するペプチド用量が10倍であった。PR1ワクチン試験は、黒色腫ワクチン試験で使用するペプチド用量と類似のペプチド用量を使用する。第3に、b3a2ペプチドに対する免疫応答を評価するために使用したLDAによる51Cr放出CTLPfは、本発明のマイクロタイターCalcein AMベースのアッセイよりも感度が低い。最後に、PR1ワクチン試験には、全ての骨髄性白血病型が含まれるため、免疫応答を見出す機会が広がる。
【０２９０】
PR1に対する潜在的非応答性を、骨髄性白血病患者におけるPR1特異的T細胞の生成によって評価する。この第I/II相研究では、PR1特異的CTL応答をペプチドワクチンの使用によって患者に誘発することができるかどうかを決定する。免疫応答が誘発されない患者または免疫応答は生じるがワクチンに対する臨床応答を示さない患者では、これらの患者由来のPR1特異的CTLが自己白血病細胞を認識および/または死滅させることができるかどうかを知ることが重要である。PR1特異的CTLが本明細書中に記載の方法を使用してインビトロでPBMCから誘発することができるかどうか決定するために、これらの患者をさらに調査する。これらの患者では、PR1特異的CTLがインビトロで誘発されないか、拡大することができる任意のCTLは白血病を認識したり死滅させることができないことが予想される。
【０２９１】
疾患に基づいて任意の相違を同定するために、ワクチンに対して免疫応答を生じないCML、AML、およびMDS患者由来のPBMCを選択する。500万個のT2細胞を無血清CMで3回洗浄し、50mLのコニカルチューブ中に10×106細胞/mLを懸濁する。95％を超える純度で合成されたPR1ペプチド(Biosynthesis, Lewisville, TX)を10μg/mLでT2細胞に添加し、T2細胞を加湿インキュベーター中に37℃で90分入れる。PRlパルスT2細胞に7500 cGyを照射し、無血清CMで2回洗浄し、50 mLのCM＋10％ヒトAB血清(10％AB)中で患者PBMCと1:1の比で組み合わせ、75cm2の組織培養フラスコに入れる。必要に応じて培地を交換し、7日目にPBMCをCM＋10％ABで洗浄し、新鮮なT2細胞と1:1の比で組み合わせる（同様に、PR1でパルスし、照射し、洗浄する）。8日目に、20IU/mLの組換えヒトインターロイキン-2 (rhIL-2)(Biosource International, Camarillo, CA)を培養物に添加する。培養14日目に、PR1パルスT2細胞で第3の刺激を行い、その後15日目にrhIL-2を添加する。21日目に第4の刺激を行い、その後22日目に20IU/mL rhIL-2を添加する。全部で25〜27日間の培養後、PR1刺激T細胞を、自己BMCおよび同種BMC由来のT2細胞および白血病細胞に対するペプチド特異的細胞毒性について試験する。
【０２９２】
以前に発表された研究と同一の半自動化マイクロタイター細胞傷害アッセイを使用して、特異的溶解を決定する。PR1パルスT2細胞の存在下で成長させたエフェクター細胞を、6×103〜25×103細胞/ウェルにて2連で調製し、40μLの60ウェルTerasakiトレイ(Robbins Scientific, Sunnyvale, CA)に入れ、希釈あたり6つの複製物を作製する。標的細胞(T2細胞±PR1、自己骨髄由来白血病細胞、または正常ドナー由来の骨髄)を解凍し、無血清CMで3回洗浄し、2×106細胞/mLの濃度で懸濁し、10mg/mLのCalcein-AM(CAM; Molecular Probes Inc, Eugene, OR)にて37℃で60分間染色する。CM＋10％ABで3回の洗浄後、標的細胞を105細胞/mLで再懸濁する。標的細胞のみおよび培地のみを含むウェルを、それぞれ最大（max）および最小（min）蛍光放射のために使用する。5％CO2にて37℃で4時間のインキュベーション後、5μLのFluoroQuench EB Stain-Quench Reagent(One Lambda, Inc, Canoga Park, CA)を各ウェルに添加し、トレイを60gで1分間遠心分離し、その後自動化Lambda Fluoroscan (One Lambda, Inc)を使用して蛍光を測定する。一旦FluoroQuench試薬中に含まれるヘモグロビンが放出された色素を消光すると、蛍光放射の減少は、標的細胞の溶解度に比例する。各E:T比での6ウェル由来の平均および標準偏差の蛍光を計算し、溶解率を計算する。
【０２９３】
細胞毒性アッセイにおける陰性対照標的細胞集団としてのFluペプチドコーティングT2 細胞の使用によってPR1特異性を確認する。正常ドナー由来の自己BMCおよびHLA-A2+BMCを同様に調製し、白血病反応性を試験するための標的細胞としても使用する。さらに、患者PBMCを並行して使用してFlu特異的CTL株を作成し、FluペプチドコーティングT2細胞の溶解について同様に試験する。CTL免疫をFluペプチドに対して保存するがPR1に対して誘発することができない場合、任意の既存のプレワクチンPR1免疫（ELISPOTによるCTLPf、PRl四量体陽性CTL、またはPR1特異的CLTによって測定）との比較によってPR1に対する寛容の発生を評価する。
【０２９４】
これらの実験におけるHLA-A2.1特異性を確認するために、100μL/mLのHLA-A2特異的遮断抗体BB7.2(ATCC; Rockville, MD)を、エフェクター細胞との同時インキュベーション前に1×106個のPRlコーティングT2細胞と37℃で30分間同時インキュベートする。出発PBMCおよび得られたT細胞集団を、PR1四量体,抗-CD3, CD4 +CD8, CD3 + CD16 + 56, および抗-TCR-αβ (Becton Dickinson)を使用してT細胞サブセットについて表現型解析を行う。
【０２９５】
インビトロで自己PR1特異的細胞毒性を誘発するために、使用することができる別のアプローチは、接着性PBMC集団に由来し、これらの患者由来のPBMCを使用して反応者CTLを刺激するためにT2細胞の代わりにIL-4およびGM-CSF中で7〜10日間成長させたPR1パルス樹状細胞（DC）を使用する（Nestle et al., 1998）。PR1に対する免疫応答の喪失が認められた患者では、前に記載のように100μLの血液を回収し、Ficoll-Hypaque密度勾配によってPBMCを単離する。PBMCをプラスチック製の75-cm2フラスコに37℃で2時間接着させる。非接着細胞を除去し、接着細胞をGM-CSF(800 U/mL; Sandoz, Germany)およびIL-4 (500U/mL ; PharMingen, Hamburg, Germany)と7日間培養する。光学顕微鏡によって表現型の変化をモニタリングし、DC表現型を確認するためにフローサイトメトリーを行う。前に記載のように、細胞を、高レベルのHLAクラスI、HLAクラスII、および同時刺激分子(CD80およびCD86)について評価する。PR1を使用して、正常ドナーの末梢血由来の樹状細胞（DC）をパルスし、これらのPR1パルスDCを、PR1特異的CTLを誘発するための前の実験でT2細胞のように使用する。PR1特異的溶解を、前に考察したアッセイを使用したDC生成CTLを使用して評価し、T2生成CTLと比較する。
【０２９６】
さらなる実験では、患者BMCのPr3発現を、インターフェロン-γ、インターフェロン-α、およびGM-CSFの添加後に評価する。これらのサイトカインはT細胞MHC分子および同時刺激分子を増加させることが示されており(Tsukada et al., 1997)、Pr3発現も増加させることが示されている(Mayet et al., 1997; Sibelius et al., 1998)。したがって、サイトカインの同時投与により、より有効な抗PR1免疫を得ることができる(Dermime et al., 1997)。
【０２９７】
HLA-A2ドナー由来のPR1特異的CTLのFACS選別集団が自己および同種白血病細胞の溶解を増強することができるかどうかの決定。図17に示すように、PR1四量体を使用して、正常骨髄細胞のバックグラウンド溶解を含まない高特異的溶解を示すPR1選択CTLの同質集団をFACS選別することができる。したがって、PR1四量体を本発明で使用して、培養2〜3週間目に確立されたバルク培養CTL株からCTLの同質集団をFACS選別する。これらのCTL株を、抗原提示細胞としてPR1パルスT2細胞を使用したCMLおよびAMLを罹患したHLA-A2.1+患者および正常ドナー由来のPBMCを使用して生成する。PR1四量体を使用して、これらの細胞をFACS選別し、その活性化状態および表現型を比較し（CD28、CD69、CD25、およびCD45ROの測定による）、PR1コーティングT2ならびに新鮮な自己白血病細胞および同種白血病細胞を溶解するその能力を比較する。
【０２９８】
これらの細胞毒性実験の結果を、バルク培養CTLおよび選別手順後に残存したCTL集団から得た結果と比較する。白血病細胞に対して細胞毒性を示すPR1選別CTLも、正常ドナー骨髄細胞および前に記載の方法を使用して白血病GFU-GMおよび正常HLA-A2.1+CFU-GMを阻害するその能力を評価する。
【０２９９】
図16に示すように、PRl選別CTLは、PR1対する明らかな特異性を示さないいくつかのCD8+細胞を含む。しかしながら、PR1四量体使用して、PR1特異的CTLのさらにより均質な集団をを獲得し、これらの細胞はより有効にクローン化可能である。300μL CM＋10％HSおよび60IU/mL IL-2中に1×105個の同種PBMC (7,500 cGyで予め照射)を含む96ウェルプレートに0.3細胞/ウェルをプレートするポアソン分布による限界希釈によって細胞をクローン化する。これらのウェルを、37℃および5％C02で7〜10日間置く。7〜10日後に培地を交換し、成長細胞を含むウェルを拡大し、その後前に記載のようにPR1コーティングT2細胞の特異的溶解について研究する。これらのクローンを、上記抗体を使用して表現型についても評価する。
【０３００】
本明細書中で考察されるように、これらの方法を使用して得たクローンを使用して、Hmy2.CIR-A2トランスフェクタントおよびPr3遺伝子でトランスフェクトされた他の細胞を調査する。
【０３０１】
以前の研究(Molldrem et al., 1999) と同様に、PRlパルスT2標的細胞の高特異的溶解を示すCML患者由来のCTLは誘発されなかった。したがって、白血病患者におけるこの自己ペプチドに対する明らかな非反応性を克服するために、正常ドナー由来のPR1特異的CTLのFACS選別集団を調査する。
【０３０２】
マウスにおいてアデノウイルス関連腫瘍に特異的なCTLを使用して示されるように、PR1四量体を使用してFACS選別した正常ドナー由来同種PR1特異的CTLを、HLA-A2.1対立遺伝子についてのみ選択した白血病患者への安全な養子免疫伝達のために使用することができる(Toes et al., 1996)。この同種療法型により、伝統的な骨髄移植および完全なHLA適合ドナーを必要とせずに宿主白血病の選択的な死滅が可能である。
【０３０３】
実施例8
免疫学的方法を使用して白血病反応性ヒトCTLを誘発するためのPR3における潜在的なHLA-A2.1制限ペプチドエピトープの同定
HLA-A2.1に結合することが予想されるPr3内に含まれる残りの自己ペプチドに対してCTL反応性を誘発することができるかどうかの決定。白血病の有効なペプチドワクチンの開発は、単一ペプチドは全個体で免疫原性を示さないため、いくつかのペプチドエピトープの同定を含む可能性が高い。Pr3内の他のペプチドもCTL免疫を誘発する可能性が高く、PR1ペプチドを見出すための同一の方法を使用して、HLA-A2.1結合モチーフ（表4、PR3-PR9）を含むPr3内の7つのさらなるペプチドが同定されている。これらのペプチドは、純度が95％であり(Biosynthesis Co.)、前に記載の方法を使用したペプチドコーティングT2細胞上のHLA-A2.1発現のためのフローサイトメトリーの実施によってHLA-A2.1結合について試験した。ペプチドコーティングT2細胞を照射し、ペプチドでパルスし、正常ドナー由来のPBMCを刺激するために使用する場合、これらのペプチドを使用して、CTLを誘発する。これらの得られたCTL株を、最初にペプチドコーティングT2細胞のペプチド特異的認識について試験し（非コーティングT2との比較）、次いで、白血病患者由来の新鮮なHLA-A2.1+BMCの溶解について試験する（正常HLA-A2.1+ドナー由来のBMCとの比較)。HLA-A2.1(BB7.2)および無関係のFluペプチドコーティングT2細胞標的に対する抗体を使用した遮断研究を使用して、細胞毒性アッセイにおいて対立遺伝子特異性を確認する。PR1と比較したこれらのペプチドのHLA-A2.1に対する相対結合親和性を、PR1＋各ペプチドの連続希釈物のT2細胞とのインキュベーションおよびフローサイトメトリーによる表面HLA-A2.1発現の分析によって決定する。この方法では、各ペプチドのIC50値を決定する。
【０３０４】
表4中でHLA-A2.1に結合すると予想されるペプチドはサブドミナントエピトープであり得るため、ペプチドパルスT2細胞に対するCTL免疫を容易に誘発することができるが、HLA-A2.1+白血病標的に対するその後の免疫を欠き得る。この環境では、自己樹状細胞に抗原提示細胞としてT2細胞株を置換し、得られたCTLをHLA-A2.1+白血病標的に対する細胞毒性について試験する。
【０３０５】
HLA-A2.1に対する推定結合親和性が比較的低いペプチドPR5-6およびPR8-9について、ペプチドパルスT2細胞に対して弱い免疫が誘発されてさえいたならば、HLA-A2.1アンカー位置を置換する。ペプチドの2位および9 位で、既存のアミノ酸をロイシンおよびメチオニンまたはバリンに置換し、これらのペプチドを使用し、T2細胞を使用してCTL免疫を再度誘発する。これらのアミノ酸は、HLA-A2.1対立遺伝子への高親和性結合に関連し(Rammensee et al., 1995)、アンカーアミノ酸の置換はペプチドコーティング標的細胞のCTL溶解を増加させることが示され(Parkhurst et al., 1996)、これはおそらくMHCクラスI重鎖へのペプチドのより安定な結合に起因する(Sette et al., 1994)。いかなる免疫も誘発しないペプチドは、ドナーPBMCのTCRレパートリーの範囲内に含まれないと見なされる。
【０３０６】
PR1ペプチドに対するCTL応答性をHLA-A2.1アンカーモチーフ位置中の1アミノ酸置換によって増強することができるかどうかを決定する。以前に示すように、ペプチド中の一定のアミノ酸の置換によりHLA-A2.1へのペプチド結合を増強することができ、その後CTLによって標的認識を増強することができることが公知である(Rosenberg et al., 1998)。したがって、HLA-A2.1アンカー残基に1つまたは2つのアミノ酸置換を含む相同PR1ペプチドを使用して、T2細胞をコーティングし、特異的溶解について試験する。これらのペプチド（表10）は、PR1およびPR2ペプチドを予想するために使用される同一のアルゴリズムに基づいてHLA-A2.1に対してより高い結合親和性を有することが予想される(Parker et al., 1994)。これらのペプチドを合成し(Biosynthesis Co.)、T2細胞を使用してHLA-A2.1結合について試験し、PR1特異性を示すTCLを使用して特異的溶解を天然のPR1コーティングT2細胞と比較する小細胞毒性（mini-cytotoxicity）アッセイで試験する。PR1特異的バルク培養CTLを、本明細書中に記載の方法を使用して生成する。
【０３０７】
表10からCTL応答を得るために使用することができる任意のさらなるHLA-A2.1結合ペプチドが見出される場合、PR1とこのペプチドとの組み合わせを使用して、特異的溶解を試験するためにT2標的細胞をコーティングする。固定E:T比での特異的溶解の減少によって測定されるTCR認識の潜在的妨害を試験するために、このペプチドに特異的なCTLを使用して、T2細胞を固定濃度の10μg/mLのペプチド＋PR1の連続希釈物(0.1〜50μg/mL)でコーティングする。これらの実験結果＋各ペプチドのIC50を使用して、可能なドミナントペプチドおよびサブドミナントペプチドを比較する。これを使用し、CTL免疫を刺激するためのペプチドの組み合せを使用してワクチンを開発する(Nestle et al., 1998)。
【０３０８】
表10のT2細胞をコーティングするために使用されるペプチドにより、PR1コーティングT2細胞標的よりも高い細胞毒性が得られない場合、PR1四量体選別後に得られるPR1特異的CTLを、PR1-異種ペプチドコーティングT2細胞を認識して溶解する能力について研究する。これらの細胞がさらにより均質なCTL集団であるため、これらは改良されたCTL免疫のより感度の高い指標であると予想される。
【０３０９】
（表１０）アミノ酸置換された合成PR1様ペプチド
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【０３１０】
Pr3中に公知の1アミノ酸多型が及ぶHLA-A2.1制限ペプチドを使用して逆多型（opposite polymorphism）を有するドナーのPBMCからCTL免疫を誘発することができるかどうかの決定。前の研究に基づいて、Pr3の第3のエクソン中に、HLA-A2.1に対して高親和性で結合することができるペプチド中の1アミノ酸の相違をコードする多型を見出した。アミノ酸相違はHLA-A2.1アンカー領域を含まないが、TCRによって認識されるペプチド領域を含む可能性が高い。したがって、この多型は、造血組織に制限され、かつ同種養子免疫療法ストラテジーのための理想的な標的を提供する新規の副抗原を示す。
【０３１１】
したがって、これらの2つのペプチド（PR7IおよびPR7V）を合成し、これを使用してPR1反応性を得るための方法を使用して逆多型を有することが既知のドナー由来のPBMCのインビトロ免疫化のためにT2細胞をコーティングする。得られたCTL株を、元のペプチドまたは多型ペプチドのいずれかでパルスしたT2細胞の特異的溶解について試験する。これらのペプチドを、逆多型を含むことが予め決定されている患者由来の白血病細胞の溶解についても評価する。HLA-A2.1遮断研究によりA2.1制限を確認し、無関係のFluペプチドによりペプチド特異性を確認する。自己骨髄前駆体が溶解しないこれらの白血病標的細胞の溶解は、ヒトで見出された第1の潜在的な新規の副抗原としてのPR7IおよびPR7Vを証明する。
【０３１２】
PR7IおよびPR7VのCTL免疫を誘発する能力を適切に評価するために、全個体がペプチドを認識することができるT細胞を有さないと予想されるため、数人のPBMCドナーを研究する必要がある。さらに、多型ペプチドを含むドナー由来の自己PR7ペプチドに対してCTLを誘発する対照は、多型を含まないドナーから誘発されたCTLと比較される必要がある。3人または4人のドナー由来のPBMCを使用したいかなるこれらの組み合せを使用しても反応性を見出すことができない場合、これらのペプチドのいずれかをCTLによって認識できる可能性は低い。
【０３１３】
Pr3ペプチド、PR1ペプチドを含むリポソーム、または他のPr3由来のペプチドでパルスした自己樹状細胞を使用したワクチン接種を含む研究も本発明に含まれる。さらに、PR1に対する寛容機構の調査のためのHLA-A2,1トランスジェニックマウスモデルの使用(Toes et al. 1996b; Toes et al.,1996c)も意図される。さらに、PR1四量体を使用して白血病反応性CTLの均質集団を選択することができ、初めて白血病を治療するためのMHCバリアに対するCTLの養子免疫伝達が可能である(Toes et al., 1996a)。
【０３１４】
実施例9
抗原提示細胞（APC）はCMLに指向する免疫を誘発する
CML細胞由来の自己抗原提示細胞（APC）がCMLに指向する免疫応答を誘発することができるかどうかを研究するために、いくつかのアプローチを調査した。第1に、末梢血単球から拡大した自己樹状細胞（DC）を使用して自己PR1特異的CTLをインビトロで誘発することができるかどうかを決定した。第2に、誘発されたPR1-CTLがペプチド特異的細胞毒性を示すかどうかを決定した。第3に、自己PR1パルスDCを使用して誘発されたPR1-CTLを、PR1/HLA-A2コーティングマイクロビーズおよび高速フローサイトメトリーの使用によってバルクCTL培養物からさらに精製することができるかどうかを決定した。図10は、P3転写物は100倍の濃度（約100pgのcDNAに対応する）での骨髄中でのみ検出可能であることを示す。重要には、骨髄の外側の組織中でP3は発現せず、特に、胸腺P3発現は存在せず、末梢寛容がPR1に対するT細胞免疫の制御で重要な役割を果たし得ることが示唆される。
【０３１５】
BMTまたはIFNでの治療後の骨髄性白血病患者におけるPR1特異的免疫およびPR1特異的T細胞の欠失寛容の分析。白血病抗原としてのPR1の関連性を評価するために、PRl特異的CTLを、PR1/HLA-A2四量体を使用して異なる治療を受けたHLA-A2.1+CML患者由来のPBMC中で見出すことができるかどうかを決定した。異なる病期の38人のHLA-A2.1+CML患者および5人の健常ボランティアドナー由来のPBMCを獲得し、低温保存した。CMLの診断を、治療前の全患者由来の骨髄吸引液中の100％Ph+細胞と定義した。10人の患者は、ヒドロキシ尿素、シタラビン、シクロホスファミド、およびトポテカンを含む化学療法のみを受けた。19人の患者は、IFNのみ（6人の患者）または化学療法薬であるシタラビンおよびホモハリングトニン（homoharingtonine）との組み合わせ(13人の患者)からなるIFN-α2bベースの療法を受けた。9人の患者は、関連ドナー由来のHLA同一同種BMTを受けた。治療応答を評価するために、骨髄吸引液由来の分裂中期細胞を、Ph+細胞の比率について試験した。PBMCを、PR1/HLA-A2四量体染色について同時に試験した。臨床応答を、完全(CR、Ph、0％)、部分的(PR、Ph、1％〜34％)、または軽微(MR、Ph、35％〜90％)に分類した(Faderl et al.,1999)。以前に記載のように、四量体の合成および検証を行った(Molldrem et al., 1999; Altman et al., 1996)。PR1/HLA-A2四量体の特異性を、健常HLA-A2.1+ドナーに由来するが同一ドナー由来のCMV特異的株に由来しないPR1特異的T細胞株を4℃で染色する能力によって示した（データ示さず）。
【０３１６】
IFNを使用しないで化学療法のみを受けた10人の患者、および5人のHLA-A2.1+健常ボランティアドナー対照サンプルは全て、検出可能なPR1特異的CTLを有していなかった。化学療法のみを受けた1人の患者が応答したにもかかわらず、PR1特異的CTLは四量体染色によって検出不可能であった（表11）。同様に、IFNを投与された3人の多発性骨髄腫患者および新たに乳癌と診断された2人の患者由来のHLA-A2.1+PBMC中に検出可能なPR1特異的CTLは存在しなかった。
【０３１７】
（表１１）患者の特徴
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【０３１８】
高TCRアビディティおよび低TCRアビディティを有するPR1特異的CTLを健常ドナーから誘発することができる。高アビディティおよび低アビディティのPR1-CTLが健常ドナーに存在するかどうかを決定するために、高TCRアビディティおよび低TCRアビディティに相関する高蛍光強度および低蛍光強度の四量体+細胞を視覚化するために限界四量体濃度を使用した修正四量体染色技術(Savage et al., 1999)を使用した。漸増ペプチド濃度でのPBMCの28日間の刺激によって十分なPR1-CTLを誘発した。毎週0.2μM PR1を28日間刺激したHLA-A2.1+健常ドナー由来のPBMCが蛍光チャネルの中央値（MCF）が293の1.3％高い強度のPR1/HLA-A2四量体染色CTL（高アビディティPR1-CTL）を誘発する一方で、20 μM PR1での刺激によってアビディティが3.1％低い(MCF = 93)PR1特異的CTLが産生された（図11A）。2μM PR1で刺激したPBMCは、中等度TCRアビディティを有するPR1-CTLを誘発した（MCF=211）。全TCR-ab発現は、0.2、2.0、または20μM PR1で誘発された細胞と類似しており、四量体染色の相違TCR発現レベルの相違に起因しないことが示唆される。2μM PR1で刺激した培養物は、混合したTCRアビディティを有するより少ないPR1特異的CTLを産生する一方で、0.02μM以下のPR1での刺激により、0.1％未満のPR1-CTLが誘導された。CTL培養物中のPR1/HLA-A2四量体+事象の総数に基づいて10:1のE:T比で正規化した場合、低（0.2μM）PR1PR1で誘発されたPR1-CTL（白抜きの円）は、高（20μM）PR1濃度で誘発されたPR1-CTL（黒塗りの円）よりもPR1パルスT2標的細胞のより高い特異的溶解を示した（図11C）。四量体染色強度がTCRアビディティと相関することをさらに検証するために、以前に記載の技術（Savage et al., 1999）を使用して四量体染色減衰速度を決定した。低(0.2μM)または高(20μM)PR1濃度のいずれかで4週間誘発したPR1-CTLを、PR1/HLA-A2四量体および再結合を防止するための飽和濃度のBB7.2抗HLA-A2モノクローナル抗体とインキュベートした。正規化総蛍光を、4℃の適切な測定点で測定し、線形四量体染色減衰プロットを獲得し、四量体染色半減期(tl/2)が各TCRペプチド/HLA-A2複合体のtl/2に比例することを示す(図11D)。低(0.2μM)PR1で誘発されたPR1-CTLは、高(20μM)PR1で誘発されたPR1-CTL よりもtl/2が3倍長く(19分に対して58分)、これはそれぞれ全体的な高四量体蛍光および低四量体蛍光と相関し（図11A）、相対TCRアビディティを示すための全四量体蛍光の使用が立証される。
【０３１９】
高アビディティおよび低アビディティPR1特異的CTL培養物由来のスペクトル型は固有のクローン誘導を支持する。高いおよび低いTCRアビディティを有する短期PR1-CTL株は個別のクローン集団に由来することができ、同一ドナー由来の4週齢CTLのTCR-VβCDR3スペクトル型を分析した。0.2μM PR1で誘発された高アビディティPR1-CTLは、TCR-VβファミリーVβ11内に存在すべき最も顕著なドミナントクローンを示し、20μM PR1を使用して同一ドナーから誘発された低アビディティPR1-CTLはVβ2でドミナントクローンを示した(図12)。Vβ3、Vβ5.1、およびVβ14以外の各PR1-CTL株中のVβファミリーの大部分で、2つの異なるCTL株で同様に非対称のレパートリー（skewed repertoires）を示すガウスパターンを示した。繰り返し実験によって同様に非対称のスペクトル型が得られ、高アビディティおよび低アビディティのPR1-CTLの固有のクローン起源が示唆される。
【０３２０】
PR1特異的CTLによるCML標的細胞の死滅はTCRアビディティと相関する。異なるTCRアビディティを有するCTL株が異なるエフェクター機能を示すかどうかを評価するために、健常ドナーまたはCML患者由来の4週齢のPR1-CTL株を、急性転化CML患者由来のHLA-A2+CML標的細胞、診断時の患者CML番号3由来の自己慢性期CML細胞、または健常ドナー由来の細胞を死滅させる能力について試験した。高アビディティまたは低アビディティを有する健常ドナー由来のPR1-CTLを、4時間の細胞毒性アッセイにおいてそれぞれCML患者由来の骨髄（BM）または患者の健常HLA適合同胞由来のBMのいずれかと組み合わせた。0.2μM PR1で誘発された高アビディティPR1-CTLは、20μM PR1で誘発された低アビディティPR1-CTLよりも1細胞あたり同一のCML BM細胞のほぼ2倍の溶解を示した（図13A）。0.2μM PR1を使用したCML患者（CML番号3）由来のPR1-CTL株による自己BM細胞の特異的溶解は、健常ドナー由来の低アビディティPR1-CTL株によるCML BM細胞の溶解量と類似していた（図13B）。同様に、0.2μM PR1で誘発された患者CML番号1およびCML番号2由来のCTLは、20:1のE:T比でそれぞれ24％±5％および33％±6％のCML番号3のBM細胞の溶解が示された。
【０３２１】
高アビディティPR1特異的CTLは、細胞遺伝学的に寛解したインターフェロン感受性CML患者のみで示される。CML患者における機能的PR1-CTLの検出がインターフェロンαに対する細胞遺伝学的応答と相関することが以前に示された(Molldrem et al., 2000)。これにより、高アビディティPR1-CTLがIFN感受性患者のみで存在することが示唆される。この可能性に取り組むために、急性転化（CML番号1）もしくは慢性期CML（CML番号2）の非治療HLA-A2+患者またはIFN-αで3ヶ月治療した慢性期患者（CML番号3）由来のPBMCを、PR1で毎週刺激した。低アビディティPR1-CTLのみを任意の3人の患者から誘発することができる（図14A）。反復ペプチド刺激前のPBMCにおける四量体染色によって検出可能なPR1-CTLは存在しなかった。低アビディティPRl-CTLは、患者2ではわずか0.02μMのPR1および患者3では0.002μMのPR1で惹起される一方で、患者1由来のPR1-CTLは0.2μM未満のPR1で誘発することができず、全体としてより少ないCTLが得られた。患者1および2は、核型によってBM中に100％フィラデルフィア染色体陽性（Ph+）細胞を有するが、患者3は、IFN-αに対する細胞遺伝学的応答を生じ、80％Ph+細胞を有していた。高アビディティCTLが再刺激のより早い時期に惹起することができる可能性のために、第4の慢性期非治療CML患者（CML番号4）由来の培養物を、四量体陽性CTLの出現について0.2μM PR1でパルスしたT2細胞での再刺激前に毎週研究し、高アビディティPR1-CTLが培養中に出現なかった（図14B）。CMV血清反応陽性患者CML2由来の高アビディティp65特異的CTLが0.2μM pp65ペプチドパルスT2細胞を使用して誘発されるため、高アビディティCTL誘発の失敗がPR1に制限された（図14C）。
【０３２２】
高アビディティPR1-CTLがIFN感受性患者のみにおいて存在する可能性にさらに取り組むために、インターフェロン治療から9ヶ月後に細胞遺伝学的に寛解した2人のCML患者 (それぞれ0％および85％のPh+細胞を有するCML番号5およびCML番号6)、細胞遺伝学的に寛解していないインターフェロン耐性患者(CML番号7およびCML番号8)、および高および低アビディティTCRを有するPR1-CTLの存在について治療していない新規に診断された患者（CML番号9）を研究した。高アビディティPR1-CTLが両細胞遺伝学的寛解患者で同定されたが、インターフェロン耐性患者または非治療患者では同定されなかった（図15）。しかしながら、インターフェロン耐性患者で低アビディティPR1-CTLを同定することができるが、合計でCD8+細胞の0.1％未満であった。さらに、急性転化(CML番号1)もしくは慢性期(CML番号2)の非治療HLA-A2+患者またはインターフェロンαで3ヶ月治療した慢性期患者(CML番号3)由来のPBMCを、PR1で毎週刺激した。低アビディティPR1-CTLのみを任意の3人の患者から誘発することができる。これにより、インターフェロン感受性患者の細胞遺伝学的寛解に寄与するには少数の高アビディティPR1-CTLで十分であり得ることが示唆されるが、多数の低アビディティPR1-CTLが寛解に寄与し得るかどうかは、未解決のままである。
【０３２３】
高PR1濃度およびプロテイナーゼ3過剰発現CML細胞が高アビディティPR1特異的CTLのアポトーシスを誘導する。高親和性ウイルス特異的T細胞が高ウイルス量で感染された標的細胞によって消失すること(Alexander-Miller et al., 1998; Alexander-Miller et al., 1996a)およびCML細胞がプロテイナーゼ3を頻繁に過剰発現すること((Molldrem et al., 1996; Molldrem et al., 1997)を示す以前の研究により、標的抗原を過剰発現するCML細胞による選択的消失によって高アビディティPR1-CTLは非治療CML患者で検出不可能であることが示唆された。これを証明するために、健常ドナー由来の同数のPR1-CTLを高用量または低用量のPR1でパルスしたT2細胞で攻撃誘発し、16または18時間後にアネキシンVによるアポトーシスの証拠について研究する。高アビディティPR1-CTLは高用量（20μM）のPR1ペプチドで攻撃誘発した場合にアポトーシスを受けたが、低用量（0.2μM）のPR1で攻撃誘発した場合にはアポトーシスを受けなかった（図16）。高用量PR1に曝露された全ての高アビディティPR1-CTLは、同時培養の36〜48時間後に死滅した。HLA-A2.1に対するBB7.2遮断抗体の存在下でアポトーシスは無効になったが、20μMの無関係のペプチドFluをPR1の代わりに使用した場合、アポトーシスは認められなかった。対照的に、高濃度または低濃度のPR1のいずれかで攻撃誘発した場合、低アビディティPR1-CTLはアポトーシスを受けなかった。
【０３２４】
CML細胞が同様に高アビディティPR1-CTLのアポトーシスを誘導するかどうかを決定するために、CML患者由来のHLA適合BM細胞を使用して同時インキュベーション研究を行い、同時インキュベーションの16〜18時間後アネキシンV染色を行った。高アビディティPR1-CTLは100％Ph+細胞を有する慢性期のHLA適合CML患者由来のBMとの同時培養の18時間後までにアポトーシスを受けた（図17A）。100％Ph+細胞を有するHLA-A2陰性CML患者由来のBM細胞との同時インキュベーションやHLA-A2+健常ドナー由来のBM細胞との同時インキュベーションによってアポトーシスは誘導されなかった。対照的に、HLA-A2+CML細胞またはHLA-A2-CML細胞のいずれかで攻撃誘発した場合、1％未満の低アビディティPR1-CTLがアポトーシスを受けた(FIG. 17B)。各CML患者由来のBM細胞で細胞質プロテイナーゼ3の類似の過剰発現が見出され(健常ドナーBM細胞と比較して、HLA-A2+細胞で2.8倍およびHLA-A2細胞で3.3倍)、2つの患者サンプルでMHC I発現が類似していた（図17C）。したがって、アポトーシスの相違は、CML細胞上に提示されるPR1ペプチド量の相違に起因する可能性が高かった。
【０３２５】
高アビディティPR1-CTLは、全療法を停止したIFN感受性CML患者で持続する。IFN感受性患者がCMLを死滅させることができる末梢血中で高アビディティPR1-CTLを有することが示されているため、PR1-CTLがCR停止（off）療法において患者の寛解を維持するかどうかを決定した。IFN中断後に完全に細胞遺伝学的寛解を示した3人の患者を研究した。患者は、5〜9年間CMLを有し、研究の18〜26ヶ月前にIFNを停止した（表11および表12）。RT-PCRによって、全患者はbcr-abl転写物を有し続けていた。高アビディティおよび低アビディティのPR1-CTLが全患者で同定されたにも関わらず、25％〜30％のPR1-CTLのみが高親和性を示した（図18）。重要なことには、PR1ペプチドまたはSEBのいずれかでの刺激がCFCによるγ-IFN産生を誘導CD69を上方制御したため、全ての高親和性PR1-CTLが機能的に活性である一方で、低親和性PR1-CTLはγ-IFNを産生しなかったが、CD69を上方制御した。特に、21ヶ月目に試験した場合にUPN3由来の高親和性PR1-CTLはCD69を上方制御するがγ-IFNを生産せず、細胞遺伝学的再発の5ヶ月前の抗白血病免疫機能の喪失およびPR1-CTLの同時消失を示す。
【０３２６】
（表１２）IFN感受性CML患者の停止療法におけるPR1-CTL
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【０３２７】
高親和性PR1-CTLは、エフェクター記憶またはおそらくナイーブ表現型を示すCD45RA+/CD28+/CCR7+/CCR5-のみであった。さらに、高親和性PR1-CTLは、低親和性PR1-CTLよりも有意に高いCD28発現（p=0.03）および低いCCR5発現（p=0.01）を示し（図19）、低親和性PR1-CTLは抗白血病活性をほとんど示さない最終的に分化された記憶細胞であることが示唆される。これらの結果は、IFN治療によりIFN療法の中断後に何人かの患者における持続的細胞遺伝学的寛解の継続に寄与する高親和性PR1-CTLの長期継続更新（renewing）集団が誘導されることを示した。高親和性PR1-CTLの機能活性の喪失または低親和性PR1-CTLのみの存在により、最終的に再発する寛容の獲得が示唆される。この初期非反応性はアネルギー状態を反映し得るが、再発時のPR1-CTLの喪失は欠失に起因し得る。
【０３２８】
PR1ペプチドワクチンは、骨髄性白血病患者においてPR1-CTL免疫を誘発することができる。予備データにより、PR1特異的CTL免疫応答を誘発または増加させることができる骨髄性白血病患者では、PR1-CTLは抗白血病免疫応答を伝達し、寛解に寄与することが示唆される。これを試験するために、不応性白血病患者で第I/II相ワクチン研究を開始した。プロテイナーゼ3に対して検出可能な抗体を含まない（検出可能なcANCAを含まない）CML（インターフェロン耐性またはBMT後に再発）、AML（くすぶり型または第2のCR以上）、またはMDS（RAEBまたはRAEBt）を有するHLA-A2+患者がふさわしかった。BMT後に再発すする患者またはBMTにふさわしくない患者も研究にふさわしかった。妊娠した患者、HIV+患者、および公知の脈管炎を罹患した患者を排除した。患者は、研究開始4週間前から免疫抑制（すなわち、シクロスポリン、ステロイド）を中断する必要があった。
【０３２９】
一次エンドポイントは、(1)ヴェゲナー肉芽腫症（cANCA抗体に関連する全身性脈管炎）に類似の自己免疫の誘導を含む毒性評価;および(2)ワクチン接種前および最後のワクチン接種から3週間後のγ-IFNのサイトカインフローサイトメトリー（CFC）およびPBMCのPR1/HLA-A2四量体染色によって評価された免疫応答の誘導であった。第2に、最後のワクチン接種から3週間後の骨髄生検、細胞遺伝学的研究（標準的な染色体バンディング（banding））、および分子研究（bcr-ablまたはt(15 ; 17)、invl6などの他の公知の異常についてのPCR）を含む基準によって臨床応答を評価した。患者を、研究期間中、3週間毎にクリニックで観察および評価を行った。バイアルド（vialed）PR1ペプチド(NSC698102)およびアジュバント(モンタニドISA-51、NSC675756)を本研究で使用した。
【０３３０】
全研究を、以下の2つの部分に分けた： 0.25mg、0.5mg、または1.0 mgの3つの用量のPR1ペプチドのうちの1つを含むフロイント不完全アジュバント(モンタニドISA-51)を皮下注射し、GM-CSF 75 mgを3週間毎に3回皮下注射する3つのコホートで治療した9人の患者からなる第I相。前記用量が研究の第I相部分で毒性に基づいて排除されなかったため、同一の3つのPR1ペプチド用量の1つに無作為に分類された4つのコホートに患者が参加した研究の第II相部分。連続再評価モデルを統計的デザインで使用し、免疫応答の基準（ワクチン研究時のPR1特異的CTL数の2倍以上増加）およびグレード3または4の器官毒性を使用して最良の用量レベルを評価した。任意の患者が脈管炎および/またはcANCAを発症した場合に試験を中止し、任意の各患者がグレード3または4の器官毒性を示した場合にこの患者に対するワクチン接種を差し控える。グレード3毒性またはグレード4毒性を有する患者数を毒性について評価した患者数で割ったものが3/4、4/8、5/12、または6/16以上である場合、いかなる用量レベルも中断する。この用量レベル中の第1の12人の患者が免疫応答を示さない場合、いかなる用量レベルも終了する。免疫応答が認められた場合、患者は連続無作為化によって用量レベルあたり最大20人までこの用量レベルに参加し続ける。測定可能な免疫応答を有するか有さない研究期間中任意の臨床応答が認められた場合、これを有効性エンドポイントと見なし、患者を用量あたり最大20人までこの用量レベルに参加させる。患者を、胸部X線、ANCA力価、および身体検査ならびにPR1/HLA-A2四量体を使用した免疫応答を使用して3週間毎にモニタリングした。病状を評価するために最初のワクチン接種前および最後のワクチン接種から3週間後に骨髄細胞（BMC）を得た。
【０３３１】
今日まで、16人の患者が第I/II相研究の組み合わせに参加し、図20に示すように、15人の患者が毒性、免疫応答、および臨床応答について十分に評価可能である。イマチニブに進行した2人の患者を、血球数を制御するために同一用量を保持し、ワクチンで治療した。1人のAML患者は、研究前に血液学的に寛解した。脈管炎の発症やcANCA変換（conversion）は認められなかった(図20)。第1の注射から2週間までに用量レベル3でグレード2皮膚注射反応が1人の患者で認められ（UPN13、図20）、1週間後に散らされ、4人の患者で軽度の疲労が認められた。UNP13由来の皮膚生検により血管周囲リンパ球浸潤が示され、PR1/HLA-A2四量体染色によって、65％のCD8+リンパ球がPR1特異的であることが確認され、局在化免疫応答（図20）を示す。四量体+PR1-CTLの比率の2倍超として定義される免疫応答が、15人の患者のうち8人で認められた（図21）。図23および24は、誘発されたPR1-CTLが10μM PR1とのインキュベーション後にCFCによって機能的であり、四量体+画分のうちの約半分がサイトカインを分泌することができることを示す。これら8人の患者のうちの5人で研究機関中にCR（1人の明らかな急性白血病患者が含まれる）が誘導された。二次エンドポイントであるにもかかわらず、本研究で臨床応答も認められた（図21）。ワクチン接種前にAMLが再発した3人の患者(UPN4、UPN7、およびUPN15)は、それぞれ用量レベル2、3、および1での第2または第3の注射後に細胞遺伝学的寛解（CR）が得られた。寛解は、それぞれ20ヶ月、9ヶ月、および4ヶ月持続し、それぞれ0.58％、0.2％、および1％の循環PR1特異的CTL（CD8リンパ球に基づく）を含む。6人のCML患者のうちの2人のみが研究前に100％未満のPh+細胞を有し、イマチニブにも進んだこれらの患者のうちの1人（UPN12）が用量レベル1（0.25mg）で細胞遺伝学的寛解（CR）を示した。臨床応答が3つ全ての用量レベルで認められたため、試験デザインは、研究の第II相部分の各用量レベルで20人と義務づける。
【０３３２】
（表１３）PRIワクチンにより毒性が最小になる
□  cANCAの誘導なし
□  血管炎またはウェグナー様自己免疫なし
□  最大耐量または毒性制限用量に達っしていない
2007504149.tif 000024
【０３３３】
ワクチン誘導PR1-CTLは細胞遺伝学的寛解に寄与する。PR1- CTL誘導寛解を示すために、 UPN4（以前に同種BMTで治療して4回再発し、3回の漸増用量のDLIで治療し、最後のワクチン接種から1ヶ月後に白血球搬出法（LP）によって回収したPBMCを有することが個別に認められた27歳のAPLの男性）由来の細胞を試験した。ドナー由来PR1-CTLは3回目のワクチン接種後に0.1％から0.54％に増加し、エフェクター記憶CD45RA+/CD28+/CD57ドナー由来CTLが富化し(PCRマイクロサテライト分析による)、これは最初のワクチン接種から6週間後のRT-PCRによってt(15;17)転写物の喪失と相関した（図24A)。PR1-CTLは、ワクチン接種完了から22ヶ月後に0.2％に保持される。ワクチン接種後に得られた四量体選別精製PR1-CTLは、ペプチドパルスT2細胞に対するPR1特異性を示し、10:1のE:T比で寛解時に採取されたBMCはたった14％の溶解であることに対して、再発時に採取したBMCは44％の溶解であった（図24B）。別のinvl6 AML患者(UPN15)では、第2の再発時にPR1-CTL免疫が誘発された。この32歳の男性に自家移植を受けさせた一方で、第2の寛解で、inv16のプローブを使用したFISHによってAMLの証拠はなかった。2ヶ月後、この男性の血小板数は24,000個に減少し、FISHによるとinv16を有していた（図25）。0.25mg（用量レベル1）のPR1ワクチンの最後の注射から3週間後、この男性の血小板数は正常値に回復し、FISHやRT-PCRによってもinv16は存在しなかった。まとめると、この試験由来のデータは、白血病患者へのペプチドワクチン接種により細胞遺伝学的寛解を誘導する白血病細胞に対する非常に活性な特異的免疫を誘発することができるという直接的証拠を初めて証明する。免疫応答は必要であるが臨床応答には十分でないにもかかわらず、臨床応答は免疫応答の誘導に相関した（p = 0.02)。したがって、PR1-CTLがアビディティがより低いPR1-CTLよりも良好に白血病を死滅させ、それにより臨床的に有効な抗白血病免疫を示すため、PR1-CTLはCR患者でより高いTCRアビディティを有することが示唆される。図26は、高アビディティおよび低アビディティのPR1-CTLを同定するための低用量の四量体の使用により、PR1-CTLの平均TCRアビディティが、先在する四量体+CTLを有する非応答者におけるワクチン接種後PR1-CTLと比較して臨床応答者で1.5倍である（p=0.02）ことが見出されることを示す。
【０３３４】
高アビディティPR1-CTLの喪失およびP3抗原の下方制御由来のT細胞寛容は、ワクチン接種後にCMLの進行と相関する。UPN6（非応答者）は、0.5mgのPR1でのワクチン接種前に高アビディティおよび低アビディティのPR1-CTLの両方を有するが、最後の注射から3週間後には低アビディティPR1-CTLのみを有することが見出された（図27）。さらに、PR1-CTLの総数は研究中に3.2％から0.5％に減少し、Ph+分裂中期染色体数は90％から95％に増加した(図27)。興味深いことに、PR1/HLA-A2四量体選別CTLは、20μM PR1でパルスしたT2細胞のペプチド特異的溶解を示し、これは2μM PR1でパルスしたT2細胞のほぼ等価な溶解（1細胞あたり）が得られるUPN4由来のPR1-CTLに類似していた。UPN6がワクチン接種中に応答者UPN4と同一のペプチド用量を投与されるにも関わらず、この用量は、高アビディティPR1-CTLの消失およびCMLの増殖に十分であった。高アビディティPR1-CTLがUPN6末梢血PBMC中で検出不可能なため、PR1パルスT2細胞を使用して、これらを拡大することができるかどうかを決定した。UPN4およびUPN6由来のLP産物由来のPBMCを、種々の用量のPR1(0.2μM〜200μM)コーティングT2細胞で毎週刺激した。しかしながら、図28に示すように、高アビディティPR1-CTLをUPN4からのみ拡大することができ、UPN6からは拡大することができなかった。この実験は、高アビディティPR1-CTLがこの非応答者で欠失されたという予想を支持した。しかしながら、高アビディティPR1-CTLは依然としてUPN6中に存在し得るが拡大することができず、このことは、不十分な増殖能力、不十分なサイトカイン産生、またはより一般化された抗原の非応答性に起因する。
【０３３５】
防御抗原プロセシング(Restifo et al., 1993; Maeurer et al., 1996)、標的抗原変異、またはMHC (Lehmann et al., 1995)もしくは標的抗原(Marincola et al., 1996)の下方制御によって免疫が回避されて腫瘍が増殖することが十分に記載されているため、UPN4およびUPN6へのワクチン接種前後のP3発現の比較によってこれらの可能性を調査するための研究を行った。UPN4におけるP3発現に変化がないことと比較して、ワクチン接種後のUPN6においてP3が60％まで減少することが見出された。興味深いことに、P3発現はより未成熟のCD34+前駆細胞に移行し、これによりMHC発現がより低く(Bernhard et al., 1995)、かつ骨髄中でより成熟した骨髄細胞よりもT細胞に対する抗原をプロセシングして提示する能力が低下し得る。まとめると、これらの研究は、高アビディティPR1-CTLの拡大と比較したUPN6（非臨床応答者）における白血病細胞におけるP3標的抗原発現が同時に減少した高アビディティPR1-CTLの優先的喪失およびUPN4（臨床応答者）におけるワクチン接種後の全P3発現の保存を示す。全MHC-I、CD80(B7.1)、およびCD54(ICAM-1)発現は、ワクチン接種後の両患者で変化しないままであった。したがって、少なくとも2つまたはそれ以上の機構はUPN6で作用しているようであり、最終的に抗白血病免疫から回避される。
【０３３６】
単球由来樹状細胞（DC）は自己PR1特異的CTLを拡大することができ、PR1/HLA-A2単量体を使用して養子免疫療法のためにPR1-CTLを選択することができる。本発明の別の中心的局面は、同種骨髄移植（BMT）後にGVLに寄与するCTLおよびGVHDを発症するCTLが固有の抗原をターゲティングすることである。以前に、本発明者らは、正常な骨髄よりもCMLを優先的に死滅させるCTLを誘発することができるP3由来のHLA-A2制限ペプチドPR1を同定した。さらに、末梢血単核球細胞を染色するために可溶性ペプチド/MHC四量体を使用して、細胞遺伝学的寛解を起こしたBMTレシピエントの末梢血中にPRl特異的CTLを同定することができる。つい最近、本発明者らは、PR1-CTLを証明するために非骨髄機能根絶幹細胞移植（NST）治療方式を受けたAML患者の末梢血を研究した。HA-1などの副組織適合抗原に指向する免疫がPR1などの自己ペプチドに対する免疫と共存するかどうかを決定するために、異なるペプチドエピトープで折り畳まれたHLA-A2四量体を使用して、NSTから約60日後に患者を研究した。蛍光色素であるPE(Cy7)とPEとの組み合わせを使用して、複数の四量体を使用して異なるペプチド特異的T細胞のための末梢血の小アリコート（small aliquot）を同時に染色するために使用することができる四量体を構築し、単一の四量体染色血液サンプルと類似の結果が得られた（図29A）。約60日目にPR1に特異的なより高い比率のCD8+T細胞がNSTから1年後の寛解と相関することが見出された(p = 0.03、図29B)。PR1、HA-1、およびWT-1の四量体の組み合わせにより、順位制を定義し、GVLおよびGVHDに対する各抗原に対する免疫応答の相対的寄与を決定することができる。さらに、これらの試薬を使用して養子免疫療法で使用することができるポリクローナルT細胞からペプチド抗原特異的CTLを選択することもできると判断した。特に自己抗原についてのこれらのT細胞の前駆体頻度は非常に低いため、四量体染色を使用した選択はバルク培養における抗原特異的T細孔の優先的拡大を追跡する必要があろう。BMT後の患者への養子免疫送達で使用するためのエクスビボでの臨床的に実践的なペプチド特異的CTLの拡大方法を模索した。ペプチドパルスT2細胞(非常に信頼できるが、不適切なペプチド特異的CTLの臨床的誘発方法)を、ペプチドパルス樹状細胞（DC）と比較した。臨床での使用が既に承認されている試薬を使用することが望ましいため、インターフェロン-α2b（IFN）およびGM-CSFは抗原特異的T細胞を拡大するためのペプチドパルスAPCとして有用であるため(Santini et al., 2000)、インターフェロン-α2b（IFN）およびGM-CSFを使用して末梢血単球から拡大したDCを使用した。7日間拡大したDCを、IFN(1,000U/ml)およびGM-CSF (500ng/ml)対IL-4およびGM-CSFを使用して7日間拡大したDCを使用して比較した。自己PBMC由来のPRl特異的CTLの収率を、7人の健常HLA-A2+ドナー由来のこれらの各APCを使用して比較した(図30)。各患者由来のPBMCを、PR1ペプチドパルスT2、IFN＋GM-CSF処置DC(DC/IGM)、またはIL-4＋GM-CSF処置DC(DC/4GM)で毎週刺激した。図30に示すように、21日の培養終了時のペプチド特異的CTLの収率は、これら3つの群全てで類似していた。細胞毒性実験により、ペプチド特異性および3つ全ての群の標的としてのPRlパルスT2細胞の類似の特異的溶解量も確認された（図31）。DC/IGMは、養子免疫伝達研究のためのPR1特異的CTLを誘発するために使用すること���できるAPCの信頼できる供給源とされている。さらに、図24および27に示した実験は、十分に高頻度でPR1-CTLが存在する場合に高速フローサイトメトリーによってPR1特異的T細胞を選択するために使用することができる四量体使用の実行可能性を示した。重要には、PR1-CTLは、選別後に白血病に対するその細胞傷害能力を保持していた。
【０３３７】
実施例10
PR1ペプチドワクチン接種後に誘導された特異的免疫は細胞遺伝学的寛解と相関する
本発明者らは、IFN-γに対して細胞遺伝学的応答を示すか寛解を示すCML患者が、HLA-A2制限ペプチドPR1に特異性を有する循環細胞毒性Tリンパ球（CTL）を有することを示した。PR1-CTLは、白血病のペプチド特異的溶解を示し、患者によっては寿命が長い。これはPR1-CTLが悪性細胞のクリアランスで重要であり得ることを示すにも関わらず、PR1-CTLが悪性腫瘍に応答して発生し、その消失に十分であるかどうかは明らかでない。フロイント完全アジュバントおよびGM-CSFと組み合わせて皮下投与される漸増用量のPR1ペプチドを評価する第I相研究では、0.5mg PR1を3週間毎に3回注射した以下の2人の患者由来の結果を報告した：同種BMT後に再発した後期慢性期（late chronic phase）CMLを罹患した38歳の女性（UPN6）および同種BMTおよびDLI×3後に不応性APMLを罹患した27歳の男性（UPN4）。PR1/HLA-A2四量体を使用して、PR1-CTLを同定し、機能分析のための試験終了後に得た白血球搬出産物から99％を超える純度にFAC選別した。総T細胞集団およびFAC選別PR1-CTLのキメラ現象をDNAマイクロサテライト分析によって行った。ワクチンの1ヶ月前までに、UPN6にIFN-γを投与し、かつ1.9％のPR1-CTLを有し、第3のワクチン接種から1ヶ月後に0.83％に減少した。全ドナーT細胞で15％のキメラ現象しか存在しないにもかかわらず、PR1-CTLは100％ドナー由来であった。この患者は臨床応答を示さず、95％Ph+細胞が持続していた。対照的に、UPN4は、ワクチン前に0.1％未満のPR1-CTLを有し、第3のワクチン接種後に1.5％に増加し、全体を通して100％ドナーT細胞キメラを維持した。同時に、ワクチン接種前のRT-PCRによる検出可能なt(15;17)転写物は、ワクチン接種から1ヶ月後にもはや検出不可能であった。興味深いことに、UPN6は、PR1ワクチン投与から1ヶ月後に制限された口腔および眼の慢性GvHDを発症した。次いで、FAC選別PR1-CTLの機能的能力とCD8+PR1/HLA-A2四量体陰性細胞の機能的能力とを、標準的な4時間の細胞毒性アッセイで比較した。両患者由来のPR1-CTLは、標的細胞として10:1〜1:1のE:T比でPR1パルスT2細胞を使用して、PR1ペプチド特異性を示した。UPN4由来のPR1-CTLは、10:1のE:T比での四量体-CTLによるたった27％の特異的溶解と比較して、BMT前に得たCML骨髄（BM）細胞の49％特異的溶解を示した。同様に、UPN4由来のPR1-CTLは、寛解時に採取したBMのたった14％の溶解に対して再発時のBM溶解は44％であった。それに反して、CD8+PR1/HLA-A2四量体陰性細胞は、10:1のE:T比でそれぞれ再発および寛解BMのたった25％および6％の溶解を示した。この研究は、白血病患者のペプチドワクチン接種によって白血病細胞に対して高度に活性な特異的免疫を誘導することができるという直接的証拠を初めて示した。何故UPN6におけるワクチン接種により機能的PR1-CTL数が減少するのかということを決定するために、各患者由来のPR1-CTLおよび残存標的細胞の両方を調査するためのさらなる研究を行った。プロテイナーゼ3（PR1が由来するタンパク質）の発現がCML細胞と比較してより豊富に発現されるため、APMLがより感受性の高いワクチン標的である可能性がある。
【０３３８】
エクスビボで高アビディティT細胞受容体を有するPR1特異的細胞毒性Tリンパ球（CTL）を拡大に至適な方法の決定。本研究では、IFNとGM-CSFとの組み合わせが養子免疫療法のためのPR1-CTLを誘発するために使用することができるDCを産生することができるかどうかについて試験した。P3過剰発現のためにPR1-CTLが正常なBMよりも白血病を優先的に死滅させるという以前の所見に基づいて、P3は造血組織においてのみ発現されるため、養子免疫伝達されたPR1-CTLがGVHDを発症することなくGVLを産生することが示された。高アビディティPR1-CTLが白血病細胞のより有効な殺し屋（killer）であるにもかかわらず、高P3発現白血病細胞とインキュベートした場合にアポトーシスを起こすこともできることも示された。これにより、同種骨髄移植後に多数の高アビディティPR1-CTLが微小病変（minimal disease）を有する骨髄性白血病患者に養子免疫伝達された場合、得られたPR1-CTLの有意な白血病誘導性喪失前に十分なGVL効果が得られ、GVHDを有意に発症することなく寛解が促進されることがさらに示唆された。インビトロでPR1-CTLを誘発するための2つの一般的な拡大方法を前に記載のように比較する。
【０３３９】
簡単に述べれば、1,000 U/ml IL-4＋500 U/ml GM-CSF (DC/4GMと呼ぶ)または1,000 U/ml インターフェロン-α2b＋500 U/ml GM-CSF (DC/IGMと呼ぶ)のいずれかの組み合わせを使用してDCを成長させた。予め低温保存していたHLA-A2+健常ドナー由来のPBMCを解凍し、洗浄し、プラスチック製のフラスコに接着し、その後上記サイトカインを添加した培地＋10％ヒト血清(HS)を添加した。T2細胞を、RPMI＋10％HS中で維持し、その後ドナーPBMCと同時培養した。7日目終了時に、DCに20μg/ml PR1ペプチドをパルスし、照射し、同一ドナー由来の新鮮なPBMCと1:2の比で合わせた。7日目に、培養物をPR1パルスDC(またはT2)で再刺激し、8日目に20U/mlのIL-2を培養物に添加した。PR1-CTL培養物をPR1コーティング標的細胞またはCML細胞を溶解する能力について試験する場合、26日目から28日目まで再刺激およびIL-2添加を毎週繰り返した。PR1-CTLを、PR1/HLA-A2四量体および抗CD8を使用して表面表現型について評価した。一般に、DC/IGMおよびT2細胞の両方がPR1-CTLを誘発した。しかしながら、T2はほぼ2倍有効であり、典型的には、4週間目までに（四量体染色によって決定したところ、バルク培養の）3％〜6％のPR1-CTLが得られ、DC/IGM ではたった1.5％〜4％のPR1-CTLしか得られなかった。臨床目的でのT2細胞の使用に関する規制の懸念のために、別の刺激者の供給源を研究する。
【０３４０】
CTL拡大効率をさらに改良するために、DCの代替物として人工抗原提示細胞（AAPC）を構築した。このアプローチの利点は、より容易に利用可能であることおよび最終合成産物中で潜在的により一貫性があるという点である。PR1ペプチドを使用した予備実験では、HLA-A*0201重鎖およびβ2-ミクログロブリンを、それぞれ大腸菌（E.coli）中で産生し、発現したタンパク質をPR1の存在下でインビトロで折り畳んだ。折り畳まれた単量体複合体を、ゲル濾過およびイオン交換によって精製した。次いで、PR1/HLA-A2単量体を、ジオレオリルホスファチジルコリン(DOPC)(Avanti Polar Lipids)と1:100、1:500、または1:1000のモル比で混合し、ドライアイス/アセトン浴で凍結し、一晩凍結乾燥させて有機溶媒を除去した。凍結乾燥生成物を、-20℃で保存し、PBS緩衝液で水和し、使用前に強くボルテックスした。T2細胞を、PR1/HLA-A2 AAPC (分子比1:100、1:500、1:100)と3時間および24時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、マウス抗HLA-A*0201モノクローナル抗体BB7.2で表面染色し、FITC標識ヤギ抗マウス抗体で二次的に染色し、人工膜へのPR1/HLA-A2の適切な挿入を判断するために共焦点蛍光顕微鏡下で観察した。これを確認した後、毎週刺激した4週間の培養後のPR1-CTL誘発についてのリポソームカプセル化T2細胞の有効性をDCと比較した。PR1/HLA-A2 AAPCで3〜5週間誘発したCTLは、PR1ペプチドでパルスしたT2標的細胞を有効に溶解し、DCから得られたPR1-CTL株による溶解と等価であった。いずれかの方法を使用して産生されたPR1-CTL 数は最初の実験で等価であるが、2つのさらなる実験では、AAPCはT2細胞と類似しているようであり、一般に、そのPR1-CTLを拡大する能力においてペプチド特異的CTLの誘発でDCよりも有効である。
【０３４１】
予備実験では、より高いモル比のDOPCに対するペプチド/A2単量体で抗原発現を増加させ、有効性をより改良することができることを留意した。しかしながら、結果として高アビディティPR1-CTLのアポトーシスが起こり、抗原濃度の「治療濃度域」が最適である可能性が高い。DC/IGMを、IL-4、GM-CSF、およびTNF-αを使用して成長したDCならびにAAPCおよびペプチドパルスT2細胞の両方と直接比較した。上記で考察するように、PR1を使用した予備実験では、AAPCはT2細胞と等価であり、言い換えると、DC/IGMより有効であることが示された。抗原特異的四量体+細胞数の典型的な収率は、AAPCまたはT2細胞を使用して3％〜5％PR1-CTLであるが、DC/IGMを使用した場合、たった0.3％〜2％である。これらの所見は、HA-1およびGVLの他の推定標的抗原（WT-1）に適用する可能性が高いが、これらのペプチドを使用して全ての比較実験を繰り返す。さらに、無血清成長条件を、DC培養およびCTL培養における血清代替物としての10％HSおよび5％アルブミンと比較する。予備実験では、プールしたヒトAB血清は、DC/IGMを拡大するために使用される培養物への補給物としてFBSとほぼ等価であり、その後PR1-CTLを拡大するためのペプチドパルスAPCとして使用することができる（図32）。一旦これらの方法が確認されると、臨床使用の実現可能性を証明するために、スケールアップ手順を両フラスコおよび蓋付きバッグシステムで行う。本研究の特定の局面は、最も短期間で最も多数の機能的な高アビディティPR1-CTLを産生する条件を最初に決定することである。一旦条件が至適化されてスケールアップ実験で実現可能性が示されると、エクスビボで生成されたPR1-CTLを使用して養子免疫療法研究を開始する。バルク培養再刺激中の毎週の四量体染色を使用してPR1-CTLの収率および活性を比較し、CFCおよび細胞毒性実験を使用して細胞のエフェクター機能を比較する。
【０３４２】
第2に、バルク培養からの抗原特異的CTLの2つの選択方法を比較する。上記のバルク培養条件によって患者に養子免疫伝達した場合に有意なGVHDを発症しないCTLが得られることが示唆されるにもかかわらず、バルク培養物中に残存する非特異的CTLによってGVHDを発症し得る可能性がある。最終バルク培養でのCTLクローニングは時間がかかり、それによって各患者に予防的に実施する必要があり、CTLクローンの導入によってインビボで長期生存CTLが得られそうにないため(Riddell et al., 1997)、バルク培養物からのペプチド特異的画分の分離によってPR1-CTLの純度が改良され、それによりGVHDが減少する。最初の細胞導入は、前の実験で実施したペプチド拡大CTLの漸増用量のバルク培養物を含む。GVHDが存在しない場合、非選択バルク培養物であるPR1-CTLの用量を増加させる。患者がグレードII以上のGVHDを発症する場合、下記方法を使用してPR1-CTLをバルク培養物から選択する。抗原特異的CTLを選択するための第1のアプローチでは、高速フローサイトメトリーの使用により、可溶性ペプチド/MHC四量体を使用して個別の抗原特異的CTLを検証する。抗CD8およびPR1/HLA-A2四量体での白血球搬出産物の染色により、PR1-CTLをCD8+リンパ球の残存物から分離することができ、これらの選別細胞は有効に白血病細胞を死滅させることができる（図24Bおよび27)。
【０３４３】
細胞傷害実験のために1×106個のPR1-CTLが得られるように予備実験をデザインしたが、わずか0.4％のPR1-CTL(CD8+リンパ球に基づく)を含む細胞産物から養子免疫療法に十分な細胞を得るためにスケールアップすることができる。例えば、白血球搬出法から回収した全部で1010個の細胞が、典型的な4週間の拡大の終了時に2×109個の細胞が得られると予想される。4週間の拡大終了時の細胞の収率についての最小の想定に基づいて（40％がリンパ球であり、そのうちのたった20％がCD8リンパ球であり、四量体頻度がたった0.4％PR1-CTLである細胞が含まれる）、0.9×106 PR1-CTL/kgの用量を、平均70kgのレシピエントに養子免疫送達を行うことができる。細胞純度は90％超であり、効率は95％超である。
【０３４４】
第2のアプローチでは、IFN捕捉法を、抗原特異的CTLを選択するために開発した修正ペプチド/MHC抱合ビーズ法と比較する。PR1ペプチドを使用した予備実験では、混合リンパ球のバルク培養物から抗原特異的CTLを分離するためにストレプトアビジンコーティングビーズ(Miltenyi Inc, Germany)に連結したPR1ペプチド/HLA-A2単量体の使用可能性を証明した(Wang et al., 2000).。短期ポリクローナルCTL株を、PR1コーティングT2細胞＋インターロイキン2での6人の異なる健常HLA-A2.1+ドナー由来の70×106個のPBMCのパルシングによって誘発した。培養21日後、フィコエリトリン（PE）に抱合したPR1-HLA-A2四量体で定量したこれらのPR1パルスCTLは、培養物の2％〜8％含まれていた。PR1抗原特異的T細胞を優先的に選択するために、ストレプトアビジンコーティングマイクロビーズ(Miltenyi,Inc.)を使用した方法を開発し、至適化した。ビーズを、重鎖のビオチン標識C末端を介して、HLA-A2.1重鎖＋PR1骨髄性白血病ペプチドと抱合した。PR1パルス短期CTL株を、PR1/HLA-A2コーティングマイクロビーズと30分間インキュベートし、磁性MACSカラムを使用して選択した。ビーズ選択CTLおよびビーズ非選択CTLを、PR1-HLAA2四量体を使用したFACS分析によって定量し、最初のポリクローナルCTL株と比較した。選択後の収率は85％〜100％であり、PR1特異的CTL純度は11％〜21％の埴であった（抗原特異的CTLの純度の3〜5倍増加する）。PR1コーティングT2細胞およびCML骨髄細胞の特異的溶解は6つ全ての培養物で増加し、正常なHLA-A2.1正常骨髄のバックグラウンド溶解は、非選択PR1特異的CTLと比較して消失した。フローサイトメトリー法および単量体コーティングマイクロビーズ法の両方を、Miltenyi Inc.によって開発され、抗原特異的CTLが抗原攻撃誘発後にIFNを分泌する能力に依存するサイトカイン捕捉マイクロビーズ技術と比較する。4週間の毎週の再刺激後に得られたPR1-CTLをPR1抗原とインキュベートし、抗CD45および抗IFNへの結合能力を有する二重特異性抗体を細胞と同時インキュベートする。次いで、マイクロビーズ（Miltenyi, Inc製）に直接連結された抗IFN抗体を有する二次抗体を使用して、バルク培養物からIFN分泌CTLを選択する。
【０３４５】
市販のサイトカイン捕捉テクノロジーによって十分な純度のCTLが産生されると予想することが妥当であるにもかかわらず、このデバイスは同族ペプチド/MHCリガンドを認識する可能性がある全てのCTLを捕捉しない。非分泌抗原特異的CTLがインビボでより機能的な画分を維持することが必要であり得るかどうか、または非分泌CTLがエフェクター機能を発現する能力を後に生じるかどうかが不明確であるため、市販の製品を使用して非常に少数のCTLを選択することができる。同様に、単量体コーティングビーズは、高アビディティPR1-CTLを選択的に精製することができるように分子比に基づいてより容易に拡大縮小が可能な能力を有する。
【０３４６】
養子免疫伝達されたプロテアーゼ3ペプチド特異的CTLが移植片対白血病（GVL）効果に寄与するかどうかの決定。本発明の別の局面は、その後に抗原特異的CTL療法を送達するためのプラットフォームとして使用することができる、移植された同種血液幹細胞または骨髄細胞を移植するための前処置の使用によってGVLを増強し、かつGVHDを軽減することである。優先的GVL活性を有する抗原特異的T細胞の養子免疫伝達によってGVHDを排除し、GVLを増強することができると仮定される。したがって、高アビディティPR1-CTLの養子免疫伝達によってGVHDを増大させることなくGVLが誘導されるかどうかを試験し、臨床試験により、GVLが得られる一方で、急性GVHDの発症が防止されるPR1特異的CTLの最大用量を決定する（グレード3および4急性GVHDのベースライン比は15％未満）。T細胞は、GVHDを引き起こし(Drobyski et al., 1994; Mavroudis et al., 1996; Gaschet et al., 1996; Debergie et al., 1997; van Lochem et al., 1992; Barrett et al., 1998)、移植を容易にする(Reich-Zeliger et al., 2000)ことが示されており、M. D. Anderson Cancer Center(Houston, Texas)などで開発された確立された非破壊的前処置を使用して拒絶を防止することが必要である。健常HLA適合ドナー由来の白血球搬出サンプルを使用し、本明細書中に記載の拡大法を使用して、エクスビボでPR1-CTLを拡大する。本発明で開発された拡大法も臨床使用のための細胞産物の産生のために使用する。移植研究にふさわしい進行疾患患者に同種BMTを実施し、移植後にメシル酸イマチニブを投与し、疾患の継続または増大の証拠を得るためのPCRによってモニタリングする。HLA-A2+である患者が60日目にbcr-ablについてPCR+である場合、漸増用量にてエクスビボで拡大したPR1-CTLを投与する。予備実験結果で示された低用量PR1を使用したエクスビボ培養条件の変更により、高アビディティPR1-CTLをドナーから優先的に拡大する。これらの細胞を、レシピエント体重の1kgあたり1×107、5×107、および1×108バルクCTLから出発する漸増用量で拡大から4週間後にPCR+ドナーにに注入する。培養4週間後、バルクPR1-CTL培養物は、四量体染色および機能分析によって観察したところ、前に実施した拡大に基づいて1.5％〜4％のPR1特異的CTLを含む。2つの白血病搬出産物（LP）は、(1)0.2mMのPR1ペプチドでパルスしたAPCとして十分なDC/IGM（LPの低温保存アリコート由来）を誘発すること、(2) PR1-CTLバルク培養物を誘発することが必要である。PR1-CTLを使用した養子免疫伝達細胞療法試験を開始する前に臨床規模の拡大を行う。疾患が進行するかどうかを決定するために、bcr-abl/abl転写物比について定量的PCRを毎月行う。この比が2倍以上増加する場合、および患者のGVHDが2以下である場合、次のより高い用量のバルクPR1-CTLを注入する。進行し続ける場合、元のドナー由来の非操作DLIを1×108CD3 T細胞/kgの用量で注入する。しかしながら、bcr abl/ablが減少する場合、2ヶ月連続で増加しなくなるまで患者を毎月モニタリングする。この方法では、用量を各患者の範囲内で増加させ、コホートの3人の各患者に対して実施する。第1のPR1-CTL注入後に患者がグレード2を超えるGVHDを発症した場合、レシピエント体重の1kgあたり1 ×105、5×105、および1×106 PRl-CTLから出発する漸増用量の選択されたPR1-CTLを注入する。四量体染色によって正確なPR1-CTL数を決定し、PR1-CTLを上記で決定した至適な方法に基づいて選択する。予備実験では、MoFloサイトメーターを使用したPR1/HLA-A2四量体ベースの高速細胞選別に加えてペプチド/四量体コーティングマイクロビーズを使用して、高度に精製されたPR1-CTL集団を付加することができることが示された。
【０３４７】
PR1-CTLを投与した患者は四量体+細胞を最初に惹起すると同時臨床応答を示すため、これらは免疫を喪失して再発し得る可能性がある。T細胞を使用した多数の養子免疫療法試験でこのことが示されている。したがって、本発明では、PR1ペプチドワクチンが白血病患者でPR1-CTLを誘発することができることが示されているため、微視的残存病変が存在する間（10％未満のPh+細胞またはPCR+のみ）および全身腫瘍組織量が非常に多くなる前に養子免疫伝達後にPR1ワクチンを慎重に患者に投与する。巨大な全身腫瘍組織量は、白血病細胞によって誘導されたPR1-CTLアポトーシスによって白血病に有利に働き得る。したがって、臨床試験のプロトコールは、0.25mg SQの用量のPR1ワクチンを3週間毎に3回注射するための患者の規定およびワクチン接種後に長期持続するPR1-CTLを誘発する用量および投与計画を含む。PR1-CTL細胞はスケールアップ法の効率に依存するため、一旦臨床規模が確認されると、統計学的考慮（サンプルサイズの決定、患者内および患者間の用量漸増の適切な順序付けが含まれる）を行う。
【０３４８】
高アビディティPR1-CTLがGVL応答を優先的に引き起こし、GVHDを増大させることなく分子寛解に寄与することも示された。したがって、標準的な治療アプローチにしたがって、患者の無作為化対照群に非操作DLIを行う。PR1-CTL またはDLIの最後の注入後に1週間間隔で4週間全患者の採血を行い、その後1年間または研究終了まで毎月採血する。30日目、60日目に骨髄生検を行い、その後6ヶ月まで毎月行い、1年後または研究終了まで行う。レシピエントにおける機能的PR1-CTLの全比率を、四量体染色および標準的なCFCアッセイによって決定する。さらに、CMV免疫患者におけるpp65-CTL数により、注入後にPR1-CTL数が増加するかどうかおよびこれらの細胞の寿命が長いかどうかを決定するための内部対照が得られる。同様に、非操作DLIの修復免疫（restorative immunity）を、TREC数、CD4およびCD8数、ならびにCFC+細胞の割合の決定によって養子免疫伝達PR1-CTLを投与した患者の修復免疫と比較する。PR1ワクチン試験における所見に基づいて、TCRのアビディティおよび機能によって測定したPR1-CTLの応答量は、おそらく、PR1-CTLのより簡素な測定よりも寛解を得るために重要である。したがって、存在するPR1-CTLのアビディティを、(1)ドナー産物、(2)移植片およびCTL注入前のレシピエント、および(3)PBMCを染色するための限界用量の四量体を使用した注入後の測定点でのレシピエントで比較する。この方法を、測定物のアビディティを確認するために四量体解離半減期と比較する。さらに、PR1-CTL 産物のアリコートを使用して、BMT、CTL注入前に低温保存したBM標的細胞および標準的な細胞傷害アッセイにおける分子寛解時に採取したBM細胞によって高アビディティPR1-CTLが患者のCMLを優先的に死滅させるかどうかを研究する。さらに、標準的な細胞毒性アッセイにおいて標的として使用することができる十分な細胞を有さない患者について図11Cに示すようにペプチド用量-応答CFCアッセイを行う。抗原特異的CTLクローンの養子免疫伝達によって寿命が長い免疫が得られないことが示されているにもかかわらず(Riddell et al., 1992)、PR1ペプチドでのワクチン接種によって、2年までの寿命の長いPR1-CTLが得られる。この明らかな矛盾する結果は、PR1特異的応答が単一クローンに制限されることに起因し得る。したがって、臨床試験の養子免疫伝達プロトコールは、エクスビボで拡大された広範なオリゴ-クローンPR1-CTLレパートリーを含む。
【０３４９】
予備データに基づいて、高アビディティPR1-CTLが養子免疫伝達後のGVHDを発症することのない完全な寛解に寄与することが示唆される。したがって、これらの実験により、CRを達成するか達成しない患者とCRを達成しているがGVHDが悪化した患者とを直接比較可能である。後者の患者では、GVHDの活性部位でより多くのPR1-CTLが存在するかどうかを決定するために、PBMCおよびBMのPR1/HLA-A2四量体染色を、GVHD部位の組織生検由来の細胞と比較する。皮膚などの末梢組織中にP3発現が存在しないため、これらのGVHD部位にPR1-CTLはほとんど存在しないか全く存在しないことを示す。しかしながら、PR1-CTLが存在する場合、これにより、前記TCRアビディティを循環PR1-CTLのTCRアビディティと比較する。最近のマウスモデルは、GVHDエフェクター細胞が同種抗原独立性であり、宿主APCが有益であり、GVHDを開始させる必要があり得ることを示している(Teshima et al., 2002; Shlomchik et al., 1999)。PR1が自己抗原であるにもかかわらず、GVHD部位でのPR1-CTLが循環PR1-CTLよりもアビディティが低いTCRを有し、潜在的に他のペプチドリガンドとの交差反応性が高くなり、かつPR1リガンドに対する特異性が低くなることが示唆される。このような所見により、CTLのペプチド特異性はほとんどなく、マウス系における所見と一致するという状況が得られる。
【０３５０】
ヒトでは、データはあまり明確ではない。Dickinson, et al. (2002)は、副組織適合抗原特異的CTLがヒトのGVHDの活性部位（造血制限HA-2および至るところで発現するH-Y抗原の両方に特異性を有する）に存在するにもかかわらず、H-Y抗原に特異性を有する唯一のCTLがGVHD部位でサイトカインを産生することを示した。Dickinson,et al. (2002)は、至るところに発現する副抗原がGVHDの標的であるにもかかわらず、HA-2特異的CTLにおけるTCRアビディティを測定も比較もしなかったと結論づけた。したがって、性不適合移植片のレシピエントの皮膚および血液におけるHA-Y特異的CTLの頻度およびアビディティを決定し、PR1-CTLと比較する。高アビディティPR1-CTLの欠失寛容が養子免疫伝達後に起こるかどうかを決定し、これを臨床結果と比較する。高アビディティPR1-CTLの選択的喪失は、高アビディティPR1-CTLを保持し、かつ臨床的に寛解状態であり得る患者由来のBM細胞中のP3発現と比較して高いP3発現を有するCML細胞の持続に起因することが予想される。欠失寛容を、伝達後のアビディティが比較的高いおよび低いPR1-CTLの相対的消失の比較および高アビディティPR1-CTLの不均衡な消失とCMV免疫患者における高アビディティpp65-CTLの消失速度との比較によって決定する。示すように、PR1-CTL免疫からのCMVの逃避は、P3抗原発現の減少などのさらなる機構に起因し得る。したがって、レシピエントBMおよびPBMCにおけるP3発現量を、実時間PCR（商標）およびフローサイトメトリーによって決定し、健常ドナーと比較する。各患者における一般的免疫状態に関するデータは、患者内および患者間の特異的高アビディティPR1-CTLの比較のためのベースラインとして役立つ。さらに、最終的分化状態への成熟表現型の変化によって無効な抗CML免疫が得られると予想されるため、表現型データによってPR1-CTLの分化状態を比較可能である。
【０３５１】
注入後の四量体染色によって同定されたPR1-CTLが養子免疫伝達産物に由来するかどうかを決定するために、選択した患者においてTCR-Vβスペクトル分類およびその後の制限されたTCR-Vβファミリーの反復的配列決定を行う。予備実験データでは、この技術を使用してPR1-CTL応答の大きさを決定することができ、この技術はMDS患者のクローンT細胞発達を追跡するために以前に使用されていたことが示された(Kochenderfer et al., 2002)。ファミリーおよび配列を、各産物および各クローンの結果を追跡するための各測定点由来のPR1/HLA-A2四量体選別CTLと比較することができる。この技術はまた、最近、養子免疫伝達後の黒色腫特異的CTLのクローン持続を証明するために使用された(Dudley et al., 2002)。エクスビボ拡大時の形質導入リンパ球のTCRレパートリーを決定するためにもHSV Tk形質導入リンパ球のスペクトル型分析を行う。PR1-CTLクローンと類似のCDR3領域配列を有する形質導入細胞内のクローンにより、重複抗原特異性が示唆される。
【０３５２】
最後に、24p3（ヒトホモログはNGALである）がCMLによって分泌され、これが二倍体細胞増殖を阻害することが最近見出された。この因子はまた、CML特異的T細胞の増殖能力の喪失に寄与し得る。NGALの定量的測定を行うことができるように、患者由来の血清サンプルを表示の各測定点で採取する。NGALが高レベルで発現する場合、MTTによる細胞増殖を、インビトロでのNGALへのPR1-CTLの曝露後に決定する。
【０３５３】
PR1ペプチドワクチンを使用して、自己骨髄移植またはメシル酸イマチニブ（Gleevec）およびインターフェロン後の微視的残存病変を有する患者においてPR1-CTL免疫を誘発することができるかどうかの決定。予備実験の結果は、ヴェゲナー肉芽腫症または他の脈管炎の発症を示さず、今までのところ、グレード2毒性患者は1人だけ認められている。試験した3つの用量を毒性によって排除しておらず、組み合わせたデータは、免疫応答および臨床応答の両方を示す。さらに、白血病誘導性アポトーシスの可能性および最も強力な抗白血病高アビディティPR1-CTLの選択的欠失が示されている。しかしながら、他の研究所由来のデータにより、移植後の免疫再構成の増殖期に抗原に曝露した場合、T細胞免疫を「リセット」してナイーブT細胞（おそらく高アビディティT細胞が含まれる）を拡大可能であるため、高用量化学療法後のワクチン接種（自己移植片など）は化学療法を使用しないワクチン接種より有効であり得ることが示唆された(Borrello et al., 2000)。または、低アビディティ抗CML T細胞の十分な拡大もまた白血病の消失に有効であり、この拡大は移植後にも増強される(Morgan et al., 1998)。
【０３５４】
不応性CMLのための自己BMTのレシピエントにおいてPR1ペプチドワクチンがPR1-CTLを誘発することができるかどうかを決定する。この試験に基礎となる仮説は、自己BMT後のPR1ペプチドのワクチン接種により以前はCML細胞によって消失していた高アビディティPR1-CTLを再拡大可能である点である。任意の潜在的な自己免疫毒性の非存在下で、得られた高アビディティPR1-CTLが分子寛解に寄与すると予想される。T細胞のこの拡大の効率を、事前に移植せずに行ったワクチン接種と比較した高アビディティ細胞の総数の増加、誘導されたPR1-CTLの全アビディティの平均的増加、または高アビディティPR1-CTLプールのより迅速な拡大速度として測定することができる。最後に、ワクチン接種後にPR1特異的TCRレパートリーの幅も広げることができ、このことはペプチド、それによる白血病に対するより強力かつ持続的な免疫反応を反映し得る。移植後PR1ワクチンを、疾患が進行し、かつ適切な同種ドナーが存在しないCMLのために自己移植のレシピエントに投与する。臨床試験により、ワクチン接種していないHLA-A2対立遺伝子を含まない患者（生物学的無作為化）と比較してPR1ワクチン接種が高アビディティPR1-CTLを誘導し、HLA-A2+患者で無白血病生存が増加するかどうかも決定する。前の研究に基づいて、慢性骨髄性白血病における結果に対するHLA-A2対立遺伝子の影響は認められないと予想される(Cortes et al.,1998).。HLA-A2を有する患者を、3つの用量レベル(0.25mg、0.50mg、および1.0 mg)のPR1ペプチドを3週間毎の3回の注射として投与するために無作為化する。PR1ペプチドを水に溶解し、固定用量のフロイント不完全アジュバント(Montanide ISA-51)と混合する。GM-CSF 75mgを、第2の注射としてワクチンと同一部位に投与する。現在のPR1ワクチン試験（同一のワクチン接種計画を使用してAMLおよびMDS患者を治療する）には、高アビディティPR1-CTLを拡大する能力に対して明確な用量効果があるかかどうかを決定するのに十分な患者が参加していない。しかしながら、ペプチドワクチンのみによって分子寛解を誘導することができる最も顕著な例は、2回目のAMLの再発のためにワクチン接種の2ヶ月前に自己BMTを受け、かつ最も低い用量（0.25mg）のPR1ペプチドを投与した患者UPN15である（図25）。
【０３５５】
骨髄および末梢血を、ワクチン接種前に採取し、3回のワクチン注射のうちの最後から3週間後に再度採取し、末梢血を患者が試験している間に3週間毎に採取する。これらのサンプルを使用して、四量体を使用したワクチン接種の前後および四量体染色による検出可能な応答が示さない患者ではLDAによってPR1-CTL数を定量する。PR1-CTL TCRアビディティをMHC-I四量体の限界希釈の使用によって決定し、「高」および「低」強度集団の最大蛍光強度を分離する力価を、前に考察するように、試薬の各バッチのために確立する。ペプチド特異的TCRレパートリーの幅が変化したかどうかを確認するために、TCR-Vβスペクトル型を、PR1-CTL数が2倍またはそれ以上に増加または減少した選択された患者で行う。四量体標識およびMoFloを使用した高速フローサイトメトリーを使用した細胞の分離による総CD8+リンパ球、高および低アビディティPR1-CTL、四量体陰性CD8+リンパ球のスペクトル型の比較によってワクチン接種後にUPN4（応答者）由来のCTLに対して予備実験を行った。TCR-Vβ3ファミリー中のたった2つのドミナントクローンが高アビディティPR1-CTL内に見出されるのに対して、少なくとも4つの異なるTCR-Vβファミリー中の低アビディティPR1-CTL中で複数のクローンがドミナントであることが見出された。現在、単離クローンの配列類似性の決定によってこれらの最初の所見を確認するために、クローンのCDR3領域がクローン化され、配列決定されている(Kochenderfer et al., 2002)。TCRレパートリーはPR1ワクチンによって影響を受けないはずであるため、これらを患者から単離したpp65特異的CTL（CMV特異的HLA-A2制限エピトープ）と比較する。UPN4から得たPBMCサンプルに対する予備実験により、誘導された高アビディティPR1-CTLが非常に限定された数のクローンに由来し、これらの細胞の寿命に負の影響を与え得ることが示唆される。しかしながら、最後のワクチン接種から20ヶ月後に、患者は末梢循環中に0.58％のPR1-CTLを有し続けることに留意した。したがって、応答者および非応答者の両方におけるクローンのCDR3配列を長期にわたり比較することが重要である。抗原特異的T細胞を使用したT細胞トランスジェニックマウスモデルで示されるように(Savage et al., 1999)、これにより、PR1-CTL区画中でクローンが長期間安定しているかどうかまたはクローンが長期にわたり次第に置換され、その後に得られたTCRアビディティが微調整されるるかどうかの理解の助けになる。
【０３５６】
TCRアビディティが免疫応答と相関することが見出され、かつ低用量のPR1がより高いアビディティのPR1-CTLをインビトロで誘発するため、当初は、より低い用量のPR1ペプチドワクチンによってより高いアビディティのPR1-CTLが産生されると考えることが妥当である。しかしながら、PR1-CTL応答を誘発するために注射したペプチドの細胞取り込みおよび提示が必要であるため、変動のうちで患者の不均一性、異なる白血病型および異なる病期、以前の治療数、循環リンパ球数を仮定すると、明確な用量-応答効果を確立することができない。その代わりに、PR1-CTLの応答および得られたアビディティを、各ペプチド用量での試験前後にモニタリングし、臨床応答者群および非応答者群を比較し、これらの所見に対するペプチド用量の効果を分析する。0.25mg〜1.0mgのPR1の経験的用量範囲は、TCRアビディティに対して生物学的に測定可能な効果を示すより適切な用量の範囲外であり得る。しかしながら、他の腫瘍ワクチン試験でこれらの効果をモニタリングしていないため、これらの効果を観察する。さらに、多数の低アビディティPR1-CTLは、ワクチンと共に拡大した場合、CMLの消失に十分であり得る(Molldrem et al., 2002a; Morgan et al.,1998 ; Molldrem et al., 2002b)。記載のように、本ワクチン試験におけるほとんどの患者は、ワクチン接種前に検出された循環PR1-CTLを有していた。全患者におけるTCRアビディティの相違を測定する。さらに、新鮮なPBMCサンプルのPR1ペプチド刺激後のγ-IFN分泌についてのCFC分析を、各再診で比較する。0.2μM〜200μMの範囲のペプチド用量を使用して、CTLの活性化閾値を比較し、これを四量体を使用して測定したTCRアビディティと比較する。CMVに対して血清反応陽性の患者について、HLA-A2制限pp65ペプチド抗原を使用して、各ペプチド特異的CTLの活性化閾値およびTCR閾値を比較する。
【０３５７】
PR1ペプチドが自己BMTのレシピエント中で高アビディティPR1-CTLを誘導することにより、pp65特異的CTLはPR1ワクチン接種後に全アビディティが変化しないと予想される。しかしながら、アビディティが増加することに注目する場合、アビディティは移植を受ける患者のTCRレパートリーのより一般的な変化を反映し得る。したがって、移植を受けていない患者由来のCTLに対するアビディティを比較する。代替的には、PR1ペプチドが非応答性またはアネルギーによっていかなるPR1-CTL応答も誘発できないということである。CD80、CD86、CD28、CTLA-4の表面発現ならびにBM細胞およびPR1-CTL上でのHLA-A2およびHLA-DR発現の測定によってこれを評価する。さらに、ワクチン接種前後のBMにおけるP3発現を比較する。さらに、白血病細胞におけるP3の過剰発現によって白血病細胞のPR1-CTL媒介溶解に対する感受性が導かれ、低アビディティPR1-CTLを超える高アビディティPR1-CTLのアポトーシスも優先的に誘導するかどうかを試験する。後者によって白血病を発症する。P3発現と同様にPR1ワクチンに対する臨床応答を比較し、ワクチン試験における全ての患者で誘導されたPR1-CTLのTCRアビディティが変化する。ワクチン患者研究に加えて、同種BMTを受けた患者およびDLIを受けた患者の全ての血液サンプルおよび骨髄サンプルを採取する。これらのサンプルを使用して、BM細胞におけるP3発現およびBMT後に再発し、その後DLIを受けたHLA-A2+のCML患者中のPBMCのPR1-CTLアビディティを試験する。移植前、寛解、および再発サンプルを比較する。現在、試験に十分なサンプル数および細胞数を有するこのような患者は12人存在する。
【０３５８】
データに基づいて、P3発現は、BMT前に高く（正常なBMと比較）、寛解時に低く、再発時に再度高いが、BMT後に高アビディティPR1-CTL応答を保存する患者における首尾の良いBMTまたは免疫療法後に低いと予想される。BMT後の寛解時に高アビディティPR1-CTL 集団を有し、その後においてBMT後に高アビディティ細胞を喪失した患者では、BM細胞が前者の患者群よりも長期的により高い平均P3発現を有するか、P3発現がBMT後の寛解時に比較的「高く」維持され、その後の免疫療法後に増加するか実質的に変化しないと予想される。これらの患者では、免疫療法に対して臨床応答を示さず、高アビディティPR1-CTLを付随的に喪失するとさらに予想される。
【０３５９】
他のパラメーターは、PR1ワクチンで治療した患者UPN4およびUPN6に示すように、結果に影響を与える可能性が高い。したがって、P3分布を、フローサイトメトリー、CD80、CD86、ICAM-1(CD54)の表面発現、全MHCおよびHLA-A2発現を使用して初期とより後期のBM前駆体で測定し、PR1-CTLの活性化閾値を、γ-IFN CFCアッセイを使用して試験し、四量体染色を使用して測定したTCR活性と相関する。BMがより多数の白血病細胞の部位であり、高アビディティPR1-CTLが骨髄中には存在し得ないがPBMC中には依然として存在し得るため、BMおよびPBMCを、2つの区画間のTCRアビディティおよびP3発現の任意の相違を比較するためにも試験する。白血病におけるP3過剰発現により高アビディティ白血病特異的T細胞の選択的喪失を誘導することを確立するようにパラメーターをより容易に操作することができる動物モデルと比較して、患者で原因および結果を確立することはより困難であるにもかかわらず、抗原が十分に定義されており、ツールが確立されており、実験の実施に必要な患者サンプル利用可能であるため、これらの実験で寛容の性質についての重要な洞察が得られる可能性が高いと予想される。
【０３６０】
本発明者らおよび他(Burchert et al., 2002)は、IFNが骨髄細胞中でP3発現を誘導することも見出した。この発現の増加により、PR1-CTL媒介死滅に対する感受性が変化し得るが、PR1-CTLのアポトーシスも引き起こし得る。予備実験では、IFNはIFNでの治療後に細胞遺伝学的寛解を引き起こした患者および高アビディティPR1-CTL免疫応答が四量体染色によって示される患者のみでP3を優先的に上方制御することが示された（図33）。これを、P3過剰発現によって高アビディティPR1-CTLが選択的に喪失されないことを意味すると解釈することができる。しかしながら、I型インターフェロンが活性化抗原特異的Tリンパ球におけるアポトーシスを抑制することが公知であるため、PR1-CTLに対するIFNの他の効果は高アビディティ細胞の生存に影響を与え得る(Stark et al.,1998 ; Tanaka et al., 1998; Nakamoto et al., 1997)。したがって、CML患者由来の低温保存BMおよびPBMCを、前述のように行うが、IFNが（P3発現の増加に加えて）PR1-CTLのアポトーシスを防止するかどうかを決定するために、IFN-αおよびIFN-γならびにIFN-αまたはIFN-γに対する抗体を使用するか使用しないでCML細胞と共に高および低アビディティPR1-CTLとインキュベートする。正しい場合、これはまた、黒色腫および腎細胞癌などの腫瘍特異的CTLによってもターゲティングされる他の充実性腫瘍の治療にIFNは無用であることを説明するのに役立ち得る。最後に、CMLを治療するためのIFN形質導入間葉幹細胞（MSC）のマウスモデルからも寛容に関する手がかりを得ることができる。例えば、IFN発現の誘導後のP3発現の増加により、P3特異的T細胞による免疫攻撃に対する感受性を増加することができると同時に、アポトーシスによって最終的に根絶することができる。
【０３６１】
臨床試験では、前述のように3週間毎に3回の注射によって投与したPR1ワクチンがPR1-CTL 応答を誘導するかどうか、およびワクチンがメシル酸イマチニブ（Gleevec）に対して不応性のCML患者における細胞遺伝学的応答および分子応答を誘導するかどうかを決定する。PR1ワクチンはイマチニブに不応性の患者においてPR1-CTLを誘導し、患者の細胞遺伝学的寛解を改善すると予想される。イマチニブでの治療によるP3の潜在的下方制御がワクチンによって誘導された高アビディティPR1-CTLの拡大を容易にすることができるとも予想される。イマチニブ治療の9ヶ月後に10％〜90％Ph+疾患患者においてIFNを使用するか使用しないPR1ペプチドに対してIFNのみを投与するためにHLA-A2発現に基づいて患者を無作為化する。診断時に低温保存されたBMサンプル中のP3（利用可能な場合）を定量し、研究開始時に比較し、ワクチン接種から3週間後に再度比較する。ワクチンレシピエント中のP3発現を、IFNのみまたはIFN+PR1を投与した患者と比較する。イマチニブはP3を下方制御する一方でIFNはP3発現を上方制御するため、どの機構がP3発現を優位に変化させることができるかを予想することは不可能である。しかしながら、臨床研究由来のBMサンプルの試験に付随して、健常ドナーおよびインビトロで新規に診断されたCML患者由来のBM細胞上でのP3発現に対する両薬剤の効果を試験する。P3遺伝子のメチル化などの後成的変化によってP3発現が変化し(Lubbert et al., 1999)、これはイマチニブまたはIFNのいずれかの効果に依存し、これを患者サンプルで調査する。さらに、高用量のPR1に曝露した場合に高アビディティPR1-CTLはアポトーシスを受けることが見出されたため、イマチニブ治療患者における非常に低いP3発現が前に枯渇した高アビディティPR1-CTLの再出現を容易にすることができると予想される。高アビディティPR1-CTLがワクチン接種前に存在するかどうか、およびその可能な再出現に対するIFNと比較したワクチンの相対的影響を決定する。低または高アビディティPR1-CTLにおける機能的活性に相違が存在するかどうかを決定するために、CFC研究を前述のように行う。表現型データを使用して、全身T細胞非応答性に関連し得るCTLの成熟状態を比較する。
【０３６２】
実施例11
ミエロペルオキシダーゼ(MPO)
つい最近、本発明者らは、別の骨髄制限タンパク質であるミエロペルオキシダーゼ（MPO）（好中球アズール親和性顆粒の主要成分を構成する初期骨髄分化時に合成されるヘムタンパク質）を研究した。
【０３６３】
MY4(RLFEQVMRI(SEQ ID NO：30))（HLA-A2.1に結合するMPO由来の9アミノ酸タンパク質）を使用して、インビトロでHLA-A2.1+正常ドナー由来のCTLを誘発することができることが見出された(Braunschweig et al., 2000)。これらのMY4特異的CTLは、HLA同一正常ドナー骨髄を超える同種HLA-A2.1+骨髄性白血病細胞に対する優先的細胞毒性を示す(Braunschweig et al., 2000)。MY4特異的CTLは、CML患者の骨髄由来のコロニー形成単位顆粒球マクロファージ(CFU-GM)も阻害するが、正常HLA適合ドナー由来のCFU-GMは阻害しない。したがって、PR1と同様に、MY4は新鮮なヒト骨髄性白血病細胞の特異的CTL溶解を誘発することができるペプチド抗原である。MPO由来の他のペプチドはHLA-A2.1に結合するが、これらの全てをその免疫刺激能力について試験したわけではない。
【０３６４】
いくつかの以前の研究では、PR1が重要な白血病関連抗原（LAA）であることが確立されており、Pr3およびMPOに指向する免疫の性質の多数の顕著な類似性のために、MPO特異的免疫に適用した類似の方法によってMY4が確立され、潜在的に他のMPOペプチドがLAAと同様に重要である可能性が高い(Kochenderfer and Molldrem, 2001)。
【０３６５】
実施例12
ペプチド選択および結合アッセイ
骨髄性白血病の養子免疫療法のために使用することができるT細胞の第1の生成工程では、公開されたアルゴリズムを使用してHLA-A*0201に結合すると予想される公開されたMPO配列由来のいくつかのペプチドを同定した(Molldrem et al., 1996; Parker et al., 1994)。米国国民における頻度の高さ（個体の49％）によって任意の最終的な免疫療法ストラテジーの治療妥当性を最大にするため、この対立遺伝子を選択した。公知のHLAA2.1結合モチーフに基づいて十分に高い結合親和性を有すると予想される10種のペプチドのうち、最も高く結合が予想される5つを次に合成した(MY1〜MY5と命名する)(表14)。ペプチドを、生合成(Lewisville, TX)またはM. D. Anderson Protein CORE Facility(Houston, TX)によって高速液体クロマトグラフィ（HPLC）による測定によって最低純度95％に合成した。HLA-A2.1へのペプチド結合を、2つのアッセイを使用して確認した。第1に、間接的フローサイトメトリーを使用して、ペプチドでコーティングしたA2T＋T2細胞株上のHLA-A2.1表面発現を測定した。T2細胞は、TAP1およびTAP2遺伝子を欠き、それによって内因性MHCクラスI制限抗原を提示できないヒトリンパ球株である。ペプチドが有効にHLA-A2.1に結合する場合、ペプチドはβ2-ミクログロブリンを使用して複合体を安定化し、HLA-A2.1表面発現を増加させ、それによりフローサイトメトリーを使用して測定することができる。HLA-A2.1特異的モノクローナル抗体(BB7.2, ATCC, Rockville, MD)およびその後のFITC標識二次抗体(CALTAG)を使用して、HLA-A2.1の表面発現を測定した。第2のアッセイでは、HLA-A2.1重鎖、ペプチド、およびβ2-ミクログロブリンのヘテロ三量体複合体からのI125標識β2-ミクログロブリンの解離速度を測定し、それにより結合半減期（t1/2）を計算する。標識ヘテロ三量体複合体を、高速液体クロマトグラフィによって非組み込みβ2-ミクログロブリンから分離した。
【０３６６】
（表１４）開始ペプチドアミノ酸（aa）、サブシーケンス、残基解離半減期
2007504149.tif 000025
【０３６７】
MPOペプチドは、クロマトグラフィゲル濾過によってHLA-A2.1に結合することが予想され、β2-ミクログロブリンの解離半減時間を、複合体のアリコートを第2ラウンドのゲル濾過に供することによって決定した。5つのペプチドが、ペプチドを添加しないT2細胞（バックグラウンドHLA-A2.1発現）と比較して表面HLA-A2.1発現の増加が認められた(図34;Braunschweig et al., 2000)。対照ペプチドはPR1ペプチドおよびインフルエンザB核タンパク質(aa 85-94; Flu)であり、これらは共にHLA-A2.1に対する公知の高結合親和性を有する。β2-ミクログロブリン解離を使用して測定した長期測定t1/2により、MY1〜MY5のHLAA2.1への結合が確認された(Molldrem et al., 1996)。
【０３６８】
実施例13
ペプチドに対する一次CTL応答の誘導
上記で考察した5つのMPOペプチドを使用して、ペプチドコーティング標的に特異的なT細胞を刺激した。HLA-A2.1にヘテロ接合性の正常な健常ドナー由来のPBMCを、ペプチドパルスT2細胞で刺激した。他は、ペプチド特異的CTLの生成のための抗原提示細胞としてT2細胞株を使用した。簡単に述べれば、T2細胞（同時刺激分子B7.1を同時発現する）を、ぺニシン/ストレプトマイシンおよびグルタミン（CM）を補足した無血清RPMI培養培地で3回洗浄し、0.2〜200μg/mLの濃度範囲のペプチドとCM中にて2時間インキュベートした。次いで、ペプチド負荷T2細胞を、7500cGyで照射し、1回洗浄し、1:1の比の新たに単離したPBMCと共に10％ヒト血清(HS)(Sigma, St. Louis, MO)を補足したCM中に懸濁した。培養7日後、第2の刺激を行い、翌日に、60IU/mLの組換えヒトインターロイキン-2(rhIL2)(Biosource International, Camarillo, CA)を添加した。培養14日後、第3の刺激を行い、その後15日目にrhIL-2を添加した。21日目に第4の刺激を行い、その後22日目にrhIL-2を添加した。全部で27日間の培養後、ペプチド刺激T細胞を採取し、カルセインAM標識T2細胞、白血病細胞株、および新鮮なヒト白血病細胞に対するペプチド特異的細胞毒性について試験した。図35および図36は、種々のエフェクター：標的（E:T）比で2.0μg/mLのMY2もしくはMY4のいずれかで負荷したT2細胞またはペプチドを付加しないT2細胞に対するCTL株のペプチド特異的溶解を示す。異なるドナーおよび異なるペプチド濃度を使用して試験すること以外は、MY1、MY3、またはMY5ペプチドを使用してペプチド特異的CTL株を誘発することができなかった。MY2ペプチドに対して生成されたCTL株は、MY2負荷標的細胞に対する高特異性溶解が証明されるのに対して、MY4に対して生成されたCTL株はMY2負荷標的に対していかなる有意な細胞毒性も示さなかった（Molldrem et al., 1996）。MY4に対して生成されたCTLを使用した逆の実験を同時に試験した。HTLV-1 tax(aa 11-19)（HLAA2.1に対して高結合親和性を有する無関係のペプチド）で負荷したT2細胞に対する細胞毒性も測定し、MY2またはMY4のいずれかに特異的なCTLによって50:1のE:T比で20％未満の特異的溶解が得られた。より高い濃度またはより低い濃度のMY2またはMY4のいずれかで毎週刺激したCTLは、培養終了時にペプチドコーティングT2標的の特異的溶解によって測定したところ、4〜6週間で短期CTL株を産生しなかった。2. 0μg/mlのペプチドで刺激したCTLのみが、有効な短期CTL株を産生した。この所見は、CTLを誘発するために研究で使用された10人の健常HLA-A2.1+ドナーPBMCによって再現可能であった。この現象は、他の自己ペプチドに対して誘発されたCTLで前に示されていた。
【０３６９】
実施例14
HLA-A2.1制限CTL応答
MY2またはMY4に対するCTL応答がHLA-A2.1分子を発現する標的細胞に特異的であるかどうかをさらに証明するために、2.0μg/mLのMY2またはMY4で負荷しているか負荷していないT2細胞を調製した。各ペプチドに対して生成されたCTL株を使用して、特異的溶解についても試験した。HLA-A2.1に対するマウスモノクローナル抗体(BB7.2)を使用して、CTL株によるHLA-A2.1制限認識を遮断した。ペプチドを含まないが抗体が存在するT2細胞を使用して、任意の潜在的な非特異的抗体媒介細胞毒性を制御した。
【０３７０】
図37は、HLA-A2.1に対する抗体を付加して特異的溶解が遮断されることを証明した。さらに、抗体のみの存在下ではT2細胞のバックグラウンド溶解のみが存在した。図37に示すデータは、3つの個別に生成したCTL株を使用した、3つの個別の実験由来の結果の組み合わせである。これは、認められた細胞毒性がHLA-A2.1制限されていることを証明した。
【０３７１】
実施例15
PR1特異的CTLはヒト骨髄性白血病細胞を優先的に溶解する
次に、MY2およびMY4特異的CTL株がHLA-A2.1陽性個体由来の同種ヒト骨髄性白血病細胞を溶解することができるかどうかを決定した。標的は、移植前HLA-A2.1陽性AML患者由来のBM細胞であった。対照として、HLA-A2.1陰性AML患者由来のBM細胞、HLA-A2.1陽性健常ドナー由来のBM、および低レベルのMPOを発現する2つの細胞株を使用した： HLA-A2.1トランスフェクトK562細胞およびHLA-A2.1を欠き、それによってHLA-A2.1制限様式でペプチドを提示することができないU937細胞。
【０３７２】
図35は、3つのMY4特異的CTL株由来の3つの別個の実験の結果の組み合わせを示す。健常HLA-A2.1陽性ドナー、HLA-A2.1陽性AML患者、HLA-A2.1陰性AML患者由来のBMまたは外因的に2.0μg/mLのMY4ペプチドを添加したT2細胞のいずれかの種々のE:T比でのMY4特異的CTLによる特異的溶解を示す。MY4特異的CTLによるU937およびHLA-A2.1陽性K562細胞の特異的溶解は、ペプチドを添加しないT2細胞に対して認められたバックグラウンド溶解より低い。結果は、MY4ペプチドで誘発したCTLによってAML細胞を特異的に死滅させるが正常細胞を死滅させないMY4およびHLA-A2.1特異性両方を有する短期CTL株が得られることを示す。
【０３７３】
対照的に、図36は、異なるMY2特異的CTL株を使用した3つの実験由来の典型的な細胞毒性の結果を示す。HLA-A2.1陽性AMLを有する患者由来の骨髄細胞は、たった5:1のE:T比で容易に溶解された。しかしながら、HLA-A2.1陽性正常健常ドナーから採取した骨髄細胞はまた、HLA-A2.1陽性AML細胞と類似の有意な溶解（20:1のE:T比で43％溶解）を示した。
【０３７４】
実施例16 
白血病細胞のMY2-およびMY4特異的CTL溶解は、異常なMPO発現に関連する
全標的細胞を、細胞質MPOの存在についてアッセイした。Ortho PermeaFix (Ortho Diagnostics, Raritan, NJ)を使用した細胞膜の透過処理後、MPOに対するFITC標識抗体 (Accurate Chemicals, Westbury, NY)およびCD34に対するPE標識抗体(Becton-Dickinson, San Jose, CA)を使用した染色およびその後のフローサイトメトリーを行った。
【０３７５】
表15は、MPOに陽性染色されたサンプル集団中の細胞の比率および細胞内MPO染色の蛍光強度の中央値を列挙する。同一の標的細胞集団における表面MHCクラスIおよびCD80（同時刺激分子B7.1）を発現する細胞の比率もFITC標識抗体での染色によって評価した。これらの実験は、インビトロで骨髄性白血病細胞に対して細胞毒性を示す正常HLA-A2. 1陽性ドナーからMY2およびMY4自己ペプチドに特異的なCTLを誘発することが可能であることを示す。さらに、細胞毒性の程度は、異常なMPO発現に関連した。しかしながら、MY2特異的CTLはまた、正常ドナーの骨髄細胞の特異的溶解を示し、インビボでこのペプチドに対して誘発された免疫によって白血病細胞と正常骨髄前駆体細胞とを区別することができない自己免疫を生じることが示唆される。最後に、CTLを短期アッセイにおいて白血病患者由来の全骨髄に対して試験したため、MPOを異常に発現し得ない白血病前駆細胞がCTL認識を回避することが可能であった。したがって、AMLコロニー形成アッセイにおいてMY4特異的CTLによって白血病前駆細胞を消失させることができるかどうかを調査した。白血病および正常CD34+細胞中のMPO発現も決定した。
【０３７６】
（表１５）細胞毒性実験で使用した標的細胞の細胞質MPO発現および表面表現型
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＊指定の細胞毒性実験の標的；MPO＝脊髄過酸化酵素；MFI＝蛍光強度の中央値
【０３７７】
実施例17 
MY4特異的CTLはAMLコロニー形成単位を優先的に阻害する
HLA-A2.1にホモ接合性の2人の正常な健常ドナー由来のPBMCを、前記方法を使用してペプチドパルスT2細胞で刺激した。図38は、13日目のMY4ペプチドパルス培養物由来のCTL（CTL1）を使用したコロニー阻害アッセイの結果を示す。患者P1(M2-AML)およびP2(M4-AML)由来のCFU-GMは、それぞれ63％(p=0.006)および34％(p=0.007)阻害を示した。対照的に、P1およびP2の対応するHLAが同一の骨髄ドナー由来の正常骨髄（D1およびD2）由来のCFUGMの阻害は認められなかった。同一の実験条件下でメチルセルロース中に5×105細胞/mlにて単独でプレートしたコントロールCTL1は、16日目までにCFU-GMを示さなかった。
【０３７８】
実施例18 
MPOは白血病CD34+細胞中で発現する-発現は造血細胞に限定される
次に、初期CD34陽性CML細胞中でMPOが発現することを確認した。CPのCML患者、AML患者および比較のための正常ドナー由来のG-CSF動員末梢血単核球由来の正常CD34細胞から骨髄を得た。細胞を最初にPE抱合抗CD34抗体(Becton Dickinson, San Jose, CA)で標識し、その後MPOについて細胞質染色を行った。
【０３７９】
図39は、19％のCML細胞がCD34陽性であり、これらの細胞の16％がPr3を高度に発現した。さらに、CD34陰性細胞もMPOを発現した。対照的に、正常なCD34陽性細胞はMPOを発現しなかった。別のAML患者由来の細胞では、57％のAML細胞がCD34陽性であり、これら細胞の5％がMPOを高度に発現した。これは、非常に初期の前駆細胞がMPOを過剰発現するのに対して、正常な前駆細胞はMPOを発現しないことを示す。
【０３８０】
MPO発現が造血細胞に限定されることを確認するために、MPO RNA発現のためのヒト組織のパネルをRT-PCRを使用して分析した。各組織サンプル由来のRNAの単離および逆転写後、30サイクルのPCRを使用してcDNAを増幅した。第3および第4のコード領域に及ぶ領域を増幅するプライマー（結合位は613位）
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を選択し、これを使用してPCR産物を生成し、2％アガロースゲルで分離した。ゲルBioRad分析器で画像化し、GelDocソフトウェアを使用して産物を定量した。図40は、MPOの発現が骨髄に限定されることを示す。
【０３８１】
実施例19 
ペプチドHLA-A2 四量体を使用して非骨髄機能根絶幹細胞移植レシピエントの末梢血で同定されたMY4特異的CTL
MY2およびMY4の両方に対するCTL株を正常ドナーから誘発してAMLを死滅させることができるため、次に、AML患者の末梢血中でこれらのCTLを検出可能であるかどうかを評価した。MY4に特異性を有するCTLと対照的に、MY2特異的CTLは白血病および健常な骨髄細胞の両方を溶解し、抗白血病免疫に加えて自己免疫を媒介し得るため、多数の循環MY2特異的CTLを見出す見込みがないことが示唆される。HLA-A2.1制限白血病関連抗原(LAA)として同様に推定されるペプチドPR1を同定するためのペプチド/HLAA2四量体を使用した以前の首尾の良い方法(Molldrem et al., 2000)により、この同一の方法を使用して、MY2およびMY4も潜在的なLAAsであるかどうかを決定することができるということが強く主張された。
【０３８２】
ペプチド/MHC四量体は、他で詳細に記載されている(Molldrem et al., 2000)。簡単に述べれば、BirA依存性ビオチン化のための15アミノ酸基質ペプチド(BSP)を、HLA A2のCOOH末端上で操作した。A2 BSP融合タンパク質およびヒトβ2ミクログロブリン（β2M）を大腸菌中で発現させ、インビトロで特定のペプチドリガンドを使用して折り畳んだ。適切に折り畳まれたMHCペプチド複合体を、FPLCおよび陰イオン交換を使用して十分に精製し、BirA酵素(Avidity, Denver, CO)を使用してBSP内の単一のリジン上でビオチン化した。ビオチン化MHCペプチド複合体とフィコエリトリン（PE）抱合ニュートラアビジン(Molecular Probes)またはPE(Cy7)抱合ニュートラアビジンとの4:1のモル比での混合によって四量体を生成した。MY2およびMY4四量体を、各ペプチドに特異的なCTL株に対する染色によって立証した。CMV免疫個体由来のPBMCでの染色によってCMV四量体を立証した。無関係のCTLの染色の欠如によって特異性を証明した。正常な対照由来のPBMCへの陽性CTLの適定により、検出限度がCD8+細胞の0.01％であることが確証された。各四量体試薬を個別に適定し、至適濃度（一般に、20μg/ml〜50μg/ml）で使用した。
【０３８３】
同種NST前および移植60日後に再発した9人のHLA-A2.1陽性AML患者を、ペプチド/MHC四量体を使用して試験した。全患者は、移植前にCMV免疫患者であるため、pp65/HLA-A2.1四量体は、抗原特異的免疫の証拠のための陽性対照として役立つ。利用可能なサンプル量が制限されるため、染色方法を、PBMCサンプルを同時に染色するための2つまたはそれ以上の異なる四量体を使用するように修正した。
【０３８４】
死滅白血病に加えてHLA-A2+正常BMCの45％特異的溶解を示したMY2-CTLと対照的に、MY4-CTLは、正常なBMCを溶解せずに死滅した白血病細胞のみを溶解し、MY4はより生物学的に関連する白血病抗原であり得ることが示唆される。多数の循環MY2-CTLは見出されなかったが、MY4-CTLは白血病患者で検出することができると予想された。9人のHLA-A2 AML患者においてNSTから60日後に得られた血液サンプル由来のCTLを、6つのHLA-A2四量体とMoFloサイトメーター(Cytomation, Fort Collins, CO）を使用したマルチパラメーターフローサイトメトリーとの組み合わせを使用して研究した。A2四量体を、ペプチドPR1、MY2、MY4、CMV pp65ペプチド、ならびに副抗原HA-1R (陰性対照)(den Haan et al., 1998)およびHA-1H(CTL応答が示された対立遺伝子)(den Haan et al., 1995; den Haan et al.,1998 ; Marijt et al., 1995)を使用して構築した。全患者は、研究時のDNAマイクロサテライト分析によってドナーキメラ現象の証拠を示し、全て血清陽性であった。
【０３８５】
図41は、多四量体染色は0.1％の感度の喪失に関連することを示すが、単一四量体染色と比較した場合、抗原特異的CTLの比率は保存された。図42に示すように、HLA-A2.1陽性健常ドナーおよびリンパ由来腫瘍（多発性骨髄腫および慢性リンパ球性白血病）患者由来のPBMCの染色は、骨髄特異的抗原に対する検出可能なCTL免疫が存在しないことを示した。しかしながら、図43に示すように、PR1-CTLおよびMY4-CTLはこれらの患者の末梢血中で検出されるが、MY2-CTLは検出されない(細胞適定実験における感度の限界は0.01％である)。この図は、NSTから60日後に得られ、多四量体法およびCD8を使用して染色し、CellQuestソフトウェアを使用して分析した代表的な患者の末梢血サンプルを示す。
【０３８６】
次に、全部で9人のHLA-A2+NSTレシピエントを、移植60日後に6人の各患者に対する免疫について試験した。図44にまとめたように、再発速度の比較により、再発に向かう患者（中央値1.55％）に対して1年間寛解し続けた患者（中央値2.45％）でPR1-CTLの比率がより高かった（p=0.03）。寛解している患者でMY4-およびHA-1H-CTLの両方の比率がより高くなる傾向があるにもかかわらず、統計的有意性には到達しなかった。研究したいかなる患者においてもMY2-CTLは同定されなかった。グレードII以上の球性GvHDまたは
慢性GvHDの発症は、研究したいかなるペプチド特異的CTLの比率と相関しなかったにもかかわらず、GvHDを有意に発症した患者のHA-1-CTL数はより多くなる傾向があった。重要には、これらの予備実験により(1)NSTレシピエントに対するPRl特異的CTL免疫の重要性が増大し、(2)NSTレシピエントいおけるMY4特異的CTL免疫の予想される関連性が強調され、(3)抗白血病応答の一部としてのMY2特異的CTL免疫が生物学的に関連する可能性が減少した。
【０３８７】
これは、GVL効果における白血病関連抗原の相対的重要性を決定するために同時多四量体分析と他の表面表現型マーカーとを組み合わせるための最初の研究である。これらの結果は、MY2特異性を有するCTLが四量体染色を使用して検出限度未満であるにもかかわらずNSTでMY4-CTLおよびHA-1H-CTLが増加するため、AMLのためのNST後のGVL効果において重要であり得ることを示す。これらの結果を前の結果にも適用し、PR1-CTLはNST後のAMLの消失にも寄与し得ることが示唆される。
【０３８８】
実施例20 
選別抗原特異的CTLは白血病細胞を特異的に死滅させる
四量体選別抗原特異的CTLが機能的であることを示すために、白血球搬出法から得たドナーリンパ球（DLI）由来のPR1/HLA-A2四量体+CTLを染色し、選別し、ドナーおよびレシピエントの低温保存BMの溶解物（90％を超える芽細胞を含む）について試験した。レシピエントは、同種BMTから6ヶ月目まで寛解したが、12ヶ月目までに100％Ph+BM細胞で慢性期CMLを再発した。次いで、PBMCを試験に利用可能である場合、患者を12ヶ月目から13ヶ月目まで他の治療を行わずに全部で7×107 DLI/kg体重で治療し、18ヶ月目まで0％Ph+BM細胞で寛解した、。
【０３８９】
PR1/HLA-A2四量体での染色およびMoFloサイトメーターでの選別後、選別したPR1/HLA-A2四量体+細胞の収率は81％、純度は90％であり、選別した四量体陰性集団は検出可能なPR1/HLA-A2四量体+CTLを含まなかった。図45に示すように、選別したPR1/HLA-A2四量体陽性CTLは、非選別PBMCよりも再発時に採取したレシピエント骨髄をより溶解した。選別したPR1/HLA-A2四量体陰性CTLは非選別PBMCよりもレシピエントBMを溶解しないが、ドナーBMに対するバックグラウンド溶解よりも高かった。これは、他の白血病抗原に対する活性を有する非PRl特異的CTLを反映する可能性がある。選別 PR1/HLA-A2四量体陽性CTLまたは非選別PBMCでは、ドナーBMの溶解は最小または全くなかった。これは、PRl特異的CTLが能動的にCMLを溶解し、この患者の寛解に寄与するということの強力な証拠である(Molldrem et al., 2000)。
【０３９０】
PRl特異的CTLの白血病特異性を確認するために、レシピエント由来のPBMCを、PR1/HLA-A2四量体を使用して再度選別し、HLA不適合標的細胞の溶解について試験した。図46に示すように、PR1/HLA-A2四量体選別PBMCは、2人の無関係の患者由来のHLA-A2.1+CML細胞の溶解を示し、5:1のE:T比でのHLA-A2.1-CML細胞またはHLA-A2.1+正常ドナー骨髄細胞のいずれの溶解は示さなかった。
【０３９１】
演繹的ストラテジーを使用して同定したMY4などのペプチドに特異性を有するCTLを首尾よくクリニックに翻訳することができることを示すために、フロント不完全アジュバントおよびGM-CSFと共にワクチンとしてPR1ペプチドを使用した第I相試験を開始した。これは、これらの方法を使用して非常に有用なLAAを同定することができることをさらに証明する。
【０３９２】
ワクチンにふさわしい患者には、従来の療法が失敗したHLA-A2+CMLおよびAML患者または第2のCR（すなわち、再発リスクが高い）のAML患者が含まれた。PR1を0.25、0.5、または1.0mgにて3週間毎に3回注射した場合、6〜9人の患者でPRl特異的CTL免疫が誘発され（四量体染色による）、2患者（1 AML患者および1CML患者）で完全寛解した。AML患者は、t(15;17)転座に陽性であり、その後ワクチン接種後にPCR陰性となった。重要には、この患者の末梢血由来の拡大したPR1特異的CTLを、四量体染色によって単離し、再発したBM細胞を死滅させたが、寛解時に採取したBM細胞は死滅しなかった。この技術を、他の白血病形態、他のHLA型に適用することができ、潜在的には他の腫瘍の治療にも適用することができる。
【０３９３】
したがって、有効な白血病特異的免疫療法を開発するために、Pr3およびMPOを組織制限タンパク質として調査し、HLA-A2.1制限自己ペプチド（それぞれPr3およびMPO由来のPR1、MY4）を使用して、標的細胞中の親タンパク質の異常な発現に基づいて骨髄性白血病を優先的に攻撃するペプチド特異的CTLを誘発することができることが見出された。移植後およびインターフェロン後に治療された患者をペプチド特異的免疫について研究するために四量体を使用することにより、白血病関連抗原としてPR1が確立された。
【０３９４】
データにより、PR1およびMY4を能動および受動白血病特異的免疫の療法を刺激するための標的抗原として使用することができることが示唆された。MY4特異的CTLを、非骨髄機能根絶幹細胞移植を使用した養子免疫療法の研究で投与し、第I相臨床試験で同定された他のペプチド抗原をこのアプローチに付加する。白血病反応性CTLの産生のためにMY4抗原を使用してMY4特異的CTLをエクスビボで選択および拡大し、GVL効果を獲得してGVHDを最小にする。
【０３９５】
インビトロで白血病特異的CTL応答を誘発するために使用することができる共通のHLA対立遺伝子に制限されるミエロペルオキシダーゼ由来のペプチド抗原を同定するための演繹的ストラテジー。前記で考察されるように、PR1に加えてNSTを受けた9人のHLA-A2+AML患者において、MY4は別の新規の潜在的LAAであることが示された。しかしながら、米国国民の48％しかHLA-A2対立遺伝子を有していない。したがって、新規に同定されたペプチド抗原に基づいて任意の得られた免疫療法ストラテジーを評価するするために、HLA-A3およびHLA-B7対立遺伝子に高結合性（半減時間10超の解離）を有すると予想される各ペプチドペプチド特異的CTLを誘発することができるかどうかについて検討する。
【０３９６】
HLA-A2.1に結合すると予想される表14中の残存する5つのペプチドに対してCTL免疫を誘発することが可能であるかどうかを決定する。さらに、予想されるMPO由来のHLA-A3-およびHLA-B7制限エピトープに対するCTLを誘発することができるかどうかを決定する。HLA-A2制限ペプチドを推定するために使用される同一の方法を使用して、その各HLA対立遺伝子に高い親和性で結合すると予想されるいくつかのさらなるペプチドを同定した。これらのペプチドを、表16および表17に示す。以前に示すように、10を超える予想解離半減期を有するペプチドは、関連HLA対立遺伝子に結合する可能性が最も高い(Molldrem et al., 1996)。したがって、20種全てのA3-およびB7制限ペプチドを合成および試験する。
【０３９７】
最低純度95％で全ペプチドを合成する。ペプチドを最小量のDMSOに溶解し、溶解性に留意する。各HLA-A2.1制限ペプチドの結合を、野生型T2細胞を使用し、間接的蛍光およびフローサイトメトリーによるHLA-A2の決定方法を使用して行った。BB7.2ハイブリドーマ(ATCC)を使用して相対蛍光を得て、公知の結合特性を有するペプチド（PR1およびpp65）と比較する。
【０３９８】
（表１６）HLA-A3に結合すると予想されるMPOペプチド、HLA-A3開始ペプチド（aa）、サブシーケンス、残基解離半減期
2007504149.tif 000028
【０３９９】
表16および17の残存するペプチドもHLAに結合するかどうかを決定するために、HLA-A3+およびHLA-B7+正常ドナー由来のEBV形質転換B細胞由来のHLA-A3およびHLA-B7対立遺伝子を最初にクローン化した。これらの遺伝子を、HLA-A2.1四量体を構築するために使用したBirA含有カセットに挿入し、これらを使用し、各対立遺伝子に対して高結合親和性を有するペプチドを使用してHLA-A3およびHLA-B7四量体を折り畳んだ。新規に同定されたペプチドで折り畳まれた四量体を、患者が循環ペプチド特異的CTLの証拠を有するかどうかを試験するための試薬として使用する。
【０４００】
インビトロで健常ドナーか生成したペプチド特異的溶解を示すペプチド特異的CTL株を、四量体の特異性を確認するための「試薬」として使用する。A3およびB7対立遺伝子も、CMVプロモーター(Clonetech)を含む哺乳動物ベクターにクローン化した。エレクトロポレーションを使用して、これらのベクターでT2細胞に形質導入する。次いで、形質導入されたT2細胞を、1ヶ月まで拡大し、安定化したA3およびB7結合ペプチドの添加後にA3またはB7表面発現の増加に基づいてMoFlo高速細胞選別器を使用して選別精製する。
【０４０１】
得られたT2細胞を使用して、表16および17由来の推定ペプチドがA3およびB7特異的モノクローナル抗体(Immunotech andPharmingen)の使用および表面発現の測定によってA3およびB7に結合するかどうかを決定することができる。これらの結合の結果を、インフルエンザマトリクスおよびCMV pp65由来ペプチドなどのA3およびB7に対する公知の結合親和性を有するペプチドと比較する。HLA対立遺伝子に対するこれらのペプチドの相対結合親和性を、各ペプチドの連続希釈およびフローサイトメトリーによる表面HLA発現についての分析後のPR1との比較によって決定する。この方法では、各ペプチドについてのIC50値を決定する。
【０４０２】
PR1について記載した方法および試験した最初の5つのMPOペプチドを使用して、得られたペプチド誘発CTL株を、ペプチドコーティングT2細胞、新たな白血球細胞、ならびにU937およびK562などの確立された白血病細胞を死滅させる能力について特徴づける。HLA制限を、関連対立遺伝子を含まない標的を使用し、かつ関連対立遺伝子に特異的な抗体を使用した遮断実験によって確認した。標的細胞死滅量を、標準的な4時間アッセイ(Molldrem et al., 1996; Hensel et al., 1999)を使用して決定し、白血病細胞および健常ドナーBM細胞の標的抗原発現および表面表現型と相関させる。
【０４０３】
（表１７）HLA-B7に結合すると予想されるMPOペプチド、HLA-B7開始ペプチド（aa）、サブシーケンス、残基解離半減期
2007504149.tif 000029
【０４０４】
MPO細胞内タンパク質発現を、FITC標識マウスモノクローナル抗体を使用したMPOタンパク質の直接細胞内FACS染色を使用して決定する。この細胞内株を、CD34、CD33、CD13、CD14、CD16、およびHLA-DRなどの骨髄分化マーカーの表面抗体と比較して、どの分化段階がCTL死滅により感受性を示し得るかを決定する。MoFloサイトメーターは、同時10色分析が可能であり、前駆体の発生段階の分析が非常に容易である。BMおよびPBMCを、MPO発現および表面表現型について同時に試験し、位置（骨髄対末梢血）に基づいて表面感受性が異なるかどうかを決定する。
【０４０５】
ミエロペルオキシダーゼ由来ペプチドに特異性を有するCTLを、NSTの前後および化学療法を使用した治療の後に患者においてインビボで検出することができるかどうかの決定。MY2およびMY4の両方に対するCTLを正常ドナーおよび死滅AML細胞から誘発することができるため、次に、AML患者の末梢血中でこれらのCTLを検出することが可能であるかどうかを決定した。MY4に特異性を有するCTLと対照的に、MY2特異的CTLは白血病および健常な骨髄細胞の両方を溶解させ、抗白血病免疫に加えて自己免疫を媒介するため、多数の循環MY2特異的CTL数が見出される可能性が低いことが示唆される。HLAA2.1制限白血病関連抗原（LAA）として同様に推定されたペプチドを同定するためのペプチド/HLA-A2四量体を使用した以前の研究(Molldrem et al., 2000)により、いくつかの方法を使用してMY2およびMY4も潜在的なLAAであるかどうかを決定することができることが強く主張された。したがって、非骨髄機能根絶幹細胞移植（最初の3年間に1年あたり30回まで）を使用して治療した90人のAML患者由来のサンプル対を試験する。患者を、抗白血病免疫を誘発することが見出されている任意のペプチド抗原に加えて考察された6つのペプチドに対する免疫について試験する。これには、HLA-A3およびHLA-B7制限されたペプチドが含まれる。患者の末梢血サンプルを、移植前および移植から10日目から100日目まで続けて毎週得る。次いで、患者サンプルを、BMTクリニックにて移植後毎月1年間まで各追跡検査で試験する。PBMCサンプルを、移植前にもドナーから得る。BMを移植片として使用する場合、BM細胞をドナーおよび移植前のレシピエントから獲得し、移植から30、100、および365日後にも得る。PBMCおよびBMサンプルを低温保存する。より多数のペプチドが潜在的なLAAとして同定された場合（本明細書中で考察）、PBMCサンプルをその後の評価に使用する。いくつかのマーカー（CD3、CD4、CD8、CD16+56、CD45RA、CD45RO、CD57、CD28、CD27が含まれる）の表面発現および四量体染色についてリンパ球を試験する。
【０４０６】
研究時の最大数の四量体+細胞を決定する。ウイルス抗原特異的CTL、HA-1特異的CTL、およびPR1特異的CTLを使用した以前の経験により、四量体+細胞の最高数は3〜4週間にわたって起こり、しばしば報告された寛解と一致する（1週間または2週間遅延し得る）ことが示唆される。さらに、他のペプチド特異的CTLのピークは、通常は1％〜10％の範囲である。研究中に生じたベースラインを超える四量体+細胞の有意な増加を検証する。この研究規模では、ピーク時の1パーセント点（以前のデータに基づいて、SD=3.5％、タイプIエラー=0.05）の平均絶対増加を確立するために85％の検出力（power）が得られる。さらに、ピークで少なくとも1％の細胞が陽性と定義された四量体陽性を示す患者集団（50％陽性の想定率下でSD+/-10％）を評価する。BM細胞の成熟点を決定可能な表面表現型マーカーと組み合わせた細胞質内染色を使用して、MPO発現についてBM細胞を研究する。CD1la、CD13、CD14、CD16、CD33、CD34、CD80、CD86、HLA-ABC、およびHLA-DRの発現を試験する。本研究におけるMY4および他のペプチドは自己抗原であるため、化学療法のみで治療したAML患者は、PR1/HLA-A2四量体を使用したCML患者の以前の研究に基づいたMY4/MHC四量体+細胞の循環数を有し得ることが可能であるが、これはありそうもない。これらのペプチドが寛解しているAML患者で検出される場合、化学療法後の免疫の回復は寛解の獲得および寛解期間に重要であることを示し得る。NST群に関して治療開始後の同一の測定点で得たサンプルと共に、血液サンプルをNSTの代わりとして化学療法を受けた10人の連続的なAML患者から得る。したがって、四量体陽性を示す患者の比率が化学療法群とNST群との間で異なるかどうかを検討する。約50％のNST患者と比較して、5％未満の化学療法患者が陽性を示すことが予想される。2つの集団を比較するカイ二乗試験は、10人の化学療法患者と90人のNST患者とを比較して、目的の相違を検出するための検出力は92％である（タイプIエラー=0.05）。循環四量体+細胞の有意性を決定するために、MY4四量体+リンパ球の存在が疾患の応答期間と関連するかどうかも評価する。NSTを開始する90人の患者の全てまたはほぼ全てが完全に寛解するか、NST療法後にこれを達成する。データ分析時に30〜40人が再発し、1年後に最後の患者を治療する。患者が検出可能な四量体+細胞を有するかどうかに基づいて、患者を2つの群に分類する。比例ハザードを仮定して、四量体の陽性状態に対する応答持続時間の関連をモデル化する。本研究は、四量体+リンパ球の検出の失敗に関連する再発リスクの3倍増（tripling）の検出力がある。さらに、分子および細胞遺伝学的方法によって決定した四量体陽性と応答期間との関連を個別に評価する。MY4-CTLが機能的であるかどうかも重要である。機能の種々の評価方法が記載されており、サイトカイン分泌、CD69上方制御、細胞増殖、および細胞毒性が含まれる。MoFloがこれらの実験を非常に容易にするため、四量体染色およびサイトカインフローサイトメトリー（CFC）を全患者に対して決定する。γ-インターフェロンおよびPECy7標識四量体に対するPE標識抗体をこれらの研究で使用する。細胞を最初に四量体およびFITC標識CD8にて37℃で10分間標識し、2μg/mlのMY4ペプチドで刺激する。サイトカインの分泌を阻害するために培養中にブレフェルジンAを添加し、6時間���に細胞を透過処理し、インターフェロンで染色する。この技術を首尾よく使用して、ワクチン後のPR1-CRL応答をモニタリングし、CFC陽性が細胞毒性と相関することが見出された。十分な数の利用可能なPBMCおよび四量体+細胞を使用した患者の選択では、四量体+集団を、MoFloを使用した高速選別によって精製する。四量体+および四量体-細胞の両方を、NSTまたは化学療法の前に低温保存した白血病標的に対する細胞毒性について試験する。MoFloが4様式同時選別が可能であるため、溶解能力を直接比較するために、MY4-CTLのペプチドコーティング標的細胞の死滅を、他のペプチド特異的CTL（すなわち、血液反応陽性患者においてはpp65）と比較する。
【０４０７】
NSTレシピエントの養子細胞免疫療法のために使用することができる健常ドナーからペプチド特異的CTLの最適な選択および拡大方法の決定。骨髄自己抗原を有するCTLが非常に低い前駆体頻度で存在する場合(Molldrem et al., 1999)、これらのCTLを拡大し、そのごこれらを養子免疫伝達免疫療法ストラテジーの一部として使用することができる。現在サイトカイン分泌に基づいた抗原特異的CTLの分離のためのいくつかの市販の方法が存在するが、これらは現在患者への使用が許可されておらず、抗原特異的CTLを分離するための最良の方法は定義されていない。同様に、短期培養条件における至適なCTL拡大方法も定義されておらず、ウシ胎児血清を使用しない大規模拡大が依然として細胞性免疫療法対する大きな障害となっている。インビトロでMY4-CTLを誘発するための2つの一般的な拡大方法を比較する。
【０４０８】
第1のアプローチでは、ペプチドパルス樹状細胞（DC）を使用して、4〜6週間にわたり毎週応答者のPBMCを刺激する。DCを成熟させるための前駆体（CD34+細胞由来造血前駆体が含まれる）について多数の潜在的供給源が存在するにもかかわらず、ドナーの白血球搬出法産物から多数をより容易に利用可能であるため、単球由来DCを選択した。実際的理由のために、この方法は、潜在的最大数のDCが得られる可能性が最も高く、自己抗原特異的CTLを低前駆体頻度で成長させる必要がある。類似の実際的理由のために、最後の48時間〜72時間の培養時に細胞成長させるために添加するTNF-αを使用するか使用しないでDCを成長させるためのインターフェロン（IFN）およびGM-CSFの使用を研究した。利点は、IFNおよびGMCSFの両方が市販されており、ヒトで広く使用されていることである。簡単に述べれば、1,000U/ml IL-4＋500U/ml GM-CSF(DC/4GMと呼ぶ)または1,000U/mlインターフェロン-α2b＋500U/ml GM-CSF(DC/IGMと呼ぶ)のいずれかの組み合わせを使用してDCを成長させた。予め低温保存していたHLA-A2+健常ドナー由来のPBMCを解凍し、洗浄し、プラスチック製のフラスコに接着し、その後上記サイトカインを添加した培地＋10％ヒト血清(HS)を添加した。T2細胞を、RPMI＋10％HS中で維持し、その後ドナーPBMCと同時培養した。7日目終了時に、DCに20μg/ml PR1ペプチドをパルスし、照射し、同一ドナー由来の新鮮なPBMCと1:2の比で合わせた。7日目に、培養物をPR1パルスDC(またはT2)で再刺激し、8日目に20U/mlのIL-2を培養物に添加した。PR1-CTL培養物をPR1コーティング標的細胞またはCML細胞を溶解する能力について試験する場合、26日目から28日目まで再刺激およびIL-2添加を毎週繰り返した。PR1-CTLを、PR1/HLA-A2四量体および抗CD8を使用して表面表現型について評価した。一般に、DC/IGMおよびT2細胞の両方がPR1-CTLを誘発した。しかしながら、T2はほぼ2倍有効であり、典型的には、4週間目までに（四量体染色によって決定したところ、バルク培養の）3％〜6％のPR1-CTLが得られ、DC/IGM ではたった0.5％〜2％のPR1-CTLしか得られなかった。T2細胞を規制を理由に臨床で使用することが困難であり得るため、別の刺激者の供給源を研究する。
【０４０９】
この手順は、本明細書およびMolldrem et al.(2003); (2002); (1999); (1998); (1997)（それぞれ参照により本明細書に組み入れられる)で詳細に考察されている。AAPC またはT2細胞を使用した抗原特異的四量体+細胞数の典型的な収率は3％〜5％PR1-CTLであるが、DC/IGMを使用した場合、たった0.3％〜2％であった。これらの所見は、MY4に適用される可能性が高いが、このペプチドを使用して全ての比較実験を繰り返す。さらに、無血清成長条件を、DC培養およびCTL培養の両方における血清代替物として10％HSおよび5％アルブミンと比較する。これにより、最も短期間に最も多数の機能的MY4-CTLが産生される条件を決定する。バルク培養再刺激時の毎週の四量体刺激を使用して、MY4-CTL数を比較し、CFCおよび細胞毒性実験を使用して細胞のエフェクター機能を比較する。
【０４１０】
さらに、バルク培養物から抗原特異的CTLを選択する2つの方法を比較する。上記のバルク培養条件によって、患者に養子免疫伝達される場合、有意なGVHDを生成しないCTLが得られると予想されるにも関わらず、バルク培養物中に残存する非特異的CTLによってGVHDを発症する可能性がある。バルク培養終了時のCTLクローニングは非常に時間がかかり、各患者において予防的に実施する必要があり、かつCTLクローンの導入によってインビボで寿命の長いCTLが得られるため(Riddell and greenberg, 1994; riddell and Greenberg, 1995a; Riddell and Greenberg, 1995b)、バルク培養物からのペプチド特異的画分の分離により純度を改善し、それによりGVHDを軽減することができると示唆される。抗原特異的CTLを分泌するための第1のアプローチでは、抗原の攻撃誘発後に抗原特異的CTLがIFNを分泌する能力に依存するMiltenyi Inc.によって開発されたサイトカイン捕捉マイクロビーズテクノロジーを使用する。これらの試薬は市販されているが、依然として臨床用に承認されていない。毎週の再刺激の4週間後に得られたMY4-CTLをMY4抗原とインキュベートし、抗CD45および抗IFNへの結合能力を有する二重特異性抗体を細胞と同時インキュベートする。次いで、マイクロビーズ（Miltenyi, Inc., Germany製）に直接連結された抗IFN抗体を有する二次抗体を使用して、バルク培養物からIFN分泌CTLを選択する。第2のアプローチでは、IFN捕捉法を、抗原特異的CTLを選択するために開発した修正ペプチド/MHC抱合ビーズ法と比較する。PR1ペプチドを使用した予備実験では、混合リンパ球のバルク培養物から抗原特異的CTLを分離するためにストレプトアビジンコーティングビーズ(Miltenyi Inc, Germany)に連結したPR1ペプチド/HLA-A2単量体の使用可能性を証明した（Molldrem et al.(2003); (2002); (1999); (1998); (1997)（それぞれ参照により本明細書に組み入れられる）も参照されたい）。抗原特異的CTLと類似の収率を得ることができるかどうかを決定するために、MY4/HLA-A2単量体を使用してこれらの研究を繰り返す。この方法を、Miltenyiによって開発された標準的なIFN捕捉法と比較する。市販のテクノロジーによって十分な純度のCTLが産生されると予想することが妥当であるにもかかわらず、このデバイスは同族ペプチド/MHCリガンドを認識する能力を有するCTLを捕捉することができない。非分泌抗原特異的CTLがインビボでより機能的な画分を維持することが必要であり得るかどうか、または、非分泌CTLがその後エフェクター機能を発現することができるようになるかどうかが不明確であるため、市販の製品を使用すると非常に少数のCTLしか選択することができない。以前の研究に示すように、単量体コーティングビーズは、バルク培養から利用可能な抗原特異的CTLを全て捕捉する可能性がある。
【０４１１】
移植を促進し、GVLを追加免疫し、GVHDを軽減するためにT細胞枯渇NST後にペプチド抗原特異的CTLを骨髄性白血病患者に養子免疫伝達することができるかどうかの決定。GVLを増強してGVHDを軽減するための全治療ストラテジーは、同種血液幹細胞の移植または骨髄移植を達成すための非根絶予備治療計画を使用し、抗原特異的CTL療法を送達させるためのプラットフォームであることである。目的は、80％を超える患者で移植される最大用量のMY4特異的CTLを決定する一方で、急性GVHDの発症を防止し（15％未満のグレード3および4の急性GVHDのベースライン率）、 GVL効果を媒介することあである。T細胞は移植を容易にすることが示されており、確立された非根絶予備治療計画を使用して拒絶を防止する必要がある。最近、非根絶予備治療計画（フルダラビンおよびメルファランが含まれる）の使用は、AMLおよび他の血液学的悪性腫瘍患者におけるHLA同一同胞またはHLA適合非関連ドナー由来の同種血液幹細胞または骨髄移植片が首尾よく移植されることを示した。このアプローチにより、高用量の骨髄機能根絶治療計画に不適格となる高齢者または共存症患者の同種移植が可能となる。急性GVHDは、罹患率および死亡率の主な原因であり、GVHDの治療は特に高齢者および衰弱した患者で不満足なままである。したがって、本研究は、MY4-CTL (および以前に決定された他の抗原特異的CTL)の富化による同種反応性細胞を減少させるためのドナー細胞の操作を使用してこの治療ストラテジーを拡大する。MY4-CTLの選択および養子免疫伝達によってこれを行う。したがって、これらの細胞は、レシピエント組織に対して反応すると予想されないが、依然として抗白血病効果を媒介することができる。最初の化学療法に応答することができないか再発後のHLA適合関連または非関連ドナーを有するAML患者を使用する。2×108 CD3+T細胞/kgの採取を目的とした血液成分分離法によってリンパ球をドナーから採取する。ドナー型末梢血単核球を、75mmフラスコ中に2×106細胞/mlでプレートし、患者のドナー由来の2×106照射ドナー由来DCで刺激する。
【０４１２】
上記で考察されるように、他の方法によって優れた結果が得られる場合、これらの方法を組み込む用に手順を修正する。本明細書中に記載のように、CTLバルク培養物を毎週再刺激する。同時培養から28日後、細胞を回収し、生細胞をFicoll勾配で単離する。培養物を、8日目およびその後毎週IL-2を20U/mLの最終濃度で処置する。全ての応答者および刺激者を、2mM L-グルタミン、100U/mLペニシリン、0.1mg/mLストレプトマイシン、25mM Hepes、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mM 非必須アミノ酸、および5×105M 2-メルカプトエタノールを含むRPMI-1640培地に懸濁する。10％の自己血清を補足する。アルブミンまたは無血清条件を置き換えることができることを示す場合、これを修正する。標準的な手順にしたがって、G-CSF投与後に幹細胞をドナーの血液から採取する。G-CSF投与に対して医学的禁忌が存在する場合、骨髄採取によって幹細胞を回収する。CD34+細胞の正の選択後に>5×106CD34+細胞/kgレシピエント体重を超えるCD34+細胞を回収するために、全部で4つまでの手順のために血液成分を分離する。最小許容数は、2×106 CD34+細胞/kgレシピエント体重である。>2×106 CD34+細胞および<1×105 T細胞/kgを含む最終組成を使用したIsolexまたはMiltenyiデバイスを使用して、細胞に対してCD34選択を行う。毎日の血液成分分離生成物を、標準的な手順にしたがって低温保存する。予備治療計画のために、患者に6、5、4、3、2日目の同時間に30分にわたりフルダラビン25mg/m2を毎日静脈内投与し、フルダラビンの完了後にメルファラン70mg/m2を3および2日目に投与する。>2×106 CD34+細胞＋MY4-CTLからなる同種造血細胞注入を0日目に行う。GVHDを発症することなく投与することができる最大用量を定義するために、第I相研究においてMY4-CTLを投与する。バルク培養終了時に四量体染色を行う。
【０４１３】
投与レベルは、1:5×107 CD8+細胞/kg;2:1×108 CD8+細胞/kg、および3:5×108 CD8+細胞/kgである。患者に移植後免疫抑制療法または成長因子を行わないが、感染防止のための標準的な支持療法を行う。前の結果に基づいて、現在の拡大技術によって2×108 CD3+T細胞/kgの回収物から十分なMY4-CTLが得られると予想される。患者を、移植から28日目、56日目、90日目、180日目、365日目、および毎年移植およびキメラ現象について評価する。キメラ現象をマイクロサテライトSTR（短縦列反復）マーカーによって評価し、末梢血に対してGeneScanソフトウェアを使用して分析し、T細胞および骨髄細胞を個別にアッセイする。移植を、90日目の50％を超えるドナー由来のT細胞の文書化（documentation）と定義する。疾患の寛解を、28日目、90日目、および180日目、ならびにその後の骨髄評価によって評価する。急性および慢性GVHDを、標準的基準によって評価する。前に実施した四量体染色および表面表現型分類のために末梢血を採取する。
【０４１４】
ドナー白血球注入の評価。GVHDが認められない場合、および抗原特異的CTLがもはや検出可能でない場合、患者を45日目に抗原特異的T細胞の注入について評価する。寛解患者およびT細胞キメラ現象の証拠（5％以上のレシピエント）はドナー細胞注入にふさわしい。同一の細胞用量を導入する。一次エンドポイントは、50％を超えるドナーT細胞および骨髄細胞の恒久的存在（白血病の非再発における）として定義される恒久的移植の達成および標準的基準を使用したグレード3急性GVHDの発症である。二次エンドポイントは、AMLの再発、非再発性の死亡および生存を含む。非同種反応性CTLは、白血病を再発しないGVHDを誘導しない移植を主張することが意図される。患者を、6人の患者のコホートで治療する。出発用量レベルは、レベル1である。所与の群の2人でGVHDを発症せずに移植が失敗した場合、確実な移植には用量が低すぎると見なし、次の患者には次のより高い用量レベルに参加させる。グレード3急性GVHDが所与の群で起こらない場合、次の患者により高い用量レベルを投与する。グレード3急性GVHDを1人の患者が発症した場合、6人のさらなる患者を所与のレベルで治療する。グレード3急性GVHDを所与のレベルで2人の患者（最大12人のうち）が発症した場合、GVHD率が過剰であると見なし、このレベルで終了する。MTDは、6人の患者のうち少なくとも5人で過剰なGVHDを発症せずに移植されるレベルである。10人のさらなる患者を、MTDで治療する。過剰な死亡または再発が起こる事象で研究を終了するための早期停止基準を確立する。最大60人の患者を3つの細胞用量レベルに割り当てる第I相試験を行う。モニタリングすべき結果は、免疫応答およびGVHDの発症であり、これらは共に移植から100日にわたり定義する。各用量群内で、目的は、免疫応答を示す患者の比率が少なくとも20％を達成しながらGVHDの比率が最大で20％を維持することである。患者の結果をモニタリングし、Bayesian法を使用して計算した停止境界と比較する。前者は、急性免疫療法のPR1ペプチドワクチン試験の結果に基づき、用量を独立していると仮定する。ワクチン試験は、全CD8+細胞の2％でピーク四量体応答を示し、受動養子免疫伝達細胞療法のプロトコールのデザインのための良好な出発推定値を提供する。停止境界を、市販のソフトウェアを使用して計算する。蓄積したデータに基づいて少なくとも20％の免疫応答率を達成する計算された確率が10％未満である場合、20％GVHD率の確率が少なくとも90％である場合、これは用量レベルを終了することを意図する。GVHD率が大きく違わない限り、初期に終了しない用量レベルのうで認められた最も高い免疫応答率を有する用量レベルを最適とする。
【０４１５】
前のデータに基づいて、自己造血タンパク質由来のペプチドに基づいた療法によって骨髄性白血病の治療が進行すると予想される。他のMPOエピトープに特異的なCTLと組み合わせたペプチド特異的養子T細胞免疫療法により、このようなアプローチの有効性を高めることができる。臨床研究でMY4-CTLの養子免疫伝達（CTLの養子免疫伝達を含む研究）に対する抗白血病免疫応答を伝達することができない場合、他のMPOまたはPr3由来のペプチドで実施することができる。さらに、HLA-A2.1トランスジェニックマウスモデルの使用により、MPOペプチド（MY4などであるが、これに限定されない）に対する寛容機構を調査することができる。さらに、MY4/HLA-A2四量体を使用して白血病反応性CTLの均質な集団を選択することができる確率により、初めてMHC障壁を通過してCTLが養子免疫伝達されて白血病を治療することができる(Toes et al., 1996)。本明細書中に開示の結果は、MY4に対する寛容の発生を示す。
【０４１６】
実施例21
サイクリンEl
他の潜在的な腫瘍関連抗原を検索するために、サイクリンEは細胞周期と独立していくつかの腫瘍細胞で構成性に発現し、サイクリンEの異常な発現は染色体の不安定性の結果として腫瘍形成に寄与するため、タンパク質のサイクリンEファミリーを調査した。サイクリンE2は、サイクリンE1のホモログであり、両タンパク質は組織分布を制限した。サイクリンE1およびE2が血液悪性腫瘍で過剰発現するかどうかを調査するために、サイクリンE1およびサイクリンE2のmRNA発現を、21人の血液悪性腫瘍患者（11人のCML(CP)、5人のCML(BC)、2人のAML、2人のALL、1人のNHL）および12人の正常ドナーにおいてRT-PCRによって最初に分析した。15人の患者および5人の正常なドナー由来のPBMCは、サイクリンE1のmRNAを発現した。β-アクチンに対して正規化されたサイクリンE1のmRNAの相対発現レベルは、正常なドナーよりも患者で高かった（p=0.0149）。サイクリンE2のmRNAは、正常ドナーのPBMC（0/12;p=0.0109）と比較して、患者のPBMCで高度に過剰発現した（10/21）。次に、サイクリンE1タンパク質発現を、ウェスタンブロッティングによって21人の血液悪性腫瘍患者のうち18人および12人の正常ドナーのうちの3人で分析した。正常ドナー由来のPBMCはサイクリンE1タンパク質を発現しないが、患者由来のPBMCは、1人のCML（CP）患者を除いて、患者由来のほぼ全てのPBMCが同一測定点でmRNAを発現しないとしてもサイクリンE1タンパク質を発現した。
【０４１７】
サイクリンE1およびサイクリンE2に由来し、HLA-A2対立遺伝子に結合すると予想される9量体ペプチドは、7位のみが異なる類似のアミノ酸配列を有する。したがって、ペプチド結合アッセイによって、CCNE1144-l52(サイクリンE1由来)およびCCNE2144-152 (サイクリンE2由来)を、PR1の結合と比較した。CCNE1144-l52およびCCNE2144-152がT2細胞表面上でHLA-A2を安定化する能力は、PR1とほぼ同一であった(FI CCNE1144-152/FI PR1=1.008、FICCNE2144-152/FI PR1=1.189)。CCNE1144-l52およびCCNE2144-152特異的CTLをインビトロで誘発することができるかどうかを決定するために、7人のHLA-A2陽性正常ドナー由来のPBMCを、ペプチドパルスT2細胞で刺激した。7人のドナーのうちの3人で、CCNE144-152刺激CTL株は、CCNEl144-152およびCCNE2144-152パルスT2細胞の両方を死滅させるが、非ペプチドパルスT2および無関係のペプチドをパルスしたT2細胞は死滅しなかった。7人の同一のドナーのうちの4人で、CCNE2l44-l52刺激CTL株はCCNE2144-152およびCCNE1144-152パルスT2細胞を死滅させるが、非ペプチドパルスT2細胞および無関係のペプチドをパルスしたT2細胞は死滅しなかった。
【０４１８】
したがって、各ペプチド特異的CTLは、HLA-A2を有する両ペプチドを認識することができるが、各ペプチドの免疫原性は個体間で異なる。さらに、CCNEl144-152パルスT2細胞を死滅させる4つのCCNE1144-152刺激CTL株はサイクリンE1タンパク質を過剰発現するHLA-A2トランスフェクトK562白血病細胞株を死滅させるが、非トランスフェクトK562白血病細胞株死滅させなかった。したがって、CCNE1144-152特異的CTLは、白血病細胞株と正常なPBMCとを区別することができる。このデータから、1)サイクリンE1/E2が血液悪性腫瘍において高度に過剰発現し、2)サイクリンE1/E2ペプチドがCTLを刺激するのに十分にHLA-A2に結合することができ、3)CCLE1114-152特異的CTLが白血病細胞株HLA-A2をそれぞれ死滅させるため、サイクリンE1/E2由来のペプチドが潜在的な腫瘍抗原であると結論づけた。
【０４１９】
本明細書中に開示され、かつ特許請求の範囲に記載されている全ての組成物および/または方法を、本開示を考慮して過度に実験することなく実施および実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して記載しているが、本発明の概念、精神、および範囲を逸脱することなく、本明細書中に記載の組成物および/または方法ならびに工程または工程の順序を変更することができることが当業者に明らかである。より詳細には、化学的および生理学的に関与する一定の薬剤に本明細書中に記載の薬剤を置換することができる一方で、同一または類似の結果が達成されることが明らかである。当業者に明らかであるこのような類似の置換物および修飾物は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲、および概念の範囲内であると見なす。
【０４２０】
XIII.引用文献
以下の引用文献は、引用文献が本明細書を補足する例示的手順または他の詳細を提供する範囲で、特に参照により本明細書に組み入れられる。
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【図面の簡単な説明】
【０４２１】
図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の一定の局面をさらに証明するために含まれる。本発明を、本明細書に記載の特定の態様の詳細な説明と組み合わせた一つまたは複数のこれらの図面の参照によってより深く理解することができる。
【０４２２】
【図１】ペプチド負荷T2細胞に対するCTLのペプチド特異的細胞毒性。50:1〜6:1のE:T比での4時間の細胞毒性アッセイにおいて、エフェクター細胞を標的細胞と共にプレートした。PR-1またはPR-2をパルスしたT2に対して惹起したCTLを、同一の各標的細胞/標的ペプチド組み合わせに対する特異的溶解について試験した。6つの複製物を、エフェクター細胞の各希釈に使用した。データを、3つの個別のCTL株を使用した3つの個別の試験からプールし、平均特異的溶解±標準偏差として示した。
【図２】PR1特異的CTLは、新鮮な骨髄性白血病細胞を優先的に溶解する。50:1〜6:1のE:T比での4時間の細胞毒性アッセイにおいて、エフェクター細胞を標的細胞と共にプレートした。6つの複製物を、エフェクター細胞の各希釈に使用した。データを、3つの個別のCTL株を使用した3つの個別の試験からプールし、平均特異的溶解±標準偏差として示した。図2Ａ-HLA-A2.1（低プロテイナーゼ3発現）をトランスフェクトしたK562細胞およびPR-1を負荷したT2細胞（陽性対照）に対する低特異的溶解を示すPR-1に特異的なCTL。U937（低プロテイナーゼ3発現、HLA-A2.1ネガティブ）およびペプチドを負荷していないT2細胞（陰性対照）に対してはバックグラウンド溶解のみが存在した。図2Ｂ-慢性期（CML-CP）、加速期（CML-AP）、急性転化（CML-BC）、および急性骨髄形成白血病（M4サブタイプ）の患者由来の骨髄細胞に対する高特異的溶解、ならびに患者P3について健常者の骨髄ドナー（D2）由来の骨髄細胞に対するバックグラウンドのみの溶解を示す。
【図３】Pr3遺伝子でトランスフェクトしたHMY-A2.1+細胞は細胞質タンパク質を発現する。HMy2.CIR-A2細胞を、Pr3含有ベクターpRTZ.2でトランスフェクトし、ゼオシンの存在下での培養で成長させた。次いで、細胞を漸増濃度のゼオシンを使用した限界希釈物中で成長させた。次いで、得られた細胞株クローン2.2およびクローン1.4およびトランスフェクトされていない親細胞株HMy2.CIR-A2を、FITC標識二次抗体での直接染色を使用したフローサイトメトリーによって細胞質Pr3発現について分析した。細胞質Pr3についての蛍光の平均チャネル（MCF）強度に対する細胞数のヒストグラムを示す。
【図４】PR1特異的CTLは、Pr3トランスフェクトHMY-A2.1+細胞を溶解する。25:1のE:T比での4時間の細胞毒性アッセイにおいて、CTLエフェクター細胞を標的細胞と共にプレートした。6つの複製物を使用し、データを平均特異的溶解±標準偏差として示す。PR-1に特異的なCTLは、Pr3でトランスフェクトHMy2.CIR-A2細胞の36％特異的溶解（クローン1.4）および急性転化の慢性骨髄形成白血病（CML-BC）患者由来の骨髄細胞（陽性対照）の73％溶解を示す。HL-60細胞（低プロテイナーゼ3発現、HLA-A2.1ネガティブ）、非Pr3トランスフェクトHMy2.CIR-A2細胞、CATトランスフェクトHMy2.CIR-A2細胞、および正常なドナー由来の骨髄細胞（陰性対照）ではバックグラウンド溶解のみが存在した。
【図５】PR1特異的CTLを、PR1四量体によって同定することができる。図5Ａ-PR1に対して誘発された17日目のCTL株を抗CD8-FITCで30分間標識し、PBSで3回洗浄し、PR1-四量体-PEで30分間標識した。次いで、細胞を、PBSで3回以上洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。2.4％のCTL株は、PR1に特異的であった。図5Ｂ-新規のショックペプチドに特異的なHLA-A2四量体は、0.2％のPR1特異的CTLを染色した。図5Ｃ-インフルエンザ核タンパク質に対して誘発された17日目のCTL株も抗CD8-FITCおよびPR1-四量体-PEで標識し、陰性対照として示す。
【図６】PR-四量体を使用して、PR1特異性を有するCTLを選別することができる。PR1に対して誘発された32日目のCTL株を、抗CD8-FITCで2時間染色し、PBSで3回洗浄し、氷上にて2時間PR1-四量体-PE抱合体で標識した。次いで、細胞を、抗CD4およびPIで3回標識し、PBSで3回洗浄し、二重染色CD8+PR1-四量体陽性細胞について選別した。FL1-HはCD8-FITCであり、FL2-HはPR1-四量体-PEである。選別後のCTL株を示す。
【図７】PR1特異性について選別したCTLは、非選別バルク培養CTLよりも白血病標的の特異的溶解が高く、バックグラウンド溶解が低い。32日目のバルク培養PR1パルスCTLを、加速期のCML（CML BM）のHLA-A2.1+患者由来の骨髄細胞または同一の正常ドナー（正常BM）由来の骨髄細胞と共にプレートしたエフェクター細胞としてのPR1-四量体選別CTLと比較した。CTLは、HLA-A2のみについて適合する非関連正常ドナーに由来した。
【図８】5つのPR3エクソンのSSCP分析。10対のドナー-レシピエント（D-R）対における各エクソン（Ex 1〜5）で得られた最良の結果をここに示す。矢印は、レシピエントに存在するがドナーに存在しないバンドを示した。
【図９】多型を含むPr3エクソン3は、HLA-A2.1に結合するペプチドをコードする。100μgのPR71、PR7V、またはコントロールインフルエンザペプチドのいずれかとのT2細胞の18時間のインキュベーション後の表面HLA-A2.1発現。アイソタイプコントロールを左端に示す。
【図１０】プロテイナーゼ3の組織発現。
【図１１】T2上のHLA-A*0201発現。低用量のPR1ペプチドは高強度でPR1/HLA-A2四量体染色されたCTLを誘導し、この誘導はTCR活性と相関し、エフェクター機能の閾値と反比例する。図11Ａ-健常なHLA-A2.1+ドナーから回収したPBMCを、各FACSプロット上に示したペプチド濃度でのPR1ペプチドパルスT2細胞で毎週刺激した。4週間後、得られた培養物を、CD8（FITC）AbおよびPR1/HLA-A2四量体で染色し、四量体で染色されたCD8+細胞の比率を、各FACSプロット内に示す。図11Ｂ-T2細胞上の表面HLA-A2発現は、2μM〜200μMのPR1ペプチド濃度の増加と共に直線的に増加する。T2細胞を示した濃度のPR1ペプチドとインキュベートし、表面HLA-A2発現をフローサイトメトリーによって測定した。図11Ｃ-0.2μM（白抜きの円）または20μM（黒塗りの円）のPR1で誘発されたCTLを、表示のペプチド濃度でPR1ペプチドパルスされたT2細胞と、10:1のエフェクター/標的（E/T）比（四量体陽性CTL数に基づいて調整）にて37℃で4時間インキュベートし、特異的溶解率を測定した。図11Ｄ-0.2μM（白抜きの円）または20μM（黒塗りの円）でそれぞれ誘発された28日齢のRP1/HLA-A2四量体染色CTLについての表示測定点での正規化抗原特異的蛍光のプロッティングによって、四量体崩壊（t1/2）は58分および19分であることが決定された。四量体の再結合を防止するための飽和濃度のBB7.2 Abの存在下およびFACSゲートから死滅細胞を排除するためのPI（1μg/ml）の存在下でのRP1/HLA-A2四量体染色の4℃での解離速度を測定した。
【図１２】低および高アビディティPR1特異的CTL培養物由来のスペクトル型（spectratyppe）。0日目および26日目のVβ2およびVβ11を示す。図12Ａ-0.2μM PR1。図12Ｂ-20μPR1。
【図１３】高アビディティPR1特異的CTLは、低アビディティRP1特異的CTLよりもCML BM細胞をより特異的に溶解する。培養4週間後、PR1刺激CTLを、4時間の微小細胞毒性アッセイにおいて骨髄細胞と同時インキュベートし、特異的溶解を測定した。エフェクター細胞の各希釈のために6つの複製物を使用した。特異的溶解を、E/T比に対してプロットし、エフェクター数を、バルク培養におけるRP1/HLA-A2四量体染色細胞数について正規化した。図13A-健常ドナー由来の高アビディティPR1特異的CTLは、低アビディティPR1特異的CTLよりも高いCML標的細胞の特異的溶解を示した。図13B-IFN治療から3ヶ月後のCML患者由来のPR1特異的CTL株は、第三者由来の健常なHLA-A2+BM細胞の診断時に採取した自己BM標的細胞を優先的に溶解し、CML標的細胞溶解量は、健常ドナー由来の低アビディティPR1特異的CTLによって産生されたCML標的細胞溶解量と類似している。
【図１４】CML患者の末梢血から低アビディティPR1特異的CTLのみが誘発される。3人の異なるHLA-A2+CML患者由来のPBMCを、0.002μM〜200μMの範囲のPR1でのPR1パルスT2細胞で毎週刺激した。4週間後、得られた培養物を、CD8 AbおよびPR1/HLA-A2四量体で染色し、FACSによって分析した。関連する四量体でのCD8+細胞の染色率を、各FACSプロット内に示す。図14Ａ-0.2μＭ、0.02μM、および0.002μMのPR1で誘発された培養物により、同用量のPR1で誘発された健常ドナー由来のCTLよりも低強度で四量体染色されたCTLが得られた。図14Ｂ-非処置慢性期CML患者（CML番号4）由来のPBMCを、PR1/HLA-A2四量体と共にPR1パルスT2細胞で再刺激する前に毎週研究した。4週間にわたり四量体染色強度が低いPR1特異的CTLのみが存在し、四量体強度が比較的高いCTLは存在しなかった。図14Ｃ-培養4週間後にpp65/HLA-A2四量体染色強度が高い0.2μM pp65ペプチド誘発CTLで毎週刺激したCML番号2由来のPBMC。
【図１５】高アビディティPR1特異的CTLは、細胞遺伝学的寛解（図15Ａ）でのIFN感受性CML患者の末梢血で同定されたが、（図15Ｂ）IFN耐性（図15Ｃ）や非処置の新規に診断されたCML患者では同定されない。PBMCを、CD8、dump（CD14+CD19）、およびPR1-HLA-A2四量体で染色した。患者5〜8を、IFNで最低9ヶ月間処置した。同時BM標本におけるPh+染色体の比率を、各FACSプロット上に示し、高アビディティPR1特異的CTLを有するCD8+細胞の比率を、各FACSプロット内に示す。
【図１６】高アビディティPR1特異的CTLは、高濃度PR1ペプチドでの刺激から18時間後にアポトーシスを受ける。0.2μMまたは20mμM PR1パルスT2細胞のいずれかでの毎週の再刺激から28日後の健常なドナー由来のPBMCは、それぞれ比較的高いおよび低いアビディティのPR1-CTLを確立した（左端のパネル）。得られたPR1-CTLを洗浄し、0.2μMまたは20μMのPR1ペプチドのいずれかでパルスしたT2細胞と四量体陽性細胞数に基づいて1:1の比で合わせた。16〜18時間後、細胞をアネキシンV Abで染色し、生細胞をPI染色に基づいて分析した。四量体陽性を示すCD8+の比率を左端のパネルに示し、アネキシンVで染色された四量体陽性細胞の比率を残りのパネルに示す。図16Ａ-アネキシンV発現は、高濃度（20μM）のPR1に曝露した高アビディティPR1-CTLで増加するが、低（0.2μM）濃度のPR1への曝露後には増加しなかった。アネキシンV下方制御は、PR1-CTLとの同時培養前の抗HLA-A2（BB7.2）でのペプチドパルスT2細胞の前処置によって遮断された。図16Ｂ-アネキシンVは、低濃度（0.2μM）または高濃度（20μM）PR1ペプチドのいずれかとの低アビディティPR1-CTLの同時培養から18時間後に上方制御されなかった。
【図１７】高アビディティPR1-CTLは、プロテイナーゼ3を過剰発現するHLA-A2+CML細胞との同時インキュベーションから18時間後にアポトーシスを受ける。高アビディティおよび低アビディティのPR1-CTLを、未処置HLA-A2+およびHLA-A2-患者由来のCML BM細胞と四量体陽性細胞数に基づいて1:1の比で合わせた。同時インキュベーションから18時間後にPI染色に基づいて肝臓細胞に対するアネキシンV染色を測定した。四量体陽性を示すCD8+の比率を左端のパネルに示し、アネキシンVで染色された四量体陽性細胞の比率を残りのパネルに示す。図17Ａ-アネキシンVは、HLA-A2+細胞との同時インキュベーション後に高アビディティPR1-CTLで上方制御されたが、HLA-A2細胞との同時インキュベーション後に上方制御されなかった。培養物中の残りの低アビディティPR1-CTLは、アネキシンVを上方制御しなかった。図17Ｂ-対照的に、低アビディティPR1-CTLは、HLA-A2+またはHLA-A2-CML BM細胞のいずれかとの同時インキュベーション後にアネキシンVを上方制御しなかった。図17Ｃ-pan-HLA-A、B、C Abでの表面染色によって測定したところ、全MHC-I発現およびプロテイナーゼ3発現は、両CML BM標的細胞で類似しなかった。図17Ｄ-プロテイナーゼ3発現は、健常なドナーBM細胞と比較して、HLA-A2+またはHLA-A2-患者のBMでそれぞれ2.8倍および3.3倍であった。
【図１８】治療を受けていないIFN感受性CML患者における高アビディティPR1-CTL。
【図１９】インターフェロンを処置されていないCCRにおけるCML患者のPR1-CTL表現型：高アビディティPR1-CTLは、エフェクター記憶表現型を有する。
【図２０】PR1ワクチンは、注射部位でPR1-CTL免疫を誘発する。
【図２１】PR1ワクチンは、免疫応答および臨床反応を誘導する。
【図２２】PR1ワクチンは、PR1-CTL免疫およびAMLを有するUPN4における分子寛解を誘導する。機能的PR1-CTL対pp65-CTLの画分は、PR1ワクチンに対して免疫応答を示すCMV+患者で類似する。
【図２３】PR1ワクチンは、6ヶ月を超えて持続する機能的PR1-CTL免疫を誘発する。UPN9：3回目のPR1（1.0mg）の6ヶ月後に治療+およびCD69/IFN+PR1-CTLについて分析したPBMC。
【図２４】AML t(15;17)を有するUPN4患者では、PR1-CTLのワクチン誘導拡大後の長期分子寛解を試験し（図24A）、ワクチン誘導PR1-CTLは白血病細胞を優先的に死滅させることが示された（図24）。
【図２５】PR1ワクチンは、inv(16)AMLを有するUPN15患者において分子寛解を誘導する。
【図２６】臨床反応は、PR1-CTLの免疫応答およびより高いT細胞受容体アビディティに相関する。データは、免疫応答を示さない7人の患者における0の臨床反応に対する免疫応答を示す8人の患者における5つの臨床反応を示す。P=0.02。
【図２７】高アビディティPR1-CTLはワクチン接種後に優先的に喪失され、残りの低アビディティPR1-CTLはUPN6患者において自己白血病細胞を死滅させる。図27A-患者6（UPN6）由来のサンプルを使用して、抗原特異的CTL率を評価した。図27B-ワクチン前およびワクチン後。図27C-PR1/A2四量体選別CTLはペプチド特異的である。図27D-四量体選別PR1-CTLはCMLを優先的に死滅させる。
【図２８】高親和性PR1-CTLは、ワクチン接種後にUPN6に存在しない。UPN6（CML）およびUPN4（AML）患者のサンプルを、200μMおよび0.2μMのPR1から30日後に比較する。高PR1-CTLアビディティは、UPN4患者で拡大されたがUPN6I患者では拡大されないことが見出された。
【図２９】60日目のPR1-CTL免疫は、AMLのためのNSTから1年後の寛解に相関する。
【図３０】CTLを誘発するための種々のAPC集団の効率。PR1パルスT2 DC/IGMまたはDC/4GM抗原提示細胞で誘発したCTL培養物の細胞数比較。
【図３１】種々のAPCで誘発したPR1-CTLの細胞毒性比較。DC/IGM（図31Ａ）またはDC/4GM（図31Ｂ）抗原提示細胞におけるT2＋PR1に対するT2のみについての特異的溶解率を示す。
【図３２】CTL刺激に対するDC成長条件の比較。種々の条件下で自己DC/IGMで刺激したPR1-CTL株の細胞増殖を示す。
【図３３】IFN誘導P3発現は、PR1-CTL応答およびIFNに対するCCRと相関する。
【図３４】5つのMPO推定ペプチドはHLA-A2.1に結合する。
【図３５】MY2特異的CTLは、白血病細胞を死滅させ、健常ドナーの骨髄細胞も死滅させる。
【図３６】MY4特異的CTLは、AML骨髄細胞を優先的に死滅させるが、健常骨髄細胞は死滅させない。
【図３７】MY4パルスT2細胞のMY4特異的CTL溶解は、HLA-A2制限される。
【図３８】MY4-CTLは、白血病前駆体を阻害する。
【図３９】MPOタンパク質は、CD34+白血病細胞中に存在するが、正常なCD34+細胞中に存在しない。
【図４０】ミエロペルオキシダーゼの組織発現。
【図４１】複数のペプチド/HLA-A2四量体を使用して1つの患者サンプルを同時に染色することができる。
【図４２】PR1-CTL、MY2-CTL、およびMY4-CTLは、健常ドナーまたはリンパ性悪性疾患を罹患したNSTレシピエント中に存在する。
【図４３】完全に寛解した骨髄非破壊的幹細胞移植（NST）レシピエントでPR1-CTLおよびMY4-CTLは検出可能であるが、MY2-CTLは検出不可能である。
【図４４】PR1-TL、MY4-CTL、およびHA1-CTLの比率は全て寛解状態と相関する。
【図４５】PR1-CTLは、白血病を死滅させるが、正常な骨髄は死滅させない。
【図４６】標的のPR1-CTL 溶解は、HLA-A2制限される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2007504149.tif 000059
【図１６】
2007504149.tif 000060
【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2007504149.tif 000069
【図２３】
2007504149.tif 000070
【図２４】
2007504149.tif 000071
【図２５】
2007504149.tif 000072
【図２６】
2007504149.tif 000073
【図２７Ａ】
2007504149.tif 000074
【図２７Ｂ】
2007504149.tif 000075
【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２８】
2007504149.tif 000078
【図２９】
2007504149.tif 000079
【図３０】
2007504149.tif 000080
【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
2007504149.tif 000085
【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
2007504149.tif 000090
【図４１】
2007504149.tif 000091
【図４２】
2007504149.tif 000092
【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年8月1日(2006.8.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
本出願は、2003年8月26日提出の米国特許仮出願第60/498,238号（その全内容が参照により本明細書に組み入れられる）の優先権の恩典を主張する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2007504149.tif 000111