(57)【要約】  本発明は、レトロウイルス核粒子に会合した、天然の機能性prM及びEエンベロープ糖タンパク質を含むフラビウイルス偽-粒子の世代、及び使用に関する。これらの粒子は、高感染性を有し、操作がカテゴリー3又は4研究室を必要としないフラビウイルスビリオンの有効なモデルを構築する。
2007527205.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
−パッケージング・コンピテントレトロウイルス-由来ゲノムを含む第一核酸配列を提供すること；
−前記レトロウイルスから核タンパク質をコードするcDNAを含む第二核酸配列を提供すること；
−フラビウイルス核タンパク質、及びフラビウイルスprMタンパク質及び/又はフラビウイルスEタンパク質を連続的に含むポリタンパク質をコードするcDNAを含む第三核酸配列を提供すること；
−前記核酸配列で宿主細胞をトランスフェクトし、次いで、cDNAの発現によりフラビウイルス及びレトロウイルスから構造タンパク質を産生させるために十分な時間、当該トランスフェクトされた細胞を培養中に維持すること；並びに
−当該構造タンパク質をウイルス-様粒子に形成すること
を含む、フラビウイルス-様粒子のex vivo製造方法。
【請求項２】
前記パッケージング・コンピテントレトロウイルス-由来ゲノム及び核タンパク質が、MLV、ALV、RSV、MPMV、HIV-1、HIV-2、SIV、EIAV、CAEV又はHFVからなる群より選ばれるレトロウイルス由来である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記フラビウイルス核タンパク質が、核タンパク質シグナルペプチドを含むフラビウイルス核のカルボキシ-末端である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記ポリタンパク質が、フラビウイルス核タンパク質及びフラビウイルスprMタンパク質を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記ポリタンパク質が、フラビウイルス核タンパク質及びフラビウイルスEタンパク質を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
天然フラビウイルスprM及び/又はEタンパク質を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記ポリタンパク質が、フラビウイルス核タンパク質、天然フラビウイルスprMタンパク質及び天然フラビウイルスEタンパク質を含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記核、prM及びEフラビウイルスタンパク質が、同一のフラビウイルス由来である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記フラビウイルスが、西ナイルウイルス、デング熱ウイルス及び黄熱病ウイルスからなる群より選ばれる、請求頁１〜８のいずれか１項記載の方法。 
【請求項１０】
パッケージング・コンピテントレトロウイルス-由来ゲノムを含む前記核酸配列が、導入遺伝子を更に含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
レトロウイルス由来の核タンパク質、及びフラビウイルスprM糖タンパク質及び/又はフラビウイルスEタンパク質を含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法によって取得できる感染性フラビウイルス-様粒子。
【請求項１２】
prM及びEフラビウイルス糖タンパク質を含む、請求項１１記載の感染性粒子。
【請求項１３】
prMフラビウイルス糖タンパク質を含む、請求項１１記載の感染性粒子。
【請求項１４】
Eフラビウイルス糖タンパク質を含む、請求項１１記載の感染性粒子。
【請求項１５】
天然prM及び/又はEフラビウイルス糖タンパク質を含む、請求項１１〜１４のいずれか１項記載の感染性粒子。
【請求項１６】
前記レトロウイルスが、MLV、ALV、RSV、MPMV、HIV-1、HIV-2、SIV、EIAV、CAEV又はＨＦＶからなる群より選ばれる、請求項１１〜１５のいずれか１項記載の感染性粒子。
【請求項１７】
前記フラビウイルスが、西ナイルウイルス、デング熱ウイルス及び黄熱病ウイルスからなる群より選ばれる、請求頁１１〜１６のいずれか１項記載の感染性粒子。
【請求項１８】
パッケージング・コンピテントレトロウイルス-由来ゲノムを含む前記核酸配列が、導入遺伝子を更に含む、請求項１１〜１７のいずれか１項記載の感染性粒子。
【請求項１９】
フラビウイルス感染症に対するワクチンとして有用な医薬の製造のための3種の核酸配列の使用であって、当該核酸配列が
−パッケージング・コンピテントレトロウイルス-由来ゲノムを含む第一核酸配列；
−前記レトロウイルス由来の核タンパク質をコードするcDNAを含む第二核酸配列；
−フラビウイルス核タンパク質、及びフラビウイルスprM及び/又はフラビウイルスEタンパク質を連続的に含むポリタンパク質をコードするcDNAを含む第三塩核酸配列；並びに
−対象の細胞に導入される場合には、フラビウイルス及びレトロウイルス由来の構造タンパク質の製造を可能にする核酸配列、ここで、当該構造タンパク質は免疫原性であるウイルス-様粒子を形成する、
である、前記使用。
【請求項２０】
請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の感染性粒子の結合を検出することを含む、フラビウイルスprM及び/又はE糖タンパク質に対する受容体のex vivo同定方法。
【請求項２１】
次のステップ：
−フラビウイルスの受容体である可能性が高いタンパク質をコードする核酸配列によって、フラビウイルス感染を許容しない細胞をトランスフェクトすること、
−当該形質転換細胞を、請求項１１〜１８のいずれか１項記載のフラビウイルス-様粒子と接触させること；
−当該形質転換細胞がフラビウイルス感染を許容するようになったか否かを決定すること；及び
−許容するようになった当該形質転換細胞によって発現される当該タンパク質を、フラビウイルスに対する細胞受容体として同定すること
を含む、フラビウイルスに対する細胞受容体のex vivo同定方法。
【請求項２２】
次のステップ：
−フラビウイルス感染許容細胞から取得される発現cDNAライブラリーを提供すること；
−当該発現cDNAライブラリーによって、フラビウイルス感染を許容しない細胞をトランスフェクトすること；
−当該形質転換細胞を、請求項１１〜１７のいずれか１項記載のフラビウイルス-様粒子と接触させること；
−フラビウイルス感染を許容するようになった当該形質転換細胞を同定及び単離すること；
−許容するようになった細胞中でトランスフェクトされた当該発現ベクターを単離すること；及び
−当該単離発現ベクターのcDNA配列によってコードされるタンパク質を、フラビウイルスに対する受容体として同定すること
を含む、フラビウイルスに対する細胞受容体のex vivo同定方法。
【請求項２３】
候補分子の存在又は非存在下で、請求項１１〜１７のいずれか１項記載の感染性粒子による細胞感染レベルの比較を含む、細胞におけるフラビウイルス進入を妨害することができる分子のex vivoスクリーニング又は同定方法。
【請求項２４】
患者の生物試料中に存在するらしい抗-フラビウイルス抗体と、請求項１１〜１７のいずれか１項記載のフラビウイルス-様粒子との相互作用によって形成される免疫複合体を検出することを含む、当該患者のフラビウイルス感染症のin vitro診断方法。
【請求項２５】
請求項１１〜１７のいずれか１項記載のフラビウイルス-様粒子による許容細胞の感染に対する、患者の生物試料中に存在するらしい抗-フラビウイルス抗体の阻害効果を検出することを含む、当該患者のフラビウイルス感染症のin vitro診断方法。
【請求項２６】
請求項１１〜１７のいずれか１項記載のフラビウイルス-様粒子及び当前記免疫複合体の好適な検出手段を含む、請求項２５記載の方法に有用な診断キット。
【請求項２７】
請求項１１〜１８のいずれか１項記載のフラビウイルス-様粒子及び薬学的に許容される担体を含む、ワクチン組成物。
【請求項２８】
請求項１１〜１７のいずれか１項記載のフラビウイルス-様粒子で細胞を感染させることを含む、標的細胞における対象導入遺伝子のin vitro導入方法であって、ここで当該フラビウイルス-様粒子は対象導入遺伝子を運ぶ、前記方法。
【請求項２９】
患者の疾患の予防又は治療医薬の製造のための、対象導入遺伝子を運ぶ請求項１１〜１７のいずれか１項記載のフラビウイルス-様粒子の使用であって、ここで当該フラビウイルス-様粒子は、当該患者の細胞に対象導入遺伝子を導入させることができ、当該疾患に対する予防的又は治療的効果を有する産物をコードする、前記使用。
【請求項３０】
−パッケージング・コンピテントレトロウイルス-由来ゲノムを含む第一核酸配列；
−当該レトトウイルス由来の核タンパク質をコードするcDNAを含む第二核酸配列；及び
−フラビウイルス核タンパク質、及びフラビウイルスprMタンパク質及び/又はフラビウイルスEタンパク質を連続的に含むポリタンパク質をコードするcDNAを含む第三核酸配列
を含む形質転換宿主細胞。
【請求項３１】
候補分子の存在又は非存在下、請求項３０で定義された形質転換細胞の、標的宿主細胞に対する比融合レベルの較を含む、細胞におけるフラビウイル進入を妨害することができる分子のex vivoスクリーニング又は同定方法。
【請求項３２】
次のステップ：
−シンシチウム形成、すなわち細胞-細胞融合を可能にする条件、及び任意の候補分子の非存在下での標的宿主細胞においてフラビウイルス-様粒子進入を可能にする条件で、候補分子の存在又は非存在下に、形質転換宿主細胞を標的宿主細胞と共-培養すること；
−前記候補分子の非存在及び存在下でシンシチウム形成を評価すること；
−前記候補分子の存在下で測定されたシンシウム形成と、任意の候補分子の非存在下で測定されたシンシウム形成とを比較すること；及び
−前記分子の存在下で測定されたシンシウム形成が任意の候補分子の非存在下で測定されたシンシウム形成に比較して減少するような候補分子を、フラビウイルスを妨害することができる分子として同定すること
を含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記フラビウイルスが西ナイル熱ウイルス、デング熱ウイルス及びハロー熱ウイルス(Hellow fever virus）からなる群より選ばれる、請求項２０〜２５、２８、３１及び３２のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レトロウイルス核粒子に結集する天然の機能性prM及びE糖タンパク質を含むフラビウイルス偽粒子の生成、及び使用に関する。これらの粒子は、高感染性であり、操作が部類3又は部類4の研究室を必要としないフラビウイルスビリオンの有効なモデルを構成する。
【背景技術】
【０００２】
フラビウイルスは、フラビビリダエ(Flaviviridae)科属を構成する小20面体エンベロープウイルスであり、ペスチウイルス属及びヘパチウイルス（ヒトC型肝炎ウイルス）属をも含む。種々のフラビウイルスは、重要な蚊-又はダニ-由来ヒト病原体、例えば黄熱、デング熱、日本脳炎、西ナイル及びダニ-由来脳炎（TBE）ウイルスである。フラビウイルス構造タンパク質及び非構造タンパク質は、単一のポリタンパク質前駆体から発現し、細胞性及びウイルス性プロテアーゼによる開裂の際にそれらの各々の細胞コンパートメントにそれぞれ放出される。その他のフラビウイルス属から類推すると、フラビウイルス・ゲノム組織は、ウイルス性ゲノムと、2種のエンベロープ糖タンパク質prM及びEを含む脂質エンベロープによって被覆された核タンパク質(C)とを含むヌクレオカプシドからなるウイルスを示唆している。Eタンパク質は、ビリオン表面の主な構成体であり、細胞受容体の結合及びエンドソームの低pH-誘発膜融合の介在という両機能を有している。ウイルス会合は、小胞体中で起こり、最初に融合-不全で不完全なビリオンの生成を引き起こす。Eタンパク質は、当該ビリオン中で、M (prM)の前駆体との安定なヘテロ二両体型複合体を形成する。不完全ビリオンは、細胞貪食作用経路によって移送され、その放出直前に、prMはトランス-ゴルジネットワーク中でフリン又は関連するプロテアーゼによって開裂し、融合-機能性の成熟感染性ビリオンを生成する。
【０００３】
西ナイルウイルス（WNV）、すなわち単一-鎖正極性RNAウイルスは、西ナイル脳炎の病因因子である。WNVは、蚊及び鳥間の自然サイクルで維持されるが、ヒト、馬その他の動物に感染する。WNVは、アフリカ、ヨーロッパ、中東及びアジアの一部に特有であり(Hubalek及びHalouzka, 1999)、過去3年以上のアメリカ合衆国での発生は西半球での存在を認めさせることを意味する(Lanciottiら, 1999)。ヒトは熱病に罹り、一部では髄膜炎又は脳炎症候群に進行する(Hubalek及びHalouzka, 1999)。現在、ヒト使用には具体的治療法もワクチンも承認されていない。
【０００４】
ヒト及び他の動物におけるWNV感染の分子的根拠は、明確には確立されていない。WNV感染の従来の齧歯動物モデルが血清及び中枢神経系（CNS）におけるウイルス複製の証拠を明らかにしてきたが、病因及び免疫応答に関する多くのメカニズム的疑問は依然として解決されていない。例えば、複製の周辺部位は特定されておらず、CNSに対する蔓延メカニズムは明確ではない。加えて、CNSにおける感染の標的細胞は明確には特定されておらず、組織損傷がウイルス感染に直接関連するのか又は免疫応答に直接関連するのか知られていない。最後に、重度のWNV感染に対する感受性は十分に機能しない免疫系に関連するが(Hubalek及びHalouzka, 1999)、本質的で適応性の免疫応答が疾患を制限するメカニズムは明らかになっていない。関連及び非関連RNAウイルスの実験は、抗体がWNV感染に対して重要な保護的役割を果たしている、ことを示唆している。モノクローナル抗体(MAbs)の許容される投与は、いくつかのフラビウイルス（セントルイス脳炎、日本脳炎及び黄熱ウイルス）及び非フラビウイルス（シンドビス、マウス肝炎及びリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）によって起こる脳炎に限定している。しかしながら、これらの多くのウイルスに関し、抗体がCNS感染を弱毒化するメカニズムは明確には証明されていない。抗体は病原の種々の段階での異なったメカニズムを介してウイルス感染を制限することがあるので、アイソタイプ、親和力及び中和を含むMAbsのin vitroの性質は、必ずしも保護とは関連しない。抗体は、直接的中和、補充的活性化又は食細胞によるウイルス取り込みの増加を介する血行性蔓延を制限することによってCNSでのウイルス負荷を減じることができる。あるいは、抗体は、複製を繰り返すことによってCNSにおいて直接的に作用し、ニューロンに広がる。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、非修飾prM及びEタンパク質を有する感染性フラビウイルス偽-粒子の形成及び使用を記載する。
【０００６】
定義
用語「ベクター」、「クローニングベクター」及び「発現ベクター」は、それによってDNA又はRNA配列（例えば外来遺伝子）が宿主細胞に導入され、その結果、当該宿主を形質転換し、導入配列の発現（例えば転写及び翻訳）を促進できる媒体を意味する。ベクターは典型的には、外来DNAがそこに挿入される伝染性因子のDNAを含む。
【０００７】
DNAの1断片をDNAの別の断片に挿入する一般的方法は、制限部位と呼ばれる特定の部位（特定の群のヌクレオチド）でDNAを切断する制限酵素と呼ばれる酵素の利用を含む。一般的には、外来DNAはベクターDNAの1又はそれ以上の制限部位に挿入され、次いで伝染性ベクターDNAと共に当該ベクターによって宿主細胞に運ばれる。挿入又は付加DNAを有するDNA断片又は配列、例えば発現ベクターは、「DNAコンストラクト」とも呼ばれる。ベクターの一般的種類は、一般的には二本鎖DNAの自己-充足的分子である「プラスミド」であり、それは、付加的（外来）DNAを容易に受容できかつ好適な宿主細胞に容易に導入され得る細菌起源であるのが通常である。プラスミドベクターは、コーディングDNA及びプロモーターDNAを含み、外来DNAを挿入するために好適な1又はそれ以上の制限部位を含む。コーディングDNAは、特定のタンパク質又は酵素のための特定のアミノ酸配列をコードするDNA配列である。プロモーターDNAは、コーディングDNAの発現を開始もしくは調節、又は介在もしくは制御するDNA配列である。プロモーターDNA及びコーディングDNAは、同一遺伝子でも異なった遺伝子でもよく、同一の生物由来でも異なった生物由来でもよい。プラスミド及びかびベクターを含む多数のベクターは、多数の真核細胞宿主及び原核細胞宿主における複製及び/又は発現用に記載されている。
【０００８】
「コーディング配列」又は発現産物例えばRNA、ポリペプチド、タンパク質又は酵素を「コード化する」配列は、発現された場合には、RNA、ポリペプチド、タンパク質又は酵素を産生するヌクレオチド配列である。すなわち、当該ヌクレオチド配列はポリペプチド、タンパク質又は酵素のためのアミノ酸配列をコードする。
【０００９】
用語「トランスフェクション」は、外来核酸 (DNA、cDNA又はRNA)の細胞への導入を意味し、その結果、当該宿主細胞は導入遺伝子又は配列を発現し、所望の物質、典型的には導入遺伝子又は配列によってコードされるタンパク質を産生する。導入遺伝子は、調節又は制御配列、例えば開始、終了、プロモーター、シグナル、分泌又は細胞の遺伝的機構によって用いられる他の配列を含んでもよい。導入DNA又はRNAを受け入れ、発現する宿主細胞は「形質転換され」ている。
【００１０】
用語「宿主細胞」は、細胞による物質の産生、例えば遺伝子、DNA配列、タンパク質、ビリオンに係る細胞による発現のために、任意の方法により選択、修飾、形質転換、成長又は使用もしくは操作される任意の生物の任意の細胞を意味する。本発明の文脈において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。特に、宿主細胞は、単核マクロファージ、単球又は樹状細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、ニューロン/神経芽細胞腫細胞、肝細胞/肝臓癌細胞からなる群より選ばれる。好適な宿主細胞は、293Tヒト胎児胚腎細胞(ATCC CRL-1573)、Huh-7ヒト肝細胞癌(Nakabayashiら，1982)、Helaヒト上皮腺癌(CCL-2)、PS、LLMK2、SW13、神経-2aマウス神経芽細胞腫(CCL-131)、HepG2ヒト肝細胞癌(HB-8065)、TE671ヒト横紋筋肉腫(CRL-8805)、VERO African green monkey腎(CCL-81)及びBHK-21ゴールデンハムスター腎(CCL-10)を含む。
【００１１】
本明細書で用いる用語「許容細胞」は、フラビウイルス感染を許容できる細胞を意味する。許容細胞の例は、上記の哺乳動物の単核マクロファージ、単球又は樹状細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、ニューロン/神経芽細胞腫細胞、肝細胞/肝臓癌細胞を含む。
【００１２】
「フラビウイルス」は、ペスチウイルス及びヘパチウイルスをも含むフラビビリダエウイルス科属である。フラビウイルス・ゲノムは、構造的（「核」(C)と呼ばれるN-末端ヌクレオカプシドタンパク質、及び糖タンパク質prM及びE）及び非-構造的(NS)タンパク質に同時翻訳的及び後翻訳的に処理される、単一ポリタンパク質NH2-C-prM-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-COOHをコードする。本発明の文脈では、フラビウイルスは、任意のその構成員、遺伝子型、株、サブタイプ及び変異体である。
【００１３】
用語「変異体」は、フラビウイルスの超可変に起因して、異なったフラビウイルス株で見られる同質ポリヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列を言う。
【００１４】
フラビウイルスの例としては、ダニ-由来脳炎ウイルス等のダニ由来ウイルス又は跳躍病ウイルス、及びデング熱ウイルス(DEN)、黄熱ウイルス(YFV)、西ナイル熱ウイルス(WNV)又は日本脳炎ウイルス等の蚊-由来ウイルスが挙げられる。好ましくは、前記フラビウイルスは、西ナイル熱ウイルス(WNV)、デング熱ウイルス(DEN)又は黄熱ウイルス(YFV)からなる群より選ばれる。好ましくは、前記フラビウイルスは、西ナイル熱ウイルス(WNV)、より好ましくは、Israelian株ISR98-G001)である。好ましくは、前記フラビウイルスはデング熱ウイルス(DEN)、より好ましくはDEN-1(Fga/89)株由来又はDEN-2、DEN-3及びDEN-4株由来である。好ましくは、前記フラビウイルスは黄熱ウイルス(YFV)、より好ましくは、17D-204-Pasteur株由来である。
【００１５】
本明細書で用いる、用語「フラビウイルス-様粒子」又は「フラビウイルス偽-粒子」は、フラビウイルスのエンベロープタンパク質を含む非天然型ウイルス粒子を言う。本発明のフラビウイルス偽-粒子は、標的細胞に感染性である。本発明の粒子は、より具体的にはレトロウイルス性核タンパク質を含む。かかる粒子は、遺伝子工学的技術においては当業者によって容易に製造され得る。例えば、免疫応答を調節するための抗原を発現する合成レトロウイルス性粒子の製造を記載している欧州特許第1 201 750号に言及することができる。
【００１６】
本発明の文脈において、用語「感染性」は、細胞進入を招くウイルスサイクルの初期ステップを完了するための、本発明の粒子能力を記載するために用いられる。しかしながら、宿主細胞との相互作用によって、フラビウイルス-様粒子は子孫ウイルスを産生する場合もしない場合もある。
【００１７】
用語「フラビウイルスのエンベロープタンパク質」は、フラビウイルスの天然型prMもしくはE糖タンパク質、又はその変異体を意味する。
【００１８】
「prM糖タンパク質」又は「prMタンパク質」は、フラビウイルス株の任意の遺伝子型、サブタイプ及び変異体由来のエンベロープprMタンパク質を意味する。
【００１９】
「E糖タンパク質」又は「Eタンパク質」は、フラビウイルス株の任意の遺伝子型、サブタイプ及び変異体由来のエンベロープEタンパク質を意味する。
【００２０】
好ましくは、prM及びE糖タンパク質は同一のフラビウイルス株から得られる。
【００２１】
用語「突然変異体」又は「突然変異」は、天然prM又はEタンパク質のアミノ酸配列の修飾となる変更を意味する。かかる修飾は、例えば1又はそれ以上のアミノ酸の置換及び/又は削除でもよい。突然変異体が天然prM及びEタンパク質の断片を含むことは明白である。変異体は天然突然変異体の特定の例である。突然変異体は、細胞感染性を維持するか、又はワクチン目的のprM及び/又はE抗原性を増加させるために必要なprM及び/又はEタンパク質の構造要素を同定するために特に有用であると考えられている。
【００２２】
本明細書で用いる、用語「フラビウイルス核」は、様々なフラビウイルス株の天然核タンパク質、その断片又はその変異体を意味する。フラビウイルス核はタンパク質を小胞体に転座することができる、それに結合しているprM又は場合によりEに対するシグナルペプチドを提供する。西ナイルウイルス核シグナルタンパク質は、WNV核(QKKRGGKTGIAVMIGLIASVGA, 配列番号1)のカルボキシ-末端の最後の22残基に対応する。デング熱核シグナルペプチドは、DEN-1核(MNRRKRSVTMLLMLLPTVLA, 配列番号2)のカルボキシ-末端の最後の20残基に対応する。黄熱ウイルス核シグナルペプチドは、YFV核(RSHDVLTVQFLILGMLLMTG, 配列番号3)のカルボキシ-末端の最後の20残基に対応する。
従って、実施態様によれば、核タンパク質は、フラビウイルス核シグナルペプチドを含むフラビウイルス核(ΔC)のN-末端部分体である。好ましくは、ΔCは、フラビウイルス核のカルボキシ-末端の最後の20残基、好ましくは最後の22残基である。特に、フラビウイルス核は、フラビウイルス核のカルボキし-末端の最後の60残基に存在する。
【００２３】
その問題となっている機能の完了時に、核タンパク質は、細胞プロテアーゼによって処理され、その結果ポリタンパク質prMEによって切断される。従って、フラビウイルス核タンパク質は、本発明に従う偽-粒子中には見出されない。
【００２４】
本発明の文脈において、用語「天然」又は「非修飾」は、野生型の全長タンパク質を記載するために差別なく用いられる。
【００２５】
本明細書で用いる、用語「ポリタンパク質」は、配列中で互いに連結される個々のタンパク質からなり、それによって個々のタンパク質は、それらのもとの関連した生物活性を保持するタンパク質コンストラクトを記載するために用いられる。
【００２６】
用語「フラビウイルスprMタンパク質又はフラビウイルスEタンパク質に結合したフラビウイルス核タンパク質を含むポリタンパク質」又は「フラビウイルス核タンパク質及びフラビウイルスprMタンパク質及び/又はフラビウイルスEタンパク質を連続的に含むポリタンパク質」は、CprME、CEprM、CprM、CE、ΔCprME、ΔCEprM、ΔCprM及びΔCEポリタンパク質を含む。「CprME」は、フラビウイルス核タンパク質、フラビウイルスprMタンパク質及びフラビウイルスEタンパク質を連続的に含むポリタンパク質を意味する。「CEprM」は、フラビウイルス核タンパク質、フラビウイルスEタンパク質及びフラビウイルスprMタンパク質を連続的に含むポリタンパク質を意味する。「CprM」は、フラビウイルスprMタンパク質に連結したフラビウイルス核タンパク質を含むポリタンパク質を意味する。「CE」は、フラビウイルスEタンパク質に連結したフラビウイルス核タンパク質を含むポリタンパク質を意味する。「ΔCprME」は、フラビウイルス核タンパク質のカルボキシ末端、及びフラビウイルスprM及びフラビウイルスEタンパク質を連続的に含むポリタンパク質を意味する。「ΔCEprM」は、フラビウイルス核タンパク質のカルボキシ末端、及びフラビウイルスE及びフラビウイルスprMタンパク質を連続的に含むポリタンパク質を意味する。「ΔCprM」は、フラビウイルスprMタンパク質に連結したフラビウイルス核タンパク質のカルボキシ末端を含むポリタンパク質を意味する。「ΔCE」は、フラビウイルスEタンパク質に連結したフラビウイルス核タンパク質のカルボキシ末端を含むポリタンパク質を意味する。ΔCprME及びΔCEは、Eの末端に終止コドンを挿入することによって構築されているが、ΔCEprM及びΔCprMは、prMの末端に終止コドンを挿入することによって構築されている。
【００２７】
「レトロウイルス」は、ゲノムがRNA分子からなり、逆-転写酵素、すなわちレトロビリダエ属の構成員含むウイルスを意味する。レトロウイルスは、オンコウイルス、レンチウイルス及びスプマウイルスに分類される。好ましくは、当該レトロウイルスは、オンコウイルス、例えばMLV、ALV、RSVもしくはMPMV、レンチウイルス、例えばHIV-1、HIV-2、SIV、EIAVもしくはCAEV、又はスプマウイルス、例えばHFVである。これらのレトロウイルスのゲノムは、データベースから容易に入手できる。
【００２８】
本発明の文脈において、「パッケージング・コンピテントレトロウイルス-由来ゲノムを含む核酸配列」は、「シス-作用性」配列として知られているレトロウイルス核酸配列を含む配列を意図している。これらは、転写及び伸張の制御のためのレトロウイルス、長期末端反復配列(LTR)、カプシド形成に必要なpsi配列、及びプライマー結合部位(PBS)及びレトロウイルス・ゲノムの逆転写に必要なポリプリン・トラック(polypurine track (PPT))配列を含む。有利なことに、パッケージング・コンピテントレトロウイルス-由来ゲノムを含む当該核酸配列は、導入遺伝子を更に含む。
【００２９】
前記レトロウイルス・ゲノムは、トランス-補充機能が存在しない場合には、複製-欠損又は複製-コンピテントのいずれでもよい。複製-コンピテントゲノムは、gag、pol及びenvレトロウイルス遺伝子を更に含む。複製-欠損ゲノムでは、ウイルス遺伝子gag、pol及びenvが検出される。しかしながら、ウイルス偽-粒子の会合は、「シス」配列が欠損しているgag、pol及びenvを含む別のベクターを提供することによって達成される。その発現は、ウイルス・ゲノムの増殖及び完全なウイルス粒子の形成に必要な遺伝子を除いて、導入遺伝子のカプシド形成を可能にする。
【００３０】
本明細書で用いる、用語「導入遺伝子」は、本発明の粒子による感染により標的細胞中に発現する遺伝子を言う。
【００３１】
導入遺伝子の例は、治療対象の分子をコードする遺伝子、マーカー遺伝子、免疫調節因子をコードする遺伝子、抗原又は自殺遺伝子を含む。
【００３２】
「マーカー遺伝子」は、発現が検出できる遺伝子を意味する。例えば、マーカー遺伝子発現は、検出可能なシグナル、例えば蛍光発光、チトクローム反応を生成することができ、又はそこで発現される細胞に成長上の利点を与えることができる（抗生物質耐性遺伝子)。
【００３３】
「免疫調節因子」は、in vivoにおける対象の免疫系の活性を変更する遺伝子産物を言う。免疫調節因子の例は、サイトカインを含む（例えばインターロイキン、インターフェロン又はhaematopoieticコロニー刺激因子）、ケモカイン等を含む。形質転換細胞による免疫調節因子の発現は、細胞環境を変え、免疫細胞分化を変更し、そして所与の抗原に対して誘導された免疫応答の種類及び強さを変更することができる。
【００３４】
「抗原」は、分子、例えばそれに対して免疫応答が要求されるペプチド、ポリペプチド又はタンパク質等の分子を言う。当該抗原は、例えば腫瘍性、細菌性、病原性、タンパク質(proteic)抗原又はウイルス抗原でもよい。
【００３５】
「自殺遺伝子」は、細胞での発現がプログラムされた-細胞死（アポトーシス）を誘導する遺伝子、例えば条件付きI型単純ヘルペスウイルス チミジンキナーゼ遺伝子を意味する。
【００３６】
「レトロウイルス由来の核タンパク質」は、gag及びpol遺伝子によってコードされるタンパク質を言う。gap遺伝子は、レトロウイルスプロテアーゼによって更に処理されて核を含む構造タンパク質になる、ポリタンパク質をコードする。pol遺伝子は、レトロウイルスプロテアーゼ、逆-転写酵素及びインテグラーゼをコードする。gap遺伝子の発現のみで、十分に核粒子の放出を誘導する；しかし、かかる粒子は、pol遺伝子がコードするレトロウイルス複製酵素が存在しない結果、感染性でない。そのため、「レトロウイルス由来の核タンパク質」は、gag及びpol遺伝子又はgag遺伝子単独によってコードされるタンパク質を意味する。
【００３７】
「薬学的に許容される担体」は、本発明に従うワクチン組成物が調合される任意の媒体を言う。それは、リン酸緩衝液生理食塩水等の生理食塩水を含む。一般的に、希釈剤又は担体は、投与方式及び経路、及び標準的な薬務に基いて選択される。
【００３８】
本願の文脈では、「ワクチン接種」は、予防的又は治療的ワクチン接種を意図している。「治療的ワクチン接種」は、フラビウイルスに感染した患者のワクチン接種を意味する。
【００３９】
本発明によれば、用語「対象」又は「患者」は、フラビウイルスに感染しそうな任意の哺乳動物、ヒト又は動物を意味する。
【００４０】
フラビウイルス粒子の製造
本発明者は、レトロウイルス核粒子上に会合する機能的、より具体的には非修飾のフラビウイルス糖タンパク質を含む感染性偽-粒子を作製した。フラビウイルスprMEは、核(C)タンパク質又はその断片、特にCタンパク質のカルボキシ末端を含むポリタンパク質から発現し、prM又はE、及びprM及び/又はE糖タンパク質のシグナルペプチドとして働く。
【００４１】
従って、本発明は、以下のステップ：
−パッケージング・コンピテントレトロウイルス-由来ゲノムを含む第一核酸配列を提供すること；
−前記レトロウイルスから核タンパク質をコードするcDNAを含む第二核酸配列を提供すること；
−フラビウイルス核タンパク質、及びフラビウイルスprMタンパク質及び/又はフラビウイルスEタンパク質を連続的に含むポリタンパク質をコードするcDNAを含む第三核酸配列を提供すること；
−前記核酸配列で宿主細胞をトランスフェクトし、次いで、cDNAの発現によりフラビウイルス及びレトロウイルスから構造タンパク質を産生させるために十分な時間、当該トランスフェクトされた細胞を培養中に維持すること；並びに
−当該構造タンパク質をウイルス-様粒子に形成すること
を含む、フラビウイルス-様粒子のex vivo製造方法を提供する。
【００４２】
前記レトロウイルス由来の核タンパク質をコードするcDNAは、gag及びpol遺伝子又はgag遺伝子のみを含むことができる。
【００４３】
本発明は、以下のステップ：
−パッケージング・コンピテントレトロウイルス-由来ゲノムを含む第一核酸配列を提供すること；
−前記レトロウイルスから核タンパク質をコードするcDNAを含む第二核酸配列を提供すること；
−フラビウイルス核タンパク質、及びフラビウイルスprMタンパク質及び/又はフラビウイルスEタンパク質を連続的に含むポリタンパク質をコードするcDNAを含む第三核酸配列を提供すること；
−前記核酸配列でin vivoにおいて宿主細胞をトランスフェクトし、次いで、cDNAの発現によりフラビウイルス及びレトロウイルスから構造タンパク質を産生させ；並びに
当該構造タンパク質をウイルス-様粒子に形成すること
を含む、フラビウイルス-様粒子のin vivo製造方法を更に提供する。
【００４４】
本発明の別の局面は、フラビウイルス感染症に対するワクチンとして有用な医薬の製造のための3種の核酸配列の使用であって、当該核酸配列が
−パッケージング・コンピテントレトロウイルス-由来ゲノムを含む第一核酸配列；
−前記レトロウイルス由来の核タンパク質をコードするcDNAを含む第二核酸配列；
−フラビウイルス核タンパク質、及びフラビウイルスprM及び/又はフラビウイルスEタンパク質を連続的に含むポリタンパク質をコードするcDNAを含む第三塩核酸配列；並びに
−対象の細胞に導入される場合には、フラビウイルス及びレトロウイルス由来の構造タンパク質の製造を可能にする核酸配列、ここで、当該構造タンパク質は免疫原性であるウイルス-様粒子を形成する、
である、前記使用である。
【００４５】
トランスフェクションの目的のためには、前記第一、第二及び第三の核酸配列は、同一のベクター又は2又は3の別個のベクターで運ばれる。
【００４６】
特に、プラスモウイルス、アデノウイルス、複製偽-ウイルス及び麻疹ウイルス由来の複製ウイルスベクターは、上記配列を運ぶために好適なベクターの例である。プラスモウイルスワクチンは、前記フラビウイルスに対する免疫応答を誘導するために患者に投与後のフラビウイルス偽-粒子の発現を可能にするかかるプラスミドDNA調製物からなる。かかるプラスモウイルスワクチンの投与は、フラビウイルス-誘導疾患の危険性のある人々への予防的ワクチン又はフラビウイルス-感染症患者への治療的ワクチンとして達成されている。アデノウイルスは、フラビウイルス偽-粒子をコードする上記核酸配列を提供する他の方法からなる。この場合、上記(レトロウイルス核、ゲノム及びフラビウイルス糖タンパク質)の3種の核酸配列をコードするアデノウイルス、すなわち組換えアデノウイルスを設計することができ、又は異なった核酸配列を含む「弱い(guttless)」組換えアデノウイルスから得られる単一アデノウイルスを設計することもできる。かかるアデノウイルスは、抗-フラビウイルス免疫応答を誘導するためにプラスモウイルスとして患者に投与することができる。複製偽-レトロウイルスは、フラビウイルス偽-粒子をコードする全ての上記核酸を発現する別の代わりの可能性がある。かかる構造は、実際には、ゲノムが次の感染、接種患者の細胞へのその増殖を可能にし、その結果、複製フラビウイルス偽-粒子の製造を更に誘起するように設計されているフラビウイルス偽-粒子である。この場合、レトロウイルスのゲノムは、（レトロウイルス糖タンパク質をコードする）レトロウイルスEnv遺伝子の代わりに、フラビウイルスE及びprM糖タンパク質を発現するように修飾される。レトロウイルス核タンパク質をコードする遺伝子は不変である。例えばマーカー遺伝子又は免疫調節因子をコードする更に別の遺伝子はこのゲノムから発現することができる。麻疹ウイルス(MV)ベクターはワクチンMV株から得られ、イムノゲンをコードする別の遺伝子を含む複製-獲得MVゲノムを有する。かかる組換えMVの複製は、このイムノゲンに対して強度の免疫応答を誘起する(Combredetら, 2003)。これは、例えば、強い中和抗体及びHIVに対する細胞性免疫応答を誘起するHIV-1抗原を発現するMVベクターで接種したマウスにおいて明らかである(Lorinら, 2004)。
【００４７】
本発明の文脈において、MV-由来ベクターは、追加の遺伝子として、フラビウイルスprMEタンパク質、及びgag遺伝子とpol遺伝子又はgag遺伝子のみによってコードされるレトロウイルス核タンパク質を発現するコンストラクトを提供する。このMV-系ベクターの複製は、フラビウイルス偽-粒子の持続分泌を誘起することができ、その後、フラビウイルスタンパク質に対して強い免疫応答を誘起することができる。
【００４８】
フラビウイルスprME及びレトロウイルス発現コンストラクトの例は、図1A及び1Bに示されている。好ましくは、前記フラビウイルスは、西ナイル熱ウイルス、デング熱ウイルス及び黄熱ウイルスからなる群より選ばれる。
【００４９】
具体的な実施態様によれば、前記パッケージング・コンピテントレトロウイルス・ゲノム及び核タンパク質は、MLV、ALV、RSV、MPMV、HIV-1、HIV-2、SIV、EIAV、CAEV及びHFVからなる群より選ばれるレトロウイルスから得られる。
【００５０】
有利なことに、パッケージング・コンピテントレトロウイルス・ゲノムは、マーカーゲノム又は免疫調節因子を更に含む。
【００５１】
本発明の方法では、前記ポリタンパク質は、フラビウイルスprMタンパク質に連結したフラビウイルス核タンパク質を、又はフラビウイルスEタンパク質に連結したフラビウイルス核タンパク質を、又はフラビウイルス核タンパク質、フラビウイルスprMタンパク質及びラビウイルスEタンパク質を連続的に、又はフラビウイルス核タンパク質、フラビウイルスEタンパク質及びフラビウイルスprMタンパク質を連続的に含む。
【００５２】
実施態様によれば、prM及び/又はEは天然タンパク質である。別の実施態様によれば、prM及び/又はE糖タンパク質は、フラビウイルス感染の糖タンパク質決定基を特徴付けるために有用な粒子を取得するために突然変異される。
【００５３】
好ましくは、前記prM及びE糖タンパク質は、いずれも同一のフラビウイルス株から得られる。
【００５４】
別の実施態様によれば、前記フラビウイルス核タンパク質は、核タンパク質シグナルペプチドを含むフラビウイルス核タンパク質のカルボキシ末端体(ΔC)である。特に、前記フラビウイルス核タンパク質は、フラビウイルス核のカルボキシ-末端の最後の20アミノ酸、好ましくは最後の22アミノ酸を含む。
【００５５】
本発明によれば、当該分野の技術内の一般的分子生物学、微生物学及び組換えDNA技術を使用することができる。例えばSambrookら, 1989 ; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B. D.Hames U; S. J. Higgins eds. (1985)]; Transcription and Translation [B. D. Hames & S. J. Higgins編 (1984)]; Animal Cell Culture [R. I. Freshney編 (1986)]; Immobilized Cells and Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubelら, 1994を参照されたい。
【００５６】
特に、本発明のベクターは、ex vivo又はin vivoの培養中での核酸の細胞核への送達について知られた任意の技術によって、標的細胞に導入することができる。
【００５７】
核酸配列の導入は、当業者によって周知の標準的方法、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈降法、又は遺伝子ガンの使用によって実行することができる(例えばWuら, 1992; Wuら, 1988を参照されたい)。
【００５８】
提供核酸標的装置は、リポフェクション法によって導入することもできる。ある実施態様では、リポソーム及び/又はナノ粒子の使用では、ドナー核酸標的装置の宿主細胞への導入を考慮している。ナノカプセルは、一般的に安定かつ再現可能な方法で化合物を取り込むことができる。生分解ポリアルキル-シアノアクリレートポリマーを用いて設計できる超微粒子（大きさが約0.1μm)は、本発明での使用が考慮され、かかる粒子は容易に調製できる。
【００５９】
リポソームは、水性媒体中に分散されたリン脂質から形成され、同時に多層同軸二分子層（多分子層(MLV)とも称する）を形成する。MLVは、一般的に25 nm〜4μmの径を有する。MLVの超音波処理によって、核中に水溶液を含む200〜500Åの範囲の径の小単層(SUV)を形成する。カチオン性脂質の使用は、負に荷電した核酸の取り込みを促進し、負に荷電した細胞膜との融合を促進することができる(Feignerら, 1989)。In vivoでの標的遺伝子送達は、国際特許公開WO 95/28494号に記載されている。あるいは、ベクターは、上記のリポソーム又はナノ粒子を用い、リポフェクションによってin vivoで導入することができる。In vitroで用いられる技術(例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション)に類似した方法を用いてin vitroでベクターを導入することもできる。
【００６０】
形質転換細胞
本発明は更に、
−パッケージング・コンピテントレトロウイルス-由来ゲノムを含む第一核酸配列；
−前記レトロウイルス由来の核タンパク質をコードするcDNAを含む第二核酸配列；
−フラビウイルス核タンパク質、及びフラビウイルスprM及び/又はフラビウイルスEタンパク質を連続的に含むポリタンパク質をコードするcDNAを含む第三塩核酸配列
を含む形質転換宿主細胞に更に関する。
【００６１】
前記レトロウイルス由来の核タンパク質は、gag及びpol遺伝子又はgag遺伝子のみのいずれかによってコードされる。
【００６２】
かかる形質転換宿主細胞は上記方法によって得られる。
【００６３】
別の局面では、本発明は、細胞へのフラビウイルス進入を妨害することができる分子の同定のための、上記形質転換宿主細胞の使用に関する。本発明は、特に、候補化合物の存在又は非存在下、形質転換宿主の、標的細胞との細胞融合のレベル比較を含む、細胞中のフラビウイルス進入を妨害することができる分子のex vivoスクリーニング又は同定方法を提供する。前記方法は、好ましくは、次のステップ：
−シンシチウム形成、すなわち細胞-細胞融合を可能にする条件、及び任意の候補分子の非存在下での標的宿主細胞においてフラビウイルス-様粒子進入を可能にする条件で、候補分子の存在又は非存在下に、形質転換宿主細胞を標的宿主細胞と共-培養すること；
−前記候補分子の非存在及び存在下でのシンシチウム形成を評価すること；
−前記候補分子の存在下で測定されたシンシウム形成と、任意の候補分子の非存在下で測定されたシンシウム形成とを比較すること；及び
−前記分子の存在下で測定されたシンシウム形成が任意の候補分子の非存在下で測定されたシンシウム形成に比較して減少するような候補分子を、フラビウイルスを妨害することができる分子として同定すること
を含む。
【００６４】
形質転換宿主細胞の標的宿主細胞及び候補化合物との接触は、前記宿主細胞、標的宿主細胞及び候補分子を同時に接触させることによって実行できる。あるいは、これらの3種の要素のうちの2種を、3番目の欠けた要素を添加する前に、相互作用させるに十分な条件下で接触させることができる。
【００６５】
好ましくは、前記標的宿主細胞は形質転換されていない、すなわち前記標的宿主細胞は少なくとも上記の第一、第二及び第三の核酸配列を含まない。
【００６６】
シンシチウム形成は、当業者によって容易に評価することができる。すなわち、共培養は、pH-5の酸性pH滴を添加して5分間インキュベーションし、更に12時間、標準培地でインキュベートする。次いで、製造者の忠告に従い、メイグリュンワルド・ギムザ溶液(MERCK)を添加することによって培養物を染色する。2又はそれ以上の核を含む細胞をシンシチウムと定義する。次いで、融合指数を、(N-S)/T[ここで、Nはシンシチウム中の核の数を示し；Sはシンシチウムの数を示し；Tは計数される核の総数を示す。]のパーセンテージで定義する。
【００６７】
フラビウイルス-様粒子
上記の方法では、レトロウイルス核上での正確な会合のためには、prME糖タンパク質の構造的修飾は必要とされない。従って、本発明の方法は、機能性prME糖タンパク質を有する、高力価の感染性フラビウイルス偽-粒子を生成させることができる。本明細書で説明したように、これらの粒子は、ウイルス感染サイクルの初期ステップに関する、フラビウイルスビリオンの有効なモデルを構築する。
【００６８】
本発明は更に、レトロウイルス由来の核タンパク質及びprM及び/又はEフラビウイルス糖タンパク質を含む、感染性フラビウイルス-様粒子に関する。かかる粒子は、上記方法によって取得できる。
【００６９】
実施態様によれば、本発明の感染性粒子は、天然型フラビウイルスprMタンパク質、天然型フラビウイルスEタンパク質又は天然型フラビウイルスprMタンパク質及び天然型フラビウイルスEタンパク質を含んでもよい。好ましくは、前記prM及びE糖タンパク質はいずれも同一のフラビウイルス株から得られる。別の実施態様によれば、prM及び/又はE糖タンパク質が突然変異する。
【００７０】
前記レトロウイルスは、ALV、ALV、RSV、MPMV、HIV-1、HIV-2、SIV、EIAV、CAEV及びHFVからなる群より選ばれる。
【００７１】
有利なことに、前記感染性粒子は、導入遺伝子を更に運ぶ。例えば、前記導入遺伝子は、本発明の感染性粒子による追加的細胞感染を可能にするマーカー遺伝子でもよく、例えばフラビウイルス進入に関連する細胞受容体の同定に適用することができる。前記導入遺伝子は、治療対象分子をコードする遺伝子及び/又は自殺遺伝子でもよい。従って、哺乳動物単核マクロファージ、単球又は樹状細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、ニューロン/神経芽細胞腫細胞、肝細胞/肝細胞腫細胞を特に標的とする本発明の粒子は、遺伝子導入及び/又は遺伝子治療のための有用なベクターを含む。
【００７２】
本発明の感染性フラビウイルス-様粒子の使用
これらの粒子の高感染力は、フラビウイルスprM及びE糖タンパク質の役割、及び細胞中のそれらの可能性のある受容体、フラビウイルス宿主の範囲及びフラビウイルス患者血清由来の抗体による中和についての研究を可能にする。
【００７３】
従って、本発明は、フラビウイルスprM及び/又はE糖タンパク質に対する細胞受容体のex vivo同定のための、上記のフラビウイルス-様感染性粒子の使用に関する。
【００７４】
実施態様によれば、本発明は、細胞受容体への前記粒子の結合を検出することを含む、フラビウイルスprM及び/又はE糖タンパク質に対する受容体のex vivo同定方法を提供する。より具体的には、当該方法は、以下のステップ：
−フラビウイルス感染感受性細胞を、前記細胞の表面に発現した受容体への前記粒子の特異的結合を可能にするために十分な条件下で、本発明の感染性フラビウイルス-様粒子に接触させること；
−受容体への前記粒子の結合を検出すること；及び
−前記受容体を同定すること
を含む。
【００７５】
フラビウイルス感染感受性細胞は、好ましくは、哺乳動物単核マクロファージ、単球又は樹状細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、ニューロン/神経芽細胞腫細胞、肝細胞/肝細胞腫細胞からなる群より選ばれる。
【００７６】
受容体への粒子結合の検出は、当業者によって周知の古典的方法に従って達成することができる。例えば、これは、本発明の粒子の放射活性、酵素又は蛍光標識、及び好適な方法による次の検出を含む。多数の蛍光材料が知られており、標識として利用することができる。これらは、例えば、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッドを含む。酵素標識は、対象分子、例えばポリペプチドへの酵素の結合からなり、任意の比色分析法、分光学的法又はフッ素分光学的法によって検出することができる。本発明の偽-粒子を有するprM又はEタンパク質に対する標識抗体を用いるフローサイトメトリー分析(FACS)も好適である。
【００７７】
別の実施態様によれば、本発明は、次のステップ：
−フラビウイルスに対する受容体である可能性が高いタンパク質をコードする核酸配列で、フラビウイルス感染を許容しない細胞をトランスフェクトすること、
−当該形質転換細胞を、本発明のフラビウイルス-様粒子と接触させること；
−当該形質転換細胞がフラビウイルス感染を許容するようになったか否かを決定すること；及び
−許容されるようになった当該形質転換細胞によって発現される当該タンパク質を、フラビウイルスに対する細胞受容体として同定すること
を含む、フラビウイルスに対する細胞受容体のex vivo同定方法を提供する。
【００７８】
形質転換細胞がフラビウイルス感染を許容するようになった否かの決定は、本発明のフラビウイルス-様粒子を用いて容易に達成できる。特に、前記粒子がマーカー遺伝子、例えばGFPを運ぶ場合には、許容度(すなわち、フラビウイルス及び特にはフラビウイルス-様粒子で感染される細胞能力)は、形質転換細胞のFACS分析によって評価される。マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子である場合には、フラビウイルス-様粒子によって感染した細胞の同定は、前記抗生物質への暴露によって容易に達成される。
【００７９】
所与のタンパク質を、細胞中のフラビウイルス侵入に対する受容体であると疑わない場合には、上記方法は、フラビウイルスに対する細胞受容体のスクリーニング及び同定に有利に適用することができる。特に、発現cDNAライブラリーは、例えばフラビウイルス感染を許容する細胞由来の細胞mRNAの逆-転写によって得られるcDNAライブラリーから調製することができる。かかるcDNAの発現は、核酸配列が好適なベクターにおいてcDNAライブラリーに融合されるプロモーターによって駆動される。かかるライブラリーは、フラビウイルスの細胞受容体をコードするベクターを含む。次いで、非許容細胞は、この発現ライブラリーでトランスフェクトされ、更にフラビウイルスの細胞受容体の同定のためにスクリーニングされる。
【００８０】
このために、本発明は、次のステップ：
−フラビウイルス感染を許容する細胞から取得される発現cDNAライブラリーを提供すること；
−当該発現cDNAライブラリーで、フラビウイルス感染を許容しない細胞をトランスフェクトすること；
−当該形質転換細胞を本発明のフラビウイルス-様粒子と接触させること；
−フラビウイルス感染を許容するようになった当該形質転換細胞を同定及び単離すること；
−許容するようになった細胞中でトランスフェクトされた当該発現ベクターを単離すること；及び
−当該単離発現ベクターのcDNA配列によってコードされるタンパク質を、フラビウイルスに対する受容体として同定すること
を含む、フラビウイルスに対する細胞受容体のex vivo同定方法を提案する。
【００８１】
形質転換細胞がフラビウイルス感染を許容するようになったか否かの決定は、本発明のフラビウイルス-様粒子を用いて容易に達成することができる。特に、前記粒子がマーカー遺伝子、例えばGFPを運ぶ場合には、許容性(すなわち、フラビウイルス及び特にフラビウイルス-様粒子で感染される細胞の許容量)は、当該形質転換細胞のFACS分析によって評価することができる。マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子である場合には、フラビウイルス-様粒子によって感染した細胞の同定は、前記抗生物質への暴露によって容易に達成される。
【００８２】
有利なことに、発現DNAライブラリーは、フラビウイルス非許容細胞の感染を可能にする糖タンパク質を含むレトロウイルスベクターから発現できる。かかる糖タンパク質は、受容体がほとんどの細胞種においてex vivoで発現する水疱性口内炎ウイルス(VSV)由来のVSV-糖タンパク質でもよい。かかるウイルス粒子は、発現DNAライブラリー及び場合によりマーカー遺伝子を含むパッケージング・コンピテントレトロウイルス-由来ゲノムを用いて組み立てられる。この実施態様によれば、本発明のフラビウイルス-様粒子による感染に許容できるようになった細胞において発現する発現ベクターを単離する方法は、非常に促進される。実際に、この後者の実施態様は、細胞トランスフェクションに比較して、レトロウイルスベクターを有する細胞感染の過程が高い有効性を有するという点で特に有益である。更に、細胞感染は、細胞ゲノムにおけるウイルス・ゲノムの集積を安定化する。従って、本発明の偽-粒子によって運ばれる導入遺伝子すなわちcDNA及びマーカー遺伝子は、感染細胞によって安定に発現することが見出されている。これは、細胞ゲノムに結合しないトランスフェクション用古典的ベクター、及び発現が一時的である古典的ベクターとは対照的である。
【００８３】
別の局面では、本発明は、細胞へのフラビウイルス進入を妨害することができる分子の同定のための上記定義の感染性粒子の使用に関する。特に本明細書では、候補分子の存在又は非存在下での本発明の粒子による細胞感染のレベルの比較を含む、細胞へのフラビウイルス進入を妨害することができる分子のex vivoスクリーニング又は同定方法を提供する。前記方法は、好ましくは、
−フラビウイルス感染感受性細胞を、任意の候補分子の非存在下でフラビウイルス-様粒子で細胞を感染させる条件下で、感染性フラビウイルス-様粒子と候補分子の非存在又は存在下で接触させること；
−前記候補分子の非存在及び存在下で細胞感染力を評価すること；
−前記候補分子の存在下で測定された細胞感染力を、任意の候補分子の非存在下で測定された細胞の感染力を比較すること；
−前記分子の存在下で測定された細胞感染力が任意の候補分子の非存在下で測定された細胞感染力と比べて減少している候補分子を、フラビウイルス進入で妨害することができる分子として同定すること
を含む。
【００８４】
フラビウイルス感染感受性細胞の、感染性フラビウイルス-様粒子及び候補分子との接触は、前記細胞、フラビウイルス-様粒子及び候補分子を同時に接触させることによって実行される。あるいは、これら3種の要素の内の2種を、3番目の欠落した要素の添加前にそれらの相互作用を可能にするために十分な条件下で接触することができる。
【００８５】
細胞感染力は当業者によって容易に評価することができる。当業者は、感染性フラビウイルス-様粒子が検出マーカーを運ぶ実施態様を利用して、細胞感染を検出することができる。好ましい実施態様では、マーカー遺伝子は、蛍光マーカー遺伝子、例えばGFPであり、感染は、蛍光測定手段、例えば塩基感染性粒子と接触した細胞のフローサイトメトリー分析によって検出される。
【００８６】
フラビウイルス進入を妨害する分子の同定方法に用いられる好適な細胞は、上記のフラビウイルス感染に対する任意の許容細胞でよい。
【００８７】
細胞においてフラビウイルス進入を妨害できるこのような分子は、新規な抗ウイルス剤を構成することができる。
【００８８】
本発明の感染性粒子は、フラビウイルス感染症の診断、及びフラビウイルス感染症の追跡、例えば患者の治療効果の評価に更に有用である。
【００８９】
従って、本発明は、フラビウイルス感染感受性対象由来の生物試料中のフラビウイルスに対する抗体のin vitro検出のための、感染性フラビウイルス-様粒子の使用に関する。前記生物試料は、生物的液体、例えば血液もしく血清、又は生体組織でもよい。具体的実施態様では、前記抗体は、prM及び/又はEフラビウイルス糖タンパク質に対するものである。
【００９０】
従って、本発明は、患者の生物試料中に存在しそうな抗-フラビウイルス抗体と、本発明のフラビウイルス-様粒子との相互作用によって形成される免疫複合体を検出することを含む、患者のフラビウイルス感染症のin vitro診断方法を提供する。上記方法は、特に、以下のステップ：
−生物試料を本発明の感染性フラビウイルス-様粒子と、当該生物試料中に存在するフラビウイルスに対する抗体に当該感染性粒子を結合させることによって複合体を形成させるために十分な条件下で、接触させること；及び
−その存在がフラビウイルス感染の指標である、当該複合体を検出すること
を含むことができる。
【００９１】
フラビウイルス-様粒子と反応する抗体の存在は、標準的な電気泳動法及び免疫学的検定法、例えば競争的、直接反応、又はサンドウィッチ型検定を含む、免疫診断的方法を用いて検出することができる。かかる検定は、ウェスタンブロット；凝集試験；酵素-標識及び介在免疫検定法、例えばELISA；ビオチン/アビジン型検定；放射免疫測定法；免疫電気泳動法；免疫沈降法等に限定されない。反応は、一般的に露出標識、例えば蛍光、化学発光、放射活性、酵素標識又は色素分子、又はフラビウイルス-様粒子及び抗体又はそれと反応する抗体間の複合体の形成を検出するための他の方法を含む。
【００９２】
別の実施態様では、患者のフラビウイルス感染症の当該in vitro診断法は、本発明のフラビウイルス-様粒子による許容細胞の感染に対する、患者の生物試料中に存在しそうな抗-フラビウイルス抗体の阻害効果を検出することを含む。
当該方法は、以下のステップ：
−フラビウイルス感染許容細胞をフラビウイルス-様粒子及び生物試料と接触させること；
−当該生物試料の存在下で測定された細胞感染力を、当該生物試料の非存在下で測定された細胞感染力と比較すること;
−当該生物試料の非存在下で測定された細胞感染力と比べた当該生物試料の存在下で測定された細胞感染力の減少として、許容細のフラビウイルス-様粒子感染阻害を検出すること、ここで当該阻害はフラビウイルス感染の指標ある、
ことを含む。
【００９３】
この実施態様は、当該方法が細胞感染を中和する特異的抗体、すなわちウイルス血症に対して効果的な患者の抗体、の検出に依拠する点で有利である。
【００９４】
本発明の更なる実施態では、商業的診断キットは、フラビウイルス粒子及びフラビウイルス感受性対象由来の生物試試料中のフラビウイルスに対する抗体によって形成される免疫複合体の存在又は非存在を検出することによって、あるいは患者の生物試料中に存在しそうな抗-フラビウイルス中和抗体による許容細胞のフラビウイルス-様粒子感染阻害を検出することによって、上記診断方法を実行するために有用である。かかるキットは、少なくとも本発明のフラビウイルス-様粒子を含むことができる。当該方法が免疫複合体の検出を含む場合には、キットは、前記免疫複合体の好適な検出手段を更に含むことができる。好ましくは、本発明のキットは、例えば「競争型」、「サンドウィッチ型」等の選ばれた方法に依拠した方法及びプロトコールを更に含む。キットは、周辺試薬、例えば緩衝液、安定化剤等を含んでもよい。
【００９５】
本発明の別の局面では、感染性フラビウイルス-様粒子はワクチン接種目的のために使用することができる。
【００９６】
実施態様によれば、本発明は、フラビウイルス-様粒子のそれを必要としている対象への投与を含む、特にフラビウイルス感染に対するワクチン接種法を提供する。本発明は、ウイルス-様粒子及び薬学的に許容される担体を含むワクチン組成物にも関する。本発明は更に、本明細書に開示の薬学的に許容される担体、フラビウイルス-様粒子を含む免疫原性組成物を提供する。
【００９７】
本発明のワクチン及び免疫原性組成物は、免疫を付与し又はフラビウイルスに対する免疫応答を引き起こすために使用することができる。
【００９８】
しかしながら、本発明のフラビウイルス-様粒子が、フラビウイルス抗原とは異なった別の抗原をコードする別の遺伝子を更に運ぶ場合には、本発明は、前記抗原に対する免疫応答を引き起こすために有用な組換えウイルスワクチンを提供する。現に、本明細書に記載の偽-粒子の使用は、抗原の数種類の提示及び処理経路を組み合わせることにより、誘起された免疫応答を改善することができる。例えば、本発明のワクチン組成物は、投与されると、フラビウイルス-様粒子感染宿主細胞を生成する。次いで、抗原をコードする導入遺伝子は、細胞ゲノムに集積され、続いて当該細胞により発現し、その結果、ワクチン組成物によって誘起された細胞性及び体液性応答が生じる。
【００９９】
有利なことに、フラビウイルス-様粒子は更に、免疫調節因子をコードする導入遺伝子を運び、生じた免疫反応を亢進させる。
【０１００】
本発明のワクチン接種又は免疫原性組成物は、更にアジュバントを含んでもよい。多数のアジュバントが当業者に周知である。好適なアジュバントの例としては、例えば水酸化アルミニウム；サポニン；ツィーン80等の洗浄剤；動物油、鉱油又は植物油；コリネバクテリウム属又はプロピオン酸菌属-由来アジュバント；ウシ型結核菌(バチルス・カルメット及びゲリン(Guerinn)又はBCG)；サイトカイン；カーボマー等のアクリル酸ポリマー；EMA；又はそれらの組み合わせを含む。
【０１０１】
投与経路は、ワクチン分野で使用される任意の一般的な経路である。一般的指針として、本発明のワクチン組成物は、粘膜表面、例えば眼の、鼻腔内、肺の、経口、腸の、直腸の、膣の及び尿路の表面によって；非経口経路、例えば静脈内、皮下、腹膜内、皮内、表皮内又は筋肉内経路によって投与される。投与経路の選択は、選択される処方に依拠する。
【０１０２】
更に別の実施態様では、本発明の粒子は、遺伝子導入及び/又は遺伝子療法のベクターとして用いることができる。遺伝子療法は、その表現型又は遺伝子型を変化させるための細胞への遺伝子材料の導入と定義される。一次的又は癌性許容細胞のいずれかに対するその親和性のため、本明細書に記載のフラビウイルス-様粒子は、感染性で複製-欠損フラビウイルス-様粒子の高力価を生じる再現性をスケールアップできるような効率的な遺伝子送達システムを含む。
【０１０３】
従って、本発明は、対象導入遺伝子の細胞へのin vivo又はin vitro導入のための方法に関し、ここで、当該方法は本発明のフラビウイルス-様粒子で細胞を感染することを含み、当該粒子は対象の導入遺伝子を運ぶ。
【０１０４】
本発明は更に、患者の疾患の予防又は治療用医薬の調製のための、対象導入遺伝子を運ぶ本発明のフラビウイルス-様粒子の使用に関し、ここで、当該フラビウイルス-様粒子は、患者の細胞に対象導入遺伝子を導入し、当該疾患に対して予防又は治療的効果を有する産物をコードする。
【０１０５】
好ましくは、標的細胞は、哺乳動物単核マクロファージ、単球又は樹状細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、ニューロン/神経芽細胞腫細胞、肝細胞/肝細胞腫細胞からなる群より選ばれる。
【０１０６】
本発明は、以下の実施例及び添付図面の点から更に理解できよう。
【実施例】
【０１０７】
実施例１:フラビウイルス偽-粒子(FVpp)の作製
マウス白血病ウイルス(MLV)から得られたレトロウイルス核タンパク質に完全長、非修飾型prM及びE糖タンパク質を会合させることによって、フラビウイルス偽-粒子(FVpp)を作製した(図1)。
【０１０８】
ウイルス成分、すなわちprM、E又はprME糖タンパク質及びウイルス核タンパク質をコードする発現ベクターの構築。
野生型prMEポリタンパク質を発現するプラスミドは、標準的方法によって構築した(Sambrookら, 1989)。
すなわち、西ナイル熱ウイルス由来のprM及びE糖タンパク質をコードするphCMV-ΔCprME-WNV発現ベクターは、フラビウイルス核(C)及び全てのprM及びEタンパク質の最後の22残基をコードする平滑末端断片をBamHI消化及びクレノウ平滑ベクターphCMV-Gに挿入することによって作製した(Negreら, 2000)。
【０１０９】
西ナイル熱ウイルスのΔCprMEオープンリーディング配列を配列番号4で示し、そのΔCprMEタンパク質のアミノ酸配列を配列番号5で示す。
【０１１０】
デング熱ウイルスのΔCprMEオープンリーディング配列を配列番号6で示し、そのΔCprMEタンパク質のアミノ酸配列を配列番号7で示す。
【０１１１】
黄熱ウイルスのΔCprMEオープンリーディング配列を配列番号8で示し、そのΔCprMEタンパク質のアミノ酸配列を配列番号9で示す。
【０１１２】
黄熱ウイルスのprME糖タンパク質の発現ベクターは、同様の方法によって構築した。
【０１１３】
従って、フラビウイルスprME糖タンパク質は、prM糖タンパク質のシグナルペプチドとして働く核（ΔC）タンパク質のカルボキシ-末端を含むポリタンパク質から発現させた。一方、prM膜貫通型ドメインはE糖タンパク質のシグナルペプチドとして働く。
【０１１４】
フラビウイルス偽-粒子の生成
レトロウイルスの核は、様々な異なった細胞性及びウイルス性糖タンパク質を取り込み、宿主細胞DNAに遺伝子マーカーをパッケージ及び結合することができるので、レトロウイルスをFVpp会合の基本骨格として選択した。
【０１１５】
293Tヒト胚腎細胞(ATCC CRL-1573)を、ΔCprMEポリタンパク質、gag及びpol遺伝子又はgag遺伝子のみによってコードされるMLV核タンパク質、及びGFP(緑蛍光タンパク質)遺伝子マーカーを提供するパッケージング・コンピテントMLV-由来ゲノムをコードする3種の発現ベクターでトランスフェクトすることによって、FVppを作製した。このコンストラクトは、発現がCMV(サイト・メガロウイルス)隣接初期プロモーター(immediate early promoter)によって駆動されるGFPマーカー遺伝子を含む。CMV及びGFP核酸配列は、gag、pol及びenv遺伝子が除去され、及びベクターゲノムパッケージング、逆転写及び集積を制御するレトロウイルスシス-作用要素が保持されている、LV由来のレトロウイルスベクターに挿入した。
【０１１６】
対照偽-粒子は、VSV-G糖タンパク質（Negreら，2000）、RD114ウイルスエンベロープ糖タンパク質（Sandrinら，2002）及び/又は会合-欠損MLV核タンパク質（MLV-G2A)（Swanstromら，1997）を用いて作製した。
【０１１７】
簡単に言えば、発現コンストラクトは、製造者の推薦に従うリン酸カルシウムトランスフェクションプロトコール（Clontech，France）を用いて、前日に10cmプレートに播いた2.5×106 293T細胞にトランスフェクトした。培地（8ml/プレート）をトランスフェクションの16時間後に交換した。偽-粒子を含む上清を24時間後に採取し、0.45μm−孔-サイズ膜で濾過し、上記のようにして処理した（Negreら，2000）。
【０１１８】
偽-粒子の構造成分のイムノブロット分析
トランスフェクト細胞及び20%ショ糖-クッションでペレット化した偽-粒子の溶解物をイムノブロットした。西ナイル熱ウイルス又はデング熱ウイルス又は黄熱ウイルス由来のprM及びE糖タンパク質、及びMLV核タンパク質の発現は、前に述べたように、prM及びEに対するモノクローナル抗体(P Despres, Institut Pasteur, Parisから戴いた)及び抗-カプシド(MLV CA)抗血清(ViroMed Biosafety Laboratories, USA)によって確認した(Sandrinら, 2002)。対照偽-粒子中で発現したVSV-Gは、モノクローナル抗体P5D4(Sigma-Aldrich, France)で検出した。
【０１１９】
トランスフェク細胞のイムノブロット分析により、偽-粒子の構造成分が容易に予想の分子量で検出される、ことが判った；すなわち、prM糖タンパク質は30 kDa、E糖タンパク質は60 kDa、VSV-G糖タンパク質は60 kDa及びRD114糖タンパク質は70 kDa。 MLV核タンパク質は、MLVプロテアーゼによって一部分が未熟核成分に処理される65 kDaのGagタンパク質前駆体として検出した。gag遺伝子のみを用いて処理された場合に、gagタンパク質がpol遺伝子によってコードされるウイルスプロテアーゼが存在しない結果として、gagタンパク質が発現したことを除いて、レトロウイルス核タンパク質がgag及びpol遺伝子によってコードされているか又はgag遺伝子のみによってコードされているかによって発現パターンに差は認められなかった。
【０１２０】
prM及びE糖タンパク質は、ウイルス会合-欠損MLV-G2A変異体ではなく、野生型-MLV核粒子で生成した精製ビリオンのペレット中に容易に検出された。
【０１２１】
プロデューサー細胞溶解物に対するウイルスペレット中のVSV-G又フラビウイルス糖タンパク質の相対的レベルの比較は、prM及びEのウイルス粒子への効率的な取り込みを示唆した。同様に、prM及びE糖タンパク質は、HIV-1由来のレトロウイルス核タンパク質に効率的に会合できた。
【０１２２】
これらの結果は、293T細胞中のprM及びEの一時的過剰-発現が、レトロウイルス核で生成した偽-粒子へのフラビウイルス糖タンパク質の特異的かつ効率的な取り込みをもたらした、ことを示す。フラビウイルスはERから出芽するので、これは、FVppがERルーメンへの出芽によって形成するか、又はprME分画がMLV出芽が通常起こる細胞表面に到達する、ことを示す(Swanstrom及びWills, 1997)。
【０１２３】
実施例２: FVpp細胞株感染力
西ナイル熱ウイルス又はデング熱ウイルスで生じるFVppの感染力は、次の標的細胞株で評価した：Helaヒト上皮腺癌(CCL-2)、TE671ヒト横紋筋肉腫(ATCC CRL-8805)及びVERO African green monkey腎(CCL-81)。
【０１２４】
標的細胞（前日に、8×104細胞/12-ウェルプレートに播種）をFVppを含むプロデューサー細胞からの上清希液で3時間インキュベートし、次いで洗浄し、ビリオンによって提供されるGFPマーカー遺伝子の発現を72時間後にFACS分析によって評価するまで培養した(Sandrinら, 2002)。FVppは複製-欠損ウイルス成分によって生成するので、この方法は、1循感染過程後の偽-粒子の特異的感染力の評価を可能にした。
【０１２５】
5×104TU/mlまでの感染力価は、VERO African green monkey細胞上に西ナイル熱ウイルスによって生成するFVppを評価した(図2)。超遠心分離放によるプロデューサー細胞上清の濃度から、106TU/mlの感染力価の平均を容易に得た。
【０１２６】
AZT、すなわち集積-コンピテントプロウイルスDNAとしてFVppのレトロウイルスRNAゲノムの変換を阻害する逆-転写阻害剤によって、FVpp及び標的細胞をインキュベーションすると、形質導入が阻害された(図2)。
【０１２７】
更に、GFPの長期発現は、1ケ月以上の間の感染細胞の連鎖継代後に明らかとなった。
【０１２８】
これらの結果は、標的細胞の感染が、宿主細胞における集積、及びFVppによって形質導入されるGFPマーカー遺伝子の安定発現を招く、ことを示した。加えて、prM及びE糖タンパク質得を欠損又は核タンパク質を欠損したウイルス粒子を用いても、あるいはthe MLV-G2A会合-欠損核タンパク質を用いた場合にも、感染は起こらなかった(図2)。
【０１２９】
Hela及びTE671細胞上に西ナイル熱ウイルスprM及びE糖タンパク質を提供するFVpp、及びVero、Hela及びTE671細胞上にデング熱ウイルス糖タンパク質によって生成するFVppでも、同様な結果が得られた。
【０１３０】
最後に、西ナイル熱ウイルスprM及びE糖タンパク質を提供するFVppの感染力は、不活性化西ナイル熱ウイルスで免疫したマウス由来の血清(図2)、及び西ナイル熱ウイルスワクチン候補又は西ナイル熱ウイルス糖タンパク質に対する精製抗体によって中和することができた。
【０１３１】
更に、これらの結果は、prM及びE糖タンパク質及びレトロウイルス核タンパク質を提供するFVppが、感染性であり、そのベクターゲノムのレトロウイルス-介在集積を招く、ことを証明した。これらデータは、FVppが野生型フラビウイルスによる初期感染事象に酷似し、抗生物質等の中和化合物を検出するための、有用な生物学的研究における安全な感染検定として利用することができる、ことを示している。
【０１３２】
実施例３：西ナイル熱ウイルスから得られた偽-粒子の宿主-範囲
西ナイル熱ウイルス(WNVpp)、デング熱ウイルス(DENpp)又は黄熱ウイルス(YFVpp)由来のprM-E糖タンパク質を有する偽-粒子の宿主範囲を、脊椎動物の標的細胞群に対するそれらの感染力を測定することによって試験した(表1)。齧歯類及び霊長類を含む幅広い細胞種がWNVppによる感染を許容することが判った。
【０１３３】
【表１】
2007527205.tif 000003
【０１３４】
C型レクチン、例えばVERO、Huh-7又はHeLa標的細胞中のL-SIGNの異所発現は、偽-粒子の感染力をHeLa細胞中のWNVppの30倍まで刺激することが判った(表1)。一方、VSV-G又はRD114糖タンパク質によって得られた対照偽-粒子は、C型レクチンの発現に感受性でなかった(表1)。WNVppの感染力の増強におけるL-SIGNの役割を更に分析するために、ビリオン及び細胞表面間の相互作用を研究した。第一に、L-SIGNの発現によって、WNVppの標的細胞表面への結合が10倍まで増加することが判った。第二に、WNV E糖タンパク質の153番アミノ酸のN-グリコシル化の除去が、WNVppにおいて、C型レクチンに対する感受性の著しい減少をもたらした。これは、標的細胞表面に対する結合の減少及び感染力によって明らかとなった。第三に、C型レクチンは、フラビウイルスの受容体成分の１つを形成し、おそらく細胞表面に対するビリオンを捕獲することによって感染を刺激する、ことを示している。
【０１３５】
結論として、本発明は、prME糖タンパク質(プロセシング、突然変異)のウイルス会合の正確な研究を可能にするツール、及びフラビウイルスの細胞進入におけるその役割を提供する。レトロウイルス及びレンチウイルス核上へのprME糖タンパク質の正確な会合には、prME糖タンパク質の構造的修飾は必要とされず、機能性prME糖タンパク質を有する高力価感染性FVppを生成することができる。マーカー遺伝子のFVppへの挿入は、フローサイトメトリーによる偽-粒子の感染力の正確かつ迅速な測定を可能にした。
【０１３６】
これらの感染性、フラビウイルス偽-粒子の開発により、フラビウイルス感染の初期事象、例えば新規なフラビウイルス受容体(複数)又は共-受容体(複数)の同定、を研究することができ、血清変換患者における中和抗体の検出のための診断検定を実行することができ、並びにフラビウイルス感染に対する有効な阻害剤、例えば免疫学的阻害剤、ワクチン及び中和抗体、及び薬理的阻害剤を開発することができる。
【０１３７】
参考文献
Ausubel F. M. et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994). 
Combredet C, Labrousse V, Mollet L, Lorin C, Delebecque F, Hurtrel B, McClure H, Feinberg MB, Brahic M, Tangy F. A molecularly cloned Schwarz strain of measles virus vaccine induces strong immune responses in macaques and transgenic mice. J Virol. 2003 Nov; 77 (21): 11546-54. 
Felgner et al. Science 337,387-388. (1989). 
Guguen-Guillouzo and Guillouzo. Methods for preparation of adult and fetal hepatocytes. p 1-12. In A. Guillouzo and C. Guguen-Guillouzo (ed.), Isolated and cultured hepatocytes. Les Editions INSERM Paris. John Libbey and Co, Ltd., London, United Kingdom (1986). 
Hubalek,Z., and J. Halouzka. 1999. West Nile fever-a reemerging mosquito-borne viral disease in Europe. Emerg. Infect. Dis. 5: 643-650 Lanciotti, R. S., A. J. Kerst, R. S. Nasci, M. S. Godsey, C. J. Mitchell, H. 
M. Savage, N. Komar, N. A. Panella, B. C. Allen, K. E. Volpe, B. S. Davis, and J. T. Roehrig. 2000. Rapid detection of West Nile virus from human clinical specimens, fietd-coitected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay. J. Clin. Microbiol. 38: 4066-4071. Nakabayashi H. et al, GancerRes42, 3858-63. (1982). 
Lorin C, Mollet L, Delebecque F, Combredet C, Hurtrel B, Charneau P, Brahic M, Tangy F. A single injection of recombinant measles virus vaccines expressing human immunodeficiency virus (HIV) type 1 clade B envelope glycoproteins induces neutralizing antibodies and cellular immune responses to HIV. J Virol. 2004 Jan; 78(1): 146-57. Negre D. et al., Gene Ther 7, 1613-1623 (2000). 
Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989). 
Sandrin V. et al, Blood 100, 823-832 (2002). 
Swanstrom R., Wills J. W., in Retroviruses J. M. Coffin, S. H. Hughes, H. E. Varmus, Eds. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 1997) pp. 263-334. 
Wu et al., (1988) J. Biol. Chem. 263: 14621-14624. 
Wu et al., (1992) J. Biol. Chem. 267: 963-967.
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１Ａ】図１Ａは、フラビウイルスprME及びレトロウイルスの発現コンストラクトを示す。フラビウイルスポリタンパク質遺伝子由来のcDNAをprM及びE糖タンパク質、及びprM (SP prM)のシグナルペプチドを提供するCタンパク質のカルボキシ-末端を発現するために使用した。タンパク質の翻訳を終了するための、発現コンストラクトに挿入された終止コドン（スター）の位置を示す。prMの膜貫通型ドメイン（TMD）は、E糖タンパク質のシグナルペプチド(SP E)を提供する。NTRは、非-翻訳領域である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、フラビウイルスprME及びレトロウイルスの発現コンストラクトを示す。感染性偽-粒子を会合するために必要な異なった成分をコードする発現コンストラクトを示す。充填ボックスは、ウイルス遺伝子及び感染細胞に導入されたマーカー遺伝子（GFP）を示す。オープンボックスは、シス-作用配列を示す。LTRは、長期反復配列；CMVは、ヒトサイトメガロ・ウイルスの隣接初期プロモーター(immediate-early promoter);PBSは、プライマー結合部位；Ψは、パッケージング配列；PPTは、ポリ-プリントラック；ポリAは、ポリアデニル化部位、を示す。ベクタター粒子を、パッケージング機能、導入ベクター及びウイルス糖タンパク質（GP）を293T細胞に提供するプラスミドの共トランスフェクションによって製造した。ウイルスGPは、ΔCprMEポリタンパク質(図6A)、VSV-G又はRD114糖タンパク質を発現した、西ナイル熱ウイルス、デング熱ウイルス及び黄熱ウイルスprM及びE糖タンパク質であった。トランスフェクト細胞の上清を一時的発現中に回収し、超遠心分離によって濃縮し、標的細胞形質導入に使用した。
【図２】図２は、prM及びE糖タンパク質(prMEなし)なし、レトロウイルス核タンパク質(核なし)なし、MLV-G2会合-欠損核タンパク質(G2A核変異体)あり、同一のベクターからシス(核prME)発現したprM及びE糖タンパク質あり、の条件で生成したFVppの感染力の結果を示す。FVppを、25μM AZT(3'-アジド-3'-デオキシチミジン;Sigma-Aldrich, France) (核prME+AZT)、又は標的細胞の感染前後にprM-E免疫遺伝子(核prME+N-血清)で免疫した動物由来の1/50希釈血清で処理した。TU/mlで表わされる感染力価は、Vero標的で測定し、4実験までの平均標準偏差として表わした。
2007527205.tif 000004
【図２】
2007527205.tif 000005
【配列表】
2007527205000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月17日(2007.5.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
−パッケージング・コンピテントレトロウイルス-由来ゲノムを含む第一核酸配列を提供すること；
−前記レトロウイルスから核タンパク質をコードするcDNAを含む第二核酸配列を提供すること；
−フラビウイルス核タンパク質、及びフラビウイルスprMタンパク質及び/又はフラビウイルスEタンパク質を連続的に含むポリタンパク質をコードするcDNAを含む第三核酸配列を提供すること；
−前記核酸配列で宿主細胞をトランスフェクトし、次いで、cDNAの発現によりフラビウイルス及びレトロウイルスから構造タンパク質を産生させるために十分な時間、当該トランスフェクトされた細胞を培養中に維持すること；並びに
−当該構造タンパク質をウイルス-様粒子に形成すること
を含む、フラビウイルス-様粒子のex vivo製造方法。
【請求項２】
前記パッケージング・コンピテントレトロウイルス-由来ゲノム及び核タンパク質が、MLV、ALV、RSV、MPMV、HIV-1、HIV-2、SIV、EIAV、CAEV又はHFVからなる群より選ばれるレトロウイルス由来である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記フラビウイルス核タンパク質が、核タンパク質シグナルペプチドを含むフラビウイルス核のカルボキシ-末端である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記ポリタンパク質が、フラビウイルス核タンパク質及びフラビウイルスprMタンパク質を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記ポリタンパク質が、フラビウイルス核タンパク質及びフラビウイルスEタンパク質を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
天然フラビウイルスprM及び/又はEタンパク質を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記ポリタンパク質が、フラビウイルス核タンパク質、天然フラビウイルスprMタンパク質及び天然フラビウイルスEタンパク質を含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記核、prM及びEフラビウイルスタンパク質が、同一のフラビウイルス由来である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記フラビウイルスが、西ナイルウイルス、デング熱ウイルス及び黄熱病ウイルスからなる群より選ばれる、請求頁１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
パッケージング・コンピテントレトロウイルス-由来ゲノムを含む前記核酸配列が、導入遺伝子を更に含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
レトロウイルス由来の核タンパク質、及びフラビウイルスprM糖タンパク質及び/又はフラビウイルスEタンパク質を含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法によって取得できる感染性フラビウイルス-様粒子。
【請求項１２】
prM及びEフラビウイルス糖タンパク質を含む、請求項１１記載の感染性粒子。
【請求項１３】
prMフラビウイルス糖タンパク質を含む、請求項１１記載の感染性粒子。
【請求項１４】
Eフラビウイルス糖タンパク質を含む、請求項１１記載の感染性粒子。
【請求項１５】
天然prM及び/又はEフラビウイルス糖タンパク質を含む、請求項１１〜１４のいずれか１項記載の感染性粒子。
【請求項１６】
前記レトロウイルスが、MLV、ALV、RSV、MPMV、HIV-1、HIV-2、SIV、EIAV、CAEV又はＨＦＶからなる群より選ばれる、請求項１１〜１５のいずれか１項記載の感染性粒子。
【請求項１７】
前記フラビウイルスが、西ナイルウイルス、デング熱ウイルス及び黄熱病ウイルスからなる群より選ばれる、請求頁１１〜１６のいずれか１項記載の感染性粒子。
【請求項１８】
パッケージング・コンピテントレトロウイルス-由来ゲノムを含む前記核酸配列が、導入遺伝子を更に含む、請求項１１〜１７のいずれか１項記載の感染性粒子。
【請求項１９】
3種の核酸配列を含む、フラビウイルス感染症に対するワクチンとして有用な医薬であって、当該核酸配列が
−パッケージング・コンピテントレトロウイルス-由来ゲノムを含む第一核酸配列；
−前記レトロウイルス由来の核タンパク質をコードするcDNAを含む第二核酸配列；
−フラビウイルス核タンパク質、及びフラビウイルスprM及び/又はフラビウイルスEタンパク質を連続的に含むポリタンパク質をコードするcDNAを含む第三塩核酸配列；並びに
−対象の細胞に導入される場合には、フラビウイルス及びレトロウイルス由来の構造タンパク質の製造を可能にする核酸配列、ここで、当該構造タンパク質は免疫原性であるウイルス-様粒子を形成する、
である、前記医薬。
【請求項２０】
請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の感染性粒子の結合を検出することを含む、フラビウイルスprM及び/又はE糖タンパク質に対する受容体のex vivo同定方法。
【請求項２１】
次のステップ：
−フラビウイルスの受容体である可能性が高いタンパク質をコードする核酸配列によって、フラビウイルス感染を許容しない細胞をトランスフェクトすること、
−当該形質転換細胞を、請求項１１〜１８のいずれか１項記載のフラビウイルス-様粒子と接触させること；
−当該形質転換細胞がフラビウイルス感染を許容するようになったか否かを決定すること；及び
−許容するようになった当該形質転換細胞によって発現される当該タンパク質を、フラビウイルスに対する細胞受容体として同定すること
を含む、フラビウイルスに対する細胞受容体のex vivo同定方法。
【請求項２２】
次のステップ：
−フラビウイルス感染許容細胞から取得される発現cDNAライブラリーを提供すること；
−当該発現cDNAライブラリーによって、フラビウイルス感染を許容しない細胞をトランスフェクトすること；
−当該形質転換細胞を、請求項１１〜１７のいずれか１項記載のフラビウイルス-様粒子と接触させること；
−フラビウイルス感染を許容するようになった当該形質転換細胞を同定及び単離すること；
−許容するようになった細胞中でトランスフェクトされた当該発現ベクターを単離すること；及び
−当該単離発現ベクターのcDNA配列によってコードされるタンパク質を、フラビウイルスに対する受容体として同定すること
を含む、フラビウイルスに対する細胞受容体のex vivo同定方法。
【請求項２３】
候補分子の存在又は非存在下で、請求項１１〜１７のいずれか１項記載の感染性粒子による細胞感染レベルの比較を含む、細胞におけるフラビウイルス進入を妨害することができる分子のex vivoスクリーニング又は同定方法。
【請求項２４】
患者の生物試料中に存在するらしい抗-フラビウイルス抗体と、請求項１１〜１７のいずれか１項記載のフラビウイルス-様粒子との相互作用によって形成される免疫複合体を検出することを含む、in vitroアッセイ法であって、当該アッセイの結果が当該患者のフラビウイルス感染症を診断するために使用される、前記方法。
【請求項２５】
請求項１１〜１７のいずれか１項記載のフラビウイルス-様粒子による許容細胞の感染に対する、患者の生物試料中に存在するらしい抗-フラビウイルス抗体の阻害効果を検出することを含む、in vitroアッセイ法であって、当該アッセイの結果が当該患者のフラビウイルス感染症を診断するために使用される、前記方法。
【請求項２６】
請求項１１〜１７のいずれか１項記載のフラビウイルス-様粒子及び当前記免疫複合体の好適な検出手段を含む、請求項２５記載の方法に有用な診断キット。
【請求項２７】
請求項１１〜１８のいずれか１項記載のフラビウイルス-様粒子及び薬学的に許容される担体を含む、ワクチン組成物。
【請求項２８】
請求項１１〜１７のいずれか１項記載のフラビウイルス-様粒子で細胞を感染させることを含む、標的細胞における対象導入遺伝子のin vitro導入方法であって、ここで当該フラビウイルス-様粒子は対象導入遺伝子を運ぶ、前記方法。
【請求項２９】
対象導入遺伝子を運ぶ請求項１１〜１７のいずれか１項記載のフラビウイルス-様粒子を含む、患者の疾患の予防又は治療医薬であって、ここで当該フラビウイルス-様粒子は、当該患者の細胞に対象導入遺伝子を導入させることができ、当該疾患に対する予防的又は治療的効果を有する産物をコードする、前記医薬。
【請求項３０】
−パッケージング・コンピテントレトロウイルス-由来ゲノムを含む第一核酸配列；
−当該レトトウイルス由来の核タンパク質をコードするcDNAを含む第二核酸配列；及び
−フラビウイルス核タンパク質、及びフラビウイルスprMタンパク質及び/又はフラビウイルスEタンパク質を連続的に含むポリタンパク質をコードするcDNAを含む第三核酸配列
を含む形質転換宿主細胞。
【請求項３１】
候補分子の存在又は非存在下、請求項３０で定義された形質転換細胞の、標的宿主細胞に対する比融合レベルの較を含む、細胞におけるフラビウイル進入を妨害することができる分子のex vivoスクリーニング又は同定方法。
【請求項３２】
次のステップ：
−シンシチウム形成、すなわち細胞-細胞融合を可能にする条件、及び任意の候補分子の非存在下での標的宿主細胞においてフラビウイルス-様粒子進入を可能にする条件で、候補分子の存在又は非存在下に、形質転換宿主細胞を標的宿主細胞と共-培養すること；
−前記候補分子の非存在及び存在下でシンシチウム形成を評価すること；
−前記候補分子の存在下で測定されたシンシウム形成と、任意の候補分子の非存在下で測定されたシンシウム形成とを比較すること；及び
−前記分子の存在下で測定されたシンシウム形成が任意の候補分子の非存在下で測定されたシンシウム形成に比較して減少するような候補分子を、フラビウイルスを妨害することができる分子として同定すること
を含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記フラビウイルスが西ナイル熱ウイルス、デング熱ウイルス及びハロー熱ウイルス(Hellow fever virus）からなる群より選ばれる、請求項２０〜２５、２８、３１及び３２のいずれか１項記載の方法。
【国際調査報告】
2007527205.tif 000020
2007527205.tif 000021
2007527205.tif 000022
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