(57)【要約】  基板（４）上の有機吸着体層（７）を解析するための方法は、解析される有機吸着体の屈折率に等しいか近い屈折率を有する表面を持つ基板（４）を設けるステップを含む。基板（４）の表面に、生体物質の屈折率を持つ少なくとも１つの層（５）を持つ層システム（５、６）が塗布され、層システムの上に有機吸着体層（７）が塗布される。基板上に偏光光を作用させると、反射および／または透過における偏光特性の変化が検出される。
2007527999.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上の有機吸着体層を解析するための方法であって、
・解析される有機吸着体の屈折率に等しいか近い屈折率を有する表面を有する基板を設けるステップと、
・前記基板の前記表面に、前記生体物質の屈折率とはかなり異なる屈折率を持つ少なくとも１つの層を含む層システムを塗布するステップと、
・前記層システムの上に前記有機吸着体の層を塗布するステップと、
・前記基板上に偏光光を作用させるステップと、
・前記基板に作用させた前記光の反射および／または透過における偏光特性の変化を検出するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記基板に作用させた前記光の反射および／または透過振幅を検出するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ガラスおよびプラスチック材の群から基板材料を選択するステップを含む、上記請求項のいずれかひとつに記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの層がＴａ２Ｏ５、Ｎｂ２Ｏ５、ＴｉＯ２、ＨｆＯ２、ＺｒＯ２、ＭｇＦ２の群から選択されることを特徴とする、上記請求項のいずれかひとつに記載の方法。
【請求項５】
解析される吸着体層の変化に対する所望の好ましくは最高感度を可能にする最適な応答をもたらすために、前記層システムの層の層厚分布を最適化するステップを含む、上記請求項のいずれかひとつに記載の方法。
【請求項６】
接触層および／または解析される吸着体層との界面を形成する最上層としてＳｉＯ２を選択するステップを含む、上記請求項のいずれかひとつに記載の方法。
【請求項７】
構造化された層システムを塗布することにより、異なる吸着体層特性に対して最高感度を持つ複数のサブエリアを形成するステップを含む、上記請求項のいずれかひとつに記載の方法。
【請求項８】
上記請求項のいずれかひとつに記載の方法のステップを含むイメージングエリプソメトリを実行する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、表面で生体関連分子の吸着および結合プロセスを検出するためのバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
生体関連分子の結合反応、例えば抗体抗原反応の検出は、薬学的薬剤スクリーニングのような多くのバイオ技術分野で重要な役割を果たす。そのような反応をモニタするには、関連分子種の少なくとも１つに付着した蛍光標識を使用する光度検出が、一般的な技術である。
【０００３】
しかし、分子を標識化するための追加的な手間以外に、そのようなマーカの存在は、反応動態を変化させる疑いがある。したがって、関心のある分子に対する蛍光標識、ナノ粒子、または放射性マーカのようなマーカの付着を必要としないマーカ無しの検出方式の重要性が高まっている。
【０００４】
表面で分子の結合反応またはより一般的に分子の吸着もしくは沈降の直接検出を可能にする、幾つかのマーカ無しの検出方式が開発されている。表面は、化学特異的になるように調整することができる。免疫反応の場合、これは、化学的に前処理された表面に抗体を固定化し、その後適切な検出システムによりプローブされた溶液から抗原を結合することによって達成することができる。検出は、感知面を溶液に接触させて、または事前に溶液を除去した後空気に接触させて、行なうことができる。吸着動態の詳細なモニタリングを可能とする計器は、特定の分子種の有無をプローブするバイナリ検出方式と同様に公知である。
【０００５】
特に、光学検出技術は成功裏に適用され、遠隔的非接触感知が可能になった。これらの技術の多くに共通する特徴は、強度の変化の測定、検査面で反射または透過するプローブ光の偏光の位相または状態の測定、あるいはこれらの組合せである。この主要な物理的効果は、層の誘電特性または幾何学的な層の厚さの変化のいずれか、あるいは両方のため、吸着体層の光学的厚さの変化によって生じる。
【０００６】
エリプソメトリ（ｅｌｌｉｐｓｏｍｅｔｒｙ）は、光学層の厚さ、または成長中のその変化を決定するための周知の技術である。電磁放射線が試料によって反射または透過されるときの偏光の状態の変化を敏感に測定する。そのような装置の古典的な実施形態は、直線偏光子（Ｐ）と４分の１波長板（Ｃ）の形の補償器との組合せによって与えられる可変偏光制御器を通過する、視準光ビームを放出する光源によって与えられる。偏光光ビームは、既知の傾斜角度で試料（Ｓ）に入射し、試料表面で反射し、光検出器の助けを借りて第２の直線偏光子（Ａ）によって解析される。このＰＣＳＡのエリプソメータ構成では、測定は、Ｃの光軸を一定の方位角に、例えば入射面に対して４５°に維持しながら、光検出器が最小限の強度を受光するまで、構成部品ＰおよびＡの方位角を変化させることによって行なうことができる。この「ヌル化」状態の場合の構成部品Ｐ、Ｃ、およびＡの方位角は、所与の入射角および光の波長における試料の光学パラメータに特異的なエリプソメトリック角度デルタおよびプシーを計算するために使用することができる。適切な光学モデルおよび数値回帰を使用して、数量デルタおよびプシーは、光学層の厚さまたは成長過程におけるそれらの変化の観点から再計算することができる。
【０００７】
この古典的なヌル化エリプソメータ以外に、多数の他の形のエリプソメータが実現されており、その中の幾つかは、偏光解消効果の根拠である２つのエリプソメトリック角度またはシステムのうちの１つしか測定しない。
【０００８】
生体分子の結合反応のモニタリングに対するエリプソメトリの適用は、１９４２年に遡る（Ａ．Ｒｏｔｈｅｎ、Ｋ．Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ、７６、４３７（１９４２））。結合反応中に表面に吸着された生体物質の量は、数量デルタおよびプシーから再計算することができる。
【０００９】
先行技術として、空間分解検出器および結像光学系を使用して例えばデルタおよび／またはプシーマップの形でエリプソメトリックデータの超並行測定を可能にする、イメージングエリプソメトリ（ｉｍａｇｉｎｇ  ｅｌｌｉｐｓｏｍｅｔｒｙ）（米国特許第５，０７６，６９６号）もある。そのようなマップは次に、吸着物質の層厚さ、光屈折率、化学組成、または量の表面マップに変換することができる。往々にしてバイオセンサは、複数の分子種の高スループットスクリーニングが同時に可能となるように、スポットまたはウェルの配列の形で設計される。その固有の並行検出方式を持つイメージングエリプソメトリは、これらのいわゆるバイオチップ、マイクロアレイ、またはマイクロプレートのための検出技術として有利に使用することができる（Ａ．Ｅｉｎｇ、Ｍ．Ｖａｕｐｅｌ、「Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｅｌｌｉｐｓｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、２００２、ＩＳＢＮ３‐９８０７２７９‐６‐３）。
【００１０】
イメージングエリプソメトリは、測定される表面に入射し測定に使用される光が周囲の媒体から来ることによって実証されてきた。他の測定構成は、例えば米国特許第６，５９４，０１１号に記載されるように全内部反射に基づく。ここで、光源からの光は内部反射素子を通って、検出対象の試料で反射するように方向付けられる。
【００１１】
吸着される物質の量は通常非常に小さく、ナノメートルまたはそれ以下の範囲の厚さ変化に相当し、タンパク質またはＤＮＡのような多くの関心物質は、容易にアクセス可能なＵＶ‐ＶＩＳ‐ＮＩＲ波長領域で顕著な光吸収を示さないので、光検出のための信号応答は充分に高くなく、よって感度が限定されることが非常に多い。
【００１２】
したがって、一部のイメージングエリプソメータは、光検出のための信号応答を高めるために表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用する。ＳＰＲは薄い金属層を使用して、表面プラズモンの励起および伝搬を可能にする。金属層の片面は透明な支持構造と接触し、通常プリズムに付着されて、傾斜角度下で光と結合することが可能になる一方、層の反対側は周囲媒体に露出される。吸着体層の形成による周囲の光屈折率の変化は、表面プラズモン共鳴を発生させ、反射光強度の変化を引き起こす入射角の変化としてモニタされる。
【００１３】
ＳＰＲをベースとするセンサの場合、例えば米国特許第５，９９９，１４８号に記載されているように、金属膜とプローブされる表面との間の中間誘電体層が、感度をさらに高める手段として働くことができることが知られている。この特許は、光屈折率の高い酸化物を含むそのような中間層の使用を記載しており、所望の性能を達成するための特定の層厚さの重要性に言及している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明が解決しようとする先行技術の問題
エリプソメトリは、薄膜用途、特に半導体の領域に使用では、非常に成功している。しかし、解析される吸着体層が、下にある基板の光屈折率に等しいか近い光屈折率を持つ場合、エリプソメトリック検出の感度は非常に限定される。これは、そのような場合、吸着
体層が基板との有意の光学界面を形成しないので、この界面に光学干渉が全く発生しないか、あるいは弱い光学干渉しか発生しないためである。したがって、吸着体層の厚さの変化は、下にある基板の厚さの変化に匹敵し、結果的に検出可能な位相シフト効果を生じるだけである。非常にしばしば、ガラスまたは透明なプラスチック材は、生体物質を測定するために使用するのに好適な基板材料である。残念ながら、タンパク質またはＤＮＡのような生体物質光屈折率は、ガラスまたは透明なプラスチック材のそれに近く、そのような基板に吸着された有機物質の場合のエリプソメトリック検出の感度は限定される。
【００１５】
したがって、本発明の目的は、エリプソメトリック測定で、表面プラズモン共鳴以外の作用の結果もたらされる改善された光学応答を提供する基板試料を開示することである。この文脈における改善とは、吸着体層の測定に対する感度の向上および／またはより優れた線形性および／またはダイナミックレンジの増大を意味する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の開示
該問題は、検出対象の吸着体層とはかなり異なる光屈折率を持つ少なくとも１つの誘電体層を含む増幅層システムを基板に塗布することによって解決する。その結果、少なくとも１つの有意の光学界面が吸着体層と基板との間に確立され、光学界面効果がより顕著になる。誘電体層システムは、吸着体層の厚さの変化の結果、かなりの位相シフトが発生し、したがってエリプソメトリック測定における改善された光学応答が導かれるように選択することができる。
【００１７】
増幅層システムの設計を最適化するために、吸着体層の厚さの関数としてのエリプソメトリック角度の応答を計算しなければならない。該計算自体は、Ｒ．Ｍ．Ａ．ＡｚｚａｍおよびＮ．Ｍ．Ｂａｓｈａｒａ著「Ｅｌｌｉｐｓｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  Ｌｉｇｈｔ」、Ｎｏｒｔｈ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９７７に記載されているように、周知の手順によって行なうことができる。感度の増大を確立するためには、最適化の目標は、吸着体層の層厚さの関数としての測定エリプソメトリック角度の勾配を大きくすることである（通常、デルタは非常に薄い膜の場合、より敏感である）。より大きい勾配はより高い感度を表わす。しかし、同時に、測定手順中の検出器における信号応答も充分でなければならない。エリプソメータの検出器応答のための方程式もまた、Ｒ．Ｍ．Ａ．ＡｚｚａｍおよびＮ．Ｍ．Ｂａｓｈａｒａ著「Ｅｌｌｉｐｓｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  Ｌｉｇｈｔ」、Ｎｏｒｔｈ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  １９７７に記載されている。
【００１８】
信号応答およびデルタ勾配の両方を均衡させることによって、本発明に係る特定の設計の中間層システムに対し、実際の測定の最適な感度を見出すことができる。
【００１９】
目的が特定の厚さ範囲の吸着体層でバイオセンサの線形応答を実現することである場合、光学応答の線形性をもたらす設計が優先されるように最適化の目標を修正して、上述した方法に従って増幅層システムのレイアウトをモデル化することができる。
【００２０】
本発明の１つの実施形態では、増幅層システムは単一の誘電体層のみを含む。この層の屈折率は、吸着体層の屈折率より低いか高いかのいずれかである。しかし、本発明の別の実施形態では、中間層システムは、交互の屈折率を持つ材料の複数の層を含む。
【００２１】
中間層システムの光学設計に応じて、センサは、ＴＩＲ条件を含むが必ずしもそれに限らず、様々な入射角度で働く。
【００２２】
増幅層システムは、リンカ化学および／または接触層および／または活性層および／ま
たは所望の表面化学特性を形成するために必要な他の追加的中間層を含むことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
増幅層システムの最適なレイアウトはバイオセンサの動作条件に依存するので、実施例として、結合動態の測定のためにＰＣＳＡエリプソメータを使用して、測定構成について記載する。そのような装置は、第１直線偏光子（Ｐ）および４分の１波長板（Ｃ）の形の補償器の組合せによって得られる可変偏光制御器を通過する視準光ビームを放出する光源を含む。偏光光ビームは試料基板（Ｓ）に既知の傾斜角度で入射し、試料基板の感知面から反射し、光検出器の助けを借りて第２直線偏光子（Ａ）によって解析される。
【００２４】
そのような測定の場合、感知面は、それに吸着または結合する分子種の溶液と接触していなければならない。これは、表面上における被分析物質の制御された流れを可能にするフローセル内、またはマイクロプレートのウェル内で行なわれることが好ましい。感知面はそのようなフローセルまたはマイクロプレートのウェルの底面を形成し、光のビームは基板試料の基板中を感知面まで伝搬し、感知面で反射する。
【００２５】
我々の実施例では、測定中に、光ビーム１は、図１に示すように、カップリングプリズム２に入り、光学接触層３を基板４および吸着体層７まで透過する。
【００２６】
カップリングプリズム２は、全内部反射の臨界角より高い入射角により、基板４を通して感知面を照射するために使用される。エリプソメトリの感度は入射角に強力に依存するので、カップリングプリズム２を使用することにより、より高い内角に達することが有利である。
【００２７】
しかし、プリズムまたは他のカップリング装置を必要とすることなく、低い内角を生じる直接照射でも依然として、適切な増幅層を使用することにより、一部の用途には充分な間とを導くことができ、この場合、好適な解決策であろう。我々の実施例では、カップリングプリズム２はＢＫ７から作製されたが、いずれかの他の透過ガラスまたはプラスチックタイプを使用することができる。場合によっては、偏光解消効果を回避するために、低応力複屈折性を持つガラスを使用することが有利であるかもしれない。
【００２８】
光学接触層３は、カップリングプリズム２と基板４との間の界面からの追加的反射を回避するために使用される。光学接触層３は、例えば屈折率整合オイルのような屈折率整合流体とすることができる。
【００２９】
図１から分かるように、本発明に係る増幅層システム５は、基板４の頂面に設けられる。我々の実施例では、増幅層システム５は、ガラス基板上に堆積された高光屈折率材料の単一の誘電体層を含む。該層は、有機吸着体層の高感度および高線形測定を可能にする厚さを有する。この単一の誘電体層の厚さは増幅層として働くために極めて重要であり、上述の通り光学モデリングから推測される。
【００３０】
実施例として、我々は、１．５２の光屈折率を持つ例えばＢＫ７のガラス基板４、２．２の光屈折率および０〜１５０ｎｍの可変厚さを持つ例えばＴａ２Ｏ５の単一の誘電体層を持つ増幅層システムを含むシステムをモデル化した。この増幅層の上に、吸着体層に接触層を提供するために、１．４６の光屈折率を持つ１０ｎｍのＳｉＯ２の層が塗布される。（そのような接触層が塗布される理由のさらなる詳細は下述する）。該吸着体層は１．５の光屈折率を有する。周囲媒体は１．３３３の光屈折率を持つ水と想定され、波長は６３２．８ｎｍであり、ガラス基板内の入射角は６０度であり、プリズムまたは他の光結合器が必要である。
【００３１】
表１は、光学モデリングによってシミュレーションした、増幅層がある場合とない場合の動態センサのエリプソメトリック性能の比較を示す。比較は、上述したＰＣＳＡヌル化エリプソメータの測定およびデータ解析プロセスを考慮に入れた性能指数（ＦＯＭ）に基く。増幅層の無いセンサは１のＦＯＭを有すると定義する。表１から分かるように、厚さ９０ｎｍの増幅層の場合、約３０の最大ＦＯＭに達することができ、薄層の吸着体分子の検出の感度が３０倍に増加することに対応する。したがって、この実施例の増幅層の場合、最適な厚さは９０ｎｍであるが、７０ｎｍないし１００ｎｍの層厚さが同様に優れた性能を示す。
【００３２】
多数の細部および代替例があり、以下でそれらについて述べる。
ａ）増幅層システム
上述した実施形態では、Ｔａ２Ｏ５の薄層を増幅層システムとして使用した。しかし、Ｎｂ２Ｏ５、ＴｉＯ２、ＨｆＯ２、またはＺｒＯ２のような他の材料を同様に使用することができる。Ｓｉ３Ｎ４のような窒化物も使用することができ、ＩＲ波長でＳｉさえも使用することができる。原則的に、吸着体層の屈折率より高いか低い光屈折率を有する任意の他の一般的な薄膜材料を使用することができる。屈折率の低い材料の一例としてＭｇＦ２がある。
【００３３】
さらに、増幅層システムとして光学多層システムを最適化して使用することが可能である。そのような多層システムは、高い屈折率と低い屈折率の交互層を含むことができる。そのようなシステムをモデル化するために、公知の転送行列法を適用することができる。そのようなシステムを最適化するために、例えば遺伝的アルゴリズムまたはシミュレーテッドサーマルアニーリング法のような公知の最適化技法を適用することができる。パラメータの数（層の厚さ）が増加するため、所望の光学応答を達成するための最適化に高い自由度が得られる。実施例として、我々は上記の実施例で、今や接触層として働くだけでなく実質的に増幅層構造の一部になった、ＳｉＯ２層の層厚さを増加する影響をモデル化した。９０ｎｍの厚さを持つＴａ２Ｏ５の最適化された単一増幅層から着手して、今、Ｓｉ０２の以前の接触層の厚さを１０ｎｍから２８０ｎｍの範囲で変化させる。上に定義した性能指数の結果を表２に掲げる。それは、ＳｉＯ２層が２５０ｎｍの厚さのとき、二重増幅層構造が吸着剤層の結合の理論的感度がさらに３倍に増大することを示す。
【００３４】
総合的な反射は、関係する全ての光学界面における反射成分のコヒーレントおよびインコヒーレントな重ね合せであることに注目されたい。分かり易くするために、それらの一部は図１では省かれている。
【００３５】
ｂ）接触層
上述した第１の実施例では、１０ｎｍのＳｉＯ２層を増幅層の上に塗布した。この接触層６は、化学特異的感知層の付着をさらに促進するために塗布された。そのような接触層６は、それが少なくとも部分的に透明であり、かつその光学的効果が充分にセンサのダイナミックレンジ内であることを前提として、常に増幅層システム５の上に塗布することができる。好適な形態では、この接触層は、数ナノメートルのＳｉＯ２の薄層、その後に続くシラン系リンカ化学および／または他の中間層、ならびに最終的に化学的感応層、例えば固定化抗体を含む。
【００３６】
他方、そのような接触層は、増幅層システムの一部とすることもできる。その場合、本発明に係る最適化はこの接触層の光学的効果を考慮に入れる。時々、上に示した通り、接触層自体の厚さを最適化パラメータとしても使用することができる。
【００３７】
ｃ）照射手段
我々の実施形態では、内部全反射の臨界角より高い照射をもたらすために、プリズムを使用した。プリズムの代わりに、ガラス基板４の底面に格子結合器を代替的に使用することができる。
【００３８】
ｄ）イメージングエリプソメトリ
エリプソメータに統合されたフローセルにこのセンサを取り付けることにより、被分析物質の溶液から形成される吸着剤層７の厚さもしくは表面被覆率、または結合動態の測定が可能になる。イメージングエリプソメトリを適用することにより、このバイオセンサは、複数の結合部位またはスポットを超並行的に同時にモニタすることができる。
【００３９】
ｅ）エリプソメータ構成および適用の代替例
このセンサの代替的形態は、底板としてマイクロプレートに組み込むことを含み、その場合各ウェルは個別に密閉されるバイオセンサを形成し、あるいは例えば高スループットのスクリーニング用に空気中でマイクロアレイと共に使用するための倒置設計を含み、その場合、光ビーム１は、図２にしたがって大気側から入射する。再び、増幅層システム５の厚さは光学モデリングによって最適化される。最大限の性能から譲歩することにより、センサ基板を液中および周囲空気中の両方で使用するように設計することも可能である。
【００４０】
ｆ）多数のサブエリア
別の変形は、単一の結合部位を複数のサブエリアに分割し、ダイナミックレンジまたは線形性で妥協することにより、各々が特定の吸着体層厚さまたは表面被覆率に対して最大感度を持つようにすることである。これは、増幅層をパターン形成し、その厚さを局所的に最適化することによって達成することができる。さらなる変形では、内部校正を可能にする、つまりエリプソメトリック信号の非特異的結合または温度ドリフトの効果を補償する基準チャネルとして働く、サブエリアを含めることができる。
【００４１】
マイクロプレートを使用する場合、または多数の検出部位を持つ大きい領域を解析する必要のある他の用途の場合、可能な変形は、局所的格子構造、マイクロプリズム、または浮出し面レリーフ構造を使用して、各々の個別ウェルまたは検出部位に対して光ビームを結合する。
【００４２】
ｇ）蛍光法との組合せ
別の変形は、国際公開番号ＷＯ９５／３３１９７および米国特許出願番号第２００２／１３５７８０の号ような格子および導波モード蛍光ベース検出との組合せである。格子構造は、共鳴外れ（ｏｆｆ−ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）モードで検出が行なわれる場合に支障を生じない。
【００４３】
【表１】
2007527999.tif 000003
【００４４】
【表２】
2007527999.tif 000004
【図１】
2007527999.tif 000005
【図２】
2007527999.tif 000006
【国際調査報告】
2007527999.tif 000007
2007527999.tif 000008
2007527999.tif 000009