(57)【要約】  細胞内への核酸の送達を増強するため、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドを核酸と混合する、複合体形成させる又はコンジュゲートさせる。輸送された核酸は、少なくとも一部ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により仲介された、標的遺伝子の発現を変調する阻害的低分子核酸（ｓｉＮＡ）として、標的細胞中で活性である。本発明のｓｉＮＡ／ポリペプチド組成物及び方法は、遺伝子発現を変調するための、及び、ｓｉＮＡ／ポリペプチド組成物が投与された標的細胞又は対象個体において、疾患症状を除去する又は疾患可能性を改変する様式で表現型を改変することによることを含む、哺乳動物において表現型を改変するための有効なツールを提供する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物細胞内へ二本鎖核酸の取り込みを起こすための方法であって、前記細胞と、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド及び前記核酸を含む混合物をインキュベートすることを含む、前記方法。
【請求項２】
核酸が、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドと混合される、複合体形成される、又はコンジュゲートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸が、阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
核酸が、ＴＮＦ−α遺伝子の一部と相補的であるｓｉＲＮＡを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
核酸が、３０又はそれより短い長さのヌクレオチド又はヌクレオチド塩基対を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ヒストンタンパク質又はポリペプチド又はペプチド断片、誘導体、類似体、又はそれらのコンジュゲートを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、両親媒性アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、タンパク質形質導入ドメイン又はモチーフを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、膜融合性ペプチドドメイン又はモチーフを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ＤＮＡ結合ドメイン又はモチーフを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、表２〜８に列挙された一つまたはそれより多くのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ヒストンＨ１、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ３及びヒストンＨ４ｌ、又はそれらの断片から選択される一つまたはそれより多くのヒストンタンパク質、ＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ、ＲＶＩＲＶＷＦＱＮＫＲＣＫＤＫＫ、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ、ＧＥＱＩＡＱＬＩＡＧＹＩＤＩＩＬＫＫＫＫＳＫ及びＷＷＥＴＷＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＴＲＱＡＲＲＮＨＲＲＲＨＲ、ポリＬｙｓ−Ｔｒｐ（４：１、ＭＷ２０，０００〜５０，０００）、ポリＯｒｎ−Ｔｒｐ（４：１、ＭＷ２０，０００〜５０，０００）又はミエリンから選択されるアミノ酸配列、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ペグ化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記混合物がさらに、カチオン性脂質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
カチオン性脂質が、リポフェクチン（登録商標）又はリポフェクタミン（登録商標）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド及び二本鎖核酸を含む組成物であって、動物細胞内への前記核酸の取り込みを起こす、前記組成物。
【請求項１７】
核酸が、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドと混合される、複合体形成される、又はコンジュゲートされる、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記核酸が、阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
核酸が、ＴＮＦ−α遺伝子の一部と相補的であるｓｉＲＮＡを含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
核酸が、３０又はそれより短い長さのヌクレオチド又はヌクレオチド塩基対を有する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２１】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ヒストンタンパク質又はポリペプチド又はペプチド断片、誘導体、類似体、又はそれらのコンジュゲートを含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２２】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、両親媒性アミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２３】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、タンパク質形質導入ドメイン又はモチーフを含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２４】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、膜融合性ペプチドドメイン又はモチーフを含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２５】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ＤＮＡ結合ドメイン又はモチーフを含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２６】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、表２〜８に列挙された一つまたはそれより多くのアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２７】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ヒストンＨ１、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ３及びヒストンＨ４ｌ、又はそれらの断片から選択される一つまたはそれより多くのヒストンタンパク質、ＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ、ＲＶＩＲＶＷＦＱＮＫＲＣＫＤＫＫ、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ、ＧＥＱＩＡＱＬＩＡＧＹＩＤＩＩＬＫＫＫＫＳＫ及びＷＷＥＴＷＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＴＲＱＡＲＲＮＨＲＲＲＨＲ、ポリＬｙｓ−Ｔｒｐ（４：１、ＭＷ２０，０００〜５０，０００）、ポリＯｒｎ−Ｔｒｐ（４：１、ＭＷ２０，０００〜５０，０００）又はミエリンから選択されるアミノ酸配列、を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２８】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ペグ化されている、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２９】
さらにカチオン性脂質を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項３０】
カチオン性脂質が、リポフェクチン（登録商標）又はリポフェクタミン（登録商標）である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
動物細胞中の標的遺伝子の発現を修飾するための方法であって、前記細胞と、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド及び核酸、ここで前記核酸は前記標的遺伝子の領域と相補的である、を含む混合物をインキュベートすることを含む、前記方法。
【請求項３２】
核酸が、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドと混合される、複合体形成される、又はコンジュゲートされる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記核酸が、阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
核酸が、ＴＮＦ−α遺伝子の一部と相補的であるｓｉＲＮＡを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
核酸が、３０又はそれより短い長さのヌクレオチド又はヌクレオチド塩基対を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ヒストンタンパク質又はポリペプチド又はペプチド断片、誘導体、類似体、又はそれらのコンジュゲートを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、両親媒性アミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、タンパク質形質導入ドメイン又はモチーフを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、膜融合性ペプチドドメイン又はモチーフを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ＤＮＡ結合ドメイン又はモチーフを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、表２〜８に列挙された一つまたはそれより多くのアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ヒストンＨ１、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ３及びヒストンＨ４ｌ、又はそれらの断片から選択される一つまたはそれより多くのヒストンタンパク質、ＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ、ＲＶＩＲＶＷＦＱＮＫＲＣＫＤＫＫ、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ、ＧＥＱＩＡＱＬＩＡＧＹＩＤＩＩＬＫＫＫＫＳＫ及びＷＷＥＴＷＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＴＲＱＡＲＲＮＨＲＲＲＨＲ、ポリＬｙｓ−Ｔｒｐ（４：１、ＭＷ２０，０００〜５０，０００）、ポリＯｒｎ−Ｔｒｐ（４：１、ＭＷ２０，０００〜５０，０００）又はミエリンから選択されるアミノ酸配列、を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４３】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ペグ化されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項４４】
前記混合物がさらに、カチオン性脂質を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４５】
カチオン性脂質が、リポフェクチン（登録商標）又はリポフェクタミン（登録商標）である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド及び二本鎖核酸を含む組成物であって、動物細胞内への前記核酸、ここで前記核酸は標的遺伝子の領域と相補的でありそして前記細胞中の前記標的遺伝子の発現を修飾する、の取り込みを起こす、前記組成物。
【請求項４７】
動物対象の表現型を変化させるための方法であって、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド及び二本鎖核酸（当該核酸は前記対象中の標的遺伝子の領域と相補的である）の混合物を前記対象へ投与することを含む、前記方法。
【請求項４８】
前記対象が、動物細胞又は個体である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
核酸が、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドと混合される、複合体形成される、又はコンジュゲートされる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記核酸が、阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
核酸が、ＴＮＦ−α遺伝子の一部と相補的であるｓｉＲＮＡを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
核酸が、３０又はそれより短い長さのヌクレオチド又はヌクレオチド塩基対を有する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ヒストンタンパク質又はポリペプチド又はペプチド断片、誘導体、類似体、又はそれらのコンジュゲートを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、両親媒性アミノ酸配列を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５５】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、タンパク質形質導入ドメイン又はモチーフを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５６】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、膜融合性ペプチドドメイン又はモチーフを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５７】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ＤＮＡ結合ドメイン又はモチーフを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５８】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、表２〜８に列挙された一つまたはそれより多くのアミノ酸配列を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５９】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ヒストンＨ１、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ３及びヒストンＨ４ｌ、又はそれらの断片から選択される一つまたはそれより多くのヒストンタンパク質、ＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ、ＲＶＩＲＶＷＦＱＮＫＲＣＫＤＫＫ、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ、ＧＥＱＩＡＱＬＩＡＧＹＩＤＩＩＬＫＫＫＫＳＫ及びＷＷＥＴＷＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＴＲＱＡＲＲＮＨＲＲＲＨＲ、ポリＬｙｓ−Ｔｒｐ（４：１、ＭＷ２０，０００〜５０，０００）、ポリＯｒｎ−Ｔｒｐ（４：１、ＭＷ２０，０００〜５０，０００）又はミエリンから選択されるアミノ酸配列、を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項６０】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ペグ化されている、請求項４７に記載の方法。
【請求項６１】
前記混合物がさらに、カチオン性脂質を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項６２】
カチオン性脂質が、リポフェクチン（登録商標）又はリポフェクタミン（登録商標）である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド及び二本鎖核酸を含む混合物であって、動物の細胞内への前記核酸、ここで前記核酸は前記細胞中の標的遺伝子の領域と相補的でありそして細胞又は動物の表現型の変化を仲介する前記標的遺伝子の発現を変調する活性がある、の取り込みを起こす、前記混合物。
【請求項６４】
動物対象における疾患又は有害な状態を治療する方法であって、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド及び二本鎖核酸を含む、有効量の混合物［ここで前記混合物は対象の細胞内への前記核酸の取り込みを起こし、及び前記核酸は前記細胞中の標的遺伝子の領域と相補的でありそして対象における前記疾患又は状態の一つまたはそれより多くの症状の発生又は重症度の防止又は減少を仲介する前記標的遺伝子の発現を変調する活性がある］を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項６５】
前記対象が、動物細胞又は個体である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
核酸が、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドと混合される、複合体形成される、又はコンジュゲートされる、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記核酸が、阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
核酸が、ＴＮＦ−α遺伝子の一部と相補的であるｓｉＲＮＡを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
核酸が、３０又はそれより短い長さのヌクレオチド又はヌクレオチド塩基対を有する、請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ヒストンタンパク質又はポリペプチド又はペプチド断片、誘導体、類似体、又はそれらのコンジュゲートを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７１】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、両親媒性アミノ酸配列を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７２】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、タンパク質形質導入ドメイン又はモチーフを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７３】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、膜融合性ペプチドドメイン又はモチーフを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７４】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ＤＮＡ結合ドメイン又はモチーフを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７５】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、表２〜８に列挙された一つまたはそれより多くのアミノ酸配列を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７６】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ヒストンＨ１、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ３及びヒストンＨ４ｌ、又はそれらの断片から選択される一つまたはそれより多くのヒストンタンパク質、ＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ、ＲＶＩＲＶＷＦＱＮＫＲＣＫＤＫＫ、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ、ＧＥＱＩＡＱＬＩＡＧＹＩＤＩＩＬＫＫＫＫＳＫ及びＷＷＥＴＷＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＴＲＱＡＲＲＮＨＲＲＲＨＲ、ポリＬｙｓ−Ｔｒｐ（４：１、ＭＷ２０，０００〜５０，０００）、ポリＯｒｎ−Ｔｒｐ（４：１、ＭＷ２０，０００〜５０，０００）又はミエリンから選択されるアミノ酸配列、を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７７】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ペグ化されている、請求項６４に記載の方法。
【請求項７８】
前記混合物がさらに、カチオン性脂質を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７９】
カチオン性脂質が、リポフェクチン（登録商標）又はリポフェクタミン（登録商標）である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
一つまたはそれより多くのポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドへ複合体形成された又は共有結合されたセンス及びアンチセンス鎖を有する二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）を含む、組成物。
【請求項８１】
ｄｓＮＡアンチセンス鎖が、目的の細胞内に存在するｍＲＮＡにハイブリダイズすることが可能である、請求項８０に記載の組成物。
【請求項８２】
ｄｓＮＡの各鎖が、３０又はそれより少ないヌクレオチド対を有する、請求項８０に記載の組成物。
【請求項８３】
ｄｓＮＡの各鎖が、約１９〜２５ヌクレオチド間の長さを有する、請求項８０に記載の組成物。
【請求項８４】
ｄｓＮＡが、阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む、請求項８０に記載の組成物。
【請求項８５】
ｄｓＮＡが、二本鎖（ｄｓ）ハイブリッド核酸（ｄｓ  Ｈｙｂｒｉｄ）であるか、又は鎖の一つがＤＮＡの鎖であり、他の鎖がＲＮＡの鎖である、センス及びアンチセンス鎖を有する、請求項８０に記載の組成物。
【請求項８６】
一つまたはそれより多くのポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド混合された、複合体形成された又は共有結合された、センス及びアンチセンス鎖を有している二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）及びカチオン性脂質を含む、組成物。
【請求項８７】
カチオン性脂質が、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート，１，３−ジオレイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）−プロピルアミド、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド、テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン、テトラメチルテトラオレイルスペルミン、テトラメチルテトララウリルスペルミン、テトラメチルテトラミリスチルスペルミン及びテトラメチルジオレイルジオレイルスペルミン、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３，３−（トリメチルアンモニウム）プロパン）、ＤＭＲＩＥ（１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、多価カチオン性脂質、リポスペルミン、ＤＯＳＰＡ（２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート）、ＤＯＳＰＥＲ（１，３−ジオレイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）−プロピル−アミド、ジ−及びテトラ−アルキル−テトラ−メチルスペルミン、ＴＭＴＰＳ（テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン）、ＴＭＴＯＳ（テトラメチルテトラオレイルスペルミン）、ＴＭＴＬＳ（テトラメチルテトララウリルスペルミン）、ＴＭＴＭＳ（テトラメチルテトラミリスチルスペルミン）、ＴＭＤＯＳ（テトラメチルジオレイルスペルミン）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシル−アミドグリシルスペルミン（ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標））、非カチオン性脂質と組み合わされたカチオン性脂質、ＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰｈＰＥ（ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン）又はコレステロール、ＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥの３：１（ｗ／ｗ）混合物、及びＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥの１：１（ｗ／ｗ）混合物から構成されたカチオン性脂質組成物、から成る群より選択される、請求項８６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００４年５月４日に提出された米国仮特許出願番号６０／５６８，０２７、２００４年５月１２日に提出された米国仮特許出願番号６０／５７０，５１２、２００４年５月１２日に提出された米国仮特許出願番号６０／５７０，５１３、２００４年９月２７日に提出された米国仮特許出願番号６０／６１３，４１６、２００５年２月２５日に提出された米国仮特許出願番号６０／６５６，５７２及び２００５年４月１日に提出された米国仮特許出願番号６０／６６７，８３３（これらの開示は、本明細書において全体が援用される）の優先権を請求する。
【０００２】
技術分野
本発明は、細胞内へ核酸を送達するための方法及び組成物に関する。より具体的には、本発明は、標的遺伝子の発現を修飾して、細胞の疾患状態又は可能性のような表現型を改変するために、細胞内へ二本鎖ポリヌクレオチドを送達する方法及び調製物に関する。
【背景技術】
【０００３】
動物及び植物細胞内への核酸の送達は、長く分子生物学研究及び開発の重要な目的であった。遺伝子療法の領域における最近の開発、アンチセンス療法及びＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）療法は、細胞内へ核酸を導入するより効率的な手段を開発する必要性を作り出した。
【０００４】
プラスミドの多様なアレイ及び他の核酸「ベクター」が、大きなポリヌクレオチド分子を細胞内へ送達するために開発されてきた。典型的には、これらのベクターは、科学的又は治療的に目的とする遺伝子を発現するために、標的細胞を形質転換することを目的とした無傷の遺伝子を含む、大きなＤＮＡ分子を取り込んでいる。
【０００５】
外来性核酸が、細胞内へ人工的に送達されるプロセスは、一般にトランスフェクションと称される。多様な技術及び材料を使用し、外来性源の機能性核酸を取り込むように細胞をトランスフェクトすることが可能である。最も普通に使用されるトランスフェクション法は、リン酸カルシウムトランスフェクション及び電気穿孔法である。外来性ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を送達するため、細胞に形質導入するための多様な他の方法が開発されており、ウイルス仲介形質導入、カチオン性脂質又はリポソーム送達、及び機械的又は生化学的膜破壊／浸透を目標にする多数の方法（例えば、界面活性剤、マイクロインジェクション又は粒子銃を使用して）が含まれる。
【０００６】
ＲＮＡ干渉は、標的化されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の一部と配列が相同的である二本鎖（ｄｓ）ポリヌクレオチド（通常ｄｓＲＮＡ）により開始される、配列特異的翻訳後遺伝子サイレンシングのプロセスである。細胞内への適したｄｓＲＮＡの導入は、内在性同族ｍＲＮＡ（即ち、導入されたｄｓＲＮＡと実質的配列同一性を共有するｍＲＮＡ）の破壊を導く。ｄｓＲＮＡ分子は、ダイサーと称されるＲＮａｓｅＩＩＩファミリーヌクレアーゼにより、１９〜２３ヌクレオチド（ｎｔ）の長さであるショートインターフェアリング（ｓｈｏｒｔ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）へ切断される。ｓｉＲＮＡは次ぎに、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体又は「ＲＩＳＣ」として知られている多成分ヌクレアーゼ複合体内に取り込まれる。ＲＩＳＣは、ｓｉＲＮＡとの相同性を通してｍＲＮＡ基質を同定し、標的とされたｍＲＮＡへ結合しそして破壊することにより、遺伝子発現のサイレンシングを実現する。
【０００７】
ＲＮＡ干渉は、植物及び動物細胞中の特定の遺伝子の発現を修飾するために、新たに現れた有望な技術であり、それ故、外来性遺伝子発現の修飾による治療を受け入れられる、広範囲の疾患及び障害を治療するための有用なツールを提供すると期待されている。
【発明の開示】
【０００８】
細胞内へｓｉＲＮＡ及び他の阻害的低分子核酸（ｓｍａｌｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｔｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ：ｓｉＮＡｓ）を送達するためのより良好なツール及び方法について、特に、細胞へ核酸を送達するための存在している技術が、送達試薬の乏しい効率及び／又は高い毒性により制限されているという事実の点から見て、当該技術分野で長年の要求が存在する。有効な量で、活性でそして耐えた状態で、及び無毒の送達ビヒクルを使用して、標的とされた細胞の表現型又は疾患状態を改変するであろう様式で遺伝子発現の調節を仲介するために、選択された細胞、組織又は区画へｓｉＮＡを送達する、改良された方法及び製剤についての関連する要求が存在する。
【０００９】
発明の例示的態様の説明
本発明は、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドと組み合わされた、ショートインターフェアリング核酸（ｓｉＮＡ）又はそれらの前駆体を用いる新規組成物及び方法を提供することにより、これらの要求を満足させ、そして追加の目的を果たす。ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドは、ｓｉＮＡ及びそれらの前駆体を含むポリヌクレオチドの細胞内送達又は取り込みを増強するその能力で選択された、天然の又は人工のポリペプチドである。
【００１０】
本発明の新規組成物内で、ｓｉＮＡをポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドと混合する、複合体形成させ、又はコンジュゲートさせることができ、標的細胞と裸のｓｉＮＡ（即ち、送達増強ポリペプチドが存在しないｓｉＮＡ）との接触により生じる送達と比較し、ｓｉＮＡの細胞内送達を増強する組成物が形成される。
【００１１】
本発明の特定の態様において、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドは、ヒストンタンパク質、又はポリペプチド又はペプチド断片、誘導体、類似体、又はそれらのコンジュゲートである。これらの態様内では、ｓｉＮＡを、一つまたはそれより多くの完全長ヒストンタンパク質、又はヒストンタンパク質の部分配列の少なくとも一部に対応しているポリペプチド、例えば、一つまたはそれより多くの以下のヒストンタンパク質：ヒストンＨ１、ヒストンＨ２Ａ、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ３又はヒストンＨ４，又は少なくともヒストンタンパク質の部分配列、典型的には、天然のヒストンタンパク質の少なくとも５〜１０又は１０〜２０近接残基を含む、一つまたはそれより多くのポリペプチド断片又はそれらの誘導体、と混合する、複合体形成させる又はコンジュゲートさせる。より詳細な態様において、ｓｉＲＮＡ／ヒストン混合物、複合体又はコンジュゲートは、両親媒性化合物を実質的に含んでいない。他の詳細な態様において、ヒストンタンパク質又はポリペプチドと混合され、複合体形成され又はコンジュゲートされたｓｉＮＡは、二本鎖ＲＮＡ、例えば、３０又はより少ないヌクレオチドを有する二本鎖ＲＮＡを含むであろうし、ショートインターフェアリングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。例示的態様において、ヒストンポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドは、以下に本明細書で記載される、ＰＮ３７と名付けられたポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドにより例示されるような、ヒストンＨ２Ｂの断片を含む。さらに追加の詳細な態様において、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドは、特にインビボ投与に関連して、安定性及び／又は有効性を改良するために、ペグ化することができる。
【００１２】
本発明の追加の態様内において、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドを、両親媒性アミノ酸配列を含むように選択又は合理的に設計する。例えば、有用なポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドを、荷電配列ドメイン又はモチーフを形成する多数の荷電アミノ酸残基に連結された、疎水性配列ドメイン又はモチーフを形成する多数の非極性又は疎水性アミノ酸残基を含むように選択することができ、両親媒性ペプチドを得る。
【００１３】
他の態様において、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドを、タンパク質形質導入ドメイン又はモチーフ、及び膜融合ペプチドドメイン又はモチーフを含むように選択する。タンパク質形質導入ドメインは、細胞の膜内へ浸透する、そして好ましくは膜を通して通過させることが可能であるペプチド配列である。膜融合ペプチドは、脂質膜、例えば、原形質膜又はエンドソームを取り囲んでいる膜を不安定化することができる（それは低ｐＨで増強することができる）ペプチドである。例示的膜融合ドメイン又はモチーフは、広範囲のウイルス融合タンパク質及び他のタンパク質、例えば、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）、に見ることができる。
【００１４】
本発明のポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドを合理的に設計するため、原形質膜を通した細胞内への核酸の移行を容易にするであろうモチーフとして、タンパク質形質導入ドメインを用いる。特定の態様において、輸送される核酸は、エンドソーム中に封入されているであろう。エンドソームの内部は、低いｐＨを有しており、膜融合ペプチドモチーフがエンドソームの膜を不安定化することを生じる。エンドソーム膜の不安定化及び崩壊は、細胞質内へのｓｉＮＡの放出を可能にし、そこでｓｉＮＡはＲＩＳＣ複合体と会合することが可能であり、その標的ｍＲＮＡへ方向付けられる。
【００１５】
本発明のポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドに随意に組み込まれるタンパク質形質導入ドメインの例には以下のものが含まれる：
１．ＴＡＴタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）（配列番号１）KRRQRRR ；
２．ペネトラチンＰＴＤ（配列番号２）RQIKIWFQNRRMKWKK ；
３．ＶＰ２２  ＰＴＤ（配列番号３）DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD ；
４．カポジＦＧＦシグナル配列（配列番号４）AAVALLPAVLLALLAP 、及び（配列番号５）AAVLLPVLLPVLLAAP ；
５．ヒトβ３インテグリンシグナル配列（配列番号６）VTVLALGALAGVGVG ；
６．ｇｐ４１融合配列（配列番号７）GALFLGWLGAAGSTMGA ；
７．カイマン・クロコディラス（Ｃａｉｍａｎ ｃｒｏｃｏｄｙｌｕｓ）Ｉｇ（ｖ）軽鎖（配列番号８）MGLGLHLLVLAAALQGA ；
８．ｈＣＴ−由来ペプチド（配列番号９）LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP ；
９．トランスポータン（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）（配列番号１０）GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL ；
１０．ロリゴマー（Ｌｏｌｉｇｏｍｅｒ）（配列番号１１）TPPKKKRKVEDPKKKK ；
１１．アルギニンペプチド（配列番号１２）RRRRRRR ；及び
１２．両親媒性モデルペプチド（配列番号１３）KLALKLALKALKAALKLA 。
【００１６】
本発明のポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドに随意に組み込まれるウイルス融合ペプチド膜融合ドメインの例には以下のものが含まれる：
１．インフルエンザＨＡ２（配列番号１４）GLFGAIAGFIENGWEG ；
２．センダイＦ１（配列番号１５）FFGAVIGTIALGVATA ；
３．呼吸系発疹ウイルスＦ１（配列番号１６）FLGFLLGVGSAIASGV ；
４．ＨＩＶ  ｇｐ４１（配列番号１７）GVFVLGFLGFLATAGS ；及び
５．エボラＧＰ２（配列番号１８）GAAIGLAWIPYFGPAA 。
【００１７】
本発明のさらに追加の態様内において、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドは、ポリペプチド−ｓｉＮＡ複合体形成を容易にし、及び／又は本発明の方法及び組成物内のｓｉＮＡの送達を増強する、ＤＮＡ結合ドメインを組み込んで提供される。この場合における例示的ＤＮＡ結合ドメインには、下記表１に同定されているような、ＤＮＡ結合調節タンパク質及び他のタンパク質について記載されている、多様な「亜鉛フィンガー」ドメインが含まれる（例えば、Simpson et al., J. Biol. Chem. 278:28011-28018, 2003 を参照されたい）。
【００１８】
【表１】
2007536253.tif 000003
【００１９】
本発明のポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドを構築するために有用な他のＤＮＡ結合ドメインには、例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質配列（下記実施例を参照されたい）の一部が含まれる。
【００２０】
本明細書の以下に記載した本発明の例示的態様内において、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドを、標的細胞内へのｓｉＮＡの増強された送達を仲介するのに有効な単一ポリペプチド内へ、前述の構造要素、ドメイン又はモチーフのいずれかを組み合わせることにより、合理的に設計できそして構築することができる。例えば、ＴＡＴポリペプチドのタンパク質形質導入ドメインを、ＨＡ２と名付けられたインフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質のＮ末端２０アミノ酸と融合させ、本明細書の一つのポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドを得た。多様な他のポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド構築物が本開示で提供され、ｓｉＮＡ送達を増強するために有効なポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドの多様な集合を作り出す及び使用するために、本発明の概念が広範囲に適用可能であることを証明している。
【００２１】
本発明内のさらに追加の例示的ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドを、以下のペプチドから選択することができる：WWETWKPFQCRICMRNFSTRQARRNHRRRHR （配列番号２７）；GKINLKALAALAKKIL （配列番号２８）、RVIRVWFQNKRCKDKK （配列番号２９）、GRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQ （配列番号３０）、GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK （配列番号３１）、ポリＬｙｓ−Ｔｒｐ、４：１、ＭＷ２０，０００−５０，０００; 及びポリＯｒｎ−Ｔｒｐ、４：１、ＭＷ２０，０００−５０，０００。本明細書の組成物及び方法内で有用である、追加のポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドは、メリチン（ｍｅｌｌｉｔｉｎ）タンパク質配列のすべて又は一部を含む。
【００２２】
さらに別の例示的ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドは、以下の実施例で同定されている。これらのペプチドのいずれか一つ又は組み合わせを選択する又は組み合わせることができ、本発明の方法及び組成物内のｓｉＮＡの細胞内送達を誘導する又は容易にする、有効なポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド試薬を得る。
【００２３】
本発明のより詳細な側面において、ｓｉＮＡ及びポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドを含む、混合物、複合体又はコンジュゲートは、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）のようなカチオン性脂質と組み合わせてもよい（例えば、混合して又は複合体形成して）。この関連において、ｓｉＲＮＡのみと複合体形成した又はコンジュゲートしたポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドは、ＲＮＡｉによる遺伝子サイレンシングを仲介するのに十分なｓｉＮＡの送達を実現するであろうことが、本明細書で予想外に開示されている。しかしながら、ｓｉＲＮＡ／ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド複合体又はコンジュゲートが、リポフェクチンのようなカチオン性脂質と混合されている又は複合体形成されている場合、ｓｉＮＡ送達及び遺伝子サイレンシングを仲介することについて、さらにより大きな活性を示すであろうことが、本明細書でさらに予想外に開示されている。ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド、ｓｉＲＮＡ及びカチオン性脂質を含むこれらの組成物を作製するには、細胞培養培地のような適した培地中で最初にｓｉＲＮＡ及びペプチドを一緒に混合し、その後、混合物にカチオン性脂質を加え、ｓｉＲＮＡ／送達ペプチド／カチオン性脂質組成物を形成することができる。場合により、細胞培養培地のような適した培地中でペプチド及びカチオン性脂質を一緒に混合し、その後、その後、ｓｉＲＮＡを加えて、ｓｉＲＮＡ／送達ペプチド／カチオン性脂質組成物を形成することが可能である。
【００２４】
本発明のこれらの側面内において有用なカチオン性脂質の例には、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、及びジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート，１，３−ジオレイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）−プロピルアミド、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド、テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン、テトラメチルテトラオレイルスペルミン、テトラメチルテトララウリルスペルミン、テトラメチルテトラミリスチルスペルミン及びテトラメチルジオレイルジオレイルスペルミン、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３，３−（トリメチルアンモニウム）プロパン）、ＤＭＲＩＥ（１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）又はＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）が含まれる。多価カチオン性脂質には、リポスペルミン、特に、ＤＯＳＰＡ（２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート）及びＤＯＳＰＥＲ（１，３−ジオレイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）−プロピル−アミド、及び限定されるわけではないが、ＴＭＴＰＳ（テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン）、ＴＭＴＯＳ（テトラメチルテトラオレイルスペルミン）、ＴＭＴＬＳ（テトラメチルテトララウリルスペルミン）、ＴＭＴＭＳ（テトラメチルテトラミリスチルスペルミン）及びＴＭＤＯＳ（テトラメチルジオレイルスペルミン）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシル−アミドグリシルスペルミン（ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標））を含む、ジ−及びテトラ−アルキル−テトラ−メチルスペルミンが含まれる。他の有用なカチオン性脂質は、例えば、米国特許第６，７３３，７７７号；米国特許第６，３７６，２４８号；米国特許第５，７３６，３９２号；米国特許第５，６８６，９５８号；米国特許第５，３３４，７６１号及び米国特許第５，４５９，１２７号に記載されている。
【００２５】
カチオン性脂質は場合により、非カチオン性脂質、特に中性脂質、例えば、ＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰｈＰＥ（ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン）又はコレステロールと組み合わされてもよい。ＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥの３：１（ｗ／ｗ）混合物又はＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥ（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、Invitrogen ）の１：１（ｗ／ｗ）混合物から構成されたカチオン性脂質組成物が、本発明の組成物をトランスフェクトする場合に一般的に有用である。好ましいトランスフェクション組成物は、高等真核生物細胞株の実質的トランスフェクションを誘導するものである。
【００２６】
例示的態様において、本発明は、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドと混合された、複合体形成された又はコンジュゲートされた、ショートインターフェアリング核酸（ｓｉＮＡ）、ショートインターフェアリングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロ−ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）のような小さな核酸分子を含む組成物を特色とする。
【００２７】
本明細書で使用される用語「ショートインターフェアリング核酸」、「ｓｉＮＡ」、「ショートインターフェアリングＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「ショートインターフェアリング核酸分子」、「ショートインターフェアリングオリゴヌクレオチド分子」又は「化学修飾ショートインターフェアリング核酸」とは、例えば、配列特異的様式でＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」又は遺伝子サイレンシングを仲介することにより、遺伝子発現又はウイルス複製を抑制又は下方調節できる、いずれかの核酸分子を指している。例示的態様内において、ｓｉＮＡは、自己相補的センス及びアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子であり、ここでアンチセンス領域は、発現を下方調節するために、標的核酸分子又はそれらの一部中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなり、そしてセンス領域は、標的核酸配列又はそれらの一部に対応する（即ち、その配列と実質的に同一である）ヌクレオチド配列を含む。
【００２８】
「ｓｉＮＡ」は、短い長さの二本鎖核酸（又は、場合によりそれらのより長い前駆体であってもよい）であり、そして標的細胞において許容できる毒性である、小さな干渉核酸、例えば、ｓｉＲＮＡを意味する。本発明内の有用なｓｉＮＡの長さは、特定の態様において、およそ２１〜２３ｂｐ長の長さに最適化されているであろう。しかしながら、ｓｉＲＮＡその他の有用なｓｉＮＡの長さには、特定の制限はない。例えば、ｓｉＮＡは、標的細胞への送達により、又は送達後に、存在しそして遺伝子サイレンシング活性を発揮するであろう、ｓｉＮＡの最終の、又は加工された形態とは実質的に異なっている、前駆体形で最初に細胞に提示することが可能である。ｓｉＮＡの前駆体形は、例えば、送達の時点で又は後に、加工され、分解され、改変され又は切断されて、細胞内で遺伝子サイレンシングを仲介するために活性であるｓｉＮＡを生成する、前駆体配列要素を含むことができる。それ故、特定の態様において、本発明内で有用なｓｉＮＡは、標的細胞内で活性な加工されたｓｉＮＡを生成するであろう、例えば、およそ１００〜２００塩基対、５０〜１００塩基対又は約５０塩基対より少ない前駆体長を有するであろう。他の態様において、有用なｓｉＮＡ又はｓｉＲＮＡ前駆体は、およそ１０〜４９ｂｐ、１５〜３５ｂｐ又は約２１〜３０ｂｐの長さであろう。
【００２９】
前に指摘したように、本発明の特定の態様において、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドは、ｓｉＮＡの大きな核酸前駆体を含む、慣用的ｓｉＮＡよりも大きな核酸分子の送達を容易にするために使用する。例えば、本明細書の方法及び組成物は、所望のｓｉＮＡの「前駆体」を表すより大きな核酸の送達を増強するために用いることができ、ここで、前駆体アミノ酸は、標的細胞への送達前に、送達間に、又は送達後に切断され、さもなければ加工されることができ、標的細胞内で遺伝子発現を変調するための活性ｓｉＮＡを形成する。例えば、ｓｉＮＡ前駆体ポリヌクレオチドは、二つ又はそれより多くのループ構造及び自己相補的センス及びアンチセンス領域を含むステムを有している、環状、一本鎖ポリヌクレオチドとして選択することができ、ここで、アンチセンス領域は、標的核酸分子又はそれらの一部中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなり、そしてセンス領域は、標的核酸配列又はそれらの一部に対応するヌクレオチド配列を有しており、そしてここで、環状ポリヌクレオチドは、インビトロ又はインビボで加工することが可能であり、ＲＮＡｉを仲介することができる活性ｓｉＮＡ分子を発生させる。
【００３０】
哺乳動物細胞において、３０塩基対より長いｄｓＲＮＡは、通常インターフェロンにより誘発される、ｄｓＲＮＡ−依存性キナーゼＰＫＲ及び２’−５’−オリゴアデニレートシンセターゼを活性化可能である。活性化されたＰＫＲは、翻訳因子真核生物開始因子２α（ｅＩＦ２α）のリン酸化による一般翻訳を阻害し、一方、２’−５’−オリゴアデニレートシンセターゼは、ＲＮａｓｅＬを経る非特異的ｍＲＮＡ分解を起こす。通常３０塩基対未満、そして最も普通には約１７〜１９、１９〜２１又は２１〜２３塩基対の間の、これらの小さなサイズのおかげで（特に非前駆体形を参照すると）、本発明のｓｉＮＡはインターフェロン応答の活性化を避けている。
【００３１】
長いｄｓＲＮＡの非特異的影響とは対照的に、ｓｉＲＮＡは、哺乳動物システムにおいて、選択的遺伝子サイレンシングを仲介することが可能である。短いループ及びステムに１９〜２７塩基対を有するヘアピンＲＮＡもまた、二本鎖ステム中の配列に相同的である遺伝子のサイレンス発現を選択的に仲介する。哺乳動物細胞は、短いヘアピンＲＮＡをｓｉＲＮＡに変換することができて、選択的遺伝子サイレンシングを仲介する。
【００３２】
ＲＩＳＣは、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖と相補的である配列を有する、一本鎖ＲＮＡの切断を仲介する。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖と相補的な領域の中間で起こる。二つのヌクレオチド３’−オーバーハングを含有している場合、２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡ二重鎖が最も活性であることを研究は示した。さらに、一つ又は両方のｓｉＲＮＡ鎖の２’−デオキシ（２’−Ｈ）又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドでの完全置換がＲＮＡｉ活性を破壊するが、一方、３’−末端ｓｉＲＮＡオーバーハングのデオキシヌクレオチド（２’−Ｈ）での置換は、許容的であることが報告されている。
【００３３】
２ヌクレオチド３’−オーバーハングを有している２１−ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡ二重鎖の３’−オーバーハングセグメントを、デオキシリボヌクレオチドで置き換えても、ＲＮＡｉ活性には有害な影響を与えないことを、研究は示している。ｓｉＲＮＡの各末端の４ヌクレオチドまでをデオキシリボヌクレオチドで置き換えることは、十分に許容的であると報告されているが、一方、デオキシリボヌクレオチドによる完全置換は、ＲＮＡｉ活性を消失させる。
【００３４】
もしくは、ｓｉＲＮＡは、単一又は複数のｓｉＮＡをコードしそして標的細胞内でのそれらの発現を方向付ける、ポリヌクレオチドベクターにより発現される単一又は複数転写生成物として送達することが可能である。これらの態様において、標的細胞内で発現されるべきｓｉＮＡの最終転写生成物の二本鎖部分は、例えば、１５〜４９ｂｐ、１５〜３５ｂｐ又は約２１〜３０ｂｐ長であることが可能である。例示的態様内において、ｓｉＮＡの二本鎖部分（二つの鎖が対になる）は、完全に対をなしたヌクレオチドセグメントには制限されず、そして、ミスマッチ（対応するヌクレオチドが相補的ではない）、バルジ（一つの鎖上に対応する相補的ヌクレオチドを欠いている）、オーバーハングなどによる、非対形成部分を含むことができる。非対形成部分を、それらがｓｉＮＡ形成を妨害しない程度まで含むことが可能である。より詳細な態様において、「バルジ」は、１〜２の非対形成ヌクレオチドを含むことができ、そして二つの鎖が対になる、ｓｉＮＡの二本鎖領域は、約１〜７、又は約１〜５のバルジを含むことができる。加えて、ｓｉＮＡの二本鎖領域中に含まれる「ミスマッチ」部分は、約１〜７、又は約１〜５の数で存在することができる。ミスマッチの場合において最もしばしば、ヌクレオチドの一つはグアニンであり、そして他方はウラシルである。こうしたミスマッチングは、例えば、センスＲＮＡをコードする、対応するＤＮＡ中のＣからＴ、ＧからＡへの突然変異、又はこれらの混合物に起因しうることができるが、他の原因も又考えられる。さらに、本発明において、二つの鎖が対になっているｓｉＮＡの二本鎖領域は、特定されたおよその数値範囲で、バルジ及びミスマッチの両方を含んでいてもよい。
【００３５】
本発明のｓｉＮＡの末端構造は、ｓｉＮＡが標的遺伝子のサイレンス発現のための活性を保持している限り、平滑末端でも付着末端（オーバーハング）のどちらであってもよい。付着（オーバーハング）末端構造は、他で報告されているような３’オーバーハングのみに限定されない。それどころか、５’オーバーハンギング構造を、それがＲＮＡｉのような遺伝子サイレンシング効果を誘発さえすれば、含むことができる。加えて、オーバーハンギングヌクレオチドの数は、２又は３ヌクレオチドの報告されている制限に限定されず、オーバーハングがｓｉＮＡの遺伝子サイレンシング活性を害しない限り、任意の数であることが可能である。例えば、オーバーハングは、約１〜８ヌクレオチド、より頻繁には約２〜４ヌクレオチドを含むことができる。付着末端を有しているｓｉＮＡの全長は、対形成した二本鎖部分の長さ、及び両端のオーバーハンギング一本鎖を含む対の長さの合計として表現される。例えば、両端に４ヌクレオチドオーバーハンギングを有する１９ｂｐ二本鎖ＲＮＡの具体例の場合において、全長は２３ｂｐとして表現される。さらに、オーバーハンギング配列は、標的遺伝子に対して低い特異性を有していてもよく、標的遺伝子配列と相補的（アンチセンス）又は同一（センス）である必要はない。さらに、ｓｉＮＡが標的遺伝子に対するその遺伝子サイレンシング効果を維持している限り、低分子量構造（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ又はウイルスＲＮＡのような天然のＲＮＡ分子、又は人工ＲＮＡ分子）を、例えば、両端のオーバーハンギング部分に含有することができる。
【００３６】
加えて、ｓｉＮＡの末端構造は、二本鎖核酸の一つの端がリンカー核酸、例えば、リンカーＲＮＡで連結されている、ステムループ構造を有することができる。二本鎖領域（ステムループ部分）の長さは、例えば、１５〜４９ｂｐ、しばしば１５〜３５ｂｐ、そしてより普通には約２１〜３０ｂｐ長であることが可能である。もしくは、標的細胞中で発現されるべきｓｉＮＡの最終転写生成物である、二本鎖領域の長さは、例えば、およそ１５〜４９ｂｐ、１５〜３５ｂｐ又は約２１〜３０ｂｐ長であることができる。リンカーセグメントを用いる場合、それがステム部分の対形成を邪魔しない限り、リンカーの長さに特別の制限はない。例えば、ステム部分の安定な対形成及びこの部分をコードするＤＮＡ間の組換えの抑制のため、リンカー部分はクローバー葉構造を有することができる。たとえリンカーが、ステム部分の対形成を邪魔するであろう長さを有していても、例えば、前駆体ＲＮＡが成熟ＲＮＡへプロセシングされる間にイントロンが切り出され、それによりステム部分の対形成を可能にするように、イントロンを含むリンカー部分を構築することが可能である。ステムループｓｉＲＮＡの場合、ループ構造を有していないＲＮＡの両末端（頭部及び尾部）は、低分子量ＲＮＡを有することができる。上述のように、これらの低分子量ＲＮＡは、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ又はウイルスＲＮＡのような天然のＲＮＡ分子、又は人工ＲＮＡ分子を含むことができる。
【００３７】
ｓｉＮＡはまた、標的核酸分子のヌクレオチド配列又はそれらの一部と相補的なヌクレオチド配列を有している一本鎖ポリヌクレオチドを含むことが可能であり（例えば、こうしたｓｉＮＡ分子は、標的核酸配列又はそれらの一部に対応するヌクレオチド配列のｓｉＮＡ分子内の存在を必要としない）、ここで一本鎖ポリヌクレオチドは、５’−リン酸（例えば、Martinez et al., Cell., 110: 563-574 (2002) 及びSchwarz et al., Molecular Cell, 10: 537-568(2002) を参照されたい）又は５’，３’−二リン酸のような末端リン酸基をさらに含むことが可能である。
【００３８】
本明細書で使用する場合、用語ｓｉＮＡ分子は、天然に存在するＲＮＡ又はＤＮＡを含有する分子に限定されず、また化学修飾ヌクレオチド及び非ヌクレオチドも包含する。特定の態様において、本発明のショートインターフェアリング核酸分子は、２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠いている。特定の態様において、ショートインターフェアリング核酸分子は、ＲＮＡｉを仲介するために２’−ヒドロキシ基を有しているヌクレオチドの存在を必要とせず、そしてそのようであるので、本発明のショートインターフェアリング核酸分子は、場合によりいずれのリボヌクレオチド（例えば、２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）も含んでいなくてもよい。ＲＮＡｉを支援するため、ｓｉＮＡ分子内のリボヌクレオチドを必要としないこうしたｓｉＮＡ分子は、しかしながら、２’−ＯＨ基を有する一つまたはそれより多くのヌクレオチドを含有する、結合されたリンカー又は複数のリンカー、又は他の結合された付随する基、部分又は鎖を有することが可能である。場合により、ｓｉＮＡ分子は、ヌクレオチド位の約５、１０、２０、３０、４０又は５０％でリボヌクレオチドを含むことが可能である。
【００３９】
本明細書で使用する場合、用語ｓｉＮＡは、例えば、ショートインターフェアリングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロ−ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ショートインターフェアリングオリゴヌクレオチド、ショートインターフェアリング核酸、ショートインターフェアリング修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾ｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）その他のような、配列特異的ＲＮＡｉを仲介可能な核酸分子を記載するために使用される他の用語と均等であることを意味している。
【００４０】
他の態様において、本発明内で使用するためのｓｉＮＡ分子は、分離したセンス及びアンチセンス配列又は領域を含むことができ、ここで、センス及びアンチセンス領域は、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー分子により共有結合で連結されているか、又は代わるべきものとしてイオン性相互作用、水素結合、ファンデルヴァールス相互作用、疎水性相互作用及び／又はスタッキング相互作用による非共有結合で連結されている。
【００４１】
「アンチセンスＲＮＡ」は、標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列を有し、標的遺伝子ｍＲＮＡに結合することによりＲＮＡｉを誘発すると考えられているＲＮＡ鎖である。「センスＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡに相補的な配列を有し、その相補的アンチセンスＲＮＡへアニールされてｓｉＲＮＡを形成する。これらのアンチセンス及びセンスＲＮＡは、ＲＮＡ合成機で慣用的に合成されてきた。
【００４２】
本明細書で使用する場合、用語「ＲＮＡｉ構築物」とは、本明細書を通して使用される一般用語であり、小さなインターフェアリングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ヘアピンＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡを形成させるためにインビボで切断することが可能である他のＲＮＡ種を含んでいる。本明細書において、ＲＮＡｉ構築物はまた、細胞中でｄｓＲＮＡ又はヘアピンＲＮＡを形成する転写体、及び／又はインビボでｓｉＲＮＡを生成することが可能な転写体を生じさせることが可能である発現ベクター（ＲＮＡｉ発現ベクターとも称される）も含む。場合により、ｓｉＲＮＡはｓｉＲＮＡの一本鎖又は二本鎖を含むことができる。
【００４３】
ｓｉＨｙｂｒｉｄ分子は、ｓｉＲＮＡと類似の機能を有する二本鎖核酸である。二本鎖ＲＮＡ分子の代わりに、ｓｉＨｙｂｒｉｄは、ＲＮＡ鎖及びＤＮＡ鎖を含む。好ましくは、ＲＮＡ鎖は、標的ｍＲＮＡへ結合する鎖のようなアンチセンス鎖である。ＤＮＡ及びＲＮＡ鎖のハイブリダイゼーションにより作製されたｓｉＨｙｂｒｉｄは、ハイブリダイズされた相補的部分、及び好ましくは少なくとも一つの３’オーバーハンギング末端を有する。
【００４４】
本発明内で使用するためのｓｉＮＡは、二つの別々のオリゴヌクレオチドから組み立てることが可能であり、ここで一つの鎖はセンス鎖であり、そして他はアンチセンス鎖であり、ここにおいて、アンチセンス及びセンス鎖は自己相補的である（即ち、各鎖は、他の鎖中のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含んでなり；アンチセンス鎖及びセンス鎖が、例えば、二本鎖領域が約１９塩基対である、二重又は二本鎖構造を形成するように）。アンチセンス鎖は、標的核酸分子又はそれらの一部中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含むことができ、そしてセンス鎖は、標的核酸配列又はそれらの一部に対応するヌクレオチド配列を含むことができる。もしくは、ｓｉＮＡは単一のオリゴヌクレオチドから組み立てることが可能であり、ここでｓｉＮＡの自己相補的センス及びアンチセンス領域は、核酸に基づいた又は非核酸に基づいたリンカー（単数又は複数）により連結する。
【００４５】
追加の態様内において、本発明の方法及び組成物に従った細胞内送達のためのｓｉＮＡは、自己相補的センス及びアンチセンス領域を有する、二重鎖、非対称性二重鎖、ヘアピン又は非対称性ヘアピン二次構造のポリヌクレオチドであることが可能であり、ここでアンチセンス領域は別の標的核酸分子又はそれらの一部のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含んでなり、そしてセンス領域は、標的核酸配列又はそれらの一部に対応するヌクレオチド配列を含む。
【００４６】
ｓｉＮＡ中に行うことが可能な化学修飾の非制限例には、限定ではなく、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、「汎用性塩基」ヌクレオチド、「非環式」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド及び末端グリセリル及び／又は逆方向デオキシ脱塩基残基取り込みが含まれる。種々のｓｉＮＡ構築物で使用された場合、これらの化学的修飾は、ＲＮＡｉ活性を細胞中で保存し、一方同時に、これらの核酸分子の血清安定性を劇的に増加させることが示されている。
【００４７】
非制限例において、核酸分子内への化学修飾ヌクレオチドの導入は、外因的に送達された天然のＲＮＡ分子に固有のインビボ安定性及び生物学的利用能の潜在的制限を克服する強力なツールを提供する。例えば、化学修飾核酸分子は、化学修飾核酸分子が血清中でより長い半減期を有する傾向があるので、規定の療法効果について特定の核酸分子の低用量を可能にすることができる。さらに、特定の化学修飾は、特定の細胞又は組織を標的とすることにより、及び／又は核酸分子の細胞取り込みを改良することにより、核酸分子の生物学的利用能を改良することが可能である。それ故、たとえ天然の核酸分子と比較して、例えば、全ＲＮＡ核酸分子と比較した場合に、化学修飾核酸分子の活性が減少していても、修飾核酸分子の全体的な活性は、改良された分子の安定性及び／又は送達のため、天然の分子よりも大きくすることが可能である。天然の未修飾ｓｉＮＡと異なり、化学修飾ｓｉＮＡはまた、ヒトにおけるインターフェロン活性を活性化する可能性を最小にすることが可能である。
【００４８】
本明細書に記載したｓｉＮＡ分子において、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、前記アンチセンス領域の３’−末端にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことが可能である。本明細書に記載したｓｉＮＡ分子のいずれの態様においても、アンチセンス領域は、前記アンチセンス領域の５’−末端に約１〜約５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことが可能である。本明細書に記載したｓｉＮＡ分子のいずれの態様においても、本発明のｓｉＮＡ分子の３’−末端ヌクレオチドオーバーハングは、核酸の糖、塩基又は主鎖が化学修飾されているリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含むことが可能である。本明細書に記載したｓｉＮＡ分子のいずれの態様においても、３’−末端ヌクレオチドオーバーハングは、一つまたはそれより多くの汎用塩基リボヌクレオチドを含むことが可能である。本明細書に記載したｓｉＮＡ分子のいずれの態様においても、３’−末端ヌクレオチドオーバーハングは、一つまたはそれより多くの非環式ヌクレオチドを含むことが可能である。
【００４９】
例えば、非制限例において、本発明は、一つのｓｉＮＡ鎖中に約１、２、３、４、５、６、７、８又はそれより多いホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する化学修飾ショートインターフェアリング核酸（ｓｉＮＡ）を特色とする。さらに別の態様において、本発明は、両方のｓｉＮＡ鎖中に、個々に約１、２、３、４、５、６、７、８又はそれより多いホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する化学修飾ショートインターフェアリング核酸（ｓｉＮＡ）を特色とする。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、ｓｉＮＡの一つ又は両方のオリゴヌクレオチド鎖、例えば、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖中に存在することが可能である。本発明のｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖の３’−末端、５’−末端又は３’−末端及び５’−末端の両方に、一つまたはそれより多くのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことが可能である。例えば、本発明の例示的ｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖の５’−末端に、約１〜約５又はそれより多くの（例えば、約１、２、３、４、５又はそれより多くの）連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことが可能である。別の非制限例において、本発明の例示的ｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖中に、一つまたはそれより多くの（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多くの）ピリミジンホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことが可能である。さらに別の非制限例において、本発明の例示的ｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖中に、一つまたはそれより多くの（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多くの）プリンホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことが可能である。
【００５０】
ｓｉＮＡ分子は、環状核酸分子を含むことができ、ここで、ｓｉＮＡは、約１８〜約２３（例えば、約１８、１９、２０、２１、２２又は２３）の塩基対を有する、約３８〜約７０（例えば、約３８、４０、４５、５０、５５、６０、６５又は７０）ヌクレオチド長であり、ここで環状オリゴヌクレオチドは、約１９の塩基対及び２つのループを有するダンベル型構造を形成する。
【００５１】
環状ｓｉＮＡ分子は、二つのループモチーフを含有し、ｓｉＮＡ分子の一つ又は両方のループ部分は生分解可能である。例えば、本発明の環状ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子のループ部分の分解が、約２ヌクレオチドを含む３’−末端ヌクレオチドオーバーハングのような、３’−末端ヌクレオチドオーバーハングを有する二本鎖ｓｉＮＡ分子を発生可能なように設計する。
【００５２】
ｓｉＮＡ分子中、好ましくはｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖中、しかしまた場合によりセンス及び／又はアンチセンス及びセンス両鎖中、に存在する修飾ヌクレオチドは、天然に存在するリボヌクレオチドに類似した特性又は特徴を有する修飾ヌクレオチドを含む。例えば、本発明は、ノーザンコンホメーション（例えば、ノーザン擬回転サイクル、例えば、Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag ed., 1984 、を参照されたい）を有する修飾ヌクレオチドを含んでいるｓｉＮＡ分子を特色とする。このように、本発明のｓｉＮＡ分子中、好ましくは本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖中、しかしまた場合によりセンス及び／又はアンチセンス及びセンス両鎖中、に存在する化学修飾ヌクレオチドは、ヌクレアーゼ分解に対して耐性であり、一方同時にＲＮＡｉを仲介する能力を維持している。ノーザンコンフィギュレーションを有するヌクレオチドの非制限例には、ロックド（ｌｏｃｋｅｄ）核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド）；２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド；２’−メチル−チオ−エチル，２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−クロロヌクレオチド、２’−アジドヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが含まれる。
【００５３】
二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖は、センス鎖の３’−末端、５’−末端又は３’及び５’−両末端に、逆方向デオキシ脱塩基部分のような末端キャップ部分を有することができる。
【００５４】
コンジュゲートの非制限例には、図を含んでその全体が本明細書において援用される、Vargeese et al. により２００３年４月３０日に提出された、米国特許出願番号１０／４２７，１６０に記載されているコンジュゲート及びリガンドが含まれる。別の態様において、コンジュゲートは、生分解性リンカーを経て、化学修飾ｓｉＮＡ分子へ共有結合で結合されている。一つの態様において、コンジュゲート分子は、化学修飾ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖かまたは両鎖の３’−末端で結合されている。別の態様において、コンジュゲート分子は、化学修飾ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖かまたは両鎖の５’−末端で結合されている。さらに別の態様において、コンジュゲート分子は、化学修飾ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖かまたは両鎖の３’−末端及び５’−末端の両方、又はそれらのいずれかの組み合わせで結合されている。一つの態様において、本発明のコンジュゲート分子は、細胞のような生物学的システム内への化学修飾ｓｉＮＡ分子の送達を容易にする分子を含む。別の態様において、化学修飾ｓｉＮＡ分子へ結合されたコンジュゲート分子は、ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン、又は細胞取り込みを仲介することが可能である、細胞受容体のリガンドである。化学修飾ｓｉＮＡ分子へ結合することが可能な、本発明により企図された具体的コンジュゲートの例は、Vargeese et al. により２００３年７月１０日に公開された米国特許出願公開番号２００３０１３０１８６及び２００４年６月１０日に公開された米国特許出願公開番号２００４０１１０２９６に記載されている。使用されるコンジュゲートの型及び本発明のｓｉＮＡ分子のコンジュゲーションの程度は、同時にＲＮＡｉ活性を仲介するｓｉＮＡの能力を維持している間の、改良された薬物動態学的プロフィール、生物学的利用能及び／又はｓｉＮＡ構築物の安定性について評価することが可能である。このように、当業者は、多様なコンジュゲートで修飾されたｓｉＮＡ構築物を、例えば、当該技術分野で一般に知られている動物モデルにおいて、ＲＮＡｉ活性を仲介する能力を維持している間に、ｓｉＮＡコンジュゲート複合体が改良された特性を所有しているかどうかを決定するためにスクリーニングすることが可能である。
【００５５】
ｓｉＮＡはさらに、ｓｉＮＡのセンス領域をｓｉＮＡのアンチセンス領域へ連結する、ヌクレオチド、非ヌクレオチド又は混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドリンカーを含むことができる。一つの態様において、ヌクレオチドリンカーは、＞２ヌクレオチド長、例えば、約３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド長のリンカーであり得る。別の態様において、ヌクレオチドリンカーは、核酸アプタマーであり得る。本明細書で使用される「アプタマー」又は「核酸アプタマー」とは、標的分子に特異的に結合する核酸分子を意味し、ここで、核酸分子は、自然の設定において標的分子により認識される配列を含む配列を有する。もしくは、アプタマーは、標的分子へ結合する核酸分子であり得、ここで標的分子は自然には核酸へ結合しない。標的分子は、目的とするいずれも分子でもあり得る。例えば、アプタマーは、タンパク質のリガンド結合ドメインへ結合させるために使用することが可能であり、それにより、天然に存在するリガンドとタンパク質の相互作用を妨げる。これは非制限例であり、当業者は、当該技術分野で一般的に知られている技術を使用して、他の態様を容易に作製することが可能であることを認識するであろう。［例えば、Gold et al, Annu. Rev. Biochem., 64: 763 (1995); Brody and Gold, J. Biotechnol., 74: 5 (2000); Sun, Curr. Opin. Mol. Ther., 2:100 (2000); Kusser, J. Biotechnol., 74: 27 (2000); Hermann and Patel, Science 287: 820 (2000); 及び Jayasena, Clinical Chemistry, 45: 1628. (1999) を参照されたい］。
【００５６】
非ヌクレオチドリンカーは、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素、又は他の重合体化合物（例えば、２〜１００エチレングリコール単位を有するポリエチレングリコール）を含むことができる。具体的例には、Seela and Kaiser, Nucleic Acids Res., 18:6353 (1990) 及び Nucleic Acids Res., 15:3113 (1987); Cload and Schepartz, J. Am. Chem. Soc., 113:6324 (1991); Richardson and Schepartz, J. Am. Chem. Soc., 113:5109 (1991); Ma et al., Nucleic Acids Res., 21:2585 (1993) 及び Biochemistry 32:1751(1993); Durand et al., Nucleic Acids Res., 18:6353 (1990); McCurdy et al., Nucleosides & Nucleotides, 10:287 (1991); Jschke et al., Tetrahedron Lett., 34:301 (1993); Ono et al., Biochemistry, 30:9914 (1991); Arnold et al., 国際公開番号WO 89/02439 ; Usman et al., 国際公開番号WO 95/06731 ; Dudycz et al., 国際公開番号WO 95/11910 、及びFerentz and Verdine, J. Am. Chem. Soc., 113:4000 (1991) に記載されているものが含まれる。「非ヌクレオチド」はさらに、糖及び／又はリン酸基置換を含む、一つまたはそれより多くのヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖内に取り込まれることが可能であり、そして残った塩基がそれらの酵素活性を示すことを可能にする、いずれかの基又は化合物を意味する。基及び化合物は、例えば、糖のＣ１位に、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル又はチミンのような普通に認識されるヌクレオチド塩基を含まないことにおいて、脱塩基であり得る。
【００５７】
化学修飾することが可能である、本発明のｓｉＮＡ分子の合成は、（ａ）ｓｉＮＡ分子の二つの相補鎖の合成；（ｂ）二本鎖ｓｉＮＡ分子を得るのに適した条件下での、二つの相補鎖を一緒にするアニーリング、を含む。別の態様において、ｓｉＮＡ分子の二つの相補鎖の合成は、固相オリゴヌクレオチド合成による。さらに別の態様において、ｓｉＮＡ分子の二つの相補鎖の合成は、固相タンデムオリゴヌクレオチド合成による。
【００５８】
オリゴヌクレオチド（例えば、特定の修飾オリゴヌクレオチド又はリボヌクレオチドを欠くオリゴヌクレオチドの一部）は、例えば、Caruthers et al., 1992, Methods in Enzymology 211, 3-19, Thompson et al., 国際ＰＣＴ公開番号WO 99/54459 , Wincott et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684, Wincott et al., 1997, Methods Mol. Bio., 74, 59, Brennan et al., 1998, Biotechnol Bioeng., 61, 33-45, 及び Brennan, 米国特許第6,001,311 号、に記載されているような、当該技術分野で知られているプロトコールを使用して合成した。本発明の特定のｓｉＮＡ分子を含む、ＲＮＡの合成は、例えば、Usman et al., 1987, J. Am. Chem. Soc., 109, 7845; Scaringe et al., 1990, Nucleic Acids Res., 18, 5433; 及び Wincott et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684 Wincott et al., 1997, Methods Mol. Bio., 74, 59 、に記載されているような一般法に従った。
【００５９】
本発明で使用するための核酸分子の送達についての追加の又は補足的な方法は、例えば、Akhtar et al., Trends Cell Bio., 2, 139 (1992); Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995, Maurer et al.,Mol. Membr. Biol., 16: 129-140 (1999); Hofland and Huang, Handb. Exp. Pharmacol., 137: 165-192 (1999); 及び Lee et al., ACS Symp. Ser., 752: 184-192 (2000) 、に記載されている。Sullivan et al., 国際ＰＣＴ公開番号WO 94/02595 は、酵素的核酸分子の送達のための一般法をさらに記載している。これらのプロトコールは、本発明で企図された実質的にいずれの核酸分子の、追加の又は補足的送達に利用することが可能である。
【００６０】
核酸分子及びポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドは、当業者には既知の多様な方法により細胞へ投与することが可能であり、限定されるわけではないが、ｓｉＮＡ及びポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドのみを含む、又は薬学的に許容できる坦体、希釈剤、賦形剤、補助剤、乳化剤、緩衝化剤、安定化剤、保存剤などのような一つまたはそれより多くの追加の成分をさらに含む、製剤中での投与が含まれる。特定の態様において、ｓｉＮＡ及び／又はポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドは、リポソームに封入する、イオン注入により投与する、又はヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、生体接着性（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ）ミクロスフェア又はタンパク質性ベクター（例えば、O'Hare and Normand，国際ＰＣＴ公開番号WO 00/53722 を参照されたい）のような他のビヒクル内へ取り込ませることが可能である。もしくは、核酸／ペプチド／ビヒクルの組み合わせは、直接注射により、又は注入ポンプの使用により局所的に送達することも可能である。本発明の核酸分子の直接注射は、皮下、筋肉内又は皮内であれ、標準針及びシリンジ方法論を使用して、又はConry et al., Clin. Cancer Res., 5: 2330-2337 (1999) 及び Barry et al., 国際ＰＣＴ公開番号WO 99/31262 に記載されているもののような針なし技術により行われる。
【００６１】
本発明の組成物は、医薬品として効果的に用いることが可能である。医薬品は、患者における疾患状態又は他の有害な状態を防止する、発生又は重症度を変調する、又は治療する（一つまたはそれより多くの病状を検出可能な又は測定可能な程度まで軽減する）。
【００６２】
それ故追加の態様において、本発明は、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドと混合され、複合体形成され、又はコンジュゲートされ、場合により、希釈剤、安定化剤、緩衝化剤その他のような薬学的に許容できる坦体と配合された、一つまたはそれより多くのポリ核酸、典型的には一つまたはそれより多くのｓｉＮＡの存在又は投与を特色とする、医薬組成物及び方法を提供する。
【００６３】
本発明は、対象における特定の疾患状態又は他の有害な状態に関連する遺伝子の発現を変調するショートインターフェアリング核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供することにより、追加の目的及び利点を満足させる。典型的には、ｓｉＮＡは、対象疾患状態又は有害な状態に関連する、原因となる又は寄与因子として上昇したレベルで発現される遺伝子を標的とするであろう。これに関連して、ｓｉＮＡは、一つまたはそれより多くの関連する疾患徴候の重度又は再発を防止する、軽減する又は減少する程度まで、遺伝子の発現を効果的に下方調節するであろう。もしくは、疾患又は他の有害な状態の結果又は後遺症として、標的遺伝子の発現が必ずしも上昇していない多様な異なった疾患モデルについても、標的遺伝子の下方調節は、それにもかかわらず、遺伝子発現を低下させることにより（即ち、標的遺伝子の選択されたｍＲＮＡ及び／又はタンパク質生成物が減少したレベルまで）、療法的効果を生じるであろう。もしくは、本発明のｓｉＮＡは、その発現が標的遺伝子の生成物又は活性により負に調節されている「下流」遺伝子の上方調節を生じることが可能である、一つの遺伝子のより低い発現を標的とすることができる。
【００６４】
例示の態様において、本発明の組成物及び方法は、慢性関節リュウマチ（ＲＡ）の症状を治療する又は防止するため、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の発現を調節するための療法的ツールとして有用である。これに関連して、本発明はさらに、小さな核酸分子を使用するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により、ＴＮＦ−αの発現及び活性を変調するための化合物、組成物及び方法を提供する。より詳細な態様において、本発明は、哺乳動物対象におけるＲＡの症状を防止する又は軽減するため、ＴＮＦ−α及び／又はＴＮＦ−α遺伝子の発現を変調するために有効である、ショートインターフェアリング核酸（ｓｉＮＡ）、ショートインターフェアリングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロ−ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）及びショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子のような小さな核酸分子及び関連する方法を提供する。これら及び関連する療法的組成物及び方法において、例えば、インビボにおけるヌクレアーゼ分解に対する増加した耐性を提供することにより及び／又は改良された細胞取り込みを通して、化学修飾ｓｉＮＡの使用は、天然のｓｉＮＡ分子の特性と比較して、修飾ｓｉＮＡの特性をしばしば改良するであろう。本明細書の開示に従って容易に決定できるように、多化学修飾を有する有用なｓｉＮＡは、それらのＲＮＡｉ活性を保持しているであろう。本発明のｓｉＮＡ分子はそれ故、多様な療法的、診断的、標的確認、遺伝子発見、遺伝子工学及び薬理ゲノミクス応用のための有用な試薬及び方法を提供する。
【００６５】
本発明のこのｓｉＮＡは、任意の形態、例えば、経皮的に又は局所注射により投与することができる（例えば、乾癬を治療するための乾癬斑の部位での、又は乾癬性関節炎又はＲＡに苦しめられている患者の関節内への局所注射）。より詳細な態様において、本発明は、ＴＮＦ−α  ＲＮＡを効果的に下方調節し、そしてそれにより一つまたはそれより多くのＴＮＦ−α関連炎症性状態（単数又は複数の）を減少する又は防止する、ＴＮＦ−αのｍＲＮＡに方向付けられた療法的に有効量のｓｉＮＡを投与するための製剤及び方法を提供する。動物対象における選択された疾患状態に関連する一つまたはそれより多くの異なった遺伝子の発現を標的とする、同等の方法及び組成物が提供され、その発現が、選択された疾患状態に関連する原因又は寄与因子として異常に増加することが知られている、多くの遺伝子のいずれもが含まれる。
【００６６】
本発明のｓｉＮＡ／ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド混合物は、標的とされた疾患状態のための他の標準治療と組み合わせて、例えば、ＲＡ又は乾癬のような炎症性疾患に有効な療法剤と組み合わせて投与することが可能である。これに関連して組み合わせ的に有用な及び有効な剤の例には、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、メトトレキセート、金化合物、Ｄ−ペニシラミン、抗マラリア剤、スルファサラジン、グルココルチコイド、及びインフィキシマブ及びエントラセプトのような他のＴＮＦ−α中和剤が含まれる。
【００６７】
陰性に荷電した本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ）は、安定化剤、緩衝化剤などと共に、又はなしで、医薬組成物を形成するためのいずれの標準手段によっても、患者へ投与することが可能である。リポソーム送達機構を使用することが望まれる場合、リポソームの形成のための標準プロトコールに従うことが可能である。本発明の組成物はまた、経口投与のための錠剤、カプセル又はエリキシルとして、直腸投与のための座剤として、注射可能投与のための滅菌液剤、懸濁剤として、又は当該技術分野で知られている他の組成物として製剤する及び使用することができる。
【００６８】
本発明はまた、本明細書に記載した組成物の薬学的に許容できる製剤を含む。これらの製剤は、上記の化合物の塩、例えば、酸付加塩、例えば、塩酸、臭化水素酸、酢酸及びベンゼンスルホン酸の塩、を含む。
【００６９】
薬理学的組成物又は製剤とは、細胞又は患者（例えば、ヒトを含む）内への投与、例えば、全身投与に適した形態の組成物又は製剤を指している。適した形態は、一部、使用又は移行の経路（例えば、経口、経皮又は注射による）に依存する。こうした形態は、標的細胞（即ち、陰性に荷電した核酸の送達が望まれている細胞）へ組成物又は製剤が到達することを妨げるべきではない。例えば、血流内へ注射された薬理学的組成物は可溶性でなければならない。他の因子は当該技術分野で周知であり、毒性のような考慮が含まれる。
【００７０】
「全身投与」とは、血流中の薬剤のインビボ全身吸収又は蓄積、続いての全身を通した分布を意味する。全身吸収を導く投与経路には、限定ではないが：静脈内、皮下、腹腔内、吸入、経口、肺内及び筋肉内が含まれる。これらの投与経路の各々は、所望の陰性に荷電したポリマー、例えば、核酸を、到達できる疾患組織へ暴露する。循環内への薬剤の移行の速度は、分子量又はサイズの関数であることが示されている。本発明の化合物を含むリポソーム又は他の薬剤坦体の使用は、例えば、網様体内皮システム（ＲＥＳ）の組織のような特定の組織型に、薬剤を潜在的に局在化させることが可能である。薬剤と、リンパ球及びマクロファージのような細胞の表面との会合を容易にするリポソーム製剤もまた有用である。このアプローチは、癌のような異常細胞のマクロファージ及びリンパ球免疫認識の特異性を利用することにより、標的細胞への薬剤の増強された送達を提供することができる。
【００７１】
「薬学的に許容できる製剤」とは、本発明の核酸分子の有効な分布を、それらの望まれる活性に最も適した生理学的位置で可能にする組成物又は製剤を意味する。本発明の核酸分子との製剤に適した剤の非制限例には以下のものが含まれる：ＣＮＳ内への薬剤の移行を増強することが可能であるＰ−糖タンパク質阻害剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ８５のような）[Jolliet-Riant and Tillement, Fundam. Clin. Pharmacol., 13:16-26 (1999)] ；脳内移植後の徐放性放出送達のためのポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）のような生分解性ポリマー[Emerich, D F et al., Cell Transplant, 8: 47-58 (1999)](Alkermes, Inc. Cambridge, Mass.) ；及び血液脳関門を超えて薬剤を送達することが可能であり、そして神経細胞取り込み機構を改変可能である、ポリブチルシアノアクリレートから作製されたもののような、添加ナノ粒子[Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 23: 941-949, (1999)] 。本発明の核酸分子についての送達戦略の、他の非制限例には、Boado et al., J. Pharm. Sci., 87:1308-1315 (1998); Tyler et al., FEBS Lett., 421: 280-284 (1999); Pardridge et al., PNAS USA., 92: 5592-5596 (1995); Boado, Adv. Drug Delivery Rev., 15: 73-107 (1995); Aldrian-Herrada et al., Nucleic Acids Res., 26: 4910-4916 (1998); 及び Tyler et al., PNAS USA., 96: 7053-7058 (1999) に記載されている材料が含まれる。
【００７２】
本発明はまた、薬学的に許容できる坦体又は希釈剤中に、薬学的に有効量の所望の化合物を含む、保存又は投与のために製造された組成物も含む。療法的使用のための許容できる坦体又は希釈剤は、薬学分野では周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985) に記載されている。例えば、保存剤、安定化剤、色素及び芳香剤を提供することができる。これらには、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。加えて、抗酸化剤及び懸濁剤を使用することができる。
【００７３】
薬学的に有効な用量とは、疾患状態を防止する、発生を抑制する、又は治療する（症状をある程度、好ましくは症状のすべてを軽減する）ために必要とされる用量である。薬学的に有効な用量は、疾患の型、使用される組成物、投与経路、治療されている哺乳動物の型、考慮されている特定の哺乳動物の生理学的特徴、併用薬物療法、及び医学分野の当業者が認識するであろう他の因子に依存する。一般に、陰性に荷電したポリマーの効力に依存して、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の活性成分の量で投与される。
【００７４】
水性懸濁剤は、水性懸濁剤の製造に適した賦形剤と混合された活性物質を含む。こうした賦形剤は、懸濁剤であり、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピル−メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアラビアゴム；分散剤又は湿潤剤は、天然に存在するリン脂質、例えば、レシチン、又はアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンステアレート、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートのようなエチレンオキシドと、脂肪酸及びヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合生成物、又はエチレンオキシドと、脂肪酸及びヘキシトール無水物から誘導された部分エステルとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、であり得る。水性懸濁剤はまた、一つまたはそれより多くの保存剤、例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル又はｎ−プロピル、一つまたはそれより多くの芳香剤、及びスクロース又はサッカリンのような一つまたはそれより多くの甘味剤も含有することが可能である。
【００７５】
油性懸濁液は、活性成分を植物油、例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油又はココナツ油、又は流動パラフィンのような鉱物油に懸濁することにより製剤することが可能である。油性懸濁剤は、増粘剤、例えば、蜜ろう、硬パラフィン又はセチルアルコール、を含有することが可能である。甘味剤及び芳香剤を、口にあう経口調製物を提供するために加えることが可能である。これらの組成物は、アスコルビン酸のような抗酸化剤の添加により保存することが可能である。
【００７６】
水の添加による水性懸濁剤の調製に適した、分散可能散剤及び顆粒剤は、分散又は湿潤剤、懸濁剤及び一つまたはそれより多くの保存剤と混合された活性成分を提供する。適した分散又は湿潤剤又は懸濁剤は、上ですでに述べたものにより例示される。追加の賦形剤、例えば、甘味、芳香及び着色剤もまた存在することが可能である。
【００７７】
本発明の医薬組成物はまた、油中水乳剤の形態であることもできる。油相は、植物油又は鉱物油、又はこれらの混合物であり得る。適した乳化剤は、天然に存在するゴム、例えば、アラビアゴム又はトラガカントゴム、天然に存在するリン脂質、例えば、大豆レシチン、及び脂肪酸とヘキシトール、無水物から誘導されるエステル又は部分エステル、例えば、ソルビタンモノオレエート、及び前記部分エステルとエチレンオキシドの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、であり得る。乳剤はまた、甘味及び芳香剤を含有することが可能である。
【００７８】
医薬組成物は、滅菌注射可能水性または油性懸濁液の形態であることも可能である。この懸濁液は、上に記述した、適した分散または湿潤剤及び懸濁剤を使用し、既知の技術に従って製剤することが可能である。滅菌注射可能製剤はまた、無毒の非経口的に許容できる希釈剤又は溶媒中の滅菌注射可能溶液又は懸濁剤であることが可能である（例えば、１，３−ブタンジオール溶液として）。中でも、用いることが可能である許容できるビヒクル及び溶媒は、水、リンガー液及び等張塩化ナトリウム溶液である。加えて、滅菌固定油は、溶媒又は懸濁媒質として慣用的に用いられている。この目的には、合成モノ又はジグリセリドを含む、いずれかの刺激性の低い固定油を用いることが可能である。加えて、オレイン酸のような脂肪酸の、注射可能剤の調製における使用が見出されている。
【００７９】
ｓｉＮＡはまた、座剤の形態で投与することも可能である（例えば、薬剤の直腸投与）。これらの組成物は、薬剤を、常温では固体であるが直腸温度で液体であり、そしてそれ故、直腸で融解して薬剤を放出するであろう、適した非刺激性賦形剤と混合することにより調製可能である。こうした材料には、カカオ脂及びポリエチレングリコールが含まれる。
【００８０】
ｓｉＮＡは、ヌクレアーゼ耐性基、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｈ、での修飾により、安定性を増強するために広範に修飾することが可能である。［総説として、Usman and Cedergren, TIBS 17: 34 (1992); Usman et al., Nucleic Acids Symp. Ser. 31: 163 (1994) を参照されたい］。ｓｉＮＡ構築物は、一般法を使用するゲル電気泳動により精製することが可能であり、又は高速液体クロマトグラフィーにより精製することが可能であり、そして水に再懸濁する。
【００８１】
修飾（塩基、糖及び／又はリン酸）を有する核酸分子を化学的に合成することは、血清リボヌクレアーゼによるそれらの分解を防止することを可能にし、それは効力を増加させる。例えば、Eckstein et al., 国際公開番号 WO 92/07065 ; Perrault et al., Nature 344: 565 (1990); Pieken et al., Science 253, 314 (1991); Usman and Cedergren, Trends in Biochem. Sci. 17: 334 (1992); Usman et al.,  国際公開番号 WO 93/15187 ；及びRossi et al., 国際公開番号WO 91/03162 ; Sproat, 米国特許第5,334,711 号； Gold et al., 米国特許第6,300,074 号を参照されたい。前記の参照文献のすべてが、本明細書に記載した核酸分子の塩基、リン酸及び／又は糖部分へ行うことが可能な、多様な化学修飾を記載している。
【００８２】
ヌクレアーゼ安定性及び有効性における有意な増強を伴って核酸分子内へ導入することが可能である、糖、塩基及びリン酸修飾を記載しているいくつかの例が当該技術分野に存在する。例えば、オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性基での修飾、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｈ、ヌクレオチド塩基修飾により、安定性を増強するため及び／又は生物学的活性を増強するために修飾される。総説として、Usman and Cedergren, , TIBS. 17: 34 (1992); Usman et al., Nucleic Acids Symp. Ser. 31:163 (1994); Burgin et al., Biochemistry, 35: 14090 (1996) を参照されたい。核酸分子の糖修飾は、当該技術分野で広範に記述されている。Eckstein et al., 国際公開ＰＣＴ番号WO 92/07065; Perrault et al. Nature,344, 565-568 (1990); Pieken et al. Science, 253: 314-317 (1991); Usman and Cedergren, Trends in Biochem. Sci., 17: 334-339 (1992); Usman et al. 国際公開ＰＣＴ番号WO 93/15187; Sproat, 米国特許第5,334,711 号及びBeigelman et al., 1995, J. Biol. Chem., 270, 25702; Beigelman et al., 国際ＰＣＴ公開番号WO 97/26270; Beigelman et al., 米国特許第5,716,824 号; Usman et al., 米国特許第5,627,053 号; Woolf et al., 国際ＰＣＴ公開番号WO 98/13526; Thompson et al., Karpeisky et al., Tetrahedron Lett., 39: 1131 (1998); Earnshaw and Gait, Biopolymers (Nucleic Acid Sciences), 48: 39-55 (1998); Verma and Eckstein, Annu. Rev. Biochem., 67: 99-134 (1998); and Burlina et al., Bioorg. Med. Chem., 5: 1999-2010 (1997) 、を参照されたい。こうした公開物は、触媒を変調することなく、核酸分子内に糖、塩基及びリン酸修飾の取り込み位置を決定するための一般法及び戦略を記載している。こうした教示を考えて、細胞中でＲＮＡｉを促進するｓｉＮＡの能力が有意に阻害されない限り、本発明のｓｉＮＡ核酸分子を修飾するため、本明細書で記載されたような類似の修飾を使用することが可能である。
【００８３】
ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート及び／又は５’−メチルホスホネート結合による、オリゴヌクレオチドヌクレオチド間結合の化学修飾は、安定性を改良するが、過剰な修飾は、若干の毒性を引き起こし、活性を低下させることが可能である。それ故、核酸分子を設計する場合、これらのヌクレオチド間結合の量は最小にすべきである。これらの結合の濃度減少は、毒性を低下させるべきであり、結果としてこれらの分子の増加した有効性及びより高い特異性を生じる。
【００８４】
一つの態様において、本発明は、一つまたはそれより多くのホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミデート、カルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール及び／又はアルキルシリル置換を含むリン酸主鎖修飾を有する、修飾ｓｉＮＡ分子を特色とする。オリゴヌクレオチド主鎖修飾の総説については、Hunziker and Leumann, Nucleic Acid Analogues: Synthesis and Properties, in Modern Synthetic Methods, VCH, 331-417 (1995), 及び Mesmaeker et al., Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides, in Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ACS, 24-39 (1994) 、を参照されたい。
【００８５】
核酸分子の送達のための方法は、Akhtar et al., Trends Cell Bio., 2: 139 (1992); Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, (1995), Maurer et al., Mol. Membr. Biol., 16: 129-140 (1999); Hofland and Huang, Handb. Exp. Pharmacol., 137: 165-192 (1999); 及び Lee et al., ACS Symp. Ser., 752: 184-192 (2000) 、に記載されている。Beigelman et al., 米国特許第6,395,713 号及びSullivan et al., PCT WO 94/02595 は、核酸分子の送達のための一般法をさらに記載している。これらのプロトコルは、実質的にいずれの核酸分子の送達にも利用することが可能である。核酸分子は、当業者には既知の多様な方法により細胞へ投与することが可能であり、限定されるわけではないが、以下のものが含まれる、リポソームへの封入、イオン注入、又は生分解性ポリマー、ヒドロゲル、シクロデキストリン（例えば、Gonzalez et al., Bioconjugate Chem., 10: 1068-1074 (1999); Wang et al., 国際ＰＣＴ公開番号WO 03/47518 及びWO 03/46185 、を参照されたい）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）及びＰＬＧＡミクロスフェア（例えば、米国特許第6,447,796 号及び米国特許出願公開番号US 2002130430 、を参照されたい）、生分解性ナノカプセル及び生体接着性ミクロスフェア又はタンパク質性ベクター（O'Hare and Normand, 国際ＰＣＴ公開番号WO 00/53722 ）。もしくは、核酸／ビヒクルの組み合わせは、直接注射により、又は注入ポンプの使用により局所的に送達する。本発明の核酸分子の直接注射は、皮下、筋肉内又は皮内であれ、標準針及びシリンジ方法論を使用して、又はConry et al., Clin. Cancer Res., 5: 2330-2337 (1999) 及び Barry et al., 国際ＰＣＴ公開番号WO 99/31262 に記載されているもののような針なし技術により行われる。本発明の分子は、医薬品として効果的に用いることが可能である。医薬品は、患者における疾患状態を防止する、発生を変調する、又は治療する（症状をある程度、好ましくは症状のすべてを軽減する）。
【００８６】
本明細書で使用する用語「リガンド」とは、直接的か又は間接的に、受容体のような別の化合物と相互作用することが可能である、薬剤、ペプチド、ホルモン又は神経伝達物質のようないずれかの化合物又は分子を指す。リガンドと相互作用する受容体は、細胞の表面上に存在することが可能であり、もしくは細胞間受容体であることも可能である。リガンドと受容体の相互作用は、生化学的反応を生じることが可能であるが、単に物理的相互作用又は会合であることも可能である。
【００８７】
本明細書で使用する場合、「非対称ヘアピン」とは、アンチセンス領域、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含むループ部分、及びセンス領域がアンチセンス領域との塩基対に十分な相補的ヌクレオチドを有し、そしてループを有する二重鎖を形成する程度まで、アンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含むセンス領域、を含む直線状ｓｉＮＡ分子を意味する。例えば、本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は、Ｔ細胞中でＲＮＡｉを仲介するために十分な長さ（例えば、約１９〜約２２（例えば、約１９、２０、２１又は２２）ヌクレオチド）を有するアンチセンス領域、及び約４〜約８（例えば、約４，５、６、７又は８）ヌクレオチドを含むループ領域、及びアンチセンス領域と相補的である約３〜約１８（例えば、約３、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８）ヌクレオチドを有するセンス領域、を含むことが可能である。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子はまた、化学的に修飾することが可能である、５’−末端リン酸基も含む。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子のループ領域は、本明細書で記載したヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカー分子又はコンジュゲート分子を含むことが可能である。
【００８８】
本明細書で使用する場合、「非対称二重鎖」とは、センス領域及びアンチセンス領域を含む、二つの別々の鎖を有するｓｉＮＡ分子を意味し、ここで、センス領域は、センス領域がアンチセンス領域との塩基対に十分な相補的ヌクレオチドを有し、そしてループを有する二重鎖を形成する程度まで、アンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含む。例えば、本発明の非対称二重鎖ｓｉＮＡ分子は、Ｔ細胞中でＲＮＡｉを仲介するために十分な長さ（例えば、約１９〜約２２（例えば、約１９、２０、２１又は２２）ヌクレオチド）を有するアンチセンス領域、及びアンチセンス領域と相補的である約３〜約１８（例えば、約３、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８）ヌクレオチドを有するセンス領域、を含むことが可能である。
【００８９】
「遺伝子発現を変調する」とは、標的遺伝子の発現が上方調節される又は下方調節されることを意味し、それは、細胞中に存在するｍＲＮＡレベル、又はｍＲＮＡ翻訳、又は標的遺伝子によりコードされたタンパク質又はタンパク質サブユニットの合成の上方調節又は下方調節を含む。遺伝子発現の変調はまた、対象タンパク質又はサブユニットの発現、レベル又は活性が、変調剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）の非存在下で観察されたものより多く又はより少なくなるように、上方調節された又は下方調節された標的遺伝子によりコードされている一つまたはそれより多くのタンパク質又はタンパク質サブユニットの存在、量又は活性で決定することが可能である。例えば、用語「変調する」は、「抑制する」を意味することが可能であるが、用語「変調する」の使用は、この定義に制限されていない。
【００９０】
発現を「抑制する」、「下方調節する」又は「減少させる」とは、遺伝子の発現、又は一つまたはそれより多くのタンパク質又はタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子又は均等なＲＮＡ分子のレベル、又は標的遺伝子によりコードされている一つまたはそれより多くのタンパク質又タンパク質サブユニットの活性レベルが、本発明の核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ）の非存在下で観察されるものよりも減少していることを意味している。一つの態様において、ｓｉＮＡ分子による抑制、下方調節又は減少は、不活性化又は減弱された分子の存在下で観察されるレベルよりも低い。別の態様において、ｓｉＮＡ分子による抑制、下方調節又は減少は、例えば、スクランブルされた配列又は不適正塩基対を有するｓｉＮＡ分子の存在下で観察されるレベルよりも低い。別の態様において、本発明の核酸分子による遺伝子発現の抑制、下方調節又は減少は、核酸分子非存在下よりもその存在下でより大きい。
【００９１】
遺伝子「サイレンシング」とは、細胞中の標的とされた遺伝子発現の抑制を通した、部分的又は完全な機能喪失を指し、そして「ノックダウン」と呼ぶこともできる。取り組むべき状況及び生物学的問題に依存し、部分的に遺伝子発現を減少させることが好ましいこともある。もしくは、遺伝子発現を可能な限り減少させることが望まれてもよい。サイレンシングの程度は、当該技術分野では既知の方法により決定することができ、そのいくつかは国際公開番号WO 99/32619 に要約されている。アッセイに依存して、遺伝子発現の定量は、例えば、ベースライン（即ち、正常）又は特定の疾患状態又は療法の標的とされた他の状態に付随するであろう上昇した発現レベルを含む他の対照レベルの１０％、３０％、５０％、７５％、９０％、９５％又は９９％に等しいか又は大きい程度まで、ｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベル又は活性の点から、標的遺伝子発現をノックダウンすることが可能であろう、予防的及び療法的方法を含む本発明の特定の態様で望むことができる抑制の多様な量の検出を可能にする。
【００９２】
句「標的遺伝子の発現を抑制すること」とは、標的遺伝子のサイレンシングを開始する、本発明のｓｉＮＡの能力を指している。遺伝子サイレンシングの程度を試験するため、目的とする生物体又は特定の構築物を発現している培養中の細胞の試料又はアッセイを、構築物の発現を欠く対照試料と比較する。対照試料（構築物発現を欠く）を１００％の相対値に割り当てる。試験値が対照に関して約９０％、しばしば５０％、そして特定の態様においては２５〜０％である場合、標的遺伝子の発現の抑制が達成されている。適したアッセイには、例えば、ドットブロット、ノーザンブロット、インサイツハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、酵素機能、ならびに当業者には既知である表現型アッセイのような、当業者には既知の技術を使用する、タンパク質又はｍＲＮＡレベルの試験が含まれる。
【００９３】
「対象」とは、生物体、組織又は細胞を意味し、それは対象としての、又は移植された細胞のドナー又はレシピエントとしての生物体、又はそれ自身がｓｉＮＡ送達の対象である細胞を含むことができる。それ故「対象」は、本発明の核酸分子が、そして本明細書に記載したポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドにより投与する及び増強することが可能である、インビトロ又はエクスビボの器官、組織又は細胞対象を含む、生物体、器官、組織又は細胞を指すことができる。対象の例には、哺乳動物個体又は細胞、例えば、ヒト患者又は細胞が含まれる。
【００９４】
本明細書で使用する「細胞」は、通常の生物学的感覚で使用し、全多細胞生物体を指してはおらず、特にヒトを指してはいない。細胞は、生物体、例えば、トリ、植物、及びヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌ及びネコのような哺乳動物中に存在することが可能である。細胞は、原核生物（例えば、細菌細胞）又は真核生物（例えば、哺乳動物又は植物細胞）であり得る。細胞は、体細胞性又は生殖系列性起源、全能性又は多能性、分割性又は非分割性であり得る。細胞はまた、配偶子又は胚、幹細胞又は完全に分化した細胞に由来する、又は含むことが可能である。
【００９５】
「ベクター」とは、所望の核酸を送達するために使用される、いずれかの核酸−及び／又はウイルス−に基づいた技術を意味する。
【００９６】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、単語「含む」に何が続いていようとも、それを包含するが、それに限定されるわけではないことを意味している。それ故、用語「含む」の使用は、列挙された要素が必要とされ又は必須であること、及び他の要素は任意であり、そして存在する又は存在しないことができることを示している。「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」とは、句「から成る」に何が続いていようとも、それを包含しており、それに限定されることを意味している。それ故、句「から成る」は、列挙された要素が必要とされ又は必須であること、及び他の要素は存在しないことを示している。「から本質的に成る」とは、句の後に列挙されたいずれの要素も包含し、及び列挙された要素についての開示において特定された活性及び作用を妨害しない又は寄与しない他の要素に制限される、ことを意味する。それ故、句「から本質的に成る」は、列挙された要素は必要とされ又は必須であるが、他の要素は任意であり、列挙された要素の活性又は作用に影響しないかどうかに依存して、存在する又は存在しないことができることを示している。
【００９７】
「ＲＮＡ］とは、少なくとも一つのリボヌクレオチド残基を含んで成る分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、ベータ−Ｄ−リボ−フラノース部分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。本用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡのような単離されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え的に生成されたＲＮＡ、ならびに、一つまたはそれより多くのヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は改変により、天然に存在するＲＮＡとは異なった改変されたＲＮＡを包含する。こうした改変は、例えば、ＲＮＡの一つまたはそれより多くのヌクレオチドでの、ｓｉＮＡの末端（単数又は複数）への又は内部的な、非ヌクレオチド材料の付加を含むことが可能である。本発明のＲＮＡ分子中のヌクレオチドはまた、天然に存在しないヌクレオチド又は化学的に合成されたヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドのような、非標準ヌクレオチドも含むことが可能である。これらの改変されたＲＮＡは、類似体又は天然に存在するＲＮＡの類似体と称することが可能である。
【００９８】
「高度に保存された配列領域」とは、標的遺伝子中の一つまたはそれより多くの領域のヌクレオチド配列が、一つの世代から他の世代間で、又は一つの生物学的システムから他のシステム間で有意には変化しないものを意味している。
【００９９】
「センス領域」とは、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域と相補性を有するｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。加えて、ｓｉＮＡ分子のセンス領域は、標的核酸配列と相同性を有する核酸配列を含むことが可能である。
【０１００】
「アンチセンス領域」とは、標的核酸配列と相補性を有するｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、場合により、ｓｉＮＡ分子のセンス領域と相補性を有する核酸配列を含むこともできる。
【０１０１】
「標的核酸」とは、その発現又は活性が変調されるべきいずれかの核酸配列を意味する。標的核酸はＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。
【０１０２】
「相補性」とは、核酸が、伝統的ワトソン−クリックか又は他の非伝統型により、別の核酸配列と水素結合（単数又は複数）の形成が可能であることを意味する。本発明の核酸分子に関して、核酸分子とその相補的配列についての結合自由エネルギーは、核酸の関連する機能、例えば、ＲＮＡｉ活性、が進行するのを可能にするには十分である。核酸分子についての結合自由エネルギーの決定は、当該技術分野では周知である（例えば、Turner et al., 1987, CSH Symp. Quant. Biol. LII pp.123-133; Frier et al., 1986, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9373-9377; Turner et al., 1987, J. Am. Chem. Soc. 109:3783-3785 、を参照されたい）。パーセント相補性は、第二の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対形成）を形成することが可能な、核酸分子中の連続した残基のパーセンテージを示している（例えば、１０ヌクレオチドを有する第二の核酸配列へ、第一のオリゴヌクレオチド中の総計で１０ヌクレオチドの内の５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチドが塩基対形成されていれば、各々、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％及び１００％相補性を意味する）。「完全に相補的」とは、核酸配列のすべての連続残基が、第二の核酸配列中の同数の連続残基と水素結合するであろうことを意味する。
【０１０３】
本明細書で使用する「汎用塩基」とは、各々の天然のＤＮＡ／ＲＮＡ塩基と、それらとの間でほとんど区別なく塩基対を形成する、ヌクレオチド塩基類似体を指している。汎用塩基の非制限例には、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチル及び他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、及び当該技術分野で既知の３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール及び６−ニトロインドールのようなニトロアゾール誘導体が含まれる（例えば、Loakes, 2001, Nucleic Acids Research, 29, 2437-2447 、を参照されたい）。
【０１０４】
本明細書で使用する用語「非環式ヌクレオチド」とは、例えば、リボース炭素のいずれか（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４又はＣ５）が独立して、又は組み合わせて、ヌクレオチドに存在しない非環式リボース糖を有している、いずれかのヌクレオチドを指している。
【０１０５】
本明細書で使用する用語「生分解性」とは、生物学的システムにおける分解、例えば、酵素分解又は化学分解、を指している。
【０１０６】
本明細書で使用する用語「生物学的に活性な分子」とは、システムにおける生物学的応答を惹起できる又は修飾できる化合物又は分子を指している。単独で又は本発明により企図された他の分子と組み合わされる生物学的に活性なｓｉＮＡ分子の非制限例には、抗体、コレステロール、ホルモン、抗ウイルス剤、ペプチド、タンパク質、化学療法剤、小分子、ビタミン、補因子、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素的核酸、アンチセンス核酸、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、２，５−Ａキメラ、ｓｉＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アロザイム、アプタマー、デコイ及びそれらの類似体のような療法的活性分子が含まれる。本発明の生物学的に活性な分子はまた、他の生物学的に活性な分子、例えば、脂質、及びポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール及び他のポリマーのようなポリマー類の薬物動態学及び／又は薬物動力学を変調することができる分子も含む。
【０１０７】
本明細書で使用する用語「リン脂質」とは、少なくとも一つのリン基を含む、疎水性分子を指す。例えば、リン脂質は、リン含有基、及びＯＨ、ＣＯＯＨ、オキソ、アミン又は置換又は未置換アリール基で置換されていてもよい、飽和又は不飽和アルキル基を含むことが可能である。
【０１０８】
「キャップ構造」とは、オリゴヌクレオチドの両方の末端に取り入れられている、化学修飾を意味する（例えば、本明細書において援用される、Adamic et al.,米国特許第5,998,203 号、を参照されたい）。これらの末端修飾は、エキソヌクレアーゼ分解から核酸分子を保護し、そして細胞内への送達及び／又は局在化を助けることができる。キャップは５’−末端（５’−キャップ）又は３’−末端（３’−キャップ）に存在することができ、又は両末端に存在することもできる。非制限例において、５’−キャップには、限定されるわけではないが、グリセリル、逆方向デオキシ脱塩機残基（部分）；４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド；炭素環式ヌクレオチド；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−逆方向ヌクレオチド部分；３’−３’−逆方向脱塩機部分；３’−２’−逆方向ヌクレオチド部分；  ３’−２’−逆方向脱塩機部分；１，４−ブタンジオールホスフェート；３’−ホスホロアミデート；ヘキシルホスフェート；アミノヘキシルホスフェート；３’−ホスフェート；３’−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；又は架橋又は非架橋メチルホスホネート部分が含まれる。
【０１０９】
３’−キャップの非制限例には、限定されるわけではないが、グリセリル、逆方向デオキシ脱塩機残基（部分）；４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド；炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルホスフェート；１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート；３−アミノプロピルホスフェート；６−アミノヘキシルホスフェート；１，２−アミノドデシルホスフェート；ヒドロキシプロピルホスフェート；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−逆方向ヌクレオチド部分；５’−５’−逆方向脱塩機部分；５’−ホスホロアミデート；  ５’−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールホスフェート；５’−アミノ；架橋又は非架橋５’-ホスホロアミデート、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエート、架橋又は非架橋メチルホスホネート及び５’-メルカプト部分が含まれる（より詳細については、本明細書において援用されるBeaucage and lyer, 1993, Tetrahedron 49, 1925 を参照されたい）。
【０１１０】
用語「非ヌクレオチド」とは、糖及び／又はリン酸置換を含む、一つまたはそれより多くのヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖内に取り込まれることが可能で、残っている塩基がそれらの酵素活性を示すことを可能にする、いずれかの基又は化合物を意味する。基又は化合物は、それがアデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル又はチミンのような通常認識されるヌクレオチド塩基を含有せず、そしてそれ故、１’−位の塩基を欠く、脱塩基である。
【０１１１】
本明細書において使用する「ヌクレオチド」とは、当該技術分野で認識されているようであり、天然の塩基（標準）及び当該技術分野において周知である修飾塩基含んでいる。こうした塩基は一般に、ヌクレオチド糖部分の１’−位に位置している。ヌクレオチドは一般に、塩基、糖及びリン酸基を含む。ヌクレオチドは、未修飾であるか又は糖、リン酸及び／又は塩基部分で修飾されうる（また、ヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチドその他と互換的に称される；例えば、Usman and McSwiggen, 上記文献； Eckstein et al., 国際ＰＣＴ公開番号WO 92/07065; Usman et al, 国際ＰＣＴ公開番号 WO 93/15187; Uhlman & Peyman, 上記文献、すべてが本明細書において援用される、を参照されたい）。Limbach et al, 1994, Nucleic Acids Res. 22, 2183 、により要約されているような、当該技術分野で既知の修飾核酸塩基のいくつかの例がある。核酸分子内へ導入することが可能である、塩基修飾のいくつかの非制限例には、イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、プソイドウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）又は６−アザピリミジン又は６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピン及びその他が含まれる（Burgin et al., 1996, Biochemistry, 35, 14090; Uhlman & Peyman, 上記文献）。この側面において「修飾塩基」とは、１’位のアデニン、グアニン、シトシン及びウラシル以外のヌクレオチド塩基又はそれらの均等物を意味する。
【０１１２】
「標的部位」とは、そのアンチセンス領域内に標的配列と相補的である配列を含有する、ｓｉＮＡ構築物により仲介される切断の「標的とされ」ている、標的ＲＮＡ内の配列を意味する。
【０１１３】
「検出可能な切断のレベル」とは、標的ＲＮＡの無作為分解により産生されたＲＮＡのバックグラウンドより上の、切断生成物を識別するのに十分な程度の標的ＲＮＡの切断（及び切断生成物ＲＮＡの形成）を意味する。標的ＲＮＡの１〜５％からの切断生成物の生成は、ほとんどの検出法においてバックグラウンドより上であることを検出するのに十分である。
【０１１４】
「生物学的システム」とは、限定されるわけではないが、ヒト、動物、植物、昆虫、細菌、ウイルス又はその他の起源を含む、生物学的起源からの、精製された又は精製されていない形態の、材料を意味し、ここで、システムは、ＲＮＡｉ活性に必要とされる要素を含む。用語「生物学的システム」は、例えば、細胞、組織又は器官、又はそれらの抽出物を包含する。用語生物学的システムはまた、インビトロ設定で使用することが可能である、再構築されたＲＮＡｉシステムも包含する。
【０１１５】
本明細書で使用する用語「生分解性リンカー」とは、一つの分子を別の分子、例えば、生物学的に活性な分子を、本発明のｓｉＮＡ分子又は本発明のｓｉＮＡ分子のセンス及びアンチセンス鎖、に連結するための生分解性リンカーとして設計されている、核酸又は非核酸リンカー分子を指す。生分解性リンカーは、その安定性が、特定の組織又は細胞型への送達のような特定の目的のために変調することが可能であるように設計する。核酸に基づいた生分解性リンカー分子の安定性は、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、及び２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−アミノ、２’−Ｏ−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−Ｏ−アリル及び他の２’−修飾又は塩基修飾ヌクレオチドのような化学的修飾ヌクレオチドの組み合わせ、のような多様な化学を使用することにより変調することが可能である。生分解性核酸リンカー分子は、二量体、三量体、四量体、又は、例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０ヌクレオチド長のより長い核酸分子であることが可能であり、又はリンに基づいた結合、例えば、ホスホロアミデート又はホスホジエステル結合を有する単一ヌクレオチドを含むことも可能である。生分解性核酸リンカー分子はまた、核酸主鎖、核酸糖又は核酸塩基の修飾を含むことも可能である。
【０１１６】
「脱塩基」とは、１’位に塩基を欠いているか、又は塩基の代わりに他の化学基を有する糖部分を意味し、例えば、Adamic et al. による米国特許第5,998,203 号を参照されたい。
【０１１７】
「未修飾ヌクレオシド」とは、ベータ−Ｄ−リボ−フラノースの１’炭素に連結された塩基アデニン、シトシン、グアニン、チミン又はウラシルのうちの一つを意味する。
【０１１８】
「修飾ヌクレオシド」とは、未修飾ヌクレオチド塩基、糖及び／又はリン酸の化学構造における修飾を含有するいずれかのヌクレオチド塩基を意味する。修飾ヌクレオチドの非制限例は、式Ｉ〜ＶＩＩにより示されているもの、及び／又は本明細書に記載されている他の修飾である。
【０１１９】
本発明について記載した２’−修飾ヌクレオチドに関連して、「アミノ」は、２’−ＮＨ２又は２’−Ｏ−−ＮＨ２を意味し、それらは修飾されているか又は未修飾であることが可能である。こうした修飾基は、例えば、Eckstein et al. 米国特許第5,672,695 号及びMatulic-Adamic et al. 米国特許第6,248,878 号に記載されている。
【０１２０】
ｓｉＮＡ分子は、カチオン性脂質と複合体形成され、リポソーム内に封入され、又は別の方法で標的細胞又は組織へ送達することが可能である。核酸又は核酸複合体は、注射、注入ポンプ又はステントを通して、バイオポリマー内へ取り込まれて又は取り込みなしで、局所的に投与することが可能である。別の態様において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、本発明のｓｉＮＡ化合物へ、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドへ、又は両方へ共有結合で結合させることが可能である。結合されたＰＥＧは、随意の分子量、好ましくは約２，０００〜約５０，０００ダルトン（Ｄａ）でありうる。
【０１２１】
センス領域は、ポリヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーのようなリンカー分子を経て、アンチセンス領域へ連結することが可能である。
【０１２２】
「逆方向反復」とは、反復が転写された場合、センス及びアンチセンス要素が二本鎖ｓｉＲＮＡを形成することが可能であるように位置されている、センス及びアンチセンス要素を含む核酸配列を指す。逆方向反復は場合により、リンカー又は反復の二つの要素間の自己切断リボザイムのような異種配列を含んでいてもよい。逆方向反復の要素は、二本鎖ＲＮＡを形成するために十分な長さを有する。典型的には、逆方向反復の各要素は、約１５〜約１００ヌクレオチド長、好ましくは約２０〜３０塩基ヌクレオチド、好ましくは約２０〜２５ヌクレオチド長、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチド長である。
【０１２３】
「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、及び一本鎖又は二本鎖形のそれらのポリマーを指す。本用語は、合成、天然に存在する及び天然には存在しない、参照核酸と類似の結合特性を有する、及び参照ヌクレオチドと類似の様式で代謝される、既知のヌクレオチド類似体又は修飾主鎖残基又は結合を含有する核酸を包含する。こうした類似体には、限定されるわけではないが、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれる。
【０１２４】
「大きな二本鎖ＲＮＡ」とは、約４０塩基対（ｂｐ）より大きな、例えば、１００ｂｐより大きな、より特別には３００ｂｐより大きなサイズを有する二本鎖ＲＮＡを指す。大きなｄｓＲＮＡの配列は、ｍＲＮＡのセグメント又は全ｍＲＮＡを表してもよい。大きなｄｓＲＮＡの最大サイズは、本明細書では制限されていない。二本鎖ＲＮＡは修飾塩基を含んでいてもよく、ここで修飾はリン酸糖主鎖又はヌクレオシドに対するものであることができる。こうした修飾は、窒素又は硫黄ヘテロ原子又は当該技術分野で既知のいずれかの他の修飾を含むことができる。
【０１２５】
二本鎖構造は、ヘアピン又はマイクロＲＮＡで起こるような自己相補的ＲＮＡ鎖により、又は二つの異なった相補的ＲＮＡ鎖のアニーリングにより形成することができる。
【０１２６】
「オーバーラッピング」とは、二つのＲＮＡ断片が、一つの鎖上で複数のヌクレオチドがオーバーラップする配列を有する場合を指す（複数のヌクレオチド（ｎｔ）数は最小２〜５ヌクレオチド又は５〜１０ヌクレオチドまで又はそれ以上）。
【０１２７】
「一つまたはそれより多くのｄｓＲＮＡ」とは、配列に基づいて、お互いに異なっているｄｓＲＮＡを指す。
【０１２８】
「標的遺伝子又はｍＲＮＡ」とは、目的のいずれかの遺伝子又はｍＲＮＡを指す。実際、遺伝学により又は配列決定により以前に同定されているいずれの遺伝子も、標的になることができる。標的遺伝子又はｍＲＮＡは、発生遺伝子及び調節遺伝子、ならびに代謝又は構造遺伝子又は酵素をコードする遺伝子を含むことができる。標的遺伝子は、表現型が調べられている細胞中、又は生物体中で、直接的に又は間接的に表現型特徴に影響する様式で、発現されることができる。標的遺伝子は、内在性でも又は外来性であることもできる。こうした細胞には、成体の身体又は胎仔動物又は植物中のいずれかの細胞が含まれ、配偶子又は不死細胞株又は初代細胞培養で生じるような単離された細胞も含んでいる。
【０１２９】
本明細書及び付随する特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」の単数形は、文脈が明瞭に指示しない限り、複数表示を含む。
【実施例】
【０１３０】
実施例１
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドと複合体形成したｓｉＲＮＡを含む組成物の製造及び特徴付け
候補ｓｉＲＮＡ及び本発明のポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド間に複合体を形成するため、適量のｓｉＲＮＡを、前もって決められている量のポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド、例えば、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）細胞培地（Invitrogen ）と規定された比で混合し、室温で約１０〜３０分インキュベートした。続いて、選択された容量（例えば、約５０μｌ）のこの混合物と標的細胞を接触させ、細胞を前もって決められた期間（本実施例では約２時間）インキュベートした。ｓｉＮＡ／ペプチド混合物は、場合により、ウシ胎児血清のような細胞培養培地又は他の添加物を含むことが可能である。Ｈ３、Ｈ４及びＨ２ｂについて、異なった比でこれらのポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドとｓｉＲＮＡを複合体形成させるため、一連の実験を実施した。一般に、この実験は、１：０．０１〜１：５０のｓｉＲＮＡ／ヒストン比で開始した。９６ウェルマイクロタイタープレート中の各ウェルに、４０ｐｍ  ｓｉＲＮＡを加えた。各ウェルは５０％コンフルエンシーでベータ−ｇａｌ細胞を含有していた。トランスフェクション効率のための例示の最適比は下記表２に示されている。
【０１３１】
トランスフェクションは、正規のｓｉＲＮＡか又は上に定義したヒストンタンパク質の一つと複合体形成したｓｉＲＮＡを用い、９Ｌ／ベータ−ｇａｌ細胞に対して実施した。ｓｉＲＮＡは、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡを特異的にノックダウンするように設計され、そして活性は対照からのベータ−ｇａｌ活性のパーセンテージとして表現されている（対照細胞は、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドなしのリポフェクタミンを使用してトランスフェクトした）。
【０１３２】
ｓｉＲＮＡ送達の効率を検出する及び／又は定量するためのアッセイは、慣用法、例えば、ベータ−ガラクトシダーゼアッセイ又はフローサイトメトリー法を使用して実施した。
【０１３３】
ベータ−ガラクトシダーゼアッセイについては、ベータ−ガラクトシダーゼを構成的に発現する細胞株、９Ｌ／ＬａｃＺ細胞を使用し、ベータ−ｇａｌ  ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡを化学的に合成し、そしてノックダウン効率を評価するため、送達試薬とともに使用した。
【０１３４】
トランスフェクション手順
本手順の第１日目に、Ｔ７５フラスコから飽和９Ｌ／ＬａｃＺ培養物をとり、細胞を引き離しそして１０ｍｌの完全培地（ＤＭＥＭ、１ｘＰＳ、１ｘＮａピルビン酸、１ｘＮＥＡＡ）内に希釈した。細胞をさらに１：１５に希釈し、この調製物の１００μｌを９６ウェルプレートのウェル内へ分注すると、それは一般に、トランスフェクションの次の日までに約５０％細胞コンフルエンスを生成するであろう。ウェルの端は空のまま残し、２５０μｌの水で満たし、そしてプレートは積み重ねずに、３７℃で一夜インキュベーター（５％ＣＯ２インキュベーター）中に置いた。
【０１３５】
第２日目、トランスフェクション複合体をＯｐｔｉ−ＭＥＭ中で調製した（各ウェル５０μｌ）。プレートから培地を除去し、ウェルを２００μｌのＰＢＳ又はＯｐｔｉ−ＭＥＭで１回洗浄した。プレートの液体を吸い取り、逆にしてティッシュペーパーで完全に乾燥させた。トランスフェクション混合物を次に各ウェルへ加え（５０μｌ／ウェル）、そして乾燥を防ぐため、端のウェルに２５０μｌの水を加えた。細胞は次に３７℃で少なくとも３時間インキュベートした（５％ＣＯ２インキュベーター）。トランスフェクション混合物を除去し、１００μｌの完全培地（ＤＭＥＭ、１ｘＰＳ、１ｘＮａピルビン酸、１ｘＮＥＡＡ）に置き換えた。細胞を既定の時間について培養し、酵素アッセイのために収集した。
【０１３６】
酵素アッセイ
酵素アッセイのための試薬は、Invitrogen (β−Ｇａｌアッセイキット、カタログ番号）及びFisher（Pierce Micro BCA タンパク質アッセイ試薬キット、カタログ）から購入した。
Ａ：細胞溶解
・培地を除去し、２００μｌのＰＢＳで１回洗浄、プレートから液体を吸い取り、逆さにして乾燥する。
【０１３７】
・β−Ｇａｌキットからの３０μｌ溶解緩衝液を各ウェルに加える。
【０１３８】
・細胞を２回、凍結−融解させて溶解物を発生させる。
Ｂ：β−Ｇａｌアッセイ
・アッセイ混合物を調製する（５０μｌ  １ｘ緩衝液、１７μｌ  ＯＮＰＧ、各ウェル）。
【０１３９】
・新規プレートを使用し、各ウェル内に６５μｌのアッセイ混合物を加える。
【０１４０】
・各ウェル内に１０μｌの細胞溶解物を加える。バックグラウンド活性を差し引くため、ブランクウェルがなければならない。
【０１４１】
・３７℃で、約２０分インキュベートする、ＯＮＰＧが役に立たなくなる及び高発現に偏らせるであろう、長いインキュベーションは回避する。
【０１４２】
・１００μｌの停止溶液を加える。
【０１４３】
・４２０ｎｍでＯＤを測定する。
Ｃ：ＢＣＡアッセイ
・ＢＳＡ標準を調製する（ウェル当たり１５０μｌ）、各点は各々のプレート上で二重でなければならない。
【０１４４】
・各ウェル内に１４５μｌの水を入れ、そして５μｌの細胞溶解液を各ウェル内へ加える。
【０１４５】
・製造元の指示に従って、最終アッセイ試薬を調製する。
【０１４６】
・各ウェル内に１５０μｌのアッセイ試薬を加える。
【０１４７】
・３７℃で、約２０分インキュベートする。
【０１４８】
・５６２ｎｍでＯＤを測定する。
Ｄ：比活性の計算
比活性は、ｎｍｏｌのＯＮＰＧ加水分解物／ｔ／ｍｇタンパク質として表現され、ここでｔは３７℃でのインキュベーション時間（分）であり；ｍｇタンパク質は、ＢＣＡ法により決定された、タンパク質のアッセイ値である。
【０１４９】
ＦＩＴＣ／ＦＡＭにコンジュゲートされたｓｉＲＮＡのフローサイトメトリー測定
ａ）ｓｉＲＮＡ／ペプチドの複合体への暴露後、細胞を少なくとも３時間インキュベートした。
【０１５０】
ｂ）２００μｌのＰＢＳで細胞を洗浄する。
【０１５１】
ｃ）１５μｌのＴＥで細胞を剥離させ、３７℃でインキュベートする。
【０１５２】
ｄ）３０μｌのＦＡＣＳ溶液（０．５％ＢＳＡ及び０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）を含む５つのウェルに細胞を再懸濁する。
【０１５３】
ｅ）５つのウェルすべてを一つのチューブに合併する。
【０１５４】
ｆ）各チューブ内に５μｌのＰＩ（ヨウ化プロピジウム）を加える。
【０１５５】
ｇ）製造元の指示に従って、蛍光励起細胞分取装置（ＦＡＣＳ）で細胞を分析する。
【０１５６】
ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡを沈黙させるために使用したｓｉＲＮＡ配列は以下のようであった：
C.U.A.C.A.C.A.A.A.U.C.A.G.C.G.A.U.U.U.dT.dT （センス）（配列番号）
A.A.A.U.C.G.C.U.G.A.U.U.U.G.U.G.U.A.G.dT.dT （アンチセンス）（配列番号）
【０１５７】
【表２】
2007536253.tif 000004
【０１５８】
ｓｉＲＮＡ／ペプチド／脂質
ｓｉＮＡポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド混合物、複合体又はコンジュゲートに対するカチオン性脂質の影響を評価するため、製造元の指示に従って一定濃度（０．２μｌ／１００μｌＯｐｔｉ−ＭＥＭ）で、ｓｉＮＡ／ポリヌクレオチド送達製剤にリポフェクチン（Invitrogen ）を加えたことを除いて、上記の手順を追随した。
【０１５９】
GKINLKALAALAKKIL （配列番号）、ｓｉＲＮＡ及びLIPOFECTIN （登録商標）(Invitrogen)を含む組成物を生成するためには、最初にｓｉＲＮＡ及びペプチドを、室温にて、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ細胞培養培地中で一緒に混合し、その後、混合物に室温でLIPOFECTIN （登録商標）を加えて、ｓｉＮＡ／ペプチド／カチオン性脂質組成物を形成させた。
【０１６０】
RVIRVWFQNKRCKDKK （配列番号）、ｓｉＲＮＡ及びLIPOFECTIN （登録商標）(Invitrogen)を含む組成物を生成するためには、最初にペプチド及びLIPOFECTIN （登録商標）を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ細胞培養培地中で一緒に混合し、この混合物にｓｉＲＮＡを加えて、ｓｉＮＡ／ペプチド／LIPOFECTIN （登録商標）組成物を形成させた。
【０１６１】
GRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQ （配列番号）又はGEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK （配列番号４）を使用してｓｉＮＡ／ペプチド／カチオン性脂質組成物を生成するためには、ｓｉＮＡ／ペプチド／カチオン性脂質組成物を生成するために一緒に加えられる成分の順序は問題ではない。
【０１６２】
ｓｉＲＮＡ／メリチン／LIPOFECTIN （登録商標）を生成するためには、最初にｓｉＲＮＡ及びメリチンを、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ細胞培養培地中で一緒に混合し、その後、混合物にLIPOFECTIN （登録商標）を加えた。
【０１６３】
ｓｉＲＮＡ／ヒストンＨ１／LIPOFECTIN （登録商標）組成物を生成するためには、最初にヒストンＨ１及びLIPOFECTIN （登録商標）を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ細胞培養培地中に一緒に加えて完全に混合し、次ぎにｓｉＲＮＡを加え、ヒストンLIPOFECTIN （登録商標）混合物と完全に混合して、ｓｉＲＮＡ／ヒストンＨ１／LIPOFECTIN （登録商標）組成物を形成させた。
【０１６４】
【表３】
2007536253.tif 000005
【０１６５】
上記の結果に基づくと、本発明の例示のポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドは、ｓｉＮＡの細胞取り込みを実質的に誘導する又は増強することが可能であり、一方、特定の本発明のｓｉＮａ／ポリペプチド混合物への随意のカチオン性脂質の添加は、ｓｉＮＡ送達効率を実質的に改良することができることが明らかである。
【０１６６】
実施例２
ＴＡＴ−ＨＡポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドとコンジュゲートされたｓｉＲＮＡを含む組成物の製造及び特徴付け
本実施例は、ｓｉＲＮＡの一つの鎖に共有結合でコンジュゲートされた特定のペプチドの合成及び取り込み活性を記述している。これらのコンジュゲートは、細胞質内にｓｉＲＮＡを効果的に送達し、所望の標的遺伝子のノックダウンを仲介する。
【０１６７】
ペプチド合成
ペプチドは、Rainin Symphony 合成機を使用し、ＣＬＥＡＲ−アミド樹脂上、固相Ｆｍｏｃ化学により合成した。カップリング工程は５当量のＨＣＴＵ及びＦｍｏｃアミノ酸を使用し、過剰のＮ−メチルモルホリンで４０分実施した。Ｆｍｏｃ除去は、ペプチド樹脂を２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液で、２回の１０分サイクル処理することにより達成した。全ペプチドが完了したら、Ｆｍｏｃ基をピペリジンで除去し、ＤＭＦでよく洗浄した。マレイミド修飾ペプチドは、６当量のＮ−メチルモルホリン存在下、ペプチド樹脂のＮ末端に、３．０当量の３−マレイミドプロピオン酸及びＨＣＴＵをカップリンさせることにより製造した。カップリングの程度は、カイザー試験によりモニターした。１０ｍＬの２．５％水及び２．５％トリイソプロピルシラン含有ＴＦＡを加え、続いて室温で２時間穏やかにかき混ぜることにより、樹脂からペプチドを切断した。生じた粗ペプチドは、エーテルで摩砕し、続いての濾過により集めた。粗生成物をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水に溶解し、凍結乾燥した。粗ペプチドを、１５ｍＬの０．０５％ＴＦＡ含有水及び３ｍＬの酢酸に溶解し、５ｍＬインジェクションループを通して５ｍＬ／分の流速で、Ｚｏｒｂａｘ  ＲＸ−Ｃ８逆相（２２ｍｍＩＤｘ２５０ｍｍ、５μｍ粒子サイズ）上に充填した。精製は、０．１％Ｂ／分の直線ＡＢ濃度勾配を行うことにより達成された（溶媒Ａは、０．０５％ＴＦＡ含有水であり、溶媒Ｂは、０．０５％ＴＦＡ含有アセトニトリルである）。精製したペプチドを、ＨＰＬＣ及びＥＳＭＳにより分析した。
【０１６８】
コンジュゲートの合成
ペプチド及びＲＮＡの両方とも、標準固相合成法を使用して製造した。ペプチド及びＲＮＡ分子は、お互いの共有結合を可能にするため、特定の部分で官能化されていなければならない。ペプチドについては、Ｎ末端を、例えば、３−マレイミドプロピオン酸で官能化する。しかしながら、ブロモ又はヨードアセチル部分のような他の官能基も同様に働くであろうことが認識される。ＲＮＡ分子については、センス鎖の５’末端又はアンチセンス鎖の３’末端を、例えば、以下の合成法に従って１−Ｏ−ジメトキシトリチル−ヘキシル−ジスルフィドリンカーで官能化する。
【０１６９】
５’修飾Ｃ６ＳＳ−オリゴヌクレオチド（GCAAGCUGACCCUGAAGUUCAU ；３．４６７ｍｇ；０．４５８２μｍｏｌ）を、０．３ｍｌの０．１Ｍトリエチルアミンアセテート（ＴＥＡＡ）緩衝液（ｐＨ７．０）中、室温で３時間、０．３９３ｍｇ（３当量）のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）で遊離チオール基へ還元した。還元オリゴヌクレオチドを、０．１Ｍ  ＴＥＡＡ緩衝液（ｐＨ７）中、２０分以内での０〜３０％ＣＨ３ＣＮの直線濃度勾配を使用する、ＸＴｅｒｒａ（登録商標）ＭＳ  Ｃ１８  ４．６ｘ５０ｍｍカラムでのＲＰ  ＨＰＬＣにより精製した（ｔｒ＝５．９３１分）。
【０１７０】
精製還元オリゴヌクレオチド（１．３６１ｍｇ、０．１９０８５μｍｏｌ）を、０．２  ｍｌの０．１Ｍ  ＴＥＡＡ緩衝液（ｐＨ＝７）に溶解し、ペプチドＮ末端に結合されたマレイミド部分を有するペプチド（０．７９ｍｇ、１．５当量）をオリゴヌクレオチド溶液に加えた。ペプチドの添加後、沈殿が直ぐに形成されるが、それは１５０μｌの７５％ＣＨ３ＣＮ／０．１Ｍ  ＴＥＡＡの添加により消失した。室温で一夜撹拌後、生じたコンジュゲートを、０．１Ｍ  ＴＥＡＡ緩衝液（ｐＨ７）中、２０分以内での０〜３０％ＣＨ３ＣＮの直線濃度勾配、そして続いての５分以内での１００％Ｃを使用する、ＸＴｅｒｒａ（登録商標）ＭＳ  Ｃ１８  ４．６ｘ５０ｍｍカラムでのＲＰ  ＨＰＬＣにより精製した（ｔｒ＝２１．００７分）。コンジュゲートの量は、λ＝２６０ｎｍでの計算されたモル吸光係数に基づいて分光学的に決定した。ＭＡＬＤＩ質量分析は、コンジュゲートについて観察されたピーク（１０  ５８５．３  ａｍｕ）が計算された質量と一致していることを示した。収量：０．５０９ｍｇ、０．０４８１５μｍｏｌ、２５．２％）。
【０１７１】
ペプチドコンジュゲートセンス鎖及び相補的アンチセンス鎖は、５０ｍＭ酢酸カリウム、１ｍＭ酢酸マグネシウム及び１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中、９０℃で２分加熱し、続いて３７℃で１時間インキュベーションすることによりアニール化した。二本鎖ＲＮＡコンジュゲートの形成は、非変性（１５％）ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びエチジウムブロミドでの染色により確認した。
【０１７２】
ペプチド−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの構造
【０１７３】
【化１】
2007536253.tif 000006
【０１７４】
取り込み実験
トランスフェクション時におよそ〜５０から８０％のコンフルエントであるように、１日前に２４ウェルプレートに細胞を蒔いた。複合体については、ｓｉＲＮＡ及びペプチドをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）培地（Invitrogen ）中で希釈し、ＰＢＳで洗浄した細胞へ加える５〜１０分前に混合し、複合体形成させた。ｓｉＲＮＡの最終濃度は、各ペプチド濃度（２〜５０μＭ）で５００ｎＭであった。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）培地で希釈したコンジュゲートを、６２．５ｎＭ〜５００ｎＭの範囲の最終濃度で細胞へ加えた。５００ｎＭ濃度では、洗浄された細胞へ加える直前に、２０％ＦＢＳも併用した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で３時間トランスフェクトした。細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、そしてフローサイトメトリーにより分析した。ｓｉＲＮＡ取り込みは、Ｃｙ５蛍光の強度により測定し、細胞生存率はヨウ化プロピジウムの添加により評価した。
【０１７５】
図１及び２に示したように、より高い取り込み及びより大きな平均蛍光取り込みが、ペプチド及びＲＮＡを単に複合体形成させたものと比較してコンジュゲートについて観察された。このことは、特定の態様において、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドをｓｉＮＡ分子へコンジュゲートさせることが望ましいであろうことを示している。
【０１７６】
実施例３
ｓｉＲＮＡ／送達ペプチド複合体のスクリーニングは、合理的に設計されたポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドの多様な集団による、９Ｌ／ＬａｃＺ細胞におけるｓｉＲＮＡ取り込みの効率的な誘導を示す
本実施例は、本発明の合理的に設計されたポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドの広範な及び多様な集団が、ｓｉＲＮＡと複合体形成された場合、ｓｉＲＮＡ取り込みを誘導する又は増強することの追加の証拠を提供する。
【０１７７】
翌日のトランスフェクション時に〜５０％のコンフルエントであるように、およそ１０，０００の９Ｌ／ｌａｃＺ細胞を、平底９６ウェルプレート中のウェル当たりに蒔いた。ＦＡＭ標識ｓｉＲＮＡ及びペプチドを、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）培地（Invitrogen ）中で最終濃度の２倍に希釈した。等量のｓｉＲＮＡ及びペプチドを混合し、室温で５〜１０分複合体形成させ、次ぎに５０μＬを、あらかじめＰＢＳで洗浄した細胞へ加えた。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で３時間トランスフェクトした。細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、そしてフローサイトメトリーにより分析した。ｓｉＲＮＡ取り込みは、ＦＡＭ蛍光の強度により測定し、細胞生存率はヨウ化プロピジウムの添加により評価した。スクリーニングアッセイの結果は、下記表４に例示されている。
【０１７８】
【表４】
2007536253.tif 000007
【０１７９】
【表５】
2007536253.tif 000008
【０１８０】
実施例４
マウス細胞において、ｓｉＲＮＡ／送達はポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドにより増強される
本実施例は、ＬａｃＺ細胞及びマウス初代線維芽細胞における、本発明のポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドによるｓｉＲＮＡ取り込みの誘導／増強を例示する。これらの実験に使用された材料及び方法は、上記のものと一般的に同じであるが、但し、マウスの実験では９Ｌ／ＬａｃＺ細胞をマウス尾部線維芽細胞に置き換えた。これらの研究の結果は、下記表５及び６に提供されている。
【０１８１】
【表６】
2007536253.tif 000009
【０１８２】
【表７】
2007536253.tif 000010
【０１８３】
実施例５
ｓｉＲＮＡ送達はポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドへのｓｉＲＮＡのコンジュゲーションにより増強される
本実施例は、９Ｌ／ＬａｃＺ培養細胞株及びマウス尾部からの初代線維芽細胞における、ｓｉＲＮＡ取り込みを誘導する又は増強するためのｓｉＲＮＡ／ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドの活性を評価するため、スクリーニングからの結果を提供する。これらの実験に使用された材料及び方法は、上記のものと一般的に同じであるが、但し、ｓｉＲＮＡ／ペプチド複合体を生成するためのｓｉＲＮＡ／ペプチド混合は必要とされなかった。これらの研究の結果は、下記表７及び８に提供されている。
【０１８４】
【表８】
2007536253.tif 000011
【０１８５】
【表９】
2007536253.tif 000012
【０１８６】
上記のデータは、本発明のｓｉＲＮＡ／ペプチドコンジュゲートの多様な集団が、高い効率で異なった細胞型内へのｓｉＲＮＡの送達を仲介することを明らかにしている。
【０１８７】
実施例６
ｓｉＲＮＡ遺伝子発現ノックダウンは、ｓｉＲＮＡへコンジュゲートされたポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドにより増強される
本実施例は、本発明のｓｉＲＮＡ／ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド複合体による、標的遺伝子発現の効果的ノックダウンを示す。本研究において、ヒト及び他の哺乳動物対象で過剰発現された場合、ＲＡの発生又は進行を仲介すると関係付けられている、ヒト腫瘍壊死因子−α（ｈＴＮＦ−α）遺伝子の発現を変調するペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体の能力を試験した。
【０１８８】
健康なヒトの血液は、Golden West Biologicals (CA) から購入し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ficoll-Pague plus (Amersham) 勾配を使用して、血液から精製した。次ぎにヒト単球を、Miltenyi Biotech からの磁気マイクロビーズを使用して、ＰＢＭＣ分画から精製した。単離されたヒト単球を、４ｍＭグルタミン、１０％ＦＢＳ、１ｘ非必須アミノ酸及び１ｘペニシリン−ストレプトマイシンを補給したＩＭＤＭ中に再懸濁し、使用するまで４℃で保存した。
【０１８９】
９６ウェル平底プレート中、ヒト単球を１００Ｋ／ウェル／１００μｌＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）培地（Invitrogen ）で蒔いた。トランスフェクション試薬を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地中、所望の濃度で、２０分（リポフェクタミン２００；Invitrogen 、について）又は５分（ペプチドについて）室温にてｓｉＲＮＡと混合した。インキュベーション終了時、ＦＢＳを混合物に加え（最終３％）、５０μｌの混合物を細胞へ加えた。細胞を、３７℃で３時間インキュベートした。トランスフェクション後、細胞をＶ底プレートへ移し、細胞を１５００ｒｐｍ／５分ペレット化した。細胞を増殖培地（グルタミン、非必須アミノ酸及びペニシリン−ストレプトマイシンを補給したＩＭＤＭ）に再懸濁した。一夜インキュベーション後、細胞を、１ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Sigma ）で３時間刺激した。誘導後、ｍＲＮＡ定量のために上記のように細胞を集め、そして上清は、タンパク質定量のために取っておいた。
【０１９０】
ｍＲＮＡ測定のため、Genospectra (CA) からのブランチ（ｂｒａｎｃｈ）ＤＮＡ技術を、製造元の指示に従って使用した。細胞中のｍＲＮＡレベルを定量するため、ハウスキーピング遺伝子（ｃｙｐＢ）及び標的遺伝子（ＴＮＦ−α）ｍＲＮＡの両方を測定し、ＴＮＦ−αの読み取り値をｃｙｐＢで規格化して、相対ルミネセンス単位を得た。タンパク質レベルを定量するには、BD Bioscience からのＴＮＦ−αＥＬＩＳＡを、製造元の指示に従って使用した。
【０１９１】
これらの研究のためのｓｉＲＮＡは、下記表９に例示したＴＮＦ−αｍＲＮＡの異なった領域を標的にするように方向付けられていた。
【０１９２】
【表１０】
2007536253.tif 000013
【０１９３】
【表１１】
2007536253.tif 000014
【０１９４】
上記の研究は、ＴＮＦ−α発現を標的とするｓｉＲＮＡが、本発明のポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドにより活性な状態で効果的に送達され、単球におけるＴＮＦ−α発現のノックダウンを仲介することを示している。
【０１９５】
【表１２】
2007536253.tif 000015
【０１９６】
【表１３】
2007536253.tif 000016
【０１９７】
【表１４】
2007536253.tif 000017
【０１９８】
上記のデータは、本発明の新規ｓｉＮＡ／ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド組成物を使用し、哺乳動物細胞におけるＴＮＦ−α遺伝子発現ノックダウンを効果的レベルで達成することが可能であることを証明している。
【０１９９】
スクリーニング及び特徴付け
図１は、ＴＮＦ−αノックダウン活性についてｓｉＲＮＡ候補配列をスクリーニングするための例示のアッセイシステムを特徴付けている。ＬＰＳで処理されたヒト単球（ＣＤ１４＋）は、およそ２時間以内にＴＮＦ−α特異的ｍＲＮＡを誘導し、２時間後にＴＮＦ−αタンパク質のピークレベルが続いた。リポフェクタミン２０００を使用してｓｉＲＮＡ候補配列で単球をトランスフェクトし、感染細胞をＬＰＳで処理で処理し、そしておよそ１６時間後にＴＮＦ−α  ｍＲＮＡレベル測定することにより、ｓｉＲＮＡのノックダウン活性についてスクリーニングした。５６のｓｉＲＮＡ配列を設計し、活性化ヒト一次単球において、ＴＮＦ−α  ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルをノックダウンするそれらの能力をスクリーニングした。２７ｓｉＲＮＡ配列の代表的組の活性は、８０％ｍＲＮＡノックダウンから検出可能な活性なしの範囲であった。一般に、ＴＮＦ−αタンパク質レベルは、ｍＲＮＡレベルよりも減少した、例えば、ＴＮＦ−α  ｍＲＮＡ（ＴＮＦ−α−１）の５０％ノックダウンは、ＴＮＦ−αタンパク質レベルにおいて７５％の減少を生じた。３０〜６０％のノックダウンレベルを示す、選択されたｓｉＲＮＡについての用量応答曲線を得た。計算されたＩＣ５０値は１０〜２００ピコモルの範囲であった。評価されたｓｉＲＮＡ配列は、ＴＮＦーα転写体を通して分布しており、同定された最も強力なｓｉＲＮＡは２つの領域に分布していた：コード領域の中央及び３’−ＵＴＲに位置していた。
【０２００】
実施例７
ｓｉＲＮＡ遺伝子発現ノックダウンは、ｓｉＲＮＡへ複合体形成されたポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドにより増強される
本実施例は、本発明のペプチド／ｓｉＲＮＡコンジュゲートによる、標的遺伝子発現のノックダウンを示している。これらの実験に使用された材料及び方法は、上記のものと一般的に同じであるが、但し、ｓｉＲＮＡ及びペプチドの混合を必要としない。本一連の研究において、ノックダウン実験は、リポフェクタミン有り及び無しでの、ｓｉＲＮＡ／ペプチド仲介ノックダウンの比較を含んでいる。
【０２０１】
【表１５】
2007536253.tif 000018
【０２０２】
上記のデータは、ｓｉＲＮＡと複合体形成された、本発明のポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドの多様な集合が、哺乳動物対象におけるＴＮＦ−遺伝子発現のｓｉＲＮＡ仲介ノックダウンを増強するように機能したことを証明している。
【０２０３】
実施例８
ｓｉＲＮＡ遺伝子発現ノックダウンの時間経過
本実施例は、ｓｉＲＮＡ仲介遺伝子発現ノックダウンの時間経過に関連する研究を示す。ｓｉＲＮＡ効果の持続を試験するため、上で示したｓｉＲＮＡトランスフェクション手順を用いたが、但し、ｅＧＦＰ発現マウスに由来する線維芽細胞を使用した。ここで使用したトランスフェクション試薬は、リポフェクタミンであった。細胞は、過剰増殖のため、第１８日目に再び蒔いた。二回目のトランスフェクションは、第一のトランスフェクション後の第１９日目に実施した。第１９日目、トランスフェクション後にｅＧＦＰレベルを測定した。ＧＦＰＩｓｉＲＮＡ（ＧＦＰＩ）及びヘアピンｓｉＲＮＡ（Ｄ＃２１）とともに、スクランブル又はナンセンスｓｉＲＮＡ（Qiagen ）を対照として使用した。ノックダウン活性は、スクランブルｓｉＲＮＡ（Qiagen 対照）で較正した。
【０２０４】
【表１６】
2007536253.tif 000019
【０２０５】
上記の研究は、ｓｉＲＮＡノックダウン活性は第３日目頃に明らかになり、そして第９日まで保持され、その後標的遺伝子発現は第１７日目頃にベースラインレベルに戻った。第１８日目の二回目のトランスフェクション後、ｅＧＦＰ発現の新たな減少が生じ、試薬を繰り返し投与することが可能であり、反復された又は持続された遺伝子発現ノックダウンを得た。
【０２０６】
実施例９
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドと複合体形成されたｓｉＲＮＡにより仲介されたＴＮＦ遺伝子発現ノックダウンの用量依存性
本実施例は、活性化ヒト単球における、例示のポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド（ＰＮ７３）と複合体形成されたｓｉＲＮＡにより仲介されるノックダウン活性が、用量依存性であることを示す。
【０２０７】
ｓｉＲＮＡ／ＰＮ７３複合体は、約ＰＮ７３：ｓｉＲＮＡ＝８２：１の、ＰＮ７３とｓｉＲＮＡを一定の比で提供した。４００ｎＭ  ｓｉＲＮＡを、３３μＭ  ＰＮ７３と５分間、ＯｐｔｉＭＥＭ培地中で複合体形成させた。複合体形成後、複合体をＯｐｔｉＭＥＭで連続的に希釈した（１：２の比）。複合体を、トランスフェクションのためにヒト単球に添加した。次ぎに続く誘導及び、ｍＲＮＡ定量を上の記述に従って実施した。
【０２０８】
【表１７】
2007536253.tif 000020
【０２０９】
関連する一連の実験において、ｓｉＲＮＡを連続的に希釈し、そして固定量のＰＮ７３（１．６７μＭ）と組み合わせた。別の言い方をすると、ＰＮ７３ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドを、滴定量のｓｉＲＮＡと複合体形成させた。ＰＮ７３（１．６７μＭ）は、各滴定量のｓｉＲＮＡと、ＯｐｔｉＭＥＭ培地中、ＲＴで５分、複合体形成させた。複合体を、トランスフェクションのためにヒト単球に添加した。下記表６に提供されている誘導及びｍＲＮＡ定量データは、上記の方法により得た。
【０２１０】
【表１８】
2007536253.tif 000021
【０２１１】
実施例１０
哺乳動物細胞において、ｓｉＲＮＡノックダウン効果を延伸するための複数回投与プロトコール
本実施例は、複数回投与スケジュールが、本発明のｓｉＮＡ／ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド組成物により仲介された、哺乳動物における遺伝子発現ノックダウン効果を効果的に延長するであろうことを示している。これらの研究に用いられた材料及び方法は、上記のものと一般的に同じであるが、但し、示された時間に反復トランスフェクションを実行した。スクランブルｓｉＲＮＡ（Qiagen ）を並行対照に利用した。
【０２１２】
【表１９】
2007536253.tif 000022
【０２１３】
上記の研究は、複数回トランスフェクションが、時宜を得て実施された場合（この場合、第１回目のトランスフェクション後、およそ第５〜７日目の間）、遺伝子発現ノックダウン効果が、哺乳動物細胞において、延長する又は再誘導することが可能なことを示している。
【０２１４】
実施例１１
インビボｓｉＲＮＡ／ペプチド仲介ＴＮＦ−α遺伝子発現ノックダウン
本実施例は、全身性送達を仲介するための、本発明のｓｉＲＮＡ／ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド組成物の有効性、及び療法的様式で、標的遺伝子発現を変調し及び細胞の表現型を修飾するために有効な、ｓｉＲＮＡによる療法的遺伝子ノックダウンを示している、インビボ研究を提供する。
【０２１５】
ヒトＮＦ−α発現マウスは、Hellenic Pasture Institute, (Greece) から、５週齢で購入した。マウスに、週２回、３００μｌの食塩水（４マウス）、週１回、ＲＡ薬剤ラミケード（Ｒａｍｉｃａｄｅ）（５ｍｇ／ｋｇ）（２マウス）、又は週２回、ＰＮ７３と１：５のモル比で混合したＮ１４５  ｓｉＲＮＡ（２ｍｇ／ｋｇ）（２マウス）、をｉ．ｖ．で投与した。注射時間の間、血漿試料をＥＬＩＳＡ試験（R&D Systems 、カタログ番号SSTA00C ）のために集め、ＲＡ疾患進行及び療法有効性の認められた指標として、足（ｐａｗ）スコアを週２回測定した。
【０２１６】
【表２０】
2007536253.tif 000023
【０２１７】
上記のデータは、ラミケード又は食塩水（対照）処理マウスにおけるレベルと比較して、ｓｉＲＮＡ／ペプチド処理マウスにおける循環血中のｈＴＮＦ−αレベルの効果的な減少を示している。
【０２１８】
本発明のｓｉＲＮＡ／ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド組成物及び方法の、インビボ有効性の追加の証拠は、ＲＡ疾患状態及び治療有効性の認められた表現型指標である足スコアを使用して、上記マウス対象から得られた。出発時点の相違のため（何匹かの動物は、より早い時点を呈する）、実験のすべての動物について０であるようにスコアを調節した。各足には、以下のスコアリング指標に従って、０から３の間のスコアを与えた（最も高いスコアは１２）。
０：正常
１：足又は足首関節の浮腫又は歪み
２：足及び足首関節の歪み
３：足又は足首関節の強直。
【０２１９】
これらの足スコア評価の結果は、図３にグラフで示されている。データは、ｓｉＲＮＡ／ペプチド注射動物は、遅延されたＲＡ進行を示し、それは、ラミケード処置マウスにより示されたものに匹敵していたことを示している。上述の研究からの結果は、本発明の小さな干渉核酸及びポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド組成物が、遺伝子発現を調節する、及び疾患を治療する及び管理するための有望な新規療法的ツールを提供することを示している。本発明のｓｉＮＡ、例えば、分解のためにヒトｈＴＮＦ−α特異的ｍＲＮＡを標的とするｓｉＮＡは、現在のＲＡのための小分子、可溶性受容体又は抗体療法よりも、より高い特異性、より低い免疫原性及びより大きな疾患改変を与える。ｈＴＮＦ−αを標的とする５０を超える候補ｓｉＲＮＡをスクリーニングし、３０〜８５％の一回投与ノックダウンを得た。２０を超えるコンピューター設計ペプチド複合体及び／又は共有結合分子を、単球による蛍光ＲＮＡ取り込みについて比較し、多数が、リポフェクタミン又はコレステロール−コンジュゲートｓｉＲＮＡよりも有意に良好な取り込みを、＜１０ｐＭのＩＣ５０値で、有することを観察した。ペプチド−ｓｉＲＮＡ製剤は、インビトロにおいて、活性化ヒト単球中の、ＴＮＦ−α  ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルを効果的にノックダウンした。
【０２２０】
一つの例示の候補ｓｉＲＮＡ／送達ペプチド製剤を、ヒトＴＮＦ−αを構成的に発現している、慢性関節リューマチ（ＲＡ）の２つのトランスジェニックマウスモデルで評価した。週２回、ＩＶ注射による２ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ又はインフリキシマブで、６週齢の初めから治療した動物は、疾患状態が１０週まで持続する対照と比較して、ＲＡスコアの安定化（足及び関節炎症）を７週齢の初めで示した。９週齢において、ｓｉＲＮＡ処置動物は、ＲＡスコアのインフリキシマブ処置動物に匹敵する減少、しかし有意により低い血漿ＴＮＦ−αタンパク質レベルを示した。
【０２２１】
本明細書の開示に基づくと、標的遺伝子、例えば、炎症のような病理学的状態に重要な役割を果たす、ＴＮＦ−αのようなサイトカインの発現を抑制するためのｓｉＲＮＡの使用は、哺乳動物対象においてＲＡにより典型的に示される疾患の症状を軽減する又は防止するための有効な治療を提供する。本発明の方法及び組成物内で用いられる、例示のｓｉＲＮＡ／ペプチド組成物は、抗体又は可溶性受容体の場合のように、標的遺伝子（例えば、ＴＮＦ−α）の生成物と複合体形成することによるよりもむしろ、標的遺伝子発現（例えば、ＴＮＦ−α発現）を減少させる又は排除するそれらの能力に関係した利点を提供する。
【０２２２】
本発明の教示に従った核酸の全身性送達を改良することは、薬剤としてのｓｉＮＡの開発についての、さらなる追加の利点を提供する。この関連における具体的チャレンジには、ｓｉＮＡの安定性を維持しながらの、標的細胞又は組織への組織障壁を通した送達、及び細胞内送達が含まれる−有効であるのに十分な量で細胞内へ細胞膜を横切ってｓｉＮＡを得ること。本開示は、ヒトＴＮＦ−αの発現のような特異的遺伝子発現を標的とする、新規ペプチド−ｓｉＲＮＡ組成物を含む効率的なインビボ送達システムを初めて示しており、それは、ＲＡのマウスモデルを使用した研究により例示されたように、標的疾患が予測されるトランスジェニック動物モデルにおいて疾患活性を減弱する。これらの結果は、ＲＮＡｉ経路が、ＴＮＦ経路に対する細胞内効果を通して、細胞表現型及び疾患進行の改変を効果的に仲介し、そして、ＲＡのための現在の抗体療法を特徴付ける、残余免疫反応性を伴う循環抗体／ＴＮＦ−α複合体による毒性効果を避けていることを示している。特に、本明細書のすべての試験は、これらの例で示されたｓｉＮＡ及びポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドの用量が、常に少なくとも８０〜９０％又はそれ以上の細胞生存率と相関するように、付随する毒性効果を最小にして実行された。
【０２２３】
実施例１２
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドの合理的設計の最適化
本実施例は、本発明のポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドの合理的設計を最適化するための、研究設計及びデータの例を提供する。対象合理的設計操作は、ヒストンＨ２Ｂ由来ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドについて行った。
【０２２４】
【表２１】
2007536253.tif 000024
【０２２５】
上記表１９は、ＰＮ７３の一次構造及びＰＮ−７３に基づいたポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドの合理的設計を最適化するために発生させたその誘導体の図を提供する。親ペプチドＰＮ７３は、細胞へのｓｉＲＮＡ送達を誘導する又は増強するためのポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドの優れた例であることが上に示されている。この及び他のポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドの機能−構造活性相関をより良く理解するため、ＰＮ７３と他の化学部分間とのコンジュゲートの、Ｃ及びＮ末端機能及び活性を特徴付けることにより、一次構造研究を実施した。
【０２２６】
上で指摘したように、ＰＮ７３はヒストン２Ｂからのペプチドである、残基１２〜４８ａａ。ＰＮ３６０はＰＮ７３のＣ末端欠失バージョンであり（１２〜３５）、ＰＮ３６１はＰＮ７３のＮ末端欠失バージョンである（２３〜４８）。ＰＮ４０４は、下に示されたように、すべてのリジンがアルギニンで置き換えられているＰＮ７３のバージョンである：
NH2-RGSRRAVTRAQRRDGRRRRRSRRESYSVYVYRVLRQ- アミド（配列番号）。
ＰＮ５０９はペグ化（ＰＥＧ分子量１ｋダルトン）ＰＮ７３誘導体であり、Ｎ末端がペグ化されている。
【０２２７】
図４は、前述のＰＮ７３合理的設計誘導体ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドについて、マウス線維芽細胞における取り込み効率及び生存率の結果を提供する。マウス尾部線維芽細胞における、修飾ＰＮ７３の活性変化が示されている。ＰＮ４０４と異なり、ＰＮ５０９は、毒性を増加させることなく取り込みが増加した。一方、ＰＮ７３のＮ末端欠失部分は活性を減少させ、Ｃ末端残基の除去は、活性を消失させた。ＰＮ７３及びＰＮ５０９の両方が、一次細胞において、リポフェクタミン（Invitrogen, CA ）よりも高い活性を示した。取り込み測定は、マウス尾部線維芽細胞を使用して実施した。
【０２２８】
前述の発明を、理解を明瞭にする目的で、実施例により詳細に説明してきたが、それらは制限ではなく例示のために示されており、特定の変更及び改変を付随する特許請求の範囲の範囲内で実施することができることが、当業者には理解されるであろう。これに関連して、多様な出版物及び他の参照文献が、記述の節約のために前述の開示内で引用されてきた。これらの参照文献の各々は、すべての目的について、その全体が本明細書において援用される。しかしながら、本明細書で議論された多様な出版物は、本出願の出願日に先だったそれらの開示のために単に取り込まれ、そして発明者は、先の発明によってこうした開示の日付を前にする権利を留保することが特筆される。
【図面の簡単な説明】
【０２２９】
【図１】図１は、本発明のポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドへ複合体形成された又はコンジュゲートされたｓｉＮＡのペプチド仲介取り込みを図示している。
【図２】図２は、本発明のポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドへ複合体形成された又はコンジュゲートされたｓｉＮＡのペプチド仲介取り込みをさらに図示している。
【図３】図３は、ｓｉＲＮＡ／ペプチド注射マウスの足データを示しており、それは、ラミケード処置対象により示されたものに匹敵する、処置マウスにおける遅延ＲＡ進行を示している。
【図４】図４は、本発明のＰＮ７３合理的設計誘導体ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドについての、マウス線維芽細胞における取り込み効率及び生存率の結果を提供している。
【図１】
2007536253.tif 000025
【図２】
2007536253.tif 000026
【図３】
2007536253.tif 000027
【図４】
2007536253.tif 000028
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月10日(2007.7.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物細胞内へ二本鎖核酸の取り込みを起こすための方法であって、前記細胞と、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド及び前記核酸を含む混合物とをインキュベートすることを含む、前記方法。
【請求項２】
動物細胞中の標的遺伝子の発現を修飾するための方法であって、前記細胞と、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド及び核酸を含む混合物とをインキュベートすることを含み、ここで前記核酸は前記標的遺伝子の一領域と相補的である、前記方法。
【請求項３】
核酸が、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドと混合される、複合体形成される、又はコンジュゲートされる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸が、阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
核酸が、ＴＮＦ−α遺伝子の一部と相補的であるｓｉＲＮＡを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
核酸が、３０又はそれより短い長さのヌクレオチド又はヌクレオチド塩基対を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ヒストンタンパク質又はポリペプチド又はペプチド断片、誘導体、類似体、又はそれらのコンジュゲートを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、両親媒性アミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、タンパク質形質導入ドメイン又はモチーフを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、膜融合性ペプチドドメイン又はモチーフを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ＤＮＡ結合ドメイン又はモチーフを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、表２〜８に列挙された一つまたはそれより多くのアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ヒストンＨ１、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ３及びヒストンＨ４ｌから選択される一つまたはそれより多くのヒストンタンパク質、又はそれらの断片、ＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ、ＲＶＩＲＶＷＦＱＮＫＲＣＫＤＫＫ、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ、ＧＥＱＩＡＱＬＩＡＧＹＩＤＩＩＬＫＫＫＫＳＫ及びＷＷＥＴＷＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＴＲＱＡＲＲＮＨＲＲＲＨＲから選択されるアミノ酸配列、ポリＬｙｓ−Ｔｒｐ（４：１、ＭＷ２０，０００〜５０，０００）、ポリＯｒｎ−Ｔｒｐ（４：１、ＭＷ２０，０００〜５０，０００）又はメリチンを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ペグ化されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
前記混合物がさらに、カチオン性脂質を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１６】
カチオン性脂質が、リポフェクチン（登録商標）又はリポフェクタミン（登録商標）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド及び二本鎖核酸を含む組成物であって、該組成物により動物細胞内への前記核酸の取り込みを起こす、前記組成物。
【請求項１８】
核酸が、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドと混合される、複合体形成される、又はコンジュゲートされる、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記核酸が、阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
核酸が、ＴＮＦ−α遺伝子の一部と相補的であるｓｉＲＮＡを含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２１】
核酸が、３０又はそれより短い長さのヌクレオチド又はヌクレオチド塩基対を有する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２２】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ヒストンタンパク質又はポリペプチド又はそれらのペプチド断片、誘導体、類似体、又はコンジュゲートを含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２３】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、両親媒性アミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２４】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、タンパク質形質導入ドメイン又はモチーフを含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２５】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、膜融合性ペプチドドメイン又はモチーフを含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２６】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ＤＮＡ結合ドメイン又はモチーフを含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２７】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、表２〜８に列挙された一つまたはそれより多くのアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２８】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ヒストンＨ１、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ３及びヒストンＨ４ｌから選択される一つまたはそれより多くのヒストンタンパク質、又はそれらの断片、ＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ、ＲＶＩＲＶＷＦＱＮＫＲＣＫＤＫＫ、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ、ＧＥＱＩＡＱＬＩＡＧＹＩＤＩＩＬＫＫＫＫＳＫ及びＷＷＥＴＷＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＴＲＱＡＲＲＮＨＲＲＲＨＲから選択されるアミノ酸配列、ポリＬｙｓ−Ｔｒｐ（４：１、ＭＷ２０，０００〜５０，０００）、ポリＯｒｎ−Ｔｒｐ（４：１、ＭＷ２０，０００〜５０，０００）又はメリチンを含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２９】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ペグ化されている、請求項１７に記載の組成物。
【請求項３０】
さらにカチオン性脂質を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項３１】
カチオン性脂質が、リポフェクチン（登録商標）又はリポフェクタミン（登録商標）である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド及び二本鎖核酸を含む組成物であって、該組成物により動物細胞内への前記核酸の取り込みを起こし、ここで前記核酸は標的遺伝子の一領域と相補的でありそして前記細胞中の前記標的遺伝子の発現を修飾する、前記組成物。
【請求項３３】
動物対象における疾患又は有害な状態を治療する医薬の製造のための、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド及び二本鎖核酸を含む混合物の使用であって、ここで前記混合物は前記対象の細胞内への前記核酸の取り込みを起こし、及び前記核酸は前記細胞中の標的遺伝子の一領域と相補的でありそして前記標的遺伝子の発現を変調する活性があり、前記治療が、前記疾患又は状態の一つまたはそれより多くの症状の発生又は重症度の防止又は減少を仲介するための有効量の前記混合物を前記対象に投与することを含む、前記使用。
【請求項３４】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド及び二本鎖核酸の混合物を動物対象へ投与することにより該対象の表現型を変化させる医薬の製造のための、前記混合物の使用であって、当該核酸は前記対象中の標的遺伝子の一領域と相補的である、前記使用。
【請求項３５】
前記対象が、動物細胞又は個体である、請求項３３または３４に記載の使用。
【請求項３６】
核酸が、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドと混合される、複合体形成される、又はコンジュゲートされる、請求項３３に記載の使用。
【請求項３７】
前記核酸が、阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項３３に記載の使用。
【請求項３８】
核酸が、ＴＮＦ−α遺伝子の一部と相補的であるｓｉＲＮＡを含む、請求項３３に記載の使用。
【請求項３９】
核酸が、３０又はそれより短い長さのヌクレオチド又はヌクレオチド塩基対を有する、請求項３３に記載の使用。
【請求項４０】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ヒストンタンパク質、又はポリペプチド又はそれらのペプチド断片、誘導体、類似体、又はコンジュゲートを含む、請求項３３に記載の使用。
【請求項４１】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、両親媒性アミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の使用。
【請求項４２】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、タンパク質形質導入ドメイン又はモチーフを含む、請求項３３に記載の使用。
【請求項４３】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、膜融合性ペプチドドメイン又はモチーフを含む、請求項３３に記載の使用。
【請求項４４】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ＤＮＡ結合ドメイン又はモチーフを含む、請求項３３に記載の使用。
【請求項４５】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、表２〜８に列挙された一つまたはそれより多くのアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の使用。
【請求項４６】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ヒストンＨ１、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ３及びヒストンＨ４ｌから選択される一つまたはそれより多くのヒストンタンパク質、又はそれらの断片、ＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ、ＲＶＩＲＶＷＦＱＮＫＲＣＫＤＫＫ、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ、ＧＥＱＩＡＱＬＩＡＧＹＩＤＩＩＬＫＫＫＫＳＫ及びＷＷＥＴＷＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＴＲＱＡＲＲＮＨＲＲＲＨＲから選択されるアミノ酸配列、ポリＬｙｓ−Ｔｒｐ（４：１、ＭＷ２０，０００〜５０，０００）、ポリＯｒｎ−Ｔｒｐ（４：１、ＭＷ２０，０００〜５０，０００）又はメリチンを含む、請求項３３に記載の使用。
【請求項４７】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドが、ペグ化されている、請求項３３に記載の使用。
【請求項４８】
前記混合物がさらに、カチオン性脂質を含む、請求項３３に記載の使用。
【請求項４９】
カチオン性脂質が、リポフェクチン（登録商標）又はリポフェクタミン（登録商標）である、請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】
一つまたはそれより多くのポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドへ複合体形成された又は共有結合されたセンス及びアンチセンス鎖を有する二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）を含む、組成物。
【請求項５１】
ｄｓＮＡアンチセンス鎖が、目的の細胞内に存在するｍＲＮＡにハイブリダイズすることが可能である、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
ｄｓＮＡの各鎖が、３０又はそれより少ないヌクレオチド対を有する、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５３】
ｄｓＮＡの各鎖が、約１９〜２５ヌクレオチド間の長さを有する、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５４】
ｄｓＮＡが、阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５５】
ｄｓＮＡが、二本鎖（ｄｓ）ハイブリッド核酸（ｄｓ  Ｈｙｂｒｉｄ）であるか、又は鎖の一つがＤＮＡの鎖であり、他の鎖がＲＮＡの鎖である、センス及びアンチセンス鎖を有する、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５６】
ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチド及び二本鎖核酸を含む混合物の、細胞又は動物の表現型の変化を仲介する医薬の製造のための使用であって、前記混合物は動物の細胞内への前記核酸の取り込みを起こし、ここで前記核酸は前記細胞中の標的遺伝子の一領域と相補的でありそして前記標的遺伝子の発現を変調する活性がある、前記使用。
【請求項５７】
一つまたはそれより多くのポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドと、混合された、複合体形成された又は共有結合された、センス及びアンチセンス鎖を有している二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）及びカチオン性脂質を含む、組成物。
【請求項５８】
カチオン性脂質が、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート，１，３−ジオレイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）−プロピルアミド、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド、テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン、テトラメチルテトラオレイルスペルミン、テトラメチルテトララウリルスペルミン、テトラメチルテトラミリスチルスペルミン及びテトラメチルジオレイルジオレイルスペルミン、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３，３−（トリメチルアンモニウム）プロパン）、ＤＭＲＩＥ（１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、多価カチオン性脂質、リポスペルミン、ＤＯＳＰＡ（２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート）、ＤＯＳＰＥＲ（１，３−ジオレイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）−プロピル−アミド、ジ−及びテトラ−アルキル−テトラ−メチルスペルミン、ＴＭＴＰＳ（テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン）、ＴＭＴＯＳ（テトラメチルテトラオレイルスペルミン）、ＴＭＴＬＳ（テトラメチルテトララウリルスペルミン）、ＴＭＴＭＳ（テトラメチルテトラミリスチルスペルミン）、ＴＭＤＯＳ（テトラメチルジオレイルスペルミン）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシル−アミドグリシルスペルミン（ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標））、非カチオン性脂質と組み合わされたカチオン性脂質、ＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰｈＰＥ（ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン）又はコレステロール、ＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥの３：１（ｗ／ｗ）混合物、及びＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥの１：１（ｗ／ｗ）混合物から構成されたカチオン性脂質組成物、から成る群より選択される、請求項８６に記載の組成物。
【国際調査報告】
2007536253.tif 000029
2007536253.tif 000030
2007536253.tif 000031
2007536253.tif 000032
2007536253.tif 000033
2007536253.tif 000034
2007536253.tif 000035