(57)【要約】      （修正有）【課題】高性能顕微鏡検査、質量分析（ＭＳ）、遺伝子シーケンシング分析や次世代シーケンシング（ＮＧＳ）分析、およびプロテオミクスなどのゲノミクスに使用可能とするために、プラズマ集束イオンビーム（ＦＩＢ）を用いた生物学的凍結試料の処理のための方法、装置およびシステムを提供する。【解決手段】生物学的試料１を凍結形態で提供するステップと、Ｏ＋および／またはＸｅ＋プラズマの少なくとも１つを含むプラズマイオンビームによって試料の少なくとも一部をミリングするステップとを含む、生物学的試料の処理方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの生物学的試料の処理方法であって、
−凍結形態で少なくとも１つの生物学的試料を提供するステップと、
−Ｏ＋およびＸｅ＋プラズマの少なくとも１つを含むプラズマイオンビームによって前記試料の少なくとも一部をミリングするステップとを備える方法。
【請求項２】
Ｘｅ＋プラズマベースのイオンビームにより、Ｏ２ガスが添加された、前項に記載の方法。
【請求項３】
前記ミリングが、少なくとも１０％のＯ＋プラズマイオン、より好ましくは少なくとも６６％、より好ましくはほぼまたは正確に１００％のＯ＋プラズマイオンを含むプラズマイオンビームによって行われる、前項のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前項のうちいずれか１項に記載の方法において、
−少なくとも６ｎＡ、好ましくは少なくとも５００ｎＡ、さらにより好ましくは少なくとも１０００ｎＡの実効ビーム電流、および／または、
−少なくとも１００μｍ３／秒、より好ましくは少なくとも５００μｍ３／秒、より好ましくは少なくとも１０００μｍ３／秒の質量除去速度で、少なくとも１つのプラズマイオンビームによって前記試料の少なくとも一部をミリングするさらなるステップを有する。
【請求項５】
前記試料の不要部分の除去および標的の抽出のうちの少なくとも１つを行うために、前記試料をミリングするステップを有する、前項のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
蓄積された試料中に複数の標的を蓄積するさらなるステップを有する、前項のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記処理がサブミクロン処理であり、前記方法が、さらに、可視化およびミリング制御の少なくとも１つのために少なくとも１つの顕微鏡画像を生成するステップを備え、特に、前記顕微鏡画像が、ＳＥＭおよびＴＥＭ顕微鏡の少なくとも１つによって生成される、前項のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
質量分析によって、好ましくはオービトラップ融合質量分析計によって、前記試料または前記蓄積された試料、特に前記試料中のタンパク質を分析するさらなるステップを有する、前項のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって前記標的をシーケンシングするさらなるステップを有する、請求項５から８のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
好ましくは前記試料中に含まれるタンパク質を分析する際に、前記標的の空間情報もまた追跡され、その分析にさらに使用される、請求項５から９のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
特に前項のうちいずれか１項に記載の方法を実施するための、少なくとも１つの生物学的試料を処理するための装置であって、
−凍結形態の少なくとも１つの生物学的試料のための少なくとも１つの支持部と、
−Ｏ＋またはＸｅ＋プラズマの少なくとも１つを含む少なくとも１つのプラズマイオンビームを発生させるように構成された少なくとも１つのプラズマイオンビーム発生器具とを備える装置。
【請求項１２】
二重プラズマイオンビーム発生器を備え、特に、前記プラズマイオンビーム発生器が、少なくとも１０％のＯ＋プラズマイオン、好ましくは少なくとも６６％、より好ましくはほぼまたは正確に１００％のＯ＋プラズマイオンを含むプラズマイオンビームを発生させるように構成されている、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
視覚化およびミリング制御の少なくとも１つのために顕微鏡画像を生成するための顕微鏡、好ましくはＳＥＭまたはＴＥＭ顕微鏡を有する、前２項に記載の装置。
【請求項１４】
前項のうちいずれか１項に記載の装置と、顕微鏡、好ましくはＳＥＭまたはＴＥＭ顕微鏡、質量分析計、好ましくはオービトラップ融合質量分析計、およびシーケンシングステーション、好ましくはＮＧＳステーションのうちの少なくとも１つを備えるシステム。
【請求項１５】
プロテオーム分析、遺伝子シーケンシングなどのゲノミクス、およびＳＥＭまたはＴＥＭなどの高性能顕微鏡の少なくとも１つのための請求項１から１０のうちいずれか１項に記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プラズマ集束イオンビーム（ＦＩＢ）を用いた生物学的凍結試料の処理のための方法、装置及びシステムに関する。そして、試料は、質量分析（ＭＳ）、遺伝子シーケンシング分析や次世代シーケンシング（ＮＧＳ）分析、およびプロテオミクスなどのゲノミクスに使用可能である。
【背景技術】
【０００２】
２０世紀後半の電子顕微鏡と走査型プローブ顕微鏡の開発は、ナノメートル、分子、および原子分解能で物質の内部構造および組成の素晴らしい画像を生成している。大部分は、この進歩は、顕微鏡操作、データ取得、および分析のコンピュータ支援方法によって可能になった。２１世紀の初めにイメージング技術が進歩したことで、構造と機能性に関する高い正確性の情報が利用できるようになったことが知られている。ハードウェアの観点からは、高分解能イメージング法は、サブオングストロームの精度で原子位置を定常的に解決し、原子構造や物質のダイナミクスを洞察することができる。
【０００３】
電子顕微鏡、荷電粒子顕微鏡、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、および走査透過型電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）、およびイオンビームミリングまたはイオンビーム蒸着（ＩＢＩＤ）またはイオンベースのイメージングなどの支援活動を可能にする集束イオンビーム（ＦＩＢ）をさらに使用するいわゆる「デュアルビーム」ツール（例えば、ＦＩＢ−ＳＥＭ）などの様々な副種などの様々な種類の顕微鏡が本発明に関連することができる。これは、高性能顕微鏡法の非排他的なリストである。
【０００４】
より具体的には、ＳＥＭでは、走査電子ビームによる試料の照射は、二次電子、後方散乱電子、Ｘ線、および光ルミネセンス（赤外線、可視および／または紫外線光子）の形態で、例えば、発散するこの放射束の１つ以上の成分がその後に検出されて画像蓄積の目的で使用される、試料からの「補助」放射の発散を早める。
【０００５】
ＴＥＭでは、試料を照射するために使用される電子ビームは、試料に浸透するのに十分なエネルギーを有するように選択され（この目的のために、一般に、ＳＥＭ試料の場合よりも薄くなる）、そして、画像を作成するために試料から放出される透過電子の束が使用されることができる。そのようなＴＥＭが走査モードで動作する（したがって、ＳＴＥＭになる）とき、問題の画像は、ビームの走査動作中に蓄積される。
【０００６】
照射ビームとして電子を使用する代わりに、荷電粒子顕微鏡はまた、荷電粒子の他の種を用いて行うことができる。この点に関して、「荷電粒子」という語句は、例えば、電子、正イオン（例えば、ＧａまたはＨｅイオン）、負イオン、陽子および陽電子を含むものとして広く解釈されるべきである。
【０００７】
イオン系顕微鏡に関して、いくつかのさらなる情報は、例えば、次のようなソースから収集することができる：W.H. Escovitz, T. R.Fox and R. Levi-Setti, Scanning Transmission Ion
Microscope with a Field Ion Source, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72(5), pp
1826-1828 (1975)。
【０００８】
イメージングに加えて、荷電粒子顕微鏡（ＣＰＭ）はまた、分光法、ディフラクトグラムの検査、（局部的な）表面改質（例えば、ミリング、エッチング、蒸着）などの実施など、他の機能も有することができることに留意すべきである。
【０００９】
数十年にわたって様々な形態の走査型顕微鏡が知られているが、それらは、科学技術の多くの分野においてボトルネックとして現れ始めている共通の欠点を有する。この欠点は、走査に基づくイメージングが比較的遅く退屈なプロセスである傾向があるという事実によって行う必要があり、したがって、例えば、ＣＰＭでは数十ナノメートルおよび共焦点顕微鏡法では数十ミクロンの典型的なスケールなど、伝統的に非常に小さい（一部の）試料を調査することに限定されていた。しかしながら、多くの人間の努力傾注分野において、これらの技術によって提供される解像度を維持する必要性が高まっているが、そのイメージング領域を数桁拡大する必要がある。例えば、細胞生物学においては、例えば（特に異なる種類の）細胞間、特に脳組織、筋組織、新生物（癌組織）などの相互作用をより明確に調査するように細胞レベルのイメージングを組織レベルに拡大することが望まれる。
【００１０】
鉱物／岩石学では、例えば、追跡調査における石のマトリックス材料中のガス捕集挙動、石英地層中の貴金属のカプセル化、合成宝石および他の結晶中の望ましくない含有物などをより明確に調査するために、粒や粒界のレベルまで分子レベルでの分析を拡大する必要がある。
【００１１】
半導体業界では、例えば、品質制御ならびにクリティカルディメンション、オーバーレイ、コンタミネーションなどを行う際に、個々の接合部のレベルでの調査を、素子や素子アレイ全体のより広い適格へと拡大することが望まれている。
【００１２】
しかしながら、そのような大型のイメージングスケールまで現在の走査顕微鏡技術を拡張することは、基本的にそのような拡張を理不尽にレンダリングするために、非常に拡張された画像蓄積時間を伴うことになる。したがって、大きな要望と必要性にもかかわらず、現在の技術は、この点に関して現実的な適用性から自己を排除するほど実用的ではない。
【００１３】
現代の走査顕微鏡技術の別の問題は、（生体）生物学的試料、極低温試料などの放射感受性試料をイメージングする際に自己を明らかにすることができる。エネルギッシュビーム（特に荷電粒子ビーム）によってそのような試料を照射するという行為は、照射ビームのインピンジメントフットプリントにおいて／その付近で損傷（分子再配列／変異、解凍、乾燥など）を引き起こす傾向がある。この影響を軽減するために、照射ビームの強度を減少させることおよび／または走査速度を増加させることを考慮することができるが、そのような手段は、一般に、信号対雑音比（ＳＮＲ）の望ましくない低下をもたらす。
【００１４】
そのような技術は、本発明の譲受人に譲渡された欧州特許出願公開第２  ９６３  ６７３号明細書ならびに欧州特許出願公開第２  ９５８  １３１号明細書にさらに記載されている。そのようなアプローチはまた、譲受人によって近年広く開発されている。
【００１５】
顕微鏡のさらなるアプローチは、ＦＩＢとしても知られている集束イオンビームによる材料の部位特異的分析、蒸着、およびアブレーションに関する。この技術は、特に、半導体産業、材料科学において、およびますます生物学分野において使用された。ＦＩＢセットアップは、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）に類似している科学機器である。しかしながら、ＳＥＭは、チャンバ内の試料をイメージングするために電子の集束ビームを使用するが、ＦＩＢセットアップは、代わりにイオンの集束ビームを使用する。ＦＩＢはまた、電子ビームカラムとイオンビームカラムの双方を備えたシステムに組み込まれることもでき、どちらのビームを使用しても同じ特徴を調査することができる。
【００１６】
最も普及している機器は、液体金属イオン源（ＬＭＩＳ）、特にガリウムイオン源を使用している。元素金とイリジウムベースのイオン源もまた利用可能である。ガリウムＬＭＩＳにおいて、ガリウム金属は、タングステン針と接触して配置され、加熱されたガリウムは、タングステンを濡らして針の先端に流れ、表面張力および電場の対向する力は、テイラーコーンと呼ばれる尖頭形の先端にガリウムを形成する。このコーンの先端半径は、非常に小さい（〜２ｎｍ）。この小さな先端における巨大電界（センチメートル当たり１×１０８ボルトよりも大きい）は、ガリウム原子のイオン化および電界放出を引き起こす。
【００１７】
そして、ソースイオンは、一般に、１〜５０ｋｅＶ（キロ電子ボルト）のエネルギーに加速され、静電レンズによって試料上に集束される。ＬＭＩＳは、非常に小さなエネルギー拡散を有する高電流密度イオンビームを生成する。現代のＦＩＢは、数十ナノアンペアの電流を試料に送達することができ、または数ナノメートルのオーダーのスポットサイズで試料をイメージングすることができる。
【００１８】
集束イオンビーム（ＦＩＢ）システムは、主に大規模半導体製造業者のために、約２０年間にわたって商業的に製造されてきた。ＦＩＢシステムは、電子ビームではなく、その名称が示すように走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）と同様の方法で動作する。ＦＩＢシステムは、イメージングのために低ビーム電流でまたは部位特異的スパッタリングもしくはミリングのために高ビーム電流で動作可能な精細に集束されたイオンビーム（通常はガリウム）を使用する。
【００１９】
ガリウム（Ｇａ＋）一次イオンビームは、試料表面に当たって、二次イオン（ｉ＋またはｉ−）または中性原子（ｎ０）のいずれかを表面に残す少量の材料をスパッタリングする。一次ビームはまた、二次電子（ｅ−）も生成する。試料表面上での一次ビームラスタとして、スパッタリングされたイオンまたは二次電子からの信号が収集されて画像を形成する。
【００２０】
低一次ビーム電流では、材料がほとんどスパッタリングされず、現代のＦＩＢシステムは、５ｎｍのイメージング解像度（Ｇａイオンによるイメージング解像度は、スパッタリングおよび検出器の効率によって〜５ｎｍに制限される）を容易に達成することができる。より高い一次電流では、スパッタリングによって大量の材料が除去されることができ、サブマイクロメータまたはナノスケールまでの試料の精度の高いミリングを可能にする。
【００２１】
試料が非導電性である場合、低エネルギー電子フラッドガンが電荷中和を提供するために使用可能である。このようにして、正の一次イオンビームを用いた正の二次イオンによるイメージングにより、ＳＥＭで要求されるように、高度に絶縁性の試料でさえも、表面コーティングを行うことなくイメージングおよびミリングされることができる。
【００２２】
最近まで、ＦＩＢの圧倒的な使用は半導体産業にあった。集積回路上の部位特異的位置の不良分析、回路変更、フォトマスク修復、および透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）試料調製のような用途は、一般的な手順になっている。最新のＦＩＢシステムは、高解像度のイメージング能力を有し、インサイチュでの切断と組み合わせられるこの能力は、多くの場合、別個のＳＥＭ機器でＦＩＢ切断試料を検査する必要性を排除した。最高解像度のイメージングと感受性試料の損傷を防ぐためには、ＳＥＭイメージングが依然として必要である。しかしながら、ＳＥＭおよびＦＩＢカラムを同じチャンバに組み合わせることは、双方の利点が利用されるのを可能にする。
【００２３】
電子顕微鏡とは異なり、ＦＩＢは、試料にとって本質的に破壊的である。高エネルギーのガリウムイオンが試料を打つとき、それらは、表面から原子をスパッタリングする。ガリウム原子もまた、表面の上部の数ナノメートルに注入され、表面は、アモルファスを構成する。
【００２４】
スパッタリング能力のため、ＦＩＢは、マイクロおよびナノ機械加工ツールとして使用され、マイクロスケールおよびナノスケールで材料を修正または機械加工する。ＦＩＢマイクロ機械加工は、独自の広範な分野になっているが、ＦＩＢによるナノ機械加工は、まだ発展している分野である。一般に、イメージングのための最小ビームサイズは、２．５−６ｎｍである。最小のミリングされた特徴は、これが全ビームサイズおよびミリングされる試料との相互作用に依存するために若干大きい（１０−１５ｎｍ）。
【００２５】
ＦＩＢツールは、表面をエッチングまたは機械加工するように設計されており、理想的なＦＩＢは、次層の原子を何ら破壊することなくまたは表面上のいかなる崩壊もなく１つの原子層を機械加工によって削り取る。しかしながら、現在のところ、スパッタリングのために、機械加工は、典型的には、サブミクロンの長さスケールで表面を粗面化する。ＦＩＢはまた、イオンビーム誘起蒸着を介して材料を蒸着するために使用可能である。タングステンヘキサカルボニル（Ｗ（ＣＯ）６）などのガスが真空チャンバに導入され且つ試料上での化学吸着が可能にされるとき、ＦＩＢ支援化学蒸着が生じる。ビームで領域を走査することによって、前駆体ガスは、揮発性および不揮発性成分に分解され、タングステンなどの不揮発性成分は、析出物として表面上に残る。これは、析出した金属が犠牲層として使用可能であるため、下方にある試料をビームの破壊的スパッタリングから保護するのに有用である。ナノメートルから１００マイクロメートルの長さまで、タングステン金属析出は、金属線を必要な場所に置くことを可能にする。プラチナ、コバルト、炭素、金などの他の材料もまた、局所的に蒸着されることができる。
【００２６】
ＦＩＢ試料調製の欠点は、高解像度「格子イメージング」ＴＥＭまたは電子エネルギー損失分光法などの技術を使用しているときに顕著な効果を生み出す上述した表面損傷および注入である。この損傷した層は、より低いビーム電圧またはより低いイオンエネルギーでのＦＩＢミリングによって、またはＦＩＢプロセスの完了後の低電圧アルゴンイオンビームでのさらなるミリングによって最小限に抑えることができる。
【００２７】
ＦＩＢ調製は、生物学的試料、医薬品、フォーム、インク、および食品などの液体または脂肪を含有する試料の断面分析を可能にする、適切に装備された機器で極低温凍結試料とともに使用可能である。
【００２８】
ＦＩＢはまた、二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）にも使用される。放出された二次イオンは、試料の表面が一次集束イオンビームでスパッタリングされた後に収集されて分析される。
【００２９】
より低いビーム電流では、ＦＩＢイメージング解像度は、イメージングトポグラフィの面でより使い慣れた走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）に匹敵するようになるが、一次イオンビームによって双方とも生成される二次電子と二次イオンを使用するＦＩＢの２つのイメージングモードは、ＳＥＭよりも多くの利点を提供する。
【００３０】
ＦＩＢの二次電子像は、強烈な粒子配向のコントラストを示す。その結果、化学的エッチングに頼ることなく、粒子形態を容易に画像化することができる。粒界のコントラストはまた、イメージングパラメータの慎重な選択によって強化することもできる。ＦＩＢ二次イオン像はまた、化学的な差異も明らかにし、酸素の存在下では金属の二次イオン収量が３桁増加し、腐食の存在を明らかにするため、腐食研究に特に有用である。
【００３１】
ＦＩＢの二次電子イメージングの別の利点は、イオンビームがタンパク質の標識に使用される蛍光プローブからの信号を変化させず、したがって蛍光顕微鏡によって得られる画像とＦＩＢの二次電子像を相関させる機会を作り出すという事実である。
【００３２】
電位アプリケーションのさらなる分野は、質量分析（ＭＳ）である。これは、化学種をイオン化し、その質量対電荷比に基づいてイオンを分類する分析技術である。簡単に言えば、質量スペクトルは、試料内の質量を測定する。質量分析は、多くの異なる分野で使用されており、純粋な試料だけでなく複雑な混合物にも適用される。
【００３３】
質量スペクトルは、質量対電荷比の関数としてのイオン信号の強度のプロットである。これらのスペクトルは、試料の元素または同位体特性、粒子および分子の質量を判定し、ペプチドおよび他の化合物などの分子の化学構造を解明するために使用される。
【００３４】
典型的なＭＳ手順において、固体、液体、または気体であり得る試料は、例えば、電子と衝突することによってイオン化される。これは、試料の分子の一部を荷電した断片に破壊させることがある。そして、これらのイオンは、典型的にはそれらを加速してそれらを電界または磁場にかけることによって、その質量電荷比にしたがって分離され、同じ質量電荷比のイオンは、同じ量の偏向を受ける。イオンは、電子増倍管などの荷電粒子を検出することができる機構によって検出される。結果は、質量電荷比の関数としての検出されたイオンの相対存在量のスペクトルとして表示される。既知の質量を同定された質量と、または特徴的な断片化パターンと相関させることは、試料中の原子または分子を同定することができる。
【００３５】
質量分析は、とりわけタンパク質の特徴付けおよびシーケンシングのための重要な方法である。タンパク質全体のイオン化のための２つの主な方法は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）およびマトリックス支援レーザ脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）である。利用可能な質量分析計の性能および質量範囲に合わせて、タンパク質を特徴付けるために２つのアプローチが使用される。第１に、無傷のタンパク質は、上述した２つの技術のいずれかによってイオン化され、その後、質量分析器に導入される。このアプローチは、タンパク質分析の「トップダウン」戦略と呼ばれる。しかしながら、トップダウンアプローチは、スループットの低い単一タンパク質研究に主として限定されている。第２に、タンパク質は、電気泳動分離後の溶液またはゲルのいずれかで、トリプシンまたはペプシンなどのプロテアーゼを用いて酵素的により小さなペプチドに消化される。他のタンパク質分解剤もまた使用される。そして、ペプチド生成物の収集物が質量分析計に導入される。ペプチドの特徴的なパターンがタンパク質の同定に使用される場合には、この方法は、ペプチド質量フィンガープリンティング（ＰＭＦ）と呼ばれ、タンデムＭＳ分析で判定されたシーケンスデータを使用して同定が行われる場合には、デノボペプチドシーケンシングと呼ばれる。タンパク質分析のこれらの手順はまた、「ボトムアップ」アプローチとも称される。しかしながら、第３のアプローチが使用され始めており、この中間的な「ミドルダウン」アプローチは、典型的なトリプシンペプチドよりも大きいタンパク質分解性ペプチドを分析することを含む。
【００３６】
関心のあるさらなる分野は、大規模並列シーケンシングであり、または大規模並列シーケンシングは、大規模並列処理の概念を用いたＤＮＡシーケンシングのためのいくつかの高スループットのアプローチのいずれかである。それはまた、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）または第二世代シーケンシングとも呼ばれる。これらの技術の一部は、１９９４年から１９９８年に登場し、２００５年から市販されている。これらの技術は、１回の計測で１００万から４３０億回の短い読み取り（５０−４００塩基毎）をシーケンシングするために、小型化および並列化されたプラットフォームを使用する。
【００３７】
多くのＮＧＳプラットフォームは、エンジニアリング構成およびシーケンシング化学が異なる。それらは、空間的に分離されることによって大規模並列シーケンシングの技術的パラダイムを共有し、フローセルにＤＮＡテンプレートまたは単一ＤＮＡ分子をクローン増幅した。この設計は、個々のシーケンシング反応で生成された連鎖停止生成物の電気泳動分離に基づいている−キャピラリーシーケンシングまたは第一世代シーケンシングとしても知られている−サンガーシーケンシングとは非常に異なる。
【００３８】
様々な技術が使用されているが、それぞれには、いくつかの点で制限がある。ＴＥＭは、その固有の環境におけるタンパク質の構造的詳細を明らかにすることができるが、電子ビームは、生体組織に非常に損傷を与え、その線量は、非常に低く保たれなければならず、信号と解像度を制限する。オミックス研究（例えば、ゲノミクス、プロテオミクス、およびメタボロミクス）は、空間的または時間的に解明されていない。ＣｈＩＰ−ＳｅｑおよびＣＬＩＰ−Ｓｅｑ手順は、退屈な生化学的分離工程を必要とする。ＦＩＳＳＥＱなどのインサイチュ遺伝子シーケンシング技術は、核小体またはストレス顆粒などの高密度領域を解明することができない。質量分析プロテオミクスは、細胞内のタンパク質組成の包括的、定量的分析を生成することができる。しかしながら、ＭＳは、固有の空間的局在を提供せず、分別または免疫沈殿などの抽出方法の特異性によって制限される。
【００３９】
極低温試料のＦＩＢミリングが広く使用されているが、Ｇａ＋のＦＩＢは、６５ｎＡの典型的な最大ビーム電流によって制限される。生物学的試料の典型的な寸法を考えると、ＧａのＦＩＢミリングは、通常は非実用的に遅い。さらに、Ｇａ汚染は、その後の分析に悪影響を与えることがある。Ｏ＋のＦＩＢミリングの利点は、高い適合性（カーテン処理およびＧａ汚染などのミリングアーチファクトの減少）および生物学的組織に対する高い材料除去速度であり、部分的な生物学的欠失および／またはオルガネラ切除などの新たな単離および精製技術を可能にする。
【００４０】
前に引用したすべての特許および非特許文献ならびにその中に含まれる引用は、参照することによって本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００４１】
上記に照らして、特に凍結または極低温保存形態における生物学的試料の処理のための改良されたおよび／または代替の方法および装置およびシステムを提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００４２】
この目的は、本発明にかかる方法、装置およびシステムを用いて達成される。
【００４３】
本発明は、特に、少なくとも１つの生物学的試料の処理方法に関する。本方法は、特に、高性能顕微鏡検査、プロテオミクス分析、ＮＧＳなどのシーケンシングに使用される。本発明によれば、本方法は、少なくとも１つの生物学的試料を凍結形態で提供するステップを備える。これは、ミリングおよびさらなる分析に適合するガラス質または他の任意の形態であり得る。ミリングは、Ｏ＋および／またはＸｅ＋プラズマの少なくとも１つを含むプラズマイオンビームによって試料の少なくとも一部を処理する。Ａｒ＋、Ｎ＋、Ｋｒ＋、Ｎｅ＋、Ｈｅ＋および／またはＨ＋をさらに含むイオンビームも同様に使用可能である。
【００４４】
これは、とりわけ、これらのプラズマまたは任意の他のプラズマの任意の混合物を含む。さらに、Ｏ＋またはＯ＋プラズマまたはＯ＋プラズマビームと称されるとき、Ｏ＋、Ｏ２＋、および他の種、ならびにＯ＋、Ｏ２＋、および他のＯ−ベースの関連種を含むプラズマまたはプラズマビームが含まれる。
【００４５】
ＰＦＩＢなどの二重プラズマもまたカバーされる。
【００４６】
Ｘｅ＋プラズマまたはプラズマビームが使用される場合、Ｏ２ガスが添加されることができる。これは、生物学的試料へのいかなる害も回避するために、特にビームの周囲における試料の保護において特に有利であることが示されている。
【００４７】
ミリングは、少なくとも１０％Ｏ＋プラズマイオン、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６６％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、およびより好ましくはほぼまたは正確に１００％のＯ＋プラズマイオンを含むプラズマイオンビームによって行われることができる。これらのプラズマイオンはまた、プローブまたは試料がスパッタリングされ、それゆえに物理的および化学的ストレスを受けているときに、試料保護の有利な効果を提供することができる。
【００４８】
本発明にかかる方法はまた、好ましくは、極低温保存または極低温形態または任意の関連する状態にある生物学的試料をミリングすることを備えることができる。
【００４９】
少なくとも６ｎＡ、より好ましくは少なくとも１０ｎＡ、より好ましくは少なくとも５０ｎＡ、より好ましくは少なくとも１００ｎＡ、より好ましくは少なくとも２００ｎＡ、さらにより好ましくは少なくとも３００ｎＡ、さらにより好ましくは少なくとも４００ｎＡ、さらにより好ましくは少なくとも５００ｎＡ、さらにより好ましくは少なくとも６００ｎＡ、さらにより好ましくは少なくとも６５０ｎＡ、さらにより好ましくは少なくとも７００ｎＡ、さらにより好ましくは少なくとも８００ｎＡ、さらにより好ましくは少なくとも９００ｎＡ、さらにより好ましくは少なくとも１０００ｎＡの実効ビーム電流において少なくとも１つのプラズマイオンビームによって試料の少なくとも一部をミリングするさらなるステップもまた実現可能である。これは、むしろ速いまたは以前よりもはるかに速い試料の処理およびミリングをサポートすることができる。とにかく、試料は、損傷していないかまたは損傷が少なくなる。
【００５０】
試料の少なくとも一部をミリングするさらなるステップは、さらに好ましくは、少なくとも１００μｍ３／秒、より好ましくは少なくとも２００μｍ３／秒、より好ましくは少なくとも３００μｍ３／秒、より好ましくは少なくとも５００μｍ３／秒、より好ましくは少なくとも１０００μｍ３／秒の質量除去速度において少なくとも１つのプラズマイオンビームによって行われることができる。これは、生物学的試料を依然として保存している間に従来技術よりも速く、これよりも１０倍またはさらに複数倍の因子である。例えば、５００μｍ３／秒のミリング速度は、１μＡのビーム電流および０．５μｍ３／ｎＣのミリング効率で標的材料を得ることができる。２μＡの大きなビーム電流が使用される場合、１０００μｍ３／秒の除去速度が得られることができる。
【００５１】
本発明は、試料の不要部分の除去および標的の抽出の少なくとも１つを実行するために試料をミリングするステップを備えることができる。したがって、必要に応じて、多数のアブレーションステップまたはサイクルを用いてスポット的にまたは平面的にアブレーションすることにより、ミリングが制御される。
【００５２】
蓄積された試料中の複数の標的を蓄積するさらなるステップも実現可能である。これは、画像生成、プロテオミクス、ゲノミクスなどの多くの異なるタスクに適用することができる。
【００５３】
処理は、サブミクロン処理とすることができ、本方法は、さらに、可視化のための少なくとも１つの顕微鏡画像を生成し、ミリングまたは双方を制御するステップを備えることができる。
【００５４】
ＳＥＭおよび／またはＴＥＭ顕微鏡は、顕微鏡画像を生成することができる。他の顕微鏡的アプローチまたはそれらの組み合わせも使用可能である。
【００５５】
質量分析によって試料または蓄積試料を分析するさらなるステップは、好ましくは、特にプロテオミクスの目的のためにそのような試料の分析に特に有用であることが示されている、いわゆるオービトラップ融合質量分析計によって同様に行うことができる。したがって、本発明は、試料中のタンパク質を分析および／または判定するさらなるステップを提供することができる。
【００５６】
代替的にまたは追加的に、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって標的をシーケンシングするさらなるステップを行うことができる。
【００５７】
標的の空間情報もまた、本発明により追跡されることができ、さらに、好ましくは試料中に含まれるタンパク質を分析する際に標的の分析に使用される。
【００５８】
本発明はまた、特に、凍結形態での少なくとも１つの生物学的試料と、Ｏ＋またはＸｅ＋プラズマの少なくとも１つを含む少なくとも１つのプラズマイオンビームを発生させるように構成された少なくとも１つのプラズマイオンビーム発生器との少なくとも１つのサポートを含む前述の方法を実施するための、少なくとも１つの生物学的試料の処理のための装置を指す。Ａｒ＋、Ｎ＋、Ｋｒ＋、Ｎｅ＋、Ｈｅ＋および／またはＨ＋をさらに含むイオンビームも同様に使用可能である。前および後に説明され、方法に関連して特許請求される他の任意の特徴もまた、装置カテゴリにおいて本発明によってカバーされる。
【００５９】
本発明はまた、二重プラズマイオン発生器を備える。
【００６０】
装置のプラズマイオンビーム発生器は、少なくとも１０％のＯ＋プラズマイオン、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６６％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、およびより好ましくはほぼまたは正確に１００％のＯ＋プラズマイオンを含むプラズマイオンビームを発生させるように構成されることができる。
【００６１】
装置はまた、本発明にかかる方法に関連して前述されて特許請求された実効ビーム電流および／または質量除去速度を実現するように構成されることができる。
【００６２】
装置はまた、視覚化およびミリング制御の少なくとも１つのために顕微鏡画像を生成するために、顕微鏡、好ましくはＳＥＭまたはＴＥＭ顕微鏡を備えることができる。
【００６３】
本発明はまた、前述および後述する装置と、少なくとも１つの顕微鏡、好ましくはＳＥＭまたはＴＥＭ顕微鏡と、質量分析計、好ましくはオービトラップ融合質量分析計と、シーケンシングステーション、好ましくはＮＧＳステーションとを備えるシステムまたはアセンブリを対象としている。そのようなシステムによって、プロテオーム分析およびシーケンシングのための新規且つ有利なワークフローが実現可能である。
【００６４】
本発明はまた、プロテオーム分析、遺伝子シーケンシングなどのゲノミクス、およびＳＥＭまたはＴＥＭなどの高性能顕微鏡の少なくとも１つの前述した、後述するおよび特許請求された方法の使用を含む。
【００６５】
プラズマ構成の正確な性質および量は、ＲＦ電源を含む多くの因子に依存する。場合によっては、優先的に形成された種が試料をミリングする際により効果的であると考える証拠がある場合には、１つの種を他に対して強調するようにＲＦ電力を調整することが好ましいこともある。より高いＲＦ電力は、より多くのＯ＋を生成する傾向があり、より低いＲＦ電力は、より多くのＯ２＋を生成する傾向があり、それに応じてそれを調整することができる。
【００６６】
本発明は、好ましくは、細胞のより包括的なタンパク質組成物のために極低温保存細胞のＦＩＢミリングを使用して、標的または関心領域（ＲＯＩ）を単離することによりプロテオミクスデータを局在化することができる。対照的に、標準的な技術を用いて、タンパク質は局在化されず、細胞内の特定の位置に容易に局在化されることができない。
【００６７】
レーザ解剖法は、いくつかの領域を分離するために存在するが、試料は、生きたままにしておくか（時間の面を破棄する）、または化学的に固定してプロテオミクスの結果に影響を与えて特定の信号を低下させなければならない。本発明は、これを好ましくは回避することができる。
【００６８】
本発明は、生物学的試料内の高い時間および空間分解能で感受性タンパク質分析を可能にする。発達生物学研究では、現在、様々な技術がタンパク質分析に使用されているが、それぞれが何らかの方法で制限されている。本発明は、Ｘｅ＋またはより具体的にはＯ＋プラズマＦＩＢ（Ａｒ＋、Ｎ＋、Ｋｒ＋、Ｎｅ＋、Ｈｅ＋および／またはＨ＋などの他のイオン種も同様に）を使用することができ、極低温保存された生物学的試料における非常に高い除去速度を提供し、本譲受人の質量分析計による高感度タンパク質検出を提供する。
【００６９】
本発明はまた、質量分析タンパク質分析および遺伝子シーケンシング分析のために極低温生物学的試料を単離および濃縮するための方法またはワークフローを備える。
【００７０】
プランジ凍結処理は、細胞活性をすぐに停止し、したがって時間的に特定の瞬間に生物の状態を維持することから、極低温調製が重要である。この時間分解能に加えて、試料内の高い空間分解能は、ＦＩＢミリング技術を用いて達成されることができる。具体的には、譲受人の最近の研究により、Ｏ＋プラズマＦＩＢは、極低温生物学的組織を含む有機基材上の大量の物質除去において非常に有効であることが明らかになった。
【００７１】
ＰＦＩＢにおけるＯ＋の高いミリング速度は、２つの可能な実施形態のうちの１つにおいて固有に利用される：第１に、試料の特定の領域を除去するためにＯ＋ミリングが使用可能であり、その結果は、残りの領域の後続のタンパク質分析が無傷のバルク試料のタンパク質シグネチャによって汚染されて希釈されないというものである。タンパク質の分布は、細胞または生物体内の領域によって異なる可能性があり、望ましくない領域を除去するこの方法は、生物の発達の研究にとって重要であり得る関心のある真の信号を集中させるのに役立つ。第２に、試料内の標的領域を切除するために従来のチャンク化およびリフトアウト技術が使用可能である。このプロセスは、後続の分析ツールの検出限界にとって適切な材料の必要量を達成するために、必要に応じて複数の同一試料で繰り返すことができる。
【００７２】
現在、Ｏ＋プラズマＦＩＢ技術を譲受人の質量分析技術と組み合わせたワークフローが生物学的試料分析のための固有な強力なツールをもたらすように、プロテオミクスのための最高の感度（大規模タンパク質抽出および分析）を有する質量分析器は、譲受人の融合質量分析計である。ＦＩＢによって提供される極低温調製および部位指定は、ユーザが高い空間および時間分解能で関心領域を捕捉することを可能にし、質量分析計の感度は、微妙なタンパク質変化を検出することを可能にする。したがって、本発明は、生物学的研究のための強力な新しいツールとなり得る。
【００７３】
本発明によれば、凍結された試料は、凍結によって処理され、影響を受けまたは外皮が形成され、極低温または極低温保存された形態とすることもできる。
【００７４】
Ｏ＋プラズマビームは、これらのより大きな生物学的試料における現実的な試料調製を可能にし、将来の切り替え可能なイオン種ＰＦＩＢに価値を提供する。
【００７５】
本技術は、ここで添付図面を参照して説明される。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、従来技術にかかるワークフローの実施形態を示している。
【図２】図２は、ＦＩＢミリングステーションの原理構成を示している。
【図３】図３は、本発明にかかるミリングの結果を示している。
【図４】図４は、それぞれ前胚および後胚のためのグリッドの調製を示している。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
図１は、当該技術分野において実施されているような典型的なワークフローの実施形態を示している。示される生物学的試料１は、さらに分析されるように意図され、生物学的試料は、１つ以上の生物、細胞、構造、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡなどから構成される。細胞を分析するために、生物学的試料１中に含まれている細胞の一部、タンパク質、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡは、各容器２によって象徴される１つ以上の消化物または酵素によって、選択された破壊および崩壊などのために１つ以上の段階に曝される。特に関心のある部分をよりよく分離できるように、部分、分子、タンパク質などが高圧液体クロマトグラフ３（ＨＰＬＣ）でさらに分離されることができる。そして、これらは、関心のある部分、分子、タンパク質などをさらに単離して特定するために、質量分析計４に転送されることができる。１つの欠点は、これらのタンパク質などを局在化させることなく、むしろ不特定の化学的および物理的分離であることである。
【００７８】
さらにまた、レーザ解剖は、関心のある部分を単離することが知られている。しかしながら、試料は、時間的側面を破棄しながら生きていなければならず、またはプロテオミクスの結果に影響を与え且つ信号を低下させることがある化学的固定でなければならない。
【００７９】
図２は、ＦＩＢ試料調製の例示的な例を示している。図２が示すように、Ｇａ＋イオン発生器５によって発生されたガリウム（Ｇａ＋）一次イオンビームは、試料表面に当たり、二次イオン（ｉ＋またはｉ−）または中性原子（ｎ０）のいずれかとして表面を離れる少量の材料をスパッタリングする。一次ビームはまた、二次電子（ｅ−）を生成する。試料表面上の一次ビームラスタとして、スパッタリングされたイオンまたは二次電子からの信号が収集されて画像を形成する。
【００８０】
本発明によれば、前述および以下に特許請求されたように、一次イオンビームは、ここでＯ＋および／またはＸｅ＋を含む。Ａｒ＋、Ｎ＋、Ｋｒ＋、Ｎｅ＋、Ｈｅ＋および／またはＨ＋もまた、構成されることができる。
【００８１】
低一次ビーム電流では、材料がほとんどスパッタリングされず、現代のＦＩＢシステムは、５ｎｍのイメージング解像度（Ｇａイオンによるイメージング解像度は、スパッタリングおよび検出器の効率によって〜５ｎｍに制限される）を容易に達成することができる。より高い一次電流では、スパッタリングによって大量の材料が除去されることができ、サブマイクロメータまたはナノスケールまでの試料の精度の高いミリングを可能にする。
【００８２】
ガス支援エッチングおよび／または任意のガスガン６は、選択された蒸着を実現することができる。これは、特に一次イオンビームＯ２がガスガン６によって添加されることが有利であるためにＸｅ＋が使用されている場合、本発明にしたがって適用することができる。
【００８３】
試料が非導電性である場合、低エネルギー電子フラッドガン７が電荷中和を提供するために使用可能である。このようにして、正の一次イオンビームを用いた正の二次イオンによるイメージングにより、ＳＥＭで要求されるように、高度に絶縁性の試料でさえも、表面コーティングを行うことなくイメージングおよびミリングされることができる。
【００８４】
図３によれば、生物学的試料１は、標的１１の選択および／または不要部分１２の除去によって本発明にしたがって処理されることができる。示されているように、これは、不要部分１２からミリングにより標的１１をミリングすることによってまたは標的１１から不要部分１２をスパッタリングすることによって行うことができる。後者は、不要部分または容積の大量除去である。
【００８５】
図４では、２つのチャートが示されている。左のものは、胚の２つの異なる領域、前（ｙ軸）および後（ｘ軸）のグリッドの調製を例示しており、本発明の好ましい利点の１つ、すなわち、空間情報のさらなる使用を実証している。より具体的には、図４は、本発明にかかる生物学的試料中の標的の空間的選択または分布を示している。この場合、胚の２つの異なる領域（ショウジョウバエ胚）のグリッドは、前方および後方に発達している。より多くの領域が追跡されることもできる。
【００８６】
試料は、種々のタンパク質を同定するために、本譲受人のオービトラップ融合質量分析計によって行われた。前述したように、それらは、空間的に割り当てられることもできる。
【００８７】
図４の右側には、タンパク質発現標的ならびにＲＮＡ発現標的の分布が示されている。
【００８８】
「約（ａｂｏｕｔ）」、「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」などの相対的用語が本明細書で使用されるときはいつでも、そのような用語もまた、正確な用語も含むと解釈されるべきである。すなわち、例えば、「実質的にまっすぐ（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｓｔｒａｉｇｈｔ）」は、「（正確に）まっすぐ」も含むと解釈されるべきである。
【００８９】
ステップが上記または添付の特許請求の範囲に列挙されるときはいつでも、本明細書でステップが列挙される順序が好ましい順序であり得るが、列挙されたステップを列挙された順序で実行することは必須ではないことに留意すべきである。すなわち、別段の指定がない限り、または当業者に明らかでない限り、ステップが列挙される順序は、必須ではない場合がある。すなわち、本明細書が、例えば、方法がステップ（Ａ）および（Ｂ）を備えることを記載している場合、これは、ステップ（Ａ）がステップ（Ｂ）に先行することを必ずしも意味しないが、ステップ（Ａ）がステップ（Ｂ）と（少なくとも部分的に）同時に実行されるかまたはステップ（Ｂ）がステップ（Ａ）に先行することも可能である。さらにまた、ステップ（Ｘ）が別のステップ（Ｚ）に先行すると記載されたとき、これは、ステップ（Ｘ）とステップ（Ｚ）の間にステップがないことを意味するものではない。すなわち、ステップ（Ｚ）に先行するステップ（Ｘ）は、ステップ（Ｚ）の直前にステップ（Ｘ）が実行される状況を包含するが、ステップ（Ｚ）が続く１つ以上のステップ（Ｙ１）、・・・、の前にステップ（Ｘ）が実行される状況も包含する。対応する考慮事項は、「後」または「前」などの用語が使用される場合に適用される。
比較例
【００９０】
Ｇａ＋、Ｘｅ＋、Ｏ＋による試験が行われた。試料調製は、極低温保存されたショウジョウバエ（ショウジョウバエの胚）の大部分を選択的に除去することを必要とする。以下が観察された。
【００９１】
Ｇａ＋プラズマイオンビームにより、利用可能な電流は、５０ｎＡ付近であった。ミリング速度は、線量が試料上で増加するにつれて減少するようにみえる。ミリングに要する時間は、必要とされる試料の量にとって有利でないようにみえる。
【００９２】
Ｘｅ＋により、電流の増加は、ミリング速度の１０倍の改善を可能にした。しかしながら、ミリング速度は、Ｏ２ガスでもさらに改善される可能性があった。
【００９３】
一次イオンビームとしてのＯ＋の使用は、本出願のために最良の結果を示し、最大で４５００μｍ３／秒（Ｇａ＋に比べて４５ｘ拡張）のミリング速度を達成した。さらに有利なことに、試料は、そのような高いミリング速度で予想されるように、イオンビームによって（おそらく局所加熱によって）損傷を受けていないようにみえた。これは、試料がより小さくなるかまたは氷の中で支持／沈下されない試料上でさらに顕著である。
【００９４】
Ｏ＋プラズマイオンビームは、１μＡの設定で３０ｋｅＶの電圧を有し、６８０ｎＡの実効電流が測定された。これは、Ｇａ＋イオンビームのセットアップと比較して１３倍以上の電流である。
【００９５】
Ｏ＋プラズマイオンビームによる前述の例では、ビームは、１５μｍのｚ深さ、１μｓの滞留時間、６５％のｘオーバーラップおよび８５％のｙオーバーラップを有するＣＣＳパターンを受けた。したがって、ショウジョウバエの胚の半分は、〜７分で除去されることができた。
【００９６】
したがって、本発明にかかるＯ＋プラズマイオンビームは、多くの試料が単一セッションで調製されることを可能にするワークフローを形成することができる。最終的に、１つの試料に対して〜１００個の細胞が必要とされることができ、標準的な方法と比較して非常に長い時間が節約される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
2019120691.tif 000005
【図４】
2019120691.tif 000006
【外国語明細書】
2019120691000001.pdf