(57)【要約】  開示されているのは、幹細胞の作成方法である。特に説明されているのは、分化した細胞をリプログラミングすることによる多能性幹細胞の作成方法である。幹細胞の作成方法は、既存の胚幹細胞から細胞質体を得るステップと、細胞質雑種を作成するために細胞質体を分化した細胞に融合させるステップと、多能性幹細胞をもたらすために細胞質雑種を培養するステップとを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．既存の胚幹細胞から細胞質体を得るステップと、
ｂ．細胞質雑種を作成するために上記細胞質体を分化した細胞に融合させるステップと、
ｃ．幹細胞をもたらすために上記細胞質雑種を培養するステップとを含むこと
を特徴とする幹細胞の作成方法。
【請求項２】
上記既存の胚幹細胞は、哺乳類種から得られること
を特徴とする請求項１記載の幹細胞の作成方法。
【請求項３】
Ｇ０／Ｇ１フェーズで上記既存の胚幹細胞を捕捉するステップをさらに含むこと
を特徴とする請求項１記載の幹細胞の作成方法。
【請求項４】
上記細胞質体を得るステップは、上記既存の胚幹細胞を除核するステップを含むこと
を特徴とする請求項１記載の幹細胞の作成方法。
【請求項５】
上記細胞質体を得るステップは、上記既存の胚幹細胞の細胞質体を分離するステップをさらに含むこと
を特徴とする請求項４記載の幹細胞の作成方法。
【請求項６】
細胞質体を得るために上記既存の胚幹細胞を除核するステップをさらに含むこと
を特徴とする請求項１記載の幹細胞の作成方法。
【請求項７】
哺乳類種から上記分化した細胞を得るステップをさらに含むこと
を特徴とする請求項１記載の幹細胞の作成方法。
【請求項８】
上記分化した細胞は、ヒトのリンパ球を含むこと
を特徴とする請求項７記載の幹細胞の作成方法。
【請求項９】
上記細胞質体を融合する前にＧ０／Ｇ１フェーズで上記ヒトのリンパ球を捕捉するステップをさらに含むこと
を特徴とする請求項８記載の幹細胞の作成方法。
【請求項１０】
上記融合のステップは、化学融合によって実行されること
を特徴とする請求項９記載の幹細胞の作成方法。
【請求項１１】
上記幹細胞をもたらすために細胞質雑種を培養するステップの前に上記細胞質雑種を支持細胞層上に移すステップをさらに含むこと
を特徴とする請求項１記載の幹細胞の作成方法。
【請求項１２】
上記支持細胞層は、線維芽細胞の支持細胞層を含むこと
を特徴とする請求項１１記載の幹細胞の作成方法。
【請求項１３】
上記細胞質雑種は、幹細胞質雑種であること
を特徴とする請求項１記載の幹細胞の作成方法。
【請求項１４】
上記幹細胞は、多能性であること
を特徴とする請求項１記載の幹細胞の作成方法。
【請求項１５】
上記細胞質雑種は、上記分化した細胞のヒト組織適合性抗原（Human Leukocyte Antigens；ＨＬＡ）を発現すること
を特徴とする請求項１記載の幹細胞の作成方法。
【請求項１６】
ａ．既存の胚幹細胞から細胞質体を得るステップと、
ｂ．細胞質雑種を作成するために上記細胞質体をリンパ球に融合させるステップと、
ｃ．幹細胞をもたらすために上記細胞質雑種を培養するステップとを含むこと
を特徴とする胚幹細胞の作成方法。
【請求項１７】
上記既存の胚幹細胞は、哺乳類種から得られること
を特徴とする請求項１６記載の胚幹細胞の作成方法。
【請求項１８】
Ｇ０／Ｇ１フェーズで上記既存の胚幹細胞を捕捉するステップをさらに含むこと
を特徴とする請求項１６記載の胚幹細胞の作成方法。
【請求項１９】
上記細胞質体を得るステップは、上記既存の胚幹細胞を除核するステップを含むこと
を特徴とする請求項１６記載の胚幹細胞の作成方法。
【請求項２０】
上記細胞質体を得るステップは、上記既存の胚幹細胞の細胞質体を分離するステップをさらに含むこと
を特徴とする請求項１９記載の胚幹細胞の作成方法。
【請求項２１】
細胞質体を得るために上記既存の胚幹細胞を除核するステップをさらに含むこと
を特徴とする請求項１６記載の胚幹細胞の作成方法。
【請求項２２】
哺乳類種から上記リンパ球を得るステップをさらに含むこと
を特徴とする請求項１６記載の胚幹細胞の作成方法。
【請求項２３】
上記細胞質体を融合する前にＧ０／Ｇ１フェーズで上記リンパ球を捕捉するステップをさらに含むこと
を特徴とする請求項２２記載の胚幹細胞の作成方法。
【請求項２４】
上記融合のステップは、化学融合によって実行されること
を特徴とする請求項２３記載の胚幹細胞の作成方法。
【請求項２５】
上記幹細胞をもたらすために細胞質雑種を培養するステップの前に上記細胞質雑種を支持細胞層上に移すステップをさらに含むこと
を特徴とする請求項１６記載の胚幹細胞の作成方法。
【請求項２６】
上記支持細胞層は、線維芽細胞の支持細胞層を含むこと
を特徴とする請求項２５記載の胚幹細胞の作成方法。
【請求項２７】
上記細胞質雑種は、幹細胞質雑種であること
を特徴とする請求項１６記載の胚幹細胞の作成方法。
【請求項２８】
上記幹細胞は、多能性であること
を特徴とする請求項１６記載の胚幹細胞の作成方法。
【請求項２９】
上記細胞質雑種は、上記リンパ球のヒト組織適合性抗原（Human Leukocyte Antigens；ＨＬＡ）を発現すること
を特徴とする請求項１６記載の胚幹細胞の作成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願の特許請求の範囲は、２００３年５月１６日に出願された米国仮特許出願第６０／４７１，１６３号明細書に基づく優先権を主張するものであり、その内容は、引用することによってここにその全体が組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、一般に、幹細胞の作成に関する。特に、本発明は、分化した細胞を用いて、既存の胚幹細胞の細胞質体を融合させることによる幹細胞の作成方法に関する。結果として得られる細胞質雑種とその子孫は、幹細胞の特定のマーカーを示す。特に、結果として得られる細胞質雑種とその子孫は、多能性幹細胞の特定のマーカーを示す。幹細胞は分化した細胞としてのヒト組織適合性抗原（Human Leukocyte Antigens；ＨＬＡ）と同じ発現であると思われる。
【背景技術】
【０００３】
幹細胞は、皮膚、ニューロン、又は他の器官細胞等、多くの異なる細胞種類をもたらす特異な能力を有する未分化の細胞である。幹細胞はまた、不定期間に自己再生する能力を有する。幹細胞が特定種類の細胞の成長のポテンシャルを有し、無限に増殖することができるという事実は、移植のための器官や組織の開発、変性疾患のための細胞療法、遺伝子療法、新薬の毒性試験等のアプリケーションにおいて潜在的に有効になる。
【０００４】
胚幹細胞は、胚の成長の最も初期段階である胚胞期の１つから発生する。特に、胚幹細胞は、子宮壁に植え付ける前の段階での胚盤胞の内側の細胞群に由来する。最も重要なことは、胚幹細胞は自己再生可能であって３つ全ての胚葉細胞を含む人体の殆どの種類の細胞に分化可能である意味で多能性であることである。
【０００５】
また、胚幹細胞に対して、成人幹細胞も存在する。成人幹細胞は、分化した組織でみられる未分化の細胞である。成人幹細胞は、それが発生した組織から細胞種類に分化する能力を有する。骨髄、血流、目の角膜や網膜、歯の歯髄、肝臓、皮膚、消化管、及び膵臓において成人幹細胞をみつけることができる。しかしながら、胚幹細胞と異なり、成人幹細胞が多能性であるという証拠は全くない。したがって、多能性幹細胞を作成する必要がある。
【０００６】
ヒト胚性幹細胞の１つのソースは、体外受精（ＩＶＦ）によって作られた胚から得られる。ＩＶＦ技術は、実験室で受精を実行し、胚を育てることを可能にした。伝統的に、この技術は、多くのそうでなければ不妊となるカップルが子供を持つことを許容してきた。しかしながら、多くの場合、作られた全ての胚が使用されているわけではなく、残った胚は、凍結されて格納されているかもしれない。胚は、ヒト胚性幹細胞のための可能なソースを提供する。代わりに、胚幹細胞はまた、治療型クローニングとして知られている核移植を使用することによって作成されるかもしれない。
【０００７】
しかしながら、ヒト胚性幹細胞のソースは、体外受精からの余剰胚及びそれらの使用から、倫理的及び政治的な問題を提起した。ＩＶＦ技術や治療型クローニング等の技術は、これらの問題のいくつかに対応するために開発された。しかしながら、これらの技術を使用することについての懸念が未だに存在している。
【０００８】
本発明は、既存の胚幹細胞の細胞質体は分化した細胞の核を多能性幹細胞にリプログラミングすることができるという信念に基づいている。さらに、結果として得られる細胞質雑種は、ドナーの分化した細胞と免疫学的に互換性があると思われる。新たに作成された多能性幹細胞株は、核のソースとしてのヒト組織適合性抗原（ＨＬＡ）と同じ発現で細胞に分化するであろう。その結果、患者における潜在的な拒絶反応の問題を回避することができる。したがって、本発明は、他の問題と同様に、上述した問題を解決するように設計される。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、分化した細胞を幹細胞にリプログラミングすることによる幹細胞の作成方法を提供する。幹細胞の作成方法は、既存の胚幹細胞から細胞質体を得るステップと、細胞質雑種を作成するために細胞質体を分化した細胞に融合させるステップと、幹細胞をもたらすために細胞質雑種を培養するステップとを含む。結果として得られる細胞質雑種は、多能性幹細胞である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、多くの異なる形式の具体例に影響されやすい一方で、この開示は、単に本発明の原理の例示であるとみなされ且つ本発明の幅広い様相を例証した特定の具体例に限定するようには意図されないものであるという理解のもとに、本発明の少なくとも１つの望ましい具体例、及び可能な代替具体例について詳細に記述するであろう。
【００１１】
本発明はまた、"幹細胞質雑種（stem cybrid）"と称される多能性幹細胞である細胞質雑種をもたらすために、分化したドナー細胞を用いて、既存の胚幹細胞から細胞質体を融合させることによる幹細胞の作成に関する。結果として得られる幹細胞質雑種は、分化したドナー細胞の主要組織適合性複合体（Major Histocompatibility Complex；ＭＨＣ）を発現し、特に、分化した細胞のソースとしてのヒト組織適合性抗原（Human Leukocyte Antigens；ＨＬＡ）と同じ発現であると思われる。
【００１２】
既存の胚幹細胞株が本発明に使用される。周知の方法によって分化した２倍体の哺乳類細胞が得られるかもしれない。望ましくは、この発明は、核質又は核と比べて低量の細胞質体がある哺乳類の２倍体細胞を使用する。リンパ球は核型に対して比較的少量の細胞質体を有していることから、この発明の１つの具体例においては２倍体の哺乳類のリンパ球が使用される。通常、リンパ球は、細胞の核質又は核を囲む非常に薄い細胞質体のリムを有する。既存の胚幹細胞の細胞質体と融合させるための非常に低量の細胞質体を有する分化した細胞を使用することは望ましい。ホスト核の形質発現を変更するある細胞質要素があると思われるため、分化した細胞の細胞質体に比べてより多くのドナー細胞の細胞質体を有していることは望ましい。周知の方法を使用することにより、ヒトからのヘパリン添加血液からヒトの２倍体のリンパ球を得ることができ、Ｃａ，Ｍｇなしのリン酸緩衝液（Phosphate Buffer Solution；ＰＢＳ）を用いて希釈される。
【００１３】
胚幹細胞の懸濁液は、エチレンジアミンテトラアセテート（Ethylene Diamine Tetra Acetate；ＥＤＴＡ）又はＥＧＴＡ（Ｃａ，ＭｇなしのＰＢＳ又はハンク溶液中で０．０２％）内で細胞群体をバラバラにした後、１００μＭナイロンセルストレーナを介して濾過することによって用意される。胚幹細胞のクラスタは、マトリゲル等の成長媒体を用いてコーティングされた１８ｍｍの円形のカバースリップ上において約８０％の密集濃度で夜通し育てられる。胚幹細胞は、少なくとも約１８時間培養される。胚細胞がバラバラになった後、胚幹細胞は、それらが細胞周期の同じ段階、細胞融合前にあるように同期する。細胞は、細胞融合の効率を増加させるように同期するかもしれない。
【００１４】
分化した細胞の懸濁液は、周知の方法を用いて分化した哺乳類の２倍体細胞を得ることによって用意される。この発明の１つの具体例においては、ヘパリン添加血液を用いてヒトの２倍体細胞が用意される。より望ましくは、密度勾配を用いてヒトのリンパ球が用意される。ヒトのヘパリン添加血液は、Ｃａ，ＭｇなしのＰＢＳを用いて希釈される。望ましくは、ＰＢＳ溶液に対するヒトのヘパリン添加血液の量は、比で１：２である。ＰＢＳの添加後、Histopaque1083等の試薬がヘパリン添加血液とＰＢＳとの混合物に添加される。望ましくは、ヘパリン添加血液が多量であるときHistopaqueの量の２倍あるように、Histopaque1083が添加される。Histopaque1083は、１．０８３ｇ／ｍＬの濃度に調整され、既存単核細胞の再生を容易にする試薬である。リンパ球を懸濁させるのに使用された密度勾配は、ワンステップはしご勾配（one-step ladder gradient）である。ヘパリン添加血液をＰＢＳ及びHistopque中に懸濁させた後、懸濁液は、約３０分間、室温で６００Ｇで遠心分離される。遠心分離後、ヘパリン添加血液は、濃度により、チューブ底部でペレットを構成する赤血球及びチューブ内での勾配上のリンパ球層と分離される。細胞融合のためのリンパ球を用意するためにいかなる血清の跡をも除去するように、リンパ球層は除去されて取り扱われる。
【００１５】
融合の効率を増加させるように、既存の胚幹細胞は、それらが除核される前に同期するのが望ましい。望ましくは、細胞の個体群における約５０％が細胞周期の１つの段階で捕捉され、より望ましくは、細胞の個体群における７０％が細胞周期の１つの段階で捕捉され、最も望ましくは、細胞の個体群における約９０％が融合前の細胞周期の１つの段階で捕捉される。既存の胚幹細胞は、周知の方法を使用することによって同期することができる。細胞周期段階は、相対的な細胞サイズに基づいて、又は様々な周知の細胞マーカーによって区別可能である。本発明においては、既存の胚幹細胞の個体群がそれらの相対的なサイズに基づいて分離されるのが望ましい。さらに、既存の胚幹細胞の個体群が除核前のＧ０／Ｇ１段階で捕捉されるのが望ましい。細胞がＧ０／Ｇ１フェーズにあるとき、それらは、有糸分裂細胞の分裂によって活発には増殖していない。Ｇ０／Ｇ１フェーズにおいては、通常リンパ球が存在するため、それらは、融合前に同期する必要なかった。
【００１６】
既存の胚幹細胞がＧ０／Ｇ１フェーズで同期した後、それらは、細胞から細胞質体を分離するために除核される。除核は、核を細胞の細胞質体から分離する周知の技術である。分化した細胞の除核は、サイトカラシンＢ又はサイトカラシンＤが存在するもとでのficollのはしご勾配での高速遠心分離によって実現することができる。細胞骨格におけるアクチンフィラメントを分裂させる生物学的又は化学的製剤製品（これに限定されないが）を含む他の試薬が除核に使用されてもよい。Wigler & Weinstein，１９７５年，Biochem. Biophys. Res. Commun.，63(3):669-674を参照してほしい。既存の胚幹細胞の除核は、胚幹細胞の細胞質体が核と比べて小さく、線維芽細胞等の分化した細胞と同じ方法で分離することができないため、分化して付着している細胞の除核と比べて異なる技術を必要とする。胚幹細胞の除核は、遠心分離の間、核がチューブの底部に向かって移動する一方で、細胞質体がガラスに固定されて留まるのを可能にする高密度に支持された溶液を使用する手順を含む。本発明の１つの具体例において、既存の胚幹細胞は、ficollのワンステップはしご勾配で除核される。密度勾配は、４．７ｍＬのHTF-HEPESと１．３ｍＬの血清代替物（Serum Replacement）とを用いた標準のHTF-HEPES溶液内に、３．３ｍＬ、２５％のficoll F400を混合することによって作成される。細胞除核溶液は、３．４μｇ／ｍＬのCystohalisin Dと０．５μｇ／ｍＬのnocodasolとを含む。既存の胚幹細胞をともなうカバーガラスは、スリップ下に気泡なしで円形の遠心分離チューブ内の底部表面に置かれる。それらは、３５℃に予熱されたHB-4 Bucket Rotorにおいて２００００Ｇで遠心分離され、温度は、遠心分離の間、約１時間、３６℃に維持される。遠心分離が完了した後、既存の胚幹細胞の細胞質体をともなうカバースリップは、１０％のウシ胎仔血清（fetal bovine serum）を用いたHTF-HEPES又はハンク溶液で洗浄され、再生のために２〜３時間、成長媒体とともに３５ｍｍのペトリ皿に移される。そして、図２に示すように、除核の効率は、ヘキスト３３３４２（３ｍｋｇ／ｍＬ）を用いて紫外線顕微鏡のもとに評価される。染色部分が核であり、非染色部分が細胞質体である。
【００１７】
除核された既存の胚幹細胞の細胞質体とリンパ球等の分化した細胞とを得た後、細胞の細胞質体と分化した細胞との融合を実行することができる。この発明の１つの様相においては、当業者にとって周知の電気的又は化学的手段によって脂質膜を融合することができる。例えば、融合は、化学融合試薬であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を化学的に使用することによって実現される。Pontecorvo，"哺乳類の体細胞雑種の作成におけるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）"，Cytogenet Cell Genet.，１９７６年，16(1-5): 399-400を参照してほしい。ＰＥＧの分子重量範囲は、少なくとも約１５００であるのが望ましい。しかしながら、細胞融合のために広範囲の分子重量のＰＥＧ分子を使用することができる。
【００１８】
分化した細胞との細胞質体の融合は、以下の通り実行される：哺乳類のリンパ球が６ｍＬの血液から分離された後、それらがハンク溶液で洗浄され、付着される既存の胚幹細胞の細胞質体の上に慎重に層化される。懸濁液は、除核された既存の胚幹細胞の細胞質体と哺乳類のリンパ球との密接な接触を提供するために、１５００ｒｐｍで１０分間、遠心分離される。望ましくは、１０個のリンパ球あたり１つの細胞質体の比率が使用されるべきである。４０〜５０％のＰＥＧと５％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）とを含む融合剤は、カバーガラスに添加され、室温で６０〜９０秒間培養するのを可能とする。続いて、融合剤、すなわちＰＥＧは、追加の血清なしの培地を添加することによって希釈される。そして、血清なしの培地は、成長媒体に取り替えられ、カバーガラスは、マトリゲルとともにペトリ皿に移され、約１８時間＋３７℃で培養することによって増殖することができる。
【００１９】
さらなる増殖において、幹細胞質雑種は、標準の手順を用いて培養される。例えば、付着された幹細胞質雑種があるカバーガラスは、胚線維芽細胞の支持細胞層とともにペトリ皿に移され、さらなる増殖のために培養することができる。
【００２０】
２週間目の終わりに、主要コロニーが出現した。既存の胚幹細胞の細胞質体と哺乳類のリンパ球とから形成された、融合された幹細胞質雑種は、図３に示されるとともに表１に記述されるように、さらに増殖した。融合しなかった既存の胚幹細胞の細胞質体と哺乳類のリンパ球とは、増殖しなかった。
【００２１】
多能性幹細胞に関連する特定のマーカーについてのさらなる選別は、蛍光in situハイブリッド形成法（Fluorescence in situ Hybridization；ＦＩＳＨ）等の交配方法を用いてなされた。選別の結果を表２に示す。表２は、結果として得られる幹細胞質雑種が多能性幹細胞の特定のマーカーを含むのを示す。
【００２２】
実施例
以下の実施例は、限定されるものではなく、単に実演の様々な様相と特徴とを代表しているにすぎない。
【００２３】
実施例１：雄のリンパ球の多能性幹細胞へのリプログラミング
上述した技術を用いて、リプロダクティブ  ジェネティクス  インスティチュートのコレクションからの既存の細胞株９６の雌の細胞質体が使用された。既存の細胞株は、正倍数体核型４６，ＸＸを含んでいる。予備のテストされたリンパ球は、２倍体核型４６，ＸＹを有する。既存の胚幹細胞株９６の除核は、１時間、２００００ｇでの高濃度溶液内における、１８ｍｍのカバーガラス上のメッキされた１５×１０４個の既存の胚幹細胞の遠心分離による手順に書かれるように実行された。細胞培地における２時間の再生後、既存の胚幹細胞の細胞質体は、ＰＢＳ（血清なし）で２度洗浄され、１．５×１０６個の予備の分離されているリンパ球は、細胞質体上に沈殿した。細胞の細胞質体融合は、５％のＤＭＳＯをともなう４０％のＰＥＧ１５００によって実行された。
【００２４】
【表１】
2007536930.tif 000002
【００２５】
分離されたクローンは、蛍光in situハイブリッド形成法を用いて多能性幹細胞の特定のマーカー（以下に示す）について選別され、首尾よく凍結して、解凍することができる。
【００２６】
【表２】
2007536930.tif 000003
【００２７】
ヒトのリンパ球のリプログラミング及び不死化は、５０％のＰＥＧ４０００によってサイトカラシンＢを用いて除核されたマウスＬ細胞の細胞質体を用いた融合によって実行され、さらに培養されてきた。細胞質体でヒトのリンパ球を融合するという結果として、リプログラミングされたリンパ細胞系が得られた。Abken等，形質転換マウスＬ細胞の細胞質体を用いた融合によるヒトのリンパ球の不死化，The Journal of Cell Biology，１９８６年９月，(103):795-805を参照してほしい。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】既存の胚幹細胞株が成長媒体の薄層上で成長するのを示す図である（対象１０Ｘ）。
【図２】除核されてヘキスト３３３４２を用いて染色された後の既存の胚幹細胞株を示す図である（対象２０Ｘ）。
【図３】１〜２週間の培養後に胚幹細胞の細胞質体とリンパ球とを融合した後の幹細胞のコロニーを示す図である（対象２０Ｘ）。
【図１】
2007536930.tif 000004
【図２】
2007536930.tif 000005
【図３】
2007536930.tif 000006
【国際調査報告】
2007536930.tif 000007
2007536930.tif 000008
2007536930.tif 000009