(57)【要約】【課題】より広いｍ／ｚの範囲について精密に質量分析装置を較正する。【解決手段】較正方法は、配列番号１のアミノ酸配列を有する分子を含む試料のマススペクトルを質量分析装置により取得することと、マススペクトルにおいて、当該分子に対応するピークを選択することと、当該ピークが、上記アミノ酸配列に基づいたｍ／ｚ値に対応することに基づいて質量分析装置により取得された測定データを較正することと、を備える。【選択図】図１
2019090654.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を有する分子を含む試料のマススペクトルを質量分析装置により取得することと、
前記マススペクトルにおいて、前記分子に対応するピークを選択することと、
前記ピークが、前記アミノ酸配列に基づいたｍ／ｚ値に対応することに基づいて前記質量分析装置により取得された測定データを較正することと、
を備える較正方法。
【請求項２】
請求項１に記載の較正方法において、      
前記マススペクトルにおいて、前記分子に対応するピークを、２８２１．１以上２８４９．６以下のｍ／ｚ値に対応するピークから選択する較正方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の較正方法において、
前記アミノ酸配列に基づいたｍ／ｚ値は、２８３０．０以上２８５０．０以下である較正方法。
【請求項４】
請求項１に記載の較正方法において、
前記分子に含まれるアミノ酸の少なくとも一部が修飾を受けており、
前記ピークが、前記アミノ酸配列および前記修飾に基づいたｍ／ｚ値に対応することに基づいて前記質量分析装置により取得された測定データを較正すること、
を備える較正方法。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれか一項に記載の較正方法において、
前記試料は、前記分子を産生する微生物、または前記微生物から調整した試料である較正方法。
【請求項６】
請求項５に記載の較正方法において、
前記微生物は、大腸菌である較正方法。
【請求項７】
請求項５または６に記載の較正方法において、
前記微生物は、配列番号１のアミノ酸配列を有する前記分子の発現が増幅する遺伝子操作を受けた微生物である較正方法。
【請求項８】
請求項１から７までのいずれか一項に記載の較正方法により較正された前記測定データに基づいて、前記質量分析装置により取得されたマススペクトルを較正することと、
較正された前記マススペクトルに基づいて、微生物を識別することと、
を備える微生物の識別方法。
【請求項９】
ｍ／ｚ値に基づいてイオンを分離する質量分離部と、
前記質量分離部で分離されたイオンを検出する検出部と、
前記検出部が検出したイオンに基づいてマススペクトルを作成するマススペクトル作成部と、
前記マススペクトルにおいて、配列番号１のアミノ酸配列を有する分子に対応するピークを決定し、前記ピークが、前記アミノ酸配列に基づいたｍ／ｚ値に対応することに基づいて前記検出部の検出により取得された測定データを較正する較正部と、
を備える質量分析装置。
【請求項１０】
配列番号１のアミノ酸配列を有する分子を備える、質量分析装置の較正用試薬。
【請求項１１】
質量分析装置により取得された、配列番号１のアミノ酸配列を有する分子を含む試料の第１マススペクトルから、前記分子に対応するピークを選択し、
前記ピークが、前記アミノ酸配列に基づいたｍ／ｚ値に対応することに基づいて前記質量分析装置により取得された測定データを較正する較正処理を処理装置に行わせるプログラム。
【請求項１２】
請求項１１に記載のプログラムにおいて、
前記較正処理は、前記質量分析装置により取得された、前記分子を産生する微生物または前記微生物から調整された試料の第２マススペクトルを較正し、
前記プログラムは前記処理装置に、
前記第２マススペクトルと、データベース上の複数の微生物のマススペクトルとを比較した結果に基づいて、前記試料がいずれの種類の微生物から調整されたものかを識別する識別処理を行わせるプログラム。
【請求項１３】
配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクターを含む、質量分析装置の較正用形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、較正方法、微生物の識別方法、質量分析装置、質量分析装置の較正用試薬、プログラム、および質量分析装置の較正用形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
イオン化された分子の質量を質量分析により測定する場合、測定する分子の質量を高い精度で測定することが求められる。例えば、分子量数千Ｄａの高分子を測定する場合に数Ｄａ以下の質量値の差を区別することが求められることは少なくない。従って、測定精度を上げるために、組成から質量の理論値が算出可能な基準物質を測定して、当該基準物質の質量の実測値と理論値との差に基づいて、質量分析装置の較正をすることが行われている。
【０００３】
質量分析装置の較正において使用される基準物質は、所望の測定条件下において明瞭なピークが検出される必要がある。例えば、微生物の種等の識別では、特許文献１に示すように、リボソームのサブユニットを構成するタンパク質（以下、リボソームタンパク質と呼ぶ）が基準物質として使用される。リボソームタンパク質は、大腸菌等の微生物中において比較的多量に発現し、かつイオン化されやすいため検出が容易であるという利点があった。
【０００４】
しかしながら、大腸菌のゲノム情報によると、大腸菌には約４３００Ｄａより小さな分子量を有するリボソームタンパク質が存在しないため、これより低い分子量を有する分子の測定の際には、較正が適切に行われず測定精度が低下するという問題があった。
【０００５】
図７（Ａ）は、図７（Ｂ）に示された、微生物に含まれるタンパク質のマススペクトルに基づいて、従来の較正方法により作成された較正曲線の一例を示した図である。従来の較正方法では、リボソームタンパク質に対応するピークＰ１〜Ｐ６が、当該リボソームタンパク質のアミノ酸配列に基づいたｍ／ｚ（質量電荷比）の理論値に対応することに基づいて較正曲線ＣＣ１が作成される。
【０００６】
図７（Ａ）に示された較正曲線ＣＣ１では、較正前のｍ／ｚ値を横軸にとり、ｍ／ｚの較正前の値と理論値とのずれを縦軸にとって示している。較正曲線ＣＣ１は、各基準物質のピークＰ１〜Ｐ６に対応するｍ／ｚの理論値と実測値とのずれ（ｍ／ｚの理論値からｍ／ｚの実測値を引いた値を、ｍ／ｚの実測値で割った値）をそれぞれ較正曲線ＣＣ１を示すグラフ上で基準となる点（以下、基準点と呼ぶ）Ｃ１〜Ｃ６としてプロットし、基準点Ｃ１〜Ｃ６を基に内挿および外挿等されて作成される。
【０００７】
上述のように、従来の較正方法では、基準物質として好適に利用可能な、約４３００Ｄａよりも小さな分子量の分子が見いだされていなかった。従って、例えば図７（Ａ）中の破線のように、分子量が４３００Ｄａ以上の基準物質のピークに対応する基準点Ｃ１，Ｃ２から得られた較正曲線ＣＣ１を外挿等してｍ／ｚがより低い領域の較正曲線を得ていたが、十分な正確性が得られない場合があった。また、分子量が４３００Ｄａ以上の基準物質の二価以上のイオンを利用して、つまりｚの値を大きくして、ｍ／ｚ値が４３００以下の基準点を得ることができるが、二価以上のイオンはマトリックスの種類や試料の濃度等の、イオン化の際の測定条件に影響を受けて観測されにくい等の問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−３１６０６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
約４３００以下のｍ／ｚの範囲において精度よく質量分析装置を較正する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の好ましい実施形態による較正方法は、配列番号１のアミノ酸配列を有する分子を含む試料のマススペクトルを質量分析装置により取得することと、前記マススペクトルにおいて、前記分子に対応するピークを選択することと、前記ピークが、前記アミノ酸配列に基づいたｍ／ｚ値に対応することに基づいて前記質量分析装置により取得された測定データを較正することと、を備える。
さらに好ましい実施形態では、前記マススペクトルにおいて、前記分子に対応するピークを、２８２１．１以上２８４９．６以下のｍ／ｚ値に対応するピークから選択する。
さらに好ましい実施形態では、前記アミノ酸配列に基づいたｍ／ｚ値は、２８３０．０以上２８５０．０以下である。
さらに好ましい実施形態では、前記分子に含まれるアミノ酸の少なくとも一部が修飾を受けており、前記ピークが、前記アミノ酸配列および前記修飾に基づいたｍ／ｚ値に対応することに基づいて前記質量分析装置により取得された測定データを較正すること、を備える。
さらに好ましい実施形態では、前記試料は、前記分子を産生する微生物、または前記微生物から調整した試料である。
さらに好ましい実施形態では、前記微生物は、大腸菌である。
さらに好ましい実施形態では、前記微生物は、配列番号１のアミノ酸配列を有する前記分子の発現が増幅する遺伝子操作を受けた微生物である。
本発明の好ましい実施形態による微生物の識別方法は、上述の較正方法により較正された前記測定データに基づいて、前記質量分析装置により取得されたマススペクトルを較正することと、較正された前記マススペクトルに基づいて、微生物を識別することと、を備える。
本発明の好ましい実施形態による質量分析装置は、ｍ／ｚ値に基づいてイオンを分離する質量分離部と、前記質量分離部で分離されたイオンを検出する検出部と、前記検出部が検出したイオンに基づいてマススペクトルを作成するマススペクトル作成部と、前記マススペクトルにおいて、配列番号１のアミノ酸配列を有する分子に対応するピークを決定し、前記ピークが、前記アミノ酸配列に基づいたｍ／ｚ値に対応することに基づいて前記検出部の検出により取得された測定データを較正する較正部と、を備える。
本発明の好ましい実施形態による質量分析装置の較正用試薬は、配列番号１のアミノ酸配列を有する分子を備える。
本発明の好ましい実施形態によるプログラムは、質量分析装置により取得された、配列番号１のアミノ酸配列を有する分子を含む試料の第１マススペクトルから、前記分子に対応するピークを選択し、前記ピークが、前記アミノ酸配列に基づいたｍ／ｚ値に対応することに基づいて前記質量分析装置により取得された測定データを較正する較正処理を処理装置に行わせる。
さらに好ましい実施形態では、前記較正処理は、前記質量分析装置により取得された、前記分子を産生する微生物または前記微生物から調整された試料の第２マススペクトルを較正し、前記プログラムは前記処理装置に、前記第２マススペクトルと、データベース上の複数の微生物のマススペクトルとを比較した結果に基づいて、前記試料がいずれの種類の微生物から調整されたものかを識別する識別処理を行わせる。
本発明の好ましい実施形態による質量分析装置の較正用形質転換体は、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクターを含む。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、約４３００以下のｍ／ｚの範囲でも精度よく質量分析装置を較正することができ、より精密な質量分析が実現される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、一実施形態の較正方法を説明するための図であり、（Ａ）は較正曲線の一例を示す図であり、（Ｂ）はマススペクトルの一例を示す図である。
【図２】図２は、一実施形態の較正方法に係る分析装置の概略構成を示す図である。
【図３】図３は、一実施形態の較正方法を含む微生物の識別方法の流れを示すフローチャートである。
【図４】図４は、ピークに対応する分子を二段階の質量分離（ＭＳ／ＭＳ）の後に検出して得たマススペクトルを示す図である。
【図５】図５は、ピークに対応する分子をＭＳ／ＭＳにより同定した結果を示す図である。
【図６】図６は、一実施形態の較正方法に係るプログラムを説明するための図であるである。
【図７】図７は、従来の較正方法を説明するための図であり、（Ａ）は較正曲線の一例を示す図であり、（Ｂ）はマススペクトルの一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明する。本実施形態の較正方法は、配列表の配列番号１に示された、大腸菌に含まれるアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．１１：ｐａｎＤ）のβ鎖のアミノ酸配列(Met Ile Arg Thr Met Leu Gln Gly Lys Leu His Arg Val Lys Val Thr His Ala Asp Leu His Tyr Glu Gly)を有し、既知の分子量を有する分子（以下、ｐａｎＤβ鎖と呼ぶ）を測定することにより、質量分析の結果取得した測定データの較正を行うものである。
【００１４】
図１（Ａ）は、図１（Ｂ）に示された、微生物に含まれるタンパク質のマススペクトルＭＳ０に基づいて、本実施形態の較正方法により作成された較正曲線ＣＣの一例を示した図である。図１（Ａ）（Ｂ）の横軸、縦軸は図７（Ａ）（Ｂ）とそれぞれ同様のものを示す。配列番号１のアミノ酸配列に基づくと、アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼのβ鎖（ｐａｎＤβ鎖）の一価イオン［Ｍ＋Ｈ］＋はｍ／ｚ値２８３５．３５を有する。本実施形態の較正方法では、ｍ／ｚ値が２８３５．３５の近傍の所定の範囲内にあるピークＰ０を、ｐａｎＤβ鎖に対応するピーク、すなわちｍ／ｚが２８３５．３５の理論値に対応するピークとし、ピークＰ０の実測値と理論値に基づいて較正曲線ＣＣを作成する。
【００１５】
図１では、較正曲線ＣＣを示すグラフ上に、ピークＰ０の実測値と理論値に基づいてプロットされた、基準となる点（基準点）Ｃ０が示されている。基準点Ｃ０およびリボソームタンパク質に対応するピークについての基準点Ｃ１〜Ｃ６を用いて較正曲線ＣＣが作成される。
なお、図１では、７つの基準物質に対応するピーク、Ｐ０〜Ｐ６および基準点Ｃ０〜Ｃ６を用いて較正曲線ＣＣを作成しているが、所望のｍ／ｚの領域に較正曲線が得られれば基準物質の数は特に限定されない。また、基準物質としては、リボソームタンパク質以外の基準物質を用いてもよい。
【００１６】
以下では、本実施形態の較正方法を用いた分析の一例として、質量分析装置による微生物の識別方法を説明するが、本実施形態の較正方法は、ｍ／ｚ値が約４３００以下の領域において較正曲線を作成する方法として、微生物の識別以外にも適宜用いることができる。
【００１７】
図２は、質量分析装置１の概略構成を示す図である。質量分析装置１は、測定部１００と、制御部４０とを備える。
なお、制御部４０の機能の一部または全部は、測定部１００とは物理的に離れた電子計算機、サーバ等に配置してもよい。
【００１８】
測定部１００は、試料由来のタンパク質イオンＳを生成するイオン化部１０と、イオン加速部２１と、質量分離部２２と、検出部３０とを備える。測定部１００により測定される試料は、識別対象試料と、質量分析装置１の較正のための較正用試料とを含む。識別対象試料は、菌種（属名および種形容語）等が未知であって識別の対象となっている微生物または当該微生物から調整した試料である。較正用試料は、配列番号１のアミノ酸配列に対応するｐａｎＤβ鎖を産生する大腸菌等の微生物、または当該微生物から調整した試料を含む。イオン化部１０で生成されたタンパク質イオンＳの移動を矢印Ａ１で模式的に示した。
【００１９】
制御部４０は、入力部４１と、通信部４２と、記憶部４３と、出力部４４と、処理部５０とを備える。処理部５０は、装置制御部５１と、マススペクトル作成部５２と、較正部５３と、識別部５４とを備える。測定部１００の検出部３０からのタンパク質イオンＳの検出信号の流れを矢印Ａ２で模式的に示した。装置制御部５１による測定部１００の制御を矢印Ａ３で模式的に示した。
【００２０】
測定部１００のイオン化部１０は、試料プレートを支持する不図示の試料プレートホルダと、試料プレート上にレーザ光を照射する不図示のレーザ装置を備えるイオン源を備え、試料成分をマトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法によりイオン化する。
なお、試料のイオン化の方法としては、ＭＡＬＤＩ法以外にもエレクトロスプレー（ＥＳＩ）法等の任意のソフトイオン化法を用いることができる。ＥＳＩ法によりイオン化を行う場合、質量分析装置１が液体クロマトグラフをさらに備え、液体クロマトグラフで分離された試料成分をイオン化部１０がイオン化する構成にすると、高い分離能を得ることができるため好ましい。
【００２１】
培地で培養されたｐａｎＤβ鎖を発現する微生物（以下、較正用微生物と呼ぶ）は、培地から取り出され、試料プレートに較正用試料として配置される。較正用微生物を直接試料プレートに配置せず、較正用微生物からタンパク質を抽出してから試料プレートに配置する場合は、較正用微生物からギ酸等を用いてタンパク質を抽出した後、抽出液を試料プレートに較正用試料として配置する。
【００２２】
菌種等が未知であって識別を行う対象となる微生物（以下、識別対象微生物と呼ぶ）も、培地から取り出され、試料プレートに識別対象試料として配置される。識別対象微生物を直接試料プレートに配置せず、識別対象微生物からタンパク質を抽出してから試料プレートに配置する場合は、識別対象微生物からギ酸等を用いてタンパク質を抽出した後、抽出液を試料プレートに識別対象試料として配置する。識別対象試料は、上記試料プレート上の、ｐａｎＤβ鎖を含む試料が配置された位置とは異なる位置に配置される(外部標準法)。また、ｐａｎＤβ鎖を含む試料が配置された位置と同じ位置に配置されてもよい(内部標準法)。この場合、識別対象試料を調整する際にｐａｎＤβ鎖が混合されて調整される。
【００２３】
試料プレートに較正用試料および識別対象試料が配置された後、これらの試料には、マトリックスが添加され、乾燥させられる。その後、試料プレートはイオン化部１０の真空容器内の試料プレートホルダに設置される。マトリックスの種類は特に限定されないが、タンパク質試料を効率よくイオン化する観点からシナピン酸またはα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）等を用いることが好ましい。
【００２４】
イオン化部１０は、試料プレートが設置された真空容器を減圧した後、レーザ光を試料プレート上の各試料に照射して順次イオン化を行う。レーザ光を照射するレーザ装置の種類は、選択したマトリックスに吸収される光を発振することができれば特に限定されず、例えばマトリックスがシナピン酸またはＣＨＣＡを含む場合には、Ｎ２レーザ（波長３３７ｎｍ）等を好適に用いることができる。イオン化部１０でイオン化されたタンパク質イオンＳは、不図示の引出電極等による電場により引き出され、イオン加速部２１に導入される。
【００２５】
イオン加速部２１は、加速電極２１０を備え、導入されたタンパク質イオンＳを加速させる。加速されたタンパク質イオンＳの流れは、不図示のイオンレンズにより適宜収束されて質量分離部２２に導入される。
【００２６】
質量分離部２２は、フライトチューブ２２０を備え、それぞれのタンパク質イオンＳがフライトチューブ２２０の内部を飛行する際の、飛行時間の違いよりタンパク質イオンＳを分離する。
なお、図２ではリニア型のフライトチューブ２２０が示されているが、リフレクトロン型やマルチターン型等でもよい。較正用試料および識別対象試料に含まれるタンパク質イオンＳを分離して検出することができれば、質量分析の方法は特に限定されない。
【００２７】
検出部３０は、マルチチャンネルプレート等のイオン検出器を備え、質量分離部２２で分離されたタンパク質イオンＳを検出し、検出部３０に入射したイオンの数に応じた強度の検出信号を出力する。検出部３０から出力された検出信号は、制御部４０の処理部５０に入力される。
【００２８】
制御部４０の入力部４１は、マウス、キーボード、各種ボタンおよび／またはタッチパネル等の入力装置を含んで構成される。入力部４１は、測定部１００の動作の制御に必要な情報、および処理部５０の行う処理に必要な情報等を、ユーザから受け付ける。
【００２９】
制御部４０の通信部４２は、インターネット等の無線や有線接続により通信可能な通信装置を含んで構成される。通信部４２は、識別部５４の識別処理に必要なデータを受信したり、識別部５４の識別結果等の処理部５０が処理したデータを送信したり、適宜必要なデータを送受信する。
【００３０】
制御部４０の記憶部４３は、不揮発性の記憶媒体を備える。記憶部４３は、較正部５４が作成した較正曲線ＣＣ、マススペクトル作成部５２が作成したマススペクトル、識別部５４が識別を行う際に比較対象とする各微生物種のマススペクトル、測定部１００から出力された測定データおよび処理部５０が処理を実行するためのプログラム等を記憶する。
【００３１】
制御部４０の出力部４４は、液晶モニタ等の表示装置やプリンター等を含んで構成され、測定部１００の測定に関する情報や、識別部５４の識別結果等を、表示装置に表示したり、紙媒体に印刷したりする。
【００３２】
制御部４０の処理部５０は、ＣＰＵ等のプロセッサを含んで構成され、分析装置１を制御する動作の主体として機能する。処理部５０は、記憶部４３等に記憶されたプログラムを実行することにより各種処理を行う。
【００３３】
処理部５０の装置制御部５１は、入力部４１から入力された測定条件に関するデータに基づいて、測定部１００の動作を制御する。
【００３４】
処理部５０のマススペクトル作成部５２は、検出部３０が検出したタンパク質の検出量と、当該タンパク質の飛行時間とを含む測定データから、較正曲線ＣＣに基づいて飛行時間をｍ／ｚ値に換算し、各ｍ／ｚ値に対応する検出量を示すマススペクトルＭＳを作成する。較正曲線ＣＣが作成されていない場合、マススペクトル作成部５２は、予め記憶部４３に記憶されていた較正曲線に従って、較正用試料を測定した未較正のマススペクトルＭＳ０を作成する。
【００３５】
較正部５３は、未較正のマススペクトルＭＳ０から、ｐａｎＤβ鎖に対応するピークを選択する。較正部５３は、ｐａｎＤβ鎖の一価イオン［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚの理論値２８３５．３５を中心に５０００ｐｐｍ（０．５％）の質量の誤差範囲を考慮し、マススペクトルＭＳ０中の２８２１．１以上２８４９．６以下のｍ／ｚ値の範囲に存在するピークを、ｐａｎＤβ鎖に対応するピークとして選択する。
【００３６】
較正部５３がマススペクトルＭＳ０からｐａｎＤβ鎖に対応するピークを選択する際の質量の誤差範囲は、較正用試料および識別対象試料を質量分析する際の精度に応じて適宜増減される。当該精度が高ければ高い程、質量の誤差範囲を狭くすることが好ましい。例えば、較正部５３は、ｐａｎＤβ鎖の一価イオン［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚの理論値２８３５．３５を中心に２０００ｐｐｍ（０．２％）の質量の誤差範囲を考慮し、マススペクトルＭＳ０中の２８２９．６以上２８４１．１以下のｍ／ｚ値の範囲に存在するピークを、ｐａｎＤβ鎖に対応するピークとして選択することができる。
【００３７】
較正部５３は、マススペクトルＭＳ０において、上記の質量の誤差範囲に複数のピークが有る場合、ｍ／ｚ値が２８３５．３５に最も近いピークや、ピーク強度または、ピークに対応する面積であるピーク面積が最も大きいピークをｐａｎＤβ鎖に対応するピークとして選択することができる。較正部５３は、ピーク強度やピーク面積の算出の際には、スムージング等の公知のノイズを低減する処理を行って算出することが好ましい。
【００３８】
較正部５３は、マススペクトルＭＳ０においてｐａｎＤβ鎖に対応するピークを選択したら、当該ピークが２８３５．３５のｍ／ｚ値に対応することに基づいて、較正曲線ＣＣを作成する。
【００３９】
なお、質量分析装置１の質量分解能が高い場合は、ｐａｎＤβ鎖に対応するピークはｐａｎＤβ鎖の各同位体に対応するそれぞれのピークに分解される等、ｍ／ｚ値にばらつきが生じ得る。ｐａｎＤβ鎖の各同位体の相対質量に基づく、一価イオン［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ値は２８３３．４９、２８３４．５０、２８３５．５１、２８３６．５３、２８３７．５４、２８３８．５３、２８３９．５５、２８４０．５４、２８４１．５５、２８４２．５６、２８４３．５７および２８４４．５７等となる。この点を鑑み、較正部５３は、選択したｐａｎＤβ鎖に対応するピークが、これらのいずれかのｍ／ｚ値に対応することに基づいて、較正曲線ＣＣを作成することができる。較正部５３は、選択したｐａｎＤβ鎖に対応するピークが、ｐａｎＤβ鎖の最も存在量の多い同位体の一価イオン［Ｍ＋Ｈ］＋の相対質量２８３４．５０に対応することに基づいて、較正曲線ＣＣを作成することが好ましい。
【００４０】
また、較正部５３は、質量分析におけるばらつきにより各ピーク同士が重なった場合も考慮し、選択したｐａｎＤβ鎖に対応するピークが、２８３０．０以上２８５０．０以下のいずれかのｍ／ｚ値に対応することに基づいて、較正曲線ＣＣを作成することができる。さらに、較正部５３は、選択したｐａｎＤβ鎖に対応するピークが、２８３３．０以上２８３８．０以下のいずれかのｍ／ｚ値に対応することに基づいて、較正曲線ＣＣを作成することが好ましい。この範囲は、ｐａｎＤβ鎖の主な同位体に対応する一価イオン［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ値をカバーしているため、この範囲からｍ／ｚの理論値を選択することで質量分解能が様々に変化しても対応し得ると考えられる。
【００４１】
較正部５３は、マススペクトルＭＳ０におけるｐａｎＤβ鎖に対応するピークＰ０（図１）および、基準物質に対応するピークＰ１〜Ｐ６について、それぞれ対応するｍ／ｚの実測値と理論値のずれを算出する。較正部５３は、当該ずれとｍ／ｚ値との関係を示す基準点Ｃ０〜Ｃ６に基づいて較正曲線ＣＣを定める。較正部５３は、図１（Ａ）に示すように基準点Ｃ０〜Ｃ６をｍ／ｚの小さい順番（または大きい順番）に結んで較正曲線ＣＣを作成する。
なお、基準点Ｃ０〜Ｃ６を用いて較正曲線ＣＣを作成する方法は特に限定されず、例えば各ピークＰ０〜Ｐ６のノイズ量等に応じて信頼度を設定し、この信頼度に基づいて定まる基準点Ｃ０〜Ｃ６の近傍の所定の範囲に較正曲線ＣＣが通過するようにしたり等、適宜様々な方法を用いることができる。
【００４２】
識別部５４は、識別対象微生物について、較正曲線ＣＣに基づいてマススペクトル作成部５２が作成したマススペクトルＭＳと、記憶部４３に記憶されたデータベース中の、過去に測定された複数の菌種の微生物のマススペクトルとの比較を行う。
なお、複数の菌種の微生物のマススペクトルは、質量分析装置１の遠隔に配置されたサーバに配置されていてもよい。また、識別部５４の行う処理は、遠隔に配置されたサーバで行われてもよい。
【００４３】
識別部５４は、データベース上のあるマススペクトルと、マススぺクトルＭＳとの類似度を算出する。識別部５４は、データベース上のマススペクトルに存在する、あるピークについて、マススペクトルＭＳに対応するピークが存在する場合、存在しない場合に比べて類似度を高くする。データベース上のマススペクトルの各ピークは、例えば当該ピークが対応する菌種の微生物のマススペクトルにおいてどの程度の頻度で観察されるかに応じて、重み付けされている。識別部５４は、データベース上のマススペクトルの一部または全部のピークについて、マススペクトルＭＳにも当該ピークが存在するか否かを判定し、上記重み付けに基づいて類似度を算出する。
【００４４】
識別部５４は、データベース上の複数の菌種の微生物のマススペクトルと、マススペクトルＭＳとの類似度を算出し、類似度の最も高い菌種を、識別対象微生物の属する菌種として同定する。識別部５４は、類似度の最も高い菌種の類似度が、所定の閾値未満の場合、識別対象微生物は、データベース上のいずれの菌種にも該当しないとする。当該所定の閾値は、例えば、互いに異なる菌種に属すものの、ＤＮＡの相同性が比較的高い複数の微生物のマススペクトルを比較した結果に基づいて設定することができる。
なお、識別部５４の識別処理の方法および記憶部４３のデータベースの構成は、マススペクトル同士がどの程度類似しているかを定量し、定量した数値等に基づいて識別対象微生物の分類についての判定を行うものであれば特に限定されない。
【００４５】
図３は、本実施形態の較正方法を含む微生物の識別方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ１００１において、ユーザは、配列番号１のアミノ酸配列を有する分子（ｐａｎＤβ鎖）を発現する微生物を、試料プレートに配置してマトリックスを添加する。ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３に進む。
【００４６】
ステップＳ１００３において、イオン化部１０は、試料プレート上の較正用微生物および識別対象微生物に順次レーザを照射し、これらの微生物由来のタンパク質をイオン化する。ステップＳ１００３が終了したら、ステップＳ１００５に進む。ステップＳ１００５において、質量分離部２２は、イオン化部１０がイオン化したタンパク質を質量分離する。ステップＳ１００５が終了したら、ステップＳ１００７に進む。
【００４７】
ステップＳ１００７において、検出部３０は、質量分離部２２が質量分離したタンパク質イオンＳを検出する。ステップＳ１００７が終了したら、ステップＳ１００９に進む。ステップＳ１００９において、マススペクトル作成部５２は、検出部３０が検出した較正用試料由来のタンパク質イオンＳのマススペクトルＭＳ０を作成し取得する。ステップＳ１００９が終了したら、ステップＳ１０１１に進む。
【００４８】
ステップＳ１０１１において、較正部５４は、マススペクトル作成部５２が取得したマススペクトルＭＳ０において、配列番号１のアミノ酸配列を有する分子に対応するピークＰ０を選択する。ステップＳ１０１１が終了したら、ステップＳ１０１３に進む。ステップＳ１０１３において、較正部５４は、選択したピークＰ０が、配列番号１のアミノ酸配列に基づいたｍ／ｚ値に対応することに基づいて較正曲線ＣＣを作成する。ステップＳ１０１３が終了したら、ステップＳ１０１５に進む。
【００４９】
ステップＳ１０１５において、マススペクトル作成部５２は、識別したい微生物（識別対象微生物）に含まれるタンパク質のマススペクトルＭＳを較正曲線ＣＣに基づいて作成する。ステップＳ１０１５が終了したら、ステップＳ１０１７に進む。ステップＳ１０１７において、識別部５４は、較正曲線ＣＣに基づいて作成したマススペクトルＭＳと、データベース上の複数の微生物のマススペクトルとの比較を行い、比較した結果に基づいて識別したい微生物がいずれの種類の微生物かを識別する。ステップＳ１０１７が終了したら、ステップＳ１０１９に進む。
なお、識別する微生物の種類は、属、種が好ましいが、マススペクトルの差異に基づいて識別可能であれば特に限定されない。
【００５０】
ステップＳ１０１９において、出力部４４は、ステップＳ１０１７で識別した識別結果および／またはステップＳ１０１５で取得したマススペクトルＭＳ等を表示する。ステップＳ１０１９が終了したら、処理を終了する。
【００５１】
（大腸菌に含まれるタンパク質のマススペクトルにおける、ｍ／ｚ  ２８３５の近傍に存在するピークが配列番号１のアミノ酸配列を有する分子であることを示す実験例）
大腸菌に含まれるタンパク質を、四重極イオントラップおよび飛行時間型質量分析計を備えるＡｘｉｍａ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（株式会社島津製作所、京都、日本）を用いて質量分析した。大腸菌はLB培地で18時間培養し、遠心(5,000g、10分)して集菌した。集菌した大腸菌を蒸留水に再懸濁し、再び遠心で集菌した後に2.5% トリフルオロ酢酸、50% アセトニトリルで懸濁した。更に遠心して、その上清を大腸菌のタンパク質を含む試料とした。 この大腸菌由来のタンパク質を含む試料を試料プレートに配置し、ＭＡＬＤＩ法によりイオン化した後、四重極イオントラップにおいて、ｍ／ｚ  ２８３４を前駆イオンとし、分離した前駆イオンを衝突誘起解離（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＣＩＤ）により断片化して生成イオンを生成した。生成した生成イオンを飛行時間型質量分析計により質量分離して検出した。
【００５２】
図４は、質量分離により得られた生成イオンのマススペクトルを示す図である。図４に示した生成イオンのマススペクトルから、公知のソフトウェア（Ｍａｓｃｏｔ：Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．；ボストン、アメリカ合衆国）を用いた解析により前駆イオンのアミノ酸配列を導出した。
【００５３】
図５は、Ｍａｓｃｏｔによる解析結果を示す図である。領域Ｍ２には、横軸にデータの信頼度、縦軸に当該信頼度で同定されたタンパク質の数が示されている。領域Ｍ１の文章には、領域Ｍ２に示された横軸の値が５６を超える場合、ｐ値が０．０５以下で同一性が有意であることが記載されている。領域Ｍ２には、横軸の値が９８であり、実験例での前駆イオンと有意に同一なペプチドが一例あることが示されている。領域Ｍ３には、当該ペプチドのアミノ酸配列が表示されており、アミノ酸の一文字表記で“ＭＩＲＴＭＬＱＧＫＬＨＲＶＫＶＴＨＡＤＬＨＹＥＧ”であることが示されている。この一文字表記のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列に対応する。
【００５４】
上述の実施の形態によれば、次の作用効果が得られる。
（１）本実施形態の較正方法は、配列番号１のアミノ酸配列を有する分子ｐａｎＤβ鎖を含む較正用試料のマススペクトルＭＳ０を質量分析装置１により取得することと、マススペクトルＭＳ０において、ｐａｎＤβ鎖に対応するピークＰ０を選択することと、ピークＰ０が、配列番号１のアミノ酸配列に基づいたｍ／ｚ値に対応することに基づいて分析装置１により取得された測定データを較正することと、を備える。これにより、質量分析の測定データにおける約４３００よりも小さいｍ／ｚ値を正確に較正することができる。
【００５５】
（２）本実施形態の較正方法では、マススペクトルＭＳ０において、ｐａｎＤβ鎖に対応するピークＰ０を、２８２１．１以上２８４９．６以下のｍ／ｚ値に対応するピークから選択することができる。これにより、質量分析でのｍ／ｚ値のばらつきを考慮し、測定データにおける約４３００よりも小さいｍ／ｚ値を正確に較正することができる。
【００５６】
（３）本実施形態の較正方法において、アミノ酸配列に基づいたｍ／ｚ値（ｍ／ｚの理論値）は、２８３０．０以上２８５０．０以下とすることができる。これにより、ｐａｎＤβ鎖の一価イオンやその同位体の質量に基づいて、質量分析の測定データにおける約４３００よりも小さいｍ／ｚ値を正確に較正することができる。
【００５７】
（４）本実施形態の較正方法において、較正用試料は、ｐａｎＤβ鎖を産生する微生物、またはこの微生物から調整した試料である。これにより、微生物または微生物から調整した試料に対し識別等のために質量分析を行う場合、試料の調整方法が略同一であるためより正確な較正を行うことができる。
【００５８】
（５）本実施形態の較正方法において、較正用試料は、大腸菌または大腸菌から調整した試料である。これにより、大腸菌が発現する配列番号１のアミノ酸配列を有するｐａｎＤβ鎖を用いて、質量分析の測定データにおける約４３００よりも小さいｍ／ｚ値を正確に較正することができる。
【００５９】
（６）本実施形態に係る微生物の識別方法は、本実施形態の較正方法により較正された測定データに基づいて、質量分析装置１により取得されたマススペクトルＭＳを較正することと、較正されたマススペクトルＭＳに基づいて、識別対象微生物を識別することと、を備える。これにより、約４３００よりも小さいｍ／ｚ値についても正確に較正されたマススペクトルを用いて、正確に微生物の識別を行うことができる。
【００６０】
（７）本実施形態に係る質量分析装置１は、検出部３０が検出したタンパク質イオンＳに基づいてマススペクトルＭＳ０を作成するマススペクトル作成部５２と、マススペクトルＭＳ０において、配列番号１のアミノ酸配列を有する分子に対応するピークＰ０を決定し、ピークＰ０が、配列番号１のアミノ酸配列に基づいたｍ／ｚ値に対応することに基づいて検出部３０の検出により取得された測定データを較正する較正部５３と、を備える。これにより、質量分析の測定データにおける約４３００よりも小さいｍ／ｚ値を正確に較正することができる。
【００６１】
次のような変形も本発明の範囲内であり、上述の実施形態と組み合わせることが可能である。以下の変形例において、上述の実施形態と同様の構造、機能を示す部位等に関しては、同一の符号で参照し、適宜説明を省略する。
（変形例１）
上述の実施形態では、較正用試料に含まれるｐａｎＤβ鎖が、翻訳後修飾を受けていないものとして、対応するｍ／ｚの理論値を算出して較正を行った。しかし、ｐａｎＤβ鎖に生じる翻訳後修飾を考慮して、対応するｍ／ｚの理論値を算出して較正を行ってもよい。
【００６２】
較正部５３は、ｐａｎＤβ鎖に生じ得る、メチオニンの酸化またはリシン若しくはアルギニンのメチル化等の翻訳後修飾によって生じる分子量の変化に基づいて、較正用試料のマススペクトルＭＳ０からｐａｎＤβ鎖に対応するピークＰ０を選択することができる。較正部５３は、例えば、ｐａｎＤβ鎖のｎ個のメチオニンが酸化されそれぞれメチオスルホキシドに変化した場合、ｐａｎＤβ鎖の分子量が１６．００×ｎ増加することに基づいて、ピークＰ０を選択する。較正部５３は、例えば、ｐａｎＤβ鎖にｎ個のメチル基が付加した場合、ｐａｎＤβ鎖の分子量が１５．０３×ｎ増加することに基づいて、ピークＰ０を選択する。
【００６３】
較正部５３は、ｐａｎＤβ鎖に生じ得る、メチオニンの酸化またはリシン若しくはアルギニンのメチル化等の翻訳後修飾によって生じる分子量の変化に基づいて、マススペクトルＭＳ０において選択したｐａｎＤβ鎖に対応するピークＰ０に対応するｍ／ｚの理論値を算出することができる。較正部５３は、例えば、ｐａｎＤβ鎖のｎ個のメチオニンが酸化されメチオスルホキシドに変化した場合、ｐａｎＤβ鎖の分子量が１６．００×ｎ増加することに基づいて、選択したピークＰ０に対応するｍ／ｚの理論値を算出する。較正部５３は、例えば、ｐａｎＤβ鎖にｎ個のメチル基が付加した場合、ｐａｎＤβ鎖の分子量が１５．０３×ｎ増加することに基づいて、選択したピークＰ０に対応するｍ／ｚの理論値を算出する。較正部５３は、これらの理論値に基づいて較正曲線ＣＣを作成することができる。
【００６４】
本変形例の較正方法は、ｐａｎＤβ鎖に含まれるアミノ酸の少なくとも一部が修飾を受けており、ピークＰ０が、配列番号１のアミノ酸配列およびこの修飾に基づいたｍ／ｚ値に対応することに基づいて質量分析装置１により取得された測定データを較正する。これにより、較正用微生物において発現しているｐａｎＤβ鎖が修飾を受けている場合にも、質量分析の測定データにおける約４３００よりも小さいｍ／ｚ値を正確に較正することができる。
【００６５】
（変形例２）
上述の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列を有する分子を含む微生物または当該微生物から調整された試料を較正用試料としたが、化学合成により得られた、配列番号１のアミノ酸配列を有する分子を含む試料を較正用試料としてもよい。また、ユーザがこのような較正用試料を容易に作成できるようにするための質量分析装置用の較正用試薬として、化学合成により得られた、配列番号１のアミノ酸配列を有する分子を含む較正用試薬を提供することができる。
【００６６】
当該較正用試薬には、適宜、分子量が既知のリボソームタンパク質または任意のタンパク質等が含まれることが好ましい。これにより、多数のキャリブラントで較正することになり、較正の範囲と精度および確度が向上する。これは、本件の目的である、キャリブラントの数を増やしてこのような効果を得ることに合致する。
なお、較正用試薬に含まれる配列番号１のアミノ酸配列を有する分子は、微生物に含まれるタンパク質を精製して取得したものでもよい。
【００６７】
（変形例３）
上述の実施形態では、較正部５３は、配列番号１のアミノ酸配列を有する分子の一価イオンに対応するピークＰ０を選択し、当該一価イオンに対応するｍ／ｚの理論値に基づいて較正曲線ＣＣを作成した。しかし、較正部５３は、配列番号１のアミノ酸配列を有する分子の二価以上のイオンに対応するピークを選択し、当該イオンに対応するｍ／ｚの理論値に基づいて較正曲線を作成してもよい。
【００６８】
（変形例４）
質量分析装置１の情報処理機能を実現するためのプログラムをコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録して、この記録媒体に記録された、上述した較正および微生物の識別の処理およびそれに関連する処理の制御に関するプログラムをコンピュータシステムに読み込ませ、実行させてもよい。なお、ここでいう「コンピュータシステム」とは、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）や周辺機器のハードウェアを含むものとする。また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、光ディスク、メモリカード等の可搬型記録媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置のことをいう。さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムを送信する場合の通信線のように、短時間の間、動的にプログラムを保持するもの、その場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリのように、一定時間プログラムを保持するものを含んでもよい。また上記のプログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであってもよく、さらに前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせにより実現するものであってもよい。
【００６９】
また、パーソナルコンピュータ（以下、ＰＣと記載）等に適用する場合、上述した制御に関するプログラムは、ＣＤ−ＲＯＭ等の記録媒体やインターネット等のデータ信号を通じて提供することができる。図６はその様子を示す図である。ＰＣ９５０は、ＣＤ−ＲＯＭ９５３を介してプログラムの提供を受ける。また、ＰＣ９５０は通信回線９５１との接続機能を有する。コンピュータ９５２は上記プログラムを提供するサーバーコンピュータであり、ハードディスク等の記録媒体にプログラムを格納する。通信回線９５１は、インターネット、パソコン通信などの通信回線、あるいは専用通信回線などである。コンピュータ９５２はハードディスクを使用してプログラムを読み出し、通信回線９５１を介してプログラムをＰＣ９５０に送信する。すなわち、プログラムをデータ信号として搬送波により搬送して、通信回線９５１を介して送信する。このように、プログラムは、記録媒体や搬送波などの種々の形態のコンピュータ読み込み可能なコンピュータプログラム製品として供給できる。
【００７０】
上述した情報処理機能を実現するためのプログラムとして、質量分析装置１により取得された、配列番号１のアミノ酸配列を有する分子を含む試料の第１マススペクトル（マススペクトルＭＳ０）から、当該分子に対応するピークＰ０を選択し、ピークＰ０が、配列番号１のアミノ酸配列に基づいたｍ／ｚ値に対応することに基づいて分析装置１により取得された測定データを較正する較正処理を処理装置に行わせるプログラムが含まれる。これにより、質量分析の測定データにおける約４３００よりも小さいｍ／ｚ値を正確に較正することができる。
【００７１】
本変形例のプログラムにおいて、上記較正処理は、質量分析装置１により取得された、ｐａｎＤβ鎖を産生する微生物または当該微生物から調整された試料の第２マススペクトル（マススペクトルＭＳ）を較正し、本変形例のプログラムは処理装置に、第２マススペクトルと、データベース上の複数の微生物のマススペクトルとを比較した結果に基づいて、前記試料がいずれの種類の微生物から調整されたものかを識別する識別処理と、を行わせる。これにより、質量分析の測定データにおける約４３００よりも小さいｍ／ｚ値について正確に較正されたマススペクトルに基づいて、正確に微生物を識別することができる。
【００７２】
（変形例５）
上述の実施形態において、較正用微生物として、遺伝子操作によりｐａｎＤβ鎖の発現を増幅させた形質転換体を用いてもよい。これにより、較正用試料のマススペクトルＭＳ０におけるピークＰ０の強度が大きくなり、より明瞭にピークＰ０を同定することができる。微生物の識別においては、識別対象微生物を試料プレートに配置してイオン化を行う場合、本変形例の較正用微生物を試料プレートに配置してイオン化を行うと測定条件を合わせられるのでより正確に較正を行うことができる。
【００７３】
較正用微生物の作成においては、配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子を、作動可能となるようにプロモータに連結して挿入し、発現ベクターを作成する。例えば、導入遺伝子として、大腸菌(K12株)のPanD遺伝子(NCBI gene ID:945686)の全長若しくはタンパク質のコード領域を含む一部を用いる。または、配列番号１のアミノ酸配列を有する、大腸菌のPanD遺伝子と９０％以上の相同性をもつ他の菌の遺伝子も用いることができる。この遺伝子をpUC系プラスミドベクターに組み込む。得られた組換えベクターを、大腸菌のＪＭ１０９株などを宿主として遺伝子導入する。得られた形質転換体を培地において培養することで作成することができる。遺伝子が組み込まれたことはβ-Ｄ-ガラクトシダーゼの活性消失を指標とする青白選抜などの方法が用いて確認することができる。また、ＭＡＬＤＩ-ＭＳによる測定で、ｍ／ｚの値が２８３５付近となるピークを観察することで確認することも可能である。
【００７４】
本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。
【符号の説明】
【００７５】
１…分析装置、１０…イオン化部、２１…イオン加速部、２２…質量分離部、３０…検出部、４０…制御部、５０…処理部、５１…装置制御部、５２…マススペクトル作成部、５３…較正部、５４…識別部、１００…測定部、Ｃ０…配列番号１のアミノ酸配列を有する分子に対応する基準点、Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３，Ｃ４，Ｃ５，Ｃ６…基準点、ＣＣ…較正曲線、ＣＣ１…従来の較正曲線、Ｐ０…配列番号１のアミノ酸配列を有する分子に対応するピーク、Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４，Ｐ５，Ｐ６…基準物質に対応するピーク、Ｓ…タンパク質イオン。
【図１】
2019090654.tif 000003
【図２】
2019090654.tif 000004
【図３】
2019090654.tif 000005
【図４】
2019090654.tif 000006
【図５】
2019090654.tif 000007
【図６】
2019090654.tif 000008
【図７】
2019090654.tif 000009
【配列表】
2019090654000001.app