(57)【要約】本発明は、各種の白血病及びリンパ腫の存在に関連する染色体変化の検出方法に関する。この方法は、個体からリンパ球を含む生体サンプルを得るステップ、そのサンプルを分析して、RP11-147H23あるいはRP11-327P2内に存在する第13番染色体領域に対応する第13番染色体領域における染色体欠失を検出するステップを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体がリンパ芽球性白血病(ALL)あるいは慢性リンパ球性白血病(CLL)に罹患している可能性を有するか診断する方法であって、 
ａ）リンパ球を含む骨髄あるいは血液のサンプルを採取するステップ、及び
ｂ）前記リンパ球において、バクテリア人工染色体(BAC)のRP11-147H23あるいはRP11-327P2に存在している第13番染色体配列に対応する、第13番染色体の13q14領域の全てあるいは一部が欠失しているかどうかを検出するステップを含み、
ステップｂ）で検出された欠失は、前記個体がCLLあるいはALLに罹患している可能性を表す
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
BACのRP11-147H23あるいはRP11-327P2に存在している第13番染色体配列に対応する第13番染色体の13q14領域の全てあるいは一部が欠失しているかどうかの検出が、蛍光in-situハイブリダイゼーションによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ステップｂ）が、テスト・プローブ及びコントロール・プローブのハイブリダイゼーションを測定するステップを含んでおり、
前記テスト・プローブは、BACのRP11-147H23あるいはRP11-327P2に存在している第13番染色体配列内の配列に対応し、
前記コントロール・プローブは、第13番染色体内の配列であって、BACのRP11-147H23及びRP11-327P2に存在している第13番染色体の前記領域の外の配列に対応し、
前記細胞内における前記テスト・プローブ及びコントロール・プローブ由来の２組の共-局在化シグナルは欠失の非存在を表し、１組の共-局在化シグナルは欠失の存在を表す
ことを特徴とする請求項１に記載の方法
【請求項４】
前記テスト・プローブ及びコントロール・プローブのハイブリダイゼーションを、蛍光in-situハイブリダイゼーション(FISH)によって測定する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記テスト・プローブ及びコントロール・プローブを、蛍光色素結合ヌクレオチドで標識する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記蛍光色素結合ヌクレオチドが、FITC-標識ヌクレオチド、テキサス・レッド-結合ヌクレオチドまたはローダミン-結合ヌクレオチドからなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記コントロール・プローブが、BACのRP11-215B15またはRP11-131F1である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
ヒト第13番染色体の13q14領域における欠失の存在あるいは非存在を検出する方法であって、
ａ）リンパ球を含む骨髄あるいは血液由来の細胞サンプルを得るステップ、及び
ｂ）テスト・プローブ及びコントロール・プローブのハイブリダイゼーションを測定するステップを含み、
前記テスト・プローブは、BACのRP11-147H23あるいはRP11-327P2に存在する第13番染色体配列内の配列に対応し、
前記コントロール・プローブは、第13番染色体上の配列であって、BACのRP11-147H23及びRP11-327P2に存在している第13番染色体の前記領域の外の配列に対応し、
前記細胞内における前記テスト・プローブ及びコントロール・プローブ由来の２組の共-局在化シグナルは前記リンパ球内の欠失の非存在を表し、１組の共-局在化シグナルは前記リンパ球内の欠失の存在を表す
ことを特徴とする方法。
【請求項９】
前記テスト・プローブ及びコントロール・プローブのハイブリダイゼーションを、蛍光in-situハイブリダイゼーション(FISH)によって測定する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記テスト・プローブ及びコントロール・プローブを、蛍光色素結合ヌクレオチドで標識する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記蛍光色素結合ヌクレオチドが、FITC-標識ヌクレオチド、テキサス・レッド-結合ヌクレオチドまたはローダミン-結合ヌクレオチドからなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記コントロール・プローブが、BACのRP11-215B15またはRP11-131F1である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
個体がALLあるいはCLLに罹患している可能性を有するか診断する方法であって、 
ａ）前記個体からリンパ球を含む血液あるいは骨髄細胞を得るステップ、
ｂ）リンパ球の中に２つの完全なWDFY2遺伝子のコピーが存在するかどうか測定するステップを含み、
WDFY2遺伝子の完全なコピーが２つ未満であれば、前記個体がCLLに罹患していることが示唆される、
ことを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記ステップｂ）が、さらに
i）前記リンパ球からmRNAを単離するステップ、
ii）単離したmRNAをWDFY2mRNAの一部と相補的なプライマーでハイブリッド形成させるステップ、
iii）逆転写を利用して一本鎖cDNAを合成するステップ、
iv）ステップiii)でcDNAが存在すれば、ポリメラーゼ連鎖反応法及び前記cDNAの逆鎖と相補的な一組のプライマーを用いて、ステップiii)のcDNAを増幅するステップ、
v）増幅されたcDNAの存在あるいは非存在を検出するステップを含み、
増幅cDNAの非存在が、前記リンパ球に存在するWDFY2遺伝子の完全なコピーが２つ未満であることを示唆する
ことを特徴する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップii)の前記プライマーが、配列番号１及び配列番号２からなる群から選択される配列を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップiii)の前記プライマーが、配列番号１及び配列番号２である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
細胞内に２つの完全なWDFY2遺伝子のコピーが存在するかどうか測定するために、
第１プローブ及び第２プローブのハイブリダイゼーションを測定するステップを含み、  前記第１プローブは、WDFY2遺伝子の第１エキソン内の配列に対応し、前記第２プローブは、WDFY2遺伝子の第２エキソン内の配列に対応し、
共-局在化していない一組のシグナルは、WDFY2遺伝子の完全なコピーが２つ未満存在することを示唆する、
ことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１及び第２プローブのハイブリダイゼーションを、蛍光in-situハイブリダイゼーション(FISH)によって測定する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１及び第２プローブを、蛍光色素結合ヌクレオチドで標識する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記蛍光色素結合ヌクレオチドが、FITC-標識ヌクレオチド、テキサス・レッド-結合ヌクレオチドまたはローダミン-結合ヌクレオチドからなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１及び第２プローブが、互いに異なるものであって、
11I11、35P6、2N18、2N16、2K1及び12L24からなる群から選択されるコスミドの群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
個体がALLあるいはCLLに罹患している可能性があるか診断する際に使用されるキットであって、
蛍光色素結合ヌクレオチドをそれぞれ含んでいるテスト・プローブ及びコントロール・プローブを有し、
前記テスト・プローブは、BACのRP11-147H23あるいはRP11-327P2に存在する第13番染色体領域に対応する配列である第13番染色体の13q14領域の一部と相補的なヌクレオチド配列を有し、
前記コントロール・プローブは、BACのRP11-147H23及びRP11-327P2に存在する第13番染色体の前記領域に対応する前記配列外のヒト第13番染色体領域に対応するヌクレオチド配列を有する
ことを特徴とするキット。
【請求項２３】
前記蛍光色素結合ヌクレオチドが、FITC-標識ヌクレオチド、テキサス・レッド-結合ヌクレオチドまたはローダミン-結合ヌクレオチドからなる、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
個体がALLあるいはCLLに罹患している可能性があるか診断する際に使用されるキットであって、
蛍光色素結合ヌクレオチドをそれぞれ含む第１プローブ及び第２プローブを含み、
前記第１プローブは、WDFY2遺伝子の第１エキソン内の配列に対応し、
前記第２プローブは、WDFY2遺伝子の第２エキソン内の配列に対応する
ことを特徴とするキット。
【請求項２５】
前記蛍光色素結合ヌクレオチドが、FITC-標識ヌクレオチド、テキサス・レッド-結合ヌクレオチドまたはローダミン-結合ヌクレオチドからなる、請求項２４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主にリンパ球増殖性疾患に関する。より詳しくは、そのような疾患に関連する染色体変化の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ細胞性慢性リンパ球性白血病(B-CLL)は、西洋諸国において最も一般的な白血病であり、その推定発生率は、一年あたり1/100,000である。それは、CD5マーカーを発現し、寿命の長い（撹乱したアポトーシスプログラムに起因する可能性がある）Ｂリンパ球のモノクロナール増殖を特徴とする。
【０００３】
疾患に関連する遺伝子変化がまだ特定されていないため、B-CLLの分子病態に関する現在の知識は限られている。特にB-CLLは、相互均衡型染色体転座と関連していない。従って、他の成熟Ｂ細胞悪性腫瘍における染色体転座に関与するプロトオンコジーン（サイクリンDl、BCL-2、BCL-6、PAX-5、及びc-MYCを含む）は、B-CLLでは主に変化していない。B-CLL症例のごく一部において、癌抑制遺伝子p53（染色体17p13上）の不活性化及びATM遺伝子（染色体11q22-23上）の欠失または変異が報告されているが、そのような病変は疾患の後期に観察され、初期の腫瘍原性イベントを代表しない。しかしながら、染色体レベルで、ヒトの第13番染色体の13q14領域は、複数の血液悪性腫瘍において非常に頻繁に失われることが知られている。染色体13q14欠失(患者の約50%)は、B-CLLに関係する最も一般的な染色体変化であり(Dohner等，J Mol Med. ; 77：266-281. 1999：Kalachikov等，Genomics.；42:369-377. 1997)、その後に染色体11qの構造異常(症例の19%)及び第12番染色体のトリソミー(15%)が続く。さらに第13番染色体の欠失は、細胞遺伝学的に検出可能な唯一の異常かもしれず、B-CLL発病において初期的な役割を果たしている。
【０００４】
同様に、13q14変化（主に欠失）は、急性白血病、多発性骨髄腫及びマントル細胞リンパ腫において頻繁に観察される。13q14の変化（サンプルの25〜40%）は、転帰の独立要因として統計的に有意な予後不良を伴う骨髄腫患者をもたらす(Zojer等、Blood 2000 95: 1925-30；Shaughnessy等、Blood 2000 96：1505-11)。第13番染色体の欠失が、意義不明の単クローン性γグロブリン血症(MGUS)から多発性骨髄腫への移行と関連することも示された。13q14の欠失はまた、マントル細胞リンパ腫症例の50%で観察される(Cuneo等、Blood 1999 93: 1372-80)。 
【０００５】
CLLサンプルの核型分析により、13q14で観察された欠失の特異性及び発生頻度が、病理学的意義を有することを示唆している、相対的に少ない染色体異常が同定された。いくつかのグループは、欠失の標的となった遺伝子あるいは遺伝子群を同定するために、ポジショナルクローニングを使用した。1Mb以上の領域が完全に配列決定され、特性が詳細に明らかになった(Bullrich等、Cancer Res 2001 61 : 6640-8；Migliazza等、Blood 2001 97 : 2098-2104)。いままでのところ、CLLの弧発性及び家族性の症例において、合計８つの遺伝子：Leu-l(BCMSあるいはEST70/Leu-1)，Leu2(ALT1あるいはIB4/Leu-2)，Leu5(CAR)，CLLD6, KPNA3，CLLD7，LOC51131(推定亜鉛フィンガープロテインNY-REN-34抗原)及びCLLD8が同定され、DNA及び／またはRNAレベルの変化がスクリーニングされた。 しかしながら、広範囲に及ぶヘテロ接合性欠失(LOH)、変異及び発現の研究を含む、詳細な遺伝子解析では、欠損した領域に位置する遺伝子のいずれかが、一貫して関与していることを実証することはできなかった。
【０００６】
マーカーD13S31及びRB1の間の13q14.3における最小限欠失領域の決定に伴い、ヘテロ接合性欠失(LOH)状態に対して多数の腫瘍を分析することが可能になり、ホモ接合型欠失が主にD13S25遺伝子座(Chapman等, Oncogene 1994 9: 1289-93)の周辺に集中することがじきに明らかになった。ホモ接合型欠失の観察は、13q14における重要遺伝子の機能の損失が、B-CLLの発展において重要であるということも実証した。多数の腫瘍のその後の解析は、ホモ接合型欠失の観察を確認し、最小限欠失領域の範囲の絞り込みを可能にした。(Bullrich等, Blood 1996, 88 : 3109-15; Bouyge-Moreau等, Genomics 1997,46 :183-90)。 
【０００７】
絞り込まれつつある臨界領域を定義することを試みるレポートにはいくつかのバリエーションがあるが、これらは、これらの症例における独特の再配列に起因している可能性のある単一腫瘍での観察に依存していることが多く、白血病誘発と無関係かもしれない。現在、臨界領域は、約700kbの領域内にあり、マーカーD13S319及びD13S25によって結合されていると理解されている。
【０００８】
それに応じて、大がかりなスクリーニングが、様々なアプローチを利用して行われた（そのうち、FISHは最も重要なアプローチの一つであり、マーカーRB1，D13S25及びD13S319に特異的なゲノムプローブが使用されている[Vysis社などの会社から現在市販されている]）。しかしながら、これらのスクリーニングで使用された遺伝子及び／またはプローブは、いずれも、CLLにおいて13q14欠失の検出率100%を達成し得なかった。13q14の同じ領域／遺伝子は、多発性骨髄腫及びマントル細胞リンパ腫で研究されたが、13q14に位置する潜在的な癌抑制遺伝子に対して一貫性のある観察結果は得られなかった。
【０００９】
その後、特有のt(12；13)(p12；ql4)転座(Meyer等, Leukemia 2001 15(9): 1471-4)を内部に有する患者のサンプルの一つから得た細胞株を利用し、急性白血病における13q切断点の性質決定のためのプロジェクトが開始された。この細胞株は、白血病を誘発する可能性のある病原性事象の分子特性を確立するために、この再配列内に含まれる遺伝子（群）を同定する目的で使用された。そのような転座の病理的帰結の一つは、個々の染色体上に通常見うけられるDNA断片の近位由来の腫瘍特異的融合遺伝子の創造である。他方、反回性の染色体欠失は、欠失領域内の癌抑制遺伝子の存在、その他の変異と関連する対立遺伝子の欠失を示唆する。染色体12p12上の単一転座に含まれる遺伝子が、多くの均衡型転座に含まれるETV6遺伝子として同定される一方、潜在的なパートナー遺伝子をクローン化する試みは成功しなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、個体が急性リンパ性白血病(ALL)あるいは慢性リンパ球性白血病(CLL)を有する可能性が高いことを示すヒト第13番染色体の13q14領域における染色体変化を検出する方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、個体がALLあるいはCLLに罹患している可能性があるかどうかを判断するための方法を提供する。当該方法は、前記個体のリンパ球を含む血液あるいは骨髄由来の細胞サンプルを得るステップ、第13番染色体13q14領域の一部（この配列は、バクテリア人工染色体(BAC)のRP11-147H23あるいはRP11-327P2内の第13番染色体の配列に対応する）が欠失しているかどうか検出するステップを含む。
【００１２】
ある実施形態において、個体の細胞において第13番染色体の13q14領域の一部が欠失しているかどうかを検出するステップには、個体の染色体を蛍光in-situハイブリダイゼーション(FISH)分析することが含まれる。この方法の一実施形態では、テスト・プローブ及びコントロール・プローブのハイブリダイゼーション・パターンを決定するために、FISH分析が行われる（テスト・プローブはBACのRP11-147H23あるいはRP11-327P2内の配列に対応し、コントロール・プローブはBACのRP11-147H23及びRP11-327P2内の領域外の第13番染色体上の配列に対応する）。ハイブリダイゼーション・パターンにおいて、テスト及びコントロール・プローブから得られる共-局在化シグナルが２組あれば、欠失はなく、共-局在化シグナルが一組だけであれば、欠失の存在が示唆される。
【００１３】
別の実施形態では、第13番染色体の13q14領域の一部が欠失しているかどうか検出するステップに、細胞内にWDFY2の完全なコピーが２つあるかどうか測定するため、WDFY2遺伝子を含む第13番染色体の領域をFISH分析することが含まれる。この方法の一実施形態では、第１及び第２プローブのハイブリダイゼーション・パターンが測定される（第１プローブは、WDFY2遺伝子の第１エキソンに対応し、第２プローブは、WDFY2遺伝子の第２エキソンに対応する）。一組のみの共-局在化シグナルを有するハイブリダイゼーション・パターンが検出されれば、細胞内にWDFY2遺伝子の完全なコピーが一つ存在することが示唆される。
【００１４】
別の実施形態では、核酸を分析するステップには、BACのRP11-147H23に対応する第13番染色体の領域内に存在する遺伝子から転写したmRNAの存在を検出することが含まれる。この方法の特に好ましい実施形態では、WDFY2遺伝子から発現されるmRNAの存在あるいは非存在を検出するために、RT-PCRが行われる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、個体がALLあるいはCLLに罹患していると診断される可能性が高いかどうかを判断する方法を提供する。この方法には、個体の血液あるいは骨髄由来の細胞サンプル（サンプルはリンパ球を含む）を採取するステップ、及び第13番染色体の13q14領域の一部が欠失しているかどうか検出するステップが含まれる。欠失しているかどうかを分析する13q14部分は、D13S25及びD13S31マーカーの間に存在し、バクテリア人工染色体(BAC)のRP11-147H23あるいはRP11-327P2内に存在する第13番染色体の領域に対応する。この領域内の欠失の検出は、個体がCLLあるいはALLに罹患している可能性を示唆する。
【００１６】
本発明の方法で分析されるリンパ球は、なんらかの方法で採取すればよい。例えば、リンパ球は、標準的な瀉血技術を用いて採取された血液中に存在しうる。リンパ球を含む骨髄は、骨組織内に挿入したニードルを用いた吸引あるいは生検によって採取できる。
【００１７】
リンパ球内の核酸は、ノーザンブロット、サザンブロット、制限断片長多型分析、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)、逆転写PCR(RT-PCR)、RACE法、FISH分析、あるいは核酸検出に関し当業者に既知の方法など、染色体欠失を検出する様々な方法によって分析することができる。
【００１８】
ある実施形態では、個体がALLあるいはCLLに罹患していると診断される可能性があるかどうかを判定するために、FISHが用いられる。FISHは、変性染色体DNAに対する蛍光標識DNA（プローブ）のハイブリダイゼーションによって、染色体あるいは染色体領域の存在または非存在を同定するために使用される細胞遺伝学的手法である。FISHは、当業者に既知の方法で行うことができるが、世界中の多くの研究室で行われるFISHの手順は、一般に、Kuo等("Detection of Aneuploidy Involving Chromosomes 13,  18 or 21, by Fluorescence in Situ Hybridization to Interphase and Metaphase Amniocytes, "Am. J. Hum. Genet. 49: 112-119 (1991))；Klinger等("Rapid Detection of Chromosome Aneuploidies in Uncultured Amniocytes by Using Fluorescence in Situ Hybridization(FISH)," Am J. Hum. Genet. 51: 55-65 (1992))；及びWard, B. E.等("Rapid Prenatal Diagnosis of Chromosomal Aneuploidies by Fluorescence in Situ Hybridization; Clinical Experience with 4,500 Specimens, "Am. J. Hum. Genet. 52: 854-865 (1993))らの手順と同様である。
【００１９】
一般に、FISH分析の実行は、染色体DNAを含む生体サンプルを採取するステップ、DNAを変性させるステップ、変性染色体DNAに蛍光標識DNAをハイブリッド形成させるステップ及び蛍光顕微鏡を使用してハイブリダイゼーション・パターンを検出するステップを含む。FISH分析に使用するための蛍光標識プローブを得る方法は、業界では広く知られており、例えば、蛍光色素結合ヌクレオチドを用いてニックトランスレーションによりDNAプローブを標識することによって達成できる。これは市販のキットを用いて行うことができる(Vysis，Downers Grove，IL)。好適な蛍光色素結合ヌクレオチドとしては、例えば、緑の蛍光を発するFITC-標識ヌクレオチド、赤の蛍光を発するテキサス・レッド(Texas Red)結合ヌクレオチドなどがある。
【００２０】
ある実施形態では、FISH分析は、プローブとしてポリヌクレオチドを使用して行うことができ、前記ポリヌクレオチドは、ヒト第13番染色体上のヒト染色体13q14領域部分を有する。このようなポリヌクレオチドは、コスミド、酵母人工染色体あるいはバクテリア人工染色体(BACs)の一部を含む、様々な形態で提供することができる。
【００２１】
ある実施形態では、FISHを使用して、コントロール・プローブ及びテスト・プローブの相対的位置を検出して、第13番染色体の13q14領域内に欠失があるかどうかを判定することによって、個体がCLLあるいはALLに罹患していそうかどうかを判断する。ある実施形態では、欠失が分析される第13番染色体の領域は、BACのRP11-147H23 あるいはRP11-327P2に対応する第13番染色体領域である。
【００２２】
このような方法の一実施形態において、BACのRP11-147H23の配列に対応する第13番染色体領域を含むテストポリヌクレオチドプローブを使用するFISH分析は、第13番染色体のその他の部分（BACのRP 11-147H23配列に対応する領域外の部分）とハイブリッド形成するコントロール・プローブとの組み合わせで使用することができる。各プローブは、お互いに区別することができるよう、異なる色の蛍光を発する蛍光色素結合ヌクレオチドで標識することができる。
【００２３】
正常な第13番染色体に対するこの組のプローブのハイブリダイゼーションは、各組のプローブ由来のシグナルが、１つの第13番染色体の染色分体上に共-局在化するといった予測可能なハイブリダイゼーション・パターンを生じる。この結果は、細胞内の２つの第13番相同染色体の各染色分体上に生じる（Ｓ期後、セントロメアで連結している複製染色分体に基づき、各染色体上に各プローブに対する２つの結合サイトがある）
【００２４】
一方、BACのRP11-147H23配列に対応する染色体領域内の欠失を有する細胞に対して、同様のFISH分析を行った場合、異なるハイブリダイゼーション・パターンが生じるであろう。この場合、１組のプローブは、正常な第13番染色体上で共-局在化するかもしれないが、欠失を有する相同染色体上のプローブの組は、共-局在化しないであろう。むしろ、テスト・プローブ由来のシグナルは、BACのRP11-147H23配列に対応する染色体領域が転座したことが原因で、異なる染色体上に分離するかもしれない。BACのRP11-147H23に対応する染色体領域が完全に欠失している場合、テスト・プローブ由来のシグナルは、全く検出されない。このようなハイブリダイゼーション・パターンは、その染色体を採取した個体がCLLあるいはALLと診断され得ることを示す。
【００２５】
別の実施形態では、BACのRP11-147H23に対応する染色体領域内に欠失がある細胞でFISH分析を行った場合、テスト・プローブ及びコントロール・プローブは、欠失の反対側にあるかもしれない。この実施形態では、正常な第13番染色体及びBACのRP11-147H23に対応する染色体領域内に欠失を有する第13番染色体が存在する場合、テスト・プローブ及びコントロール・プローブは、正常な第13番染色体上に共-局在化し、欠失を有する染色体上で共-局在化しないであろう。327由来のシグナルもまた、327クローンが染色体切断点にまたがらないため、分裂しないであろう。
【００２６】
別の実施形態では、FISH分析において、BACのRP11-147H23内に存在する第13番染色体の領域に対応する染色体領域部分に対応するプローブのパネルを使用することができる。本発明のこの実施形態は、細胞中にWDFY2遺伝子(GenBank WDFY2 cDNA 受入番号：NM052950)の２つの完全なコピーがあるかどうかを測定するために使用することができる。この方法の一実施形態では、第１及び第２の蛍光標識プローブのFISHハイブリダイゼーション・パターンが測定される（第１プローブはWDFY2遺伝子の第１エキソンに対応し、第２プローブはWDFY2遺伝子の第２エキソンに対応する）。共-局在化シグナルが一組のみ検出されるハイブリダイゼーション・パターンは、細胞内にWDFY2遺伝子の完全なコピーが一つだけ存在することを示唆する。
【００２７】
本発明の別の実施形態では、核酸をサンプル内の細胞から単離し、ノーザンブロット、サザンブロット、制限断片長多型分析、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)、逆転写PCR(RT-PCR)、RACE法(RACE)など、核酸検出の分野の当業者に既知の何らかの方法によって分析し、BACのRP11-147H23あるいはRP11-327P2配列に対応する第13番染色体の領域内の欠失を証明することによって、個体がALLまたはCLLに罹患している可能性が高いかどうか判断する。
【００２８】
例えば、核酸（PCR分析の場合は一般にDNAであり、RT-PCR分析に対しては総mRNA）を血液細胞あるいは骨髄中のリンパ球から抽出する。DNA及びRNAはいずれも、当業界で周知の一般的な方法によって抽出することができる。例えば、Maniatis, T.等の"Molecular Cloning-A Laboratory Manual"、Cold Spring Harbor Laboratory (1982)を参照できる。PCR反応は、当業者に既知の様々な方法で行うことができる。同様に、mRNAを単離した場合は、RT-PCRにかければよい。一般に、RT-PCRは、mRNAをcDNAに逆転写するステップ、その後、ポリメラーゼ連鎖反応法によって逆転写されたcDNAを増幅するステップを含む。
【００２９】
本発明の一実施形態によれば、RT-PCR反応に対し、BACのRP11-147H23クローンの配列に対応するDNA領域から転写したmRNAを増幅することができるプライマーを、そのようなmRNAの存在あるいは非存在を検出するために使用してもよい（そのようなmRNAが存在しなければ、その総mRNAを採取した個体が、ALLまたはCLLと診断される可能性が示唆される）
【００３０】
ある実施形態では、RT-PCRは、WDFY2遺伝子由来のcDNAを検出するために使用される。明細書中に開示するように、BACのRP11-147H23は、染色体切断点にまたがるWDFY2遺伝子を含み、この範囲で染色体欠失が存在する場合、その染色体が採取された個体は、ALLあるいはCLLに罹患していると診断される可能性が高い。
【００３１】
PCR及びRT-PCR反応産物はいずれも、当業界で既知の方法（ゲル電気泳動、DNA塩基配列決定法などを含むがこれに限定されない）によって分析できる。BACのRP11-147H23 あるいはRP11-327P2配列に対応する第13番染色体領域内に正常に位置する核酸配列の増幅は、染色体欠失を示さず、このような増幅がなければ、その領域内の欠失の証拠となる。このような欠失は、RT-PCRで分析したサンプルが採取された個体が、CLLに罹患している可能性が高いことを示唆する。
【００３２】
本発明のさらに別の実施形態は、BACのRP11-147H23またはRP11-327P2に存在している第13番染色体領域に対応する第13番染色体領域内の染色体欠失を検出するキットに関する。 
【００３３】
本発明を以下の実施例により詳細に説明する（実施例はいかなる限定も意味しない）。
【実施例１】
【００３４】
本実施例は、個体がALLまたはCLLに罹患している可能性が高いか判断する際に使用するDNA配列を同定するための実例を説明するものである。
【００３５】
そのような配列を同定するために、ヒト第13番染色体へのFISH染色体歩行アプローチを、RPCIのBACクローン、RP11-147H23、RP11-215B15(GenBank 受入番号：AL136527)、RP11-131F1(AL157761)及びRP11-327P2(AL 162377)（明細書中ではそれぞれ"147"、"215"、"131"及び"327"とも表す）を用いて行った。
【００３６】
FISH分析で使用するためのBACクローンを調製するために、BACのDNAを、DNA抽出キット(Qiagen)を用いて大腸菌から抽出した。その後、抽出したBACのDNAに、市販のキットを用いて、蛍光色素結合ヌクレオチドを利用するニックトランスレーション標識法を適用した(Vysis, Downers Grove, IL)。 
【００３７】
これらのクローンをダブルカラーFISH分析で使用した。このアプローチにおいて、215クローンを、個体のFISH分析において、残り３つのBACクローンのぞれぞれと組み合わせて使用した。215クローンは、赤の蛍光シグナルを発して、第13番染色体上の基準点として役立ち、赤の蛍光シグナルの位置は、FISH分析結果において、第13番染色体の物理的な位置に対応する。他のBACクローンは、緑色の蛍光シグナルを発する。
【００３８】
図１は、13q14領域内で第13番染色体の転座があることが知られているMUTZ5細胞株（左の上下パネル）、正常な個体から採取した細胞（右上パネル）及びCLL患者から採取した細胞（右下パネル）におけるFISH分析を示す。４つのパネルの中央に示した染色分体は、下流方向におけるRb遺伝子座、D13S319マーカー、D13S25マーカー、WDFY2遺伝子及びD13S31遺伝子座それぞれの相対位置のマップを含む。赤の垂直方向のバーは、215クローン(コントロール・プローブ)のハイブリダイゼーション位置を示し、緑の垂直方向のバーは、残り３つのBACクローン（テスト・プローブ）のハイブリダイゼーション位置を示す（３つの数字の省略形で示す）。矢印は、どのBACクローンを用いて４つのパネルそれぞれのハイブリダイゼーション・パターンを生じたかを示す。215クローンは各パネルで使用された。
【００３９】
図１から分かるように、右上のパネルは、共-局在化シグナルを生じた215及び131クローンのハイブリダイゼーションである（第13番染色体相同体の２つの染色分体のそれぞれに対するクローンのハイブリダイゼーションがあるため、２セットのシグナルがある）。赤あるいは緑のシグナルのどちらも消滅せずあるいは異なる染色体に転座(言い換えれば、非-共局在化)しないので、この結果から、これらのクローンとハイブリッド形成する染色体座は、転座中に染色体切断が起こる位置の外側にあることが実証される。 
【００４０】
図１の右下側のパネルに示すクローン215及び327のハイブリダイゼーション（CLLに罹患した患者から採取した２つの細胞を示す）は、１つの緑及び１つの赤のシグナルが「正常な」第13番染色体相同体上に共-局在化し、他の赤及び緑のシグナルのペアは分裂するハイブリダイゼーション・パターンを生じる。この結果は、染色体切断点が215及び327クローンのハイブリダイゼーションサイトの間に局在化していることを示す。１組のプローブに関して、検出された緑のシグナルが全て赤のシグナルから分離しているため、327プローブと相補的な配列を含む染色体部分は、215クローンとハイブリッド形成する染色体領域から離れて転座したことが示唆される。
【００４１】
図１の左の上下パネルにおいて、クローン215及び147のハイブリダイゼーションは、１つの緑及び１つの赤のシグナルが共-局在化したハイブリダイゼーション・パターンを生じる。しかし、他のペアの赤と緑のシグナルでは、正常な赤のシグナルが小さな緑のシグナルとともに共-局在化していた。このハイブリダイゼーション・パターンは、147クローンの一部が結合する染色体の一部の転座に原因がある。また、別の小さな緑のシグナルが、派生（転座パートナー）染色体12上に見られ、第13番染色体の転座部分の位置が示される。
【００４２】
従って、本実施例は、CLL細胞内の染色体切断点の同定を実証するものであり、クローン147は、転座に関与する配列群／遺伝子（群）を含む染色体切断点にまたがっており、また、RP11-327P2内に存在する第13番染色体配列に対応する第13番染色体領域は、前記切断点の下流にあることが示される。
【実施例２】
【００４３】
本実施例は、実施例１に記載したダブルカラーFISH分析が、個体がALLに罹患している可能性があると判断するために有用であることを実証するものである。
【００４４】
ALLと診断された９つの個体から得た一連の骨髄サンプルを、RP11-215B13（実施例１のクローン215）と供にRP11-147H23クローンで分析した。これらのプローブは、前述のようにハイブリッド形成され、実施例１で記載したように検出された。表１にまとめるように、９つのサンプルのうち８つが、一つの対立遺伝子の欠失を示した。
【００４５】
【表１】
2007504827.tif 000002
【００４６】
コントロール・プローブに対し（−）を示す患者は、コントロール・プローブと相補的な染色体領域を包含する染色体を欠失しているものと解釈される。
【００４７】
従って、本実施例は、ALLと診断された個体の第13番染色体領域内の欠失を検出するために、クローン147が使用できることを実証する。
【実施例３】
【００４８】
本実施例は、実施例１に記載したダブルカラーFISH分析が、個体がCLLに罹患している可能性が高いと判断するために有用であることを実証するものである。
【００４９】
CLLに罹患した個体の染色体を研究するために、１０のCLL症例を無作為に選択し、FISH分析した。図２の３つのパネルに示されるように、１０のアッセイは全て（図２のパネル１〜３に分布している）、欠失FISHハイブリダイゼーション・パターンを示した（共-局在化した一対の赤と緑のシグナル及び147クローンが正常にハイブリッド形成する領域が欠失した第13番染色体由来の不対の赤のシグナルによって各症例で実証される）。さらに、ロズウェル・パーク癌研修所(RPCI)から入手した２５のCLL症例を、前記技術を用いて研究した結果、これら２１症例のうち１８例(85%)が、欠失ハイブリダイゼーション・パターンを示した（データは示さない）。
【００５０】
さらに、一連の非選択サンプルも、147及び215クローンを用いてハイブリッド形成させ、FISHで分析した。表２にまとめた結果は、クローン147に対する欠失ハイブリダイゼーション・パターンを示す細胞のパーセントを表す。
【００５１】
【表２】
2007504827.tif 000003
【００５２】
表２は、CLLに罹患した個体が、147クローン内のヒト第13番染色体領域に対応する第13番染色体領域の欠失を特徴とするハイブリダイゼーション・パターンをもつ細胞を有することを実証する。正常な個体（すなわち、C1〜C3と記されたコントロール）も、この欠失特徴を示すハイブリダイゼーション・パターンが検出される細胞を、一定の割合で有するが、そのようなパーセンテージは、欠失検出レベルのバックグラウンド（細胞を採取した個体がCLLと診断される可能性の指標となる細胞パーセンテージの閾値となる）を設定するために使用されることが、当業者に明白に理解されるであろう。
【実施例４】
【００５３】
本実施例は、147クローンに対応する第13番染色体領域内に位置する遺伝子の発現（あるいはその欠失）に関して、CLLに罹患した個体のサンプルにおいて第13番染色体欠失の検出を説明するものである。
【００５４】
CLL症例から得た１２のDNAサンプルを、WDFY2遺伝子の発現を調べるためにRT-PCRによって分析した。RT-PCR反応で使用したプライマーは、WDFY2の全翻訳領域を増幅するものである。順方向プライマーは、配列：5' tctgtctcaacctgtgtccc 3'（配列番号１）を有し、逆方向プライマーは、配列：5' gaagagtccccttgcgagt 3'（配列番号２）を有する。
【００５５】
図３は、RT-PCR増幅産物の電気泳動分離後のゲルの写真を示す。下のパネルは、ローディング・コントロールとして使用されたGAPDH増幅のRT-PCRを示す。レーン１及び１６に示すのは、EBV-LIN細胞（不死化リンパ球）及び１２のCLLサンプル（レーン４〜７及び８〜１５）のアッセイである。４つのCLLサンプル（レーン４〜７）はWDF2 mRNAがネガティブであり、WDF2遺伝子あるいはその発現に必要な染色体要素のいずれかの欠失を示す。追加の８つのサンプルを、同じアプローチを使用して分析した結果（レーン８〜１４）、WDFY2レベルの大幅な発現低下を示した。
【００５６】
レーン８〜１４のサンプルにおけるWDF2mRNAの大幅な発現低下の検出は、これらのサンプルが高濃度のCLL細胞を基準に選択されなかったことに原因があるかもしれない（活性CLLが唯一の選択基準であった）。一方、レーン４〜７のサンプルは、高濃度のCLL細胞を基準に選択された（すなわち、蛍光標識細胞分取によって約95%CLLリンパ球を有する個体を選択した）。
【００５７】
従って、本実施例は、WDFY2遺伝子をコードするmRNAの欠如の検出が、そのmRNAを単離した個体がCLLと診断される可能性が高いと決定するために使用できることを実証する。
【実施例５】
【００５８】
本実施例は、WDFY2遺伝子の一部の欠失の検出が、個体がCLLに罹患している可能性が高いと判定するために使用できることを実証するものである。
【００５９】
WDFY2遺伝子に特異的なDNAプローブを得るために、WDFY2cDNAをプローブとして使用し、サザンブロットにおいて、LANL第13番染色体特異的コスミドライブラリーをスクリーニングした。このライブラリーは、フィルター上にプレグリッドしたヒトゲノム・マッピングプロジェクト(HGMP)(ケンブリッジ、英国)から得た。
【００６０】
６つのポジティブクローンをサザンブロットで同定した。そのクローンが位置するWDFY2遺伝子エキソンを、そのクローンの５’及び３’末端の配列を決定し、その両末端とWDFY2遺伝子配列を比較することによって、同定した。その後、前記クローンのうち３つを、緑色に蛍光を発する蛍光色素結合ヌクレオチドで標識し、別の３つのクローンを赤色に蛍光を発する蛍光色素結合ヌクレオチドで標識した。
【００６１】
【表３】
2007504827.tif 000004
【００６２】
１４のCLLサンプルを実施例１で記述した方法と本質的に同じFISH技術を用いて研究した（例外は、表３にまとめた通り、標識した６つのクローン全てを含む反応混液をプローブとして使用したことである）。FISH分析の結果を表４にまとめる。
【００６３】
【表４】
2007504827.tif 000005
【００６４】
アスタリスクは、細胞の閾値パーセンテージに基づき、実際に欠失と見なされることが必要とされる欠失が検出された数字に付されている。本実施例では、実際の欠失とみなす検出閾値を25％に設定した。この解釈を使用した結果、サンプル１４例のうち１２例(86%)がWDFY2遺伝子の欠失を示した。表４にまとめた全ての症例における欠失は、全対立遺伝子あるいは遺伝子の５’末端のいずれかを含む。従って、本実施例は、WDFY2遺伝子領域を含むポリヌクレオチドの欠損の検出が、細胞内にWDFY2の２つの完全なコピーがあるかどうかを測定し、それによって、個体がCLLに罹患していると診断される可能性が高いかどうかを判定するために使用できることを実証する。
【００６５】
特定の実施形態についての上記記述は、説明を目的とし限定と解釈されない。本発明の教示から、当業者は、様々な修正及び変更が、本発明の精神から逸脱することなくなされることを認識するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、MUTZ5細胞（上下の左側パネル）、CLLと診断された個体から採取した細胞（右下パネル）及び正常な個体から採取した細胞（右上パネル）のFISH分析の写真を示す。BACクローン215、131、147及び327を用いた染色体歩行によって、BACクローン147が13q14切断点にまたがっていることが確認された。
【図２】図２は、パネル１〜３に分布する10個のサンプルにおける、BACクローン147の配列に対応する第13番染色体領域の欠失を実証するFISHハイブリダイゼーション・パターンを示す、CLL患者サンプルのFISH分析の写真を示す。
【図３】図３は、WDF2及びコントロールcDNAのRT-PCR増幅産物の電気泳動分離後のゲルの写真を示す。上のパネルは、RT-PCRを用いたWDF2cDNAの増幅を示す。下のパネルは、ローディング・コントロールに対するGAPDH増幅のRT-PCRを示す。レーンは、以下の各ソースからのRT-PCR増幅産物の分離を示す；レーン１：EBV-LIN(不死化リンパ球)；レーン２：G519(マントル細胞リンパ腫)；レーン３：正常リンパ球；レーン４〜１５：CLLサンプル；レーン１６：EBV-LIN。２つの非標識レーンはサイズマーカーである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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