(57)【要約】  本発明は一般に分子生物学、臨床細菌学、およびタンパク質折り畳みの分野に関する。より詳しくは、本発明は、宿主細胞における可溶性成熟化膿連鎖球菌外毒素Ｂ（ＳｐｅＢ）ポリペプチドを組換え発現させるための方法に関する。
2007536900.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞における成熟化膿連鎖球菌外毒素Ｂ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ  Ｂ）（ＳｐｅＢ）ポリペプチドを組換え発現させるための方法であって、（ａ）ＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインをコード化するポリヌクレオチド配列と、（ｂ）成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列とを含むポリシストロニックプラスミドで宿主細胞を形質転換し、形質導入し、トランスフェクトし、または感染させ、該宿主細胞によって該成熟ＳｐｅＢポリペプチドおよび該ＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインの発現を可能にする条件下で該宿主細胞を培養することを含む、その成熟ＳｐｅＢポリペプチドが該宿主細胞において可溶性であるところの、方法。
【請求項２】
前記ＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインが、配列番号２のアミノ酸残基２８〜１４５を含んで成るポリペプチドとしてさらに規定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記成熟ＳｐｅＢポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸残基１４６〜３９８を含んで成るポリペプチドとしてさらに規定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記成熟ＳｐｅＢポリペプチドのアミノ酸残基１９２での前記システインがセリンによって置換される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記成熟ＳｐｅＢポリペプチドが哺乳類宿主において免疫原性である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記成熟ＳｐｅＢポリペプチドに特異的な抗体が野生型ＳｐｅＢポリペプチドと交差反応し、かつＳｐｅＢポリペプチド活性を無力化する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記プラスミドがＴ７プロモーター含有プラスミドである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記プラスミドが、ｐＥＴ、ｐＲＳＥＴ、ｐＣＲＴ７−ＣＴＴＯＰＯ、およびｐＩＶｅＸより成る群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主細胞が細菌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記宿主細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記大腸菌が、ＢＬＲ（ＤＥ３）、ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＡＤ４９４（ＤＥ３）、ＡＤ４９４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、ＢＬ２１ｔｒｘＢ（ＤＥ３）、ＢＬ２１ｔｒｘＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、およびＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩより成る群から選択される菌株である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
宿主細胞における成熟ＳｐｅＢポリペプチドを組換え発現させるための方法であって、（ａ）（ｉ）ＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインをコード化するポリヌクレオチド配列を含んで成るプラスミドおよび（ｉｉ）成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列を含んで成るプラスミドで宿主細胞を形質転換し、形質導入し、トランスフェクトし、または感染させ、
（ｂ）前記ＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインおよび前記成熟ＳｐｅＢポリペプチドを共発現させるのに適切な条件下で宿主細胞を培養すること
を含む、前記成熟ＳｐｅＢポリペプチドが宿主細胞において可溶性であるところの、方法。
【請求項１３】
前記ＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインが、配列番号２のアミノ酸残基２８〜１４５を含んで成るポリペプチドとしてさらに規定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記成熟ＳｐｅＢポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸残基１４６〜３９８を含んで成るポリペプチドとしてさらに規定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記成熟ＳｐｅＢポリペプチドのアミノ酸残基１９２での前記システインがセリンによって置換される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記成熟ＳｐｅＢポリペプチドが哺乳類宿主において免疫原性である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記成熟ＳｐｅＢポリペプチドに特異的な抗体が野生型ＳｐｅＢポリペプチドと交差反応し、かつＳｐｅＢポリペプチド活性を無力化する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記プラスミドがＴ７プロモーター含有プラスミドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記プラスミドが、ｐＥＴ、ｐＲＳＥＴ、ｐＣＲＴ７−ＣＴＴＯＰＯ、およびｐＩＶｅＸより成る群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記宿主細胞が細菌細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記宿主細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記大腸菌が、ＢＬＲ（ＤＥ３）、ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＡＤ４９４（ＤＥ３）、ＡＤ４９４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、ＢＬ２１ｔｒｘＢ（ＤＥ３）、ＢＬ２１ｔｒｘＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、およびＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩより成る群から選択される菌株である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
成熟ＳｐｅＢポリペプチドを生成するための方法であって、
（ａ）成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列を含むプラスミドを宿主細胞において組換え発現させ、ここで前記ＳｐｅＢポリペプチドが前記宿主細胞において不溶性ポリペプチド集合体を形成し、
（ｂ）前記ポリペプチド集合体を可溶化し、ここで前記可溶化ポリペプチドが非ネイティブ成熟ＳｐｅＢポリペプチドとして規定され、
（ｃ）１つもしくはそれ以上のシャペロンタンパク質の存在下に前記非ネイティブ成熟ＳｐｅＢポリペプチドを再折り畳みし、ここで前記非ネイティブ成熟ＳｐｅＢポリペプチドがネイティブ成熟ＳｐｅＢポリペプチドへ折り畳まれ、
（ｄ）前記ネイティブ成熟ＳｐｅＢポリペプチドを回収すること
を含んで成る方法。
【請求項２４】
前記１つもしくはそれ以上のシャペロンタンパク質が、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ、ペプチジル−プロリルイソメラーゼ（ＰＰＩ）、ペプチドジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）およびＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインより成る群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記シャペロンタンパク質が、配列番号２のアミノ酸残基２８〜１４５を含んで成るＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記成熟ＳｐｅＢが、配列番号２のアミノ酸残基１４６〜３９８を含んで成るポリペプチドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記成熟ＳｐｅＢポリペプチドのアミノ酸残基１９２における前記システインがセリンによって置換される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記不溶性ポリペプチド集合体が封入体としてさらに規定される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記ポリペプチドの可溶化が尿素、塩化グアニジニウム、および熱より成る群から選択される変性剤である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
宿主細胞において（ｉ）成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＧｒｏＥＬポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列とを含んで成るポリシストロニックプラスミドを発現させることを含む、前記成熟ＳｐｅＢポリペプチドが前記宿主細胞において可溶性である、宿主細胞において成熟ＳｐｅＢポリペプチドを組換え発現させるための方法。
【請求項３１】
前記成熟ＳｐｅＢポリペプチドのアミノ酸残基１９２における前記システインがセリンによって置換される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記プラスミドが、ＧｒｏＥＳポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドをさらに含んで成る、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
成熟ＳｐｅＢポリペプチドを生成するための方法であって、
（ａ）（ｉ）成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＧｒｏＥＬポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列とを含んで成るポリシストロニックプラスミドで宿主細胞を形質転換し、形質導入し、トランスフェクトし、または感染させ、
（ｂ）前記成熟ＳｐｅＢポリペプチドおよび前記ＧｒｏＥＬポリペプチドを発現させるのに適切な条件下で前記宿主細胞を培養し、ここで前記成熟ＳｐｅＢポリペプチドが前記宿主細胞において可溶性であり、
（ｃ）前記ネイティブ成熟ＳｐｅＢポリペプチドを回収すること
を含んで成る方法。
【請求項３４】
前記成熟ＳｐｅＢポリペプチドのアミノ酸残基１９２における前記システインがセリンによって置換される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１に記載の方法に従って生成される成熟ＳｐｅＢポリペプチド。
【請求項３６】
請求項１２に記載の方法に従って生成される成熟ＳｐｅＢポリペプチド。
【請求項３７】
請求項２３に記載の方法に従って生成される成熟ＳｐｅＢポリペプチド。
【請求項３８】
請求項３０に記載の方法に従って生成される成熟ＳｐｅＢポリペプチド。
【請求項３９】
請求項３３に記載の方法に従って生成される成熟ＳｐｅＢポリペプチド。
【請求項４０】
請求項３５に記載のＳｐｅＢポリペプチドを含んで成る免疫原性組成物。
【請求項４１】
請求項３６に記載のＳｐｅＢポリペプチドを含んで成る免疫原性組成物。
【請求項４２】
請求項３７に記載のＳｐｅＢポリペプチドを含んで成る免疫原性組成物。
【請求項４３】
請求項３８に記載のＳｐｅＢポリペプチドを含んで成る免疫原性組成物。
【請求項４４】
請求項３９に記載のＳｐｅＢポリペプチドを含んで成る免疫原性組成物。
【請求項４５】
請求項４０に記載の免疫原性量の組成物を哺乳類対象に投与することを含む化膿連鎖球菌に対して前記対象を免疫化する方法。
【請求項４６】
請求項４１に記載の免疫原性量の組成物を哺乳類対象に投与することを含む化膿連鎖球菌に対して前記対象を免疫化する方法。
【請求項４７】
請求項４２に記載の免疫原性量の組成物を哺乳類対象に投与することを含む化膿連鎖球菌に対して前記対象を免疫化する方法。
【請求項４８】
請求項４３に記載の免疫原性量の組成物を哺乳類対象に投与することを含む化膿連鎖球菌に対して前記対象を免疫化する方法。
【請求項４９】
請求項４４に記載の免疫原性量の組成物を哺乳類対象に投与することを含む化膿連鎖球菌に対して前記対象を免疫化する方法。
【請求項５０】
（ａ）ＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインをコード化するポリヌクレオチド配列と、（ｂ）成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列とを含む、ここで前記成熟ＳｐｅＢポリペプチドが宿主細胞において発現されると可溶性である、ポリシストロニックプラスミド。
【請求項５１】
前記成熟ＳｐｅＢポリペプチドのアミノ酸残基１９２での前記システインがセリンによって置換される、請求項５０に記載のプラスミド。
【請求項５２】
前記プラスミドがＴ７プロモーター含有プラスミドである、請求項５０に記載のプラスミド。
【請求項５３】
ＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインをコード化するポリヌクレオチド配列を含んで成るプラスミド、および成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列を含んで成るプラスミドであって、ここで前記成熟ＳｐｅＢポリペプチドが宿主細胞において発現されると可溶性であるところの、プラスミド。
【請求項５４】
前記成熟ＳｐｅＢポリペプチドのアミノ酸残基１９２での前記システインがセリンによって置換される、請求項５３に記載のプラスミド。
【請求項５５】
前記プラスミドがＴ７プロモーター含有プラスミドである、請求項５３に記載のプラスミド。
【請求項５６】
（ａ）成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列と、（ｂ）ＧｒｏＥＬポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列とを含んで成り、ここで前記成熟ＳｐｅＢポリペプチドが宿主細胞で発現されると可溶性であるところの、ポリシストロニックプラスミド。
【請求項５７】
前記成熟ＳｐｅＢポリペプチドのアミノ酸残基１９２における前記システインがセリンによって置換される、請求項５６に記載のプラスミド。
【請求項５８】
前記プラスミドがＴ７プロモーター含有プラスミドである、請求項５６に記載のプラスミド。
【請求項５９】
（ａ）成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列と、（ｂ）ＧｒｏＥＬポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列と、（ｃ）ＧｒｏＥＳポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列とを含んで成り、ここで前記成熟ＳｐｅＢポリペプチドが宿主細胞で発現されると可溶性であるところの、ポリシストロニックプラスミド。
【請求項６０】
前記成熟ＳｐｅＢポリペプチドのアミノ酸残基１９２における前記システインがセリンによって置換される、請求項５９に記載のプラスミド。
【請求項６１】
前記プラスミドがＴ７プロモーター含有プラスミドである、請求項５９に記載のプラスミド。
【請求項６２】
（ａ）成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列と、（ｂ）ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメイン、ＰＤＩ、およびＰＰＩより成る群から選択される１つもしくはそれ以上のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列とを含んで成り、ここで前記成熟ＳｐｅＢポリペプチドが宿主細胞で発現されると可溶性であるところの、ポリシストロニックプラスミド。
【請求項６３】
前記成熟ＳｐｅＢポリペプチドのアミノ酸残基１９２における前記システインがセリンによって置換される、請求項６２に記載のプラスミド。
【請求項６４】
前記プラスミドがＴ７プロモーター含有プラスミドである、請求項６２に記載のプラスミド。
【請求項６５】
請求項５０に記載のプラスミドで形質転換され、形質導入され、トランスフェクトされ、または感染される宿主細胞。
【請求項６６】
請求項５３に記載のプラスミドで形質転換され、形質導入され、トランスフェクトされ、または感染される宿主細胞。
【請求項６７】
請求項５６に記載のプラスミドで形質転換され、形質導入され、トランスフェクトされ、または感染される宿主細胞。
【請求項６８】
請求項５９に記載のプラスミドで形質転換され、形質導入され、トランスフェクトされ、または感染される宿主細胞。
【請求項６９】
請求項６２に記載のプラスミドで形質転換され、形質導入され、トランスフェクトされ、または感染される宿主細胞。
【請求項７０】
前記ＰＰＩが化膿連鎖球菌ＲｏｐＡ  ＰＰＩである、請求項２４に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＰＰＩが化膿連鎖球菌ＲｏｐＡ  ＰＰＩである、請求項６２に記載のプラスミド。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、分子生物学、臨床細菌学、およびタンパク質折り畳みの分野に関する。より詳しくは、本発明は、宿主細胞における成熟化膿連鎖球菌外毒素Ｂ（ＳｐｅＢ）ポリペプチドを組換え発現させるための方法に関する。
【０００２】
（従来技術）
Ａ群連鎖球菌（ｇｒｏｕｐ  Ａ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）（ＧＡＳ）とも呼ばれる化膿連鎖球菌は、ヒトの一般的なグラム陽性細菌病原体である。化膿連鎖球菌は、咽頭炎、膿痂疹、および敗血症を含むヒトにおけるさまざまな病状を引き起こす。感染後には、リウマチ熱および急性糸球体腎炎など自己免疫合併症もヒトにおいて発生する。化膿連鎖球菌は、猩紅熱、壊疽性筋膜炎、および毒性ショックなど重篤な急性疾患も引き起こす。
【０００３】
Ａ群連鎖球菌によって引き起こされる咽頭炎は、一般的に「連鎖球菌性咽頭炎」と呼ばれ、季節によって一般医療における全呼び出しの少なくとも１６％を占める（非特許文献１）。Ａ群連鎖球菌は、壊疽性筋膜炎に関与する毒性ショックの北米および他の四大陸における最近の再流行の原因でもある（非特許文献２）。
【０００４】
連鎖球菌感染は現在、抗生物質療法によって治療されている。しかし、治療された者の２５−３０％は再発性疾患を有し、かつ／または粘膜分泌物中の微生物を削減する。毒性ショックおよび重篤な感染症の抗生物質による治療は多くの場合、無効であり、かつ死亡率が５０％を越えうる（非特許文献３）。ペニシリンが重篤な侵襲性の連鎖球菌感染をうまく治療しえないことは、大きな接種原が迅速に固定相に達し、かつペニシリンがゆっくり増殖する細菌に対してあまり有効ではない現象によって生じる（非特許文献４）。したがって、依然として、連鎖球菌感染を予防し、または改善する有効な手段の継続的必要性がある。さらに具体的には、連鎖球菌感染を予防する免疫原性組成物に有用である抗原（または免疫原）を同定または開発する必要性が存在する。現在、免疫原として考えられているかかるポリペプチド抗原が、連鎖球菌システインプロテアーゼ、連鎖球菌プロテイナーゼ、またはストレプトペイン（ｓｔｒｅｐｔｏｐａｉｎ）としても知られる化膿連鎖球菌外毒素Ｂ（ＳｐｅＢ）である。
【０００５】
化膿連鎖球菌外毒素Ｂ（ＳｐｅＢ）は、４０ｋＤａ不活性プレ−プロ−酵素（すなわち、チモーゲン）として発現され（非特許文献５、非特許文献６）、２７アミノ酸ＮＨ２−末端シグナル配列を有し、そして１１８アミノ酸プロ−ペプチド配列（アミノ酸２８−１４５）、および２５３アミノ酸成熟配列（アミノ酸１４６−３９８）が続く。分泌すると、４０ｋＤａ  ＳｐｅＢチモーゲンは自己触媒活性化を受け、結果として１２ｋＤａ  ＮＨ２−末端プロ−ペプチドの除去および成熟２８ｋＤａ活性ＳｐｅＢ酵素の形成が生じる。この活性酵素への変換機序は、望ましくないタンパク質分解を阻止し、かつタンパク質分解活性の空間的および時間的調節を可能にする（非特許文献７）。
【０００６】
酵素のシステインエンドペプチダーゼ基のメンバーとして、ＳｐｅＢは活性部位でＣｙｓ−Ｈｉｓ対を含有する（非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０）。１９２位での単一のシステイン残基のセリンへ（以下、「Ｃ１９２Ｓ」）の置換は結果としてＳｐｅＢ酵素の検出可能なタンパク質分解活性の喪失が生じ、４０ｋＤａ  ＳｐｅＢチモーゲンの２８ｋＤａ成熟ＳｐｅＢ形態へのプロセッシングを阻止する（非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３）。
【０００７】
以前の試験の結果は、Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢ変異株の成熟形態が野生型ＳｐｅＢ酵素への最大の阻害活性による抗体の生成に必要であることを示した（非特許文献１２）。これは、免疫化のためにＣ１９２Ｓ  ＳｐｅＢ変異株のＮＨ２−末端切断、２８ｋＤａ成熟形態を生成する必要を示す。しかし、成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢの組換え発現（すなわち、そのＮＨ２−末端プロ配列の欠損）の結果として大腸菌における不溶性タンパク質の蓄積が生じる。
【０００８】
可溶性成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢ変異株を生成するための１つの方法は、４０ｋＤａ  ＳｐｅＢチモーゲンの制限タンパク質分解によっている。例えば、成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢ変異株を生成する４０ｋＤａ  Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢ変異株チモーゲンの制限タンパク質分解は、エラスターゼ、ペプシン、サーモリシン（非特許文献１２）、およびパパインを含む一部のプロテアーゼを使用して達成されている。これらのデータのほか、トリプシンおよびスブチリシンを利用する非特許文献６によって公開されたデータは、所望の２８ｋＤａ成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢ変異株が、さまざまなプロテイナーゼによる４０ｋＤａ  Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢ変異株チモーゲンの処理によって有効に生成されることを示す。
【０００９】
しかし、この方法には大規模生成に対するいくつかの制限を有する。第一に、成熟プロテアーゼの最終生成物収量は２つの連続精製ステップに対する要件、完全長チモーゲンに対する第１と、加工成熟プロテアーゼに対する第２の要件のため低い。第二に、特に大規模に、制限タンパク質分解反応のコンシステンシーおよび再現性と関係がある難点がある。最後に、切断に使用される酵素的に活性の外来プロテアーゼによる最終生成物の固有の汚染リスクがある。かかる汚染は、反応が樹脂固定化プロテアーゼで行われる場合でも回避することはきわめて困難である。
【００１０】
したがって、依然として、哺乳類宿主における連鎖球菌感染に対して有効な免疫原性組成物に対する技術上の必要性がある。したがって、成熟ＳｐｅＢが哺乳類宿主に投与された場合でも免疫原性である、成熟ＳｐｅＢポリペプチドを生成し、または発現させる方法を特定することがきわめて望ましい。また、成熟ＳｐｅＢポリペプチドの免疫原性形態を生成し、または発現させるかかる方法が、ＳｐｅＢ収量の減少、タンパク質分解コンシステンシー／再現性の制限、および外来酵素汚染のリスクなど前記大規模制限を回避することも望ましい。
【非特許文献１】ホープ・シンプソン（Ｈｏｐｅ−Ｓｉｍｐｓｏｎ）、１９８１年
【非特許文献２】スティーブンス（Ｓｔｅｖｅｎｓ）、１９９２年
【非特許文献３】デービス（Ｄａｖｉｅｓ）ら、１９９６年
【非特許文献４】スティーブンス（Ｓｔｅｖｅｎｓ）ら、１９９３年
【非特許文献５】ショセ（Ｃｈａｕｓｓｅｅ）ら、１９９３年
【非特許文献６】リュー（Ｌｉｕ）とエリオット（Ｅｌｌｉｏｔ）、１９６５年
【非特許文献７】カーン（Ｋｈａｎ）とジェイムズ（Ｊａｍｅｓ）、１９９８年
【非特許文献８】リュー（Ｌｉｕ）ら、１９６５年
【非特許文献９】リュー（Ｌｉｕ）、１９６５年
【非特許文献１０】タイ（Ｔａｉ）ら、１９７６年
【非特許文献１１】グッバ（Ｇｕｂｂａ）ら、１９９８年
【非特許文献１２】マツカ（Ｍａｔｓｕｋａ）ら、１９９９年
【非特許文献１３】ムサー（Ｍｕｓｓｅｒ）、１９９６年
【００１１】
（発明の開示）
本発明は、概して、宿主細胞における成熟化膿連鎖球菌外毒素Ｂ（ＳｐｅＢ）ポリペプチドを組換え発現させる方法、およびその免疫原性組成物に関する。より詳しくは、本発明は、宿主細胞における１２ｋＤａ  ＳｐｅＢプロ−ペプチドおよび２８ｋＤａ成熟ＳｐｅＢポリペプチドを共発現させ、ここで成熟ＳｐｅＢポリペプチドが宿主細胞において可溶性である新たな方法に関する。
【００１２】
したがって、一部の実施形態においては、本発明は、宿主細胞における成熟化膿連鎖球菌外毒素Ｂ（ＳｐｅＢ）ポリペプチドを組換え発現させるための方法であって、この方法は、（ｉ）（ａ）ＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインをコード化するポリヌクレオチド配列と（ｂ）成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列とを含んで成る、ポリシストロニックプラスミドで宿主細胞を形質転換し、形質導入し、トランスフェクトし、または感染させるステップと、（ｉｉ）宿主細胞によって成熟ＳｐｅＢポリペプチドおよびＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインの発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養するステップとを含んで成り、かつ成熟ＳｐｅＢポリペプチドが宿主細胞において可溶性である方法に関する。したがって、本発明のポリシストロニックプラスミド系においては、単一のプロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）がポリシストロニックｍＲＮＡ転写物の発現を推進するが、ここでポリシストロニックｍＲＮＡはその正確なリーディングフレームにおける２つもしくはそれ以上のポリペプチド（例えば、ＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインおよび成熟ＳｐｅＢポリペプチド）をコード化する。一部の実施形態においては、ＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインは配列番号２のアミノ酸残基２８〜１４５を含んで成るポリペプチドとしてさらに規定され、かつ成熟ＳｐｅＢポリペプチドは配列番号２のアミノ酸残基１４６〜３９８を含んで成るポリペプチドとしてさらに規定される。好ましい実施形態においては、成熟ＳｐｅＢポリペプチドのアミノ酸残基１９２でのシステインはセリンによって置換される。別の実施形態においては、成熟ＳｐｅＢポリペプチドは哺乳類宿主において免疫原性である。さらに別の実施形態においては、成熟ＳｐｅＢポリペプチドに特異的な抗体は野生型ＳｐｅＢポリペプチドと交差反応し、かつＳｐｅＢポリペプチド活性を無力化する。一部の好ましい実施形態においては、プラスミドはＴ７プロモーター含有プラスミドである。特定の実施形態においては、Ｔ７プロモーター含有プラスミドはｐＥＴ、ｐＲＳＥＴ、ｐＣＲＴ７−ＣＴＴＯＰＯ、およびｐＩＶｅＸより成る群から選択される。別の好ましい実施形態においては、宿主細胞は細菌細胞である。一部の実施形態においては、細菌宿主細胞は大腸菌である。さらに他の実施形態においては、大腸菌は、ＢＬＲ（ＤＥ３）、ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＡＤ４９４（ＤＥ３）、ＡＤ４９４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、ＢＬ２１ｔｒｘＢ（ＤＥ３）、ＢＬ２１ｔｒｘＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、およびＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩより成る群から選択される菌株である。
【００１３】
他の実施形態においては、本発明は、（ａ）（ｉ）ＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインをコード化するポリヌクレオチド配列を含んで成るプラスミドおよび（ｉｉ）成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列を含んで成るプラスミドで宿主細胞を形質転換し、形質導入し、トランスフェクトし、または感染させるステップと、（ｂ）ＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインおよび成熟ＳｐｅＢポリペプチドを共発現させるのに適切な条件下で宿主細胞を培養するステップとを含み、成熟ＳｐｅＢポリペプチドが宿主細胞において可溶性である、宿主細胞において成熟ＳｐｅＢポリペプチドを組換え発現させるための方法に関する。一部の実施形態においては、ＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインは配列番号２のアミノ酸残基２８〜１４５を含んで成るポリペプチドとしてさらに規定され、かつ成熟ＳｐｅＢポリペプチドは配列番号２のアミノ酸残基１４６〜３９８を含んで成るポリペプチドとしてさらに規定される。好ましい実施形態においては、成熟ＳｐｅＢポリペプチドのアミノ酸残基１９２でのシステインはセリンによって置換される。他の実施形態においては、成熟ＳｐｅＢポリペプチドは哺乳類宿主において免疫原性である。さらに他の実施形態においては、成熟ＳｐｅＢポリペプチドに特異的な抗体は野生型ＳｐｅＢポリペプチドと交差反応し、かつＳｐｅＢポリペプチド活性を無力化する。別の好ましい実施形態においては、プラスミドはＴ７プロモーター含有プラスミドである。特定の実施形態においては、Ｔ７プロモーター含有プラスミドはｐＥＴ、ｐＲＳＥＴ、ｐＣＲＴ７−ＣＴＴＯＰＯ、およびｐＩＶｅＸより成る群から選択される。さらに他の実施形態においては、宿主細胞は細菌細胞である。１つの好ましい実施形態においては、宿主細胞は大腸菌であり、ここで大腸菌は、ＢＬＲ（ＤＥ３）、ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＡＤ４９４（ＤＥ３）、ＡＤ４９４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、ＢＬ２１ｔｒｘＢ（ＤＥ３）、ＢＬ２１ｔｒｘＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、およびＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩより成る群から選択される菌株である。
【００１４】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列を含んで成るプラスミドを宿主細胞において組換え発現させ、ここで前記ＳｐｅＢポリペプチドが宿主細胞において不溶性ポリペプチド集合体を形成するステップと、（ｂ）ポリペプチド集合体を可溶化し、可溶化ポリペプチドが非ネイティブ成熟ＳｐｅＢポリペプチドとして規定されるステップと、（ｃ）シャペロンタンパク質の存在下に非ネイティブ成熟ＳｐｅＢポリペプチドを再折り畳みし、非ネイティブ成熟ＳｐｅＢポリペプチドがネイティブ成熟ＳｐｅＢポリペプチドへ折り畳まれるステップと、（ｄ）ネイティブＳｐｅＢポリペプチドを回収するステップとを含んで成る成熟ＳｐｅＢポリペプチドを生成するための方法に関する。好ましい実施形態においては、シャペロンタンパク質は、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ、ＰＰＩ、ＰＤＩ、およびＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインより成る群から選択される。特定の実施形態においては、シャペロンタンパク質は、配列番号２のアミノ酸残基２８〜１４５を含んで成るＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインである。好ましい実施形態においては、成熟ＳｐｅＢは、配列番号２のアミノ酸残基１４６〜３９８を含んで成るポリペプチドである。別の好ましい実施形態においては、成熟ＳｐｅＢポリペプチドのアミノ酸残基１９２におけるシステインがセリンによって置換される。さらに別の実施形態においては、不溶性ポリペプチド集合体は封入体としてさらに規定される。他の実施形態においては、ポリペプチドの可溶化が尿素、塩化グアニジニウム（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および熱などより成る群から選択される変性剤である。
【００１５】
さらに他の実施形態においては、本発明は、宿主細胞において（ｉ）成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＧｒｏＥＬポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列とを含んで成るポリシストロニックプラスミドを発現させるステップを含んで成り、成熟ＳｐｅＢポリペプチドが宿主細胞において可溶性である、宿主細胞において成熟ＳｐｅＢポリペプチドを組換え発現させるための方法に関する。好ましい実施形態においては、成熟ＳｐｅＢポリペプチドのアミノ酸残基１９２におけるシステインがセリンによって置換される。特定の実施形態においては、プラスミドは、ＧｒｏＥＳポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドをさらに含んで成る。
【００１６】
さらに他の実施形態においては、本発明は、（ａ）（ｉ）成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＧｒｏＥＬポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列とを含んで成るポリシストロニックプラスミドで宿主細胞を形質転換し、形質導入し、トランスフェクトし、または感染させるステップと、（ｂ）成熟ＳｐｅＢポリペプチドおよび前記ＧｒｏＥＬポリペプチドを発現させるのに適切な条件下で宿主細胞を培養し、ここで成熟ＳｐｅＢポリペプチドが宿主細胞に可溶性であるステップと、（ｃ）ネイティブ成熟ＳｐｅＢポリペプチドを回収するステップとを含んで成る成熟ＳｐｅＢポリペプチドを生成するために方法に関する。好ましい実施形態においては、成熟ＳｐｅＢポリペプチドのアミノ酸残基１９２におけるシステインがセリンによって置換される。
【００１７】
一部の他の実施形態においては、本発明は、本発明に記載された方法の１つもしくはそれ以上に従って生成される成熟ＳｐｅＢポリペプチドに関する。他の実施形態においては、本発明は、本発明の方法の１つに従って生成されるＳｐｅＢポリペプチドを含んで成る免疫原性組成物に関する。さらに他の実施形態においては、本発明は、化膿連鎖球菌に対して哺乳類の対象を免疫化する方法に関し、この方法は、対象に免疫原性量の免疫原性組成物を投与するステップを含んで成り、ここで免疫原性組成物は本発明の方法に従って生成される成熟ＳｐｅＢポリペプチドを含んで成る。
【００１８】
他の実施形態においては、本発明は、（ａ）ＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインをコード化するポリヌクレオチド配列と、（ｂ）成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列とを含んで成り、成熟ＳｐｅＢポリペプチドが宿主細胞において発現されると可溶性である、ポリシストロニックプラスミドに関する。一部の実施形態においては、成熟ＳｐｅＢポリペプチドのアミノ酸残基１９２でのシステインはセリンによって置換される。一部の他の実施形態においては、プラスミドはＴ７プロモーター含有プラスミドである。
【００１９】
一部の他の実施形態においては、本発明は、（ａ）ＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインをコード化するポリヌクレオチド配列を含んで成るプラスミド、および（ｂ）成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列を含んで成るプラスミドに関し、成熟ＳｐｅＢポリペプチドは宿主細胞において発現されると可溶性である。好ましい実施形態においては、成熟ＳｐｅＢポリペプチドのアミノ酸残基１９２でのシステインはセリンによって置換される。プラスミドはＴ７プロモーター含有プラスミドである。
【００２０】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列と、（ｂ）ＧｒｏＥＬポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列とを含んで成り、成熟ＳｐｅＢポリペプチドが宿主細胞で発現されると可溶性であるポリシストロニックプラスミドに関する。好ましい実施形態においては、成熟ＳｐｅＢポリペプチドのアミノ酸残基１９２におけるシステインはセリンによって置換される。一部の他の実施形態においては、プラスミドはＴ７プロモーター含有プラスミドである。
【００２１】
さらに別の実施形態においては、本発明は、（ａ）成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列と、（ｂ）ＧｒｏＥＬポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列と、（ｃ）ＧｒｏＥＳポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列とを含んで成り、成熟ＳｐｅＢポリペプチドが宿主細胞で発現されると可溶性であるポリシストロニックプラスミドに関する。好ましい実施形態においては、成熟ＳｐｅＢポリペプチドのアミノ酸残基１９２におけるシステインはセリンによって置換される。他の実施形態においては、プラスミドはＴ７プロモーター含有プラスミドである。
【００２２】
さらに他の実施形態においては、（ａ）成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列と、（ｂ）ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＰＤＩ、およびＰＰＩより成る群から選択される１つもしくはそれ以上のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列とを含んで成り、成熟ＳｐｅＢポリペプチドが宿主細胞で発現されると可溶性であるポリシストロニックプラスミドに関する。好ましい実施形態においては、成熟ＳｐｅＢポリペプチドのアミノ酸残基１９２におけるシステインがセリンによって置換される。他の実施形態においては、プラスミドはＴ７プロモーター含有プラスミドである。
【００２３】
別の実施形態においては、本発明は、本発明のプラスミドにより形質転換され、形質導入され、トランスフェクトされ、または感染された宿主細胞を提供する。
【００２４】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、その好ましい実施形態、および請求の範囲から明らかであろう。
【００２５】
（図面の簡単な記載）
図１Ａおよび１Ｂは組換え成熟ＳｐｅＢとプロ配列ドメインの相互作用を示す。図１Ａはペプシン生成成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢ（黒丸）、および成熟野生型ＳｐｅＢ（黒四角）の濃度増大を示し、これらはプロ配列ドメイン（黒記号）、またはリゾチーム（白記号）含有マイクロタイタープレートでインキュベートされ、かつ実施例１によって示されているようにＥＬＩＳＡで分析された。データは、各々二重に行われた３つの実験を代表する。図１Ｂは実施例１に示されているようにバイオコア（Ｂｉｏｃｏｒｅ）３０００の使用によって行われた、プロ配列ドメインと成熟ＳｐｅＢポリペプチドとの相互作用の実時間分析を示す。結果は表面プラスモン共鳴（相対反応）として表されている。
【００２６】
図２Ａおよび２Ｂは成熟ＳｐｅＢのプロ配列ドメイン介在阻害を示す。示されているのは、レゾルフィン標識カゼイン（図２Ａ）またはシステインプロテアーゼパパイン（図２Ｂ）を使用した成熟野生型ＳｐｅＢの阻害であり、ＳｐｅＢプロ配列ドメイン（黒四角）、またはリゾチーム（白三角）を使用した基質が実施例１に示されているように分析された。
【００２７】
図３は変性成熟ＳｐｅＢの再折り畳みに対する組換えプロ配列ドメインの効果を示す。変性成熟ＳｐｅＢを、ＰＢＳ、０．５Ｍアルギニン（黒丸）、ＰＢＳ、０．５Ｍアルギニン、２０μＭプロテアーゼ阻害剤Ｅ−６４（白丸）、ＰＢＳ（黒四角）、およびＰＢＳ、２０μＭ  Ｅ−６４（白四角）を含有する増大濃度のプロ配列ドメイン中に迅速に希釈した。反応を実施例１に示されているように行い、レゾルフィン標識カゼイン切断アッセイを使用してプロテアーゼ活性の存在について評価した。
【００２８】
図４は２−プラスミドベース発現構成物を示す略図である。２−プラスミドベース発現ベクターの特徴としては、図のように、ＫａｎＲ−カナマイシン耐性遺伝子（ａｐｈ（３’）−ｌａ）、ＡｍｐＲ−アンピシリン耐性遺伝子（ｂ−ラクタマーゼ）、複製のＯｒｉ−ｏｒｉｇｉｎ、ｌａｃｌｑ−ｌａｃレプレッサ、Ｔ７ベースプロモーター（Ｔ７またはＴ７ｌａｃ）、およびＴ７ターミネータが挙げられる。
【００２９】
図５Ａおよび５Ｂは、各々、ポリシストロニック発現系および合成リンカー領域を示す図表である。ポリシストロニック発現ベクター（図５Ａ）の特徴としては、図のように、ＫａｎＲ−カナマイシン耐性遺伝子（ａｐｈ（３’）−ｌａ）、複製のＯｒｉ−ｏｒｉｇｉｎ、ｌａｃｌｑ−ｌａｃレプレッサ、Ｔ７ｌａｃプロモーター、およびＴ７ターミネータが挙げられる。分析されたリンカー領域の塩基組成が示されている（図５Ｂ）。各リンカー領域のヌクレオチド番号（５ｎｔ、１０ｎｔ、２０ｎｔ、４０ｎｔ）は、プロ配列ドメインの遺伝子工学的ＴＡＡ翻訳停止コドン（ＰＳＤ停止）（太字テキスト）と、最適化シャイン・ダルガノリボソーム結合部位（ＳＤ）との間の塩基の数を示す。第２のシストロンの翻訳ＡＴＧ開始コドンは太字イタリックで示されている。
【００３０】
図６Ａおよび６Ｂはポリシストロニック発現系における可溶性成熟ＳｐｅＢおよびプロ配列ドメインレベルの評価および相対定量を示す。可溶性フラクションにおけるプロ配列ドメイン、および成熟ＳｐｅＢ発現に対する５ｎｔ、１０ｎｔ、２０ｎｔ、４０ｎｔリンカー含有Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢポリシストロニック系のＳＤＳ−ＰＡＧＥ評価が行われた（図６Ａ）。発現タンパク質の定量は、分子動力学パーソナル濃度計を使用して行われ、スキャン面の測定は発現レベルとして示された（図６Ｂ）。
【００３１】
図７はポリシストロニックｃＤＮＡの定量的ＰＣＲ分析を示す。ｃＤＮＡおよび−ＲＴ制御は実施例１に記載されているように調製され分析された。すべてのＣｔ値はＫａｎＲ  ｍＲＮＡ発現に標準化された。
【００３２】
図８は成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢの熱変性を示す。発現Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢチモーゲンのペプシン切断によって、または２−プラスミドおよびポリシストロニック共発現系によって生成された精製成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢの変性曲線は、実施例１に示されているように分析された。
【００３３】
図９は成熟野生型ＳｐｅＢの熱誘発変性を示す。自己触媒的プロセシング（すなわち、チモーゲン生成）によって、または２−プラスミドおよびポリシストロニック共発現系によって生成された精製成熟野生型ＳｐｅＢの変性曲線は、実施例１に示されているように分析された。
【００３４】
図１０は組換え成熟ＳｐｅＢの操作モル濃度の評価を示す。自動触媒（黒四角）のほか、２−プラスミド（黒丸）およびポリシストロニック（黒三角）共発現によって生成された当量（０．１２μＭ）の精製成熟野生型ＳｐｅＢが、実施例１に記載されているようにレゾルフィン標識カゼイン切断アッセイを使用して評価された。２５℃下に１時間のインキュベーション時間を切断反応用に使用した。ポリシストロニック発現によって生成された精製成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢ（白ダイヤ）が対照として評価された。
【００３５】
図１１は野生型ＳｐｅＢタンパク質分解活性の抗体介在阻害を示す。２−プラスミド（黒ダイヤ）、またはポリシストロニック系（白四角）によって生成された成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢに対して生成される抗血清の増大量が、レゾルフィン標識カゼイン切断アッセイを使用して成熟野生型ＳｐｅＢのタンパク質分解活性を特異的に阻害する能力について評価された。３７℃下に２時間のインキュベーション時間を切断反応用に使用した。免疫前血清が分析用の陰性対照（トリ−スター）が使用された。
【００３６】
（発明の詳細な記載）
以下に記載される本発明は、免疫原性組成物で使用する化膿連鎖球菌外毒素Ｂ（以下、「ＳｐｅＢ」）を生成する方法に対する技術上の必要性に対処する。一部の好ましい実施形態においては、本発明は、免疫原性組成物で使用する成熟ＳｐｅＢを生成する方法に関する。より詳しくは、以下に記載される本発明は、宿主細胞における成熟ＳｐｅＢポリペプチドを組換え発現させる方法に対する技術上の必要性に対処し、ここで発現成熟ＳｐｅＢポリペプチドは宿主細胞において可溶性である。好ましい実施形態においては、本発明の方法に従って生成される成熟ＳｐｅＢポリペプチドは、哺乳類宿主に投与されると免疫原性である。
【００３７】
以下に規定される、化膿連鎖球菌で発現される「ＳｐｅＢチモーゲン」は、配列番号２のアミノ酸１−３９８を含んで成る４０ｋＤａプレ−プロ−ポリペプチドである。ＳｐｅＢチモーゲンは、２７アミノ酸ＮＨ２−末端シグナル（「プレ」）配列を有する酵素的に不活性な（すなわち、チモーゲン）、４０ｋＤａ、プレ−プロ−ポリペプチドとして発現され、そして１１８アミノ酸プロ−ポリペプチド（「プロ」）配列、および２５３アミノ酸成熟ポリペプチド配列が続く。したがって、以下に規定されているように、ＳｐｅＢチモーゲンの「プレ」配列は、配列番号２のアミノ酸１−２７を含んで成る。同様に、以下に規定されているように、ＳｐｅＢチモーゲンの「プロ配列」、「プロ配列ドメイン」、「プロ−ポリペプチド配列」、および「プロ−ポリペプチドドメイン」は同じ意味で使用され、ここでプロ配列は配列番号２のアミノ酸２８−１４５を含んで成る。
【００３８】
ネイティブ細菌（すなわち、化膿連鎖球菌）によって分泌されると、４０ｋＤａ  ＳｐｅＢチモーゲンは自己触媒活性化を受け、結果として１２ｋＤａ  ＮＨ２−末端プロ−ポリペプチド配列（すなわち、配列番号２のアミノ酸８−１４５）の除去および成熟２８ｋＤａタンパク質分解活性ＳｐｅＢポリペプチド（または酵素）の形成が生じる。以下に規定されているように、「成熟ＳｐｅＢ」ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１４６−３９８を含んで成る２８ｋＤａポリペプチドであり、ここで成熟ＳｐｅＢポリペプチドはシステインプロテアーゼ活性を有する。以下に規定されているように、「成熟ＳｐｅＢ」ポリペプチドおよび「成熟野生型ＳｐｅＢ」ポリペプチドは同じ意味で使用され、その両方は配列番号２のアミノ酸１４６−３９８を含んで成る野生型２８ｋＤａポリペプチドを指し、ここでポリペプチドはシステインプロテアーゼ活性を有する。
【００３９】
ＳｐｅＢ活性部位は、配列番号２のアミノ酸残基１９２および３４０でＣｙｓ−Ｈｉｓ対を含有する。１９２位での単一のシステイン残基のセリン残基（以下、「Ｃ１９２Ｓ」または「Ｃ１９２Ｓ変異株」）へのアミノ酸置換（すなわち、突然変異）は、成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢポリペプチドの検出可能なタンパク質分解活性の喪失をもたらす。したがって、以下に規定されているように、「Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢチモーゲン」または「Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢ変異株」は、配列番号２のアミノ酸２８−３９８を含んで成り、ここで１９２位でのシステインアミノ酸残基はセリンアミノ酸残基に変異されている。以下に規定されているように、「成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢ」ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１４６−３９８を含んで成る２８ｋＤａポリペプチドであり、ここで１９２位でのシステインアミノ酸残基はセリンアミノ酸残基に変異されており、ここで成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢポリペプチドは成熟野生型ＳｐｅＢポリペプチドに対するシステインプロテアーゼ活性を有さない。
【００４０】
したがって、一部の実施形態においては、本発明は、成熟ＳｐｅＢポリペプチド、かつより好ましくは、成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢポリペプチドを含んで成る免疫原性組成物に関する。例えば、Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢ変異株による以前の免疫学的試験では、成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢポリペプチド（すなわち、ＮＨ２−末端プロ−ポリペプチド配列の欠損）が、成熟野生型ＳｐｅＢポリペプチドへの最大の阻害活性（すなわち、交差再活性）による抗体の生成に必要であることが明らかにされている（マツカ（Ｍａｔｓｕｋａ）ら、１９９９年）。したがって、本明細書では、化膿連鎖球菌感染に対して哺乳類を免疫化するために有効な免疫原性組成物が、少なくとも成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢまたは成熟野生型ＳｐｅＢポリペプチド抗原を含んで成ることが考えられている。しかし、大腸菌宿主細胞における成熟ＳｐｅＢポリペプチドの組換え発現が、もっぱら大腸菌における不溶性ＳｐｅＢポリペプチド集合体の生成をもたらすことが当技術分野で周知である（マツカ（Ｍａｔｓｕｋａ）ら、１９９９年）。
【００４１】
したがって、特定の実施形態においては、本発明は、「成熟」および「可溶性」である宿主細胞におけるＳｐｅＢポリペプチドの発現の困難さを克服する方法に関する。例えば、本発明の１つの実施形態においては、成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢポリペプチド（または成熟野生型ＳｐｅＢ）をコード化するプラスミドと、宿主細胞におけるプロ−ポリペプチドドメイン（すなわち、配列番号２のアミノ酸２８−１４５）をコード化するプラスミドとの共発現が、宿主細胞における可溶性、成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢポリペプチド（または成熟野生型ＳｐｅＢ）の有効な発現をもたらすことが明らかにされている（例えば、実施例３を参照）。同様に、ポリシストロニックプラスミドが、成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢポリペプチド（または成熟野生型ＳｐｅＢ）とプロ−ポリペプチド配列（配列番号２のアミノ酸２８−１４５）の両方をコード化する、宿主細胞におけるポリシストロニックプラスミドの組換え共発現も、」宿主細胞における可溶性、成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢポリペプチド（または成熟野生型ＳｐｅＢ）の発現をもたらす（例えば、実施例４を参照）。
【００４２】
したがって、以下に記載される本発明は、宿主細胞において可溶性成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢポリペプチド（または成熟野生型ＳｐｅＢ）を発現させ、可溶性成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢポリペプチドが化膿連鎖球菌感染に対して哺乳類を免疫化するための免疫原性組成物において特に有用である、新たな方法、およびその新たな組成物を提供する。したがって、一部の好ましい実施形態においては、本発明は、成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢポリペプチド（または成熟野生型ＳｐｅＢ）をコード化するプラスミドと、宿主細胞におけるプロ−ポリペプチドドメイン（すなわち、配列番号２のアミノ酸２８−１４５）をコード化するプラスミドを共発現させ、ここで成熟ＳｐｅＢポリペプチドが宿主細胞において可溶性である方法に関する。一部の他の好ましい実施形態においては、本発明は、宿主細胞におけるポリシストロニックプラスミドを発現させる方法に関し、ここでポリシストロニックプラスミドは、成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢポリペプチド（または成熟野生型ＳｐｅＢ）とプロ−ポリペプチド配列（配列番号２のアミノ酸２８−１４５）の両方をコード化し、ここで成熟ＳｐｅＢポリペプチドは宿主細胞において可溶性である。
【００４３】
本発明は、可溶性成熟ＳｐｅＢの生成を調節するプロ配列ドメインの要件を明らかにし、プロ配列ドメインが成熟ＳｐｅＢポリペプチドの適切な折り畳みに対する分子内シャペロンとして機能することを示す。成熟野生型ＳｐｅＢポリペプチドまたは成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢのいずれかとのプロ配列ドメインの関連性は、それぞれ、約１１ｎｍおよび３４ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する（実施例２）。これらの結合値は、プロ配列ドメインと成熟ＳｐｅＢポリペプチドドメインとの間の高い親和性を示す。また、プロ配列ドメインの分子シャペロン活性は、尿素変性成熟ＳｐｅＢを使用してインビトロで明らかにされている（実施例２）。
【００４４】
したがって、特定の実施形態においては、本発明は、不溶性成熟ＳｐｅＢ集合体のタンパク質補助折り畳みの方法に関する。例えば、本発明の１つの実施形態は、（ａ）成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列を含んで成るプラスミドを宿主細胞において組換え発現させ、ここでＳｐｅＢポリペプチドが宿主細胞において不溶性ポリペプチド集合体を形成するステップと、（ｂ）ポリペプチド集合体を可溶化し、可溶化ポリペプチドが非ネイティブ成熟ＳｐｅＢポリペプチドとして規定されるステップと、（ｃ）１つもしくはそれ以上のシャペロンタンパク質の存在下に非ネイティブ成熟ＳｐｅＢポリペプチドを再折り畳みし、非ネイティブ成熟ＳｐｅＢポリペプチドがネイティブ成熟ＳｐｅＢポリペプチドへ折り畳まれるステップと、（ｄ）ネイティブ成熟ＳｐｅＢポリペプチドを回収するステップとを含んで成る成熟ＳｐｅＢポリペプチドを生成するための方法に関する。
【００４５】
同様に、他の実施形態においては、本発明は、成熟ＳｐｅＢポリペプチドが１つもしくはそれ以上の分子シャペロンタンパク質の存在下に発現される、タンパク質補助折り畳みの方法に関する。例えば、本発明は、（ａ）成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列と、（ｂ）ＧｒｏＥＬポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列とを含んで成るポリシストロニックプラスミドを宿主細胞において組換え発現させ、ここで成熟ＳｐｅＢポリペプチドが宿主細胞において可溶性であり、かつ（ｃ）ネイティブ成熟ＳｐｅＢポリペプチドを回収するステップを含んで成る、宿主細胞において成熟ＳｐｅＢポリペプチドを発現するための方法を提供する。
【００４６】
Ａ．ＳｐｅＢ抗原をコード化するポリヌクレオチド
本発明の単離および精製化膿連鎖球菌ポリヌクレオチドは、成熟ＳｐｅＢポリペプチド抗原の生成において使用される。さらに具体的には、一部の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは成熟ＳｐｅＢポリペプチドおよびＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインをコード化し、ここで成熟ＳｐｅＢポリペプチドは宿主細胞において発現されると可溶性である。したがって、本発明の一部の実施形態においては、ポリヌクレオチドは配列番号２のアミノ酸１４６〜３９８を含んで成る成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化し、第２のポリヌクレオチドは配列番号２のアミノ酸２８〜１４５を含んで成るプロ−ポリペプチドドメインをコード化する。好ましい実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは成熟Ｃ１９２ＳｐｅＢポリペプチドをコード化し、ここで成熟Ｃ１９２ＳＳｐｅＢポリペプチドは配列番号２のアミノ酸１４６〜３９８を含んで成り、ここで配列番号２のアミノ酸残基１９２でのシステインはセリン残基に変異されている。一部の好ましい実施形態においては、成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは配列番号１のヌクレオチド４３６〜１１９７を含んで成り、成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは配列番号１のヌクレオチド４３６〜１１９７を含んで成り、ここで配列番号２のアミノ酸残基１９２はセリンアミノ酸であり、かつプロ−ポリペプチドドメインをコード化するポリヌクレオチドは配列番号１のヌクレオチド８２〜４３５を含んで成る。
【００４７】
したがって、特定の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドはＤＮＡ分子であり、ここでＤＮＡはゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはｃＤＮＡでありうる。好ましい実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは組換えｃＤＮＡポリヌクレオチドである。別の好ましい実施形態においては、成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは第１のプラスミドベクターに含まれており、かつＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインをコード化するポリヌクレオチドは第２のプラスミドベクターに含まれており、ここで両方のベクターは宿主細胞において共発現される。別の好ましい実施形態においては、成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドおよびＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインをコード化するポリヌクレオチドはポリシストロニック発現構成物に含まれている。セクションＥ（実施例４および図９）に記載されているように、本発明のポリシストロニック構成物は、５’〜３’の方向でＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインを第１のシストロンとして含んで成り、そして翻訳エンハンサーおよび最適化シャイン・ダルガノリボソーム結合部位および成熟ＳｐｅＢを第２のシストトロンとして含んで成る合成リンカーが続く。別の実施形態においては、本発明のポリシストロニック構成物は、５’〜３’の方向で成熟ＳｐｅＢを第１のシストロンとして含んで成り、そして翻訳エンハンサーおよび最適化シャイン・ダルガノリボソーム結合部位およびＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインを第２のシストロンとして含んで成る合成リンカーが続く。
【００４８】
以下で使用される「ポリヌクレオチド」という語は、ホスホジエステル結合によって結合されたヌクレオチドの配列を意味する。ポリヌクレオチドは以下、５’〜３’の方向で示されている。本発明のポリヌクレオチドは、約１０〜約数十万の塩基対を含んで成る。好ましくは、ポリヌクレオチドは約１０〜約３，０００の塩基対を含んで成る。特定のポリヌクレオチドの好ましい長さは以下に記載されている。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子、リボ核酸（ＲＮＡ）分子、またはヌクレオチド類似体を使用して生成されるＤＮＡもしくはＲＮＡの類似体である。核酸分子は一本鎖また二本鎖であるが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。ポリヌクレオチドはＤＮＡ分子である場合、その分子は遺伝子、ｃＤＮＡ分子、またはゲノムＤＮＡ分子である。ヌクレオチド塩基は、単一の文字表記によって以下に示されている。すなわち、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、イノシン（Ｉ）およびウラシル（Ｕ）。
【００５０】
「単離」は、天然状態から「人が作ったものによって」変化されていることを意味する。「単離」組成物または物質は、その最初の環境から変更もしくは除去、または変更および除去されているものである。例えば、生きた動物に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されず、その天然状態の共存する物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、その語が以下で使用されるように「単離」である。
【００５１】
好ましくは、「単離」ポリヌクレオチドは、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおける核酸を天然にフランキングする配列（すなわち、核酸の５’および３’末端に位置した配列）を含まない。例えば、さまざまな実施形態においては、単離ＳｐｅＢ核酸分子は、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおける核酸分子を天然にフランキングする約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有する。しかし、ＳｐｅＢ核酸分子はタンパク質コードまたは調節配列に融合し、それでも単離とみなされる。
【００５２】
本発明のＳｐｅＢポリヌクレオチドは、標準クローニングおよびスクリーニング法を使用し、ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡライブラリーから得られる。本発明のポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡライブラリー（例えば、化膿連鎖球菌ライブラリー）などの天然源からも得られ、または公知および市販の方法を使用して合成される。
【００５３】
成熟ＳｐｅＢおよび／またはＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインをコード化するポリヌクレオチドの相同分子種および対立遺伝子変異体は、当技術分野で周知の方法を使用して容易に同定される。ポリヌクレオチドの対立遺伝子変異体および相同分子種は、配列番号１に示されているヌクレオチド配列、またはこのヌクレオチド配列の断片の一般的に少なくとも約７０−７５％、より一般的に少なくとも約８０−８５％、かつ最も一般的に少なくとも約９０−９５％もしくはそれ以上の相同のヌクレオチド配列を含んで成る。かかる核酸分子は、好ましくは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１に示されているヌクレオチド配列、またはこのヌクレオチド配列の断片にハイブリッド可能であることが容易に同定される。
【００５４】
成熟ＳｐｅＢポリペプチドおよびＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインをコード化するポリヌクレオチドは、宿主細胞における可溶性成熟ＳｐｅＢポリペプチドまたはその断片の組換え生成のために使用される。ポリヌクレオチドは、成熟ＳｐｅＢポリペプチドのコード配列および／またはＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインのコード配列を含みうる。ポリヌクレオチドは、転写、非翻訳配列、スプライシングシグナル、プロモーター／エンハンサー配列、リボソーム結合部位、およびポリアデニル化シグナルなど非コード５’および３’配列も含有しうる。
【００５５】
したがって、一部の実施形態においては、本発明によって提供されるポリペプチド配列情報（すなわち、配列番号１）は、以下に開示される選択ポリヌクレオチドの遺伝子配列に特異的にハイブリッドする能力を有する比較的短いＤＮＡ（またはＲＮＡ）オリゴヌクレオチド配列の調製を可能にする。以下で使用される「オリゴヌクレオチド」という語は、２個もしくはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、通常、３個（３）超、および通常１０個（１０）超、さらに１００個（１００）もしくはそれ以上（ただし好ましくは、２０〜３０個）までから成る分子として規定される。正確なサイズは、多くの因子によって決まり、言い換えると、オリゴヌクレオチドの最終の機能または使用によって決まる。したがって、本発明の特定の実施形態においては、適切な長さの核酸プローブが選択ヌクレオチド配列の検討に基づき調製される。かかる核酸プローブが成熟ＳｐｅＢポリペプチドまたはＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインをコード化するポリヌクレオチドに特異的にハイブリッドする能力は、さまざまな実施形態においてそれらに特定の有用性を与える。最も重要なことだが、これらのプローブは所定のサンプルにおける相補配列の存在を検出するためのさまざまなアッセイにおいて使用される。
【００５６】
一部の実施形態においては、オリゴヌクレオチドプライマーを使用することが有利である。これらのプライマーは、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、またはその組合せを含む任意のやり方で生成されうる。かかるプライマーの配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して原核細胞からＳｐｅＢポリペプチドをコード化するＳｐｅＢポリヌクレオチドの規定部分を検出、増幅、または変異で使用するための本発明のポリヌクレオチドを使用して指定される。
【００５７】
一部の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドをハイブリッド形成を検出するための適切な標識と組合せて使用することが有利である。多種多様の適切な標識は、検出可能シグナルを与える能力があるアビジン／ビオチンなど、放射性、酵素、または他のリガンドを含めて当技術分野で周知である。
【００５８】
本発明による利点の一部を提供するために、ハイブリダイゼーション試験またはアッセイに使用される好ましい核酸配列としては、配列番号２のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの少なくとも１０個〜約１８個のヌクレオチド長ストレッチに相補的であるプローブ分子が挙げられる。長さが少なくとも１０個のヌクレオチドのサイズは、断片が安定かつ選択的である二重分子を形成するのに十分な長さであることを確実にするために役立つ。しかし、ハイブリッドの安定性および選択性を増大させ、それによって得られる特異的ハイブリッド分子の質および程度を改善するために、長さが１０個超の塩基のストレッチにわたって相補配列を有する分子が一般に好ましい。かかる断片は、例えば、化学的手段によって断片を直接合成することによって、（参照することにより本明細書で援用される米国特許第４，６８３，２０２号明細書）のＰＣＲ技術など核酸再生成技術の適用によって、または適切な挿入および適切な制限酵素部位を含有する組換えプラスミドから選択ＤＮＡ断片を切除することによって容易に調製される。
【００５９】
したがって、本発明のポリヌクレオチドプローブ分子は、遺伝子の相補ストレッチで二重分子を選択的に形成するその能力のために使用される。想定される適用によって、ターゲット配列のためにプローブの各種程度の選択性を達成するのに各種条件のハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを使用することが望まれる（以下の表１を参照）。高度の選択性を必要とする用途のために、通常、比較的ストリンジェントな条件を使用してハイブリッドを形成することが望まれる。一部の用途、例えば、基礎を成すテンプレートにハイブリッドされる変異株プライマー鎖を使用する変異株を調製することが望まれ、または相同ポリペプチドコード配列を他の細胞、機能的同等物などから単離することが求められる場合には、ヘテロ２本鎖形成を可能にするあまり厳しくないハイブリダイゼーション条件が通常、必要とされる（表１を参照）。それによって、クロスハイブリダイゼーション種は、対照ハイブリダイゼーションに対する陽性ハイブリダイゼーションシグナルとして容易に同定される。ともかく、一般に、条件は、温度の上昇と同じやり方でハイブリッド二本鎖の不安定化に使用される増加量のホルムアミドの添加によって、より厳しく与えられることが予想される。したがって、ハイブリダイゼーション条件は容易に操作され、したがって、一般に所望の結果によって選択される方法となる。
【００６０】
本発明は、低ストリンジェントな条件、より好ましくは、ストリンジェントな条件、かつ最も好ましくは、高ストリンジェントなな条件下で、以下に記載されたポリヌクレオチドにハイブリッド可能なポリヌクレオチドも含む。ストリンジェントな条件の例は以下の表１に示されている。すなわち、高ストリンジェントな条件は、少なくとも、例えば、条件Ａ−Ｆのストリンジェンシーであり、ストリンジェントな条件は、少なくとも、例えば、条件Ｇ−Ｌのストリンジェンシーであり、低ストリンジェントな条件は、少なくとも、例えば、条件Ｍ−Ｒのストリンジェンシーである。
【００６１】
【表１】
2007536900.tif 000003
【００６２】
（ｂｐ）Ｉ：ハイブリッド長さは、ハイブリダイズするポリヌクレオチドののハイブリッド領域について予想される。ポリヌクレオチドを未知の配列のターゲットポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合、ハイブリッド長さはポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションのものと想定される。既知の配列のポリヌクレオチドがハイブリダイズされる場合、ハイブリッド長さはポリヌクレオチドの配列を調整し、最適な配列相補性の領域または各領域を同定することによって決定される。
バッファーＨ：ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄バッファー中ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、および１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）に代替され、洗浄はハイブリダイゼーションの完了後１５分間行われる。
ＴＢ〜ＴＲ：長さが５０未満の塩基対であることが予想されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）よりも５−１０℃低くあるべきであり、ここでＴｍは以下の等式に従って決定される。長さが１８未満の塩基対のハイブリッドは、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の＃）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の＃）。長さが１８〜４９の塩基対のハイブリッドでは、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、ここでＮはハイブリッド中の塩基の数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーションバッファー中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。
【００６３】
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件の追加の例は、参照することにより以下に援用される、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州、第９章および第１１章、およびオーズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、１９９５年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）編、第２．１０節および第６．３−６．４節に示されている。
【００６４】
Ｂ．成熟ＳＰＥＢポリペプチド抗原
特定の実施形態においては、本発明は、成熟ＳｐｅＢポリペプチドおよび／または成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢポリペプチドを含んで成る免疫原を提供する。一部の実施形態においては、これらの免疫原は化膿連鎖球菌感染に対して哺乳類宿主を免疫化するための免疫原性組成物において使用される。好ましい実施形態においては、免疫原は、高率の異種化膿連鎖球菌株に対する保護（すなわち、交差保護）を与える成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢポリペプチドである。
【００６５】
抗原または免疫原が通常、免疫原性に基づき規定される。免疫原性は、体液性および／または細胞介在免疫応答を誘発する能力として規定される。したがって、「抗原」または「免疫原」という語は、以下に規定されているように、体液性および／または細胞介在免疫応答を誘発する能力を有する分子である。
【００６６】
したがって、１つの実施形態においては、本発明は、少なくとも化膿連鎖球菌成熟ＳｐｅＢポリペプチドおよび／または成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢポリペプチドを含んで成る免疫原性組成物に関する。好ましい実施形態においては、成熟ＳｐｅＢポリペプチド抗原は、配列番号２のアミノ酸１４６〜３９８を含んで成る。別の好ましい実施形態においては、成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢポリペプチド抗原は配列番号２のアミノ酸１４６〜３９８を含んで成り、ここで配列番号２の１９２位でのアミノ酸はシステインからセリン残基に変異されている。本発明の一部の他の実施形態においては、成熟ＳｐｅＢポリペプチドおよび／または成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢポリペプチドを含んで成る免疫原性組成物は、１つまたは追加のポリペプチド抗原（すなわち、ＳｐｅＢ以外のポリペプチド）をさらに含んで成り、ここで１つもしくはそれ以上の追加のポリペプチド抗原は化膿連鎖球菌抗原または他の感染性細菌および／またはウイルスからの抗原である。
【００６７】
本発明によるＳｐｅＢポリペプチドの生物学的同等物または変異体は、ＳｐｅＢチモーゲン、Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢチモーゲン、成熟ＳｐｅＢポリペプチド、成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢポリペプチド、およびＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインより成る群から選択される化膿連鎖球菌ポリペプチドと実質的な相同を含有するポリペプチドを包含する。例えば、成熟ＳｐｅＢポリペプチドおよび成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢポリペプチドの生物学的同等物または変異体も、成熟ＳｐｅＢポリペプチドが免疫原性反応を引き出す能力を維持する限り、配列番号２の成熟ＳｐｅＢポリペプチドが修飾されているポリペプチドを含む。一般に、成熟ＳｐｅＢポリペプチドの機能的な生物学的同等物または変異体は天然アミノ酸配列変異体であり、ここで成熟ＳｐｅＢポリペプチドは免疫原性反応を引き出す能力を維持する。
【００６８】
修飾および変更が本発明の成熟ＳｐｅＢポリペプチドの構造においてなされ、それでもＳｐｅＢ免疫原性特性を有する分子が得られる。ポリペプチドの生物学的機能活性を規定するのはポリペプチドの相互作用的能力および性質であるため、一部のアミノ酸配列置換がポリペプチド配列（または、もちろん、その基礎を成すＤＮＡコード配列）においてなされ、それでも同様の特性を有するポリペプチドが得られる。
【００６９】
アミノ酸置換は一般に、アミノ酸側鎖置換、例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズなどの相対類似性に基づく（例えば、以下、参照することによりその全体が援用される、カイト（Ｋｙｔｅ）とドリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）、１９８２年、および米国特許第４，５５４，１０１号明細書を参照）。さまざまな上述の特性を考慮に入れる例示の置換は当業者には公知であり、アルギニンおよびリジン、グルタミン酸塩およびアスパラギン酸塩、セリンおよびトレオニン、グルタミンおよびアスパラギン、およびバリン、ロイシンおよびイソロイシンを含む（以下の表２を参照）。したがって、本発明では、上記されているように成熟ＳｐｅＢポリペプチドの機能的または生物学的同等物が意図されている。
【００７０】
【表２】
2007536900.tif 000004
【００７１】
本発明の特定の実施形態においては、多価または組合せ免疫原性組成物が提供される。組合せ免疫原性組成物が、１つもしくはそれ以上の追加の抗原とともに、１つもしくはそれ以上の本発明のポリペプチド（例えば、成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢ）、またはその断片（例えば、ＳｐｅＢエピトープ断片）を含むことによって提供される。特に、組合せ免疫原性組成物は１つもしくはそれ以上の成熟ＳｐｅＢポリペプチド、またはその断片を、１つもしくはそれ以上のポリペプチド、ポリペプチド断片、糖質、オリゴ糖類、脂質、リポオリゴ糖類、多糖類、オリゴ糖類−タンパク質コンジュゲート、多糖類−タンパク質コンジュゲート、ペプチド−タンパク質コンジュゲート、オリゴ糖類−ペプチドコンジュゲート、多糖類−ペプチドコンジュゲート、タンパク質−タンパク質コンジュゲート、リポオリゴ糖類−タンパク質コンジュゲート、または多糖類−タンパク質コンジュゲートと組合わせることによって提供される。
【００７２】
したがって、一部の実施形態においては、上記の１つもしくはそれ以上の抗原は、化学的付着（すなわち、接合）によって抗原担体タンパク質にコンジュゲートされる。ポリペプチドを担体タンパク質に接合させる手段は当技術分野で周知であり、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンコイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、カルボジイミド、およびビス−ビアゾチ化（ｂｉａｚｏｔｉｚｅｄ）ベンジジンを含む。
【００７３】
例示の従来のタンパク質担体は、大腸菌ＤｎａＫタンパク質、ガラクトキナーゼ（ｇａｌＫ）、ユビキチン、α−接合因子、β−ガラクトシダーゼ、およびインフルエンザＮＳ−１タンパク質を含むがこれらに限定されない。トキソイド（すなわち、その毒性活性を削減するように十分な修飾による天然毒素をコード化する配列）、例えば、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイド、その各毒素、およびこれらタンパク質の突然変異型も担体として使用されうる。例示の担体タンパク質はジフテリア毒素ＣＲＭ１９７である（ジフテリア毒素の非毒性形態、参照することによりその全体が本明細書で援用される、米国特許第５，６１４，３８２号明細書を参照）。他の担体としては、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の外毒素Ａ、大腸菌の易熱性毒素、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）、およびロタウイルス粒子（ロタウイルスおよびＶＰ６粒子を含む）が挙げられる。あるいは、担体タンパク質または他の免疫原性タンパク質の断片またはエピトープが使用されうる。例えば、ハプテンが細菌毒素のＴ細胞エピトープに結合されうる（米国特許第５，７８５，９７３号明細書を参照。同様に、さまざなな細菌熱ショックタンパク質、例えば、マイコバクテリアｈｓｐ−７０が使用されうる。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は別の有用な担体である。当業者は、これに関して使用される適切な担体を容易に選択することができる。
【００７４】
一部の実施形態においては、本発明は、不溶性成熟ＳｐｅＢ集合体のタンパク質補助折り畳みの方法に関する。同様に、他の実施形態においては、本発明はタンパク質補助折り畳みの方法に関し、ここで成熟ＳｐｅＢポリペプチドは、１つもしくはそれ以上の分子シャペロンタンパク質の存在下に発現される。
【００７５】
例えば、１つの実施形態においては、本発明は、（ａ）成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列を含んで成るプラスミドを宿主細胞において組換え発現させ、ここでＳｐｅＢポリペプチドが宿主細胞において不溶性ポリペプチド集合体を形成するステップと、（ｂ）ポリペプチド集合体を可溶化し、可溶化ポリペプチドが非ネイティブ成熟ＳｐｅＢポリペプチドとして規定されるステップと、（ｃ）シャペロンタンパク質の存在下に非ネイティブ成熟ＳｐｅＢポリペプチドを再折り畳みし、非ネイティブ成熟ＳｐｅＢポリペプチドがネイティブ成熟ＳｐｅＢポリペプチドへ折り畳まれるステップと、（ｄ）前記ネイティブ成熟ＳｐｅＢポリペプチドを回収するステップとを含んで成る成熟ＳｐｅＢポリペプチドを生成するための方法に関する。一部の他の実施形態においては、本発明は、（ｉ）成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＧｒｏＥＬポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列とを含んで成るポリシストロニックプラスミドを含んで成る宿主細胞における成熟ＳｐｅＢポリペプチドを組換え発現させ、ここで成熟ＳｐｅＢポリペプチドが宿主細胞において可溶性である方法を提供する。
【００７６】
したがって、特定の実施形態においては、本発明は、成熟ＳｐｅＢポリペプチドの折り畳みを支援する分子シャペロンタンパク質を提供する。分子シャペロンは当技術分野で周知であり、トリガー因子（ＴＦ）などのリボソーム結合タンパク質、Ｈｓｐ７０、ＤｎａＫ、Ｈｓｐ４０、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥなどのシャペロンのＨｓｐ７０ファミリー、およびＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ１０などのシャペロンのシャペロニンファミリーを含むがこれらに限定されない（クレイトン（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）、１９９３年、ハルトル（Ｈａｒｔｌ）とヘイヤー・ハルトル（Ｈａｙｅｒ−Ｈａｒｔｌ）、２００２年）。本発明の使用に考えられている分子シャペロンタンパク質のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は当技術分野で周知であり（例えば、各々参照することによりその全体が本明細書で援用される、米国特許第６，１５９，７０８号明細書、米国特許第６，０１０，８７９号明細書、米国特許第５，７７６，７２４号明細書、およびロリマー（Ｌｏｒｉｍｅｒ）とボールドウィン（Ｂａｌｄｗｉｎ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９９８年を参照）、折り畳み／再折り畳み要件、補因子などが、所定の分子シャペロンタンパク質に対して以下に記載されている。
【００７７】
したがって、非限定的実施例によって、大腸菌からの分子シャペロニンＧｒｏＥＬはシャペロンの熱ショックタンパク質６０（Ｈｓｐ６０）クラスのメンバーであり、大腸菌ＧｒｏＥオペロンからのＧｒｏＥＳとともに発現される。ＧｒｏＥＬは、集合の傾向があるポリペプチド中間体の濃度およびオフ経路集合率を減少させる折り畳まれていないタンパク質（例えば、成熟ＳｐｅＢ）を結合することによってタンパク質折り畳み反応を支援し、それによってネイティブな立体構造（例えば、適切に折り畳まれた可溶性成熟ＳｐｅＢ）に有利に分配する。補シャペロニンＧｒｏＥＳ、およびＡＴＰ、Ｋ＋、およびＭｇ２＋などの補因子は、ＧｒｏＥＬ介在ポリペプチド折り畳み反応の収量をさらに増大させることが知られている。したがって、特定の実施形態においては、当業者は、シャペロン介在（または補助）タンパク質折り畳みを改善または強化するために当技術分野で周知の成分、補因子、追加のシャペロンタンパク質などを含めるであろう。
【００７８】
機序は所定のシャペロンファミリーまたはクラスで変動しうるが、すべてのシャペロンタンパク質（以下に記載されるＰＤＩおよびＰＰＩを除き）によって共有される基礎を成す特徴は、その非ネイティブ立体構造においてタンパク質を結合する能力である。以下に規定されているように、本発明の「分子シャペロン」または「シャペロン」タンパク質は、インビボおよび／またはインビトロでのポリペプチドの折り畳みを補助するタンパク質である。
【００７９】
本明細書では分子シャペロン「型」タンパク質としても考えられているのが、タンパク質ジスフィルドイソメラーゼ（ＰＤＩ）およびペプチジル−プロリルｃｉｓ／ｔｒａｎｓイソメラーゼ（ＰＰＩ）であり、これらはタンパク質ジスフィド結合形成およびプロリンｃｉｓ／ｔｒａｎｓ異性化をそれぞれ触媒する（ロリマー（Ｌｏｒｉｍｅｒ）とボールドウィン（Ｂａｌｄｗｉｎ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９９８年を参照）。例えば、化膿連鎖球菌におけるＳｐｅＢの発現がＲｏｐＡタンパク質を必要とすることが、化膿連鎖球菌突然変異によって明らかにされた（リヨン（Ｌｙｏｎ）ら、１９９８年）。ＲｏｐＡタンパク質は、リボソーム上で新生ポリペプチドに結合し、ＧｒｏＥＬに結合し、かつペプチジル−プロリルイソメラーゼ活性を有することが知られている分子シャペロンである。したがって、本発明の一部の他の実施形態においては、成熟ＳｐｅＢポリペプチドを生成するための方法は、非ネイティブ成熟ＳｐｅＢポリペプチドを再折り畳みし、またはＰＰＩ、特にＲｏｐＡ  ＰＰＩの存在下に成熟ＳｐｅＢを発現させるステップを含んで成る。
【００８０】
Ｃ．組換え発現ベクターおよび宿主細胞
別の実施形態においては、本発明は、ＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインおよび成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含んで成る発現ベクターに関する。一部の実施形態においては、本発明の発現ベクターはポリシストロニック核酸配列を含んで成り、ここで１つのシストロンがＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインをコード化するポリヌクレオチドを含んで成り、第２のシストロンが成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含んで成る。一部の他の実施形態においては、本発明の発現ベクターは、ＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインをコード化するポリヌクレオチドを含んで成り、第２の発現ベクターは成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含んで成る。１つの好ましい実施形態においては、本発明の発現ベクターはプラスミド構成物である。別の好ましい実施形態においては、本発明の発現ベクターは表３、実施例１に記載されているプラスミドである。
【００８１】
本明細書で使用される「ベクター」という語は、それが結合されている別の核酸を輸送する能力がある核酸分子を指す。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、追加のＤＮＡ部分がライゲーションされているこれは環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の型のベクターはウイルスベクターであり、ここでは追加のＤＮＡ部分がウイルスゲノムへライゲーションされている。一部のベクターは、それらが導入される宿主細胞（例えば、複製の細菌源を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）において自己複製が可能である。さらに、一部のベクターは、それらが操作的に結合される遺伝子の発現を方向づけることが可能である。かかるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用性の発現ベクターはしばしばプラスミドの形態である。本明細書においては、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるため同じ意味で使用される。しかし、本発明では、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連性ウイルス）など他の形態のかかる発現ベクターを含むことは意図されている。
【００８２】
原核生物におけるタンパク質の発現は、融合または非融合タンパク質のいずれかの発現を方向づける構成的または誘導的プロモーターを含有するベクターにより大腸菌において最も多く行われる。融合ベクターは、その中でコード化されたタンパク質、組換えタンパク質のアミノまたはカルボキシ末端に多くのアミノ酸を添加する。
【００８３】
一部の実施形態においては、宿主細胞が、（ｉ）ＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインをコード化するポリヌクレオチド配列、および（ｉｉ）成熟ＳｐｅＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列を含んで成るポリシストロニックプラスミドで形質転換され、形質導入され、トランスフェクトされ、または感染される。本明細書で規定されているように、「ポリシストロニックｍＲＮＡ」は、２つもしくはそれ以上のポリペプチドをコードする。したがって、以下に規定されているように、本発明の「ポリシストロニックポリヌクレオチド」、「ポリシストロニックｃＤＮＡ」、または「ポリシストロニックプラスミド」は、ポリシストロニックｍＲＮＡをコードし、次いで２つもしくはそれ以上のポリペプチドをコード化する。
【００８４】
適切な誘導的、非融合、大腸菌発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（アマン（Ａｍａｎｎ）ら、１９８８年）、ｐＥＴ  ＩＩｄ（スタディール（Ｓｔｕｄｉｅｒ）ら、１９９０年）、ｐＥＴ、ｐＲＳＥＴ、ｐＣＲＴ７−ＣＴＴＯＰＯ、およびｐＩＶｅＸが挙げられる。ｐＴｒｃベクターからのターゲット遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依拠する。ｐＥＴ  ＩＩｄベクターからのターゲット遺伝子発現は、共発現ウイルスＲＮＡポリメラーゼＴ７ｇｎｌによって介在されるＴ７ｇｎ１β−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依拠する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下にＴ７ｇｎｌ遺伝子を有する常在プロファージからの宿主菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳＩ７４（ＤＥ３）によって供給される。一部の実施形態においては、ｐＲＫ５、ｐＣＭＶＢｌｕｅ、ｐＣＭＶ−ＬＩＣ、ｐＡＰＬ４００−０２３、ｐＡＰＬ４００−０８７、およびｐＡＰＬ４００−０８８などヒトＣＭＶまたはシミアンＣＭＶプロモーターを含んで成るプラスミドベクターも考えられている。
【００８５】
大腸菌における組換えタンパク質発現を最大限にする１つの方法は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力障害による宿主細菌におけるタンパク質の発現である。別の方法は、発現ベクターへ挿入される核酸の核酸配列を変化させ、各アミノ酸に対する個々のコドンが大腸菌において優先的に利用されるものとなることである。本発明の核酸配列のかかる変化は、標準のＤＮＡ突然変異または合成法によって行われる。
【００８６】
プロモーターは、通常、転写の開始点（すなわち、転写開始部位）の前（上流）で約１００個のヌクレオチド対内のＤＮＡ分子の領域である。その領域は通常、異なる遺伝子における同様のそれぞれの位置に配置されている数種類のＤＮＡ配列要素を含有する。本明細書で使用される「プロモーター」という語は、技術上、上流プロモーター領域またはプロモーター領域と呼ばれるものを含む。
【００８７】
本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入されている宿主細胞に関する。「宿主細胞」、「遺伝子組換え宿主細胞」、および「組換え宿主細胞」は、本明細書では同じ意味で使用される。かかる語は特定の対象の細胞だけではなく、かかる細胞の子孫または潜在的子孫を指すことが理解される。特定の修飾が突然変異または環境的影響により後世において起こりうるため、かかる子孫は、実際には、親細胞と同一ではありえないが、それでも本明細書で使用される語の範囲内に含まれる。宿主細胞は原核または真核生物細胞であるが、好ましくは、原核細胞である。例えば、ＳｐｅＢポリペプチドは大腸菌、および化膿連鎖球菌など細菌細胞で発現される。他の実施形態においては、ＳｐｅＢポリペプチドは昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９、高５およびＳｆ２１細胞）、酵母（例えば、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｐ．メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、およびＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））または哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、Ｃｏｓ−１、ＣＶ−１、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＥＲ−Ｃ６、およびＮＳＯにおいて発現される。他の適切な宿主細胞は当業者に周知である。
【００８８】
培養における原核祝細胞など本発明の宿主細胞が、ＳｐｅＢポリペプチドを生成する（すなわち、発現させる）ために使用される。１つの実施形態においては、方法は、成熟ＳｐｅＢポリペプチドおよびＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインが生成されるまで適切な培地で（成熟ＳｐｅＢポリペプチドおよびＳｐｅＢプロ−ポリペプチドドメインをコード化する組換え発現ベクターが導入されている）本発明の宿主細胞を培養するステップを含んで成る。別の実施形態においては、方法は、成熟ＳｐｅＢポリペプチドを培地または宿主細胞から単離するステップをさらに含んで成る。
【００８９】
ベクターＤＮＡは、従来のトランスフォーメーション、形質導入、感染、またはトランスフェクション法によって原核または真核細胞へ導入される。本明細書で使用される「トランスフォーメーション」、「感染」、および「トランスフェクション」は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、リポフェクション、感染、またはエレクトロポレーションを含む宿主細胞へ外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入する技術上認められたさまざまな方法を指すことが意図されている。宿主細胞を形質転換し、感染し、トランスフェクトする適切な方法は、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州、１９８９年）、および他の実験マニュアルに見出される。
【００９０】
最も広く使用されている方法は、リン酸カルシウムまたはＤＥＡＥ−デキストランのいずれかによって介在されるトランスフェクションである。機序は依然として不明であるが、トランスフェクトされたＤＮＡはエンドサイトーシスによって細胞の細胞質に入り、核に輸送されると考えられている。細胞型によって、培養細胞の９０％までの集団がつねにトランスフェクトされる。その高い効率により、リン酸カルシウムまたはＤＥＡＥ−デキストランによって介在されるトランスフェクションは、多数の細胞における外来ＤＮＡの一時的発現を必要とする実験に選択される方法である。リン酸カルシウム介在トランスフェクションは、通常、宿主細胞ゲノムへの頭−尾タンデムで配置される外来ＤＮＡのコピーを組込む細胞系を確立するためにも使用される。
【００９１】
発現ベクターのコード配列は、操作的に転写終了領域へ結合される。ＲＮＡポリメラーゼは、ポリアデニル化が起こる部位を通じてコード化ＤＮＡ配列を転写する。通常、ポリアデニル化部位の数百塩基対下流に位置したＤＮＡ配列は転写を終了させる役目をする。それらのＤＮＡ配列は本明細書では転写終了領域と呼ばれる。それらの領域は転写メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の有効なポリアデニル化に必要とされる。転写終了領域は当技術分野で周知である。例示の転写終了領域は、ＳＶ４０またはプロタミン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含んで成る。
【００９２】
本発明のＤＮＡ分子、遺伝子、またはポリヌクレオチドは、当技術分野で周知である多くの方法によってベクターへ組入れられる。例えば、ベクターｐＵＣ１８は有用性が明らかにされている。同様に、関連ベクターＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９は、特に、ジデオキシ配列決定の実施における本発明の一部の実施形態において使用される。
【００９３】
好ましい実施形態においては、本発明の組換え宿主細胞は原核宿主細胞である。好ましくは、本発明の組換え宿主細胞は大腸菌のＤＨ５α菌株の細菌細胞である。一般に、原核細胞が、ＤＮＡ配列の初期クローニングおよび本発明において有用であるベクターの構成のために好ましい。例えば、大腸菌Ｋ１２菌株はとりわけ有益である。使用される他の微生物菌株としては、大腸菌Ｂおよび大腸菌ｘ（Ｅ．ｃｏｌｉｘ）１９７６（ＡＴＣＣ番号３１５３７）が挙げられる。これらの例は、もちろん、限定ではなく例示が目的とされている。
【００９４】
原核生物も発現のために使用される。上記の菌株のほか、Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ番号２７３３２５）、ＢＬＲ（ＤＥ３）、ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＡＤ４９４（ＤＥ３）、ＡＤ４９４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、ＢＬ２１ｔｒｘＢ（ＤＥ３）、ＢＬ２１ｔｒｘＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、  ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、およびＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩなどの大腸菌株、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの桿菌、またはネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）もしくは霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓａｎｓ）、およびさまざまなシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種などの腸内細菌科が使用される。
【００９５】
一般に、宿主細胞と共存できる種由来であるレプリコンおよび制御配列を含有するプラスミドベクターが、これらの宿主といっしょに使用される。ベクターは通常、複製部位、および形質転換された細胞における表現型選択を提供する能力がある標識配列を有する。例えば、大腸菌は、大腸菌種由来のプラスミド、ｐＢＲ３２２を使用して形質転換される（ボリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ）ら、１９７７年）。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含有し、したがって形質転換された細胞を同定する容易な手段を提供する。ｐＢＲプラスミド、もしくは他の微生物プラスミドまたはファージは、それぞれのポリペプチドの発現のための微生物によって使用されるプロモーターも含有しなければならず、または含有するように修飾される必要がある。
【００９６】
組換えＤＮＡ構成において最も一般的に使用されるプロモーターとしては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（チャン（Ｃｈａｎｇ）ら、１９７８年、イタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ）ら、１９７７年、ゲデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら、１９７９年、ゲデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら、１９８０年）、トリプトファン（ＴＲＰ）プロモーター系（欧州出願第ＥＰ００３６７７６号明細書、シーブウェンリスト（Ｓｉｅｂｗｅｎｌｉｓｔ）ら、１９８０年）、およびＴ７またはＴ７ｌａｃプロモーター系が挙げられる。これらは最も一般的に使用されているが、他の微生物プロモーターが発見され、かつ利用されており、それらのヌクレオチド配列に関する詳細は公開されており、当業者が機能的プロモーターをプラスミドベクターへ導入することが可能である（シーブウェンリスト（Ｓｉｅｂｗｅｎｌｉｓｔ）ら、１９８０年）。
【００９７】
トランスフェクション後、細胞は培養条件下でＳｐｅＢポリペプチドの発現に十分な時間にわたって維持される。培養条件は当技術分野で周知であり、イオン組成および濃度、温度、ｐＨなどを含む。通常、トランスフェクトされた細胞は培養培地で培養条件下で維持される。さまざまな細胞型のための適切な培地は当技術分野で周知である。好ましい実施形態においては、温度は約２０℃〜約５０℃、より好ましくは、約３０℃〜約４０℃、かつさらに好ましくは、約３７℃である。
【００９８】
ｐＨは、約６．０の値〜約８．０の値、より好ましくは、約６．８の値〜約７．８の値、かつ最も好ましくは、約７．４である。オスモル濃度は、好ましくは、約２００ミリオスモル／リットル（ｍｏｓｍ／Ｌ）〜約４００ｍｏｓｍ／Ｌ、より好ましくは、約２９０ｍｏｓｍ／Ｌ〜約３１０ｍｏｓｍ／Ｌである。コード化ポリペプチドのトランスフェクションおよび発現のための他の生物学的条件は当技術分野で周知である。
【００９９】
トランスフェクトされた細胞は、ＳｐｅＢポリペプチドの発現に十分な時間にわたって維持される。適切な時間は、とりわけ、使用される細胞型によって決まり、当業者によって容易に決定可能である。通常、維持時間は、約２〜約１４日である。
【０１００】
組換えＳｐｅＢポリペプチドは、トランスフェクトされた細胞またはその細胞が培養されている培地のいずれかより回収され、または収集される。回収は、ＳｐｅＢポリペプチドの単離および精製を含んで成る。ポリペプチドのための単離および精製法は当技術分野で周知であり、沈殿、ろ過、クロマトグラフィー、電気泳動などの方法を含む。
【０１０１】
さらに別の実施形態においては、本発明のＳｐｅＢポリペプチドは、細胞を含まない翻訳系などインビトロタンパク質翻訳系によって生成される（例えば、ベトン（Ｂｅｔｔｏｎ）、２００３年、ブラウン（Ｂｒａｕｎ）ら、２００２年、ジェルムツス（Ｊｅｒｍｕｔｕｓ）ら、１９９８年、キグワ（Ｋｉｇａｗａ）ら、１９９９年、キム（Ｋｉｍ）ら、１９９６年、およびスピリン（Ｓｐｉｒｉｎ）ら、１９８８年を参照）。例えば、各々参照することによりその全体が本明細書で援用される、米国特許第６，３９９，３２３号明細書、および米国特許第５，４７８，７３０号明細書は、細胞を含まない（インビトロ）翻訳系におけるポリペプチダーゼの調製または生成のための方法、条件などを記載している。
【０１０２】
Ｄ．免疫原性組成物
一部の好ましい実施形態においては、本発明は、成熟ＳｐｅＢポリペプチド免疫原（すなわち、成熟野生型または成熟Ｃ１９２Ｓ）および生理的に許容される担体を含んで成る成熟ＳｐｅＢ免疫原性組成物を提供する。より好ましくは、免疫原性組成物は、配列番号２のアミノ酸１４６−３９８を含んで成る成熟野生型ＳｐｅＢポリペプチド、または配列番号２のアミノ酸１４６−３９８を含んで成る成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢポリペプチドを含んで成り、ここで配列番号２のシステインアミノ酸１９２はセリンに変異されている。本発明のさらに他の実施形態においては、多価または組合せ免疫原性組成物が提供される。組合せ免疫原性組成物が、化膿連鎖球菌および／または他の細菌種からの１つもしくはそれ以上の追加の抗原とともに、１つもしくはそれ以上の本発明のポリペプチド（例えば、成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢ）を含むことによって提供される。特に、組合せ免疫原性組成物が、本発明の１つもしくはそれ以上の成熟ＳｐｅＢポリペプチドを、１つもしくはそれ以上のポリペプチド、ポリペプチド断片、糖質、オリゴ糖類、脂質、リポオリゴ糖類、多糖類、オリゴ糖類−タンパク質コンジュゲート、多糖類−タンパク質コンジュゲート、ペプチド−タンパク質コンジュゲート、オリゴ糖類−ペプチドコンジュゲート、多糖類−ペプチドコンジュゲート、タンパク質−タンパク質コンジュゲート、リポオリゴ糖類−タンパク質コンジュゲート、または多糖類−タンパク質コンジュゲートと組合わせることによって提供される。
【０１０３】
本発明の成熟ＳｐｅＢポリペプチドは、哺乳類対象、例えば、ヒトへの投与に適切な免疫原性組成物へ組入れられる。かかる組成物は通常、「免疫原性」組成物および薬剤として許容される担体を含んで成る。以下で使用される「薬剤として許容される担体」という言葉は、薬剤投与と適合するすべての溶剤、分散剤、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことが意図されている。薬剤活性物質のためのかかる溶剤および薬剤の使用は当技術分野で周知である。従来の溶剤または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除き、かかる溶剤は本発明の組成物において使用される。補助活性化合物も組成物へ組入れられる。
【０１０４】
本発明の免疫原性組成物は、その投与の意図された経路と適合性であるように製剤化される。投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下、筋内、腹腔内）、粘膜（例えば、経口、直腸、鼻内、口腔、膣、呼吸器）、および経皮（局所）が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液としては、以下の要素、すなわち、注射用の水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶剤など滅菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなど抗菌剤、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなど抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などキレート化剤、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などバッファー、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなど張性の調整剤が挙げられる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなど酸または塩酸で調整される。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器、もしくはガラスまたはプラスチック製のマルチドーズ用バイアルに入れられる。
【０１０５】
滅菌注射溶液は、活性化合物（例えば、成熟ＳｐｅＢ）を、必要に応じて上記列挙した成分の１つまたは組合せとともに適切な溶剤中で必要な量において組入れた後、ろ過滅菌によって調製される。一般に、分散剤は、基礎分散溶剤および上記列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルへ活性化合物を組入れることによって調製される。滅菌注射溶液用の滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これによりその以前に滅菌ろ過した溶液から活性成分＋追加の所望の成分の粉末が得られる。
【０１０６】
経口組成物は一般に不活性希釈剤または食用担体を含む。それらはゼラチンカプセルに入れられ、または錠剤の中へ圧縮される。治療用の経口投与のために、活性化合物は賦形剤とともに組入れられ、錠剤、トローチ、またはカプセルの形で使用される。経口組成物は、口内洗浄剤として使用される液体担体を使用しても調製され、ここで液体担体中の化合物は経口適用され、局所使用され、吐出され、または燕下される。製剤適合性結合剤、および／または佐剤物質が組成物の一部として含まれる。錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、以下の成分のいずれか、または類似した性質の化合物のいずれかを含有する。すなわち、微結晶性セルロース、トラガカントゴム、またはゼラチンなど結合剤、でんぷんまたはラクトースなど賦形剤、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、またはコーンスターチなど崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムまたはステロート（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）など潤滑剤、コロイド状二酸化ケイ素など流動促進剤、スクロースまたはサッカリンなど甘味剤、またはペパーミント、サルチル酸メチル、またはオレンジ香味料など香料添加剤。
【０１０７】
吸入による投与のために、化合物は、適切な推進剤、例えば、炭酸ガスなどのガスを含有する加圧容器またはディスペンサー、またはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形で送達される。全身投与も粘膜または経皮手段による。粘膜または経皮投与のために、浸透されるバリアに適切な浸透剤が製剤で使用される。かかる浸透剤は一般に当技術分野で周知であり、例えば、粘膜投与のための洗浄剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体を含む。粘膜投与は、鼻腔用スプレーまたは坐剤を使用して行われる。経皮投与のために、活性化合物は軟膏、膏薬、ゲル、または一般に当技術分野で周知であるクリームへ処方される。
【０１０８】
化合物は坐剤（例えば、カカオバターおよび他のグリセリドなど従来の坐剤の基剤による）または直腸送達用の停留浣腸の形でも調製される。
【０１０９】
１つの実施形態においては、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出製剤など体内からの急速な排泄に対して化合物を保護する担体とともに調製される。
【０１１０】
生体分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などが使用される。かかる製剤の調製方法は当業者には明らかであろう。材料は、アルザ・コーポレーション（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびノバ・ファルマセウティカルズ（Ｎｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）からも市販されている。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体による感染細胞にターゲティングされたリポソームを含む）も薬剤として許容される担体として使用される。これらは、例えば、以下で参照することにより援用される、米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載されているように、当業者に周知の方法に従って調製される。
【０１１１】
投与を容易にし、投与量を均一にするために、用量単位剤形で経口または非経口組成物を処方することが特に有利である。以下で使用される用量単位剤形は、治療される対象のための単位用量として適した物理的に分離した単位を指し、各単位は、必要な薬剤担体とともに所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の用量単位剤形の仕様は、活性化合物の独自の特徴および達成される特定の治療効果、ならびに個人の治療用にかかる活性化合物を配合する技術上固有の制限によって決定され、かつ直接それらに依存している。
【０１１２】
薬剤として許容されるビヒクルは、副作用を引き起こすことがなく、例えば、活性化合物の投与を促進し、体内におけるその寿命および／またはその有効性を増大し、溶液中の溶解度を増大し、あるいは、その保存を強化することを可能にする薬剤または免疫原性組成物へ入る化合物または化合物の組合せを指定すると理解されている。これら薬剤として許容されるビヒクルは公知であり、選択された活性化合物の性質および投与方法に従って当業者によって適合されるであろう。
【０１１３】
本発明の免疫原性原性は、１つもしくはそれ以上の佐剤をさらに含んで成りうる。「佐剤」は、抗原の免疫原性を強化するのに役立つ物質である。したがって、佐剤はしばしば免疫応答を高め、当業者には公知である。本発明で意図されている佐剤の例は、リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムなどアルミニウム塩（ａｌｕｍ）、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、細菌性リポ多糖、アミノアルキルグルコサミンリン酸化合物（ＡＧＰ）、もしくはその誘導体または類似体を含むがこれらに限定されず、これらはコリザ（Ｃｏｒｉｘａ）（ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）、モンタナ州（ＭＴ））から市販されており、かつ米国特許第６，１１３，９１８号明細書に記載されており、かかるＡＧＰの１つは、２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル（ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｏｘｙｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌ）］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ（ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｏｘｙｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌａｍｉｎｏ）］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドであり、これは５２９としても知られる（以前はＲＣ５２９として知られる）が、これは安定乳剤または水性剤形として処方されており、米国特許第４，９１２，０９４号明細書に記載されているＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ）（コリザ（Ｃｏｒｉｘａ））、ＣｐＧモチーフ（米国特許第６，２０７，６４６号明細書）を含有するオリゴヌクレオチドなど合成ポリヌクレオチド、ポリペプチド、米国特許第５，０５７，５４０号明細書に記載されている、Ｑｕｉｌ  ＡまたはＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１（アンチジェニックス（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ）、フラミンガム（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ）、マサシューセッツ州）などサポニン、百日咳毒素（ＰＴ）、または大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）、特にＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＣＴ−Ｓ１０９、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９、例えば、国際特許公開国際公開第９３／１３３０２号パンフレットおよび同第９２／１９２６５号パンフレットを参照、コレラ毒素（野生型または突然変異体のいずれか、例えば、ここでアミノ酸２９位でのグルタミン酸が別のアミノ酸、好ましくは、公開された国際特許出願番号国際公開第００／１８４３４号パンフレットに従って、ヒスチジンで置換されている）。さまざまなサイトカインおよびリンフォカインが佐剤としての使用に適している。かかる佐剤の１つが、米国特許第５，０７８，９９６号明細書に記載されているヌクレオチド配列を有する、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である。ＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを含有するプラスミドは、大腸菌へ形質転換されており、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、１０８１Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州（ＶＡ）２０１１０−２２０９により、登録番��３９９００で寄託されている。サイトカインインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、米国特許第５，７２３，１２７号明細書に記載されている別の佐剤である。他のサイトカインまたはリンフォカインは、インターロイキン１−α、１−β、２、４、５、６、７、８、１０、１３、１４、１５、１６、１７、および  １８、インターフェロン−α、β、およびγ、顆粒球コロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子αおよびβを含むがこれらに限定されない免疫修飾活性を有することが示されており、佐剤としての使用に適している。
【０１１４】
本発明の組成物は通常、標準、公知、非毒性の生理的に許容される担体、佐剤、および所望のビヒクルを含有する用量単位製剤で非経口投与される。以下で使用される非経口という語は、静脈内、皮下、皮内、筋内、動脈内注射、または注入技術を含む。
【０１１５】
注射製剤、例えば、滅菌注射水性または油性懸濁液は、適切な分散または湿潤剤および懸濁剤を使用して既知の技術に従って処方される。滅菌注射製剤は、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶剤中の注射溶液または懸濁液でもある。
【０１１６】
使用されうる許容されるビヒクルおよび溶剤としては、水、リンガー溶液、および生理食塩液が挙げられる。また、滅菌、固定油が従来、溶剤または懸濁化剤として使用されている。このために、合成モノ−またはジ−グリセリドを含む無菌性固定油が使用されている。また、オレイン酸など脂肪酸が注射剤の調製に使用されている。
【０１１７】
好ましい担体としては、リン酸塩、乳酸塩、トリス（Ｔｒｉｓ）などによる中性食塩水バッファーが挙げられる。ウイルスベクターの投与に際しては、ベクターは十分に精製され、欠陥干渉アデノウイルス粒子または内毒素および他の発熱源など、望ましくない汚染物を実質的に含まないようにし、ベクター構成物が投与される個人において有害反応を引き起こさないようにする。ベクターを精製する好ましい手段には、塩化セシウム勾配遠心分離など浮遊密度勾配の使用が含まれる。
【０１１８】
担体はリポソームでもある。送達ビヒクルとしてリポソームを使用する手段は当技術分野で周知である。
【０１１９】
特定の実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、遺伝子発現を制御する調節配列と操作的に関連する本発明のポリヌクレオチド配列を含んで成る。目的とするポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡの発現を促進する調節要素、すなわち、プロモーターおよび／またはエンハンサー要素の制御下にプラスミドなど発現ベクターへ工学的に入れられる。好ましい実施形態においては、ヒトサイトメガロウイルス介在早期プロモーター／エンハンサーが使用される（米国特許第５，１６８，０６２号明細書）。プロモーターは細胞特異的であり、かつ所定の細胞でのみポリヌクレオチドの実質的な転写を可能にしうる。
【０１２０】
ポリヌクレオチドは、「裸の」ＤＮＡ（米国特許第５，５８０，８５９号明細書）として宿主へ直接導入されるか、またはブピビカインおよび他の局所麻酔薬（米国特許第５，５９３，９７２号明細書）およびカチオンポリアミン（米国特許第６，１２７，１７０号明細書）など免疫化を促進する薬剤で組成物中に処方される。
【０１２１】
このポリヌクレオチド免疫化方法においては、本発明のポリペプチドはインビボでの一過性に発現され、宿主の染色体に挿入または組込まれる遺伝物質はない。この方法は、目標が目的とする遺伝物資を染色体へ挿入または組込む遺伝子療法とは区別されるべきである。免疫化によって投与されるポリヌクレオチドが宿主における形質転換表現型を生じさせないことを確認するアッセイが使用される（米国特許第６，１６８，９１８号明細書）。
【０１２２】
すべての特許および刊行物は、参照することにより本明細書で援用される。
Ｅ．実施例
以下の実施例は、他の方法で詳細に記載されている場合を除き、当業者に公知であり、かつルーチンである標準の方法を使用して行われる。以下の実施例は、例示目的に示されており、決して本発明の範囲を限定するものとして考えるべきではない。
【０１２３】
実施例１
材料と方法
培地と試薬。大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）（ノバーゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）、カリフォルニア州（ＣＡ））を発現試験用に使用した。適切な抗生物質選択条件下で細菌をルリア寒天培地（ＬＢ）で生育させた。アンピシリンを濃度１００μｇ／ｍＬで使用し、カナミシンを５０μｇ／ｍＬで使用した。ＺｅｒｏＢｌｕｎｔＴＯＰクローニングベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（インビトロジェン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）、カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリフォルニア州（ＣＡ））をＰＣＲ生成断片のクローニング用に使用した。Ｃｅｎｔｕｒｙ−Ｐｌｕｓ  ＲＮＡ  Ｍａｒｋｅｒｓ（商標）、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  ＲＮＡ  Ｍａｒｋｅｒｓ（商標）、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ−Ｍｉｄｉ（商標）、ＤＮＡ−ｆｒｅｅ（商標）、ＵＬＴＲＡｈｙｂ（商標）、ＮｏｒｔｈｅｒｎＭａｘ（商標）、およびＲＥＴＲＯｓｃｒｉｐｔ（商標）をアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）（オースチン（Ａｕｓｔｉｎ）、テキサス州（ＴＸ））から得た。ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ（商標）ハイブリダイゼーション膜、蛍光−Ｎ６−ｄＡＴＰ、Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ（登録商標）Ａｎｔｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＡＰコンジュゲートポリクローナル抗体、およびＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）をパーキンエルマー・ライフ・サイエンシス（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ）、マサチューセッツ州（ＭＡ）から得た。すべての制限酵素をニュー・イングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）（べバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）、マサチューセッツ州（ＭＡ））から入手した。
【０１２４】
ポリメラーゼ連鎖反応。特に断りのない限り、ＰＣＲ増幅を以下の反応条件を使用して最終容量５０μＬで行った。すなわち、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１．０ｍＭ  ＤＴＴ、０．８μＭ各プライマー、１０Ｕ熱安定ポリメラーゼ、および１×熱安定ポリメラーゼバッファー。クローニングおよび突然変異反応のために、Ｐｗｏポリメラーゼ（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インディアポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）、インディアナ州（ＩＮ））を使用したが、他のすべて増幅ではＴａｑポリメラーゼ（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、フォスターシティー（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）、カリフォルニア州（ＣＡ））を使用した。増幅は、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間の２５サイクルで構成された。
【０１２５】
プラスミド構成物。成熟ＳｐｅＢコード領域に対応する７７０ｂｐ断片を、それぞれＮｃｏ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉ部位を含有するフォワード （５’ＣＣＡＴＧＧＡＡＣＣＡＧＴＴＧＴＴＡＡＡＴＣＴＣＴＣＣ３’）（配列番号３）プライマーおよびリバース（５’ＧＧＡＴＣＣＴＡＡＧＧＴＴＴＧＡＴＧＣＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣ３’）（配列番号４）プライマー（下線）を使用してＰＣＲ増幅した。フォワードプライマーは、ＮｃｏＩクローニング部位内にネストしたＡＴＧ翻訳開始コドンを含有するように設計され、結果として発現タンパク質のＮ末端へ追加のメチオニン残基が生じ、第１の残基をグルタミン（ＣＡＡ）からグルタミン酸塩（ＧＡＡ）へ変更した。同様に、プロ配列ドメイン（アミノ酸２８−１４６）を含む３６７ｂｐ断片を、クローニングのための工学的ＮｃｏＩ（フォワード）部位およびＢａｍＨＩ（リバース）部位とともに、フォワード（５’ＣＣＡＴＧＧＡＴＣＡＡＡＡＣＴＴＴＧＣＴＣＧＴＡＡＣＧ３’）（配列番号５）プライマー、およびリバース（５’ＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＴＡＡＴＣＴＣＡＧＣＧＧＴＡＣＣＡＧＣ３’）（配列番号６）プライマーを使用して増幅した。リバースプライマーにおけるＢａｍＨＩ部位のすぐ３’方向に終止コドンを挿入し、発現組換えタンパク質の翻訳終了を指令した。ＰＣＲ反応では、以前に記載されているように（マツカ（Ｍａｔｓｕｋａ）ら、１９９９年）、単一システインを１９２位でセリン置換（Ｃ１９２Ｓ）にコード化するＴＧＴ〜ＡＧＴ突然変異によるＳｐｅＢチモーゲンを含有するプラスミドベースのテンプレートを使用した。ＰＣＲ産物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔヘサブクローン化し、その後にＮｃｏＩおよびＢａｍＨ  Ｉを使用して制限消化によって切除した。７７０ｂｐ成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢおよび３６７ｂｐプロ配列ドメインコード断片をアガロースゲル電気泳動によって精製し、それぞれ、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を使用してｐＥＴ２８ａおよびｐＥＴ３ｄへライゲートした。結果として生じる発現プラスミド、ｐＬＰ６８１およびｐＬＰ６８２を標準方法を使用して大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）へ同時形質転換した。生成細菌発現菌株を２−プラスミドベースの共発現分析に利用した。
【０１２６】
成熟野生型ＳｐｅＢ発現構成物を、単一のＡ〜Ｔ塩基変更（太字）とともに、重複フォワード
2007536900.tif 000005
（配列番号７）プライマー、およびリバース
2007536900.tif 000006
（配列番号８）プライマーを使用する突然変異ＰＣＲを使用して生成し、ＰＣＲのためのテンプレートとして使用したｐＬＰ６８１におけるＣ１９２Ｓ突然変異を復帰した。突然変異生成は、ワイナー（Ｗｅｉｎｅｒ）ら（１９９４年）によって記載された方法の変形で構成され、以下のサイクル条件を使用した。すなわち、９４℃で１分、９４℃で１５秒および６８℃で１０分の１６サイクルの後、９４℃で１５秒および６８℃で１０分の１２サイクルとともに、６８℃で各サイクルで１５秒増分で増加させる延長時間により、結果として６８℃で１３分の最終延長時間が生じた。ＰＣＲ反応を大腸菌へのトランスフォーメーション前にＤｐｎＩで切断した。結果として生じるクローンｐＬＰ６８０を使用前に配列決定し、所望の突然変異を検証した。プラスミドをｐＬＰ６８２で大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）へ同時形質転換し、２−プラスミドベース共発現試験で使用した。
【０１２７】
ポリシストロニック発現ベクターを構成するために、ｐＬＰ６８２からのＳｐｅＢプロ配列ドメインコード領域をＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩを使用する制限消化によって切断した。３６７ｂｐ断片をアガロースゲル電気泳動によって精製し、やはりＮｃｏ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉで制限したｐＥＴ２８ａへライゲートし、結果としてｐＬＰ６８８が生じた。
【０１２８】
長さを増大させる４種類のリンカー領域に引き続いて、以下のフォワードプライマーを使用するＰＣＲによって成熟ＳｐｅＢコード領域を生成した。すなわち、
2007536900.tif 000007
すべてのフォワードプライマーは、５’末端（下線）上にＢｇｌＩＩ制限部位、最適化シャイン・ダルガノ部位（太字イタリック）、および翻訳開始コドン（太字）を含んだ。翻訳終止コドンへの５’直後にＸｈｏＩ部位（下線）を含有するリバースプライマー（５’ＣＴＣＧＡＧＣＴＡＡＧＧＴＴＴＧＡＴＧＣＣＴＡ−ＣＡＡＣＡＧＣ３’）（配列番号１３）をすべてのリンカーベースの増幅反応のために使用した。
【０１２９】
上記のプライマーを使用し、５ｎｔ、１０ｎｔ、または２０ｎｔリンカー＋成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢコード領域を増幅し、ｐＬＰ６８１をＰＣＲのためのテンプレートとして利用した。同様に、ｐＬＰ６８０をテンプレートとして使用し、２０ｎｔリンカー＋成熟野生型ＳｐｅＢ  ＰＣＲ産物を生成した。ＰＣＲ断片をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔへサブクローン化し、ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩによる制限消化によって切除し、アガロースゲル電気泳動によって精製した。単離後、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を使用して断片をｐＬＰ６８８へライゲートし、ｐＬＰ６８３、ｐＬＰ６８４、ｐＬＰ６８５、およびｐＬＰ６８７ポリシストロニック発現構成物を生成した。同一のやり方で、上記のプライマーによりＰＣＲのためのテンプレートとしてｐＬＰ６８５を使用してｐＬＰ６８６を合成した。インビボ分析のために生成され、使用されたすべての発現プラスミドの明細が表３に示されている。表３に示されているすべての発現は、特に断りのない限り、ｐＥＴ２８ａバックグラウンドにおけるものである。
【０１３０】
【表３】
2007536900.tif 000008
【０１３１】
組換えタンパク質の発現。ポリシストロニックおよび２−プラスミドベースの共発現試験のために、適切な抗生物質を含有するＬＢ２００ｍＬを所望の細菌発現ショックで接種し、３７℃下に一夜、生育させた。一夜培養物を培地を含有する新鮮抗生物質２Ｌへ１：１０に希釈し、２５℃下に約０．６のＯＤ６００に生育させ、２５℃下に１６時間、１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘発した。遠心分離で細胞を収集し、結果として生じる細胞ペレットを使用するまで−２０℃下に保存した。誘発前後のサンプルをタンパク質発現およびＲＮＡ単離の分析用に採取した。ＲＮＡ分析用のサンプルを使用するまで−７０℃下にＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）で保存した。
【０１３２】
タンパク質発現を超音波処理による細胞融解後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって評価した。不溶性材料を遠心分離によってペレット化し、可溶性上清フラクションを回収した。細胞残屑をＰＢＳ  １ｍＬ中に再懸濁する前にＰＢＳで２回洗浄した。すべての可溶性および不溶性フラクションを細胞融解前のＯＤ６００の細菌培養に基づき標準化した。クマシーブルー染色によって、かつ標準方法によるＰＶＤＦ膜への移動後のウェスタンブロット分析によってタンパク質発現を視覚化した。ＳｐｅＢのチモーゲン形態に対して生成されたポリクローナル抗体を使用してブロットをプローブし、発現プロ配列ドメインおよび成熟２８ｋＤａ  ＳｐｅＢの同時の検出を可能にした。
【０１３３】
ＲＮＡの単離。総ＲＮＡをＲＮＡｑｕｅｏｕｓ−Ｍｉｄｉ（商標）を使用して細菌培養物から単離した。ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）で保存した誘発後サンプルを室温下に解凍し、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（商標）溶解／結合バッファー１ｍＬ中に再懸濁する前にペレット化した。次いで、溶解物を説明マニュアルに規定されているように処理した。単離ＲＮＡをＬｉＣｌを使用して沈殿させ、ＤＮＡ−ｆｒｅｅ（商標）で２回、メーカーの仕様とおり処理し、汚染ゲノムまたはプラスミドＤＮＡを除去した。２６０ｎｍでの吸光度の分析によってＲＮＡを定量し、吸光度比Ａ２６０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍの測定によって純度を評価した。ＲＮＡサンプル（１μｇ）を、以前に記載されているように適切なプライマー使用してＰＣＲによって分析し、汚染プラスミドＤＮＡが存在しないことを検証した。また、すべてのサンプルをＰＣＲ反応に添加したｐＬＰ６８５プラスミド１ｎｇのスパイク回収分析によって残留ＤＮＡｓｅについて評価した。ＤＮＡおよびＤＮａｓｅ汚染がないことが証明されたサンプルのみその後の分析に使用した。
【０１３４】
ノーザンブロットハイブリダイゼーション。総ＲＮＡ（５μｇ）を、メーカーによって規定されているようにＮｏｒｔｈｅｒｎＭａｘ（商標）を使用して変性条件下で１％アガロースゲル上で断片化した。ミレニアムおよびセンチュリーＲＮＡマーカー（各２μｇ）をＥｔＢｒで前染色し、これを使用してＲＮＡサイズを評価した。サンプルをナイロン膜（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ（商標））に移し、ＵＶ架橋し、８０℃下に２時間乾燥させ、ＲＮＡ断片化に使用されるホルムアルデヒド反応を逆転させた。ＲＮＡ標準をＵＶによって視覚し、断片位置をハイブリダイゼーション前にナイロン膜上に示した。膜を２×ＳＳＣ（０．３Ｍ  Ｎａｃｌ、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）で前湿潤させ、４２℃下に２時間、ＵＬＴＲＡｈｙｐ（商標）で前ハイブリダイゼーションした。ノーザン分析用のプローブをテンプレートとしてｐＬＰ６８５、および上記で詳述されているように、プロ配列ドメイン（３６７ｂｐ）および成熟ＳｐｅＢ配列（７７０ｂｐ）に特異的な一連のプライマーを使用してＰＣＲ合成した。蛍光−Ｎ６−ｄＡＴＰ（１０μＭ）をＰＣＲ反応で使用し、無作為に標識成熟ＳｐｅＢおよびプロ配列ドメインＤＮＡプローブを生成した。結果として生じるプローブをアガロースゲル電気泳動によって精製し、各々の３２ｐｇを変性させ、４２℃下に一夜、ＵＬＴＲＡｈｙｐ（商標）での膜ハイブリダイゼーションに使用した。ハイブリダイゼーション後、膜を２回過剰な２×ＳＳＣで１０分間、室温下、２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで２回２０分間、４２℃下、および０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２回２０分間、４２℃下に洗浄した。膜をＢＬＯＴＴＯでブロックし、アルカリホスファターゼ−コンジュゲート抗フルオレセインポリクローナル抗体、およびＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）を、メーカーの仕様のとおりに使用して展開した。ブロットをＢｉｏＭａｘ  ＭＲ−２オートラジオグラフフィルム（イーストマン・コダック（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ）、ロチェスター（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）、ニューヨーク州（ＮＹ））に５分間、室温下に露出し、信号検出させた。
【０１３５】
ｃＤＮＡの合成。ＲＴ−ＰＣＲ用のＲＥＴＲＯｓｃｒｉｐｔ（商標）ファースト・ストランド（Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ）合成キット、および無作為十量体をメーカーによって規定された条件下で使用する逆転写によって総ＲＮＡの２μｇからｃＤＮＡを調製した。陰性対照サンプルを同一の条件を使用し、ただし逆転写酵素（−ＲＴ）の非存在下に生成した。反応産物をＰＣＲおよび定量的ＰＣＲ分析の使用前にヌクレアーゼを含まない水中に１：２００で希釈した。
【０１３６】
ｃＤＮＡの定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析。プロ配列ドメイン、成熟ＳｐｅＢ、およびｐＥＴ２８ａコード化カナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）に特異的なプライマーおよびプローブを、プライマー発現ソフトウェア（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、フォスターシティー（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）、カリフォルニア州（ＣＡ））を使用して設計した。定量的ＰＣＲ反応を以下の条件下で行った。すなわち、３００ｎＭの各プライマー（フォワードおよびリバース）、２００ｎＭ  ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡプローブ、２×ＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックス（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、および１μＬ希釈ｃＤＮＡまたは陰性対照サンプル。サイクル条件として、５０℃で２分間、９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の４０サイクルをＡＢＩ７０００配列検出システムで使用して最終容量２５μＬで反応を行った。ＫａｎＲ  ｃＤＮＡレベルを内部制御として使用し、全反応をＫａｎＲ閾値サイクル（Ｃｔ）に基づき標準化した。結果は標準化Ｃｔ値として表されている。
【０１３７】
ｃＤＮＡのＰＣＲ分析。希釈ｃＤＮＡおよび陰性対照サンプルをＰＣＲによって分析し、発現プラスミドから生じたｍＲＮＡ転写をさらに評価した。プロ配列ドメイン、成熟ＳｐｅＢ、およびプロ配列ドメインフォワード（５’ＣＣＡＴＧＧＡＴＣＡＡＡＡＣＴＴＴＧＣＴＣＧＴＡＡＣＧ３’）（配列番号１４）プライマー、および成熟プロテアーゼリバース（５’ＣＴＣＧＡＧＣＴＡＡＧＧＴＴＴＧＡＴＧＣＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣ３’）（配列番号１５）プライマーに特異的な上記のＰＣＲプライマーからの第３のセットを使用し、それぞれ、プロ配列ドメイン、成熟ＳｐｅＢ、および完全長ＳｐｅＢチモーゲン（１１１９ｂｐ）、およびポリシストロニックｃＤＮＡ（１１４５−１１８０ｂｐ）を増幅した。１μＬの各希釈サンプルを、増幅サイクルを３０に増大したことを除き、上記の条件下で使用し、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析した。
【０１３８】
ＳｐｅＢプロ配列ドメインの精製。溶解バッファー（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．２、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０μｇ／μＬ  ＤＮａｓｅ）中、１５ｍＬバッファー／ｇ細胞の割合で細胞を再懸濁し、Ｍ１１０−Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（マイクロフルイディクス（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）、ニュートン（Ｎｅｗｔｏｎ）、マサチューセッツ州（ＭＡ））を使用して溶解した。細胞残屑を遠心分離でペレット化し、可溶性フラクションを回収し、５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．２）に対して４℃下に一夜、透析した。透析は、大腸菌タンパク質の顕著な沈殿によって達成された。沈殿物質を遠心分離で除去し、回収上清を１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）に対する透析前にｐＨ４．５に変更した。サンプルをＳＰ−セファロース陽イオン交換カラムへ供給し、組換えプロ配列ドメインタンパク質を１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、１Ｍ塩化ナトリウムの勾配で溶出した。プロ配列ドメイン含有フラクションをプールし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって純度をチェックし、タンパク質濃度をＢＣＡアッセイによって測定した（スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、１９８５年）。
【０１３９】
組換え発現成熟野生型ＳｐｅＢの精製。溶解バッファー（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．２、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０μｇ／μＬ  ＤＮａｓｅ）中、１５ｍＬバッファー／ｇ細胞の割合で細胞を再懸濁し、顕微溶液化によって溶解した。細胞残屑を遠心分離で除去し、不溶性成熟野生型ＳｐｅＢ含有フラクションを回収した。ペレットを処理し（５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２％トリトンＸ−１００）４℃下に一夜、室温下に１．５時間、室温下に３．５時間、すべて静かに攪拌して３連続洗浄を行った。ペレットを室温下に一夜、攪拌して２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、０．８Ｍ尿素中に溶解し、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５、８Ｍ尿素で平衡したＳＰ−セファロースカラム上にサンプルを塗布する前に酢酸ナトリウムでｐＨを４．５に変更した。組換え成熟野生型ＳｐｅＢタンパク質を０〜７５０ｍＭ勾配の塩化ナトリウムで溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって純度を分析し、タンパク質濃度をＢＣＡによって測定した。精製、変性タンパク質をインビトロ再折り畳み実験に利用した。
【０１４０】
共発現成熟ＳｐｅＢの精製。ポリシストロニックまたは２−プラスミド系のいずれかによって共発現された組換え成熟野生型ＳｐｅＢおよび成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢの精製方法は同一であった。溶解バッファー（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．２、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０μｇ／μＬ  ＤＮａｓｅ）中、１５ｍＬバッファー／ｇ細胞の割合で誘発細菌細胞ペレットを再懸濁し、顕微溶液化によって溶解した。細胞残屑を遠心分離でペレット化し、可溶性フラクションを回収し、５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．２）に対して４℃下に一夜、透析した。透析は、大腸菌タンパク質の顕著な沈殿によって達成され、ｐＨを４．５に迅速に変更する前に遠心分離で浄化した。サンプルを１０Ｍ尿素で１：１に希釈し、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、５Ｍ尿素で平衡したＳＰ−セファロースカラム上に供給した。カラムからの非結合物質をＡ２８０ｎｍがベースラインに達するまで平衡バッファーで洗浄した。カラムを１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で洗浄し、尿素を除去し、組換え成熟プロテアーゼを０〜１．０Ｍ塩化ナトリウムの勾配で溶出した。回収タンパク質をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して透析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動によって純度を評価し、タンパク質濃度をＢＣＡによって測定した。
【０１４１】
ポリクローナル抗血清の生成。精製成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢ（ポリシストロニックまたは２−プラスミドベースの共発現によって生成）を抗血清の生成のために使用した。スイス・ウェブスター（Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ）マウスを０、４、６週にＭＰＬ  ５０ｍｇおよびＡＩＰＯ４  １００μｇを佐剤として使用して精製タンパク質５μｇで免疫化した。
【０１４２】
成熟ＳｐｅＢのプロ配列ドメインとの相互作用。ＳｐｅＢプロ配列ドメイン／成熟ＳｐｅＢ相互作用の解離定数（Ｋｄ）を酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）またはバイオコア（Ｂｉｏｃｏｒｅ）３０００装置を使用して測定した。ＥＬＩＳＡ分析のために、２０μＭ  Ｅ−６４で阻害した増大濃度のペプシン生成組換え成熟Ｃ１９２Ｓ（マツカ（Ｍａｔｓｕｋａ）ら、１９９９年）および組換え成熟野生型ＳｐｅＢを、精製プロ配列ドメイン、またはリゾチーム（陰性対照）のいずれかでコーティングしたマイクロタイターウェルでインキュベートした。プレートをＴＢＳ、ｐＨ７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、検出されたＳｐｅＢを４０５ｎｍでの吸光度を測定することによって成熟ＳｐｅＢに対して生成された親和性精製ポリクローナル抗体と結合した。結果として生じる吸光度（Ａ）の濃度依存増大を等式ΔＡ＝Ａｍａｘ＋［Ｌ］／Ｋｄ＋［Ｌ］に適合したが、ここでＫｄは解離定数であり、［Ｌ］は遊離リガンドの濃度である。
【０１４３】
プロ配列ドメインのペプシン生成組換え成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢの実時間相互作用をバイオコア（Ｂｉｏｃｏｒｅ）３０００（バイオコア（Ｂｉｏｃｏｒｅ）、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州（ＮＪ））を使用する表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）によって明らかにした。精製プロ配列ドメインをメーカーの仕様に従って活性化カルボキシメチルデキストランでコーティングされたバイオセンサチップに共有結合した。結合実験をＴＢＳ（ｐＨ７．４）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中、２５℃下に行った。増大濃度のペプシン生成組換え成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢを固定化プロ配列ドメインに添加し、その結合を実時間でモニタリングした。結合過程のセンソグラムを器具とともに供給されたソフトウェアを使用して分析した。
【０１４４】
ＳｐｅＢプロ配列ドメインの阻害活性の評価。成熟ＳｐｅＢ（０．１μＭ）を、増大濃度のプロ配列ドメイン、またはリゾチーム（陰性対照）を利用し、レゾルフィン標識カゼイン基質（０．４％）の存在下、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＤＴＴ中２５℃下に１時間インキュベートした。インキュベーション後、非消化基質を２％トリクロロ酢酸を使用する沈殿によって除去し、浄化上清フラクションにおける放出レゾルフィン標識ペプチドの吸光度を５７４ｎｍで分光光度法により測定した。また、密接に関係したシステインプロテアーゼ（パパイン）を陰性対照と同一条件下で分析し、プロ配列ドメイン／成熟ＳｐｅＢ相互作用の特異性を明らかにした。
【０１４５】
変性成熟ＳｐｅＢのインビトロ再折り畳み。１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、８Ｍ尿素中の組換え変性成熟ＳｐｅＢを、０．５Ｍアルギニンを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）、またはＰＢＳ（ｐＨ７．４）のいずれかにより迅速に希釈した（１：２０ｖ／ｖ）。希釈は、示されているように増大濃度の精製プロ配列ドメインの存在下に２０μＭ  Ｅ−６４阻害剤の有無により行った。希釈後、１０ｍＭ  ＤＴＴを各反応物に添加し、サンプルを４℃下に２４時間インキュベートした。反応物におけるＳｐｅＢの最終濃度は５μＭであった。インキュベーション後、１００μＬ反応物アリコートをレゾルフィン標識カゼイン切断アッセイを使用して評価し、再折り畳みＳｐｅＢの活性を評価した。
【０１４６】
成熟ＳｐｅＢのカゼイン分解活性。酵素のタンパク質分解活性を評価するために、指示量のＳｐｅＢを、規定されているように、０．４％レゾルフィン標識カゼイン、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＤＴＴ（２％）の存在下にインキュベートした。非消化基質をトリクロロ酢酸沈殿（２％）によって除去し、サンプルを遠心分離によって浄化し、上清フラクションにおける放出レゾルフィン標識ペプチドの吸光度を５７４ｎｍで分光光度法により測定した。
【０１４７】
成熟ＳｐｅＢの熱誘発変性。組換え発現成熟ＳｐｅＢの融解をＴＢＳ（ｐＨ７．４）中のタンパク質サンプルを加熱することによって評価すると同時に、ＳＬＭ  ＡＢ２蛍光分光光度計を使用し、２８０ｎｍでの励起により、３５０ｎｍ／３２０ｎｍでの固有の蛍光強度の比をモニタリングした。
【０１４８】
実施例２
ＳｐｅＢプロ配列ドメインの阻害およびシャペロン活性
そのＮＨ２末端プロ配列ドメインを欠く成熟ＳｐｅＢの組換え発現は、もっぱら大腸菌における不溶性タンパク質の生成をもたらす（マツカ（Ｍａｔｓｕｋａ）ら、１９９９年）。可溶性成熟ＳｐｅＢを支配するプロ配列ドメインの要件は、ドメインが分子内シャペロンとして機能し、タンパク質の適切な折り畳みを方向づけることを示す。かかる活性を検査するために、ＳｐｅＢプロ配列ドメイン、４０ｋＤａ  ＳｐｅＢチモーゲンのほか、成熟野生型ＳｐｅＢおよび成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢを特徴づけのための大腸菌から発現させ、精製した（データは示さず）。プロ配列ドメインと成熟ＳｐｅＢタンパク質の結合を、ＥＬＩＳＡ（図１Ａ）、およびバイオコア３０００（図１Ｂ）を使用する表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して調査した。実施例１で規定された計算パラメータを使用することにより、プロ配列ドメインの野生型およびＣ１９２Ｓ成熟ＳｐｅＢとの相互作用が、それぞれ、１１ｎｍおよび３４ｎＭのＫｄを有することが推定された。ＳＰＲによって測定されるプロ配列ドメインおよび成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢの相互作用の実時間分析は、１１ｎＭのＫｄを有することが推定された。両方の方法によって測定される結合値は、プロ配列ドメインと成熟ＳｐｅＢドメインとの間の高い親和性を示す。
【０１４９】
プロ配列ドメインの成熟ＳｐｅＢとの結合は、プロテアーゼ活性の阻害をもたらす。これは基質としてレゾルフィン標識カゼインを使用するカゼイン分解切断アッセイを使用して明らかにされた（図２Ａ）。プロ配列ドメイン、またはリゾチーム制御を、０．１μＭの成熟ＳｐｅＢを使用する０〜１００μＭの阻害剤濃度範囲にわたって分析した。結果は、プロ配列ドメインが０．３μＭの濃度で最大のプロテアーゼ活性の半分を阻害し（ＩＣ５０＝０．３μＭ）、阻害剤としてのリゾチームの添加は同じ濃度範囲にわたって成熟ＳｐｅＢの活性に対する影響はないことを示した。同一条件下での密接に関係したシステインプロテアーゼ（パパイン）の分析は、パパインプロテアーゼ活性に対する影響を示さなかった（図２Ｂ）。かかる結果は、ＳｐｅＢとプロ配列ドメインとの間の相互作用の特異性をさらに明らかにし、かつプロ配列ドメインの分子内阻害活性がインサイツでのプロテアーゼ活性の調節に役立ちうることを示す。
【０１５０】
プロ配列ドメインの分子内シャペロン活性は、尿素変性成熟システインプロテアーゼを使用してインビトロで明らかにされた。増大濃度のプロ配列ドメインの存在下に再折り畳みされた変性成熟プロテアーゼは、レゾルフィン標識カゼイン基質の切断によってモニタリングされるように回収プロテアーゼ活性の顕著な増大を明らかにした（図３）。反応における不可逆性システインプロテアーゼ阻害剤（Ｅ−６４）の添加は基質切断を阻止し、確認されたカゼイン分解切断は特に再折り畳み成熟ＳｐｅＢの活性に関与することを示した。これらのデータは、ＳｐｅＢプロ配列ドメインが分子内シャペロンとして作用し、成熟ＳｐｅＢの折り畳みを方向づけることを示す。さらに、結果は、２つの領域が適切な折り畳みを方向づけるために共有結合される必要がないことをはっきり示す。
【０１５１】
実施例３
ＳＰＥＢプロ配列ドメインおよび成熟ＳＰＥＢの２−プラスミドベースの共発現
インビトロでの成熟ＳｐｅＢの正確な再折り畳みを方向づけるプロ配列ドメインの能力は、インビボでの２つのタンパク質の独立した共発現が潜在的に正確に折り畳まれる成熟ＳｐｅＢの生成がもたらされることを示す。したがって、本実施例では、２−プラスミド共発現系が開発され、この場合、一方のプラスミドはプロ配列ドメイン（ｐＬＰ６８２）をコード化し、かつ他方は成熟ＳｐｅＢポリペプチド（ｐＬＰ６８０またはｐＬＰ６８１）をコード化する（図４）。ｐＬＰ６８０もしくはｐＬＰ６８１のいずれかのみで形質転換され、またはｐＬＰ６８２で同時形質転換された大腸菌を使用し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットを使用してタンパク質発現を調査した。成熟野生型または成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢ構成物のいずれかによる唯一の発現（データは示さず）は、優先的に不溶性２８ｋＤａ成熟ＳｐｅＢの生成をもたらした。これは、プロ配列ドメイン非存在下の成熟ＳｐｅＢの発現が、不正確に折り畳まれるタンパク質の生成をもたらすことを示す。対照的に、プロ配列ドメインとともに成熟ＳｐｅＢポリペプチドのインビボ共発現は、細胞の可溶性フラクションの両方のタンパク質の実質的レベルの生成をもたらし、両方のタンパク質の独立した共発現がＳｐｅＢの適切な折り畳みを促進することを示す。ＳｐｅＢチモーゲンに対するポリクローナル抗体を利用するウェスタンブロット分析では、プロ配列ドメインおよび成熟ＳｐｅＢポリペプチドの同時の検出が可能であった（データは示さず）。ブロット分析では、発現タンパク質の同一性が確認され、さらにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって証明される結果が検証された。これらの結果によりインビトロデータが再確認され、プロ配列ドメインおよび成熟ＳｐｅＢポリペプチドが成熟ＳｐｅＢの適切な折り畳みを方向づけるために共有結合される必要がないことを示した。
【０１５２】
実施例４
ＳＰＥＢプロ配列ドメインおよび成熟ＳＰＥＢのポリシストロニックベースの共発現
実施例３に記載されているように、プロ配列ドメインおよび成熟ＳｐｅＢの２−プラスミドベースの共発現は、可溶性に正確に折り畳まれたＳｐｅＢを生成するかかる方法の有用性を明らかにした。成熟ＳｐｅＢの大規模生成のために、プロ配列ドメインと成熟ＳｐｅＢポリペプチドの独立した共発現のためのポリシストロニック発現系が開発された。したがって、この発現系は、第１のシストロンとしてのプロ配列ドメインに引き続き、翻訳エンハンサーおよび最適化シャイン・ダルガノリボソーム結合部位を含有する合成リンカー（バリック（Ｂａｒｒｉｃｋ）ら、１９９４年、カリー（Ｃｕｒｒｙ）とトミッチ（Ｔｏｍｉｃｈ）、１９９８年、リングクイスト（Ｒｉｎｇｑｕｉｓｔ）ら、１９９２年）５’の第２のシストロンが設計された（図５）。第１のシストロンの翻訳終止コドンと第２のシストロンのシャイン・ダルガノとの間の合成リンカーの増大する長さ（５ｎｔ、１０ｎｔ、２０ｎｔ、４０ｎｔ）を２つのタンパク質の発現レベルの違いについて調査した。リンカー領域は、転写ＲＮＡにおける２つのシストロン間の第２の構造を最小限にするように設計され、非制限リボソームの流れおよび第２のシストロンでの翻訳の再開始を可能にした。それぞれ、５ｎｔ、１０ｎｔ、２０ｎｔ、および４０ｎｔリンカーを含有するポリシストロニック成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢ発現構成物ｐＬＰ６８３、ｐＬＰ６８４、ｐＬＰ６８５、およびｐＬＰ６８６のほか、成熟野生型ＳｐｅＢの２０ｎｔポリシストロニック発現構成物（ｐＬＰ６８７）を利用する実験を行った。
【０１５３】
ｐＬＰ６８５およびｐＬＰ６８７ポリシストロニック構成物を使用するタンパク質発現の分析では、プロ配列ドメイン（１２ｋＤａ）および成熟ＳｐｅＢ（２８ｋＤａ）の両方の生成が確認された（データは示さず）。２−プラスミド系で示されているように、大腸菌における両方のタンパク質の同時かつ独立の共発現は、優先的に細胞の可溶性フラクションにおける成熟ＳｐｅＢの生成をもたらした。４つのＣ１９２Ｓポリシストロニック構成物のそれぞれの誘発培養からの全細胞溶解物の可溶性フラクションもＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された（図６Ａ）。発現のレベルを定量するために、濃度計を使用してゲルを分析し、２８ｋＤａ成熟ＳｐｅＢ、または１２ｋＤａプロ配列ドメインに対応する各バンドの面積を測定した（図６Ｂ）。各構成物によってプロ配列ドメインのレベルにはほとんど違いは確認されなかったが、４０ｎｔリンカー含有ポリシストロンからの不溶性成熟ＳｐｅＢ発現の顕著な減少が確認された。興味深いことに、１１９ｎｔリンカー領域を含有する構成物からの可溶性成熟ＳｐｅＢ発現は、５ｎｔ、１０ｎｔ、および２０ｎｔリンカーポリシストロンのものと同等のレベルをはっきり示した（データは示さず）。
【０１５４】
実施例５
ポリシストロニックｍＲＮＡ転写の分析および転写レベルの評価
総ＲＮＡをすべてのポリシストロニック構成物、野生型ＳｐｅＢチモーゲン、成熟野生型ＳｐｅＢ、成熟Ｃ１９２Ｓ ＳｐｅＢ、およびプロ配列ドメインの誘発培養物から単離した。単離ＲＮＡのノーザンブロット分析を行い、２０ｎｔリンカー含有構成物、および規定されているように適切な陽性対照から生じた転写のサイズを評価した（データは示さず）。得られた結果により、対照からの成熟野生型ＳｐｅＢ（約８９２塩基）、成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢ（約８９２塩基）およびプロ配列ドメイン（約４８７塩基）ｍＲＮＡ転写はすべて予想されたサイズで移動することが明らかにされた。野生型およびＣ１９２Ｓ  ２０ｎｔリンカー含有ポリシストロニック発現系の両方からのｍＲＮＡ転写の検出は、野生型ＳｐｅＢチモーゲン対照のもの（約１２４６塩基）よりわずかに高い同等のサイズ（約１２８７塩基）で移動する転写シグナルを示した。かかる結果は、予測されるように、各々の完全長、ポリシストロニックｍＲＮＡの生成と一致する。成熟ＳｐｅＢおよびプロ配列ドメイン対照で確認されるものと同等の、これらサンプルにおけるより小さい転写の検出の欠如は、ＳｐｅＢの発現がポリシストロニック転写の生成に直接帰するものであり、多様なｍＲＮＡ種の存在の結果によるものではないことを示す。
【０１５５】
すべてのポリシストロニック種から生じる転写の完全長の性質もｃＤＮＡのＰＣＲ分析によって検証された。ポリシストロニックサンプルおよび単一のシストロン対照からの総ＲＮＡを使用し、対応するｃＤＮＡを生成し、かつ希釈ｃＤＮＡサンプルをＰＣＲによって分析した。逆転写酵素（−ＲＴ）を除くすべての反応成分を含む各サンプルの陰性対照を生成し、単離ＲＮＡ内の潜在的なプラスミドＤＮＡ汚染を評価した。プロ配列ドメイン（３６７ｂｐ）、成熟ＳｐｅＢ（７７０ｂｐ）、および完全長プロ配列／成熟ＳｐｅＢ（１１１９−１１８０ｂｐ）コード領域に特異的な一連のプライマーを使用し、ｃＤＮＡサンプル、−ＲＴ陰性対照、およびｐＬＰ６８５陽性対照を検査した（データは示さず）。プロ配列ドメインのＰＣＲ増幅により、その発現構成物におけるプロ配列ドメインヌクレオチド配列を含有するすべてのｃＤＮＡサンプルにおける予想されるサイズの産物が生じた。この配列を欠くサンプル、成熟野生型ＳｐｅＢおよび成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢ発現構成物は、増幅産物を生成しなかった。成熟プロテアーゼコード領域の増幅について、プロ配列ドメイン発現系のものを除くすべてのｃＤＮＡサンプルは陽性バンドを生成した。完全長プロ配列／成熟ＳｐｅＢ領域の増幅により、ポリシストロニックおよびＳｐｅＢチモーゲンサンプルのみについてＰＣＲ産物が生じたが、成熟野生型ＳｐｅＢ、成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢ、およびプロ配列ドメイン発現系からのサンプルは、予測されるように産物生成の欠如を証明した。すべてのサンプルの−ＲＴ陰性対照は増幅産物を生成せず、ｍＲＮＡの逆転写に由来するｃＤＮＡサンプルで確認された陽性シグナルの生成を示し、汚染ＤＮＡの増幅を示さなかった。
【０１５６】
異なる発現系のｍＲＮＡ転写レベルの検査は、ｃＤＮＡサンプルおよび−ＲＴ対照の定量的ＰＣＲ分析によって測定された。プロ配列および成熟ＳｐｅＢ領域の各々に特異的な一連のプライマー／プローブを使用し、培養物間の転写レベルを比較した。カナマイシン耐性をコード化する遺伝子がすべての発現構成物上に存在することを考えて、ＫａｎＲｍＲＮＡを分析中の内標準として使用し、発現サンプル間のプラスミドコピー数の潜在的な違いに対して制御した。結果は、各構成物の誘発中に生成されたｍＲＮＡ転写のレベルが同等であることをはっきり示す（図７）。より重要なことには、データは、プロ配列のｍＲＮＡレベルが成熟ＳｐｅＢのものと同等であることを示す。これらの結果は、ポリシストロニック構成物間の可溶性成熟ＳｐｅＢの確認された量の明らかな違いが、転写の早過ぎる終了によるものではないことを示す。
【０１５７】
実施例６
共発現成熟ＳｐｅＢの特徴づけ
２−プラスミドベースおよびポリシストロニック系の両方によって生成された精製成熟ＳｐｅＢをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し（データは示さず）、すべてのタンパク質を熱誘発展開実験にかけた（図８および図９）。融解（すなわち、変性）曲線を上昇温度範囲（０−９０℃）にわたってタンパク質サンプルを加熱すると同時に、固有の蛍光の比の変化をモニタリングすることによって得た。２−プラスミドおよびポリシストロニック共発現Ｃ１９２Ｓ（図８）の両方、または野生型（図９）成熟ＳｐｅＢによる変性曲線は、明確な移行部をはっきり示し、ＳｐｅＢチモーゲンとはそれぞれ対応する発現のものと同様の中間点を有し、インビトロ切断（パパイン生成）、または自己触媒（野生型ＳｐｅＢチモーゲン）によって加工された。かかる結果は、いずれかの共発現系によって生成される組換えタンパク質が、対応する組換え発現および加工チモーゲンと同様に展開されることを示す。
【０１５８】
すべての組換え成熟野生型ＳｐｅＢの固有のプロテアーゼ活性をその操作的モル濃度の測定によって評価した（図１０）。各々について、同等濃度のＳｐｅＢ（０．１２μＭ）を、レゾルフィン標識カゼイン基質の添加前に、不可逆性システインプロテアーゼ阻害剤、Ｅ−６４の増大量の存在下にプレインキュベートした。標識ペプチドの放出を分光光度法で測定し、結果を阻害剤濃度の関数としてプロットした。２−プラスミド（０．１２１μＭ）、ポリシストロニック（０．１２４μＭ）、および自己触媒加工（０．１２４μＭ）成熟ＳｐｅＢポリペプチドについて得られた値は、それらが酵素的に区別不可能であり、タンパク質濃度に基づく０．１２μＭの予想値と同等であることを示した。
【０１５９】
以前のデータは、パパインによるインビトロ切断によって生成された成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢに対して生成された抗体が、野生型ＳｐｅＢのタンパク質分解活性を阻害する能力があることを示した（マツカ（Ｍａｔｓｕｋａ）ら、１９９９年）。いずれにかの共発現系によって生成される組換えタンパク質が同様の活性を発揮するを判定するために、２−プラスミドまたは２０ｎｔポリシストロニック系のいずれかによって生成された成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢで免疫化したマウスからの増大濃度の抗血清をカゼイン分解切断アッセイを使用して分析した（図１１）。結果は、基質の加水分解が、プレ免疫対照に対して、いずれかの共発現系によって生成されるタンパク質で免疫化した動物からの血清の増大量の存在下に阻害されることを示す。さらに、各々について証明された阻害のレベルは、ＳｐｅＢチモーゲンとして発現され、かつペプシンを使用してインビトロで加工された成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢに対して生成された血清について以前に報告されたものと同等である（マツカ（Ｍａｔｓｕｋａ）ら、１９９９年）。
【０１６０】
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【０１６１】
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【０１６２】
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【０１６３】
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【０１６４】
2007536900.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】組換え成熟ＳｐｅＢとプロ配列ドメインの相互作用を示す。
【図２】成熟ＳｐｅＢのプロ配列ドメイン介在阻害を示す。
【図３】変性成熟ＳｐｅＢの再折り畳みに対する組換えプロ配列ドメインの効果を示す。
【図４】２−プラスミドベース発現構成物を示す略図である。
【図５】ポリシストロニック発現系および合成リンカー領域を示す図表である。
【図６】ポリシストロニック発現系における可溶性成熟ＳｐｅＢおよびプロ配列ドメインレベルの評価および相対定量を示す。
【図７】ポリシストロニックｃＤＮＡの定量的ＰＣＲ分析を示す。
【図８】成熟Ｃ１９２Ｓ  ＳｐｅＢの熱変性を示す。
【図９】成熟野生型ＳｐｅＢの熱誘発変性を示す。
【図１０】組換え成熟ＳｐｅＢの操作モル濃度の評価を示す。
【図１１】野生型ＳｐｅＢタンパク質分解活性の抗体介在阻害を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年3月10日(2006.3.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007536900000001.app
【国際調査報告】
2007536900.tif 000031
2007536900.tif 000032
2007536900.tif 000033
2007536900.tif 000034