(57)【要約】  本発明はプローブ分子と標的分子との間の特異的相互作用を検出する装置および方法に関する。特に、本発明は、ａ）装置の第１の表面上に配置され、プローブ分子がアレイ要素上に固定化された、基材を有するマイクロアレイと、ｂ）マイクロアレイがその上に配置された第１の領域と第２の表面との間に画定された反応チャンバとを備え、マイクロアレイと第２の表面との間の距離が修正可能である、プローブ分子と標的分子との間の分子相互作用を定性的および／または定量的に検出する装置に関する。
2007536541.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．装置の第１の表面上に配置され、プローブ分子がアレイ要素上に固定化された、基材上のマイクロアレイと、および
ｂ．前記マイクロアレイがその上に配置された第１の表面と第２の表面との間に画定された反応チャンバと（前記マイクロアレイと前記第２の表面との間の距離は可変である。）
を備える、プローブ分子と標的分子との間の分子相互作用を定性的および／または定量的に検出する装置。
【請求項２】
前記マイクロアレイと前記第２の表面との間の距離が、約０から約１ｍｍの範囲で可変である、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記反応チャンバ内の温度を制御および／または調節するための温度制御ユニットおよび／または温度調節ユニットをさらに備える、請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
前記温度制御および調節ユニットが前記第１の表面に組み込まれている、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記温度制御および調節ユニットが、各々所定温度まで予熱される温度ブロックを含む、請求項３に記載の装置。
【請求項６】
前記温度ブロックが直線的にまたは回転円盤上に配置されている、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
検出システムを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項８】
前記検出システムが光学系である、好適には蛍光光学系である、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記蛍光光学系が自動焦点合わせ装置なしの蛍光顕微鏡である、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記検出システムが、前記第２の表面上に置かれたときに前記検出システムと前記第２の表面との間の間隔を調節するスペーサに接続されている、請求項７から９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１１】
横方向を制限する補償ゾーンが、前記第１の表面と前記第２の表面との間に形成された反応チャンバに提供され、該補償ゾーンが、前記マイクロアレイと前記第２の表面との間の間隔が短縮されたときに前記反応チャンバ内の容量を実質的に一定に保持する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１２】
前記第２の表面が透明な材料、好適にはガラスから作成されている、請求項１から１１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１３】
前記第１の表面と前記第２の表面との間に形成された前記反応チャンバが弾性シールによって横方向に範囲が定められている、請求項１から１２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１４】
前記第１の表面が、前記マイクロアレイと前記第２の表面との間の距離が可変であるように前記マイクロアレイが前記第２の表面に対して誘導され得るように、少なくとも前記マイクロアレイの下のゾーン内に構成されている、請求項１から１３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１５】
前記第１の表面が、少なくとも前記マイクロアレイの下のゾーンにおいて弾性的に変形される、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記第１の表面が弾性プラスチックから作成されている、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記第１の表面が、重ね合わされた２つの層から形成され、該重ね合わされた２つの層の外側層が、少なくとも前記マイクロアレイの下のゾーンにおいて凹部を有する、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１８】
前記重ね合わされた２つの層の内側層が弾性シールから形成されている、請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
前記マイクロアレイを前記第２の表面に対して誘導することのできる手段を少なくとも含む、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２０】
前記手段が圧縮力および／または牽引力によって前記第１の表面に作用することによって、前記マイクロアレイを前記第２の表面に対して誘導することのできる、請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
前記第１の表面が前記手段によって振動させることのできる、請求項１９または２０に記載の装置。
【請求項２２】
前記マイクロアレイと前記第２の表面との間の距離が可変であるように、前記第１の表面に対して前記第２の表面を誘導することのできる、請求項１から２１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２３】
前記マイクロアレイと前記第２の表面との間の距離が可変であるように、前記スペーサが圧縮力および／または牽引力によって前記第２の表面に作用することによって、前記第２の表面を前記第１の表面に対して誘導することのできる、請求項１０から２２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２４】
前記マイクロアレイと前記第２の表面との間の距離が可変であるように、前記第１の表面および前記第２の表面を誘導することのできる、請求項１から２３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２５】
前記反応チャンバが前記チャンバ担体と前記マイクロアレイとの間の毛細管ギャップである、請求項１から２４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２６】
前記毛細管ギャップが約０μｍから約１００μｍの範囲の厚さを有する、請求項２５に記載の装置。
【請求項２７】
前記反応チャンバが少なくとも２つのサブチャンバを含み、該サブチャンバが第１の非圧縮状態において相互に流体接続され、第２の非圧縮状態ではサブチャンバ間に流体接続は存在しない、請求項１から２６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２８】
各サブチャンバが前記マイクロアレイの定められた領域に割り当てられる、請求項２７に記載の装置。
【請求項２９】
前記マイクロアレイおよび／または前記第２の表面が前記サブチャンバ間で壁として機能する空洞を備えている、請求項２７または２８に記載の装置。
【請求項３０】
前記サブチャンバ間の前記壁が弾性シールによって形成されている、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３１】
プローブ溶液を精製および／または再濃縮する、および／または前記反応チャンバに流体を充填および／または排出することを調節する充填ユニットおよび／または再処理ユニットをさらに含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３２】
前記反応チャンバおよび充填ユニットおよび／または再処理ユニットが、２つのカニューレを介して相互に接続され、該カニューレが、第１のカニューレが前記充填ユニットおよび／または再処理ユニットから前記反応チャンバ内への流体の供給を保証し、第２のカニューレが供給された流体によって押し出される前記反応チャンバからの空気の排出を保証するように配置されている、請求項３１に記載の装置。
【請求項３３】
前記検出システムが受け取った信号を処理するための、前記検出システムに関連するユニットを備える、請求項１から３２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３４】
外部コンピュータ用のインタフェースを有する、請求項１から３３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３５】
物質ライブラリおよび／または増幅反応の実行および／または検出反応に関する情報を含んでいる、コーディング、好適にはデータマトリクスまたはバーコードを備える、請求項１から３４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３６】
前記プローブ分子および／または標的分子が、核酸ペプチド、タンパク質、抗原、抗体、炭水化物、および／またはこれらの類似体からなる群から選択されるバイオポリマーおよび／または上記バイオポリマーの共重合体である、請求項１から３５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３７】
前記プローブ分子および／または標的分子が、核酸および／または核酸類似体である、請求項３６に記載の装置。
【請求項３８】
導電性材料から作成されたチャンバ本体を含む、請求項１から３７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３９】
前記導電性材料が導電性プラスチックである、請求項３８に記載の装置。
【請求項４０】
前記導電性プラスチックが、５〜３０％の炭素繊維を有するポリアミド、５〜３０％の炭素繊維を有するポリカーボネート、２〜２０％のステンレス鋼繊維を有するポリアミド、および５〜４０％の炭素繊維を有するＰＰＳからなる群から選択される、請求項３９に記載の装置。
【請求項４１】
ａ）請求項１から４０のいずれか一項に記載の装置の反応チャンバに標的分子を含んでいる試料を供給するステップと、
ｂ）前記標的分子と前記基材上に固定化されたプローブ分子との間の相互作用を検出するステップと
を含む、前記標的分子と前記基材上に固定されたプローブ分子との間の相互作用を定性的／および定量的に検出する方法。
【請求項４２】
検出前に、前記マイクロアレイと前記第２の表面との間の距離が、前記標的分子と前記基材上に固定された前記プローブ分子との間の相互作用を可能にする位置に保持される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
工程ｂ）において、前記マイクロアレイと前記第２の表面との間の距離が変えられる、好適には短縮される、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
工程ｂ）において、前記マイクロアレイと前記第２の表面との間の距離が、前記マイクロアレイと前記第２の表面との間のプローブ溶液が実質的に除去されるように変えられる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記標的分子が検出可能なマーカーを備える、請求項４１から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記検出可能なマーカーが蛍光マーカーである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記蛍光マーカーの検出が、自動焦点合わせ装置なしの蛍光顕微鏡を用いて行われる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記蛍光マーカーの検出が、焦点が固定された蛍光顕微鏡を用いて行われる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記プローブ分子および／または標的分子が核酸および／または核酸類似体である、請求項４１から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記標的分子が周期的な増幅反応によって前記反応チャンバ内で増幅される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記周期的増幅反応中の検出が、１つまたはそれ以上のサイクルの後でおよび／または前記周期的増幅反応の終了後に行われる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
マイクロアレイに基づいた試験を実行するための、請求項１から４０のいずれか一項に記載の装置の使用。
【請求項５３】
ａ）プローブ分子がアレイ要素の上に固定化された基材を備えたマイクロアレイを有する反応チャンバに標的分子を含んでいる試料を供給するステップと、および
ｂ）前記標的分子と前記基材上に固定化されたプローブ分子との間の相互作用を検出するステップとを含み、
反応チャンバにおいて標的分子を含む前記プローブを導入するステップと検出するステップとの間に、前記反応チャンバ内の溶液を交換するステップおよび／または前記反応チャンバから溶液を除去するステップが回避される、
プローブ分子と標的分子との間の分子相互作用を定性的／および定量的に検出する方法。
【請求項５４】
請求項４１から５１のいずれか一項に記載の方法に従ってさらに実行される、請求項５３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的分子とプローブ分子との間の特異的相互作用を検出する装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物医学的試験は多くの場合、知られている量で知られている位置に存在する分子（分子プローブ）と検出される１種または複数の未知の分子（分子標的分子）との間の相互作用に基づく。現代の試験では、試料が種々のプローブで並列様式により同時に分析され得るように、プローブは担体上、いわゆるマイクロアレイまたはチップ上に物質ライブラリの形態で配置されている（例えば、Ｊ．Ｌｏｃｋｈａｒｔ，Ｅ．Ａ．Ｗｉｎｚｅｌｅｒ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ａｒｒａｙｓ；Ｎａｔｕｒｅ  ２０００、第４０５巻、８２７〜８３６頁を参照）。この場合、プローブは一般に、例えば、国際公開第００／１２５７５号（例えば、米国特許第５４１２０８７号、国際公開第９８／３６８２７号を参照）に記載のように適したマトリクス上に固定されるか、またはマイクロアレイ作成のために所定の様式（例えば、米国特許第５１４３８５４号を参照）で合成的に生成される。
【０００３】
標的分子およびプローブ分子の両方が一本鎖核酸の形態で存在することが、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の形態である蛍光基で標識された標的分子をマイクロアレイの核酸プローブに結合させるための必須条件である。効率的で特異的なハイブリダイゼーションは、このような分子間でのみ生じ得る。一本鎖核酸の標的分子および核酸プローブ分子は通常、熱変性ならびに温度、イオン強度、およびらせん構造を不安定にさせる分子の濃度のようなパラメータの最適な選択を用いて得ることができる。このため、実質的に完全に相補的であるプローブ、すなわち相互に対応する配列を有するプローブのみが標的配列と対になったままであることが保証される（Ａ．Ａ．Ｌｅｉｔｃｈ、Ｔ．Ｓｃｈｗａｒｚａｃｈｅｒ，Ｄ．Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｉ．Ｊ．Ｌｅｉｔｃｈ、１９９４年、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓｉｅｒｕｎｇ、Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、ハイデルベルグ／ベルリン／オックスフォード）。
【０００４】
生物学的試験方法においてマイクロアレイを使用するための典型的な例は、生物医学的診断において試料中の微生物を検出することが挙げられる。この場合、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の遺伝子が遍在的に拡散されており、個々の種に特徴的な配列部分を有するという事実が利用される。これらの種に特徴的な配列は一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの形態でマイクロアレイ上に適切に配置される。被試験標的ＤＮＡ分子はまず被試験試料から単離され、マーカー、例えば蛍光マーカーを付けられる。続いて、標識された標的ＤＮＡ分子がマイクロアレイ上に固定されたプローブとともに溶液中でインキュベートされる；非特異的に発生する相互作用は対応する洗浄工程によって除去され、特異的相互作用が蛍光光学的評価によって検出される。このような方法では、例えば、ある１回の試験を用いて１つの試料中でいくつかの微生物を同時に検出することが可能である。この試験方法では、検出可能な微生物の数は、理論的には、マイクロアレイ上に施された特異的プローブの数だけに依存している。
【０００５】
固体表面上のマイクロアレイおよびプローブアレイをそれぞれ用いて分子相互作用を検出するための、あるものは市販されている種々の方法および技術的体系を説明する。
【０００６】
分子相互作用を検出するための古典的な系は、蛍光標識されたスペクトル的に励起された標的分子の蛍光強度の比較に基づくものである。蛍光とは、特定の波長の光によって励起されたときにそれら自身の光を放出する特定の分子の能力である。この場合、特徴的吸収および発光挙動が続いて起こる。分析中、例えば、標的分子とプローブ分子との間の分子相互作用の効率が高まるために、官能化された表面上の標識された分子密度が増大するにつれて蛍光シグナルが比例的に増大するものと推定される。
【０００７】
特に、蛍光シグナルの定量的検出は蛍光顕微鏡の修正された方法を用いて実行される。ここでは、吸収波長を有する光が、発光波長を有する光からフィルタまたは菫青石を用いて分離され、測定された光は、対物鏡およびレンズのような光学素子を用いて、例えば二次元ＣＣＤアレイのような適した検出器の上に結像される。一般に、分析はデジタル画像処理を用いて行われる。
【０００８】
これまでに知られている技術的解決策は、その光学的設備および使用される要素によって異なる。このような設備の問題および制限は信号雑音（バックグラウンド）から生じ、この信号雑音は使用される色素の退色および消光のような効果、その媒体の自己蛍光性、組立要素、および光学要素によって本質的に決定されるとともに、光学的設備内の分散、反射、および二次光源によって本質的に決定される。
【０００９】
この結果、プローブアレイの定性的および定量的比較のための非常に高感度の蛍光検出器の設備に対して高い技術的労力が必要となる。特に、中間スループットおよび高スループットでスクリーニングするにはある程度の自動化を示す特別に適合された検出システムが必要である。
【００１０】
分子アレイを読み出すための標準的な落射蛍光設備を最適化するために、ＣＣＤベースの検出器が知られており、この検出器は、分散および反射などの光学的効果の識別のための入射光または透過光を用いて、暗視野内でフルオロフォアの励起を行う（例えば、Ｃ．Ｅ．Ｈｏｏｐｅｒら、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｄ  ＣＣＤ  Ｃａｍｅｒａｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（１９９０年）、３３７〜３４４頁を参照）。ここでは、アレイの結像はここで、露光またはより高分解能の光学系を用いるラスタライズのいずれかによって行われる。多重スペクトル光源の使用により、異なる励起フィルタ（組合せ）を用いて異なる蛍光プローブに比較的容易にアクセス可能である。しかし、欠点は、アレイ上の照明の均質性のような自己蛍光およびシステムに関連する光学作用が、複雑な照明光学系およびフィルタシステムを必要とすることである。
【００１１】
蛍光シグナルの定量的検出のためのさらなる方法は共焦点蛍光顕微鏡に基づくものである。例えば米国特許５３０４８１０号に記載のような共焦点走査系は、２つのピンホールを用いて光軸に沿って蛍光シグナルを検出することに基づく。このため、試料調節に大きな努力を要するか、または効果的なオートフォーカスシステムがそれぞれ確立される。このようなシステムは、技術的解決法に関して非常に複雑である。レーザ、ピンホール、例えばＰＭＴのような状況に応じて冷却される検出器、アバランシェダイオードまたはＣＣＤ、複雑で非常に正確な機械式平行移動要素、および光学系などの必要な構成要素は最適な形で調整されなければならず、相当の労力を要する（例えば、米国特許第５４５９３２５号；第５１９２９８０号；第５８３４７５８号を参照）。小型化の程度および価格は構成要素の多様性および機能性によって制限される。
【００１２】
最近は、プローブアレイに基づいた分析は通常、蛍光光学的に読み出される（例えば、Ａ．Ｍａｒｓｈａｌｌ  ａｎｄ  Ｊ．Ｈｏｄｇｓｏｎ、ＤＮＡ  Ｃｈｉｐｓ：Ａｎ  ａｒｒａｙ  ｏｆ  ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１６巻、１９９８年、２７〜３１頁；Ｇ．Ｒａｍｓａｙ、ＤＮＡ  Ｃｈｉｐｓ：Ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１６巻、１９９８年１月、４０〜４４頁を参照）。しかし、上記の検出装置および方法の不利は信号バックグラウンドが高いことであり、これは精度を制限することになり、ときに相当な技術的労力を生じるとともに、検出方法に関連するコストが高くなる。
【００１３】
流体チャンバ内に設置されるアレイフォーマットの小規模集積物質ライブラリの検出に適している種々の系、特に共焦点系が知られている（例えば、米国特許第５３２４６３３号、第６０２７８８０号、第５５８５６３９号、国際公開第００／１２７５９号を参照）。
【００１４】
しかし、上記の方法およびシステムは、特に分散、反射、および光学収差が中で発生するために、非常に限定された方法で特に流体システム内に取り付けられる大規模集積分子アレイの検出にのみ適合することが可能である。さらに、そのような大規模集積アレイでは、空間分解能に関わる大きな需要があるが、しかし現在までは技術的に実施することができなかった。
【００１５】
したがって、高い精度と比較的わずかな技術的労力でプローブと標的との間の相互作用を定性的および／または定量的に検出することのできる高度に集積化されたアレイの必要性がある。
【００１６】
選択性の幅が広くなり、代替構成要素が利用し易くなれば、固体に結合されたアッセイのための蛍光偏光および時間分解蛍光のような代替的撮像技術を確立し易くなる。マイクロタイター形式で定量するために、偏光形態で励起されたフルオロフォアを用いて偏光軸を捻るという効果が使用される。さらに、高スループットを有する安価なシステム（ＨＴＳシステム）を、それに応じて修正されたポリマー箔を偏光フィルタとして用いて設定するアプローチがある（Ｉ．Ｇｒｙｃｚｃｙｎｓｋｉら、Ｐｏｌａｒｉｓａｔｉｏｎ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｖｉｓｕａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９年、第７１巻、１２４１〜１２５１頁を参照）。
【００１７】
さらに最近の開発はランタノイドなどの無機材料の蛍光（Ｍ．Ｋｗｉａｔｏｗｓｋｉら、Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈｅｌａｔｅ−ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒｉｐｌｅ−ｃｏｌｏｒ  ｌｉｇａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４年、２２、１３）および量子ドット（Ｍ．Ｐ．Ｂｒｕｃｈｅｚら、Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ  ａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｌａｂｅｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年、第２８１巻、２０１３頁）を利用する。マイクロ秒の範囲内の長い放出時間を示すランタノイドキレートなどの染料は染料から移動相への転換を必要とするので、局所的に分解された検出は不可能である。
【００１８】
金ビーズによって標識された試料を検出するための光学設備および銀増幅を用いたそれらの視覚化については、国際特許出願第００／７２０１８号に記載されている。しかし、そこに記載の装置は静的測定における検出だけに適している。静的測定では、プローブアレイ上にレイアウトされたプローブとの標的の相互作用に続いて、また相互作用が生じたそれらのアレイ要素上に沈着をもたらす反応の開始に続いて、画像は、記録され、測定されたグレー値濃度に割り当てられるが、これは沈着形成の程度に依存する。
【００１９】
プローブアレイ上のプローブと標的との間の分子相互作用を用いて試料中の標的を定性的および／または定量的に検出する方法は、国際公開第０２／０２１８０号に提供されており、そこではアレイ要素における沈着形成の時間依存挙動が信号強度の形式で検出される。すなわち、動的測定が実行される。沈着形成を時間の関数として表す曲線関数に基づいて、アレイ要素上のプローブと標的との間の相互作用を定量する値、故に結合している標的の量が各アレイ要素に割り当てられる。
【００２０】
このような動的測定は、例えば、特定の熱的条件下で、または例えば記録時の特定の解決法の存在下における手順の特定の段階下での画像系列を記録することが必要である。これは特に遺伝子型特定の分野で使用する際には、高度に集積化されたアレイの個々の構成要素の複雑な連携を必要とする。
【００２１】
さらに、生物医学的診断における多数の試験では、分子は検出に十分な量では最初は存在しておらず、したがって多くの場合、最初は実際の試験手順の前に試料から増幅しなければならないという問題が生じる。典型的には、ＤＮＡ分子の増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて実行される。ＲＮＡ増幅のためには、逆転写によってＲＮＡ分子を相応する相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転換しなければならない。次いで、前記ｃＤＮＡもＰＣＲを用いて増幅することができる。ＰＣＲは（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１年）のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓのような）標準的な実験方法である。
【００２２】
ＰＣＲを用いたＤＮＡの増幅は比較的高速であり、小型化された方法を用いた少量の設定体積での高試料スループットを可能にし、自動化により運転が効率化される。
【００２３】
しかし、単なる増幅を用いた核酸の特徴付けは不可能である。むしろ、増幅の後にＰＣＲ産物の特徴付けのために、核酸配列決定、ハイブリダイゼーション、および／または電気泳動分離および単離法のような分析方法を使用することが必要である。
【００２４】
一般に、核酸の増幅およびそれらの検出のための装置ならびに方法は、実験者による介入が可能な限り少なくて済むような方法で設計されなければならない。核酸の増幅およびこの検出を可能にし、この検出過程で実験者が最低限介入するだけでよい方法の利点は明白である。一方では、汚染が回避される。他方では、そのような方法の再現性は、それらの方法が自動化を使用できることから実質的に増大される。これは、さらに診断方法の承認を考慮する上でも非常に重要である。
【００２５】
現在、核酸の増幅およびそれらの検出のための多様な方法が存在し、まず標的物質がＰＣＲ増幅を用いて増幅され、続いてプローブアレイに対するハイブリダイゼーションを用いて、標的配列の識別または遺伝状態が決定される。一般に、ハイブリダイゼーションの範囲内で定性的および定量的検出に十分な自由に使える量を有するためには、検出されるべき核酸分子または標的分子の増幅が必要である。
【００２６】
ハイブリダイゼーションを用いた核酸のＰＣＲ増幅およびそれらの検出はともに、いくつかの基本的な問題を被る。同様に、これはハイブリダイゼーションを用いた核酸のＰＣＲ増幅とそれらの検出を組み合わせた方法に当てはまる。例えば、ＰＣＲ増幅とハイブリダイゼーションを用いたこの検出を組み合わせたある方法を用いて、検出される核酸分子または検出される標的分子に蛍光標識されたプライマー形態の検出可能なマーカーを挿入する場合、実際の検出の前には洗浄工程が一般に行われる。そのような洗浄工程は、増幅産物に比して非常に多量に存在する未転換のプライマーを除去するほか、検出反応に関与しないかまたはマイクロアレイの核酸プローブと特異的にハイブリダイズしていない蛍光標識の付いたそのようなヌクレオチドを除去する。このように、これらの分子によって引き起こされる高いレベルの信号バックグラウンドは低減されるものと仮定される。しかし、そのような付加的な手順工程は検出方法の速度を著しく遅くする。さらに、検出可能な信号は検出される核酸（れらの核酸は、マイクロアレイの核酸プローブと特異的にハイブリダイズする。）に対しても著しく低減される。こ後者は主に、ハイブリダイゼーションを用いて結合された標的と溶解された標的との間の平衡が洗浄工程後には最早存在しないという事実に基づく。アレイ上に位置する核酸プローブと既にハイブリダイズした核酸が洗浄によって結合部位から離れ、したがって、溶解された分子とともに洗い出される。結局、溶解された分子の洗浄またはリンス工程を既にハイブリダイズしている核酸の脱離よりも高速で行えば、検出可能な信号のみが残ることになる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
したがって、高い精度とわずかの技術的努力でプローブと標的との間の相互作用を定性的および／または定量的に検出することができる高度に集積されたアレイの必要性がある。
【００２８】
さらに、ＰＣＲおよび例えばハイブリダイゼーション反応などの分析反応の実行を１つの反応空間で可能にする装置の必要性がある。
【００２９】
したがって、特にアッセイと試験系との適合性の欠如に起因して生じる上記の当該技術の問題を解決することが本発明の根本的な課題である。
【００３０】
特に、プローブアレイ上のプローブと標的との分子間相互作用を定性的および／または定量的に検出することのできる高い精度と高感度であることに加えて容易で費用効率の高い方法および装置をそれぞれ提供することが、本発明の根本的な課題である。
【００３１】
さらに、検出手順において実験者の介入を最小にすることのできる、核酸の増幅ならびに定性的および定量的検出のための装置および方法をそれぞれ提供することが、本発明の根本的な課題である。
【００３２】
アレイ上の標的分子とプローブ分子との間の相互作用を損なうことなく、マイクロアレイ上の相互作用の検出において高い信号対雑音比が補償される、核酸の定性的および／または定量的検出のための方法および装置をそれぞれ提供することが、本発明の根本的なさらなる課題である。
【００３３】
さらに、検出の高い動的解像度が達成される、すなわち強い信号間の弱いプローブ／標的相互作用の検出が保証されたままである装置および方法をそれぞれ提供することが、本発明の根本的なさらなる課題である。
【００３４】
核酸の増幅および特徴付けを高スループット率でほぼ同時に可能にする装置および方法をそれぞれ提供することが、本発明の根本的な課題である。
【００３５】
本発明の根本的なこれらおよびさらなる問題は本特許請求の範囲を特徴とする実施形態を提供することによって解決される。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
本発明によれば、溶液の交換および／または除去を省くことのできる、すなわち特に洗浄工程またはリンス工程を省くことのできる、プローブ分子と標的分子との間の分子間相互作用を定性的および／または定量的に検出する方法が提供される。
【００３７】
本発明によるそのような方法は特に：
ａ）プローブ分子がアレイ要素の上に固定化された基材を備えたマイクロアレイを有する反応チャンバに標的分子を含んでいる試料を供給するステップと、
ｂ）基材上に固定化された標的分子とプローブ分子との間の相互作用を検出するステップとを含み、
標的分子を含んでいる試料を供給した後で、検出手順の前およびその間に反応チャンバ内の溶液の交換および／または反応チャンバからの溶液の除去が行われない。
【００３８】
さらに、本発明の範囲内で、そのような方法を実行するのに適した装置を提供する。
【００３９】
特に、本発明の範囲内で、
ａ）装置の第１の表面上に配置され、プローブ分子がアレイ要素上に固定化された基材を有するマイクロアレイと、および
ｂ）マイクロアレイがその上に配置された第１の表面と第２の表面との間に画定された反応チャンバと（マイクロアレイと第２の表面との間の距離が可変である。）を備えるプローブ分子と標的分子との間の分子相互作用を定性的および／または定量的に検出する装置を提供する。
【００４０】
特に、通常は本発明の装置の検出平面を形成する、マイクロアレイと第２の表面との間の距離の可変性によって、マイクロアレイのプローブ分子に対して特異的親和性を有さず、故にそれらと相互作用しない標識した標的分子によって引き起こされる信号バックグラウンドが著しく低減されるか、完全に回避されることが可能となる。
【００４１】
さらに、本発明によれば、
ａ）上記のような本発明の装置の反応チャンバ内に標的分子を含んでいる試料溶液を供給するステップと、
ｂ）基材上に固定された標的分子とプローブ分子との間の相互作用を検出するステップとを含む、
プローブ分子と標的分子との間の分子相互作用の定性的および／または定量的検出のための方法を提供する。
【００４２】
標的分子を検出する本発明の方法および装置は、検出方法を実行する、場合によっては標的分子の増幅を実行するのに必要な実験者の反応チャンバ内での介入が可能な限り少なくなるように設計される。これは汚染がそれによって回避されるという必要不可欠な利点を提供する。さらに、本発明の方法は外的介入が最小であるために自動化を利用することができるので、本発明の方法の再現性が従来の方法に比して著しく増大される。上記利点は診断方法の承認という観点では重要な役割を果たす。
【００４３】
また、特に本発明を説明するために、以下の定義を用いる。
【００４４】
本発明の範囲内で、プローブまたはプローブ分子あるいは分子プローブとは、特定の特徴的結合挙動および／または特定の反応性による他の分子の検出に使用される分子を表すものと理解されたい。固体表面に結合させることが可能であり、また特異親和性を有する各タイプの分子はアレイ上に配置されたプローブとして使用され得る。好適な実施形態においては、これらは生体ポリマー、特に、ペプチド、タンパク質、抗原、抗体、炭水化物、核酸および／またはそれらの類似体のクラスからの生体ポリマーおよび／または上記生体ポリマーの混合されたポリマーである。プローブは核酸および／または核酸類似体であることが特に好ましい。
【００４５】
特に、ハイブリダイゼーション法において標的分子の検出に使用される、定義され、知られている配列の核酸分子をプローブと呼ぶ。ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子はともに核酸として使用することができる。例えば、核酸プローブまたはオリゴヌクレオチドプローブは１０〜１００塩基長、好適には１５〜５０塩基長、特に好適には２０〜３０塩基長を有するオリゴヌクレオチドであり得る。典型的には、本発明によれば、一本鎖核酸分子または核酸類似体の分子、好適には標的分子の配列領域と相補的な少なくとも１つの配列領域を有する一本鎖ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。検出方法および使用に応じて、このプローブを例えばマイクロアレイの形態で固体支持基材上に固定化することができる。さらに、検出方法に応じて、プローブを放射性または非放射性に標識することができるので、現行技術における従来の検出方法を用いて検出可能である。
【００４６】
本発明の範囲内で、標的また標的分子は分子プローブを用いて検出される分子を表すものと理解されたい。本発明の好適な実施形態では、検出される標的は核酸である。しかし、本発明のプローブアレイは、類似する方法で、ペプチド／プローブ相互作用、タンパク質／プローブ相互作用、炭水化物／プローブ相互作用などの検出にも使用され得る。
【００４７】
本発明の範囲内で、標的がプローブアレイ上に配置されたプローブに対するハイブリダイゼーションを用いて検出される核酸または核酸分子である場合、４０〜１０，０００塩基長、好適には６０〜２，０００塩基長、また好適には６０〜１，０００塩基長、特に好適には６０〜５００塩基長、最も好適には６０〜１５０塩基長の配列を含む。場合によっては、これらの配列は、プライマーの配列とともに、これらのプライマーによって定義されるテンプレートの配列領域を含む。特に、標的分子は一本鎖または二本鎖核酸分子であり、一方の鎖または両方の鎖が放射活性物質または非放射活性物質で標識され、当該分野で慣行の検出方法を用いて検出可能である。
【００４８】
本発明によれば、標的配列とは、プローブを用いたハイブリダイゼーションによって検出される、標的の配列領域を表す。本発明によれば、標的配列とはプローブによってアドレスされる前記領域も指す。
【００４９】
本発明の範囲内で、物質ライブラリとは多数の異なる分子、好適には少なくとも２〜１，０００，０００種の異なる分子、特に好適には少なくとも１０〜１０，０００種の異なる分子、最も好適には１００〜１，０００種の異なる分子を表すものと理解されたい。特別な実施形態では、物質ライブラリは単に少なくとも５０種以下または少なくとも３０，０００種の異なる分子を含み得る。この物質ライブラリは本発明の装置の反応チャンバ内の担体上にアレイの形態でレイアウトされることが好ましい。
【００５０】
本発明の範囲内で、プローブアレイは、各プローブの位置が別々に定義されている担体上の分子プローブまたは物質ライブラリの配置を表すものと理解されたい。好適には、アレイは定義された部位および／または所定の領域、いわゆるアレイ要素を含み、該アレイ要素は、特に好適には特定のパターンで配置され、各アレイ要素は通常ただ１つの化学種のプローブを含む。ここで、担体上の分子またはプローブの配置は、共有結合または非共有結合相互作用を用いて形成され得る。ここでは、プローブは反応チャンバに面する担体の側に配置される。この配置内、すなわちアレイ内の位置は通常、スポットと呼ばれる。
【００５１】
本発明の範囲内で、アレイ要素、所定領域、スポット、またはアレイスポットは、表面上の分子プローブの堆積に関して決定される特定の領域を表すものと理解されたい。つまり、占有されている全てのアレイ要素全体がプローブアレイである。
【００５２】
本発明の範囲内で、担体要素または担体または物質ライブラリ担体または基材は、プローブアレイが配置される固形物を表すものと理解されたい。担体は、通常基材またはマトリクスとも呼ばれ、例えば物体担体またはウエハあるいはセラミック材料を表し得る。特別な実施形態では、プローブを第１の表面上に、好適には第１の表面の少なくとも一部分の上に直接固定化することもできる。
【００５３】
基材または検出表面上にアレイ配置で適切に配置された分子の、または基材もしくは検出表面上にアレイ配置で配置された物質ライブラリの、および担体または基材の全体はまた、「チップ」、「マイクロアレイ」、「ＤＮＡチップ」、「プローブアレイ」等ともときに呼ばれる。
【００５４】
本発明の範囲内で、検出平面は、本発明の装置の第２の表面を表すものと理解されたい。マイクロアレイ上に配置されたプローブは、特にマイクロアレイと第２の表面との間の距離が約ゼロにまで短縮されるという事実により、プローブと標的との間の相互作用を検出する間は検出平面内に実質的に置かれることが好ましい。
【００５５】
本発明の範囲内で、チャンバ本体は、反応チャンバの底を形成する固体物を表すものと理解されたい。物質ライブラリ担体またはチップは通常、チャンバ本体の一部であり、物質ライブラリ担体はチャンバ本体の残りの部分とは異なる材料で作成され得る。
【００５６】
本発明の範囲内で、反応チャンバまたは反応空間は、マイクロアレイと第２の表面との間に形成された空間、および好適には毛細管ギャップの形で設計された空間を表すものと理解される。この反応空間は、例えば弾性シールとして実施され得る側壁によって横方向に制限されている。マイクロアレイ上に固定化されたプローブは、反応チャンバの内側に面する側面上に位置している。反応チャンバまたは反応空間の底部は、アレイの第１の表面または第２の表面とによってそれぞれ定義される。特に、第２の表面または検出平面と基材またはマイクロアレイの表面との間の距離は、反応空間または反応チャンバまたは毛細管ギャップの厚さと呼ばれる。本発明の範囲内で、反応空間は通常、ごくわずかな厚さ、例えば最大で１ｃｍ、好適には最大で５ｍｍ、特に好適には最大で３ｍｍ、および最も好適には最大で１ｍｍの厚さである。
【００５７】
本発明の範囲内で、マイクロアレイと第２の表面との間の距離は、マイクロアレイ基材の表面、すなわち反応空間に面するマイクロアレイの側と、反応空間に面する第２の表面の側との間の距離を表すものと理解されたい。マイクロアレイと第２の表面との間の距離が約ゼロの場合、これは基材の表面が第２の表面の上に均一に寄り置かれていることを意味する。
【００５８】
本発明の範囲内で、毛細管ギャップは、マイクロアレイと第２の表面との間に作用する毛管力を用いて満たされることができる反応空間を表すものと理解される。通常、毛細管ギャップはわずかな厚さ、例えば最大で１ｍｍ、好適には最大で７５０μｍ、および特に好適には最大で５００μｍの厚さである。本発明によれば、１０から３００μｍ、１５μｍから２００μｍ、または２５μｍから１５０μｍの範囲の厚さが毛細管ギャップの厚みとして好ましい。本発明の特別な実施形態では、毛細管ギャップの厚さは、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、または９０μｍである。本発明の範囲内では、反応空間または反応チャンバの厚さが２ｍｍを超える場合、反応空間または反応チャンバは、最早毛細管ギャップと呼ばれない。
【００５９】
本発明の範囲内では、カートリッジまたは反応カートリッジとは、反応チャンバとチャンバ本体および対応する鋳造物とのユニットを表すものと理解されたい。
【００６０】
本発明の範囲内で、共焦点蛍光検出システムは、物体が点光源を用いて対物レンズの焦点面内で照射される蛍光検出システムを表すものと理解される。ここで、点光源、物体、および点光源検出器は、光学的共役面上に正確に配置される。共焦点システムの実施例については、Ａ．Ｄｉａｓｐｒｏ、Ｃｏｎｆｏｃａｌ  ａｎｄ  ２−ｐｈｏｔｏｎ−ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｄｖａｎｃｅｓ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、２００２年に記載されている。
【００６１】
本発明の範囲内で、反応チャンバ全体の全体積を撮像する蛍光光学系は、非共焦点蛍光検出システム、すなわち点光源を用いた照明が物体に制限されない蛍光検出システムを表すものと理解される。したがって、このような蛍光検出システムは焦点制限を有さない。
【００６２】
本発明の範囲内の従来のアレイまたはマイクロアレイは、例えば１ｍｍから４ｍｍ×１ｍｍから４ｍｍ、好適には２ｍｍ×２ｍｍの好適には正方形表面上で、約５０から１０，０００、好適には１５０から２，０００の異なる化学種のプローブ分子を含む。本発明の範囲内の他の実施形態において、マイクロアレイは、数ｍｍ２から数ｃｍ２、好適には約１ｍｍ２から１０ｃｍ２、特に好適には２ｍｍ２から１ｃｍ２、および最も好適には約４ｍｍ２から６．２５ｍｍ２の表面上で、約５０から約８０，０００、好適には約１００から約６５，０００、特に好適には約１，０００から約１０，０００個の異なる化学種のプローブ分子を含む。例えば、従来のマイクロアレイは、２ｍｍ×２ｍｍの表面上で１００から６５，０００個の異なる化学種のプローブ分子を有する。
【００６３】
本発明の範囲内で、標識またはマーカーは、検出可能ユニットを、例えば検出可能ユニットが組み合せ得るフルオロフォアまたはアンカー基を表すものと理解されたい。
【００６４】
本発明の範囲内で、増幅反応は、通常、１０から５０以上の増幅サイクル、好適には約２５から４５サイクル、特に好適には約４０サイクルを含む。本発明の範囲内で、循環増幅反応は好適にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。
【００６５】
本発明の範囲内で、増幅サイクルは循環増幅反応の単一の増強工程を表す。ＰＣＲの増強工程はＰＣＲサイクルとも呼ばれる。
【００６６】
本発明の範囲内で、増幅生成物は、循環増幅反応、好適にはＰＣＲを用いて増幅される核酸分子の増強または複写もしくは増幅から得られる生成物を表す。ＰＣＲを用いて増幅される核酸分子はＰＣＲ生成物とも呼ばれる。
【００６７】
本発明の範囲内で、変性温度は、二本鎖ＤＮＡが増幅サイクル内で分離される温度を表すものと理解される。変性温度は通常、特にＰＣＲにおいて９０℃を超えており、好適には約９５℃である。
【００６８】
本発明の範囲内で、アニーリング温度は、プライマーと検出される核酸とがハイブリッド形成する際の温度を表すものと理解される。アニーリング温度は通常、特にＰＣＲにおいて５０℃から６５℃の範囲内にあり、好適には約６０℃である。
【００６９】
本発明の範囲内で、鎖伸展温度または伸展温度は、モノマー成分の挿入によって核酸が合成される温度を表すものと理解される。伸展温度は通常、特にＰＣＲにおいて約６８℃から約７５℃の範囲内にあり、好適には約７２℃である。
【００７０】
本発明の範囲内で、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプライマーは、循環増幅反応において検出されるＤＮＡの相補鎖の合成が結合部位から始まり、標的ＤＮＡとも呼ばれる検出されるＤＮＡを結合またはハイブリッドを形成するオリゴヌクレオチドを表す。特に、プライマーは、より長いＤＮＡまたはＲＮＡ分子の一部と相補的であり、遊離３−ＯＨ基を３’末端に有する好適には約１２から３０個の塩基を含む短いＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドを表す。前記遊離３’ＯＨ基に起因して、プライマーは、いずれかのＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼの基質として作用することができ、ヌクレオチドを５’−３’方向でプライマーに合成することができる。ここで、新しく合成されたヌクレオチドの配列は、プライマーの遊離３’ＯＨ基の向こうにある、プライマーとハイブリッドを形成するテンプレートの配列によって予め決定される。プライマーの通常の長さは、ヌクレオチド１２から５０個分、好適には１５から３０個分である。
【００７１】
相補核酸鎖の合成のために鋳型として作用する二本鎖核酸分子または核酸鎖は通常、テンプレートまたはテンプレート鎖と呼ばれる。
【００７２】
本発明の範囲内で、分子相互作用または相互作用とは標的分子と固定されたプローブ分子との間の、特異的な共有または非共有結合を表すものと理解されたい。本発明の好適な実施形態では、プローブ分子と標的分子との間の相互作用はハイブリダイゼーションである。
【００７３】
相補一本鎖核酸分子からの二本鎖核酸分子または二本鎖分子の形成は、ハイブリダイゼーションと呼ばれる。ここで、この会合は、好適に常にＡおよびＴとＧおよびＣとの対として起こる。ハイブリダイゼーションの範囲内において、例えばＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖、ＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖、またはＲＮＡ−ＲＮＡ二本鎖が形成されることができる。ハイブリダイゼーションを用いて核酸類似物による二本鎖も形成可能であり、例えばＤＮＡ−ＰＮＡ二本鎖、ＲＮＡ−ＰＮＡ二本鎖、ＤＮＡ−ＬＮＡ二本鎖、およびＲＮＡ−ＬＮＡ二本鎖である。ハイブリダイゼーションの実験は通常、配列相補性、したがって２つの異なる核酸分子の識別を検出するために使用される。
【００７４】
本発明の範囲内で、処理は、精製、濃縮、標識、増幅、相互作用、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄およびすすぎ工程とともに、物質ライブラリを用いて標的を検出する際に実行されるさらなる方法工程を表すものと理解されたい。検出自体は処理という用語に該当しない。
【００７５】
本発明の範囲内で、試料または試料溶液または検体または溶液とは、分析される液体であり、特に、検出され、場合によって増幅される標的分子を含む。さらに、例えば、溶液のような緩衝液などの従来の添加剤に加え、特に、増幅反応を実行するのに必要な、プライマーなどの物質を含み得る。
【００７６】
本発明の範囲内で、反応チャンバからの反応チャンバ中の溶液の交換とは、特に、リンス工程または洗浄工程をいう。溶液の交換は、例えば、相互作用の終了に続いて試料溶液を未標識の溶液と交換することによって、マイクロアレイ上のプローブと特異的に相互作用しない、検出可能なマーカーで標識された分子を除去するように働く。マイクロアレイ上のプローブと特異的に相互作用しない分子は、例えば、増幅反応中に転換されなかった、検出可能なマーカーで標識されたプライマーか、または標的分子と特異的に相互作用する、アレイ上に相補的プローブを有さない、検出可能なマーカーで標識された標的分子である。
【００７７】
本発明の範囲内で、反応チャンバからの溶液の除去とは、マイクロアレイ上のプローブと特異的に相互作用しない、検出可能なマーカーで標識された分子を反応チャンバから除去する工程を表すものと理解されたい。マイクロアレイ上のプローブと特異的に相互作用しない分子とは、例えば、増幅反応中に転換されなかった、検出可能なマーカーで標識されたプライマーか、または標的分子と特異的に相互作用する、マイクロアレイ上で相補的プローブを有する、検出可能なマーカーで標識された標的分子である。
【００７８】
しかし、本発明の範囲内において、反応チャンバ内での溶液の交換および／または反応チャンバからの溶液の除去が標的分子を含んだ試料を反応チャンバ内に供給する工程と相互作用の検出工程との間で行われない場合、この時間間隔中に反応チャンバ内に既に存在する溶液の交換または除去を行うことなく溶液反応チャンバ内に供給することはあり得ることである。
【００７９】
したがって、本発明の第１の目的は、特に、
ａ）プローブ分子がアレイ要素の上に固定化された基材を備えたマイクロアレイを有する反応チャンバに標的分子を含んでいる試料を供給するステップと、および
ｂ）基材上に固定化された標的分子とプローブ分子との間の相互作用を検出するステップとを含み、
標的分子を含む試料が供給された後であって、検出の前または検出の間に反応チャンバ内の溶液の交換および／または反応チャンバからの溶液の除去が行われない、プローブ分子と標的分子との間の分子相互作用を定性的および／または定量的に検出する方法を含む。
【００８０】
本発明のこの態様において、本発明の方法の実質的な特徴は、検出される標的分子とマイクロアレイの基材上に固定化されたプローブ分子との間の相互作用の検出は反応チャンバ内での溶液の交換または反応チャンバからの溶液の除去を行うことなく実行されることである。すなわち、標的とプローブとの間の相互作用の検出は、相互作用に続いて必要であるリンス工程または洗浄工程を行うことなく、および／または相互作用に続いて反応チャンバから除去される、マイクロアレイ上のプローブと特異的に相互作用しない分子なしで実行可能である。
【００８１】
本発明の方法は、特に、例えば、共焦点技術の手段によるような、または例えば全反射に起因する深さ選択性照明の使用に基づくまたは導波路に基づく、試料物質における励起光の一過性のデカップリング（ＴＩＲＦ）の手段によるような、焦点選択性検出法方法の手段により、保証され得る。このような焦点選択性の方法は、感度を上げるために、液体中に存在する、すなわちハイブリダイズしていない蛍光分子によって生じるバックグラウンド信号をさらに除外する場合に特に好ましい。蛍光標識した標的分子の使用により、全反射照明蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦ）または共焦点蛍光顕微鏡のような方法によって、特異的相互作用信号をバックグラウンドの蛍光からかくして識別することができる。
【００８２】
この例としては、ＣＣＤベースの検出器であり、この検出器は、分散および反射などの光学的効果を識別するために、入射光または透過光を用いて暗視野内で蛍光プローブの励起を行う（例えば、Ｃ．Ｅ．Ｈｏｏｐｅｒら、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｐｈｏｔｏｎｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＬＩｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｄ  ＣＣＤ  Ｃａｍｅｒａｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａ  ｎｄ  Ｃｈｅｍｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（１９９０年）、３３７〜３４４頁を参照）。本発明の方法に使用することのできる蛍光検出系の別の代替例は、例えば国際公開第００／１２７５９号、国際公開第００／２５１１３号、および国際公開第９６／２７０２５号に記載されているような白色光設備；例えば米国特許第５３２４６３３号、米国特許第６０２７８８０号、米国特許第５５８５６３９号、および国際公開第００／１２７５９号に記載されているような共焦点系；例えば米国特許第５７６０９５０号に記載されているような共焦点結像の場合のニプコーディスクに基づく共焦点励起系；例えば国際公開第９８／５７１５１号に記載されているような構造化励起分布に基づく系；例えば国際公開第９９／２７１４０号に記載されているようなマイクロ光学系を使用する大規模集積蛍光検出系；および例えば国際公開第００／１２７５９号に記載されているようなレーザ走査システムである。このような従来の蛍光検出システムを使用する蛍光検出法の一般的な経過は、例えば米国特許第５３２４６３３号明細書に記載されている。
【００８３】
反応チャンバが毛細管ギャップによって形成される、国際公開第２００４／０８７９５１号に記載された装置は、反応チャンバ内の溶液を交換することなくおよび／または反応チャンバから溶液を除去することなく本発明の検出方法を実行するのに特に適している。国際公開第２００４／０８７９５１号の関連する内容をここで明示的に参照する。
【００８４】
本発明のこの態様のさらなる実施形態において、反応チャンバから溶液を交換および／または除去することは、例えば、国際公開第０３／００４６９９号に記載されているようにアレイ表面の質量変化の検出を用いて検出を実行することによって回避される。国際公開第０３／００４６９９号の関連する内容をここで明示的に参照する。
【００８５】
本発明のこの態様のさらなる実施形態において、反応チャンバから溶液を交換および／または除去することは、例えば、Ｚ．ＧｕｔｔｅｎｂｅｒｇらのＬａｂ  Ｃｈｉｐ．２００５年；５（３）：３０８〜３１７頁に記載されているように表面超音波の検出を用いて検出を実行することによって回避される。
【００８６】
本発明のこの態様のさらなる実施形態では、反応チャンバから溶液を交換および／または除去することは、例えば、酸化還元電位の変化を測定すること（例えば、Ｘ．Ｚｈｕら，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ．２００４年；４（６）：５８１〜５８７頁を参照）またはサイクリックボルタンメトリ（例えば、Ｊ．Ｌｉｕら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．、２００５年；７７（９）：２７５６〜２７６１頁；Ｊ．Ｗａｎｇ、ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．、２００３年；７５（１５）：３９４１〜３９４５頁を参照）によってなど、アレイの表面上の電極を介した電気化学的検出を用いて検出を実行することによって回避される。
【００８７】
本発明のこの態様のさらなる実施形態において、反応チャンバから溶液を交換および／または除去することは、例えば、インピーダンス測定（特に、Ｓ．Ｍ．Ｒａｄｋｅら、Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．、２００５年；２０（８）：１６６２〜１６６７頁を参照）によってなど、アレイの表面上の電極を介した電気的検出を用いて検出を実行することによって回避される。
【００８８】
本発明のこの態様のさらなる実施形態において、反応チャンバから溶液を交換および／または除去することは、ＦＲＥＴローブ（ＦＲＥＴ＝蛍光共鳴エネルギー移動）を有するマイクロアレイを採用することによって回避される。このようなＦＲＥＴプローブの使用は例えば、Ｂ．Ｌｉｕら、ＰＮＡＳ、２００５年、１０２、３、５８９〜５９３頁；Ｋ．Ｕｓｕｉら、Ｍｏｌ  Ｄｉｖｅｒｓ．、２００４年；８（３）：２０９〜２１８頁；Ｊ．Ａ．Ｃｒｕｚ−Ａｇｕａｄｏら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．、２００４年；７６（１４）：４１８２〜４１８８頁およびＪ．Ｓｚｏｌｌｏｓｉら、Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００２年；８２（３）：２５１〜２６６頁に記載されている。
【００８９】
本発明のこの態様のさらに特に好適な実施形態において、反応チャンバから溶液を交換および／または除去することは、以下に詳細に記載するように、プローブ分子と標的分子との間の分子相互作用を定性的および／または定量的に検出する本発明の装置を採用することによって回避され、該装置は、
ａ）装置の第１の表面上に配置され、プローブ分子がアレイ要素上に固定化された基材を有するマイクロアレイと、および
ｂ）マイクロアレイがその上に配置された第１の表面と第２の表面との間に画定された反応チャンバ（マイクロアレイと第２の表面との間の距離は可変である。）を備える。
【００９０】
本発明のさらなる目的は、標的分子を含む試料を反応チャンバ内に供給する前または供給の間あるいはプローブと標的分子との間の分子との相互作用を定性的および／または定量的に検出する前または検出の間に反応チャンバ内における溶液の交換および／または反応チャンバからの溶液の除去を回避するための、上記のようなＦＲＥＴプローブ分子の使用に関し、および／または上記のような全反射照明蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦ）、共焦点蛍光顕微鏡、上記のような質量変化を検出する方法、上記のような表面超音波を検出する方法、上記のような電気化学的および／または電気的検出方法からなる群から選択される検出方法に関し、特に、
ａ）プローブ分子がアレイ要素の上に固定化された基材を備えたマイクロアレイを有する反応チャンバに標的分子を含む試料を供給するステップと、
ｂ）基材上に固定化された標的分子とプローブ分子との間の相互作用を検出するステップとを含む。
【００９１】
本発明のさらなる目的は、特に、プローブ分子と標的分子との間の分子相互作を定性的および／または定量的に検出する装置であり、この装置は
ａ）装置の第１の表面上に配置され、プローブ分子がアレイ要素上に固定化された基材を有するマイクロアレイと、
ｂ）前記マイクロアレイがその上に配置された第１の表面と第２の表面との間に画定された反応チャンバと（前記マイクロアレイと第２の表面との間の距離が可変である。）備える。
【００９２】
プローブ分子と標的分子との間の相互作用の終了に続いて、不所望のバックグラウンドが、プローブ分子と相互作用しない、試料溶液中に存在する標識された分子によって引き起こされる。プローブおよび／または標的分子が核酸および／または核酸類似体である場合、前記バックグラウンドは、特に、試料溶液中に存在する、プローブ分子と相互作用しない、標識されたプライマーおよび／または標識された核酸によって引き起こされる。
【００９３】
邪魔になるバックグラウンドの除去の知られている見込みは、相互作用の終了後に、試料溶液を標識されていない例えば非蛍光性の溶液と交換することである。しかし、この変形例は一般に費用がかかり、腐食、溶液の経時的変化および不浸透性という問題があるために障害を生じ易い。
【００９４】
マイクロアレイと第２の表面との間の距離が可変であることが本発明の装置の実質的な特徴である。マイクロアレイと第２の表面との間の距離が可変であるということは、本発明の装置の反応チャンバが圧縮可能であることを意味する。特に、マイクロアレイと第２の表面との間の距離は、その活性側、すなわち核酸プローブアレイが固定化された側に関してマイクロアレイが第２の表面上に均一におよび／または可逆的に置くことができるか、または第２の表面上に押圧され得るように可変である。
【００９５】
したがって、圧縮可能な反応チャンバは、検出を実行する前にマイクロアレイと検出平面との間の距離を短縮することによって、プローブ分子と相互作用しない、故に不所望のバックグラウンドを生じる標識された分子を含んだ試料溶液の交換を可能にする。このようにして、任意の光学検出系を用いたプローブ分子と標的分子との間の相互作用の検出が、試料溶液を、検出の前に標識されていない溶液と交換することなく可能になる。例えば、試料溶液を標識されていない、特に蛍光性の弱い溶液と交換することなく、発明の装置を用いた相互作用信号を検出するためのＤＮＡチップの簡単な蛍光顕微鏡による画像化が可能となる。
【００９６】
特に、以下に記載の本発明の装置の実施形態を用いれば、光学検出系の焦点合わせを最早必ずしも必要としないことが最終的に保証される。このため、本発明の装置は、核酸検出にこれまで使用されていた蛍光光学検出系とは対照的に、例えば、ハイブリダイズしていない標的核酸のようなアレイに結合していない標的分子を除去するのに特に洗浄工程などの溶液を取り扱う工程を必要としない標的とプローブとの間のハイブリダイゼーションを検出する読取装置として、例えば、オートフォーカス機能のない単純な蛍光顕微鏡装置の使用を可能にする。
【００９７】
本発明の装置を用いて実行可能である多機能な試料処理および分析にも拘わらず、試料中の標的分子を検出し、場合によって増幅する非常に費用効率の高い装置が提供される。本発明の装置は、特に光学検出系と関連して、携帯使用にも適するほどにさらに堅牢である。
【００９８】
チップ、処理プロトコルおよび分析用化学物質を適切に選択することによって、例えば、素因診断、病原菌診断および分類などの最も異なるタイプの遺伝子分析に本発明の装置を用いることが可能である。したがって、完璧な遺伝子分析が、使い捨て可能なカートリッジとしても実施可能な本発明の装置において小さな装置労力で実施可能である。したがって、本発明の装置によって例えば、献血中に現場で検出の実行が可能となる。好適には０．５〜２時間以内に、測定結果を迅速に取得することができる。核酸の精製、処理および増幅などの本発明の装置により実行可能なすべての工程および実際のハイブリダイゼーションを自動で行うことが可能である。操作者は試料の引き抜き、本発明の装置への試料の供給に慣れること、および分析結果に注意することだけでよい。
【００９９】
マイクロアレイと第２の表面との間の距離は約０〜約１ｍｍの範囲で可変であることが好ましい。マイクロアレイと第２の表面との間の距離のさらに好適な下限は、約０．１μｍ、約１μｍおよび約１０μｍである。マイクロアレイと第２の表面との間のさらに好適な上限は、約０．０１ｍｍ、約０．５ｍｍ、約１ｍｍであり、約０．３ｍｍが最も好ましい。驚くべきことに、アレイ上のプローブと標的との間の距離は、基材表面と第２の表面との間の距離が近似的にゼロまたは約ゼロの場合であっても、影響すら受けることはない。
【０１００】
本発明の装置は検出系をさらに備えることが好ましい。この場合、検出系は光学系であることが好ましい。本発明の範囲内で適した系の例には、蛍光、光学的吸収、共鳴伝達等に基づいた検出系がある。光学検出系は蛍光光学系であることが好ましい。蛍光光学系は、オートフォーカスのない蛍光顕微鏡、例えば、焦点が固定された蛍光顕微鏡であることが特に好ましい。
【０１０１】
さらなる実施形態において、検出系は、第２の表面に置かれたときに検出系と第２の表面との間の距離を調節する少なくとも１つのスペーサに接続されている。マイクロアレイと第２の表面との間の距離が約ゼロの場合、スペーサがチップの表面と検出装置の光学系との間の距離を決定する。このようにして光学検出装置とマイクロアレイ表面との間の距離の変動を非常に小さく保つことが可能となる。この変化は、第２の表面の、一般にはガラス表面の厚さの変化、第２の表面の偏位、チップと検出平面との間のまたはスペーサと検出平面との間の押圧表面にある可能性のある不純物により生じる層の厚さを含んでいるだけである。これにより光学系を焦点に合わせるための再焦点合わせが不要になり、装置の操作を非常に容易にしおよび／または高価な自動焦点合わせを不要にする。
【０１０２】
さらなる実施形態では、マイクロアレイと第２の表面との間の距離が縮小されるときに反応チャンバ内の容積を基本的に一定に保つ横方向に制限する補償領域が、第１の表面と第２の表面との間に画定された反応空間に提供される。
【０１０３】
第１の表面と第２の表面との間に画定された反応空間は、弾性シールによってさらに横方向に制限されることが好ましい。この弾性シールはシリコーンゴムから作成されるのが特に好ましい。
【０１０４】
プローブ分子と標的分子との間の相互作用を確実に検出するために、第２の表面は特に光学的に透過性の材料、好適にはガラスから作成される。
【０１０５】
本発明の装置のさらなる実施形態において、第１の表面は、マイクロアレイがマイクロアレイと第２の表面との間の距離が可変であるように第２の表面に対してマイクロアレイが誘導されるように開発された少なくともマイクロアレイの下の領域にある。
【０１０６】
ここでは、第１の表面は、少なくともマイクロアレイの下の領域において、マイクロアレイと第２の表面との間の距離が短縮されるように、マイクロアレイを第２の表面の方向に向かって誘導できるようにおよび／またはマイクロアレイと第２の表面との間の距離が増大されるようにマイクロアレイを第２の表面から離れた方へ誘導できるように、開発され得る。
【０１０７】
この実施形態では、少なくともマイクロアレイの下の領域において、第１の表面は弾性的に変形され得る。第１の表面は弾性のある合成材料、例えば、弾性膜から作成されることが特に好ましい。
【０１０８】
第１の表面は重ね合わされた２枚の層から形成され、該重ね合わされた２枚の層の外側層は少なくともマイクロアレイの下の領域において凹部を有していることがさらに好ましくあり得る。この実施形態において、重ね合わされた２枚の層の内側層は、通常は反応空間を横方向に制限もする（図６を参照）弾性シール材または封止膜から形成されることが好ましい。該封止膜は第２の表面方向に誘導され得る。該封止膜は、通常はチャンバ本体の下部側に対応する、外側層の凹部を閉鎖する。反応チャンバにおけるＰＣＲの実行中、ＰＣＲ内には高温が蔓延しているために、封止膜が比較的柔軟であるにも拘わらず反応チャンバを圧力抵抗性にする内圧が生じる。このため、この実施形態は自動閉鎖弁に相当する。この封止膜の弾性を保証するために、該膜は補償用のひだ部（図６を参照）を備えることが好ましい。
【０１０９】
マイクロアレイを第２の表面に対して誘導することのできる少なくとも１つの手段を含む装置がさらに提供され得る。以下では、前記手段は第１の表面の誘導手段と呼ばれる。前記第１の表面誘導手段はロッド、ピン、タペットおよびネジからなる群から選択されることが好ましい。
【０１１０】
ここでは、本装置は第１の表面を誘導する少なくとも１つの手段を含むことができ、それによりマイクロアレイと第２の表面との間の距離が短縮されるように第２の表面に対してマイクロアレイを誘導することができおよび／またはそれによりマイクロアレイと第２の表面との間の距離が増大されるように第２の表面から離れる方へマイクロアレイを誘導することができる。
【０１１１】
第１の表面上に及ぼされる圧力および／または牽引力を用いて第２の表面に関連してマイクロアレイを誘導することができるのが特に好ましい。
【０１１２】
ここでは、第２の表面に置かれている上記スペーサが、第１の表面を誘導する手段用の保持部として機能し得る。
【０１１３】
第１の表面を誘導する手段によって、第１の表面を振動させることができる、特に１０〜３０Ｈｚの周波数で振動させることができる、特に好適には約２０Ｈｚで振動させることができることはさらに好ましくあり得る。このようにして、検出を妨げる可能性のある、チップの上に存在する気泡を除去することができ、および／または第１の表面を誘導する手段の振動による混合によって、相互作用の速度、例えば、ハイブリダイゼーション速度が増大され得る。
【０１１４】
マイクロアレイとでとの間の距離が可変になるように、第２の表面が第１の表面に関連して誘導され得ることも好ましくあり得る。
【０１１５】
ここでは、マイクロアレイと第２の表面と間の距離を短縮できるようにおよび／またはマイクロアレイと第２の表面との間の距離を増大するように、第２の表面が第１の表面に関連して誘導され得る。
【０１１６】
これは特に、マイクロアレイと第２の表面との間の距離が可変になるようにスペーサが第２の表面上に圧力および／または牽引力を及ぼすことによって第１の表面に対して誘導可能である第２の表面によって保証することができる。
【０１１７】
本発明の装置のさらに好適な実施形態において、第１の表面および第２の表面の両方を、マイクロアレイと第２の表面との間の距離が可変になるように誘導することができる。
【０１１８】
さらなる実施形態において、既に最初の状態において、第１の表面上に設置されたマイクロアレイが検出平面を形成する第２の表面上に好適には均一に置かれるように、本発明の装置が開発される。マイクロアレイと第２の表面との間の距離を増大できるように、第１の表面が誘導され得る。この場合、第１の表面は弾性材料から作成されることが好ましい。
【０１１９】
本発明の装置のさらなる実施形態において、第１の表面は回転軸周囲に枢転可能であるように開発される。該回転軸は第１の表面を２つの側に分割する。この実施形態では、マイクロアレイは第１の表面の第１の側面部分上に配置される。旋回運動用のこの回転軸は第１の表面の中心を通るのが好ましい。すなわち、２つの側面部分は等しい大きさであることが好ましい。第１の表面は弾性材料から作成されるのが好ましい。
【０１２０】
枢転可能な第１の表面の第１の位置において、第１の表面は第２の表面に基本的に平行に配置される。第１の位置において、マイクロアレイの表面は第２の表面に基本的に均一に接触する。すなわち、プローブ分子が上に固定化された基材表面は基本的には、試料溶液によって湿らされない。前記第１の部分では、以下においては処理チャンバとも呼ばれる空間が第１の表面の第２の側面部分と第２の表面との間に形成されている。前記処理チャンバは試料溶液を処理するためのチャンバとして機能し得る。
【０１２１】
枢転可能な第１の表面の第２の位置においては、第１の表面は第２の表面に対して１８０°以外の角度で配置される。前記第２の位置では、マイクロアレイの表面は第２の表面と接触しない。すなわち、マイクロアレイの基材上に固定化されたプローブ分子は、試料溶液中に存在する標的分子に自由に接近することが可能で、したがって標的分子と相互作用することができる。該第２の位置において、処理チャンバが圧縮される。
【０１２２】
第１の表面の第１の側面部分上に牽引力を及ぼすことによっておよび／または第１の表面の第２の側面部分に圧力を及ぼすことによって、枢転可能な第１の表面を旋回させることができるのは好ましい。上記のような第１の表面を誘導する手段を用いて圧力および／または牽引力を及ぼすことができる。
【０１２３】
チップまたは基材または第１の表面は、好適には、酸化アルミニウムセラミック、ボロフロートガラス、石英ガラス、単結晶ＣａＦ２、サファイアディスク、トパーズ、ＰＭＭＡ、ポリカーボネートおよび／またはポリスチレンなどのシリコンセラミック材料から構成され得る。また材料の選択は、装置および／またはチップの用途に合わせて調整される。例えば、チップがＰＣＲ生成物の特徴付けに使用される場合、９５℃の温度に耐え得る材料のみが使用可能である。
【０１２４】
チップは、核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子により官能化されるのが好ましい。しかし、これらはまた、ペプチドおよび／またはタンパク質（例えば抗体、受容体分子、薬理活性ペプチドおよび／またはホルモン）、炭水化物、および前記生体ポリマーの混合ポリマーなどにより官能化され得る。
【０１２５】
さらに好適な実施形態において、分子プローブは、ポリマーリンカー、例えば修飾されたシラン層を介して基材表面上に固定化される。このようなポリマーリンカーは、基材表面の誘導体合成に、したがって分子プローブの固定化に使用されることができる。プローブの共有結合の場合、エポキシドまたはアルデヒドのような反応性官能基を使用して官能化され、および／または修飾されたポリマー、例えばシランが使用される。さらに、当業者はまた、イソチオシアン酸塩、スクシニミド、およびイミドエステルを用いた表面の活性化に精通している。この目的のために、アミノ官能化表面は多くの場合、それに応じて誘導体化される。さらに、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドなどのカップリング試薬の添加は、分子プローブの対応する固定化を保証することができる。
【０１２６】
反応チャンバのチャンバ本体は、好適にはガラス、合成材料および／または高品位の鋼鉄、アルミニウム、および真鍮などの金属から形成される。チャンバ本体の製造のために、例えば射出成形に適した剛性材料が使用され得る。特に、マクロロン、ナイロン、ＰＭＭＡおよびテフロンなどの剛性材料が考えられる。特別な実施形態において、５〜３０％の炭素繊維を有するポリアミド、５〜３０％の炭素繊維を有するポリカーボネート、２〜２０％のステンレス鋼繊維を有するポリアミド、および５〜４０％の炭素繊維を有する、特に好適には２０〜３０％の炭素繊維を有するＰＰＳなどの導電性合成材料が好ましい。場合によってはおよび／またはそれに加えて、第１の表面と第２の表面との間の反応空間は、例えば注射器を用いて反応空間を満たすことができるようになる隔壁を用いて閉鎖されることができる。好適な実施形態において、チャンバ本体は、ガラス、ＰＭＭＡ、ポリカーボネート、ポリスチレン、および／またはトパーズなどの光学的に透明な材料からなる。ここで、材料の選択は、装置の意図した使用に合わせて調整される。例えば、材料の選択時に装置が曝される温度が考慮されるべきである。例えば、装置がＰＣＲの実行に使用される場合、例えば長時間にわたり９５℃程度の温度でも安定している合成材料のみが使用されることができる。
【０１２７】
特に、チャンバ本体は第２の表面に対して均一におよび／または核酸プローブがその上に固定化される、その活性側すなわちアレイの側に対して可逆的に押圧されるように開発される。
【０１２８】
特別な実施形態において、本発明の装置は、チャンバ本体（好ましくは合成材料から作製される）、隔壁または反応チャンバを密閉するシール、ＤＮＡチップおよび／または透明な第２表面（好適にはガラス板）からなる群より選択されるモヂュールを含む。ここで、前記第２表面は同時にチップとしても場合によって機能し得る（図２および３を参照）。この実施形態において、チャンバ本体およびシールは弾性的に開発され、ＤＮＡチップはガラスカバーに対してその活性側に関して均一および可逆的に押圧され得る。これにより、ＤＮＡチップと検出表面との間に位置する標識した分析液体が完全に移動される（図５および６を参照）。このようにして、高感度の蛍光検出、例えば、試料溶液のバックグラウンド蛍光によって干渉されることなくコンピュータ画像による蛍光顕微鏡検査法を実行することができる。
【０１２９】
チャンバ本体の第２の表面は、ガラスおよび／または光学的に透明な合成材料、例えばＰＭＭＡ、ポリカーボネート、ポリスチレン、またはアクリルなどの透明材料からなることが好ましい。
【０１３０】
反応チャンバは第２の表面とマイクロアレイとの間に、厚さが可変である毛細管ギャップの形態で開発される。チップと検出平面との間に毛細管ギャップを形成することによって、毛管力を利用して反応チャンバを安全に充填することができる。前記毛管力は反応チャンバの非圧縮状態で既に生じている。しかし、毛管力は反応チャンバを圧縮することによって増大され得る。毛細管ギャップは約０μｍ〜約１００μｍの厚さを有していることが特に好ましい。
【０１３１】
反応空間を圧縮できるという可能性、故にマイクロアレイと検出平面との間のギャップの幅を低減できるという可能性から、反応チャンバ内において液体を取り扱う得るというさらなる可能性が生じる。したがって、本発明のさらなる実施形態において、いくつかのサブチャンバが１つの単一チャンバの代わりに設けられ、この場合、前記サブチャンバ間の間仕切りは第２の表面の高さに達していないので、反応チャンバの非圧縮状態においてサブチャンバ間に流体接続が生じる。反応チャンバを圧縮することによって、このチャンバは分離され得る。したがって、チャンバ間の間仕切りを圧縮することによって、この間仕切りを弁のように操作することができる。
【０１３２】
弁によって分割されたサブチャンバの特別な実施形態は、本発明の装置の反応空間を異なるＰＣＲチャンバに再分割することである。最初、サブチャンバには同時に検体が充填される。続いて、反応空間が圧縮される。この後、反応空間はＰＣＲ用の温度サイクルに曝される。各サブチャンバに異なるプライマーが充填されると、異なる増幅反応が各チャンバにおいて発生する。チャンバ間のやり取りは生じない。
【０１３３】
ＰＣＲが行われた後、ハイブリダイゼーションが起こる。この場合、サブチャンバは個々のチップ領域または個々のチップを含み得る。しかし、また、マイクロアレイと第２の表面との間の距離を増大させることによってサブチャンバ間の流体接続を可能にすることもでき、これにより、増幅すべき異なる物質が混合され、このようにしてチップ表面にハイブリダイズする。
【０１３４】
サブチャンバが弁により分離されているこの実施形態の利点は、１ステージの反応においては生化学的理由のために限定される、ＰＣＲの多重性が増大すること、すなわち、１つの試料に対して独立したＰＣＲの数が増えることである。このように、ＰＣＲの数をチップ表面上のプローブの可能な数に合わせることが可能である。
【０１３５】
本発明のさらなる実施形態において、かくのごとく反応チャンバは少なくとも２つのサブチャンバを含み、この場合第１の非圧縮状態においてはサブチャンバは流体接続され、第２の圧縮状態ではサブチャンバ間に流体接続は存在しない。
【０１３６】
各サブチャンバはマイクロアレイの所定領域に割り当てられることが特に好ましい。
【０１３７】
特に、サブチャンバは、マイクロアレイを、および／またはサブチャンバ間の壁として機能する空洞を有する第２の表面に設けることによって形成することができる。
【０１３８】
サブチャンバ間の壁は弾性シールによって形成されることが特に好ましい。
【０１３９】
当然、弁によって分離されたサブチャンバーを有する処理ユニットのこの実施形態は、任意に上記圧縮原理のいずれかと組み合わせることが可能である。
【０１４０】
本発明の装置のさらなる実施形態において、第１の表面は、部分的に変形可能な弾性部材、例えば弾性膜から作成される。反応空間の一部のみが圧縮され得るという点で、チップが第２の表面に向かって誘導されるサブチャンバ、互いに分離され得ないサブチャンバ、および変更され得ないサブチャンバが特に形成され得る。これによって、例えば、増幅反応の終わりにハイブリダイゼーションチャンバに塩を圧送するのに使用することのできる簡単なポンプシステムを反応空間内に提供することが可能である。これは例えば、ＰＣＲ実行のためだけに最適化されたＰＣＲ緩衝液の化学的ハイブリダイゼーションを最適化するのに有利であり得る。
【０１４１】
反応チャンバをいくつかのサブチャンバに分割する場合、攪拌用のいくつかの手段を用いることが好ましい。通常、攪拌用の手段は第１の表面を誘導するための手段と同一である。これにより、個々のチャンバを特定的に攪拌することが可能である。これは例えば、別個の増幅空間および／またはハイブリダイゼーション空間を提供するのに適切であり得る。
【０１４２】
当然、攪拌用のいくつかの手段を有する本発明の装置のこの実施形態は、上記圧縮原理のいずれとも任意に組み合わせることが可能である。
【０１４３】
チャンバ本体、反応空間を横方向に制限するシール、マイクロアレイ、および検出表面からなる群から選択された本発明の装置の上記構成要素またはモジュールは、所謂本発明の装置の処理ユニットを形成する。処理ユニットにおいて、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション反応、検出および／または評価を行うことができる。これは、プローブ、および例えば、検出される抗体およびタンパク質である標的にも同様に当てはまるので、ＰＣＲを実行しなくてよい。しかし、核酸標的およびプローブを用いた検出技術に関して、以下の説明を特に行う。しかし、当業者であれば、以下に記載のユニットをどのように改変してそれらユニットを他の用途に適合させるかは明白である。
【０１４４】
本発明の装置の処理ユニットはモジュール形態で構成されるのが好ましい。このことは処理ユニットがモジュールの任意の組合せを含んでよいことを意味する。分析中にモジュールを交換することも可能である。
【０１４５】
さらに好適な実施形態において、本発明の装置は、反応チャンバ内の温度を制御および／または調節するための温度制御および／または調節ユニットをさらに含む。反応チャンバ内の温度を制御および／または調節するためのこのような温度制御および／または調節ユニットは特に、加熱および／または冷却要素あるいは温度ブロックを含む。この場合、加熱および／または冷却要素あるいは温度ブロックは、第１の表面および／または第２の表面と接触するように配置することが可能である。第１の表面および第２の表面の両方を接触させることによって、特に効率的な温度制御および調節が保証される。
【０１４６】
この実施形態において、マイクロアレイの基材または第１の表面および／または第２の表面は、加熱および／または冷却要素あるいは温度ブロックに接続され、また、良好な熱伝導性を有する材料から構成されるべきであることが好ましい。このような熱伝導性材料は、反応チャンバの表面全体にわたって均一な温度プロファイルを提供するという利点を提供し、したがって例えば、ＰＣＲのような温度依存性の反応を反応チャンバ全体にわたって均一に実行することが可能となるので、高い収量が得られるとともに、高精度で制御可能または調節可能である。
【０１４７】
したがって、好適な実施形態において、マイクロアレイの基材または第１の表面または第２の表面は、熱伝導率の高い、好適には１５から５００Ｗｍ−１Ｋ−１の範囲、特に好適には５０から３００Ｗｍ−１Ｋ−１の範囲、最も好適には１００から２００Ｗｍ−１Ｋ−１の範囲の熱伝導率を有する材料からなり、これらの材料は通常、光学的に透明ではない。適切な熱伝導材料の例として、シリコン、酸化アルミニウムセラミックなどのセラミック材料、および／または高等級の鋼鉄、アルミニウム、銅または真鍮などの金属が挙げられる。
【０１４８】
本発明の装置のマイクロアレイの基材または第１の表面または第２の表面が実質的にセラミック材料からなる場合、酸化アルミニウムセラミックが使用されることが好ましい。このような酸化アルミニウムセラミックの例として、Ｋｙｏｃｅｒａ（ドイツ、ノイス）のＡ−４７３、Ａ−４７６、およびＡ−４９３が挙げられる。
【０１４９】
好適には、マイクロアレイの基材または第１の表面または第２の表面は、その逆側、すなわち反応チャンバから逆向きに面する側に、場合により小型化された温度センサおよび／または電極を備えまたは加熱構造を有し、試料液の温度を加減し、誘導電気浸透圧流を用いた試料液の混合を行うことができる。
【０１５０】
温度センサは、例えばニッケル−クロム薄膜抵抗温度センサの形で実装され得る。
【０１５１】
電極は、例えば金−チタン電極の形態、特に４重極の形態で実装され得る。
【０１５２】
加熱および／または冷却要素は、好適には、毛細管ギャップ内の液体の高速加熱および冷却が可能なように選択され得る。ここで、高速加熱および冷却が、過熱および／または冷却要素により、０．２Ｋ／秒から３０Ｋ／秒の範囲、好適には０．５Ｋ／秒から１５Ｋ／秒の範囲、特に好適には２Ｋ／秒から１５Ｋ／秒の範囲、および最も好適には８Ｋ／秒から１２Ｋ／秒または約１０Ｋ／秒の範囲の温度変化を媒介可能であることを表すものと理解されたい。好適には、１Ｋ／秒から１０Ｋ／秒の温度変化がまた加熱および／または冷却要素により媒介されることが可能である。
【０１５３】
加熱および／または冷却要素、例えば抵抗ヒータは、例えばニッケル−クロム薄膜抵抗ヒータの形態で実装され得る。
【０１５４】
温度センサの、加熱および／または冷却要素のまたは温度上昇手段の、ならびに電極の仕様および寸法のさらなる詳細については、国際特許出願公開第０１／０２０９４号の内容を参照されたい。
【０１５５】
好適な実施形態において、反応チャンバの温度加減は、導電性材料からなるチャンバ本体を用いることによって保証される。そのような導電性材料は、場合によっては５〜３０％の炭素繊維を有するポリアミド、場合によっては５〜３０％の炭素繊維を有するポリカーボネート、および／または場合によっては２〜２０％のステンレス鋼繊維を有するポリアミドなどの導電性合成材料であることが好ましい。５〜４０％の炭素繊維を有する、特に好適には２０〜３０％の炭素繊維を有するＰＰＳ（ポリフェニレンスルフィド）が導電性合成材料として使用されるのが好ましい。チャンバ本体は隆起部分および先細部分を有しているように開発されることがさらに好ましい。このようなチャンバ本体内の隆起部分および先細部分は、反応チャンバまたは対応する表面を特定的に加熱することを可能にする。さらに、このような容積導体を使用することは、場合によって使用されるより低い熱伝導率の材料により、熱が各容積要素内に放出される、チャンバまたは対応する表面の均一な温度加減が保証されるという利点がある。
【０１５６】
反応空間内に熱をつなぎおよび熱を引き出すことは、種々の方法で実行することが可能である。特に、外的なマイクロ波放射、内部または外部抵抗加熱、内部誘導コイルまたは表層、水による冷却および加熱、摩擦、光特に赤外光による照射、空気による冷却および／または加熱、摩擦、温度放射体、およびペルチェ素子などを介するの熱を取り込むことが意図される。
【０１５７】
反応空間内の温度測定は、例えば、マイクロアレイを誘導する手段内に内蔵された、内蔵抵抗センサ、半導体センサ、光導波路センサ、多染性の染料、多染性の液晶、赤外線放射のような外部温度計および／またはあらゆる種類の温度センサを用いて、種々の方法で実行することが可能である。
【０１５８】
反応チャンバ内の温度測定はさらに、例えば、チャンバ本体の製造工程の過程において射出によって温度センサをチャンバ本体に組み込むことにより、高温計、赤外線センサ、および／または熱電対列を用いた非接触的測定によって、例えば装置に組み込まれ、チャンバ本体またはチャンバの適した表面または適した容量に接触させる温度センサを用いた接触的測定により、検出平面における屈折率の温度依存性の変化を測定することにより、例えば溶液中、プローブアレイ上またはチャンバシール内の特定の分子の色の温度依存性の変化を測定することにより、および／または例えばその吸収を測定することにより、ｐＨ感受性指示器の色変化を測定することにより使用される、溶液のｐＨ値の温度依存性の変化を測定することにより、行うことができる。
【０１５９】
さらに、ヒータの抵抗の急激な電圧変化により温度の自動的な制限が起こり得、この場合それに対応する閾値温度は９５℃〜１１０℃の範囲にある。この閾値温度に達すると、ヒータの抵抗は急に上昇し、これにより電流は実質的には流れず、したがって熱は実質的に最早放出されない。特に、ポリマーのマトリクスの変化または位相変化のために抵抗がその閾値温度で上昇する導電性ポリアミドなどのポリマーをそのようなヒータに用いることができる。
【０１６０】
一実施形態において、温度制御および調節ユニットを第１の表面および／または第２の表面に組み込むことが可能である。この実施形態において、処理ユニットは特に、ＰＣＲおよびハイブリダイゼーションにおいて温度変更を実施するために働くヒータ（図４を参照）を装備している。
【０１６１】
処理ユニットは低い熱容量を有することが好ましく、それにより、温度変更の最高速度が例えば少なくとも５Ｋ／秒の低い電力需要で実施可能である。処理ユニットの高速冷却を保証するために、別の好適な実施形態は、冷却システム、例えば空冷システムを提供することを意図する。
【０１６２】
好ましくは、処理ユニットの冷却は処理ユニットを囲む空間をより低い温度まで加減し、これによりカートリッジを受動的に冷却することによっても達成可能である。これによって反応カートリッジの能動冷却は不要となる。
【０１６３】
さらなる実施形態において、温度制御および調節ユニットは、各々所定温度まで予熱される温度ブロックを含み得る。前記実施形態において、処理ユニットは特に、組み込みヒータを含まない。組み込まれる加熱システムが省かれることで、処理ユニットをより一層費用効率的に提供することが可能である。
【０１６４】
温度制御および調節ユニットの温度ブロック間の熱移動は、好ましくは、温度ブロックが本発明の装置の第１の表面および／または第２の表面と接触するということで保証される。好ましくは、温度ブロックは、直線的にまたは回転円盤上に配置され得、前記のように、例えば検出装置内に組み込まれることが好ましい。図７はいくつかの温度ブロックを有する回転円盤を示しており、該ブロックの各々は所定温度に調節される。処理ユニットの下の温度ブロックを交換することによって、処理ユニットは該温度ブロックによって定められた特定温度にされる。温度ブロックは処理ユニットよりもかなり高い温度容量を有するように製造されるのが好ましく、これにより、この実施形態において、例えば５ｋ／秒の温度変更の最高速度も実施可能である。温度ブロックは、加熱または冷却される代わりに熱的に固定化されるに過ぎないことが好ましく、これれにより、そのエネルギー需要はこの場合、最小となる。この実施形態では、処理ユニットの冷却および加熱を省いてよい。
【０１６５】
さらなる実施形態において、温度制御および調節ユニットは、第１の表面を誘導する手段および／または攪拌する手段、および／またはスペーサに組み込まれる。この実施形態において、熱移動はこれら手段および／またはスペーサを第１の表面および／または第２の表面と接触させることによって行われる。
【０１６６】
本装置は、試料溶液を精製および／または再濃縮する、および／または反応チャンバに流体をロードおよびアンロードするための再処理ユニットをさらに備えていることが好ましい。本発明の範囲内では、流体とは液体および気体を表すものと理解されたい。さらに、分析溶液を再処理ユニット内で再緩衝化することが可能である。この再処理ユニットは最終的には、必要な分析化学薬品を提供するためにも使用可能である。流体容器と反応チャンバとの接続は、例えば、国際特許出願公開第０１／０２０９４号に記載されているように行われ得る。
【０１６７】
この実施形態において、反応チャンバおよび再処理ユニットは、第１のカニューレが再処理ユニットから反応チャンバへの流体の送り込みを保証するようにおよび第２のカニューレが送り込まれた流体によって移動された空気を反応チャンバから逃がすのを保証するように配置された２つのカニューレを介して接続されるのが特に好ましい。再処理ユニット内へ送り込まれる試料はこのようにしてカニューレを介して処理ユニットの反応チャンバに達し得る。このために、カニューレはカニューレガイドを介して反応チャンバ内に達するように配置される。
【０１６８】
再処理ユニットは、それが処理ユニットから分離されるように開発され得る。反応チャンバを試料溶液で充填後、場合によってはさらなる反応液で充填後、再処理ユニットはこのように処理ユニットから分離され、好適にははずされ、場合によっては廃棄され得る。
【０１６９】
以下に、充填ユニットまたは再処理ユニットとも呼ばれる、反応チャンバを充填するための組み込みまたは非組み込みユニットの実施形態について記載する。
【０１７０】
いつものように、反応溶液は、適した器具、例えばピペットを用いて、充填ユニットの特定の開口部内に入れられる。本装置内への液体の輸送は、ピペットにより、または例えば処理オートマットの機能的構成要素である、例えばシリンジまたは自動ユニットなどの別の圧力発生器具により及ぼされる圧力によって行われる。
【０１７１】
充填ユニットは手動操作用に人間工学的に適するように開発されるのが好ましい。さらに、充填ユニットは反応性物質を送り込むための、容易に使用しうる追加の外部開口部を有することが好ましい。
【０１７２】
充填ユニットは、チャンバ本体のシールを貫通する適した流体インタフェースをさらに有することが好ましい。この目的のために、例えばハイグレード鋼またはポリマーから構成された、通常０．０５ｍｍ〜２ｍｍの直径を有する特別なカニューレが使用される。好ましくは少なくとも１つ以上のカニューレが、特に好ましくは２つのカニューレ（一方は反応液を充填するのに使用でき、他方は反応空間の通気用であるとともに余分な流体の取り上げ用である。）が配置される。このようなカニューレは固定された様式でまたは相互交換可能な様式で充填ユニットと接続が可能であり、この場合、廃棄可能な充填物を提供するための操作者が取り外しできない接続が提供されることが好ましい。
【０１７３】
充填ユニットは起こる可能性のある操作者のけがまたは環境の汚染をシステムの分離後に回避できるように、カニューレを覆うユニットをさらに含み得る。
【０１７４】
充填ユニットは反応カートリッジを嵌め込み接触させるための適した機械的インタフェースをさらに含むことが好ましい。前記インタフェースは、例えば、特定のスナップ形態で開発され得る。このようにして、好ましい部位でチャンバ本体のシールを貫通することが保証され得る。
【０１７５】
対応する処理オートマットにおいて反応カートリッジを処理する場合、適した機械的測定が行われるべきであり、この測定が装置における調節および正確な位置決めを可能にする。これは特に、液体の交換および／または送り込みのための位置決め、および／または反応チャンバ内での反応実行後に信号を検出するための反応カートリッジの位置決めに適用される。
【０１７６】
本装置または充填ユニットは、例えば保護ガス充填物または緩衝液などの余分なあるいは移動された気体または液体を取り上げるために働く、組み込まれた廃棄容器をさらに含み得る。この廃棄容器は、例えば液体物質または気体物質を可逆的または不可逆的に結合させる、例えばセルロース、フィルタ材料、シリカゲルなどのさらなる気体媒体、液体媒体または固体媒体を充填されることができる。また、該廃棄容器は通気用開口部を有し得るか、またはユニット全体の充填挙動を向上させるための負圧を呈し得る。
【０１７７】
あるいは、この廃棄容器は別個のモジュールとして開発することも可能である。この場合、充填ユニットは、例えば、ＬｕｅｒＬｏｃｋなどの市販の標準物に対応し得るとともに外部へと通じる、それに対応する流体インタフェースを装備する。このようなインタフェースは連続するシステムとの枠型（ｆｏｒｍ）または強制型（ｆｏｒｃｅ）接続部を有し得る。
【０１７８】
第１の特別な実施形態において、充填は組み込みの廃棄容器を有する取り外し可能な充填ユニットを用いて実行される。特に、充填ユニットは反応チャンバを１回のみ充填するために働く。この充填ユニットは、例えば、カートリッジに差し込まれるようにまたは一時的に取り付けられるように、試料が反応空間に送り込まれるように、および充填完了後に、充填ユニットがカートリッジから再度分離されて廃棄されるように開発される。この特別な第１の実施形態では、充填ユニットは、上記のように開発が可能な、組み込みの廃棄容器をさらに含む。この実施形態の一例を図２２に示す。モジュール式の充填ユニットを用いて反応カートリッジを充填する手順を図２３に示す。
【０１７９】
第２の特別な実施形態において、充填は組み込まれた充填ユニットを用いて行われる。この場合、この充填ユニットは反応カートリッジの組み込まれた構成要素であり、したがって反応カートリッジから分離されなく、充填ユニットおよびカートリッジの廃棄は同時に行われる。この場合、充填ユニットは反応チャンバの１回きりの充填のために、および可能であればさらなる処理−内部流体ステップのために使用されることが好ましい。この実施形態において、充填ユニットは、特にチャンバ本体のシールにカニューレを不注意で穿刺するのを防ぐために、このシステムにカニューレの好ましい位置決めを提供する技術的装置をさらに含むことが好ましい。しかし、カニューレが前記好ましい位置においてチャンバ本体のシールを穿刺することも想像できる。前記技術的装置は、例えば、バネ、弾性要素またはひっかけ（ｃａｔｈ）を提供するための特定の凹部または隆起部を確立することによって提供できる。この実施形態において、この充填ユニットは、充填および廃棄用チャネルをさらに含み、この充填および廃棄用チャネルは、対応する流体インタフェースを備え、例えばＬｕｅｒＬｏｃｋなどの市販の標準物に対応し得、および外部に通じている。このようなインタフェースは連続するシステムとのポジティブまたは非ポジティブなインターロックを有し得る、および気体媒体および／または液体媒体を供給しおよび／または除去するために働き得る。この実施形態の一例を図２４に示す。組み込まれた充填ユニットを有する反応カートリッジを充填する手順を図２５に示す。
【０１８０】
第３の特別な実施形態において、充填は組み込まれた廃棄容器を有する組み込まれた充填ユニットを用いて行われる。前記実施形態において、充填ユニットは反応カートリッジの組み込まれた構成要素であり、したがって、反応カートリッジから分離されなく、充填ユニットおよびカートリッジは同時に廃棄される。この場合、充填ユニットは反応チャンバの１回きりの充填のために、および可能であればさらなる処理−内部流体ステップのために使用されることが好ましい。この実施形態において、充填ユニットは、特にチャンバ本体のシールにカニューレを不注意で穿刺するのを防ぐために、システムにカニューレの好ましい位置決め提供する技術的装置をさらに含むことが好ましい。しかし、カニューレが前記好ましい位置においてチャンバ本体のシールを穿刺することも想像できる。前記技術的装置は、例えば、バネ、弾性部材またはひっかけを提供するための特定の凹部または隆起部の手段を確立することによって提供でき得る。この実施形態において、充填ユニットは、上記のように開発が可能な組み込みの廃棄容器をさらに含む。この実施形態の一例を図２６に示す。組み込まれた充填ユニットおよび組み込まれた廃棄容器により反応カートリッジを充填する手順は、例えば図２３および２５に記載の手順を組み合わせることによって実行することができる。
【０１８１】
以下において、圧縮手順中に圧力を平衡にするためにカニューレを配置するための特別な実施形態を記載する。カートリッジ用の充填ツールのカニューレは、例えば、非圧縮状態デの充填および反応空間を圧縮している間の余分な反応溶液の移動の両方が可能であるように配置され得る。この配置は、好ましくは、シールとカニューレ配置との適合された構成を用いて達成することが可能であり、この場合、カニューレは反応チャンバ内の補償領域を穿刺することが好ましい。余分な容量を特別なシール設計により取り上げることができない場合、このような配置は特に好ましい。シールの形態が変えられていない垂直なカニューレ配置の一例を図２７に示す。
【０１８２】
本発明の装置は、試験手順の制御および／または検出システムによって記録された信号の処理のための、検出システムに接続されたユニットをさらに含み得る。この制御および／または処理ユニットはマイクロコントーラまたは汎用コンピュータであってよい。検出ユニットと処理ユニットとのこの組合せは反応結果を分析結果に転換することを保証し、特に、例えば、医学的診断において、本発明の装置を携帯型の装置として使用することが可能となる。
【０１８３】
また、本発明の装置は、外部コンピュータ用のインタフェースをさらに有することが好ましい。特に、これによって外部で保存するためのデータの移動が可能となる。
【０１８４】
さらに好適な実施形態において、本装置は、物質ライブラリおよび／または増幅の実行および／または検出反応に関する情報データを含んでいるコーディング、好ましくはデータマトリクスおよび／またはバーコード、を備えている。このような個々の識別番号の手段により、読み取り装置または検出装置はどの試験が行われたかを自動的に認識することができる。この目的のために、本発明の装置の製造の際に、物質ライブラリ、検出反応の実行などに関する情報を含むデータレコードなどがデータベースに貯蔵される。このデータレコードは、このように、特にアレイ上のプローブの配置に関する情報および最も有利な方法で評価をどのように実施すべきかに関する情報をも含むことが可能である。データレコードまたはデータマトリクスは、さらに標的分子の増幅のために場合により温度制御および／または調整ユニット実行されるべきＰＣＲの温度−時間レジメンに関する情報も含むことができる。このようにして蓄積されたデータレコードは、データマトリクスの形態のホルダー付けられる番号を備えることが好ましい。データマトリクスに登録されている番号を用いることにより、蓄積されたデータレコードは、次いで、物質ライブラリの読み出し時に任意に呼び出すことができる。最後に、データマトリクスは、温度制御および／または調整ユニットにより、および、例えば流体容器を介して反応チャンバに充填することおよび反応チャンバから液体を除くことの制御などののようなその他のコントローラにより、読み出され、増幅および検出反応の自動実行が保証され得る。
【０１８５】
データマトリクスなどのコーディングは、情報全体を無理に含む必要はない。コーディングは識別番号またはアクセス番号を単に含むことができ、次いで、これを用いて必要なデータがコンピュータまたはデータ担体からダウンロードされる。
【０１８６】
本発明の装置は極めて簡単に製造することができる。図３に、処理ユニットは相互に簡単な嵌め込みの４つの個々の構成要素からなり得ることを示している。図１０および１１は、本発明の構成なるが故に、いくつかの構成要素からなるが、容易に製造することがまた可能な実施形態を示している。個々の構成要素の寸法の幾何学許容度は、非常に大きな幅、例えば、１／１０〜２／１０であり得、例えば、シールおよびチャンバ本体の大規模な射出成形を非常に費用効率的に行うことができる。この低い許容度は、チップが検出平面に対して押しつけられることにより促進される。なぜなら、これにより検出顕微鏡への光路は処理ユニットの構成要素による影響を殆ど受けないからである。低い許容度を有する幾何学量はチップのｘ、ｙ位置および検出平面の厚さのみである。しかし、チップのｚ位置の変動は従属的役割をするだけである。これらの低い技術的要件にも拘わらず、光学系、例えば蛍光検出顕微鏡における焦点調整装置を必要としない。これらの特性は本発明の装置が携帯による現場での使用に適していることを明白に示している。
【０１８７】
本発明のさらなる態様において、
ａ）試料、好適には標的分子を含んだ試料溶液を上記のような本発明の装置の反応チャンバ内に供給するステップ工程と、および
ｂ）標的分子と基材上に固定化されたプローブ分子との間の相互作用を検出する工程とを含む、プローブ分子と標的分子との間の分子相互作用を定性的および／または定量的に検出する方法が提供される。
【０１８８】
本発明の方法によって、相互作用の完了後および検出前に、妨げになるバックグラウンドを除去するための試料液または反応液の交換を必要とせずに、反応チャンバ内におけるプローブ分子と標的分子との間の分子相互作用の定性的および／または定量的な検出が可能となる。
【０１８９】
本発明の範囲内において、プローブと標的分子との間の相互作用の検出は通常以下のように実行される。１つまたは複数のプローブを所定の方法によりマイクロアレイの形態で特定のマトリクスへ固定化後またはマイクロアレイを提供後、標的が溶液中のプローブと接触させられ、定められた条件下でインキュベートされる。インキュベートの結果、プローブと標的との間に特定の相互作用またはハイブリダイゼーションが発生する。ここで発生する結合は、標的分子と該標的分子に特異的ではないプローブとの結合よりも著しく安定している。
【０１９０】
標的とそのプローブとの間の特定の相互作用の検出は、標的分子とマイクロアレイとの相互作用の前、相互作用中、または相互作用の後に標的分子に挿入されたマーカーの種類により通常異なる種々の方法を用いて実行することができる。典型的には、このようなマーカーは蛍光基であり、したがって、特定の標的／プローブ相互作用は、高い局所的分解度をもって、蛍光光学的に読み出されることが可能である。また、他の従来の検出方法、特に質量に影響を受け易い方法と比較して、労力が少ない（例えばＡ．Ｍａｒｓｈａｌｌ、Ｊ．Ｈｏｄｇｓｏｎ、ＤＮＡ  ｃｈｉｐｓ：Ａｎ  ａｒｒａｙ  ｏｆ  ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９８年、１６、２７〜３１頁、Ｇ．Ｒａｍｓａｙ、ＤＮＡ  Ｃｈｉｐｓ：Ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｔ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９８年、１６、４０〜４４頁を参照）。
【０１９１】
マイクロアレイ上に固定化された物質ライブラリおよび標的分子の化学的性質に応じて、核酸と核酸との相互作用、タンパク質とタンパク質との相互作用、および核酸とタンパク質との相互作用が、この試験原理の手段により検査することができる（例えば、Ｆ．Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ、Ｈ．Ｚｏｒｂａｓ、１９９８年、Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ、Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、ドイツ国ハイデルベルク／ベルリンを参照）。
【０１９２】
ここで、抗体ライブラリ、受容体ライブラリ、ペプチドライブラリおよび核酸ライブラリが物質ライブラリとみなされ、これらはマイクロアレイまたはチップ上に固定化される。
【０１９３】
核酸ライブラリは、特に最も重要な役割を果たす。これらは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子またはリボ核酸（ＲＮＡ）分子が固定化されているマイクロアレイである。
【０１９４】
本発明の方法の好適な実施形態おいて、マイクロアレイと第２の表面との間の距離は、ステップｂ）における検出の前に、試料溶液の処理および／または標的分子と基材上に固定されたプローブとの間の相互作用、例えば検出すべき核酸の増幅および／または検出すべき核酸と基材上に固定される核酸プローブとの間のハイブリダイゼーション、を可能にする位置に維持される。
【０１９５】
ステップｂ）において、マイクロアレイと第２の表面との間の距離が変更されることが、好適には短縮されることがさらに好ましい。すなわち、検出はマイクロアレイと検出平面との間の距離が短縮された状態で行われることが好ましい。マイクロアレイと検出平面との間の距離は検出中は約ゼロであることが特に好ましい。
【０１９６】
一実施形態において、マイクロアレイと第２の表面との間の距離を短縮するために、マイクロアレイは第２の表面に向かって誘導される。これは第１の表面を誘導する少なくとも１つの手段、例えば、タペット、ロッド、ピンおよび／またはネジによって及ぼされる圧力を用いて第１の表面を圧することによって保証されるのが好ましく、この場合これら手段の圧力の地点は、特にマイクロアレイの下に位置する。
【０１９７】
第２の表面または検出表面に対してマイクロアレイを押圧することは、第１の表面が少なくともマイクロアレイの下の領域において、弾性的に変形されるということで可能になる。あるいは、第１の表面は重ね合わせられた２つの層を用いて開発され得、この場合重ね合わせられた２つの層のうち一方の外側層は少なくともマイクロアレイの下の領域に凹部を有し、重ね合わせられた２つの層のうちの内側層は弾性シールによって形成される。次いで、圧力が第１の表面を誘導する手段によって前記凹部近傍の内側層の上に及ぼされる。
【０１９８】
しかし、第１の表面を誘導する手段、例えば、ピン、タペットおよび／またはネジは第１の表面上に圧力を及ぼすために働くだけではない。気泡がＤＮＡチップ上に形成されて、検出を妨害するかもしれない場合には、これらの気泡は、例えば、第１の表面に適用される約２０Ｈｚの振動周波数によって、特に弾性膜の形態である第１の表面を誘導する手段を用いて攪拌することによって、除去され得る。
【０１９９】
さらに、チップ表面での相互作用、例えばハイブリダイゼーションは非常に長い時間を要するという問題がたびたび存在する。他にも理由はあるが、これは相互作用またはハイブリダイゼーションの速度が拡散によって決定されるという事実に起因する。相互作用またはハイブリダイゼーションの速度は、このましくは、攪拌または振動は反応チャンバ内で混合をもたらすので、第１の表面を誘導する手段を用いて攪拌することによって、例えば、特に弾性膜の形態である第１の表面に適用される約２０Ｈｚの振動周波数によって、増大され得る。
【０２００】
さらなる実施形態において、マイクロアレイと第２の表面との間の距離を短縮させるために、第２の表面が反応空間に向かって誘導される。特に、これはスペーサによって第２の表面上に及ぼされる圧力により第２の表面が第１の表面に向かって誘導されるという点で保証され得る。
【０２０１】
さらなる実施形態において、マイクロアレイと第２の表面との間の距離を短縮させるために、反応空間が第２の表面に向かって誘導され、第２の表面が第１の表面に向かって誘導される。
【０２０２】
以下において、第２の表面に対して第１の表面を誘導する実施形態および第１の表面に対して第２の表面を誘導する実施形態を記載する。前記実施形態は、第２の表面または検出表面に対して第１の表面またはプローブアレイを位置決めするのに適するのみならず、特に、検出表面に対してプローブアレイを移動させるのにも使用することができる。このような動きを用いれば、例えば、反応チャンバ内における溶液の攪拌を達成することが可能である。
【０２０３】
一実施形態において、プローブアレイは磁界によって検出表面に対して移動されるか、またはチャンバ内で移動される。プローブアレイおよび／または第２の表面は、例えば、磁性材料を含むか、または磁性材料が添加された成分を含む、および／または完全または部分的な磁性材料からなるホルダ内に設置される。プローブアレイおよび／または第２の表面は、個々の表面の下に配置されおよび例えば、磁界によって前記表面と接続された磁性体を動かすことによって受動的に移動させられることがさらに好ましい。
【０２０４】
さらなる実施形態において、プローブアレイは重力による影響によって検出表面に対して移動および／または位置決めされる。
【０２０５】
さらなる実施形態において、プローブアレイは反応チャンバ内で発生した流れによって検出表面に対して移動および／または位置決めされる。この目的のために、本装置は、例えば、プローブアレイが液体流によって囲まれている場合には反応チャンバの一方の側では負圧が発生され、反対側では正圧が発生されて、これがプローブアレイを反応チャンバ内に移動させるように開発し得る。このような流れは、例えば、チャンバ内の局所的な温度差によって生じる熱対流を用いて提供し得る。
【０２０６】
さらなる実施形態において、プローブアレイは電界の影響によって検出表面に対して移動および／または位置決めされる。
【０２０７】
さらなる実施形態では、局所的な加熱によりプローブアレイの下に気泡を生じさせ、これによってチップが反応チャンバ内で移動されるか、または検出表面に向かって誘導される。
【０２０８】
検出前にマイクロアレイと第２の表面との間の距離を短縮させることによって、試料溶液がマイクロアレイと検出表面との間の領域から実質的に完全に除去されることが好ましい。これにより、例えば、標識されたプライマーによってアレイ表面に結合していない標識された分子および／またはアレイ表面に結合していない標識された標的核酸によって生じるバックグラウンド信号が低減される。
【０２０９】
したがって、工程ｂ）において、マイクロアレイと第２の表面との間の距離は、マイクロアレイと第２の表面との間の距離が実質的になくなるように変更されることが好ましい。次いで、マイクロアレイが検出表面内に実質的に位置決めされ、妨げとなるなバックグラウンドが実質的に回避される。
【０２１０】
さらなる変形実施形態において、マイクロアレイは、装置の当初の状態において既にある検出表面を形成する第２の表面に均一に置かれるだけでなく、第２の表面に向かって第１の表面を誘導し、および／または第１の表面に向かって第２の表面を誘導することによって検出表面内に移動させられる。この実施形態において、マイクロアレイは処理工程中に試料溶液によって湿らされない。相互作用、例えばハイブリダイゼーションを実行するために、弾性材料、例えば弾性膜から作成されるのが好ましい第１の表面が、検出表面から誘導される。これにより、チップ表面が検出表面から離れる方に移動させられ、試料溶液によって湿らされる。相互作用、例えばハイブリダイゼーションが生じ得る。検出およびさらには処理を行うために、例えば、弾性膜の形態である第１の表面が再び放され、これによって第１の表面はその元の調節された位置まで跳ね戻るが、これは、第１の表面を誘導する手段、例えば、ピン、ロッド、ネジおよび／またはタペットによって及ぼされる圧力によって促進され得る。これによって、マイクロアレイが再び検出表面に対し圧され、バックグラウンドなしに検出を行うことが可能となる。
【０２１１】
本発明の方法のさらなる実施形態では、上記のような本発明の装置が使用され、その第１の表面は回転軸周囲に枢転可能であるように開発される。
【０２１２】
初期位置とも呼ばれる第１の位置において、第１の側面部分に配置されたマイクロアレイの表面は第２の表面上に実質的に均一に置かれる。すなわち、プローブ分子が上に固定化された基材表面は試料溶液によって実質的には湿らされない。第１の表面の第２の側面部分と第２の表面との間の第１の位置に形成された空間において、処理チャンバ、反応溶液の処理、すなわち、特に精製工程、再濃縮工程、洗浄およびリンス工程および／または増幅工程が行われるのが好ましい。
【０２１３】
続いて、枢転可能な第１の表面が第２の位置に移動される。この位置では、第１の表面は第２の表面に対して１８０°以外の角度で、好適には４５°で配置されるのが好ましい。これは上記のような第１の表面を誘導する手段を用いて、第１の表面の第１の側面部分上に及ぼされる牽引力および／または第１の表面の第２の側面部分上に及ぼされる圧力によって行われる。第１の表面を第２の位置まで誘導すれば、マイクロアレイは第２の表面から離れた方へ誘導され、試料溶液がマイクロアレイと第２の表面との間に形成された空洞に浸透する。マイクロアレイの基材上に固定化されたプローブ分子は試料溶液中に存在する標的分子に自由に接近できるので、プローブ分子と標的分子との間の相互作用が生じ得る。本発明の方法のこの実施形態においては、第１の表面第１の表面第１の表面に及ぼされる圧力および／または牽引力は、このように、試料溶液が動かされ、したがって相互作用が加速され得るという利点を有する。
【０２１４】
検出および場合によって処理を行うために、枢転可能な第１の表面は、例えば、第１の表面の第１の側面部分上に及ぼされる圧力および／または第１の表面の第２の側面部分上に及ぼされる牽引力によって、あるいは、第１の表面の弾性的伸長の場合には第１の側面部分を解放することによって、第１の位置まで再度誘導される。この時点において、マイクロアレイは第２の表面上に実質的に均一に再度置かれるので、第２の表面とマイクロアレイとの間の試料溶液はこの位置において実質的に移動され、実質的にバックグラウンドのない検出を行うことができる。
【０２１５】
試験される標的は、あらゆる種類の試料中に、好適には生体試料内に存在することができる。
【０２１６】
標的は本発明の方法によって検出されおよび定量される前に、検出および定量化の前に分離され、精製され、複写され、および／または増幅されることが好ましい。
【０２１７】
本発明の方法により、反応チャンバ内で核酸の増幅ならびに定性的および定量的検出が可能となり、試料液または反応液の交換を必要とせずに、循環増幅反応の完了直後に分子相互作用またはハイブリダイゼーションの検出が実行可能である。さらに、本発明の方法はまた、増幅におけるハイブリダイゼーション事象の循環検出、すなわち循環増幅反応におけるハイブリダイゼーションの検出を保証する。最後に、本発明の方法を用いて、増幅産物を増幅反応中および増幅反応の完了後にも定量化することができる。
【０２１８】
通常、増幅は、上記のように従来のＰＣＲ法を用いて、または標的分子と物質ライブラリ担体とのハイブリダイゼーションによるＰＣＲおよび検出を用いて分析される標的分子の増幅を並列実行する方法を用いて実行される。
【０２１９】
さらなる実施形態において、増幅は２工程の多重ＰＣＲとして実行される（国際公開第９７／４５５５９号も参照）。第１工程においては、多重ＰＣＲは、３’末端が遺伝子固有であり、および５’末端が普遍的領域である融合プライマーを用いて実行される。普遍的領域は、多重反応で使用される全てのフォワードプライマーおよびリバースプライマーにおいて同じである。この第１工程では、プライマー量は制限的である。これにより、全ての多重生成物は、サイクル数が全ての生成物についてプライマー制限に達するのに十分である場合、一様なモルレベルに到達するまで増幅され得る。第２工程では、融合プライマーの５’領域と同じ普遍的プライマーが存在する。増幅は、所望量のＤＮＡが得られるまで実行される。
【０２２０】
本発明の方法の好適な実施形態において、検出は、循環増幅反応の実行中または循環増幅反応の完了後に実行される。好適には、検出は各増幅サイクルで増幅反応中に実行される。また、検出は、２番目のサイクル毎に、あるいは３番目のサイクル毎に、または他の間隔で任意に決定されることができる。
【０２２１】
標的量が各工程に関してある量だけ増加する線形増幅反応、または標的量が各工程に関して乗算的に増大する指数関数的増幅反応、例えばＰＣＲを行う場合、処理ユニットにおいては、したがってチップは毎増幅工程後に検出平面に対して押圧されるので、検出が可能となる。増幅反応のオンライン調査がこのように可能である。非線形増幅反応の場合、これによってＤＮＡ標的量の最初の濃度を決定することが可能である。
【０２２２】
このようにして、増幅工程の回数をオンラインで最適化することがさらに可能となる。ＤＮＡ標的量が特定の濃度に達するや、増幅が中止される。最初の標的濃度が低い場合、増幅工程の回数は、産物の確実な分析を実施できるように増大される。陽性対照の反応時間が低減されている場合、分析処理を非常に早い段階で中断することが可能である。
【０２２３】
例えば、ポリメラーゼ、緩衝液、塩化マグネシウム、プライマー、標識されたプライマー、特に蛍光標識されたプライマー、ｄＮＴＰなどの増幅反応の実行に必要な化学物質は、例えば、凍結乾燥形態で反応チャンバに内に提供され得る。
【０２２４】
好適には、循環増幅反応はＰＣＲである。ＰＣＲでは通常、各ＰＣＲサイクルに対する３つの温度が生じる。好適には、ハイブリダイゼーションされた核酸は、最高温度、つまり変性温度でマイクロアレイから脱離する。変性温度の好ましい値は９５℃である。したがって、ゼロ値、または各ＰＣＲサイクルで検出される核酸についての基準値として提供されるハイブリダイゼーションシグナルは、この変性温度で決定され得る。
【０２２５】
ＰＣＲサイクルにおける温度に続く温度において、アニ−ル温度、例えば約６０℃、が検出されるべき核酸とミクロアレイの基材上に固定化された核酸とのハイブリダイゼーションを可能にする。したがって、本発明の方法の一実施形態において、ＰＣＲサイクル中に存在する標的核酸の検出はアニーリング温度で実行される。
【０２２６】
本発明の方法の感度を高めるために、好適にはさらに、検出が増幅サイクルのアニーリング温度以下の温度で実行されるように、温度をアニーリング温度以下に下げるとよい。例えば、検出は２５℃から５０℃の範囲、好適には３０℃から４０℃の範囲の温度で実行されることができる。
【０２２７】
本発明の方法のさらなる代替実施形態において、後のハイブリダイゼーションの温度を上昇させるために、検出される核酸と、マイクロアレイの基材上に固定化された核酸との間のハイブリダイゼーションが、まず低い温度で実行される。このような実施形態は、相互作用の特異性を失わずに５０℃よりも高い温度でのハイブリダイゼーションに比べてハイブリダイゼーション時間が短縮されるという利点がある。
【０２２８】
変性温度で決定されたゼロ値または基準値を、アニーリング温度またはそれ以下の温度で決定された測定値から差し引くと、変動およびドリフトが排除された外乱のない測定結果が得られる。
【０２２９】
通常、検出される標的分子は検出可能なマーカーが取り付けられている。本発明の方法において、検出はこのように、ステップｂ）で検出される少なくとも１つの標識を用いて結合された標識を取り付ける手段によって好ましく実行される。
【０２３０】
既に述べたように、標的またはプローブと組み合されている標識は、好適には、検出可能ユニットまたはアンカー基を介して標的またはプローブに結合されている検出可能ユニットでよい。検出および／または標識の可能性に関して、本発明の方法は非常に柔軟性が高い。したがって、本発明の方法は、種々の物理的、化学的または生化学的検出方法と相性がある。唯一の前提条件は、検出されるユニットまたは構造が、プローブまたは標的、例えばオリゴヌクレオチドに直接組み合せ可能であるか、および／または、オリゴヌクレオチドと結合可能なアンカー基を介してプローブまたは標的に連結可能であるということである。
【０２３１】
標識の検出は、蛍光、磁力、電荷、質量、親和性、酵素活性、反応性、金標識などに基づくことができる。したがって、標識は、例えば蛍光標識構造または成分の使用に基づくことができる。蛍光検出に関連して、標識は、合成中または合成後に標的またはプローブと組み合せ可能な任意の着色剤であり得る。例として、Ｃｙ着色剤（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、スウェーデン、ウプサラ）、Ａｌｅｘａ着色剤、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、米国オレゴン州ユージン）、サマリウムなどのランタニド、イッテルビウム、およびユウロピウム（ＥＧ＆Ｇ社、ドイツ、フライブルグ、ウォーレス）が挙げられる。
【０２３２】
前記検出可能なマーカーは蛍光マーカーであることが特に好ましい。既に述べたように、本発明の方法において本発明の装置を使用することは、自動焦点装置のない蛍光顕微鏡、例えば、焦点が固定された蛍光顕微鏡を用いて蛍光マーカーを検出することを保証する。
【０２３３】
蛍光マーカーの他に、ルミネセンスマーカー、金属マーカー、酵素マーカー、放射性マーカーおよび／またはポリマーマーカーが、本発明の範囲内で標的またはプローブと組合せられる標識および／または検出ユニットとして使用されることができる。
【０２３４】
同様に、標識されたレポーターとのハイブリダイゼーション（サンドイッチハイブリダイゼーション）の手段により検出されることができる核酸は、標識（タグ）として使用されることができる。タグの検出のために、プライマー伸長、ライゲーションおよびＲＣＡなどの様々な分子生物学的検出反応が使用される。
【０２３５】
本発明の方法の代替実施形態において、検出可能ユニットは、アンカー基を介して標的またはプローブと結合させられる。好適には、使用されるアンカー基は、ビオチン、ジゴキシゲニンなどである。後の反応において、このアンカー基は、検出可能になるまたは検出可能反応を引き起こすようになる特異的結合成分、例えばストレプトアビジン複合体または抗体複合体、により転換される。アンカー基を使用することによって、アンカー基の検出可能なユニットへの転換は、標的を含む試料を加える前、加えている間もしくは加えた後、または場合によってプローブ内の選択的に開裂可能な結合の開裂の前、開裂中もしくは開裂後に行うことができる。プローブにおけるこのような選択的に開裂可能な結合は、例えば、国際特許出願第０３／０１８８３８号に開示されており、この内容を本明細書で明示的に参照する。
【０２３６】
本発明によれば、標識はまた、標識された分子とプローブ分子との相互作用を用いて行うことができる。例えば、標識は、上記のように、標識されたオリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチド標的とのハイブリダイゼーションの手段により行ことができる。
【０２３７】
本発明の範囲内における好適なさらなる標識方法および検出システムは、例えばＬｏｔｔｓｐｅｉｃｈとＺｏｒｂａｓ、Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ、Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、１９９８年、２３．３章および２３．４章に記載されている。
【０２３８】
本発明の方法の好適な実施形態において、析出をもたらす特定の溶解産物を有する付加物を結果において与える検出方法が使用される。標識のために、難溶性の、通常着色された生成物に転換されることができる、特に基質または析出し得る物が使用される。この標識反応において、例えば基質の難溶性生成物への転換を触媒する酵素が使用することができる。アレイ要素において析出をもたらすのに適した反応は、析出の検出の可能性と共に、例えば国際特許出願公開第００／７２０１８号および国際特許出願公開第０２／０２８１０号に記載されており、この内容は本願で明示的に参照される。
【０２３９】
本発明の方法の特に好適な実施形態において、結合された標的は、可溶性基質または析出し得る物の反応を触媒して、プローブ／標識相互作用が生じたアレイ要素において難溶性沈殿を形成する標識、または、可溶性基質または析出し得る物の、プローブ／標識相互作用が生じたアレイ要素にける難溶性沈殿への変換のための結晶核として作用する標識を備えている。
【０２４０】
このようにして、本発明の方法を使用することにより、様々なプローブ／標的相互作用の定性的および定量的分析を同時に行うことを可能にする。このとき、個々のアレイ要素は、１０００μｍ以下、好適には１００μｍ以下、特に好適には５０μｍ以下のサイズを有する。
【０２４１】
酵素標識を使用することは、免疫細胞化学およびマイクロタイタープレートに基づく免疫学的検査で知られている（Ｅ．ＬｉｄｅｌｌとＩ．Ｗｅｅｋｓ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、１９９５年を参照）。したがって、例えば、酵素は基質の、難溶性の通常着色されている生成物への転換を触媒する。
【０２４２】
特に好適には、アレイ要素において析出形成をもたらす反応は、酵素により触媒される、難溶性生成物への可溶性基質または析出し得る物の転換である。特別な実施形態において、アレイ要素において析出形成をもたらす反応は、ペルオキシダーゼにより触媒される３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンの酸化である。
【０２４３】
ホースラディシュペルオキシダーゼは、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンの酸化に好ましく使用される。しかし、当業者は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンの酸化に使用される他のペルオキシダーゼを知っている。
【０２４４】
３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンは、ペルオキシダーゼの触媒作用下において、最初のステップにおいて酸化されて青色着色ラジカルカチオンを形成すると考えられる（例えば、ＧａｌｌａｔｉとＰｒａｃｈｔ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８５年、２３、８、４５４頁を参照）。この青色着色ラジカルカチオンは、例えば硫酸デキストランなどの多価陰イオンの手段により錯体の形態で析出される。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンのペルオキシダーゼ触媒酸化の手段による析出反応は、例えば欧州特許出願公開第０４５６７８２号明細書に記載されている。
【０２４５】
完全であるとは主張することなく、下記の表１は、標的とプローブとの間の相互作用が生じたアレイ要素において析出をもたらすのに適していると思われるいくつかの反応の調査を提供する。
【０２４６】
【表１】
2007536541.tif 000003
【０２４７】
不溶性析出物を介したプローブ／標的相互作用の検出については、特に国際公開第０２／０２８１０号に記載されている。
【０２４８】
以下において、例えば、検出平面とプローブアレイとの間のニュートン環の形成の可能性を阻止するなどの、固体担体上の分子相互作用の検出において通常生じ易い問題を克服するのに役立ち得る、本発明の実施形態を記載する。
【０２４９】
ニュートン環の発現は、照明の種類、検出に使用される光の波長、検出表面とプローブアレイとの間の距離、およびチャンバ中に存在する溶液の屈折率によって本質的に決定される。このようなニュートン環は、例えば、検出に使用される光の波長を変えること、検出および／またはプローブアレイと同じかまたは類似する屈折率を有する溶液を用いること、および／または検出表面とプローブアレイとの間に浸漬液を用いることによって阻止することが可能である。
【０２５０】
さらに、ニュートン環はチップの上および／またはチップと向き合う検出平面の側上にスペーサを適用することによって阻止が可能である。
【０２５１】
さらに、ニュートン環は担体の粗い表面上にプローブアレイを適用することによって阻止が可能である。
【０２５２】
さらに、ニュートン環は光吸収表面上にプローブアレイを適用することによって阻止が可能である。
【０２５３】
接触圧を恒常的に修正することがさらに可能であり、これによってチップは検出表面に対して誘導される。したがって、チップと検出表面との間の空隙の厚さ、故にニュートン環の位置も変えられる。検出される蛍光シグナルを時間にわたって積分することによって、相互に関連しているスポットの測定値の歪がこのようにして阻止される。
【０２５４】
結合した標的のフルオロフォアを照射し故に攪拌するために、異なる方向からの幾つかの光源を使用して、ニュートン環を阻止することは、特に好ましい可能性あることである。
【０２５５】
移された液体中にある結合していない標識のフルオロフォアによって生じるバックグラウンド蛍光は検出される信号の歪みをもたらし得る。この歪みは、例えば、検出表面上またはチップ上および／またはチップ周囲あるいは撮像光学系に設けられ、プローブアレイの表面のみが照明されまたは像影されるように開発されたシェードを用いる手段により、好ましく阻止し得る。
【０２５６】
例えばレーザのような光源の使用により、光のコヒーレンスによる照明の不均一性が生じ得る。このような不均一性は、導波路を用いることによっておよび／またはフィルタおよび／または異なる導波路の光を組み合わせることによって、低減または阻止し得る。同様に、このような作用を除去するために光源を移動させることも想定される。
【０２５７】
プローブアレイの担体上の、選択された波長範囲において非蛍光性である有機または無機の光吸収層を用いて、プローブ担体および／または後ろに位置する要素によって生じる蛍光バックグラウンド信号を低減または阻止することができる。黒色クロム層を保護層として用いるのが好ましい。
【０２５８】
本発明の装置の上述の実施形態の全てにおいて、分析される材料の事前増幅は必要ない。特に本発明の装置または独国特許出願公開第１０２５３９６６号明細書に記載されているような物質ライブラリ担体の存在下で、細菌、血液またはその他の細胞から抽出された試料物質から、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いて特定の区画が増幅されて担体とハイブリッドが形成され得る。これは、実験費用の大幅削減を意味する。
【０２５９】
したがって、本発明の方法は、ＰＣＲの手段による分析すべき標的分子の増幅とおよび標的分子の物質ライブラリ担体とのハイブリダイゼーションの手段による検出との、平行的実行に特に適している。ここで、検出される核酸は、まずＰＣＲを用いて増幅され、好適には、ＰＣＲを用いて増幅される２つのテンプレート鎖のうちの１つの形成を抑制する好適には少なくとも１つの競合物質が初めに反応に加えられる。特に、テンプレートへの結合についてテンプレートのＰＣＲ増幅に使用されるプライマーのうちの１つと競合し、および酵素的に伸展されないＤＮＡ分子がＰＣＲに加えられる。ＰＣＲを用いて増幅された一本鎖核酸分子は、次いで、相補的プローブとのハイブリダイゼーションを用いて検出される。あるいは、検出される核酸は、まずＰＣＲを用いて一本鎖余剰で増幅され、相補的プローブとの、その後のハイブリダイゼーションの手段により検出される。ここにおいて、テンプレートの２つの鎖のうちの１つにハイブリダイズすることができるが、プローブハイブリダイゼーションの手段により検出される領域にはハイブリダイズすることができないＤＮＡ分子または核酸類似物の分子であり、および酵素的に伸展されない競合物質が、初めにＰＣＲ反応に加えられる。
【０２６０】
ＰＣＲ反応において存在する２つのテンプレート鎖のうちの１つのみの好ましい増幅を引き起こす全ての分子は、ＰＣＲにおける競合物質として使用し得る。したがって、本発明によれば、競合物質は、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡリガンド、挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒｓ）、核酸またはこれらの類似物であることができる。配列特異性を有する一本鎖核酸に結合することが可能な、および上記で定義されている特性を有するタンパク質またはペプチドが、好適に競合物質として使用される。特に好適には、核酸分子および核酸類似分子が２次構造切断物質として使用される。
【０２６１】
２つのテンプレート鎖のうちの１つの形成は、増幅時にＰＣＲへの競合物質の初期添加により実質的に抑制される。「実質的に抑制」とは、ＰＣＲの範囲内において、ハイブリダイゼーションの手段により増幅された鎖を効率よく検出するのに十分である、一本鎖余剰および一定量の他のテンプレート鎖が作成されることを意味する。したがって、増幅は、２ｎ（ｎ＝サイクル数）の形態の指数関数的反応速度に従わず、むしろ＜２ｎの形態の減衰増幅反応キネティックスに従う。
【０２６２】
非増幅鎖に関してＰＣＲを用いて得られる一本鎖余剰は、因数１．１に対して１，０００、好適には因数１．１に対して３００、また好適には因数１．１に対して１００、特に好適には因数１．５に対して１００、また特に好適には因数１．５に対して５０、とりわけ好適には因数１．５に対して２０、最も好適には因数１．５に対して１０を有する。
【０２６３】
競合物質の機能は典型的に、２つのテンプレート鎖のうちの１つに選択的に結合すること、したがって対応する相補鎖の増幅を抑制することである。したがって、競合物質は、ＰＣＲで増幅される２つのテンプレート鎖のうちの１つに対する特異性を有する一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ結合タンパク質であることができる。これらはまた、増幅される２つのテンプレート鎖のうちの１つの特定の領域にのみ配列特異的に結合するアプタマーであることができる。
【０２６４】
核酸または核酸類似物は、競合物質として好ましく使用される。この核酸または核酸類似物は、通常どおり、プライマー結合部位についてＰＣＲに使用されるプライマーのうちの１つと競合すること、または配列相補性のために検出されるテンプレート鎖の領域とハイブリダイゼーションすることができることのいずれかにより、ＰＣＲの競合物質として作用する。この領域はプローブにより検出される配列ではない。このような核酸競合物質は酵素的に伸展され得ない。
【０２６５】
核酸類似物は、例えばいわゆるペプチド核酸（ＰＮＡ）であることができる。しかし、核酸類似物はまた、ヌクレオチドがリン酸結合の代わりにフォスフォチオエイト結合を介して互いに連結されている核酸分子であることもできる。これらはまた、天然に存在する糖成分リボースまたはデオキシリボースが、例えばアラビノースまたはトレハロースなどの代替糖で置き換えられた核酸類似物であることも可能である。さらに、核酸誘導体は「ロックド核酸」（ＬＮＡ）であることもできる。他の従来の核酸類似物は当業者に周知である。
【０２６６】
ＤＮＡまたはＲＮＡ分子、特に好適にはＤＮＡもしくはＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはその類似物は、好ましくは競合物質として使用される。
【０２６７】
競合物質として使用される核酸分子または核酸類似物の配列に依存して、ＰＣＲ反応の範囲内における２つのテンプレート鎖のうちの１つの増幅の抑制は、異なるメカニズムに基づく。ＤＮＡ分子の例を用いて、これを以下で説明する。
【０２６８】
例えばＤＮＡ分子が競合物質として使用される場合、このＤＮＡ分子は、ＤＮＡ競合物質分子と対応するテンプレート鎖との特異的ハイブリダイゼーションがストリンジェント条件下で可能であるような方法において、ＰＣＲに使用されるプライマーのうちの１つの配列と少なくとも部分的に同じである配列を有することができる。本発明によれば、この場合における競合のために使用されるＤＮＡ分子はＤＮＡポリメラーゼの手段により伸展可能ではなく、このＤＮＡ分子は、テンプレートとの結合に関してＰＣＲ反応時に各プライマーと競合する。したがって、ＤＮＡ競合物質分子とプライマーとの比に応じて、プライマーにより定義されるテンプレート鎖の増幅は、このテンプレート鎖の作成が著しく低減されるような形で抑制され得る。ここで、このＰＣＲは、使用される競合物質の量に関して予想される以上に高い指数関数的反応速度により進行する。このようにして、一本鎖余剰が、ハイブリダイゼーションの手法により増幅された標的分子を効率よく検出するのに十分である量で生じる。
【０２６９】
この実施形態において、競合に使用される核酸分子または核酸分子類似物は、酵素的に伸展可能であってはならない。「酵素的に伸展可能でない」とは、増幅に使用されるＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼが核酸競合物質をプライマーとして使用できない、すなわちこの競合物質により定義される配列からテンプレート３’の対応する反対の鎖を合成することができないことを意味する。
【０２７０】
上記の可能性の他に、ＤＮＡ競合物質分子はまた、プライマー配列のうちの１つによって扱われない、および酵素的に伸展可能でない、検出されるテンプレート鎖の領域に対して相補的な配列を有することができる。ＰＣＲの範囲内において、ＤＮＡ競合物質は、次いで、このテンプレート鎖とハイブリッドを形成し、それに応じてこの鎖の増幅を阻止する。
【０２７１】
ＤＮＡ競合物質分子のまたは一般的に核酸競合物質分子の配列は対応して選択可能であることは当業者に周知である。核酸競合物質分子が、ＰＣＲに使用されるプライマーのうちの１つの配列に実質的に等しくないが、検出されるテンプレート鎖の他の領域に対して相補的である配列を有する場合、この配列は、ハイブリダイゼーションの範囲内においてプローブで検出されるテンプレート配列の領域内に入らないように選択される必要がある。このことは、ＰＣＲとハイブリダイゼーション反応との間の処理反応を有さないために必要である。検出される領域内に入る核酸分子が競合物質として使用された場合、プローブへの結合に関して一本鎖標的分子と競合するであろう。
【０２７２】
このような競合物質は、プローブにより検出されたテンプレート配列の近くでハイブリダイゼーションするのが好ましい。ここで、「近く」という位置指定は、本発明において２次構造切断分子について与えられているのと同じように理解されるものである。しかし、本発明の競合物質はまた、検出される配列のすぐ近くで、すなわち検出される標的配列から厳密にヌクレオチド１個分の距離の範囲内でハイブリダイゼーションすることができる。
【０２７３】
酵素的に伸展可能でない核酸または核酸類似物が競合分子として使用される場合、これらは、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼにより酵素的に伸展可能でないようにその配列および構造に応じて選択される。好適には、核酸競合物質の３’末端は、テンプレートに対する相補性を有さない、および／またはその３’末端で３−ＯＨ基の代わりに他の置換基を有するように設計される。
【０２７４】
核酸競合物質の３’末端がテンプレートとの相補性を有さない場合、この核酸競合物質が、テンプレートのプライマー結合部位の１つに結合するか、またはＰＣＲを用いて増幅されるテンプレートの配列の１つに結合するかに関係なく、この核酸競合物質は、その３’末端において塩基相補性を欠いていることに起因して、従来のＤＮＡポリメラーゼによって伸展されることができない。ＤＮＡポリメラーゼによる核酸競合物質のこの種の非伸展性は当業者に周知である。好適には、核酸競合物質は、最後の４塩基、特に好適には最後の３塩基、とりわけ好適には最後の２塩基、最も好適には最後の塩基に関してその３’末端で標的配列に対して相補性を有さない。説明されている位置において、このような競合物質はまた、ハイブリダイゼーションを許さない非自然的な塩基を有することができる。
【０２７５】
酵素的に伸展可能でない核酸競合物質が、酵素的に伸展可能でないようにそのバックボーンで、またはその３’末端で修飾されている場合、これらはまた、その標的配列に対する１００％相補性を有することができる。
【０２７６】
核酸競合物質がその３’末端でＯＨ基と異なる基を有する場合、これらの置換基は、好適にはリン酸基、水素原子（ジデオキシヌクレオチド）、ビオチン基またはアミノ基である。これらの基は、従来のポリメラーゼによって伸展されることができない。
【０２７７】
テンプレートの結合に関してＰＣＲに使用される２つのプライマーのうちの１つと競合し、化学合成中にその３’末端にアミノ結合を備えるＤＮＡ分子のこのような方法における競合物質としての使用が、特に好ましい。そのような競合物質は、その標的配列に対して１００％の相補性を有することができる。
【０２７８】
しかし、例えば、ＰＮＡのような核酸競合物質は、ブロックされた３’ＯＨ基または非相補塩基をその３’末端に有する必要はない。なぜならば、これらは、バックボーンがペプチド結合により修飾されているためにＤＮＡポリメラーゼによって認識されず、したがって伸展されないからである。ＤＮＡポリメラーゼにより認識されないリン酸基の他の対応する修飾は、当業者に周知である。これに属しているのは、特に例えば２’−５’アミノ結合などのバックボーン修飾を有する核酸（Ｃｈａｎら（１９９９年）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１、３１５〜３２０頁）、スルフィド結合（Ｋａｗａｉら（１９９３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１（６）、１４７３〜１４７９頁）、ＬＮＡ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎら（２００２年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２４（１０）、２１６４〜２１７６頁）、およびＴＮＡ（Ｓｃｈｏｎｉｎｇら（２０００年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９０（５４９５）、１３４７〜１３５１頁）である。
【０２７９】
テンプレートの異なる領域（例えば、特にプライマー結合部位）とハイブリダイゼーションするいくつかの競合物質もまた、ＰＣＲで同時に使用されることができる。ハイブリダイゼーションの効率は、競合物質が２次構造切断分子の特性を有する場合に、さらに高められることができる。
【０２８０】
代替実施形態において、ＤＮＡ競合物質分子はまた、プライマーの１つに相補的な配列を有することができる。アンチセンスＤＮＡ競合物質分子とプライマーとの比に依存して、このような、例えばアンチセンスＤＮＡ競合物質分子は、このＤＮＡ競合物質分子が対応するテンプレート鎖と最早ハイブリッドを形成しなく、対応して他のプライマーにより定義されたテンプレートだけが増幅されるように、ＰＣＲ反応において用いられてプライマーを滴定することができる。当業者は、本発明のこの実施形態において、核酸競合物質が酵素的に伸展可能であるが、そうする必要はないことを認識している。
【０２８１】
本発明の範囲内において、核酸競合物質について言うとき、これは、各文脈から異なる意味が生じない限り核酸類似競合物質を含む。核酸競合物質は、可逆的に、または非可逆的にテンプレートの対応する鎖に結合することができる。この結合は、共有結合または非共有結合相互作用を用いて生じることができる。
【０２８２】
核酸競合物質の結合は非共有結合相互作用を介して生じ、可逆であるのが好ましい。テンプレートへの結合がワトソン−クリック塩基対合の形成を介して生じるのが特に好ましい。
【０２８３】
核酸競合物質の配列は通常、検出されるテンプレート鎖の配列に適合している。しかし、アンチセンスプライマーの場合、これらは、滴定されるプライマー配列に適合しているが、このプライマー配列は、しかし、その後テンプレート配列により定義される。
【０２８４】
核酸のＰＣＲ増幅は標準的な実験室方式であり、各種の変更および開発が可能であることは、当業者にはよく知られている。原則として、ＰＣＲは、二本鎖核酸テンプレート、通常は二本鎖ＤＮＡ分子が、まず９５℃の温度で５分間熱変性を受け、それによって、２つの鎖が互いに分離することを特徴とする。いわゆる（低い溶融温度を有するプライマーにより定められる）「アニーリング」温度まで冷却した後、反応液中に存在する「フォワード」および「リバース」プライマーは、プライマー自体の配列に相補的な各テンプレート鎖の相補的部位に蓄積する。ここで、プライマーの「アニーリング」温度は、プライマーの長さおよび塩基構造に合せてある。「アニーリング」温度は、理論的考察に基づいて計算されることができる。「アニーリング」温度の計算に関する情報は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（上記参照）において見出される。
【０２８５】
通常、４０から７５℃までの間、好適には４５から７２℃までの間、特に好適には５０から７２℃までの間の温度範囲で実行されるプライマーのアニーリング後に伸長工程が続き、デオキシリボヌクレオチドが、反応液中に存在するＤＮＡポリメラーゼの活性によりプライマーの３’末端と連鎖される。ここで、挿入されたｄＮＴＰの特質は、プライマーとハイブリダイゼーションしたテンプレート鎖の配列に依存している。通常の熱安定ＤＮＡポリメラーゼが使用される場合、伸長工程は普通６８から７２℃の間で実行される。
【０２８６】
対称的ＰＣＲにおいて、プライマー配列により定義された標的の核酸領域の指数関数的増大は、プライマーの変性、アニーリングおよび伸長の記載されたサイクルを繰り返すことにより達成される。ＰＣＲの緩衝条件、使用可能なＤＮＡポリメラーゼ、二本鎖ＤＮＡテンプレートの生成、プライマーの設計、アニーリング温度の選択および古典的ＰＣＲの変更形態に関して、当業者は多数の文献を自由に使用できる。
【０２８７】
また、例えばｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡがテンプレートとして使用されることができることも、当業者によく知られている。通常、これは逆転写を用いて二本鎖ｃＤＮＡに予め転写されている。
【０２８８】
好適な実施形態において、熱安定ＤＮＡ依存ポリメラーゼがポリメラーゼとして使用される。特に好適な実施形態において、Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社、ドイツ、ハンブルグおよびＱｉａｇｅｎ社、ドイツ、ヒルデン）、Ｐｆｕ−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、米国、ラ  ホーヤ）、Ｔｔｈ−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｚｙｍ  Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．社、米国、マディソン）、Ｖｅｎｔ−ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、米国、ビバリー）、Ｅｘｐａｎｄ−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ社、ドイツ、マンハイム）からなる群から選択される熱安定性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼが使用される。
【０２８９】
特定の変更または進化的変更の手段による、天然に存在するポリメラーゼからの最適化されたポリメラーゼの使用も好ましい。物質ライブラリ担体の存在下においてＰＣＲが行われる場合、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ドイツ）によるＴａｑポリメラーゼまたはクロンテック社（米国カリフォルニア州パロアルト）によるＡｄｖａｎｔａｇｅ  ｃＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘの使用が特に好ましい。
【０２９０】
本発明のさらなる態様は、マイクロアレイベースの試験を行うための本発明の装置の使用に関する。
【０２９１】
以下では、本発明の装置または本発明の方法の特別な実施形態を示す。
【０２９２】
図５において、ここでは弾性部材である第１の表面が示されている。ここにおいて、加熱装置が好ましく組み込まれていて、ピンまたはタペットによって変形されていて、これによってチップが検出平面の方に圧されている。さらに、検出平面は第２の表面上のスペーサによって反応チャンバ内に押し込まれ、およびこのようにＤＮＡチップと検出平面との間の液体がほぼ完全に移されるまで上からＤＮＡチップに達している。反応チャンバを密閉している弾性シールはチップへ検出平面を誘導することによって圧縮される。移された液体は空気が空気補償チャンバ内で圧縮されるようにシールを変形させる。
【０２９３】
しかし、処理ユニットはまた、例えば弾性部材形態の第１の表面のみが変形されるか、または検出平面のみがチャンバ内に押し込まれるのかのいずれかであるように、開発され得る。
【０２９４】
図６には処理ユニットを圧縮するさらなる技術的実施形態を示す。反応チャンバは、ＤＮＡチップが上に固定されたシール部材によって、横方向におよび検出平面と反対の側で囲まれている。ＤＮＡチップのレベルにおいて、シール部材がチャンバ本体の下部側の穴を密封する。この穴はＤＮＡチップよりもわずかに小さい。反応チャンバ内でＰＣＲを実行する場合、この穴は、ＰＣＲに接続された温度上昇によって形成された内圧によってきつく密封される。したがって、柔軟性のあるシール部材にも拘わらず、チャンバは圧力に耐えられる（自動閉鎖弁の原理）。検出のために、ピンまたはタペットが下部側の穴に押し通される。
【０２９５】
シール膜が持ち上げられ、ＤＮＡチップが検出平面に対して押圧される。シール膜の必要な弾性を確保するために、このシール膜は補償用のひだ部を備え得る。この実施形態では、圧力補償チャンバはまた移された液体によって圧縮される。
【０２９６】
以下の実施例は本発明の例示の目的に適うものであって、限定的に解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２９７】
（実施例１）
加熱装置を有する反応カートリッジの構造
図８および９において、加熱装置および検出平面に向かってＤＮＡチップを誘導する装置が組み込まれていない処理ユニットの一実施形態を示す。図示の装置にあるＤＮＡチップは従来の蛍光顕微鏡（例えば、Ａｘｉｏｓｋｏｐ、Ｚｅｉｓｓ、Ｊｅｎａ、ドイツ）によって読み出すことが可能である。
【０２９８】
（実施例２）
シリコン製加熱基材を有する反応カートリッジの構造
図１０および１１に示す本発明の装置の処理ユニットの変形例は、組み込まれたプローブアレイ（ＤＮＡチップ）、反応チャンバ内の特徴的な温度を調節するための、組み込まれた温度センサを有するシリコン製加熱基材（「加熱基材」）および加熱基材を電気的に接触させるためのＥＰＲＯＭを場合によって有する回路板を備えた、小型化された反応カートリッジである。個々の構成要素は合成材料から作成された２つのシェル内に埋め込まれている。このユニット全体は空間的に閉鎖されたシステムであり、ここでは必要なすべての反応（例えば、ＰＣＲ）が温度制御された様式で実行され得る。
【０２９９】
まず、（ＥＰＲＯＭを下側に向けた状態で）回路板が下部シェルに設けられた軸に挿入される。回路板の上部側では、３つの電気接触パッドが配置されており、このパッドは続いて挿入される加熱基材との電気的接続を確実にする。この基材は次に接触パッドを担持する。前記加熱基材は８ｍｍ×６ｍｍの大きさおよび約０．６ｍｍの厚さを有する。この加熱基材は実行される試験の範囲内における異なる温度（例えば、４０℃〜９５℃）の正確な調整を保証する。ここでは、反応チャンバ内の温度の測定は、加熱基材に組み込まれている温度センサか、または加熱基材の表面上で直接温度を測定する外部測定ユニットのいずれかを用いて実行され得る。後者の場合、加熱基材に組み込まれたセンサを省いてよい。加熱および／または温度測定に使用される組み込まれた構成要素は、例えば、ダイオードでもよいし、またはトランジスタでもよい。シリコン製加熱基材の表面は反応空間の方に向いており、電気系を全く含まず、ＳｉＯ２不動態化層で被覆されている。
【０３００】
次の構成要素は弾性シールであり、これは反応空間を横方向に制限する。
【０３０１】
反応空間の中心において、ＤＮＡチップがプローブアレイが検出平面に向くように取り付けられている。ガラス表面の形態の検出平面を挿入後、前記表面は下部シェルから０．２ｍｍだけ依然として突出している。ピンを位置決めすることによって誘導される上部シェルを続いて連結することによって、ガラス表面がシールに対して押圧され、したがって反応チャンバの最適な密封が保証される。
【０３０２】
続いて、反応チャンバが反応溶液で充填され得る。ここでは、チップを含んだ内部空間のみが充填されるが、外部チャンバは充填されないことに留意されたい。設けられたカニューレガイドを介してカニューレを用いて必要な液体が注入される。
【０３０３】
続いて、例えばＰＣＲおよび／またはハイブリダイゼーションなどの、加熱基材により制御された生化学反応が反応チャンバ内で実行され得る。
【０３０４】
中間結果または最終結果を検出するために、検出平面とプローブアレイとの間の距離が約ゼロになるまで、検出平面が検出ユニットのスペーサを用いて上からＤＮＡチップに対して押圧される。ここでは、取り巻いている液体が外部チャンバに移動され、この外部チャンバにおいてこの液体が局所的な空気を圧縮する。この工程は可逆的であり、例えば、各ＰＣＲサイクルの後に実行することができる。
【０３０５】
デザインが小型であり、ＥＰＲＯＭを有し加熱基材が組み込まれている内部回路板であるために、本発明の装置のこの変形例は特に携帯での使用に特に適している。
【０３０６】
（実施例３）
検体を移動させることによるバックグラウンド信号の低減の検出
この実施例に記載のすべての蛍光測定は、蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｊｅｎｅ、ドイツ）を用いて行った。白色光源およびＣｙａｎｉｎｅ３に適したフィルタセットを用いて、入射光において励起を行った。ＣＣＤカメラ（ＰＣＯ−Ｓｅｎｓｉｃａｍ、Ｋｅｈｌｈｅｉｍ、ドイツ）を用いて信号を記録した。以下では、ギャップの厚さはマイクロアレイと検出平面との間の距離を表す。
【０３０７】
ａ）ギャップの厚さに応じた検体の蛍光シグナルの測定
所定のチャネル深さ（５μｍ、１０μｍ、２８μｍ）を有するチャネルシェルをＳｙｌｇａｒｄから成形した。チャネル幅は１２５μｍとした。ガラスチップを不均一な深さのチャネルに設置した。次いで、チャネルに２×ＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳ中のＣｙ３標識オリゴヌクレオチドの２００ｎＭ溶液を充填し、１．５秒の露光時間で信号を測定した。
【０３０８】
図１２に、測定された結果を示す。信号はチャネル深さが大きくなるほど線形的に上昇している。真っ直ぐな回帰線を算出することができた（式１）。
（式１）Ｆ（ｘ）＝６．２４６８ｘ＋５０．０１６
【０３０９】
得られた回帰線（式１）を用いて、今や、バックグラウンド蛍光シグナルを用いてＤＮＡチップと検出平面との間の層厚を決定することができる。
【０３１０】
これを、焦点を合わせることができる、構造化されたマーク（図１４の十字型、番号、およびデータマトリクス）をその上部側に有する２つのガラス表面（チップ）を重ねることによって検証した。このチップは構造化されたマークが互いに向けられ、薄い液層で単に分離されただけのように積層されている。２×ＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳ中のＣｙ３標識したオリゴヌクレオチドの２００ｎＭ溶液を液体として用いた。スケールを備えた顕微鏡の焦点調節装置を用いて、マークとしたがって液膜の層厚との距離を直接決定することができた。バックグラウンドの強度は０．７５秒の露光時間で１５８グレー値であった。蛍光顕微鏡にて測定されたギャップの厚さは４０μｍである。測定されたこのグレー値が露光時間（図１３を参照）に関して線形的に動くとすると、式１を用いて得られるギャップの厚さは４２．６μｍとなる。このように得られた液層の厚さの値はよくマッチしている。
【０３１１】
ｂ）処理ユニットを用いてバックグラウンド蛍光を低減または除去する実験
前記実験では、タペットによって及ぼされる圧力を用いた蛍光検体の移動に基づいてハイブリダイゼーション信号を測定した。この実験設定を図１５に示す。タペットを押圧することによって、シリコンチップ（３．１５×３．１５ｍｍ）をプローブチップ（ＤＮＡチップ）に対して押圧し、このプロセスにおいて２表面間に位置する液体を移動させた。
【０３１２】
この実験を行うために、あるＰＣＲハイブリダイゼーションにおける条件のためのモデルシステムであるハイブリダイゼーション溶液でチャンバを充填した。このハイブリダイゼーション溶液は、プローブアレイと相補性を有するＣｙ３標識オリゴヌクレオチド（２×ＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳ中の最終濃度２ｎＭ）を含んだ。また、このハイブリダイゼーション溶液は、プローブアレイとハイブリダイズせず、したがって単に溶液中の蛍光バックグラウンド信号の原因とはなるが、スポットにおいては特定の信号の原因とはならない同様のＣｙ３標識オリゴヌクレオチドを含んだ。
【０３１３】
ハイブリダイゼーションを１０分間行った。続いてハイブリダイゼーション信号を読み出すために、１．５秒の固定した露光時間を選択した。この実験設定では、各記録後にプローブアレイ（検出平面）の近くの方に押圧したところ、ハイブリダイゼーション溶液が充填されたアレイと第２の表面との間のギャップが低減された。
【０３１４】
図１６は厚さ１０μｍのギャップに関するハイブリダイゼーション信号の記録を示す。このスポットにおけるバックグラウンド信号およびハイブリダイゼーション信号の測定結果を図１７に示す。予想によれば、両信号はギャップの厚さに関して線形的に動く。したがって、バックグラウンドによって補正されたスポット信号はギャップの厚さに関して変化しない。
【０３１５】
２２５のグレー値に達すると、測定機器が過負荷になる。すなわち、約１７μｍの厚さでは、スポット強度の測定は露光時間を短縮することによって可能となるだけである。したがって、次いで測定感度が低減された。
【０３１６】
このため、動的測定範囲はギャップの厚さを低減することによって増大される。スポット信号のバックグラウンド調節（差の形成）を用いれば、測定および測定結果に影響を及ぼすことなくギャップの厚さを幅広く変えることが可能となる。非常に大きな厚さのギャップ（＞２０μｍ）を用いれば、検出器の過負荷によって測定は大きく損なわれる。
【０３１７】
ｃ）１ステージ反応としての増幅、ハイブリダイゼーションおよび検出
図１５の構造を有する２つの処理ユニットを設置し、番号を付けた。
【０３１８】
以下の組成を有する２つの同一の反応設定を調整した；
反応設定
２０ｍＭのｄＮＴＰ  ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．５μｌ
１Ｍの酢酸カリウム（Ｋａａｃ）  ．．．．．．．．．．．．．．．．．．３μｌ
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社の２５ｍＭの酢酸マグネシウム  ．．．．．．．．．５μｌ
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＣ−ＤＮＡ  ＰＣＲ緩衝液  ．．．．．．．．．．．５μｌ
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社のＴａｑ−ポリメラーゼ  ．．．．．．．．．．．．３μｌ
１０μＭのプライマーＣＭＶ＿ＤＰ＿Ｃｙ３  ．．．．．．．．．．．．．１μｌ
Ｃｙ３＿５’ＴＧＡＧＧＣＴＧＧＧＡＡＲＣＴＧＡＣＡ３’
１０μＭのプライマーＣＭＶ＿ＵＰ＿ＮＨ２  ．．．．．．．．．．．．０．６６μｌ
５’ＧＧＧＹＧＡＧＧＡＹＡＡＣＧＡＡＡＴＣ３’＿ＮＨ２
１０μＭのプライマーＣＭＶ＿ＵＰ  ．．．．．．．．．．．．．．．．０．３３μｌ
５’ＧＧＧＹＧＡＧＧＡＹＡＡＣＧＡＡＡＴＣ３’
１０μＭのプライマーＥｎｔｅｒｏ＿ＤＰ＿Ｃｙ３  ．．．．．．．．．．１μｌ
Ｃｙ３＿５’ＣＣＣＴＧＡＡＴＧＣＧＧＣＴＡＡＴ３’
１０μＭのプライマーＥｎｔｅｒｏ＿ＵＰ＿ＮＨ２  ．．．．．．．．．０．６６μｌ
５’ＡＴＴＧＴＣＡＣＣＡＴＡＡＧＣＡＧＣＣ３’＿ＮＨ２
１０μＭのプライマーＥｎｔｅｒｏ＿ＵＰ  ．．．．．．．．．．．．．０．３３μｌ
５’ＡＴＴＧＴＣＡＣＣＡＴＡＡＧＣＡＧＣＣ３’
１０μＭのプライマーＨＳＶ１＿ＤＰ＿Ｃｙ３  ．．．．．．．．．．．．１μｌ
Ｃｙ３＿５’ＣＴＣＧＴＡＡＡＡＴＧＧＣＣＣＣＴＣＣ３’
１０μＭのプライマーＨＳＶ１＿ＵＰ＿ＮＨ２  ．．．．．．．．．．．０．６６μｌ
５’ＣＧＧＣＣＧＴＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＣＧ３’＿ＮＨ２
１０μＭのプライマーＨＳＶ１＿ＵＰ  ．．．．．．．．．．．．．．．０．３３μｌ
５’ＣＧＧＣＣＧＴＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＣＧ
１０μＭのプライマーＨＳＶ２＿ＵＰ＿Ｃｙ３  ．．．．．．．．．．．．１μｌ
Ｃｙ３＿５’ＣＧＣＴＣＴＣＧＴＡＡＡＴＧＣＴＴＣＣＣＴ３’
１０μＭのプライマーＨＳＶ２＿ＤＰ＿ＮＨ２  ．．．．．．．．．．．０．６６μｌ
５’ＴＣＴＡＣＣＣＡＣＡＡＣＡＧＡＣＣＣＡＣＧ３’＿ＮＨ２
１０μＭのプライマーＨＳＶ２＿ＤＰ  ．．．．．．．．．．．．．．．０．３３μｌ
５’ＴＣＴＡＣＣＣＡＣＡＡＣＡＧＡＣＣＣＡＣＧ３’
１０μＭのプライマーＶＺＶ＿ＤＰ＿Ｃｙ３  ．．．．．．．．．．．．．１μｌ
Ｃｙ３＿５’ＴＣＧＣＧＴＧＣＴＧＣＧＧＣ
１０μＭのプライマーＶＺＶ＿ＵＰ＿ＮＨ２  ．．．．．．．．．．．．０．６６μｌ
５’ＣＧＧＣＡＴＧＧＣＣＣＧＴＣＴＡＴ３’＿ＮＨ２
１０μＭのプライマーＶＺＶ＿ＵＰ  ．．．．．．．．．．．．．．．．０．３３μｌ
５’ＣＧＧＣＡＴＧＧＣＣＣＧＴＣＴＡＴ
テンプレートＣＭＶ  ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１μｌ
ＰＣＲ等級水  ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２２．５μｌ
合計  ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．５０μｌ
【０３１９】
処理ユニットを５０μｌの反応設定で充填し、以下の温度−時間レジメンに従って処理した。
１  変性  ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．９５℃
持続時間  ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．３００秒
２  変性  ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．９５℃
持続時間  ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１０秒
３  アニーリング／伸長  ．．．．．．．．．．．．．．６０℃
持続時間  ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２０秒
工程２〜３の反復回数  ．．．．．．．．．．．．．．．３５回
４  変性  ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．９５℃
持続時間  ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．３００秒
５  ハイブリダイゼーション  ．．．．．．．．．．．．４０℃
持続時間  ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．３６００秒
【０３２０】
続いて、２つの処理ユニットを異なる処理に供した。第１の場合（処理ユニット１）、検体を置換させることによりバックグラウンド蛍光を低減させた。検出平面の方向にタペットを押し上げることによってこれを確実にし、反応溶液が充填されたギャップを可能な限り低減させた。
【０３２１】
第２の場合（処理ユニット２）、検体を非蛍光溶液と交換した。この溶液の交換を２×ＳＳＣを用いて変動率３００μｌ／分および９００μｌのリンス容量で行った。この手順は最新のものに対応する。
【０３２２】
続いて、バックグラウンド蛍光を低減させる両戦略を比較した。このために、上記で設定した蛍光顕微鏡カメラを用いて、両処理ユニットにおけるハイブリダイゼーションシグナルを検出した。
【０３２３】
露光時間は５秒とした（図１８および１９を参照）。物質ＣＭＶ＿Ｓ＿２１−３（５’−ＮＨ２ＴＧＴＴＧＧＧＣＡＡＣＣＡＣＣＧＣＡＣＴＧ−３’）のスポットを用いてスポット強度を比較した。プローブの位置を図１８および１９に示した。
【０３２４】
図２０には実験結果をまとめた。処理ユニット２の反応チャンバをリンスすることによって、処理ユニット１の置換の場合に比してハイブリダイゼーションシグナルが低減された。これはプローブのブリーディングに起因するものと推定される。
【０３２５】
このように、本発明の方法による検体置換は溶液の置換に好ましい。
【０３２６】
増幅産物の量および整合性を検出すために、各溶液５μｌを２％アガロースゲル上でさらに分析した。この結果（ＵＶトランスイルミネーターを用いて、エチジウムブロマイドで染色したゲルを検出した）を図２１に示す。
【０３２７】
（実施例４）
本発明の反応カートリッジを処理および検出する装置
この実施例に従って本発明の反応カートリッジを処理および検出する装置を図２８に示す。
【０３２８】
本発明の反応カートリッジを用いてマイクロアレイベースの試験を実行する装置は通常、１つの装置に統合可能かまたはいくつかの部分的な装置からモジュールとして組み立てることが可能ないくつかの構成要素からなる。この場合、該装置は場合によっては、組込みコンピュータを介して、または外部コンピュータとのインタフェースを介して起動することができる。該装置の構造を図２８に示す。
【０３２９】
例示的な手順は以下の通り行われる。
【０３３０】
操作者は反応カートリッジの流体インタフェースを充填位置に手動で持って行く。ここでカニューレがチャンバ本体のシールを穿刺する。続いて、操作者は標準的な実験用ピペットを用いて反応混合物を反応チャンバに送り込む。両工程はそれに対応して開発された装置を用いて行うこともできる。次いで、流体インタフェースを再度最初の位置にする。この場合、前記手順はそれに対応して開発された装置を用いて行うことも可能である。
【０３３１】
次いで、反応カートリッジを装置に挿入する。装置内に配置されたデータマトリクスリーダーが、反応カートリッジに取り付けられた一対一の対応関係のデータマトリクスを認識し、ユーザによって送信されたデータ記録によって、反応カートリッジおよび実行される試験に特徴的であるデータを制御コンピュータにロードする。次いで、前記コンピュータは、例えば増幅およびハイブリダイゼーションを含む個々の処理工程を制御する。組み込まれた圧力機構を介して、続いて反応チャンバ内のキャピラリーギャップが本発明による検出のために低減される。
【０３３２】
検出は従来の蛍光光学結像系および非結像系を用いて実行され得る。続いて、得られたデータは、制御コンピュータに送信され、該コンピュータがデータを評価して、内部または外部インタフェースに呈示または保存される。
【０３３３】
次いで、反応カートリッジが装置から取り出され、操作者によって廃棄され得る。
【０３３４】
（実施例５）
導電性合成材料から作成した反応カートリッジ
図２９に示した反応カートリッジを調製する。
【０３３５】
反応カートリッジの下部シェル（１）は、反応チャンバのベースを形成する導電性合成材料（Ｃｏｎｄｕｃｔ２、ＲＫＴ社、ドイツ）から構成されている。ホイルＰＴ−１００温度センサが、適した接着剤、例えば、Ｌｏｃｔｉｔｅ４０１（Ｌｏｃｔｉｔｅ、ドイツ）を用いてチャンバベースの下部側に固定されている。シール（３）およびカバーガラス（４）と共に、下部シェルは本発明のカートリッジの反応チャンバを形成する。
【０３３６】
該カートリッジは電気的接触のためのネジ山のついたドリル穴（２）、例えばアクリルから作成された、反応カートリッジの上部シェル（５）、上部シェル取付け用のドリル穴（６）、および上部シェルの検出窓（７）をさらに有する。
【０３３７】
標準的なＰＣＲ反応混合物を調製する：
３０．５μｌの脱イオン水
５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（例えば、１０×ｃＤＮＡ  ＰＣＲ反応緩衝液、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、ドイツ）
５μｌの酢酸マグネシウム、２５ｍＭ（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社、ドイツ）
０．５μｌのｄＮＴＰ、各２０ｍＭ
１μｌの１６ｓｆＤ１（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’）、１０ｍＭ
１μｌの１６ｓＲａ（５’−ＴＡＣＣＧＴＣＡＣＣＡＴＡＡＧＧＣＴＴＣＧＴＣＣＣＴＡ−３’）、１０ｍＭ
３μｌのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｇｅｎａｘｘｏｎ社、ドイツ）
１μｌのテンプレート
【０３３８】
インシュリン用注射器（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、ドイツ）を用いて、反応チャンバに反応混合物を充填する。充填手順中に通気を行うために、第２のカニューレをチャンバ本体のシールに穿刺する。充填後、通気用カニューレおよびインシュリン用注射器を専門的に廃棄する。
【０３３９】
次いで、接続用に提供された２本のネジを用いて調整ユニット（ＣＬＯＮＤＩＡＧ  ｃｈｉｐ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ社、ドイツ）にチャンバを接続する。同様に、調整ユニットの下部シェルの下部側に温度センサを接続する。前記調整ユニットは所定のプログラムに従って下部シェル内の特定の温度を調節することが可能である。
【０３４０】
このようにして、以下のＰＣＲプログラムを実行する：９５℃で５分間。３０回×（９５℃で３０秒、６２℃で３０秒、７２℃で５０秒）。
【０３４１】
図３０は９５℃の温度で熱画像カメラで記録された反応カートリッジの画像を示す。
【０３４２】
プログラム終了後、インシュリン用注射器を用いて反応チャンバから反応産物を取り出す。同様に、カニューレをチャンバ本体のシールに穿刺して、反応チャンバを空にする間の通気を行う。
【０３４３】
ここで、アガロースゲル電気泳動により反応産物分析する。このために、反応溶液５μｌを適した緩衝液（例えば、５０％グリセリン、ブロモフェノールブルー中の５μｌ、２５０ｍＭ）とともに２％アガロースゲルのポケットに入れ、電気泳動を行う。この結果を図３１に示す。
【０３４４】
明らかなように、正確な大きさおよび陽性対照に匹敵する量の増幅産物を全例で得ることができた。
【図面の簡単な説明】
【０３４５】
【図１】読み出し装置および処理ユニットを備えた本発明の装置を示す略図である。
【図２】本発明の処理ユニットを示す図である。
【図３】検出平面、シール、ＤＮＡチップおよびチャンバ本体を備えた本発明の処理ユニットを示す分解図である。チャンバ本体は可逆的に変形可能な弾性膜を有する。
【図４】弾性膜内に射出成形された合成材料によって囲まれた加熱用の蛇行体を有するチャンバ本体を示す図である。
【図５】読み出し装置における本発明の処理ユニットの状態を示す図である（Ａ）ＰＣＲ中、Ｂ）検出前、Ｃ）検出中）。
【図６】膜シール、補償用ひだ部においておよび下部横穴を有する本発明の処理ユニットの機能のモードを示す図である。Ａ）においては、処理ユニットは通常の位置にある。Ｂ）においては、処理ユニットは圧縮された形態であり、ＤＮＡチップと検出平面との間の蛍光溶液が移動される。
【図７】４つの温度ブロックが上に設置された回転円盤を示す図である。温度ブロックは各々ある温度に自動的に温度調節される。円盤および／または処理ユニットを回転させることによって、反応チャンバ内の温度を変えることができる。
【図８】穴が開けられボルトが嵌められた処理ユニットの一例を示す図である。
【図９】従来の蛍光顕微鏡におけるハイブリダイゼーション信号を検出するための圧縮または圧接装置の一例を示す図である。
【図１０】ヒータおよび温度センサ用の電気接続である回路基材を有する本発明の処理ユニットを示す図である。
【図１１】図１０に示した処理ユニットを示す分解組立図である。
【図１２】フルオロフォアが充填されたギャップの幅を決定するための真っ直ぐな回帰線を示す図である。
【図１３】測定領域にわたって露光時間が増大するにつれて、蛍光シグナルが線形的に進むのを示す図である。
【図１４】２つの重ね合わせられたチップの蛍光記録を示し、二つのチップの間のギャップは２００ｎＭのＣｙ３フルオロフォアで充填されている。バックグラウンド強度は０．７５秒の露光時間で１５８グレー値であった。蛍光顕微鏡にて測定されたギャップの厚さは４０．００μｍである。測定されたこのグレー値が露光時間（図１３を参照）に関して線形的に動くと仮定すると、式１を用いて得られるギャップの厚さは４２．６μｍとなる。このように得られた層の厚さの値はよく適合している。
【図１５】リンス工程なしにＤＮＡアレイを検出するための実験設定を示す図である。
【図１６】チップがアレイに押圧されたアレイの蛍光記録を示す。白いふちによって、移動された試料溶液のバックグラウンド放射があるのがわかる。
【図１７】ギャップの厚さが低減されたときの信号およびバックグラウンドの絶対強度の減少を示す。両値の差は測定領域にわたって一定である。
【図１８】バックグラウンド蛍光を移動させることによってプローブ信号を検出を示す。左端には移動されていない液体があるのがわかる。
【図１９】リンス工程によってバックグラウンドが調節された、ＤＮＡアレイのプローブ信号の検出を示す。
【図２０】検体の移動および交換を実験的に比較した測定結果のまとめである。
【図２１】ゲル電気泳動を用いた処理ユニットにおけるＰＣＲの参照分析を示す。
【図２２】反応カートリッジに反応性物質または緩衝液を充填するための取り外し可能な充填ユニットを示す略図である。ここでは、以下の参照番号を用いる。  １充填ユニット  １．１機械的インタフェース充填ユニット−カートリッジ  ２カートリッジ  ２．１機械的インタフェースカートリッジ−充填ユニット  ２．２シール  ２．３反応チャンバ  ２．４カニューレ用のカートリッジの好ましい開口部  ３充填チャネル  ３．１試料添加ツールとの流体的および機械的インタフェース  ３．２充填カニューレ  ４廃棄容器との廃棄チャネル  ４．１通気穴  ４．２廃棄カニューレ
【図２３ａ】モジュール式充填ユニットの手段により反応カートリッジを充填する手順の図である。
【図２３ｂ】モジュール式充填ユニットの手段により反応カートリッジを充填する手順の図である。
【図２４】チャンバ本体のシールを貫通させずに、好適な位置において反応カートリッジに反応性物質または緩衝液を充填するための組み込まれた充填ユニットを示す略図である。ここでは、以下の参照番号を用いる。  １充填ユニット−カートリッジ  １．１機械的インタフェースカートリッジ−充填ユニット  ２反応カートリッジ  ２．１機械的インタフェースカートリッジ−充填ユニット  ２．２シール  ２．３反応空間  ２．４カートリッジケース内のカニューレ用の好ましい開口部  ３充填チャネル  ３．１試料送り込みツールとの流体的および機械的インタフェース  ３．２充填カニューレ  ４廃棄容器との廃棄チャネル  ４．１試料排出ユニットとの流体的および機械的インタフェース  ４．２廃棄カニューレ  ５好ましい位置のための機器。ここではバネ
【図２５ａ】組み込まれた充填ユニットを有する反応カートリッジを充填するための手順を示す図である。
【図２５ｂ】組み込まれた充填ユニットを有する反応カートリッジを充填するための手順を示す図である。
【図２６】チャンバ本体のシールを貫通させずに、好適な位置において反応カートリッジに反応性物質または緩衝液を充填するための組み込まれた廃棄容器を有する組み込まれた充填ユニットを示す略図である。ここでは、図２４の参照番号に加えて以下の参照番号を用いる。  ４廃棄容器との廃棄チャネル  ４．１通気穴
【図２７】ａ）余分な液体を廃棄容器またはチャネルに排出するときの反応空間の充填を示す。ｂ）検出のために反応空間を低減させるときに余分な液体を排出すのを示す。ここでは、以下の参照番号を用いる。  １反応チャンバ  ２シール  ３圧力機構  ４流体インタフェース  ４．１排出カニューレ  ４．２送り込みカニューレ
【図２８】実施例４に従って本発明の反応カートリッジを処理しおよび検出する装置を示す。ここでは、以下の参照番号を用いる。  １反応カートリッジ  １．１マイクロアレイを備えた反応チャンバ  １．２流体システムインタフェース  １．３チャンバ本体のシール  １．４加熱システム用の電気接続部。場合によっては温度センサでもある。  １．５チップ  １．６好ましい位置を実施し、カニューレを誘導するための位置確保システム  １．７カニューレ  ２圧力機構  ３同定システム。例えば、バーコードまたはデータマトリクス  ３．１同定光学系。例えば、バーコードまたはデータマトリクス  ４検出光学系  ５流体接続部
【図２９】実施例５の反応カートリッジを示す。
【図３０】温度９５℃において熱画像カメラで記録した実施例５の反応カートリッジの記録を示す。
【図３１】アガロースゲル電気泳動を用いた実施例５の反応産物の分析を示す。ここでは、以下の参照番号を用いる。  １、５：熱サイクラーからの陽性対照  ２−４：カートリッジからの反応産物  ６：１００ｂｐ標準
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３ａ】
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【図２３ｂ】
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【図２４】
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【図２５ａ】
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【図２５ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【国際調査報告】
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