(57)【要約】  本発明は、クリプトスポリジウムなどの寄生虫を、非イオン性洗浄剤及びＥＣＬ検出を使用して、分子マーカー又は抗原を効果的に抽出することによって検出するための有効で、感受性が高く、信頼できる方法を提供し、さらにそのような方法を実施するためのキット及び組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）試料を抽出試薬と合わせて、抽出混合物を形成するステップであって、前記抽出試薬が式Ｒ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｏ−Ｚ（式中、
ｉ）Ｒは、−Ｈ又は−ＣＨ３であり、
ｉｉ）ｎは、２を超える整数であり、
ｉｉｉ）Ｚは、アルキル基である）
の非イオン性洗浄剤を含むステップと、
（ｂ）前記抽出混合物を、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）オーシストの１種又は複数のマーカーを抽出するのに十分な時間インキュベートするステップと、
（ｃ）前記１種又は複数のマーカーを測定するステップと
を含む、前記試料におけるクリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）を検出する方法。
【請求項２】
ＲはＨであり、ｎは８〜２３であり、Ｚは−（ＣＨ２）ｍＣＨ３（式中、ｍは７〜１７である）である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
クリプトスポリジウムパルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）に選択的なマーカーを測定する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記非イオン性洗浄剤が、Ｌａｕｒｅｔｈ−１２である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記測定ステップが、
（ａ）アッセイ混合物を形成するステップであって、前記アッセイ混合物が、
（ｉ）前記マーカー及び
（ｉｉ）前記マーカーに特異的な抗体
を含むステップと、
（ｂ）前記抗体を前記マーカーに結合させるのに十分な条件下で、前記アッセイ混合物をインキュベートすることによって、抗体−マーカー複合体を形成するステップと
を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記測定がイムノアッセイによって実施される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記検出がＥＣＬイムノアッセイによって実施される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抽出試薬がｐＨ緩衝剤をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記測定ステップの前に、前記抽出混合物を前記測定ステップに最適な異なる緩衝液へ交換する請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記抽出混合物のＬａｕｒｅｔｈ−１２の濃度が０．００２〜０．１重量％である請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
Ｌａｕｒｅｔｈ−１２の濃度が０．０１〜０．０５重量％である請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記マーカーが炭水化物マーカー、タンパク質マーカー及び／又は糖タンパク質マーカーである請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抽出混合物を、５０℃を超える温度でインキュベートする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記抽出混合物を、７５℃を超える温度でインキュベートする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記抽出混合物を、９５℃を超える温度でインキュベートする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料を前記抽出試薬と合わせる前に、前記試料内のクリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）を濃縮するステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記マーカーを測定する前に、前記抽出混合物から不溶性細片を取り除くことをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）試料を抽出試薬と合わせることによって前記試料を抽出して、抽出混合物を形成するステップであって、前記抽出試薬が式Ｒ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｏ−Ｚ（式中、
ｉ）Ｒは、−Ｈ又は−ＣＨ３であり、
ｉｉ）ｎは、２を超える整数であり、
ｉｉｉ）Ｚは、アルキル基である）
の非イオン性洗浄剤を含むステップと、
（ｂ）前記抽出混合物内で、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）オーシスト及び／又はスポロゾイトの抗原を可溶化するステップと、
（ｃ）（ｉ）前記可溶化した抗原、及び
（ｉｉ）前記抗原に特異的な抗体を
含むアッセイ混合物を形成するステップと、
（ｄ）前記抗体を前記抗原に結合させるのに十分な条件下で、前記アッセイ混合物をインキュベートすることによって、抗体−抗原複合体を形成するステップと、
（ｅ）前記抗体−抗原複合体を測定することによって、前記試料内のクリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）を測定するステップと
を含む、前記試料内のクリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）を検出する方法。
【請求項１９】
ＲはＨであり、ｎは８〜２３であり、Ｚは−（ＣＨ２）ｍＣＨ３（式中、ｍは７〜１７である）である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記マーカーがクリプトスポリジウムパルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）に選択的である請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記非イオン性洗浄剤がＬａｕｒｅｔｈ−１２である請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記抽出混合物の前記Ｌａｕｒｅｔｈ−１２の濃度が０．００２〜０．１重量％である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抽出混合物の前記Ｌａｕｒｅｔｈ−１２の濃度が０．０１〜０．０５重量％である請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記抽出を、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）オーシストのマーカーを可溶化するのに十分な時間、５０℃を超える温度で実施する請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記抽出を、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）オーシストのマーカーを可溶化するのに十分な時間、７５℃を超える温度で実施する請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記抽出を、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）オーシストのマーカーを可溶化するのに十分な時間、９５℃を超える温度で実施する請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記試料を抽出する前に、前記試料のクリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）を濃縮するステップをさらに含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体−抗原複合体を測定する前に、前記抽出混合物から不溶性細片を取り除くステップをさらに含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
（ａ）試料を抽出試薬と合わせて、抽出混合物を形成するステップと、
（ｂ）クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）オーシストのマーカーを可溶化するのに十分な時間、前記抽出混合物をインキュベートするステップと、
（ｃ）イムノアッセイにより前記マーカーを測定するステップと
を含む前記試料のクリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）を検出するための改善された方法であって、前記改善が化学式
Ｒ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｏ−Ｚ（式中、
ｉ）Ｒは、−Ｈ又はＣＨ３であり、
ｉｉ）ｎは、２を超える整数であり、
ｉｉｉ）Ｚは、アルキル基である）
の非イオン性洗浄剤から選択した洗浄剤を含む抽出試薬の使用である改善された方法。
【請求項３０】
ＲはＨであり、ｎは８〜２３であり、Ｚは−（ＣＨ２）ｍＣＨ３（式中、ｍは７〜１７である）である請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記マーカーが選択的マーカーＣ．パルバム（Ｃ．ｐａｒｖｕｍ）である請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記非イオン性洗浄剤がＬａｕｒｅｔｈ−１２である請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記抽出混合物の前記Ｌａｕｒｅｔｈ−１２の濃度が０．００２〜０．１重量％である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記抽出混合物の前記Ｌａｕｒｅｔｈ−１２の濃度が０．０１〜０．０５重量％である請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記可溶化を、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）オーシストのマーカーを可溶化するのに十分な時間、５０℃を超える温度で実施する請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記可溶化を、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）オーシストのマーカーを可溶化するのに十分な時間、７５℃を超える温度で実施する請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記可溶化を、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）オーシストのマーカーを可溶化するのに十分な時間、９５℃を超える温度で実施する請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
前記試料を前記抽出試薬と合わせる前に、前記試料内のクリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）を濃縮するステップをさらに含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
前記濃縮ステップが前記試料を遠心することを含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記マーカーを測定する前に、前記抽出混合物から不溶性細片を取り除くステップをさらに含む請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
前記不溶性細片の除去ステップが前記抽出混合物を遠心することを含む請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
（ａ）一般式Ｒ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｏ−Ｚ（式中、
ｉ）Ｒは、−Ｈ又はＣＨ３であり、
ｉｉ）ｎは、２を超える整数であり、
ｉｉｉ）Ｚは、アルキル基である）
の非イオン性洗浄剤を含む抽出試薬と、
（ｂ）クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）オーシストのマーカーに結合する抗体と
を１つ又は複数の容器に含み、
前記抽出試薬がクリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）を抽出して前記マーカーを可溶化するのに適している、試料内のクリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）を測定するためのキット。
【請求項４３】
前記抽出試薬がＬａｕｒｅｔｈ−１２である請求項４２に記載のキット。
【請求項４４】
電気化学発光標識をさらに含む請求項４３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
Ｉ．背景
本出願は、２００３年９月１６日出願の米国仮特許出願番号第６０／５０３，３６２号に対する優先権の利益を主張し、本願明細書にこの全体を援用する。
【背景技術】
【０００２】
クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）は、ヒト及び動物に感染して、重篤な腸障害を引き起こす食媒性寄生虫及び水媒性寄生虫の属である（Ｃ．Ｄｒｏｚｄら（１９９６）Ａｐｐｌｄ．Ｅｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ．，６２（４）：１２２７−１２３２）。この感染は、オーシストの形で、主に糞口接触を通して伝播する。一方、クリプトスポリジウム感染は、一般に、ヒトの生命を脅かすものではないが、免疫無防備状態に対しては非常に危険である可能性がある。汚染された水によるクリプトスポリジウムパルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ；Ｃ．パルバム（Ｃ．ｐａｒｖｕｍ））の最近の集団発生は、水、食品、環境試料、ヒト、動物及びその他の潜在性汚染源でクリプトスポリジウムを検出することの重要性を強調している。
【０００３】
クリプトスポリジウムオーシストの検出方法は、米国特許番号第６，１４６，８３８号（Ｗｉｌｌｉａｍｓら）及び米国特許番号第６，４７５，７４７号（Ｔｓａｎｇら）に記載され、これらは本願明細書に援用する。両方の特許は、クリプトスポリジウム卵母細胞由来の抗原を可溶化すること、及びこの可溶化した抗原を検出することについて述べている。米国特許番号第６，１４６，８３８号は、胆汁酸塩及び／又はイオン性洗浄剤の存在下での可溶化について特に述べている。米国特許番号第６，４７５，７４７号は、両性イオン性洗浄剤を使用したオーシストの可溶化について述べている。また、両方の特許は、可溶化した抗原を検出するために電気化学発光（ＥＣＬ）イムノアッセイを使用することを述べている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本明細書ではクリプトスポリジウムオーシストの検出のために改善された方法を示す。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ＩＩ．発明の概要
本発明は、クリプトスポリジウム寄生虫検出のための有効で、感受性が高く、信頼できる方法を提供する。
【０００６】
本発明の一実施形態は、例えば、クリプトスポリジウムのオーシスト及び／又はスポロゾイトなどの、クリプトスポリジウムを試料内で測定するための方法であって、前記試料を、例えば、炭水化物、タンパク質又は糖タンパク質のマーカーなどのクリプトスポリジウムの１種又は複数のマーカーである抽出媒体に、抽出、及び好ましくは可溶化するのに十分な時間、抽出媒体でインキュベートする方法である。
【０００７】
抽出媒体は、一般式Ｒ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｏ−Ｚ（式中、（ｉ）Ｒは、−Ｈ又は−ＣＨ３であり、（ｉｉ）ｎは、２を超える整数であり、（ｉｉｉ）Ｚは、例えば−（ＣＨ２）ｍＣＨ３（式中、ｍは７〜１７である）などのアルカリ基である）の非イオン性アルカリポリオキシエチレン洗浄剤を含む抽出試薬を含む。本発明の特定の実施形態において、抽出媒体は、一般式Ｒ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｏ−Ｚ（式中、（ｉ）Ｒは、−Ｈであり、（ｉｉ）ｎは、８〜２３の整数であり、（ｉｉｉ）Ｚは、−（ＣＨ２）ｍＣＨ３（式中、ｍは７〜１７である）である）の非イオン性アルカリポリオキシエチレン洗浄剤を含む抽出試薬を含む。本試験の様々な実施形態において、抽出媒体は、一般式Ｒ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｏ−Ｚ（式中、（ｉ）Ｒは、−Ｈであり、（ｉｉ）ｎは、１２であり、（ｉｉｉ）Ｚは、−（ＣＨ２）ｍＣＨ３（式中、ｍは１１である）である）の非イオン性アルカリポリオキシエチレン洗浄剤を含む抽出試薬を含む。特定の実施形態において、抽出試薬は、Ｌａｕｒｅｔｈ−１２としても知られるＨ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）１２−Ｏ−（ＣＨ２）１１ＣＨ３を含むことができる。
【０００８】
試料抽出の間、洗浄剤の濃度は、０．００１〜１．０重量％とすることができる。一部の実施形態において、洗浄剤の濃度は、０．００２〜０．１重量％とすることができる。特定の実施形態において、洗浄剤の濃度は、０．０１〜０．０５重量％とすることができる。さらに、抽出媒体は、ｐＨ緩衝剤を含むことができる。本試料は、７５℃又は９５℃を超える温度などの５０℃を超える温度で、抽出媒体の存在下でインキュベートすることができる。一部の実施形態において、本抽出媒体の温度は、１００℃以上とすることができる。
【０００９】
抽出したクリプトスポリジウムのマーカーは、本試料のクリプトスポリジウムを検出するために測定する。マーカーの測定は、例えば、ＥＣＬイムノアッセイなどのイムノアッセイを使用して実施することができる。特定の実施形態において、この測定は、抽出マーカー及び（場合によって）可溶化マーカー、並びにマーカーを認識する抗体を含むアッセイ混合物を形成し、マーカーが抗体に結合して、抗体−抗原複合体を形成するのに十分な条件下でこの混合物を培養し、この抗体−抗原複合体の存在を判定することによって、クリプトスポリジウムを測定することを含むことができる。
【００１０】
本発明の特定の実施形態に従って、抽出ステップの生成物は、クリプトスポリジウムの検出ステップの実施前に、検出ステップを最適化する緩衝液などによって、緩衝液を交換することができる。さらに、遠心及び／又はろ過を、可溶化マーカーの検出前に、本抽出ステップの生成物から粒状の細片を取り除くために使用してもよい。さらに、試料を抽出試薬と接触させる前に、例えば、ろ過又は遠心によって濃縮してもよい。
【００１１】
さらに、本発明は、試料内の例えばＣ．パルバムなどのクリプトスポリジウムを測定するキット（及び試薬組成物）に関する。一部の実施形態に従って、本キットは、ｉ）本発明の抽出方法に従って、例えば、Ｃ．パルバムの卵母細胞などのクリプトスポリジウム卵母細胞のマーカーを可溶化することにおいて好適な例えば、Ｌａｕｒｅｔｈ−１２などの非イオン性洗浄剤を含む抽出試薬、及びｉｉ）マーカーに結合する抗体を、１つ又は複数の容器に含む。本発明の抗体は、例えば、電気化学発光標識などの検出可能な標識で標識することができる。また、本キットはマーカーに結合する第二抗体を含むことができる。本キットは、第二抗体を固定するか、固定することが可能な固相をさらに含むことができる。一部の実施形態において、例えば、この固相は磁化可能粒子などの粒子である。他の実施形態では、この固相は、例えば、マルチウェルプレートのウェルの表面など、スライド又は容器の表面とすることができる。特定の実施形態において、この固相は、例えば、炭素電極の表面など、電極の表面とすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
ＩＩＩ．発明の詳細な説明
本発明の一態様は、試料から微生物マーカーを抽出するための方法に関する。本明細書では、マーカーは、試料内の微生物の量又は存在を判定するために測定することができる微生物の成分を指す。本明細書では、抽出は、マーカーをより測定しやすいようにするために試料を加工することを指す。本明細書では、測定は、定量的及び定性的測定を含むと理解され、分析物の存在を検出すること、分析物の量を測定すること、及び／又は試料の分析物を特定することを含むが、これらには限定されない様々な目的のために実施される測定を含む。この方法は、様々な種類の試料で、例えば、Ｃ．パルバムを含むクリプトスポリジウム及びこれら菌の卵母細胞などの微生物の測定を迅速かつ容易に実施するのに適している。本発明の抽出方法は、多種多様な微生物からのタンパク質様マーカー、炭水化物マーカー、核酸マーカー及び／又は脂質マーカーなどの多種多様のマーカーによって使用することができる。特定の実施形態において、本マーカーは、例えば、病原菌に存在するタンパク質、炭水化物及び／又は糖タンパク質を含む抗原などの抗原マーカーであって、例えば、Ｃ．パルバムのようなクリプトスポリジウム属のメンバーを含む卵母細胞形成原生動物などの原生動物である病原菌である。
【００１３】
本発明の一部の実施形態に従って、病原菌（例えば、Ｃ．パルバムのようなクリプトスポリジウム属のメンバーなどの卵母細胞形成原生動物などの原生動物）による汚染が疑われる試料を菌からマーカーを、抽出及び場合によっては可溶化する抽出試薬によって処理する。マーカーが当該の属又は種に固有である場合、本発明において有益である。次に、抽出及び場合によっては可溶化したマーカーを測定する。抽出したマーカーの測定は、試料内の菌の存在、量及び／又は菌種の検出を可能にする。例として、抽出は、例えば（ｉ）膜、細胞壁、エンベロープなどを破壊又は可溶化してマーカーを放出し、膜、細胞壁又はエンベロープなどに含めるか入れる、結合させる、及び／又は組み入れることによって、（ｉｉ）マーカーを大きな化学的成分から切断することによって、（ｉｉｉ）多糖類の外被を分解及び／又は溶解することによって、並びに／或いは（ｉｖ）ゼリーの外被を分解及び／又は溶解することによって、細胞、微生物又は細胞小器官からマーカーを遊離することを含むことができる。また、抽出ステップは、周囲の試料基質の成分からマーカー、細胞、細胞小器官及び／又は微生物を遊離することを含むことができる。基質は、菌及びマーカーが存在する媒体を含むことができる。様々な実施形態において、試料の抽出は、当該のマーカーの可溶化につながる。
【００１４】
本発明の特定の実施形態に従って、クリプトスポリジウムの卵母細胞による汚染が疑われる試料を、試料内のクリプトスポリジウム卵母細胞由来のマーカーを可溶化する抽出試薬によって処理する。マーカーは、例えば、Ｃ．パルバムなどのクリプトスポリジウムに固有とすることが可能である。そのあと、可溶化したマーカーを（測定ステップ時に）測定することができる。可溶化マーカーの測定は、試料内のクリプトスポリジウムの存在又は量の検出を可能にする。特定の実施形態において、測定結果をマーカーの種類に対して特異的とすることができる。例として、可溶化マーカーの測定を、例えばＣ．パルバム卵母細胞などのクリプトスポリジウム卵母細胞に対して特異的にすることができる。もちろん、非常に特異的なアッセイであっても、いくつかの密接に関連した交差反応物質が存在する可能性があることがわかっている。
【００１５】
一部の実施形態において、本発明の抽出／可溶化ステップに使用する抽出試薬は、一般式Ｒ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｏ−Ｚ（式中、ｉ）Ｒは、−Ｈ又はＣＨ３であり、ｉｉ）ｎは、８、１２及び２３などの２を超える整数であり、ｉｉｉ）Ｚは、例えば−（ＣＨ２）ｍＣＨ３（式中、ｍは７〜１７であり、一部の実施形態では１１である）などのアルカリ基である）の非イオン性アルカリポリオキシエチレン洗浄剤を含む抽出試薬とすることができる。本発明の試薬は、化粧品原料国際命名法（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ；ＩＮＣＩ）に従って、Ｌａｕｒｅｔｈ−１２としても知られるＨ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）１２−Ｏ−（ＣＨ２）１１ＣＨ３を含むことができる。
【００１６】
本発明で有用な洗浄剤の例を次に掲げる、
・ＢＲＩＪ３５、３０％水溶液、
・ＢＲＩＪ（登録商標）３５、タンパク質グレード（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＧＲＡＤＥ）洗浄液、無菌ろ過済１０％溶液、
・ＧＥＮＡＰＯＬ  Ｃ−１００、タンパク質グレード洗浄液、無菌ろ過済１０％溶液、
・ＧＥＮＡＰＯＬ  Ｘ−０８０、タンパク質グレード洗浄液、無菌ろ過済１０％溶液、
・ＧＥＮＡＰＯＬ  Ｘ−１００、タンパク質グレード洗浄液、無菌ろ過済１０％溶液、
・オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、
・水素化オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、
・水素化オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、
・ポリエチレングリコールドデシルエーテル、
・ポリエチレングリコールラウリルエーテル、
・ポリオキシエチレン（１０）ドデシルエーテル、
・ポリオキシエチレン（１０）イソトリデシルエーテル、
・ポリオキシエチレン（８）ドデシルエーテル、
・ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル、
・ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル、
・ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、
・ポリオキシエチレングリコールドデシルエーテル、
・ポリオキシエチレングリコールドデシルエーテル、
・ポリオキシプロピレンポリオキシエチレンブロック共重合体である。
【００１７】
例えば、Ｌａｕｒｅｔｈ−１２などの、これらの非イオン性洗浄剤は、先行技術において使用されている両性イオン性合成化合物及びイオン性洗浄剤と比べて、クリプトスポリジウムのマーカーの抽出法及び測定法の性能を向上させることが認められている。本発明の試薬は、分析に有用で、利用可能なマーカーをより生産し、より低い濃度で使用することができる。本抽出試薬は、主に水性にすることができ、塩及び／又はｐＨ緩衝剤を含むこともできる。一部の実施形態において、試薬を、イムノアッセイで抗原抗体複合体の構成体と適合性を持つｐＨで緩衝することができる。例えば、ｐＨを６．５〜８．５とすることができる。一部の実施形態において、ｐＨを７．０〜８．０とすることができる。代わりに、試料を、例えば、透析、限外ろ過、ゲルろ過及び当技術分野において周知のその他の方法を通した検出ステップの前に、緩衝液交換することができる。
【００１８】
本発明の一部の実施形態において、クリプトスポリジウムオーシストを含むことが疑われる試料を、例えば、Ｌａｕｒｅｔｈ−１２などの前述の非イオン性アルカリポリオキシエチレン洗浄剤を含む緩衝液に接触させることが可能で、この場合、接触は微生物マーカーを可溶化するのに十分な時間、高温で実施する。特定の実施形態では、７５℃を超える温度で接触を実施する。他の実施形態では、接触を９５℃又は１００℃を超える温度で実施したあと、可溶化した物質で、クリプトスポリジウム試験用試薬を使用して、クリプトスポリジウムマーカーの検出を行う。
【００１９】
試料を抽出試薬に接触させる前及び／又は検出ステップの前に、本発明の抽出法は、クリプトスポリジウムオーシストを含むことが疑われる試料を、例えば、ろ過又は遠心によって濃縮することを含むことができる。また、遠心又はろ過を、可溶化後、しかし可溶化したマーカーの検出前に、粒状の細片を取り除くために使用してもよい。
【００２０】
抽出したマーカーの測定は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、核酸増幅アッセイ、細胞培養アッセイ、凝集検査、イムノアッセイ（又は当該マーカーの特異的な結合パートナーの使用に基づくその他のアッセイ形式）、免疫クロマトグラフィーアッセイ、酵素アッセイなどを含むがこれに限定されない、生物検定の技術分野で利用できる多数の技術のいずれかによって実施することができる。様々な実施形態において、検出法を、例えば、イムノアッセイなどの結合アッセイとすることが可能であり、この検出ステップは、当該のマーカーに特異的に結合することが可能な１種又は複数の検出分子とアッセイ組成物を接触させることによって実施することができる。特定の実施形態において、アッセイはサンドイッチアッセイ又は競合結合アッセイ形式を使用する。試験紙で実施するサンドイッチイムノアッセイの例は、米国特許番号第４，１６８，１４６号（Ｇｒｕｂｂら）及び米国特許番号第４，３６６，２４１号（Ｔｏｍら）に記載されており、これらは本願明細書に援用する。本発明の使用に適した競合イムノアッセイ装置の例は、米国特許番号第４，２３５，６０１号（Ｄｅｕｔｓｃｈら）、米国特許番号第４，４４２，２０４号（Ｌｉｏｔｔａ）及び米国特許番号第５，２０８，５３５号（Ｂｕｅｃｈｌｅｒら）によって開示される装置を含み、それぞれ本願明細書に援用する。一部の実施形態では、そのようなアッセイに用いられる結合試薬のうちの少なくとも１種は、固相担体上で固定することができる。本発明の一部の実施形態では、この病原菌検出を電気化学発光（ＥＣＬ）標識抗体によるイムノアッセイを使用することによってさらに改善することができる。
【００２１】
本発明の特定の実施形態に従って、試料に本発明の抽出法を行い、その後、例えば、ＥＣＬイムノアッセイなどのＥＣＬアッセイ形式を使用してマーカーの測定を実施することができる。ＥＣＬの高い感受性、広いダイナミックレンジ及び選択性は、医学的診断目的にとって有用である。市販のＥＣＬ器具は、複合試料基質に対する優れた感受性、ダイナミックレンジ、精度及び許容性など、様々な理由により広く使用されるようになっている。
【００２２】
様々な実施形態において、マーカーを、ＥＣＬ検出を使用した固相サンドイッチイムノアッセイで測定することができる。固相サンドイッチイムノアッセイでは、マーカーに対してｉ）固相に（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用などの特定の結合対の形成を通して）結びつくことができるか、結びつく能力がある捕捉抗体、及びｉｉ）ＥＣＬ標識などの標識に（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用などの特定の結合対の形成を通して）結びつくことができるか、結びつく能力がある検出抗体の２種の抗体を使用することができる。マーカーの存在下で、２種の抗体をマーカーに結合させて、標識を含む固相上で「サンドイッチ複合体」を形成させることができるように、可溶化マーカーを含む試料を、２種の抗体及び固相と接触させることができる。固相上の標識を、試料内のマーカー測定の代用として、測定することができる。
【００２３】
特定の市販の器具類は、永続的で再使用可能なフローセルによる、フローセルに基づいた設計を使用している。これらの器具の種類で実施される大部分の結合アッセイは、固相結合アッセイのための固相担体として、磁気反応性の粒子を使用している。この粒子に結合するＥＣＬ標識を含む免疫複合体を、磁石を用いてフローセルの電極上で収集することができる。収集した粒子上の標識を、電極に電圧をかけることによって、ＥＣＬを放出するように誘発することが可能で、標識量測定の代用として、ＥＣＬを測定することができる。また、ＥＣＬアッセイ法は、ＥＣＬを誘発する電圧をかける前に、ＥＣＬ共反応物を導入するステップを含むことができる。
【００２４】
最近、ＥＣＬ器具使用について、ＥＣＬを誘発するために使用される電極上に固定した試薬を使用することが述べられている（参照、米国特許番号第６，１４０，０４５号、同第６，０６６，４４８号、同第６，０９０，５４５号、同第６，２０７，３６９号及び発行ＰＣＴ出願番号第Ｗ０９８／１２５３９号）。この場合、電極自体が固相担体となる。また、そのようなＥＣＬ測定に適した電極が組み込まれたマルチウェルプレートも、最近開示されている（例えば、出願中の米国出願番号第１０／１８５，２７４号及び同第１０／１８５，３６３号を参照（表題「アッセイプレート、リーダーシステム及び発光試験測定法（Assay Plates, Reader Systems and Methods for Luminescence Test Measurements）」、それぞれ２００２年６月２８日に出願された。これらは、この参照により開示に含まれる）。これらの電極が組み込まれたマルチウェルプレートは、ウェル内に複数のアッセイドメインを有するプレートを含むことが可能で、複数の結合試薬を固定化することができる。マルチウェルアッセイプレートを使用することにより、プレートのマルチウェル内に分散させた複数の試料の並行した加工及び分析が可能となる。
【００２５】
本発明の特定の実施形態は、イムノアッセイでのＥＣＬ標識、及びＥＣＬ標識抗体などのＥＣＬ標識を含む標識試薬を使用する。現時点で、分析的測定のための多くのＥＣＬ標識が市販されている。ＥＣＬ標識、共試薬、並びに検出又は測定の方法及びシステムは、例えば、米国特許番号第５，０９３，２６８号、同第５，１４７，８０６号、同第５，３２４，４５７号、同第５，５９１，５８１号、同第５，５９７，９１０号、同第５，６４１，６２３号、同第５，６４３，７１３号、同第５，６７９，５１９号、同第５，７０５，４０２号、同第５，８４６，４８５号、同第５，８６６，４３４号、同第５，７８６，１４１号、同第５，７３１，１４７号、同第６，０６６，４４８号、同第６，１３６，２６８号、同第５，７７６，６７２号、同第５，３０８，７５４号、同第５，２４０，８６３号、同第６，２０７，３６９号及び同第５，５８９，１３６号、並びにＰＣＴ出願番号第ＷＯ９９／６３３４７号、同第Ｗ０００／０３２３３号、同第ＷＯ９９／５８９６２号、同第ＷＯ９９／３２６６２号、同第Ｗ０９９／１４５９９号、同第Ｗ０９８／１２５３９号、同第Ｗ０９７／３６９３１号、同第Ｗ０９８／５７１５４号、並びにＰＣＴ／ＵＳＯ２／１９７８８に記載されており、これらすべてを本願明細書に援用する。本発明に有用なＥＣＬ標識の例は、ｉ）金属が、トリスビピリジルルテニウム（ＲｕＢｐｙ）などのＲｕ含有有機金属化合物及びＯｓ含有有機金属化合物を含むＶＩＩＩ群の貴金属に由来する、有機金属化合物、並びにｉｉ）ルミノール及び関連の化合物を含む。
【００２６】
ＥＣＬステップでＥＣＬ標識に関与する種を、本明細書ではＥＣＬ共反応物と呼ぶ。一般に使用されるＥＣＬ共反応物は、第３級アミン（例えば、米国特許番号第５，８４６，４８５号参照。本記載を本願明細書に援用する）、シュウ酸塩、ＲｕＢｐｙ由来のＥＣＬのための過硫酸塩及びルミノール由来のＥＣＬのための過酸化水素（例えば、米国特許番号第５，２４０，８６３号参照。本記載を本願明細書に援用する）を含む。さらに、ＥＣＬ標識によって発生した光を、診断におけるレポーターシグナルとして使用することができる（米国特許番号第５，２３８，８０８号（Ｂａｒｄら）参照。本記載を本願明細書に援用する）。例えば、ＥＣＬ標識を、抗体などの結合試薬に共有結合させることが可能であり、結合相互作用における結合試薬の関与は、ＥＣＬ標識から放出されるＥＣＬを測定することによって監視することができる。
【実施例】
【００２７】
ＩＶ．実施例
以下の実施例は、本発明の範囲内に入る抽出、プレート、キット及び方法の一部を例証する。もちろん、これらはいかなる形であれ本発明を制限するものと考慮されない。過度の実験なしに当業者によって、本発明に関する数多くの変更及び改造を行うことが可能である。
【００２８】
材料及び方法
試験試料：
クリプトスポリジウムオーシストは、Ｐｌｅａｓａｎｔ  Ｈｉｌｌ  Ｆａｒｍｓから購入し、分析前にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）で所望の濃度に希釈した。
【００２９】
抽出：
一連の抽出試薬を比較した。それぞれが、０．０６％Ｌａｕｒｅｔｈ−１２、０．０３％Ｌａｕｒｅｔｈ−１２、２％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）、０．５％ＳＤＳ又は０．２５％ＳＤＳのいずれかで補われたＰＢＳから成っていた。抽出試薬を、被験試料と１：１の比で混合して、０．０３％Ｌａｕｒｅｔｈ−１２、０．０１５％Ｌａｕｒｅｔｈ−１２、１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）、０．２５％ＳＤＳ又は０．１２５％ＳＤＳの最終濃度にし、１００℃で６０分間培養した。
【００３０】
試料を１３，０００ｒｃｆで１０分間遠心して細片を取り除き、分析のために一定分量５００μＬを使用した。また、ＳＤＳ含有試料を１０％ＢＳＡ又は５％ＢＳＡで処理して、洗浄剤の分析に及ぼす影響を排除した。
【００３１】
（実施例１）
試料調製の有効性を、クリプトスポリジウムに対するＥＣＬサンドイッチイムノアッセイによって検査した（キットとしてＢｉｏｖｅｒｉｓ社から入手可能なＰＡＴＨ／ＧＥＮ（登録商標）クリプトスポリジウムパルバム試験）。このアッセイは、ビオチン標識捕捉抗体、及びルテニウム（ＩＩ）−トリス−ビピリジンの誘導体であるＢＶ―ＴＡＧ（登録商標）ＮＨＳエステル（Ｂｉｏｖｅｒｉｓ社）で標識した検出抗体を使用した。試料を、あらかじめストレプトアビジンでコーティングした磁気反応性ビーズに結合させたＴＡＧ標識抗体及びビオチン抗体と合わせ、さらに培養してビーズ上にサンドイッチ複合体を形成させた。得られたビーズ懸濁液を、ＯＲＩＧＥＮ（登録商標）分析器（ＩＧＥＮインターナショナル）及びＥＣＬ検出によって分析した。
【００３２】
表１〜３に示した結果は、非イオン性洗浄剤Ｌａｕｒｅｔｈ−１２が、両性イオン性洗浄剤Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）及びイオン性洗浄剤ＳＤＳと比べて、より低い濃度の洗浄剤で、より優れた抽出効率をもたらすことを実証している。ＥＣＬは生の電気化学発光シグナルであり、Ｓ／ＢＧはバックグラウンド比に対するシグナルである（すなわち、可溶化卵母細胞の存在下及び不在下でのシグナル比である）。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【国際調査報告】
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