(57)【要約】  本発明は、ＣＢ１受容体の不活性化によって肝臓損傷や肝臓疾患に係る肝臓の線維形成を減少させることの発見に基づき、肝臓疾患の治療、好ましくは肝線維症に至る肝臓疾患の治療のための種々の方法や組成物を提供することを目的としている。このため、本発明は、肝臓病治療用の組成物を調製するためのＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用、より好ましくは、Ｎ−ピペリジノ−５−（４−クロロフェニル）−１−（２，４−ジクロロフェニル）−４−メチルピラゾール−３−カルボキサミドの使用する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓病治療のための組成物の製造におけるＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
【請求項２】
前記ＣＢ１受容体のアンタゴニストは、特異性のあるＣＢ１受容体アンタゴニストであることを特徴とする請求項１に記載のＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
【請求項３】
前記肝臓病は、肝線維症に至るものであることを特徴とする請求項１または請求項２に記載のＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
【請求項４】
前記肝臓病は、アルコール肝硬変であることを特徴とする請求項１〜請求項３に記載のＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
【請求項５】
前記肝臓病は、慢性ウイルス性肝炎であることを特徴とする請求項１〜請求項３に記載のＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
【請求項６】
前記肝臓病は、非アルコール性脂肪性肝炎であることを特徴とする請求項１〜請求項３に記載のＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
【請求項７】
前記肝臓病は、原発性肝癌であることを特徴とする請求項１〜請求項３に記載のＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
【請求項８】
前記アンタゴニストは、式ＩＩの化合物、あるいはその薬学的に良好な塩の一つであることを特徴とする請求項１〜請求項７に記載のＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
【数１】
2007527893.tif 000009
式中、ｇ２、ｇ３、ｇ４、ｇ５、ｇ６およびｗ２、ｗ３、ｗ４、ｗ５、ｗ６は、同一でも異なってもよく、それらは、それぞれ独立して水素、塩素、若しくは臭素原子、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、トリフロロメチル、またはニトロ基であり、ｇ４は、任意のフェニル基であり；Ｒ４は、水素または（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；Ｘは、直結合あるいは、基−（ＣＨ２）ｘ−Ｎ（Ｒ３）−であり（Ｒ３は、水素または（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり、ｘは、０または１である）；Ｒは：基−ＮＲ１Ｒ２（Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルである）；任意に置換された非芳香族（Ｃ３−Ｃ１5）炭素環基（この置換は置換カルボニル以外である）；アミノ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基（前記アミノは任意に（Ｃ１−Ｃ３）アルキルで二置換されたものである）；シクロアルキル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル（前記シクロアルキルはＣ３−Ｃ１2である）；非置換またはハロゲンや（Ｃ１−Ｃ５）アルキルや（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシで単一置換または多置換されたフェニル；フェニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル；ジフェニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル；ナフチル；アンスラセニル（ａｎｔｈｒａｃｅｎｙｌ）；非置換または（Ｃ１−Ｃ３）アルキルやヒドロキシルやベンジルで置換された飽和の５員から８員の複素環基；１−アダマンチルメチル（ａｄａｍａｎｔｙｌｍｅｔｈｙｌ）；非置換またはハロゲンや（Ｃ１−Ｃ５）アルキルや（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシで単一置換または多置換される芳香族複素環；非置換またはハロゲンや（Ｃ１−Ｃ５）アルキルや（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシで単一置換もしくは多置換された芳香族複素環で置換された（Ｃ１−Ｃ３）アルキル；あるいは、Ｒ１は水素であり、Ｒ２は上記記載の通りであり；あるいは、Ｒ１およびＲ２は、それらが結合している窒素原子を有する飽和の５員から８員の複素環基を形成し（前記複素環基は、ｗ２、ｗ３、ｗ４、ｗ５、ｗ６、ｇ２、ｇ３、ｇ４、ｇ５、ｇ６が全て水素の場合には、モルホリン以外である）；Ｘが−（ＣＨ２）ｘＮ（Ｒ３）−の場合には上記のＲ２基；Ｘが直接結合の場合にはＲ５基（Ｒ５は、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル）である）；非置換または（Ｃ１−Ｃ５）アルキルで置換された（Ｃ３−Ｃ１2）シクロアルキル；非置換またはハロゲンまたは（Ｃ１−Ｃ５）アルキルで置換されたフェニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル；シクロアルキル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル（前記シクロアルキルは、Ｃ３−Ｃ１2であり、非置換または（Ｃ１−Ｃ５）アルキルで置換されている）；あるいは、２−ノルボルニルメチルである。
【請求項９】
前記アンタゴニストは、Ｎ−ピペリドノ（ｐｉｐｅｒｉｄｏｎｏ）−３−ピラゾールカルボキサミド、あるいはその薬学的に良好な塩の一つであることを特徴とする請求項１〜請求項７に記載のＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
【請求項１０】
前記アンタゴニストは、Ｎ−ピペリジノ−５−（４−ブロモフェニル）−１−（２，４−ジクロロフェニル）−４−エチルピラゾール−３−カルボキサミド、あるいはその薬学的に良好な塩の一つであることを特徴とする請求項１〜請求項７に記載のＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
【請求項１１】
前記アンタゴニストは、Ｎ−ピペリジノ−５−（４−クロロフェニル）−１−（２，４−ジクロロフェニル）−４−メチルピラゾール−３−カルボキサミド、あるいはその薬学的に良好な塩の一つであることを特徴とする請求項１〜請求項７に記載のＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
【請求項１２】
前記ＣＢ１受容体は、 
ａ）ＴＨＣを結合可能で細胞シグナルを変換可能なＧタンパク質共役細胞受容体の生物学的機能を有する、配列番号１からなるアミノ酸配列または配列番号１の一部からなるアミノ酸配列を有するタンパク質と、
ｂ）ＴＨＣを結合可能で細胞シグナルを変換可能なＧタンパク質共役細胞受容体の生物学的機能を有する、配列番号２からなるアミノ酸配列または配列番号２の一部からなるアミノ酸配列を有するタンパク質と、
ｃ）ＴＨＣを結合可能で細胞シグナルを変換可能なＧタンパク質共役細胞受容体の生物学的機能を有する、配列番号１または２からなるアミノ酸配列を有するタンパク質の対立遺伝子と、
ｄ）２００位でフェニルアラニンからロイシンへ置換、および／または２１６位でイソロイシンからバリンへ置換、および／または２４６位でバリンからアラニンへ置換された、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質と、
ｅ）１３９位でフェニルアラニンからロイシンへ置換、および／または１５５位でイソロイシンからバリンへ置換、および／または１８５位でバリンからアラニンへ置換された、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質と、
ｆ）ＴＨＣを結合可能で細胞シグナルを変換可能なＧタンパク質共役細胞受容体の生物学的機能を有する、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８、配列番号９のアミノ酸配列、またはこれらと８０％相同であるアミノ酸配列を有するタンパク質と、からなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜請求項１１に記載のＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
【請求項１３】
前記ＣＢ１受容体は、アミノ酸レベルで配列番号１と少なくとも４５％の相同性を有するタンパク質であって、このタンパク質は、ＴＨＣを結合可能で細胞シグナルを変換可能なＧタンパク質共役細胞受容体の生物学的機能を有することを特徴とする請求項１〜請求項１１に記載のＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
【請求項１４】
前記相同性は、少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、もっと好ましくは９５％であることを特徴とする請求項１３に記載のＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
【請求項１５】
前記ＣＢ１受容体アンタゴニストの日常的投薬量は、０．０１ｍｇ〜５００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ〜１００ｍｇであることを特徴とする請求項１〜請求項１４に記載のＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
【請求項１６】
ＣＢ１受容体のダウンレギュレーションまたは抑制による肝臓病治療用の組成物を調製するための、配列番号１、配列番号２、配列番号１の一部、配列番号２の一部からなるタンパク質をコードする核酸配列の使用。
【請求項１７】
哺乳類の肝臓病を治療するに有効な量のＣＢ１受容体のアンタゴニストをそれが必要な哺乳類に投与することからなる肝臓病治療方法。
【請求項１８】
前記アンタゴニストは、式ＩＩの化合物、あるいはその薬学的に良好な塩の一つであることを特徴とする請求項１７に記載の肝臓病治療方法。
【数２】
2007527893.tif 000010
式中、ｇ２、ｇ３、ｇ４、ｇ５、ｇ６およびｗ２、ｗ３、ｗ４、ｗ５、ｗ６は、同一でも異なってもよく、それらは、それぞれ独立して水素、塩素、若しくは臭素原子、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、トリフロロメチル、またはニトロ基であり、ｇ４は、任意のフェニル基であり；Ｒ４は、水素または（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；Ｘは、直結合あるいは、基−（ＣＨ２）ｘ−Ｎ（Ｒ３）−であり（Ｒ３は、水素または（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり、ｘは、０または１である）；Ｒは：基−ＮＲ１Ｒ２（Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルである）；任意に置換された非芳香族（Ｃ３−Ｃ１5）炭素環基（この置換は置換カルボニル以外である）；アミノ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基（前記アミノは任意に（Ｃ１−Ｃ３）アルキルで二置換されたものである）；シクロアルキル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル（前記シクロアルキルはＣ３−Ｃ１2である）；非置換またはハロゲンや（Ｃ１−Ｃ５）アルキルや（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシで単一置換または多置換されたフェニル；フェニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル；ジフェニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル；ナフチル；アンスラセニル（ａｎｔｈｒａｃｅｎｙｌ）；非置換または（Ｃ１−Ｃ３）アルキルやヒドロキシルやベンジルで置換された飽和の５員から８員の複素環基；１−アダマンチルメチル（ａｄａｍａｎｔｙｌｍｅｔｈｙｌ）；非置換またはハロゲンや（Ｃ１−Ｃ５）アルキルや（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシで単一置換または多置換される芳香族複素環；非置換またはハロゲンや（Ｃ１−Ｃ５）アルキルや（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシで単一置換もしくは多置換された芳香族複素環で置換された（Ｃ１−Ｃ３）アルキル；あるいは、Ｒ１は水素であり、Ｒ２は上記記載の通りであり；あるいは、Ｒ１およびＲ２は、それらが結合している窒素原子を有する飽和の５員から８員の複素環基を形成し（前記複素環基は、ｗ２、ｗ３、ｗ４、ｗ５、ｗ６、ｇ２、ｇ３、ｇ４、ｇ５、ｇ６が全て水素の場合には、モルホリン以外である）；Ｘが−（ＣＨ２）ｘＮ（Ｒ３）−の場合には上記のＲ２基；Ｘが直接結合の場合にはＲ５基（Ｒ５は、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル）である）；非置換または（Ｃ１−Ｃ５）アルキルで置換された（Ｃ３−Ｃ１2）シクロアルキル；非置換またはハロゲンまたは（Ｃ１−Ｃ５）アルキルで置換されたフェニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル；シクロアルキル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル（前記シクロアルキルは、Ｃ３−Ｃ１2であり、非置換または（Ｃ１−Ｃ５）アルキルで置換されている）；あるいは、２−ノルボルニルメチルである。
【請求項１９】
前記ＣＢ１受容体アンタゴニストは、Ｎ−ピペリドノ（ｐｉｐｅｒｉｄｏｎｏ）−３−ピラゾールカルボキサミド、あるいはその薬学的に良好な塩の一つであることを特徴とする請求項１７に記載の肝臓病治療方法。
【請求項２０】
前記ＣＢ１受容体アンタゴニストは、Ｎ−ピペリジノ−５−（４−ブロモフェニル）−１−（２，４−ジクロロフェニル）−４−エチルピラゾール−３−カルボキサミド、あるいはその薬学的に良好な塩の一つであることを特徴とする請求項１７に記載の肝臓病治療方法。
【請求項２１】
前記ＣＢ１受容体アンタゴニストは、Ｎ−ピペリジノ−５−（４−クロロフェニル）−１−（２，４−ジクロロフェニル）−４−メチルピラゾール−３−カルボキサミド、あるいはその薬学的に良好な塩の一つであることを特徴とする請求項１７に記載の肝臓病治療方法。
【請求項２２】
前記肝臓病は、肝臓線維症であることを特徴とする請求項１７〜請求項２１に記載の肝臓病治療方法。
【請求項２３】
前記肝臓病は、アルコール肝硬変であることを特徴とする請求項１７〜請求項２１に記載の肝臓病治療方法。
【請求項２４】
前記肝臓病は、慢性ウイルス性肝炎であることを特徴とする請求項１７〜請求項２１に記載の肝臓病治療方法。
【請求項２５】
前記肝臓病は、非アルコール性脂肪性肝炎であることを特徴とする請求項１７〜請求項２１に記載の肝臓病治療方法。
【請求項２６】
前記肝臓病は、原発性肝癌であることを特徴とする請求項１７〜請求項２１に記載の肝臓病治療方法。
【請求項２７】
前記ＣＢ１受容体アンタゴニストの日常的投薬量は、０．０１ｍｇ〜５００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ〜１００ｍｇであることを特徴とする請求項１７〜請求項２６に記載の肝臓病治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓病の治療に有効な組成物を製造するためのＣＢ１受容体のアンタゴニストの新たな使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
肝線維症は、慢性肝臓損傷に対する共通反応結果であって、究極的には、肝硬変症、その合併症、門脈圧亢進症、肝不全、肝細胞癌に至るものである。線維形成の経過は、マトリックス劣化の抑制体や線維形成成分を合成する肝臓筋線維芽細胞の強増殖および蓄積と連続している（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，  Ｓ．  Ｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５，２２４７−５０（２０００））。
【０００３】
大麻（Ｃａｎｎａｂｉｓ  Ｓａｔｉｖａ）は６０以上の化合物を含有しており、そのうち最も有効な成分は、（−）Δ９−テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）である。内因性の天然カンナビノイドは、アナンダミド（ａｎａｎｄａｍｉｄｅ）、２−アラキドニルグリセロールとして特徴づけられており、これはアラキドン酸誘導脂質である（Ｐｉｏｍｅｌｌｉ，  Ｄ  ｅｔ  ａｌ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  ２１，２１８−２４（２０００））。カンナビノイドは、等しくＴＨＣを結合する２つのＧタンパク質結合受容体（ＣＢ１およびＣＢ２）に結合する（Ｐｅｒｔｗｅｅ，  Ｒ．  Ｇ．，Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ６，  ６３５−６４（１９９９））。ＣＢ１は、二つの既知のカンナビノイド細胞受容体の一つである。Ｇタンパク質結合膜貫通受容体であるこの受容体は、脳や血管で発現し（Ｐｅｒｔｗｅｅ，  Ｒ．  Ｇ．，  Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ６，６３５−６４（１９９９））、肝細胞では発現しない（Ｇｕｚｍａｎ，  Ｍ  ＆  Ｓａｎｃｈｅｚ，  Ｃ．，  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６５，  ６５７−６４（１９９９））ものとして知られている。ＣＢ１は、大麻の精神活性作用を伝達する。これに対し、ＣＢ２受容体は、主に免疫系で発現するものであって、精神活性作用を有していない（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，  Ｓ．  Ｌ．，  ＪＢｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５，２２４７−５０（２０００））。カンナビノイドは、これらの精神活性作用に加え、鎮痛作用、制吐作用、食欲促進中枢効果をもたらす（Ｈａｒｒｏｌｄ，  Ｊ．  Ａ．  ＆  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｇ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｎｕｔｒ  ９０，７２９−３４（２００３））。さらに、カンナビノイドは、抗炎症作用、血管緊張低下作用ももたらす（Ｋｕｍａｒ，  Ｒ．  Ｎ．，  Ｃｈａｍｂｅｒｓ，  Ｗ．  Ａ．  ＆  Ｐｅｒｔｗｅｅ．，  Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉａ  ５６，１０５９−６８（２００１））。いくつかの研究により、カンナビノイドは、神経膠腫や皮膚腫瘍を含む様々なタイプの実験腫瘍を退行させる能力があることから、潜在的な抗腫瘍の薬剤となりうることが示された。この抗腫瘍作用は、その抗増殖性やアポトーシス性質を主な原因とするものである（Ｂｉｆｕｌｃｏ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆａｓｅｂ  Ｊ２９，  ２９（２００１）、Ｃａｓａｎｏｖａ，  Ｍ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１１，  ４３−５０（２００３）、Ｓａｎｃｈｅｚ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１，５７８４−９（２００１））。
【０００４】
カンナビノイドの肝臓作用に関するデータは、数少ない。ＣＢ１およびＣＢ２受容体は、肝細胞には発現しない（Ｇｕｚｍａｎ，  Ｍ．  ＆  Ｓａｎｃｈｅｚ，  Ｃ．  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６５，６５７−６４（１９９９））。しかし、ＣＢ１受容体は、肝動脈から分離した内皮細胞に存在するのであって、肝硬変の際にその発現が増加する（Ｂａｔｋａｉ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ７，８２７−３２．（２００１））。
【０００５】
２つのＣＢ１受容体のイソフォームは、それらのリガンドの親和性が異なった、長いイソ型（配列番号１に対応する）と、スプライスバリアントに相当するＮＨ２末端部で切断された短いイソ型（配列番号２に対応する）とに分離されている（Ｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＪＢｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，（１９９５）、  Ｒｉｎａｌｄｉ−Ｃａｒｍｏｎａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ（１９９６））。ＣＢ１受容体遺伝子のコード領域において５つの一塩基変異多型が存在している。これらのうち、３つのみがＣＢ１受容体への単一アミノ酸変化に至った（配列番号１において、２００位でフェニルアラニンからロイシンに置換、２１６位でイソロイシンからバリンに置換、２４６位でバリンからアラニンに置換）（および配列番号２の対応する位置で置換）。脊椎動物で強力に保存されるものの他のカンナビノイド受容体では現れないＣＢ１受容体の７ドメイン共通配列が存在する（Ａｔｔｗｏｏｄ，  Ｔ．  Ｋ．  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｌａｙ，  Ｊ．  Ｂ．  Ｃ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ７（２）  １９５−２０３（１９９４）、  Ａｔｔｗｏｏｄ，  Ｔ．  Ｋ．  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｌａｙ，  Ｊ．  Ｂ．  Ｃ．，  ７ＴＭ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ２  Ｅｄｓ  Ｇ．  Ｖｒｉｅｎｄ  ａｎｄ  Ｂ．  Ｂｙｗａｔｅｒ，（１９９３）、  Ｂｉｒｎｂａｕｍｅｒ，  Ｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ，  ３０，６７５−７０５（１９９０）、  Ｃａｓｅｙ，  Ｐ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ，  Ａ．  Ｇ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６３  （６）  ２５７７−２５８０（１９８８）、  ５．  Ａｔｔｗｏｏｄ，  Ｔ．  Ｋ．  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｌａｙ，  Ｊ．  Ｂ．  Ｃ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ６（２）  １６７−１７６（１９９３）、  Ｗａｔｓｏｎ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ａｒｋｉｎｓａｌｌ，  Ｓ，  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ，  １９９４，  ＰＰ  ８０−８３）。この共通アミノ酸配列は、配列番号３から配列番号９の７つの蛋白質ドメインからなる。
【０００６】
リバース（インバース）アゴニストを含むＣＢ１受容体のアンタゴニストは、上記のように説明されてきた。このアンタゴニストには、ＷＯ０３／０７７８４７に記載の置換アミド、ＷＯ０３／０８７０３７に記載の置換アリールアミド、ＷＯ０３／０６３７８１に記載の置換イミダゾール、ＷＯ０３／０８６２８８に記載の二環式アミド、ＷＯ０３／０８４９４３に記載のテルフェニル誘導体、ＥＰ−Ｂ−６５６３５４に記載のＮ−ピペリドノ（ｐｉｐｅｒｉｄｏｎｏ）−３−ピラゾールカルボキサミドおよびＮ−ピペリジノ−５−（４−クロロフェニル）−１−（２，４−ジクロロフェニル）−４−メチルピラゾール−３−カルボキサミド、ＵＳ５５９６１０６およびＵＳ５７４７５２４にそれぞれ記載のアリール−ベンゾ［ｂ］チオフェンおよびベンゾ［ｂ］フラン化合物、ＦＲ２８０５８１７に記載のアゼチジン誘導体、ＦＲ２８０５８１０に記載の３−アミノ−アゼチジン、ＦＲ２８０５８１８に記載の３−置換あるいは３，３−二置換の１−（ジ−（（ヘテロ）アリール）−メチル）−アゼチジン誘導体が含まれる。これらの文献は、参照することにより本明細書に組み込まれる。その他のアンタゴニスト、例えばＡＭ２５１として知られるＮ−（ピペリジン（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ）−１−イル）−１−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−ヨードフェニル）−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボキサミド、あるいはＬＹ−３２０１３５として知られる化合物は市場を通じて入手可能である。
【０００７】
これらのＣＢ１受容体のアンタゴニストは、性的機能不全（ＷＯ０３／０８２２５６）、下痢（ＷＯ０１／８５０９２）、あるいはニューロ−炎症性疾患、薬物乱用障害、肥満症、喘息、便秘（ＷＯ０３／０７７８４７）の治療に用いられることが知られている。
【０００８】
文献ＵＳ５，９３９，４２９、ＷＯ０３／０７７８４７、ＷＯ０３／０８４９３０、ＷＯ０３／０８４９４３、ＷＯ０３／０６３７８１、ＷＯ０３／０８７０３７は、ＣＢ１受容体のアンタゴニストが硬変門脈圧亢進症を有するラットの全身血行動態変化を後退させることを開示している。
【０００９】
【特許文献１】ＵＳ５，９３９，４２９公報
【特許文献２】ＷＯ０３／０７７８４７公報
【特許文献３】ＷＯ０３／０８４９３０公報
【特許文献４】ＷＯ０３／０８４９４３公報
【特許文献５】ＷＯ０３／０６３７８１公報
【特許文献６】ＷＯ０３／０８７０３７公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、これらの文献は、ＣＢ１アンタゴニストがあらゆる病因（アルコール中毒性、ウイルス性、有毒性）による肝臓疾患における線維形成を減少させることは開示していない。さらに、非アルコール性脂肪性肝炎および肝臓発癌におけるＣＢ１受容体の関与やＣＢ１アンタゴニストの効果も知られていない。
【００１１】
発明者は、驚くべきことに、ＣＢ１アンタゴニストには強力な肝臓の抗線維形成性質があり、これは肝臓疾患の治療、好ましくは肝線維症に至る肝臓疾患の治療に用いることができることを証明した。
【００１２】
そこで本発明は、ＣＢ１受容体の不活性化によって肝臓損傷や肝臓疾患に係る肝臓の線維形成を減少させることの発見に基づき、肝臓疾患の治療、好ましくは肝線維症に至る肝臓疾患の治療のための種々の方法や組成物を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
そこで、本発明は、以下に関するものである。 
請求項１：肝臓病治療のための組成物の製造におけるＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
請求項２：前記ＣＢ１受容体のアンタゴニストは、特異性のあるＣＢ１受容体アンタゴニストであることを特徴とする請求項１に記載のＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
請求項３：前記肝臓病は、肝線維症に至るものであることを特徴とする請求項１または請求項２に記載のＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
請求項４：前記肝臓病は、アルコール肝硬変であることを特徴とする請求項１〜請求項３に記載のＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
請求項５：前記肝臓病は、慢性ウイルス性肝炎であることを特徴とする請求項１〜請求項３に記載のＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
請求項６：前記肝臓病は、非アルコール性脂肪性肝炎であることを特徴とする請求項１〜請求項３に記載のＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
請求項７：前記肝臓病は、原発性肝癌であることを特徴とする請求項１〜請求項３に記載のＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
請求項８：前記アンタゴニストは、式ＩＩの化合物、あるいはその薬学的に良好な塩の一つであることを特徴とする請求項１〜請求項７に記載のＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
【数１】
2007527893.tif 000002
式中、ｇ２、ｇ３、ｇ４、ｇ５、ｇ６およびｗ２、ｗ３、ｗ４、ｗ５、ｗ６は、同一でも異なってもよく、それらは、それぞれ独立して水素、塩素、若しくは臭素原子、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、トリフロロメチル、またはニトロ基であり、ｇ４は、任意のフェニル基であり；Ｒ４は、水素または（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；Ｘは、直結合あるいは、基−（ＣＨ２）ｘ−Ｎ（Ｒ３）−であり（Ｒ３は、水素または（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり、ｘは、０または１である）；Ｒは：基−ＮＲ１Ｒ２（Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルである）；任意に置換された非芳香族（Ｃ３−Ｃ１5）炭素環基（この置換は置換カルボニル以外である）；アミノ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基（前記アミノは任意に（Ｃ１−Ｃ３）アルキルで二置換されたものである）；シクロアルキル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル（前記シクロアルキルはＣ３−Ｃ１2である）；非置換またはハロゲンや（Ｃ１−Ｃ５）アルキルや（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシで単一置換または多置換されたフェニル；フェニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル；ジフェニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル；ナフチル；アンスラセニル（ａｎｔｈｒａｃｅｎｙｌ）；非置換または（Ｃ１−Ｃ３）アルキルやヒドロキシルやベンジルで置換された飽和の５員から８員の複素環基；１−アダマンチルメチル（ａｄａｍａｎｔｙｌｍｅｔｈｙｌ）；非置換またはハロゲンや（Ｃ１−Ｃ５）アルキルや（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシで単一置換または多置換される芳香族複素環；非置換またはハロゲンや（Ｃ１−Ｃ５）アルキルや（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシで単一置換もしくは多置換された芳香族複素環で置換された（Ｃ１−Ｃ３）アルキル；あるいは、Ｒ１は水素であり、Ｒ２は上記記載の通りであり；あるいは、Ｒ１およびＲ２は、それらが結合している窒素原子を有する飽和の５員から８員の複素環基を形成し（前記複素環基は、ｗ２、ｗ３、ｗ４、ｗ５、ｗ６、ｇ２、ｇ３、ｇ４、ｇ５、ｇ６が全て水素の場合には、モルホリン以外である）；Ｘが−（ＣＨ２）ｘＮ（Ｒ３）−の場合には上記のＲ２基；Ｘが直接結合の場合にはＲ５基（Ｒ５は、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル）である）；非置換または（Ｃ１−Ｃ５）アルキルで置換された（Ｃ３−Ｃ１2）シクロアルキル；非置換またはハロゲンまたは（Ｃ１−Ｃ５）アルキルで置換されたフェニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル；シクロアルキル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル（前記シクロアルキルは、Ｃ３−Ｃ１2であり、非置換または（Ｃ１−Ｃ５）アルキルで置換されている）；あるいは、２−ノルボルニルメチルである。
請求項９：前記アンタゴニストは、Ｎ−ピペリドノ（ｐｉｐｅｒｉｄｏｎｏ）−３−ピラゾールカルボキサミド、あるいはその薬学的に良好な塩の一つであることを特徴とする請求項１〜請求項７に記載のＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
請求項１０：前記アンタゴニストは、Ｎ−ピペリジノ−５−（４−ブロモフェニル）−１−（２，４−ジクロロフェニル）−４−エチルピラゾール−３−カルボキサミド、あるいはその薬学的に良好な塩の一つであることを特徴とする請求項１〜請求項７に記載のＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
請求項１１：前記アンタゴニストは、Ｎ−ピペリジノ−５−（４−クロロフェニル）−１−（２，４−ジクロロフェニル）−４−メチルピラゾール−３−カルボキサミド、あるいはその薬学的に良好な塩の一つであることを特徴とする請求項１〜請求項７に記載のＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
請求項１２：前記ＣＢ１受容体は、
ａ）ＴＨＣを結合可能で細胞シグナルを変換可能なＧタンパク質共役細胞受容体の生物学的機能を有する、配列番号１からなるアミノ酸配列または配列番号１の一部からなるアミノ酸配列を有するタンパク質と、
ｂ）ＴＨＣを結合可能で細胞シグナルを変換可能なＧタンパク質共役細胞受容体の生物学的機能を有する、配列番号２からなるアミノ酸配列または配列番号２の一部からなるアミノ酸配列を有するタンパク質と、
ｃ）ＴＨＣを結合可能で細胞シグナルを変換可能なＧタンパク質共役細胞受容体の生物学的機能を有する、配列番号１または２からなるアミノ酸配列を有するタンパク質の対立遺伝子と、
ｄ）２００位でフェニルアラニンからロイシンへ置換、および／または２１６位でイソロイシンからバリンへ置換、および／または２４６位でバリンからアラニンへ置換された、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質と、
ｅ）１３９位でフェニルアラニンからロイシンへ置換、および／または１５５位でイソロイシンからバリンへ置換、および／または１８５位でバリンからアラニンへ置換された、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質と、
ｆ）ＴＨＣを結合可能で細胞シグナルを変換可能なＧタンパク質共役細胞受容体の生物学的機能を有する、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８、配列番号９のアミノ酸配列、またはこれらと８０％相同であるアミノ酸配列を有するタンパク質と、からなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜請求項１１に記載のＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
請求項１３：前記ＣＢ１受容体は、アミノ酸レベルで配列番号１と少なくとも４５％の相同性を有するタンパク質であって、このタンパク質は、ＴＨＣを結合可能で細胞シグナルを変換可能なＧタンパク質共役細胞受容体の生物学的機能を有することを特徴とする請求項１〜請求項１１に記載のＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
請求項１４：前記相同性は、少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、もっと好ましくは９５％であることを特徴とする請求項１３に記載のＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
請求項１５：前記ＣＢ１受容体アンタゴニストの日常的投薬量は、０．０１ｍｇ〜５００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ〜１００ｍｇであることを特徴とする請求項１〜請求項１４に記載のＣＢ１受容体のアンタゴニストの使用。
請求項１６：ＣＢ１受容体のダウンレギュレーションまたは抑制による肝臓病治療用の組成物を調製するための、配列番号１、配列番号２、配列番号１の一部、配列番号２の一部からなるタンパク質をコードする核酸配列の使用。
請求項１７：哺乳類の肝臓病を治療するに有効な量のＣＢ１受容体のアンタゴニストをそれが必要な哺乳類に投与することからなる肝臓病治療方法。
請求項１８：前記アンタゴニストは、式ＩＩの化合物、あるいはその薬学的に良好な塩の一つであることを特徴とする請求項１７に記載の肝臓病治療方法。
【数２】
2007527893.tif 000003
式中、ｇ２、ｇ３、ｇ４、ｇ５、ｇ６およびｗ２、ｗ３、ｗ４、ｗ５、ｗ６は、同一でも異なってもよく、それらは、それぞれ独立して水素、塩素、若しくは臭素原子、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、トリフロロメチル、またはニトロ基であり、ｇ４は、任意のフェニル基であり；Ｒ４は、水素または（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；Ｘは、直結合あるいは、基−（ＣＨ２）ｘ−Ｎ（Ｒ３）−であり（Ｒ３は、水素または（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり、ｘは、０または１である）；Ｒは：基−ＮＲ１Ｒ２（Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルである）；任意に置換された非芳香族（Ｃ３−Ｃ１5）炭素環基（この置換は置換カルボニル以外である）；アミノ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基（前記アミノは任意に（Ｃ１−Ｃ３）アルキルで二置換されたものである）；シクロアルキル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル（前記シクロアルキルはＣ３−Ｃ１2である）；非置換またはハロゲンや（Ｃ１−Ｃ５）アルキルや（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシで単一置換または多置換されたフェニル；フェニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル；ジフェニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル；ナフチル；アンスラセニル（ａｎｔｈｒａｃｅｎｙｌ）；非置換または（Ｃ１−Ｃ３）アルキルやヒドロキシルやベンジルで置換された飽和の５員から８員の複素環基；１−アダマンチルメチル（ａｄａｍａｎｔｙｌｍｅｔｈｙｌ）；非置換またはハロゲンや（Ｃ１−Ｃ５）アルキルや（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシで単一置換または多置換される芳香族複素環；非置換またはハロゲンや（Ｃ１−Ｃ５）アルキルや（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシで単一置換もしくは多置換された芳香族複素環で置換された（Ｃ１−Ｃ３）アルキル；あるいは、Ｒ１は水素であり、Ｒ２は上記記載の通りであり；あるいは、Ｒ１およびＲ２は、それらが結合している窒素原子を有する飽和の５員から８員の複素環基を形成し（前記複素環基は、ｗ２、ｗ３、ｗ４、ｗ５、ｗ６、ｇ２、ｇ３、ｇ４、ｇ５、ｇ６が全て水素の場合には、モルホリン以外である）；Ｘが−（ＣＨ２）ｘＮ（Ｒ３）−の場合には上記のＲ２基；Ｘが直接結合の場合にはＲ５基（Ｒ５は、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル）である）；非置換または（Ｃ１−Ｃ５）アルキルで置換された（Ｃ３−Ｃ１2）シクロアルキル；非置換またはハロゲンまたは（Ｃ１−Ｃ５）アルキルで置換されたフェニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル；シクロアルキル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル（前記シクロアルキルは、Ｃ３−Ｃ１2であり、非置換または（Ｃ１−Ｃ５）アルキルで置換されている）；あるいは、２−ノルボルニルメチルである。
請求項１９：前記ＣＢ１受容体アンタゴニストは、Ｎ−ピペリドノ（ｐｉｐｅｒｉｄｏｎｏ）−３−ピラゾールカルボキサミド、あるいはその薬学的に良好な塩の一つであることを特徴とする請求項１７に記載の肝臓病治療方法。
請求項２０：前記ＣＢ１受容体アンタゴニストは、Ｎ−ピペリジノ−５−（４−ブロモフェニル）−１−（２，４−ジクロロフェニル）−４−エチルピラゾール−３−カルボキサミド、あるいはその薬学的に良好な塩の一つであることを特徴とする請求項１７に記載の肝臓病治療方法。
請求項２１：前記ＣＢ１受容体アンタゴニストは、Ｎ−ピペリジノ−５−（４−クロロフェニル）−１−（２，４−ジクロロフェニル）−４−メチルピラゾール−３−カルボキサミド、あるいはその薬学的に良好な塩の一つであることを特徴とする請求項１７に記載の肝臓病治療方法。
請求項２２：前記肝臓病は、肝臓線維症であることを特徴とする請求項１７〜請求項２１に記載の肝臓病治療方法。
請求項２３：前記肝臓病は、アルコール肝硬変であることを特徴とする請求項１７〜請求項２１に記載の肝臓病治療方法。
請求項２４：前記肝臓病は、慢性ウイルス性肝炎であることを特徴とする請求項１７〜請求項２１に記載の肝臓病治療方法。
請求項２５：前記肝臓病は、非アルコール性脂肪性肝炎であることを特徴とする請求項１７〜請求項２１に記載の肝臓病治療方法。
請求項２６：前記肝臓病は、原発性肝癌であることを特徴とする請求項１７〜請求項２１に記載の肝臓病治療方法。
請求項２７：前記ＣＢ１受容体アンタゴニストの日常的投薬量は、０．０１ｍｇ〜５００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ〜１００ｍｇであることを特徴とする請求項１７〜請求項２６に記載の肝臓病治療方法。
【発明の効果】
【００１４】
以上詳細に説明した如くこの本発明によれば、ＣＢ１アンタゴニストには強力な肝臓の抗線維形成性質があり、これは肝臓疾患の治療、好ましくは肝線維症に至る肝臓疾患の治療に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
上述の如く発明したことにより、本発明は、肝線維症を含む肝臓病を治療するための方法及び組成物（医薬組成物等）を提供するものである。
【００１６】
前記肝臓病には、これに限定されないが、アルコール肝硬変、慢性ウイルス性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎、原発性肝癌も含まれる。
【００１７】
出願人は、ＣＢ１受容体の抑制（ダウンレギュレーション）およびＣＢ１受容体のアンタゴニストやリバースアゴニストの使用により、種々のタイプの肝線維症を治療できることを証明した。これはいくつかの実験で証明されている。
【００１８】
まず第１に、肝線維症進行中のＣＢ１受容体の役割については、線維症を誘導する慢性四塩化炭素中毒のモデルにおいて、ＣＢ１受容体発現を欠如するように操作したＣＢ１受容体ノックアウトマウス（ＣＢ１ＫＯ、ｎ＝１５）およびその野生型対象物（ＷＴ、ｎ＝１２）で研究した。線維症や壊死性炎は、ＭＥＴＡＶＩＲによるスコア値により判定された。ＣＢ１ノックアウト（欠如）マウスにおいては、野生型動物と比較して、肝線維症が減少していることを示した（肝線維症のスコア：２．５９±０．１３対３．３３±０．１３、ｐ＜０．０５）。それに応じて、ヒドロキシプロリン判定によると、ＣＢ１ノックアウトマウスの肝臓のコラーゲンは、野生型マウスと比較して４０％減少した（０．４６±０．０６対０．７３±０．１１ｍｇ／ｍｇ組織、ｐ＜０．０５）。壊死性炎スコア値は、両方のグループにおいて同様のものであった。かかるＣＢ１受容体の不活性化は、製剤手段によるＣＢ１受容体の完全な拮抗的ブロックと表現型が同等である。肝臓の組織学的解析およびヒドロキシプロリン含量の測定（特定のコラーゲン沈着生化学マーカー）の両方に基づくと、ＣＢ１ノックアウトマウスの肝線維症は、対照標準マウスと比較して非常に減少した。さらに、ＣＢ１ノックアウトマウスにおける平滑筋αアクチンおよびＴＧＦ−β１の発現は、ＣＣｌ４で処理した場合に野生型マウスと比較して、減少したことが示された。最後に、ＣＢ１不活性化によりマウス肝臓の筋線維芽細胞のアポトーシスが増加することが示された。そこで、ＣＢ１受容体の不活性化は、肝線維症を減少させることになる。
【００１９】
第２に、正常なヒト肝臓、硬変した肝臓、培養した肝臓の筋線維芽細胞に対して、免疫組織化学上のラベリングを行った。免疫化学によると、様々な病因による硬変サンプル（ｎ＝１３）のアップレギュレーションと比較して、線維状隔膜内およびその縁部の非実質細胞で顕著な正常な肝臓（ｎ＝３）のＣＢ１受容体の発現が弱いことが示された。二重免疫組織化学によると、筋線維芽細胞をＣＢ１受容体の主要供給源としており、それ故、ＣＢ１受容体が培養したヒト肝臓の筋線維芽細胞に発現することを確認した。ＣＢ１受容体は、正常な肝臓の内類洞細胞によって弱く発現し、慢性肝疾患時に著しくアップレギュレートする。二重免疫組織化学によると、肝臓の筋線維芽細胞は硬変肝臓においてＣＢ１受容体を発現する顕著な細胞型であることが明らかになった。したがって、ＣＢ１受容体の発現および活動は、肝線維症と相関関係がある。
【００２０】
第３に、Ｃ型慢性肝炎患者のコホートに対して疫学調査が行われ、線維症の割合が大麻非喫煙者と比較して大きいことから、日常の大麻喫煙はＣ型慢性肝炎の線維症進行のリスク要因となることが示された。これは、肝線維症のカンナビノイド信号伝達の関与を証明するものである。したがって、カンナビノイド信号経路が肝線維症に関与している。
【００２１】
第４に、ヒトおよびマウスの肝臓の筋線維芽細胞培養に対してＳＲ１４１７１６（あるいはＳＲ１４１７１６Ａ）やリモナバントとして商業上既知のＮ−ピペリジノ−５−（４−クロロフェニル）−１−（２，４−ジクロロフェニル）−４−メチルピラゾール−３−カルボキサミドであるＣＢ１受容体のアンタゴニストによる効果の生体外研究が行われ、ＣＢ１アンタゴニストは肝臓の筋線維芽細胞成長を抑制することが示された。この化合物やその調製は、欧州特許出願ＥＰ６５６３５４−Ａ１に記載されており、これは以下の式Ｉで表される。
【数３】
2007527893.tif 000004
かかるＣＢ１に対するアンタゴニストおよびその薬学的に良好な塩は、欧州特許出願ＥＰ６５６３５４に従って調製でき、医薬組成物も同特許出願に従って同様に調製できる。
【００２２】
第５に、マウスに対して生体内実験が行われ、ＣＢ１アンタゴニストＳＲ１４１７１６は、誘発肝線維症のモデルである四塩化炭素によって誘発される致死率を減少させることが示された。
【００２３】
ＣＢ１受容体のアンタゴニストは、ここでは、ＣＢ１受容体の活動または発現を抑制可能な化合物として規定される。
【００２４】
ＣＢ１受容体を抑制可能な化合物には、特に、ＣＢ１受容体のアゴニストとの相互作用をもたらすもの、前記アゴニストの結合を抑制するもの、あるいは前記結合から生じるＣＢ１受容体の活動を抑制するものが含まれる。
【００２５】
特に、適切なＣＢ１受容体のアンタゴニストは、ＣＢ１に対して特異性のあるもの、あるいはそうでないものであり、リバースアゴニストを含む。これらのアンタゴニストは、ＷＯ０３／０７７８４７に記載の置換アミド、ＷＯ０３／０８７０３７に記載の置換アリールアミド、ＷＯ０３／０６３７８１に記載の置換イミダゾール、ＷＯ０３／０８６２８８に記載の二環式アミド、ＷＯ０３／０８４９４３に記載のテルフェニル誘導体、ＥＰ−Ｂ−６５６３５４に記載のＮ−ピペリドノ（ｐｉｐｅｒｉｄｏｎｏ）−３−ピラゾールカルボキサミドおよびＮ−ピペリジノ−５−（４−クロロフェニル）−１−（２，４−ジクロロフェニル）−４−メチルピラゾール−３−カルボキサミド、ＵＳ５５９６１０６およびＵＳ５７４７５２４にそれぞれ記載のアリール−ベンゾ［ｂ］チオフェンおよびベンゾ［ｂ］フラン化合物、ＦＲ２８０５８１７に記載のアゼチジン誘導体、ＦＲ２８０５８１０に記載の３−アミノ−アゼチジン、ＦＲ２８０５８１８に記載の３−置換あるいは３，３−二置換の１−（ジ−（（ヘテロ）アリール）−メチル）−アゼチジン誘導体、Ｎ（ピペリジン（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ）−１−イル）−１−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−ヨードフェニル）−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボキサミド（ＡＭ２５１として知られている）、あるいはＬＹ−３２０１３５として商業上既知のその化合物が含まれる。適切なＣＢ１アンタゴニストは、欧州特許ＥＰ１１５０９６１に記載のＮ−ピペリジノ−５−（４−ブロモフェニル）−１−（２，４−ジクロロフェニル）−４−エチルピラゾール−３−カルボキサミドも含む。
【００２６】
その他のＣＢ１アンタゴニストは欧州特許ＥＰ５７６３５７に記載されており、以下の式ＩＩの化合物を含む。
【数４】
2007527893.tif 000005
式中、ｇ２、ｇ３、ｇ４、ｇ５、ｇ６およびｗ２、ｗ３、ｗ４、ｗ５、ｗ６は、同一でも異なってもよく、それらは、それぞれ水素、塩素、若しくは臭素原子、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、トリフロロメチル、またはニトロ基であり、ｇ４は、任意のフェニル基であり、Ｒ４は、水素または（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり、Ｘは、直結合あるいは、基−（ＣＨ２）ｘ−Ｎ（Ｒ３）−であり（Ｒ３は、水素または（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり、ｘは、０または１である）、Ｒは、基−ＮＲ１Ｒ２−であるか（Ｒ１およびＲ２は、それぞれ（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルである）、任意に置換された非芳香族（Ｃ３−Ｃ１５）炭素環基であるか（この置換は置換カルボニル以外である）、アミノ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基であるか（前記アミノは任意に（Ｃ１−Ｃ３）アルキルで二置換されたものである）、シクロアルキル（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであるか（前記シクロアルキルはＣ３−Ｃ１２である）、非置換またはハロゲンや（Ｃ１−Ｃ５）アルキルや（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシで単一置換または多置換されたフェニルであるか、フェニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであるか、ジフェニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであるか、ナフチルであるか、アンスラセニル（ａｎｔｈｒａｃｅｎｙｌ）であるか、非置換または（Ｃ１−Ｃ３）アルキルやヒドロキシルやベンジルで置換された飽和の５−員から８−員の複素環基であるか、１−アダマンチルメチル（ａｄａｍａｎｔｙｌｍｅｔｈｙｌ）であるか、非置換またはハロゲンや（Ｃ１−Ｃ５）アルキルや（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシで単一置換または多置換される芳香族複素環であるか、非置換またはハロゲンや（Ｃ１−Ｃ５）アルキルや（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシで単一置換もしくは多置換された芳香族複素環で置換された（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであるか、あるいは、Ｒ１は水素であり、Ｒ２は上記記載の通りであるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、それらが結合している窒素原子を有する飽和の５員から８員の複素環基であるか（前記複素環基は、ｗ２、ｗ３、ｗ４、ｗ５、ｗ６、ｇ２、ｇ３、ｇ４、ｇ５、ｇ６が全て水素の場合には、モルホリン以外である）、Ｘが−（ＣＨ２）ｘＮ（Ｒ３）−の場合には上記のＲ２基であるか、Ｘが直接結合の場合にはＲ５基であるか（Ｒ５は、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル）である）、非置換または（Ｃ１−Ｃ５）アルキルで置換された（Ｃ３−Ｃ１２）シクロアルキルであるか、非置換またはハロゲンまたは（Ｃ１−Ｃ５）アルキルで置換されたフェニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであるか、シクロアルキル（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであるか（前記シクロアルキルは、Ｃ３−Ｃ１２であり、非置換または（Ｃ１−Ｃ５）アルキルで置換されている）、２−ノルボルニルメチルである。
【００２７】
これらの結果は、ヒトに限定されないのであって、概ね哺乳類に適用可能である。
【００２８】
ＣＢ１アンタゴニストを含有する組成物は、予防のため、および／または治療のために投与することができる。医薬組成物における有効成分（例えばＣＢ１受容体のアンタゴニスト）は「有効量」で存在する。医薬組成物の有効量とは、所期の効果をもたらすために十分だが毒性のない薬剤量を意味する。この用語は、対象（例えば哺乳類、特にヒト）を治療するに十分な量を指す。したがって、「治療に役立つ量」という用語は、疾病の進行やその他のいかなる望ましくない症状等を防止、妨害、遅らせる、あるいは後退させることによって、疾病状態または症候状態を治療するのに十分な量を指す。「予防に効果的な」量という用語は、まだ罹患していない対象に与えられる量であってその疾病を防止、妨害、あるいは遅らせるに効果的な量を指す。
【００２９】
治療の用途においては、治療するに十分な量あるいは少なくとも部分的に疾病や合併症を阻止するに十分な量で、組成物を既に疾病に苦しむ患者に適宜投与する。適切な医薬組成物の投薬量は、いくつか確立した計画書（プロトコル）の一つに従うことで容易に決定できる。例えば、体重ｋｇあたりの生物活性薬剤の最大許容投薬量を決定するために、動物（例えばマウスやラット）実験が一般に行われる。通常の少なくとも一つの実験動物種は、ほ乳類である。動物実験の結果は、他の種（例えばヒト）への投与量を推測決定するために用いられる。有効量がどうなるかは、疾患の性質や程度、また患者の健康状態に左右される。
【００３０】
予防の用途においては、例えばＣＢ１受容体のアンタゴニストを含有する組成物が、肝臓疾患にかかりやすい患者、あるいは肝臓疾患の危険がある患者に投与される。かかる量は、「予防に効果的な」量・投与量であると規定される。この用途の場合、正確な量は、患者の健康状態や体重に左右される。
【００３１】
治療処置および予防処置の両方において、医薬組成物に含まれるアンタゴニストは、要望の反応が達成されるまで数回の投薬量あるいは一回の投薬量で投与される。この処置は監視するのが通常であり、必要に応じて投薬を繰り返す。本発明の化合物は、ＣＢ１受容体の不活性化が必要とされる度に確立された用法用量に従って投与される。
【００３２】
日常の投薬量は、大人一人あたり一日０．０１〜１，０００ｍｇと幅広く異なる。好ましくは、化合物は、治療すべき患者への投薬の対症適応のため、０．０１ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１．０ｍｇ、２．５ｍｇ、５．０ｍｇ、１０．０ｍｇ、１５．０ｍｇ、２５．０ｍｇ、５０．０ｍｇ、１００ｍｇ、２５０ｍｇ、５００ｍｇの有効成分を含有している。薬剤は、通常、約０．０１ｍｇ〜５００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ〜１００ｍｇの有効成分を含有する。薬剤の効果的な量は、通常、一日当たり体重に対して０．０００２ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、特に０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの投薬レベルで供給される。しかし、この特定の患者への特定の投与レベルおよび頻度は、様々な因子、例えば使用される特定の化合物の活動、代謝の安定性、その化合物の活動時間、年齢、体重、健康状態、性別、ダイエット、投与の態様および時間、排泄の割合、薬の組合せ、特定の状態の程度、および受けている治療によって異なることが理解されよう。
【００３３】
本発明の口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所、あるいは直腸へ投与するための医薬組成物においては、有効成分は、単独であるいは他の有効成分と組み合わせて、従来の薬剤保持体との混合物とした投与ユニット形態で動物や人間に投与される。適切な投与ユニット形態は、経口形態（例えばタブレット、ゲルカプセル、粉末、顆粒剤、経口懸濁液や溶液）、舌下や頬側の投与形態（噴霧投与、インプラント投与）、皮下投与、経皮投与、局所投与、腹腔内投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、経皮投与、クモ膜下投与、鼻腔内投与の形態、あるいは直腸投与の形態を含む。
【００３４】
適切な投与ユニット形態は、経口形態（例えばタブレット、ゲルカプセル、粉末、顆粒剤、経口懸濁液や溶液）、舌下や頬側投与の形態（噴霧投与やインプラント投与）、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、鼻腔内投与あるいは眼球内投与の形態、および直腸投与の形態が含まれる。
【００３５】
本発明の医薬組成物においては、有効成分は、通常、一日投薬単位あたりの前記有効成分の０．５〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜５００ｍｇ、より好ましくは、２〜２００ｍｇの投薬単位量で処方される。
【００３６】
タブレット形状の固体組成物を調製する際には、ラウリル硫酸塩ナトリウムのような湿潤剤を任意に微粉化した有効成分添加し、それからシリカ、ゼラチン、デンプン、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アラビアゴム等のような賦形薬に混合することができる。このタブレットは、種々の重合体やその他の適切な物質を含有する蔗糖で被覆されるか、あるいはタブレットは、持続活性や遅延活性を有するとともに所定の有効成分量を連続して放出するように処理される。
【００３７】
ゼラチンカプセル形状での調製は、有効成分とグリコールやグリセロールエステルのような希釈液とを混合し、この混合物をソフトまたはハードゼラチンカプセルに注入することで調製される。
【００３８】
シロップやエリキシル形状での調製は、防腐剤、香料、適切な色付け用としての好ましくはカロリーなしのメチルパラベンやプロピルパラベンである甘味料とともに有効成分を含有させてもよい。
【００３９】
水和剤や顆粒剤には、分散剤や湿潤剤やポリビニルピロリドンのような懸濁化剤を混合させた有効成分、あるいは甘味料や味付材を混合させた有効成分を含有させてもよい。
【００４０】
直腸投与は、例えばカカオバターやポリエチレングリコールのような直腸温で溶融する結合剤で調製した坐薬を使用してなされる。
【００４１】
腸管外、鼻腔内、あるいは眼球内の投与は、水性懸濁液、等張食塩水液、または例えばプロピレングリコール、ブチレングリコール、またはポリエチレングリコールのような薬理学的に両立できる分散剤および／または湿潤剤を含有する注射可能な無菌溶液を用いてなされる。
【００４２】
したがって、助溶剤（例えばエチルアルコールのようなアルコール、例えばポリエチレングリコールやプロピレングリコールのようなグリコール）、Ｔｗｅｅｎ．ＲＴＭ．８０のような親水性界面活性剤は、経静脈経路による注射可能な水溶液薬物を調製するために使用できる。有効成分は、トリグリセリドまたはグリセロールエステルによって可溶化し、筋肉内経路で注射可能な油性溶液を調製する。
【００４３】
経皮投与は、多層パッチや、有効成分がアルコール溶液の形態で貯留された貯留体を用いてなされる。
【００４４】
吸入投与は、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、あるいは生物学的に両立できるその他の噴射剤気体と共に、例えばソルビタントリオレアートまたはオレイン酸を含有する噴射剤を用いてなされる。
【００４５】
有効成分は、任意の一つ以上の輸送体や添加剤とともに、マイクロカプセルやマイクロスフェアとして調製することもできる。
【００４６】
慢性治療に有用な持続放出の形態のうちでは、インプラントが用いられる。これは、油性溶液の形態または等浸透圧媒体内のマイクロスフェア懸濁剤の形態で調製される。
【００４７】
有効成分は、α−、β−、γ−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、あるいはメチル−β−シクロデキストリンの形態でも存在する。
【００４８】
その他の適切なＣＢ１受容体アンタゴニストは、ＣＢ１受容体とＣＢ１受容体アゴニストとの結合を妨げる抗体である。
【００４９】
種々のＣＢ１受容体のイソフォームやその他の変異型が存在する。したがって、変異ＣＢ１受容体に対するアンタゴニストの使用は、本発明の範囲外とはならないであろう。一般的には、そしてタンパク質配列の同一性あるいは相同性に加えて、ＣＢ１受容体の生物学的機能は、ＴＨＣを結合可能で細胞シグナルを変換可能なＧタンパク質共役細胞受容体であることである。熟練技術者は、既知の標準的な方法で、ＣＢ１受容体の機能につき実験できるであろう。この標準的な方法には、ＣＨＯ細胞の推定ＣＢ１相補ＤＮＡの発現を含みうるのであって、次の試験は、ＣＢ１リガンドおよび、活性した推定ＣＢ１受容体の活性信号を伝達する細胞の測定、例えば環状ＡＭＰ産出の測定を行う。
別の薬理学的手段によるＣＢ１受容体を介したカンナビノイド信号伝達を減少させる方法は、ＣＢ１受容体のダウンレギュレーションあるいは抑制によるものである。熟練技術者が使用可能な遺伝子発現をダウンレギュレートあるいは抑制する種々の技術が知られている。これには、網羅的なリストではないが、相同的組換えによる不活性化（Ｇｏｓｓｅｎ，  Ｊ，  ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  ９：  ２７−３１，１９９３）、ＲＮＡ干渉（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  Ｓ．  Ｍ．，  Ｎａｔｕｒｅ．  ２００１  Ｍａｙ  ２４；  ４１１  （６８３６）：  ４２８−９）、ドミナントネガティブ受容体の発現（Ｄｏｓｉｌ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １９９８  Ｏｃｔ，  １８  （１０）：  ５９８１−９１）、抑制転写因子のトランスジェニック発現が含まれる。
【００５０】
上記のように（Ｌｉ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２５，４６０−９  （２００３）および  Ｄａｖａｉｌｌｅ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，  ＪＢｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  （２００２））、正常なヒト肝臓の外科的試料から調製した外植片の増生（アウトグロース）によって得た筋線維芽細胞培養を使用して、抗線維性質を有するＣＢ１アンタゴニストをスクリーニングすることも可能である。
特に、選択的な抗線維化性質を有するＣＢ１アンタゴニストのスクリーニング方法は、
ａ）筋線維芽細胞の多細胞培養株を準備する工程、
ｂ）細胞培養株のそれぞれを実験対象の化合物の一つに曝す工程、
ｃ）細胞生存や成長状態を評価することで筋線維芽細胞の線維形成性質に対する化合物の作用を判定する工程、
ｄ）実験を行った化合物の一つを選択する工程からなる。
【００５１】
別の方法は、上記方法のうち、
ｃ）が細胞外マトリックスの合成能力やその劣化抑制の成分を評価することで筋線維芽細胞の線維形成性質に対する化合物の作用を判定する工程に関するものである。
【００５２】
さらに別の方法は、上記方法のうち、
ｃ）がサイトカインの産出や移動を評価することで筋線維芽細胞の線維形成性質に対する化合物の作用を判定する工程に関するものである。
【００５３】
熟練技術者は、文献（例えばＬｉ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２５，４６０−９  （２００３）、Ｄａｖａｉｌｌｅ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  （２００２）、Ｌｉ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００１  ｅｔ  Ｄａｖａｉｌｌｅ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５，３４６２８−３３  （２０００））に記載される既知の手順により、これらの個々の工程を実施できるであろう。
【００５４】
それから、かかる手段によって分離された化合物は、肝臓病治療用の組成物の製造に使用できる。
【実施例１】
【００５５】
：ヒト肝硬変におけるＣＢ１受容体のアップレギュレーション。
【００５６】
材料。
培地や試薬は、Ｇｉｂｃｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、フランス）であった。ウシ胎児血清は、ＪＢｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（フランス）のものであった。貯留されたヒトのＡＢ＋血清は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒのものであった。ウサギの抗ＣＢ１受容体の抗血清（ヒトＣＢ１受容体の残基１〜１４に対して）およびＣＢ１阻害ペプチド（ＣＢ１受容体の残基１〜１４）は、Ｃａｙｍａｎ（Ｓｐｉｂｉｏ、フランス）のものであった。
【００５７】
ＲＮＡ調製およびＲＴ−ＰＣＲ。
ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、フランス）を用いて、１００ｍｍシャーレの融合性静止細胞から総ＲＮＡが抽出された。０．０５μｇ／μｌのオリゴ（ｄＴ）１２−１８プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、フランス）と、０．５ｍＭのｄＮＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ、フランス）と、第１ストランドバッファ中の１０ｍＭのジチオスレイトール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、フランス）と、を含有する２０μｌ反応液において２００ユニットのＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、フランス）を用いて、３７℃で１時間の逆転写によって２μｇのＲＮＡからｃＤＮＡが合成された。最終的なゲノムＤＮＡ汚染を検査するため、逆転写がないこと以外は同じ条件で照合が行われた。１．２５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フランス）、および５０μｌの全容積中、２ｍＭのＭｇＣｌ２と０．２ｍＭのｄＮＴＰと２５ｐモルの各プライマーとで補充された対応バッファを使用して、２μｌの逆転写反応物とともにＰＣＲが行われた。ＧｅｎｅＡｍｐ２７００サーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フランス）でＰＣＲサイクル４０回が実施された。各サイクルは、９５℃で４５秒の変性、５８℃で４５秒のアニーリング、７２℃で３０秒の拡張からなり、第１サイクルは、ポリメラーゼ活性化のための変性時間延長（１０分）を含み、最終サイクルは、時間延長（１０分）を含む。ＣＢ１用オリゴヌクレオチドプライマー（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、フランス）は、以下の通りであった：２８７ｂｐの予想ＰＣＲ産出物を伴う、ＣＢ１センスプライマー５’−ＴＴＴＧＧＣＴＡＣＡＣＡＡＴＴＧＧＡＡＧＴＣＴＡＡＧＡＡＣＣＣ−３’、ＣＢ１アンチセンスプライマー５’−ＧＣＡＣＡＣＡＴＴＧＡＣＡＣＧＴＡＴＣＣＡＣＴＧＣＴＴＧ−３’。ＰＣＲ増幅産出物は、１．５％アガロースゲルで分析し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、フランス）にブロットした。６ＸＳＳＣ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８、５Ｘ  ｄｅｎｈａｒｄｔ、０．１％ＳＤＳ、および０．１ｍｇ／ｍｌ  ｓｓＤＮＡを含有するバッファでの４２℃、２時間のプレハイブリダイゼーションの後、膜は、５０ｎｇのＣＢ１オリゴヌクレオチドプローブ５’−ＣＣＴＧＴＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＣＡＧＴＧＴＴＴＡＴＧＴＧＣ−３（［γ−３２Ｐ］アデノシン三リン酸とラベルがある）を含有する同じバッファにおいて、４２℃でＴ４キナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、フランス）を用いて一晩のハイブリダイゼーションを行った。このハイブリダイゼーションの後、０．１％ＳＤＳ、１ＸＳＳＣで室温３０分でブロットを二回洗浄し、それからホスホイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、フランス）で分析を行った。
【００５８】
ヒト肝臓の試料。
１３人の患者（男性８人、女性５人、平均年齢は５５歳、３９〜７２歳）から切除し急速冷凍した肝臓は、遡及的に研究された。正常な肝臓サンプルは、結腸直腸の転移のための肝臓の切除を行った３人の女性から得られた（ｎ＝３）。硬変のサンプルは、肝臓移植を行った患者の肝臓から８つ得られ、肝細胞癌のため肝臓切除がなされた患者から２つ得られた。肝硬変は、慢性ＨＣＶ（ｎ＝１）またはＨＢＶ（ｎ＝２）の感染、原発性胆汁性肝硬変（ｎ＝１）、アルコール性肝疾患（ｎ＝４）、ウィルソン病（ｎ＝１）に続いて起こったものであった（１つのケースは原因不明）。
【００５９】
正常な肝臓および硬変した肝臓のＣＢ１受容体の免疫組織化学的検出。
凍結切片（５〜７μｍ）は、空気乾燥され、そして氷冷アセトンに−２０℃で１０分間配置した。２０％ヒト血清とともに５０ｍＭ、ｐＨ７．６のトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）で室温で切片を１時間プレインキュベートすることにより、非特異的結合が遮断された。さらに、この切片は、抗体希釈液（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ、フランス）で１／２０００に希釈したヒトＣＢ１受容体のウサギポリクローナル抗血清（Ｃａｙｍａｎ、Ｓｐｉｂｉｏ、フランス）とともに、４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳで３回リンスした後で、切片は、１／５０希釈しＴＢＳで３回リンスしたハツカネズミモノクローナル抗ウサギ免疫グロブリンＧ抗体（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ、フランス）とともに、室温で４５分間インキュベートし、さらに１／５０希釈したウサギの抗マウス免疫グロブリン抗体（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ、フランス）とともに、室温で３０分間インキュベートし、それからアルカリホスファターゼ−抗アルカリホスファターゼ（ＡＰＡＡＰ）複合体免疫酵素法を使用して、刊行物（Ｌｉ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２５，  ４６０−９  （２００３））に記載のように処理された。一次抗体の特異性を確認するため、比較対照には、対応する合成ペプチドを前吸着させたもの（１００ｇ／ｍｌ、１時間、室温）あるいは一次抗体を排除したものを含ませた。肝臓の筋線維芽細胞がＣＢ１タンパク質を発現するかを判断するため、ＣＢ１および平滑筋αアクチンの二重免疫染色を行った。まず切片は、標準的な３段階のビオチン−ストレプトアビジン免疫ペルオキシダーゼ法によりＣＢ１免疫染色を行った。アセトン固定の切片をＴＢＳ／０．３％Ｈ２Ｏ２中で３０分間のインキュベートすることで一時的に内因性ペルオキシダーゼを抑制し、それからＴＢＳで洗浄した。切片をＴＢＳ／２０％ヒト血清とともに３０分間プリインキュベートすることで、非特異的結合が遮断された。それから、アビジンで１５分間、ビオチンで１５分間インキュベートし（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ａｖｉｄｉｎ／Ｂｉｏｔｉｎ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｋｉｔ）、さらに抗ＣＢ１抗血清とともに４℃で一晩インキュベートした。その後、切片は、ＴＢＳで清浄し、引き続いてヤギ抗ウサギ二次性ビオチン化抗体（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ、フランス、１／５００）およびストレプトアビジン−ホースラディシュペルオキシダーゼ複合体（１／５０、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｐｅｒｂｉｏ、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、フランス）とともに、それぞれ３０分間インキュベートした。金属強化ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基材（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、フランス）を用いてペルオキシダーゼ活性が現れた。特に言及がある場合を除き、全工程は室温で実施された。それから、平滑筋αアクチンに対する単クローン抗体（Ｓｉｇｍａ、フランス）の１／５０００希釈とともに上記のＡＰＡＡＰ法を使用して、平滑筋αアクチンの免疫染色が行われた。スライドは、水溶ヘマトキシリンで対比染色された。一重および二重の染色は、デジタルイメージシステムハママツ３ＣＣＤカラーカメラ、浜松フォトニクス社、フランス）を備えたＡｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、ドイツ）の明視野顕微写真で視覚化された。
【００６０】
ヒト肝臓の筋線維芽細胞の分離および培養。
ヒト肝臓の筋線維芽細胞は、正常な肝臓の外科試料で準備した外植片の増生によって得られた。この正常な肝臓は、文献（Ｄａｖａｉｌｌｅ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５，３４６２８−３３  （２０００））に記載のように、良性のあるいは悪性の肝腫瘍の手術により得られたものである。１０％血清（５％ウシ胎仔血清、５％ヒト血清、ＤＭＥＭ  ５／５）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で細胞は培養され、第３〜第７継代培養間で使用された。特に言及がない場合は、実験は、血清なしのＷａｙｍｏｕｔｈ培地で４５時間のインキュベートを行って静止状態の細胞に対して行われた。これらの細胞の筋線維芽性質は、文献（Ｄａｖａｉｌｌｅ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５，３４６２８−３３  （２０００））に記載の通りに評価され、これらには、肝臓線維形成時にｉｎ  ｓｉｔｕでみられる線維形成細胞の表現型性質や機能特性があることが示された（Ｗｉｎ，  Ｋ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １８，１３７−４５  （１９９３））。培養株は、平滑筋αアクチンを発現するとともに、肝臓筋線維芽細胞の２つの標識であるフィブリン（ｆｉｂｕｌｉｎ）２およびインターロイキン６を発現することが分かった（Ｄａｖａｉｌｌｅ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＪＢｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５，３４６２８−３３  （２０００））。
【００６１】
培養されたヒト肝臓の筋線維芽細胞におけるＣＢ１受容体の免疫細胞化学的検出。
ヒト肝臓の筋線維芽細胞は、３５ｍｍ皿に植えつけ（１０，０００／ｃｍ２）、血清添加培地で２４時間成長させ、４８時間血清を排除し、ＴＢＳで清浄し、４％パラホルムアルデヒドに１０分間固定させた。ひとたびＴＢＳで清浄した後、細胞は２０％ヒト血清を含有するＴＢＳで３０分間室温でインキュベートし、さらに抗ＣＢ１抗血清（ＴＢＳ／２０％ヒト血清で１／５００希釈）とともに３時間室温でインキュベートし、湿気のある部屋で４℃で一晩インキュベートした。それから、細胞は広範囲にわたってＴＢＳでリンスし、Ｃｙ３接合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、フランス）（ＴＢＳ／２０％ヒト血清で１／５０希釈）とともに３０分間の暗所、室温でインキュベートし、清浄し、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ培地（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、カナダ）でカバーし、蛍光マイクロスコープで観察した。一次抗体の特異性を確認するため、標準対照には、対応する合成ペプチドを前吸着させたもの（１００μｇ／ｍｌ、１時間、室温）あるいは一次抗体を排除したものを含ませた。
【００６２】
ＣＢ１受容体の発現は、正常な外科試料（ｎ＝３）、硬変肝臓（ｎ＝１０）から調製した凍結組織切片につき、ヒトＣＢ１受容体に対するポリクローナル抗体で免疫組織化学的に研究された。肝硬変は、慢性ＨＣＶ（ｎ＝１）またはＨＢＶ（ｎ＝２）の感染、原発性胆汁性肝硬変（ｎ＝１）、アルコール性肝疾患（ｎ＝４）、ウィルソン病（ｎ＝１）に続いて起こったものであった（１つのケースは原因不明）。正常な肝臓においては、類洞壁に沿って分離し断続したＣＢ１免疫反応を検出した。硬変肝臓においては、肝硬変の病因論とは関係なく、ＣＢ１免疫染色の全体的強度が著しく増加した。多数の紡錘状細胞が線維化隔壁に沿って分散されたことから、ＣＢ１の存在はほぼ明白であった。ＣＢ１受容体の発現は、線維化隔壁に沿って位置する炎症細胞や細管増殖細胞を含む他の非実質細胞でも見られた。ＣＢ１遮断ペプチドの存在下で、あるいは一次抗体の非存在下でインキュベートした切片のシグナルが存在しないことから、抗体の特異性が証明された。
【００６３】
抗ＣＢ１受容体抗体および抗平滑筋αアクチン抗体を使用した二重免疫組織化学により、ＣＢ１受容体を発現する顕著な細胞型として線維化隔壁内に肝臓筋線維芽細胞が明らかに確認された。従って、ＲＴ−ＰＣＲ解析や免疫細胞化学によって証明されたように、ＣＢ１受容体は、培養されたヒト肝臓筋線維芽細胞にも発現した。
【実施例２】
【００６４】
：ＣＢ１欠如マウスにおける線維形成反応の減少。
【００６５】
動物および実験計画。
ＣＢ１受容体を無効にした雄のＣＤ１マウスおよび野生型同腹子は、上述の刊行物（Ｌｅｄｅｎｔ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３，４０１−４．  （１９９９））のように生み出された。異型接合マウスは、野生型や本研究に使用される突然変異体マウスが生じる前、ＣＤ１バックグラウンドの１５世代以上飼育された。４０の雄：８−１０週のＷＴ（ｎ＝２０）、ＣＢ１−／−（ｎ＝２０）が使用され、動物は以下のグループに区分された。すなわち、ＷＴ仮病（オリーブ油、ｎ＝８）；ＷＴＣＣｌ４（ｎ＝１２）；ＣＢ１−／−仮病（オリーブ油、ｎ＝５）；ＣＢ１−／−ＣＣｌ４（ｎ＝１５）である。特に言及がなければ、動物は、制御された温度および湿度の部屋に収容され、１２時間の昼／夜サイクルを維持し、餌および水は無制限に与えられた。ＣｒｅｍｏｐｈｏｒおよびＰＢＳ（５／５／９０）と混和させた同容積のエチルアルコールで週３回変性させ、１週間に１度の内部腹膜噴射（ＩＰ）によって０．５ｍｌ／ｋｇ体重でオリーブ油（１ｖｏｌ：１０ｖｏｌ）で混和した四塩化炭素（ＣＣｌ４）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ−  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、フランス）を与えることで、線維症が誘発された。ＣＣｌ４の仮病動物にはオリーブ油が与えられた。４週間後、動物は一晩飢えさせて、最後のＣＣｌ４注射の４８時間後に殺された。肝臓試料は、いくつかの葉から取得され、ｉ）液体窒素で急速冷凍しＲＮＡ抽出溶液で均質化するか、ｉｉ）ヒドロキシプロリン測定のためＨ２Ｏで均質化して液体窒素で急速冷凍するか、ｉｉｉ）緩衝ホルマリンで固定させた。急速冷凍された試料は、使用されるまで−８０℃で保管された。血液試料も非活性ゲルバリアや血餅活性剤ディスク（Ｖｅｎｏｊｅｃｔ、Ｔｅｒｕｍｏ、フランス）を含有するシリコーン管で収集され、血清は遠心分離で分離され、使用するまで−２０℃で保管された。
【００６６】
肝臓機能検査。
自動分析器により、日常の肝機能血液試験（ビリルビン、アルカリ性ホスファターゼ、およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ）が行われた。
【００６７】
線維症、炎症、および壊死の判定。
肝臓試料は、１０％ホルマリンに固定され、パラフィン包埋を行った。組織切片（厚さ４μｍ）は、日常試験のためのヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）あるいは肝臓コラーゲン沈着視覚化ためのピクロ−シリウス赤で染色された。組織学的グレード（壊死や炎症性浸潤）や進度（線維症）は、独立した解剖病理学者によって、各肝臓の異なる領域からの少なくとも４つの断片に対して無分別に判定された。半定量的な改良ＭＥＴＡＶＩＲスコアリングシステムによれば、線維症は、以下の通りに０〜４目盛りの段階でグレードが示された。すなわち、線維症なし＝０、隔膜なしの門脈線維症＝１、ほとんど隔膜なし＝２、肝硬変なしの多数の隔膜＝３、肝硬変＝４であった。肝臓の全体にわたる線維症の異質性は、それが存する場合は、断片ごとの個別的なスコアレベルに対応するパーセント領域を評価するとともに各肝臓ごとにデータを結合することで考慮された。好酸性体、気球状変性および／または肝細胞性の壊死の散在病巣性によって規定される壊死は、次のように等級分けした。すなわち、不存在＝０、軽症（小葉または小結節の１／３が関係）＝１、中程度（小葉または小結節の１／３〜２／３が関係）＝２、特徴的（２／３を超える小葉または小結節が関係）＝３であった。炎症性浸潤は、０〜３にグレード分けされた。不存在＝０、１／３未満の小葉または小結節において温和な（門脈および／または小葉の）炎症性浸潤＝１、小葉または小結節の１／３〜２／３が関係した中位の（門脈および／または小葉の）炎症性浸潤＝２、２／３を越える小葉または小結節が関係した特徴的な（門脈および／または小葉の）炎症性浸潤＝３であった。試料の全ては同時に記録された。
【００６８】
ヒドロキシプロリンの含有量。
ヒドロキシプロリンの含有量は、刊行物（Ｇｒｅｎａｒｄ，  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２６，  １３５６−６２．  （１９９７））の記載の通りに判定された。各肝臓の３つの小断片は、プールされ、蒸留水で均質化され、凍結乾燥され、一晩、１１０℃の６Ｎ  ＮＣｌ（１０ｍｇの乾燥肝臓粉／ｍｌ  ＨＣｌ  ６Ｎ）で加水分解された。それから加水分解物は、活性炭で処理され、濾過され、蒸発され、蒸留水で再懸濁される。加水分解物の分取は、刊行物（Ｃｒｅｅｍｅｒｓ，  Ｌ．  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２，６５６−８  （１９９７））の通りに改良されたＷｏｅｓｓｎｅｒの方法（Ｗｏｅｓｓｎｅｒ，  Ｊ．  Ｆ．，  Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ９３，４４０−７  （１９６１））に従い、エールリッヒ試薬で化学反応することによるヒドロキシプロリン（ＨＰ）内容の分光測光法で測定するために使用された。肝臓のヒドロキシプロリン含量は、マイクログラム／組織ミリグラム（乾燥重量）で表示された。
【００６９】
マウスの肝臓筋線維芽細胞の分離および培養。
マウスの筋線維芽細胞は、コラゲナーゼ灌流で分離されるとともに、Ｎｉｃｏｄｅｎｚの密度勾配（Ｖｒｏｃｈｉｄｅｓ，  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，  １９９６．２３  （６）：  ｐ．１６５０−５）で浄化された。分離後、細胞は、２０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培地で培養された。初日には、清浄により細胞残屑や非付着細胞が除去され、さらに細胞は１０％ＦＣＳを含有するＤＥＭＥ培地で培養された。細胞は第３〜第９継代が使用され、平滑筋αアクチン、フィブリン（ｆｉｂｕｌｉｎ）２、インターロイキン６を発現することが分かった。
【００７０】
カスパーゼ−３様活性。
アポトーシス分析評価は、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地に一晩配置して指定時間の間血清飢餓させた非融合性の細胞に対して行われた。カスパーゼ−３様活性は、細胞溶菌液において、刊行物（Ｄａｖａｉｌｌｅ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２００２．２７７  （４０）：  ｐ．３７３２３−３０、  Ｌｉ，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２００１．２７６  （４１）：  ｐ．  ３８１５２−８）に記載の通りに基体としてＡＣ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣを使用して、分析された。
【００７１】
細胞生存率の判定。
マウスの肝臓筋線維芽細胞（９６穴板において１穴あたり７，０００細胞）は、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地に一晩配置して、指定時間の間、血清飢餓させた。試薬であるＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを各穴に添加した。吸収度は４９０ｎｍであった。
【００７２】
肝臓のＴＧＦ−β１の測定。
酸で活性化された肝臓ホモジネートにおいて肝臓のＴＧＦ−β１の測定が行われた。冷凍の肝臓試料は、溶解緩衝剤（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１％  ＮＰ４０、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．３ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、ホスファターゼ、プロテアーゼインヒビター）にて３０分間４℃で均質化された。１２，０００ｇ、４℃で１０分間の遠心分離の後、分離された組織溶解液が収集され、解析まで−８０℃で保管された。蛋白質濃度は、基準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いたＢＣＡタンパク質測定法（Ｐｉｅｒｃｅ）によって測定された。不顕性ＴＧＦ−β１を免疫反応性の形態に活性化するため、組織溶解液は、同容積の２．５Ｎ酢酸および１０Ｍ尿素で室温・１０分間の酸性化を行い、続いて１Ｍ  ＨＥＰＥＳ中の２．７Ｍ  ＮａＯＨを用いて中和した。製造者の指示に従い、マウスＴＧＦ−β１  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、フランス）を使用した酵素免疫吸着測定が行われた。ネズミＴＧＦ−β１組換え型タンパク質が標準として用いられた。結果は、ＴＧＦ−β１につきｐｇ／可溶タンパク質ｍｇで表されている。
【００７３】
平滑筋αアクチンの免疫組織化学的染色。
肝臓組織はホルマリンに固定され、パラフィン包埋された。平滑筋αアクチンの免疫組織化学的染色は、ベクトルＭ．Ｏ．Ｍ．免疫検出キットを使用し、製造者（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が指定のプロトコルに従って行われた。一時的に、パラフィン包埋切片は、脱パラフィンおよびキシレンおよびエタノールによりＴＢＳ（５０ｍＭ  トリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．６）に再水和された。スライドは、クエン酸塩バッファー内で７００Ｗ、各５分間、２回のマイクロ波処理を行った。内因性のペルオキシダーゼ活性は、ＴＢＳの０．３％Ｈ２Ｏ２の１時間ものインキュベートにより抑制した。切片をＴＢＳの１．５％ウマ血清で１時間プリインキュベートすることで非特異的結合を遮断した後、切片をアビジンで１５分間インキュベートした。それから、ビオチン（Ａｖｉｄｉｎ／Ｂｉｏｔｉｎ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｋｉｔ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で１５分間インキュベートし、さらに、ＭＯＭマウスＩｇ遮断溶液とともに１時間インキュベートした。それから切片はＴＢＳで清浄し、引き続いてＭＯＭ希釈溶液とともに５分間、１：１０００希釈の平滑筋αアクチンの単クローン抗体（Ｓｉｇｍａ、フランス）とともに３０分間、ＭＯＭビオチン化抗マウスＩｇＧ試薬とともに１０分間、最後に５分の間のＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ試薬とともに５分間のインキュベートを行った。金属強化ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基材（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、フランス）を用いてペルオキシダーゼ活性が現れた。工程の全ては、室温で実施された。一次抗体の代わりにＭＯＭ希釈液で染色された対照スライドには、陽性染色は見られなかった。陽性染色領域はＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓソフトウェア（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、ＭｉｃｒｏＭｅｃａｎｉｑｕｅ、フランス）を備えた形態計測による解析システムを用いて、動物あたり４〜５つの肝臓破片で測定された。
【００７４】
統計。
結果は、実験ｎ回の平均±標準誤差で表される。結果は、２方向分散分析法（ＡＮＯＶＡ）で分析され、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎｎ−Ｋｅｕｌ法に従い補正された一対の比較を行った。ｐ＜０．０５は、最小の有意水準とされた。
【００７５】
ＣＢ１受容体欠如マウス（ＣＢ１−／−）および、その野生型同腹子（ＷＴ）には、慢性的なＣＣｌ４処理が行われた。仮病のマウス（ＣＢ１−／−およびＷＴ）にはオリーブ油が与えられた。平均体重、肝臓の重さ、肝臓／身体の体重比率は、表１に示すように、４つの実験グループ間において、ほとんど異ならなかった。
【表１】
2007527893.tif 000006
【００７６】
野生型（ＷＴ）マウスは、ＰｉｃｒｏＳｉｒｉｕｓ赤で染色した肝臓組織切片の組織学的分析に示されるように、ＣＣｌ４処理４週間後に肝線維症を発病した。ＣＣｌ４処理した野生型マウスでは、若干の小結節を有する多数の隔膜が形成された。ひときわ、ＣＣｌ４処理したＣＢ１−／−マウスでは、線維形成隔膜の形成が少なく線維形成反応が比較的弱かった。したがって、ＣＣｌ４処理されたＣＢ１−／−マウスの線維症スコアは、ＣＣｌ４処理されたＷＴグループと比較して、かなり低かった（それぞれ２．５９±０．１３と３．３３±０．１３。ｐ＜０．０５）。さらに肝臓のヒドロキシプロリン測定により判定されたＣＣｌ４処理のＣＢ１欠如マウスの肝臓のコラーゲン量は、ＣＣｌ４処理されたＷＴグループと比較して、４０％減少した（それぞれ０．４５±０．０６と０．７３±０．１１ｍｇ／ｍｇ組織（乾燥重量）。ｐ＜０．０５）。最後に、表２に示されるように、ＣＣｌ４処理されたＷＴ型もＣＢ１−／−マウスも、壊死および炎症はほとんど異ならなかった。
【表２】
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【００７７】
線維形成サイトカインＴＧＦ−β１の肝臓含量が測定されるとともに、平滑筋αアクチンの発現が判定された。これは、肝臓の筋線維芽細胞のマーカーおよび活性した肝臓の星細胞のマーカーとなる。ＣＣｌ４処理の動物において、ＣＢ１欠如マウスのＴＧＦ−β１の生成は、野生型マウスと比較して減少した（図１のＡ）。さらに、ＣＣｌ４処理ＣＢ１−／−マウスの平滑筋αアクチンは、ＣＣｌ４処理された野生型動物と比較して、著しく減少した（１．２３±０．０９対２．５８±０．２３。ｐ＜０．０５）（図１のＢ）。
【００７８】
最後に、ＣＢ１の不活性化により肝臓の筋線維芽細胞の増殖が減少および／またはアポトーシスが減少することで筋線維芽細胞の蓄積が減少したか否かを判定するため、ＷＴマウスおよびＣＢ１−／−マウスから分離した肝臓の筋線維芽細胞が使用された。アポトーシス刺激として、血清枯渇を行った。血清枯渇は、野生型マウス（ＷＴ）から分離した肝臓の筋線維芽細胞の生存率にほとんど影響を与えなかった（図２）。これに対し、細胞の球状化、収縮化、分離化、生存率の減少に示されるように（図２のＡ）、血清飢餓により、ＣＢ１−／−動物から分離した肝臓の筋線維芽細胞に対する細胞傷害効果が生じた。血清枯渇により、ＷＴ型細胞と比較して、ＣＢ１−／−細胞におけるカスパーゼ−３様活性の刺激が高められた（図２のＢ）。このように、ＣＢ１−／−マウスからの肝臓の筋線維芽細胞は、ＷＴマウスからの細胞よりも高いアポトーシス率を示す。
【００７９】
この結果は、ＣＢ１受容体の無効が肝臓の筋線維芽細胞のアポトーシスに対する感度を高めることを証明するものである。
【実施例３】
【００８０】
：日常の大麻喫煙は、Ｃ型慢性肝炎における線維症進行のリスク要因となる。
【００８１】
汚染記録のある１９５人の実験を受けたことがない一連の患者（男／女：１４０／５５、年齢４２±１０）が実験に組み込まれた。収集されたデータは、大麻の消費の有無、疾患存続時のアルコール・タバコの有無、汚染時の年齢、性別、伝染経路、遺伝子型、ＢＭＩ、脂肪症、活性度と線維形成（ＭＥＴＡＶＩＲ）、および線維症進行率（メジアン値は年０．０８）であった。
【００８２】
単変量解析によって、０．０８／年を越える線維症進行率は、大麻喫煙については表３に示すように、３０ｇ／ｄ以上のアルコール摂取量は６４％（ｐ＝０．０３）、中程度または著しい脂肪症は６５％（ｐ＝０．００４）、２５歳以上の汚染年齢は６３％（ｐ＜０．０１）、およびＡ２以上の組織学的活動は６５％（ｐ＜０．００１）であった。多変量解析において、線維症進行率＞０．０８は、それぞれ日常の大麻喫煙（ＯＲ＝３．８、９５％Ｃｌ（１．７〜８．７））、３０ｇ／ｄ以上のアルコール摂取量（ＯＲ＝２．１、９５％Ｃｌ（１．０〜４．６））、２５歳以上の汚染年齢（ＯＲ＝４．０、９５％Ｃｌ（１．９〜８．４））、およびＡ２以上の組織学的活動（ＯＲ＝７．５、９５％Ｃｌ（３．５〜１６．１））であった。したがって、日常の大麻消費と線維症進行との間には因果関係がある。
【表３】
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【実施例４】
【００８３】
：ＣＢ１受容体アンタゴニストの存在下における肝臓の筋線維芽細胞培養。
【００８４】
ヒト肝臓の筋線維芽細胞の分離および栽培。
前述のように、良性あるいは悪性の腫瘍肝腫瘍の外科手術から得た正常な肝臓の外科試料から調製した外植片を増生することによって、ヒト肝臓の筋線維芽細胞が得られた。この工程は、フランス立法による倫理規制に従って行われた。細胞は、１０％血清（５％ウシ胎仔血清、５％ヒト血清、ＤＭＥＭ５／５）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養され、第３〜第７継代が使用された。特に言及がなければ、血清なしのＷａｙｍｏｕｔｈ培地で４８時間のインキュベートによって静止状態になった細胞に対して実験が行われた。
【００８５】
マウス肝臓の筋線維芽細胞の分離および培養。
マウスの筋線維芽細胞は、既に述べたように、コラゲナーゼ灌流で分離され、Ｎｉｃｏｄｅｎｚの密度勾配で浄化された。分離後、細胞は２０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培地で培養された。初日に、清浄により細胞残屑や非付着細胞が除去され、さらに細胞は１０％ＦＣＳを含有するＤＥＭＥ培地で培養された。細胞は、第３〜第７継代が使用された。
【００８６】
アポトーシス分析評価。
アポトーシス分析評価は、文献（Ｄａｖａｉｌｌｅ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，  ＪＢｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００２；  ２７７：  ３７３２３−３０、Ｌｉ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００１；  ２７６：  ３８１５２−８）に記載の通り、ＤＭＥＭ５／５培地に一晩配置して４８時間の血清飢餓させた非融合性の細胞に対して行われた。原子核の形態はＤＡＰＩ染色法を用いて分析され、カスパーゼ−３様活性は基材としてＡＣ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣを用いた細胞溶菌液で分析され、ＤＮＡラダーは、アポトーシスＤＮＡラダーキットを使用して抽出された全ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動によって分析された。
【００８７】
細胞生存率。
細胞（９６穴板において１穴あたり７，０００細胞）は、ＤＭＥＭ５／５に一晩配置され、フェノールレッドなしにＤＭＥＭで４８時間の血清飢餓を行い、指定のエフェクタで１６時間の処理を行った。試薬であるＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを各穴に添加した。吸収度は４９０ｎｍであった。
【００８８】
ＤＮＡ合成の測定。
ＤＮＡ合成は、上記の通り（Ｔａｏ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  １９９９．２７４  （３４）：  ｐ．  ２３７６１−２３７６９）、［３Ｈ］チミジンの組み込みによって三重の穴で測定された。融合性のヒト肝臓の筋線維芽細胞は、４８時間の血清飢餓を行い、さらに２０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢで３０時間刺激した。融合性のマウス肝臓の筋線維芽細胞は、０．１％ＢＳＡの存在下で２４時間の血清飢餓を行い、さらに０．０１％ＢＳＡの存在下で２０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢで３０時間刺激した。［３Ｈ］チミジン（０．５μＣｉ／穴）がインキュベートの最終２０時間において添加された。
【００８９】
細胞培養は、本明細書の実施例１に記載の通りに行われた。ヒト肝臓およびマウス肝臓の筋線維芽細胞の細胞培養株は、増加した服用量のＣＢ１受容体アンタゴニストＳＲ１４１７１６に露出して、肝臓の筋線維芽細胞のＤＮＡ合成が測定された。
【００９０】
ヒト肝臓の筋線維芽細胞において、ＳＲ１４１７１６は、２０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢによって誘発されたＤＮＡ合成を適用量に応じて抑制した（図３のＡ）。３００〜４００ｎＭの化合物の場合、最大抑制の半分となった。
【００９１】
また、野生型マウスから分離したマウスの筋線維芽細胞において、ＳＲ１４１７１６は、２０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢによって誘発されたＤＮＡ合成を抑制したが、そのＣＢ１−／−細胞の増殖への影響はわずかであった（図３のＢ）。
【００９２】
これらの結果は、ＣＢ１アンタゴニストＳＲ１４１７１６は、ヒト肝臓およびマウス肝臓の筋線維芽細胞の成長を阻止すること、およびＣＢ１受容体を通して作用していることを証明している。
【実施例５】
【００９３】
：誘発された肝臓線維症に対するＳＲ１４１７１６の治療効果の評価。
【００９４】
四塩化炭素による慢性中毒で誘発された肝臓線維症の試験モデルにおけるＣＢ１アンタゴニストＳＲ１４１７１６の抗線維形成の可能性が評価された。
【００９５】
投薬。
ＳＲ１４１７１６（１０ｍｇ／ｋｇ体重）が、使用前に新たにビヒクル溶液（１０％ジメチルスルホキシドおよび５％エチルアルコールを含有する１０ｍｌＰＢＳにトゥイーン８０を２滴）に溶解し、超音波処理を行った。
【００９６】
動物および実験計画。
ＣＢ１マウスは、Ｊａｎｖｉｅｒ（フランス）から取得したものであった。全ての実験は、倫理ガイドラインに従って行われた。１０〜１２週間の雄３６匹が使用され、動物は、以下のグループに区分された。すなわち、ビヒクル処理のオリーブ油群（ｎ＝３）、ビヒクル処理のＣＣｌ４群（ｎ＝１４）、ＳＲ１４１７１６処理のオリーブ油群（ｎ＝３）、ＳＲ１４１７１６Ａ処理のＣＣｌ４群（ｎ＝１６）である。特に言及がなければ、動物は、制御された温度および湿度の部屋に収容され、１２時間の昼／夜サイクルを維持し、餌および水は無制限に与えられた。週に２度の１ヶ月の間、内部腹膜注射により０．５ｍｌ／ｋｇ体重でオリーブ油（１ｖｏｌ：１０ｖｏｌ）を混和した四塩化炭素（ＣＣｌ４）（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ−Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、フランス）によって、線維症が誘発された。ＳＲ１４１７１６またはビヒクルは、腹腔内注射によって日常的に投与された。治療は四塩化炭素（ＣＣｌ４）注射の７日前に開始し、ＣＣｌ４処理の間は続けられた。
【００９７】
ビヒクル（１０％ＤＭＳＯ、５％エチルアルコール、０．１％トゥイーン８０を含有するＰＢＳ）とのＣＣ１４の同時投与により、一月後において、個体群の５０％に至る動物の大量死が生じた（図４）。これに対し、ＣＣｌ４マウスへの１０ｍｇ／ｋｇのＳＲ１４１７１６の同時投与の場合、１ヵ月の生存率がより高かった（８３％）。ＳＲ１４１７１６で治療されたかビヒクルで治療されたかとは関係なしに、仮病動物の死は生じなかった。
【００９８】
従って、これらの結果は、ＣＢ１アンタゴニストＳＲ１４１７１６の肝臓保護な役割があることを示している。
【実施例６】
【００９９】
：肝線維症治療におけるＳＲ１４１７１６経口投与の最適摂生の判定。
【０１００】
ＳＲ１４１７１６による長期治療の最適状態を決定するため、以下を行った。
【０１０１】
４０匹の雌ＣＤ１マウスは、以下のグループに区分された。すなわち、仮病（オリーブ油、ｎ＝３）、ＣＣｌ４（ｎ＝１２）、ＳＲ１４１７１６処理の仮病群（オリーブ油、ｎ＝３）、ＳＲ１４１７１６処理のＣＣ１４群２つ（ｎ＝２×１２）である。特に言及がなければ、動物は、制御された温度および湿度の部屋に収容され、１２時間の昼／夜サイクルを維持し、餌および水は無制限に与えられた。週に２度の１ヶ月の間、内部腹膜（ＩＰ）注射により０．５ｍｌ／ｋｇ体重でオリーブ油（１ｖｏｌ：１０ｖｏｌ）を混和した四塩化炭素（ＣＣｌ４）（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ−Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、フランス）によって、線維症が誘発された。ＣＣｌ４の仮病動物には、オリーブ油が与えられた。ＳＲ１４１７１６は、６５ｍｇ／ｋｇ濃度で、ＲＭ１マウスフード（ＤＩＥＴＥＸ、フランス）に含まれ、ＳＲ１４１７１６処理のグループに与えられた。３０ｇのネズミが一日に５ｇの餌を食べると想定すると、ＳＲ１４１７１６の最終的な期待服用量は、１０ｍｇ／ｋｇとなる。ＳＲ１４１７１６の処理は、四塩化炭素（ＣＣｌ４）注射の７日前に開始するか（１２匹）、最初の注射の７日後に開始し（１２匹）、ＣＣｌ４処理の間は継続される。５週間後、動物は一晩飢餓状態にし、最後のＣＣｌ４注射の４８時間後に殺された。肝臓試料は、いくつかの葉から取得され、ｉ）液体窒素で急速冷凍しＲＮＡ抽出溶液で均質化するか、ｉｉ）ヒドロキシプロリン測定のためＨ２Ｏで均質化して液体窒素で急速冷凍するか、ｉｉｉ）緩衝ホルマリンで固定させた。急速冷凍された試料は、使用されるまで−８０℃で保管された。血液試料も非活性ゲルバリアや血餅活性剤ディスク（Ｖｅｎｏｊｅｃｔ、Ｔｅｒｕｍｏ、フランス）を含有するシリコーン管で収集され、血清は遠心分離で分離され、使用するまで−２０℃で保管された。結果は、毒性が治療的に良好となる濃度を判定するために使用された。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】肝臓のＴＧＦβ−１の含量（ｐｇ／可溶タンパク質ｍｇ）のヒストグラム（パネルＡ）、および全切片の表面染色をパーセンテージで示した肝臓平滑筋αアクチン発現のヒストグラムであり（パネルＢ）、両方とも、野生型のマウス（ＷＴと示す）およびＣＢ１欠如マウス（ＣＢ１−／−と示す）を示している。ＯＯはオリーブ油のみを与えられたマウスのグループを、ＣＣｌ４はＣＣｌ４中毒のマウスの結果を示している。肝臓のＴＧＦβ−１の生成物が計測された（統計的有意性は、ｐ＜０．０５である）。平滑筋αアクチンの判定のため、動物あたり４〜５個の肝臓組織切片において染色を定量化した（統計的有意性は、ｐ＜０．０５である）。
【図２】それぞれ、野生型マウス（ＷＴと示す）およびＣＢ１欠如マウス（ＣＢ１ＫＯと示す）における、血清枯渇の開始時および４８時間後の肝臓の筋線維芽細胞の生存率（パネルＡ）およびカスパーゼ−３様活性（パネルＢ）のヒストグラムである。４８時間の血清枯渇によってアポトーシスが誘発された。３つの野生型マウスおよび２つのＣＢ１−／−マウスの肝臓から分離した細胞から得られた６〜９回の実験に基づいた肝臓の筋線維芽細胞の生存率の結果は、細胞生存率±標準誤差で示される（ＣＢ１−／−についての統計的有意性ｐは０．０５未満である）。カスパーゼ−３様活性の結果は、０日の活動の倍数として示される（平均±標準誤差は、３つの野生型マウスおよび３つのＣＢ１−／−マウスの肝臓から分離した細胞から得られた６〜９回の実験によるものである）。統計的有意性ｐは０．０５未満である。
【図３】ヒト肝臓の筋線維芽細胞のＤＮＡ合成（パネルＡ）、および野生型マウス（ＷＴ）およびＣＢ１欠如マウス（ＣＢ１ＫＯ）の肝臓の筋線維芽細胞のＤＮＡ合成（パネルＢ）に対する、ＣＢ１アンタゴニストＳＲ１４１７１６の増加量の効果を示すプロット線図である。ＤＮＡ合成は、ビヒクルＳＲ１４１７１６処理の細胞におけるＤＮＡ合成の割合として表現され、ＳＲ１４１７１６の増加量ｎＭに対してプロットしている。ヒト肝臓の筋線維芽細胞は、２０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢが存在する状況下で、様々な濃度のＣＢ１受容体アンタゴニストＳＲ１４１７１６で３０時間の刺激を受けた。ＤＮＡに組み込んだ［３Ｈ］チミジンは、３〜６回の実験の平均±標準誤差として測定され、対照標準に対する割合として表現されている（統計的有意性ｐは０．０５未満である）。誤差線はプロットに示されている。（丸印でプロットされる野生型マウスおよびダイア印でプロットされるＣＢ１欠如マウスからの）肝臓の筋線維芽細胞は、２０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢが存在する状況下で、様々な濃度のＣＢ１受容体アンタゴニストＳＲ１４１７１６で、３０時間の刺激を受けた。ＤＮＡに組み込んだ［３Ｈ］チミジンは、３〜６の実験の平均±標準誤差として測定され、対象標準に対する割合として表現されている（統計的有意性ｐは０．０５未満である）。誤差線はプロットに示されている。
【図４】四塩化炭素によるマウス死亡に対するＳＲ１４１７１６またはそのビヒクルの効果を示すプロット図である。ＳＲ１４１７１６の場合（点線）あるいは処理なしの場合（実線はＣＢ１アンタゴニストのみなしのビヒクルの投与）におけるＣＣｌ４で処理したマウスの生存率は、経過日数に対して示される。ＣＣｌ４投与時は、矢印で示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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