(57)【要約】      （修正有）【課題】不安定プラークを有する被験者を同定するため、または被験者における不安定プラークの存在を予測するためのバイオマーカーおよびその検査方法を提供する。【解決手段】被験者の血清試料からロイシンリッチα２グリコプロテイン（ＬＲＧ）の発現量を測定することにより、被験者の無症候性不安定プラークを予測、同定し、また被験者がアテローム血栓性脳梗塞または急性冠症候群の発病を予測することが可能な方法、キット及びセンサー。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から得られた試料について、ロイシンリッチα２グリコプロテイン（Ｌｅｕｃｉｎ−ｒｉｃｈ  ａｌｐｈａ−２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＬＲＧ）の発現量を測定することを含む、被験者における不安定プラークの存在を予測する方法。
【請求項２】
被験者から得られた試料について、ＬＲＧの発現量を測定することを含む、無症候性不安定プラークを有する被験者の同定方法。
【請求項３】
被験者から得られた試料について、ＬＲＧの発現量を測定することを含む、当該被験者におけるアテローム血栓性脳梗塞または急性冠症候群の発症を予測する方法。
【請求項４】
試料が、体組織、血液、血漿または血清である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
試料が血清である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
不安定プラークを有さない被験者の適切な母集団の正常値を基準とし、当該基準と比較してＬＲＧが高値であることより、被験者における不安定プラークの存在を予測する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
不安定プラークを有さない被験者の適切な母集団の正常値を基準とし、当該基準と比較してＬＲＧが高値であることより、被験者が無症候性不安定プラークを有することを決定する、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
不安定プラークを有さない被験者の適切な母集団の正常値を基準とし、当該基準と比較してＬＲＧが高値であることより、アテローム血栓性脳梗塞または急性冠症候群の発症を予測する、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
被験者から得られた試料について、ＬＲＧの発現量を測定するセンサー。
【請求項１０】
被験者から得られた試料について、ＬＲＧの発現量を測定するための試薬を含むキット。
【請求項１１】
個人から得られた試料について、ＬＲＧの発現量を測定することを含む、アテローム血栓性脳梗塞または急性冠症候群の発症を予測又は診断する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、不安定プラークを有する被験者を同定するため、または被験者における不安定プラークの存在を予測するためのバイオマーカーおよびその検査方法を提供する
【背景技術】
【０００２】  内頚動脈起始部は、アテローム性動脈硬化の好発部位である。アテローム（プラーク）は動脈の内膜に生じた動脈硬化性の肥厚であり、長い時間をかけて無症候性に進展するが、その経過中に繊維性被膜に覆われ安定化に向かうものと、不安定プラーク（脂質コアの増大、繊維性被膜の菲薄化、プラークへの炎症細胞浸潤、血管新生およびプラーク内出血を示すプラーク）に移行するものとに分かれる。この不安定プラークが破綻することにより、アテローム血栓性脳梗塞を起こす（塞栓性、血栓性、血行力学的）。アテローム血栓性脳梗塞は、元来、欧米人に多く、日本人には少ないとされていたが、近年の食生活の欧米化などに伴い、日本人にも増加傾向にある。一旦、脳梗塞を発症すれば、後遺症を残すことが多く、脳梗塞発症前に不安定プラークの患者を同定し、適切な治療を開始することが必要である。従来、プラークの性状を判別する為には、頚動脈エコー、核磁気共鳴断層撮影（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ、ＭＲＩ）および核磁気共鳴血管撮影（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｙ、ＭＲＡ）などが用いられてきたが、いずれの検査も、手技的、時間的および費用的にも負担が大きく、一般検診レベルで不安定プラーク患者を簡便に同定する方法の確立が望まれる。【０００３】  ロイシンリッチα２グリコプロテイン（Ｌｅｕｃｉｎ−ｒｉｃｈ  ａｌｐｈａ−２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＬＲＧ）は、ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔを持つタンパク質であり、ＴＧＦ−β／ＴＧＦ−β受容体の複合体と相互作用することによりＴＧＦ−βシグナル伝達を調整し、血管新生や肺線維化を促進することが報告されている（非特許文献１および２）。血液中のＬＲＧは、種々の疾患のバイオマーカーとして有用であることが報告されている。例えば、関節リウマチ（非特許文献３〜５）、スチル病（非特許文献６）、クローン病（非特許文献３）および潰瘍性大腸炎（非特許文献７）に対する疾患活動性バイオマーカーとしての有用性、また心不全患者を同定するバイオマーカーとしての有用性（非特許文献８）が報告されている。さらに、皮膚バリアの機能異常の有無を評価する指標（特許文献１）、膵臓がん診断用マーカーとしての有用性（特許文献２）および、ベーチェット病、クローン病または関節リウマチの検査用バイオマーカー（特許文献３）についても報告されている。しかしながら、動脈硬化性疾患における不安定プラークに対するバイオマーカーとしてのＬＲＧの有用性については報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１−８３２７９
【特許文献２】特表２０１６−５３８５３０
【特許文献３】特許第５２４６７０９号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｗａｎｇ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１３；４９９：３０６−３１１．
【非特許文献２】Ｈｏｎｄａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｐ．２０１７；５（２４）：ｅ１３５５６．
【非特許文献３】Ｓｅｒａｄａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ．２０１０；６９（４）：７７０−７７４．
【非特許文献４】Ｈａ，Ｙ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｋｏｒｅａｎ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．２０１４；２９（９）：１１９９−１２０４．
【非特許文献５】Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２０１５；６７（８）：２０５６−２０６０．
【非特許文献６】Ｈａ，Ｙ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２０１５；４４（５）：３９９−４０３．
【非特許文献７】Ｓｅｒａｄａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ．２０１２；１８（１１）：２１６９−２１７９．
【非特許文献８】Ｗａｔｓｏｎ，Ｃ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｉｒｃ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌ．２０１１；４（２）：１８８−１９７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  本発明は、一般検診レベルで施行可能な、無症候性不安定プラークを有する被験者を同定するため、または被験者における不安定プラークの存在を予測するための末梢血バイオマーカーとその測定方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  無症候性不安定プラークを有する被験者の末梢血を用いて、二次元電気泳動法を用いた網羅的プロテオミクス解析を行った。その結果、統計学的に優位に変動のあるタンパク質スポットを１８個特定した。この１８個のスポットを、質量分析法を用いてタンパク質の同定を行い、１６個のスポットのタンパク質を同定した。これらのタンパク質には、ロイシンリッチα２グリコプロテイン（Ｌｅｕｃｉｎ−ｒｉｃｈ  ａｌｐｈａ−２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＬＲＧ）、補体Ｃ９（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｃ９）、アンジオテンシノーゲン（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｏｇｅｎ）、ビタミンＤ結合タンパク質（Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、アンチトロンビンＩＩＩ（Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ＩＩＩ）、ゲルゾリン（Ｇｅｌｓｏｌｉｎ）、ヘモペキシン（Ｈｅｍｏｐｅｘｉｎ）、凝固第ＸＩＩ因子（Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩ）、グルタチオン・ペルオキシダーゼ３（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ３）およびセルロプラスミン（Ｃｅｒｕｌｏｐｌａｓｍｉｎ）が含まれる。これらのタンパク質は、いずれもバイマーカーとなり得る。【０００８】  同定したタンパク質の中で、不安定プラーク被験者群において二次元電気泳動にて最大の変動（１．５倍以上）を示したＬＲＧに関しては、酵素結合免疫吸着測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）を用いて多数例で解析を行い、簡便に不安定プラークを有する被験者を同定することができることを確認した。また、頚動脈内膜剥離術を施行された不安定プラークを有する患者のプラーク組織を用いて免疫染色を行い、ＬＲＧは、不安定プラーク内に浸潤したマクロファージが産生していることを確認した。【０００９】  これらの知見に基づき、本発明は無症候性不安定プラークを有する被験者の同定、または被験者における不安定プラークの存在を予測するためのバイオマーカーとその測定法を提供する。試験実施にあたっては、被験者よりインフォームド・コンセントを得た。本発明は以下の通りである。【００１０】  （１）被験者から得られた試料について、ロイシンリッチα２グリコプロテイン（Ｌｅｕｃｉｎ−ｒｉｃｈ  ａｌｐｈａ−２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＬＲＧ）の発現量を測定することを含む、被験者における不安定プラークの存在を予測する方法。
（２）被験者から得られた試料について、ＬＲＧの発現量を測定することを含む、無症候性不安定プラークを有する被験者の同定方法。
（３）被験者から得られた試料について、ＬＲＧの発現量を測定することを含む、当該被験者におけるアテローム血栓性脳梗塞または急性冠症候群の発症を予測する方法。
（４）試料が、体組織、血液、血漿または血清である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５）試料が血清である、（４）に記載の方法。
（６）不安定プラークを有さない被験者の適切な母集団の正常値を基準とし、当該基準と比較してＬＲＧが高値であることより、被験者における不安定プラークの存在を予測する、（１）に記載の方法。
（７）不安定プラークを有さない被験者の適切な母集団の正常値を基準とし、当該基準と比較してＬＲＧが高値であることより、被験者が無症候性不安定プラークを有することを決定する、（２）に記載の方法。
（８）不安定プラークを有さない被験者の適切な母集団の正常値を基準とし、当該基準と比較してＬＲＧが高値であることより、アテローム血栓性脳梗塞または急性冠症候群の発症を予測する、（３）に記載の方法。
（９）被験者から得られた試料について、ＬＲＧの発現量を測定するセンサー。
（１０）被験者から得られた試料について、ＬＲＧの発現量を測定するための試薬を含むキット。
（１１）個人から得られた試料について、ＬＲＧの発現量を測定することを含む、アテローム血栓性脳梗塞または急性冠症候群の発症を予測又は診断する方法。
【発明の効果】
【００１１】  本発明では、ＬＲＧが無症候性安定プラークを有する被験者の同定、または被験者における不安定プラークの存在を予測するためのバイオマーカーとして有用であること、またＬＲＧはＥＬＩＳＡなどを用いて簡便に測定可能であり、一般検診レベルでの施行が可能であることを示した。
不安定プラークの治療に関しては、薬物療法、頚動脈内膜剥離術、頚動脈ステント留置術など有効な治療法がある。しかしながらこれらの治療法は脳梗塞発症後では遅く、発症前に患者を同定し、いかに早く治療を開始するかが十分な治療効果を得る上で重要となる。検診や人間ドックなどにおいて施行可能なＬＲＧの測定を行うことにより、無症候性の不安定プラークを有する患者を同定し、速やかに治療を開始することでできれば、脳梗塞の発症を予防することができ、患者のクオリティ・オブ・ライフに貢献するとともに、医療経済的にも意義があると期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】無症候性不安定プラークを有する被験者の頸動脈のＭＲＡ（飛行時間型、Ｔｉｍｅ−ｏｆ  ｆｌｉｇｈｔ）とプラークイメージング（Ｂｌａｃｋ−ｂｌｏｏｄ法）を示す図である。矢印は不安定プラークを示す。不安定プラークは、ＭＲＡでは低信号を呈し、プラークイメージでは高信号を呈する。
【図２】二次元電気泳動像を示す図である。赤丸は、不安定プラークを有する被験者と不安定プラークを認めなかった対照被験者との間で有意差を認めたスポット（１８個）である。右下挿入写真図は、ＬＲＧスポットの拡大図である。
【図３】不安定プラークの免疫染色像を示す図である。上段：低倍率、下段：拡大倍率。左図：ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色、中央図：ＬＲＧの免疫染色（ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）染色）、右図：ＣＤ６８（マクロファージ）の免疫染色（ＤＡＢ）染色。矢印はプラーク、星印（＊）は血管内腔の位置を示す。
【図４】ＬＲＧとＣＤ６８の蛍光免疫染色像を示す図である。左図（緑色）：ＬＲＧ、中央図（赤色）：ＣＤ６８、右図：マージ（ｍｅｒｇｅ）。青色は核染色像を示す。
【図５】血清中ＬＲＧ量を、不安定プラークを有する被験者と不安定プラークを認めなかった対照被験者との間で比較した図である。ＬＲＧはＥＬＩＳＡを用いて測定した。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００１３】（１）血清タンパク質の収集
一般診療においてＭＲＩ／ＭＲＡ／プラークイメージングを施行した被験者の中で、無症候性に偶然発見された不安定プラークを有する被験者（ｎ＝１７）に対して、同意書を取得のもと、一般採血時に、１ｍＬ余分に採血し、この血清を−８０℃で冷凍保存した。不安定プラークは、プラークイメージング（Ｂｌａｃｋ−ｂｌｏｏｄ法）により、隣接する胸鎖乳突筋（ｓｔｅｒｎｏｃｌｅｉｄｏｍａｓｔｏｉｄ  ｍｕｓｃｌｅ）と比較して、５０％以上信号強度が増強しているものと定義した。同様に、不安定プラークを認めなかった被験者（ｎ＝１６）を対照群として、同意書の取得後同様な採血を行い、−８０℃で血清を冷凍保存した。図１は、不安定プラークを有する被験者のＭＲＡ画像とその元画像（矢印は低信号となったプラークを示す）、およびプラーク画像（矢印は高信号となったプラークを示す）である。不安定プラークを有する被験者（ｎ＝１７）と不安定プラークを有さない対照被験者（ｎ＝１６）の背景を表１に示す。【００１４】
【表１】
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【００１５】（２）二次元電気泳動を用いた網羅的プロテオミクス解析
二次元電気泳動を用いた解析は、不安定プラークを有する被験者６例および不安定プラークを有さない対照被験者６例の血清を用いて行った。
〔試料の調製〕
二次元電気泳動により微量タンパク質の解析を行うためには、血清中に多量に存在するアルブミンやグロブリンなどを除去する必要がある。そこで、マルチプルアフィニティーカートリッジ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ、Ｈｕｍａｎ  １４  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｐｉｎ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ、アジレント社）を用いて以下のタンパク質を血清試料から除去し、二次元電気泳動用の試料を調製した。タンパク質は、アルブミン、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇ、アンチトリプシン、ＩｇＡ、トランスフェリン、ハプトグロビン、フィブリノーゲン、α２マクログロブリン、α１−酸性糖タンパク質、ＩｇＭ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ、補体Ｃ３およびトランスサイレチンである。
〔二次元電気泳動〕
二次元電気泳動は、二次元ディファレンスゲル電気泳動（Ｔｏｗ−ｄｅｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２Ｄ−ＤＩＧＥ）法を用いて行った（発明者らが以前に報告した論文に記載の方法と同様な方法を用いた。Ｙａｔａ  Ｋ，Ｏｉｋａｗａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ２０１１  １４１０：１２−２３）。血清中に多量に混在するタンパク質を除去した後の試料を、溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ、３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％  ｗ／ｖ  ＣＨＡＰＳ、プロテアーゼ阻害剤カクテル、ｐＨ８．５）に溶解した。それぞれ５０μｇの血清タンパク質を、２００ｐｍｏｌ  ＣｙＤｙｅ  Ｆｌｕｏｒ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｄｙｅｓ（ＧＥヘルスケア社）を用いて、製品プロトコールに基づきタンパク質の蛍光標識を行った。一枚のゲルに不安定プラーク患者、コントロール患者およびゲル間の比較を行うための内部標準の３種類のタンパク質を添加し、ｐＨと分子量に基づき、タンパク質の泳動を行った。図２は、電気泳動後の図を示す。右下挿入図は、ＬＲＧのスポットを示す。不安定プラークを有する被験者のスポットを赤色で示し、不安定プラークを認めなかった対照被験者のスポットを緑色で示す。発現量が等量の場合、二群のスポットをマージ（Ｍｅｒｇｅ）させると黄色になる。発現量の差異に基づき、蛍光は緑色側や赤色側に触れることになる。図２の場合、不安定プラークを有する被験者でＬＲＧが増加しているので、スポットは赤色を呈している。
〔二次元電気泳動の画像解析〕
電気泳動後のゲルは、イメージアナライザー（Ｔｙｐｈｏｏｎ９４００、ＧＥヘルスケア社）を用いて撮影を行った。撮影された各タンパク質スポットの解析は、ＤｅＣｙｄｅｒ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥヘルスケア社）を用いて行った。同定されたすべてのスポットの蛍光強度について、不安定プラークを有する被験者に由来するスポットと不安定プラークを認めなかった対照被験者に由来するスポットとの間で二群間比較（スチューデントｔ検定）を行った。その結果  有意差のあるスポットとして、図２においてに赤丸で囲った１８個のスポットが確認された。各スポットの発現量の差異とＰ値を表２に示した。
〔スポットのタンパク質の同定〕
各スポットのタンパク質を同定するために、ゲルをクマシーブリリアントブルー染色し、各スポットを切り出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計（アプライドバイオシステムズ社、フレイミングハム、米国マサチューセッツ州）を用いてタンパク質を同定した。タンパク質データベース検索は、ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ（登録商標）ソフトウェア（アプライドバイオシステムズ社、カールスバッド、米国カリフォルニア州）を用いたＰａｒａｇｏｎ（登録商標）法により行った。１８個のスポットのうち、１６個のスポットでタンパク質を同定することが可能であった。同定されたタンパク質の名称を表２に示した。同定されたタンパク質の中で、不安定プラークを有する被験者において発現が亢進し（この場合、Ａｖ．Ｒａｔｉｏ値は正の値を示す）、かつ最も変動が大きいタンパク質はＬＲＧであることが示された。【００１６】
【表２】
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【００１７】（３）プラークの組織学的検索
不安定プラークを有する患者であって、頚動脈内膜剥離術を施行された患者の摘出プラーク組織を用いて組織学的検索を行った。ホルマリン固定した摘出標本を、血管が冠状断になる様にパラフィン包埋し、切片を作成した。この切片を用いてＨＥ染色ならびにＬＲＧおよびＣＤ６８（マクロファージのマーカー）の免疫染色を行った（図３および４）。
図３において、左図はＨＥ染色を示す。矢印はプラークを示す。星印（＊）は血管内腔の位置を示す。中央図は、ＬＲＧのＤＡＢ染色の結果を示す。この結果より、ＬＲＧはプラーク内に広範に発現していることが示された。右図は、ＣＤ６８のＤＡＢ染色の結果を示す。この結果より、プラーク内に広範にマクロファージが浸潤していることが示された。
図４は、ＬＲＧとＣＤ６８の蛍光免疫染色像を示す。マージ（ｍｅｒｇｅ）させた図より、ＬＲＧとＣＤ６８の発現はほぼ一致しており、浸潤したマクロファージがＬＲＧを産生していることが確認された。【００１８】（４）ＥＬＩＳＡを用いた多数例での解析
不安定プラークを有する被験者において、血清中でのＬＲＧの発現亢進をより確実に、かつ簡便に検査する方法を確立するため、ＥＬＩＳＡを用いた測定を行った。不安定プラークを有する被験者１７例、不安定プラークを認めなかった対照被験者１６例について解析を行った。ＥＬＩＳＡキットは市販のキット（ヒトＬＲＧアッセイキット、株式会社免疫生物研究所）を用いた。測定は、キットに添付されたアッセイプロトコールに従って行った。図５は、２群の各被験者におけるＬＲＧ発現量を示す。不安定プラークを認めなかった対照被験者群のＬＲＧ量は５７５００．０５±１０９８８．２ｎｇ／ｍＬであるのに対し、不安定プラークを有する被験者群のＬＲＧ量は９９６４３．８±４３４６８．５９ｎｇ／ｍＬであり、有意なＬＲＧ発現亢進が確認された（Ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）。血清中のＬＲＧ量を測定することにより、不安定プラークを有する被験者の同定が可能であることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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