(57)【要約】      （修正有）【課題】薬剤透過選択性が高いために特定の薬剤しか透過することができない血液脳関門、血液神経関門、血液網膜関門、血液髄液関門等を容易に透過することができる新規薬剤送達用キャリア、コンジュゲート及びこれらを含んでなる組成物、並びにこれらの投与方法の提供。【解決手段】薬剤送達用のキャリアを含んでなる、投与計画に従って対象に投与するための組成物であって、前記投与計画は、（１）前記対象を絶食させるか低血糖を誘発させる工程、（２）前記対象に前記組成物を投与する工程、及び（３）前記対象において血糖値の上昇を誘発させる工程を含み、前記キャリアは、その外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている、組成物。前記キャリアは前記薬剤を内包する小胞であって、前記小胞を形成する高分子の１０〜４０モル％がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されていることが好ましい。【選択図】図１
2019194220.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤送達用のキャリアを含んでなる、投与計画に従って対象に投与するための組成物であって、
該投与計画は、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与することおよび該対象において血糖値の上昇を誘発させることを含み、
該キャリアは、その外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている、組成物。
【請求項２】
薬剤とＧＬＵＴ１リガンドとのコンジュゲートを含んでなる、投与計画に従って対象に投与するための組成物であって、
該投与計画は、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与することおよび該対象において血糖値の上昇を誘発させることを含む、組成物。
【請求項３】
薬剤を脳に送達するための、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
薬剤に血液脳関門を通過させるための、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
薬剤に血液神経関門、血液網膜関門または血液髄液関門を通過させるための、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項６】
薬剤を脳血管内皮細胞に送達するための、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項７】
血糖値の上昇がグルコース投与により誘発される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
組成物がグルコースの投与と同時にまたはその前に投与される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
組成物が、静脈内に輸液投与され、輸液投与が１０分以上継続される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
キャリアが小胞であり、小胞を形成する高分子の１０〜４０モル％がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている、請求項１および３〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
キャリアが小胞であり、小胞を形成する高分子の４０〜１００モル％がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている、請求項１および３〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
キャリアが送達する薬剤を内包している、請求項１および３〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
キャリアが小胞であり、小胞が直径４００ｎｍ以下の小胞である、請求項１および３〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
コンジュゲートが、薬剤とＧＬＵＴ１リガンドとがリンカーを介して連結されてなるものである、請求項２〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
ＧＬＵＴ１リガンドがグルコースである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
薬剤が、生理活性物質、抗体、核酸、生体適合性の蛍光色素、および造影剤から選択される少なくとも１つの薬剤である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
１分子のＧＬＵＴ１リガンドと１分子の高分子とのコンジュゲートであって、コンジュゲートはＧＬＵＴ１リガンドが小胞の表面に露出するように小胞を形成することができる、コンジュゲート。
【請求項１８】
ＧＬＵＴ１リガンドがグルコースである、請求項１７に記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
グルコースがその６位の炭素を介して高分子とコンジュゲートされている、請求項１８に記載のコンジュゲート。
【請求項２０】
下記式(I)、下記式(II)、下記式（III）若しくは下記式（XVI）：
【化１】
2019194220.tif 000067
｛式中、ｎ１およびｍ１はそれぞれ、５〜２０，０００である。｝
【化２】
2019194220.tif 000068
｛式中、ｎ２およびｍ２はそれぞれ、５〜２０，０００である。｝
【化３】
2019194220.tif 000069
｛式中、ｎ３およびｍ３はそれぞれ、５〜２０，０００である。｝
【化４】
2019194220.tif 000070
｛式中、ｎ１６は、５〜２０，０００の整数、およびｍ１６は、２〜５，０００の整数である。｝
で示される請求項１９に記載のコンジュゲートまたは薬学的に許容可能なその塩。
【請求項２１】
請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含んでなる薬剤送達用小胞であって、
該コンジュゲートが、小胞を形成する全高分子の１０〜４０モル％である、小胞。
【請求項２２】
請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含んでなる薬剤送達用小胞であって、
該コンジュゲートが、小胞を形成する全高分子の４０〜１００モル％である、小胞。
【請求項２３】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２１若しくは２２に記載の小胞を製造するための、ＧＬＵＴ１リガンドの使用。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、特願２０１３−２４２３４７号（出願日：２０１３年１１月２２日）および特願２０１４−９６９３５号（出願日：２０１４年５月８日）の優先権の利益を享受する出願であり、これらは引用することによりその全体が本明細書に取り込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、薬剤送達用のキャリア、コンジュゲートおよびこれらを含んでなる組成物並びにこれらの製造方法および投与方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
血液と脳との間には、物質交換を制限する血液脳関門が存在することが知られている。これは脳血管内皮細胞が密着結合を形成し、細胞の隙間が極めて狭いこと、並びに、細胞自体が選択的な物質の取り込みおよび排出を行なっていることによると考えられている。
【０００４】
血液脳関門の透過選択性は高く、一部の物質（例えば、アルコール、カフェイン、ニコチンおよびグルコース）を除いてはほとんど通過することができない。そして、このことが、脳治療薬による脳疾患の治療、脳診断薬による脳疾患の診断または造影剤による脳の造影を困難なものにしてきた。
【０００５】
グルコースが血液脳関門を通過する特性を利用して、抗体を脳へ送達する技術が開発されている（特許文献１）。しかしながら、この抗体は単に抗体をグリコシル化するだけの技術であり、効果は限定的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００７／０６８４２９
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、薬剤送達用のキャリア、コンジュゲートおよびこれらを含んでなる組成物並びにこれらの投与方法を提供する。
【０００８】
本発明者らは、低血糖を誘発させた対象にグルコースでその外表面を修飾したミセルなどの小胞を投与し、その後、血糖値を上昇させると、小胞が脳に極めて効率良く送達されることを見出した。本発明は、この知見に基づく発明である。
【０００９】
すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）薬剤送達用のキャリアを含んでなる、投与計画に従って対象に投与するための組成物であって、
該投与計画は、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与することおよび該対象において血糖値の上昇を誘発させることを含み、
該キャリアは、その外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている、組成物。
（２）薬剤とＧＬＵＴ１リガンドとのコンジュゲートを含んでなる、投与計画に従って対象に投与するための組成物であって、
該投与計画は、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与することおよび該対象において血糖値の上昇を誘発させることを含む、組成物。
（３）薬剤を脳に送達するための、上記（１）または（２）に記載の組成物。
（４）薬剤に血液脳関門を通過させるための、上記（１）または（２）に記載の組成物。
（５）薬剤に血液神経関門、血液網膜関門または血液髄液関門を通過させるための、上記（１）または（２）に記載の組成物。
（６）薬剤を脳血管内皮細胞に送達するための、上記（１）または（２）に記載の組成物。
（７）血糖値の上昇がグルコース投与により誘発される、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の組成物。
（８）組成物がグルコースの投与と同時にまたはその前に投与される、上記（７）に記載の組成物。
（９）組成物が、静脈内に輸液投与され、輸液投与が１０分以上継続される、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の組成物。
（１０）キャリアが小胞であり、小胞を形成する高分子の１０〜４０モル％がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている、上記（１）および（３）〜（９）のいずれかに記載の組成物。
（１１）キャリアが小胞であり、小胞を形成する高分子の４０〜１００モル％がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている、上記（１）および（３）〜（９）のいずれかに記載の組成物。
（１２）キャリアが、送達する薬剤を内包している、上記（１）および（３）〜（１１）のいずれかに記載の組成物。
（１３）キャリアが小胞であり、小胞が、直径４００ｎｍ以下の小胞である、上記（１）および（３）〜（１２）のいずれかに記載の組成物。
（１４）コンジュゲートが、薬剤とＧＬＵＴ１リガンドとがリンカーを介して連結されてなるものである、上記（２）〜（９）のいずれかに記載の組成物。
（１５）ＧＬＵＴ１リガンドがグルコースである、上記（１）〜（１４）のいずれか一項に記載の組成物。
（１６）薬剤が、生理活性物質、抗体、核酸、生体適合性の蛍光色素、および造影剤から選択される少なくとも１つの薬剤である、上記（１）〜（１５）のいずれかに記載の組成物。
（１７）１分子のＧＬＵＴ１リガンドと１分子の高分子とのコンジュゲートであって、コンジュゲートはＧＬＵＴ１リガンドが小胞の表面に露出するように小胞を形成することができる、コンジュゲート。
（１８）ＧＬＵＴ１リガンドがグルコースである、上記（１７）に記載のコンジュゲート。
（１９）グルコースがその６位の炭素を介して高分子とコンジュゲートされている、上記（１８）に記載のコンジュゲート。
（２０）下記式(I)、下記式(II)、下記式（III）若しくは下記式（XVI）：
【化１】
2019194220.tif 000003
｛式中、ｎ１およびｍ１はそれぞれ、５〜２０，０００である。｝
【化２】
2019194220.tif 000004
｛式中、ｎ２およびｍ２はそれぞれ、５〜２０，０００である。｝
【化３】
2019194220.tif 000005
｛式中、ｎ３およびｍ３はそれぞれ、５〜２０，０００である。｝
【化４】
2019194220.tif 000006
｛式中、ｎ１６は、５〜２０，０００の整数、およびｍ１６は、２〜５，０００の整数である。｝で示される上記（１９）に記載のコンジュゲートまたは薬学的に許容可能なその塩。
（２１）上記（１７）〜（２０）のいずれかに記載のコンジュゲートを含んでなる薬剤送達用小胞であって、
該コンジュゲートが、小胞を形成する全高分子の１０〜４０モル％である、小胞。
（２２）上記（１７）〜（２０）のいずれかに記載のコンジュゲートを含んでなる薬剤送達用小胞であって、
該コンジュゲートが、小胞を形成する全高分子の４０〜１００モル％である、小胞。
（２３）上記（１）〜（１６）のいずれかに記載の組成物、または上記（２１）若しくは（２２）に記載の小胞を製造するための、ＧＬＵＴ１リガンドの使用。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、外表面がグルコースで修飾されたポリイオンコンプレックス型ミセル（ＰＩＣミセル）とその調製方法を示す。
【図２】図２は、実施例１で得られたＧｌｃ（６）−Ｃｙ５−ＰＩＣミセルの粒径分布の動的光散乱測定（ＤＬＳ）の結果と透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による粒子像を示す。ここで、Ｇｌｃ（６）は、グルコースの６位の炭素でミセルを形成する高分子と結合していることを示す。
【図３】図３は、実施例１で得られたＧｌｃ（６）−Ｃｙ５−ＰＩＣミセルの脳への選択的かつ効果的蓄積を示す図である。
【図４】図４は、グルコースをその３位または６位の炭素で高分子に結合させて得たミセルの脳への蓄積を示す図である。
【図５】図５は、ミセルが脳に取り込まれる際の脳実質部の蛍光顕微鏡画像（図５Ａ）および血糖値と脳への取り込み量の推移（図５Ｂ）を示す図である。
【図６】図６は、直径１００ｎｍのPICsomeの脳への蓄積を示す図である。
【図７】図７は、グルコースで外表面を修飾したｓｉＲＮＡミセルの脳への蓄積を示す。図７Ａは、ｓｉＲＮＡミセルとその調製方法を示し、図７Ｂは、脳への蓄積量の推移を示す。
【図８】図８は、脳細胞内へのｓｉＲＮＡミセルの蓄積を示す蛍光顕微鏡像である。
【図９】図９は、グルコース１分子をコンジュゲートした高分子の脳への蓄積を示す図である。
【図１０】図１０は、グルコースをリンカーを介して連結させてなるＩｇＧ抗体の脳への蓄積を示す図である。Ｇ−ＩｇＧは、グルコースを連結したＩｇＧを示す。
【図１１】図１１は、グルコースを腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した３０分後にＧｌｃ（６）−Ｃｙ５−ＰＩＣミセルを静脈内（ｉ．ｖ．）投与した場合の脳実質における蛍光強度変化を示す図である。
【図１２】図１２は、Ｇｌｃ（６）−Ｃｙ５−ＰＩＣミセルの一部が、脳血管内皮細胞に蓄積できることを示す図である。
【図１３】図１３は、マウス大脳皮質における静脈投与後のPICミセルの局在を示す図である。
【図１４】図１４は、マウス大脳皮質の切片における静脈投与後のPICミセルの局在を示す図である。
【図１５】図１５は、マウス大脳皮質における静脈投与後のPICミセルの継時的局在変化を示す図である。
【発明の具体的な説明】
【００１１】
本発明では、「薬物輸送体」とは、薬物送達のためのキャリアを意味し、薬物を内包できる微粒子、例えば、小胞、デンドリマー、ハイドロゲルおよびナノスフェアなどが挙げられる。薬物輸送体は、一般的には、直径１０ｎｍ〜４００ｎｍの大きさを有する。
【００１２】
本明細書では、「小胞」とは、ミセルや中空微粒子を意図している。小胞は、好ましくは生体適合性の外殻を有し、その外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾を受けている。これにより、小胞は、ＧＬＵＴ１と相互作用することができる。
【００１３】
本明細書では、「ミセル」とは、１層の分子膜により形成される小胞を意味する。ミセルとしては、界面活性剤などの両親媒性分子により形成されるミセル、および、ポリイオンコンプレックスにより形成されるミセル（ＰＩＣミセル）が挙げられる。ミセルは、血中滞留時間の観点では、その外表面をポリエチレングリコールで修飾することが好ましいと知られている。
【００１４】
本明細書では、「リポソーム」とは、２層の分子膜により形成される小胞を意味する。分子膜は通常はリン脂質による二重膜である。
【００１５】
本明細書では、「ポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム」（以下、「PICsome」ともいう）とは、ポリイオンコンプレックスにより形成される中空の微粒子を意味する。PICsomeは、血中滞留時間の観点では、その外表面をポリエチレングリコールで修飾することが好ましいと知られている。
【００１６】
本明細書では、「ポリイオンコンプレックス」（以下、「PIC」ともいう）とは、ＰＥＧとアニオン性ブロックとの共重合体と、ＰＥＧとカチオン性ブロックとの共重合体とを水溶液中で荷電を中和するように混合すると両ブロック共重合体のカチオン性ブロックとアニオン性ブロックとの間で形成されるイオン層である。ＰＥＧと上記の荷電性連鎖とを結合させる意義は、ポリイオンコンプレックスが凝集して沈殿することを抑制すること、および、それにより、ポリイオンコンプレックスが粒径数十ｎｍの単分散なコア−シェル構造を有するナノ微粒子を形成することである。この際、ＰＥＧはナノ微粒子の外殻（シェル）を覆うため、生体適合性が高く、血中滞留時間を向上させる点で都合がよいことでも知られている。また、ポリイオンコンプレックス形成において、一方の荷電性ブロックコポリマーは、ＰＥＧ部分を必要とせず、ホモポリマー、界面活性剤、核酸および／または酵素に置き換えてもよいことが明らかとなっている。そして、ポリイオンコンプレックス形成においては、アニオン性ポリマーおよびカチオン性ポリマーの少なくとも１つがＰＥＧとの共重合体を形成しており、その両方がＰＥＧとの共重合体を形成していてもよい。また、ＰＥＧ含有量を増加させるとPICミセルが形成されやすく、ＰＥＧ含有量を低減させるとＰＩＣｓｏｍｅが形成されやすいことがよく知られている。ポリイオンコンプレックスの作製によく用いられるアニオン性ポリマーまたはブロックとしては、例えば、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸および核酸（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ）が挙げられ、カチオン性ポリマーまたはブロックとしては、例えば、ポリリジンおよびポリ（５−アミノペンチルアスパラギン酸）が挙げられる。ここで、ｍＲＮＡとは、翻訳によりタンパク質合成に用いられるメッセンジャーＲＮＡを意味し、ｓｉＲＮＡとは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導することができる二本鎖ＲＮＡ（核酸）を意味する。ｓｉＲＮＡは、特に限定されないが、２０〜３０ｂｐ、好ましくは、２１〜２３ｂｐ、２５ｂｐ、２７ｂｐからなる二本鎖ＲＮＡであって、標的遺伝子の配列と相同な配列を有する二本鎖ＲＮＡである。
【００１７】
本明細書では、「薬剤送達用の」とは、生体適合性であること、および、薬剤を小胞に内包できることを意味する。本明細書では、「薬剤送達用の」とは、薬剤の血中滞留時間を、裸の薬剤の血中滞留時間と比べて長期化する作用を利用した用途を意味することがある。
【００１８】
本明細書では、「低血糖を誘発させる」とは、対象において、その処置がされなければ示したはずの血糖よりも血糖値を低下させることをいう。低血糖を誘発させる方法としては、糖尿病薬の投与などが挙げられる。例えば、低血糖を誘発させる際に、低血糖を誘発させるという目的を達する限りにおいて、例えば、他の薬剤を摂取し、または水などの飲料を飲むことは許容される。低血糖を誘発させることは、血糖に実質的に影響しない他の処置を伴ってもよい。
【００１９】
本明細書では、「絶食させる」とは、対象に絶食、例えば、３時間以上、４時間以上、５時間以上、６時間以上、７時間以上、８時間以上、９時間以上、１０時間以上、１１時間以上、１２時間以上、１３時間以上、１４時間以上、１５時間以上、１６時間以上、１７時間以上、１８時間以上、１９時間以上、２０時間以上、２１時間以上、２２時間以上、２３時間以上、２４時間以上、２５時間以上、２６時間以上、２７時間以上、２８時間以上、２９時間以上、３０時間以上、３１時間以上、３２時間以上、３３時間以上、３４時間以上、３５時間以上、３６時間以上、３７時間以上、３８時間以上、３９時間以上、４０時間以上、４１時間以上、４２時間以上、４３時間以上、４４時間以上、４５時間以上、４６時間以上、４７時間以上または４８時間以上の絶食をさせることを意味する。絶食により対象は低血糖を引き起こす。絶食期間は、対象の健康状態に鑑みて医師等により決定され、例えば、対象が空腹時血糖に達する時間以上の期間とすることが好ましい。絶食期間は、例えば、脳血管内皮細胞の血管内表面でのＧＬＵＴ１の発現が増大する、またはプラトーに達する以上の時間としてもよい。絶食期間は、例えば、１２時間以上、２４時間以上または３６時間以上である上記期間とすることができる。また、絶食は、血糖値やＧＬＵＴ１の血管内表面での発現に実質的に影響しない他の処置を伴ってもよい。
【００２０】
本明細書では、「血糖値の上昇を誘発させる」とは、低血糖を誘発させた対象、または、低血糖状態を維持させた対象において血糖値を上昇させることをいう。血糖値は、当業者に周知の様々な方法により上昇させることができるが、例えば、血糖値の上昇を誘発するものの投与、例えば、グルコース、フルクトース（果糖）、ガラクトースなどの血糖値の上昇を誘発する単糖の投与、マルトースなどの血糖値の上昇を誘発する多糖の投与、若しくは、デンプンなどの血糖値の上昇を誘発する炭水化物の摂取、または、食事により上昇させることができる。
【００２１】
本明細書では、「血糖操作」とは、対象に対して、低血糖を誘発させ、その後、血糖値を上昇させることをいう。対象に対して低血糖を誘発させた後は、対象の血糖値を低血糖に維持することができる。対象の血糖値を低血糖に維持する時間は、例えば、０時間以上、１時間以上、２時間以上、３時間以上、４時間以上、５時間以上、６時間以上、７時間以上、８時間以上、９時間以上、１０時間以上、１１時間以上、１２時間以上、１３時間以上、１４時間以上、１５時間以上、１６時間以上、１７時間以上、１８時間以上、１９時間以上、２０時間以上、２１時間以上、２２時間以上、２３時間以上、２４時間以上、２５時間以上、２６時間以上、２７時間以上、２８時間以上、２９時間以上、３０時間以上、３１時間以上、３２時間以上、３３時間以上、３４時間以上、３５時間以上、３６時間以上、３７時間以上、３８時間以上、３９時間以上、４０時間以上、４１時間以上、４２時間以上、４３時間以上、４４時間以上、４５時間以上、４６時間以上、４７時間以上、４８時間以上とすることができる。その後、血糖値を上昇させることができる。本明細書では、「血糖を維持する」とは、対象において低血糖を維持するという目的を達する限りにおいて、例えば、他の薬剤を摂取し、または水などの飲料を飲むことは許される。低血糖を誘発させることは、血糖に実質的に影響しない他の処置を伴ってもよい。
【００２２】
本明細書では、「対象」とは、ヒトを含む哺乳動物である。対象は、健常の対象であってもよいし、何らかの疾患に罹患した対象であってもよい。ここで疾患としては、脳神経疾患、例えば、精神病性障害、うつ病、気分障害、不安、睡眠障害、認知症および物質関連障害が挙げられる。また、認知症としては、特に限定されないがアルツハイマー病およびクロイツフェルト・ヤコブ病が挙げられる。
【００２３】
本明細書では、「血液脳関門」とは、血行と脳の間に存在して物質の透過に対して選択性を持つ機能的障壁をいう。血液脳関門の実態は、脳血管内皮細胞などであると考えられている。血液脳関門の物質透過性については、不明な点が多いが、グルコース、アルコールおよび酸素は血液脳関門を通過し易いことが知られ、脂溶性物質や小分子（例えば、分子量５００未満）は、水溶性分子や高分子（例えば、分子量５００以上）に比べて通過し易い傾向があると考えられている。多くの脳疾患治療薬や脳診断薬が血液脳関門を通過せず、このことが脳疾患の治療や脳の分析等の大きな障害となっている。本明細書では、「血液神経関門」とは、血行と末梢神経の間に存在して物質の透過に対して選択性を持つ機能的障壁をいう。本明細書では、「血液髄液関門」とは、血行と脳脊髄液との間に存在して物質の透過に対して選択性を持つ機能的障壁をいう。本明細書では、「血液網膜関門」とは、血行と網膜組織の間に存在して物質の透過に対して選択性を持つ機能的障壁をいう。血液神経関門、血液髄液関門および血液網膜関門の実体は、それぞれの関門に存在する血管内皮細胞などであると考えられており、その機能は血液脳関門と同様であると考えられている。
【００２４】
本明細書では、「ＧＬＵＴ１リガンド」とは、ＧＬＵＴ１と特異的に結合する物質を意味する。ＧＬＵＴ１リガンドとしては、様々なリガンドが知られ、特に限定されないが例えば、グルコースおよびヘキソースなどの分子が挙げられ、ＧＬＵＴ１リガンドは、いずれも本発明でグルコースの代わりにキャリアまたはコンジュゲートの調製に使用することができる。ＧＬＵＴ１リガンドは、好ましくはＧＬＵＴ１に対してグルコースと同等またはそれ以上の親和性を有する。２−Ｎ−４−（１−アジ−２，２，２−トリフルオロエチル）ベンゾイル−１，３−ビス（Ｄ−マンノース−４−イルオキシ）−２−プロピルアミン（ＡＴＢ−ＢＭＰＡ）、６−（Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）−２−デオキシグルコース（６−ＮＢＤＧ）、４，６−Ｏ−エチリデン−α−Ｄ−グルコース、２−デオキシ−Ｄ−グルコースおよび３−Ｏ−メチルグルコースもＧＬＵＴ１と結合することが知られ、これらの分子もＧＬＵＴ１リガンドとして本発明に用いることができる。
【００２５】
本発明によれば、グルコースでその外表面を修飾した上記キャリアは、対象に投与するだけでも脳への蓄積を示すことを見出した。従って、本発明による投与計画では、絶食若しくは低血糖を誘発させなくてよく、および／または、血糖値の上昇を誘発させなくてもよい。また、本発明者らは、グルコースが表面に露出するようにグルコースでその外表面を修飾したキャリア、具体的にはミセルまたはポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム（PICsome）などの小胞をある投与計画に従って投与すると、顕著にこれらのキャリアが血液脳関門を超えて脳内（脳実質部）に送達されることを見出した。従って、本発明による投与計画は、好ましくは、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与することを含むが、より好ましくは、本発明による投与計画は、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与することおよび該対象において血糖値の上昇を誘発させることを含む。本発明による投与計画では、該組成物は、該対象における血糖値の上昇の誘発と、同時に、連続してまたは逐次的に該対象に投与され得る。投与計画は、該対象への組成物の投与と該対象における血糖値の上昇の誘発との間にインターバルを有してもよいし、有さなくてもよい。該組成物が該対象における血糖値の上昇の誘発と同時に投与される場合には、該組成物は、血糖値の上昇の誘発を引き起こす薬剤と混合した形態で該対象に投与してもよいし、該対象における血糖値の上昇の誘発を引き起こす薬剤とは別の形態で投与してもよい。また、該組成物は、該対象における血糖値の上昇の誘発と、連続してまたは逐次的に該対象に投与される場合には、該組成物は該対象における血糖値の上昇の誘発より前に該対象に投与してもよいし、後に投与してもよいが、好ましくは、該組成物は該対象における血糖値の上昇の誘発より前に該対象に投与することができる。該対象への該組成物の投与よりも先に該対象において血糖値の上昇を誘発させる場合には、該対象において血糖値の上昇を誘発させてから、１時間以内、４５分以内、３０分以内、１５分以内または１０分以内に該対象に該組成物を投与することが好ましい。また、該対象への該組成物の投与よりも後に該対象において血糖値の上昇を誘発させる場合には、該対象に該組成物を投与してから、６時間以内、４時間以内、２時間以内、１時間以内、４５分以内、３０分以内、１５分以内または１０分以内に該対象において血糖値の上昇を誘発させることが好ましい。上記の投与計画のサイクルは、２回以上行なってもよい。グルコース投与とサンプル投与の前後関係は、血液脳関門を通過させるタイミングにより決定することができる。
【００２６】
大脳皮質は６層で構成され、表層から、分子層（第１層）、外顆粒層（第２層）、外錐体細胞層（第３層）、内顆粒層（第４層）、内錐体細胞層（第５層）および多形細胞層（第６層）が存在するが、本発明によれば、これらのいずれの層においても脳実質にキャリアを送達することができる。これらの層の中では特に、外錐体細胞層（第３層）および内顆粒層（第４層）において本発明によるキャリアの送達が顕著に有効である。
【００２７】
本発明では、ミセルまたはPICsomeのような巨大なキャリア（直径約４０ｎｍ〜１００ｎｍ）が、極めて効率良く脳に送達できることもまた、非常に大きな驚きであった。このような小胞でさえ脳に送達できたという事実は、グルコースで修飾した様々な巨大分子およびキャリアを上記投与計画に従って投与することにより、これら巨大分子およびキャリアに血液脳関門を効果的に通過させ得ることを意味する。
【００２８】
以下、本発明におけるグルコースの血液脳関門における役割を説明する。本発明におけるグルコースの役割は、脳の血管内皮細胞の血管内表面に発現するグルコーストランスポーターであるＧＬＵＴ１に結合することであると考えられる。従って、本発明では、ＧＬＵＴ１リガンドもグルコースと同じ役割を果たすことができる。また、本発明では、ＧＬＵＴ１リガンドは、脳の血管内皮細胞の血管内表面に発現するグルコーストランスポーターに結合することができるように、その外表面に露出するように結合させることができる。従って、ＧＬＵＴ１にＧＬＵＴ１リガンドを提示することができる分子、複合体および小胞その他であれば、ＧＬＵＴ１と結合し得、結合後にグルコースによりＧＬＵＴ１が細胞内に取り込まれる際に、一緒に血管内皮細胞内に取り込まれるものと考えられる。また、血管内皮細胞に取り込まれると、取り込まれた小胞は、血液脳関門を通過して脳実質に移行する。小胞を修飾するグルコース分子が多いと、脳実質に到達する小胞の割合がわずかであるが低下した。このことは、小胞を修飾するグルコース分子が多いと、小胞がエンドサイトーシスにより細胞に取り込まれ、そのまま、細胞を脳実質に向けて通過すること、および、小胞が血管内皮細胞から脳実質に移行する際に、小胞と血管内皮細胞との解離の効率が低下することを示唆するものである。言い換えれば、エンドサイトーシスにより細胞に取り込まれた小胞の一部は、脳血管内皮細胞と解離せず、脳血管内皮細胞に蓄積する。従って、本発明の組成物またはコンジュゲートは、脳血管内皮細胞に送達することに用いることができる。また、本発明におけるグルコースの役割は、血液神経関門、血液網膜関門および血液髄液関門においても、同様である。特に、血液神経関門、血液網膜関門および血液髄液関門においても、低血糖時の血管内皮細胞にはＧＬＵＴ１が発現する。従って、本発明の組成物またはコンジュゲートは、血液神経関門、血液網膜関門および血液髄液関門を通過させるために用いることができる。本発明の組成物またはコンジュゲートはまた、血液神経関門、血液網膜関門および血液髄液関門に存在する血管内皮細胞に送達することに用いることもできる。
【００２９】
本発明者はまた、グルコースをその３位の炭素を介してコンジュゲートした高分子を用いて得られるミセルよりも、グルコースをその６位の炭素を介してコンジュゲートした高分子（例えば、図１（ａ）参照）を用いて得られるミセルの方が脳への取り込み効率が高いことを見出した。ＧＬＵＴ１とグルコースとの結合には、１位、３位および４位の炭素原子の置換基であるＯＨ基が強く関与していることが知られている。ＧＬＵＴ１との結合に使われない６位の炭素原子を介して高分子を修飾して得たミセルの方がより効果的に脳に蓄積しやすいことは、脳蓄積へのＧＬＵＴ１の関与を示す。また、ＧＬＵＴ１との認識に重要と言われる３位の炭素原子を介して高分子を修飾して得たミセルでも脳への蓄積を示した。このことは、ＧＬＵＴ１との結合への関与が低い２位の炭素原子を介して高分子を修飾して得たミセルではより多くのミセルの脳への蓄積が起こることを示す。従って、グルコースは、その１位、３位および４位の炭素原子のいずれか１つの炭素原子を介して、好ましくはその２位の炭素または６位の炭素原子を介して高分子や薬剤とコンジュゲートさせることができる。ある態様では、コンジュゲートしたグルコースの少なくとも、１位、３位および４位のＯＨ基が還元末端である。このように本発明では、ＧＬＵＴ１リガンドは、そのリガンドとしての機能を失わないように他の分子を修飾させることができ、当業者であればＧＬＵＴ１との結合様式に基づき容易に薬剤との結合箇所を決定できる。本明細書では、ｎ位の炭素原子を介して結合したグルコースを「Ｇｌｃ（ｎ）」｛但し、ｎは、１〜４および６のいずれかの整数である｝と表記することがある。例えば、本明細書では、６位の炭素原子を介して結合したグルコースを「Ｇｌｃ（６）」と表記し、２位の炭素原子を介して結合したグルコースを「Ｇｌｃ（２）」と表記し、３位の炭素原子を介して結合したグルコースを「Ｇｌｃ（３）」と表記することがある。
【００３０】
本発明では、グルコースの代わりにＧＬＵＴ１に結合するグルコースの誘導体を用いてもよいであろう。
【００３１】
本発明では、外表面をＧＬＵＴ１リガンドで修飾することができるキャリアとしては、薬剤送達用のミセル、リポソームおよびPICsomeなどの小胞、並びにデンドリマー、ナノスフェアおよびハイドロゲルが挙げられる。本発明において、薬剤送達用のキャリアを用いる利点は、例えば、キャリア内部に薬剤を内包させ、標的部位での薬剤濃度を高めること、または、標的部位以外での薬剤による副作用を低減することである。本発明で用いられるキャリアは、特に限定されないが、例えば、その直径が４００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１５０ｎｍ以下、１００ｎｍ以下または８０ｎｍ以下であり、例えば、２０ｎｍ以上、３０ｎｍ以上または４０ｎｍ以上である。本発明で用いられるキャリアは、例えば３０ｎｍ〜１５０ｎｍ、または、例えば３０ｎｍ〜１００ｎｍの直径を有する。
【００３２】
本発明で用いられるミセルとしては、薬剤送達用のミセルが挙げられる。薬剤送達用のミセルとしては、ブロック共重合体により形成されるミセルが知られている。ミセルを形成するブロック共重合体は、特に限定されないが、PICミセルの場合、荷電性ポリマーブロック（例えば、ポリアニオンブロックまたはポリカチオンブロック）と生体適合性ブロック（例えば、ポリエチレングリコールブロック）との共重合体または薬学的に許容可能なその塩とすることができる。また、ブロック共重合体としては、生分解性であるブロック共重合体を用いることが好ましく、そのような共重合体としては様々な共重合体が知られ、いずれを用いることも原理的に可能である。例えば、生体適合性が高く、生分解性であるブロック共重合体としては、例えば、ポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸、ポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸、およびポリエチレングリコール−ポリ（（５−アミノペンチル）−アスパラギン酸）ブロック共重合体などを用いることができる。ポリイオンコンプレックス型ミセル（PICミセル）として、ポリアニオンとポリカチオンとの静電的相互作用により形成されるポリイオンコンプレックス層を有するミセルが知られている。疎水性部分同士をミセル内部で安定化させる観点で、それぞれの荷電性ブロックには、外殻を形成するＰＥＧとは別の末端にコレステリル基などの疎水性部分を連結させてもよい（例えば、実施例のｓｉＲＮＡミセルを参照）。蛍光色素でのブロック共重合体へのラベルは、ブロック共重合体のポリエチレングリコール側と反対の末端を蛍光色素で修飾することにより行なうことができる（例えば、図１（ａ）の化合物のＮＨ２末端）。ＰＩＣミセルでは、ＰＥＧ側の末端にＧＬＵＴ１リガンドを連結させることで、ＧＬＵＴ１リガンドはミセルの外表面に露出する。
【００３３】
本発明で用いられるポリイオンコンプレックス型ポリマーソームとしては、薬剤送達用のPICsomeが挙げられる。薬剤送達用のPICsomeとしては、ブロック共重合体により形成されるPICsomeが知られている。PICsomeを形成するブロック共重合体としては、PEGブロックとポリカチオンブロックとのブロック共重合体およびホモポリアニオン、または、PEGブロックとポリアニオンブロックとのブロック共重合体およびホモポリカチオンが挙げられる。ブロック共重合体としては、生分解性であるブロック共重合体を用いることが好ましく、そのような共重合体としては様々な共重合体が知られ、いずれを用いることも原理的に可能である。例えば、生体適合性が高く、生分解性であるブロック共重合体としては、例えば、ポリ（アスパラギン酸−テトラエチレンペンタアミン（Ａｓｐ−ＴＥＰ））ブロック共重合体、および、ポリエチレングリコール−ポリ（（５−アミノペンチル）−アスパラギン酸）ブロック共重合体を用いることができる。PICsomeでは、PEG側の末端にＧＬＵＴ１リガンドを連結させることで、ＧＬＵＴ１リガンドはPICsomeの外表面に露出する。
【００３４】
本発明によれば、下記式(I)〜(XV)で表される化合物またはその塩がそれぞれ提供される。塩は、好ましくは薬学的に許容可能な塩である。
【００３５】
Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ−ポリアスパラギン酸
【化５】
2019194220.tif 000007
｛式中、ｎ１およびｍ１はそれぞれ、５〜２０，０００である。｝
【００３６】
Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ−ポリグルタミン酸
【化６】
2019194220.tif 000008
｛式中、ｎ２およびｍ２はそれぞれ、５〜２０，０００である。｝
【００３７】
Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ−ポリ（（５−アミノペンチル）−アスパラギン酸）
【化７】
2019194220.tif 000009
｛式中、ｎ３およびｍ３はそれぞれ、５〜２０，０００である。｝
【００３８】
ＰＥＧ−ポリアスパラギン酸
【化８】
2019194220.tif 000010
｛式中、ｎ４およびｍ４はそれぞれ、５〜２０，０００である。｝
【００３９】
ＰＥＧ−ポリグルタミン酸
【化９】
2019194220.tif 000011
｛式中、ｎ５およびｍ５はそれぞれ、５〜２０，０００である。｝
【００４０】
ＰＥＧ−ポリ（（５−アミノペンチル）−アスパラギン酸）
【化１０】
2019194220.tif 000012
｛式中、ｎ６およびｍ６はそれぞれ、５〜２０，０００である。｝
【００４１】
ポリアスパラギン酸
【化１１】
2019194220.tif 000013
｛式中、ｍ７は、５〜２０，０００である。｝
【００４２】
ポリグルタミン酸
【化１２】
2019194220.tif 000014
｛式中、ｍ８は、５〜２０，０００である。｝
【００４３】
ポリ（（５−アミノペンチル）−アスパラギン酸）
【化１３】
2019194220.tif 000015
｛式中、ｍ９は、５〜２０，０００である。｝
【００４４】
Ｇｌｃ（３）−ＰＥＧ−ポリアスパラギン酸
【化１４】
2019194220.tif 000016
｛式中、ｎ１０およびｍ１０はそれぞれ、５〜２０，０００である。｝
【００４５】
Ｇｌｃ（３）−ＰＥＧ−ポリグルタミン酸
【化１５】
2019194220.tif 000017
｛式中、ｎ１１およびｍ１１はそれぞれ、５〜２０，０００である。｝
【００４６】
Ｇｌｃ（３）−ＰＥＧ−ポリ（（５−アミノペンチル）−アスパラギン酸）
【化１６】
2019194220.tif 000018
｛式中、ｎ１２およびｍ１２はそれぞれ、５〜２０，０００である。｝
【００４７】
Ｇｌｃ（２）−ＰＥＧ−ポリアスパラギン酸
【化１７】
2019194220.tif 000019
｛式中、ｎ１３およびｍ１３はそれぞれ、５〜２０，０００である。｝
【００４８】
Ｇｌｃ（２）−ＰＥＧ−ポリグルタミン酸
【化１８】
2019194220.tif 000020
｛式中、ｎ１４およびｍ１４はそれぞれ、５〜２０，０００である。｝
【００４９】
Ｇｌｃ（２）−ＰＥＧ−ポリ（（５−アミノペンチル）−アスパラギン酸）
【化１９】
2019194220.tif 000021
｛式中、ｎ１５およびｍ１５はそれぞれ、５〜２０，０００である。｝
【００５０】
上記式(I)〜式(XV)の化合物またはその塩は、その外表面がグルコースで修飾されたＰＩＣミセルまたはPICsomeを形成することに用いることができる。上記式(I)〜式(XV)の化合物の塩にポリイオンコンプレックスを形成させるためには、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７、ｎ８、ｎ９、ｎ１０、ｎ１１、ｎ１２、ｎ１３、ｎ１４、およびｎ１５は、それぞれ独立して５〜２０，０００の整数、好ましくは１０〜５，０００の整数、より好ましくは４０〜５００の整数、さらに好ましくは５〜１，０００の整数、さらにより好ましくは１０〜２００の整数とすることができる。また、ｍ１、ｍ２、ｍ３、ｍ４、ｍ５、ｍ６、ｍ７、ｍ８、ｍ９、ｍ１０、ｍ１１、ｍ１２、ｍ１３、ｍ１４およびｍ１５は、それぞれ独立して、２〜２０，０００の整数、好ましくは２〜５，０００の整数、より好ましくは４０〜５００の整数、さらに好ましくは５〜１，０００の整数、さらにより好ましくは１０〜２００の整数とすることができる。塩は、好ましくは、薬学的に許容可能な塩である。
【００５１】
ＰＩＣミセルは、ある態様では、式(I)の化合物若しくはその塩、式（X）の化合物若しくはその塩または式(XIII)の化合物若しくはその塩と、式（IV）の化合物若しくはその塩と、式（VI）の化合物若しくはその塩とを混合して得られる。ＰＩＣミセルの更なる特定の態様では、上記式においてｎ１、ｎ１０、ｎ１３、ｎ４およびｎ６は、４４であり、ｍ１、ｍ１０、ｍ１３、およびｍ４は、８０であり、ｍ６は、７２である。塩は、好ましくは、薬学的に許容可能な塩である。
【００５２】
ＰＩＣｓｏｍｅは、ある態様では、式(I)の化合物若しくはその塩、式（X）の化合物若しくはその塩または式(XIII)の化合物若しくはその塩と、式（IV）の化合物若しくはその塩と、式（IX）の化合物若しくはその塩とを混合して得られる。ＰＩＣｓｏｍｅの更なる特定の態様では、上記式においてｎ１、ｎ１０、ｎ１３、ｎ４およびｎ９は、４４であり、ｍ１、ｍ１０、ｍ１３、およびｍ４は、８０であり、ｍ９は、７２である。塩は、好ましくは、薬学的に許容可能な塩である。
【００５３】
ｓｉＲＮＡミセルは、ある態様では、コレステロールをコンジュゲートしたｓｉＲＮＡと、式(XVI)に示されるコレステロールをコンジュゲートしたＧｌｃ（６）−ＰＥＧ−ポリ（Ａｓｐ−ＴＥＰ）またはその塩とを混合して得られる。塩は、好ましくは、薬学的に許容可能な塩である。コレステロールをコンジュゲートしたｓｉＲＮＡは、特に限定されないが、ＲＮＡ鎖の５’末端または３’末端にコレステロールがコンジュゲートしたｓｉＲＮＡであるが、これらは当業者であれば適宜合成することができ、または、カスタム合成により商業的に入手可能であり、本発明で用いることができる。ｓｉＲＮＡは、特に限定されないが、好ましくは、センス鎖の３’末端またはアンチセンス鎖の５’末端若しくは３’末端にコレステロールをコンジュゲートさせることができる。
【００５４】
Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ−ポリ（Ａｓｐ−ＴＥＰ）−Ｃｈｏｌ
【化２０】
2019194220.tif 000022
｛式中、ｎ１６およびｍ１６はそれぞれ、５〜２０，０００である。｝
【００５５】
ｎ１６は、５〜２０，０００の整数、好ましくは１０〜５，０００の整数、より好ましくは４０〜５００の整数、さらに好ましくは５〜１，０００の整数である。ｍ１６は、２〜２０，０００の整数、好ましくは２〜５，０００の整数、より好ましくは４０〜５００の整数、さらに好ましくは５〜１，０００の整数、さらにより好ましくは１０〜２００の整数である。ｓｉＲＮＡミセルの更なる特定の態様では、上記においてｎ１６は４４０であり、ｍ１６は６０である。
【００５６】
本発明で用いられるリポソームとしては、特に限定されないが、リン脂質、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）により形成されるリポソームが挙げられる。リポソームは、古くから様々なものが知られ、当業者であれば適宜調製することが可能である。当業者であれば、リポソームに薬剤を適宜内包させることができる。
【００５７】
ＧＬＵＴ１リガンドによる小胞の修飾は、特に限定されないが、例えば小胞を形成する高分子をＧＬＵＴ１リガンドにより修飾してから小胞を形成させることにより行なうことができる。小胞の外表面に露出させる観点からは、高分子の修飾部位は、小胞を形成させたときに外表面に位置する部位とすることができる。このようなＧＬＵＴ１リガンドにより修飾された高分子は、当業者であれば適宜調製することができる。一例として、グルコースにより修飾された高分子（特に、Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ−ポリ（アニオン）ブロック共重合体またはＧｌｃ（６）−ＰＥＧ−ポリ（カチオン）ブロック共重合体）の調製方法の例を以下に説明する。Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ−ポリ（アニオン）ブロック共重合体またはＧｌｃ（６）−ＰＥＧ−ポリ（カチオン）ブロック共重合体は、例えば、グルコースの６位以外の炭素上の水酸基を保護した上で、グルコースにブロック共重合体を重合させて得ることができる。
【００５８】
スキーム１Ａは、ｎ１が４４であり、ｍ１が８０である、式(I)の化合物の合成スキームを例示する。
スキーム１Ａ
【化２１】
2019194220.tif 000023
スキーム１Ａでは、ＥＯは、エチレンオキサイドを示し；Ｋ−Ｎａｐｈは、カリウムナフタレンを示し；ＴＥＡは、トリエチルアミンを示し；ＭｓＣｌは、メタンスルホニルクロリドを示し；ＮＨ３ａｑ．は、アンモニア水を示し；ＮＣＡ−ＢＬＡは、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物を示す。
【００５９】
以下、スキーム１Ａを簡単に説明する。グルコースの保護基の導入は、例えば、１，２−Ｏ−イソプロピリデン５，６−Ｏ−ベンジリデン−α−Ｄ−グルコフラノース（以下、「ＢＩＧ」という）により達成される。例えば、PICミセルまたはPICsomeを作製する場合には、ＢＩＧにエチレンオキサイドを重合させて、ＢＩＧ−ＰＥＧ−ＯＨを合成する。ＢＩＧは、例えば、１，２−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラノース（以下、「ＭＩＧ」という）の３位と５位の炭素の置換基であるＯＨ基をベンジル基で保護することにより得られる。具体的には、ＢＩＧは、ＭＩＧとベンズアルデヒドを反応させ、酢酸エチルで抽出することにより得られる。次に、ＰＥＧの分子量を一定に揃える観点では、重合反応前に、反応容器内でＢＩＧ−ＯＨをベンゼンで凍結乾燥させ、その後、減圧乾燥（例えば、７０℃で一晩の減圧乾燥）させて、ＢＩＧ−ＯＨを容器壁面に付着させることが好ましい。また、重合度は添加するエチレンオキサイドの量により適宜調節することができる。重合後、ＢＩＧ−ＰＥＧ−ＯＨのＯＨ基をアミノ化してＢＩＧ−ＰＥＧ−ＮＨ２を得て、さらに、ＢＩＧ−ＰＥＧ−ＮＨ２のＮＨ２基に対してポリカチオン若しくはポリアニオンまたは保護されたその前駆体（例えば、ポリアスパラギン酸の保護された単量体であるβ−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ）または、ポリグルタミン酸の保護された単量体である、γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸−Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＧ−ＮＣＡ））を重合させて、ＢＩＧ−ＰＥＧ−ポリ（アニオン）またはＢＩＧ−ＰＥＧ−ポリ（カチオン）を得ることができる。重合度は、ポリカチオン若しくはポリアニオンまたは保護されたその前駆体の量により適宜調節することができる。最後にグルコースおよびアニオンまたはカチオンの保護基を脱保護して、グルコース−ＰＥＧ−ポリ（アニオン）またはグルコース−ＰＥＧ−ポリ（カチオン）を得ることができる。グルコースを結合した共重合体は、ＰＩＣミセルまたはPICsomeの調製に用いることができる。具体的には、水溶液中で電荷を中和する比率でポリカチオンブロックを有するポリマーとポリアニオンブロックを有するポリマーとを混合すると、ＰＩＣミセルまたはPICsomeが自発的に形成される。このようにすることで、ポリイオンコンプレックスが生体適合性部分により覆われ、その生体適合性部分はグルコースにより修飾を受けたPICミセルまたはPICsomeを得ることができる。
【００６０】
同様に、Ｇｌｃ（３）−ＰＥＧ−ポリ（アニオン）およびＧｌｃ（３）−ＰＥＧ−ポリ（アニオン）は、上記においてＢＩＧの代わりに、例えば、１，２，５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラノース（ＤＩＧ）を出発物質として用いて合成することができ、その他の部分は、上記と全く同一である（スキーム１Ｂ参照）。また、同様に、Ｇｌｃ（２）−ＰＥＧ−ポリ（アニオン）およびＧｌｃ（２）−ＰＥＧ−ポリ（アニオン）も当業者であれば適宜合成することができる。
【００６１】
スキーム１Ｂでは、ｎ１が４４であり、ｍ１が８０である、式(X)の化合物の合成スキームを例示する。スキーム１Ｂは、出発物質としてＢＩＧの代わりにＤＩＧを用いる以外は、スキーム１Ａと同一である。
スキーム１Ｂ
【化２２】
2019194220.tif 000024
スキーム１Ｂでは、ＥＯは、エチレンオキサイドを示し；Ｋ−Ｎａｐｈは、カリウムナフタレンを示し；ＴＥＡは、トリエチルアミンを示し；ＭｓＣｌは、メタンスルホニルクロリドを示し；ＮＨ３ａｑ．は、アンモニア水を示し；ＮＣＡ−ＢＬＡは、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物を示す。
【００６２】
本発明によれば、式（I）で表されるコンジュゲートまたは薬学的に許容可能なその塩：
【化２３】
2019194220.tif 000025
｛式中、ｎ１およびｍ１はそれぞれ、５〜２０，０００である。｝の製造方法であって、(i)式(Ia)：
【化２４】
2019194220.tif 000026
で表される１，２−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラノースとベンズアルデヒドとを反応させて、
式(Ib)：
【化２５】
2019194220.tif 000027
で表される１，２−Ｏ−イソプロピリデン５，６−Ｏ−ベンジリデン−α−Ｄ−グルコフラノース（ＢＩＧ）を得ることと、
(ii)式(Ib)で表されるＢＩＧとエチレンオキシドとを反応させて式(Ic)：
【化２６】
2019194220.tif 000028
｛式中、ｎ１７は、ｎ１とは等しい。｝
で表されるＢＩＧ−ポリエチレングリコール（ＢＩＧ−ＰＥＧ−ＯＨ）を得ることと、
(iii)式(Ic) で表されるＢＩＧ−ＰＥＧ−ＯＨをアミノ化して式(Id)：
【化２７】
2019194220.tif 000029
で表されるＢＩＧ−ＰＥＧ−ＮＨ２を得ることと、
(iv) 式(Id)で表されるＢＩＧ−ＰＥＧ−ＮＨ２にβ−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物を重合させることと、その後、保護基を脱保護すること
を含んでなる方法が提供される。
【００６３】
本発明によれば、式(II) で表されるコンジュゲートまたは薬学的に許容可能なその塩：
【化２８】
2019194220.tif 000030
｛式中、ｎ２およびｍ２はそれぞれ、５〜２０，０００である。｝の製造方法であって、(i) (i)式(Ia)：
【化２９】
2019194220.tif 000031
で表される１，２−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラノースとベンズアルデヒドとを反応させて、
式(Ib)：
【化３０】
2019194220.tif 000032
で表される１，２−Ｏ−イソプロピリデン５，６−Ｏ−ベンジリデン−α−Ｄ−グルコフラノース（ＢＩＧ）を得ることと、
(ii)式(Ib)で表されるＢＩＧとエチレンオキシドとを反応させて式(Ic)：
【化３１】
2019194220.tif 000033
｛式中、ｎ１７は、ｎ２とは等しい。｝
で表されるＢＩＧ−ポリエチレングリコール（ＢＩＧ−ＰＥＧ−ＯＨ）を得ることと、
(iii)式(Ic) で表されるＢＩＧ−ＰＥＧ−ＯＨをアミノ化して式(Id)：
【化３２】
2019194220.tif 000034
で表されるＢＩＧ−ＰＥＧ−ＮＨ２を得ることと、
(iv) ＢＩＧ−ＰＥＧ−ＮＨ２とγ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸−Ｎ−カルボン酸無水物を反応させることと、その後、保護基を脱保護することとを含んでなる、方法が提供される。
【００６４】
本発明によれば、式（III）で表されるコンジュゲートまたは薬学的に許容可能なその塩：
【化３３】
2019194220.tif 000035
｛式中、ｎ３およびｍ３はそれぞれ、５〜２０，０００である。｝の製造方法であって、(i)式(Ia)：
【化３４】
2019194220.tif 000036
で表される１，２−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラノースとベンズアルデヒドとを反応させて、
式(Ib)：
【化３５】
2019194220.tif 000037
で表される１，２−Ｏ−イソプロピリデン５，６−Ｏ−ベンジリデン−α−Ｄ−グルコフラノース（ＢＩＧ）を得ることと、
(ii)式(Ib)で表されるＢＩＧとエチレンオキシドとを反応させて式(Ic)：
【化３６】
2019194220.tif 000038
｛式中、ｎ１７は、ｎ３とは等しい。｝
で表されるＢＩＧ−ポリエチレングリコール（ＢＩＧ−ＰＥＧ−ＯＨ）を得ることと、
(iii)式(Ic) で表されるＢＩＧ−ＰＥＧ−ＯＨをアミノ化して式(Id)：
【化３７】
2019194220.tif 000039
で表されるＢＩＧ−ＰＥＧ−ＮＨ２を得ることと、
(iv) 式(Id)で表されるＢＩＧ−ＰＥＧ−ＮＨ２にβ−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物を重合させることと、
(v)得られた化合物と１，５−ジアミノペンタン（ＤＡＰ）とを反応させることと、その後、保護基を脱保護することと
を含んでなる方法が提供される。
【００６５】
本発明によれば、式(X)で表されるコンジュゲートまたは薬学的に許容可能なその塩：
【化３８】
2019194220.tif 000040
｛式中、ｎ１０およびｍ１０はそれぞれ、５〜２０，０００である。｝の製造方法であって、
(i)式(Xa)：
【化３９】
2019194220.tif 000041
で表される１，２，５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラノース（ＤＩＧ）とエチレンオキサイドとを反応させて式(Xb)：
【化４０】
2019194220.tif 000042
｛式中、ｎ１８は、ｎ１０と等しい。｝
で表されるＤＩＧ−ポリエチレングリコール（ＤＩＧ−ＰＥＧ−ＯＨ）を合成することと、
(ii)式(Xb)で表されるＤＩＧ−ＰＥＧ−ＯＨのＯＨ基をアミノ基に置換して、式(Xc)：
【化４１】
2019194220.tif 000043
で表されるＤＩＧ−ＰＥＧ−ＮＨ２を得ることと、
(iii) ＤＩＧ−ＰＥＧ−ＮＨ２のアミノ基に、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物を重合させることと、その後、保護基を脱保護することとを含んでなる、方法が提供される。
【００６６】
本発明によれば、式(XI)で表されるコンジュゲートまたは薬学的に許容可能なその塩：
【化４２】
2019194220.tif 000044
｛式中、ｎ１１およびｍ１１はそれぞれ、５〜２０，０００である。｝の製造方法であって、
(i)式(Xa)：
【化４３】
2019194220.tif 000045
で表される１，２，５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラノース（ＤＩＧ）とエチレンオキサイドとを反応させて式(Xb)：
【化４４】
2019194220.tif 000046
｛式中、ｎ１８は、ｎ１１と等しい。｝
で表されるＤＩＧ−ポリエチレングリコール（ＤＩＧ−ＰＥＧ−ＯＨ）を合成することと、
(ii)式(Xb)で表されるＤＩＧ−ＰＥＧ−ＯＨのＯＨ基をアミノ基に置換して、式(Xc)：
【化４５】
2019194220.tif 000047
で表されるＤＩＧ−ＰＥＧ−ＮＨ２を得ることと、
(iii) ＤＩＧ−ＰＥＧ−ＮＨ２のアミノ基に、とγ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸−Ｎ−カルボン酸無水物を反応させることと、その後、保護基を脱保護することとを含んでなる、方法が提供される。
【００６７】
本発明によれば、式(XII)で表されるコンジュゲートまたは薬学的に許容可能なその塩：
【化４６】
2019194220.tif 000048
｛式中、ｎ１２およびｍ１２はそれぞれ、５〜２０，０００である。｝の製造方法であって、
(i)式(Xa)：
【化４７】
2019194220.tif 000049
で表される１，２，５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラノース（ＤＩＧ）とエチレンオキサイドとを反応させて式(Xb)：
【化４８】
2019194220.tif 000050
｛式中、ｎ１８は、ｎ１０と等しい。｝
で表されるＤＩＧ−ポリエチレングリコール（ＤＩＧ−ＰＥＧ−ＯＨ）を合成することと、
(ii)式(Xb)で表されるＤＩＧ−ＰＥＧ−ＯＨのＯＨ基をアミノ基に置換して、式(Xc)：
【化４９】
2019194220.tif 000051
で表されるＤＩＧ−ＰＥＧ−ＮＨ２を得ることと、
(iii) ＤＩＧ−ＰＥＧ−ＮＨ２のアミノ基に、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物を重合させることと、
(iv)得られた化合物と１，５−ジアミノペンタン（ＤＡＰ）とを反応させることと、その後、保護基を脱保護することと、その後、保護基を脱保護することとを含んでなる、方法が提供される。
【００６８】
同様に、Ｇｌｃ（２）−ＰＥＧ−ポリ（アニオン）およびＧｌｃ（２）−ＰＥＧ−ポリ（アニオン）も当業者であれば適宜合成することができる。Ｇｌｃ（２）−ＰＥＧ−ポリ（アニオン）およびＧｌｃ（２）−ＰＥＧ−ポリ（アニオン）は、以下に限られないが、２位の炭素を置換するＯＨ基以外のＯＨ基が保護されたグルコースを出発物質として用いて合成することができ、例えば、１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−マンノピラノースを出発化合物として用いて、２位の炭素を置換するＯＨ基をベンジル基により保護し、その後、アセチル基をアルカリ加水分解してＯＨ基にし、シリル系化保護基（例えば、ＴＢＳ基）により保護した後に、ベンジル基をパラジウム触媒または白金触媒と水素ガスにより脱保護して、光延反応により２位の炭素を置換するＯＨ基を立体的に反転させて、２位の炭素を置換するＯＨ基以外のＯＨ基が保護されたグルコースを得ることができるであろう。そして、当該分子をＢＩＧやＤＩＧの代わりに用いて、その他は、Ｇｌｃ（３）やＧｌｃ（６）−ＰＥＧ−ポリ（アニオン）およびＧｌｃ（２）−ＰＥＧ−ポリ（アニオン）を製造するのと同一の方法により合成することができることは当業者であれば容易に理解できることであろう。
【００６９】
本発明によれば、式(XVI)で表されるコンジュゲートの製造方法：
【化５０】
2019194220.tif 000052
｛式中、ｎ１６およびｍ１６はそれぞれ、５〜２０，０００である。｝であって、(i)式(Ia)：
【化５１】
2019194220.tif 000053
で表される１，２−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラノースとベンズアルデヒドとを反応させて、
式(Ib)：
【化５２】
2019194220.tif 000054
で表される１，２−Ｏ−イソプロピリデン５，６−Ｏ−ベンジリデン−α−Ｄ−グルコフラノース（ＢＩＧ）を得ることと、
(ii)式(Ib)で表されるＢＩＧとエチレンオキシドとを反応させて式(Ic)：
【化５３】
2019194220.tif 000055
｛式中、ｎ１７は、ｎ１とは等しい。｝
で表されるＢＩＧ−ポリエチレングリコール（ＢＩＧ−ＰＥＧ−ＯＨ）を得ることと、
(iii)式(Ic) で表されるＢＩＧ−ＰＥＧ−ＯＨをアミノ化して式(Id)：
【化５４】
2019194220.tif 000056
で表されるＢＩＧ−ＰＥＧ−ＮＨ２を得ることと、
(iv) 式(Id)で表されるＢＩＧ−ＰＥＧ−ＮＨ２にβ−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物を重合させてＢＩＧ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡを得ることと、
(v) ＢＩＧ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡと４−コレステリルアミノ−４−ブタン酸を反応させて、式(XVIa)：
【化５５】
2019194220.tif 000057
で表される、ＢＩＧ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ｃｈｏｌを得ることと、
(vi) ＢＩＧ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ｃｈｏｌとテトラエチレンペンタアミン（ＴＥＰ）とを反応させて、式(XVIb)：
【化５６】
2019194220.tif 000058
で表されるＢＩＧ−ＰＥＧ−ポリ（Ａｓｐ−ＴＥＰ）−ｃｈｏｌを得ることと、その後、保護基を脱保護することと
を含んでなる方法が提供される。
【００７０】
小胞は、上記重合体を用いて周知の方法により形成させることができる。一般的に小胞は、上記のような重合体を一定濃度以上の濃度で溶解させた溶液を攪拌して得ることができる。また、ポリイオンコンプレックスに基づいて形成される小胞の場合は、ポリカチオン部分を有する高分子とポリアニオン部分を有する高分子とを同割合で混合して得ることができる。小胞に薬剤を内包させる方法は当業者に周知であり、本発明でも周知の方法を用いることができる。例えば、ＰＩＣミセルに薬剤を内包させるには、ミセル形成後、薬剤をミセル溶液に添加すればよい。薬剤は、その荷電により自発的にＰＩＣミセルに内包される。また、例えば、PICsomeの場合は、PICsomeを形成する高分子と薬剤との混合液を調製し、攪拌混合すれば、薬剤はPICsomeに内包される。リポソームも、リポソームを形成する高分子と薬剤との混合液を調製し、攪拌混合すれば、薬剤はリポソームに内包される。ポリイオンコンプレックスのアニオン性ブロックとカチオン性ブロックとを架橋することもできる。この目的に用いられる架橋剤としては、特に限定されないが例えば、アミノ基とカルボキシ基とを縮合させることができる１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）が好ましく用いられ得る。
【００７１】
小胞を構成する高分子中におけるグルコース結合高分子の割合が１０〜４０％であるときには、とりわけ組成物の脳実質への送達効率が高く、小胞を形成する高分子におけるグルコース結合高分子の割合は、１０〜４０％、好ましくは２０〜３０％、より好ましくは２２〜２８％、さらに好ましくは２４〜２６％（例えば、約２５％）とすることができる。また、小胞を構成する高分子中におけるグルコース結合分子の割合が４０％以上のときには、とりわけ組成物の脳血管内皮細胞への送達効率が高く、小胞を形成する高分子におけるグルコース結合高分子の割合は、４０〜１００％、例えば、４０〜６０％とすることができる。小胞の外表面をＧＬＵＴ１リガンドで修飾するためには、小胞を対象としてＧＬＵＴ１リガンド修飾（例えば、グリコシル化）することもできるが、小胞表面上のＧＬＵＴ１リガンド修飾の割合を制御する観点では、小胞を構成する高分子それぞれにあらかじめＧＬＵＴ１リガンドを結合させておき、ＧＬＵＴ１リガンドによる修飾のなされていない高分子との配合比を調節した上で、高分子に小胞を形成させることが好ましい。
【００７２】
本発明では、薬剤とＧＬＵＴ１リガンドとのコンジュゲートも本発明の血糖操作により脳へ送達することができる。薬剤とＧＬＵＴ１リガンドとは、リンカーを介してコンジュゲートさせてもよい。リンカーは、生体適合性のリンカーとすることができ、例えば、ポリエチレングリコールを用いることができる。薬剤は２分子以上のＧＬＵＴ１リガンドとコンジュゲートされていてもよい。２分子以上のＧＬＵＴ１リガンドは、好ましくは、リンカーを介して薬剤にコンジュゲートされ得る。２分子以上のＧＬＵＴ１リガンドをリンカーを介して薬剤にコンジュゲートする場合には、例えば、側鎖に複数のＧＬＵＴ１リガンドを結合させたポリアミノ酸（例えば、ポリアスパラギン酸）を用いてコンジュゲートすることができる。薬剤とポリアミノ酸との間には、ＰＥＧなどのリンカーを介在させてもよい。側鎖に複数のＧＬＵＴ１リガンドを結合させたポリアミノ酸（例えば、ポリアスパラギン酸）としては、例えば、下記式(XIX)：
【化５７】
2019194220.tif 000059
｛式中、ｎ１９は、５〜２０，０００の整数、およびｍ１９は、２〜５，０００の整数である。｝
で表される化合物を用いることができる。ｎ１９は、５〜２０，０００の整数、好ましくは１０〜５，０００の整数、より好ましくは４０〜５００の整数、さらに好ましくは５〜１，０００の整数、さらにより好ましくは１０〜２００の整数である。ｍ１９は、２〜２０，０００の整数、好ましくは２〜５，０００の整数、より好ましくは４０〜５００の整数、さらに好ましくは５〜１，０００の整数、さらにより好ましくは１０〜２００の整数である。ある態様では、ｎ１９は、２７３であり、ｍ１９は、４８である。
【００７３】
ＰＥＧと複数のＧＬＵＴ１リガンドを結合させたポリアスパラギン酸との共重合体は、以下のように合成することができる。
【００７４】
スキーム２
【化５８】
2019194220.tif 000060
ＤＭＦは、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドを表し、Ｂｎは、ベンジル基を表し、ＥＤＣは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を示す。その他の略称は、上述のスキームの通りである。
【００７５】
以下、スキーム２を簡単に説明する。スキーム２の出発化合物である、式(XIXa)で表される化合物は以下のように得ることができる：
【化５９】
2019194220.tif 000061
｛式中、ｎ１９は、５〜２０，０００の整数である。｝。
【００７６】
２−（２−ヒドロキシエトキシ）テトラヒドロピランとエチレンオキシドとを反応させ、ＴＨＰ−ＰＥＧ−ＯＨを得る。次に、ＴＨＰ−ＰＥＧ−ＯＨのＯＨ基をメタンスルホン酸クロライドなどを用いてメシル化する。得られたＭｓＯ−ＰＥＧ−ＴＨＰをアジ化ナトリウムと反応させて、アジド基を片末端に有するテトラヒドロピラニル基のポリエチレングリコール（Ｎ３−ＰＥＧ−ＴＨＰ）を得る。その後、ＴＨＰ保護基を脱保護して、式(XIXa)で表されるアジド基片末端３−ヒドロキシプロピル基のポリエチレングリコール（Ｎ３−ＰＥＧ−ＯＨ）を得る。重合度は添加するエチレンオキサイドの量により適宜調節することができる。
【００７７】
上記のようにして、式(XIXa)で表される化合物を得た後は、Ｎ３−ＰＥＧ−ＯＨのＯＨ基をアミノ化してＮ３−ＰＥＧ−ＮＨ２を得て、さらに、Ｎ３−ＰＥＧ−ＮＨ２のＮＨ２基に対してβ−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ）を反応させて、Ｎ３−ＰＥＧ−ＰＢＬＡを得る。アルカリ加水分解により保護基を脱保護して、その後、保護したアミノグルコースである６−アミノ−６−デオキシ−１，２：３，５−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラノース（Ｐ−アミノグルコース）とＥＤＣ存在下で反応させてアミノグルコースのアミノ基とアスパラギン酸残基のカルボキシ基との間で縮合させる。その後、保護基を脱保護することにより、片末端がアジド基のポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体（Ｎ３−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ））が得られる。
【００７８】
６−アミノ−６−デオキシ−１，２：３，５−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラノース（Ｐ−アミノグルコース）は、例えば、Carbohydr. Res. 19, 197-210 (1971)の記載に基づいて作製することができる。Carbohydr. Res. 19, 197-210 (1971)によれば、Ｐ−アミノグルコースは、以下のスキーム３により得られる。
【００７９】
スキーム３
【化６０】
2019194220.tif 000062
ＴｓＣｌは、塩化トルエンスルホニルを表す。
【００８０】
以下、スキーム３を簡単に説明する。まず、１，２−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラノース（1）をトシル化して、１，２−Ｏ−イソプロピリデン−６−Ｏ−ｐ−トルエンスルホニル−α−Ｄ−グルコフラノース（2）を得る。次に、得られた１，２−Ｏ−イソプロピリデン−６−Ｏ−ｐ−トルエンスルホニル−α−Ｄ−グルコフラノース（2）と２，２−ジメトキシプロパンとを反応させて１，２：３，５−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−６−Ｏ−ｐ−トルエンスルホニル−α−Ｄ−グルコフラノース（3）を得る。その後、１，２：３，５−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−６−Ｏ−ｐ−トルエンスルホニル−α−Ｄ−グルコフラノース（3）をフタルイミドカリウムと反応させて、６−デオキシ−１，２：３，５−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−６−フタルイミド−α−Ｄ−グルコフラノース（4）を得る。６−デオキシ−１，２：３，５−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−６−フタルイミド−α−Ｄ−グルコフラノース（4）をヒドラジン水和物と反応させて、６−アミノ−６−デオキシ−１，２：３，５−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラノース（Ｐ−アミノグルコース）（5）を得ることができる。
【００８１】
本発明では、式(XIX)で表されるマルチグルコースポリマー：
【化６１】
2019194220.tif 000063
｛式中、ｎ１９は、５〜２０，０００の整数、およびｍ１９は、２〜５，０００の整数である。｝
の製造方法であって、(i) 式(XIXa)：
【化６２】
2019194220.tif 000064
で表されるＮ３−ＰＥＧ−ＯＨのＯＨ基をアミノ化して式(XIXb)：
【化６３】
2019194220.tif 000065
で表されるＮ３−ＰＥＧ−ＮＨ２を得ることと、
(ii)得られたＮ３−ＰＥＧ−ＮＨ２をβ−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物と反応させて、式(XIXc)：
【化６４】
2019194220.tif 000066
｛式中、Ｂｎは保護基であるベンジル基を表す｝
で表されるＮ３−ＰＥＧ−ＰＢＬＡを得ることと、
(iii) 得られたＮ３−ＰＥＧ−ＰＢＬＡの保護基をアルカリ加水分解により脱保護することと、
(iv)得られたＮ３−ＰＥＧ−ポリアスパラギン酸のカルボキシ基と６−アミノ−６−デオキシ−１，２：３，５−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラノースのアミノ基と縮合させることと、その後、ＯＨ基の保護基を脱保護することと、
を含む、方法が提供される。
【００８２】
本発明で用いられる薬剤としては、特に限定されないが、生理活性物質、抗体、核酸、生体適合性の蛍光色素、並びに超音波、ＭＲＩおよびＣＴ用造影剤などの造影剤を用いることができる。本発明では、薬剤を選択性高く脳に送達することができる。従って、薬剤としては、特に限定されないが、例えば、脳の生理機能を高める生理活性物質、脳の疾患を処置し得る生理活性物質、脳疾患に特徴的な抗原を認識する抗体、脳疾患に関連する遺伝子の発現を調節する核酸、脳を染色できる生体適合性の蛍光色素、並びに超音波、ＭＲＩおよびＣＴ用造影剤などの造影剤を用いることができる。例えば、薬剤として脳の生理機能を高める生理活性物質、脳の疾患を処置し得る生理活性物質、脳疾患に特徴的な抗原を認識する抗体、脳疾患に関連する遺伝子の発現を調節する核酸を用いた本発明の組成物は、医薬組成物として提供され得る。薬剤として脳を染色できる生体適合性の蛍光色素、並びに超音波、ＭＲＩおよびＣＴ用造影剤などの造影剤を用いた本発明の組成物は、診断薬として提供され得る。
【００８３】
本発明の組成物またはコンジュゲートは、対象にそのまま投与することもできるし、本発明による投与計画に基づき投与することもできる。本発明による投与計画では、好ましくは、まず、対象に絶食させるか、または対象に低血糖を誘発させるが、その後、該対象に該組成物を投与する。本発明による投与計画では、より好ましくは、まず、対象に絶食させるか、または対象に低血糖を誘発させるが、その後、該対象に該組成物を投与することおよび該対象において血糖値の上昇を誘発させる。ここで、本発明による投与計画では、該対象への該組成物の投与は、該対象における血糖値の上昇の誘発と、同時に、連続してまたは逐次的に行なわれる。低血糖状態の誘発は、ＧＬＵＴ１を血管内皮細胞（例えば、脳血管内皮細胞）の内表面に発現させるために有用であると考えられる。但し、本発明によれば、本発明の組成物またはコンジュゲートは、投与対象における血糖値の上昇がこれらの脳への送達に極めて効果的である。本発明によれば、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象における本発明の組成物（キャリアなど）またはコンジュゲートの血中濃度が一定値以上であるときに、血糖値を上昇させることにより、本発明の組成物（キャリアなど）またはコンジュゲートが極めて効果的に脳内に送達できるのである。また、本実施例によれば、対象において血糖値の上昇を誘発させた後もしばらくの間は本発明の組成物（キャリアなど）またはコンジュゲートは該対象の脳内へ送達される。
【００８４】
本発明の組成物（キャリアなど）またはコンジュゲートの血中濃度を一定値以上に保つ観点では、本発明の組成物またはコンジュゲートを対象に輸液投与することが好ましい。このようにすることで、血中滞留時間の短い組成物またはコンジュゲートであっても、一定の血中濃度を確保し易い。例えば、血中滞留時間の短いｓｉＲＮＡを内包するｓｉＲＮＡミセルは、輸液により対象に投与すると効果を上げやすい。輸液投与は、好ましくは、１０分以上、１５分以上、３０分以上、４５分以上、６０分以上、９０分以上、または２時間以上行なうことができる。輸液投与は、好ましくは一定の輸液速度で行なう。例えば、精密投与ポンプを用いれば、一定の輸液速度による投与が可能である。輸液投与は、対象における血糖値の上昇の誘発と同時になされてもよく、輸液投与中に対象において血糖値の上昇を誘発させてもよい。
【００８５】
本発明の組成物またはコンジュゲートは、本発明による投与計画に基づき投与すると、脳への送達効率が選択的に高まる。従って、本発明の組成物またはコンジュゲートは、脳に薬剤を送達するために用いることができる。本発明の組成物またはコンジュゲートはまた、薬剤に血液脳関門を通過させることができる。従って、本発明の組成物またはコンジュゲートは、従来は送達が困難であった脳実質に、生理活性物質、抗体、核酸、生体適合性の蛍光色素、並びに超音波、ＭＲＩおよびＣＴ用造影剤などの造影剤などの薬剤を送達することに用いることができる。本発明の組成物またはコンジュゲートはまた、薬剤を脳血管内皮細胞に蓄積させることができる。従って、本発明の組成物またはコンジュゲートは、従来は送達が困難であった脳血管内皮細胞に、生理活性物質、抗体、核酸、生体適合性の蛍光色素、並びに超音波、ＭＲＩおよびＣＴ用造影剤などの造影剤などの薬剤を送達することに用いることができる。また、本発明の組成物またはコンジュゲートは、脳血管内皮細胞間の接着を弱める、または破壊する薬剤を脳血管内皮細胞に送達することに用いることもできる。同様に、本発明の組成物またはコンジュゲートは、網膜、末梢神経および／または髄液に、生理活性物質、抗体、核酸、生体適合性の蛍光色素、並びに超音波、ＭＲＩおよびＣＴ用造影剤などの造影剤などの薬剤を送達するために用いることができる。本発明の組成物またはコンジュゲートはまた、血液神経関門、血液網膜関門または血液髄液関門にそれぞれ存在する血管内皮細胞に生理活性物質、抗体、核酸、生体適合性の蛍光色素、並びに超音波、ＭＲＩおよびＣＴ用造影剤などの造影剤などの薬剤を送達するために用いることができる。本発明の組成物またはコンジュゲートは、血液神経関門、血液網膜関門または血液髄液関門にそれぞれ存在する血管内皮細胞間の接着を弱める、または破壊する薬剤を脳血管内皮細胞に送達することに用いることもできる。血管内皮細胞間の接着を弱め、または破壊することにより、関門の機能を弱め、様々な薬剤に関門を通過させることができるようになる。
【００８６】
本発明の組成物およびコンジュゲートは、経口投与および非経口投与（例えば、静脈内投与または腹腔内投与）により投与することができる。
【００８７】
本発明によれば、外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている薬剤送達用キャリアを投与計画に従って対象に投与することを含んでなる、脳組織を標的化する方法が提供される。本発明によればまた、外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている薬剤送達用キャリアを投与計画に従って対象に投与することを含んでなる、脳血管内皮細胞を標的化する方法が提供される。本発明による投与計画は、好ましくは、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該キャリアを投与することを含むが、より好ましくは、本発明による投与計画は、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与することおよび該対象において血糖値の上昇を誘発させることを含む。同様に本発明によれば、外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている薬剤送達用キャリアを投与計画に従って対象に投与することを含んでなる、末梢神経組織、網膜および／または髄液を標的化する方法が提供される。本発明によればまた、外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている薬剤送達用キャリアを投与計画に従って対象に投与することを含んでなる、血液神経関門、血液網膜関門または血液髄液関門にそれぞれ存在する血管内皮細胞を標的化する方法が提供される。
【００８８】
本発明によれば、キャリアには、生理活性物質、抗体、核酸、生体適合性の蛍光色素、並びに超音波、ＭＲＩおよびＣＴ用造影剤などの造影剤などの薬剤を内包することができ、これにより、キャリアに内包された薬剤を脳、末梢神経組織、網膜および／または髄液に効果的に送達することが可能である。
【００８９】
本発明によれば、薬剤とＧＬＵＴ１リガンドとのコンジュゲートまたは薬剤とＧＬＵＴ１リガンドとがリンカーを介して連結してなるコンジュゲートを、投与計画に従って対象に投与することを含んでなる、脳組織を標的化する方法または脳組織に薬剤を送達する方法が提供される。本発明によればまた、薬剤とＧＬＵＴ１リガンドとのコンジュゲートまたは薬剤とＧＬＵＴ１リガンドとがリンカーを介して連結してなるコンジュゲートを、投与計画に従って対象に投与することを含んでなる、脳血管内皮細胞を標的化する方法が提供される。本発明による投与計画は、好ましくは、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与することを含むが、より好ましくは、本発明による投与計画は、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与することおよび該対象において血糖値の上昇を誘発させることを含む。同様に本発明によれば、薬剤とＧＬＵＴ１リガンドとのコンジュゲートまたは薬剤とＧＬＵＴ１リガンドとがリンカーを介して連結してなるコンジュゲートを投与計画に従って対象に投与することを含んでなる、末梢神経組織、網膜および／または髄液を標的化する方法が提供される。本発明によればまた、薬剤とＧＬＵＴ１リガンドとのコンジュゲートまたは薬剤とＧＬＵＴ１リガンドとがリンカーを介して連結してなるコンジュゲートを、投与計画に従って対象に投与することを含んでなる、血液神経関門、血液網膜関門または血液髄液関門にそれぞれ存在する血管内皮細胞を標的化する方法が提供される。
【００９０】
本発明によれば、コンジュゲートに含まれる薬剤として生理活性物質、抗体、核酸、生体適合性の蛍光色素、並びに超音波、ＭＲＩおよびＣＴ用造影剤などの造影剤などの薬剤を用いることができ、これにより、薬剤を脳、末梢神経組織、網膜および／または髄液に効果的に送達することが可能である。
【００９１】
本発明によれば、薬剤として脳疾患治療薬または予防薬を用いることができる。この場合、本発明によれば、外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾され、かつ脳疾患治療薬または予防薬を内包した薬剤送達用キャリアを投与計画に従ってその必要のある対象に投与することを含んでなる、脳疾患の治療または予防方法が提供される。同様に、本発明によれば、外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾され、かつ末梢神経疾患治療薬または予防薬を内包した薬剤送達用キャリアを投与計画に従ってその必要のある対象に投与することを含んでなる、脳疾患の治療または予防方法が提供される。同様に、本発明によれば、外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾され、かつ網膜疾患治療薬または予防薬を内包した薬剤送達用キャリアを投与計画に従ってその必要のある対象に投与することを含んでなる、脳疾患の治療または予防方法が提供される。本発明による投与計画は、好ましくは、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与することを含むが、より好ましくは、本発明による投与計画は、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与することおよび該対象において血糖値の上昇を誘発させることを含む。
【００９２】
本発明によれば、薬剤として脳疾患治療薬または予防薬を用いることができる。この場合、本発明によれば、脳疾患治療薬若しくは予防薬とＧＬＵＴ１リガンドとのコンジュゲートまたは脳疾患治療薬若しくは予防薬とＧＬＵＴ１リガンドとがリンカーを介して連結してなるコンジュゲートを、投与計画に従ってその必要のある対象に投与することを含んでなる、脳疾患の治療または予防方法が提供される。同様に、本発明によれば、末梢神経疾患治療薬若しくは予防薬とＧＬＵＴ１リガンドとのコンジュゲートまたは末梢神経疾患治療薬若しくは予防薬とＧＬＵＴ１リガンドとがリンカーを介して連結してなるコンジュゲートを、投与計画に従ってその必要のある対象に投与することを含んでなる、末梢神経疾患の治療または予防方法が提供される。同様に、本発明によれば、網膜疾患治療薬若しくは予防薬とＧＬＵＴ１リガンドとのコンジュゲートまたは網膜疾患治療薬若しくは予防薬とＧＬＵＴ１リガンドとがリンカーを介して連結してなるコンジュゲートを、投与計画に従ってその必要のある対象に投与することを含んでなる、網膜疾患の治療または予防方法が提供される。本発明による投与計画は、好ましくは、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与することを含むが、より好ましくは、本発明による投与計画は、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与することおよび該対象において血糖値の上昇を誘発させることを含む。
【００９３】
従って、本発明によれば、脳疾患治療薬または予防薬を含んでなる、脳疾患を処置または予防するための医薬組成物が提供される。本発明によれば、薬剤の脳への取り込みが向上し、本発明の医薬組成物は脳疾患の治療または治療に有用であることが明らかである。本発明によればまた、末梢神経疾患治療薬若しくは予防薬を含んでなる、末梢神経疾患を処置または予防するための医薬組成物が提供される。本発明によれば、薬剤の末梢神経への取り込みが向上し、本発明の医薬組成物は末梢神経疾患の治療または予防に有用であることが明らかである。本発明によればさらに、網膜疾患治療薬若しくは予防薬を含んでなる、網膜疾患を処置または予防するための医薬組成物が提供される。本発明によれば、薬剤の網膜への取り込みが向上し、本発明の医薬組成物は網膜疾患の治療または予防に有用であることが明らかである。本発明によれば、上記治療薬または予防薬は、キャリアに内包された形態で組成物に含まれるか、または、ＧＬＵＴ１リガンドとリンカーを介してまたは介さずにコンジュゲートされた形態で組成物に含まれ得る。
【００９４】
脳疾患としては、脳疾患治療薬に血液脳関門を通過させることで治療できる脳疾患、例えば、不安、うつ病、睡眠障害、アルツハイマー病、パーキンソン病および多発性硬化症などが挙げられる。従って、本発明では、これらの脳疾患を治療するために、抗不安剤、抗うつ剤、睡眠導入剤、アルツハイマー治療薬、パーキンソン病治療薬および多発性硬化症治療薬などの脳疾患治療薬または予防薬が用いられ得る。アルツハイマー病治療薬としては、例えば、Ａβ抗体がよく知られ、パーキンソン病治療薬としては、例えば、ドーパミン受容体アゴニストおよびＬ−ドーパがよく知られ、多発性硬化症治療薬としては、例えば、副腎ステロイド薬、インターフェロンβ（ＩＦＮβ）、および免疫抑制剤がよく知られ、これらの治療薬が本発明で用いられ得る。末梢神経疾患としては、末梢神経疾患治療薬に血液脳関門を通過させることで治療できる末梢神経疾患、例えば、ギランバレー症候群、フィッシャー症候群および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチーが挙げられる。網膜疾患としては、網膜疾患治療薬に血液脳関門を通過させることで治療できる網膜疾患、例えば、網膜色素変性症、脳回状網脈膜萎縮、コロイデレミア、クリスタリン網膜症、先天黒内障、先天性停在性夜盲、小口病、白点状眼底、白点状網膜症、色素性傍静脈網脈絡膜萎縮、スターガルト病、卵黄状黄斑ジストロフィー、若年網膜分離症、中心性輪紋状脈絡膜ジストロフィー、オカルト黄斑ジストロフィー、家族性滲出性硝子体網膜症および網膜色素線条が挙げられる。
【実施例】
【００９５】
実施例１：Ｇｌｃ（６）−ＰＩＣミセルの作製
実施例１では、ミセル形成に必要な高分子の合成を行なった。
【００９６】
１−１．Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）の合成
まず、１，２−Ｏ−イソプロピリデン−５，６−Ｏ−ベンジリデン−α−Ｄ−グルコフラノース（以下、「ＢＩＧ−ＯＨ」という）を合成した。具体的には、１，２−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラノース（以下、「ＭＩＧ」という）（和光純薬工業社製）１０ｇ、ベンズアルデヒド４０ｍＬをフラスコ中で混合し、ロータリーエバポレーターで４時間回転させながら混合し、反応させた。反応後、酢酸エチル  ６６ｍＬを加え、蒸留水  １２０ｍＬで洗浄し、有機層（酢酸エチル層）のみを回収し、ヘキサン  ５００ｍＬに加えて０℃で再結晶し、ＢＩＧ−ＯＨ  ９．２ｇ（収率８５％）を得た。
【００９７】
次に、得られたＢＩＧ−ＯＨからＢＩＧ−ポリエチレングリコール（ＢＩＧ−ＰＥＧ−ＯＨ）を合成した。具体的には、ＢＩＧを反応容器のガラス壁面に均一に付着させるために、ベンゼン凍結乾燥後、７０℃で一晩減圧乾燥したＢＩＧ−ＯＨ  ０．７２ｇをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）５ｍＬに溶解した。これにより、分子量の揃った単峰性のピークを有するゲル浸透クロマトグラムが得られた（データ非掲載）。０．３Ｍのナフタレンカリウムを含んだＴＨＦ溶液３．３ｍＬをＢＩＧ−ＯＨ溶液に滴下し、エチレンオキシド（ＥＯ）２．２ｍＬをアルゴン雰囲気下で添加し常温で４８時間反応させる。その後、１ｍＬのメタノールを反応液に添加し、１０％メタノールを含む冷却エーテルで再沈殿させＢＩＧ−ＰＥＧ−ＯＨ  ２．８ｇ（収率８９％）を回収した。
【００９８】
さらに、得られたＢＩＧ−ＰＥＧ−ＯＨのＯＨ基をアミノ化して、アミノエチル基を有するＢＩＧ−ＰＥＧ−ＮＨ２を合成した。具体的には、ベンゼン凍結乾燥したＢＩＧ−ＰＥＧ−ＯＨ  ２．０ｇを０．８ｍＬのトリエチルアミンを溶解したＴＨＦ溶液２０ｍＬに溶解する。メタンスルホニルクロリド５７０ｍｇを冷ＴＨＦ  ２０ｍＬに溶解した溶液を上記のＢＩＧ−ＰＥＧ−ＯＨ溶液に添加し、室温で一晩反応させた。沈殿した塩を濾過により取り除き、ろ液を１０％メタノールを含むジエチルエーテルを含む寒剤５００ｍＬで再沈殿させ、濾過後、減圧乾燥した。得られた粉末を２５％アンモニア水溶液１００ｍＬに溶解し、室温で２日間反応させた。透析膜（分画分子量１，０００）を用いて２０００倍希釈したアンモニウム水溶液で透析し、その後、純水で透析した。その後、ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−２５（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でアミノ化が進まなかったフラクションを除去し、凍結乾燥を行いＢＩＧ−ＰＥＧ−ＮＨ２  １．６ｇ（収率８５％）を回収した。精製後のＢＩＧ−ＰＥＧ−ＮＨ２のＨ１  ＮＭＲスペクトルには不純物に起因するピークは観察されなかった（データ非掲載）。
【００９９】
さらに、得られたＢＩＧ−ＰＥＧ−ＮＨ２からＢＩＧ−ＰＥＧ−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）（以下、「ＢＩＧ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ」という）を合成した。具体的には、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物（以下、「ＢＬＡ−ＮＣＡ」という）  １．７ｇをＤＭＦ３．５ｍＬに溶解し、３０ｍＬのジクロロメタンで希釈した。ベンゼン凍結乾燥後のＢＩＧ−ＰＥＧ−ＮＨ２  ２００ｍｇを４  ｍＬのジクロロメタンに溶解し、その溶液をＢＬＡ−ＮＣＡ溶液に加え、アルゴン存在下、３５℃で４０時間重合した。ＩＲ分析で重合反応が終了したことを確認したのち、反応混合物をヘキサン／酢酸エチル＝６：４  ５００ｍＬに滴下して沈澱したポリマーを吸引濾過により回収し、真空乾燥してＢＩＧ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ  １．３９ｇ（収率５８％）を得た。得られたＢＩＧ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡは、分子量の揃った単峰性のピークを有するゲル浸透クロマトグラムを示した（データ非掲載）。
【０１００】
さらに、得られたＢＩＧ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡからＢＩＧ−ＰＥＧ−ポリアスパラギン酸（以下、「ＢＩＧ−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）」という）を合成した。ＢＩＧ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ  ５００ｍｇを０．５Ｎ水酸化ナトリウムに懸濁しながら室温でベンジルエステルを加水分解する。コポリマーが溶解した後、透析膜（分画分子量１，０００）を用いて水中で透析した。膜内の溶液を凍結乾燥してＢＩＧ−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）  １３２ｍｇ（収率６８％）を得た。
【０１０１】
その後、ＢＩＧ−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）からＧｌｃ（６）−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）を合成した。ここで、Ｇｌｃ（６）は、グルコースがその６位の炭素でＰＥＧに結合していることを意味する。ＢＩＧ−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）１００ｍｇをトリフエルオロ酢酸／純水（８：２）１０ｍＬに溶解し、１時間反応させた。透析膜（分画分子量１，０００）を用いて０．０１Ｎ  ＮａＯＨ、純水の順で透析した。膜内の溶液を凍結乾燥してＧｌｃ（６）−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）７０ｍｇ（収率７０％）を得た。
【０１０２】
１−２．ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）およびＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．−ＡＰ）の合成
まず、ポリエチレングリコール−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）ブロック共重合体（ＰＥＧ−ＰＢＬＡ）をβ−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ）（中央化製品社に製造委託して得た）の重合により得た。具体的には、ＢＬＡ−ＮＣＡ  １８．９ｇをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２０ｍＬに溶解する。メトキシ基の末端とアミノエチル基の末端を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＮＨ２）（分子量２，０００）２．０ｇをＤＭＦ  ２０ｍＬに溶解し、その溶液をＢＬＡ−ＮＣＡ溶液に加える。混合溶液を３５℃に保ちながら４０時間重合した。赤外分光（ＩＲ）分析で重合反応が終了したことを確認した後、反応混合物をジエチルエーテル２Ｌに滴下して沈澱したポリマーを吸引濾過により回収し、ジエチルエーテルで洗浄した後に真空乾燥してＰＥＧ−ＰＢＬＡ  １５．５１ｇ（収率７９％）を得た。
【０１０３】
次に、ＰＥＧ−ＰＢＬＡからポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体（ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）を合成した。具体的には、ＰＥＧ−ＰＢＬＡ  １．０ｇを０．５Ｎ水酸化ナトリウムに懸濁しながら室温でベンジルエステルを加水分解した。コポリマーが溶解した後、透析膜（分画分子量６，０００−８，０００）を用いて水中で透析した。膜内の溶液を凍結乾燥してＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）  ６５４ｍｇ（収率７８％）を得た。
【０１０４】
次に、ＰＥＧ−ＰＢＬＡからポリエチレングリコール−ポリ（（５−アミノペンチル）−アスパラギン酸）ブロック共重合体（ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．−ＡＰ））を合成した。具体的には、ベンゼン凍結乾燥をしたＰＥＧ−ＰＢＬＡ  １ｇをＤＭＦ  １０ｍＬに溶解する。１，５−ジアミノペンタン（ＤＡＰ）  ８ｍＬをＰＥＧ−ＰＢＬＡ溶液に加えた。混合溶液を５℃に保ちながら１時間反応させた。その後、反応液に２０重量％の酢酸水溶液１５．２ｍＬを添加し、透析膜（分画分子量６，０００−８，０００）を用いて水中で透析した。膜内の溶液を凍結乾燥してＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．−ＡＰ）  ９５４ｍｇ（収率８１％）を得た。
【０１０５】
１−３．蛍光ラベル化ポリマーＣｙ５−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）の合成
上記で得られたＰＥＧ−ＰＢＬＡ  ５００ｍｇをジメチルスルフォオキシド（ＤＭＳＯ）  ２０ｍＬに溶解した。スルホ型Ｃｙ５−Ｎ−ヒドロキシスクシイミドエステル（Lumiprobe社製、製品番号：43320）２５ｍｇを、ＰＥＧ−ＰＢＬＡ溶液に加え、常温で２日間反応させた。その後、０．５Ｎ水酸化ナトリウムを７５ｍＬ添加し、室温でベンジルエステルを加水分解した。透析膜（分画分子量６，０００−８，０００）を用いてエタノール、水の順で透析した。膜内の溶液を凍結乾燥してＣｙ５−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）  ４５６ｍｇ（収率８６％）を得た。
【０１０６】
１−４．Ｇｌｃ（３）−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）の合成
まず、ベンゼン凍結乾燥した１，２，５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラノース（ＤＩＧ）からＤＩＧ−ＰＥＧ−ＯＨを得た。具体的には、ＤＩＧ（ＴＣＩ社製）  ０．７２ｇをＴＨＦ  ５ｍＬに溶解して、ＤＩＧ−ＯＨ溶液を得た。その後、０．３Ｍのナフタレンカリウムを含んだＴＨＦ溶液  ３．５ｍＬを得られたＤＩＧ−ＯＨ溶液に滴下し、エチレンオキシド（ＥＯ）２．５ｍＬをアルゴン雰囲気下で添加し常温で４８時間反応させた。その後、１ｍＬのメタノールを反応液に添加し、１０％メタノールを含むエーテルを寒剤でよく冷やしたもので再沈殿させＤＩＧ−ＰＥＧ−ＯＨ  ３．２ｇ（収率８６％）を回収した。
【０１０７】
次に、得られたＤＩＧ−ＰＥＧ−ＯＨをアミノ化してＤＩＧ−ＰＥＧ−ＮＨ２を得た。具体的には、ベンゼン凍結乾燥したＤＩＧ−ＰＥＧ−ＯＨ  ３．２ｇを０．８ｍＬのトリエチルアミンを溶解したＴＨＦ溶液  ３２ｍＬに溶解する。メタンスルホニルクロリド９１２ｍｇを冷ＴＨＦ  ３２ｍＬに溶解した溶液を上記のＤＩＧ−ＰＥＧ−ＯＨ溶液に添加し、室温で一晩反応させた。沈殿した塩を濾過により取り除き、ろ液を１０％メタノールを含むジエチルエーテルを含む寒剤５００ｍＬで再沈殿させ、濾過後減圧乾燥した。得られた粉末を２５％アンモニア水溶液１００ｍＬに溶解し、室温で２日間反応させた。透析膜（分画分子量１，０００）を用いて２０００倍希釈したアンモニウム水溶液中、純水の順番で透析した。その後、ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−２５（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でアミノ化がすすんでいないフラクションを除き凍結乾燥を行いＤＩＧ−ＰＥＧ−ＮＨ２  ２．９５ｇ（収率８９％）を回収した。
【０１０８】
さらに、得られたＤＩＧ−ＰＥＧ−ＮＨ２からＤＩＧ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡを合成した。具体的には、ＢＬＡ−ＮＣＡ  １．７ｇをＤＭＦ  ３．５ｍＬに溶解し、３０ｍＬのジクロロメタンで希釈した。ベンゼン凍結乾燥後のＤＩＧ−ＰＥＧ−ＮＨ２  ２００ｍｇを４ｍＬのジクロロメタンに溶解し、その溶液をＢＬＡ−ＮＣＡ溶液に加え、アルゴン存在下、３５℃で４０時間重合した。ＩＲ分析で重合反応が終了したことを確認したのち、反応混合物をヘキサン／酢酸エチル（ヘキサン：酢酸エチル＝６：４）  ５００ｍＬに滴下して、沈澱したポリマーを吸引濾過により回収し、真空乾燥してＤＩＧ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ  １．３２ｇ（収率７０％）を得た。
【０１０９】
さらに、得られたＤＩＧ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡからＤＩＧ−ＰＥＧ−ポリアスパラギン酸（ＤＩＧ−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．））を合成した。具体的には、ＤＩＧ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ  ５００ｍｇを０．５Ｎ水酸化ナトリウムに懸濁しながら室温でベンジルエステルを加水分解する。コポリマーが溶解した後、透析膜（分画分子量１，０００）を用いて水中で透析した。膜内の溶液を凍結乾燥してＤＩＧ−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）  １４５ｍｇ（収率５４％）を得た。
【０１１０】
さらに、得られたＤＩＧ−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）からＧｌｃ（３）−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）を合成した。ここで、Ｇｌｃ（３）は、グルコースがその３位の炭素でＰＥＧに結合していることを意味する。具体的には、ＤＩＧ−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）  １００ｍｇをトリフエルオロ酢酸／純水（トリフルオロ酢酸：水＝８：２）  １０ｍＬに溶解し、１時間反応させた。透析膜（分画分子量１，０００）を用いて０．０１Ｎ  ＮａＯＨ、純水の順で透析した。膜内の溶液を凍結乾燥してＧｌｃ（３）−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）  ７５ｍｇ（収率８６％）を得た。
【０１１１】
１−５．Ｃｙ５−ＰＩＣミセルの調製
Ｃｙ５−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）５０ｍｇを１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ  ７．４、０ｍＭ  ＮａＣｌ）５０ｍＬに溶解し、１ｍｇ／ｍＬのＣｙ５−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）溶液を調製した。ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．−ＡＰ）  ５０ｍｇも同様にＰＢ  ５０ｍＬに溶解し、１ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．−ＡＰ）溶液を調製した。２種類の水溶液Ｃｙ５−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）とＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．−ＡＰ）それぞれ４ｍＬと７．０ｍＬを５０ｍＬのコニカルチューブに添加し、ボルテックスで２分間撹拌した（２０００ｒｐｍ）。その後、水溶性の縮合剤である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（１０ｍｇ／ｍＬ）を含有するＰＢ溶液５．６ｍＬを加え、一晩静置しポリイオンコンプレクスのコアを架橋した。その後、分画分子量１００，０００の膜のついた限外濾過チューブを用いて、ミセル形成に関与していないポリマーおよびＥＤＣの副生成物などを除去した。
【０１１２】
１−６．得られたＣｙ５−ＰＩＣミセルのキャラクタリゼーション
得られたＣｙ５−ＰＩＣミセルのサイズ（Ｚ平均粒子径）および多分散指数（ＰＤＩ）は、ゼータサイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ）で測定した。サイズはブラウン運動により移動している粒子の拡散を測定し、その測定結果をストークス・アインシュタインの式を用いて粒子径と粒度分布に変換した。またミセルの形状は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＪＥＭ−１４００）を用いて評価した。ここで、Ｚ平均粒子径とは、粒子分散  物等の動的光散乱法の測定データを、キュムラント解析法を用いて解析したデータである。キュムラント解析においては、粒子径の平均値と多分散指数（ＰＤＩ）が得られ、本発明においては、この平均粒子径をＺ平均粒子径と定義する。厳密には、測定で得られたＧ１相関関数の対数に、多項式をフィットさせる作業を、キュムラント解析といい、下式：
ＬＮ（Ｇ１）＝ａ＋ｂｔ＋ｃｔ２＋ｄｔ３＋ｅｔ４＋・・・における定数ｂが、二次キュムラントまたは、Ｚ平均拡散係数と呼ばれる。Ｚ平均拡散係数の値を分散媒の粘度と幾つかの装置定数を用いて粒子径に換算した値がＺ平均粒子径であり、分散安定性の指標として品質管理目的に適した値である。
【０１１３】
１−７．Ｇｌｃ（６）−Ｃｙ５−ＰＩＣミセルの調製
Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）２０ｍｇとＣｙ５−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）４０ｍｇを１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ７．４、０ｍＭ  ＮａＣｌ）６０ｍＬに溶解し、１ｍｇ／ｍＬのＣｙ５−Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）とＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）混合溶液を調製した。ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．−ＡＰ）５０ｍｇも同様にＰＢ  ５０ｍＬに溶解し、１ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．−ＡＰ）溶液を調製した。２種類の水溶液、すなわち、Ｃｙ５−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）とＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）との混合液とＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．−ＡＰ）溶液のそれぞれ４ｍＬと７．０ｍＬを５０ｍＬのコニカルチューブに添加して、ボルテックスにより２分間撹拌した（２０００ｒｐｍ）。その後、水溶性の縮合剤であるＥＤＣ（１０ｍｇ／ｍＬ）を含有するＰＢ溶液  ５．６ｍＬを加え、一晩静置しポリイオンコンプレクスのコアを架橋した。その後、分画分子量１００，０００の膜のついた限外濾過チューブを用いて、ミセル形成に関与していないポリマー、ＥＤＣの副生成物などを除去した。
【０１１４】
１−８．Ｇｌｃ（６）−Ｃｙ５−ＰＩＣミセルのキャラクタリゼーション
得られたＧｌｃ（６）−Ｃｙ５−ＰＩＣミセルのサイズ（Ｚ平均粒子径）および多分散指数（ＰＤＩ）は、ゼータサイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ）で測定した。その結果、平均粒径４０ｎｍであり、粒径が均一なミセルを得たことが明らかとなった（図２Ａ）。また、ミセルの形状は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＪＥＭ−１４００）を用いて、酢酸ウラニルで染色後に観察した（図２Ｂ）。
【０１１５】
１−９．Ｇｌｃ（３）−Ｃｙ５−ＰＩＣミセルの調製
Ｇｌｃ（３）−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）２０ｍｇとＣｙ５−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）４０ｍｇをｐＨ７．４  １０ｍＭリン酸緩衝液  （ＰＢ、０ｍＭ  ＮａＣｌ）６０ｍＬに溶解し、１ｍｇ／ｍＬのＣｙ５−Ｇｌｃ（３）−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）とＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）混合溶液を調製した。ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．−ＡＰ）  ５０ｍｇも同様にＰＢ  ５０ｍＬに溶解し、１ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．−ＡＰ）溶液を調製した。２種類の水溶液Ｃｙ５−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）、ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）混合液とＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．−ＡＰ）溶液のそれぞれ４ｍＬと４．３ｍＬを５０ｍＬのコニカルチューブに添加して、ボルテックスで２分間撹拌した（２０００ｒｐｍ）。その後、水溶性の縮合剤であるＥＤＣ（１０ｍｇ／ｍＬ）を含有するＰＢ溶液５．６ｍＬを加え、一晩静置しポリイオンコンプレクスのコアを架橋した。その後、分画分子量１００，０００の膜のついた限外濾過チューブを用いて、ミセル形成に関与していないポリマー、ＥＤＣの副生成物などを除去した。得られたＧｌｃ（６）−Ｃｙ５−ＰＩＣミセルのサイズ（Ｚ平均粒子径）および多分散指数（ＰＤＩ）は、ゼータサイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ）で測定した。またミセルの形状は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＪＥＭ−１４００）を用いて評価した。得られたミセルは、直径３２ｎｍ（ＰＤＩ＝０．０４３）であった（データ非掲載）。
【０１１６】
実施例２．ＰＩＣミセルの体内動態評価実験
実施例１で作製したミセルをマウスに静脈投与してその体内動態を調べた。ミセルを投与する際には、血糖操作の効果も加えて評価した。
【０１１７】
以下の実施例において、脳への蓄積は、全投与量に対する脳１ｇ当りに蓄積する量（％）に基づいて評価した。
【０１１８】
上記の各ミセル溶液（すなわち、Ｇｌｃ（６）−Ｃｙ５−ＰＩＣミセル、Ｇｌｃ（３）−Ｃｙ５−ＰＩＣミセルまたはＣｙ５−ＰＩＣミセルの溶液（濃度１ｍｇ／ｍＬ））の容量２００μＬを２４時間給餌しなかった絶食マウス（Ｂａｌｂ／ｃ  ♀６週齢）と自由に給餌をしたマウスにそれぞれ２００μＬずつ静脈投与（ｉ．ｖ．）した。ここで示す１ｍｇ／ｍＬとはそれぞれのポリアニオンに結合してあるＣｙ５由来の蛍光をＮａｎｏＤｒｏｐで測定した結果求められた値である。なお、絶食したマウス群は、ミセル溶液投与６時間後に給餌を再開した。所定の時間経過を待った後、マウスに麻酔を施し開腹後、腹部大動脈から血液を採取し、更に脳、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、肺および大腿筋を取り出した。採取した血液を４℃、１５，０００ｒｐｍにて５分間遠心して血漿を調製し、９６穴プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，米国）に分注して、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００  ＰＲＯを用いた蛍光測定によって血漿の蛍光強度から血中のミセル濃度を定量した。このとき対照として、サンプルが投与されなかったマウスの血液を使用した。また、マウスの全血を２ｍＬ、うち血漿の量を５５％と仮定し、薬物の体内動態を評価した。脳、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、肺および大腿筋にそれぞれ溶解緩衝液とメタルコーンを加え、破砕して懸濁液とし、９６穴プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、米国）にそれぞれ注入し、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００  ＰＲＯを用いた蛍光測定によってミセルの各臓器への蓄積効率（％）を定量した。
【０１１９】
その結果、グルコースの６位の炭素を介してその外表面が修飾されたミセル（Ｇｌｃ（６）−ＰＩＣミセル）は、絶食させてからマウスに投与した場合には、給餌の再開と同時に脳へのミセルの蓄積量が顕著に増大し、脳１ｇに対して最大で全投与ミセル量の約３．８％が蓄積した（図３Ａ）。このとき、血中ミセル濃度は給餌の再開と同時に減少した（データ非掲載）。このような脳へのミセルの蓄積量の増大は、グルコースでその外表面が修飾されていないミセルでは、観察されなかった。従って、この結果から、脳へのＧｌｃ（６）−ＰＩＣミセルの蓄積は、絶食によりマウスの血糖値を低下させることと、ミセル投与前後に該マウスの血糖値を上昇させることとが重要であることが明らかとなった。ただし、絶食させたマウスにおいてミセル投与後、給餌再開前であっても一部のミセルは脳に取り込まれている（図３Ａの黒い四角）。また、絶食させていないマウスにおいてもミセル投与後、一部のミセルは脳に取り込まれた（図３Ａの白抜き四角）。また、ミセルの各臓器への集積量を評価したところ、血糖操作により脳への蓄積量が選択的に増大した（図３Ｂ）。従って、血糖操作による蓄積量の増大は、脳特異的であることが理解できる。なお、肝臓や腎臓は、血糖操作の有無によらず、それぞれ約８％および４％の蓄積を示した（データ非掲載）。また、グルコースの６位の炭素を介してその外表面が修飾されたミセル（Ｇｌｃ（６）−ＰＩＣミセル）を調製する際に用いられるカチオン性高分子のすべてをＧｌｃ（６）−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）とすると、グルコース導入率５０％のミセルを得ることができ、半分をＧｌｃ（６）−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）とすると、グルコース導入率２５％のミセルを得ることができる。得られたミセルを上記方法で投与すると、グルコース導入率２５％のミセルは３％を超える脳への蓄積を示したのに対して、グルコース導入率５０％のミセルは約１．３％の脳への蓄積を示した。
【０１２０】
さらに、グルコースの３位の炭素を介してその外部表面が修飾されたミセル（Ｇｌｃ（３）−ＰＩＣミセルとＧｌｃ（６）−ＰＩＣミセル）の脳への蓄積量を比較した。具体的には、上記の方法でＧｌｃ（６）−Ｃｙ５−ＰＩＣミセルとＧｌｃ（３）−Ｃｙ５−ＰＩＣミセルを絶食マウスにｉ．ｖ．投与し、６時間後に給餌を再開し、投与から８時間後（給餌再開から２時間後）に脳を摘出し、上記の方法でそれぞれのサンプルの脳への集積量を算出した。すると、Ｇｌｃ（３）−ＰＩＣミセルよりも多くのＧｌｃ（６）−ＰＩＣミセルが脳への蓄積を示した（図４Ｂ）。
【０１２１】
さらに脳内へのミセルの蓄積部位を詳細に調べるため、In vivo共焦点顕微鏡観察を行なった。具体的には、まず、２．５％イソフルラン麻酔下で２４時間絶食したマウス（Ｂａｌｂ／ｃ、♀、６週齢）の開頭を行なった。次に、麻酔を維持しながら、サンプルのｉ．ｖ．投与用のカテーテルを微静脈にセットし、また、グルコース溶液の腹腔内投与（ｉ．ｐ．）用のカテーテルを腹腔内にセットし、共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ａ１Ｒ）のステージにセットした。観察開始から５分後にＧｌｃ（６）−Ｃｙ５−ＰＩＣミセル（１ｍｇ／ｍＬ、２００μＬ）をカテーテルを通してｉ．ｖ．投与した（グラフ図５Ｂの０分は、サンプル投与のタイミングである）。次いで、サンプル投与から３０分後に２０ｖ／ｖ％グルコース溶液をカテーテルを通してｉ．ｐ．投与した。蛍光は励起波長６３８ｎｍのレーザーを用いて約３時間にわたり脳内におけるサンプルの挙動をリアルタイム観察した（蛍光波長６６２〜７３７ｎｍ）。すると、血管内にのみ観察された蛍光が、時間経過と共に脳実質（例えば、点線部）にしみ出すようすが観察された（図５Ａ）。上記の観察で得られた動画を基に、横軸を観察経過時間とし、縦軸を脳血管と重ならない５つの領域（図５Ａに示す脳実質の点線部）のＲＯＩ（ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）における蛍光強度の平均をプロットした。すると、血糖値の上昇に追随してミセルの脳実質への取り込みが上昇した（図５Ｂ）。なお、マウスの血糖値は、グルコース溶液をｉ．ｐ．投与する直前、投与２０分後、３０分後、５０分後または９０分後に血液を５μＬずつ微静脈より採取し、実験動物用血糖値測定器を用いて、血糖値を測定して求めた（図５Ｂ）。ミセルの脳への取り込みは、血糖値の上昇後の血糖値の低下と共に起こったことから、ミセルの投与は血糖値上昇の後であってもよいと考えられる。
【０１２２】
次に、ミセルの投与を血糖値上昇の後に行っても、ミセルが脳実質に移行することを確認した。具体的には、まず、２．５％イソフルラン麻酔下で２４時間絶食したマウス（Ｂａｌｂ／ｃ、♀、６週齢）の開頭を行なった。次に、麻酔を維持しながら、グルコース溶液の腹腔内投与（ｉ．ｐ．）用のカテーテルを腹腔内にセットし、共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ａ１Ｒ）のステージにセットした。２０ｖ／ｖ％グルコース溶液をカテーテルを通してｉ．ｐ．投与し、次いで、グルコース投与から３０分後にＧｌｃ（６）−Ｃｙ５−ＰＩＣミセル（１ｍｇ／ｍＬ、２００μＬ）をカテーテルを通してｉ．ｖ．投与して、またはカテーテルを用いずにｉ．ｐ．投与して観察を開始した（グラフ図１１Ｂの０分は、サンプル投与のタイミングを示す）。蛍光は励起波長６３８ｎｍのレーザーを用いて約３時間にわたり図１１Ａに示される４つの脳実質領域におけるサンプルの蓄積を蛍光強度を指標としてリアルタイム観察した（蛍光波長６６２〜７３７ｎｍ）。すると、図１１Ｂに示されるように、サンプルのｉ．ｖ．投与直後から脳実質内へのサンプルの取り込みが観察され、時間経過に従って穏やかに取り込み量が増大し、３時間にわたり取り込みが持続した。グルコース投与とサンプル投与の前後関係を変えることにより、サンプルの脳実質への取り込み量の経時パターンが変化した。このことは、グルコース投与とサンプル投与の前後関係を変えることにより、血液脳関門を通過させるタイミングが制御可能であることを意味する。
【０１２３】
このことから、本発明の組成物は、血糖操作により血液脳関門を通過して効果的に脳実質に到達し得ることが明らかとなった。
【０１２４】
実施例３．ＰＩＣｓｏｍｅの作製と体内動態評価実験
直径約１００ｎｍの中空キャリアとしてＰＩＣｓｏｍｅを作製し、体内動態評価により脳への標的化効果を検証した。
【０１２５】
３−１．ホモＰ（Ａｓｐ．−ＡＰ）の合成
まず、ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）（ホモＰＢＬＡポリマー）をＢＬＡ−ＮＣＡの重合により得た。具体的には、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ）２０ｇをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３３．３ｍＬ、ジクロロメタン３００ｍＬに溶解する。Ｎ−ブチルアミン８９．０μＬを上記ＢＬＡ−ＮＣＡ溶液に加える。混合溶液を３５℃に保ちながら４０時間重合した。赤外分光（ＩＲ）分析で重合反応が終了したことを確認したのち、反応混合物をヘキサン／酢酸エチル溶液（ヘキサン：酢酸エチル＝６：４）１Ｌに滴下して沈澱したポリマーを吸引濾過により回収し、ジエチルエーテルで洗浄した後に真空乾燥してホモＰＢＬＡポリマー  １４．８２ｇ（７９％）を得た。
【０１２６】
次に、得られたホモＰＢＬＡポリマーからポリ（（５−アミノペンチル）−アスパラギン酸）（ホモＰ（Ａｓｐ．−ＡＰ））を合成した。具体的には、ベンゼン凍結乾燥をしたホモＰＢＬＡ  １ｇをＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）１０ｍＬに溶解する。ＤＡＰ  １７．２ｍＬをＮＭＰ  １７．２ｍＬに溶解し、ホモＰＢＬＡ溶液に加える。混合溶液を５℃に保ちながら４０分反応した。その後、反応液に２０重量％の酢酸水溶液１０ｍＬを添加し、透析膜（分画分子量６，０００−８，０００）を用いて水中で透析した。膜内の溶液を凍結乾燥してＰ（Ａｓｐ．−ＡＰ）  ０．７６ｇ（８２％）を得た。
【０１２７】
３−２．Ｇｌｃ（６）−Ｃｙ５−ＰＩＣｓｏｍｅの調製
実施例１で得たＧｌｃ（６）−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）２０ｍｇとＣｙ５−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）４０ｍｇを１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ７．４、０ｍＭ  ＮａＣｌ）６０ｍＬに溶解し、１ｍｇ／ｍＬのＧｌｃ（６）−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）とＣｙ５−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）との混合溶液を調製した。また、ホモＰ（Ａｓｐ．−ＡＰ）５０ｍｇも同様にＰＢ  ５０ｍＬに溶解し、１ｍｇ／ｍＬのホモＰ（Ａｓｐ．−ＡＰ）溶液を調製した。次に、２種類の水溶液、すなわち、Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）とＣｙ５−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）との混合液およびホモＰ（Ａｓｐ．−ＡＰ）溶液のそれぞれ４．０ｍＬおよび５．０ｍＬを５０ｍＬのコニカルチューブ中で混合し、ボルテックスにより２分間撹拌した（２０００ｒｐｍ）。その後、水溶性の縮合剤であるＥＤＣ（１０ｍｇ／ｍＬ）を含有するＰＢ溶液５．６ｍＬを加え、一晩静置してポリイオンコンプレクスのコアを架橋した。その後、分画分子量１００，０００の膜のついた限外濾過チューブを用いて、ＰＩＣｓｏｍｅ形成に関与していないポリマー、ＥＤＣの副生成物などを除去した。得られたＧｌｃ（６）−Ｃｙ５−ＰＩＣｓｏｍｅのサイズ（Ｚ平均粒子径）および多分散指数（ＰＤＩ）は、ゼータサイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ）で測定した。またミセルの形状は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＪＥＭ−１４００）を用いて、酢酸ウラニルで染色後に観察した。すると、直径１００ｎｍ（ＰＤＩ＝０．０８６）のPICsomeを得たことが明らかとなった（データ非掲載）。
【０１２８】
３−３．体内動態評価
ＰＩＣミセルの代わりに得られたPICsomeを投与する以外は実施例２と全く同じ方法で、PICsomeをマウスに投与し、脳へのPICsomeの蓄積を観察した。すると、グルコースでその外表面が修飾されたPICsomeのみが給餌後、急激に脳内に蓄積する様子が観察された（図６）。グルコースでその外表面が修飾されたPICsomeの脳１ｇ当りの蓄積量は約２％であった（図６）。
【０１２９】
このことから、小胞は直径１００ｎｍでも問題無く血液脳関門を通過し得ることが明らかとなった。
【０１３０】
さらに、脳（大脳皮質）の深部における小胞の局在を２光子顕微鏡（高速共焦点レーザー顕微鏡用多光子励起レーザー Nikon A1RMP-IS-S33）を用いて観察した。得られた結果は図１３に示される通りであった。すなわち、脳表層におけるよりも、脳深部においてＰＩＣミセル由来の強い蛍光が観察された。
【０１３１】
脳の表層から０μｍ、６０μｍ、２００μｍ、３００μｍ、５００μｍまたは６００μｍの位置における切片の蛍光像を観察した。すると、いずれの深さにおいてもPICミセルの脳実質への移行が確認されたが、特に２００μｍ〜５００μｍにおいて大量の蛍光が脳実質に局在した（図１４）。
【０１３２】
さらに大脳皮質における継時的な蛍光強度変化を確認した。図１５に示されるように、１日後〜１週間後において、脳実質に大量の蛍光が局在した。
【０１３３】
これらのことから、グルコースで該表面を修飾したPICミセルは、本発明の血糖操作を伴って対象に投与されると、脳深部（例えば、６０μｍ〜６００μｍ）においても脳実質に蓄積させることが可能であることが明らかとなった。また、その蓄積は、投与１週間後でも持続した。脳は、表層から、分子層、外顆粒層、外錐体細胞層、内顆粒層、内錐体細胞層および多形細胞層が存在するが（例えば、図１３〜図１５参照）、これらのいずれの層においても脳実質にキャリアを送達することができた。これらの層の中では特に、外錐体細胞層および内顆粒層においてキャリアの送達が顕著に有効であった。
【０１３４】
実施例４：ｓｉＲＮＡミセルの作製と体内動態評価
本実施例では、血中滞留時間が短く送達効率の低いｓｉＲＮＡを用いて実施例２および３と同様に体内動態評価を行なった。より具体的には、本実施例では、グルコースをコンジュゲートしたＰＥＧ−ポリカチオンと蛍光標識ｓｉＲＮＡからなるミセルを用いて、ｓｉＲＮＡの脳への蓄積を評価した。
【０１３５】
４−１．Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．−ＴＥＰ）−Ｃｈｏｌの合成
まず、実施例１に記載の方法により得たＢＩＧ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡからＢＩＧ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ｃｈｏｌを合成した。具体的には、ＢＩＧ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ  １２０ｍｇをＮＭＰ  １０ｍＬに溶解し、ＰＢＬＡの末端のアミノ基に対し１０等量の４−コレステリルアミノ−４−ブタン酸および触媒量のジメチルアミノピリジンを添加し、その後、室温にて６時間撹拌した。反応溶液をジエチルエーテル／２−プロパノール（９：１）溶液に滴下し、目的物を沈殿させた。沈殿物をろ過後減圧乾燥させてＢＩＧ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ｃｈｏｌを１３０ｍｇ得た（収率９５％）。
【０１３６】
次に、得られた（ＢＩＧ）−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−ＣｈｏｌからＢＩＧ−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＴＥＰ）−Ｃｈｏｌを合成した。具体的には、ＢＩＧ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ｃｈｏｌ  １００ｍｇをＮＭＰ  ５ｍＬに溶解し、ＮＭＰで希釈したテトラエチレンペンタアミン（ＴＥＰ）溶液に対しポリマー溶液を滴下し、その後２０℃にて１時間反応した。反応溶液を氷冷した１Ｎ  塩酸に対して滴下し、分画分子量１２，０００−１４，０００の透析膜を用いて、４℃で透析した。透析外液としては、０．０１Ｎ塩酸を用い、その後、透析外液として純水を用いて透析したのち、得られた溶液を凍結乾燥して、５６ｍｇのＢＩＧ−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＴＥＰ）−Ｃｈｏｌを回収した（収率７３％）。
【０１３７】
最後に、ＢＩＧ−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＴＥＰ）−ＣｈｏｌからＧｌｃ（６）−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＴＥＰ）−Ｃｈｏｌを得た。具体的には、ＢＩＧ−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＴＥＰ）−Ｃｈｏｌ  ５６ｍｇをトリフルオロ酢酸／純水（８：２）溶液  ８ｍＬに溶解し、１時間反応させた。透析膜（分画分子量１，０００）を用いて透析外液として０．０１Ｎ  ＮａＯＨを用いて透析し、次いで純水で透析した。得られた溶液を凍結乾燥して６７ｍｇのＧｌｃ（６）−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＴＥＰ）−Ｃｈｏｌ（収率８２％）を得た。
【０１３８】
４−２．Ｇｌｃ（６）−ｓｉＲＮＡミセルの調製
Ｇｌｃ（６）−ｓｉＲＮＡミセルは、図７Ａのスキームに従って調製した。具体的には、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中に溶解させたＧｌｃ（６）−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．−ＴＥＰ）−Ｃｈｏｌ（２ｍｇ／ｍＬ）  ２６２．５μＬをＨＥＰＥＳ緩衝液４３７．５μＬで希釈した。北海道システム・サイエンス社製のスクランブルｓｉＲＮＡであるＣｙ５−ｓｉＲＮＡ−ｃｈｏｌ（７５μＭ）  ２７９μＬをHEPES緩衝液１１２１μＬで希釈した。得られた２液を混合して１０回ピペッティングし、Ｇｌｃ（６）−ｓｉＲＮＡミセルを得た。Ｉｎ  ｖｉｖｏ実験直前に２．１ｍＬのミセル溶液に６５μＬの５Ｍ  ＮａＣｌ溶液を加え、ピペッティングすることで等張液にしてから投与に用いた。得られたＧｌｃ（６）−Ｃｙ５−ｓｉＲＮＡミセルのサイズ（Ｚ平均粒子径）および多分散指数（ＰＤＩ）は、ゼータサイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ）で測定した。またミセルの形状は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＪＥＭ−１４００）を用いて、酢酸ウラニルで染色後に観察した。結果、直径８０ｎｍ（ＰＤＩ＝０．１０４）のｓｉＲＮＡミセルが得られたことが明らかとなった。
【０１３９】
４−３．体内動態評価
得られたＧｌｃ（６）−Ｃｙ５−ｓｉＲＮＡミセル  ２００μＬ／２時間を静脈投与により３０分または２時間にわたりシリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ社）を用いて精密持続静注し、投与開始５分後に２０％グルコース溶液を腹腔内投与した。ｓｉＲＮＡミセルの投与終了から１時間後に脳を摘出し、マルチビーズショッカーで粉砕後に、ＩＶＩＳイメージングシステム（Xenogen社）をもちいてそれぞれの輝度を評価した。すると、静脈投与の時間が長くなると、脳の輝度が上昇し、２時間の静脈投与による脳への蓄積は、３０分の静脈投与による脳への蓄積よりも多かった（図７Ｂ）。また、脳への蓄積量を算出すると、ｓｉＲＮＡミセルでは、２時間の静脈投与において、その投与量の１．３％を脳（１ｇ当り）に送達することができていることが明らかとなった。さらに、投与終了から６時間後に脳を摘出し、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０）で観察を行い、脳実質における蛍光強度を測定した。すると、ｓｉＲＮＡミセルは、脳細胞内に蓄積していることが明らかとなった（図８）。
【０１４０】
実施例４の結果から、血中滞留時間が短く、送達効率の低いｓｉＲＮＡのような物質であっても、本発明の方法により極めて効果的に脳に送達できることが明らかとなった。本発明の血糖操作によれば急速静注によってもｓｉＲＮＡミセルを脳実質に送達することは可能であるが、本実施例では、持続静注により、ｓｉＲＮＡミセルの脳実質への送達量を大幅に改善できることが明らかとなった。
【０１４１】
実施例５：グルコース修飾したブロック共重合体の体内動態評価
本実施例では、Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ−ポリアスパラギン酸をミセルを形成させずにマウスに投与してその体内動態を評価した。
【０１４２】
Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ−ポリアスパラギン酸としては、実施例１で合成したＧｌｃ（６）−ＰＥＧ−ポリアスパラギン酸を用いた。対照としては、ＰＥＧ−ポリアスパラギン酸を用いた。
【０１４３】
Ｂａｌｂ／ｃマウス（♀、６週齢、ｎ＝３）に対して、それぞれ３ｍｇ／ｍＬのＧｌｃ（６）−ＰＥＧ−ポリアスパラギン酸および対照を２００μＬずつ静脈内投与した。投与は、２時間かけて一定速度で行なった。投与開始５分後に２０％グルコース溶液を腹腔内投与した。Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ−ポリアスパラギン酸および対照の投与が終了して１時間後にグルコース修飾したブロック共重合体の体内動態を分析した。
【０１４４】
結果は図９に示す通りであった。図９に示されるように、グルコースをコンジュゲートしていないＰＥＧ−ポリアスパラギン酸は、脳への蓄積を示さなかったのに対して、グルコースをコンジュゲートしたＧｌｃ（６）−ＰＥＧ−ポリアスパラギン酸は、脳１ｇ当り全投与量の０．４％の脳の蓄積を示した。このように、上記ポリマーは１分子のグルコースで修飾されれば、脳への送達に十分であった。とりわけ血液脳関門を突破しやすいと言われるドネペジル塩酸塩ですら、全投与量に対して脳１ｇ当り０．１３％しか蓄積しない（Drug Metabolism and Disposition, 1999, 27 (12):1406-1414）。
【０１４５】
実施例６：グルコースコンジュゲート抗体の調製と体内動態評価
本実施例では、抗体にグルコースをコンジュゲートさせ、体内動態を評価した。すると、抗体も血糖操作により脳への蓄積を示した。
【０１４６】
抗体としては、市販のマウスＩｇＧ、アイソタイプコントロール（Southern Biotechnology Associates Inc.）を用いた。抗体とグルコースとのコンジュゲートは以下のように作製した。
【０１４７】
６−１．ＤｙＬｉｇｈｔ４８８蛍光標識化グルコース導入ポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体の合成
【０１４８】
まず、ＴＨＰ−ＰＥＧ−ＯＨを合成した。具体的には、２−（２−ヒドロキシエトキシ）テトラヒドロピラン（ＴＨＰ）０．１０４ｍＬをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１００ｍＬに溶解した。０．３Ｍのナフタレンカリウムを含んだＴＨＦ溶液２．８ｍＬをＴＨＰ溶液に滴下し、エチレンオキシド（ＥＯ）８．９ｍＬをアルゴン雰囲気下で添加し４０℃で１日間反応させた。その後、反応液をジエチルエーテルで再沈殿させ、片末端テトラヒドロピラニル基片末端３−ヒドロキシプロピル基のポリエチレングリコール（ＴＨＰ−ＰＥＧ−ＯＨ）（分子量１２，０００）  ８．５６ｇ（収率９５％）を得た。
【０１４９】
次に、得られたＴＨＰ−ＰＥＧ−ＯＨのＯＨ基をメシル化した。具体的には、メタンスルホン酸クロライド（ＭｓＣｌ）  １９．７μＬをＴＨＦ  ２０ｍＬに溶解した。また、ＴＨＰ−ＰＥＧ−ＯＨ（分子量１２，０００）  １．４ｇをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）  １０ｍＬに溶解し、そこにトリエチルアミン８９μＬを加えた。水浴で冷却したＭｓＣｌ溶液に対して、ＴＨＰ−ＰＥＧ−ＯＨ溶液を滴下し、３時間３０分撹拌した。反応混合物をジエチルエーテル２００ｍＬに滴下して沈殿したポリマーを吸引濾過により回収し、ジエチルエーテルで洗浄した後に真空乾燥することで、片末端３−メタンスルホニル基片末端テトラヒドロピラニル基のポリエチレングリコール（ＭｓＯ−ＰＥＧ−ＴＨＰ）（収率１００％）１．５０ｇを得た。
【０１５０】
次に、得られたＭｓＯ−ＰＥＧ−ＴＨＰからＮ３−ＰＥＧ−ＴＨＰを合成した。具体的には、ＭｓＯ−ＰＥＧ−ＴＨＰ（分子量１２，０００）  １５ｇをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）  １００ｍＬに溶解した。反応溶液を室温で撹拌しながら、アジ化ナトリウム  １．６３ｇを加えた。混合溶液を４５℃に保ちながら、７１時間撹拌した。混合溶液を室温に戻した後、純水２００ｍＬを加えた。混合溶液に対して、分液ロートを用いて、塩化メチレン２００ｍＬで６回抽出を行い、得られた有機層をロータリーエバポレーターにより１５０ｍＬまで濃縮した。濃縮液をエタノール２Ｌに滴下して沈殿したポリマーを吸引濾過により回収した後に真空乾燥して片末端アジド基片末端テトラヒドロピラニル基のポリエチレングリコール（Ｎ３−ＰＥＧ−ＴＨＰ）  １４．３ｇ（収率９５％）を得た。
【０１５１】
次に、Ｎ３−ＰＥＧ−ＴＨＰを脱保護してＮ３−ＰＥＧ−ＴＨＰを得た。具体的には、Ｎ３−ＰＥＧ−ＴＨＰ（分子量１２，０００）１４．１ｇを  メタノール２００ｍＬに溶解した。室温下、混合溶液中に１Ｎ  ＨＣｌ水溶液を２４ｍＬ加えた。反応温度を２５  ℃に保ちながら、４時間撹拌した。反応混合物をジエチルエーテル２．５Ｌに滴下して沈殿したポリマーを吸引濾過により回収し、ジエチルエーテルで洗浄した後に真空乾燥することで、片末端アジド基片末端３−ヒドロキシプロピル基のポリエチレングリコール（Ｎ３−ＰＥＧ−ＯＨ）  １３．７ｇ（収率９６％）を得た。
【０１５２】
次に、Ｎ３−ＰＥＧ−ＯＨをアミノ化してＮ３−ＰＥＧ−ＮＨ２を得た。具体的には、Ｎ３−ＰＥＧ−ＯＨ（分子量１２，０００）  １．０２ｇをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）  ３０ｍＬに溶解し、そこにトリエチルアミン４７．４μＬを加えた。メタンスルホン酸クロライド１９．７μＬをＴＨＦ  ２０ｍＬに溶解し、Ｎ３−ＰＥＧ−ＯＨ溶液を室温の水浴で冷却しながら、Ｎ３−ＰＥＧ−ＯＨ溶液に加えた。混合溶液を室温で６時間撹拌した。沈殿した塩を濾過により取り除き、反応混合物をジエチルエーテル９５０ｍＬと２−プロパノール５０ｍＬの混合溶液に滴下して沈殿したポリマーを吸引濾過により回収し、ジエチルエーテルで洗浄した後に真空乾燥した。得られた粉末を２８％アンモニア水溶液８ｍＬに溶解し、室温で３日間反応させた。透析膜（分画分子量６０００−８０００）を用いて、純水で透析した。その後、ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−２５  （ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でアミノ化が進まなかったフラクションを除去し、凍結乾燥を行い、片末端アジド基片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール（Ｎ３−ＰＥＧ−ＮＨ２）６２０ｍｇ（収率６１％）を回収した。
【０１５３】
次に、Ｎ３−ＰＥＧ−ＮＨ２からＮ３−ＰＥＧ−ＰＢＬＡを合成した。具体的には、ベンゼン凍結乾燥後のＮ３−ＰＥＧ−ＮＨ２（分子量１２，０００）１５０ｍｇを５．４ｍＬのジクロロメタンに溶解した。β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物２１８ｍｇをＤＭＦ  ０．６ｍＬに溶解し、その溶液をＮ３−ＰＥＧ−ＮＨ２溶液に加え、アルゴン存在下、３５℃で２日間重合した。ＩＲ分析で重合反応が終了したことを確認したのち、反応混合物をジエチルエーテル１５０ｍＬに滴下して沈殿したポリマーを吸引濾過により回収し、真空乾燥して片末端アジド基のポリエチレングリコール−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）ブロック共重合体（Ｎ３−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ）（分子量１２，０００）２５０ｍｇ（収率９１％）を得た。
【０１５４】
次に、Ｎ３−ＰＥＧ−ＰＢＬＡからＮ３−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）を得た。具体的には、Ｎ３−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ  ２５０ｍｇをアセトニトリル４ｍＬに溶解し、そこに０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を５．５ｍＬ加え、室温で１時間撹拌した。反応液を、透析膜（分画分子量６０００−８０００）を用いて、水中で透析した。膜内の溶液を凍結乾燥して、片末端アジド基のポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体（Ｎ３−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ））（分子量１２，０００）１８９ｍｇ（収率８９％）を得た。
【０１５５】
次に、６−アミノ−６−デオキシ−１，２：３，５−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラノース（Ｐ−アミノグルコース）を合成した。Ｐ−アミノグルコースは、Carbohydr. Res. 19, 197-210 (1971)の記載に基づいて合成した。
【０１５６】
保護グルコースを導入したポリエチレンクリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体を合成した。具体的には、６−アミノ−６−デオキシ−１，２：３，５−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラノース（Ｐ−アミノグルコース）１３７ｍｇをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）４ｍＬに溶解した。片末端がアジド基のポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体（Ｎ３−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ））（分子量１２，０００）４０ｍｇをＤＭＦ  ４ｍＬおよび水１ｍＬの混合溶媒に溶解し、その溶液を上記Ｐ−アミノグルコース溶液に加えた。その後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩２０３ｍｇをさらに加えた。得られた混合溶液を室温下で１３時間撹拌した。その後、混合溶液を透析膜（分画分子量６，０００−８，０００）を用いて、ＤＭＳＯ中で透析し、次いで水中で透析した。膜内の溶液を凍結乾燥して、保護グルコースを導入したポリエチレンクリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体４９ｍｇ（収率９６％）を得た。
【０１５７】
次に、グルコースの保護基を脱保護して、グルコース導入ポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体を得た。具体的には、保護グルコース導入ポリエチレンクリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体４９ｍｇに対して、トリフルオロ酢酸および水をそれぞれ１８ｍＬおよび２ｍＬ混合した溶液を加え、室温で２０分撹拌した。その後、透析膜（分画分子量６，０００−８，０００）を用いて、４℃に保ちながら水中で透析した。膜内の溶液を凍結乾燥して、グルコース導入ポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体４０ｍｇ（収率８７％）を得た。
【０１５８】
さらに、蛍光色素としてＤｙＬｉｇｈｔ４８８で得られた共重合体を標識した。具体的には、グルコース導入ポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体４０ｍｇをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１０ｍＬに溶解した。また、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８  Ｎ−スクシンイミドエステルをＤＭＳＯ  ５ｍＬに溶解し、その溶液をグルコース導入ポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体溶液に加えた。混合溶液を室温下４８時間撹拌した。次に、混合溶液を透析膜（分画分子量６，０００−８，０００）を用いて、水中で透析した。膜内の溶液を凍結乾燥し、黄色の固体が得られた。得られた固体をＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により、精製した。溶出液を透析膜（分画分子量６，０００−８，０００）を用いて、水中で透析した。膜内の溶液を凍結乾燥して、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８蛍光標識化グルコース導入ポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体３３ｍｇを得た。
【０１５９】
６−２．グルコース導入抗体の調製
次に、得られたＤｙＬｉｇｈｔ４８８蛍光標識化グルコース導入ポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体と抗体とをコンジュゲートさせてグルコース導入抗体を得た。具体的には以下の通りである。
【０１６０】
まず、ＩｇＧ抗体をＣｙ５標識した。具体的には、市販のマウスＩｇＧ、アイソタイプコントロール（Southern Biotechnology Associates Inc.）（５ｍｇ／ｍＬ）溶液の５ｍＬをＶＩＶＡＳＰＩＮ（分画分子量１０，０００）の上部パーツに入れた。ここで、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ８．４）を加えた後に、４℃、２０００ｒｐｍで遠心する操作を繰り返して、溶媒を０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ８．４）に置換して、その後、溶液量が２．５ｍＬとなるまで濃縮した。次に、Ｃｙ５  Ｎ−スクシンイミドエステル（Ｃｙ５−ＮＨＳ  エステル）（１ｍｇタンパク質ラベル用）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  ｃａｒｅ社）にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド３００μＬを加え、ピペッティングを行い、そのうち２５０μＬをＩｇＧ溶液に加えた。その後、混合溶液を室温で４時間穏やかに震盪した。そして、ＶＩＶＡＳＰＩＮ（分画分子量１０，０００）を用いて、４℃、２０００ｒｐｍで限外濾過を繰り返し、ＩｇＧ溶液の精製を行うと共に、溶媒をＤ−ＰＢＳ（−）へと置換し、Ｃｙ５標識化されたＩｇＧ（Ｃｙ５−ＩｇＧ）（０．９ｍｇ／ｍＬ）溶液５ｍＬを得た。
【０１６１】
次に、抗体と６−１で得た共重合体とのコンジュゲートを得るため、抗体にジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）を導入した。具体的には、Ｃｙ５−ＩｇＧ  ０．９ｍｇ／ｍＬ溶液２ｍＬをＶＩＶＡＳＰＩＮ（分画分子量１０，０００）の上部パーツに入れた。上部パーツに０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ８．４）を加えた後に、４℃、２０００ｒｐｍで限外濾過を繰り返し、溶媒を０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ８．４）に置換して、その後、溶液量が２ｍＬとなるまで濃縮した。次に、ＩｇＧ溶液にジベンジルシクロオクチン−Ｎ−スクシンイミドエステル（ＤＢＣＯ−ＮＨＳエステル）の０．４１ｍｇ／ｍＬ  ＤＭＦ溶液を２００μＬ加えた。混合溶液を室温下４時間穏やかに震盪させた。反応終了後、反応液をＶＩＶＡＳＰＩＮ（分画分子量１０，０００）の上部ユニットに入れ、Ｄ−ＰＢＳ（−）を加えた後に、４℃、２０００ｒｐｍで限外濾過を繰り返し、ＩｇＧ溶液の精製を行うと共に、溶媒をＤ−ＰＢＳ（−）へと置換し、４ｍＬのＤＢＣＯが導入されたＣｙ５標識−ＩｇＧ（Ｃｙ５標識ＤＢＣＯ−ＩｇＧ）溶液を得た。
【０１６２】
さらに、ＤＢＣＯと６−１で得た共重合体のアジド基を反応させて、抗体と共重合体とのコンジュゲートを得た。具体的には、まず、グルコース導入ＤｙＬｉｇｈｔ４８８蛍光標識化ポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体３．５ｍｇをＤ−ＰＢＳ（−）８００μＬに溶解した。得られた溶液をＣｙ５標識ＤＢＣＯ−ＩｇＧ溶液２ｍＬに加えた。混合溶液を−３０℃で３６時間静置し、その後、４℃で４時間静置して、ゆっくりと融解させた。得られた反応液をＶＩＶＡＳＰＩＮ（分画分子量５０，０００）の上部パーツに入れた。上部パーツにＤ−ＰＢＳ（−）を加え、４℃、２０００ｒｐｍで限外濾過を繰り返して、ＩｇＧ溶液の精製を行い、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８蛍光標識化ポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体が抗体１分子に対して平均２分子結合したＣｙ５標識ＩｇＧ（Ｇｌｃ−ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＩｇＧ）溶液（０．１１ｍｇ／ｍＬ）３ｍＬを得た。
【０１６３】
６−３．抗体の体内動態評価
６週齢のＢａｌｂ／Ｃ♀マウス８匹の給餌を２４時間止めた。８匹のマウスをＡ群、Ｂ群およびコントロール群（それぞれ３匹、３匹および２匹）に分けた。Ａ群のマウスにはＧｌｃ−ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＩｇＧを、Ｂ群のマウスにはＣｙ５−ＩｇＧをそれぞれ７５０ｎＭで２００μＬずつ静脈内注射し、その５分後に２０％グルコース溶液２００μＬを腹腔内投与した。なお、各抗体のＣｙ５に由来する蛍光強度は同等であった。Ａ群およびＢ群のマウス３匹ずつを抗体投与から５７分後にジエチルエーテル麻酔にかけ、その３分後に採血と臓器摘出（脳、肝臓、腎臓、肺、心臓、脾臓および大腿筋）を行った。コントロール群２匹も別途、採血と臓器摘出を行った。採血により得られた血液は、それぞれ４℃、１５，０００ｒｐｍで遠心をし、上清を回収した。８匹のマウスの摘出した臓器はまず全体の重量の測定を行った後、脳は半分、肝臓はおよそ２００ｍｇを切りとり、また、腎臓は片側を取得して、重量の測定を行い、マルチビーズショッカー用のチューブに臓器を金属のコーンとともに入れた。また、コントロール群のうちの１匹を除いた７匹の脳および肝臓のサンプルには１×Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを６００μＬ、脾臓、心臓および大腿筋のサンプルには３００μＬ、腎臓および肺のサンプルには４００μＬずつ加えた。一方、コントロール群のうちの残った１匹のマウス（１００％コントロール）の臓器のサンプルには、静脈内注射したサンプル全てが該当する臓器に集積したと仮定した時のサンプル量を計算し、その量のＣｙ５−ＩｇＧ溶液を臓器のサンプルに加え、さらに加える溶液量の合計が他の７匹のマウスと同じになるように１×Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを加えた。全ての臓器サンプルをマルチビーズショッカーにより、２０００ｒｐｍで３０秒動作を５回繰り返し、臓器をホモシナイズした。臓器のチューブからコーンを除いた後、それぞれのサンプルを１００μＬずつマルチプレートの各ウェルに入れ、マルチプレートリーダーで励起波長６４３ｎｍ、蛍光波長６６７ｎｍとして蛍光強度の測定を行った。コントロール群のうちＣｙ５−ＩｇＧ溶液を加えていない方をブランクとし、加えた方を１００％として各臓器の抗体の集積率を計算し、血液以外は、得られた集積率を臓器の重量（ｇ）で除した値を算出した。
【０１６４】
すると、グルコースをコンジュゲートさせた抗体は、血液脳関門を突破し、脳実質に到達した。脳実質への抗体の到達量は、対照（Ｃｙ５−ＩｇＧ）の２倍であった（図１０）。
【０１６５】
上記実施例１〜６によれば、外表面をグルコースで修飾したＰＩＣミセル（実施例２）、ＰＩＣｓｏｍｅ（実施例３）、ｓｉＲＮＡミセル（実施例４）、グルコースコンジュゲート高分子（実施例５）およびグルコースコンジュゲート抗体（実施例６）は、血糖操作を伴ってマウスに投与すると、血液脳関門を通過し、顕著に脳に蓄積した。血液脳関門の物質透過性は限定的であり、多くの薬剤は血液脳関門を通過することができず、その本来の効果を示すことができない。本発明によれば、薬剤をグルコースで修飾し、または薬剤を内包する小胞をグルコースで修飾して、血糖操作を伴って投与すると、ミセルやＰＩＣｓｏｍｅのような巨大な小胞であっても血液脳関門を通過させることができた。この成果は、従来血液脳関門を通過しなかった分子を脳に送達する画期的な手法を提供するものであり、様々な既存のまたは今後生み出される脳疾患薬および脳画像診断薬に適用可能であり、脳疾患治療または脳画像診断における新たな途を切り拓くものである。
【０１６６】
実施例７．血管内皮細胞への送達
上記実施例２によれば、グルコース導入率２５％のミセルは３％を超える脳への蓄積を示したのに対して、グルコース導入率５０％のミセルは約１．３％の脳への蓄積を示した。このことは、グルコースの導入率が増加することにより、脳血管内皮細胞に取り込まれたミセルと脳血管内皮細胞との解離が低下することを意味すると考えられた。そこで、本実施例では、グルコース導入率と脳血管内皮細胞へのミセルの蓄積との関係を確認した。
【０１６７】
まず、実施例１−７および実施例２に記載の通り、Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）とＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）との混合量を調節して、グルコース導入率１０％のミセル、グルコース導入率２５％のミセルまたはグルコース導入率５０％のミセルを調製した。
【０１６８】
得られたミセルをそれぞれマウスにｉ．ｖ．投与して２日後に、常法により脳の組織切片（厚み：１４μｍ）を作成し、免疫蛍光染色により脳血管内皮細胞を染色し、ミセルの蛍光との局在を観察した。脳血管内皮細胞は、一次抗体として抗ＰＥＣＡＭ−１抗体（Santa Cruz社製、製品番号：SC18916, Rat monoclonal）を用い、二次抗体としてＡｌｅｘａ４８８コンジュゲート−ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（インビトロジェン社製、製品番号：A11006）を用いて検出した。また、ミセルはＣｙ５の蛍光により検出した。
【０１６９】
すると、図１２Ａに示されるように、グルコース導入率５０％のミセルを投与したマウスの脳では、脳血管内皮細胞とミセルとの共局在が特に頻繁に観察された（図１２Ａ内の矢じり）。また、図１２Ｂに示されるように、グルコース導入率１０％、２５％および５０％のいずれでも脳血管内皮細胞へのミセルの共局在が観察されたが、グルコース導入率５０％のときに脳血管内皮細胞への局在頻度が顕著に増加した。
【０１７０】
実施例１〜６により、表面をグルコースで覆ったミセルなどの小胞や、グルコースをコンジュゲートした抗体などの化合物は、脳血管内皮細胞を通過して脳実質内に極めて効率良く送達できることが示されたが、一方で、脳血管内皮細胞内にも一部の小胞や化合物が蓄積する可能性が示唆されていた。特に、表面をグルコースで覆ったミセルについては、グルコースの導入率が高まるほど、脳血管内皮細胞から脳実質に脱出するミセルの量が低下することから、ミセルはその一部が脳血管内皮細胞にも蓄積できることが示されていた。実施例７でこの事実をさらにしたところ、確かに、ミセルが脳血管内皮細胞にも蓄積することが示された。また、グルコース導入率が５０％のときに顕著に脳血管内皮細胞にミセルが蓄積することが示された。
【図１】
2019194220.tif 000071
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2019194220.tif 000080
【図１１】
2019194220.tif 000081
【図１２】
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【図１３】
2019194220.tif 000083
【図１４】
2019194220.tif 000084
【図１５】
2019194220.tif 000085
【手続補正書】
【提出日】令和1年7月24日(2019.7.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤送達用のキャリアを含んでなる、投与計画に従って対象に投与するための組成物であって、
該投与計画は、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与することおよび該対象において血糖値の上昇を誘発させることを含み、
該キャリアは、その外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている、組成物。