(57)【要約】【課題】内皮細胞の増殖、およびその結果として望ましくない血管形成を抑制するのに有用な新規な方法および組成物を提供する。【解決手段】本発明は、フィブリノーゲン鎖Ｃ−末端フラグメントに関連するポリペプチド、または内皮細胞の増殖を阻害するためのポリペプチドをコードする核酸の新規な使用を提供するものである。このポリペプチドまたは核酸を用いる方法を提供する。また、ポリペプチドまたは核酸を含む組成物、および組成物を含むキットも提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドおよび薬学的に許容できる担体を含む組成物であって、該ポリペプチドが、（ａ）配列番号３、４または６の全長に対して少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでおり、（ｂ）内皮細胞の増殖を阻害することを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイで内皮細胞の増殖を阻害することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記アミノ酸配列が、配列番号３であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記アミノ酸配列が、配列番号４であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記アミノ酸配列が、配列番号６であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記アミノ酸配列が、配列番号３のアミノ酸残基１〜２４９であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
核酸および薬学的に許容できる担体を含む組成物であって、該核酸が、（ａ）配列番号３、４または６の全長に対して少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、（ｂ）内皮細胞の増殖を阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする組成物。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイで内皮細胞の増殖を阻害することを特徴とする請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記アミノ酸配列が、配列番号３であることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記アミノ酸配列が、配列番号４であることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記アミノ酸配列が、配列番号６であることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
前記アミノ酸配列が、配列番号３のアミノ酸残基１〜２４９であることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
【請求項１３】
前記核酸が、発現カセットであることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
【請求項１４】
内皮細胞を有効量のポリペプチドと接触させるステップを含んでおり、該ポリペプチドが、（ａ）配列番号３、４または６の全長に対して少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）内皮細胞の増殖を阻害することを特徴とする、内皮細胞の増殖を阻害するための方法。
【請求項１５】
対象に有効量のポリペプチドを投与するステップを含んでおり、該ポリペプチドが、（ａ）配列番号３、４または６の全長に対して少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）内皮細胞の増殖を阻害することを特徴とする、対象における内皮細胞の増殖を阻害するための方法。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイで内皮細胞の増殖を阻害することを特徴とする請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アミノ酸配列が、配列番号３であることを特徴とする請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記アミノ酸配列が、配列番号４であることを特徴とする請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記アミノ酸配列が、配列番号６であることを特徴とする請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記アミノ酸配列が、配列番号３のアミノ酸残基１〜２４９であることを特徴とする請求項１４または１５に記載の組成物。
【請求項２１】
前記投与が局所的に行われることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の組成物を含むことを特徴とする、内皮細胞の増殖を阻害するためのキット。
【請求項２３】
（ａ）配列番号３、４または６の全長に対して少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、（ｂ）内皮細胞の増殖を阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む有効量の核酸を、内皮細胞と接触させるステップを含むことを特徴とする、内皮細胞の増殖を阻害するための方法。
【請求項２４】
（ａ）配列番号３、４または６の全長に対して少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、（ｂ）内皮細胞の増殖を阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む有効量の核酸を、患者に投与するステップを含むことを特徴とする、患者における内皮細胞の増殖を阻害するための方法。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイで内皮細胞の増殖を阻害することを特徴とする請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記アミノ酸配列が、配列番号３であることを特徴とする請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記アミノ酸配列が、配列番号４であることを特徴とする請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記アミノ酸配列が、配列番号６であることを特徴とする請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記アミノ酸配列が、配列番号３のアミノ酸残基１〜２４９であることを特徴とする請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記投与が局所的に行われることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
請求項７に記載の組成物を含むことを特徴とする、内皮細胞の増殖を阻害するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管を形成するプロセスである血管形成に関する。
【０００２】
なお、本出願は、その内容が全て参照として本明細書に組み込まれる、２００４年５月７日出願の米国仮特許出願第６０／５６９００２号の優先権を主張するものである。また、本発明は、米国国立衛生研究所による助成金番号第ＧＭ４９８９９号のもとに米国政府援助で行われた。米国政府は、本発明におけるある種の権利を所有している。
【背景技術】
【０００３】
血管を形成するプロセスである血管形成は、正常なおよび病的な組織機能の根底にある多くの生理学的プロセスにおける重要な事象である。この血管を形成するプロセスは血管の内腔の裏面を成す内皮細胞の増殖に依存している。個体発生の間、血管形成は正常な細胞、組織、および器官の発達および維持に必要とされる血管の網状構造を確立するのに必要である。成体の生物体では、新血管の生成は、器官の恒常性（例えば、メスの子宮内膜の周期における）に、傷の治癒の間の血管の成熟に、および生物体の完全性の維持に関わる他のプロセスに必要とされている。新血管の形成は、例えば、身体の内部および外部の、組織の修復の促進、組織工学、および新組織の成長を含めた再生医学においても重要である。
【０００４】
全ての血管形成が有益なわけではない。不適切で異所性の血管形成は、生物体にとって有害であることがある。いくつかの病理学的状態が、外来性の血管の成長に関連している。これには、例えば、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、乾癬、後水晶体線維増殖症、血管繊維腫、および炎症が含まれる。さらに、癌性組織および腫瘍性組織に付随する血液供給の増加は、成長を助長し、急速な腫瘍の拡大および転移をもたらす。
【０００５】
血管形成を調節するために、多くの取組みがなされている。例えば、新血管形成の誘発は、虚血性心筋疾患、および十分な血液供給が欠如することにより生じる他の状態（例えば、虚血肢、脳卒中）の処置に用いられている。例えば、Ｒｏｓｅｎｇａｒｔら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１００巻（５）、４６８〜７４頁、１９９９年を参照されたい。血管形成は、前駆細胞および幹細胞からの新組織の成長を支持するのに必要な重要なプロセスの１つである。血管新生が望ましくない場合、例えば、癌および上記した病理学的状態に対しては、処置的治療として血管形成の阻害が用いられている。例えば、血管形成を阻害するための組成物および方法についての、米国特許第５９９４３８８号、第６０２４６８８号、第６１７４８６１号、第６２４２４８１号、第６３８０２０３号、第６４１３５１３号、第６５２５０１９号、第６５４８４７７号、第６５７３０９６号、第６５８９９７９号、および第６６７３８４３号を参照されたい。
【０００６】
例えば、通常は静止状態の内皮細胞を活性化することにより、毛細血管を発達させるための化学誘因物質として作用することにより、または遺伝子の発現を刺激することにより、血管形成を刺激する多くの様々な因子が同定されている。これらの因子には、例えば、ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２などの線維芽細胞増殖因子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、および血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）が含まれる。
【０００７】
血管形成の阻害は、ＴＮＰ−４７０、モノクローナル抗体、アンチセンスの核酸、ならびにアンジオスタチンおよびエンドスタチンなどのタンパク質などの薬物を用いて実現されている。Ｂａｔｔｅｇａｙ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、７３巻、３３３〜３４６頁（１９９５年）；Ｈａｎａｈａｎら、Ｃｅｌｌ、８６巻、３５３〜３６４頁（１９９６年）；Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３３巻、１７５７〜１７６３頁（１９９５年）を参照されたい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
血管形成、特に腫瘍生物学におけるその関与は重要であるので、血管形成を調節するための新規な戦略を開発する必要が依然としてある。本発明は、この必要性および他の必要性に対処するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、フィブリノーゲンγ鎖のγ鎖全体ではなく、カルボキシル末端フラグメント（フィブリノーゲンγＣ）が内皮細胞に対する抗増殖作用を有するという驚くべき発見に基づき、内皮細胞の増殖、およびその結果として望ましくない血管形成を抑制するのに有用な新規な方法および組成物を提供する。したがって、一態様では、本発明は、フィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドおよび薬学的に許容できる担体を含む組成物に関する。このポリペプチドは、２つの基本的な特性を有し、第１には、配列番号３、４、または６の全長に対して少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２には、内皮細胞の増殖を阻害することができる。なお、配列番号１〜６は、表１に示されている。
【００１０】
いくつかの実施形態では、フィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイで内皮細胞の増殖を阻害する。他の実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号３、配列番号４、または配列番号６である。一例では、このアミノ酸配列は、配列番号３の１〜２４９の配列である。いくつかの実施形態では、投与は、内皮細胞の継続的な増殖により増悪した状態の器官中への直接の送達（例えば、腫瘍中への直接注射）など、局所的に行われる。他の実施形態では、組成物は内皮細胞の増殖を阻害するためのキットの一部である。
【００１１】
第２の態様では、本発明は、核酸および薬学的に許容できる担体を含む組成物に関する。この核酸は、（ａ）配列番号３、４、または６の全長に対して少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）内皮細胞の増殖を阻害する、フィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドをコードするポリペプチドヌクレオチド配列を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、フィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイで内皮細胞の増殖を阻害する。他の実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号３、配列番号４、または配列番号６である。一例では、このアミノ酸配列は、配列番号３のサブ配列（アミノ酸残基１〜２４９、両端を含む）の配列である。他の実施形態では、投与は局所的に行われる。さらに他の実施形態では、この特許請求される組成物は、内皮細胞の増殖を阻害するためのキットの一部である。
【００１３】
第３の態様では、本発明は、内皮細胞の増殖を阻害するための方法に関する。この方法は、内皮細胞を、有効量のフィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドに接触させるステップを含む。本発明は、患者に有効量のフィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドを投与するステップを含む、患者における内皮細胞の増殖を阻害するための方法にも関する。両方法において、フィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドは、（ａ）配列番号３、４、または６の全長に対して少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）内皮細胞の増殖を阻害することができることを特徴とする。
【００１４】
他の実施形態では、この特許請求される組成物は、内皮細胞の増殖を阻害するためのキットの一部である。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイで内皮細胞の増殖を阻害する。他の実施形態では、このアミノ酸配列は配列番号３、配列番号４、または配列番号６である。一例では、このアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸１〜２４９である。さらに他の実施形態では、投与は局所的に行われる。
【００１５】
第４の態様では、本発明は、内皮細胞の増殖を阻害するための方法に関する。この方法は、フィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸の有効量に、内皮細胞を接触させるステップを含む。本発明は、フィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸の有効量を患者に投与するステップを含む、患者における内皮細胞の増殖を阻害するための方法にも関する。両方法において、フィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドは、配列番号３、４、または６の全長に対して少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、内皮細胞の増殖を阻害することができる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、フィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイで内皮細胞の増殖を阻害する。他の実施形態では、アミノ酸配列は配列番号３、配列番号４、または配列番号６である。一例では、このアミノ酸配列は配列番号３のアミノ酸１〜２４９である。さらに他の実施形態では、投与は局所的に行われる。
【００１７】
定義
本明細書で用いられる「阻害する」または「阻害」は、内皮細胞の増殖に対するあらゆる検出可能の負の作用を意味する。このような負の作用には、細胞増殖の減速または阻止、および細胞死の誘発が含まれ得る。典型的には、阻害は、対照と比較した場合、内皮細胞の増殖における少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％の減少に、あるいは内皮細胞のアポトーシスにおける少なくとも１０％、２０％、５０％、または１００％の上昇に反映される。
【００１８】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、および一重鎖または二重鎖のいずれかの形態のそれらのポリマーを意味する。特に限定されなければ、この語は、基準の核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で代謝される天然のヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。別段の指摘がなければ、特定の核酸配列は、明示した配列とともに、保存的に修飾されたその変異体（例えば、縮重コドンの置換）、対立遺伝子、相同分子種、ＳＮＰ、および相補的な配列も暗に包含する。特に、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が混合の塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することにより、縮重コドンの置換が実現することができる（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１９巻、５０８１頁（１９９１年）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０巻、２６０５〜２６０８頁（１９８５年）；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ、８巻、９１〜９８頁（１９９４年））。核酸という語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によりコードされているｍＲＮＡと、交換可能に用いられる。
【００１９】
「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の生成に関わるＤＮＡのセグメントを意味する。これは、コード領域の前および後の領域（リーダーおよびトレーラー）、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）の間の介在配列（イントロン）を含むことができる。
【００２０】
「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに、天然に存在するアミノ酸と同様のやり方で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸ミメティックを意味する。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによりコードされるアミノ酸、および後で修飾されるこれらのアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、Ｏ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合しているα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを意味する。このような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）、または修飾されたペプチドのバックボーンを有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持している。「アミノ酸ミメティック」は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様のやり方で機能する化学化合物を意味する。
【００２１】
当技術分野には、非天然のアミノ酸誘導体または類似体を、部位特異的なやり方でポリペプチド鎖中に組み込むことを可能にする様々な知られた方法が存在する。例えばＷＯ第０２／０８６０７５号を参照されたい。
【００２２】
アミノ酸は、本明細書では、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会が推奨する、一般に知られている３文字記号、または１文字記号のいずれかにより言及することができる。同様に、ヌクレオチドは、その一般に認められている１文字コードにより言及することができる。表１に、本明細書の配列番号１〜６におけるアミノ酸及びヌクレオチド配列の配列リストを示す。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
「保存的に修飾されている変異体」は、アミノ酸配列にも核酸配列にも適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に修飾されている変異体」は、同一の、または本質的に同一のアミノ酸配列をコードしているこれらの核酸を意味し、あるいは核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に配列同一性を意味する。遺伝暗号の縮重により、多数の機能的に同一の核酸が、任意の所与のタンパク質をコードしている。例えば、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵというコドンは全て、アミノ酸のアラニンをコードしている。したがって、アラニンがコドンによって特定されるあらゆる位置で、コードするポリペプチドを変更することなく、コドンを、記載されているあらゆる対応するコドンに変更することができる。このような核酸の変異は、保存的に修飾された変異の一種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書の全ての核酸配列は、あらゆる可能な核酸のサイレント変異を記載するものでもある。当業者であれば、核酸における各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧ以外）を修飾して機能的に同一の分子を産生することができることを理解するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、各々の記載された配列に暗黙のうちに含まれている。
【００２５】
アミノ酸配列に関して、コードされている配列における１つのアミノ酸またはわずかなパーセントのアミノ酸を変更し、付加し、または欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の配列に対する個々の置換、欠失、または付加は、この変更により化学的に類似のアミノ酸でのアミノ酸の置換がもたらされている「保存的に修飾されている変異体」であることを、当業者であれば理解するであろう。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当技術分野ではよく知られている。このような保存的に修飾されている変異体は、本発明の、多形の変異体、種間の相同体、および対立遺伝子に加えられるものであり、これらを排除するものではない。
【００２６】
以下の８グループは、相互に保存的置換であるアミノ酸をそれぞれ含んでいる。
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ニューヨーク、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．（１９８４年）を参照されたい）。
【００２７】
アミノ酸は、本明細書では、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会が推奨する、一般に知られている３文字記号または１文字記号のいずれかにより言及することができる。同様に、ヌクレオチドは、その一般に認められている１文字コードにより言及することができる。
【００２８】
本出願において、アミノ酸残基は、非修飾の野生型ポリペプチド配列において、１と番号付けた一番左の残基からのその相対的な位置に従って番号付けられている。
【００２９】
本明細書で用いられる、２つ以上のポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列を記載する文脈において、「同一」または「同一性」パーセントは、以下の配列比較のアルゴリズムの１つを用いてまたはマニュアルによるアラインメントおよび肉眼の検査により測定した比較ウィンドウ、または示した領域にわたって最大の一致について比較し、アラインメントを行った場合に、同一である、または同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセント値を有する２つ以上の配列またはサブ配列を意味する（例えば、本発明のγＣ関連のアミノ酸配列は、基準配列、例えば、配列番号３、４、または６に、少なくとも８０％の同一性、好ましくは８５％、９０％、９１％、９２％、９３、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する）。その場合に、このような配列は、「実質的に同一」であると言う。ポリヌクレオチド配列に関しては、この定義は、試験配列の相補体も意味する。長さが少なくとも約５０個のアミノ酸またはヌクレオチドである領域にわたって同一性が存在することが好ましく、あるいはある領域にわたって長さが７５〜１００個のアミノ酸またはヌクレオチドであることがより好ましい。
【００３０】
配列の比較では、典型的には、１つの配列が基準配列として働き、これに対して試験配列を比較する。配列比較のアルゴリズムを用いる場合には、試験配列および基準配列がコンピュータに入力され、必要な場合には配列の座標が指定され、配列のアルゴリズムプログラムのパラメータが指定される。デフォルトのプログラムパラメータを用いてもよく、代替のパラメータを指定してもよい。次いで、配列比較のアルゴリズムが、プログラムのパラメータに基づいて、基準配列に対する試験配列の配列の同一性パーセントを計算する。核酸およびタンパク質を、フィブリノーゲンγＣ核酸およびタンパク質、例えば、配列番号１および配列番号３に対する配列と比較するには、以下に論じるＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０のアルゴリズムおよびデフォルトパラメータを用いる。
【００３１】
本明細書で用いられる「比較ウィンドウ」は、２つの配列が任意選択によりアラインメントを行った後の隣接する位置の同数の基準配列と配列を比べることができる、２０から６００まで、通常は約５０から約２００まで、より通常は約１００から約１５０までからなる群から選択される隣接する位置の任意の１つの数のセグメントに対する照会が含まれる。比較のための配列のアラインメント方法は、当技術分野ではよく知られている。比較のための配列の最適のアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズム、Ａｄｖ  Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ、２巻、４８２頁（１９８１年）により、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８巻、４４３頁（１９７０年）により、Ｐｅｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎの類似性の方法の探索、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５巻、２４４４頁（１９８８年）により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化した実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、ウィスコンシン州、Ｍａｄｉｓｏｎ、５７５Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．）により、またはマニュアルによるアラインメントおよび肉眼の検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編集、１９９５年補完）により行うことができる。
【００３２】
配列の同一性パーセントおよび配列の類似性を決定するのに適するアルゴリズムの好ましい例としては、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムがあり、これらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻、３３８９〜３４０２頁（１９７７年）、およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５巻、４０３〜４１０頁（１９９０年）にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０を、本明細書に記載したパラメータで用いて、本発明の核酸およびタンパク質に対する配列の同一性パーセントを決定する。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイドから公的に入手できる。
【００３３】
このアルゴリズムは、第１に、データベース配列における同じ長さのワードとアラインメントを行った場合にいくつかの正の値の閾値スコアＴとマッチし、またはそれを満足させるクエリ配列における長さＷの短いワードを同定することにより、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上述）。これらの、最初の隣接のワードは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるためのサーチを開始するためのシードとして働く。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増大することができる限り、各配列に沿って、両方向に延長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてはパラメータＭ（１組のマッチング残余に対する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチング残余に対するペナルティースコア；常に＜０）を用いて計算する。アミノ酸配列については、スコアマトリックスを用いて累積スコアを計算する。ワードヒットの各方向における延長は、累積アラインメントスコアがその最高達成値からＸの量だけ脱落し、累積スコアが、１つまたは複数の負のスコア残余アラインメントの蓄積によりゼロまたはそれ未満になり、あるいはどちらかの配列の末端に達した場合に停止する。
【００３４】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータである、Ｗ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）を、デフォルトとして、ワード長さ（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列では、ＢＬＡＳＴＮプログラムは、デフォルトとして、ワード長さ３、期待値（Ｅ）１０を用い、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻、１０９１５頁（１９８９年）を参照されたい）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を用いる。
【００３５】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計学的分析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻、５８７３〜５７８７頁（１９９３年）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する最小和確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験する核酸を対照の核酸に比べたときの最小和確率が、約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に、ある核酸は基準配列に類似であるとみなされる。
【００３６】
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることを示すものは、以下に記載するように、第１の核酸がコードするポリペプチドが、第２の核酸がコードするポリペプチドに対して生じた抗体に免疫学的に交差反応性があることである。したがって、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合に、あるポリペプチドが第２のポリペプチドに対して、典型的に実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることを示す別のものは、以下に記載するように、２つの分子またはこれらの相補体が、厳密な条件下で相互にハイブリダイズするということである。２つの核酸配列が実質的に同一であることを示すさらに別のものとして、配列を増幅するのに同じプライマーを用いることができるということがある。
【００３７】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書では交換可能に用いて、アミノ酸残基のポリマーを意味する。３つの語は全て、１個または複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学ミメティックであるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび非天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書で用いられるこれらの語は、アミノ酸残基がペプチド共有結合により結合している全長のタンパク質を含む、あらゆる長さのアミノ酸鎖を包含する。
【００３８】
本明細書で用いられる「有効量」は、そのために物質を投与する、治療的効果を生成する量を意味する。この効果には、疾患／状態およびあらゆる検出可能な程度の関連する合併症の症状の進行の予防、矯正、または阻害が含まれる。正確な量は処置の目的に依存し、当業者であれば周知の技術を用いて確認できる（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（１〜３巻、１９９２年）；Ｌｌｏｙｄ、Ｔｈｅ  ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９年）；およびＰｉｃｋｅｒ、Ｄｏｓａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９年）を参照されたい）。
【００３９】
「発現カセット」は、宿主細胞における特定のポリヌクレオチド配列の転写を可能にする一連の特定された核酸エレメントで、組換えまたは合成により生成した核酸構築物である。発現カセットは、プラスミドの一部、ウィルスのゲノム、または核酸フラグメントであってよい。典型的には、発現カセットはプロモーターに操作可能に結合している、転写されるべきポリヌクレオチドを含んでいる。
【００４０】
本明細書で用いられる「フィブリノーゲンγ鎖Ｃ末端フラグメントに関連するポリペプチド」または「γＣ関連ポリペプチド」は、一般的にフィブリノーゲンγ鎖のカルボキシル末端フラグメントに対応し、その全長が、例えば、配列番号２または５が例示するコアのアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。このコアのγＣアミノ酸配列は、アミノ酸の欠失、付加、または置換などのいくつかの変異を含むことができるが、内皮細胞の増殖を抑制することができるフィブリノーゲンγ鎖Ｃ末端フラグメント（例えば、配列番号３、４、または６）に対する実質的なレベルの配列相同性（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより高い配列相同性）を維持していなければならない。コアのγＣアミノ酸配列のいくつかの例には、配列番号３のＣ末端から少なくとも４個のアミノ酸（ＡＧＤＶ）が欠失したものが含まれる。配列番号３からのこのような欠失は、Ｃ末端から２０個までのアミノ酸、より好ましくは１５または１２個までのアミノ酸であることができる。１つの例示のコア配列は、配列番号３の１〜２４９セグメントである。同様に、コアのγＣアミノ酸配列は、配列番号４から少なくとも４個のアミノ酸が欠失し（ＡＧＤＶ）、配列番号４のＣ末端から２０個までのアミノ酸が欠失することにより生成することができ、より好ましくは１２または１５個までのアミノ酸が欠失してもよい。
【００４１】
コアのγＣアミノ酸配列の他に、本発明のγＣ関連ポリペプチドは、異種の起源（例えば、エピトープタグ）でも同族の起源（例えば、フィブリノーゲンγ鎖からのさらなる配列）でもよい、さらなるアミノ酸配列をさらに含むことができるが、同じ機能性を保持していなければならず、すなわち、内皮細胞の増殖を阻害することができなければならない。本出願で用いられるγＣ関連ポリペプチドは、全長のフィブリノーゲンγ鎖を包含するわけではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
Ｉ．はじめに
フィブリノーゲンは、ジスルフィド結合した２つの同一のサブユニットからなり、各サブユニットが今度は、α、β、およびγの３つの異なるポリペプチド鎖からなる、３４０ｋＤａの主要な血漿糖タンパク質である。フィブリノーゲンは、血液凝固、細胞およびマトリックスの相互作用、炎症、傷の治癒、および新形成などの生理学的および病理学的プロセスで重要な役割を担っていることが知られている。例えば、フィブリノーゲンと、細胞外マトリックスタンパク質（フィブリノーゲンを含む）の主要な細胞表面レセプターのクラスのメンバーであるインテグリンαｖβ３との間の結合は、傷の治癒および腫瘍形成で、細胞の成長を促進することが示されている。例えば、Ｂｒｏｏｋｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６４巻、５６９〜５７１（１９９４年）；Ｃｌａｒｋら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４８巻、１４０７〜１４２１頁（１９９６年）を参照されたい。フィブリン（フィブリノーゲン）結合繊維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）は、内皮細胞の増殖を刺激することも報告されている。Ｓａｈｎｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２７４巻、１４９３６〜４１頁（１９９９年）。
【００４３】
インテグリンαｖβ３は、フィブリノーゲンに対する主要なレセプターであり、内皮細胞を含む様々な細胞の表面上に見られる。フィブリノーゲンとインテグリンαｖβ３との間の相互作用は、腫瘍が誘発する血管形成に結びつけられている。フィブリノーゲンγ鎖のカルボキシル末端領域（γＣ）は、約２５０個のアミノ酸からなり分子量約３０ｋＤａであるが、以前の研究でインテグリンαｖβ３と特異的に相互作用することが示されている。Ｙｏｋｏｙａｍａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙ、３８巻、５８７２〜５８７７頁（１９９９年）。
【００４４】
驚くべきことに、フィブリノーゲンγＣは、完全なフィブリノーゲンとは異なり、内皮細胞で成長の停止およびアポトーシスを誘発することが見出されている。いかなる特定の理論により拘泥されようとするものではないが、内皮細胞の死をもたらす細胞のシグナルは、フィブリノーゲンγＣによるＥｒｋ１およびＥｒｋ２などのＭＡＰキナーゼの活性化により伝達されると考えられている。
【００４５】
本発明の例示的なフィブリノーゲンγＣポリペプチドは、配列番号３、配列番号４、または配列番号６に述べるアミノ酸配列を有する。内皮細胞の増殖に対する阻害効果が本質的に同じであるより短いポリペプチドは、当業者であれば以下に記載する方法に従って容易に生成し、同定することができる。したがって、このようなより短いポリペプチドも、本発明の企図の範囲内である。例示的なより短いγＣアミノ酸配列は、本発明者らが、驚くべきことに、内皮細胞におけるプログラムされた細胞死を誘発するのに効果的であることを見出した配列番号３のアミノ酸１〜２４９である。その他のより短い配列には、配列番号３のＣ末端から少なくとも４個、２０個までのアミノ酸の欠失したものが含まれる。いくつかの場合では、γＣアミノ酸配列のこれらの変異型は、配列番号３、４、または６から、Ｃ末端の配列を変更するがＮ末端の配列に変更を加えずに生成することができる。
【００４６】
フィブリノーゲンγＣが内皮細胞の増殖を抑制する活性を発見した上で、本発明は、内皮細胞の増殖が重要な役割を果たす、望ましくない生理学的または病理学的プロセスを阻害するための有用な組成物および方法を提供する。本発明は、したがって、過形成（例えば、様々なタイプの癌）、転移、および外来性の血管の成長に付随する他の疾患（例えば、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、乾癬、後水晶体線維増殖症、血管繊維腫、炎症、リウマチ性関節炎、加齢黄斑変性など）を処置するための新規な治療上の戦略を提供するものである。
【００４７】
ＩＩ．フィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドの獲得
Ａ．一般的な組換え技術
組換え遺伝学の分野における一般的な方法および技術を公表する基本的な教科書には、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１年）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０年）；およびＡｕｓｕｂｅｌら編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４年）が含まれる。
【００４８】
核酸については、サイズはキロベース（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）のいずれかで表される。これらは、アガロースまたはアクリルアミドゲルの電気泳動に、配列決定された核酸に、または発表されているＤＮＡ配列に由来する概算である。タンパク質については、サイズはキロダルトン（ｋＤａ）またはアミノ酸残基数で表される。タンパク質のサイズは、ゲル電気泳動から、配列決定されたタンパク質から、由来するアミノ酸配列から、または公表されているタンパク質配列から概算される。
【００４９】
市販のオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ＆Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、２２巻、１８５９〜１８６２頁（１９８１年）に最初に記載されている固相ホスホラミダイトトリエステル法に従って、Ｖａｎ  Ｄｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１２巻、６１５９〜６１６８頁（１９８４年）に記載されている自動化された合成装置を用いて、化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、あらゆる技術分野で認められている戦略を用いて、例えば、天然アクリルアミドゲル電気泳動、またはＰｅａｒｓｏｎ＆Ｒｅａｎｉｅｒ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．、２５５巻、１３７〜１４９頁（１９８３年）に記載されている陰イオン交換ＨＰＬＣを用いて行われる。
【００５０】
フィブリノーゲンγ鎖遺伝子、フィブリノーゲンγ鎖Ｃ末端セグメントをコードするポリヌクレオチド、および合成のオリゴヌクレオチドの配列は、例えば、Ｗａｌｌａｃｅら、Ｇｅｎｅ、１６巻、２１〜２６頁（１９８１年）の、二重鎖テンプレートを配列決定するためのチェーンターミネーション法を用いて、クローニングまたはサブクローニング後に検証することができる。
【００５１】
Ｂ．フィブリノーゲンγＣに対するコード配列のクローニングおよびサブクローニング
フィブリノーゲンγ鎖をコードする数々のポリヌクレオチド配列、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受諾番号ＢＣ００７０４４、ＢＣ０２１６７４、およびＡＦ１１８９０２は同定されており、供給業者から入手することができる。
【００５２】
ヒトゲノムの研究が急速に発達したことで、以前に同定されたヒトフィブリノーゲンγ鎖をコードするものなど、既知のヌクレオチド配列に対してあるパーセント値の配列相同性を有するあらゆる遺伝子セグメントを求めてヒトＤＮＡ配列データベースを探索することができるクローニングの取組みが可能になっている。そのように同定されたあらゆるＤＮＡの配列を、引き続き化学的合成、および／または、オーバーラップエクステンション法などのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術により得ることができる。短い配列では、完全にｄｅ  ｎｏｖｏ合成が十分であることができるのに対し、より長い遺伝子を得るために、合成プローブを用いてヒトｃＤＮＡまたはゲノムのライブラリーから全長のコード配列をさらに分離することが必要なこともある。
【００５３】
あるいは、ヒトフィブリノーゲンγ鎖をコードする核酸配列は、相同性に基づくプライマーがフィブリノーゲンγＣポリペプチドをコードする既知の核酸配列にしばしば由来し得るポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの標準のクローニング技術を用いて、ヒトのｃＤＮＡまたはゲノムのＤＮＡライブラリーから単離することができる。この目的で最も一般的に用いられる技術は、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌの上述の標準の教科書に記載されている。
【００５４】
ヒトフィブリノーゲンγ鎖に対するコード配列を得るのに適するｃＤＮＡライブラリーは、市販で入手することができ、または構築することができる。ｍＲＮＡを単離し、逆転写によりｃＤＮＡを作成し、ｃＤＮＡを組換えベクター中に結合させ、増殖させるために組換え宿主にトランスフェクトし、スクリーニングし、クローニングする一般的な方法は、よく知られている（例えば、ＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎ、Ｇｅｎｅ、２５巻、２６３〜２６９頁（１９８３年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、上述を参照されたい）。ＰＣＲによりヌクレオチド配列を増幅したセグメントを得る際には、セグメントをプローブとしてさらに使用して、ｃＤＮＡライブラリーからフィブリノーゲンγ鎖をコードする全長のポリペプチドヌクレオチド配列を単離することができる。好適な手順についての一般的な記載を、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ、上述に見ることができる。
【００５５】
ヒトゲノムのライブラリーから、ヒトフィブリノーゲンγ鎖をコードする全長の配列、例えば、上記に記載したＧｅｎＢａｎｋ受諾番号の任意の１つを得るために同様の手順を続けてもよい。ヒトゲノムのライブラリーは市販されており、または様々な技術分野で認められている方法に従って構築することができる。一般的に、ゲノムのライブラリーを構築するために、フィブリノーゲンγ鎖が見られそうな組織からＤＮＡを最初に抽出する。このＤＮＡを、次いで、機械的にせん断し、または酵素的に消化して、長さ約１２〜２０ｋｂのフラグメントを得る。フラグメントを、引き続き、望ましくないサイズのポリヌクレオチドフラグメントから勾配の遠心分離により分離し、バクテリオファージのλベクターに挿入する。これらのベクターおよびファージを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでパッケージングする。組換えファージを、ＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖｉｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９６巻、１８０〜１８２頁（１９７７年）に記載されているプラークハイブリダイゼーションにより分析する。Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７２巻、３９６１〜３９６５頁（１９７５年）に記載されている通りに、コロニーハイブリダイゼーションを行う。
【００５６】
配列相同性に基づいて、縮重オリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてデザインすることができ、適切な条件下でＰＣＲを行って（例えば、Ｗｈｉｔｅら、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９３年；ＧｒｉｆｆｉｎおよびＧｒｉｆｆｉｎ、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、１９９４年を参照されたい）、ｃＤＮＡまたはゲノムのライブラリーからのヌクレオチド配列のセグメントを増幅することができる。増幅されたセグメントをプローブとして用いて、フィブリノーゲンγ鎖をコードする全長の核酸を得る。
【００５７】
フィブリノーゲンγ鎖をコードする核酸配列を獲得する際に、γ鎖のカルボキシル末端領域に対するコード配列、例えば、Ｃ末端の２６１アミノ酸を、制限エンドヌクレアーゼ消化、ＰＣＲ、およびＰＣＲに関連した方法などの、数々のよく知られた技術により得ることができる。フィブリノーゲンγＣポリペプチド（または内皮細胞の増殖を阻害する活性を保持しているγＣのフラグメント）をコードするポリヌクレオチド配列を、次いで、発現ベクターなどのベクター中にサブクローンすることができ、その結果、得られた構築物から組換えフィブリノーゲンγＣポリペプチドを生成することができる。フィブリノーゲンγＣコード配列に対するさらなる修飾、例えば、ヌクレオチド置換を引き続き行って、ポリペプチドの特徴を変更することができる。
【００５８】
Ｃ．フィブリノーゲンγＣコード配列の修飾
以下に記載するｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの方法で決定して、内皮細胞の増殖を阻害するポリペプチドの能力を維持または増強しながら、フィブリノーゲンγＣポリペプチドのアミノ酸配列、例えば、配列番号３、４、または５を修飾することができる。フィブリノーゲンγＣポリペプチドのアミノ酸配列に対する可能な修飾には、１個または複数のアミノ酸残基の保存的置換、欠失、または付加（例えば、精製または同定を容易にするための、６ｘＨｉｓなどのタグ配列のポリペプチドの一末端における付加）；フィブリノーゲンγＣポリペプチドのＮ−およびＣ−末端のいずれかまたは両方における約１０、２０、４０、６０、８０、または１００個のアミノ酸からの範囲のフラグメントの切断；およびフィブリノーゲンγＣポリペプチド内の約１０、２０、４０、６０、８０、または１００個のアミノ酸からの範囲のフラグメントの切断が含まれ得る。これらの切断修飾を行うための一般的な戦略は、ある一続きではＮ末端から最小の切断で始めて約１００個のアミノ酸まで長さを徐々に増大させ、別の一続きではＣ末端から最小の切断で始めて約１００個のアミノ酸まで長さを徐々に増大させる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのアッセイでそのように生成された切断されたポリペプチドの機能性を試験する際、また、そのような試験の結果に応じて、Ｎ末端およびＣ末端の切断の両方で、または内部の切断で、さらなるフィブリノーゲンγＣポリペプチドを生成することができ、それらが内皮細胞の増殖を阻害する能力をさらに試験することができる。
【００５９】
そのような修飾されたγＣアミノ酸配列のいくつかの例には、配列番号３のＣ末端に少なくとも４個および最高２０個までのアミノ酸の欠失のある、配列番号３に概ね対応しているものが含まれる。例えば、本発明者らは、配列番号３の１〜２４９のフラグメントが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイで内皮細胞のアポトーシスを誘発するのに特に効果的であることを見出している。
【００６０】
当技術分野において、様々な突然変異を生じるプロトコールが確立され、記載されており、フィブリノーゲンγＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を修飾するために容易に用いることができる。例えば、Ｚｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４巻、４５０４〜４５０９頁（１９９７年）；およびＳｔｅｍｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３７０巻、３８９〜３９１頁（１９９４年）を参照されたい。手順を別々に、または組み合わせて用いて、１組の核酸の変異型を生成することができ、その結果コードされたポリペプチドの変異型を生成することができる。変異原性、ライブラリー構築、および他の多様性を生成する方法のためのキットは、市販されている。
【００６１】
多様性を生成する突然変異の方法には、例えば、部位特異的突然変異誘発（ＢｏｔｓｔｅｉｎおよびＳｈｏｒｔｌｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻、１１９３〜１２０１頁（１９８５年））、ウラシル含有のテンプレートを使用する突然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２巻、４８８〜４９２頁（１９８５年））、オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発（ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、１０巻、６４８７〜６５００頁（１９８２年））、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発（Ｔａｙｌｏｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１３巻、８７４９〜８７６４頁および８７６５〜８７８７頁（１９８５年））、ならびにギャップのある二重鎖ＤＮＡを用いた突然変異誘発（Ｋｒａｍｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１２巻、９４４１〜９４５６頁（１９８４年））が含まれる。
【００６２】
突然変異を生成するための他の可能な方法には、ポイントミスマッチ修復（Ｋｒａｍｅｒら、Ｃｅｌｌ、３８巻、８７９〜８８７頁（１９８４年））、修復欠損した宿主株を用いた突然変異誘発（Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１３巻、４４３１〜４４４３頁（１９８５年））、欠失突然変異誘発（ＥｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１４巻、５１１５頁（１９８６年））、制限選択および制限精製（Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ、３１７巻、４１５〜４２３頁（１９８６年））、全遺伝子の合成による突然変異誘発（Ｎａｍｂｉａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２３巻、１２９９〜１３０１頁（１９８４年））、二重鎖切断修復（Ｍａｎｄｅｃｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３巻、７１７７〜７１８１頁（１９８６年））、ポリヌクレオチド鎖ターミネーション法による突然変異誘発（米国特許第５６９５４０８号）、ならびにエラープローンＰＣＲ（Ｌｅｕｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１巻、１１〜１５頁（１９８９年））が含まれる。
【００６３】
Ｄ．宿主生物体における好ましいコドン使用のための核酸の修飾
フィブリノーゲンγＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、特定の宿主の好ましいコドン使用と一致するようにさらに変更することができる。例えば、細菌細胞の１つの菌株の好ましいコドン使用を用いて、本発明のフィブリノーゲンγＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導くことができ、この菌株が好むコドンを含む。宿主細胞が表す好ましいコドン使用頻度は、宿主細胞が発現する多数の遺伝子における好ましいコドン使用頻度を平均することにより計算することができる（例えば、計算サービスは、日本、かずさＤＮＡ研究所のウェブサイトで利用できる）。この分析は、宿主細胞が高度に発現する遺伝子に限定することが好ましい。
【００６４】
修飾の完了時には、コード配列を配列決定により検証し、次いで、フィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドの組換体生成のために好適な発現ベクター中にサブクローンする。
【００６５】
Ｅ．フィブリノーゲンγＣの化学的合成
いくつかのイソ型を含むフィブリノーゲンγ鎖のアミノ酸配列が確立されている（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受諾番号Ｐ０２６７９、ＡＡＨ０７０４４、ＡＡＫ１９７５１、ＡＡＢ５９５３１、およびＡＡＰ３５７４４）。γ鎖のＣ末端領域の結晶構造は記載されており、この領域のアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受諾番号１ＦＩＢ、１ＦＩＣＢ、および１ＦＩＤに述べてあり、または配列番号３、配列番号４、もしくは配列番号６に示した通りである。
【００６６】
上記に記載したように、フィブリノーゲンγＣポリペプチドのアミノ酸配列は、内皮細胞の増殖を阻害するその能力を損なわないで修飾することもできる。本発明の、フィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドは、したがって、従来のペプチド合成、または当技術分野ではよく知られている他のプロトコールを用いて化学的に合成することもできる。
【００６７】
ポリペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５巻、２１４９〜２１５６頁（１９６３年）；ＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、「Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ」、Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＧｒｏｓｓおよびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ（編集）、ニューヨーク、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２巻、３〜２８４頁（１９８０年）；ならびにＳｔｅｗａｒｔら、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、イリノイ州、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．（１９８４年）に記載されているものと同様の手順を用いて固相ペプチド合成方法により合成することができる。合成中、保護された側鎖を有するＮ−α−保護したアミノ酸を、そのＣ末端により結合している成長するポリペプチド鎖に、および固体の支持体、すなわちポリスチレンのビーズに、段階的に加える。Ｎ−α−脱保護したアミノ酸のアミノ基を、それをジシクロヘキシルカルボジイミドなどの試薬と反応させることにより活性化したＮ−α−保護したアミノ酸のα−カルボキシ基に結合することによりペプチドを合成する。遊離のアミノ基を活性化したカルボキシルに結合することで、ペプチド結合の形成をもたらす。最も通常用いられるＮ−α−保護基には、酸に不安定であるＢｏｃ、塩基に不安定であるＦｍｏｃが含まれる。
【００６８】
固体支持体として用いるのに適する材料は、当業者にはよく知られており、それだけには限定されないが、以下のものが含まれる：クロロメチル樹脂またはブロモメチル樹脂などのハロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、４−（α−［２，４−ジメトキシフェニル］−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシ樹脂などのフェノール樹脂、ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニル−ヒドラジド化樹脂など。このような樹脂は市販されており、これらの調製方法は、当業者であれば知っている。
【００６９】
手短に述べると、Ｃ−末端のＮ−α−保護したアミノ酸を、最初に固体支持体に結合させる。次いで、Ｎ−α−保護基を取り除く。脱保護したα−アミノ基を、次のＮ−α−保護したアミノ酸の活性化したα−カルボキシレート基に結合させる。望ましいペプチドが合成されるまで、このプロセスを繰り返す。得られたペプチドを、次いで、不溶性のポリマー支持体から切断し、アミノ酸の側鎖を脱保護する。より長いペプチドは、保護したペプチドフラグメントの濃縮により引き出され得る。好適な化学、樹脂、保護基、保護されたアミノ酸、および試薬の詳細は、当技術分野ではよく知られているので、本明細書では詳しく論じない（Ａｔｈｅｒｔｏｎら、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）、およびＢｏｄａｎｓｚｋｙ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９９３年）。
【００７０】
ＩＶ．フィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドの発現および精製
コード配列を検証した後、本発明のフィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドを、本明細書に開示したポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を頼りに、組換え遺伝学の技術分野におけるルーチンの技術を用いて生成することができる。
【００７１】
Ａ．発現システム
本発明のフィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドをコードする核酸の高レベルの発現を得るために、フィブリノーゲンγＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、転写を指示する強力なプロモーター、転写／翻訳のターミネーター、および翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含む発現ベクター中にサブクローンするのが典型的である。適切な細菌のプロモーターは、当技術分野ではよく知られており、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、上述、ならびにＡｕｓｕｂｅｌら、上述に記載されている。フィブリノーゲンγＣポリペプチドを発現するための細菌の発現システムは、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、および（カウロバクター）Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒで利用できる。このような発現システムのためのキットは市販されている。哺乳動物細胞、酵母菌、および昆虫細胞のための、真核生物の発現システムは、当技術分野ではよく知られており、やはり市販されている。一実施形態では、真核生物の発現ベクターは、アデノウィルスのベクター、アデノ随伴のベクター、またはレトロウィルスベクターである。
【００７２】
異種性の核酸の発現を導くために用いるプロモーターは、特定の適用に左右される。プロモーターは、異種性の転写開始部位から、天然の状況における転写開始部位からとおよそ同じ距離に、任意選択で位置している。しかし、当技術分野では知られているが、この距離におけるいくつかの変異体は、プロモーターの機能を失わずに順応させることができる。
【００７３】
発現ベクターは、プロモーターの他に、転写ユニット、または宿主細胞でフィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドを発現するために必要とされる全てのさらなる要素を含む発現カセットを含むのが典型的である。したがって、典型的な発現カセットは、フィブリノーゲンγＣポリペプチドおよび転写の効果的なポリアデニレーションに必要とされるシグナルをコードする核酸配列に操作可能に結合しているプロモーター、リボソーム結合部位、ならびに翻訳終結を含む。フィブリノーゲンγＣポリペプチドをコードする核酸配列は、典型的には、形質転換した細胞によるフィブリノーゲンγＣポリペプチドの分泌を促進するための切断可能なシグナルペプチド配列に結合している。このようなシグナルペプチドには、数ある中で、組織プラスミノーゲンアクチベーター、インスリン、および神経増殖因子、およびオオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）の幼若ホルモンエステラーゼ由来のシグナルペプチドが含まれる。カセットのさらなる要素は、エンハンサーを含むことがあり、構造遺伝子としてゲノムのＤＮＡを用いる場合には、機能上のスプライスドナーおよびアクセプター部位を有するイントロンを含むことがある。
【００７４】
発現カセットは、プロモーター配列の他に、効果的な終結をもたらすために、構造遺伝子の下流に転写終結領域も含まなければならない。終結領域は、プロモーター配列として同じ遺伝子から得てもよく、異なる遺伝子から得てもよい。
【００７５】
遺伝情報を細胞中に輸送するために用いる特定の発現ベクターは、特に重要ではない。原核生物または真核生物の細胞で発現させるために用いるあらゆる従来のベクターを用いることができる。標準的な細菌の発現ベクターには、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ、ならびにＧＳＴおよびＬａｃＺなどの融合発現システムなどのプラスミドが含まれる。単離する便利な方法を提供するために、ｃ−ｍｙｃなどのエピトープのタグも組換えタンパク質に加えることができる。
【００７６】
真核生物のウィルスからの調節エレメントを含む発現ベクターは、典型的には、真核生物の発現ベクターで、例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウィルスベクター、およびエプスタイン−バーウィルスに由来するベクターで用いられる。他の例示的な真核細胞のベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウィルスｐＤＳＶＥ；ならびに、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ネズミ科動物乳癌ウィルスプロモーター、ラウス肉腫ウィルスプロモーター、ポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）プロモーター、または真核生物の細胞で発現させるのに有効であることが示された他のプロモーターの指示のもとでタンパク質を発現させるあらゆる他のベクターが含まれる。
【００７７】
いくつかの発現システムは、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸還元酵素など、遺伝子の増幅をもたらすマーカーを有する。あるいは、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウィルスプロモーターの指示のもとでフィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する昆虫細胞におけるバキュロウィルスベクターなど、遺伝子の増幅を伴わない高収率の発現システムも適切である。
【００７８】
発現ベクターに典型的に含まれる要素には、また、組換えプラスミドを内部に持つ細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子である、大腸菌で機能するレプリコン、および真核生物の配列の挿入を許すプラスミドの不必要な領域における独自の制限部位が含まれる。選択される特定の抗生物質耐性の遺伝子は決定的ではなく、当技術分野で知られている多くの耐性の遺伝子のあらゆるものが適切である。原核生物の配列は、必要であれば、真核生物の細胞におけるＤＮＡの複製を妨げないように、任意選択で選択される。抗生物質耐性の選択マーカー同様、既知の代謝経路に基づく代謝選択マーカーを、形質転換された宿主細胞を選択するための手段として用いることもできる。
【００７９】
組換えタンパク質（例えば、本発明のフィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチド）のペリプラズムの発現が望まれる場合には、発現ベクターは、発現されるべきタンパク質のコード配列の５’に直接結合している大腸菌ＯｐｐＡ（ペリプラズマのオリゴペプチド結合性タンパク質（Ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ））分泌シグナルまたはその修飾されたバージョンなどの分泌シグナルをコードする配列をさらに含む。このシグナル配列は、細胞質で細胞膜を通してペリプラズマ間隙中に生成された組換えタンパク質を指示している。発現ベクターは、組換えタンパク質がペリプラズマ間隙に侵入しているときにシグナル配列を酵素的に切断することができる、シグナルペプチダーゼ１に対するコード配列をさらに含むことがある。組換えタンパク質の、ペリプラズマの生成に関するより詳しい記載は、例えば、Ｇｒａｙら、Ｇｅｎｅ、３９巻、２４７〜２５４頁（１９８５年）、米国特許第６１６００８９号、および第６４３６６７４号に見ることができる。
【００８０】
上記に記載したように、当業者であれば、フィブリノーゲンγＣポリペプチドの生物学的活性、例えば、内皮細胞の増殖に対する阻害効果を依然として保持しながら、あらゆる野生型または修飾されたフィブリノーゲンγＣフラグメント、またはそのコード配列に対して様々な保存的置換を行うことができることが理解されよう。さらに、得られるアミノ酸配列を変更しないで特定の発現宿主における好ましいコドン使用に順応するために、ポリヌクレオチドコード配列の修飾も行うことができる。
【００８１】
Ｂ．形質移入方法
標準の形質移入方法を用いて、大量のフィブリノーゲンγＣポリペプチドを発現する細菌、哺乳動物、酵母菌、昆虫、または植物の細胞系を生成し、次いで、標準の技術を用いてこれを精製する（例えば、Ｃｏｌｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４巻、１７６１９〜１７６２２頁（１９８９年）；「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８２巻、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編集、１９９０年）を参照されたい）。真核生物および原核生物の細胞の形質転換は、標準の技術に従って行う（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１３２巻、３４９〜３５１頁（１９７７年）；Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ＆Ｃｕｒｔｉｓｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１巻、３４７〜３６２頁（Ｗｕら、編集、１９８３年）を参照されたい）。
【００８２】
外来のヌクレオチド配列を宿主に導入するためのあらゆるよく知られた手順を用いることができる。これには、リン酸カルシウム形質移入、ポリブレン、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター（ｐｌａｓｍａ  ｖｅｃｔｏｒｓ）、ウィルスベクター、および、クローンされたゲノムのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、もしくは他の外来の遺伝物質を宿主細胞に導入するためのあらゆる他のよく知られた方法の使用が含まれる（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、上述を参照されたい）。用いられる特定の遺伝子工学の手順が、フィブリノーゲンγＣポリペプチドを発現することができる宿主細胞中に少なくとも１つの遺伝子を上首尾に導入することができることのみが必要である。
【００８３】
Ｃ．宿主細胞におけるγＣ関連ポリペプチドの組換え発現の検出
発現ベクターを好適な宿主細胞中に導入した後、フィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドの発現に好都合な条件下で、形質移入した細胞を培養する。次いで、組換えポリペプチドの発現について細胞をスクリーニングし、引き続き組換えポリペプチドを標準の技術を用いて培養物から回収する（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（１９８２年）；米国特許第４６７３６４１号；Ａｕｓｕｂｅｌら、上述；およびＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、上述を参照されたい）。
【００８４】
遺伝子の発現をスクリーニングするためのいくつかの一般的な方法は、当業者にはよく知られている。第１に、遺伝子の発現は、核酸レベルで検出することができる。核酸のハイブリダイゼーション技術を用いて特定のＤＮＡおよびＲＮＡを測定する様々な方法を、通常用いる（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、上述）。電気泳動による分離を伴う方法もある（例えば、ＤＮＡを検出するためのサザンブロット、およびＲＮＡを検出するためのノーザンブロット）が、ＤＮＡまたはＲＮＡの検出は電気泳動なしでも行うことができる（例えば、ドットブロットにより）。形質移入された細胞におけるフィブリノーゲンγＣポリペプチドをコードする核酸の存在は、配列に特異的なプライマーを用いてＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲによって検出することもできる。
【００８５】
第２に、遺伝子の発現はポリペプチドのレベルで検出することができる。当業者であれば、特に、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドなどの本発明のフィブリノーゲンγＣポリペプチドと特異的に反応するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いて、遺伝子産物のレベルを測定するために、様々な免疫学的アッセイを日常的に使用する（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第１章、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８８年；ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻、４９５〜４９７頁（１９７５年）。このような技術は、フィブリノーゲンγＣポリペプチドまたはその抗原部分に対して特異性の高い抗体を選択することによる抗体の調製を必要とする。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生させる技術は十分に確立されており、これらの記載は文献で見ることができる。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上述；ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６巻、５１１〜５１９頁（１９７６年）を参照されたい。本発明のフィブリノーゲンγＣポリペプチドに対する抗体を調製し、フィブリノーゲンγＣポリペプチドを検出する免疫学的アッセイを行うことのさらに詳しい記載を後節で述べる。
【００８６】
Ｄ．組換えにより生成されたγＣ関連ポリペプチドの精製
形質移入された宿主細胞における組換えフィブリノーゲンγＣポリペプチドの発現が確認されたら、次いで、組換えポリペプチドを精製する目的で、宿主細胞を好適な規模で培養する。
【００８７】
１．組換えにより生成されたγＣペプチドの細菌からの精製
本発明のフィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドは、典型的にはプロモーター導入した後に、形質移入された細菌により大量に組換えで生成されるが、発現は構成的であることができ、ポリペプチドは不溶性の凝集物を形成することがある。タンパク質封入体の精製に適するプロトコールはいくつか存在する。例えば、凝集したタンパク質（以降、封入体と呼ぶ）を精製するには、典型的には、細菌細胞を破壊することにより、例えば、リゾチーム約１００〜１５０μｇ／ｍｌ、および非イオン性界面活性剤である０．１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ４０のバッファー中でインキュベートすることにより、封入体の抽出し、分離し、かつ／または精製することを含む。細胞懸濁液は、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ粉砕装置（ニューヨーク州、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて粉砕してもよい。あるいは、細胞を氷上で超音波処理してもよい。細菌を溶解する代替法は、Ａｕｓｂｅｌら、ならびにＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、両者とも上述に記載されており、当業者であれば明らかであろう。
【００８８】
細胞懸濁液を、一般的には遠心分離し、封入体を含むペレットを、封入体を溶解しないが洗浄するバッファー（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２０ｍＭ（ｐＨ７．２）、ＥＤＴＡ  １ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、および非イオン性界面活性剤であるＴｒｏｔｏｎ−Ｘ１００  ２％に再懸濁する。細胞片をできるだけ多く除去するために洗浄のステップを繰り返す必要があることがある。封入体の残りのペレットを、好適なバッファー（例えば、リン酸ナトリウム２０ｍＭ、ｐＨ６．８、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ）に再懸濁してもよい。他の好適なバッファーは、当業者であれば明らかであろう。
【００８９】
洗浄ステップの後、強力な水素受容体でもあり強力な水素供与体でもある溶媒（またはこれらの特性の１つを各々が有する溶媒の組合せ）を加えて、封入体を可溶化する。次いで、適合性のバッファーで希釈または透析して、封入体を形成しているタンパク質を再生することができる。適切な溶媒には、それだけには限定されないが、尿素（約４Ｍから約８Ｍまで）、ホルムアミド（容積／容積ベースで、少なくとも約８０％）、および塩酸グアニジン（約４Ｍから約８Ｍまで）が含まれる。凝集物形成性のタンパク質を可溶化することができるいくつかの溶媒、例えば、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）および７０％ギ酸は、免疫原性および／または活性を欠くことを伴う、タンパク質の不可逆的な変性の可能性があるので、この手順で使用するには不適当なことがある。塩酸グアニジンおよび類似の物質は変性剤であるが、この変性は不可逆的ではなく、変性剤を除去し（例えば、透析により）、または希釈すると再生が起こることがあり、重要な、免疫学的におよび／または生物学的に活性なタンパク質の再編成が可能となる。可溶化後、タンパク質は、標準の分離技術により、他の細菌のタンパク質から分離することができる。細菌の封入体から組換えポリペプチドを精製するさらなる記載は、例えば、Ｐａｔｒａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、１８巻、１８２〜１９０頁（２０００年）を参照されたい。
【００９０】
あるいは、細菌のペリプラズムから、組換えポリペプチド、例えば、フィブリノーゲンγＣポリペプチドを精製することは可能である。組換えタンパク質が細菌のペリプラズムに搬出される場合、当業者には知られている他の方法の他に、冷却の浸透圧ショックにより、細菌のペリプラズムの分画を単離することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、上述を参照されたい）。組換えタンパク質をペリプラズムから単離するために、細菌細胞を遠心分離してペレットを形成させる。ペレットは、ショ糖を２０％含むバッファーに再懸濁する。細胞を溶解するために、細菌を遠心分離し、ペレットを、氷冷したＭｇＳＯ４５ｍＭに再懸濁し、約１０分間氷浴中に保つ。細胞懸濁液を遠心分離し、上清をデカントし保存する。上清に存在する組換えタンパク質は、当業者にはよく知られている標準の分離技術により、宿主タンパク質から分離することができる。
【００９１】
２．精製のための標準のタンパク質分離技術
組換えポリペプチド、例えば、本発明のフィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドが、宿主細胞で可溶性の形態で発現される場合、その精製は、以下に記載する標準のタンパク質精製手順に従うことができる。この標準の精製手順は、化学合成、またはフィブリノーゲンγ鎖の酵素的消化から得られたフィブリノーゲンγＣポリペプチドの精製にも適している。
【００９２】
ｉ．溶解度分画法
しばしば最初のステップとして、およびタンパク質混合物が複合体の場合、最初の、塩の分画法で、対象の組換えタンパク質、例えば、本発明のフィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドから、不必要な宿主のタンパク質（または細胞培養液に由来するタンパク質）の多くを分離することができる。好ましい塩は、硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水の量を効果的に減少させることにより、タンパク質を沈殿させる。次いで、タンパク質を、その溶解性に基づいて沈殿させる。タンパク質の疎水性が強いほど、より低濃度の硫酸アンモニウムで沈殿する傾向が強くなる。典型的なプロトコールは、得られた硫酸アンモニウムの濃度が２０〜３０％の間になるように、飽和硫酸アンモニウムをタンパク質溶液に加えることである。これにより、ほとんどの疎水性タンパク質は沈殿する。（対象のタンパク質が疎水性でなければ）沈殿物を廃棄し、対象のタンパク質を沈殿させることがわかっている濃度まで、上清に硫酸アンモニウムを加える。次いで、沈殿物をバッファーに可溶化し、必要であれば過剰の塩を、透析またはダイアフィルトレーションのいずれかで除去する。冷却エタノール沈殿など、タンパク質の溶解性に依存する他の方法は、当業者にはよく知られており、複合体のタンパク質混合物を分画するのに用いることができる。
【００９３】
ｉｉ．サイズ別ろ過
計算した分子量に基づいて、サイズの大きい、および小さいタンパク質を、サイズの様々な孔の膜（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ膜）を通した限外ろ過を用いて単離することができる。第１のステップとして、タンパク質混合物を、対象のタンパク質、例えばフィブリノーゲンγＣポリペプチドの分子量よりも分子量のカットオフの低い孔サイズの膜を通して限外ろ過する。次いで、限外ろ過の保持液を、対象のタンパク質の分子量よりも分子カットオフの大きい膜に対して限外ろ過する。組換えタンパク質は、膜を通過してろ過物中に入る。次いで、ろ液を、以下に記載するようにクロマトグラフィーにかけることができる。
【００９４】
ｉｉｉ．カラムクロマトグラフィー
対象のタンパク質（例えば、本発明のフィブリノーゲンγＣポリペプチド）を、そのサイズ、正味の表面電荷、疎水性、またはリガンドに対する親和性をもとに、他のタンパク質から分離することもできる。さらに、フィブリノーゲンγＣフラグメントに対して産生された抗体を、カラムマトリックスに結合させ、フィブリノーゲンγポリペプチドを免疫精製することができる。これらの方法は全て、当技術分野ではよく知られている。
【００９５】
クロマトグラフィーの技術は、あらゆる規模で、多くの様々な製造業者（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）からの機器を用いて行うことができることは、当業者であれば明らかであろう。
【００９６】
Ｖ．組換えフィブリノーゲンγＣ発現の検出のための免疫アッセイ
組換えフィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドの生成を確認するために、サンプル中でポリペプチドの発現を検出するのに免疫学的アッセイが有用であることがある。免疫学的アッセイは、組換えフィブリノーゲンγＣポリペプチドの発現レベルを定量するのにも有用である。フィブリノーゲンγＣポリペプチドに対する抗体は、これらの免疫学的アッセイを行うのに必要である。
【００９７】
Ａ．フィブリノーゲンγＣポリペプチドに対する抗体の生成
対象の免疫原と特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を生成するための方法は、当業者には知られている（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ、ニューヨーク、１９９１年；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年；Ｓｔｉｔｅｓら（編集）、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）、カリフォルニア州、Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ、Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏ、およびそれに引用されている参照；Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、（第２版）、ニューヨーク州、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６年、およびＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻、４９５〜４９７頁、１９７５年）。このような技術には、ファージまたは同様のベクターにおける組換え抗体のライブラリーから抗体を選択することによる抗体の調製が含まれる（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻、１２７５〜１２８１頁、１９８９年；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻、５４４〜５４６頁、１９８９年を参照されたい）。
【００９８】
望ましい特異性を有する抗体を含む抗血清を生成するために、対象のポリペプチド（例えば、本発明のフィブリノーゲンγＣポリペプチド）またはその抗原フラグメントを用いて適切な動物、例えば、マウス、ウサギ、または霊長動物を免疫化することができる。フロイントアジュバントなどの標準のアジュバントを、標準の免疫化のプロトコールに従って用いることができる。あるいは、その特定のポリペプチドに由来する合成の抗原ペプチドをキャリアタンパク質に複合させ、引き続き免疫源として用いることができる。
【００９９】
免疫源の調製物に対する動物の免疫反応は、試験血液を採取し、対象の抗原に対する反応性の力価を決定することによりモニターする。抗原に対する適切に高力価の抗体を得る場合には、血液を動物から回収し、抗血清を調製する。抗原に対して特に反応性の抗体を濃縮するための抗血清のさらなる分画、および抗体の精製を引き続き行うことができ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上述を参照されたい）、タンパク質精製の一般的な記載は上記に提供した。
【０１００】
モノクローナル抗体は、当業者にはなじみ深い様々な技術を用いて得られる。典型的には、望ましい抗原で免疫化した動物からの脾臓細胞を、一般的には、ミエローマ細胞と融合することにより不死化する。（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６巻、５１１〜５１９頁、１９７６年を参照されたい）不死化の代替の方法には、例えば、エプスタインバーウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ）、癌遺伝子、もしくはレトロウィルスでの形質転換、または当技術分野でよく知られている他の方法が含まれる。単一の不死化した細胞から生じたコロニーを、抗原に対する望ましい特異性および親和性の抗体の生成についてスクリーニングし、そのような細胞が生成したモノクローナル抗体の収量を、脊椎動物の宿主の腹腔内に注射することを含む様々な技術により増大させることができる。
【０１０１】
さらに、Ｈｕｓｅら、上述が概説した一般的なプロトコールに従ってヒトＢ細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、望ましい特異性を有する抗体、またはそのような抗体の結合性フラグメントをコードする核酸配列を同定する際に、モノクローナル抗体を組換えで生成することもできる。上記で論じた組換えポリペプチド生成の一般的な原理および方法は、組換え方法による抗体生成に応用可能である。
【０１０２】
Ｂ．組換えフィブリノーゲンγＣ発現を検出するための免疫アッセイ
本発明のフィブリノーゲンγＣポリペプチドに特異的な抗体が入手できたら、細胞可溶化物などのサンプル中のポリペプチドの量を、当業者に定性のおよび定量の結果を提供する様々な免疫アッセイ方法により、測定することができる。一般的な免疫学的手順および免疫アッセイの手順の再考には、例えば、Ｓｔｉｔｅｓ、上述；米国特許第４３６６２４１号、第４３７６１１０号、第４５１７２８８号、および第４８３７１６８号を参照されたい。
【０１０３】
１．免疫アッセイにおける標識化
免疫アッセイでは、抗体および標的のタンパク質が形成する結合性の複合体に、特異的に結合し、標識する標識化物質を利用することが多い。標識化物質は、それ自体が、抗体／標識タンパク質複合体を含む部分の１つであってもよく、または別の抗体など、抗体／標識タンパク質複合体に特異的に結合する第３の部分であってもよい。標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的な手段により検出することができる。例として、それだけには限定されないが、磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、イソチオシアネート、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、ローダミンなど）、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡで通常用いられるその他のもの）、ならびに、金コロイド、または着色ガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）のビーズなどの比色ラベルが含まれる。
【０１０４】
いくつかの場合には、標識化物質は、検出可能な標識を有する第２の抗体である。あるいは、第２の抗体は標識を欠くことがあるが、その代わりに、第２の抗体が由来する種の抗体に特異的な標識された第３の抗体に結合することがある。第２の抗体を、酵素標識したストレプトアビジンなど第３の標識した分子が特異的に結合することができる、ビオチンなどの検出可能な部分で修飾することができる。
【０１０５】
Ａタンパク質またはＧタンパク質など、免疫グロブリンの定常部に特異的に結合することができる他のタンパク質も、また、標識物質として用いることができる。これらのタンパク質は、連鎖球菌の細胞壁の通常の構成成分である。これらは様々な種に由来する免疫グロブリンの定常部と、強力な非免疫原性の反応性を示す（一般的には、Ｋｒｏｎｖａｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１１巻、１４０１〜１４０６頁（１９７３年）；およびＡｋｅｒｓｔｒｏｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３５巻、２５８９〜２５４２頁（１９８５年）を参照されたい）。
【０１０６】
２．免疫アッセイのフォーマット
サンプルからの対象の標的のタンパク質（例えば、フィブリノーゲンγＣポリペプチド）を検出するための免疫アッセイは、競合的でも、非競合的でもよい。非競合的な免疫アッセイは、捕獲された標的のタンパク質の量を直接測定するアッセイである。例えば、１つの好ましい「サンドイッチ」アッセイでは、標的のタンパク質に特異的な抗体は、抗体が固定化されている固体の基質に直接結合することができる。次いで、これは、試験サンプル中の標的タンパク質を捕獲する。このように固定化された抗体／標的タンパク質複合体は、次いで、上記に記載したように、標識を有する第２のまたは第３の抗体などの標識化物質によって結合される。
【０１０７】
競合アッセイでは、標的タンパク質に特異的な抗体からサンプルに存在する標的タンパク質によって置き換えられた（または競合してなくなってしまった）添加した（外来性の）標的タンパク質の量を測定することにより、サンプルにおける標的タンパク質の量を間接的に測定する。このようなアッセイの典型的な例では、抗体は固定化され、外来の標的タンパク質は標識されている。抗体に結合している外来の標的タンパク質の量は、サンプル中に存在する標的タンパク質の濃度に反比例するので、サンプル中の標的タンパク質のレベルは、このように、抗体に結合し、したがって固定化している外来の標的タンパク質の量に基づいて決定することができる。
【０１０８】
いくつかの場合では、ウェスタンブロット（免疫ブロット）分析を用いて、サンプル中のフィブリノーゲンγＣポリペプチドの存在を検出し定量する。この技術は、一般的に、分子量に基づいたゲル電気泳動によりサンプルのタンパク質を分離し、分離したタンパク質を適切な固体支持体（例えば、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘導体化したナイロンフィルター）に移し、標的タンパク質に特異的に結合する抗体とともにサンプルをインキュベートする。これらの抗体を直接標識してもよく、またはその代わりに、フィブリノーゲンγＣポリペプチドに対する抗体に特異的に結合する標識した抗体（例えば、標識したヒツジ抗マウス抗体）を用いて引き続き検出してもよい。
【０１０９】
他のアッセイフォーマットにはリポソーム免疫アッセイが含まれ、これは、特定の分子（例えば、抗体）に結合し、カプセル化した試薬またはマーカーを放出するようにデザインしたリポソームを用いる。次いで、放出された化学物質を、標準の技術に従って検出する（Ｍｏｎｎｒｏｅら、Ａｍｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｖ．、５巻、３４〜４１頁（１９８６年）を参照されたい）。
【０１１０】
ＩＩＩ．機能上のアッセイ
Ａ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイ
内皮細胞を、０．５〜４８時間、組織培養液で、フィブリノーゲンγＣポリペプチド０．１〜２０μｇ／ｍｌに曝した後、直接細胞数計数、ＢｒｄＵまたはＨ３チミジンの組込み、臭化３，［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテラゾリウム（ＭＴＴ）テトラゾリウム塩の細胞増殖アッセイ、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）細胞増殖アッセイ、ニワトリ胚漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイ、ＴＵＮＮＥＬアッセイ、アネキシンＶ結合アッセイなどの方法を用いて、内皮細胞の増殖／生存状態について試験する。細胞の増殖における統計的に有意な減少が、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、または５０％であることが見出された場合は、阻害効果が検出される。同様に、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％のプログラムされた細胞死におけるあらゆる統計的に有意な上昇があれば、細胞死の促進に正の効果があると認められる。
【０１１１】
Ｂ．ｉｎ  ｖｉｖｏのアッセイ
本発明のフィブリノーゲンγＣポリペプチドの阻害効果は、ｉｎ  ｖｉｖｏのアッセイでも実証することができる。例えば、フィブリノーゲンγＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットで形質移入し、ポリペプチドの分泌型を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、免疫系の損なわれた動物（例えば、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、またはＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス）に注射することができる。腫瘍の発生を、フィブリノーゲンのコード配列のない発現カセットで形質移入した癌細胞だけを受けた対照群の動物と比べて、モニターする。試験群に、腫瘍の成長に対して統計学的に有意な負の作用が確立された場合に、阻害作用が検出される。好ましくは、負の作用が少なくとも１０％の減少であり、より好ましくは減少が少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％である。
【０１１２】
ＩＶ．薬剤組成物および投与
本発明は、予防上の、および治療上の両適用において内皮細胞の増殖を阻害するための、フィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチド、またはフィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの有効量を含む薬剤組成物を提供するものでもある。本発明の薬剤組成物は、様々な薬物送達システムにおける使用に適する。本発明で使用するのに適する製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ペンシルバニア州、フィラデルフィア、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、第１７版（１９８５年）に見られる。薬物送達の方法の簡潔な再考については、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻、１５２７〜１５３３頁（１９９０年）を参照されたい。
【０１１３】
本発明の薬剤組成物は、様々な経路、例えば、皮下、経皮、筋肉内、静脈内、または腹腔内により投与することができる。薬剤組成物を投与する好ましい経路は、１日あたり７０ｋｇの成年のヒトに対し１日投与量約０．０１〜５０００ｍｇ、好ましくは５〜５００ｍｇのフィブリノーゲンγＣポリペプチドの、内皮細胞（例えば、腫瘍）の増殖により増悪した状態を有する器官または組織への局所送達である。好適な投与量を、１回の１日投与量で、または好適な間隔で、例えば、１日あたり２、３、４、またはそれを超えるサブドーズ（ｓｕｂｄｏｓｅ）で表される分画された投与量で投与してもよい。
【０１１４】
フィブリノーゲンγＣポリペプチドを含む薬剤組成物を調製するために、不活性な、薬学的に許容できる担体を用いる。薬剤上の担体は、固体でも液体でもよい。固体の形態の調製物には、例えば、粉末剤、錠剤、分散可能な顆粒剤、カプセル剤、カシェ剤、および坐剤が含まれる。固体の担体は、希釈剤、着香料、可溶化剤、滑沢剤、懸濁化剤、結合剤、または錠剤崩壊剤としても作用することができる１つまたは複数の物質であってもよく、カプセル化材料であってもよい。
【０１１５】
粉末剤では、担体は、一般的には微粉化した有効構成成分、例えばフィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドと混合した微細化した固体である。錠剤では、有効成分（フィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチド）を、必要な結合特性を有する担体と適切な比率で混合し、望ましい形状および大きさに成型する。
【０１１６】
坐剤の形状の薬剤組成物を調製するためには、脂肪酸グリセリドとココアバターとの混合物などの低融点ワックスを最初に融解し、有効成分をその中に、例えば撹拌により分散させる。融解した均一の混合物を、次いで、好都合な大きさの型の中に注ぎ、放冷して、固化させる。
【０１１７】
粉末剤および錠剤は、約５重量％から約７０重量％の間の有効成分のフィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドを含むことが好ましい。適切な担体には、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ラクトース、糖、ペクチン、デキストリン、デンプン、トラガカントゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、ココアバターなどが含まれる。
【０１１８】
薬剤組成物は、有効化合物のフィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドの製剤を、フィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチド（他の担体とともに、またはそれなしで）が担体によって取り囲まれ、したがって担体が化合物に結合しているカプセル剤を提供する担体としてのカプセル化材料とともに含むことができる。同様のやり方で、カシェ剤も含まれ得る。錠剤、粉末剤、カシェ剤、およびカプセル剤は、経口投与に適する固体の投与量形態として用いることができる。
【０１１９】
液体の薬剤組成物には、例えば、経口投与または非経口投与に適する溶液剤、懸濁剤、および経口投与に適する乳剤が含まれる。有効構成成分（例えば、フィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチド）の滅菌水溶液、または水、緩衝液、食塩水、ＰＢＳ、エタノール、もしくはプロピレングリコールを含む溶媒における有効構成成分の滅菌溶液は、非経口投与に適する液体組成物の例である。組成物は、おおよその生理学的条件に必要とされる薬学的に許容できる補助剤、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張化剤、湿潤剤、界面活性剤などを含むことができる。
【０１２０】
滅菌溶液は、有効構成成分（例えば、フィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチド）を望ましい溶媒系に溶解し、次いで得られた溶液を滅菌にするためにメンブランフィルターを通過させて滅菌にし、またはその代わりに滅菌の化合物を前もって滅菌にした溶媒に滅菌の条件下で溶解することにより調製することができる。得られた水溶液を、そのままで、または凍結乾燥として使用するために包装してもよく、凍結乾燥の調製物は、投与の前に滅菌の水溶性担体と組み合わせる。調製物のｐＨは、典型的には、３と１１の間であり、より好ましくは５から９まで、最も好ましくは７から８までである。
【０１２１】
フィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドを含む薬剤組成物を、予防および／または治療的処置のために投与することができる。治療上の適用では、内皮細胞の増殖、例えば、血管形成が支える腫瘍の成長により増悪することがある状態にすでに罹患している患者に、状態の症状およびその合併症を、防ぎ、治療し、逆転させ、または少なくとも部分的に遅らせもしくは停止するのに十分な量で、組成物を投与する。これを実現するのに十分な量を、「治療上有効な投与量」と定義する。この使用に有効な量は、疾患または状態の重症度、ならびに患者の体重および全身状態に依存するが、一般的に７０ｋｇの患者に対して１日あたり約０．１ｍｇから約２０００ｍｇまでのフィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドの範囲であり、７０ｋｇの患者に対して１日あたり約５ｍｇから約５００ｍｇのポリペプチドの投与量をより一般的に使用する。
【０１２２】
予防的適用では、フィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドを、内皮細胞の増殖が望ましくない疾患もしくは状態に感受性があるまたは疾患もしくは病状を発症する危険性のある患者に、症状の開始を遅らせ、または防ぐのに十分な量で投与する。このような量を、「予防上有効な投与量」と定義する。この使用では、フィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドの正確な量は、やはり、患者の健康状態および体重に依存するが、一般的に、１日あたり７０ｋｇの患者に対して約０．１ｍｇから約２０００ｍｇまでの、より一般的には１日あたり７０ｋｇの患者に対して約５ｍｇから約５００ｍｇまでのポリペプチドの範囲である。
【０１２３】
組成物の１回または複数回の投与を、処置する医師が選択した投与量のレベルおよびパターンで行うことができる。いずれにしても、薬剤製剤は、治療的に、または予防的に、患者における内皮細胞の増殖を効果的に阻害するのに十分な量のフィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドを提供しなければならない。
【０１２４】
Ｖ．核酸を使用する治療的適用
コード配列が転写され、フィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドが細胞で生成されるように本発明のフィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドをコードする核酸を細胞中に導入することを含む、治療上の取組みにより、様々な疾患を処置することができる。この取組みにより処置に敏感に反応する疾患には、その生存および成長が継続した血液供給に頼り、したがって新血管の形成を必要とする、広範囲の固形腫瘍が含まれる。遺伝疾患および獲得された疾患の処置への遺伝子治療の適用に関する考察については、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３５７巻、４５５〜４６０頁（１９９２年）；およびＭｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０巻、９２６〜９３２頁（１９９３年）を参照されたい。
【０１２５】
Ａ．遺伝子送達のためのベクター
細胞または生物体に送達するために、本発明のフィブリノーゲンγＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ベクター内に組み入れることができる。このような目的に用いるベクターの例には、標的の細胞における核酸の発現を指示することができる発現プラスミドが含まれる。他の例では、ベクターはウィルスのベクターシステムであり、標的細胞に形質移入することができるウィルスのゲノム中にポリヌクレオチドが組み込まれている。好ましい一実施形態では、フィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、望ましい標的の宿主細胞でポリペプチドの発現を指示することができる発現配列およびコントロール配列に操作可能に結合することができる。したがって、標的細胞において好適な条件下で、フィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドの発現を達成することができる。
【０１２６】
Ｂ．遺伝子送達システム
フィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドの発現に有用なウィルスのベクターシステムには、例えば、天然に存在する、または組換えウィルスのベクターシステムが含まれる。特定の適用に応じて、適切なウィルスのベクターには、複製競合、複製欠損、および条件付複製のウィルスのベクターが含まれる。例えば、ウィルスのベクターは、ヒトまたはウシのアデノウィルス、ワクシニアウィルス、ヘルペスウィルス、アデノ随伴ウィルス、マウスの微小ウィルス（ＭＶＭ）、ＨＩＶ、シンドビスウィルス、およびレトロウィルス（それだけには限定されないがラウス肉腫ウィルスを含む）、およびＭｏＭＬＶのゲノムに由来することができる。典型的には、対象の遺伝子（例えば、本発明のフィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドをコードするもの）を、そのようなベクター中に挿入して、典型的にはウィルスのＤＮＡを伴う遺伝子構築物のパッケージングを可能にし、その後、感受性の宿主細胞が感染し、対象の遺伝子が発現する。
【０１２７】
本明細書で用いられる「遺伝子送達システム」は、本発明の核酸を標的細胞へ送達するためのあらゆる手段を意味する。本発明のいくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡ結合部分などの好適な結合部分により取込み（例えば、コーティングされたピットの陥入、およびエンドソームのインターナリゼーション）を促進するための細胞の受容体のリガンドに結合している（Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３巻、１４６２１〜１４６２４頁（１９８８年）；ＷＯ第９２／０６１８０号）。例えば、核酸は、ポリリジン部分により、肝細胞のアシアロ糖タンパク質受容体に対するリガンドであるアシアロオロムコシド（ａｓｉａｌｏ−ｏｒｏｍｕｃｏｃｉｄ）を通して結合することができる。
【０１２８】
同様に、本発明の核酸を含む遺伝子構築物をパッケージングするために用いられるウィルスのエンベロープは、特定の細胞内への受容体が媒介するエンドサイトーシスを可能にするために、受容体リガンドまたは受容体に特異的な抗体を加えることにより修飾することができる（例えば、ＷＯ第９３／２０２２１号、ＷＯ第９３／１４１８８号、およびＷＯ第９４／０６９２３号を参照されたい）。本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＤＮＡ構築物は、エンドサイトーシスを促進するためにアデノウィルス粒子などのウィルスタンパク質に結合している（Ｃｕｒｉｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８８巻、８８５０〜８８５４頁（１９９１年））。他の実施形態では、本発明の分子複合体は、微小管阻害物質（ＷＯ第９４／０６９２２号）、インフルエンザウィルスのヘマグルチニンを模倣する合成ペプチド（Ｐｌａｎｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９巻、１２９１８〜１２９２４頁（１９９４年））、およびＳＶ４０Ｔ抗原などの核移行シグナル（ＷＯ第９３／１９７６８号）を含むことができる。
【０１２９】
レトロウィルスベクターも、本発明のフィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドのコード配列を標的の細胞または生物体中に導入するのに有用であることがある。レトロウィルスベクターは、遺伝子操作されているレトロウィルスにより生成される。レトロウィルスのウィルスのゲノムはＲＮＡである。感染の際、このゲノムのＲＮＡがＤＮＡコピー中に逆転写され、ＤＮＡのコピーが高度の安定性および有効性で導入された細胞の染色体のＤＮＡ中に組み込まれる。組み込まれたＤＮＡのコピーは、プロウィルスと呼ばれ、あらゆる他の遺伝子のように娘細胞に遺伝される。野生型のレトロウィルスのゲノムおよびプロウィルスのＤＮＡには、３つの遺伝子：ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖがあり、２つの末端長反復（ＬＴＲ）配列が隣接している。ｇａｇ遺伝子は、内部の構造の（ヌクレオカプシド）タンパク質をコードしており、ｐｏｌ遺伝子は、ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）を指示するＲＮＡをコードしており、ｅｎｖ遺伝子はウィルスのエンベロープ糖タンパク質をコードしている。５’および３’ＬＴＲは、ビリオンＲＮＡの転写およびポリアデニレーションを促進するように働く。５’ＬＴＲに対する近接は、ゲノムの逆転写（ｔＲＮＡプライマー結合部位）に、およびウィルスのＲＮＡの粒子内（Ｐｓｉ部位）中への効果的なカプセル化に必要な配列である（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｉｎｏｕｙｅ（編集）、１５５〜１７３頁（１９８３年）；Ｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ、３３巻、１５３〜１５９頁（１９８３年）；ＣｏｎｅおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．、８１巻、６３４９〜６３５３頁（１９８４年）を参照されたい）。
【０１３０】
レトロウィルスベクターのデザインは、当業者にはよく知られている。手短に述べると、カプシド形成（またはレトロウィルスのＲＮＡの、感染性ビリオンへのパッケージング）に必要な配列がウィルスのゲノムから失われている場合に、ゲノムのＲＮＡのカプシド形成を防ぐｃｉｓ作用性の欠陥という結果になる。しかし、得られる突然変異体は、依然として、全てのビリオンタンパク質の合成を指示することができる。それからこれらの配列の欠失しているレトロウィルスゲノム、および染色体中に安定して組み込まれる突然変異のゲノムを含む細胞系は、当技術分野ではよく知られており、レトロウィルスベクターを構築するのに用いられる。レトロウィルスベクターの調製、およびその使用については、例えば、欧州特許出願ＥＰＡ第０１７８２２０号、米国特許第４４０５７１２号、Ｇｉｌｂｏａ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４巻、５０４〜５１２頁（１９８６年）；Ｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ、３３巻、１５３〜１５９頁（１９８３年）；ＣｏｎｅおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻、６３４９〜６３５３頁（１９８４年）；Ｅｇｌｉｔｉｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻、６０８〜６１４頁（１９８８年）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、７巻、９８１〜９９０頁（１９８９年）；Ｍｉｌｌｅｒ（１９９２年）、上述；Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９９３年）、上述；およびＷＯ第９２／０７９４３号を含む多くの出版物に記載されている。
【０１３１】
レトロウィルスベクター粒子は、望ましいヌクレオチド配列をレトロウィルスベクター中に組換えにより挿入し、パッケージングの細胞系を使用してレトロウィルスのカプシドタンパク質でベクターをパッケージングすることにより調製する。得られたレトロウィルスベクター粒子は、宿主細胞では複製できないが、望ましいヌクレオチド配列を含むプロウィルスの配列として宿主細胞のゲノム中に組み込むことができる。その結果、患者は、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを生成することができ、したがって、細胞を通常の表現型にする。
【０１３２】
レトロウィルスベクター粒子を調製するために用いられるパッケージングの細胞系は、典型的には、パッケージングに必要とされる必要なウィルスの構造タンパク質を生成するが、感染性のビリオンを生成することができない、組換え哺乳動物組織の細胞系である。一方、用いられる欠損したレトロウィルスベクターは、これらの構造遺伝子を欠くが、パッケージングに必要な残りのタンパク質をコードしている。パッケージングの細胞系を調製するために、パッケージング部位が欠失している望ましいレトロウィルスの感染性のクローンを構築することができる。この構築物を含む細胞は、全てのウィルスの構造タンパク質を発現するが、導入されたＤＮＡをパッケージングすることはできない。あるいは、パッケージングの細胞系は、細胞系を、好適なコアタンパク質およびエンベロープタンパク質をコードする１つまたは複数の発現プラスミドで細胞系を形質転換することにより、生成することができる。これらの細胞では、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子は、同一の、または異なるレトロウィルスに由来することができる。
【０１３３】
本発明に適する数々のパッケージングの細胞系は、また、先行技術で入手可能である。これらの細胞系の例には、Ｃｒｉｐ、ＧＰＥ８６、ＰＡ３１７、およびＰＧ１３が含まれる（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６５巻、２２２０〜２２２４頁（１９９１年）を参照されたい）。他のパッケージング細胞系の例は、ＣｏｎｅおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ、８１巻、６３４９〜６３５３頁（１９８４年）；ＤａｎｏｓおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ、８５巻、６４６０〜６４６４頁（１９８８年）；Ｅｇｌｉｔｉｓら（１９８８年）、上述；およびＭｉｌｌｅｒ（１９９０年）、上述に記載されている。
【０１３４】
キメラのエンベロープタンパク質を有するレトロウィルスベクター粒子を生成することができるパッケージングの細胞系を用いることができる。あるいは、ＰＡ３１７およびＧＰＸパッケージング細胞系が生成するものなどの、両種指向性の、または異種指向性のエンベロープタンパク質を用いて、レトロウィルスベクターをパッケージングすることができる。
【０１３５】
Ｃ．薬剤製剤
フィブリノーゲンγＣポリペプチドをコードする核酸を薬剤上の目的に用いる場合には、一般的には、それをリン酸緩衝食塩水またはリン酸ナトリウム／硫酸ナトリウム、Ｔｒｉｓバッファー、グリシンバッファー、滅菌水、および、Ｇｏｏｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５巻、４６７頁（１９６６年）に記載されているものなど当業者に周知の他のバッファーなどのあらゆる薬学的に許容できるバッファーであることができる適切なバッファーに配合する。
【０１３６】
組成物は、安定化剤、増強剤、または他の薬学的に許容できる担体もしくは媒体をさらに含むことができる。薬学的に許容できる担体は、例えば、本発明の核酸およびあらゆる付随するベクターを安定化するように働く生理学的に許容できる化合物を含むことができる。生理学的に許容できる化合物は、例えば、グルコース、ショ糖、またはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸またはグルタチオン酸などの抗酸化剤、キレート化剤、低分子量のタンパク質、または他の安定化剤もしくは賦形剤を含むことができる。他の生理学的に許容できる化合物は、湿潤剤、乳化剤、分散剤、または、微生物の成長もしくは活動を防ぐのに特に有用である保存剤が含まれる。様々な保存剤がよく知られており、例えば、フェノールおよびアスコルビン酸などが含まれる。担体、安定化剤、または補助剤の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ペンシルバニア州、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、第１７版（１９８５年）に見ることができる。
【０１３７】
Ｄ．製剤の投与
本発明のフィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドをコードする核酸を含む製剤を、当業者には周知のあらゆる送達方法を用いて、あらゆる組織または器官に送達することができる。本発明のいくつかの実施形態では、フィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドをコードする核酸を、粘膜用、局所用、および／またはバッカル製剤に、詳しくは、粘膜付着性のゲル製剤および局所のゲル製剤に調合する。経皮送達のための、例示的な透過増強の組成物、ポリマーのマトリックス、および粘膜付着性のゲル調製物は、米国特許第５３４６７０１号に開示されている。
【０１３８】
本発明の核酸を含む製剤を、典型的には細胞に投与する。細胞を、内皮膜などの組織の一部として、または組織培養物など、単離された細胞として提供することができる。細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏで、ｅｘ  ｖｉｖｏで、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで提供することができる。
【０１３９】
製剤は、様々な方法によりｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで対象の組織中に導入することができる。本発明のいくつかの実施形態では、本発明の核酸を、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム沈降法、リポソーム融合、超音波、電気穿孔、または微粒子銃などの方法により細胞中に導入する。さらなる実施形態では、核酸は、対象の組織により直接摂取される。
【０１４０】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明の核酸を、患者から体外に移植した細胞または組織にｅｘ  ｖｉｖｏで投与し、次いで患者に戻す。治療用の遺伝子構築物のｅｘ  ｖｉｖｏの投与の例は、Ｎｏｌｔａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３巻（６）、２４１４〜９頁（１９９６年）；Ｋｏｃら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２３巻（１）、４６〜６５頁（１９９６年）；Ｒａｐｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ、２２３巻（２）、１１６〜２６頁（１９９６年）；Ｄａｌｅｓａｎｄｒｏら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉ．Ｓｕｒｇ．、１１巻（２）、４１６〜２２頁（１９９６年）；およびＭａｋａｒｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３巻（１）、４０２〜６頁（１９９６年）に含まれる。
【０１４１】
製剤の有効投与量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、および投与する他の薬物を含む多くの様々な要因に応じて変化する。したがって、処置投与量を滴定して、安全性および有効性を最適化する必要がある。投与すべきベクターの有効量を決定する際には、医師は、用いる特定の核酸、診断した疾患状態、患者の年齢、体重、および全身状態、循環血漿レベル、ベクターの毒性、疾患の進行、ならびに抗ベクター抗体の生成を評価しなければならない。投与量のサイズは、また、特定のベクターの投与に付随するあらゆる有害な副作用の存在、性質、および程度により決定する。本発明を実施するためには、患者あたり、約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ、または３０〜３００μｇのＤＮＡの範囲の投与量が典型的である。投与量は、一般的には体重１ｋｇあたり、約０．０１と約５０ｍｇの間、好ましくは約０．１と約５ｍｇ／ｋｇ体重の間、または注射１回あたり約１０８〜１０１０または１０１２粒子の範囲である。一般的に、ベクター由来のネーキッドの核酸と同等の投与量は、典型的な７０ｋｇの患者に対して約１μｇ〜１００μｇであり、レトロウィルス粒子を含むベクターの投与量は、フィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドをコードする核酸の同等の量を生じるように計算される。
【０１４２】
ＶＩ．キット
本発明は、本発明の方法により内皮細胞の増殖を阻害するためのキットも提供する。キットは、典型的には、有効量のフィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチド、またはフィブリノーゲンγＣ関連ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する薬剤組成物を含む容器、ならびに、処置することができる患者のタイプ（例えば、進行した腫瘍塊を発症する危険性のあるヒト）、スケジュール（例えば、投与量および頻度）、および投与経路などの記載を含めた、薬剤組成物の調剤方法についての指示を含む情報材料を含む。
【０１４３】
以下に実施例を示すが、以下の実施例は、例示として提供するにすぎず、限定的なものではない。当業者であれば、実質的に同様の結果をもたらすために、変更し、または修飾することができる、様々な重要ではないパラメータを、容易に理解するであろう。
【実施例１】
【０１４４】
フィブリノーゲンγＣが誘導する内皮細胞のアポトーシス
フィブリノーゲンγ鎖Ｃ末端領域（γＣと示す、３０Ｋｄ、アミノ酸残基約２５０、配列は配列番号３に示す通り）は、インテグリンαｖβ３に対する主要結合部位を含む。インテグリンに結合すると増殖性のシグナルを発生する天然のフィブリノーゲンとは対照的に、γＣはウシ動脈内皮（ＢＡＥ）細胞培養物の増殖を効果的に阻止した。γＣが誘発するＢＡＥ細胞のアポトーシスは、アネキシンＶ結合アッセイで実証された。
【０１４５】
γＣが大規模のＭＡＰキナーゼの活性化を誘発することから、γＣは、（他のインテグリンリガンドへの細胞の結合を阻止しないで）アポトーシスをもたらす細胞間シグナルを積極的に伝達するようである。この知見は新規であり、フィブリノーゲンからのシグナルを理解するのに重要であり、新しい抗血管形成の戦略を開発するのに特に有用である。
【０１４６】
γＣによる内皮細胞の増殖の阻害
単離したγＣ領域（フラグメントＤの部分である）は、１μｇ／ｍｌ未満の濃度でＢＡＥ細胞の増殖を阻止した（図１）。図１において、ＢＡＥ細胞を、９６ウェルの組織培養プレートのウェルに、培養液中に可溶性の天然フィブリノーゲンである、フラグメントＤまたはγＣ（各１２．５μｇ／ｍｌ）の存在下、１ウェルあたり１×１０４細胞で接種した。示したように、γＣは、ＢＡＥ細胞の増殖を阻止した（写真は４８時間後に撮ったものである）。天然フィブリノーゲンまたはフラグメントＤは、用いた条件下では、そのような効果を誘発しなかった。すなわち、ＢＡＥ細胞の増殖に影響を及ぼさなかった。フラグメントＤは、検出可能なアポトーシス効果を誘発するのに、はるかに高濃度（１００μｇ／ｍｌ）を必要とした。
【０１４７】
γＣ領域は、また、ＭＴＳアッセイでＢＡＥ細胞の増殖を阻止した（図２）。図２において、増殖する細胞の数は、テトラゾリウム化合物ＭＴＳ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）アッセイ）を用いて決定した。γＣは、非常に低いレベルのγＣ（１μｇ／ｍｌ未満）でＢＡＥ細胞の増殖を効果的に阻止することを、データは示している。それとは対照的に、γＣは、ＣＨＯまたはβ３−ＣＨＯ細胞の増殖に対して、殆どまたは全く効果を示さなかった。これは、γＣの抗増殖効果は、内皮細胞に特異的であることを指摘するものである。すなわち、この増殖の抑制は、ＢＡＥ細胞で観察されたが、ＣＨＯまたはβ３−ＣＨＯ細胞では観察されず、γＣの抗−増殖効果は、内皮細胞に特異的であることを示していた。
【０１４８】
γＣによるＢＡＥ細胞のアポトーシスの誘発
γＣ領域は、アネキシンＶ結合アッセイにより検出して、ＢＡＥ細胞のアポトーシスを２〜４時間で誘発した（図３）。図３において、ＢＡＥ細胞を、示した時間、組換え可溶性γＣまたは天然のフィブリノーゲン１０μｇ／ｍｌで処置した。処置したＢＡＥ細胞に対するアネキシンＶまたはヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の結合を、フローサイトメトリーで測定した（図３（Ａ））。上部のウィンドウにおける細胞（高−ＰＩ）は死細胞を表し、右下のウィンドウにおける細胞（低−ＰＩ、高−アネキシンＶ結合）は初期のアポトーシス細胞を表している。γＣが誘発するＢＡＥ細胞のアポトーシスはし、２〜４時間で検出可能であった（図３（Ｂ））。これとは対照的に、天然のフィブリノーゲンは、このような効果を誘発しなかった。すなわち、同じ効果を示さなかった。
【０１４９】
γＣによるＭＡＰキナーゼの活性化の誘発
可溶性のγＣは、非常に低い濃度で（培養液中１μｇ／ｍｌ未満）ＭＡＰキナーゼの活性化を強力に誘発することが示された。これは、γＣが誘発するアポトーシスは、細胞−細胞外の相互作用の阻止によるのではなく、γＣが誘発する細胞内シグナルの直接効果による可能性がある（図４）。図４において、組換えαｖβ３（β３−ＣＨＯ細胞）を発現するＣＨＯ細胞を、指摘した濃度の可溶性γＣと３０分間インキュベートし、ＭＡＰキナーゼ（Ｅｒｋ１および２）のレベルを、抗リン酸化Ｅｒｋ１および２でウェスタンブロッティングを行って決定した。各レーンにおける全ＭＡＰキナーゼのレベルは、比較可能である。γＣは、拮抗薬として作用し、インテグリンへの結合を競合することにより他のインテグリンリガンドからのシグナリングを阻止する可能性が依然としてある。
【０１５０】
γＣによるＰＡＥ細胞におけるアポトーシスおよびカスパーゼの活性化の誘発
フィブリノーゲンγＣは、仔ウシ肺動脈内皮（ＣＰＡＥ）細胞でアポトーシスを誘発した。タンパク質発現の高いレベルでも酵素活性の高いレベルでも、カスパーゼ−３およびカスパーゼ−７がγＣにより活性化することより、γＣが誘発する内皮細胞のアポトーシスはカスパーゼにより媒介されることが示唆される。
【実施例２】
【０１５１】
フィブリノーゲンのγＣによる動物で腫瘍の成長の抑制
Ｙｏｎｏｕら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００１年、６１巻（５）、２１７７〜２１８２頁）が記載したように、ヒト異種移植マウスを動物モデルとして用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏでフィブリノーゲンγＣの腫瘍抑制作用を実証する。ヒト乳腺腺癌ＢＴ２０細胞を、７〜９週齢のオス非肥満糖尿病／重症複合型免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスに、皮下注射する。動物を、各群５匹ずつの４群に分ける。各動物に、注射で２×１０６細胞を与える。処置群であるグループ１〜３に、毎日、組換えγＣを腹腔内注射する。対照群であるグループ４には、毎日、等容量のＰＢＳの注射を行う。腫瘍の寸法を測定し、腫瘍の体積を計算する。処置２週間後に、動物を屠殺し、腫瘍を切除し、切断し、組織学的に評価する。腫瘍の脈管構造を試験するために、腫瘍切片をＣＤ３１抗マウスモノクローナル抗体（カリフォルニア州、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）で染色する。腫瘍の大きさおよび腫瘍の脈管構造の程度を、全処置群および対照群間で比較する。
【実施例３】
【０１５２】
分泌されたγＣを発現する癌細胞の腫瘍原性
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に、フィブリノーゲンγＣの発現および分泌を指示する分泌ベクターであるｐＳＥＣタグで、最初に形質移入する。対照の細胞は、また、γＣに対するコード配列のない空のｐＳＥＣタグベクターで、ＣＨＯ細胞に形質移入することにより確立する。形質移入した癌細胞を確立する際、実施例２で記載したように、細胞をＮＯＤ／ＳＩＤマウスに導入する。試験群および対照群両方の動物の腫瘍の３次元を測定することにより、週に２から３回、腫瘍の体積をモニターする。実験開始２週間後、実施例２に記載したように、全動物を屠殺し、腫瘍を切除し、腫瘍の体積および脈管構造を調べる。
【実施例４】
【０１５３】
γＣ―３９９ｔｒによる内皮細胞増殖の阻害
γＣ−３９９ｔｒと呼ばれる、γＣのＣ末端から１２個のアミノ酸が切断されたγＣの欠失変異体（配列番号３の１〜２４９のアミノ酸配列を有する）を、組換えで生成し、精製した。この突然変異体のＣＰＡＥ増殖に対する効果を、野生型のγＣとともに試験した（図５）。図５において、ＣＰＡＥの増殖を、ＭＴＳおよびリン酸アッセイを用いて測定した。１０％血清が誘発する増殖は、１×１０５／ｍｌの４８時間経過後、濃度依存の様式でγＣにより阻害された。γＣ−３９９ｔｒは、ＣＰＡＥ細胞のアポトーシスを誘発するのに、約３倍、より効率的である。すなわち、γＣ−３９９ｔｒは、驚くべきことに、ＣＰＡＥ細胞でアポトーシスを誘発するのに効果的であり、野生型のγＣの約３倍の効力があることが見出された。
【０１５４】
γＣ−３９９ｔｒが誘発する内皮細胞のアポトーシスは、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害物質であるＳＢ−２０３５８０により阻止され得るが、いくつかの他のＭＰＡキナーゼの阻害物質により阻止されないことが、さらに観察された。図６は、ＭＡＰＫ阻害物質のいくつかの例、およびγＣ−３９９ｔｒが誘発するアポトーシスを阻止するその能力を示している。阻害物質の飽和濃度は１０μＭである。他のＭＡＰＫに対する阻害物質は、γＣ−３９９ｔｒが誘発するアポトーシスを阻止しない。
【実施例５】
【０１５５】
γＣ−３９９ｔｒによる動物での腫瘍の成長の抑制
実施例２で記載した一般的な手順にしたがい、ＤＬＤ−２ヒト結腸腺癌細胞を、ＳＣＩＤマウス中に注射した。処置群のマウスは組換えγＣ−３９９ｔｒのＰＢＳ溶液の注射を受け、一方、対照群にＰＢＳの注射を与えた。実験の間中、腫瘍の大きさを処置群と対照群の間で比較した。γＣ−３９９ｔｒ処置は、一貫して、腫瘍の大きさの減少をもたらした。
【０１５６】
本出願で引用した、全ての特許、特許出願、およびＧｅｎＢａｎｋ受諾番号を含む他の出版物は、全ての目的のために、全文が参照として組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】フィブリノーゲンγＣが誘発する、ウシ動脈内皮（ＢＡＥ）細胞の成長の停止を示す図である。
【図２】フィブリノーゲンγＣは、ＢＡＥ細胞の増殖を阻止したが、ＣＨＯ細胞の増殖を阻止しなかったことを示す図である。
【図３】フィブリノーゲンγＣは、ＢＡＥ細胞のアポトーシスを誘発することを示す図である。
【図４】フィブリノーゲンγＣが誘発する、ＭＡＰキナーゼＥｒｋ１および２の活性化を示す図である。
【図５】フィブリノーゲンγＣおよびγＣ−３９９ｔｒが誘発するＣＰＡＥ増殖の阻害を示す図である。
【図６】ｐ３８ＭＡＰＫ阻害物質ＳＢ−２０３５８０は、投与量依存の様式でγＣ−３９９ｔｒが誘発するアポトーシスを阻止することを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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