(57)【要約】【課題】比較的簡便かつ安価に製造することができ、かつ難治性であるカバジタキセル耐性前立腺がんに対して抗がん効果を発揮する低分子化合物を有効成分とする、カバジタキセル耐性前立腺がんの予防又は治療剤を提供すること。【解決手段】ピモジド及びその医薬的に許容される塩、Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤、並びにＫＩＦ２０Ａ阻害剤から選択される１又は２種以上の物質を、カバジタキセル耐性前立腺がんの予防又は治療剤とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピモジド及びその医薬的に許容される塩、Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤、並びにＫＩＦ２０Ａ阻害剤から選択される１又は２種以上の物質を含むことを特徴とするカバジタキセル耐性前立腺がんの予防又は治療剤。
【請求項２】
Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤が、Ａｕｒｏｒａ Ｂキナーゼ阻害剤であることを特徴とする請求項１に記載の予防又は治療剤。
【請求項３】
Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤がＡＺＤ１１５２であり、ＫＩＦ２０Ａ阻害剤がPaprotrainであることを特徴とする請求項１又は２に記載の予防又は治療剤。
【請求項４】
抗がん剤と併用されることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の予防又は治療剤。
【請求項５】
抗がん剤がカバジタキセルであることを特徴とする請求項４に記載の予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピモジド（Pimozide）及びその医薬的に許容される塩（以下、これらを総称して「ピモジド類」ということがある）、Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤、並びにＫＩＦ２０Ａ阻害剤から選択される１又は２種以上の物質（以下、「本件物質」ということがある）を含む、カバジタキセル耐性前立腺がんを予防及び／又は治療するための製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺がんは、男性の生殖器の一つである前立腺で発症するがんであり、欧米、特に米国では男性で最も多いがんである。前立腺がんは、動物性脂肪の摂取量の多い食生活や、高齢が関連していると考えられている。実際に、日本でも食生活の欧米化や高齢化に伴い、近年、前立腺がんの罹患数が急速に増加しており、例えば、２０１３年の部位別がん罹患数において前立腺がんは第４位であった。前立腺がんは７０歳以降になると罹患率が飛躍的に増加することから、日本をはじめ高齢化の進む先進諸国において今後さらなる増加が予想される。このため、前立腺がんに対する効果的な治療方法の開発が求められている。
【０００３】
前立腺がんの増殖は、男性ホルモンであるアンドロゲンによって刺激され、その発生や進行には、アンドロゲン受容体（androgen receptor；ＡＲ）が大きな役割を果たしていることが知られている。このため、前立腺がんのホルモン療法（内分泌療法）として、アンドロゲンの作用を抑制する方法（アンドロゲン遮断療法［Androgen Deprivation Therapy；ＡＤＴ］）が一般的である。ＡＤＴは一時的には有効ではあるが、通常、数年以内には、ＡＤＴに抵抗性を示すホルモン不応性前立腺がん（Hormone Refractory Prostate Cancer；ＨＲＰＣ）やアンドロゲン非依存性前立腺がん（Androgen Independent Prostate Cancer；ＡＩＰＣ）へと進展していく。このように進展した去勢抵抗性前立腺がん（Castration Resistant Prostate Cancer；ＣＲＰＣ）（「再燃性進行前立腺がん」ともいう）には、ドセタキセルやエンザルタミドが用いられるが、これらの薬剤に対しても耐性を示すがん細胞が出現してしまい、臨床上問題となっている。かかる問題に対抗する手段の１つとして、ドセタキセル等と併用する治療方法が報告されている（特許文献１）。
【０００４】
前立腺がんに適用可能な新たなタキサン系抗がん剤として、カバジタキセルがある。カバジタキセルは、ドセタキセルを含む前治療歴のある去勢抵抗性前立腺がんに対しても抗腫瘍効果を発揮することが確認されており、内科的療法の最後の砦ともいうべきものである。カバジタキセルは、米国、欧州において、ホルモン治療抵抗性前立腺がんへの適応が認められており、２０１４年７月４日に、日本においても前立腺がんへの適応が承認された。カバジタキセルは、パクリタキセルやドセタキセルと構造が類似するものの、Ｐ糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）との親和性が低いことから、Ｐ−ｇｐ活性化による薬剤耐性化は生じにくいと考えられていた。しかしながら、カバジタキセル耐性前立腺がんの症例もまた報告されており、カバジタキセル耐性前立腺がんの治療は極めて急務である。
【０００５】
一方、ピモジドを有効成分とするオーラップ（アステラス製薬社製）は、精神神経安定剤として市販されている。また、ピモジドを有効成分とする、がん幹細胞の増殖抑制剤も報告されている（特許文献２）。しかしながら、ピモジドが、カバジタキセル耐性前立腺がんの予防又は治療効果を有することはこれまで知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第５６０５５１１号公報
【特許文献２】特開２０１７-３１０５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、比較的簡便かつ安価に製造することができ、かつ難治性であるカバジタキセル耐性前立腺がんに対して抗がん効果を発揮する低分子化合物を有効成分とする、カバジタキセル耐性前立腺がんの予防又は治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を進める過程において、まず、前立腺がん細胞株を低濃度のカバジタキセル存在下で培養し、カバジタキセル耐性前立腺がん細胞株を樹立した。次いで、樹立したカバジタキセル耐性前立腺がん細胞株の遺伝子発現プロファイルを、前立腺がん細胞株の遺伝子発現プロファイルへ変化し得る化合物を解析した結果、３４種の化合物をカバジタキセル耐性前立腺がんの候補薬剤としてスクリーニングの結果見出した。そして、これら３４種のカバジタキセル耐性前立腺がんの候補薬剤について、カバジタキセル耐性前立腺がん細胞株を用いたインビトロやインビボによる解析を行ったところ、細胞の増殖抑制効果が認められない化合物も多数あったが、試行錯誤の末に、ピモジドは、カバジタキセル耐性前立腺がんに対して、既存の抗がん薬（カバジタキセル）よりも、高い増殖抑制効果を有することを見出した。さらに、ピモジドは、既存の抗がん剤（カバジタキセル）と併用することにより、カバジタキセル耐性前立腺がんに対する抗がん効果をさらに高めることも確認した。本発明は、これらの知見に基づき、完成するに至ったものである。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕ピモジド及びその医薬的に許容される塩、Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤、並びにＫＩＦ２０Ａ阻害剤から選択される１又は２種以上の物質を含むことを特徴とするカバジタキセル耐性前立腺がんの予防又は治療剤。
〔２〕Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤が、Ａｕｒｏｒａ Ｂキナーゼ阻害剤であることを特徴とする上記〔１〕に記載の予防又は治療剤。
〔３〕Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤がＡＺＤ１１５２であり、ＫＩＦ２０Ａ阻害剤がPaprotrainであることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載の予防又は治療剤。
〔４〕抗がん剤と併用されることを特徴とする上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の予防又は治療剤。
〔５〕抗がん剤がカバジタキセルであることを特徴とする上記〔４〕に記載の予防又は治療剤。
【００１０】
また本発明の実施の他の形態として、本件物質を、カバジタキセル耐性前立腺がんの予防又は治療を必要とする対象に投与するステップを含む、カバジタキセル耐性前立腺がんを予防又は治療する方法；や、カバジタキセル耐性前立腺がんの予防又は治療剤として使用するための本件物質；や、カバジタキセル耐性前立腺がんの予防又は治療における使用のための本件物質；や、カバジタキセル耐性前立腺がんの予防又は治療剤を製造するための、本件物質の使用；を挙げることができる。
【発明の効果】
【００１１】
本件物質は、カバジタキセル耐性前立腺がんにおける上皮間葉系移行（Epithelial Mesenchymal Transition；ＥＭＴ）の抑制作用等の作用により、カバジタキセル耐性前立腺がんに対して優れた抗がん効果を有する。かかる効果は、既存の抗がん剤（好ましくは、タキサン系抗がん剤）と併用することにより、さらに高めることもできる。また、本件物質がピモジド類の場合、本発明のカバジタキセル耐性前立腺がんの予防又は治療剤は、比較的簡便に製造できる低分子化合物であるピモジド類を、カバジタキセル耐性前立腺がんの予防又は治療の有効成分とするため、比較的簡便かつ安価に製造できる点でも優れている。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＤＵ１４５細胞株及びＤＵ１４５ＣＲ細胞株を、各種濃度（０ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、４ｎＭ、８ｎＭ、及び１６ｎＭ）のカバジタキセル存在下で培養したときの生細胞レベルを解析した結果を示す図である。縦軸の「生細胞レベル」は、カバジタキセル非存在下で培養したときの生細胞数を１としたときの相対値（平均値±標準偏差［ＳＤ］）として示す。図中の「＊＊＊」は、ＤＵ１４５細胞株及びＤＵ１４５ＣＲ細胞株の間で、統計学的に有意差（ｐ＜０．００１）があることを示す。
【図２】図２Ａは、ＤＵ１４５細胞株及びＤＵ１４５ＣＲ細胞株のＣＤＨ１遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを解析した結果を示す図である。図２Ｂは、ＤＵ１４５細胞株及びＤＵ１４５ＣＲ細胞株の５種類の遺伝子（ＳＮＡＩ１遺伝子、ＳＮＡＩ２遺伝子、ＶＩＭ遺伝子、ＺＥＢ１遺伝子、及びＺＥＢ２遺伝子）のｍＲＮＡの発現レベルを解析した結果を示す図である。縦軸の「ｍＲＮＡの発現レベル」は、各種遺伝子について、ＤＵ１４５細胞株における発現レベルを１としたときの相対値（平均値±標準偏差［ＳＤ］）として示す。図中の「＊」及び「＊＊」は、ＤＵ１４５細胞株及びＤＵ１４５ＣＲ細胞株の間で、それぞれ統計学的に有意差（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）があることを示す。
【図３】ＤＵ１４５細胞株及びＬＮ−ＣａＰ細胞株を、各種濃度（０μＭ、０．１μＭ、１μＭ、５μＭ、及び１０μＭ）のピモジド存在下で培養したときの生細胞レベルを解析した結果を示す図である。縦軸の「生細胞レベル」は、ピモジド非存在下で培養したときの生細胞数を１としたときの相対値（平均値±標準偏差［ＳＤ］）として示す。
【図４】ＤＵ１４５ＣＲ細胞株を、各種濃度（０μＭ、３μＭ、及び６μＭ）のピモジドと、各種濃度（０ｎＭ、３ｎＭ、及び６ｎＭ）のカバジタキセル存在下で培養したときの生細胞レベルを解析した結果を示す図である。縦軸の「生細胞レベル」は、ピモジド及びカバジタキセル非存在下で培養したときの生細胞数を１としたときの相対値（平均値±標準偏差［ＳＤ］）として示す。
【図５】ＤＵ１４５ＣＲ細胞株を、ピモジド存在下（ピモジド処理群）又は非存在下（対照群）で培養したときの４種類の遺伝子（ＣＤＨ１遺伝子、ＶＩＭ遺伝子、ＺＥＢ１遺伝子、及びＳＮＡＩ２遺伝子）のｍＲＮＡの発現レベルを解析した結果を示す図である。縦軸の「ｍＲＮＡの発現レベル」は、各種遺伝子について、ＤＵ１４５細胞株における発現レベルを１としたときの相対値（平均値±標準偏差［ＳＤ］）として示す。図中の「＊」及び「＊＊」は、ＤＵ１４５細胞株及びＤＵ１４５ＣＲ細胞株の間で、それぞれ統計学的に有意差（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）があることを示す。
【図６】図６Ａ及び６Ｂは、それぞれＡｕｒｏｒａ Ｂキナーゼ及びＫＩＦ２０Ａの発現と、前立腺がん治療成績との相関をLog-rank testにより解析した結果を示す図である。
【図７】図７Ａ及びＢは、ＤＵ１４５ＣＲ細胞株を、それぞれ各種濃度（０μＭ、１μＭ、及び１０μＭ）のＡｕｒｏｒａ Ｂキナーゼ阻害剤（ＡＺＤ１１５２）及びＫＩＦ２０Ａ阻害剤（Paprotrain）存在下で培養したときの生細胞レベルを解析した結果を示す図である。縦軸の「生細胞レベル」は、上記阻害剤非存在下で培養したときの生細胞数を１としたときの相対値（平均値±標準偏差［ＳＤ］）として示す。
【図８】ＤＵ１４５ＣＲ細胞株を用いて作製した皮下腫瘍モデルマウスの４群（対照群［Ｃｏｎｔ］、カバジタキセル投与群［ＣＢＺ］、ピモジド投与群［Ｐｉｍｏｚｉｄｅ］、及び「カバジタキセル＋ピモジド投与群」［ＣＢＺ ＆ Ｐｉｍｏｚｉｄｅ］）について、腫瘍体積の変化を解析した結果を示す図である。縦軸の「腫瘍体積」は、投与直後（０日）の対照群における腫瘍体積を１としたときの相対値を示す。横軸の「日数」は、カバジタキセルやピモジドを投与後の日数を示す。図中の「＊＊＊」は、統計学的に有意差（ｐ＜０．００１）があることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のカバジタキセル耐性前立腺がんの予防又は治療剤は、「カバジタキセル耐性前立腺がんを予防又は治療するため」という用途が限定された、ピモジド類、Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤、及びＫＩＦ２０Ａ阻害剤から選択される１又は２種以上の物質を含有する製剤（以下、「本件予防／治療剤」ということがある）であり、ここでカバジタキセル耐性前立腺がんの予防には、カバジタキセル耐性前立腺がんの発症予防の他、カバジタキセル耐性前立腺がんの症状悪化の予防も含まれる。本件予防／治療剤は、単独で医薬品（製剤）として使用してもよいし、さらに添加剤を混合し、組成物の形態（医薬組成物）として使用してもよい。
【００１４】
本明細書において、「カバジタキセル耐性前立腺がん」とは、カバジタキセルに対して耐性を示す前立腺がんを意味し、より具体的には、インビボの場合、１０ｍｇ／ｋｇ（体重）／日のカバジタキセルを少なくとも１４日間、前立腺がん患者に投与したときに、腫瘍体積が増加する前立腺がんを意味する。また、インビトロの場合、カバジタキセル耐性前立腺がん細胞株のカバジタキセルに対する耐性は、カバジタキセル非耐性前立腺がん細胞株と比較して、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）で少なくとも１．２倍以上、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２．０倍以上、さらに好ましくは２．３倍以上、さらにより好ましくは２．６倍以上、最も好ましくは２．８倍以上である。
【００１５】
本発明のピモジドは、
1-{1-[4,4-Bis(4-fluorophenyl)butyl］piperidin-4-yl}-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-oneであり、下記の式で表される化合物である。
【００１６】
【化１】
2019127437.tif 000002
【００１７】
上記ピモジド類（すなわち、「ピモジド及びその医薬的に許容される塩」）におけるピモジドの医薬的に許容される塩としては、医薬的に許容されるものであればよく、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸等の無機酸；酢酸、シュウ酸、マレイン酸、フマール酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、酒石酸、安息香酸等の有機酸；などを挙げることができる。
【００１８】
上記Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤としては、Ａｕｒｏｒａキナーゼ、すなわち、Ａｕｒｏｒａ Ａキナーゼ、Ａｕｒｏｒａ Ｂキナーゼ、及びＡｕｒｏｒａ Ｃキナーゼから選択される１又は２種以上のＡｕｒｏｒａキナーゼの活性を阻害、及び／又は前記Ａｕｒｏｒａキナーゼの発現レベルを減少できる物質であればよく、Ａｕｒｏｒａ Ｂキナーゼの活性を阻害、及び／又はＡｕｒｏｒａ Ｂキナーゼの発現レベルを減少するものが好ましい。Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤としては、具体的に、ＭＬＮ８２３７（Alisertib）、ヘスペラジン（Hesperadin）（ＵＳ２００３／００６９２９９）、ＺＭ４４７４３９（ＷＯ０１／２１５９６）、ＰＨＡ−６８０６３２（ＷＯ０２／１２２４２）、ＡＺＤ１１５２（Barasertib）（ＷＯ０４／０５８７８１）、ＪＮＪ−７７０６６２１（Journal of Medicinal Chemistry, 48, 4208-4211, 2005）、ＶＸ−６８０（Tozasertib）（Expert Opinion on Therapeatic Patents, 15, 1169-1182, 2005）等を挙げることができ、Ａｕｒｏｒａ Ｂキナーゼに対する特異性が高いため、ＡＺＤ１１５２が好ましい。
【００１９】
上記ＫＩＦ２０Ａ阻害剤としては、ＫＩＦ２０Ａ（Kinesin family member 20A）の活性を阻害、及び／又はＫＩＦ２０Ａの発現レベルを減少できる物質であればよく、例えば、Paprotrain、文献「Bioorganic & Medicinal Chemistry 24 (2016) 721-734」に開示されているＢＫＳ０３４９（「AACR Annual Meeting 2017; April 1-5, 2017; Washington, DC」、タイトル：「Identification of a selective MKLP2/KIF20A inhibitor with high in-vivo antitumor activity」）等を挙げることができ、Paprotrainが好ましい。
【００２０】
カバジタキセル耐性前立腺がんに対する抗がん作用をより高めるために、本件予防／治療剤に加えて、抗がん剤を併用することが好ましい。本件予防／治療剤と併用する抗がん剤としては、ＤＮＡ複製阻害、細胞分裂阻害等の作用により、がんの増殖（好ましくは、前立腺がんの増殖）を抑制することが知られている物質であればよく、例えば、シクロフォスファミド（Cyclophosphamide）、ダカルバジン（Dacarbazine）、クロラムブシル（Chlorambucil）、メトトレキサート（Methotrexate）、シタラビン（Cytarabine）、アクチノマイシンＤ（Actinomycin D）、ブレオマイシン（Bleomycin）、ドキソルビシン（Doxorubicin）、ビンクリスチン（Vincristine）、ビンブラスチン（Vinblastine）、シスプラチン（Cisplatin）、オキサリプラチン（Oxaliplatin）、カルボプラチン（Carboplatin）、イリノテカン（Irinotecan）、ストレプトゾトシン（Streptozocin）、パクリタキセル（Paclitaxel）、ドセタキセル（Docetaxel）、カバジタキセル（Cabazitaxel）、エトポシド（Etoposide）、ゲムシタビン（Gemcitabine）、ベバシズマブ（Bevacizumab）、リツキシマブ（Rituximab）、ブレフェルジンＡ（Brefeldin A）、トラスツズマブ（Trastuzumab）、イマチニブ（Imatinib）、ペメトレキセド（Pemetrexed）、カペシタビン（Capecitabine）、ボルテゾミブ（Bortezomib）、リュープロレリン（Leuprorelin）、エルロチニブ（Erlotinib）、スニチニブ（Sunitinib）、セツキシマブ（Cetuximab）、ゴセレリン（Goserelin）、ダサチニブ（Dasatinib）、ソラフェニブ（Sorafenib）、５−フルオロウラシル（ＦＵ）等を挙げることができ、これらの中でも、タキサン系抗がん剤（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル等）が好ましく、微小管に結合し、微小管の重合促進及び／又は安定化をもたらし、細胞分裂を阻害する作用を有する前記タキサン系抗がん剤がより好ましく、後述する本実施例において、ピモジド類との併用効果が実証されているため、カバジタキセルが最も好ましい。
【００２１】
本件予防／治療剤は、必要に応じて、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、等張剤、添加剤、被覆剤、可溶化剤、潤滑剤、溶解補助剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、溶剤、ゲル化剤、栄養剤等の配合成分がさらに添加されたものを例示することができる。かかる配合成分としては、具体的に、水、生理食塩水、動物性脂肪及び油、植物油、乳糖、デンプン、ゼラチン、結晶性セルロース、ガム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、グリセリンを例示することができる。
【００２２】
本件予防／治療剤の投与形態としては、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液などの剤型で投与する経口投与や、溶液、乳剤、懸濁液などの剤型を注射（例えば、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射）、又はスプレー剤の型で鼻孔内投与する非経口投与を挙げることができ、経口投与が好ましい。
【００２３】
本件予防／治療剤における本件物質の投与量は、年齢、体重、性別、症状、薬剤への感受性等に応じて適宜決定され、例えば、０．１μｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ（体重）／日の投与量の範囲である。後述する本実施例において、モデルマウスを用いた実験により、７．５ｍｇ／ｋｇ／日のピモジドの投与量が具体的に示されている。かかる投与量は、マウスにおけるヒト等価用量（ＨＥＤ）１２．３（資料「Guidance for Industry Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers」参照）を基に、ヒトへの投与量に換算した場合、６１０μｇ／ｋｇ／日である。このため、本件予防／治療剤における本件物質の投与量としては、１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ／日が好ましく、１０μｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ／日がより好ましく、３０μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ／日がさらに好ましく、６０μｇ〜５ｍｇ／ｋｇ／日がさらにより好ましく、１００μｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇ／日が最も好ましい。なお、本件予防／治療剤は、一日あたり単回又は複数回（例えば、２〜４回）に分けて投与してもよい。
【００２４】
本件予防／治療剤としては、本件物質以外にも、カバジタキセル耐性前立腺がんに対して抗がん作用（抗カバジタキセル耐性前立腺がん作用）を有する成分を含むものであってもよいが、本件物質単独でも抗前立腺がん作用を発揮するため、本件物質以外の抗カバジタキセル耐性前立腺がん作用成分（例えば、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、植物由来の抽出物、ポリマー）を含まないものであってもよい。
【００２５】
本件物質は、化学合成、微生物による生産、酵素による生産等のいずれの公知の方法によっても製造することができるが、市販品を用いることもできる。例えば、オーラップ（ピモジド製剤）（アステラス製薬社製）、ピモジド（Tocris Bioscience社製）、Paprotrain（ＫＩＦ２０Ａ阻害剤）（MERCK社製）、ＡＺＤ１１５２（Barasertib）（AdooQ BioScience社製）、ＭＬＮ８２３７（Alisertib）（武田薬品工業社製）等を挙げることができる。
【００２６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
１．カバジタキセル耐性前立腺がん細胞株の樹立
転移性ＣＲＰＣ細胞株であるＤＵ１４５細胞株を基に、カバジタキセル耐性前立腺がん細胞株の樹立を試みた。
【００２８】
［方法］
ＤＵ１４５細胞株（ＡＴＣＣ［American Type Culture Collection］より入手）を、０．２ｎＭのカバジタキセル（Carbosynth社製）存在下で培養し、徐々にカバジタキセル濃度を３ｎＭまで上昇させながら約２年間培養することにより、ＤＵ１４５ＣＲ細胞株を樹立した。樹立したＤＵ１４５ＣＲ細胞株と、ＤＵ１４５細胞株を、それぞれ９６ウェルプレートで２４時間培養し、各種濃度（０ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、４ｎＭ、８ｎＭ、及び１６ｎＭ）のカバジタキセル存在下でさらに２４時間培養した後、生細胞数を「Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System」（Takara Bio社製）を用いて測定した。なお、以降の実施例も含めて、ＤＵ１４５細胞株及びＤＵ１４５ＣＲ細胞株の培養は、ＲＰＭＩ１６４０培養液中で５％ＣＯ２／２０％Ｏ２、３７℃条件下で行った。
【００２９】
［結果］
ＤＵ１４５ＣＲ細胞株の生細胞数は、いずれの濃度のカバジタキセル存在下においても、ＤＵ１４５細胞株の生細胞数と比べ、増加することが示された（図１参照）。かかる結果を基に、カバジタキセルへの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を測定したところ、ＤＵ１４５細胞株のＩＣ５０は３．８ｎＭであったのに対して、ＤＵ１４５ＣＲ細胞株のＩＣ５０は１１．０ｎＭであった。
以上の結果から、カバジタキセルへの耐性が約３倍上昇した前立腺がん細胞株（ＤＵ１４５ＣＲ細胞株）が樹立されたことが確認された。
【実施例２】
【００３０】
２．カバジタキセル耐性前立腺がん細胞株の遺伝子発現解析
樹立したカバジタキセル耐性前立腺がん細胞株（ＤＵ１４５ＣＲ細胞株）の遺伝子発現プロファイルを解析した。
【００３１】
［方法］
ＤＵ１４５ＣＲ細胞株と、コントロールであるＤＵ１４５細胞株のｍＲＮＡを、「RNeasy Mini kit」（Qiagen社製）を用いて抽出した。抽出したｍＲＮＡを、「PrimeScript RT reagent Kit」（Takara Bio社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。６種類の因子（Ｅ−カドヘリン、「Zinc finger protein SNAI1」、「Zinc finger protein SNAI2」、ビメンチン、「Zinc finger E-box-binding homeobox 1」、及び「Zinc finger E-box-binding homeobox 2」）をコードする遺伝子（それぞれ、ＣＤＨ１遺伝子、ＳＮＡＩ１遺伝子、ＳＮＡＩ２遺伝子、ＶＩＭ遺伝子、ＺＥＢ１遺伝子、及びＺＥＢ２遺伝子）のｍＲＮＡの発現レベルを解析するために、以下の表１に示すプライマー及びTaqManプローブセット（TaqMan Gene Expression Assays）（Applied Biosystems社製）と、ＣＦＸ９６リアルタイムシステム（Bio-Rad社製）を用いて定量ＰＣＲ解析を行った。
【００３２】
【表１】
2019127437.tif 000003
【００３３】
［結果］
ＥＭＴに関連する５種類のタンパク質（「Zinc finger protein SNAI1」及び「Zinc finger protein SNAI2」、「Zinc finger E-box-binding homeobox 1」及び「Zinc finger E-box-binding homeobox 2」、並びにビメンチン）をコードするｍＲＮＡの発現レベルは、いずれもＤＵ１４５細胞株と比べ、ＤＵ１４５ＣＲ細胞株の方が増加していた（図２Ｂ参照）。また、ＥＭＴにおいて発現が減少するＥ−カドヘリンをコードするｍＲＮＡの発現レベルは、ＤＵ１４５細胞株と比べ、ＤＵ１４５ＣＲ細胞株の方が減少していた（図２Ａ参照）。
これら結果は、カバジタキセル耐性前立腺がん細胞株（ＤＵ１４５ＣＲ細胞株）はＥＭＴが誘導され、前立腺がん細胞株（ＤＵ１４５細胞株）と比べ、浸潤レベルや転移レベルが上昇していることを示唆している。
【実施例３】
【００３４】
３．カバジタキセル耐性前立腺がんの候補薬剤のスクリーニング１
カバジタキセル耐性前立腺がんの候補薬剤をスクリーニングするために、上記実施例２で抽出したＤＵ１４５細胞株及びＤＵ１４５ＣＲ細胞株のｍＲＮＡを、それぞれ「Affymetrix GeneChip WT Terminal Labeling Kit」（Affymetrix社製）を用いてｃＤＮＡのフラグメンテーションとラベリングを行い、「GeneChip Fluidics Station 450」（Affymetrix社製）を用いて洗浄後、マイクロアレイシステム（GeneChip Scanner 3000 7G、Affymetrix社製）を用いてマイクロアレイ解析し、ＤＵ１４５細胞株から、ＤＵ１４５ＣＲ細胞株への遺伝子発現プロファイルの変化率を解析した。次いで、かかる変化率と、臨床上使用可能な化合物のライブラリーによる遺伝子発現プロファイルの変化率との比較・検証を、米国ブロード研究所のＣＭＡＰ解析を応用して行い、カバジタキセル耐性前立腺がん細胞株（ＤＵ１４５ＣＲ細胞株）の遺伝子発現プロファイルを、前立腺がん細胞株（ＤＵ１４５細胞株）の遺伝子発現プロファイルへ変化し得る３４種の化合物を、カバジタキセル耐性前立腺がんの候補薬剤としてスクリーニングの結果見出した。その結果、かかる候補薬剤の１つに、ピモジドが含まれることが示された。
【実施例４】
【００３５】
４．前立腺がんに対するピモジド類の細胞増殖抑制効果
ピモジド類が抗前立腺がん効果を有することを確認するために、高転移性の前立腺がん細胞株であるＤＵ１４５細胞株と、低転移性の前立腺がん細胞株であるＬＮ−ＣａＰ細胞株とをピモジド類存在下で培養し、細胞増殖性を解析した。
【００３６】
［方法］
ＤＵ１４５細胞株及びＬＮ−ＣａＰ細胞株（ＡＴＣＣ［American Type Culture Collection］より入手）を、９６ウェルプレート上で２４時間培養した後、ピモジド（Tocris Bioscience社製）を各種濃度（０μＭ、０．１μＭ、５μＭ、及び１０μＭ）となるように培養液に添加し、さらに４８時間培養した後、生細胞数を「Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System」（Takara Bio社製）を用いて測定した。なお、ＬＮ−ＣａＰ細胞株についても、ＤＵ１４５細胞株と同様に、ＲＰＭＩ１６４０培養液中で５％ＣＯ２／２０％Ｏ２、３７℃条件下で培養した。
【００３７】
［結果］
ＤＵ１４５細胞株及びＬＮ−ＣａＰ細胞株を、ピモジド存在下で培養すると、濃度依存的に生細胞数が減少することが示され、特に、ＤＵ１４５細胞株においてその減少レベルが高かった（図３参照）。
この結果は、ピモジド類が前立腺がん、特に転移性の前立腺がんに対して高い細胞増殖抑制効果を有することを示している。
【実施例５】
【００３８】
５．カバジタキセル耐性前立腺がんに対するピモジド類の細胞増殖抑制効果
ピモジド類が、抗カバジタキセル耐性前立腺がん効果を有することを確認するために、カバジタキセル耐性前立腺がん細胞株（ＤＵ１４５ＣＲ細胞株）をピモジド類存在下で培養し、細胞増殖性を解析した。
【００３９】
［方法］
実施例１で樹立したカバジタキセル耐性前立腺がん細胞株（ＤＵ１４５ＣＲ細胞株）を、９６ウェルプレート上で２４時間培養した後、ピモジド（Tocris Bioscience社製）を、各種濃度（０μＭ、３μＭ、及び６μＭ）となるように培養液に添加するとともに、カバジタキセル（Carbosynth社製）を、各種濃度（０ｎＭ、３ｎＭ、及び６ｎＭ）となるように培養液に添加し、さらに４８時間培養した後、生細胞数を「Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System」（Takara Bio社製）を用いて測定した。
【００４０】
［結果］
ＤＵ１４５ＣＲ細胞株を、ピモジド存在下で培養すると、ピモジド非存在下で培養した場合と比べ、濃度依存的に生細胞数が有意に減少することが示された（図４のカバジタキセル濃度０［ｎＭ］参照）。さらに、ピモジドとカバジタキセルを併用すると、ピモジド単独で使用した場合と比べ、生細胞数の減少レベルが、さらに高まることが示された（図４のカバジタキセル濃度３［ｎＭ］及び６［ｎＭ］と、カバジタキセル濃度０［ｎＭ］との比較参照）。
これらの結果は、ピモジド類がカバジタキセル耐性前立腺がんに対して細胞増殖抑制効果を有することを示すとともに、ピモジド類をカバジタキセルと併用することにより、その効果はさらに向上することを示している。
【実施例６】
【００４１】
６．カバジタキセル耐性前立腺がん細胞におけるピモジド類のＥＭＴ抑制効果
ピモジド類が、カバジタキセル耐性前立腺がん細胞におけるＥＭＴを抑制する効果を有することを確認するために、実施例１で樹立したＤＵ１４５ＣＲ細胞株を、９６ウェルプレート上で２４時間培養し、１０μＭのピモジド（Tocris Bioscience社製）又はピモジド非存在下で４８時間培養後（それぞれ、ピモジド処理群及び対照群）、実施例２に記載の方法に従って、４種類の因子（Ｅ−カドヘリン、ビメンチン、「Zinc finger E-box-binding homeobox 1」、及び「Zinc finger protein SNAI2」）をコードする遺伝子（それぞれ、ＣＤＨ１遺伝子、ＶＩＭ遺伝子、ＺＥＢ１遺伝子、及びＳＮＡＩ２遺伝子）のｍＲＮＡの発現レベルを解析した。
その結果、ＥＭＴに関連する３種類のタンパク質（ビメンチン、「Zinc finger E-box-binding homeobox 1」、及び「Zinc finger protein SNAI2」）をコードするｍＲＮＡの発現レベルは、いずれも対照群と比べ、ピモジド処理群の方が減少していた（図５参照）。また、ＥＭＴにおいて発現が減少するＥ−カドヘリンをコードするｍＲＮＡの発現レベルは、対照群と比べ、ピモジド処理群の方が増加していた（図５参照）。
これら結果は、カバジタキセル耐性前立腺がん細胞株（ＤＵ１４５ＣＲ細胞株）におけるＥＭＴは、ピモジド処理により抑制されたことを示している。
【実施例７】
【００４２】
７．カバジタキセル耐性前立腺がんの候補薬剤のスクリーニング２
カバジタキセル耐性前立腺がんの候補薬剤をスクリーニングするために、上記実施例３の結果を基に、ＤＵ１４５ＣＲ細胞株におけるｍＲＮＡの発現が、ＤＵ１４５細胞株と比べ、上昇する１７７種類の遺伝子を同定した。さらに、上記実施例６で抽出したピモジド処理群及び対照群のｍＲＮＡを、それぞれ「Affymetrix GeneChip WT Terminal Labeling Kit」（Affymetrix社製）を用いてｃＤＮＡのフラグメンテーションとラベリングを行い、「GeneChip Fluidics Station 450」（Affymetrix社製）を用いて洗浄後、マイクロアレイシステム（GeneChip Scanner 3000 7G、Affymetrix社製）を用いてマイクロアレイ解析した結果、ピモジド処理群におけるｍＲＮＡの発現が、対照群と比べ、減少する７４３種類の遺伝子を同定した。そして、これら結果を基に、カバジタキセル耐性獲得によりｍＲＮＡの発現レベルが上昇する遺伝子（上記１７７種類の遺伝子）であり、かつ、ピモジド処理によりｍＲＮＡの発現レベルが減少する遺伝子（上記７４３種類の遺伝子）をスクリーニングした結果、Ａｕｒｏｒａ Ｂキナーゼ及びＫＩＦ２０Ａが同定された。
【００４３】
次に、Ａｕｒｏｒａ Ｂキナーゼ及びＫＩＦ２０Ａの発現と、前立腺がんの予後との関連性を検証するために、The Cancer Genome Atlas（ＴＣＧＡ）データベースより前立腺がん患者の予後及び腫瘍内の遺伝子発現プロファイルを抽出し、Ａｕｒｏｒａ Ｂキナーゼ及びＫＩＦ２０Ａの発現と、治療成績との相関をLog-rank testにより解析した。無再発生存期間曲線は、Kaplan-Meier法によって算出した。これらの分析は、SPSS version 24.0の統計ソフトウェアパッケージ（SPSS社製）を用いて行った。結果を図６に示す。
【００４４】
図６から明らかなとおり、Ａｕｒｏｒａ Ｂキナーゼ及びＫＩＦ２０Ａの発現が高いほど、前立腺がんの予後は悪くなることが有意な結果（それぞれ、ｐ＝０．００３及びｐ＜０．００１）として示された。このため、Ａｕｒｏｒａ ＢキナーゼやＫＩＦ２０Ａの発現又は活性を阻害する物質が、カバジタキセル耐性前立腺がんの候補薬剤として有用であると考えられる。また、ＤＵ１４５ＣＲ細胞株をピモジド処理すると、Ａｕｒｏｒａ Ｂキナーゼ及びＫＩＦ２０Ａの発現レベルが減少することから、カバジタキセル耐性前立腺がんに対するピモジド類の細胞増殖抑制効果は、Ａｕｒｏｒａ Ｂキナーゼ及びＫＩＦ２０Ａを抑制することにより発揮される可能性が考えられる。
【実施例８】
【００４５】
８．カバジタキセル耐性前立腺がんに対するＡｕｒｏｒａ Ｂキナーゼ阻害剤及びＫＩＦ２０Ａ阻害剤の細胞増殖抑制効果
Ａｕｒｏｒａ Ｂキナーゼ阻害剤及びＫＩＦ２０Ａ阻害剤が、抗カバジタキセル耐性前立腺がん効果を有することを確認するために、カバジタキセル耐性前立腺がん細胞株（ＤＵ１４５ＣＲ細胞株）をＡｕｒｏｒａ Ｂキナーゼ阻害剤又はＫＩＦ２０Ａ阻害剤存在下で培養し、細胞増殖性を解析した。
【００４６】
［方法］
実施例１で樹立したカバジタキセル耐性前立腺がん細胞株（ＤＵ１４５ＣＲ細胞株）を、９６ウェルプレート上で２４時間培養した後、ＡＺＤ１１５２（Ａｕｒｏｒａ Ｂキナーゼ阻害剤）（Sigms-Aldrich社製）及びPaprotrain（ＫＩＦ２０Ａ阻害剤）（Sanata Cruz社製）を、それぞれ各種濃度（０μＭ、１μＭ、及び１０μＭ）となるように培養液に添加し、さらに４８時間培養した後、生細胞数を「Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System」（Takara Bio社製）を用いて測定した。
［結果］
ＤＵ１４５ＣＲ細胞株を、ＡＺＤ１１５２存在下で培養すると、ＡＺＤ１１５２非存在下で培養した場合と比べ、濃度依存的に生細胞数が有意に減少することが示された（図７Ａ参照）。同様に、ＤＵ１４５ＣＲ細胞株を、Paprotrain存在下で培養すると、Paprotrain非存在下で培養した場合と比べ、濃度依存的に生細胞数が有意に減少することが示された（図７Ｂ参照）。
これらの結果は、Ａｕｒｏｒａ Ｂキナーゼ阻害剤（ＡＺＤ１１５２）及びＫＩＦ２０Ａ阻害剤（Paprotrain）が、カバジタキセル耐性前立腺がんに対して細胞増殖抑制効果を有することを示している。
【実施例９】
【００４７】
９．カバジタキセル耐性前立腺がんモデルマウスに対するピモジド類の抗がん効果
ピモジド類のカバジタキセル耐性前立腺がんに対する抗がん効果を確認するために、カバジタキセル耐性前立腺がん細胞株（ＤＵ１４５ＣＲ細胞株）の皮下腫瘍モデルマウスに、ピモジド類を投与し、腫瘍体積の変化を解析した。
【００４８】
［方法］
実施例１で樹立した、１×１０６個のＤＵ１４５ＣＲ細胞株を、去勢したオスヌードマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）の皮下に接種し、皮下腫瘍モデルマウスを作製した。腫瘍の大きさが２００ｍｍ３前後に達したとき、皮下腫瘍モデルマウスを４種類の群（対照群、カバジタキセル投与群、ピモジド投与群、及び「カバジタキセル＋ピモジド投与群」）に分け、カバジタキセル投与群（ｎ＝５）には、１０ｍｇ／ｋｇ（体重）のカバジタキセル（Carbosynth社製）を単回腹腔内投与し、ピモジド投与群（ｎ＝５）には、７．５ｍｇ／ｋｇ（体重）／日のピモジド（Tocris Bioscience社製）を連日経口投与し、「カバジタキセル＋ピモジド投与群」（ｎ＝５）には、１０ｍｇ／ｋｇ（体重）のカバジタキセル（Carbosynth社製）の単回腹腔内投与、及び７．５ｍｇ／ｋｇ（体重）／日のピモジド（Tocris Bioscience社製）の連日経口投与を施行した。なお、対照群（ｎ＝５）には、カバジタキセル及びピモジドのいずれも投与しなかった。経口投与直後（０日）、並びに経口投与４日後、６日後、８日後、１０日後、１２日後、及び１４日後に、腫瘍体積を測定し、平均値を算出した。
【００４９】
［結果］
ピモジド投与群における腫瘍体積は、対照群における腫瘍体積と比べ、減少することが示された（図８参照）。また、ピモジド投与群における腫瘍体積の減少レベルは、カバジタキセル投与群における腫瘍体積の減少レベルと比べ、高いことも示された。さらに、「カバジタキセル＋ピモジド投与群」における腫瘍体積の減少レベルは、ピモジド投与群における腫瘍体積の減少レベルと比べ、高いことも示された。
これらの結果は、ピモジド類が、カバジタキセル耐性前立腺がん腫瘍に対して、既存の抗がん薬（カバジタキセル）よりも高い増殖抑制効果を有することを示すとともに、ピモジド類を既存の抗がん薬と併用すると、その効果はさらに向上することを示している。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、カバジタキセル耐性前立腺がんの予防又は治療に資するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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