(57)【要約】  本発明は、少なくとも第１部分及び第２部分を持つ分子を含むタンパク質キナーゼ阻害剤を提供するものであって、該第１部分は当該分子の細胞透過能を持ち、該第２部分は当該細胞内におけるタンパク質キナーゼ阻害効果を持ち、当該第１部分はリンカーまたはスペーサーを介して当該第２部分に結合されることを特徴とするものである。本発明の複合分子は、好ましくは公知のタンパク質キナーゼ阻害剤と比較してより改良された細胞透過性、血清安定性及びキナーゼ選択性を有するペプチド複合体である。また、これらのタンパク質キナーゼ阻害剤を含む医薬品組成物、及びタンパク質キナーゼ−活性と関連する癌及び他の疾患を治療するための、かかる組成物の使用方法も開示するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも第１部分及び第２部分を有する分子を含むタンパク質キナーゼ阻害剤であって、該第１部分は当該分子の細胞透過能を持ち、該第２部分は当該細胞内におけるタンパク質キナーゼ阻害効果を持ち、当該第１部分は直接結合またはスペーサーを介して当該第２部分に結合されているタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項２】
タンパク質キナーゼＢに対して選択性がある請求項１に記載のタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項３】
第２部分がＰＫＢ基質またはＰＫＢ基質の模倣物を含むペプチドまたはペプチド模倣物である請求項２のタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項４】
ＰＫＢ基質がグリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）である請求項３のタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項５】
第２部分が５−２０アミノ酸のペプチドである請求項１に記載のタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項６】
第２部分が６−１５アミノ酸のペプチドである請求項１に記載のタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項７】
第２部分がペプチド模倣物である請求項１に記載のタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項８】
第１部分と第２セグメントとが共有結合を介して直接的に結合された請求項１のタンパク質キナーゼ阻害剤の複合体。
【請求項９】
当該共有結合がアミド結合である請求項８のタンパク質キナーゼ阻害剤複合体。
【請求項１０】
第１部分と第２部分とがスペーサーを介して結合された請求項１に記載のタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項１１】
スペーサーが少なくとも１つのアミノ酸残基を含む請求項９のタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項１２】
第１部分が、タンパク質キナーゼ阻害性ペプチド部分のアミノ末端に結合する請求項１〜１１のいずれかに記載のタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項１３】
第１部分が、タンパク質キナーゼ阻害性ペプチド部分のカルボキシ末端に結合する請求項１〜１１のいずれかに記載のタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項１４】
ＡＴＰの模倣部分をさらに含む請求項１に記載のタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項１５】
ＡＴＰの模倣部分がイソキノリン誘導体である請求項１４のタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項１６】
第２部分が下記式（Ｉ）（配列番号：２）のペプチド、その類似体、塩類または機能的誘導体を含む請求項１に記載のタンパク質キナーゼ阻害剤。
式（Ｉ）：Ｍ−Ｘ１−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｘ４−Ｘ３−Ｘ５−Ｘ７
上記式では、
Ｍは不在であるか、またはＤ−Ｌｙｓ２−４またはＬ−Ｌｙｓ２−４から選択されるものであり、
Ｘ１は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＯｒｎまたはＤａｂであり、
Ｘ４は、Ｎｖａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＡｂｕまたはＯｒｎであり、
Ｘ５は、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、ＧｌｙＮＨ２、Ｓｅｒ（Ｍｅ）、Ｇｌｕ、またはＧｌｕ（ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＳＯ２−イソキノリン）であり、
Ｘ６は、Ｄａｐ、Ａｂｕ、ＧｌｙＮＨ２、Ｓｅｒ（Ｍｅ）、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＳｅｒであり、及び
Ｘ７は芳香族または脂肪族のかさ高い残基である。
【請求項１７】
下記式（ＩＩ）（配列番号：３）のペプチド、その類似体、塩類または機能的誘導体を含む請求項１６に記載のタンパク質キナーゼ阻害剤。
式（ＩＩ）：Ｍ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７
上記式では、
Ｍは、Ｄ−Ｌｙｓ３またはＬｙｓ３であり、
Ｘ４は、Ｎｖａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＡｂｕまたはＯｒｎであり、
Ｘ５は、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、ＧｌｙＮＨ２、Ｓｅｒ（Ｍｅ）、Ｇｌｕ、またはＧｌｕ（ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−−ＳＯ２−イソキノリン）であり、
Ｘ６は、Ｄａｐ、Ａｂｕ、ＧｌｙＮＨ２、Ｓｅｒ（Ｍｅ）、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＳｅｒであり、及び
Ｘ７は芳香族または脂肪族のかさ高い残基である。
【請求項１８】
Ｘ７がＰｈｅまたはＨｏｌである請求項１６または１７のタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項１９】
下記からなる群から選択されるペプチドを含む請求項１６または１７のタンパク質キナーゼ阻害剤。
ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ（配列番号：５）、
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ（配列番号：６）、
Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ（配列番号：７）、
Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ−Ｇｌｕ−（ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＳＯ２−イソキノリン）Ｓｅｒ−Ｐｈｅ（配列番号：８）および、
Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｏｌ（配列番号：９）。
【請求項２０】
細胞透過部分が、コレステロール、（ＤＬｙｓ）２−１０、（Ｌｙｓ）２−１０、ビタミンＥ、Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、ＡｈＸ６−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＧｌｎ−Ａｒｇ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−ＤＡｒｇ、及び（ＤＡｒｇ）７−９からなる群より選択される請求項１６〜１９のいずれか一項に記載のタンパク質キナーゼ阻害剤であって、Ｚは不在であるか、またはカルバマート及びＧｌｙより選択されるタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項２１】
下記式（ＩＩＩ）（配列番号：４）のペプチド複合体を含む請求項１に記載のタンパク質キナーゼ阻害剤。
式（ＩＩＩ）：Ｙ−Ｚ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｘ６−Ｈｏｌ    
上記式では、Ｘ６がＤａｐまたはＡｌａであり、
Ｙは、細胞透過部分であり、及び
Ｚは、Ｙをペプチドに結合させるスペーサーまたは結合である。
【請求項２２】
Ｙが、コレステロール、（ＤＬｙｓ）２−１０、（Ｌｙｓ）２−１０、ビタミンＥ、Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、ＡｈＸ６−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＧｉｎ−Ａｒｇ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−ＤＡｒｇ、及び（ＤＡｒｇ）７−９からなる群より選択される請求項２１のタンパク質キナーゼ阻害剤であって、Ｚは不在であるか、またはカルバマート及びＧｌｙより選択されるタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項２３】
下記からなる群から選択される請求項１に記載のタンパク質キナーゼ阻害剤。
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１０）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１１）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）４−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１２）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）６−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ（Ｍｅ）−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１３）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−（ＤＬｙｓ）３−ＮＨ２（配列番号：１４）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）３−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ（Ｍｅ）−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１５）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（Ｌｙｓ）３−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＯＨ（配列番号：１６）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）３−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１７）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ｏｒｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１８）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）３−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１９）、
ビタミンＥ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）３−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２０）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）２−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２１）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２２）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２３）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２４）、
ビタミンＥ−スクシナート−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２５）、
Ｈ−（ＤＡｒｇ）９−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２６）、及び
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ−Ｇｌｕ（アミノエチルスルホンアミドイソキノリン）−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（配列番号：２７）。
【請求項２４】
活性成分としてのタンパク質キナーゼ阻害剤複合体を含む医薬品組成物であって、当該阻害剤複合体が、少なくとも第１部分及び第２部分を有しており、該第１部分は当該分子の細胞透過能を持ち、該第２部分は当該細胞内におけるタンパク質キナーゼ阻害効果を持ち、当該第１部分はリンカーを介して当該第２部分に結合されている分子を含む医薬品組成物。
【請求項２５】
当該タンパク質キナーゼ阻害剤がタンパク質キナーゼＢに対して選択性がある請求項２４の医薬品組成物。
【請求項２６】
当該タンパク質キナーゼ阻害剤の第２部分がＰＫＢ基質またはＰＫＢ基質の模倣物を含むペプチドまたはペプチド模倣物である請求項２５の医薬品組成物。
【請求項２７】
ＰＫＢ基質がＧＳＫ３である請求項２６の医薬品組成物。
【請求項２８】
当該タンパク質キナーゼ阻害剤の第２部分が、５−２０アミノ酸のペプチドである請求項２４の医薬品組成物。
【請求項２９】
当該タンパク質キナーゼ阻害剤の第２部分が、６−１５アミノ酸のペプチドである請求項２４の医薬品組成物。
【請求項３０】
当該タンパク質キナーゼ阻害剤の第２部分がペプチド模倣物を含む請求項２４の医薬品組成物。
【請求項３１】
当該タンパク質キナーゼ阻害剤の第１部分及び第２部が共有結合を介して直接的に結合されている請求項２４の医薬品組成物。
【請求項３２】
共有結合がアミド結合である請求項３１の医薬品組成物。
【請求項３３】
当該タンパク質キナーゼ阻害剤の第１部分及び第２部がスペーサーを介して結合されている請求項２４の医薬品組成物。
【請求項３４】
スペーサーが少なくとも１つのアミノ酸残基を含む請求項３３の医薬品組成物。
【請求項３５】
当該タンパク質キナーゼ阻害剤の第１部分が、タンパク質キナーゼ阻害性ペプチド部分のアミノ末端に結合している請求項２４〜３４のいずれか一項に記載の医薬品組成物。
【請求項３６】
当該タンパク質キナーゼ阻害剤の第１部分が、タンパク質キナーゼ阻害性ペプチド部分のカルボキシ末端に結合している請求項２４〜３４のいずれか一項に記載の医薬品組成物。
【請求項３７】
ＡＴＰの模倣部分をさらに含む請求項２４に記載の医薬品組成物。
【請求項３８】
ＡＴＰの模倣部分がイソキノリン誘導体である請求項３７の医薬品組成物。
【請求項３９】
タンパク質キナーゼ阻害剤が下記の式（Ｉ）（配列番号：２）のペプチド、その類似体、塩類または機能的誘導体を含む請求項２４の医薬品組成物。
式（Ｉ）：Ｍ−Ｘ１−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７
上記式では、
Ｍは不在であるか、またはＤ−Ｌｙｓ２−４またはＬ−Ｌｙｓ２−４から選択されるものであり、
Ｘ１は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＯｒｎまたはＤａｂであり、
Ｘ４は、Ｎｖａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＡｂｕまたはＯｒｎであり、
Ｘ５は、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、ＧｌｙＮＨ２、Ｓｅｒ（Ｍｅ）、Ｇｌｕ、またはＧｌｕ（ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＳＯ２−イソキノリン）であり、
Ｘ６は、Ｄａｐ、Ａｂｕ、ＧｌｙＮＨ２、Ｓｅｒ（Ｍｅ）、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＳｅｒであり、及び
Ｘ７は芳香族または脂肪族のかさ高い残基である。
【請求項４０】
タンパク質キナーゼ阻害剤が下記式（ＩＩ）（配列番号：３）のペプチド、その類似体、塩類または機能的誘導体を含む請求項３９の医薬品組成物。
式（ＩＩ）：Ｍ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７
上記式では、
Ｍは、Ｄ−Ｌｙｓ３またはＬｙｓ３であり、
Ｘ４は、Ｎｖａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＡｂｕまたはＯｒｎであり、
Ｘ５は、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、ＧｌｙＮＨ２、Ｓｅｒ（Ｍｅ）、Ｇｌｕ、またはＧｌｕ（ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＳＯ２−イソキノリン）であり、
Ｘ６は、Ｄａｐ、Ａｂｕ、ＧｌｙＮＨ２、Ｓｅｒ（Ｍｅ）、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＳｅｒであり、及び
Ｘ７は芳香族または脂肪族のかさ高い残基である。
【請求項４１】
Ｘ７がＰｈｅまたはＨｏｌである請求項３９または４０の医薬品組成物。
タンパク質キナーゼ阻害剤が下記からなる群から選択されるペプチドを含む請求項３９または４０の医薬品組成物。
ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ（配列番号：５）、
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ（配列番号：６）、
Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ（配列番号：７）、
Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ−Ｇｌｕ−（ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＳＯ２−イソキノリン）Ｓｅｒ−Ｐｈｅ（配列番号：８）と、
Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｏｌ（配列番号：９）。
【請求項４２】
当該タンパク質キナーゼ阻害剤の細胞透過部分がコレステロール、（ＤＬｙｓ）２−１０、（Ｌｙｓ）２−１０、ビタミンＥ、Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、ＡｈＸ６−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＧｌｎ−Ａｒｇ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−ＤＡｒｇ、及び（ＤＡｒｇ）７−９からなる群より選択される請求項４１に記載の医薬品組成物であって、Ｚは不在であるか、またはカルバマート及びＧｌｙより選択される医薬品組成物。
【請求項４３】
下記式（ＩＩＩ）（配列番号：４）のタンパク質キナーゼ阻害剤を含む請求項２４の医薬品組成物。
式（ＩＩＩ）：Ｙ−Ｚ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｘ６−Ｈｏｌ    
上記式（ＩＩＩ）では、
Ｘ６はＤａｐまたはＡｌａであり、
Ｙは、細胞透過部分であり、及び
Ｚは、Ｙをペプチドに結合させるスペーサーまたは結合である。
【請求項４４】
Ｙが、コレステロール、（ＤＬｙｓ）２−１０、（Ｌｙｓ）２−１０、ビタミンＥ、Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、ＡｈＸ６−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＧｉｎ−Ａｒｇ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−ＤＡｒｇ、及び（ＤＡｒｇ）７−９からなる群より選択される請求項４３の医薬品組成物であって、Ｚは不在であるか、またはカルバマート及びＧｌｙより選択されるものである医薬品組成物。
【請求項４５】
当該タンパク質キナーゼ阻害剤が下記からなる群より選択される請求項２４の医薬品組成物。
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１０）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１１）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）４−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１２）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）６−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ（Ｍｅ）−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１３）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−（ＤＬｙｓ）３−ＮＨ２（配列番号：１４）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）３−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ（Ｍｅ）−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１５）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（Ｌｙｓ）３−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＯＨ（配列番号：１６）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）３−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１７）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ｏｒｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１８）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）３−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１９）、
ビタミンＥ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）３−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２０）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）２−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２１）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２２）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２３）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２４）、
ビタミンＥ−スクシナート−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２５）、
Ｈ−（ＤＡｒｇ）９−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２６）、及び
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ−Ｇｌｕ（アミノエチルスルホンアミドイソキノリン）−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（配列番号：２７）。
【請求項４６】
請求項１〜２３のいずれかの一項に係る化合物の有効量を含む医薬品組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む疾患の治療方法。
【請求項４７】
疾患が、癌、異常増殖疾患、糖尿病、心血管症状、出血性ショック、肥満症、炎症性疾患、中枢神経系疾患、及び自己免疫性疾患からなる群より選択される請求項４６に係る方法。
【請求項４８】
疾患が癌である請求項４７に係る方法。
【請求項４９】
疾患が：前立腺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、腎臓癌、黒色腫及び皮膚癌、肺癌、及び肝臓癌からなる群より選択される請求項４８に係る方法。
【請求項５０】
癌が前立腺癌である請求項４９に係る方法。
【請求項５１】
疾患が異常増殖細胞に関係する請求項４７に係る方法。
【請求項５２】
疾患が再狭窄、良性腫瘍、アテローム性動脈硬化、外科術、異常創傷治癒、異常血管形成に起因する体組織侵襲、組織線維症を起こす疾患、反復動作による障害、高度に血管新生化を起こしていない組織障害、臓器移植に関連する増殖反応より選択される請求項５１の方法。
【請求項５３】
請求項１〜２３のいずれかの化合物の治療有効量を哺乳動物に投与すること、及び少なくとも１つの細胞毒性薬剤の治療有効量を同時投与することを含む、腫瘍進行阻害を必要としている哺乳動物における腫瘍進行阻害するのための方法。
【請求項５４】
タンパク質キナーゼ−活性と関連する疾患治療用の薬物を調製するための、請求項１〜２３のいずれかの一項に係る化合物の使用法。
【請求項５５】
疾患が、癌、異常増殖疾患、糖尿病、心血管症状、出血性ショック、肥満症、炎症性疾患、中枢神経系疾患、及び自己免疫性疾患からなる群より選択される請求項５４に係る使用法。
【請求項５６】
疾患が癌である請求項５５に係る使用法。
【請求項５７】
疾患が：前立腺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、腎臓癌、黒色腫及び皮膚癌、肺癌、及び肝臓癌からなる群より選択される請求項５６に係る使用法。
【請求項５８】
癌が前立腺癌である請求項５７に係る使用法。
【請求項５９】
疾患が異常増殖細胞に関係する請求項５５に係る使用法。
【請求項６０】
疾患が再狭窄、良性腫瘍、アテローム性動脈硬化、外科術、異常創傷治癒、異常血管形成に起因する体組織侵襲、組織線維症を起こす疾患、反復動作による障害、高度に血管新生化を起こしていない組織障害、臓器移植に関連する増殖反応より選択される請求項５９に係る使用法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、選択的タンパク質キナーゼ阻害剤として細胞透過性増強部分及びペプチドまたはペプチド模倣物を含む細胞透過性のある安定した複合体に関するものであって、かつそれらを含有する医薬品組成物、ならびにかかる複合分子の調製及び使用のためのプロセスに関するものでもある。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質キナーゼはシグナル伝達経路に関与し、正常条件及び病理学的条件の両条件下で成長因子、ホルモン及び他の細胞調節分子を細胞の成長、生存及び代謝に結び付けるものである。タンパク質キナーゼのスーパーファミリーには、タンパク質キナーゼＡ及びタンパク質キナーゼＣ、ならびにごく最近になって発見されたタンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢ）も含まれる。
ＰＫＢは抗アポトーシス性のタンパク質キナーゼであり、その活性はヒト悪性腫瘍において強く上昇する。ＰＫＢは当初、ラットＴ−細胞白血病におけるウィルスの発癌遺伝子ｖ−Ａｋｔとして発見されたものであるが、ＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔが細胞質であるのに対して、ｖ−Ａｋｔは細胞酵素ＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔの発癌バージョンであり、略ウィルス群に特異的な抗原ｇａｇ（コア蛋白遺伝子）が完全長Ａｋｔ−１にインフレームで融合され、膜接合されていることを特徴とするということは後に確立された。ＡｋｔのシーケンシングによりＰＫＡ（およそ７５％）及びＰＫＣアイソザイム（およそ５０％）に対する高度の相同性が明らかにされ、その事実のためにＰＫＢと命名されることになった。
【０００３】
ＰＫＢ活性化には、２つのアミノ酸残基：Ｓｅｒ４７３及びＴｈｒ３０８のリン酸化が関与する。該酵素は、ＰＩ’−３−キナーゼによって産生される第２メッセンジャーＰＩＰ３によって活性化される。ＰＩＰ３は、ＰＫＢのプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインに対して結合し、該ドメインを膜に漸加し、該膜においてリン酸化されて活性型に変換する。ＰＫＢ活性化はＰＩ’−３−キナーゼ依存性であるので、ＩＧＦ−１受容体、ＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ｐｐ６０ｃ−Ｓｒｃ等の特定タンパク質チロシンキナーゼの持続的な活性化は、実に多くの腫瘍において見られる現象であるＰＫＢの持続的な活性化につながる。また、腫瘍抑制因子ＰＴＥＮに対する遺伝子コーディングの欠失は、ＰＴＥＮがこの酵素の負の制御因子であるため、ＰＫＢ／ｃＡｋｔの持続的な活性化も誘導する。また、ＰＫＢは、１５％の卵巣癌、１２％の膵臓癌及び３％の乳癌において過剰発現し、細胞をアポトーシスから保護する生存シグナルを作り出して化学療法耐性に寄与することが明らかにされている。
【０００４】
ＰＫＢは、アポトーシス、増殖、分化及び代謝をはじめとする広範かつ多岐の細胞プロセスの極めて重大な制御因子として出現した。現在、正常なＰＫＢ／Ａｋｔのシグナル伝達の破壊は、いくつかのヒト癌における頻繁な事象として記録されており、該酵素がその進行において重要な役割を演ずるように思われる（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  １４，３８１，２００２）。
ＰＫＢのこれら分子特性及び腫瘍形成におけるその中心的な役割は、このタンパク質キナーゼが新規抗癌薬剤用の魅力ある標的であり得ることを意味する。理想的には、ＰＫＢを阻害する薬物は、細胞周期停止とアポトーシス促進の両方を引き起こさなくてはならない。かかる活性は、結果としてＰＫＢが増幅される腫瘍組織における細胞死の増加を生じ、化学療法薬剤耐性を低下させる。
前立腺癌は、男性において最も高い頻度で診断される癌であり、米国では年間の４１，０００人の死亡原因となっている（Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．Ｌ．，らの１９９６，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．，６５：５−２７）。初期段階では、臓器限局の前立腺癌は、患者が無関係の原因から死亡するまで、多くの場合外科術または放射療法によって管理される。
【０００５】
ホルモン不応性前立腺癌（ＨＲＰＣ）は非根治的な癌型であり、米国男性では第二番目の癌による死亡原因となっている．化学療法耐性とＰＫＢの活性化との間の直接的な相関関係はいくつかの前立腺癌細胞株及びヒト腫瘍性組織において示されており、前立腺腫瘍組織におけるＰＫＢレベルの上昇は臨床的にＨＲＰＣと関連する（Ｙｏｎｇｄｅらの２００３，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１０７，６７６−６８０）。前立腺癌患者におけるＰＫＢレベルのＧｌｅａｓｏｎパターンとＰＳＡ（前立腺特有抗原）レベルとの高い相関性は、この型の癌におけるＰＫＢの重要な役割を示すものである。
Ｈｉｌｌ  ＭＭ，及びＨｅｍｍｉｎｇｓ  ＢＡ，（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００２，９３，２４３−５１，２００２）は、卵巣、乳房及び膵臓など他の腫瘍におけるＰＢＫの介入を記述している。
強力なタンパク質キナーゼ阻害剤には通常、基質のペプチド構造あるいはＡＴＰの模倣物に基づいた基質の模倣物が含まれる必要がある。
Ｈｉｄａｋａ  Ｈ．らの（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２，５０３６，１９８４）は、サイクリックヌクレオチド依存型タンパク質キナーゼ（ＰＫＡ及びＰＫＧ）及びタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）に対して阻害活性を有する別型のイソキノリンスルホンアミドを記述している。イソキノリンスルホニルの付加的誘導体はＨｉｄａｋａによって、欧州特許第１０９０２３号、米国特許第４４５６７５７号、米国特許第４５２５５８９号、及び米国特許第４５６０７５５号に開示されている。
国際公開番号ＷＯ９３／１３０７２では、５−イソキノリンスルホンアミド誘導体が薬剤を阻害するタンパク質キナーゼとして開示されている。国際公開番号ＷＯ９８／５３０５０では、セリン／トレオニンキナーゼの活性を制御調節するセリン／トレオニンキナーゼのＨＪループに由来する短いペプチドが開示されている。
【０００６】
ＰＫＢによる効率的なリン酸化の最小共通配列は、Ａｌｅｓｓｉらによって見出されている（Ｆｅｄ．Ｅｕｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３９９，３３３，１９９６）。これは、基質配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ（配列番号：１）を有する最も活性なペプチドを持つ７−ｍｅｒモチーフである。国際公開番号ＷＯ９７／２２３６０では、ＰＫＢ活性を測定する基質として有用な７−アミノ酸長を有する特定のＰＫＢ基質ペプチドが開示されている。
Ｏｂａｔａらの（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１７，３６１０８，２０００）では、ＰＫＢ基質の最適なアミノ酸配列を決定するための、指向性ペプチドライブラリー手法の使用が記載されている。同定されたすべての基質は、配列Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｓａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒを有する既知のモチーフを含んでいた。
Ｒｉｃｏｕａｒｔらの（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９１，３４，７３−７８）には、ＰＫＡを阻害するためのイソキノリンスルホンアミド及びペプチド複合体が記載されている。Ｌｏｏｇらの（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９９９，９，１４４７−１４５２）にはＰＫＡ及びＰＫＣ阻害用のアデノシン及びペプチドを有するキメラが記載されているが、その開示された化合物を用いて得られる阻害は極めて不十分なものである。Ｓｃｈｌｉｔｚｅｒらの（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００，１９９１−２００６）では、基質のペプチド部を置換することを意図する非ペプチドの長鎖部分に連結する小分子を論じているが、その開示された化合物は不十分な阻害活性を示す。
【０００７】
Ｐａｒａｎｇらの（Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８，３７，２００１）には、ＡＴＰがタンパク質キナーゼペプチド基質に結合することを特徴とするタンパク質キナーゼＡ阻害剤のペプチドＡＴＰ二基質類似体が記載されているが、このアプローチにもやはり、最適以下の薬物動態学特性制限がある。ＷＯ０１／７０７７０には、インスリン受容体チロシンキナーゼのための二基質阻害剤、及び２炭素スペーサーを介してペプチド基質類似体に結合するＡＴＰ−γ−Ｓを含む特定の強力かつ選択的阻害剤が開示されている。
本発明者等及び同僚の一人による国際公開番号ＷＯ０１／９１７５４は、ＰＫＢ阻害剤である特定のイソキノリン誘導体に関するものである。
本発明の出願人は、ＷＯ０３／０１０２８１において、ペプチドまたはペプチド模倣物に結合したＡＴＰ模倣物を含む二基質タンパク質キナーゼ阻害剤を開示する。タンパク質キナーゼのＡＴＰ結合部位に対して高親和性を有する小分子（具体的にはイソキノリン誘導体）は、ＰＫＢの基質を模倣するペプチドまたはペプチド模倣物に結合される。一部のペプチド自体は高度に活性かつ選択的であったが、血清中で安定性がなく、細胞内で活性でないので、治療値は低い。これらのキメラ化合物は増加した活性を実証するが、ＡＴＰ模倣部分が存在することに起因して、ペプチドに比べると選択性が劣る。その上、キメラ化合物は、細胞内で低活性を示し、血清中では低度から中度の安定性を示す。
Ｌｉｎｄｇｒｅｎらの（ＴｉＰＳ  ２１，９９−１０３２０００）では、細胞透過ペプチドを用いた細胞送達が論評されている。
【０００８】
化学療法及び併用療法
腫瘍細胞及び腫瘍の成長に対する闘いは、生物学的研究及び医療研究の大きな課題となっている。かかる研究は、腫瘍性疾患の治療において有用な可能性がある新規細胞毒性薬剤の発見をもたらしている。化学療法において一般的に用いられる細胞毒性薬剤の例には、微小管形成を妨害する抗代謝薬剤、アルキル化剤、白金ベースの薬剤、アントラサイクリン、抗生物質剤、トポイソメラーゼ阻害剤、及び他の薬剤が含まれる。
単に潜在的に有用な化学療法薬を同定することに加えて、癌研究は、これらの薬剤が腫瘍細胞、ならびに他の細胞に対して作用する機構に関する理解を高めている。たとえばコレカルシフェロール（ビタミンＤ）は、分化に影響し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ両方の細胞のうち、そのいくつかの細胞型の増殖を低下することができる。ビタミンＤ及び類似体の活性代謝物は、樹立した腫瘍の成長を遅延させ及び腫瘍誘導を防止することによって著しいｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を仲介する（Ｃｏｌｓｔｏｎらの１９８９，Ｌａｎｃｅｔ，１，１８８；Ｂｅｌｌｅｌｉらの１９９２，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１３，２２９３；ＭｃＥｌｗａｉｎらの１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｄｉｆｆ．，３，３１−５０；Ｃｌａｒｋらの１９９２，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１１８，１９０；Ｚｈｏｕらの１９８９，Ｂｌｏｏｄ，７４，８２−９３）。
【０００９】
白金ベース薬剤は、化学治療用途において広範に利用される。たとえば、シスプラチンは、共有のクロスＤＮＡまたはストランド内ＤＮＡ付加体の形成を介して腫瘍細胞を死滅させる（Ｓｈｅｒｍａｎらの１９８７，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，８７，１１５３−８１；Ｃｈｕ，Ｊ．１９９４，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，７８７−９０）。かかる白金ベース薬剤を用いた治療はＤＮＡ合成の阻害につながる（Ｈｏｗｌｅらの１９７０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９，２７５７−６２；Ｓａｌｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１１２，５５５−６３）。
他の化学療法薬はさまざまな機構で作用する。たとえば微小管形成を妨害する薬剤（たとえばビンクリスチン、ビンブラスチン、パクリタキセル、ドセタキセルなど）は、有糸分裂紡錘体装置の適切な形成を妨害することによって腫瘍細胞に対して作用する（たとえばＭａｎｆｒｅｄｉらの１９８４、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２５，８３−１２５を参照）。すなわち、微小管形成を妨害する薬剤は、細胞サイクルの有糸分裂相中に主に作用する（Ｓｃｈｉｆｆらの１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７，１５６１−６５；Ｆｕｃｈｓらの１９７８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｐ．，６２，１２１９−２２；Ｌｏｐｅｓらの１９９３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３２，２３５−４２）。代謝拮抗物質は、成長細胞における種々の酵素経路に作用する。たとえば、メトトレキセート（ＭＴＸ）は、ジヒドロ葉酸の低減酵素を阻害する葉酸類似体であるので、ＤＮＡ合成に必要なチミジル酸とプリンの合成を阻止する。また、他の細胞毒性薬剤を利用することもできる（たとえばドセタキセル（たとえばＴＡＸＡＴＥＲＥＴＭ）などのタキサン）。
【００１０】
今日の癌治療における主要問題のうちの１つは、腫瘍細胞の化学療法薬耐性を高める能力である。種々の細胞毒性薬剤の生物学的機構における相違のため、さまざまな細胞毒性薬剤の組み合わせを含むプロトコルが試みられている（たとえば、Ｊｅｋｕｎｅｎらの１９９４，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６９，２９９−３０６；Ｙｅｈらの１９９４，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，５４，４３１−３５）。併用治療プロトコルは、互換性のある細胞毒性薬剤を用いることによって細胞変性プロトコルの効力を増加することを目的とする。同様に、細胞毒性薬剤の所与の組み合わせから十分な抗腫瘍性活性を実現できる可能性は、有害な副作用を最小化するために個々の細胞毒性薬剤の薬用量を低減する可能性を提示する。その理由の一つには、種々の細胞毒性薬剤が細胞サイクルのさまざまな段階中に作用することが挙げられ、組み合わせプロトコルの成功は、頻繁に薬物適用の順序によって左右されるからである（たとえば、Ｊｅｋｕｎｅｎらの前出文献；Ｓｔｕｄｚｉｎｓｋｉらの１９９１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５１，３４５１）。
米国特許第６，５５９，１３９号には、ビタミンＤまたはその誘導体を他の公知の化学療法薬剤と共に用いる併用療法が記載されている。米国特許第６，６６７，３３７号では、ｘａｎｔｈｅｎｏｎｅ酢酸類とパクリタキセルまたはドセタキセルのどちらかの化合物組み合わせを用いて癌治療方法が開示されている。
米国特許第５，９８５，８７７では、前立腺癌を治療するためのチロシンキナーゼ阻害剤及び化学的去勢の組み合わせが開示されている。
【００１１】
米国特許第５，５１６，７７１号、第５，６５４，４２７号及び第５，６５０，４０７号では、インドロカルバゾール型チロシンキナーゼ阻害剤及び前立腺癌が論考されている。米国特許第５，４７５，１１０号、第５，５９１，８５５号、及び第５，５９４，００９号、及びＷＯ９６／１１９３３では、融合ピロロカルバゾール型チロシンキナーゼ阻害剤及び前立腺癌が論考されている。
しかし、前立腺癌をはじめとする種々の癌において効果のある治療投与計画の必要性が引き続き存在している。本発明は、細胞透過性、選択性及びバイオ劣化耐性などの改良された薬理学的特性を有するペプチド及びペプチド模倣物の複合体を含むタンパク質キナーゼの阻害剤を提供することによって公知の抗増殖薬剤及び抗癌薬剤の限界を克服するものである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ペプチドまたはペプチド模倣物と細胞透過性エンハンサーとの複合体を含む新規タンパク質キナーゼ阻害剤を提供する。
本発明は、ＰＫＢが増幅される腫瘍組織における細胞死の増加と、公知の化学療法薬剤耐性の低下とにつながる細胞周期停止及びアポトーシス促進の両方を引き起こす能力を持つタンパク質キナーゼＢの特異的な阻害剤に対する未だ満たされていないニーズを満たすものである。本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤を他の治療と組み合わせて用いると、臨床効果を高めること、あるいは有害な副作用発生率を低下させることができるので、従来の化学治療剤の用量を増加することが可能となる。
本発明はさらに、少なくとも第１部分及び第２部分を有する分子を含むタンパク質キナーゼ阻害剤を提供するものであって、該第１部分は当該分子の細胞透過能を持ち、該第２部分は当該細胞内におけるタンパク質キナーゼ阻害効果を持ち、当該第１部分はリンカーまたはスペーサーを介して当該第２部分に結合されることを特徴とする。具体的には、本発明は医療用及び治療用のタンパク質キナーゼ阻害剤である細胞透過性ペプチド及びペプチド模倣物の複合体を提供する。
特定の実施形態によれば、本発明の複合体は細胞透過部分に結合されたペプチド基質の模倣物を含む。
【００１３】
別の実施形態によれば、本発明の複合体は選択タンパク質キナーゼ阻害剤Ｂ（ＰＫＢ）であるペプチド及びペプチド模倣物を含む。これらのペプチド及びペプチド模倣物の複合体は、先に記載のＰＫＢ阻害剤よりもさらに改良された薬理学的特性を持つ。
従って本発明のペプチド複合体は、細胞透過部分の第１セグメント、及びペプチドコアとしての機能を果たすペプチドまたはペプチド模倣物の第２セグメントを含むものである。該第１セグメントと該第２セグメントとは、共有結合を介して直接的に結合してもよいし、またはスペーサーを介して結合してもよい。
当技術分野で公知の化合物の細胞への透過を能動的または受動的に促進または増強する部分であれば、いかなる部分も本発明に係るペプチドコアとの結合に使用することができる。その非限定的な例としては、脂肪酸、ステロイド及びかさ高い芳香族または脂肪族の化合物などの疎水性部分と、ステロイド、ビタミン類及び糖類、天然及び非天然のアミノ酸及びトランスポーターペプチドなどの細胞膜の受容体または担体を有することができる部分とが挙げられる。
本発明に係る複合分子のタンパク質キナーゼ阻害性ペプチド部分は、タンパク質キナーゼ阻害性ペプチドまたはタンパク質キナーゼ阻害性ペプチド模倣物より選択する。かかる阻害性コアペプチドは、ＰＫＢ基質またはＰＫＢ基質の模倣物を構成する公知または新規のペプチド及びペプチド模倣物をベースとして設計する。本発明に係るペプチドコアは、一般にアミノ酸番号４〜２５のアミノ酸の配列からなり、特定の実施形態によれば、本ペプチドコアはアミノ酸番号５〜２０のアミノ酸を含むが、別の実施形態によれば、本ペプチドコアはアミノ酸番号６〜１５のアミノ酸を含む。
【００１４】
本発明の具体的な実施形態によれば、ペプチド部分はＰＫＢ基質に由来する。より好適な実施形態によれば、ペプチドコアはＰＫＢ基質グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）に由来する。
別の実施形態によれば、本発明の複合体にはＡＴＰの模倣部分をさらに含むこともできる。
該細胞透過部分は、直接的またはスペーサーを介して間接的にペプチド部分のいかなる位置にも結合することができる。具体的な実施形態によれば、該細胞透過部分はペプチド部分のアミノ末端またはカルボキシ末端に結合する。該随意的な結合スペーサーはさまざまな長さであってよく、また、限定するものではないが、アミン結合、アミド結合、カルバマート結合、チオエーテル結合、オキシエーテル結合、スルホンアミド結合などをはじめとする任意の好適なケミストリーを含む高次構造であってもよい。かかるスペーサーの非限定的な例としては、アミノ酸、スルホンアミド誘導体、アミノチオール誘導体及びアミノアルコール誘導体が挙げられる。
また、さらに改良された安定性及び細胞透過特性を持つペプチド模倣化合物を含むペプチドベースのタンパク質キナーゼ阻害剤を提供することも、本発明のもう一つの目的である。かかる化合物配合の非限定的な例としては、選択されたペプチド残基のＮ−アルキル化、選択されたペプチド残基、非天然アミノ酸の側鎖修飾、ペプチド結合を置換するためのカルバマート、尿素、スルホンアミド及びヒドラジンの使用、及び限定するものではないが、ピペリジン、ピペラジン及びピロリジンを含む非ペプチド部分のペプチドまたは非ペプチド結合を介した組み込みが挙げられる。本発明に係るペプチド模倣物コア内のアミノ酸（ＡＡ）間の修飾結合は、アミド結合、尿素結合、カルバマート結合、ヒドラジン結合またはスルホンアミド結合からなる群から選択することができる。現在、より好適な実施形態では、ＡＡ間の結合は特に別段の指定がない限り、すべてアミド結合である。
また、本発明はペプチドベースのＡＴＰの模倣部分をさらに含む細胞透過性キメラ化合物を提供する。ＡＴＰの模倣部分には、限定するものではないが、ダンシル、イソキノリン、キノリン及びナフタレンが含まれており、スペーサーによってペプチドコアに便宜結合させる。好ましくは、ＡＴＰの模倣物はイソキノリンまたはその誘導体である。該スペーサーはさまざまな長さのスペーサーであり、また、限定するものではないが、アミン結合、アミド結合、カルバマート結合、チオエーテル結合、オキシエーテル結合、スルホンアミド結合などをはじめとする任意の好適なケミストリーの高次構造を有するスペーサーである。かかるスペーサーの非限定的な例としては、スルホンアミド誘導体、アミノチオール誘導体及びアミノアルコール誘導体が挙げられる。
【００１５】
一実施形態によれば、本発明の化合物は下記式（Ｉ）に従った配列、その類似体、塩類または機能的誘導体を含む。
式（Ｉ）：Ｍ−Ｘ１−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列番号：２）
上記式では、
Ｍは不在であるか、またはＤ−Ｌｙｓ２−４またはＬ−Ｌｙｓ２−４から選択されるものであり、
Ｘ１は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＯｒｎまたはＤａｂであり、
Ｘ４は、Ｎｖａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＡｂｕまたはＯｒｎであり、
Ｘ５は、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、ＧｌｙＮＨ２、Ｓｅｒ（Ｍｅ）、Ｇｌｕ、またはＧｌｕ（ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＳＯ２−イソキノリン）であり、
Ｘ６は、Ｄａｐ、Ａｂｕ、ＧｌｙＮＨ２、Ｓｅｒ（Ｍｅ）、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＳｅｒであり、及び
Ｘ７は、芳香族または脂肪族のかさ高い残基、好ましくはＰｈｅまたはＨｏｌを表す。
具体的な実施形態によれば、本発明の化合物は下記式（ＩＩ）に従った配列、その類似体、塩類または機能的誘導体を含む。
式（ＩＩ）：Ｍ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列番号：３）
上記式では、
Ｍは、Ｄ−Ｌｙｓ３またはＬｙｓ３であり、
Ｘ４は、Ｎｖａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＡｂｕまたはＯｒｎであり、
Ｘ５は、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、ＧｌｙＮＨ２、Ｓｅｒ（Ｍｅ）、Ｇｌｕ、またはＧｌｕ（ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＳＯ２−イソキノリン）であり、
Ｘ６は、Ｄａｐ、Ａｂｕ、ＧｌｙＮＨ２、Ｓｅｒ（Ｍｅ）、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＳｅｒであり、及び
Ｘ７は、芳香族または脂肪族のかさ高い残基、好ましくはＰｈｅまたはＨｏｌを表す。別の実施形態によれば、本発明のペプチド複合体は、コレステロール、（ＤＬｙｓ）２−５、（Ｌｙｓ）２−５、ビタミンＥ、Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、ＡｈＸ６−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＧｌｎ−Ａｒｇ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−ＤＡｒｇであり、（ＤＬｙｓ）８−１０、及び（ＤＡｒｇ）７−９からなる群から選択される細胞透過部分を含む。
【００１６】
本発明の具体的な実施形態によれば、タンパク質キナーゼ阻害剤は下記式（ＩＩＩ）の配列を含む。
式（ＩＩＩ）：Ｙ−Ｚ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｘ６−Ｈｏｌ（配列番号：４）
上式では、Ｘ６はＤａｐまたはＡｌａであり、Ｙは細胞透過部分であり、ＺはＹをペプチドに結合させるスペーサーまたは結合である。
好ましくは、Ｙは、コレステロール、（ＤＬｙｓ）２−１０、（Ｌｙｓ）２−１０、ビタミンＥ、Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号：９２）、ＡｈＸ６−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＧｌｎ−Ａｒｇ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−ＤＡｒｇ（配列番号：９３）、及び（ＤＡｒｇ）７−９からなる群より選択されるものであって、Ｚは不在であるか、またはカルバマート及びＧｌｙより選択されるものである。
さらなる実施形態によれば、タンパク質キナーゼ阻害剤は、下記からなる複合体を含む。
（ａ）下記からなる群から選択されるペプチドセグメント。
ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ（配列番号：５）、
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ（配列番号：６）、
Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ（配列番号：７）、
Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ−Ｇｌｕ−（ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＳＯ２−イソキノリン）Ｓｅｒ−Ｐｈｅ（配列番号：８）、
Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｏｌ（配列番号：９）。
【００１７】
（ｂ）コレステロール、Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、ビタミンＥ、及び（ＤＡｒｇ）９群から選択される細胞透過部分。
現在、本発明に係る最も好ましいタンパク質キナーゼ阻害剤は下記からなる群から選択される。
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１０）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１１）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）４−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１２）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）６−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ（Ｍｅ）−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１３）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−（ＤＬｙｓ）３−ＮＨ２（配列番号：１４）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）３−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ（Ｍｅ）−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１５）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（Ｌｙｓ）３−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＯＨ（配列番号：１６）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）３−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１７）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ｏｒｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１８）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）３−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１９）、
ビタミンＥ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）３−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２０）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）２−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２１）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２２）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２３）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２４）、
ビタミンＥ−スクシナート−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２５）、
Ｈ−（ＤＡｒｇ）９−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２６）、及び
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ−Ｇｌｕ（アミノエチルスルホンアミドイソキノリン）−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（配列番号：２７）。
【００１８】
本発明の別態様では、タンパク質キナーゼ阻害剤である新規ペプチド複合体を活性成分として含む医薬品組成物を狙いとし、また、これらの新規タンパク質キナーゼ阻害剤を含む医薬品組成物の調製法及び使用法をもその狙いとする。
本発明の別態様では、疾患及び障害の治療に役立つ薬物製造のためのこれらペプチド複合体を含む医薬品組成物の使用法を狙いとする。本発明は、限定するものではないが、癌、増殖疾患、糖尿病、心血管症状、出血性ショック、肥満症、炎症性疾患、中枢神経系疾患、及び自己免疫性疾患をはじめとするタンパク質キナーゼが関与する障害の治療方法を開示する。本発明の具体的な実施形態によれば、本発明に係る医薬品組成物は、ホルモン不応性前立腺癌、または限定するものではないが、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、腎臓癌、黒色腫及び皮膚癌、肺癌、及び肝臓癌を含む、ＰＫＢレベルと関連または相関する他の癌型の治療に有用である。
【００１９】
またさらなる一実施形態によれば、本発明に係る医薬品組成物は、他の化学治療物質と組み合わせて投与するものである。本発明に係るタンパク質キナーゼ阻害剤と共に投与し得る化学療法薬物には、限定するものではないが、ミトキサントロン、トポイソメラーゼ阻害剤、紡錘体毒ビンカ：ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン（タキソール）、パクリタキセル、ドセタキセルと、アルキル化剤：メクロレタミン、クロランブシル、シクロホスファミド、メルファラン、イホスファミドと、メトトレキセートと、６−メルカプトプリンと、５−フルオロウラシル、シタラビン、ゲムシタビンと、ポドフィロトキシン：エトポシド、イリノテカン、トポテカン、ダカルバジンと、抗生物質：ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ブレオマイシン、マイトマイシンと、ニトロソ尿素：カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン、エピルビシン、イダルビシン、ダウノルビシンと、無機イオン：シスプラチン、カルボプラチンと、インターフェロン、アスパラギナーゼと、ホルモン：タモキシフェン、ロイプロリド、フルタミド、及びメゲストロールアセテートをはじめとする当技術分野で公知の任意の薬剤が含まれる。
【００２０】
本発明はさらに、タンパク質キナーゼ阻害剤であるペプチド複合体の治療有効量の投与を含む、被験者におけるタンパク質キナーゼの活性調節方法を提供する。
本質的に、従来技術におけるタンパク質キナーゼ阻害剤の公知または想定されるすべての使用方法は、本発明の分子を用いて実現することができる。
例示として、本発明で開示した化合物をタンパク質キナーゼＢの阻害剤として選択した。本明細書で開示した調製物及び方法を用いると、他種類のタンパク質キナーゼの活性を阻害する化合物を得ることが可能性である。本発明の上記及び他の特徴は、以下の図、説明、実施例及び特許請求の範囲と結び付けてさらに良く理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
種々のＰＫＢ阻害剤候補の製造及びスクリーニングにおいては驚いたことに、本発明に係るペプチド及びペプチド模倣物の複合体が、既知のＰＫＢ阻害剤よりも改良された薬理学的特性を所有していることが見出された。ＡＴＰの模倣物及び基質の模倣物を含む、先に記載のキメラ分子は無細胞アッセイにおけるＰＫＢ酵素阻害においてより強力であるが、新規ペプチド複合体はＰＫＡに比べてＰＫＢに対してより選択的であることが判明し、その細胞透過性のためにそれらの構成成分には細胞に透過してアポトーシス及びリン酸化などの細胞内の事象を阻害する能力があるが、キメラ分子は細胞内のＰＫＢを阻害しないことも判明した。よって、本発明のペプチド複合体は治療用薬剤としての使用により好適である。
【００２２】
本発明では、それらの薬理学的特性を改善し、ＰＫＡよりもＰＫＢに対して選択性を保持する細胞透過性および血清安定性の阻害剤を得るために、選択的阻害剤であるが細胞内では低活性の非依存性基質を模倣するペプチド阻害剤を修飾した。
本発明に係るペプチド複合体のスクリーニングの際、驚いたことに、特定の脂肪親和性部分が他の部分よりも細胞透過性エンハンサーとして好適であることが見出された。たとえばコレステロールを含むペプチド複合体の活性は、ミリストイルまたはラウリルを含む類似化合物の活性と比較して大幅に高かった。
本発明では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏのＰＫＢ阻害効果を有するコアペプチド模倣化合物を同定した。最も強力かつ選択的な化合物を最適化して、すべての細胞アッセイにおいて約５倍強力であり、さらに著しく選択的な新規化合物を実現した。新規化合物は、１〜２μＭで前立腺癌細胞株における細胞死及びアポトーシスを誘導するが、正常細胞に対しては４０μＭでも安全である。また、新規化合物は、３μＭで癌細胞におけるアポトーシス誘導し、３〜５μＭでウエスタンブロット法によるＰＫＢ下流基質の阻害を示す。本発明に係る組成物の有用性は、当技術分野で公知の種々の測定を用いて確立することができる。本発明の好適な化合物は、タンパク質キナーゼの活性阻害及び癌細胞内での細胞死とアポトーシスの誘導において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイパネルで活性であるが、正常細胞内では活性でないことが判明した。加えて、腫瘍成長、腫瘍回帰、及び化学療法薬剤との潜在的な相乗作用効果に対するそれらの影響を評価するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで高活性を示す選択された化合物をｉｎ  ｖｉｖｏで検査する。
【００２３】
選択された本発明に係る化合物は、血漿中で６〜２４時間安定であり、肝細胞によって緩慢に代謝され、かつ膜透過性であるＰＫＢのペプチドベースの基質を模倣する阻害剤である。これらの化合物は、関連キナーゼよりもＰＫＢに対して１０〜２００倍選択的であり、このタンパク質キナーゼの強力かつ選択的阻害剤として組織培養中において特徴付けられている。阻害剤は、特にＰＫＢが高度に活性化される前立腺癌細胞、乳癌細胞及び腎臓癌細胞において細胞死を誘導するが、ＰＫＢ活性化がほとんどない正常細胞においては細胞死を誘導しない。阻害剤は、細胞死誘導濃度と同じ濃度で前立腺癌細胞においてアポトーシスを誘導するが、これらの濃度では、細胞サイクル分析による細胞毒性死は認められない。その上、阻害剤は前立腺癌細胞におけるＰＫＢ下流基質のリン酸化を減少する。
【００２４】
薬理学的に活性であるタンパク質キナーゼ阻害剤及び薬剤的に許容できる担体または希釈液を含む本発明に係る医薬品組成物は、本発明に係るタンパク質キナーゼ阻害剤の有効量を含む医薬品組成物を用いた該医薬品組成物を必要とする哺乳動物の治療方法と同様に本発明の別の実施形態を提示する。本発明の組成物を用いる治療方法は、癌、増殖疾患、糖尿病、心血管症状、出血性ショック、肥満症、炎症性疾患、中枢神経系疾患、及びかかる組成物を用いた自己免疫性疾患の療法に有用である。
本発明に係る医薬品組成物は、最も好ましくは、ホルモン不応性前立腺癌と、前立腺癌（ＺｉｎらのＣｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００１７，２４７５−９）と、乳癌（Ｐｅｒｅｚ−Ｔｅｎｏｒｉｏ  ａｎｄ  Ｓｔａｌ，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００２８６，５４０−４５，ＳａｌｈらのＩｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００２９８，１４８−５４）と、卵巣癌（ＬｉｕらのＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９８１５，２９７３−７）と、結腸癌（ＳｅｍｂａらのＣｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．２００２８，１９５７−６３）と、黒色腫及び皮膚癌（Ｗａｌｄｅｒｍａｎ，Ｗｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｄｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ．２００２１２，４５−５０）と、肺癌（ＺｉｎらのＣｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００１７，２４７５−９）と、肝臓癌（ＦａｎｇらのＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１２６８，４５１３−９）の群から選択される悪性腫瘍の防止及び治療に使用することができる。
本発明を用いて治療することができるさらなる特定の型の癌には、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、子宮癌、胆管癌、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌、胃肉腫、グリア細胞腫、白血病、肺癌、リンパ腫、黒色腫、複数の骨髄腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、胃腸癌、または手術不能腫瘍を含めた局在部位の腫瘍、または腫瘍の局所治療が有益な腫瘍、及び固体腫瘍が含まれる。
【００２５】
加えて、本発明の医薬品組成物を用いて治療することができる適応症には、タンパク質キナーゼのレベル、特にＰＫＢレベルが高いか、または適応症と関連または相関しているという条件で、望ましくない細胞増殖または無制限な細胞増殖に関与するすべての状態が含まれる。かかる適応症には、再狭窄、良性腫瘍、原発腫瘍及び腫瘍転移などの各種癌、内皮細胞の異常刺激作用（アテローム性動脈硬化）、外科術、異常創傷治癒、異常血管形成に起因する体組織侵襲、組織線維症を生じる疾患、反復動作による障害、血管新生を高度に促進しない組織障害、及び臓器移植に関連する増殖反応が含まれる。
本発明を用いて治療することができる特定の型の再狭窄病変には、冠動脈病変、頸動脈病変、及び大脳病変が含まれる。本発明を用いて治療することができる特定の型の良性腫瘍には、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ及び化膿性肉芽腫が含まれる。
【００２６】
外科術中の体組織侵襲に起因する細胞増殖の治療は、接合外科術、腸外科術、及びケロイド瘢痕をはじめとする種々の外科手術において行うことができる。線維組織を生じる疾患には肺気腫が含まれる。本発明を用いて治療することができる反復動作による障害には、手根管症候群が含まれる。本発明を用いて治療することができる細胞増殖障害の例としては骨腫瘍が挙げられる。
本発明を用いて治療することができる異常血管形成には、関節リウマチを伴う異常血管形成、乾癖、糖尿病性網膜症、及び未熟児網膜症（水晶体後線維増殖症）、黄斑変性症、角膜移植拒絶反応、ｎｅｒｏｓｃｕｌａｒ緑内障及びＯｓｔｅｒ  Ｗｅｂｂｅｒ症候群などの他の眼血管形成疾患が含まれる。
本発明を用いて治療することができる臓器移植に関連する増殖反応には、臓器拒絶または関連合併症の原因となる可能性がある増殖反応が含まれる。特異的にこれらの増殖反応は、心臓、肺臓、肝臓、腎臓、及び他の体器官または器官系の移植中に起こる可能性がある。
【００２７】
本発明に係る医薬品組成物は都合よく、少なくとも１つのタンパク質キナーゼ阻害剤を含む。これらの医薬品組成物は、局所的投与または全身的投与をはじめとする任意の好適な経路で投与することが可能である。好ましい投与方法には、限定するものではないが、静脈内注入の及び筋肉内注入などの非経口的な経路、ならびに経鼻摂取または経口摂取が含まれる。
当業者であれば公知のように、医薬品組成物は単独または治療すべき状態に対する新たな治療薬と併せて投与することが可能である。
現在、本発明に係る抗ＰＫＢ化合物と、公知の化学療法薬物との両方を同時投与または連続投与すると、抗腫瘍活性が高くなり、併用療法による抗癌効果は各薬剤を単独投与した場合と比べてはるかに大きく、個々の薬剤効果の和を大幅に超えることが見出されている。よって、本特許申請は悪性腫瘍または他の増殖反応の治療に使用される公知のいかなる他薬剤との併用療法に使用することが可能なタンパク質キナーゼ阻害剤を提供するものである。
【００２８】
用語と定義
本明細書及び本特許請求の範囲における用語「タンパク質キナーゼ」は、上記のように１つまたは複数のタンパク質リン酸化する働きをする酵素スーパーファミリーのメンバーを意味する。
本明細書及び本特許請求の範囲において使用した用語「阻害剤」は「拮抗薬」を示すために互換的に用いたものであって、これらの用語は特定の酵素活性を低下させる能力、または当該酵素基質の活性または機能と競合する能力を備えている組成物を定義するものである。
本明細書及び本特許請求の範囲において使用した用語「キメラ化合物」または「キメラ分子」は、ＰＫＢ基質の模倣部に結合したＡＴＰ模倣部分を示す。
本明細書中で使用した「ペプチド」は、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸配列を示す。本発明のペプチド類似体は、４〜２５アミノ酸残基、好ましくは５〜２０残基、より望ましくは６〜１５アミノ酸の配列を含むものであって、各残基がアミノ末端及びカルボキシ末端を持つことを特徴とする。
用語「ペプチド模倣物」は、本発明に係るペプチドが少なくとも１つの非コード化残基または非ペプチド結合を含むように修飾されていることを意味する。かかる修飾には、たとえば１つまたは複数の残基のアルキル化及びより特異的なメチル化、非天然アミノ酸による天然アミノ酸の挿入または置換、アミド結合の他共有結合との置換が含まれる。本発明に係るペプチド模倣物は、便宜、少なくとも１つの結合を含むことができ、該結合は尿素結合、カルバマート結合、スルホンアミド結合、ヒドラジン結合、または任意の他共有結合などを含むアミド置換結合である。適切な「ペプチド模倣物」の設計はコンピュータを使って行うことも可能である。
【００２９】
用語「スペーサー」は化学的部分を示し、その目的は細胞透過部分及びペプチドまたはペプチド模倣物を共有的に結合することである。スペーサーを用いて細胞透過部分とペプチドとの間に距離を設けるか、または該スペーサー任意の型の化学結合とすることもできる。リンカーは直接化学結合またはスペーサーを示す。
用語「ペプチド類似体」は、アミド結合の１つまたは複数のアミノ酸置換または１つまたは複数の修飾／置換を除いて、本発明に係るアミノ酸配列を有する分子を示す。
本発明に関しては、用語「核」はペプチドセグメント、またはペプチドまたはペプチド模倣物を含み、便宜、細胞透過性エンハンサーに結合したタンパク質キナーゼ阻害剤の部分を意味する。
【００３０】
「透過性」は薬剤または物質の障壁、膜、または皮膚層を介して透過、浸透、または拡散する能力を意味する。「細胞透過性」または「細胞透過」部分は、当技術分野で公知の、膜を介して分子の透過を促進または増強することができる任意の分子を意味する。その非限定的な例としては、脂質、脂肪酸、ステロイド及びかさ高い芳香族または脂肪族の化合物などの疎水性部分と、ステロイド、ビタミン類及び糖類、天然及び非天然のアミノ酸及びトランスポーターペプチドなどの細胞膜の受容体または担体を有することができる部分とが挙げられる。本発明に従って使用することができる脂質部分の例は下記の通りである。リポフェクタミン、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ、ＤＭＲＩＥ、ＤＬＲＩＥ、ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＭＥＡＰ、ＤＯＤＭＰ、ＤＯＰＣ、ＤＤＡＢ、ＤＯＳＰＡ、ＥＤＬＰＣ、ＥＤＭＰＣ、ＤＰＨ、ＴＭＡＤＰＨ、ＣＴＡＢ、ｌｙｓｙｌ−ＰＥ、ＤＣ−Ｃｈｏ、−アラニンコレステロールと、ＤＣＧＳ、ＤＰＰＥＳ、ＤＣＰＥ、ＤＭＡＰ、ＤＭＰＥ、ＤＯＧＳ、ＤＯＨＭＥ、ＤＰＥＰＣ、プルロニック、Ｔｗｅｅｎ、ＢＲＩＪ、プラスマロゲン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、グリセロール−３−エチルホスファチジルコリン、ジメチルアンモニウムプロパン、トリメチルアンモニウムプロパン、ジエチルアンモニウムプロパン、トリメチルアンモニウムプロパン、ジメチルジオクタデシル臭化アンモニウム、スフィンゴ脂質、スフィンゴミエリン、リソリピド（ｌｙｓｏｌｉｐｉｄ）、糖脂質、スルファチド、スフィンゴ糖脂質、コレステロール、コレステロールエステル、コレステロール塩、オイル、Ｎ−スクシニルジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、１、２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール、１、３−ジパルミトイル−２−スクシニルグリセロール、１、２−ジパルミトイル−ｓｎ−３−スクシニルグリセロール、１−ヘキサデシル−２−パルミトイルグリセロホスファチジルエタノールアミン、パルミトイルホモシステイン、Ｎ、Ｎ’−ビス（ドデシルアミノカルボニルメチレン）−Ｎ、Ｎ’−ビス（（−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムエチル−アミノカルボニルメチレン）四ヨウ化エチレンジアミンと、Ｎ、Ｎ”−ビス（ヘキサデシルアミノカルボニルメチレン）−Ｎ、Ｎ’、Ｎ”−トリス（（−Ｎ、Ｎ、Ｎ−六ヨウ化トリメチルアンモニウム−エチルアミノカルボニルメチレンジエチレントリアミンと、Ｎ、Ｎ’−ビス（ドデシルアミノカルボニルメチレン）−Ｎ、Ｎ”−ビス（（−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムエチルアミノカルボニルメチレン）シクロヘキシレン−１、４−四ヨウ化ジアミンと、１、７、７−テトラ−（（Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｎ−テトラメチルアンモニウムエチルアミノ−カルボニルメチレン）−３−ヘキサデシルアミノカルボニル−メチレン−１、３、７−七ヨウ化トリアザヘプタンと、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラ（（−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウム−エチルアミノカルボニルメチレン）−Ｎ’−（１、２−ジオレオイルグリセロ−３−ホスホエタノールアミノカルボニルメチレン）四ヨウ化ジエチレントリアミンと、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、脂肪酸、リソリピド（ｌｙｓｏｌｉｐｉｄ）、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴ脂質、糖脂質、糖脂質、スルファチド、スフィンゴ糖脂質、ホスファチジン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、オレイン酸、重合体を有する脂質、スルホン化サッカロイド（糖類）を有する脂質、コレステロール、トコフェロールヘミサクシネート、エーテル結合された脂肪酸を備えた脂質、エステル結合された脂肪酸を備えた脂質、重合脂質、ジアセチルリン酸（リン酸塩）、ステアリルアミン、カルジオリピン、６〜８の炭素長の脂肪酸を備えたリン脂質、不斉アシル鎖を備えたリン脂質、６−（５−コレステン−３ｂ−イルオキシ）−１−チオ−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド、ジガラクトシルジグリセリド、６−（５−コレステン−３ｂ−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシ−１−チオ−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−（５−コレステン−３ｂ−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシル−１−チオ−ａ−Ｄ−マンノピラノシド、１２−（（（７’−ジエチルアミノ−クマリン−３−イル）カルボニル）メチルアミノ）−オクタデカン酸と、Ｎ−［１２−（（（７’−ジエチルアミノ−クマリン−３−イル）カルボニル）メチルアミノ）オクタデカノイル］−２−アミノパルミチン酸と、コレステリル）４’−トリメチル−アンモニオ）ブタノアートと、Ｎ−スクシニルジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミンと、１、２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロールと、１、２−ジパルミトイル−ｓｎ−３−スクシニル−グリセロールと、１、３−ジパルミトイル−２−スクシニルグリセロール、１−ヘキサデシル−２−パルミトイルグリセロ−ホスホエタノールアミン、及びパルミトイルホモシステイン。
【００３１】
本明細書及び本特許請求の範囲における用語「治療有効量」は、タンパク質キナーゼ阻害剤または同阻害剤を含む組成物の、本明細書に記載した適応症に対して宿主に投与し、所望の結果を達成するための量を意味するものであって、該適応症には、限定するものではないが癌、糖尿病、心血管症状、出血性ショック、肥満症、炎症性疾患、中枢神経系疾患、及び自己免疫性疾患が含まれる。
本明細書中で使用した「癌」及び「癌性」は、哺乳動物細胞におけるすべての悪性増殖を意味する。
２つの化合物を組み合わせて投与するか、または本発明に係る併用療法を用いる際、用語「組み合わせ」は、本発明に関しては、複数の薬物が同時に、同時または連続的に被験者に与えられることを意味する。この用語は、本発明に関しては、組織的な治療の過程で２つ以上の治療薬を投与して改善された臨床成果を達成することを意味するように定義されている用語「同時投与」と互換可能である。また、かかる同時投与は同一であってもよい。すなわち、同時投与は重複する期間中に発生してもよいものである。
【００３２】
チロシンキナーゼ阻害剤と別薬剤との同時投与は、別々の製剤、すなわち、チロシンキナーゼの製剤と別薬剤の製剤の同時発生的な投与によって行い得るものである。別々の製剤の投与は、その投与のタイミングがチロシンキナーゼ阻害剤及び他の薬剤の薬理活性が治療を受ける哺乳動物において同時に起こるような場合、「同時発生的」といえる。
本発明の一部の実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤及び別薬剤の同時投与は、両剤を単一組成物に製剤することによって達成する。
本明細書中では、本発明及び本発明の製造と使用の様式を説明するため、特定の略称を使用する。例として、ＡＴＰはアデノシンの３つのリン酸（リン酸塩）を意味し、ＢＳＡはウシ血清アルブミンを意味し、ＢＴＣはビス−（トリクロロメチル）カルボナートまたはトリホスゲンを意味し、ＤＩＥＡはジイソプロピル−エチルアミンを意味し、ＤＭＦはジメチルホルムアミドを意味し、ＥＤＴはエタンジチオールを意味し、ＥＤＴＡはエチレンジアミンテトラアセテートを意味し、ＥＬＩＳＡは酵素結合免疫測定法を意味し、ＥＧＦは上皮成長因子を意味し、ＦＡＣＳは蛍光標示式細胞分取器を意味し、ＦＫＨＲはフォークヘッドを意味し、ＧＳＫ３はグリコーゲン合成酵素キナーゼ３を意味し、ＨＡは赤血球凝集素を意味し、ＨＢＴＵは１−ヒドロキシベンズトリアゾリルテトラメチル−ウロニウムを意味し、ＨＥＰＥＳは４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸を意味し、ＨＯＢＴは１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを意味し、ＨＲＰＣはホルモン不応性前立腺癌を意味し、ＩＧＦはインスリン成長因子を意味し、ＭＯＰＳは４−モルホリンプロパンスルホン酸を意味し、ＭＰＳは複数の平行合成を意味し、ＮＭＰはＮ−メチルホルムアミドを意味し、ＭＴＤは最大耐量を意味し、ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩水を意味し、ＰＫＡはタンパク質キナーゼＡを意味し、ＰＫＢはタンパク質キナーゼＢを意味し、ＰＫＣはタンパク質キナーゼＣを意味し、ｒｐｍは毎分の回転数を意味し、ＳＡＲは構造活性相関を意味し、ＴＨＦはテトラヒドロフランを意味し、ＴＩＳはトリ−イソプロピル−シランを意味し、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸を意味する。
【００３３】
ケミストリー：
本発明に係る好適なペプチドは、種々のペプチド模倣手法をはじめとする当技術分野で公知の任意の方法を用いて合成することができる。これらの方法には、固相合成法、ならびに液相合成法が含まれる。ペプチド性部分と透過性部分との結合は、固相化学または液相化学のどちらかによって、当技術分野で公知の任意の方法を用いて行うことができる。これらの方法の非限定的な例を本明細書に記載した。本発明の好適な化合物の一部は、液相合成法を用いて好都合に調製することができる。本発明の化合物と同様の化合物を調製するための当技術分野で公知の他の方法を使用することが可能であり、それらの方法も本発明の範囲内に含まれるものとする。
本発明において使用するアミノ酸は、市販されているアミノ酸か、または通常の合成法によって得られるアミノ酸である。特定の残基をペプチドに組み込むために特別な方法が必要とされる場合があり、ペプチド配列の連続合成法、分岐合成法及び収束合成手のいずれの手法も本発明において有用である。コード化された天然アミノ酸及びそれらの誘導体は、ＩＵＰＡＣ条約に従った３文字コードによって表示する。特定の表示がないときは、Ｌ−異性体を使用した。Ｄ−異性体は、残基の略称の前に「Ｄ」を付けて表示する。
【００３４】
アミノ酸の同類置換は、当業者には周知のように本発明の範囲内に含まれるものとする。アミノ酸の同類置換には、あるアミノ酸を同型の官能基または側鎖、たとえば脂肪族側鎖、芳香族側鎖、正に帯電した側鎖、負に帯電した側鎖を有する別のアミノ酸と置換することが含まれる。これらの置換により、経口バイオアベイラビリティ、中枢神経系への透過、特定の細胞集団へのターゲッティングなどの機能を高めることができる。当業者ならば、ペプチド、ポリペプチド、または単一アミノ酸またはコード化された配列における極めて少量のアミノ酸を改変、添加または削除するタンパク質配列への個々の置換、欠失または付加が、「保存的に修飾された変異」であって、その改変の結果、アミノ酸の化学的に類似したアミノ酸による置換が起こることを認識するであろう。機能的に類似するアミノ酸を提供する同類置換表は当技術分野で公知である。
【００３５】
以下の６つの群のそれぞれには、相互に同類置換であるアミノ酸が含まれる。
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）
３）アスバラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）
非コード化アミノ酸の非限定的な例の一覧表では、Ａｂｕは２−アミノ酪酸を意味する、ＡｈＸ６はアミノヘキサン酸を意味し、Ａｐｅ５はアミノペンタン酸を意味し、ＡｒｇＯｌはアルギニノールを意味し、ｂＡｌａはβ−アラニンを意味し、Ｂｐａは４−ベンゾイルフェニルアラニンを意味し、Ｂｉｐはβ−（４−ビフェニル）−アラニンを意味し、Ｄａｂはジアミノ酪酸を意味し、Ｄａｐはジアミノプロピオン酸を意味し、Ｄｉｍはジメトキシフェニルアラニンを意味し、Ｄｐｒを意味しジアミノプロピオン酸、Ｈｏｌはホモロイシンを意味し、ＨＰｈｅはホモフェニルアラニンを意味し、ＧＡＢＡはγ−アミノ酪酸を意味し、ＧｌｙＮＨ２はアミノグリシンを意味し、Ｎｌｅはノルロイシンを意味し、Ｎｖａはノルバリンを意味し、Ｏｒｎはオルニチンを意味し、Ｐｈｅカルボキシはパラカルボキシフェニルアラニンを意味し、ＰｈｅＣｌはパラクロロフェニルアラニンを意味し、ＰｈｅＦはパラフルオロフェニルアラニンを意味し、ＰｈｅＭｅはパラメチルフェニルアラニンを意味し、ＰｈｅＮＨ２はパラアミノフェニルアラニンを意味し、ＰｈｅＮＯ２はパラニトロフェニルアラニンを意味し、Ｐｈｇはフェニルグリシンを意味し、Ｔｈｉはチエニルアラニンを意味する。
【００３６】
薬理
他の考慮事項は別として、本発明の新規活性成分がペプチド、ペプチド類似体またはペプチド模倣物であるということは、製剤がこれらの型の化合物の投与に好適なものでなくてはならないことである。明らかにペプチドは、胃酸または腸内酵素による消化に対する脆弱性のために経口投与にあまり好適ではない。ペプチドの好適な投与経路は、関節内、静脈内、筋肉内、皮下、真皮内、またはクモ膜下腔内である。より好適な経路は、障害部位か疾患部位またはその近傍部への直接注入である。しかし、本発明の化合物の一部は、細胞膜を通過する能力に加えて代謝劣化に対して高度に耐性であることが判明している。これらの特性は、本発明の化合物を経口投与に潜在的に好適なものにしている。
本発明の医薬品組成物は、当技術分野で周知であるようなプロセスで製造することができ、それらの態様としては、従来の混合、溶解、造粒、粉砕、微粉砕、糖衣錠製造、研和、乳化、カプセル化、取り込み、または凍結乾燥プロセス等があげられる。
【００３７】
かくして、本発明に従って使用される医薬品組成物は、薬剤的に使用することができる調製物への活性化合物の処理を容易にする賦形剤及び助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容できる担体を用いて従来の方式で製剤することができる。適切な製剤は選択される投与経路によって決まる。
注入用としては、本発明の化合物を水溶液中、好ましくはハンクスの溶液、リンゲルの溶液、または生理食塩水などの生理学的に適合した緩衝液緩衝液中で製剤することができる。経粘膜投与用の場合には、浸透しようとする障壁に適切な浸透剤を製剤において使用する。かかる浸透剤、たとえばポリエチレングリコールは当技術分野で公知である。
糖衣錠核には好適なコーティングを施す。このコーティングのため、便宜、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、漆液及び好適な有機溶媒または混合溶媒を含有することができる濃縮砂糖水を使用してもよい。染料または色素を識別のためまたは活性化合物投与量のさまざまな組み合わせを特徴づけるために錠剤または糖衣錠コーティングを加えることもできる。
【００３８】
経口剤として使用できる医薬品製剤には、ゼラチンでできている押しバメ式カプセル、ならびにゼラチン及びグリセロームまたはソルビトールなどの可塑剤でできている密封されたソフトカプセルおよびコーティングも含まれる。差込式カプセルは、ラクトースなどの充填剤、澱粉などの結合剤、タルクなどの潤滑剤またはステアリン酸マグネシウム及び、便宜、安定剤との混合物中の活性成分を含有することができる。ソフトカプセルでは、脂肪性油類、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体中に、活性化合物を溶解または懸濁することができる。加えて、安定剤を加えることもできる。経口投与用のすべての製剤は、選択された投与経路に対して好適な薬用量でなくてはならない。頬側投与の場合には、組成物は、錠剤形態または従来の方式で製剤されたローゼンジ錠形態をとることもできる。
吸入による投与の場合は、本発明に従って使用される変異体を、好都合には、好適な噴霧剤、たとえばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ−テトラフルオロエタンまたは二酸化炭素を用いて、加圧パックまたは噴霧器からエアゾールスプレー提示の形式で投与する。加圧エアゾールの場合、単位用量は定量投与するための弁部を設けることによって決定することができる。たとえば吸入器用ゼラチンのカプセル及びカートリッジは、ペプチド及びラクトースまたは澱粉などの好適な粉末ベースの混合粉体を含有するように製剤することができる。
【００３９】
非経口的な投与用の医薬品組成物には水溶性型で活性成分の水溶液が含まれる。加えて、活性化合物の懸濁液は適切な油状の注入懸濁液として調製してもよい。好適な天然または合成の担体は当技術分野で公知である（ＰｉｌｌａｉらのＣｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５，４４７，２００１）。また便宜、懸濁液は、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために化合物の溶解度を増大させる好適な試薬または安定剤を保持させることもできる。あるいは、活性成分は使用前に好適な媒体、たとえば滅菌、発熱物質を含まない水を用いて再構成を行うために粉末形態であってもよい。
また、本発明の化合物は、たとえばカカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐薬の基剤を用いて坐薬または停留浣腸などの直腸用の組成物として製剤することもできる。 
本発明に関して使用するのに好適な医薬品組成物には、活性成分が所期の目的を達成するために有効な量で含有されていることを特徴とする組成物が含まれる。より具体的には、治療有効量とは治療を受けている被験者の疾患の症候を防止、軽減または寛解させるうえに効果のある化合物の量を意味する。治療有効量の決定は、当業者の能力範囲で行えるものである。
【００４０】
本明細書に記載したペプチドの毒性及び治療効果は、細胞培養または実験動物内において標準製薬方法、たとえば対象化合物のＩＣ５０（５０％の活性を阻害する濃度）及びＬＤ５０（検査動物の５０％の死を引き起こす致死量）を定量することによって確定することができる。細胞培養試験および動物実験から得たデータは、ヒトにおける用量範囲の設定に使用することができる。薬用量は、用いられる剤形及び投与経路に応じてさまざまに変わる。適確な製剤、投与経路及び薬用量は、それぞれの医師によって患者の状態に鑑みて選択することができる（たとえばＦｉｎｇｌらの１９７５、「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、Ｃｈ．１ｐ．１）。
治療しようとする状態の重症度及び応答性にもよるが、投薬は治療過程的で数日から数週間持続するか、または治癒が起こるまで、または疾患状態の改善が達成されるまで持続する持続放出薬剤組成物の単独投与であり得る。組成物の投与量はもとより、治療を受けている被験者、症状の重症度、投与様式、処方医師の判断、及びその他のすべての該当する要因によって左右されるであろう。
【００４１】
一実施形態では、本発明はタンパク質キナーゼ阻害剤と細胞毒性薬剤とを細胞に同時投与することによって細胞（たとえばターゲッティングされる細胞）を死滅させる方法を提供する。加えて、本発明の方法では任意期間の前処置を行うこともできるが、具体的な前処置の期間は本発明の方法の用途に応じてさまざまであろう。たとえば、治療用途においては、かかる前処置は最低約１日から最大約５日間以上までの期間、より望ましくは、前処置期間は約２日間から約４日間（たとえば約３日間）であり得る。前処置後、本発明の方法には細胞毒性薬剤の投与が含まれるが、他の実施形態では、糖質コルチコイド（たとえばコルチゾール、デキサメサゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾンなど）、ジフェンヒドラミン、ランチジン（ｒａｎｔｉｄｉｎｅ）、制吐−オンダンセトロン（ｏｎｄａｓｔｅｒｏｎ）、またはｇａｎｉｓｔｒｏｎを付属的に投与することができ、かかる薬剤はタンパク質キナーゼ阻害剤と共に投与することができる。細胞毒性薬剤は、前処置後に単独またはタンパク質キナーゼ阻害剤の継続的な投与と共に投与することができる。特定の実施形態によれば、治療は細胞毒性薬剤が投与される時点で中断するが、その投与は必要に応じて一定期間（たとえば数日間にわたって定期的に）継続することができる。
【００４２】
ターゲッティングされる細胞は単生であって他の同類細胞（培養液中の単一細胞またはｉｎ  ｖｉｖｏの転移性または散在性の腫瘍細胞など）から分離された細胞であり得るか、またはターゲッティングされる細胞が細胞（たとえば腫瘍内）コレクションのメンバーであり得る。好ましくは、本細胞は腫瘍細胞（たとえば、癌性または形質転換細胞などの無制限増殖を示す細胞の型）である。腫瘍細胞は、腫瘍内または他の細胞コレクション内に、均一または他の細胞型（腫瘍細胞または別の細胞型）と共に不均一に、分離（たとえば、単一細胞培養液中またはｉｎ  ｖｉｖｏの転移性または散在性腫瘍細胞）されているか、または凝集状態で存在している。細胞が腫瘍内にある場合、本発明の一部の実施形態では、タンパク質キナーゼ阻害剤を腫瘍に投与し、引き続いて細胞毒性薬剤を腫瘍に投与することによって腫瘍の成長を遅延させる方法を提供する。個々の細胞への細胞変性効果の効力により、本発明の方法は、長い間に腫瘍腫瘤に追加された細胞数を低減または実質上除去することができる。好ましくは、本発明の方法は腫瘍内の細胞数の低減に効果を及ぼし、最も好ましくは、本方法は結果として腫瘍の部分的または完全な破壊（たとえば、腫瘍内の細胞の一部または実質上すべてを死滅させることによって）に導く。
【００４３】
ターゲッティングされる細胞が患者（たとえばヒト）内の腫瘍性疾患に関係する場合、本発明の一部の実施形態は、タンパク質キナーゼ阻害剤を患者に投与し、引き続いて細胞毒性薬剤を患者に投与することによって患者を治療する方法を提供する。このアプローチは、無処置または散在性の癌を有する哺乳類の治療に効果がある。たとえば、細胞が散在性細胞（たとえば転移性腫瘍症）である場合、本発明の方法の細胞変性効果は、患者の全身に腫瘍細胞が蔓延する可能性を低減または実質上除去することができ、それによってかかる細胞が増殖して患者体内に新規腫瘍を形成する可能性を低減または最小化することもできる。その上、腫瘍細胞をはじめとする腫瘍の成長を遅延させることによって本発明の方法は、かかる腫瘍からの細胞が最終的に転移または散在するという可能性を低減する。もとより、本発明の方法により腫瘍サイズの縮小（そして特に腫瘍の排除）が実現されると、本方法は患者体内のかかる腫瘍の病理効果を減弱させる。別の用途は、腫瘍細胞が持続または首尾良く再成長する可能性を低減するために骨髄移植または再構成（たとえば白血病性疾患の治療）を必要とする高用量化学療法である。
多くの場合、細胞毒性薬剤を用いた治療前のタンパク質キナーゼ阻害剤を用いた細胞または腫瘍の前処置は添加物に影響し、多くの場合、細胞死の相乗度にも影響を及ぼす。本明細書に関しては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで共に投与される２つの化合物の効果（所与の濃度にて）が個々に投与される各化合物の効果の和（同一濃度で）を超える場合、２つの化合物は相乗的に作用するものと考慮される。かかる相乗作用は多くの場合細胞サイクルのＧ０−Ｇ１相における細胞に対して作用することができる細胞毒性薬剤を用いて実現される。
【００４４】
本発明に関しては、任意の細胞毒性薬剤を利用することができ、既に述べたように化学療法に好適な多くの細胞毒性薬剤は当技術分野で公知である。かかる薬剤は、たとえば、限定するものではないが、代謝の阻害またはＤＮＡ合成、細胞骨格組織との干渉、ＤＮＡの不安定化または化学修飾、アポトーシスなどを含む任意の機構によって死を媒介する任意の化合物細胞であり得る。たとえば、細胞毒性薬剤は、代謝拮抗物質（たとえば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキセート（ＭＴＸ）、フルダラビン、など）、抗微小管剤（たとえばビンクリスチン、ビンブラスチン、タキサン（パクリタキセル及びドセタキセルなど）、など）、アルキル化剤（たとえばシシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈａｓｐｈａｍｉｄｅ）、メルファラン、ビスクロロエチルニトロソ尿素（ＢＣＮＵ）、など）、白金剤（たとえばシスプラチン（別名ｃＤＤＰ）、カルボプラチン、オキサリプラチン、ＪＭ−２１６、ＣＩ−９７３、など）、アントラサイクリン（たとえばドキソルビシン、ダウノルビシン、など）、抗生物質剤（たとえばマイトマイシン−Ｃ）、トポイソメラーゼ阻害剤（たとえばエトポシド、カンプトテシン、など）、または他の細胞毒性薬剤（たとえばデキサメサゾン）であり得る。細胞毒性薬剤の選択は、本発明の方法の用途によって決まる。研究の場合には、いかなる潜在的な細胞毒性薬剤も（新規細胞毒性薬剤でさえも）、毒素のビタミンＤ（または誘導体）を用いて前処置した細胞または腫瘍への影響を研究するために用いることができる。治療目的に使用する場合、好適な細胞毒性薬剤の選択は、多くの場合患者に独特のパラメータによって決まるであろうが、所与の化学治療プロトコルに対する細胞毒素の投与計画の選択は、当業者の能力範囲で行うものとする。
【００４５】
ｉｎ  ｖｉｖｏアプリケーションの場合、所与の細胞毒性薬剤の適切な投与量は、薬剤及びその製剤によって決まり、所与の患者に対する薬用量及び製剤を最適化することは、当業者の能力範囲で十分に行えるものである。すなわち、たとえば、かかる薬剤は、製剤の標準方法を用いて、経口、皮下、非経口、粘膜下、静脈内、または他の好適な経路を介する投与用に製剤することができる。たとえばカルボプラチンは、約４〜約１５（たとえば約５〜約１２）、またはさらに約６〜約１０のＡＵＣ（「濃度曲線下面積」）を実現するために算出された１日投与量で投与することができる。一般に、ＡＵＣは、クレアチニンの糸球体濾過速度に基づいて、カルバート式を用いて計算される（たとえば査定血漿サンプルを分析することによって）（たとえばＭａｒｔｉｎｏらの１９９９，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９（６Ｃ），５５８７−９１を参照）。パクリタキセルは、約５０ｍｇ／ｍ２〜約１００ｍｇ／ｍ２（たとえば約８０ｍｇ／ｍ２）の濃度範囲で用いることができる。デキサメサゾンを利用する場合、患者体内では、約１ｍｇと約１０ｍｇ（たとえば約２ｍｇ〜約８ｍｇ）間の範囲の投与量で使用することができ、より具体的には、特に患者がヒトである場合、約４ｍｇ〜約６ｍｇの投与量で使用することができる。
【００４６】
本発明に係るチロシンキナーゼ阻害剤の薬用量は、１日当たり、体重１ｋｇにつき、１μｇ〜１ｇである。一実施形態によれば、チロシンキナーゼ阻害剤の薬用量は、１日当たり、体重１ｋｇにつき、０．０１ｍｇ〜１００ｍｇである。チロシンキナーゼ阻害剤の最適な薬用量は、前立腺癌の型及び進行度、患者の全体的な健康状態、チロシンキナーゼ阻害剤の効力、及び投与経路などの要因によってさまざまに変わるであろう。チロシンキナーゼ薬用量の最適化は、当業者の能力範囲で行えるものである。
【００４７】
本発明の別の実施形態は、付属的にタンパク質キナーゼ阻害剤及び糖質コルチコイドを患者に投与することによって患者体内の前立腺癌を治療する方法を提供する。本発明のこの態様によれば、任意のタンパク質キナーゼ阻害剤及び糖質コルチコイドを用いることができ、それらの多くの化合物は本明細書中で論考されているが、他の化合物は当技術分野で公知のものである。また、タンパク質キナーゼ阻害剤及び糖質コルチコイドは任意の適切な方法によって患者に投与するが、その方法の一部を本明細書中に示した。かくしてタンパク質キナーゼ阻害剤及び糖質コルチコイドを好適な調製物に製剤することができ、必要に応じて皮下、静脈内、経口などの経路を介して投与することができる。また、たとえば、糖質コルチコイドをタンパク質キナーゼ阻害剤の投与の前または後に、同時的に患者に投与する。有効な投薬計画の１つには、約５μｇと約２５μｇ／ｋｇ間の量のタンパク質キナーゼ阻害剤を隔日（たとえば月曜日−水曜日−金曜日または火曜日−木曜日−土曜日などの１週間に２〜４日）に投与することであり、また同時に、約１ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇ間の量のデキサメサゾンもヒト患者に隔日で投与することが挙げられる。かかる投与計画では、タンパク質キナーゼ阻害剤を投与する隔日と糖質コルチコイドを投与する隔日とは異なっていてもよいが、同日に投与するほうが好ましい。さらにより望ましくは、同時発生的な治療に先立って、糖質コルチコイドを単独で一回投与する。もとより、本治療は所望の最終結果を達成するために所望の期間にわたって継続することができるが、繰り返すことも可能である。かかる結果には、前立腺癌進行の減弱、当該腫瘍の収縮、または望ましくは、すべての症候の緩解が含まれ得るが、いかなる程度の効果でも、本方法の首尾良いアプリケーションであると考慮する。本方法の効力を評価する好都合な方法は、患者体内の前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）濃度変化に注目する方法である。典型的には、かかる反応は、ＰＳＡ値を約６週間にわたって測定することによって評価する。望ましくは、本方法によりアプリケーション後６週間でＰＳＡ値が少なくとも約５０％減少し、より望ましくはＰＳＡ値が少なくとも約８０％減少する。もとより最も望ましい成果は、ＰＳＡ値がおよそ正常値まで下がることである。
【００４８】
一般的合成法：
ＭＰＳフォーマットのキメラの一般的合成方法
以下の手順では、正常結合用ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴ法を用いた、９６ウェルプレート（ＭＰＳプレート）内、６μｍｏｌペプチド／ウェルのスケール、リンク（Ｒｉｎｋ）アミド樹脂上ペプチド合成を記述する。
１グラムのリンク（Ｒｉｎｋ）アミド（濃度０．６ｍｍｏｌ／ｇ）をＮＭＰ中で穏やかな揺動状態にて一晩膨潤させた。樹脂を９６ウェルプレート（１ウェルにつき約１０ｍｇ）に分注した。
各ウェルに対して、５００μｌの２５％ピペリジン溶液をＮＭＰ中に加えることによってＦｍｏｃ脱保護を行い、６５０ｒｐｍの回転数で１５分間混合し、ピペリジン溶液を窒素の圧力によって除去し、別部分のピペリジン溶液を加えて１５分間拘束した。Ｆｍｏｃ脱保護後及び結合後の樹脂の洗浄を、６００μｌのＮＭＰを各ウェルに入れ、２分間混合し、m窒素圧力によってＮＭＰを除去して行う。この洗浄手順を４回繰り返す。
【００４９】
規則結合を、樹脂に対してＦｍｏｃ保護アミノ酸（１５０μｌ、０．２Ｍ）溶液をＨＯＢＴ／ＮＭＰ中に加え、続いてＨＢＴＵ溶液をＤＭＦ（１５０μｌ、０．２Ｍ）中に加え、ＤＩＥＡをＮＭＰ（１５０μｌ、０．４Ｍ）中に加えることによって行う。反応容器のブロックを６５０ｒｐｍの回転数で１時間混合し、次いで窒素の圧力によって除去した。この手順を一回繰り返す。本構築に用いた最後のアミノ酸をＮ−Ｂｏｃ保護する。構築の終わりに、Ｐｄ（ＰＰｈｅ３）４（５％ＡｃＯＨ＋０２．５％ＮＭＭを含有するクロロホルム中０．２Ｍ）の５００μｌ溶液を注入して１時間混合することによってアリル脱保護を行う（Ｇｌｕ（ＯＡｌｌｙｌ）またはＣ−基礎単位）。この手順を一回繰り返す。アリル脱保護後の樹脂の洗浄を、６００ｕｌのクロロホルムの各ウェルへの添加、及び５分間の混合によって行う。本溶媒は窒素圧力によって除去する。この洗浄をさらに４回繰り返す。アリル保護リンカーのペプチド樹脂への結合を、アリル保護リンカー（１５０ｕｌ、０．２Ｍ、ＮＭＰ中）を入れ、続いてＰｙＢｏＰ（０．２Ｍ、ＮＭＰ中）及びＤＩＥＡ（０．４ｍ、ＮＭＰ中）の添加によって行う。反応容器ブロックを１時間混合し、溶液を窒素の圧力によって除去する。この手順を一回繰り返す。結合後、樹脂を、５００μｌのＮＭＰを各ウェルに添加することによって洗浄する。リンカーからのアリル除去を、上記に記載した同一手順に従って実行する。アリル脱保護後、イソキノリン誘導体（１５０μｌ、０．２Ｍ、ＮＭＰ中）の溶液を追加し、続いてＢｙＢｏＰ（１５０μｌ、０．２Ｍ、ＮＭＰ中）及びＤＩＥＡ（１５０μｌ、０．４Ｍ、ＮＭＰ中）の添加を行う。反応ブロックを２時間混合する。
この結合後、樹脂の洗浄を、６００μｌのＮＭＰを各ウェルに添加し、２分間混合することによって行う。本溶媒は窒素圧力によって除去する。この洗浄をさらに４回繰り返す。
【００５０】
切断及び包括的脱保護を、樹脂を反応容器ブロックからディープウェルマイクロタイタープレート（切断プレート）に移行することによって行う。このプレートに、９２．５％ＴＦＡ、２．５％Ｈ２Ｏ、２．５％ＴＩＳ、２．５％ＥＤＴの溶液を３５０μｌ追加する。該プレートを１０００ｒｐｍで１時間混合し、次いでＴＦＡ溶液を蒸発させ乾燥する。
Ｓｅｐ−Ｐａｋ（セップパック）による精製は、９００μｌの溶液（０．１％ＴＦＡ、水中）＋ＣＨ３ＣＮ  １：１中で樹脂の残基ペプチドを用いて溶解し、Ｃ−１８Ｓｅｐ−Ｐａｋ（セップパック）カートリッジを通すことによって行う。この手順をもう一度繰り返す。プレートを液体窒素中で少なくとも１５分間凍結し、ペプチド凍結乾燥する。
【００５１】
タンパク質キナーゼ活性阻害のための生物学的スクリーニングアッセイ：
（Ａ）無細胞系（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）におけるタンパク質キナーゼ阻害活性のためのアッセイ：
（Ａ１）ＰＫＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼ活性測定法
（１）ＰＫＡ酵素をＰｒｏｍｅｇａから購入した。ＰＫＡ活性を７−ｍｅｒペプチド、ＬＲＲＡＳＬＧ、として知られているｋｅｍｐｔｉｄｅで測定する。測定を９６ウェルプレート内で１ウェルにつき５０μｌの最終容量で実行する。反応混合物には、種々濃度の阻害剤、５０ｍＭのＭＯＰＳ、１０ｍＭのＭｇＡｃ、０．２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、１０μＭのＡＴＰ、２０μＭのＫｅｍｐｔｉｄｅ及び１μのＣｉγ３２Ｐ  ＡＴＰが含まれる。反応は、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．４Ｕ／ウェル中に希釈したＰＫＡの触媒サブユニットを１５μｌ添加して開始する。酵素なしの２つの空ウェルをすべての測定に含める。プレートを３０℃にて１０分間連続的に攪拌する。反応を、１２μｌの２００ｍＭのＥＤＴＡを加えることによって停止する。測定混合物の２０μｌ分割量を２ｃｍ２のホスホセルロース条片（たとえばＷｈａｔｍａｎ  Ｐ８１）上に点滴し、７５ｍＭのリン酸（１サンプルにつき１０ｍｌ）中に浸漬する。ホスホセルロース条片を６回洗浄する。洗浄を５分間の連続回旋で行う。最後洗浄をアセトン中で行う。条片を空気乾燥した後、シンチレーション分光によって放射を測定する。
【００５２】
（２）ＰＫＡ阻害化合物のスクリーニングを、以下にＰＫＢのために記載したように、９６ウェルプレート内でＳＰＡビーズを用いて行ったが、以下の記載と異なる点は、酵素基質を５μＭのビオチン標識された−ｋｅｍｐｔｉｄｅペプチド（ビオチン−ＫＬＲＲＡＳＬＧ）としたことである。キナーゼ緩衝液は、５０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７、０．２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、１０ｍＭのマグネシウムアセテートとした。０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ中に希釈したＰＫＡ（０．４ユニット）を各ウェルに加えた。
【００５３】
（Ａ２）ＰＫＢのｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼ活性測定法
（１）ＰＫＢ活性を、Ａｌｅｓｓｉらの（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３９９，３３３，１９９６）に記載のように測定したが、異なる点は、ビーズに結合したＨＡ−ＰＫＢ代わりに、ニッケルカラム上に沈殿後、可溶Ｈｉｓ−ＨＡ−ＰＫＢを使用したことである。酵素活性測定を、ＰＫＡのためのアッセイに記載のように行う。
（２）ＰＫＢ阻害用化合物のスクリーニングを、９６ウェルプレート内で、先に記載された方法に修正を加えた方法を用いて行った（ＫｕｍａｒらのＢＢＡ，１５２６：２５７−２６８，２００１）。キナーゼ反応を最終容量５０μｌで実行した。各ウェルには、キナーゼ緩衝液［５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ及び０．１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、０．０１％トリトンＸ−１００及び２％ジメチル（Ｍｅ２ＳＯ）］中の２．５μＭのビオチン標識された−Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅペプチド（ビオチン−ＫＧＲＰＲＴＳＳＦＡ）、Ｈｉｓ−ＰＫＢ酵素及び潜在的阻害化合物を含有させた。反応は、１０μｌの２μＭ冷ＡＴＰ及びキナーゼ緩衝液中の０．２５μＣｉの［γ３３Ｐ］−ＡＴＰを加えることによって開始した。gプレートを２７℃にて１時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、２００μｌのＰＢＳを含有する０．１％トリトンＸ−１００、５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＡＴＰ及び０．３ｍｇ／ｍｌのＳＰＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって反応を停止した。室温にて１５分間のインキュベーション後、Ｐａｃｋａｒｄ  ＧＦ／Ｂ  ９６ウェルプレートを用いて反応混合物をろ過した。プレートは、２ＭのＮａＣｌ及び１％オルトリン酸で２回洗浄し、続いてエタノール洗浄を行い１時間空気乾燥させた。マイクロプレートＰａｃｋａｒｄトップカウントを用いて放射能を計数した。
【００５４】
（Ａ３）ＰＫＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイ
ＰＫＣをＰｒｏｍｅｇａから取得し、リン脂質の存在下および不在下で、同一製造者から取得したキットを用いて製造者の指示に従って測定を行った。リン脂質存在下活性からリン脂質不在下活性を減算することによってＰＫＣ活性を定量した。アッセイにおけるＡＴＰ濃度は１０μ（ＡＴＰ＝５０μＭに対するＫｍ）であった。
【００５５】
（Ｂ）無処置細胞におけるＰＫＢ活性阻害のためのアッセイ：
いくつかの癌細胞株を用いて無処置細胞におけるＰＫＢ阻害化合物の活性を定量した。ヒト前立腺癌腫細胞株、ＰＣ−３及びＬＮＣａＰ。ヒト急性Ｔ細胞白血病細胞株、ジャーカット。ヒト乳癌腫細胞株：ＭＣＦ−７及びＭＤＡ４６８及び腎アデノ癌腫細胞７８６−Ｏ。ＬＮＣａＰ、ＭＤＡ４６８、７８６−Ｏ及びジャーカット細胞株は高い基礎レベルの活性化ＰＫＢを発現する。ＰＣ−３は中程度の活性化ＰＫＢを発現する。ＭＣＦ−７は、レベルは低いが誘発性の活性化ＰＫＢを発現する。対照細胞を、ＰＢＬ、正常ドナー（血液銀行）から取得した正常末梢血液リンパ球、及び抗腫瘍性の乳房細胞株であるＭＣＦ１０Ｆとする。該対照細胞を使用して、タンパク質キナーゼ阻害剤の検査癌細胞及び正常細胞に及ぼす影響を比較検討する。
【００５６】
（Ｂ１）アポトーシス検出のためのアッセイ：
酵素阻害アッセイにおいて活性であるペプチド複合体を、癌細胞株のアポトーシスの誘導に関して、細胞内で検査した。アポトーシスを、個々の細胞株において少なくとも２つの方法によってアッセイした。細胞を、異なる時点に対する阻害化合物による処置の有無にかかわらず、各方法に対して適切なプレートに播種し、下記方法のうちの１つによって解析した。
【００５７】
（ａ）アネキシンＶ染色
このアッセイは、細胞膜上のホスファチジル（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌ）−セリン提示の初期事象を同定する。細胞を、アネキシンＶ（Ｂｅｎｄｅｒ  ｍｅｄｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてアポトーシスに対してアッセイした。細胞を６−ウェルプレート（０．３ｘ１０６／ウェル）に播種し、阻害化合物を用いた治療後２４時間、ＰＢＳで２回洗浄し、アネキシンＶ結合性緩衝液（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ／ＮａＯＨ  ｐＨ７．４、１４０ｍＭのＮａＣｌ及び２．５ｍＭのＣａＣｌ２）中で再懸濁した。アネキシンＶを１：４０で希釈し、０．２ｎＭのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）と共に個々のサンプルに加えた。１サンプル毎に０．５ｘ１０６細胞を採取し、ＦＡＣＳ法によって解析した。
（ｂ）カスパーゼ活性。
このアッセイはアポトーシスの極めて初期の事象を示す。カスパーゼ（１、８、９、５、７、３、６、４、及び２）活性を、阻害化合物を用いた治療後２４時間、ＣａｓｐａＴａｇカスパーゼ活性キット（Ｉｎｔｅｒｇｅｎｅ）を用いて、製造者の指示に従ってアッセイした。簡単に、１０６の懸濁細胞／サンプルを１０μｌの３０Ｘ作動希釈液ＦＡＭ−ペプチド−ＦＭＫ−フルオレッセインで標識化し、１時間３７℃にて５％ＣＯ２下でインキュベートした。サンプルを、１Ｘ作動希釈液、洗浄緩衝液で３時間洗浄し、細胞ペレットを７００μｌの同一緩衝液で再縣濁した。２μｌの０．２ｎＭヨウ化プロピジウム溶液を加え、カスパーゼ活性をＦＡＣＳ分析によって定量した。
【００５８】
（ｃ）ＤＮＡ断片化測定。
ＤＮＡ断片化は、アポトーシスカスケードにおける後発事象である。ＤＮＡ断片化を、阻害化合物を用いた治療後７２時間、ｉｎ  ｓｉｔｕ細胞死検出キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、製造者の指示に従って測定した。簡単に、２ｘ１０６の接着細胞／サンプルをトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、９６ウェルプレート内に置換した。次いで、サンプルを室温にて１時間、ＰＢＳ内の２％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、ＰＢＳで洗浄し、氷上で２分間透過処理溶液で再懸濁した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１時間、３７℃にて、標識溶液及びＴｄＴ酵素溶液を含有するＴＵＮＥＬ反応混合物を用いて標識化した。サンプルを再度ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳ法によって解析した。
【００５９】
（Ｂ２）成長阻害アッセイ：
酵素阻害アッセイにおいて活性であることが見出された選択ペプチド複合体を腫瘍細胞株の成長を阻害する能力に関してスクリーニングした。当初、５０μＭの濃度で阻害化合物のスクリーニングを行った。第１スクリーニングからの活性化合物を、そのＩＣ５０を定量するため、種々の濃度（５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５及び１．５６μＭ）にてさらに検査した。成長阻害を、２つの方法：（Ａ）メチレンブルーによる生存能力のある細胞の染色法、（Ｂ）３Ｈ−チミジンの組み込み法をそれぞれ用いて検査した。両方法の場合、検査化合物を加える前に、９６ウェルプレート：ＬＮＣａＰ（１ウェルにつき５０００細胞、７２時間）、ＰＣ３（１ウェルにつき５０００細胞、４８時間）、ジャーカット（１ウェルにつき２５００細胞、２４時間）、ＭＤＡ４６８（１ウェルにつき５０００細胞、２４時間）、及び７８６−Ｏ（１ウェルにつき１０００細胞、２４時間）内で細胞を育てた。本測定は、１〜６日間、３通りで行った。
【００６０】
（ａ）メチレンブルーによる生存能力のある細胞の染色法：
細胞を０．５％グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ）によって固定し、続いて、１時間、ボラート緩衝液（Ｓｉｇｍａ社）中で１％メチレンブルーを用いて染色した。次いで、細胞を蒸留水で数回洗浄し、空気乾燥し、３７℃にて１時間、０．１ＭのＨＣｌをに加えることによって色を抽出した。°ＥＬＩＳＡリーダーにより、６００ｎｍにて光学密度を測定することによって色の強度の定量化を行った。
（ｂ）３Ｈ−チミジンの組み込み法：
適時に、培養液中、５時間、１ｕｃｉの３Ｈ−チミジン（５Ｃｉ／ｍｍｏｌｅの在庫、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を１００ｕｌの培地を含有する各ウェルに加えた。インキュベーションの終わりに、細胞を、セルハーベスター（Ｐａｃｋａｒｄ、米国）を用いてＰＢＳで数回洗浄し、数時間空気乾燥し、５０μｌのシンチレーション液を加えた。マイクロプレートカウンター：Ｐａｃｋａｒｄトップカウントを用いて放射能を計数した。
Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）３．３、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）の一部位競合モデルにおける非線形回帰を用いて、５０パーセント阻害濃度（ＩＣ５０）値を計算した。
【００６１】
（Ｂ３）ＰＫＢ及び下流基質リン酸化の阻害：
ＰＫＢの阻害剤として同定されたペプチド複合体を、いくつかのＰＢＫ下流基質のリン酸化を阻害する能力に関して細胞内でさらに検査した。基質ＧＳＫ３は細胞代謝及び細胞サイクルと関連する。フォークヘッド（ＦＫＨＲ）は直接的にアポトーシスと関連する。また、これらのアッセイにおける阻害活性は、陽性化合物が細胞を透過することも示す。
細胞（２ｘ１０６）を２５ｃｍ２のフラスコに播種し、正常培地条件にて２日間増殖した。阻害化合物を２４時間加え、それらのＳｅｒ４７３残基でＰＫＢリン酸化に及ぼす影響、およびＰＫＢ、ＧＳＫ３及びＦＫＨＲの特定の基質のリン酸化に及ぼす影響を解析した。治療の終わりに、細胞を溶解緩衝液を用いて溶解した（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％トリトン−ｘ１００、２５ｍＭのＮａＦ、２ｍＭのＡＥＢＳＦ、１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、１０ｍＭのβ−グリセロリン酸（リン酸塩）、１μｇ／ｍｌのアプロトニン及び５μｇ／ｍｌのロイペプチン）。等分量の細胞タンパク質ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、ＰＶＤＦ膜にエレクトロブロットした。Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から取得したホスホ−Ａｋｔ１（Ｓｅｒ４７３）、ホスホ−ＧＳＫ３α（Ｓｅｒ２１）及びリン光体−ＦＫＨＲ（Ｔｈｒ２４）、及びＡｋｔ１（Ｕｐｓｔａｔｅ）、ＧＳＫ３α（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、及びＦＫＨＲ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対する抗体を用いてウエスタンブロット分析を行った。
ＭＣＦ−７細胞株を使用する際、阻害化合物の添加後１０分間、５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１（Ｓｉｇｍａ社）を用いて細胞を刺激し、ＩＧＦ−１のみによって刺激した細胞と比較検討した。阻害化合物の効果を上記詳細のとおり分析した。
【００６２】
（Ｃ）ＰＫＢ阻害剤の効力を評価するためのｉｎ  ｖｉｖｏモデル
急性及び慢性毒性の諸研究によって実験的に決定された化合物の適切な投与量を、腫瘍に対して、その成長のさまざまな段階で注入する。初期段階での注入は、腫瘍成長に対して複合作用を及ぼし、確立した腫瘍への注入は、その退行に影響を及ぼす。加えて、化合物を公知の化学療法薬剤と共に腫瘍に注入するような相乗研究を行い、アポトーシス増加につながるＰＫＢ阻害が原因で化学療法に対する感受性を増加した腫瘍から生じる相乗作用効果を評価する。
本化合物を、前立腺癌細胞株に由来する腫瘍異種移植片において、その腫瘍成長に及ぼす影響に関して試験する。
【００６３】
（ｉ）ＰＣ３細胞
（ｉｉ）ＬＮＣａＰ細胞
（ｉｉｉ）ＭＤＡ４６８
（ｉｉｉｉ）７８６−Ｏ
本研究は、２つの部分：最大耐量（ＭＴＤ）の決定と、効力実験とに分かれている。
（Ｃ１）    ＭＴＤ決定
Ｂａｌｂ／Ｃマウス（雄、生後４〜６週間、Ｈａｒｌａｎ  Ｃｏ．Ｉｓｒａｅｌ）を用いてＭＴＤを決定した。
急性用ＭＴＤの決定：急性用ＭＴＤを決定するために、個々の化合物をさまざまな薬用量にてＩＶ注入し、注入後マウスの急性的な臨床的症状の発現を２４時間にわたって観察した。
【００６４】
加えて、急性用及び慢性用ＭＴＤを決定した。第１ステップとして、１ｋｇの体重につき、１６０、８０、４０、２０及び１０ｍｇの薬用量でＩＰ注入を一回づつ行った後、急性用ＭＴＤを決定した。慢性用ＭＴＤをさらに検査するため、マウスに連続３週間、毎日急性用ＭＴＤの５０％、２５％及び１２．５％のＩＰ注入を行った。マウスの全体的な健康状態を、治療期間中及び治療後さらに３週間にわたって毎日監視した。実験終了時点では、全解剖を行った。
【００６５】
（Ｃ２）          ＰＣ３腫瘍を有するマウスにおける有効性研究
（ａ）ＰＣ３細胞（５Ｘ１０６）を、雄ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｃｏ．、Ｉｓｒａｅｌ）のマトリゲルと臀部に皮下注入した。腫瘍サイズは、キャリパーによって測定し、（式）：長さＸ（幅２）Ｘ０．４を用いて決定した。腫瘍を、体積が約５０ｍｍ３になるまで成長させた後、治療を開始した。化合物の適切な投与量を腫瘍周辺部位（ＩＴ注入）に皮下注入した。治療は、週に３回、２週間にわたって隔日毎に与え、腫瘍サイズを２日置きに測定した。
（ｂ）ヒト前立腺のＰＣ−３癌細胞を生後５週間で約２０ｇのＢａｌｂ／ｃ雄ヌードマウスの皮下に移植した。個々のマウスには、第１日目に２．５ｘ１０６細胞が提供されるであろう。腹腔内（ｉ．ｐ．）治療は、腫瘍体積が約５０ｍｍ３到達するときに開始する。ｉ．ｐ．投与は、予備試験において高度に満足できるものであり、血液及び肝臓の安定性、血液を介した腫瘍への分配を実証する。対照群は、１ｘ１０−２Ｍ滅菌生理食塩水中で媒体（１０％ＤＭＳＯと９０％２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）を用いて処理した。キャリパーによる腫瘍体積の測定値（方程式＝長さｘ幅２ｘ０．４）及び体重は、週３回（月曜日、水曜日及び金曜日）に記録する。マウスの全体的な健康状態は１日に２回監視する。それぞれの媒体による処置群の腫瘍質量が体重の約２０％に達する時点、または、治療３週間後に処置群の腫瘍質量が体重の約２０％に達しない場合には、マウスを屠殺する。実験終了時点には、個々の群において屠殺したマウスの最初の３匹の腫瘍を回収し、さらなる組織学的な検討のためにパラフィンブロック内に包埋する。残りの腫瘍を回収し、ウエスタンブロット分析用に液体窒素中で凍結する。
【００６６】
以下の実施例は、本発明の製造方法及び使用方法を例示する目的で提供されるものであり、本発明を限定するものとして解釈されてはならない。これから本発明をその具体的な実施形態に関して説明するが、当業者であれば多くの修正形態及び変形形態を容易になし得ることは明らかである。従って、かかるすべての修正形態及び変形形態は本発明の特許請求の範囲の真の趣旨及び広義の範囲内に包含されるものとする。
【００６７】
実施例１
ペプチド及びペプチド模倣物の複合体の設計及びスクリーニング
３つのペプチド及びペプチド模倣物を核分子として使用し、種々の複合体をベースとする数種類の修正形態を適用した。コアペプチドを、そのタンパク質キナーゼ阻害活性と共に以下の表に提示する。
【００６８】
【表１】
2007527858.tif 000002
【００６９】
この実施例においてコアペプチドに対する結合に使用した細胞透過性部分は下記の通りである。
脂肪酸、ステロイド及びかさ高い芳香族または脂肪族の化合物などの疎水性部分。
ステロイド、ビタミン類及び糖類などの細胞膜受容体または担体を有することができる部分。
公知のトランスポーターペプチドまたはアミノ酸。
結果として生じたペプチド複合体をタンパク質キナーゼ活性の阻害に関して種々の無細胞及び細胞に基づくアッセイにおいて検査したが、そのスクリーニングの結果は、一部の修正形態が安定性及び細胞透過性を誘導し、その結果として８〜２０μＭの細胞活性を関連する細胞株：前立腺癌ＰＣ３及びＬＮＣａＰ、Ｔ−細胞白血病ジャーカット、及び乳癌ＭＣＦ−７において起こすことを示した。加えて、一部の新規複合体は、先に記載のキメラ化合物とは対照的に、ＰＫＡよりもＰＫＢに対して１０〜２０倍選択的でもあった。
【００７０】
疎水性部分の複合体ファミリーのうちでは、コレステロールが最善の結果を示したが、テストステロン及びリトコール酸などの他のステロイドは細胞活性をまったく示さなかった。また、脂肪酸複合体の細胞活性は、コレステロールＰＴＲ６１６４の１２μＭと比べてＰＴＲ６１８０の場合には、極めて低い値２５〜５０μＭを示した。また、ＰＴＲ６１６４は、膜受容体、または疎水性検討材料及び膜受容体／トランスポーターの組み合わせを介して透過することもできる。ビオチン及びフルオレッセイン（ＰＴＲ６１５８及びＰＴＲ６１８２）などの他の疎水性複合体は、低細胞透過性を示した。
膜受容体またはトランスポーターを目的としたファミリーのうちでは、糖類が極めて低い細胞活性を示した。検査したいくつかのビタミン類は、細胞活性を有していなかったが、１５〜２０μＭの細胞活性を示したビタミンＥ複合体はその例外である。
ペプチドトランスポーター複合体のうちでは、検査した９６のすべての化合物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにおいて極めて活性であり、１０〜５０倍と極めて選択的であったが、細胞内ではほとんどの化合物は不活性であった。選択した６つの活性複合体は細胞内で８〜２０μＭの活性を示す。
【００７１】
実施例２
ＰＴＲ６１５４、ＰＴＲ６１８４、ＰＴＲ６１８０、ＰＴＲ６２４４、及びＰＴＲ６２５２の合成
１グラムのリンク（Ｒｉｎｋ）アミドＭＢＨＡ樹脂（０．６４ｍｍｏｌ／ｇ）を焼結ガラス底部を装備する反応容器内のＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中で膨潤させ、振盪機に載せた。すべてのＦｍｏｃ保護群を、ＮＭＰ中の２０％ピペリジンとの反応（２回、１５分間、各１０ｍｌ）によって除去し、続いてＮＭＰ洗浄（５回、２分間、各１５ｍｌ）を行った。Ｆｍｏｃ除去はニンヒドリン検査によって監視した。第１アミノ酸を、３当量のＦｍｏｃ保護アミノ酸＋３当量のＰｙＢｒｏＰ＋６当量のＤＩＥＡ（７ｍｌのＮＭＰ中）を用いることによって反応時間１．５時間で樹脂に結合した、他のＦｍｏｃ保護アミノ酸の結合を、ＮＭＰ（７ｍｌ）中、３当量１．９２ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃアミノ酸＋ＰｙＢｒｏｐ（３当量、１．９２ｍｍｏｌ）＋ＤＩＥＡ（６当量、３．８４ｍｍｏｌ）を用いて１時間室温にて実行した。反応完了は定性的ニンヒドリン検査（カイザーテスト）によって監視した。個々の結合後、ペプチド樹脂をＮＭＰで洗浄した（５回、１５ｍｌのＮＭＰを使用、各２分間）。
【００７２】
構築終了時には、ペプチド樹脂をＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、低圧力下で乾燥し、次いで、ＴＦＡ  ９５％、水２．５％、ＴＩＳ（トリ−イソプロピル−シラン）２．５％との、アルゴン雰囲気下、０（零）℃にて１５分間、及び室温にて１．５時間の反応によって樹脂から切断した。混合物をろ過し、樹脂を小容量のＴＦＡで洗浄した。濾液をロータリエバポレータに配置し、すべて揮発性成分を除去した。油状生成物を取得した。油状生成物をエーテルで倍散し、エーテル液で３回デカントした。白色粉末を取得した。この粗生成物を低圧力下で乾燥した。
【００７３】
ＰＴＲ６１５４：Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：７）
【００７４】
【化１】
2007527858.tif 000003
【００７５】
ＰＴＲ６１８４：Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：９）
【００７６】
【化２】
2007527858.tif 000004
【００７７】
ＰＴＲ６１８０：ミリスチル−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２８）
【００７８】
【化３】
2007527858.tif 000005
【００７９】
ＰＴＲ６２４４：ビタミンＥスクシナート−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２５）
【００８０】
【化４】
2007527858.tif 000006
【００８１】
ＰＴＲ６２５２：（ＤＡｒｇ）９−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２６）
【００８２】
【化５】
2007527858.tif 000007
【００８３】
実施例３
ＰＴＲ６２６０の合成
５００ｍｇのリンク（Ｒｉｎｋ）アミドＭＢＨＡ樹脂（０．６４ｍｍｏｌ／ｇ）を、焼結ガラス底部を装備するリアクター内で１．５時間ＮＭＰ中で膨潤させ、振盪機に取り付けた。Ｆｍｏｃを、ＮＭＰ（４ｍｌ）中２５％ピペリジンを２回１５分間用いて樹脂から分離し、続いてＮＭＰ（５ｍｌ）で各２分間の慎重な洗浄を７回行った。Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｏｒｎ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ａｒｇの構築を、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＡｌｌｙｌ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、及びＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨのそれぞれを用いて結合サイクルによって達成した。個々の結合サイクルでは、アミノ酸（３当量）をＮＭＰ中に溶解し、ＰｙＢｒｏＰ（３当量）及びＤＩＥＡ（６当量）を用いて活性化した。ポジション４にてＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨの結合後、アリル脱保護を、５％ＡｃＯＨ及び２．５％ＮＭＭを含有するＣＨ２Ｃｌ２溶液中のＰｄ（ＰＰｈ３）４を用いて行った。遊離酸を、ＮＭＰ中３当量のＰｙＢｏＰ、６当量のＤＩＥＡによって活性化し、３当量のエチレンジアミンスルホンアミドイソキノリンと１時間結合した。結合後、ペプチド樹脂をＮＭＰで洗浄し、次いでＦｍｏｃを除去し、続いてＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨとＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨとの結合を行った。コレステロールのＮ−末端Ａｒｇへの結合を、ジオキサン：１、コレステロール（５当量）＋ＢＴＣ（１．６６当量）＋コリジン（１５当量）を含有する３−ジクロロプロパン１：２の溶液を１５ｍｌ加えることによって実行した。結合時間は１．５時間であった。
【００８４】
合成の終わりに、アルゴン雰囲気下、０（零）℃にて１５分間、次いで室温にて１時間、総容量１０ｍｌの反応混液混合物中で７０％ＴＦＡ、７％ＴＩＳ及び２３％ＣＨ２Ｃｌ２を用いてペプチドを樹脂から切断した。抽出フィルターを介して溶液をポリプロピレンチューブ内にろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２中７０％ＴＦＡの溶液５ｍｌを用いて樹脂を洗浄した。結合溶液を蒸発させて油状残基を得、該油状残基を冷Ｅｔ２Ｏによる処理を行って凝固させる。真空下、一晩にわたる白色固体のＥｔ２Ｏ層の遠心分離及びデカンテーション、及び冷Ｅｔ２Ｏの追加部分による処理、それに続く遠心分離、デカンテーション及び乾燥を行うことによって以下の構造を有するＰＴＲ６２６０を示した粗材料を得た。
【００８５】
ＰＴＲ  ６２６０：コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ−Ｇｌｕ（アミノエチルスルホンアミドイソキノリン）−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（配列番号：２７）
【００８６】
【化６】
2007527858.tif 000008
【００８７】
実施例４
コレステロールに結合したペプチドの合成
１グラムのリンク（Ｒｉｎｋ）アミドＭＢＨＡ樹脂（０．６４ｍｍｏｌ／ｇ）を焼結ガラス底部を装備する反応容器内のＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中で膨潤させ、振盪機に載せた。すべてのＦｍｏｃ保護群を、ＮＭＰ中の２０％ピペリジンとの反応（２回、１５分間、各１０ｍｌ）によって除去し、続いてＮＭＰ洗浄（５回、２分間、各１５ｍｌ）を行った。Ｆｍｏｃ除去はニンヒドリン検査によって監視した。第１アミノ酸を、３当量のＦｍｏｃ保護アミノ酸＋３当量のＰｙＢｒｏＰ＋６当量のＤＩＥＡ（７ｍｌのＮＭＰ中）を用いることによって反応時間１．５時間で樹脂に結合した、他のＦｍｏｃ保護アミノ酸の結合を、ＮＭＰ（７ｍｌ）中、３当量１．９２ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃアミノ酸＋ＰｙＢｒｏｐ（３当量、１．９２ｍｍｏｌ）＋ＤＩＥＡ（６当量、３．８４ｍｍｏｌ）を用いて１時間室温にて実行した。反応完了は定性的ニンヒドリン検査（カイザーテスト）によって監視した。個々の結合後、ペプチド樹脂をＮＭＰで洗浄した（５回、１５ｍｌのＮＭＰを使用、各２分間）。コレステロールのＮ−末端Ａｒｇへの結合を、ジオキサン：１、コレステロール（５当量）＋ＢＴＣ（１．６６当量）＋コリジン（１５当量）を含有する３−ジクロロプロパン１：２の溶液を１５ｍｌ加えることによって実行した。結合時間は１．５時間であった。
【００８８】
構築終了時では、ペプチド樹脂をＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、低圧力下で乾燥し、次いで、ＴＦＡ  ７０％、水、ＴＩＳ（トリ−イソプロピル−シラン）７％、ＣＨ２Ｃｌ２２３％との、アルゴン雰囲気下、０（零）℃にて１０分間、及び室温にて５０分の反応によって樹脂から切断した。混合物をろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２中の小容量の７０％ＴＦＡで樹脂を洗浄した。濾液をロータリエバポレータに配置し、すべて揮発性成分を除去した。油状生成物を取得した。油状生成物をエーテルで倍散し、エーテル液で３回デカントした。白色粉末を取得した。この粗生成物を低圧力下で乾燥した。
【００８９】
ＰＴＲ６１６４：コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２２）
【００９０】
【化７】
2007527858.tif 000009
【００９１】
ＰＴＲ６１９６：コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２３）
【００９２】
【化８】
2007527858.tif 000010
【００９３】
ＰＴＲ６１９８：コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２４）
【００９４】
【化９】
2007527858.tif 000011
【００９５】
実施例５
トランスポーターペプチドに結合したペプチド
表２では、トランスポーターペプチドを含むペプチド複合体のスクリーニングを記述する。細胞内でも活性であったペプチドには斜線を施した。
【００９６】
【表２−０１】
2007527858.tif 000012
【表２−０２】
2007527858.tif 000013
【００９７】
表３には、選択したトランスポータープレート６００２５からの最も活性であるペプチドのＩＣ５０（μＭ）値を示す。上記のアッセイＢ２に従って成長阻害を測定した。上記のアッセイＡ２、ＬＮＣａＰ細胞におけるＰＫＢのｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼ活性測定法に従って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＰＫＢ阻害を測定した。
【００９８】
【表３】
2007527858.tif 000014
【００９９】
実施例６
ペプチド複合体の活性
選択した最も活性であるペプチド複合体の活性及び選択性を表４に提示する。
【表４】
2007527858.tif 000015
【０１００】
癌細胞における細胞死を引き起こす化合物の能力を判定するこれら化合物の成長阻害曲線を下記の図１〜図３に提示する。
図１には、ＰＴＲ６１６４及びＰＴＲ６２４４による治療後のＰＣ３細胞の生存性を描写し、図２には、ＰＴＲ６１８０、ＰＴＲ６１９８及びＰＴＲ６２４４による治療後のＬＮＣａＰ細胞の生存性を記述し、図３には、ＰＴＲ６２５２、ＰＴＲ６２６０及びＰＴＲ６２４４による治療後のＬＮＣａＰ細胞の責務を示す。
記載の高阻害活性は、本化合物には、効果的な抗癌薬物としての化合物の評価において重要な、腫瘍における細胞死または成長停止を誘導することに効率的であることを示す。
表５では、細胞内で不活性な選択ペプチド複合体を提示する。
【０１０１】
【表５】
2007527858.tif 000016
【０１０２】
実施例７
細胞内におけるペプチド複合体の阻害活性のさらなる評価
下流基質リン酸化アッセイは、ＰＫＢ経路において阻害剤が作用しているかどうかを評価することを目的とする。いくつかのタンパク質をリン酸化するＰＫＢは、細胞サイクル、細胞代謝及びアポトーシス、及び細胞内の酵素阻害に関与する結果、その基質のリン酸化を低下させる。これらの諸研究では、ＧＳＫ３（細胞代謝と関連する）及びＦＫＨＲ（フォークヘッド、アポトーシスと直接的に関連する）のリン酸化を検討した。その結果は、癌細胞の本発明に係る選択ペプチド複合体への暴露によって生じるこれら基質のリン酸化における著しい減少を示す。
ＰＫＢは、癌細胞のアポトーシスにおいて中心的な役割を演じる。ＰＫＢは、癌細胞によるプログラム細胞死を防止する「生存シグナル」を送信する。よって、該阻害は、アポトーシスを介した細胞死を引き起こす。アポトーシスアッセイは、本ＰＫＢ阻害剤と接触する癌細胞がプログラム細胞死の結果として死滅することの確定を目的とする。これは、阻害剤の効果は単なる細胞毒性ではなく、ＰＫＢの阻害によって誘導されるアポトーシスプロセスであることを意味する。アポトーシスは複雑なプロセスなので、さまざまなステップを標的にする下記の３つのアッセイを使用する。それらおｎアッセイは、（１）極めて初期のアポトーシス事象における種々のカスパーゼの活性を測定するカスパーゼ活性アッセイ。（２）より高度な事象において細胞膜上に存在する特定化合物を染色するアネキシンＶ染色。及び（３）アポトーシスプロセスにおいて後発的に起こるＤＮＡ断片化。その結果は、選択した阻害剤が少なくとも２つの異なるアポトーシスアッセイにおいて効果を有することを示す。
図４では、ＬＮＣａＰ細胞におけるＡＫＴ（Ｓ４７３）及びＧＳＫ３（Ｓ９／２１）リン酸化の同定を開示する。細胞を３０μＭのＰＴＲ６１６４、ＰＴＲ６１９６または１０ｕＭのＰＴＲ６０７２で２４時間処理し、ウエスタンブロット分析法によってリン酸化を測定した。
【０１０３】
表６では、ＤＮＡ断片化をＬＮＣａＰ細胞内のアポトーシスのマーカー及びジャーカット細胞内のカスパーゼ活性として示し、ＬＮＣａＰ細胞を３０μＭのＰＴＲ６１９８、ＰＴＲ６１９６、ＰＴＲ６１６４またはＰＴＲ６２４４で７２時間処理した。ジャーカット細胞を１５μＭのＰＴＲ６１９８、ＰＴＲ６１９６、ＰＴＲ６１６４または２５μＭのＰＴＲ６２４４で２４時間処理した。アポトーシスは、材料および方法において詳細したように、ＬＮＣａＰ細胞内のＤＮＡ断片化測定及びジャーカットにおけるカスパーゼ活性のＦＡＣＳ分析によって測定した。
【０１０４】
【表６】
2007527858.tif 000017
【０１０５】
実施例８
ＰＫＢの細胞透過性および血清安定性の阻害剤としてのＰＴＲ６１６４のさらなる特徴付け
ここで活性なＰＫＢ阻害剤として発見したＰＴＲ６１６４は、いくつかの追加アッセイにおいてさらに特徴づけられている。最近明らかになったのは、この化合物が強力で選択的な血清安定性を持つ細胞透過性ＰＫＢ阻害剤であって、抗癌薬物のさらなる開発に有望な候補であるという事実である。この化合物は、癌細胞内の細胞死、３つの異なるアッセイにおいてアポトーシスを誘導し、減少ＧＳＫ３及びＦＫＨＲのリン酸化を減少する。
図５には、３７℃でのマウス血漿中におけるＰＴＲ−６１６４のバイオスタビリティーの結果を示す。０．５ｍｇのＰＴＲ６１６４を５０μｌのＤＭＳＯ中に溶解し、水で４５０倍希釈した。１０μｌのこの溶液を、さまざまな時間に、各３通りに、９０μｌのマウス（Ｂａｌｂ  Ｃ）血漿に加え、３７℃でインキュベーションした。インキュベーション後、サンプルを一晩凍結した。ペプチド量を、水で５倍に希釈した後の血漿から直接的にＨＰＬＣ−ＭＳによって決定した。個々のサンプルを以下の仕様を用いて２回注入した。
【０１０６】
カラム：ｐｅｐ８５Ｃ１８Ｚｏｂｒａｘ  ２．１＊５０ｍｍ
溶出剤：ＭｅＣＮ：水（＋０．１％ＴＦＡ）８：２、２．１分のＲＴでペプチド出現。
検出器：ＳＲＭ、ＭＳ、スプリットレスモード。
実行時間：６分間。
図６には、アネキシンＶ染色を用いてジャーカット細胞内に誘導したアポトーシスを示す。細胞を１２．５μＭまたは２５μＭのＰＴＲ６１６４で１２及び２４時間処理し、及び時間／用量依存性アポトーシスをアネキシンＶ染色及びＦＡＣＳ分析によって測定した。
【０１０７】
実施例９
正常血球と対比した癌細胞内の本ＰＫＢ阻害剤によって誘導された細胞成長阻害
阻害剤の安全性を評価するするために、誘導された癌（前立腺ＬＮＣａＰ系）細胞死を誘導された正常血球死と比較した。第７図において、ＰＴＲ６１６４（Ａ）及びＰＴＲ６２６０（Ｂ）を結合するペプチドは７〜１１μＭで癌細胞の死を引き起こすが、正常細胞に対しては５０μＭを超えても安全であることが観察されるであろう。逆に、小分子（ＰＴＲ６０７４）は、正常細胞に対する場合と比べると癌細胞に対して３倍の毒性を持つ。
【０１０８】
実施例１０
インビトロ研究
鉛化合物ＰＴＲ６１６４をはじめとする選択した活性複合体を、使用上の最大耐量（ＭＴＤ）を決定するために上記のアッセイ（Ｃ１）で検査した。ＰＴＲ６１６４に対して見出されたＭＴＤ値は、極めて安全な値と考慮される１３０ｍｇ／ｋｇ以上であった。ＰＴＲ６１６４の高安全性によって、極めて大きな治療濃度域が可能になる。複合体をさらに、上記（Ｃ２）で記載したように有効性研究においてｉｎ  ｖｉｖｏで下記の通り検査した。
ペプチドを隔日毎に腫瘍領域に注入した。３注入後、腫瘍サイズ低減の指標傾向を観察した。第２週間で、低減は継続し、高投与量のＰＴＲ６１６４によって処置した群では、５匹の動物のうちの４匹は、第８図に記載のように腫瘍の完全退行を示した。ペプチド投与量は３．３ｍｇ／ｋｇではあったが、この化合物のＭＴＤは４０倍高く、高い治療指数を指摘する。
ＭＴＤが０．５及び０．２５である、２つの濃度６６ｍｇ／ｋｇ及び３３ｍｇ／ｋｇを検査した。比較的に高い用量を選択したが、その理由は、本発明者等には前もって本化合物の薬物動態学に関する認識がなく、高用量の結果として毒性効果は期待されたものの、最大効果を得ることを望んだからである。
化合物を生理食塩水中１０％ＤＭＳＯ／９０％シクロデキストリンの溶液中に溶解した。各９匹のマウスからなる６群を検査した。２群には化合物を４８時間毎にｉ．ｖ．注入し、２群には動化合物を毎日ｉ．ｐ．注入した。治療は、移植後７日目に開始し、２１日間を継続し、続いて１４日間の観察期間をおいた。実験は、表７のように４つの実験群からなる。
【０１０９】
【表７】
2007527858.tif 000018
【０１１０】
結果は、４８時間毎に注入を受けた群が腫瘍サイズへの影響を表さないことを示した。しかし、毎日注入を受けた群は、腫瘍成長の著しい阻害を示した。興味深いことには、６６ｍｇ／ｋｇ及び３３ｍｇ／ｋｇの両投与は同一の効果を示し、効力を失うことなしに濃度をさらに低下できる可能性があることを暗示した。最も重要なことは、実験により、化合物を血流を介して腫瘍に効果的に分配し得ることが証明された。これはペプチドベースの薬物にとって極めて重要な観察である。図９には、２つの異なるｉ．ｐ．処置群の対照動物及び処置動物における腫瘍サイズのグラフを描写し、図１０には、ＰＴＲ６１６４の、異種移植片を有するヌードマウスＰＣ３からの染色された腫瘍切片におけるアポトーシス及び有糸分裂への影響を記述する。阻害剤の効果が、腫瘍病原力に関わらず極めて著しいことは明白である。この化合物の予備試験は、６１６４の一般構造体を持つペプチドベースの化合物を全身的に効率的かつ効果的に投与できることを証明した。
【０１１１】
実施例１１
ＰＴＲ６１６４の最適化
最適化プロセスをプロトタイプ化合物ＰＴＲ６１６４に対して行い、ＰＴＲ６１６４の一般構造体を有する新規化合物を、構造上のペプチド模倣修飾と共に、タンパク質キナーゼ活性阻害向けに合成及びスクリーニングした。配列及び活性結果を表８に提示する。驚いたことに、Ｌｙｓ２−４のＰＴＲ６１６４への添加が、化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性に寄与することが見出された。具体的には、わずかな量の新規化合物が、すべての細胞アッセイにおいてＰＴＲ６１６４よりも約５倍強力であり、著しくより選択的であることが判明した。
【０１１２】
【表８−０１】
2007527858.tif 000019
【表８−０２】
2007527858.tif 000020
【表８−０３】
2007527858.tif 000021
【表８−０４】
2007527858.tif 000022
【０１１３】
活性が癌細胞内で観察されたが正常細胞では観察されないとき（ＰＢＬｓ  ＩＣ５０／ＬＮＣａＰＩＣ５０＞５）、及びＰＫＢ阻害活性が０．５μＭ以上であり、ＰＫＡ阻害活性が少なくとも３倍低いときには化合物を活性であると考慮した（表で斜線背景）。
【０１１４】
実施例１２
ＰＴＲ６３２０：コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）３−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１０）の合成
１グラムのリンク（Ｒｉｎｋ）アミドＭＢＨＡ樹脂（０．６４ｍｍｏｌ／ｇ）を焼結ガラス底部を装備する反応容器内のＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）で３時間膨潤させ、振盪機に載せた。すべてのＦｍｏｃ保護群をＮＭＰ中の２５％ピペリジンとの反応（２回、１５分間、各１０ｍｌ）によって除去し、続いてＮＭＰ洗浄（５回、２分間、各１５ｍｌ）を行った。Ｆｍｏｃ除去はニンヒドリン検査によって監視した。第１アミノ酸を、３当量のＦｍｏｃ保護アミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｈｏｌ−ＯＨ）＋３当量のＰｙＢｒｏＰ＋６当量のＤＩＥＡ（７ｍｌのＮＭＰ中）を用いることによって反応時間１．５時間で樹脂に結合した、他のＦｍｏｃ保護アミノ酸［Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｎｖａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−ＤＬｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ］の結合を、３当量（１．９２ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃアミノ酸＋ＰｙＢｒｏｐ（３当量、１．９２ｍｍｏｌ）＋ＤＩＥＡ（６当量、３．８４ｍｍｏｌ）、ＮＭＰ中（７ｍｌ）室温にて１時間（または別法として、ＤＭＦ中、３当量のＦｍｏｃ−ＡＡ−ＯＨ＋３当量のＨＯＢＴ＋３当量のＤＩＣを用いて室温にて１時間）を用いて実行した。反応完了は定性的ニンヒドリン検査（カイザーテスト）によって監視した。個々の結合後、ペプチド樹脂をＮＭＰで洗浄した（５回、１５ｍｌのＮＭＰを使用、各２分間）。コレステロールのＮ−末端ＤＬｙｓへの結合を、ジオキサンとコレステロール（５当量）＋ＢＴＣ（１．６６当量）＋コリジン（１５当量）を含有する１、３−ジクロロプロパンとの混合率が１：１の溶液を１５ｍｌ加えることによって実行した。結合時間は６０℃にて１．５時間であった。
【０１１５】
構築終了時には、ペプチド樹脂をＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、低圧力下で乾燥し、次いで７％ＴＩＳ（トリ−イソプロピル−シラン）、２３％ＣＨ２Ｃｌ２を含有する２５ｍｌのＴＦＡ溶液を用いて、アルゴン雰囲気下、０（零）℃にて１０分間及び、室温にて１時間の反応によって樹脂から切断した。混合物をろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２中の小容量の７０％ＴＦＡで樹脂を洗浄した。濾液をロータリエバポレータに配置し、すべて揮発性成分を除去した。油状生成物を取得した。油状生成物をエーテルで倍散し、エーテル液で３回デカントした。白色粉末を取得した。この粗生成物を低圧力下で乾燥した（粗ペプチドの６５％収率）。
【０１１６】
実施例１３
ＰＴＲ６３２０及びＰＴＲ６３４４の付加的特徴付け
一連のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでは、ＰＴＲ６３２０及びＰＴＲ６３４４が前立腺癌細胞株において１−２μＭで細胞死及びアポトーシスを誘導するが、正常細胞に対しては４０μＭでも安全であることが見出された。また、新規化合物は、３μＭで癌細胞におけるアポトーシス誘導し、３〜５μＭでウエスタンブロット法によるＰＫＢ下流基質の阻害を示す。図１１には、タンパク質キナーゼＡ活性と対比したタンパク質キナーゼＢの阻害において、ＰＴＲ６１６４よりも改良されたＰＴＲ６３２０のｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択性（約２０倍）を示す。表９には、正常通常と対比した前立腺癌細胞株における、タンパク質キナーゼ阻害剤によって誘導された細胞死を表す。誘導される細胞死の規模は、図１２に記載のように種々の細胞における活性化ＰＫＢの値と直接的に相関する。最適化された鉛化合物ＰＴＲ６３２０及びＰＴＲ６３４４は、プロトタイプ分子ＰＴＲ６１６４と比較して５倍優れた効力とより改良された選択性を示す。表９に記載のように、そのレベルは、本阻害剤によって誘導される細胞死の規模と直接的に相関する。
【０１１７】
【表９】
2007527858.tif 000023
【０１１８】
表１０では、ヒト乳房アデノ癌腫細胞株ＭＤＡ−４６８及びヒト腎細胞株７８６−Ｏにおける、ＰＴＲ６１６４及びその最適化された化合物のＩＣ５０値を記述する。
【０１１９】
【表１０】
2007527858.tif 000024
【０１２０】
図１３には、ＰＴＲ６１６４、ＰＴＲ６３２０及びＰＴＲ６３４４で処理したＬＮＣａＰ細胞におけるＡＫＴ及びＦＫＨＲリン酸化のウエスタンブロット分析を記述する。第１４図には、ＰＴＲ６１６４及びＰＴＲ６３２０で処理した７８６−Ｏ（Ａ）細胞及びＭＤＡ４６８（Ｂ）細胞におけるＡＫＴ及びＦＫＨＲリン酸化のウエスタンブロット分析を記述し、第１５図では、カスパーゼ活性によって測定したＰＴＲ６１６４及びＰＴＲ６３２０による前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ）におけるアポトーシスの誘導を示す。
加えて、ＰＴＲ６３２０の肝癌腫細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ代謝をＬＣ−ＭＳによって分析した。結果は、１時間後の初期の薬物代謝及び２４時間後の進行した薬物代謝を示す。Ｈｅｐ  Ｇ２細胞を３０ｕＭのＰＴＲ６３２０で６時間インキュベートし、ペプチドを細胞の上澄み及びペレットから抽出した。サンプルを、ＭＳ  ＥＳＩ検出器をスプリットレスモードで使用して、溶出剤中のｐｅｐ  ２４Ｃ１８Ｖｙｄａｃ  １．０＊１５０ｍｍカラム、ＭｅＣＮと水（＋０．１％ＴＦＡ）の勾配を用いてＬＣ−ＭＳによって解析した。結果は、６時間後、ペプチドのＣ末端からのｄｅｓ  Ｔｙｒ−Ｄａｐ−ＨｏｌであるＰＴＲ６３２０の１主要代謝物と共に依然としてかなりの量の非分解性ペプチドが存在することを示す。これは、肝細胞におけるＰＴＲ６３２０の緩慢な劣化を示し、効率的な分配のため、ペプチドをシステムに十分な時間保持することができることを暗示する。
未処置動物（３３ｍｇ／ｋｇのＰＴＲ６１６４を用いたｉ．ｐ．治療）と対比した処置動物からの腫瘍切片におけるアポトーシス及び有糸分裂の結果を表１１に提示する。
個々の群からの３つの腫瘍を検討した結果、ＰＫＢの阻害を介してアポトーシスの誘導を暗示する処理腫瘍におけるアポトーシス増加の明らかな傾向を認めた。腫瘍を、長期間的な効果を検討するために一切の処置を施さない１４日間の観察期間後に回収した。腫瘍切片での有糸分裂に対するアポトーシスの比率は腫瘍生存性を表現する。生存能力のある組織では有糸分裂プロセスが優性であり、アポトーシスは劣性であるが、瀕死の組織ではこの関係は逆となる。腫瘍成長において退行が見られるときは、処理マウスの腫瘍において見られるように、有糸分裂細胞よりもアポトーシス細胞の数が多い。
【０１２１】
【表１１】
2007527858.tif 000025
【０１２２】
実施例１４
ＰＴＲ６３２０及び他の化学療法薬の組み合わせを用いた治療
使用した化学療法薬は、ミトキサントロンヒドロ塩化物（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ，Ｗｙｅｔｈ  Ｌｅｄｅｒｌｅ  Ｓ．ｐ．Ａ．Ｃａｔａｎｉａ、Ｉｔａｌｙ）であり、３．８ｍＭの滅菌水の溶液として供給された。ドキソルビシン、エトポシド及びビンブラスチン硫酸塩（Ｓｉｇｍａ社）を１００％ＤＭＳＯに溶解して１０ｍＭの濃度で保存溶液を調製した。ポリソルバート８０中、１１．６ｍＭのドセタキセル（Ｔａｘｐｔｅｒ、Ａｖｅｎｔｉｓ）保存溶液。インビトロ研究に使用する直前に、これらの薬剤を培地中で希釈した。
上記のように、６つの濃度の化学治療用薬剤の存在下で、ＰＴＲ６３２０の有無にかかわらず、成長阻害アッセイを行った（そのＩＣ５０値の上下で）。本薬物の存在下で、細胞を５日間インキュベートし、続いてメチレンブルーによる細胞の固定及び染色を行った。上記のように、各化学療法薬単独の場合及びＰＴＲ６３２０の存在下でのＩＣ５０値を算出した。
【０１２３】
前立腺癌細胞株の細胞死における相乗作用効果を、治療本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤といくつかの市販化学療法薬剤との組み合わせを用いて図１６Ａ〜図１６Ｅに示す。１．５μＭのＰＴＲ６３２０と組み合わせたときには、個々の薬物のＩＣ５０において１０〜１０倍の改善が認められる。その結果を表１２に要約した。
【０１２４】
【表１２】
2007527858.tif 000026
【０１２５】
本発明を特定の好適な実施形態及び実施例に関して説明したが、当業者ならば、本発明のペプチド及び類似体の活性を最適化するために多くの変形形態及び修正形態行い得ることは理解されるであろう。これらの実施例は、非制限的であり、開示した本発明の原理および以下に記載の特許請求の範囲によって規定する範囲を例示するためのものであることを解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】成長阻害アッセイで測定したＰＴＲ６１６４及びＰＴＲ６２４４による治療後のＰＣ３細胞の生存性。
【図２】成長阻害アッセイで測定したＰＴＲ６１８０、ＰＴＲ６１９８及びＰＴＲ６２４４による治療後のＬＮＣａＰ細胞の生存性。
【図３】成長阻害アッセイで測定したＰＴＲ６２５２、ＰＴＲ６２６０及びＰＴＲ６２４４による治療後のＬＮＣａＰ細胞の生存性。
【図４】ＰＴＲ６０７２、ＰＴＲ６１９６及びＰＴＲ６１６４で処理したＬＮＣａＰ細胞におけるＡＫＴ（Ｓ４７３）及びＧＳＫ３（Ｓ９／２１）リン酸化のウエスタンブロット分析。
【図５】ＨＰＬＣで測定した血漿中ＰＴＲ６１６４のバイオスタビリティー。
【図６】アネキシンＶ染色及びＦＡＣＳ分析を用いて測定した、ＰＴＲ６１６４によってジャーカット細胞内に誘導されたアポトーシス。
【図７】正常血球内と対比した癌細胞内におけるＰＫＢ阻害剤、ＰＴＲ６１６４（Ａ）及びＰＴＲ６２６０（Ｂ）によって誘導された細胞成長阻害。
【図８】ＰＴＲ６１６４のくも膜下腔内（ｉ．ｔ．）投与を用いた、ＰＣ３腫瘍異種移植片のマウスにおけるインビボ検査の効力。
【図９】マウス内の前立腺癌異種移植片の成長に対するＰＴＲ６１６４の全身（腹腔内（ｉ．ｐ．））投与の影響。
【図１０】ヌードマウス内で成長するＰＣ３腫瘍及び染色された腫瘍切片内におけるアポトーシス及び有糸分裂に対するＰＴＲ６１６４を用いた治療の影響。
【図１１】タンパク質キナーゼＢ活性と対比したタンパク質キナーゼＡの阻害におけるＰＴＲ６１６４に比べたＰＴＲ６３２０のｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択性。
【図１２】正常細胞と対比した前立腺癌細胞株におけるＰＴＲ６３２０によって誘導された細胞死。
【図１３】ＰＴＲ６１６４、ＰＴＲ６３２０及びＰＴＲ６３４４で処理したＬＮＣａＰ細胞におけるＡＫＴ及びＦＫＨＲリン酸化のウエスタンブロット分析。
【図１４】ＰＴＲ６１６４及びＰＴＲ６３２０で処理した７８６−Ｏ（Ａ）細胞及びＭＤＡ４６８（Ｂ）細胞におけるＡＫＴ及びＦＫＨＲリン酸化のウエスタンブロット分析。
【図１５】ＰＴＲ６１６４及びＰＴＲ６３２０によって前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ）において誘導された、カスパーゼ活性による前立腺癌細胞におけるアポトーシスの誘導。
【図１６】タンパク質キナーゼ阻害剤と公知の化学療法薬剤との併用治療を用いた治療後の前立腺癌細胞株の細胞死。
【図１】
2007527858.tif 000027
【図２】
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【図３】
2007527858.tif 000029
【図４】
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【図５】
2007527858.tif 000031
【図６】
2007527858.tif 000032
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
2007527858.tif 000035
【図９】
2007527858.tif 000036
【図１０】
2007527858.tif 000037
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
2007527858.tif 000040
【図１３】
2007527858.tif 000041
【図１４】
2007527858.tif 000042
【図１５】
2007527858.tif 000043
【図１６Ａ】
2007527858.tif 000044
【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
2007527858.tif 000046
【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年5月18日(2007.5.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも第１部分及び第２部分を有する分子を含むタンパク質キナーゼ阻害剤であって、該第１部分は当該分子の細胞透過能を持ち、該第２部分は当該細胞内におけるタンパク質キナーゼ阻害効果を持ち、当該第１部分は直接結合またはスペーサーを介して当該第２部分に結合されているタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項２】
タンパク質キナーゼＢに対して選択性がある請求項１に記載のタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項３】
第２部分がＰＫＢ基質またはＰＫＢ基質の模倣物を含むペプチドまたはペプチド模倣物である請求項２のタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項４】
ＰＫＢ基質がグリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）である請求項３のタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項５】
第２部分が５−２０アミノ酸のペプチドである請求項１に記載のタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項６】
第１部分と第２セグメントとが共有結合を介して直接的に結合された請求項１のタンパク質キナーゼ阻害剤の複合体。
【請求項７】
当該共有結合がアミド結合である請求項６のタンパク質キナーゼ阻害剤複合体。
【請求項８】
第１部分と第２部分とがスペーサーを介して結合された請求項１に記載のタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項９】
スペーサーが少なくとも１つのアミノ酸残基を含む請求項７のタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項１０】
第１部分が、タンパク質キナーゼ阻害性ペプチド部分のアミノ末端に結合する請求項１〜９のいずれかに記載のタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項１１】
第１部分が、タンパク質キナーゼ阻害性ペプチド部分のカルボキシ末端に結合する請求項１〜９のいずれかに記載のタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項１２】
ＡＴＰの模倣部分をさらに含む請求項１に記載のタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項１３】
ＡＴＰの模倣部分がイソキノリン誘導体である請求項１２のタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項１４】
第２部分が下記式（Ｉ）（配列番号：２）のペプチド、その類似体、塩類または機能的誘導体を含む請求項１に記載のタンパク質キナーゼ阻害剤。
式（Ｉ）：Ｍ−Ｘ１−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｘ４−Ｘ３−Ｘ５−Ｘ７
上記式では、
Ｍは不在であるか、またはＤ−Ｌｙｓ２−４またはＬ−Ｌｙｓ２−４から選択されるものであり、
Ｘ１は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＯｒｎまたはＤａｂであり、
Ｘ４は、Ｎｖａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＡｂｕまたはＯｒｎであり、
Ｘ５は、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、ＧｌｙＮＨ２、Ｓｅｒ（Ｍｅ）、Ｇｌｕ、またはＧｌｕ（ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＳＯ２−イソキノリン）であり、
Ｘ６は、Ｄａｐ、Ａｂｕ、ＧｌｙＮＨ２、Ｓｅｒ（Ｍｅ）、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＳｅｒであり、及び
Ｘ７は芳香族または脂肪族のかさ高い残基である。
【請求項１５】
下記式（ＩＩ）（配列番号：３）のペプチド、その類似体、塩類または機能的誘導体を含む請求項１４に記載のタンパク質キナーゼ阻害剤。
式（ＩＩ）：Ｍ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７
上記式では、
Ｍは、Ｄ−Ｌｙｓ３またはＬｙｓ３であり、
Ｘ４は、Ｎｖａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＡｂｕまたはＯｒｎであり、
Ｘ５は、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、ＧｌｙＮＨ２、Ｓｅｒ（Ｍｅ）、Ｇｌｕ、またはＧｌｕ（ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−−ＳＯ２−イソキノリン）であり、
Ｘ６は、Ｄａｐ、Ａｂｕ、ＧｌｙＮＨ２、Ｓｅｒ（Ｍｅ）、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＳｅｒであり、及び
Ｘ７は芳香族または脂肪族のかさ高い残基である。
【請求項１６】
Ｘ７がＰｈｅまたはＨｏｌである請求項１４または１５のタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項１７】
下記からなる群から選択されるペプチドを含む請求項１４または１５のタンパク質キナーゼ阻害剤。
ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ（配列番号：５）、
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ（配列番号：６）、
Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ（配列番号：７）、
Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ−Ｇｌｕ−（ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＳＯ２−イソキノリン）Ｓｅｒ−Ｐｈｅ（配列番号：８）および、
Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｏｌ（配列番号：９）。
【請求項１８】
細胞透過部分が、コレステロール、（ＤＬｙｓ）２−１０、（Ｌｙｓ）２−１０、ビタミンＥ、Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、ＡｈＸ６−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＧｌｎ−Ａｒｇ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−ＤＡｒｇ、及び（ＤＡｒｇ）７−９からなる群より選択される請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のタンパク質キナーゼ阻害剤であって、Ｚは不在であるか、またはカルバマート及びＧｌｙより選択されるタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項１９】
下記式（ＩＩＩ）（配列番号：４）のペプチド複合体を含む請求項１に記載のタンパク質キナーゼ阻害剤。
式（ＩＩＩ）：Ｙ−Ｚ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｘ６−Ｈｏｌ    
上記式では、Ｘ６がＤａｐまたはＡｌａであり、
Ｙは、細胞透過部分であり、及び
Ｚは、Ｙをペプチドに結合させるスペーサーまたは結合である。
【請求項２０】
Ｙが、コレステロール、（ＤＬｙｓ）２−１０、（Ｌｙｓ）２−１０、ビタミンＥ、Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、ＡｈＸ６−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＧｉｎ−Ａｒｇ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−ＤＡｒｇ、及び（ＤＡｒｇ）７−９からなる群より選択される請求項１９のタンパク質キナーゼ阻害剤であって、Ｚは不在であるか、またはカルバマート及びＧｌｙより選択されるタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項２１】
下記からなる群から選択される請求項１に記載のタンパク質キナーゼ阻害剤。
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１０）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１１）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）４−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１２）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）６−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ（Ｍｅ）−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１３）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−（ＤＬｙｓ）３−ＮＨ２（配列番号：１４）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）３−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ（Ｍｅ）−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１５）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（Ｌｙｓ）３−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＯＨ（配列番号：１６）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）３−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１７）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ｏｒｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１８）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）３−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１９）、
ビタミンＥ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）３−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２０）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）２−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２１）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２２）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２３）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２４）、
ビタミンＥ−スクシナート−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２５）、
Ｈ−（ＤＡｒｇ）９−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２６）、及び
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ−Ｇｌｕ（アミノエチルスルホンアミドイソキノリン）−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（配列番号：２７）。
【請求項２２】
活性成分としてのタンパク質キナーゼ阻害剤複合体を含む医薬品組成物であって、当該阻害剤複合体が、少なくとも第１部分及び第２部分を有しており、該第１部分は当該分子の細胞透過能を持ち、該第２部分は当該細胞内におけるタンパク質キナーゼ阻害効果を持ち、当該第１部分はリンカーを介して当該第２部分に結合されている分子を含む医薬品組成物。
【請求項２３】
当該タンパク質キナーゼ阻害剤がタンパク質キナーゼＢに対して選択性がある請求項２２の医薬品組成物。
【請求項２４】
当該タンパク質キナーゼ阻害剤の第２部分がＰＫＢ基質またはＰＫＢ基質の模倣物を含むペプチドまたはペプチド模倣物である請求項２３の医薬品組成物。
【請求項２５】
ＰＫＢ基質がＧＳＫ３である請求項２４の医薬品組成物。
【請求項２６】
当該タンパク質キナーゼ阻害剤の第２部分が、５−２０アミノ酸のペプチドである請求項２２の医薬品組成物。
【請求項２７】
当該タンパク質キナーゼ阻害剤の第１部分及び第２部が共有結合を介して直接的に結合されている請求項２２の医薬品組成物。
【請求項２８】
共有結合がアミド結合である請求項２７の医薬品組成物。
【請求項２９】
当該タンパク質キナーゼ阻害剤の第１部分及び第２部がスペーサーを介して結合されている請求項２２の医薬品組成物。
【請求項３０】
スペーサーが少なくとも１つのアミノ酸残基を含む請求項２９の医薬品組成物。
【請求項３１】
当該タンパク質キナーゼ阻害剤の第１部分が、タンパク質キナーゼ阻害性ペプチド部分のアミノ末端に結合している請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の医薬品組成物。
【請求項３２】
当該タンパク質キナーゼ阻害剤の第１部分が、タンパク質キナーゼ阻害性ペプチド部分のカルボキシ末端に結合している請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の医薬品組成物。
【請求項３３】
ＡＴＰの模倣部分をさらに含む請求項２２に記載の医薬品組成物。
【請求項３４】
ＡＴＰの模倣部分がイソキノリン誘導体である請求項３３の医薬品組成物。
【請求項３５】
タンパク質キナーゼ阻害剤が下記の式（Ｉ）（配列番号：２）のペプチド、その類似体、塩類または機能的誘導体を含む請求項２２の医薬品組成物。
式（Ｉ）：Ｍ−Ｘ１−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７
上記式では、
Ｍは不在であるか、またはＤ−Ｌｙｓ２−４またはＬ−Ｌｙｓ２−４から選択されるものであり、
Ｘ１は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＯｒｎまたはＤａｂであり、
Ｘ４は、Ｎｖａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＡｂｕまたはＯｒｎであり、
Ｘ５は、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、ＧｌｙＮＨ２、Ｓｅｒ（Ｍｅ）、Ｇｌｕ、またはＧｌｕ（ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＳＯ２−イソキノリン）であり、
Ｘ６は、Ｄａｐ、Ａｂｕ、ＧｌｙＮＨ２、Ｓｅｒ（Ｍｅ）、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＳｅｒであり、及び
Ｘ７は芳香族または脂肪族のかさ高い残基である。
【請求項３６】
タンパク質キナーゼ阻害剤が下記式（ＩＩ）（配列番号：３）のペプチド、その類似体、塩類または機能的誘導体を含む請求項３５の医薬品組成物。
式（ＩＩ）：Ｍ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７
上記式では、
Ｍは、Ｄ−Ｌｙｓ３またはＬｙｓ３であり、
Ｘ４は、Ｎｖａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＡｂｕまたはＯｒｎであり、
Ｘ５は、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、ＧｌｙＮＨ２、Ｓｅｒ（Ｍｅ）、Ｇｌｕ、またはＧｌｕ（ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＳＯ２−イソキノリン）であり、
Ｘ６は、Ｄａｐ、Ａｂｕ、ＧｌｙＮＨ２、Ｓｅｒ（Ｍｅ）、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＳｅｒであり、及び
Ｘ７は芳香族または脂肪族のかさ高い残基である。
【請求項３７】
Ｘ７がＰｈｅまたはＨｏｌである請求項３５または３６の医薬品組成物。
【請求項３８】
タンパク質キナーゼ阻害剤が下記からなる群から選択されるペプチドを含む請求項３５または３６の医薬品組成物。
ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ（配列番号：５）、
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ（配列番号：６）、
Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ（配列番号：７）、
Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ−Ｇｌｕ−（ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＳＯ２−イソキノリン）Ｓｅｒ−Ｐｈｅ（配列番号：８）と、
Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｏｌ（配列番号：９）。
【請求項３９】
当該タンパク質キナーゼ阻害剤の細胞透過部分がコレステロール、（ＤＬｙｓ）２−１０、（Ｌｙｓ）２−１０、ビタミンＥ、Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、ＡｈＸ６−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＧｌｎ−Ａｒｇ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−ＤＡｒｇ、及び（ＤＡｒｇ）７−９からなる群より選択される請求項３７に記載の医薬品組成物であって、Ｚは不在であるか、またはカルバマート及びＧｌｙより選択される医薬品組成物。
【請求項４０】
下記式（ＩＩＩ）（配列番号：４）のタンパク質キナーゼ阻害剤を含む請求項２２の医薬品組成物。
式（ＩＩＩ）：Ｙ−Ｚ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｘ６−Ｈｏｌ    
上記式（ＩＩＩ）では、
Ｘ６はＤａｐまたはＡｌａであり、
Ｙは、細胞透過部分であり、及び
Ｚは、Ｙをペプチドに結合させるスペーサーまたは結合である。
【請求項４１】
Ｙが、コレステロール、（ＤＬｙｓ）２−１０、（Ｌｙｓ）２−１０、ビタミンＥ、Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、ＡｈＸ６−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＤＧｉｎ−Ａｒｇ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−ＤＡｒｇ、及び（ＤＡｒｇ）７−９からなる群より選択される請求項４０の医薬品組成物であって、Ｚは不在であるか、またはカルバマート及びＧｌｙより選択されるものである医薬品組成物。
【請求項４２】
当該タンパク質キナーゼ阻害剤が下記からなる群より選択される請求項２２の医薬品組成物。
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１０）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１１）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）４−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１２）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）６−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ（Ｍｅ）−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１３）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−（ＤＬｙｓ）３−ＮＨ２（配列番号：１４）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）３−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ（Ｍｅ）−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１５）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（Ｌｙｓ）３−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＯＨ（配列番号：１６）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）３−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１７）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ｏｒｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１８）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）３−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：１９）、
ビタミンＥ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）３−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２０）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−（ＤＬｙｓ）２−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２１）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２２）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２３）、
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２４）、
ビタミンＥ−スクシナート−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２５）、
Ｈ−（ＤＡｒｇ）９−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｏｌ−ＮＨ２（配列番号：２６）、及び
コレステリル−Ｏ−ＣＯ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ−Ｇｌｕ（アミノエチルスルホンアミドイソキノリン）−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（配列番号：２７）。
【請求項４３】
タンパク質キナーゼ−活性と関連する疾患治療用の薬物を調製するための、請求項１〜２１のいずれかの一項に係る化合物の使用。
【請求項４４】
疾患が、癌、異常増殖疾患、糖尿病、心血管症状、出血性ショック、肥満症、炎症性疾患、中枢神経系疾患、及び自己免疫性疾患からなる群より選択される請求項４３に係る使用。
【請求項４５】
疾患が癌である請求項４４に係る使用。
【請求項４６】
疾患が：前立腺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、腎臓癌、黒色腫及び皮膚癌、肺癌、及び肝臓癌からなる群より選択される請求項４５に係る使用。
【請求項４７】
癌が前立腺癌である請求項４４に係る使用。
【請求項４８】
疾患が異常増殖細胞に関係する請求項４４に係る使用。
【請求項４９】
疾患が再狭窄、良性腫瘍、アテローム性動脈硬化、外科術、異常創傷治癒、異常血管形成に起因する体組織侵襲、組織線維症を起こす疾患、反復動作による障害、高度に血管新生化を起こしていない組織障害、臓器移植に関連する増殖反応より選択される請求項４８に係る使用。