(57)【要約】  本発明は、式Ｉの新規固定相及び、精製の分解能及び／又は生産性を向上させるための、式Ｉの固定相を含む、選択固定相を用いた液体クロマトグラフィーにおけるペプチド又はリポペプチドを精製するための方法に関する。本クロマトグラフィー法は、分析的又は分取スケールの精製のいずれに対しても使用することができる。
2007504460.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2007504460.tif 000020
の固定相（式中、
Ｒは、
ｃ）−（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨ２又は
ｄ）−ＣＯＯＲ１であり；
ｎは、１から４であり；
Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ２アルキルである。）。
【請求項２】
【化２】
2007504460.tif 000021
からなる群から選択される、請求項１に記載の式Ｉの固定相。
【請求項３】
精製の選択性及び／又は生産性を向上させるための、請求項１に記載の式Ｉの固定相、Ｔｏｓｏｈ  Ａｍｉｄｅ−８０、
【化３】
2007504460.tif 000022
からなる群から選択される固定相及び移動相を有する液体クロマトグラフィー系を用いることによる、ペプチド又はリポペプチドの精製のための方法。
【請求項４】
前記移動相が１又は複数の溶媒を含む溶媒系である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記溶媒系中の溶媒が、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ヘキサン、ヘプタン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、アセトニトリル、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）及び塩化メチレンからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記液体クロマトグラフィー系が、ペプチドの精製用である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記液体クロマトグラフィー系が、リポペプチドの精製用である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記リポペプチドが、カスポファンギン（ｃａｓｐｏｆｕｎｇｉｎ）、ミカファンギン（ｍｉｃａｆｕｎｇｉｎ）、シロファンギン（ｃｉｌｏｆｕｎｇｉｎ）、アンデュリファンギン（ａｎｄｕｌｉｆｕｎｇｉｎ）及びダプトマイシン（ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ）の発酵産物前駆体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記リポペプチドが、カスポファンギンの前駆体、ニューモカンディン（ｐｎｅｕｍｏｃａｎｄｉｎ）Ｂ０である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記移動相が、水、メタノール及び酢酸エチルを含む溶媒系である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドが、オキシトシン（ｏｘｙｔｏｃｉｎ）又はブラジキニン（ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
精製の選択性及び／又は生産性を向上させるために、Ｔｏｓｏｈ  Ａｍｉｄｅ−８０、
【化４】
2007504460.tif 000023
から選択される固定相及び移動相を含む、液体クロマトグラフィー系によりニューモカンディンＢ０を精製する方法。
【請求項１３】
前記移動相が、溶媒系を含み、該溶媒系中の溶媒が、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ヘキサン、ヘプタン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、アセトニトリル、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）及び塩化メチレンからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記溶媒系が、酢酸エチル、メタノール及び水の混合液である、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ニューモカンディン（Ｐｎｅｕｍｏｃａｎｄｉｎ）Ｂ０など、リポペプチドは、発酵プロセスの産物であることが多い。そのような発酵プロセス中に、所望する産物とともに多くの近縁種である類似物が産生される。この未精製発酵産物を精製するために、液体クロマトグラフィー系がよく使用される。液体クロマトグラフィー系は、通常、固定相及び移動相からなる。ペプチド又はリポペプチドの精製用には、固定相はシリカゲル、アルミナ又は他の物質であり得、移動相は、１種類の溶媒又は有機溶媒と水とを含む溶媒の混合液であり得る。
【背景技術】
【０００２】
シリカゲルクロマトグラフィー及び他のタイプの液体クロマトグラフィーは、これらの類似物の分離に有用である。しかし、実際には、クロマトグラフィーの分解能が低く、つまり、クロマトグラフィーのピークが重なってしまうことから、所望する産物からのある種の近縁類似物の分離は、満足できるものでないことが多い。妥当な回収率で主要産物の所望する純度を得るためには、１回の実験あたりのカラムに添加する物質の量（フィード又はカラムロードといわれることが多い。）を制限する必要があり、これによりこの操作の生産性が制限される。
【０００３】
ニューモカンディンＢ０のクロマトグラフィー精製は、クロマトグラフィーの分解能が低いために、従来、困難であった。このクロマトグラフィーでは、シリカゲルカラムにおいて、溶媒の混合液からなる移動相、特に、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）、メタノール（ＭｅＯＨ）及び水、を利用する。以前はニューモカンディンＢ０からの、ニューモカンディンＢ５及びＥ０など主要な混入物の分離は、クロマトグラフィーの分解能が低いために困難であった。ある種の類似物は、分取条件を用いて主要産物のピークから一部しか分離されなかった。この限定的な分離で所望する産物の純度を得るためには、カラムへの添加量を低くしてこの精製段階を遂行する必要があり、そのため、生産性が制限された。
【０００４】
分子量が１０６５ダルトンである、ニューモカンディンＢ０は、天然産物であり、カスポファンギン（Ｃａｓｐｏｆｕｎｇｉｎ）アセテート（Ｃａｎｃｉｄａｓ（Ｒ））の産生における中間体である。ニューモカンディンＢ０は、真菌Ｇｌａｒｅａ  ｌｏｚｏｙｅｎｓｉｓ（グラレア・ロゾエンシス）の発酵による二次代謝産物として産生される。米国特許第５，１９４，３７７号及び第５，２０２，３０９号を参照のこと。ニューモカンディンＢ０及び主要な類似混入物の３種類の構造は全て、ミリスチン酸ジメチル側鎖と連結した環状ヘキサペプチドからなり、表１に示す。
【０００５】
【化５】
2007504460.tif 000003
【０００６】
【表１】
2007504460.tif 000004
【０００７】
シリカゲルクロマトグラフィーでは、精製を達成するために、所望産物のヒドロキシ−リッチな環状ヘキサペプチドコアと、ニューモカンディンＢ５、Ｃ０及びＥ０を含む類似混入物との結合親和性におけるわずかな変化を利用する。シリカゲルＨＰＬＣ精製において、ニューモカンディンＢ５及びＥ０という、ニューモカンディンＢ０の発酵において同時に産生される２種類の主要な類似混入物は、ニューモカンディンＢ０と非常に密接して溶出される。したがって、これら及び同様の類似物に対する精製物質における標的不純物レベルを適合させるために、カラムに添加できる未精製ニューモカンディンＢ０の量が制限される。その結果、主要な混入物の分解能を向上させるために多大な努力が払われてきた。例えば、３成分、酢酸エチル−メタノール−水の移動相は、ニューモカンディンＢ０と主要な類似混入物との間の分離能を最適化するために調整されてきた。Ｄ．Ｊ．Ｒｏｕｓｈ，Ｆ．Ｄ．Ａｎｔｉａ，Ｋ．Ｅ．Ｇｏｋｌｅｎ  Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｕｒａｐｈｙ  Ａ、８２７（１９９８）３７３-３８９。さらに、移動相修飾剤の使用により、ニューモカンディンＢ０と主要な類似混入物との間の分離能及び選択性が向上することが明らかとなっている。Ｊ．Ｎｔｉ−Ｇｙａｂａａｈら、“Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｎｅｕｍｏｃａｎｄｉｎ  Ｂ０，ａ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｆｏｒ  ＣＡＮＣＩＤＡＳ”，ＰＲＥＰ−２００３，１６ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｅｘｈｉｂｉｔ  ａｎｄ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐｓ  ｏｎ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ／Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，Ｗｅｄｎｅｓｄａｙ，Ｊｕｌｙ  ２，２００３又は米国仮出願番号第６０／４２２，３５６号（２００２年１０月３０日出願）。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の要約
本発明は、式Ｉの新規固定相及び、精製の選択性及び／又は生産性を向上させるための、該式Ｉの固定相を含む、選択固定相と移動相とを有する液体クロマトグラフィー系を用いたペプチド又はリポペプチドの精製のための方法に関する。
【０００９】
式Ｉ：
【００１０】
【化６】
2007504460.tif 000005
の固定相（式中、
Ｒは、
ａ）−（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨ２又は
ｂ）−ＣＯＯＲ１であり；
ｎは、１から４であり；
Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ２アルキルである。）。
【００１１】
式Ｉの本固定相の実施形態は：
【００１２】
【化７】
2007504460.tif 000006
である。
【００１３】
本精製に有用なさらなる固定相は：
Ａｍｉｄｅ−８０（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｅｐ  ＬＬＣ．，Ｊａｐａｎ製造）、
【００１４】
【化８】
2007504460.tif 000007
（ＳｗｅｄｅｎのＥｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製造）及び
【００１５】
【化９】
2007504460.tif 000008
（米国特許第６，３４２，１６０号に記載。）である。
【００１６】
精製の選択性及び／又は生産性を向上させるための、上記の式Ｉの固定相、Ａｍｉｄｅ−８０、
【００１７】
【化１０】
2007504460.tif 000009
からなる群から選択される固定相と移動相とを有する液体クロマトグラフィー系を用いることによる、ペプチド又はリポペプチドの精製のための方法が開示される。
【００１８】
さらなる固定相は、ある種のペプチド及びリポペプチドの精製に有用であり得、それは、下記：
【００１９】
【化１１】
2007504460.tif 000010
（式中、
Ｒは、
ａ）Ｈ、
ｂ）Ｎ−アセチル−Ｄ−アスパルギニル、
ｃ）Ｄ−グルタミニル、
ｄ）Ｌ−プロリニル、
ｅ）イソ−Ｌ−グルタミニル、
ｆ）−（ＣＨ２）ｎＮＨ２、
ｇ）−（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨ２、
ｈ）−ＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈ、
ｉ）−ＣＯＮＨ２、
ｊ）−ＣＯＮＨＲ１、
ｋ）−ＣＯＯＲ１又は
ｌ）−ＣＯＲ２であり；
ｎは、１から４であり；
Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ６アルキル（置換されていないか、又はＣｌ、Ｆ、Ｂｒ又はＩから選択される１、２又は３個の置換基で置換されている。）であり；
Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ６アルキル（置換されていないか、又はＣｌ、Ｆ、Ｂｒ又はＩ、アリール（アリールは、フェニル又はナフチルとして定義され、置換されていないか、又はＣｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉもしくはニトロから選択される１、２もしくは３個の置換基で置換されている。）から選択される１、２もしくは３個の置換基で置換されている。）である。）
で定義されるとおりの式Ｉａの範囲内に含まれる。
【００２０】
この精製プロセスが有用であるリポペプチドの例は、ニューモカンディンＢ０、カスポファンギン、シロファンギン（Ｃｉｌｏｆｕｎｇｉｎ）及びミカファンギン（Ｍｉｃａｆｕｎｇｉｎ）などのエキノカンジン（Ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ）誘導体ならびに、アニドゥラファンギン（Ａｎｉｄｕｌａｆｕｎｇｉｎ）及びダプトマイシン、及び特にカスポファンギン、ミカファンギン、シロファンギン（Ｃｉｌｏｆｕｎｇｉｎ）、アニドゥラファンギン（Ａｎｉｄｕｌａｆｕｎｇｉｎ）及びダプトマイシン（Ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ）の天然産物前駆体である。カスポファンギンに対する天然産物／発酵産物前駆体は、ニューモカンディンＢ０である。カスポファンギンアセテート（ＣＡＮＣＩＤＡＳ（Ｒ））は、静脈投与用の抗真菌薬として米国で最近販売されている、半合成リポペプチド  エキノカンジンＢ誘導体である。アニドゥラファンギンは、静脈投与用の抗真菌薬としてＥｌｉ  Ｌｉｌｌｙ／Ｖｅｒｓｉｃｏｒにより開発中の半合成リポペプチド  エキノカンジンＢ誘導体である。アニドゥラファンギンは、米国特許第５，９６５，５２５号及び第６，３８４，０１３号（参照により本明細書に組み込む。）で開示されている。シロファンギンは、米国特許第４，２９３，４８９号（参照により本明細書に組み込む。）においてＥｌｉ  Ｌｉｌｌｙにより抗真菌薬としての使用が開示されているエキノカンジン  リポペプチドである。ミカファンギン（ＦＵＮＧＡＲＤＴＭ）は、静脈投与用の抗真菌薬としてＦｕｊｉｓａｗａにより開発中のエキノカンジン様のリポペプチドである。ミカファンギンは、米国特許第６，１０７，４５８号（参照により本明細書に組み込む。）に開示されている。ダプトマイシン（ＣＩＤＥＣＩＮＴＭ）は、抗菌薬としてＣｕｂｉｓｔにより開発中の半合成リポペプチド誘導体である。ダプトマイシンは、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙにより、米国特許第４，５３７，７１７号（参照により本明細書に組み込む。）で開示されている。
【００２１】
液体クロマトグラフィー系は、移動相及び固定相を有する。この移動相は、１又は複数の溶媒を含有する溶媒系であり、この組成は、精製プロセスを通して一定であるか、又は精製プロセス中に溶媒組成が時間により変化する勾配性のものであるかのいずれかである。この移動相溶媒には、これらに限定されないが、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ヘキサン、ヘプタン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、アセトニトリル、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）及び塩化メチレンが含まれる。この固定相は、式Ｉの固定相：
【００２２】
【化１２】
2007504460.tif 000011
（式中、Ｒは、−（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨ２又は−ＣＯＯＲ１であり；ｎは、１から４であり；Ｒ１はＣ１−Ｃ２アルキルである。）；
Ｔｏｓｏｈ  Ａｍｉｄｅ８０
【００２３】
【化１３】
2007504460.tif 000012
からなる群から選択される。
【００２４】
本発明は、シリカゲルアミノ又はアミド含有固定相を用いる、ペプチド又はリポペプチドのためのクロマトグラフィー精製方法を提供する。カラム体積（以後、ｃｖと呼ぶ。）は、カラムを通り抜けるのに必要とされる溶媒の体積として定義される。カラムロードは、１回の注入サイクルにおいてカラムに適用する物質（未精製リポペプチド又はペプチド）の量を意味する。カラムロードはまた、カラムフィード（ｃｏｌｕｍｎ  ｆｅｅｄ）又はフィードロード（ｆｅｅｄ  ｌｏａｄ）とも呼ばれる。
【００２５】
本明細書中で提供される例は、本発明のさらなる理解の一助となるものである。特定の物質、使用する種及び条件は、本発明をさらに例示することを意図するものであり、その適切な範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００２６】
【化１４】
2007504460.tif 000013
【００２７】
Ｎ−β−アラニンアミドプロピルシリカの調製
Ｋｒｏｍａｓｉｌ  アミノシリカ（５ｇ、１０μ、１００Å）を１００ｍＬ  丸底フラスコに置き、そこに、ジクロロメタン  ２５ｍＬを添加した。この固定相を完全に湿らせた後、穏やかに撹拌しながら、ジクロロメタン  ２５ｍＬ中の、フリーラジカル阻害剤として２５−３０ｐｐｍの第二銅イオン（１４ｍｍｏｌ）を含有するアクリルアミド溶液を添加し、室温にてロータリーエバポレーター装置で、真空を適用せずにその混合物を一晩循環させた。翌朝、焼結ガラス漏斗でその混合物を濾過し、ジクロロメタン中の２０％  メタノール  ３０ｍＬで３回洗浄し、スラリー中で２−プロパノールを用いて溶解し、評価のために、４．６ｍｍ  ｉｄ  ｘ２５ｃｍ長のＨＰＬＣカラムに充填した。カラム充填リザーバーから取った残った固定相を高真空下で一晩乾燥させ、次に、燃焼分析に供した（Ｃ６．３％；Ｎ１．８％）。
【実施例２】
【００２８】
【化１５】
2007504460.tif 000014
【００２９】
Ｎ−β−アラニンアミドプロピルシリカのインシトゥ調製
市販のアミノシリカカラム（Ｃｈｒｏｍｅｇａｂｏｎｄ  Ａｍｉｎｅ；５μ粒子サイズ；６０Åポアサイズ；４．６ｍｍ  カラム  ｉ．ｄ．；２５ｃｍ  カラム長）に、流速２ｍＬ／ｍｉｎで、３０分間、ジクロロメタンを流した。次に、アセトニトリル中のアクリルアミドの１０Ｍ溶液を、アミノプロピルシリカＨＰＬＣカラムを介して流速２ｍＬ／ｍｉｎで循環させ、そのカラムからの流出物をポンプインレットリザーバーに誘導し、試薬が再循環できるようにした。その試薬液を４時間にわたって流し続け、そのカラムを、最初に２ｍＬ／ｍｉｎで２０分間、ジクロロメタンの溶液で洗浄し、次に、２ｍＬ／ｍｉｎで２０分間、ジクロロメタン中の２０％  メタノールで洗浄した。
【実施例３】
【００３０】
【化１６】
2007504460.tif 000015
【００３１】
Ｎ−メチルカルバモイル−３−アミノプロピルシリカの調製
Ｋｒｏｍａｓｉｌアミノシリカ（５ｇ、１０μ、１００Å）を１００ｍＬ  丸底フラスコに置き、そこにジクロロメタン２５ｍＬを添加した。その固定相を完全に湿らせた後、穏やかに撹拌しながら、次に、ジクロロメタン  ２５ｍＬ中のクロロギ酸メチルの溶液（１０ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１０ｍｍｏｌ、１.０ｅｑ）を添加し、ロータリーエバポレーター装置で室温にて、真空を適用せずにその混合物を一晩循環させた。翌朝、焼結ガラス漏斗でその混合物を濾過し、ジクロロメタン中の２０％  メタノール  ３０ｍＬで３回洗浄し、スラリー中で２−プロパノールを用いて溶解し、評価のために、４．６ｍｍ  ｉｄ  ｘ２５ｃｍ長のＨＰＬＣカラムに充填した。カラム充填リザーバーから取った残った固定相を高真空下で一晩乾燥させ、次に、燃焼分析に供した（Ｃ６．０％；Ｎ１．４％）。
【実施例４】
【００３２】
【化１７】
2007504460.tif 000016
【００３３】
Ｎ−メチルカルバモイル−３−アミノプロピルシリカのインシトゥ調製
市販のアミノシリカカラム（Ｃｈｒｏｍｅｇａｂｏｎｄ  Ａｍｉｎｅ；５μ粒子サイズ；６０Åポアサイズ；４．６ｍｍ  カラム  ｉ．ｄ．；２５ｃｍ  カラム長）に、流速２ｍＬ／ｍｉｎで、３０分間、ジクロロメタンを流した。次に、トリエチルアミン１等量を含有するジクロロメタン中のクロロギ酸メチルの１Ｍ溶液を流速２ｍＬ／ｍｉｎでカラムに通した。次にそのカラムに２ｍＬ／ｍｉｎで１０分間、ジクロロメタンを流し、続いて、２ｍＬ／ｍｉｎで２０分間、ジクロロメタン中の２０％  メタノールを流した。
【実施例５】
【００３４】
【化１８】
2007504460.tif 000017
【００３５】
Ｎ−Ｌ−プロリル−３−アミノプロピルシリカの調製
Ｋｒｏｍａｓｉｌアミノシリカ（５ｇ、１０μ、１００Å）を１００ｍＬ  丸底フラスコに置き、そこにジクロロメタン２５ｍＬを添加した。固定相を完全に湿らせた後、穏やかに撹拌しながら、次に、ジクロロメタン  ２５ｍＬ中のＢｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ（４．７ｍｍｏｌ）及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、４．７ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）を添加し、室温にてロータリーエバポレーター装置で、真空を適用せずにその混合物を一晩循環させた。翌朝、焼結ガラス漏斗でその混合物を濾過し、ジクロロメタン中の２０％  メタノール  ３０ｍＬで３回洗浄し、高真空下で乾燥させた。乾燥後、ジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の３５％溶液  ４５ｍＬを添加し、得られたスラリーを室温にて４５分間、振盪した。次にそのスラリーを濾過し、回収した固定相をジクロロメタン中の２０％  メタノール  ３０ｍＬで３回洗浄し、次に、ジクロロメタン中の１０％  Ｈｕｎｉｇ’ｓ  ｂａｓｅの溶液  ３０ｍＬで洗浄し、スラリー中で２−プロパノールを用いて溶解し、評価のために、４．６ｍｍ  ｉｄｘ２５ｃｍ長のＨＰＬＣカラムに充填した。カラム充填リザーバーから取った残った固定相を高真空下で一晩乾燥させ、次に、燃焼分析に供した（Ｃ７．５％；Ｎ２．０％）。
【実施例６】
【００３６】
【化１９】
2007504460.tif 000018
【００３７】
Ｎ−Ｌ−プロリル−３−アミノプロピルシリカのインシトゥ調製
市販のアミノシリカカラム（Ｃｈｒｏｍｅｇａｂｏｎｄ  Ａｍｉｎｅ；５μ粒子サイズ；６０Åポアサイズ；４．６ｍｍ  カラム  ｉ．ｄ．；２５ｃｍ  カラム長）に、流速２ｍＬ／ｍｉｎで、３０分間、ジクロロメタンを流した。次に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩  １等量を含有するアセトニトリル中のＢｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏの１Ｍ溶液を流速２ｍＬ／ｍｉｎで５０分間、カラムに通した。次にそのカラムに２ｍＬ／ｍｉｎで１０分間、ジクロロメタンを流し、続いて、２ｍＬ／ｍｉｎで２０分間、ジクロロメタン中の２０％  メタノールを流した。最初にカラムにジクロロメタンを５ｍＬ／ｍｉｎで１０分間流し、続いて、ジクロロメタン中の４％  トリフルオロ酢酸溶液を５ｍＬ／ｍｉｎで４０分間流すことにより、インシトゥでＢｏｃ保護基の除去を行い、次に、５ｍＬ／ｍｉｎで２０分間、ジクロロメタンで洗い流した。次に、ジクロロメタン中の０．５％トリエチルアミンの溶液をカラムを介して５ｍＬ／ｍｉｎで４０分間押し出し、続いて、ジクロロメタンを５ｍＬ／ｍｉｎで２０分間押し出した。
【実施例７】
【００３８】
低ロード量での様々な固定相におけるニューモカンディンＢ０のＨＰＬＣの比較。
【００３９】
ニューモカンディンＢ０及びその類似物の分析的ロードを使用した際の様々な固定相により得られる保持力及び選択特性を比較するために、分析スケールのＨＰＬＣカラム、２５０ｍｍ長ｘ４．６ｍｍ  ｉｄを使用した。この様々な固定相には、（１）標準的シリカ、及び（２）アミノプロピルシリカ（Ｅｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｂｏｈｕｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）より入手。）及び（３）Ａｍｉｄｅ−８０（シリカに結合したアミド部分、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｅｐ  ＬＬＣ（Ｊａｐａｎ）より入手。）が含まれた。これらの充填物は全て、１０μｍ  粒子サイズ及び１２０Åポア直径であった。この標準的シリカは、単純な液体クロマトグラフィー系としての実験であり、Ｌ−プロリンで修飾した移動相を用い、その結果、そのシリカはプロリンで飽和された。Ｊ．Ｎｔｉ−Ｇｙａｂａａｈら、“Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｎｅｕｍｏｃａｎｄｉｎ  Ｂ０，ａ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｆｏｒ  ＣＮＡＣＩＤＡＳ”，ＰＲＥＰ−２００３，１６ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｅｘｈｉｂｉｔ  ａｎｄ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐｓ  ｏｎ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ／Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，Ｗｅｄｎｅｓｄａｙ，Ｊｕｌｙ  ２，２００３又は米国仮出願番号第６０／４２２，３５６号（２００２年１０月３０日出願）を参照のこと。
【００４０】
Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ，ＰＡ，ＵＳＡ）からのＨＰＬＣグレードの溶媒を用いて、３種類からなる移動相及びフィード希釈液（８４／９／７  ｖ／ｖ／ｖ  酢酸エチル、メタノール及び水）を調製した。プロリン溶出シリカ実験に対して使用したＬ−プロリンは、Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ（Ｊａｐａｎ）から入手した。Ｌ−プロリンは、３種類からなる移動相で、０．１２ｇ／Ｌになるように溶解した。フィードは、ＰｎＢ５、ＰｎＣ０及びＰｎＥ０を含有する溶液のアリコートと純粋なＰｎＢ０（標準的シリカゲル法により精製された未精製ＰｎＢ０）を混合することにより、これらの類似物が、およそ１ｇ／Ｌで存在するＰｎＢ０の、およそ１０％濃度でそれぞれ存在するように調製した。ＰｎＣ０に富む溶液は、標準的なシリカゲル法を用いたシリカゲルにおいて未精製ＰｎＢ０の注入からテールカット（ｔａｉｌｃｕｔ）分画を選択することにより得た。ＰｎＢ５及びＰｎＥ０に富む溶液は、プロリン溶出法を用いてシリカゲルにおいてＰｎＢ０の注入からフォアカット（Ｆｏｒｅｃｕｔ）分画を選択し、次に、ＰｎＢ０の分析的分析（この実施例で後に述べる。）のために使用したものと同様であるがフィードローディング量が大きい逆相法により、それらの部分をさらに精製することにより得た。ＨＰＬＣ実験ならびに分画分析には、ダイオードアレイ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ−１１００ＨＰＬＣシステム（Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、検出のために２７８ｎｍの波長を用いた。
【００４１】
各注入に対して、１ｇ／Ｌ  フィード溶液  １０μＬを注入した。移動相の流速は、１．１ｍＬ／ｍｉｎであった。プロリン修飾移動相及び標準的シリカを用いた実験のために、Ｌ−プロリンを〜０．１２ｇ／Ｌになるようにこの移動相に溶解し、次にその溶液の〜４８０ｍＬを、シリカカラムを介して押し出した（そのシリカをプロリンでインシトゥ被覆するために）。この実験のために、溶出液としてＬ−プロリン含有溶液を使用した。この実験から得られたクロマトグラムを図１、２、３及び４で示す。
【００４２】
各実験に対して、分画を回収し、米国仮出願番号第６０／４２２，３５６号（２００２年１０月３０日出願）（参照により本明細書に組み込む。）又はＪ．Ｎｔｉ−Ｇｙａｂａａｈら、“Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｎｅｕｍｏｃａｎｄｉｎ  Ｂ０，ａ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｆｏｒ  ＣＡＮＣＩＤＡＳ”，ＰＲＥＰ−２００３，１６ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｅｘｈｉｂｉｔ  ａｎｄ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐｓ  ｏｎ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ／Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，Ｗｅｄｎｅｓｄａｙ，Ｊｕｌｙ  ２，２００３に記載の方法を用いて順相及び逆相ＨＰＬＣでそれらを分析することによりピークを確認した。次に、ニューモカンディンＢ０、Ｅ０、Ｂ５及びＣ０の保持時間を用いて、容量比を計算し、そこから、ＰｎＢ０と３種類の類似物との間の選択性を得た。その結果を図１から５及び表２に示す。
【００４３】
【表２】
2007504460.tif 000019
【実施例８】
【００４４】
固定相としてＡｍｉｄｅ−８０を用いたニューモカンディンＢ０の精製
Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｅｐ  ＬＬＣから、２５０ｍｍ長ｘ４．６ｍｍ  ｉｄカラム（１０μｍ粒子サイズ、８ｎｍ  ポアサイズ、球状）としてＡｍｉｄｅ−８０結合相を得た。対照として、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙから販売されているＷ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ／Ｄａｖｉｓｏｎ  シリカゲルＧｒａｄｅ−６３１カラム（２５０ｍｍ長ｘ４．６ｍｍ  ｉｄ，１６−２０Ｔｍ粒子サイズ、６０Åポアサイズ、不均一）を用いて、プロリン修飾移動相で平衡化した非修飾シリカカラムにおいて同じフィード物質を用いた分離を行った。両実験に対する移動相組成は、８８／９／７  ｖ／ｖ／ｖ  酢酸エチル／メタノール／水（ｅ／ｍ／ｗ）であり；プロリン修飾移動相はまた、Ｌ−プロリン  ０．１２ｇ／Ｌを含有していた。溶媒は全て、Ｆｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＨＰＬＣグレード試薬であった。プロリンは、Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ（Ｊａｐａｎ）から得た。
【００４５】
６１．９％の純度を有するニューモカンディンＢ０（ＰｎＢ０  未精製）の部分精製調製物を、カラムフィードを調製するために使用した。ＰｎＢ０未精製物を調製するための方法は、米国特許第５，２０２，３０９号、第５，１９４，３７７号及び第６，６１０，８２２号で与えられる。Ａｍｉｄｅ−８０の実験に対して、７５／２０／８  ｖ／ｖ／ｖ  酢酸エチル、メタノール及び水の混合液に、フィード溶液中のニューモカンディンＢ０濃度が〜４５ｇ／Ｌになるように、ＰｎＢ０未精製物を溶解することによりフィード溶液を調製した。対照実験のために、７５／１７／８  ｖ／ｖ／ｖ  酢酸エチル／メタノール／水のフィード溶媒混合液を用い、１．５ｇ／Ｌ  プロリン及び〜４５ｇ／Ｌ  ＰｎＢ０とした。
【００４６】
使用前に、カラムにメタノール  １０カラム体積（ｃｖ）を流し、移動相  １０ｃｖで平衡化した。各注入に対して、フィード溶液  １．２ｍＬを注入（〜１５ｇ／Ｌベッドに相当）した。移動相流速は、〜０．５ｍＬ／ｍｉｎであった。各実験に対して、分画を回収し、分離の特性を評価するために分析した。一貫した溶出プロファイルであることを確実にするために、各注入を繰り返した。プロリン修飾移動相を用いた実験に対して、最初の注入前に、プロリン含有移動相の〜４８０ｍＬを、非修飾シリカカラムを介して押し出した。
【００４７】
分析方法：
各実験に対して、分画を回収し、逆相及び順相ＨＰＬＣにより分析した。その試料をＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ−１１００分析的ＨＰＬＣ系で分析した。逆相法においてＰｎＢ０とともに溶出される、ＰｎＣ０を除く殆どの種を定量するために、逆相ＨＰＬＣを使用した。ＰｎＣ０を測定するために、順相ＨＰＬＣアッセイを使用した。
【００４８】
ＰｎＣ０の測定
順相ＰｎＢ０アッセイ、５μｍの粒子サイズ及び１２０ÅのポアサイズであるＹＭＣシリカカラム（ＳＬ１２Ｓ０５−２５４６ＷＴ）を用いた定組成ＨＰＬＣ法により、ＰｎＣ０の量を測定した。カラムは、２５０ｘ４．６ｍｍ  ｉ．ｄ．であり、２５℃で維持した。溶出は、８４／９／７  酢酸エチル／メタノール／水  溶出液の定組成であった。流速は、１．２ｍＬ／ｍｉｎであり、検出は、２７８ｎｍのＵＶ吸収により行った。産物試料は、注入前に特別な調製を必要としなかった。
【００４９】
ＰｎＢ０及び他の種の測定
ＰｎＢ０／ＰｎＣ０及び、ＰｎＥ０及びＰｎＢ５を含む他の種を測定するために、逆相ＨＰＬＣアッセイを使用する。この逆相アッセイにおいて、４μｍ粒子サイズ、８０ÅポアサイズのＹＭＣ  Ｊ’Ｓｐｈｅｒｅカラム（ＪＭ０８Ｓ０４−２５４６ＷＴ）を用いて、勾配ＨＰＬＣ法を使用する。カラムは、２５０ｘ４．６ｍｍ  ｉ．ｄ．であり、３０℃で維持した。使用した２種類の移動相は、０．１％  リン酸（Ａ）及びアセトニトリル（Ｂ）であった。溶出勾配は、６０％Ａ及び４０％Ｂから開始して、１％Ａ及び９９％Ｂまで、１．５ｍＬ／ｍｉｎで４５分間にわたり変化させ、２２０ｎｍでＵＶ検出を行った。分析前に、窒素下で試料を吹き込み乾燥し、元の濃度になるようにメタノールに再溶解した。
【００５０】
結果
非修飾シリカゲルにおいてプロリン修飾移動相を用いて得られる典型的なクロマトグラムを図６に示す。図に示されるように、ＰｎＢ０が、大きな高濃度の分画として溶出され、ＰｎＥ０及びＰｎＢ５（先行するピークで溶出）から良く分離されている。
【００５１】
Ａｍｉｄｅ−８０カラムにおける実験から得られたクロマトグラムを図７に示す。この実験では、移動相又はフィード溶媒のいずれにもプロリン又は他の修飾剤を用いなかった。対照の場合よりもメタノール濃度がわずかに高いフィード溶媒混合液を使用する。この固相におけるＰｎＢ０の保持力は、プロリン修飾移動相を用いた対照実験に対して得られたもの（図６で示す。）と同様であった。実際に、溶出プロファイルは、対照システムと、主要なＰｎＢ０ピークがより平らで広がっていることを除き、非常に似ている。
【００５２】
〜６から１４カラム体積（ｃｖ）から多くの分画を回収し、その分画を順相及び逆相ＨＰＬＣ両方で分析した。この分析により、ＰｎＥ０及びＰｎＢ５などの類似物がＰｎＢ０から良く分離され、これらの類似物が、図７において〜６から８．５ｃｖに相当する分画に含有されたことが確かめられた。順相分析の結果から、殆どのＰｎＣ０が、図７において１３から１４ｃｖに相当する分画に分離されたことが示された。したがって、図７において示される〜８．５から１３ｃｖに相当する分画は、回収率が＞９０％の純粋で高濃度の部分を得るために合わせることができる。
【実施例９】
【００５３】
固定相としてＮ−Ｌ−プロリル−３−アミノプロピルシリカを用いたニューモカンディンＢ０の精製
Ｎ−Ｌ−プロリル−３−アミノプロピルシリカ固定相を含有してカラムを調製した。この固定相の調製方法は、実施例５及び６で示した。利用したカラムは、２５０ｍｍ長ｘ４．６ｍｍ  ｉ．ｄ．であり、５μｍの粒子サイズ及び６０Åのポアサイズである、ＥＳ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓの球状シリカに結合したプロリン−アミド部分を含有していた。この実験は、他の部分は、実施例８で述べたものと同じであり、その結果はまた、図６で説明されるその実施例における対照に対して評価し得る。
【００５４】
Ｎ−Ｌ−プロリル−３−アミノプロピルシリカ結合相における実験から得たクロマトグラムを図８に示す。示されるように、フィードにおけるメタノール濃度が高くなっており、この系からプロリンが除外されているにもかかわらず、この相におけるＰｎＢ０の保持力は、プロリン修飾移動相を用いて非修飾シリカにおいて得られたもの（図６で示す。）と同様であった。しかし、重要な違いがいくつかある。第一に、対照のシステムにおいて通常観察される大きな溶媒の最前部のピークが小さくなっているように見えることである。その他の違いは、主要なＰｎＢ０ピークの開始部分において溶出される混入物が互いに良く分離されているように見えることである。最後に、ＰｎＢ０ピークのテール部分が長くなっていることである（図６と比較）。
【００５５】
〜１０から２１ｃｖから多くの分画を回収し、順相及び逆相ＨＰＬＣの両方によりこの分画を分析した。分析結果から、ＰｎＢ５及びＰｎＥ０などの主要な初期に溶出される混入物がＰｎＢ０からはっきりと分離されたことが示された。これらの混入物は、図８における１０−１３ｃｖの範囲に相当する分画に殆ど含有される。順相分析の結果から、ＰｎＣ０の殆どが図８における１３から１４ｃｖの範囲に相当する分画に分離されたことが示された。したがって、〜１３から１９ｃｖ（図８で示される。）は、回収率が＞９０％の純粋で高濃度の部分を得るために合わせることができる。
【実施例１０】
【００５６】
固定相としてＮ−メチルカルバモイル−３−アミノプロピルシリカを用いたニューモカンディンＢ０の精製
Ｎ−メチルカルバモイル−３−アミノプロピルシリカ固定相を含有してカラムを調製した。この固定相の調製方法は、実施例３及び４で示した。この実施例におけるカラムは、２５０ｍｍ長ｘ４．６ｍｍ  ｉｄであり、５μｍの粒子サイズ及び６０Åのポアサイズである、ＥＳ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓの球状シリカに結合したＮ−メチルカルバモイル−３−アミノプロピルシリカ部分を含有していた。この実験は、他の部分は、実施例８で述べたものと同じであり、その結果はまた、図６で説明されるその実施例における対照に対して評価し得る。
【００５７】
Ｎ−メチルカルバモイル−３−アミノプロピルシリカ結合相における実験から得たクロマトグラムを図９に示す。フィードにおけるメタノール濃度が高くなっており、この系からプロリンが除外されているにもかかわらず、この相におけるＰｎＢ０の保持力は優れていた（図６と比較。）。〜２１から４０ｃｖから多くの分画を回収した。その分画を順相及び逆相ＨＰＬＣにより分析した。分画分析から、ＰｎＥ０及びＰｎＢ５などの初期に溶出される類似物がＰｎＢ０から良く分離され、図９に示される、〜２１から２５ｃｖに相当する分画に含有されていたことが示された。順相分析の結果から、ＰｎＣ０などの遅れて溶出される類似物からのＰｎＢ０の分離が対照のプロセスに相当するものであることが示された。この実験の高濃度部分において数％レベルで、先行する実施例においては存在したとしても痕跡レベルでしか見られなかった開環分解が存在した。この分解以外、この遅れて溶出される分画は非常に純粋であった。
【実施例１１】
【００５８】
固定相としてＮ−β−アラニンアミドプロピルシリカを用いたニューモカンディンＢ０の精製
Ｎ−β−アラニンアミドプロピルシリカ固定相を含有してカラムを調製した。この固定相の調製方法は、実施例１及び２で示した。使用したカラムは、２５０ｍｍ長ｘ４．６ｍｍ  ｉ．ｄ．であり、５μｍの粒子サイズ及び６０Åのポアサイズである、ＥＳ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓの球状シリカに結合したアミノプロピル部分に結合した１個のプロピルアミド部分を含有していた。この実験は、他の部分は、実施例８で述べたものと同じであったが、固定相は、評価した他の殆どのものよりも保持力が著しく強く、このカラムからＰｎＢ０を完全に溶出するためには、より強力な移動相（７５／１７／８  酢酸エチル／メタノール／水）が必要であった。この結果は、なお、図６で示される対照に対して評価し得る。
【００５９】
Ｎ−β−アラニンアミドプロピルシリカ結合相における実験から得られたクロマトグラムを図１０に示す。プロリン溶出法の系で通常観察される大きな溶媒の最前部のピークが、小さくなっているように見えることを指摘することは重要である。他の違いは、主要なＰｎＢ０ピークの開始部で溶出される主要な混入物が良く分離されていることである。
【００６０】
〜６から１３ｃｖから、いくつかの分画を回収した。この分画を順相及び逆相ＨＰＬＣの両方で分析した。この分析結果から、ＰｎＥ０及びＰｎＢ５などの初期に溶出される類似物がＰｎＢ０からはっきりと分離されていることが示された。これらの混入物は、殆ど、〜６から８ｃｖに相当する分画に含有されていた。順相分析の結果から、ＰｎＣ０の殆どが１１から１３ｃｖに相当する分画に分離されたことが分かった。〜８から１１ｃｖに相当する分画（図１０で示される。）は、回収率が＞９０％の純粋で高濃度の部分を得るために合わせることができる。低いレベルの開環分解が高濃度部分において検出された。この保持力により、溶媒の強度においてフィード溶媒混合液と非常に近い溶出のための移動相を使用することができ、その結果、非常に安定したクロマトグラフィー性能が得られるので、これは、より優れた固定相である可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】未精製ニューモカンディンＢ０のシリカゲルクロマトグラフィー精製のクロマトグラム（吸収２７８ｎｍ対時間）。
【図２】プロリン修飾移動相を用いた、未精製ニューモカンディンＢ０のシリカゲルクロマトグラフィー精製のクロマトグラム（吸収２７８ｎｍ対時間）。
【図３】未精製ニューモカンディンＢ０のアミノプロピル−シリカゲルクロマトグラフィー精製のクロマトグラム（吸収２７８ｎｍ対時間）。
【図４】未精製ニューモカンディンＢ０のＡｍｉｄｅ−８０−シリカゲルクロマトグラフィー精製のクロマトグラム（吸収２７８ｎｍ対時間）。
【図５】シリカゲル、シリカゲル−プロリン修飾、アミノプロピルシリカゲル及びＡｍｉｄｅ−８０−シリカゲルにおける、ニューモカンディンＢ０及び関連類似物の容量比。
【図６】プロリン修飾移動相、０.１２ｇ／Ｌ  プロリンが入った８８：９：７  酢酸エチル：メタノール：水  溶出液（前もって飽和させたカラム）及びフィード中に１.５ｇ／Ｌプロリンが入ったフィード溶媒混合液としての７５：１７：８酢酸エチル：メタノール：水を用いた、未精製ニューモカンディンＢ０のシリカゲルクロマトグラフィー精製に対するクロマトグラム（吸収２７８ｎｍ対カラム体積）。
【図７】相、８８：９：７  酢酸エチル：メタノール：水  溶出液及びフィード溶媒混合液として７５：２０：８  酢酸エチル：メタノール：水を用いた、未精製ニューモカンディンＢ０のＡｍｉｄｅ−８０−シリカゲルクロマトグラフィーに対するクロマトグラム（吸収２７８ｎｍ対カラム体積）。
【図８】相、８８：９：７  酢酸エチル：メタノール：水  溶出液及びフィード溶媒混合液として、７５：２０：８  酢酸エチル：メタノール：水を用いた、未精製ニューモカンディンＢ０のＮ−Ｌ−プロリル−３−アミノプロピルシリカゲルクロマトグラフィーに対するクロマトグラム（吸収２７８ｎｍ対カラム体積）。
【図９】８８：９：７  酢酸エチル：メタノール：水  溶出液及びフィード溶媒混合液として、７５：２０：８  酢酸エチル：メタノール：水を用いた、未精製ニューモカンディンＢ０のＮ−メチルカルバモイル−３−アミノプロピルシリカゲルクロマトグラフィーに対するクロマトグラム（吸収２７８ｎｍ対カラム体積）。
【図１０】８８：９：７  酢酸エチル：メタノール：水  溶出液及びフィード溶媒混合液として、７５：２０：８  酢酸エチル：メタノール：水を用いた、未精製ニューモカンディンＢ０のＮ−β−アラニンアミドプロピルシリカゲルクロマトグラフィーに対するクロマトグラム（吸収２７８ｎｍ対カラム体積）。
【図１】
2007504460.tif 000024
【図２】
2007504460.tif 000025
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2007504460.tif 000029
【図７】
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【図８】
2007504460.tif 000031
【図９】
2007504460.tif 000032
【図１０】
2007504460.tif 000033
【国際調査報告】
2007504460.tif 000034