(57)【要約】  ＧＡＧ結合部位を、特性決定された蛋白質に導入する方法であって、工程：−構造保持に必須でない蛋白質中の領域を同定すること；−塩基性アミノ酸を上記部位中に導入するか、及び／又は、少なくとも一つの巨大な及び／又は酸性のアミノ酸を上記部位において欠失させることを含み、ＧＡＧ結合部位はＫｄ≦１０μＭ、好ましくは≦１μＭ、さらに好ましくは≦０．１μＭのＧＡＧ結合親和性を有する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＡＧ結合部位を、特性決定された蛋白質に導入する方法であって、工程：
・構造保持に必須でない蛋白質中の領域を同定すること
・塩基性アミノ酸を上記部位中に導入するか、及び／又は、少なくとも一つの巨大な及び／又は酸性のアミノ酸を上記部位において欠失させること
を含み、
ＧＡＧ結合部位はＫｄ≦１０μＭ、好ましくは≦１μＭ、さらに好ましくは≦０．１μＭのＧＡＧ結合親和性を有する、
方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法により得ることができる蛋白質。
【請求項３】
修飾されたＧＡＧ結合蛋白質であって、当該蛋白質内のＧＡＧ結合領域が少なくとも一つのアミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠失により修飾されることにより、上記ＧＡＧ結合領域中の塩基性アミノ酸の相対量を増加させるか、及び／又は上記ＧＡＧ結合量中、好ましくは溶剤露出位置において巨大か及び／又は酸性のアミノ酸を減少させることを特徴とし、そして当該蛋白質のＧＡＧ結合親和性が各野生型蛋白質のＧＡＧ結合親和性に比較して増加していることを特徴とする、修飾されたＧＡＧ結合蛋白質。
【請求項４】
Ａｒｇ，Ｌｙｓ，及びＨｉｓからなる群から選択される少なくとも一つの塩基性アミノ酸がＧＡＧ結合領域に挿入されていることを特徴とする、請求項２又は３記載の蛋白質。
【請求項５】
蛋白質がケモカイン、好ましくはＩＬ−８，ＲＡＮＴＥＳ又はＭＣＰ−１であることを特徴とする、請求項２乃至４の何れか１項記載の蛋白質。
【請求項６】
ＧＡＧ結合領域がＣ末端αヘリックスであることを特徴とする、請求項５記載の蛋白質。
【請求項７】
ＩＬ−８の１７、２１、７０、及び／又は７１位がＡｒｇ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ，Ａｓｎ及び／又はＧｌｎにより置換されていることを特徴とする、請求項６記載の蛋白質。
【請求項８】
増加したＧＡＧ結合親和性が硫酸ヘパラン及び／又はヘパリンに対する増加した結合親和性であることを特徴とする、請求項２乃至７の何れか１項記載の蛋白質。
【請求項９】
さらなる生物学上活性な領域が修飾されることにより上記蛋白質のさらなる生物学上の活性を阻害するか及び／又はダウン制御することを特徴とする、請求項２乃至８の何れか１項記載の蛋白質。
【請求項１０】
さらなる生物学上活性な領域が、欠失、挿入、及び／又は置換により、好ましくはアラニン、立体構造上及び／又は静電上類似の残基により修飾されていることを特徴とする、請求項９記載の蛋白質。
【請求項１１】
蛋白質がケモカインであり、そしてさらなる生物学上の活性が白血球活性化であることを特徴とする、請求項９又は１０記載の蛋白質。
【請求項１２】
蛋白質がＩＬ−８であり、そしてさらなる生物学上活性な領域が最初の１０個のＮ末端アミノ酸の中に位置することを特徴とする、請求項１１記載の蛋白質。
【請求項１３】
蛋白質がＩＬ−８であり、そして最初の６個のＮ末端アミノ酸が欠失していることを特徴とする、請求項１２記載の蛋白質。
【請求項１４】
蛋白質が、ｄｅｌ６Ｆ１７ＲＥ７０ＫＮ７１Ｒ，ｄｅｌ６Ｆ１７ＲＥ７０ＲＮ７１Ｋ及びｄｅｌ６Ｅ７０ＫＮ７１Ｋからなる群から選択されるＩＬ−８であることを特徴とする、請求項１２記載の蛋白質。
【請求項１５】
請求項２乃至１４の何れか１項に記載された蛋白質をコードすることを特徴とする、単離されたポリ核酸分子。
【請求項１６】
ストリンジェントな条件下で請求項１５記載のＤＮＡ分子にハイブリダイズすることを特徴とする、単離されたポリ核酸分子。
【請求項１７】
請求項１５又は１６記載の単離されたＤＮＡ分子を含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項１８】
請求項１７記載のベクターにより安定にトランスフェクトされていることを特徴とする、組換え細胞。
【請求項１９】
請求項２乃至１４の何れか１項記載の蛋白質、請求項１５又は１６記載のポリ核酸又は請求項１７記載のベクター及び薬学上受容可能な担体を含むことを特徴とする、薬学組成物。
【請求項２０】
請求項２乃至１４の何れか１項記載の蛋白質、請求項１５又は１６記載のポリ核酸又は請求項１７記載のベクターの、各野生型蛋白質の生物活性を阻害するか又は抑圧するための方法における、使用。
【請求項２１】
請求項２乃至１４の何れか１項記載の蛋白質、請求項１５又は１６記載のポリ核酸又は請求項１７記載のベクターの、炎症性の症状の治療のための医薬を製造するための方法における、使用。
【請求項２２】
炎症性症状が、慢性関節リウマチ、乾癬、骨関節症、喘息、アルツハイマー疾患、及び多発性硬化症からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２１記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、ケモカインと白血球上のそれらの高親和性受容体の相互作用の阻害のための方法とツール及び炎症性疾患の治療処置のための方法に関する。
ケモカインは、化学誘引物質サイトカインを起源とし、実際は５０より多いメンバーを含み、そして小さくて誘導可能な、そして分泌される、低分子量の蛋白質（それらのモノマー形態において６−１２ｋＤａ）のファミリーを表し、免疫監視機構及び炎症のプロセスの間に決定的な役割を担う。免疫及び炎症におけるそれらの機能に依存して、それらは、２つのクラスに区別することができる。多くの異なる組織細胞により、並びに細菌の毒素及び炎症性サイトカイン、例えばＩＬ−１，ＴＮＦ及びインターフェロンに応答して白血球を移入する（immigrating）ことにより、炎症性ケモカインは生産される。それらの主な機能は、宿主の防御のため及び炎症のプロセスにおいて白血球を補充することである。ホーミングケモカインは、他方、リンパ組織の規定されたエリアにおいて構成的に発現される。それらは、免疫系において白血球及び星状細胞の往来及びホーミングを指示する。これらのケモカインは、ＢＣＡ−１，ＳＤＦ−１又はＳＬＣにより例示されたとおり、成熟、分化、活性化のコンテクストにおいて白血球の再配置及び再循環を制御し、そして二次リンパ器官内でそれらの正確なホーミングを確保する（ensure）。
【０００２】
多数の見本にも拘わらず、ケモカインは顕著に類似の構造的折り畳み（folds）を示すが、配列相同性は２０から７０パーセントの間で変化する。ケモカインは、大まかに、７０−１３０アミノ酸からなり、４つの保存されたシステイン残基を伴う。システインは２つのジスルフィド結合を形成し（Ｃｙｓ  １→Ｃｙｓ  ３，Ｃｙｓ  ２→Ｃｙｓ  ４）、それらの特徴的な三次元構造に必須である。走化性ケモカインは、短いアミノ末端ドメイン（３−１０アミノ酸）、第１システイン残基、β鎖並びに第２及び第４システイン残基の間に見いだされる接続ループ、並びに２０−６０アミノ酸のカルボキシル末端αヘリックスからなる。蛋白質のコアは、うまく整列された構造を有するが、Ｎ−及びＣ−末端部分は乱れている。分泌蛋白質のように、それらは、２０−２５アミノ酸のリーダー配列を伴って合成されて、放出の前に分割されて、はずれる。
【０００３】
ケモカインは成熟蛋白質内のそれらのシステイン残基の相対的な位置に基づいて４つのファミリーに副次的に分けられる。αケモカインサブファミリーにおいては、４つのシステインのうちの最初の２つが単一アミノ酸（ＣＸＣ）として分離され、一方βケモカインにおいては対応するシステイン残基が互いに隣接し合う（ＣＣ）。αケモカインは、さらに、Ｎ末端にＥＬＲ配列を含むことにより好中球に走化性であるもの（ＩＬ−８、例えば）、及びＥＬＲモチーフを欠きリンパ球に作用するもの（Ｉ−ＴＡＣ、例えば）に分類することができる。構造上、βケモカインは２つのファミリーに副次的に分類することができ、単球−化学誘引性蛋白質エオタキシンファミリーであって５つの単球化学誘引性蛋白質（ＭＣＰ）と互いに約６５パーセント同一のエオタキシンを含むものと、それ以外のβケモカインである。ＣＸＣ−ファミリーの場合のように、ＣＣ−残基の上流のＮ−末端アミノ酸が、ケモカインの生物活性及び白血球選択性に必須の成分である。βケモカインは、一般に、好中球には作用せず、しかし単球、好酸球、好塩基球及びリンパ球を可変性選択性をもって誘引する。
【０００４】
ほんのわずかなケモカインがＣＣ−又はＣＸＣ−ファミリーに適合しない。リンフォタクチンは、これまで、その初期構造において４つの特徴的なシステインの代わりにたった２つしか示さない唯一のケモカインであり、即ち、γ−又はＣ−ケモカインとして分類される。他方、この分類を締めくくることにより、フラクタルカイン（fractalkine）は最初の２つのシステインを隔てる３つのアミノ酸を有するδ−又はＣＸＸＸＣ−サブファミリーの唯一の代表である。リンフォタキシン及びフラクタルカインはどちらもＴ−細胞及びナチュラルキラー細胞の走化性を誘導する。
【０００５】
ケモカインは、特定の細胞表面、標的細胞上の７つの膜貫通スパニング（７ＴＭ）Ｇ−プロテイン共役受容体に結合することにより、細胞の移動（migration）及び活性化を誘導する。１８のケモカイン受容体がこれまでにクローン化されており、６つのＣＸＣ、１０のＣＣ、１つのＣＸ３Ｃ及び１つのＸＣ受容体を含む。ケモカイン受容体は特定の細胞に限定され（例えば、ＣＸＣＲ１は好中球に限定される）るが、その他は、より広く発現される（例えば、ＣＣＲ２は単球、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞及び好塩基球上で発現される）。ケモカインに類似して、上記受容体は特定の細胞上で構成的に発現されるが、いくつかは誘導可能である。それらのいくつかはダウン制御さえもされ得て、細胞を特定のケモカインに対して非応答性にするが、その他に対しての応答性は残す。ほとんどの受容体が１つより多いケモカインを認識し、逆もまた同じで、しかしながら認識は対応するサブファミリーのケモカインに限定される（表１を参照）。
【０００６】
【表１】
2007536906.tif 000002
【０００７】
ケモカインはそれらの受容体への相互作用のための主要な２つの部位を有し、一つはアミノ末端ドメイン中にあり、そして他方は第２と第３システイン残基の間に伸びるバックボーンの露出されたループ内にある。両部位はジスルフィド結合により近い位置を持つ。受容体は最初にドッキングドメインとして機能するらしいループ領域内の結合部位を認識する。この相互作用はケモカインの移動性（mobility）を制限し、即ち、アミノ末端ドメインの正確な位置付けを容易にする。それらの受容体に対して有効に今まで通り結合するがシグナルを生じない変異体ケモカインを用いて、研究が実施された。これらの変異体は例えば、ＩＬ−８，ＲＡＮＴＥＳ及びＭＣＰ−１のＮ末端内のアミノ酸欠失又は修飾により得られた。
【０００８】
複数の細胞内シグナリング経路が、受容体活性化後に、ケモカイン結合の結果として生じる。ケモカインは、２種類の非シグナリング分子とも相互作用する。一つはＤＡＲＣ受容体であって、赤血球上及び内皮細胞上で発現されてＣＣ−ケモカイン並びにＣＸＣ−ケモカインに結合することによりそれらが循環されるのを阻止する。第２の種類は、硫酸ヘパラングリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）であり、プロテオグリカンの一部であって、ケモカインの共同受容体として機能する。それらは、ホーミング組織（例えば、内皮細胞）の表面上でケモカインを捕捉して提示することにより、局所的濃度勾配を確立する。炎症性応答、例えば慢性関節リウマチにおいては、セレクチン媒介性プロセスにおいて内皮上の白血球ローリングが、細胞表面のプロテオグリカンにより提示されるケモカインと接触する。それにより、白血球インテグリンが活性化されるようになり、安定した接着及び溢出を導く。補充された白血球は、局所炎症性ケモカインにより活性化されて、ケモカインの局所性高濃度のためにさらなるケモカインシグナリングに対して鈍感になるかもしれない。組織血流ケモカイン勾配を保持するために、ＤＡＲＣ受容体は過剰のケモカインのための下水だめ（sink）として機能する。
【０００９】
硫酸ヘパラン（ＨＳ）グリコサミノグリカンは、グリコサミノグリカンの側鎖に共有結合したコア蛋白質からなり、ほとんどの哺乳類細胞及び組織に見いだされる。蛋白質部分は細胞膜中又は細胞外マトリックス内のプロテオグリカンの位置決めを決定するが、グリコサミノグリカン成分は様々な細胞外リガンド、例えば成長因子、ケモカイン及び接着分子との相互作用を媒介する。プロテオグリカンの生合成は以前に広く総説された。細胞表面プロテオグリカンの主要なグループは、膜貫通蛋白質のシンデカンファミリー（哺乳類においては４つのメンバー）及びグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）テイルにより細胞膜に結合される蛋白質のグリピカン（哺乳類においては６つのメンバー）である。グリピカンは、神経系において、腎臓において、広範囲に、そして少ない程度では骨格筋及び平滑筋において発現されるが、シンデカン−１は上皮細胞において主要なＨＳＰＧであり、シンデカン−２は繊維芽細胞及び内皮細胞において支配的であり、そしてシンデカン−３は神経細胞において富裕であり、そしてシンデカン−４は広範囲に発現される。特定のセリン上のテトラサッカライド結合領域を通してシンデカンコア蛋白質に添加されるＧＡＧ鎖の大多数は、ＨＳ鎖である。膜貫通及びサイトプラズムドメインとは対照的に、特定のシンデカンタイプの細胞外ドメインのアミノ酸配列は異なる種の間では保存されていないが、ＧＡＧ鎖の数及び位置は高度に保存されている。ＧＡＧの構造は、しかしながら、種特異的であり、さらに、ＨＳＰＧ発現組織の性質に依存する。
【００１０】
硫酸ヘパラン（ＨＳ）は直鎖状ポリサッカライドのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ファミリーのもっとも豊富な蛋白質であり、ヘパリン、硫酸コンドロイチン、硫酸デルマタン及び硫酸ケラタンも含む。天然のＨＳはＤ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及びＤ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）から構成される２０−１００のジサッカライドユニットの直鎖により特徴付けされ、Ｎ−及びＯ−硫酸化（グルコサミンの６−Ｏ及び３−Ｏ硫酸化及びウロン酸の２−Ｏ硫酸化）並びにβ−Ｄ−グルクロン酸のα−Ｌ−イズロン酸（ＩｄｏＡ）へのエピマー化（epimerisation）を含むように修飾され得る。
【００１１】
低硫酸化の領域により分離されるＮ−及びＯ−硫酸化糖残基のクラスターは、多数の蛋白質結合及びＨＳの制御特性に主に必須であると推測される。ＨＳの硫酸基の塩基性アミノ酸への静電相互作用に加えて、ファンデルワース相互作用及び疎水性相互作用も蛋白質結合に関与すると考えられる。さらに、コンフォメーション上柔軟なイズロン酸残基の存在は、蛋白質へのＧＡＧ結合に好都合のようである。他の因子、例えば蛋白質結合部位の間の間隔をあけることも、蛋白質−ＧＡＧ結合相互作用において決定的な役割を担う：例えば、ＨＳにより誘導される−インターフェロンの二量体化は、低硫酸化の７ｋＤａ領域により分離される２つの蛋白質結合配列を伴うＧＡＧ鎖を必要とする。いくつかのリガンドの完全な生物活性には付加的な配列がときどき必要とされ：ＦＧＦ−２シグナルトランスダクションをサポートするためには、ＨＳがＦＧＦ受容体と相互作用すると想像される最少結合配列並びに追加の残基の両方を有さねばならない。
【００１２】
ヘパリン結合蛋白質は、しばしば、塩基性アミノ酸残基のクラスターからなる。リジン、アルギニン、アスパラギン、ヒスチジン及びグルタミンは、しばしば、ＧＡＧ上の硫酸基及びカルボキシル基との静電接触に関与する。塩基性アミノ酸の間隔（spacing）は、ときどき蛋白質３−Ｄ構造により決定されるが、ＧＡＧ結合特異性及び親和性を制御すると想定される。当該リガンドの生物活性はＨＳ−蛋白質相互作用のキネティクスによっても影響され得る。成長因子拡散の面積を減少させることは、ＧＡＧ鎖の長い繰り返しの特性並びにそれらの相対的に早い蛋白質結合のオン及びオフの速度が理想的に適合される、示唆されたＨＳＰＧ機能の一つである。いくつかの場合、熱力学よりもキネティクスが、ＨＳ−蛋白質結合の生理機能を推進する。ほとんどのＨＳリガンド機能は、明確な長さ及び構造のＧＡＧ配列を必要とする。マスト細胞により生産されるヘアピンは、構造上、硫酸ヘパランに類似しているが、相対的に小さな程度の構造多様性を伴って均一に高度な硫酸化をもたらす高いレベルの重合後修飾により特徴付けされる。即ち、硫酸ヘパラン中の高度に修飾されたブロックは、ときどき、「ヘアピン様」と呼ばれる。このため、ヘアピンはそのまま蛋白質の生物物理研究のための完璧なＨＳ類似体として使用可能であり、さらには、大量に利用できるので、ＨＳよりも経費がかからない。異なる細胞種が異なるグリコサミノグリカン構造を有するプロテオグリカンを合成することが示されており、その構造は病理の間、発生の間、又は細胞外シグナル、例えば成長因子に応答して変化する。ＨＳＰＧｓのこの構造多様性は、高い結合融通性を導き、プロテオグリカンの多大な重要性を強調する。
【００１３】
硫酸ヘパランプロテオグリカンはＦＧＦシグナリングに必須であるとの証明以来、幾人かの研究者がケモカイン活性を促進させるためのケモカイン−ＧＡＧ結合の重要性を示そうと実行した。第１に、これまでに研究されたほとんど全てのケモカインはインビトロにおいてＨＳを結合するらしく、これはこれらの蛋白質の根本的な特性を表すことを示唆する。第２に、インビボにおいてＴリンパ球がＣＣ−ケモカインをグリコサミノグリカンとの複合体として分泌するとの発見は、この形態の相互作用が生理学上関連していることを示す。さらに、ケモカインとＨＳの対合（association）は内皮表面を横切る濃度勾配を安定化させるのを助け、それにより白血球を移動させるための方向性の情報を提供することが知られている。ＨＳは蛋白質分解からケモカインを保護すること及びそれらのオリゴマー化を誘導すること、即ち、Ｇ−共役シグナリング受容体の付近で局所的高濃度を促進するとも考えられる。オリゴマー化の機能的な関連性は、しかしながら、議論が残されているが、全てのケモカインはマルチマー化のための明確な構造上の基礎を有する。β−シートの対合を通したダイマー化はＣＸＣ−ファミリー（例えば、ＩＬ−８）の全てのケモカインにおいて観察されており、それらのＮ−末端鎖を通してダイマー化するＣＣ−ケモカインファミリー（例えば、ＲＡＮＴＥＳ）のほとんどのメンバーとは対照的である。
【００１４】
豊富なデータがケモカインの相互作用の阻害及び低分子量化合物による白血球上のそれらの親和性受容体に関して蓄積した。しかしながら、このアプローチによる炎症性疾患の治療処置におけるブレイクスルーはない。
【００１５】
インターロイキン−８（ＩＬ−８）は慢性及び急性の炎症の間、好中球誘引（attraction）に関与する重要分子である。これまでにＩＬ−８の作用をブロックするためにいくつかのアプローチが企てられたが、例えば、グルココルチコイド、ビタミンＤ３，シクロスポリンＡ，形質転換成長因子β、インターフェロン等によるＩＬ−８生産の阻害に始まるが、それら全てはＩＬ−８のｍＲＮＡの生産レベルにおいてＩｌ−８活性を阻害する。以前使用されたさらなるアプローチは、特異的アンタゴニストとして作用するために白血球上の受容体に対するか又はＩＬ−８自身に対する特異的抗体を用いることによりＩＬ−８のその受容体への結合を阻害すること、即ちＩＬ−８活性を阻害することである。
【００１６】
本発明の目的は、よって、白血球上のケモカイン／受容体の相互作用の阻害又は妨害のための別の戦略を提供することである。特に、そのような戦略により、ＩＬ−９，ＲＡＮＴＥＳ又はＭＣＰ−１の作用を標的にすべきである。
【００１７】
本発明の主題は、よって、新規なＧＡＧ結合蛋白質並びにＧＡＧ−共同受容体に対して（野生型よりも）高い親和性を示す別のＧＡＧ結合蛋白質を生産する方法を提供することである。そのような修飾されたＧＡＧ結合蛋白質は野生型のＧＡＧ結合蛋白質との競合因子として作用することができ、そして野生型ＧＡＧ結合蛋白質の活性を阻害する点ではダウン制御することができるが、しかしながら当業界において使用される公知の組換え蛋白質を用いたときに生じる副作用がない。本発明による分子は上記の不都合をもたない。本修飾ＧＡＧ結合蛋白質は様々な治療用用途のためのドラッグにおいて使用することができ、特に、ケモカインの場合、当業界において使用される公知の組換え蛋白質を用いたときに生じる公知の不都合なしに炎症性疾患を治療するためのドラッグにおいて使用することができる。本発明によるＧＡＧ結合部位の修飾はこの部位に対する結合事象上にその活性が基づく全ての蛋白質、特にＧＡＧ部位によるケモカイン、のための広く適用可能な戦略であることが判明した。高いＧＡＧ結合親和性を有する本発明による好ましい分子は、それらの生物学上の効果、特にＧＡＧ部位に関する野生型分子とのそれらの競合によりそれらの抗炎症活性に関して特に有利であることが証明された。
【００１８】
よって、本発明は、ＧＡＧ結合部位を、特性決定された蛋白質に導入する方法を提供するが、工程：
―構造保持に必須でない蛋白質中の領域を同定すること
―塩基性アミノ酸を上記部位中に導入するか、及び／又は、少なくとも一つの巨大な及び／又は酸性のアミノ酸を上記部位において欠失させること
を含み、ＧＡＧ結合部位はＫｄ≦１０μＭ、好ましくは≦１μＭ、さらに好ましくは≦０．１μＭのＧＡＧ結合親和性を有する。塩基性アミノ酸を上記部位中に導入するか、及び／又は、少なくとも一つの巨大な及び／又は酸性のアミノ酸を上記部位において欠失させることにより、新規で改良された「人工の」ＧＡＧ結合部位が上記蛋白質に導入される。これは、上記修飾の前にはＧＡＧ結合活性を示さなかった蛋白質へのＧＡＧ結合部位の新規で完璧な導入を含む。これは、既にＧＡＧ結合活性を示す蛋白質へのＧＡＧ結合部位の導入も含む。新規なＧＡＧ結合部位は、ＧＡＧ結合親和性を示さない蛋白質の領域並びにＧＡＧ結合親和性を示す蛋白質の領域へ導入することができる。しかしながら、本発明のもっとも好ましい態様によれば、与えられたＧＡＧ結合蛋白質のＧＡＧ結合親和性の修飾が提供され、上記修飾された蛋白質のＧＡＧ結合能力が野生型蛋白質に比べて増加する。本発明は、ＧＡＧ結合部位を蛋白質に導入する方法、修飾されたＧＡＧ結合蛋白質、並びに単離されたＤＮＡ分子、ベクター、組換え細胞、薬学組成物、及び上記修飾された蛋白質の使用法に関する。
【００１９】
用語「少なくとも一つの塩基性アミノ酸を導入する」は、追加のアミノ酸の導入並びにアミノ酸の置換に関する。主要な目的は、塩基性アミノ酸、好ましくはＡｒｇ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ，Ａｓｎ及び／又はＧｌｎの上記部位における全アミノ酸に対する相対量を増加させることであり、それにより、結果のＧＡＧ結合部位が好ましくは少なくとも３つの塩基性アミノ酸、さらに好ましくは４、もっとも好ましくは５つのアミノ酸を含むべきである。
【００２０】
ＧＡＧ結合部位は、好ましくは、溶媒露出位置、即ち、ループにある。これは、有効な修飾を保証する。
蛋白質の領域が構造の保持に必須であるか否かは、例えば、当業者には知られている特定のプログラムとともにコンピュータの方法により試験することができる。蛋白質の修飾の後に、コンフォメーションの安定性をインシリコにて試験することが好ましい。
【００２１】
用語「巨大な」アミノ酸は、長いか又は立体構造干渉性の側鎖を有するアミノ酸を意味する；これらは特にＴｒｐ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｐｈｅ，Ｔｙｒである。酸性アミノ酸は、特に、Ｇｌｕ及びＡｓｐである。好ましくは、結果のＧＡＧ結合部位が巨大かつ酸性のアミノ酸を含まないことであり、すべての巨大なかつ酸性のアミノ酸が除去されていることを意味する。
【００２２】
ＧＡＧ結合親和性を測定する−本出願の保護の範囲のため−解離定数Ｋｄを通して。一つの可能性は、リガンド結合における構造変化によるあらゆる与えられた蛋白質の解離定数（Ｋｄ）を測定することである。さまざまな技術が当業者には知られており、例えば、恒温蛍光滴定、恒温滴定熱量測定、表面プラズモン共鳴、ゲル移動度アッセイ、放射性標識されたＧＡＧリガンドを用いた競合実験により間接的に行う。さらなる可能性は、これも当業者には知られているコンピュータによる方法によりによる計算により結合領域を予測することであり、いくつかのプログラムを使用してよい。
【００２３】
蛋白質中にＧＡＧ結合部位を導入するためのプロトコルは、例えば以下のとおりである：
・全体の構造保持に必須ではなくかつＧＡＧ結合に適しているかもしれない蛋白質の領域を同定する
・何れかの位置において塩基性Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ，Ａｓｎ及び／又はＧｌｎ残基を導入すること（置換又は挿入）により新規のＧＡＧ結合部位をデザインする
・インシリコにおいて結果の変異蛋白質のコンフォメーションの安定性をチェックする
・野生型蛋白質のｃＤＮＡをクローン化する（あるいは：ｃＤＮＡを購入する）
・これをＰＣＲ−補助変異導入法のための鋳型として使用することによりアミノ酸配列に上記の変化を導入する
・変異体遺伝子を適当な発現系にサブクローン化する（生物学上必要とされる翻訳後修飾に依存して原核生物又は真核生物）
・インビトロにおいて変異体蛋白質の発現、精製及び特性決定
・導入されたＧＡＧ結合親和性ＫｄＧＡＧ（変異体）＜１０μＭの基準。
【００２４】
新規のＧＡＧ結合部位を有する上記の操作された蛋白質の例は、例えば、ＩｇＧのＦｃ並びに以下のとおりに修飾された補体因子Ｃ３及びＣ４である。
【００２５】
【化１】
2007536906.tif 000003
【００２６】
本発明のさらなる側面は、上記の発明の方法により得ることが可能な蛋白質である。発明の蛋白質は、よって、−野生型の蛋白質に比較すると−上記のとおり新規なＧＡＧ結合部位を含み、よって、天然ＧＡＧ結合蛋白質との競合因子として作用することになるが、特に発明の蛋白質のＧＡＧ結合親和性が極めて高い、例えばＫｄ≦１０μＭだからからである。
【００２７】
本発明のさらなる側面は修飾されたＧＡＧ結合蛋白質であり、上記の蛋白質の中のＧＡＧ結合領域が少なくとも一つのアミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠失により修飾されることにより、上記ＧＡＧ結合領域の塩基性アミノ酸の相対量を増加させるか、及び／又はＧＡＧ結合領域の巨大及び／又は酸性のアミノ酸の量を増加させるか減少させるが、好ましくは溶剤露出位置においてであり、そして上記蛋白質のＧＡＧ結合親和性が各々の野生型蛋白質のＧＡＧ結合親和性に比較して増加する。
【００２８】
驚きをもって示されたことは、ＧＡＧ結合領域中の塩基性アミノ酸、特にＡｒｇ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ，Ａｓｎ及び／又はＧｌｎの相対領域を増加させることにより、修飾されたＧＡＧ結合蛋白質が野生型蛋白質に比較して増加したＧＡＧ結合親和性を示すことであり、特に塩基性アミノ酸の相対量を溶剤露出位置において増加させた場合であるが、蛋白質表面上の陽性荷電したエリアが結合親和性を増強することが示されたからである。好ましくは、３つの塩基性アミノ酸、さらに好ましくは４、もっとも好ましくは５つのアミノ酸がＧＡＧ結合領域中に存在する。
【００２９】
用語「ＧＡＧ結合蛋白質」は、ＧＡＧ共同受容体に結合するあらゆる蛋白質を意味する。蛋白質がＧＡＧ共同受容体に結合するか否かは、上記のとおりに公知のプロトコルの助けを借りて試験することができる。Ｈｉｌｅｍａｎら（ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  ２０（１９９８），１５６−１６７）は、グリコサミノグリカン結合する蛋白質内のコンセンサス部位を開示する。この文献内に開示された情報は、本発明のための開始情報としても有用である。用語「蛋白質」は、本発明により提供される分子が少なくとも８０アミノ酸の長さであることを明らかにする。これは、それらを、本抗炎症戦略のために適した候補にするために要求される。ＧＡＧ結合部位と相互作用し、かつその相互作用のための生理学上又は病理学上関連するより小さな分子は知られていないし、本発明に関係しない。好ましくは、本発明による分子は、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００又は少なくとも５００のアミノ酸残基から構成される。
【００３０】
本発明の範囲において、用語「ＧＡＧ結合領域」は、恒温蛍光滴定により測定されたところによれば、１００μＭ以下、好ましくは５０μＭ以下、さらに好ましくは２０μＭ以下の解離定数（Ｋｄ−値）にてＧＡＧに結合する領域として定義される（以下の実施例を参照）。
【００３１】
本出願において言及される如何なる修飾も、公知の生化学法、例えば部位特異的変異導入法を用いて実施することができる。ＧＡＧ結合部位の分子はクローン化はもちろん従来技術であり(例えば、ＷＯ９６／３４９６５  Ａ，ＷＯ０２／０７９３５  Ａ，Ｊａｙａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４８２（２０００），１５４−１５８），ＷＯ０２／２０７１５  Ａ，Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６（１９９４），４５５−４６８)、ＧＡＧ領域の分子シャッフリング又はデノボ合成が記載されていることも注目すべきである；Ｂｕｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４００９（１９９７），１８３−１８７）（人工ペプチドに関し、蛋白質ではない）；Ｊｕｎｎｏ−Ｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ，（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２００１），１２４３９−１２４４５）デノボ合成）を参照）。
【００３２】
ＧＡＧ結合領域は、置換、挿入及び／又は欠失により修飾することができる。これは、非塩基性アミノ酸が塩基性アミノ酸により置換されてよいこと、塩基性アミノ酸がＧＡＧ結合領域に挿入されてよいこと又は非塩基性アミノ酸が欠失してよいことを意味する。さらに、ＧＡＧ結合を干渉するアミノ酸、好ましくはすべての干渉するアミノ酸結合が欠失する。そのようなアミノ酸は特に上記のとおり巨大なアミノ酸又は酸性アミノ酸であり、例えばＧｌｕ及びＡｓｐである。アミノ酸がＧＡＧ結合を干渉するか否かは、例えば数学の方法又はコンピュータの方法により試験してよい。これらの修飾の如何なる結果も、上記ＧＡＧ結合領域中の塩基性アミノ酸の相対量が増加することであり、「相対」はＧＡＧ結合領域中のすべてのアミノ酸の数に比較したＧＡＧ結合領域中の塩基性アミノ酸の量を意味する。さらに、立体構造上又は静電上ＧＡＧ結合を干渉するアミノ酸を欠失させる。
【００３３】
アミノ酸が溶剤露出位置中に存在するか否かは、例えば、上記のとおり蛋白質の公知の三次元構造の助けを借りてか又はコンピュー法の助けを借りて決定することができる。
上記の修飾の蛋白質のＧＡＧ結合親和性が各野生型蛋白質のＧＡＧ結合親和性に比較して増加しているか否かは、上記のとおり、例えば、解離定数を測定する蛍光滴定実験の助けを借りて測定することができる。改良されたＧＡＧ結合親和性に関する基準は、Ｋｄ（変異体）＜Ｋｄ（野生型）であり、好ましくは少なくとも１００％である。特別に改良されて修飾のされた蛋白質は、野生型のＫｄに比較して、最小５、好ましくは最小１０、さらに好ましくは最小１００のファクターだけ高いＧＡＧ結合親和性を有する。増加したＧＡＧ結合親和性は、よって、好ましくは１０μＭ以下、好ましくは１０μＭ以下、さらに好ましくは０．１μＭ以下のＫｄを示す。
【００３４】
ＧＡＧ結合親和性を増加させることにより、修飾された蛋白質は、特異的アンタゴニストになり、そしてＧＡＧ結合に関して野生型のＧＡＧ結合蛋白質と競合することになる。
好ましくは、Ａｒｇ，Ｌｙｓ，及びＨｉｓからなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸が上記ＧＡＧ結合領域に挿入される。これらのアミノ酸は、ＧＡＧ結合領域に容易に挿入されるが、用語「挿入される」は、挿入それ自体並びにあらゆる非塩基性アミノ酸をアルギニン、リジン又はヒスチジンで置換することに関する。もちろん、一つより覆い塩基性アミノ酸を挿入することが可能であり、それにより同じ塩基性アミノ酸が挿入されるか又は上記アミノ酸２つ又は３つの組み合わせでもよい。
【００３５】
さらに好ましくは、上記蛋白質がケモカイン、好ましくはＩＬ−８，ＲＡＮＴＥＳ又はＭＣＰ−１である。ケモカインは共同受容体との相互作用の部位を有することが知られており、このケモカイン結合はしばしば上記のとおりさらなる受容体活性化の条件である。ケモカインはしばしば炎症性疾患において見いだされるから、ケモカイン受容体活性化をブロックすることに主な興味がある。そのようなケモカインは、好ましくは、ＩＬ−８，ＲＡＮＴＥＳ又はＭＣＰ−１であり、よく特性決定された分子であって、ＧＡＧ結合領域がよく知られている分子である（例えば、Ｌｏｒｔａｔ−Ｊａｃｏｂ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９９（３）（２００２），１２２９−１２３４を参照）。これらのケモカイン中のＧＡＧ結合領域の中の塩基性アミノ酸の量を増加させることにより、それらの結合親和性が増加し、よって野生型蛋白質の濃度に関しての修飾された蛋白質の濃度に依存して、野生型ケモカインはほとんど又は全く結合しなくなる。
【００３６】
有利な側面によれば、上記ＧＡＧ結合領域はＣ末端のαヘリックスである。典型的な化学的モノマーがＣ末端のαヘリックスによりオーバーレイされた三重鎖逆平行βシートの周囲に組織化される。ケモカイン中のこのＣ末端αヘリックスがＧＡＧ結合に関与する主要な部分であり、そのため、塩基性アミノ酸の量を増加させるためにこのＣ末端αヘリックス中の修飾が増加したＧＡＧ結合親和性を有する修飾ケモカインをもたらすことが示された。
【００３７】
有利なことには、ＩＬ−８中の１７、２１、７０、及び／又は７１位が、Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ，Ａｓｎ及び／又はＧｌｎにより置換されている。ここでは、これらの前記の部位のたった一つが修飾されることがあり得る。しかしながら、これらの部位の一つより多く並びに全ても修飾されてよく、全ての修飾がＡｒｇ又はＬｙｓ又はＨｉｓ又はＡｓｎ又はＧｌｎ又はそれらの混合の何れかであってよい。ＩＬ−８においては、これらの位置がＩＬ−８のＧＡＧ結合親和性を大いに増加させることが示されていることから、これらの位置は修飾に特に適している。
【００３８】
好ましくは、増加した結合親和性は、硫酸ヘパラン及び／又はヘパリンに対しての増加した結合親和性である。硫酸ヘパランは直鎖状のポリサッカライドのＧＡＧファミリーのもっとも豊富なメンバーであり、ヘパリンも含む。ヘパリンは硫酸ヘパランに構造上極めて類似しており、相対的に小さい程度の構造多様性の、均一に高度な硫酸化をもたらす高いレベルの重合後修飾により特徴付けられる。よって、硫酸ヘパラン中の高度に修飾されたブロックは、ときに、ヘパリン様と呼ばれ、そしてヘパリンは蛋白質の生物物理研究のための硫酸ヘパラン類似体として使用することができる。何れにせよ、硫酸ヘパランとヘパリンは共に特に適している。
【００３９】
さらに好ましくは、さらに生物学上活性な領域が修飾されることにより、上記蛋白質のさらなる生物学上の活性を阻害するか又はダウン制御する。このさらなる生物学上の活性は、ほとんどのＧＡＧ結合蛋白質、例えばケモカインに関して知られている。これは、受容体、例えば７ＴＭ受容体に対する結合領域になる。用語「さらなる（further）」は、ＧＡＧ結合領域ではないが、しかし他の分子、細胞又は受容体に結合するか及び／又はそれらを活性化する、生物学上活性な領域を規定する。このさらなる生物学上活性な領域を修飾することにより、この蛋白質のさらなる生物学上の活性が阻害されるか又はダウン制御され、そしてそれにより野生型蛋白質よりも強いアンタゴニストである修飾された蛋白質が提供される。これは、他方で、ＧＡＧ結合親和性が野生型ＧＡＧ結合蛋白質よりも高いことを意味し、修飾された蛋白質は野生型蛋白質に代わりＧＡＧに対して大部分結合する。一方、蛋白質がＧＡＧに結合したときに主に起こる野生型蛋白質のさらなる活性は阻害されるか又はダウン制御されるが、修飾された蛋白質がこの特異的な活性を実行しないか又は低い程度でこの活性を実行するからである。この修飾された蛋白質を用いて、当業界の状況において記載されるとおり、他の組換え蛋白質から知られる副作用を示さない、野生型ＧＡＧ結合蛋白質に関して有効なアンタゴニストが提供される。このさらなる生物学上の活性領域は、例えば、受容体競合アッセイによりインビトロにおいて測定することができる（蛍光標識されたｗｔケモカインを用いる、カルシウム流入、及び細胞移動（天然白血球又は７ＴＭ安定にトランスフェクトされた細胞系）を用いて）。そのようなさらなる生物学上活性な領域の例は、さらなる受容体結合部位に加えて（成長因子ファミリーにおけるように）、酵素部位（ヒドロラーゼ、リアーゼ、スルフォトランスフェラーゼ、Ｎ−デアセチラーゼ、及びコポリメラーゼにおけるように）、蛋白質相互作用部位（アンチトロンビンＩＩＩにおけるように）、及び膜結合ドメイン（ヘルペスシンプレックスウイルスｇＤ蛋白質におけるように）である。二重に修飾された蛋白質のこの好ましい態様により、よって、優性（ＧＡＧ結合に関して）陰性（受容体に関して）変異体が提供され、本発明の対象物のセットに関して特に有利である。
【００４０】
さらに好ましくは、上記のさらなる生物学上の活性領域が、欠失、挿入、及び／又は置換により、好ましくはアラニン、立体構造上及び／又は静電上類似の残基により修飾される。もちろん、上記のさらなる生物学上活性な領域中で少なくとも一つのアミノ酸を欠失させるか又は挿入するか又は置換するかの何れかが可能である。しかしながら、これらの修飾の少なくとも２つ又はそれら全部３つの組み合わせを提供することも可能である。与えられたアミノ酸をアラニン又は立体構造上／静電上類似の残基で修飾することにより−「類似」は置換されるアミノ酸に類似なことを意味する−修飾された蛋白質は、全くか又はほとんど立体構造上／静電上修飾されない。これは特に有利であるが、何故ならば、修飾された蛋白質の他の活性、特にＧＡＧ結合領域に対する親和性が変化しないからである。
【００４１】
有利には、上記蛋白質がケモカインであり、そして上記のさらなる生物学上の活性が白血球活性化である。上記のとおり、ケモカインは慢性及び急性炎症の間、白血球誘引に関与する。よって、白血球活性化を阻害するか又はダウン制御することにより、炎症が減少するか又は阻害され、この特定の修飾された蛋白質を、炎症性疾患を研究し、診断し、そして治療するための重要なツールにする。
【００４２】
有利な側面によれば、上記蛋白質がＩＬ−８であり、そしてさらなる生物学上活性な領域が最初の１０個のＮ末端アミノ酸内に位置する。最初のＮ末端のアミノ酸は白血球活性化に関与し、特に、Ｇｌｕ−４，Ｌｅｕ−５及びＡｒｇ−６は受容体結合及び活性化に必須であることが分かっている。よって、これら３つ又は最初の１０個のＮ末端アミノ酸全てさえ置換するか又は欠失させることにより、受容体結合及び活性化を阻害するか又はダウン制御することができる。
【００４３】
さらなる有利な蛋白質は、最初の６個のＮ末端アミノ酸が欠失したＩＬ−８変異体である。上記のとおり、この変異体は全くか又はほとんど白血球に結合して白血球を活性化せず、その結果、炎症性疾患を研究し、診断し、そして治療するのに適している。
【００４４】
好ましくは、上記蛋白質がｄｅｌ６Ｆ１７ＲＥ７０ＫＮ７１Ｒ，ｄｅｌ６Ｆ１７ＲＥ７０ＲＮ７１Ｋ及びｄｅｌ６Ｅ７０ＫＮ７１Ｋからなる群から選択されるＩＬ−８変異体である。これらの変異体が特に有利であることが示されたのは、最初の６個のＮ末端アミノ酸の欠失が受容体結合及び活性化を阻害するか又はダウン制御するからである。さらに、１７及び２１位の２つのフェニルアラニンが、受容体ののちの活性化を促進するためにそのＮ末端細胞外ドメイン上で受容体と最初に接触することがわかった。あらゆる好中球接触を阻止するために、これらの２つのアミノ酸１７及び２１を交換するが、それらは塩基性アミノ酸に交換され、何故ならば、それらが蛋白質の三次元モデル上で観察され得るように、Ｃ末端のαヘリックスのＧＡＧ結合モチーフに極めて近接しているからである。１７及び／又は２１位をアルギニン又はリジンに交換することにより、ＧＡＧ結合親和性は、よって、増加する。
【００４５】
本発明のさらなる側面は、上記の発明の蛋白質をコードする単離されたポリ核酸分子である。当該ポリ核酸はＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。それにより、発明の修飾された蛋白質を導く修飾がＤＮＡ又はＲＮＡレベルで実施される。この発明の単離されたポリ核酸分子は、診断方法並びに遺伝子治療及び発明の修飾された蛋白質の大規模な生産に適している。
【００４６】
さらに好ましくは、単離されたポリ核酸分子は、ストリンジェントな条件下で上において規定された発明の単離されたポリ核酸分子にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件に依存して、相補二重鎖が２つのＤＮＡ又はＲＮＡ分子間に形成され、完全にマッチするか又はミスマッチ塩基を含むかの何れかによる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）。約５０ヌクレオチドを超える長さのプローブは、２５から３０％間でのミスマッチ塩基をもってよい。小さなプローブは少数のミスマッチしかもたない。ミスマッチ塩基対を含む二重鎖を形成する標的及びプローブの傾向は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーにより制御され、それ自身は因子、例えばハイブリダイゼーションバッファー中の塩濃度又はホルムアルデヒド濃度、ハイブリダイゼーションの温度及びハイブリダイゼーション後の洗浄条件の函数である。ハイブリッド二重鎖条件の形成において起こるよく知られた原理を適用することにより、所望のストリンジェンシーを有する条件が、当業者により、ハイブリダイゼーションバッファー、温度及び洗浄条件の様々から選択することにより達成され得る。即ち、完全にマッチしたか又は部分的にミスマッチの二重鎖の何れかの検出を許容する条件が選択可能である。二重鎖の融解温度（Ｔｍ）は適切なハイブリダイゼーション条件を選択するために有用である。２００ヌクレオチドの長さを超えるポリヌクレオチド分子のためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には、予測される二重鎖の融解温度の１５−２５℃低い温度においてハイブリダイズさせることを含む。長いプローブよりも安定性の劣る二重鎖を形成させる３０ヌクレオチドを超えるオリゴヌクレオチドに関しては、ストリンジェントハイブリダイゼーションは通常Ｔｍより５から１０℃低い温度にてハイブリダイズさせることにより達成される。核酸二重鎖のＴｍは、核酸中に含まれるＧ＋Ｃパーセントに基づいた式を用いて計算することができ、鎖の長さを参酌し、例えば、式Ｔｍ＝８１．５−１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］））＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、式中、Ｎは鎖の長さである。
【００４７】
本発明のさらなる側面は、上で規定された本発明の単離されたＤＮＡ分子を含むベクターに関する。当該ベクターは、有効なトランスフェクション並びに蛋白質の有効な発現に必要な全ての制御要素を含む。そのようなベクターは、当業界でよく知られており、この目的のために如何なる適切なベクターも選択することができる。
【００４８】
本発明のさらなる側面は、上で規定された本発明のベクターにより安定にトランスフェクトされた組換え細胞に関する。そのような組換え細胞並びにそれからの子孫細胞は上記ベクターを含む。それにより、構成的又は上記ベクターの活性化に際して、上記修飾蛋白質を発現する細胞系が提供される。
【００４９】
本発明のさらなる側面は、上で規定された本発明による蛋白質、ポリ核酸又はベクター及び薬学上受容可能な担体を含むことを特徴とする薬学組成物に関する。もちろん、当該薬学組成物は、薬学組成物中に通常存在する追加の物質、例えば、塩、バッファー、乳化剤、発色剤、等をさらに含んでよい。
【００５０】
本発明のさらなる側面は、上で規定された本発明による修飾蛋白質、ポリ核酸又はベクターの、各野生型蛋白質の生物活性を阻害するか又は抑圧するための方法における使用に関する。上で言及されたとおり、修飾蛋白質は、公知の組換え蛋白質を用いて起こる副作用が発明の修飾蛋白質を用いて起こらないようなアンタゴニストとして作用する。ケモカインの場合、これは特に炎症性反応に関与する生物活性である。
【００５１】
よって、本発明による修飾蛋白質、ポリ核酸又はベクターのさらなる使用は、炎症性の症状の治療のための医薬を製造するための方法における。特に、修飾蛋白質がケモカインの場合、それは副作用の内アンタゴニストとして作用して、炎症性症状の治療に特に適する。よって、本出願のさらなる側面は、本発明による単離された修飾蛋白質、本発明による単離されたポリ核酸分子又はベクター又は本発明による薬学組成物を患者に投与するための方法でもある。
【００５２】
好ましくは、炎症性の症状は、慢性関節リウマチ、乾癬、骨関節症、喘息、アルツハイマー疾患、及び多発性硬化症からなる群から選択される。ケモカインを通した活性化は本発明による修飾蛋白質により阻害され得るから、上で言及された炎症性の症状が阻止されるか又は治療されるようにして、炎症性反応が阻害されるか又はダウン制御され得る。
【００５３】
本発明は、発明を限定するためのものではない以下の実施例及び図面の助けを借りてさらに詳細に説明されるが、図１はＣＤスペクトルであり；図２は様々な変異体の二次構造コンテンツを示し；図３及び４は様々な変異体の蛍光異方性試験の結果のグラフであり；図５は恒温蛍光滴定の結果のグラフであり；図６は様々な変異体のアンフォールド実験の結果のグラフであり；図７はＩＬ−８変異体の走化性指数を示し；そして図８はＲＡＮＴＥＳ走化性アッセイの結果を示す。
実施例
実施例１：組換えＩＬ−８遺伝子の生成及び変異体のクローン化
ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いることにより、センス及びアンチセンス変異導入プライマーを用いて変異を導入して変異体に関しての所望のｃＤＮＡｓを生成した。ｗｔＩＬ−８に関するｃＤＮＡを含む合成プラスミドを鋳型として用い、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）２ポリメラーゼミックスをＤＮＡポリメラーゼとして適用し、そしてＰＣＲ反応をエッペンドルフマスターグラディエントサイクラーを用いて実施した。用いられた変異導入プライマーは以下の表に要約され、フォワードプライマーから始める（５’から３’）：
・ＣＡＣＣ  ＡＴＧ  ＴＧＴ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＡＴＡ  ＡＡＧ  ＡＣＡ  ＴＡＣ  ＴＣＣ（変異Δ６のためのプライマー）
・ＣＡＣＣ  ＡＴＧ  ＴＧＴ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＡＴＡ  ＡＡＧ  ＡＣＡ  ＴＡＣ  ＴＣＣ  ＡＡＡ  ＣＣＴ  ＡＧＧ  ＣＡＣ  ＣＣＣ  ＡＡＡ  ＡＧＧ  ＡＴＡ（変異Δ６  Ｆ１７Ｒ  Ｆ２１Ｒのためのプライマー）
リバースプライマーは（５’から３’）：
・ＴＴＡ  ＴＧＡ  ＡＴＴ  ＣＣＴ  ＡＧＣ  ＣＣＴ  ＣＴＴ（変異Ｅ７０Ｒのためのプライマー）
・ＴＴＡ  ＴＧＡ  ＡＴＴ  ＣＴＴ  ＡＧＣ  ＣＣＴ  ＣＴＴ（変異Ｅ７０Ｋのためのプライマー）
・ＴＴＡ  ＴＧＡ  ＣＴＴ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＣＣＴ  ＣＴＴ（変異Ｎ７１Ｋのためのプライマー）
・ＴＴＡ  ＴＧＡ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＡＧＣ  ＣＣＴ  ＣＴＴ（変異Ｅ７０Ｋ  Ｎ７１Ｋのためのプライマー）
・ＴＴＡ  ＴＧＡ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＡＧＣ  ＣＣＴ  ＣＴＴ（変異Ｅ７０Ｒ  Ｎ７１Ｋのためのプライマー）
・ＴＴＡ  ＴＧＡ  ＣＣＴ  ＣＴＴ  ＡＧＣ  ＣＣＴ  ＣＴＴ（変異Ｅ７０Ｋ  Ｎ７１Ｒのためのプライマー）
・ＴＴＡ  ＴＧＡ  ＣＣＴ  ＣＣＴ  ＡＧＣ  ＣＣＴ  ＣＴＴ（変異Ｅ７０Ｒ  Ｎ７１Ｒのためのプライマー）。
【００５４】
ＰＣＲ産物は精製し、ｐＣＲ（登録商標）Ｔ７／ＮＴ−ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ（インビトロジェン）にクローン化して、そしてＴＯＰ１０Ｆコンピテントエシェリヒアコリ（インビトロジェン）を形質転換した。次の工程として、配列の確認を二重鎖ＤＮＡ配列決定によりＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＣＥ１シークエンサーにより実施した。
実施例２：組換え蛋白質の発現及び精製
配列が確認されたら、発現のために、構築物によりカルシウム−コンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）エシェリヒアコリを形質転換した。細胞を撹拌しながら、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む１ｌのＬｅｎｎｏｘ  Ｂｒｏｔｈ（シグマ）中で３７℃においてＯＤ６００が０．８に到達するまで生育させた。蛋白質発現の誘導は、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭまで加えることにより達成した。４時間後に、細胞を６０００ｇにおいて２０分間遠心分離することにより回収した。細胞沈殿物を次に、２０ｍＭ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ８を含むバッファーに懸濁し、１００ワットにて５ｘ２０秒音波処理し、そして最後に再び１０，０００ｇにて２０分間遠心分離した。組換えＩＬ−８蛋白質の主要フラクションが封入体（inclusion body）中に見いだされたので、さらなる精製のために変性条件を選択した。そうして、細胞沈殿物を６Ｍ  Ｇｕａ／ＨｃＬ及び５０ｍＭ  ＭＥＳ，ｐＨ６．５を含むバッファーに懸濁した。懸濁液を次に４℃において４時間撹拌して、次に、５０ｍＭ  ＭＥＳ，ｐＨ６．５に対する透析工程に続いた。結果の懸濁液を次に遠心分離し、そして濾過して強カチオン交換カラム（ファルマシアバイオテックのＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標））に負荷した。５０ｍＭ  ＭＥＳバッファー，ｐＨ６．５中の０Ｍ−１Ｍ  ＮａＣｌからの直線勾配により、６０分かけて溶出を達成した。所望の蛋白質を含むフラクションの凍結乾燥後に、第２の精製工程をＣ１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣにより実施した。この場合、１０％−９０％アセトニトリルの非直線勾配を選択することにより、所望の蛋白質を溶出した。上記と同じ条件下で同じカチオン交換カラムにより、変性蛋白質のリフォールディングを最後に達成した。
【００５５】
蛋白質を、次に、精製度及び同一性に関して、最初の場合は銀染色、そして第２においてはウエスタンブロット分析により、ＩＬ−８に対する特異的モノクローナル抗体を用いてチェックした。円偏光二色性（ＣＤ）測定により、蛋白質のリフォールディングも確認した。
実施例３：変異体の生物物理特性決定
３．１円偏光二色性測定及び分析
硫酸ヘパラン（ＨＳ）の存在及び不在下で上記変異体蛋白質の二次構造変化を調査するために、ＣＤ分光法を実施した。測定値は、Ｊａｓｃｏ  Ｊ−７１０旋光分散計（spectropolarimeter）上で１９５−２５０ｎｍの範囲にわたり記録し、そして０．１ｃｍの経路（path）の長さのセルを用いた。５μＭの濃度による蛋白質溶液のスペクトルを１秒のレスポンス時間、０．２ｎｍの工程解析、５０ｎｍ／分の速度、１ｎｍのバンド幅及び２０ｍｄｅｇの感度にて記録した。３つのスキャンを平均化してスムーズなスペクトルを生じさせた。蛋白質のスペクトルを、次に、バッファー自体又はバッファー／ＢＳの何れかのＣＤ−シグナルに関してバックグラウンド補正した。プログラムＳＥＬＣＯＮを用いて、ＨＳ存在及び不在下での蛋白質の二次構造分析を最後に実施した。
【００５６】
非常に多くのアミノ酸が新規な組み合わせにおいて交換されたため、円偏光二色性により結果の二次構造変化の寸法を見いだそうと試みた。
導入された変異に依存して異なる構造が得られた。何の構造も示さなかった一つの発現変異体（変異Δ６  Ｆ１７Ｒ  Ｆ２１Ｒ  Ｅ７０Ｋ  Ｎ７１Ｒ）を除いて、全ての変異体が測定可能なα−ヘリックス、β−シート及びループを呈した。ＩＬ−８ｗｔに比較して、一つの変異体のみ（変異Δ６  Ｅ７０Ｒ）がほぼ類似の構造を示したが、その他は主にそれらのα−ヘリックスに差異があり、全体の構造の１７．２％から４５．２％の範囲であった。にも拘らず、この事実は、ＩＬ−８ｗｔの全体の構造が蛋白質配列内での多くの変化にも拘わらず保持されたことを示唆する。これは、以前には予測され得なかった。硫酸ヘパランオリゴサッカライドのみがＩＬ−８ｗｔ二次構造に影響し得てヘパリンは不可能であったという既に見いだされた事実から、未分画の硫酸ヘパランにより誘導された効果に注意が引き付けられた。試験された変異体全てがＨＳ結合に際して構造変化を示し、複合体形成の証拠として観察され得る。
【００５７】
導入された変異及び硫酸ヘパラン添加に際しての構造変化を証明するために、得られたいくつかのデータを上及び下のグラフにおいて要約する。
３．２蛍光測定
濃度及びリガンド依存性の第４の構造変化を研究するため、蛍光分光法を実施した。その高い感度のために、ナノグラム量の蛋白質しか必要とせず、蛍光技術は所望の調査を実施するための選択の方法であった。測定は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（ビーカンズフィールド、英国）ＬＳ５０Ｂ分光計を用いて企てられた。
３．３蛍光異方性（Anisotropy）
外来発色団ｂｉｓＡＮＳによりもたらされるケモカインの濃度依存性の蛍光異方性を記録することにより、上記変異体のダイマー化定数を発見することを目指した。測定はＰＢＳ中で実施し、高濃度で開始し（４μＭまでの蛋白質）、徐々に希釈した。各データ点に関して、５０７ｎｍにおいて記録された異方性シグナル（ｒ）を６０秒間かけて平均化した。
【００５８】
ＩＬ−８のオリゴマー化は、蛋白質ＧＡＧ結合特性に対して関連性をもって影響することが報告されていた。モノマー濃度における設定により、ＩＬ−８結合サイズはダイマー濃度よりも１０００倍強固にオリゴサッカライドを限定した（defined）。よって、蛍光異方性により、ＩＬ−８変異体のオリゴマー化特性を調査した。ＩＬ−８固有のフルオロフォア（Ｔｒｐ５７）は全ての変異体に関して十分な感度がないため、外来のフルオロフォアｂｉｓ−ＡＮＳをこれらの測定に用いた。再び、二次構造に関しては既に注目されたとおり、変異体Δ６  Ｅ７０Ｒは、オリゴマー化定数においてもＩＬ−８ｗｔ（ｋｏｌｉｇｏ＝３７９ｎＭ）に比較して高い類似度を示した（ｋｏｌｉｇｏ＝３５０ｎＭ）。高いｋｏｌｉｇｏ（ｋｏｌｉｇｏ＝４６０ｎＭ）の変異体は、よって、ダイマー化が不完全であり、Δ６  Ｆ１７ＲＦ２１ＲＥ７０ＲＮ２１Ｋであった。以前の研究は、β−シートが主にダイマー化プロセスに関与していることを明らかにしたが、事実、この変異体の二次構造に関する結果と相関しており、たった１１．４％のβ−シートの極めて低い割り当て（share）を示した。もっとも低いｋｏｌｉｇｏ（ｋｏｌｉｇｏ＝１４７ｎＭ）の変異体はΔ６  Ｆ１７ＲＦ２１Ｒ  Ｅ７０Ｋであることがわかったが、調査された全変異体のβ−シート構造のもっとも高い割り当て（２９．８％）を再び示した。硫酸ヘパラン付加の衝撃も観察された。ＩＬ−８ｗｔに関しては、硫酸ヘパランがオリゴマー化定数のはるかに高いレベルへのシフト（ｋｏｌｉｇｏ＝１．０７５ｎＭ）を誘導したが、これは調査されたＩＬ−８変異体に関しても観察された。Δ６  Ｆ１７ＲＦ２１Ｒ  Ｅ７０Ｋは０．１４７μＭから１．１６２μＭにシフトし、そして変異体Δ６  Ｅ７０Ｒは硫酸ヘパラン存在下において０．３５μＭから１．５０５μＭにシフトした。得られた結果のいくつかを図３及び４に示すが、図３はケモカイン濃度におけるＰＢＳ中のＩＬ−８変異体の蛍光異方性の依存度を示し、そして図４はＨＳの存在（１０倍過剰）及び不在（（ｐｃ＝１０ｘｙ過剰）蛋白質濃度）下でのケモカイン濃度におけるＰＢＳ中のΔ６  Ｆ１７ＲＦ２１Ｒ  Ｅ７０Ｋの蛍光異方性の依存度を示す。
３．４恒温蛍光滴定（ＩＦＴ）実験
解離定数（Ｋｄ値）はリガンドの蛋白質に対する結合親和性に関する測定値であり、よって、リガンド結合に際して蛋白質の蛍光放射特性の濃度依存性変化（蛍光クエンチング）がＫｄの測定に用いられた。これらの変異体は、提案された（proposed）ＧＡＧ結合部位においてか又はその近くに位置する固有のトリプトファン発色団を含むためにリガンド結合に際して構造的な変化に感受性であるべきだから、ＩＦＴ実験はこの種の調査に適しているようであった。蛍光強度滴定をＰＢＳ中で７００ｎＭの蛋白質濃度を用いて実施した。各ＧＡＧリガンドのアリコートの付加及び６０秒の平衡期間の後に、２８２ｎＭにおける励起に際しての蛋白質溶液の放射を３００−４００ｎｍの範囲にわたり記録した。
【００５９】
未分画のヘパリン及び硫酸ヘパランの結合を調査した。十分な感度を保証するために、変異体をダイマー濃度に設定した。ＧＡＧ結合に際したＴｒｐ５７蛍光強度のクエンチングが２５−３５％の範囲内で記録された。リガンド結合の顕著な改善が、特にヘパリン結合に関して観察された。ＩＬ−８ｗｔ（Ｋｄ＝３７μＭ）に比較して、Δ６  Ｆ１７ＲＮ７１Ｒ  Ｅ７０Ｋ（Ｋｄ＝１４ｎＭ）及びΔ６  Ｆ１７ＲＦ２１Ｒ  Ｎ７１Ｋ（Ｋｄ＝１４．６ｎＭ）は、２６００倍良好な結合を示し、そしてΔ６  Ｅ７０Ｋ  Ｎ７１Ｋ（Ｋｄ＝７４ｎＭ）は１７６０倍良好な結合を示した。良好な結果は硫酸ヘパランに関しても得られた。Δ６  Ｆ１７ＲＮ７１Ｒ  Ｅ７０Ｋに関しては、１０７ｎＭのＫｄが観察され、Δ６  Ｆ１７ＲＦ２１Ｒ  Ｎ７１Ｋに関してはＫｄが９５ｎＭであり、そして変異体Δ６  Ｅ７０Ｋ  Ｎ７１Ｋは３４ｎＭのＫｄを示した。ＩＬ−８ｗｔが４．２μＭのＫｄにて結合するように、変異体に関して見いだされたＫｄｓは結合に関しての異例の改善を表したので、図５を参照されたい。
３．５アンフォールド実験
蛋白質の安定性及びこの安定性がＧＡＧリガンド結合に際して変化するのか否かについての情報を得るため、アンフォールド実験を企画した。上記のとおり、蛍光技術は第４の構造変化を観察するのに極めて感度がよく、よって蛋白質の熱構造変化を調査するためのえり抜きの方法である。測定はＩＦＴに関して記載されたとおりに企画し、リガンド濃度は変化させずに温度を変化させた。蛋白質の構造は０．７μＭの濃度において１５−８５℃の温度において１０倍過剰の硫酸ヘパラン及びヘパリンの不在下及び存在下において観察された。
【００６０】
蛋白質の放射の最大は３４０ｎｍから３５７ｎｍの範囲であり、値は溶剤露出トリプトファン残基に関して典型的である。アンフォールド実験を１５℃において開始し、変異体の放射の最大は３４０ｎｍ−３５１ｎｍの間で変化した。その放射最大が３４０ｎｍにおいて観察されたＩＬ−８ｗｔに比較して、これはわずかに高い値を意味する。温度の増加と共に、放射最大の強度が低下し、最大値の高いか又は低い波長へのシフトの何れかを伴った。Δ６  Ｅ７０Ｒ及びΔ６  Ｅ７０Ｋ  Ｎ７１Ｋの放射最大は、３５２．５ｎｍ−３５７ｎｍ及び３４３ｎｍ−３４５ｎｍにシフトし、Ｔｒｐ５７残基の溶剤への温度増加を伴うさらなる暴露に関して典型的であるが、おもしろいことにΔ６  Ｆ１７ＲＮ７１Ｒ  Ｅ７０Ｋ及びΔ６  Ｆ１７ＲＦ２１Ｒ  Ｅ７０Ｒは青いシフトを示し、３５０ｎｍ−３４３ｎｍ及び著しくないが３５０ｎｍ−３４８ｎｍの範囲であった（図６を参照）。温度をゆっくりと低下させることにより、アンフォールドのプロセスが波長シフト及び強度の変化に関しては部分的に可逆性であった。５倍過剰の硫酸ヘパランの付加は蛋白質の安定性の増加を導いたが、おそらくは複合体形成のためである。これは、一方では融解温度の高い温度へのシフトにより観察できたし、他方では温度増加に際しての放射最大の著しくは顕著でないシフトにより観察できた。
実施例４：優性−陰性ＩＬ−８変異体の受容体『陰性』機能の細胞に基づくアッセイ
好中球誘引に関してのＩＬ−８変異体の損なわれた受容体機能を特性決定するために、ＩＬ−８変異体に応答した好中球のトランスフィルターに基づく走化性を、５μｍのＰＶＰ−無しのポリカーボネート膜を備えたマイクロ走化性チェンバー内でアッセイした。
細胞調製：
簡単に言えば、好中球フラクションを新たに回収されたヒト血液から調製した。これは、６％デキストラン溶液のヘパリン処理された血液への添加（２：１）により行い、次に、４５分間沈降のために放置した。上清の透明な溶液を回収し、そしてＨＢＳＳ  ｗ／ｏ  Ｃａ及びＭｇにより２回洗浄した。細胞を数え、そして最後にＨＢＳＳにより２Ｍｉｏ／ｍｌ細胞懸濁液にて希釈して、数えられた細胞の６０％のみが好中球であることを考慮した。
走化性アッセイ：
ＩＬ−８変異体を１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ及び０．１μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、そしてチェンバーの底部区画へ同じものを３通りにして置いた（ウエルあたり２６μｌ）。新たに調製された好中球を上部チェンバー内に接種し（ウエルあたり５０μｌ）、そして３０分間、３７℃において５％のＣＯ２加湿インキュベーター中でインキュベートした。インキュベーション後に、チェンバーを解体し、フィルターの上部側を洗浄し、そしてふき取り（wiped off）、そして底部側に付着した細胞をメタノールで固定してＨｅｍａｃｏｌｏｒ溶液（メルク）により染色した。細胞を、次に、４００ｘの倍率にて、ウエルあたり４つのランダムに選択された顕微鏡の視野の中で数えた。最後に、３つの個別の実験の平均をケモカイン濃度に対してプロットした。図７において、様々なＩＬ−８変異体の走化性指数を示す。予測されたとおり、全ての変異体が顕著に低下した受容体結合活性を示した。
実施例５：組換えＲＡＮＴＥＳ遺伝子の生成、発現、変異体の生物物理特性決定及び活性の特性決定
優性な陰性「ＧＡＧ−マスキング」ケモカイン変異体のコンセプトを、移植拒絶のようなタイプＩＶの高感受性反応、アトピー性皮膚炎並びに関節炎、進行性糸球体腎炎及び炎症性肺疾患のような他の炎症性傷害に関与するケモカインであるＲＡＮＴＥＳにも用いた。
【００６１】
ｗｔ蛋白質を開始メチオニン残基に導入することにより、受容体結合活性が損なわれた。エシェリヒアコリ内でのｗｔ  ＲＡＮＴＥＳの発現は、このメチオニン残基の保有を導き、ｗｔ  ＲＡＮＴＥＳを単球移動の有力な阻害剤にし、いわゆるＭｅｔ−ＲＡＮＴＥＳである。ＧＡＧ結合親和性を増強する別の変異をＰＣＲに基づく部位特異的変異導入法により導入した。
【００６２】
これらの９つのＲＡＮＴＥＳ変異体がこれまでにクローン化され、発現されて、精製された、Ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳ  Ａ２２Ｋ，Ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳ  Ｈ２３Ｋ，Ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳ  Ｔ４３Ｋ，Ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳ  Ｎ４６Ｒ，Ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳ  Ｎ４６Ｋ，Ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳ  Ｑ４８Ｋ，Ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳ  Ａ２２Ｋ／Ｎ４６Ｒ，Ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳ  Ｖ４９Ｒ／Ｅ６６Ｓ及びＭｅｔ−ＲＡＮＴＥＳ  １５ＬＳＬＡ１８  Ｖ４９Ｒ／Ｅ６６Ｓ。
【００６３】
恒温蛍光滴定実験を実施することにより、サイズで規定されたヘパリンに関するＲＡＮＴＥＳの相対的親和性定数（Ｋｄ値）を測定した。表に見られるとおり、全てのＲＡＮＴＥＳ変異蛋白質はこのヘパリンに関して高い親和性を示し、Ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳ  Ａ２２Ｋ，Ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳ  Ｈ２３Ｋ，Ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳ  Ｔ４３Ｋ及びＭｅｔ−ＲＡＮＴＥＳ  Ａ２２Ｋ／Ｎ４６Ｒがもっとも有望な結果を示した。
【００６４】
Ｋｄ（ｎＭ）
野生型Rantes                   ４５６．２±８．５
Met-Rantes V49R/E66S           ３４５．５±２１．７
Rantes 15LSLA18 V49R/E66S      ２９７．３±１４．１
Rantes N46R                    ３６７．７±１１．７
Rantes N46K                    ２５７．４±１０．２
Rantes H23K                    ２０２．５±１２．８
Rantes Q48K                    ３８３．４±３９．６
Rantes T43K                    １３９．２±３０．１
Rantes A22K                    ２０２．１±  ９．８
Rantes A22K/N46R               １６４．０±１６．６
ＲＡＮＴＥＳ走化性アッセイ
ＲＡＮＴＥＳ変異体により指示された細胞移動を、５μｍのＰＶＰ−コートされたポリカーボネート膜を備えた４８ウエルＢｏｙｄｅｎチェンバーシステムを用いて調査した。ＲＡＮＴＥＳ及びＲＡＮＴＥＳ変異体の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．３及び１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＲＰＭＩ  １６４０の希釈液を３通りにしてチェンバーの底部ウエル内に置いた。同じ培地中の２ｘ１０６／ｍｌ細胞の５０μｌのＴＨＰ−１細胞懸濁液（セルカルチャーのヨーロッパコレクションからの前単球細胞系）を上部ウエル中に置いた。３７℃における５％ＣＯ２加湿の２時間のインキュベーションの後に、フィルターの上部表面をＨＢＳＳ溶液で洗浄した。移動した細胞をメタノールにより固定して、Ｈｅｍａｃｏｌｏｒ溶液（メルク）により染色した。４００ｘの倍率にて、ウエルあたり５つを数え、３つの個別の実験の平均を図８においてケモカイン濃度に対してプロットした。エラーバーは３つの実験の平均の標準誤差を表す。再び、ＩＬ−８変異体の場合のように、全てのＲＡＮＴＥＳ変異体が顕著に低下した受容体結合活性を示した。
実施例６：ＧＡＧ結合領域を有する蛋白質
バイオインフォマティックス及びプロテオームにより、ＧＡＧ結合蛋白質をそれらのＧＡＧ結合領域と共に特性決定した。以下の表２及び３において、ケモカインとそれらのＧＡＧ結合領域（表２）を示し、そして他の蛋白質の例もそれらのＧＡＧ結合領域と共に提供する（表３）。
【００６５】
【表２】
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【００６６】
【表３】
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【００６７】
【表４】
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【００６８】
【表５】
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【００６９】
【表６】
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【００７０】
【表７】
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【００７１】
【表８】
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【００７２】
【表９】
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【００７３】
【表１０】
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【００７４】
【表１１】
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【００７５】
【表１２】
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【００７６】
【表１３】
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【００７７】
【表１４】
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【００７８】
【表１５】
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【００７９】
【表１６】
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【００８０】
【表１７】
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【００８１】
【表１８】
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【００８２】
【表１９】
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【００８３】
【表２０】
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【００８４】
【表２１】
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【００８５】
【表２２】
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【００８６】
【表２３】
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【００８７】
【表２４】
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【００８８】
【表２５】
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【００８９】
【表２６】
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【００９０】
【表２７】
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【００９１】
【表２８】
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【００９２】
【表２９】
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【００９３】
【表３０】
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【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１はＣＤスペクトルである。
【図２】図２は様々な変異体の二次構造コンテンツを示す。
【図３】図３は様々な変異体の蛍光異方性試験の結果のグラフである。
【図４】図４は様々な変異体の蛍光異方性試験の結果のグラフである。
【図５】図５は恒温蛍光滴定の結果のグラフである。
【図６】図６は様々な変異体のアンフォールド実験の結果のグラフである。
【図７】図７はＩＬ−８変異体の走化性指数を示す。
【図８】図８はＲＡＮＴＥＳ走化性アッセイの結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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