(57)【要約】  本発明は、アポリポタンパク質BのHSPGレセプター結合領域に由来する、アポリポタンパク質Bの直列反復又はその短縮型を含むポリペプチド及びその誘導体又は類似体に関する。そのようなペプチドはウイルス感染の進行を治療又は予防するために有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポリポタンパク質Bの直列反復又はその短縮型を含み、前記直列反復又はその短縮型がアポリポタンパク質BのHSPGレセプター結合領域に由来することを特徴とする、ポリペプチド、その誘導体又は類似体。
【請求項２】
ポリペプチド、その誘導体又は類似体が、アポリポタンパク質B LDLレセプター結合ドメインクラスターBに由来する直列反復を含む、請求項1に記載のポリペプチド、その誘導体又は類似体。
【請求項３】
アポB3359-3367の直列反復又はその短縮型を含む請求項1に記載のポリペプチド、その誘導体又は類似体。
【請求項４】
配列番号:1のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のポリペプチド、その誘導体又は類似体。
【請求項５】
第1、第２、第３、第７、第８、第９、第10、第11、第12、第16、第17又は第18番目の残基の少なくとも1つが置換されているか又は欠失している、請求項3または4に記載のポリペプチド、その誘導体又は類似体。
【請求項６】
下記式をもつ請求項1に記載のポリペプチド：
abcRKRxyza'b'c'RKRx'y'z'
式中、
a及びa'は、それぞれ独立に、アルギニン（R）若しくはリジン（K）若しくはヒスチジン（H）のいずれかから選択することができる陽性荷電残基；ロイシン（L）；トリプトファン（W）から選択されるか、又は欠失されてあり；
b及びb'は、それぞれ独立にロイシン（L）；アルギニン（R）；リジン（K）から選択されるか、又は欠失されてあり；
c及びc'は、それぞれ独立に、スレオニン（T）；トリプトファン（W）；又はアルギニン（R）若しくはリジン（K）若しくはヒスチジン（H）から選択することができる陽性荷電残基から選択され；
x及びx'は、それぞれ独立に、グリシン（G）；トリプトファン（W）；ロイシン（L）；又はアルギニン（R）若しくはリジン（K）若しくはヒスチジン（H）から選択することができる陽性荷電残基から選択され；
y及びy'は、それぞれ独立に、ロイシン（L）；又はアルギニン（R）若しくはリジン（K）若しくはヒスチジン（H）から選択することができる陽性荷電残基から選択されるか、又は欠失されてあり；
z及びz'は、それぞれ独立に、アルギニン（R）若しくはリジン（K）若しくはヒスチジン（H）から選択することができる陽性荷電残基；又はロイシンから選択されるか、又は欠失されてある。
【請求項７】
以下のアミノ酸配列を含む請求項1又は2に記載のポリペプチド、その誘導体又は類似体：LRTRKRGRKLRTRKRGRK（配列番号:2）；RTRKRGRKRTRKRGRK（配列番号:3）；RTRKRGRRTRKRGR（配列番号:4）；LRKRKRLLRKRKRL（配列番号:5）；LRKRKRLRKLRKRKRLRK（配列番号:6）；WRWRKRWRKWRWRKRWRK（配列番号:7）；RRWRKRWRKWRWRKRWRK（配列番号:34）；KRWRKRWRKWRWRKRWRK（配列番号:35）；LRWRKRWRKWRWRKRWRK（配列番号:36）；HRWRKRWRKWRWRKRWRK（配列番号:37）；RWRKRWRKWRWRKRWRK（配列番号:38）；RRWRKRWRKRRWRKRWRK（配列番号:39）；KRWRKRWRKKRWRKRWRK（配列番号:40）；LRWRKRWRKLRWRKRWRK（配列番号:41）；HRWRKRWRKHRWRKRWRK（配列番号:42）；RWRKRWRKRWRKRWRK（配列番号:43）；RWRKRGRKRWRKRGRK（配列番号:44）；RTRKRWRKRTRKRGRK（配列番号:45）；RWRKRWRKRWRKRWRK（配列番号:46）；又はRWRKRWRWRKRWRWRKRW（配列番号:47）。
【請求項８】
医薬として使用される、請求項1から7のいずれかに記載のポリペプチド、その誘導体又は類似体請求項。
【請求項９】
ウイルス感染治療のための医薬の製造のための、請求項1から7のいずれかに記載のポリペプチド、その誘導体又は類似体の使用。
【請求項１０】
治療の必要がある対象者に治療的に有効な量の請求項1から7のいずれか1項に記載のポリペプチド、その誘導体又は類似体を投与することを含む、ウイルス感染を予防及び/又は治療する方法。
【請求項１１】
医薬として使用される、請求項1から7のいずれか1項記載のポリペプチド、その誘導体又は類似体の生物学的活性を高めることができる薬剤。
【請求項１２】
請求項1から7のいずれか1項記載のポリペプチド、その誘導体又は類似体の生物学的活性を高めることができる、ウイルス感染治療用医薬の製造のための薬剤。
【請求項１３】
請求項1から7のいずれか1項記載のポリペプチド、その誘導体又は類似体をコードする核酸配列。
【請求項１４】
医薬として使用するための、請求項13に記載の核酸。
【請求項１５】
ウイルス感染治療用医薬の製造のための、請求項13に記載の核酸。
【請求項１６】
前記核酸が、配列番号:8（アポB3359-3367）、配列番号:9（GIN16）、配列番号:10（GIN35）、配列番号:11（GIN36）、配列番号:12（GIN37）、配列番号:13（GIN38）又は配列番号:14（GIN33）として示されるヌクレオチド配列を含む、請求項13に記載の核酸。
【請求項１７】
治療の必要がある対象者に治療的に有効な量の請求項13から16のいずれか1項記載の核酸を投与することを含む、ウイルス感染を予防及び/又は治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ウイルス活性を有するポリペプチド、その誘導体又は類似体、及び前記をコードする核酸に関する。本発明はさらに、前記のようなポリペプチド、誘導体、類似体又は核酸の医薬としての使用及び治療方法における使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
抗ウイルス剤はウイルス複製サイクルの6つの段階の1つを標的とすることができる。これらの段階は以下のとおりである：
１．ウイルスの細胞への付着；
２．侵入（又はウイルス膜と細胞膜との融合）；
３．ウイルスの脱外被；
４．ウイルス核酸の複製；
５．子孫ウイルス粒子の成熟；及び
６．子孫ウイルスの細胞外液への放出。
これら６つの段階のうちで、複製（上記段階４）は、通常の抗ウイルス療法がもっとも効果的に影響を与える標的である。ウイルスの細胞への付着は、しかしながら薬剤が宿主細胞内に移行する必要がないために、より魅力的な標的であると主張することができる。しかしながら、前記は、具合のよい治療法が未だにほとんど開発されていない領域である。
【発明の開示】
【０００３】
したがって本発明のある目的は、細胞への侵入及び付着を含むウイルスの活性を調節する治療薬を提供することである。
リポタンパク質（LP）は血清及び他の細胞外液に存在する球状の巨大分子複合体であり、脂質及びタンパク質から成り、身体周囲の脂肪の輸送に必要である。リポタンパク質はそれらの密度にしたがって分類され、主要なクラスには高密度リポタンパク質（HDL）、低密度リポタンパク質（LDL）及び超低密度リポタンパク質（VLDL）がある。それらのタンパク質はアポリポタンパク質と称され、アポリポタンパク質A、B、C、D、E、F、G、H及びJを含む多くのものが報告されている。さらにまた、アポリポタンパク質A、B及びCのいくつかのサブタイプが記載されている。
LPとウイルスを連関させる種々の相互反応が記載されてきた。これらの反応のほとんどがウイルスとリポタンパク質との結合に関与し、ウイルスの感染性の減少をもたらすか、又は逆にウイルスが細胞内に侵入するための“ヒッチハイカー”の方法を提供する。さらにまた、いくつかのウイルスは、細胞に侵入する手段として、LPのための細胞レセプター（例えばLDLレセプター）を利用する。ただしこれらのレセプターは、内因性抗ウイルス薬として細胞によって放出されることがある（例えば、VLDLレセプターの可溶型はHeLa細胞によって培養液中に放出され、ヒトのライノウイルス感染を阻害する）。さらにまた、ある種のアポリポタンパク質とウイルスタンパク質との間の直接結合もまたは報告されている。例えば、
ａ．C型肝炎ウイルスコアタンパク質はアポリポタンパク質AIIと結合する；
ｂ．Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原はアポリポタンパク質Ｈと結合する；さらに
ｃ．サル免疫不全ウイルス（SIV）のgp32タンパク質及びヒト免疫不全ウイルス（HIV）のgp41タンパク質はアポリポタンパク質A1と結合する。
【０００４】
発明者の研究室で行った実験によって、潜伏している単純ヘルペスウイルス1型（HSV1）の脳内の存在、及び特殊な遺伝子の特定の対立遺伝子座（APOE遺伝子のAPOE-e4対立遺伝子座）の保持は、アルツハイマー病（AD）発症リスクを増加させることが示された。APOE-e4保因者は単純ヘルペス病巣（前記は末梢神経系におけるHSV1の再活性化後に見出される病巣である）をいっそう惹起しやすいというまた別の発見とも合わせれば、これらの結果は、APOE-e4保因者はHSV1感染による損傷をいっそう受けやすいことを示唆し、さらにアポリポタンパク質Eとある種のウイルスとの相互作用の存在の可能性を示唆する（ただしそのような相互作用が必ずしも抗ウイルス作用を含むとは限らない）。
アポリポタンパク質Eは、Tリンパ球の増殖の抑制を含む、免疫系に対する影響を有することが示された（おそらく脂質代謝におけるその役割とは無関係と思われる）。アポEの残基130−169から誘導された多数のペプチドとリンパ球との間の相互作用が調べられた（Clay et al., Biochemistry, 34：11142−11151 (1995)）。アポE残基141−149から成る領域は特に重要であると予想される。そのようなペプチドの類似の相互作用が神経細胞株で報告されている。
【０００５】
WO94/04177は、脂質及び両親媒性ヘリックスペプチドを含む粒子の投与によって微生物により産生された毒素が除去され、細菌膜に対する作用を介して抗菌剤の効果が増強されえることを開示している。しかしながら、そのようなアポA誘導ペプチド含有粒子が抗ウイルス薬として用いることができるということは提唱されていない。さらにまた粒子としてのペプチドの投与（これは前記開示された開発の重要な要素である）によって、（粒子が投与前又は内因的に形成されるか否かにかかわらず）粒子のどちらかの成分のいずれかの抗ウイルス作用の効果的利用がもたらされるのかどうかは明らかではない。
アポAに由来する両親媒性ヘリックスペプチド（Ananatharamiah（Meth. Enz. 128:627-647 (1986)）により記載された）は、ウイルス膜と細胞膜との融合を妨げ、さらに感染細胞の膜の融合を妨げることが示された（Srinivas et al., J. Cellular Biochem., 45:224-237 (1991)）。前記ペプチドはまた、HSV1及びHIVもいずれについても融合の防止に有効であった（Owens et al., J. Clin. Invest. 86:1142-1150 (1990)）。しかしながら、このペプチドは、HSV1の少なくとも細胞への付着に対しては全く影響を及ぼさなかった（Srinivas et al.上掲書）。
AzumaらはアポEのペプチド誘導体、ゲンタマイシンの抗菌作用に匹敵する強力な抗菌作用を有することを報告した（Peptides 21:327-330 (2000)）。アポE133−162がもっとも有効で、アポE134−155はほとんど効果をもたなかった。
【０００６】
上述の研究を考慮して、発明者は、一連の多様なアポリポタンパク質及びその誘導体に由来するポリペプチドの抗ウイルス活性を精査するための実験を実施することにした。
本発明の第一の特徴にしたがえば、アポリポタンパク質Bの直列反復又はその短縮型を含み、前記直列反復又はその短縮型がアポリポタンパク質BのHSPGレセプター結合領域に由来することを特徴とするポリペプチド、その誘導体又は類似体が提供される。
本発明の第一の特徴のポリペプチドは、好ましくはアポリポタンパク質B LDLレセプター結合ドメインクラスターBに由来する直列反復を含む。前記LDLレセプター結合ドメインクラスターBはLaw & Scott（J. Lipid Res. 1990, 31:11092-20）によって記載され、アポリポタンパク質BのHSPGレセプター結合領域内に位置しえる。
“その誘導体又は類似体”とは、ポリペプチド内のアミノ酸残基が、類似の側鎖又はペプチド骨格特性を持つ残基（天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸又はアミノ酸模倣体にかかわりなく）によって置換されているポリペプチドを意味する。さらにまた、そのようなペプチドの末端は、アセチル又はアミド基と類似の特性を有するN及びC末端保護基によって保護されてあってもよい。
“その短縮型”とは、直列反復が、アミノ酸の除去によりサイズが縮小されていることを意味する。アミノ酸の減少は、前記ペプチドのC又はN末端から残基が除去される場合でも、又はペプチドのコア内から1つ又は2つ以上のアミノ酸が欠失する場合でもよい。
本明細書で用いられる“〜に由来する”という用語は、アポリポタンパク質BのHSPGレセプター結合領域又は前記領域の中のアポリポタンパク質B LDLレセプター結合ドメインクラスターBを形成するアミノ酸配列の誘導体又は改変物である、直列反復を指すか又は前記を含むことを意図する。驚くべきことに、本発明の第一の特徴のポリペプチド、その誘導体又は類似体は、抗ウイルス活性を提示することが示された。
【０００７】
発明者は、アポリポタンパク質Eのヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)/ LDLレセプター結合領域に由来するいくつかのペプチドが、何らかの抗ウイルス活性を示すことを知ったので、アポリポタンパク質由来の直列反復の抗ウイルス活性を精査することを決めた（例えばアポE141-149の直列反復）。したがって、発明者は、他の多数のアポリポタンパク質由来のヘパリン結合領域が何らかの抗ウイルス活性を示すか否かを調べた。発明者は、とりわけ以下を調べた：
（i）アポリポタンパク質B内のヘパリン結合領域（アミノ酸配列RALVDTLKFVTQAEGAKを有するアポB1000-1016）、本明細書ではGIN17（配列番号:15）と称される。GIN17はLDLR相互作用とは連携していない（Shin et al. 1990 PNAS）。前記は17merであったので、GIN17の直列反復は構築されなかった；
（ii）本明細書でGIN16（配列番号:2）と称されるペプチド。前記は、アポリポタンパク質BのLDLRレセプター結合領域Bの直列反復ペプチドのわずかに改変された形であり、本発明者が構築した。GIN16はヒトアポリポタンパク質B(3359-3367)repeatから成り、アミノ酸配列LRTRKRGRKLRTRKRGRKを有し、前記配列では、残基3359と3360が逆転され、3366位のロイシン残基がアルギニンで置換されている；
（iii）アポリポタンパク質H内のヘパリン結合領域、本明細書ではGIN27（配列番号:16）と称される。GIN27は、直列反復ペプチドアポH(281-288)repeatであり、アミノ酸配列CKNKEKKCCKNKEKKCを有し、アポリポタンパク質H（アカベータ2糖タンパク質）（Guerin et al., J. Biol. Chem. 2002, Jan., 25:277(4):2644-9）のヘパリン結合領域を基にして発明者が構築した。
【０００８】
さらにまた、発明者は、多数のヒトアポリポタンパク質に由来する、一連の陽イオン性両親媒性αヘリックスを調べた。例えば以下が調べられた：
（i）GIN28（配列番号:17）（LRKEKKRLLLRKEKKRLL）。前記は、上記で言及したGIN27の形態を有するが発明者が改変し、陽性荷電リジン残基は同じ場所に残されているが、アポE141-149（アポE由来ペプチド；実施例1を参照されたい）の特徴のいくつかが付加されている（とりわけLR配列で開始し、RLL配列で終わる）；及び
（ii）GIN30（配列番号:18）。前記は、アポリポタンパク質Jの一領域から構築されたペプチドで、両親媒性αヘリックスから成ると報告されていた（Bailey et al., Biochemistry 2001, 40:11828-409）。すなわち前記は、アミノ酸配列LQVAERLTRKYNELLKSYQを有するヒトアポリポタンパク質J331-349である。
実施例の図4に示すように、GIN17、GIN27、GIN28及びGIN30のいずれも全く抗ウイルス活性を示さなかった。しかしながら、発明者を驚かせたことには、本発明の第一の特徴のアポBから改変された直列反復のみ（すなわちGIN16）が、単純ヘルペスウイルス1型（HSV1）に対して相当な抗ウイルス作用を有していた。このデータは、LDLレセプターのブロッキングはHSV1感染を阻害するとは予想されなかったので特に驚くべきことであった（このウイルスは細胞への侵入にLDLレセプターを使用し、それによって細胞に感染するとは考えられていない）。
【０００９】
したがって、GIN16の抗ウイルス特性のこの驚くべき発見にしたがい、発明者はGIN16の多数の誘導体及び改変物を作製し、その抗ウイルス活性を精査した。発明者を驚かせたことには、これらのいくつかはまた抗ウイルス特性を保有し、一方、あるものは抗ウイルス特性をもたないことが見出された。驚くべきことに、本発明の第一の特徴のペプチド、すなわちアポリポタンパク質BのHSPGレセプター結合領域に由来する直列反復領域を含むペプチドは抗ウイルス特性を示した。
驚くべきことに、任意のアポリポタンパク質由来の任意のHSPG結合領域の単純な直列反復の使用は、必ずしも抗ウイルス活性を示すペプチドを生じるわけではないことを示す更なる証拠が存在する。例えば、
１．GIN14はアポEの第二のHSPGレセプター結合領域由来の直列反復（配列番号:19）であるが、ウイルス活性をもたない；さらに
２．Azumaらは、アポE133-162の抗菌活性を開示している上掲書で、一連のヘパリン結合領域（アポB、VEGF、PACAP及びVnを含む）に由来するペプチドがいかに抗菌活性を持たなかったかを述べている。したがって、Azumaによってヘパリン結合領域に由来するある種のペプチドによるものとされた広範囲の抗菌特性は、そのような領域に由来する大半のペプチドの例に適用できない。
結論すれば、本発明の第一の特徴の直列反復ペプチド（すなわちアポリポタンパク質BのHSPGレセプター結合領域に由来する）は予期に反して抗ウイルス活性を有しているのである。
【００１０】
発明者はいかなる理論にも拘束されないが、HSV1ウイルスとアポリポタンパク質アポBとの相互作用の可能な態様は、二次的レセプターと引き続き結合する前に、両者は、細胞とのそれらの最初の結合部位として硫酸ヘパランプロテオグリカン（HSPG）分子を使用するという事実によると発明者は考えている。したがって、発明者は、HSV1ウイルスとアポB（前記はリポタンパク質を含む）との間の競合は、これらHSPG部位で生じ、これがウイルスの侵入に影響を及ぼす可能性があると提唱した。発明者は、いくつかのウイルスは最初の結合部位として前記部位を用いる（一方、限定された数のウイルスがLDLレセプターを有することが報告されている）ので、GIN16のこの抗ウイルス活性は細胞表面のHSPG部位のブロッキングによるものであろうと提唱している。したがって、発明者らは、前記が、本発明の第一の特徴のアポリポタンパク質BのHSPGレセプター結合領域由来のペプチドが抗ウイルス活性を示す１つの理由であると示唆した。
したがって、本発明の第一の特徴のペプチドは配列番号:2のアポB3359-3367の直列反復又はその短縮型を含むことが好ましい。
【００１１】
“配列番号:2のアポB3359-3367の直列反復”という表現は、そのペプチドが実質的にアミノ酸配列RLTRKRGLKRLTRKRGLK、すなわち18mer（配列番号:2）を含むことを意味する。したがって、配列番号:2のアポB3359-3367の直列反復は、好ましくはアミノ酸配列RLTRKRGLK、すなわち9mer（配列番号:1）の繰返しを含む。明確にすると、配列番号:2（18mer）のアポB3359-3367の直列反復は、配列番号:1（9mer）のアミノ酸配列RLTRKRGLKの2量体繰返し（2ｘ）である。
“配列番号:2の短縮型”とは、直列反復（例えば配列番号:2の18mer）が、アミノ酸の除去によりサイズが減少していることを意味する。アミノ酸の減少は、ペプチドのC又はN末端から残基が除去されることによって生じてもよいし、又はペプチドのコア内（すなわち配列番号:2のアミノ酸2−17）から1つ又は2つ以上のアミノ酸の欠失によって生じてもよい。
下記の表Aは、本発明の第一の特徴の他の好ましいペプチド（実施例を参照）の対応するアミノ酸とアラインメントを実施したアポB3359-3367のアミノ酸配列（すなわち配列番号:1の9mer）を示す。本発明に従ってこの９merが繰り返されているのが分かるであろう。
【００１２】
表A：抗ウイルス特性を示す効果的ペプチド配列の分析
2007536910.tif 000003
下線が付与された残基はアポB3359-3367の残基と同じであることを示している。
【００１３】
このアラインメントのデータから、発明者は、配列番号:2に由来する活性なペプチド内には繰り返されるアミノ酸モチーフが存在することを知った。このモチーフはトリペプチド、アルギニン-リジン-アルギニン（RKR）に一致し、配列番号:2のアミノ酸位置4、5、6及び13、14、15に見出される。したがって、本発明のペプチドは2つのRKRモチーフを含むことが好ましい。
好ましくは、第一の特徴のペプチドは配列番号:2のアポB3359-3367の直列反復又はその短縮型を含み、RKRモチーフ以外の少なくとも1つのアミノ酸残基はグリシン（G）、スレオニン（T）、ヒスチジン（H）、トリプトファン（W）、アルギニン（R）若しくはロイシン（L）残基又はその誘導体によって置換されてあることを特徴とする。
適切には1つ又は2つ以上、より適切には2つ又は3つ以上、さらに適切には3つ又は4つ以上のアミノ酸残基が、グリシン（G）、スレオニン（T）、ヒスチジン（H）、トリプトファン（W）、アルギニン（R）若しくはロイシン（L）残基又はその誘導体によって置換される。好ましくは4つ又は5つ以上、より好ましくは5つ又は6つ以上、さらに好ましくは6つ又は7つ以上アミノ酸残基がこれらアミノ酸又はその誘導体によって置換される。好ましくは、置換又は代用される残基は、配列番号:2の第一、第二、第三、第七、第八、第九、第10、第11、第12、第16、第17又は第18番残基である。
本発明のポリペプチドは18のアミノ酸（又はその誘導体）を含み、それによって置換を含む又は含まない配列番号:2の完全な長さと一致することができる。しかしながら、発明者らは、驚くべきことに、配列番号:2を基にした短縮ペプチドもまた抗ウイルス剤として有効性を有することを見出した。したがって、好ましいペプチド又はその誘導体は18未満のアミノ酸を有することができる。例えば、本発明の第一の特徴のいくつかのペプチドは17、16、15、14、13、12、11、10又はそれ未満の長さでもよい。欠失は好ましくは配列番号:2の1、2、8、9、10、11、17及び/又は18位で生じる。
【００１４】
本発明の第一の特徴のポリペプチドは好ましくは下記の式Iを有することができる：
{abcRKRxyz}＋{a'b'c'RKRx'y'z'}
式中、
a及びa'は、それぞれ独立に、アルギニン（R）若しくはリジン（K）若しくはヒスチジン（H）のいずれかから選択することができる陽性荷電残基；ロイシン（L）；トリプトファン（W）から選択されるか、又は欠失されてあり；
b及びb'は、それぞれ独立にロイシン（L）；アルギニン（R）；リジン（K）から選択されるか、又は欠失されてあり；
c及びc'は、それぞれ独立に、スレオニン（T）；トリプトファン（W）；又はアルギニン（R）若しくはリジン（K）若しくはヒスチジン（H）から選択することができる陽性荷電残基から選択され；
x及びx'は、それぞれ独立に、グリシン（G）；トリプトファン（W）；ロイシン（L）；又はアルギニン（R）若しくはリジン（K）若しくはヒスチジン（H）から選択することができる陽性荷電残基から選択され；
y及びy'は、それぞれ独立に、ロイシン（L）；又はアルギニン（R）若しくはリジン（K）若しくはヒスチジン（H）から選択することができる陽性荷電残基から選択されるか、又は欠失されてあり；
z及びz'は、それぞれ独立に、アルギニン（R）若しくはリジン（K）若しくはヒスチジン（H）から選択することができる陽性荷電残基；又はロイシンから選択されるか、又は欠失されてある。
【００１５】
本発明の第一の特徴のポリペプチドは好ましくは下記式IIを有することができる：
{abcRKRxyz}＋{abcRKRxyz}
式中、
aは、それぞれ独立に、アルギニン（R）若しくはリジン（K）若しくはヒスチジン（H）のいずれかから選択することができる陽性荷電残基；ロイシン（L）；トリプトファン（W）から選択されるか、又は欠失されてあり；
bは、それぞれ独立にロイシン（L）；アルギニン（R）；リジン（K）から選択されるか、又は欠失されてあり；
cは、それぞれ独立に、スレオニン（T）；トリプトファン（W）；又はアルギニン（R）若しくはリジン（K）若しくはヒスチジン（H）から選択することができる陽性荷電残基から選択され；
xは、それぞれ独立に、グリシン（G）；トリプトファン（W）；ロイシン（L）；又はアルギニン（R）若しくはリジン（K）若しくはヒスチジン（H）から選択することができる陽性荷電残基から選択され；
yは、それぞれ独立に、ロイシン（L）；又はアルギニン（R）若しくはリジン（K）若しくはヒスチジン（H）から選択することができる陽性荷電残基から選択されるか、又は欠失されてあり；
zは、それぞれ独立に、アルギニン（R）若しくはリジン（K）若しくはヒスチジン（H）から選択することができる陽性荷電残基；又はロイシン（L）から選択されるか、又は欠失されてある。
【００１６】
本発明の第一の特徴のポリペプチドは好ましくは下記式IIIを有することができる：
{abcRKRxyz}＋{abcRKRxyz}
式中、
aは、それぞれ独立に、トリプトファン（W）；アルギニン（R）；ロイシン（L）；から選択されるか、又は欠失されてあり；
bは、それぞれ独立にロイシン（L）；アルギニン（R）又はリジン（K）；から選択されるか、又は欠失されてあり；
cは、それぞれ独立に、トリプトファン（W）；スレオニン（T）；リジンから選択され；
xは、それぞれ独立に、トリプトファン（W）；グリシン（G）；ロイシン（L）；アルギニン（R）から選択され；
yは、それぞれ独立に、ロイシン（L）；又はアルギニン（R）若しくはリジン（K）若しくはヒスチジン（H）から選択することができる陽性荷電残基から選択されるか、又は欠失されてあり；
zは、それぞれ独立に、アルギニン（R）若しくはリジン（K）若しくはヒスチジン（H）から選択することができる陽性荷電残基；又はロイシン（L）から選択されるか、又はここで短縮されている。
発明者はまた、配列番号:2のアポB3359-3367の単なる二量体直列反復より大きいもの又はその短縮型を含む本発明のペプチドも利用することができることも知った。例えば、配列番号:1の三量体、又はそれより大きい数の繰返しを有用な抗ウイルス剤として用いることができる。
したがって、本ポリペプチドは好ましくは下記式IVを有することができる：
{abcRKRxyz}n
式中、a、b、c、x、y及びzは、式I、II又はIIIについて上記で定義したとおりであり、式中ｎは2、3、4又は5に等しいか、又はそれより大きい。
他の好ましいペプチドは、式Iに定義した18merペプチドの繰返し（又はその短縮型）を含むことができる（例えば、式Iのペプチドを含む9merのヘテロダイマーの繰返し）。
【００１７】
本発明の第一の特徴の好ましいペプチドは以下のアミノ酸配列を含む：
（a）LRTRKRGRKLRTRKRGRK（配列番号:2）、このペプチドは本明細書で言及するときはGIN16と呼ぶ；
（b）RTRKRGRKRTRKRGRK（配列番号:3）、このペプチドは本明細書で言及するときはGIN35と呼ぶ；
（c）RTRKRGRRTRKRGR（配列番号:4）、このペプチドは本明細書で言及するときはGIN36と呼ぶ；
（d）LRKRKRLLRKRKRL（配列番号:5）、このペプチドは本明細書で言及するときはGIN37と呼ぶ；
（e）LRKRKRLRKLRKRKRLRK（配列番号:6）、このペプチドは本明細書で言及するときはGIN38と呼ぶ；
（f）WRWRKRWRKWRWRKRWRK（配列番号:7）、このペプチドは本明細書で言及するときはGIN33と呼ぶ；
（g）RRWRKRWRKWRWRKRWRK（配列番号:34）、このペプチドは本明細書で言及するときはMU28と呼ぶ；
（h）KRWRKRWRKWRWRKRWRK（配列番号:35）、このペプチドは本明細書で言及するときはMU29と呼ぶ；
（i）LRWRKRWRKWRWRKRWRK（配列番号:36）、このペプチドは本明細書で言及するときはMU30と呼ぶ；
（j）HRWRKRWRKWRWRKRWRK（配列番号:37）、このペプチドは本明細書で言及するときはMU31と呼ぶ；
（k）RWRKRWRKWRWRKRWRK（配列番号:38）、このペプチドは本明細書で言及するときはMU32と呼ぶ；
（l）RRWRKRWRKRRWRKRWRK（配列番号:39）、このペプチドは本明細書で言及するときはMU33と呼ぶ；
（m）KRWRKRWRKKRWRKRWRK（配列番号:40）、このペプチドは本明細書で言及するときはMU34と呼ぶ；
（n）LRWRKRWRKLRWRKRWRK（配列番号:41）、このペプチドは本明細書で言及するときはMU35と呼ぶ；
（o）HRWRKRWRKHRWRKRWRK（配列番号:42）、このペプチドは本明細書で言及するときはMU36と呼ぶ；
（p）RWRKRWRKRWRKRWRK（配列番号:43）、このペプチドは本明細書で言及するときはMU37と呼ぶ；
（q）RWRKRGRKRWRKRGRK（配列番号:44）、このペプチドは本明細書で言及するときはMU69と呼ぶ；
（r）RTRKRWRKRTRKRGRK（配列番号:45）、このペプチドは本明細書で言及するときはMU70と呼ぶ；
（s）RWRKRWRKRWRKRWRK（配列番号:46）、このペプチドは本明細書で言及するときはMU71と呼ぶ；
（t）RWRKRWRWRKRWRWRKRW（配列番号:47）、このペプチドは本明細書で言及するときはMU84と呼ぶ。
【００１８】
本発明の第二の特徴にしたがえば、医薬として使用するための本発明の第一の特徴のポリペプチド、その誘導体又は類似体が提供される。
本発明の第三の特徴にしたがえば、本発明の第一の特徴のポリペプチド、その誘導体又は類似体の、ウイルス感染治療用医薬の製造を目的とする使用が提供される。
本発明のポリペプチド、その誘導体又は類似体の治療作用はまた、そのようなポリペプチド、誘導体又は類似体の活性を高める薬剤によって“間接的に”仲介されえることは理解されよう。本発明は、そのような薬剤の第一医薬用途を提供する。
したがって、本発明の第四の特徴にしたがえば、医薬として使用される本発明の第一の特徴のポリペプチド、誘導体又は類似体の生物学的活性を高めることができる薬剤が提供される。
本発明のポリペプチド、誘導体又は類似体の生物学的活性を高めることができる薬剤は、多数の手段によってそれらの作用を発揮することができる。例えば、そのような薬剤は、そのようなポリペプチド、誘導体又は類似体の発現を増加させることができる。また別には、（又はそれに付け加えて）、そのような薬剤は、例えば前記ポリペプチド、誘導体又は類似体の代謝を低下させることによって、生物学的な系における本発明のポリペプチド、誘導体又は類似体の半減期を増加させることができる。
それらの生物学的活性の増加のために、本発明のポリペプチド、誘導体又は類似体は抗ウイルス剤として有用である。
【００１９】
本発明のポリペプチド、誘導体又は類似体は、多数のウイルス感染の治療に用いることができる。前記ウイルスは任意のウイルスでもよいが、特にエンベロープをもつウイルスがよい。好ましいウイルスはポックスウイルス、イリドウイルス、トガウイルス又はトロウイルスである。より好ましいウイルスは、フィロウイルス、アレナウイルス、ブニヤウイルス又はラブドウイルスである。さらに好ましいウイルスはパラミクソウイルス又はオルトミクソウイルスである。ウイルスには好ましくはヘパドナウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス又はレトロウイルスを含むことができると考える。好ましくは、前記ウイルスにはヘルペスウイルス又はレンチウイルスが含まれる。好ましい実施態様では、前記ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、ヒト単純ヘルペスウイルス2型（HSV2）又はヒト単純ヘルペスウイルス1型（HSV1）であろう。
本発明のポリペプチド、誘導体又は類似体を、単独療法として（すなわち本化合物のみを使用）又は抗ウイルス療法で用いられる他の化合物若しくは療法と併用して用いウイルス感染を治療することができる（前記他の化合物は、例えばアシクロヴィル、ガンシクロヴィル、リバビリン、インターフェロン、抗HIV薬（逆転写酵素のヌクレオシド、ヌクレオチド又は非ヌクレオチド阻害剤、プロテアーゼ阻害剤及び融合阻害剤を含む）である）。
本発明のペプチド及びその誘導体は、好ましくはIC50値が30μM又はそれ未満のような、ウイルス増殖を阻害する効能を有する。IC50値は20μM又はそれ未満が好ましい。より好ましくは、IC50値は10μM又はそれ未満である。好ましいペプチドは、ウイルス種の間で類似のIC50値を有する。例えば、好ましいペプチドは、HSV1、HSV2及びHIVの増殖阻害について同様なIC50値を有する。
【００２０】
当業者に公知の多数のアミノ酸変種を用い、改変アミノ酸で本発明のアポBの直列反復を代用することができることは理解されよう。そのようなペプチドもなお抗ウイルス活性を有するであろうが、ただし前記改変がその化学的特徴を有意に変化させないことを条件とする。例えば、R又はKの側鎖アミン上の水素はメチレン基で置き換えることができる（-NH2 −＞ -NH(Me) −＞ -N(Me)2）。さらにまた、本ペプチドのN-末端アミノ基はカルボン酸との反応によって保護することができ、本ペプチドのC-末端のカルボキシル基はアミンとの反応によって保護することができる。
本発明のポリペプチドの誘導体にはまた、in vivoで前記ポリペプチドの半減期を増減させる誘導体を含むことができる。本発明のポリペプチドの半減期を増加させることができる誘導体の例には、前記ポリペプチドのペプトイド誘導体、前記ポリペプチドのD-アミノ酸誘導体及びペプチド-ペプトイドハイブリッドが含まれる。
本発明のポリペプチドは多数の手段（例えば生物学的な系におけるプロテアーゼ活性）によって分解に付されえる。そのような分解は前記ポリペプチドの生体利用性を制限し、したがってそれらの生物学的機能を達成する前記ポリペプチドの能力を制限するであろう。生物学的環境における安定性を強化させたペプチド誘導体を設計し製造する確立された広範囲の技術が存在する。そのようなペプチド誘導体は、プロテアーゼ介在分解に対する耐性の強化の結果として、改善された生体利用性を有することができる。好ましくは、本発明の使用に適したペプチド誘導体又は類似体は、前記が誘導されたペプチドよりもより強いプロテアーゼ耐性を有する。ペプチド誘導体及び前記誘導体が由来したペプチドのプロテアーゼ耐性は、周知のタンパク質分解アッセイの手段によって評価することができる。前記ペプチド誘導体及びペプチドのプロテアーゼ耐性の相対値を続いて比較することができる。
【００２１】
本発明のペプチドのペプトイド誘導体は、本発明の第一の特徴のペプチドの構造に関する情報から容易に設計することができる。市販のソフトを用いて確立されたプロトコルにしたがってペプトイド誘導体を開発することができる。
レトロペプトイド（全てのアミノ酸が逆の順序でペプトイド残基によって置き換えられている）はまた、アポリポタンパク質から誘導される抗ウイルスペプチドを模倣することができる。レトロペプトイドは、ペプチド又は1つのペプトイド残基を含むハイブリッドと比べたとき、リガンド結合溝において反対の向きで結合すると予想される。結果として、前記ペプトイド残基の側鎖は本来のペプチドの側鎖と同じ方向に向くことができる。
本発明のポリペプチドの改変形のまた別の実施態様はポリペプチドのD-アミノ酸型を含む。L-アミノ酸ではなくD-アミノ酸を含むペプチドの調製物は、正常な代謝プロセスによる前記薬剤の望ましくない分解を大きく低下させ、投与されねばならない薬剤量を減少させるとともにその投与頻度も減少させる。
本発明のポリペプチド、類似体又は誘導体は、生物学的細胞が有利に発現することができる生成物である。
したがって、本発明はまた第五の特徴において、本発明の第一の特徴のポリペプチド、誘導体又は類似体をコードする核酸を提供する。
本発明の第五の特徴の好ましい核酸は、アポB3359-3367、GIN16、GIN35、GIN36、GIN37、Gin38及びGIN33を対応する核酸配列によりコードする。
cgtcttactc gtaaacgtgg tcttaaacgt cttactcgta aacgtggtct taaa（配列番号:8）；
cttcgtactc gtaaacgtgg tcgtaaactt cgtactcgta aacgtggtcg taaa（配列番号:9）；
cgtactcgta aacgtggtcg taaacgtact cgtaaacgtg gtcgtaaa（配列番号:10）；
cgtactcgta aacgtggtcg tcgtactcgt aaacgtggtc gt（配列番号:11）；
cttcgtaaac gtaaacgtct tcttcgtaaa cgtaaacgtc tt（配列番号:12）；
cttcgtaaac gtaaacgtct tcgtaaactt cgtaaacgta aacgtcttcg taaa（配列番号:13）；及び
tggcgttggc gtaaacgttg gcgtaaatgg cgttggcgta aacgttggcg taaa（配列番号:14）。
当業者には、本発明の他の好ましいペプチドの核酸配列を容易に作製することができることは理解されよう。
【００２２】
遺伝暗号の縮退のために、いずれの核酸配列もそれによってコードされるペプチド配列に実質的に影響を及ぼすことなく変動させ又は変更して、それにより機能的な変種を提供することができることは明白である。適切なヌクレオチド変種は、配列内で同じアミノ酸をコードする異なるコドンを代用することによって別個の配列を有する（したがってサイレント変化を生じる）ものである。他の適切な変種は、相同なヌクレオチド配列を有するが、配列の全て又は部分が、置換されるアミノ酸と類似の生物物理学的特性の側鎖を有するアミノ酸をコードする別個のコドンの代用によって変更され、保存的変化を生じるものである。例えば、小さな非極性、疎水性アミノ酸にはグリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン及びメチオニンが含まれる。大きな非極性疎水性アミノ酸にはフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが含まれる。極性中性アミノ酸にはセリン、スレオニン、システイン、アスパラギン及びグルタミンが含まれる。陽性荷電（塩基性）アミノ酸にはリジン、アルギニン及びヒスチジンが含まれる。陰性荷電（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。
本発明のポリペプチド、誘導体及び類似体は、そのような分子をコードする核酸配列の細胞による発現を含む技術によって投与することが有利な薬剤であることは理解されよう。そのような細胞による発現方法は、前記ポリペプチド、誘導体及び類似体の治療効果が長期にわたって要求される医薬的利用に特に適している。
したがって、本発明の第六の特徴によれば、医薬として使用される、本発明の第五の特徴の核酸配列が提供される。
前記核酸は好ましくは単離又は精製された核酸配列であろう。前記核酸配列は好ましくはDNA配列であろう。
前記核酸配列はさらに、その発現を制御及び/又は強化することができるエレメントを含むことができる。前記核酸分子は適切なベクターに含ませて、組換えベクターを形成することができる。前記ベクターは、例えばプラスミド、コスミド又はファージでありえる。そのような組換えベクターは、本発明のデリバリー系において細胞を前記核酸で形質転換するために非常に有用である。
【００２３】
組換えベクターはまた他の機能的エレメントを含むことができる。例えば、組換えベクターは、それらが細胞内で自律的に複製するように設計することができる。この事例では、核酸の複製を誘導するエレメントが組換えベクターに必要とされるであろう。また別には、組換えベクターは、前記ベクター及び組換え核酸分子が細胞のゲノムに組み込まれるように設計することができる。この事例では、標的とされる組み込みに有利な（例えば相同組換えによる）核酸配列が所望される。組換えベクターは又、クローニングプロセスで選別可能マーカーとして用いることができる遺伝子をコードするDNAを含むことができる。
さらに前記組換えベクターはまた、遺伝子の発現を必要なように制御するためにプロモーター又は調節因子を含むことができる。
前記核酸分子は、治療される対象者の細胞のDNAに組み込まれる核酸であってよい（必ずしもというわけではないが）。未分化細胞が安定的に形質転換され、遺伝的に改変された娘細胞の産生をもたらす（この場合には、例えば特別な転写因子又は遺伝子活性化因子により対象者における発現の調節が要求されるであろう）。また別には、治療される対象者の分化細胞の不安定性又は一過性形質転換に有利なように、デリバリー系を設計することができる。この場合には、形質転換細胞が死んだとき又は前記タンパク質の発現を停止したときに（理想的には必要な治療効果が達成されたときに）DNA分子の発現が停止するので、発現の調節は前述の事例ほど重要ではない。
【００２４】
前記デリバリー系は、前記核酸分子をベクター内に取り込むことなく対象者に前記分子を提供することができる。例えば、前記核酸分子はリポソーム又はウイルス粒子内に取り込むことができる。また別には、“裸の”核酸分子を対象者の細胞に適切な手段（例えば直接的エンドサイトーシスによる取り込み）によって挿入してもよい。
核酸分子は、トランスフェクション、感染、マイクロインジェクション、細胞融合、プロトプラスト融合又は弾道ボンバードメント（ballistic bombardment）によって、治療されるべき対象者の細胞に移すことができる。例えば、導入は、被覆金粒子による弾道トランスフェクション、核酸分子を含むリポソーム、ウイルスベクター（例えばアデノウイルス）、及び核酸分子を直接適用することによって直接的な核酸の取り込みを提供する手段（例えばエンドサイトーシス）によることができる。
本発明のポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体を単独療法（すなわち本発明のポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体のみを使用してウイルス感染を予防及び／又は治療する）で用いることができることは理解されよう。また別には、本発明のポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体を、付属物として、又は既知の療法と併用して用いてもよい。
【００２５】
本発明のポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体を、種々の多くの形態を有する組成物中で、特に前記組成物が用いられる態様に応じて組み合わせることができる。したがって、例えば、前記組成物は散剤、錠剤、カプセル、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エーロゾル、スプレー、ミセル、経皮パッチ、リポソームの形態であるか、又は人間又は動物に投与することができる任意の他の適切な形態でありえる。本発明の組成物の賦形剤は、前記組成物が投与される対象者が十分に耐性を有し、さらに前記ポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体の脳へのデリバリーを可能にするように好ましくは順化されてあるものでなければならないことは理解されよう。本発明のポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体は、それらの血液脳関門の通過が許容されるような態様で製剤化されるのが好ましい。
本発明のポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体を含む組成物は多数の方法で用いることができる。例えば経口投与は、錠剤、カプセル又は液体の形態で例えば経口的に摂取できる組成物中に前記化合物を収納することができる場合に要求することができる。また別には、前記組成物は血流中に注射によって投与することができる。注射は、静脈内（ボラス投与又は輸液）又は皮下注射（ボラス投与又は輸液）であろう。前記化合物は吸入によって（例えば鼻腔内から）投与してもよい。
【００２６】
組成物は局所的使用を目的として製剤化してもよい。例えば、軟膏は皮膚、口若しくは性器内又はその周辺に塗布して特定のウイルス感染を治療することができる。皮膚への局所適用は皮膚のウイルス感染治療に、又は他の組織への経皮デリバリーの手段として特に有用である。膣内投与は性交により伝達される疾患（エイズを含む）の治療に有効である。
ポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体はまた徐放性又は遅放性装置内に取り込ませることができる。そのような装置は、例えば皮膚上に又は皮下に挿入し、数週間又は数ヶ月にさえわたって前記化合物を放出することができる。そのような装置は、本発明のポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体による長期治療が必要とされるとき、さらに通常頻繁な投与（例えば少なくとも毎日の注射）が必要とされるときに特に有利であろう。
必要とされるポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体の量は、その生物学的活性及び生体利用性（前記は、用いられるポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体の投与態様、及び前記ポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体が単独療法として又は併用療法として用いられるか否かに依存する）によって決定されることは理解されよう。投与頻度はまた、上述の要因及び特に治療される対象者の体内での前記ポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体の半減期によって影響されるであろう。
【００２７】
投与されるべき最適用量を当業者は決定することができ、さらに前記最適用量は、使用される個々のポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体、調製物の濃度、投与の態様、及び症状の進行状況にしたがって変動するであろう。治療される個々の対象者に左右されるさらに別の要因が用量調節の必要をもたらすであろう。前記には対象者の年齢、体重、性別、食生活及び投与時期が含まれる。
公知の方法、例えば製薬工業において（例えばin vivo実験、臨床試験などで）通常的に用いられるような方法を用いて、本発明のポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体の具体的な製剤及び正確な治療計画（例えばポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体の1日の用量及び投与頻度）を確立することができる。
一般的には、1日の用量として本発明のポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体の0.01μg/kg体重から0.5g/kg体重が、ウイルス感染の予防及び/又は治療のために用いられ得るが、前記は使用される具体的なポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体に左右される。より好ましくは1日の用量は0.01mg/kg体重から200mg/kg体重、もっとも好ましくはおよそ1mg/kgから100mg/kgである。 
【００２８】
1日の用量は1回の投与として与えることができる（例えば毎日1回の注射）。あるいは、使用されるポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体は1日に2回または3回以上の投与を必要とするかもしれない。一例として、本発明のポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体は、毎日2回（又は症状の重篤度に応じて3回以上）、1日25mgから7000mg（すなわち体重70kgと仮定して）の間の用量で投与することができる。治療を受ける患者は、最初の投与を起床時に続いて夕方に第二回目の投与を（2回投与計画の場合）、又はその後3若しくは4時間間隔で投与を受けることができる。また別には、徐放性装置を用いて、反復投薬の必要なく患者に最適用量を用いることができる。
本発明は、治療的に有効な量の本発明のポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体及び場合によって医薬的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物を提供する。ある実施態様では、ポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体の量は約0.01mgから約800mgの量である。別の実施態様では、ポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体の量は約0.01mgから約500mgの量である。また別の実施態様では、ポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体の量は約0.01mgから約250mgの量である。また別の実施態様では、ポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体の量は約0.1mgから約60mgの量である。また別の実施態様では、ポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体の量は約0.1mgから約20mgの量である。
【００２９】
本発明は、治療的に有効な量の本発明のポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体及び医薬的に許容できる賦形剤を一緒に含む医薬組成物を製造する方法を提供する。“治療的に有効な量”とは、本発明の第一の特徴のポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体の任意の量であって、対象者に投与されたときにウイルス感染の予防および／または治療を提供する量である。“対象者”は、脊椎動物、哺乳動物、家畜又はヒトである。
本明細書で用いられる“医薬的に許容できる賦形剤”は、医薬組成物の製剤化で有用な、当業者に公知の任意の生理学的賦形剤である。
好ましい実施態様では、前記医薬賦形剤は液体であり、医薬組成物は溶液の形態である。別の実施態様では、医薬的に許容できる賦形剤は固体であり、医薬組成物は散剤又は錠剤の形態である。さらに別の実施態様では、医薬賦形剤はゲルであり、組成物はクリームなどの形態である。
固体の賦形剤は1つ又は2つ以上の物質を含むことができ、前記物質はまた、香料、滑沢剤、可溶化剤、懸濁剤、充填剤、研磨剤、圧縮補助剤、結合剤又は錠剤崩壊剤として機能してもよい。前記はまた被包化物質であってもよい。散剤では、前記賦形剤は微細に分割された固体であって、微細に分割された活性なポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体と混合されている。錠剤では、活性なポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体は、必要な圧縮特性を有する賦形剤と適切な割合で混合され、所望の形状及びサイズに圧縮される。前記散剤及び錠剤は、好ましくは99%までの活性なポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体を含む。適切な固体の賦形剤には、例えばリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ロウ及びイオン交換樹脂が含まれる。
【００３０】
液体賦形剤は、溶液、懸濁液、乳濁液、シロップ、エリキシル及び加圧組成物の製造で用いられる。活性なポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体は、医薬的に許容できる液体賦形剤、例えば水、有機溶媒、両者の混合物又は医薬的に許容できる油若しくは脂肪に溶解又は懸濁することができる。液体賦形剤は他の適切な医薬的添加物、例えば可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、保存料、甘味剤、香料、懸濁剤、膨張剤、着色剤、粘度調節剤、安定化剤、又は浸透圧調節剤を含むことができる。経口及び非経口投与を目的とする適切な液体賦形剤の例には、水（上記のような添加物、例えばセルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロース溶液を部分的に含む）、アルコール（一価アルコール及び多価アルコール（例えばグリコール）を含む）及びそれらの誘導体、並びに油（例えば分別化ココナッツ油及び落花生油）が含まれる。非経口投与のためには、賦形剤はまた油状エステル、例えばオレイン酸エチル及びイソプロピルミリステートであろう。滅菌液体賦形剤は、非経口投与を目的とした滅菌液体組成物で有用である。加圧組成物のための液体賦形剤は、ハロゲン化炭化水素又は他の医薬的に許容できる発射薬であろう。
【００３１】
滅菌溶液又は懸濁液の液体医薬組成物は、例えば筋肉内、硬膜下腔内、硬膜外、腹腔内、静脈内及び特に皮下、脳内又は脳室内注射で利用することができる。ポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体は滅菌固体組成物として製造することができ、前記を投与時に滅菌水、生理食塩水又は他の適切な無菌的注射用媒体を用いて溶解又は懸濁させることができる。賦形剤は必要な不活性結合剤、懸濁剤、滑沢剤、香料、甘味剤、保存料、色素及びコーティングを含むことが意図される。
本発明のポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体は、無菌的溶液又は懸濁液の形態で経口的に投与することができる。前記は、他の溶質又は懸濁剤（例えば溶液を等張にするために十分な生理食塩水又はグルコース）、胆汁塩、アラビアゴム、ゼラチン、モノオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート80（エチレンオキシドと共重合させたソルビトールとその無水物のオレイン酸エステル）などを含む。
本発明のポリペプチド、薬剤、核酸又は誘導体はまた、液体又は固体組成物形態のどちらかで経口的に投与することができる。経口投与に適した組成物には、固体形（例えばピル、カプセル、顆粒、錠剤及び散剤）及び液体形（例えば溶液、シロップ、エリキシル及び懸濁液）が含まれる。非経口投与に有用な形態には無菌的溶液、乳濁液及び懸濁液が含まれる。
本明細書（添付の特許請求の範囲、要約書及び図面の一切を含む）に記載した特徴の全て、及び/又は開示した一切の方法又はプロセスの工程のいずれも上記の任意の特徴と任意の組合せで結合させることができる（ただしそのような特徴及び/又は工程の少なくともいくつかが相互に矛盾する組合せは除く）。
本発明の実施態様はこれらからさらに、単なる例示の態様で、以下の実施例及び図面を参考にしながら記載されるであろう。
【００３２】
実施例１
先ず初めに以下を用いて実施した：（i）アポリポタンパク質EのHSPGレセプター結合領域由来のアポE141-149の直列反復（アポE141-149dp）；及び（ii）HSPGレセプター結合に関与しないアポリポタンパク質Eの領域由来のアポE263-286。これらの実験は、ペプチド（i）が抗ウイルス剤として何らかの効能を有しているか否かを確認するために実施した。この実験の結果が、他のペプチド（本発明のペプチドを含む）の有効性を調べる動機を発明者に与えた（以下の実施例を参照されたい）。
1.1 HSV1
図1及び表1は、抗HSV1活性についてのテストの典型的な結果を示している。前記アッセイは、24ウェルプレートのコンフルエントなVero細胞をウイルスと種々の量のペプチドを含む培養液で1時間処理し、続いてこの接種物を除去し、粘稠な“オーバーレイ”培養液（0.2%高粘度カルボキシメチルセルロースを含む）を添加することを含む。前記オーバーレイ培養液は、感染細胞の直ぐ隣の細胞の感染のみを許容する。2日間のインキュベーション後、続いて固定及び染色し、感染細胞の小区画（又は“プラーク”）を可視化し、その数を数える。これらの各々は、1時間の接種中の単一細胞の感染に一致する。アポE141-149dpは、ほぼ20μMの濃度でプラーク数の40%の減少をもたらした。ペプチドはこの実験系で1時間存在していただけであることに留意されたい。
【００３３】
表1：アポE141-149dp又はアポE263-286とともにウイルスを接種した後のVero細胞におけるHSV1プラークの形成。未処理細胞の値には下線が付されている。
2007536910.tif 000004
【００３４】
1.2 HSV2
図2及び表2は、抗HSV2活性についてのテストの典型的な結果を示している。前記アッセイは、Vero細胞ではなくてHep-2細胞を用いたことを除いて、抗HSV1アッセイの場合のように実施した。アポE141-149dpは、ほぼ20μMの濃度でプラーク数の50%の減少をもたらした。改めて、このペプチドはこの実験系で1時間存在していただけであることに留意されたい。
【００３５】
表2：アポE141-149dp又はアポE263-286とともにウイルスを接種した後のHep-2細胞におけるHSV2プラークの形成。未処理細胞の値には下線が付されている。
2007536910.tif 000005
【００３６】
1.3 HIV
図3及び表3は、抗HIV活性についてのテストの典型的な結果を示している。前記アッセイは、HIV感染U937細胞を種々の濃度のペプチドの存在下で7日間インキュベートし、続いて細胞中のHIVタンパク質p24のレベルについて酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）技術を用いてアッセイすることによって実施した。アポE141-149dpは、20μMで感染性の95%低下をもたらした。アポE263-286は、20μMで感染性の20%低下をもたらした。
HIVに対する作用はより低濃度のペプチドで出現する。ただしこれは、ヘルペスウイルスによるプラーク減少アッセイではほんの1時間の接触に対して、ペプチドを細胞に7日間接触させたことによるのかもしれない。あるいは、異なる活性はアッセイ系の相違によるものかもしれない。
【００３７】
表3：ELISAで測定したときの、急性感染U937細胞におけるアポE141-149dp及びアポE263-286によるHIV-1 p24産生阻害
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1.1から1.3に表わされた結果は、アポE141-149dpがアポE263-286よりも有効であることを示している。
これらの結果を考慮して、発明者らは、アポリポタンパク質から生成した他のペプチドのテストを進め、そのようなペプチドが抗ウイルス活性を有するか否かを精査した（実施例２参照）。
【００３８】
実施例２
実施例１で報告した研究にしたがい発明者らによって得られた情報が与えられたので、アポB及び他のアポリポタンパク質から誘導した多数のペプチドの抗ウイルス作用を判定するための実験を実施した。テストした領域には、ヘパリン結合領域、LDLR結合領域又はアポリポタンパク質B、及び両親媒性αヘリックス領域が含まれていた。ペプチドが短い場合には、αヘリックス生成の確率が増すように直列反復を構築した。
驚くべきことには、発明者らは、テストしたペプチドのうちほんの少数だけが抗ウイルス作用を有することを見出した（2.2参照）。そのようなペプチドは本発明のペプチドである。
【００３９】
2.1材料と方法
2.1.1細胞培養：アフリカミドリザル腎（Vero）細胞を、アールの塩を含むイーグル最小必須培地（EMEM）に10%ウシ胎児血清（加熱不活化）、4mMのL-グルタミン及び1%（v/v）非必須アミノ酸の他にペニシリン及びストレプトマイシン（それぞれ100IU/mg及び100mg/mL）を補充したもの（10%EMEMと称する維持培養液）で維持した。細胞を37℃で5%CO2を含む空気による湿潤雰囲気中でインキュベートした。
採集に際して、単層培養物をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、PBS中のトリプシンとともに30分インキュベートすることによって剥離し、その後、等容積の10%EMEMを添加することによってトリプシンを不活化し、500g（5分、4℃）で遠心した。細胞ペレットを10%EMEMに再懸濁させ、細胞を計測し、24ウェルプレートへ播した。抗ウイルスアッセイの場合、わずかに0.5%のFCSを含む培養液（0.5%EMEMと称する）を用いた。
2.1.2ウイルス： Vero細胞に感染させ、組織培養上清及び細胞溶解物から半純粋ウイルス懸濁液を調製することによって3つの別々のHSV1ウイルス継代物を調製し、-85℃でアリコットを凍結した。ウイルス感染性は、溶融アリコットの段階希釈についてプラークアッセイを実施することにより判定した（pfu/mLで表した）。
2.1.3ペプチド：ペプチドは業者（AltaBioscience, University of Birmingham又はAdvanced Biomedical）から凍結乾燥形で入手し、5マイクロモルスケールで調製した。N-末端はアセチル基の付加によって保護し、C-末端はアミド基の付加によって保護した。
ペプチドの分子量は、フィンニガン（Finnigan）LASERMAT 2000MALDI-飛行時間質量分析装置又はサイエンティフィック・アナリシス・グループMALDI-TOF質量分析計を用いてレーザー脱離質量分析により確認した。ペプチドのHPLC精製は、ヴァイダック（Vydac）分析用C-4逆相カラムにより、溶媒として0.1%TFA及び0.1%TFA/80%アセトニトリルを用い、又はいくつかのペプチドについてはACE C18逆相カラムにより、溶媒として0.05%TFA及び60%アセトニトリルを用いて実施した。ペプチドMU27（配列番号:3）のための典型的な質量分析データ及び高速液体クロマトグラフィー（HPLC）トレース（純度＞80%）は図７及び８に示されている。
少量のペプチドを滅菌エッペンドルフ試験管で秤量し、その後、十分な0.5%EMEMを添加して1.5mMのストック溶液を作製し、前記を小分けして-20℃で凍結した。
【００４０】
2.1.4プラーク減少アッセイ：Vero細胞を10%EMEMに125,000細胞/ウェルで播種し、一晩インキュベートしてコンフルエントな単層培養物を得た。ペプチドを0.5%EMEMで希釈して最終所望濃度の2倍を得て、100μLアリコットを24ウェルプレートのために用いられるべき編成で96ウェルプレートに配置し、標準の0.5%EMEMを含むコントロールウェルもまた準備した。ウイルスストック（p3）を溶融し、およそ100pfuが100μLに含まれるように0.5%EMEMで希釈した。各24ウェルプレートに別々に接種した。最初に100μLのウイルスストックを、96ウェルプレートに配置されたペプチド培養液又はコントロール培養液に添加した。これを接種前に37℃で10分間インキュベートした。コンフルエントなVeroを含む24ウェルプレートの4つのウェルから培養液を除去し、適切なウェルに200μLの接種物を添加した。いったん全てのウェルを処理したら、この24ウェルプレートをさらに60−80分インキュベートした。最後に、ペプチド含有接種物を除去し、1%のカルボキシメチルセルロースを含む1%EMEMの1mLを各ウェルに添加した。プレートをさらに22時間、又はいくつかの実験では40時間インキュベートし、その後オーバーレイを除去し、PBS中の10%のホルムアルデヒドを添加した。さらに1時間インキュベートした後、固定液を除去し、単層培養を数回水道水で洗浄し、水に溶解させたカルボールフクシンで染色した。30分後に色素を除去し、プレートを数回水道水で洗浄した後風乾した。オリンパスLX70倒立顕微鏡を用いてプラークを数え、抗ウイルス作用は、各ペプチド濃度のコントロール値の百分率として表した。IC50はペプチド濃度に対する阻害作用のプロットから算出した。
【００４１】
2.1.5毒性試験：Vero細胞を96ウェルプレートの10%EMEMに30,000細胞/ウェルで播種し、一晩インキュベートしてコンフルエントな単層培養物を得た。GINペプチドを0.5%EMEMで希釈して所望の最終濃度を作製し、100μlアリコットを別個の無細胞96ウェルプレートに配置し、Veroウェルプレートを取り、10%EMEMを除去し、ペプチドを含む0.5%EMEMを添加した。48時間インキュベートした後、1.5mg/mLのMTT溶液（0.5%EMEM中）を25μL/ウェルで添加し、プレートをインキュベーターに1時間戻した。最後に培養液をウェルから除去し、100μLのジメチルスルホキシド（DMSO）の添加により青色ホルマザン結晶を溶解させた。続いて得られた溶液の吸収を570nmで測定し、毒性作用を各ペプチド濃度についてコントロールの百分率で表した。可能な場合は、EC50をペプチド濃度に対する毒性作用のプロットから算出した。幸いなことに、40μMのペプチドを用いて2日間細胞を暴露したとき、毒性の徴候はテストした細胞株については全く見出されなかった。
【００４２】
2.2結果
図4は、GIN16（配列番号:2）、GIN17（配列番号:15）、GIN27（配列番号:16）、GIN28（配列番号:17）及びGIN30（配列番号:18）として同定された5つのペプチドについて得られたデータを示す。図4は、驚くべきことに本発明の第一の特徴のGIN16のみが抗ウイルス活性を示し、一方、GIN17、GIN27、GIN28及びGIN30は抗ウイルス活性を示さなかったことを明瞭に示している。
表4は一連のヒトアポリポタンパク質から構築したGINペプチドについて得られたデータのまとめである。
【００４３】
表4：一連のヒトアポリポタンパク質から構築したGINペプチドの抗HSV1について得られたデータ
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【００４４】
実施例３
さらに数を増やしたペプチドで更なる一連の実験を行い、HSV-1に対する本発明のぺプチドの作用を評価した。下記表5及び図5によって、本発明の第一の特徴のGIN33（配列番号:7）、GIN35（配列番号:3）、GIN36（配列番号:4）、GIN37（配列番号:5）及びGIN38（配列番号:6）と称されるペプチドが抗ウイルス活性を有することが確認される。
【００４５】
表5：GIN16に由来するGINペプチドについて得られた抗HSV1のデータの要旨
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【００４６】
実施例４
実施例2に記載した実験と同様な実験を実施して、HIV感染に対する本発明のペプチドの有効性をテストした。CD4及び適切なコレセプター（CCR5又はCXCR4）の両者を過剰発現しているグリオーマ細胞株NP2を10%FCS補充DMEMで維持した。48ウェルプレートの各ウェルに、2ｘ104細胞を感染24時間前に播種し、37℃で増殖させた。続いて細胞を洗浄し、0.1から10μMの範囲の濃度のペプチドを含むDMEM/FCSで30分、37℃でインキュベートした。続いてHIV-1ストックの200フォーカス形成単位を各ウェルに添加し、細胞をさらに2時間37℃でインキュベートした。続いて細胞を2回PBSで洗浄し新しい培養液に置き換えた。3日間増殖させた後、細胞を冷メタノール/アセトンで固定し、HIV-1 p24の発現についてモノクローナル抗p24抗体、続いて二次抗マウス抗体β-ガラクトシダーゼ結合を用いてin situで染色した。発現はX-Gal染色によって可視化し、感染中心は光学顕微鏡によって数えた。
本発明のペプチドはHSV-1及びHIVに対して類似の有効性を有することが判明した。
図6は、CCR5コレセプターを過剰発現しているNP-2グリオーマ細胞で増殖させた、HIV単離株SF162に対するペプチドGIN33（配列番号:7）の抗HIV作用を示している。
【００４７】
実施例５
HSV-1に対する本発明のペプチドの有効性をテストするために、更なる実験を実施した。
5.1方法
用いた方法は、ペプチドをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に400μMストックとして調製した点を除いて、実施例1−4で記載した方法とした。
5.2結果
5.2.1本発明のさらに別のアポBペプチドの作用
【００４８】
表6
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MU35はHSV-1に対して活性を有することが見出された。しかしながら、HSV活性は15μMまでの濃度で50%低下しなかった。
【００４９】
実施例６
HSV2に対する本発明のペプチドの有効性をテストするために更なる実験を実施した。
6.1方法
プラークアッセイを実施した。本方法は、HSV2臨床単離株（リバプール大学のアンソニー・ハート（Anthony Hart）教授提供）を代わりに用いた点を除いて、HSV1プラークアッセイのために先行の実施例で記載したとおりであった（Vero細胞の使用を含む）。
6.2結果
HSV1に対して有効性を有することが判明した多数のペプチドをまたHSV2に対してテストした。表7は、本発明のペプチドはHSV1及びHSV2に対して有効であったことを示している。このことは、これらペプチドがウイルスに対して広域スペクトル活性を有するであろうということを示している。
【００５０】
表7
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MU32、33及び70はHSV-2に対して活性を有することが見出された。しかしながら、HSV-2活性は20μMまでの濃度で50%低下しなかった。
【００５１】
実施例７
ヒト免疫不全ウイルス（HIV）に対する本発明のペプチドの有効性をテストするために更なる実験を実施した。本発明のペプチドの作用を、実施例4でテストした株と異なるHIV株に対してテストした。
7.1方法
ペプチド（前述のように調製）を50μLアリコットで希釈し、40,000細胞/ウェルのT細胞（C8166）と混合した。次に、HIV-1 111Bを感染多重度（MOI）0.01で添加し、前記混合物を37℃で5日間インキュベートした。シンシチウム形成は倒立顕微鏡を用いて視覚的に判定し、さらに上清のウイルスgp120濃度は抗原捕捉にGNAを用いgp120 ELISAにより判定した。50μLのGNA（Galanthus nivalis）で被覆した96ウェルプレートを洗浄し、続いて100μLのRPMI（10%ウシ胎児血清）で処理し1時間静置した。さらに洗浄した後、25μLの上清テストサンプルを感染コントロールサンプルと併せてウェルに添加した。全てのウェルを0.5%のエムピゲン（Empigen；ウイルス溶解に用いられる界面活性剤）で3時間処理して溶解させ、洗浄した後、50μLのヒト抗HIV血清を添加し、プレートを一晩インキュベートした。さらに洗浄した後、1000倍希釈の抗ヒトIgペルオキシダーゼ結合物の50μLを添加し、プレートを37℃で90分インキュベートした。最後の洗浄の後で、50μLのペルオキシダーゼ基質を各ウェルに添加し、プレートを10−30分インキュベートした。反応は25μLのH2SO4（2M）で停止させ、A450を測定した。
7.2結果
実施例４で提示したデータを補足するために更なるテストを実施して、本発明のペプチドはHSV1及びHSV2の両者と同様にHIVに対しても有効であることを示した。
【００５２】
表8
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【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】実施例1に記載したように、HSV1の感染性に対するアポE141-149dp及びアポE263-286の作用を示す（点は4つまでの値の平均から得られた）。
【図２】実施例1に記載したように、HSV2の感染性に対するアポE141-149dp及びアポE263-286の作用を示す（点は4つまでの値の平均から得られた）。
【図３】実施例1に記載したように、ELISAによって測定した、急性感染U937細胞におけるアポE141-149dp及びアポE263-286によるHIV-1 p24産生の阻害を示す（値は3つの実験の平均である）。
【図４】実施例2に記載したように、HSV1の感染性に対する5つのペプチド（GIN16、GIN17、GIN27、GIN28及びGIN30）の作用を示す。
【図５】実施例2に記載したように、HSV1の感染性に対する5つのペプチド（GIN33、GIN35、GIN36、GIN37及びGIN38）の作用を示す。
【図６】実施例4に記載したように、HIV単離株SF162（CCR5コレセプターを過剰発現するNP-2グリオーマ細胞で増殖）に対するペプチドGIN33の抗HIV作用を示す。
【図７】MU27の典型的な質量分析データを示す（予想された質量イオン値は2939.5であり、前記は入手した値と正確に合致した。）。
【図８】MU27の典型的なHPLC精製データを示し、前記ペプチドが概して80%を超える純度を有することを表示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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