(57)【要約】基材表面上に分子を効果的に固定化する方法を提供する。この方法は、ガラス表面などの未修飾の表面上に、イソシアネート化合物を用いて、反応性イソシアネート表面を形成し、表面上のナノ粒子ならびにシリル化したオリゴヌクレオチドまたはタンパク質などのシリル化分子を形成する。ガラス表面などの表面を修飾するための化合物、装置およびキットも提供する。
2007536527.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面上に分子を固定化する方法であって、
（ａ）分子を、式ｉ：
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−ＮＣＹ                      ｉ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）
を有する薬剤に接触させて、反応性中間体を形成する工程と、
（ｂ）該反応性中間体を前記表面と接触させて、前記表面上に該分子を固定化する工程と
から成る方法。
【請求項２】
前記表面はガラス表面である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記表面は前記反応性中間体と反応する少なくとも１つの基を有する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記基はヒドロキシル基またはアミノ基からなる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記薬剤は３−（イソシアナトプロピル）トリエトキシシランである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記分子はプローブからなる請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記プローブは、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、アミノ酸、連結された核酸、ヌクレオシド三リン酸、糖質、脂質、脂質結合タンパク質、アプタマー、ウイルス、細胞断片、または細胞全体からなる請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記脂質結合タンパク質はＧタンパク質結合受容体からなる請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記プローブは抗体、抗原、受容体、またはリガンドからなる請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
ガラス表面上に分子を固定化する方法であって、
（ａ）分子を、式ｉ：
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−ＮＣＹ                ｉ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）
を有する薬剤に接触させて形成する工程と、
（ｂ）該反応性中間体を該ガラス表面に接触させて、前記表面上に分子を固定化する工程と
から成る方法。
【請求項１１】
前記分子はプローブである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プローブはタンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、アミノ酸、連結された核酸、ヌクレオシド三リン酸、糖質、脂質、脂質結合タンパク質、アプタマー、ウイルス、細胞断片、または細胞全体からなる請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記脂質結合タンパク質はＧタンパク質結合受容体からなる請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記プローブは抗体、抗原、受容体、またはリガンドからなる請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
表面上に分子を固定化する方法であって、
（ａ）Ｓｉ（ＮＣＹ）４（式中、Ｙは酸素または硫黄を表す）を、式ｉｉ：
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ                        ｉｉ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｚはヒドロキシ基またはアミノ基を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）
を有する薬剤に接触させて、第１の反応性中間体を形成する工程と、
（ｂ）該第１の反応性中間体を分子に接触させて、第２の反応性中間体を形成する工程と、
（ｃ）該第２の反応性中間体を前記表面に接触させて、前記表面上に該分子を固定化する工程と
から成る方法。
【請求項１６】
前記表面はガラス表面である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記表面は前記反応性中間体と反応する少なくとも１つの基を有する請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記基はヒドロキシル基またはアミノ基からなる請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記薬剤は４−アミノフェニルトリメトキシシラン、４−アミノフェニルトリエトキシシラン、３−アミノフェニルトリメトキシシラン、３−アミノフェニルトリエトキシシラン、またはこれらの混合物である請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記薬剤およびテトライソシアナトシランが４：１のモル比で存在する請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記分子および前記第１の反応性中間体が３：１のモル比で存在する請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の反応性中間体が、式ｉｖ：
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ−Ｓｉ（ＮＣＹ）３      ｉｖ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）
を有する請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はメトキシを表し、Ｘはフェニルを表し、Ｙは酸素を表し、ＺはＮＨを表す請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２の反応成中間体が、式ｖ：
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ−Ｓｉ（ＮＨＣＹＬ−Ｍ）３ 
ｖ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｌはリンカー基を表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表し、Ｍは分子を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）
を有する請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
Ｌは前記分子からの求核基を表す請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記求核基は−ＮＨ、−Ｓ−、−Ｏ−または−ＯＯＣ−を含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１の反応性中間体が、式ｖｉ：
［（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ］２−Ｓｉ（ＮＣＹ）２      ｖｉ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）
を有する請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はメトキシを表し、Ｘはフェニルを表し、Ｙは酸素を表し、ＺはＮＨを表す請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２の反応性中間体が、式ｖｉｉ：
［（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ］２Ｓｉ（ＮＨＣＹＬ−Ｍ）２
ｖｉｉ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｌはリンカー基を表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表し、Ｍは分子を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）
を有する請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
Ｌは前記分子からの求核基を表す請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記求核基は−ＮＨ、−Ｓ−、−Ｏ−または−ＯＯＣ−を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記分子はプローブからなる請求項１５に記載の方法。
【請求項３３】
前記プローブは、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、アミノ酸、連結された核酸、ヌクレオシド三リン酸、糖質、脂質、脂質結合タンパク質、アプタマー、ウイルス、細胞断片、または細胞全体からなる請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記脂質結合タンパク質はＧタンパク質結合受容体からなる請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記プローブは抗体、抗原、受容体、またはリガンドからなる請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
ガラス表面上に分子を固定化する方法であって、
（ａ）Ｓｉ（ＮＣＹ）４（式中、Ｙは酸素または硫黄を表す）を、式ｉｉ：
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ                      ｉｉ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｚはヒドロキシ基またはアミノ基を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）
を有する薬剤に接触させて、第１の反応性中間体を形成する工程と、
（ｂ）該第１の反応性中間体を分子に接触させて、第２の反応性中間体を形成する工程と、
（ｃ）該第２の反応性中間体を前記表面に接触させて、前記表面上に該分子を固定化する工程と
から成る方法。
【請求項３７】
前記表面はガラス表面である請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記表面は前記反応性中間体と反応する少なくとも１つの基を有する請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記基はヒドロキシル基またはアミノ基からなる請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記薬剤は４−アミノフェニルトリメトキシシラン、４−アミノフェニルトリメトキシシラン、３−アミノフェニルトリエトキシシラン、３−アミノフェニルトリエトキシシラン、またはこれらの混合物である請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記薬剤およびテトライソシアナトシランが１：１のモル比で存在する請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記分子および前記第１の反応性中間体が３：１のモル比で存在する請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
前記第１の反応性中間体が、式ｉｖ：
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ−Ｓｉ（ＮＣＹ）３      ｉｖ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）
を有する請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はメトキシを表し、Ｘはフェニルを表し、Ｙは酸素を表し、ＺはＮＨを表す請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記第２の反応成中間体が、式ｖ：
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ−Ｓｉ（ＮＨＣＹＬ−Ｍ）３ 
ｖ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｌはリンカー基を表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表し、Ｍは分子を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）
を有する請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
Ｌは前記分子からの求核基を表す請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記求核基は−ＮＨ、−Ｓ−、−Ｏ−または−ＯＯＣ−からなる請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記第１の反応性中間体が、式ｖｉ：
［（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ］２−Ｓｉ（ＮＣＹ）２      ｖｉ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フ
ェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）
を有する請求項３６に記載の方法。
【請求項４９】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はメトキシを表し、Ｘはフェニルを表し、Ｙは酸素を表し、ＺはＮＨを表す請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記第２の反応性中間体が、式ｖｉｉ：
［（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ］２Ｓｉ（ＮＨＣＹＬ−Ｍ）２
ｖｉｉ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｌはリンカー基を表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表し、Ｍは分子を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）
を有する請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
Ｌは前記分子からの求核基を表す請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記求核基は−ＮＨ、−Ｓ−、−Ｏ−または−ＯＯＣ−からなる請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記分子はプローブからなる請求項３６に記載の方法。
【請求項５４】
前記プローブは、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、アミノ酸、連結された核酸、ヌクレオシド三リン酸、糖質、脂質、脂質結合タンパク質、アプタマー、ウイルス、細胞断片、または細胞全体からなる請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記脂質結合タンパク質はＧタンパク質結合受容体からなる請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記プローブは抗体、抗原、受容体、またはリガンドからなる請求項３６に記載の方法。
【請求項５７】
分子が固定化された表面を含んでなるデバイスであって、前記表面は請求項１、１０、１５、または３６のいずれか１項に記載の方法によって製造されることを特徴とするデバイス。
【請求項５８】
前記表面はガラス表面である請求項５７に記載のデバイス。
【請求項５９】
前記分子はプローブである請求項５７に記載のデバイス。
【請求項６０】
前記プローブは、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、連結された核酸、アミ
ノ酸、ヌクレオシド三リン酸、糖質、脂質、脂質結合タンパク質、アプタマー、ウイルス、細胞断片、または細胞全体からなる請求項５９に記載のデバイス。
【請求項６１】
前記脂質結合タンパク質はＧタンパク質結合受容体からなる請求項６０に記載のデバイス。
【請求項６２】
前記プローブは抗体、抗原、受容体、またはリガンドからなる請求項５９に記載のデバイス。
【請求項６３】
前記プローブはアミノ基およびヒドロキシル基のうち少なくともいずれか一方を１つまたは複数含むように誘導体化されている、請求項６２に記載のデバイス。
【請求項６４】
式ｉｉｉ：
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−ＮＨＣＹＬ−Ｍ      ｉｉｉ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｌはリンカー基を表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｍは分子を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）
を有する化合物。
【請求項６５】
Ｌは前記分子からの求核基を表す請求項６４に記載の化合物。
【請求項６６】
前記求核基は−ＮＨ、−Ｓ−、−Ｏ−または−ＯＯＣ−からなる請求項６５に記載の化合物。
【請求項６７】
前記プローブは、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、アミノ酸、連結された核酸、ヌクレオシド三リン酸、糖質、脂質、脂質結合タンパク質、アプタマー、ウイルス、細胞断片、または細胞全体からなる請求項６４に記載の化合物。
【請求項６８】
前記脂質結合タンパク質はＧタンパク質結合受容体からなる請求項６７に記載の化合物。
【請求項６９】
前記分子は抗体、抗原、受容体、またはリガンドからなる請求項６４に記載の化合物。
【請求項７０】
式ｉｖ：
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ−Ｓｉ（ＮＣＹ）３      ｉｖ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）
を有する化合物。
【請求項７１】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はメトキシを表し、Ｘはフェニルを表し、Ｙは酸素を表し、ＺはＮＨを表す請求項７０に記載の化合物。
【請求項７２】
式ｖ：
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ−Ｓｉ（ＮＨＣＹＬ−Ｍ）３ 
ｖ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｌはリンカー基を表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表し、Ｍは分子を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）
を有する化合物。
【請求項７３】
Ｌは前記分子からの求核基を表す請求項７２に記載の化合物。
【請求項７４】
前記求核基は−ＮＨ、−Ｓ−、−Ｏ−または−ＯＯＣ−からなる請求項７３に記載の化合物。
【請求項７５】
前記分子は、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、アミノ酸、連結された核酸、ヌクレオシド三リン酸、糖質、脂質、脂質結合タンパク質、アプタマー、ウイルス、細胞断片、または細胞全体からなる請求項７２に記載の化合物。
【請求項７６】
前記脂質結合タンパク質はＧタンパク質結合受容体からなる請求項７２に記載の化合物。
【請求項７７】
前記分子は抗体、抗原、受容体、またはリガンドからなる請求項７２に記載の化合物。
【請求項７８】
式ｖｉ：
［（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ］２−Ｓｉ（ＮＣＹ）２      ｖｉ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）
を有する化合物。
【請求項７９】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はメトキシを表し、Ｘはフェニルを表し、Ｙは酸素を表し、ＺはＮＨを表す請求項７８に記載の化合物。
【請求項８０】
式ｖｉｉ：
［（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ］２Ｓｉ（ＮＨＣＹＬ−Ｍ）２
ｖｉｉ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フ
ェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｌはリンカー基を表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表し、Ｍは分子を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）
を有する化合物。
【請求項８１】
Ｌは前記分子からの求核基を表す請求項８０に記載の化合物。
【請求項８２】
前記求核基は−ＮＨ、−Ｓ−、−Ｏ−または−ＯＯＣ−からなる請求項８１に記載の化合物。
【請求項８３】
式ｉ：
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−ＮＣＹ              ｉ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）
の化合物を含んだ容器と、
任意選択の基材と
から成るキット。
【請求項８４】
Ｓｉ（ＮＣＹ）４（式中、Ｙは酸素または硫黄を表す）を含んだ第１の容器と、
式ｉｉ：
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ            ｉｉ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｚはヒドロキシ基またはアミノ基を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）
を有する薬剤を含んだ第２の容器と、
任意選択の基材と
から成るキット。
【請求項８５】
式ｉｖ：
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ−Ｓｉ（ＮＣＹ）３      ｉｖ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含
む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）
を有する化合物を含んだ容器と
任意選択の基材と
から成るキット。
【請求項８６】
式ｖｉ：
［（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ］２−Ｓｉ（ＮＣＹ）２      ｖｉ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）
を有する化合物を含んだ容器と、
任意選択の基材と
から成るキット。
【請求項８７】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はメトキシを表し、Ｘはフェニルを表し、Ｙは酸素を表し、ＺはＮＨを表す請求項８６に記載のキット。
【請求項８８】
式ｖｉｉ：
［（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ］２Ｓｉ（ＮＨＣＹＬ−Ｍ）２
ｖｉｉ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｌはリンカー基を表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表し、Ｍは分子を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）
を有する化合物を含んだキット。
【請求項８９】
Ｌは前記分子からの求核基を表す請求項８８に記載の化合物。
【請求項９０】
前記求核基は−ＮＨ、−Ｓ−、−Ｏ−または−ＯＯＣ−を表す請求項８９に記載の化合物。
【請求項９１】
標的分析物の検出に使用するための基材を製造する方法であって、
（ａ）表面を有する基材を提供する工程と、
（ｂ）前記表面を、
Ｓｉ（ＮＣＹ）４；
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−ＮＣＹ                              ｉ；
［（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ］２−Ｓｉ（ＮＣＹ）２      ｖｉ；および
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ−Ｓｉ（ＮＣＹ）３      ｉｖ；（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）
から成る群から選択されるイソシアネート化合物に接触させて、遊離イソシアネート基を含んだ表面を提供する工程と
から成る方法。
【請求項９２】
工程（ｂ）の後に、
（ｃ）遊離イソシアネート基を含む前記表面をスペーサー分子に接触させて、遊離アミノ基を含む表面を提供する工程と、
（ｄ）遊離アミノ基を含む前記表面をリンカー分子に接触させて、反応性遊離基を有する反応性表面を提供する工程と
をさらに含む請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
工程（ｃ）および工程（ｄ）を１回または複数回繰り返す工程をさらに含む請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
工程（ｄ）の後に、
（ｅ）前記反応性表面を、標的分析物に特異的な少なくとも１種類の捕捉プローブに接触させて、捕捉プローブが固定化された表面を提供する工程と、
（ｅ）捕捉プローブが固定化された前記表面をキャッピング剤に接触させて、表面の、捕捉プローブが固定化されていない領域上に未反応で残存している遊離イソシアネート基をブロッキングし、かつキャッピング剤と接触しない表面に比べてナノ粒子の非特異的結合に起因するバックグラウンド・シグナルが実質的に低い基材を生産する工程と
をさらに含む請求項９２または９３に記載の方法。
【請求項９５】
（ｃ）遊離イソシアネート基を含む前記表面を水に接触させて、遊離アミノ基を含む表面を提供する工程と、
（ｄ）遊離アミノ基を含む前記表面をリンカー分子に接触させて、反応性遊離基を有する反応性表面を提供する工程と
をさらに含む請求項９１に記載の方法。
【請求項９６】
工程（ｄ）の後に、
（ｅ）遊離イソシアネート基を含む前記表面をスペーサー分子に接触させて、遊離アミノ基を含む表面を提供する工程と、
（ｆ）遊離アミノ基を含む前記表面をリンカー分子に接触させて、反応性遊離基を有する反応性表面を提供する工程と
をさらに含む請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
工程（ｅ）および工程（ｆ）を１回または複数回繰り返す工程をさらに含む請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
（ｉ）標的分析物に特異的な少なくとも１種類の捕捉プローブに前記反応性表面を接触させて、捕捉プローブが固定化された表面を提供する工程と、
（ｉｉ）捕捉プローブが固定化された前記表面をキャッピング剤に接触させて、表面の、捕捉プローブが固定化されていない領域上に未反応で残存している遊離イソシアネート基をブロッキングし、かつキャッピング剤と接触しない表面に比べてナノ粒子の非特異的結合に起因するバックグラウンド・シグナルが実質的に低い基材を生産する工程と
をさらに含む請求項９５、９６または９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記ジシリルイソシアネート化合物は、２−トリメトキシシラン−６−トリイソシアナトシランウレアベンゼン、３−（トリエトキシシリル）プロピルイソシアネート、およびテトライソシアナトシランから成る群から選択される請求項９１に記載の方法。
【請求項１００】
前記スペーサー分子は、イソシアネート基と反応し得る少なくとも２つの官能基を有する、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０１】
前記スペーサー分子は、ポリマー、糖質または抗生物質である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記スペーサー分子は、ポリ（ダイマー酸コアルキルポリアミン）−９５、ポリ（ダイマー酸コアルキルポリアミン）−１４０、ポリ（アリルアミン）、ポリ（ｍ−キシレンジアミン−エピクロロヒドリンジアミン末端、トリス（２−アミノメチルアミン）、および第０世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、ネオマイシン、および３，３’−ジアミノベンジジンから成る群から選択される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
前記キャッピング剤は、アミノ酸、タンパク質、糖質、カルボン酸、チオール、アルコールおよびアミンから成る群から選択される、請求項９４または９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記キャッピング剤はグリシンである請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記イソシアネート化合物は、フェニレン１，４−ジイソシアネート、トリレン−２，６−ジイソシアネート、トリレン−α，４−ジイソシアネート、およびイソホロンジイソシアネートから成る群から選択される、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０６】
前記リンカー分子は、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）、スベリン酸ジスクシンイミジル、１，６−ジイソシアナトヘキサン、メチレンビス−（４−シクロヘキシルイソシアネート）、グルタルジアルデヒド、メチレン−ｐ−フェニルジイソシアネート、およびクエン酸トリエチルから成る群から選択される、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０７】
前記捕捉プローブは核酸である、請求項９４または９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
各々特定の標的分析物に特異的な２種類以上の捕捉プローブを、第２の反応性部分を有する前記表面に接触させる、請求項９４または９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記捕捉プローブを、前記基材の表面上の別個の所定領域にアレイ化する、請求項９４または９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１０】
標的分析物の検出に使用するための基材を製造する方法であって、
（ａ）表面を有する基材を提供する工程と、
（ｂ）前記表面を、
Ｓｉ（ＮＣＹ）４；
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−ＮＣＹ              ｉ；
［（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ］２−Ｓｉ（ＮＣＹ）２      ｖｉ；および
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ−Ｓｉ（ＮＣＹ）３      ｉｖ；（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）
から成る群から選択されるイソシアネート化合物に接触させて、遊離イソシアネート基を含む表面を提供する工程と、
（ｃ）遊離イソシアネート基を含む前記表面をスペーサー分子に接触させて、遊離アミノ基を含む表面を提供する工程と、
（ｄ）遊離アミノ基を含む前記表面をリンカー分子に接触させて、反応性遊離基を有する反応性表面を提供する工程と、
（ｅ）前記反応性表面を標的分析物に特異的な少なくとも１種類の捕捉プローブに接触させて、捕捉プローブが固定化された表面を提供する工程と、
（ｆ）捕捉プローブが固定化された前記表面をキャッピング剤に接触させて、未反応で残存している遊離イソシアネート基をブロッキングし、かつキャッピング剤と接触しない表面に比べてナノ粒子の非特異的結合に起因するバックグラウンド・シグナルが実質的に低い基材を生産する工程と
から成る方法。
【請求項１１１】
前記基材は前記イソシアネート化合物と反応する少なくとも１つの基を有する、請求項９１または１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記基はヒドロキシル基、アミノ基、またはカルボキシレート基からなる請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
１つまたは複数の標的分析物の検出に使用するための基材であって、請求項９４、９８または１１０のいずれか１項に記載の方法にしたがって製造された、捕捉プローブが結合した表面を含んでなる基材。
【請求項１１４】
前記捕捉プローブに結合することのできる遊離アミン基と、負に荷電したイオン基とを含んでなるポリマー層を有する表面を備えた基材。
【請求項１１５】
前記表面は、可視光または蛍光を用いて画像化するときに、前記ポリマー層を有していない基材に比べてバックグラウンド・シグナルが実質的に低減されたバックグラウンド・シグナルを生じる、請求項１１４に記載の基材。
【請求項１１６】
前記基材は約２５〜７５°の水接触角を有する請求項１１３に記載の基材。
【請求項１１７】
前記基材は約１．４００〜１．９００の屈折率を有する請求項１１６に記載の基材。
【請求項１１８】
請求項２２、２３、２５または２５のいずれか１項に記載の基材を含んでなる、１つまたは複数の標的分析物を検出するためのキット。
【請求項１１９】
試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する１つまたは複数の標的分析物を検出する方法であって、
（ａ）請求項９１または１１０のいずれか１項に記載の基材であって、その表面に少なくとも１種類の捕捉プローブが固定化されており、各種類の捕捉プローブが標的分析物に特異的であることを特徴とする基材を提供する工程と、
（ｂ）標的分析物に特異的な検出体プローブとナノ粒子とを含んでなる少なくとも１種類の検出用プローブを提供する工程と、
（ｃ）捕捉プローブおよび検出体プローブが特異的標的分析物に結合するのに有効な条件下で、捕捉プローブ、検出用プローブおよび試料を接触させて、基材の表面上に固定化複合体を形成する工程と、
（ｄ）基材の表面を洗浄して、結合していないナノ粒子を除去する工程と、
（ｅ）前記標的分子の有無の指標としての前記複合体の有無を観察する工程と
から成る方法。
【請求項１２０】
表面上にナノ粒子を固定化する方法であって、
（ａ）表面を有する基材と、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子であって、該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分がナノ粒子と結合していない末端に遊離アミン基を有することを特徴とするナノ粒子とを提供する工程と、
（ｂ）該ナノ粒子を、式ｉ：
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−ＮＣＹ                ｉ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）
を有する薬剤に接触させて、反応性中間体を形成する工程と、
（ｂ）該反応性中間体を前記表面と接触させて、前記表面上に該分子を固定化する工程と
から成る方法。
【請求項１２１】
前記表面はガラス表面である請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記表面は前記反応性中間体と反応する少なくとも１つの基を有する請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２３】
前記基はヒドロキシ基、アミノ基またはカルボキシレート基からなる請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記薬剤は、３−（イソシアナトプロピル）トリエトキシシランまたは３−（イソシアナトプロピル）ジメチルモノエトキシシランからなる請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２５】
前記オリゴヌクレオチドは官能性部分を介してナノ粒子と結合している請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２６】
前記官能性部分は、チオ酸、アルキルチオール基またはジスルフィド基からなる請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記ジスルフィド基はエピアンドロステロンジスルフィドである請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
表面上にナノ粒子を固定化する方法であって、
（ａ）アミン基と反応する反応性部分を含む表面を有する基材と、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子であって、該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分がナノ粒子と結合していない末端にアミン基を有することを特徴とするナノ粒子とを提供する工程と、
（ｂ）前記反応性部分を該ナノ粒子に接触させて、前記表面上に該ナノ粒子を固定化する工程と
から成る方法。
【請求項１２９】
前記表面はガラス表面である請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記反応性部分はイソシアネート類、無水物類、ハロゲン化アシル類またはアルデヒド類からなる請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３１】
前記オリゴヌクレオチドは官能性部分を介してナノ粒子と結合している請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３２】
前記官能性部分はチオ酸、アルキルチオール基またはジスルフィド基からなる請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記ジスルフィド基はエピアンドロステロンジスルフィドである請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
請求項９１または１１０のいずれか１項に記載の方法によって製造された基材。
【請求項１３５】
請求項１３２に記載の基材を含んでなるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子が固定化された基材を製造する方法および基材に関する。
【背景技術】
【０００２】
（相互参照）
本願は、共に２００４年５月６日出願の米国仮特許出願第６０／５６８７６７号および同第６０／５６８８７９号の利益を主張するものであり、また２００３年５月２８日出願の米国仮特許出願第６０／３８３５６４号の利益を主張する２００４年５月２８日出願の米国特許出願第１０／４４７０７３号の一部係属出願であり、かつ、２００１年７月１３日出願の米国仮特許出願第６０／３０５３６９号および２００２年３月１２日出願の米国仮特許出願第第６０／３６３４７２号の優先権の利益を主張する２００２年７月１２日出願の米国特許出願第１０／１９４１３８号の一部係属出願である。これらをすべて本明細書に援用する。
【０００３】
（発明の背景）
表面修飾は、マイクロアレイの生体分子検出技術においてバックグラウンドおよびスポット形態を制御するための重要な役割を果たす。オリゴヌクレオチドなどの生体分子を固定化するための、異なる種類の市販のシラン類（シリルアミンなど）、アルデヒド類、チオール類等を用いたいくつかの修飾が開発された。反応性シランで表面を被覆した後、次の課題は修飾された表面上に所要の生体分子を固定化することである。この表面への装荷は様々なシランによって常に変化し、同種のシランであったとしても、再現可能な結果を生じない場合がある。表面への装荷はアッセイの性能を決定するため、この分野では最適な表面への装荷の再現性が常に大きな課題であった。固定化のために単純な直鎖状分子を用いる場合であっても、表面上に最適に装荷することは達成が困難である。修飾されたガラス表面にＤＮＡを結合させることは、遺伝子発現解析などのＤＮＡ診断産業における多数の用途のための中心的工程である。一般に、ＤＮＡは非共有結合、イオン相互作用、または多段階工程もしくは単純なカップリング反応を用いてガラス表面に結合させることが可能である。様々な種類のシリル化剤で修飾したガラス表面を用いたいくつかの方法が文献に報告されている。例えば、非特許文献１〜６を参照されたい。報告されているこれらの方法はすべて、高価な試薬および分析器具を使用するシリル化工程を必要とする。また、これらの方法は大きな労力を要し費用のかかる多段階の工程でもある。例えば、非特許文献７、８を参照されたい。これまでに報告されている方法は煩雑な合成と時間のかかる手順を伴っていた。例えば、非特許文献９、２００１年６月２８日公開のヒューバーら（Ｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）の特許文献１、２００１年６月２８日公開のヒューバーら（Ｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）の特許文献２、および２００１年６月２８日公開のヒューバーら（Ｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）の特許文献３を参照されたい。
【０００４】
実際、現行の固定化方法の多くが多数の不利点のうち１つまたは複数を被っている。これら不利点の一部は、複雑で高価な反応スキームであり、オリゴヌクレオチド装荷の歩留まりが低く、不安定な反応性中間体は副作用を生じ易く、固定化されたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション動態は好ましいものではない。オリゴヌクレオチドまたは他の分子をガラス表面上にアレイ状に効果的に固定化するには、ａ）異なるバッチに対しても再現性よく装荷できる単純で信頼性の高い反応、ｂ）安定な反応中間体、ｃ）装荷量が高く、ハイブリダイゼーション速度の速いアレイ、ｄ）高温安定性、ｅ）低コスト、ｆ）５’もしくは３’末端またはヌクレオチド内部での特異的結合、ならびにｇ）バックグランド・ノイズが低いこと、が必要である。
【０００５】
ＤＮＡ検出方法における１つの重要な発展は、特定のＤＮＡの存在を示すためにオリゴヌクレオチドで修飾された金ナノ粒子プローブを使用することを伴う。例えば、そのような方法の１つは本明細書にその全体を援用する特許文献４に記載されている。典型的には、検出される核酸と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合させる。核酸とのハイブリダイゼーションにより形成されたナノ粒子複合体によって、検出可能な変化が生じ、該変化により標的の核酸の存在が示される。核酸を検出する多くの方法は、本明細書にその全体を援用した特許文献５に記載されたようなアレイ基材を利用する。基材を利用すれば、銀染色法を用いて検出可能な変化を増幅することができ、アッセイの感度が著しく増大する。
【０００６】
捕捉用基材上の標的分析物を検出するために、ナノ粒子で標識したプローブ、特に金ナノ粒子プローブを必要とする場合、試料中の極く少量の標的分析物の検出は、ナノ粒子ベースの検出プローブの基材表面上への非特異的結合に起因する比較的高いバックグラウンドのシグナルによって、複雑になる可能性がある。同様に、比較的低濃度の標的分析物に関連する場合、ナノ粒子で標識された検出プローブが基材表面上に固定化されていないことが、試料中に標的分析物が存在しないことに起因するのか、または基材表面の調製上の不具合に起因するのかを確かめることが望ましいであろう。したがって、ナノ粒子ベースの検出系におけるバックグラウンド・ノイズのレベルを除去または実質的に低減させる基材および製造方法が、非常に望ましいであろう。また、異なるバッチの修飾基材のハイブリダイゼーション効率（故に、品質）を検出するための陽性対照、および異なる大きさのＤＮＡ修飾ナノ粒子プローブを用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の角度変化技法により標的を検出するための陽性対照などの、基材表面にナノ粒子を直接固定化する方法は、上記の方法を含むいくつかの検出方法において有用であろう。
【０００７】
本発明は、これらの目的を満たすかまたはこれらの目的に近づくことに向けた重要な進展について述べる。
【特許文献１】国際公開第０１／４６２１４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０１／４６２１３号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０１／４６４６４号パンフレット
【特許文献４】国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ００／１７５０７号
【特許文献５】米国特許出願公開第２００４／００７２２３１号明細書
【非特許文献１】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２２巻、ｐ．５４５６〜５４６５（１９９４年）
【非特許文献２】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２４巻、ｐ．３０４０〜３０４７（１９９６年）
【非特許文献３】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２４巻、ｐ．３０３１〜３０３９（１９９６年）
【非特許文献４】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２７巻、ｐ．１９７０〜１９７７（１９９９年）
【非特許文献５】Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ、第３８巻、第９号、ｐ．１２９７（１９９９年）
【非特許文献６】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２８０巻、ｐ．１４３〜１５０（２０００年）
【非特許文献７】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２９巻、ｐ．９５５〜９５９（２００１年）
【非特許文献８】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２９巻、第１３号ｅ６９（２００１年）
【非特許文献９】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２８巻、第１３号Ｅ７１（２０００年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、分子が固定化された基材を製造する方法および基材を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、煩雑な合成工程が不要で、表面への装荷密度が高く、かつ再現性がより高く事前の表面修飾が不要な、未修飾のガラス表面またはポリマー基材などの基材表面の上にオリゴヌクレオチドまたはタンパク質などの分子を結合させる方法に関する当該分野における必要性を満たすものである。ＤＮＡなどの分子（標識されたものまたは未標識のもの）の３’または５’末端のいずれかを以下に記載のようにシリル化することが可能であり、次いで、この３’または５’シリル化ＤＮＡを、ハイブリダイゼーション・アッセイに使用される事前洗浄したガラス表面などの表面に直接共有結合させることができる（スキーム）。さらに、ある種のシリル化試薬を用いることにより現在では、複数の分子を結合させた修飾シリル化試薬を用いることによって表面への装荷密度をさらに増大させることが可能である。さらに、ある種のシリル化試薬を、遊離アミノ基を有するポリマーなどのスペーサー分子および架橋分子と併用すれば、ナノ粒子ベースの検出システムに使用するのに非常に適した基材を製造することが可能である。したがって本発明は、基材上に分子を結合させる新規な方法、係る方法によって製造されたデバイス、および組成物を提供する。該方法は簡素さ、コスト、速さ、安全性および再現性の点で現在の技術にまさる大きな利点を提供する。
【００１０】
したがって、本発明の１実施形態では、標的分析物検出において使用される基材を製造する方法が提供される。該方法は、（ａ）表面を有する基材を提供する工程と、（ｂ）前記表面を、
Ｓｉ（ＮＣＹ）４；
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−ＮＣＹ                                ｉ；
［（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ］２−Ｓｉ（ＮＣＹ）２  ｖｉ；および
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ−Ｓｉ（ＮＣＹ）３        ｉｖ；
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）
から成る群から選択されるイソシアネート化合物に接触させて、遊離イソシアネート基を含んだ表面を提供する工程と、から成る。
【００１１】
本発明の別の実施形態では、標的分析物の検出に使用される基材を製造する方法が提供される。該方法は、（ａ）表面を有する基材を提供する工程と、（ｂ）前記表面を、
Ｓｉ（ＮＣＹ）４；
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−ＮＣＹ                              ｉ；
［（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ］２−Ｓｉ（ＮＣＹ）２  ｖｉ；および
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ−Ｓｉ（ＮＣＹ）３      ｉｖ；（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フ
ェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）
から成る群から選択されるイソシアネート化合物に接触させて、遊離イソシアネート基を含んだ表面を提供する工程と、（ｃ）遊離イソシアネート基を含む前記表面をスペーサー分子に接触させて、遊離アミノ基を含む表面を提供する工程と、（ｄ）遊離アミノ基を含む前記表面をリンカー分子に接触させて、反応性遊離基を有する反応性表面を提供する工程と、から成る。
【００１２】
この実施形態の１態様では、工程（ｃ）および（ｄ）は１回または複数回繰り返されてよい。
この実施形態の別の態様では、該方法は、工程（ｄ）の後に、（ｅ）標的分析物に特異的な少なくとも１種類の捕捉プローブに前記反応性表面を接触させて、捕捉プローブが固定化された表面を提供する工程と、（ｆ）捕捉プローブが固定化された前記表面をキャッピング剤に接触させて、表面の、捕捉プローブが固定化されていない領域上に未反応で残存している遊離イソシアネート基をブロッキングし、かつキャッピング剤と接触しない表面に比べてナノ粒子の非特異的結合に起因するバックグラウンド・シグナルが実質的に低い基材を生産する工程とをさらに含む。
【００１３】
本発明のこの実施形態の別の態様では、該方法は、（ｉ）標的分析物に特異的な少なくとも１種類の捕捉プローブに前記反応性表面を接触させて、捕捉プローブが固定化された表面を提供する工程と、（ｉｉ）捕捉プローブが固定化された前記表面をキャッピング剤に接触させて、表面の、捕捉プローブが固定化されていない領域上に未反応で残存している遊離イソシアネート基をブロッキングし、かつキャッピング剤と接触しない表面に比べてナノ粒子の非特異的結合に起因するバックグラウンド・シグナルが実質的に低い基材を生産する工程とをさらに含む。
【００１４】
本発明の別の実施形態では、標的分析物の検出において使用される基材を製造する方法が提供される。該方法は、（ａ）表面を有する基材を提供する工程と、（ｂ）前記表面を、
Ｓｉ（ＮＣＹ）４；
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−ＮＣＹ                                ｉ；
［（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ］２−Ｓｉ（ＮＣＹ）２  ｖｉ；および
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ−Ｓｉ（ＮＣＹ）３        ｉｖ；
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）から成る群から選択されるイソシアネート化合物に接触させて、遊離イソシアネート基を含んだ表面を提供する工程と、（ｃ）遊離イソシアネート基を含む前記表面を水に接触させて、遊離アミノ基を含む表面を提供する工程と、（ｄ）
遊離アミノ基を含む前記表面をリンカー分子に接触させて、反応性遊離基を有する反応性表面を提供する工程と、から成る。
【００１５】
本発明のこの実施形態の１態様では、該方法は、工程（ｄ）の後に、（ｅ）遊離イソシアネート基を含む前記表面をスペーサー分子に接触させて、遊離アミノ基を含む表面を提供する工程と、（ｆ）遊離アミノ基を含む前記表面をリンカー分子に接触させて、反応性遊離基を有する反応性表面を提供する工程とをさらに含む。
【００１６】
本発明の１態様では、工程（ｅ）および（ｆ）は１回または複数回繰り返されてよい。
本発明のこの実施形態の別の態様では、該方法は、（ｉ）標的分析物に特異的な少なくとも１種類の捕捉プローブに前記反応性表面を接触させて、捕捉プローブが固定化された表面を提供する工程と、（ｉｉ）捕捉プローブが固定化された前記表面をキャッピング剤に接触させて、表面の、捕捉プローブが固定化されていない領域上に未反応で残存している遊離イソシアネート基をブロッキングし、かつキャッピング剤と接触しない表面に比べてナノ粒子の非特異的結合に起因するバックグラウンド・シグナルが実質的に低い基材を生産する工程とをさらに含む。
【００１７】
本発明のさらに別の実施形態では、標的分析物の検出において使用される基材を製造する方法が提供される。該方法は、（ａ）表面を有する基材を提供する工程と、（ｂ）前記表面を、
Ｓｉ（ＮＣＹ）４；
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−ＮＣＹ                              ｉ；
［（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ］２−Ｓｉ（ＮＣＹ）２  ｖｉ；および
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ−Ｓｉ（ＮＣＹ）３      ｉｖ；（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）から成る群から選択されるイソシアネート化合物に接触させて、遊離イソシアネート基を含んだ表面を提供する工程と、（ｃ）遊離イソシアネート基を含む前記表面をスペーサー分子に接触させて、遊離アミノ基を含む表面を提供する工程と、（ｄ）遊離アミノ基を含む前記表面をリンカー分子に接触させて、反応性遊離基を有する反応性表面を提供する工程と、（ｅ）標的分析物に特異的な少なくとも１種類の捕捉プローブに前記反応性表面を接触させて、捕捉プローブが固定化された表面を提供する工程と、（ｆ）捕捉プローブが固定化された前記表面をキャッピング剤に接触させて、未反応で残存している遊離イソシアネート基をブロッキングし、かつキャッピング剤と接触しない表面に比べてナノ粒子の非特異的結合に起因するバックグラウンド・シグナルが実質的に低い基材を生産する工程と、から成る。
【００１８】
基材を製造する上記方法のいずれにおいても、イソシアネート化合物は、２−トリメトキシシラン−６−トリイソシアナトシランウレアベンゼン、３−（トリエトキシシリル）プロピルイソシアネート）およびテトライソシアナトシランから成る群から選択され得る。
【００１９】
スペーサー分子は複数の官能基を提供する分子構造を有する任意の物質で有り得る。１実施形態では、該スペーサー分子は、先に表面に結合させた遊離イソシアネート基と反応
し得る少なくとも１つの第１の官能基と；後で別のスペーサー分子または捕捉プローブに結合させることが可能な架橋分子に結合するための少なくとも１つの第２の官能基と；負電荷を提供する少なくとも１つの任意選択の第３の官能基とを含む。第１および第２の官能基はいずれも、イソシアネートなどの反応性官能基と反応し得る任意の適切な求核基である。求核基の例には、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨおよび−ＮＨ２が挙げられる。任意選択の第３の官能基にはカルボキシレート基が挙げられる。第１および第２の官能基は遊離アミノ基であることが好ましい。
【００２０】
スペーサー分子は多数の異なる種類のポリマー、好ましくは複数の官能基を組み込んだポリマーを含み得る。このような種類のポリマーの代表例には、限定するものではないが、ポリ（ダイマー酸コアルキルポリアミン）−９５、ポリ（ダイマー酸コアルキルポリアミン）−１４０、ポリ（アリルアミン）、およびジアミン末端ポリ（ｍ−キシレンジアミン−エピクロロヒドリン、および第０世代ＰＡＭＡＭデンドリマーが挙げられる。ポリマーの種類には、限定するものではないが、糖質類および多糖類が挙げられる。代表例にはネオマイシンがある。他のスペーサー分子には、指定の機能性を提供する低分子量の化合物が含まれる。好適な例としては３，３’−ジアミノベンジジンおよびトリス（２−アミノエチルアミン）が挙げられる。
【００２１】
反応性部分を不活性化する任意の適切なキャッピング剤を使用してよい。キャッピング剤の例には、アミノ酸、タンパク質、糖質、カルボン酸塩、チオール、アルコールおよびアミンが挙げられる。限定するものではないが、代表例にはグリシンがある。
【００２２】
限定するものではないが、イソシアネート化合物の代表例にはフェニレン１，４−ジイソシアネート、トリレン−２，６−ジイソシアネート、トリレン−α，４−ジイソシアネート、およびイソホロンジイソシアネートが挙げられる。
【００２３】
リンカー分子の非限定的な例には、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート、スベリン酸ジスクシンイミジル、１，６−ジイソシアナトヘキサン、メチレンビス−（４−シクロヘキシルイソシアネート）、グルタルジアルデヒド、メチレン−ｐ−フェニルジイソシアネートおよびクエン酸トリエチルが挙げられる。
【００２４】
任意の適切な基材が上記方法において使用されてよい。該基材はヒドロキシル基、アミノ基およびカルボキシレート基などの、イソシアネート化合物と反応する少なくとも１つの基を含むことが好ましい。
【００２５】
本発明のさらに別の実施形態では、標的分析物の検出に使用される基材が提供される。該基材は上記方法のいずれかによって修飾された表面を備える。
本発明のさらに別の実施形態では、基材は前記捕捉プローブに結合することが可能な遊離アミノ基と、負に帯電したイオン基とから成るポリマー層を有する表面を含む。
【００２６】
本発明の別の態様では、基材表面は、可視光または蛍光を用いて画像化するときに、前記ポリマー層を有していない基材に比べてバックグラウンド・シグナルが実質的に低減されたバックグラウンド・シグナルを生じる。
【００２７】
本発明のまたさらに別の態様では、基材は１．４００〜＿１．９００の屈折率を有する。
本発明の別の実施形態では、標的分析物を検出するキットが提供される。該キットは上記基材および上記方法によって製造された基材のいずれかを含む。
【００２８】
本発明の別の実施形態では、試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する１または複
数の標的分析物を検出する方法が提供される。該方法は、（ａ）本発明の方法のいずれか１つによって製造された基材であって、その表面に少なくとも１種類の捕捉プローブが固定化されており、各種類の捕捉プローブが標的分析物に特異的であることを特徴とする基材を提供する工程と、（ｂ）標的分析物に特異的な検出体プローブとナノ粒子とを含んでなる少なくとも１種類の検出用プローブを提供する工程と、（ｃ）捕捉プローブおよび検出体プローブが特異的標的分析物に結合するのに有効な条件下で、捕捉プローブ、検出用プローブおよび試料を接触させて、基材の表面上に固定化複合体を形成する工程と、（ｄ）基材の表面を洗浄して、結合していないナノ粒子を除去する工程と、（ｅ）前記標的分子の有無の指標としての前記複合体の有無を観察する工程と、から成る。
【００２９】
本発明の別の実施形態では、表面上にナノ粒子を固定化する方法が提供され、該方法は、（ａ）表面を有する基材と、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子であって、該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分がナノ粒子と結合していない末端に遊離アミン基を有することを特徴とするナノ粒子とを提供する工程と、（ｂ）前記ナノ粒子を、式ｉ
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−ＮＣＹ                    ｉ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）を有する薬剤に接触させて、反応性中間体を形成させる工程と、（ｂ）前記反応性中間体を前記表面と接触させて、前記表面上に前記分子を固定化する工程とから成る。
【００３０】
この実施形態の１態様では、表面はガラス表面である。
この実施形態の別の態様では、該表面は反応性中間体と反応する少なくとも１つの基を有する。基の代表例にはヒドロキシル基、アミノ基またはカルボキシレート基が挙げられる。薬剤の非限定的な例には、３−（イソシアナトプロピル）トリエトキシシランまたは３−（イソシアナトプロピル）ジメチルモノエトキシシランが挙げられる。
【００３１】
この実施形態の別の態様では、オリゴヌクレオチドは、チオ酸、アルキルチオールまたはジスルフィド基（例えば、エピアンドロステロンジスルフィド）などの官能性部分を介してナノ粒子と結合され得る。
【００３２】
本発明の別の実施形態では、表面上にナノ粒子を固定化する方法が提供される。該方法は、（ａ）アミン基と反応する反応性部分を含んだ表面を有する基材と、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子であって、該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分がナノ粒子と結合していない末端にアミン基を有することを特徴とするナノ粒子とを提供する工程と、（ｂ）前記ナノ粒子に前記反応性部分を接触させて、前記表面上に前記ナノ粒子を固定化する工程とから成る。
【００３３】
この実施形態の１態様では、表面はガラス表面である。
この実施形態の別の態様では、表面は反応性中間体と反応する少なくとも１つの基を有する。基の代表例にはヒドロキシル基、アミノ基またはカルボキシレート基が挙げられる。薬剤の非限定的な例には３−（イソシアナトプロピル）トリエトキシシランまたは３−（イソシアナトプロピル）ジメチルモノエトキシシランが挙げられる。
【００３４】
別の態様では、オリゴヌクレオチドは、チオ酸、アルキルチオールまたはジスルフィド基（例えば、エピアンドロステロンジスルフィド）などの官能性部分を介してナノ粒子と
結合され得る。
【００３５】
別の態様では、反応性部分はイソシアネート類、無水物類、ハロゲン化アシル類またはアルデヒド類を含む。
本発明の別の実施形態では、修飾基材を製造するためのキットが提供される。該キットは、分子をシリル化するための任意の試薬と、任意の基材、洗浄工程および結合工程を含むアッセイを実行するための緩衝液を含み得る。
【００３６】
本発明の別の実施形態では、表面上に分子を固定化する方法が提供され、該方法は、
（ａ）前記分子を、式ｉ：
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−ＮＣＹ                      ｉ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）を有する薬剤に接触させて、反応性中間体を形成する工程と、
（ｂ）前記反応性中間体を前記表面と接触させて、前記表面上に前記分子を固定化する工程とから成る。
【００３７】
この実施形態の１態様では、ガラス表面に分子を固定化する方法が提供される。
本発明の別の実施形態では、表面上に分子を固定化する方法が提供され、該方法は、
（ａ）Ｓｉ（ＮＣＹ）４（式中、Ｙは酸素または硫黄を表す）を、式ｉｉ：
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ                    ｉｉ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｚはヒドロキシ基またはアミノ基を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）を有する薬剤に接触させて、第１の反応性中間体を形成する工程と、
（ｂ）第１の反応性中間体を分子に接触させて、第２の反応性中間体を形成する工程と、
（ｃ）前記第２の反応性中間体を前記表面に接触させて、前記表面上に前記分子を固定化する工程と、から成る。該方法により、表面上に分岐状のオリゴヌクレオチドなどの捕捉された分岐状分子の構造体を生成させることが可能となり、これは核酸などの標的分析物の検出を増強するのに有用である。
【００３８】
本発明のこの実施形態の１態様では、ガラス表面上に分子を固定化する方法が提供される。
本発明の別の実施形態では、式ｉｉｉ：
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−ＮＨＣＹＬ−Ｍ              ｉｉｉ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含
む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｌはリンカー基を表し、Ｍは分子を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）を有する化合物が提供される。
【００３９】
本発明の別の実施形態では、式ｉｖ：
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ−Ｓｉ（ＮＣＹ）３    ｉｖ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）を有する化合物が提供される。
【００４０】
本発明の別の実施形態では、式ｖ：
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ−Ｓｉ（ＮＨＣＹＬ−Ｍ）３    ｖ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｌはリンカー基を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表し、Ｍは分子を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）を有する化合物が提供される。
【００４１】
本発明の別の実施形態では、式ｖｉ：
（（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ）２−Ｓｉ（ＮＣＹ）２    ｖｉ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）を有する化合物が提供される。
【００４２】
本発明の別の実施形態では、式ｖｉｉ：
（（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ）２Ｓｉ（ＮＨＣＹＬ−Ｍ）２
ｖｉｉ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｌはリンカー基を表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表し、Ｍは分子を表す。ただし、
Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）を有する化合物が提供される。
【００４３】
本発明のこれらおよび他の実施形態は以下の詳細な説明から明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
本明細書において引用した特許文献、特許出願明細書および参照文献すべての全容を本明細書に援用する。
本明細書で定義される「分子」という用語は、基材の表面上に固定化され得る、所望の特異的結合メンバーなどの任意の所望の物質を指す。本明細書で定義される「特異的結合メンバー」とは、対応結合対のいずれかのメンバーを意味する。本明細書で定義される「対応結合対」とは、一般にイオンの引力、水素結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用等の非共有結合性相互作用を介して相互に特異的に結合する、任意のリガンドと受容体との組み合わせである。例示的な対応結合対および相互作用は当技術分野では周知であり、例示であって限定するものではないが、抗体またはＦａｂフラグメントとその抗原、ハプテンまたは抗原決定基との間の免疫学的相互作用；タンパク質（例えば、ホルモンまたは酵素）とその受容体（例えば、アビジンまたはストレプトアビジンおよびビオチン）との間の、あるいは糖質とレクチンとの間の生化学的相互作用；例えば金属とキレート剤との間の化学的相互作用；ならびに核酸の相補的な鎖の間の核酸塩基対合；ペプチド核酸類似体であって核酸または他のＰＮＡと対応結合対を形成するものが挙げられる。したがって、分子は、抗原と抗体の特異的結合対、ビオチンとアビジンの結合対、糖質とレクチンの結合対、相補的ヌクレオチド配列、相補的ペプチド配列、エフェクタ分子および受容体分子、酵素補因子および酵素、ならびに酵素阻害剤および酵素から成る群から選択される特異的結合メンバーで有り得る。他の特異的結合メンバーには、限定するものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、抗体、抗原、糖質、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖質、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬物、ウイルス、多糖類、脂質、リポ多糖類、糖タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、免疫グロブリン、アルブミン、ヘモグロビン、凝固因子、ペプチドホルモンおよびタンパク質ホルモン、非ペプチドホルモン、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、腫瘍特異的抗原決定基を含んだペプチド、細胞、細胞表面分子、微生物、微生物の断片、一部、成分または微生物による産物、有機小分子、核酸およびオリゴヌクレオチド、これらの物質のいずれかの代謝産物、あるいはこれらの物質のいずれかに対する抗体が挙げられる。核酸およびオリゴヌクレオチドは、遺伝子、ウイルスＲＮＡおよびＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、真菌ＤＮＡ、哺乳類ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ断片およびＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖核酸および二本鎖核酸、天然核酸および合成核酸、ならびにアプタマーを含む。抗体およびオリゴヌクレオチドの特異的結合メンバーの調製方法は当技術分野では周知である。分子が基材上に固定化され、標的分析物の捕捉プローブとして働いてもよい。分子はフルオロフォアまたはナノ粒子などの検出標識を含んでもよい。分子（Ｍ）は、シリル化剤と結合または反応して基材の表面を修飾するのに有用な反応性シリル化分子を形成することができる、少なくとも１つ以上の求核基、例えば、アミノ基、カルボキシレート基またはヒドロキシル基を有する。これらの求核基は基材の表面上でイソシアネート基および架橋分子などの反応性部分と反応することもできる。これらの求核基は分子上に既存のものであるか、または既知の化学的方法によって導入される。
【００４５】
用語「標識」または「検出標識」とは、光学的手段、電気的手段、光電子的手段、磁気的手段、重力による手段、音響学的手段、酵素的手段あるいは他の物理的または化学的手段によって検出することのできる検出可能なマーカーを指す。
【００４６】
「スペーサー分子」という用語は、複数の官能基を提供する分子構造を有する任意の物
質であり得る。１実施形態では、スペーサー分子は、先に表面に結合させた遊離イソシアネート基と反応し得る少なくとも１つの第１の官能基と、後で別のスペーサー分子または捕捉プローブに結合させることができる架橋分子に結合するための少なくとも１つの第２の官能基と、負電荷を提供する少なくとも１つの任意選択の第３の官能基を含む。第１および第２の官能基はいずれも、イソシアネートなどの反応性官能基と反応し得る任意の適切な求核基である。求核基の例には、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ−およびＮＨ２がある。任意選択の第３の官能基にはカルボキシレート基がある。第１および第２の官能基は遊離アミノ基であることが好ましい。スペーサー分子は、基材の表面上のイソシアネート基などの反応性部分またはリンカー分子と結合または反応することができる複数の１種類以上の求核基、例えば、アミノ基、カルボキシレート基またはヒドロキシル基を有する、ポリマー、糖質、抗生物質などの物質に関連し得る。
【００４７】
スペーサー分子には多数の異なる種類のポリマー；好適には複数の官能基を組み入れたポリマーが含まれうる。このような種類のポリマーの代表例には、限定するものではないが、ポリ（ダイマー酸コアルキルポリアミン）−９５、ポリ（ダイマー酸コアルキルポリアミン）−１４０、ポリ（アリルアミン）、およびジアミン末端ポリ（ｍ−キシレンジアミン−エピクロロヒドリン、および第０世代ＰＡＭＡＭデンドリマーが挙げられる。ポリマーの種類には、限定するものではないが、糖質および多糖類も挙げられる。代表例にはネオマイシンがある。他のスペーサー分子には指定の機能性を提供する低分子量の化合物がある。好適な例には３，３’−ジアミノベンジジンおよびトリス（２−アミノエチルアミン）が挙げられる。「キャッピング剤」という用語は、捕捉プローブを基材表面上にプリントまたは結合した後に、基材表面の領域上に存在し得る反応性部分を不活性化する物質を指す。捕捉プローブを結合する直前に、遊離アミノ基を有する表面を、一方の官能基が遊離アミノ基と反応する二官能性の架橋分子で処理してもよい。該架橋分子の他方の官能基は、捕捉プローブに直接的または間接的に結合するのに利用することができる。捕捉プローブの結合後に何らかの反応性官能基が残っていることは、これらの基が標的分子または検出標識と反応または結合して相当のバックグラウンド・ノイズを発生させる恐れがあるので、一般に望ましくない。したがって、反応せずに残っている全ての反応性部分は一般に、標的検出のために基材を使用する前に不活性化される。キャッピング剤の例にはアミノ酸、タンパク質、糖質、カルボキシレート、チオール、アルコールおよびアミンが挙げられる。限定するものではないが、代表例にはグリシンがある。
【００４８】
「架橋分子（クロスリンカー分子）」、「リンカー分子」または「リンカー化合物」という用語は、種々の物質の間、またはある物質と基材表面との間の橋または連結体として働く分子を指す。１実施形態では、リンカー分子は、スペーサー分子と基材上の遊離ヒドロキシル基、アミノ基またはカルボキシレート基との間の結合などの少なくとも２つの共有結合を形成することができる。リンカー分子の非限定的な例には、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）、スベリン酸ジスクシンイミジル、１，６−ジイソシアナトヘキサン、メチレンビス−（４−シクロヘキシルイソシアネート）、グルタルジアルデヒド、メチレン−ｐ−フェニルジイソシアネートおよびクエン酸トリエチルが挙げられる。
【００４９】
本明細書において定められるように、「基材」という用語はオリゴヌクレオチドおよび他の分子を固定化するのに適した任意の固体支持体を指し、当技術分野では周知である。これらにはナイロン、ニトロセルロース、活性化アガロース、ジアゾ化セルロース、ラテックス粒子、プラスチック、ポリスチレン、ガラスおよびポリマーで被覆された表面がある。これらの固体支持体は、メンブレン、マイクロタイタープレート、ビーズ、プローブ、ディップスティック、光ファイバ等の多数の形式で使用される。本発明の背景として特に興味深いのは、近年報告された（ラムゼイ（Ｒａｍｓａｙ）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第１６巻：ｐ．４０〜４４（１９９８年））ＤＮＡマイクロアレイの製造にお
いてガラスおよびナイロンの表面を使用することである。Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ誌はマイクロアレイの実用性および限界について述べた特別補遺を発行した（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第２１巻第１号：ｐ．１〜６０（１９９９年））。本願にその全体を援用した米国特許第６８０７３５２号明細書に記載されたものなどの光学基材も興味深い。典型的には、固体支持体を使用するには、求核基と反応することができる「反応基」を含んだ本発明のシリル化分子と反応させるための、求核基が存在することが必要となる。適切な求核基または求核部分には、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基およびアミノ基または本発明のシリル化分子と結合することのできる任意の部分が挙げられる。固体支持体の上に求核基または反応基を導入する化学的手法は当技術分野では周知であり、ナイロン（米国特許第５５１４７８５号）、ガラス（ロジャースら（Ｒｏｄｇｅｒｓ  ｅｔ
ａｌ．）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２３〜３０頁（１９９９年））、アガロース（ハイスミスら（Ｈｉｇｈｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第１２巻：４１８〜４２３頁（１９９２年））およびポリスチレン（ゴシュら（Ｇｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、第１５巻：５３５３〜５３７２頁（１９８７年））を活性化するための手法が含まれる。好適な基材はガラスである。
【００５０】
基材は多孔性または無孔性の表面を有し得る。本明細書に定めるように、用語「多孔性」表面とは該表面が拡散を生じさせること意味する。用語「無孔性」表面とは該表面が拡散を生じさせないことを意味する。
【００５１】
本明細書で用いられる「分析物」または「標的分析物」という用語は、本発明の方法によって製造した基材またはデバイスを用いて試験試料中に定量または検出される物質である。分析物は、天然の特異的結合メンバー（例えば、抗体、ポリペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞、ウイルス等）が存在するか、または特異的結合メンバーを調製することができる任意の物質であってよく、該分析物はアッセイにおいて１つまたは複数の特異的結合メンバーに結合することができる。
【００５２】
本発明の１実施形態では、基材表面上に分子を固定化する方法が提供され、該方法は、分子を、式ｉ：
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−ＮＣＹ                ｉ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）を有する薬剤に接触させて反応性中間体を形成する工程と、該反応性中間体を前記表面に接触させて、前記表面上に該分子を固定化する工程とから成る。
【００５３】
実際には、分子を溶液中で薬剤と接触させる。一般には、分子を溶解して溶液とし、この分子溶液に薬剤を液滴として添加する。限定するものではないが、該溶液を調製する際に使用される溶媒の好適な例には、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、エタノール、およびＤＭＳＯ／エタノールなどの溶媒混合物が挙げられる。好適な溶媒はエタノールである。水は分子の効果的な修飾に干渉する恐れがあるので、水を反応溶媒から除外することが好ましい。しかし、溶液中の分子の溶解性を高めるために水が必要な場合、水の量は一般に約０．１％〜約１％、通常は１％以下である。
【００５４】
薬剤に対する分子の量は一般に、約１〜約１．５モル等量、典型的には約１〜約１．１モル等量、好適には約１〜約１モル等量の範囲である。反応は任意の適切な温度で実施す
ればよい。一般に、この温度は約０℃〜約４０℃、好適には約２０℃〜約２５℃である。十分な量の分子および薬剤が反応して反応性中間体を形成するまで、この反応をある時間の間攪拌する。該反応性中間体は式ｉｉｉによって定められた構造を有する。
【００５５】
この後、反応性中間体を含んだ反応溶液を次いで濃縮し、所望の溶媒に溶解してスポッティング溶液を得、次いで該溶液を基材の表面に塗布する。該反応性中間体をスポッティング溶液として塗布する。スポッティング溶液を調製するために、任意の適切な溶媒を用いることができる。スポッティング溶液の調製に使用するのに適した溶媒の例には、限定するものではないが、ＤＭＦ、ＤＭＳＯおよびエタノールのほか、ＤＭＦ／ピリジンなどの任意の適切な溶媒混合物が挙げられる。任意の適切な濃度のスポッティング溶液を調製することができるが、一般にスポッティング溶液の濃度は約１ｍＭである。スポットを作製するために、任意の適切なスポッティング技術を用いてよい。代表的な技術には、限定するものではないが、手作業によるスポティング、米国特許第５２３３３６９号および同第５４８６８５５号に記載のものなどのインクジェット技術；米国特許第５５６７２９４号および同第５５２７６７３号に記載のものなどのアレイ・ピンまたはキャピラリー・チューブ；マイクロスポッティング・ロボット（例えば、カルテシアン社（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ）から市販）；チップメーカー（商標）マイクロスポッティング装置（例えば、テレケム・インターナショナル社（ＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒａｔｉｏｎａｌ）から市販）が挙げられる。ＡｒｒａｙＩｔ（登録商標）チップメーカー３スポッティング装置などの、適切なスポッティング装置およびプロトコルが市販されている。該スポッティング技術を用いて、単一のスポットまたは複数のスポットを任意の適切な離散パターンまたはアレイ状に作製することができる。
【００５６】
好適な実施形態では、薬剤はトリエトキシシリルイソシアネートである。好適な分子は核酸である。
本発明の別の実施形態では、基材表面上に分子を固定化する方法が提供され、該方法は、Ｓｉ（ＮＣＹ）４を、式ｉｉ：
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ                ｉｉ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚはヒドロキシ基またはアミノ基を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）を有する薬剤に接触させて第１の反応性中間体を形成する工程と、該第１の反応性中間体を分子に接触させて、第２の反応性中間体を形成する工程と、該第２の反応性中間体を前記表面に接触させて、分子を前記表面上に固定化する工程とから成る。
【００５７】
本発明のこの実施形態では、該方法は、分岐状の分子で基材表面を修飾して、基材表面の分子装荷量を増大させる。これらの分岐状の分子はデンドリマー様の挙動をしてアッセイの性能の感度を増強する。実際には、Ｓｉ（ＮＣＯ）４またはＳｉ（ＮＣＳ）４のいずれかを式ｉｉの化合物と反応させて、式ｉｖ：
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ−Ｓｉ（ＮＣＹ）３        ｉｖ；
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選
択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）を有する第１の反応性中間体を形成する。
【００５８】
一般的には、Ｓｉ（ＮＣＯ）４またはＳｉ（ＮＣＳ）４を上記のような適切な乾燥溶媒に溶解する。実際には、エタノールが好適な溶媒である。得られたエタノール溶液を反応フラスコに入れ、式ｉｉの化合物の溶液を該反応フラスコに加える。この式ｉｉの溶液は上記のような乾燥溶媒のいずれかを含み得る。実際には、エタノールが好適な溶媒である。反応温度は一般に、約０℃〜約４０℃、好適には約２２℃である。該反応混合物を約１分〜約６０分、通常は約５分〜約１０分間、完了するまで攪拌する。Ｓｉ（ＮＣＯ）４またはＳｉ（ＮＣＳ）４の、式ｉｉの化合物に対するモル量は一般に、約３：１〜１：１、好適には１：１である。
【００５９】
この後、分子を第１の反応性中間体に接触させて、式ｖ：
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ−Ｓｉ（ＮＨＣＹＬ−Ｍ）３ 
ｖ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｌはリンカー基を表し、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表し、Ｍは分子を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）を有する第２の反応性中間体を形成する。リンカー基Ｌは、前記分子に元々存在するかまたは化学的に付加された、アミノ基、スルフヒドリル基、ヒドロキシ基、カルボキシレート基または任意の適切な部分などの求核剤であり得る。Ｌは−ＮＨ、−Ｓ−、−Ｏ−または−ＯＯＣ−を表し得る。
【００６０】
該分子を溶液中で第１の反応性中間体に接触させる。一般には、該分子を溶媒に溶解し、第１の反応性中間体を入れた反応フラスコに液滴として添加する。一般に、上記のような任意の適切な溶媒中で該分子を混合する。第１の反応性中間体に対する分子のモル量は一般に、約１〜約１０、典型的には約１〜約３、好適には約１〜約４である。反応は任意の適切な温度で実施すればよい。一般に、この温度は約０℃〜約４０℃、好適には約２０℃〜約２５℃である。十分な量の分子および第１の反応性中間体が反応して第２の反応性中間体を形成するまで、この反応をある時間の間攪拌する。一般に、過剰な量の分子を用いて第１の反応性中間体と反応させる。実際には、一般に少なくとも３等量の分子と１等量の第１の反応性中間体とを用いる。
【００６１】
この後、次いで第２の反応性中間体を、上記技術を用いて基材の表面上に塗布する。
この発明の別の態様では、Ｓｉ（ＮＣＯ）４またはＳｉ（ＮＣＳ）４と式ｉｉの化合物との比が約１：２（等量／等量）の場合、式ｖｉ：
（（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ）２−Ｓｉ（ＮＣＹ）２    ｖｉ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含
む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）を有する第１の反応性中間体が形成される。Ｒ１、Ｒ２およびＲ３がメトキシ基を表し、Ｘがフェニルを表し、Ｙが酸素を表し、ＺがＮＨ基を表すことが好ましい。
【００６２】
この後、分子を上記の式ｖｉの第１の反応性中間体と反応させて、式ｖｉｉ：
（（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ）２Ｓｉ（ＮＨＣＹＬ−Ｍ）２
ｖｉｉ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｌはリンカー基を表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表し、Ｍは分子を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）を有する第２の反応性中間体を生成する。リンカー基Ｌは、前記分子に元々存在するかまたは化学的に付加された、アミノ基、スルフヒドリル基、ヒドロキシ基、カルボキシレート基または任意の適切な部分などの求核剤であり得る。Ｌは−ＮＨ、−Ｓ−、−Ｏ−または−ＯＯＣ−を表し得る。一般に、過剰な量の分子を用いて第１の反応性中間体と反応させる。実際には、一般に少なくとも３等量の分子と１等量の第１の反応性中間体とを用いる。
【００６３】
この後、次いで第２の反応性中間体を、上記技術を用いて基材の表面上に塗布する。
本発明の別の実施形態では、式ｉｉｉ：
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−ＮＨＣＹＬ−Ｍ        ｉｉｉ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｌはリンカー基を表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｍは分子を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）を有する化合物が提供される。リンカー基Ｌは、分子に元々存在するかまたは化学的に付加された、アミノ基、スルフヒドリル基、ヒドロキシ基、カルボキシレート基または任意の適切な部分などの求核剤であり得る。Ｌは−ＮＨ、−Ｓ−、−Ｏ−または−ＯＯＣ−を表し得る。好適な実施形態では、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はアルコキシを表し、Ｌは−ＮＨ−を表し、Ｘはプロピルを表し、ＹはＯを表す。該化合物は基材表面を所望の分子で修飾するのに有用である。
【００６４】
本発明の別の実施形態では、式ｉｖ：
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ−Ｓｉ（ＮＣＹ）３      ｉｖ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）を有する化合物が提供される。好適な実施形態では、Ｒ１
、Ｒ２およびＲ３はエトキシまたはメトキシを表し、Ｘはベンジルを表し、Ｙは酸素を表し、ＺはＮＨを表す。該化合物は分子を基材表面に結合させることができるように該分子を修飾するのに有用である。
【００６５】
本発明の別の実施形態では、式ｖ：
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ−Ｓｉ（ＮＨＣＹＬ−Ｍ）３ 
ｖ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｌはリンカー基を表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表し、Ｍは分子を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）を有する化合物が提供される。リンカー基Ｌは、前記分子に元々存在するかまたは化学的に付加された、アミノ基、スルフヒドリル基、ヒドロキシ基、カルボキシレート基または任意の適切な部分などの求核剤であり得る。Ｌは−ＮＨ、−Ｓ−、−Ｏ−または−ＯＯＣ−を表し得る。好適な実施形態では、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はエトキシまたはメトキシを表し、Ｘは３−フェニルまたは４−フェニルを表し、Ｙは酸素を表し、ＺはＮＨを表す。該化合物は分子を基材表面に結合させることができるように該分子を修飾するのに有用である。
【００６６】
本発明の別の実施形態では、試料中の標的分析物を検出するためのデバイスが提供される。該デバイスは、標的分析物に対する特異的結合メンバーである分子が固定化された表面を含み、該表面は上記方法のいずれかによって調製される。好適な表面はガラス表面である。標的分析物の異なる部分、または複数の異なる種類の標的分析物を検出できるように、該表面に１つまたは複数の異なる特異的結合メンバーがアレイ状に結合していてもよい。
【００６７】
本発明の別の実施形態では、キットが提供される。該キットは、上記シリル化剤のいずれかとともに任意選択の基材が入った１つまたは複数の容器と、指示書一式とを含み得る。
【００６８】
本発明は、ナノ粒子を用いた標的分析物の検出に使用される、種々の表面特性（すなわち、多孔性および非多孔性、不浸透性および浸透性）を有する基材表面（例えば、ガラス、プラスチック、金属）を誘導体化することにも関する。特に、基材は典型的には、遊離ヒドロキシル基、アミノ基またはカルボキシレート基、あるいはこれらの組み合わせが結合した表面を有することになる。次いで該基材表面を、シリルアルコキシ基およびシリルイソシアネート基の両方を有するジシリル化合物に接触させる。このジシリル化合物を接触させるということは、シリルアルコキシ基が優先的に基材の表面に接触して、遊離イソシアネート基を有するアンカー分子が提供されるということである。その後のスペーサー分子の結合は、遊離イソシアネート基に反応させることによって可能となる。
【００６９】
次いで、遊離イソシアネート基を提供している基材表面のアンカー基をスペーサー分子と反応させることが可能である；適切なスペーサー分子を付加すれば、所望の表面特性が得られると同時に、追加のスペーサー分子を結合させるための遊離アミノ基が得られる。適切なスペーサー分子は多数の遊離アミノ基から成るものでよく、一部の遊離アミノ基はアンカー分子が提供する遊離イソシアネート基と反応し、その他の遊離アミノ基は追加のスペーサー分子と結合する表面を提供する。この種の好適なスペーサー分子は３，３’−ジアミノベンジジンである。他の適切なスペーサー分子は一般に、多官能性基、特に、ア
ミノ基のほか負に荷電した部分を提供する官能基から成るとよい。適切なスペーサー分子の例はポリマーである。ポリマーの例には、限定するものではないが、ポリ（ダイマー酸コアルキルポリアミン）−９５、ポリ（ダイマー酸コアルキルポリアミン）−１４０、ポリ（アリルアミン）、およびジアミン末端ポリ（ｍ−キシレンジアミン−エピクロロヒドリン、トリス（２−アミノエチルアミン）および第０世代ＰＡＭＡＭデンドリマーが挙げられる。好適なポリマーは、負に荷電した官能基（その一例はカルボン酸）も含んだものである。好適なポリマーの例として、ポリ（ダイマー酸コアルキルポリアミン）−９５およびポリ（ダイマー酸コアルキルポリアミン）−１４０がある。他の適切なスペーサーには炭水化物ポリマー、およびネオマイシンなどの抗生物質がある。
【００７０】
別例として、遊離イソシアネート基を提供しているアンカー基を、任意選択でスペーサー分子と結合させずに水と反応させることも可能である。この水との反応は、遊離イソシアネート基が加水分解を受けて遊離アミノ基を生成するということである。次いで、スペーサー分子の結合を記載したように行うことができる。
【００７１】
リンカー分子は、表面上に提供された遊離アミノ基と反応することが可能な官能基を含み、遊離アミノ基が提供される任意の工程において結合させることができる。本発明によれば、リンカー分子は、標的分析物に特異的な捕捉プローブの結合（すなわち、アレイ作製中）に適した官能基（例えば、カルボン酸、エステル基およびイソシアネート類）を提供する。好適なリンカー分子には、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）、スベリン酸ジスクシンイミジル、１，６−ジイソシアナトヘキサン、メチレンビス−（４−シクロヘキシルイソシアネート）、グルタルジアルデヒド、メチレン−ｐ−フェニルジイソシアネートおよびクエン酸トリエチルが挙げられる。
【００７２】
加水分解されたアンカー基に直接リンカー基を結合させることも可能である。追加のスペーサー分子を結合させて、所望の表面特性を有する基材表面を提供することが好ましい。まずジイソシアネート化合物を遊離アミノ基表面に反応させて遊離イソシアネート基を提供することによって、遊離アミノ基を含んだ任意の表面に追加のスペーサー分子を結合させることができる。好適なジイソシアネート化合物には、フェニレン１，４−ジイソシアネート、トリレン−２，６−ジイソシアネート、トリレン−α，４−ジイソシアネート、およびイソホロンジイソシアネートが挙げられる。次いで、表面上の遊離イソシアネート基と追加のスペーサー分子上の遊離アミノ基との間の反応を介して、追加のスペーサー分子を結合させることができる。結果として本発明に従った表面が得られる任意の数のスペーサー分子を結合させることが意図されるが、好適なスペーサー分子の数は２〜７個である。
【００７３】
リンカー分子を表面に結合させた後、捕捉プローブを結合させるために、基材をアレイ化して表面上の別個の所定領域とする。２種類以上の捕捉プローブを表面に接触させることが可能であり、各種類の捕捉プローブは特定の標的分析物に特異的である。好適な捕捉プローブは核酸である。
【００７４】
本発明の方法の原理上の利点は、多数の種類のアミン結合化合物を３次元的にポリマー層に結合させることが可能であり、従って検出のために表面上で標的のＤＮＡおよびＲＮＡ生体分子を最大限ハイブリダイズさせることができることである。この固定化用のアミン分子は基材表面とは直接接触せず、むしろ基材の表面上を被覆するポリマーと接触する。ガラス表面上のこのコポリマー層は、分子鎖全体にわたってアミン基および酸基の両方を含みアミド結合を備えている。いかなる特定の理論によっても拘束されるものではないが、分子鎖中の酸基は表面への金ナノ粒子プローブの非特異的結合を制御するのに役立ち、ひいてはバックグラウンド・ノイズを最小化するので、本発明のコポリマー被覆によって良好な結果が得られると考えられる。実施例１はポリマーで被覆された基材を製造する
一般的なプロトコルを提供する。
【００７５】
任意の適切な基材を本発明において使用することができる。適切な基材には透明な固体表面（例えば、ガラス、石英、プラスチックおよび他のポリマー）、不透明な固体表面、および導電性固体表面がある。基材は任意の形状または厚さであり得るが、一般には、平坦で薄いものである。スライドガラスなどのガラス基材が好ましい。
【００７６】
本発明の１実施形態では、標的分析物の検出に使用される基材を製造する方法が提供される。該方法は、（ａ）表面を有する基材を提供する工程と、（ｂ）前記表面を、
Ｓｉ（ＮＣＹ）４；
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−ＮＣＹ                              ｉ；
［（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ］２−Ｓｉ（ＮＣＹ）２  ｖｉ；および
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ−Ｓｉ（ＮＣＹ）３      ｉｖ；（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）から成る群から選択されるイソシアネート化合物に接触させて、遊離イソシアネート基を含む表面を提供工程と、から成る。本発明の別の実施形態では、標的分析物の検出に使用される基材を製造する方法が提供される。該方法は、（ａ）表面を有する基材を提供する工程と、（ｂ）前記表面を、
Ｓｉ（ＮＣＹ）４；
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−ＮＣＹ                                ｉ；
［（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ］２−Ｓｉ（ＮＣＹ）２    ｖｉ；および
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ−Ｓｉ（ＮＣＹ）３        ｉｖ；
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）から成る群から選択されるイソシアネート化合物に接触させて、遊離イソシアネート基を含む表面を提供する工程と、（ｃ）遊離イソシアネート基を含む前記表面をスペーサー分子に接触させて、遊離アミノ基を含む表面を提供する工程と、（ｄ）遊離アミノ基を含む前記表面をリンカー分子に接触させて、反応性遊離基を有する反応性表面を提供する工程と、から成る。
【００７７】
この実施形態の１態様では、工程（ｃ）および（ｄ）は１回または複数回繰り返されてよい。
この実施形態の別の態様では、該方法は工程（ｄ）の後に、（ｅ）標的分析物に特異的な少なくとも１種類の捕捉プローブに前記反応性表面を接触させて、捕捉プローブが固定化された表面を提供する工程と、（ｆ）捕捉プローブが固定化された前記表面をキャッピング剤に接触させて、表面の、捕捉プローブが固定化されていない領域上に未反応で残存
している遊離イソシアネート基をブロッキングし、かつキャッピング剤と接触しない表面に比べてナノ粒子の非特異的結合に起因するバックグラウンド・シグナルが実質的に低い基材を生産する工程とをさらに含む。
【００７８】
本発明のこの実施形態の別の態様では、該方法は、（ｉ）標的分析物に特異的な少なくとも１種類の捕捉プローブに前記反応性表面を接触させて、捕捉プローブが固定化された表面を提供する工程と、（ｉｉ）捕捉プローブが固定化された前記表面をキャッピング剤に接触させて、表面の、捕捉プローブが固定化されていない領域上に未反応で残存している遊離イソシアネート基をブロッキングし、かつキャッピング剤と接触しない表面に比べてナノ粒子の非特異的結合に起因するバックグラウンド・シグナルが実質的に低い基材を生産する工程とをさらに含む。
【００７９】
本発明の別の実施形態では、標的分析物の検出において使用される基材を製造する方法が提供される。該方法は、（ａ）表面を有する基材を提供する工程と、（ｂ）前記表面を、
Ｓｉ（ＮＣＹ）４；
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−ＮＣＹ                              ｉ；
［（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ］２−Ｓｉ（ＮＣＹ）２  ｖｉ；および
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ−Ｓｉ（ＮＣＹ）３      ｉｖ；（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）から成る群から選択されるイソシアネート化合物に接触させて、遊離イソシアネート基を含む表面を提供する工程と、（ｃ）遊離イソシアネート基を含む前記表面を水に接触させて、遊離アミノ基を含む表面を提供する工程と、（ｄ）遊離アミノ基を含む前記表面をリンカー分子に接触させて、反応性遊離基を有する反応性表面を提供する工程と、から成る。
【００８０】
本発明のこの実施形態の１態様では、該方法は工程（ｄ）の後に、（ｅ）遊離イソシアネート基を含む前記表面をスペーサー分子に接触させて、遊離アミノ基を含む表面を提供する工程と、（ｆ）遊離アミノ基を含む前記表面をリンカー分子に接触させて、反応性遊離基を有する反応性表面を提供する工程とをさらに含む。
【００８１】
本発明の１態様では、工程（ｅ）および（ｆ）は１回または複数回繰り返されてよい。
本発明のこの実施形態の別の態様では、該方法は、（ｉ）標的分析物に特異的な少なくとも１種類の捕捉プローブに前記反応性表面を接触させて、捕捉プローブが固定化された表面を提供する工程と、（ｉｉ）捕捉プローブが固定化された前記表面をキャッピング剤に接触させて、表面の、捕捉プローブが固定化されていない領域上に未反応で残存している遊離イソシアネート基をブロッキングし、かつキャッピング剤と接触しない表面に比べてナノ粒子の非特異的結合に起因するバックグラウンド・シグナルが実質的に低い基材を生産する工程とをさらに含む。
【００８２】
本発明のさらに別の実施形態では、標的分析物の検出において使用される基材を製造する方法が提供される。該方法は、（ａ）表面を有する基材を提供する工程と、（ｂ）前記表面を、
Ｓｉ（ＮＣＹ）４；
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−ＮＣＹ                                ｉ；
［（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ］２−Ｓｉ（ＮＣＹ）２    ｖｉ；および
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ−Ｓｉ（ＮＣＹ）３      ｉｖ；（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）から成る群から選択されるイソシアネート化合物に接触させて、遊離イソシアネート基を含む表面を提供する工程と、（ｃ）遊離イソシアネート基を含む前記表面をスペーサー分子に接触させて、遊離アミノ基を含む表面を提供する工程と、（ｄ）遊離アミノ基を含む前記表面をリンカー分子に接触させて、反応性遊離基を有する反応性表面を提供する工程と、（ｅ）標的分析物に特異的な少なくとも１種類の捕捉プローブに前記反応性表面を接触させて、捕捉プローブが固定化された表面を提供する工程と、（ｆ）捕捉プローブが固定化された前記表面をキャッピング剤に接触させて、未反応で残存している遊離イソシアネート基をブロッキングし、かつキャッピング剤と接触しない表面に比べてナノ粒子の非特異的結合に起因するバックグラウンド・シグナルが実質的に低い基材を生産する工程と、から成る。
【００８３】
基材を製造する上記方法のいずれにおいても、イソシアネート化合物は、２−トリメトキシシラン−６−トリイソシアナトシランウレアベンゼン、３−（トリエトキシシリル）プロピルイソシアネート）およびテトライソシアナトシランから成る群から選択され得る。
【００８４】
スペーサー分子は複数の官能基を提供する分子構造を有する任意の物質で有り得る。１実施形態では、スペーサー分子は、表面に先に結合させた遊離イソシアネート基と反応し得る少なくとも１つの第１の官能基と；後で別のスペーサー分子または捕捉プローブに結合させることが可能な架橋分子に結合させるための少なくとも１つの第２の官能基と；負電荷を提供する少なくとも１つの任意選択の第３の官能基とを含む。第１および第２の官能基はいずれも、イソシアネートなどの反応性官能基と反応し得る任意の適切な求核基である。求核基の例には、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ−および−ＮＨ２が挙げられる。任意選択の第３の官能基にはカルボキシレート基が挙げられる。第１および第２の官能基は遊離アミノ基であることが好ましい。
【００８５】
スペーサー分子は多数の異なる種類のポリマー、好ましくは複数の官能基を組み込んだポリマーを含み得る。これらの種類のポリマーの代表例には、限定するものではないが、ポリ（ダイマー酸コアルキルポリアミン）−９５、ポリ（ダイマー酸コアルキルポリアミン）−１４０、ポリ（アリルアミン）、およびジアミン末端ポリ（ｍ−キシレンジアミン−エピクロロヒドリン、および第０世代ＰＡＭＡＭデンドリマーが挙げられる。ポリマーの種類には、限定するものではないが、糖質類および多糖類も挙げられる。代表例にはネオマイシンがある。他のスペーサー分子には、指定の機能性を提供する低分子量の化合物が挙げられる。好適な例としては３，３’−ジアミノベンジジンおよびトリス（２−アミノエチルアミン）が挙げられる。
【００８６】
反応性部分を不活性化する任意の適切なキャッピング剤を使用してよい。キャッピング剤の例にはアミノ酸、タンパク質、糖質、カルボン酸、チオール、アルコールおよびアミ
ンが挙げられる。限定するものではないが、代表例にはグリシンがある。
【００８７】
限定するものではないが、イソシアネート化合物の代表例にはフェニレン１，４−ジイソシアネート、トリレン−２，６−ジイソシアネート、トリレン−α，４−ジイソシアネート、およびイソホロンジイソシアネートが挙げられる。
【００８８】
リンカー分子の非限定的な例には、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート、スベリン酸ジスクシンイミジル、１，６−ジイソシアナトヘキサン、メチレンビス−（４−シクロヘキシルイソシアネート、グルタルジアルデヒド、メチレン−ｐ−フェニルジイソシアネートおよびクエン酸トリエチルが挙げられる。
【００８９】
任意の適切な基材が上記方法において使用されてよい。基材表面（例えば、ガラス、プラスチック、金属）は、本発明のジシリル化合物と反応する少なくとも１つの基、例えばヒドロキシル基、アミノ基またはカルボキシレート基、あるいはこれらの任意の組み合わせなどを含むことが好ましい。
【００９０】
ナノ粒子を用いる検出方法に適した基材材料には、種々の関連する表面特性が含まれる。したがって、本発明の１態様では、該基材材料は１．４００〜１．９００の屈折率を有する。本発明の別の態様では、基材材料は、光線透過率、すなわち、光を水平軸に平行に基材材料を通過させるかまたは光を水平軸に垂直に基材材料を通過させることによって、基材の表面に吸収されたり反射されたりせずに基材を通過する光の量、が８０％を超える。
【００９１】
本発明のさらに別の態様では、修飾された基材表面は、可視光または蛍光を用いて画像化する際に、前記ポリマー層を有していない基材に対してバックグラウンド・シグナルが実質的に低減されたバックグラウンド・シグナルを生じる。捕捉プローブを結合させる前の該基材表面は、２５〜７５°の好ましい水接触角を有する。
【００９２】
本発明のさらに別の実施形態では、基材は、負に荷電したイオン基と、前記捕捉プローブを結合することができる遊離イソシアネート基とを含んだポリマー層を有する表面を含んで成る。
【００９３】
本発明のさらに別の実施形態では、標的分析物の検出に用いられる基材が提供される。該基材は上記方法のいずれかによって修飾された表面を含む。
本発明の別の実施形態では、標的分析物を検出するためのキットが提供される。該キットは上記基材および上記方法によって製造された基材のうちいずれかを含む。
【００９４】
本発明の別の実施形態では、試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する１つまたは複数の標的分析物を検出する方法が提供される。該方法は、（ａ）本発明の方法のいずれかによって製造された基材であって、その表面に少なくとも１種類の捕捉プローブが固定化されており、各種類の捕捉プローブが標的分析物に特異的であることを特徴とする基材を提供する工程と、（ｂ）標的分析物に特異的な検出体プローブとナノ粒子とを含んでなる少なくとも１種類の検出用プローブを提供する工程と、（ｃ）捕捉プローブおよび検出体プローブが特異的標的分析物に結合するのに有効な条件下で、捕捉プローブ、検出用プローブおよび試料を接触させて、基材の表面上に固定化複合体を形成する工程と、（ｄ）基材の表面を洗浄して、結合していないナノ粒子を除去する工程と、（ｅ）前記標的分子の有無の指標としての前記複合体の有無を観察する工程と、から成る。
【００９５】
本発明は基材表面上にナノ粒子を固定化する方法にも関する。３’アミン結合オリゴヌクレオチドが合成され得る。該３’アミン結合オリゴヌクレオチドの５’末端を、例えば
スルフィド・リンカーを介してナノ粒子に結合させる。スルフィド基でオリゴヌクレオチドを官能化する方法およびナノ粒子に付着させる方法は、例えば、米国特許出願公開第２００３／０１４３５９８Ａ１号および同第２００２／０１５５４４２Ａ１号明細書に記載されており、それらの全体を本明細書に援用する。オリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合させるための好適なスルフィド・リンカーはエピアンドロステロン・リンカーである。このオリゴヌクレオチドの３’末端をさらに修飾して３’末端修飾オリゴヌクレオチドを形成し、次いで該３’末端修飾オリゴヌクレオチドをナノ粒子表面と接触させる。修飾オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子を次にアルデヒドで修飾された基材表面に接触させると、結果として基材表面上にナノ粒子が固定化されることになる。
【００９６】
別の実施形態では、本発明の方法は３’シリル官能化オリゴヌクレオチドを合成して３’末端修飾オリゴヌクレオチドを形成する工程を含む。該修飾オリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド上のスルフィド・リンカーを介してナノ粒子表面に結合させる。次いで、３’シリル結合オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子を、アルデヒドで修飾された基材表面に接触させると、結果として基材表面上にナノ粒子が固定化されることになる。
【００９７】
本明細書に記載の基材表面上でのナノ粒子の固定化は、いくつかの検出技法において有用である。例えば、本発明の固定化方法は、ガラス表面上で銀増幅試薬を分析するのに有用である。例えば、本発明の方法によってガラス表面上に固定化された金ナノ粒子は、銀による増幅を用いるＤＮＡ検出アッセイ法において陽性対照として用いることができる。あるいは、陽性対照としてガラス表面に結合された捕捉ＤＮＡ鎖にＤＮＡプローブを直接ハイブリダイズさせることが可能である。このハイブリダイゼーション法は修飾されたスライドガラスのバッチごとに変化し、シグナルはハイブリダイゼーション効率に左右される。
【００９８】
また、本発明の方法を用いることによって、基材表面上にナノ粒子を固定化するために捕捉プローブを利用するアッセイにおいて、捕捉プローブをハイブリダイゼーションさせる手順を省略することができる。一般にそのようなアッセイでは、陽性対照はナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを基材表面上の相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることによって提供される。ナノ粒子が基材表面上に直接固定化されるので、本発明はこのハイブリダイゼーション工程を排除する。
【００９９】
さらに、本発明によるナノ粒子の直接固定化は、大きさの異なるＤＮＡで修飾されたナノ粒子プローブを用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の角度変化技法によりＤＮＡ標的を検出するのにも非常に有用である。サンドイッチ形式のアッセイにおいて、ＤＮＡ標的を、固定化されているナノ粒子に結合した捕捉鎖と、ＤＮＡ修飾ナノ粒子の検出用プローブとにハイブリダイズさせる場合、ＳＰＲの角度変化を、分光分析法を用いて計測することができる。このことは、大きなサイズのＤＮＡ結合ナノ粒子プローブが存在する場合にＳＰＲ分光分析を用いて標的ＤＮＡを検出する方法を提供している。このナノ粒子が結合した捕捉体とナノ粒子が結合したプローブとの方法を用いれば、１塩基多型（ＳＮＰ）をも検出することが可能である。
【０１００】
本発明では、表面を修飾してアルデヒド基を含む表面を提供することのできる任意の基材を用いることができる。適切な基材には、透明な固体表面（例えば、ガラス、石英、プラスチックおよびその他のポリマー）、不透明な固体表面、および導電性固体表面がある。基材は任意の形状または厚さであってよいが、一般には平坦で薄いものになるであろう。スライドガラスなどのガラス基材が好ましい。
【０１０１】
したがって、本発明の１実施形態では、表面上にナノ粒子を固定化する方法が提供され、該方法は、（ａ）表面を有する基材と、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子であっ
て、該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分がナノ粒子と結合していない末端に遊離アミン基を有するナノ粒子とを提供する工程と、（ｂ）前記ナノ粒子を、式ｉ：
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−ＮＣＹ              ｉ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）を有する薬剤に接触させて、反応性中間体を形成する工程と、（ｂ）前記反応性中間体を前記表面と接触させて、前記表面上に前記分子を固定化する工程とから成る。
【０１０２】
本発明を実施する際に有用なナノ粒子には、金属（例えば、金、銀、銅および白金）、半導体（例えば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、およびＺｎＳで被覆されたＣｄＳまたはＣｄＳｅ）ならびに磁性（例えば、強磁性）コロイド物質が挙げられる。本発明を実施する際に有用な他のナノ粒子には、ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＴｉＯ２、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓおよびＧａＡｓが挙げられる。ナノ粒子の大きさは約５ｎｍ〜約１５０ｎｍ（平均径）であることが好ましく、約５〜約５０ｎｍであることがさらに好ましく、約１０〜約３０ｎｍであることが最も好ましい。該ナノ粒子はロッドであってもよい。本発明に有用な他のナノ粒子には、シリカおよびポリマー（例えば、ラテックス）ナノ粒子がある。
【０１０３】
金属ナノ粒子、半導体ナノ粒子および磁性ナノ粒子を製造する方法は、当技術分野では周知である。例えば、シュミット、ゲー．（Ｓｃｈｍｉｄ，Ｇ．）編「Ｃｌｕｓｔｅｒｓ
ａｎｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ」（ＶＣＨ，ヴァインハイム（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）、１９９４年）；ハヤト、エム．エイ．（Ｈａｙａｔ，Ｍ．Ａ．）編「Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｇｏｌｄ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（米国サンディエゴ州所在のアカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９１年）；マサート、アール．（Ｍａｓｓａｒｔ，Ｒ．）、ＩＥＥＥ  Ｔａｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  Ｏｎ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、第１７巻、ｐ．１２４７、１９８１年；アーマディ、ティ．エス．ら（Ａｈｍａｄｉ．Ｔ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７２巻、ｐ．１９２４、１９９６年；ヘングレイン、エイ（Ｈｅｎｇｌｅｉｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．）ら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．第９９巻、ｐ．１４１２９、１９９５年；カーティス、エイ．シー．ら（Ｃｕｒｔｉｓ，Ａ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、第２７巻、ｐ．１５３０、１９８８年を参照のこと。蛍光物質または燐光物質を含浸させたシリカ・ナノ粒子を製造する方法も当技術分野では周知である（タン（Ｔａｎ）および共同研究者、ＰＮＡＳ、２００４年、第１０１巻、ｐ．１５０２７〜１５０３２を参照されたい）。
【０１０４】
ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＴｉＯ２、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓ、およびＧａＡｓのナノ粒子を製造する方法も当分野では周知である。例えば、ウェラー（Ｗｅｌｌｅｒ）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、第３２巻、ｐ．４１、１９９３年；ヘングレイン（Ｈｅｎｇｌｅｉｎ）、Ｔｏｐ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．、第１４３巻、ｐ．１１３、１９８８年；ヘングレイン（Ｈｅｎｇｌｅｉｎ）、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、第８９巻、ｐ．１８６１、１９８９年；ブラス（Ｂｒｕｓ）、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ａ．、第５３巻、ｐ．４６５、１９９１年；バーンクマン（Ｂａｈｎｃｍａｎｎ）、「Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｏｒａｇｅ  ｏｆ  
Ｓｏｌａｒ  Ｅｎｅｒｇｙ」、ペリツェッティ（Ｐｅｌｉｚｅｔｔｉ）とスキアヴェロ（Ｓｃｈｉａｖｅｌｌｏ）編、１９９１年、ｐ．２５１；ワン（Ｗａｎｇ）とヘロン（Ｈｅｒｒｏｎ）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、第９５巻、ｐ．５２５、１９９１年；オルシャフスキーら（Ｏｌｓｈａｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第１１２巻、ｐ．９４３８、１９９０年；ウシダら（Ｕｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、第９５巻、ｐ．５３８２、１９９２年を参照されたい。
【０１０５】
適切なナノ粒子は、例えばテッドペラインインコーポレイティッド社（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ．Ｉｎｃ．）（金）、アマシャムコーポレイション社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（金）、ナノプローズインコーポレイティッド社（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）（金）、およびクオンタムドットインコーポレイティッド社（Ｑｕａｎｔｏｍ  Ｄｏｔ  Ｉｎｃ．）（ＣｄＳｅ／ＺｎＳなどの半導体コアシェル粒子）から市販もされている。
【０１０６】
オリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合させるために、ナノ粒子、オリゴヌクレオチド、またはその両方を官能化する。この方法は当分野においては周知である。例えば、アルカンチオールで３’末端または５’末端を官能化したオリゴヌクレオチドは容易に金ナノ粒子に結合する。例えば、ホワイトサイズ（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ）、米国テキサス州ヒューストン（Ｈｏｕｓｔｏｎ）における「ロバート  エイ  ウェルチ基金（Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｗｅｌｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）第３９回ケミカル・リサーチ・ナノフェイズ・ケミストリー（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｎａｎｏｐｈａｓｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）会議会報」、ｐ．１０９〜１２１、１９９５年を参照のこと。また、マキックら（Ｍｕｃｉｃ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、ｐ．５５５〜５５７、１９９６年も参照されたい（３’チオールＤＮＡを平坦な金表面に結合させる方法について記載されている。この方法を用いてオリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合させることができる）。アルカンチオール法を用いて、オリゴヌクレオチドを他の金属、半導体および磁性コロイド、ならびにその他の上記に列挙したナノ粒子に結合させることもできる。オリゴヌクレオチドを固体表面に結合させるための他の官能基には、ホスホロチオエート基（例えば、オリゴヌクレオチド−ホスホロチオエートの金表面への結合については米国特許第５４７２８８１号明細書を参照されたい）、置換アルキルシロキサン（例えば、オリゴヌクレオチドのシリカ表面およびガラス表面への結合についてはバーウェル（Ｂｕｒｗｅｌｌ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第４巻、ｐ．３７０〜３７７、１９７４年ならびにマットイッチ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）とカルサース（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第１０３巻、ｐ．３１８５〜３１９１、１９８１年を、アミノアルキルシロキサンの結合およびメルカプトアルキルシロキサンの同様の結合についてはグラバーら（Ｇｒａｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、第６７巻、ｐ．７３５〜７４３を参照されたい）が挙げられる。末端が５’チオヌクレオシドまたは３’チオヌクレオシドであるオリゴヌクレオチドを用いてオリゴヌクレオチドを固体表面に結合させてもよい。以下の参照文献には、オリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合させるために使用可能なその他の方法が記載されている：ヌッツォら（Ｎｕｚｚｏ  ｅｔ
ａｌ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、第１０９巻、ｐ．２３５８、１９８７年（金上のジスルフィド）；アラーラ（Ａｌｌａｒａ）とヌッツォ（Ｎｕｚｚｏ）、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第１巻、ｐ．４５、１９８５年（アルミニウム上のカルボン酸）；アラーラ（Ａｌｌａｒａ）とトンプキンス（Ｔｏｍｐｋｉｎｓ）、Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．、第４９巻、ｐ．４１０〜４２１、１９７４年（銅上のカルボン酸）；アイラー（Ｉｌｅｒ）、「Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｉｌｉｃａ」、第６章、ワイリー（Ｗｉｌｅｙ）社、１９７９年（シリカ上のカルボン酸）；ティモンズ（Ｔｉｍｍｏｎｓ）とジスマン（Ｚｉｓｍａｎ）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、第６９巻、ｐ．９８４〜９９０、１９６５年（白金上のカルボン酸）；ソリアガ（Ｓｏｒｉａｇａ）とハッバード（Ｈｕｂｂａｒｄ）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第１０４巻、ｐ．３９３
７、１９８２年（白金上の芳香環化合物）；ハッバード（Ｈｕｂｂａｒｄ）、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．、第１３巻、ｐ．１７７、１９８０年（白金上のスルホラン、スルホキシドおよびその他の官能化溶媒）；ヒックマンら（Ｈｉｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、第１１１巻、ｐ．７２７１、１９８９年（白金上のイソニトリル）；マオズ（Ｍａｏｚ）とサギブ（Ｓａｇｉｖ）、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第３巻、ｐ．１０４５、１９８７年（シリカ上のシラン）；マオズ（Ｍａｏｚ）とサギブ（Ｓａｇｉｖ）、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第３巻、ｐ．１０３４、１９８７年（シリカ上のシラン）；ヴァッサーマンら（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第５巻、ｐ．１０７４、１９８９年（シリカ上のシラン）；エルテコーヴァ（Ｅｌｔｅｋｏｖａ）とエルテコフ（Ｅｌｔｅｋｏｖ）、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第３巻、ｐ．９５１、１９８７年（二酸化チタンおよびシリカ上の芳香族カルボン酸、アルデヒド、アルコールおよびメトキシ基）；レックら（Ｌｅｃ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、第９２巻、ｐ．２５９７、１９８８年（金属上のリジッドなリン酸）。本明細書にその全体を援用した米国特許第６７６７７０２号には、環状ジスルフィドおよびポリチオールを用いてオリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合させる方法も記載されている。
【０１０７】
この実施形態の１態様では、表面はガラス表面である。
この実施形態の別の態様では、該表面は反応性中間体と反応する少なくとも１つの基を有する。基の代表例にはヒドロキシル基、アミノ基またはカルボキシレート基が挙げられる。薬剤の非限定的な例には、３−（イソシアナトプロピル）トリエトキシシランまたは３−（イソシアナトプロピル）ジメチルモノエトキシシランが挙げられる。
【０１０８】
この実施形態の別の態様では、オリゴヌクレオチドはチオ酸、アルキルチオールまたはジスルフィド基（例えば、エピアンドロステロンジスルフィド）などの官能性部分を介してナノ粒子と結合され得る。
【０１０９】
本発明の別の実施形態では、表面上にナノ粒子を固定化する方法が提供される。該方法は、（ａ）アミン基と反応する反応性部分を含んだ表面を有する基材と、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子であって、該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分がナノ粒子と結合していない末端にアミン基を有するナノ粒子とを提供する工程と、（ｂ）前記ナノ粒子に前記反応性部分を接触させて、前記表面上に前記ナノ粒子を固定化する工程とから成る。
【０１１０】
この実施形態の１態様では、表面はガラス表面である。
この実施形態の別の態様では、表面は反応性中間体と反応する少なくとも１つの基を有する。基の代表例にはヒドロキシル基、アミノ基またはカルボキシレート基が挙げられる。薬剤の非限定的な例には３−（イソシアナトプロピル）トリエトキシシランまたは３−（イソシアナトプロピル）ジメチルモノエトキシシランが挙げられる。
【０１１１】
別の態様では、オリゴヌクレオチドはチオ酸、アルキルチオールまたはジスルフィド基（例えば、エピアンドロステロンジスルフィド）などの官能性部分を介してナノ粒子と結合され得る。
【０１１２】
別の態様では、反応性部分はイソシアネート類、無水物類、ハロゲン化アシル類またはアルデヒド類を含む。
本発明の別の実施形態では、修飾基材を製造するためのキットが提供される。該キットは分子をシリル化するための任意選択の試薬および任意選択の基材、洗浄工程と結合工程とを含むアッセイを実行するための緩衝液を含み得る。
【０１１３】
［実施例］
本発明をさらに以下の実施例によって実証する。該実施例は例示として提供されるものであって、本発明をどのように制限することも意図していない。これらの実施例において、百分率はすべて、固体については重量％、液体については体積％であり、特に注記のない限り、温度はすべて摂氏温度である。
【実施例１】
【０１１４】
ＤＮＡアレイ・チップの製造
この実施例は、シリル化された単一の分子またはシリル化された樹枝状分子の手順により、例えば、３’または５’シリル化ＤＮＡなどの分子を、事前洗浄したガラスなどの表面に直接共有結合させるための一般的な手順を提供する。
【０１１５】
（ａ）方法番号１
図１に示すように、事前洗浄したガラス表面に３’−アミノまたは５’−アミノＤＮＡ分子を結合させる方法が示されている。ＤＮＡ合成装置を用いたＤＮＡ合成の標準的プロトコルに従って、３’−アミン結合ＤＮＡを合成する。固体支持体上で合成された該３’アミン修飾ＤＮＡを、スクシニル・リンカーを介して固体支持体に結合させる。合成後、固体支持体に結合しているＤＮＡを、アンモニア水を用いることによって遊離させると、その結果３’末端に遊離アミン基を含んだＤＮＡ鎖が生成された。該粗製物を、酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）緩衝液およびアセトニトリルを用いてＨＰＬＣで精製した。ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基は、トリフルオロ酢酸を用いてカラム上で除去した。
【０１１６】
精製後、続いて１等量の３’−アミン結合ＤＮＡを、１．２等量のトリエトキシシリルイソシアネート（ゲレスト社（ＧＥＬＥＳＴ）、米国ペンシルバニア州モリスビル（Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ）所在）を用いて室温で１〜３時間、１０％ＤＭＳＯエタノール溶液中で処理した。蒸発後にＤＮＡ中に残った微量の水は反応に影響を及ぼさなかった。３時間後、この反応混合物を蒸発乾固させ、アレイヤー（アフィメトリクス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、スポッティング用の５００ミクロンのピンを備えたＧＭＳ４１７アレイヤー）を用いて事前洗浄したガラス表面上に直接スポッティングした。典型的には、１ｍＭのシリル化ＤＮＡを用いてガラス表面をアレイ化し、次いで、該アレイ化基材をチャンバ内に４〜５時間放置した。この後、このスライドガラスをナノピュア水中で１０分間インキュベートして結合していないＤＮＡを除去し、エタノールで洗浄し、デシケータで乾燥させた。乾燥後、これらのプレートを、標的ＤＮＡ試料を用いて試験した。
【０１１７】
上記手順によって製造した直鎖シリルオリゴヌクレオチドを用いてガラス表面にスポッティングした予備試験では、ＤＭＳＯまたはＤＭＦ中でスポッティングすることにより意外にもスポットの分枝化または拡散が制御されることが観察された。図２を参照されたい。スポットの形状は鮮明で、個々に離散していた。チャンバの一部に水を入れ、スライドガラスを架台上で水位より上で一晩保管することによって製造したデシケータ・チャンバ内で基材を過剰に水和させると、スライドガラスは過剰に水和する。過剰に水和させたスライドガラス上では、ＤＭＳＯまたはＤＭＦ溶媒を用いても望ましくないスポットの分枝化が観察された。図３を参照されたい。スポッティング用の唯一の溶媒として水を用いた場合、得られるスポットは分岐し、他のスポットにまで拡がった。図４を参照されたい。どのような作用機構の理論にも拘束されるものではないが、水性のスポッティング溶液および／または過剰に水和した基材中の水の存在により、シリルオリゴヌクレオチドの重合が生じるため、所望の分子による表面の修飾が妨害される。このため、ＤＭＦ、ＤＭＳＯなどの乾燥した極性非プロトン性溶媒ならびにエタノール、イソプロパノールおよびＤＭＦ／ピリジンのような溶媒混合物などの乾燥極性溶媒が、シリル修飾オリゴヌクレオチドをアレイ化するのに適した溶媒であることが認められた。スポッティング溶液中に水（＞１％）が存在するか、またはスライドが過剰に水和されると、アレイ化の後にスポットの
分枝化が生じてしまう。結合試験において偽陽性の結果をもたらす恐れがあるので、スポットの分枝化は望ましくない。
【０１１８】
（ｂ）方法番号２
図５に示すように、ガラス表面に５’−アミノまたは３’−アミノＤＮＡ分子を結合させる方法が示されている。乾燥アセトニトリル中の１等量のシリルアミンに１．２等量のテトライソシアネートを滴加し、該反応混合物を室温で１０分間攪拌して化合物３を形成させた。５’−アミンまたは’３’−アミン結合オリゴヌクレオチドを合成し、従来の手順によってアンモニア水を用いて脱保護した。ＨＰＬＣ精製後、遊離の５’−アミンまたは３’−アミンオリゴヌクレオチドを１：１０のＤＭＳＯ／エタノール（体積比）混合物中にて化合物３で処理した。１０分後、修飾されたオリゴヌクレオチドを減圧蒸発させ、ＤＭＳＯまたはＤＭＦ媒体中で未修飾のガラス表面上にスポットした。
【実施例２】
【０１１９】
ＤＮＡアレイ・チップを用いた第Ｖ因子標的配列の検出
この実施例は、実施例１に記載のように製造したＤＮＡプレートが、核酸標的を検出するためのサンドイッチ・ハイブリダイゼーション・アッセイに有用であることを示す。
【０１２０】
（ａ）金コロイドの調製
金コロイド（直径１３ｎｍ）は、フレンス（Ｆｒｅｎｓ）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｈｙｓ．Ｓｃｉ．、第２４１巻、ｐ．２０（１９７３年）およびグレーバー（Ｇｒａｂａｒ）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、第６７巻、ｐ．７３５（１９９５年）に記載のように、ＨＡｕＣｌ４をクエン酸塩で還元することによって調製した。簡潔に述べれば、すべてのガラス器具を王水（ＨＣｌ：ＨＮＯ３＝３：１）で洗浄し、Ｎａｎｏｐｕｒｅ（登録商標）Ｈ２Ｏで濯ぎ、次いで使用前にオーブンで乾燥した。ＨＡｕＣｌ４およびクエン酸ナトリウムはアルドリッチケミカルカンパニー社（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）から購入した。ＨＡｕＣｌ４水溶液（１ｍＭ、５００ｍＬ）を攪拌しながら還流した。次いで、３８．８ｍＭのクエン酸ナトリウム（５０ｍＬ）を迅速に添加した。該溶液の色が淡黄色から赤紫色に変わり、還流を１５分間続けた。室温まで冷却後、この赤色の溶液をミクロンセパレーションズインコーポレイテッド社（Ｍｉｃｒｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）の１ミクロンフィルタで濾過した。ヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）８４５２Ａダイオード・アレイ分光光度計を用いたＵＶ−Ｖｉｓ分光分析および日立（Ｈｉｔａｃｈｉ）８１００透過型電子顕微鏡を用いた透過型電子顕微鏡解析（ＴＥＭ）によって、Ａｕコロイドを特徴付けした。直径１３ｎｍの金粒子は、１０〜３５ヌクレオチドの範囲の標的およびプローブオリゴヌクレオチド配列により凝集すると、可視的に色が変化する。
【０１２１】
（ｂ）オリゴヌクレオチドの合成：
ミリジーン（Ｍｉｌｌｉｇｅｎｅ）のＥｘｐｅｄｉｔｅ（商標）ＤＮＡ合成装置を用いて、シングル・カラム・モードでホスホロアミダイト法によって、１マイクロモルのスケールでオリゴヌクレオチドを合成した。エクスタイン、エフ．（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．）編、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）、１９９１年）。溶液はすべてミリジーン社（Ｍｉｌｌｉｇｅｎｅ）から購入した（ＤＮＡ合成等級）。平均的な結合効率は９８〜９９．８％で変化し、最後のジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基は、合成装置上で、オリゴヌクレオチドから切断して最終的なエピアンドロステロン結合を行った。捕捉鎖は手順に基づいてＤＭＴを用いて合成し、ＨＰＬＣ系で精製した。
【０１２２】
（ｃ）オリゴヌクレオチドの精製
トーソー・バイオセップ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｅｐ）のＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ（登録商標）ＭＤ−Ｇ  ＣＧ−３００Ｓカラム（１０×１１８ｍｍ、粒径３５μｍ）を装備したアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）１１００シリーズのシステムにより、０．０３ＭのＥｔ３ＮＨ＋ＯＡｃ−緩衝液（ＴＥＡＡ）（ｐＨ７）を用いて９５％ＣＨ３ＣＮ／５％ＴＥＡＡの１％／分の勾配で逆相ＨＰＬＣを実施した。流速は１ｍＬ／分、２６０ｎｍでのＵＶ検出とした。結合した最終ＤＭＴをそのＨＰＬＣカラム上で１〜３％トリフルオロ酢酸およびＴＥＡＡ緩衝液を用いて脱保護した。ＤＭＴが切断されたオリゴヌクレオチドを含んだ緩衝液を収集および蒸発させた後、ほぼ蒸発乾燥させた。オリゴヌクレオチドの量を２６０ｎｍの吸光度によって決定し、逆相ＨＰＬＣによって最終的な純度を評価した。
【０１２３】
同じプロトコルをエピアンドロステロン結合オリゴヌクレオチドについて使用してプローブを製造したが、ＤＭＴの除去は必要としなかった１０。
（ｄ）オリゴヌクレオチドの金ナノ粒子への付着
実施例に使用したプローブ：（３’−ａｃｔ  ｔｔａ  ａｃａ  ａｔａ  ｇ−ａ２０−Ｅｐｉ−５’および３’−ｔ  ｔａａ  ｃａｃ  ｔｃｇ  ｃ−ａ２０−Ｅｐｉ−５’）（配列番号１）を以下のように結合させた。これらのプローブはＭ１３標的配列の検出用に設計されたものである。
【０１２４】
金コロイド（１５ｎＭ）の１ｍＬ水溶液を過剰な（３．６８：Ｍ）５’エピアンドロステロン結合オリゴヌクレオチド（塩基長３３および３１）水溶液と混合し、該混合物を室温で１２〜２４時間放置した。次いで、０．１Ｍのリン酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００μＬおよび１．０ＭのＮａＣｌ  １００μＬを予め混合してから添加した。１０分後、１０μＬの１％ＮａＮ３水溶液を添加し、該混合物をさらに２０時間放置し、塩濃度を０．３まで上昇させた。０．３Ｍ  ＮａＣｌとして４時間放置した後、再度１ＭのＮａＣｌまで上昇させてさらに１６時間放置した。この「熟成（エイジング）」工程は、エピジスルフィド結合オリゴヌクレオチドによる表面被覆率を増大させ、金表面からオリゴヌクレオチド塩基を引き離すために設計した。４０時間のインキュベーション後にドライアイス槽で溶液を凍結させ、その後室温で解凍したところ、その後のアッセイでは幾分きれいで、より輪郭のはっきりした赤色のスポットが得られた。いずれにせよ、次に、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）の遠心分離装置５４１４を用いて溶液を１４，０００ｒｐｍで約１５分間遠心分離すると、金コロイド７〜１０％（５２０ｎｍにおける吸光度によって示される）とともにオリゴヌクレオチドの大半（２６０ｎｍにおける吸光度によって示される）を含んだ薄いピンク色の上清と、チューブの底の緻密で暗色のゼラチン状の残渣とが生じた。この上清を取り除き、残渣を約２００μＬの緩衝液（１０ｍＭのリン酸，０．１ＭのＮａＣｌ）に再懸濁させ、再度遠心分離した。上清溶液を除去した後、残渣を１．０ｍＬの緩衝液（１０ｍＭのリン酸，０．１ＭのＮａＣｌ）および１０μＬの１％ＮａＮ３水溶液内に入れた。溶液をピペットで数回吸い上げたり、吐き出したりして溶解を容易にした。得られた赤色のマスター溶液は、室温で数ヶ月間放置しても、シリカ薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート上にスポットしても、２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、または高濃度のサケ精子ＤＮＡ含有溶液を添加しても、安定であった（すなわち、赤色のままで、凝集しなかった）。
【０１２５】
実施例２〜５については、上記のようにして、１７ｎＭ（１５０μＬ）のＡｕコロイド水溶液を用いて様々な第Ｖ因子プローブセットを調製し、３．７５μＭ（４６μＬ）の５’−エピアンドロステロン−ａ２０−ｔａｔｔｃｃｔｃｇｃｃ（配列番号２）と混合し、１ｍＬのエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）製キャップ付きバイアル中で室温にて２４時間放置した。第２のコロイド溶液を３．７５μＭ（４６μＬ）の５’−エピアンドロステロン−ａ２０−ａｔｔｃｃｔｔｇｃｃｔ−３’（配列番号３）と反応させた。これらのオリゴヌクレオチドは非相補的であることに留意されたい。残渣を上記と同じ手順で溶解し、得られた溶液を後で使用するためにガラス瓶に保存した。
【０１２６】
（ｅ）ハイブリダイゼーション条件
ストック緩衝溶液：ハイブリダイゼーション緩衝液用に、以下のストック溶液を用いた：３．０  ＮａＣｌ、０．３Ｍのクエン酸ナトリウム、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、４．０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４および０．００５％ＳＤＳ。
【０１２７】
０．５％のＴｗｅｅｎを添加することによってストック緩衝液から希釈した緩衝液（０．７８ＭのＮａＣｌ、７０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２．６４ｍＭのＭｇＣｌ２、１．１ｍＭのリン酸ナトリウム，０．０１％）を用いて、ハイブリダイゼーション・アッセイを実施した。典型的な実験手順では、標的およびプローブを該ハイブリダイゼーション緩衝液と混合し、９５℃で５分間混合物を加熱した。室温まで冷却後、分割したもの（アリコート）をガラス基材上に移し、ハイブリダイゼーションのために湿潤チャンバ内に入れた（各プローブは異なる融点を有しているため、異なる温度条件にて種々のアッセイを行った）。ハイブリダイゼーション後、２つの異なる洗浄緩衝液でプレートを洗浄し、遠心して乾燥させた。乾燥したプレートを銀増幅溶液（銀Ａ＋銀Ｂ）（米国ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）６３１７８所在のシグマ社（ＳＩＧＭＡ）から市販の銀増幅キット、カタログ番号：Ｓ５０２０およびＳ５１４５）で処理し、本明細書にその全体を援用したいずれも２００２年８月２日出願の米国特許出願第１０／２１０９５９号およびＰＣＴ／ＵＳ０２／２４６０４号（ナノスフェアー  インコーポレイテッド社（Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ，Ｉｎｃ．）が譲受人）に記載のデータ収集用の画像化システムを用いて、増幅処理したプレートからデータを収集した。
【０１２８】
（ｆ）使用した標的配列
この第Ｖ因子の標的配列を検出用に実施例２〜６において使用した。プローブが捕捉鎖の試験プレートを直接標的とするように実施例１においてはＭ１３プローブを用いたが、ここでは標的の検出を実施しなかった。しかし、実施例２〜５から、第Ｖ因子プローブおよびＭ１３プローブの存在下で第Ｖ因子の標的検出を行った。ここでは、Ｍ１３プローブは対照の役割を果たすものとした。プレート番号５では、１つのプレート上で第Ｖ因子の野生型およびミスマッチの検出など異なる組み合わせのアッセイを実施した。プレート番号６の各ウェルは、使用した標的およびプローブにより明確に規定された。
【０１２９】
第Ｖ因子野生型の配列：
５’ｇａｃａｔｃｇｃｃｔｃｔｇｇｇｃｔａａｔａｇｇａｃｔａｃｔｔｃｔａａｔｃｔｇｔａａｇａｇｃａｇａｔｃｃｃｔｇｇａｃａｇｇｃａａｇｇａａｔａｃａｇｇｔａｔｔｔｔｇｔｃｃｔｔｇａａｇｔａａｃｃｔｔｔｃａｇ３’（配列番号４）
プローブ配列：
プローブＦＶ（１３Ｄ）：５’−ｅｐｉ−ａ２０−ｔａｔｔｃｃｔｃｇｃｃ３’（配列番号５）
プローブＦＶ（２６Ｄ）：５’−ｅｐｉ−ａ２０−ａｔｔｃｃｔｔｇｃｃｔ３’（配列番号６）
第Ｖ因子標的検出用の捕捉鎖：
５’−ｔｃｃ  ｔｇａ  ｔｇａ  ａｇａ  ｔｔａ  ｇａｃ  ａｔｔ  ｃｔｃ  ｇｔｃ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−Ｓｉ−（ＯＥｔ）３−３’（配列番号７）
ストック緩衝溶液：ハイブリダイゼーション緩衝液については、次のストック溶液を用いた：３．０  ＮａＣｌ、０．３Ｍのクエン酸ナトリウム、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、４．０ｍＭのＮａＨ２Ｐ０４および０．００５％ＳＤＳ。
【実施例３】
【０１３０】
ＤＮＡアレイ・チップを用いたＭ１３標的配列の検出
この実施例では、プローブが捕捉鎖を直接標的とするようにして、検出アッセイを実施
した。実施例１（方法番号１）に記載のようにプレート番号１〜３を製造した。プレート２および３では、プローブ（図６）は捕捉鎖に４５分以内に明確にハイブリダイズした。捕捉鎖にハイブリダイズした金コロイドナノ粒子は銀増幅前でもはっきりと見えた。プレート１（図６）では、特異性を示すための異なるプローブを使用してアッセイを進めた。銀染色後、シグナルは銀増幅の後でもガラス表面上には見られなかった。この実験は本発明に従って製造されたＤＮＡチップの特異性を証明した。
【０１３１】
Ｍ１３捕捉配列：
５’−ｔｇａ  ａａｔ  ｔｇｔ  ｔａｔ  ｃ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−Ｓｉ−（ＯＥｔ）３−３’（配列番号８）
プレート番号２〜３で使用したプローブ：
３’−ａｃｔ  ｔｔａ  ａｃａ  ａｔａ  ｇ−ａ２０−Ｅｐｉ−５’（配列番号９）。
【０１３２】
プレート番号１では、配列特異性の試験のために、捕捉鎖に非相補的な検出プローブ３’−ｔ  ｔａａ  ｃａｃ  ｔｃｇ  ｃ−ａ２０−Ｅｐｉ−５’（配列番号１０）を用いた（シグナルなし）。このことにより、捕捉鎖配列およびプローブの両方の特異性がはっきり示された。いずれの場合も、希釈した緩衝液条件において６ｎＭプローブを用いた。典型的な実験手順では、３０μｌの希釈した緩衝液（１．３ＭのＮａＣｌ、１３０ｍＭのクエン酸ナトリウム、４．３８ｍＭのＭｇＣｌ２、１．８２ｍＭリン酸ナトリウム、０．００３％ＳＤＳ）および２０μｌのプローブ（１０ｎＭ）でアレイ化したガラス・チップ上を浸し、室温で１．５時間ハイブリダイズさせた。プローブの終濃度は４ｎＭであり、緩衝液の濃度は０．７８ＭのＮａＣｌ、７０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２．６４ｍＭのＭｇＣｌ２、１．１ｍＭのリン酸ナトリウム、０．００２％ＳＤＳであった。この後、チップを０．７５Ｍの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸および０．０５％Ｔｗｅｅｎの緩衝液で洗浄し、０．５Ｍの硝酸ナトリウム緩衝液で再度洗浄した。次いで、プレートを銀増幅溶液の銀Ａ＋銀Ｂ（１ｍＬ＋１ｍＬ＝計２ｍＬ）で４分間処理し、ナノピュア（登録商標）水で洗浄した。最終的に、該プレートを画像化システムに曝露して、上記のようにデータを収集した。
【実施例４】
【０１３３】
ＤＮＡアレイ・チップを用いた第Ｖ因子標的配列の検出
この実施例では、シリル化した２種類の異なる捕捉鎖を直接プレート上にスポットし、検出した。実施例１に記載のように該プレートを製造した（方法番号１）。真中の列には常に、上下の列に他の捕捉鎖がある陽性対照の捕捉鎖があるものとした。ここでは、野生型、変異型およびヘテロ接合の試料を検出に用いた。上記アッセイ条件を用いて、すべての試料について適切な場所にシグナルが見出された。図７を参照されたい。
【０１３４】
ａ）陽性対照の捕捉配列：
５’−ｔｇａ  ａａｔ  ｔｇｔ  ｔａｔ  ｃ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−Ｓｉ−（ＯＥｔ）３−３’（配列番号１０）
陽性対照について使用したプローブ：
３’−ａｃｔ  ｔｔａ  ａｃａ  ａｔａ  ｇ−ａ２０−Ｅｐｉ−５’（配列番号１１）
ｂ）標的の検出に用いたプローブ：
プローブＦＶ１３Ｄ（野生型標的用のプローブ）：５’−Ｅｐｉ−ａ２０−ｔａｔｔｃｃｔｃｇｃｃ３’（配列番号１２）
プローブＦＶ２６Ｄ（変異型標的用のプローブ）：５’−Ｅｐｉ−ａ２０−ａｔｔｃｃｔｔｇｃｃｔ３’（配列番号１３）
第Ｖ因子標的検出用の捕捉鎖配列：
５’−ｔｃｃ  ｔｇａ  ｔｇａ  ａｇａ  ｔｔａ  ｇａｃ  ａｔｔ  ｃｔｃ  ｇｔｃ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−Ｓｉ−（ＯＥｔ）３−３’
野生型第Ｖ因子の標的配列：
５’ｇａｃａｔｃｇｃｃｔｃｔｇｇｇｃｔａａｔａｇｇａｃｔａｃｔｔｃｔａａｔｃｔｇｔａａｇａｇｃａｇａｔｃｃｃｔｇｇａｃａｇｇｃａａｇｇａａｔａｃａｇｇｔａｔｔｔｔｇｔｃｃｔｔｇａａｇｔａａｃｃｔｔｔｃａｇ３’（配列番号１３）
変異型第Ｖ因子の標的配列：
ｇｔａｇｇａｃｔａｃｔｔｃｔａａｔｃｔｇｔａａｇａｇｃａｇａｔｃｃｃｔｇｇａｃａｇｇｔａａｇｇａａｔａｃａｇｇｔａｔｔｔｔｇｔｃｃｔｔｇａａｇｔａａｃｃｔｔｔｃａｇ−３’（配列番号１４）。
【０１３５】
ヘテロ接合型：５０％が野生型および５０％が変異型の標的
ウェル１：ヘテロ接合型−  プローブ２６Ｄを使用。
ウェル２：ヘテロ接合型−  プローブ１３Ｄを使用。
【０１３６】
ウェル３：対照−  プローブ２６Ｄを使用。陽性対照のみが現れるはずである。
ウェル４：対照−  プローブ１３Ｄを使用。陽性対照のみが現れるはずである。
ウェル５：変異型標的−  変異型プローブ２６Ｄ＋陽性対照プローブを使用。
【０１３７】
ウェル６：変異型標的−  野生型プローブ１３Ｄ＋陽性対照を使用。
ウェル７：ヘテロ接合型−  プローブ２６Ｄを使用。
ウェル８：ヘテロ接合型−  プローブ１３Ｄを使用。
【０１３８】
ウェル９：野生型標的−  変異型プローブ２６Ｄを使用。
ウェル１０：野生型標的−  野生型プローブ１３Ｄを使用。
【実施例５】
【０１３９】
ＤＮＡアレイ・プレートを用いたＭＴＨＦＲ標的配列の検出
この実施例では、ＭＴＨＦＲの１００ｍｅｒの合成標的と２０８塩基対のＰＣＲ産物（１０ｎＭ〜５０ｎＭ）を検出アッセイに用いた。実施例１（方法番号１）に記載のようにプレートを製造した。Ｍ１３標的およびＭＴＨＦＲの１８ｍｅｒプローブを用いて片方のウェルを対照として用いたところ、銀シグナルの増幅後でも銀の痕跡すら見られなかった。プレート番号１（図８）に示すように、融点を超えるとハイブリダイズしないことを示すために７０℃で実験を行った（ＭＴＨＦＲ標的および１８ｍｅｒプローブ）。この結果から、プローブには特異性があり、高温ではプローブはシリルオリゴを結合させた基材に非特異的に結合していないことがわかる。
１００ｍｅｒの合成標的：
５’−ａａｇ  ｃａｃ  ｔｔｇ  ａａｇ  ｇａｇ  ａａｇ  ｇｔｇ  ｔｃｔ  ｇｃｇ  ｇｇａ  ｇｃｃ  ｇａｔ  ｔｔｃ  ａｔｃ  ａｔｃ  ａｃｇ  ｃａｇ  ｃｔｔ  ｔｔｃ  ｔｔｔ  ｇａｇ  ｇｃｔ  ｇａｃ  ａｃａ  ｔｔｃ  ｔｔｃ  ｃｇｃ  ｔｔｔ  ｇｔｇ  ａａｇ  ｇｃａ  ｔｇｃ  ａｃｃ  ｇａ−３’（配列番号１４）
３枚のプレートすべてに使用した１８ｍｅｒのプローブ配列：
３’−ｃｔｇ  ｔｇｔ  ａａｇ  ａａｇ  ｇｃｇ  ｔｔｔ−Ａ２０−Ｅｐｉ−５’（配列番号１５）
ＰＣＲ産物：２０８塩基対
【０１４０】
【化１】
2007536527.tif 000003
【０１４１】
実験条件：
典型的な実験手順（プレート番号２）では、３０μｌの希釈した緩衝液（１．３ＭのＮａＣｌ、１３０ｍＭのクエン酸ナトリウム、４．３８ｍＭのＭｇＣｌ２、１．８２ｍＭのリン酸ナトリウム、０．００３％ＳＤＳ）に、１０μｌの１８ｍｅｒプローブ（１０ｎＭ）および２μｌの１００ｍｅｒの合成標的（１０μＭ）、８μｌの水を混合し、アレイ化したガラス・チップ上を浸し、室温にて１．５時間ハイブリダイズさせた。プローブの終濃度は２ｎＭ、標的濃度は４００ｐＭ、緩衝液の濃度は０．７８ＭのＮａＣｌ、７０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２．６４ｍＭのＭｇＣｌ２、１．１ｍＭのリン酸ナトリウム、０．０１％となった。この後、０．７５Ｍの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸、０．０５％Ｔｗｅｅｎの緩衝液で洗浄し、次いで０．５Ｍの硝酸ナトリウム緩衝液で再度洗浄した。このプレートを、銀Ａ＋銀Ｂ（１ｍＬ＋１ｍＬ＝計２ｍＬ）（米国ミズーリ州セントルイス６３１７８所在のシグマ社から市販されている銀増幅キット、カタログ番号：Ｓ５０２０およびＳ５１４５）で４分間処理し、ナノピュア水で洗浄した。最終的に、プレートを画像システムに曝して上記のようにデータを収集した。プレート番号２を用いた実施例３では、ウェル番号：２１、４、５、８は対照であり、対照はＭ１３の合成標的およびＭＴＨＦＲの１８ｍｅｒプローブ（５’−ｔａｔ  ｇｃｔ  ｔｃｃ  ｇｇｃ  ｔｃｇ  ｔａｔ  ｇｔｔ  ｇｔｇ  ｔｇｇ  ａａｔ  ｔｇｔ  ｇａｇ  ｃｇｇ  ａｔａ  ａｃａ  ａｔｔ  ｔｃａ−３’）（配列番号１７）から成るものとした。
【０１４２】
先に述べたように、プレート番号１を用いた実験（図８）は７０℃で行われ、融点を超えると、プローブである１８ｍｅｒプローブは捕捉プローブに結合しないことが示された。
【０１４３】
同じ実験手順に従い、同じプローブを用いて、プレート番号３（図８）を生成した。１０μｌ（２ｎｍ〜１０ｎＭ）のＭＴＨＦＲのＰＣＲ産物を標的として用いた。プレート番号３のウェル２、３、６および７は、第Ｖ因子の９９ｍｅｒの変異型標的およびＭＴＨＦＲの１８ｍｅｒプローブを用いた対照である。
第Ｖ因子の９９ｍｅｒの変異型第Ｖ因子標的は、以下の配列：
５’ｇｔａｇｇａｃｔａｃｔｔｃｔａａｔｃｔｇｔａａｇａｇｃａｇａｔｃｃｃｔｇｇａｃａｇｇｔａａｇｇａａｔａｃａｇｇｔａｔｔｔｔｇｔｃｃｔｔｇａａｇｔａａｃｃｔｔｔｃａｇ−３’）（配列番号１８）
を有するものとした。
【実施例６】
【０１４４】
ＤＮＡアレイ・プレートを用いた第Ｖ因子標的配列の検出
この実施例および以下の実施例７では、同一の捕捉鎖をプレート上にアレイ化した。この実験の目的は、同じオリゴマーをスライド上の異なる場所にスポッティングしたときの、銀増幅後のスポットの強度の差を見出すことにあった。スライド上の２つの第Ｖ因子４Ｇオリゴマー捕捉鎖の中間に陽性対照をスポッティングした。この結果を図９に示す。
【０１４５】
第Ｖ因子標的検出用の捕捉鎖配列は、
５’ｔｃｃ  ｔｇａ  ｔｇａ  ａｇａ  ｔｔａ  ｇａｃ  ａｔｔ  ｃｔｃ  ｇｔｃ−ＮＨ
−ＣＯ−ＮＨ−Ｓｉ−（ＯＥｔ）３−３’（配列番号１９）
であった。
【０１４６】
スポッティングした陽性対照の捕捉鎖（Ｍ１３）は：
５’ｔｇａ  ａａｔ  ｔｇｔ  ｔａｔ  ｃ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−Ｓｉ−（ＯＥｔ）３−３’（配列番号２０）
であった。
【０１４７】
使用した標的配列は、野生型第Ｖ因子の９９塩基対の一本鎖ＤＮＡであり、以下の配列：
ｇｔａｇｇａｃｔａｃｔｔｃｔａａｔｃｔｇｔａａｇａｇｃａｇａｔｃｃｃｔｇｇａｃａｇｇｃａａｇｇａａｔａｃａｇｇｔａｔｔｔｔｇｔｃｃｔｔｇａａｇｔａａｃｃｔｔｔｃａｇ−３’）（配列番号２１）
を有していた。
【０１４８】
変異型の第Ｖ因子標的は、以下の配列：
ｇｔａｇｇａｃｔａｃｔｔｃｔａａｔｃｔｇｔａａｇａｇｃａｇａｔｃｃｃｔｇｇａｃａｇｇｔａａｇｇａａｔａｃａｇｇｔａｔｔｔｔｇｔｃｃｔｔｇａａｇｔａａｃｃｔｔｔｃａｇ−３’）（配列番号２２）
を有し、使用したプローブは、以下の配列：
プローブＦＶ１３Ｄ：５’−Ｅｐｉ−ａ２０−ｔａｔｔｃｃｔｃｇｃｃ３’（配列番号２３）
プローブＦＶ２６Ｄ：５’−Ｅｐｉ−ａ２０−ａｔｔｃｃｔｔｇｃｃｔ３’（配列番号２４）
を有していた。
【０１４９】
第Ｖ因子標的検出用の捕捉鎖配列：
５’−ｔｃｃ  ｔｇａ  ｔｇａ  ａｇａ  ｔｔａ  ｇａｃ  ａｔｔ  ｃｔｃ  ｇｔｃ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−Ｓｉ−（ＯＥｔ）３−３’（配列番号２５）
陽性対照配列は：
５’−ｔｇａ  ａａｔ  ｔｇｔ  ｔａｔ  ｃ−ＮＨ２−３’（配列番号２６）
であり、陽性対照について用いたプローブは：
３’−ａｃｔ  ｔｔａ  ａｃａ  ａｔａ  ｇ−ａ２０−Ｅｐｉ−５’（配列番号２７）
であった。
【０１５０】
典型的な実験手順では、２５μｌの希釈した緩衝液（１．３ＭのＮａＣｌ、１３０ｍＭのクエン酸ナトリウム、４．３８ｍＭのＭｇＣｌ２、１．８２ｍＭのリン酸ナトリウム、０．００３％ＳＤＳ）に、１０μｌのプローブ（１０ｎＭ）および１０μｌのＰＣＲ標的（１５〜５０ｎＭ）および５μｌの陽性対照プローブ（１０ｎＭ）を混合し、アレイ化したガラス・チップ上を満たし、室温で１．５時間ハイブリダイズさせた。プローブの終濃度は２ｎＭ、緩衝液の濃度は０．７８ＭのＮａＣｌ、７０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２．６４ｍＭのＭｇＣｌ２、１．１ｍＭのリン酸ナトリウム、０．０１％）とし、次いで、該プレートを０．７５の塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸および０．０５％Ｔｗｅｅｎ緩衝液で洗浄し、次いで０．５Ｍの硝酸ナトリウム緩衝液で再度洗浄した。該プレートを銀Ａ＋銀Ｂ（１ｍＬ＋１ｍＬ＝計２ｍＬ）で４分間処理し、ナノピュア水で洗浄した。最後に、プレートを上記画像化システムに曝露してデータを収集した。プローブの選択性を示すために、陽性対照プローブおよび標的反応プローブの両方を混合してアッセイを行った。ウェルは以下のように特定した：
ウェル１、６、８および９は、陽性対照プローブのみを標的および緩衝液とともに有する。
【０１５１】
ウェル２、５は、陽性対照プローブおよび標的プローブを標的および緩衝液とともに有した。
ウェル４、７および１０は、標的プローブのみを標的および緩衝液とともに有し、ここには陽性対照のプローブおよび標的は存在しなかった。
【０１５２】
ウェル３には、いかなる標的も陽性対照プローブもなかったが、標的プローブおよび緩衝液を有していた。
これらの結果（図９）から、プローブは標的検出に特異性を有し、標的が存在しない場合には非特異的なバックグラウンド・ノイズは認められなかったことがわかる。
【実施例７】
【０１５３】
第Ｖ因子の標的配列の検出
この実施例では、捕捉鎖のパターンはすべて実施例６に記載のものと同じである。また、実施例６に記載したのと同じ実験条件および濃度を用い、５２℃でアッセイを実施した。野生型および変異型の標的は実施例６で提供されている。結果を図１０に示す。ウェルは以下のように特定した：
ウェル１：実施例４に示した同じ緩衝液条件において捕捉鎖を直接探査する陽性対照プローブ。
【０１５４】
ウェル２：第Ｖ因子プローブ５’−Ｅｐｉ−ａ２０−ａｔｔｃｃｔｔｇｃｃｔ−３’（２６Ｄ）（配列番号２７）および第Ｖ因子の９９塩基対変異型標的、陽性対照プローブならびに緩衝液。
【０１５５】
ウェル３：第Ｖ因子プローブ５’−Ｅｐｉ−ａ２０−ａｔｔｃｃｔｔｇｃｃｔ−３’（２６Ｄ）（配列番号２８）および第Ｖ因子の９９塩基対変異型標的およびハイブリダイゼーション緩衝液。
【０１５６】
ウェル４：プローブ１３Ｄおよび第Ｖ因子の変異型ＰＣＲ標的、陽性対照ならびにハイブリダイゼーション緩衝液。
ウェル５：プローブ１３Ｄおよび第Ｖ因子の変異型ＰＣＲ標的、ならびにハイブリダイゼーション緩衝液。
【０１５７】
ウェル６：対照（ＭＴＨＦＲ標的およびプローブ１３Ｄならびにハイブリダイゼーション緩衝液）。
ウェル７：野生型の第Ｖ因子標的、プローブ（２６Ｄ）、陽性対照プローブおよびハイブリダイゼーション緩衝液。
【０１５８】
ウェル８：野生型の第Ｖ因子標的およびプローブ（２６Ｄ）、ならびにハイブリダイゼーション緩衝液。
ウェル９：野生型の第Ｖ因子標的、プローブ１３（Ｄ）、陽性対照プローブおよびハイブリダイゼーション緩衝液。
【０１５９】
ウェル１０：野生型の第Ｖ因子標的、プローブ１３（Ｄ）、およびハイブリダイゼーション緩衝液。
プローブＦＶ１３Ｄ：５’−Ｅｐｉ−ａ２０−ｔａｔｔｃｃｔｃｇｃｃ−３’（配列番号２９）
プローブＦＶ２６Ｄ：５’−Ｅｐｉ−ａ２０−ａｔｔｃｃｔｔｇｃｃｔ−３’（配列番号３０）
これらの結果（図１０）から、プローブは標的と特異的に反応し、プローブを異なる標
的と混合してもプローブと標的との間に交差ハイブリダイゼーションは観察されなかったことがわかる。
【実施例８】
【０１６０】
ポリマー被覆基材を製造するためのプロトコル
ポリマー被覆基材を製造し、該ポリマー被覆表面上にアミン修飾ＤＮＡをプリントするための標準プロトコルは次の通りである。
【０１６１】
アミン修飾ＤＮＡを、標準的プロトコルを用いて遺伝子合成装置で合成し、ＨＰＬＣで精製する。ＧＭＳ  Ａｆｆｙｍａｔｒｉｘ（登録商標）アレイヤーを利用して、ｐＨ８．５の３００ｍＭリン酸緩衝液を用いてオリゴヌクレオチドをプリントした。図１１は標的分析物を検出するための基材を製造する代表的な方法を示す略図であり、該方法は基材をイソシアネート化合物（２−トリメトキシシラン−６−（トリイソシアナトシランウレア）ベンゼン）で修飾してイソシアネート基を有する表面を形成する工程と、イソシネート基を有する該表面を複数のアミノ基を有するスペーサー分子（ポリ（ダイマー酸コアルキルポリアミン）−９５）に接触させて遊離アミノ基を有する表面を形成する工程と、遊離アミノ基を有する該表面をリンカー分子（ＥＧＳ）に接触させて反応性部分を有する表面を形成する工程とを伴う。得られた表面を用いて核酸分子などの捕捉プローブを結合させることができる。
【０１６２】
使用した材料：
スライドガラス：
Ｇｏｌｄ  ｓｅａｌ（登録商標）製品、カタログ番号：３０１１
フィッシャーサイエンティフィック社（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、カタログ番号：１２−５４４−１
シラン：
３−（トリエトキシシリル）プロピルイソシアネート、シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、カタログ番号：４１３３６−４
ｍ−アミノフェニルトリメトキシシラン、ゲレスト社（Ｇｅｌｅｓｔ）、カタログ番号：ＳＩＡ０５９９．０
テトライソシアナトシラン、ゲレスト社、カタログ番号：ＳＩＴ１２５．０
ポリマー：
ポリ（ダイマー酸コアルキルポリアミン）−１４０、シグマアルドリッチ社、カタログ番号：１９１０４３
ポリ（ダイマー酸コアルキルポリアミン）−９０、シグマアルドリッチ社、カタログ番号：１９１０１９
ネオマイシン、シグマアルドリッチ社、カタログ番号：Ｎ１１４２
ポリ（アリルアミン）、シグマアルドリッチ社、カタログ番号：４７９１４４
ポリ（ｍ−キシリレンジアミン−エピクロロヒドリン）、ジアミン末端、シグマアルドリッチ社、カタログ番号：４５６８８８
トリス（２−アミノメチルアミン）、シグマアルドリッチ社、カタログ番号：２２５６３−０
第７世代Ｐａｎａｍデンドリマー、シグマアルドリッチ社、カタログ番号：５３６７２−５
リンカー：
エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）ＥＧＳ、ピアース社（Ｐｉｅｒｃｅ）、カタログ番号：２１５６５
スベリン酸スクシンイミジル、（ＤＳＳ）、ピアース社、カタログ番号：２１５５５
１，６ジイソシアナトヘキサン、シグマアルドリッチ社、カタログ番号：Ｄ１２４
７０−２
グルタル酸ジアルデヒド、シグマアルドリッチ社、カタログ番号：３４０８５−５
スライドガラスの洗浄：
すべてのスライドガラスを最初にＮａＯＨ（５％水溶液）に室温で３０分間浸漬し、水で洗浄してｐＨ７にした。次いで、これらを５％ＨＣｌに室温で３０分間浸漬し、再度水で１回洗浄した。最後に、スライドガラスを５％ＨＣｌ中の３％Ｈ２Ｏ２で室温にて３時間処理し、（ｐＨ７になるまで）水で３回洗浄し、エチルアルコールで３回洗浄し、遠心して乾燥させた。この後、この空気乾燥させたスライドガラスをオーブンで１２０℃にて一晩硬化させた。
【０１６３】
工程１：２−トリメトキシシラン−６−（トリイソシアナトシランウレア）ベンゼンの合成：
１．９６（０．０１Ｍ）のテトライソシアナトシランおよび２．１３ｇ（０．０１Ｍ）のｍ−アミノフェニルトリメトキシシランを混合し、室温で２０分間攪拌した。２００ｍＬのエチルアルコールを該混合物に添加し、室温でさらに６０分間攪拌した（図１１を参照）。
【０１６４】
工程２：シラン化：
４．０９ｇの２−トリメトキシシラン−６−（トリイソシアナトシランウレア）ベンゼン（０．０１Ｍ）（１）のエタノール溶液２００ｍＬを用いて、軽く攪拌しながら２５枚のスライドガラスを室温で２時間処理した。２時間の反応後、浴槽からスライドガラスを取り出し、エタノールで３回洗浄し、さらに乾燥させることなく次の工程に用いた（図１１を参照）。
【０１６５】
工程３：ポリマー被覆：
１．５ｇのポリ（ダイマー酸コポリアミン）−９５（２）（米国ミズーリ州セントルイス所在のアルドリッチ・ケミカル（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から購入）をピリジン／ジクロロメタン混合物（１５０ｍＬ；５：１）に添加し、室温で１．５時間攪拌した。シリル化したスライドガラスをこの溶液に入れ、室温で４．５時間放置した。次いで、以下の順序でスライドガラスを洗浄した（図１１を参照）。
・ピリジンで２回（５分間）
・ジクロロメタンで２回（各５分間ずつ）
・エタノールで３回（各５分間ずつ）。
【０１６６】
工程４：表面への架橋剤の添加：
ＥＧＳ架橋剤
ａ）工程３で製造したスライドガラスを、エチレングリコールビス−スクシンイミジルスクシネート（３−ＥＧＳ）の２０ｍＭ溶液（５０ｍｌのＤＭＳＯに０．４５６ｇ）を用いて、室温で４時間処理した。次いで、処理したスライドガラスをエタノール：ＤＭＳＯ混合物（９：１）で１回、エタノールで３回洗浄し、乾燥させた。図１１は分岐状のシランによる被覆の化学式を示している：分岐状のシランを表面被覆に用いて標的検出の感度を増大させた。実際、この分岐状シランは標的検出の再現性に役立つとともに、感度を上げるのにもある程度役立った。図１２は、ガラス表面上のポリマー被覆のモデル画像であり、ポリマーがガラス表面上で角度を為して位置しておりＤＮＡのプリントに最適であることがわかる。
【０１６７】
ジイソシアネート架橋剤
ｂ）工程３で製造したスライドガラスを、１，６−ジイソシアナトヘキサン（３−Ｃ６）の２６ｍＭ溶液（１００ｍｌのＤＭＳＯに０．４３６ｇ）を用いて、室温で４時間処理した。次いで、処理したスライドガラスをエタノール：ＤＭＳＯ（９：１）混合物で１回
、エタノールで３回洗浄し、乾燥させた。架橋剤を添加後、３’アミン修飾ＤＮＡのアレイを形成し、湿潤チャンバ内に１２時間放置した。アレイ形成したこのスライドガラスを、アッセイを進める前に洗浄し、乾燥させた。
【実施例９】
【０１６８】
ポリマーで被覆したスライドガラスおよびデンドリマー修飾スライドガラス上へのＣｙ３オリゴヌクレオチドのスポッティングならびに平均強度の比較
分岐状表面を製造するための表面被覆として種々のポリマーおよびリンカーを評価した。図１３は代表的なポリマーおよびリンカーならびに使用順序を示す概略図である。これら全てのポリマーのうちで、ポリ（ダイマー酸コアルキルポリアミン）−９５が金ナノ粒子プローブを用いた標的ＤＮＡの検出において良好な結果を生み、かつバックグラウンド・ノイズが最小限の再現可能な結果をもたらした。デンドリマー、トリス（２−アミノメチルアミン）、ポリ（アリルアミン）などのアミンが豊富な化合物で被覆された表面は、金ナノ粒子プローブを用いたとき、ポリ（ダイマー酸コアルキルポリアミン）−９５で被覆された表面に比べて少し高いバックグラウンドを示した。どのような作用理論にも拘束されるものではないが、金ナノ粒子が表面上の未反応のアミンと結合していると考えられる。アミンが豊富なデンドリマー表面上へのＣＹ３標識オリゴヌクレオチドのプリントを用いると、高いバックグラウンドが観察された。
【０１６９】
ポリマーによる表面修飾すべてについて、スライドの洗浄および表面修飾など、実施例８に記載の手順に従った。デンドリマー被覆の前に、第２頁の手順を用いてすべてのスライドを洗浄した。該スライドを無水エタノール中の５％３−イソシアナトプロピルトリエトキシシランで処理し、室温で１時間放置し、エタノールで３回洗浄し、デシケータで減圧乾燥させた。次いで、乾燥したスライドをＤＭＳＯ中のＰａｎａｍ  Ｓｔａｒｂｕｓｔ（登録商標）Ｇ７デンドリマー（終濃度０．１５％）で処理し、室温で５時間放置した。この処理したスライドをＤＭＳＯおよびエタノールで洗浄し（２回）、デシケータで減圧乾燥させた。最後に、デンドリマーが結合したスライドをＤＭＳＯ中の１００ｍＭのＥＧＳリンカーで６時間架橋し、ＤＭＳＯ、エタノールで逐次洗浄し、デシケータで減圧乾燥させた。一晩デシケータで乾燥後、このスライドをＤＮＡのプリントに用いた。
【０１７０】
この実施例では、ＣＹ３結合オリゴヌクレオチドをポリマー被覆した表面にプリントし、６時間後に水で洗浄した。蛍光スキャナを用いて、表面に結合したオリゴヌクレオチドからのＣＹ３強度を測定した。この結果を図１４に示す。この図は、修飾表面に結合したアミン結合ＣＹ３結合オリゴヌクレオチドの平均スポット強度を示している。ＣＹ３オリゴヌクレオチドをスポッティングした後の、異なる種類のスライドについて、図１５（ａ）の３Ｅおよび３Ｄならびに図１６に示した。図１５（ａ）および（ｂ）は、ＣＹ３結合オリゴヌクレオチドをスポッティングした後のポリマー被覆スライドを示している。図１６は、ＣＹ３結合オリゴヌクレオチドをスポッティングした後のデンドリマー修飾スライドを示している。
【０１７１】
ポリマー被覆スライド（図１５（ａ）および（ｂ））をデンドリマーのスライド（図１６）と比較すると、デンドリマーのスライドは金ナノ粒子を用いるアッセイおよびＣＹ３結合試験に用いた場合に高いバックグラウンド・ノイズを発生した。いかなる作用理論によっても拘束されるものではないが、これは、ＤＮＡ金プローブのような負に荷電した分子を吸引する正に荷電した環境を生み出している、表面上の過剰なアミン基に起因する可能性があると考えられる。
【０１７２】
この実験に使用したプロトコルは次の通りである：
１．オリゴ溶液の調製−ＦＶ４３Ｈ＋Ｃｙ３（７５ナノモル＋６０ピコモル）
２．カルテシアン（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ）のアレイヤーを用いて、スライド１枚あたり計
９６０スポットをスポッティングした。
３．該スライドをチャンバ内で１８時間水和させた。
４．次いで、該スライドを乾燥させ、走査し、また洗浄・走査し、解析した。
５．次の量のＤＮＡ：
ａ．ＦＶ４３Ｈ＝ＧＧＣＧＡＧＧＡＡＴＡ−（ｐｅｇ）３−ＮＨ２（７５ナノモル）＋
ｂ．ＣＹ３オリゴ＝Ｃｙ３−ＴＣＡＴＣＡＴＣＡ−（スペーサー１８）−ＮＨ２（６０ピコモル）
を用いてオリゴ混合物を調製した。
６．基材全域に溶液を分配し、基材を水和させてオリゴ混合物を基材に結合させた。
７．次いで、基材を乾燥させ、０．２％ＳＤＳ、ＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水で順に洗浄した。
８．次いで、ＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）４１００Ａスキャナを用いて４００ＰＭＴ、４０μｍの分解能で基材を走査した。
９．走査した画像を保存し、ＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）Ｐｒｏ４ソフトウェアを用いてグリッド表示した。
１０．データを収集し、ＭＳ（登録商標）Ｅｘｃｅｌで整理した。
１１．シグナル強度がより高いことは、存在しているＣｙ３タグが多い、故に結合能力が高いことと合致する。
【０１７３】
このアッセイ結果は、どれだけの量のＤＮＡがハイブリダイズしたか、かつ／または銀染色後のバックグラウンドの制限においてその基材がどれだけ優れているかを示唆するものではない。上記プロトコルに従って製造したすべてのスライドを図１５（ａ）、（ｂ）および図１６に示し、それらの強度の比較を図１４に示す。この試験は、スライド全体にわたって修飾表面にアミン結合ヌクレオチドを共有結合することができることを示している。
【実施例１０】
【０１７４】
ポリマー被覆基材の評価
この実施例は、本発明のポリマー被覆基材を用いたＰＣＲ産物の検出を示す。ナノ粒子系プローブを用いたワンステップ・ハイブリダイゼーション・アッセイを用いた。
【０１７５】
ＰＣＲ産物の検出：スライド１、２および３のＰＣＲ増幅した二本鎖（８０ｎＭ）を検出に用いた。結果を図１６（ａ）〜（ｃ）にそれぞれ示す。
ＦＶ９９ＰＣＲ産物
ＣＴＧＡＡＡＧＧＴＴＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡＡＡＴＡＣＣＴＧＴＡＴＴＣＣＴＣＧＣＣＴＧＴＣＣＡＧＧＧＡＴＣＴＧＣＴＣＴＴＡＣＡＧＡＴＴＡＧＡＡＧＴＡＧＴＣＣＴＡＴＴＡＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＧＡＴＧＴＣ
捕捉体：
野生型第Ｖ因子捕捉体：ＦＶ４３Ｈ−５’−ＧＧＣ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＴＡ−（スペーサー１８）３−ＮＨ２−３’
変異型第Ｖ因子捕捉体：ＦＶ４４Ｈ−５’−ＡＧＧ  ＣＡＡ  ＧＧＡ  ＡＴ−（スペーサー１８）３−ＮＨ２−３’
陽性対照捕捉体：ＰＨＡ２Ｈ−５’−ＴＧＡ  ＡＡＴ  ＴＧＴ  ＴＡＴ  Ｃ−（スペーサー１８）３−ＮＨ２−３’
第Ｖ因子プローブ：ＦＶ４５Ｑ−５’Ｅｐｉ−ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ−（スペーサー１８）１−ＣＴ  ＴＣＴ  ＡＡＴ  ＣＴＧ  ＴＡＡ  ＧＡＧ  ＣＡＧ  ３’
陽性対照プローブ：ＰＨＡ１Ｄ−５’Ｅｐｉ−ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＧ  ＡＴＡ  ＡＣＡ  ＡＴＴ  ＴＣＡ−３’。
【０１７６】
標準プロトコルによってナノ粒子の装荷を行った。典型的には、５’ｅｐｉ−ジスルフィド（ｅｐｉ＝エピアンドロステロン）オリゴヌクレオチドを、クエン酸修飾した金ナノ粒子に装荷し、暗所で室温にて２４時間放置した（１ｍＬ当たり４μＭの修飾オリゴヌクレオチドを装荷）。次いで塩の添加を開始し、６時間かけて０．５Ｍまで上昇させ、その塩条件で暗所に室温で総計４０時間放置した。４０時間後、オリゴヌクレオチドが結合した金ナノ粒子を濾過し、プラスチック・チューブを用いて遠心分離した。次いで、該ナノ粒子複合体を水で洗浄し、０．１ＭのＮａＣｌ、１０ｎＭのリン酸、０．０１％アジドのｐＨ７の緩衝液に再懸濁させた。
【０１７７】
スライド１，２および３の実験手順：すべてのスライドを実験直前に０．２％ＳＤＳおよび水で洗浄し、室温で遠心により乾燥させた。アッセイ用の一定分量を第Ｖ因子プローブおよび陽性対照プローブを用いて調製し、ウェルに入れた。典型的には、３５μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（２×ＳＳＣ、０．２  Ｔｗｅｅｎ）、５μｌの水、５μｌの標的、１０μのコロイドを各ウェルについて混合し、９７℃で加熱し、室温で３分間冷却した。次いで、ピペットを用いてスライド上の個々のウェルに一定分量を移した。陽性対照については、プローブと捕捉体とのハイブリダイゼーションであるので、標的の代わりに水を用いた。４０℃で１２０分のハイブリダイゼーションの後、スライドを５ＭのＮａＮＯ３で洗浄し、市販の銀増幅溶液を用いて室温で４分間増幅した。次いで、水で２回洗浄し、スライドを遠心により乾燥させた。スライドをＶＥＲＩＧＥＮＥ（商標）（ナノスフェアー（Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ）画像化システム）で画像化し、この画像をワード・ファイルに転送した。
【０１７８】
スライド番号１：キシレンポリマーで被覆したスライドをＤＮＡ検出に用いた。該スライドは実施例８に従って製造した。陽性対照にはウェル１および３を用い、野生型標的にはウェル２および４を用いた。図１６（ａ）を参照されたい。
【０１７９】
スライド番号２：トリス−（２，アミノエチレン）で被覆したスライド上のＰＣＲ二本鎖の検出。該スライドは実施例１に従って製造した。画像に示されるように、このアミンが豊富なスライドは金ナノ粒子プローブによるバックグラウンドを示した。図１６（ｂ）を参照されたい。
【０１８０】
スライド番号３：ポリマー−９５で被覆した表面上の、野生型のＰＣＲ二本鎖の検出。該スライドは実施例８に記載のように製造した。ウェル１、４、５、９および１０をプローブ対照に用いた。ウェル２、３、７および８を野生型の第Ｖ因子標的に用い、ウェル６を＋ｖｅ対照プローブに用いた。図１６（ｃ）を参照されたい。
【０１８１】
上記３枚のスライドから、ならびに図１６（ａ）〜（ｃ）に示されるように、コポリマー（ダイマー酸コアルキルポリアミン）−９５スライドはバックグラウンドおよび感度の点で良く機能した。しかし、トリス−（２，アミノエチレン）で被覆したスライド２は、アッセイに金ナノ粒子プローブを用いたところ、高いバックグラウンドを示した。この結果から、アミンが豊富な表面は金ナノ粒子アッセイに直接使用するのには適さず、おそらくブロッキングの必要があることがわかる。
【０１８２】
スライド番号４：デンドリマー結合スライド：デンドリマーのスライドおよびポリマー−９５で被覆したスライドを、金ナノ粒子を用いて比較した。図１６（ｄ）および（ｅ）を参照されたい。デンドリマースライドは、ベンタースら（Ｂｅｎｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第３０巻、第２号、ｅ１０、ｐ．１〜７（２００２年）に記載のように製造した。われわれの実験では、デンドリマースライドはポリマーで被覆されたスライドに比べて高いバックグラウンドを示した。
【０１８３】
スライド４の実験手順：両方のスライドを０．２％ＳＤＳおよび水で実験直前に洗浄した。洗浄後、すべてのスライドガラスを室温で遠心して乾燥させた。７００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（２×ＳＳＣ、０．２  Ｔｗｅｅｎ）、１００μｌの水、２００μｌのコロイドを混合し、ピペットを用いてスライド上に層化した。４０℃で６０分間の後、スライドを５ＭのＮａＮＯ３で洗浄し、市販の銀増幅溶液を用いて室温で４分間増幅した。銀処理した該スライドを水で２回洗浄し、遠心して乾燥させ、ＶＥＲＩＧＥＮＥ（商標）で画像化した。
【０１８４】
スライド番号５：この実験では、ＰＣＲ標的を異なる濃度に希釈し、ポリマー−９５で被覆したスライド上での検出に用いた。図１６（ｆ）を参照されたい。
実験手順：修飾スライドを実験直前に０．２％ＳＤＳおよび水で洗浄した。洗浄後、すべてのスライドを室温で遠心して乾燥させた。各ウェルに異なる濃度の標的を用いて感度を試験した（それぞれ１８０ｎＭ、１．８ｎＭ、１８０ｐＭおよび１８ｐＭ）。典型的には、３５μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（２×ＳＳＣ、０．２  Ｔｗｅｅｎ）、５μｌの水、５μｌの標的、１０μｌのコロイドを各ウェルについて混合し、９７℃で加熱し、室温で３分間冷却した。次いで、ピペットを用いてスライド上の個々のウェルに一定分量を移した。４０℃で１２０分間のハイブリダイゼーション後、スライドを５ＭのＮａＮＯ３で洗浄し、室温にて４分間、銀で増幅した。次いで、水で２回洗浄し、スライドを遠心して乾燥させた。スライドをＶＥＲＩＧＥＮＥ（商標）（ナノスフェアー（Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ）画像化システム）で画像化し、この画像をワード・ファイルに転送した。画像から、ポリ（ダイマー酸コアルキルアミン）−９５で被覆したスライドを用いて１８ｐＭの標的を検出できることが認められた。
【０１８５】
スライド番号６：このスライドは、野生型標的、変異型標的およびヘテロ接合型標的の、ポリマー−９５で被覆したスライド上での同時検出を示す。図１６（ｇ）を参照されたい。
【０１８６】
スライド番号６の実験手順：修飾スライドを実験直前に０．２％ＳＤＳおよび水で洗浄した。洗浄後、すべてのスライドを室温で遠心により乾燥させた。野生型標的、変異型標的およびヘテロ接合型標的などの異なる種類の試料を異なるウェルにおいて用いて、特異性を試験した。典型的には、３５μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（２×ＳＳＣ、０．２  Ｔｗｅｅｎ）、５μｌの水、５μｌの標的、１０μｌのコロイドを各ウェルについて混合し、９７℃で加熱し、次いで室温で３分間冷却した。次に、ピペットを用いてスライド上の個々のウェルに一定分量を移した。陽性対照については、プローブと捕捉体とのハイブリダイゼーションであるので、標的の代わりに水を用いた。４０℃で１２０分間のハイブリダイゼーション後、スライドを５ＭのＮａＮＯ３で洗浄し、市販の銀増幅溶液を用いて室温で４分間増幅した。次いで、水で２回洗浄し、スライドを遠心により乾燥させた。スライドをＶＥＲＩＧＥＮＥ（ナノスフェアー画像化システム）で画像化し、この画像をワード・ファイルに転送した。
【０１８７】
スライド番号７：捕捉体とプローブとの直接ハイブリダイゼーション・アッセイを用いて、ポリマー−９５で被覆したスライドを市販のＣｏｄｅｌｉｎｋ（登録商標）（アマシャムコーポレイション社）と比較した。この実験の結果に基づけば、本発明のポリマー−９５で被覆したスライドは、Ｃｏｄｅｌｉｎｋ（登録商標）スライドとほぼ同じ性能を発揮した。図１６（ｈ）を参照されたい。
【０１８８】
実験手順：この実験では、ポリマーで被覆したスライドをＣｏｄｅｌｉｎｋスライドと比較するために、陽性対照プローブを直接捕捉鎖にハイブリダイズさせた。３５μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（２×ＳＳＣ、０．２  Ｔｗｅｅｎ）に、１５μｌの水、５μｌのコロイドを混合し、各ウェルに添加した。該スライドを湿潤チャンバ内に１時間放
置し、５ＭのＮａＮＯ３溶液で室温にて洗浄し、銀溶液を用いて４分間増幅した。ポリマーで被覆したスライド（ａ）およびＣｏｄｅｌｉｎｋ（ｂ）スライドガラスは共に、ハイブリダイゼーションの点では同様の結果を示した。
【０１８９】
陽性対照および第Ｖ因子のＰＣＲ標的を用いて、１〜７に示したスライド全部を構築した。図１６（ａ）〜（ｉ）に示した結果から、ポリマー−９５で被覆した基材は市販のＣｏｄｅｌｉｎｋ（登録商標）スライドに匹敵すると結論付けられた。しかしながら、アミンが豊富なポリマーで被覆したスライドは金ナノ粒子を用いるアッセイにおいて、比較的高いバックグラウンドを有していた（スライド２（図１６（ｂ））およびスライド４ａ（図１６（ｄ））。結論として、アミンで被覆した表面は金ナノ粒子プローブを用いるアッセイには良好でなく、より良い結果を得るにはブロッキング工程を必要とした。
【０１９０】
ＰＣＲ産物の検出が完了した後、ポリマー−９５で被覆したスライドを用いたワンステップ工程のアッセイ形式で、ゲノム標的の第Ｖ因子および第ＩＩ因子の検出を試みた。ゲノム標的を用いたすべての結果を以下に示す。
【０１９１】
使用した捕捉体：
ＦＶゲノムＷＴ−５’−ＴＧＧ  ＡＣＡ  ＧＧＣ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＴＡＣ  ＡＧＧ  ＴＡＴ−ＮＨ２−３’
ＦＶゲノムＭｕｔ−５’−ＣＴＧ  ＧＡＣ  ＡＧＧ  ＣＡＡ  ＧＧＡ  ＡＴＡ  ＣＡＧ
ＧＴＡ  ＴＴ−ＮＨ２−３’
使用した検出プローブ
ＦＶ  Ｅｐｉ  Ｐｒｏ４６−５’ｅｐｉ−ＣＣＡ  ＣＡＧ  ＡＡＡ  ＡＴＧ  ＡＴＧ  ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＧＣＴ  ＴＡＡ  ＣＡＡ  ＧＡＣ  ＣＡＴ  ＡＣＴ  ＡＣＡ  ＧＴＧ  Ａ  ３’
スライドＧ１〜Ｇ３についての実験手順：修飾スライドを実験直前に０．２％ＳＤＳおよび水で洗浄した。洗浄後、すべてのスライドを室温で遠心して乾燥させた。典型的には、３５μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（２×ＳＳＣ、０．２  Ｔｗｅｅｎ）、５μｌのホルムアミド、５ｍｌのゲノム標的（４ｍｇ／ｍｌ）、２ｍｌの塩化マグネシウム（２４．５ｍＭ）、１０ｍｌのコロイドを各ウェルについて混合し、９７℃で加熱し、室温で５分間冷却した。対照はすべて、標的ＤＮＡの代わりに水を用いて調製した。次いで、ピペットを用いてスライド上の個々のウェルに一定分量を移した。４０℃で１２０分間のハイブリダイゼーション後、スライドを５ＭのＮａＮＯ３で洗浄し、市販の銀増幅溶液を用いて室温で４分間増幅した。次いで、処理したスライドを水で２回洗浄し、スライドを遠心して乾燥させた。スライドをＶＥＲＩＧＥＮＥ（ナノスフェアー画像化システム）で画像化し、この画像をＭＳ（登録商標）ワード・ファイルに転送した。「Ｔ」と記された場合、そのウェルでは標的が用いられ、「Ｃ」と記された場合は対照が用いられた。
【０１９２】
スライドＧ１：ゲノムＤＮＡの第Ｖ因子（５μｇ／μｌ試料）の検出であり、計２０μｇの試料をアッセイに用いた。アッセイを４０℃で実施したが、変異型および野生型のいずれのハイブリッドも４０℃を超える融点を有するので、変異型および野生型いずれの捕捉体もシグナルを示した。図１６（ｊ）を参照されたい。
【０１９３】
スライドＧ２：ゲノムＤＮＡの第Ｖ因子（５μｇ／μｌ試料）の検出であり、計２０μｇの試料をアッセイに用いた。アッセイを４０℃で実施し、変異型および野生型いずれの捕捉体も４０℃で出現した。図１６（ｋ）を参照されたい。
【０１９４】
スライドＧ３：２倍希釈したゲノムＤＮＡ試料の検出（２．５μｇ／μｌ試料）であり、計１０μｇのゲノムＤＮＡを各ウェルに用いた。図１６（Ｌ）を参照されたい。
スライドＧ４：ゲノムＤＮＡの第Ｖ因子（５μｇ／μｌ試料）の検出であり、計２０μ
ｇの試料をアッセイに用いた。アッセイを４７℃および４７℃以上で実施した。写真に見られるように、標的が変異型捕捉体に非常に弱く結合した図１６（ｍ）の温度を参照されたい。
【０１９５】
スライドＧ４〜Ｇ５の実験手順：修飾スライドを実験直前に０．２％ＳＤＳおよび水で洗浄した。洗浄後、すべてのスライドを室温で遠心して乾燥させた。典型的には、３５μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（２×ＳＳＣ、０．２  Ｔｗｅｅｎ）、５μｌのホルムアミド、５μｌの第Ｖ因子ゲノム標的（４μｇ／ｍｌ）、２μｌの塩化マグネシウム（２４．５ｍＭ）、１０μｌのコロイドを各ウェルについて混合し、９７℃で加熱し、室温で５分間冷却した。対照はすべて標的ＤＮＡの代わりに水を用いて調製した。次いで、ピペットを用いてスライド上の個々のウェルに一定分量を移した。４７℃で１２０分間のハイブリダイゼーション後、スライドを５ＭのＮａＮＯ３で洗浄し、市販の銀増幅溶液を用いて室温で４分間増幅した。次いで、水で２回洗浄し、スライドを遠心することによって乾燥させた。スライドをＶＥＲＩＧＥＮＥ（ナノスフェアー画像化システム）で画像化し、この画像をワード・ファイルに転送した。「Ｔ」と記された場合はそのウェルに標的を用い、「Ｃ」と記された場合は対照を用いた。ここで、４７℃において野生型捕捉体と変異型捕捉体とを区別することができた。
【０１９６】
スライドＧ５：ゲノムＤＮＡの第Ｖ因子（５μｇ／ｍｌ試料）の検出であり、計２０μｇの試料をアッセイに用いた。アッセイを４７℃で実施したが、ここでは変異型捕捉体は出現せず、野生型捕捉体はシグナルを示した。図１６（ｎ）を参照されたい。
【０１９７】
スライドＧ６：ゲノムＤＮＡの第ＩＩ因子（５μｇ／ｍｌ試料）の検出であり、計２０μｇの試料をアッセイに用いた。ゲノムＤＮＡの第ＩＩ因子（５μｇ／ｍｌ試料）。図１６（ｏ）を参照されたい。
【０１９８】
スライドＧ６の実験手順：修飾スライドを実験直前に０．２％ＳＤＳおよび水で洗浄した。洗浄後、すべてのスライドを室温で遠心して乾燥させた。典型的には、３５μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（２×ＳＳＣ、０．２  Ｔｗｅｅｎ）、５μｌのホルムアミド、５ｍｌのゲノム標的（４μｇ／μｌ）、２μｌの塩化マグネシウム（２４．５ｍＭ）、１０μｌの第ＩＩ因子コロイドを各ウェルについて混合し、９７℃で加熱し、室温で５分間冷却した。次いで、ピペットを用いてスライド上の個々のウェルに一定分量を移した。４０℃で１２０分間のハイブリダイゼーション後、スライドを５ＭのＮａＮＯ３で洗浄し、銀を用いて室温で４分間増幅した。次いで、水で２回洗浄し、スライドを遠心することによって乾燥させた。スライドをＶＥＲＩＧＥＮＥ（ナノスフェアー画像化システム）で画像化し、この画像をワード・ファイルに転送した。「Ｔ」と記された場合はそのウェルに標的を用い、「Ｃ」と記された場合は対照を用いた。標的ＤＮＡの代わりに水を用いてすべての対照を調製した。この結果を図１６（ｊ）〜（ｏ）に示した。
【０１９９】
結論として、本発明者らは、新しく開発されたコポリマー−９５で被覆した表面上で、オリゴヌクレオチド修飾された金ナノ粒子プローブを用いて第Ｖ因子のＰＣＲ試料およびゲノム試料のいずれの標的の検出も実証した。この表面処理は商業上必要な環境で製造するのに簡単で経済的である。
【実施例１１】
【０２００】
３’アミン修飾ＤＮＡが結合した金ナノ粒子の合成（図１７）
グレンリサーチ社（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の３’アミン支持体を用いて、ｅｘｐｅｄｉｔｅ（登録商標）遺伝子合成装置で３’アミン結合オリゴヌクレオチドを合成した。合成終了時、脱トリチル化工程を用いずに５’末端エピアンドロステロン（「ｅｐｉ」）ジスルフィドホスホロアミダイトを３’アミンオリゴヌクレオチドに結合させた。合
成完了後、オリゴヌクレオチドが結合した固体支持体を乾燥させ、５５℃のアンモニア溶液中に一晩置いた。１８時間の脱保護の後、チューブ内への窒素流を用いてアンモニアを溶液からチューブに取り除いた。次いでこれを濾過し、ｐＨ７のリン酸緩衝液の条件下で逆相カラムを用いてＨＰＬＣで精製した。精製後、３’−アミンおよび５’−エピジスルフィド結合オリゴヌクレオチドをＵＶ−ＶＩＳ分光分析によって定量した。３’−アミンおよび５’−エピジスルフィドオリゴヌクレオチドをクエン酸修飾金ナノ粒子に装荷し、暗所にて室温で２４時間放置した（１ｍＬ当たり４μＭの修飾オリゴヌクレオチドを装荷）。本明細書にその全体を援用する、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第１２０巻、ｐ．１９５９〜１９６４；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１１巻、第２号、ｐ．２８９〜２９１を参照されたい。次いで、塩の添加を開始し、６時間かけて０．５Ｍまで上昇させ、その塩条件で暗所にて室温で計４０時間放置した。４０時間後、３’アミン結合金ナノ粒子を濾過し、プラスチック製チューブを用いて遠心分離した。次いで、該試料を水で洗浄し、０．１ＭのＮａＣｌ、１０ｎＭのリン酸、０．０１％アジドのｐＨ７の緩衝液に再懸濁させた。得られたＤＮＡ修飾金ナノ粒子プローブを０．１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸および０．０１％アジ化ナトリウムのｐＨ７の緩衝液中に保存した。
【０２０１】
次いで、これらの３’アミン修飾ＤＮＡが結合した金ナノ粒子を、カルテシアン（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ）のアレイヤーを用いて、アルデヒド修飾ガラス表面上に異なる濃度で固定化のためにスポッティングした（実施例１３を参照）。スポッティング後、スライドをチャンバ内に８〜１２時間置き、水で洗浄し、銀で増幅し、固定化した金ナノ粒子のシグナルの増幅を確かめた（図１７）。
【実施例１２】
【０２０２】
３’−シリル結合金ナノ粒子調製物の合成：（図１８）
グレンリサーチ社から入手した３’−アミン支持体材料を用いて、ｅｘｐｅｄｉｔｅ（登録商標）遺伝子合成装置で３’−アミン結合ヌクレオチドを合成した。合成の終了時、脱トリチル化工程を用いずに５’末端エピジスルフィドホスホロアミダイトを３’−アミンオリゴヌクレオチドに結合させた。合成完了後、オリゴヌクレオチドが結合した該固体支持体を乾燥させ、５５℃のアンモニア溶液中に一晩置いた。１８時間の脱保護後、チューブ内への窒素流を用いてアンモニアをすべて溶液から取り除いた。次いでこれを濾過し、ｐＨ７のリン酸緩衝液の条件下で逆相カラムを用いてＨＰＬＣで精製した。精製後、３’−アミンおよび５’−エピアンドロステロンジスルフィド結合オリゴヌクレオチドをＵＶ分光分析によって定量した。精製した「３’アミン−５’エピアンドロステロン」オリゴヌクレオチドをＥｔＯＨ／ＤＭＳＯ混合物中の３−イソシアナトプロピルトリエトキシシランを用いて室温で処理し、３’シリル結合および５’−エピジスルフィドオリゴヌクレオチドを得た。１時間後、該反応混合物を蒸発乾固させた。
【０２０３】
３’シリル結合および５’−エピジスルフィドオリゴヌクレオチドをクエン酸修飾金ナノ粒子に装荷し、暗所にて室温で２４時間放置した（１ｍＬ当たり４μＭの修飾オリゴヌクレオチドを装荷）。塩の添加を開始し、６時間かけて０．５Ｍまで上昇させ、その塩条件で暗所にて室温で計４０時間放置した。次いで、該３’アミン結合金ナノ粒子を濾過し、プラスチック製チューブを用いて遠心分離した。次いで、該試料を水で洗浄し、０．１ＭのＮａＣｌ、１０ｎＭのリン酸、０．０１％アジドのｐＨ７の緩衝液に再懸濁させた。
【実施例１３】
【０２０４】
３’アミン結合金ナノ粒子および３’シリル結合金ナノ粒子をスライドガラス上へプリントする手順
３’シリル結合ＤＮＡで修飾された金ナノ粒子および３’−アミンで修飾された金ナノ粒子（ＤＳＰ）を二成分系の一部としてスライド上にアレイ化した。成分Ａには、プロー
ブ保存緩衝液（１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７）中の１００ｍＭ塩化ナトリウム）中に最終濃度×２のＤＳＰを含めた。成分Ｂには、２×テレケム（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ）のマイクロスポッティングプラス緩衝液（カタログ番号：ＭＳＰ、テレケム・インターナショナル（ＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））を含めた。アレイ作製に用いたガラス基材のスライドは、ノアブ・バイオディスカバリー（Ｎｏａｂ  ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ）社から入手したノアブ（Ｎｏａｂ）ハイドロゲルアルデヒド活性化スライド（カタログ番号ＵＡＳ０００５ＨＡ）であった。
【０２０５】
カルテシアン（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ）のＰｒｏＳｙｓ（商標）４５１０−８ＳＱアレイヤーを用いて、スライドをアレイ化した。アレイ化処理中の室温は２０〜２５℃とし、スライドにスポッティング中のアレイヤー内の相対湿度は２５％〜４０％の相対湿度とした。アレイ化作業が終了して１時間後、スライドを相対湿度８５％以上の密封チャンバ内で８〜１８時間インキュベートした。該スライドを少なくとも１時間（ただし、２４時間未満）減圧乾燥させ、０．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＤＮＡｓｅ、ＲＮａｓｅ、プロテアーゼを含まず、０．２μｍで濾過したもの）を用いて２分×２回洗浄し、ＭｉｌｌｉＱ水で２分×２回洗浄した。該スライドを遠心分離して乾固させ（約１分）、使用するまでデシケータ（相対湿度＜３０％）に保存した。
【０２０６】
使用した銀増幅処理は次のようなものである。すなわち、増幅前に、シグマ（Ｓｉｇｍａ）の銀溶液ＡおよびＢを４℃から２５℃の水槽に移し、少なくとも２０分間平衡化した。等量のシグマＡおよびＢを混合し、これを用いて２〜７分間、シグナルを増幅した。５％酢酸を添加してこの反応を止め、酢酸で濯ぎ（３回）、最後にスライドをＭｉｌｌｉＱ水で濯いだ（４回）。スライドを４５秒間遠心して乾燥させ、ＡｒｒａｙＷｏｒｘ（登録商標）Ｅバイオチップ・リーダーで走査した。
【０２０７】
ＡｒｒａｙＷｏｒｘの走査設定は、チャネル：４、曝露時間：０．２秒、感度：ハイ・ダイナミック・レンジ、解像度：１３．００８０ｕｍとした（図１９および２０））。図１９では、各調製物について３．５ｎＭで始まる４種の希釈液をスポッティングした。トリエトキシ体（「トリエトキシ」）は一層大きなシグナルおよび用量反応を生じているように思われる。キャリー・オーバーは観察されなかった。右側のスポットを分析し、データとして示す。左側のスポットは分析しなかった。
【０２０８】
図２０では、「０．８Ｍ」はプローブが０．８Ｍの塩条件で装荷されたことを意味し、「０．５Ｍ」はプローブが０．５Ｍの塩条件で装荷されたことを意味する。トリエトキシ（ＴｒｉＥｔｈｏｘｙ）はトリエトキシシリル結合金ナノ粒子を意味し、モノエトキシ（ｍｏｎｏｅｔｈｏｘｙ）はジメチルモノエトキシシリル結合金ナノ粒子を意味する。上記は８枚のスライドからの全データの平均を示す。（シグナル中の）スライド毎のばらつきが非常に大きいので、エラーバーを示していない。しかし、同じ傾向は観察された。全ての条件において用量反応が観察されたが、トリエトキシ体が有意に高いシグナルを有していた。
【実施例１４】
【０２０９】
別の基材の製造および評価
この実施例では、いくつかの別の基材を製造および評価した。使用した試薬および条件を以下に記載する。
【０２１０】
スライドガラス（１ａ）の洗浄：
スライドガラスを、周囲温度の４種の別個の溶液に浸漬することによって洗浄および調製した後、各々の洗浄の後に水で３回濯いだ。まず、スライドを５％（重量／容量）の水酸化ナトリウム水溶液に３０分間入れた。次いで、該スライドを５％（容量／容量）の塩
酸溶液で３０分間洗浄し、続いて３％過酸化水素：５％（容量／容量）塩酸溶液（Ｈ２Ｏ２：ＨＣｌ）で３０分間洗浄した。水で濯いだ後、該スライドをエタノールで３回濯ぎ、スライド遠心分離器を用いて遠心して乾燥させた。空気乾燥させた後、該スライドを１２０℃のオーブンに一晩入れた。
【０２１１】
プラスチック製スライド（１ｂ）の洗浄：
プラスチック製スライドを、周囲温度の４種の別個の溶液に浸漬することによって洗浄および調製した後、各洗浄の後に水で３回濯いだ。まず、該スライドをエタノール溶液で３０分間洗浄し、続いて５％（重量／容量）の重炭酸ナトリウム水溶液中で３０分間洗浄した。次いで、該スライドを５％（容量／容量）の塩酸溶液で３０分間洗浄し、続いて３％過酸化水素：５％（容量／容量）塩酸溶液（Ｈ２Ｏ２：ＨＣｌ）で３０分間洗浄した。水で濯いだ後、該スライドをエタノールで３回濯ぎ、スライド遠心分離器を用いて遠心して乾燥させた。空気乾燥させた後、該スライドをデシケータに入れた。プラスチックは、ポリカーボネート（Ｌｅｘａｎ（登録商標）、Ｐｌｅｘｉｇｌａｓｓ（登録商標））、ポリフェノール（Ｂａｃｋｌｉｔｅ（登録商標））、および多環式ノルボルネンである。
【０２１２】
２−トリメトキシシラン−６−（トリイソシアナトシランウレア）ベンゼン（４）の調製：
テトライソシアナトシラン（２）（６．６６９２ｇ、０．０３４モル）およびｍ−アミノフェニルトリメトキシシラン（３）（７．２９５４ｇ、０．０３４２モル）を混合し、室温で２０分間攪拌した。該溶液に乾燥エタノール（８５０ｍＬ）を添加し、室温でさらに４５分間攪拌して（４）を得た。（４）を溶液のままにしておき、スライドに添加した。
【０２１３】
（４）を用いたスライドガラス（５ａ）のシラン化：
０．０４Ｍの（４）｛（２−トリメトキシシラン−６−トリイソシアナトシランウレア）ベンゼン｝２５０ｍＬを用いて、軽く掻き混ぜながらスライドガラス（２５）を周囲温度で２時間処理した。次いで、該スライドガラスを取り出し、エタノールで３回洗浄し、スライド遠心分離器を用いて遠心して乾燥させ、（５ａ）を得た。該基材（５ａ）をデシケータでさらに一晩減圧乾燥させた。
【０２１４】
（４）を用いたプラスチック製スライド（５ｂ）のシラン化：
０．０４Ｍの（４）｛（２−トリメトキシシラン−６−トリイソシアナトシランウレア）ベンゼン｝３００ｍＬをそれぞれ用いて、２個の容器に入れたプラスチック製スライド（６５）を、軽く掻き混ぜながら周囲温度で２時間処理した。次いで、該スライドを取り出し、エタノールで３回洗浄し、スライド遠心分離器を用いて遠心して乾燥させ、（５ｂ）を得た。該基材（５ｂ）をデシケータでさらに一晩減圧乾燥させた。
【０２１５】
５ａ（ガラス）および５ｂ（プラスチック）をジアミノベンジジン（ＤＡＢ）と反応させて６ａ（ガラス）および６ｂ（プラスチック）を製造する工程：
３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド二水和物（８．９ｇ，０．０２２５モル）およびトリエチルアミン（１１．８４ｇ、０．１１７モル）（ＴＥＡ）を８３４ｍＬのエタノールに添加し、室温で１時間攪拌し、濾過した。２５枚のシリル化スライドガラスを周囲温度の２５０ｍＬのＤＡＢ溶液に３時間入れ、次いでエタノールで５分間にわたって３回洗浄し、続いてスライド遠心分離器を用いて遠心して乾燥させ、６ａを製造した。２つの容器中の６５枚のプラスチック製スライドを各々３００ｍＬおよび２５０ｍＬのジアミノベンジジン（ＤＡＢ）溶液で周囲条件にて３時間処理した。該プラスチック製スライドをエタノール（３回）で５分間各々洗浄し、続いてスライド遠心分離器を用いて遠心して乾燥させ、６ｂを得た。
【０２１６】
５ｂ（プラスチック）を水：エタノールと反応させて６ｃ（プラスチック）を製造する工程：
スライド（５ｂ）を、１３０ｍＬの水／エタノール混合物（１：１）を用いて、軽く掻き混ぜながら周囲温度で２時間処理した。該スライドを取り出し、エタノール（２×１００ｍＬ）で洗浄し、周囲温度にてデシケータで減圧乾燥させて６ｃを得た。
【０２１７】
６ａ（ガラス）および６ｂ（プラスチック）の残存イソシアネート基をグリシンでキャッピングして７ａ（ガラス）および７ｂ（プラスチック）を製造する工程：
グリシン（６．３８ｇ、０．０８５モル）を８５０ｍＬの水に添加し、周囲温度で１５分間攪拌して０．１Ｍグリシン溶液を作製した。２５枚のスライドガラス（６ａ）およびプラスチック製スライド（６ｂ）を、周囲温度の前記０．１Ｍグリシン溶液中に、軽く掻き混ぜながら２時間置いた。該スライドを水（２回）で５分間洗浄し、続いてエタノール（３回）で各々５分間洗浄し、スライド遠心分離器を用いて遠心して乾燥させ、７ａ（ガラス）および７ｂ（プラスチック）を得た。
【０２１８】
７ａ（ガラス）および７ｂ（プラスチック）をトリレン−２，６−ジイソシアネートと反応させて８ａ（ガラス）および８ｂ（プラスチック）を製造する工程：
０．２６２４ｇ（０．００１４６モル）のトリレン−２，６−ジイソシアネートに、８５０ｍＬの乾燥ヘキサンを添加し、周囲条件下で１５分間攪拌した。２４枚のスライドガラス（７ａ）を２５０ｍＬのトリレンジイソシアネート溶液中に入れ、６４枚のプラスチック製スライド（７ｂ）はそれぞれ３００ｍＬおよび２５０ｍＬの２つの別個の容器中で、周囲温度で４時間放置した。該スライドをヘキサン（３回）で洗浄し、スライド遠心分離器を用いて遠心して乾燥させ、８ａ（ガラス）および８ｂ（プラスチック）を得た。注意：類似の工程においては、トリレン−２，６−ジイソシアネートを１，４−フェニレンジイソシアネートに代えた。
【０２１９】
７ａ（ガラス）を１，４−フェニレンジイソシアネートと反応させて８ｃ（ガラス）を製造する工程：
１，４−フェニレンジイソシアネート（０．０９５ｇ、０．０００５９４Ｍ）を２５０ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（０．００２４ｍｏｌ／Ｌ溶液）に添加し、室温で１５分間攪拌した。該ジイソシアネート溶液に２５枚のスライドガラス（７ａ）を入れ、室温で３時間放置した。終了後、スライドをＤＭＦで１回、エタノール（各５分ずつ）洗浄し、スライド遠心分離器を用いて遠心して乾燥させ、８ｃを得た。
【０２２０】
８ａ（ガラス）をポリ（ダイマー酸コポリアミン）−９５（Ｐ９５）と反応させて９ａ（ガラス）を製造する工程：
ポリ（ダイマー酸コポリアミン）−９５（３．０ｇ）を、２２５ｍＬのピリジンおよび３５ｍＬのジクロロメタンの混合物に添加し、周囲温度で１．５時間攪拌した。周囲温度で軽く掻き混ぜながら２４枚のスライドガラス（８ａ）をポリマー溶液で４時間処理した。次いで、該スライドをピリジンで５分間（２×２５０ｍＬ）、ジクロロメタンで５分間（１×２５０ｍＬ）、エタノールで５分間（１×２５０ｍＬ）、ジイソプロピルエチルアミン：エタノール：水の溶液（５：１２７：１２７ｍＬ比）で２時間、その後エタノールで５分間（３×２５０ｍＬ）洗浄した。スライドをスライド遠心分離器で遠心して乾燥させ、９ａを得た。
【０２２１】
８ｂ（プラスチック）を３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド二水和物（ＤＡＢ）と反応させて９ｂ（プラスチック）を製造する工程：
３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド二水和物（１．０７ｇ、０．００２７モル）およびトリエチルアミン（ＴＥＡ）（１．４２０７ｇ、０．０１４モル）を２７０ｍＬのエタノールに添加し、周囲温度で１時間攪拌し、濾過した。１５枚のプラスチ
ック製スライド（８ｂ）を溶液に入れ、軽く掻き混ぜながら温度で４時間放置した。次いで、該スライドをエタノールで３回（各５分ずつ）洗浄し、スライド遠心分離器を用いて遠心して乾燥させ、９ｂを得た。
【０２２２】
８ｂ（プラスチック）を第０世代ＰＡＭＡＭデンドリマーと反応させて９ｃ（プラスチック）を製造する工程：
ＰＡＭＡＭ（０．５８ｍＬ）の２０％メタノール溶液を１５０ｍＬのエタノールに添加し、周囲温度で３０分間攪拌した。５枚のスライドをこの溶液に入れ、軽く掻き混ぜながら４時間処理した。次いで、スライドをエタノールで３回（各５分ずつ）洗浄し、スライド遠心分離器を用いて遠心して乾燥させ、９ｃを得た。
【０２２３】
８ｂ（プラスチック）をポリ（ｍ−キシリレンジアミン−エピクロロヒドリン）、ジアミン末端（ＰｏＸｙｌ）と反応させて９ｄ（プラスチック）を製造する工程：
ＰｏＸｙｌ（４．１９ｇ、０．００６２４モル）を５２０ｍＬのエタノールに添加し、室温で２０分間攪拌した。４４枚のプラスチック製スライドをこの溶液に入れた。軽く掻き混ぜながらスライドを４時間処理した。次いで、スライドをエタノールで３回（各５分ずつ）洗浄し、スライド遠心分離器を用いて遠心して乾燥させ、９ｄを得た。一晩減圧乾燥させた。
【０２２４】
５ｂ（プラスチック）をＤＡＢ−Ａｍ−８、ポリプロピレンイミンオクタアミンデンドリマー第２．０世代と反応させて９ｅ（プラスチック）を製造する工程：
ポリプロピレンイミンオクタアミン（０．６０ｇ、０．０００７７５Ｍ、ＭＷ＝７７３．３１ｇ／モル）を１２５ｍＬのエタノールに添加し、周囲温度で３０分間攪拌した。８枚のシリル化スライド（５ｂ）をポリアミン溶液と周囲温度で２時間反応させた。該スライドをエタノールで３回（３×１００ｍＬ、各５分ずつ）洗浄し、スライド遠心分離器を用いて遠心して乾燥させた。
【０２２５】
８ｃ（ガラス）をポリ（ダイマー酸コポリアミン）−９５（Ｐ９５）と反応させて９ｆ（ガラス）を製造する工程：
ポリ（ダイマー酸コポリアミン）−９５（３．０ｇ）を、２２５ｍＬのピリジンおよび３５ｍＬのジクロロメタンの混合物に添加し、周囲温度で１．５時間攪拌した。該Ｐ９５溶液中に２５枚のスライド（８ｃ）を３時間入れた。次いで、スライドをピリジン（２回、各々５分ずつ）、ジクロロメタン（５分）、エタノール（５分）、トリエチルアミン：エタノール溶液（５ｍＬ：２２５ｍＬ）で２時間洗浄し、最後にエタノール（３回、各５分ずつ）で濯いだ。該スライドを、スライド遠心分離器を用いて遠心して乾燥させ、９ｆを得た。
【０２２６】
５ａ（ガラス）をポリ（ダイマー酸コポリアミン）−９５（Ｐ９５）と反応させて９ｇ（ガラス）を製造する工程：
ポリ（ダイマー酸コポリアミン）−９５（１．５ｇ）を１５０ｍＬのピリジン／ジクロロメタン混合物（５：１）に添加し、周囲温度で１．５時間攪拌した。該Ｐ９５溶液にスライド（５ａ）を入れ、室温で４．５時間放置した。次いで、スライドをピリジン（各５分間）、ジクロロメタン（２×５分間）、エタノール（３×５分間）で洗浄した。該スライドを、スライド遠心分離器を用いて遠心して乾燥させ、９ｇを得た。
【０２２７】
９ａ（ガラス）をヘキサメチレンジイソシアネート（ＤＣＨ）と反応させて１０ａ（ガラス）を製造する工程：
ヘキサメチレンジイソシアネート（ＤＣＨ）２２．８９１ｇ（０．１３６１モル）を２０８ｍＬのヘキサンに添加し、周囲条件で１５分間攪拌した。１５枚のスライド（９ａ）を、軽く掻き混ぜながらＤＣＨ溶液で５時間処理した。該スライドをヘキサン（２×２５
０ｍＬ）およびエタノール（２×２５０ｍＬ）で洗浄した。スライドを、スライド遠心分離器を用いて遠心して乾燥させ、デシケータ内で保存して１０ａを得た。
【０２２８】
９ａ（ガラス）をクエン酸トリエチルと反応させて１０ｂ（ガラス）を製造する工程：
クエン酸トリエチル（４．４２１ｇ、０．０１６モル）および３．４８ｍＬのジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を２２８ｍＬのエタノールに添加し、室温で１５分間攪拌した。１４枚のスライドガラス９ａを、軽く掻き混ぜながらクエン酸溶液で５時間処理した。該スライドをエタノール（３×２５０ｍＬ）で洗浄し、スライド遠心分離器を用いて遠心して乾燥させた。
【０２２９】
９ａ（ガラス）、９ｂ（プラスチック）、９ｃ（プラスチック）、９ｄ（プラスチック）を４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート（ＨＭＤＩ）と反応させてそれぞれ１０ｅ（ガラス）、１０ｆ（プラスチック）、１０ｇ（プラスチック）、１０ｈ（プラスチック）を製造する工程：
９ａ〜９ｄのプラスチックおよびガラスの組み合わせから、６２枚のプラスチック製および２３枚のガラス製スライド用に、４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート（ＨＭＤＩ）の溶液を調製した。ＨＭＤＩ（７７．６４ｇ、０．２９６モル）および１０５０ｍＬのヘキサン（０．２６モル／Ｌ）を組み合わせ、室温で１５分間攪拌した。２つの容器に入った６２枚のプラスチック製スライドを、３００ｍＬおよび２５０ｍＬのＨＭＤＩ溶液で処理し、別個の容器に入った２３枚のガラス製スライドを２５０ｍｌのＨＭＤＩ溶液で周囲温度にて６時間処理した。該スライドをヘキサンで３回、エタノールで１回洗浄し、スライド遠心分離器を用いて遠心して乾燥させ、１０ｅ（ガラス）、１０ｆ、１０ｈ、１０ｇ（プラスチック）を得た。
【０２３０】
６ｃ（プラスチック）を１，６−ヘキサメチレンジイソシアネート（ＤＣＨ）と反応させて１０ｉ（プラスチック）を製造する工程：
１，６−ヘキサメチレンジイソシアネート（１３．０８ｇ）および７５ｍＬの乾燥エタノールを周囲温度で共に混合した。その後５枚のスライド（６ｃ）を垂直型スライド染色ディッシュに入れ、軽く掻き混ぜながらＤＣＨ溶液で４時間処理した。該スライドをエタノール（３×５０ｍＬ）で洗浄し、遠心して乾燥させた。
【０２３１】
６ｃ（プラスチック）をクエン酸トリエチルと反応させて１０ｊ（プラスチック）を製造する工程：
クエン酸トリエチル（２７．６ｇ）およびトリエチルアミン（３．０３ｇ）を７５ｍＬのエタノールに添加し、１５分間攪拌した。（６ｃ）のスライド５枚を、軽く掻き混ぜながらクエン酸溶液で周囲温度にて２４時間処理した。該スライドをエタノールで３回（３×５０ｍＬ）洗浄し、スライド遠心分離器を用いて遠心して乾燥させた。
【０２３２】
９ｅ（プラスチック）をヘキサメチレンジイソシアネート（ＤＣＨ）と反応させて１０ｋ（プラスチック）を製造する工程：
１，６−ヘキサメチレンジイソシアネート（ＤＣＨ）（１０．０１ｇ、０．０６０Ｍ）を１２０ｍＬの乾燥エタノールに添加し、周囲温度で完全に混合した。８枚のスライド（９ｅ）を掻き混ぜながらＤＣＨ溶液で周囲温度にて５時間処理した。該スライドをエタノールで３回（３×１００ｍＬ）洗浄し、スライド遠心分離器を用いて遠心して乾燥させた。
【０２３３】
９ｆ（ガラス）を１，６−ヘキサメチレンジイソシアネートと反応させて１０Ｌ（ガラス）を製造する工程：
１１０ｍＬのＥｔＯＨ中の１，６−ヘキサメチレンジイソシアネート（９．９ｍＬのエタノール中に１０．１ｇ）の０．５Ｍ溶液１０ｍＬが入った垂直型スライド染色ディッシ
ュに４枚のスライド（９ｆ）を入れた。スライドをジイソシアネートで周囲温度にて５時間処理した。スライドを取り出し、エタノールで３回洗浄し、スライド遠心分離器を用いて遠心して乾燥させ、１０Ｌを得た。
【０２３４】
９ｆ（ガラス）を４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート（ＨＭＤＩ）と反応させて１０ｍ（ガラス）を製造する工程：
６１ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート（ＨＭＤＩ）（９．１８ｇ／８．６ｍＬ（０．０３５Ｍ）の０．５０Ｍ溶液７０ｍＬが入った垂直型スライド染色ディッシュ中に、４枚のスライド（９ｆ）を周囲温度で５時間置いた。スライドを取り出し、ＤＭＦで３回洗浄し、スライド遠心分離器を用いて遠心して乾燥させ、１０ｍを得た。
【０２３５】
９ｆ（ガラス）を４，４’−メチレンジフェニルジイソシアネート（ＭＤＩ）と反応させて１０ｎ（ガラス）を製造する工程：
７０ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の４，４’−メチレンジフェニルジイソシアネート（ＭＤＩ）（８．７６ｇ、０．０３５モル）の０．５０Ｍ溶液７０ｍＬが入った垂直型スライド染色ディッシュ中に、４枚のスライド（９ｆ）を周囲温度で５時間置いた。スライドを取り出し、ＤＭＦで３回洗浄し、スライド遠心分離器を用いて遠心して乾燥させ、１０ｎを得た。
【０２３６】
９ｆ（ガラス）を反応させて１０ｏ（ガラス）を製造する工程：
１０１ｍＬのエタノール中のクエン酸トリエチル（Ｔ）（１６．５８ｇ、０．００６モル）の０．５０Ｍ溶液１２０ｍＬおよびのトリエチルアミン（ＴＥＡ）（３．３３ｇ、０．０３４Ｍ）が入った垂直型スライド染色ディッシュ中に、４枚のスライド（９ｆ）を入れた。スライドを室温で２４時間放置し、エタノールで３回洗浄し、スライド遠心分離器を用いて遠心して乾燥させ、１０ｏを得た。
【０２３７】
９ｆ（ガラス）をクエン酸トリエチルおよび１，６−ヘキサメチレンジイソシアネートと反応させて１０ｐ（ガラス）を製造する工程：
クエン酸トリエチル（７．４２５ｇ、０．０２７モル）、１，６−ヘキサメチレンジイソシアネート（１．３５ｇ、０．００８モル）およびトリエチルアミン（０．９７ｇ、０．０１０モル）のエタノール溶液６１ｍＬが入った垂直型スライド染色ディッシュ中に、３枚のスライド（９ｆ）を周囲温度で５時間置いた。スライドを取り出し、エタノールで３回洗浄し、スライド遠心分離器を用いて遠心して乾燥させ、１０ｐを得た。
【０２３８】
９ｆ（ガラス）をクエン酸トリエチルおよび４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート（ＨＭＤＩ）と反応させて１０ｑ（ガラス）を製造する工程：
クエン酸トリエチル（７．４２５ｇ、０．０２７モル）、４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート（ＨＭＤＩ）（２．１０ｇ、０．００８モル）およびトリエチルアミン（０．９７ｇ、０．０１０モル）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液６０ｍＬが入った垂直型スライド染色ディッシュ中に、３枚のスライド（９ｆ）を周囲温度で５時間置いた。スライドを取り出し、ＤＭＦで３回洗浄し、スライド遠心分離器を用いて遠心して乾燥させ、１０ｑを得た。
【０２３９】
９ｆ（ガラス）をクエン酸トリエチルおよび４，４’−メチレンジフェニルジイソシアネート（ＭＤＩ）と反応させて１０ｒ（ガラス）を製造する工程：
クエン酸トリエチル（７．４２５ｇ、０．０２７モル）、４，４’−メチレンジフェニルジイソシアネート（ＭＤＩ）（２．０ｇ、０．００８モル）およびトリエチルアミン（０．９７ｇ、０．０１０モル）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液６２ｍＬが入った垂直型スライド染色ディッシュ中に、３枚のスライド（９ｆ）を周囲温度で５時間置いた
。スライドを取り出し、ＤＭＦで３回洗浄し、スライド遠心分離器を用いて遠心して乾燥させ、１０ｒを得た。
【０２４０】
９ｆ（ガラス）をエチレングリコールビス−スクシンイミジルスクシネート（３−ＥＧＳ）と反応させて１０ｓ（ガラス）を製造する工程：
スライド９ｆを、２０ｍＭ（ＤＭＳＯ５０ｍＬ中０．４５６ｇ）のエチレングリコールビス−スクシンイミジルスクシネート（３−ＥＧＳ）ＤＭＳＯ溶液を用いて室温で４時間処理した。次いで、処理したスライドをエタノール：ＤＭＳＯ混合物（９：１）で１回、エタノールで３回洗浄し、乾燥させた。
【０２４１】
９ｆ（ガラス）を１，６ヘキサメチレンジイソシアネートと反応させて１０ｔ（ガラス）を製造する工程：
スライド９ｆを、２６ｍＭ（１００ｍＬのＤＭＳＯ中０．４３６ｇ）の１，６−ヘキサメチレンジイソシアネート溶液を用いて周囲温度で４時間処理した。次いで、処理したスライドをエタノール：ＤＭＳＯ（９：１）混合物で１回、エタノールで３回洗浄し、乾燥させた。
【０２４２】
スライドのアレイ化：
ピン式または非接触式アレイ化システムを用いて、アミン修飾オリゴヌクレオチド捕捉体をアレイ化した。捕捉オリゴヌクレオチドを水溶液に溶解して、（濃度０．００１％〜０．１％の）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ｐＨ＝７．２の３００ｍＭリン酸緩衝液および／またはホルムアミドを用いて、ある濃度範囲（４０ｍＭ〜４００ｍＭ）に調製した。いくつかの異なる種類の捕捉オリゴヌクレオチド配列を、１０〜１００塩基長の５’または３’アミノ修飾配列を用いて調製した。該オリゴヌクレオチドは末端に３’−アミノ修飾リンカー結合していてもよい。
【０２４３】
アレイ化したスライドのブロッキング：
１０枚のスライドを、７０ｍＬの水に溶解したグリシン０．５２５ｇの溶液に入れ、軽く掻き混ぜながら周囲条件で２時間放置した。スライドをＳＤＳ（０．２％）溶液で洗浄し、水で３回洗浄した。スライドを、スライド遠心分離器を用いて２分間乾燥させた。
【０２４４】
修飾スライド用の典型的なハイブリダイゼーション条件−シングル・ステップ法：
アレイ化したスライドをアッセイ実施前に０．２％ＳＤＳで洗浄した。ハイブリダイゼーション緩衝液（１０×ＳＳＣ；０．１％Ｔｗｅｅｎ、ホルムアミド濃度は１８〜７０％）を用いて、ウェル１つ当たり５０Ｌの反応容量を調製した。ナノ粒子プローブ（１ｎＭ）および濃度１μｇ／１μｌのゲノム標的をハイブリダイゼーション混合物に用いた。該ハイブリダイゼーション混合物を９７℃で５分間加熱し、周囲温度で５分間冷却し、次いでウェルに移した。スライドを湿潤条件下で４０℃〜４１℃に保ってハイブリダイゼーションし、次いで緩衝液（０．５ＭのＮａＮＯ３、０．０１％Ｔｗｅｅｎ）で洗浄した。次いで、表面上のナノ粒子を銀増強試薬（シグマアルドリッチ社）に５分間曝露し、Ｖｅｒｉｇｅｎｅ（登録商標）検出器（ナノスフェアー社）を用いて画像化してデータ分析に供した。オリゴヌクレオチドを備えたナノ粒子プローブの開発については別途記載されている。（スルフィド基でオリゴヌクレオチドを官能化し、ナノ粒子へ結合させる方法については、例えば、米国特許出願第２００３／０１４３５９８Ａ１号および同第２００２／０１５５４４２Ａ１号に記載されている。前記文献は各々その全体を本明細書に援用する。オリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合させる好適なスルフィド・リンカーはエピアンドロステロン・リンカーである。その全体を本明細書に援用する２００１年１月１２日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０１１９０号を参照されたい。）。
【０２４５】
各ウェルを適切な文字およびＴ、Ｃ、＋ｖｅ  Ｃ、ＭおよびＨｅｔで印付けした。
Ｔ＝野生型ゲノムＤＮＡ標的を特異的プローブおよびハイブリダイゼーション緩衝液とともに用いた。陽性対照プローブおよび他の標的は使用しなかった。
Ｃ＝ハイブリダイゼーション緩衝液と混合したゲノム・プローブを使用し、いかなる標的も陽性対照プローブも使用しなかった。
＋ｖｅＣ＝ハイブリダイゼーション緩衝液中の陽性対照プローブを使用し、いかなる標的も他のプローブも使用しなかった。
Ｍ＝これらのウェルには、変異型ゲノム標的をハイブリダイゼーション緩衝液および特異的プローブと共に用いた。陽性対照プローブまたは他の標的は使用しなかった。
Ｈｅｔ＝これらのウェルには、ヘテロ接合型ゲノム標的をハイブリダイゼーション緩衝液および特異的プローブと共に用いた。陽性対照プローブまたは他の標的は使用しなかった。
【０２４６】
各ウェルに適切な文字で印をつけた。Ｔ＝これらのウェルにゲノム標的を使用、Ｃ＝対照、標的なし、＋Ｖｅ対照プローブなし、＋ＶｅＣ＝陽性対照プローブ、標的なし、Ｍ＝変異型標的を使用、Ｈｅｔ＝ヘテロ接合型標的を使用。
【０２４７】
修飾スライド用の典型的なハイブリダイゼーション条件−デュアル・ステップ法：
工程１：アレイ化したスライドをアッセイ実施直前に０．２％ＳＤＳで洗浄した。ハイブリダイゼーション緩衝液（１０×ＳＳＣ；０．１％Ｔｗｅｅｎ、ホルムアミド濃度は１８〜７０％）を用いて、ウェル１つ当たり総量５０μＬの反応容量を調製し、ゲノムＤＮＡ標的の濃度は１０２〜１０７コピー／μＬの範囲で変化させた。ハイブリダイゼーション混合物を９５℃で４分間変性させ、周囲温度で３分間冷却した後、個々のウェルに移した。湿潤条件下で、ハイブリダイゼーションするためにスライドを４０℃で２時間インキュベートした。
【０２４８】
工程２：標的のハイブリダイゼーション後、スライドをＮａＮＯ３、Ｔｗｅｅｎで洗浄し、遠心して乾燥させた。プローブ溶液をハイブリダイゼーション混合物と混合し、各ウェルに添加し、湿潤条件下４０℃で３０〜１２０分間インキュベートした。スライドを洗浄緩衝液で洗浄し、銀溶液ＡおよびＢで５分間処理し、Ｖｅｒｉｇｅｎｅ（登録商標）装置を用いてデータ分析のために画像化した。オリゴヌクレオチドを用いたナノ粒子プローブの開発については別途記載されている（スルフィド基でオリゴヌクレオチドを官能化し、ナノ粒子に結合させる方法については、例えば、米国特許出願第２００３／０１４３５９８Ａ１号および同第２００２／０１５５４４２Ａ１号に記載されている。前記文献は各々その全体を本明細書に援用する。オリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合させる好適なスルフィド・リンカーはエピアンドロステロン・リンカーである。その全体を本明細書に援用する２００１年１月１２日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０１１９０号を参照されたい）。
【０２４９】
各ウェルを適切な文字およびＴ、Ｃ、＋ｖｅ  Ｃ、ＭおよびＨｅｔで印付けした。
Ｔ＝野生型ゲノムＤＮＡ標的を特異的プローブおよびハイブリダイゼーション緩衝液とともに用いた。陽性対照プローブおよび他の標的は使用しなかった。
Ｃ＝ハイブリダイゼーション緩衝液と混合したゲノム・プローブを使用し、いかなる標的も陽性対照プローブも使用しなかった。
＋ｖｅＣ＝ハイブリダイゼーション緩衝液中の陽性対照プローブを使用し、いかなる標的も他のプローブも使用しなかった。
Ｍ＝これらのウェルには、変異型ゲノム標的をハイブリダイゼーション緩衝液および特異的プローブと共に用いた。陽性対照プローブまたは他の標的は使用しなかった。
Ｈｅｔ＝これらのウェルには、ヘテロ接合型ゲノム標的をハイブリダイゼーション緩衝液および特異的プローブと共に用いた。陽性対照プローブまたは他の標的は使用しなかった。
【０２５０】
試薬リスト：
ＮａＯＨ−水酸化ナトリウム；ペレット；フィッシャーサイエンティフィック社（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
ＨＣｌ−塩酸、３５〜３８％；フィッシャーサイエンティフィック社
Ｈ２Ｏ２−過酸化水素、３０％；フィッシャーサイエンティフィック社
ＥｔＯＨ−エチルアルコール、２００度数、ＡＣＳ／ＵＳＰ等級；ファルムコ・インコーポレイテッド（Ｐｈａｒｍｃｏ，Ｉｎｃ．）
ＮａＨＣＯ３−重炭酸ナトリウム；フィッシャーサイエンティフィック社
Ｓｉ（ＮＣＯ）４−テトライソシアナトシラン；ゲレスト・インコーポレイテッド（Ｇｅｌｅｓｔ，Ｉｎｃ）
ｍ−アミノフェニルトリメトキシラン、ゲレスト社
ＤＡＢ−３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド二水和物
ＴＥＡ−トリメチルアミン；フィッシャーサイエンティフィック社
ＧＬＹ−グリシン、シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
ＴＤＩＣ−トリレン−２，６−ジイソシアネート、アルドリッチ社（Ａｌｄｒｉｃｈ）
Ｈｘｎ−ヘキサン、フィッシャーサイエンティフィック社
ＰＤＩＣ−１，４−フェニレンジイソシアネート、アルドリッチ社
Ｐ９５−ポリ（ダイマー酸コポリアミン）−９５、シグマアルドリッチ社
ピリジン−シグマアルドリッチ社
ＤＣＭ−ジクロロメタン、フィッシャーサイエンティフィック社
ＤｉＰＥＡ−ジシソプロピルエチルアミン、アルドリッチ社
第０世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、シグマアルドリッチ社
ＰｏＸｙｌ−ポリ（ｍ−キシリレンジアミン−エピクロロヒドリン）、ジアミン末端、アルドリッチ社
ＤＡＢ−Ａｍ−８−ポリプロピレンイミンオクタアミンデンドリマー、第２．０世代、アルドリッチ社
ＤＣＨ−ヘキサメチレンジイソシアネート、シグマアルドリッチ社
Ｔ−クエン酸トリエチル、シグマアルドリッチ社
ＨＭＤＩ−−４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート、アルドリッチ社
ＭＤＩ−４，４’−メチレンジフェニルジイソシアネート、アルドリッチ社
３−ＥＧＳ−エチレングリコールビス−スクシンイミジルスクシネート、ピアース社（Ｐｉｅｒｃｅ）
ＤＭＳＯ−ジメチルスルホキシド、アルドリッチ社
ＳＤＳ−硫酸ドデシルナトリウム、２０％溶液、フィッシャーサイエンティフィック社
ホルムアミド、シグマアルドリッチ社、フィッシャーサイエンティフィック社
２０×ＳＳＣ緩衝液、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、フィッシャーサイエンティフィック社
Ｔｗｅｅｎ２０−ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、シグマアルドリッチ社ＮａＮＯ３−硝酸ナトリウム、シグマアルドリッチ社
銀増強溶液Ａ、シグマアルドリッチ社
銀増強溶液Ｂ、シグマアルドリッチ社
装置および材料
タイマー：フィッシャーサイエンティフィック社のＴｒａｃｅａｂｌｅ（登録商標）タイマー、カタログ番号＃０６−６６２−５５、較正有効期限０６／０５、＃３２０８０８９３５
遠心分離機：テレケム・インターナショナル（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ  Ｉｎｔ’ｌ）、マイクロアレイ高速遠心分離機、カタログ番号＃ＭＨＣ１１０Ｖ
サーミックス（Ｔｈｅｒｍｉｘ）スターラー：フィッシャーサイエンティフィック社、カタログ番号＃１４−４９３−１２０Ｓ、１２０Ｓ型
水銀温度計：フィッシャーサイエンティフィック社、カタログ番号＃１０３６０６、−１０℃〜＋３５０℃、１℃、シリアル番号２１２１
濾紙：ワットマン・インターナショナル社（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｔ，Ｌｔｄ．）、カタログ番号＃１２０２−３２０
【０２５１】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【０２５２】
【図１】本発明の１実施形態を示すスキームの図。該スキームは、３’−アミノまたは５’−アミノのいずれかの修飾を有するオリゴヌクレオチドなどの分子を修飾して、シリル化ＤＮＡ中間体を製造する工程を示している。次いで、このシリル化中間体を、基材、例えばガラス基材の表面上にスポッティングし、洗浄する。
【図２】水またはＤＭＦに溶解したシリル化ＤＮＡを含有するＤＭＦ溶液で基材をスポッティングした後の、スポットの形状を示す図。水溶液を用いた場合にスポットの分枝化および拡散が観察された。
【図３】過剰に水和した基材上にシリル化ＤＮＡ含有ＤＭＦ溶液を用いてスポッティングされたスポットの形状を示す図。過剰に水和した基材ではスポットの分枝化が観察された。
【図４】シリル化ＤＮＡを含まない水溶液（「Ｂｌａｎｋ」対照）およびシリル化ＤＮＡを含んだ水溶液（「Ｓｉｌｙｌ」）のスポットの形状を示す図。
【図５Ａ】本発明の別の実施形態を示すスキームの図。該スキームは、テトライソシアナトシランを１−アミノ−４−トリエトキシシリルベンゼンに結合させて第１の反応性中間体４を形成する工程を示す。次いで、該反応性中間体を３’または５’の遊離アミン基を有するオリゴヌクレオチドに結合させて、３個の分子が結合した第２の反応性中間体としてシリル化ＤＮＡ中間体を得る。次いで、このシリル化中間体を基材、例えばガラス基材の表面上にスポッティングする。
【図５Ｂ】本発明の別の実施形態を示すスキームの図。該スキームは、テトライソシアナトシランを１−アミノ−４−トリエトキシシリルベンゼンに結合させて第１の反応性中間体４を形成する工程を示す。次いで、該反応性中間体を３’または５’の遊離アミン基を有するオリゴヌクレオチドに結合させて、２個の分子が結合した第２の反応性中間体としてシリル化ＤＮＡ中間体を得る。
【図６】実施例１（方法番号１）に記載のように製造したＤＮＡアレイ・チップを用いてＭ１３捕捉体配列を検出した結果を示す図。プレート番号１では、ナノ粒子で標識した非相補的オリゴヌクレオチドプローブを用いた。プレート番号２および３では、ナノ粒子で標識した特異的な相補的オリゴヌクレオチドプローブを用いた。予想通り、特異的な相補的プローブを用いたプレートは検出が示された。実施例３を参照されたい。
【図７】サンドイッチ式ハイブリダイゼーション・アッセイを用いた第Ｖ因子の標的配列の検出結果を示す図。第Ｖ因子捕捉プローブを用いて、実施例１（方法番号１）に記載のようにＤＮＡアレイ・チップを製造した。該ＤＮＡチップは予想通り機能した。実施例４を参照されたい。
【図８】実施例１（方法番号１）に記載のように製造したＤＮＡアレイ・チップを用いてＭＴＨＦＲ標的配列を検出した結果を示す図。該ＤＮＡチップは予想通り機能した。プレート番号１は、検出プローブがその融点より高い温度ではハイブリダイズしないことを示している。プレート番号２は、１００ｍｅｒの合成のＭＴＨＦＲ標的の検出を示した。プレート番号３は、ＭＴＨＦＲのＰＣＲ産物の検出を示した。実施例５を参照されたい。
【図９】実施例１（方法番号１）に記載のように製造したＤＮＡアレイ・チップを用いて第Ｖ因子標的配列を検出した結果を示す図。該ＤＮＡチップは予想通り機能した。非特異的なバックグラウンド・ノイズは認められなかった。実施例６を参照されたい。
【図１０】実施例１（方法番号１）に記載のように製造したＤＮＡアレイ・チップを用いて第Ｖ因子標的配列を検出した結果を示す図。該ＤＮＡチップは予想通り機能した。プローブは標的配列に特異的に反応し、プローブと標的との間に交差ハイブリダイゼーションは観察されなかった。実施例７を参照されたい。
【図１１Ａ】ポリマー被覆スライドを製造し、ＥＧＳリンカー・スライド上にＤＮＡをプリントするスキームを示す略図。
【図１１Ｂ】ポリマー被覆スライドを製造し、ＥＧＳリンカー・スライド上にＤＮＡをプリントするスキームを示す略図。
【図１１Ｃ】ポリマー被覆スライドを製造し、ＥＧＳリンカー・スライド上にＤＮＡをプリントするスキームを示す略図。
【図１１Ｄ】ポリマー被覆スライドを製造し、ＥＧＳリンカー・スライド上にＤＮＡをプリントするスキームを示す略図。
【図１２】ガラス表面上のポリマーおよびＥＧＳ修飾の化学モデルを示す図。
【図１３】種々のポリマーおよびリンカーを用いてポリマー被覆スライドを製造するための工程図。
【図１４】ポリマー被覆スライドおよびデンドリマースライドを比較したグラフ。
【図１５】ポリマー被覆スライドおよびデンドリマースライドについてアレイ化されたＣＹ３−オリゴヌクレオチドの強度比較を示す図。
【図１６Ａ】陽性対照および第Ｖ因子標的を用いた、ポリマー被覆スライドの性能を示す図。
【図１６Ｂ】金ナノ粒子プローブを用いた、トリス（２−アミノエチレン）修飾スライドの性能を示す図。
【図１６Ｃ】金ナノ粒子プローブを用いたアッセイ方式における、ポリマー−９５被覆スライドの性能を示す図。
【図１６Ｄ】デンドリマースライド上に金ナノ粒子プローブを拡げ、銀で増幅した後のバックグラウンドを示す図。
【図１６Ｅ】ポリマー−９５スライド上に金ナノ粒子プローブを拡げ、銀で増幅した後のバックグラウンドを示す図。
【図１６Ｆ】各ウェルにおいて異なる標的濃度を用いた、ポリマー−９５スライド上での標的の検出を示す図。
【図１６Ｇ】ポリマー−９５修飾スライド上での多重検出を示す図。
【図１６Ｈ】ポリマー−９５スライド上での陽性対照の検出を示す図。
【図１６Ｉ】比較のために市販のスライド上での陽性対照の検出を示す図。
【図１６Ｊ】ポリマー−９５スライド上において、上方の列で標的の検出を、下方の列で対照の検出を示す図。
【図１６Ｋ】ポリマー−９５スライド上において、ウェル２、３、４、５、７、８、９および１０での標的の検出を示す図。ウェルはすべてＰＣＲ  ＤＮＡ標的を有しているが、ウェル１および６は標的を有していない。
【図１６Ｌ】銀染色した金ナノ粒子を用いた、ポリマー−９５スライド上での標的の検出を示す図。
【図１６Ｍ】銀染色した金ナノ粒子を用いた、ポリマー−９５スライド上での標的の検出を示す図。
【図１６Ｎ】銀染色した金ナノ粒子を用いた、ポリマー−９５スライド上での標的の検出を示す図。
【図１６Ｏ】ポリマー−９５スライド上でのゲノム標的の検出を示す図。ウェル１、７、８、９ではシグナルがはっきりと観察された。
【図１７】銀増幅を用いて、アルデヒド修飾表面上への金ナノ粒子の固定化を示す図。
【図１８】シリル結合金ナノ粒子を未修飾の表面に結合させ、銀で増幅するスキームを示す略図。
【図１９】銀増幅を用いて、異なる種類のシリル結合金ナノ粒子が未修飾の表面にプリントされて結合していることを示す図。
【図２０】金ナノ粒子調製物中の塩含有量に基づくシグナル強度の差を示すグラフ。
【図２１】基材表面の上面に層を形成する際に必要な化学反応を示すスキームの略図。該スキームの第１の工程は、二官能性のジシリル部分を基材の表面上に結合させる工程であり、該ジシリル部分を表面の上部に「Ａ」と印す。表面を「Ａ」で官能化すると、次に、利用可能な反応性イソシアネート基を求核試薬と反応させて、生体分子「Ｐ」をプリントしてもよいし、スペーサー基「Ｓ」を加えてもよいし、あるいは加水分解により第１級アミンを表面上に生成させてもよい。イソシアネート基を生体分子「Ｐ」でプリントした場合は、次に表面を求核分子「Ｂ」でブロッキングする。「Ａ」のイソシアネート基をジアミンまたはテトラアミンなどの多官能性スペーサー基「Ｓ」と反応させた場合は、残存している全てのイソシアネート基を求核分子でキャッピングして「Ｃ」とする。キャッピング後、ジイソシアネート「ＤＩ」などの別の多官能分子を加えて表面上に利用可能な反応性イソシアネートを生成させることもできる。該イソシアネートが表面上にある場合は、リンカー基「Ｌ」とみなされる。この新しい表面「基材−Ａ−Ｌ−ＤＩ」には再び多様な経路があり、プリントしてもよいし、加水分解してもよいし、追加のリンカーを付加してからジイソシアネートを加えてもよい。最後のスペーサー「Ｓ」を加え、ジイソシアネートまたは他の二官能性求電子試薬と反応させると、遊離イソシアネートを有する最終表面が得られる。付加されるべきこの最後の二官能性求電子試薬または二官能性分子混合物は、次いで生体分子のプリントに用いることができるリンカー「Ｌ」である。この段階では、表面上に第１級アミン基を生成させるために加水分解されたイソシアネート表面が、二官能性求電子試薬「ＤＩ」を加えるために開放されており、あらゆる組み合わせを受けることができる。実施例１４を参照されたい。
【図２２】スペーサー分子の化学構造を示す図。
【図２３】イソシアネートおよび活性エステルの化学構造を示す図。
【図２４】２−トリメトキシ−６−（トリイソシアナトシランウレア）ベンゼン（４）の合成を示す図。
【図２５】二官能性ジシリル４を基材表面に付加して、ガラス（５ａ）またはプラスチック（５ｂ）上に遊離イソシアネート基を備えた被覆基材を製造する工程を示す図。
【図２６】表面上でイソシアネート基を加水分解して、次いでリンカー基「Ｌ」に結合される第１級アミン基を得る工程を示す図。第１の例では１，６−ヘキサメチレンジイソシアネートを用いて表面に遊離イソシアネート基を提供し、第２の例ではクエン酸のトリエステルを用いて、プリントに利用可能な活性化エステル基を表面上に提供する。
【図２７】スペーサーのデンドリマーに続きリンカーの１，６−ヘキサメチレンジイソシアネートを付加する工程を示す図。
【図２８】スペーサーの３，３’−ジアミノベンジジンを付加する工程を示す図。
【図２９】図２８からの続きであり、スペーサーを付加した後にイソシアネートをキャッピングする工程を示す図。
【図３０】図２９からの続きであり、ジイソシアネートの付加を示す図。これをアレイ化してもよいし、別のスペーサーを付加して処理工程を続けてもよい。
【図３１】図３０からの続きであり、Ｐ９５ポリマーをガラス基材上の遊離イソシアネートに付加する工程を示す図。
【図３２】図３１からの続きであり、リンカー基４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネートを付加する工程を示す図。これをプリントしてもよいし、追加のスペーサーを付加してもよい。
【図３３】図２９からの続きであり、スペーサーの３，３’−ジアミノベンジジンを付加する工程を示す図。
【図３４】図３１からの続きであり、リンカー基４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネートを付加する工程を示す図。これをプリントしてもよいし、追加のスペーサーを付加してもよい。
【図３５】図２９からの続きであり、ＰｏＸｙｌポリマーをスペーサーとして付加する工程を示す図。
【図３６】図３５からの続きであり、リンカーとして４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネートを付加する工程を示す図。これをプリントしてもよいし、追加のスペーサーを付加してもよい。
【図３７】基材を生体分子でアレイ化した後で、表面上の全てのイソシアネートをブロッキングするためにグリシンを付加する工程を示す図。
【図３８】図２５からの続きであり、スペーサーＰ９５をアンカー基に付加し、続いてエチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）をリンカーとして付加する工程を示す図。
【図３９】１，６−ヘキサメチレンのリンカーを有するガラス基材（１０ｉ）を示す画像。基材１０ｉは３つのウェルそれぞれが３行×４列にアレイ化されている。どの列においても３つのスポット各々がスライド上にアレイ化された同一の捕捉体を有する。列ごとの捕捉体の種類は上から下へ野生型捕捉体、変異型捕捉体、陰性対照、および陽性対照捕捉体のＤＮＡ配列である。ウェル１および３は、野生型ゲノム標的を陽性および野生型のナノ粒子プローブとともに示し、陽性およびゲノムのいずれの捕捉体にも結合がみられる。ウェル２は、ゲノムＤＮＡのない状態でのナノ粒子プローブを示しており、基材に対する非特異的結合がないことを実証している。
【図４０】クエン酸トリエチルおよび１，６−ヘキサメチレンジイソシアネートのリンカー混合物を備えたガラス基材（１０ｐ）を示す画像。基材１０ｐは５個のウェル各々において３行×４列にアレイ化されている。どの列においても３つのスポット各々がスライド上にアレイ化された同一の捕捉体を有する。列ごとの捕捉体の種類は上から下へ陽性対照、野生型捕捉体、変異型捕捉体および陰性対照捕捉体のＤＮＡ配列である。ウェル１は陽性対照のナノ粒子プローブを示しており、ＤＮＡ標的は存在せず、陽性対照捕捉体への結合が見られる。ウェル２および４は、ＰＣＲの野生型標的を野生型ナノ粒子プローブとともに示し、野生型捕捉体に結合がみられる。ウェル３は変異型ナノ粒子プローブを変異型ＤＮＡ標的とともに示し、変異型捕捉体のみに結合がみられる。対照であるウェル５には、野生型および変異型のナノ粒子プローブがＤＮＡ標的を伴わずに含まれており、ナノ粒子プローブの非特異的結合がないことを実証している。
【図４１】クエン酸トリエチルのリンカーを有するガラス基材（１０ｂ）を示す画像。基材１０ｂは５個のウェル各々において３行×４列にアレイ化されている。どの列においても３つのスポット各々がスライド上にアレイ化された同一の捕捉体を有する。列ごとの捕捉体の種類は上から下へ陽性対照、野生型捕捉体、変異型捕捉体および陰性対照捕捉体のＤＮＡ配列である。ウェル１は、陽性対照のナノ粒子プローブを示しており、ＰＣＲ標的は存在せず、陽性対照捕捉体に結合がみられる。ウェル２は、ヘテロ接合型のＰＣＲ  ＤＮＡ標的を野生型および変異型のナノ粒子プローブとともに示し、野生型および変異型のいずれの捕捉体にも結合がみられる。ウェル３は、変異型ＤＮＡ標的とともに変異型ナノ粒子プローブを示し、変異型捕捉体のみに結合がみられる。ウェル４は、野生型ＤＮＡ標的とともに野生型ナノ粒子プローブを示し、野生型捕捉体のみに結合がみられる。対照であるウェル５には、野生型および変異型のナノ粒子プローブがＤＮＡ標的を伴わずに含まれており、プローブの非特異的結合がないことを実証している。
【図４２】メチレンジフェニルジイソシアネートのリンカーを有するガラス基材（１０ｎ）を示す画像。基材１０ｎは５個のウェル各々において３行×４列にアレイ化されている。どの列においても３つのスポット各々がスライド上にアレイ化された同一の捕捉体を有する。列ごとの捕捉体の種類は上から下へ陽性対照、変異型捕捉体、野生型捕捉体、および陰性対照捕捉体のＤＮＡ配列である。ウェル１は、陽性対照のナノ粒子プローブを示し、ＤＮＡ標的は存在せず、陽性対照捕捉体に結合がみられる。ウェル２および３は、野生型ゲノムＤＮＡ標的を野生型ナノ粒子プローブとともに示し、野生型および変異型の捕捉体に結合がみられる。ウェル４は、変異型ＤＮＡ標的とともに変異型ナノ粒子プローブを示し、変異型捕捉体のみに結合がみられる。対照であるウェル５には、野生型および変異型のナノ粒子プローブがＤＮＡ標的を伴わずに含まれており、プローブの非特異的結合がないことを実証している。
【図４３】クエン酸トリエチルのリンカーおよびメチレンジフェニルジイソシアネートのリンカーを有するガラス基材（１０ｒ）を示す画像。基材１０ｒは５個のウェル各々において３行×４列にアレイ化されている。どの列においても３つのスポット各々がスライド上にアレイ化された同一の捕捉体を有する。列ごとの捕捉体の種類は上から下へ陽性対照、変異型捕捉体、野生型捕捉体、および陰性対照捕捉体のＤＮＡ配列である。ウェル１は、陽性対照のナノ粒子プローブを示しており、ＤＮＡ標的は存在せず、陽性対照捕捉体に結合がみられる。ウェル２は、ヘテロ接合型ＰＣＲ  ＤＮＡ標的を野生型および変異型のナノ粒子プローブとともに示し、野生型および変異型のいずれの捕捉体にも結合がみられる。ウェル３は野生型ＤＮＡ標的とともに野生型ナノ粒子プローブを示し、野生型捕捉体のみに結合がみられる。ウェル４は、変異型ＤＮＡ標的とともに変異型ナノ粒子プローブを示し、変異型捕捉体のみに結合がみられる。対照であるウェル５には、野生型および変異型のナノ粒子プローブがＤＮＡ標的を伴わずに含まれており、プローブの非特異的結合がないことを実証している。
【図４４】４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネートのリンカーを有するガラス基材（１０ｍ）を示す画像。基材１０ｍは５個のウェル各々において３行×４列にアレイ化されている。どの列においても３つのスポット各々がスライド上にアレイ化された同一の捕捉体を有する。列ごとの捕捉体の種類は上から下へ陽性対照、野生型捕捉体、変異型捕捉体、および陰性対照捕捉体のＤＮＡ配列である。ウェル１は、陽性対照のナノ粒子プローブを示しており、ＤＮＡ標的は存在せず、陽性対照捕捉体のみに結合がみられる。ウェル２および４は、ＰＣＲ野生型標的を野生型ナノ粒子プローブとともに示し、野生型捕捉体のみに結合がみられる。ウェル３は、変異型ナノ粒子プローブを変異型ＤＮＡ標的とともに示し、変異型捕捉体のみに結合がみられる。対照であるウェル５には、野生型および変異型のナノ粒子プローブがＤＮＡ標的を伴わずに含まれており、プローブの非特異的結合がないことを実証している。
【図４５】１，６−ヘキサメチレンジイソシアネートのリンカーを有するガラス基材（１０Ｌ）を示す画像。基材１０Ｌは５個のウェル各々において３行×４列にアレイ化されている。どの列においても３つのスポット各々がスライド上にアレイ化された同一の捕捉体を有する。列ごとの捕捉体の種類は上から下へ陰性対照、変異型捕捉体、野生型捕捉体、および陽性対照捕捉体のＤＮＡ配列である。ウェル１は、図４０の陽性対照プローブの濃度と比較して１００倍（２ｌｏｇｓ）希釈された陽性ナノ粒子対照プローブを示している。ＤＮＡ標的は使用せず、陽性対照捕捉体への結合が示されている。ウェル２、３および４は、ＰＣＲ野生型標的を野生型ナノ粒子プローブとともに示し、野生型捕捉体のみに結合がみられる。ウェル４は最も高い濃度の標的を含み、ウェル３および２は各々対数的に希釈した標的をそれぞれ含むものとした。対照であるウェル５には、野生型および変異型のナノ粒子プローブがＤＮＡ標的を伴わずに含まれており、プローブの非特異的結合がないことを実証している。
【図４６】メチレンジフェニルジイソシアネートのリンカーを有するガラス基材（１０ｎ）を示す画像。基材１０ｎは５個のウェル各々において３行×４列にアレイ化されている。どの列においても３つのスポット各々がスライド上にアレイ化された同一の捕捉体を有する。列ごとの捕捉体の種類は上から下へ陽性対照、野生型捕捉体、変異型捕捉体、および陰性対照捕捉体のＤＮＡ配列である。ウェル１は、陽性対照ナノ粒子プローブを示しており、ＤＮＡ標的は存在せず、陽性対照捕捉体のみに結合がみられる。ウェル２および４は、ＰＣＲ野生型標的を野生型ナノ粒子プローブとともに示し、野生型捕捉体のみに結合がみられる。ウェル３は、変異型ナノ粒子プローブを変異型ＤＮＡ標的とともに示し、変異型捕捉体のみに結合がみられる。対照であるウェル５には、野生型および変異型のナノ粒子プローブがＤＮＡ標的を伴わずに含まれており、プローブの非特異的結合がないことを実証している。
【図４７】ナノスフェアー社のプラスチック製基材（１０ｈ）を市販のガラス基材と比較するための２枚の別個のスライドを示す画像。上側のスライド（プラスチック）は、ＨＭＤＩ表面上の異なるウェルにホルムアミドの濃度差をつけて、野生型と変異型の違いを示している。ナノスフェアー社の修飾スライドと比較するために、同様の実験を市販のスライドガラスを用いて実施した。プラスチック製の修飾基材では強度が高く、野生型および変異型の捕捉体配列と合成ＤＮＡ標的との間でホルムアミド濃度３０％において識別が認められた。このことは、ホルムアミド濃度４０％で野生型および変異型の合成ＤＮＡ標的が識別された市販のスライドガラスと対比される。アッセイ条件：ハイブリダイゼーション緩衝液、野生型、変異型および対照の金ナノ粒子プローブを用い、ホルムアミド濃度を上げて、一定分量１００Ｌを各ウェルに対して調製した。標準的アッセイ条件に従って修飾スライド上でアッセイを行い、Ｖｅｒｉｇｅｎ（登録商標）装置で画像化した。
【図４８】表面に１，６ヘキサメチレンジイソシアネートのリンカーを有するプラスチック基材（１０Ｋ）を示す画像。基材１０Ｋは５個のウェル各々において３行×４列にアレイ化されている。どの列においても３つのスポット各々がスライド上にアレイ化された同一の捕捉体を有する。列ごとの捕捉体の種類は上から下へ変異型捕捉体、陰性対照、野生型捕捉体、および陽性対照捕捉体のＤＮＡ配列である。ウェル１および５は、陽性対照ナノ粒子プローブを示しており、ＤＮＡ標的は存在せず、陽性対照捕捉体のみに結合がみられる。ウェル２、３および４は、野生型ゲノム標的を野生型および陽性対照ナノ粒子プローブとともに示し、野生型および陽性対照の捕捉体のみに結合がみられる。
【図４９】表面に４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネートのリンカーを有するプラスチック製基材（１０ｅ）を示す画像。基材１０ｅは５個のウェル各々において３行×４列にアレイ化されている。どの列においても３つのスポット各々がスライド上にアレイ化された同一の捕捉体を有する。列ごとの捕捉体の種類は、野生型−１、野生型−１、変異型−１、野生型−ＩＩ、変異型−ＩＩおよび陽性対照の捕捉体である。すべての標的を、標準的なアッセイ・プロトコルに従ってそれぞれの捕捉体に室温でハイブリダイズさせ、修飾スライド上の捕捉体について調べた。ウェル１、３、４、５はすべてのゲノム捕捉体を示し、ウェル２は陽性対照の捕捉体を示している。
【図５０】４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネートのリンカーを表面に有するプラスチック製基材（１０ｅ）を示す画像。基材１０ｅは５個のウェル各々において３行×４列にアレイ化されている。どの列においても３つのスポット各々がスライド上にアレイ化された同一の捕捉体を有する。列ごとの捕捉体の種類は上から下へ変異型−Ｉ、野生型−Ｉ、変異型−ＩＩ、野生型−ＩＩ、および陽性対照の捕捉体ＤＮＡ配列である。ウェル１および２を陽性対照に用い、ウェル３、４および５は、野生型ゲノム標的を変異型から区別するかどうか調べるために用いた。ウェル３、４および５では、陽性対照プローブおよび遺伝子特異的なプローブの両方を用いて、シグナルの配置について確認した。
【図５１】４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネートのリンカーを表面に有するプラスチック製基材（１０ｅ）を示す画像。上側の試料はＤＮＡ捕捉体でアレイ化した後でグリシンによりブロッキングされており、下側の基材はアレイ化の後での修飾は行われていない。いずれの試料もゲノムＤＮＡの変異型および野生型を用いて試験した。各々同じようにアレイ化し、アッセイを行い、現像した。ブロッキングされていない基材（下）は眼に見えて高いバックグラウンドを示し、シグナル応答は約２．５〜３倍高い。基材１０ｅは５個のウェル各々において３行×４列にアレイ化されている。どの列においても３つのスポット各々がスライド上にアレイ化された同一の捕捉体を有する。列ごとの捕捉体の種類は上から下へ野生型−１、野生型−１、変異型−１、野生型−ＩＩ、変異型−ＩＩ、および陽性対照の捕捉体である。
【図５２】プラスチック上に製造したいくつかの異なる表面について示すグラフ。表面には、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）リンカーとともに、１，６−ヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＭＤＩ）、４，４’−メチレンジフェニルジイソシアネート（ＭＤＩ）、またはクエン酸トリエチル（Ｔ）のリンカーが表面上に含まれている。野生型（ＷＴ）、変異型（ＭＴ）および陽性対照（ＰＣ）の捕捉体を用いて基材をアレイ化した。バックグラウンド（ＢＧＲ）のウェルはプローブまたはＤＮＡを用いずに実施し、水対照（ＷＣ）のウェルは水に曝露した。各スライドについて、１．９ｎＭ（シグナル１００）、１９０ｐＭ（シグナル１０）および１９ｐＭ（シグナル１）の野生型または変異型のＤＮＡ標的と適切なナノ粒子プローブとを用いて実施した。銀増強後、すべてのスライドをＶｅｒｉｇｅｎｅ（登録商標）検出器システムで走査した。シグナル応答をプロットし、種々の修飾基材を比較した。
【図５３】ガラス上に製造したいくつかの異なる表面について示すグラフ。「ＨＭＤＩ」と記した表面は調製物１０ｍから、「ＭＤＩ」と記した表面は調製物１０ｎから、「Ｔ」と記した表面は調製物１０ｏから、「Ｄ−ｔ」と記した表面は調製物１０ｐから、「Ｄ」と記した表面は調製物１０ａから製造したものである。野生型（ＷＴ）、変異型（ＭＴ）および陽性対照（ＰＣ）の捕捉体を用いて基材をアレイ化した。バックグラウンド（ＢＧＲ）のウェルはナノ粒子プローブまたは標的ＤＮＡを用いずに実施した。水対照（ＷＣ）のウェルは水に曝露した。各スライドについて、１．９ｎＭ（シグナル１００）、１９０ｐＭ（シグナル１０）および１９ｐＭ（シグナル１）の野生型または変異型のＤＮＡ標的と適切なナノ粒子プローブとを用いて実施した。銀増強後、すべてのスライドをＶｅｒｉｇｅｎｅ（登録商標）検出器システムで走査した。シグナル応答をプロットし、種々の修飾基材を比較した。
【図５４】ガラス製基材およびプラスチック製基材を比較したとき、またプラスチック上の種々のスペーサー基を比較したときの平均シグナル強度を示すグラフ。陽性、陰性、変異型および野生型のＤＮＡ捕捉体を用いてスライドを作製し、本明細書に先に記載したようなナノ粒子プローブを用いて実施した。ＰｏＸｙｌについては２回実施した。
【図５５】ガラス基材（１０ｈ）およびプラスチック基材（１０ｍ）がＣｙ３捕捉プローブを用いて均一にアレイ化されたことを示す図。
【図５６】プローブ濃度を上昇させて、ガラス基材（１０ｍ）およびプラスチック基材（１０ｈ）へＣｙ５プローブをワンステップ・ハイブリダイゼーションしたことを示すグラフ。プローブ濃度が上昇するにつれて、検出器からの蛍光応答も上昇している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図２４】
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【図３７】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【図１６Ｈ】
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【図１６Ｉ】
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【図１６Ｊ】
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【図１６Ｋ】
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【図１６Ｌ】
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【図１６Ｍ】
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【図１６Ｎ】
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【図１６Ｏ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２５】
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【図２６】
2007536527.tif 000049
【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年6月7日(2006.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分析物の検出に使用するための基材を製造する方法であって、
（ａ）表面を有する基材を提供する工程と、
（ｂ）前記表面を、
Ｓｉ（ＮＣＹ）４；
［（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ］２−Ｓｉ（ＮＣＹ）２      ｖｉ；および
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−Ｚ−ＣＹＮＨ−Ｓｉ（ＮＣＹ）３      ｉｖ；（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表し、Ｚは酸素またはＮＨを表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）
から成る群から選択されるイソシアネート化合物に接触させて、遊離イソシアネート基を含んだ表面を提供する工程と
から成る方法。
【請求項２】
工程（ｂ）の後に、
（ｃ）遊離イソシアネート基を含む前記表面をスペーサー分子に接触させて、遊離アミノ基を含む表面を提供する工程と、
（ｄ）遊離アミノ基を含む前記表面をリンカー分子に接触させて、反応性遊離基を有する反応性表面を提供する工程と
をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｃ）および工程（ｄ）を１回または複数回繰り返す工程をさらに含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｄ）の後に、
（ｅ）前記反応性表面を、標的分析物に特異的な少なくとも１種類の捕捉プローブに接触させて、捕捉プローブが固定化された表面を提供する工程と、
（ｅ）捕捉プローブが固定化された前記表面をキャッピング剤に接触させて、表面の、捕捉プローブが固定化されていない領域上に未反応で残存している遊離イソシアネート基をブロッキングし、かつキャッピング剤と接触しない表面に比べてナノ粒子の非特異的結合に起因するバックグラウンド・シグナルが実質的に低い基材を生産する工程と
をさらに含む請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
（ｃ）遊離イソシアネート基を含む前記表面を水に接触させて、遊離アミノ基を含む表面を提供する工程と、
（ｄ）遊離アミノ基を含む前記表面をリンカー分子に接触させて、反応性遊離基を有する反応性表面を提供する工程と
をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｄ）の後に、
（ｅ）遊離イソシアネート基を含む前記表面をスペーサー分子に接触させて、遊離アミノ基を含む表面を提供する工程と、
（ｆ）遊離アミノ基を含む前記表面をリンカー分子に接触させて、反応性遊離基を有する反応性表面を提供する工程と
をさらに含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｅ）および工程（ｆ）を１回または複数回繰り返す工程をさらに含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（ｉ）標的分析物に特異的な少なくとも１種類の捕捉プローブに前記反応性表面を接触させて、捕捉プローブが固定化された表面を提供する工程と、
（ｉｉ）捕捉プローブが固定化された前記表面をキャッピング剤に接触させて、表面の、捕捉プローブが固定化されていない領域上に未反応で残存している遊離イソシアネート基をブロッキングし、かつキャッピング剤と接触しない表面に比べてナノ粒子の非特異的結合に起因するバックグラウンド・シグナルが実質的に低い基材を生産する工程と
をさらに含む請求項５、６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記ジシリルイソシアネート化合物は、２−トリメトキシシラン−６−トリイソシアナトシランウレアベンゼン、およびテトライソシアナトシランから成る群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記スペーサー分子は、イソシアネート基と反応し得る少なくとも２つの官能基を有する、請求項２または６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記スペーサー分子は、ポリマー、糖質または抗生物質である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記スペーサー分子は、ポリ（ダイマー酸コアルキルポリアミン）−９５、ポリ（ダイマー酸コアルキルポリアミン）−１４０、ポリ（アリルアミン）、ポリ（ｍ−キシレンジアミン−エピクロロヒドリンジアミン末端、トリス（２−アミノメチルアミン）、および第０世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、ネオマイシン、および３，３’−ジアミノベンジジンから成る群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記キャッピング剤は、アミノ酸、タンパク質、糖質、カルボン酸、チオール、アルコールおよびアミンから成る群から選択される、請求項４または８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記キャッピング剤はグリシンである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記リンカー分子は、フェニレン１，４−ジイソシアネート、トリレン−２，６−ジイソシアネート、トリレン−α，４−ジイソシアネート、およびイソホロンジイソシアネートから成る群から選択される、請求項２、５または６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記リンカー分子は、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）、スベリン酸ジスクシンイミジル、１，６−ジイソシアナトヘキサン、メチレンビス−（４−シクロヘキシルイソシアネート）、グルタルジアルデヒド、メチレン−ｐ−フェニルジイソシアネート、およびクエン酸トリエチルから成る群から選択される、請求項２、５または６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記捕捉プローブは核酸である、請求項４または８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
各々特定の標的分析物に特異的な２種類以上の捕捉プローブを、第２の反応性部分を有する前記表面に接触させる、請求項４または８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記捕捉プローブを、前記基材の表面上の別個の所定領域にアレイ化する、請求項４または８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
（ｃ）遊離イソシアネート基を含む前記表面をスペーサー分子に接触させて、遊離アミノ基を含む表面を提供する工程と、
（ｄ）遊離アミノ基を含む前記表面をリンカー分子に接触させて、反応性遊離基を有する反応性表面を提供する工程と、
（ｅ）前記反応性表面を標的分析物に特異的な少なくとも１種類の捕捉プローブに接触させて、捕捉プローブが固定化された表面を提供する工程と、
（ｆ）捕捉プローブが固定化された前記表面をキャッピング剤に接触させて、未反応で残存している遊離イソシアネート基をブロッキングし、かつキャッピング剤と接触しない表面に比べてナノ粒子の非特異的結合に起因するバックグラウンド・シグナルが実質的に低い基材を生産する工程と
からさらに成る、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記基材は前記イソシアネート化合物と反応する少なくとも１つの基を有する、請求項１または２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記基はヒドロキシル基、アミノ基、またはカルボキシレート基からなる請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
１つまたは複数の標的分析物の検出に使用するための基材であって、請求項４、８または２０のいずれか１項に記載の方法にしたがって製造された、捕捉プローブが結合した表面を含んでなる基材。
【請求項２４】
前記捕捉プローブに結合することのできる遊離アミン基と、負に荷電したイオン基とを含んでなるポリマー層を有する表面を備えた基材。
【請求項２５】
前記表面は、可視光または蛍光を用いて画像化するときに、前記ポリマー層を有してい
ない基材に比べてバックグラウンド・シグナルが実質的に低減されたバックグラウンド・シグナルを生じる、請求項２４に記載の基材。
【請求項２６】
前記基材は約２５〜７５°の水接触角を有する請求項２３に記載の基材。
【請求項２７】
前記基材は約１．４００〜１．９００の屈折率を有する請求項２６に記載の基材。
【請求項２８】
試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する１つまたは複数の標的分析物を検出する方法であって、
（ａ）請求項１または２０のいずれか１項に記載の基材であって、その表面に少なくとも１種類の捕捉プローブが固定化されており、各種類の捕捉プローブが標的分析物に特異的であることを特徴とする基材を提供する工程と、
（ｂ）標的分析物に特異的な検出体プローブとナノ粒子とを含んでなる少なくとも１種類の検出用プローブを提供する工程と、
（ｃ）捕捉プローブおよび検出体プローブが特異的標的分析物に結合するのに有効な条件下で、捕捉プローブ、検出用プローブおよび試料を接触させて、基材の表面上に固定化複合体を形成する工程と、
（ｄ）基材の表面を洗浄して、結合していないナノ粒子を除去する工程と、
（ｅ）前記標的分子の有無の指標としての前記複合体の有無を観察する工程と
から成る方法。
【請求項２９】
表面上にナノ粒子を固定化する方法であって、
（ａ）表面を有する基材と、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子であって、該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分がナノ粒子と結合していない末端に遊離アミン基を有することを特徴とするナノ粒子とを提供する工程と、
（ｂ）該ナノ粒子を、式ｉ：
（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ−Ｘ−ＮＣＹ                ｉ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は個別にＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールを表し、Ｘは直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシから成る群から選択される１つまたは複数の基で置換されたアリールであって、酸素、窒素または硫黄を含む１つまたは複数のヘテロ原子によって任意選択で置換されており、Ｙは酸素または硫黄を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルコキシを表す）
を有する薬剤に接触させて、反応性中間体を形成する工程と、
（ｂ）該反応性中間体を前記表面と接触させて、前記表面上に該分子を固定化する工程と
から成る方法。
【請求項３０】
前記表面はガラス表面である請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記表面は前記反応性中間体と反応する少なくとも１つの基を有する請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記基はヒドロキシ基、アミノ基またはカルボキシレート基からなる請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記オリゴヌクレオチドは官能性部分を介してナノ粒子と結合している請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記官能性部分は、チオ酸、アルキルチオール基またはジスルフィド基からなる請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ジスルフィド基はエピアンドロステロンジスルフィドである請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
表面上にナノ粒子を固定化する方法であって、
（ａ）アミン基と反応する反応性部分を含む表面を有する基材と、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子であって、該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分がナノ粒子と結合していない末端にアミン基を有することを特徴とするナノ粒子とを提供する工程と、
（ｂ）前記反応性部分を該ナノ粒子に接触させて、前記表面上に該ナノ粒子を固定化する工程と
から成る方法。
【請求項３７】
前記表面はガラス表面である請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記反応性部分はイソシアネート類、無水物類、ハロゲン化アシル類またはアルデヒド類からなる請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記オリゴヌクレオチドは官能性部分を介してナノ粒子と結合している請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記官能性部分はチオ酸、アルキルチオール基またはジスルフィド基からなる請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ジスルフィド基はエピアンドロステロンジスルフィドである請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
請求項１または２０のいずれか１項に記載の方法によって製造された基材。
【請求項４３】
請求項４２に記載の基材を含んでなるキット。
【国際調査報告】
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