(57)【要約】      （修正有）【課題】ハイブリドーマ及び２５−ヒドロキシビタミンＤ及び２５−ヒドロキシビタミンＤを認識できるモノクローナル抗体またはそのフラグメントの作製方法の提供。【解決手段】免疫原性が付与された、特定式で示されるハプテン、その塩、またはカルボン酸官能基がエステル、アミドまたはオキサゾリンの形成により保護されている誘導体で、動物を免疫して作成したハイブリドーマから得られた、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識することができるモノクローナル抗体またはそのフラグメントの作成方法、および、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識する診断デバイス。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリドーマ、及び、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識することができるモノクローナル抗体またはそのフラグメントを作製する方法であって、
ａ）免疫原性が付与された、化学式（Ｉ）：
【化１】
2011136978.tif 000017
（式中、ｎは０〜３の整数を示し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ１５はそれぞれ独立に水素または炭素数１〜４のアルキルを示し、Ｒ１２及びＲ１３はそれぞれ炭素数１〜４のアルキルを示し、Ｒは水素またはアシル、ベンジル、アルキル、アリール、アルキルエーテル、ジメトキシトリチル、メトキシトリチル、テトラヒドロピラニル、トリフェニルメチル基及びシリル誘導体からなる群から選択された置換基を示す）で示されるハプテン、その塩、またはカルボン酸官能基がエステル、アミドまたはオキサゾリンの形成により保護されている誘導体で、動物を免疫するステップと、
ｂ）前記動物により作製されたＢ細胞を採取し、ハイブリドーマを作製するためにそのＢ細胞をミエローマ細胞と融合さすせるステップと、
ｃ）得られたハイブリドーマの少なくとも一部から、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識することができるモノクローナル抗体またはそのフラグメントを作製するステップと、を有する
ことを特徴とするハイブリドーマ、及び、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識することができるモノクローナル抗体またはそのフラグメントの作製方法。
【請求項２】
同一の試料中に存在する２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両者を、前記モノクローナル抗体により同時に認識する
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体による２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の認識率が７０〜１１０％の範囲である
請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ハプテンが、ｎが０で、Ｒ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ１５がそれぞれ水素で、Ｒ１２及びＲ１３がそれぞれメチル基である、化学式（Ｉ）の誘導体である
請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ハイブリドーマが、寄託番号ＬＭＢＰ７０１１ＣＢ、ＬＭＢＰ７０１２ＣＢ、ＬＭＢＰ７０１３ＣＢ、ＬＭＢＰ７２０４ＣＢ及びＬＭＢＰ７２０５ＣＢでＢＣＣＭ／ＬＭＢＰに寄託されているハイブリドーマからなる群から選択される
請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ハプテンが、前記ハプテンのカルボン酸官能基を介して、担体タンパク質と共有結合されることにより免疫原性を付与されている
請求項１ないし５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識することができる
ことを特徴とするモノクローナル抗体またはそのフラグメントの作製に好適なハイブリドーマ。
【請求項８】
前記ハイブリドーマが、寄託番号ＬＭＢＰ７０１１ＣＢ、ＬＭＢＰ７０１２ＣＢ、ＬＭＢＰ７０１３ＣＢ、ＬＭＢＰ７２０４ＣＢ及びＬＭＢＰ７２０５ＣＢでＢＣＣＭ／ＬＭＢＰに寄託されているハイブリドーマからなる群から選択される
請求項７に記載のハイブリドーマ。
【請求項９】
２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識することができる
ことを特徴とするモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項１０】
同一の試料中に存在する２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両者を同時に認識する
請求項９に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の認識率が７０〜１１０％の範囲であることを特徴とする
請求項９または１０に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１２】
寄託番号ＬＭＢＰ７０１１ＣＢ、ＬＭＢＰ７０１２ＣＢ、ＬＭＢＰ７０１３ＣＢ、ＬＭＢＰ７２０４ＣＢ及びＬＭＢＰ７２０５ＣＢでＢＣＣＭ／ＬＭＢＰに寄託されているハイブリドーマからなる群から選択されるハイブリドーマにより作製される
請求項９ないし１１のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項１３】
免疫原性が付与された、化学式（Ｉ）：
【化２】
2011136978.tif 000018
（式中、ｎは０〜３の整数を示し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ１５はそれぞれ独立に水素または炭素数１〜４のアルキルを示し、Ｒ１２及びＲ１３はそれぞれ炭素数１〜４のアルキルを示し、Ｒは水素またはアシル、ベンジル、アルキル、アリール、アルキルエーテル、ジメトキシトリチル、メトキシトリチル、テトラヒドロピラニル、トリフェニルメチル基及びシリル誘導体からなる群から選択された置換基を示す）で示される化合物からなるハプテン、その塩、またはカルボン酸官能基がエステル、アミドまたはオキサゾリンの形成により保護されている誘導体の、ハイブリドーマ及び２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識できるモノクローナル抗体またはそのフラグメントもしくは組換えフラグメントの作製のための使用。
【請求項１４】
前記ハプテンが、前記ハプテンのカルボン酸官能基を介して、担体タンパク質と共有結合されることにより免疫原性を付与されている
請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
化学式（Ｉ）の前記ハプテンが、ｎが０で、Ｒ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ１５がそれぞれ水素で、Ｒ１２及びＲ１３がそれぞれメチル基である、化学式（Ｉ）の化合物である
請求項１３または１４に記載の使用。
【請求項１６】
作製される前記モノクローナル抗体またはそのフラグメントが、請求項９ないし１２のいずれかに記載のモノクローナル抗体である
請求項１３ないし１５のいずれかに記載の使用。
【請求項１７】
免疫原性が付与された、化学式（Ｉ）：
【化３】
2011136978.tif 000019
（式中、ｎは０〜３の整数を示し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ１５はそれぞれ独立に水素または炭素数１〜４のアルキルを示し、Ｒ１２及びＲ１３はそれぞれ炭素数１〜４のアルキルを示し、Ｒは水素またはアシル、ベンジル、アルキル、アリール、アルキルエーテル、ジメトキシトリチル、メトキシトリチル、テトラヒドロピラニル、トリフェニルメチル基及びシリル誘導体からなる群から選択された置換基を示す）で示される化合物からなるハプテン、その塩、またはカルボン酸官能基がエステル、アミドまたはオキサゾリンの形成により保護されているその誘導体の、試験される試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識または定量できる診断デバイスの製造のための使用。
【請求項１８】
請求項９ないし１２のいずれかに記載のモノクローナル抗体を有する試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識及び／または定量することができる
ことを特徴とする診断デバイス。
【請求項１９】
化学式（ＩＩ）：
【化４】
2011136978.tif 000020
（式中、ｎは０〜３の整数を示し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ１５はそれぞれ独立に水素または炭素数１〜４のアルキルを示し、Ｒ１２及びＲ１３はそれぞれ炭素数１〜４のアルキルを示し、Ｒは水素またはアシル、ベンジル、アルキル、アリール、アルキルエーテル、ジメトキシトリチル、メトキシトリチル、テトラヒドロピラニル、トリフェニルメチル基及びシリル誘導体からなる群から選択された置換基を示し、Ｒ１６はＨＲＰタンパク質（西洋ワサビペルオキシダーゼ）、アルカリホスファターゼタンパク質、ＰＯＤタンパク質（ペルオキシダーゼ）、化学式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）：
【化５】
2011136978.tif 000021
【化６】
2011136978.tif 000022
に示される基、１２５Ｉ−標識ヒスタミン、１２５Ｉ−標識ヒスチジン、１２５Ｉ−標識チロシン、１２５Ｉ−標識メチルチロシネート、蛍光基、化学発光基または化学式（Ｖ）：
【化７】
2011136978.tif 000023
（式中、Ｚはリンカーであり、Ｗはカルボニル基に結合できる官能基である）で示される化学基である））で示される、トレーサ試料をさらに有する
請求項１８に記載の診断デバイス。
【請求項２０】
酵素免疫測定（ＥＩＡ）デバイス、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）デバイス、蛍光免疫測定（ＩＦＡ）デバイス、放射免疫測定（ＲＩＡ）デバイス、「磁気分離測定（ＭＳＡ）」デバイス、「ラテラルフローアッセイ」デバイス、「拡散免疫測定」デバイス、免疫沈降デバイス、「免疫吸着」または「抗原−ダウン測定」デバイス、免疫凝集デバイス、「化学発光免疫測定（ＣＬＩＡ）」デバイス及びバイオセンサーを使用するデバイスからなる群から選択される
請求項１８または１９に記載の診断デバイス。
【請求項２１】
免疫原性が付与された、一般化学式（Ｉ）：
【化８】
2011136978.tif 000024
（式中、ｎは０〜３の整数を示し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ１５はそれぞれ独立に水素または炭素数１〜４のアルキルを示し、Ｒ１２及びＲ１３はそれぞれ炭素数１〜４のアルキルを示し、Ｒは水素またはアシル、ベンジル、アルキル、アリール、アルキルエーテル、ジメトキシトリチル、メトキシトリチル、テトラヒドロピラニル、トリフェニルメチル基及びシリル誘導体からなる群から選択された置換基を示す）で示されるハプテン、その塩、またはカルボン酸官能基がエステル、アミドまたはオキサゾリンの形成により保護されているその誘導体の、ハイブリドーマの作製のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリドーマ及び複数の抗原に存在する１つのエピトープを認識することができる、前記ハイブリドーマから得られたモノクローナル抗体の作製方法に関する。特に、ハイブリドーマ及び複数のビタミンＤ代謝物、すなわち、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識することができるモノクローナル抗体またはそのフラグメントの作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＤは、ビタミンＤ２またはエルゴカルシフェロール及びビタミンＤ３またはコレカルシフェロールを指す総称である。ヒトは、皮膚が紫外線太陽光に曝されると自然にビタミンＤ３を作製する。ビタミンＤ３は肝臓に運ばれ、そこで、体内を循環しているビタミンＤの主な形である２５−ヒドロキシビタミンＤ３へと代謝される。１９世紀以降、ビタミンＤ２は食物を介して経口摂取が可能になり、太陽光にほとんど曝されることのない人々などにおけるビタミンＤ３不足が補われるようになった。ビタミンＤ２の経口摂取は、この数世紀その重要性を増し続けてきた。実際に、ビタミンＤが体内でのカルシウム結合及び骨の石灰化において中心的な役割を担っていることは、広く知られている。さらに、ビタミンＤは様々な代謝経路において重要な役割を果たしている。２５−ヒドロキシビタミンＤ、特に、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３は、体内に最も容易に蓄積されるビタミンＤの形である。これら２つの前駆体は、腎臓において、生物学的に活性な形である１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの形に変換される。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、化学式（Ａ）及び（Ｂ）の１及び２５位に水酸基を有する（ビタミンＤホルモンとしても知られている）ビタミンＤの活性型に関連している。今までに、約５０以上のビタミンＤの代謝物が発見されていて、その中に、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ及び２５，２６−ジヒドロキシビタミンＤがある。
【０００３】
体内のビタミンＤ量を測定できることを確保することは重要である。しかし、ビタミンＤ濃度は、ビタミンＤ２の経口摂取による変動が激しいので、実際には、ビタミンＤ量の測定にはほとんど価値がない。体内量が比較的低く、２５−ヒドロキシビタミンＤに比較してその変動が激しいビタミンＤの生理活性型（１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ）についても同様である。これらの理由により、２５−ヒドロキシビタミンＤ（２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３）の定量化が、各人のビタミンＤの全体的分析を容易にする、価値ある手段である。２５−ヒドロキシビタミンＤを定性する方法には、免疫学的方法を含め、種々の方法が知られている。
【０００４】
通常、免疫学的方法は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用する。ポリクローナル抗体は古くから知られている。ポリクローナル抗体を取得するためには、高純度に精製した抗原の調製物で動物（例えば、ウサギ）を免疫する必要がある。免疫は、そのような精製調製物で繰り返し行われなければならない。しかし、ほとんどの場合、抗体の混合物が作製され、この混合物は複数の抗原にバラバラに結合するので、非特異的な測定となる。第一の問題は、宿主動物の寿命である。生物学的変動性のために、複数の動物を免疫する必要がある。最も特異性の高い抗血清源である動物を選択する必要があり、その動物が死亡すると、次の動物の免疫まで、所望の抗体の作製は停止することになる。第二には、所望の抗体は、異種遺伝子型の混合物である血清中の全抗体の一分画に過ぎないので、抗血清の反応性も問題になる。また、この技術では、バッチ間の変動にも悩まされる。しかし、ポリクローナル抗体の作製は迅速で安価な方法であるので、免疫に今なお広く使用されている。
【０００５】
ビタミンＤ代謝物の定性分野では、ポリクローナル抗体の使用について記述した多数の資料が知られている。例えば、非特許文献１、特許文献１、非特許文献２、３は、ポリクローナル抗体の作製及びビタミンＤのラジオイムノアッセイにおけるそれらの使用について記載している。
【０００６】
特許文献２において、ロシュ・ダイアグノスティックス及びエフ・ホフマン・ラ・ロシュは、最先端の様々な方法を開示している。エフ・ホフマン・ラ・ロシュは、２５−ヒドロキシビタミンＤに対するポリクローナル抗体を作製する方法を開示している。本方法は、２５−ヒドロキシビタミンＤ３または２５−ヒドロキシビタミンＤ２をハプテンとして含有するコンジュゲートで動物を免疫し、この動物の血清または血漿を分離し、この血清または血漿に含有される抗体を、ハプテンが２５−ヒドロキシビタミンＤ３の場合には２５−ヒドロキシビタミンＤ２を、ハプテンが２５−ヒドロキシビタミンＤ２の場合には２５−ヒドロキシビタミンＤ３を有する相補マトリックス上で免疫吸着により精製するステップを有する。免疫吸着マトリックス材としては、ＥＡＨ−セファロースが好ましい。この方法では、抗体がポリクローナル抗体、すなわち、抗体を取得するために動物を免疫しなければならないという大きな問題が生じる。また、実際は試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両者を測定するのであれば、２５−ヒドロキシビタミンＤの２つの成分の総量を検出するために、ポリクローナル抗体を有する２つの検査セット、すなわち、一方の検査で試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤ２量を決定し、他方の検査で同じ試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤ３量を決定する必要があるという問題もある。
【０００７】
生物学的試料中の分子を定量するために、例えば、診断用キットにおいて、モノクローナル抗体を使用することもできる。１９７５年になされたＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの発明は、ＨＧＰＲＴ遺伝子突然変異により薬剤感受性としたミエローマ細胞に、対象となる抗原で免疫された宿主動物から得た免疫脾臓Ｂ細胞を、ポリエチレングリコールの存在下に、融合させることを有する技術を介して、免疫学に全く新しい分野を開拓した。ハイブリドーマ細胞は生存し、適宜の培地（ＨＡＴ）中で培養してもよく、不死とされる。各ハイブリドーマは１つのＢ細胞から由来するので、単一のモノクローナル抗体のコピーとなる。対象となる抗体を作製するハイブリドーマは、培地中で成長し、大量のモノクローナル抗体を作製する。モノクローナル抗体は分離されて、次の使用に供される。モノクローナル抗体は、１つのエピトープに対して特異性の高い抗体として知られていることは注目すべきである。
【０００８】
ビタミンＤの代謝を認識する分野においては、モノクローナル抗体も使用されている。例えば、非特許文献４、特許文献３、非特許文献５は、１，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールに対するモノクローナル抗体の使用を開示している。１つの特異的抗原に対するモノクローナル抗体の通常の作製方法が１種のハプテンの使用及び１種の動物（通常、マウス）の免疫を含み、脾臓細胞とミエローマ細胞の融合の後に、１つのハイブリドーマが作製される。このハイブリドーマを培養し、不死化して、単一の抗原の単一のエピトープに対して特異的な１種のモノクローナル抗体を作製してもよい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】欧州特許第００９２００４号
【特許文献２】国際特許公開ＷＯ２００７／０３９１９３号
【特許文献３】米国特許第４５８５７４１号
【特許文献４】国際特許公開ＷＯ０３／１０４８２０号
【特許文献５】国際特許公開ＷＯ２００７／０３９１９４号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｈｏｌｌｉｓら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９３，  ３９，  ５２９−５３３
【非特許文献２】Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｓｔｅｒｏｉｄｓ，  １９９４，  ５９，  ４０１−４１１
【非特許文献３】Ｃｌｅｍｅｎｓら、Ｓｔｅｒｏｉｄｓ，  １９８３，  ４２，  ５０３−５０９
【非特許文献４】Ｐｅｒｒｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，  １９８３，  １１２，  ４３１−４３６
【非特許文献５】Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｂｉｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．，  １９９７，  ２０（９），  ９４８−９５３
【非特許文献６】Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｒａ  ｒａｉｓｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ２５−ｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３−［Ｃ−３］−ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，  Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  １９９２，  ５７（１０），  ４８８−４９３
【非特許文献７】Ｂａｓａｌｐら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  Ｃｕ２＋−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ａ  ｓｔｅｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ，  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎ，  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｓ”（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ，  ２００２，  ２１（１），  ４５−５１
【非特許文献８】Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、  Ｎａｔｕｒｅ  １９７５  （２５６），  ４９５−４９７またはＥｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９７６  （６），  ５１１−５１９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
複数の抗原を、モノクローナル抗体を使用して検出する場合、当業者は、検出する各分子に対するモノクローナル抗体を並行して作製しなければならない。例えば、特許文献４は、液体試料中のビタミンＡ及びＤ３の定量を開示している。ビタミンＡに対するモノクローナル抗体は、ビタミンＡ−ＫＬＨコンジュゲート（すなわち、ハプテンはビタミンＡである）から、通常の方法を使用して作製する。ビタミンＤ３に対するモノクローナル抗体は、ビタミンＤ３−ＫＬＨコンジュゲート（すなわち、ハプテンはビタミンＤ３である）から作製する。従って、液体試料中の両ビタミンの量を得るには、２つの試験を行わなければならない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明に係る方法が、技術的な予測に全く反して、１つかつ同一のハイブリドーマにより作製されたモノクローナル抗体が、複数の抗原に存在する１つのエピトープを認識できることを見出した。特に、本発明者らは、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両者が、単一のハイブリドーマに由来するモノクローナル抗体と結合することを見出した。
【００１３】
明確にするために、本発明では、所定のハイブリドーマは所定の種類のモノクローナル抗体、すなわち、実際には同一の構造のいくつかの分子を作製すると理解されるべきであるが、本明細書では、本発明に関して、「モノクローナル抗体」は、単一のハイブリドーマにより作製されたモノクローナル抗体を示し、「モノクローナル抗体類」は、異なる複数のハイブリドーマにより作製されたモノクローナル抗体を示す。
【００１４】
他に特に規定しない限り、本明細書内において、用語「ビタミンＤ」は、下記の化学式（Ａ）及び（Ｂ）に示されるビタミンＤ２及びビタミンＤ３を含むものであることが理解されるべきである。
【００１５】
【化１】
2011136978.tif 000002
【００１６】
【化２】
2011136978.tif 000003
【００１７】
化学式（Ａ）及び（Ｂ）において、ビタミンＤの位置は、ステロイドの命名に反映されている。２５−ヒドロキシビタミンＤは、化学式（Ａ）及び（Ｂ）の２５位が水酸化されているビタミンＤ代謝物、すなわち、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を示す。上記のように、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３は、診断目的に使用される場合のビタミンＤに特に関連性のある形である。
【００１８】
ビタミンＤ代謝物それ自体は、免疫原ではない。ビタミンＤの代謝により得られる成分の化学的活性化は、担体タンパク質または連結基への結合と同様重要である。従って、免疫を確実に成功させるために、ビタミンＤの代謝物またはその誘導体をハプテンとして含有するコンジュゲートを調製することが極めて重要である。「ハプテン」は、それ自身は免疫原性を有さないが、担体タンパク質と結合することによって、それに対する抗体が産生される形を表す物質であることは、当業者に理解されるべきである。ハプテンのコンジュゲートの作製に使用される担体タンパク質、すなわち、免疫原は、当業者において公知である。ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ）、β−ガラクトシダーゼまたはキーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎｅ：ＫＬＨ）が担体タンパク質として一般的に使用されている。「担体タンパク質」は、特定の物質または物質群を細胞膜、細胞外液または細胞内区画を介して輸送するタンパク質を指す。
【００１９】
化学式（Ａ）及び（Ｂ）に示されるような構造の３位のみが、原則として、担体タンパク質の活性化及び結合に好適である。実際、ビタミンＤ代謝物は、３位を介して結合していると考えられている（特許文献５、非特許文献６）。
【００２０】
第１の態様によれば、本発明は、ハイブリドーマ、及び２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識することができるモノクローナル抗体またはそのフラグメントの作製方法に関し、
ａ）免疫原性が付与された、一般化学式（Ｉ）：
【００２１】
【化３】
2011136978.tif 000004
【００２２】
（式中、ｎは０〜３の整数を示し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ１５はそれぞれ独立に水素または炭素数１〜４のアルキルを示し、Ｒ１２及びＲ１３はそれぞれ炭素数１〜４のアルキルを示し、Ｒは水素またはアシル、ベンジル、アルキル、アリール、アルキルエーテル、ジメトキシトリチル、メトキシトリチル、テトラヒドロピラニル、トリフェニルメチル基及びシリル誘導体からなる群から選択された置換基を示す）で示されるハプテン、その塩またはカルボン酸官能基がエステル、アミドまたはオキサゾリンの形成により保護されているその誘導体で動物を免疫し、
ｂ）前記動物により作製されたＢ細胞を採取し、ハイブリドーマを作製するためにそのＢ細胞をミエローマ細胞と融合させ、
ｃ）得られたハイブリドーマの少なくとも一部から、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識することができるモノクローナル抗体またはそのフラグメントを作製する、ステップを有する。
【００２３】
本方法は、免疫原性が付与された単一のハプテン、すなわち、単一のコンジュゲートでの免疫により得られたハイブリドーマから、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３（２つの異なる分子）に結合または認識できるモノクローナル抗体を作製することができる。これは、従来技術では考えられなかった、全く予期されなかった結果である。実際、上述したように、モノクローナル抗体は、使用したハプテンと同類である１つの抗原に特異的に結合することは、技術的に知られている。この点で、本発明は、驚くべきことに、異なる抗原に結合するモノクローナル抗体を開示していて、前記モノクローナル抗体は、一般化学式（Ｉ）の単一のハプテンで免疫して得られたハイブリドーマにより作製される。
【００２４】
一般化学式（Ｉ）のハプテンは、カルボン酸塩の形でもよく、有機または無機塩が好適である。従って、使用される塩は、例えば、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウム塩であってよい。または、一般化学式（Ｉ）のハプテンは、カルボン酸官能基がエステル、アミドまたはオキサゾリンの形成により保護されていてもよい誘導体であってもよい。エステルは、アルキル、アリール、ベンジル、チオ、セレノ、シリルまたはオルトエステルであってよい。
【００２５】
本発明では、用語「炭素数１〜４のアルキル」は、ｍが１〜４の整数である、化学式ＣｍＨ２ｍ＋１で表される炭化水素ラジカルを意味する。例えば、用語「炭素数１〜４のアルキル」は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチル及びｔ−ブチルラジカルを意味する。用語「アシル」は、Ｔ１がアルキルまたはアリール置換基である、化学式Ｔ１Ｃ（Ｏ）−で表されるラジカルを意味する。用語「ベンジル」は、Ｔ２がアリール基である、化学式Ｔ２ＣＨ２−で表されるラジカルを意味する。用語「アルキルエーテル」は、化学式Ｔ３ＯＴ４−で表されるラジカルを意味し、Ｔ３はアルキル、アリールまたはベンジルであり、Ｔ４はｐが１〜１０の整数である、化学式−（ＣＨ２）ｐ−で表される炭化水素鎖である。用語「ジメトキシトリチル」は、ビス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチルラジカルを意味し、用語「メトキシトリチル」は、（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルラジカルを意味する。
用語「アリール」は、通常炭素数６〜１０の、単環または、少なくとも１つの環が芳香族である、融合（例えば、ナフチル）もしくは共有結合により連結する多環を有するポリ不飽和芳香族炭化水素基を意味する。環は置換されていてもよい。限定的な例としては、フェニル、ナフチル、アントラシル及びビフェニル基が挙げられる。
本発明において使用される用語「置換された」は、表現「置換された」を使用して指示された原子上の１つまたは複数の水素が、指示された原子の原子価がその標準原子価を超えないことを条件として、指示された基からの選択物と交換され、その置換が化学的に安定な化合物として、すなわち、化合物が明らかに同一の形状を保ち、反応混合物から許容できる純度で得られるだけの充分な強さをもって得られることを示す。置換基は、これに限定されないが、アルキル、アリール、シクロアルキル、ハロゲン化物、水酸、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ及びシアノ基からなる群から選択することができる。本発明で、用語「ニトロ」は、ＮＯ２−基を意味する。本発明で、用語「シアノ」は、ＣＮ−基を意味する。本発明で、用語「水酸」は、ＯＨ−基を意味する。本発明で、用語「アミド」は、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−基を意味する。本発明で、用語「カルボキシ」は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−基を意味する。本発明で、用語「ハロゲン化物」は、塩化物、フッ化物、臭化物及びヨウ化物ラジカルを意味する。本発明で、用語「アミノ」は、置換または非置換の３価窒素原子のラジカルを意味する。本発明で、用語「シクロアルキル」は、全ての炭化水素が１つまたは２つの環を有する、または単環または二環式基を有する、環状アルキル基を意味する。シクロアルキルは、環中に少なくとも３つの炭素原子、好ましくは３〜１０の炭素原子を有し、置換されていてもよい。
用語「アルキル」は、ｍが１より大きい整数である、化学式ＣｍＨ２ｍ＋１で示される炭化水素ラジカルを意味する。通常、本発明のアルキル基は、１〜１０の炭素原子を有する。例えば、用語「炭素数１〜１０のアルキル」は、これらに限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、１−ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、ｉ−ペンチル、ネオ−ペンチル、ｔ−ペンチル、１−ヘキシル、２−ヘキシル、３−ヘキシル、１−メチル−１−エチル−ｎ−ペンチル、１，１，２−トリメチル−ｎ−プロピル、１，２，２−トリメチル−ｎ−プロピル、３，３−ジメチル−ｎ−ブチル、１−ヘプチル、２−ヘプチル、１−エチル−１，２−ジメチル−ｎ−プロピル、１−エチル−２，２−ジメチル−ｎ−プロピル、１−オクチル、３−オクチル、４−メチル−３−ｎ−ヘプチル、６−メチル−２−ｎ−ヘプチル、２−プロピル−１−ｎ−ヘプチル、２，４，４−トリメチル−１−ｎ−ペンチル、１−ノニル、２−ノニル、２，６−ジメチル−４−ｎ−ヘプチル、３−エチル−２，２−ジメチル−３−ｎ−ペンチル、３，５，５−トリメチル−１−ｎ−ヘキシル、１−デシル、２−デシル、４−デシル、３，７−ジメチル−１−ｎ−オクチル、３，７−ジメチル−３−ｎ−オクチルラジカルを指す。アルキル基は置換されていてもよい。
用語「テトラヒドロピラニル」は、２−テトラヒドロピランのラジカルを意味する。
用語「トリフェニルメチル」は、３つのアリール基、好ましくはフェニルにより置換されているメチルラジカルを意味する。
用語「シリル誘導体」は、Ｔ５、Ｔ６及びＴ７がそれぞれ独立にアルキル、アリール、アルコキシまたはアリールオキシである、化学式Ｔ５Ｔ６Ｔ７Ｓｉ−で表されるラジカルである。本発明において、用語「アルコキシ」は、Ｔ８が置換または非置換のアルキルである、化学式−ＯＴ８で表されるラジカルである。本発明では、用語「アリールオキシ」は、Ｔ９が置換または非置換のアリールである、化学式−ＯＴ９で表されるラジカルである。
【００２６】
前記ハプテンは、免疫原性担体タンパク質との共有結合、リポソームへの封入、リポソームへの固定、高分子と前記ハプテンの結合、生体高分子での誘導または多抗原性ペプチドとの結合により免疫原性を付与されてよい。用語「免疫原」は、免疫反応を引き起こす可能性のある物質を意味する。免疫原とは異なり、ハプテンは免疫システム（例えば、抗体）により識別される誘導体であるが、免疫反応を引き起こすことはない。
【００２７】
前記ハプテンを免疫原性担体タンパク質と共有結合させる場合、担体タンパク質は、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、オボアルブミン、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）、ＴＨＹ（サイログロブリン）、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）、ｃＢＳＡ（陽イオン化ウシアルブミン）、β−ガラクトシダーゼまたはＣＣＨ（ロコガイヘモシアニン）であってよい。
【００２８】
前記ハプテンを高分子と結合させる場合、高分子は、合成、天然または修飾天然高分子であってよい。したがって、合成高分子は、これらに限定されないが、例えば、ポリ−Ｌ−リジンまたはアガロースであってよい。また、天然高分子は、これに限定されないが、デキストランであってよい。また、修飾天然高分子は、これに限定されないが、カルボキシメチルセルロースであってよい。
【００２９】
また、前記ハプテンは、生体高分子での誘導により免疫原性を付与されてもよい。その工程は、非特許文献７に記載されている。
【００３０】
また、前記ハプテンは多抗原性ペプチドに結合させてもよい。多抗原性ペプチドは、ポリリジンコアに２〜１６の合成ペプチドのコピーが結合したものであってもよい。
【００３１】
好ましくは、前記ハプテンは、担体タンパク質との共有結合により免疫原性を付与される。ＫＬＨ及びＢＳＡは、本発明の方法及び使用に、特に効果的な担体タンパク質である。ハプテンと担体タンパク質との結合は、ハプテンのカルボン酸官能基を介してなされてよい。
【００３２】
好ましくは、ハプテンは、ｎが０である、一般化学式（Ｉ）により示される誘導体である。特に、前記ハプテンは、ｎが０で、Ｒ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ１５がそれぞれ水素であり、Ｒ１２及びＲ１３がそれぞれメチル基である、一般化学式（Ｉ）で示される誘導体であってよい。従って、そのようなハプテンのＩＵＰＡＣ標準に従う名前は、（２Ｓ）−２−（（７ａＲ，Ｅ）−４−（（Ｚ）−２−（（Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−メチレンシクロヘキシリデン）エチリデン）−７ａ−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル）プロパン酸である。この化合物は、また、２３，２４，２５，２６，２７−ペンタノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−３β−オール−２２−オイック酸と命名され、そのＣＡＳ番号は、９９５１８−３８−４である。
【００３３】
また、ハプテンは、ｎが１である、一般化学式（Ｉ）により示される誘導体であってもよい。特に、前記ハプテンは、ｎが１であって、Ｒ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ１５がそれぞれ水素であり、Ｒ１２及びＲ１３がそれぞれメチル基である、一般化学式（Ｉ）で示される誘導体であってよい。従って、そのようなハプテンのＩＵＰＡＣ標準に従う名前は、（Ｒ）−３−（（１Ｒ，３ａＳ，７ａＲ，Ｅ）−４−（（Ｚ）−２−（（Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−メチレンシクロヘキシリデン）−エチリデン）−７ａ−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル）ブタン酸である。この化合物は、また、２４，２５，２６，２７−テトラノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−３β−オール−２２−オイック酸と命名され、そのＣＡＳ番号は７６７９４−３４−８である。
【００３４】
また、ハプテンは、ｎが２である、一般化学式（Ｉ）により示される誘導体であってもよい。特に、前記ハプテンは、ｎが２であって、Ｒ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ１５がそれぞれ水素であり、Ｒ１２及びＲ１３がそれぞれメチル基である、一般化学式（Ｉ）で示される誘導体であってよい。従って、そのようなハプテンのＩＵＰＡＣ標準に従う名前は、（Ｒ）−４−（（１Ｒ，３ａＳ，７ａＲ，Ｅ）−４−（（Ｚ）−２−（（Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−メチレンシクロヘキシリデン）エチリデン）−７ａ−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル）ペンタン酸である。この化合物は、また、２５，２６，２７−トリノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−３β−オール−２２−オイック酸と命名される。
【００３５】
また、ハプテンは、ｎが３である、一般化学式（Ｉ）により示される誘導体であってもよい。特に、前記ハプテンは、ｎが３であって、Ｒ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ１５がそれぞれ水素であり、Ｒ１２及びＲ１３がそれぞれメチル基である、一般化学式（Ｉ）で示される誘導体であってよい。従って、そのようなハプテンのＩＵＰＡＣ標準に従う名前は、（Ｒ）−５−（（１Ｒ，３ａＳ，７ａＲ，Ｅ）−４−（（Ｚ）−２−（（Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−メチレンシクロヘキシリデン）エチリデン）−７ａ−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル）ヘキサン酸である。この化合物は、また、２６，２７−ビスノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−３β−オール−２２−オイック酸と命名される。
【００３６】
好ましくは、ミエローマを動物のＢ細胞と融合させて作製されたハイブリドーマは、２００９年９月２１日に寄託番号ＬＭＢＰ７０１１ＣＢ、ＬＭＢＰ７０１２ＣＢ及びＬＭＢＰ７０１３ＣＢでＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ（ＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ（登録商標）Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ−Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｇｈｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）に寄託されているハイブリドーマ及び２０１０年３月９日に寄託番号ＬＭＢＰ７２０５ＣＢ及びＬＭＢＰ７２０４ＣＢでＢＣＣＭ／ＬＭＢＰに寄託されているハイブリドーマからなる群から選択することができる。実験に使用される動物は、ウサギ、マウス、ハムスター、ラットなどでよい。
【００３７】
本方法の単一のハイブリドーマにより作製された各モノクローナル抗体は、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識することができる。２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の認識は、同時に起こってよい。用語「同時」とは、本発明の方法により作製されたモノクローナル抗体が、２５−ヒドロキシビタミンＤ２と２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両者が同じ試料に存在する場合に、両抗原に結合、認識できることを意味する。従って、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の認識率は、７０〜１１０％であってよい。認識率は、試験される試料中に存在する２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の総有効量に対する、本発明に係る抗体によって認識された２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の総量の比に１００を掛けて得られる比率である。比率は、１００％を超えてもよい。これは、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の全量を測定する方法にかかわる不確実性によるものであって、この種の測定については当業者によく知られている現象である。
【００３８】
本発明の第２の態様によれば、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識できるモノクローナル抗体またはそのフラグメントを作製できるハイブリドーマが提供される。ハイブリドーマは、本方法のステップａ）及びｂ）により取得してよい。前記ハイブリドーマは、２００９年９月２１日に寄託番号ＬＭＢＰ７０１１ＣＢ、ＬＭＢＰ７０１２ＣＢ及びＬＭＢＰ７０１３ＣＢでＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ（ＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ（登録商標）Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ−Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｇｈｅｎｔ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）に寄託されているハイブリドーマ及び２０１０年３月９日に寄託番号ＬＭＢＰ７２０５ＣＢ及びＬＭＢＰ７２０４ＣＢでＢＣＣＭ／ＬＭＢＰに寄託されているハイブリドーマからなる群から選択することができる。上述のように、これらハイブリドーマのそれぞれは、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識するモノクローナル抗体またはそのフラグメントを作製することができる。本発明に係るハイブリドーマにより作製されたモノクローナル抗体による２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の認識は、試験試料が２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両者を含有する場合、同時に起こってよい。本発明に係るハイブリドーマにより作製されたモノクローナル抗体またはフラグメントが、７０〜１１０％の２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の認識率を示すことは、特に注目に値する。前記ハイブリドーマは、試料または試験試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識、定量することができる診断デバイスの製造に使用してもよく、または２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識できるモノクローナル抗体またはそのフラグメントの作製に使用してもよい。前記ハイブリドーマは、作製したモノクローナル抗体の分泌が促進されるように遺伝子操作されてもよい。すなわち、プラスミドまたはＤＮＡ配列をハイブリドーマのＤＮＡ配列に添加して、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識するモノクローナル抗体を作製するために使用できる、遺伝子操作ハイブリドーマを形成してもよい。
【００３９】
本発明の第３の態様によれば、モノクローナル抗体またはそのフラグメントが提供される。前記モノクローナル抗体またはそのフラグメントは２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識することができる。従って、２つの抗原、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３、に対するモノクローナル抗体またはそのフラグメントが提供される。前記モノクローナル抗体は、好ましくは本発明の方法により取得される。好ましくは、前記モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、寄託番号ＬＭＢＰ７０１１ＣＢ、ＬＭＢＰ７０１２ＣＢ及びＬＭＢＰ７０１３ＣＢでＢＣＣＭ／ＬＭＢＰに寄託されているハイブリドーマ及び２０１０年３月９日に寄託番号ＬＭＢＰ７２０５ＣＢ及びＬＭＢＰ７２０４ＣＢでＢＣＣＭ／ＬＭＢＰに寄託されているハイブリドーマからなる群から選択されたハイブリドーマにより作製することができる。これらのハイブリドーマのそれぞれは、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識することができるモノクローナル抗体またはそのフラグメントを作製することができる。
【００４０】
前記モノクローナル抗体の２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の認識は、同時に起こってよい。さらに、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の認識率は、７０〜１１０％であってよい。
【００４１】
本発明の第４の態様によれば、本発明は、免疫原性が付与された、一般化学式（Ｉ）：
【００４２】
【化４】
2011136978.tif 000005
【００４３】
（式中、ｎは０〜３の整数を示し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ１５はそれぞれ独立に水素または炭素数１〜４のアルキルを示し、Ｒ１２及びＲ１３はそれぞれ炭素数１〜４のアルキルを示し、Ｒは水素またはアシル、ベンジル、アルキル、アリール、アルキルエーテル、ジメトキシトリチル、メトキシトリチル、テトラヒドロピラニル、トリフェニルメチル基及びシリル誘導体からなる群から選択された置換基を示す）で示される化合物からなるハプテン、その塩またはカルボン酸官能基がエステル、アミドまたはオキサゾリンの形成により保護されているその誘導体の、ハイブリドーマ及び２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識できるモノクローナル抗体またはそのフラグメントの作製のための使用に関する。また、一般化学式（Ｉ）の化合物からなるハプテンは、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識できる組換えモノクローナル抗体フラグメントの作製のために使用してよい。前記ハプテンを上述の本発明の方法のステップａ）及びｂ）によるハイブリドーマの作製に使用してもよい。前記ハプテンを上述の本発明の方法によるモノクローナル抗体の作製に使用してもよい。
【００４４】
前記ハプテンは、免疫原性担体タンパク質との共有結合、リポソームへの封入、リポソームへの固定、高分子と前記ハプテンの結合、生体高分子での誘導または多抗原性ペプチドとの結合により免疫原性を付与されてよい。
【００４５】
前記ハプテンを免疫原性担体タンパク質と共有結合させる場合、担体タンパク質は、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、オボアルブミン、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）、ＴＨＹ（サイログロブリン）、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）、ｃＢＳＡ（陽イオン化ウシアルブミン）、β−ガラクトシダーゼまたはＣＣＨ（ロコガイヘモシアニン）であってよい。
【００４６】
前記ハプテンを高分子と結合させる場合、高分子は、合成、天然または修飾天然高分子であってよい。したがって、合成高分子は、これらに限定されないが、例えば、ポリ−Ｌ−リジンまたはアガロースであってよい。また、天然高分子は、これに限定されないが、デキストランであってよい。また、修飾天然高分子は、これに限定されないが、カルボキシメチルセルロースであってよい。
【００４７】
また、前記ハプテンは、生体高分子での誘導により免疫原性を付与されてもよい。その工程は、参考として添付された非特許文献７に記載されている。
【００４８】
また、前記ハプテンは多抗原性ペプチドに結合させてもよい。多抗原性ペプチドは、ポリリジンコアに２〜１６の合成ペプチドのコピーが結合したものであってもよい。
【００４９】
好ましくは、前記ハプテンは、担体タンパク質との共有結合により免疫原性を付与される。ＫＬＨ及びＢＳＡは、本発明の方法及び使用に、特に効果的な担体タンパク質である。ハプテンと担体タンパク質との結合は、ハプテンのカルボン酸官能基を介してなされてよい。
【００５０】
好ましくは、ハイブリドーマ及びそのハイブリドーマから得られる２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識できるモノクローナル抗体の作製に使用されるハプテンは、ｎが０である、化学式（Ｉ）により示される化合物である。特に、前記ハプテンは、（２Ｓ）−２−（（７ａＲ，Ｅ）−４−（（Ｚ）−２−（（Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−メチレンシクロヘキシリデン）エチリデン）−７ａ−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル）プロパン酸、すなわち、ｎが０で、Ｒ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ１５がそれぞれ水素であり、Ｒ１２及びＲ１３がそれぞれメチル基である、化学式（Ｉ）で示される化合物であってよい。また、ハイブリドーマ及びそのハイブリドーマから得られる２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識できるモノクローナル抗体の作製に使用されるハプテンは、ｎが１である、化学式（Ｉ）により示される化合物であってもよい。特に、前記ハプテンは、（Ｒ）−３−（（１Ｒ，３ａＳ，７ａＲ，Ｅ）−４−（（Ｚ）−２−（（Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−メチレンシクロヘキシリデン）−エチリデン）−７ａ−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル）ブタン酸、すなわち、ｎが１であって、Ｒ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ１５がそれぞれ水素であり、Ｒ１２及びＲ１３がそれぞれメチル基である、化学式（Ｉ）で示される化合物であってよい。また、ハイブリドーマ及びそのハイブリドーマから得られる２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識できるモノクローナル抗体の作製に使用されるハプテンは、ｎが２である、化学式（Ｉ）により示される化合物であってもよい。特に、前記ハプテンは、（Ｒ）−４−（（１Ｒ，３ａＳ，７ａＲ，Ｅ）−４−（（Ｚ）−２−（（Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−メチレンシクロヘキシリデン）エチリデン）−７ａ−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル）ペンタン酸、すなわち、ｎが２であって、Ｒ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ１５がそれぞれ水素であり、Ｒ１２及びＲ１３がそれぞれメチル基である、化学式（Ｉ）で示される化合物であってよい。また、ハイブリドーマ及びそのハイブリドーマから得られる２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識できるモノクローナル抗体の作製に使用されるハプテンは、ｎが３である、化学式（Ｉ）により示される化合物であってもよい。特に、前記ハプテンは、（Ｒ）−５−（（１Ｒ，３ａＳ，７ａＲ，Ｅ）−４−（（Ｚ）−２−（（Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−メチレンシクロヘキシリデン）エチリデン）−７ａ−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル）ヘキサン酸、すなわち、ｎが３であって、Ｒ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ１５がそれぞれ水素であり、Ｒ１２及びＲ１３がそれぞれメチル基である、化学式（Ｉ）で示される化合物であってよい。
【００５１】
従って、同一の試料中に２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３が存在する場合、前記モノクローナル抗体またはそのフラグメントによる両抗原の認識は同時に起こってよい。さらに、前記モノクローナル抗体またはそのフラグメントによる２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の認識率は、７０〜１１０％であってよい。
【００５２】
本発明に係るハプテン及び／またはモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、試料または試験試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識、定量することができる診断デバイスの製造に使用することができる。上述のような一般化学式（Ｉ）に示される化合物であるハプテンは、試験試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識、定量することができる診断デバイスの製造に使用してもよい。その場合、同一の試料中に２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３が存在する場合、前記モノクローナル抗体による両抗原の認識は同時に起こってよい。前記モノクローナル抗体による２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の認識率は、７０〜１１０％であってよい。
【００５３】
本発明の他の態様によれば、試験試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識及び／または定量できる診断デバイスが提供される。ここで使用される用語「診断デバイス」はまた、試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の認識及び／または定量用キットを指す。試料はヒトまたは動物からの試料であってよい。診断デバイスには、動物研究用の試験手段も含まれる。前記診断デバイスは、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識できるモノクローナル抗体またはそのフラグメントを有する。好ましくは、前記診断デバイスのモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、本発明によれば、寄託番号ＬＭＢＰ７０１１ＣＢ、ＬＭＢＰ７０１２ＣＢ、ＬＭＢＰ７０１３ＣＢ、ＬＭＢＰ７２０４ＣＢ及びＬＭＢＰ７２０５ＣＢでＢＣＣＭ／ＬＭＢＰに寄託されているハイブリドーマからなる群から選択されたハイブリドーマから作製してもよい。前記モノクローナル抗体またはそのフラグメントによる２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の認識は、同時であってよい。さらに、前記モノクローナル抗体またはそのフラグメントによる２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の認識率は、７０〜１１０％であってよい。試験される前記試料は、ヒトまたは動物由来の生体試料であってよい。
【００５４】
診断デバイスはまた、化学式（Ｉ）：
【００５５】
【化５】
2011136978.tif 000006
【００５６】
（式中、ｎは０〜３の整数を示し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ１５はそれぞれ独立に水素または炭素数１〜４のアルキルを示し、Ｒ１２及びＲ１３はそれぞれ炭素数１〜４のアルキルを示し、Ｒは水素またはアシル、ベンジル、アルキル、アリール、アルキルエーテル、ジメトキシトリチル、メトキシトリチル、テトラヒドロピラニル、トリフェニルメチル基及びシリル誘導体からなる群から選択された置換基を示す）の化合物、その塩、またはカルボン酸官能基がエステル、アミドまたはオキサゾリンの形成により保護されているその誘導体の試料を含有してもよい。
【００５７】
好ましくは、診断デバイスは、ｎが０で、Ｒ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ１５がそれぞれ水素であり、Ｒ１２及びＲ１３がそれぞれメチル基である、化学式（Ｉ）で示される化合物試料を有してよい。また、診断デバイスは、ｎが１であって、Ｒ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ１５がそれぞれ水素であり、Ｒ１２及びＲ１３がそれぞれメチル基である、化学式（Ｉ）で示される化合物試料を有してよい。また、診断デバイスは、ｎが２であって、Ｒ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ１５がそれぞれ水素であり、Ｒ１２及びＲ１３がそれぞれメチル基である、化学式（Ｉ）で示される化合物試料を有してよい。また、診断デバイスは、ｎが３であって、Ｒ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ１５がそれぞれ水素であり、Ｒ１２及びＲ１３がそれぞれメチル基である、化学式（Ｉ）で示される化合物試料を有してよい。
【００５８】
診断デバイスはまた、試験試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の存在を表すシグナルを発現する手段を有してもよい。
【００５９】
前記シグナルの発現手段は、化学式（ＩＩ）：
【００６０】
【化６】
2011136978.tif 000007
【００６１】
（式中、ｎは０〜３の整数を示し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ１５はそれぞれ独立に水素または炭素数１〜４のアルキルを示し、Ｒ１２及びＲ１３はそれぞれ炭素数１〜４のアルキルを示し、Ｒは水素またはアシル、ベンジル、アルキル、アリール、アルキルエーテル、ジメトキシトリチル、メトキシトリチル、テトラヒドロピラニル、トリフェニルメチル基及びシリル誘導体からなる群から選択された置換基を示し、Ｒ１６はＨＲＰタンパク質（西洋ワサビペルオキシダーゼ）、アルカリホスファターゼタンパク質、ＰＯＤタンパク質（ペルオキシダーゼ）または化学式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）：
【００６２】
【化７】
2011136978.tif 000008
【００６３】
【化８】
2011136978.tif 000009
【００６４】
に示される基である）で示されるトレーサであってよい。
式中、「Ｉ１２５」は、ヨウ素原子の放射性同位体を示す。化学基（ＩＩＩ）は、その「アミノ」ＮＨ−官能基により化学式（ＩＩ）の化合物に結合される。化学基（ＩＶ）は、その「アミド」Ｃ（Ｏ）ＮＨ−官能基により化学式（ＩＩ）の化合物に結合される。あるいは、Ｒ１６は、１２５Ｉ−標識ヒスタミン、１２５Ｉ−標識ヒスチジン、１２５Ｉ−標識チロシン、１２５Ｉ−標識メチルチロシネート、蛍光基、化学発光基または化学式（Ｖ）：
【００６５】
【化９】
2011136978.tif 000010
【００６６】
（式中、Ｚはリンカーであり、Ｗはカルボニル基に結合できる官能基であり、Ｚは置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキルであってよく、Ｗはアミノ、アミド、水酸またはヒドラジン部分であってよい）で示される化学基であってよい。
【００６７】
好ましくは、前記トレーサは化学式（ＩＩ）：
【００６８】
【化１０】
2011136978.tif 000011
【００６９】
（式中、ｎは０〜３の整数であり、Ｒ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ１５はそれぞれ水素であり、Ｒ１２及びＲ１３はそれぞれメチル基であり、Ｒ１６は化学式（ＩＩＩ）で示される基である）であってよい。
特に、診断デバイスは、ｎが０で、Ｒ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ１５がそれぞれ水素であり、Ｒ１２及びＲ１３がそれぞれメチル基であり、Ｒ１６が化学式（ＩＩＩ）の基である、化学式（ＩＩ）に示されるトレーサ試料を含有してよい。
【００７０】
また、前記シグナルの発現手段はバイオセンサーである。バイオセンサーはモノクローナル抗体が１つの抗原に結合するとシグナルを発現する。用語「バイオセンサー」は、物理化学、光学、圧電、電気化学または電磁気的手法で生体試料を検出できる、物理化学的デバイスを指す。バイオセンサーは、特に関連電子要素、またはデータを処理または表示する信号処理部、及びシグナルの形で物理化学的変化を検出する検出要素を有している。モノクローナル抗体は、バイオセンサーの支持体に結合していてよい。
【００７１】
本発明の他の態様によれば、上述のように、免疫原性が付与された一般化学式（Ｉ）に示されるハプテンは、ハイブリドーマの作製に使用されてよい。ハイブリドーマの前記作製は、
ａ）免疫原性が付与された、一般化学式（Ｉ）：
【００７２】
【化１１】
2011136978.tif 000012
【００７３】
（式中、ｎは０〜３の整数を示し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ１５はそれぞれ独立に水素または炭素数１〜４のアルキルを示し、Ｒ１２及びＲ１３はそれぞれ炭素数１〜４のアルキルを示し、Ｒは水素またはアシル、ベンジル、アルキル、アリール、アルキルエーテル、ジメトキシトリチル、メトキシトリチル、テトラヒドロピラニル、トリフェニルメチル基及びシリル誘導体からなる群から選択された置換基を示す）で示さるハプテン、その塩またはカルボン酸官能基がエステル、アミドまたはオキサゾリンの形成により保護されているその誘導体で動物を免疫し、
ｂ）前記動物により作製されたＢ細胞の採取とハイブリドーマを作製するために採取したＢ細胞をミエローマ細胞に融合させる、ステップを有してよい。本方法により得られたハイブリドーマから、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３に対するまたは認識するモノクローナル抗体またはそのフラグメントを作製する方法が提供される。
【発明の効果】
【００７４】
得られたモノクローナル抗体が、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を識別できるという事実は、非常に驚くべきことであり、そのような特性は単一のハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体を使用しては得られなかったという障害を克服するものである。本発明の方法の重要な利点は、簡単な手順で試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を同時に認識することができ、かつ容易に再現可能でるということである。さらに、この方法は、数十年間知られていたモノクローナル抗体類の分野における技術であるという事実にもかかわらず、長く満たされなかった産業上のニーズに対応するものである。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
以下に、本発明を、動物の免疫に使用されるハプテンが、ｎが０で、Ｒ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ１５がそれぞれ水素であり、Ｒ１２及びＲ１３がそれぞれメチル基である、化学式（Ｉ）で示される誘導体である、特定の形態による実施にしたがって記載する。このハプテンは、以下の記載において（Ｈ）と称する。本発明はこの実施形態に限定されないことを理解することは重要である。例えば、ハプテンは、置換基はそのままで、ｎが１、２または３である化学式（Ｉ）の誘導体であってもよい。
【００７６】
モノクローナル抗体の作製方法
モノクローナル抗体の作製は、従来の方法、例えば、非特許文献８に記載の手順にしたがって行ってもよい。この方法にしたがって、モノクローナル抗体を作製する、ハイブリドーマとして知られている融合細胞を取得するために、骨髄細胞を免疫した動物のリンパ球Ｂ細胞と結合させる。この方法では、ハプテンを担体タンパク質に結合させて、免疫原性を誘導することができる免疫原を形成する。担体タンパク質は、このように、ハプテンに免疫反応を引き起こす能力を与える。
【００７７】
ハプテンの合成及び免疫原の調製
従って、本発明では、その合成は当業者に公知である、ハプテン（Ｈ）をまず、以下のプロトコルにしたがってウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合させる。無水ジメチルホルムアミド（Ｆｌｕｋａ  １３８６９２３−４３４０８２３１）、無水ジオキサン（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓ３９１３６−２７７）及びジイソプロピルエチルアミン（Ｆｌｕｋａ  ０３４４０）を含有する培地中で、ある量のハプテン（Ｈ）を室温で４時間、無水ジメチルホルムアミドに溶解したＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート（ＴＳＴＵ−Ｆｌｕｋａ  ８５９７２）で、活性化させる。続いて、１００〜１０００当量のハプテン溶液を、炭酸塩緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９．４）で希釈したＢＳＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  １２６５９）１当量に添加する。溶液を室温で１８時間、光を避けて、撹拌した後、反応混合物を食塩水（ＮａＣｌ：９ｇ／Ｌ）中、４８時間４℃で透析する。２４時間後に新しい食塩水を再添加する。
【００７８】
ハプテン（Ｈ）はまた、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン：Ｓｉｇｍａ  Ｈ２１３３）に結合させてもよい。その場合には、炭酸塩緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９．４）で希釈したＫＬＨ１当量に２０，０００〜５００，０００当量のハプテンを添加する。溶液を室温で１８時間、光を避けて、撹拌した後、反応混合物を食塩水（ＮａＣｌ：９ｇ／Ｌ）中、４８時間４℃で透析して目的の免疫原を得る。２４時間後に新しい食塩水を再添加する。
【００７９】
動物の免疫
雌マウス（６週齢）は、ＣＲＥＡＬ社より入手した。免疫原（生理食塩水中２０μｇ）を、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ、Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：  ２６３８１０）またはフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ、Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：  ２６３９１０）となる添加剤（５０％食塩水／５０％添加剤（ｖ／ｖ））とともにマウスに皮下注射した。ＣＦＡは死菌マイコバクテリアを含有する油であり、ＩＦＡはマイコバクテリアを含有しないことを除けばＣＦＡと同じアジュバントである。アジュバントは、動物の体内に免疫反応を引き起こす。免疫原の注射（３〜１０回）の後、各免疫マウスの血清を検査し、注射された抗原に対する特異抗体に関して、漿液性の内容物を調べた。マウスは、陽性（すなわち、マウス血清とインキュベートした際に、放射性物質標識抗原または酵素標識の結合率が少なくとも１０％である）と見なされ次第、細胞融合用に選択し、血清試験の１ヶ月後に細胞融合に使用した。融合の間には、（ＣＯ２を使用して）動物を安楽死させ、その脾臓を摘出し、３７℃に保たれた１０ｍＬのＷ／Ｏ培地、すなわち、タンパク質不含で２％（ｖ／ｖ）のペニシリン及びストレプトマイシン混合物（１００ｘ）が補足されたＤＭＥＭダルベッコ変性イーグル培地（ＧＩＢＣＯ  ２１９６９）でゆっくり灌流しながら、脾臓を先端が平らな鉗子でこすって前記動物の脾臓に存在する免疫担当細胞を回収した。そのように採取された細胞をペトリ皿に移し、１５ｍＬの滅菌円錐チューブ内で遠心分離した。細胞残渣を回収し、骨髄細胞と結合させた。
【００８０】
骨髄細胞
通常、マウス脾細胞の融合に使用されるミエローマは、ＮＳＯミエローマ（Ｓｉｇｍａ  ｒｅｆ：８５１１０５０３）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ  ｒｅｆ：ＣＲＬ−１５８１）またはＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ  ｒｅｆ：１５８０）である。ミエローマは、２％（ｖ／ｖ）のペニシリン及びストレプトマイシン混合物（１００ｘ）の追加タンパク質を含まないＤＭＥＭ基本混合物、２〜５％（ｖ／ｖ）グルタミン、２％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸（１００ｘ）、２％（ｖ／ｖ）ピルビン酸ナトリウム（１００ｘ）及び１％（ｖ／ｖ）ゲンタマイシンを含有する培地中で培養した。培地にはさらに、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を添加した。培養物は、５０ｍＬの滅菌円錐チューブ内で遠心分離した（１０００ｒｐｍ、１０分間）。底部を集めて、１５ｍＬのチューブで遠心分離した。一般的に、１ｍＬのミエローマ中に１×１０６〜２×１０８個の細胞が存在する。
【００８１】
細胞融合
脾臓細胞とミエローマ細胞とを、ミエローマ１個に対して約５〜１０脾臓細胞の割合で混合し、ハイブリドーマを形成した。本実施例では、３．４×１０６個／ｍＬのＮＳＯミエローマ４．７ｍＬを８×１０７個の脾臓細胞と混合した。脾臓細胞とミエローマ細胞との混合物を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞残渣を、３７℃に温度を保持しながら、ゆっくり（１分間）と１ｍＬの５０％ポリエチレングリコール溶液に懸濁した。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液は、５ｇのポリエチレングリコール（Ｍｅｒｃｋ，  ｒｅｆ：  １．０９７２７．０１００）を５ｍＬの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、５％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ  Ｄ２６５０）を添加し、ろ過滅菌（０．２μｍ）して調製した。細胞残渣をＰＥＧ溶液に再懸濁し、Ｗ／Ｏ培地（２％（ｖ／ｖ）のペニシリン及びストレプトマイシン混合物（１００ｘ）の追加タンパク質を含まないＤＭＥＭ）を添加して少なくとも１０倍に希釈した。チューブを遠心分離し、細胞残渣を、タンパク質不含、２％（ｖ／ｖ）のペニシリン及びストレプトマイシン混合物（１００ｘ）含有ＤＭＥＭ基本混合物、２〜５％（ｖ／ｖ）グルタミン、２％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸（１００ｘ）、２％（ｖ／ｖ）ピルビン酸ナトリウム（１００ｘ）、１％（ｖ／ｖ）ゲンタマイシン、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、２％（ｖ／ｖ）ヒポキサンチンチミジン（５０ｘ）、２％（ｖ／ｖ）アミノプテリン（５０ｘ）及び最後に２％（ｖ／ｖ）ニュートリドーマＣＳ（Ｒｏｃｈｅ  ｒｅｆ：  １３６３  ７４３）を含有するＨＡＴ培地に再懸濁した。細胞残渣に添加されたＨＡＴ培地の体積は、各ウェル当たり５×１０４〜１０５個の細胞が９６−ウェルプレートに広がるように、各ウェル当たり１５０〜２００μＬとした。プレートを８〜１０日間３７℃で５％ＣＯ２下に培養した。
【００８２】
ハプテン特異的抗体を作製するハイブリドーマの予備選択
２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識できるモノクローナル抗体を作製するハイブリドーマを含有するウェルを、均一相での放射免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）により、深ウェルプレートから選択し、免疫沈降を行った。この方法では、融合の深ウェルプレートからのある量（５０〜１００μＬ）の培養培地を、ｎが０で、Ｒ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ１５がそれぞれ水素であり、Ｒ１２及びＲ１３がそれぞれメチル基であり、Ｒ１６が化学式（ＩＩＩ）である、化学式（ＩＩ）で示されるトレーサとインキュベートすることからなる。４〜８時間のインキュベーション後、ＳＡＣ細胞（抗マウス抗体を含有するセルロース懸濁液、ＩＤＳ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：  ＡＡＳＡＣ４）を培地に添加して反応を停止させた。遠心分離後、底部の放射活性をガンマカウンターで測定した。陽性ウェル（すなわち、添加全放射性活性量の１０％以上の結合）は、ハプテン（Ｈ）に特異的なマウス抗体を含有、すなわち、特異的なハイブリドーマクローンを含有した。
【００８３】
２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両者を認識するモノクローナル抗体を作製するハイブリドーマクローンの選択
得られた陽性ハイブリドーマ（すなわち、トレーサを同定したモノクローナル抗体類を作製するハイブリドーマ）の中から、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両者を同定するものを、前記トレーサの結合による抑制試験により選択した。この試験は、ハイブリドーマ（ペトリ皿上）の培養培地の上清（例えば、１００μＬ）を、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の存在下に、トレーサ（ヨウ素１２５で標識）とインキュベートすることからなる。混合物は、１８時間室温でインキュベートした。使用された２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３はそれぞれ、ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｈ１７９３７及びｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｈ４０１４としてＳｉｇｍａから入手した。確認試験は、１０００ｎｇ／ｍＬの濃度の２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の溶液を使用して行った。トレーサは、１０ｇ／ＬのＣＰ（カゼインペプトン：ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：  １９５１６）を含む、体積比で２５％水／２５％エタノール／５０％０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）の混合溶液中に含まれる。反応は、ＳＡＣ細胞（抗マウス抗体を含有するセルロース懸濁液、ＩＤＳ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：  ＡＡＳＡＣ４）をインキュベーション培地に添加して免疫沈降により反応を停止させた。
【００８４】
結果
表１は、ハプテン−特異的モノクローナル抗体を作製するハイブリドーマの予備選択試験後に選択された、ハイブリドーマクローンに対する２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の認識結果を示す。
【００８５】
【表１】
2011136978.tif 000013
【００８６】
第１のカラムは、上述の寄託ハイブリドーマに対応する試験クローンの番号を記載している。第２のカラムは、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３非存在下に、対応するクローンにより作製されたモノクローナル抗体への前記トレーサの結合率を示す。第３のカラムは、１μｇ／ｍＬの２５−ヒドロキシビタミンＤ２溶液の存在下に、対応するクローンにより作製されたモノクローナル抗体への前記トレーサの結合率を示す。第４のカラムは、１μｇ／ｍＬの２５−ヒドロキシビタミンＤ２溶液の存在下に、対応するモノクローナル抗体の抑制率を示す。この抑制率は、２５−ヒドロキシビタミンＤ２非存在における結合に対する、１０００ｎｇ／ｍＬの２５−ヒドロキシビタミンＤ２存在下における結合率に１００を掛けて、１００％から差し引いて算出される。第５のカラムは、１μｇ／ｍＬの２５−ヒドロキシビタミンＤ３溶液の存在下に、対応するクローンにより作製されたモノクローナル抗体への前記トレーサの結合率を示す。第６ののカラムは、１μｇ／ｍＬの２５−ヒドロキシビタミンＤ３溶液の存在下に、対応するモノクローナル抗体の抑制率を示す。この抑制率は、２５−ヒドロキシビタミンＤ３非存在における結合に対する、１μｇ／ｍＬの２５−ヒドロキシビタミンＤ３存在下における結合率に１００を掛けて、１００％から差し引いて算出される。
【００８７】
２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の濃度がそれぞれ約１μｇ／ｍＬの場合、ＬＭＢＰ７０１２ＣＢクローンにより作製されたモノクローナル抗体の抑制率は、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３に対して８０％を超えている。
【００８８】
２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を同時に認識する例
２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を同時に認識する試験を被覆チューブ上で行った。モノクローナル抗体は、０．５μｇ／ｍＬの濃度で乾燥チューブ（直接被覆）に固定した。使用された抗体は、ＬＭＢＰハイブリドーマ７０１３ＣＢにより作製した。続いて、３００μＬのインキュベーション緩衝液（５０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．４、２ｇ／Ｌのカゼインペプトン、０．５ｇ／Ｌのアジ化ナトリウム）及び１００μＬの２５−ヒドロキシビタミンＤ２または２５−ヒドロキシビタミンＤ３をチューブに添加した。両溶液を室温で２時間放置後に分析した。
【００８９】
【表２】
2011136978.tif 000014
【００９０】
表２の表題「Ｄ３」及び「Ｄ２」のカラムは、それぞれｎｇ／ｍＬで表される、認識試験に使用された２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の濃度を示す。例えば、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の濃度がそれぞれ５０ｎｇ／ｍＬの場合、９９ｎｇ／ｍＬ以上の２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３が検出された。この結果は、特に注目に値する。
【００９１】
同一の試験をＬＢＭＰハイブリドーマ７０１２ＣＢにより作製されたモノクローナル抗体を使用して行った。２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の濃度がそれぞれ１．５ｎｇ／ｍＬの場合、認識率は８６％であった。同様に、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の濃度がそれぞれ５ｎｇ／ｍＬの場合、認識率は７７％であった。その他の濃度でも優れた結果が得られた。さらに、ＬＭＢＰ７２０４ＣＢまたはＬＭＢＰ７２０５ＣＢハイブリドーマにより作製されたモノクローナル抗体を使用して試験を行った。２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の濃度がそれぞれ１．５ｎｇ／ｍＬの場合、ＬＭＢＰ７２０４ＣＢハイブリドーマのモノクローナル抗体での認識率は１０４％であった。２５−ヒドロキシビタミンＤ２の濃度が５ｎｇ／ｍＬであり、２５−ヒドロキシビタミンＤ３の濃度が５０ｎｇ／ｍＬであった場合、ＬＭＢＰ７２０５ＣＢハイブリドーマのモノクローナル抗体での認識率は１００％であった。これら２つのクローンは、２５−ヒドロキシビタミンＤ２の認識に優れていた。ＬＭＢＰ７０１１ＣＢハイブリドーマにより作製されたモノクローナル抗体を使用して行った試験もまた、良好な結果を示した。
【００９２】
試験は、患者のヒト血清でも行った。前処理により２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を放出させた後、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の同時認識を、モノクローナル抗体が２５ｎｇ／ｍＬの濃度で乾燥チューブ（直接被覆）に固定された被覆チューブ上で行った。表３に示したモノクローナル抗体は、ＬＭＢＰハイブリドーマ７０１３ＣＢにより作製した。表４に示したモノクローナル抗体は、ＬＭＢＰハイブリドーマ７０１２ＣＢにより作製した。参照として、測定されたヒト血清中の濃度を、液クロマトグラフィー／マススペクトロメトリー（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＬＣ−ＭＳ）により確認した。
【００９３】
【表３】
2011136978.tif 000015
【００９４】
【表４】
2011136978.tif 000016
【００９５】
同じプロトコルによりラット血清及びマウス血清を試験したところ、同様の結果が得られた。
【００９６】
モノクローナル抗体の取得
対象となるクローンの選択後、細胞は長期保存のために液体窒素中で凍結した。モノクローナル抗体の作製は、ハイブリドーマ細胞の体外培養のシステム、例えば、スピナーフラスコ（Ｗｈｅａｔｏｎ  Ｍａｇｎａ−Ｆｌｅｘ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｐｉｎｎｅｒ  Ｆｌａｓｋｓ）、ＣＥＬＬＩＮＥ（Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはその他のハイブリドーマに好適な体外培養により行われる。あるいは、モノクローナル抗体は、法律で認められた腹水での生体内での方法により作製することもできる。
【００９７】
モノクローナル抗体の精製
ハイブリドーマ細胞の体外培養システム由来の培養上清を、従来のプロテインＡ及び／またはプロテインＧ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム、ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡサポート（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、上でアフィニティクロマトグラフィーにより精製する。
【００９８】
診断デバイス
本発明に係る診断デバイスは、免疫測定デバイスとしても知られていて、「酵素免疫測定（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ）」デバイス、「酵素結合免疫吸着測定（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）」デバイス、「蛍光免疫測定（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｓｓａｙ：ＩＦＡ）」デバイス、「放射測定（ｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ）または放射免疫測定（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）」デバイス、「磁気分離測定（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ：ＭＳＡ）」デバイス、「ラテラルフローアッセイ」デバイス、「拡散免疫測定」デバイス、「免疫沈降」デバイス、「免疫吸着」または「抗原−ダウン測定」デバイス、「免疫凝集」デバイス、「化学発光免疫測定（ｃｈｅｍｉｌｕｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ：ＣＬＩＡ）」デバイス及びバイオセンサーを使用するデバイスが挙げられる。
【００９９】
チューブ、マイクロタイタープレート、ブロックなど様々なタイプの支持体を使用することができる。モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、ビオチニル化して、種々の支持体への結合性または感受性を改良することができる。
【０１００】
モノクローナル抗体またはそれに関連するフラグメントは、支持体に直接結合してもよい。また、支持体に抗マウス抗体を結合させ、本発明に係るモノクローナル抗体またはそのフラグメントを最初の抗体に結合させてもよい。モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、ビオチニル化されていることが好ましい。
【０１０１】
あるいは、ハプテンを支持体に結合させた後、本発明に係るモノクローナル抗体を添加し、抗−ＨＲＰ第２抗体を結合させてもよい。支持体上の免疫原性結合を事前に検出するために、必要に応じ、モノクローナル抗体またはそのフラグメントを直接ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）結合させて使用することもできる。あるいは、モノクローナル抗体または前記モノクローナル抗体に関連するフラグメントをビオチニル化した後、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−  ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：ＳＡｖ−ＨＲＰ）を添加してもよい。
【０１０２】
トレーサは、ＲＩＡ試験のためにヨウ素１２５で標識したチラミンに結合させてもよい。また、ＥＬＩＳＡやＣＬＩＡ試験を行うために、ビオチニル化またはＨＲＰへの結合後に使用してもよい。次いで、ルミノールまたはテトラメチルベンジジンをＨＲＰに結合させることもできる。
【０１０３】
最後に、試験は、開放または閉鎖自動ユニットで行うことができる。
【０１０４】
競合ＲＩＡ試験では、ｎが０で、Ｒ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ１５がそれぞれ水素であり、Ｒ１２及びＲ１３がそれぞれメチル基であり、Ｒ１６が化学式（ＩＩＩ）である、化学式（ＩＩ）で示されるトレーサの一定量が、ポリスチレン支持体の表面に固定された一定量の特異抗体に対して、試料、コントロールまたはキャリブレータ中の２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３と競合を開始する。室温または３７℃で２〜２４時間のインキュベーション後、競合反応を吸引段階において停止する。チューブを洗浄後、放射活性をガンマカウンターで測定する。
【０１０５】
本発明の結果、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を含有する試料に対して本発明に係る診断デバイスを使用することにより、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３を同時に認識することができる。
【０１０６】
本明細書に使用された用語及び記載は、単なる参照を意図したものであって、網羅的であることを意図したものではない。他に特に規定がない限り、全ての用語がより広く容認されるものの一部として理解されなければならない、以下の特許請求の範囲及びその同等物に記載されている本発明の性質及び広さにおいて、様々な変更が可能であることは一般的に認識されている。
【外国語明細書】
2011136978000001.pdf