(57)【要約】【課題】ナノ材料の生体分子に対する酸化能を高精度で迅速に評価する方法を提供する。【解決手段】ナノ材料の生体分子に対する酸化能を評価する方法であって、（ａ）ナノ材料と生体分子とを混合して試料を調製するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で調製した試料を、暗中放置し、所定の光条件下に曝した後に暗中放置し、試料の発光を測定することを、異なる光条件及び／又は測定条件で行い、複数の発光量を測定するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）で測定された複数の発光量に基づいて評価値を算出するステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）で算出した評価値に基づいてナノ材料の生体分子に対する酸化能を評価するステップと、を含む、方法。【選択図】図１
2011047827.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ材料の生体分子に対する酸化能を評価する方法であって、
（ａ）ナノ材料と生体分子とを混合して試料を調製するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で調製した試料を、暗中放置し、所定の光条件下に曝した後に暗中放置し、試料の発光を測定することを、異なる光条件及び／又は測定条件で行い、複数の発光量を測定するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で測定された複数の発光量に基づいて評価値を算出するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で算出した評価値に基づいてナノ材料の生体分子に対する酸化能を評価するステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ｂ）で測定する発光量は、
試料を暗中放置し、試料の発光量を測定する第１の条件下での発光量Ｄ及び
試料を暗中放置し、光を照射した後に暗中放置し、試料の発光量を測定する第２の条件下での発光量Ｌ
である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）で測定する発光量は、
試料を暗中放置し、所定の波長域の試料の発光量を測定する第１の条件下での発光量Ｄ及び
試料を暗中放置し、光を照射した後に暗中放置し、第１の条件下と同一の波長域の試料の発光量を測定する第２の条件下での発光量Ｌ
である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）で測定する発光量は、
試料を暗中放置し、光を照射した後に暗中放置し、所定の波長域の試料の発光量を測定する第１の条件下での発光量Ｌ１及び
試料を暗中放置し、光を照射した後に暗中放置し、第１の条件下とは異なる波長域の試料の発光量を測定する第２の条件下での発光量Ｌ２
である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｂ）で測定する発光量は、
試料を暗中放置し、所定の波長域の試料の発光量を測定する第１の条件下での発光量Ｄ１、
試料を暗中放置し、光を照射した後に暗中放置し、第１の条件下と同一の波長域の試料の発光量を測定する第２の条件下での発光量Ｌ１、
試料を暗中放置し、第一の条件下とは異なる波長域の試料の発光量を測定する第３の条件下での発光量Ｄ２及び
試料を暗中放置し、光を照射した後に暗中放置し、第３の条件下と同一の波長域の試料の発光量を測定する第４の条件下での発光量Ｌ２、
である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ナノ材料は炭素系ナノ材料である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ナノ材料はフラーレン又はその誘導体、カーボンナノチューブ又はその誘導体及び多環芳香族炭化水素からなる群から選択される化合物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
生体分子は脂質、核酸及びタンパク質からなる群から選択される化合物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノ材料の生体分子に対する酸化能を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ナノ材料を使った多くの商品が市場に出されており、その安全性が問題となっている。ナノ材料の多くは酸化作用を持つと報告されている（例えば非特許文献１を参照）。また、Ｃ６０フラーレンが引き起こす細胞毒性は、脂質の過酸化が原因の１つであるとの報告がある（例えば、非特許文献２を参照）。また、脂質が酸化されると微弱な発光が生じることが報告されている（例えば、非特許文献３を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００５／０６２０２７号パンフレット
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｔｅｒｎ  ＳＴ  ａｎｄ  ＭｃＮｅｉｌ  ＳＥ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ．，２００８，１０１（１），４−２１．
【非特許文献２】Ｓａｙｅｓ  ＣＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００５，２６（３６），７５８７−９５．
【非特許文献３】萩原昌司、他、日本食品科学工学会誌、２００３、５０（７）、３０３−３０９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ナノ材料の安全性が問題とされているにもかかわらず、ナノ材料の安全性を評価する方法は確立されていない。そこで、本発明は、ナノ材料の安全性を評価する方法、より具体的には、ナノ材料の生体分子に対する酸化能を高精度で迅速に評価する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ナノ材料の生体分子に対する酸化能を評価する方法であって、（ａ）ナノ材料と生体分子とを混合して試料を調製するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で調製した試料を、暗中放置し、所定の光条件下に曝した後に暗中放置し、試料の発光を測定することを、異なる光条件及び／又は測定条件で行い、複数の発光量を測定するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）で測定された複数の発光量に基づいて評価値を算出するステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）で算出した評価値に基づいてナノ材料の生体分子に対する酸化能を評価するステップと、を含む方法を提供する。
この方法により、ナノ材料の生体分子に対する酸化能を高精度で迅速に評価することが可能になる。生体分子に対する酸化能が高いナノ材料は、生体に対する毒性が高いと考えられる。
【０００７】
１つの態様において、上記のステップ（ｂ）で測定する発光量は、試料を暗中放置し、試料の発光量を測定する第１の条件下での発光量Ｄ及び試料を暗中放置し、光を照射した後に暗中放置し、試料の発光量を測定する第２の条件下での発光量Ｌであってもよい。
【０００８】
１つの態様において、上記のステップ（ｂ）で測定する発光量は、試料を暗中放置し、所定の波長域の試料の発光量を測定する第１の条件下での発光量Ｄ及び試料を暗中放置し、光を照射した後に暗中放置し、第１の条件下と同一の波長域の試料の発光量を測定する第２の条件下での発光量Ｌであってもよい。
【０００９】
１つの態様において、上記のステップ（ｂ）で測定する発光量は、試料を暗中放置し、光を照射した後に暗中放置し、所定の波長域の試料の発光量を測定する第１の条件下での発光量Ｌ１及び試料を暗中放置し、光を照射した後に暗中放置し、第１の条件下とは異なる波長域の試料の発光量を測定する第２の条件下での発光量Ｌ２であってもよい。
【００１０】
１つの態様において、上記のステップ（ｂ）で測定する発光量は、試料を暗中放置し、所定の波長域の試料の発光量を測定する第１の条件下での発光量Ｄ１、試料を暗中放置し、光を照射した後に暗中放置し、第１の条件下と同一の波長域の試料の発光量を測定する第２の条件下での発光量Ｌ１、試料を暗中放置し、第一の条件下とは異なる波長域の試料の発光量を測定する第３の条件下での発光量Ｄ２及び試料を暗中放置し、光を照射した後に暗中放置し、第３の条件下と同一の波長域の試料の発光量を測定する第４の条件下での発光量Ｌ２であってもよい。
【００１１】
上記のナノ材料は、炭素系ナノ材料であることが好ましい。より具体的には、ナノ材料は、フラーレン又はその誘導体、カーボンナノチューブ又はその誘導体及び多環芳香族炭化水素からなる群から選択される化合物であることが好ましい。本発明の方法により、これらのナノ材料の生体分子に対する酸化能を評価することができる。
【００１２】
上記の生体分子は、脂質、核酸及びタンパク質からなる群から選択される化合物であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、未だに確立されていない、ナノ材料の安全性を評価する方法、より具体的には、ナノ材料の生体分子に対する酸化能を高精度で迅速に評価する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（ａ）及び（ｂ）は、本発明の態様を説明する図である。
【図２】（ａ）及び（ｂ）は、本発明の態様を説明する図である。
【図３】（ａ）及び（ｂ）は、本発明の態様を説明する図である。
【図４】（ａ）〜（ｃ）は、本発明の態様を説明する図である。
【図５】比較例の結果を示すグラフである。
【図６】実施例１の結果を示すグラフである。
【図７】実施例２の結果を示すグラフである。
【図８】実施例３の結果を示すグラフである。
【図９】実施例４の結果を示すグラフである。（ａ）〜（ｈ）は、それぞれ、フィルター無し、３９８ｎｍ、４４７ｎｍ、４９８．５ｎｍ、５３８．５ｎｍ、５７７．５ｎｍ、６２８ｎｍ及び６８０．５ｎｍのバンドパスフィルターを用いた結果を示す。
【図１０】実施例４の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明において、用語「ナノ材料」とは、ｎｍサイズの物質をいい、生体分子に対する酸化能の評価の対象となる、既知及び未知の様々な物質を包含する。ナノ材料は、例えば、フラーレン及びその誘導体、カーボンナノチューブ及びその誘導体、多環芳香族炭化水素（ｐｏｌｙａｒｏｍａｔｉｃ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ、ＰＡＨ）などの炭素系のナノ材料であることが好ましいが、これらに限定されない。ナノ材料は、単一種であっても、複数種の混合物であってもよい。ナノ材料は炭素系のナノ材料であっても無機物質であってもよく、これらの混合物であってもよい。
【００１６】
本発明において、用語「フラーレン」は、炭素原子６０個からなる切頂二十面体（サッカーボール状）構造のＣ６０フラーレンや、炭素数が７０、７４、７６、７８などの高次フラーレン、並びに中空の骨格内にスカンジウム、ランタン、セリウム、チタンなどの金属原子を包み込んだ内包フラーレンを含む。
また、フラーレン誘導体とは、フラーレンを基本骨格として、これに部分的な化学構造の変化を加えて得られる化合物をいう。具体的には、フラーレン骨格に水素原子、水酸基、アミノ基、ハロゲン基、有機基などが単数又は複数付加した化合物や、カリックスアレーンやシクロデキストリンなどのホスト分子とフラーレン分子とからなる包括体などが例示でき、より具体的には、水酸化フラーレンや水素化フラーレンなどが例示できる。なお、「有機基」とは、直鎖構造、分岐構造、環構造のいずれを有していてもよい炭化水素基をいい、水酸基、アミノ基、ハロゲン基などの置換基を有していてもよい。
【００１７】
本発明において、用語「カーボンナノチューブ」はシングルウォールカーボンナノチューブ、マルチウォールカーボンナノチューブ、カーボンナノホーンなどを包含する。
また、カーボンナノチューブ誘導体とは、カーボンナノチューブに部分的な化学構造の変化を加えて得られる化合物をいう。具体的には、カーボンナノチューブに水素原子、水酸基、アミノ基、ハロゲン基、有機基などが単数又は複数付加した化合物などが例示できる。
【００１８】
本発明において、用語「生体分子」とは、脂質、核酸及びタンパク質などに例示される生体を構成する分子を意味し、天然分子であっても人工的に合成された分子であってもよい。本発明において、生体分子は脂質であることが好ましい。脂質としては、フォスファチジルコリン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミンなどのリン脂質に例示されるレシチン、パルミチンなどの飽和脂肪酸、オレイン酸などのｎ−９系脂肪酸、リノール酸などのｎ−６系脂肪酸及びリノレン酸などのｎ−３系脂肪酸などの不飽和脂肪酸、ドコサヘキサエン酸やエイコサペンタエン酸などの多価不飽和脂肪酸などが用いられる。
【００１９】
本発明は、ナノ材料の生体分子に対する酸化能を評価する方法を提供する。
本発明において、「所定の光条件」とは、０秒間、すなわち、光照射なしの条件を含む。
本発明の１つの態様を図１（ａ）に示す。まず、ナノ材料を生体分子と混合して試料を調製する。試料の溶媒としてはナノ材料及び生体材料を溶解、分散あるいは懸濁できるものであれば特に限定されないが、トルエン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２−プロパノール、クロロホルム、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、メチルセロソルブ及び水などが好ましく用いられる。溶媒は単一の物質であっても２種以上の混合物であってもよい。より好ましくは、２−プロパノール、トルエン、ＤＭＦ、クロロホルム及びメタノールを、それぞれ容量比０〜５０：２５〜５５：１５〜３５：１〜５：１〜５で混合した溶媒が用いられる。試料中のナノ材料の濃度は０．０１〜２ｍＭであることが好ましく、生体分子の濃度は１ｍＭ〜４Ｍであることが好ましい。
【００２０】
試料を調製した後、暗中放置する。これは、試料の光環境の違いによる差を低減させる目的で実施する。暗中放置する時間は５秒〜２４時間であることが好ましく、１〜３０分であることがより好ましい。このような時間、暗中放置すれば、試料の光環境の違いによる差を低減することができる。続いて、試料から放出される発光（遅延発光）を測定し、発光量Ｄを測定する。遅延発光とは、光照射により生じる発光の一種であり、遅延蛍光とも呼ばれる。通常の蛍光がマイクロ秒からピコ秒という非常に短い時間で減衰するのに対し、遅延発光は数秒〜数十秒にわたってゆっくりと減衰する。
試料からの発光は、光電子増倍管、超高感度カメラ、フォトダイオードなどを用いて測定することができるが、光電子増倍管を用いることが高感度である点で好ましい。
試料からの発光の測定時間は、０．１秒〜３０分であることが好ましく、５〜３０秒であることがより好ましく、例えば２５秒間測定するとよい。より正確な測定を行うために、測定の間、試料をマグネティックスターラーなどで攪拌して、試料溶液から析出物が生じた場合、試料分散液、あるいは、試料懸濁液の懸濁状態を維持することが好ましい。
【００２１】
続いて、試料を暗中放置する。この態様においては、試料に光が照射されていないため、この暗中放置は実施しなくてもよい。次に、試料を光条件に曝す。光条件は、特に限定されないが、例えば、白色ＬＥＤによる、光量子束密度２０００μｍｏｌ／ｍ２／秒の光を１〜６０秒間、例えば、５秒間照射する条件であってよい。あるいは、特定の波長域の光を照射してもよい。特定の波長域の光を測定するには、例えばバンドパスフィルターを用いることができる。
【００２２】
続いて、試料を暗中放置する。これは、試料の容器に由来する自家蛍光などの、試料以外から生じる発光を低減させる目的で実施する。暗中放置する時間は０．１〜１０秒であることが好ましく、１〜５秒であることがより好ましい。１０秒を超えると、試料から放出される発光が減衰してしまう場合があり、０．１秒未満であると、試料以外から生じる発光が十分に低減されない場合がある。
次に、試料から放出される発光を測定し、発光量Ｌを測定する。ここで、発光の測定条件は上記の発光量Ｄの測定条件と同一であることが好ましい。
【００２３】
次に、測定された発光量Ｄ及びＬに基づいて評価値を算出する。この場合の評価値（以下、場合により評価値Ｒという。）は次式（１）により算出されることが好ましいがこれに限定されない。
（評価値Ｒ）＝発光量Ｌ／発光量Ｄ…（１）
【００２４】
１つの態様において、本発明の方法は図１（ｂ）に示すように実施されてもよい。すなわち、調製した試料を２つに分け、その一方で発光量Ｄの測定を行い、もう一方で発光量Ｌの測定を行ってもよい。これにより、ナノ材料の生体分子に対する酸化能を評価するのに要する時間を短縮することができる。
【００２５】
本発明の別の態様を図２（ａ）に示す。試料を調製した後、暗中放置する。続いて、試料から放出される発光を測定し、発光量Ｄを測定する。ここで、試料からの発光を分光し、第１の波長域の発光のみを測定する。分光には例えばバンドパスフィルターが好ましく用いられる。
ここで、第１の波長域は、５３８．５〜６８０．５ｎｍであることが好ましい。実施例に示すように、このような波長域の発光量に基づいて評価値を算出することにより、従来法による評価とよく一致する、ナノ材料の生体分子に対する酸化能の評価を行うことができる。
続いて、試料を暗中放置する。この態様においては、試料に光が照射されていないため、この暗中放置は実施しなくてもよい。
【００２６】
次に、試料を光条件に曝し、続いて、暗中放置する。次に、試料から放出される発光を測定し、発光量Ｌを測定する。ここで、試料からの発光を分光し、上記、発光量Ｄを測定した時と同一の第１の波長域の発光のみを測定する。
次に、測定された発光量Ｄ及びＬに基づいて評価値を算出する。この場合の評価値は、次式（１）により算出することが好ましいがこれに限定されない。特定の波長域の発光量を測定することにより、評価値の精度を高めることができる。
（評価値Ｒ）＝発光量Ｌ／発光量Ｄ…（１）
【００２７】
１つの態様において、本発明の方法は図２（ｂ）に示すように実施されてもよい。すなわち、調製した試料を２つに分け、その一方で発光量Ｄの測定を行い、もう一方で発光量Ｌの測定を行ってもよい。
【００２８】
本発明の更に別の態様を図３（ａ）に示す。試料を調製した後、暗中放置する。続いて、試料を光条件に曝し、暗中放置する。次に、試料から放出される発光を測定し、発光量Ｌ１を測定する。ここで、試料からの発光を分光し、第１の波長域の発光のみを測定する。
次に、試料を暗中放置する。続いて、試料を光条件に曝し、暗中放置する。次に、試料から放出される発光を測定し、発光量Ｌ２を測定する。ここで、試料からの発光を分光し、上記、発光量Ｌ１を測定した時とは異なる第２の波長域の発光のみを測定する。
ここで、第１の波長域は、中心波長４９８．５ｎｍ、半値幅５ｎｍであることが好ましく、第２の波長域は、中心波長５３８．５ｎｍ、半値幅５ｎｍであることが好ましい。実施例に示すように、このような波長域の発光量に基づいて評価値を算出することにより、従来法による評価とよく一致する、ナノ材料の生体分子に対する酸化能の評価を行うことができる。
次に、測定された発光量Ｌ１及びＬ２に基づいて評価値を算出する。この場合の評価値は、次式（２）により算出することが好ましいがこれに限定されない。特定の波長域の発光量を測定することにより、評価値の精度を更に高めることができる。
（評価値Ｒ）＝発光量Ｌ１／発光量Ｌ２…（２）
【００２９】
１つの態様において、本発明の方法は図３（ｂ）に示すように実施されてもよい。すなわち、調製した試料を２つに分け、その一方で発光量Ｌ１の測定を行い、もう一方で発光量Ｌ２の測定を行ってもよい。図３（ａ）に示す態様では、Ｌ１の測定前に照射した光により試料が変化し、Ｌ２の測定に影響を及ぼす場合があるため、図３（ｂ）に示すように試料を２つに分けて発光量を測定することがより好ましい場合がある。
【００３０】
本発明の更に別の態様を図４（ａ）に示す。試料を調製した後、暗中放置する。続いて、試料から放出される発光を測定し、発光量Ｄ１を測定する。ここで、試料からの発光を分光し、第１の波長域の発光のみを測定する。
続いて、試料を暗中放置する。この態様においては、試料に光が照射されていないため、この暗中放置は実施しなくてもよい。続いて、試料を光条件に曝し、暗中放置する。次に、試料から放出される発光を測定し、発光量Ｌ１を測定する。ここで、試料からの発光を分光し、発光量Ｄ１を測定した時と同じ、第１の波長域の発光のみを測定する。
【００３１】
次に、試料を暗中放置する。続いて、試料から放出される発光を測定し、発光量Ｄ２を測定する。ここで、試料からの発光を分光し、上記の発光量Ｄ１及びＬ１を測定した時とは異なる、第２の波長域の発光のみを測定する。
続いて、試料を光条件に曝し、暗中放置する。次に、試料から放出される発光を測定し、発光量Ｌ２を測定する。ここで、試料からの発光を分光し、上記、発光量Ｄ２を測定した時と同じ、第２の波長域の発光のみを測定する。
ここで、第１の波長域は、中心波長４９８．５ｎｍ、半値幅５ｎｍであることが好ましく、第２の波長域は、中心波長５３８．５ｎｍ、半値幅５ｎｍであることが好ましい。実施例に示すように、このような波長域の発光量に基づいて評価値を算出することにより、従来法による評価とよく一致する、ナノ材料の生体分子に対する酸化能の評価を行うことができる。
次に、測定された発光量Ｄ１、Ｌ１、Ｄ２及びＬ２に基づいて評価値を算出する。この場合の評価値は、次式（３）により算出することが好ましいがこれに限定されない。このような評価値を用いることにより、評価値の精度を更に高めることができる。
（評価値Ｒ）＝（発光量Ｌ１−発光量Ｄ１）／（発光量Ｌ２−発光量Ｄ２）…（３）
【００３２】
１つの態様において、本発明の方法は図４（ｂ）に示すように実施されてもよい。すなわち、発光量Ｄ１及びＤ２の測定を先に行い、続いて発光量Ｌ１及びＬ２の測定を行ってもよい。図４（ａ）に示す態様では、Ｌ１の測定前に照射した光により試料が変化し、Ｄ２の測定に影響を及ぼす場合があるが、発光量Ｄ１及びＤ２の測定を先に行うことにより、この影響を低減することができる場合がある。
【００３３】
１つの態様において、本発明の方法は図４（ｃ）に示すように実施されてもよい。すなわち、調製した試料を２つに分け、その一方で発光量Ｄ１及びＬ１の測定を行い、もう一方で発光量Ｄ２及びＬ２の測定を行ってもよい。図４（ａ）及び（ｂ）に示す態様では、Ｌ１の測定前に照射した光により試料が変化し、Ｄ２及びＬ２の測定に影響を及ぼす場合があるため、図４（ｃ）に示すように試料を２つに分けて発光量を測定することがより好ましい場合がある。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明の実施例を示して、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲での種々の変更が可能である。
【００３５】
（比較例）
（従来法によるナノ材料の生体分子に対する酸化能の評価）
従来法である、ジエチルチオバルビツール酸（ＤＥＴＢＡ）法により、ナノ材料の脂質に対する酸化能を評価した。
ナノ材料として、フラーレン（Ｃ６０、バックミンスターフラーレン、９９．９％、Ｓｔｒａｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｃ．、米国）、水酸化フラーレン（Ｃ６０（ＯＨ）ｎ、ｎ＝約１０、ｎａｎｏ  ｓｐｅｃｔｒａ  Ｄ１００、フロンティアカーボン株式会社）、及び水素化フラーレン（Ｃ６０Ｈｎ、ｎ＝約３０、ｎａｎｏ  ｓｐｅｃｔｒａ  Ａ１００、フロンティアカーボン株式会社）を用いた。生体分子としてレシチン（卵由来、東京化成工業株式会社）を用いた。
【００３６】
ナノ材料及びレシチンを、２−プロパノール、トルエン、ＤＭＦ、クロロホルム、メタノール又はそれらから選ばれる混合溶媒を用いて溶解し、最終的な容量比が２−プロパノール：トルエン：ＤＭＦ：クロロホルム：メタノール＝２７：１８：１２：２：１の混合溶媒中、ナノ材料０．２ｍＭ及びレシチン０．５（ｗ／ｖ）％になるように調製し、試料１０ｍＬを作製した。
１００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ３．０）に、ジエチルチオバルビツール酸（ＤＥＴＢＡ）、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ、和光純薬工業株式会社）及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を、１０ｍＭ  ＤＥＴＢＡ、１ｍＭ  ＢＨＴ、及び１．４％ＳＤＳとなるように溶解して、ＤＥＴＢＡ溶液を調製した。
２４℃にて３時間暗中放置した試料、及び２４℃にて蛍光灯による２００μｍｏｌ／ｍ２／秒の光を照射する光条件下に３時間放置した試料各１００μＬに、ＤＥＴＢＡ溶液を９００μＬずつ添加し、９５℃で１５分間過熱した。冷却後、各試料に酢酸エチルを１ｍＬずつ添加し、室温にて１００００  ｒｐｍで１０分間遠心分離し、酢酸エチル層を分離した。酢酸エチル層中のＤＥＴＢＡと過酸化脂質の反応物（ＤＥＴＢＡ反応物質）の濃度をＨＰＬＣ法により測定した。具体的には、各試料の酢酸エチル層の５３２ｎｍの吸収スペクトルを測定した。
【００３７】
図５に結果を示す。図では、各試料中の過酸化脂質の濃度を、主要な脂質過酸化分解生成物の一つであるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）に換算した値で示す。Ｃ６０、Ｃ６０（ＯＨ）ｎ及びＣ６０Ｈｎは、光照射によりレシチンを基質として脂質過酸化物を生成し、その生成量は、Ｃ６０  ＞  Ｃ６０（ＯＨ）ｎ  ＞  Ｃ６０Ｈｎであった。一方、暗中放置した試料では、脂質過酸化物量にほとんど変化が見られなかった。
【００３８】
（実施例１）
（ナノ材料の生体分子に対する酸化能の評価）
比較例と同様に、ナノ材料として、フラーレン（Ｃ６０）、水酸化フラーレン（Ｃ６０（ＯＨ）ｎ）、及び水素化フラーレン（Ｃ６０Ｈｎ）を用いた。生体分子としてレシチンを用いた。
ナノ材料及びレシチンを、２−プロパノール、トルエン、ＤＭＦ、クロロホルム、メタノール又はそれらから選ばれる混合溶媒を用いて溶解し、最終的な容量比が２−プロパノール：トルエン：ＤＭＦ：クロロホルム：メタノール＝２７：１８：１２：２：１の混合溶媒中、ナノ材料０．２ｍＭ及びレシチン０．５（ｗ／ｖ）％になるように調製し、試料１０ｍＬを作製した。試料溶液から析出物が生じた場合でも懸濁状態を維持するため、計測の間、試料をマグネティックスターラーで撹拌した。
【００３９】
（発光量Ｄの測定）
試料を２０分間暗中放置した後、０秒間（光照射なし）の光条件を実施した。続いて５秒間暗中放置した。次に、光電子増倍管（バイアルカリタイプ・Ｒ７５１８ＨＡ、浜松ホトニクス株式会社）を用いて試料の発光（遅延発光）を測定した。具体的には、波長３５０ｎｍ〜８００ｎｍの発光を１００ミリ秒間隔で２５秒間計測した。光の測定値の総和を発光量Ｄとして記録した。
【００４０】
（発光量Ｌの測定）
発光量Ｄの測定に引き続いて、発光量Ｌの測定を行った。試料を２０分間暗中放置した後、白色ＬＥＤによる２０００μｍｏｌ／ｍ２／秒の光を５秒間照射する光条件下に放置した。次に５秒間暗中放置した。続いて、発光量Ｄの測定と同様に試料の発光を測定した。波長３５０ｎｍ〜８００ｎｍの発光を１００ミリ秒間隔で２５秒間計測し、光の測定値の総和を発光量Ｌとして記録した。
【００４１】
（評価値Ｒの算出）
上記の発光量Ｄ及び発光量Ｌを使用し、下記式（１）により評価値Ｒを算出した。
（評価値Ｒ）＝発光量Ｌ／発光量Ｄ…（１）
図６に結果を示す。Ｃ６０、Ｃ６０（ＯＨ）ｎ及びＣ６０Ｈｎは、レシチンを基質として光照射により遅延発光を放出し、その放出量は、Ｃ６０  ＞  Ｃ６０（ＯＨ）ｎ  ＞  Ｃ６０Ｈｎであった。この結果は、従来法による脂質過酸化物の生成量の測定結果とよく一致した。また、従来法よりもはるかに簡便、迅速にナノ材料の生体分子に対する酸化能を評価することができた。
【００４２】
（実施例２）
（ナノ材料の生体分子に対する酸化能の評価）
実施例１と同様に、ナノ材料として、フラーレン（Ｃ６０）、水酸化フラーレン（Ｃ６０（ＯＨ）ｎ）、及び水素化フラーレン（Ｃ６０Ｈｎ）を用いた。生体分子としてレシチンを用いた。
ナノ材料及びレシチンを、２−プロパノール、トルエン、ＤＭＦ、クロロホルム、メタノール又はそれらから選ばれる混合溶媒を用いて溶解し、最終的な容量比が２−プロパノール：トルエン：ＤＭＦ：クロロホルム：メタノール＝２７：１８：１２：２：１の混合溶媒中、ナノ材料０．２ｍＭ及びレシチン０．５（ｗ／ｖ）％になるように調製し、試料１０ｍＬを作製した。試料溶液から析出物が生じた場合でも懸濁状態を維持するため、計測の間、試料をマグネティックスターラーで撹拌した。
【００４３】
（発光量Ｌ１の測定）
試料を２０分間暗中放置した後、白色ＬＥＤによる２０００μｍｏｌ／ｍ２／秒の光を５秒間照射する光条件下に放置した。次に５秒間暗中放置した。続いて、光電子増倍管を用いて試料の発光（遅延発光）を測定した。具体的には、中心波長５３８．５ｎｍ、半値幅５ｎｍの発光を１００ミリ秒間隔で２５秒間計測した。光の測定値の総和を発光量Ｌ１として記録した。
【００４４】
（発光量Ｌ２の測定）
発光量Ｌ１の測定に引き続いて、発光量Ｌ２の測定を行った。試料を２０分間暗中放置した後、白色ＬＥＤによる２０００μｍｏｌ／ｍ２／秒の光を照射する光条件下に５秒間放置した。次に５秒間暗中放置した。続いて、発光量Ｌ１の測定と同様に試料の発光を測定した。中心波長４９８．５ｎｍ、半値幅５ｎｍの発光を１００ミリ秒間隔で２５秒間計測した。光の測定値の総和を発光量Ｌ２として記録した。
【００４５】
（評価値Ｒの算出）
上記の発光量Ｌ１及び発光量Ｌ２を使用し、下記式（２）により評価値Ｒを算出した。
（評価値Ｒ）＝発光量Ｌ１／発光量Ｌ２…（２）
図７に結果を示す。Ｃ６０、Ｃ６０（ＯＨ）ｎ及びＣ６０Ｈｎは、レシチンを基質として光照射により遅延発光を放出し、その放出量は、Ｃ６０  ＞  Ｃ６０（ＯＨ）ｎ  ＞  Ｃ６０Ｈｎであった。この結果は、従来法による脂質過酸化物の生成量の測定結果とよく一致した。
【００４６】
（実施例３）
（ナノ材料の生体分子に対する酸化能の評価）
実施例１と同様に、ナノ材料として、フラーレン（Ｃ６０）、水酸化フラーレン（Ｃ６０（ＯＨ）ｎ）、及び水素化フラーレン（Ｃ６０Ｈｎ）を用いた。生体分子としてレシチンを用いた。
ナノ材料及びレシチンを、２−プロパノール、トルエン、ＤＭＦ、クロロホルム、メタノール又はそれらから選ばれる混合溶媒を用いて溶解し、最終的な容量比が２−プロパノール：トルエン：ＤＭＦ：クロロホルム：メタノール＝２７：１８：１２：２：１の混合溶媒中、ナノ材料０．２ｍＭ及びレシチン０．５（ｗ／ｖ）％になるように調製し、試料１０ｍＬを作製した。試料溶液から析出物が生じた場合でも懸濁状態を維持するため、計測の間、試料をマグネティックスターラーで撹拌した。
【００４７】
（発光量Ｄ１の測定）
試料を２０分間暗中放置した後、０秒間（光照射なし）の光条件を実施した。次に５秒間暗中放置した。続いて、光電子増倍管を用いて試料の発光（遅延発光）を測定した。具体的には、中心波長５３８．５ｎｍ、半値幅５ｎｍの発光を１００ミリ秒間隔で２５秒間計測した。光の測定値の総和を発光量Ｄ１として記録した。
【００４８】
（発光量Ｄ２の測定）
発光量Ｄ１の測定に引き続いて、発光量Ｄ２の測定を行った。試料を２０分間暗中放置した後、０秒間（光照射なし）の光条件を実施した。次に５秒間暗中放置した。続いて、光電子増倍管を用いて試料の発光（遅延発光）を測定した。具体的には、中心波長４９８．５ｎｍ、半値幅５ｎｍの発光を１００ミリ秒間隔で２５秒間計測した。光の測定値の総和を発光量Ｄ２として記録した。
【００４９】
（発光量Ｌ１の測定）
発光量Ｄ２の測定に引き続いて、発光量Ｌ１の測定を行った。試料を２０分間暗中放置した後、白色ＬＥＤによる２０００μｍｏｌ／ｍ２／秒の光を５秒間照射する光条件下に放置した。次に５秒間暗中放置した。続いて、光電子増倍管を用いて試料の発光（遅延発光）を測定した。具体的には、中心波長５３８．５ｎｍ、半値幅５ｎｍの発光を１００ミリ秒間隔で２５秒間計測した。光の測定値の総和を発光量Ｌ１として記録した。
【００５０】
（発光量Ｌ２の測定）
発光量Ｌ１の測定に引き続いて、発光量Ｌ２の測定を行った。試料を２０分間暗中放置した後、白色ＬＥＤによる２０００μｍｏｌ／ｍ２／秒の光を５秒間照射する光条件下に放置した。次に５秒間暗中放置した。続いて、光電子増倍管を用いて試料の発光（遅延発光）を測定した。具体的には、中心波長４９８．５ｎｍ、半値幅５ｎｍの発光を１００ミリ秒間隔で２５秒間計測した。光の測定値の総和を発光量Ｌ２として記録した。
【００５１】
（評価値Ｒの算出）
上記の発光量Ｄ１、Ｌ１、Ｄ２及びＬ２を使用し、下記式（６）により評価値Ｒを算出した。
（評価値Ｒ）＝（発光量Ｌ１−発光量Ｄ１）／（発光量Ｌ２−発光量Ｄ２）…（３）
図８に結果を示す。Ｃ６０、Ｃ６０（ＯＨ）ｎ及びＣ６０Ｈｎは、レシチンを基質として光照射により遅延発光を放出し、その放出量は、Ｃ６０  ＞  Ｃ６０（ＯＨ）ｎ  ＞  Ｃ６０Ｈｎであった。この結果は、従来法による脂質過酸化物の生成量の測定結果とよく一致した。
【００５２】
（実施例４）
（遅延発光の分光解析）
実施例１と同様に、ナノ材料として、フラーレン（Ｃ６０）、水酸化フラーレン（Ｃ６０（ＯＨ）ｎ）、及び水素化フラーレン（Ｃ６０Ｈｎ）を用いた。生体分子としてレシチンを用いた。
ナノ材料及びレシチンを、２−プロパノール、トルエン、ＤＭＦ、クロロホルム、メタノール又はそれらから選ばれる混合溶媒を用いて溶解し、最終的な容量比が２−プロパノール：トルエン：ＤＭＦ：クロロホルム：メタノール＝２７：１８：１２：２：１の混合溶媒中、ナノ材料０．２ｍＭ及びレシチン０．５（ｗ／ｖ）％になるように調製し、試料１０ｍＬを作製した。試料溶液から析出物が生じた場合でも懸濁状態を維持するため、計測の間、試料をマグネティックスターラーで撹拌した。
光電子増倍管を用いた試料の発光（遅延発光）の測定において、試料の発光の全量（フィルター無し）、波長３９８、４４７、４９８．５、５３８．５、５７７．５、６２８、及び６８０．５ｎｍのバンドパスフィルターを透過した光を測定した。各バンドパスフィルター透過光の測定値は、バンドパスフィルターの光の透過率及び光電子増倍管の分光感度を考慮して補正した。
【００５３】
（発光量Ｄの測定）
試料を２０分間暗中放置した後、０秒間（光照射なし）の光条件を実施した。次に５秒間暗中放置した。続いて、光電子増倍管を用いて試料の発光（遅延発光）を測定した。具体的には、フィルター無しの状態で試料の発光を１００ミリ秒間隔で２５秒間計測した。光の測定値の総和を発光量Ｄとして記録した。
【００５４】
（発光量Ｌの測定）
発光量Ｄの測定に引き続いて、発光量Ｌの測定を行った。試料を２０分間暗中放置した後、白色ＬＥＤによる２０００μｍｏｌ／ｍ２／秒の光を５秒間照射する光条件下に放置した。次に５秒間暗中放置した。続いて、光電子増倍管を用いて試料の発光（遅延発光）を測定した。具体的には、フィルター無しの状態で試料の発光を１００ミリ秒間隔で２５秒間計測した。光の測定値の総和を発光量Ｌとして記録した。
【００５５】
（発光量Ｄ３９８の測定）
試料を２０分間暗中放置した後、０秒間（光照射なし）の光条件を実施した。次に５秒間暗中放置した。続いて、光電子増倍管を用いて試料の発光（遅延発光）を測定した。具体的には、波長３９８ｎｍのバンドパスフィルターを透過した試料の発光を１００ミリ秒間隔で２５秒間計測した。光の測定値の総和を発光量Ｄ３９８として記録した。ここで、Ｄ３９８は、波長３９８ｎｍのバンドパスフィルターを用いて測定した発光量Ｄを表す。
【００５６】
（発光量Ｌ３９８の測定）
発光量Ｄ３９８の測定に引き続いて、発光量Ｌ３９８の測定を行った。試料を２０分間暗中放置した後、白色ＬＥＤによる２０００μｍｏｌ／ｍ２／秒の光を５秒間照射する光条件下に放置した。次に５秒間暗中放置した。続いて、光電子増倍管を用いて試料の発光（遅延発光）を測定した。具体的には、波長３９８ｎｍのバンドパスフィルターを透過した試料の発光を１００ミリ秒間隔で２５秒間計測した。光の測定値の総和を発光量Ｌ３９８として記録した。ここで、Ｌ３９８は、波長３９８ｎｍのバンドパスフィルターを用いて測定した発光量Ｌを表す。
【００５７】
（発光量Ｄ４４７、Ｄ４９８．５、Ｄ５３８．５、Ｄ５７７．５、Ｄ６２８及びＤ６８０．５、並びに発光量Ｌ４４７、Ｌ４９８．５、Ｌ５３８．５、Ｌ５７７．５、Ｌ６２８及びＬ６８０．５の測定）
バンドパスフィルターを波長４４７、４９８．５、５３８．５、５７７．５、６２８、及び６８０．５ｎｍのものに変更した以外は、発光量Ｄ３９８及びＬ３９８の測定と同様にして、それぞれ発光量Ｄ４４７、Ｄ４９８．５、Ｄ５３８．５、Ｄ５７７．５、Ｄ６２８及びＤ６８０．５、並びに発光量Ｌ４４７、Ｌ４９８．５、Ｌ５３８．５、Ｌ５７７．５、Ｌ６２８及びＬ６８０．５を測定した。
【００５８】
（評価値Ｒの算出）
上記の各発光量Ｄ及びＬを使用し、下記式（１）により評価値Ｒを算出した。
（評価値Ｒ）＝発光量Ｌ／発光量Ｄ…（１）
表１及び図９に各測定波長における評価値Ｒの結果を示す。波長５３８．５〜６８０．５ｎｍのバンドパスフィルターを用いた場合の評価値Ｒにおいて、Ｃ６０、Ｃ６０（ＯＨ）ｎ及びＣ６０Ｈｎが、レシチンを基質として光照射により放出した遅延発光の放出量は、Ｃ６０  ＞  Ｃ６０（ＯＨ）ｎ  ＞  Ｃ６０Ｈｎであった。この結果は、従来法による脂質過酸化物の生成量の測定結果とよく一致した。一方、フィルター無し並びに波長３９８〜４９８．５ｎｍ及び７３０ｎｍのバンドパスフィルターを用いた場合の評価値Ｒの結果では、試料の遅延発光の放出量がＣ６０  ＞  Ｃ６０（ＯＨ）ｎ  ＞  Ｃ６０Ｈｎとはならず、従来法による脂質過酸化物の生成量の測定結果とは一致しなかった。
【００５９】
【表１】
2011047827.tif 000003
【００６０】
図１０に、上記の測定結果に基づいて、各測定波長における発光量Ｌから発光量Ｄを差し引いた値（Ｌ−Ｄ）をプロットしたグラフを示す。上述したように、各バンドパスフィルター透過光の測定値は、バンドパスフィルターの光の透過率及び光電子増倍管の分光感度を考慮して補正されている。その結果、各試料の発光は、４９８．５ｎｍ付近と５３８．５ｎｍ付近にピークを持つ２つの発光成分を含むことが明らかとなった。これらの発光成分は、それぞれ、ナノ材料が生体分子（レシチン）を酸化する際の発光、及びナノ材料が脂質過酸化物を還元する際の発光であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明により、未だに確立されていない、ナノ材料の安全性を評価する方法、より具体的には、ナノ材料の生体分子に対する酸化能を高精度で迅速に評価する方法が提供される。
【図１】
2011047827.tif 000004
【図２】
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【図３】
2011047827.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
2011047827.tif 000009
【図７】
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【図８】
2011047827.tif 000011
【図９】
2011047827.tif 000012
【図１０】
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