(57)【要約】【課題】生体由来の被検出物質の検出や定量分析を、安定して行うことができる生体物質検出装置を得る。【解決手段】試料液Ｓを流通させる微小流路１１と、この微小流路１１内の一部に形成されて試料液Ｓに含まれる生体由来の被検出物質Ａを吸着するセンサ表面１４とを備えたセンサチップ１０を用い、上記センサ表面１４の部分に光Ｌ0を照射し、吸着している被検出物質Ａまたはそれと結合している標識物質からの光Ｌｆを検出する生体物質検出装置において、微小流路１１内を流通する試料液Ｓの流速を、被検出物質Ａの吸着において拡散律速が起きない範囲の値に制御する流速制御手段３６、３７を設ける。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料液を流通させる微小流路が設けられ、この微小流路内の一部に、試料液中に含まれる被検出物質、あるいはこの被検出物質と試料液中で競合する競合物質と特異的に結合する物質を固定したセンサ表面が配設されてなるセンサチップを用い、
前記センサ表面の部分に光を照射し、前記センサ表面に固定されている物質と結合している被検出物質あるいは競合物質、またはそれと結合している標識物質からの光を検出する生体物質検出装置において、
前記微小流路内を流通する試料液の流速を、被検出物質あるいは競合物質の、前記センサ表面に固定されている物質との結合において拡散律速が起きない範囲の値に制御する流速制御手段が設けられたことを特徴とする生体物質検出装置。
【請求項２】
前記流速を1.0ｍｍ／秒以上とすることを特徴とする請求項１記載の生体物質検出装置。
【請求項３】
前記流速を1.0〜5.0ｍｍ／秒とすることを特徴とする請求項１記載の生体物質検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料液中の被検出物質を検出する生体物質検出装置、特に詳細には、試料液を流通させる微小流路を備えたセンサチップを用いる生体物質検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
バイオ測定においては、抗原抗体反応などの生体分子反応を検出することにより、被検出物質である抗原（あるいは抗体）などの存在の有無、量を測定している。
【０００３】
例えば、互いに特異的に結合する２つの物質の一方の物質（抗原、抗体、各種酵素、受容体など）を基板上に固定化し、他方の物質（これは被検出物質そのものであってもよいし、あるいは試料中で被検出物質と競合する競合物質であってもよい）を基板上に固定された固定層に結合させ、この結合反応を検出することにより、試料中における被検出物質の有無、量を測定することができる。具体的には、試料に含まれる被検出物質である抗原を検出するため、基板上にその抗原と特異的に結合する抗体を固定しておき、基板上に試料を供給することにより抗体に抗原を特異的に結合させ、次いで、抗原と特異的に結合する、標識が付与された標識抗体を添加し、抗原と結合させることにより、抗体―抗原―標識抗体の、所謂サンドイッチを形成し、標識からの信号を検出するサンドイッチ法や、標識された競合抗原を被検出物質である抗原と競合的に固定化抗体と結合させ、固定化抗体と結合した競合抗原に付与されている標識からの信号を検出する競合法などのイムノアッセイが知られている。
【０００４】
なお上記サンドイッチ法においては、被検出物質である抗原が上記「他方の物質」に相当し、競合法においては競合抗原が上記「他方の物質」に相当する。後者の競合法においては、固定化抗体と結合した競合抗原の量が多いほど、被検出物質である抗原の量が少ないという関係があるので、この関係に基づいて、競合抗原の量に対応する標識からの信号レベルにより抗原の量を求めることができる。
【０００５】
また、上述のようなバイオ測定に適用可能で、高感度かつ容易な測定法として蛍光検出法が広く用いられている。この蛍光検出法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する被検出物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射し、そのとき蛍光を検出することによって被検出物質の存在を確認する方法である。また、被検出物質が蛍光体ではない場合、蛍光色素で標識されて被検出物質と特異的に結合する物質を試料に接触させ、その後上記と同様にして蛍光を検出することにより、この結合すなわち被検出物質の存在を確認することも広くなされている。
【０００６】
さらに、このような蛍光検出法において、感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が特許文献１などに提案されている。この方法は、透明な支持体上の所定領域に金属層を設けたセンサチップを用い、支持体と金属膜との界面に対して支持体の金属層形成面と反対の面側から、全反射角以上の入射角で励起光を入射させ、この励起光の照射により金属層に表面プラズモンを生じさせ、その電場増強作用によって蛍光を増強させることにより、Ｓ／Ｎを向上させるものである。
【０００７】
以上述べたようなバイオ測定においては測定時間の短縮化が望まれており、そこで、センサ表面上における反応を効率良く生じさせて、測定時間の短縮を図る方法が種々提案されている。例えば特許文献２には、微小流路（マイクロ流路）型のセンサチップを用い、試料液を一定の高速で流下させることにより測定の高速化を図ることが提案されている。この種のセンサチップは、上述した蛍光検出による被検出物質の検出や定量分析を行うために適用することも可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平１０−３０７１４１号公報
【特許文献２】特開２００７−１０１２２１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述した微小流路型のセンサチップを用い、光検出によって被検出物質の検出や定量分析を行うようにした従来の生体物質検出装置においては、検出や定量分析の安定性の点で改良の余地が残されている。
【００１０】
そこで本発明は、被検出物質の検出や定量分析を安定して行うことができる生体物質検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明による生体物質検出装置は、
試料液を流通させる微小流路が設けられ、この微小流路内の一部に、試料液中に含まれる被検出物質、あるいはこの被検出物質と試料液中で競合する競合物質と特異的に結合する物質を固定したセンサ表面が配設されてなるセンサチップを用い、
前記センサ表面の部分に光を照射し、前記センサ表面に固定されている物質と結合している被検出物質あるいは競合物質、またはそれと結合している標識物質からの光を検出する生体物質検出装置において、
前記微小流路内を流通する試料液の流速を、被検出物質あるいは競合物質の、前記センサ表面に固定されている物質との結合において拡散律速が起きない範囲の値に制御する流速制御手段が設けられたことを特徴とするものである。
【００１２】
なお上記の流速は、微小流路内を試料液が層流状態で流れるものとし、その平均流速で規定する。そしてこの流速は好ましくは1.0ｍｍ／秒以上、より好ましくは1.0〜5.0ｍｍ、さらに好ましくは1.0〜4.7ｍｍ／秒に設定されるのが望ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明者は、従来の生体物質検出装置において検出や定量分析の安定性が損なわれる原因について研究した結果、以下の知見を得た。
【００１４】
上述したセンサチップのセンサ表面に、抗原抗体反応等の反応によって被検出物質が捕捉されると、該表面近傍の被検出物質濃度が低下して、反応が拡散律速状態になりやすくなる。このとき、微小流路に試料液を流通させていれば、新しい試料液がセンサ表面に供給され続けるので、被検出物質濃度の低下が起き難くなって拡散律速が解消される傾向になる。
【００１５】
しかし、センサ表面への被検出物質の吸着（センサ表面に固定されている物質との結合）の速度が速くて、かつ流速が小さい場合は、被検出物質の吸着による表面濃度の低下に対して、被検出物質の供給が追いつかなくなり、拡散律速状態に陥り、反応速度は低下してしまう。また、拡散律速状態になると、反応速度が流速に依存するようになって、流速変動に大きく影響を受けるようになる。流速変動はポンプなどの送液装置のメカニカルな変動でも起こり得るし、温度環境や試料液の粘性の変動によっても起こり得るので、反応速度を安定させるのは非常に困難になる。また、予め前段階の反応をさせた試料液を流路に流通させる場合、試料液が不均一で、その供給の始めと終わりとで温度や粘性が異なる場合には、流速が短時間内に変動して反応速度が不安定になることがある。このように拡散律速状態になると、流速を精密に一定に制御しても、反応速度の不安定な速度領域では、測定する被検出物質量のばらつきが大きくなってしまう。また拡散律速状態下では、反応時間に対する反応量の変化は複雑な数式表現となるために、解析が複雑になって、定量性が損なわれることもある。
【００１６】
なお以上は、被検出物質と特異的に結合する物質がセンサ表面に固定されている場合にについて説明したが、試料液中で被検出物質と競合する競合物質と特異的に結合する物質がセンサ表面に固定されている場合も、その競合物質のセンサ表面への吸着（センサ表面に固定されている物質との結合）について同様のことが言える。
【００１７】
本発明による生体物質検出装置は上記の知見に基づいて得られたものであり、微小流路内を流通する試料液の流速を、被検出物質あるいは競合物質のセンサ表面への吸着において拡散律速が起きない範囲の値に制御するようにしたので、外的要因の影響を受け難い、安定した反応速度が実現される。これにより本装置によれば、被検出物質を安定して検出あるいは定量分析することが可能になる。なお、特に競合物質をセンサ表面に吸着させる場合に関してより詳しく説明すれば、本発明装置の上記構成により競合物質を安定して検出あるいは定量分析可能となるが、それにより、ひいては被検出物質を安定して検出あるいは定量分析することが可能になる。
【００１８】
また、特に標識物質に蛍光粒子、磁性粒子、磁性蛍光粒子を用いる場合、粒子の大きさは通常、数十〜数千ｎｍの大きさになる。このような標識は、蛍光分子などを用いる場合に比べると、物質サイズが大きいために拡散係数が小さくなり、拡散律速が起こりやすくなる。このような標識物質はサイズが大きくなるため一個あたりの信号が大きくなるという利点があるが、拡散律速が起こりやすいという問題があった。本発明によれば、流速で拡散律速を解消することで、通常のELISA法よりさらに大きなサイズの標識物質を使うことができるという効果も得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の一実施形態による生体物質検出装置を示す一部破断正面図
【図２】上記生体物質検出装置に用いられる微小流路型センサチップを示す斜視図
【図３】図２の２Ｂ−２Ｂ線に沿った部分の断面形状を示す立断面図
【図４】上記微小流路型センサチップを示す平面図
【図５】上記微小流路型センサチップの微小流路内における試料液の流れを説明する図
【図６】上記センサチップにおける試料液の流速と、該チップから発せられる蛍光の強度との関係を示すグラフ
【図７】微小流路型センサチップの別の例を示す平面図
【図８】微小流路型センサチップのさらに別の例を示す平面図
【図９】図２のセンサチップにおける生体物質検出時の状態を説明する図
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、図面を参照して本発明の実施形態を詳細に説明する。図１は、本発明の一実施形態による生体物質検出装置の正面形状を、一部破断して示すものである。本実施形態の生体物質検出装置は、先に述べた通りの微小流路型センサチップ（以下、単にセンサチップという）１０を用いて生体由来物質を検出するものである。まず図２〜４を参照して、このセンサチップ１０について説明する。
【００２１】
図２〜４に示される通りセンサチップ１０は、試料液が流される微小流路１１を有する流路部材１２と、互いに特異的に結合する２つの物質のうちの一方の物質から構成されて上記微小流路１１の壁面に形成された固定層１４と、流路部材１２の上に固着された上板部材１７とを備えてなるものである。本実施形態では、抗原抗体反応においてサンドイッチ法によるアッセイを行う場合を例とし、そこで固定層１４として、被検出物質である抗原Ａと特異的に結合する抗体１３を備えている場合について説明する。
【００２２】
なお、抗体１３は直接微小流路１１の壁面に固定されてもよいが、後述するように表面プラズモンによる電場増強により蛍光を増強する場合は、この壁面の上に金属膜（図示せず）が形成され、その上に抗体１３が固定される。
【００２３】
上記上板部材１７は、上表面に開口した試料液流入口１６ａおよび試料液流出口１６ｂと、試料液流入口１６ａと微小流路１１の上流端とを連通させる開口１５ａと、試料液流出口１６ｂと微小流路１１の下流端とを連通させる開口１５ａとを有している。この上板部材１７と流路部材１２は、例えば超音波溶接により接合されている。
【００２４】
流路部材１２および上板部材１７はポリスチレン等の透明な誘電体材料からなり、射出成型によりそれぞれ成型されている。微小流路１１のサイズは、一例として幅が２ｍｍ、深さが５０μｍ程度である。
【００２５】
また本例のセンサチップ１０においては、図９にも示すように、固定層１４が設けられている領域の上流側において微小流路１１の内面に、標識抗体２０が付着されている。標識抗体２０は、被検出物質に対して、前述の抗体１３とは異なるエピトープに特異的に結合する抗体２３と蛍光標識２２とから構成されたものである。ここでは蛍光標識２２として、多数の蛍光色素分子ｆと該蛍光色素分子ｆを内包する光透過材料２１とからなる蛍光微粒子が用いられている。
【００２６】
上記蛍光微粒子の大きさには特に制限はないが、直径数十ｎｍ〜数百ｎｍ程度が好ましく、ここでは一例として直径100ｎｍのものが用いられている。材料２１としては、具体的には、ポリスチレンやＳｉＯ2などが挙げられるが、蛍光色素分子ｆを内包でき、かつ該蛍光色素分子ｆからの蛍光を透過させて外部に放出できるものであれば特に制限されない。本例における標識抗体２０は、蛍光標識２２を、それよりも小さい抗体２３により表面修飾して構成されている。
【００２７】
次に図１に戻って生体物質検出装置について説明する。この生体物質検出装置は、上記センサチップ１０が例えば屈折率マッチングオイルを介して載置されるプリズム３０と、このプリズム３０とセンサチップ１０との界面に対して、全反射条件となる入射角で励起光Ｌ0を入射させる半導体レーザ等からなる光源３１と、センサチップ１０の試料液流入口１６ａに連通される試料液流入管３２と、センサチップ１０の試料液流出口１６ｂに連通される試料液流出管３３と、この試料液流出管３３に接続された試料吸入ポンプ３４とを備えている。なお励起光Ｌ0は、表面プラズモンを誘起するように、上記界面に対してｐ偏光で入射させる。
【００２８】
さらにこの生体物質検出装置は、センサチップ１０の固定層１４の近傍部分から後述するようにして発せられる蛍光Ｌｆを検出する光検出器３５と、微小流路１１における試料液の流速を計測する流速計３６と、この流速計３６の出力を受ける制御部３７と、この制御部３７により動作が制御されて前記試料吸入ポンプ３４を駆動する駆動回路３８とを有している。なお上記流速計３６としては、レーザドップラー流速計や熱流速計、さらには微小流路１１内で発生した蛍光粒子の流れを画像測定して流速を求めるもの等を適宜用いることができる。
【００２９】
次に、この生体物質検出装置による被検出物質の検出について説明する。ここでは一例として、血漿である試料液Ｓに含まれる可能性のある抗原Ａを検出する場合について説明する。まず、図１に示す試料液流入管３２を介して、あるいは試料液流入管３２を介さず直接的に試料液流入口１６ａに試料液Ｓが注入され、それとともに試料吸入ポンプ３４が駆動されて、試料液Ｓがセンサチップ１０の微小流路１１内に導入される。
【００３０】
微小流路１１に導入された試料液Ｓは、図９に模式的に示すように、該流路１１に吸着固定されている標識抗体２０と混ぜ合わされる。それにより、抗原Ａが標識抗体２０の抗体２３と結合し、さらに抗体２３と結合した抗原Ａが、固定層１４の抗体１３と結合し、抗原Ａが抗体１３と抗体２３で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
【００３１】
このようにして固定層１４の部分に吸着した抗原Ａは、以下の通りにして検出される。光源３１から発せられた励起光Ｌ0は、プリズム３０とセンサチップ１０の界面に対して、全反射条件となる入射角で入射する。すると、この場合は抗体１３と微小流路１１の壁面との間に介在している金属膜（図示せず）上の試料液Ｓ中にエバネッセント波が滲み出し、このエバネッセント波によって金属膜中に表面プラズモンが励起される。この表面プラズモンにより金属膜表面に電界分布が生じ、電場増強領域が形成される。
【００３２】
このとき、エバネッセント波の滲み出し領域内に蛍光標識２２が存在すると、その蛍光標識２２が励起されて蛍光Ｌｆが発生する。ここで、エバネッセント波の染み出し領域とほぼ同等の領域に存在する表面プラズモンによる電場増強効果により、蛍光Ｌｆは増強されたものとなる。光検出器３５は、この増強された蛍光Ｌｆを検出する。以上のようにして蛍光標識２２の存在を検出することは、すなわち、抗体１３と結合した抗原Ａの存在を検出することになる。こうして、光検出器３５の蛍光検出出力に基づいて、抗原Ａの存在の有無や、その量を検出可能となる。
【００３３】
なお微小流路１１中には、固定されている抗体１３と結合していない抗原Ａや標識抗体２０が浮遊しており、また固定層１４には標識抗体２０が非特異吸着している。これらを除去するため、蛍光Ｌｆの検出前に、適宜洗浄液を流路に導入するようにしてもよい。
【００３４】
また、例えば励起光Ｌ0として７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、前述の金属膜として金（Ａｕ）膜を用いる場合、金属膜の厚みは５０ｎｍ±２０ｎｍが好適である。さらに好ましくは、４７ｎｍ±１０ｎｍである。なお、金属薄膜は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。
【００３５】
ここで、微小流路１１中における試料液Ｓの好ましい流速について説明する。図６は、ｈＣＧ濃度が９ｐＭの血漿を試料液Ｓとした免疫アッセイ後の、蛍光Ｌｆの強度（これは光検出器３５が出力する蛍光信号のレート値で対応させている）と流速との相対関係を示すものである。なお図６の特性は、図１に示した基本構成を有する生体物質検出装置を用いて求めたものである。このとき使用したセンサチップ１０は微小流路１１の深さが６０μｍのものであり、この点だけが図２〜４に示したものと異なっている。
【００３６】
図６に示されるように、流速が1.0〜5.0ｍｍ／秒の範囲は、蛍光強度が安定して、固定層１４の抗体１３と抗原Ａとの反応速度が安定していることが裏付けられている。つまりこの領域は、抗原Ａの固定層１４への吸着において拡散律速が起きない領域となっている。
【００３７】
以上の知見に基づいて本実施形態では、図１に示す流速計３６と制御部３７とによって、微小流路１１中の試料液流速を上記1.0〜5.0ｍｍ／秒の範囲に収まるようにフィードバック制御している。すなわち制御部３７は、流速計３６の出力が示す試料液流速が1.0ｍｍ／秒に達するかあるいはそれよりもやや大きい程度の低い値になったら、試料吸入ポンプ３４の吸入量が増大する方向に駆動回路３８の動作を制御し、流速計３６の出力が示す試料液流速が5.0ｍｍ／秒に達するかあるいはそれよりもやや小さい程度の大きい値になったら、試料吸入ポンプ３４の吸入量が減少する方向に駆動回路３８の動作を制御して、試料液流速を上記範囲内に保つ。
【００３８】
本実施形態においては、以上の通りに試料液Ｓの流速を制御することにより、外的要因の影響を受け難い、安定した抗原抗体反応速度が実現される。これにより、抗原Ａを安定して検出あるいは定量分析することが可能になる。
【００３９】
ここで試料液Ｓの流速は、先に説明した通り、微小流路１１内を試料液Ｓが層流状態で流れるものとし、その平均流速で規定する。Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐやμ―ＴＡＳなどのマイクロスケールの流れは、生体由来の血、尿などの被検査物質を扱う場合、そのレイノルズ数が低いため（Ｒｅ＜２００）、乱流は発生せずに層流が支配的となる。層流とは図５に示すように、微小流路内の流線が壁面に対して平行で、流路中央部で最も流速が速く、流路壁面に近づくにつれて摩擦力により流速が小さくなる流れのことである。
【００４０】
また、上記とは別の例として、低濃度の被検出物質を定量する時に、反応時間をできるだけ稼いで反応量を増やしたいなどの目的がある場合は、流速1.0ｍｍ／秒付近で、その値を下回らないように流速制御することにより、安定的な反応速度を長時間に亘って保つことも可能になる。
【００４１】
なお試料液の流速は、上述のように1.0〜5.0ｍｍ／秒の範囲に収まるように制御する他、常時その範囲の中央値程度に維持されるように制御してもよい。また流速測定は、被検出物質を測定するセンサ表面上（上記実施形態では固定層１４の上）で行うのが特に好ましいが、被検出物質量測定の邪魔にならないように、センサ表面のやや上流側あるいは下流側で行うようにしてもよい。
【００４２】
また本発明の生体物質検出装置においては、前述したように微小流路１１の両端に試料液流入口１６ａおよび試料液流出口１６ｂを有するセンサチップ１０の他、図７に示すように微小流路１１の途中にポンプ用空気口５０が開口しているタイプのセンサチップ１１０や、微小流路１１から分岐された空気流路５１にポンプ用空気口５０が開口しているタイプのセンサチップ１２０を用いることもできる。これらのセンサチップ１１０、１２０を用いる場合は、毛細管現象で試料液を微小流路１１に導入した後、ポンプ用空気口５０から空気を送ってその圧力で試料液を押し流すことができる。
【００４３】
また上記の実施形態では、表面プラズモンによる電場増強を利用して蛍光強度を高めているが、通常の落射法による光照射を適用してもよい。その場合は、固定層１４の部分に先に述べた金属膜を形成しておくことは不要になる。
【００４４】
さらに、本発明の生体物質検出装置が対象とする被検出物質（アナライト）は抗原や抗体の他、遺伝子、細胞などの固層化して観察できる生体由来物質であれば、特に制限がない。遺伝子、細胞を検出する場合は、それらに特異的に吸着する物質を微小流路の内壁に固定しておけばよい。反対に、遺伝子、細胞に特異的に吸着する物質を本発明の生体物質検出装置によって検出することも可能であり、その場合は遺伝子、細胞を微小流路の内壁に固定しておけばよい。
【００４５】
遺伝子や細胞、あるいは特異的に吸着する物質を検出する場合も、試料液の好ましい流速範囲は上述と同じ1.0〜5.0ｍｍ／秒である。このような場合のいずれも、タンパク質間相互作用で吸着させるので、結合速度定数Ｋonは１０4〜１０6 （１／Ｍｓ）程度になる。これは、センサ表面に奪われる（結合する）速度が同じであるならば、奪われる粒子の濃度低下も同程度になり、拡散律速を解消するために必要な流速も同程度になるからである。
【００４６】
また、被検出物質、あるいは試料中で被検出物質と競合する競合物質と特異的に結合する物質は、センサ表面に直接固定されている必要はなく、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）、ＳｉＯ２等の誘電体膜、カルボキシメチルデキストラン等の高分子膜などを介して固定されていてもよい。
【００４７】
また、被検出物質、あるいはこの被検出物質と試料液中で競合する競合物質と、それと特異的に結合する物質との組合せも、上述した抗原と抗体に限られるものではなく、その他、アビジン・ビオチン反応、酵素・基質反応など、バイオアッセイに使われる反応により結合する物質の組合せが用いられる場合にも、本発明は同様に適用可能である。
【００４８】
さらに、免疫アッセイを適用する場合は、先に説明したサンドイッチアッセイだけではなく、競合法を適用することも可能である。
【００４９】
また標識物質は蛍光分子に限らず、蛍光ビーズ、金属微粒子など光応答性があるその他の物質からなるものも適用可能である。
【符号の説明】
【００５０】
１０、１１０、１２０    微小流路型センサチップ
１１    微小流路
１２    流路部材
１３    抗体
１４    固定層（センサ表面）
２０    標識抗体
２１    光透過材料
２２    標識
２３    抗体
３０    プリズム
３１    光源
３２    試料液流入管
３３    試料液流出管
３４    試料吸入ポンプ
３５    光検出器
３６    流速計
３７    制御部
３８    ポンプ駆動回路
Ａ      抗原
Ｌ0      励起光
Ｌｆ    蛍光
【図１】
2011221009.tif 000003
【図２】
2011221009.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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