(57)【要約】【課題】  パッシブターゲッティング療法に使用しうる薬物封入ナノ粒子において、頻回投与に伴い薬理効果の低減や、副作用発現の見られない、ＡＢＣ現象の誘発を抑制した低分子薬物含有ナノ粒子を提供すること【解決手段】  陰荷電基を持つ低分子薬物を金属イオンにより疎水化し、これを、（ａ）ポリＤＬ−又はＬ−乳酸又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）共重合体、及び、（ｂ）（ポリＤＬ−又はＬ−乳酸）／（ポリビニルピロリドン）ブロック共重合体、（ポリＤＬ−又はＬ−乳酸）／（ポリアクリロイルモルフォリン）ブロック共重合体、及び（ポリＤＬ−又はＬ−乳酸）／（ポリジメチルアクリルアミド）ブロック共重合体から選択される共重合体の一種、と作用させることにより得られる陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子；である。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
陰荷電基を持つ低分子薬物を金属イオンにより疎水化し、これを、
（ａ）ポリＤＬ−又はＬ−乳酸又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）共重合体、及び、
（ｂ）（ポリＤＬ−又はＬ−乳酸）／（ポリビニルピロリドン）ブロック共重合体、（ポリＤＬ−又はＬ−乳酸）／（ポリアクリロイルモルフォリン）ブロック共重合体、及び（ポリＤＬ−又はＬ−乳酸）／（ポリジメチルアクリルアミド）ブロック共重合体から選択される共重合体の一種、
と作用させることにより得られる陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子。
【請求項２】
さらに、塩基性低分子化合物を混合することを特徴とする請求項１に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子。
【請求項３】
さらに界面活性剤を配合することからなる請求項１又は２に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子。
【請求項４】
粒子の直径が２０〜３００ｎｍ、好ましくは５０〜２００ｎｍである請求項１〜３のいずれかに記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子。
【請求項５】
金属イオンが、亜鉛イオン、鉄イオン、銅イオン、ニッケルイオン、ベリリウムイオン、マンガンイオン又はコバルトイオンの１種又は２種以上である請求項１又は２に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子。
【請求項６】
陰荷電基を持つ低分子薬物が、前記金属イオンにより疎水化されるためのリン酸基、硫酸基又はカルボキシル基を有していることを特徴とする請求項１又は２に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子。
【請求項７】
陰荷電基を持つ低分子薬物が、抗炎症性ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、プロスタグランジン又はその誘導体、抗微生物薬又は抗癌薬である請求項１、２又は６に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子。
【請求項８】
（ｂ）の（ポリＤＬ−又はＬ−乳酸）／（ポリビニルピロリドン）ブロック共重合体、（ポリＤＬ−又はＬ−乳酸）／（ポリアクリロイルモルフォリン）ブロック共重合体、及び（ポリＤＬ−又はＬ−乳酸）／（ポリジメチルアクリルアミド）ブロック共重合体の重量平均分子量が２，０００〜５０，０００である請求項１又は２に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子。
【請求項９】
塩基性低分子化合物が、（ジメチルアミノ）ピリジン、ピリジン、ピペリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、キノリン、キヌクリジン、イソキノリン、ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン、ナフチルアミン、モルホリン、アマンタジン、アニリン、スペルミン、スペルミジン、ヘキサメチレンジアミン、プトレシン、カダベリン、フェネチルアミン、ヒスタミン、ジアザビシクロオクタン、ジイソプロピルエチルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、エチレンジアミン、トリメチレンジアミンから選択される１種又は２種以上のものである請求項２に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子。
【請求項１０】
界面活性剤が、ホスファチジルコリン、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレート、ポリオキシエチレン（８０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）コレステロールエステル、脂質−ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油及び脂肪酸−ポリエチレングリコール共重合体から選択される１種又は２種以上のものである請求項３に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子。
【請求項１１】
請求項１〜１０に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子を有効成分とする非経口投与用製剤。
【請求項１２】
製剤が静脈注射用製剤、局所注射用製剤、点鼻剤、点眼剤、吸入剤又は噴霧剤である請求項１１に記載の非経口投与用製剤。
【請求項１３】
陰荷電基を持つ低分子薬物と金属イオンを溶媒中で混合して相互作用させ、この混合液中に、
（ａ）ポリＤＬ−又はＬ−乳酸又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）共重合体、及び、
（ｂ）（ポリＤＬ−又はＬ−乳酸）／（ポリビニルピロリドン）ブロック共重合体、（ポリＤＬ−又はＬ−乳酸）／（ポリアクリロイルモルフォリン）ブロック共重合体、及び（ポリＤＬ−又はＬ−乳酸）／（ポリジメチルアクリルアミド）ブロック共重合体から選択される共重合体の一種、
を加えて混合することを特徴とする請求項１に記載された陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子の製造方法。
【請求項１４】
請求項１３の製造方法において、さらに塩基性低分子化合物を混合することを特徴とする請求項１３に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子の製造方法。
【請求項１５】
塩基性低分子化合物が、（ジメチルアミノ）ピリジン、ピリジン、ピペリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、キノリン、キヌクリジン、イソキノリン、ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン、ナフチルアミン、モルホリン、アマンタジン、アニリン、スペルミン、スペルミジン、ヘキサメチレンジアミン、プトレシン、カダベリン、フェネチルアミン、ヒスタミン、ジアザビシクロオクタン、ジイソプロピルエチルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、エチレンジアミン、トリメチレンジアミンから選択される１種又は２種以上のものである請求項１４に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は薬物含有ナノ粒子に関し、さらに詳しくは患部ターゲッティング及び徐放性に優れ、かつ肝臓集積を低減し、血中滞留性を高めた陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子に関し、特に、頻回投与による薬物のステルス性が失われるＡＢＣ現象の誘発を抑制したナノ粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年において、薬物送達システム、すなわちドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ：Drug Delivery System）に基づく製剤（ＤＤＳ製剤）の開発が積極的に行われてきており、最近のＤＤＳ製剤にあっては、アクティブターゲッティング療法における分子標的治療薬と、パッシブターゲッティング療法におけるナノテクノロジーによって薬剤を標的細胞に集積し易くした製剤がある。
このパッシブターゲッティング療法に利用されている物質としては、ポリエチレングリコール（以後、「ＰＥＧ」と記す場合もある）が広く用いられている。
【０００３】
例えば、タンパク質であるインターフェロンアルファ−２ｂの１箇所のアミノ酸残基に直接ＰＥＧを修飾したＰＥＧ化インターフェロン製剤（ペガシス（登録商標）、ペグイントロン（登録商標）など）や、薬物キャリアであるリポソームや高分子ミセルをＰＥＧにより修飾した、ＰＥＧ修飾リポソームを長期血中滞留性リポソームとして薬物キャリアにし、ドキソルビシンを封入した製剤（ドキシル（登録商標））などが臨床的に利用されている。
【０００４】
ＰＥＧは、その骨格構造が単純であるため、柔軟性が高いものであり、また多くの水分子を水和できるという特性を有しており、ＰＥＧにより薬物粒子やキャリアを修飾することにより、粒子表層に重厚な水和層が形成される。この水和層により、血清タンパク質や細胞との相互作用が抑制され、その結果、薬物の血中（体内）滞留時間が大きく延伸されること（ステルス化：Stealth化）が知られている。
【０００５】
このように、ＰＥＧにより修飾化した医薬品は、今後も新規製剤化技術において重要な一翼を担うと期待されており、現在も多くのものが臨床治験中である。しかしながら、近年ＰＥＧにより表面修飾したリポソームや高分子ミセルにおいて、その繰り返し投与（頻回投与）により薬物のステルス性が失われる現象（Accelerated Blood Clearance：ＡＢＣ現象）が生じることが報告されてきている（非特許文献１、２）。
【０００６】
このＡＢＣ現象は、頻回投与に伴い薬理効果の低減や、予期せぬ副作用が誘導される可能性があることを意味している。したがって、今後このようなＰＥＧ化医薬品にあっては、適応疾患の種類や、薬物投与様式（投与量／投与回数／投与頻度）に制約が課せられることも予想され、この課題の克服が強く望まれている。
【０００７】
ところで、ＡＢＣ現象のメカニズムに関しては、その詳細が明らかにされていないのが現状である。一つの有力な仮説としては、ＰＥＧ化医薬品が脾臓のＢ細胞を刺激して、抗ＰＥＧ−ＩｇＭが産生されることでＡＢＣ現象が誘導されることが述べられている（非特許文献３）。しかしながら、ＰＥＧの末端構造や、ＰＥＧの分子量を変化させてもＡＢＣ現象の誘起に影響がなかったことからすれば、ＰＥＧを用いる限り本質的にＡＢＣ現象を回避することは困難であると考えられる。
したがって、ＰＥＧに代わる、抗体産生を誘導しない新たな水溶性高分子化合物（いわゆる、ポストＰＥＧ化合物）を見出すことが、ＡＢＣ現象の回避には必要であると思われる。
【０００８】
これまで、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリアクリロイルモルフォリン（ＰＡｃＭ）、ポリグリセリン（ＰＧ）、ポリヒドロキシエチルアスパラギンなどを修飾剤として用いてリポソームやタンパク質にステルス性を付与できることが報告されている（非特許文献４〜８）。しかしながら、これらの高分子化合物により修飾させたナノ粒子については、ステルス性やＡＢＣ現象に関する知見は未だ何もないのが現状である。
【０００９】
本発明者等は、これまでにポリ乳酸、すなわち乳酸重合体（以後、「ＰＬＡ」と記す場合もある）とポリエチレングリコールとを結合したＰＬＡ−ＰＥＧブロック共重合体のマイクロ粒子ないしナノ粒子に薬物を封入させた、患部ターゲッティング及び徐放性に優れ、かつ肝臓集積を低減し、血中滞留性を高めた陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子を提供してきている（特許文献１）。
そこで、ＰＬＡ−ＰＥＧブロック共重合体におけるＰＥＧに代えて、これら高分子化合物を用いてＰＬＡと結合させたブロック共重合体を合成し、そのナノ粒子のステルス性とＡＢＣ現象に関する検討を行うことで、パッシブターゲッティングが可能なポストＰＥＧ化粒子の検索を行った。
【００１０】
その結果、ＰＬＡとの共重合体成分として、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアクリロイルモルフォリン（ＰＡｃＭ））、及びポリジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡＡ）を用いて得られたＰＬＡとのブロック共重合体のナノ粒子に薬物を封入した場合には、上記したＡＢＣ現象が誘導されないことを新規に見出し、その結果本発明を完成させるに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開  ＷＯ２００８／１３９８０４
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】J. Pharmacol. Exp. Ther., 292(3): 1071-1079 (2000)
【非特許文献２】Int. J. Pharma., 255(1-2): 167-174 (2003)
【非特許文献３】J. Control Release, 112(1): 15-25 (2006)
【非特許文献４】Biomaterials, 25(16): 3259-3266 (2004)
【非特許文献５】Eur. J. Pharma. Biopharma., 48(2): 123-129 (1999)
【非特許文献６】J. Pharma. Sci., 84(9): 1049-1053 (1995)
【非特許文献７】Int. J. Pharma., 111: 103-107 (1994)
【非特許文献８】Biochem. Biophys. Acta, 1768(3): 737-743 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって本発明は、パッシブターゲッティング療法に使用しうる薬物封入ナノ粒子において、頻回投与に伴い薬理効果の低減や、副作用発現の見られない、ＡＢＣ現象の誘発を抑制した低分子薬物含有ナノ粒子を提供することを課題とする。
【００１４】
かかる課題を解決するべく、本発明者らは鋭意検討した結果、陰荷電基を持つ低分子薬物を金属イオンにより疎水化し、（ポリＤＬ−、Ｄ−又はＬ−乳酸）／（ポリビニルピロリドン、ポリアクリロイルモルフォリン、又はポリジメチルアクリルアミド）ブロック共重合体を作用させることにより得られる陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子が、患部ターゲッティング及び徐放性に優れ、なおかつ肝臓集積を低減し、血中滞留性に優れ、特に徐放性に優れると共に、頻回投与によってもその効果の減少が見られない、ＡＢＣ現象の誘発を抑制したものであることを確認して、本発明を完成するに至った。
【００１５】
特に本発明は、これまで使用されているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に代えて、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアクリロイルモルフォリン（ＰＡｃＭ））、又はポリジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡＡ）を用いてＰＬＡと共重合させたブロック共重合体を使用することにより、ＡＢＣ現象の誘発が抑制される点に特徴がある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
したがって本発明は、これまでに頻回投与により薬理効果の減少が認められるＡＢＣ現象を誘発することなく、ステルス性に優れ、患部ターゲッティング及び徐放性に優れると共に、肝臓集積を低減することにより副作用を軽減し、さらに血中滞留性に優れた陰荷電基を持つ低分子薬物を含有するナノ粒子を提供する。
さらに本発明は、当該ナノ粒子を有効成分とする静脈注射用製剤、局所注射用製剤、点鼻剤、点眼剤、吸入剤、噴霧剤などの非経口投与用製剤を提供する。
【００１７】
より具体的には、本発明は以下の構成からなる。すなわち、
（１）陰荷電基を持つ低分子薬物を金属イオンにより疎水化し、これを、
（ａ）ポリＤＬ−又はＬ−乳酸又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）共重合体、及び、
（ｂ）（ポリＤＬ−又はＬ−乳酸）／（ポリビニルピロリドン）ブロック共重合体、（ポリＤＬ−又はＬ−乳酸）／（ポリアクリロイルモルフォリン）ブロック共重合体、及び（ポリＤＬ−又はＬ−乳酸）／（ポリジメチルアクリルアミド）ブロック共重合体から選択される共重合体の一種、
と作用させることにより得られる陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子；
（２）さらに、塩基性低分子化合物を混合することを特徴とする上記１に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子；
（３）さらに界面活性剤を配合することからなる上記１又は２に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子；
（４）粒子の直径が２０〜３００ｎｍ、好ましくは５０〜２００ｎｍである上記１〜３のいずれかに記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子；
（５）金属イオンが、亜鉛イオン、鉄イオン、銅イオン、ニッケルイオン、ベリリウムイオン、マンガンイオン又はコバルトイオンの１種又は２種以上である上記１又は２に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子；
（６）陰荷電基を持つ低分子薬物が、前記金属イオンにより疎水化されるためのリン酸基、硫酸基又はカルボキシル基を有していることを特徴とする上記１又は２に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子；
（７）陰荷電基を持つ低分子薬物が、抗炎症性ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、プロスタグランジン又はその誘導体、抗微生物薬又は抗癌薬である上記１、２又は６に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子；
（８）（ｂ）の（ポリＤＬ−又はＬ−乳酸）／（ポリビニルピロリドン）ブロック共重合体、（ポリＤＬ−又はＬ−乳酸）／（ポリアクリロイルモルフォリン）ブロック共重合体、及び（ポリＤＬ−又はＬ−乳酸）／（ポリジメチルアクリルアミド）ブロック共重合体の重量平均分子量が、２，０００〜５０，０００である上記１又は２に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子；
（９）塩基性低分子化合物が、（ジメチルアミノ）ピリジン、ピリジン、ピペリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、キノリン、キヌクリジン、イソキノリン、ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン、ナフチルアミン、モルホリン、アマンタジン、アニリン、スペルミン、スペルミジン、ヘキサメチレンジアミン、プトレシン、カダベリン、フェネチルアミン、ヒスタミン、ジアザビシクロオクタン、ジイソプロピルエチルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、エチレンジアミン、トリメチレンジアミンから選択される１種又は２種以上のものである上記２に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子；
【００１８】
（１０）界面活性剤が、ホスファチジルコリン、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレート、ポリオキシエチレン（８０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）コレステロールエステル、脂質−ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油及び脂肪酸−ポリエチレングリコール共重合体から選択される１種又は２種以上のものである上記３に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子；
（１１）上記１〜１０に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子を有効成分とする非経口投与用製剤；
（１２）製剤が静脈注射用製剤、局所注射用製剤、点鼻剤、点眼剤、吸入剤又は噴霧剤である上記１１に記載の非経口投与用製剤；
（１３）陰荷電基を持つ低分子薬物と金属イオンを溶媒中で混合して相互作用させ、この混合液中に、
（ａ）ポリＤＬ−又はＬ−乳酸又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）共重合体、及び、
（ｂ）（ポリＤＬ−又はＬ−乳酸）／（ポリビニルピロリドン）ブロック共重合体、（ポリＤＬ−又はＬ−乳酸）／（ポリアクリロイルモルフォリン）ブロック共重合体、及び（ポリＤＬ−又はＬ−乳酸）／（ポリジメチルアクリルアミド）ブロック共重合体から選択される共重合体の一種、
を加えて混合することを特徴とする上記１に記載された陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子の製造方法；
（１４）上記１３の製造方法において、さらに塩基性低分子化合物を混合することを特徴とする上記１３に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子の製造方法；
（１５）塩基性低分子化合物が、（ジメチルアミノ）ピリジン、ピリジン、ピペリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、キノリン、キヌクリジン、イソキノリン、ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン、ナフチルアミン、モルホリン、アマンタジン、アニリン、スペルミン、スペルミジン、ヘキサメチレンジアミン、プトレシン、カダベリン、フェネチルアミン、ヒスタミン、ジアザビシクロオクタン、ジイソプロピルエチルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、エチレンジアミン、トリメチレンジアミンから選択される１種又は２種以上のものである上記１４に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子の製造方法；
である。
【００１９】
すなわち本発明は、陰荷電基を持つ低分子薬物を金属イオンにより疎水化し、この疎水化された薬物を、（ポリＤＬ−、Ｄ−又はＬ−乳酸）／（ポリビニルピロリドン等）ブロック共重合体と作用させることによりナノ粒子に封入した陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子を作製することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２０】
本発明が提供する陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子は、陰荷電基を持つ低分子薬物を患部ターゲッティングし、薬物の徐放性に優れ、さらに肝臓集積を低減することにより副作用を軽減し、さらにまた血中滞留性に優れており、特に徐放性において優れていると共に、ＡＢＣ現象を抑制し、頻回投与によっても薬理効果の低減が認められず、ステルス性に優れたものである。
特に、従来から使用されているＰＥＧに代えてＰＶＰ、ＰＡｃＭ或いはＰＤＭＡＡを使用し、これとポリ乳酸との共重合体を使用することにより、ＡＢＣ現象の誘発を抑制し、ステルス性に優れたものとなる点に本発明の特徴がある。
【００２１】
したがって、これまで十分に達成されていなかった陰荷電基を持つ低分子薬物のターゲッティング及び持続的な徐放性を向上させ、さらに肝臓集積による副作用を軽減し、さらに血中濃度を持続向上させるナノ粒子を提供する点で、特に優れたものである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施例３の結果を示した図である。
【図２】実施例４の結果を示した図であり、対照としてのＰＥＧ修飾粒子の結果を示した。
【図３】実施例４の結果を示した図であり、本発明のＰＶＰ修飾粒子の結果を示した。
【図４】実施例５の結果を示した図であり、対照としてのＰＥＧ修飾粒子の結果を示した。Ｂは本発明のＰＶＰ修飾粒子の結果である。
【図５】実施例５の結果を示した図であり、本発明のＰＶＰ修飾粒子の結果を示した。
【図６】実施例６の結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の態様である陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子は、陰荷電基を持つ低分子薬物を金属イオンにより疎水化し、この疎水化した薬物をポリＤＬ−又はＬ−乳酸又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）共重合体、及び（ポリＤＬ−、Ｄ−又はＬ−乳酸）／（ポリビニルピロリドン、ポリアクリロイルモルフォリン、又はポリジメチルアクリルアミド）ブロック共重合体［以下、これらブロック共重合体を、「ポリＤＬ−、Ｄ−又はＬ−乳酸）／（ポリビニルピロリドン等）ブロック共重合体」と記す場合もある］と作用させることにより得られる。また、界面活性剤を配合してもよく、界面活性剤を配合することにより、生成したナノ粒子を安定化することができる。
【００２４】
本発明の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子は、ナノ粒子を形成するために使用する生分解性高分子として、Ｌ異性体であるポリＬ−乳酸又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体を使用することも、また一つの特徴とする。
ポリ−Ｌ−乳酸はポリ−ＤＬ−乳酸に比し、有機溶媒への溶解性が異なり、また結晶性が高いことが知られている。本発明では、ポリ−Ｌ−乳酸を、（ポリＤＬ−、Ｄ−又はＬ−乳酸）／（ポリビニルピロリドン等）ブロック共重合体と共に混合しナノ粒子を形成させることにより、ポリ−Ｌ−乳酸の水相での結晶化を抑止し、安定に分散可能なナノ粒子を調製することができる。
ポリ−Ｌ−乳酸は、アセトンに不溶性であるため、その溶解性を上げるために、アセトン／ジオキサンあるいはアセトン／テトラヒドロフランの混合液を使用して、ナノ粒子を調製した。
【００２５】
上記の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子は、界面活性剤を配合していてもよく、界面活性剤を配合することにより、生成したナノ粒子を安定化し、粒子間の凝集を抑止することができる。
【００２６】
上記により提供される本発明の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子は、静脈注射用製剤、局所注射用製剤、点鼻剤、点眼剤、吸入剤、噴霧剤などの非経口投与用製剤とすることにより、投与することができる。
【００２７】
本発明が提供する陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子は、以下のとおり作製することができる。
すなわち、陰荷電基を持つ低分子薬物と金属イオンを、有機溶媒又は含水有機溶媒の溶媒中で混合して疎水性薬物とし、この混合液中にポリＤＬ−又はＬ−乳酸又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）共重合体、さらに（ポリＤＬ−、Ｄ−又はＬ−乳酸）／（ポリビニルピロリドン等）ブロック共重合体を加えて攪拌し、この溶液を水中に添加、拡散することにより調製することができる。
【００２８】
また、ポリＤＬ−又はＬ−乳酸又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）共重合体、さらに（ポリＤＬ−、Ｄ−又はＬ−乳酸）／（ポリビニルピロリドン等）ブロック共重合体を溶媒に溶解した溶液と、陰荷電基を持つ低分子薬物の水溶液、及び金属イオン水溶液を同時に加えて混合しても同様のナノ粒子を調製することができる。
【００２９】
本発明においては、（ポリＤＬ−、Ｄ−又はＬ−乳酸）／（ポリビニルピロリドン等）ブロック共重合体をナノ粒子の表面修飾剤として用いることで、ポリＤＬ−又はＬ−乳酸又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）共重合体の水相における結晶化を抑制し、その結果、粒子の大きさが均一で安定なナノ粒子を得ることができる。
【００３０】
使用される金属イオンとしては、亜鉛イオン、鉄イオン、銅イオン、ニッケルイオン、ベリリウムイオン、マンガンイオン、コバルトイオンのいずれかであり、それらの水溶性金属塩の１種又は２種以上が使用される。そのなかでも好ましくは亜鉛イオン、鉄イオンであり、塩化亜鉛、塩化鉄などが好ましく使用できる。
【００３１】
上記の反応に使用される溶媒としては、アセトン、アセトニトリル、エタノール、メタノール、プロパノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、テトラヒドロフランなどの有機溶媒、あるいはこれらの含水溶媒であり、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、テトラヒドロフランが好ましい。
【００３２】
陰荷電基を持つ低分子薬物は、上記の金属イオンと結合して疎水化され易いように分子内にリン酸基、硫酸基又はカルボキシル基を有していることが好ましく、また分子量が１，０００以下であることが好適である。
【００３３】
そのような陰荷電基を持つ低分子薬物としては、種々の薬物を挙げることができるが、なかでも水溶性の抗炎症性ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、プロスタグランジン又はその誘導体、抗微生物薬、又は抗癌薬が好適であり、より具体的には、リン酸ベタメタゾン、リン酸デキサメタゾン、リン酸プレドニゾロン、リン酸ヒドロコルチゾン、コハク酸プレドニゾロン、コハク酸ヒドロコルチゾンなどの抗炎症性ステロイド；ロキソプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ジクロフェナック、フェンブフェンなどの非ステロイド性抗炎症薬；プロスタグランジンＥ１、プロスタグランジンＥ２又はその誘導体；バンコマイシン、コハク酸クロラムフェニコール、ラタモキセフ、セフピロム、リン酸クリンダマイシン、カルモナムなどの抗微生物薬；ビンクリスチン、ビンブラスチンなどの抗癌薬などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
（ポリＤＬ−、Ｄ−又はＬ−乳酸）／（ポリビニルプロリドン等）ブロック共重合体は、ポリＤＬ−乳酸（ＰＤＬＬＡということもある）、ポリＤ−乳酸（ＰＤＬＡということもある）若しくはポリＬ−乳酸（ＰＬＬＡということもある）（これらの重合体をブロックＡという）と、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）ポリアクリロイルモルフォリン（ＰＡｃＭ））、又はポリジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡＡ）（これらをブロックＢという）とを、ジイソプロピルカルボジイミド、エチレンジメチルアミノプロピルカルボジイミドなどの縮合剤のもとで反応させることにより、生成することができるが、市販されている同様のブロック共重合体を使用してもよい。
【００３５】
（ポリＤＬ−、Ｄ−又はＬ−乳酸）／（ポリビニルプロリドン等）ブロック共重合体の構成としては、Ａ−Ｂタイプ、Ａ−Ｂ−Ａタイプ、Ｂ−Ａ−Ｂタイプのいずれであっても本発明の目的を達成することができる。また、これらのブロック共重合体の重量平均分子量は２，０００〜５０，０００であることが好ましい。
【００３６】
また、本発明の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子は、（ポリＤＬ−、Ｄ−又はＬ−乳酸）／（ポリビニルピロリドン等）ブロック共重合体に対するポリＤＬ−又はＬ−乳酸又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）共重合体の混合比を高くすると、大きなナノ粒子が生成され、かつ薬物のナノ粒子への封入率が増加する傾向にある。
【００３７】
本発明の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子おいて、さらに塩基性低分子化合物を混合することにより薬物のナノ粒子への封入率が増加し、１０％程度まで封入することができる。
このような塩基性低分子化合物としては（ジメチルアミノ）ピリジン、ピリジン、ピペリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、キノリン、キヌクリジン、イソキノリン、ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン、ナフチルアミン、モルホリン、アマンタジン、アニリン、スペルミン、スペルミジン、ヘキサメチレンジアミン、プトレシン、カダベリン、フェネチルアミン、ヒスタミン、ジアザビシクロオクタン、ジイソプロピルエチルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、エチレンジアミン、トリメチレンジアミン等を挙げることができ、好ましくは、２級又は３級アミン類であり、ジエタノールアミンが特に好ましい。
【００３８】
かくして調製された陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子に界面活性剤を配合してもよく、界面活性剤を配合することにより、生成したナノ粒子を安定化し、かつ粒子間の凝集を抑制することができる。したがって、ナノ粒子を含有する製剤の製剤化工程にとって好ましいものとなる。
【００３９】
使用される界面活性剤としては、ホスファチジルコリン、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレート、ポリオキシエチレン（８０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）コレステロールエステル、脂質−ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油及び脂肪酸−ポリエチレングリコール共重合体等をあげることができ、これらの界面活性剤から選択される１種又は２種以上を使用するのが好ましい。
【００４０】
本発明が提供する陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子にあっては、その粒子の直径は２０〜３００ｎｍの範囲内であり、好ましくは５０〜２００ｎｍであり、それぞれの薬物が目的とするターゲット患部に依存して、その粒子径を決定することができる。
例えば、薬物を関節炎、癌、閉塞性動脈硬化症などに使用する場合には、５０〜２００ｎｍの粒径を有するナノ粒子を静脈注射することが好ましい。
【００４１】
この粒径は、例えば、（ポリＤＬ−、Ｄ−又はＬ−乳酸）／（ポリビニルピロリドン等）ブロック共重合体を溶解する溶媒、好ましくはアセトン又はジオキサンの量を調節することにより調整することができ、アセトン又はジオキサンの量を多くすることにより小さな粒径のナノ粒子が得られる。また、ナノ粒子の粒径が大きくなるほど薬物の封入率が高くなる傾向にある。
【００４２】
かくして調製した本発明の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子は、ナノ粒子の溶液又は懸濁液を、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、フィルター濾過、ファイバー透析などの操作により適宜精製した後、凍結乾燥して取得、保存される。
【００４３】
その際、凍結乾燥した製剤を再懸濁して投与できるようにするため安定化剤及び／又は分散化剤を加えて凍結乾燥されることが好ましく、そのような安定化剤、分散化剤としてはショ糖、トレハロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどが好ましく使用される。
【００４４】
本発明が提供する陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子は、静脈注射用製剤、局所注射用製剤、点鼻剤、点眼剤、吸入剤、噴霧剤などの非経口投与用製剤の医薬品として使用され、なかでも静脈注射用製剤とすることで、当該ナノ粒子の特性、効果をより良く発揮することができる。
【００４５】
これらの非経口投与用製剤の調製に使用される基剤、その他の添加剤成分としては、製剤学的に許容され、使用されている各種基剤、成分を挙げることができる。具体的には、生理食塩水、単糖類、二糖類、糖アルコール類、多糖類などの糖類；ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロースなどの高分子添加剤；イオン性又は非イオン性界面活性剤；などが剤型に応じて適宜選択され、使用することができる。
【実施例】
【００４６】
以下に本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４７】
実施例１：ブロック共重合体の合成
ＰＬＡとのブロック共重合体の相手として、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアクリロイルモルフォリン（ＰＡｃＭ）、及びポリジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡＡ）を選択し、ブロックポリマー（すなわち、ＰＶＰ−ＰＬＡブロック共重合体、ＰＡｃＭ−ＰＬＡブロック共重合体、及びＰＶＰ−ＰＤＭＡＡブロック共重合体）は、ラジカル重合により合成した。
ＰＬＡ（多木化学社製、Ｄ，Ｌ−体、平均分子量：１８，３００）とアミノエタンチオール塩酸塩（和光純薬工業社製）を、ジイソプロピルカルボジイミド（Sigma社製）により縮合することで、末端チオール化ＰＬＡを合成した。
得られた末端チオール化ＰＬＡ（３００ｍｇ）を用い、反応開始剤のアゾビスイソブチロニトリル（１０ｍｇ）、及び各モノマー（１１００ｍｇ：ビニルピロリドン、アクリロイルモルフォリン、及びジメチルアクリルアミド）をジメチルホルムアミド１ｍＬ中に溶解し、７０℃にて４時間反応させた。次いで反応物を水中に分散し、限外濾過により精製し、凍結乾燥することにより各ポリマーを得た。
【００４８】
得られた各ポリマーの分子量及び組成は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及びプロトンＮＭＲにより解析した。各親水性鎖（ＰＶＰ、ＰＡｃＭ、及びＰＤＭＡＡ）の平均分子量はおよそ３０，０００程度であり、ポリマー中に占める親水性鎖の割合は、およそ６０〜７０％であった。
【００４９】
その結果を下記表１中に示した。
なお、ＰＬＡとポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアクリロイルモルフォリン（ＰＡｃＭ）、及びポリジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡＡ）とのブロックポリマーを、以下、ＰＶＰ−ＰＬＡ、ＰＡｃＭ−ＰＬＡ、及びＰＤＭＡＡ−ＰＬＡとそれぞれ表記する。
【００５０】
【表１】
2011084541.tif 000003
【００５１】
Ｍｗ：重量平均分子量
Ｍｎ：数平均分子量
＊１：何れもＳＥＣにより算出した親水性鎖（ＰＶＰ、ＰＡｃＭ及びＰＤＭＡＡ）の分子量を示した。
【００５２】
実施例２：ナノ粒子の調製
上記表１に示したブロック共重合体を用い、薬物としてプロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）を封入したナノ粒子を調製した。
２５ｍｇの表１に示した各ポリマー、２５ｍｇのＰＬＡ（Ｌ−体、分子量：１７５００）、１０ｍｇのプロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）、９．５ｍｇのジエタノールアミンを、アセトン／ジオキサン混合液（混合比：７／３）１．５ｍＬに溶解し、０．５Ｍの塩化第二鉄無水物のアセトン溶液３０μＬを添加した。この混合液を１０分静置した後、攪拌子を用い１０００ｒｐｍで攪拌している水中（２５ｍＬ）に、一気に添加した。直ちに、２．５ｍＬの０．５Ｍクエン酸ナトリウム水溶液と１２５μＬの２００ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０水溶液を添加し、限外濾過により精製・濃縮しナノ粒子を得た。
また、対照として特許文献１に記載の方法に準じて得た、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いたＰＥＧ−ＰＬＡブロック共重合体（ＰＥＧ−ＰＬＡ）を使用し、薬物としてプロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）を封入したナノ粒子を調製した。
【００５３】
得られたナノ粒子の特性を、下記表２に示した。
【００５４】
【表２】
2011084541.tif 000004
【００５５】
粒子径及びゼータ電位は、Zetasizer Nano ZS (Malvern)により測定した。
ＰＧＥ１量はＨＰＬＣにより測定した。
【００５６】
表２中に示した結果から判明するように、各ブロック共重合体を用いて調製したナノ粒子にあっては、その粒子径は１２０〜１３０ｎｍ程度であった。
また、表面電位は、いずれのナノ粒子もわずかにマイナスの値を有していた。
プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）の封入率（粒子全量中のＰＧＥ１重量比）は１％弱程度であった。これらの値は、ＰＥＧ−ＰＬＡを用い調製したナノ粒子とほぼ同等の値であった。
以上の結果から、表１に示した各ポリマーを使用することによっても、ＰＥＧ−ＰＬＡを使用して調製したＰＥＧ修飾ナノ粒子と同様に、ＰＧＥ１を含有するナノ粒子を調製できることが明らかになった。
【００５７】
実施例３：各ナノ粒子を投与した場合の薬物の血中滞留性評価
実施例２で得られた各ナノ粒子（以下、ＰＶＰ修飾粒子、ＰＡｃＭ修飾粒子、ＰＤＭＡＡ修飾粒子及びＰＥＧ修飾粒子と記す）の１，０００μｇを、Ｗｉｓｔｅｒ系ラット（雄性：６週齢）に尾静脈注射し、経時的にプロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）の血中濃度を、ＥＩＡ法により測定した。
【００５８】
その結果を図１に示した。
ＰＧＥ１を単独で血中投与した場合には、投与後数分で血中から消失することが報告されているが、図中に示した結果からも判明するように、いずれの粒子においても、ＰＧＥ１の血中滞留性の大幅な増大が認められた。ＰＶＰ修飾粒子、ＰＡｃＭ修飾粒子およびＰＤＭＡＡ修飾粒子は、ＰＥＧ修飾粒子ほど高くないが、ほぼ同程度の血中滞留性を示していた。
【００５９】
実施例４：ＰＶＰ修飾粒子及びＰＥＧ修飾粒子におけるＡＢＣ現象の惹起
実施例２で得られたＰＶＰ修飾粒子（５０μｇ或いは１，０００μｇ）を、Ｗｉｓｔｅｒ系ラット（雄性：６週齢）に尾静脈注射し、一定のインターバル後、再びＰＶＰ修飾粒子（１，０００μｇ）を尾静脈注射し、ＰＧＥ１の血中濃度を測定した。
また、対照として、ＰＥＧ修飾粒子を用い、同様に評価した。
【００６０】
その結果を図２及び３に示した。
図中に示した結果からも判明するように、ＰＥＧ修飾粒子の場合（図２）には、前投与なしに比べ、７日前にＰＥＧ修飾粒子を前投与（５０μｇ或いは１，０００μｇ）すると、２度目の投与時にはＰＧＥ１の血中濃度が激減することがわかった。
これは典型的なＡＢＣ現象が惹起しているものといえる。
一方、本発明のＰＶＰ修飾粒子においては（図３）、３日、７日、１４日前にＰＶＰ修飾粒子を前投与（５０μｇ）した場合、或いは、７日前にＰＶＰ修飾粒子を前投与（１，０００μｇ）した場合であっても、２度目の投与時にＰＧＥ１の大きな血中濃度の変化は認められず、ＡＢＣ現象が惹起されなかった。
【００６１】
実施例５：複数回投与時のＰＶＰ修飾粒子及びＰＥＧ修飾粒子におけるＡＢＣ現象の惹起
実施例２で得られたＰＶＰ修飾粒子（５０μｇ或いは１，０００μｇ）をＷｉｓｔｅｒ系ラット（雄性：６週齢）に１週間間隔で３度尾静脈注射し、３度目の投与から１週間後にＰＶＰ修飾粒子（１，０００μｇ）を尾静脈注射し、ＰＧＥ１の血中濃度を測定した。
また、対照としてＰＥＧ修飾粒子を用い、同様にしてＰＧＥ１の血中濃度を測定した。
【００６２】
その結果を図４及び５に示した。
図中に示した結果からも判明するように、ＰＥＧ修飾粒子の場合（図４）には、ＰＧＥ１の血中濃度が前投与なしに比べ減少したことから、ＡＢＣ現象が誘導されていることがわかる。
一方、本発明のＰＶＰ修飾粒子の場合（図５）には、いずれの投与量においても、ＡＢＣ現象が惹起されていなかった。
【００６３】
実施例６：ＰＡｃＭ修飾粒子及びＰＤＭＡＡ修飾粒子におけるＡＢＣ現象の惹起
実施例２で得られたＰＡｃＭ修飾粒子或いはＰＤＭＡＡ修飾粒子（各５０μｇ）をＷｉｓｔｅｒ系ラット（雄性：６週齢）に尾静脈注射し、７日後、再び同じ粒子（１，０００μｇ）を尾静脈注射し、ＰＧＥ１の血中濃度を測定した。
【００６４】
その結果を図６に示した。
図中に示した結果からも判明するように、ＰＡｃＭ修飾粒子及びＰＤＭＡＡ修飾粒子のいずれの場合においても、前投与の有無に関わらずほぼ同じＰＧＥ１の血中滞留性を示していた。すなわち、これらの修飾粒子においても、ＡＢＣ現象が惹起されていなかった。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
以上のように、本発明が提供する低分子薬物含有ナノ粒子は、陰荷電基を持つ低分子薬物を患部ターゲッティングし、薬物の徐放性に優れ、さらに肝臓集積を低減することにより副作用を軽減し、さらにまた血中滞留性に優れており、特に徐放性において優れていると共に、ＡＢＣ現象を抑制し、頻回投与によっても薬理効果の低減が認められず、ステルス性に優れたものである。
特に、従来から使用されているＰＥＧに代えてＰＶＰ等を使用し、これとポリ乳酸との共重合体を使用することにより、ＡＢＣ現象を抑制し、ステルス性に優れたものとなる点で、その産業上の利用性は多大なものである。
【図１】
2011084541.tif 000005
【図２】
2011084541.tif 000006
【図３】
2011084541.tif 000007
【図４】
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【図５】
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【図６】
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