(57)【要約】【課題】サイレージ試料の抽出液におけるＶＢＮ含有量、及びＶ２−スコアーの値を測定するための高い精度の検量線を得ることのできる検量線作成方法、及び該方法を行うプログラムを提供すること。【解決手段】  揮発性塩基態窒素の含有量、及び／又はＶ２スコアーが既知であるサイレージ試料の抽出液に光を照射し、得られた透過光スペクトルの前処理を行い、該前処理された透過光スペクトルにおける特定の波長領域内から複数の波長を選択して重回帰分析を行い揮発性塩基態窒素の含有量、及び／又はＶ２スコアーの検量線を作成する方法において、特定の波長領域は、６４０〜７００ｎｍの波長領域（ａ）と、１６５０〜１８００ｎｍの波長領域（ｂ）を含み、波長を、波長領域（ａ）、及び波長領域（ｂ）のそれぞれの領域から少なくとも１つずつ選択する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
揮発性塩基態窒素の含有量、及び／又はＶ２スコアーが既知であるサイレージ試料の抽出液に光を照射して得られた当該抽出液の透過光スペクトルの平滑化処理及び微分処理を行い、該処理された透過光スペクトルにおける特定の波長領域内から複数の波長を選択して重回帰分析を行い揮発性塩基態窒素の含有量、及び／又はＶ２スコアーの検量線を作成する方法において、
前記特定の波長領域は、６４０〜７００ｎｍの波長領域（ａ）と、１６５０〜１８００ｎｍの波長領域（ｂ）を含み、
前記波長は、波長領域（ａ）、及び波長領域（ｂ）のそれぞれの領域から少なくとも１つずつ選択されることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記特定の波長領域は、さらに、２１００〜２３５０ｎｍの波長領域（ｃ）を含み、
前記波長は、波長領域（ｃ）からも選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記作成される検量線は、揮発性塩基態窒素の含有量の検量線であり、
波長領域（ａ）から選択される波長は、６４８ｎｍ、６７２ｎｍ、及び６７６ｎｍであり、
波長領域（ｂ）から選択される波長は、１７４８ｎｍであることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記作成される検量線は、Ｖ２スコアーの検量線であり、
波長領域（ａ）から選択される波長は、６７８ｎｍであり、
波長領域（ｂ）から選択される波長は、１６９４ｎｍ、１７１２ｎｍであり、
波長領域（ｃ）から選択される波長は、２２７０ｎｍであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
揮発性塩基態窒素の含有量、及び／又はＶ２スコアーが既知であるサイレージ試料の抽出液に光を照射して得られた透過光のスペクトルの平滑化処理及び微分処理を行い、該処理された透過光スペクトルにおける複数の特定波長領域を選択してＰＬＳ回帰分析を行い、揮発性塩基態窒素の含有量、及び／又はＶ２スコアーの検量線を作成する方法において、
前記複数の特定波長領域は、
６００〜１０８２ｎｍの波長区間（Ａ）、１１１６〜１３００ｎｍの波長区間（Ｂ）、１６００〜１８００ｎｍの波長区間（Ｃ）、及び２０８０〜２３６０ｎｍの波長区間（Ｄ）の内、相異なる２以上の区間から選択されることを特徴とする方法。
【請求項６】
波長区間（Ａ）から選択される特定波長領域が、
６４０〜７００ｎｍであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
波長区間（Ａ）から選択される特定波長領域が、６４０〜７００ｎｍであり、
波長区間（Ｃ）から選択される特定波長領域が、１６３０ｎｍ〜１７５０ｎｍであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記作成される検量線は、揮発性塩基態窒素の含有量の検量線であり、
波長区間（Ａ）から選択される特定波長領域が、６００〜１０５０ｎｍであり、
波長区間（Ｃ）から選択される特定波長領域が、１６００〜１８００ｎｍであり、波長区間（Ｄ）から選択される特定波長領域が、２０８０〜２３５０ｎｍであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記作成される検量線は、揮発性塩基態窒素の含有量の検量線であり、
波長区間（Ｂ）から選択される特定波長領域は、１１５６〜１３００ｎｍであり、波長区間（Ｃ）から選択される特定波長領域は、１６００〜１８００ｎｍであり、波長区間（Ｄ）から選択される特定波長領域は、２１００〜２３５０ｎｍであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記作成される検量線は、Ｖ２スコアーの検量線であり、
波長区間（Ａ）から選択される特定波長領域が、６１６〜１０８２ｎｍであり、
波長区間（Ｂ）から選択される特定波長領域が、１１１６〜１３００ｎｍであり、
波長区間（Ｃ）から選択される特定波長領域が、１６３０〜１８００ｎｍであり、
波長区間（Ｄ）から選択される特定波長領域が、２０８４〜２３６０ｎｍであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記抽出液の透過光路長は、
４ｍｍ以下である事を特徴とする請求項１〜請求項１０の何れか1項に記載の方法。
【請求項１２】
前記サイレージ試料の原料は、
牧草、飼料作物、食品副産物のいずれか、又はこれらのうち少なくとも一つを含む混合物であることを特徴とする請求項１〜１１の何れか1項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２の何れか1項に記載の検量線作成方法を実行する検量線作成プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検量線作成方法、及び該方法を行うプログラムに関し、特に、サイレージの発酵状態の指標となる揮発性塩基態窒素の含有量、及び／又はＶ２スコアーを算出するための検量線作成方法、及び該方法を行うプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、一定水分を含有させた牧草・飼料作物や食品副産物等の原料を密封貯蔵し、嫌気的条件下で原料に含まれる糖分と乳酸菌等により乳酸発酵させることで、乳酸・酢酸等の有機酸を生成させて製造されるサイレージが知られている。このサイレージは、青果や魚肉等の新鮮物と同様に、その腐敗と共に蛋白質が分解し、有害物質である揮発性塩基態窒素（以下、ＶＢＮ）を発生することが知られている。従って、サイレージ中においてこのＶＢＮの含有量は、その品質評価の指標として用いられている。
【０００３】
ＶＢＮの含有量を測定する方法として、測定対象であるサイレージの抽出液をアルカリ性としたときに発生する揮発性塩基ガスを標準捕集液で回収し、滴定にて定量する水蒸気蒸留法や微量拡散法が知られており、高い精度でＶＢＮの含有量を測定することができる。しかし、これらの方法は、測定精度は高いものの、水蒸気蒸留法は大掛かりな実験装置が必要であること、１試料あたりの測定に１０分程度の長い時間がかかってしまうこと、さらに、強アルカリの廃液が排出されてしまうなどの欠点がある。また、微量拡散法に関しても、水蒸気蒸留法と同じく測定に時間がかかることと、及び滴定操作に熟練が要求されることが欠点として挙げられる。
【０００４】
そこで、近年では、ＶＢＮの含有量の近赤外分析を用いた測定が試みられている。この近赤外分析とは、波長が８００ｎｍ〜２５００ｎｍの近赤外線を測定対象に照射し、その透過光や反射光のスペクトルを解析してＶＢＮの含有量を測定するもので、例えば、畜肉の腐食成分を非破壊検査するためなどに用いられる手法であり、例えば、非特許文献１や非特許文献２等に記載されている。
【０００５】
そして、非特許文献３には、近赤外線分析装置を用いて、サイレージ試料の透過光のスペクトルに２次微分を施したうえで線形重回帰分析を行ってＶＢＮ含有量の検量線を定めることが記載されている。
【０００６】
一方で、サイレージ１００ｇ中のＶＢＮの量を示すＶＢＮｍｇ／１００ｇ、及び酢酸、プロピオン酸、及び酪酸等の揮発性脂肪酸（以下、ＶＦＡと記載する）の量を用いて定義されるＶ２−スコアーが知られている。この値は、サイレージの発酵品質評価の指標として用いられている。
【０００７】
なお、Ｖ２−スコアーと類似した品質評価の指標としてＶ−スコアーが知られているが、これは、サイレージ１００ｇ中のＶＢＮの量を示すＶＢＮｍｇ／１００ｇではなくＶＢＮ／Ｔ−Ｎ％を用いる必要があり、全窒素量を分析するために労力が必要であり、したがって、サイレージの発酵品質評価の指標としては、Ｖ２−スコアーが好ましく用いられている。
【０００８】
そして、従来、Ｖ２−スコアーを算出するための量であるＶＢＮｍｇ／１００ｇは、サイレージ試料の抽出液から水蒸気蒸留法や微量拡散法を用いて測定され、ＶＦＡは、当該抽出液をガスクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーにて分析することで測定されていた。
具体的にＶ２−スコアーは、以下の表１において示されている各量ＹＮ、ＹＡ、及びＹＢの総和ＹＮ+ＹＡ+ＹＢとして定義される。
【０００９】
【表１】
2011047831.tif 000003
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Y.M.Bae et. Al Amerian Society of Agricultal and biological Eengineers  Vol.49(2):557-561,2006
【非特許文献２】T. S. Park et. Biological Engineering. 1(2): 173-180.,2008
【非特許文献３】“近赤外分光法によるイタリアンライグラスサイレージ発酵品質の迅速評価法”［online］、平成１０年度、農林水産研究情報、［平成２１年８月２５日検索］、インターネット＜URL:http://www.affrc.go.jp/ja/agropedia/seika/data_knaes/h10/1998117＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかし、非特許文献３に記載されている近赤外線分析を用いたサイレージのＶＢＮ含有量の測定では、ＶＢＮ含有量測定のために作成される検量線の精度が、実用に足る精度に達していないという問題があった。また、Ｖ２−スコアーに関しては、近赤外分析は試みられていないが、当該分析によるＶＢＮ含有量測定用の検量線の精度が低いことから、仮に近赤外分析を試みても、このＶＢＮの含有量に依存するＶ２−スコアーの値の検量線の精度が低いことは容易に予想される。
【００１２】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、サイレージ試料の抽出液におけるＶＢＮ含有量、及びＶ２−スコアーの値を測定するための高い精度の検量線を得ることのできる検量線作成方法、及び該方法を行うプログラムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的は、ＶＢＮの含有量、及び／又はＶ２スコアーが既知であるサイレージ試料の抽出液に光を照射して得られた透過光のスペクトルの平滑化処理及び微分処理を行い、該処理された透過光スペクトルにおける特定の波長領域内から複数の波長を選択して重回帰分析を行いＶＢＮの含有量、及び／又はＶ２スコアーの検量線を作成する方法において、特定の波長領域は、６４０〜７００ｎｍの波長領域（ａ）と、１６５０〜１８００ｎｍの波長領域（ｂ）を含み、波長を、波長領域（ａ）、及び波長領域（ｂ）のそれぞれの領域から少なくとも１つずつ選択することによって達成される。これにより、既知のサイレージ試料のＶＢＮ含有量及び／又はＶ２スコアーとの間で高い相関係数を示し標準誤差の低い検量線が得られる。すなわち、精度の高いＶＢＮ含有量及びＶ２スコアーの検量線を得ることができる。
【００１４】
本発明に係る好ましい態様は以下の通りである。
（１）特定の波長領域は、さらに、２１００〜２３５０ｎｍの波長領域（ｃ）を含み、波長は、波長領域（ｃ）からも選択する。これにより、より高い精度の検量線を得ることができる。
（２）作成される検量線は、ＶＢＮの含有量の検量線であり、
波長領域（ａ）から選択される波長は、６４８ｎｍ、６７２ｎｍ、及び６７６ｎｍであり、波長領域（ｂ）から選択される波長は、１７４８ｎｍである。これにより、特に精度の高いＶＢＮの含有量の検量線を得ることができる。
（３）作成される検量線は、Ｖ２スコアーの検量線であり、
波長領域（ａ）から選択される波長は、６７８ｎｍであり、波長領域（ｂ）から選択される波長は、１６９４ｎｍ、１７１２ｎｍであり、波長領域（ｃ）から選択される波長は、２２７０ｎｍである。これにより、特に精度の高いＶ２スコアーの検量線を得ることができる。
【００１５】
また、上記目的は、ＶＢＮの含有量、及び／又はＶ２スコアーが既知であるサイレージ試料の抽出液に光を照射して得られた透過光のスペクトルの平滑化処理及び微分処理を行い、該処理された透過光スペクトルにおける複数の特定波長領域を選択してＰＬＳ（partial least squares）回帰分析を行い、ＶＢＮの含有量、及び／又はＶ２スコアーの検量線を作成する方法において、複数の特定波長領域を、６００〜１０８２ｎｍの波長区間（Ａ）、１１１６〜１３００ｎｍの波長区間（Ｂ）、１６００〜１８００ｎｍの波長区間（Ｃ）、及び２０８０〜２３６０ｎｍの波長区間（Ｄ）の内、相異なる２以上の区間から選択することで達成される。これにより、既知のサイレージ試料のＶＢＮ含有量及び／又はＶ２スコアーとの間で高い相関係数を示し標準誤差の低い検量線が得られる。すなわち、精度の高いＶＢＮ含有量及びＶ２スコアーの検量線を得ることができる。
【００１６】
本発明に係る好ましい態様は以下の通りである。
（４）波長区間（Ａ）から選択される特定波長領域が、６４０〜７００ｎｍである。
（５）波長区間（Ａ）から選択される特定波長領域が、６４０〜７００ｎｍであり、波長区間（Ｃ）から選択される特定波長領域が、１６３０ｎｍ〜１７５０ｎｍである。
（４）及び（５）によれば、より高い精度の検量線を得ることができる。
（６）作成される検量線は、ＶＢＮ含有量の検量線であり、波長区間（Ａ）から選択される特定波長領域が、６００〜１０５０ｎｍであり、波長区間（Ｃ）から選択される特定波長領域が、１６００〜１８００ｎｍであり、波長区間（Ｄ）から選択される特定波長領域が、２０８０〜２３５０ｎｍである。
（７）作成される検量線は、ＶＢＮ含有量の検量線であり、波長区間（Ｂ）から選択される特定波長領域は、１１５６〜１３００ｎｍであり、波長区間（Ｃ）から選択される特定波長領域は、１６００〜１８００ｎｍであり、波長区間（Ｄ）から選択される特定波長領域は、２１００〜２３５０ｎｍである。
（６）及び（７）によれば、特に精度の高いＶＢＮ含有量の検量線を得ることができる。
（８）作成される検量線は、Ｖ２スコアーの検量線であり、波長区間（Ａ）から選択される特定波長領域が、６１６〜１０８２ｎｍであり、波長区間（Ｂ）から選択される特定波長領域が、１１１６〜１３００ｎｍであり、波長区間（Ｃ）から選択される特定波長領域が、１６３０〜１８００ｎｍであり、波長区間（Ｄ）から選択される特定波長領域が、２０８４〜２３６０ｎｍである。これにより、特に精度の高いＶ２スコアーの検量線を得ることができる。
（９）抽出液の透過光路長は、４ｍｍ以下である事が好ましい。
（１０）サイレージ試料の原料は、牧草、飼料作物、食品副産物のいずれか、又はこれらのうち少なくとも一つを含む混合物である。
【００１７】
また、本発明によれば、上記検量線作成方法を実行する検量線作成プログラムが提供される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、既知のサイレージ試料のＶＢＮの含有量及び／又はＶ２スコアーとの間で高い相関係数を示し標準誤差の低い高精度の検量線を得ることができる。従って、既知のサイレージ試料のＶＢＮの含有量及び／又はＶ２スコアーと、上記作成した検量線を用いた評価用試料の予測値との相関係数も高くなり、評価用試料の予測標準誤差を低くすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本実施の形態にかかる方法を実行するための近赤外分析装置の概要を示す図である。
【図２】本実施の形態にかかる検量線作成方法、及び検量線の評価方法の概要を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明に係る実施の形態について説明する。図１は、本実施の形態にかかる方法を実行するための近赤外分析装置の概要を示す図である。図示のように、近赤外分析装置１０は、例えば、波長２００ｎｍ〜２４００ｎｍの光を発するハロゲンランプ等の光源装置１２と、この光源装置１２から発生られる光を一定幅の光束に集束させる第１スリット１４と、第１スリット１４で集束された光を折り返すミラー１６と、ミラー１６で折り返された光を波長成分に分解するグレーティング（回折格子）１８と、グレーティング１８と同期して波長成分に分解された光束から所定波長の単色光を発生させるリファレンス２０及びフィルター２２と、発生した所定波長の単色光から所望の波長域の光を透過させる第２スリット２４と、この第２スリット２４を透過した所望波長の光を透過させる試料用セル２６と、試料用セル２６を透過した光を検出する検出器２８を備えている。
【００２１】
グレーティング１８は紙面に垂直な軸の周りに回動可能に構成されており、第２スリット２４を透過する光束の波長帯域が調整可能となっている。グレーティング１８を回転させながら検出器２８から出力される光強度を測定することにより、試料用セル２６に収容されている試料の透過光スペクトルを求めることができる。本実施の形態では、特に、試料として、サイレージの抽出液が用いられる。
【００２２】
また、近赤外分析装置１０は、検出器２８により検出された光の強度スペクトルを分析するプログラムを備えた、ＣＰＵ等の演算装置、メインメモリ等の記憶装置、ディスプレイ等の出力装置、マウスやキーボード等の入力装置を備えたコンピュータを具備している。特に、本実施の形態の方法は、上記透過光のスペクトルを分析するプログラムの手順にしたがって実行される。
【００２３】
図２は、本実施の形態にかかる検量線作成方法、及び検量線の評価方法の概要を示すフローチャートである。
【００２４】
図示のように、ステップＳ１０１において、集められたｐ点の検量線作成用試料の内、所定の検量線作成用試料ｉに対して検出器２８で検出された透過光の強度スペクトルデータＩｉ（λ）がコンピュータに入力される。この入力は、上述のグレーティング１８を回動させることで、スリット２４を透過させる光の波長を６００ｎｍ〜２４００ｎｍの範囲で連続的に変化させた強度Ｉｉ（λ）について行われる。
【００２５】
ステップＳ１０２において、コンピュータに入力された強度スペクトルデータＩｉ（λ）に対して、スペクトルに重畳するランダムノイズを低減させるために移動平均処理やＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ法等の平滑化処理を行なう。例えば、移動平均処理では、処理後のスペクトルは、重み係数ｗｋ、元の透過光スペクトルをＩｉ（λ）を用いて、所定のデータ点をＭとすると、
【００２６】
【数１】
2011047831.tif 000004
と表される。これにより、データ点Ｍを中心とする２Ｌ＋１個の透過光の重み付き平均が計算される。ここで、重み係数ｗｋは、要求されるノイズの低減量と演算時間の短縮量のバランスに応じて設定される関数であり、例えば、１／２Ｌ＋１の値をとる。
【００２７】
次に、ステップＳ１０３において、平滑化処理が行われた強度スペクトルデータＩｉ（λ）に対して２次微分処理を行ないピーク位置を検出する。
具体的に、２次微分処理は、以下の式２
【００２８】
【数２】
2011047831.tif 000005
を計算することにより行われる。なお、ピーク位置の検出に1次微分処理を用いても良い。
【００２９】
ステップＳ１０４において、このようにして得られた波長λから、複数の波長（ｎ個）を選択し、ｊ番目の波長における２次微分処理した透過光スペクトルデータＩｉ（λｊ）の強度と、精度の高い公知の水蒸気蒸留法や微量拡散法で測定したＶＢＮ含有量とから重回帰分析によって検量線を求める。
【００３０】
具体的に、検量線作成試料iについて、選択した複数の波長λｊでの透過光スペクトルの強度をＩｉ（λｊ）として、係数Ａｊを用いてＶＢＮ含有量の予測値がＩｉ（λｊ）の線形結合である以下の式３
【００３１】
【数３】
2011047831.tif 000006
で表されると仮定する。なお、式中のｎは、上述のように選択する波長の数であり、重回帰分析における説明変数の数となる。従って、選択する波長の数について、複数であれば、特に制限はないが、検量線の標準誤差を極力小さくすることができるように小さすぎず、且ついわゆるオーバーフィッティングを発生させないように大きすぎない値をとる必要がある。後述する実施例では、ｎ＝４に設定される。
【００３２】
以下、上記式３で算出される値を＜ＶＢＮｉ＞とする。そして、公知の水蒸気蒸留法や微量拡散法で求めた検量線作成用試料ｉのＶＢＮ含有量の測定値をＶＢＮｉとすれば、以下の式４で表される残差
【００３３】
【数４】
2011047831.tif 000007
が最小となるようにＡｊを決定するいわゆる最小二乗法を実行する。具体的には、各ｊ（１≦ｊ≦ｎ）におけるＡｊで式４を偏微分し、得られるｎ次連立方程式を解くことでＡｊが定まる。そして、決定された係数Ａｊを式３に代入したものが検量線として使用される。なお、残差を最小にする方法は、最小二乗法に限られず、他の種々の数学的アルゴリズムを用いることが可能である。
【００３４】
ステップＳ１０５において、示されている数式に測定された透過光スペクトルＩｉ（λｊ）を代入することで、集められたｑ点の評価用試料の内の評価用試料ｍに対するＶＢＮ含有量の予測値＜ＶＢＮｉ＞が算出される。
ステップＳ１０６において、算出された＜ＶＢＮｉ＞と上述の公知の方法で測定したＶＢＮｉとの重相関係数Ｒの２乗Ｒ２（以下、検量線の相関係数と呼ぶ）、及び検量線の標準誤差ＳＥＣ（standard deviation of residual）を算出する。
検量線の相関係数Ｒ２は、以下の式５により算出される。
【００３５】
【数５】
2011047831.tif 000008
一方、標準誤差ＳＥＣは、以下の式６により算出される。
【００３６】
【数６】
2011047831.tif 000009
このようにして算出された検量線の相関係数Ｒ２、及び標準誤差ＳＥＣの値で検量線の精度の良さを判定する。検量線の相関係数Ｒ２の値が高く、標準誤差ＳＥＣの小さい検量線が精度の高い良好な検量線と判断される。
【００３７】
ステップＳ１０７において、ＶＢＮ含有量が公知の方法でＶＢＮｍと測定されている評価用試料ｍのｎ個の波長に対する透過光スペクトルを取り、ＶＢＮ含有量の推定値を係数Ａｊが定まった上記式３の検量線を用いて算出する。ここで、この算出されるＶＢＮ含有量の推定値を［ＶＢＮｍ］とする。
【００３８】
ステップＳ１０８において、算出された評価用試料ｍのＶＢＮ含有量の推定値［ＶＢＮｍ］と、予め知られている試料ｍのＶＢＮ含有量であるＶＢＮｍとの間の重相関係数ｒの２乗ｒ２（以下、評価用試料の相関係数と呼ぶ）、及び予測標準誤差ＳＥＰ（standard error of prediction）を算出する。評価用試料の相関係数ｒ２の算出は、ステップＳ１０６における検量線作成用試料の相関係数Ｒ２の算出とほぼ同様の方法で行うことが可能である。
一方で、ＳＥＰは、以下の式７の方法で算出される。
【００３９】
【数７】
2011047831.tif 000010
【００４０】
【数８】
2011047831.tif 000011
算出される値である。
【００４１】
試料の測定は、上述の評価用試料の相関係数ｒ２が大きく、ＳＥＰの値が小さいほど高い精度を有すると判定される。
【００４２】
なお、Ｖ２スコアーの検量線の相関係数Ｒ２、標準誤差ＳＥＣ、評価用試料の相関係数ｒ２、及び予測標準誤差ＳＥＰも、Ｖ２スコアーが既知である検量線作成用試料に対して、上記ステップＳ１０１〜Ｓ１０８に記載した処理を適用し求めることができる。
【００４３】
一方、２次微分した透過光スペクトル強度の変化を表す線形変数と既知のＶＢＮの含有量とからＰＬＳ回帰分析にて検量線を求めても良い。このＰＬＳ回帰分析によっても、上述の重回帰分析を行った場合と同様に、ＶＢＮやＶ２スコアーの相関係数Ｒ２、標準誤差ＳＥＣ、評価用試料の相関係数ｒ２、及び予測標準誤差ＳＥＰを定めることができる。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明を実施例にて具体的に説明する。以下、実施例１〜４は、ＶＢＮの検量線作成、及びその評価に関するものであり、実施例５、６は、Ｖ２スコアーの検量線作成、及びその評価に関するものである。
【００４５】
（実施例１）
１．サイレージ試料の抽出液の透過光スペクトルデータ収集
牧草サイレージ、トウモロコシサイレージ試料４０点から抽出液を得た。
これら抽出液を水蒸気蒸留法にてＶＢＮ含有量を測定し、検量線作成時に用いる化学分析値とした。その濃度範囲は２７.２〜５６０Ｎ・ｍｇ/リットルであった。
【００４６】
次に、これら抽出液を光路長４ｍｍの石英ガラス製セルに充填し、透過光スペクトルを測定するために近赤外分析計にてλ＝４００〜２５００ｎｍの光を照射し、セルを通過するその透過光の強度のスペクトルデータを収集した。
【００４７】
２．検量線の作成
収集したデータを、セグメントサイズ１０ｎｍ、ギャップサイズ０ｎｍで平滑化処理し、２次微分処理を行った後、検量線作成用の試料３０点と評価用の試料１０点に区分した。波長として６７２、１７４８、６７６、６４８ｎｍの４種を選択して、検量線作成用の試料３０点について重回帰分析を行ない検量線を決定した。
【００４８】
３．作成した検量線を用いた評価用の試料のＶＢＮ含有量測定
決定された検量線を用いて評価用試料１０点についてＶＢＮ含有量の値を求めた。
【００４９】
４．作成した検量線、及び検量線を用いて測定した評価用試料の推定値の精度評価
作成した検量線の相関係数、及び標準誤差ＳＥＣを求めた。一方で、作成した検量線を用いて、評価用試料のＶＢＮ含有量の推定値を算出し、評価試料の相関係数、及び予測標準誤差ＳＥＰを求めた。
結果を表２に示す。
【００５０】
【表２】
2011047831.tif 000012
【００５１】
なお、比較例１は、選択波長が１６８８、１６５８、８０８、２２１６ｎｍの４種である点が、実施例１の条件と異なっている。比較例２は、光路長が１ｍｍである点、及び選択波長が１６８８、１６５８、８０８、２２１６ｎｍの４種である点が実施例１の条件と異なっている。また、比較例３は、透過光スペクトルの前処理方法が１次微分処理である点、及び解析方法がＰＬＳ回帰分析である点が実施例１と異なっている。
【００５２】
５．精度評価の結果について
本実施例では、各比較例１〜３に対して、検量線の相関係数Ｒ２、及び評価試料の相関係数ｒ２が極めて高い値を示しており、一方で、標準誤差ＳＥＣ、及び予測標準誤差ＳＥＰは非常に低い値を示している。本実施例においては、波長６７２、１７４８、６７６、６４８ｎｍの４種を選択したことにより、比較例１〜３に対して精度が大幅に改善され、良好な結果が得られている。
【００５３】
（実施例２）
以下、実施例２について説明する。
【００５４】
１．サイレージ試料の抽出液の透過光スペクトルデータ収集
実施例１と同様の条件で透過光スペクトルデータを収集した。
【００５５】
２．検量線の作成
実施例１と同様にスペクトルデータの平滑化処理、及び２次微分処理を行ない、検量線作成用の試料３０点と評価用の試料１０点に区分した。そして、本実施例では、波長領域６４０ｎｍ〜１７５０ｎｍを用いてＰＬＳ回帰分析で検量線を決定した。
【００５６】
３．作成した検量線を用いた評価用試料のＶＢＮ含有量の測定
実施例１の場合と同様に、決定された検量線を用いて評価用試料１０点についてＶＢＮの値を求めた。
【００５７】
４．作成した検量線、及び検量線を用いて測定した評価用試料の推定値の精度評価
実施例１で説明した精度評価方法と同様の解析を行った。
結果を表３に示す。
【００５８】
【表３】
2011047831.tif 000013
【００５９】
なお、比較例３は、選択波長領域が９５０〜１６５０ｎｍである点、及び透過光スペクトルの前処理が１次微分処理である点で実施例２の条件と異なっている。比較例４は、光路長が１ｍｍである点、及び選択波長領域が１２００〜１３００ｎｍである点で実施例２の条件と異なっている。
【００６０】
５．精度評価の結果について
本実施例では、波長領域６４０〜７００ｎｍ、及び１６３０〜１７５０ｎｍを用いてＰＬＳ回帰分析を行ったことにより、比較例３、４に対して、検量線の相関係数Ｒ２、及び評価試料の相関係数ｒ２が極めて高い値を示しており、一方で、標準誤差ＳＥＣ、及び予測標準誤差ＳＥＰは非常に低い値を示している。すなわち、精度の高い良好な検量線が得られている。
【００６１】
（実施例３）
以下、実施例３について説明する。
【００６２】
１．サイレージ試料の抽出液の透過光スペクトルデータ収集
牧草サイレージ、トウモロコシサイレージおよびそれらとビール粕、副産物、配合飼料を混合した試料４９４点から抽出液を得た。
【００６３】
これら抽出液を水蒸気蒸留法にてＶＢＮ含有量を測定し、検量線作成時に用いる化学分析値とした。その濃度範囲は１８．４〜５７２Ｎ・ｍｇ/リットルであった。
次に、これら抽出液を光路長１ｍｍの石英ガラス製セルに充填し、透過光スペクトルを測定するために近赤外分析計にて波長４００〜２５００ｎｍの光を照射し、セルを通過する
その透過光の強度のスペクトルデータを収集した。
【００６４】
２．検量線の作成
収集したデータを、セグメントサイズ１０ｎｍ、ギャップサイズ０ｎｍで平滑化処理し、２次微分処理を行った後、検量線作成用の試料３７０点と評価用の試料１２４点に区分した。波長領域１１５６〜１３００ｎｍ、１６００〜１８００ｎｍ、及び２１００〜２３５０ｎｍを選択して、検量線作成用の試料３７０点についてＰＬＳ回帰分析を行ない検量線を決定した。また、１７１０〜１７７０ｎｍ、２０８０〜２２００ｎｍ、及び２２２０〜２３５０ｎｍの波長領域も選択して、試料３７０点についてＰＬＳ回帰分析を行い検量線を決定した。
【００６５】
３．作成した検量線を用いた評価用試料のＶＢＮ含有量の測定
決定された検量線を用いて評価用試料１２４点についてＶＢＮ含有量の値を求めた。
【００６６】
４．作成した検量線、及び検量線を用いて測定した評価用試料の推定値の精度評価
検量線の相関係数Ｒ２、及び検量線の標準誤差ＳＥＰを求めた。一方で、評価試料の相関係数ｒ２、及び予測標準誤差ＳＥＰも求めた。
結果を表４に示す。なお、表中において、波長領域１１５６〜１３００ｎｍ、１６００〜１８００ｎｍ、及び２１００〜２３５０ｎｍを選択した検量線の結果については、実施例３−１の項目として記載し、波長領域１７１０〜１７７０ｎｍ、２０８０〜２２００ｎｍ、及び２２２０〜２３５０ｎｍを選択した検量線の結果については、実施例３−２の項目として記載する。
【００６７】
【表４】
2011047831.tif 000014
【００６８】
なお、比較例４は、選択波長領域が１２００〜１３００ｎｍである点で実施例３−１、及び３−２の条件と異なっている。比較例５は、前処理として１次微分処理を用いている点、及び選択波長領域が９５０〜１６５０ｎｍである点で実施例３−１、及び３−２の条件と異なっている。
【００６９】
本実施例では、選択波長領域を１１５６〜１３００ｎｍ、１６００〜１８００ｎｍ、及び２１００〜２３５０ｎｍ、或いは１７１０〜１７７０ｎｍ、２０８０〜２２００ｎｍ、及び２２２０〜２３５０ｎｍとし、ＰＬＳ回帰分析で検量線を作成することにより、比較例４、５と比較して、検量線の相関係数Ｒ２、及び評価試料の相関係数ｒ２が極めて高い値を示しており、一方で、標準誤差ＳＥＣ、及び予測標準誤差ＳＥＰは非常に低い値を示している。すなわち、精度の高い良好な検量線が得られている。
【００７０】
（実施例４）
以下、実施例４について説明する。
【００７１】
１．サイレージ試料の抽出液の透過光スペクトルデータ
実施例３と同様の条件で透過光スペクトルデータを収集した。
【００７２】
２．検量線の作成
実施例３と同様にスペクトルデータの平滑化処理、及び２次微分処理を行ない、検量線作成用の試料３７０点と評価用の試料１２４点に区分した。そして、本実施例では波長領域６００〜１０５０ｎｍ、１６００〜１８００ｎｍ、及び２０８０〜２３５０ｎｍを選択して、ＰＬＳ回帰分析で検量線を決定した。また、７００〜８００ｎｍ、１７１０〜１７７０ｎｍ、２０８０〜２２００ｎｍ、及び２２２０〜２３５０ｎｍの波長領域も選択し、ＰＬＳ回帰分析を行い検量線を決定した。
【００７３】
３．作成した検量線を用いた評価用試料のＶＢＮ含有量の測定
実施例３の場合と同様に、決定された検量線を用いて評価用試料１２４点についてＶＢＮ含有量の値を求めた。
【００７４】
４．作成した検量線、及び検量線を用いて測定した評価用試料の推定値の精度評価
実施例３で説明した精度評価方法と同様の解析を行った。
【００７５】
結果を表５に示す。なお、表中において、波長領域６００〜１０５０ｎｍ、１６００〜１８００ｎｍ、及び２０８０〜２３５０ｎｍを選択した検量線の結果については、実施例４−１の項目に記載し、波長領域７００〜８００ｎｍ、１７１０〜１７７０ｎｍ、２０８０〜２２００ｎｍ、及び２２２０〜２３５０ｎｍを選択した検量線の結果については、実施例４−２の項目に記載する。
【００７６】
【表５】
2011047831.tif 000015
【００７７】
本実施例では、選択波長領域を６００〜１０５０ｎｍ、１６００〜１８００ｎｍ、及び２０８０〜２３５０ｎｍ、或いは１７００〜８００ｎｍ、１７１０〜１７７０ｎｍ、２０８０〜２２００ｎｍ、及び２２２０〜２３５０ｎｍとし、ＰＬＳ回帰分析で検量線を作成することにより、比較例４、５と比較して、検量線の相関係数Ｒ２、及び評価試料の相関係数ｒ２が極めて高い値を示しており、一方で、標準誤差ＳＥＣ、及び予測標準誤差ＳＥＰは非常に低い値を示している。すなわち、精度の高い良好な検量線が得られている。
【００７８】
（実施例５）
以下、実施例５について説明する。
【００７９】
１．サイレージ試料の抽出液の透過光スペクトルデータ
牧草サイレージ、トウモロコシサイレージおよびそれらとビール粕、副産物、配合飼料を混合した試料４９４点から抽出液を得た。
【００８０】
これら抽出液を水蒸気蒸留法にてＶＢＮ含有量を測定し、ガスクロマトグラフィーにてＶＦＡを測定し、上記表１に示された定義に基づきＶ２スコアーを算出して検量線作成時に用いる化学分析値とした。その値の範囲は０．９８〜１００であった。
【００８１】
次に、これら抽出液を光路長１ｍｍの石英ガラス製セルに充填し、透過光スペクトルを測定するために近赤外分析計にて波長４００〜２５００ｎｍの光を照射し、セルを通過するその透過光の強度のスペクトルデータを収集した。
【００８２】
２．検量線の作成
収集したデータを、セグメントサイズ１０ｎｍ、ギャップサイズ０ｎｍで平滑化処理し、２次微分処理を行った後、検量線作成用の試料３７０点と評価用の試料１２４点に区分した。波長６７８、１６９４、１７１２、及び２２７０ｎｍの４種を選択して、検量線作成用の試料３７０点について重回帰分析を行ないＶ２スコアーの検量線を決定した。
【００８３】
３．作成した検量線を用いた評価用の試料のＶ２スコアーの測定
決定された検量線を用いて評価用試料１２４点についてＶ２スコアーの値を求めた。
【００８４】
４．作成した検量線、及び検量線を用いて測定した評価用試料の推定値の精度評価
検量線の相関係数Ｒ２、及び検量線の標準誤差ＳＥＰを求めた。一方で、評価試料の相関係数ｒ２、及び予測標準誤差ＳＥＰも求めた。
結果を表６に示す。
【００８５】
【表６】
2011047831.tif 000016
【００８６】
５．精度評価の結果について
本実施例では、波長として、６７８、１６９４、１７１２、及び２２７０ｎｍの４種の選択することで、検量線の相関係数Ｒ２、及び評価試料の相関係数ｒ２は、実用に足る数値に達している。一方で、標準誤差ＳＥＣ、及び予測標準誤差ＳＥＰは非常に低い値を示し、精度の高い良好な結果が得られている。
【００８７】
（実施例６）
以下、実施例６について説明する。
【００８８】
１．サイレージ試料の抽出液の透過光スペクトルデータ
実施例５と同様の条件で透過光スペクトルデータを収集した。
【００８９】
２．検量線の作成
実施例５と同様にスペクトルデータの平滑化処理、及び２次微分処理を行ない、検量線作成用の試料３７０点と評価用の試料１２４点に区分した。そして、本実施例では波長領域６１６〜１０８２ｎｍ、１１１６〜１３００ｎｍ、１６３０〜１８００ｎｍ、及び２０８４〜２３６０ｎｍを選択して、ＰＬＳ回帰分析で検量線を決定した。また、７００〜８００ｎｍ、１７１０〜１７７０ｎｍ、２０８４〜２２００ｎｍ、及び２２２０〜２３６０ｎｍの波長領域も選択し、ＰＬＳ回帰分析を行い検量線を決定した。
【００９０】
３．作成した検量線を用いた評価用の試料のＶ２スコアーの測定
実施例５の場合と同様に、決定された検量線を用いて評価用試料１２４点についてＶ２スコアーの値を求めた。
【００９１】
４．作成した検量線、及び検量線を用いて測定した評価用試料の推定値の精度評価
実施例３で説明した精度評価方法と同様の解析を行った。結果を表７に示す。なお、表中において、波長領域６１６〜１０８２ｎｍ、１１１６〜１３００ｎｍ、１６３０〜１８００ｎｍ、及び２０８４〜２３６０ｎｍを選択した検量線の結果については、実施例６−１の項目に記載し、波長領域７００〜８００ｎｍ、１７１０〜１７７０ｎｍ、２０８４〜２２００ｎｍ、及び２２２０〜２３６０ｎｍを選択した検量線の結果については、実施例６−２の項目に記載する。
【００９２】
【表７】
2011047831.tif 000017
【００９３】
５．精度評価の結果について
本実施例では、選択波長領域を、６１６〜１０８２、１１１６〜１３００、１６３０〜１８００、及び２０８４〜２３６０ｎｍ、或いは、７００〜８００ｎｍ、１７１０〜１７７０ｎｍ、２０８４〜２２００ｎｍ、及び２２２０〜２３６０ｎｍとしてＰＬＳ回帰分析で検量線を作成することにより、極めて精度の良い（１に近い値の）検量線の相関係数Ｒ２、及び評価試料の相関係数ｒ２が得られており、また、標準誤差ＳＥＣ、及び予測標準誤差ＳＥＰも非常に低い値を示しており、極めて精度の高い良好な検量線が得られている。
【００９４】
なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものではなく、発明の要旨の範囲内で種々の変更が可能である。
【符号の説明】
【００９５】
１０      分析装置
１２      光源
１４      第１スリット
１６      ミラー
１８      グレーティング
２０      リファレンス
２２      フィルター
２４      第２スリット
２６      試料セル
２８      検出器
【図１】
2011047831.tif 000018
【図２】
2011047831.tif 000019