(57)【要約】      （修正有）【課題】甲状腺刺激ホルモンレセプター（ＴＳＨＲ）を支持体に固定化した状態で用いる免疫測定法において、固定化の際にＴＳＨＲが不安定となり測定結果に変動を生じる可能性を回避するために、ＴＳＨＲを水性媒体中で安定化する方法を提供する。【解決手段】リン酸ナトリウム又はリン酸カリウムに代表されるリン酸塩を共存させ、また好ましくは両イオン界面活性等の界面活性剤を共存させる事による、甲状腺刺激ホルモンレセプターを水性媒体中で安定化させる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸塩を共存させることを特徴とする、甲状腺刺激ホルモンレセプターを水性媒体中で安定させるための方法。
【請求項２】
更に、界面活性剤を共存させることを特徴とする、請求項１記載の甲状腺刺激ホルモンレセプターを水性媒体中で安定させるための方法。
【請求項３】
甲状腺刺激ホルモンレセプターが支持体に固定化されていることを特徴とする、請求項１又は２に記載の甲状腺刺激ホルモンレセプターを水性媒体中で安定させるための方法。
【請求項４】
甲状腺刺激ホルモンレセプターが細胞外ドメインを備えたものである、請求項１又は２に記載の甲状腺刺激ホルモンレセプターを水性媒体中で安定させるための方法。
【請求項５】
リン酸塩として、リン酸ナトリウム又はリン酸カリウムを使用することを特徴とする、請求項１又は２に記載の甲状腺刺激ホルモンレセプターを水性媒体中で安定させるための方法。
【請求項６】
界面活性剤として、両イオン界面活性（ＡＳＢ−１４（ａｍｉｄｏｓｕｌｆｏｂｅｔａｉｎｅ−１４）、ＡＳＢ−１６（ａｍｉｄｏｓｕｌｆｏｂｅｔａｉｎｅ−１６）、Ｃ７ＢｚＯ、ＣＨＡＰＳ（３−［３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ＣＡＰＳＯ（３−［３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−２−ｈｙｄｏｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ＥＭＰＩＧＥＮ  ＢＢ、ＳＢ３−８（３−（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｏｃｔｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ  ｉｎｎｅｒ  ｓａｌｔ）、ＳＢ３−１０（３−（Ｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ  ｉｎｎｅｒ  ｓａｌｔ）、ＳＢ３−１２（３−（Ｄｏｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ  ｉｎｎｅｒ  ｓａｌｔ）、ＳＢ３−１４（３−（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｍｙｒｉｓｔｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）ＳＢ３−１６（３−（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｐａｌｍｉｔｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）及びＳＢ３−１８（３−（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）からなる群から選択される一種以上を使用することを特徴とする、請求項１又は２に記載の甲状腺刺激ホルモンレセプターを水性媒体中で安定させるための方法。
【請求項７】
リン酸塩及びリン酸により安定化された甲状腺刺激ホルモンレセプターを含有する水性媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、甲状腺刺激ホルモンレセプター（Ｔｈｙｒｏｉｄ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；以下「ＴＳＨＲ」と記載することがある）の安定化方法等に関するものである。より具体的には、本発明は、支持体に固定化等されたＴＳＨＲの安定化方法、安定化されたＴＳＨＲ、それを用いる免疫測定試薬測定試薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトＴＳＨＲは、分子量約１００ｋＤａの糖蛋白で甲状腺細胞膜上に存在する甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の受容体であり、脳下垂体から分泌されるＴＳＨが甲状腺の細胞膜にあるＴＳＨＲに結合すると、甲状腺は代謝機能の調節ホルモンであるＴ３およびＴ４を分泌する。このレセプターに対する自己抗体が自己免疫性甲状腺疾患（バセドウ病及び甲状腺機能低下症の一部）の患者血中に認められる。この抗体は、ＴＳＨがレセプターに結合するのを阻止することになるためＴＳＨ結合阻止抗体−ＴＢＩＩともよばれる。そしてこの抗体には、刺激型と阻害型の２種類があり、刺激型はＴＳＨＲを刺激し甲状腺機能亢進を、阻害型はＴＳＨのＴＳＨＲへの結合を阻害して機能低下を引き起こすことが知られており、臨床的測定の意義が高く確定診断の補助に有効である。つまり、ＴＳＨレセプター抗体（ＴＲＡｂ）陽性ならば、バセドウ病である可能性が高く、かつその抗体の力価は病態を反映し、治療効果の判定や寛解・再発の指標となる。また，甲状腺ホルモンの欠乏が認められ、かつレセプター抗体が陽性であれば、甲状腺ホルモン欠乏がＴＳＨＲ阻止抗体によるものである可能性を示し、機能低下症の診断あるいは発症の予測に有用である。
【０００３】
このＴＲＡｂの測定にはスミスらによって開発された液相法による１ステップ法（第１世代）（非特許文献１）から固定化したＴＳＨレセプターと標識ＴＳＨを用いた２ステップ法（第２世代）へと進化し、さらに近年、酵素標識抗ヒトＴＳＨレセプターモノクローナル抗体を用いた測定法も開発されている（非特許文献２）。また従来はＴＲＡｂが存在するとＴＳＨのＴＳＨＲへの結合反応が阻害されことから結合阻害率（ＴＢＩＩ％）で算出され、ＴＢＩＩ値がＴＲＡｂの値を反映すると言われていたが、最近では測定精度の向上により国際標準品に準拠した濃度値（ＩＵ／Ｌ）が用いられてきており、疾患の鑑別だけでなく治療経過、寛解、再発の判断を正確に判断することが試みられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７４，４０５〜４２０，１９８１及びＥｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．，９，１０６〜１２０，１９８８
【非特許文献２】ＴＳＨ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ−ｎｅｗ  ａｎｄ  ｏｌｄ  ａｓｓａｙｓ，Ｒｅｅｓ  Ｓｍｉｔｈ，ＲＳＲ  Ｌｔｄ，ＣＦ２３  ８ＨＥ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＴＲＡｂの測定にはＴＳＨＲが支持体に固定化された状態で用いられるが、支持体への固定化の際にＴＳＨＲが不安定性となってしまうという課題があった。ＴＳＨＲが不安定になると、製造されるＴＳＨＲ固定化支持体のロット内変動、ロット間差を生じ、微量ながら測定結果に変動を生じることになる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記課題に鑑みて、本発明者らは、かかる微量な変動をも生じないＴＲＡｂ測定試薬を提供することを目的としてＴＳＨＲの安定化方法等について鋭意検討を行った結果、本発明を完成するに至った。即ち本発明は、リン酸塩を共存させることを特徴とする、甲状腺刺激ホルモンレセプターを水性媒体中で安定させるための方法である。また本発明は、リン酸塩及びリン酸により安定化された甲状腺刺激ホルモンレセプターを含有する水性媒体である。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】
本発明は、リン酸塩を共存させることにより、ＴＳＨＲを水性媒体中で安定させるものである。ＴＳＨＲと共存させるリン酸塩として、リン酸ナトリウム塩、リン酸カリウム塩等を例示することができる。本発明では、このようなリン酸塩を単独で、又は２種類以上混合して、使用することができる。ＴＳＨＲと共存させるリン酸塩の濃度は、ＴＳＨＲを含む水性媒体において０．０２〜１．０Ｍ、好ましくは０．１〜０．５Ｍである。ここで水性媒体とは、水を主体とし、可溶化が良好に行われ、さらに可溶化されたＴＳＨＲが媒体中で安定して保持されるものであれば種々の組成の媒体を用いることができ、例えば、各種の緩衝液等を好適なものとして例示することができる。
【０００８】
本発明では、リン酸塩に加えて、更に界面活性剤を共存させることが好ましい。界面活性剤を共存させるとＴＳＨＲの安定効果が強くなる傾向があり、共存させる濃度としては、ｗ／ｖ換算で０．０５〜１％、好ましくは０．０５〜０．２％である。界面活性剤としては、具体的に、両イオン界面活性（ＡＳＢ−１４（ａｍｉｄｏｓｕｌｆｏｂｅｔａｉｎｅ−１４）、ＡＳＢ−１６（ａｍｉｄｏｓｕｌｆｏｂｅｔａｉｎｅ−１６）、Ｃ７ＢｚＯ、ＣＨＡＰＳ（３−［３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ＣＡＰＳＯ（３−［３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−２−ｈｙｄｏｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ＥＭＰＩＧＥＮ  ＢＢ、ＳＢ３−８（３−（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｏｃｔｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ  ｉｎｎｅｒ  ｓａｌｔ）、ＳＢ３−１０（３−（Ｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ  ｉｎｎｅｒ  ｓａｌｔ）、ＳＢ３−１２（３−（Ｄｏｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ  ｉｎｎｅｒ  ｓａｌｔ）、ＳＢ３−１４（３−（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｍｙｒｉｓｔｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）ＳＢ３−１６（３−（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｐａｌｍｉｔｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）及びＳＢ３−１８（３−（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）からなる群から選択される一種以上を使用することができる。中でも、ＳＢ３−１６（３−（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｐａｌｍｉｔｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ＣＨＡＰＳ（３−［３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）は、ＴＳＨＲの安定化において最も高い効果を発揮した。
【０００９】
リン酸塩や界面活性剤の共存のさせ方に特に限定はなく、例えばＴＳＨＲを含む水性媒体中に単に添加すれば良い。添加する順序にしても特に制限はなく、リン酸塩と界面活性剤のどちらかを先に添加しても良いし、同時に添加してもよい。
【００１０】
リン酸塩の共存により安定化されるＴＳＨＲは、天然由来のもの（例えばブタから精製されたブタＴＨＳＲ等）に加えて、遺伝子組み換え品（例えばヒトやブタの組換えＴＳＨＲ）であっても良い。またＴＳＨＲは、遊離した分子として水性媒体中に存在していても良いし、また例えば支持体に固定化されていても良い。固定化は、物理的な吸着であっても化学的結合であっても良い。遊離しているＴＳＨＲには、その後支持体に固定化されるべきＴＳＨＲも含まれる。更にＴＳＨＲは、全長であるものや一部分であっても安定化が可能であり、少なくとも細胞外ドメインを備えたものであれば制限はない。なお、支持体としては、ポリスチレン・ポリプロピレンといった材質のプラスチック製のビーズやマイクロタイタープレート等の一般的材料が例示できる。
【００１１】
本発明の安定化方法では、目的に応じて保剤（例えばウシ血清アルブミン等）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸やビタミンＥ等）、結合剤（例えばカルボキシメチルセルロース等）、湿潤剤（例えばセルロース、ポロエチレングリコール等）、着色剤（例えば合成食用色素等）、懸濁化剤（例えばポリビニルピロリドン等）、乳化剤（例えばアルキルスルホン酸等）、溶解補助剤（例えばグリセリン等）、緩衝剤（例えばトリスヒドキシルアミン塩酸塩等）、等張化剤（例えばＤ−ソルビトール、塩化ナトリウム等）等の、ＴＳＨＲの安定化効果には寄与しないものの、種々の助剤としての効果が期待できる添加物を共存させても良い。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のＴＳＨＲの安定化方法や安定化されたＴＳＨＲは、例えばＴＳＨＲを試薬構成の一部として使用する種々の免疫測定法で使用するＴＳＨＲに適用することが可能である。従って、免疫測定の分野において重要な測定項目の一つであるＴＲＡｂの測定の際、支持体に固定化された状態で用いられるＴＳＨＲが固定化の際に不安定性となってしまうという課題を排除することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を記載するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。なお本実施例においては、固定化したＴＳＨＲと標識ＴＳＨを用いた２ステップ法の酵素免疫測定法（ＥＩＡ）でＴＲＡｂを測定した例を示したが、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）又は発光免疫測定法（ＬＩＡ）等すべての方法に適用することができる。
【実施例１】
【００１４】
方法
【００１５】
組換えヒトＴＳＨＲ（特開平８−２２８７６９号公報に記載している方法に従って調製）を固定化した磁性ビーズ（フェライトを練りこんだエチレン−酢酸ビニル共重合体（ＥＶＡ）による粒子：東ソ−（株）製）を表１に示した組成の緩衝液で４℃に保存した後、免疫測定装置として市販の自動免疫測定装置（ＡＩＡ−１８００、東ソー（株）製）を用い、２ステップ競合法によりＴＲＡｂの測定を行った。測定は、専用のプラスチックカップに上記条件で保存された各ＴＳＨＲ固定化磁性ビーズと１次反応液（１％ＢＳＡを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．５））と分注した後に、ＴＲＡｂ陰性血清を分注して３７℃にて１０分間インキュベートした。その後に、洗浄水で洗浄することにより遊離の検体成分を除去し、次にアルカリ性ホスファターゼ標識アビジンとビオチン標識ＴＳＨを含む２次反応液（１％ＢＳＡ、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛を含むトリス緩衝液（ｐＨ７．５））を分注し３７℃にて１０分間インキュベートした。その後、洗浄水で洗浄することにより遊離のアルカリ性ホスファターゼ標識アビジンとビオチン標識ＴＳＨを除去し、磁性ビーズに結合した酵素活性を測定するために基質として４−メチルウンベリフェリルリン酸を添加し、蛍光物質（４−メチルウンベリフェロン）の生成速度（レート値）を測定した。支持体に固定化したＴＳＨＲの活性は、下記式１に示す、調製直後のレート値と保存後のレート値を比較した「百分率」を算出し、比較することで判断した。
【００１６】
【表１】
2011136911.tif 000002
【００１７】
式１  百分率＝（（４℃で７日保存した時点のレート値）／（調製直後のレート値））×１００                                                                          
【実施例２】
【００１８】
リン酸塩による効果の確認
【００１９】
ＴＳＨＲを結合させた磁性ビーズを表１に示す添加剤を各０．１Ｍで調製された緩衝液ＡからＥ（ｐＨ７．０）で４℃保存し、保存開始から７日目の時点で上記手段にてレート値を測定した。結果を表２に示す。
【００２０】
【表２】
2011136911.tif 000003
【００２１】
表２から明らかなように、リン酸塩を共存させていない溶液Ａ〜Ｄでは、７日間の保存により測定値が大幅に減少していたが、溶液Ｅでは、リン酸塩を共存させたことにより、７日後でも残存活性が８０％以上を示していた。以上の結果から、リン酸塩を共存させることにより、支持体に結合したＴＳＨＲの安定性を確保できることが明らかである。
【実施例３】
【００２２】
リン酸塩濃度による効果の確認
【００２３】
ＴＳＨＲを結合させた磁性ビーズを０．１、０．２、０．５、１．０Ｍのリン酸緩衝液（リン酸２水素ナトリウムとリン酸水素２カリウムで調製）の溶液ＡからＥで４℃保存し、保存開始から７日目の時点で上記手段にてレート値を測定した。結果を表３に示す。
【００２４】
【表３】
2011136911.tif 000004
【００２５】
表３の結果から、リン酸塩の添加濃度によってその効果は高くなり、０．５Ｍ以上では７日後でも残存活性が実に９５％以上を示すことが分かる。
【実施例４】
【００２６】
界面活性剤を共存させることによる効果の確認
【００２７】
ＴＳＨＲを結合させた磁性ビーズをリン酸２水素ナトリウムとリン酸水素２カリウムで調製した０．１Ｍのリン酸緩衝液（溶液Ａ）、溶液Ａに界面活性剤（ＳＢ３−１６（３−（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｐａｌｍｉｔｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ＣＨＡＰＳ（３−［３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ］ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ））０．１％を共存させた溶液Ｂで４℃保存し、保存開始から７日目の時点で上記手段にてレート値を測定した。結果を表４に示す。
【００２８】
【表４】
2011136911.tif 000005
【００２９】
表４の結果から、界面活性剤を共存させていない溶液Ａの残存活性が８５％に対して、界面活性剤を共存させた溶液Ｂは界面活性剤を共存させたことで残存活性９５％以上を示し、リン酸塩に界面活性剤を共存させることにより、支持体に結合したＴＳＨＲの安定性向上できることが明らかである。