(57)【要約】【課題】光刺激をしてから、光刺激をした領域をイメージングするまでのタイムラグを短縮する。【解決手段】レーザユニット１とは、低強度のレーザ光と高強度のレーザ光とを切り替えて射出可能であり、光路切替ユニット１０および１３により、レーザユニット１と標本１６との間の光路が、光路Ｒ１と光路Ｒ２とで切り替えられる。また、共振型ガルバノスキャナ１２は、光路Ｒ２に配置され、全観察領域で低強度のレーザ光を走査し、制御型ガルバノスキャナ１１は、光路Ｒ１に配置され、部分領域に高強度のレーザ光を照射させる。そして、部分領域の直前で共振型ガルバノスキャナ１２による走査が一時的に停止され、制御型ガルバノスキャナ１１により部分領域に高強度のレーザ光が照射された後、その停止の続きから、共振型ガルバノスキャナ１２による走査が再開される。本発明は、例えば、レーザ走査型顕微鏡システムに適用できる。【選択図】図１
2011128423.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被観察面に光を走査させて観察する走査型顕微鏡において、
第１の強度の光と、前記第１の強度より高強度の第２の強度の光とを切り替えて射出可能な光源と、
前記光源と前記被観察面との間の光路を、少なくとも第１の光路と第２の光路とで切り替える光路切替手段と、
前記第１の光路に配置され、前記被観察面において観察を行う領域である全観察領域で前記光源から射出される前記第１の強度の光を走査する走査手段と、
前記第２の光路に配置され、前記被観察面において光刺激を行う領域である部分領域に、前記光源から射出される前記第２の強度の光を照射させる制御型走査手段と、
前記光源、前記切替手段、前記走査手段、および前記制御型走査手段を制御する制御手段と
を備え、
前記制御手段は、
前記光路切替手段により前記第１の光路を選択させ、前記光源から第１の強度の光を射出させて、前記走査手段により前記全観察領域で前記第１の強度の光の走査を開始させ、
前記部分領域を光刺激するタイミングであると判定した場合、前記走査手段による前記第１の強度の光の走査を一時的に停止させ、
前記光路切替手段により前記第１の光路から前記第２の光路に切り替えさせ、前記光源から第２の強度の光を射出させて、前記制御型走査手段により前記部分領域に前記第２の強度の光を照射させ、
前記光路切替手段により前記第２の光路から前記第１の光路に切り替えさせ、前記光源から第１の強度の光を射出させて、前記一時的に停止させた続きから、前記走査手段による前記第１の強度の光の走査を再開させる
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項２】
前記切替手段は、前記光路の分岐箇所へ挿脱可能なミラーを含む
ことを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
【請求項３】
被観察面に光を走査させて観察する走査型顕微鏡の制御方法において、
前記走査型顕微鏡は、
第１の強度の光と、前記第１の強度より高強度の第２の強度の光とを切り替えて射出可能な光源と、
前記光源と前記被観察面との間の光路を、少なくとも第１の光路と第２の光路とで切り替える光路切替手段と、
前記第１の光路に配置され、前記被観察面において観察を行う領域である全観察領域で前記光源から射出される前記第１の強度の光を走査する走査手段と、
前記第２の光路に配置され、前記被観察面において光刺激を行う領域である部分領域に、前記光源から射出される前記第２の強度の光を照射させる制御型走査手段と
を備え、
前記光路切替手段により前記第１の光路を選択させ、前記光源から第１の強度の光を射出させて、前記走査手段により前記全観察領域で前記第１の強度の光の走査を開始させ、
前記部分領域を光刺激するタイミングであると判定した場合、前記走査手段による前記第１の強度の光の走査を一時的に停止させ、
前記光路切替手段により前記第１の光路から前記第２の光路に切り替えさせ、前記光源から第２の強度の光を射出させて、前記制御型走査手段により前記部分領域に前記第２の強度の光を照射させ、
前記光路切替手段により前記第２の光路から前記第１の光路に切り替えさせ、前記光源から第１の強度の光を射出させて、前記一時的に停止させた続きから、前記走査手段による前記第１の強度の光の走査を再開させる
ステップを含むことを特徴とする制御方法。
【請求項４】
被観察面に光を走査させて観察する走査型顕微鏡を制御するコンピュータに実行させるプログラムにおいて、
前記走査型顕微鏡は、
第１の強度の光と、前記第１の強度より高強度の第２の強度の光とを切り替えて射出可能な光源と、
前記光源と前記被観察面との間の光路を、少なくとも第１の光路と第２の光路とで切り替える光路切替手段と、
前記第１の光路に配置され、前記被観察面において観察を行う領域である全観察領域で前記光源から射出される前記第１の強度の光を走査する走査手段と、
前記第２の光路に配置され、前記被観察面において光刺激を行う領域である部分領域に、前記光源から射出される前記第２の強度の光を照射させる制御型走査手段と
を備え、
前記光路切替手段により前記第１の光路を選択させ、前記光源から第１の強度の光を射出させて、前記走査手段により前記全観察領域で前記第１の強度の光の走査を開始させ、
前記部分領域を光刺激するタイミングであると判定した場合、前記走査手段による前記第１の強度の光の走査を一時的に停止させ、
前記光路切替手段により前記第１の光路から前記第２の光路に切り替えさせ、前記光源から第２の強度の光を射出させて、前記制御型走査手段により前記部分領域に前記第２の強度の光を照射させ、
前記光路切替手段により前記第２の光路から前記第１の光路に切り替えさせ、前記光源から第１の強度の光を射出させて、前記一時的に停止させた続きから、前記走査手段による前記第１の強度の光の走査を再開させる
ステップを含むことを特徴とする処理をコンピュータに実行させるプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、走査型顕微鏡および走査型顕微鏡の制御方法、並びにプログラムに関し、特に、光刺激をしてから、光刺激をした領域をイメージングするまでのタイムラグを短縮することができるようにした走査型顕微鏡および走査型顕微鏡の制御方法、並びにプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、イメージング用の光学系に光刺激用の光学系を組み合わせたレーザ走査顕微鏡では、標本の一部へ特定波長の光で刺激を与え、その周辺で生じる変化を観察すること（光刺激観察）が可能である。
【０００３】
例えば、特許文献１には、光源から被観察面への光路を、経路の異なる複数の光路で切り替えることにより、イメージングと光刺激とを同時に行うことができるレーザ走査顕微鏡が開示されている。このレーザ走査顕微鏡では、光路切替手段として、ダイクロイックミラー、全反射ミラーおよび中空ブロックの組み合わせ、およびハーフミラーを使用することが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００８／００４３３６号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１のレーザ走査顕微鏡で全反射ミラーおよび中空ブロックの組み合わせによる光路切替手段を利用する構成においては、試料に照射されるレーザ光のパワーが減少することがなく、かつ、イメージング用と光刺激用とで同一の波長のレーザ光を使用することができる。
【０００６】
しかしながら、全反射ミラーおよび中空ブロックの組み合わせによる光路切替手段を利用する構成においては、光刺激を行った後に、全観察領域のイメージングを行うように制御されているため、光刺激をしてから、全観察領域のイメージングを開始して、光刺激をした領域に達するまでにタイムラグがあり、光刺激の直後の反応を観察することができなかった。一般的に、光刺激をした試料の反応は時間の経過に応じて変化するため、光刺激と、光刺激をした領域のイメージングとのタイムラグは短い方が望ましい。
【０００７】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、光刺激をしてから、光刺激をした領域をイメージングするまでのタイムラグを短縮することができるようにするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の走査型顕微鏡は、被観察面に光を走査させて観察する走査型顕微鏡であって、第１の強度の光と、前記第１の強度より高強度の第２の強度の光とを切り替えて射出可能な光源と、前記光源と前記被観察面との間の光路を、少なくとも第１の光路と第２の光路とで切り替える光路切替手段と、前記第１の光路に配置され、前記被観察面において観察を行う領域である全観察領域で前記光源から射出される前記第１の強度の光を走査する走査手段と、前記第２の光路に配置され、前記被観察面において光刺激を行う領域である部分領域に、前記光源から射出される前記第２の強度の光を照射させる制御型走査手段と、前記光源、前記切替手段、前記走査手段、および前記制御型走査手段を制御する制御手段とを備え、前記制御手段は、前記光路切替手段により前記第１の光路を選択させ、前記光源から第１の強度の光を射出させて、前記走査手段により前記全観察領域で前記第１の強度の光の走査を開始させ、前記部分領域を光刺激するタイミングであると判定した場合、前記走査手段による前記第１の強度の光の走査を一時的に停止させ、前記光路切替手段により前記第１の光路から前記第２の光路に切り替えさせ、前記光源から第２の強度の光を射出させて、前記制御型走査手段により前記部分領域に前記第２の強度の光を照射させ、前記光路切替手段により前記第２の光路から前記第１の光路に切り替えさせ、前記光源から第１の強度の光を射出させて、前記一時的に停止させた続きから、前記走査手段による前記第１の強度の光の走査を再開させることを特徴とする。
【０００９】
本発明の走査型顕微鏡の制御方法またはプログラムは、被観察面に光を走査させて観察する走査型顕微鏡の制御方法、または、その走査型顕微鏡を制御するコンピュータに実行させるプログラムであって、前記走査型顕微鏡は、第１の強度の光と、前記第１の強度より高強度の第２の強度の光とを切り替えて射出可能な光源と、前記光源と前記被観察面との間の光路を、少なくとも第１の光路と第２の光路とで切り替える光路切替手段と、前記第１の光路に配置され、前記被観察面において観察を行う領域である全観察領域で前記光源から射出される前記第１の強度の光を走査する走査手段と、前記第２の光路に配置され、前記被観察面において光刺激を行う領域である部分領域に、前記光源から射出される前記第２の強度の光を照射させる制御型走査手段とを備え、前記光路切替手段により前記第１の光路を選択させ、前記光源から第１の強度の光を射出させて、前記走査手段により前記全観察領域で前記第１の強度の光の走査を開始させ、前記部分領域を光刺激するタイミングであると判定した場合、前記走査手段による前記第１の強度の光の走査を一時的に停止させ、前記光路切替手段により前記第１の光路から前記第２の光路に切り替えさせ、前記光源から第２の強度の光を射出させて、前記制御型走査手段により前記部分領域に前記第２の強度の光を照射させ、前記光路切替手段により前記第２の光路から前記第１の光路に切り替えさせ、前記光源から第１の強度の光を射出させて、前記一時的に停止させた続きから、前記走査手段による前記第１の強度の光の走査を再開させるステップを含むことを特徴とする。
【００１０】
本発明の走査型顕微鏡および走査型顕微鏡の制御方法、並びにプログラムにおいては、光路切替手段により第１の光路が選択され、光源から第１の強度の光が射出されて、走査手段により全観察領域で第１の強度の光の走査が開始される。そして、部分領域を光刺激するタイミングであると判定された場合、走査手段による第１の強度の光の走査が一時的に停止され、光路切替手段により第１の光路から第２の光路に切り替えられて、光源から第２の強度の光が射出され、制御型走査手段により部分領域に第２の強度の光が照射される。その後、光路切替手段により第２の光路から第１の光路に切り替えられ、光源から第１の強度の光が射出されて、一時的に停止された続きから、走査手段による第１の強度の光の走査が再開される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の走査型顕微鏡および走査型顕微鏡の制御方法、並びにプログラムによれば、光刺激をしてから、光刺激をした領域をイメージングするまでのタイムラグを短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明を適用したレーザ走査型顕微鏡システムの一実施の形態の構成例を示す図である。
【図２】イメージングの光路および光刺激の光路について説明する図である。
【図３】イメージングの途中で光刺激を行う光刺激観察方法により観察を行う処理を説明するフローチャートである。
【図４】レーザ光の走査を模式的に示す図である。
【図５】イメージング、光路切替動作、およびレーザパワーの動作タイミングを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。
【００１４】
図１は、本発明を適用したレーザ走査型顕微鏡システムの一実施の形態の構成例を示す図である。なお、システムとは、複数の装置により構成される装置全体を表すものである。
【００１５】
図１において、レーザ走査型顕微鏡システムは、顕微鏡本体１００、コントローラ２０、コンピュータ２１、モニタ２２、および入力器２３を備えて構成される。
【００１６】
顕微鏡本体１００には、レーザユニット１、光ファイバ７、コリメートレンズ８、ダイクロイックミラー９、光路切替ユニット１０、制御型ガルバノスキャナ１１、共振型ガルバノスキャナ１２、光路切替ユニット１３、リレーレンズ１４、対物レンズ１５、標本１６、集光レンズ１７、共焦点検出用のピンホール絞り１８、光検出器１９などが配置される。このうち、ダイクロイックミラー９、集光レンズ１７、ピンホール絞り１８、光検出器１９が、検出用光学系１００Ａを構成している。なお、標本１６は、不図示のステージ上に支持された蛍光観察用の標本（蛍光色素が添加された標本）である。
【００１７】
制御型ガルバノスキャナ１１は、直列の関係で配置された主走査用ガルバノミラーと副走査用ガルバノミラーとを備え、共振型ガルバノスキャナ１２は、直列の関係で配置された主走査用共振型ガルバノミラーと、副走査用制御型ガルバノミラーとを備える。このうち、制御型ガルバノスキャナ１１は、スキャン速度が遅いものの、スキャン領域を自由に設定することが可能という利点があるので、レーザ光の照射先を標本１６の観察領域の所望の部分領域に限定するときに有効であり、共振型ガルバノスキャナ１２は、スキャン領域を自由に設定することが困難である反面、スキャン速度が速いという利点があるので、標本１６を高速にレーザスキャンするときに有効である。
【００１８】
レーザユニット１には、レーザ光源および音響光学フィルタ（ＡＯＴＦ）が搭載されており、コントローラ２０の制御に従って、出射光のオン／オフや、出射光の強度調節などを行う。
【００１９】
レーザユニット１から射出したレーザ光は、ファイバカプラを介して光ファイバ７の一端へ入射する。そのレーザ光は、光ファイバ７の内部を伝搬した後、光ファイバ７の他端から射出し、コリメートレンズ８において平行光束化された後、ダイクロイックミラー９へ入射する。そのレーザ光は、ダイクロイックミラー９を通過し、光路切替ユニット１０に入射する。
【００２０】
光路切替ユニット１０は、複数の光学素子（設定素子）を装着可能なターレットで構成されており、コントローラ２０の制御に従って、光路に挿入する光学素子を交換することで、光路を切り替えることができる。図１の構成例では、光路切替ユニット１０のターレットには、全反射ミラー１０Ｍおよび中空ブロック１０Ｂが装着されており、中空ブロック１０Ｂを光路に挿入することによる光路Ｒ１と、全反射ミラー１０Ｍを光路に挿入することによる光路Ｒ２とが切り替えられる。
【００２１】
光路切替ユニット１０により中空ブロック１０Ｂが光路に挿入されると、中空ブロック１０Ｂを通過したレーザ光は、光路Ｒ１を通り、制御型ガルバノスキャナ１１で反射した後、光路切替ユニット１３に入射する。一方、光路切替ユニット１０により全反射ミラー１０Ｍが光路に挿入されると、全反射ミラー１０Ｍにおいて反射されたレーザ光は、光路Ｒ２を通り、共振型ガルバノスキャナ１２で反射した後、光路切替ユニット１３に入射する。
【００２２】
光路切替ユニット１３は、光路切替ユニット１０と同様に、全反射ミラー１３Ｍおよび中空ブロック１３Ｂが装着されたターレットで構成されており、光路切替ユニット１０と同期して動作する。即ち、光路切替ユニット１３は、光路切替ユニット１０が中空ブロック１０Ｂを光路に挿入したとき、中空ブロック１３Ｂを光路に挿入し、光路切替ユニット１０が全反射ミラー１０Ｍを光路に挿入したとき、全反射ミラー１３Ｍを光路に挿入する。
【００２３】
従って、光路Ｒ１を通って制御型ガルバノスキャナ１１で反射した後、光路切替ユニット１３に入射したレーザ光は、光路切替ユニット１３の中空ブロック１３Ｂを通過し、リレーレンズ１４及び対物レンズ１５を通り標本１６上にスポットを形成する。そのスポットで生じた蛍光（スポットを形成したレーザ光よりも波長が若干長い）は、スポットを形成したレーザ光と同じ光路Ｒ１を逆に辿りダイクロイックミラー９へ向かう。この状態で制御型ガルバノスキャナ１１が駆動されると、スポットが標本１６上を二次元的にスキャンする。
【００２４】
一方、光路Ｒ２を通って共振型ガルバノスキャナ１２で反射した後、光路切替ユニット１３に入射したレーザ光は、光路切替ユニット１３の全反射ミラー１３Ｍで反射され、リレーレンズ１４及び対物レンズ１５を通り標本１６上にスポットを形成する。そのスポット部分で生じた蛍光（スポットを形成したレーザ光よりも波長が若干長い）は、スポットを形成したレーザ光と同じ光路Ｒ２を逆に辿りダイクロイックミラー９へ向かう。この状態で共振型ガルバノスキャナ１２が駆動されると、スポットが標本１６上を二次元的にスキャンする。
【００２５】
ダイクロイックミラー９へ入射した蛍光はダイクロイックミラー９で反射して検出用光学系１００Ａへ取り込まれる。集光レンズ１７において集光され、ピンホール絞り１８を通過した蛍光は、光検出器１９へ入射して電気信号へ変換される。
【００２６】
このように、顕微鏡本体１００では、光路切替ユニット１０および１３による設定素子を、中空ブロック１０Ｂおよび中空ブロック１３Ｂの組み合わせにセットした場合、レーザユニット１と標本１６との間では光路Ｒ１が選択される。また、光路切替ユニット１０および１３による設定素子を、全反射ミラー１０Ｍおよび１３Ｍの組み合わせにセットした場合、レーザユニット１と標本１６との間では光路２が選択される。
【００２７】
ここで、光路切替ユニット１０および１３は、モータにより電動化されており、設定素子の組み合わせは、中空ブロック１０Ｂおよび中空ブロック１３Ｂの組み合わせと、全反射ミラー１０Ｍおよび１３Ｍの組み合わせとでよいので、光路切替ユニット１０および１３が共通のモータで駆動するように構成されていてもよい。
【００２８】
さらに、光路切替ユニット１０および１３と、顕微鏡本体１００のその他の駆動部（レーザユニット１、制御型ガルバノスキャナ１１、共振型ガルバノスキャナ１２、光検出器１９など）とは、コントローラ２０によって制御される。コントローラ２０は、コンピュータ２１の支配下にあり、ユーザからの指示は、モニタ２２、入力器２３を介してコンピュータ２１へと与えられ、そのコンピュータ２１を介してコントローラ２０へと与えられる。
【００２９】
コントローラ２０は、コンピュータ２１からの指示に従い、顕微鏡本体１００の各駆動部へ必要な指示や駆動信号を与え、それによって顕微鏡本体１００の設定及び駆動を行う。
【００３０】
例えば、コントローラ２０は、光路Ｒ２が有効となるよう顕微鏡本体１００を設定した上で、レーザユニット１と共振型ガルバノスキャナ１２と光検出器１９とを同期駆動しつつ光検出器１９から電気信号を取り込めば、標本１６の観察領域の蛍光画像データを取得すること（イメージング）ができる。この蛍光画像データは、コントローラ２０からコンピュータ２１へと送出され、必要に応じてモニタ２２へ送出されたり、コンピュータ２１にて保存されたりする。
【００３１】
また、コントローラ２０は、光路Ｒ１が有効となるよう顕微鏡本体１００を設定した上で、レーザユニット１と制御型ガルバノスキャナ１１とを同期駆動することで、標本１６の所定の領域を光刺激することができる。
【００３２】
このように、顕微鏡本体１００は、光路切替ユニット１０および１３の使用により、１対のガルバノスキャナ（制御型ガルバノスキャナ１１及び共振型ガルバノスキャナ１２）を、ダイクロイックミラー９と標本１６との間の光路に対し並列の関係で配置しているので、１つの光源ユニット１と１つの検出用光学系１００Ａとが、１対のガルバノスキャナ（制御型ガルバノスキャナ１１及び共振型ガルバノスキャナ１２）に共用されることになる。
【００３３】
したがって、顕微鏡本体１００は、レーザユニット１と検出用光学系１００Ａとを一台ずつしか搭載していないにも拘わらず、レーザユニット１の投光先を１対のガルバノスキャナの間で選択することや、イメージングに用いられるガルバノスキャナを１対のガルバノスキャナの間で選択することが可能である。
【００３４】
例えば、顕微鏡本体１００では、光刺激とイメージングとで同一の波長のレーザ光を使用し、イメージングの途中で光刺激を行う光刺激観察方法による観察を行うことができる。このような光刺激観察方法による観察では、標本１６に適用された蛍光色素の励起波長に応じて、例えば、４８８ｎｍのアルゴンレーザ光が使用され、イメージング時と光刺激時とで、光路Ｒ２と光路Ｒ１とが切り替えられるとともに、アルゴンレーザ光の強度が切り替えられる。
【００３５】
図２を参照して、イメージングの光路Ｒ２および光刺激の光路Ｒ１について説明する。
【００３６】
図２Ａには、レーザユニット１から低強度のアルゴンレーザ光が照射され、光路切替ユニット１０および１３により光路Ｒ２が選択されている状態が示されている。低強度のアルゴンレーザ光は、図２Ａに実線で示すとおり、光路Ｒ２を通り標本１６へ到達可能であり、そのアルゴンレーザ光のスポットは、共振型ガルバノスキャナ１２により、標本１６の全観察領域をスキャンすることが可能である。そのスポットで生じる蛍光は、図２Ａに点線で示すとおり、ダイクロイックミラー９で反射可能なので、検出用光学系１００Ａの側へと抽出される。
【００３７】
また、図２Ｂには、レーザユニット１から高強度のアルゴンレーザ光が照射され、光路切替ユニット１０および１３により光路Ｒ１が選択されている状態が示されている。高強度のアルゴンレーザ光は、図２Ｂに実線で示すとおり、光路Ｒ１を通り標本１６へ到達可能であり、そのアルゴンレーザ光のスポットは、制御型ガルバノスキャナ１１により、標本１６の部分領域をスキャンすることが可能である。このように、高強度のアルゴンレーザ光により標本１６の部分領域へ光刺激が与えられる。なお、そのスポットで生じる蛍光は、図２Ｂに点線で示すとおり、ダイクロイックミラー９で反射可能なので、検出用光学系１００Ａの側へと抽出されるが、このときにはイメージングの必要は無く、光検出器１９を駆動する必要は無い。
【００３８】
このように、顕微鏡本体１００では、イメージングと光刺激とを切り替えることができ、イメージングの途中に光刺激をする部分領域があると、イメージングを中断し、アルゴンレーザ光の光路および強度を切り替えて光刺激をした後、中断していた箇所からイメージングを再開することができる。
【００３９】
図３のフローチャートを参照して、図１の顕微鏡本体１００が、イメージングの途中で光刺激を行う光刺激観察方法により観察を行う処理について説明する。
【００４０】
例えば、ユーザが、顕微鏡本体１００の図示しないステージに標本１６をセットし、入力器２３を操作して観察の開始を指示すると処理が開始され、ステップＳ１１において、コントローラ２０は、アルゴンレーザ光がイメージング用の強度（低強度）で射出されるようにレーザユニット１を設定する。また、コントローラ２０は、光路切替ユニット１０および１３により光路に挿入される設定素子を、図２Ａに示すように、全反射ミラー１０Ｍおよび１３Ｍの組み合わせに設定し、処理はステップＳ１２に進む。
【００４１】
ステップＳ１２において、コントローラ２０は、レーザユニット１、共振型ガルバノスキャナ１２、及び光検出器１９を駆動し、アルゴンレーザ光で標本１６の全観察領域（図２Ａ下部参照）のイメージングを行う。
【００４２】
ステップＳ１２の処理後、処理はステップＳ１３に進み、ステップＳ１２のイメージングで取得された標本１６の蛍光画像データがコンピュータ２１へ送出され、コンピュータ２１は、標本１６の蛍光画像データをモニタ２２に出力する。コンピュータ２１は、モニタ２２に表示された画面上で、ユーザに対し光刺激を行うべき一つまたは複数の部分領域を指定させ、ユーザが、入力器２３を操作し、所望する部分領域をコンピュータ２１へ指定すると、処理はステップＳ１４に進む。
【００４３】
ステップＳ１４において、ユーザが指定した部分領域の情報がコンピュータ２１からコントローラ２０に送信され、コントローラ２０は、制御型ガルバノスキャナ１１のスキャン領域を、ユーザの指定した一つまたは複数の部分領域に設定すると共に、その部分領域に光刺激を行うタイミングを特定する。例えば、顕微鏡本体１００では、全観察領域の上端から１ラインずつスポットのスキャンが行われており、コントローラ２０は、１ライン目のスキャンを開始してから、各部分領域を通過するラインの直前のラインまでのライン数を特定する。
【００４４】
ステップＳ１４の処理後、処理はステップＳ１５に進み、コントローラ２０は、ステップＳ１１における設定を維持したまま、レーザユニット１、共振型ガルバノスキャナ１２、及び光検出器１９を駆動し、低強度のアルゴンレーザ光による標本１６の全観察領域のイメージングを開始する。また、このイメージングで取得された標本１６の蛍光画像データは、コンピュータ２１へ送出される。
【００４５】
ステップＳ１６において、コントローラ２０は、例えば、１ラインのスキャンを行うたびに、全観察領域のイメージングにおけるスキャンのラインが、光刺激を行う部分領域の直前に到達したか否かを判定する。そして、コントローラ２０は、全観察領域のイメージングにおけるスキャンのラインが、光刺激を行う部分領域の直前に到達したと判定するまで、全観察領域のイメージングを継続する。
【００４６】
例えば、コントローラ２０は、ステップＳ１５で全観察領域の上端の１ライン目からスキャンを開始したイメージングのライン数をカウントし、そのカウント数が、ステップＳ１４で特定したライン数未満である場合、全観察領域のイメージングにおけるスキャンのラインが、光刺激を行う部分領域の直前に到達していないと判定する。一方、コントローラ２０は、カウント数が、ステップＳ１４で特定したライン数となった場合、全観察領域のイメージングにおけるスキャンのラインが、光刺激を行う部分領域の直前に到達したと判定する。
【００４７】
ステップＳ１６において、コントローラ２０が、全観察領域のイメージングにおけるスキャンのラインが、光刺激を行う部分領域の直前に到達したと判定した場合、処理はステップＳ１７に進み、コントローラ２０は、レーザユニット１、共振型ガルバノスキャナ１２、及び光検出器１９の駆動を中断させ、イメージングを一時的に停止する。
【００４８】
ステップＳ１７の処理後、処理はステップＳ１８に進み、コントローラ２０は、光路切替ユニット１０および１３により光路に挿入される設定素子が、図２Ｂに示すように、中空ブロック１０Ｂおよび中空ブロック１３Ｂの組み合わせになるように設定を変更する。さらに、コントローラ２０は、アルゴンレーザ光が光刺激用の強度（高強度）で射出されるようにレーザユニット１の設定を変更して、処理はステップＳ１９に進む。
【００４９】
ステップＳ１９において、コントローラ２０は、レーザユニット１、および制御型ガルバノスキャナ１１を駆動し、アルゴンレーザ光で標本１６の部分領域（図２Ｂ下部参照）へ光刺激を与える。そして、その部分領域でのスキャンが終了すると、処理はステップＳ２０に進む。
【００５０】
ステップＳ２０において、コントローラ２０は、ステップＳ１１と同様に、アルゴンレーザ光がイメージング用の強度（低強度）で射出されるようにレーザユニット１の設定を変更するとともに、光路切替ユニット１０および１３により光路に挿入される設定素子が、図２Ａに示すように、全反射ミラー１０Ｍおよび１３Ｍの組み合わせとなるように設定を変更する。
【００５１】
ステップＳ２０の処理後、処理はステップＳ２１に進み、光刺激を行っていない部分領域があるか否かを判定する。
【００５２】
ステップＳ２１において、コントローラ２０が、光刺激を行っていない部分領域がある（残っている）と判定した場合、処理はステップＳ２２に進み、コントローラ２０は、レーザユニット１、共振型ガルバノスキャナ１２、及び光検出器１９を駆動し、低強度のアルゴンレーザ光による標本１６の全観察領域のイメージングを再開する。このとき、ステップＳ１７でスキャンを停止したラインの次のラインから、スキャンが行われる。また、このイメージングで取得された標本１６の蛍光画像データは、コンピュータ２１へ送出される。ステップＳ２２の処理後、処理はステップＳ１６に戻り、次の部分領域の直前に到達するまでイメージングが行われ、以下、同様の処理が繰り返される。
【００５３】
一方、ステップＳ２１において、コントローラ２０が、光刺激を行っていない部分領域がない（残っていない）と判定した場合、即ち、ユーザにより指定された全ての部分領域に対して光刺激を行ったと判定した場合、処理はステップＳ２３に進む。
【００５４】
ステップＳ２３において、コントローラ２０は、レーザユニット１、共振型ガルバノスキャナ１２、及び光検出器１９を駆動し、低強度のアルゴンレーザ光による標本１６の全観察領域のイメージングを再開する。このとき、ステップＳ１７でスキャンを停止したラインの次のラインから、スキャンが行われる。また、このイメージングで取得された標本１６の蛍光画像データは、コンピュータ２１へ送出される。そして、全観察領域の最後のラインまでスキャンが行われると、即ち、スキャンを再開してから残りの全観察領域のイメージングが行われると、処理はステップＳ２４に進む。
【００５５】
ステップＳ２４において、コンピュータ２１は、標本１６の蛍光画像データをモニタ２２へ出力する。その画面上で、ユーザは、光刺激直後の標本１６の様子を観察することができる。コンピュータ２１は、その蛍光画像データを、必要に応じて保存し、処理は終了する。
【００５６】
上述した各ステップは必要に応じて繰り返しや前段ステップへの戻りが行われる。以上、本実施の形態では、光路切替ユニット１０および１３の中空ブロック１０Ｂおよび１３Ｂ、並びに、全反射ミラー１０Ｍおよび１３Ｍを有効に利用するので、光刺激とイメージングとに共通の光源を使用することができる。
【００５７】
なお、上述したステップＳ１９では、光刺激を１回しか行わなかったが、連続して繰り返して行ってもよい。そうすれば、より強く刺激することができる。また、上述したステップＳ１５乃至Ｓ２３の処理を連続して繰り返し行ってもよい。そうすれば、連続する複数フレーム分の蛍光画像データが得られるので、光刺激直後における標本１６の時間変化を観察することが可能になる。
【００５８】
以上のように、顕微鏡本体１００では、光刺激を行う部分領域の直前に到達するとイメージングを一時的に停止し、アルゴンレーザ光の光路および強度を切り替えて部分領域を光刺激した後、一時的に停止していた続きからイメージングを再開するので、部分領域を光刺激してから、その部分領域をイメージングするまでのタイムラグを短縮することができ、部分領域を光刺激した直後の反応を観察することができる。
【００５９】
即ち、光刺激を行った後に全観察領域のイメージングを行うように制御されるレーザ走査顕微鏡では、部分領域を光刺激した後に、全観察領域の上端からスキャンが開始されるので、部分領域がイメージングされるまでにタイムラグがあり、光刺激直後の反応を観察することができなかったのに対し、顕微鏡本体１００では、そのタイムラグを短縮して光刺激直後の反応を観察することができる。
【００６０】
また、例えば、ハーフミラーによる光切替手段を備えたレーザ走査顕微鏡では、試料に照射されるレーザ光のパワーが大きく減少してしまうのに対し、顕微鏡本体１００では、全反射ミラー１０Ｍおよび１３Ｍと中空ブロック１０Ｂおよび１３Ｂとの切り替えにより光路を切り替えるので、レーザ光のパワーが減少することを抑制することができ、エネルギー効率を向上させることができる。また、光刺激時における高強度のレーザ光が、イメージングに悪影響を及ぼすことを回避することができる。
【００６１】
また、ダイクロイックミラーによる光路切替手段を備えたレーザ走査顕微鏡では、イメージング用と光刺激用とで同一の波長のレーザ光を使用することができないのに対し、顕微鏡本体１００では、イメージング用と光刺激用とで同一の波長のレーザ光を使用することができ、これにより、波長の異なる複数の光源を用意する必要がなく、装置を小型化することや、低コスト化を図ることができる。
【００６２】
また、例えば、スキャナを備えた２台の装置を用いて、それぞれの装置により全観察領域のイメージングと、部分領域の光刺激とを行うようなシステムにより、イメージングの途中で光刺激を行うこともできるが、そのようなシステムよりも、顕微鏡本体１００では、装置の小型化および低コスト化を図ることができる。
【００６３】
次に、図４および図５を参照して、イメージングの途中で光刺激を行う光刺激観察方法についてさらに説明する。
【００６４】
図４には、標本１６の表面におけるレーザ光の走査が模式的に示されており。図５には、顕微鏡本体１００におけるイメージング、光路切替動作、およびレーザパワーの動作タイミングが示されている。ここで、図４の全観察領域５１に示されているように、２箇所の部分領域５２および５３が設定された例について説明する。
【００６５】
例えば、ユーザからの入力に応じて部分領域５２および５３が設定（図３のステップＳ１４）された後、時刻ｔ1において、コントローラ２０は、全観察領域のイメージングをＯＮにする。即ち、全反射ミラー１０Ｍおよび１３Ｍの組み合わせが光路に設定されて光路Ｒ２が選択された状態で、コントローラ２０は、レーザユニット１、共振型ガルバノスキャナ１２、及び光検出器１９を駆動し、低強度のアルゴンレーザ光による標本１６の全観察領域のイメージングを開始する（図３のステップＳ１３）。
【００６６】
これにより、全観察領域５１−１において実線で示すように、全観察領域のスキャンが行われ、そのスキャンのラインが部分領域５２の直前に到達すると、時刻ｔ2において、全観察領域のイメージングがＯＦＦ（図３のステップＳ１７）される。そして、コントローラ２０は、光路の切り替えを指示する信号を光路切替ユニット１０および１３に供給する。これにより、中空ブロック１０Ｂおよび中空ブロック１３Ｂの組み合わせが光路に設定され、光路Ｒ２から光路Ｒ１に切り替えられる（図３のステップＳ１８）。
【００６７】
その光路の切り替え後、時刻ｔ3において、コントローラ２０がレーザユニット１から射出されるアルゴンレーザのレーザパワーを低強度から高強度に切り替える制御を行い、全観察領域５１−２において実線で示すように、部分領域５２に対して光刺激が行われる（図３のステップＳ１９）。
【００６８】
部分領域５２におけるスキャンが終了すると、時刻ｔ4において、コントローラ２０は、レーザユニット１から射出されるアルゴンレーザのレーザパワーを高強度から低強度に切り替える制御を行うと同時に、光路の切り替えを指示する信号を光路切替ユニット１０および１３に供給する。これにより、全反射ミラー１０Ｍおよび１３Ｍの組み合わせが光路に設定され、光路Ｒ１から光路Ｒ２に切り替えられる（図３のステップＳ２０）。
【００６９】
その後、時刻ｔ5において、コントローラ２０は、全観察領域のイメージングをＯＮにすると、全観察領域５１−３において実線で示すように、時刻ｔ2で一時的に停止していたラインの続きからスキャンが再開される（図３のステップＳ２２）。これにより、部分領域５２を刺激した直後の反応をイメージングすることができる。
【００７０】
そして、イメージングのスキャンのラインが部分領域５３の直前に到達すると、時刻ｔ6において、全観察領域のイメージングがＯＦＦ（図３のステップＳ１７）される。その後、時刻ｔ6から時刻ｔ9までの間に、時刻ｔ2から時刻ｔ5までと同様の処理が行われ、全観察領域５１−４において実線で示すように、部分領域５３に対して光刺激が行われる。
【００７１】
その後、時刻ｔ9において、コントローラ２０が全観察領域のイメージングをＯＮにし、全観察領域５１−５において実線で示すように、時刻ｔ6で停止したラインの続きからスキャンが再開され（図３のステップＳ２３）、残りの全観察領域のイメージングが行われた後、時刻ｔ10で全観察領域のイメージングがＯＦＦされる。
【００７２】
なお、図４および図５の例では、全観察領域５１に２つの部分領域５２および５３を設定しているが、部分領域は、１箇所に設定したり、３箇所以上に設定してもよい。このように、任意の位置に任意の個数の部分領域を設定することで、顕微鏡本体１００では、任意のタイミングで部分領域を光刺激することができる。
【００７３】
また、レーザユニット１に異なる波長の複数の光源を搭載し、部分領域ごとに光刺激を行うレーザ光の波長を切り替えてもよい。また、光刺激を行う際のレーザ光の強度を部分領域ごとに切り替えてもよい。このように、それぞれ特徴の異なる光刺激を部分領域ごとに与えることで、それぞれ異なる反応を観察することができる。
【００７４】
なお、本実施の形態では、部分領域の直前に到達したときに、全観察領域のイメージングを一時的に停止しているが、全観察領域のイメージングを停止するタイミングは、部分領域の直前のラインよりも数ライン手前で行ってもよい。また、部分領域の途中までイメージングしたときに、全観察領域のイメージングを一時的に停止して、その部分領域を光刺激するようにしてもよい。また、部分領域をイメージングした後に、全観察領域のイメージングを一時的に停止して、その部分領域を光刺激するようにしてもよい。このように、部分領域に対して任意のタイミングで全観察領域のイメージングを停止してもよく、その停止のタイミングは、部分領域の位置とは独立したものとすることができる。
【００７５】
さらに、レーザユニット１から標本１６までの光路を、光路Ｒ１と光路Ｒ２とで切り替える切替手段としては、全反射ミラーと中空ブロックとの組み合わせによる切替手段に限られるものではなく、光路Ｒ１と光路Ｒ２とに選択的にレーザ光を入射できるような光学系を使用することができる。また、切替手段により、３つ以上の光路に切り替えてもよい。
【００７６】
なお、本システムの顕微鏡本体１００では、１対のガルバノスキャナの配置される光路Ｒ１，Ｒ２の分岐箇所を、ダイクロイックミラー９とリレーレンズ１４との間としたが、リレーレンズ４と対物レンズ１５との間や、リレーレンズ４の光路中としてもよい。但し、分岐箇所の一方をリレーレンズ４の光路中とする場合、光路Ｒ１，Ｒ２の各々にリレーレンズの一部を配置する必要があるので、光学素子の点数が若干増える。
【００７７】
また、本システムの顕微鏡本体１００では、光路切替ユニット１０および１３をターレットで構成したが、スライド機構などの他の機構で構成してもよい。また、上述した顕微鏡本体１００には、１対のガルバノスキャナとして互いに異なる種類のガルバノスキャナ（制御型ガルバノスキャナ１１，共振型ガルバノスキャナ１２）が搭載されたが、同じ種類のガルバノスキャナが搭載されてもよい。但し、異なる種類のガルバノスキャナを搭載した方が、使い分けを行う自由が得られるので、より好ましい（また、ガルバノスキャナに限られず、光の向きが変えられる部材、例えば音響光学素子を用いてもよい。）。
【００７８】
なお、上述した一連の処理は、ハードウエアにより実行することもできるし、ソフトウエアにより実行することもできる。一連の処理をソフトウエアにより実行する場合には、そのソフトウエアを構成するプログラムが、専用のハードウエアに組み込まれているコンピュータ、または、各種のプログラムをインストールすることで、各種の機能を実行することが可能な、例えば汎用のパーソナルコンピュータなどに、プログラム記録媒体からインストールされる。
【００７９】
そのコンピュータでは、ROM（Read Only Memory）に記憶されているプログラムや、ハードディスクや不揮発性のメモリなどよりなる記憶部に記憶されているプログラムなどが、RAM（Random Access Memory）にロードされ、CPU（Central Processing Unit）により実行される。それにより、上述した一連の処理が行われる。
【００８０】
また、それらのプログラムは、あらかじめ記憶部に記憶させておく他、ネットワークインタフェースなどよりなる通信部を介して、あるいは、磁気ディスク（フレキシブルディスクを含む）、光ディスク（CD-ROM(Compact Disc-Read Only Memory),DVD(Digital Versatile Disc)等）、光磁気ディスク、または半導体メモリなどのリムーバブルメディアを駆動するドライブを介して、コンピュータにインストールすることができる。
【００８１】
なお、コンピュータが実行するプログラムは、本明細書で説明する順序に沿って時系列に処理が行われるプログラムであっても良いし、並列に、あるいは呼び出しが行われたとき等の必要なタイミングで処理が行われるプログラムであっても良い。また、プログラムは、１つのCPUにより処理されるものであっても良いし、複数のCPUによって分散処理されるものであっても良い。
【００８２】
なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【符号の説明】
【００８３】
１  レーザユニット，  ７  光ファイバ，  ８  コリメートレンズ，  ９  ダイクロイックミラー，  １０  光路切替ユニット，  １０Ｂ  中空ブロック，  １０Ｍ  全反射ミラー，  １１  制御型ガルバノスキャナ，  １２  共振型ガルバノスキャナ，  １３  光路切替ユニット，  １３Ｂ  中空ブロック，  １３Ｍ  全反射ミラー，  １４  リレーレンズ，  １５  対物レンズ，  １６  標本，  １７  集光レンズ，  １８  共焦点検出用のピンホール絞り，  １９  光検出器，  ２０  コントローラ，  ２１  コンピュータ，  ２２  モニタ，  ２３  入力器
【図１】
2011128423.tif 000003
【図２】
2011128423.tif 000004
【図３】
2011128423.tif 000005
【図４】
2011128423.tif 000006
【図５】
2011128423.tif 000007