(57)【要約】【課題】  哺乳動物の細胞および組織サンプルにおける前がん状態を検出する方法、ＴＣＰＰを可溶化する新規な、そしてより有効な方法、ならびにこの方法によって可溶化されたＴＣＰＰを含んでなる組成物の提供。【解決手段】  サンプルを可溶化された５，１０，１５，２０−テトラキス（カルボキシフェニル）ポルフィン（ＴＣＰＰ）とともにインキュベートし、サンプルにおけるＴＣＰＰ蛍光を測定し、そして細胞のそれぞれの状態と相関するＴＣＰＰ蛍光に基づいて、サンプルを非がん性、前がん性もしくはがん性と分類。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の異形成またはがん腫細胞を検出するキットであって、サンプル中の異常な前がんまたはがん細胞の検出に使用するために、容器中の５，１０，１５，２０−テトラキス（カルボキシフェニル）ポルフィンおよび指図書を含有するキット。
【請求項２】
８．５〜１２．０のｐＨにおける５０％〜９０％アルコールのアルコール水溶液中に溶解された５，１０，１５，２０−テトラキス（カルボキシフェニル）ポルフィンを含有する組成物を含有する、請求項１のキット。
【請求項３】
ａ）細胞のサンプルを収集するための構成要素；
ｂ）固形支持体にサンプルを付着させるための構成要素；
ｃ）既知のがん、異形成、化生または正常状態の対照細胞サンプル；および
ｄ）５，１０，１５，２０−テトラキス（カルボキシフェニル）ポルフィン蛍光を定量するための構成要素：
の１つ以上をさらに含む、請求項１のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、「５，１０，１５，２０−テトラキス（カルボキシフェニル）ポルフィンを使用するヒト組織サンプルにおける前がん症状を検出する方法」と題して２０００年１１月１７日提出の係属中の暫定特許出願第６０／２４９，５０５号の優先権を請求するものであり、これのすべては本明細書に引用によって組み入れられている。
【０００２】
発明の分野
本発明は、両イン・ビトロおよびイン・サイチューの種々の組織サンプル由来の、異形成、前がんおよびがん細胞を検出するためのある種のポルフィリンの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
種々の科学的および学問的論文は、明細書をとおして挿入語句において言及されている。これらの論文は、本発明が属する技術の状態を記述するために引用によって本明細書に組み入れられている。
【０００４】
疾病の進行を検査し、そしてがんを含む異常について組織サンプルを分析する病理学者は、細胞の異常な形成もしくは成熟を指す異形成と呼ばれる細胞の状態が、前がん症状における細胞を潜在的に同定できることを決定した。チェックされなかった異形成は、軽度、中等度および重度の段階をとおって、最後にはがんにまで進行することがある。異形成の７つの中等の症例について約１症例ががんにまで進行し、そして重度の異形成をもつ症例の８３％が、伴われる細胞のタイプに応じてがんに進行すると報告されている。しかしながら、弱および中等度の異形成の除去は、一般にがんの発生を低下させる。肺においては、異形成細胞の除去はがん細胞の形成を一般に低下させるだけでなく、若干の症例では、肺組織は正常な形態に復帰できる。
【０００５】
一般に、より早くがんが検出されるほど、予後は患者の生存についてより良好である。乳がんが、まだ１個の塊に局在している早期に検出されれば、５年後の生存率は９６％以上である。それが離れた場所に拡散した場合、５年後の生存率は２０％未満である。肺がんでは、それが１個の塊として検出される場合、５年後の生存率は４６％以上である。それが拡散した場合、５年後の生存率は１４％未満である。頸がんでは、前がん変化が発見され、そしてより重い段階に進展する前に治療された場合に、生存におけるさらなる改善が生じる（非特許文献１および非特許文献２）。
【０００６】
肺がん腫は、現在、米国における男女の中でがんによる死亡率の第１の原因である（非特許文献３）。１９９７年には、肺がんによると評価された死亡者は１６０，０００人であり、このことは、米国の男性における全がん死亡の１２％、そして米国の女性では２％と計算される（非特許文献１）。また、肺がんは、５年後の生存率わずか１４％に反映されているように、もっとも致死性のがんタイプの１つである。他のタイプのヒトのがんに比較して、肺がん患者に関する不幸な予後は、多くは有効な早期の検出方法の欠如による。臨床的な（症候の）提示の時点で、全患者の３分の２以上が、１領域の小結節の併発または遠方への転移を有し、この両方は通常は治癒不能である。しかしながら、局在性（病期０もしくは１）肺がんをもつ患者の研究では、５年後の生存率は４０％から７０％の範囲であった（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００７】
歴史的には、症候が生じる前に肺がんを検出するために使用される唯一の診断試験は、喀痰細胞法および胸部放射線写真法であった。その結果、大量のスクリーニングの道具としてのこれらの有効性は、過去数十年にわたる研究において広く評価されてきた。両試験は、前兆の、早期のがん腫、特に扁平上皮細胞のがん腫を検出する。
【０００８】
スクリーニング法の改良は、多くは、検鏡における技術的進歩をとおして喀痰細胞法の利用を改良することに集中した。喀痰細胞法は細胞サンプルの肉眼的検査を必要とし、そこでは、細胞の大きさ、形状、組織および細胞の核と細胞質のサイズ間の比が、細胞の形態を決定するために使用される。細胞形態のこの調査は肉眼的点検と分類を必要とするので、その技術は臨床観察者の代わりにかなりの専門知識量を要する。種々の研究が実施されて、コンピュータに助けられる高分解能画像解析が、数種の組織タイプに関する肉眼的に正常な核における肉眼では見られない変化の検出を可能にすることを示唆する結果を得た（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。細胞サンプルにおけるＤＮＡ分布のコンピュータ補助の解析は、標準の細胞学的試験と比較した場合、材料のヒトによる検査もなく、そして肉眼的に異常な核の存在を必要とせずに、核の７４％の正確な形態学的分類を与えた。
【０００９】
また、細胞標本の形態学的調査は、肺腫瘍病理学の知識における進歩により改善した。この仕事の多くは、「バイオマーカー（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）」の同定に集中した。バイオマーカーは、悪性腫瘍に完全に転換する気管支上皮についての潜在力を決定するのに使用できる呼吸粘膜の広範な進行性の表現型および遺伝子の異常を指す。マーカーは、形態学的変化、別々に発現したタンパク質についての免疫／組織化学的マーカー、遺伝的不安定性についてのマーカー、後成的発現変化のマーカー（例えば、異常なメチル化）および遺伝子突然変異として広く分類された（非特許文献７）。
【００１０】
これらのマーカーの発現レベルは、今日、高い危険集団から収集された異形成および新形成の細胞／組織学的組織サンプルにおいて評価されつつある。それらの中でも、調査的マーカー解析のために近年標的とされている標本は喀痰である。バイオマーカー研究のための喀痰サンプルに関する関心は、肺がんがもっともしばしば気管支上皮において発生するので、喀痰中に回収される剥脱細胞が初期がん腫のもっとも早期の可能な指標であるという長い間の信念から生れていた。高度に洗練された分子遺伝子工学の応用（例えば、ＰＣＲに基づくアッセイ）をとおしての研究は、選ばれたバイオマーカーが喀痰中に検出できる証拠を提供しつつある（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。
【００１１】
商業的に利用できるがんスクリーニングまたは検出業務は、各サンプルを観察し、そして異常細胞タイプの程度および同定を決定する訓練された臨床医による細胞形態学的診断に基づく試験によっている。この方法は、高価な、そして時間を費やすのみならず、また、それはヒトの判断と、したがって操作への過誤を導入する。近年、５，１０，１５，２０−テトラキス（カルボキシフェニル）ポルフィン（ＴＣＰＰ）の使用による肺のがん細胞を検出するための方法が開発された（特許文献１）。この方法は、非がん細胞より多量にそれらの環境からＴＣＰＰを蓄積するがん細胞の性質に頼る。ＴＣＰＰ２００μｇ／ｍｌとともに６−２４時間細胞サンプルをインキュベートすることにより、ＴＣＰＰが細胞に侵入し、そして新形成細胞の核周辺膜およびミトコンドリアに結合する。それによって、紫外線下でのＴＣＰＰ蛍光が、形態に関係なく蛍光の強度によってのみ診断できる。前がん組織症状（例えば、異形成細胞）を同定するためのこの化合物の使用の拡大は、高い危険集団において、組織が浸潤性がん症状へと進行しつつあるそれらの個々を同定するためのスクリーニングを可能にし、それによってもっとも治療可能な病期におけるがんもしくは異形成を捕らえることを容易にする。そのようなスクリーニング方法の望ましい特性
は、急速、安価であり、そして最小の専門技術だけを必要とする操作である。
【００１２】
前記理由から、異形成細胞をそれらのもっとも早期において検出するための技術および方法に対するニーズがある。さらに、高度に信頼できる診断結果を提供でき、そして診断を行う臨床医の主観的な解析に頼らない技術に対するニーズが存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】Ｃｏｌｅら、米国特許第５，１６２，２３１号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｂｏｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｑｕｉｒｅｓ  １９９３，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  ４３：７−２６
【非特許文献２】Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  １９９０，Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｎ  Ａｍ  ４：１０５３−１１６８
【非特許文献３】Ｗｉｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，ＣＡ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  ４５：８−３０
【非特許文献４】Ｍｏｎｔａｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ａｎａｌ  Ｑｕａｎｔ  Ｃｙｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｌ  １３：１５９−１６７
【非特許文献５】Ｈａｒｏｓｋｅ  ｅｔ  ａｌ．１９８８，Ａｒｃｈ  Ｇｅｓｃｈｗｕｌｓｔｆｏｒｓｃｈ，５８：１５９−０６８
【非特許文献６】Ｈｕｎｔｃｈｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９２，Ａｎａｌ  Ｑｕａｎｔ  Ｃｙｔｏｌ  Ｅｓｔｏｌ  ４：３３０−３３４
【非特許文献７】Ｈｉｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９７，Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  １７：１６３−１７４
【非特許文献８】Ｍａｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５４：１６３４−１６３７
【非特許文献９】Ｍａｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９４，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：９８７１−９８７５
【非特許文献１０】Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ  １９９５，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ８７：１２０１−１２０２
【非特許文献１１】Ｔｏｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８８，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，１１：１６８５−１６９３
【非特許文献１２】Ｔｏｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９４，Ｃｈｅｓｔ，１０６：３８５ｓ−３９０ｓ
【発明の概要】
【００１５】
発明の概要
本発明は、ＴＣＰＰを可溶化する新規な、そしてより有効な方法、改良された染色操作、および種々の細胞分類戦略と同時に、ＴＣＰＰが異形成および前がん、ならびにがん細胞を検出するために使用できるという発見に由来する。ＴＣＰＰは、生きている、または固定された前がんならびにがん細胞の成分に、それらが由来した細胞および組織の状態を疾病進行の連続体において分類できる方式で、結合することがここに発見された蛍光化合物である。前がん組織の検出のこの方法は、組織もしくは細胞サンプルのイン・ビトロ診断ならびにイン・サイチュー診断に好適である。
【００１６】
本発明の１つの態様は、前がん細胞を検出する方法であって、そのもっとも単純な形態では、生存もしくは固定（すなわち、死滅）細胞を、細胞成分に結合するのに十分な時間ＴＣＰＰ溶液中でインキュベートし、そして結合したＴＣＰＰを蛍光測定法により検出することを含む方法である。この方法は多くの変法を有する。１つの変法では、細胞は、表
面、好ましくは顕微鏡スライド上に、そしてもっとも好ましくはモノレアーにおいて固定される。その他の変法では、細胞は、ホルマリンまたはその他の適当な固定液で処理され、懸濁液中に維持され、ＴＣＰＰとともに処理され、細胞は未結合のＴＣＰＰから分離され、次いで解析され、そしてフローサイトメトリーによって選別される。
【００１７】
インキュベーション段階の好適な実施態様は、ＴＣＰＰ約４μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌを含有するＴＣＰＰ溶液、温度約２３℃〜約４２℃、および時間約０．２分〜２時間を用いることを含む。未結合ＴＣＰＰが除去され、そして残っているＴＣＰＰが蛍光測定法により検出される。好適な実施態様では、ＴＣＰＰは、アッセイが実施された後約１〜２４時間に検出される。
【００１８】
本発明のその他の実施態様では、細胞サンプル中の蛍光細胞のパーセントが算出される。好適な実施態様は、蛍光強度および他の細胞形態学的特徴についての蛍光細胞の解析を含む。特に好適な実施態様では、蛍光細胞は、予定された蛍光強度および細胞形態学的特徴のセットにしたがって分類され、これが、正常から化生ないし異形成（軽度〜重度）ないしがん腫（軽度〜重度）までの連続範囲に沿った細胞の特徴付けを可能にし、そして本発明の方法を用いて作成した診断および予後の有効性および信頼性を増大する。本発明の他の実施態様は、蛍光強度の基準を用いて（例えば、蛍光フローサイトメトリーを介して）、サンプル中の正常もしくは化生細胞を異形成もしくはがん腫細胞から分別することを含む。
【００１９】
前記検出方法の実行を容易にするために、本発明のその他の態様は、約ｐＨ８．５を超え約ｐＨ１２．５未満のｐＨにおいて約５０％〜約９０％のアルコール中にＴＣＰＰを溶解することを含む、ＴＣＰＰ溶液の作成方法を提供する。１つの好適な実施態様では、アルコールはイソプロパノールであり、そしてその他の実施態様では、溶液のｐＨは重炭酸ナトリウムもしくは水酸化アンモニウムにより調整される。
【００２０】
本発明のその他の態様は、約ｐＨ８．５を超え約ｐＨ１２未満のｐＨにおいて約５０％〜約９０％のアルコール中にＴＣＰＰを含有する組成物である。１つの好適な実施態様では、アルコールはイソプロパノールであり、そしてその他の実施態様では、溶液のｐＨは重炭酸ナトリウムもしくは水酸化アンモニウムにより調整される。１つの実施態様では、組成物はＴＣＰＰ溶液を作成する方法によって作成される。関連する実施態様では、検出方法において使用されるＴＣＰＰ溶液は希釈される。
【００２１】
本発明のその他の態様では、細胞は哺乳動物患者内にイン・サイチューに存在する。細胞はＴＣＰＰ溶液にさらされ、そして蛍光が内視鏡技術を用いて検出される。
【００２２】
本発明のその他の態様は、容器中に本発明の組成物を含有する前がん細胞を検出するためのキットである。その他の実施態様では、キットは１種以上のさらなる構成要素、例えば、本発明の検出方法を実施するための指図書および試薬、またはポジティブおよびネガティブ対照を含有する。
【００２３】
本発明の他の特徴および長所は、以下に示す図面、詳細な記述および実施例を参照して、より良く理解することができる。
【００２４】
発明の詳細な記述
本発明は、５，１０，１５，２０−テトラキス（カルボキシフェニル）ポルフィン（ＴＣＰＰ）を用いるヒト細胞における前がん症状を検出するための組成物および方法を含む。本発明は、ＴＣＰＰが、がん細胞に加えて前がん性異常細胞に特異的に結合するが、正常（非がん性）細胞には結合しないという発見に由来する。さらに、この異なる結合は、
固定された細胞ならびに生存細胞において観察される。ＴＣＰＰのこの新しい、そして有用な性質に加えて、さらに本発明は、その活性をより大きい程度に保持するＴＣＰＰを可溶化する改良法、ならびにこの方法をスクリーニングおよび自動化に良好に適合させるいくつかの新規な態様を組み入れている。本発明の方法を使用すれば、米国特許第５，１６２，２３１号に記述されている方法と比較した場合、細胞がＴＣＰＰを結合するために、より少ない時間（例えば、２４時間に対して０．２分−２時間）ですみ、そしてまたより低い濃度のＴＣＰＰ（例えば、２００μｇ／ｍｌに対して４０μｇ／ｍｌ）ですむ。さらに、細胞の溶液がまた使用されてもよいが、細胞のモノレアーが細胞の溶液よりもむしろ使用できる。
【００２５】
検出方法の便宜性および効率に対するキーは、ＴＣＰＰを可溶化する新規な方法である。従来の方法は、ポルフィリンを溶解するために１ＭＮａＯＨを使用した。この方法は、不正確である１ＭＨＣｌによる滴定を必要とし、そして各溶液が未溶解のＴＣＰＰについてチェックされることが必要であった。さらに、ＮａＯＨ法は、ｐＨ１３．０のような高いｐＨによる酸化的環境下にポルフィリンを置くので、ポルフィリンは分解という高い危険にさらされる。本発明の可溶化法は、より完全な、そして信頼できる可溶化を実施するために、新規な９０％アルコールの添加と同時にｐＨ９．１を使用する。最後に、本発明の方法は、最終の実行ＴＣＰＰ溶液のｐＨを好適な範囲５．８〜６．８において安定化するためにバッファーを使用する。
【００２６】
本発明は、健全な細胞よりも多量にＴＣＰＰを結合するこれらの細胞の独特な性質を用いるヒト組織のサンプルにおける前がんおよびがん細胞の検出を伴う。本明細書で使用されるように、用語「前がん性」もしくは「異常な前がん性」は、軽度ないし重度の異形成を表す細胞を指し、そして用語「がん性」は、軽度ないし重度のがん腫を表す細胞を指す。これらの細胞学的状態は、Ｐａｐａｎｉｃａｌｏｕ染色（「ＰＡＰ染色」）細胞学を用いて細胞の形態を決定するために使用される基準によって、本明細書では形態学的に定義される。また、それらは、特定の細胞もしくは組織について技術的に通常使用される他の指標によって定義されてもよい（例えば、肺もしくは喀痰サンプルにおける肺の炎症の指標）。「正常」から「重度にがん腫」までの細胞の状態は、ここでは、（１）正常（有意な異常なし）、（２）化生（扁平上皮化生）、（３）軽度異形成（扁平上皮の非定型性）、（４）中等度異形成（扁平上皮の非定型性）、（５）重度異形成（顕著な扁平上皮の非定型性）、（６）扁平上皮内がん（ＣＩＳ、非浸潤性）（また、軽度〜中等度がん腫とも呼ばれる）、および（７）扁平上皮がん（十分に分化し角質化しているタイプ−浸潤性）（また、中等度〜重度のがん腫とも呼ばれる）として分類される。ＴＣＰＰへの暴露後、異形成およびがん腫細胞はＴＣＰＰ蛍光を示すが、一方正常細胞はＴＣＰＰ蛍光をほとんどまたは全く示さないことが、本発明によって決定された。若干の化生細胞が低いか中くらいのＴＣＰＰ蛍光を示すこともあるが、多くの例では、それらは蛍光を示さない；それ故、ＴＣＰＰ蛍光は、それが異形成およびがん腫についての指標と同様な化生についての信頼しうる指標ではない。
【００２７】
本方法は、（１）異常な前がんもしくはがん細胞がサンプル中に存在していれば、いずれかそれらの細胞成分にＴＣＰＰを結合させるのに十分な時間、固定もしくは生存細胞のサンプルをＴＣＰＰとともにインキュベートし、（２）組み入れられなかったＴＣＰＰを除去し、（３）もしいずれか存在すれば、サンプル中に残っているＴＣＰＰ量を蛍光測定法によって定量し；そして場合によっては段階（３）の結果に応じて、（４）正常（または異常化生であるが異形成ではない）状態からがんに向かって逸脱しているそれらの状態について，ＴＣＰＰ蛍光細胞を評価することを含む。具体的には、上記のように、本発明の方法は、細胞サンプルが、異形成（軽度〜重度）またはがん腫（軽度〜重度）である細胞を含有しているという決定を可能にする。
【００２８】
１つの例では、実施態様を限定するものではないが、検出方法は、次の段階：
１．顕微鏡スライド上にモノレアーにおいて細胞を固定し；
２．下記のように、約ｐＨ６．１におけるバッファー溶液中約４０μｇ／ｍｌにおけるＴＣＰＰ溶液に（例えば、溶液中にスライドを浸漬するか、またはスライド上に溶液の滴を置くことによって）、約３６℃で一定時間、細胞をさらし；
３．約ｐＨ６．１のバッファー溶液によってスライドを洗浄し；
４．少なくとも１時間、しかし２４時間未満待機し；そして
５．約３８０−４５０ｎｍの光線で励起した場合約６１０−７４０ｎｍにおいて細胞からの蛍光を定量すること；
を含む。
【００２９】
この代表的方法の変法が以下により詳細に記述される。
【００３０】
本発明のアッセイ混合液の成分または他のパラメーターを記述する際に本明細書で使用される場合、用語「約」は、標準方法を用いて実施される決定について普通に許容できる誤差の限界内を意味する。
【００３１】
細胞を固定液とともにインキュベートする第１段階は、この代表的実施態様および他の実施態様において、インキュベーションに要する時間、ならびに実行溶液中のＴＣＰＰ濃度を低下させることが見い出されたので、最適であるが好適である。
【００３２】
以下の節では本発明の種々の他の実施態様が記述される。
【００３３】
本発明の方法は、下記のような種々の細胞タイプにおいて使用でき、そしてさらに家畜ならびにヒトの診断および予後の適用に応用可能である。したがって、本明細書で使用される用語「患者」もしくは「被験者」は、ヒトまたは動物に適用することを意図する。
【００３４】
本検出方法は、イン・ビトロにおいて細胞サンプル中の前がんおよびがん細胞を検出するために使用できる。細胞サンプルは、細胞病理学の分野において現在使用されるいずれかの方法によって獲得できる。例えば、細胞は、喀痰サンプル（実施例１参照）、頸部スワブ、気管支洗液、甲状腺および乳腺の微細針吸引およびコアの生検、膀胱洗液、尿、口腔洗液、浣腸液、および当該技術分野において既知の他の生検から収集されてもよい。細胞サンプルの他の起源は、いくつか名をあげれば、血液もしくはその画分、リンパ液、脳脊髄液、骨および骨髄を含む。本発明の方法は、体内のいかなる組織もしくは器官からのいかなる細胞サンプルにも応用することができる。
【００３５】
場合によっては、細胞は、限定されるものではないが、ホルムアルデヒド、メタノール、エタノールもしくはイソプロパノールを含有する溶液を含む、ＴＣＰＰにさらされる前に、標準の操作によって固定されてもよい。１つの実施態様では、細胞は９５％エタノール中で固定される。
【００３６】
アッセイは、細胞濃度当たりの総蛍光を測定することによって溶液において、または表面上に細胞を付着することによって実施されてもよい。細胞は固定液で処理されなくてもよいが、固定細胞は、ある実施態様、特に、細胞が固形支持体に付着される実施態様において好適である。１つの実施態様では、細胞はスライドにモノレアーとして付着される。他の実施態様では、液体に基づくスライド調製システムＭｏｎｏＰｒｅｐ２もしくはＭｏｎｏＰｒｅｐＧ（ＭｏｎｏＧｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｎｄｏｎ，Ｖａ．）またはＴｈｉｎｐｒｅｐ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ｃｙｔｙｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）が使用される。
【００３７】
また、本発明の方法は、イン・サイチューにおいて前がんおよびがん細胞を検出するため、ならびにそれぞれの手術を補助するために使用されてもよい。例えば、本方法は、適当な媒質におけるＴＣＰＰの注射と、それに続く蛍光気管支鏡によってイン・サイチューで肺における異形成細胞を検出するために使用されてもよい。また、類似の方法が、手術中の切除のために異常細胞を検出するために使用されてもよい。イン・サイチューの適用は、類似の内視鏡具の使用によって、限定されるものではないが、乳腺、前立腺、肺、頸管、咽喉、膀胱、口腔咽頭、皮膚および胃腸管を含む、体のいづれかの器官について見いだされる。この実施態様における使用のために好適なＴＣＰＰ量は、投与方式および送達部位によって決定される。例えば、ＴＣＰＰが血流中に注射される場合は、ＴＣＰＰの有効濃度は、生理食塩水もしくは血液中のその最高溶解度（例えば、約１００μｇ／ｍｌ）に依存する。罹患組織中への直接注射では、ＴＣＰＰの有効濃度は、標的組織およびその組織への注射の接近具合（例えば、約１−２０ｍｇ）に依存する。肺では、例えば、濃度２０−５０μｇ／ｍｌにおいて５−１０ｍｌのエアゾル送達が適当であろう。診断薬剤として投与されるためのそのようなＴＣＰＰ量の決定方法は、薬化学者および関連分野における他の技術者には周知である。
【００３８】
実行溶液におけるＴＣＰＰ濃度および細胞がＴＣＰＰ溶液にさらされる時間は、整合様式で変えられてもよい２つの変数である。ＴＣＰＰ濃度は、好ましくは、４−１００μｇ／ｍｌ、より好ましくは４−４０μｇ／ｍｌ、そしてもっとも好ましくは２０−４０μｇ／ｍｌである。暴露時間は、１つの実施態様では約０．２分〜約２時間、そしてより好適な実施態様では１０〜６０分まで変えられる。低濃度のＴＣＰＰ溶液が使用される場合は、より長い暴露時間が適当であり、そして高濃度のＴＣＰＰが使用される場合は、より短い時間が適当である。例えば、好適な実施態様では、スライドは、ＴＣＰＰ４０μｇ／ｍｌ中で１０分間、さもなくばＴＣＰＰ４μｇ／ｍｌ中で６０分間さらされる。実行溶液におけるＴＣＰＰの濃度および暴露時間を最適化する方法は、細胞学の熟達者には周知であり、その目的は、バックグラウンドおよび他の非特異的な吸収および蛍光を最小化しつつ、細胞成分へのＴＣＰＰの最高の特異的結合を達成することである。
【００３９】
ＴＣＰＰ溶液は約３６℃においてバッファー水性媒質中にＴＣＰＰを含んでなる。１つの実施態様では、緩衝能は１００ｍＭＭＥＳによるが；しかし、２０〜２００ｍＭの濃度範囲は同等の効力をもってこの方法で使用することができる。１つの実施態様では、溶液はｐＨ約６．１を有するが；ｐＨ範囲５．８〜６．７は十分な効力をもって使用できる。また、範囲５．８〜６．７において効果のある他の緩衝化合物が使用されてもよい。暴露段階が特に温度に敏感ではなければ、やや室温以上の温度が最適化のために望ましい。暴露段階の適当な温度範囲は、好適な実施態様では約２３℃〜約４２℃、そしてより好適な実施態様では約３０℃〜約４０℃である。
【００４０】
他の化合物が、バックグラウンドの蛍光を減少させ、安定性を増大させ、または自己蛍光もしくは消光を減少させるために実行溶液に添加されてもよい。例えば、洗剤はバックグラウンドの蛍光を低下させるために使用でき、そして還元剤、抗酸化剤、および他の活性酸素種の発生もしくは拡散のインヒビターが、ＴＣＰＰの酸化を防止するか、または光脱色を低下させるために使用されてもよい。興味ある化合物は、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール、トリトン、ジチオトレイトール、ジチオエリトリトール、２−メルカプトエタノール、またはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，Ｐ−７４８１，Ｓ−２８２８，Ｓ−７４６１）によって供給される「Ａｎｔｉｆａｄｅ  ｋｉｔｓ」を含む。さらに、ヘマトキシリンがＴＣＰＰとともに含有されてもよく、対比染色として作用し、そして白色光検鏡を容易にする。
【００４１】
洗浄溶液は、一般に、ＴＣＰＰ実行溶液のために使用される水溶液に類似しているがＴＣＰＰを含有しない。顕微鏡スライドが使用される場合、スライドは、少なくとも１回、
もっとも好ましくは３回、そして好ましくは過剰の洗浄溶液において撹拌しながら洗浄する必要がある。アッセイが溶液において実施される場合、未結合ＴＣＰＰは、細胞を遠心分離し、上澄液をデカントし、そして新鮮なバッファー中に細胞を再懸濁することによって除去される。この段階は必要ならば反復されてもよい。また、染色溶液から細胞を分離する別の手段が使用されてもよい、例えば、膜における細胞の捕捉による濾過または急速透析（スピン透析を含む）。適当な洗浄条件は、細胞の蛍光をモニターすることによって決定できる。洗浄は、バックグラウンドと他の非特異的結合を除去するのに十分でなければならないが、特異的に結合したＴＣＰＰを細胞成分から除去するほど過剰であってはならない。洗浄段階の最適化は細胞学の習熟者には周知である。効力または安定性を改良するために洗浄溶液に添加されてもよい組成物は、限定されるものではないが、アルコール、洗剤もしくは低モル濃度の塩溶液を含む。
【００４２】
検出方法における重要な段階は、スライドがＴＣＰＰ実行溶液にさらされた時からスライドが解読される時まで、１時間以上であるが２４時間未満放置することである。スライドが２４時間より後に解読される場合、正確な結果を得るためにはＴＣＰＰにおける劣化があまりに多すぎる。細胞が１時間より前に読まれる場合、バックグラウンドの蛍光レベルは極端に高くなるかもしれない。
【００４３】
検出段階で使用される波長は、特異的なピーク範囲がもっとも効果的である広い範囲によって包含される。ｐＨ５．０−７．０の水溶液におけるＴＣＰＰの励起のピークは約４１５ｎｍにおいて生じるが、一方、発光の１つのピークは約６４５ｎｍにおいて起き、そして第２の発光のピークは約７０６ｎｍにおいて起きる。一般に、ＴＣＰＰは、サンプルに紫外線（ＵＶ）を照射し、そしてサンプルから発光する光を約５００ｎｍ以上で検出することによって検出できる。本発明の方法においてＴＣＰＰを励起するために使用される波長は、好ましくは、範囲約３８０〜約４５０ｎｍの１部もしくは全部、そしてもっとも好ましくは約４１５ｎｍ近傍の狭い波長帯を含んでもよい。同様に、検出される波長は、範囲約６１０ｎｍ〜約７４０ｎｍの１部もしくは全部、そしてもっとも好ましくは約６５０ｎｍ近傍の狭い範囲を含んでもよい。ある環境下では、約７０６ｎｍ近傍の狭い範囲における発光を検出することが好ましいことは、蛍光検鏡法の習熟者には明らかである。波長の選択は光学フィルターによってもっとも容易に達成できる。一般的な蛍光染料用のフィルターセットは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から容易に得ることができる。本発明の方法においてＴＣＰＰを励起し、検出するための適当な波長選択は、フルオレセインイソシアネート（これ以降「ＦＩＴＣ」）を検出するために設計されたフィルターセットを用いてもっとも容易に得ることができ、これは一般に、４００〜４９０ｎｍの励起フィルターおよび５００ｎｍ以上の発光のためのバリヤーフィルターを有する。他のフィルター系の選択も検鏡法の習熟者には周知である。
【００４４】
蛍光は、肉眼的もしくは機械的、手作業もしくは自動的手段によって検出されてもよい。非蛍光細胞に比較して適度の蛍光でも有する細胞は、ヒトの肉眼によって容易に区別することができる。したがって、本発明のある実施態様は、蛍光顕微鏡下でＴＣＰＰ処理した細胞を簡単に観察し、そして手作業でサンプル中の蛍光を発する細胞のパーセントを定量することを含む。しかしながら、好適な実施態様は、当該技術分野において周知の自動的方法、および当該技術分野において周知であるように、細胞がカウント機器中にプログラムされた予定の閾値レベル以上の蛍光を示せば、蛍光を発するとして「カウント」される機械的定量を含む。例えば、顕微鏡スライドに付着された細胞のモノレアーを含む実施態様では、自動スライドリーダーは、標準の統計的方法によって決定されるように、等価の正常な細胞に比較して統計的に有意であると予め決定された蛍光を有するすべての細胞を蛍光を発するとしてカウントするようにプログラムすることができる（そのような機器は、前がんもしくはがん性異常の第２の指標を提供できるある種の形状をもつ細胞をカウントするようにプログラムすることもできる）。あるいはまた、溶液に基づくアッセイを
含む実施態様では、ＴＣＰＰ染色され、そして洗浄された細胞サンプルは、蛍光標示式セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって解析されてもよく、ここでは、正常細胞と比較して統計的に決定できるように、ＦＡＣＳが、蛍光の予定レベルを有する細胞を分離するようプログラムされる。
【００４５】
サンプル中に存在する細胞の総数は、ＴＣＰＰ−蛍光性である全部のパーセントを算出するために決定される。この決定は当該技術分野において既知の種々の方法において達成できる。１つの実施態様では、全細胞がヘマトキシリンにより染色され、そして白色光顕微鏡測定下でカウントされる。その他の実施態様では、細胞が、ＴＣＰＰとは異なる波長で蛍光を発する適当な蛍光対比染色（例えば、細胞の外部もしくは内部膜を染色するもの）により染色される。この後者の実施態様では、細胞のマーカー蛍光に対するＴＣＰＰ蛍光の比が定量される。
【００４６】
上記のように、本発明の方法の新規性は、ＴＣＰＰ染色が、既に知られているようながん細胞を同定するのみならず、また前がん性の異形成細胞も同定するという本発明者の出願にある。この理由により、上記方法は、従来可能であると信じられているよりも広い範囲の多くの情報をもたらす。したがって、ＴＣＰＰ蛍光定量の結果は、その後の解析段階がとられるか否か、そして何が形成されているかの決定因子になる。
【００４７】
例えば、本方法は、ＴＣＰＰ蛍光性であるサンプルにおける細胞のパーセントを特定できる。サンプル中の細胞の約１−３％、より特別には約２−３％が蛍光性である場合には、サンプルは少なくとも異常な前がん性（異形成）もしくはがん性である細胞を含有している。したがって、単純な解析スキームは、サンプルが少なくとも約１％のＴＣＰＰ−蛍光細胞を含有しているか否かを決定することを伴う。そうでなかった場合には、サンプルはネガティブ（正常）として診断される。そうであれば、さらなる試験が患者のために推奨される。サンプルが１％より少ない蛍光細胞を含有している場合でも、他の因子（例えば、がんに対する患者の素質、またはその他の組織における既存のがん）が、さらなる試験が実施されることを示唆できることが、この実施態様と合わせて注目されるべきである。以下に非常に詳細に記述される本発明の１つの利点は、蛍光細胞の集積された集団がＦＡＣＳを介して患者から得られることである。
【００４８】
さらに、サンプル中の特定の細胞の蛍光レベルが、その細胞のがんに伴う症状と相関することが見い出された（実施例１参照）。したがって、個々の細胞もしくは細胞群が、それらの全部の蛍光強度について評価でき、そして、さらなる試験が必要か否かの決定はこの評価に一部基づいてもよい。
【００４９】
本明細書で使用される用語「高い」、「中くらい」および「低い」蛍光、および関連する用語は、試験サンプル中の単一細胞もしくは細胞群の蛍光強度が、がんに関して正常であることが分かっている等価の起源（例えば、喀痰）からの細胞（ネガティブ対照）と少なくとも比較される、比較用語であることを当業者には理解できる。この比較は、肉眼的評価によっても、また自動システムにおいても達成でき、それは、実施例２に記述されるように、サンプル集団の中央値の蛍光からの偏差のような統計的パラメーターを用いてプログラムされてもよい。好適な実施態様では、試験サンプルからの細胞は、がん状態が既に決定され、そしてＴＣＰＰ蛍光強度と既に相関されているさらなる対照細胞と、蛍光強度について比較される（例えば、実施例１に記述されるように）。
【００５０】
用語「蛍光性」および「非蛍光性」もまた本明細書で使用される。蛍光強度の種々のレベルの上記定義を守りながら、用語「非蛍光性」および「蛍光性」は比較の用語として使用され、ここでは、蛍光は、等価起源からの正常細胞に対して、および／または蛍光の検出において使用される試薬もしくは装置から起こる一般的バックグラウンドの蛍光に対し
て比較される。それ故、細胞もしくは細胞サンプルが「蛍光性」と決定される場合、蛍光は、バッググラウンドの蛍光または既知の正常細胞において観察される蛍光以上のある強度において存在する。細胞もしくは細胞サンプルが「非蛍光性」と決定される場合、観察された蛍光は、バッググラウンドの蛍光または正常細胞において観察される蛍光以上においては、最小であるかまたは全く存在しない。この比較は関連する技術分野における習熟者によっては理解できる。
【００５１】
標準の評価技術による細胞の肉眼的評価が、わずかに蛍光を発する化生（非がん性）細胞を異形成（前がん）細胞から区別できるので、ＴＣＰＰ蛍光と組み合わせた細胞形態学的評価は、低レベルの蛍光を有する細胞培養物に関して特に有用である。本方法の１つの実施態様は、蛍光の定量に加えて、特に、細胞および核輪郭の可視化を助けるヘマトキシリンのような標準の細胞学的染色を用いる、細胞形態学的評価のさらなる段階を含む。その他の実施態様は、ある閾値要件が合致する場合、例えばサンプルが１％以上の蛍光細胞を含有する場合には、その後の段階として細胞形態学的評価を用いる。
【００５２】
本発明の特に好適な実施態様では、選ばれた細胞形態学的特徴が、細胞サンプル中に存在しているかもしれない種々の段階の化生、異形成およびがん腫の効率的な、再現性のある診断のために非常に有用である分類システムを作成するために、蛍光強度と組み合わされる。そのような分類システムは実施例１において詳細に記述されている。この実施態様では、ＴＣＰＰ蛍光細胞は、蛍光強度、ならびに細胞の形状と大きさ、核の数と大きさ、細胞集塊の存在と細胞もしくは細胞集塊の退行変性、不規則な不同の（ａｎｉｓｏｉｄ）細胞の存在、細胞膜の可視性、および核破片の存在と性質を含む単純な形態学的特徴に基づく、１つ以上の数字で示したクラスに指定される。ＴＣＰＰ蛍光細胞の細胞形態学的評価を行う技術者もしくは科学者は、チェックリストとしてこの分類を使用することができる、すなわち、検査される細胞は、数字で示したクラスの各々に関して「プラス」もしくは「マイナス」としてチェックされる。特定の細胞に指定された数字で示したクラスの数字および細胞に指定された特定のクラスのパターンが、共に、その細胞のがんもしくは前がん症状に関する情報を伝える。実例によれば、実施例１は、１４の数字で示したクラスを含んでなる分類システムを記述している。喀痰サンプルの存在をアッセイするその実施例の表２において示されるように、ネガティブもしくは化生細胞は、一般に、ごくわずかのクラスにしか指定できず、一方重度のがん腫細胞はいくつかのクラスに指定できる。さらなる実例として、ネガティブもしくは化生細胞は、しばしばクラス１１に指定されるのに対して、中等度の異形成ないしがん腫細胞は指定されず、そしてがん腫細胞が、しばしばクラス６に指定されるのに対して、化生および異形成細胞は指定されない。
【００５３】
本発明のその他の実施態様では、がん腫を有すると決定された１人の患者からの溶液におけるＴＣＰＰ処理された細胞は、それらの蛍光レベルに基づくフローサトメトリーによって分離できる。高レベルの蛍光を示す細胞は、がん性であるとみなされ、一方、中ないし低レベルの蛍光は異形成とみなされ、そして蛍光をもたない細胞は正常であるとみなされる。この種の分別は、患者の異形成もしくはがん細胞を患者自身の正常細胞に対して比較することができるので、これにより理想の「内部」対照集団を提供する。
【００５４】
その他の実施態様では、同じ患者からのがん細胞と正常細胞を分離することによって、種々の化学療法剤が、有効性について試験するためにアッセイされることができる。分離された細胞は一定分量に分配される。選ばれた治療剤が、次に、高度に蛍光性の細胞の一定分量および低レベルの蛍光性細胞の一定分量と、同濃度において混合できる。この段階は、新しい分量および異なる治療剤を用いて繰り返される。細胞死滅率は当該技術分野で既知の技術を用いてアッセイすることができる。次いで、治療についてもっとも好適な治療剤が、がん性であると決定された細胞（すなわち、高度に蛍光性の細胞）の最多数を殺傷し、そして正常細胞（すなわち、ＴＣＰＰ処理後ほとんどもしくは全く蛍光をもたない
細胞）の最少数しか殺傷しない化学療法剤を選択することによって決定することができる。
【００５５】
本発明のスクリーニングまたは診断検出法と同時に、本方法ならびに他の応用における使用のためにＴＣＰＰを溶解する方法が開発された。この方法は、約ｐＨ８．５を超え，そしてｐＨ１２．５未満のｐＨを有する約５０％〜約９０％アルコール中にＴＣＰＰを溶解することを含む。本発明における使用のためには、低級アルコール、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノールおよびｎ−プロパノールが好適である。より好ましくは、アルコールはイソプロパノールであり、そしてそのｐＨは、ｐＨ８．５を超え，そして重炭酸ナトリウムもしくは水酸化アンモニウムによってｐＨ１０．０未満のｐＨに調整される。ある実施態様では、イソプロパノールの濃度は５０％〜９０％であってもよく、そして重炭酸ナトリウムは２０ｍＭ〜１００ｍＭであってもよい。ＴＣＰＰの濃度は約２ｍｇ／ｍｌまでであってもよい。１つの実施態様では、ＴＣＰＰ溶液は、５０％イソプロパノールおよび５０ｍＭ重炭酸ナトリウムの溶液中に１ｍｇ／ｍｌにおいて溶解される。
【００５６】
また本発明は、ｐＨ７超のアルコール中にＴＣＰＰを含有するＴＣＰＰを利用するすべての方法での使用のために有用な組成物を含む。この溶液は、好ましくは、先に詳述されたＴＣＰＰを溶解する方法によって作成できる。この組成物は、好ましくは、暗所において約４℃で保存しなければならない。
【００５７】
さらに、本発明は、場合によっては指図書とともに、容器中にＴＣＰＰを含有してなる、前がんおよびがん細胞を検出するためのキットを包含する。１つの実施態様では、キットは本発明の検出法によって使用されるように設計されている。１つの実施態様では、キットは、容器中に塩基性アルコール中に溶解されたＴＣＰＰを含有する本発明の組成物を含む。このＴＣＰＰ溶液は、前がんおよびがん細胞を検出する目的でバッファー水溶液中に希釈される保存溶液として使用されてもよい。キットは、実施例１の喀痰回収容器におけるような、細胞サンプルを収集するための構成要素を含有してもよく、あるいはまた、既に得たサンプルにおける前がん細胞の検出のための品目を含有してもよい。キットは、スライド調製システム、例えば３種の名を示すと、ＭｏｎｏＰｒｅｐ２もしくはＭｏｎｏＰｒｅｐＧ（ＭｏｎｏＧｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）またはＴｈｉｎｐｒｅｐ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ｃｙｔｙｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）による使用のために整備されてもよい。また、これらのキットは、顕微鏡スライド以外のフォーマット、例えばミクロタイタープレートまたはフローサイトメトリー器具により使用されるように設計されてもよい。いかなる前記実施態様においても、キットは、本発明のアッセイを実施する際に当業者によって用いられるような、ポジティブもしくはネガティブ対照または両者を含有してもよい。
【００５８】
次の実施例は、本発明を一層詳細に記述するために提供される。それらは、具体的に説明することを意図し、本発明を限定することを意図しない。
【実施例１】
【００５９】
ＴＣＰＰを用いる前がんおよびがん細胞の検出のためのガラススライドアッセイ
この実施例は、ＰＡＰ染色された喀痰スライドの標準の細胞形態学的解析をとおして達成された診断結果を、ＴＣＰＰで処理され、そして蛍光検鏡法によって解析されたスライドに対して比較する。結果は、本発明のＴＣＰＰ検出技術が、新形成細胞（イン・サイチューの異形成およびがん腫）および真性がん腫の検出において慣用の喀痰細胞法と同等であることを示している。また結果は、当該技術分野における習熟した者が、組織サンプルに存在する異形成の程度を評価するために、単純な分類法則と同時に本方法を使用することができることを示している。
【００６０】
方法
モノレアースライドの作成において使用される喀痰処理操作．この研究における解析のために選ばれたすべてのモノレアースライドは、早朝、自然な咳きの手段を行う患者を通じて収集された喀痰サンプルから作成された。具体的には、患者が、リファンピン（ｒｉｆａｍｐｉｎ）０．０３−０．０５ｍｇ／ｍｌを含有する５０％アルコール／５０％Ｓａｃｃｏｍａｎｎｏ液中２％Ｃａｒｂｏｗａｘからなる固定液で満たされた容器中に３日連続の朝に咳きをしていかなるものでも吐き出すよう教育された。リファンピンは、Ｍ．チュバキュローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を保持している患者またはＮ．メニンギチス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）の無症候性のキャリヤーであるかもしれない患者に対する予防薬剤として役立つよう固定液に添加された。
【００６１】
２％Ｃａｒｂｏｗａｘ溶液は、５０％エタノール９８ｍｌに融解Ｃａｒｂｏｗａｘ（１５０）２ｍｌを添加し、そして３０分間混合することによって作成された。溶液を作成するために使用されるガラス容器は、不正確な計量を引き起こす作成中の表面上のワックスの固化を予防するために暖め続けた。Ｃａｒｂｏｗａｘは、ＴＣＰＰ実行溶液にさらす前に、少なくとも１５分間９５％アルコール中に浸漬して除去された。
【００６２】
リファンピン溶液（３ｍｇ／ｍｌ）は、エチルアルコール１００ｍｌ中にリファンピンの３００ｍｇカプセル剤を溶解し、そしてＷａｒｉｎｇブレンダーにおいて高速で混合することによって作成された。この溶液１ｍｌがＳａｃｃｏｍａｎｎｏ溶液各３０ｍｌに添加されるかまたはＳａｃｃｏｍａｎｎｏ溶液１リットル当たり２０ｍｌ添加され、そして十分に混合された。Ｓａｃｃｏｍａｎｎｏ溶液の調製は、細胞学の分野の技術者には周知の標準方法にしたがった。
【００６３】
２枚のｔｈｉｎ−ｐｒｅｐ顕微鏡スライドおよび５０ｍｌプラスチック遠心管１本が患者の情報について標識された。喀痰標本が５０ｍｌプラスチック遠心管に注入され、そして必要ならば容積を５０ｍｌにするために、さらなる５０％エチルアルコール溶液が添加された。遠心管の内容物が２５０ｍｌ容Ｅｂｅｒｂａｃｈセミミクロブレンダー容器に注入され、そしてその標本および粘液様内容物の肉眼検査に応じて１０〜６０秒間ホモジナイズされた。濃い粘液様標本は、ある場合には、より長い混合時間を要した。標本が遠心管に再び注入され、そして１８５０ｒｐｍで１０分間遠心された。上澄液がデカントされ、遠心管中に１〜２ｍｌを残して沈降物（遠心物）と混合された。チューブは回転ミキサー上で約１０秒間撹拌された。沈殿物の１〜３滴がＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔバイアル（Ｃｙｔｙｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）中に入れられた。標本は５分間インキュベートされて、全微生物およびウイルス生物を失活させた。
【００６４】
サンプルの単細胞層が、Ｔｈｉｎｐｒｅｐ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ｃｙｔｙｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を用いて製造者の指示にしたがってスライド上に固定された。Ｔｈｉｎｐｒｅｐ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒにおいて、細胞がポリカーボネートフィルター（孔径０．５ｍｍ）上に回収され、そしてガラススライドに移された。次いで、Ｔｈｉｎｐｒｅｐ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒが、直ちに、９５％エタノールを含有する固定液浴中にスライドを沈めた。
【００６５】
ＴＣＰＰ保存溶液．重炭酸ナトリウム４００ｍｇを５０％イソプロパノール約９０ｍｌに添加し（５０ｍＭ重炭酸ナトリウム）、そして完全に溶解するまで混合して塩基性５０％イソプロパノールを作成した。ＴＣＰＰ１００ｍｇをこの塩基性５０％イソプロパノール（５０ｍＭ重炭酸ナトリウム）に徐々に添加し、そして溶解するまで３〜５分間混合した。ＴＣＰＰ溶液は塩基性５０％イソプロパノールにより容積１００ｍｌにされ、よく混合し、そして冷蔵庫内にフォイルで覆った褐色試薬瓶に保存した。保存溶液中のＴＣＰＰの最終濃度は１ｍｇ／ｍｌであった。
【００６６】
ＴＣＰＰ実行溶液．新鮮なＴＣＰＰ実行溶液は各日に調製された。濃度１ｍｇ／ｍｌのＴＣＰＰ保存溶液約１０ｍｌを室温にもたらした。ＴＣＰＰ保存溶液（１ｍｇ／ｍｌ）の８ｍｌを２００ｍｌ容メスフラスコに入れ、そしてＭＥＳバッファー約１００ｍｌを徐々に添加した。溶液を静かに混合した。さらなるＭＥＳバッファーを添加して溶液を容積２００ｍｌにした。溶液を３〜５分間混合し、そして褐色びん中２−４℃で保存した。実行溶液におけるＴＣＰＰの最終濃度は４０μｇ／ｍｌであった。
【００６７】
ＴＣＰＰ暴露操作．スライドを９５％アルコール中、室温で３０分間固定した。スライドを固定後直ちに、または３日後までにＴＣＰＰに暴露した。スライドを４０μｇ／ｍｌのＴＣＰＰ溶液に３６℃で１０分間浸漬し、次いで１００ｍＭＭＥＳバッファー中で３回、各１分、室温で撹拌しつつ洗浄した。スライドを１時間以上２４時間未満後に観察した。
【００６８】
顕微鏡情報．ＴＣＰＰ処理した喀痰細胞スライドの観察に利用した顕微鏡は、反射光蛍光顕微鏡測定のために載物台下の照明装置と台上の水銀ランプをもつＯｌｙｍｐｕｓ  ｍｏｄｅｌ  ＢＨ−１顕微鏡であった。水銀ランプは３６５ｎｍ，４０５ｎｍ，４３６ｎｍおよび５４５ｎｍにおける１次発光線を有した。蛍光フィルターアッセンブリーは２つのジクロティックキューブ（ｄｉｃｈｒｏｔｉｃ  ｃｕｂｅ）からなった。グリーンキューブ（４９０ｎｍ）は、４００−４９０ｎｍを透過する励起フィルターと５００ｎｍ以上の発光を透過する遮蔽フィルターをもつフィルターシステムを含有した。
【００６９】
改変ＰＡＰ染色技術による喀痰スライド染色操作．操作配列（ｎｏ．）、試薬および時間（分：秒）は次のとおりであった：（１）９５％アルコール  １５：００；（２）水道水
１：００；（３）ｇｉｌ−ｉ  ｈｅｍｏｔｏｘ  ２：３０；（４）水道水  １：００；（５）青染色（ｂｌｕｉｎｇ）試薬  ：３０；（６）水道水  １：００；（７）９５％アルコール  ：１０；（８）ｏｇ−６  １：３０；（９）９５％アルコール  ：１０；（１０）９５％アルコール  ：１０；（１１）ｅａ−５０  １：１５；（１２）９５％アルコール  ：２０；（１３）９５％アルコール  ：３０；（１４）１００％アルコール  １：００；（１５）１００％アルコール  １：００；（１６）１００％アルコール  １：３０；（１７）キシレン  １：００；（１８）キシレン  １：００；および（１９）キシレン
１：００。
【００７０】
Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ染色したスライドの日常の細胞形態学的解析の方法．ＰＡＰ染色したスライドを半定量的細胞形態学的評価にかけた。（１）異形成および新形成細胞を伝統的な形態学的基準の使用により同定し、そして（２）肺性炎症の７つの基本的指標（肺胞のマクロファージ、好中球、柱状細胞、粘液、粘膜螺線（ｍｕｃｏｕｓ  ｓｐｉｒａｌ）、着色マクロファージ、化生細胞）の発現レベルを定量した。これらの炎症指標を定量化する方法は、既に文献で議論されている（Ｒｏｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ａｃｔａ  Ｃｙｔｏｌ  ３４：１４７−１５４；Ｒｏｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ａｃｔａ  Ｃｙｔｏｌ  ３４：１４０−１４６；Ｓｃｈｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｒ  Ｄｉｓ  １３９：６０１−６０３）。ＰＡＰ染色した細胞を用いて細胞形態を決定するために使用される基準が以下に議論される。
【００７１】
有意な異常性なし．次の基準が満たされた場合、細胞は有意な異常性をもたないと同定された：
１．炎症細胞のほかにグレード１−２の色素をもつマクロファージと混じり合った好塩基性の繊毛のある上皮細胞；
２．基礎的に定位置にある上皮の丸い核；
３．平均に分散した染色質；
４．不明瞭な核膜；
５．不明瞭な核小体；および
６．化生細胞および異形成細胞の不在。
【００７２】
扁平上皮化生（異形成なし）．次の基準が満たされた場合、細胞は異形成のない扁平上皮化生と同定された：
１．繊毛のない好塩基性細胞の集塊；
２．均一な細胞および核の大きさ；
３．低い核／細胞質（Ｎ／Ｃ）比；
４．細かく顆粒状の核染色質；および
５．小さい丸い核小体（通常１個）が存在することがある。
【００７３】
軽度の異形成（扁平上皮異型）．次の基準が満たされた場合、細胞は軽度の異形成と同定された：
１．化生細胞より小さい；
２．凝集した塊、または単独で見られる；
３．細胞は両核と細胞質をはっきりと平らに（シート状に）存在している；
４．細胞は大きさにおいて変化は少ない；
５．細胞質は好エオシン性または好塩基性である；
６．鋭い細胞質の縁；
７．細胞は大きさにおいて変化は少なく、通常は丸ないし卵形、分割の場合、核の２つの半分は鏡像的であり、Ｎ／Ｃ比は変化が少ない；
８．核膜は平滑；
９．細かく顆粒状の核染色質（やや増加）、場合によっては染色中心；および
１０．繊維状細胞、広がった細胞質と核膜の明瞭な核をもつ長い細胞−細かい網目状ないし顆粒状細胞質は通常明るい黄橙色−角質化して単独、は、ケラチンの中心コアの回りに渦巻きを形成して上皮パールを形成することがある。
【００７４】
中等度の異形成（扁平上皮異型）．次の基準が満たされた場合、細胞は中等度の異形成と同定された：
１．大きさにおいて変化があり、通常は比較的大きいが軽度の異形成より小さいこともある；
２．形状およびＮ／Ｃ比において軽度異形成よりも変化がある：
３．細胞質は濃く、好酸性成分が著しく多い；非定型細胞数の増大；
４．核は半分ずつ等しくないこともある（鏡像的ではない）；
５．核の小葉、間隙および小節が存在する；
６．核質（ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｔｅｒｉａｌ）は多くの点彩を伴う過染色性を示す−染色質パターンに類似；
【００７５】
重度の異形成（顕著な扁平上皮異型）．次の基準が満たされた場合、細胞は重度の異形成と同定された：
１．細胞は大きさおよび形状において著しく変化する；
２．通常は中等度異形成よりやや大きい細胞サイズ；
３．Ｎ／Ｃ比は高いが変化しうる（極端に）：
４．単独の細胞が著しく多い；核はＣＩＳより中心的である；
５．核は細胞質の形状にしたがうことがある；核はＣＩＳより少ないゆがみを示す；
６．核の多形性は、存在する粗い染色質および核エンベロープに沿った濃厚さとともに増大する；
７．パラクロマチン、大きい核、集中的に厚くなったマルチ−ヌクラスタード（ｍｕｌｔｉ−ｎｕｃｌｕｓｔｅｒｅｄ）核膜；
８．細胞は顕著に好酸性細胞質を示す。
【００７６】
扁平上皮内がん（ＣＩＳ、非浸潤性）．次の基準が満たされた場合、細胞は扁平上皮内がんであると同定された：
１．単独または凝集体（塊）の細胞；
２．細胞の大きさは変化する−顕著な異形成細胞より小さいか大きい  通常は浸潤性扁平上皮がんよりも小さい；
３．細胞は対称に位置する核とともに大きく、丸い；
４．細胞の退化が存在する；
５．乏しい細胞質、核の周囲は分散して均一に角質化しているかまたは同心的に角質化していない（ｏｒａｎｇｅｏｐｈｉｌｉｃまたは好塩基性）；
６．Ｎ／Ｃ比は変化しうる−正常より高いか低い：
７．粗い濃い核染色質顆粒は明瞭なゾーンによって隔離されている；
８．核膜の起伏をもつ均一に厚くなった染色質の縁；
９．核の小葉が見られる；
１０．ｃａｎｎｉｂａｌｉｓｍが見られるが、常にではない；
１１．多核細胞が存在することもある；
１２．核内に核小体なし；有糸分裂細胞が存在することがある；および
１３．きれいなバックグラウンド。
【００７７】
扁平上皮がん（十分に分化した角質化タイプ−浸潤性）．次の基準が満たされた場合、細胞は扁平上皮がんであると同定された：
１．通常は単独のｏｒａｎｇｅｏｐｈｉｌｉｃであるが、集塊で存在することもあり、そして退化した細胞；
２．細胞は大きいか小さい、角がある、よく保存された核と明確な細胞境界を有する；
３．細胞はイン・サイチューよりも通常は大きい  そして多形で、大きさと形状とも広範囲；
４．パール形成が見られる（がんパール）；
５．異常な「テーリング」（浸潤と合致する）を有する適当量の細胞質；異様な細胞形状−オタマジャクシ、星、紡錘型；過染色性を有する予測できない凝集および明確なパラクロマチンおよび明確に定まった染色質、パラクロマチン境界面を有する角ばった核染色質；
６．染色質は、特に核膜に沿って粗く凝集している；
７．核は、存在する場合大きくそして好酸性である；
８．核膜自体は厚く、そして不規則である；核染色質縁の厚さの不規則性；
９．Ｎ／Ｃ比は非常に高い：
１０．形状、サイズ、数において顕著な核小体の不規則性（娘核小体）；異常有糸分裂、多核化；
１１．ｃａｎｎｉｂａｌｉｓｍおよび多核化が普通；および
１２．壊死性バックグラウンド物質が共通している。
【００７８】
結果
６０サンプルを試験したブラインド研究では、結果は、異常細胞（軽度、中等度もしくは重度の異形成またはがん性）がＰＡＰ染色操作に比較してＴＣＰＰ検出操作により正確に検出できることを示している（表１）。ＴＣＰＰ暴露細胞の２−３％が蛍光性であった場合は、サンプルは少なくとも軽度に異形成の診断と確実に相関した。標準の細胞形態学的ＰＡＰ染色操作によって軽度に異形成ないしがん性であると決定された５０の喀痰中５０が、また、ＴＣＰＰ検出によって異常であると同定された。ＰＡＰ染色操作に基づいて正常もしくは化生であると特徴付けられた１０サンプル中、４サンプルが、ＴＣＰＰ法を用いて同じ形態を例証した。正常と診断されたサンプルは、ＴＣＰＰの最少の取り込みを示したかまたは取り込みを示さなかった。
【００７９】
細胞形態学的にネガティブまたは化生であると決定された細胞におけるＴＣＰＰの取り込みは、認識可能な、そして診断できる特徴的な蛍光強度とパターンを有した。表２は、それぞれＰＡＰ染色細胞形態学およびＴＣＰＰ技術によって決定される細胞形態と蛍光の間の比較を提示している。ＴＣＰＰ処置サンプルにおける蛍光強度とパターンに基づいて、細胞は、形態的記述に関する１４の可能な数字分類の１つに分類された。細胞が、ＴＣＰＰ決定を用いてクラス１１であり、そしてスライド上の細胞の２−３％以下がバックグラウンドレベル以上の蛍光性であった場合、その時は、サンプルは化生であり、そして異形成ではないと決定された。化生細胞は、ほとんど見ることができない細胞膜によるそれらの適度の蛍光によって正常細胞とは容易に区別された。ＰＡＰ染色によってネガティブもしくは化生であると決定された１０の細胞サンプルについて６つは、ＴＣＰＰ蛍光に基づいてクラス１１の細胞記述により指定された。クラス１１の指定をもつ６ＴＣＰＰ細胞については、また３つが核デブリからの蛍光を示し（すなわち、クラス１３もしくは１４）、そして２つがクラス１１の指定を示した（核のみからの蛍光）。
【００８０】
表２に示されたその他のパターンは、数字で示した分類６−不規則な不同の細胞、低〜中間レベルの蛍光に関する。比較的わずかな異形成細胞だけがこの分類に指名されたのに対して、ほとんどのがん腫細胞は分類６を得たことは注目される。それ故、この分類は、本発明の方法を用いて異形成からがん腫を区別する上で特に重要性をもつと期待される。
【００８１】
表２において示されたその他の重要な観察は、正常から重度のがん腫へと進行した細胞形態につれて、各試験された細胞に割り当てられた数字分類の総数もまた増大したことである。具体的に示せば、ネガティブまたは化生形態をもつ細胞は、２という数字分類の平均を割り当てられたのに対して、腺がん、扁平上皮細胞および小細胞がん腫を示す細胞は、５という数字分類の平均を割り当てられた。数字分類が異なる種類の細胞の異常性の記述を含有するので、異形成もしくはがん腫の程度と、細胞において観察された異なる異常性の数字との間のポジティブな相関関係は合理的である。しかしながら、そのような相関関係は、従来、細胞のサンプルにおける前がんおよびがん症状を診断するために、体系化されていなかったし、そして使用されていなかった。
【００８２】
【表１】
2011185947.tif 000002
【００８３】
【表２】
2011185947.tif 000003
【実施例２】
【００８４】
ＴＣＰＰを用いる前がんおよびがん細胞の検出および分離のための懸濁液アッセイ
この実施例は、喀痰サンプル中に見いだされる細胞の異常を検出するために、細胞形態学的スライド検鏡法と組み合わせて、蛍光フローサイトメトリーと同時のＴＣＰＰ染色の使用を開示する。ＴＣＰＰ染色の特異性のために、フローサイトメトリーとそれに続くスライド検鏡法の組み合わせは、特に威力があり、細胞形態学的なスライドの比較に関して内面的対照を提供する。
【００８５】
方法
懸濁液およびモノレアースライドの作成において使用される喀痰処理操作．すべての懸濁液およびモノレアースライドは、早朝、自然な咳きの手段を行う患者を通じて収集された喀痰サンプルから作成された。具体的には、患者は、リファンピン０．０３−０．０５ｍｇ／ｍｌを含有する５０％アルコール／５０％Ｓａｃｃｏｍａｎｎｏ液中２％Ｃａｒｂｏｗａｘからなる固定液で満たされた容器中に３日連続の朝に咳きをしていかなるものでも吐き出すよう教育される。リファンピンは、Ｍ．チュバキュローシスを保持している患者またはＮ．メニンギチスの無症候性のキャリヤーであるかもしれない患者に対する予防薬剤として役立つよう固定液に添加される。
【００８６】
２％Ｃａｒｂｏｗａｘ溶液は、５０％エタノール９８ｍｌに融解Ｃａｒｂｏｗａｘ（１５０）２ｍｌを添加し、そして３０分間混合することによって作成される。溶液を作成するために使用されるガラス容器は、不正確な計量を引き起こす作成中の表面上のワックスの固化を防ぐために暖め続ける。Ｃａｒｂｏｗａｘは、ＴＣＰＰ実行溶液にさらす前に、少なくとも１５分間９５％アルコール中に浸漬して除去された。
【００８７】
リファンピン溶液（３ｍｇ／ｍｌ）は、エチルアルコール１００ｍｌ中にリファンピンの３００ｍｇカプセル剤を溶解し、そしてＷａｒｉｎｇブレンダーにおいて高速で混合することによって作成された。この溶液１ｍｌがＳａｃｃｏｍａｎｎｏ溶液各３０ｍｌに添加されるかまたはＳａｃｃｏｍａｎｎｏ溶液１リットル当たり２０ｍｌ添加され、そして十分に混合された。Ｓａｃｃｏｍａｎｎｏ溶液の調製は、細胞学の分野の技術者には周知の標準方法にしたがった。
【００８８】
喀痰標本が５０ｍｌプラスチック遠心管に注入され、そして必要ならば容積を５０ｍｌにするために、さらなる５０％エチルアルコール溶液が添加された。遠心管の内容物が２５０ｍｌ容Ｅｂｅｒｂａｃｈセミ・ミクロブレンダー容器に注入され、そしてその標本および粘液様内容物の肉眼検査に応じて１０〜６０秒間ホモジナイズされた。濃い粘液様標本は、ある場合には、より長い混合時間を要した。標本が遠心管に再び注入され、そして低速で１０分間遠心された。上澄液がデカントされ、遠心管中に１〜２ｍｌを残して細胞ペレットと混合された。チューブは回転ミキサー上で約１０秒間撹拌された。サンプルは１００ｍＭＭＥＳバッファー、ｐＨ〜６．１５中に再懸濁される。細胞が回転され、そして１００ｍＭＭＥＳバッファーを用いて２回以上洗浄され、最後に、細胞を再懸濁するために遠心管中に〜１ｍｌを残す。次いで、細胞は、室温で（〜２０℃）で３０分間静かに撹拌しながら９５％エタノール（５％１００ｍＭＭＥＳバッファー）中に再懸濁される。次いで、遠心管を低速で１０分間遠心する。上澄液の全部１−２ｍｌを除去する。
【００８９】
ＴＣＰＰ保存溶液．重炭酸ナトリウム４００ｍｇを５０％イソプロパノール約９０ｍｌに添加し（５０ｍＭ重炭酸ナトリウム）、そして完全に溶解するまで混合して塩基性５０％イソプロパノールを作成した。ＴＣＰＰ１００ｍｇをこの塩基性５０％イソプロパノール（５０ｍＭ重炭酸ナトリウム）に徐々に添加し、そして溶解するまで３〜５分間混合する。ＴＣＰＰ溶液は塩基性５０％イソプロパノールにより容積１００ｍｌにして、よく混合し、そして冷蔵庫内にフォイルで覆った褐色試薬瓶に保存した。保存溶液中のＴＣＰＰの
最終濃度は１ｍｇ／ｍｌである。
【００９０】
ＴＣＰＰ実行溶液．新鮮なＴＣＰＰ実行溶液は各日に調製された。濃度１ｍｇ／ｍｌのＴＣＰＰ保存溶液約１０ｍｌを室温にもたらした。ＴＣＰＰ保存溶液（１ｍｇ／ｍｌ）の８ｍｌを２００ｍｌ容メスフラスコに入れ、そしてＭＥＳバッファー約１００ｍｌを徐々に添加した。溶液を静かに混合した。さらなるＭＥＳバッファーを添加して溶液を容積２００ｍｌにした。溶液を３〜５分間混合し、そして褐色びん中２−４℃で保存した。実行溶液におけるＴＣＰＰの最終濃度は４０μｇ／ｍｌである。
【００９１】
ＴＣＰＰ暴露操作．予め、室温で３０分間９５％アルコールにさらされた懸濁液細胞を、固定後直ちにまたは３日後までにＴＣＰＰに暴露する。細胞を４０μｇ／ｍｌのＴＣＰＰ溶液に３６℃で１０分間、静かに撹拌しながら再懸濁し、次いで室温の１００ｍＭＭＥＳバッファー２０ｍｌを用いて３回、１０分内に細胞をゆるいペレットにする最低速度の遠心を用いて洗浄する。洗浄した細胞ペレットをＭＥＳバッファー１５−１０ｍｌに再懸濁する。これらの懸濁液、またはその一定分量を、蛍光フローサイトメトリー装置を通過させる。
【００９２】
蛍光フローサイトメトリー．第１回通過．最少１０，０００個の細胞を、細胞選別能をもつフローサイトメーターを通過させる。フローサイトメーターは、約３９０ｎｍ〜４９０ｎｍの光線を透過させるフィルターを有する、約４１５ｎｍにおいて放射する光源を備えてなければならない。蛍光発光は約６３０ｎｍ〜７３０ｎｍ（６４５ｎｍ〜７０６ｎｍで発光最大）においてモニターすべきである。５００ｎｍ以上の光線を透過する遮蔽フィルターが満足できる。第１回通過において、個々の細胞がカウントされ、そしてそれらの特定の蛍光が測定される。平均蛍光が算出され、そして平均からの標準偏差が算出される。また、中央値が決定される（半分がその値より小さく、そして半分がその値より大きい特定の蛍光値）。
【００９３】
細胞選別を伴う蛍光フローサイトメトリー．第２回通過．最少１００，０００個の細胞を、第１回通過と同様に装備された細胞選別能をもつ蛍光フローサイトメーターを通過させる。中央値の蛍光未満の蛍光＋平均値からの標準偏差１．３を有する細胞（細胞の約９０％）が、操作上、低い蛍光を有すると定義され、そして１つの試験管に保存され、そして中央値の蛍光を超えるかまたは等しい特定の蛍光＋平均値からの標準偏差１．３を有する細胞（細胞の約１０％）が、操作上、高い蛍光を有すると定義され、そしてその他の試験管に保存される。あるいはまた、細胞は、第１回の通過において見い出された中央値の特定の蛍光に関して、それらの蛍光にしたがってチューブ中に選別することもできる。中央値の特定の蛍光の２倍未満をもつ細胞は「正常」または低い蛍光であり、次いで、細胞は、中央値の蛍光の２−４倍、４−６倍、および中央値の蛍光の６倍超とともにプールすることができる。より高い強度の蛍光プールの各々は、異常な細胞に非常に富んでいることが予測できる。細胞の２−３％以上が中央値の蛍光の３倍以上を保持する場合は、少なくとも進行した前がん症状の予測を支持できる。
【００９４】
モノレアースライドの作成．低および高蛍光細胞サンプルを低いｒｐｍで１０分間遠心して細胞を沈降させる。上澄液を除去し、遠心管中に１〜２ｍｌを残して細胞ペレットと混合する。チューブを回転ミキサー上で約１０秒間撹拌する。沈殿物の１〜３滴をＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔバイアル（Ｃｙｔｙｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）中に入れる。標本を５分間インキュベートして、全微生物およびウイルス生物を失活させる。
【００９５】
サンプルの単細胞層が、Ｔｈｉｎｐｒｅｐ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ｃｙｔｙｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を用いて製造者の指示にしたがって
スライド上に固定される。Ｔｈｉｎｐｒｅｐ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒにおいて、細胞がポリカーボネートフィルター（孔径０．５ｍｍ）上に回収され、そしてガラススライドに移される。次いで、Ｔｈｉｎｐｒｅｐ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒが、直ちに、９５％エタノールを含有する固定液浴中にスライドを沈める（３０分間維持）。
【００９６】
改変ＰＡＰ染色技術による喀痰スライド染色操作．操作配列（ｎｏ．）、試薬および時間（分：秒）は次のとおりである：（１）９５％アルコール  １５：００；（２）水道水  １：００；（３）ｇｉｌ−ｉ  ｈｅｍｏｔｏｘ  ２：３０；（４）水道水  １：００；（５）青染色（ｂｌｕｉｎｇ）試薬  ：３０；（６）水道水  １：００；（７）９５％アルコール  ：１０；（８）ｏｇ−６  １：３０；（９）９５％アルコール  ：１０；（１０）９５％アルコール  ：１０；（１１）ｅａ−５０  １：１５；（１２）９５％アルコール  ：２０；（１３）９５％アルコール  ：３０；（１４）１００％アルコール  １：００；（１５）１００％アルコール  １：００；（１６）１００％アルコール  １：３０；（１７）キシレン  １：００；（１８）キシレン  １：００；および（１９）キシレン  １：００。
【００９７】
Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ染色したスライドの日常的細胞形態学的解析の方法．ＰＡＰ染色したスライドを半定量的細胞形態学的評価にかける。（１）異形成および新形成細胞を伝統的な形態学的基準の使用により同定し、そして（２）肺性炎症の７つの基本的指標（肺胞のマクロファージ、好中球、柱状細胞、粘液、粘膜螺線、着色マクロファージ、化生細胞）の発現レベルを定量する。これらの炎症指標を定量化する方法は、既に文献で議論されている（Ｒｏｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ａｃｔａ  Ｃｙｔｏｌ  ３４：１４７−１５４；Ｒｏｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ａｃｔａ  Ｃｙｔｏｌ  ３４：１４０−１４６；Ｓｃｈｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｒ  Ｄｉｓ  １３９：６０１−６０３）。ＰＡＰ染色した細胞を用いて細胞形態を決定するために使用される基準が以下に議論される。
【００９８】
有意な異常性なし．次の基準が満たされた場合、細胞は有意な異常性をもたないと同定される：
１．炎症細胞のほかにグレード１−２の色素をもつマクロファージと混じり合った好塩基性の繊毛のある上皮細胞；
２．基礎的に定位置にある上皮の丸い核；
３．平均に分散した染色質；
４．不明瞭な核膜；
５．不明瞭な核小体；および化生細胞および異形成細胞の不在。
【００９９】
扁平上皮化生（異形成なし）．次の基準が満たされた場合、細胞は異形成のない扁平上皮化生と同定される：
１．繊毛のない好塩基性細胞の集塊；
２．均一な細胞および核の大きさ；
３．低い核／細胞質（Ｎ／Ｃ）比；
４．細かく顆粒状の核染色質；および
５．小さい丸い核小体（通常１個）が存在することがある。
【０１００】
軽度の異形成（扁平上皮異型）．次の基準が満たされた場合、細胞は軽度の異形成と同定される：
１．化生細胞より小さい；
２．凝集した集塊、または単独で見られる；
３．細胞には両核と細胞質がはっきりと平らに（シート状に）存在している；
４．細胞は大きさにおいて変化は少ない；
５．細胞質は好エオシン性または好塩基性である；
６．鋭い細胞質の縁；
７．細胞は大きさにおいて変化は少なく、通常は丸ないし卵形、分割の場合、核の２つの半分は鏡像的であり、Ｎ／Ｃ比は変化が少ない；
８．核膜は平滑；
９．細かく顆粒状の核染色質（やや増加）、場合によっては染色中心；および
１０．繊維状細胞、広がった細胞質と核膜の明瞭な核をもつ長い細胞−細かい網目状ないし顆粒状細胞質は通常明るい黄橙色−角質化して単独、は、ケラチンの中心コアの回りに渦巻きを形成して上皮パールを形成することがある。
【０１０１】
中等度の異形成（扁平上皮異型）．次の基準が満たされた場合、細胞は中等度の異形成と同定される：
１．大きさにおいて変化があり、通常は比較的大きいが軽度の異形成より小さいこともある；
２．形状およびＮ／Ｃ比において軽度異形成よりも変化がある：
３．細胞質は濃く、好酸性成分が著しく多い；非定型細胞数の増大；
４．核は半分ずつ等しくないこともある（鏡像的ではない）；
５．核の小葉、間隙および小節が存在する；および
６．核質は多くの点彩を伴う過染色性を示す−染色質パターンに類似；
【０１０２】
重度の異形成（顕著な扁平上皮異型）．次の基準が満たされた場合、細胞は重度の異形成と同定される：
１．細胞は大きさおよび形状において著しく変化する；
２．通常は中等度異形成よりやや大きい細胞サイズ；
３．Ｎ／Ｃ比は高いが変化しうる（極端に）：
４．単独の細胞が著しく多い；核はＣＩＳより中心にある；
５．核は細胞質の形状にしたがうことがある；核はＣＩＳより少ないゆがみを示す；
６．核の多形性は、存在する粗い染色質および核エンベロープに沿った濃厚さとともに増大する；
７．パラクロマチン、大きい核、集中的に厚くなったマルチ−ヌクラスタード（ｍｕｌｔｉ−ｎｕｃｌｕｓｔｅｒｅｄ）核膜；
８．細胞は顕著に好酸性細胞質を示す。
【０１０３】
扁平上皮内がん（ＣＩＳ、非浸潤性）．次の基準が満たされた場合、細胞は扁平上皮内がんであると同定される：
１．単独または凝集体（集塊）の細胞；
２．細胞の大きさは変化する−顕著な異形成細胞より小さいか大きい  通常は浸潤性扁平上皮がんよりも小さい；
３．細胞は対称に位置する核とともに大きく、丸い；
４．細胞の退化が存在する；
５．乏しい細胞質、核の周囲は分散して均一に角質化しているかまたは同心的に角質化していない（ｏｒａｎｇｅｏｐｈｉｌｉｃまたは好塩基性）；
６．Ｎ／Ｃ比は変化しうる−正常より高いか低い：
７．粗い濃い核染色質顆粒は明瞭なゾーンによって隔離されている；
８．核膜の起伏をもつ均一に厚くなった染色質の縁；
９．核の小葉が見られる；
１０．ｃａｎｎｉｂａｌｉｓｍが見られるが、常にではない；
１１．多核細胞が存在することもある；
１２．核内に核小体なし；有糸分裂細胞が存在することがある；および
１３．きれいなバックグラウンド。
【０１０４】
扁平上皮がん（十分に分化した角質化タイプ−浸潤性）．次の基準が満たされた場合、細胞は扁平上皮がんであると同定される：
１．細胞は、通常単独のｏｒａｎｇｅｏｐｈｉｌｉｃであるが、集塊で存在することもあり、そして退化している；
２．細胞は大きいか小さい、角がある、よく保存された核と明確な細胞境界を有する；
３．細胞はイン・サイチューよりも通常は大きい  そして多形で、大きさと形状とも広範囲；
４．パール形成が見られる（がんパール）；
５．異常な「テーリング」（浸潤と合致する）を有する適当量の細胞質；異様な細胞形状−オタマジャクシ、星、紡錘型；過染色性を有する予測できない凝集および明確なパラクロマチンおよび明確に定まった染色質、パラクロマチン境界面を有する角ばった核染色質；
６．染色質は、特に核膜に沿って粗く凝集している；
７．核は、存在する場合大きくそして好酸性である；
８．核膜自体は厚く、そして不規則である；核染色質縁の厚さの不規則性；
９．Ｎ／Ｃ比は非常に高い：
１０．形状、サイズ、数において顕著な核小体の不規則性（娘核小体）；異常有糸分裂、多核化；
１１．ｃａｎｎｉｂａｌｉｓｍおよび多核化が普通；および
１２．壊死性バックグラウンド物質が共通している。
【０１０５】
細胞病理学的解析．喀痰サンプルは、互いに点々と配置された肺における多くの場所からの細胞を含有しているので、特定の細胞（薄層切片染色とは異なり）の正常性または異常性を判定するための背景はほとんどない。低蛍光細胞のコレクションの利用性は、高い蛍光ＴＣＰＰ染色細胞と比較するために、正常もしくは正常に近い患者の細胞の内部対照サンプルを提供する。標準ＰＡＰ染色を用いて、当該分野に習熟した細胞病理学者は、分画されてないモノレアーと比較して異常細胞について１０倍集積されている高い蛍光ＴＣＰＰ細胞の異常性の程度を容易に決定することができる。
【０１０６】
本発明は、先に記述され、そして例示された実施態様に限定されるものではなく付随する請求項の範囲内で変更および修飾をすることが可能である。
【０１０７】
以下に本発明の主な特徴と態様を列挙する。
１．細胞サンプルが、異形成またはがん腫細胞を含有しているか否かを決定する方法であって、
ａ）いずれかが存在していれば、異常な前がんまたはがん細胞の成分へのＴＣＰＰの結合を可能にする条件下で、サンプルをＴＣＰＰ溶液と接触させ；
ｂ）未結合のＴＣＰＰをサンプルから除去し；そして
ｃ）サンプルにおけるＴＣＰＰ蛍光を検出して、ＴＣＰＰ蛍光の存在が、サンプルが異形成またはがん腫細胞を含有することを表す：
段階を含む、方法。
２．サンプルが、喀痰サンプル、頸部スワブ、気管支洗液、甲状腺および乳腺の微細針吸引およびコア生検、膀胱洗液、尿、口腔洗液、便サンプル、血液もしくはその画分、リンパ液、脳脊髄液、骨および骨髄からなる群から選ばれる、上記１の方法。
３．サンプルが、ホルムアルデヒド、メタノール、エタノール、イソプロパノールおよびそれらのすべての組み合わせ液からなる群から選ばれる固定液中で固定される、上記１の方法。
４．固定液が９５％エタノールである、上記３の方法。
５．サンプルが固形支持体に付着される、上記１の方法。
６．固形支持体が顕微鏡スライドである、上記５の方法。
７．サンプルが液体中に懸濁される、上記１の方法。
８．ＴＣＰＰの溶液が、塩基性アルコール中に予め溶解され、そしてバッファー水溶液中に希釈されたＴＣＰＰを含有する、上記１の方法。
９．ＴＣＰＰの溶液がｐＨ約５．８〜約６．７に緩衝化される、上記８の方法。
１０．溶液が、バックグラウンドの蛍光を減少させ、ＴＣＰＰの酸化を防止するか、またはＴＣＰＰ蛍光の消光を防止する１種以上の試薬をさらに含有する、上記８の方法。
１１．サンプルにおけるＴＣＰＰの濃度が約４〜約１００μｇ／ｍｌである、上記１の方法。
１２．サンプルが約０．２分〜約２時間ＴＣＰＰと接触される、上記１の方法。
１３．接触の間、サンプルが温度約２３℃〜約４２℃において維持される、上記１の方法。
１４．サンプルにおけるＴＣＰＰ蛍光が肉眼的に検出される、上記５の方法。
１５．サンプルにおけるＴＣＰＰ蛍光がスライドリーダーにより検出される、上記５の方法。
１６．ＴＣＰＰ蛍光が蛍光フローサイトメーターにより検出される、上記７の方法。
１７．検出段階が、除去段階後約１時間〜約２４時間に実施される、上記１の方法。
１８．ＴＣＰＰ−蛍光性であるサンプル中の細胞のパーセントを決定する段階をさらに含む、上記１の方法。
１９．約１％以上の蛍光細胞を含有するサンプルが、異常な前がんまたはがん細胞を含有するとして分類される、上記１８の方法。
２０．ＴＣＰＰ−蛍光性であるサンプル中の細胞のパーセントを決定する段階が、ＴＣＰＰを含有しているサンプル中の細胞のパーセントと蛍光強度を相関させる方式で、サンプル中のＴＣＰＰ蛍光強度を定量することを含む、上記１８の方法。
２１．ＴＣＰＰ蛍光が、サンプル中のすべての細胞に結合している検出可能なマーカーとサンプルを接触させ、未結合の検出可能なマーカーを除去し、そしてサンプルにおけるＴＣＰＰ蛍光と検出可能なマーカー量の比率を確定することによって定量される、上記２０の方法。
２２．検出可能なマーカーが蛍光化合物である、上記２１の方法。
２３．サンプルにおけるＴＣＰＰ蛍光を検出することにより、化生、異形成もしくはがん腫について蛍光細胞を特徴決定することをさらに含む、上記１の方法。
２４．特徴決定が、蛍光細胞の蛍光強度を分類し、そして蛍光強度を細胞の化生、異形成もしくはがん腫状態と相関させることを含む、上記２３の方法。
２５．特徴決定が、細胞形状、細胞の大きさ、細胞の集塊、細胞もしくは細胞集塊の変性量、核の数、核の大きさ、細胞膜の可視性および核破片の存在からなる群から選ばれる１つ以上の形態学的特徴について蛍光細胞を分類し、そして形態学的特徴を細胞の化生、異形成もしくはがん腫状態と相関させることを含む、上記２３の方法。
２６．特徴決定が、蛍光強度について、ならびに細胞形状、細胞の大きさ、細胞の集塊、細胞もしくは細胞集塊の変性量、核の数、核の大きさ、細胞膜の可視性および核破片の存在からなる群から選ばれる１つ以上の形態学的特徴について蛍光細胞を分類し、そして蛍光強度および形態学的特徴を細胞の化生、異形成もしくはがん腫状態と相関させることを含む、上記２３の方法。
２７．蛍光細胞によって示される形態学的特徴と蛍光強度の総数が、化生、異形成もしくはがん腫について蛍光細胞を特徴決定する際のファクターとして使用される、上記２６の方法。
２８．形態学的特徴と蛍光強度のパターンが、化生、異形成もしくはがん腫について蛍光細胞を特徴決定する際のファクターとして使用される、上記２６の方法。
２９．サンプル中の蛍光細胞が、同じサンプルまたは同じ患者由来の第２のサンプルからの非蛍光細胞と比較される、上記２３の方法。
３０．蛍光細胞が、蛍光フローサイトメトリーによって非蛍光細胞から分離される、上記
２９の方法。
３１．選ばれた組織もしくは器官の早期がんまたは前がん症状について患者を診断する方法であって、
ａ）選ばれた組織もしくは器官から細胞のサンプルを得て；そして
ｂ）細胞のサンプルが異常な前がんもしくはがん細胞を含有しているか否かを上記１の方法によって決定して、その陽性の決定が、患者の選ばれた組織もしくは器官の早期がんまたは前がん症状の陽性診断を表す：
ことを含む方法。
３２．がん治療に対する患者の応答の予後を判定する方法であって、
ａ）治療の前に、がんについて治療される患者の組織もしくは器官からの細胞のサンプルにおいて上記１の方法を実施し；
ｂ）治療中一定間隔でおよび治療に続いて、がんについて治療されている患者の組織もしくは器官からの細胞の別のサンプルにおいて上記１の方法を実施し；そして
ｃ）治療中および治療後に試験されたサンプルにおける異常な前がんまたはがん細胞のパーセントが、治療前に試験されたサンプルと比較して低下されたか否かを決定して、低下が、がん治療に対する患者の応答の予後を判定する：
ことを含む方法。
３３．蛍光フローサイトメトリーによって細胞を、正常細胞を含有する集団と異常な前がんおよびがん細胞を含有する集団とに分別することをさらに含む、上記３２の方法。
３４．がん治療に対する患者の応答の予後を判定する方法であって、
ａ）治療の前に、がんについて治療される患者の組織もしくは器官からの細胞の非固定サンプルにおいて上記１の方法を実施し；
ｂ）蛍光フローサイトメトリーによって細胞を、低い蛍光または非蛍光集団は正常または化生、高い蛍光集団は異形成またはがん腫である、低い蛍光または非蛍光の集団と高い蛍光集団とに分離し；
ｃ）分離した細胞集団を可能性のあるがん治療剤によってイン・ビトロで処理し；そしてｄ）２つの細胞集団の各々において薬剤の効果を観察して、薬剤が、異形成またはがん腫細胞集団では所望のネガティブ効果を発揮し、そして正常細胞では効果を発揮しないか、または低い量において発揮するという観察が、がん治療に対する患者の応答の予後を判定する：
段階を含む方法。
３５．患者の選ばれた標的組織において異形成またはがん腫細胞を検出する方法であって、
ａ）いずれかが存在していれば、異形成またはがん腫細胞の成分へのＴＣＰＰの結合を可能にする条件下で、ＴＣＰＰ溶液を標的組織中に導入し；
ｂ）未結合のＴＣＰＰを標的組織から除去し；そして
ｃ）標的組織の細胞におけるＴＣＰＰ蛍光を検出して、そこでのＴＣＰＰ蛍光の存在が、標的組織が異形成またはがん腫細胞を含有することを表す：
段階を含む、方法。
３６．標的組織が、肺、乳腺、前立腺、頸部、咽喉、膀胱、口腔咽頭、皮膚および胃腸管からなる群から選ばれる、上記３５の方法。
３７．ｐＨ約８．５〜約ｐＨ１２．０における、約５０％〜約９０％のアルコールを含有するアルコール水溶液中にＴＣＰＰを溶解することを含む、ＴＣＰＰ溶液を作成する方法。
３８．アルコールがイソプロパノールである、上記３７の方法。
３９．ｐＨが重炭酸ナトリウムもしくは水酸化アンモニウムにより調整される、上記３７の方法。
４０．溶解されるＴＣＰＰが約２ｍｇ／ｍｌ以下である、上記３７の方法。
４１．約８．５〜約１２．０のｐＨにおける約５０％〜約９０％アルコールのアルコール水溶液中に溶解されたＴＣＰＰを含有する組成物。
４２．溶液中のＴＣＰＰの濃度が約２ｍｇ／ｍｌ以下である、上記４１の組成物。
４３．アルコールがイソプロパノールである、上記４１の組成物。
４４．重炭酸ナトリウムもしくは水酸化アンモニウムにより調整されるｐＨを有する、上記４１の組成物。
４５．５０％イソプロパノールおよび５０ｍＭ重炭酸ナトリウム中にＴＣＰＰ１ｍｇ／ｍｌを含有する、上記４１の組成物。
４６．サンプル中の異形成またはがん腫細胞を検出するキットであって、サンプル中の異常な前がんまたはがん細胞の検出に使用するために、容器中のＴＣＰＰおよび指図書を含有するキット。
４７．上記４１の組成物を含有する、上記４６のキット。
４８．ａ）細胞のサンプルを収集するための構成要素；
ｂ）固形支持体にサンプルを付着させるための構成要素；
ｃ）既知のがん、異形成、化生または正常状態の対照細胞サンプル；および
ｄ）ＴＣＰＰ蛍光を定量するための構成要素：
の１つ以上をさらに含む、上記４６のキット。