(57)【要約】      （修正有）【課題】抗腫瘍剤の有効成分として有用な化合物を提供する。【解決手段】ノナエチレングリコールよりノナエチレングリコールモノ（ｐ−トルエンスルホニル）エステルを作製し、これをノナエチレングリコールモノ（’４−ヨード−４−ビフェニル）エステルに誘導した化合物９ｂｗ、及ドデカエチレングリコールよりドデカエチレングリコールモノ（ｐ−トルエンスルホニル）エステルを作製し、これをドデカエチレングリコールモノ（’４−ヨード−４−ビフェニル）エステルに誘導した化合物８ｂｗを有効成分として抗腫瘍剤とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で示されるポリエチレングリコールモノエーテル化合物またはその塩。
【化１】
2011084632.tif 000038
【請求項２】
下記式（２）で示されるポリエチレングリコールモノエーテル化合物またはその塩。
【化２】
2011084632.tif 000039
【請求項３】
下記式（１）で示されるポリエチレングリコールモノエーテル化合物及びその塩、
【化３】
2011084632.tif 000040
ならびに下記式（２）で示されるポリエチレングリコールモノエーテル化合物及びその塩
【化４】
2011084632.tif 000041
からなる群から選択される１種の化合物を有効成分として含む抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリエチレングリコールの誘導体およびそれを有効成分として含む抗腫瘍剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞死を誘導する化合物あるいは細胞死を誘導する化合物の作用を増強する化合物としては種々の化合物が知られており、種々の疾患の予防あるいは治療用の医薬における有効成分としての利用についての検討は盛んに行なわれている。
【０００３】
細胞死誘導剤及び抗癌剤の活性成分として利用可能なポリエチレングリコール誘導体（例えば、ポリオキシエチレン（２，４−ジイソオクチルフェニル）エーテル）およびその製造方法については、ＷＯ２００６／０４３３３８号（Ａ１）パンフレット、ＷＯ２００６／０４３３５３号（Ａ１）パンフレット及びＷＯ２００６／１３４６４８号（Ａ１）パンフレットに記載されている。更に、かかるポリエチレングリコール誘導体の合成についてはOrg. Lett., 2002, 4, 2329-2332に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２００６／０４３３３８号パンフレット、
【特許文献２】ＷＯ２００６／０４３３５３号パンフレット
【特許文献３】ＷＯ２００６／１３４６４８号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Org. Lett., 2002, 4, 2329-2332
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、抗腫瘍剤の有効成分として有用であり、かつより簡便な方法により製造可能な化合物及びそれを有効成分とする抗腫瘍剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明にかかる抗腫瘍剤は、下記式（１）で示されるポリエチレングリコールモノエーテル化合物及びその塩、並びに下記式（２）で示されるポリエチレングリコールモノエーテル化合物及びその塩からなる群から選択された少なくとも１種の化合物を含む。
【０００８】
【化１】
2011084632.tif 000002
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、抗腫瘍剤などの有効成分として有用な化合物を提供することができる。また、上記の効率良い中間体化合物の製造方法により、かかる有用な化合物の効率良い製造が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】化合物９ｂｗの安全性試験の結果を示す図である。
【図２】化合物９ｂｗの安全性試験の結果を示す図である。
【図３】化合物８ｂｗの安全性試験の結果を示す図である。
【図４】化合物８ｂｗの安全性試験の結果を示す図である。
【図５】化合物９ｂｗのMeth-A腫瘍細胞に対するDNA合成阻害効果を示す図である。
【図６】化合物９ｂｗの腹腔内投与マウスの体重変化を示す図である。
【図７】化合物９ｂｗの腹腔内投与によるMeth-A腫瘍体積の変化を示す図である。
【図８】化合物９ｂｗ投与後の腫瘍縮小比を示す図である。
【図９】化合物９ｂｗ投与後のMeth-A腫瘍重量を示す図である。
【図１０】化合物９ｂｗの連続１０日間投与による体重変化を示す図である。
【図１１】化合物９ｂｗの連続１０間投与による腫瘍体積の変化を示す図である。
【図１２】化合物９ｂｗの連続１０間投与による腫瘍体積比の変化を示す図である。
【図１３】化合物９ｂｗの腫瘍内投与マウスの体重の変化を示す図である。
【図１４】化合物９ｂｗの腫瘍内投与における腫瘍体積の変化を示す図である。
【図１５】化合物９ｂｗの腫瘍内投与における腫瘍体積の変化を示す図である。
【図１６】化合物９ｂｗの抗腫瘍効果を示す図である。
【図１７】化合物９ｂｗのMeth-A腫瘍細胞に対するDNA合成阻害効果を示す図である。
【図１８】マウス脾リンパ球のマイトジェン反応に対する化合物９ｂｗの効果を示す図である。
【図１９】実施例５におけるマウス体重（解剖時）の変化を示す図である。
【図２０】実施例５における腫瘍重量の変化を示す図である。
【図２１】実施例５における赤血球数の変化を示す図である。
【図２２】実施例５における白血球数の変化を示す図である。
【図２３】実施例５における血小板数の変化を示す図である。
【図２４】実施例５におけるヘモグロビン量の変化を示す図である。
【図２５】実施例５におけるヘマトクリット値の変化を示す図である。
【図２６】実施例５の参考試験（１）における体重の変化を示す図である。
【図２７】実施例５の参考試験（１）における腫瘍重量の変化を示す図である。
【図２８】実施例５の参考試験（１）における赤血球数の変化を示す図である。
【図２９】実施例５の参考試験（１）における白血球数の変化を示す図である。
【図３０】実施例５の参考試験（１）における血小板数の変化を示す図である。
【図３１】実施例５の参考試験（１）におけるヘモグロビン量の変化を示す図である。
【図３２】実施例５の参考試験（１）におけるヘマトクリット値の変化を示す図である。
【図３３】実施例５の参考試験（２）におけるMIA-PaCa-2に対する９ｂｗの効果を示す図である。
【図３４】化合物9bw及び8bwの正常細胞と腫瘍細胞に対する選択性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明にかかるポリエチレングリコールモノエーテル化合物８ｂｗ及び９ｂｗ（以下単に化合物８ｂｗ及び９ｂｗ、８ｂｗ及び９ｂｗ、あるいはＰＥＧ（８ｂｗ）及びＰＥＧ（９ｂｗ）という）。上記の化合物８ｂｗ及び９ｂｗは、これらのそれぞれに対応する中間体化合物のパラトルエンスルホニル基をＲに置換する以下の反応により合成可能である。
【００１２】
【化２】
2011084632.tif 000003
【００１３】
反応は、水、水と任意の割合で混和しない溶媒及び水溶性である塩基性の金属塩の存在下、空気雰囲気下で行うことができる。溶媒としては上記のものの他に、ジクロロメタンを挙げることができる。塩基性の金属塩としては、実施例において使用しているものに加えて、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水素化リチウム、水酸化カリウムなどを挙げることができる。触媒としては、、実施例において使用しているものに加えて、臭化テトラブチルアンモニウム、ヨウ化テトラブチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウムなどの４級アンモニウム塩を挙げることができる。反応温度は、室温を含む範囲から適宜設定できる。反応終了後、反応液から目的とする化合物８ｂｗ及び９ｂｗを回収する。この回収には、ろ過、各種のクロマトグラフィーを利用した分離方法などの常法を用いることができる。
【００１４】
また、これらの中間体化合物は、対応するポリエチレングリコールと塩化パラトルエンスルホニルをトルエン等の不活性溶媒中で水酸化ナトリウム等のアルカリ水溶液および塩化ベンジルトリエチルアンモニウム等の相間移動触媒の存在下で反応させることにより得ることができる。反応温度は、室温を含む範囲から適宜設定できる。反応終了後、反応液から目的とする中間化合物を回収する。この回収には、ろ過、各種のクロマトグラフィーを利用した分離方法などの常法を用いることができる。
【００１５】
上記の合成における経路を以下の反応スキームとして示す。
【００１６】
【化３】
2011084632.tif 000004
【００１７】
本発明にかかる化合物８ｂｗ及び９ｂｗ、並びにこれらの塩、特に、薬理学的に許容される塩から選択された少なくとも１種を有効成分として抗腫瘍剤とすることができる。抗腫瘍剤の形態としては、例えば、点滴（静脈注）、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤などの固形製剤、注射剤、懸濁剤、シロップ剤、乳剤などの液体製剤、貼付剤等の半固形剤などを挙げることができる。これらの剤形に応じた担体、希釈剤、賦形剤、各種添加剤を適宜選択して製剤化を行うことができる。
【００１８】
化合物８ｂｗ及び９ｂｗの薬理学的に許容される塩は、常法によって得ることができる。例えば、例えば塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸などの無機酸、あるいはギ酸、酢酸、フマル酸、クエン酸、マレイン酸、シユウ酸、リンゴ酸、酒石酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などの有機酸との塩として用いることができる。
【００１９】
本発明の抗癌剤は、膵臓がんなどに特に有効である。
【実施例】
【００２０】
以下実施例により本発明を詳細に説明する。
【００２１】
（実施例１）化合物９ｂｗの合成
（１）化合物５の合成
Nonaethylene glycol mono(p-toluenesulfonyl) ester (5) 
【００２２】
【化４】
2011084632.tif 000005
【００２３】
ノナエチレングリコール 2 (1.00 g, 2.41 mmol) をトルエン (10 mL) に溶解させた。これに塩化ベンジルトリエチルアンモニウム (0.05 g, 0.24 mmol) および20% 水酸化ナトリウム水溶液 (10 mL) を加え撹拌した。このものに塩化p-トルエンスルホニル (0.53 g, 2.75 mmol) のトルエン (5.0 mL) 溶液を添加し、室温で18時間撹拌を続けた。その後10% 塩酸 (25 mL) を加えトルエン層と水層を分離した。水層は酢酸エチル (25 mL×3) で抽出した。トルエン層と 酢酸エチル層を合し、水 (20 mL)、飽和重曹水 (20 mL)、飽和食塩水 (20 mL) で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後これを濾過し、エバポレーターで濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル : 20 g, 展開溶媒 : 酢酸エチル-メタノール混合溶媒 1 対 0 → 200 対 1 → 16 対 1) で分離精製し、無色液体5 (0.88 g, 1.55 mmol, 純度100％、収率48%)を得た。IR（ATR）v max cm-1: 3433。1H-NMR(CDCl3)δ: 2.27 (3H, s), 2.93 (1H, br), 3.56-3.64 (34H, br), 4,14 (2H, t, J=5.0 Hz), 7.34 (2H, d, J=8.4 Hz), 7.79 (2H, d, J=8.4 Hz)。
【００２４】
（２）化合物９ｂｗの合成
Nonaethylene glycol mono(4'-iodo-4-biphenyl) ether (9bw)
【００２５】
【化５】
2011084632.tif 000006
【００２６】
7bw (296 mg, 1.00 mmol) を THF (5.0 mL) に溶解させた。これに水素化ナトリウム (ミネラルオイル懸濁, 純度 60%, 46 mg, 1.15 mmol) を加え室温にて1時間撹拌した。このものに5 (176 mg, 0.31 mmol) の THF (3.0 mL) 溶液を添加し、室温で24時間撹拌を続けた。反応溶液を酢酸エチル (10 mL) で希釈し、水 (10 mL)、飽和食塩水 (10 mL) で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後これを濾過し、エバポレーターで濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル : 4 g, 展開溶媒 : 酢酸エチル-メタノール混合溶媒 1 対 0 → 8 対 1 → 7 対 2) で分離精製し、9bw (119 mg, 0.17 mmol, 純度100%、収率92%、分子量：675)を得た。1H-NMR(CDCl3)δ: 2.64 (1H, br), 3.56-3.64 (32H, br), 3.88 (2H, t, J=4.9 Hz), 4.17 (2H, t, J=4.9 Hz), 6.98 (2H, d, J=8.6 Hz), 7.29 (2H, d, J=8.6 Hz), 7.47 (2H, d, J=8.6 Hz), 7.73 (2H, d, J=8.6 Hz)。
【００２７】
（実施例２）化合物８ｂｗの合成
（１）化合物（３）の合成
Dodecaethylene glycol mono(p-toluenesulfonyl) ester (3)
【００２８】
【化６】
2011084632.tif 000007
【００２９】
ドデカエチレングリコール 1 (1.00 g, 1.83 mmol) をトルエン (10 mL) に溶解させた。これに塩化ベンジルトリエチルアンモニウム (0.04 g, 0.19 mmol) および20% 水酸化ナトリウム水溶液 (10 mL) を加え撹拌した。このものに塩化p-トルエンスルホニル (0.36 g, 1.90 mmol) のトルエン (5.0 mL) 溶液を添加し、室温で18時間撹拌を続けた。その後10% 塩酸 (25 mL) を加えトルエン層と水層を分離した。水層は酢酸エチル (25 mL×3) で抽出した。トルエン層と酢酸エチル層を合し、水 (20 mL)、飽和重曹水 (20 mL)、飽和食塩水 (20 mL) で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後これを濾過し、エバポレーターで濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル : 16 g, 展開溶媒 : 酢酸エチル-メタノール混合溶媒 1 対 0 → 60 対 1 → 8 対 1) で分離精製し、無色液体3 (0.76 g, 1.08 mmol, 純度99%、収率 49%) を得た。IR(ATR) v max cm-1: 3462。1H-NMR(CDCl3)δ: 2.03 (1H, br), 2.27 (3H, s), 3.56-3.64 (46H, br), 4.14 (2H, t, J=5.0 Hz), 7.34 (2H, d, J=8.4 Hz), 7.79 (2H, d, J=8.4 Hz)。
（２）化合物８ｂｗの合成
Dodecaethylene glycol mono(4'-iodo-4-biphenyl) ether (8bw)
【００３０】
【化７】
2011084632.tif 000008
【００３１】
7bw (310 mg, 1.05 mmol) を THF (5.0 mL) に溶解させた。これに水素化ナトリウム (ミネラルオイル懸濁, 純度 60%, 51 mg, 1.28 mmol) を加え室温にて1時間撹拌した。このものに3(200 mg, 0.29 mmol) の THF (2.0 mL) 溶液を添加し、室温で24時間撹拌を続けた。反応溶液を酢酸エチル (10 mL) で希釈し、水 (10 mL)、飽和食塩水 (10 mL) で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後これを濾過し、エバポレーターで濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル : 5 g, 展開溶媒 : 酢酸エチル-メタノール混合溶媒 1 対 0 →  45 対 1 → 45 対 2 → 8 対 1 → 7 対 2) で分離し、8bw (52 mg, 0.06 mmol, 純度100%、収率 75%、分子量：807)を得た。1H-NMR(CDCl3)δ: 2.75 (1H, br), 3.56-3.64 (44H, br), 3.88 (2H, t, J=4.9 Hz), 4.17 (2H, t, J=4.9 Hz), 6.98 (2H, d, J=8.6 Hz), 7.29 (2H, d, J=8.6 Hz), 7.47 (2H, d, J=8.6 Hz), 7.73 (2H, d, J=8.6 Hz)。
【００３２】
（参考合成例）
Nonaethylene glycol mono(4-iodophenyl) ether (9ah)
【００３３】
【化８】
2011084632.tif 000009
【００３４】
7ah (230 mg, 1.05 mmol) を THF (2.0 mL) に溶解させた。これに水素化ナトリウム (ミネラルオイル懸濁, 純度 60%, 49 mg, 1.23 mmol) を加え室温にて1時間撹拌した。このものに 5 (210 mg, 0.37 mmol) の THF (2.0 mL) 溶液を添加し、室温で24時間撹拌を続けた。反応溶液を酢酸エチル (10 mL)で希釈し、水 (10 mL)、飽和食塩水 (10 mL) で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後これを濾過し、エバポレーターで濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル:4g, 展開溶媒:酢酸エチル-メタノール混合溶媒 1 対 0 → 90 対 1 → 12 対 1 → 4 対 1) で分離精製し、9ah (154 mg, 0.25 mmol, 収率 68%) を得た。1H-NMR(CDCl3)δ: 2.61 (1H, br), 3.57-3.73 (32H, br), 3.84 (2H, t, J=4.8 Hz), 4.09 (2H, t, J=4.8 Hz), 6.69 (2H, d, J=9.2 Hz), 7.54 (2H, d, J=9.2 Hz)。
【００３５】
Nonaethylene glycol mono(4-bromophenyl) ether (9j)
【００３６】
【化９】
2011084632.tif 000010
【００３７】
7j (126 mg, 0.73 mmol) を THF (1.0 mL) に溶解させた。これに水素化ナトリウム (ミネラルオイル懸濁, 純度 60%, 36 mg, 0.90 mmol) を加え室温にて1時間撹拌した。このものに 5 (192 mg, 0.34 mmol) の THF (2.0 mL) 溶液を添加し、室温で24時間撹拌を続けた。反応溶液を酢酸エチル (10 mL) で希釈し、水 (10 mL)、飽和食塩水 (10 mL) で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後これを濾過し、エバポレーターで濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル : 4 g, 展開溶媒 : 酢酸エチル-メタノール混合溶媒 1 対 0 → 10 対 1) で分離精製し、9j (130 mg, 0.23 mmol, 収率 68%) を得た。1H-NMR(CDCl3)δ: 2.78 (1H, br), 3.59-3.74 (32H, br), 3.83 (2H, t, J=4.8 Hz), 4.09 (2H, t, J=4.6 Hz), 6.79 (2H, d, J=9.2 Hz), 7.35 (2H, d, J=9.2 Hz)。
【００３８】
Nonaethylene glycol mono(4-trifluoromethylphenyl) ether (9o)
【００３９】
【化１０】
2011084632.tif 000011
【００４０】
7o (170 mg, 1.05 mmol) を THF (1.5 mL) に溶解させた。これに水素化ナトリウム (ミネラルオイル懸濁, 純度 60%, 50 mg, 1.25 mmol) を加え室温にて1時間撹拌した。このものに 5 (200 mg, 0.35 mmol) の THF (2.0 mL) 溶液を添加し、室温で24時間撹拌を続けた。反応溶液を酢酸エチル(10 mL)で希釈し、水(10 mL)、飽和食塩水(10 mL)で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後これを濾過し、エバポレーターで濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル : 4 g, 展開溶媒 : 酢酸エチル-メタノール混合溶媒 1 対 0 → 8 対 1) で分離精製し、9o (99 mg, 0.18 mmol, 収率 49%) を得た。1H-NMR(CDCl3)δ: 2.73 (1H, br), 3.57-3.73 (32H, br), 3.86 (2H, t, J=4.8 Hz), 4.16 (2H, t, J=4.8 Hz), 6.97 (2H, d, J=8.7 Hz), 7.52 (2H, d, J=8.7 Hz)。
【００４１】
Nonaethylene glycol mono(4-cyanophenyl) ether (9r)
【００４２】
【化１１】
2011084632.tif 000012
【００４３】
7r (200 mg, 1.68 mmol) を THF (3.0 mL) に溶解させた。これに水素化ナトリウム (ミネラルオイル懸濁, 純度 60%, 82 mg, 2.05 mmol) を加え室温にて1時間撹拌した。このものに 5 (240 mg, 0.42 mmol) の THF (2.0 mL) 溶液を添加し、室温で24時間撹拌を続けた。反応溶液を酢酸エチル (10 mL) で希釈し、水 (10 mL)、飽和食塩水 (10 mL) で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後これを濾過し、エバポレーターで濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル : 5 g, 展開溶媒 : 酢酸エチル-メタノール混合溶媒 1 対 0 → 100 対 1 → 8 対 1) で分離精製し、9r (82 mg, 0.16 mmol, 収率 38%) を得た。1H-NMR(CDCl3)δ: 2.64 (1H, br), 3.59-3.74 (32H, br), 3.86 (2H, t, J=4.8 Hz), 4.16 (2H, t, J=4.8 Hz), 6.96 (2H, t, J=8.9 Hz), 7.57 (2H, d, J=8.9 Hz)。
【００４４】
Nonaethylene glycol mono(6-quinolyl) ether (9s)
【００４５】
【化１２】
2011084632.tif 000013
【００４６】
7s (200 mg, 1.38 mmol) 及び塩化ベンジルトリエチルアンモニウム (30 mg, 0.13 mmol) を THF (2.0 mL) に溶解させた。これに水素化ナトリウム (ミネラルオイル懸濁, 純度 60%, 60 mg, 1.50 mmol) を加え室温にて1時間撹拌した。このものに 5 (180 mg, 0.32 mmol) の THF (2.0 mL) 溶液を添加し、室温で24時間撹拌を続けた。反応溶液を水 (10 mL) で希釈し、クロロホルム (10 mL×4) で抽出した。クロロホルム層は、水 (10 mL)、飽和食塩水 (10 mL) で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後これを濾過し、エバポレーターで濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル : 4 g, 展開溶媒 : 酢酸エチル-メタノール混合溶媒 1 対 0 → 16 対 1 → 8 対 1 → 7 対 2) で分離精製し、9s (103 mg, 0.19 mmol, 収率 60%) を得た。1H-NMR(CDCl3)δ: 2.89 (1H, br), 3.58-3.79 (32H, br), 3.94 (2H, t, J=4.9 Hz), 4.26 (2H, t, J=4.9 Hz), 7.09 (1H, d, J=2.7 Hz), 7.36 (1H, dd, J=8.2 Hz, 4.1 Hz), 7.41 (1H, dd, J=9.4 Hz, 2.7 Hz), 8.00 (1H, d, J=9.4 Hz), 8.04 (1H, dd, J=8.2 Hz, 1.7 Hz), 8.77 (1H, dd, J=4.1 Hz, 1.7 Hz)。
【００４７】
Nonaethylene glycol mono(2,4-bis(1,1-dimethylpropyl)phenyl) ether (9z)
【００４８】
【化１３】
2011084632.tif 000014
【００４９】
7z (222 mg, 0.95 mmol) を THF (2.0 mL) に溶解させた。これに水素化ナトリウム (ミネラルオイル懸濁, 純度 60%, 50 mg, 1.25 mmol) を加え室温にて1時間撹拌した。このものに 5 (220 mg, 0.39 mmol) の THF (2.0 mL) 溶液を添加し、室温で24時間撹拌を続けた。反応溶液を酢酸エチル (10 mL) で希釈し、水 (10 mL)、飽和食塩水 (10 mL) で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後これを濾過し、エバポレーターで濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル : 4 g, 展開溶媒 : 酢酸エチル-メタノール混合溶媒 1 対 0 → 50 対 1 → 8 対 1 → 4 対 1) で分離精製し、9z (134 mg, 0.21 mmol, 収率 55%) を得た。1H-NMR(CDCl3)δ: 0.60 (3H, t, J=7.3 Hz), 0.66 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.25 (6H, s), 1.34 (6H, s), 1.59 (2H, q, J=7.3 Hz), 1.83 (2H, q, J=7.3 Hz), 2.843 (1H, br), 3.58-3.74 (32H, br), 3.87 (2H, t, J=5.2 Hz), 4.10 (2H, t, J=4.8 Hz), 6.75 (1H, d, J=8.2 Hz), 7.07 (1H, dd, J=8.2 Hz, 2.3 Hz), 7.16 (1H, d, J=2.3 Hz)。
【００５０】
Dodecaethylene glycol mono(4-iodophenyl) ether (8ah)
【００５１】
【化１４】
2011084632.tif 000015
【００５２】
7ah (216 mg, 0.98 mmol) を THF (2.0 mL) に溶解させた。これに水素化ナトリウム (ミネラルオイル懸濁, 純度 60%, 51 mg, 1.28 mmol) を加え室温にて1時間撹拌した。このものに 3 (172 mg, 0.25 mmol) の THF (2.0 mL) 溶液を添加し、室温で24時間撹拌を続けた。反応溶液を酢酸エチル (10 mL) で希釈し、水 (10 mL)、飽和食塩水 (10 mL) で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後これを濾過し、エバポレーターで濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル : 4 g, 展開溶媒 : 酢酸エチル-メタノール混合溶媒 1 対 0 → 45 対 1 → 45 対 2 → 8 対 1) で分離精製し、8ah (74 mg, 0.10 mmol, 収率 40%) を得た。1H-NMR(CDCl3)δ: 2.70 (1H, br), 3.59-3.73 (44H, br), 3.84 (2H, t, J=4.8 Hz), 4.09 (2H, t, J=4.8 Hz), 6.70 (2H, d, J=8.9 Hz), 7.54 (2H, d, J=8.9 Hz)。
【００５３】
Dodecaethylene glycol mono(p-biphenyl) ether (8aj)
【００５４】
【化１５】
2011084632.tif 000016
【００５５】
7aj (173 mg, 1.02 mmol) を THF (1.5 mL) に溶解させた。これに水素化ナトリウム (ミネラルオイル懸濁, 純度 60%, 45 mg, 1.13 mmol) を加え室温にて1時間撹拌した。このものに 3 (216 mg, 0.31 mmol) の THF (2.0 mL) 溶液を添加し、室温で24時間撹拌を続けた。反応溶液を酢酸エチル (10 mL) で希釈し、水 (10 mL)、飽和食塩水 (10 mL) で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後これを濾過し、エバポレーターで濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル : 4 g, 展開溶媒 : 酢酸エチル-メタノール混合溶媒 1 対 0 → 45 対 1 → 30 対 1 → 45 対 2 → 8 対 1 → 7 対 2) で分離精製し、8aj (105 mg, 0.15 mmol, 収率 49%) を得た。1H-NMR(CDCl3)δ: 3.57 (1H, t, J=6.0 Hz), 3.59-3.75 (44H, br), 3.88 (2H, t, J=4.9 Hz), 4.18 (2H, t, J=4.9 Hz), 6.99 (2H, d, J=8.7 Hz), 7.30-7.57 (7H, m)。
【００５６】
Dodecaethylene glycol mono(4-bromophenyl) ether (8j)
【００５７】
【化１６】
2011084632.tif 000017
【００５８】
7j (169 mg, 0.98 mmol) を THF (1.5 mL) に溶解させた。これに水素化ナトリウム (ミネラルオイル懸濁, 純度 60%, 47 mg, 1.18 mmol) を加え室温にて1時間撹拌した。このものに 3 (215 mg, 0.31 mmol) の THF (2.0 mL) 溶液を添加し、室温で24時間撹拌を続けた。反応溶液を酢酸エチル (10 mL) で希釈し、水 (10 mL)、飽和食塩水 (10 mL) で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後これを濾過し、エバポレーターで濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル : 4 g, 展開溶媒 : 酢酸エチル-メタノール混合溶媒 1 対 0 → 30 対 1 → 8 対 1 → 7 対 2) で分離精製し、8j (44 mg, 0.06 mmol, 収率 20%) を得た。1H-NMR(CDCl3)δ: 2.78 (1H, br), 3.58-3.65 (44H, br), 3.83 (2H, t, J=4.6 Hz), 4.08 (2H, t, J=4.6 Hz), 6.79 (2H, d, J=9.2 Hz), 7.35 (2H, d, J=9.2 Hz)。
【００５９】
Dodecaethylene glycol mono(4-trifluoromethylphenyl) ether (8o)
【００６０】
【化１７】
2011084632.tif 000018
【００６１】
7o (162 mg, 1.00 mmol) を THF (2.0 mL) に溶解させた。これに水素化ナトリウム (ミネラルオイル懸濁, 純度 60%, 65 mg, 1.63 mmol) を加え室温にて1時間撹拌した。このものに 3 (250 mg, 0.36 mmol) の THF (1.5 mL) 溶液を添加し、室温で24時間撹拌を続けた。反応溶液を酢酸エチル (10 mL) で希釈し、水 (10 mL)、飽和食塩水 (10 mL) で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後これを濾過し、エバポレーターで濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル : 5 g, 展開溶媒 : 酢酸エチル-メタノール混合溶媒 1 対 0 → 45 対 1 → 8 対 1) で分離精製し、8o (54 mg, 0.08 mmol, 収率 22%) を得た。1H-NMR(CDCl3)δ: 2.75 (1H, br), 3.57-3.73 (44H, br), 3.87 (2H, t, J=4.8 Hz), 4.17 (2H, t, J=4.8 Hz), 6.98 (2H, d, J=8.5 Hz), 7.53 (2H, d, J=8.5 Hz)。
【００６２】
Dodecaethylene glycol mono(2,4-bis(1,1-dimethylpropyl)phenyl) ether (8z)
【００６３】
【化１８】
2011084632.tif 000019
【００６４】
7z (240 mg, 1.02 mmol) を THF (2.0 mL) に溶解させた。これに水素化ナトリウム (ミネラルオイル懸濁, 純度 60%, 53 mg, 1.33 mmol) を加え室温にて1時間撹拌した。このものに 3 (225 mg, 0.32 mmol) の THF (2.0 mL) 溶液を添加し、室温で24時間撹拌を続けた。反応溶液を酢酸エチル (10 mL) で希釈し、水 (10 mL)、飽和食塩水 (10 mL) で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後これを濾過し、エバポレーターで濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル : 4 g, 展開溶媒 : 酢酸エチル-メタノール混合溶媒 1 対 0 → 60 対 1 → 30 対 1 → 4 対 1) で分離精製し、8z (192 mg, 0.25 mmol, 収率 79%) を得た。1H-NMR(CDCl3)δ: 0.61 (3H, t, J=7.5 Hz), 0.66 (3H, t, J=7.5 Hz), 1.25 (6H, s), 1.34 (6H, s), 1.59 (2H, q, J=7.5 Hz), 1.83 (2H, q, J=7.5 Hz), 2.73 (1H, br), 3.59-3.74 (44H, br), 3.86 (2H, t, J=5.2 Hz), 4.10 (2H, t, J=4.8 Hz), 6.75 (1H, d, J=8.4 Hz), 7.07 (1H, dd, J=8.4 Hz, 2.4 Hz), 7.16 (1H, d, J=2.4 Hz)。
【００６５】
Nonaethylene glycol mono(p-biphenyl) ether (9aj)
【００６６】
【化１９】
2011084632.tif 000020
【００６７】
7aj (170 mg, 1.00 mmol) を THF (1.5 mL) に溶解させた。これに水素化ナトリウム (ミネラルオイル懸濁, 純度 60%, 44 mg, 1.10 mmol) を加え室温にて1時間撹拌した。このものに 5 (205 mg, 0.36 mmol) の THF (2.0 mL) 溶液を添加し、室温で24時間撹拌を続けた。反応溶液を酢酸エチル (10 mL) で希釈し、水 (10 mL)、飽和食塩水 (10 mL) で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後これを濾過し、エバポレーターで濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル : 4 g, 展開溶媒 : 酢酸エチル-メタノール混合溶媒 1 対 0 → 90 対 1 → 12 対 1 → 4 対 1) で分離精製し、9aj (172 mg, 0.30 mmol, 収率 84%) を得た。1H-NMR(CDCl3)δ: 2.77 (1H, t, J=6.0 Hz), 3.59-3.75 (32H, br), 3.88 (2H, t, J=5.4 Hz), 4.18 (2H, t, J=5.4 Hz), 6.98 (2H, d, J=8.7 Hz), 7.30-7.56 (7H, m)。
【００６８】
（実施例３）マウス（BALB/c、雄）の腹腔内および静脈内投与に対する安全性に関する試験
（Ａ）化合物9bwの安全性に関する試験
［材料及び方法］
（１）マウス腹腔／静脈内投与に対する50％致死量の検討
１．実験動物：
ヌードマウス（BALB/c Slc-nu/nu 雄、エスエルシー（株））80匹を7週令で購入して1週間の予備飼育を実施した後に8週令で使用した。
２．試料の調整：
化合物９ｂｗのサンプルを滅菌水およびPBSで希釈調製した。滅菌は０．４５μｍのろ過フィルターを用いて行った。
３．投与方法及び投与量：
投与は腹腔内および静脈内の単一投与とし、投与容量は共に0.2ml/マウスとした。投与容量は400mg／kg（9.3mg/0.2ml/マウス/23g体重）を基本濃度として作成し、200mg／kg、150mg／kg、100mg/kg、75mg/kg、50mg／kg、40mg/kg、30mg/kgおよび20mg/kgの８濃度を滅菌PBS(-)にて調整した。
４．観察期間：
投与後：３週間の観察を行った。また、投与開始前から投与後３週間まで投与各群の体重を経時的に測定した。
５．投与群を下記の表１に示した。
【００６９】
【表１】
2011084632.tif 000021
【００７０】
６．実験開始前平均体重（n = 13)：
投与開始前の平均体重は23. 36±0.89 ( SE）であった。
７．致死量の算出
LD50はプロビット法により算出した。
８．結果
ヌードマウスに対する化合物9bwの腹腔内（ip）および静脈内（iv）投与後の生存率の結果を表２に示す。また、化合物9bwの投与にかかるヌードマウスの体重変化を図１及び図２に示す。
【００７１】
【表２】
2011084632.tif 000022
【００７２】
（Ｂ）化合物8bwの安全性に関する試験
［材料及び方法］
（１）マウス腹腔／静脈内投与に対する50％致死量の検討
１．実験動物：
ヌードマウス（BALB/c Slc-nu/nu 雄、エスエルシー（株））100匹を7週令で購入して1週間の予備飼育を実施した後に8週令で使用した。
２．試料の調整：
化合物８ｂｗ（表及び図ではPEG(9bw)と表記する）のサンプルを滅菌水およびPBSで希釈調製した。滅菌は０．４５μｍのろ過フィルターを用いて行った。
３．投与方法及び投与量：
投与は腹腔内および静脈内の単一投与とし、投与容量は共に0.2ml/マウスとした。投与容量は 400mg／kg（9.3mg/0.2ml/マウス/23g体重）を基本濃度として作成し、150mg／kg、100mg/kg、75mg/kg、60mg/kg、50mg／kg、40mg/kg、30mg/kgおよび20mg/kgの８濃度を滅菌PBS(-)にて調整した。
４．観察期間：
投与後：３週間の観察を行った。また、投与開始前から投与後３週間まで投与各群の体重を経時的に測定した。
５．投与群を下記の表に示した。
【００７３】
【表３】
2011084632.tif 000023
【００７４】
６．実験開始前平均体重（n = 13)：
投与開始前の平均体重は23.21±0.25 ( SE）であった。
７．致死量の算出
LD50はプロビット法により算出した。
８．結果
ヌードマウスに対する化合物8bwの腹腔内（ip）および静脈内（iv）投与後の生存率の結果を表４に示す。また、化合物8bwの投与にかかるヌードマウスの体重変化を図３及び図４に示す。
【００７５】
【表４】
2011084632.tif 000024
【００７６】
（Ｃ）Meth -A腫瘍細胞に対するDNA合成阻害効果の検討（インビトロ）
１．腫瘍細胞：
Meth - A 腫瘍細胞（マウス肉腫）
２．培養液：
RPMI-l640 medium ( Sigma Chemicals, MO , USA）にfetal bovine serum 10 %, L-glutamine, gentamycinおよびstreptomycinを添加した。
３．試料の調整：
化合物9bwを滅菌蒸留水にて 2mg/mlの濃度に調整し、ゆるやかに撹拝した後に1夜冷蔵保存すると透明な状態で溶解した。しかし、溶解した化合物は室温（21〜25℃で）に置くとわずかに白濁が確認された。この状態で培養液にて96-well plates (F96 microwell plate NUNC）中で2n希釈を行い、各wellにMeth-A細胞を加えて24時間の培養（37℃, 5%  CO2）を行った。
４．トリチュウムーチミジンの取り込み：
培養17時間後に3H-thymidine (methyl-3H, MP Biomedicals, CA, USA ）を37 kBq/well 添加し、さらに7時間の培養を行った後にシンシレーションカウンター（1450 MicroBeta TriLux . Ma11ac , Finland）を用いて放射活性を測定した。
【００７７】
［試験結果］
化合物９ｂｗのMeth-A腫瘍細胞に対するDNA合成阻害効果について
１．活発な増殖を示すMeth-A細胞に培養液で希釈調整した化合物9bwを128μｇ／mlから 4μｇ／mlの濃度に添加し、24時間の培養を行い細胞内に取り込まれた 3H-チミジンの放射活性を測定した。化合物９ｂｗ非添加細胞（対照）が取り込んだ放射活性（CPM)を100％とした時，128μg/mlの濃度では約11％と細胞の増殖、分裂が抑制されており、 8μｇ/m1では約71％の抑制効果が認められた。
【００７８】
（実施例４）マウス（BALB/c、雄）に移植したMeth-A腫蕩に対する化合物の抗腫瘍効果に関する試験
［材料及び方法］
（１）動物試験：腫瘍移植マウスに対する化合物9bwの抗腫瘍効果判定
１．実験動物：
通常マウス（BALB/c，雄，SLC )80匹を6週令で購入して1週間の予備飼育を実施した後に7週令で使用した。
２．移植腫瘍：
腫瘍はマウスの肉腫（Meth-A）を用い、マウス腹腔内で増殖（15匹使用）させた本腫瘍をマイクロシリンジにてマウス右大腿部皮下に約１×１０7/ 60μlの細胞を移植した。移植後1週間で腫瘍径が7mm前後に達したマウスを選別して投与群および担癌対照群を作成した。また、腹腔内60mg/kg連続10回投与群および腫瘍内直接投与群には腫瘍が比較的大きく成長した個体を選択した。（腫瘍の発育不良な個体および極端な増殖過多な個体は除外した。）
３．試料の調整：化合物９ｂｗのサンプルは滅菌水および PBS で希釈調製した。
４．投与方法および投与量：
投与経路は腹腔内および腫瘍内直接投与とし、投与容量は腹腔内0.2ml／マウスおよび腫瘍内 50μl／マウスとした。投与量は腹腔内投与で 30mg／kg および 60mg/kgさらに腫瘍内投与では7.5mg/kgおよび15mg/kgに設定した。
５．投与回数および期間：
a）腹腔内投与：連続 30mg/kg  ×10回（10日間）、隔日 60mg/kg投与 ×５回（10日間）および連続 60mg/kg×10回（10日間）
b )腫瘍内投与：連続 7.5mg /kg投与（10日間）および連続 15mg/kg投与（10日間）の5群を設定した。
６．腫瘍体積：
マウスの右大腿部皮下に移植した腫瘍体積は、ノギスを用いて腫瘍径を計測し、以下の計算式により算出した。
【００７９】
腫瘍体積（mm3）＝長径（mm）×短径（mm）×短径（mm）/ 2
投与対象の腫瘍体積＝100mm3〜200mm3
７． 投与群を下記の表５に示した。
【００８０】
【表５】
2011084632.tif 000025
【００８１】
（２）Meth-A腫瘍細胞に対する DNA合成阻害効果の検討（インビトロ）
１．腫瘍細胞：
Meth -A 腫瘍細胞（マウス肉腫）
２．培養液：
RPMI-1640 medium（Sigma Chemical, MO, USA）にfetal bovine serum 10 %, L-gluta  mne、gentamycinおよびstreptomycinを添加した。
３．試料の調整：
化合物９ｂｗを滅菌蒸留水にて 2mg/mlの濃度に調整し、ゆるやかに撹拝した。この状態で培養液にて96-well plates（F96 microwell plate NUNC）中で2n希釈を行い、各wellにMeth-A 細胞を加えて24時間の培養( 37℃、5 % CO2）を行った。
４．トリチュウム−チミジンの取り込み：
培養終了前に 3H−thymidine(3H-TdR、 methyl-3H, MP Biomedicals, CA, USA）を37 kBq/well添加し、さらに7時間の培養を行った後にシンシレーションカウンター（1450 MicroBeta TriLuX, Wallas, Finland）を用いて放射活性を測定した。
５．脾細胞の調整：
正常マウスの脾臓を無菌的に採取し、脾細胞に含まれる赤血球を塩化アンモニウム・トリス緩衝液にて溶解した。脾細胞はPBSにて2回洗浄し、500万個／ml となるように培養液で調製した。調製した脾リンパ球細胞は、96wellの平底プレートに50万個／wellずつ分注してマイトジェンを添加して培養を行った。
６．マイトジェン反応：
マウス脾リンパ球のマイトジェンとしてConcanavalin A (Con A. Pharmacia Fine chemicals）を用いた。Con A は、5μ/ mlの濃度となるように培養液に添加した。
７．Meth-A 細胞および脾リンパ球細胞の照射：
X線発生装置（日立製作所・MBR-1520R-3）を用いて、3.0 Gy（管電圧 150kv／管電流 20mA、フィルター A1 1.0mm、線量率 2.48 Gy）の照射を行った。
８．培養時間：
Meth -A 細胞は化合物９ｂｗ添加後24時間の培養を行い、終了6〜7時間前に3H -TdRを添加した。マウス正常脾リンパ球細胞は、マイトジェン(Con A)および化合物９ｂｗを添加後48時間の培養を行い、Meth -A 細胞と同様に終了6〜7時間前に3H -TdRを添加した。
［試験結果］
１．担癌（Meth-A 腫瘍）マウスに対する化合物９ｂｗ投与の抗腫瘍効果
A . 化合物９ｂｗ腹腔内投与の効果判定（30mg/kg連日投与および60mg/kg隔日投与）
得られた結果を図５〜９に示す。図６の体重について、化合物９ｂｗの30mg/kgおよび 60mg / kg 投与ともに投与開始から 10 回投与後まで体重の減少は認められなかった。図７の結果においては、腫瘍体積に関して、化合物９ｂｗの30mg/kgおよび60mg/kg投与とも投与開始時の腫瘍体積より減少する傾向が認められた。図８の結果においては、腫瘍体積比に関して、投与前の腫瘍体積を100とした指数で表示すると投与開始後一過性の腫瘍増加がみられるが、投与後６日目以降で明らかな縮小効果が認められた（腫瘍縮小比：３０mg/kg、６０mg/kg投与群とも50％前後に縮小）。図９の結果においては、解剖時の腫瘍重量について、最終投与24時間後の腫瘍重量は担癌対照群で1459±620mg、30mg/kg投与群で42±22mgおよび60mg/kgで66±18mgであった。
B . 化合物９ｂｗ腹腔内投与の効果判定（60mg/kg 連日10回投与）
得られた結果を図１０〜図１２に示す。図１０の結果において、体重に関して化合物９ｂｗの連続10回投与では投与開始から終了まで体重の減少および死亡例は認められなかった。図１１の結果において、腫瘍体積に関して60mg/kgの連続投与により投与後6日後から腫瘍体積の縮小効果が認められた。図１２の結果において、腫瘍体積比に関して、比較的大きく成長した腫瘍を選択し、60mg/kgの連日10回投与を実施した。個々の投与前体積を1.00とした時の指数では、10回の投与後で約0.5もしくは0.5以下に縮小した個体は7匹中4匹（57%）、0.5〜1.0以下に縮小した個体が2匹（28%）、効果がみられない個体が1匹（14%）であった。
【００８２】
更に得られた結果を下記表６−１及び６−２に示す。
【００８３】
【表６】
2011084632.tif 000026
【００８４】
Ｃ．化合物９ｂｗ腫瘍内投与の効果判定（ 7.5mg/kgおよび15mg/kg、隔日5回投与）
得られた結果を図１３〜図１６に示す。図１３に示す結果において、体重について、化合物９ｂｗの7.5mg/kgおよび15mg/kg腫瘍内投与ともに投与開始から投与後まで体重の減少は認められなかった。図１４に示す結果において、腫瘍体積（C -1)について、4匹中1匹（No.3）の個体では腫瘍の増加がみられたが、残り3個体では明らかな腫瘍の縮小効果が認められた。また、腫瘍内投与ではNo.3のように投与前の腫瘍体積（腫瘍の大きさ）に関連すると思われる。図１５の結果において、腫瘍体積（C - 2)について、5匹中2匹（No. 4、No. 5）の個体では腫瘍の増加がみられたが、3個体では顕著な腫瘍の縮小効果が認められた。図１６に、腫瘍重量に関して、化合物９ｂｗの投与による担癌マウスの解剖時腫瘍重量を図にまとめた。投与開始時に腫瘍長径が7mm前後の腫瘍（A）では抗腫瘍効果が大きい結果が得られた。
【００８５】
（２）Meth -A 腫瘍細胞に対するDNA合成阻害効果（インビトロ）
得られた結果を図１７及び図１８に示す。図１７の結果において、Meth-A 細胞における 化合物９ｂｗの非添加時で非照射の3H-TdR取り込みは24,407±988cpmであり、3.0 Gy の照射では15,104 ±517cpmであった。したがって、3.0 Gy照射は Meth-A 細胞のDNA合成を約38％抑制する効果を持っと計算される（3.0 Gy 照射時 cpm/非照射−1.0×100＝=38.1 % ）。この3 Gyの照射効果は、化合物９ｂｗを64μl添加した時の3H-TdR取り込み（15,676cpm）とほぼ等しい。また、照射と化合物９ｂｗの併用により、化合物９ｂｗに対する感受性が向上する可能性も示唆された。
【００８６】
（実施例５）ヌードマウス（BALB/c-nu/nu、雄）に移植したヒト膵臓がん腫瘍に対する化合物９ｂｗ及び８ｂｗの抗腫瘍効果に関する試験
［材料及び方法］
１．実験動物：
ヌードマウス（BALB/c-nu/nu、雄、SLC)を4週令で購入して1週間の予備飼育を実施した後に5週令で使用した。
２．移植腫瘍：
腫瘍はヒト膵臓がん細胞（MIA -PaCa -2）を購入し、直径10cmの培養シャーレに専用の培養液を用いて培養した。成長したMIA-PaCa-2細胞はマイクロシリンジにてマウス右大腿部皮下に約2.5×107/60plの細胞を移植した。移植後3〜4週間で腫瘍径が7mm前後に達したマウスを選別して投与群および担癌対照群を作成した（腫瘍の発育不良な個体および極端な増殖過多な個体は除外した）。
３．試料の調整：化合物８ｂｗ及び化合物９ｂｗを使用した。これらのサンプルはPBS（−）で希釈調製した。
４．投与方法および投与量：
投与経路は腹腔内投与とし投与容量は0.2mlで45mg/kgおよび参考試験として60mg/kgを実施した。投与回数は1日1回で20回の連日投与を設定した。また同じく参考試験（本試験前の予備試験）として30mg/kg腹腔内隔日投与および同量の腫瘍内直接投与を行い、腫瘍内には100μl／腫瘍／マウスとして隔日5回の投与を実施した。
５．試験／投与群を下記の表７に示した。
【００８７】
【表７】
2011084632.tif 000027
【００８８】
［試験結果］
１．本試験：担癌ヌードマウスに対する化合物９ｂｗおよび８ｂｗの45mg/kg連続20回投与の効果
得られた結果を図１９〜図２５に示す。
【００８９】
図１９の結果において、体重に関して、化合物９ｂｗおよび８ｂｗの45mg/kg(20回）投与では投与開始から投与終了まで体重の減少は認められなかった。図２０の結果において、腫瘍重量に関して、化合物９ｂｗおよび８ｂｗの45mg/kgの(20回）投与により、腫瘍の増殖が抑制される結果が得られた。しかし投与開始時の腫瘍体積より減少する傾向は認められなかった。
【００９０】
化合物９ｂｗまたは８ｂｗ投与によるMIA-PaCa-2移植腫瘍の有効抑制率を算出した。その結果を以下の表８に示す。
【００９１】
【表８】
2011084632.tif 000028
【００９２】
有効個体：担癌対照群の平均腫瘍重量2404mgの1/3以下（801mg以下）の重量を有する個体を有効と設定した場合。1 ):20回の投与後45mg/kgを2日間追加投与し、さらに60mg/kgに増加して投与したところ翌日死亡した。この継続投与した各3匹の腫瘍重量を加えて有効抑制率を算出した。
【００９３】
図２１の結果において、解剖時の赤血球数は、正常対照群に対して担癌対照群で減少傾向がみられたが化合物９ｂｗ投与群および化合物８ｂｗ投与群ではやや増加する傾向がみられた。図２２の結果において、白血球数は担癌対照群で正常対照群に対して有意な上昇が認められた。化合物９ｂｗ投与群および化合物８ｂｗ投与群ではやや増加する傾向がみられたが、有意差を伴う数値ではなかった。図２３における結果において、血小板数は、正常対照群に対して化合物９ｂｗ投与群および化合物８ｂｗ投与群で有意な増加が認められた。正常ヌードマウスに対する安全性試験（実施例１）においてもこの傾向がみられ、本剤の特徴と思われる。
【００９４】
図２４の結果において、へモグロビン量は正常対照群、担癌対照群および化合物９ｂｗ投与群および化合物８ｂｗ投与群で近似の測定値であった。化合物８ｂｗ投与群ではやや増加する傾向がみられるが、有意差を伴う増加ではなかった。図２５の結果において、ヘマトクリット値は、化合物９ｂｗ及び化合物８ｂｗ投与群で増加する傾向がみられたが、有意差を伴う変化ではなかった。また、８ｂｗ投与群では赤血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリットなどの測定値でやや高い傾向がみられた。
【００９５】
２．参考試験（１）：担癌ヌードマウスに対する化合物９ｂｗの60mg/kg連続投与の抗腫瘍効果
比較的小さい腫瘍に化合物９ｗｂの60mg/kg連日20回投与を実施した。得られた結果を図２６~図３２に示す。
【００９６】
図２６の結果において、化合物９ｂｗの60mg/kg連日20回投においても投与群で体重の減少は認められなかった。図２７の結果において、化合物９ｂｗの60mg/kg連日20回腹腔内投与では、腫瘍の増殖抑制が認められ対照群の24.2%の重量であった。図２８の結果において、化合物９ｂｗ投与群の赤血球数は正常対照群に対し、平均で１０％の減少傾向がみられた。図２９の結果において、白血球数は化合物９ｂｗ投与群で16.2%の増加傾向がみられたが、個体差（バラツキ）がみられ、有意差を伴う変化ではなかった。図３０の結果において、血小板数は化合物９ｂｗ投与群で増加する傾向がみられた。図３１の結果において、ヘモグロビンは化合物９ｂｗ投与群および化合物８ｂｗ投与群で正常対照群に対し、約10.8%の減少がみられたが有意差を伴うことはなかった。図３２の結果において、ヘマトクリット値は正常対照群に対し有意な減少が認められた。化合物９ｂｗの60mg/kgの20回投与では、赤血球数、ヘモグロビン及びヘマトクリット値は減少し、赤血球系に対する抑制が認められた。
【００９７】
３．参考試験（２）：担癌ヌードマウスに対する化合物９ｂｗの腹腔内および腫瘍内投与の腫瘍縮小効果
本試験に先立ち、MIA-PaCa-2腫傷細胞の移植数および増殖能力を検討した。また、その際腫瘍細胞が生着したマウスに化合物９ｂｗを投与して抗腫瘍効果について検討した。
１）投与量：
化合物９ｂｗ  30mg/kg−腹腔内投与−腫瘍１〜腫瘍３(n=3)
化合物９ｂｗ  30mg/kg−腫瘍内投与−腫傷A〜B(n=2)
２）投与回数：
腹腔内投与および腫瘍内投与ともに隔日5回投与
得られた結果を図３３に示す。図３３の結果において、腫瘍体積は腹腔内投与3匹中1匹が投与前体積の約4.5倍、他の2匹が約2.4倍に増殖した。腫瘍内投与では2匹中1匹が約50％に縮小、他の1匹が約1. 5の増加であった。
【００９８】
［まとめ]
１．ヒト膵臓がん細胞であるMIA-PaCa-2は、移植後10〜14日後に一旦移植局所から消失したかの様に縮小し、その後徐々に発育する腫傷である。また、増殖し始めると移植局所で確実な発育を示す腫傷である。
２．化合物９ｂｗまたは８ｂｗの連続20回投与（45mg/kgおよび60mg/kg）による体重の減少はみられず、投与終了後の解剖所見では、臓器の癒着、腫瘍の転移などは認められなかった。また、血液検査では血小板数の増加が認められた。
３．化合物９ｂｗまたは８ｂｗの投与時（45mg/kgおよび60mg/kg）にマウスの自発運動が減少し、ゲージ内にうずくまる状態が約40〜60分継続した。またこの時点で体温が低下する傾向がみられた。この状態は60mg/kg投与時に顕著であった。
４．MIA-PaCa-2腫瘍移植マウスに対する化合物９ｂｗまたは８ｂｗの45mg/kg連日20回腹腔内投与は腫瘍増殖抑制効果が認められた。しかし、投与開始時の腫瘍に対する縮小効果はみられなかった。
５．同腫瘍移植マウスに対する化合物９ｂｗの60mg/kg連日20回腹腔内投与（参考試験）ではさらなる腫傷増殖抑制効果が認められた。
６．同腫瘍移植マウスに対するか化合物９ｂｗの30mg/kg隔日5回（10日間）の腫瘍局所内投与（参考／予備試験）では投与開始前の腫瘍体積が約50％に縮小する効果が認められた。
７．これらの結果から、化合物９ｂｗおよび化合物８ｂｗは低分子であり腹腔内投与後速やかに吸収されて排池されると推測される。この吸収され排池される時間が投与後40〜60分の自発運動低下時期であると思われる。したがって、投与した化合物９ｂｗまたは化合物８が腫傷に到達する量、もしくは到達／循環時間が非常に少なく十分な効果が発揮できないと推側される。仮に、化合物９ｂｗおよび化合物８ｂｗが腫瘍に十分に到達したなら、予備実験で示された腫瘍内投与の結果のように腫瘍縮小効果が示される可能性があると思われる。
【００９９】
（実施例６）  細胞レべルでのバイオアッセイ
MTT法を用いて腫瘍細胞に対する細胞毒性の計測を行った。MTT法は比触法の一種である。MTT試薬[3-(4,5-Dimethylthioazol-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide]は生細胞中のミトコンドリア内脱水素酵素により、不溶性のMTT formazan （暗青色）に変換される。このMTT formaznの生成量を測定し、相対的な細胞の生存率として表す。
【０１００】
手順
１．細胞の前培養：初発細胞密度が2×104 cells/cm2となるように調整したHela細胞（子宮ガン由来）懸濁液を、50μ1ずつ96 well培養ブレートの各wellに分注した。CO2インキュベーター（37℃で、CO2濃度5 %）を用いて24時問培養した。
２．検定化合物の溶解：超純水に333μg/mlとなるよう溶解した。難溶で白濁するものに関しては、マグネチックスターラーによる撹拌を２時間以上継続することをもって溶解作業が終了したものとみなした。等量の2倍濃度細胞培養液と混合した後、クリーンべンチ内で濾過滅菌と同時に48 well培養ブレートに分注した。
３．検定化合物の希釈系列の作製：クリーンべンチ内で、48well培養プレートを用いて無菌的に、5倍希釈による濃度系列を作製した。細胞毒性活性の強さに応じて以下の2種類の濃度範囲のものを準備した。
１）  100、20、4、0.8およびO（ppm）（本培養時の最終濃度）
２）  4、0.8、0.16、0.032およびO（ppm）（本培養時の最終濃度）
４．本培養：所定濃度の検定化合物を含む培養液75μlを各wellに添加して本培養を開始した（培養液の全俄は125μlとなるため、検定化合物の濃度は60％に希釈される。すなわち、333μg／ml（検定化合物溶解時）→166.5 μg／ml（2倍濃度培養液との混合時）→ 99.9μg/ml（本培養開始時））。培養期間は3日間とした。
５．MTT反応：本培養終了後の培養プレートの各wellに0.5%MTT試薬を12.5μl添加し、C02インキュべーター内に4時間放置した。イソプロパノールに溶解した0.04N HClを各wellに137.5μ1加えて反応を停止させた後、青い粒子が溶けるまで十分にピペッティングを行った。
６．吸光度の測定：プレートリーダーにより570nm（peak)と630nm（bottom）における吸収光度差を測定した。
７．細胞生存率の算出：０ppm 作用区（生存率100%)における値に対する相対値を算出し、当該濃度作用区における細胞生存率（%）とした。なお、この値がマイナスになる場合は一律細胞生存率0％とみなした。
【０１０１】
アッセイは3連で行い、数値計算は得られた3つの値の単純平均を用いて行う。
【０１０２】
（試験結果）
細胞レベルでのバイオアッセイにより得られた結果を以下の表９に示す。表上に試験された化合物番号を記載している。
【０１０３】
【表９】
2011084632.tif 000029
【０１０４】
（実施例７）化合物9bw及び8bwの正常細胞と腫瘍細胞に対する選択性
MTT法により化合物9bw及び8bwの腫瘍選択性を調べた。
【０１０５】
ヒト表皮角化細胞（正常細胞、コージンバイオ株式会社）を使用細胞とし、Cell Counting Kit-8（Dojindo）を用いてMTT法を行って、化合物9bw及び8bwの腫瘍選択性を試験した。培地としては、市販の正常ヒト表皮角化細胞用無血清培地（基礎培地＋ウシ脳下垂体エキス）を用い、凍結乾燥による濃縮によって基準の２倍濃度の培地を調製して使用した。
【０１０６】
MTT法は、キットに添付のマニュアルに従って実施した（作用期間：３日間；作用濃度：０．０３２、０．１６、０．８、４（ｐｐｍ））。
【０１０７】
得られた結果を図３４に示す。
【０１０８】
（実施例８）化合物9bw及び8bwの各種腫瘍細胞に対する作用
・試験化合物及び対照化合物
試験化合物として化合物9bw及び8bw、対照化合物としてCDDP（シスプラチン、シグマ、フランス）を用いた。
【０１０９】
試験化合物（粉末、純度１００％）をPBSで溶解し、無血清培地で目的とする濃度に希釈して試料とした。対照化合物は、PBSで所定の濃度に希釈して用いた。
・使用腫瘍細胞
使用した腫瘍細胞を以下の表１０に示す。
【０１１０】
【表１０】
2011084632.tif 000030
【０１１１】
【表１１】
2011084632.tif 000031
【０１１２】
【表１２】
2011084632.tif 000032
【０１１３】
【表１３】
2011084632.tif 000033
【０１１４】
・培養条件
湿度を保った雰囲気（５％ＣＯ２、９５％空気）内、３７℃で腫瘍細胞は付着一層または懸濁状態で培養した。培養液としては２ｍＭのＬ−グルタミンを含み、１０％fetal bovine serum（Lonza）を補充したＲＰＭＩ１６４０を用いた。試験を行う際に、付着細胞は、カルシウムまたはマグネシウムを含まないHank's培地で希釈され、完全組成の培地で中和されたtrypsin-versene（Lonza）を用いた５分間の処理で培養フラスコから剥離させた。細胞数はヘモサイトメータで計測し、細胞の生存率は０．２５％トリパンブルーの排出に基づいて算出した。各試験に用いる際の各細胞（セルライン）の生存率は少なくとも８４％であった。
・試験方法
（Ａ）  マイコプラズマ検定（Mycoplasma detection）は、MycoAlert（商標登録）マウコプラズマ検出キット（Lonza）を用い、その使用書の記載に基づいて行った。MycoAlert（商標登録）アッセイは、マイコプラズマ酵素の活性を利用した選択的な生化学試験である。生きているマイコプラズマを溶解し、ADPをATPに変換する触媒であるMycoAlert（商標登録）基質と酵素を反応させる。MycoAlert（商標登録）基質の添加の前後における試料中のATPの量（レベル）を計測することによって、マイコプラズマの有無を示す割合が得られる。マイコプラズマ検定は、細胞培養液の上清から２連で行い、陽性及び陰性の対照（MycoAlert（商標登録） Assay Control Set、Lonza）と比較された。
・結果
使用した細胞全てにおいて陰性の結果が得られた。
（Ｂ）ＩＣ50測定
・細胞増幅及び培養
腫瘍細胞は９６−ウエル平底マイクロタイタープレートに植え付け、１９０μｌの試験化合物を含まない培養液（１０％ＦＢＳ補充）で３７℃２４時間培養した。HeLa細胞を対照として用いた。各細胞の植え付け密度を下記表１１に示す。
【０１１５】
【表１４】
2011084632.tif 000034
【０１１６】
・ＩＣ50測定
細胞は、各試験化合物について１／４の段階希釈で得られた１０種の濃度のそれぞれの濃度条件において７２時間インキュベータされた。試験化合物（9bw及び8bw）を１００μＭ〜０．２８ｎＭの範囲で用い、CDDPは３３μＭ〜０．１２６ｎＭの範囲で用いた。細胞（１９０μｌ）を最終容量２００μｌの試験化合物または対照化合物を含む培養液（１０％ＦＢＳ補充）中で３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気でインキュベートされた。それぞれの化合物毎に独立した試験を３回行い、各濃度は４連の実験から得た。Ａ−６７３、ＫＢ、ＭＩＡ−ＰａＣａ−２、ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３の各細胞については、４回目の試験を行い、３回の試験での結果の確認を行った。コントロール細胞（コントロール）は試験化合物を含まない以外は同じ条件で試験した。処理の最後に、ＭＴＳアッセイにより細胞毒性について試験した。
【０１１７】
・ＭＴＳアッセイ
テトラゾリウム化合物（MTS、3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethy phenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium；プロメガ、フランス）及びPMS（エレクトロンカップリング剤：pheazine methosulfate）を用いたＭＴＳアッセイにより試験化合物及び対照化合物のin vitroでの細胞毒性試験を行った。このテトラゾリウム化合物は、細胞により還元されて、別の処理操作をする必要なく培養液に直接溶解するホルマザン化合物を生成する。細胞処理の最後に、Dulbecco's Phosphate Buffered Saline（Lonza）中のＭＴＳ（２０ｍｌ（２ｍｇ／ｍｌ））とＰＭＳ（シグマ、１ｍｌ（０．９２ｍｇ／ｍｌ））の混合物（ろ過処理済：０．２２μＭ）の４０μｌを各ウエルに加えた。培養プレートを３７℃で２４時間インキュベーとした。各ウエルでにの４９０ｎｍ吸光度（OD）をＶＩＣＴＯＲ3（商標登録）１４２０マルチラベルカウンター（パーキンエルマー、フランス）で測定した。
【０１１８】
・結果
対照化合物に対する各腫瘍細胞における化合物9bw及び8bwの相対強度（CDDPのIC50を１００とした場合の相対値）を表１２及び表１３に示す。
【０１１９】
【表１５】
2011084632.tif 000035
【０１２０】
【表１６】
2011084632.tif 000036
【０１２１】
（実施例９）MIA-Pa-Ca-2（すい臓がん）腫瘍移植マウスにおける８bwの抗腫瘍効果
健康なSWISSヌードマウス（雌）にMIA-Pa-Ca-2腫瘍断片を移植した。移植から１９日経過後、各マウス１０匹からなる４群にランダムに組分けした。マウスの腫瘍体積は１００ｍｍ3〜２００ｍｍ3であった。一回当りの投与量及び投与回数を表１４に示すように設定して、化合物8bw並びにCDDPの各々について抗腫瘍効果をみた。
【０１２２】
【表１７】
2011084632.tif 000037
【０１２３】
上記の条件での各投与の結果、10mg/kg投与の群１では、最初の２回の処理において耐性を示し、体重減少及び死亡例は見られなかった。この群では、最終的に、一匹の死亡例が認められ、更なる体重減少は見られない。これらの結果から、ヒト膵臓Mia Paca-2腫瘍を有するマウスでの8bw の10mg/kg投与での顕著な抗腫瘍効果が認められる。
【図１】
2011084632.tif 000042
【図２】
2011084632.tif 000043
【図３】
2011084632.tif 000044
【図４】
2011084632.tif 000045
【図５】
2011084632.tif 000046
【図６】
2011084632.tif 000047
【図７】
2011084632.tif 000048
【図８】
2011084632.tif 000049
【図９】
2011084632.tif 000050
【図１０】
2011084632.tif 000051
【図１１】
2011084632.tif 000052
【図１２】
2011084632.tif 000053
【図１３】
2011084632.tif 000054
【図１４】
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【図１５】
2011084632.tif 000056
【図１６】
2011084632.tif 000057
【図１７】
2011084632.tif 000058
【図１８】
2011084632.tif 000059
【図１９】
2011084632.tif 000060
【図２０】
2011084632.tif 000061
【図２１】
2011084632.tif 000062
【図２２】
2011084632.tif 000063
【図２３】
2011084632.tif 000064
【図２４】
2011084632.tif 000065
【図２５】
2011084632.tif 000066
【図２６】
2011084632.tif 000067
【図２７】
2011084632.tif 000068
【図２８】
2011084632.tif 000069
【図２９】
2011084632.tif 000070
【図３０】
2011084632.tif 000071
【図３１】
2011084632.tif 000072
【図３２】
2011084632.tif 000073
【図３３】
2011084632.tif 000074
【図３４】
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