(57)【要約】【課題】  微生物により産生されるコンドロイチナーゼに代わり、タンパク質分解酵素などの混入のおそれの少ないヒト由来のグリコサミノグリカン分解活性を有するタンパク質を、医薬などとして提供し、またこのタンパク質を用いた機能性オリゴ糖の製造方法を提供する。【解決手段】  配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号１に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数十個のアミノ酸が置換され、欠失され、または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−グルクロン酸に結合した硫酸化Ｎ−アセチル−ＤーガラクトサミンのＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を有するタンパク質を有効成分とする。【選択図】  図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号１に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数十個のアミノ酸が置換され、欠失され、または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−グルクロン酸に結合した硫酸化Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を有するタンパク質を有効成分とする、グリコサミノグリカン分解促進剤。
【請求項２】
配列番号１において１〜３３番目および／または４６３〜４８１番目のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号１において１〜３３番目および／または４６３〜４８１番目のアミノ酸残基が欠失し、さらに１個もしくは数個のアミノ酸が置換され、欠失され、または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を有効成分とする、請求項１に記載のグリコサミノグリカン分解促進剤。
【請求項３】
グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸またはコンドロイチン硫酸を含む混成多糖である、請求項１または２に記載のグリコサミノグリカン分解促進剤。
【請求項４】
コンドロイチン硫酸が、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄおよびコンドロイチン硫酸Ｅからなる群から選択される１または２以上のコンドロイチン硫酸である、請求項３に記載のグリコサミノグリカン分解促進剤。
【請求項５】
タンパク質が融合タンパク質の形態である、請求項１〜４のいずれかに記載のグリコサミノグリカン分解促進剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のグリコサミノグリカン分解促進剤および薬学的不活性成分を含む医薬組成物。
【請求項７】
脊髄損傷治療用の、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
脊椎損傷が椎間板ヘルニアによる損傷である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
椎間板ヘルニアが、硬膜外遊走型椎間板ヘルニアまたは経靭帯性脱出型椎間板ヘルニアである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
グリコサミノグリカンからグルクロン酸を非還元末端として有するオリゴ糖を製造する方法であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数十個のアミノ酸が置換され、欠失され、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−グルクロン酸に結合した硫酸化Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を有するタンパク質、配列番号１において１〜３３番目および／または４６３〜４８１番目のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、および配列番号１において１〜３３番目および／または４６３〜４８１番目のアミノ酸残基が欠失し、さらに１個もしくは数個のアミノ酸が置換され、欠失され、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−グルクロン酸に結合した硫酸化Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を有するタンパク質よりなる群から選択される１または２以上のタンパク質とグリコサミノグリカンとを反応させる工程、およびグルクロン酸を非還元末端として有するオリゴ糖を回収する工程を含む、前記方法。
【請求項１１】
グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸またはコンドロイチン硫酸を含む混成多糖である、請求項１０に記載のオリゴ糖を製造する方法。
【請求項１２】
コンドロイチン硫酸が、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄおよびコンドロイチン硫酸Ｅからなる群から選択される１または２以上のコンドロイチン硫酸である、請求項１１に記載のオリゴ糖を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト由来のグリコサミノグリカン加水分解活性を有するタンパク質を有効成分とするグリコサミノグリカン分解促進剤、およびその医薬用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
コンドロイチナーゼやヒアルロニダーゼは、コンドロイチンやヒアルロナンなどのアミノ糖を有する長鎖多糖類であるグリコサミノグリカン（ムコ多糖）を分解する酵素タンパク質として知られている。中でもコンドロイチナーゼは、ヒアルロナン、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、デルマタン硫酸などのグリコサミノグリカンを、不飽和糖を含む二糖に分解する反応を触媒する。
【０００３】
これまでに、多種の生物由来のコンドロイチナーゼが報告されている。代表的な例は、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のコンドロイチナーゼＡＢＣ（ＣＳａｓｅＡＢＣ；特許文献１）、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＡＣ（ＣＳａｓｅＡＣ；非特許文献１）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ由来のコンドロイチナーゼＡＣＩＩ（ＣＳａｓｅ ＡＣＩＩ；非特許文献２）、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．Ｈｐ１０２由来のコンドロイチナーゼ ＡＣＩＩＩ、コンドロイチナーゼＣ（ＣＳａｓｅ ＡＣＩＩＩ、ＣＳａｓｅＣ；非特許文献３）、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＢ（ＣＳａｓｅＢ；非特許文献４）などである。
【０００４】
ＣＳａｓｅＡＢＣ（ＥＣ ４．２．２．４）は、哺乳動物軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ａ、サメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ｃおよび哺乳動物皮膚由来のコンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸）のみならず、ヒアルロナンも分解するという特異性を有するタンパク質であり、動物組織からのグリコサミノグリカンの除去剤、また組織中のグリコサミノグリカンを同定するための試薬として市販されている。
【０００５】
最近、コンドロイチナーゼ、特にＣＳａｓｅＡＢＣあるいはＣＳａｓｅＡＣを、椎間板腔に直接投与する椎間板ヘルニア治療剤として利用する試みが行なわれている（特許文献２）。従来、植物パパイヤ由来のタンパク分解酵素キモパパインや、バクテリア由来の膠質分解酵素コラゲナ−ゼなどをヘルニア症患者の椎間板腔に注入する、椎間板溶解療法（ＩＤ療法）が利用されてきた。しかし、タンパク分解酵素を用いるＩＤ療法には、脊椎・椎間板のヘルニア部分のみならず周辺の構造組織のタンパク部分が分解されるために神経麻痺やアレルギー発現などの副作用を生じやすい、という欠点が指摘されている。
【０００６】
したがって、タンパク質分解酵素ではなく、グリコサミノグリカン分解酵素活性を有するコンドロイチナーゼを用いた脊椎損傷治療に、多くの期待が寄せられている。しかし、既知のコンドロイチナーゼの多くはタンパク質分解酵素も同時に生産する微生物から得られるものがほとんどである。ＣＳａｓｅＡＢＣは、その典型例である。その微生物培養物には、プロテアーゼ活性、エンドトキシン活性、さらには核酸などが混在しているため、微生物由来のコンドロイチナーゼの椎間板ヘルニアの治療薬として人体に投与するための高純度の試薬への利用は、不都合な面を有している。
【０００７】
一方、本発明者らによって、線虫由来のコンドロイチナーゼ活性を有する酵素タンパク質であるＣｅ−Ｃｈａｓｅが開示されている（非特許文献５）が、ヒト由来のコンドロイチナーゼ活性を有する酵素タンパク質ではない。
【０００８】
さらに、ヒアルロニダーゼ活性を有する酵素タンパク質をコードする遺伝子とされていたヒトＨＹＡＬ４（Ｈｙａｌｕｒｏｎｏｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ４）遺伝子がコンドロイチン硫酸特異的な酵素タンパク質をコードするのではないかとの示唆がされている（非特許文献６）が、どのような酵素であるかなど、何ら具体的な開示がなされていない。
【０００９】
また、長鎖多糖類であるグリコサミノグリカンについては保湿性、潤滑性その他の有用性が指摘されており、グリコサミノグリカンを含む健康食品や医薬が種々開発されているが、これらの多糖類に代わり、これを低分子化したオリゴ糖についても様々な生理活性機能を有することが期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平６−１５３９４７号公報
【特許文献２】米国特許第４６９６８１６号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】中川允利ら、帯大研法Ｉ、１７、７〜１２（１９９０）
【非特許文献２】Ｈｉｙａｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９７５年、第２５０巻、第１８２４頁
【非特許文献３】宮園博文ら、「生化学」、１９８９年、第６１巻、第１０２３頁
【非特許文献４】Ｍｉｃｈｅｌａｃｃｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、１９７４年、第５６巻、第９７３頁
【非特許文献５】Ｋａｎｅｉｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００８年、第２８３巻、第１４９７１頁
【非特許文献６】Ｃｓｏｋａら、Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ．、２００１年、第２０巻、第４９９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明においては、微生物により産生されるコンドロイチナーゼに代わり、タンパク質分解酵素などの混入のおそれの少ないヒト由来のグリコサミノグリカン分解活性を有するタンパク質を、医薬などとして提供し、またこのタンパク質を用いた機能性オリゴ糖の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、ヒトにおけるコンドロイチンの生理機能に関する研究過程において、ヒトにコンドロイチナーゼ活性を有する酵素タンパク質が存在することを見いだし、下記の各発明を完成した。
【００１４】
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号１に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数十個のアミノ酸が置換され、欠失され、または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−グルクロン酸に結合した硫酸化Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を有するタンパク質を有効成分とする、グリコサミノグリカン分解促進剤。
【００１５】
（２）配列番号１において１〜３３番目および／または４６３〜４８１番目のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号１において１〜３３番目および／または４６３〜４８１番目のアミノ酸残基が欠失し、さらに１個もしくは数個のアミノ酸が置換され、欠失され、または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を有効成分とする、（１）に記載のグリコサミノグリカン分解促進剤。
【００１６】
（３）グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸またはコンドロイチン硫酸を含む混成多糖である、（１）または（２）に記載のグリコサミノグリカン分解促進剤。
【００１７】
（４）コンドロイチン硫酸が、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄおよびコンドロイチン硫酸Ｅからなる群から選択される１または２以上のコンドロイチン硫酸である、（３）に記載のグリコサミノグリカン分解促進剤。
【００１８】
（５）タンパク質が融合タンパク質の形態である、（１）〜（４）のいずれかに記載のグリコサミノグリカン分解促進剤。
【００１９】
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載のグリコサミノグリカン分解促進剤および薬学的不活性成分を含む医薬組成物。
【００２０】
（７）脊髄損傷治療用の、（６）に記載の医薬組成物。
【００２１】
（８）脊椎損傷が椎間板ヘルニアによる損傷である、（７）に記載の医薬組成物。
【００２２】
（９）椎間板ヘルニアが、硬膜外遊走型椎間板ヘルニアまたは経靭帯性脱出型椎間板ヘルニアである、（８）に記載の医薬組成物。
【００２３】
（１０）グリコサミノグリカンからグルクロン酸を非還元末端として有するオリゴ糖を製造する方法であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数十個のアミノ酸が置換され、欠失され、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−グルクロン酸に結合した硫酸化Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を有するタンパク質、配列番号１において１〜３３番目および／または４６３〜４８１番目のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、および配列番号１において１〜３３番目および／または４６３〜４８１番目のアミノ酸残基が欠失し、さらに１個もしくは数個のアミノ酸が置換され、欠失され、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−グルクロン酸に結合した硫酸化Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を有するタンパク質よりなる群から選択される１または２以上のタンパク質とグリコサミノグリカンとを反応させる工程、およびグルクロン酸を非還元末端として有するオリゴ糖を回収する工程を含む、前記方法。
【００２４】
（１１）グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸またはコンドロイチン硫酸を含む混成多糖である、（１０）に記載のオリゴ糖を製造する方法。
【００２５】
（１２）コンドロイチン硫酸が、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄおよびコンドロイチン硫酸Ｅからなる群から選択される１または２以上のコンドロイチン硫酸である、請求項１１に記載のオリゴ糖を製造する方法。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のグリコサミノグリカン分解促進剤は、細菌毒素などを含まないヒト由来の酵素タンパク質を有効成分とするグリコサミノグリカン分解促進剤として、脊椎障害などの治療に利用可能である。また、グリコサミノグリカン分解促進剤であるタンパク質を用いて製造されるオリゴ糖は、非還元末端にグルクロン酸を有する様々な構造からなるオリゴ糖であり、哺乳動物、特にヒトに対して抗原性の低い安全な機能性オリゴ糖を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】組み換え細胞に発現させたタンパク質について銀染色法およびウエスタン法を行った図である。レーン１〜３は銀染色法を行った結果を示す。レーン４および５は還元条件でウエスタン法を行った結果を示し、レーン６および７は非還元条件でウエスタン法を行った結果を示す。レーン２、４、６は組み換え細胞の培地から得たタンパク質について行った結果であり、レーン３、５、７はコントロールとして、組み換えを行っていない細胞の培地から得たタンパク質について行った結果である。レーン１は分子量マーカーである。
【図２】酵素反応前のＦＩＴＣでラベルしたヒアルロン酸（パネルＡ）、ＣＳ−Ａ（パネルＣ）、ＣＳ−Ｃ（パネルＥ）、ＣＳ−Ｄ（パネルＧ）のゲル濾過の溶出パターンと、酵素反応によるそれぞれの分解生成物のゲル濾過の溶出パターン（パネルＢ、Ｄ、ＦおよびＨ）を示す図である。Ｖ０はボイド、Ｖｔは全容量をそれぞれ示す。
【図３】２ＡＢで蛍光標識した分解生成物のゲル濾過の溶出パターンを示す図である。パネルＡはＣＳ−Ｄ、パネルＢはＣＳ−Ｃ、パネルＣはＣＳ−Ａの結果を示す。またＶ０はボイド、Ｖｔは全容量をそれぞれ示す。また図中の▼で示した各ピークを分取し、それぞれ抽出物Ｄ−１、Ｄ−２およびＤ−３としている。
【図４】グリコサミノグリカン分解活性を有するタンパク質であるヒトＣＳＨＹのＣＳ−Ｄ分解活性の最適ｐＨを示すグラフ図である。
【図５】ＣＳ−Ａ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−ＤおよびＣＳ−Ｅの、濃度を変えたものをそれぞれヒトＣＳＨＹで加水分解した際の反応初速度を用いて作成したＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを示すグラフ図である。グラフＡ、Ｂ、ＣおよびＤは、それぞれＣＳ−Ａ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−ＤおよびＣＳ−Ｅの結果を示す。
【図６】ＣＳ−ＤのヒトＣＳＨＹ分解生成物である抽出物Ｄ−１、Ｄ−２およびＤ−３をＣＳａｓｅ ＡＣ−ＩＩで消化し、得られた分解生成物を２ＡＢで蛍光標識してアニオン交換クロマトグラフィー分析した結果を示す図である。
【図７】ＣＳ−ＡおよびＣＳ−ＣのヒトＣＳＨＹ分解生成物をＣＳａｓｅ ＡＣ−ＩＩで消化し、得られた分解生成物を２ＡＢで蛍光標識してアニオン交換クロマトグラフィー分析した結果を示す図である。
【図８】ＣＳ−Ｃ中におけるヒトＣＳＨＹによって切断される部位の構造を示す模式図である。
【図９】ＣＳ−Ｄに対する変異ヒトＣＳＨＹの分解活性を示す図である。パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦはそれぞれ、無活性コントロール、変異体１、変異体２、変異体４、変異体３および有活性コントロール（野生型）を用いた場合の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明に係るグリコサミノグリカン分解促進剤について詳細に説明する。本発明のグリコサミノグリカン分解促進剤は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる、ヒト由来のタンパク質を有効成分とする。
【００２９】
配列番号１のアミノ酸配列をコードするヒトＨＹＡＬ４（Ｈｙａｌｕｒｏｎｏｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ４）遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋＴＭ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿０１２２６９として、２００８年に登録されている。このヒトＨＹＡＬ４遺伝子は、５’末端側に６３８ｂｐの非翻訳領域を、４つのＮ−グリコシル化部位をもつ４８１アミノ酸残基に相当する１４４６ｂｐのＯＲＦを、そして３’末端側に３２７ｂｐの非翻訳領域を有している。また、膜タンパク質における二次構造を予測するＳＯＳＵＩ Ｓｙｓｔｅｍ（ｈｔｔｐ：／／ｂｐ．ｎｕａｐ．ｎａｇｏｙａ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉ／）を用いた、前記ＯＲＦにコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質の二次構造の解析から、同タンパク質は、Ｎ末端３３アミノ酸残基からなる疎水性領域と、Ｃ末端１９アミノ酸残基からなるＧＰＩアンカー領域とを有する、Ｉ型の膜貫通型タンパク質であると推測される。
【００３０】
さらに、タンパク質のアミノ酸配列情報に関するデータベースに対して、前記ＯＲＦにコードされているアミノ酸配列に相同なタンパク質の検索を行うことにより、ヒト由来のヒアルロニダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋＴＭ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿００７３１２）が４０％の相同性を有するタンパク質として特定される。しかしながら、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の機能ないし生理活性は、不明なままであった。
【００３１】
また、前述のとおり、Ｃｓｏｋａらにより、ＨＹＡＬ４遺伝子がコンドロイチン硫酸特有の酵素タンパク質をコードするのではないかとの示唆がされていたが、どのような酵素であるかなど、何ら具体的な開示がなされていなかった（非特許文献６）。
【００３２】
本発明者らは、その後の研究により、前記配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質が、Ｄ−グルクロン酸に結合した硫酸化Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を有し、グリコサミノグリカン、特にコンドロイチン硫酸またはコンドロイチン硫酸を含む混成鎖からなるグリコサミノグリカンに対して分解活性を示すタンパク質であることを、組み換え細胞を用いて発現させた当該タンパク質を利用した実験を通じて確認した。本発明はかかる知見に基づいて完成された発明である。以下、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をヒトＣＳＨＹと表すこととする。
【００３３】
既知のコンドロイチナーゼのアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列との間の同一性は、配列番号１のアミノ酸配列を１００とすると、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のＣＳａｓｅＡＢＣが０．５％、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のＣＳａｓｅＡＣが５．７％、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ由来のＣＳａｓｅ ＡＣＩＩが２．５％、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のＣＳａｓｅＢが５．３％である。このように、本発明のヒトＣＳＨＹは、既知のコンドロイチナーゼに対してはほとんど同一性を示さない、特徴的なアミノ酸配列を有している。
【００３４】
ヒトＣＳＨＹのグリコサミノグリカン分解活性は、グリコサミノグリカン、例えばコンドロイチン硫酸を基質として適当な緩衝液中でヒトＣＳＨＹを反応させることにより生じる分解生成物を、ゲル濾過その他の方法で検出することによって確認することができる。特に、基質であるグリコサミノグリカンをＦＩＴＣ（フルオレセイン５（６）イソチオシアネート）やその他の適当なラベリング試薬を用いてあらかじめラベルしておき、蛍光その他のシグナルを利用して分解生成物を検出あるいは定量することで、グリコサミノグリカンの分解活性を簡便に測定し、さらには定量することができる。
【００３５】
ＣＯＳ７細胞を用いて組み換えタンパク質として発現させたヒトＣＳＨＹと、ＦＩＴＣでラベル化した各種グリコサミノグリカンとを反応させ、またはヒトＣＳＨＹと各種グリコサミノグリカンとを反応させて得られた生成物を２−アミノベンズアミド（２ＡＢ）でラベル化することによって確認されたヒトＣＳＨＹの酵素学的性質は、次の通りである。
【００３６】
１）ヒトＣＳＨＹはＤ−グルクロン酸に結合した硫酸化Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を有する。その結果、コンドロイチン硫酸またはコンドロイチン硫酸を含む混成鎖を有するグリコサミノグリカンを分解する。特にコンドロイチン硫酸に対して高い分解活性を示し、コンドロイチンに対してはほとんど分解活性を示さない。分解活性の高低は、コンドロイチン硫酸Ｄ＞コンドロイチン硫酸Ｃ＞コンドロイチン硫酸Ａ＞コンドロイチン硫酸Ｅである。コンドロイチン硫酸Ｄを基質としたときのヒトＣＳＨＹとの親和性を１００とすると、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ａまたはコンドロイチン硫酸Ｅを基質としたときの親和性は、それぞれ５０、３３．３および５である。また、コンドロイチン硫酸を含む混成鎖を有するグリコサミノグリカンに対しては、コンドロイチン硫酸とそれ以外のグリコサミノグリカンとの混成比によって分解活性は変動する。
【００３７】
２）例えば、ヒトＣＳＨＹによるコンドロイチン硫酸Ｄの分解反応による生成物は、ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）β１−４ＧｌｃＡ（２Ｓ）β１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（「ＧｌｃＡ」はＤ−グルクロン酸を、「ＧａｌＮＡｃ」はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを、「β１−３」はβ１−３結合を、「β１−４」はβ１−４結合を、「ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）またはＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）」はＧａｌＮＡｃの４位または６位が硫酸化していることを、「ＧｌｃＡ（２Ｓ）」はＧｌｃＡの２位が硫酸化していることを、それぞれ示す）であり、還元末端はＧａｌＮＡｃ（Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン）である。この結果は、ヒトＣＳＨＹが加水分解酵素であるエンド−β−ガラクトサミニダーゼの一種であることを示すものである。なお、既知のコンドロイチナーゼは、いずれも細菌由来であり、かつ加水分解酵素ではなく脱離酵素（エリミナーゼ）である。既知の細菌由来コンドロイチナーゼと本発明のヒトＣＳＨＹとの間にほとんど同一性がないのは、この反応機構の相違と関係しているものと推察される。
【００３８】
３）ヒトＣＳＨＹのコンドロイチン硫酸分解活性の好ましいｐＨはｐＨ４．５〜６．５であり、より好ましいｐＨはｐＨ４．５〜６．０であり、さらに好ましいｐＨはｐＨ４．５〜５．５、最も好ましいｐＨは５．０である。
【００３９】
このように、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃおよびデルマタン硫酸を強く分解し、ヒアルロナンを弱く分解する脱離酵素の一種である従来のＣＳａｓｅＡＢＣ、ＢＣ、ＡＣＩＩなどと比較して、加水分解酵素の一種であるヒトＣＳＨＹは、Ｄ−グルクロン酸に結合した硫酸化Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解し、特にコンドロイチン硫酸に対して高い分解活性を有する酵素タンパク質である。
【００４０】
本発明は、上記に説明したヒトＣＳＨＹ、すなわち配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を有効成分とするグリコサミノグリカン分解促進剤に加えて、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が置換され、欠失され、または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−グルクロン酸に結合した硫酸化Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を有するタンパク質を有効成分とするグリコサミノグリカン分解促進剤を提供する。
【００４１】
本発明におけるアミノ酸配列の置換、欠失、および／または付加に関する「１若しくは数十個」とは、１〜数十アミノ酸以内、好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜３０個、特に好ましくは１〜１５個のアミノ酸残基の変化を意味する。アミノ酸配列の同一性（％）で表せば、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列として表すことができる。
【００４２】
タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸残基の電荷、大きさ、疎水性などの物理化学的性質について、保存性の高い変異が許容され得ることが、経験的に認められている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）などが挙げられる。また、上述の保存性を超えた場合でも、なおそのタンパク質の本質的な機能を失わない変異が存在し得ることも当業者において経験されるところである。
【００４３】
従って、配列番号１に記載されたアミノ酸配列において、１若しくは数十個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、Ｄ−グルクロン酸に結合した硫酸化Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を分解する活性を有する場合もあり、このようなタンパク質をグリコサミノグリカン分解促進剤として利用することは本発明の一態様である。例えば、後に詳細に説明するように、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端３３アミノ酸残基および／またはＣ末端１９アミノ酸残基からなる疎水性領域を欠失させたアミノ酸配列からなるヒトＣＳＨＹは、コンドロイチン硫酸を分解する活性を保持している。かかるＮ末端３３アミノ酸残基および／またはＣ末端１９アミノ酸残基が欠失されたタンパク質も本発明であるヒトＣＳＨＹの一態様である。
【００４４】
すなわち本発明は、配列番号１において１〜３３番目および／または４６３〜４８１番目のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号１において１〜３３番目および／または４６３〜４８１番目のアミノ酸残基が欠失し、さらに１個もしくは数個のアミノ酸が置換され、欠失され、または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−グルクロン酸に結合した硫酸化Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を有するタンパク質、さらにはそれらタンパク質を有効成分とするグリコサミノグリカン分解促進剤も提供するものである。
【００４５】
また上記のヒトＣＳＨＹは、そのＮ末端および／またはＣ末端に、その他のタンパク質またはポリペプチドを付加させた、いわゆる融合タンパク質として製造し、グリコサミノグリカン分解促進剤として利用することができる。このような融合タンパク質およびそのグリコサミノグリカン分解促進剤としての利用も、本発明の一態様である。かかる融合タンパク質は、ヒトＣＳＨＹにその他のタンパク質またはポリペプチドが示す機能が付加される点で、ヒトＣＳＨＹを単独で製造し、あるいは使用する場合に比べて、高められた有用性を有する。
【００４６】
タンパク質の例としては、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、プロテインＡ、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ、プレプロトリプシンその他の、融合タンパク質の製造に汎用されるタンパク質を挙げることができる。また、ＦＬＡＧ（Ｒ）タグ、ヒスチジンタグまたはキチン結合配列のように、組み換えタンパク質の製造、特に組み換えタンパク質の精製を容易にするポリペプチドを利用すれば、ヒトＣＳＨＹの製造をより有利に行うことができる。
【００４７】
さらに、ヒトＣＳＨＹには、必要に応じて、蛍光物質や放射性物質などの適当な標識化合物を付加したり、種々の化学修飾物質やポリエチレングリコールなどの高分子を結合させたりすることが可能であり、あるいはヒトＣＳＨＹを不溶性担体へ結合させたりすることも可能である。こうしたタンパク質を対象とした化学的修飾法は当業者に広く知られており、本発明で使用されるタンパク質の機能を損なわない限り、どの様に修飾し、利用してもよい。かかる修飾を有する前記ヒトＣＳＨＹを有効成分とするグリコサミノグリカン分解促進剤も、本発明の一態様である。
【００４８】
本発明にかかるヒトＣＳＨＹは、ヒト細胞から直接精製して使用してもよいが、ヒトＣＳＨＹをコードする核酸、配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡを用い、組み換えタンパク質として製造することが好ましい。
【００４９】
配列番号２に示される塩基配列からなる核酸は、ヒトゲノムＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、配列番号２に示される塩基配列情報を基に適当なＰＣＲプライマーを設計、合成し、ｃＤＮＡライブラリーに対して公知の方法（例えばＭｉｃｈａｅｌ Ａ．Ｉ．ら，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９０年参照）に従ってＰＣＲ反応を行うことで、クローニングする事ができる。また配列番号２に示される塩基配列からなる核酸は、本明細書に開示された塩基配列情報を基に、ホスホアミダイト法などの化学合成的手法により、あるいは市販のＤＮＡシンセサイザーなどを用いて製造することもできる。
【００５０】
なお、ヒトＣＳＨＹは、ヒト細胞から直接精製して使用する場合、あるいはＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを鋳型として配列番号２に示される塩基配列からなる核酸をクローニングする場合の器官などは特に限定されないが、本実施例においてはヒト胎盤のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として当該クローニングを行っている。
【００５１】
本発明にかかるヒトＣＳＨＹをコードするＤＮＡは、適当な発現ベクターに組み換えることができ、かかる組み換えベクターは前記した本発明で使用されるタンパク質の組換え的生産に利用される。当該組換えベクターは、環状、直鎖状などいかなる形態のものであってもよい。かかる組換えベクターは、本発明で使用されるタンパク質をコードする核酸に加え、必要ならば他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列とは、リーダー配列、エンハンサー配列、プロモーター配列、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他のポリペプチドをコードする塩基配列、ポリＡ付加配列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列などのことである。
【００５２】
融合タンパク質の作成や変異タンパク質の作成の際に行う遺伝子組み換えの方法としては、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを、ヒトＣＳＨＹをコードする核酸に付加したり、あるいは塩基配列内に適当な制限酵素切断配列を新たに発生させたりあるいは消失させたりすることも可能である。これらは当業者が通常行う作業の範囲内であり、当業者はヒトＣＳＨＹをコードするＤＮＡを基に任意かつ容易に加工することができる。
【００５３】
また本発明で使用されるタンパク質をコードする核酸を保持するベクターは、使用する宿主に応じた適当なベクターを選択して使用すればよく、プラスミドの他にバクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルスなどの種々のウイルスを用いることも可能である。
【００５４】
利用可能な市販の発現ベクターとしては、ｐｃＤＭ８（フナコシ社）、ｐｃＤＮＡＩ（フナコシ社）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＧＢＴ−９(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社)、ｐＧＥＭ（Ｒ）−Ｔ Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ｐ３ＸＦＬＡＧ−ＣＭＶ−８（Ｓｉｇｍａ社）などを例示することができる。
【００５５】
本発明で使用されるタンパク質の発現は、このタンパク質をコードする遺伝子固有のプロモーター配列の制御下に発現させることができる。あるいは、本発明で使用されるタンパク質をコードする塩基配列の上流に別の適当な発現プロモーターを連結して使用することもできる。
【００５６】
発現プロモーターは、宿主および発現の目的に応じて適宜選択すればよく、例えば宿主が大腸菌である場合にはＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λＰＬプロモーターなどが、宿主が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが、宿主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィルスプロモーター、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを挙げることができる。
【００５７】
本発明で使用されるタンパク質をコードする核酸、好ましくはＤＮＡを上記に例示されたプロモーターに連結する、あるいは発現ベクターに組み込むなどの操作は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら｛Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），１９８９年、参照｝をはじめとする、種々の遺伝子組み換え操作を詳細に解説した実験操作マニュアル書の指示に基づいて行うことができる。
【００５８】
宿主細胞の例としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、エルウニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属細菌、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属微生物、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属微生物、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母などの微生物、カイコなどの昆虫細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＭＥＦ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＷＩ３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ１２７細胞、ＨＫＧ細胞、ヒト腎細胞株などの動物細胞を挙げることができる。中でも、真核生物の細胞、特にＣＯＳ−７細胞などの哺乳類細胞の利用が好ましい。
【００５９】
宿主細胞に発現ベクターを導入する方法としては、前記のＳａｍｂｒｏｏｋらを初めとする実験操作マニュアル書に記載されている方法、例えば、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈澱法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法などにより行うことができる他、例えば、ＮｕｐｈｅｒｉｎＴＭ −Ｎｅｕｒｏｎ（ＢＩＯＭＯＬ社）、ＨｉｌｙＭａｘ（同仁化学研究所）、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅＴＭ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）、ｊｅｔＰＥＩ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ社）、ＰｏｌｙＭａｇ（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ＦｕＧＥＮＥ（Ｒ） ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）、ＦｕＧＥＮＥ（Ｒ） ６（Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）などの市販のトランスフェクション試薬を用いて行うことができる。Ｓｆ９やＳｆ２１などの昆虫細胞の利用については、バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２年）やＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９８８年、第６巻、第４７頁などに記載されている。
【００６０】
本発明で使用されるタンパク質は、前記の発現ベクターを上記の宿主細胞内で発現させ、宿主細胞あるいは培地から目的とするタンパク質を回収し、精製することによって得ることができる。タンパク質を精製する方法としては、タンパク質の精製に通常使用されている方法の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン（アニオン、カチオン）交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィーなどの各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーなど、通常使用され得る方法の中から適切な方法を適宜選択し、必要により高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＨＰＬＣ）システムなどを使用して適当な順序で精製を行えばよい。
【００６１】
本発明で使用されるタンパク質を他の機能性タンパク質やポリペプチドとの融合タンパク質として発現させた場合には、その機能性タンパク質やポリペプチドに特徴的な精製法を採用することが好ましい。融合タンパク質は、適当なプロテアーゼ（トロンビン、トリプシンなど）を用いて切断し、本発明のタンパク質を回収することができる。
【００６２】
このように本発明で使用されるタンパク質は、それ単独の形態でも別種のタンパク質との融合タンパク質の形態でも調製することができるが、これらのみに制限されるものではなく、本発明で使用されるタンパク質をさらに種々の形態へと変換させることも可能である。例えば、タンパク質に対する種々の化学修飾、ポリエチレングリコールなどの高分子との結合、不溶性担体への結合、リポソームへの封入など、当業者に知られている多種の手法による加工が考えられる。
【００６３】
また本発明で使用されるタンパク質は、例えばＦｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)やｔＢｏｃ法(ｔ−ブチルオキシカルボニル法)などの、有機化学的合成方法、あるいは市販されている適当なペプチド合成機を用いて製造することもできる。
【００６４】
本発明は、上記したヒトＣＳＨＹを有効成分とするグリコサミノグリカン分解促進剤、およびこのグリコサミノグリカン分解促進剤と薬学的不活性成分とを含む医薬組成物を提供する。当該医薬組成物は、脊髄損傷治療用、特に椎間板ヘルニア、より好ましくは硬膜外遊走型椎間板ヘルニアまたは経靭帯性脱出型椎間板ヘルニアによる脊椎損傷を治療するための医薬組成物である。
【００６５】
医薬組成物中のヒトＣＳＨＹの含有量は、脊椎に損傷を与えているグリコサミノグリカンを含む物質、具体的には髄核を分解ないし溶解するための有効量であればよい。ここで「有効量」とは、突出、遊走などにより脊髄硬膜外腔に存在する髄核を溶解し、髄核による影響を排除することのできる量を意味する。
【００６６】
薬学的不活性成分は、それ自体は治療目的に対する有効成分ではない、すなわち薬理活性を持たない成分であるが、担体、賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤その他のような、薬剤あるいは医薬組成物の調製に通常用いられる成分を意味する。
【００６７】
例えば、担体あるいは賦形剤としては、デキストラン類、スクロース、ラクトース、マルトース、キシロース、トレハロース、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、イノシトール、血清アルブミン、ゼラチン、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール）などを挙げることができる。
【００６８】
本発明組成物中のヒトＣＳＨＹと薬学的不活性成分の配合比率は特に限定されるものではなく、投与量や組成物の形態などに応じて、当業者が適宜決定することができる。また本発明のグリコサミノグリカン分解促進剤またはこれを含む医薬組成物は、液剤、固体剤、ペーストその他の形態のいずれであってもよく、それらは製剤学的に公知の方法を採用することで、適宜調製することができる。好ましい形態は、ヒトＣＳＨＹを含む注射用製剤の形態であり、特に凍結乾燥状態の製剤である。かかる製剤は、タンパク質を含む注射用製剤、特に凍結乾燥製剤を調製する一般的な方法によって製造することができる。
【００６９】
なお、本発明のグリコサミノグリカン分解促進剤、およびこのグリコサミノグリカン分解促進剤と薬学的不活性成分とを含む医薬組成物には、ヒトＣＳＨＹのＤ−グルクロン酸に結合した硫酸化Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を抑制あるいは不活性化するものでなければ、鎮痛剤、消炎剤その他の薬理活性成分を含んでいてもよい。
【００７０】
本発明の医薬組成物は、脊椎損傷、例えば椎間板ヘルニアによる脊椎損傷、特に硬膜外遊走型椎間板ヘルニアや経靭帯性脱出型椎間板ヘルニアなどの、突出や遊離などによって髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアの治療に用いることができる。ヘルニアによる脊椎損傷に対するＣＳａｓｅＡＢＣによる治療効果はすでに確認されており（池上ら、「臨床整形外科」、２００７年、第４２巻、第２号、第１２４−１２８頁）、コンドロイチンを分解する活性を有するヒトＣＳＨＹも、ＣＳａｓｅＡＢＣと同様、脊椎損傷、特に椎間板ヘルニアによる脊椎損傷に対する治療効果を有するものである。
【００７１】
また、これまでに医薬として利用が検討されているＣＳａｓｅＡＢＣを初めとする細菌由来の既知のコンドロイチナーゼは、脱離反応によって、非還元末端に不飽和結合を持つウロン酸を有するオリゴ糖を生成させる。不飽和ウロン酸は哺乳動物には存在しない糖であり、哺乳動物に対して抗原性を示す。そのため、既知の細菌由来のコンドロイチナーゼの利用は、ヒトに対して抗原性を示す物質が投与されたヒトの体内で生成してしまうという問題を有している。一方の本発明にかかるヒトＣＳＨＹは、加水分解反応によって、非還元末端に不飽和結合を持たないグルクロン酸を有するオリゴ糖が生成される。グルクロン酸は哺乳動物に対する抗原性は非常に低く、従って、ヒトＣＳＨＹを含むグリコサミノグリカン分解促進剤またはこのグリコサミノグリカン分解促進剤と薬学的不活性成分とを含む医薬組成物をヒトに投与しても、細菌由来の既知のコンドロイチナーゼの投与で指摘される問題は発生しない。
【００７２】
本発明は、上記の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数十個のアミノ酸が置換され、欠失され、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−グルクロン酸に結合した硫酸化Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を有するタンパク質、配列番号１において１〜３３番目および／または４６３〜４８１番目のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、および配列番号１において１〜３３番目および／または４６３〜４８１番目のアミノ酸残基が欠失し、さらに１個もしくは数個のアミノ酸が置換され、欠失され、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−グルクロン酸に結合した硫酸化Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を有するタンパク質よりなる群から選ばれるタンパク質とグリコサミノグリカンとを反応させる工程、およびグルクロン酸を非還元末端として有するオリゴ糖を回収する工程を含む、グリコサミノグリカンからグルクロン酸を非還元末端として有するオリゴ糖を製造する方法も提供する。
【００７３】
タンパク質とグリコサミノグリカンとを反応させる工程は、先に説明したヒトＣＳＨＹのグリコサミノグリカン分解活性が発揮されるｐＨ、温度などの条件において、適当量の基質と酵素タンパク質とを混合してインキュベートする工程である。ヒトＣＳＨＹは組み換え生産されたタンパク質であることが好ましく、特に適当なレジンに固相化したヒトＣＳＨＹであることが特に好ましい。かかる固相化されたヒトＣＳＨＹを利用すれば、固相化した酵素タンパク質とグリコサミノグリカンを連続的に反応させることで、機能性グリコサミノグリカンを連続的に、また大量に製造することができる。
【００７４】
グルクロン酸を非還元末端として有するオリゴ糖を回収する工程は、タンパク質とグリコサミノグリカンとを反応させた後の反応液から、生成物であるグルクロン酸を非還元末端として有するオリゴ糖を、反応液の形態で回収する、部分的に精製された形態で回収する、または実質的に完全に精製された形態で回収する工程である。上記したような固相化した酵素タンパク質とグリコサミノグリカンとの連続反応では、固相担体から分離される反応液の形態ですでに生成物であるオリゴ糖は十分に精製された状態になっている。またオリゴ糖は、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン（アニオン、カチオン）交換クロマトグラフィーその他のオリゴ糖の精製に通常用いられる、当業者に広く知られた種々の分画方法によって、高度に精製し、あるいはオリゴ糖の構成糖の種類、あるいは糖鎖数毎にさらに細かく分画して利用してもよい。
【００７５】
グルクロン酸を非還元末端として有するオリゴ糖は、ヒトに対する抗原性が非常に低く、かつグリコサミノグリカンとして抗炎症作用、癌転移の阻害その他の有用な機能を発揮することが期待されており、本発明は、かかる機能性オリゴ糖を製造する方法として有益である。
【００７６】
なお、本発明におけるヒトＣＳＨＹはコンドロイチン硫酸やコンドロイチン硫酸を含む混成多糖に対して、特にコンドロイチン硫酸に対して高い分解活性を示すことから、本発明のグリコサミノグリカン分解促進剤およびこれを含む医薬の好ましい態様は、コンドロイチン分解促進剤、コンドロイチン硫酸分解促進剤またはそれらを含む医薬であり、特に好ましい態様はコンドロイチン分解促進剤またはそれを含む医薬である。また同様に、グリコサミノグリカンからオリゴ糖を製造する方法の好ましい態様は、コンドロイチン硫酸またはコンドロイチン硫酸を含む混成多糖からオリゴ糖を製造する方法であり、特に好ましい態様はコンドロイチン硫酸からオリゴ糖を製造する方法である。
【００７７】
以下、本発明に係るグリコサミノグリカン分解促進剤について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００７８】
＜実施例１＞  組み換えヒトＣＳＨＹの製造
（１）クローニング
ヒトＨＹＡＬ４遺伝子の塩基配列情報を基に下記の２組のプライマーＤＮＡを用意し、ヒト胎盤のｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてネスティッドＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）を行った。
【００７９】
プライマーＦ１（配列番号３）
５’−ＧＧＴＴＴＧＧＡＧＣＣＡＴＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＣＣ−３’ 
プライマーＲ１（配列番号４）
５’−ＴＴＴＣＣＴＡＧＣＣＡＧＡＣＴＧＧＡＧＧＣ−３’
プライマーＦ２（配列番号５）
５’−ＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＡＣＴＡＡＡＧＧＡＣＣＡ−３’
プライマーＲ２（配列番号６）
５’−ＣＡＴＣＣＴＴＣＴＴＴＡＡＡＴＧＡＣＴＡＧＧＣ−３’
【００８０】
ＰＣＲは、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）を用い、５％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシドの存在下で、［９４℃を３０秒間、５５℃で４５秒間、６８℃で２分間］からなるサイクルを３０回行った。増幅されたＤＮＡ断片（約１．４ｋｂｐ）を回収し、末端にアデノシンモノリン酸を付加し、ｐＧＥＭ（Ｒ）−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に挿入した。挿入部分の塩基配列を決定し、配列番号２に示すＤＮＡ（配列番号１のアミノ酸配列をコードするＯＲＦを含む全１４４６ｂｐのＤＮＡ）を保持した組み換えベクターが得られたことを確認した。
【００８１】
（２）発現ベクターの構築
（１）で得た組み換えベクターを鋳型として、下記の一組のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件は（１）と同じである。
【００８２】
プライマーＦ３（配列番号７）
５’−ＧＣＧＡＴＡＴＣＧＴＧＴＣＴＡＡＡＡＣＣＴＧＣＴＣ−３’
プライマーＲ３（配列番号８）
５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡＡ−３’
【００８３】
増幅されたＤＮＡ断片（約１４００ｂｐ）をＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩとで消化し、発現ベクターｐ３ＸＦＬＡＧ−ＣＭＶ−８（Ｓｉｇｍａ社）のＥｃｏＲＶサイトとＢａｍＨＩサイトにサブクローニングした。この操作により、配列番号１のＮ末端から３３アミノ酸残基およびＣ末端から１９アミノ酸残基が欠失した可溶化型ヒトＣＳＨＹのＮ末端側にプレプロトリプシンのリーダー配列および３ＸＦＬＡＧタグが付加された融合タンパク質をコードするＤＮＡを保持した発現ベクターを得た。この融合タンパク質の全アミノ酸配列は、配列番号９に示されるとおりである。
【００８４】
（３）組み換え細胞を用いた発現
ＦｕＧＥＮＥ（Ｒ）６（Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いて、（２）で得た発現ベクター（６．７μｇ）をＣＯＳ７細胞に導入し、３７℃で３日間培養後、１ｍＬの培地を回収して、１０μＬのＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ（Ｒ） Ｍ２ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｇｅｌと４℃で一晩インキュベートした。その後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２５ｍＭのトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）でレジンを洗浄して、培地に含まれるタンパク質を吸着したレジンを得た。
【００８５】
（４）培地に含まれるタンパク質の分子量の確認
本実施例（３）で得たレジンに吸着したタンパク質について、定法に従いウエスタン法および銀染色法を行い、分子量を確認した。その結果を図１に示す。
【００８６】
図１に示すように、銀染色法および還元条件でウエスタン法を行った場合、約８０ｋＤａの明確なバンド（図中、星印で示す）が確認された一方で、コントロールでは同じ分子量のバンドは確認されなかった。また、非還元条件でウエスタン法を行った場合は約７０ｋＤａの明確なバンド（図中、星印で示す）が確認された一方で、コントロールでは同じ分子量のバンドは確認されなかった。
【００８７】
以上の結果から、これらの約８０ｋＤａのバンドおよび約７０ｋＤａのバンドは、ヒトＣＳＨＹに由来することが確認された。また、作成した融合タンパク質の予想分子量は５３ｋＤａであることから、培養液中に含まれるヒトＣＳＨＹタンパク質は、翻訳後に糖鎖付加等の修飾を受けたことが示唆された。
【００８８】
＜実施例２＞  コンドロイチン硫酸分解促進活性の測定
実施例１（３）で調製したヒトＣＳＨＹが結合したＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ（Ｒ） Ｍ２ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｇｅｌを、ＴＢＳ−Ｔ、さらに１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄後、ＦＩＴＣでラベルしたクジラ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳ−Ａ）、サメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ｃ（ＣＳ−Ｃ）、サメヒレ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ｄ（ＣＳ−Ｄ）およびイカ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ｅ（ＣＳ−Ｅ）各１０μｇを含む同緩衝液に再懸濁し、３７℃で１２時間反応させた。Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いた濾過でレジンを除いた後、濾液を０．２ＭのＮＨ４ＨＣＯ３で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にアプライしてゲル濾過を行った。検出は励起波長４９０ｎｍ、発光波長５２０ｎｍの蛍光を検出することで行った。活性は、ＲＴ１９分〜５１分までの総ピーク面積をＦＩＴＣでラベルしたコンドロイチン硫酸の総蛍光強度とし、総蛍光強度に対する低分子量フラグメント（ＲＴ３４分〜５１分）の存在比率をそのピーク面積から求めることで表した。酵素反応前のＦＩＴＣでラベルした各種コンドロイチン硫酸のゲル濾過の溶出パターンを図２のパネルＡ、Ｃ、ＥおよびＧに、酵素反応後の濾液のゲル濾過の溶出パターンを図２のパネルＢ、Ｄ、ＦおよびＨに、それぞれ示す。
【００８９】
図２に示すように、酵素反応によりコンドロイチン硫酸Ｄのピークが消失し、オリゴサッカライドのピークが観察された。
【００９０】
＜実施例３＞  酵素特性の解析
（１）基質特異性の確認
実施例１（３）で調製したヒトＣＳＨＹが結合したＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ（Ｒ） Ｍ２ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｇｅｌ １０μＬを、コンドロイチン、ＣＳ−Ａ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｅ、ブタ皮膚由来のコンドロイチン硫酸Ｂ（ＣＳ−Ｂ）、ウシ腎臓由来のヘパラン硫酸、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ブタ皮膚由来のデルマタン硫酸（ＤＳ）、Ａｓｃｉｄｉａ ｎｉｇｒａ由来のデルマタン硫酸（２Ｓ，６Ｓ−ＤＳ）およびＡｓｃｉｄｉａ ｎｉｇｒａ由来のコンドロイチン硫酸各１０μｇと３７℃で１２時間反応させた。各分解生成物を２−アミノベンズアミド（２ＡＢ）で蛍光標識後、ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にアプライしてゲル濾過を行った。ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−ＡおよびＡｓｃｉｄｉａ ｎｉｇｒａ由来のコンドロイチン硫酸の結果を図３のパネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤにそれぞれ示す。
【００９１】
図３のパネルＡ、ＢおよびＣに示すように、分解生成物の産生量から、ヒトＣＳＨＹは、ＣＳ−Ｄ＞ＣＳ−Ｃ＞ＣＳ−Ａの順に基質特異的であることが確認された。また、パネルＤに示すように、Ａｓｃｉｄｉａ ｎｉｇｒａ由来のコンドロイチン硫酸｛代表的な構成二糖単位の構造はイズロン酸（２Ｓ）−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（６Ｓ）｝に対する作用はほとんど確認されなかった。なお、ヒトＣＳＨＹは、ＣＳ−Ｅに対する作用は非常に弱く、さらに、ＤＳ、２Ｓ，６Ｓ−ＤＳ、コンドロイチン、ＣＳ−Ｂ、ヘパラン硫酸およびヒアルロン酸に対する作用はほとんどないことが確認された。以上より、ヒトＣＳＨＹは、ＣＳ−Ｄ＞ＣＳ−Ｃ＞ＣＳ−Ａ＞ＣＳ−Ｅの順に基質特異的であることが確認された。
【００９２】
（２）至適温度
実施例１（３）で調製したヒトＣＳＨＹが結合したＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ（Ｒ） Ｍ２ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｇｅｌ １０μＬとＣＳ−Ｄ １０μｇとを、２０℃、２５℃、３０℃および３７℃でそれぞれ１２時間反応させることにより、ヒトＣＳＨＹ活性の至適温度を調べた。その結果、３７℃で測定した活性を１とすると、２０℃、２５℃、３０℃での活性はそれぞれ０．３１、０．５６および０．８２であった（図示しない）。本実施例により、以降の実験は３７℃で行うこととした。
【００９３】
（３）至適ｐＨ
実施例２の反応で用いた緩衝液を５０ｍＭリン酸緩衝液でｐＨ４．５〜７．５に調整し、２８℃で９時間反応させて、ヒトＣＳＨＹの至適ｐＨを検討した。その結果を図４に示す。
【００９４】
図４に示すように、ヒトＣＳＨＹの至適ｐＨはｐＨ５．０であることが確認された。
【００９５】
（４）速度論解析
反応初速度および基質（二糖）の濃度変化から作成したＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットにより、ヒトＣＳＨＹの、コンドロイチン硫酸アイソフォームであるＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ａ、ＣＳ−ＣおよびＣＳ−Ｅ各々を基質とする場合の最大反応速度Ｖｍａｘと、見かけ上のミカエリス定数Ｋｍとを決定した。その結果を図５および次の表１に示す。
【００９６】
【表１】
2011084516.tif 000003
【００９７】
図５および表１に示すように、ＣＳ−Ｄ（図５のパネルＣ）を基質とする場合のＫｍ値は、ＣＳ−Ａ（図５のパネルＡ）、ＣＳ−Ｃ（図５のパネルＢ）およびＣＳ−Ｅ（図５のパネルＤ）を基質とする場合のＫｍ値と比較して、それぞれ、１／２、１／３および１／２０であった。すなわち、ヒトＣＳＨＹ感応性であるコンドロイチン硫酸アイソフォーム各々の反応速度が様々に異なっていたこと、および基質として用いたコンドロイチン硫酸の中ではＣＳ−Ｄが最も好ましい基質であることが確認された。また、この結果は、ヒトＣＳＨＹと様々なグリコサミノグリカンとを同様の条件で反応させて生成する還元末端を定量して得られた結果（図３のパネルＡ〜Ｃ）と一致した。
【００９８】
＜実施例４＞  ヒトＣＳＨＹの認識する糖鎖配列の解析
（１）反応産物の還元末端の特定
ヒトＣＳＨＹの活性をより詳しく調べるため、ＣＳ−ＤをヒトＣＳＨＹで消化し、得られた分解生成物を２ＡＢで蛍光標識した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）でゲル濾過ＨＰＬＣを行った。その結果、各々四糖、六糖、八糖として特定される３つの主なピークの抽出物Ｄ−１、Ｄ−２およびＤ−３が得られた（図３のパネルＡ）。
【００９９】
この抽出物Ｄ−１をアニオン交換ＨＰＬＣで分析した結果、２ＡＢ−テトラサッカライド三硫酸で特定される主なピークが得られた（図示しない）。このピークに含まれる主な成分はＣＳａｓｅ ＡＣ−ＩＩでは得られないことから、抽出物Ｄ−１に含まれる内部のＧｌｃＡ残基の多くにおいて、２位の炭素が硫酸化（２−０−硫酸）されていることを強く示唆した。
【０１００】
続いて、抽出物Ｄ−１、Ｄ−２およびＤ−３に含まれる主な糖配列を決定するため、まず、これらをそれぞれＣＳａｓｅ ＡＣ−ＩＩで消化し、得られた分解生成物をそれぞれ２ＡＢで蛍光標識した後、アニオン交換ＨＰＬＣで分析した。
【０１０１】
また、上記ＣＳ−ＤのヒトＣＳＨＹ分解生成物を、２ＡＢで蛍光標識しないまま２１５ｎｍの紫外線吸光度でモニタリングし、ゲル濾過ＨＰＬＣを行った後、最も低分子である四糖のピークを回収した。回収した四糖をＣＳａｓｅＡＢＣで分解し、２ＡＢで蛍光標識した後、アニオン交換ＨＰＬＣで分析した。
【０１０２】
さらに、抽出物Ｄ−２およびＤ−３をそれぞれＣＳａｓｅＡＢＣで消化し、得られた分解生成物を２ＡＢで蛍光標識した後、アニオン交換ＨＰＬＣにより分析した。以上の結果を図６および次の表２に示す。
【０１０３】
【表２】
2011084516.tif 000004
【０１０４】
図６中、パネルＡ〜Ｃは画分Ｄ−１、Ｄ−２およびＤ−３をＣＳａｓｅ ＡＣ−ＩＩで消化した産物の溶出パターンを示し、パネルＤは、２ＡＢで蛍光標識していないヒトＣＳＨＹの分解生成物のうち最も低分子である四糖を単離し、さらにＣＳａｓｅＡＢＣで消化した後、得られた分解生成物を２ＡＢで蛍光標識したものの溶出パターンを示す。また、パネルＥおよびＦは、それぞれ、画分Ｄ−２、Ｄ−３をＣＳａｓｅＡＢＣで消化後、２ＡＢで蛍光標識した試料の溶出パターンを示す。パネルＣ、Ｆ中の各矢印は、ピークａ：ΔＨｅｘＡ（２−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）−ＧａｌＮＡｃ（６−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）−ＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ（６−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）、ピークｂ：ΔＨｅｘＡ（２−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）−ＧａｌＮＡｃ（６−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）−ＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ（４−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）、ピークｃ：ΔＨｅｘＡ−ＧａｌＮＡｃ（４−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）−ＧｌｃＡ（２−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）−ＧａｌＮＡｃ（６−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）、ピークｄ：ΔＨｅｘＡ−ＧａｌＮＡｃ（６−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）−ＧｌｃＡ（２−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）−ＧａｌＮＡｃ（６−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ））、ピーク１：ΔＨｅｘＡ−ＧａｌＮＡｃ、ピーク２：ΔＨｅｘＡ−ＧａｌＮＡｃ（６−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）、ピーク３：ΔＨｅｘＡ−ＧａｌＮＡｃ（４−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）、ピーク４：ΔＨｅｘＡ（２−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）−ＧａｌＮＡｃ（６−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）、ピーク５：ΔＨｅｘＡ（２−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）−ＧａｌＮＡｃ（４−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）、ピーク６：ΔＨｅｘＡ−ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ｄｉｓｕｌｆａｔｅ）、ピーク７：ΔＨｅｘＡ（２−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）−ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ｄｉｓｕｌｆａｔｅ）、ピーク８：ＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ（６−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）およびピーク９：ＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ（４−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）の溶出位置を示す。
【０１０５】
図６のパネルＡおよび表２（Ｄ−１）に示すように、抽出物Ｄ−１については、ＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）−２ＡＢおよびΔＨｅｘＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）−２ＡＢで特定される２つの主なピークが得られた。すなわち、ＣＳ−ＤのヒトＣＳＨＹ分解生成物の四糖画分に含まれる主な糖配列が、ＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）−ＧｌｃＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）であることが確認された。また、抽出物Ｄ−２については、図６のパネルＢに示すように、２ＡＢ−テトラッサッカライド三硫酸を示すピークが得られ、抽出物Ｄ−３についても、図６のパネルＣに示すように、同様の結果が得られた。これらの分解生成物をそれぞれ、構造既知の２ＡＢ−不飽和四糖標準品とともにアニオン交換ＨＰＬＣにより分析した結果、それぞれΔＨｅｘＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）−ＧｌｃＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）−２ＡＢとともに溶出した（表２（Ｄ−２）および（Ｄ−３））。このことから、ヒトＣＳＨＹは四糖ＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）−ＧｌｃＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）の配列を、ＣＳ−Ｄの切断部位における非還元末端側の構造として認識することが確認された。なお、以上の結果をまとめ、次の表３に示した。
【０１０６】
【表３】
2011084516.tif 000005
【０１０７】
一方、ＣＳ−ＡとＣＳ−ＣもまたヒトＣＳＨＹによってある程度まで消化されることから（図２および図３）、ＣＳ−ＡおよびＣＳ−ＣがヒトＣＳＨＹに消化されて生じるオリゴ糖の還元末端構造を分析することにより、ヒトＣＳＨＹの特異性を調べた。具体的には、ＣＳ−ＡおよびＣＳ−ＣをヒトＣＳＨＹで消化し、得られた分解生成物を２ＡＢで蛍光標識し、さらにＣＳａｓｅ ＡＣ−ＩＩで消化した後、アニオン交換ＨＰＬＣにて分析した。その結果を図７に示す。
【０１０８】
図７中、１〜７の矢印は、１：ΔＨｅｘＡ−ＧａｌＮＡｃ、２：ΔＨｅｘＡ−ＧａｌＮＡｃ（６−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）、３：ΔＨｅｘＡ−ＧａｌＮＡｃ（４−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）、４：ΔＨｅｘＡ（２−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）−ＧａｌＮＡｃ（６−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）、５： ΔＨｅｘＡ（２−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）−ＧａｌＮＡｃ（４−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）、６：ΔＨｅｘＡ−ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ｄｉｓｕｌｆａｔｅ）および７： ΔＨｅｘＡ（２−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）−ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ｄｉｓｕｌｆａｔｅ）の２ＡＢ誘導体の、それぞれの溶出位置を示す。また、白抜きの矢印は、２ＡＢで蛍光標識した標準四糖であるΔＨｅｘＡ−ＧａｌＮＡｃ（４−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）−ＧｌｃＡ（２−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）−ＧａｌＮＡｃ（６−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）の溶出位置を示す。
【０１０９】
図７のパネルＡに示すように、ＣＳ−ＡのヒトＣＳＨＹ分解生成物に含まれる、還元末端に由来する唯一の反応産物が、ΔＨｅｘＡ−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）−２ＡＢとして検出された。すなわち、ＣＳ−ＡのヒトＣＳＨＹ分解生成物における主な還元末端の二糖がＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）であることが確認された（表３）。ＣＳ−Ａを構成する主な二糖はＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（２４％）ではなく、ＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（７６％）であることから、ＧａｌＮＡｃ残基の６位炭素の硫酸化が、ヒトＣＳＨＹによる切断部位の認識には不可欠であることが確認された。
【０１１０】
また、図７のパネルＢに示すように、ＣＳ−Ｃについては、ΔＨｅｘＡ−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）−２ＡＢとΔＨｅｘＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）−ＧｌｃＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）−２ＡＢが主なオリゴ糖として検出され、そのモル比は１．２：１．０であった。すなわち、ＣＳ−ＣのヒトＣＳＨＹ分解生成物における主な還元末端の二糖の配列がＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）およびＧｌｃＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）であることが確認された（表３）。
【０１１１】
これらＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）およびＧｌｃＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）の、ＣＳ−Ｃにおけるモル比は１０．７：１．０である。すなわち、ＣＳ−ＣにおけるＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）の比率はＧｌｃＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）と比較して相当大きいが、これらはＣＳ−ＣのヒトＣＳＨＹ分解生成物に含まれる主な還元末端二糖としては、これらはほぼ同じ比率で検出される。このことは、ヒトＣＳＨＹがＣＳ−Ｃの切断部位としてＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）よりもＧｌｃＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）を選択する可能性が高いことを示唆している。すなわち、ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）残基の非還元末端側に隣接するＧｌｃＡ残基の２位の炭素の硫酸化はヒトＣＳＨＹ活性を促進すると考えられる。ここで、ＣＳ−Ｃ中におけるヒトＣＳＨＹによって切断される部位の構造を示す模式図を図８に示す。図８中、矢印の部分で切断を受け、＊印を付けた硫酸基はヒトＣＳＨＹの加水分解活性に促進的な効果を与えていることを示す。
【０１１２】
（２）反応産物の非還元末端の特定
ＣＳ−Ｄの切断部位における還元末端側の構造を調べるため、抽出物Ｄ−２および抽出物Ｄ−３に含まれる非還元末端二糖を調べた。具体的には、抽出物Ｄ−２の六糖画分をＣＳａｓｅＡＢＣで分解して２ＡＢで蛍光標識した後、アニオン交換ＨＰＬＣにて分析したところ、ＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）−２ＡＢ、ＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）−２ＡＢおよびΔＨｅｘＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）−ＧｌｃＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）−２ＡＢの３つのピークが得られた。これらのモル比は各々、０．３５、０．４０および１．０であった（図６のパネルＥおよび表２）。すなわち、抽出物Ｄ−２画分がＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）−ＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）−ＧｌｃＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）および ＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）−ＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）−ＧｌｃＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）の二つの成分を４７：５３のモル比で含むことが確認された（表３）。
【０１１３】
さらに、抽出物Ｄ−３の八糖画分をＣＳａｓｅＡＢＣで分解して２ＡＢで蛍光標識した後、アニオン交換ＨＰＬＣにて分析した。その結果、２つの飽和二糖、３つの不飽和二糖および還元末端に由来するΔＨｅｘＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）−ＧｌｃＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）が得られた（図６のパネルＦ）。これらの比率を表２に示し、抽出物Ｄ−３における主な八糖の推定配列を表３に示す。
【０１１４】
表２および表３に示すように、飽和二糖と不飽和二糖とはそれぞれ、抽出物Ｄ−３画分に含まれる八糖の非還元末端と内部に由来することが分かる。
【０１１５】
＜実施例５＞ヒトＣＳＨＹの分解活性に重要なアミノ酸の同定
ヒトＣＳＨＹの分解活性に重要である可能性のある４箇所のアミノ酸について、下記の変異体１〜４をコードする塩基配列を、定法に従い、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ II XL Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いたＰＣＲ法により作成した。
【０１１６】
具体的には、下記の４組のプライマーＤＮＡを用意し、実施例１（１）で作成した組み換えベクターを鋳型として、実施例１（２）と同様の方法でＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応溶液組成およびＰＣＲ反応条件はＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ II XL Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のプロトコールに従った。
【０１１７】
プライマーＦ１（配列番号１０）
５’−ＣＴＧＴＴＡＴＡＧＡＴＴＧＧＣＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧＡＣＣＡＣ−３’
プライマーＲ１（配列番号１１）
５’−ＧＴＧＧＴＣＧＣＣＡＡＴＡＴＴＧＣＣＡＡＴＣＴＡＴＡＡＣＡＧ−３’
プライマーＦ２（配列番号１２）
５’−ＧＧＣＣＴＴＴＧＧＧＧＴＴＡＴＧＣＴＴＴＡＴＡＴＣＣＴＧ−３’
プライマーＲ２（配列番号１３）
５’−ＣＡＧＧＡＴＡＴＡＡＡＧＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＡＡＧＧＣＣ−３’
プライマーＦ３（配列番号１４）
５’−ＡＴＡＴＣＣＴＴＣＴＡＴＣＴＡＴＧＴＣＴＧＧＡＡＡＴＣＣＣ−３’
プライマーＲ３（配列番号１５）
５’−ＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＧＡＣＡＴＡＧＡＴＡＧＡＡＧＧＡＴＡＴ−３’
プライマーＦ４（配列番号１６）
５’−ＧＧＧＡＧＣＴＡＣＡＴＡＧＣＣＧＣＴＧＴＧＡＣＣＡＧ−３’
プライマーＲ４（配列番号１７）
５’−ＣＴＧＧＴＣＡＣＡＧＣＧＧＣＴＡＴＧＴＡＧＣＴＣＣＣ−３’
【０１１８】
作成した変異ヒトＣＳＨＹをコードする塩基配列
変異体１；配列番号１のアミノ酸配列において１４７番目のグルタミン酸をグルタミンに置換した変異ヒトＣＳＨＹ（配列番号１９）をコードする塩基配列（配列番号１８）
変異体２；配列番号１のアミノ酸配列において２１８番目のチロシンをアラニンに置換した変異ヒトＣＳＨＹ（配列番号２１）をコードする塩基配列（配列番号２０）
変異体３；配列番号１のアミノ酸配列において２６３番目のグリシンをチロシンに置換した変異ヒトＣＳＨＹ（配列番号２３）をコードする塩基配列（配列番号２２）
変異体４；配列番号１のアミノ酸配列において３６８番目のアスパラギンをアラニンに置換した変異ヒトＣＳＨＹ（配列番号２５）をコードする塩基配列（配列番号２４）
【０１１９】
作成した変異体１〜４を実施例１（１）から実施例１（３）と同様の手法により組み換え細胞に発現させ、これらの変異タンパク質を吸着したレジンを調製した。続いて、実施例３（１）と同様の手法によりＣＳ−Ｄに対する分解活性を検討した。その結果を図９に示す。
【０１２０】
図９に示すように、変異体１、変異体２および変異体４は、ＣＳ−Ｄに対する分解活性を消失したことが明らかになった。一方、変異体３はコントロールの野生型ヒトＣＳＨＹの場合と同等の分解活性を有していることが明らかになった。
【０１２１】
以上の結果より、配列番号１のアミノ酸配列において１４７番目のグルタミン酸、２１８番目のチロシンおよび３６８番目のアスパラギンは、ヒトＣＳＨＹのＣＳ−Ｄに対する分解活性において重要であることが確認された。
【図１】
2011084516.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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