(57)【要約】【課題】超短パルス光の繰り返し周波数を上げて試料の劣化を抑制するとともに、高画質の観察像を容易に安定して得る。【解決手段】パルス分割装置１２は、パルスレーザ１１から射出され、所定の方向に偏光されている超短パルス光を分割する。パルス分割装置１２は、１軸結晶または２軸結晶の平行平板からなり、超短パルス光が入射する入射面に対して少なくとも１つの光学軸が平行であり、入射面がパルス分割装置１２（光学系）の光軸に対して垂直になるように配置されているパルス分割素子５１−１乃至５１−ｎを備えている。本発明は、例えば、多光子顕微鏡に適用できる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の方向に偏光されたパルス光を分割するパルス分割装置において、
１軸結晶または２軸結晶の平行平板からなり、前記パルス光が入射する入射面に対して少なくとも１つの光学軸が平行であり、前記入射面が前記パルス分割装置の光軸に対して垂直になるように配置されているパルス分割素子を
備えるパルス分割装置。
【請求項２】
前記入射面に平行な前記光学軸の方向が前記パルス光の偏光方向と４５度異なるように前記パルス分割素子が配置されている
請求項１に記載のパルス分割装置。
【請求項３】
複数の前記パルス分割素子を備え、
隣接する前記パルス分割素子の前記入射面に平行な前記光学軸の方向が互いに４５度異なるように、複数の前記パルス分割素子が前記パルス分割装置の光軸に沿って並べられている
請求項２に記載のパルス分割装置。
【請求項４】
それぞれの前記パルス分割素子により発生する前記パルス光の遅延時間がそれぞれ異なる
請求項３に記載のパルス分割装置。
【請求項５】
前記パルス分割装置内において発生する群速度分散と逆の群速度分散を前記パルス光に与える群速度分散補償手段を
さらに備える請求項１乃至４のいずれかに記載のパルス分割装置。
【請求項６】
所定の方向に偏光された超短パルス光を射出する光源と、
前記光源からの前記超短パルス光を前記試料に照射し、前記試料からの観察光を検出するための光学系と、
１軸結晶または２軸結晶の平行平板からなり、前記超短パルス光が入射する入射面に対して少なくとも１つの光学軸が平行であり、前記入射面が前記光学系の光軸に対して垂直になるように前記光源と前記試料の間に配置されているパルス分割素子と
を備える多光子顕微鏡。
【請求項７】
少なくとも前記パルス分割素子により発生する群速度分散と逆の群速度分散を前記超短パルス光に与える群速度分散補償手段を
請求項６に記載の多光子顕微鏡。
【請求項８】
所定の方向に偏光されたパルス光を分割するパルス分割素子において、
１軸結晶または２軸結晶の平行平板からなり、
前記パルス光が入射する入射面に対して少なくとも１つの光学軸が平行である
パルス分割素子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パルス分割装置、多光子顕微鏡、および、パルス分割素子に関し、特に、超短パルス光を分割して使用する場合に用いて好適なパルス分割装置、多光子顕微鏡、および、パルス分割素子に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、多光子励起を利用した走査型のレーザ顕微鏡である多光子顕微鏡が知られている。多光子顕微鏡では、非常に時間幅の短い（例えば、100フェムト秒の）パルス状のレーザ光である超短パルス光を集光して、生体等の試料に照射し、その超短パルス光の集光点近傍から発せられる多光子励起光を検出することにより、試料の観察が行われる（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
また、近年、超短パルス光を用いた多光子顕微鏡において、単位時間あたりに同じ強度の超短パルス光を試料に照射する場合、超短パルス光の１パルス当たりの強度を上げるよりも、１パルス当たりの強度を抑え、パルス数を増やすようにした方が、光褪色や光毒性などによる試料の劣化を抑制できることが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
そこで、従来、特殊な光分割素子を用いて１つの超短パルス光を複数の超短パルス光に分割し、その一部をディレイライン（長い光路）を通過させて、分割後の複数の超短パルス光の間に時間差を与えた後、全ての超短パルス光の光路を一つに統合することにより、超短パルス光の１パルス当たりの強度を下げるとともに、単位時間当たりの超短パルス光の繰り返し周波数を上げることができる装置が提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第２８４８９５２号公報
【特許文献２】米国特許出願公開２００９／００６７４５８号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】N. Ji, J. Magee, and E. Betzig, "High-speed, low-photodamage nonlinear imaging using passive pulse splitters, Nature Methods Vol.5, 2008年, p.197-202
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献２および非特許文献１に記載されている技術では、分割後の超短パルス光を遅延させるために、空気換算で最大数百mmにも及ぶディレイラインが必要となり、装置が大型化してしまう。
【０００８】
また、ディレイラインが長くなると、超短パルス光が、温度変化、空気の変動や振動などの外乱の影響を受けやすくなる上に、超短パルス光のビーム径が、ディレイラインの光路長に応じて大幅に変化する。
【０００９】
さらに、特許文献２および非特許文献１に記載されている技術では、分割した超短パルス光の光路の分岐や統合を繰り返しながら、最終的に全ての超短パルス光を、顕微鏡の対物レンズの光軸からずれないように同じ光路上を伝播する必要がある。そのため、超短パルス光の光路の分岐および統合に用いる光学素子を非常に高精度に調整する必要があり、調整の不備や光学素子の各種の誤差により、光路のズレが発生しやすい。
【００１０】
従って、特許文献２および非特許文献１に記載されている技術では、超短パルス光の一部または全部が、顕微鏡の対物レンズの後側焦点面（いわゆる瞳面）から外れてしまい、効率よく多光子励起光を励起することができなかったり、多光子励起光を励起できたとしても、照明光の開口数が不足し、得られる蛍光像の分解能が不足してしまったりしやすい。ゆえに、特許文献２および非特許文献１に記載されている技術では、明るくてＳ／Ｎ比の良い高画質の観察像を安定して得ることが難しい。
【００１１】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、多光子顕微鏡において、超短パルス光の繰り返し周波数を上げて試料の劣化を抑制するとともに、高画質の観察像を容易に安定して得ることができるようにするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の第１の側面のパルス分割装置は、所定の方向に偏光されたパルス光を分割するパルス分割装置において、１軸結晶または２軸結晶の平行平板からなり、前記パルス光が入射する入射面に対して少なくとも１つの光学軸が平行であり、前記入射面が前記パルス分割装置の光軸に対して垂直になるように配置されているパルス分割素子を備える。
【００１３】
本発明の第１の側面においては、パルス光が分割され、分割されたパルス光の間に所定の時間間隔が与えられる。
【００１４】
本発明の第２の側面の多光子顕微鏡は、所定の方向に偏光された超短パルス光を射出する光源と、前記光源からの前記超短パルス光を前記試料に照射し、前記試料からの観察光を検出するための光学系と、１軸結晶または２軸結晶の平行平板からなり、前記超短パルス光が入射する入射面に対して少なくとも１つの光学軸が平行であり、前記入射面が前記光学系の光軸に対して垂直になるように前記光源と前記試料の間に配置されているパルス分割素子とを備える。
【００１５】
本発明の第２の側面においては、超短パルス光が分割され、分割された超短パルス光の間に所定の時間間隔が与えられ、分割された超短パルス光が試料に照射され、試料からの多光子励起光が検出される。
【００１６】
本発明の第３の側面のパルス分割素子は、所定の方向に偏光されたパルス光を分割するパルス分割素子において、１軸結晶または２軸結晶の平行平板からなり、前記パルス光が入射する入射面に対して少なくとも１つの光学軸が平行である。
【００１７】
本発明の第３の側面においては、パルス光が分割され、分割されたパルス光の間に所定の時間間隔が与えられる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の第１乃至第３の側面によれば、多光子顕微鏡において、超短パルス光の繰り返し周波数を上げて試料の劣化を抑制するとともに、高画質の観察像を容易に安定して得ることができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明を適用した多光子顕微鏡の一実施の形態を示すブロック図である。
【図２】パルス分割装置の構成の例を示すブロック図である。
【図３】パルス分割素子の作用について説明するための図である。
【図４】パルス分割素子の作用について説明するための図である。
【図５】パルス分割素子の作用について説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を実施するための形態（以下、実施の形態という）について説明する。なお、説明は以下の順序で行う。
１．第１の実施の形態
２．変形例
【００２１】
＜１．第１の実施の形態＞
［多光子顕微鏡の構成例］
図１は、本発明の一実施の形態である多光子顕微鏡１の構成の例を示すブロック図である。
【００２２】
多光子顕微鏡１のパルスレーザ１１は、例えば、赤外波長（約1000nm）であって、パルス幅がフェムト秒単位の（例えば、100フェムト秒の）超短パルス光を射出する超短パルスレーザにより構成される。なお、パルスレーザ１１から射出された直後の超短パルス光は、一般に所定の方向に偏光された直線偏光となっている。
【００２３】
パルス分割装置１２は、図２乃至図５を参照して後述するように、パルスレーザ１１から入射される超短パルス光を分割し、超短パルス光の繰り返し周波数を高くして射出する。
【００２４】
ビーム調整部１３は、パルス分割装置１２から入射される超短パルス光のビーム径を、対物レンズ１６の瞳径に合わせて調整する機能、試料２から発せられる多光子励起光の波長と超短パルス光の波長との軸上の色収差（ピント差）を補正するために超短パルス光の集光および発散角度を調整する機能、超短パルス光のパルス幅が光学系を通過する間に群速度分散により広がってしまうのを補正するために、逆の群速度分散を超短パルス光に与えるプリチャープ機能（群速度分散補償機能）等を有する。
【００２５】
パルスレーザ１１から射出された超短パルス光は、パルス分割装置１２によりその繰り返し周波数が大きくされ、ビーム調整部１３により上述した調整が行われる。そして、ビーム調整部１３から射出された超短パルス光は、ダイクロイックミラー１４によりダイクロイックミラー１５の方向に反射され、ダイクロイックミラー１５を通過し、対物レンズ１６により集光されて試料２に照射される。このとき、図示せぬ走査手段により、超短パルス光が試料２の観察面において走査される。
【００２６】
試料２の超短パルス光が照射された領域およびその近傍では、試料２が染色されている蛍光色素が多光子励起され、赤外波長である超短パルス光より波長が短い蛍光（以下、観察光と称する）が発せられる。
【００２７】
試料２から対物レンズ１６の方向に発せられた観察光は、対物レンズ１６によりコリメートされ、その波長に応じて、ダイクロイックミラー１５により反射されたり、あるいは、ダイクロイックミラー１５を透過したりする。
【００２８】
ダイクロイックミラー１５により反射された観察光は、蛍光検出部１７に入射する。蛍光検出部１７は、例えば、バリアフィルタ、PMT（photo multiplier tube：光電子増倍管）などにより構成され、ダイクロイックミラー１５により反射された観察光を受光し、その光量に応じた電気信号を出力する。また、蛍光検出部１７は、超短パルス光が試料２の観察面において走査されるのに合わせて、試料２の観察面にわたる観察光を検出する。
【００２９】
一方、ダイクロイックミラー１５を透過した観察光は、図示せぬ走査手段によりデスキャンされ、ダイクロイックミラー１４を透過し、集光レンズ１８により集光され、対物レンズ１６の焦点位置とほぼ共役な位置に設けられているピンホール１９を通過し、結像レンズ２０を透過して、蛍光検出部２１に入射する。蛍光検出部２１は、例えば、バリアフィルタ、PMTなどにより構成され、結像レンズ２０により蛍光検出部２１の受光面において結像した観察光を受光し、その光量に応じた電気信号を出力する。また、蛍光検出部２１は、超短パルス光が試料２の観察面において走査されるのに合わせて、試料２の観察面にわたる観察光を検出する。
【００３０】
なお、ダイクロイックミラー１５を光路から外すことにより、試料２から対物レンズ１５の方向に発せられた全ての観察光を蛍光検出部２１で検出するようにしてもよい。
【００３１】
また、試料２から対物レンズ１６と逆の方向に発せられた観察光は、ダイクロイックミラー２２により反射され、蛍光検出部２３に入射する。蛍光検出部２３は、例えば、バリアフィルタ、PMTなどにより構成され、ダイクロイックミラー２２により反射された観察光を受光し、その光量に応じた電気信号を出力する。また、蛍光検出部２３は、超短パルス光が試料２の観察面において走査されるのに合わせて、試料２の観察面にわたる観察光を検出する。
【００３２】
蛍光検出部１７、蛍光検出部２１、および、蛍光検出部２３から出力された電気信号は、例えば、後段のコンピュータに入力され、そのコンピュータは、入力された電気信号に基づいて、観察画像を生成し、生成した観察画像を表示したり、観察画像のデータを記憶したりする。
【００３３】
［パルス分割装置の構成例］
図２は、パルス分割装置１２の詳細な構成例を示すブロック図である。
【００３４】
パルス分割装置１２は、パルス分割素子５１−１乃至５１−ｎを含むように構成される。パルス分割素子５１−１乃至５１−ｎは、水晶などの１軸結晶を、パルスレーザ１１から射出される超短パルス光が入射する入射面に対して、その光学軸が平行になるように切り出した平行平板により構成される。
【００３５】
そして、パルス分割素子５１−１乃至５１−ｎは、パルス分割装置１２（光学系）の光軸に対して入射面が垂直になるように、光軸に沿って直列に並べられる。従って、パルス分割素子５１−１乃至５１−ｎの光学軸は、パルス分割装置１２（光学系）の光軸に対して垂直となる。
【００３６】
なお、以下、パルス分割素子５１−１乃至５１−ｎの厚さを、それぞれt1乃至tnとする。また、以下、パルス分割素子５１−１乃至５１−ｎを個々に区別する必要がない場合、単にパルス分割素子５１と称する。さらに、以下、パルス分割素子５１−１乃至５１−ｎの厚さt1乃至tnを個々に区別する必要がない場合、単に厚さtと称する。また、以下、図２に示されるように、パルス分割素子５１の入射面に平行かつ水平な方向をｘ軸方向とし、パルス分割素子５１の入射面に平行かつ鉛直な方向をｙ軸方向とし、パルス分割素子５１の入射面に垂直な方向、すなわち、パルス分割装置１２（光学系）の光軸方向をｚ軸方向とする。
【００３７】
また、以下、パルスレーザ１１から射出され、パルス分割素子５１−１に入射する超短パルス光を超短パルス光Ｐと称する。さらに、以下、図３に示されるように、超短パルス光Ｐの偏光方向Ａ１が、ｙ軸方向と一致するように設定されているものとする。
【００３８】
パルス分割素子５１−１は、図４に示されるように、その光学軸Ｂ１の方向が、ｘ軸およびｙ軸に対して４５度となり、超短パルス光Ｐの偏光方向Ａ１（図３）と４５度異なるように配置されている。
【００３９】
従って、超短パルス光Ｐは、パルス分割素子５１−１の光学特性により、光学軸Ｂ１と平行な方向Ａ２ｐに振動する直線偏光で、超短パルス光Ｐの１／２の強度の超短パルス光Ｐｐと、光学軸Ｂ１と垂直な方向Ａ２ｓに振動する直線偏光で、超短パルス光Ｐの１／２の強度の超短パルス光Ｐｓに分割される。そして、超短パルス光Ｐｐと超短パルス光Ｐｓは、時間ΔT1の間隔を開けて、パルス分割素子５１−１から射出される。
【００４０】
例えば、パルス分割素子５１−１の光学軸Ｂ１の方向に振動する光（常光線）の屈折率をnoとし、光学軸Ｂ１に対して垂直な方向に振動する光（異常光線）の屈折率をneとすると、時間ΔT1は、パルス分割素子５１−１の厚さt1を用いて、次式（１）により求められる。
【００４１】
ΔT1＝(ne−no)×t1÷c  ・・・（１）
なお、cは光速である。
【００４２】
従って、パルス分割素子５１−１の厚さt1を調節することにより、時間ΔT1を調節することが可能である。
【００４３】
例えば、パルス分割素子５１−１を方解石により構成し、超短パルス光の波長を656nmとすると、屈折率no＝1.6544、屈折率ne＝1.4846となる。そして、パルス分割素子５１−１の厚さt1＝1mmとすると、時間ΔT1＝5.7×10-13秒＝0.57ピコ秒となる。従って、超短パルス光のパルス幅が、数十から数百フェムト秒のレベルなので、厚さ数mmという非常に薄いパルス分割素子５１−１を通過させるだけで、分割後の２つの超短パルス光Ｐｐと超短パルス光Ｐｓとの間に十分な間隔ΔT1を与えることができることが分かる。
【００４４】
２番目のパルス分割素子５１−２より後のパルス分割素子５１は、その光学軸の方向が、１つ前のパルス分割素子５１の光学軸に対して４５度異なるように配置される。すなわち、隣接するパルス分割素子５１の光学軸の方向が互いに４５度異なるように、各パルス分割素子５１が配置される。
【００４５】
例えば、図５に示されるように、パルス分割素子５１−２は、その光学軸Ｂ２の方向が、ｙ軸と平行となり、１つ前のパルス分割素子５１−１の光学軸Ｂ１（図４）の方向と４５度異なるように配置されている。
【００４６】
従って、超短パルス光Ｐｐは、パルス分割素子５１−２の光学特性により、光学軸Ｂ２と平行な方向Ａ３ｐに振動する直線偏光で、超短パルス光Ｐｐの１／２の強度の超短パルス光Ｐｐｐと、光学軸Ｂ２と垂直な方向Ａ３ｓに振動する直線偏光で、超短パルス光Ｐｐの１／２の強度の超短パルス光Ｐｐｓに分割される。また、超短パルス光Ｐｐｐと超短パルス光Ｐｐｓとの間には、パルス分割素子５１−２の厚さt2に応じた時間ΔT2の間隔が与えられる。同様に、超短パルス光Ｐｓは、パルス分割素子５１−２の光学特性により、光学軸Ｂ２と平行な方向Ａ３ｐに振動する直線偏光で、超短パルス光Ｐｓの１／２の強度の超短パルス光Ｐｓｐと、光学軸Ｂ２と垂直な方向Ａ３ｓに振動する直線偏光で、超短パルス光Ｐｓの１／２の強度の超短パルス光Ｐｓｓに分割される。また、超短パルス光Ｐｓｐと超短パルス光Ｐｓｓとの間には、パルス分割素子５１−２の厚さt2に応じた時間ΔT2の間隔が与えられる。
【００４７】
このように、超短パルス光は、各パルス分割素子５１を通過するごとに、２倍の数に分割されるとともに、各超短パルス光の強度が分割前の１／２となる。また、分割された超短パルス光の間には、通過したパルス分割素子５１の厚さtに応じた間隔が与えられる。
【００４８】
従って、分割された超短パルス光が互いに重ならないように、各パルス分割素子５１の厚さtを調整し、各パルス分割素子５１により発生する遅延時間ΔTを調整することにより、パルス分割装置１２に入射する１つの超短パルス光を2n個に分割し、超短パルス光の繰り返し周波数を2n倍にすることができる。なお、少なくとも各パルス分割素子５１により発生する遅延時間ΔTがそれぞれ異なるように、各パルス分割素子５１はそれぞれ異なる厚さに設定される。
【００４９】
以上のように、多光子顕微鏡１では、パルス分割装置１２を用いて、超短パルス光の繰り返し周波数を上げるとともに、１パルス当たりの強度を下げることにより、光褪色や光毒性などによる試料２の劣化を容易に抑制することができる。
【００５０】
また、パルス分割装置１２は、特許文献２および非特許文献１に記載されている技術のように、長大なディレイラインやビームスプリッタ等を必要としないため、装置を大幅に小型化することができる。その結果、光路上で超短パルス光が受ける外乱の影響や、超短パルス光のビーム径の変化を小さく抑えることができる。さらに、パルス分割装置１２では、分割された超短パルス光が全て同じ光路上を進むため、特許文献２および非特許文献１に記載されている技術に必要な、分岐した各超短パルス光の光路を最終的に一致させるような高度な調整を行う必要がなく、光路のズレがほとんど発生しない。その結果、明るくてＳ／Ｎ比の良い高画質の観察像を容易に安定して得ることが可能になる。
【００５１】
また、分割された超短パルス光が同じ光路上を進み、同じパルス分割素子５１を通過するので、パルス分割装置１２における群速度分散により発生するパルス幅の広がりが、分割後の各超短パルス光でほぼ一定となる。従って、ビーム調整部１３において、各超短パルス光の群速度に負分散を与えるプリチャープ機能を構成する光学系を１つに共通化することができる。
【００５２】
＜２．変形例＞
なお、以上の説明では、パルス分割素子５１を１軸結晶により構成する例を示したが、雲母などの２軸結晶により構成するようにしてもよい。例えば、パルス分割素子５１を雲母により構成する場合、雲母の結晶の電気主軸が入射面に対して垂直になるように結晶を切り出すことにより、２本の光学軸の少なくとも１つが入射面に対して平行になる。そして、その入射面に平行な光学軸が、上述した１軸結晶の場合の光学軸と同じ条件となるように、各パルス分割素子５１をパルス分割装置１２（光学系）の光軸に沿って直列に並べるようにすればよい。
【００５３】
また、ビーム調整部１３のプリチャープ機能は、パルス分割装置１２内において発生する群速度分散のみ補償するようにしてもよいし、多光子顕微鏡１内で発生する群速度分散全体を補償するようにしてもよい。
【００５４】
さらに、パルス分割装置１２内において発生する群速度分散を補償するプリチャープ機能をパルス分割装置１２内に設けるようにしてもよい。
【００５５】
また、以上の説明では、パルス幅がフェムト秒オーダ（例えば、100フェムト秒）の超短パルス光のパルス分割について説明したが、本発明は、パルス幅がピコ秒オーダ（例えば、10ピコ秒等）のピコ秒パルス光、ナノ秒オーダ（例えば、30ナノ秒等）のパルス光のパルス分割に用いてもよい。ここでは、パルス光は、超短パルス光を含む概念である。
【００５６】
なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明
の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【符号の説明】
【００５７】
１  多光子顕微鏡，  ２  試料，  １１  パルスレーザ，  １２  パルス分割装置，  １３  ビーム調整部，  １４，１５  ダイクロイックミラー，  １６  対物レンズ，  １７  蛍光検出部，  １８  集光レンズ，  １９  ピンホール，  ２０  結像レンズ，  ２１  蛍光検出部，  ２２  ダイクロイックミラー，  ２３  蛍光検出部，  ５１−１乃至５１−ｎ  パルス分割素子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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