(57)【要約】【課題】生体分子を生理活性が失活することなく、高い流動性及び安定性で生体分子を基板上の所望の位置に輸送でき、かつ輸送された生体分子の位置情報を長時間にわたり把握できる生体分子分析用キット、これを用いた生体分子の分析方法を目的とする。【解決手段】脂質二分子膜Ｓ２が自発展開する親水部１３が形成された輸送基板１を備える分析装置と、前記脂質二分子膜Ｓ２に導入され、前記脂質二分子膜Ｓ２の自発展開により輸送されるナノ粒子−生体関連分子複合体とを備えた生体分子分析用キットであって、前記ナノ粒子−生体関連分子複合体は、表面に反応活性基を備えるナノ粒子と、該ナノ粒子の表面の反応活性基に結合した生体関連分子とを備えるナノ粒子複合体を含有することよりなる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質二分子膜が自発展開する親水部が形成された輸送基板を備える分析装置と、
前記脂質二分子膜に導入され、前記脂質二分子膜の自発展開により輸送されるナノ粒子−生体関連分子複合体とを備えた生体分子分析用キットであって、
前記ナノ粒子−生体関連分子複合体は、表面に反応活性基を備えるナノ粒子と、該ナノ粒子の表面の反応活性基に結合した生体関連分子とを備えるナノ粒子複合体を含有することを特徴とする生体分子分析用キット。
【請求項２】
前記輸送基板は、親水部と疎水部とからなる流路パターンが形成され、
前記脂質二分子膜は、前記親水部の表面を自発展開することを特徴とする、請求項１に記載の生体分子分析用キット。
【請求項３】
前記ナノ粒子は、半導体ナノ粒子からなる量子ドット、又は金、銀、銅から選択される少なくとも１種からなる金属ナノ粒子であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の生体分子分析用キット。
【請求項４】
前記生体関連分子は、リン脂質及びポリエーテル化リン脂質から選択される少なくとも１種であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の生体分子分析用キット。
【請求項５】
前記生体関連分子は、ビオチン化ポリエーテル、マレイミド化ポリエーテル及びスクシンイミド化ポリエーテルから選択される少なくとも１種であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の生体分子分析用キット。
【請求項６】
前記ナノ粒子−生体関連分子複合体は、リン脂質からなる脂質二重層がカプセル状に形成され、前記ナノ粒子複合体が、前記脂質二重層の層内及び表面の双方又はいずれか一方に含有されてなることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の生体分子分析用キット。
【請求項７】
前記ナノ粒子−生体関連分子複合体は、前記のカプセル状に形成された脂質二重層で化学物質が内包されてなる、請求項６に記載の生体分子分析用キット。
【請求項８】
前記脂質二重層は、その表面にビオチン化ポリエーテル、マレイミド化ポリエーテル及びスクシンイミド化ポリエーテルから選択される少なくとも１種が結合したことを特徴とする、請求項６又は７に記載の生体分子分析用キット。
【請求項９】
前記ナノ粒子−生体関連分子複合体は、タンパク質を標識化していることを特徴とする請求項５又は８に記載の生体分子分析用キット。
【請求項１０】
前記タンパク質は、抗原、抗体、酵素、膜タンパク質、受容体型タンパク質、蛍光タンパク質、細胞骨格及びモータータンパク質から選択される少なくとも１種の機能性タンパク質であることを特徴とする、請求項９に記載の生体分子分析用キット。
【請求項１１】
前記分析装置は、バイオリアクターチップであることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の生体分子分析用キット。
【請求項１２】
前記バイオリアクターチップは、ナノギャップ電極を備えることを特徴とする、請求項１１に記載の生体分子分析用キット。
【請求項１３】
前記バイオリアクターチップは、ハイスループットスクリーニング検出用であり、種類及び／又は濃度の異なる複数の生体分子が、脂質二分子膜によって輸送され、前記輸送基板の任意の位置に配置されることを特徴とする、請求項１１又は１２に記載の生体分子分析用キット。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の生体分子分析用キットを用いた、生体分子の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子分析用キット、これを用いた生体分子の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
基板上に生体分子を配したバイオチップは、医療・診断用チップ、環境センシング、ナノバイオオプティクス・エレクトロニクス等の幅広い分野での応用が期待されている。特に、バイオ・環境センシング素子や医薬品開発においては、基板上に特定多数の生体分子を所望の位置に配し、生体分子の種類や濃度、あるいは生体分子間の相互作用（活性検出、分子認識等）をハイスループットで調査、診断できるバイオチップは多大な市場価値をもたらすと期待されている。
【０００３】
また、これらの産業分野だけでなく、基礎研究分野においても、酵素、抗体をはじめとするタンパク質やＤＮＡ等の生体分子を、非破壊で安定して基板上に配置し、各生体分子の相互作用や情報伝達機構、あるいは構造変化等の時間的変動を追跡できるバイオチップの開発が求められている。
【０００４】
タンパク質等の生体分子を基板上に固定化する方法としては、ビオチン−ストレプトアビジン間の特異的な結合を利用する方法が広く用いられている（非特許文献１、２）。この方法では、一般的に、末端を修飾したビオチン分子を基板上に固定化し、該ビオチン分子に、ビオチンを特異的に認識するストレプトアビジンを結合させ、該ストレプトアビジンに、ビオチン化されたタンパク質を結合させる方法が用いられる。
【０００５】
また、基板上にタンパク質を固定化する方法としては、ビオチン−ストレプトアビジン結合を利用する方法以外に、有機分子の自己組織化膜を用いる方法がある。有機分子の自己組織化膜を用いる方法としては、例えば、非特許文献３に記載の以下の方法が挙げられる。
まず、金基板上に、３−メルカプトプロピオン酸や１１−メルカプトウンデカン酸等の自己組織化膜を形成する。次いで、該自己組織化膜の上側に位置する末端のカルボキシル基に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを触媒として、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをカップリングする。次いで、該自己組織化膜の最表面にあるスクシンイミド基と、タンパク質のアミノ酸末端（Ｎ末端）とを選択的に結合させ、タンパク質を基板上に固定化する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｖ．Ｈ．Ｐｅｒｅｚ−Ｌｕｎａら、「ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）」、第１２１巻、１９９９年、第６４６９−６４７８頁
【非特許文献２】Ｋ．Ｌ．Ｃｈｒｉｓｔｍａｎら、「ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）」、第２２巻、２００６年、第７４４４１−７４５０頁
【非特許文献３】Ｍ．Ｖｅｉｓｅｈら、「ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）」、第１８巻、２００２年、第６６７１−６６７８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、非特許文献１〜２に記載の発明は、基板に結合するためのビオチン分子の末端修飾や、タンパク質の末端をビオチン化する修飾が必要であるため、その反応収率、時間的効率を考慮すると、バイオチップの大量生産には不向きである。
また、非特許文献３に記載の発明は、一般に末端がチオール化された化合物を用いる必要があるため、金表面のような特定の基板上にしかタンパク質を固定化することができない。加えて、最終的にタンパク質を結合するには、基板の前処理として、数種のスペーサー分子を結合させる必要があり、反応プロセスが多段階にわたるため工程が煩雑になると共に、反応が多段階になるほど、基板上にタンパク質を固定化する効率が低くなる。さらに、生体分子は本来流動性のある媒質中で活動しているのに対し、この方法はスペーサー分子により生体分子を基板上に強固に固定するため、生体分子の流動性が失われる。また、スペーサー分子と共有結合することで、生体分子自体の構造が変化する可能性があるため、固定化により生体分子本来の機能や活動が制限され、生理機能が損なわれるおそれがある。
【０００８】
従来の一般的なバイオチップは、上述のような方法で、基板上のある特定の位置に生体分子を固定化し、検査対象とする生体分子との相互作用を分光学的に判定・診断するものであった。通常、バイオ分野での分光測定には、生体分子を有機蛍光色素で標識化する方法が用いられている。
標識化に用いられる有機蛍光色素は光退色が激しく、バイオチップの長時間にわたる使用には不向きである。バイオチップを長時間安定して利用するためには、基板上に配置された生体分子自体の安定性と、判定・診断時の測定安定性の双方を兼ね備えたバイオチップの技術開発が求められている
【０００９】
以上のように、バイオセンサーやバイオチップ等への適用が検討されている従来の生体分子固定化基板は、生体分子の固定化手法が煩雑なために生産性が低く、固定化する基板が限定される上、固定化された生体分子の流動性及び安定性が低くなり、該生体分子の生理機能が失活するおそれがある。また、従来の生体分子固定化基板では、生体分子の流動性が低いため、基板上で生体分子を移動させ、所望の位置に輸送することはできない。
さらに、異なる種類及び／又は濃度の生体分子が配置されたバイオチップ上で、該生体分子の位置情報を把握しながら、生体分子に対する特定の化学物質の作用や生体分子間の相互作用等を、長時間にわたり検査・診断できるリアクターチップとしての機能は付与されていない。以上のことから、バイオチップの安定化、高性能化、ハイスループット化はまだ不十分であり、それらの制御のさらなる向上が望まれている。
【００１０】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、生体分子を生理活性が失活することなく、高い流動性及び安定性で生体分子を基板上の所望の位置に輸送でき、かつ輸送された生体分子の位置情報を長時間にわたり把握できる生体分子分析用キット、これを用いた生体分子の分析方法を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の生体分子分析用キットは、脂質二分子膜が自発展開する親水部が形成された輸送基板を備える分析装置と、前記脂質二分子膜に導入され、前記脂質二分子膜の自発展開により輸送されるナノ粒子−生体関連分子複合体とを備えた生体分子分析用キットであって、前記ナノ粒子−生体関連分子複合体は、表面に反応活性基を備えるナノ粒子と、該ナノ粒子の表面の反応活性基に結合した生体関連分子とを備えるナノ粒子複合体を含有することを特徴とする。
前記輸送基板は、親水部と疎水部とからなる流路パターンが形成され、前記脂質二分子膜は、前記親水部の表面を自発展開することが好ましく、前記ナノ粒子は、半導体ナノ粒子からなる量子ドット、又は金、銀、銅から選択される少なくとも１種からなる金属ナノ粒子であることが好ましく、前記生体関連分子は、リン脂質及びポリエーテル化リン脂質から選択される少なくとも１種であることが好ましく、前記生体関連分子は、ビオチン化ポリエーテル、マレイミド化ポリエーテル及びスクシンイミド化ポリエーテルから選択される少なくとも１種であってもよい。
前記ナノ粒子−生体関連分子複合体は、リン脂質からなる脂質二重層がカプセル状に形成され、前記ナノ粒子複合体が、前記脂質二重層の層内及び表面の双方又はいずれか一方に含有されてなることが好ましく、前記ナノ粒子−生体関連分子複合体は、前記のカプセル状に形成された脂質二重層で化学物質が内包されていることが好ましく、前記脂質二重層は、その表面にビオチン化ポリエーテル、マレイミド化ポリエーテル及びスクシンイミド化ポリエーテルから選択される少なくとも１種が結合していることが好ましく、前記ナノ粒子−生体関連分子複合体は、タンパク質を標識化していることが好ましく、前記タンパク質は、抗原、抗体、酵素、膜タンパク質、受容体型タンパク質、蛍光タンパク質、細胞骨格及びモータータンパク質から選択される少なくとも１種の機能性タンパク質であることがより好ましい。
【００１２】
前記分析装置は、バイオリアクターチップであることが好ましく、前記バイオリアクターチップは、ナノギャップ電極を備えることがより好ましく、前記バイオリアクターチップは、ハイスループットスクリーニング検出用であり、種類及び／又は濃度の異なる複数の生体分子が、脂質二分子膜によって輸送され、前記輸送基板の任意の位置に配置されることが好ましい。
【００１３】
本発明の生体分子の分析方法は、前記の本発明の生体分子分析用キットを用いることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、生体分子を生理活性が失活することなく、高い流動性及び安定性で生体分子を基板上の所望の位置に輸送でき、かつ輸送された生体分子の位置情報を長時間にわたり把握できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の輸送基板の斜視図である。
【図２】本発明のナノ粒子−生体関連分子複合体の一例を示す断面図である。
【図３】本発明のナノ粒子−生体関連分子複合体の一例を示す断面図である。
【図４】本発明のナノ粒子−生体関連分子複合体の一例を示す断面図である。
【図５】本発明のナノ粒子−生体関連分子複合体の一例を示す断面図である。
【図６】（ａ）本発明のナノ粒子−生体関連分子複合体の一例を示す断面図である。（ｂ）（ａ）の拡大図である。
【図７】本発明のナノ粒子−生体関連分子複合体の一例を示す断面図である。
【図８】本発明の輸送基板における案内部の拡大図である。
【図９】本発明の輸送基板における案内部の拡大図である。
【図１０】本発明の輸送基板における案内部の拡大図である。
【図１１】本発明の輸送基板における案内部の拡大図である。
【図１２】本発明の輸送基板における案内部の拡大図である。
【図１３】本発明の輸送基板における案内部の拡大図である。
【図１４】本発明の輸送基板における案内部の拡大図である。
【図１５】本発明の輸送基板における案内部の拡大図である。
【図１６】本発明のバイオリアクターチップの一例を示す斜視図である。
【図１７】合成例で得られたナノ粒子−生体関連分子複合体の共焦点レーザー蛍光顕微鏡の観察結果を示す写真である。
【図１８】実施例における共焦点レーザー蛍光顕微鏡の観察結果である。
【図１９】実施例における共焦点レーザー蛍光顕微鏡の観察結果である。
【図２０】実施例における原子間力顕微鏡の観察結果を示す写真である。
【図２１】図２０（ｇ）における断面Ａ〜Ｄの測定結果を示すグラフである。
【図２２】（ａ）実施例における自発展開後の脂質二分子膜の観察結果を示す写真である。（ｂ）（ａ）で観測された粒子の高さの測定結果を示すグラフである。
【図２３】（ａ）実施例における自発展開後の脂質二分子膜の観察結果を示す写真である。（ｂ）（ａ）で観測された粒子の高さの測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の生体分子分析用キットは、親水部が形成された輸送基板を備える分析装置と、ナノ粒子−生体関連分子複合体とを備えるものである。以下に本発明について、実施形態を示して説明する。
【００１７】
（第一の実施形態）
本発明の第一の実施形態にかかる生体分子分析用キットについて、以下に図面を参照して説明する。
本実施形態の生体分子分析用キットは、輸送基板からなる分析装置と、ナノ粒子−生体関連分子複合体とを備えるものである。
【００１８】
＜分析装置＞
図１に示すように、輸送基板１は、基板本体１０を備え、この基板本体１０の表面には、疎水部１２と親水部１３とが形成されている。
基板本体１０の表面の長手方向の両端には、試料が収容される略矩形の第一の試料収容部１４と第二の試料収容部１８とが形成されている。第一の試料収容部１４と第二の試料収容部１８との間には、第一の試料収容部１４と第二の試料収容部１８とを連絡する複数の流路１６が形成され、流路１６と、基板本体１０の長手方向に延びる疎水部１２とは、基板本体１０の短手方向に交互に形成されている。こうして、第一の試料収容部１４と、流路１６と、第二の試料収容部１８とで、第一の試料収容部１４に導入された脂質二分子膜を第二の試料収容部１８へ向けて自発展開させる親水部１３が構成されている。なお、本実施形態において、流路パターンは、第一の試料収容部１４と第二の試料収容部１８と、複数の流路１６及び複数の疎水部１２からなる縞状の案内部１９とで形成されたものである。
【００１９】
基板本体１０としては、安定に脂質二分子膜を形成する親水性の高い基板が好ましく、ガラス、石英、シリコン、サファイア、マイカ等からなる基板、疎水性の基板の表面に化学洗浄、分子修飾等の処理を施し、表面を親水化した基板等が挙げられる。かかる基板本体１０の表面が露出した部分が、親水部１３となる。
【００２０】
基板本体１０は、後述する測定方法において、膜厚４〜５ｎｍ程度の脂質二分子膜を容易に形成する観点から、ナノメートルスケールの平坦性を有するものが好ましい。
基板本体１０の厚さは、特に限定されないが、例えば、０．１〜２０ｍｍが好ましい。
【００２１】
疎水部１２は、基板本体１０の表面上に形成されたものであり、例えば、金、チタン等の金属類、フォトレジスト等の樹脂で形成した膜等が挙げられる。
疎水部１２の幅は、特に限定されないが、輸送基板１の高密度化を図る観点から、１０ｎｍ〜１μｍが好ましい。また、疎水部１２の基板本体１０上の高さは、輸送基板１の高密度化を図る観点から、１０〜１００ｎｍが好ましい。
【００２２】
第一の試料収容部１４の寸法は、特に限定されないが、例えば０．５〜２ｍｍ四方とされる。第二の試料収容部１８の寸法は、第一の試料収容部１４の寸法と同じである。
流路１６の幅は、特に限定されないが、輸送基板１の高密度化を図る観点から、１０ｎｍ〜１μｍとされる。
【００２３】
疎水部１２及び親水部１３からなる流路パターンの形成方法は、例えば、特開２００７−２４８２９０号公報に記載の公知のリソグラフィー技術で微細加工を施し、所望の凹凸パターンを描画する方法が挙げられる。この際、凹部を親水部１３とし、凸部を疎水部１２とすることができる。例えば、基板本体１０をシリコンとした場合、リソグラフィー技術としては、以下のものが挙げられる。シリコン基板に酸化膜を形成し、酸化膜上に膜厚１０ｎｍ〜１００μｍとなるようにフォトレジストを塗布し、その後、露光装置によって、レジスト薄膜の上に所定のパターンを転写する。さらに、現像液によって現像を行い、転写されたパターンに応じて所定箇所のレジスト薄膜を剥離する。このとき、レジスト薄膜が残された部分が疎水部１２となり、レジスト薄膜が剥離された部分では酸化膜が露出して親水部１３となる。
【００２４】
なお、現像後のシリコン基板に金属を蒸着し、その後レジスト薄膜を有機溶剤で剥離する通常のリフトオフプロセスを用いることにより、蒸着した金属を疎水部１２とすることができる。
【００２５】
こうして得られる凹凸パターンの寸法は、通常のリソグラフィー技術によれば、疎水部１２及び流路１６の幅、流路１６の深さを１０ｎｍ〜１００μｍの範囲で幅広く制御できる。
【００２６】
＜ナノ粒子−生体関連分子複合体＞
本発明のナノ粒子−生体関連分子複合体は、ナノ粒子と、該ナノ粒子の表面に結合した生体関連分子とを備えるナノ粒子複合体を含有するものであり、ナノ粒子複合体の単体で構成されるもの（以下、単体型ということがある）、ナノ粒子の表面に生体関連分子としてビオチン化ポリエーテル、マレイミド化ポリエーテル及びスクシンイミド化ポリエーテルから選択される少なくとも１種の機能性ポリエーテルを備えるもの（以下、機能性単体型ということがある）、ナノ粒子複合体が、カプセル状に形成されたリン脂質の脂質二重層の層内及び表面の双方又はいずれか一方に含有されるもの（以下、ベシクル型ということがある）、機能性単体型又は機能性ベシクル型がタンパク質を標識化しているもの（タンパク質標識型）等が挙げられる。以下、本発明のナノ粒子−生体関連分子複合体について説明する。
【００２７】
≪単体型≫
単体型は、ナノ粒子の表面に生体関連分子が結合されたものである。
本発明におけるナノ粒子は、半導体ナノ粒子を備える量子ドットや、金、銀、銅等の金属ナノ粒子から構成され、中でも、生体分子分析用に用いるための生体適合型のナノ粒子という観点から、量子ドット又は金ナノ粒子を用いることが好ましい。
ナノ粒子の形状は、特に限定されず、球状、ロッド状、キューブ状、ピラミッド状、金平糖状等、いかなる形状であっても構わない。
【００２８】
本発明における量子ドットは、半導体ナノ粒子からなるコア部と、該コア部の表面のポリマーからなるシェル部とを備え、その表面に反応活性基を備えるものである。
半導体ナノ粒子は、半導体のナノメートルサイズの微粒子であり、量子閉じ込め効果を有する発光材料であり、金属元素と、非金属元素又は遷移金属元素を組み合わせたものが挙げられ、例えば、セレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）、硫化カドミウム（ＣｄＳ）、テルル化カドミウム（ＣｄＴｅ）、硫化亜鉛（ＺｎＳ）等のＩＩＢ−ＶＩＢ族のもの、インジウムリン（ＩｎＰ）、ガリウムリン（ＧａＰ）等のＩＩＩＢ−ＶＢ族のもの等が挙げられる。
【００２９】
量子ドットは、コア部の半導体ナノ粒子のサイズによって、発光波長が著しく変化する。通常、バイオイメージングでは、可視域の波長を利用するため、コア部のサイズは、可視域に発光を示す１〜２０ｎｍが好ましい。また、シェル部１４の厚みは特に限定されないが、１〜３０ｎｍが好ましい。
【００３０】
シェル部を構成するポリマーとしては、後述する生体関連分子の反応活性基と結合する反応活性基を備えるものであればよく、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート等の生体適合型ポリマーに、カルボキシル基やアミノ基を反応活性基として備えるポリマーが挙げられる。中でも、生体関連分子としてリン脂質を用いる場合には、カルボキシル基を反応活性基として備えるポリマーが好ましく、カルボキシル基を反応活性基として備えるＰＥＧがより好ましい。半導体ナノ粒子は、溶液中で凝集しやすく取り扱いが困難であると共に、人体への健康被害や環境に対する毒性が懸念されるものである。半導体ナノ粒子は、生体親和性の高いポリマーで構成されるシェル部を備えることで、無害化され、医療、バイオテクノロジー分野等で汎用的に用いることができる。
加えて、ナノ粒子は、シェル部の表面に、カルボキシル基等の反応活性基が導入されていることで、生体関連分子をナノ粒子表面に直接化学結合させた、単体型のナノ粒子−生体関連分子複合体を作製することができる。
【００３１】
金ナノ粒子は、合成の簡便さから球状、ロッド状の形状のものを用いることが好ましい。金ナノ粒子は、アスペクト比に応じて吸収特性が変化し、高い波長選択性を発現する点から、ロッド状の金ナノ粒子を用いることがより好ましい。
金ナノロッドは、粒子のサイズ効果による発色特性が可視域で顕著に発現することから、金ナノロッドのアスペクト比が１〜５であることが好ましい。
また、金ナノロッドは、直径が１ｎｍ〜１００ｎｍ、長さが１ｎｍ〜１μｍのものが好ましい。
なお、金ナノ粒子は、その表面にポリマーを備えるものであってもよい。
【００３２】
生体関連分子は、生体中に存在する分子及びその誘導体である。このような生体関連分子をナノ粒子の表面に結合することで、輸送基板上に自発展開する脂質二分子膜により輸送される。生体関連分子としては、例えば、リン脂質、ポリエーテル化リン脂質、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸、ポリペプチド、オリゴペプチド、糖等が挙げられ、中でも、リン脂質又はポリエーテル化リン脂質が好ましい。
【００３３】
リン脂質は、その疎水部のアシル鎖長、アシル鎖内の二重結合の有無、さらにその二重結合の部位と数は特に限定されない。ただし、リン脂質の親水頭部は、ナノ粒子の表面にあるカルボキシル基等の活性反応基と化学結合が可能な、ホスファエタノールアミン（ＰＥ）を備える構造が好ましい。このようなリン脂質としては、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファエタノールアミン（ＤＳＰＥ）等が挙げられる。
ポリエーテル化リン脂質としては、ＰＥＧ化リン脂質、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）化リン脂質等が挙げられ、中でもＰＥＧ化リン脂質が好ましい。
【００３４】
このような単体型のナノ粒子−生体関連分子複合体としては、例えば、図２に示すナノ粒子−生体関連分子複合体５０、図３に示すナノ粒子−生体関連分子複合体６０が挙げられる。
【００３５】
図２に示すように、ナノ粒子−生体関連分子複合体５０は、半導体ナノ粒子であるコア部５４とシェル部５６とからなるナノ粒子５２と、リン脂質５８とを備え、ナノ粒子５２の表面、即ちシェル部５６に存在する活性官能基にリン脂質５８が結合したものである。
また、図３に示すように、ナノ粒子−生体関連分子複合体６０は、ナノ粒子５２とＰＥＧ化リン脂質６１とを備え、ナノ粒子５２の表面に存在する活性官能基にＰＥＧ化リン脂質６１が結合したものである。ＰＥＧ化リン脂質６１は、ＰＥＧ部６２とリン脂質部６４とからなり、ナノ粒子−生体関連分子複合体６０は、ＰＥＧ部６２の末端がシェル部５６と結合されたものである。
【００３６】
単体型のナノ粒子−生体関連分子複合体の製造方法は、ナノ粒子の表面、即ちシェル部の反応活性基に、生体関連分子の反応活性基を結合するものであり、公知の脱水縮合反応による結合方法が挙げられる。例えば、ナノ粒子を量子ドットとし、生体関連分子を、ホスファエタノールアミンを含有するリン脂質又はアミノ化ポリエチレングリコールリン脂質とする場合、量子ドットと生体関連分子とを１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）触媒下で脱水縮合する製造方法が挙げられる。
【００３７】
金ナノ粒子の表面に、リン脂質を結合する方法としては、例えば、特開２００８−００７８１５号公報、Ｈ．Ｎａｋａｓｈｉｍａら、「ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）」、第２４巻、２００８年、第５６５４−５６５８頁に記載の公知の方法を用いることができる。
【００３８】
≪機能性単体型≫
機能性単体型は、ナノ粒子の表面に生体関連分子として、機能性ポリエーテルが結合されたものである。
機能性単体型におけるナノ粒子は、単体型におけるナノ粒子と同じである。
【００３９】
機能性ポリエーテルは、ビオチン化ポリエーテル、マレイミド化ポリエーテル及びスクシンイミド化ポリエーテルから選択される少なくとも１種である。機能性単体型のナノ粒子−生体関連分子複合体は、ナノ粒子の表面に、機能性ポリエーテルが結合していることで、任意のタンパク質と特異的に結合し、タンパク質を標識化することができる。例えば、ビオチン化ポリエーテルはストレプトアビジンと結合し、マレイミド化ポリエーテル、スクシンイミド化ポリエーテルは、抗原、抗体、酵素、膜タンパク質、受容体型タンパク質、蛍光タンパク質、細胞骨格、モータータンパク質等のタンパク質の末端アミノ基と結合して、容易にタンパク質を標識化できる。
【００４０】
機能性ポリエーテルを構成するポリエーテルは、シェル部の材質等を勘案して決定でき、例えば、ＰＥＧ、ＰＰＧ等が挙げられ、中でもＰＥＧが好ましい。
ポリエーテルをＰＥＧとする場合、ＰＥＧの鎖長は特に限定されないが、質量平均分子量５００〜１００００のものが好ましい。
【００４１】
このような機能性ポリエーテルをナノ粒子の表面に付与するには、例えば、ビオチン−ポリエチレングリコール（２０００）アミン（Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ２０００−Ａｍｉｎｅ）等のビオチン化ＰＥＧアミン、マレイミド−ポリエチレングリコール（２０００）アミン（Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ２０００−Ａｍｉｎｅ）等のマレイミド化ＰＥＧアミン、スクシンイミド−ポリエチレングリコール（２０００）アミン（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ２０００−Ａｍｉｎｅ）等のスクシンイミド化ＰＥＧアミン等を用いればよい。
【００４２】
このような機能性単体型のナノ粒子−生体関連分子複合体としては、例えば、図４に示すナノ粒子−生体関連分子複合体７０、図５に示すナノ粒子−生体関連分子複合体８０が挙げられる。
【００４３】
図４に示すように、ナノ粒子−生体関連分子複合体７０は、ナノ粒子５２とビオチン化ＰＥＧ７１とを備えるものである。ナノ粒子−生体関連分子複合体７０は、シェル部５６の表面にＰＥＧ７２が結合され、ＰＥＧ７２の末端にビオチン７４が備えられていることで、その最外部にビオチン７４が位置するものとされている。
また、図５に示すように、ナノ粒子−生体関連分子複合体８０は、ナノ粒子５２とマレイミド化ＰＥＧ又はスクシンイミド化ＰＥＧからなるタンパク質結合型ＰＥＧ８１とを備えるものである。ナノ粒子−生体関連分子複合体８０は、シェル部５６の表面にＰＥＧ７２が結合され、ＰＥＧ７２の末端にマレイミド又はスクシンイミドから選択される結合部８４が備えられていることで、その最外部にマレイミド又はスクシンイミドが位置するものとされている。
【００４４】
機能性単体型のナノ粒子−生体関連分子複合体の製造方法は、「≪単体型≫」のナノ粒子と同様のものが挙げられる。
また、金ナノ粒子の表面に機能性ポリエーテルを導入する方法としては、例えば、末端にカルボキシル基を有するアルキルチオールで金ナノ粒子の表面を修飾し、該金ナノ粒子と、末端アミノ基を有するビオチン化ＰＥＧとを１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）触媒下で脱水縮合する製造方法が挙げられる。
【００４５】
≪ベシクル型≫
ベシクル型は、リン脂質の脂質二重層（リン脂質二重層）がカプセル状に形成されたベシクルとナノ粒子複合体とを備え、ナノ粒子複合体がリン脂質二重層の層内及び表面の双方又はいずれか一方に含有されてなるものである。加えて、ベシクル内に形成される内孔には、液体が保持されている。
【００４６】
ベシクルを構成するリン脂質は、その疎水部のアシル鎖長、アシル鎖内の二重結合の有無、さらにその二重結合の部位と数は特に限定されない。ベシクルを構成するリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールホスフェイト（ＰＩＰ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、スフィンゴ脂質等が挙げられる。これらリン脂質は、１種類のみを使用してもよく、２種類以上を併用してもよい。
【００４７】
ベシクルは、そのサイズにより、外径５０ｎｍ未満のスモールベシクルと、外径５０ｎｍ以上のラージベシクルとに分類され、特に、外径１０μｍ超のベシクルは、巨大ベシクルと呼ばれている。ベシクルの外径（ベシクルサイズ）は、合成方法やサイズ分離精製によって制御することができる。本発明に用いるベシクルは、その大きさが特に限定されないが、巨大ベシクルであることが好ましい。一般に、小さなベシクルサイズでは、ベシクルの膜厚が４〜５ｎｍであり、仮にベシクルサイズが５０〜１００ｎｍであると、球状構造の曲率が高くなるため、膜面に欠陥が生じやすく、構造が不安定である。このため本発明においては、ベシクルの取り扱い操作の簡便性、ベシクル構造の安定性、ベシクル内に形成された内孔内への化学物質の取り込みの制御性、という観点から巨大ベシクルを用いることがより好ましい。巨大ベシクルとすることで、化学物質を幅広い濃度で内孔に内包できる。
【００４８】
内孔内の液体の種類は、特に限定されず、ベシクル型のナノ粒子−生体関連分子複合体の製造過程で用いられる溶媒等が挙げられる。内孔内に液体が保持されていることで、ナノ粒子−生体関連分子複合体の形態が維持される。
【００４９】
内孔内には、化学物質が内包されていてもよい（以下、化学物質がベシクルに内包されたナノ粒子−生体関連分子複合体を特に化学物質内包型ということがある）。
化学物質は、対象とする生体物質と、化学結合の形成、吸着等の何らかの相互作用を生じる特異結合物質が存在するもの、即ち、例えば、ある種のタンパク質を特異的に認識したり、タンパク質を活性化したりする生理活性物質等が挙げられ、具体的には、各種アミノ酸、ＡＴＰ、イオン、糖類、タンパク質、ペプチド、低分子有機化合物等が挙げられる。
【００５０】
ベシクル型のナノ粒子−生体関連分子複合体は、さらにその表面に機能性ポリエーテルを結合させ、機能性ポリエーテルを備えていてもよい（以下、表面に機能性ポリエーテルを備えるベシクル型のナノ粒子−生体関連分子複合体を特に機能性ベシクル型ということがある）。
機能性ベシクル型のナノ粒子−生体関連分子複合体に用いられる機能性ポリエーテルは、例えば、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファエタノールアミン−Ｎ−［ビオチニル（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｂｉｏｔｉｎ）等のビオチン−ＰＥＧ化リン脂質、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファエタノールアミン−Ｎ−［マレイミド（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）等のマレイミド−ＰＥＧ化リン脂質、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファエタノールアミン−Ｎ−［スクシンイミド（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）等のスクシンイミド−ＰＥＧ化リン脂質が好適なものとして挙げられる。
ベシクルは、柔軟で、流体のような特性をもつため、長時間放置するとベシクル同士の融合が生じる可能性がある。この問題を克服するため、ベシクル表面へ機能性ポリエーテルを導入し、ベシクル融合を防止することが好ましい。機能性ポリエーテルを備えることで、ベシクル表面にあるポリエーテルの排除体積効果（立体障害）により、溶液中でベシクルを単体に保ち、ベシクル構造を長時間安定化させることができる。
加えて、機能性ベシクル型のナノ粒子−生体関連分子複合体は、機能性ポリエーテルが結合していることで、任意のタンパク質と特異的に結合し、タンパク質を標識化することができる。
【００５１】
図６（ａ）は、機能性ベシクル型かつ化学物質内包型のナノ粒子−生体関連分子複合体の一例を示す断面図であり、図６（ｂ）は、（ａ）における領域Ｘの拡大図である。
図６（ａ）に示すように、ナノ粒子−生体関連分子複合体９０は、ナノ粒子複合体９４と、内孔９６を有するカプセル状のベシクル９２と、ビオチン−ＰＥＧ化リン脂質９１とを備え、内孔９６には、液体と共に化学物質９８が内包されているものである。図６（ｂ）に示すように、ベシクル９２は、リン脂質９３の二分子層であるリン脂質二重層からなり、リン脂質二重層の層内又は表面には、ナノ粒子複合体９４が含有されている。ナノ粒子−生体関連分子複合体９０は、ベシクル９２にＰＥＧリン脂質９５が結合し、ＰＥＧリン脂質９５の末端にビオチン７４が備えられることで、その最外部にビオチン７４が位置するものとされている。
【００５２】
ナノ粒子複合体９４は、ナノ粒子の表面に生体関連分子が結合してなるものであり、単体型のナノ粒子−生体関連分子複合体、即ち、図２に示すナノ粒子−生体関連分子複合体５０と同じものである。
【００５３】
図７に示すように、ナノ粒子−生体関連分子複合体１００は、ナノ粒子複合体９４と、内孔９６を有するカプセル状のベシクル９２と、マレイミド−ＰＥＧ化リン脂質又はスクシンイミド−ＰＥＧ化リン脂質からなるタンパク質結合型ＰＥＧ化リン脂質１０１とを備え、内孔９６には、液体と共に化学物質９８が内包されているものである。加えて、ナノ粒子複合体９４は、ベシクルを構成するリン脂質二重層の層内及び表面に含有されている。
ナノ粒子−生体関連分子複合体１００は、ベシクル９２の表面にＰＥＧリン脂質９５が結合し、ＰＥＧリン脂質９５の末端に結合部８４が備えられることで、その最外部にマレイミド又はスクシンイミドが位置するものとされている。
【００５４】
さらに、機能性ベシクル型のナノ粒子−生体関連分子複合体は、タンパク質を標識化していてもよい。標識化されるタンパク質としては、ストレプトアビジン、抗原、抗体、酵素、膜タンパク質、受容体型タンパク質、蛍光タンパク質、細胞骨格、モータータンパク質等が挙げられる。
【００５５】
本発明のベシクル型のナノ粒子−生体関連分子複合体の製造方法は、ポリマーからなるシェル部を有するナノ粒子の表面に、生体関連分子を結合してナノ粒子複合体、即ち単体型のナノ粒子−生体関連分子複合体を得る第一の工程と、得られた複合体とリン脂質とを分散媒に分散した後、分散媒を除去してリン脂質を薄膜化し、次いで水溶液中で前記リン脂質をカプセル化する第二の工程とを有するものである。
【００５６】
第一の工程は、前述の「≪単体型≫」のナノ粒子−生体関連分子複合体の製造方法と同じである。
【００５７】
第二の工程は、第一の工程で得られたナノ粒子複合体と、ベシクルを構成するリン脂質（ベシクル用リン脂質）とを分散媒に分散し（分散操作）、次いで、分散媒を除去・乾燥した後、水や緩衝液中でベシクル用リン脂質をカプセル状に形成し（カプセル化操作）ベシクルとする工程である。
【００５８】
［分散操作］
分散操作は、分散媒にナノ粒子複合体及びベシクル用リン脂質を分散するものである。
分散媒は、クロロホルム等の有機溶剤が挙げられる。
分散液中の、ナノ粒子複合体の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．００１〜１ｇ／Ｌが好ましい。
また、分散液中のリン脂質濃度は、特に限定されないが、例えば、０．１〜１０ｇ／Ｌが好ましい。
【００５９】
分散液には、必要に応じて、ビオチン−ＰＥＧ化リン脂質、マレイミド−ＰＥＧ化リン脂質又はスクシンイミド−ＰＥＧ化リン脂質等の機能性ポリエーテルを添加することができる。分散液に機能性ポリエーテルを添加することで、ベシクルの表面に機能性ポリエーテルを導入できる。分散液中の機能性ポリエーテルの含有量は、ベシクル用リン脂質に対し０．１〜１質量％が好ましい。
【００６０】
［カプセル化操作］
カプセル化操作は、分散媒である有機溶剤を除去・乾燥して、ベシクル用リン脂質からなるリン脂質薄膜を形成し、このリン脂質薄膜を水や緩衝液中でカプセル状に形成させベシクルを作製するものである。ベシクルの作製の手法としては、静置水和法やエレクトロスウェリング法（電界形成法）等が挙げられ、中でも巨大ベシクルが作製しやすく、また反応時間や反応プロセスの簡易性から、電界形成法を採用することが好ましい。電界形成法は、例えば、Ｐ．Ｇｉｒａｒｄら、「バイオフィジカルジャーナル（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ）」、第８７巻、２００４年、第４１９−４２９頁に記載の公知の電解形成法が挙げられる。電界形成法は、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）等の電極上に分散液を塗布し、分散媒を除去・乾燥してリン脂質を薄膜化した後、この薄膜にベシクル化水溶液を添加し、交流電場をかけて水溶液中に巨大ベシクルを膨潤させる手法である。
分散媒の除去方法は、特に限定されず、例えば、減圧乾燥等が挙げられる。
ベシクル化水溶液としては、水又はリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等の緩衝液が用いられる。サイズのそろったベシクルを得るためには、ＩＴＯ基板上に厚さ１０ｎｍ〜１００μｍの均一なリン脂質の薄膜を形成することが好ましい。また、印加する交流電場は、周波数が１０Ｈｚ程度、振幅が１００ｍＶ〜２Ｖ程度の条件が好ましい。より低い振幅では、ベシクルの収量が低く、より高い振幅では、ベシクルの構造破壊や水の電気分解が生じ、ベシクルが製造できない可能性がある。
【００６１】
このカプセル化操作は、ベシクル化水溶液中でリン脂質からなるベシクルを形成する操作である。ベシクル化水溶液には、必要に応じて化学物質を添加することができる。ベシクル化水溶液に化学物質を添加することで、化学物質内包型のナノ粒子−生体関連分子複合体を製造できる。
以上の工程により、ベシクル型のナノ粒子−生体関連分子複合体が分散したベシクル分散液を得られる。
【００６２】
≪タンパク質標識型≫
タンパク質標識型は、機能性単体型又は機能性ベシクル型のナノ粒子−生体関連分子複合体がタンパク質を標識化したものである。標識化されるタンパク質としては、ストレプトアビジン、抗原、抗体、酵素、膜タンパク質、受容体型タンパク質、蛍光タンパク質、細胞骨格、モータータンパク質等が挙げられる。
標識化の方法は、機能性ポリエーテルの末端のビオチン、マレイミド又はスクシンイミドと、任意のタンパク質との特異的な結合により行うことができる。
【００６３】
＜分析方法＞
次に、本発明の生体分析用キット１を用いた分析方法について、図１を用いて説明する。図１中、符号Ｓ１は、脂質分子を含む混合物を示し、符号Ｓ２は、脂質二分子膜を示す。
【００６４】
まず、第一の試料収容部１４に混合物Ｓ１を配置した後、親水部１３が覆われるように基板本体１０に緩衝液を添加する。
混合物Ｓ１は、脂質分子を含むものである。脂質分子においては、各脂質の疎水部のアシル鎖長、アシル鎖内の二重結合の有無、さらにその二重結合の部位と数は特に限定されない。脂質分子としては、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールホスフェイト（ＰＩＰ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、スフィンゴ脂質等が挙げられる。中でも、例えば、卵黄由来フォスファチジルコリン（Ｌ−α−ＰＣ）やＤＯＰＥ等、室温付近（１０〜３０℃）で流動性の高い脂質分子が好ましい。このような室温で流動性の高い脂質分子のみからなる脂質二分子膜は、自発展開現象を発現する。これらの脂質分子は、１種類のみを使用してもよく、２種類以上を併用してもよい。
ここで、自発展開とは、基板本体１０の表面上を、脂質二分子膜が自己組織化によって成長しつつ広がっていくことをいう。自発展開は、通常、緩衝液中で生じる。
【００６５】
加えて、混合物Ｓ１には、分析対象とするタンパク質が含まれていてもよい。
さらに、混合物Ｓ１には、本発明のナノ粒子−生体関連分子複合体が含まれてもよい。混合物Ｓ１に含まれるナノ粒子−生体関連分子複合体としては、上述した単体型、機能性単体型、ベシクル型又はタンパク質標識型のいずれであってもよく、ベシクル型のナノ粒子−生体関連分子複合体を用いる場合には、化学物質含有型、機能性ベシクル型又はこれらを組み合わせたものであってもよい。
【００６６】
親水部１３に添加する緩衝液は、脂質二分子膜を構成する脂質分子や、分析対象とするタンパク質の種類に応じて決定でき、例えば、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。
【００６７】
親水部１３に緩衝液を添加すると、脂質分子は、混合物Ｓ１の裾野から親水部１３上を自発展開して脂質二分子膜Ｓ２となる。脂質二分子膜Ｓ２は、（人工）脂質二分子膜であり、両親媒性分子であるリン脂質等の脂質分子が二層構造を形成した脂質二分子の単一膜であり、生体膜の最も基本的な構造である。この脂質二分子膜Ｓ２は、疎水部１２上には広がらないため、矢印Ｆのように第一の試料収容部１４から流路１６を経て、第二の試料収容部１８へ向かって親水部１３上で展開する。
【００６８】
混合物Ｓ１にタンパク質が含まれている場合、脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に従い、タンパク質が第一の試料収容部１４から第二の試料収容部１８に輸送される。この際、機能性単体型又は機能性ベシクル型のナノ粒子−生体関連分子複合体を脂質二分子膜Ｓ２に導入することで、タンパク質を標識化したナノ粒子−生体関連分子複合体が第二の試料収容部１８に輸送される。
【００６９】
あるいは、混合物Ｓ１に本発明のナノ粒子−生体関連分子複合体が含まれている場合、ナノ粒子−生体関連分子複合体は、脂質二分子膜Ｓ２の表面に導入され、脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に従い、第一の試料収容部１４から第二の試料収容部１８に輸送される。
以下に、脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に伴いナノ粒子−生体関連分子複合体が輸送される形態について、図８〜１５を用いて説明する。図８〜１５は、図１の輸送基板１の案内部１９の拡大図であり、脂質二分子膜Ｓ２が矢印Ｆの方向に自発展開する様子を示したものである。
【００７０】
例えば、混合物に単体型のナノ粒子−生体関連分子複合体が含まれる例を図８〜９に示す。
図８に示すように、単体型である図２のナノ粒子−生体関連分子複合体５０が混合物に含まれると、ナノ粒子−生体関連分子複合体５０は、その表面の生体関連分子であるリン脂質と脂質二分子膜Ｓ２との親和力により脂質二分子膜Ｓ２に導入され、脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に伴って矢印Ｆの方向に輸送される。
【００７１】
あるいは、図９に示すように、混合物に単体型である図３のナノ粒子−生体関連分子複合体６０が含まれると、ナノ粒子−生体関連分子複合体６０は、ＰＥＧ化リン脂質６１と脂質二分子膜Ｓ２との親和力により脂質二分子膜Ｓ２に導入され、脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に伴って矢印Ｆの方向に輸送される。
【００７２】
また、例えば、機能性単体型のナノ粒子−生体関連分子複合体で標識化されたタンパク質が脂質二分子膜で輸送される例を図１０〜１１に示す。
図１０に示すように、機能性単体型である図４のナノ粒子−生体関連分子複合体７０は、ビオチン化ＰＥＧ７１の末端のビオチン７４と、タンパク質であるストレプトアビジン１１０との特異的な結合により、ストレプトアビジン１１０を標識化している。そして、標識化されたストレプトアビジン１１０が脂質二分子膜Ｓ２に導入されることで、ナノ粒子−生体関連分子複合体７０とストレプトアビジン１１０とは、結合した状態で、脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に伴い、矢印Ｆの方向に輸送される。かかる形態においては、ストレプトアビジン１１０をナノ粒子−生体関連分子複合体７０で標識化した後に混合物へ添加してもよいし、ストレプトアビジン１１０とナノ粒子−生体関連分子複合体７０とをそれぞれ混合物に添加してもよい。あるいは、脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に伴って輸送されるストレプトアビジン１１０に対し、ナノ粒子−生体関連分子複合体７０を添加して標識化してもよい。
【００７３】
あるいは、図１１に示すように、機能性単体型である図５のナノ粒子−生体関連分子複合体８０は、タンパク質結合型ＰＥＧ８１の末端の結合部８４とタンパク質１２０との特異的な結合により、タンパク質１２０を標識化している。そして、標識化されたタンパク質１２０が脂質二分子膜Ｓ２に導入されることで、ナノ粒子−生体関連分子複合体８０とタンパク質１２０とは、結合した状態で、脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に伴い、矢印Ｆの方向に輸送される。かかる形態においては、タンパク質１２０をナノ粒子−生体関連分子複合体８０で標識化した後に混合物へ添加してもよいし、タンパク質１２０とナノ粒子−生体関連分子複合体８０とをそれぞれ混合物に添加してもよい。あるいは、脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に伴って輸送されるタンパク質１２０に対し、ナノ粒子−生体関連分子複合体８０を添加して標識化してもよい。
【００７４】
また、例えば、機能性ベシクル型のナノ粒子−生体関連分子複合体で標識化されたタンパク質が脂質二分子膜で輸送される例を図１２〜１３を用いて説明する。
図１２に示すように、機能性単体型である図６のナノ粒子−生体関連分子複合体９０は、ビオチン−ＰＥＧ化リン脂質９１の末端のビオチン７４と、タンパク質であるストレプトアビジン１１０との特異的な結合により、ストレプトアビジン１１０を標識化している。そして、標識化されたストレプトアビジン１１０が脂質二分子膜Ｓ２に導入されることで、ナノ粒子−生体関連分子複合体９０とストレプトアビジン１１０とは、結合した状態で、脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に伴い、矢印Ｆの方向に輸送される。かかる形態においては、ストレプトアビジン１１０をナノ粒子−生体関連分子複合体９０で標識化した後に混合物へ添加してもよいし、ストレプトアビジン１１０とナノ粒子−生体関連分子複合体９０とをそれぞれ混合物に添加してもよい。あるいは、脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に伴って輸送されるストレプトアビジン１１０に対し、ナノ粒子−生体関連分子複合体９０を添加して標識化してもよい。
【００７５】
あるいは、図１３に示すように、機能性ベシクル型である図７のナノ粒子−生体関連分子複合体１００は、タンパク質結合型ＰＥＧ化リン脂質１０１の末端の結合部８４とタンパク質１２０との特異的な結合により、タンパク質１２０を標識化している。そして、標識化されたタンパク質１２０が脂質二分子膜Ｓ２に導入されることで、ナノ粒子−生体関連分子複合体１００とタンパク質１２０とは、結合した状態で、脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に伴い、矢印Ｆの方向に輸送される。かかる形態においては、タンパク質１２０をナノ粒子−生体関連分子複合体１００で標識化した後に混合物へ添加してもよいし、タンパク質１２０とナノ粒子−生体関連分子複合体１００とをそれぞれ混合物に添加してもよい。あるいは、脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に伴って輸送されるタンパク質１２０に対し、ナノ粒子−生体関連分子複合体１００を添加して標識化してもよい。
【００７６】
また、例えば、複数の流路上にそれぞれ異なるタンパク質を配置し、機能性ベシクル型のナノ粒子−生体関連分子複合体で標識化されたタンパク質が脂質二分子膜で輸送される例を図１４〜１５に示す。
図１４においては、混合物が、ナノ粒子−生体関連分子複合体９０でストレプトアビジン１１０を標識化したものを含む例を示す。図１４に示すように、案内部１９は２つの流路１６を備え、一方の流路１６にはタンパク質１３０が配置され、他方の流路１６にはタンパク質１３２が配置されている。脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に伴い、ナノ粒子−生体関連分子複合体９０で標識化されたストレプトアビジン１１０が矢印Ｆの方向に輸送されて、タンパク質１３０又はタンパク質１３２が配置された位置に到達する。この時、流路１６に塩化ナトリウムや塩化カルシウム等の塩類を含む水溶液を添加すると、ベシクル９２が崩壊し、亀裂１９０が形成され、この亀裂１９０から内包されていた化学物質９８が放出される。化学物質９８が放出されると、タンパク質１３０又は１３２はその種類に応じた生体反応を示す。この生体反応の有無を観察することで、化学物質９８又はタンパク質１３０もしくは１３２の生理活性機能を分析できる。この例では、タンパク質１３０は生体反応を示し、タンパク質１３２は生体反応を示していない。
【００７７】
図１５においては、混合物が、ナノ粒子−生体関連分子複合体１００でタンパク質１２０を標識化したものを含む例を示す。図１５に示すように、案内部１９は２つの流路１６を備え、一方の流路１６にはタンパク質１４０が配置され、他方の流路１６にはタンパク質１４２が配置されている。脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に伴い、ナノ粒子−生体関連分子複合体１００で標識化されたタンパク質１２０が矢印Ｆの方向に輸送されて、タンパク質１４０又はタンパク質１４２が配置された位置に到達する。この時、流路１６に上記のような塩類を含む水溶液を添加すると、ベシクル９２が崩壊し、亀裂１９０が形成され、この亀裂１９０から内包されていた化学物質９８が放出される。化学物質９８が放出されると、タンパク質１４０又は１４２は、その種類に応じて、輸送されてきたタンパク質１２０との間で生体分子間相互作用を示す。この生体反応の有無を観察することで、化学物質９８に対するタンパク質１４０又は１４２の生体反応を分析できる。この例では、タンパク質１４０はタンパク質１２０との間に生体分子間相互作用を示し、タンパク質１４２はタンパク質１４２との間に生体分子間相互作用を示していない。
【００７８】
上述の通り、本発明の生体分子分析用キットは、輸送基板の輸送媒体に脂質二分子膜を使用するため、輸送するナノ粒子−生体関連分子複合体、ならびにタンパク質を標識化したナノ粒子−生体関連分子複合体の流動性が高く、安定である。そのため生体分子の生理機能の失活を抑制できる。
【００７９】
本発明の生体分子分析用キットは、指標物質であるナノ粒子−生体関連分子複合体が表面に生体関連分子を備えるナノ粒子を含有するため、高い生体適合性を有すると共に、量子ドット又は金属ナノ粒子特有の優れた光学特性が発揮される。このため、輸送された生体分子の位置情報を把握することができる。
加えて、本発明の生体分子分析用キットは、輸送基板に親水部と疎水部とからなる流路パターンの形成により脂質二分子膜の自発展開を制御し（特開２００７−２４８２９０号公報）、生体分子を輸送基板上の所望の位置に輸送できる。
【００８０】
本発明の生体分子分析用キットは、ナノ粒子を量子ドット又は金属ナノ粒子とすることで、より高い光学特性を発揮できる。
加えて、生体関連分子をリン脂質又はポリエーテル化リン脂質とすることで、ナノ粒子−生体関連分子複合体の脂質二分子膜への導入をより容易にできる。
【００８１】
本発明の生体分子分析用キットは、生体関連分子をビオチン化ポリエーテル、マレイミド化ポリエーテル及びスクシンイミド化ポリエーテルとすることで、ナノ粒子−生体関連分子複合体のタンパク質への指標化を図れる。
【００８２】
従来、生理活性を検査するバイオチップ等では、添加する化学物質の大部分が溶液中に拡散し、生体分子に対する化学物質の作用が低効率となる問題があった。本発明の化学物質内包型のナノ粒子−生体関連分子複合体は、１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等の水溶液等を添加することにより、容易にベシクルが破壊されるものである。このナノ粒子−生体関連分子複合体によれば、塩類を含む水溶液を添加することで、内包する化学物質を生体分子に対して近距離で放出し、化学物質を高効率で作用させることができる。また、ベシクルがナノ粒子で標識されているため、生体組織内でターゲットとする生体分子の位置情報を容易に把握することができる。
加えて、ナノ粒子−生体関連分子複合体を機能性ベシクル型とすることで、タンパク質への標識化を図れる。
さらに、機能性単体型又は機能性ベシクル型のナノ粒子−生体関連分子複合体がタンパク質を指標化することで、各種生体分子間相互作用を分析できる。
【００８３】
（第二の実施形態）
本発明の第二の実施形態にかかる生体分子分析用キットについて、以下に図面を参照して説明する。
本実施形態の生体分子分析用キットは、分析装置をバイオリアクターチップとしたものであり、このバイオリアクターチップは、親水部及び疎水部からなる流路パターンを有する輸送基板を利用した、流路型の素子構造を有するものである。
【００８４】
＜バイオリアクターチップ＞
図１６に示すように、バイオリアクターチップ２００は、基板本体２０２上に、第一の輸送部２１０と、第二の輸送部２２０と、第三の輸送部２３０とが形成されたものである。基板本体２０２の材質は、第一の実施形態における基板本体１０と同様である。
第一の輸送部２１０は、試料配置部２１１と、反応用試薬配置部２１２と、検出部２１３と、検出用試薬配置部２１４と、試料配置部２１１と検出部２１３とを連絡する流路２１６と、検出部２１３と検出用試薬配置部２１４とを連絡する流路２１８と、流路２１６と反応用試薬配置部２１２とを連絡する流路２１７とで構成されている。基板本体２０２の第一の輸送部２１０の位置には、流路２１６上、かつ流路２１６と検出部２１３との連結部近傍にナノギャップ電極２１９が設けられている。ナノギャップ電極２１９が設けられていることで、ナノギャップ電極２１９に電圧を印加して、ナノ粒子−生体関連分子複合体及びナノ粒子−生体関連分子複合体に標識化された生体分子の輸送特性（速さ、出発・停止の輸送スイッチング）を制御できる。即ち、ナノギャップ電極２１９を備えることにより、第一の輸送部２１０における分子輸送のゲーティング機能をバイオリアクターチップ２００に付与できる。
【００８５】
第一の輸送部２１０は、親水部であり、第一の輸送部２１０が形成されていない部分、即ち基板本体２０２の表面は疎水部とされている。
流路２１６、２１７、２１８の幅は、特に限定されないが、１〜１００μｍが好ましい。
【００８６】
ナノギャップ電極２１９は、特許３７３７９９５号公報、Ｙ．Ｋａｓｈｉｍｕｒａら、「シィン・ソリッド・フィルムズ（Ｔｈｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｆｉｌｍｓ）」、第４３８−４３９巻、２００３年、第３１７−３２１頁に記載の公知の方法により製造できる。
【００８７】
第二の輸送部２２０は、試料配置部２２１と、反応用試薬配置部２２２と、検出部２２３と、検出用試薬配置部２２４と、試料配置部２２１と検出部２２３とを連絡する流路２２６と、検出部２２３と検出用試薬配置部２２４とを連絡する流路２２８と、流路２２６と反応用試薬配置部２２２とを連絡する流路２２７とで構成されている。第二の輸送部２２０には、流路２２６上、かつ流路２２６と検出部２２３との連結部近傍にナノギャップ電極２２９が設けられている。
【００８８】
第二の輸送部２２０は、親水部であり、第一の輸送部２１０と同様である。
ナノギャップ電極２２９は、ナノギャップ２１９と同様である。
【００８９】
第三の輸送部２３０は、試料配置部２３１と、反応用試薬配置部２３２と、検出部２３３と、検出用試薬配置部２３４と、試料配置部２３１と検出部２３３とを連絡する流路２３６と、検出部２３３と検出用試薬配置部２３４とを連絡する流路２３８と、流路２３６と反応用試薬配置部２３２とを連絡する流路２３７とで構成されている。第三の輸送部２３０には、流路２３６上、かつ流路２３６と検出部２３３との連結部近傍にナノギャップ電極２３９が設けられている。
【００９０】
第三の輸送部２３０は、親水部であり、第一の輸送部２１０と同様である。
ナノギャップ電極２３９は、ナノギャップ２１９と同様である。
【００９１】
＜ナノ粒子−生体関連分子複合体＞
本実施形態に用いられるナノ粒子−生体関連分子複合体は、第一の実施形態に用いられるナノ粒子−生体関連分子複合体と同じである。
【００９２】
＜分析方法＞
次に、バイオリアクターチップ２００を用いた生体分子の分析方法について、ナノ粒子−生体関連分子複合体として化学物質内包型を用いた場合を例にして説明する。
【００９３】
検出部２１３、２２３、２３３に、それぞれ異なる種類及び／又は濃度の標的生体分子を配置する。
試料配置部２１１、２２１、２３１に脂質二分子膜を形成し、それぞれの脂質二分子膜上に、ナノ粒子−生体関連分子複合体で標識化した異なる種類及び／又は濃度の検体試料を配置する。
第一の輸送部２１０において、各試料は、脂質二分子膜の自発展開により輸送され、試料配置部２１１から流路２１６に流入する。この際、反応用試薬配置部２１２にナノ粒子−生体関連分子複合体を配置し、流路２１６を輸送途中の検体試料に対して、ナノ粒子−生体関連分子複合体を標識化してもよい。反応用試薬配置部２１２には、任意の反応用試薬を配してもよい。これらの検体試料は輸送されて、標的生体分子が配置される検出部２１３に流入する。
【００９４】
検出部２１３では、例えば、試料中にナノ粒子−生体関連分子複合体に標識化された生体分子と相互作用する標的分子がある場合、該標的分子が検出部２１３において、該生体分子と相互作用する。さらに、検出用試薬配置部２１４から流路２１８を経由して導入した塩類を含む水溶液等の試薬により、ナノ粒子−生体関連分子複合体のベシクルに内包された化学物質が放出される。オプティカルプローブ２５０により、検出部２１３の分光測定を行うことで、生体分子と標的分子とが特異的に結合し、さらに、化学物質の作用により生体反応を起こした検出部２１３においてのみ、分光信号の変化が観測される。
こうして、試料中に含まれる標的分子を、分子選択的に、同定、定量、生体反応診断を行える。
【００９５】
第二の輸送部２２０、第三の輸送部２３０においても、第一の輸送部２１０と同様にして、試料中に含まれる標的分子を分子選択的に、同定、定量、生体反応診断できる。
【００９６】
上述の通り、バイオリアクターチップを用いた本発明の生体分子分析用キットによれば、各生体分子は脂質二分子膜の環境下に存在するため、生体分子の流動性及び安定性が高く、生理機能が長時間にわたり保持される。加えて、標的生体分子が配置された検出部に短時間、かつ高収率でナノ粒子−生体関連分子複合体及びナノ粒子−生体関連分子複合体に標識化された生体分子を輸送することができる。さらに、ナノ粒子−生体関連分子複合体に内包される化学物質を、高効率で標的分子に作用させることが可能となる。
【００９７】
バイオリアクターチップを用いた本発明の生体分子分析用キットによれば、ナノギャップ電極配置によるゲーティング機能の付与により、ナノ粒子−生体関連分子複合体及びナノ粒子−生体関連分子複合体に標識化された生体分子の輸送特性の制御が可能となる。加えて、量子ドット等の光安定性が高いナノ粒子を用いるため、生体分子輸送や生体分子間反応の長時間の観測が可能となる。さらに、バイオリアクターチップ上の反応点を高密度に集積させることが可能なため、バイオリアクターチップのスループットの向上、高感度化、小型化、生体分子の輸送に伴う逐次的な生体分子反応計測等の付加価値が得られる。
【００９８】
（その他の実施形態）
本発明の生体分子分析用キットは、上述の実施形態に限定されない。第一の実施形態では、案内部１９が流路１６及び疎水部１２からなる縞状の流路パターンとされているが、流路パターンはこれに限定されず、例えば、流路が渦巻き状のものとされていてもよい。
【００９９】
第二の実施形態では、基板本体２０２に３つの輸送部が形成されているが、本発明はこれに限定されず、輸送部の数は２つ以下であってもよいし、４つ以上であってもよい。
【実施例】
【０１００】
本発明について実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【０１０１】
（合成例１）
カルボキシル基修飾量子ドット５２５（量子ドット５２５（発光波長５２５ｎｍ）、Ｑｄｏｔ▲Ｒ▼ＩＴＫＴＭ  Ｃａｒｂｏｘｙｌ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔｓ，Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）８μｍｏｌを含む水溶液、ならびにＤＯＰＥを２．５ｍｇ／ｍＬ含むクロロホルム分散液、ならびに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を２０ｍｇ／ｍＬ含む水溶液、ならびにホウ酸バッファー溶液（１０ｍｍｏｌ  Ｈ３ＢＯ３、ｐＨ７．４）をそれぞれ調製した。反応容器のガラス瓶内に、クロロホルム１．１ｍＬを加え、続いてＤＯＰＥクロロホルム分散液２８６μＬ（９６０ｎｍｏｌ）を添加した。撹拌子で緩やかに撹拌しながら、ホウ酸バッファー溶液７００μＬ、量子ドット５２５水溶液１００μＬ（０．８ｎｍｏｌ）、ＥＤＣ水溶液２７６μＬ（２８．８μｍｏｌ）を添加し、反応溶液を均一系にするためにメタノール２．５ｍＬを滴下した。この反応溶液を室温で終夜撹拌すると、ガラス容器壁面に沈着する黄色の生成物を得た。反応溶液を完全に除去した後、クロロホルムを添加すると、生成物はクロロホルムに均一に分散した。このクロロホルム分散液に純水を加え、遠心分離（１０，０００回転／分、１０分、１０℃）、上澄み水相除去の操作を繰り返し行い、生成物が溶解するクロロホルム相のみを抽出することで、未反応の量子ドット５２５及び過剰なＥＤＣを除去した。その後、クロロホルムを完全に除去し、図２のナノ粒子−生体関連分子複合体５０に相当するナノ粒子−生体関連分子複合体Ａを得た。ナノ粒子−生体関連分子複合体Ａは、ナノ粒子の表面が、リン脂質分子で化学修飾されているため、クロロホルムに再分散可能であった。
【０１０２】
（合成例２）
卵黄由来フォスファチジルコリン（Ｌ−α−ＰＣ）０．２ｍｇ、実施例１で得られたナノ粒子−生体関連分子複合体Ａ１０．５μｇ（５質量％）、及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｂｉｏｔｉｎ０．６μｇ（０．３質量％）を含む複合体−クロロホルム分散液２００μＬを調製した。続いて、ＩＴＯ基板（ＳｉＯ２上に膜厚１００ｎｍのＩＴＯが薄膜化された基板、サイズ４０×４０ｎｍ、５０〜１００Ω・ｃｍ）上に、Ｌ−α−ＰＣと複合体−クロロホルム分散液を均一に塗布した。この基板を、室温で２時間、減圧乾燥して、クロロホルム分散液を完全に除去することで、均一なリン脂質薄膜をＩＴＯ基板上に形成した。このリン脂質薄膜上に、窓部を有するシリコーンゴム（外寸３０×３０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコーンゴムを２０×２０ｍｍのサイズでくり貫いた窓部を有する）を密着して配置し、窓部に２００ｍｍｏｌのスクロース水溶液４００μＬを滴下した。さらに、その上部にＩＴＯ基板を配置し、シリコーンゴム窓部にある溶液をＩＴＯ基板で挟み込んで密閉した。続いて、ＩＴＯ基板にクリップ電極を接合し、６０℃のホットプレート上で、交流電場（正弦波、１Ｖ、１０Ｈｚ）を２時間印加することで、電解形成法により、図６のナノ粒子−生体関連分子複合体９０に相当するナノ粒子−生体関連分子複合体がスクロース水溶液に分散したベシクル−スクロース分散液を得た。このベシクルの内孔には、化学物質としてスクロース水溶液を含む。
【０１０３】
＜共焦点レーザー蛍光顕微鏡測定＞
シリコーンコートされた撥水性のスライドガラス表面に、２００ｍｍｏｌのグルコース溶液を３００μＬ滴下し、液滴を形成させた。その液滴中に、合成例２で得られたベシクル−スクロース分散液１０μＬを添加した。ベシクル内部にあるスクロース水溶液と、ベシクル外液のグルコース溶液の比重の差を利用し、ベシクルをスライドガラス表面近傍に沈降させるため、５分間静置した。その後、この試料を共焦点レーザー蛍光顕微鏡（励起：４８８ｎｍアルゴンレーザー、観測：５０５〜５２５ｎｍ領域観測用の蛍光フィルター、４０倍対物レンズ）を用いて観察した。その結果を図１７に示す。
【０１０４】
図１７に示すように、共焦点レーザー蛍光顕微鏡写真から、リング状の蛍光像が多数観測された。このリング形状は、ベシクルの断面を反映した像である。リング状に蛍光成分が観測される結果は、ベシクル構造のリン脂質二重層内、又はベシクル表面に量子ドットを含有するナノ粒子−生体関連分子複合体Ａが導入されていることを示唆する。ベシクルの内孔には蛍光成分が観測されず、ナノ粒子−生体関連分子複合体Ａはベシクル内液中にはほぼ含まれていないことが推量される。
【０１０５】
（実施例１）
＜輸送用試料の調製＞
卵黄由来フォスファチジルコリン（Ｌ−α−ＰＣ）が０．２ｍｇ溶解するクロロホルム溶液０．５ｍＬに、実施例１で作製したナノ粒子−生体関連分子複合体Ａを５質量％、脂質膜の自発展開を観測するための指示薬として、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ  ＤＨＰＥ  （Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ  １，２−ｄｉｈｅｘａｄｅｃａｎｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ）を１ｍｏｌ％となるように混合した。その後、アルゴンガスを吹き付けて、クロロホルムを蒸発させ、該混合試料からなる脂質膜をガラス瓶の内壁に形成した。これを真空下で２時間乾燥させ、残存する溶液を完全に除去し、輸送用試料を得た。
【０１０６】
＜輸送基板の製造＞
ガラス基板（ガラスウエハ）上に、プライマーとしてヘキサメチルジシロキサンを滴下し、５００回転／分で、３０秒間、引き続き２０００回転／分で３０秒間のスピンコートを行った。次いで、フォトレジスト（ＴＳＭＲ−Ｖ９０、東京応化工業株式会社製）を滴下し、５００回転／分で３０秒間、引き続き２０００回転／分で３０秒間のスピンコートを行った。このガラス基板を１２０℃のオーブンで９０秒間ベーキングした。これをフォトマスクによって露光し、引き続き現像した。次に、スパッタ蒸着法によって、ガラス基板上にチタンを１０ｎｍ蒸着した。スパッタ蒸着後のガラス基板を、メチルエチルケトンに浸漬して超音波処理し、リフトオフプロセスによりレジストを溶解・剥離した。次いで、純水流水下で洗浄し、図１の輸送基板１と同様の親水部及び疎水部からなる流路パターンを有する輸送基板Ａを得た（流路高：１０ｎｍ）。その後、輸送基板Ａを、イソプロパノール−水酸化カリウム溶液、エタノール、純水、フッ化アンモニウム溶液を用いて洗浄し、基板表面のＳｉＯ２面をエッチングして親水化処理を施した。該親水化処理により、流路の高さは２０ｎｍとなった。
【０１０７】
＜共焦点レーザー蛍光顕微鏡測定＞
「＜輸送用試料の調製＞」で得られた輸送用試料をガラス製キャピラリーの先端に付着させ、輸送基板Ａの第一の試料収容部に配置した。その後、共焦点レーザー蛍光顕微鏡の対物レンズ（４０倍レンズ使用）と試料との間に、ＰＢＳ緩衝液を静かに注入した。共焦点レーザー蛍光顕微鏡の観測は、以下の２つの観測チャネルを同時に用いた。
（１）量子ドット観測用、励起：４８８ｎｍレーザー、観測：５０５〜５２５ｎｍ領域観測用の蛍光フィルター
（２）Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ  ＤＨＰＥ観測用、励起：５４３ｎｍレーザー、観測：６１０ｎｍ以上領域観測用の蛍光フィルター
ＰＢＳ緩衝液の注入から、０、１５０、３００、４５０、６００、７５０、９００、１０５０秒後の蛍光像を図１８（ａ）〜（ｈ）に示す。図１８中、符号３１４は第一の試料収容部を示し、符号３１６は流路を示す（以降において同じ）。
【０１０８】
図１８（ａ）〜（ｈ）に示すように、流動性の高い脂質分子が親水性の流路内で自発展開する様子が、前記観測チャネル（２）を用いたＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ  ＤＨＰＥの蛍光像から観測された。この脂質分子の自発展開は、疎水的な金属からなる流路外の部分には展開しなかった。また、この輸送基板は、表面を洗浄して親水性処理を施していたため、有機物質の不純物の存在等によって自発展開速度が遅延する等の不都合は確認されなかった。しかしながら、ここでは観測チャネル（１）から、ナノ粒子−生体関連分子複合体の輸送を示唆する明確な像は得られなかった。
【０１０９】
図１９に、脂質膜の自発展開後の蛍光像を示す。図１９（ａ）は観測チャネル（１）を用いてナノ粒子−生体関連分子複合体を観測した蛍光像、図１９（ｂ）は観測チャネル（２）を用いて、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ  ＤＨＰＥを観測した蛍光像、図１９（ｃ）は図１９（ａ）及び（ｂ）の重ね合わせ蛍光像である。図１９（ａ）に示すように、第一の試料収容部３１４では、脂質二分子膜の多層膜の自発展開により、ナノ粒子−生体関連分子複合体が輸送されている様子が確認された。一方、流路３１６では、ナノ粒子−生体関連分子複合体に由来する明確な蛍光像が得られなかった。流路３１６には、脂質二分子膜の単層膜のみが自発展開により進入することが可能である。そのため、流路３１６においては、単層の脂質二分子膜の自発展開により輸送されるナノ粒子−生体関連分子複合体の粒子数が少なく、蛍光顕微鏡の感度では観測できないことが推量される。そこで以下に示すように、原子間力顕微鏡を用いて、流路３１６で自発展開する脂質二分子膜、ならびに輸送されるナノ粒子−生体関連分子複合体の解析を行った。
【０１１０】
＜原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）測定＞
「＜輸送用試料の調製＞」で得られた輸送用試料をガラス製キャピラリーの先端に付着させ、輸送基板Ａの第一の試料収容部３１４に配置した。その後、ＡＦＭのカンチレバーと試料との間に、ＰＢＳ緩衝液を静かに注入した。この試料に関し、室温、溶液中でＡＦＭ測定を行った。ＡＦＭ測定では、特定の流路３１６のみを連続的に観測し、自発展開される脂質二分子膜が該観測地点に到達するまで測定を継続した。この結果を図２０（ａ）〜（ｉ）、図２１（ａ）〜（ｄ）に示す。ここでは、便宜上、脂質二分子膜が観測地点に到着する直前を０秒（図２０（ａ））とした。図２１（ａ）は、図２０（ｇ）のＡの直線における断面、図２１（ｂ）は、図２０（ｇ）のＢの直線における断面、図２１（ｃ）は、図２０（ｇ）のＣの直線における断面、図２１（ｄ）は、図２０（ｇ）のＤの直線における断面をそれぞれ測定した結果を示すグラフである。
図２０（ａ）〜（ｉ）に示すように、時間経過とともに、脂質二分子膜が輸送基板Ａの流路３１６を自発展開する様子が確認できた。また、図２１の結果から、膜厚約５ｎｍの脂質二分子膜の単分子膜が、流路３１６内を自発展開し、徐々に流路３１６を充填して行くことが明らかとなった。
【０１１１】
図２２〜２３に、自発展開後の脂質二分子膜のＡＦＭ像を示す。図２２は、輸送基板Ａにおける任意の流路３１６を観察した結果であり、図２３は、輸送基板Ａにおける任意の他の流路３１６を観察した結果である。観察した２つの流路３１６は、互いにその幅が異なるものである。図２２（ａ）、図２３（ａ）に示すように、自発展開後の脂質二分子膜内に、ナノ粒子−生体関連分子複合体に由来するドット状の粒子３３０、３３２、３３４が多数観測された。図２２（ｂ）に示すように、粒子３３２の高さは８ｎｍ程度であった。また、図２３（ｂ）に示すように、粒子３３４の高さは１２ｎｍ程度であった。この結果から、輸送基板Ａの流路３１６において、脂質二分子膜の自発展開に伴い、ナノ粒子−生体関連分子複合体が輸送されていることが判った。
【符号の説明】
【０１１２】
１        輸送基板
１２      疎水部
１３      親水部
５０、６０、７０、８０、９０、１００    ナノ粒子−生体関連分子複合体
５２      ナノ粒子
５８、９３    リン脂質
６１      ＰＥＧ化リン脂質
７１      ビオチン化ＰＥＧ
８１      タンパク質結合型ＰＥＧ
９１      ビオチン−ＰＥＧ化リン脂質
９２      ベシクル
９４      ナノ粒子複合体
９６      内孔
９８      化学物質
１０１    タンパク質結合型ＰＥＧ化リン脂質
１１０    ストレプトアビジン
１２０    タンパク質
２００    バイオリアクターチップ
２１０、２２０、２３０    輸送部
２１９、２２９、２３９    ナノギャップ電極
Ｓ２      脂質二分子膜
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図２１】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２３】
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