(57)【要約】【課題】ヘモグロビン類を短時間で高精度に測定することができ、かつ、カラム寿命を向上させることのできるヘモグロビン分離用カラム充填剤を提供する。また、該ヘモグロビン分離用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、並びに、該ヘモグロビン分離用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法を提供する。更に、該ヘモグロビン分離用カラム充填剤の製造方法を提供する。【解決手段】水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体を２０〜７０重量％、及び、架橋性アクリル系単量体を３０〜８０重量％含有するアクリル系単量体混合物を重合して得られる、平均細孔直径が２〜２０ｎｍである多孔性架橋重合体粒子の表面に、カチオン交換基を導入してなるヘモグロビン類分離用カラム充填剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体を２０〜７０重量％、及び、架橋性アクリル系単量体を３０〜８０重量％含有するアクリル系単量体混合物を重合して得られる、平均細孔直径が２〜２０ｎｍの多孔性架橋重合体粒子の表面に、カチオン交換基を導入してなる
ことを特徴とするヘモグロビン類分離用カラム充填剤。
【請求項２】
アクリル系単量体混合物は、５０重量％以下の非架橋性アクリル系単量体を含有することを特徴とする請求項１記載のヘモグロビン類分離用カラム充填剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いることを特徴とする液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項４】
請求項１又は２記載のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いることを特徴とする液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法。
【請求項５】
請求項１又は２記載のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を製造する方法であって、
水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体を２０〜７０重量％、及び、架橋性アクリル系単量体を３０〜８０重量％を含有するアクリル系単量体混合物を水系分散媒に分散し、分散液を得る工程１、
前記分散液を、重合開始剤の存在下で加温し、アクリル系共重合体からなる多孔性架橋重合体粒子を得る工程２、及び、
得られた多孔性架橋重合体粒子の表面にカチオン交換基を導入する工程３を有する
ことを特徴とするヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘモグロビン類分離用カラム充填剤及び該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法に関する。また、本発明は、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、並びに、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査の分野においては、糖尿病診断の指標としてヘモグロビンＡ１ｃの測定が汎用的に行なわれている。ヘモグロビンＡ１ｃは、液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣともいう）、免疫法、酵素法等により測定されているが、なかでもＨＰＬＣは精度が良く、短時間に測定できるため、特に糖尿病患者のヘモグロビンＡ１ｃ値の管理に用いられている。
【０００３】
ＨＰＬＣでヘモグロビンＡ１ｃを測定する際、ヘモグロビンＡ１ｃを短時間かつ高精度に測定でき、しかもカラム耐久性を高くする（カラム寿命を長くする）ために、カラム充填剤に必要な要件の１つは、測定対象試料中の成分の非特異吸着が生じ難いことである。カラム充填剤に試料中の成分が非特異吸着すると、得られるクロマトグラムが変形してヘモグロビンＡ１ｃ値の測定精度が低下する。その結果、カラム耐久性が低くなり、カラム寿命が短くなる。
【０００４】
このような非特異吸着を抑制する方法としては、カラム充填剤に用いられる重合体粒子を親水性材料により調製する方法が考えられる。しかしながら、重合体粒子を親水性にするほど、カラム充填剤の耐圧性、耐膨潤性が低下するため、迅速な分析がし難くなる。
カラム充填剤の耐圧性等を低下させずにカラム充填剤を親水化させる手段として、耐圧性に優れた重合体粒子の表面を親水性高分子で被覆し、カラム充填剤を二層構造とする方法が公知である。例えば、特許文献１には、重合体粒子の表面を親水性高分子であるポリビニルアルコールで被覆し、重合体粒子表面にイオン交換基を導入したカラム充填剤が開示されている。しかしながら、このような親水性高分子の被覆は、高分子鎖の疎水性に依存した物理的な吸着によるものであるため、多数の試料を測定する場合には、測定を繰り返すことで被覆した親水性高分子が剥離し、測定精度が低下する可能性が大きい。
【０００５】
また、より強固に親水性高分子を架橋重合体粒子の表面に被覆して二層構造とする方法としては、架橋重合体粒子の表面で親水性単量体を重合させることにより、架橋重合体粒子の表面を親水性高分子で被覆する方法が挙げられる。特許文献２には、架橋重合体粒子の表面に親水性重合体の層を形成する方法が開示されており、親水性重合体として、カチオン交換性重合体を用いることにより、ヘモグロビンＡ１ｃを高精度に分離することができるカラム充填剤が得られるとしている。しかしながら、測定のより高速化、高精度化が要望される最近では、特許文献２のカラム充填剤でも分離性能が不充分なことが多い。特許文献２の技術を用いて分離性能を改善するためには、カチオン交換性重合体の種類の変更、又は、カチオン交換基量の増減等が考えられるが、これらの最適化技術でも分離性能の改善が不充分なことが多い。また、特許文献２の技術は重合操作が煩雑である上、２段階目に添加した単量体類のホモポリマーによる凝集が発生しやすく、収率が低くなるという問題がある。
【０００６】
特許文献３には、非多孔性の架橋重合体粒子にイオン交換基を導入する方法が開示されている。特許文献３では、一般的に行われている手法、即ち、架橋重合体粒子が有する水酸基をエポキシ化した後、硫酸ナトリウムでスルホン酸基を導入する方法により得られたカラム充填剤を用いて、ヘモグロビンＡ１ｃを測定している。
しかしながら、特許文献３の技術を用いても、測定時間が長く、また、測定精度も不充分なことが多く、ヘモグロビンＡ１ｃとヘモグロビンＡ０との間に溶出する、一般に微量成分であるヘモグロビンＦの分離精度が悪いという問題がある。
【０００７】
臨床検査の現場においては、ヘモグロビンＡ１ｃ等のヘモグロビン類を、短時間で高精度に測定したいという強い要望があり、ＨＰＬＣに用いられるカラム充填剤に対しては、より高い分離性能が要望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平１１−１８３４６０号公報
【特許文献２】特開平０３−７３８４８号公報
【特許文献３】特開平０３−２５５３６０公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ヘモグロビン類を短時間で高精度に測定することができ、かつ、カラム寿命を向上させることのできるヘモグロビン類分離用カラム充填剤を提供することを目的とする。また、本発明は、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、並びに、ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法を提供することを目的とする。更に、本発明は、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体を２０〜７０重量％、及び、架橋性アクリル系単量体を３０〜８０重量％含有するアクリル系単量体混合物を重合して得られる、平均細孔直径が２〜２０ｎｍの多孔性架橋重合体粒子の表面に、カチオン交換基を導入してなるヘモグロビン類分離用カラム充填剤である。
また、上記ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、又は、ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法も本発明の１つである。
更に、水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体を２０〜７０重量％、及び、架橋性アクリル系単量体を３０〜８０重量％を含有するアクリル系単量体混合物を水系分散媒に分散し、分散液を得る工程１、上記分散液を、重合開始剤の存在下で加温し、アクリル系共重合体からなる多孔性架橋重合体粒子を得る工程２、及び、得られた多孔性架橋重合体粒子の表面にカチオン交換基を導入する工程３を有するヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法も本発明の１つである。
以下に本発明を詳述する。
【００１１】
本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤は、水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体を２０〜７０重量％、及び、架橋性アクリル系単量体を３０〜８０重量％含有するアクリル系単量体混合物を重合して得られ、かつ、平均細孔直径が２〜２０ｎｍの多孔性架橋重合体粒子を基材とする。
なお、本明細書において「アクリル系」とは、アクリル基又はメタクリル基を有することを意味する。また、本明細書において「（メタ）アクリル酸」とは、「アクリル酸又はメタクリル酸」であることを示す。
【００１２】
上記水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体は、１分子内に水酸基を一つ以上有するものであれば特に限定されないが、親水性が大きく、かつ、イオン交換基を有していないことが好ましい。
【００１３】
上記水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体としては、例えば、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、その他の水酸基を有する（メタ）アクリレート類等が挙げられる。
上記ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシトリ（ポリ）エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、プロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、ポリ（エチレングリコール・プロピレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、オクトキシポリエチレングリコールポリプロピレングリコール−モノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記その他の水酸基を有する（メタ）アクリレート類としては、例えば、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルエチル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルプロピル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
これらの水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体は、単独で用いてもよいし、２種以上を併用して用いてもよい。
【００１４】
上記アクリル系単量体混合物における上記水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体の含有量の下限は２０重量％、上限は７０重量％である。水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体の含有量が２０重量％未満であると、得られるカラム充填剤の親水性が小さくなり、非特異吸着を誘引する。水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体の含有量が７０重量％を超えると、架橋性アクリル系単量体の含有量が低下することにより、得られるカラム充填剤の耐圧性、耐膨潤性が低下し、ヘモグロビン類の正確な測定ができなくなる。上記水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体の含有量の好ましい下限は２５重量％である。
【００１５】
上記架橋性アクリル系単量体としては、例えば、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類、分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類等が挙げられる。
上記ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、ポリテトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール−テトラメチレングリコール）−ジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールポリプロピレングリコールポリエチレングリコール−ジ（メタ）アクリレート、１，３−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサグリコールジ（メタ）アクリレート、１，９−ノナンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、２−ヒドロキシ−１，３−ジ（メタ）アクリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−１−（メタ）アクリロキシ−３−（メタ）アクリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル（メタ）アクリレート、グリセロールジ（メタ）アクリレート、グリセロールアクリレートメタクリレート、ウレタン（メタ）ジアクリレート、イソシアヌル酸ジ（メタ）アクリレート、イソシアヌル酸トリ（メタ）アクリレート、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−５−メチル−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１１−ジ（メタ）アクリロキシ−４，８−ジオキサウンデガン−２，６，１０−トリオール等が挙げられる。
上記分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類としては、例えば、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタントリ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
これらの架橋性アクリル系単量体は、単独で用いてもよいし、２種以上を併用して用いてもよい。また、上記架橋性アクリル系単量体は、イオン交換基を有さない構造であることが好ましい。
【００１６】
上記アクリル系単量体混合物における上記架橋性アクリル系単量体の含有量の下限は３０重量％、上限は８０重量％である。架橋性アクリル系単量体の含有量が３０重量％未満であると、得られるカラム充填剤の耐圧性、耐膨潤性が低下し、ヘモグロビン類の正確な測定ができなくなる。架橋性アクリル系単量体の含有量が８０重量％を超えると、得られる多孔性架橋重合体粒子を構成する上記水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体に由来するセグメントの含有量が減少して得られるカラム充填剤の親水性が小さくなり、非特異吸着を誘引する。また、上記架橋性アクリル系単量体の含有量を上記範囲外とした場合、得られる架橋重合体粒子の細孔直径が後述する範囲を逸脱し、分離性能に悪影響を及ぼす。上記架橋性アクリル系単量体の含有量の好ましい下限は３５重量％、好ましい上限は７５重量％である。
【００１７】
上記アクリル系単量体混合物は、上記水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体、及び、上記架橋性アクリル系単量体に加えて、必要に応じて、その他の非架橋性アクリル系単量体を含有してもよい。
その他の非架橋性アクリル系単量体としては、親水性の非架橋性アクリル系単量体が好ましい。好適に用いられる親水性の非架橋性アクリル系単量体としては、例えば、（メタ）アクリル酸アルキル類等が挙げられる。
上記（メタ）アクリル酸アルキル類としては、例えば、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル等が挙げられる。
【００１８】
また、上記アクリル系単量体混合物は、多孔性架橋重合体粒子の表面に後述するカチオン交換基を導入するために、該カチオン交換基を有する化合物と反応する官能基（以下、反応性官能基ともいう）を有する非架橋性アクリル系単量体を含有してもよい。
ここでいう反応性官能基とは、非イオン交換性で、かつ、後述するカチオン交換基を有する化合物と反応することができる官能基であり、例えば、グリコール基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、アルデヒド基等が挙げられ、好ましくは、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基であり、より好ましくは、エポキシ基、グリシジル基である。
上記反応性官能基を有する非架橋性アクリル系単量体としては、例えば、エポキシ化（メタ）アクリレート類、アミノ化（メタ）アクリレート類、アルデヒド化（メタ）アクリレート類、シアノ化（メタ）アクリレート類等が挙げられる。
上記エポキシ化（メタ）アクリレート類としては、例えば、グリシジル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記アミノ化（メタ）アクリレート類としては、例えば、２−アミノエチル（メタ）アクリレート、２，３−ジアミノエチル（メタ）アクリレート、２−アミノプロピル（メタ）アクリレート、２，３−ジアミノプロピル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。
上記アルデヒド化（メタ）アクリレート類としては、例えば、（メタ）アクロレイン等が挙げられる。
上記シアノ化（メタ）アクリレート類としては、例えば、シアノ（メタ）アクリレート、エチル−２−シアノアクリレート等が挙げられる。
【００１９】
上記アクリル系単量体混合物における上記その他の非架橋性アクリル系単量体の含有量の好ましい上限は５０重量％である。
上記その他の非架橋性アクリル系単量体の含有量が５０重量％を超えると、相対的に水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体、及び、架橋性アクリル系単量体のバランスが崩れ、得られる多孔性架橋重合体粒子の細孔直径が後述する範囲を逸脱し、得られるカラム充填剤の分離性能に悪影響を及ぼすことがある。上記その他の非架橋性アクリル系単量体の含有量のより好ましい上限は３０重量％である。
【００２０】
上記多孔性架橋重合体粒子の形状は、平均細孔直径が後述する範囲内であれば特に限定されないが、球状であることが好ましい。
上記多孔性架橋重合体粒子の粒子径は特に限定されないが、好ましい下限は０．１μｍ、好ましい上限は５０μｍである。多孔性架橋重合体粒子の粒子径が０．１μｍ未満であると、溶離液をカラムに流すために必要となる圧力が増大し、ＨＰＬＣの装置に耐圧性付与のための特殊な部品等が必要となる。上記多孔性架橋重合体粒子の粒子径が５０μｍを超えると、カラム内の空隙率が増大し、試料が拡散しやすくなり、ピークのブロード化等により測定精度が低下する場合がある。上記多孔性架橋重合体粒子の粒子径のより好ましい下限は０．５μｍ、より好ましい上限は３０μｍである。
【００２１】
上記多孔性架橋重合体粒子における平均細孔直径の下限は２ｎｍ、上限は２０ｎｍである。上記平均細孔直径が２ｎｍ未満であると、細孔を有することによる効果が小さくなり、得られるカラム充填剤のヘモグロビン類の分離性能が不充分となる。上記平均細孔直径が２０ｎｍを超えると、細孔内への非特異吸着等によりカラム寿命が短くなる。本発明のヘモグロビン類分離用カラムは上記多孔性架橋重合体粒子を基材とするので、本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤の平均細孔直径も多孔性架橋重合体粒子と同様に上記範囲となる。
なお、上記平均細孔直径はＢＥＴ吸着法、水銀圧入法等、公知の方法により測定することができる。
【００２２】
本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤は、上記アクリル系単量体混合物を重合して得られる、平均細孔直径が２〜２０ｎｍである多孔性架橋重合体粒子と、該多孔性架橋重合体粒子の表面に導入されたカチオン交換基とにより構成される。
上記カチオン交換基とは、公知のカチオン交換性を有する官能基を指し、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられ、特にスルホン酸基が好ましい。
なお、本発明でいうカチオン交換基は、カチオン交換基に付随する構造は問わず、上記カチオン交換基を末端に有する全ての官能基を含む。例えば、本発明でいう「カルボキシル基」とは、カルボキシルエチル基、カルボキシルプロピル基等、カルボキシル基が結合する官能基類全てを含む。
また、上記多孔性架橋重合体粒子に導入されるカチオン交換基は、複数種のカチオン交換基であってもよい。
【００２３】
本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤は、上記水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体、及び、上記架橋性アクリル系単量体を上述した比率で含有するアクリル系単量体混合物を重合して得られる多孔性架橋重合体粒子が有する水酸基及び／又は反応性官能基に、上記カチオン交換基を有する化合物を反応させて、上記水酸基及び／又は反応性官能基をカチオン交換基に変換することにより得ることができる。
即ち、水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体を２０〜７０重量％、及び、架橋性アクリル系単量体を３０〜８０重量％を含有するアクリル系単量体混合物を水系分散媒に分散し、分散液を得る工程１、上記分散液を、重合開始剤の存在下で加温し、アクリル系共重合体からなる多孔性架橋重合体粒子を得る工程２、及び、得られた多孔性架橋重合体粒子の表面にカチオン交換基を導入する工程３を有する製造方法により、本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を得ることができ、このような製造方法も本発明の一つである。
【００２４】
本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法においては、まず、多孔性架橋重合体粒子を調製する。この多孔性架橋重合体粒子を調製するためには、上記水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体及び架橋性アクリル系単量体を上述した比率で含有するアクリル系単量体混合物を水系分散媒に分散させて分散液を得る（工程１）。
上記水系分散媒は、分散剤を溶解した水溶液であることが望ましい。
上記分散剤としては、公知の分散剤が用いられ、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリデン等の水溶性高分子類やリン酸カルシウム等の無機塩類等が用いられる。
上記水系分散媒中の分散剤の濃度は、分散剤の種類により異なるが、好ましい下限は０．０１重量％、好ましい上限は２０重量％である。上記分散剤の濃度が０．０１重量％未満であると、多孔性架橋重合体粒子が分散し難くなり、多孔性架橋重合体粒子の合着が起こることがある。上記分散剤の濃度が２０重量％を超えると、多孔性架橋重合体粒子の粒径が必要以上に小さくなったり、重合中に凝集塊が発生したりする場合がある。上記分散剤の濃度のより好ましい下限は０．１重量％、より好ましい上限は１０重量％である。
【００２５】
次に、上記分散液を、重合開始剤の存在下で加温して重合反応を行う（工程２）。
上記重合開始剤としては、水溶性又は油溶性の公知のラジカル重合開始剤を用いることができ、例えば、過硫酸塩、有機過酸化物、アゾ化合物等が挙げられる。
上記過硫酸塩としては、例えば、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウム等が挙げられる。
上記有機過酸化物としては、例えば、クメンハイドロパーオキサイド、ベンゾイルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、オクタノイルパーオキサイド、ｏ−クロロベンゾイルパーオキサイド、アセチルパーオキサイド、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシアセテート、ｔ−ブチルパーオキシイソブチレート、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイド等が挙げられる。
上記アゾ化合物としては、例えば、２，２−アゾビスイソブチロニトリル、２，２−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、４，４−アゾビス（４−シアノペンタン酸）、２，２−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、２，２−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル等が挙げられる。
【００２６】
上記アクリル系単量体混合物１００重量部に対する上記重合開始剤の配合量の好ましい下限は０．０５重量部、好ましい上限は５重量部である。上記重合開始剤の配合量が０．０５重量部未満であると、重合反応が不充分となったり、重合反応に長時間要したりすることがある。上記重合開始剤の配合量が５重量部を超えると、急激な反応の進行により凝集物が発生することがある。
なお、上記重合開始剤は、上記アクリル系単量体混合物に溶解させて用いることが好ましい。
【００２７】
上記重合開始剤の存在下で、上記分散液を加温することにより重合反応を行う。上記重合反応の方法としては、例えば、乳化重合法、ソープフリー重合法、分散重合法、懸濁重合法等の公知の重合反応を適用することができる。なかでも、分散重合法、懸濁重合法等が好適である。
【００２８】
本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法において、重合反応系には有機溶媒類は添加しないのが好ましい。特に一般に用いられる、粒子を多孔質化する効果のある多孔質化剤は添加しないのが好ましい。
一般に、架橋重合体粒子を多孔質化するために用いられる多孔質化剤としては、単量体混合物を溶解するが、その重合体を溶解しない有機溶媒が用いられ、該有機溶媒を単量体混合物に添加して重合反応を行い、重合反応後に上記多孔質剤を除去することにより、得られる架橋重合体粒子にマクロポアを形成する。このような有機溶媒としては、例えば、芳香族炭化水素類、飽和炭化水素類、炭素数６以上程度の高級アルコール類等が挙げられる。
しかしながら、これらの多孔質化剤は、重合後の洗浄により完全に除去することが困難であること、及び、多孔質化剤を添加することにより得られる細孔の直径が大きくなり、本発明の規定する、ヘモグロビン類の分離に適した上記の平均細孔直径を得ることが困難となることから、本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法においては添加しないのが好ましい。
但し、炭素数３以下の低級アルコール類等は、多孔質化作用がないため、他の目的により添加してもよい。ここでいう他の目的とは、連鎖移動反応を起こして重合反応を制御する、又は、単量体類の溶解度を調節する等が挙げられる。
【００２９】
その他に、公知の重合方法において用いられる各種の添加剤等は添加してもよい。
上記添加剤としては、例えば、重合反応を制御するための各種連鎖移動剤、単量体の溶解度を調節するための有機又は無機化合物等が挙げられる。
【００３０】
次に、上記工程２で得られた多孔性架橋重合体粒子の表面にカチオン交換基を導入する（工程３）。
上記多孔性架橋重合体粒子の表面へのカチオン交換基の導入は、上記多孔性架橋重合体粒子が有する反応性官能基、即ち、上記水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体に由来するセグメントにおける水酸基、及び／又は、上記その他の非架橋性アクリル系単量体に由来するセグメントにおける反応性官能基に、カチオン交換基を有する化合物を反応させることにより行われる。
【００３１】
上記反応性官能基にカチオン交換基を有する化合物を反応させる方法としては、公知の化学反応による技術を用いることができる。下記に例示する方法は全て公知の化学反応であり、上記多孔性架橋重合体粒子の分解等の反応を伴わない条件であれば、公知の反応を限定なく用いることができる。
【００３２】
上記多孔性架橋重合体粒子の有する水酸基を介してカチオン交換基を導入する場合、例えば、ブロムエタンスルホン酸ナトリウム等のハロゲン化エタンスルホン酸類やクロロ酢酸ナトリウム等のハロゲン化酢酸類を、カチオン交換基を有する化合物として用い、これらの化合物を水酸化アルカリ水溶液中で反応させることにより、上記多孔性架橋重合体粒子の表面にカチオン交換基を導入することができる。
また、カチオン交換基を有するアルデヒド化合物を、酸触媒下にてアセタール反応により、上記多孔性架橋重合体粒子の有する水酸基と反応させることにより、同様にカチオン交換基を導入することができる。
更に、トリカルバニル酸、ブタンテトラカルボン酸等の多官能カルボン酸化合物と水酸基との脱水反応によるエステル化により、カルボキシル基を導入することができる。
１，３−プロパンスルトン、１，４−ブタンスルトン等を水酸化アルカリ水溶液中又は水酸化アルカリの有機溶媒溶液中で反応させることによっても、上記多孔性架橋重合体粒子の表面にスルホン酸基を導入することができる。
【００３３】
また、エポキシ基、グリシジル基、又は、アミノ基を介してカチオン交換基を導入する場合、例えば、水酸基及び／又は上記反応性官能基を有する多孔性架橋重合体粒子に、エピクロルヒドリンやトリグリシジルエーテルのようなエポキシ化合物を水酸化アルカリ水溶液中又は水酸化アルカリの有機溶媒溶液中で反応させてエポキシ化した後、硫酸ナトリウム、タウリン、グリコール酸等のカチオン交換基含有化合物を反応させる方法、三フッ化ホウ素エーテラートを結合した後、亜硫酸ナトリウム水溶液中で加熱処理する方法等が挙げられる。上記反応性官能基がエポキシ基やグリシジル基の場合には、そのまま上記処理に供してもよい。
【００３４】
本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、ヘモグロビンＡ１ｃ等の種々の蛋白質等の試料を測定することができる。本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いたＨＰＬＣによるヘモグロビンＡ１ｃの測定方法もまた、本発明の一つである。
本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いてＨＰＬＣによりヘモグロビンＡ１ｃ等のヘモグロビン類の測定を行なう場合には、溶離液送液用のポンプ、サンプラ、検出器等を備えた公知のＨＰＬＣシステムに、本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を充填したカラムを接続し、血液試料中のヘモグロビン類の測定を行なうことができる。
【００３５】
本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いたＨＰＬＣに用いられる溶離液としては、公知の塩化合物を含む緩衝液類や有機溶媒類を用いることが好ましく、具体的には例えば、有機酸、無機酸、及び、これらの塩類、アミノ酸類、グッドの緩衝液等が挙げられる。
上記有機酸としては、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等が挙げられる。
上記無機酸としては、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等が挙げられる。
上記アミノ酸類としては、例えば、グリシン、タウリン、アルギニン等が挙げられる。
また、上記緩衝液には、他に一般に添加される物質、例えば、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物等を適宜添加してもよい。
ヘモグロビンＡ１ｃの測定を行う際の上記緩衝液の塩濃度の好ましい下限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は１０００ｍｍｏｌ／Ｌである。上記緩衝液の塩濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌ未満であると、イオン交換反応が行なわれず、ヘモグロビンを分離することができなくなることがある。上記緩衝液の塩濃度が１０００ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、塩が析出しシステムに悪影響を及ぼすことがある。
【００３６】
本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用い、ＨＰＬＣにより、上記ヘモグロビンＡ１ｃに加えて、異常ヘモグロビン類を測定することができる。このような測定方法もまた、本発明の一つである。
本発明の測定方法により測定できる異常ヘモグロビン類としては、例えば、ヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＣ等が挙げられる。また、ヘモグロビンＦ（胎児性ヘモグロビン）やヘモグロビンＡ２を測定することもできる。
【発明の効果】
【００３７】
本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤は、水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体を２０〜７０重量％、及び、架橋性アクリル系単量体を３０〜８０重量％含有するアクリル系単量体混合物を重合して得られ、平均細孔直径が２〜２０ｎｍである多孔性架橋重合体粒子と、該多孔性架橋重合体粒子の表面に導入されたカチオン交換基とにより構成される。
上記アクリル系単量体混合物に含有される水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体及び架橋性アクリル系単量体を上記組成比とすることで、ヘモグロビン類の分離に適した細孔径を有する多孔性架橋重合体粒子が得られる。そのため、本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤は、多孔質化剤を用いて作製した細孔径の大きな多孔性架橋重合体粒子を用いた従来のカラム充填剤よりも短時間で高い分離性能を示し、その結果、高精度な測定及びカラム耐久性能の向上が図られる。特に、ヘモグロビンＡ１ｃの測定において、高精度測定及びカラム耐久性の向上が達成される。
つまり、本発明によれば、ヘモグロビン類を短時間で高精度に測定することができ、かつ、カラム寿命を向上させることのできるヘモグロビン類分離用カラム充填剤を提供することができる。また、本発明によれば、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、並びに、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法を提供することができる。更に、本発明によれば、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】実施例１のカラム充填剤を用いてヘモグロビンＡ１ｃの測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図２】比較例１のカラム充填剤を用いてヘモグロビンＡ１ｃの測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図３】実施例１のカラム充填剤を用いて異常ヘモグロビン類の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図４】実施例１のカラム充填剤を用いてヘモグロビンＡ２の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図５】実施例１、実施例４、比較例１、及び、比較例５のカラム充填剤の耐久性評価の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
（実施例１）
水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体として、テトラエチレングリコールモノメタクリレート（日油社製）２００ｇ、及び、架橋性アクリル系単量体としてトリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）２００ｇを含有するアクリル系単量体混合物に、重合開始剤として過酸化ベンゾイル（ナカライテスク社製）１．０ｇを溶解した。得られた混合物を、４重量％のポリビニルアルコール（日本合成化学工業社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、８時間重合反応を行なった。
得られた架橋重合体粒子をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、水酸基を有する多孔性架橋重合体粒子を得た。
得られた多孔性架橋重合体粒子５０ｇを、１０重量％の水酸化ナトリウム水溶液１００ｍＬに分散させ、室温で４０ｇのエピクロルヒドリンを添加し、５時間反応させ、表面をエポキシ化した多孔性架橋重合体粒子を得た。得られた表面をエポキシ化した多孔性架橋重合体粒子４０ｇを２０重量％の硫酸ナトリウム水溶液に分散させ、８０℃で２０時間反応させた。得られた反応物をイオン交換水で洗浄し、表面にスルホン酸基が導入された多孔性架橋重合体粒子（ヘモグロビン類分離用カラム充填剤）を得た。
得られたヘモグロビン類分離用カラム充填剤を、全自動比表面積／細孔分布測定装置（日本ベル社製、ＢＥＴ法）により細孔分布を測定したところ、平均細孔直径は４．１ｎｍであった。
上記ヘモグロビン分離用カラム充填剤を、内径３ｍｍ、長さ３０ｍｍのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビン分離用カラムを調製した。
【００４０】
上記ヘモグロビン分離用カラムを、ＨＰＬＣシステム（島津製作所社製、「ＬＣ−１０Ａ」）に接続した。測定試料として、フッ化ナトリウム採血したヒト健常人血液を、０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）により２００倍に溶血希釈したものを用いた。溶離液Ａとして２００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）、及び、溶離液Ｂとして４００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）の２種の溶離液を用い、流速１．０ｍＬで送液して溶離液Ａから溶離液Ｂへのステップワイズグラジエント法により分離し、４１５ｎｍの吸光度を測定した結果、図１のクロマトグラムを得た。図１中、ピーク１がヘモグロビンＡ１ｃ、ピーク２がヘモグロビンＡ０である。ヘモグロビンＡ１ｃと他のヘモグロビン分画とが短時間内に良好に分離された。
【００４１】
（実施例２）
水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体として、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（日油社製）１２０ｇ、架橋性アクリル系単量体としてグリセロールジメタクリレート（日油社製）２００ｇ、及び、テトラメチロールプロパントリメタクリレート８０ｇ（新中村化学工業社製）を含有するアクリル系単量体混合物を用いた以外は、実施例１と同様に操作を行い、ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を得た。
実施例１と同様にして細孔分布を測定したところ、平均細孔直径は２．５ｎｍであった。
実施例１と同様に操作して、ヘモグロビン分離用カラムを調製し、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。
【００４２】
（実施例３）
水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体として、テトラエチレングリコールモノメタクリレート（日油社製）１００ｇ、架橋性アクリル系単量体としてトリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）２００ｇ、及び、その他のアクリル系単量体としてグリシジルメタクリレート１００ｇ（日油社製）を含有するアクリル系単量体混合物を用いた以外は、実施例１と同様に操作を行い、ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を得た。
実施例１と同様にして細孔分布を測定したところ、平均細孔直径は１２．８ｎｍであった。
実施例１と同様に操作して、ヘモグロビン分離用カラムを調製し、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。
【００４３】
（実施例４）
水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体として、２，３−ジヒドロキシルプロピルメタクリレート（日油社製）２６０ｇ、及び、架橋性アクリル系単量体としてテトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）１４０ｇを含有するアクリル系単量体混合物を用いた以外は、実施例１と同様に操作を行い、ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を得た。
実施例１と同様にして細孔分布を測定したところ、平均細孔直径は１７．５ｎｍであった。
実施例１と同様に操作して、ヘモグロビン分離用カラムを調製し、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。
【００４４】
（比較例１）
本比較例では、上記実施例４と同様の原料を用いた上で、混合比率を変化させて多孔性架橋重合体粒子を調製した例を示す。
水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体として２，３−ジヒドロキシルプロピルメタクリレート３２０ｇ、及び、架橋性アクリル系単量体としてテトラエチレングリコールジメタクリレート８０ｇを含有するアクリル系単量体混合物を用いた以外は、実施例１と同様に操作を行い、ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を得た。
実施例１と同様にして細孔分布を測定したところ、平均細孔直径は２５．０ｎｍであった。
実施例１と同様に操作して、ヘモグロビン分離用カラムを調製し、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、図２のクロマトグラムを得た。図２中、ピーク１がヘモグロビンＡ１ｃ、ピーク２がヘモグロビンＡ０である。ヘモグロビンＡ１ｃと他のヘモグロビン分画とが良好に分離されなかった。
【００４５】
（比較例２）
本比較例では、上記実施例４と同様の原料を用いた上で、混合比率を変化させて多孔性架橋重合体粒子を調製した例を示す。
水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体として２，３−ジヒドロキシルプロピルメタクリレート４０ｇ、及び、架橋性アクリル系単量体としてテトラエチレングリコールジメタクリレート３６ｇを含有するアクリル系単量体混合物を用いた以外は、実施例１と同様に操作を行い、ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を得た。
実施例１と同様にして細孔分布を測定したところ、平均細孔直径は１．２ｎｍであった。
実施例１と同様に操作して、ヘモグロビン分離用カラムを調製し、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、図２と同様のクロマトグラムを得た。
【００４６】
（比較例３）
本比較例では、上記実施例４と同様の原料を用いた上で、多孔質化剤を添加して多孔性架橋重合体粒子を調製した例を示す。
水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体として２，３−ジヒドロキシルプロピルメタクリレート２６０ｇ、及び、架橋性アクリル系単量体としてテトラエチレングリコールジメタクリレート１４０ｇ、並びに、多孔質化剤としてトルエン２００ｇを含有する単量体混合物を用いた以外は、実施例１と同様に操作を行い、ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を得た。
実施例１と同様にして細孔分布を測定したところ、平均細孔直径は３６．６ｎｍであった。
実施例１と同様に操作して、ヘモグロビン分離用カラムを調製し、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、図２と同様のクロマトグラムを得た。
【００４７】
（比較例４）
本比較例では、上記実施例４と同様の原料を用いた上で、アクリル系以外の単量体を添加して多孔性架橋重合体粒子を調製した例を示す。
水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体として２，３−ジヒドロキシルプロピルメタクリレート２６０ｇ、及び、架橋性アクリル系単量体としてテトラエチレングリコールジメタクリレート１００ｇ、並びに、アクリル系以外の単量体としてスチレン（キシダ化学社製）４０ｇを含有する単量体混合物を用いた以外は、実施例１と同様に操作を行い、ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を得た。
実施例１と同様にして細孔分布を測定したところ、平均細孔直径は１５．３ｎｍであった。
実施例１と同様に操作して、ヘモグロビン分離用カラムを調製し、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、図２と同様のクロマトグラムを得た。
【００４８】
（比較例５）
本比較例では、カチオン交換基を有する単量体を、架橋性アクリル系単量体と共重合させてカチオン交換樹脂を得た例を示す。
架橋性アクリル系単量体として２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン（日油社製）２００ｇ、及び、ジエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）２００ｇ、並びに、カチオン交換基を有する単量体として２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東亞合成社製）２００ｇを含有する単量体混合物を用いた以外は、実施例１と同様に操作を行い、ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を得た。
実施例１と同様にして細孔分布を測定したところ、平均細孔直径は３．５ｎｍであった。
実施例１と同様に操作して、ヘモグロビン分離用カラムを調製し、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、図２と同様のクロマトグラムを得た。
【００４９】
＜評価＞
実施例及び比較例で得られたヘモグロビン類分離カラムを用いて、以下の評価を行った。
【００５０】
（１）回収率試験
実施例及び比較例で調製したヘモグロビン類分離カラムを用いて、回収率試験を実施した。回収率は、カラムの代わりに内径０．２５ｍｍ、長さ１０００ｍｍのＰＥＥＫ製配管をＨＰＬＣに取り付け、実施例及び比較例で用いた試料を測定したときのピーク総面積に対する調製したヘモグロビン類分離カラムを取り付けて測定したときのピーク総面積の比率（％）により求めた。結果を表１に示す。
【００５１】
【表１】
2011047859.tif 000002
【００５２】
実施例１〜４及び比較例１で調製したヘモグロビン類分離カラムにおいては、ほぼ１００％の回収率が得られた。
一方、比較例２〜５で調製したヘモグロビン類分離カラムでは回収率が低く、特に比較例２〜４では６５％にも満たなかった。これは、測定対象であるヘモグロビンがカラム充填剤に非特異的に吸着して溶出してこなかったためであると考えられる。
【００５３】
（２）修飾ヘモグロビン類の分離性能評価
実施例に用いたヒト健常人血液の代わりに、修飾ヘモグロビン類を含む試料を人為的に調製して測定し、そのヘモグロビンＡ１ｃピークとの分離性能を評価した。
修飾ヘモグロビン類を含む試料としては、レイバイルヘモグロビンＡ１ｃ含有試料（試料Ｌ）、アセチル化ヘモグロビン含有試料（試料Ａ）、カルバミル化ヘモグロビン含有試料（試料Ｃ）の３種類を、公知の方法により調製した。
即ち、試料Ｌは、ヒト健常人血液に、グルコースを２０００ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で３時間加温することにより調製した。試料Ａは、ヒト健常人血液に、アセトアルデヒドを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。試料Ｃは、ヒト健常人血液に、シアン酸ナトリウムを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。
得られた修飾ヘモグロビン類を含む試料（試料Ｌ、試料Ａ、試料Ｃ）と、修飾ヘモグロビン類を含む試料の調製に用いたヒト健常人血液（非修飾品）とを、実施例及び比較例で調製したヘモグロビン類分離カラムを用いて測定し、ヘモグロビンＡ１ｃの測定値を比較した。分離性能は、修飾ヘモグロビン類を含む試料のヘモグロビンＡ１ｃ値から非修飾品のヘモグロビンＡ１ｃ値を差し引いた値（Δ値）を算出して比較することにより評価した。結果を表２に示す。
【００５４】
【表２】
2011047859.tif 000003
【００５５】
表２に示した実施例のΔ値は０．２％以下であり、修飾ヘモグロビン類が含まれる試料においても、正確にヘモグロビンＡ１ｃが測定できることがわかる。一方、比較例のヘモグロビン類分離カラムを用いた場合では、修飾ヘモグロビンが存在すると、ヘモグロビンＡ１ｃ値が大きく変動し、ヘモグロビンＡ１ｃ値を正確に測定することができなかった。
【００５６】
（３）異常ヘモグロビン類の分離性能評価
実施例及び比較例で調製したヘモグロビン類分離カラムを用いて、異常ヘモグロビンとしてヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含む試料（ヘレナ研究所社製、「ＡＦＳＣヘモコントロール」）の測定を行った。
実施例１のヘモグロビン類分離カラムを用いて測定した結果、得られたクロマトグラムを図３に示す。図３中、ピーク１はヘモグロビンＡ１ｃ、ピーク２はヘモグロビンＡ０、ピーク３はヘモグロビンＦ（胎児性Ｈｂ）、ピーク４はヘモグロビンＳ、ピーク５はヘモグロビンＣを示す。実施例１のヘモグロビン類ヘモグロビン類分離カラムにおいては、異常ヘモグロビン類であるヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを良好に分離することができた。他の実施例のカラム充填剤を用いた場合でも、ほぼ同様の分離性能を示した。
一方、比較例のヘモグロビン類分離カラムを用いて測定した場合、異常ヘモグロビン類であるヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを分離することはできなかった。
【００５７】
（４）ヘモグロビンＡ２の分離性能評価
実施例及び比較例で調製したヘモグロビン類分離カラムを用いて、ヘモグロビンＡ２を含む試料として、Ａ２コントロール（レベル２）（バイオラッド社製）を測定した。
実施例１のカラム充填剤を用いて測定して得られたクロマトグラムを図４に示す。図４中、ピーク１はヘモグロビンＡ１ｃ、ピーク２はヘモグロビンＡ０、ピーク３はヘモグロビンＦ（胎児性Ｈｂ）、ピーク６はヘモグロビンＡ２を示す。実施例１のヘモグロビン類分離カラムにおいて、ヘモグロビンＡ２を良好に分離することができた。他の実施例のカラム充填剤を用いた場合でも、ほぼ同様の分離性能を示した。
一方、比較例のカラム充填剤を用いて測定した場合、ヘモグロビンＡ２を分離することはできなかった。
【００５８】
（５）カラム耐久性の評価
実施例１、４、並びに、上記回収率試験及び修飾ヘモグロビン類の分離が比較的良かった比較例１、５で調製したヘモグロビン類分離カラムを用いて、同一のヒト健常人血液試料を連続測定し、ヘモグロビンＡ１ｃ値の推移を確認した。結果を図５に示す。
実施例１及び４で調製したヘモグロビン類分離カラムでは、３０００回測定においても測定値が変化しなかったが、比較例１及び５で調製したヘモグロビン類分離カラムを用いた場合は、測定値が低下し、カラム寿命が短いことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明によれば、ヘモグロビン類を短時間で高精度に測定することができ、かつ、カラム寿命を向上させることのできるヘモグロビン類分離用カラム充填剤を提供することができる。また、本発明によれば、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、並びに、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法を提供することができる。更に、本発明によれば、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法を提供することができる。
【符号の説明】
【００６０】
１  ヘモグロビンＡ１ｃ
２  ヘモグロビンＡ０
３  ヘモグロビンＦ（胎児性Ｈｂ）
４  ヘモグロビンＳ
５  ヘモグロビンＣ
６  ヘモグロビンＡ２
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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