(57)【要約】【課題】多光子顕微鏡において、超短パルス光の繰り返し周波数を上げて試料の劣化を抑制するとともに、高画質の観察像を容易に安定して得る。【解決手段】超小型レーザ１１は、その共振器長が15cm以下であり、繰り返し周波数が1GHz以上で、パルス幅がフェムト秒単位の超短パルス光を射出する。超小型レーザ１１から射出された超短パルス光は、ビーム調整部１２により各種の調整が行われた後、ダイクロイックミラー１３により反射され、ダイクロイックミラー１４および対物レンズ１５を介して試料２に照射される。超短パルス光を照射することにより試料２から発せられた観察光は、蛍光検出部１６、蛍光検出部２０、または、蛍光検出部２２により検出される。本発明は、例えば、多光子顕微鏡に適用できる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
共振器長が15cm以下であり、超短パルス光を射出するレーザ光源と、
前記レーザ光源からの前記超短パルス光を前記試料に照射し、前記試料からの多光子励起光を検出するための光学系と
を備える多光子顕微鏡。
【請求項２】
前記レーザ光源を複数備え、
複数の前記レーザ光源からの前記超短パルス光の光路を、前記試料に照射する前に１つに統合する統合手段を
さらに備える請求項１に記載の多光子顕微鏡。
【請求項３】
複数の前記レーザ光源は、同じ波長の前記超短パルス光を射出する
請求項２に記載の多光子顕微鏡。
【請求項４】
複数の前記レーザ光源は、さらに同じ偏光方向の前記超短パルス光を射出し、
前記統合手段は、
複数の前記レーザ光源からの前記超短パルス光の一部の偏光方向を所定の偏光方向に変更する偏光手段と、
前記偏光手段により偏光方向が変更された前記超短パルス光および前記偏光手段により偏光方向が変更されていない前記超短パルス光のうち一方を透過し、他方を反射する分岐手段と
を備え、
前記分岐手段により反射された前記超短パルス光の光路と、前記分岐手段を透過した前記超短パルス光の光路とが一致する
請求項３に記載の多光子顕微鏡。
【請求項５】
複数の前記レーザ光源からの前記超短パルス光が、光路が統合された後に互いに重ならないように、複数の前記レーザ光源から前記超短パルス光を射出するタイミングを制御するタイミング制御手段を
さらに備える請求項２に記載の多光子顕微鏡。
【請求項６】
複数の前記レーザ光源から出射された前記超短パルス光の強度をそれぞれ独立に調整する調整手段を
さらに備える請求項２に記載の多光子顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多光子顕微鏡に関し、特に、超短パルス光を使用可能な多光子顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、多光子励起を利用した走査型のレーザ顕微鏡である多光子顕微鏡が知られている。多光子顕微鏡では、非常に時間幅の短い（例えば、100フェムト秒の）パルス状のレーザ光である超短パルス光を集光して、生体等の試料に照射し、その超短パルス光の集光点近傍から発せられる多光子励起光を検出することにより、試料の観察が行われる（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
また、近年、超短パルス光を用いた多光子顕微鏡において、単位時間あたりに同じ強度の超短パルス光を試料に照射する場合、超短パルス光の１パルス当たりの強度を上げるよりも、１パルス当たりの強度を抑え、パルス数を増やすようにした方が、光褪色や光毒性などによる試料の劣化を抑制できることが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
そこで、従来、特殊な光分割素子を用いて１つの超短パルス光を複数の超短パルス光に分割し、その一部をディレイライン（長い光路）を通過させて、分割後の複数の超短パルス光の間に時間差を与えた後、全ての超短パルス光の光路を一つに統合することにより、超短パルス光の１パルス当たりの強度を下げるとともに、単位時間当たりの超短パルス光の繰り返し周波数を上げることができる装置が提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第２８４８９５２号公報
【特許文献２】米国特許出願公開２００９／００６７４５８号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】N. Ji, J. Magee, and E. Betzig, "High-speed, low-photodamage nonlinear imaging using passive pulse splitters, Nature Methods Vol.5, 2008年, p.197-202
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献２および非特許文献１に記載されている技術では、分割後の超短パルス光を遅延させるために、空気換算で最大数百mmにも及ぶディレイラインが必要となり、装置が大型化してしまう。
【０００８】
また、ディレイラインが長くなると、超短パルス光が、温度変化、空気の変動や振動などの外乱の影響を受けやすくなる上に、超短パルス光のビーム径が、ディレイラインの光路長に応じて大幅に変化する。
【０００９】
さらに、特許文献２および非特許文献１に記載されている技術では、分割した超短パルス光の光路の分岐や統合を繰り返しながら、最終的に全ての超短パルス光を、顕微鏡の対物レンズの光軸からずれないように同じ光路上を伝播する必要がある。そのため、超短パルス光の光路の分岐および統合に用いる光学素子を非常に高精度に調整する必要があり、調整の不備や光学素子の各種の誤差により、光路のズレが発生しやすい。
【００１０】
従って、特許文献２および非特許文献１に記載されている技術では、超短パルス光の一部または全部が、顕微鏡の対物レンズの後側焦点面（いわゆる瞳面）から外れてしまい、効率よく多光子励起光を励起することができなかったり、多光子励起光を励起できたとしても、照明光の開口数が不足し、得られる蛍光像の分解能が不足してしまったりすることが起こりやすい。ゆえに、特許文献２および非特許文献１に記載されている技術では、明るくてＳ／Ｎ比の良い高画質の観察像を安定して得ることが難しい。
【００１１】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、多光子顕微鏡において、超短パルス光の繰り返し周波数を上げて試料の劣化を抑制するとともに、高画質の観察像を容易に安定して得ることができるようにするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一側面の多光子顕微鏡は、共振器長が15cm以下であり、超短パルス光を射出するレーザ光源と、前記レーザ光源からの前記超短パルス光を前記試料に照射し、前記試料からの多光子励起光を検出するための光学系とを備える。
【００１３】
本発明の一側面においては、繰り返し周波数が1GHz以上の超短パルス光が試料に照射され、試料からの多光子励起光が検出される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の一側面によれば、多光子顕微鏡において、超短パルス光の繰り返し周波数を上げて試料の劣化を抑制するとともに、高画質の観察像を容易に安定して得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明を適用した多光子顕微鏡の第１の実施の形態を示すブロック図である。
【図２】本発明を適用した多光子顕微鏡の第２の実施の形態を示すブロック図である。
【図３】本発明を適用した多光子顕微鏡の第３の実施の形態を示すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を実施するための形態（以下、実施の形態という）について説明する。なお、説明は以下の順序で行う。
１．第１の実施の形態
２．第２の実施の形態
３．第３の実施の形態
４．変形例
【００１７】
＜１．第１の実施の形態＞
図１は、本発明の第１の実施の形態である多光子顕微鏡１の構成の例を示すブロック図である。
【００１８】
多光子顕微鏡１の超小型レーザ１１は、パルス幅がフェムト秒単位の（例えば、100フェムト秒の）超短パルス光を出射する超短パルスレーザにより構成される。より具体的には、超小型レーザ１１は、例えば、多層膜ミラーにより構成される負分散ミラー、レーザ結晶、過飽和吸収ミラー（SESAM）、および、SESAMと組み合わせたイットリビウム（Yb）ベースの固体レーザなどにより構成され、ソリトンモードロッキング（ソリトン型モード同期）技術を用いることにより、共振器長を数cmと短くしても、モードロッキング状態を安定して維持することが可能な小型の超短パルスレーザにより構成される。このような小型超短パルスレーザの詳細については、例えば、「山添昇吾，加藤雅紀，笠松直史、“小型超短パルスレーザ”、富士フイルム研究報告No.54、2009年、P.43-46」（以下、非特許文献２と称する）などに記載されている。
【００１９】
非特許文献２に記載されている小型超短パルスレーザは、超短パルス光の波長（例えば、赤外波長  約1000nm）が固定されているため、波長を変更するための可動部を設ける必要がなく、超短パルス光の射出角度が安定しており、さらに上述した技術的特徴により、従来の波長が可変の超短パルスレーザと比較して非常に小さくすることができる。また、この小型超短パルスレーザは、共振器長が短いため、従来の超短パルスレーザと比較して、超短パルス光の繰り返し周波数を大幅に高く設定することができる。例えば、非特許文献２には、共振器長を5cm未満とし、超短パルス光の最大繰り返し周波数を2.9GHzに設定できることが記載されている。
【００２０】
ビーム調整部１２は、超小型レーザ１１から入射される超短パルス光のビーム径を、対物レンズ１５の瞳径に合わせて調整する機能、試料２から発せられる多光子励起光の波長と超短パルス光の波長との軸上の色収差（ピント差）を補正するために超短パルス光の集光および発散角度を調整する機能、超短パルス光のパルス幅が光学系を通過する間に群速度分散により広がってしまうのを補正するために、超短パルス光の群速度に負分散を与えるプリチャープ機能等を有する。
【００２１】
超小型レーザ１１から発せられた超短パルス光は、ビーム調整部１２により上述した調整が行われた後、ビーム調整部１２から射出され、ダイクロイックミラー１３によりダイクロイックミラー１４の方向に反射され、ダイクロイックミラー１４を通過し、対物レンズ１５により集光されて試料２に照射される。このとき、図示せぬ走査手段により、超短パルス光が試料２の観察面において走査される。
【００２２】
試料２の超短パルス光が照射された領域およびその近傍では、試料２が染色されている蛍光色素が多光子励起され、赤外波長である超短パルス光より波長が短い蛍光（以下、観察光と称する）が発せられる。
【００２３】
試料２から対物レンズ１５の方向に発せられた観察光は、対物レンズ１５によりコリメートされ、その波長に応じて、ダイクロイックミラー１４により反射されたり、あるいは、ダイクロイックミラー１４を透過したりする。
【００２４】
ダイクロイックミラー１４により反射された観察光は、蛍光検出部１６に入射する。蛍光検出部１６は、例えば、バリアフィルタ、PMT（photo multiplier tube：光電子増倍管）などにより構成され、ダイクロイックミラー１４により反射された観察光を受光し、その光量に応じた電気信号を出力する。また、蛍光検出部１６は、超短パルス光が試料２の観察面において走査されるのに合わせて、試料２の観察面にわたる観察光を検出する。
【００２５】
一方、ダイクロイックミラー１４を透過した観察光は、図示せぬ走査手段によりデスキャンされ、ダイクロイックミラー１３を透過し、集光レンズ１７により集光され、対物レンズ１５の焦点位置とほぼ共役な位置に設けられているピンホール１８を通過し、結像レンズ１９を透過して、蛍光検出部２０に入射する。蛍光検出部２０は、例えば、バリアフィルタ、PMTなどにより構成され、結像レンズ１９により蛍光検出部２０の受光面において結像した観察光を受光し、その光量に応じた電気信号を出力する。また、蛍光検出部２０は、超短パルス光が試料２の観察面において走査されるのに合わせて、試料２の観察面にわたる観察光を検出する。
【００２６】
なお、ダイクロイックミラー１４を光路から外すことにより、試料２から対物レンズ１５の方向に発せられた全ての観察光を蛍光検出部２０で検出するようにしてもよい。
【００２７】
また、試料２から対物レンズ１５と逆の方向に発せられた観察光は、ダイクロイックミラー２１により反射され、蛍光検出部２２に入射する。蛍光検出部２２は、例えば、バリアフィルタ、PMTなどにより構成され、ダイクロイックミラー２１により反射された観察光を受光し、その光量に応じた電気信号を出力する。また、蛍光検出部２２は、超短パルス光が試料２の観察面において走査されるのに合わせて、試料２の観察面にわたる観察光を検出する。
【００２８】
蛍光検出部１６、蛍光検出部２０、および、蛍光検出部２２から出力された電気信号は、例えば、後段のコンピュータに入力され、そのコンピュータは、入力された電気信号に基づいて、観察画像を生成し、生成した観察画像を表示したり、観察画像のデータを記憶したりする。
【００２９】
ここで、超小型レーザ１１の共振器長Lの条件について考える。
【００３０】
超小型レーザ１１の共振器長Lと繰り返し周波数ｆの関係は、次式（１）により表される。
【００３１】
f＝c／(2nL）  ・・・(1)
ただし、cは光速で3×108m/s、nは共振器内の媒質の屈折率である。
【００３２】
上述した非特許文献１には、特許文献２に記載されている装置を使用して、１つの超短パルス光を１２８分割し、分割後の超短パルス光の時間間隔を37ピコ秒まで短縮することにより（すなわち、超短パルス光の繰り返し周波数fを約27GHz以上にすることにより）、光褪色や光毒性などによる試料の劣化を大幅に抑制できることが報告されている。そして、超短パルス光の繰り返し周波数f≧27GHzとするためには、超小型レーザ１１の共振器内の媒質は空気なので、屈折率n＝1とすると、式（１）から、共振器長L≦0.56cmとすればよい。
【００３３】
また、特許文献１には、１つの超短パルス光を少なくとも１６分割し、分割後の超短パルス光の時間間隔を300ピコ秒まで短縮することにより（すなわち、超短パルス光の繰り返し周波数fを約3.3GHz以上にすることにより）、試料の劣化の抑制効果が顕在化し始めることが報告されている。そして、超短パルス光の繰り返し周波数f≧3.3GHzとするためには、式（１）から、共振器長L≦4.5cmとすればよい。
【００３４】
さらに、特許文献１には、分割後の超短パルス光の時間間隔を1ナノ秒まで短縮することにより（すなわち、超短パルス光の繰り返し周波数fを約1GHz以上にすることにより）、試料の劣化を軽減する効果が現れることが報告されている。そして、超短パルス光の繰り返し周波数f≧1GHzとするためには、式（１）から、共振器長L≦15cmとすればよい。
【００３５】
以上をまとめると、多光子顕微鏡１の超小型レーザ１１の共振器長Lの条件は、望ましくは15cm以下であり、さらに望ましくは4.5cm以下であり、さらに望ましくは0.56cm以下である。
【００３６】
以上のように、多光子顕微鏡１では、超小型レーザ１１を用いて、超短パルス光の繰り返し周波数を上げることにより、光褪色や光毒性などによる試料２の劣化を容易に抑制することができる。
【００３７】
また、多光子顕微鏡１では、超小型レーザ１１を用いることにより、装置を小型化でき、超短パルス光の光路を短くすることができる。その結果、光路上で超短パルス光が受ける外乱の影響や、超短パルス光のビーム径の変化を小さく抑えることができる。さらに、多光子顕微鏡１では、特許文献２および非特許文献１に記載されている技術のように、超短パルス光の光路を分岐したり統合したりする必要がなく、光路の分岐および統合に用いる光学素子の調整も必要ないため、超短パルス光の光路の調整が容易であり、光路のズレが発生しにくい。その結果、明るくてＳ／Ｎ比の良い高画質の観察像を容易に安定して得ることが可能になる。
【００３８】
＜２．第２の実施の形態＞
図２は、本発明の第２の実施の形態である多光子顕微鏡１０１の構成の例を示すブロック図である。なお、図中、図１と対応する部分については同じ符号を付してあり、処理が同じ部分に関しては、その説明は繰り返しになるので省略する。
【００３９】
図２の多光子顕微鏡１０１は、図１の多光子顕微鏡１と比較して、超小型レーザの台数が４台に増え、タイミング制御部１１１、並びに、ミラー１２１ａ，１２１ｂ、ハーフミラー１２２ａ，１２２ｂ、λ／２波長板１２３、および、偏光ビームスプリッタ１２４からなる統合部１１２が追加されている点が異なる。
【００４０】
超小型レーザ１１ａ乃至１１ｄは、タイミング制御部１１１の制御に基づくタイミングで、同じ周波数で、かつ、同じ方向に偏光されている直線偏光の超短パルス光（以下、超短パルス光Ａ乃至Ｄと称する）を射出する。
【００４１】
なお、以下、超小型レーザ１１ａ乃至１１ｄを個々に区別する必要がない場合、単に超小型レーザ１１と称する。
【００４２】
超小型レーザ１１ａから射出された超短パルス光Ａは、ハーフミラー１２２ａに入射し、ハーフミラー１２２ａを透過する光と、ハーフミラー１２２ａにより反射される光に分岐される。そのうちハーフミラー１２２ａを透過した超短パルス光Ａは、偏光ビームスプリッタ１２４に入射する。
【００４３】
超小型レーザ１１ｂから射出された超短パルス光Ｂは、ミラー１２１ａによりハーフミラー１２２ａの方向に反射され、ハーフミラー１２２ａを透過する光と、ハーフミラー１２２ａにより反射される光に分岐される。そのうちハーフミラー１２２ａにより反射された超短パルス光Ｂは、ハーフミラー１２２ａを透過した超短パルス光Ａと同じ光路を進み、偏光ビームスプリッタ１２４に入射する。
【００４４】
超小型レーザ１１ｃから射出された超短パルス光Ｃは、ハーフミラー１２２ｂに入射し、ハーフミラー１２２ｂを透過する光と、ハーフミラー１２２ｂにより反射される光に分岐される。そのうちハーフミラー１２２ｂにより反射された超短パルス光Ｃは、λ／２波長板１２３を透過することにより、偏光の振動面が９０度回転する。そして、λ／２波長板１２３により偏光方向が変更された超短パルス光Ｃは、偏光ビームスプリッタ１２４に入射する。
【００４５】
超小型レーザ１１ｄから射出された超短パルス光Ｄは、ミラー１２１ｂによりハーフミラー１２２ｂの方向に反射され、ハーフミラー１２２ｂを透過する光と、ハーフミラー１２２ｂにより反射される光に分岐される。そのうちハーフミラー１２２ｂを透過した超短パルス光Ｄは、ハーフミラー１２２ｂにより反射された超短パルス光Ｃと同じ光路を進み、λ／２波長板１２３を透過することにより、偏光の振動面が９０度回転する。そして、λ／２波長板１２３により偏光方向が変更された超短パルス光Ｄは、偏光ビームスプリッタ１２４に入射する。
【００４６】
偏光ビームスプリッタ１２４は、λ／２波長板１２３により偏光方向が変更された後の超短パルス光Ｃおよび超短パルス光Ｄと同じ偏光方向の光を反射し、それ以外の光を透過する性質を有している。従って、偏光ビームスプリッタ１２４に入射した超短パルス光Ａおよび超短パルス光Ｂは、そのまま偏光ビームスプリッタ１２４を透過して、ビーム調整部１２に入射する。一方、偏光ビームスプリッタ１２４に入射した超短パルス光Ｃおよび超短パルス光Ｄは、偏光ビームスプリッタ１２４によりビーム調整部１２の方向に反射され、偏光ビームスプリッタ１２４を透過した超短パルス光Ａおよび超短パルス光Ｂと同じ光路を進み、ビーム調整部１２に入射する。
【００４７】
なお、このとき、超短パルス光Ａ乃至Ｄが、偏光ビームスプリッタ１２４により光路が統合された後に互いに重ならないように、タイミング制御部１１１は、超小型レーザ１１ａ乃至１１ｄから超短パルス光Ａ乃至Ｄを射出するタイミングを制御する。
【００４８】
このように、４台の超小型レーザ１１を用いるとともに、統合部１１２により、超短パルス光Ａ乃至Ｄの光路を１つに統合することにより、試料２に照射する超短パルス光の繰り返し周波数を４倍にすることができ、試料２の劣化の抑制効果をより大きくすることができる。
【００４９】
また、超短パルス光Ａ乃至Ｄの光路を１つに統合するのに、λ／２波長板１２３および偏光ビームスプリッタ１２４を用いることにより、代わりにハーフミラーを用いる場合と比較して、超短パルス光の利用効率を２倍にすることができる。なお、ハーフミラー１２２ａおよびハーフミラー１２２ｂにより発生する損失を考慮すると、統合部１１２における超短パルス光の利用効率は約50％となる。
【００５０】
＜３．第３の実施の形態＞
図３は、本発明の第３の実施の形態である多光子顕微鏡２０１の構成の例を示すブロック図である。なお、図中、図２と対応する部分については同じ符号を付してあり、処理が同じ部分に関しては、その説明は繰り返しになるので省略する。
【００５１】
図３の多光子顕微鏡２０１は、図２の多光子顕微鏡１０１と比較して、光量調整部２１１ａ乃至２１１ｄが設けられている点が異なる。
【００５２】
光量調整部２１１ａ乃至２１１ｄは、それぞれ超小型レーザ１１ａ乃至１１ｄの後段に設けられ、超小型レーザ１１ａ乃至１１ｄから射出される超短パルス光Ａ乃至Ｄの光量を独立して調整する。これにより、例えば、統合部１１２により光路が１つに統合された後の超短パルス光Ａ乃至Ｄのピーク強度がほぼ一定になるように、各超短パルス光の強度を個別に調整することが可能になる。
【００５３】
＜４．変形例＞
以上の説明では、多光子顕微鏡１０１および多光子顕微鏡２０１において、超小型レーザ１１を４台用いる例を示したが、超小型レーザ１１の台数は２台以上の任意の数に設定することが可能である。
【００５４】
また、多光子顕微鏡１０１および多光子顕微鏡１０２において、タイミング制御部１１１は必ずしも設ける必要はない。これは、超短パルス光のパルス幅が、超短パルス光の繰り返し周期と比較して非常に短く、超短パルス光が重なる可能性が低いためである。もし、超短パルス光が重なった場合には、例えば、超小型レーザ１１を再起動するだけで、容易に超短パルス光が重ならないように出射タイミングをずらすことが可能である。
【００５５】
なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明
の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【符号の説明】
【００５６】
１  多光子顕微鏡，  ２  試料，  １１，１１ａ乃至１１ｄ  超小型レーザ，  １２  ビーム調整部，  １３，１４  ダイクロイックミラー，  １５  対物レンズ，  １６  蛍光検出部，  １７  集光レンズ，  １８  ピンホール，  １９  結像レンズ，  ２０  蛍光検出部，  ２１  ダイクロイックミラー，  ２２  蛍光検出部，  １０１  多光子顕微鏡，  １１１  タイミング制御部，  １１２  統合部，  １２１ａ，１２１ｂ  ミラー，  １２２ａ，１２２ｂ  ハーフミラー，  １２３  λ／２波長板，  １２４  偏光ビームスプリッタ，  ２０１  多光子顕微鏡，  ２１１ａ乃至２１１ｄ  光量調整部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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