(57)【要約】【課題】西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼ（以下、「ＰＯＤ」という）を用いた化学発光反応に比べ、発光持続性が劣る欠点を有していた担子菌由来のＰＯＤを用いた化学発光反応の発光強度および発光持続性を増強する方法に関する。【解決手段】ＥＤＴＡ類縁体、ヒドラジン誘導体またはアセン系多環芳香族炭化水素から選択される１種または２種以上の化学発光増強剤を化学発光反応の最終反応溶液に添加する。【効果】担子菌由来のＰＯＤを用いた化学発光反応において、化学発光反応の発光強度および発光持続性を有意に増強することができる。【選択図】図１
2011043447.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
担子菌由来ペルオキシダーゼを用いた化学発光反応において、ＥＤＴＡ類縁体、ヒドラジン誘導体またはアセン系多環芳香族炭化水素から選択される１種または２種以上の化学発光増強剤を用いることを特徴とするペルオキシダーゼ化学発光反応の発光増強方法。
【請求項２】
ＥＤＴＡ類縁体が、Ｍｎ（ＩＩ）−ＥＤＴＡ、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、１，６−ヘキサメチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＨＤＴＡ）、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、トリエチレンテトラミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−六酢酸（ＴＴＨＡ）、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−五酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｏ’，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＧＥＤＴＡ）またはカルセインブルーのいずれかである請求項１記載のペルオキシダーゼ化学発光反応の発光増強方法。
【請求項３】
ヒドラジン誘導体が、ダンシルヒドラジン、イプロニアジドリン酸塩または１−フェニル−３−チオセミカルバジドのいずれかである請求項１記載のペルオキシダーゼ化学発光反応の発光増強方法。
【請求項４】
アセン系多環芳香族炭化水素が、アントラセンまたはナフタセンのいずれかである請求項１記載のペルオキシダーゼ化学発光反応の発光増強方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、担子菌由来のペルオキシダーゼを用いた化学発光反応において、発光強度を増強し、発光持続性を高める方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼ（以下、「ＰＯＤ」という）は、その酵素活性を指標とした分析用試薬として、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、例えば、非競合法あるいは競合法、およびウエスタンブロッティング法などの各種の酵素免疫測定方法に広く使用されている（例えば、特許文献１参照）。しかし、西洋ワサビ由来のＰＯＤは、原料としての西洋ワサビの栽培に長時間を要する上に、植物体を破壊し、多種多様な夾雑成分の中からＰＯＤを精製するという方法で製造されるため、その製造効率は高いとは言いがたく、大量生産が困難であった。その上、近年では、栽培効率の悪さや、需要の大きいバイオエタノール用穀物への転作などを理由に、ＰＯＤの原料としての西洋ワサビの供給不安が生じつつあり、これに代わり得る酵素に対する潜在的なニーズは大きい。
【０００３】
さらに、西洋ワサビ由来のＰＯＤには、多くのアイソザイムが存在するという問題も存在する。現在広く用いられている西洋ワサビ由来のＰＯＤの多くは、低い生産効率の中で一定の価格で流通させるという制約があるため、多くのアイソザイムの混合物である場合がほとんどである。しかし、このようなＰＯＤを用いて各種の測定、例えば、酵素免疫測定を行った場合、異なる反応特性を有する各種アイソザイムの含有量が、ＰＯＤの製造ロットごとにばらつき、このことに起因して、安定した測定結果を得ることが困難になるという重大な問題を生じている。
【０００４】
西洋ワサビ由来のＰＯＤが有する問題を克服し得ることが期待されるＰＯＤとして、微生物由来のＰＯＤがある。微生物は短時間で大量に培養可能であり、微生物由来のＰＯＤは、植物体から精製を行う場合よりも格段に少ない手間で精製を行うことができる。また、遺伝子組換え技術を用いることにより、微生物宿主内での発現量を人為的に高めることも容易である。遺伝子組換え技術を利用すれば、目的とするＰＯＤのみを多量に発現させることができるため、アイソザイムの夾雑という問題も回避が容易であると同時に、そのＰＯＤを改変し、改良することも比較的容易である。このようなことから、微生物由来のＰＯＤは、西洋ワサビ由来のＰＯＤに代わり得る有望な酵素といえる。
【０００５】
本発明者らは、すでに、西洋ワサビ由来のＰＯＤに代わり得る酵素として、例えば、Arthromyces属や担子菌Coprinus属等の微生物由来のＰＯＤを調製し（例えば、特許文献２、非特許文献１〜２参照）、これを遊離状態で用いても、抗体を標識し、ＰＯＤ標識抗体として用いても、ルミノールを基質とした化学発光反応において、西洋ワサビ由来のＰＯＤと同等かそれ以上の反応性を有することを確認している。
【０００６】
しかしながら、Coprinus属由来のＰＯＤを含む微生物由来のＰＯＤは、従来の化学発光反応の条件下では、化学発光反応開始直後に、高い発光強度を示すものの、持続性が悪いという欠点を有している。そのため、安定状態で発光量を測定することが困難で、微生物由来のＰＯＤを西洋ワサビ由来のＰＯＤに代替し、酵素免疫測定等に利用するには発光持続性向上のための解決すべき課題が残されている。
【０００７】
西洋ワサビ由来のＰＯＤを、ルミノールを基質とした化学発光反応を測定する際、その発光強度の弱さを補うために、発光強度増強効果や発光持続性効果を有する種々の化学発光増強剤を添加する方法が知られている。西洋ワサビ由来のＰＯＤに対し、発光強度増強効果や発光持続性効果を示す化学発光増強剤としては、例えば、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロムフェノール、ｐ−クロロフェノール、ｐ−フェニルフェノール、２−クロロ−４−フェニルフェノール、２，４−ジクロロフェノール、４−（シアノメチルチオ）フェノール、４−シアノメチルチオ−２−クロロフェノール、フェノールインドール、ｐ−ヒドロキシシンナミン酸、４−〔４’−（２’−メチル）チアゾリル〕フェノール、４−（４’−チアゾリル）フェノール、４−（２’−チエニル）フェノール、４−〔４’−（２’−（３’−ピリジル））チアゾール〕フェノール、フェノチアジン−Ｎ−プロピルスルフォネート、フェノールインドフェノール、４−ヒドロキシケイヒ酸、ｐ−ヒドロキシシンナミン酸等のフェノール誘導体、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、４−（４−ヒドロキシフェニル）チアゾール、４−（４−ヒドロキシフェニル）−２−メチル−チアゾール、４−（４’−ヒドロキシフェニル）−２’−（３’−ピリジル）チアゾール、ホタルルシフェリン、デヒドロルシフェリン等のチアゾール誘導体、２−ナフトール、１，６−ジブロモ−２−ナフトール等のナフトール誘導体、３−（１０−フェノチアジル）プロピルスルホン酸塩、ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸塩およびジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルベンチジン等が挙げられる（例えば、非特許文献３〜４、特許文献３〜６参照）。しかしながら、これらの化学発光増強剤は西洋ワサビ由来のＰＯＤに特有なものであり、微生物由来のＰＯＤに対して発光強度増強効果や発光持続性効果を示さない。
【０００８】
一方、微生物由来のＰＯＤの化学発光増強剤として、過酸化水素の微量の検出または定量のために、ヒドラゾベンゼン、インジゴ、３−メチル−２−ベンゾチアゾリン  ヒドラゾン塩酸塩、α−ナフトキノン、フェニルヒドラジン、８−ヒドロキシキノリン、フェノールフタリン、Ｌ−トリプトファン、Ｎ，Ｎ−ジメチルインドアニリン、カルセイン、インジゴ、カルミンおよびレゾルシンを用いた化学発光測定方法が知られている（例えば、特許文献７参照）。また、溶液中の染料や紙パルプの漂白等を目的とした微生物由来ＰＯＤの酵素反応を強化する方法として、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホネート）、４−アミノ−４’−メトキシスチルベン、４，４’−ジアミノスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、４，４’−ジヒドロキシベンゾフェノン、Ｎ−ベンジリデン−４−ビフェニルアミン、１０−メチルフェノチアジン、１０−フェノチアジン−プロピオン酸、１０−フェニルフェノチアジン、１０−メチルフェノクサジン、ベンチジン、３，３’−ジメチルベンチジン、６−アミノ−３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンアジン、６−ヒドロキシ−２−ナフトイン酸、６−ブロモ−２−ナフトール、７−アミノ−２−ナフタレンスルホン酸、１，５−ジアミノナフタレン、１０−フェノチアジンプロピオン酸、１０−エチルフェノチアジン−４−カルボン酸、１０―メチルフェノキサジンおよび１０−フェノキサジンプロピオン酸を添加する方法が知られている（例えば、特許文献８〜１０参照）。
【０００９】
上記のように、過酸化水素の微量の検出もしくは定量、溶液中の染料や紙パルプの漂白または染料移行阻止等のために、微生物由来ＰＯＤの酵素反応を増強する方法は知られているものの、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、例えば、非競合法あるいは競合法またはウエスタンブロッティング法などの各種の酵素免疫測定方法において、微生物由来ＰＯＤの化学発光反応を増強する方法は知られていない。
【００１０】
すなわち、微生物由来のＰＯＤを用いた化学発光反応を指標とした酵素免疫測定方法において、化学発光反応の発光強度を増強し、反応持続性を高める方法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２０００−８８８５０号公報
【特許文献２】特開昭６１−１０４７８４号公報
【特許文献３】特表昭５９−５００２５２号公報
【特許文献４】特開昭５９−１７１８３９号公報
【特許文献５】特開平２−２９１２９９号公報
【特許文献６】特開平８−３８１９５号公報
【特許文献７】特許第３００５２３８号公報
【特許文献８】特表平８−５０３３７１号公報
【特許文献９】特表平８−５０６００９号公報
【特許文献１０】特表平１０−５００７２８号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９，  １−６  （１９９１）
【非特許文献２】Ｋｊａｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．  １９９２  Ａｐｒ  １７；１１２０（３）：２４８−５６
【非特許文献３】Ｇｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３３，  ３３１−３５３  （１９８６）
【非特許文献４】辻章夫．  臨床検査  ３８，  １６２−１６６  （１９９４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、微生物由来のＰＯＤを用いた化学発光反応において、化学発光反応開始から長時間にわたって高い発光強度を持続する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、化学発光物質および酸化剤を用いて化学発光させる系において、ＥＤＴＡ類縁体、ヒドラジン誘導体およびアセン系多環芳香族炭化水素から選択される１種または２種以上の化合物が担子菌由来のＰＯＤの反応性を向上させ得ることを知り、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下に関する。
１）担子菌由来ペルオキシダーゼを用いた化学発光反応において、ＥＤＴＡ類縁体、ヒドラジン誘導体またはアセン系多環芳香族炭化水素から選択される１種または２種以上の化学発光増強剤を用いることを特徴とするペルオキシダーゼ化学発光反応の発光増強方法。
２）ＥＤＴＡ類縁体が、Ｍｎ（ＩＩ）−ＥＤＴＡ、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、１，６−ヘキサメチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＨＤＴＡ）、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、トリエチレンテトラミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−六酢酸（ＴＴＨＡ）、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−五酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｏ’，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＧＥＤＴＡ）またはカルセインブルーのいずれかである前記１）記載のペルオキシダーゼ化学発光反応の発光増強方法。
３）ヒドラジン誘導体が、ダンシルヒドラジン、イプロニアジドリン酸塩または１−フェニル−３−チオセミカルバジドのいずれかである前記１）記載のペルオキシダーゼ化学発光反応の発光増強方法。
４）アセン系多環芳香族炭化水素が、アントラセンまたはナフタセンのいずれかである前記１）記載のペルオキシダーゼ化学発光反応の発光増強方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により担子菌由来ＰＯＤを用いた化学発光反応の発光強度および発光持続性を有意に増強することができ、感度の高い安定した測定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】化学発光増強剤としてカルセインブルーを用いた際のカルセインブルー濃度が初発時発光強度に与える影響を示した図である。
【図２】化学発光増強剤としてＭｎ（ＩＩ）−ＥＤＴＡを用いた際のカルセインブルー濃度が初発時発光強度に与える影響を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（担子菌由来ＰＯＤ）
本発明に使用するＰＯＤとしては、担子菌由来のＰＯＤが挙げられる。担子菌に属する微生物としては、例えば、Coprinus属、Uredinales属、Auriculariales属、Agaricales属等が挙げられる。中でも、Coprinus属由来のＰＯＤは、西洋ワサビ由来のＰＯＤと比較して、同等もしくは同等以上の優れた酵素化学的性質（至適ｐＨ、ｐＨ安定性、至適温度、温度安定性）を有しており、しかも、２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を基質とした発色反応において、西洋ワサビ由来のＰＯＤよりも比活性（Ｕ／ｍｇ）が９〜１０倍程度高いため好ましい。Coprinus属に属する微生物の例としては、Coprinus cinereus（NBRC30114）、Coprinus macrorhizus（ATCC20120）、Coprinellus disseminatus、Coprinus comatus（ATCC12640）、Coprinus clastophyllus、Coprinus alkalinus、Coprinus amphibius、Coprinus micaceus、Coprinus atramentarius、Coprinus luteocephalus、Coprinus trisporus、Coprinus sclerotiger、Coprinus domesticus、Coprinus stercorarius、Coprinus radiatus等が挙げられる。なお、NBRCは、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門、ATCCは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを示す。
【００１８】
Coprinus属由来ＰＯＤは、天然のものであってもよく、耐熱性向上や基質特異性向上、その他の何らかの１以上の変異を人為的に導入したものであってもよく、キメラタンパク質等であってもよい。また、市販のCoprinus属由来ＰＯＤを用いてもよい。測定上支障がない範囲において、アイソザイムを含む複数のＰＯＤを共に使用することもできるが、測定の安定性のためには、単一精製したものを用いることが好ましい。
【００１９】
また、分類学上Coprinus属に属さない微生物であっても、例えば、Coprinus属に近縁の微生物由来のＰＯＤや、Coprinus属由来のＰＯＤとアミノ酸配列が近似するもので、本発明の酵素免疫測定において同様の反応性を示すＰＯＤ等も用いることができる。
【００２０】
本発明に使用する担子菌由来のＰＯＤは、後述する最終反応溶液中において、遊離状態または各種抗体を標識した状態で用いることができる。ＰＯＤへ抗体を標識（架橋）する方法としては、公知の各種の標識方法を用いることができ、例えば、一般的に知られている方法として、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、イソシアネート架橋法、ベンゾキノン架橋法等が挙げられる。特に、マレイミド法は、重合体形成の有無、抗原、抗体、酵素の活性維持、さらには標識効率の点で好適である。
【００２１】
（化学発光増強剤）
微生物由来ＰＯＤの化学発光増強剤として、（ａ）ＥＤＴＡ類縁体、（ｂ）ヒドラジン誘導体または（ｃ）アセン系多環芳香族炭化水素から選択される１種または２種以上の化学発光増強剤が挙げられる。
【００２２】
（ａ）ＥＤＴＡ類縁体として、金属イオンを含んだ環状構造を形成する有機化合物であれば使用でき、３配位キレート剤および４配位キレート剤等が用いられる。例えば、これらのキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ＥＤＴＡ・３Ｎａ、ＥＤＴＡ・４Ｎａ、ＥＤＴＡ・２Ｋ、ＥＤＴＡ・３Ｋ、ＥＤＴＡ・２アンモニウム、Ｃａ（ＩＩ）−ＥＤＴＡ、Ｃｏ（ＩＩ）−ＥＤＴＡ、Ｃｕ（ＩＩ）−ＥＤＴＡ、Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡ、Ｍｇ（ＩＩ）−ＥＤＴＡ、Ｍｎ（ＩＩ）−ＥＤＴＡ、Ｚｎ（ＩＩ）−ＥＤＴＡ、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノフェニル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、トランス−１，２―ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−五酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、Ｏ’，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、１，６−ヘキサメチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＨＤＴＡ）、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、１，２−ジアミノプロパン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ）、Ｎ−（ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）・３Ｎａ（ＮＴＰＯ・３Ｎａ）、トリエチレンテトラミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−六酢酸（ＴＴＨＡ）、ニトリロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）、カルセインブルー等が挙げられる。これらのうち、Ｍｎ（ＩＩ）−ＥＤＴＡ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＨＤＴＡ、ＤＰＴＡ−ＯＨ、ＴＴＨＡ、カルセインブルーが、特に高い化学発光持続性を示すため、好ましい。
【００２３】
（ｂ）ヒドラジン誘導体として、１，１−ジフェニルヒドラジン塩酸塩、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン ヒドラジン塩酸塩一水和物、フェニルヒドラジン、２−ヒドラジノベンゾチアゾール、ダンシルヒドラジン、イプロニアジドリン酸塩、２，４−ジニトロフェニルヒドラジン塩酸塩、４-ヒドラジノ安息香酸、１−フェニル−３−チオセミカルバジド、４−フェニル−３−チオセミカルバジド、１−アセチル−２−フェニルヒドラジン、４−ヒドラジノベンゼンスルホンアミド塩酸塩、ヒドラジノエタノール、１−ヒドラジノフタラジン塩酸塩、２−ヒドラジノピリジン、２−ヒドラジノキノリン等が挙げられる。これらのうち、ダンシルヒドラジン、イプロニアジドリン酸塩、１−フェニル−３−チオセミカルバジドが、特に高い化学発光持続性を示すため、好ましい。
【００２４】
（ｃ）アセン系多環芳香族炭化水素として、ナフタレン、アントラセン、ナフタセン、ペンタセン、ヘキサセン等が挙げられる。これらのうち、アントラセンおよびナフタセンが、特に高い化学発光持続性を示すため、好ましい。
【００２５】
（酸化剤）
本発明に使用する酸化剤は、無機過酸化物として、例えば、過酸化水素、過ホウ酸塩、次亜塩素酸塩等が挙げられ、有機過酸化物として、例えば、過酢酸、過プロピオン酸等が挙げられる。取扱い易さから、過酸化水素を用いるのが好ましい。
【００２６】
酸化剤の含有量は、用いる化学発光物質の種類、濃度または適用する測定方法等によって適宜設定すればよい。発光強度を高い値で維持するために、最終反応溶液中における酸化剤の濃度は０．００１〜１００ｍＭの範囲にすることが好ましく、より好ましくは、０．０１〜１０ｍＭの範囲であり、さらに好ましくは０．０５〜２ｍＭの範囲である。
【００２７】
（化学発光物質）
本発明に使用する化学発光物質としては、公知の各種化学発光物質を用いることができ、例えば、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物を用いることができる。前記化学発光物質の具体的な例としては、例えば、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−エチルイソルミノール、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノールヘミサクシミド、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−Ｎ−エチルイソルミノール等、あるいは、これらの金属塩が挙げられる。金属塩としては、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等を用いることができる。アルカリ金属塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられ、アルカリ土類金属塩としては、カルシウム塩、マグネシウム塩等が挙げられる。特にルミノールまたはルミノール金属塩が安定性や発光量子収率に優れ、好ましい。
【００２８】
化学発光物質の含有量は、用いる酸化剤の種類、濃度または適用する測定方法等によって適宜設定すればよいが、発光強度を高い値で維持するために、初発時発光強度を高い値で維持するために、最終反応溶液中における化学発光物質の濃度は０．００１〜１００ｍＭの範囲にすることが好ましく、より好ましくは、０．０１〜１０ｍＭの範囲であり、さらに好ましくは０．１〜５ｍＭの範囲である。
【００２９】
（緩衝液）
本発明に使用する緩衝液は、一般に用いられている緩衝作用が優れた緩衝液であれば特に限定されることはなく、例えば、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液、ピロリン酸緩衝液、アンモニウム緩衝液、炭酸緩衝液を用いることができる。
【００３０】
緩衝液のｐＨは、用いる化学発光物質もしくは酸化剤の種類、濃度または適用する測定方法等によって適宜設定すればよいが、発光強度を高い値で維持するために、最終反応溶液中におけるｐＨは６．０〜１２．０の範囲にすることが好ましく、より好ましくは、７．０〜１１．０の範囲であり、さらに好ましくは７．５〜１０．０の範囲である。
【００３１】
（最終反応溶液）
化学発光反応は、前記のＰＯＤ、化学発光増強剤、化学発光物質、酸化剤および緩衝液を含んでなる最終反応溶液にて行う。なお、本発明の発光量の評価は、反応開始直後の発光量もしくは測定時間ごとの発光量の相対値または積算値により行うことができる。
【００３２】
本発明の化学発光増強剤を用いた最終反応溶液は、担子菌由来のＰＯＤを利用した測定法および測定用キットとして優れた効果を発揮する。そのため、免疫測定法および免疫測定キットとして、その中でも、酵素免疫測定法および酵素免疫測定用キットに用いることが特に好ましく、不溶性担体を用いるヘテロジニアスな酵素免疫測定用キットに用いることが最も好ましい。
【００３３】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３４】
［ＰＯＤ標識マウスＩｇＧ抗体を用いた増強剤（ＥＤＴＡ類縁体）の検索］
ＰＯＤ標識抗体（ＰＯＤ−ＩｇＧ）を用いて、化学発光増強剤のうち、ＥＤＴＡ類縁体に関して検索を行った。
【００３５】
１．抗マウスＩｇＧ抗体へのＰＯＤ標識
抗マウスＩｇＧ抗体へのＰＯＤ標識を、以下のように行った。
【００３６】
１）ＩｇＧ−ＳＨの調製
ヤギ抗マウス抗体（ＩｇＧ）を、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．４）に溶液置換し、１〜１０ｍｇ／ｍｌとなるように調製した。５００ｍＭ  システアミン（Ｓｉｇｍａ社製；製品コード  Ｍ９７６８−２５Ｇ）（システアミン６ｍｇを０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．４）０．１  ｍｌに溶解）を調製し、前記の抗体溶液に１／１０（ｖ／ｖ）量加え、３７℃にて１．５時間インキュベーションした。過剰なシステアミンを透析あるいはゲルろ過カラムＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ＧＥ社製；製品コード  １７−００３３−０１、平衡化液：０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）、溶出液：平衡化液と同様、カラムサイズ：１０ｍｌ、重力による溶出）により除去した。
【００３７】
２）マレイミド化ＰＯＤの調製
市販の担子菌由来のＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ社製）を１０〜３０ｍｇ／ｍｌとなるように、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。１００ｍＭ  ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ社製；製品コード  ２２３６０）（３．３４ｍｇを０．１ｍｌのＤＭＳＯに溶解）を調製し、直ちにＰＯＤのモル濃度の５倍量を加えた。室温で３０分間インキュベーションし、前記の条件に従って、ゲルろ過カラムＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５に供し、過剰なＳＭＣＣを除去した。酵素濃度を、４０３ｎｍにおける吸光度測定値から、ε４０３ｎｍ＝８．３３×１０４  ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）を用いて求めた。
【００３８】
３）マレイミド化ＰＯＤによる抗体の標識（架橋）および標識抗体の精製
前記のマレイミド化ＰＯＤおよびＳＨ基還元抗体（溶媒は０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８））を、酵素：抗体のモル比が１０：１となるように混合した。４℃で６時間以上（一晩）インキュベーションした後、標識（架橋）後の反応溶液を、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００ＧＬ（ＧＥ社製；製品コード  １７−５１７５−０１、溶出：０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）、カラムサイズ：約２４ｍｌ、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ）に供することにより、抗体と結合されなかった酵素を除去して、担子菌由来のＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ（ＰＯＤ−ＩｇＧ）を得た。以下、微生物由来ＰＯＤとして、ＰＯＤ−ＩｇＧを用いた。
【００３９】
２．ＰＯＤ−ＩｇＧを用いた増強剤（ＥＤＴＡ類縁体）の検索
担子菌由来のＰＯＤ−ＩｇＧの化学発光を有意に増強するＥＤＴＡ類縁体を検索した。
１．８７５ｍＭ  ルミノール（Ｓｉｇｍａ社製）ならびに１２．５ｎｇ／ｍｌ  ＰＯＤ−ＩｇＧを含む１００ｍＭ、ｐＨ９．５のトリス塩酸緩衝液（以下、「スクリーニング用試液１」という。）および０．１３３ｍＭ  過酸化水素（和光純薬社製）を含む１００ｍＭ、ｐＨ９．５のトリス塩酸緩衝液（以下、「スクリーニング用試液２」という。）を調製した。
【００４０】
次に、ＥＤＴＡ類縁体として、カルセインブルーはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に適宜に溶解し、また、Ｍｎ（ＩＩ）−ＥＤＴＡはイオン交換水に適宜に溶解して、カルセインブルーを０．０１〜１．０ｍＭの濃度の範囲で含むＤＭＳＯ溶液またはＭｎ（ＩＩ）−ＥＤＴＡを０．１〜５．０ｍＭの濃度の範囲で含む水溶液を調製した。前記のＥＤＴＡ類縁体を含むＤＭＳＯ溶液および水溶液１０μｌを９６ウェルマイクロタイタープレートに分注し、１６０μｌのスクリーニング用試液１を添加した後、３０μｌのスクリーニング用試液２を添加することで化学発光反応を開始した。反応温度は３０℃で行った。対照群として、ＥＤＴＡ類縁体を含まないＤＭＳＯおよびイオン交換水１０μｌを用い、実験群と同様に化学発光反応を行った。
【００４１】
発光量は、反応開始０分（初発時）、５分、１０分、１５分における１秒間の平均発光積算量として、ＭｉｃｒｏＬｕｍａｔＰｌｕｓ  ＬＢ  ９６Ｖ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製）を用いて測定した。各ＥＤＴＡ類縁体の化学発光増強作用を確認するために、対照群の初発時発光量を１００％とした相対値を初発時発光強度として算出し、対照群の各反応時間における発光量をそれぞれ１００％とした相対値を相対発光強度として算出した。各ＥＤＴＡ類縁体濃度による初発時発光強度を図１〜２に、相対発光強度を表１〜２に示す。
【００４２】
【表１】
2011043447.tif 000003
【００４３】
【表２】
2011043447.tif 000004
【００４４】
図１〜２および表１〜２に示すとおり、担子菌由来のＰＯＤを用いて化学発光反応に供した場合、反応時間が経過するのに従い、急激に発光強度が減衰するのに対し、化学発光増強剤としてＥＤＴＡ類縁体であるカルセインブルーおよびＭｎ（ＩＩ）−ＥＤＴＡを添加すると、一様に発光強度および発光持続性が増強されることが確認された。特に、カルセインブルーは添加濃度０．１〜１．０ｍＭにおいて、Ｍｎ（ＩＩ）−ＥＤＴＡは添加濃度１．０〜５．０ｍＭにおいて優れた増強作用を示すことが確認された。
【００４５】
次に、各種ＥＤＴＡ類縁体であるＢｉｃｉｎｅ、ＨＤＴＡ、ＤＰＴＡ−ＯＨ、ＴＴＨＡ、ＤＴＰＡ、ＧＥＤＴＡ、８−ヒドロキシキノリンおよびＣｕ（ＩＩ）−ＥＤＴＡの増強作用について、前記の方法と同様に確認した。なお、カルセインブルーおよび８−ヒドロキシキノリンはジメチルスルホキド（ＤＭＳＯ）に溶解し、その他のＥＤＴＡ類縁体はイオン交換水に溶解した。各相対発光強度を表３に示す。なお、結果は、各種ＥＤＴＡ類縁体について、ＥＤＴＡ類縁体の濃度による化学発光反応に対する影響を確認した上で、最も強い増強作用を有した濃度を示している。
【００４６】
【表３】
2011043447.tif 000005
【００４７】
表３に示すとおり、ＥＤＴＡ類縁体のうちカルセインブルー、Ｍｎ（ＩＩ）−ＥＤＴＡ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＨＤＴＡ、ＤＰＴＡ−ＯＨ、ＴＴＨＡ、ＤＴＰＡおよびＧＥＤＴＡは、担子菌由来のＰＯＤを用いた化学発光反応において、優れた増強作用を示すことが確認された。一方、８−ヒドロキシキノリン、Ｃｕ（ＩＩ）−ＥＤＴＡでは、増強作用は確認できなかった。
【００４８】
上述のとおり、適切なＥＤＴＡ類縁体を選択し、適宜濃度を調整して用いることで、担子菌由来のＰＯＤを用いた化学発光反応を増強することが示唆された。
【実施例２】
【００４９】
［ＰＯＤ標識マウスＩｇＧ抗体を用いた増強剤（ヒドラジン誘導体）の検索］
担子菌由来のＰＯＤ−ＩｇＧの化学発光を有意に増強するヒドラジン誘導体を検索した。
【００５０】
市販のヒドラジン誘導体を用い、実施例１に記載の方法と同様に、ヒドラジン誘導体の化学発光反応に対する増強作用を確認した。なお、ヒドラジン誘導体の溶媒は、ジメチルスルホキド（ＤＭＳＯ）を用いた。結果を表４に示す。
【００５１】
【表４】
2011043447.tif 000006
【００５２】
表３に示すとおり、ヒドラジン誘導体のうちダンシルヒドラジン、イプロニアジドリン酸塩および１−フェニル−３−チオセミカルバジドは、担子菌由来のＰＯＤを用いた化学発光反応において、優れた増強作用を示すことが確認された。特に、イプロニアジドリン酸塩は、極めて優れた増強作用を示すことが確認された。一方、１，１−ジフェニルヒドラジン塩酸塩では、増強作用は確認できなかった。
【実施例３】
【００５３】
［ＰＯＤ標識マウスＩｇＧ抗体を用いた増強剤（アセン系多環芳香族炭化水素）の検索］
担子菌由来のＰＯＤ−ＩｇＧの化学発光を有意に増強するアセン系多環芳香族炭化水素を検索した。
【００５４】
市販のアセン系多環芳香族炭化水素を用い、実施例１に記載の方法と同様に、アセン系多環芳香族炭化水素の化学発光反応に対する増強作用を確認した。なお、アセン系多環芳香族炭化水素の溶媒は、ＤＭＳＯを用いた。結果を表５に示す。
【００５５】
【表５】
2011043447.tif 000007
【００５６】
表５に示すとおり、アセン系多環芳香族炭化水素であるアントラセンおよびナフタセンは、担子菌由来のＰＯＤを用いた化学発光反応において、優れた増強作用を示すことが確認された。特に、ナフタセンは、極めて優れた増強作用を示すことが確認された。
【図１】
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【図２】
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