(57)【要約】【課題】環境に優しい藻類類増殖抑制剤を提供する。【解決手段】スギ、クロマツ、アカマツ、ヒノキ、ヒノキアスナロ、アスナロ、クスノキ、ラクウショウ、メタセコイアなどの樹木の葉、樹皮、辺材、心材などの各部位。上記樹木の各部位などから水蒸気蒸留あるいは熱水蒸留によって得られる精油または精油成分を含有する流出液およびヘキサン、酢酸エチル、メタノールなどの溶剤によって抽出される抽出物が赤潮等の環境に優しい藻類増殖抑制剤であることを発見した。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
スギ、クロマツ、アカマツ、ヒノキ、ヒノキアスナロ、アスナロ、クスノキ、ラクウショウ、メタセコイアからなる群から選択される１以上の樹木の全体、葉、樹皮、辺材および／または心材などから抽出される抽出物を含有する藻類増殖抑制剤。
【請求項２】
前記の抽出物が、水蒸気蒸留あるいは熱水蒸留によって得られる精油または精油成分を含有する流出液およびヘキサン、酢酸エチル、メタノールなどの溶剤によって抽出される抽出物である請求項１に記載の藻類増殖抑制剤。
【請求項３】
前記抽出物が
ｉ）ゲラニオール、ヒノキチオール、カンファー、リモネン、αおよびβピネンなどを含むモノテルペン類、
ｉｉ）ロンギフォレン、カリオフィレン、エレモール、セドロール、ツヨプセン、カジネンなどを含むセスキテルペン類、
ｉｉｉ）フェルギノール、タキソディオン、１４−デオキシコレオンＵ、サルビノロン、５、６−ハイドロキシスギオールなどを含むジテルペン類、
ｉｖ）ヒノキニン、セキュイリン−Ｃ、アガサレジノール、スギレジノール、ハイドロキシスギレジノール、ヒノキレジノールなどを含むリグナン、ノルリグナン類、
ｖ）カテキン、エピカテキン、タキシフォリンなどを含むフラボノール類、
ｖｉ）バニリン、オイゲノールなど樹木成分抽出操作によって生成するリグニン分解物ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される、少なくとも1種類以上の成分を含有する請求項１および／または請求項２のいずれか１項に記載の藻類増殖抑制剤。
【請求項４】
ロンギホレン、フェルギノールおよびそれらの誘導体のいずれかのうちの1種類以上を含有する、請求項１、請求項２および請求項３のいずれか1項に記載の藻類増殖抑制剤。
【請求項５】
前記藻類増殖抑制剤が、赤潮、下水処理、ダム貯水池および湖沼等の閉鎖水区、漁網等のにおいて有効な請求項１、請求項２、請求項３および請求項４のいずれか１項に記載の藻類増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、樹木成分を含有する藻類増殖抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹木は陸上の生物では二酸化炭素の吸収量が最大であり、再生可能な資源の一つとして知られている。樹木を利用し、植林によって林業／林産業を維持発展させることは、二酸化炭素の軽減にもつながり、人類の持続的な発展のためには不可欠であるといえる。
しかしながら、樹木の製材時に発生する林産廃棄物としての樹皮や、廃材、建築解体廃棄物としての板材や柱材の量は膨大である（非特許文献１および非特許文献２）。我が国で有効利用されていない資源量（利用可能量）のうち木質バイオマスは、総利用可能量の約６割を占め、その年間発生量は４５００万トンに上る（非特許文献３）。平成１４年１２月より焼却施設の規制も強化され、二酸化炭素発生量の抑制やダイオキシンの毒性が問題になった近年では、林産業界および建築業界においてこれら廃棄物の処理問題が大きな課題となっている。
【０００３】
一方、わが国の沿岸部において１９６０年代半ば以降、赤潮あるいは貝毒といった現象
がごく頻繁に発生するようになり、赤潮発生水域の広域化、発生回数の増大、発生期間の長期化の傾向が見られるようになってきた。平成１８年までの過去１０年間の赤潮発生状況を見てもわかるとおり、赤潮問題は年によって変化はあるものの、多く発生している（図１、非特許文献４）。
【０００４】
赤潮対策としては、過去に物理的手法（赤潮回収・超音波など）や化学的手法（アクノリール・粘土の投入など）や生物的手法（殺藻藻類・殺藻ウイルスなど）が提案されているものの、「規模・コスト・安全性」といった問題により実用化には至っていない。赤潮・貝毒の漁業・養殖業に対する被害は現在も多く起こっており、日本の様々な海域で漁業・養殖業などへの多大な被害が報告されている（非特許文献５）。よって、健全な水産増養殖の振興は、極めて重要で具体的な食料対策の１つであり、赤潮・貝毒に対する有効な対策の推進は重要課題であるといえる。
【０００５】
赤潮対策として海面の赤潮を回収する、海水を循環させ赤潮の濃度を下げる、といった物理的な手法や粘土を投入しその成分によるもの、アクリノールの散布）、水酸化マグネシウムによるもの、といった化学的手法、また、海洋環境への影響を考え、海洋において互いに影響を及ぼしあっている微細藻と従属栄養細菌の関係を応用した殺藻細菌や殺藻ウイルスによる生物的手法など様々な防除法が提案されているが、いずれも実用化には至っていない。
【０００６】
特許文献１には、イソフラボン類を有効成分とする藻類の増殖抑制剤が開示されているが、原料を大豆等の食品になりうるもので世界的な食糧危機が危惧される時代に適した方法とはいえない。特許文献２にはキレート剤を水中に散布する方法が開示されているが、必ずしも環境に優しい物質ではなく、２次的な問題が発生する可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−２４８１６１
【特許文献２】特開２００９−６６５４９
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】富田文一郎（１９９９）日本木材学会第３４回名古屋国際木工機械展実行委員会主催  Ｒ＆Ｄツアーセミナー“ゼロエミッション型木材産業の構築をめざして”、名古屋、  ｐｐ．  １−１４．
【非特許文献２】高野  勉、  西村勝美、  村田光司（１９９９）製材工場における残廃材の排出と利用処理の動向、木工機械  １８３、  ５−８．
【非特許文献３】坂  志朗、  江原克信、南  英治（２００５）超臨界流体技術による木質バイオマスの利活用、木材学会誌  ５１、  ２０７−２１７．
【非特許文献４】海上保安庁（２００８）海洋汚染の現状について（平成１８年１〜１２月）、資料１海洋汚染の物質別発生確認件数の推移（過去１０年分）
【非特許文献５】運動情報版、２００７：ｗｗｗ．ｇｙｏｓａｉ．ｏｒ．ｊｐ／ｔｏｐｉｃｓ＿ｐｄｆ／ｔｏｐｉｃｓ６３．ｐｄｆ  、愛媛県・宇和海の赤潮被害で２０万尾以上の養殖魚がへい死
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
環境に優しい藻類増殖抑制剤の開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
また、天然成分由来の赤潮防除法に関する研究例はほとんど無く、赤潮の生物的防除法として樹木が利用可能かは知られていない。
【００１１】
赤潮藻類Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ  ｃｏｓｔａｔｕｍの増殖抑制に特異的に効果のある成分を特定するために、モノテルペン類（炭素数１０）１０種、セスキテルペン類（炭素数１５）５種、ジテルペン類（炭素数２０）１１種、ノルリグナン類５種、フラボノール類３種、リグニン分解物、リグナン類、キノン類、トロポロン類、フェニルプロパノイド、それぞれ１種ずつ、合計１０類３９種の樹木成分標品およびスギ、ヒノキ、クロマツの樹皮、材部、葉から熱水蒸留で採取した精油を用いて赤潮藻類Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ  ｃｏｓｔａｔｕｍ、Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ  ａｋａｓｈｉｗｏの増殖抑制実験を行った結果、両藻類に対し、スギ樹皮、クロマツ心材の精油が強い抑制効果を示した。さらにスギ樹皮、クロマツ心材の成分分析行い、成分単体での活性を検討した結果、スギ樹皮成分のフェルギノール、クロマツ心材成分のロンギフォレンが特に高い増殖抑制活性を有していることを発見し本発明に到達した。
【発明の効果】
【００１２】
本発明で示されたフェルギノールやロンギフォレンなどのスギ、ヒノキおよびクロマツなどの樹木成分の赤潮藻類増殖抑制活性についての報告はない。また、本発明で用いた、スギ樹皮やクロマツ心材は現在廃棄物となっており、利用法の開発が望まれている廃棄物資源であるため、本発明の有用性とニーズは大きい。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】過去１０年の赤潮発生件数の経時的変化を示す（非特許文献４）。
【図２】熱水蒸留装置を示す。
【図３】樹木抽出物のＳｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ  ｃｏｓｔａｔｕｍと  Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ  ａｋａｓｈｉｗｏに対する増殖抑制効果（最終平均増殖率）を示す。
【図４】モノテルペン類のＳｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ  ｃｏｓｔａｔｕｍに対する増殖抑制効果（最終平均増殖率）を示す。
【図５】セスキテルペン類のＳｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ  ｃｏｓｔａｔｕｍに対する増殖抑制効果（最終平均増殖率）を示す。
【図６】ジテルペン類のＳｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ  ｃｏｓｔａｔｕｍに対する増殖抑制効果（最終平均増殖率）を示す。
【図７】ノルリグナン類、フラボノール類、リグニン分解物、リグナン類、キノン類、トロポロン類、フェニルプロパノイドのＳｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ  ｃｏｓｔａｔｕｍに対する増殖抑制効果（最終平均増殖率）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において環境に優しい藻類増殖抑制剤の原料としての樹木はスギ、クロマツ、アカマツ、ヒノキ、ヒノキアスナロ、アスナロ、クスノキ、ラクウショウ、メタセコイアなどが挙げられるがこれらに限定されない。またそれらの全体、樹皮、心材、辺材および葉などが使用される。本発明の樹木成分は、上記樹木の全体または各部位などから水蒸気蒸留あるいは熱水蒸留によって得られる精油または精油成分を含有する流出液およびヘキサン、酢酸エチル、メタノールなどの溶剤によって抽出される抽出物が使用される。
【００１５】
その抽出物の成分としてはモノテルペン類（ゲラニオール、ヒノキチオール、カンファー、リモネン、αおよびβピネンなど樹木抽出物に含まれるモノテルペン類及びそれらの誘導体）、セスキテルペン類（ロンギフォレン、カリオフィレン、エレモール、セドロール、ツヨプセン、カジネンなどの樹木抽出物に含まれるセスキテルペン及びそれらの誘導体）、ジテルペン類（フェルギノール、タキソディオン、１４−デオキシコレオンＵ、サルビノロン、５、６−ハイドロキシスギオールなどの樹木抽出物に含まれるジテルペン類及びそれらの誘導体）、リグナン、ノルリグナン類（ヒノキニン、セキュイリン−Ｃ、アガサレジノール、スギレジノール、ハイドロキシスギレジノール、ヒノキレジノールなどの樹木抽出物に含まれるリグナン、ノルリグナン類及びそれらの誘導体）、フラボノール類（カテキン、エピカテキン、タキシフォリンなどの樹木抽出物に含まれるフラボノール類及びそれらの誘導体）リグニン分解物（バニリン、オイゲノールなど樹木成分抽出操作によって生成するリグニン分解物）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。それらの誘導体とは天然の樹木の抽出物に含まれるものだけではなく、上記化合物の水酸基と任意の脂肪族有機酸、芳香族有機酸とのエステルや、化合物のカルボニル基にヒドロキシルアミン、アルコキシアミン等を用いで合成したオキシムなどの化学合成された誘導体も含む。
【００１６】
本発明の藻類の増殖抑制剤は他の藻類の増殖抑制剤との混合剤として使用しても良く、赤潮の防止のみならず、魚類飼育水槽、プールや下水処理等に於ける藻類増殖抑制にも有用である。また養殖業の漁網に藻類が付着するのを抑制することにも有用である。またダム貯水池や湖沼などの閉鎖的水域における藻類増殖抑制にも有用である。本発明の樹木成分を含有する薬剤を対象藻類が増殖する場所に添加、散布および／または塗布する事により藻類増殖抑制が達成される。
【００１７】
より詳細には、本発明の樹木成分を、固体担体、液体担体、ガス状担体と混合し、必要に応じて界面活性剤、固着剤、分散剤および／または安定剤等を添加し、乳剤、水和剤、懸濁剤、粒剤、粉剤、ドライフロアブル、フロアブル、水性液剤、油剤、燻煙剤、エアゾール、マイクロカプセル等に製剤化して用いることができる。養殖業の漁網や閉鎖系の壁面には上記のような製剤または直接本発明の樹木成分を塗布、含浸などして使用することもできる。
【００１８】
以下、本発明に係る藻類増殖抑制剤ついてより詳細に説明する。
【００１９】
＜実験方法＞
対象株は、珪藻類のＳｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ  ｃｏｓｔａｔｕｍ（ＮＩＥＳ−１６）とラフィド藻Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ  ａｋａｓｈｉｗｏ（ＮＩＥＳ−２９３）の二種類を用いた。両藻類とも独立行政法人国立環境研究所より購入した。
【００２０】
＜培養条件＞
培養に用いた人工気象器はＮＫｓｙｓｔｅｍ  ＮＫ式人工気象器であり、培養条件は温度２０〜２２℃、１２時間の明暗周期とし、光量は明周期時が約２０００  ｌｕｘ、暗周期時が約２  ｌｕｘで行った。培地はｆ／２培地を用いた。
＜Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ  ｃｏｓｔａｔｕｍ及びＨｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ  ａｋａｓｈｉｗｏの育生・保存・培養のための培地（ｆ／２培地）＞
蒸留水１ｌに、市販人工海水の素３８ｇを投入・攪拌し、その人工海水１ｌに、表１の多量栄養素を加えた（ｆ／２）。さらに、蒸留水１ｌに表２の微量金属を加え、微量金属の混液（ｆ／２  ｍｅｔａｌｓ）をつくり、このｆ／２にｆ／２  ｍｅｔａｌｓを１ｍｌ加えて攪拌し、ｆ／２培地とした。このｆ／２培地を１０ｍｌずつ試験管に分注し、オートクレープで滅菌を行った。（１２１度、２０分）滅菌後、冷蔵庫に安置し、保存や増殖用に用いた。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
【表２】
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【００２３】
＜Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ  ｃｏｓｔａｔｕｍ及びＨｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ  ａｋａｓｈｉｗｏの増殖試験＞
段落[００２０]で作成したｆ／２培地を、試験管に３〜４ｍｌ入れ、これを濃度ごとに試験管３本ずつ用意した。次に、Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ  ｃｏｓｔａｔｕｍ（ＮＩＥＳ−１６）またはＨｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ  ａｋａｓｈｉｗｏ（ＮＩＥＳ−２９３）の種株から初期濃度がＳｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ  ｃｏｓｔａｔｕｍ：約６５０００〜１７００００  ｃｅｌｌ／ｍｌ、Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ  ａｋａｓｈｉｗｏ：約６０００〜２００００  ｃｅｌｌ／ｍｌとなるように接種後、５ｍｌにメスアップし、初期細胞濃度を計測した。段落[００２０]に示した条件で五日間または七日間培養した。２４時間経過毎に各試験管を計測した。Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ  ａｋａｓｈｉｗｏでは種株から増殖させる際、  ｆ／２培地で思ったような増殖が見られなかったため、天然海水をオートクレープで滅菌し、培地として用いた。
なお、計測には血球盤を使用し、５７６マスに何個体あるか数え、以下の計算式で１ｍｌ当たりの個体数に換算した。
【００２４】
（計算式）
１ｍｌ当たりの個体数＝
（５７６マスの中の個体数／５７６）×１０００／０．０００２５
【００２５】
（試料）
スギ（心材・葉・樹皮）は山形大学農学部付属演習林にて、それぞれ約２００ｇ〜２５０ｇを採取した。ヒノキ（心材・葉・樹皮）は山形大学農学部付属演習林にて、それぞれ約２００ｇ〜２８０ｇを採取した。クロマツの葉は山形大学農学部構内にて、約２５０ｇ採取、心材・樹皮は酒田森林組合より入手した。
【００２６】
（精油の採取）
熱水蒸留装置（図２）を用いて熱水蒸留法により精油を採取した。
採取した試料を、それぞれハサミで１〜２ｃｍ、１〜２ｃｍ２ほどになるように切り刻み、試料を２００〜３００ｇ定量した。丸底フラスコの中に試料と一緒に蒸留水を試料の４〜５倍等の量を入れ、丸フラスコの口に冷却器をつなげた（ガラス管の連結部はすり合わせのものを使用）。そこからマントルヒーターを１５０℃前後に設定し、丸フラスコの中を煮沸するまで加熱した。煮沸を目安に、そこから７〜８時間加熱抽出を行った。ある程度煮沸し、蒸発してくる水蒸気と揮発成分を冷却器に通し、液状になったものを蒸留部として回収した。蒸留終了後、冷却器を酢酸エチルで洗い流し、それらも同様に回収を行った。回収したものを、分液ロートにて、水層と有機層に分液し、有機層のみを回収し、エバポレーターによって濃縮し、抽出成分（精油成分）を得た。表３に結果を示す。
【００２７】
【表３】
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【実施例１】
【００２８】
（増殖抑制試験用試料の調製）
前記で採取した各精油を３０ｍｇ秤量し、アセトンを３０ｍｌ加え、濃度が１ｍｇ／ｍｌになるように調製した。
【００２９】
（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ  ｃｏｓｔａｔｕｍと  Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ  ａｋａｓｈｉｗｏに対する増殖抑制実験）
前記で作成したｆ／２培地を試験管に３〜４  ｍｌの培地を入れ、その試験管にメスアップ後（５ｍｌ）の濃度が１ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、１００ｐｐｍとなるように調製した濃度１  ｍｇ／ｍｌの試料を５μｌ、５０μｌ、５００μｌ添加した。そこから二時間アセトンをとばす為に常温に放置した。これを各濃度試験管３本ずつ用意した。その後、Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ  ｃｏｓｔａｔｕｍ（ＮＩＥＳ−１６）とＨｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ  ａｋａｓｈｉｗｏ（ＮＩＥＳ−２９３）を接種し、初期細胞濃度を計測した。２−２−１の条件下で５日間（Ｓ．ｃｏｓｔａｔｕｍ  ）または七日間（Ｈ．ａｋａｓｈｉｗｏ  ）培養した。２４時間毎に前記と同様に各試験管を計測した。また、増殖率の算出方法は以下の計算式で換算した。
【００３０】
（計算式）
平均増殖率（％）
＝サンプル添加培地の増殖細胞数（個）（五日目）／ブランク培地のサンプル
添加培地の増殖細胞数（個）（五日目）×１００
【００３１】
（結果）
図３に結果を示す。全ての精油で両藻類またはどちらか一方の藻類に対する抑制活性がみられた。Ｓ．ｃｏｓｔａｔｕｍに対して、スギ樹皮部、クロマツ心材部の精油が強い増殖抑制効果を示した。また、Ｈ．ａｋａｓｈｉｗｏに対して、スギ樹皮部、クロマツ心材・葉・樹皮、松根油が強い増殖抑制効果を示した。特に、両藻類に対し、スギ樹皮、クロマツ心材の精油が強い抑制効果を示した。
【実施例２】
【００３２】
赤潮藻類Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ  ｃｏｓｔａｔｕｍの増殖抑制に特異的に効果のある成分を特定するために、モノテルペン類（炭素数１０）１０種、セスキテルペン類（炭素数１５）５種、ジテルペン類（炭素数２０）１１種、ノルリグナン類５種、フラボノール類３種、リグニン分解物、リグナン類、キノン類、トロポロン類、フェニルプロパノイド、それぞれ１種ずつ、合計１０類３９種の樹木成分標品を用いて、赤潮藻類Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ  ｃｏｓｔａｔｕｍの増殖抑制実験を行った。
増殖抑制実験の培養条件、計算方法等については実施例１と同様に行った。
【００３３】
（結果）
図４にモノテルペン類、図５にセスキテルペン類、図６にジテルペン類および図７にノルリグナン類、フラボノール類、リグニン分解物、リグナン類、キノン類、トロポロン類、フェニルプロパノイドのＳｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ  ｃｏｓｔａｔｕｍに対する増殖抑制効果（最終平均増殖率）を示す。
全般にブランクと比較して藻類に対する活性を有しており、濃度等の最適化で増殖抑制剤となりうる。
モノテルペン類は三日目までの抑制効果は計測され、短期間での効果について期待できる。セスキテルペン類ではロンギフォレンに特に強い抑制効果が見られた。ジテルペン類、キノン類ではフェルギノールやタキソディオンなど特定のアビエタトリエン構造、キノン構造を持つものに特に強い抑制効果がみられた。フラボノール類での抑制効果ではエピカテキン、ノルリグナン類ではセキュイリンＣに強い活性が認められた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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