(57)【要約】【課題】ストレス性大腸運動亢進の予防及び／又は改善剤、並びにストレス性大腸知覚過敏の予防及び／又は改善剤を評価又は選択する方法の提供・【解決手段】マスト細胞の安定化作用を指標とするストレス性大腸運動亢進の予防及び／又は改善剤の評価又は選択方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マスト細胞の安定化作用を指標とするストレス性大腸運動亢進の予防及び／又は改善剤の評価又は選択方法。
【請求項２】
以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）マスト細胞又は腸管組織に被験物質及び脱顆粒促進剤を接触させる工程、
（Ｂ）当該マスト細胞又は腸管組織におけるマスト細胞の脱顆粒の程度を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）における脱顆粒の程度と、被験物質を接触させない対照群におけるマスト細胞の脱顆粒の程度とを比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、マスト細胞の脱顆粒の程度を減少させる被験物質をストレス性大腸運動亢進の予防及び／又は改善剤として評価又は選択する工程、
を含む、ストレス性大腸運動亢進の予防及び／又は改善剤の評価又は選択方法。
【請求項３】
マスト細胞の安定化作用を指標とするストレス性大腸知覚過敏の予防及び／又は改善剤の評価又は選択方法。
【請求項４】
以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）マスト細胞又は腸管組織に被験物質及び脱顆粒促進剤を接触させる工程、
（Ｂ）当該マスト細胞又は腸管組織におけるマスト細胞の脱顆粒の程度を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）における脱顆粒の程度と、被験物質を接触させない対照群におけるマスト細胞の脱顆粒の程度とを比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、マスト細胞の脱顆粒の程度を減少させる被験物質をストレス性大腸知覚過敏の予防及び／又は改善剤として評価又は選択する工程、
を含む、ストレス性大腸知覚過敏の予防及び／又は改善剤の評価又は選択方法。
【請求項５】
以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）非ヒト哺乳動物に被験物質及び脱顆粒促進剤を投与する工程、
（Ｂ）当該非ヒト哺乳動物におけるマスト細胞の脱顆粒の程度を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）における脱顆粒の程度と、被験物質を接触させない対照群におけるマスト細胞の脱顆粒の程度とを比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、マスト細胞の脱顆粒の程度を減少させる被験物質をストレス性大腸運動亢進の予防及び／又は改善剤として評価又は選択する工程、
を含む、ストレス性大腸運動亢進の予防及び／又は改善剤の評価又は選択方法。
【請求項６】
以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）非ヒト哺乳動物に被験物質及び脱顆粒促進剤を投与する工程、
（Ｂ）当該非ヒト哺乳動物におけるマスト細胞の脱顆粒の程度を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）における脱顆粒の程度と、被験物質を接触させない対照群におけるマスト細胞の脱顆粒の程度とを比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、マスト細胞の脱顆粒の程度を減少させる被験物質をストレス性大腸知覚過敏の予防及び／又は改善剤として評価又は選択する工程、
を含む、ストレス性大腸知覚過敏の予防及び／又は改善剤の評価又は選択方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレス性大腸運動亢進の予防及び／又は改善剤、並びにストレス性大腸知覚過敏の予防及び／又は改善剤を評価又は選択する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
下痢には病原性微生物の感染、炎症性腸疾患などの炎症性の下痢の他に、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、機能性下痢など、炎症を伴わない非炎症性の下痢がある。これらの非炎症性の下痢発症には、ストレスの関与が大きいと考えられており、過敏性腸症候群はストレスが疾患を増悪させることが報告されている（非特許文献１−３）。ストレスは、視床下部室傍核のｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（ＣＲＦ）分泌を介して、大腸運動亢進（下痢）と大腸知覚過敏を招くと考えられている（非特許文献４）。
このような状況下に、ストレスにより発生する各種腸疾患、特に大腸運動亢進（下痢）、知覚過敏に対する予防・治療剤として、有効性が高くかつ、安全性の高い薬剤の開発が求められている。
【０００３】
ストレスによる大腸運動の亢進を抑制する方法として、セロトニン（５−ＨＴ）受容体拮抗薬の投与、オピオイド受容体作動薬の投与が報告され、例えば、ｏｎｄａｎｓｅｔｒｏｎ（５−ＨＴ3受容体拮抗薬）投与により拘束ストレス負荷ラットの排泄糞便数増加が抑制されること（非特許文献５）、ｔｒｉｍｅｂｕｔｉｎｅ、ｌｏｐｅｒａｍｉｄｅ（オピオイド受容体作動薬）投与により条件性ストレス負荷ラットの排泄糞便数増加が抑制されること（非特許文献６）が報告されている。
これらは腸の筋層間神経叢に存在する受容体の調節により、大腸運動亢進（下痢）を改善するものである。
【０００４】
一方、マスト細胞（肥満細胞）は粘膜下組織や皮膚などの結合組織、粘膜内に存在する造血幹細胞由来の細胞で、細胞内にヒスタミンやセロトニンなどの炎症性ケミカルメディエーターを含む顆粒を持つ。これらの顆粒が免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）とそれに対する抗原刺激やｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ刺激等で放出されると、血管透過性の亢進、局所への免疫細胞の集積と活性化、発熱などの一連の生体防御反応が惹起され、体内に侵入した異物が排除される。一方、その無秩序な活性化は、喘息、アレルギーをはじめとする様々な疾患の一因と考えられている。このようにマスト細胞は、炎症や免疫反応などの生体防御機構に重要な役割を持つ細胞である。
【０００５】
大腸知覚過敏改善効果に関しては、ｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅ（マスト細胞安定化剤）投与により、２，４，６−ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＴＮＢＳ）や酢酸注腸による炎症性の大腸知覚過敏が改善することが報告されている（非特許文献７，８）。
しかしながら、これまでに、マスト細胞と炎症を伴わないストレスによって引き起こされる大腸運動亢進（下痢）や大腸知覚過敏との関連性については知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍｉｎｅｒｖａ  Ｍｅｄ．２００４；９５：４４３−４５０
【非特許文献２】Ｇｕｔ  ２００４；５３：１１０２−１１０８
【非特許文献３】Ｃｕｒｒ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  Ｒｅｐ．２００４；６：２１０−２１５
【非特許文献４】過敏性腸症候群  脳と腸の対話を求めて  ２００６；９−１５
【非特許文献５】Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．１９９２；２６１：２９７−３０３
【非特許文献６】Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ．２００８；１０６：２６４−２７０
【非特許文献７】Ｊ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．２００７；６９：１２２３−１２２８
【非特許文献８】Ｊ  Ｖｅｔ  Ｓｃｉ．２００４；５：３１９−３２４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ストレス性大腸運動亢進の予防及び／又は改善剤、並びにストレス性大腸知覚過敏の予防及び／又は改善剤を評価又は選択する方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、ストレスが大腸機能に与える影響について検討したところ、大腸内のマスト細胞がストレス性の大腸機能低下に関与していることを見出した。そして、マスト細胞の安定化作用を指標として、ストレスによって引き起こされる大腸運動亢進（下痢）や大腸知覚過敏を予防・改善できる物質の評価又は選択が可能になることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、マスト細胞の安定化作用を指標とするストレス性大腸運動亢進の予防及び／又は改善剤の評価又は選択方法を提供するものである。
また、本発明は、以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）マスト細胞又は腸管組織に被験物質及び脱顆粒促進剤を接触させる工程、
（Ｂ）当該マスト細胞又は腸管組織におけるマスト細胞の脱顆粒の程度を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）における脱顆粒の程度と、被験物質を接触させない対照群におけるマスト細胞の脱顆粒の程度とを比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、マスト細胞の脱顆粒の程度を減少させる被験物質をストレス性大腸運動亢進の予防及び／又は改善剤として評価又は選択する工程、
を含む、ストレス性大腸運動亢進の予防及び／又は改善剤の評価又は選択方法を提供するものである。
【００１０】
また、本発明は、マスト細胞の安定化作用を指標とするストレス性大腸知覚過敏の予防及び／又は改善剤の評価又は選択方法を提供するものである。
また、本発明は、以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）マスト細胞又は腸管組織に被験物質及び脱顆粒促進剤を接触させる工程、
（Ｂ）当該マスト細胞又は腸管組織におけるマスト細胞の脱顆粒の程度を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）における脱顆粒の程度と、被験物質を接触させない対照群におけるマスト細胞の脱顆粒の程度とを比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、マスト細胞の脱顆粒の程度を減少させる被験物質をストレス性大腸知覚過敏の予防及び／又は改善剤として評価又は選択する工程、
を含む、ストレス性大腸知覚過敏の予防及び／又は改善剤の評価又は選択方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、各種物質の、ストレス負荷による大腸運動亢進（下痢）、知覚過敏に対する効果をより正確に評価することができ、優れたストレス性大腸運動亢進の予防及び／又は改善剤並びにストレス性大腸知覚過敏の予防及び／又は改善剤の選択が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ストレス負荷が大腸知覚に与える影響を示す図である。
【図２】ストレス性大腸知覚過敏に対するマスト細胞安定化剤の影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ストレス性大腸運動亢進及びストレス性大腸知覚過敏は、身体的あるいは精神的に与えられたストレスによって惹起される大腸運動亢進（下痢）及び大腸知覚過敏であり、炎症を伴う下痢や知覚過敏、すなわち病原性微生物の感染や炎症性腸疾患などの炎症性の下痢や知覚過敏とは区別される概念である。ストレスを負荷すると脳内でｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（ＣＲＦ）が放出される。ＣＲＦにより仙髄副交感神経が刺激され、筋層間神経叢のアセチルコリン性ニューロンを刺激して、輪状筋の収縮を起こすことにより大腸運動亢進がおこると考えられている（日本臨床  ２００６；６４：１４０６−１４０８）。また、同時にストレスはＣＲＦの分泌を介して大腸知覚過敏を招くと考えられている（非特許文献４）。
【００１４】
これに対し、本発明者は、マスト細胞が欠損したモデルラットであるＷｓＲＣ−Ｗｓ／Ｗｓラットではストレス負荷による大腸運動の過剰な亢進及び大腸知覚過敏の誘発が認められないこと、さらに、マスト細胞安定化剤であるｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅの投与により大腸運動の過剰な亢進及び大腸知覚過敏の誘発が改善されたことから、ストレス性の大腸機能低下にマスト細胞が関与している可能性を見出した。すなわち、マスト細胞の安定化とストレス性大腸運動亢進の改善及び大腸知覚過敏の改善には正の相関関係があることが判明した。従って、各種物質のストレス性大腸運動亢進の予防・改善又はストレス性大腸知覚過敏の予防・改善効果をマスト細胞の安定化作用を指標として評価でき、ストレス性大腸運動亢進の予防及び／又は改善剤、並びにストレス性大腸知覚過敏の予防及び／又は改善剤を選択できると考えられる。
【００１５】
本発明方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことも、ｉｎ  ｖｉｖｏで行うこともできる。
本発明において、マスト細胞の安定化作用は、例えばマスト細胞の脱顆粒の程度を測定することで評価できる。脱顆粒の程度の測定は、特に制限はなく、常法に従って、例えば、β−ヘキソサミニダーゼ活性又はプロテアーゼ活性を測定するか、マスト細胞から放出されるケミカルメディエーター量を測定することにより行うことができる。ここで、ケミカルメディエーターとしては、ヒスタミン、セロトニン、プロスタグランジンＤ２、ロイコトリエンＢ４等が挙げられ、特に、簡便に測定できるという点から、β−ヘキソサミニダーゼ活性の測定又は、ヒスタミン若しくはセロトニン量の測定が好ましい。
【００１６】
本発明方法をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う場合は、具体的には以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）マスト細胞又は腸管組織に被験物質及び脱顆粒促進剤を接触させる工程、
（Ｂ）当該マスト細胞又は腸管組織におけるマスト細胞の脱顆粒の程度を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）における脱顆粒の程度と、被験物質を接触させない対照群におけるマスト細胞の脱顆粒の程度とを比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、マスト細胞の脱顆粒の程度を減少させる被験物質をストレス性大腸運動亢進の予防及び／又は改善剤、或いはストレス性大腸知覚過敏の予防及び／又は改善剤として評価又は選択する工程、
からなる。
【００１７】
本発明において、マスト細胞としては、例えば、培養細胞株であるラット好塩基球性白血病細胞（ＲＢＬ−２Ｈ３）、血液や組織から直接分離したもの等が挙げられる。マスト細胞は、培養細胞株、正常細胞の他、造血幹細胞等から分化誘導したものであってもよい。
また、腸管組織としては、哺乳動物由来の十二指腸、空腸、回腸、結腸、直腸等が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ等が挙げられる。
【００１８】
本発明において、マスト細胞又は腸管組織と被験物質及び脱顆粒促進剤との接触は、例えば、細胞又は組織が載置された培養液に、被験物質及び脱顆粒促進剤を所定の濃度になるように添加することにより行うことができる。脱顆粒促進剤は、先に被験物質をマスト細胞又は腸管組織に接触させて適宜インキュベートした後、接触させるのが、被験物質の効果をより得やすいという点から好ましい。被験物質をマスト細胞又は腸管組織に接触させた後、例えば室温（２５℃）〜３７℃で通常５分〜１２０分程度、好ましくは１０分〜６０分程度培養したのちに脱顆粒促進剤と接触させるのが好ましい。
被験物質及び脱顆粒促進剤の接触後、例えば室温（２５℃）〜３７℃で通常５分〜１２０分程度、好ましくは１０分〜６０分程度培養したのちに、培養上清を回収しマスト細胞の脱顆粒の程度を測定するのが好ましい。
【００１９】
マスト細胞の播種時の濃度は、評価可能な濃度であれば特に限定されない。マスト細胞の播種時の濃度は、２４ｗｅｌｌプレートを使用した場合、０．５×１０3〜３．０×１０6ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとするのが好ましく、特に０．５×１０4〜１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとするのが好ましい。また、腸管組織の量は、評価可能な量であれば特に限定されない。
【００２０】
被験物質としては、特に限定されず、例えば動植物抽出物、化合物、化学物質等を用いることができる。被験物質の添加濃度は、０．００００１〜１０質量％（固形残分）とするのが好ましく、特に０．０００１〜３質量％（固形残分）とするのが好ましい。
【００２１】
また、脱顆粒促進剤としては、顆粒放出を促すものであれば特に制限されないが、例えば、抗原（ＤＮＰ等）、ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０、ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ等が挙げられる。脱顆粒促進剤の添加濃度は抗原（ＤＮＰ等）:０．０１〜５０００nｇ／ｍＬ、ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０  :０．０１〜１０００μｇ／ｍＬ、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ:０．０１〜１００００μＭとするのが好ましく、特に抗原（ＤＮＰ等）:０．１〜５００nｇ／ｍＬ、ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０:０．１〜１００μｇ／ｍＬ、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ:０．１〜１０００μＭとするのが好ましい。
【００２２】
マスト細胞を培養する培地は、常用の培地を用いることができ、例えば、ＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｔ培地、Ｆ１２培地などを用いることができる。細胞継代、増殖時にはこれらの培地に、増殖因子、インスリン、ハイドロコーチゾンなどの増殖添加剤を添加することが好ましい。また、培養時にはこれらの培地に抗菌剤などの培養添加剤を添加してもよい。
腸管組織を培養する培地は、常用の培地を用いることができ、例えば、ＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｔ培地、Ｆ１２培地などを用いることができる。これらの培地に、増殖因子、インスリン、ハイドロコーチゾンなどの増殖添加剤を添加することが好ましい。また、培養時にはこれらの培地に抗菌剤などの培養添加剤を添加してもよい。
【００２３】
本発明において、マスト細胞の脱顆粒の程度は、培養後上清を回収し、常法に従って、β−ヘキソサミニダーゼ活性やケミカルメディエーター量等を測定することによって測定できる。例えば、β−ヘキソサミニダーゼ活性の測定は、酵素反応により発色する基質を用いた酵素反応を行うことにより行うことができる。また、ヒスタミン、セロトニンなどのケミカルメディエーターの測定は、ｏ−ｐｈｔｈａｌａｌｄｅｈｙｄｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｒｏｍｅｔｒｉｃ法（Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  １９５９；１２７：１８２−１８６）、或いはＥＬＩＳＡ法による抗原抗体反応により行うことができる。
【００２４】
本発明方法をｉｎ  ｖｉｖｏで行う場合、
具体的には以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）非ヒト哺乳動物に被験物質及び脱顆粒促進剤を投与する工程、
（Ｂ）当該非ヒト哺乳動物におけるマスト細胞の脱顆粒の程度を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）における脱顆粒の程度と、被験物質を接触させない対照群におけるマスト細胞の脱顆粒の程度とを比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、マスト細胞の脱顆粒の程度を減少させる被験物質をストレス性大腸運動亢進の予防及び／又は改善剤、或いはストレス性大腸知覚過敏の予防及び／又は改善剤として評価又は選択する工程、
からなる。
【００２５】
本発明方法に用いられる非ヒト哺乳動物としては、性別、月齢を問わず、いかなる種類の動物でもよい。例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ又はサルを挙げることができるが、入手が容易であり、取り扱い易いラットやマウスなどのげっ歯類が好ましい。
【００２６】
当該非ヒト哺乳動物への被験物質及び脱顆粒促進剤の投与方法としては、例えば、経口投与、消化管内投与、腹腔内投与、血管内投与、皮内投与、皮下投与等が挙げられるが、簡便さや侵襲性が低いなどの点から、経口投与する方法が好ましい。
【００２７】
被験物質の投与量は、０．０１〜５０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜５００ｍｇ／ｋｇ体重である。また、脱顆粒促進剤の投与量は、０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重である。投与回数は通常１回であるが、間隔をあけて数回に分けて投与してもよい。脱顆粒促進剤は、非ヒト哺乳動物へ被験物質を投与後、適宜飼育した後投与するのが、被験物質の効果をより得やすいという点から好ましい。脱顆粒促進剤の投与は、被験物質を投与後１０〜２４０分とするのが好ましく、特に３０〜１２０分とするのが好ましい。
【００２８】
次いで、被験物質及び脱顆粒促進剤の投与１０〜２４０分後、好ましくは３０〜１２０分後に、非ヒト哺乳動物から腹腔細胞或いは腸管組織を採取し、培養液或いは緩衝液中に１０〜２４０分後、好ましくは３０〜１２０分、インキュベートした後、回収した上清中に含まれるβ−ヘキソサミニダーゼ活性やケミカルメディエーター量を測定することで、マスト細胞における脱顆粒の程度を測定できる。脱顆粒の程度の測定方法としては、上記と同様の方法が挙げられる。また、非ヒト哺乳動物から採取した血液中のβ−ヘキソサミニダーゼ活性やケミカルメディエーター量を測定することで、マスト細胞における脱顆粒の程度を測定することもできる（Ｊ  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９９；６４：４５−５２）。
【００２９】
ストレス性大腸運動亢進の予防及び／又は改善剤、或いはストレス性大腸知覚過敏の予防及び／又は改善剤の評価は、被験物質と接触させたマスト細胞における脱顆粒の程度を、被験物質に接触させない対照群（対照細胞又は組織）におけるマスト細胞の脱顆粒の程度と比較し、その程度が減少した場合、すなわち被験物質により脱顆粒が抑制された場合、被験物質にはストレス性大腸運動亢進の予防・改善効果又はストレス性大腸知覚過敏の予防・改善効果があると評価でき、斯かる物質を選択することができる。
【００３０】
また、被験物質を投与した非ヒト哺乳動物から採取した腹腔細胞又は腸管組織におけるマスト細胞の脱顆粒の程度を、被験物質を投与しない対照群（対照動物）におけるマスト細胞の脱顆粒の程度と比較し、その程度が減少した場合、すなわち被験物質により脱顆粒が抑制された場合、被験物質にはストレス性大腸運動亢進の予防・改善効果又はストレス性大腸知覚過敏の予防・改善効果があると評価でき、斯かる物質を選択することができる。
評価に際しては、必ずしも統計学的な手法を用いる必要はないが、統計学的に有意差の有無を検定して評価することが好ましい。
【００３１】
このようにして評価又は選択された物質は、ストレスによる大腸運動亢進（下痢）、大腸知覚過敏を予防及び／又は改善するための医薬、食品等に有効成分として配合して使用するための素材となり得る。
【実施例】
【００３２】
実施例１
＜ストレスが血中成分に与える影響解析＞
１．方法
雄性Ｗｉｓｔａｒラット（９−１０週齢: 日本クレア）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（日本クレア）自由摂食下で７日間飼育した後、各群間に体重差がないように４群に群分け（Ｎ＝１０匹/群）した。２群は自由摂食下で、２群は絶食下で２０時間飼育した。
自由摂食群、絶食群各１群は、イソフルラン吸入麻酔下、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した（部分拘束ストレス、ストレス群）。覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置した後、動物の固定を解除した。対照群は、自由摂食群、絶食群各１群をイソフルラン吸入麻酔処理した後、覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置した。
麻酔下で腹部大動脈より全採血し、血中ヒスタミン、セロトニン、（ＥＬＩＳＡ法：Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ＥＩＡ  Ｋｉｔ;Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ＥＬＩＳＡ；ＤＲＧ）、ＣＲＦ量（ＥＬＩＳＡ法：Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ  ＣＲＦ−ＨＳ＿ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ、矢内原研究所）、血中サイトカイン量（ＩＬ−１β，ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−１０，ＩＬ−１３，ＴＮＦ−α）（マイクロビーズアレイ: Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をそれぞれ定量した。
【００３３】
雄性Ｗｉｓｔａｒラット（９週齢: 日本クレア）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（日本クレア）自由摂食下で７日間飼育した後、各群間に体重差がないように２群に群分け（Ｎ＝３匹/群）した。
ストレス群は、イソフルラン吸入麻酔下、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した。覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置した後、動物の固定を解除した。麻酔下にて腹部大動脈からの全採血により安楽死させた後、結腸7区画（盲結腸移行部より１ｃｍ下流から１ｃｍ長に７分割）を摘出後、各区画を０．５  ｍＬ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ/Ｒｉｎｇｅｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ(６０μＭ)中で６０分間インキュベートした。上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ＥＩＡ  Ｋｉｔ;Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により結腸組織からのヒスタミン放出量を定量した。
【００３４】
２．結果
部分拘束ストレスを負荷した場合、対照群（ストレス負荷なし）に比べて、血中ＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−１３量が絶食時、非絶食時共に高い傾向であった（表１）。絶食時の血中ＩＬ−１，ＩＬ−２量は、ストレス負荷群で低い傾向であった。その他のサイトカイン及びＣＲＦ量は、両群で差がなかった。
部分拘束ストレスを負荷した場合、対照群（ストレス負荷なし）に比べて、血中ヒスタミン量（表２）が有意に高く、血中セロトニン量は増加傾向であった（表２）。また、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ刺激による摘出結腸からのヒスタミン放出量が有意に高かった（表３）。
なお、各ポイントは平均±標準誤差で示し、群間の統計学的有意差については、対照群に対するＳｔｕｄｅｎｔ‘ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを行なった（＊ｐ＜０．０５）。
【００３５】
【表１】
2011185832.tif 000002
【００３６】
【表２】
2011185832.tif 000003
【００３７】
【表３】
2011185832.tif 000004
【００３８】
実施例２
＜ストレスが大腸運動に与える影響解析＞
１．方法
雄性Ｗｉｓｔａｒラット（９−１０週齢: 日本クレア）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（日本クレア）自由摂食下で７日間飼育した後、各群間に体重差がないように２群に群分け（Ｎ＝１０匹/群）した。１群（ストレス群）は、イソフルラン吸入麻酔下、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した。覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置し、その間の排泄糞便数を測定した（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＣＬ．  ｅｔ  ａｌ.  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １９８８;  ９４:  ６１１−６２１）。なお、排泄糞便数は、大腸運動の指標である。対照群は、イソフルラン吸入麻酔処理した後、覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置した。
雄性ＷｓＲＣ−＋／＋（野生型）ラット、ＷｓＲＣ−Ｗｓ／Ｗｓ（マスト細胞欠損）ラット（９−１２週齢: 日本ＳＬＣ）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（日本クレア）自由摂食下で７日間飼育した後、各群間に体重差がないように群分け（Ｎ＝９匹/群、平均体重２６０ｇ）した。
ストレス群は、イソフルラン吸入麻酔下、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した。覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置し、その間の排泄糞便数を測定した。
【００３９】
２．結果
Ｗｉｓｔａｒラットに、部分拘束ストレスを負荷した場合、対照群（ストレス負荷なし）に比べて、排泄糞便数が有意に増加していた（表４）。
野生型（＋／＋）ラットでは、部分拘束ストレス負荷により、対照群（ストレス負荷なし）に比べて、排泄糞便数が有意に増加していた（表５）。このストレス負荷による排便数の増加は、マスト細胞欠損（Ｗｓ／Ｗｓ）ラットでは認められなかった。
なお、各ポイントは平均±標準誤差で示し、群間の統計学的有意差については、対照群に対するＳｔｕｄｅｎｔ‘ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを行なった（＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００４０】
【表４】
2011185832.tif 000005
【００４１】
【表５】
2011185832.tif 000006
【００４２】
実施例３
＜ストレスが大腸知覚に与える影響解析＞
１．方法
２０時間絶食させた雄性Ｗｉｓｔａｒラット（８−１０週齢: 日本クレア）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（日本クレア）各群間に体重差がないように群分け（Ｎ＝８匹/群）した。
ストレス群は、イソフルラン吸入麻酔下、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した。覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置した後、動物の固定を解除し、大腸拡張試験により大腸知覚を既報の方法（Ｗｉｎｓｔｏｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２００７；  １３２：  ６１５−６２７）で評価した。すなわち、麻酔下ラットの大腸に経肛門的にバルーンカテーテル（シリコーンフォーリーカテーテル、２．０ ｍｍ（６Ｆｒ）、東レ・メディカル）を４cm挿入した。覚醒後、測定用ケージ内でバルーンカテーテルへの注水により、大腸を段階的に拡張させた。下記に示す各拡張容量における「Ａｂｄｏｍｉｎａｌ  Ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ  Ｒｅｆｌｅｘ （ＡＷＲ）スコア」をブラインド評価し、大腸知覚を半定量的に評価した。
２０時間絶食させた、雄性ＷｓＲＣ−＋／＋（野生型）ラット、ＷｓＲＣ−Ｗｓ／Ｗｓ（マスト細胞欠損）ラット（９−１３週齢: 日本ＳＬＣ）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（日本クレア）自由摂食下で飼育した後、各群間に体重差がないように群分け（Ｎ＝８−１２匹/群、平均体重２５０ｇ）した。
イソフルラン吸入麻酔下、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した。覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置した後、動物の拘束を解除し、大腸拡張試験により大腸知覚を評価した。
【００４３】
≪Ａｂｄｏｍｉｎａｌ  Ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ  Ｒｅｆｌｅｘ （ＡＷＲ）スコア≫
０：ｎｏ  ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  （変化なし）
１：ｂｒｉｅｆ  ｈｅａｄ  ｍｏｖｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ
ｉｍｍｏｂｉｌｉｔｙ  （頭を動かした後、静止）
２：ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ｍｕｓｃｌｅ
ｗｉｔｈｏｕｔ  ｌｉｆｔｉｎｇ  ｏｆ  ａｂｄｏｍｅｎ  （腹筋の収縮）
３：ｌｉｆｔｉｎｇ  ｏｆ  ａｂｄｏｍｅｎ  （腹部を上げる）
４：ｂｏｄｙ  ａｒｃｈｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｉｆｔｉｎｇ  ｏｆ
ｐｅｌｖｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  （体をアーチ状にし、骨盤を持ち上げる）
【００４４】
２．結果
Ｗｉｓｔａｒラットに、部分拘束ストレスを負荷した場合、対照群（ストレス負荷なし）に比べて、より少ない拡張容量で大きなＡＷＲ応答を示した（図１）。
野生型（＋／＋）ラットでは、部分拘束ストレス負荷により、対照群（ストレス負荷なし）に比べて、各拡張容量におけるＡＷＲスコアが有意に高かった（図１）。このストレス負荷によるＡＷＲ応答の上昇は、マスト細胞欠損（Ｗｓ／Ｗｓ）ラットでは認められなかった（図１）。
なお、各ポイントは平均±標準誤差で示し、群間の統計学的有意差については、対照群に対するＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  ｔｅｓｔを行なった（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００４５】
実施例４
＜ストレス性大腸運動亢進に対する各種薬剤の影響＞
１．方法
雄性Ｗｉｓｔａｒラット（９週齢: 日本クレア）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（日本クレア）自由摂食下で５日間飼育した後、各群間に体重差がないように群分け（Ｎ＝１０匹/群）した。
ストレス群は、イソフルラン吸入麻酔下、表６示す各種薬剤（メチルセルロース水溶液（和光純薬、０．５  ｗ／ｖ％ メチルセルロース４００溶液、０．５  ｗ／ｖ％）に懸濁）又はメチルセルロース０．５  ｗ／ｖ％水溶液を胃内投与（４ｍＬ／ｋｇ体重）し、覚醒下にて個別ケージ内に１時間静置した。対照群には、メチルセルロース０．５  ｗ／ｖ％水溶液を胃内投与（４ｍＬ／ｋｇ体重）した。ストレス群はイソフルラン吸入麻酔下、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した。覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置し、その間の排泄糞便数を測定した。
【００４６】
【表６】
2011185832.tif 000007
【００４７】
２．結果
薬剤非投与群（メチルセルロース投与）では、部分拘束ストレス負荷により、対照群に対して排泄糞便数が有意に増加した。５−ＨＴ３受容体拮抗薬（ｏｎｄａｎｓｅｔｒｏｎ）、マスト細胞安定化剤（ｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅ）、５−ＨＴ４受容体作動薬（ｍｏｓａｐｒｉｄｅ）、オピオイド受容体作動薬（ｔｒｉｍｅｂｕｔｉｎｅ）、オピオイド受容体作動薬（ｌｏｐｅｒａｍｉｄｅ）を前投与した場合、ストレス負荷による排便数の増加は有意に抑制された(表７)。
なお、各ポイントは平均±標準誤差で示し、群間の統計学的有意差については、Ｓｃｈｅｆｆｅ  ｔｅｓｔを行なった（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００４８】
【表７】
2011185832.tif 000008
【００４９】
実施例５
＜定常時の大腸運動に対する各種薬剤の影響＞
１．方法
雄性Ｗｉｓｔａｒラット（９週齢: 日本クレア）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（日本クレア）自由摂食下で５日間飼育した後、各群間に体重差がないように群分け（Ｎ＝５匹/群）した。
表６に示す各種薬剤を胃内投与（４ｍＬ／ｋｇ体重）し、覚醒下にて個別ケージ内にて１２時間（暗期）飼育し、その間の排泄糞便数を測定した。対照群には、メチルセルロース０．５  ｖ／ｗ ％水溶液を胃内投与（４ｍＬ／ｋｇ体重）した。
【００５０】
２．結果
オピオイド受容体作動薬（ｌｏｐｅｒａｍｉｄｅ）を前投与した場合、排泄糞便数は対照群（メチルセルロース投与）に比べて有意に少なかった（表８）。一方、マスト細胞安定化剤（ｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅ）、５−ＨＴ３受容体拮抗薬（ｏｎｄａｎｓｅｔｒｏｎ）、５−ＨＴ４受容体作動薬（ｍｏｓａｐｒｉｄｅ）、及びオピオイド受容体作動薬（ｔｒｉｍｅｂｕｔｉｎｅ）は排泄糞便数に影響が認められなかった。
なお、各ポイントは平均±標準誤差で示し、群間の統計学的有意差については、Ｓｃｈｅｆｆｅ  ｔｅｓｔを行なった（＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００５１】
【表８】
2011185832.tif 000009
【００５２】
実施例６
＜ストレス性大腸知覚過敏に対するマスト細胞安定化剤の影響＞
１．方法
２０時間絶食させた雄性Ｗｉｓｔａｒラット（８−１０週齢: 日本クレア）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（日本クレア）各群間に体重差がないように群分け（Ｎ＝８匹/群）した。
マスト細胞安定化剤投与群は、イソフルラン吸入麻酔下、マスト細胞安定化剤（ｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅ，メチルセルロース溶液に懸濁）を胃内投与（５ｍｇ／ｋｇ体重）と同時に、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した。対照群には、メチルセルロース０．５  ｗ／ｖ％水溶液を胃内投与（４ｍＬ／ｋｇ体重）と同時に、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した。覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置した後、動物の固定を解除し、実施例３と同様に大腸拡張試験により大腸知覚を評価した。
【００５３】
２．結果
Ｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅ投与ラットでは、対照群（メチルセルロース投与）に比べて、各拡張容量におけるＡＷＲスコアが有意に低かった（図２）。
なお、各ポイントは平均±標準誤差で示し、群間の統計学的有意差については、対照群に対するＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  ｔｅｓｔを行なった（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００５４】
以上の結果から、マスト細胞の安定化がストレス性の大腸運動亢進改善及びストレス性の大腸知覚過敏改善に寄与しているものと考えられた。
【００５５】
実施例７
＜マスト細胞安定化剤のスクリーニング＞
１．方法
ラット好塩基球性白血病細胞ＲＢＬ−２Ｈ３細胞（ＡＴＣＣ）を１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００  ｕｎｉｔ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００  μｇ／ｍＬ）を含むＭＥＭ培地中で増殖させた後、２４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにＲＢＬ−２Ｈ３細胞を８×１０3 ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ（Ｎ＝３）となるように播き、１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００  ｕｎｉｔ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００  μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３日間培養した。ＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０（０〜１５０μg／ｍＬ  フェノールレッド、血清、抗生物質を含まないＲＰＭＩ培地）で１５分間インキュベートした。
また、同様に、ＲＰＭＩ１６４０培地で３日間培養したＲＢＬ−２Ｈ３細胞を、ｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅ（０−４００μＭ）を含むＲＰＭＩ培地で室温で３０分間インキュベートした後、ｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅ（０−４００μＭ）＋１５μｇ／ｍＬ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０を含むＲＰＭＩ培地（フェノールレッド、血清、抗生物質不含）で室温で１５分間インキュベートした。
各ｗｅｌｌより培養上清を５０μＬずつ、次に各ｗｅｌｌに５００μＬの０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加えて細胞を溶解させ５０μＬずつを採取した。これにβ−ヘキソサミニダーゼの基質である２ｍＭ  ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅを含む０．２Ｍ  クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）５０μＬを加えて３７℃で２時間反応させた。反応終了後、１５０μＬ  １Ｍ  トリス緩衝液（ｐＨ９．０）で停止後、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍの吸光度を測定し、細胞内外のβ−ヘキソサミニダーゼ活性を測定し、β−ヘキソサミニダーゼ分泌（脱顆粒）（Ｏ．Ｄ．上清/(Ｏ．Ｄ．上清＋Ｏ．Ｄ．細胞溶解液)×１００(％)）を算出した。
【００５６】
２．結果
ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０は濃度依存的に脱顆粒を促進した（表９）。ｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅは濃度依存的に脱顆粒を抑制した（表１０）。
なお、各ポイントは平均±標準誤差で示し、群間の統計学的有意差については、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ＰＬＳＤを行なった（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００５７】
【表９】
2011185832.tif 000010
【００５８】
【表１０】
2011185832.tif 000011
【図１】
2011185832.tif 000012
【図２】
2011185832.tif 000013