(57)【要約】【課題】高価な保護基および特殊な原料を用いることなく、２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオシドを簡便かつ効率的に製造する方法を提供すること。【解決手段】２以上のリボヌクレオチドを含有するＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物をシリル化剤と反応させて、２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドを含有するシリル化ＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物を得ることを含む、シリル化ＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物の製造方法；２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドを含有するシリル化ＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物を加水分解反応により分解して、シリル化リボヌクレオシドまたはシリル化リボヌクレオシドのホスフェート誘導体もしくはその塩あるいはそれらの混合物を得ることを含む、シリル化リボヌクレオシドまたはシリル化リボヌクレオシドのホスフェート誘導体もしくはその塩あるいはそれらの混合物の製造方法など。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２以上のリボヌクレオチドを含有するＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物をシリル化剤と反応させて、２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドを含有するシリル化ＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物を得ることを含む、シリル化ＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物の製造方法。
【請求項２】
前記ＲＮＡが天然ＲＮＡである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記２以上のリボヌクレオチドを含有するＲＮＡが、下記式（Ｉ）：
【化１】
2011084495.tif 000009
〔式（Ｉ）中、Ｘ、Ｙは、それぞれ同一または異なって、置換されていてもよい核酸塩基を示し、
ｎは、０以上の整数を示し、
Ｗｎは、前記ｎの各整数に対応して同一または異なって、置換されていてもよい核酸塩基を示し、
Ｒ１は、水素原子、リン酸基または５’−キャッピング部分を示し、
Ｒ２は、水素原子またはリン酸基を示す。〕により表わされるＲＮＡであり、かつ
前記２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドを含有するシリル化ＲＮＡが、下記式（ＩＩ）：
【化２】
2011084495.tif 000010
〔式（ＩＩ）中、Ｘ、Ｙ、ｎ、Ｗｎは、それぞれ、前記式（Ｉ）におけるＸ、Ｙ、ｎ、Ｗｎと同義であり、
Ｒ３は、水素原子、シリル基、リン酸基、または少なくとも一つの水酸基がシリル化されていてもよい５’−キャッピング部分を示し、
Ｒ４は、水素原子、シリル基またはリン酸基を示し、
Ｒ５、Ｒ６、Ｋｎは、それぞれ同一または異なって、水素原子またはシリル基を示し、
ただし、Ｒ５、Ｒ６、Ｋｎのうちの少なくとも一つは、シリル基である。〕により表わされるシリル化ＲＮＡである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記ｎが０から１０，０００までの整数である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記塩が無機塩、有機塩または金属塩である、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記シリル化剤が、下記式（Ｖ）：
【化３】
2011084495.tif 000011
〔式（Ｖ）中、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２は、それぞれ同一または異なって、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ１〜Ｃ１０アリールを示し、
Ｌは、脱離基を示す。〕により表される化合物である、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記シリル化剤がＴＢＤＭＳＣｌである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドを含有するシリル化ＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物を加水分解反応により分解して、２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオシドのホスフェート誘導体もしくはその塩あるいはそれらの混合物を得ることを含む、シリル化リボヌクレオシドまたはシリル化リボヌクレオシドのホスフェート誘導体もしくはその塩あるいはそれらの混合物の製造方法。
【請求項９】
前記２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドを含有するシリル化ＲＮＡが、下記式（ＩＩ）：
【化４】
2011084495.tif 000012
〔式（ＩＩ）中、Ｘ、Ｙは、それぞれ同一または異なって、置換されていてもよい核酸塩基を示し、
ｎは、０以上の整数を示し、
Ｗｎは、前記ｎの各整数に対応して同一または異なって、置換されていてもよい核酸塩基を示し、
Ｒ３は、水素原子、シリル基、リン酸基、または少なくとも一つの水酸基がシリル化されていてもよい５’−キャッピング部分を示し、
Ｒ４は、水素原子、シリル基またはリン酸基を示し、
Ｒ５、Ｒ６、Ｋｎは、それぞれ同一または異なって、水素原子またはシリル基を示し、
ただし、Ｒ５、Ｒ６、Ｋｎのうちの少なくとも一つは、シリル基である。〕であり、かつ
前記シリル化ヌクレオシドまたはシリル化ヌクレオシドのホスフェート誘導体が、下記式（ＩＩＩ）：
【化５】
2011084495.tif 000013
〔式（ＩＩＩ）中、Ｑは、置換されていてもよい核酸塩基を示し、
Ｒ７、Ｒ８は、それぞれ同一または異なって、水素原子、シリル基またはリン酸基を示し、
Ｒ９は、シリル基を示す。〕である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記式（ＩＩＩ）により表される化合物が、下記式（ＩＶ）：
【化６】
2011084495.tif 000014
〔式（ＩＶ）中、Ｑは、置換されていてもよい核酸塩基を示し、
Ｒ９は、シリル基を示す。〕により表されるシリル化ヌクレオシドである、シリル化ヌクレオシドの製造方法である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記加水分解反応が、酵素による加水分解反応である、請求項８〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
（１）２以上のリボヌクレオチドを含有するＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物をシリル化剤と反応させて、２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドを含有するシリル化ＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物を得ること、ならびに
（２）前記シリル化ＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物を加水分解反応により分解して、シリル化リボヌクレオシドまたはシリル化リボヌクレオシドのホスフェート誘導体もしくはその塩あるいはそれらの混合物を得ることを含む、シリル化リボヌクレオシドまたはシリル化リボヌクレオシドのホスフェート誘導体もしくはその塩あるいはそれらの混合物の製造方法。
【請求項１３】
下記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかである、シリル化ＲＮＡまたはその塩：
（ｉ）少なくとも１個の２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドおよび少なくとも１個のリボヌクレオチドを含有するシリル化ＲＮＡ；
（ｉｉ）２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの総数が少なくとも１００個である、２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドを少なくとも含有するシリル化ＲＮＡ；
（ｉｉｉ）同種のリボヌクレオチドのみを含有し、かつ２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドを含有するシリル化ＲＮＡ；および
（ｉｖ）ＲＮＡが天然ＲＮＡである、２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドを含有するシリル化ＲＮＡ。
【請求項１４】
２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドを含有する複数種のシリル化ＲＮＡまたはその塩を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２’−Ｏ−シリル化ヌクレオシドの合成法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
化学的に合成されたオリゴリボヌクレオチド（オリゴＲＮＡ）は、遺伝子解析のＲＮＡプローブ、ＲＮＡ医薬品素材（アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ＲＮＡｉを利用した遺伝子発現制御、アプタマー）として有用である。現在行われているＲＮＡの化学合成法においては、リボヌクレオチドの２’−水酸基を、酸または塩基を用いない穏和な条件下で除去可能な保護基で保護したリボヌクレオチドホスホロアミダイトを用いた固相合成法が主流である。このような保護基として、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ基）などのシリル基が汎用されている。シリル基は、テトラブチルアンモニウムフルオリドやトリエチルアミン三フッ化水素などで除去できるため、ＲＮＡ合成に有用である。
【０００３】
リボヌクレオシドの２’−水酸基に、ＴＢＤＭＳ基等のシリル基を導入して、２’−Ｏ−シリル化ヌクレオシドを得る幾つかの方法が報告されている。
【０００４】
例えば、Ｏｇｉｌｖｉｅらは、５’−水酸基が４，４’−ジメトキシトリチル基で保護されたリボヌクレオシド誘導体を、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（ＴＢＤＭＳＣｌ）と反応させて、２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳリボヌクレオシド誘導体および３’−Ｏ−ＴＢＤＭＳリボヌクレオシドを含む混合物を調製すること、ならびに調製された混合物から２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳリボヌクレオシド誘導体を精製することを開示している（非特許文献１、２）。
【０００５】
Ｂｅｉｇｅｌｍａｎらは、リボヌクレオシド誘導体の３’−水酸基および５’−水酸基をジ（ｔｅｒｔ−ブチル）シランジイル基（ＤＴＢＳ基）で保護し、次いで、遊離の２’−水酸基にＴＢＤＭＳＣｌを反応させることにより、２’−水酸基がＴＢＤＭＳにより選択的に保護されたリボヌクレオシド誘導体を調製すること、ならびに調製された誘導体のＤＴＢＳ基をフッ化水素ピリジンで選択的に除去して、２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳリボヌクレオシドを得ることを開示している（非特許文献３）。
【０００６】
Ｊｏｎｅｓらは、リボヌクレオシド  ３’−ホスホネート誘導体を原料として用いて、２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳリボヌクレオシド誘導体を調製することを開示している（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】テトラへドロン  レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）、第１５巻、２８６１−２８６４頁、１９７４年
【非特許文献２】カナディアン  ジャーナル  オブ  ケミストリー（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第６０巻、１１０６−１１１３頁、１９８２年
【非特許文献３】テトラへドロン  レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）、第４３巻、１９８３−１９８５頁、２００２年
【非特許文献４】テトラへドロン  レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）、第４０巻、４１５３−４１５６頁、１９９９年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、これらの方法はいずれも、２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオシドの効率的な合成の観点からは問題がある。
【０００９】
Ｏｇｉｌｖｉｅらの方法では、ＴＢＤＭＳ基が２’−水酸基および３’−水酸基の両方に導入され得るため、目的とする２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳリボヌクレオシドの収率が低い。この方法はまた、２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳリボヌクレオシドおよび３’−Ｏ−ＴＢＤＭＳリボヌクレオシドを分離精製するために、クロマトグラフィーなどの煩雑な操作を必要とする。
【００１０】
Ｂｅｉｇｅｌｍａｎらの方法では、ＤＴＢＳ基をリボヌクレオシドに導入する工程および導入されたＤＴＢＳ基をリボヌクレオシドから除去する工程を必要とするため、２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳリボヌクレオシドの合成が煩雑である。この方法はまた、ＤＴＢＳ基を導入するための試薬であるＤＴＢＳビストリフルオロメタンスルホネートが高価であるため、経済的でない。
【００１１】
Ｊｏｎｅｓらの方法では、原料として用いられるリボヌクレオシド  ３’−ホスホネート誘導体が特殊であり、その合成が煩雑であるため、結果として、２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳリボヌクレオシドの合成も煩雑である。
【００１２】
本発明の目的は、高価な保護基および特殊な原料を用いることなく、２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオシドを簡便かつ効率的に製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この目的を達成するため、鋭意検討を重ねた結果、発明者らは、２以上のリボヌクレオチドを含有するＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物をシリル化剤と反応させることにより、ＲＮＡを構成するリボヌクレオチドの２’−水酸基に選択的にシリル基が導入されたシリル化ＲＮＡが得られること、ならびに得られたシリル化ＲＮＡを加水分解反応に供することにより、２’−Ｏ−シリル化ヌクレオシドが得られることなどを見出し、本願発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕２以上のリボヌクレオチドを含有するＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物をシリル化剤と反応させて、２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドを含有するシリル化ＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物を得ることを含む、シリル化ＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物の製造方法。
〔２〕前記ＲＮＡが天然ＲＮＡである、上記〔１〕の方法。
〔３〕前記２以上のリボヌクレオチドを含有するＲＮＡが、下記式（Ｉ）：
【化１】
2011084495.tif 000002
〔式（Ｉ）中、Ｘ、Ｙは、それぞれ同一または異なって、置換されていてもよい核酸塩基を示し、
ｎは、０以上の整数を示し、
Ｗｎは、前記ｎの各整数に対応して同一または異なって、置換されていてもよい核酸塩基を示し、
Ｒ１は、水素原子、リン酸基または５’−キャッピング部分を示し、
Ｒ２は、水素原子またはリン酸基を示す。〕により表わされるＲＮＡであり、かつ
前記２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドを含有するシリル化ＲＮＡが、下記式（ＩＩ）：
【化２】
2011084495.tif 000003
〔式（ＩＩ）中、Ｘ、Ｙ、ｎ、Ｗｎは、それぞれ、前記式（Ｉ）におけるＸ、Ｙ、ｎ、Ｗｎと同義であり、
Ｒ３は、水素原子、シリル基、リン酸基、または少なくとも一つの水酸基がシリル化されていてもよい５’−キャッピング部分を示し、
Ｒ４は、水素原子、シリル基またはリン酸基を示し、
Ｒ５、Ｒ６、Ｋｎは、それぞれ同一または異なって、水素原子またはシリル基を示し、
ただし、Ｒ５、Ｒ６、Ｋｎのうちの少なくとも一つは、シリル基である。〕により表わされるシリル化ＲＮＡである、上記〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕前記ｎが０から１０，０００までの整数である、上記〔３〕の方法。
〔５〕前記塩が無機塩、有機塩または金属塩である、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕前記シリル化剤が、下記式（Ｖ）：
【化３】
2011084495.tif 000004
〔式（Ｖ）中、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２は、それぞれ同一または異なって、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ１〜Ｃ１０アリールを示し、
Ｌは、脱離基を示す。〕により表される化合物である、上記〔１〕〜〔５〕のいずれかの方法。
〔７〕前記シリル化剤がＴＢＤＭＳＣｌである、上記〔６〕の方法。
〔８〕２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドを含有するシリル化ＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物を加水分解反応により分解して、２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオシドのホスフェート誘導体もしくはその塩あるいはそれらの混合物を得ることを含む、シリル化リボヌクレオシドまたはシリル化リボヌクレオシドのホスフェート誘導体もしくはその塩あるいはそれらの混合物の製造方法。
〔９〕前記２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドを含有するシリル化ＲＮＡが、下記式（ＩＩ）：
【化４】
2011084495.tif 000005
〔式（ＩＩ）中、Ｘ、Ｙは、それぞれ同一または異なって、置換されていてもよい核酸塩基を示し、
ｎは、０以上の整数を示し、
Ｗｎは、前記ｎの各整数に対応して同一または異なって、置換されていてもよい核酸塩基を示し、
Ｒ３は、水素原子、シリル基、リン酸基、または少なくとも一つの水酸基がシリル化されていてもよい５’−キャッピング部分を示し、
Ｒ４は、水素原子、シリル基またはリン酸基を示し、
Ｒ５、Ｒ６、Ｋｎは、それぞれ同一または異なって、水素原子またはシリル基を示し、
ただし、Ｒ５、Ｒ６、Ｋｎのうちの少なくとも一つは、シリル基である。〕であり、かつ
前記シリル化ヌクレオシドまたはシリル化ヌクレオシドのホスフェート誘導体が、下記式（ＩＩＩ）：
【化５】
2011084495.tif 000006
〔式（ＩＩＩ）中、Ｑは、置換されていてもよい核酸塩基を示し、
Ｒ７、Ｒ８は、それぞれ同一または異なって、水素原子、シリル基またはリン酸基を示し、
Ｒ９は、シリル基を示す。〕である、上記〔８〕の方法。
〔１０〕前記式（ＩＩＩ）により表される化合物が、下記式（ＩＶ）：
【化６】
2011084495.tif 000007
〔式（ＩＶ）中、Ｑは、置換されていてもよい核酸塩基を示し、
Ｒ９は、シリル基を示す。〕により表されるシリル化ヌクレオシドである、シリル化ヌクレオシドの製造方法である、上記〔９〕の方法。
〔１１〕前記加水分解反応が、酵素による加水分解反応である、上記〔８〕〜〔１０〕のいずれかの方法。
〔１２〕（１）２以上のリボヌクレオチドを含有するＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物をシリル化剤と反応させて、２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドを含有するシリル化ＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物を得ること、ならびに
（２）前記シリル化ＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物を加水分解反応により分解して、シリル化リボヌクレオシドまたはシリル化リボヌクレオシドのホスフェート誘導体もしくはその塩あるいはそれらの混合物を得ることを含む、シリル化リボヌクレオシドまたはシリル化リボヌクレオシドのホスフェート誘導体もしくはその塩あるいはそれらの混合物の製造方法。
〔１３〕下記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかである、シリル化ＲＮＡまたはその塩：
（ｉ）少なくとも１個の２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドおよび少なくとも１個のリボヌクレオチドを含有するシリル化ＲＮＡ；
（ｉｉ）２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの総数が少なくとも１００個である、２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドを少なくとも含有するシリル化ＲＮＡ；
（ｉｉｉ）同種のリボヌクレオチドのみを含有し、かつ２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドを含有するシリル化ＲＮＡ；および
（ｉｖ）ＲＮＡが天然ＲＮＡである、２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドを含有するシリル化ＲＮＡ。
〔１４〕２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドを含有する複数種のシリル化ＲＮＡまたはその塩を含む組成物。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法は、例えば、ＲＮＡの化学合成に用いられるホスホロアミダイト化合物の合成原料として有用であり得るシリル化リボヌクレオシド等の製造に有用である。本発明の方法によれば、高価な保護基および特殊な合成原料を用いることなく、リボースの２’−水酸基が選択的にシリル化され得る。
本発明のシリル化ＲＮＡまたはその塩、および本発明の組成物は、例えば、本発明の製造方法における原料として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳヌクレオシド混合物の溶出ピーク（保持時間：１９．９６分）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（１．本発明の製造方法Ｉ）
本発明は、シリル化ＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物の製造方法を提供する。本発明の方法は、２以上のリボヌクレオチドを含有するＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物をシリル化剤と反応させることを含む。
【００１８】
本明細書中で用いられる場合、用語「リボヌクレオチド」とは、リボ核酸（ＲＮＡ）の構成単位であって、核酸塩基部分、リボース部分、および３’−または５’−リン酸部分から構成される単位をいう。リボヌクレオチドは、主要リボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドであり得る。一方、用語「リボヌクレオシド」とは、ＲＮＡの構成単位であって、核酸塩基部分、およびリボース部分から構成される単位をいう。リボヌクレオシドは、主要リボヌクレオシドまたは修飾リボヌクレオシドであり得る。
【００１９】
本明細書中で用いられる場合、用語「主要（ｍａｊｏｒ）リボヌクレオチド」とは、天然ＲＮＡを構成する主要なリボヌクレオチドである、アデノシン  ５’−リン酸、グアノシン  ５’−リン酸、シチジン  ５’−リン酸、またはウリジン  ５’−リン酸、アデノシン  ３’−リン酸、グアノシン  ３’−リン酸、シチジン  ３’−リン酸、またはウリジン  ３’−リン酸をいう。
【００２０】
本明細書中で用いられる場合、用語「修飾（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）リボヌクレオチド」とは、Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  Ｔｒｅａｔｙ（２００９年１月１日施行版），Ａｎｎｅｘ  Ｃ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ２，Ｔａｂｌｅ  ２：Ｌｉｓｔ  ｏｆ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓに記載される修飾ヌクレオチドのうち、２’位が水酸基である修飾ヌクレオチド（３’−または５’−リン酸部分を有するもの）をいう。本資料中に記載される修飾リボヌクレオチドは、日本特許庁により公開されている「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン（平成１４年７月）」の附属書２，表２：修飾塩基表に記載される修飾ヌクレオチドと同一である。したがって、修飾リボヌクレオチドについては、上記ガイドラインもまた参照できる。具体的には、修飾リボヌクレオチドとしては、５’位にリン酸部分が付加された、４−アセチルシチジン（ａｃ４ｃ）、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン（ｃｈｍ５ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン（ｃｍｎｍ５ｕ）、ジヒドロウリジン（ｄ）、β−Ｄ−ガラクトシルキュェオシン（ｇａｌ  ｑ）、イノシン（ｉ）、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン（ｉ６ａ）、１−メチルアデノシン（ｍｌａ）、１−メチルプソイドウリジン（ｍｌｆ）、１−メチルグアノシン（ｍｌｇ）、１−メチルイノシン（ｍｌｉ）、２，２−ジメチルグアノシン（ｍ２２ｇ）、２−メチルアデノシン（ｍ２ａ）、２−メチルグアノシン（ｍ２ｇ）、３−メチルシチジン（ｍ３ｃ）、５−メチルシチジン（ｍ５ｃ）、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６ａ）、７−メチルグアノシン（ｍ７ｇ）、５−メチルアミノメチルウリジン（ｍａｍ５ｕ）、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン（ｍａｍ５ｓ２ｕ）、β−Ｄ−マンノシルキュェオシン（ｍａｎ  ｑ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン（ｍｃｍ５ｓ２ｕ）、５−メトキシカルボニルメチルウリジン（ｍｃｍ５ｕ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５ｕ）、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン（ｍｓ２ｉ６ａ）、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシル−２−メチルチオプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン（ｍｓ２ｔ６ａ）、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）Ｎ−メチルカルバモイル）トレオニン（ｍｔ６ａ）、ウリジン−５−オキシ酢酸−メチルエステル（ｍｖ）、ウリジン−５−オキシ酢酸（ｏ５ｕ）、ワイブトキソシン（ｏｓｙｗ）、プソイドウリジン（ｐ）、キュェオシン（ｑ）、２−チオシチジン（ｓ２ｃ）、５−メチル−２−チオウリジン（ｓ２ｔ）、２−チオウリジン（ｓ２ｕ）、４−チオウリジン（ｓ４ｕ）、５−メチルウリジン（ｔ）、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン（ｔ６ａ）、ワイブトシン（ｙｗ）、および３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン［（ａｃｐ３）ｕ］が挙げられる。
【００２１】
本明細書中で用いられる場合、用語「主要（ｍａｊｏｒ）リボヌクレオシド」とは、天然ＲＮＡを構成する主要なリボヌクレオシドである、アデノシン、グアノシン、シチジン、またはウリジンをいう。
【００２２】
本明細書中で用いられる場合、用語「修飾（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）リボヌクレオシド」とは、Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  Ｔｒｅａｔｙ（２００９年１月１日施行版），Ａｎｎｅｘ  Ｃ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ２，Ｔａｂｌｅ  ２：Ｌｉｓｔ  ｏｆ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓに記載される修飾ヌクレオチドのうち、２’位が水酸基である修飾ヌクレオチド（３’−および５’−リン酸部分を有しないもの）をいう。具体的には、修飾リボヌクレオシドとしては、上述したａｃ４ｃ、ｃｈｍ５ｕ、ｃｍｎｍ５ｓ２ｕ、ｃｍｎｍ５ｕ、ｄ、ｇａｌ  ｑ、ｉ、ｉ６ａ、ｍｌａ、ｍｌｆ、ｍｌｇ、ｍｌｉ、ｍ２２ｇ、ｍ２ａ、ｍ２ｇ、ｍ３ｃ、ｍ５ｃ、ｍ６ａ、ｍ７ｇ、ｍａｍ５ｕ、ｍａｍ５ｓ２ｕ、ｍａｎ  ｑ、ｍｃｍ５ｓ２ｕ、ｍｃｍ５ｕ、ｍｏ５ｕ、ｍｓ２ｉ６ａ、ｍｓ２ｔ６ａ、ｍｔ６ａ、ｍｖ、ｏ５ｕ、ｏｓｙｗ、ｐ、ｑ、ｓ２ｃ、ｓ２ｔ、ｓ２ｕ、ｓ４ｕ、ｔ、ｔ６ａ、ｙｗ、および（ａｃｐ３）ｕが挙げられる。
【００２３】
本明細書中で用いられる場合、用語「核酸塩基」とは、リボース部分および３’−または５’−リン酸部分以外のリボヌクレオチド中の部分、あるいはリボース部分以外のリボヌクレオシド中の部分をいう。核酸塩基は、主要核酸塩基または修飾核酸塩基であり得る。
【００２４】
本明細書中で用いられる場合、用語「主要（ｍａｊｏｒ）核酸塩基」とは、天然ＲＮＡを構成する主要な核酸塩基であるアデニン、グアニン、ウラシルまたはシトシンをいう。
【００２５】
本明細書中で用いられる場合、用語「修飾（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）核酸塩基」とは、Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  Ｔｒｅａｔｙ（２００９年１月１日施行版），Ａｎｎｅｘ  Ｃ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ２，Ｔａｂｌｅ  ２：Ｌｉｓｔ  ｏｆ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓに記載される修飾ヌクレオチド中の核酸塩基部分に対応する核酸塩基をいう。具体的には、修飾核酸塩基としては、上記リボヌクレオチドまたはリボヌクレオシド中の核酸塩基部分に対応する基が挙げられる。
【００２６】
本明細書中で用いられる場合、用語「置換されていてもよい核酸塩基」とは、無置換の核酸塩基、または置換基で置換されている核酸塩基をいう。置換基としては、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、アミノ基、ハロゲン原子（例、フッ素原子、臭素原子、塩素原子、ヨウ素原子）、オキソ（＝Ｏ）、チオ（＝Ｏ）、ニトロが挙げられる。核酸塩基に結合し得る置換基の数は、１〜３個であり得るが、１または２個が好ましく、１個がより好ましい。
【００２７】
アルキル基としては、直鎖状または分枝状の炭素数１〜１０のアルキル、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどのＣ１〜Ｃ１０アルキルが挙げられるが、Ｃ１〜Ｃ６アルキルが好ましい。
【００２８】
アルケニル基としては、直鎖状または分枝状の炭素数２〜１０のアルケニル、例えば、アリル、クロチル、２−ペンテニル、３−ヘキセニルなどのＣ２〜Ｃ１０アルケニルが挙げられるが、Ｃ２〜Ｃ６アルケニルが好ましい。
【００２９】
アルキニル基としては、直鎖状または分枝状の炭素数２〜１０のアルキニル、例えば、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ペンチニル、３−ヘキシニルなどのＣ２〜Ｃ１０アルキニルが挙げられるが、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルが好ましい。
【００３０】
シクロアルキル基としては、環状の炭素数３〜１０のシクロアルキル、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルが挙げられる。
【００３１】
アリール基としては、炭素数６〜１０のアリール、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチルが挙げられる。
【００３２】
アラルキル基としては、炭素数７〜１０のアラルキル、例えば、フェニル−Ｃ１〜Ｃ４アルキル（例、ベンジル、フェネチル）が挙げられる。
【００３３】
アシル基としては、炭素数２〜１０のアシル、例えば、炭素数２〜４のアルカノイル（例、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル）、あるいは炭素数６から１０のアロイル（例、ベンゾイル、トルオイルなど）が挙げられる。
【００３４】
アミノ基としては、上記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキルおよびアシルからなる群より選ばれる置換基でモノ置換またはジ置換されていてもよいアミノ、例えば、アミノ（−ＮＨ２）、メチルアミノ、ジメチルアミノが挙げられる。
【００３５】
本発明で用いられるＲＮＡは、２以上のリボヌクレオチドを含むものであれば特に限定されない。例えば、ＲＮＡは、同一の種類のリボヌクレオチドから構成されるＲＮＡ（リボヌクレオチドのホモポリマー）であっても、異なる種類のリボヌクレオチドから構成されるＲＮＡ（リボヌクレオチドのヘテロポリマー）であってもよい。ＲＮＡはまた、天然ＲＮＡであっても、人工ＲＮＡであってもよい。また、本発明で用いられるＲＮＡは、単離または精製されたものであってもよい。
【００３６】
本明細書中で用いられる場合、用語「天然ＲＮＡ」とは、天然環境中に存在するＲＮＡをいう。天然ＲＮＡとしては、例えば、天然の供給源（例、動物、植物、昆虫、藻類、細菌、真菌）から調製され得るＲＮＡが挙げられる。天然ＲＮＡはまた、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）または非コーディングＲＮＡあるいはこれらの混合物であり得る。非コーディングＲＮＡとしては、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。また、天然ＲＮＡとしては、ＲＮＡウイルス（例、レトロウイルス）、ならびに天然の鋳型ＤＮＡの存在下で、ＲＮＡポリメラーゼを含むインビトロ転写系（無細胞系または細胞系）により転写された天然ｍＲＮＡが挙げられる。天然ＲＮＡはまた、同位体（例、放射性同位体）を含むリボヌクレオチドを含有するＲＮＡであってもよい。このような天然ＲＮＡの作製は、例えば、同位体を含むリボヌクレオチドを含有する無細胞系を用いて、ＲＮＡを合成することにより、または同位体を含むリボヌクレオチドを含有する培養系を用いて、細胞または細菌を培養し、次いで培養物からＲＮＡを調製することにより、行なうことができる。
【００３７】
本明細書中で用いられる場合、用語「人工ＲＮＡ」とは、ＲＮＡ材料から人工的に合成されるＲＮＡをいう。ＲＮＡ材料としては、例えば、リボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドのホスフェート誘導体（例、リボヌクレオシド  ５’−ホスフェートもしくはリボヌクレオシド  ３’−ホスフェートであるリボヌクレオチド、またはリボヌクレオシド  ５’−ジホスフェートもしくはリボヌクレオシド  ５’−トリホスフェート）あるいはオリゴリボヌクレオチドまたはポリリボヌクレオチドが挙げられる。人工ＲＮＡの合成に用いられるＲＮＡ材料は、人工的に合成されたものであっても、天然ＲＮＡから調製されたものであってもよい。人工ＲＮＡとしては、例えば、生化学的に合成された人工ＲＮＡ、および生物学的に合成された人工ＲＮＡが挙げられる。生化学的に合成された人工ＲＮＡとしては、例えば、ＲＮＡ材料（例、同一または異なるヌクレオチド  ５’−ジリン酸）をポリヌクレオチドホスホリラーゼの存在下で重合して得られるＲＮＡ、およびＲＮＡリガーゼの存在下でＲＮＡ材料から連結されたＲＮＡが挙げられる。生物学的に合成された人工ＲＮＡとしては、例えば、ＲＮＡベクター（例、外来遺伝子が導入されたＲＮＡウイルスベクター）、および人工の鋳型ＤＮＡの存在下で、ＲＮＡポリメラーゼを含むインビトロ転写系（無細胞系または細胞系）により転写された非天然ｍＲＮＡが挙げられる。人工ＲＮＡは、同位体（例、放射性同位体）原子を含むリボヌクレオチドを含むＲＮＡであってもよい。
【００３８】
ＲＮＡ中のリボヌクレオチドの個数は、２以上であれば特に限定されないが、例えば、５個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、５０個以上、１００個以上、２００個以上、３００個以上、５００個以上、１，０００個以上であり得る。ＲＮＡ中のリボヌクレオチドの個数はまた、特に制限されないが、例えば、１００，０００個未満、５０，０００個未満、１０，０００個未満、５，０００個未満、３，０００個未満であり得る。
【００３９】
具体的には、２以上のリボヌクレオチドを含有するＲＮＡは、上記式（Ｉ）により表される化合物であり得る。
【００４０】
式（Ｉ）中、Ｘ、Ｙは、それぞれ同一または異なって、置換されていてもよい核酸塩基を示す。置換されていてもよい核酸塩基は、上述したとおりである。Ｘ、Ｙは、好ましくは、アデニン（即ち、アデニン−９−イル）、グアニン（即ち、グアニン−９−イル）、ウラシル（即ち、ウラシル−１−イル）またはシトシン（即ち、シトシン−１−イル）であり得る。
【００４１】
式（Ｉ）中、ｎは、Ｗｎを有するヌクレオチドの個数を示す。ｎの意味をより具体的に説明すると、ｎ＝０の場合、式（Ｉ）により表わされるＲＮＡは、ジヌクレオチドである。ｎ＝８の場合、式（Ｉ）により表わされるＲＮＡは、デカヌクレオチドである。ｎは、０以上の整数である限り特に限定されないが、例えば、５個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、５０個以上、１００個以上、２００個以上、３００個以上、５００個以上、１，０００個以上であり得る。ｎはまた、特に制限されないが、例えば、１００，０００個未満、５０，０００個未満、１０，０００個未満、５，０００個未満、３，０００個未満であり得る。
【００４２】
式（Ｉ）中、Ｗｎは、前記ｎの各整数に対応して同一または異なって、置換されていてもよい核酸塩基を示す。異なるｎに対応する異なるＷｎは、それぞれ、同一の核酸塩基を示していてもよく、または異なる核酸塩基を示していてもよい。置換されていてもよい核酸塩基は、上述したとおりである。Ｗｎは、好ましくは、アデニン（即ち、アデニン−９−イル）、グアニン（即ち、グアニン−９−イル）、ウラシル（即ち、ウラシル−１−イル）またはシトシン（即ち、シトシン−１−イル）であり得る。
【００４３】
式（Ｉ）中、Ｒ１は、水素原子、リン酸基（−ＨＰＯ３）、または５’−キャッピング部分を示す。本明細書中で用いられる場合、用語「５’−キャッピング部分」とは、真核生物由来ｍＲＮＡの５’−末端に存在し得る、メチルＧＴＰが５’−５’向きに結合した構造を有する部分をいう。Ｒ１が５’−キャッピング部分を示す式（Ｉ）により表される化合物は、ｍＲＮＡに対応し得る。
【００４４】
式（Ｉ）中、Ｒ２は、水素原子またはリン酸基（−ＨＰＯ３）を示す。
【００４５】
２以上のリボヌクレオチドを含有するＲＮＡの塩は、特に限定されないが、例えば、金属塩、無機塩、有機塩が挙げられる。
【００４６】
金属塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、銀塩、銅（Ｉ）塩、水銀（Ｉ）塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、ストロンチウム塩、バリウム塩、カドミウム塩、ニッケル（ＩＩ）塩、亜鉛塩、銅（ＩＩ）塩、水銀（ＩＩ）塩、鉄（ＩＩ）塩、コバルト（ＩＩ）塩、スズ（ＩＩ）塩、鉛（ＩＩ）塩、マンガン（ＩＩ）塩、アルミニウム塩、鉄（ＩＩＩ）塩、クロム（ＩＩＩ）塩が挙げられる。
【００４７】
無機塩としては、例えば、アンモニウム塩が挙げられる。
【００４８】
有機塩としては、例えば、アルキル化されたアンモニウム塩が挙げられる。アルキル化されたアンモニウム塩としては、モノアルキルアンモニウム塩、ジアルキルアンモニウム塩、トリアルキルアンモニウム塩、テトラアルキルアンモニウム塩が挙げられる。
【００４９】
本明細書中で用いられる場合、用語「モノアルキルアンモニウム」とは、窒素原子上に、直線状、分岐状または環状の炭素数１から２０の一つのアルキル基（例、置換されていてもよい核酸塩基における置換基として上述したアルキル基を含む）が結合したアンモニウムをいう。モノアルキルアンモニウムとしては、例えば、メチルアンモニウム、エチルアンモニウム、プロピルアンモニウム、イソプロピルアンモニウム、シクロプロピルアンモニウム、ブチルアンモニウム、イソブチルアンモニウム、ｓｅｃ−ブチルアンモニウム、ｔｅｒｔ−ブチルアンモニウム、シクロブチルアンモニウム、ペンチルアンモニウム、イソペンチルアンモニウム、シクロペンチルアンモニウム、ヘキシルアンモニウム、シクロヘキシルアンモニウム、ノニルアンモニウム、デシルアンモニウム、ウンデシルアンモニウム、ドデシルアンモニウム、ラウリルアンモニウムが挙げられる。なお、モノアルキルアンモニウム塩におけるモノアルキル基は、炭素原子の総数が１から２０までの基であれば特に限定されず、例えば、環状構造を有するシクロアルキルに、直線状または分岐状のモノアルキル基が結合した構造を有するもの（例、シクロヘキシルメチル）であってもよく、また、直線状または分岐状のモノアルキル基に、環状構造を有するシクロアルキルが結合した構造を有するもの（例、メチルシクロヘキシル）であってもよい。
【００５０】
本明細書中で用いられる場合、用語「ジアルキルアンモニウム」とは、上記モノアルキルアンモニウムの窒素原子に結合した水素原子の一つが炭素数１から２０の一つのアルキル基で置換されたジアルキルアンモニウムをいう。同様に、用語「トリアルキルアンモニウム」とは、上記ジアルキルアンモニウムの窒素原子に結合した水素原子の一つが炭素数１から２０の一つのアルキル基で置換されたトリアルキルアンモニウムイオンをいう。用語「テトラアルキルアンモニウム」とは、上記トリアルキルアンモニウムの窒素原子に結合した水素原子が炭素数１から２０の一つのアルキル基で置換されたテトラアルキルアンモニウムをいう。炭素数１から２０の一つのアルキル基は、前段落でアンモニウム塩として上述したアルキル基、または置換されていてもよい核酸塩基における置換基として上述したアルキル基であり得る。
【００５１】
２以上のリボヌクレオチドを含有するＲＮＡの塩は、ＲＮＡのリン酸部分中の各陰イオン部位で陽イオン（例、金属イオン、アンモニウムイオン）と対合して塩を形成し得る。２以上のリボヌクレオチドを含有するＲＮＡの塩は、各陰イオン部位において同一または異なる陽イオンと対合し得る。
【００５２】
２以上のリボヌクレオチドを含有するＲＮＡまたはその塩は、天然の供給源から調製されたＲＮＡまたはその塩そのものであり得る。ＲＮＡの塩の別の塩への変換が所望される場合、ＲＮＡの塩は、当業者に公知の方法に従って、所望される塩を形成するように調製された陽イオン交換カラムに、それを供することにより、調製できる。また、ＲＮＡの塩は、ＲＮＡまたはその塩の水溶液に、陽イオン（例、金属イオン、アンモニウムイオン）と任意の陰イオンからなる塩を添加することにより調製できる。このような陰イオンとしては、特に限定はされないが、例えば、ハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）の陰イオン、硫酸イオン、過塩素酸イオン、ホウフッ化水素酸イオン、スルホン酸イオン（例、トシル酸イオン）、カルボン酸イオン、リン酸イオンが挙げられる。調製されたＲＮＡの塩は、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、再結晶等の方法により固体として単離することも可能である。
【００５３】
２以上のリボヌクレオチドを含有するＲＮＡまたはその塩の混合物は、ＲＮＡの鎖長、ＲＮＡの構成リボヌクレオチドの組成（即ち、核酸塩基の種類）、および塩の種類からなる群より選ばれる要素のうち、少なくとも一つの要素が異なる複数種のＲＮＡおよび／またはＲＮＡ塩を含む組成物である。具体的には、ＲＮＡまたはその塩の混合物としては、組成が異なるＲＮＡを含む混合物（例、天然由来のｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ等の複数種のＲＮＡの抽出物を用いる場合）、塩の種類が異なるＲＮＡ塩を含む混合物（例、金属塩およびアンモニウム塩の混合物）、ＲＮＡおよびＲＮＡの塩を含む混合物が挙げられる。
【００５４】
２以上のリボヌクレオチドを含有するＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物は、シリル化剤を用いてシリル化され得る。本明細書中で用いられる場合、用語「シリル化剤」とは、シリル化反応において、ＲＮＡ中のリボヌクレオチドの２’−水酸基に、シリル基を付加し得る化合物をいう。
【００５５】
このようなシリル化剤は、例えば、上記式（Ｖ）により表される化合物であり得る。したがって、このようなシリル化剤との反応により生成されるシリル化ＲＮＡは、例えば、下記式（ＶＩ）：
【化７】
2011084495.tif 000008
により表されるシリル基を有し得る。
【００５６】
式（Ｖ）および（ＶＩ）中、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ１〜Ｃ１０アリールを示す。Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ１〜Ｃ１０アリールは、上記「置換されていてもよい核酸塩基」における置換基「アルキル基」および「アリール基」と同様であり得る。シリル基の具体例としては、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、トリエチルシリル（ＴＥＳ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ／ＴＢＤＭＳ）、ｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、ジメチルイソプロピルシリル（ＩＰＤＭＳ）、ジエチルイソプロピルシリル（ＤＥＩＰＳ）、ジメチルテキシルシリル（ＴＤＳ）、トリフェニルシリル（ＴＰＳ）、ジフェニルメチルシリル（ＤＰＭＳ）、ジ（ｔ−ブチル）メチルシリル（ＤＴＢＭＳ）が挙げられる。
【００５７】
脱離基は、シリル化反応において、シリル基から脱離して、ＲＮＡ中のリボヌクレオチドの２’−水酸基に、シリル基を付加し得る基である限り特に限定されない。このような脱離基としては、例えば、ハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、トリフルオロメタンスルホキシ、１−アセチルプロペン−２−イルオキシ、トリフルオロアセトアミド、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルチオ、シアノ、イミダゾリル、アセトキシ、クロロアセトキシ、ジクロロアセトキシ、トリクロロアセトキシ、フルオロアセトキシ、ジフルオロアセトキシ、トリフルオロアセトキシ、オキサゾリジノン−３−イルなどが挙げられる。
【００５８】
２以上のリボヌクレオチドを含有するＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物のシリル化剤との反応は、例えば、以下のように行うことができる。先ず、ＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物を、非プロトン性溶媒中に、所定の濃度（例、０．０１〜１．０Ｍ）になるように溶解する。次いで、この溶液に、ヌクレオチド残基１モルあたり０．１モルから５０モルのシリル化剤を添加し、０℃から１００℃の温度で５分から９６時間反応させる。この反応において反応進行に伴い酸性物質が生成する場合は、有機アミンを添加して反応を行ってもよい。非プロトン性溶媒は、シリル化反応を阻害しないものであれば特に限定されないが、例えば、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、クロロホルム、塩化メチレン、ヘキサン、アセトニトリル、アセトン、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンが挙げられる。反応系に添加され得る有機アミンとしては、その共役酸のｐＫａ値が４から１５の間の有機アミンが好ましい。このような有機アミンとしては、例えば、イミダゾール、ピリジン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、コリジン、ルチジンが挙げられる。
【００５９】
上述したような２以上のリボヌクレオチドを含有するＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物のシリル化剤との反応により、２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドを含有するシリル化ＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物が製造される。したがって、製造されるシリル化ＲＮＡは、原料として用いられた上述のＲＮＡの１以上の特徴を有し得る。製造されるシリル化ＲＮＡはまた、本発明のシリル化ＲＮＡおよびそれを含む組成物において後述する１以上の特徴を有し得る。
【００６０】
具体的には、製造されるシリル化ＲＮＡは、上記式（ＩＩ）により表される化合物であり得る。
【００６１】
式（ＩＩ）中、Ｘ、Ｙ、ｎ、Ｗｎは、それぞれ、上記式（Ｉ）におけるＸ、Ｙ、ｎ、Ｗｎと同義である。
【００６２】
式（ＩＩ）中、Ｒ３は、水素原子、シリル基、リン酸基（−ＨＰＯ３）、または少なくとも一つの水酸基がシリル化されていてもよい５’−キャッピング部分を示す。シリル基は、上述したものと同様であり得、例えば、上記式（ＶＩ）により表されるシリル基であり得る。５’−キャッピング部分は、上記Ｒ１で上述したものと同様のもの（即ち、５’−キャッピング部分中の水酸基がシリル化されていないもの）であってもよく、または５’−キャッピング部分中の水酸基がシリル化されたものであってもよい。
【００６３】
式（ＩＩ）中、Ｒ４は、水素原子、シリル基またはリン酸基（−ＨＰＯ３）を示す。シリル基は、上述したものと同様であり得、例えば、上記式（ＶＩ）により表されるシリル基であり得る。
【００６４】
式（ＩＩ）中、Ｒ５、Ｒ６、Ｋｎは、それぞれ同一または異なって、水素原子またはシリル基を示すが、Ｒ５、Ｒ６、Ｋｎのうちの少なくとも一つは、シリル基である。シリル化反応の効率が高ければ高いほど、Ｒ５、Ｒ６、Ｋｎは、多くのシリル基を有し得る。したがって、Ｒ５、Ｒ６、Ｋｎにおけるシリル基の個数は、ＲＮＡ中のヌクレオチドの個数によっても異なるが、例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、５０個以上、１００個以上、２００個以上、３００個以上、５００個以上、１，０００個以上であり得る。Ｒ５、Ｒ６、Ｋｎにおけるシリル基の個数はまた、特に制限されないが、例えば、１００，０００個未満、５０，０００個未満、１０，０００個未満、５，０００個未満、３，０００個未満であり得る。また、Ｒ５、Ｒ６、Ｋｎについて、例えば、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上、あるいは１００％のヌクレオチドがシリル化され得る。さらに、特定の場合、Ｒ５、Ｒ６、Ｋｎについて、例えば、１００％未満、９５％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満のヌクレオチドがシリル化され得るような条件で、反応が行なわれてもよい。
【００６５】
本発明の方法により製造され得る、シリル化ＲＮＡの塩、およびシリル化ＲＮＡまたはその塩の混合物は、それぞれ、「２以上のリボヌクレオチドを含有するＲＮＡの塩」で上述した塩、および「２以上のリボヌクレオチドを含有するＲＮＡまたはその塩の混合物」で上述した混合物と同様であり得る。例えば、シリル化ＲＮＡの塩の別の塩への変換が所望される場合、シリル化ＲＮＡの塩は、所定の陽イオン交換カラムに、それを供することにより、調製できる。また、シリル化ＲＮＡの塩は、シリル化ＲＮＡまたはその塩の水溶液に、陽イオンと任意の陰イオンからなる塩を添加することにより調製できる。調製されたシリル化ＲＮＡの塩は、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、再結晶等の方法により固体として単離することも可能である。
【００６６】
また、シリル化ＲＮＡの有機塩（例、アルキルアンモニウム）が水溶性の有機溶媒に可溶である場合、有機塩を金属塩に変換することもできる。先ず、有機塩を、適切な水溶性の有機溶媒（例、アセトン、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ピリジン、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルホスホラストリアミド）に溶解して溶液を得る。次いで、この溶液中に、有機溶剤に可溶な金属塩（例、金属過塩素酸塩）またはその金属塩を含む水溶液を添加し、生じた沈殿を濾過することにより、シリル化ＲＮＡの金属塩を得ることができる。
【００６７】
（２．本発明の製造方法ＩＩ）
本発明は、シリル化ヌクレオシドまたはシリル化ヌクレオシドのホスフェート誘導体もしくはその塩あるいはそれらの混合物の製造方法を提供する。本発明の方法は、２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドを含有するシリル化ＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物を加水分解反応により分解することを含む。
【００６８】
２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドを含有するシリル化ＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物としては、上述した本発明の製造方法Ｉにより製造されたものが用いられ得る。本発明で用いられるシリル化ＲＮＡは、単離または精製されたものであってもよい。
【００６９】
したがって、シリル化ＲＮＡ中のリボヌクレオチドの個数（２’−ＯＨ−リボヌクレオチドおよび２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドの総数）は、２以上であれば特に限定されないが、例えば、５個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、５０個以上、１００個以上、２００個以上、３００個以上、５００個以上、１，０００個以上であり得る。ＲＮＡ中のリボヌクレオチドの個数はまた、特に制限されないが、例えば、１００，０００個未満、５０，０００個未満、１０，０００個未満、５，０００個未満、３，０００個未満であり得る。
【００７０】
具体的には、２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドを含有するシリル化ＲＮＡは、上記式（ＩＩ）により表される化合物であり得る。
【００７１】
加水分解反応による分解は、例えば、触媒として酸性物質またはアルカリ性物質を利用する加水分解反応、触媒として酵素を利用する加水分解反応または触媒として金属または錯体を利用する加水分解反応により行なわれ得る。加水分解反応において用いられる酸性物質としては、例えば、フッ化水素酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、亜硝酸、硫酸、亜硫酸、リン酸、亜リン酸、ジ亜リン酸、炭素数１から１０のカルボン酸、クロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ジフルオロ酢酸、トリフルオロ酢酸、安息香酸、クロロ安息香酸、ジクロロ安息香酸、トリクロロ安息香酸、ニトロ安息香酸、ジニトロ安息香酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ニトロベンゼンスルホン酸、ジニトロベンゼンスルホン酸が挙げられる。加水分解反応において用いられるアルカリ性物質としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カリウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸リチウム、炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、アンモニア、アルキルアミン、ジアルキルアミン、トリアルキルアミン、水酸化テトラアルキルアンモニウムが挙げられる。加水分解反応において用いられる酵素は、核酸分解酵素または脱リン酸化酵素であり得る。核酸分解酵素としては、例えば、ヌクレアーゼＰ１、蛇毒ホスホジエステラーゼ、マングビーンホスホジエステラーゼ、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼ、大腸菌エキソヌクレアーゼＩ、ヌクレアーゼＳ１，牛脾臓ホスホジエステラーゼミクロカッカルヌクレアーゼが挙げられる。脱リン酸化酵素としては、例えば、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ、大腸菌アルカリホスファターゼ、大腸菌酸性ホスファターゼ、コムギ胚芽ホスファターゼ、ブタ脾臓酸性ホスファターゼ、ネズミ肝臓酸性ホスファターゼ、蛇毒5’−ヌクレオチダーゼ、牛精液5’−ヌクレオチダーゼ、ラット肝臓5’−ヌクレオチダーゼ、牛腸5’−ヌクレオチダーゼ、大腸菌5’−ヌクレオチダーゼ、酵母5’−ヌクレオチダーゼが挙げられる。加水分解反応において用いられる金属または錯体としては、例えば、ランタニドまたはその錯体が挙げられる。ランタニドとしては、例えば、Ｌｎ（ＩＩＩ）、Ｃｅ（ＩＶ）、Ｅｕ（ＩＩＩ）、Ｐｒ（ＩＩＩ）、Ｎｄ（ＩＩＩ）が挙げられる。ランタニド錯体としては、例えば、含窒素有機物あるいは多糖類（例、デキストラン）または単糖類に、上記ランタニドを結合させた錯体が挙げられる（例、非特許文献３〜５を参照）。これらの触媒は単独で用いても、複数を組み合わせて用いてもよい。また、これらの触媒と同等の活性を有する物質が、組織（例、植物、藻、動物等に由来する組織）の破砕物、あるいは細胞（例、植物、藻類、動物等に由来する細胞）の培養液、または菌（例、真正細菌、古細菌）の培養液中に含まれる場合には、そのような破砕物あるいは培養液を用いてもよい。
【００７２】
加水分解反応による分解は、温度、ｐＨ、緩衝液の組成、基質濃度、触媒の濃度などの条件を、選択した触媒に応じて適切に設定することにより、行なうことができる。例えば、分解は、ｐＨ５．０から１０．０の間で室温から９０℃の温度で行うことができる。
【００７３】
加水分解反応による分解により、２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオシド、または２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオシドのホスフェート誘導体もしくはその塩、あるいはそれらの混合物が製造される。２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオシドのホスフェート誘導体としては、２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオシド  ５’−ホスフェート、および２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオシド  ３’−ホスフェートが挙げられる。
【００７４】
具体的には、製造されるシリル化ヌクレオシドまたはシリル化ヌクレオシドのホスフェート誘導体は、上記式（ＩＩＩ）により表される化合物であり得る。
【００７５】
式（ＩＩＩ）中、Ｑは、置換されていてもよい核酸塩基を示す。置換されていてもよい核酸塩基は、上述したものと同様であり得る。Ｑは、好ましくは、アデニン（即ち、アデニン−９−イル）、グアニン（即ち、グアニン−９−イル）、ウラシル（即ち、ウラシル−１−イル）またはシトシン（即ち、シトシン−１−イル）であり得る。
【００７６】
式（ＩＩＩ）中、Ｒ７、Ｒ８は、それぞれ同一または異なって、水素原子、シリル基またはリン酸基（−ＨＰＯ３）を示す。シリル基は、上述したものと同様であり得、例えば、上記式（ＶＩ）により表されるシリル基であり得る。
【００７７】
式（ＩＩＩ）中、Ｒ９は、シリル基を示す。シリル基は、上述したものと同様であり得、例えば、上記式（ＶＩ）により表されるシリル基であり得る。
【００７８】
一実施形態では、本発明の製造方法ＩＩは、シリル化リボヌクレオシドあるいはその混合物を特異的に製造する方法であり得る。この場合、上記した触媒のうち、例えば、上記の核酸分解酵素と脱リン酸化酵素の任意の組み合わせで行うことができる。また、ヌクレアーゼＰ１、蛇毒ホスホジエステラーゼおよび仔ウシ腸アルカリホスファターゼの組合せなどのように複数の核酸分解酵素と脱リン酸化酵素を混合して用いてもよい。
【００７９】
具体的には、製造されるシリル化ヌクレオシドは、上記式（ＩＶ）により表される化合物であり得る。
【００８０】
式（ＩＶ）中、Ｑは、置換されていてもよい核酸塩基を示す。置換されていてもよい核酸塩基は、上述したものと同様であり得る。Ｑは、好ましくは、アデニン（即ち、アデニン−９−イル）、グアニン（即ち、グアニン−９−イル）、ウラシル（即ち、ウラシル−１−イル）またはシトシン（即ち、シトシン−１−イル）であり得る。
【００８１】
式（ＩＶ）中、Ｒ９は、シリル基を示す。シリル基は、上述したものと同様であり得、例えば、上記式（ＩＶ）により表されるシリル基であり得る。
【００８２】
別の実施形態では、本発明の製造方法ＩＩは、シリル化リボヌクレオシドの５’−ホスフェート誘導体（即ち、シリル化リボヌクレオチド）またはその塩あるいはそれらの混合物を特異的に製造する方法であり得る。この場合、上記した触媒のうち、核酸分解の結果として５’−水酸基がリン酸化された生成物を与える反応を触媒する酵素（例、ヌクレアーゼＰ１、蛇毒ホスホジエステラーゼ、マングビーンホスホジエステラーゼ、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼ、大腸菌エキソヌクレアーゼＩ、ヌクレアーゼＳ１）を単独または任意の組合せで用いて、脱リン酸化酵素の非存在下で反応を行うことにより、シリル化リボヌクレオシドの５’−ホスフェート誘導体を特異的に製造することができる。
【００８３】
さらに別の実施形態では、本発明の製造方法ＩＩは、シリル化リボヌクレオシドの３’−ホスフェート誘導体またはその塩あるいはそれらの混合物を特異的に製造する方法であり得る。この場合、上記した触媒のうち、核酸分解の結果として３’水酸基がリン酸化された生成物を与える反応を触媒する酵素（例、ウシ脾臓ホスホジエステラーゼ、ミクロコッカルヌクレアーゼ）を単独または任意の組合せで用いて、脱リン酸化酵素の非存在下で反応を行うことにより、シリル化リボヌクレオシドの３’−ホスフェート誘導体を特異的に製造することができる。
【００８４】
加水分解反応の生成物が、混合物（例、異なる核酸塩基を有するヌクレオシドの混合物）として得られる場合、この混合物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー、再結晶、再沈殿などの当業者に公知の精製法を用いて、単一の化合物に分離または精製することができる。
【００８５】
（３．本発明の製造方法ＩＩＩ）
本発明は、下記（１）および（２）を含む、シリル化ヌクレオシドまたはシリル化ヌクレオシドのホスフェート誘導体もしくはその塩あるいはそれらの混合物の製造方法を提供する：
（１）２以上のリボヌクレオチドを含有するＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物をシリル化剤と反応させて、２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドを含有するシリル化ＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物を得ること：ならびに
（２）前記シリル化ＲＮＡまたはその塩あるいはそれらの混合物を加水分解反応により分解して、シリル化ヌクレオシドまたはシリル化ヌクレオシドのホスフェート誘導体もしくはその塩あるいはそれらの混合物を得ることを含む、シリル化ヌクレオシドまたはシリル化ヌクレオシドのホスフェート誘導体もしくはその塩あるいはそれらの混合物の製造方法。
【００８６】
本発明の製造方法ＩＩＩにおける工程（１）および（２）は、本発明の製造方法ＩおよびＩＩと同様にして行なうことができる。
【００８７】
（４．本発明のシリル化ＲＮＡおよびそれを含む組成物）
本発明は、本発明の製造方法Ｉにより製造され得るシリル化ＲＮＡまたはその塩を提供する。したがって、本発明のシリル化ＲＮＡまたはその塩は、例えば、本発明の製造方法Ｉにおいて上述した特徴を有し得る。本発明のシリル化ＲＮＡまたはその塩はまた、後述する１以上の特徴を有し得る。
【００８８】
例えば、本発明のシリル化ＲＮＡまたはその塩は、少なくとも１個の２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドおよび少なくとも１個のリボヌクレオチド（即ち、２’−ＯＨ−リボヌクレオチド）を含有していてもよい。本発明のシリル化ＲＮＡまたはその塩中の２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドの個数は、１個以上であれば特に限定されないが、例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、５０個以上、１００個以上、２００個以上、３００個以上、５００個以上、１，０００個以上であり得る。本発明のシリル化ＲＮＡまたはその塩中の２’−ＯＨ−リボヌクレオチドの個数は、１個以上であれば特に限定されないが、例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、５０個以上、１００個以上、２００個以上、３００個以上、５００個以上、１，０００個以上であり得る。
【００８９】
本発明のシリル化ＲＮＡまたはその塩はまた、ＲＮＡ成分である２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド（即ち、２’−ＯＨ−リボヌクレオチド）の総数が少なくとも１００個であってもよい。換言すれば、本発明のシリル化ＲＮＡまたはその塩は、少なくとも１００個の上記成分から構成される全長を有する。この場合、本発明のシリル化ＲＮＡまたはその塩は、２’−ＯＨ−リボヌクレオチドを含有する必要はなく、例えば、少なくとも１００個の２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドのみから構成されていてもよい。本発明のシリル化ＲＮＡまたはその塩中の２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドおよび２’−ＯＨ−リボヌクレオチドの個数はまた、２’−ＯＨ−リボヌクレオチドを含有する必要がない点を除き、本発明の製造方法Ｉ、または本発明のシリル化ＲＮＡおよびそれを含む組成物において言及した個数であってもよい。
【００９０】
本発明のシリル化ＲＮＡまたはその塩はまた、同種のリボヌクレオチドのみを含有するシリル化ＲＮＡまたはその塩であってもよい。シリル化ＲＮＡが同種のリボヌクレオチドのみを含有する場合、リボヌクレオチドは、本発明の製造方法Ｉにおいて上述した核酸塩基を有し得る。この場合、シリル化ＲＮＡ中の２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド（即ち、２’−ＯＨ−リボヌクレオチド）の個数は、本発明の製造方法Ｉ、または本発明のシリル化ＲＮＡおよびそれを含む組成物において言及した個数であってもよい。
【００９１】
本発明のシリル化ＲＮＡまたはその塩はまた、天然ＲＮＡのシリル化ＲＮＡまたはその塩であってもよい。天然ＲＮＡは、本発明の製造方法Ｉにおいて上述したとおりである。したがって、本発明のシリル化ＲＮＡまたはその塩は、天然の供給源（例、動物、植物、昆虫、藻類、細菌、真菌）に由来するｍＲＮＡまたは非コーディングＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ）またはそれらの塩であり得る。天然ＲＮＡは、特徴的な構造を有し得る。例えば、ｍＲＮＡは、５’−末端に５’−キャッピング部分、および３’−末端にポリＡテイル（例えば、少なくとも５個（例、１０個以上、１５個以上））のアデノシンを有し得る。ｔＲＮＡは、種々の特徴的なドメイン、およびＡＧＣＵ以外のヌクレオチド（例、イノシン、シュードウラシル、ジヒドロウリジン）を有し得、アミノアシル化ｔＲＮＡである場合には、３’−末端のヌクレオチドの水酸基がアミノアシル化されている。ｒＲＮＡは、原核生物・真核生物等の生物種に応じて、独特なヌクレオチド組成を有し得る。また、ｒＲＮＡおよびｔＲＮＡのサイズは、一定の範囲に制限されている。したがって、このような天然ＲＮＡから製造されたシリル化ＲＮＡも同様に、このような独特なリボヌクレオチド組成およびサイズを有し得、したがって、新規なものである。なお、ｒＲＮＡおよびｔＲＮＡは、細胞中のＲＮＡ成分のうちの大部分を占めるＲＮＡ成分であるため、天然の供給源から天然ＲＮＡを抽出して、本発明の製造方法Ｉに用いた場合、シリル化ＲＮＡとして、多量のシリル化ｒＲＮＡおよびシリル化ｔＲＮＡが製造され得る。この場合、シリル化ＲＮＡ中の２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド（即ち、２’−ＯＨ−リボヌクレオチド）の個数は、本発明の製造方法Ｉ、または本発明のシリル化ＲＮＡおよびそれを含む組成物において言及した個数であってもよい。
【００９２】
本発明はまた、本発明のシリル化ＲＮＡまたはその塩を含む組成物を提供する。本発明の組成物は、２’−Ｏ−シリル化リボヌクレオチドを含有する複数種のシリル化ＲＮＡまたはその塩を含む。したがって、本発明の組成物は、上述した１以上の特徴を有し得る、異なる種類のシリル化ＲＮＡまたはその塩を含み得る。
【００９３】
本発明の組成物はまた、複数種の天然ＲＮＡを含み得る。例えば、本発明の組成物は、複数種のｒＲＮＡ、複数種のｔＲＮＡ、複数種のｍＲＮＡ、ｒＲＮＡとｔＲＮＡとの組合せ（各ＲＮＡは、単一種のＲＮＡであってもよく、複数種のＲＮＡであってもよい。以下、同様。）、ｒＲＮＡとｍＲＮＡとの組合せ、ｔＲＮＡとｍＲＮＡとの組合せ、ｒＲＮＡとｔＲＮＡとｍＲＮＡとの組合せを含み得る。勿論、本発明の組成物は、これらの組合せに加えて、他のＲＮＡ（例、他の非コーディングＲＮＡ）をさらに含んでいてもよい。
【実施例】
【００９４】
以下に、本発明の実施例を説明する。なお、本実施例により本発明が限定されるものではない。
【００９５】
原料合成例１：ＲＮＡ塩の製造
ＲＮＡ塩の製造には、ＲＮＡ−ＦＮ（日本製紙ケミカル株式会社）を用いた。ＲＮＡ−ＦＮは、酵母から抽出したリボ核酸をさらに精製することにより得られるリボ核酸ナトリウムであり、酵母由来のｍＲＮＡおよび非コーディングＲＮＡ（例、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）を含む。ＲＮＡ−ＦＮ  ６８８ｍｇを、６５℃（内温）に加熱した蒸留水１２０ｍＬに溶かし、室温まで冷却した。別途、ジメチルジラウリルアンモニウムブロミド９２５ｍｇをメタノール３ｍＬ中に溶かしたものを、１２０ｍＬの蒸留水に溶かして、溶液を作製した。この溶液を、上記のとおり調製したＲＮＡ−ＦＮ水溶液に注いだ。生じた沈殿を吸引濾過して、８５０ｍｇのＲＮＡ−ジメチルジラウリルアンモニウム塩を得た。
【００９６】
実施例１：シリル化ＲＮＡの製造
ＲＮＡ−ジメチルジラウリルアンモニウム塩０．５ｇを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド５ｍＬに溶解し、イミダゾール３６０ｍｇ、ＴＢＤＭＳＣｌ  ３１６ｍｇを加えて、室温で５．５時間攪拌した。反応液を酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、水（２０ｍＬ）で２回洗浄した。有機層を減圧下濃縮し、残渣をメタノール（０．１５ｍＬ）に溶かし、さらに０．６Ｍ  ＮａＣｌＯ４／アセトン（１．５ｍＬ）を加えて、生じた沈殿を濾過した。沈殿を蒸留水（１０ｍＬ）に懸濁し、ジエチルエーテル（１０ｍＬ）で２回洗浄した後、水層を凍結乾燥して、シリル化ＲＮＡを得た。
【００９７】
実施例２：シリル化リボヌクレオシドの製造
実施例１で合成したシリル化ＲＮＡ（２ＯＤ２６０ｎｍ）を、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴの溶液（ｐＨ７．９）に溶解し、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（４ユニット）、蛇毒ホスホジエステラーゼＩ（１０μｇ）、ヌクレアーゼＰ１（３ユニット）を加え、３８℃で２３時間反応させた。反応後、生成物を、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣ分析は、０．０３Ｍ  酢酸アンモニウムを移動相に用いて、アセトニトリルの濃度を毎分２％ずつ増やすことにより、行なった。その結果、保持時間１９．９６分に溶出ピークが認められたことから、２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳヌクレオシド混合物が得られたことが確認された（図１）。
【図１】
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