(57)【要約】【課題】天然由来の２−フェニルエタノールを製造する新たな技術を開発する。【解決手段】２−フェニルエタノールを生成する乳酸菌を提供する。また、乳酸菌に変異を導入する変異処理工程、および変異が導入された乳酸菌の中からフェニルアラニンアナログ耐性株を選抜する選抜工程を包含している、２−フェニルエタノールを製造する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−フェニルエタノールを生成する乳酸菌を製造する方法であって、
乳酸菌に変異を導入する変異処理工程、および
変異が導入された乳酸菌の中からフェニルアラニンアナログ耐性株を選抜する選抜工程
を包含している、製造方法。
【請求項２】
上記変異処理工程が薬剤処理または紫外線処理によって行われる、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
上記変異処理工程に供される乳酸菌が、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−５〜８、ＮＩＴＥ  Ｐ−９〜１１からなる群より選択される、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法によって取得される、乳酸菌。
【請求項５】
２−フェニルエタノールを生成する、乳酸菌。
【請求項６】
乳酸菌の生菌を生存可能に含有している、２−フェニルエタノールを生成する乳酸菌を製造するための組成物。
【請求項７】
２−フェニルエタノールを生成する乳酸菌を生存可能に含有している、バラの香りを付与するための組成物。
【請求項８】
２−フェニルエタノールを生成する乳酸菌を生存可能に含有している、食品。
【請求項９】
バラの香りが付与された食品を製造する方法であって、
２−フェニルエタノールを生成する乳酸菌を、目的の食品に生存可能に含有させる工程を包含する、製造方法。
【請求項１０】
上記乳酸菌がフェニルアラニンアナログ耐性株であり、
乳酸菌に変異を導入する変異処理工程、および
変異が導入された乳酸菌の中からフェニルアラニンアナログ耐性株を選抜する選抜工程
をさらに包含する、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
２−フェニルエタノールを製造する方法であって、
乳酸菌のフェニルアラニンアナログ耐性株をフェニルアラニンアナログ含有培地中で培養する工程、および
培養上清から２−フェニルエタノールを抽出する工程
を包含している、製造方法。
【請求項１２】
乳酸菌に変異を導入する変異処理工程、および
変異が導入された乳酸菌の中からフェニルアラニンアナログ耐性株を選抜する選抜工程
をさらに包含する、請求項１１に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２−フェニルエタノールを製造するための組成物およびその利用に関するものであり、より詳細には、２−フェニルエタノールを製造するための組成物、キットおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２−フェニルエタノール（以下、２−ＰＥともいう。）はバラの香りの主成分であり、香味成分として注目されている。また、２−ＰＥは抗菌作用を有している。さらに、アルカリ性環境下で分解しにくいことから、２−ＰＥは石鹸の保存剤としても用いられている。
【０００３】
２−ＰＥはフェネチルアルコール（phenethyl alcohol）とも称され、示性式がＣ６Ｈ５ＣＨ２ＣＨ２ＯＨと表されるアルコールの一種である。天然に広く存在する無色の液体であり、バラの他に、カーネーション、ヒヤシンス、アレッポマツ、イランイラン、ゼラニウム、ネロリ、キンコウボクなどの、種々の精油に含まれる。エタノールまたはエーテルとよく混和するが、水にはわずかに溶ける（２ｍＬ／１００ｍＬ・Ｈ２Ｏ）。
【０００４】
工業的には、スチレンオキシドの接触還元法または石油化学工業の副産物として合成２−ＰＥが製造されている。合成２−ＰＥのさらなる製造方法として、ベンジルクロライドとメタノールをユウロピウム化合物の存在下に光照射して反応させる方法も開示されている（特許文献１参照）。
【０００５】
一方、例えば、バラの花弁を蒸留することによって天然の２−ＰＥを得ることができる。また、酵母による発酵によって天然の２−ＰＥを得ることができる。酵母を用いる系においてより多くの２−ＰＥを得るための技術として、アルコールの製造中に生じた蒸留残渣から２−ＰＥを抽出する方法（特許文献２参照）や、酵母が元来有している２−ＰＥ生成能を改善して２−ＰＥの生産性を向上させる技術（特許文献３〜５等参照）が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平６−８７７６９号公報（平成６年３月２９日公開）
【特許文献２】特開平１１−１５７号公報（平成１１年１月６日公開）
【特許文献３】特開平３−９８５７７号公報（平成３年４月２４日公開）
【特許文献４】特開平３−９４６７０号公報（平成３年４月１９日公開）
【特許文献５】特開平９−２２４６５０号公報（平成９年９月２日公開）
【特許文献６】特開平６−２８４８８４号公報（平成６年１０月１１日公開）
【特許文献７】特開平７−６７６６９号公報（平成７年３月１４日公開）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
バラの香りを提供する２−ＰＥは世界各国で大量に製造されており、洗剤、化粧品などに広く用いられている。しかし、合成の２−ＰＥはあくまでも化学合成品であるので、ヒトの生活環境内において利用する場合には、高度な精製が求められ、その結果、その精製が非常に繁雑になっている。また、近年、天然由来の製品に対する需要が増えており、天然香料だけでなく天然食品などへの利用の観点からも、天然由来の２−ＰＥを製造する技術の開発が望まれている。
【０００８】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、天然由来の２−ＰＥを製造する新たな技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明にかかる、２−フェニルエタノールを生成する乳酸菌を製造する方法は、乳酸菌に変異を導入する変異処理工程、および変異が導入された乳酸菌の中からフェニルアラニンアナログ耐性株を選抜する選抜工程を包含していることを特徴としている。本発明にかかる製造方法において、上記変異処理工程は薬剤処理または紫外線処理によって行われることが好ましい。
【００１０】
本発明にかかる製造方法において、上記変異処理工程に供される乳酸菌は、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−５〜８、ＮＩＴＥ  Ｐ−９〜１１からなる群より選択されることが好ましい。
【００１１】
本発明にかかる乳酸菌は、２−フェニルエタノールを生成することを特徴としている。本発明にかかる乳酸菌は、フェニルアラニンアナログ耐性株であり、任意の変異を導入した乳酸菌から選抜された変異株であることが好ましい。
【００１２】
また、本発明にかかる乳酸菌は、上記製造方法によって取得されたものであってもよい。
【００１３】
本発明にかかる第１の組成物は、２−フェニルエタノールを生成する乳酸菌を製造するために、乳酸菌の生菌を生存可能に含有していることを特徴としている。本発明にかかる第１の組成物は、キット形態であってもよく、キットの場合、乳酸菌の生菌を生存可能に備えられていればよいが、該乳酸菌を薬剤処理するための試薬がさらに備えられていることが好ましい。
【００１４】
本発明にかかる第２の組成物は、バラの香りを付与するために、２−フェニルエタノールを生成する乳酸菌を生存可能に含有していることを特徴とする。また、本発明にかかる組成物は、バラの香りが付与された組成物でもあり得、好ましくは、洗剤、化粧品または食品である。
【００１５】
本発明にかかる製造方法は、バラの香りが付与された食品を製造するために、２−フェニルエタノールを生成する乳酸菌を、目的の食品に生存可能に含有させる工程を包含することを特徴としている。本発明にかかる製造方法において、上記乳酸菌はフェニルアラニンアナログ耐性株であることが好ましく、この場合、本製造方法は、乳酸菌に変異を導入する変異処理工程、および変異が導入された乳酸菌の中からフェニルアラニンアナログ耐性株を選抜する選抜工程をさらに包含することが好ましい。
【００１６】
本発明にかかる製造方法は、２−フェニルエタノールを製造するために、乳酸菌のフェニルアラニンアナログ耐性株をフェニルアラニンアナログ含有培地中で培養する工程、および培養上清から２−フェニルエタノールを抽出する工程を包含していることを特徴としている。本発明にかかる製造方法において、上記乳酸菌のフェニルアラニンアナログ耐性株は、上述した２−フェニルエタノールを生成する乳酸菌を製造する方法によって取得されることが好ましく、この場合、乳酸菌に変異を導入する変異処理工程、および変異が導入された乳酸菌の中からフェニルアラニンアナログ耐性株を選抜する選抜工程をさらに包含することが好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、天然の２−フェニルエタノールを提供し得る。２−フェニルエタノールはバラの香りの主成分であるので、本発明は、バラの香りが付与された製品を提供し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】植物および酵母における２−フェニルエタノール生合成経路を示す図である。
【図２】２−フェニルエタノールの標品（ａ）、および乳酸菌変異株の培養上清のクロロホルム抽出物（ｂ）についての、ＧＣ−ＭＳの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
〔１：２−ＰＥを生成する乳酸菌およびその製造方法〕
本発明は、２−フェニルエタノール（以下、２−ＰＥともいう。）を生成する乳酸菌を製造する方法を提供する。本発明にかかる製造方法は、乳酸菌に変異を導入する変異処理工程、および変異が導入された乳酸菌の中からフェニルアラニンアナログ耐性株を選抜する選抜工程を包含している。
【００２０】
本発明はまた、２−ＰＥを生成する乳酸菌を提供する。本発明にかかる乳酸菌は、本発明にかかる製造方法によって製造することができる。
【００２１】
２−ＰＥは以下の構造式を有している。
【００２２】
【化１】
2011030530.tif 000002
【００２３】
植物および酵母における２−ＰＥ生合成経路を、図１に示す。植物（例えばバラ）には、フェニルアラニンからフェニルアセトアルデヒドを合成する酵素が存在し、植物における２−ＰＥへの生合成を制御している。一方、酵母に、フェニルアラニンからフェニルアセトアルデヒドを合成する酵素は存在しないが、フェニルピルビン酸からフェニルアセトアルデヒドを合成する酵素が存在することによって、酵母における２−ＰＥの生合成を制御している。
【００２４】
生合成経路が部分的に異なるとはいえ、同じ真核生物である高等植物および酵母には、２−ＰＥを生成するための同様の系が存在することが知られている。そして、この系は、上述した合成２−ＰＥの系（スチレンオキシドの還元）とは明らかに異なる。
【００２５】
原核生物を用いた２−ＰＥの製造法が特許文献６および７に開示されている。具体的には、特許文献６等記載の技術は、スチレンオキシドをスチレン資化性のコリネバクテリウム細菌と接触させて２−ＰＥに変換させるものである。しかし、この技術は、微生物による反応を用いているとはいえ、原理的には合成２−ＰＥの系に過ぎない。さらに、特許文献６および７の記載は、原核生物を用いた２−ＰＥの製造には、スチレンオキシド還元酵素の存在が非常に重要であることを強く示している。
【００２６】
これらの知見は、２−ＰＥの生合成について、植物や酵母のような真核生物の系が原核生物に存在しないことが十分に示唆されている。さらに、２−ＰＥの生合成する系が原核生物に存在するとしても、それはスチレンオキシド還元酵素の関与する系であることが、十分示唆されている。もちろん、原核生物が、植物や酵母のような真核生物と同様の生合成経路を有していないことに、何ら不思議はない。確かに、酵母における２−ＰＥの生合成に関与する、フェニルアラニンからフェニルアセトアルデヒドを合成する酵素は、これまで乳酸菌において見出されていない。また、乳酸菌が２−ＰＥを生成しないことを本発明者らはこれまでに確認している（未公開）。
【００２７】
これらの知見に基づけば、当業者が、フェニルアラニンから２−ＰＥを生成する系が原核生物において存在することを予想したり、そのような系の存在の確認を動機付けられたりすることは非常に困難である。
【００２８】
また、特許文献３等には、変異処理した酵母からｐ−フルオロフェニルアラニン（ＰＦＰ）耐性株を選抜することによって、フェニルアラニンから２−ＰＥへの生合成の効率を向上させた変異株を取得することが開示されている。しかし、この技術は、上述したように、酵母が元来有している機能を改善する技術であり、新たな機能を酵母に付与する技術ではない。
【００２９】
このように、本発明の完成を合理的に期待させる公知技術は存在しない。よって、本発明は、当業者が容易に想到し得るものではない。もちろん、乳酸菌を用いて２−ＰＥを生成し得るということ自体、当業者の予測の範囲を超えているということはいうまでもない。
【００３０】
本発明にかかる製造方法において、変異処理工程は、乳酸菌の遺伝子に対して変異を無作為に導入し得る方法であればよく、種々の公知の方法（例えば、薬剤処理（エチルメタンスルホン酸、ニトロソグアニジンなどの適用）、紫外線照射など）が利用され得る。なお、本発明では、所望の形質を有する乳酸菌を得るために、変異処理工程の後の選抜工程が必須である。選抜工程は、乳酸菌のフェニルアラニンアナログ耐性株を選抜し得る方法であればよく、種々の公知の方法（例えば、フェニルアラニンのアナログを添加した培地中にて乳酸菌を培養することなど）が利用され得る。すなわち、選抜工程は、培地中にフェニルアラニンのアナログを添加する工程であり得る。この場合、添加されるべきフェニルアラニンのアナログは、精製標品であることが好ましい。本発明に適用されるフェニルアラニンのアナログとしては、汎用されているｐ−フルオロフェニルアラニン（ＰＦＰ）が挙げられるが、これに限定されない。なお、本明細書を読んだ当業者は、本明細書の記載に基づけば、２−ＰＥを生成する乳酸菌が何ら試行錯誤することなく容易に取得し得ることを、容易に理解する。
【００３１】
また、本発明にかかる製造方法を繰り返すことによって、２−ＰＥを生成する乳酸菌の能力（２−ＰＥ生成能）を増強することができる。すなわち、取得された変異株（−ＰＥを生成する乳酸菌）に対して、さらに上記変異処理工程および上記選抜工程を行うことによって、２−ＰＥ生成能が増強された変異株を製造することができる。
【００３２】
すなわち、このようなさらなる変異株もまた本発明の範囲内であり、本発明にかかる製造方法を繰り返すこともまた、本発明の範囲内である。さらに、本発明にかかる製造方法は、乳酸菌による２−ＰＥ生成能を増強する方法でもあり得る。
【００３３】
もちろん、本明細書の記載に基づけば、当業者は、変異が導入された遺伝子を同定し得る。そのような目的の遺伝子を同定すれば、遺伝子工学的手法（組換えなどによる塩基の置換、挿入および／または付加）を用いることによって、目的遺伝子に直接的な変異導入が行われてもよい。また、従来公知の遺伝子工学的手法（例えば、アンチセンス法、センス（コサプレッション）法、ＲＮＡｉ法など）を用いて、目的遺伝子の機能を阻害してもよい。
【００３４】
上述したように、本発明における選抜工程は、フェニルアラニンアナログ耐性株を取得するために、変異処理を施された乳酸菌を、フェニルアラニンのアナログ（例えばｐ−フルオロフェニルアラニン）を含有する培地中にて培養する工程であり得る。
【００３５】
乳酸菌は、古来よりチ−ズ、ヨ−グルト、醗酵バタ−等の乳製品を始め、味噌、漬物等のわが国の伝統的醗酵食品のほか、果汁、野菜汁へ接種するなどした、多くの食品に用いられ、食品の風味、組織、栄養価の改善または保存性付与等に重要な役割を果たしている。近年、乳酸菌の生理的効果として、生きた乳酸菌の接種による腸内菌叢の改善効果または整腸作用等が明らかとなり、医薬品として乳酸菌製剤も開発されている。
【００３６】
本明細書中にて使用される場合、「乳酸菌」は、発酵によって糖類から多量の乳酸を生成する細菌が意図される。本発明に適用可能な乳酸菌は、最終的に乳酸のみを生成するものであっても、乳酸以外（例えばアルコールや酢酸など）を生成するものであってもよく、球菌であっても桿菌であってもよい。
【００３７】
本発明に適用可能な乳酸菌は、哺乳動物の乳、腸管内などから分離された、いわゆる動物乳酸菌、または食肉製品（例えばナムなどの醗酵ソーセージなど）から分離された乳酸菌であっても、穀物、野菜、果物などの植物起源、またはこれらを原材料に含む発酵食品などから分離された乳酸菌であってもよい。動物乳酸菌としては、Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus juguiri, Lactobacillus lactis, Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus salvarius var. salivarius, Lactobacillus salivarius var. salicinius, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei var. casei, Lactobacillus casei var. rhamnosus, Lactobacillus casei var. alactosus, Lactobacillus fermenti, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus brevis, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus viridescens, Streptococcus diacetilactis, Streptococcus lactis var. taette, Streptococcus thermophilus などが挙げられ、植物乳酸菌としては、Lactobacillus plantarum, Lactobacillus lactis (当研究室にて花から分離されている), Lactobacillus brevis, Leuconostoc mesenteroides, Teragenococcus halophilus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus fermentum, Pedeococcus  pentosaceus, Pedeococcus  acidilactici, Bacillus coagulans, Enterococcus mundtiiなどが挙げられる。
【００３８】
なお、上述した乳酸菌のうちの具体的な菌株としては、ラクトバシラス  プランタルム  ＳＮ１３Ｔ株（分離源：タイ国産の醗酵ソーセージのナム：豚のミンチをバナナの葉で包んで醗酵させたもの）、ラクトバシラス  プランタルム  ＳＮ２６Ｔ株（分離源：ソーセージ）、ラクトバシラス  プランタルム  ＳＮ３５Ｎ株（分離源：ナシ）、ラクトバシラス  プランタルム  ＪＣＭ１１４９株（分離源：塩漬キャベツ）、ラクトバシラス  プランタルム  ＪＣＭ８３４８株（分離源：コメ）、ラクトバシラス  プランタルム  ＩＦＯ３０７０株（ＪＣＭ １０５７株）、ラクトバシラス  カゼイＫ−１株（分離源：亀田 植物乳酸菌ヨーグルト）、ラクトバシラス  カゼイＪＣＭ  ８１３６株（分離源：不明）、ペディオコッカス  ペントサセウス（分離源：大塚 野菜の戦士）、ペディオコッカス  ＪＣＭ５８８５株（分離源：酒もろみ）、ラクトバシラス  プランタルム  ＳＮ３５Ｍ株（分離源：メロン）、ラクトコッカス  ラクティス  サブスペシース  ラクティス  ＳＮ２６Ｎ株（分離源：ナシ）、エンテロコッカス  スペシース  ＳＮ２１Ｉ株（分離源：イチジク）、エンテロコッカス  ムンヅティＳＮ２９Ｎ株（分離源：ナシ）、ラクトバシラス  ヒルガルディ  ＮＢＲＣ１５８８６（分離源：ワイン）等が挙げられる。
【００３９】
本発明者らはこれまでに、植物乳酸菌として、ラクトバシラス  プランタルム  ＳＮ１３Ｔ株、ラクトバシラス  プランタルム  ＳＮ２６Ｔ株、ラクトバシラス  プランタルム  ＳＮ３５Ｎ株、ラクトバシラス  プランタルム  ＳＮ３５Ｍ株、ラクトコッカス  ラクティス  サブスペシース  ラクティス  ＳＮ２６Ｎ株、エンテロコッカス  スペシース  ＳＮ２１Ｉ株、およびエンテロコッカス  ムンヅティ  ＳＮ２９Ｎ株などを分離している。
【００４０】
ラクトバシラス  プランタルム  ＳＮ３５Ｍ株は、本発明者らによって分離された菌株であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センター（２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）へ、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−５（受託日：２００４年７月６日、移管日：２００９年２月１６日）として寄託されており、以下の菌学的性質を有する：メロンからの分離株、グラム陽性乳酸桿菌、ホモ型醗酵、カタラーゼ陰性、芽胞形成能なし、好気条件下でも培養可、分類学上の位置はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ。
【００４１】
ラクトバシラス  プランタルム  ＳＮ３５Ｎ株は、本発明者らによって分離された菌株であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センター（２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）へ、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−６（受託日：２００４年７月６日、移管日：２００９年２月１６日）として寄託されており、以下の菌学的性質を有する：ナシからの分離株、グラム陽性乳酸桿菌、ホモ型醗酵、カタラーゼ陰性、芽胞形成能なし、好気条件下でも培養可、分類学上の位置は  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ。
【００４２】
ラクトバシラス  プランタルム  ＳＮ１３Ｔ株は、本発明者らによって分離された菌株であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センター（２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）へ、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−７（受託日：２００４年７月６日、移管日：２００９年１月２８日）として寄託されており、以下の菌学的性質を有する：タイ国産のナムというソーセージからの分離株、グラム陽性乳酸桿菌、ホモ型醗酵、カタラーゼ陰性、芽胞形成能なし、好気条件下でも培養可、分類学上の位置はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ。
【００４３】
ラクトバシラス  プランタルム  ＳＮ２６Ｔ株は、本発明者らによって分離された菌株であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センター（２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）へ、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８（受託日：２００４年７月６日、移管日：２００９年２月１６日）として寄託されており、以下の菌学的性質を有する：タイ国産のナムというソーセージからの分離株、グラム陽性乳酸桿菌、ホモ型醗酵、カタラーゼ陰性、芽胞形成能なし、好気条件下でも培養可、分類学上の位置は  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ。
【００４４】
ラクトコッカス  ラクティス  サブスペシース  ラクティス  ＳＮ２６Ｎ株は、本発明者らによって分離された菌株であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センター（２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）へ、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−９（受託日：２００４年７月６日）として寄託されており、以下の菌学的性質を有する：ナシからの分離株、グラム陽性乳酸球菌、ホモ型醗酵、カタラーゼ陰性、芽胞形成能なし、好気条件下でも培養可、分類学上の位置はＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ。
【００４５】
エンテロコッカス  ムンヅティ  ＳＮ２９Ｎ株は、本発明者らによって分離された菌株であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センター（２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）へ、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０（受託日：２００４年７月６日）として寄託されており、以下の菌学的性質を有する：ナシからの分離株、グラム陽性乳酸球菌、ホモ型醗酵、カタラーゼ陰性、芽胞形成能なし、好気条件下でも培養可、分類学上の位置はＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｎｄｔｉｉ。
【００４６】
エンテロコッカス  スペシース  ＳＮ２１Ｉ株は、本発明者らによって分離された菌株であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センター（２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）へ、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１１（受託日：２００４年７月６日）として寄託されており、以下の菌学的性質を有する：イチジクからの分離株、グラム陽性乳酸球菌、ホモ型醗酵、カタラーゼ陰性、芽胞形成能なし、好気条件下でも培養可、分類学上の位置はＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．。
【００４７】
本発明において、上述した乳酸菌が単独で用いられても２つ以上を組み合わせて用いられてもよい。
【００４８】
本発明は、乳酸菌の生菌を生存可能に含有している組成物（第１の組成物）を提供する。第1の組成物は、２−ＰＥを生成する乳酸菌を製造するための組成物である。すなわち、本発明にかかる第１の組成物を用いれば、２−ＰＥを生成する乳酸菌を製造することができる。これにより、２−ＰＥによるバラの香りが付与された製品（例えば、洗剤、化粧品、食品など）を製造することができる。
【００４９】
本発明にかかる組成物は、乳酸菌によって醗酵する醗酵原料をさらに含有していてもよい。また、本発明にかかる組成物は、酒粕もしくは焼酎蒸留残渣またはこれらの抽出物をさらに含有していてもよい。なお、酒粕もしくは焼酎蒸留残渣またはこれらの抽出物については、本明細書中において参考として援用される特許文献（特開２００６−４２７９６号公報（平成１８（２００６）年２月１６日公開））にその詳細が記載されており、当業者は容易に理解し得る。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、用語「組成物」はその含有成分を単一組成物中に含有する態様と、単一キット中に別個に備えている態様であってもよい。すなわち、本発明にかかる組成物は培地をさらに含んでいてもよいが、上記乳酸菌の生菌を生存可能に含有している組成物と醗酵原料とを別々に備えているキットの形態であってもよい。また、本発明にかかる組成物は、麹菌による米醗酵物または酒粕もしくは焼酎蒸留残渣またはこれらの抽出物をさらに含んでいてもよいが、本発明にかかる組成物と酒粕もしくは焼酎蒸留残渣またはこれらの抽出物とを別々に備えているキットの形態であってもよい。また、第１の組成物がキット形態で提供される場合、当該キットは、乳酸菌の生菌を生存可能に備えられていればよいが、該乳酸菌を薬剤処理するための試薬や、乳酸菌のフェニルアラニンアナログ耐性株を選抜するための試薬がさらに備えられていることが好ましい。
【００５１】
本発明に用いられる醗酵原料は、乳、果汁および野菜汁からなる群より選択されることが好ましい。乳としては、動物乳（例えば、牛乳、ヤギ乳、めん羊乳等）が挙げられ、特に牛乳が好ましい。乳は、未殺菌乳および殺菌乳の何れであってもよく、また、これらの乳から調製した濃縮乳もしくは練乳、これらの脱脂乳、部分脱脂乳またはこれらを乾燥して粉末にした粉乳等であってもよい。果汁としては、例えば、モモ、ナシ、リンゴ、イチゴ、ザクロ、ブドウ、マンゴー、ミカン、オレンジ、パイナップル等の汁液が挙げられるがこれらに限定されず、果物のピューレであってもよい。また、野菜汁としては、例えば、ニンジン、トマト、キャベツ等の汁液が挙げられるがこれらに限定されず、野菜のピューレであってもよい。果汁および野菜汁は、果物または野菜をミキサー等で摩砕し、必要に応じて更に搾汁することにより得られる。このような果汁および野菜汁は、適宜濃縮されてもよく、濃縮液は、そのままであっても、蒸留水等で適当な濃度に希釈して用いられてもよい。上述した乳、果汁および野菜汁は、それぞれが単独で用いられても、目的に応じて組み合わせて用いられてもよい。なお、果物または野菜のピューレは、超高圧下（例えば、１００ＭＰａ）にて酵素処理を行うことによって得られ、食物繊維を豊富に含んでいる。この酵素処理に用いられる酵素は、果物または野菜の種類に応じて適宜選択され得る。
【００５２】
本明細書中において、用語「生菌を生存可能に含有している」は、目的の菌株が死滅することなく組成物中に維持されている態様であれば特に限定されない。すなわち、上記組成物中では、目的の生菌が増殖していても休眠していてもよい。
【００５３】
一実施形態において、第１の組成物は、ラクトバシラス  プランタルム  ＳＮ１３Ｔ株を生存可能に含有しており、ラクトバシラス  プランタルム  ＳＮ１３Ｔ株によって醗酵する醗酵原料をさらに含有していることが好ましく、酒粕もしくは焼酎蒸留残渣またはこれらの抽出物をさらに含有していることが好ましい。このような形態であれば、ラクトバシラス  プランタルムＳＮ１３Ｔ株の生菌の酵素活性を高く保つことができるので、この生菌を組成物中で生存可能に含有し得る。他の実施形態において、第１の組成物は、ラクトバシラス  プランタルム  ＳＮ１３Ｔ株の生菌を、適切な賦形剤とともに含んでいる。乳酸菌の生存に影響を与えない賦形剤は当該分野において周知であり、例えば、デンプン、乾燥酵母、乳糖、白糖などが挙げられ、また、組成物を錠剤に加工するためのもの（例えば、コーンペプチド、麦芽糖など）であってもよい。このように、本発明にかかる組成物は、いわゆる「醗酵種」として用いられるべきものであることが意図される。
【００５４】
〔２：２−ＰＥを生成する乳酸菌の利用〕
本発明はまた、２−ＰＥを生成する乳酸菌を生存可能に含有している組成物（第２の組成物）を提供する。第２の組成物は、２−ＰＥを含有している製品を製造するための組成物である。すなわち、本発明にかかる第２の組成物を用いれば、２−ＰＥによるバラの香りが付与された製品（例えば、洗剤、化粧品、食品など）を製造することができる。
【００５５】
第２の組成物は、第１の組成物と同様に乳酸菌によって醗酵する醗酵原料をさらに含有していてもよい。また、本発明にかかる組成物は、酒粕もしくは焼酎蒸留残渣またはこれらの抽出物をさらに含有していてもよい。第２の組成物に適用可能な醗酵原料、酒粕および焼酎蒸留残渣については、第１の組成物と同様であればよい。また、第２の組成物もまたキット形態であってもよい。もちろん、第２の組成物もまた、第１の組成物と同様に、いわゆる「醗酵種」として用いられてもよい。
【００５６】
一実施形態において、第２の組成物は、ラクトバシラス  プランタルム  ＳＮ１３Ｔ株に由来するフェニルアラニンアナログ耐性株を生存可能に含有しており、該フェニルアラニンアナログ耐性株よって醗酵する醗酵原料をさらに含有していることが好ましく、酒粕もしくは焼酎蒸留残渣またはこれらの抽出物をさらに含有していることが好ましい。このような形態であれば、上記フェニルアラニンアナログ耐性株の生菌の酵素活性を高く保つことができるので、この生菌を組成物中で生存可能に含有し得る。他の実施形態において、第２の組成物は、ラクトバシラス  プランタルム  ＳＮ１３Ｔ株に由来するフェニルアラニンアナログ耐性株の生菌を、適切な賦形剤とともに含んでいる。上記フェニルアラニンアナログ耐性株の生存に影響を与えない賦形剤としては、第１の組成物について上述したものが採用されればよい。
【００５７】
本発明にかかる組成物を用いれば、２−ＰＥによるバラの香りが付与された製品（例えば、洗剤、化粧品、食品など）を製造することができる。
【００５８】
なお、食品の場合は、第２の組成物自体が目的の製品（食用組成物）であってもよい。本発明を用いて製造される食用組成物は、２−ＰＥによるバラの香りが付与された食用組成物（すなわち、食品、飲料など）であり、嗜好性を高め得る観点から、健康食品（機能性食品）として提供される場合に極めて有用である。本発明にかかる食用組成物の製造法は特に限定されず、調理、加工および一般に用いられている食品または飲料の製造法による製造を挙げることができ、本発明によって得られた２−ＰＥが、その食品または飲料中に含有されていればよい。すなわち、本発明は、バラの香りが付与された食品を製造する方法もまた提供する。本発明にかかる製造方法は、バラの香りが付与された食品を製造するために、２−ＰＥを生成する乳酸菌を、目的の食品に生存可能に含有させる工程を包含していればよい。このような食品としては、例えば、乳製品（例えば、ヨーグルト）、健康食品（例えば、カプセル、タブレット、粉末）、飲料（例えば、乳飲料、野菜飲料など）、ドリンク剤などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００５９】
上述した第２の組成物自体が目的の食用組成物である場合には、本発明にかかる組成物は、所望の乳酸菌および醗酵原料に加えて、ゼラチン、寒天、糖類、香料、果肉などのような、醗酵食品または醗酵飲料の製造に通常使用されている原料を添加することもできる。例えば、蔗糖、グルコース、フラクトース、パラチノース、トレハロース、等の糖類、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、還元水飴等の糖アルコール類、アスパルテーム、アセスルファムカリウム等の高甘味度甘味料、蔗糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、レシチン等の乳化剤、カラギーナン、キサンタンガム、グァーガム等の増粘剤、クエン酸、乳酸、リンゴ酸等の酸味料、レモン果汁、オレンジ果汁等の果汁類の他、ビタミン類やカルシウム、鉄、マンガン、亜鉛等のミネラル類、更には甘草、桂枝、生姜のような生薬、あるいは香草、グルタミン酸ナトリウム、クチナシ色素、シリコーン、リン酸塩等の食品添加物等を添加することが可能である。
【００６０】
本発明はさらに、２−ＰＥを製造する方法を提供する。本発明にかかる製造方法は、２−ＰＥを製造するために、乳酸菌のフェニルアラニンアナログ耐性株をフェニルアラニンアナログ含有培地中で培養する培養工程、および培養上清から２−ＰＥを抽出する抽出工程を包含していることを特徴としている。本発明にかかる製造方法において、上記乳酸菌のフェニルアラニンアナログ耐性株は、上述した２−ＰＥを生成する乳酸菌を製造する方法によって取得されることが好ましい。
【００６１】
なお、上記培養工程は、醗酵原料を上記乳酸菌のフェニルアラニンアナログ耐性株の生菌で醗酵させる醗酵工程であり得る。醗酵工程は、酸度が０．６〜１．５％の範囲内になるまで醗酵原料を醗酵させることが好ましい。醗酵は、当該分野において公知の手法を用いて行われればよい。醗酵終了後に冷却したものを醗酵飲料として用いてもよい。このような醗酵飲料は、さらに希釈または殺菌を行ってもよい。
【実施例】
【００６２】
〔１．変異体の取得〕
ラクトバシラス  プランタルム  ＳＮ１３Ｔ株を、ＭＲＳ培地（ＭＥＲＣＫ）１０ｍＬ中にて３７℃で２４時間培養した。培養液２００μＬを遠心分離して菌体を回収し、フェニルアラニンを含まない完全合成培地（以下、培地Ａ）１ｍＬを用いて菌体を洗浄した。洗浄した後、菌体を１ｍＬの培地Ａ（１％のエチルメタンスルホン酸を含む。）に懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。この培養液を遠心分離して菌体を集め、１ｍＬの培地Ａに再懸濁し、ｐ−フルオロフェニルアラニン（ＰＦＰ）を２００μｇ／ｍＬまたは３００μｇ／ｍＬ含む培地Ａに１００μＬずつ塗菌した。２００μｇ／ｍＬのＰＦＰを含む培地に塗菌した場合、３７℃で２日間培養した後に、生育するクローンを１０株取得し、それぞれをLactobacillus plantarum SN13T-200-1〜Lactobacillus plantarum SN13T-200-10と名付けた。３００μｇ／ｍＬのＰＦＰを含む培地に塗菌した場合、３７℃で６日間培養した後に、生育するクローンを５株取得し、それぞれをLactobacillus plantarum SN13T-300-1〜Lactobacillus plantarum SN13T-300-5と名付けた。
【００６３】
【表１】
2011030530.tif 000003
【００６４】
なお、得られた変異体１５株は、国立大学法人広島大学産学連携センター（広島県東広島市鏡山一丁目３番２号）の管理下にて維持されており、必要に応じて分譲することが可能である。
【００６５】
〔２．変異体における２−フェニルエタノール（２−ＰＥ）の産生〕
得られた変異体１５株を、ＭＲＳ培地１０ｍＬ中にて３７℃で２４時間培養した。新鮮なＭＲＳ培地５０ｍＬに各培養液５００μＬを播種し、３７℃で４８時間培養した。培養した後の培養液を遠心分離して菌体を除去し、培養上清を得た。得られた上清について、クロロホルム５０ｍＬを用いて抽出を行った。抽出操作を３回行った。得られたクロロホルム層を合わせ、エバポレータにより溶媒を減圧留去した。残渣を適当量のクロロホルムに溶解し、ガスクロマトグラフィー・質量分析（ＧＣ−ＭＳ）装置にて分析した。標品として２−ＰＥの分析も併せて行った。
【００６６】
その結果、３００μｇ／ｍＬのＰＦＰを含む培地より得られた変異体のうち３株（Lactobacillus plantarum SN13T-300-1、Lactobacillus plantarum SN13T-300-2、およびLactobacillus plantarum SN13T-300-4）を確認したところ、いずれも２−ＰＥを産生していた。このことは、得られた変異体１５株すべてが２−ＰＥを産生し得ることを示唆している。図２は、標品である２−ＰＥのＧＣ−ＭＳの結果、および乳酸菌変異株の培養上清のクロロホルム抽出物におけるＧＣ−ＭＳの結果を示している（それぞれ、図２（ａ）および（ｂ））。また、親株が２−ＰＥを産生していないことをＧＣ−ＭＳにて確認した（データは示さず）。
【００６７】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００６８】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明は、バラの香りが付与されることが所望される種々の製品（洗剤、食品、化粧品など）へ容易に適用し得る。
【図１】
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【図２】
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