(57)【要約】【課題】心臓疾患の新たなマーカーを提供することを課題とする。【解決手段】被験者由来の試料中のＡ）ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８および／またはＢ）ＢＮＰ−３２を測定する工程を包含する、心室または心房のいずれかへの負荷を判定または検出する方法、あるいは心不全の進行または心不全治療のレベルを判定または検出する方法によって、上記課題を解決した。本発明は、心不全、心房細動、僧房弁閉鎖不全症および大動脈弁狭窄症などを峻別することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者由来の試料中のｐｒｏ−ＢＮＰ１０８を測定する工程を包含する、
心室または心房のいずれかへの負荷を判定または検出する方法。
【請求項２】
被験者由来の試料中の
Ａ）ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８および
Ｂ）ＢＮＰ−３２
を測定する工程を包含する、
心室または心房のいずれかへの負荷を判定または検出する方法。
【請求項３】
被験者由来の試料中のｐｒｏ−ＢＮＰ１０８／総ＢＮＰを測定する工程を包含する、
心室または心房のいずれかへの負荷を判定または検出する方法。
【請求項４】
前記判定または検出は、大動脈弁狭窄症、大動脈弁閉鎖不全症、僧房弁閉鎖不全症および心房細動の病状（進行）の把握からなる群より選択される症状に向けられたものである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
被験者由来の試料中のｐｒｏ−ＢＮＰ１０８を測定する工程を包含する、
心不全の進行または心不全治療のレベルを判定または検出する方法。
【請求項６】
前記判定または検出は、心不全患者の病期や予後の推測、心不全患者のβ遮断薬・ＡＣＥ阻害薬の治療効果の判定、拡張型心筋症の病態把握や治療効果の判定、心筋梗塞および梗塞後のリモデリングの把握、肥大型心筋症のタイプ分け、右室負荷疾患での右室機能の低下を示す指標、および右室負荷疾患での増加は容量負荷を示す指標からなる群より選択される症状に向けられたものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記被験者は、心不全、心房細動、僧房弁閉鎖不全症、大動脈弁閉鎖不全症および大動脈弁狭窄症からなる群より選択される少なくとも１つの疾患の疑いを有する患者である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
心室または心房のいずれかへの負荷を判定または検出するためのマーカーとしての、ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８の使用。
【請求項９】
心室または心房のいずれかへの負荷を判定または検出するためのマーカーとしての、ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８とＢＮＰ−３２との組み合わせの使用。
【請求項１０】
前記判定または検出は、大動脈弁狭窄症、大動脈弁閉鎖不全症、僧房弁閉鎖不全症および心房細動の病状（進行）の把握からなる群より選択される症状に向けられたものである、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
心不全の進行または心不全治療のレベルを判定または検出するためのマーカーとしてのｐｒｏ−ＢＮＰ１０８の使用。
【請求項１２】
前記判定または検出は、心不全患者の病期や予後の推測、心不全患者のβ遮断薬・ＡＣＥ阻害薬の治療効果の判定、拡張型心筋症の病態把握や治療効果の判定、心筋梗塞および梗塞後のリモデリングの把握、肥大型心筋症のタイプ分け、右室負荷疾患での右室機能の低下を示す指標、および右室負荷疾患での増加は容量負荷を示す指標からなる群より選択される症状に向けられたものである、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８に特異的に結合する物質を含む、心室または心房のいずれかへの負荷を判定または検出するための診断キット。
【請求項１４】
ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８に特異的に結合する物質とＢＮＰ−３２に特異的に結合する物質を含む、心室または心房のいずれかへの負荷を判定または検出するための診断キット。
【請求項１５】
ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８に特異的に結合する物質を含む、心不全の進行または心不全治療のレベルの判定または検出するための診断キット。
【請求項１６】
前記物質は、抗体である、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心臓の医療に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）は、心臓ホルモンで、ナトリウム利尿ファミリーの一員である（非特許文献１）。ＢＮＰは、アミノ酸配列および薬理学的特性に関して心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）と著しく類似している（非特許文献２）。ＡＮＰは主として心房で産生、分泌されるが、ＢＮＰは主として心室で産生、分泌される（非特許文献３）。心室壁ストレスおよび虚血によって心室のＢＮＰ遺伝子発現が刺激され、ｐｒｏＢＮＰ１０８［１−１０８］（ｐｒｏＢＮＰ−１０８）が心臓内で産生される（非特許文献４、非特許文献５）。心室心筋細胞からｐｒｏＢＮＰ−１０８が分泌されると（非特許文献４、非特許文献５）、エンドプロテアーゼの一種でプロホルモン変換酵素のフリン（Ｆｕｒｉｎ）によってｐｒｏＢＮＰ−１０８は等モルのｐｒｏＢＮＰ［７７−１０８］（ＢＮＰ−３２）とＮ末端ｐｒｏＢＮＰ［１−７６］（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）に分解される。特に、ＢＮＰ−３２や、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰはいずれも心疾患の診断マーカーとして有用であることから、これらに対する抗体、および測定方法が開発されてきた（特許文献１、２、３）。
【０００３】
しかし、最近の研究でＢＮＰ−３２およびＮＴ−ｐｒｏＢＮＰだけでなく、ｐｒｏＢＮＰ−１０８もヒト血漿中に循環しており、心不全でｐｒｏＢＮＰ−１０８濃度も増加するという所見が得られた（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。他の研究では、現在のＢＮＰ−３２測定キットが、真のＢＮＰ−３２とｐｒｏＢＮＰ−１０８とで高い交差反応性を示すという所見が得られた（非特許文献８、非特許文献９）。
【０００４】
また、ｐｒｏＢＮＰ−１０８がＢＮＰ−３２およびＮＴ−ｐｒｏＢＮＰへの特異的変換をせずに分泌される理由は依然不明である。心不全患者の血漿中のｐｒｏＢＮＰ−１０８については、あまり研究されてこなかった。さらに、ごく最近、血漿ｐｒｏＢＮＰ−１０８はＮ末端ペプチドのＯ−グリコシル化を受けることが報告された（非特許文献１０、非特許文献１１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第２６６５８５０号公報
【特許文献２】国際公開第０２／０８３９１３号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９９／０１３３３１号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Minamino  N，Horio  H，Nishikimi  T．Chapter  165．Natriuretic  peptides  in  the  cardiovascular  system，THE  HANDBOOK  OF  BIOLOGICALLY  ACTIVE  PEPTIDES：Edited  by  Abba  J．Kastin，Academic  Press，pp，1217-1225，2006
【非特許文献２】Sudoh  T，Kangawa  K，Minamino  N，Matsuo  H．A  new  natriuretic  peptide  in  porcine  brain．Nature．1988  Mar  3；332：78-81
【非特許文献３】Nishikimi  T，Maeda  N，Matsuoka  H．  The  role  of  natriuretic  peptides  in  cardioprotection．Cardiovasc  Res．2006；69：318-28
【非特許文献４】Daniels  LB．Maisel  AS．  Natriuretic  peptides．J  Am  Coil  Cardiol．2007；50：2357-68
【非特許文献５】Weber  M，Hamm  C．Role  of  B-type  natriuretic  peptide(BNP)  and  NT-proBNP  in  clinical  routine．Heart．2006；92：843-9
【非特許文献６】Lam  CS，Burnett  JC  Jr，Costello-Boerrigter  L，Rodeheffer  RJ，Redfield  MM．Alternate  circulating  pro-B-type  natriuretic  peptide  and  B-type  natriuretic  peptide  forms  in  the  general  population．J  Am  Coil  Cardiol．2007；49：1193-202
【非特許文献７】Waldo  SW，Beede  J，Isakson  S，Villard-Saussine  S，Fareh  J，Clopton  P，Fitzgerald  RL，Maisel  AS．Pro-B-type  natriuretic  peptide  levels  in  acute  decompensated  heart  failure．J  Am  Coil  Cardiol．2008；51：1874-82
【非特許文献８】Seferian  KR，Tamm  NN，Semenov  AG，Mukbaiyamova  KS，Tolstaya  AA，Koshkina  EV，Kara  AN，Krasnoselsky  MI，Apple  FS，Esakova  TV，Filatov  VL，Katrukha  AG．The  brain  natriuretic  peptide(BNP)  precursor  is  the  major  immunoreactive  form  of  BNP  in  patients  with  heart  failure．Clin  Chem．2007；53：866-73
【非特許文献９】Shimizu  H，Masuta  K，Asada  H，Sugita  K，Sairenji  T．Characterization  of  molecular  forms  of  probrain  natriuretic  peptide  in  human  plasma．Clin  Chem  Acta．2003；334：233-9
【非特許文献１０】Liang  F，O'Rear  J，Schellenberger  U，Tai  L，Lasecki  M，Schreiner  GF，Apple  FS，Maisel  AS，Pollitt  NS，Protter  AA．Evidence  for  functional  heterogeneity  of  circulating  B-type  natriuretic  peptide．J  Am  Coil  Cardiol．2007；49：1071-8
【非特許文献１１】Schellenberger  U，O'Rear  J，Guzzetta  A，Jue  RA，Protter  AA，Pollitt  NS．The  precursor  to  B-type  natriuretic  peptide  is  an  O-linked  glycoprotein．Arch  Biochem  Biophys．2006；451：160-6
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、心臓疾患の新たなマーカーを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題は、鋭意研究の結果、ｐｒｏＢＮＰ−１０８が、予想外にも、心室または心房のいずれかへの負荷の判定または検出（たとえば、大動脈弁閉鎖不全症、大動脈弁狭窄症・閉鎖不全症、僧房弁閉鎖不全症、心房細動など）に有効であることを見出したことによって解決した。
【０００９】
より詳細には、血漿中のｐｒｏＢＮＰ−１０８対総ＢＮＰ量の比およびその心不全患者の病態生理学的状態との関係を検討することが重要であると考え、本発明者らが鋭意検討したところ、ｐｒｏＢＮＰ−１０８が予想外にも、心室または心房のいずれかへの負荷の判定または検出（たとえば、大動脈弁閉鎖不全症、大動脈弁狭窄症・閉鎖不全症、僧房弁閉鎖不全症、心房細動など）に有効であることを見出した。すなわち、本発明者らは、ＢＮＰの高分子量型および低分子量型である、ｐｒｏＢＮＰ−１０８およびＢＮＰ−３２が、対照被験者、心房細動患者、心不全患者の血漿中に存在することを見出し確認した。
【００１０】
したがって、本発明は、以下を提供する。
（１）被験者由来の試料中のｐｒｏ−ＢＮＰ１０８を測定する工程を包含する、
心室または心房のいずれかへの負荷を判定または検出する方法。
（２）被験者由来の試料中の
Ａ）ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８および
Ｂ）ＢＮＰ−３２
を測定する工程を包含する、
心室または心房のいずれかへの負荷を判定または検出する方法。
（３）被験者由来の試料中のｐｒｏ−ＢＮＰ１０８／総ＢＮＰを測定する工程を包含する、
心室または心房のいずれかへの負荷を判定または検出する方法。
（４）前記判定または検出は、大動脈弁狭窄症、大動脈弁閉鎖不全症、僧房弁閉鎖不全症および心房細動の病状（進行）の把握からなる群より選択される症状に向けられたものである、項目（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）被験者由来の試料中のｐｒｏ−ＢＮＰ１０８を測定する工程を包含する、
心不全の進行または心不全治療のレベルを判定または検出する方法。
（６）前記判定または検出は、心不全患者の病期や予後の推測、心不全患者のβ遮断薬・ＡＣＥ阻害薬の治療効果の判定、拡張型心筋症の病態把握や治療効果の判定、心筋梗塞および梗塞後のリモデリングの把握、肥大型心筋症のタイプ分け、右室負荷疾患での右室機能の低下を示す指標、および右室負荷疾患での増加は容量負荷を示す指標からなる群より選択される症状に向けられたものである、項目（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）前記被験者は、心不全、心房細動、僧房弁閉鎖不全症、大動脈弁閉鎖不全症および大動脈弁狭窄症からなる群より選択される少なくとも１つの疾患の疑いを有する患者である、項目（１）〜（６）のいずれか１項に記載の方法。
（８）心室または心房のいずれかへの負荷を判定または検出するためのマーカーとしての、ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８の使用。
（９）心室または心房のいずれかへの負荷を判定または検出するためのマーカーとしての、ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８とＢＮＰ−３２との組み合わせの使用。
（１０）前記判定または検出は、大動脈弁狭窄症、大動脈弁閉鎖不全症、僧房弁閉鎖不全症および心房細動の病状（進行）の把握からなる群より選択される症状に向けられたものである、項目（８）または（９）に記載の使用。
（１１）心不全の進行または心不全治療のレベルを判定または検出するためのマーカーとしてのｐｒｏ−ＢＮＰ１０８の使用。
（１２）前記判定または検出は、心不全患者の病期や予後の推測、心不全患者のβ遮断薬・ＡＣＥ阻害薬の治療効果の判定、拡張型心筋症の病態把握や治療効果の判定、心筋梗塞および梗塞後のリモデリングの把握、肥大型心筋症のタイプ分け、右室負荷疾患での右室機能の低下を示す指標、および右室負荷疾患での増加は容量負荷を示す指標からなる群より選択される症状に向けられたものである、項目（８）〜（１１）のいずれか１項に記載の使用。
（１３）ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８に特異的に結合する物質を含む、心室または心房のいずれかへの負荷を判定または検出するための診断キット。
（１４）ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８に特異的に結合する物質とＢＮＰ−３２に特異的に結合する物質を含む、心室または心房のいずれかへの負荷を判定または検出するための診断キット。
（１５）ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８に特異的に結合する物質を含む、心不全の進行または心不全治療のレベルの判定または検出するための診断キット。
（１６）前記物質は、抗体である、項目（１３）〜（１５）のいずれか１項に記載の診断キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、心不全患者の病期や予後の推測、心不全患者のβ遮断薬・ＡＣＥ阻害薬の治療効果の判定、拡張型心筋症の病態把握や治療効果の判定、心筋梗塞および梗塞後のリモデリングの把握、肥大型心筋症のタイプ分け、右室負荷疾患でｐｒｏＢＮＰ−１０８の比率の増加は右室機能の低下を示す指標、右室負荷疾患でｐｒｏＢＮＰ−１０８の比率の増加は容量負荷を示す指標として使用することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、正常被験者（Ａ）、心房細動患者（Ｂ）、心不全患者（Ｃ）の静脈血漿のゲルろ過ＨＰＬＣ抽出物におけるＢＮＰ分子型を示す。ｐｒｏＢＮＰ−１０８およびＢＮＰ−３２にそれぞれ一致する、ＩＲ−ｐｒｏＢＮＰ−１０８（ｐｒｏＢＮＰ−１０８およびグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ−１０８の両方を含む高分子量免疫反応性（ＩＲ−）ＢＮＰ）およびＩＲ−ＢＮＰ−３２（主としてＢＮＰ−３２からなる低分子量ＩＲ−ＢＮＰ）の２つのピークが認められた。矢印は、１：ボイド容量、２：グリコシル化ｐｒｏＢＮＰ−１０８、３：ｐｒｏＢＮＰ−１０８、４：ＢＮＰ−３２を示す。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）は画分４０に抽出された（本図には表示せず）。
【図２】図２は、正常被験者、心房細動患者（Ａｆ）、心不全患者（ＨＦ）におけるｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比を示す。データは平均±ＳＤで示す。
【図３】図３は、血漿ＩＲ−ｐｒｏＢＮＰ−１０８とＩＲ−ＢＮＰ−３２との相関を示す。単位は横軸、縦軸とも（ｐｇ／ｍＬ）。
【図４】図４は、心室負荷心不全患者（Ａ）および心房負荷心不全患者（Ｂ）の静脈血漿のゲルろ過ＨＰＬＣ抽出物におけるＢＮＰ分子型を示す。矢印は、１：ボイド容量、２：グリコシル化ｐｒｏＢＮＰ−１０８、３：ｐｒｏＢＮＰ−１０８、４：ＢＮＰ−３２を示す。
【図５】図５は、心房負荷心不全患者および心室負荷心不全患者におけるｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比を示す。データは平均±ＳＤで示す。
【図６】図６は、心臓手術を受けた心不全患者の心房組織（Ａ）と心室組織（Ｂ）のゲルろ過ＨＰＬＣ抽出物におけるＢＮＰ分子型を示す。矢印は、１：ボイド容量、２：グリコシル化ｐｒｏＢＮＰ−１０８、３：ｐｒｏＢＮＰ−１０８、４：ＢＮＰ−３２を示す。
【図７】図７は、心房組織と心室組織におけるｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比を示す。データは平均±ＳＤで示す。
【図８】図８は、心臓手術を受けた心房負荷心不全患者（Ａ、Ｂ）および心室負荷心不全患者（Ｃ、Ｄ）から得た心嚢液および血漿のゲルろ過ＨＰＬＣ抽出物におけるＢＮＰ分子型を示す。ＡとＣは血漿抽出物のデータ、ＢとＤは心嚢液のデータを示す。矢印は、１：ボイド容量、２：グリコシル化ｐｒｏＢＮＰ−１０８、３：ｐｒｏＢＮＰ−１０８、４：ＢＮＰ−３２を示す。
【図９】図９は、患者８例の心嚢液と血漿におけるｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比を示す。データは平均±ＳＤで示す。
【図１０】図１０は、心不全の状態が変動した場合の心不全患者における総ＩＲ−ＢＮＰとｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比との関係を示す。Ａ．同一患者の非代償性心不全治療前（黒丸）および治療後（白丸）の血漿ｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比と総ＢＮＰ濃度との負の相関関係。Ｂ．同一患者の心不全悪化前（黒丸）および悪化後（白丸）の血漿ｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比と総ＢＮＰ濃度との正の相関関係。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当上記分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１４】
（用語の定義）
以下、本発明において使用される代表的な用語をまとめて説明し、個々の実施形態について使用される用語についても、個々の節において適宜説明する。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、用語「脳性ナトリウム利尿ペプチド（brain  natriuretic  peptide；ＢＮＰ）」とは、心臓から分泌されるナトリウム利尿ファミリーの一員であるホルモンであり、主として心室で合成されるとされており、ヒトでは、代表的に、配列番号１をもつプレプロ体のペプチドとして生産されることが知られており、本明細書では、すべてのアイソフォーム、スプライスバリアントなどを含む用語として用いられる。該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋに、それぞれ、ＡＡＨ２５７８５、ＮＰ００２５１２として登録されている。本明細書では、免疫反応性（ＩＲ）との用語を付して用いることがあり、たとえば、用語「ＩＲ−ＢＮＰ」は、免疫反応性のＢＮＰをいう。本明細書において「免疫反応性」または「ＩＲ」とは、検出用の抗体と反応性であることをいう。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、用語「ｐｒｏＢＮＰ−１０８」は、ＢＮＰの前駆体であり、代表的には、１０８個のアミノ酸からなり（配列番号２）、心室壁ストレスおよび虚血によって心室のＢＮＰ遺伝子発現が刺激され心臓内で産生されるものである。また、グリコシル化されたｐｒｏＢＮＰ−１０８も含む。心室心筋細胞からｐｒｏＢＮＰ−１０８が分泌されるとプロテアーゼによってｐｒｏＢＮＰ−１０８は等モルのｐｒｏＢＮＰ［７７−１０８］（ＢＮＰ−３２）とＮ末端ｐｒｏＢＮＰ［１−７６］（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ−７６）に変換されることが知られており、またｐｒｏＢＮＰ−１０８もヒト血漿中に循環しており（非特許文献４および５）、心不全でｐｒｏＢＮＰ−１０８濃度も増加するということも知られている（非特許文献６、７および８）。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、用語「ＢＮＰ−３２」は、ＢＮＰのうち、ｐｒｏＢＮＰ−１０８の７７−１０８番目のアミノ酸の配列を有するペプチドをいい（配列番号３）、ヒト血漿中に循環することが知られている（非特許文献６，７，８）。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、用語「総ＢＮＰ」は、ＢＮＰ−３２ならびにその前駆体および切断生成物の全体をいい、ＢＮＰ−３２やｐｒｏ−ＢＮＰ１０８など各分子形を個々に測定してこれらを合算することのほか、たとえば、これらの共通領域（例えば、７７−１０８の領域）を認識できる抗体を使用することによって測定することができる。このような抗体は市販されており容易に入手することができる（例えば、シオノリアＢＮＰキット、塩野義製薬社製）。
【００１９】
本明細書において「ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８／総ＢＮＰ」とは、総ＢＮＰ量に対するｐｒｏ−ＢＮＰ１０８量の割合をいう。
【００２０】
本明細書において「被験者由来の試料」とは、ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８、ＢＮＰ−３２などを含むと予想される被験者からの身体の構成部分の一部をいい、たとえば、心嚢液、血液、または血液を処理したもの（たとえば、血漿、血清など）を挙げることができるがこれに限定されない。より正確な診断をするために、被験者の生体から得られる、組織、細胞、体液（例えば、脳液、リンパ液）などの種々の試料を用いることができる。
【００２１】
本明細書において「被験者」または「被験体」とは、本発明の診断が適用される生物をいい、「患者」ともいわれる。患者または被験体は好ましくは、ヒトであり得る。
【００２２】
本明細書中、「抹消血液由来試料」とは、被験者の抹消血液及びその成分に由来する試料をいい、例えば、抹消血液及び末梢血液中の血漿、血小板分画が挙げられる。末梢血液由来試料は、例えば、ＤＳＭ−ＩＶ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，ｔｈｅ  ４ｔｈ  Ｅｄ．）に従って被験者から採取することができる。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、用語「心嚢液」は、「囲心腔液」ともいい、心臓のまわりをとりかこむ袋である心嚢と心臓の間に貯留する液体をいう。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、心室または心房のいずれかへの「負荷」とは、対象（ここでは、心室または心房）に与える任意の負荷をいい、代表的には圧並びに容量（血液量）の増加などをいう。そのような負荷の原因の代表例としては、対象の障害、傷害、疾患などの他、全身での血圧上昇(末梢抵抗上昇)などを挙げることができる。
【００２５】
本明細書において「心不全」とは、当該分野において用いられる最広義で用いられ、十分量の血流を押し出す心臓機能の不全に原因する症候群をいい、心搏出量の低下とそれに伴う静脈圧の増大，またその結果として生じる種々の臨床症状が包含される。たとえば、本発明の対象となる心不全の原因としては、弁膜性心疾患、虚血性心疾患、先天性心疾患、拡張型心筋症、肥大型心筋症、心房中隔欠損症、心室中隔欠損症、症候性心疾患などを挙げることができる。本発明の対象となる弁膜性心疾患をより特定すると、大動脈弁閉鎖不全症、大動脈弁狭窄症、僧房弁閉鎖不全症、僧房弁狭窄症などを挙げることができる。心不全は、心房細動とは異なり、心搏出量の低下が原因である。すなわち、心房細動では、たとえば、孤立性心房細動などが例示されるが、心臓が一部分ずつ，協調を欠いてこまかく頻繁に収縮することから、血液循環が不可能になるものであり、心搏出量とは異なるものである。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「マーカー」は、生物の遺伝的または表現的な性質を示す特徴的な生物学的因子をいい、代表的には、遺伝子である核酸、またはＲＮＡもしくはタンパク質などの遺伝子産物でありうる。このようなマーカーは、当該分野において公知の任意の適切な生物学的アッセイによって測定することができる。そして、マーカーの存在は、ある病態あるいは状態の指標として用いることができる。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「免疫測定法」とは、抗原抗体反応などの免疫学的技術を用いる任意の測定法をいい、たとえば、ドットブロット法、ウェスタンブロット、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、特に固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ），放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、競合性蛋白結合分析法などを挙げることができる。
【００２８】
本明細書において、ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８などの「測定」は当該分野において公知の任意の方法で実施することができる。すなわち、本明細書では、公知のタンパク質の測定法で行うことができ、例えば、標的となるタンパク質（たとえば、ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８など）に対する特異的ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、ＦＩＡ、化学発光イムノアッセイ、あるいはＥＣＬＩＡ法などの免疫学的な手法を用いて測定することができる。抗体を用いたアッセイにおいては、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  １９８８；特開平１０−１６０７３５等を参照することができる。
【００２９】
本明細書において、ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８とＢＮＰ−３２との識別は、たとえば、ゲル濾過高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（たとえば、ＴＳＫゲルＧ２０００ＳＷＸＬカラム（ＴＯＳＯＨ）など）における溶出位置などを指標として用いることによって実施することができる。このようなゲル濾過技術を用いると、ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８とＢＮＰ−３２との識別を行うことができる。かかる識別は、試料をゲル濾過にかけ、ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８などの標準物質の溶出位置と比較することによって、達成することができる。条件を厳密に設定することによってグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ−１０８および非グリコシル化（たとえば、組換え型）のｐｒｏＢＮＰ−１０８などの識別も行うことができる。ただし、本発明の目的では、グリコシル化ｐｒｏＢＮＰ−１０８および非グリコシル化（たとえば、組換え型）のｐｒｏＢＮＰ−１０８を区別することは必ずしも必要ではない。
【００３０】
本発明の診断方法においては、好ましくは、上記アッセイにおいて、ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８の測定を行う場合、ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８の特異的アミノ酸配列を認識し結合するが、ＢＮＰ−３２には結合しない抗体（たとえば、ＢＩＯ−ＲＡＤ社、フェニックス社、Ｈｙｔｅｓｔ社などから入手可能である）が用いられる。本発明で用いられる抗体は、上記タンパク質を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明の抗体は、標的となるタンパク質を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
【００３１】
モノクローナル抗体産生細胞の作製するために、本発明の対象となるタンパク質等を、動物に対する投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与して、抗体を生産することができる。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどの哺乳動物が挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質等と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。
【００３２】
抗原を免疫された動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０など）と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。融合操作は既知の方法、例えば、ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：  ４９５（１９７５））に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
【００３３】
ポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（本発明のタンパク質等の抗原）とキャリアーとの複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のレセプタータンパク質等に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
【００３４】
（判定、検出および診断方法）
１つの局面において、本発明は、心室または心房のいずれかへの負荷を判定または検出する方法を提供する。この方法は、被験者由来の試料中のＡ）ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８（配列番号２）および／またはＢ）ＢＮＰ−３２（配列番号３）を測定する工程を包含する。心室または心房のいずれかへの負荷を判定することによって、心臓の状況を判定することができ、心不全等の症状をより精密に判定することができる。これらの用途として、たとえば、大動脈弁狭窄症、大動脈弁閉鎖不全症、僧房弁閉鎖不全症、心房細動の病状（進行）の把握をあげることができる。
【００３５】
１つの実施形態では、これらの測定は、被験者由来の試料中のｐｒｏ−ＢＮＰ１０８／総ＢＮＰを測定するものであってもよい。ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８／総ＢＮＰの比は、生体内のＢＮＰの分子形（例えば、プレプロ体、プロ体であるｐｒｏＢＮＰ−１０８、成熟体であるＢＮＰ−３２）をそれぞれ測定して合算して、ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８をこの合算値で割るか、あるいは、これらの共通領域（例えば、７７−１０８の領域）を認識できるモノクローナル抗体などを用いた測定値を総ＢＮＰと代用することができ、これらを用いて測定することができる。
【００３６】
１つの実施形態では、本発明の方法は、被験者由来の試料中のｐｒｏ−ＢＮＰ１０８を測定する工程を包含する。本発明では、被験者由来の試料中のｐｒｏ−ＢＮＰ１０８自体の数値も、心室および心房への負荷の状況を反映していることが明らかになったことから、この数値を単独で使用することができる。
【００３７】
１つの局面では、本発明は、心不全の進行または心不全治療のレベルを判定または検出する方法を提供する。この方法は、被験者由来の試料中のｐｒｏ−ＢＮＰ１０８を測定する工程を包含する。あるいは、ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８／総ＢＮＰの比を測定してもよい。
【００３８】
本発明を利用して、心房細動と心不全とを識別することができ、このほか肥大型心筋症、大動脈弁狭窄症、大動脈弁閉鎖不全症、僧房弁狭窄症、僧房弁閉鎖不全症、などの病態を識別することができる。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「心不全の進行」とは、心不全の状態、段階あるいはその段階の移行をいう。心不全の進行は、以下の基準で分類することができる：易疲労感や息切れなどの症状（NYHA心機能分類）、胸部X線上での心拡大と肺のうっ血の程度、心エコーでの左室腔の拡大、心機能、下大静脈径、ドプラー指標など。そして、心不全の進行と、ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８とは、以下の相関関係があることがわかった心不全が進行すればｐｒｏＢＮＰ−１０８は増加し、同時にｐｒｏ−ＢＮＰ１０８／総ＢＮＰの比も上昇する。
【００４０】
すなわち、易疲労感や息切れなどの症状（ＮＹＨＡ心機能分類）、胸部Ｘ線上での心拡大と肺のうっ血の程度、心エコーでの左室腔の拡大、心機能、下大静脈径、ドプラー指標などが悪化するときにｐｒｏＢＮＰ−１０８は上昇し、ｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰの比も上昇する。したがって、ｐｒｏ−ＢＮＰのレベルがわかると、以下のような対応で、心不全の進行を判定することができる。ｐｒｏＢＮＰ−１０８のレベルの上昇がきっかけとなり、症状の増悪や、胸部Ｘ線上での心拡大と肺のうっ血の程度の悪化や、心エコーでの左室腔の拡大、心機能、下大静脈径、ドプラー指標などの悪化の推定が可能となるので、現在のＢＮＰの測定値のみで行っている診断よりも診断能が改善することである。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「心不全治療のレベル」とは、心不全治療がどの程度心不全を改善したかを示すレベルをいい、使用した治療の評価あるいはその後の治療の決定などにおいて利用することができる。心不全治療のレベルは、心不全の進行またはレベルによって決定することができ、たとえば、進行をとめること、改善することなどであり得る。また、症状（ＮＹＨＡ心機能分類）、胸部X線上での心拡大と肺のうっ血の程度、心エコーでの左室腔の拡大、心機能、下大静脈径、ドプラー指標などによって判断される。ｐｒｏＢＮＰ−１０８のレベルはこれらの心不全治療のレベルに先立って変化する生化学マーカーであるので、現在のＢＮＰの単独の測定値よりも診断能が改善することが考えられる。本発明を利用して、心不全患者の病期や予後の推測、心不全患者のβ遮断薬・ＡＣＥ阻害薬の治療効果の判定、拡張型心筋症の病態把握や治療効果の判定、心筋梗塞および梗塞後のリモデリングの把握、肥大型心筋症のタイプ分け、右室負荷疾患でｐｒｏＢＮＰ−１０８の増加は右室機能の低下を示す指標などとして用いることができる。また、右室負荷疾患として、ｐｒｏＢＮＰ−１０８、ｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比の増加は圧負荷を示す指標として用いることができる。
【００４２】
本明細書において判定することができる治療としては、たとえば、薬物による治療のほか、手術による治療などを挙げることができる。薬物治療としては、たとえば、ＡＣＥによる治療などをあげることができる。手術による治療としては、大動脈弁置換術（ＡＶＲ）、僧房弁置換術（ＭＶＲ）、２弁置換術（ＤＶＲ）、冠動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ）、ｍａｚｅ術、Ｄｏｒ術などを挙げることができる。
【００４３】
本明細書において用いる場合、「心房負荷」とは、心房に負荷がかかることをいう。
【００４４】
本明細書において用いる場合、「心室負荷」とは、心室に負荷がかかることをいう。
【００４５】
心不全は、心房および心室のいずれかまたは両方に負荷がかかって発症することが知られており、そのタイプによって、その後の治療等の方針を変更すべきであることが知られている。
【００４６】
本明細書において「心房負荷心不全」は、主に心房に負荷がかかるタイプの心不全をいう。心房負荷心不全としては、たとえば、僧房弁狭窄症、僧房弁閉鎖不全症、心房中隔欠損症などを挙げることができる。心房負荷心不全の場合は、心房負荷を軽減する医薬を投与することが好ましく、そのような医薬としては、利尿薬、血管拡張薬、ｈＡＮＰ（カルペリチド）などが挙げられる。
【００４７】
本明細書において「心室負荷心不全」は、主に心室に負荷がかかるタイプの心不全をいう。心室負荷心不全としては、たとえば、大動脈弁閉鎖不全症、大動脈弁狭窄症などを挙げることができる。心室負荷心不全の場合は、心室に主に作用する医薬を投与することあるいは治療術を施すことが好ましく、そのような医薬としては、ＡＣＥ阻害薬、アンジオテンシン受容体拮抗薬、β遮断薬、アルドステロン拮抗薬などが挙げられ、また、大動脈弁置換術の治療時期決定に使用されうる。
【００４８】
ｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰの比は、一般に心房負荷の場合は心室負荷の場合に比較して、その値は小さくなる。
【００４９】
例えば、心不全患者の血漿を用いてゲルろ過ＨＰＬＣによる画分から判定した場合、心室負荷の場合は、ｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰの比は、約０．３〜０．９にあり、好ましくは、約０．４〜０．８の間にある。心房負荷の場合は、約０．１〜０．５の間にあり、好ましくは、約０．２〜０．４の間にあり得る。これらの値は、具体的な症状の変化によって、分散する傾向があり得る。たとえば、僧房弁狭窄症患者では、約０．１５±０．０３等の数値をとる。
【００５０】
また、心嚢液を用いて測定した場合は、血漿よりもその値が大きくなる傾向がある。例えば、０．７〜０．９の値をとる。
【００５１】
また、判定は、ｐｒｏＢＮＰ−１０８の量または濃度を指標としても行うことができる。濃度で測定した場合、心室負荷心不全の場合は、ｐｒｏＢＮＰ−１０８のレベルは、０〜２０００ｐｇ／ｍＬ、好ましくは、５０〜１００ｐｇ／ｍＬ等であり得る。心房負荷心不全の場合は、０〜４００ｐｇ／ｍＬであり得る。
【００５２】
本発明は、心不全の治療の指標にも用いることができる。たとえば、非代償性心不全では、ＢＮＰ−３２およびｐｒｏＢＮＰ−１０８の両方が増加することが判明した。また、心不全が悪化すると、これらの値およびｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰが上昇することが判明した。他方、治療によって改善した患者では、ＢＮＰ−３２およびｐｒｏＢＮＰ−１０８の両方の値が減少し、かつ、ｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰが減少することも明らかになった。これらの値は、自然治癒の患者でも、同様に低下していた。したがって、ＢＮＰ−３２およびｐｒｏＢＮＰ−１０８、ならびにｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰは、いずれも、心不全のレベル、治療のレベルまたは治癒のレベルを判定するために利用することができる。
【００５３】
１つの実施形態では、本発明において、試料としては、心嚢液、血液またはその処理物（たとえば、血漿）などを用いることができるがこれに限定されない。選択した試料により、判定基準が変動することが理解される。そのような判定基準は、本明細書に記載された内容に基づいて、当業者が適宜選択し決定することができる。
【００５４】
このような試料は、心不全、心房細動、僧房弁閉鎖不全症および大動脈弁狭窄症からなる群より選択される少なくとも１つの疾患の疑いを有する患者からのものでありうる。
【００５５】
本発明に係る方法の全ての実施形態において、さらに、当該分野において使用される他のマーカーもまた使用することができる。本発明のマーカーと他のマーカーとの組合せによって、１つの診断工程において同定しようとする疾患の種類が広範囲となる点で有利である。
【００５６】
別の局面において、本発明は、被験者由来の試料中のｐｒｏ−ＢＮＰ１０８を測定する工程を包含する、心不全を診断する方法を提供する。このような診断は、上述のように、心房または心室への負荷を判断することによって、医学的知識を加味して病態を診断することができる。そのような医学的知識としては、以下を参照することができる：Braunwald's  Heart  Disease，A  Textbook  of  Cardiovascular  Medicine，Saunders；7  edition  2004。
【００５７】
本明細書において「診断」とは、被検体における疾患、障害、状態などに関連する種々のパラメータを同定し、そのような疾患、障害、状態の現状または未来を判定することをいう。本発明の方法、装置、システムを用いることによって、体内の状態を調べることができ、そのような情報を用いて、被検体における疾患、障害、状態、投与すべき処置または予防のための処方物または方法などの種々のパラメータを選定することができる。本明細書において、狭義には、「診断」は、現状を診断することをいうが、広義には「事前診断」を含む。
【００５８】
本発明の診断方法は、原則として、身体から出たものを利用することができることから、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることから、産業上有用である。本明細書において、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることを明確にするために、特に「診断を支援」すると称することがある。
【００５９】
本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消退させることをいう。
【００６０】
本発明の診断方法においては、マーカーとして、本発明の標的のタンパク質のうちの少なくとも１種の濃度を測定する。そして、その測定値を健常値と比較することにより、標的の疾患等の診断を行う。ここで、「診断」とは、標的の疾患等に罹患しているか否かを判定することのみではなく、標的の疾患等の予防を目的として標的の疾患等に罹患するおそれの有無を判定することや、標的の疾患等の改善状態や再発のモニタリングを行うことも含む。
【００６１】
本発明の疾病の診断方法の好ましい実施形態においては、マーカーに対する親和性を有する物質を固定化した担体を使用する。そして、該担体に体液または体液成分を接触させて、体液または体液成分に含まれるマーカーを、マーカーに対する親和性を有する物質を介して担体上に捕捉し、捕捉されたマーカーの量に基づいて体液中のマーカーの濃度を算出する。本発明の疾病の診断方法によれば、担体上に捕捉されたマーカーを測定対象とするので、測定試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカーの濃度を測定することができる。なお、体液成分の例としては、体液が血液である場合の血清または血漿が挙げられる。
【００６２】
本発明の疾病の診断方法の好ましい実施形態では、平面部分を有する担体を用い、マーカーに対する親和性を有する物質は該平面部分の一部に固定化されている。かかる構成により、マーカーに対する親和性を有する物質を、担体上の複数箇所にスポット的に固定化することができる。その結果、１個の担体で複数の測定試料を同時処理することや、１個の担体で複数のマーカーの濃度を同時測定することが可能となり、作業効率がよい。さらに、各スポットの面積を小さくすることにより、微量の測定試料からでもマーカーの濃度を測定することができる。なお、平面部分を有する担体の例としては、チップ等の基板が挙げられる。
【００６３】
本発明の疾病の診断方法の好ましい実施形態においては、マーカーに対する親和性を有する物質としてイオン交換体、金属キレート体または抗体を用い、イオン交換体、金属キレート体または抗体を介して測定試料中のマーカーを担体上に捕捉する。当該物質がイオン交換体または金属キレート体の場合は各種のものが入手容易であり、マーカーを捕捉するための担体を容易に調製することができる。また、当該物質が抗体の場合は、より特異的にマーカーを捕捉することができる。捕捉されたマーカーの量を測定する方法としては、質量分析、イムノアッセイ（抗体の場合）が挙げられる。
【００６４】
また、本発明に係る方法により、鑑別診断を行うことができる。鑑別診断の目的は、類似の症候、又は場合によっては同一の症候を示す疾患群の中の１以上の特定の疾患を区別し同定することである。驚くべきことに、本発明に係る方法によって、非常に類似した症候を示すことが多い大動脈弁狭窄症・閉鎖不全症、僧房弁閉鎖不全症、心房細動などの区別又は同定が可能となる。
【００６５】
（マーカーとしての使用）
１つの局面において、本発明は、心室または心房のいずれかへの負荷を検出するためのマーカーとしての、ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８の使用を提供する。従来、ＢＮＰ−32を心不全などのマーカーとして使用することは公知でしたが、ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８自体を測定することは行われておらず、本発明において初めてこのようなマーカーとしての使用ができることが示された。マーカーとしての使用のより詳細な実施形態は、（判定、検出および診断方法）の節において記載された事項を参酌して実施することができる。例えば、総ＢＮＰの測定は、実際にはＢＮＰ−３２を認識する抗体などを用いて行うことができる。ＢＮＰ−３２の領域はｐｒｏ体を含む全ての分子が共通して有していることから、この部分を認識することができる抗体を使うことにより、測定することができる。
【００６６】
別の局面において、本発明は、心室または心房のいずれかへの負荷を検出するためのマーカーとしての、ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８とＢＮＰ−３２との組み合わせの使用を提供する。このような組み合わせを使用することによって、心室または心房のいずれかへの負荷を検出することができ、大動脈弁狭窄症・閉鎖不全症の病状（進行）の把握、僧房弁閉鎖不全症の病状（進行）の把握、心房細動の病状（進行）の把握をすることができる。また、マーカーとしての使用のより詳細な実施形態は、（判定、検出および診断方法）の節において記載された事項を参酌して実施することができる。
【００６７】
別の局面において、本発明は、心不全の進行または心不全治療のレベルを検出するためのマーカーとしてのｐｒｏ−ＢＮＰ１０８の使用を提供する。この場合においても、同様に、ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８の目的として、心不全患者の病期や予後の推測、心不全患者のβ遮断薬・ACE阻害薬の治療効果の判定、拡張型心筋症の病態把握や治療効果の判定、心筋梗塞および梗塞後のリモデリングの把握、肥大型心筋症のタイプ分けを行うことができ、右室負荷疾患でｐｒｏＢＮＰ−１０８の増加は右室機能の低下を示す指標、右室負荷疾患でｐｒｏＢＮＰ−１０８の増加は容量負荷を示す指標として用いることができる。また、マーカーとしての使用のより詳細な実施形態は、（判定、検出および診断方法）の節において記載された事項を参酌して実施することができる。
【００６８】
（診断薬、治療キット、治療システム）
１つの局面において、本発明は、ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８に特異的に結合する物質を含む、心室または心房のいずれかへの負荷を検出するための診断キットを提供する。
【００６９】
別の局面において、本発明は、ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８に特異的に結合する物質とＢＮＰ−３２に特異的に結合する物質を含む、心室または心房のいずれかへの負荷を検出するための診断キットを提供する。診断キットのより詳細な実施形態は、（判定、検出および診断方法）の節において記載された事項を参酌して実施することができる。
【００７０】
別の局面において、本発明は、ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８に特異的に結合する物質を含む、心不全の進行または心不全治療のレベルの検出するための診断キットを提供する。この診断キットのより詳細な実施形態は、（判定、検出および診断方法）の節において記載された事項を参酌して実施することができる。
【００７１】
本明細書において「ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８に特異的に結合する物質」は、ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８を測定することができるものであれば、どのような物質でもよい。たとえば、ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８に特異的に結合する抗体などを挙げることができるがそれに限定されない。特異的に結合する抗体などについて、より詳細な実施形態は、（判定、検出および診断方法）の節において記載された事項を参酌して実施することができる。特異的な物質であれば、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。
【００７２】
本明細書において「ＢＮＰ−３２に特異的に結合する物質」は、ＢＮＰ−３２を測定することができるものであれば、どのような物質でもよい。たとえば、ＢＮＰ−３２に特異的に結合する抗体などを挙げることができるがそれに限定されない。この特異的に結合する抗体などについて、より詳細な実施形態は、（判定、検出および診断方法）の節において記載された事項を参酌して実施することができる。
【００７３】
本明細書において「特異的」とは、特定の生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満の）ポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、結合アッセイなどによって測定することができる。
【００７４】
本明細書中で使用される用語「結合」は、２つのタンパク質もしくは化合物または関連するタンパク質もしくは化合物の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。
【００７５】
別の局面において、本発明は、ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８をＢＮＰ−３２から識別するための手段を備える、心室または心房のいずれかへの負荷を検出するため、または心不全の進行または心不全治療のレベルの検出するための診断システムを提供する。この診断システムのより詳細な実施形態は、（判定、検出および診断方法）の節において記載された事項を参酌して実施することができる。
【００７６】
１つの実施形態において、「ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８をＢＮＰ−３２から識別するための手段」は、ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８をＢＮＰ−３２から識別するための手段であれば、どのようなものを使用してもよい。そのような手段としては、抗体またはその組み合わせ、あるいは、ゲル濾過ＨＰＬＣなどを挙げることができる。ゲル濾過についても、より詳細な実施形態は、（判定、検出および診断方法）の節において記載された事項を参酌して実施することができる。
【００７７】
別の実施形態では、この診断キットは、必要に応じて、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用試薬、ウェスタンブロッティング用ＰＶＤＦ膜、タンパク質等を含むことができる。診断キットがＥＩＡなどの手法に用いられる場合には、前記抗体は、予め固相担体に結合させておくことができる。固相には、一般に、反応容器、ビーズ（好ましくは磁気ビーズ）等が用いられる。
【００７８】
本明細書において、「システム」とは、診断するための任意の系をいい、一般に、１または複数の構成要素からなり、複数の構成要素がある場合それらの要素は互いに作用・関連し合っており、全体として調和のとれた挙動・機能を示すという３条件を満足する系をいう。システムは、装置、組成物、診断薬など任意の形態であり得る。従って、システムは、例えば、測定装置を備える大掛かりなシステムから、クロマトグラフィーを備えるシステム、免疫反応を利用したキット、抗体を含む組成物（すなわち、マーカー物質のモノクローナル抗体を含む、体外医薬品である診断薬）などを包含することが理解される。
【００７９】
本明細書において「標識」とは、目的となる分子または物質を他から識別するための存在（たとえば、物質、エネルギー、電磁波など）をいう。そのような標識方法としては、ＲＩ（ラジオアイソトープ）法、蛍光法、ビオチン法、化学発光法等を挙げることができる。上記の核酸断片および相補性を示すオリゴヌクレオチドを何れも蛍光法によって標識する場合には、蛍光発光極大波長が互いに異なる蛍光物質によって標識を行う。蛍光発光極大波長の差は、１０ｎｍ以上であることが好ましい。蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）等を使用することが好ましい。蛍光発光極大波長の差が１０ｎｍ以上である蛍光物質としては、例えば、Ｃｙ５とローダミン６Ｇ試薬との組み合わせ、Ｃｙ３とフルオレセインとの組み合わせ、ローダミン６Ｇ試薬とフルオレセインとの組み合わせ等を挙げることができる。本発明では、このような標識を利用して、使用される検出手段に検出され得るように目的とする対象を改変することができる。そのような改変は、当該分野において公知であり、当業者は標識におよび目的とする対象に応じて適宜そのような方法を実施することができる。
【００８０】
本発明の好ましい実施形態において、使用される手段は、質量分析装置、核磁気共鳴測定装置、Ｘ線解析装置、ＳＰＲ、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー）、免疫学的手段（例えば、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ）、生化学的手段（例えば、ｐＩ電気泳動、サザンブロッティング、二次元電気泳動）、電気泳動機器、化学的分析機器、蛍光二次元ディファレンシャル電気泳動法（２ＤＥ−ＤＩＧＥ）、同位体標識法（ＩＣＡＴ）、タンデムアフィニティ精製法（ＴＡＰ法）、物理学的手段、レーザーマイクロダイセクションおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００８１】
本発明の好ましい実施形態では、本発明のシステムは、さらに、マーカーの標準を含む。このような標準は、マーカーの検出手段（該マーカーに特異的に相互作用する因子、または該マーカーを選択的に認識する手段など）が正常に機能しているかどうかを確認するために用いることが好ましい。
【００８２】
好ましい実施形態では、本発明では、対象となるサンプルを精製する手段をさらに備え得る。このような精製手段としては、例えば、クロマトグラフィーなどを挙げることができる。精製することによって、診断の精度を上げることができることから、好ましい実施形態において使用され得るが、これは必須ではない。
【００８３】
１つの実施形態では、本発明において使用される手段は、本発明のマーカーの定量をする能力を有する。このような定量は、標準曲線を描いたときに、検量線がきちんと描ける手段または因子であるものがよい。好ましくは、例えば、抗体、質量分析、クロマトグラフィー分析などを挙げることができる。従って、ある実施形態では、本発明のシステムは、マーカー物質の定量を行うための定量手段をさらに備える。
【００８４】
１つの実施形態では、定量手段は、標準曲線と測定結果とを比較して前記マーカーの正常値の範囲内かどうかを判定する判定手段を含む。このような判定手段は、コンピュータを用いて実現することができる。
【００８５】
１つの実施形態では、本発明のシステムは、マーカーまたはマーカーに特異的に相互作用する物質を含む組成物である。
【００８６】
本発明の製剤の処方手順は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方などに記載されている。従って、当業者は、本明細書の記載があれば、過度な実験を行うことなく、投与すべき量を決定することができる。
【００８７】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００８８】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【００８９】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００９０】
以下、実施例により、本発明の構成をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。以下において使用した試薬類は、特に言及した場合を除いて、市販されているものを使用した。また、ヒト被験者に対しては、インフォームドコンセントを得たうえ、国際的に認定された倫理的基準等をいずれも満たした上で実験を実施した。
【００９１】
（対象患者）
日本人の心不全患者計１３２例（男性６５例、女性６７例、年齢２５歳〜９０歳、平均年齢６７±１１歳）が本研究に参加した。心不全の主原因は、弁膜性心疾患（５５例）、虚血性心疾患（４９例）、先天性心疾患（１３例）、拡張型心筋症（８例）、肥大型心筋症（８例）、その他（９例）であった。症候性心不全患者は、アンギオテンシン変換酵素阻害剤／アンギオテンシン受容体拮抗剤（６７％）、ジギタリス製剤（３５％）、および利尿剤（７２％）などの薬剤を投与されていた。ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）による心機能分類は以下の通りであった：クラスＩ、３１例（男性１２例、女性１９例）、平均年齢６５±１０歳；クラスＩＩ、６９例（男性３８例、女性３１例）、平均年齢６８±１２歳；クラスＩＩＩ、２４例（男性１２例、女性１２例）、平均年齢７１±８歳；クラスＩＶ、８例（男性３例、女性５例）、平均年齢６３±１１歳。
【００９２】
各患者からインフォームドコンセントを得、プロトコールについて本発明者らの施設の倫理委員会の承認を受け、かつ／または、獨協医科大学倫理委員会の勧告に従って研究を実施した。
【００９３】
（実施例１：正常対照被験者、心房細動患者および心不全患者の血漿中の免疫反応性のＢＮＰ−３２およびｐｒｏＢＮＰ−１０８濃度の比較）
正常対照被験者、心房細動患者および心不全患者の血漿ＢＮＰ−３２およびｐｒｏＢＮＰ−１０８濃度を測定した。心房細動患者は孤立性心房細動患者で、その他の心血管疾患は、身体診察、臨床検査、胸部レントゲン写真、心電図および心エコー検査により除外した。正常対照被験者は、１０例（男性４例、女性６例、３５歳〜７７歳、平均年齢６５±１２歳）であり、身体診察、臨床検査、胸部レントゲン写真、心電図、心エコー検査により正常所見であった。心不全の主原因は、既往歴、身体診察、胸部レントゲン写真、心電図、心エコー、および／または心カテーテル検査に基づいて評価した。患者特性を以下の表１に示す。
【００９４】
【表１】
2011047829.tif 000002
【００９５】
Ａ．血液サンプリング
全対象の前肘静脈から血液検体（３ｍＬ）を採取した。血液を、ＥＤＴＡ・２ナトリウム（１ｍｇ／ｍＬ）とアプロチニン（５００Ｕ／ｍＬ）を含有する冷蔵ガラス管に直ちに入れた。血液を４℃で直ちに遠心し、血漿を凍結、測定まで−８０℃で保管した。
【００９６】
Ｂ．血漿中ＢＮＰ−３２およびｐｒｏＢＮＰ−１０８の測定
−８０℃で保管した血漿をＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、米国）で抽出した。カートリッジを、以前報告したように（Tateyama  H，Hino  J，Minamino  N，Kangawa  K，Minamino  T，Sakai  K，Ogihara  T，Matsuo  H．Concentrations  and  molecular  forms  of  human  brain  natniuretic  peptide  in  plasma．Biochem  Biophys  Res  Commun．1992；185：760-7）各５ｍＬのクロロホルム、メタノール、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）含有５０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ、および生理食塩水で順々に前洗浄した。血漿３ｍＬを、１ｍｏｌ／Ｌ  ＨＣｌ  ２８μＬ含有生理食塩水３ｍＬで酸性化し、生理食塩水３ｍＬで希釈後、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジにローディングした。各５ｍＬの生理食塩水、０．１％ＴＦＡ、０．１％ＴＦＡ含有２０％アセトニトリルで洗浄後、吸着物を０．１％ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル４ｍＬで抽出した。抽出物を凍結乾燥した。その後、凍結乾燥物を０．１％ＴＦＡ含有３０％アセトニトリルに溶解し、同じ緩衝液のＴＳＫゲルＧ２０００ＳＷＸＬカラム（７．８×３００ｍｍ、東ソー、東京、日本）を使用するゲルろ過高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけ、０．２ｍＬ／分の速度で分離した。注入２０分後から、カラム溶出物を１分間ごとに、ウシ血清アルブミン（５０μｇ）およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（２５μｇ）を含有するポリプロピレン管に分画した。各画分を凍結乾燥し、放射性免疫測定用緩衝液に溶解、遠心した清澄溶解液をＢＮＰ−３２蛍光酵素免疫測定（東ソー）にかけた。ＢＮＰ−３２蛍光酵素免疫測定法の詳細は以前報告した通りで、塩野義製薬（大阪、日本）のＢＮＰ−３２モノクローナル抗体をこの測定法で使用した（太田敦美ら、Ｅテスト「TOSOH」II（BNP）を用いた脳性ナトリウム利尿ペプチド測定の検討、医療と検査機器・試薬  28巻３号（2005年）255〜261頁）。
【００９７】
高分子量免疫反応（ｐｒｏＢＮＰ−１０８）と低分子量免疫反応（ＢＮＰ−３２）の和に基づいた以下の式：
ｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比＝ｐｒｏＢＮＰ−１０８／（ｐｒｏＢＮＰ−１０８＋ＢＮＰ−３２）
に従って、ｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比を算出した。
【００９８】
分子量（ＭＷ）約３５Ｋのグリコシル化ｐｒｏＢＮＰが血漿中を循環しているという知見がごく最近の研究で明らかとなった（非特許文献１０、非特許文献１１）ことから、組換え型ｐｒｏＢＮＰ−１０８とグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ−１０８（ＨｙＴｅｓｔ、フィンランド）、合成ＢＮＰ−３２（ペプチド研究所、日本）を購入し、ゲルろ過中のこれら３つのペプチドの溶出位置について検討した。ｐｒｏＢＮＰ−１０８とグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ−１０８の酵素免疫測定における交差反応性を評価するため、各ペプチドを、製造者プロトコールに従いＭｏｎｏｔｉｐ  Ｃ１８カートリッジ（ジーエルサイエンス、東京、日本）で脱塩した。各ペプチド内容を推定するため、脱塩ペプチドの一定量を酵素免疫測定法にかけ、別の一定量を、１１０℃、２２時間の酸加水分解後アミノ酸分析（Ｌ−８５００分析機、日立、東京、日本）にて定量した。
【００９９】
Ｃ．統計解析
全測定値（変数）は平均±ＳＤで示した。２群間の統計学的有意差は、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定、または適切な場合は対応のないＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定で評価した。血漿ペプチド濃度について分布の正規化が適当な場合は、対数変換を使用した。分類変数はχ二乗検定を使用して比較した。３群間の比較には１元配置分散分析後、Ｂｏｎｆｅｒｏｎｉの多重比較検定を実施した。相関係数は線形回帰分析で算出した。Ｐ値０．０５未満を統計学的有意差とした。
【０１００】
Ｄ．結果
１）免疫反応性のＢＮＰ−３２およびｐｒｏＢＮＰ−１０８濃度の測定結果
ヒト血漿中ＢＮＰの分子型の特徴を知るため、逆相Ｃ−１８カラム抽出から得たペプチド画分を、ＴＳＫゲルＧ２０００ＳＷＸＬカラムを使用したゲルろ過ＨＰＬＣにかけたところ、図１に示すように、ＩＲ−ｐｒｏＢＮＰ−１０８（ｐｒｏＢＮＰ−１０８およびグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ−１０８の両方を含む高分子量免疫反応性（ＩＲ−）ＢＮＰ）およびＩＲ−ＢＮＰ−３２（主としてＢＮＰ−３２からなる低分子量ＩＲ−ＢＮＰ）の２つのＩＲ−ＢＮＰピークが常に、正常対照被験者、心房細動患者および心不全患者で認められた。第１のピーク（ＩＲ−ｐｒｏＢＮＰ−１０８）は、分子量が１３Ｋより大きい画分＃９〜１６に見られ、第２のピーク（ＩＲ−ＢＮＰ３２）は、ＢＮＰ−３２に対応する分子量３．５Ｋの画分＃１８〜２１に見られた。このゲルろ過ＨＰＬＣでは、グリコシル化ｐｒｏＢＮＰ−１０８および組み換えｐｒｏＢＮＰ−１０８は、それぞれ主として画分＃１４および画分＃１５に溶出され、互いの分離はできなかった。
【０１０１】
ＢＮＰ−３２の蛍光酵素免疫測定におけるｐｒｏＢＮＰ−１０８とグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ−１０８の交差反応性は、アミノ酸分析による正味重量に基づく推定では、５２．８％と７２．０％であった。ｐｒｏＢＮＰ−１０８とグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ−１０８は共に、ＢＮＰ−３２のＣ端構造を共有しており、ＢＮＰ−３２の蛍光酵素免疫測定はＢＮＰ−３２の構造を厳密に認識する。ｐｒｏＢＮＰ−７６のＮ末端の糖鎖がグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ−１０８の抗体認識に干渉する可能性があったが、グリコシル化ｐｒｏＢＮＰ−１０８で見られた高い交差反応性によってこの可能性は否定された。むしろ、これら２つのｐｒｏＢＮＰ−１０８は異なる組み換え技術（大腸菌由来とＨＥＫ２９３細胞由来）で産生されることから、この交差反応性の差は非グリコシル化ｐｒｏＢＮＰ−１０８およびグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ−１０８のＢＮＰ−３２部分の構造的適合度の差によるものと推定される。従って、グリコシル化ｐｒｏＢＮＰ−１０８および非グリコシル化ｐｒｏＢＮＰ−１０８の完全分子は７０％を超える交差反応性を示すと予想され、本発明者らは交差反応性に基づいてＩＲ−ｐｒｏＢＮＰ１０８濃度を補正することはしなかった。一方、合成ＢＮＰ−３２は、本測定において１００〜１１０％の範囲で常に測定された。
【０１０２】
２）正常対照被験者、心房細動患者、心不全患者における血漿ＩＲ−ＢＮＰ−３２およびＩＲ−ｐｒｏＢＮＰ−１０８濃度
ｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比を図２に示す。なお、組み換えｐｒｏＢＮＰ−１０８とグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ−１０８とが互いに分離できなかったので、ｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比は、式：ｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比＝ｐｒｏＢＮＰ−１０８／（ｐｒｏＢＮＰ−１０８＋ＢＮＰ−３２）に従って算出した。正常対照被験者および心房細動患者におけるｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比の分布は狭かったが、心不全患者では広い範囲に分布していた。結果として、心不全患者における平均ｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比は、正常対照被験者および心房細動患者に比べて有意に低かった。平均ＩＲ−ＢＮＰ−３２濃度および平均ＩＲ−ｐｒｏＢＮＰ−１０８濃度を表１に示す。心不全患者では、ＩＲ−ＢＮＰ−３２だけでなくＩＲ−ｐｒｏＢＮＰ−１０８も他の２群に比べて有意に高かった。本方法で測定したＩＲ−ＢＮＰ−３２濃度とＩＲ−ｐｒｏＢＮＰ−１０８濃度は十分に相関していた（図３）。
【０１０３】
（実施例２：心不全患者における血漿ｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比；心房負荷心不全と心室負荷心不全との比較）
実施例１の心不全患者１３２例中の６２例を、心房負荷心不全と心室負荷心不全の２群に分けた。心房負荷心不全（３２例）の内訳は、僧房弁狭窄症、僧房弁閉鎖不全症、心房中隔欠損症であった。心室負荷心不全（３０例）の内訳は、大動脈弁閉鎖不全症および大動脈弁狭窄症であった。心房負荷心不全のｐｒｏＢＮＰ−１０８／（ＢＮＰ−３２＋ｐｒｏＢＮＰ−１０８）比を心室負荷心不全のものと比較した。患者の特性を表２に示す。
【０１０４】
【表２】
2011047829.tif 000003
【０１０５】
Ａ．血液サンプリング
全対象の前肘静脈から血液検体（３ｍＬ）を採取した。血液を、ＥＤＴＡ・２ナトリウム（１ｍｇ／ｍＬ）とアプロチニン（５００Ｕ／ｍＬ）を含有する冷蔵ガラス管に直ちに入れた。血液を４℃で直ちに遠心し、血漿を凍結、測定まで−８０℃で保管した。
【０１０６】
Ｂ．血漿ＢＮＰ−３２およびｐｒｏＢＮＰ−１０８の測定
実施例１と同様の方法で血漿ＢＮＰ−３２およびｐｒｏＢＮＰ−１０８の測定を行い、ｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比を算出した。
【０１０７】
Ｃ．統計解析
全測定値（変数）は平均±ＳＤで示した。２群間の統計学的有意差は、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定、または適切な場合は対応のないＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定で評価した。血漿ペプチド濃度について分布の正規化が適当な場合は、対数変換を使用した。分類変数はχ二乗検定を使用して比較した。３群間の比較には１元配置分散分析後Ｂｏｎｆｅｒｏｎｉの多重比較検定を実施した。相関係数は線形回帰分析で算出した。Ｐ値０．０５未満を統計学的有意差とした。
【０１０８】
Ｄ．結果
ｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比の分布が広い理由を検討するため、心房負荷心不全患者および心室負荷心不全患者においてｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比を測定したところ、図４に示すように、ＩＲ−ＢＮＰの２つのピークが両群で認められた。興味深いことに、心房負荷心不全では、ＩＲ−ｐｒｏＢＮＰ−１０８のピークに比べてＩＲ−ＢＮＰ−３２のピークの方が優位であった（図４Ｂ）。対照的に、心室負荷心不全では、ＩＲ−ｐｒｏＢＮＰ−１０８およびＩＲ−ＢＮＰ−３２のピークはほぼ同等であった（図４Ａ）。結果として、心室負荷心不全の平均ｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比は、心房負荷心不全に比べて高かった（図５）。
【０１０９】
Ｅ．考察
本発明者らは、心房負荷心不全患者および心室負荷心不全患者における血漿ＩＲ−ＢＮＰ−３２およびＩＲ−ｐｒｏＢＮＰ−１０８の濃度を測定し、これら２つの状態でのｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比を比較した。心室負荷心不全患者のｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比が、心房負荷心不全患者に比べて高かったが、両ペプチドの血漿中濃度は互いに相関していた。
【０１１０】
（実施例３：心房組織および心室組織におけるｐｒｏＢＮＰ−１０８濃度およびＢＮＰ−３２濃度の比較）
心房負荷心不全のｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比が心室負荷心不全よりも低かった機序を明らかにするため、心臓手術を受けた他の患者（１１例）の心房組織および心室組織におけるＢＮＰ分子型を分析した。心房組織は僧房弁疾患（６例）および剖検（１例）から、心室組織は心臓手術（５例）および剖検（１例）から得た。心房組織および心室組織の標本を提供した患者の特性を表３に示す。
【０１１１】
【表３】
2011047829.tif 000004
【０１１２】
Ａ．左心房組織および左心室組織のサンプリング
患者７例（僧房弁置換術（ＭＶＲ）＋ｍａｚｅ術５例、２弁置換術（ＤＶＲ）＋ｍａｚｅ術１例、剖検１例）の左心房切除組織標本を、液体窒素で凍結し、−８０℃で保管した。患者６例（冠動脈バイパス移植術＋Ｄｏｒ術５例、剖検１例）から得た左心室切除組織標本を、液体窒素で凍結し、−８０℃で保管した。本発明者らの目的は、心房組織および心室組織のＢＮＰ分子型に関する生化学的証拠を得ることであった。
【０１１３】
Ｂ．心臓組織のＢＮＰ−３２およびｐｒｏＢＮＰ−１０８測定
−８０℃で保管した心房組織および心室組織を重量測定し、以前報告したように１ｍｏｌ／Ｌ酢酸１０容量中で煮沸した（Yoshihara  F，Nishikimi  T，Sasako  Y，Hino  J，Kobayashi  J，Minatoya  K，Bando  K，Kosakai  Y，Horio  T，Suga  S，Kawano  Y，Matsuoka  H，Yutani  C，Matsuo  H，Kitamura  S，Ohe  T，Kangawa  K．Plasma  atrial  natniuretic  peptide  concentration  inversely  correlates  with  left  atrial  collagen  volume  fraction  in  patients  with  atrial  fibrillation：plasma  ANP  as  a  possible  biochemical  marker  to  predict  the  outcome  of  the  maze  procedure．J  Am  Coll  Cardiol．2002；39：288-94）。その後、組織をＰｏｌｙｔｒｏｎミキサーでホモジネート（均質化）した。ホモジネートを３０００×ｇの遠心にかけ、上清を再度１５０００×ｇの遠心に１５分かけた。実施例１のＢ．で先述したようにして、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジを使用して二度目の上清を抽出した。抽出物を凍結乾燥し、ＴＳＫゲルＧ２０００ＳＷＸＬカラムを使用してゲルろ過ＨＰＬＣにかけた。各画分の一定量を凍結乾燥し、実施例１と同様の方法でＩＲ−ＢＮＰ濃度を測定した。
【０１１４】
Ｃ．統計解析
全測定値（変数）は平均±ＳＤで示した。２群間の統計学的有意差は、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定または適切な場合は対応のないＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定で評価した。血漿ペプチド濃度について分布の正規化が適当な場合は、対数変換を使用した。分類変数はχ二乗検定を使用して比較した。３群間の比較には１元配置分散分析後Ｂｏｎｆｅｒｏｎｉの多重比較検定を実施した。相関係数は線形回帰分析で算出した。Ｐ値０．０５未満を統計学的有意差とした。
【０１１５】
Ｄ．結果
血漿検体と同様に、ＢＮＰ−３２およびｐｒｏＢＮＰ−１０８に対応する２つのピークが心房組織と心室組織とで認められた。興味深いことに、心房組織では、ＢＮＰ−３２に対応する低分子量ＩＲ−ＢＮＰピークが、高分子量ＩＲ−ＢＮＰピークに比べて優位であった（７例、７７±５％）（図６Ａ）。対照的に、心室組織では、ｐｒｏＢＮＰ−１０８に対応する高分子量ＩＲ−ＢＮＰピークが低分子量ＩＲ−ＢＮＰピークに比べて優位であった（６例、６６±４％、Ｐ＜０．０００１）（図６Ｂ）。結果として、心室組織の平均ｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比の方が心房組織よりも高かった（図７）。
【０１１６】
Ｅ．考察
心室負荷心不全患者のｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比の方が心房負荷心不全患者に比べて高かった理由を明らかにするため、心房組織および心室組織のＩＲ−ＢＮＰ−３２濃度およびＩＲ−ｐｒｏＢＮＰ−１０８濃度を測定した。興味深いことに、心室組織では７０％を超えるＩＲ−ＢＮＰがｐｒｏＢＮＰ−１０８として存在していたのに対し、心房組織では７５％を超えるＩＲ−ＢＮＰがＢＮＰ−３２として存在していた。分子量４Ｋおよび分子量１３〜１５Ｋの２つのＩＲ−ＢＮＰ分子型がヒト心房抽出物に存在し、それらが抗ＢＮＰ  ＩｇＧ免疫親和性クロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣを使用した分離、各ペプチドの直接的なＮ末端配列決定によって、ＢＮＰ−３２およびｐｒｏＢＮＰ−１０８と同定されることが、Ｈｉｎｏらによって示された（Hino  J，Tateyama  H，Minamino  N，Kangawa  K，Matsuo  H．Isolation  and  identification  of  human  brain  natniuretic  peptides  in  cardiac  atrium．Biochem  Biophys  Res  Commun．1990；167：693-700）。Ｈｉｎｏらはまた、ＢＮＰ−３２がヒト心房組織中の主要な分子型であることを報告し、これは、本発明者らの結果と一致する所見であった。しかし、これまで調べた限り、ヒト心室組織中のＢＮＰ分子型を検討した過去の研究はなかった。Ｇｏｅｔｚｅら（Goetze  JP，Friis-Hansen  L，Rehfeld  JF，Nilsson  B，Svendsen  JH．Atnial  secretion  of  B-type  natniunetic  peptide．Eur  Heart  J．2006；27：1648-50）は、心不全における心房由来ＢＮＰの重要性を示唆したが、あまり注目されなかった。以上を考慮すると、心室組織ではＢＮＰ−３２よりもｐｒｏＢＮＰ−１０８がＢＮＰの主要な分子型であり、ｐｒｏＢＮＰ−１０８の大部分はプロセシングされずに心室から分泌されることが、これまでに得られたエビデンスから示唆される。最近の報告では、ＢＮＰ−３２だけでなくｐｒｏＢＮＰ−１０８の血漿濃度が、心不全患者で増加しており、血漿ｐｒｏＢＮＰ−１０８濃度は、血漿ＢＮＰ−３２濃度と強い相関を示すことが示された（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）。これらの結果は、本実施例の結果と一致する。
【０１１７】
（実施例４：心臓手術を受けた心不全患者の心嚢液および血漿中のＩＲ−ＢＮＰ−３２濃度およびＩＲ−ｐｒｏＢＮＰ−１０８濃度の比較）
心室組織から産生かつ分泌されるＢＮＰ分子型を確認するため、心臓手術を受けた心不全患者８例（大動脈弁置換術４例、僧房弁置換術４例）について、心嚢液および血漿中のｐｒｏＢＮＰ−１０８およびＢＮＰ−３２の濃度を測定した。心嚢液を提供した患者の特性を表４に示す。
【０１１８】
【表４】
2011047829.tif 000005
【０１１９】
Ａ．血漿および心嚢液の検体採取
心膜切開後直ちに、以前報告したように（Nishikimi  T，Shibasaki  I，Iida  H，Asakawa  H，Matsushita  Y，Mori  H，Mochizuki  Y，Okamura  Y，Horinaka  S，Kangawa  K，Shimada  K，Matsuoka  H．Molecular  forms  of  adrenomedullin  in  pericardial  fluid  and  plasma  in  patients  with  ischaemic  heart  disease．Clin  Sci(London)．2002；102：669-77、Nishikimi  T，Asakawa  H，Iida  H，Matsushita  Y，Shibasaki  I，Tadokoro  K，Mori  Y，Mori  H，Mochizuki  Y，Okamura  Y，Miyoshi  S，Kangawa  K，Matsuoka  H．Different  secretion  patterns  of  two  molecular  forms  of  cardiac  adrenomedullin  in  pressure-  and  volume-overloaded  human  heart  failure．J  Card  Fail．2004；10：321-7）非希釈心嚢液検体を採取した。同時にカテーテル挿入の上腕動脈から血液検体を採取した。検体は、先述のように−８０℃で保管した。
【０１２０】
Ｂ．血漿および心嚢液中のＢＮＰ−３２およびｐｒｏＢＮＰ−１０８の測定
−８０℃で保管した血漿または心嚢液検体を、実施例１に記載した方法に従って処理し、ＢＮＰ−３２およびｐｒｏＢＮＰ−１０８の測定、ならびにｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比の算出を行った。
【０１２１】
Ｃ．統計解析
全測定値（変数）は平均±ＳＤで示した。２群間の統計学的有意差は、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定または適切な場合は対応のないＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定で評価した。血漿ペプチド濃度について分布の正規化が適当な場合は、対数変換を使用した。分類変数はχ二乗検定を使用して比較した。３群間の比較には１元配置分散分析後Ｂｏｎｆｅｒｏｎｉの多重比較検定を実施した。相関係数は線形回帰分析で算出した。Ｐ値０．０５未満を統計学的有意差とした。
【０１２２】
Ｄ．結果
心室組織から産生かつ分泌されるＢＮＰ分子型を確認するため、心臓手術を受けた患者８例の心嚢液および血漿中のＩＲ−ＢＮＰ−３２およびＩＲ−ｐｒｏＢＮＰ−１０８を測定した。図８は、僧房弁閉鎖不全症患者（図８Ａ、Ｂ）と大動脈弁狭窄症患者（図８Ｃ、Ｄ）の血漿および心嚢液におけるＢＮＰ−３２およびｐｒｏＢＮＰ−１０８に対応する２つのＩＲ−ＢＮＰピークの存在を示す。血漿では、ＩＲ−ＢＮＰ−３２が僧房弁閉鎖不全症患者の主要な分子型であったのに対し、ＩＲ−ｐｒｏＢＮＰ−１０８が大動脈弁狭窄症患者の主要な分子型であった。しかし、両群の患者の心嚢液では、ＩＲ−ｐｒｏＢＮＰ−１０８が圧倒的な主要な分子型であった。結果として、心嚢液中のｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比の平均の方が血漿に比べて高かった（図９）。
【０１２３】
Ｅ．考察
心嚢液は心臓で産生される多様な生理活性物質を豊富に含むことが知られており（非特許文献１０、非特許文献１１）、その組成は心室の間質液と類似していることが知られている（Fujita  M，Ikemoto  M，Kishishita  M，Otani  H，Noliara  R，Tanaka  T，Tamaki  S，Yamazato  A，Sasayama  S．Elevated  basic  fibroblast  growth  factor  in  pericardial  fluid  of  patients  with  unstable  angina．Circulation．1996；94：610-3）。さらに、アドレノメデュリン、ＢＮＰ、ＡＮＰ、塩基性線維芽細胞増殖因子、血管内皮増殖因子などの生理活性物質の濃度が血漿に比べて心嚢液の方が高いと報告されている（Nishikimi  T，Shibasaki  I，Iida  H，Asakawa  H，Matsushita  Y，Mori  H，Mochizuki  Y，Okamura  Y，Horinaka  S，Kangawa  K，Shimada  K，Matsuoka  H．Molecular  forms  of  adrenomedullin  in  pericardial  fluid  and  plasma  in  patients  with  ischaemic  heart  disease．Clin  Sci(Lond)．2002；102：669-77、Nishikimi  T，Asakawa  H，Iida  H，Matsushita  Y，Shibasaki  I，Tadokoro  K，Mori  Y，Mori  H，Mochizuki  Y，Okamura  Y，Miyoshi  S，Kangawa  K，Matsuoka  H．Different  secretion  patterns  of  two  molecular  forms  of  cardiac  adrenomedullin  in  pressure-  and  volume-overloaded  human  heart  failure．J  Card  Fail．2004；10：321-7、Fujita  M，Ikemoto  M，Kishishita  M，Otani  H，Noliara  R，Tanaka  T，Tamaki  S，Yamazato  A，Sasayama  S．Elevated  basic  fibroblast  growth  factor  in  pericardial  fluid  of  patients  with  unstable  angina．Circulation．1996；94：610-3、Tambara  K，Fujita  M，Nagaya  N，Miyamoto  S，Iwakura  A，Doi  K，Sakaguchi  G，Nishimura  K，Kangawa  K，Komeda  M．Increased  pericardial  fluid  concentrations  of  the  mature  form  of  adrenomedullin  in  patients  with  cardiac  remodelling．Heart．2002；87：242-6）。興味深いことに、本発明者らの結果では、心嚢液中のほとんどのＩＲ−ＢＮＰが心不全のタイプにかかわらずＩＲ−ｐｒｏＢＮＰ−１０８として存在していた。これらの結果は、ｐｒｏＢＮＰ−１０８が心室のＢＮＰ主要分子型でありｐｒｏＢＮＰ−１０８の大部分は蛋白切断プロセシングを受けずに心室から分泌されるという仮説に一致する。
【０１２４】
Ｙａｎｄｌｅらは（Yandle  TG，Richards  AM，Gilbert  A，Fisher  S，Holmes  S，Espiner  EA．Assay  of  brain  natriuretic  peptide(BNP)  in  human  plasma：evidence  for  high  molecular  weight  BNP  as  a  major  plasma  component  in  heart  failure．J  Clin  Endocrinol  Metab．1993；76：832-8）心不全患者の冠静脈洞および末梢静脈の血漿中ＢＮＰ分子型を以前分析し、ＢＮＰ−３２が冠静脈洞の主要分子型でありｐｒｏＢＮＰ−１０８が静脈血漿の主要な分子型であることを示した。また本発明者らはＢＮＰ−３２よりもむしろｐｒｏＢＮＰ−１０８が正常被験者のＢＮＰ主要分子型であることを以前報告した（Tateyama  H，Hino  J，Minamino  N，Kangawa  K，Minamino  T，Sakai  K，Ogihara  T，Matsuo  H．Concentrations  and  molecular  forms  of  human  brain  natniuretic  peptide  in  plasma．Biochem  Biophys  Res  Commun．1992；185：760-7）。これらの結果から、その受容体に対する親和性がおそらく異なるため、ＢＮＰ−３２に比べてｐｒｏＢＮＰ−１０８の半減期が長いという可能性が示唆される。実際、血管平滑筋細胞および内皮細胞におけるｃＧＭＰのＢＮＰ−３２産生能はｐｒｏＢＮＰ−１０８産生能に比べて１０〜２０倍高く（非特許文献１０）、ＢＮＰ−３２の受容体依存性代謝がｐｒｏＢＮＰ−１０８よりも早いことが示唆される。本実施例では冠静脈洞の血漿ＢＮＰ−３２、ｐｒｏＢＮＰ−１０８を測定しなかったが、これらの結果から、ＢＮＰの２つの分子型の代謝も末梢循環のｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比を決める主要な因子であることが示唆される。
【０１２５】
（実施例５：心不全患者における治療後または自然経過後の血漿ＢＮＰ−３２濃度およびｐｒｏＢＮＰ−１０８濃度の比較）
心不全の病態生理学的状態の血漿ＢＮＰ分子型に対する影響を検討するため、心不全の状態が変動した前後におけるｐｒｏＢＮＰ−１０８濃度およびＢＮＰ−３２濃度を測定した。治療による症状の改善の前後で、５例の患者の血漿ｐｒｏＢＮＰ−１０８濃度およびＢＮＰ−３２濃度を測定した。また、自然経過による症状の悪化の前後で、４例の患者の血漿ｐｒｏＢＮＰ−１０８濃度およびＢＮＰ−３２濃度を測定した。患者の特性を表５に示す。
【０１２６】
【表５】
2011047829.tif 000006
【０１２７】
Ａ．血液サンプリング
全対象の前肘静脈から血液検体（３ｍＬ）を採取した。血液をＥＤＴＡ・２ナトリウム（１ｍｇ／ｍＬ）とアプロチニン（５００Ｕ／ｍＬ）を含有する冷蔵ガラス管に直ちに入れた。血液を４℃で直ちに遠心し、血漿を凍結、測定まで−８０℃で保管した。
【０１２８】
Ｂ．血漿中のＢＮＰ−３２およびｐｒｏＢＮＰ−１０８の測定
実施例１と同様の方法で血漿ＢＮＰ−３２およびｐｒｏＢＮＰ−１０８の測定を行い、ｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比を算出した。
【０１２９】
Ｃ．統計解析
全測定値（変数）は平均±ＳＤで示した。２群間の統計学的有意差は、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定または適切な場合は対応のないＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定で評価した。血漿ペプチド濃度について分布の正規化が適当な場合は、対数変換を使用した。分類変数はχ二乗検定を使用して比較した。３群間の比較には１元配置分散分析後Ｂｏｎｆｅｒｏｎｉの多重比較検定を実施した。相関係数は線形回帰分析で算出した。Ｐ値０．０５未満を統計学的有意差とした。
【０１３０】
Ｄ．結果
心不全の病態生理学的状態が血漿ＢＮＰ分子型に影響するか検討するため、心不全患者の治療前後でＩＲ−ＢＮＰ−３２濃度およびＩＲ−ｐｒｏＢＮＰ−１０８濃度を測定した。図１０Ａに示すように、上昇していた血漿ＩＲ−ＢＮＰ濃度は治療後低下し、ｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比も低下した。また、観察期間中心不全が悪化した症例ではＩＲ−ＢＮＰ濃度がｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比の増加と同時に増加した（図１０Ｂ）。
【０１３１】
Ｅ．考察
非代償性心不全では、ＩＲ−ＢＮＰ−３２およびＩＲ−ｐｒｏＢＮＰ−１０８の両方が増加していた。医学的治療に状態がより改善した患者では、血漿ＩＲ−ＢＮＰ−３２およびＩＲ−ｐｒｏＢＮＰ−１０８は低下し、ｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比の低下を伴っていた。対照的に、心不全が悪化すると、血漿ＩＲ−ＢＮＰ−３２およびＩＲ−ｐｒｏＢＮＰ−１０８濃度の両方は増加し、ｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比の増加を伴っていた。従って、ｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比は、心不全の病態生理学的状態に依存していると推定される。高度の心不全におけるｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比の増加は、心室からのｐｒｏＢＮＰ−１０８産生と分泌の増加によって一部は説明できる。別の可能性として、蛋白質切断プロセシング酵素のｍＲＮＡ発現が、高度の心不全ではＢＮＰ前駆体のｍＲＮＡ発現の増加と並行して増加しないことが挙げられる。結果として、ｐｒｏＢＮＰ−１０８のＢＮＰ−３２への変換は、ｐｒｏＢＮＰ−１０８が分泌されると低下すると考えられる。ごく最近の研究で、プロテアーゼによるｐｒｏＢＮＰ−１０８のプロセシングは分解部位に近い部位のＯ−グリコシル化によって抑制されることが示された（Semenov  AG，Postnikov  AB，Tamm  NN，Seferian  KR，Karpova  NS，Bloshchitsyna  MN，Koshkina  EV，Krasnoselsky  MI，Serebryanaya  DV，Katrukha  AG．Processing  of  pro-Brain  natriuretic  peptide  is  suppressed  by  O-glycosylation  in  the  region  close  to  the  cleavage  site．Clin  Chem．2009  Jan  23．[Epub  ahead  of  print]）。現在ｐｒｏＢＮＰ−１０８のＯ−グリコシル化における制御機序は不明であるが、機能不全の心筋におけるＯ−グリコシル化酵素が心不全におけるｐｒｏＢＮＰ−１０８血漿濃度増加に関連していると考えられる。
【０１３２】
本実施例の結果に基づくと、心房負荷は主としてＢＮＰ−３２からなる低分子量ＩＲ−ＢＮＰの産生と分泌を増加させ、心室負荷はｐｒｏＢＮＰ−１０８に対応する高分子量ＩＲ−ＢＮＰの産生と分泌を増加させる。その結果、いずれの場合も血漿ＩＲ−ＢＮＰ濃度は増加しても、心房負荷ではｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比が低下し心室負荷では増加する。
【０１３３】
要約すると、本発明者らは心不全における血漿ＢＮＰの分子型をゲルろ過ＨＰＬＣによって分析し、ＩＲ−ＢＮＰ−３２だけでなくＩＲ−ｐｒｏＢＮＰ−１０８も対照被験者、心房細動患者、心不全患者の血漿に存在することを示した。ｐｒｏＢＮＰ−１０８／総ＢＮＰ比は、主として心房負荷または心室負荷に関係する心不全の病態生理学的状態に依存して変動する。臨床現場で現在使用されている測定系では、ＢＮＰ−３２キットはｐｒｏＢＮＰ−１０８と高い交差反応を示す（非特許文献８、非特許文献９、Hammerer-Lercher  A，Halfinger  B，Sarg  B，Mair  J，Puschendorf  B，Griesmacher  A，Guzman  NA，Lindner  HH．Analysis  of  circulating  forms  of  proBNP  and  NT-proBNP  in  patients  with  severe  heart  failure．Clin  Chem．2008；54：858-65、Nishikimi  T，Minamino  N，Horii  K，Matsuoka  H．Do  commercially  available  assay  kits  for  B-type  natriuretic  peptide  measure  Pro-BNP-108，as  well  as  BNPI-32?  Hypertension．2007；50：e163）ことから、これが心不全の診断におけるＢＮＰの不明瞭性や変動性の原因となっている。ＢＮＰ−３２分子とｐｒｏＢＮＰ−１０８分子を別個に測定することによって、心不全患者を治療する心臓専門医および一般臨床医に対し原因機序に基づいたより有用な情報を提供することが可能である。
【０１３４】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１３５】
本発明によれば、簡便かつ正確な心不全の細かい分類を診断する方法を提供することができる。また、本発明によれば、心不全の治療を判定する簡便な診断キットも提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１３６】
配列番号１は、ＰｒｅＰｒｏ−ＢＮＰ（全長）のアミノ酸配列である。
【０１３７】
配列番号２は、ｐｒｏ−ＢＮＰ１０８のアミノ酸配列である。
【０１３８】
配列番号３は、ＢＮＰ−３２のアミノ酸配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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