(57)【要約】【課題】皮膚角質層において発現量が一定であるハウスキーピングタンパク質の提供を課題とする。【課題解決手段】皮膚角質層中のトータルタンパク量と挙動が同じハウスキーピングタンパク質を探索したところ、ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅ又はｋｅｒａｔｉｎ  ３がこれに該当することをつきとめ、ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅ又はｋｅｒａｔｉｎ  ３を測定することにより、皮膚角質層中のトータルタンパク量を測定する方法、または特定タンパク質の相対評価をする方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を有する、採取した皮膚角質層の特定のタンパク質量の評価方法。
（１）採取した角質層のｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量を測定する工程
（２）採取した角質層の特定のタンパク質の発現量を測定する工程
（３）（２）で求めた特定のタンパク質の発現量を（１）で求めたｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量で補正する工程
【請求項２】
特定のタンパク質の発現量をｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量で補正する工程が特定のタンパク質の発現量をｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量で除する工程である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
特定のタンパク質の発現量をｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量で補正する工程が、
特定のタンパク質の発現量を、以下の工程により求めた全タンパク質量で除する工程である請求項１に記載の方法。
（１）採取した皮膚角質層のｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量を測定する工程
（２）採取した皮膚角質層の全タンパク質量と（１）で求めたｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量の一次関数を求める工程
（３）（２）で求めた１次関数を用いて、採取した皮膚角質層のｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量から採取した皮膚角質層の全タンパク質量を求める工程。
【請求項４】
以下の工程を有する、採取した皮膚角質層の全タンパク質量を測定する方法。
（１）採取した皮膚角質層のｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量を測定する工程
（２）採取した皮膚角質層の全タンパク質量と（１）で求めたｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量の一次関数を求める工程
（３）（２）で求めた１次関数を用いて、採取した皮膚角質層のｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量から採取した皮膚角質層の全タンパク質量を求める工程。
【請求項５】
タンパク質の発現量が、抗体を用いて測定した測定強度である請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
タンパク質の発現量が、ＥＬＩＳＡ発光強度である請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚角質層中のタンパク質測定方法に関する。より詳しくはｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅ、ｋｅｒａｔｉｎ  ３を用いた皮膚角質層中のタンパク質測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハウスキーピングタンパク質とは、実験系で発現量が変動しないタンパク質のことをいい、一般に、細胞に刺激やストレスを与えても比較的変動しにくいタンパク質とされている。したがって、所望の実験系で細胞刺激などによって変動するその他のタンパク質との対照として、補正目的（ノーマライゼーション）に使われることが多い。
ここで、ハウスキーピングタンパク質として、細胞内の繊維タンパク質であるβ−ａｃｔｉｎや糖からエネルギーを作る解糖系に関わるタンパク質であるＧ３ＰＤＨが代表的である（非特許文献１，２）。
しかし、β−ａｃｔｉｎやＧ３ＰＤＨは細胞にある刺激が加わるとタンパク質の発現変化がおこることが知られており、実験系によっては、正確なタンパク質の測定ができないおそれがある。たとえば、皮膚角質層を用いた実験系においても、一般的にＧ３ＰＤＨ、β−ａｃｔｉｎがハウスキーピングタンパク質として使用されることが多い。しかし、後述する比較例に示すようにこの２種類のタンパク質の発現量は角質層中の全タンパク量と低い相関関係しか示さないことがわかった。
したがって、角質層中のタンパク質を測定する場合には、適切なハウスキーピングタンパク質の選択が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Yamazaki et al,Differentiation induction of human keratinocytes by phosphatidylethanolamine-binding protein,J.Biol.Chem., 279, 32191-32195, 2004
【非特許文献２】Hanley et al, Farnesol stimulates differentiation in epidermal keratinocytes via PPARalpha ,J.Biol.Chem, 275, 11484-11491, 2000
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これまでに皮膚角質層において発現量が一定であるハウスキーピングタンパク質の報告例はない。
本発明者らは、皮膚角質層中のタンパク量と挙動が同じハウスキーピングタンパク質を探索したところ、ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅ又はｋｅｒａｔｉｎ  ３がこれに該当することをつきとめ、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は以下の構成を有する。
〔１〕以下の工程を有する、採取した皮膚角質層の特定のタンパク質量の評価方法。
（１）採取した角質層のｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量を測定する工程
（２）採取した角質層の特定のタンパク質の発現量を測定する工程
（３）（２）で求めた特定のタンパク質の発現量を（１）で求めたｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量で補正する工程
〔２〕特定のタンパク質の発現量をｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量で補正する工程が特定のタンパク質の発現量をｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量で除する工程である〔１〕に記載の方法。
〔３〕特定のタンパク質の発現量をｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量で補正する工程が、
特定のタンパク質の発現量を、以下の工程により求めた全タンパク質量で除する工程である〔１〕に記載の方法。
（１）採取した皮膚角質層のｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量を測定する工程
（２）採取した皮膚角質層の全タンパク質量と（１）で求めたｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量の一次関数を求める工程
（３）（２）で求めた１次関数を用いて、採取した皮膚角質層のｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量から採取した皮膚角質層の全タンパク質量を求める工程。
〔４〕以下の工程を有する、採取した皮膚角質層の全タンパク質量を測定する方法。
（１）採取した皮膚角質層のｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量を測定する工程
（２）採取した皮膚角質層の全タンパク質量と（１）で求めたｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量の一次関数を求める工程
（３）（２）で求めた１次関数を用いて、採取した皮膚角質層のｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量から採取した皮膚角質層の全タンパク質量を求める工程。
〔５〕タンパク質の発現量が、抗体を用いて測定した測定強度である〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕タンパク質の発現量が、ＥＬＩＳＡ発光強度である〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、皮膚角質層中の全タンパク質量の測定を、ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅ又はｋｅｒａｔｉｎ  ３の測定により正確かつ簡易に行うことができた。したがって、皮膚角質層中の全タンパク質量を、Ｌｏｗｒｙ法などにより測定する必要がなく、ＥＬＩＳＡ法など、抗体を用いて簡易にｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅ又はｋｅｒａｔｉｎ  ３を測定することによって、正確に測定することが可能となった。
また、評価したい特定のタンパク質について、当該タンパク質の発現量相対値をｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅ又はｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量相対値で除して、全タンパク質量の補正をすることで、皮膚角質層の特定のタンパク質の量を容易に比較評価できるようになった。
また、ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅ又はｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量相対値とＬｏｗｒｙ法などの既知の方法で求めた全タンパク質量の関係を一次関数により最適化し、その一次関数を用いて、ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅ又はｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量相対値から全タンパク質量を算出し、その値で特定のタンパク質の発現量相対値を除して、全タンパク質量の補正をすることで、皮膚角質層の特定のタンパク質の量をより正確に、容易に比較評価することもできる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】角質層から抽出した全タンパク質量とＧ３ＰＤＨの発現量との相関を調べた結果を示す図である。
【図２】角質層から抽出した全タンパク質量とβ−ａｃｔｉｎの発現量との相関を調べた結果を示す図である。
【図３】角質層から抽出した全タンパク質量とｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅの発現量との相関を調べた結果を示す図である。
【図４】角質層から抽出した全タンパク質量とｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量との相関を調べた結果を示す図である。
【図５】２８名の被験者について、以下（１）と（２）との比較を示す図である。（１）ｋａｌｌｉｋｌｅｉｎ  ７の発現量をＬｏｗｒｙ法で求めた全タンパク質量で除して補正したｋａｌｌｉｋｌｅｉｎ  ７相対量（２）ｋａｌｌｉｋｌｅｉｎ  ７の発現量をｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅ発現量と全タンパク質量の一次関数を用いてｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅ発現量から求めた全タンパク質量で除して補正したｋａｌｌｉｋｌｅｉｎ  ７相対量
【図６】２８名の被験者について、以下（１）と（２）との比較を示す図である。（１）ｋａｌｌｉｋｌｅｉｎ  ７の発現量をＬｏｗｒｙ法で求めた全タンパク質量で除して補正したｋａｌｌｉｋｌｅｉｎ  ７相対量（２）ｋａｌｌｉｋｌｅｉｎ  ７の発現量を、ｋｅｒａｔｉｎ  ３発現量と全タンパク質量の一次関数を用いてｋｅｒａｔｉｎ  ３発現量から求めた全タンパク質量で除して補正したｋａｌｌｉｋｌｅｉｎ  ７相対量
【図７】２８名の被験者について、以下（１）と（２）との比較を示す図である。（１）Ｇ３ＰＤＨの発現量をＬｏｗｒｙ法で求めた全タンパク質量で除して補正したＧ３ＰＤＨ相対量（２）Ｇ３ＰＤＨの発現量を、ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅ発現量と全タンパク質量の一次関数を用いてｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅ発現量から求めた全タンパク質量で除して補正したＧ３ＰＤＨ相対量
【図８】２８名の被験者について、以下（１）と（２）との比較を示す図である。（１）Ｇ３ＰＤＨの発現量をＬｏｗｒｙ法で求めた全タンパク質量で除して補正したＧ３ＰＤＨ相対量（２）Ｇ３ＰＤＨの発現量を、ｋｅｒａｔｉｎ  ３発現量と全タンパク質量の一次関数を用いてｋｅｒａｔｉｎ  ３発現量から求めた全タンパク質量で除して補正したＧ３ＰＤＨ相対量
【図９】２８名の被験者について、以下（１）と（２）との比較を示す図である。（１）β−ａｃｔｉｎの発現量をＬｏｗｒｙ法で求めた全タンパク質量で除して補正したβ−ａｃｔｉｎ相対量（２）β−ａｃｔｉｎの発現量を、ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅ発現量と全タンパク質量の一次関数を用いてｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅ発現量から求めた全タンパク質量で除して補正したβ−ａｃｔｉｎ相対量
【図１０】２８名の被験者について、以下（１）と（２）との比較を示す図である。（１）β−ａｃｔｉｎの発現量をＬｏｗｒｙ法で求めた全タンパク質量で除して補正したβ−ａｃｔｉｎ相対量（２）β−ａｃｔｉｎの発現量を、ｋｅｒａｔｉｎ  ３発現量と全タンパク質量の一次関数を用いてｋｅｒａｔｉｎ  ３発現量から求めた全タンパク質量で除して補正したβ−ａｃｔｉｎ相対量
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明に用いられる皮膚角質層中のタンパク質のハウスキーピングタンパク質としては、ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３を用いることができる。皮膚角質層は皮膚の最外層に存在する１０層前後の層で表皮全体の厚みの１０分の１に相当する。皮膚角質層には表皮の最下層から分化してきた扁平な表皮角化細胞が脱核した状態で存在している。ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅは分子量６５ＫＤａのタンパク質でｋｅｒａｔｉｎ  １０とヘテロテトラマーを形成し、皮膚の顆粒層、有棘層に存在する。皮膚角質層の終分化に関与するといわれており、表皮角化細胞の活性や増殖、ケラチン化にも影響している。ｋｅｒａｔｉｎ  ３は分子量６４ＫＤａのタンパク質でｋｅｒａｔｉｎ  １２とヘテロテトラマーを形成しており、角質層特異的に発現している。これらのタンパク質の発現量を調べるには市販の抗体を使用して測定することができ、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロッティング法、ドットブロット法、抗体チップ等により測定することができる。
【０００９】
本発明のタンパク質の測定の意味は、広義の意味で解釈するものとし、タンパク質濃度、タンパク質量の定量測定のほか、タンパク質の有無、量の多寡を検出するための定性的な測定も含まれる。本明細書では、タンパク質量の相対的な測定のことを、タンパク質量の評価ということがある。
【００１０】
本発明のｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３をハウスキーピングタンパク質として用いる皮膚角質層中のタンパク質の測定例としては以下に示すものがある。
（１）皮膚角質層を含む試料中の全タンパク質量の測定において、ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量を測定することで試料中の全タンパク質の濃度に置き換えることができる。すなわち、ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３に対する抗体を用いて、ＥＬＩＳＡ法等により、試料中のｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量（例えばＥＬＩＳＡ発光強度）を求め、あらかじめ求めておいた全タンパク質の濃度とｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量との関係式に基づいて全タンパク質の濃度に補正換算することにより試料中の全タンパク質の濃度を求めることができる。なお、全タンパク質の相対量比較をする場合、全タンパク質量とｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量は比例関係にあるので、ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量を全タンパク質の相対量とすることもできる。
（２）皮膚角質層を含む試料中の特定のタンパク質の測定において、ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量を用いて特定のタンパク質の発現量を補正し、定量的な評価をすることができる。すなわち、測定対象・検査対象となる特定のタンパク質の発現量をｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量で除することにより、皮膚角質層の採取量を補正し、一定の皮膚角質層のタンパク質量に対する、特定のタンパク質の相対量を評価することができる。すなわち、Ｌｏｗｒｙ法等により全タンパク質の量を測定しなくても、ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量を測定すれば、異なる部位あるいは異なる被験者の皮膚角質層に存在する特定のタンパク質量の多寡を、比較評価できる。
さらに、（１）に記載した関係式により、ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅまたはｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量を全タンパク質量に換算し、その値を用いて特定のタンパク質の発現量を補正することにより、より正確に特定のタンパク質の相対量を評価することができる。
測定対象・検査対象となる特定のタンパク質としては、皮膚角質層中に存在するタンパク質であればいずれでも本発明を用いた測定をすることができ、例えばＨＳＰ２７、ＭＭＰ２、ｆｉｌａｇｇｒｉｎ等が挙げられる。
【実施例】
【００１１】
〔比較例１〕
Ｇ３ＰＤＨ、β−ａｃｔｉｎ発現量と角質層タンパク質量との相関性
一般的にハウスキーピングタンパク質として用いられるＧ３ＰＤＨ、β−ａｃｔｉｎの２種類のタンパク質について、これらのタンパク質の発現量と角質層中の全タンパク質量との相関性をＥＬＩＳＡ法を用いて調べた。
（１）試験方法
（１−１）サンプルの調整
被験者２８名の頬から５枚テープストリッピングを行い、２００μｌの０．１％ＳＤＳ／ＰＢＳで角質層タンパク質を抽出し、サンプルとして用いた。
（１−２）Ｇ３ＰＤＨ、β−ａｃｔｉｎの発現量の測定（ＥＬＩＳＡ法）
（ｉ）（１−１）で調整した被験者２８名の各サンプル（１０μｌ）と０．１％ＳＤＳ／ＰＢＳ（４０μｌ）を混合した溶液をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加し、４℃で一晩静置し、固相化した。
（ｉｉ）１％ＢＳＡ／ＰＢＳを各ウェルに１５０μｌずつ加え、３７℃、１時間ブロッキングを行った。
（ｉｉｉ）各ウェルに２００μｌずつ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳを入れて３回洗浄した。
（ｉｖ）１次抗体として抗Ｇ３ＰＤＨ抗体（Ａｂｆｒｏｎｔｉｅｒ社）、β−ａｃｔｉｎ（Ａｂｃａｍ  社）を用い、これらの抗体を０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで１０００倍希釈した抗体希釈液を前記各ウェルに添加して、３７℃，で１時間反応を行った。
（ｖ）各ウェルに２００μｌずつ０．０５  ％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳを入れて３回洗浄した。
（ｖｉ）２次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ社）を用い、本抗体を０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで１０００倍希釈した抗体希釈液を前記各ウェルに添加して、３７℃で１時間反応を行った。
（ｖｉｉ）各ウェルに２００μｌずつ０．０５  ％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳを入れて３回洗浄した。
（ｖｉｉｉ）ＥＣＬ＋（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を１００μｌ／ｗｅｌｌずつ添加し、５分間反応させて発光で検出した。検出は発光検出装置ＬＭａｘＩＩ３８４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いた。
（１−３）角質層中のタンパク質の定量
サンプル中の全タンパク質量の定量はＬｏｗｒｙ法で行った。サンプル５μｌと試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製Ｄｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）を混ぜ合わせて１５分間反応させた後、７５０ｎｍで吸光度を測定した。
（２）試験結果
角質層から抽出した全タンパク質量とＧ３ＰＤＨ、β−ａｃｔｉｎの発現量（ＥＬＩＳＡ発光強度）との相関を調べた結果を図１、図２に示す。Ｇ３ＰＤＨ発現量と全タンパク質量の関係は、Ｒ２＝０．３３、β−ａｃｔｉｎ発現量と全タンパク質量の関係は、Ｒ２＝０．０８であった。これらの結果より、Ｇ３ＰＤＨ、β−ａｃｔｉｎの発現量と角質層全タンパク質量との相関性が高くないことがわかった。従って、Ｇ３ＰＤＨ、β−ａｃｔｉｎは、角質層タンパク質測定におけるインターナルコントロールとしての有用性は低いと考える。
【００１２】
〔試験例１〕
角質層タンパク中での標準タンパク質の同定
被験者の頬の試料より抽出した角質層タンパク質を利用して、全タンパク質量を一定にして測定した場合常に発現量が一定となるタンパク質のスクリーニングを行った。
（１）試験方法
（１−１）サンプルの調整および角質層中のタンパク質の定量
参考例１に同じ。
（１−２）標準蛋白質マーカーの検索・同定
（１−１）で調整した被験者２８名の各サンプルを各レーン１μｇ分のタンパク質量になるように調整し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後、ゲルを銀染色して発現パターンがどのサンプルでも同じバンドを検索し、発現パターン（発現変動が見られない）が同じ４本のバンドについてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いて同定を行った。
（２）試験結果
上記試験方法により、角質層タンパク質量を同量にして電気泳動を行い、発現量が一定のバンドのタンパク質（４種類）を同定した。４種類のタンパク質は以下のとおりであった。なお、Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６２  ｈｏｍｏｌｏｇ、ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎについては市販の抗体がなかったため以下の試験対象からは外した。
・Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６２  ｈｏｍｏｌｏｇ
・ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅ
・ｋｅｒａｔｉｎ  ３
・ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ
【００１３】
〔実施例１〕
ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅ，ｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量と角質層タンパク質量との相関性
一定量のタンパク質中における発現量の変化が見られなかったｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅ、ｋｅｒａｔｉｎ  ３の２種類のタンパク質について、ＥＬＩＳＡ法を用いてこれらのタンパク質の発現量（ＥＬＩＳＡ発光強度）と角質層中の全タンパク質量との相関性を調べた。
（１）試験方法
（１−１）サンプルの調整
比較例１と同じ。
（１−２）ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅ，ｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量の測定（ＥＬＩＳＡ法）
１次抗体として抗ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅ抗体（Ｐｒｏｇｅｎ社）、抗Ｋｅｒａｔｉｎ３抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  社）を用いた以外は比較例１と同じ。
（１−３）角質層中のタンパク質の定量
比較例１と同じ。
（２）試験結果
角質層から抽出した全タンパク質量とｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅ、ｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量（ＥＬＩＳＡ発光強度）との相関を調べた結果を図３、図４に示す。ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅ発現量と全タンパク質量の関係は、Ｒ２＝０．７０９３、ｋｅｒａｔｉｎ  ３発現量と全タンパク質量の関係は、Ｒ２＝０．５２６６であった。これらの結果より、ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅ、ｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量と角質層全タンパク質量との相関性が高いことがわかった。従って、ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅ、ｋｅｒａｔｉｎ  ３をハウスキーピングタンパク質として用いることで角質層中のタンパク質を測定することができることがわかった。
図３の測定結果より、ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅの発現量を用いて、全タンパク質量は以下の式により求めることができる。
全タンパク質量（ｍｇ／ｍｌ）＝０．００２４４×ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅの発現量＋０．１９・・・（１）
図４の測定結果より、ｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量を用いて、全タンパク質量は以下の式により求めることができる。
全タンパク質量（ｍｇ／ｍｌ）＝０．００９２０×ｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量−０．３９・・・（２）
尚、上記の２つの計算式は、頬の角質層の測定結果から求めたが、腕の角質層についても適用できることを確認している。
【００１４】
〔実施例２〕
Ｌｏｗｒｙ法による補正と本発明の補正との比較
比較例１および試験例１において２８名の被験者から採取した皮膚角質層について、Ｌｏｗｒｙ法による全タンパク質量、ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅ、ｋｅｒａｔｉｎ  ３、Ｇ３ＰＤＨ，およびβ−ａｃｔｉｎの発現量（ＥＬＩＳＡ発光強度）を求めている。そこで、ｋａｌｌｉｋｌｅｉｎ  ７の発現量も測定し、すでに測定したＧ３ＰＤＨ，β−ａｃｔｉｎの発現量と併せた３種のタンパク質について、Ｌｏｗｒｙ法による全タンパク質量で除して補正して相対量を求めた場合と、ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅの発現量、ｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量から、実施例１の式（１），（２）により、全タンパク質量を求めて、その値で除して補正して相対量を求めた場合とを比較した。
（１）ｋａｌｌｉｋｌｅｉｎ  ７の発現量の測定方法（ＥＬＩＳＡ法）
１次抗体として抗ｋａｌｌｉｋｌｅｉｎ  ７抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた以外は比較例１と同じ方法により同じ被験者から採取した皮膚角質層について測定を行った。
（２）試験結果
結果を図５から１０に示す。ｋａｌｌｉｋｌｅｉｎ  ７、Ｇ３ＰＤＨ，β−ａｃｔｉｎの補正後の相対量について、Ｌｏｗｒｙ法による全タンパク質量で補正した相対量の小さい被験者から大きい被験者へと順番に並べた。（被験者によって、ｋａｌｌｉｋｌｅｉｎ  ７、Ｇ３ＰＤＨ、β−ａｃｔｉｎそれぞれの多寡は異なるので、それぞれについて被験者の並び順は異なる。）
図からわかるように、Ｌｏｗｒｙ法による全タンパク質量補正とｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅの発現量、ｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量から、実施例１の式により求めた全タンパク質量補正の結果は良く対応している。ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅを用いた補正とｋｅｒａｔｉｎ  ３を用いた補正を比較すると、ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅを用いた補正の方がＬｏｗｒｙ法による補正と良く対応している。
尚、ｋａｌｌｉｋｌｅｉｎ  ７、Ｇ３ＰＤＨ、β−ａｃｔｉｎの発現量をｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅ、ｋｅｒａｔｉｎ  ３の発現量で直接、除する補正も可能である。
【産業上の利用可能性】
【００１５】
ｋｅｒａｔｉｎ  ２ｅ、ｋｅｒａｔｉｎ  ３をハウスキーピングタンパク質として用いれば、皮膚角質層中のタンパク質を簡易、かつ正確に測定または評価することができる。
【図１】
2011185811.tif 000002
【図２】
2011185811.tif 000003
【図３】
2011185811.tif 000004
【図４】
2011185811.tif 000005
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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