【事件の表示】
　特願２０１３−５０４９６３「高力価、高純度のウイルスストックの作製方法及びその使用方法」拒絶査定不服審判事件〔平成２３年１０月２０日国際公開、ＷＯ２０１１／１３０１１９、平成２５年　６月１７日国内公表、特表２０１３−５２３１７５〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　手続の経緯
　本願は、平成２３（２０１１）年４月８日（パリ条約による優先権主張外国庁受理　２０１０年４月１４日　米国（ＵＳ））を国際出願日とする特許出願であって、平成２６年１２月８日付けで拒絶査定がされたところ、平成２７年４月１０日に拒絶査定不服審判の請求がされ、当審による平成２８年４月８日付け拒絶理由（以下、単に「拒絶理由」という）に応答して、同年１０月１１日に意見書および手続補正書が提出されたものである。
第２　本願発明
　本願の請求項１〜１７に係る発明は、平成２８年１０月１１日付け手続補正書により補正された特許請求の範囲の請求項１〜１７に記載された発明特定事項により特定されるものであるところ、その請求項１に係る発明（以下、「本願発明１」という）は、以下のとおりのものと認める。
「【請求項１】
　１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のタンパク質濃度を含む高純度マウスマイニュートウイルス（ＭＭＶ）ストック溶液の調製方法であって、前記方法は、
　（ａ）低血清条件下で増殖されたウイルス感染細胞の培養上清を採取し、それによりウイルスサンプルを得る工程、ここで、前記培養上清は、ウイルス誘導性細胞溶解後に採取される、
　（ｂ）限外ろ過により前記ウイルスサンプルを濃縮する工程、
　（ｃ）超遠心により前記ウイルスサンプル中のウイルスを沈殿させる工程、ここで、前記沈殿したウイルスが１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のタンパク質濃度を含む、及び
　（ｄ）前記沈殿したウイルスをクロマトグラフィーポリッシングに供し、痕跡量の不純物を除去する工程
の逐次工程を含み、それにより高純度ＭＭＶストック溶液を調製する、方法。」
第３　引用例
１．引用例１
　拒絶理由において「引用例５」として引用した、本願優先日前に頒布された刊行物であるBioProcess International,2005,Vol.3,No.10(Sup),p.40-44（以下、「引用例１」という）には、以下の事項が記載されている。
　なお、翻訳は当審によるものであり、下線は強調のため当審で付与したものである。以下、同様である。
（１−ａ）「モデルウイルスは、バイオプロセスにおいて最も遭遇しやすい大きさと型の範囲に及ぶように通常は選択される。
マイニュートマウスウイルス（ＭＭＶ）
（１−ｂ）「ＭＭＶストック調製の影響
　フィルター検証の研究に用いられるウイルスストックの調製及び分析のための標準的な手法の欠如は、研究室から研究室、もしくは一研究室の中のストックからストックにまで、汚染物質の量的又は質的な違いに繋がる可能性がある。ウイルスストックに存在する汚染物質の中には、成長培地によって持ち込まれた血清タンパク質、宿主細胞のタンパク質やＤＮＡ、並びに細胞壁の断片や脂質がある。ウイルス除去フィルターは通常は、そのような汚染物質が存在しない下流の精製プロセスにおけるある時点で実装される。仮に、汚染物質が製造プロセスにおいて代表するものでなく、ウイルスフィルターを詰まらせる可能性があり、観察される保持能力に影響する場合に、フィルター検証の研究においてよりクリーンなウイルスストックを用いることが望ましい。
　フィルター性能におけるウイルスストックの品質の効果を実証するために、我々は２つのＭＭＶ伝搬法を比較した（図２）。クルードな手法では（図２Ａ）、細胞は最小限の加工がなされる：凍結融解サイクルによる溶解と、それに続く大きな細胞の破片を除去するための低速遠心。そうすると、多くの上清の成分がウイルスストックに含まれる。「クリーンな」ＭＭＶストックの方法は文献１１が出典であり、クルードな方法とは最初のステップが異なる（図２Ｂ）。取得した細胞は遠沈され、結果として生じる上清はすぐに捨てられる。細胞はその後、細胞溶解のために、タンパク質を含まないＴＥ緩衝液（トリス＋エチレンジアミン四酢酸，ＥＤＴＡ）に再懸濁される。
サンプルはさらに２回以上の超遠心に供され、
　
図２Ｂに概要を示したクリーンなＭＭＶストックを生産するための方法
（１−ｃ）「
図２Ｂ：クリーンＭＭＶ調製方法
　感染細胞の取得及び１５００ｒｐｍでペレット化。
　　　　　　　　　↓
　上清を廃棄（培養培地）。細胞ペレットをＴＥ，ｐＨ８．７で再懸濁。
　　　　　　　　　↓
　
ウイルスを放出するため３回の細胞懸濁物の凍結融解。
　　　　　　　　　↓
　
細胞懸濁物を１５０００ｒｐｍで２０分間遠心。上清を取得。
　　　　　　　　　↓
 
８３１００ｇで１８時間遠心。ウイルスペレットをＴＥ，ｐＨ８．７に再懸濁。
（１−ｄ）「表１：クルード及びクリーンＭＭＶストックの比較（総タンパク質量の決定のためにバイオラッドＤＣプロテインアッセイが使用された）
　　　　　　　　　　　　　　クルードＭＭＶ　　　　クリーンＭＭＶ
――――――――――――――――――――――――――――――――――
Ｌｏｇ１０ストック力価　　　　８．４±０．５　　　１０．０±０．５
（ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）
感染したフラスコあたりの　　９．８±０．５　　　　９．２±０．５
Ｌｏｇ１０全ウイルス
ストック中の全タンパク質　　１．７±０．１　　　　０．６±０．４
（ｍｇ／ｍＬ）
正規化されたタンパク質量　　５．３５±１．３　　　０．０４±０．０２
（ｐｇ／ＴＣＩＤ
５０
）
」（表１）
　上記記載事項（１−ａ）〜（１−ｄ）の下線部分より、引用例１には、マイニュートマウスウイルス（ＭＭＶ）に感染した細胞懸濁物の凍結融解によりウイルスを放出させ、細胞懸濁液を１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心して上清を取得した後、８３，１００ｇで１８時間超遠心してウイルスペレットを得る、タンパク質濃度が０．０４±０．０２ｐｇ／ＴＣＩＤ５０であるクリーンＭＭＶストックの調製方法が記載されているといえる。
　そうすると、引用例１には、次の発明（以下、「引用発明」という）が記載されていると認められる。
「タンパク質濃度が０．０４±０．０２ｐｇ／ＴＣＩＤ５０であるマイニュートマウスウイルス（ＭＭＶ）ストックの調製方法であって、
　ＭＭＶに感染した細胞懸濁物の凍結融解によりウイルスを放出させ、細胞懸濁液を１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心して上清を取得した後、
　８３，１００ｇで１８時間超遠心してウイルスペレットを得る、方法。」
２．引用例２
　拒絶理由において「引用例２」として引用した、本願優先日前に頒布された刊行物であるCytotechnology,1999,Vol.30,p.169-172（以下、「引用例２」という）には、以下の事項が記載されている。
（２−ａ）「血清含有培地でのマイクロキャリアの培養とは対照的に、
血清非含有の培地における浮遊細胞増殖に適合した細胞は、１００〜１０００リットルの撹拌槽型バイオリアクターのような大規模な製造システムでスケールアップすることがより簡単である。
３．引用例３
　拒絶理由において「引用例３」として引用した、本願優先日前に頒布された刊行物であるCytotechnology,1998,Vol.28,p.81-89（以下、「引用例３」という）には、以下の事項が記載されている。
（３−ａ）「我々は、臨床試験のための治療的導入遺伝子を発現する組換えアデノウイルスベクターのための、効率的で再現性のある拡張可能な細胞培養プロセスを開発した。ＨＥＫ２９３細胞−Ｅ１の欠失したアデノウイルスの伝搬をサポートする−が、
無血清培地及び浮遊細胞増殖に最初に適用された。
４．引用例４
　拒絶理由において「引用例４」として引用した、本願優先日前に頒布された刊行物である特表２００７−５１５１７２号公報（以下、「引用例４」という）には、以下の事項が記載されている。
（４−ａ）「本発明は、細胞（例えば、Ａ５４９細胞）を適応させて、無血清および無動物材料培地懸濁培養において成長させるための方法を提供する。
本発明は、無血清および無動物材料培地懸濁培養における成長のために適応化された上記Ａ５４９細胞由来であるウイルス（例えば、アデノウイルス）を調製するための方法を提供する。
５．引用例５
　拒絶理由において「引用例１」として引用した、本願優先日前に頒布された刊行物である特表２０００−５１４２９０号公報（以下、「引用例５」という）には、以下の事項が記載されている。
（５−ａ）「実施例４：
上清中のウイルス作製
  本実施例は
自然放出後の回収によるウイルス作製実験
  ４．１．プロトコール
  本方法では実施例３と異なり、
細胞を感染後４０〜７２時間で回収せず、凍結−融解サイクルを実施する必要なしに細胞の完全溶解を得るように、インキュベーションを８〜１２日間続ける。
  その後、漸減細孔径（１０μｍ／１．０μｍ／０．８〜０．２μｍ）のディープフィルターで濾過して
上清を清澄化する。
（５−ｂ）「実施例５：限外濾過及びイオン交換によるウイルス精製
  本実施例は、濃縮液に含まれるアデノウイルスを如何にして非常に高い収率で単一イオン交換クロマトグラフィー段階で直接精製できるかを示す。
  ５．１．プロトコール
  従って、本実験では、出発材料は実施例４に記載した濃縮液（又は限外濾渣）から構成する。この濾渣はＰＢＳバッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＭリン酸、ｐＨ７．２）中５〜５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１０〜３０ｍｇ／ｍｌの全タンパタ質濃度をもつ。
  ２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び１０％グリセロールを含有するＴｒｉｓ／５０ｍＭ  ＨＣｌバッファー(ｐＨ８．０)(バッファーＡ)で平衡化したＳｏｕｒｃｅ  Ｑ１５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を入れたカラムにウイルス調製物から得られた限外濾過上清を注入する。バッファーＡ１０カラム容量でリンスした後、直線流速６０〜３００ｃｍ／時、より好ましくは１２ｃｍ／時で２５カラム容量でＮａＣｌの直線勾配（２５０ｍＭ→１Ｍ）を用いて吸着種を溶離する。２６０ｎｍで得られた典型的溶離プロフィルを図４に示す。ウイルス粒子を含むフラクションを集める。このフラクションは対称な細いピークに対応し、その保持時間は限外濾過により精製したウイルス粒子調製物で得られる保持時間に一致する。上記条件下では、ウイルス粒子ピークの優れた分離を維持しながら、Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑ１５樹脂１ｍｌ当たり最低３０ｍｇの全タンパク質を注入することが可能である。」（３７頁１８行目〜３８頁１２行目）
６．引用例６
　拒絶理由において「引用例６」として引用した、本願優先日前に頒布された刊行物である特表２００６−５１４５３８号公報（以下、「引用例６」という）には、以下の事項が記載されている。
（６−ａ）「
アデノウイルス粒子は、培養上清から回収することができるが、溶解後の細胞から回収することもでき、
７．引用例７
　拒絶理由において「引用例７」として引用した、本願優先日前に頒布された刊行物である特表２００３−５２３１６９号公報（以下、「引用例７」という）には、以下の事項が記載されている。
（７−ａ）「実施例７：Ｑ Sepharose（登録商標）ＸＬ樹脂上クロマトグラフィによるウイルスの精製
  出発原料は、ウイルス生産性カプシド化細胞を凍結−解凍して得られた培養溶解液か、または
細胞の自動溶解後に得られた上澄液
  本実施例で報告された実験では、
４．９×１０
１２
個の粒子を含有するＡＶ
１．０
ＣＭＶ．ＬａｃＺウイルスに感染したＰＥＲ．Ｃ６細胞の培養物の自動溶解液
８．引用例８
　拒絶理由において「引用例９」として引用した、本願優先日前に頒布された刊行物であるDesalination,2010,Vol.250,p.1121-1124(Available online 13 October 2009)（以下、「引用例８」という）には、以下の事項が記載されている。
（８−ａ）「高性能タンジェンシャルフローろ過を用いたマウスマイニュートウイルスの精製」（タイトル）
（８−ｂ）「膜技術は、過去２０年間、主力となる分離技術であることが証明されている。膜技術の主要な利点は、化学物質を添加しないで適用できること及び比較的低いエネルギー使用である。最近の適用として、膜技術はバイオテクノロジープロセスにおいて広く使用されてきた。細胞の取得とウイルスの精製／除去は、バイオ医薬製品の多くの下流の精製における重要なプロセスである。
この課題では、細胞培養ブロスからのウイルスの精製に限外濾過（ＵＦ）が用いられた。最近では、ＵＦがネッタイシマカ及びウイルス様粒子のような他のウイルスの精製のための強力なツールであることが示されている。より正確には、高性能タンジェンシャルフローろ過（ＨＰＴＦＦ）が用いられる。
（８−ｃ）「本研究で用いたウイルスは、平均直径が２２−２６ｎｍで正二十面体対称のパルボウイルスであるマウスマイニュートウイルス（ＭＭＶ）であった。実験は、３００，１００，５０ｋＤａのザルトリウス膜で行われた。得られた結果は、
５０又は１００ｋＤａの膜を用いるとウイルス粒子は除外される一方、３００ｋＤａの膜はウイルス粒子の進路を透過液の中に向かわせることを示す。
（８−ｄ）「
」（図１．高性能タンジェンシャルフローろ過システム。５０ｋＤａ、１００ｋＤａ及び３００ｋＤａのＰＥＳ膜が使用された。実験は１５０ｍＬ／分の流速で行われた。）
第４　対比
　本願発明１と引用発明を対比する。
　引用発明のタンパク質濃度０．０４±０．０２ｐｇ／ＴＣＩＤ５０を換算すると４０±２０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０であり、１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満の高純度であることから、引用発明の「タンパク質濃度が０．０４±０．０２ｐｇ／ＴＣＩＤ５０であるマイニュートマウスウイルス（ＭＭＶ）ストックの調製方法」は、本願発明１の「１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のタンパク質濃度を含む高純度マウスマイニュートウイルス（ＭＭＶ）ストック溶液の調製方法」に相当する。
　また、引用発明の「細胞懸濁液を１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心して上清を取得」は、本願発明１の「ウイルス感染細胞の培養上清を採取し、それによりウイルスサンプルを得る」に相当する。
　そして、引用発明の「８３，１００ｇで１８時間超遠心してウイルスペレットを得る」は、本願発明１の「超遠心により前記ウイルスサンプル中のウイルスを沈殿させる」に相当し、さらに、引用発明は、超遠心してウイルスペレットを得て、タンパク質濃度０．０４±０．０２ｐｇ／ＴＣＩＤ５０（１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満）を達成していることから、本願発明１と同じく「ここで、前記沈殿したウイルスが１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のタンパク質濃度を含む」ことは明らかである。
　そうすると、両者は
「１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のタンパク質濃度を含む高純度ウイルスストック溶液の調製方法であって、前記方法は、
（ａ）ウイルス感染細胞の培養上清を採取し、それによりウイルスサンプルを得る工程、
及び
（ｃ）超遠心により、前記ウイルスサンプル中のウイルスを沈殿させる工程、ここで、前記沈殿したウイルスが１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のタンパク質濃度を含む、
の逐次工程を含み、それにより高純度ウイルスストック溶液を調製する、方法。」
である点で一致し、以下の４点で相違する。
相違点１：
　本願発明１は、（ａ）の工程として、低血清条件下で増殖されたウイルス感染細胞の培養上清を採取しているのに対して、引用発明はウイルス感染細胞に関する特定を有しない点。
相違点２：
　本願発明１は、（ａ）の工程として、培養上清がウイルス誘導性細胞溶解後に採取されるのに対して、引用発明はＭＭＶに感染した細胞懸濁物の凍結融解によりウイルスを放出させている点。
相違点３：
　本願発明１は、（ｂ）の工程として、限外ろ過により前記ウイルスサンプルを濃縮するのに対して、引用発明はかかる工程の特定を有しない点。
相違点４：
　本願発明１は、（ｄ）の工程として、沈殿したウイルスをクロマトグラフィーポリッシングに供し、痕跡量の不純物を除去するのに対して、引用発明はかかる工程の特定を有しない点。
第５　当審の判断
　上記相違点１〜４について検討する。
相違点１について：
　上記記載事項（２−ａ）、（３−ａ）及び（４−ａ）の下線部分に記載されているように、細胞に感染させてウイルスを製造する方法において、精製の容易化及びより制御された培養のために無血清培地を用いることは、本願優先日前当業者の周知技術である。
　そうすると、引用発明において、ウイルスの精製の容易化及びより制御された培養のために無血清培地を用いることは、当業者であれば容易になし得るものである。
相違点２について：
　上記記載事項（５−ａ）、（６−ａ）及び（７−ａ）の下線部分より、細胞溶解を起こした後にウイルスを回収することは、本願優先日前当業者の周知技術である。
　そうすると、引用発明において、上記周知技術を適用し、凍結融解法によりウイルスを回収することに代えて、細胞溶解を起こした後にウイルスを回収することは、当業者であれば容易に想到し得るものである。
相違点３について：
　上記記載事項（８−ａ）〜（８−ｄ）には、高性能タンジェンシャルフローろ過を用いてＭＭＶを精製したことが記載されており、特に上記記載事項（８−ｃ）の下線部分は、マイニュートマウスウイルス粒子が５０ｋＤａまたは１００ｋＤａである膜を透過しないことを意味しており、さらに上記記載事項（８−ｄ）の図１に「Ultrafiltration module」、すなわち限外濾過モジュールが開示されていることから、分子量カットオフが５０ｋＤａまたは１００ｋＤａの限外ろ過膜を用いてウイルス粒子が保持できたことを意味しているものと認められる。
　そして、一般にウイルスストックの調製において、より高純度のものを調製しようとすることは当該技術分野の当業者にとって自明の課題であること、また、上記記載事項（８−ｂ）の下線部分において、限外ろ過、より正確には高性能タンジェンシャルフローろ過を用いたと記載されていることを考慮すれば、引用発明において、さらに限外ろ過でウイルスを精製することは、当業者であれば容易に想到し得るものである。
相違点４について：
　本願発明１の「クロマトグラフィーポリッシング」について、本願の発明の詳細な説明の【００３９】には以下の記載がある。
「本明細書で使用されるとき、「クロマトグラフィーポリッシング」は、ウイルスの大部分を通過させる一方で、不純物をその静電荷又は疎水性に基づき保持する媒体にサンプルを通過させることにより、痕跡量の不純物を除去することを指す。クロマトグラフィーポリッシングは、典型的にはウイルス沈殿によって除去されない不純物を除去する。一実施形態では、
ウイルスはフロースルークロマトグラフィーポリッシング（例えば、陽イオン交換（ＣＥＸ）膜吸着体、又はＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標）などの陰イオン交換媒体を使用する）に供される。
他のクロマトグラフィーポリッシング方法、例えば他の膜吸着体（例えば、Ｐａｌｌ  Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｓ）；適切なケミストリー（ウイルス及び緩衝液条件に依存してＳ又はＱ）によるビーズベースのクロマトグラフ媒体；サイズ排除媒体；疎水性に基づく媒体）を用いることができる。
　上記記載から、本願発明１の「クロマトグラフィーポリッシング」は、フロースルークロマトグラフィーに加えて、膜吸着体、ビーズベースのクロマトグラフ媒体、サイズ排除媒体又は疎水性に基づく媒体を用いた多様なクロマトグラフィーの形態を包含するものと認められる。
　一方で、上記記載事項（５−ｂ）に記載されているように、限外ろ過で精製されたウイルスをイオン交換クロマトグラフィーでさらに精製することは当業者が通常行う常套手段であって、ウイルスストックの調製において、より高純度のものを調製しようとすることは当該技術分野の当業者にとって自明の課題であることを考慮すれば、引用発明において、さらなるクロマトグラフィーによる精製手段を追加して、痕跡量の不純物を除去することに格別の技術的困難性は認められず、当業者であれば適宜なし得るものである。
　そして、本願発明１の効果について、「第４　対比」で述べたとおり、引用発明の方法を用いて、既に１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のタンパク質濃度を含む高純度ウイルスストック溶液が調製できることから、格別顕著なものとはいえない。
　この点に関して、平成２８年１０月１１日付け意見書において審判請求人は、本発明の方法と引用例１（意見書では引用例５）の方法を比較した表１を示した上で、以下の点を主張している。
「引用例５の方法では、タンパク質／ウイルス比（即ち、タンパク質濃度）を一貫して、本発明に係る１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満として得られることはなく、それどころか、タンパク質／ウイルス比は、５９〜５５２ｆｇ／ＴＣＩＤ５０の間で大きく変動することが理解できます。一方、本発明の方法では一貫して、タンパク質／ウイルス比を、本発明に係る１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満である３０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０以下として得ることができます。従って、本発明の方法は、従来技術の課題であるウイルスストックの収率が変動することに対する解決手段を提供し、本発明の方法により得られるウイルスストックを用いると、精度の高いウイルスクリアランス結果を得ることができます。」
　しかしながら、「第４　対比」で述べたとおり、引用発明は、超遠心してウイルスペレットを得ることでタンパク質濃度０．０４±０．０２ｐｇ／ＴＣＩＤ５０（換算すると４０±２０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０）を既に達成しており、上記意見書の表１においても、いくつかのバッチにおいて本願発明１が規定する１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満を達成している。
　そして、本発明の方法では一貫して、タンパク質／ウイルス比を、本発明に係る１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満である３０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０以下として得ることができるという主張は、本願発明１が１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満と規定されている限り、特許請求の範囲の記載に基いていないものであるから、採用の限りではない。
　したがって、本願発明１は、引用例１，８に記載された発明及び引用例２〜７に記載された周知技術・常套手段に基いて当業者が容易に発明をすることができたものである。
第６　結び　
　以上のとおりであるから、本願請求項１に係る発明は、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであり、他の請求項に係る発明について論及するまでもなく、本願は拒絶すべきものである。　
　よって、結論のとおり審決する。