(57)【要約】【課題】試料濃度が高い場合における濃度と蛍光強度との関係の非直線性を改善し、測定のダイナミックレンジを向上させる。【解決手段】測定対象の試料の濃度が高いことが分かっている場合には、励起光Ｌex通過方向に短い開口６ｂの光束制限部６を用い、励起光入射端部に近い領域から発した蛍光のみを集光レンズ７で集光して蛍光側分光器４に導入して検出する。この場合、試料液Ｓで強い吸収を受けた励起光が通過する領域から発する蛍光は測定結果に反映されないので、蛍光量は減るものの濃度と蛍光強度との関係の直線性が良好になり、高い濃度での定量精度が向上する。試料濃度が低い場合には、感度を重視して励起光Ｌex通過方向に長い開口６ａの光束制限部６を用いればよい。【選択図】図１
2011043332.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を内部に保持する試料セルと、該試料セルに励起光を照射する励起光学系と、該励起光に対して試料から放出される蛍光を検出する蛍光測定光学系と、を具備する蛍光検出器において、
前記試料セル中での励起光の通過方向に所定長さの開口を有し、試料から放出された蛍光のうち前記開口を通過しない蛍光を遮るべく前記試料セルに近接して配設される光束制限手段と、該光束制限手段の開口を通過した蛍光を集光して前記蛍光測定光学系に導入する集光手段と、を一対とする蛍光調整光学系を有し、
前記開口の長さを少なくとも２種類以上に選択可能であるように前記蛍光調整光学系を交換する又は切り替える機構を備えることを特徴とする蛍光検出器。
【請求項２】
請求項１に記載の蛍光検出器であって、
前記光束制限手段は、開口長に依らず、前記試料セルへの励起光の入射端部側から放出される蛍光が通過可能なような開口を有することを特徴とする蛍光検出器。
【請求項３】
請求項２に記載の蛍光検出器であって、
前記蛍光調整光学系は一体化された部材であり、その部材を交換することにより前記開口の長さを少なくとも２種類以上に選択可能としたことを特徴とする蛍光検出器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主として液体クロマトグラフやフローインジェクション分析装置などに用いられる、試料に励起光を照射し該試料から放出される蛍光を検出する蛍光検出器に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的な蛍光検出器は、励起側分光器で取り出した特定波長の励起光を測定対象の試料液が収容された試料セルに照射し、試料液から放出された蛍光を蛍光側分光器を通して波長分散させて光検出器に導入して検出する、という構成を有する。試料セルとしては、通常、石英ガラスなどから成る角型セルが用いられるが、液体クロマトグラフやフローインジェクション分析装置の検出器として用いられる場合にはフローセルが用いられる。
【０００３】
図５は一般的な蛍光検出器の光学系の概略図である（特許文献１など参照）。石英ガラス等の透明部材からなるフローセル３には、例えば液体クロマトグラフのカラムを通過した試料液Ｓが流通される。光源部１から発した光の中の特定の波長光が励起側分光器２で取り出され、励起光Ｌexとしてフローセル３に照射される。試料液中の目的成分は励起光Ｌexにより励起され、それにより放出された蛍光Ｌmがフローセル３を透過して蛍光側分光器４に達する。特定の波長を有する蛍光が蛍光側分光器４により取り出され、検出器５によりその蛍光強度が検出される。
【０００４】
上記のような構成では、フローセル３に入射する励起光Ｌexは試料液Ｓ中を通過する間に、その試料液Ｓにより吸収・減衰される。そのため、フローセル３の長手方向で奥側（励起光Ｌex入射位置から遠い領域）から発生する蛍光Ｌmは、その手前側（励起光Ｌex入射位置に近い領域）から発生する蛍光Ｌmよりも弱い。試料液Ｓによる励起光Ｌexの吸収・減衰の度合は試料濃度が高いほど大きい。そのため、試料濃度が高くなるに伴い、試料濃度と検出される蛍光強度との関係の直線性が悪くなる。図６は試料濃度と蛍光強度との関係を示す概略グラフであるが、試料濃度が高くなるほど、点線で示した直線からの乖離が大きくなる。
【０００５】
蛍光検出器では一般に、予め、既知濃度の標準試料を測定した結果を用いて検量線を作成し、その検量線を参照して未知試料の試料濃度を求める。通常、検量線は試料濃度と蛍光強度との関係がほぼ直線的に近似できるとの前提に基づいて作成されるため、上記のように両者の関係の直線性が悪くなると、濃度の算出精度が悪くなる。特に、高濃度の試料では蛍光強度が飽和する傾向にあるため、濃度が高くなるほどその濃度値は正確性を欠き、結果的に測定のダイナミックレンジが十分に得られないことになる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−１１６４２４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、その目的とするところは、試料濃度が高い場合であっても試料濃度と蛍光強度との関係の直線性を改善し、測定のダイナミックレンジを向上させることができる蛍光検出器を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために成された本発明は、試料を内部に保持する試料セルと、該試料セルに励起光を照射する励起光学系と、該励起光に対して試料から放出される蛍光を検出する蛍光測定光学系と、を具備する蛍光検出器において、
前記試料セル中での励起光の通過方向に所定長さの開口を有し、試料から放出された蛍光のうち前記開口を通過しない蛍光を遮るべく前記試料セルに近接して配設される光束制限手段と、該光束制限手段の開口を通過した蛍光を集光して前記蛍光測定光学系に導入する集光手段と、を一対とする蛍光調整光学系を有し、
前記開口の長さを少なくとも２種類以上に選択可能であるように前記蛍光調整光学系を交換する又は切り替える機構を備えることを特徴としている。
【０００９】
ここで、励起光学系は、光源、励起側分光器などを含み、蛍光測定光学系は、蛍光側分光器、光検出器（光電子増倍管など）などを含むものとすることができる。試料セルは、試料溶液が流通するフローセルでもよいし、試料溶液が収容される角型等のセルでもよい。また、試料セルは、励起光学系から到来する励起光が試料溶液中を一方向のみに通り抜けるものであってもよいし、励起光入射端と反対側の端部にミラーを備え、試料溶液中を通過した励起光がミラーで反射されて再び試料溶液中を反対方向に通過する（つまりは試料溶液中を励起光が往復する）構成のものでもよい。
【００１０】
本発明に係る蛍光検出器において、前記光束制限手段は、開口長に依らず、前記試料セルへの励起光の入射端部側から放出される蛍光が通過可能なような開口を有する。また、集光手段は、開口の長さや位置に応じて異なる入射光を適切に蛍光測定光学系に導入するように、異なる光学特性や光学配置を有する。例えば集光手段としては集光レンズを用いることができる。
【００１１】
本発明に係る蛍光検出器を用いた蛍光分析では、測定しようとしている試料の試料濃度が全体的に高い範囲にあることが分かっている場合に、分析者は、相対的に短い開口長の光束制限手段を含む蛍光調整光学系を用いて測定を実施する。即ち、該蛍光調整光学系を搭載した装置で既知濃度の試料を測定して検量線を作成し、その検量線を用いて未知試料の定量分析を行う。開口長が短い光束制限手段を用いた場合、試料セルの励起光入射端部に近い領域、つまり励起光により蛍光が十分に発生する領域から放出される蛍光は開口を通過するが、励起光入射端部から遠い領域から放出される蛍光は遮蔽される。そのため、試料濃度の変化に対して強度変化が小さな蛍光が測定結果に反映されなくなるので、結果的に、試料濃度に対する蛍光強度の直線性が向上する。それにより、濃度が高い範囲における濃度算出の精度が向上する。
【００１２】
また、一部の蛍光を遮蔽するために蛍光の利用効率は下がるが、開口を通過した蛍光を集光手段により効率よく蛍光測定光学系に導入するので、開口長が長い場合に比べても蛍光測定光学系に入射する蛍光の量の大幅な減少を抑えることができる。それにより、十分な感度での測定を行うことができる。
【００１３】
一方、測定しようとしている試料の試料濃度が全体的に低い範囲にあることが分かっている場合に、分析者は、相対的に長い開口長の光束制限手段を含む蛍光調整光学系を用いて測定を実施する。この場合には、短い開口長の光束制限手段を含む蛍光調整光学系を用いた場合とは逆に、試料濃度に対する蛍光強度の直線性は劣るものの、低い濃度範囲であれば直線性が高い範囲を利用することができ、且つ、蛍光の利用効率が高いので、低い濃度の試料を高感度で測定することができる。
【００１４】
本発明に係る蛍光検出器の一態様として、前記蛍光調整光学系は一体化された部材であり、その部材を交換することにより前記開口の長さを少なくとも２種類以上に選択可能とした構成とすることが好ましい。即ち、所定の開口長の光束制限手段とその開口長に応じた光学特性を有するとともに配置とされた集光手段とを一体化した構成とする。
【００１５】
この構成によれば、一体化された蛍光調整光学系部材以外、例えば励起光学系、蛍光測定光学系、試料セルなどは共通とし、装着する蛍光調整光学系部材を交換するのみで、試料濃度に応じた適切な測定が可能な状態とすることができる。したがって、分析者にとっては作業が簡単であり、面倒な調整なども不要である。
【発明の効果】
【００１６】
以上のように、本発明に係る蛍光検出器によれば、試料濃度が高い場合であっても試料濃度と蛍光強度との関係の直線性が改善されるので、検量線に基づいて算出される試料濃度の精度を向上させることができる。それにより、結果的に、測定可能な試料濃度の上限を上げ、測定のダイナミックレンジを向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の一実施例による蛍光検出器の光学系の概略構成図。
【図２】図１の光学系を具体化した構成を示す図。
【図３】図２中の蛍光調整光学ユニットの外観図及び断面図。
【図４】光束制限部の開口の長さの相違による試料濃度と蛍光強度との関係の相違を示すグラフ。
【図５】従来の一般的な蛍光検出器の光学系の概略構成図。
【図６】従来の蛍光検出器における試料濃度と蛍光強度との関係を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の一実施例である蛍光検出器について、添付図面を参照して説明する。図１は本実施例による蛍光検出器の光学系の概略構成図、図２はこの実施例による蛍光検出器の光学系の具体的な構成図、図３は図２中の蛍光調整光学ユニットの外観図及び断面図である。
【００１９】
図１中の構成要素のうち、既に説明した図５中の構成要素と同一のものには同じ符号を付している。図１と図５とを比較すれば分かるように、本実施例の蛍光検出器では、フローセル３と蛍光側分光器４との間に、光束制限部６と集光レンズ７とが配置されている。光束制限部６は励起光Ｌexの通過方向（図１では左右方向）に沿って所定長さの開口６ａ（又は６ｂ）を有し、フローセル３中の試料液Ｓから放出された蛍光のうち、開口６ａ（６ｂ）を通過した蛍光のみが集光レンズ７に導入され、集光レンズ７で集光されて凹面鏡１２を経て蛍光側分光器４に導入される。蛍光側分光器４では、入射スリット４１を通して導入された蛍光が凹面回折格子４２で波長分散され、特定波長を有する蛍光のみが出射スリット４３を通して検出器５に到達する。
【００２０】
図１（ｂ）は励起光Ｌexの通過方向における長さが長い開口６ａを有する光束制限部６を装着した場合であり、図１（ａ）は励起光Ｌexの通過方向における長さが短い開口６ｂを有する光束制限部６を装着した場合である。開口６ａ、６ｂの紙面に直交する方向の幅は同一である。図１（ｂ）の場合、フローセル３中の試料液Ｓから放出される蛍光のほぼ全てが集光レンズ７を通して蛍光側分光器４に導入される。これは実質的に図５に示した従来の一般的な蛍光検出器の構成と相違ない。これに対し、図１（ａ）の場合、開口６ｂは励起光Ｌexの入射端部側にのみ存在しているため、励起光Ｌexの入射端部から離れた領域、即ち、励起光Ｌexが試料液Ｓ中を或る程度以上進行したあとの領域から放出される蛍光は光束制限部６で遮蔽されて集光レンズ７に入射しない。したがって、図１（ａ）で明らかなように、励起光Ｌexの入射端部に近い領域から発せられた蛍光のみが、検出器５で検出される蛍光強度に反映される。つまり、試料濃度が高い場合に、励起光Ｌexが途中で吸収されてしまうために十分に行き届かないような領域から発する蛍光は蛍光強度に反映されずに捨てられる。
【００２１】
図２に示すように、透明なフローセル３は遮光性を有するセルハウジング１０の内部に収容され、セルハウジング１０に組み込まれた集光レンズ１１によりフローセル３の入射端面に励起光が入射される。図２では記載していないが、フローセル３にはその側面（図２中の手前側の面又は向こう側の面）に試料液の導入口、導出口が設けられている。セルハウジング１０には、光束制限部６と集光レンズ７とが一体化された部材である蛍光調整光学ユニット２０が取り外し自在に装着されるようになっている。図１に示した、励起光Ｌexの通過方向における長さが相違する開口６ａ、６ｂの選択は、蛍光調整光学ユニット２０自体を交換することにより実施される。
【００２２】
図３（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は蛍光調整光学ユニット２０の左面図、正面図、右面図であり、（ｄ）は（ａ）中のＡ−Ａ’矢視断面図である。これら図は、比較的濃度が低い試料を測定する場合に適した標準ユニットを示すものである。
【００２３】
蛍光調整光学ユニット２０は、有底円筒形状であって樹脂製のレンズホルダ２１と、凸レンズである集光レンズ７と、弾性を有するＯリング２２と、から成る。蛍光調整光学ユニット２０がセルハウジング１０に装着された状態では、レンズホルダ２１の底面板２１ａはフローセル３に接し、この底面板２１ａ自体が光束制限部６となっている。この底面板２１ａに穿設された孔２１ｂが開口６ａ（又は６ｂ）である。集光レンズ７はレンズホルダ２１の内部に収納され、Ｏリング２２をレンズホルダ２１の内周壁に形成された溝に嵌め込むことにより、Ｏリング２２が集光レンズ７を押圧し、その位置が固定される。
【００２４】
図３（ｃ）では孔２１ｂ（開口６ａ）の長さＬ1は４mmである。一方、図３（ｅ）は高濃度試料測定用ユニットの右面図であり、孔２１ｂ（開口６ｂ）の長さＬ2はＬ1よりも短い１．５mmである。図２から明らかなように、孔２１ｂ（開口６ａ、６ｂ）の長さが相違すると、集光レンズ７に入射する蛍光の入射角度範囲や蛍光の発生範囲が相違するのに対し、凹面鏡１２は常に一定位置の入射スリット４１に対して蛍光を集光する必要がある。そのため、集光レンズ７の光学特性（例えば焦点距離など）や光束制限部６と集光レンズ７との離間距離などの光学配置も、孔２１ｂの長さの相違に応じて変更される。つまり、光束制限部６と集光レンズ７とは一対であって、蛍光調整光学ユニット２０自体を交換することで、光束制限部６とこれに適合した集光レンズ７とが一体で交換されることになる。
【００２５】
図４は上述した２種類の、つまり高濃度試料測定用ユニット（図３（ｅ））及び標準ユニット（図３（ｃ））を使用したときの試料濃度と蛍光強度との関係を実測したグラフである。試料は硫酸キニーネである。図では２本のカーブの曲がり度合いを分かり易くするために、点線で直線関係を示している。
【００２６】
高濃度試料測定用ユニットを用いた場合、試料液Ｓから発せられた蛍光の一部を光束制限部（底面板２１ａ）６により意図的に遮蔽しているため、標準ユニットを用いた場合に比べて、蛍光強度は全体的に低くなっている。一方、標準ユニットでは非直線性が大きく、比較的高い濃度の範囲において直線関係から大きくずれているのに対し、高濃度試料測定用ユニットではこの直線性が改善され、高い濃度範囲まで良好な直線関係が維持されている。これは高濃度試料測定用ユニットを用いた場合には、図１（ａ）に示したように、励起光入射端部から遠い領域から発する蛍光が最終的な蛍光強度に反映されないため、試料液Ｓによる励起光Ｌexの吸収の影響が試料濃度と蛍光強度との関係に殆ど現れないためである。これにより、高濃度試料測定用ユニットをセルハウジング１０に装着した状態で既知濃度の試料を用いて検量線を作成し、該検量線を用いて未知試料の定量を行うことにより、高い濃度範囲でも高い精度で蛍光強度から試料濃度を算出可能であることが理解できる。
【００２７】
上記のような検量線は低い濃度範囲でも利用することができるが、上述したように高濃度試料測定用ユニットを用いた場合には蛍光強度自体が若干低くなるため、低濃度範囲ではＳＮ比等において不利である。したがって、試料濃度が比較的低い場合には、標準ユニットを使用するとよい。即ち、標準ユニットをセルハウジング１０に装着した状態で既知濃度の試料を用いて検量線を作成し、該検量線を用いて未知試料の定量を行うことにより、高い精度で且つ高い感度で蛍光強度から試料濃度を算出可能である。
【００２８】
即ち、本実施例の蛍光検出器を用いた測定において、測定しようとしている試料の濃度が高いことが予め分かっている場合には、分析者は、高濃度試料測定用ユニットをセルハウジング１０に装着して測定を行う。一方、測定しようとしている試料の濃度が低いことが予め分かっている場合や試料濃度が全く不明である場合には、分析者は、標準ユニットをセルハウジング１０に装着して測定を行う。後者の場合に、未知試料の測定結果から試料濃度が高いことが分かった場合には、定量の正確性を高めるために、高濃度試料測定用ユニットをセルハウジング１０に装着して、検量線の採取作業から再測定を行うとよい。このようにして、試料濃度が高い場合でも、従来よりも高い精度で濃度の算出を行うことが可能となる。
【００２９】
上記実施例では、励起光Ｌexの通過方向の開口の長さを２種類としていたが、開口の長さの種類をさらに増やすようにしてもよいことは明らかである。また、蛍光調整光学ユニット自体を交換するのではなく、手動や自動で光束制限部６の開口の長さを切替え可能な構成とし、その切替えと同期して集光レンズ等の集光手段も切り替える構成としてもよい。
【００３０】
また上記実施例は本発明の一例であり、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。
【符号の説明】
【００３１】
１…光源部
２…励起側分光器
３…フローセル
４…蛍光側分光器
５…検出器
６…光束制限部
６ａ、６ｂ…開口
７…集光レンズ
Ｓ…試料液
１０…セルハウジング
１１…集光レンズ
１２…凹面鏡
２０…蛍光調整光学ユニット
２１…レンズホルダ
２１ａ…底面板
２１ｂ…孔
２２…Ｏリング
【図１】
2011043332.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2011043332.tif 000007
【図６】
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