(57)【要約】      （修正有）【課題】高感度で、正確かつ再現性の良い前立腺癌の診断法を提供する。【解決手段】被検者から単離した血液試料におけるハプトグロビン糖鎖Ｎｅｕα２−６量を指標とする、前立腺癌の判定方法。ハプトグロビン糖鎖Ｎｅｕα２−６量の測定が、ハプトグロビン糖鎖Ｎｅｕα２−６に結合したレクチン量を測定することである判定方法。血液試料に抗ハプトグロビン抗体を反応させ、得られたハプトグロビン−抗ハプトグロビン抗体複合体にレクチンを反応させてハプトグロビン糖鎖Ｎｅｕα２−６に結合したレクチン量を測定するものである判定方法。抗ハプトグロビン抗体に結合したハプトグロビン量と、ハプトグロビン糖鎖Ｎｅｕα２−６に結合したレクチン量とを、表面プラズモン共鳴法による多段階法で測定するものである測定方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者から単離した血液試料におけるハプトグロビン糖鎖Ｎｅｕ  α２−６量を指標とする、前立腺癌の判定方法。
【請求項２】
ハプトグロビン糖鎖Ｎｅｕ  α２−６量の測定が、ハプトグロビン糖鎖Ｎｅｕ  α２−６に結合したレクチン量を測定することである請求項１記載の判定方法。
【請求項３】
レクチン量の測定が、表面プラズモン共鳴法により行なわれる請求項３記載の判定方法。
【請求項４】
レクチンが、レクチンＳＮＡ又はレクチンＳＳＡである請求項２又は３記載の判定方法。
【請求項５】
血液試料に抗ハプトグロビン抗体を反応させ、得られたハプトグロビン−抗ハプトグロビン抗体複合体にレクチンを反応させてハプトグロビン糖鎖Ｎｅｕ  α２−６に結合したレクチン量を測定するものである請求項２〜４のいずれか１項記載の判定方法。
【請求項６】
抗ハプトグロビン抗体に結合したハプトグロビン量と、ハプトグロビン糖鎖Ｎｅｕ  α２−６に結合したレクチン量とを、表面プラズモン共鳴法による多段階法で測定するものである請求項１〜５のいずれか１項記載の測定方法。
【請求項７】
血液試料中のハプトグロビン糖鎖Ｎｅｕ  α２−６量とハプトグロビン量との比を指標とする請求項１〜６のいずれか１項記載の判定方法。
【請求項８】
前立腺癌の判定が、罹患可能性及び／又は悪性度の判定である請求項１〜７のいずれか１項記載の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、正確かつ簡便に前立腺癌の罹患可能性及び悪性度が判定できる前立腺癌の診断法に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌は、６５歳以上で罹患率が増加する男性特有の癌である。前立腺癌の死亡率は高くないが、進行すると骨に転移しやすい。前立腺癌の治療法としては、手術療法、放射線療法、内分泌療法等が主に行なわれている。
【０００３】
従来、前立腺癌の診断は直腸診、経直腸的前立腺超音波検査、生検が主であったが、最近前立腺特異抗原（prostate specific antigen：ＰＳＡ）の検出が行なわれるようになった。この血中ＰＳＡ値を用いた診断法の開発により、前立腺癌の検出率は増加し、早期診断が可能になった。しかしＰＳＡ検査値には、いわゆるグレーゾーンが多く、あくまで前立腺癌を発見するきっかけとなる指標にすぎないといわれている。
【０００４】
かかる観点から、さらに感度の高い前立腺癌マーカーが求められており、ハプトグロビン糖鎖構造の多岐化を検出する手段としてＰＨＡ−Ｌ4レクチンを用いる方法が報告されている（非特許文献１及び２）。また、ハプトグロビンβ鎖をＲＭ２抗体を用いて検出する手段も報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−４２２１２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Fujimura T, Shinohara Y, Tissot B, Pang PC, Kurogochi M, Saito S, Arai Y, Sadilek M, Murayama K, Dell A, Nishimura S, Hakomori SI.Int J Cancer. 2008 Jan 1;122(1):39-49.
【非特許文献２】Abbott KL, Aoki K, Lim JM, Porterfield M, Johnson R, O'Regan RM, Wells L, Tiemeyer M, Pierce M.J Proteome Res. 2008 Apr;7(4):1470-80.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、ウエスタンブロット等の解析による従来のハプトグロビン糖鎖をマーカーとする前立腺癌の診断法では、感度が低く、また良性と悪性患者及び健常人との判別が困難であり、さらに高感度に再現よく前立腺癌を判別できる診断法が望まれていた。
従って、本発明は、キャリアタンパク質を修飾せずに高感度で分析し、正確かつ再現性の良い前立腺癌の診断法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで本発明者は、血液中のハプトグロビンの糖鎖構造変化に関し、β鎖やＰＨＡレクチン以外の糖鎖について種々検討した結果、ハプトグロビン糖鎖Ｎｅｕ  α２−６量を特異的に検出すれば、前立腺癌の良性と悪性とが明確に判別できることを見出し、本発明を完成した。さらに、血液中のハプトグロビン糖鎖構造変化を解析するために、ハプトグロビンの抗体でそのキャリアタンパク質を捕獲し(第一段)、その糖鎖とある種のレクチン反応(第二段)を検出する表面プラズモン共鳴の多段階分析法を確立した。その結果、血液中のハプトグロビンとその修飾糖鎖に存在するＮｅｕ  α２−６の量をほぼ同時に測定し、その比をもって前立腺癌の良性と悪性が明確に判別できることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、被検者から単離した血液試料におけるハプトグロビン糖鎖Ｎｅｕ  α２−６量を指標とする、前立腺癌の判定方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明方法によれば、悪性の前立腺癌が、正常者及び良性患者との間で有意差をもって判別できる。特に、検出手段として表面プラズモン共鳴法を採用した場合に、検出感度が高く、再現性も良好である。特に、抗ハプトグロビン抗体に結合したハプトグロビン量と、ハプトグロビン糖鎖Ｎｅｕ  α２−６に結合したレクチン量とを、表面プラズモン共鳴法による多段階法で測定すれば、ハプトグロビン量とレクチン量とが同時に測定でき、高感度かつ再現性をさらに向上する。本発明方法とＰＳＡとを併用すれば、より高感度かつ正確に前立腺癌の診断が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】抗ハプトグロビン抗体の固定化センサーグラムを示す。
【図２】ＢＩＡｃｏｒｅ２０００による血清試料分析手法を示す。（１）多段階相互作用の模式図。（２）センサーグラム。
【図３】血清ハプトグロビン量及び血清蛋白質に対するハプトグロビン量を示す。（ａ）ハプトグロビン検量線、（ｂ）ハプトグロビン濃度、（ｃ）ハプトグロビン量／血清蛋白質量×１００。
【図４】ＳＰＲによるハプトグロビンに対するレクチン結合量の比較を示す。（ａ）ＳＮＡ−１、（ｂ）ＡＡＬ、（ｃ）ＭＡＡ、（ｄ）ＰＨＡ−Ｌ4。
【図５】ＳＰＲによるハプトグロビンに対するレクチン糖鎖を示す。（ａ）ＳＮＡ−１、（ｂ）ＡＡＬ。
【図６】レクチンブロット及びウエスタンブロット法による染色パターンを示す。（ａ）抗ハプトグロビン、（ｂ）ＳＮＡ−１、（ｃ）ＡＡＬ。
【図７】レクチンブロット及びウエスタンブロットによるハプトグロビンに対するレクチン結合量比較を示す。（ａ）ＳＮＡ−１、（ｂ）ＡＡＬ、（ｃ）ＰＨＡ−Ｌ4、（ｄ）ａｎｔｉ−ｓＬｅａ。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明に用いる試料は、被検者から単離した血液試料である。被検者には、前立腺癌が疑われる者及び前立腺癌患者が含まれる。前立腺癌が疑われる者には、健常者も含まれる。また前立腺癌患者には、治療中の患者及び以前に治療した患者が含まれる。
【００１３】
血液試料としては、ハプトグロビンを含む試料であればよく、全血、血漿、血清が含まれるが、血漿又は血清が好ましい。
【００１４】
本発明の前立腺癌の判定方法は、血液中のハプトグロビン糖鎖Ｎｅｕ  α２−６量を測定し、これを指標とするものである。ハプトグロビン糖鎖Ｎｅｕ  α２−６量の測定としては、当該糖鎖を認識する抗体を用いる方法、当該糖鎖と特異的に結合するレクチンを用いる方法が挙げられるが、当該糖鎖と特異的に結合するレクチンを用いるのが好ましい。後述の実施例に示すように、従来用いられているハプトグロビン糖鎖構造の多岐化の検出のうち、ＰＨＡ−Ｌ4レクチンを用いる方法に比べて、Ｎｅｕ  α２−６を検出する本発明方法は顕著に高感度である。
【００１５】
Ｎｅｕ  α２−６と特異的に結合するレクチンとしては、セイヨウニワトコ（Sambucus nigra(elderberry)）由来レクチン（ＳＮＡ）、ニワトコ（Sambucus sieboldiana(Japanese elderberry)）由来レクチン（ＳＳＡ）、及びキカラスウリ（Tricosanthes japonica）由来レクチン（ＴＪＡ−１）が挙げられるが、レクチンＳＮＡ及びレクチンＳＳＡが特に好ましい。
【００１６】
本発明方法においては、血液試料に抗ハプトグロビン抗体を反応させ、得られたハプトグロビン−抗ハプトグロビン複合体にレクチンを反応させてハプトグロビン糖鎖Ｎｅｕ  α２−６に結合したレクチン量を測定するのが、簡便かつ高感度であり、より好ましい。
【００１７】
前記反応に用いられる抗ハプトグロビン抗体としては、市販の抗ハプトグロビン抗体であればよく、ポリクローナル抗体でも、モノクローナル抗体でもよい。この抗原抗体反応は、抗ハプトグロビン抗体を固定化した担体に血液試料を添加して行なうのが好ましい。抗原抗体反応により、血液試料中のハプトグロビン担体上に捕獲される。
次いで、前記糖鎖に特異的なレクチンを、前記担体上のハプトグロビンと反応させれば、糖鎖に特異的なレクチンが担体上のハプトグロビンに結合する。従って、結合したレクチン量を測定すれば、血液試料中のハプトグロビン糖鎖Ｎｅｕ  α２−６量が定量できる。
【００１８】
ここで上記の反応は、マイクロセンサーチップ上で行なうのが好ましい。すなわち、抗ハプトグロビン抗体を固定化したセンサーチップに血液試料をミクロフローで流して抗原抗体反応させ、次いで前記レクチンをミクロフローで流してハプトグロビン糖鎖Ｎｅｕ  α２−６にレクチンを結合させる。マイクロセンサーチップとしては、金膜にカルボキシル基を固定化したＣ１（ビアコア社）、或いは、金膜にポリエチレングリコールの先端にカルボキシル基を有するＳＡＭ（Self-assembled Monolayer）を固定化し使用する。
【００１９】
ハプトグロビン糖鎖Ｎｅｕ  α２−６に結合したレクチンの測定は、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）、レクチンアレー等により行なうことができるが、簡便性、再現性、感度の点からＳＰＲ法が特に好ましい。ＳＰＲは金属と誘電体媒質との界面で生じる光学現象であり、金属表面上の薄い被検体層の密度や屈折率の変化に対して敏感である。従って、ＳＰＲバイオセンサは、センサ表面におけるリガンドと被検体との相互作用に起因する屈折率の変化又はＳＰＲシグナルのシフトを測定することができる。ＳＰＲ法は、市販のＳＰＲ装置を用いて行なえばよい。
【００２０】
ここでＳＰＲを用いれば、抗ハプトグロビン抗体に結合したハプトグロビン量と、ハプトグロビン糖鎖Ｎｅｕ  α２−６に結合したレクチン量とが、多段階分析により同時に測定可能である。すなわちＳＰＲを用いた多段階分析法によれば、ハプトグロビン量とレクチン量とが正確かつ同時に測定できるため特に好ましい。
【００２１】
前記抗原抗体反応は、通常２０〜４０℃で、１〜１０分時間行なえばよい。また、糖鎖−レクチン結合反応は、通常２０〜４０℃で、１〜１０分時間行なえばよい。
【００２２】
得られたＮｅｕ  α２−６量を、健常者、良性患者、悪性患者、治療患者等で対比することにより前立腺癌の罹患可能性及び／又は悪性度を判定してもよいが、Ｎｅｕ  α２−６量とハプトグロビン量との比を指標として判定するのがより好ましい。判定は、予め作成しておいた健常者、良性患者及び悪性患者のＮｅｕ  α２−６量又はＮｅｕ  α２−６とハプトグロビン量との比と、被検者のそれらとを対比することにより行なうのが好ましい。ここで良性患者には、前立腺肥大症患者が含まれる。
【００２３】
また、本発明の判定方法に加えて、ＰＳＡとを併用すれば、より確実な前立腺の判定が可能となる。
【実施例】
【００２４】
Ａ．方法
（１）血清試料採取
順天堂医院泌尿器科外来を受診し、インフォームドコンセント後、同意書を提出した患者より血液を５ｍＬ採取した。採血後、数時間以内に研究基盤センター・生体分子研究部門において日立遠心分離器ＣＲ２２Ｅを用いて血清分離した（３０００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ）。血清は１０本のエッペンドルフチューブに約０．３ｍＬずつ分注し、−８０℃で保存した。コントロールである健常人血清は学内掲示により募集したボランティアに対してインフォームドコンセント後、同意書の提出を求め、患者と同様に試料調製した。
【００２５】
（２）ＰＳＡ検査及び病理組織検査
患者血清に含まれるＴｏｔａｌ  ＰＳＡ値（ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）は順天堂医院臨床検査部でＡｂｂｏｔ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＡｘＳＹＭキットにより測定した。ボランティア血清も同部内で同様の検査を実施した。
また、前立腺の病態組織は病理診断部により検査・診断した。前立腺癌（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ）群においては悪性度をＧｌｅａｓｏｎ  Ｓｃｏｒｅで表示した。また、組織過形成（Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）が観察された良性組織（Ｂｅｎｉｇｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｔｉｓｓｕｅ）は非癌群として分類した。後者には前立腺肥大（ＢＰＨ）が含まれた。健常人のボランティア群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）を癌群（Ｃａｎｃｅｒ）、非癌群（Ｂｅｎｉｇｎ）との対照に用いた。
【００２６】
（３）ＳＰＲ分析
（ｉ）センサーチップへのアミンカップリング法によるリガンド固定化
抗ヒトハプトグロビン抗体（ウサギ、ポリクローナル）をリガンドとしてセンサーチップＣ１にアミンカップリング法を用いて固定化した。ランニングバッファーにはＨＢＳ−Ｐ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．００５％  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ−２０）を用い、流速は５μｌ／ｍｉｎとした。チップＣ１表面のカルボキシル基の活性化にＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）−ＥＤＣ（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）混合液を７分間（３５μｌ）インジェクションし、次いで抗ハプトグロビン抗体（２００μｇ／ｍＬ，１０ｍＭ  酢酸バッファーｐＨ５．５溶液）を７分間（３５μｌ）インジェクションしてリガンド抗体を結合させた。チップ上の未反応活性基のキャッピングをするために１Ｍ  ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５を１０分間（５０μｌ）インジェクションした。４つのフローセルのうち一番目に相当するＦｃ１はリガンドを固定化せずにブランクセルとした。
【００２７】
（ii）血清試料の調製
血清蛋白質の定量にはＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用い、ＢＳＡを標品として測定した。
血清、レクチン、抗体等の試料及び試薬の希釈にはランニングバッファー（０．９ｍＭ  ＣａＣｌ2，０．５ｍＭ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，０．１ｍＭ  ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ，０．２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含むＨＢＳ−Ｐ  ｂｕｆｆｅｒ）を用いた。血清２μｌを１ｍｇ／ｍＬに希釈後、ウルトラフリーＭＣ  ０．４５μｍでろ過し、得られたろ液を５０ｎｇ／μｌに希釈しアナライトとした。
【００２８】
（iii）レクチン及び糖鎖抗体の調製
表１に示したレクチン及び糖鎖抗体を上記のランニングバッファーで１００ｎｇ／μｌに調製し分析に用いた。
【００２９】
【表１】
2011047846.tif 000003
【００３０】
（iv）ハプトグロビンの定量
シグマ社製ハプトグロビン標品（ｐｏｏｌｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ）の濃度０．２５，０．５，１，５，１０μｇ／ｍＬを用いて検量線を作成し、血清中のハプトグロビン定量を行った。
【００３１】
（ｖ）ＢＩＡｃｏｒｅ分析法
ＳＰＲ分析にはＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用い、流速は１０μｌ／ｍｉｎとした。抗ハプトグロビン抗体を固定化したセンサーチップに各希釈血清を４分間（４０μｌ）、次いでレクチン又は糖鎖抗体を４分間（４０μｌ）インジェクションし、ハプトグロビン及びレクチンの結合量（ＲＵ）を順次測定した。センサーチップの再生には１０ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ  ｐＨ１．７／１Ｍ  ＮａＣｌ／１％  Ｔｗｅｅｎ２０の１分間（１０μｌ）インジェクションを１０回連続的にサイクルさせるプログラムを用いた。
データはＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ４．１等により解析した。レクチンの結合量はハプトグロビン結合量に対する比｛（ｌｅｃｔｉｎ／Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ）×１００｝に換算した。
【００３２】
（４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＬｅｃｔｉｎ  Ｂｌｏｔ、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ分析
（ｉ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
患者血清のＳＤＳ−ＰＡＧＥは下記の条件で実施した。濃縮ゲル４％、分離ゲル１２％（１４０ｍｍ×８０ｍｍ×１ｍｍ）を用いた。ただし、ＳＮＡ−１レクチン解析には前出のゲルに加え、精度を上げるためにミニゲル（８０ｍｍ×８０ｍｍ×１ｍｍ）を使用して、濃縮ゲル４％、分離ゲル１０％を使用した。ランニングバッファーには２４．８ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１９２ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ／３．５ｍＭ  ＳＤＳを用いた。泳動条件は濃縮ゲル１２ｍＡ／ｇｅｌ、分離ゲル２４ｍＡ／ｇｅｌで実施した。分子量マーカーとしてＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を１０μｌをゲルに添加した。
Ｌｅｃｔｉｎ  Ｂｌｏｔ及び  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ法に用いる試料量及びハプトグロビン標品量は検出に用いるレクチンあるいは糖鎖抗体の最適検出量とした（表２）。  
【００３３】
【表２】
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【００３４】
（ii）Ｌｅｃｔｉｎ  Ｂｌｏｔ及びＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ法
電気泳動後、室温においてゲルはＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ，０．４５μｍ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に、５０Ｖ、４５分間転写した。転写バッファーは１０ｍＭ  ＣＡＰＳ  ｐＨ１１／１０％  ＭｅＯＨを用いた。Ｂｌｏｔ法において非特異的タンパク質のＰＶＤＦ膜への吸着を阻止するブロッキング用バッファーにはＴ−ＴＢＳ（−）（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）を用い、レクチンと糖鎖結合反応には必須な２価イオンを含むＴ−ＴＢＳ（＋）（０．９ｍＭ  ＣａＣｌ2／０．５ｍＭ  ＭｇＳＯ4／０．１ｍＭ  ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ  ｉｎ  Ｔ−ＴＢＳ）を用いた。
転写終了後１時間ブロッキングを実施したが、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ法においては抗ハプトグロビン抗体及び糖鎖抗体のいずれにおいても５％スキムミルク／Ｔ−ＴＢＳ（−）を用い、Ｌｅｃｔｉｎ  Ｂｌｏｔ法においては３％  ＢＳＡ／Ｔ−ＴＢＳ（−）を用いた。ブロッキング液を洗浄後、レクチン（２μｇ／ｍＬ  ＰＨＡ−Ｌ4−ＨＲＰ、ＳＮＡ−１−ＨＲＰ、ＭＡＡ−ＨＲＰ，ＡＡＡ−ＨＲＰ，ＡＡＬ−ｂｉｏｔｉｎ  ｉｎ  Ｔ−ＴＢＳ（＋））又は一次抗体（２μｇ／ｍＬ  ａｎｔｉ−Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ，ｒａｂｂｉｔ）、ａｎｔｉ−ｓｉａｌｙｌ−Ｌｅａ（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ，ｍｏｕｓｅ））を４℃において、一昼夜反応させた。反応液を除去、洗浄後、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔは二次抗体（ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ−ＨＲＰ（１０，０００倍希釈），ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−ＨＲＰ（５，０００倍希釈））を、ＡＡＬ−ｂｉｏｔｉｎにはｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（５，０００倍希釈）を室温、１時間反応させた。転写膜を洗浄後ＥＣＬ−ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア）を用いて発色し、画像を撮影、解析した。ハプトグロビン標品の染色濃度から検量線を作成し各試料中のハプトグロビン及び糖鎖濃度を解析した。
【００３５】
Ｂ．結果
（１）前立腺疾患患者のＰＳＡ値及び病理検査（Ｇｌｅａｓｏｎ  ｓｃｏｒｅ）
表３に分析した１５検体の前立腺癌群（Ｃａｎｃｅｒ）、２０検体良性前立腺組織群（Ｂｅｎｉｇｎ）及び９検体の健常人ボランテイア群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）のＰＳＡ値、病理組織結果、血清タンパク質量、ハプトグロビン量及び血清タンパク質量に対するハプトグロビン％値等を示した。
研究に用いた患者血清はＣａｎｃｅｒが１５例（４３％）で、そのうちＧｌｅａｓｏｎ  ｓｃｏｒｅは７以上が１１例、Ｇｌｅａｓｏｎ  Ｓｃｏｒｅ５及び６が４例であった。また、Ｂｅｎｉｇｎは２０例（５７％）（６例はＢＰＨ）であった。
Ｔｏｔａｌ  ＰＳＡ値は癌化で著しく高値を示す症例が存在したが、一方ではＧｌｅａｓｏｎ  Ｓｃｏｒｅが高い、すなわち悪性度の高い症例においてＰＳＡ値１０以下の検体が４症例存在した（２７％）。ＢｅｎｉｇｎにおいてＰＳＡ値２０を超える症例も存在した。コントロールはＰＳＡ値４以下であり、明らかに正常であった。
ＰＳＡ値が前立腺癌の有用な指標ではあるが、病理組織検査の有用性は高く最終診断の判定に用いられていた。早期癌診断に関連して、Ｂｅｎｉｇｎで観察されるグレイゾーンと言われるＰＳＡ値４−１０は注目される数値範囲であった。
【００３６】
【表３】
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【００３７】
（２）ＳＰＲによる血清中ハプトグロビンの定量
図１に抗ハプトグロビン抗体の固定化センサーグラムを示した。
【００３８】
図２の（１）に多段階相互作用の模式図を、図２の（２）に試料分析のセンサーグラムを示した。ＳＰＲ法の第一段目では血清中のハプトグロビンを選択的に捕捉するためアフィニティークロマトグラフィーがセンサーチップ上で実施され、第二段目でハプトグロビンの糖鎖に対するレクチンの結合が示された。
【００３９】
図３の（ａ）に標品を用いたハプトグロビン検量線を示した。検量線は再現性があり、ＳＰＲ分析法によるキャリアタンパク質検出法であるハプトグロビン検出の精度が確認された。また、本法は血清２μｌを希釈後フィルターでろ過し、更なる希釈で最終濃度５０ｎｇ／μｌとした。分析に用いた総血清タンパク質量は２μｇであった。
【００４０】
図３の（ｂ）にＣａｎｃｅｒ，Ｂｅｎｉｇｎ，Ｃｏｎｔｒｏｌのハプトグロビン量及び（ｃ）に血清タンパク質総量に対するハプトグロビン含有量（％）の症例別分布を示した。
表３に示す血清タンパク質量は、ＣｏｎｔｒｏｌとＣａｎｃｅｒでは平均値で約６％の相違がありＣａｎｃｅｒにおいて有意に増加していた。ハプトグロビン量はほぼ正常値範囲であり、血清蛋白質量の増加により、血清タンパク質総量に対するハプトグロビン含有量の平均値（％）はＣａｎｃｅｒ  １．４８％、Ｂｅｎｉｇｎ  ２．２７％、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ３．６７％を示した。健常人血清タンパク質量はやや増加し、その全タンパク質に対する含量もわずかに増加した。
【００４１】
（３）ハプトグロビン糖鎖に対するレクチン結合量の比較
ＳＰＲ法はハプトグロビン測定濃度とその糖鎖測定用ハプトグロビン濃度が一致しており、血清の希釈が一律であり、ハプトグロビン量及び糖鎖量を順次測定することに適していた。ハプトグロビン量（ＲＵ）に対する糖鎖構造を反映するレクチン結合量（ＲＵ）を１００％表示し、Ｃａｎｃｅｒ、Ｂｅｎｉｇｎ、Ｃｏｎｔｒｏｌ群間の有意差検定を実施し、比較した結果を図４に示す。
【００４２】
糖鎖の多岐化を検出するＰＨＡ−Ｌ4，ＮｅｕＡｃ  α２−６結合を検出するＳＮＡ−１，ＮｅｕＡｃ  α２−３結合を検出するＭＡＡ，Ｆｕｃ  α１−６結合を検出するＡＡＬ，Ｆｕｃα１−２及びＦｕｃ  α１−３結合を検出するＡＡＡのレクチンを用いてハプトグロビンに存在する糖鎖解析を実施した。
ＣａｎｃｅｒとＣｏｎｔｒｏｌ間で有意差が認められたのはＳＮＡ−１及びＡＡＬであった。特にＳＮＡ−１はレスポンスが大きく、前立腺癌検出マーカーとしての有用性が期待される結果を得た。さらにこれらはＣａｎｃｅｒとＢｅｎｉｇｎ間においても有意差を示し、Ｃａｎｃｅｒのみならず、Ｂｅｎｉｇｎとの識別の可能性が示唆された。
【００４３】
すでに癌化におけるハプトグロビン糖鎖構造の多岐化（ＰＨＡ−Ｌ4レクチン）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ法（非特許文献１）及び、ＰＨＡ−Ｌ4カラム精製−Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙで報告されている（非特許文献２）。
しかしながら今回のＳＰＲ法ではＰＨＡ−Ｌ4の結合量が殆ど検出されず、Ｃｏｎｔｒｏｌに対する有意な差が認められなかった。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法においては、ＳＤＳの可溶化によりハプトグロビンの高次構造が完全に破壊され、サブユニットに分離され、レクチン結合部位が暴露されていると考えられた。それに対して、ＳＰＲ法においてハプトグロビンは未変性タンパク質と抗体との反応であり、レクチンとのハプトグロビン糖鎖の結合部位と、ハプトグロビンの抗原抗体反応の部位の関係が不明であった。その結果、レクチンとハプトグロビン抗体間において糖鎖周辺の競合関係、あるいは構造阻害関係が存在している可能性も否定できない。従って、ＳＰＲ法におけるＰＨＡ−Ｌ4結合解析は試料量の検討のみならず、反応性の解明が求められた。
【００４４】
ｓＬｅａ糖鎖を検出する抗体ａｎｔｉ−ｓＬｅａ及びＦｕｃ  α１−２及びＦｕｃ  α１−３に対するＡＡＡレクチンはＳＰＲ法においてハプトグロビンとの結合が検出されなかった。これらのレクチン及び糖鎖抗体に関してもＰＨＡ−Ｌ4レクチン同様の検討が求められた。
【００４５】
図５にＳＮＡ−１及びＡＡＬのＣａｎｃｅｒ，Ｂｅｎｉｇｎ，ＣｏｎｔｒｏｌのＬｅｃｔｉｎ／Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ比の分布図を示した。
【００４６】
ＳＮＡ−１の分布はＡＡＬに比較してその有意差検定からも明らかなように、病態における結合量が増加し、Ｃａｎｃｅｒ、Ｂｅｎｉｇｎ及びＣｏｎｔｒｏｌの判別が可能となった。
【００４７】
（４）Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ法による血清中ハプトグロビンの検出
図６の（ａ）にハプトグロビン抗体によるＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ法のパターンを示した。各試料のハプトグロビンβ鎖バンドはハプトグロビン標品を用いた検量線より血清中の濃度を求めた。ＣａｎｃｅｒとＣｏｎｔｒｏｌ間でハプトグロビン量の大きな差異は認められなかった。
【００４８】
（５）Ｌｅｃｔｉｎ  Ｂｌｏｔ及びＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ法によるハトグロビン糖鎖に対する結合量の比較
図６の（ｂ）＆（ｃ）にＳＮＡ−１及びＡＡＬのＬｅｃｔｉｎ  Ｂｌｏｔ法のパターンを示した。血清中にはレクチン結合糖タンパク質が多数存在し、染色バンドが多く、正確なる再現性、定量性を求めるには困難があった。
図７にハプトグロビン１分子あたりのレクチン及び糖鎖抗体の結合量を病態別に比較した。ｔ−Ｔｅｓｔの結果、Ｐ値は低いが、ＳＰＲ法と同様にＣａｎｃｅｒとＣｏｎｔｒｏｌ間に有意差が生じたのはＡＡＬ、ＳＮＡ−１であった。また、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ法ではａｎｔｉ−ｓＬｅａも有意差を示した。今回、ｓＬｅａはＳＮＡ−１の５倍量のタンパク質量を用いた。
【００４９】
（６）ＳＰＲ法とＬｅｃｔｉｎ  Ｂｌｏｔ及びＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ法の比較
Ｌｅｃｔｉｎ  Ｂｌｏｔ及びＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ法の電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）はタンパク質変性し、サブユニット分離しているために、ＰＶＤＦ膜上でタンパク質糖鎖とレクチン或いは糖鎖抗体との反応が容易になり、その反応性は上昇したことが予測された。ただし、その方法はｉ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ii）ＰＶＤＦ膜への転写、iii）非特異的な結合を防ぐためのブロッキング、iv）レクチン或いは糖鎖抗体との反応、さらに、ｖ）ＥＣＬその他を用いたタンパク質或いは糖鎖の発色、vi）Ｘ線フィルムへの焼き付け、vii）デンシトメーターへの取り込み、viii）定量とその手技の多さに加え、必要とする時間は最低３日間を必要とした。その上、手技の熟練度により品質の異なるデータが見られ、データの再現性を得るためにはかなりの時間を要した。但し、Ｌｅｃｔｉｎ  Ｂｌｏｔ及びＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ法は一回の操作で同時に多検体の結果が得られるという利点があり、試料間の相対的な比較検討には適していた。また、血清の全タンパク質が同時に観察される様相から各レクチンで染色されるタンパク質の分子量分布が明らかとなった。
【００５０】
それに反して、ＳＰＲ分析は第一段目をタンパク質の抗体で目的とする糖タンパク質を捕獲するアフィニティークロマトグラフィーを利用するために、希釈試料を流すことで血清中から容易にハプトグロビンを分離精製した。次いで他の血清タンパク質成分を洗浄し、さらに第二段目のレクチン溶液とハプトグロビン糖鎖との反応を観察し、その結合量を測定することが可能であった。すべてのステップが自動化されており２４時間自動分析によって効率的な解析が可能であった。解析ソフトプログラムは機器に内蔵していた。
【００５１】
シアル酸（ＮｅｕＡｃ  α２−６）を認識するレクチンＳＮＡ−１はＣａｎｃｅｒとＣｏｎｔｒｏｌ間のみならず、ＣａｎｃｅｒとＢｅｎｉｇｎ間でも有意差が認められ、現在、疾患マーカーとして広く用いられているＰＳＡと併用し、前立腺癌診断を補完しうる可能性が示唆された。ＳＰＲ  法はＬｅｃｔｉｎ  Ｂｌｏｔ及びＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ法に比して、特異性、再現性、定量性、簡便性において格段の優位性を示した。
【図１】
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【図４】
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【図７】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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