(57)【要約】      （修正有）【課題】充填する充填材のサイズによって自由に孔サイズを決定することができ、高圧に耐える機械的強度を有し、分析対象試料であるタンパク質や核酸が吸着し難く、カラム洗浄に使用される例えばアルカリ溶媒に対して耐性を有する、優れた液体クロマトグラフィーカラム用のフィルターを提供する。【解決手段】ポリマー粒子、特に好ましくは、当該液体クロマトグラフィー用カラムに充填される充填材又はその基材であるポリマー粒子を、架橋剤によって積層架橋した、液体クロマトグラフィーカラム用のフィルター。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー粒子を架橋剤によって積層架橋した、液体クロマトグラフィーカラム用のフィルター。
【請求項２】
フィルター支持用のOリング内でポリマー粒子を架橋剤によって積層架橋した、Oリングと一体に形成された液体クロマトグラフィーカラム用のフィルター。
【請求項３】
前記ポリマー粒子の粒子径は、カラムに充填された充てん剤の４倍以下の粒子径である請求項１又は２の液体クロマトグラフィーカラム用のフィルター。
【請求項４】
前記ポリマー粒子は、液体クロマトグラフィー用カラムに充填される充填材又はその基材である、請求項１又は２の液体クロマトグラフィーカラム用のフィルター。
【請求項５】
内部に充填材が充填され、かつ、請求項１乃至４のいずれかの液体クロマトグラフィーカラム用のフィルターを装備した液体クロマトグラフィーカラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学、医化学等の分野で分析手段として用いられる液体クロマトグラフィーカラム用フィルター及びその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学、医化学等の分野では、タンパク質や核酸等を分析対象試料とする分析法として、液体クロマトグラフィーが利用されている。液体クロマトグラフィーには、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等、種々の手法があり、各手法を実施するのに好適な充填材を充填したカラムを使用して分析を実施する。
【０００３】
液体クロマトグラフィーに使用するカラムは、その内部に充填材を充填したカラムハウジングの両端を、フィルターを具備するカラムエンドで密閉したものであり、かかる液体クロマトグラフィーカラム用フィルターとしては、従来、ステンレス焼結体製のもの、ガラス製のもの、ポリエーテルエーテルケトン（PEEK）製のもの、四フッ化ポリエチレン（登録商標名テフロン）製のものが知られている（例えば特許文献１から８参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０００−０８１４２４号公報
【特許文献２】特開２０００−１３１３０２号公報
【特許文献３】特開２００１−２４９１２０号公報
【特許文献４】特表２００５−５０８３９８号公報
【特許文献５】特開２００６−１３８７２４号公報
【特許文献６】特開２００６−２２７０２２号公報
【特許文献７】特開平０６−２４２０９４号公報
【特許文献８】特開平０７−２６０７６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
液体クロマトグラフィーカラム用のフィルターは、カラム内部に充填材を密封（充填し
【０００６】
た充填剤が流失しないようにする）しつつも、目詰まりを起こし難い、試料や溶離液中の固形分等がカラムに流入することを防止して充填材を保護する目的で使用される多孔質体である。近年では、充填材の粒子径が小さくなってきており、充填材をカラムに充填する際の圧力や、分析の際の操作圧（分析対象となる液体を送液する圧力）もそれに比例して高くなってきている。更に、イオン性、金属配位性又は疎水性を有するタンパク質や核酸を分析対象試料とする場合、フィルターには、これらが吸着して分析結果が影響される可能性を排除できる性質（即ち、分析対象試料を吸着しない性質）や、任意の試料を分析した後に実施されるカラム洗浄において使用される各種溶媒（例えば有機溶媒やアルカリ溶媒）に安定であることも求められる。
【０００７】
上記のような要求を満足するため、液体クロマトグラフィーカラム用のフィルターには、充填する充填材のサイズによって自由に孔サイズを決定することができ、高圧に耐える機械的強度を有し、分析対象試料であるタンパク質や核酸が吸着し難く、カラム洗浄に使用される例えばアルカリ溶媒に対して耐性を有するという性質が求められる。
【０００８】
従来から使用されているステンレス焼結体製のフィルターは、孔サイズを比較的自由に決定でき、高い機械的強度を有し、しかもアルカリ性溶媒等に対する耐性も有する、優れたフィルターである。しかし、金属であるため金属配位性タンパク質が吸着するという課題があり、分析対象試料によっては使用が困難な場合がある。
【０００９】
従来から使用されている多孔質ガラス製のフィルターは、親水性が高いためにタンパク質の吸着は少ないものの、イオン性を有しているため核酸等が吸着するという課題があり、分析対象試料によっては使用が困難な場合がある。更に、孔径の小さいガラス製フィルターの作製は困難であるため、微小な充填材を充填したカラムには使用できず、またアルカリ溶媒に対する耐性が低いためにアルカリ溶媒を用いてカラム洗浄を行うことも困難である。
【００１０】
従来から使用されているポリエーテルエーテルケトン（以下PEEKと記す）製のフィルターは、タンパク質の吸着は少ないとされているが、PEEKは本来疎水性の高いポリマーであるため、実際の分析場面ではタンパク質を疎水的に吸着しやすく、またこれまで知られている液体クロマトグラフィー用PEEKフィルターは不溶成分が詰まり易いという課題がある。
【００１１】
従来から使用されている四フッ化ポリエチレン製のフィルターは、タンパク質や核酸の吸着は少ないものの、フィルター自体の機械的強度が高くないために変形しやすく、変形により操作時の圧力上昇を招いて分析条件の変動を生じ易いという課題がある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、従来から使用されている液体クロマトグラフィーカラム用のフィルターが有する課題を解決すべく、鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。即ち本発明は、充填する充填材のサイズによって自由に孔サイズを決定することができ、高圧に耐える機械的強度を有し、分析対象試料であるタンパク質や核酸が吸着し難く、カラム洗浄に使用される例えばアルカリ溶媒に対して耐性を有する、優れた液体クロマトグラフィーカラム用のフィルター及びかかるフィルターを装備したカラムを提供するものであり、ポリマー粒子を架橋剤によって積層架橋した、液体クロマトグラフィーカラム用のフィルター、又は、内部に充填材が充填され、かつ、フィルターを装備した液体クロマトグラフィーカラムである。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明は、ポリマー粒子を架橋剤によって積層架橋して液体クロマトグラフィーカラム用のフィルターとするものである。粒子を積層架橋するため、それによって得られるフィルターは多孔質となり、積層架橋するポリマー粒子の粒子径を変更することで、自由に孔サイズを決定することができる。本発明に用いるポリマー粒子としては、タンパク質や核酸を分析対象試料とする場合には、それらの吸着が少ない親水性ポリマーからなること、機械的強度が高いこと、カラム洗浄の際に使用される有機溶媒洗浄やアルカリ洗浄に耐性を有すること、架橋剤による積層架橋するために用いられる架橋剤と反応可能である官能基（例えば水酸基）を有するポリマーからなること、そして、粒子同士が積層架橋した際に、隣り合う粒子間に形成される孔のサイズがカラム内部に充填する粒子の粒径よりも大きくならないものであれば、その他に特別の制限はない。非イオン性である（メタ）アクリル酸エステルをモノマーとする親水性ポリマーが上記ポリマーとして例示できる。（メタ）アクリル酸系エステルポリマーは、親水性であるためにタンパク質や核酸といった分析対象試料の吸着が少ないこと、機械的強度が高いこと、カラム洗浄の際に使用される有機溶媒洗浄やアルカリ洗浄に耐性を有する、等といった特徴があり、タンパク質や核酸を分析対象試料とする場合、特に好適である。
【００１４】
ポリマー粒子は、例えば公知の懸濁重合法、シード重合法、分散重合法等により製造することができるが、タンパク質や核酸を分析対象試料とする場合、（メタ）アクリル酸系エステルポリマーの中でも、さらにタンパク質や核酸等の疎水的吸着を低減するために、そのエステル部位の疎水性が低いか、又は親水性を有する側鎖を導入したポリマーの粒子を使用することが好ましい。このような粒子は、例えば、（メタ）アクリル酸メチルエステル、（メタ）アクリル酸エチルエステル、（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチルエステル、（メタ）アクリル酸（２−メトキシ）エチルエステル、（メタ）アクリル酸グリセリルエステル、（メタ）アクリル酸グルコースエステル等の糖エステル類、（メタ）アクリル酸（２−ヒドロキシエトキシ）エチルエステル又は（メタ）アクリル酸ポリエチレングリコールエステル等の、（メタ）アクリル酸エステル系のモノマーを重合して得ることができる。また他には、（メタ）アクリル酸グリシジル等のモノマーを重合してポリマー粒子とした後、グリシジル基に親水性を有する化合物を導入することによっても得ることができる。このような親水性を有する化合物としては、メタノール、エタノール、エチレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、グルコース、ガラクトース等の単糖類、ショ糖等の二糖類、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコール等を例示することができる。
【００１５】
本発明では、例えば親水性を有するモノマーと架橋性を有するモノマーとを予め共重合したポリマー粒子を使用することもできる。かかる粒子は、架橋性モノマーと共重合していないポリマー粒子と比較して機械的強度が高く、本発明で使用するポリマー粒子として好適である。このような、その表面を予め架橋するための架橋性モノマーとしては、ジビニルベンセン又はビスフェノールA−ジ−アクリル酸エステル等が使用できるが、疎水性の低い架橋性モノマーがタンパク質や核酸の吸着を防止するという観点から好適である。かかる好適な架橋性モノマーとして、エチレングリコール−ジ−（メタ）アクリル酸エステル、ジエチレングリコール−ジ−（メタ）アクリル酸エステル、グリセロール−ジ−（メタ）アクリル酸エステル又はポリエチレングリコール−ジ−（メタ）アクリル酸エステル等を例示することができる。架橋性モノマーは、粒子ポリマーに対して５から３０、好ましくは１０から３０％重量部程度使用すれば良い。これ以下の割合で使用した場合、粒子ポリマーの機械的強度の向上効果が小さく、逆にこれ以上の割合で使用した場合、ポリマー粒子の疎水性が高くなる一方、機械的強度の向上効果は頭打ちとなるからである。
【００１６】
ポリマー粒子の大きさは、前記の通り、粒子同士が積層架橋した際に、隣り合う粒子間に形成される孔のサイズがカラム内部に充填する粒子の粒径よりも大きくならないことが条件であり、カラム内に充填される充填材との関係では、当該充填材の４倍程度以下とすることが例示できる。このような粒径のポリマー粒子を使用することにより、内部に充填した充填材の流失を防ぎ、かつ、目詰まりを起こし難いフィルターを提供することが可能となる。具体的に例えば、充填材の粒径が５マイクロメーターであれば、２０マイクロメーター以下のポリマー粒子を使用することが例示できる。なお、ポリマー粒子の粒径をカラム内に充填する粒子の粒子径以下とすると、操作時に不溶成分が蓄積して目詰まりを起こす確率が高くなる。
【００１７】
本発明では、ポリマー粒子はその材質及びサイズ等において、カラム内部に充填される充填材と異なるものであっても良い。しかし、本発明では、実際にそのフィルターを装備する液体クロマトグラフィー用カラムに充填される充填材又はその基材を、本発明のフィルターを構成するポリマー粒子とすることもできる。かかる態様であれば、機械強度は充填材と同等であり、タンパク質や核酸といった分析対象試料の吸着性も充填材と同等であるフィルターを容易に製造することが可能である。なお基材とは、例えば充填材がイオンクロマトグラフィーのために特別な官能基が導入された充填材である場合、当該官能基が導入されていない状態のものをいう。もっとも、充填材が液体クロマトグラフィー用充填材として広く用いられている様な細孔を有している場合であっても、ポリマー粒子は細孔を有している必要はない。
【００１８】
ポリマー粒子は、粒子同士を接着する硬化性の架橋剤により架橋する。硬化性の架橋剤としては、タンパク質や核酸を分析対象試料とする場合、ポリマー粒子の疎水性を増大させず、かつポリマー粒子を形成する化合物の官能基である水酸基と結合可能であることが好ましい。エポキシ化合物である直鎖アルキルポリオール類のグリシジルエーテル物をこのような硬化性架橋剤の好適な例として例示することが可能であり、更に具体的に、エチレングリコール−ジ−グリシジルエーテル、グリセロール−ジ−グリシジルエーテル、グリセロール−トリ−グリシジルエーテル又はソルビトール−ポリ−グリシジルエーテル等を例示することができる。エポキシ化合物は、熱硬化も可能であるが、硬化反応を促進するために、硬化触媒を用いることが好ましい。なお硬化触媒としては、硬化物がイオン性を示さないアルカリ無機塩やルイス酸を例示することができるが、反応性を制御する意味から、潜熱性硬化剤のオニュウム塩型ルイス酸が特に好ましい。
【００１９】
架橋剤は、積層架橋によって形成されるフィルターの強度を保ち、かつ、隣り合う粒子間に形成された孔がふさがれない程度の割合で使用すれば良いが、具体的に例えばポリマー粒子の１０から１００％重量部とすることが例示できる。
【００２０】
ポリマー粒子を架橋剤により積層架橋して硬化し、フィルターを製造する際に、ポリマー粒子と架橋剤との混合物の粘度を向上させるために、増粘剤を使用することも可能である。使用できる増粘剤としては、例えば、ポリビニルアルコール又はヒドロキシアルキルセルロース等を例示することができる。これら増粘剤は架橋剤とも反応可能であるため、フィルターを形成するポリマー粒子の積層・架橋構造の一部して利用することも可能である。
【００２１】
本発明の液体クロマトグラフィーカラム用のフィルターは、ポリマー粒子と架橋剤とを適当な溶媒中で混合し、混合物を薄層化し、溶媒を除去した後に架橋剤を硬化してポリマー粒子同士を固着させて積層構造とすることで製造できる。ポリマー粒子と架橋剤との混合物は、必要に応じて架橋剤の硬化触媒等を含んでいても良い。より具体的には、ガラスフィルター等の平面の多孔質体上にフィルターと同程度の厚みを有する枠を設置し、上記の混合物を該枠に流し込み、吸引によって溶媒及び余剰の硬化剤を除去し、成形した後に硬化剤を硬化させることが例示できる。吸引によって溶媒及び余剰の硬化剤を除去する態様では、余剰の硬化剤によって粒子間に形成された孔がふさがれる虞を払拭することができ、特に好ましい。この後、適切なサイズ、形状に加工すれば、本願のフィルターとして使用することができる。
【００２２】
前記の場合において、液体クロマトグラフィーカラムにフィルターを取り付ける際に使用する樹脂製のOリングを枠として使用することができる。このOリングは、フィルターの外周に装着してカラムとフィルターの間に隙間ができないようにするためのものである。本発明では、このOリングを前記枠として用いることで、Oリングが装着されたフィルターを直接製造することができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の液体クロマトグラフィー用カラムのフィルターは、充填する充填材のサイズによって自由に孔サイズを決定することができる。また、高圧に耐える機械的強度を有し、分析対象試料であるタンパク質や核酸が吸着し難く、カラム洗浄に使用される例えばアルカリ溶媒に対して耐性を有する、優れた液体クロマトグラフィーカラム用のフィルターである。またその製造の際に、フィルターをOリングを枠として直接製造することができ、従来のように、フィルターを切断してOリングに装着する場合と比較して、切断面のいびつ化等は発生しない。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】実施例１により作成したフィルターの断面を示す電子顕微鏡写真である。
【図２】実施例１により作成したフィルターの断面を示す、他の電子顕微鏡写真である。
【図３】実施例１により作成したＯリング付きフィルターの顕微鏡写真である。
【図４】市販されているPEEK製Oリングを用いて直接製造したフィルターの顕微鏡写真である。
【図５】実施例２により得られた、各種フィルター素材を用いた液体クロマトグラフィーカラムによるタンパク質の初期吸着を比較した結果を示す図である。図中、白丸は市販の焼結ＳＵＳフィルター、白三角は市販のＰＥＥＫフィルター、バツは市販のＳＵＳメッシュフィルター、そして黒丸は本願のフィルターについての結果をそれぞれ示すものである。
【図６】実施例３により得られた、各種フィルター素材を用いた液体クロマトグラフィーカラムによる、タンパク質試料注入による操作圧上昇を比較した結果を示す図である。図中、白丸は市販の焼結ＳＵＳフィルター、白三角は市販のＰＥＥＫフィルター、バツは市販のＳＵＳメッシュフィルター、そして黒丸は本願のフィルターについての結果をそれぞれ示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下に実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２６】
実施例１
シードポリマーの製造
５００ｍLのナス型フラスコに、ベンジルメタクリレート  ３０ｇ、２―エチルヘキシルチオグリコール酸エステル  １．５ｇ、過硫酸カリウム  ０．８ｇ及びイオン交換水２００ｍLを入れ、撹拌子を入れてオイルバスにセットした。還流管と窒素導入管を取り付け、マグネットスターラーで撹拌しながら、バス温度を７０度に設定した。反応を６時間継続し、粒子径１．１マイクロメーターのシード粒子を得た。
【００２７】
ポリマー粒子の製造
３００ｍLガラスビーカーに２−ヒドロキシエチルメタクリレート  ７０ｇ、エチレングリコールジメタクリレート  ３０ｇ、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）（和光純薬工業(株)製、Ｖ−６５）  ０．５ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム０．５ｇを混合し、イオン交換水１００ｍLを加え、超音波ホモジナイザーを用いて乳化しモノマー乳化液を得た。
【００２８】
以上とは別に、５００ｍLセパラブルフラスコに、１００ｍLイオン交換水及び８ｇのポリビニルアルコールを入れ、室温下で溶解した。さらに粒子径１．１マイクロメーターの前記シード粒子０．１２ｇ（乾燥重量分）を加え分散した後、モノマー乳化液を加えゆっくりと室温下１６時間攪拌した。セパラブルフラスコを７０度に設定したオイルバスに浸漬し、攪拌を停止し４時間重合を行った。得られた懸濁液を温水で洗浄し、粒子径１０マイクロメーターのポリマー粒子を得た。
【００２９】
フィルターの製造
ジオキサンで置換、洗浄した前記ポリマー粒子１０ｇ、デナコールＥＸ−３１４（ナガセケムテック(株)製）５ｇ、ジオキサン３ｇ及び潜熱性エポキシ硬化剤であるサンエイドＳＩ−８０Ｌ（三新化学工業(株)製）０．２ｇを混合し、ポリマー粒子混合液を得た。
【００３０】
液体クロマトグラフィーカラム用のテフロン（登録商標）製Ｏリングをガラスフィルター上に置き、ポリマー粒子混合液をスポイドでＯリング中に滴下し、吸引した。余剰ポリマー粒子分をスパチュラで取り除き、成形した後、ガラスフィルターから取り出し、電熱器を用いて１２０度１０分間加熱硬化しＯリング中にフィルターを形成した。
【００３１】
得られたフィルターを水洗後、フィルターを切断し、電子顕微鏡により観察したところ、ポリマー粒子同士が架橋剤として用いたエポキシ化合物により癒着し、積層架橋されたフィルターが製造されたことがわかる（図１）。このフィルターでは、積層架橋された粒子間間隙がフィルターの連続孔となっており、空孔率は０．２〜０．５である。またこのフィルターでは、粒子間隙が閉塞することなく連続孔を形成していることもわかる（図２）。顕微鏡観察により、Oリングとフィルターの間に隙間が生じることなく均一にフィルターが形成されていることもわかる（図３）。
【００３２】
図４は、市販されている液体クロマトグラフィーカラムに装着されているPEEK製フィルターを顕微鏡観察したものである。OリングとPEEKフィルターの間が一部不均一で、隙間が存在することがわかる（図４）。
【００３３】
本実施例で製造したフィルターを、エタノール、ジオキサン及び０．１Ｎ水酸化ナトリウムに浸漬し、目視で確認したが、体積変化は生じなかった。
【００３４】
実施例２
実施例１で得られたフィルターを液体クロマトグラフィーカラムに装備した本発明のカラムを使用して、フィルターへのタンパク質の吸着を測定した。本発明のフィルターを装備したカラムへの充填材の充填の際、５０ＭＰａの充填圧で充填を実施したが、フィルター変形による充填圧上昇等は観察されず、十分な機械的強度を有していることがわかった。比較のため、市販されているフィルターを用いて同様の操作を実施した。なお、カラム内部に充填した充填材はいずれも同一である。
【００３５】
まず、カラムを接続せずに試料を注入した際のピーク面積を基準として、各カラムを接続し、一定量注入毎に得られたピーク面積と比較した。結果を図５に示す。図５から、いずれのフィルターにおいても、タンパク質の初期吸着が観察されたが、実施例１で製造した本発明のフィルターでは、他のフィルターに比較して、初期吸着が極めて小さいことがわかる。
【００３６】
測定条件
カラムサイズ：４．６ｍｍＩＤｘ１００ｍｍＬ
フィルター：実施例１で製造した本発明のフィルター又は市販の焼結ＳＵＳ、ＰＥＥＫ、ＳＵＳメッシュ（２マイクロメーター目開き）フィルター
充填材：ＴＳＫｇｅｌ  ＳＰ−ＳＴＡＴ（東ソー(株)製）
溶離液：０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリム、１０ｍｍｏｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）
検出：ＵＶ  ２８０ｎｍ
試料：トリプシノーゲン
実施例３
実施例２で製造した本発明の液体クロマトグラフィーカラムを用い、タンパク質溶液を連続注入した際のカラムの詰まりやすさを、操作圧を指標に測定した。比較のため、実施例２で使用した、市販されているフィルターを装備したカラムを用いて同様の操作を実施した。結果を図６に示す。図６から、本発明のカラムは他のカラムと比較し詰まりにくく、操作圧の上昇が軽微であることがわかる。
【００３７】
測定条件
溶離液：０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリム、１０ｍｍｏｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
検出：ＵＶ  ２８０ｎｍ
試料：オボアルブミン  (１０ｇ／Ｌ)
【図１】
2011185640.tif 000003
【図２】
2011185640.tif 000004
【図３】
2011185640.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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