(57)【要約】【課題】睡眠誘発作用を有するトリプトファンの機能を向上させる、トリプトファン及び／又はトリプトファン高含有ペプチドと、ヒアルロン酸とから成る複合体としての新規食品素材、及びその製造方法を提供する【解決手段】トリプトファンのインドール環の２位とヒアルロン酸中におけるＮ−アセチルグルコサミンの１位の還元末端が炭素−炭素結合していることを特徴とするトリプトファン−ヒアルロン酸食品素材およびトリプトファン高含有ペプチド−ヒアルロン酸食品素材。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリプトファン又はトリプトファン高含有ペプチドのインドール環の２位とヒアルロン酸中におけるＮ−アセチルグルコサミン又はグルクロン酸の１位の還元末端が炭素−炭素結合していることを特徴とするトリプトファン又はトリプトファン高含有ペプチドとヒアルロン酸との複合体からなる食品素材。
【請求項２】
トリプトファン及び／又はトリプトファン高含有ペプチドをｐＨ２以下の酸性溶液に溶解する工程、ヒアルロン酸を添加・混合し、ｐＨ３以下の強酸性条件下で８０℃以上に加熱させて、トリプトファン又はトリプトファン高含有ペプチドのインドール環の２位とヒアルロン酸中におけるＮ−アセチルグルコサミン又はグルクロン酸の１位の還元末端を選択的に結合させる発色反応を伴う工程を含む請求項１に記載のトリプトファン又はトリプトファン高含有ペプチドとヒアルロン酸との複合体からなる食品素材の製造方法。
【請求項３】
請求項１記載のトリプトファン又はトリプトファン高含有ペプチドとヒアルロン酸の複合体からなる食品素材を含有する飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリプトファンがもつ睡眠促進作用を高めた機能性食品素材に関する。さらに詳しくはトリプトファンのインドール環の２位の炭素とヒアルロン酸中におけるＮ−アセチルグルコサミン又はグルクロン酸の１位の還元末端を選択的に結合させる反応を用いてヒアルロン酸にトリプトファンあるいはトリプトファン高含有ペプチドを結合させてなる新規化合物トリプトファン−ヒアルロン酸複合体及びトリプトファン高含有ペプチド−ヒアルロン酸複合体、並びにそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トリプトファンは、体内で合成することのできない必須アミノ酸の一つであり、食品から摂取する必要がある。トリプトファンは多くのタンパク質中に見出されるが、含量は低く、生体内において、酸化還元酵素に関与する補酵素をはじめ、セロトニン、メラトニンといったホルモン、キヌレニン等の生体色素、また植物において重要な成長ホルモンであるインドール酢酸、などの前駆体として重要である。トリプトファンは、蛋白質生合成の材料として必要なだけでなく、その適量の摂取は神経を落ち着かせ、睡眠をうながす作用があるといわれる。例として、トリプトファンの睡眠誘発作用を利用してヒドロキシトリプトファンを有効成分とする医薬組成物あるいは食品が、時差ぼけ・心理的不眠症等の概日リズムが変調する場合の予防法・治療法として提供されている（特許文献１）。しかしながら、今日までに存在するトリプトファン含有新規合成物質は、有機合成法を用いて合成された薬品に関する事例であり（特許文献２）、食品として機能的に促進した組成物はこれまでにない。従って、食品添加物として認可されている物質を使用してトリプトファンの睡眠誘発作用を向上させるような新規食品素材を作り出すことは非常に有意義である。
【０００３】
トリプトファンは、アミノ酸側鎖にインドール環を持ち、芳香族アミノ酸に分類されるが、必須アミノ酸のなかでもπ電子が多く、電子密度が高い性質をもっており、強酸性条件でアルデヒドと発色を伴う選択的反応を起こすことが知られている（非特許文献１，２）。また、繊維産業、特に染色産業の分野では、この選択的発色反応を利用して、合成染色に代わって天然材料、染料を用いた着色に関する技術開発が進んでいる。具体的には、天然から得られる動物繊維（絹・羊毛）に含まれているトリプトファンを発色させ、洗濯、摩擦、汗などの外的因子による移染（汚染）が生じない利点をもつ染色技術が開発されている（非特許文献１）。しかしながら、飲食品の分野において、前記トリプトファンの特異的発色反応を利用した例は見られず、さらにはトリプトファンが有する睡眠誘発機能を向上させるような飲食品用素材の開発をした例も無い。
【０００４】
一方、ヒアルロン酸は、β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンとβ−Ｄ−グルクロン酸が交互に結合した直鎖状の高分子多糖である天然高分子多糖類の一種であり、動物諸組織に広く分布し、特に硝子体、ヘソの緒、関節液、皮膚、ニワトリのトサカなどに多く存在する生体構成物質である。また、ヒアルロン酸は生体構成物質であるために人体の生体組織に対する馴染みが良好であり、その高い保水性から生体との適合性に優れている。そのため、人工血管や人工皮膚等の医療用高分子材料としての用途を期待されており、例として、ジビニルスルホン（特許文献３）、ビスエポキシド類（特許文献４）、ホルムアルデヒド（特許文献５）等の二官能性試薬を架橋剤に使用した高膨潤性の架橋ヒアルロン酸ゲルや、ヒアルロン酸水溶液を、ｐＨ２．０〜３．８、２０〜８０重量％水溶性有機溶剤存在下におくことを特徴とするヒアルロン酸ゲルの製造方法（特許文献６）などが報告されている。
【０００５】
また、医療用高分子材料への利用の観点から、ヒアルロン酸とアミノ基あるいはイミノ基を有する高分子化合物、もしくはヒアルロン酸のカルボキシル基と高分子化合物のアミノ基あるいはイミノ基をイオン複合体として結合させたヒアルロン酸高分子複合体の調製法（特許文献７）も公開されている。しかしながら、この手法はアミノ酸のアミノ基およびカルボキシル基を利用したヒアルロン酸複合体の形成ではあるが、ヒアルロン酸を水に不溶性にすることを目指したものであるため、食品素材への応用は困難を伴う。
【０００６】
また、近年、低分子薬物、ペプチド薬物、タンパク質薬物等の血中滞留性の向上、安定性の向上、溶解性の向上、抗原性の低減等を目的として、薬物と水溶性ポリマーとのコンジュゲーションが試みられている。その分野において、ヒアルロン酸は、生分解性を有する点、巨大サイズ化が可能な点、さらに、１分子中に多くの反応点をもつなどの特性を保持することから、優れたコンジュゲート担体として注目されている。そのため、ヒアルロン酸のコンジュゲート担体として血中滞留時間の延長などの機能向上を目指して、インターフェロンやヒドラジド基の導入、修飾が盛んに行われている（特許文献８、９）。
【０００７】
従って、ヒアルロン酸とトリプトファンとを結合させることで、トリプトファンの体内への吸収効率だけではなく、ヒアルロン酸の輸送担体としての機能などを鑑みて、トリプトファンの輸送効率の向上が期待でき、それに伴った睡眠導入効果も促進されることが予想される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−０８１８２９号公報
【特許文献２】特開２００６−２８１４１号公報
【特許文献３】特公平６−３７５７５号公報
【特許文献４】特開平７−９７４０１号公報
【特許文献５】特開昭６０−１３０６０１号公報
【特許文献６】特開平５−５８８８１号公報
【特許文献７】特開平６−７３１０３号公報
【特許文献８】特開平５−８５９４２号公報
【特許文献９】国際公開第２００５／０５４３０２号パンフレット
【特許文献１０】特開平９−２８３０６号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】堂ノ脇保己、トリプトファン発色反応を利用した動物繊維の着色、「繊維と工業」、2002年4月号、ｐ110-113
【非特許文献２】浦川 稔寛、アルデヒドとトリプトファン残基の選択的反応を利用するタンパク質の着色法、“BUNSEKI KAGAKU” The Japan Society for Analytical Chemistry Vol.56, No.7, ｐ567-572 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、トリプトファン及び／又はトリプトファン高含有ペプチドと、ヒアルロン酸とから成る複合体としての食品素材、及びその製造方法を提供することにある。さらに具体的には、睡眠誘発作用を有するトリプトファンの機能を向上させるような新規食品素材およびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記の事情に鑑み鋭意研究を重ねた結果、ヒアルロン酸の生体構成物質としての吸収や生体への適合性、および輸送担体としての機能に着目し、トリプトファンあるいはトリプトファン高含有ペプチドを前記ヒアルロン酸と結合させることで、トリプトファン−ヒアルロン酸複合体およびトリプトファン高含有ペプチド−ヒアルロン酸複合体を製造し、消化吸収性の向上した新規のトリプトファン化合物として提供することをもって、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、
（１）トリプトファン又はトリプトファン高含有ペプチドのインドール環の２位とヒアルロン酸中におけるＮ−アセチルグルコサミン又はグルクロン酸の１位の還元末端が炭素−炭素結合していることを特徴とするトリプトファン又はトリプトファン高含有ペプチドとヒアルロン酸との複合体からなる食品素材（以下、「トリプトファン−ヒアルロン酸食品素材」、「トリプトファン高含有ペプチド−ヒアルロン酸食品素材」とそれぞれ区別して称することもある。）。
（２）トリプトファン及び／又はトリプトファン高含有ペプチドをｐＨ２以下の酸性溶液に溶解する工程、ヒアルロン酸を添加・混合し、ｐＨ３以下の条件下で８０℃以上に加熱して、トリプトファンのインドール環の２位とヒアルロン酸中におけるＮ−アセチルグルコサミン又はグルクロン酸の１位の還元末端を選択的に結合させる発色反応を伴う工程を含む前記（１）に記載のトリプトファン−ヒアルロン酸食品素材又はトリプトファン高含有ペプチド−ヒアルロン酸食品素材の製造方法、
（３）前記トリプトファン−ヒアルロン酸食品素材及び／又はトリプトファン高含有ペプチド−ヒアルロン酸食品素材を含有する飲食品、に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のトリプトファン−ヒアルロン酸複合体及びトリプトファン高含有ペプチド−ヒアルロン酸複合体は食品素材であるため、食品で認可された物質のみを使用して生成することが可能である。
【００１４】
本発明の複合体を飲食品に使用することで、食品中の含量の低い必須アミノ酸であるトリプトファンの消化吸収率の向上および効率的な摂取を可能とする。すなわち、本発明の複合体は、ヒアルロン酸の輸送担体としての機能性を利用することで、摂取および吸収の点からトリプトファンの機能性を向上させ、睡眠誘発効果の高い食品素材となっている。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ヒアルロン酸中のＮ−アセチルグルコサミンの１位にトリプトファンが結合したトリプトファン−ヒアルロン酸複合体。
【図２】ヒアルロン酸中のグルクロン酸の１位にトリプトファンが結合したトリプトファン−ヒアルロン酸複合体。
【図３】ヒアルロン酸中のＮ−アセチルグルコサミンの１位にトリプトファン高含有ペプチド中のトリプトファン残基が結合したトリプトファン高含有ペプチド−ヒアルロン酸複合体。
【図４】ヒアルロン酸中のグルクロン酸の１位にトリプトファン高含有ペプチド中のトリプトファン残基が結合したトリプトファン高含有ペプチド−ヒアルロン酸複合体。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のトリプトファン−ヒアルロン酸複合体およびトリプトファン高含有ペプチド−ヒアルロン酸複合体は、トリプトファンのインドール環の２位とヒアルロン酸中におけるＮ−アセチルグルコサミン又はグルクロン酸の１位の還元末端が炭素−炭素結合していることを特徴とする。前記複合体は、強酸性条件でトリプトファンとアルデヒドが反応して発色する選択的反応を利用して製造される。これはアミノ酸側鎖にインドール環を持ち、必須アミノ酸のなかでもπ電子が多く、電子密度が高い性質を持つトリプトファン特有の高い反応性に基づいており、例えば、４−（ジメチルアミノ）ベンズアルデヒドの濃塩酸溶液をトリプトファンと反応させると赤色に発色するNeubauer-Rhode反応が知られている。その他、トリフルオロ酢酸・硝酸などの強酸でも発色するという報告もあり（非特許文献１，２参照。）、それらと同様の反応機構を利用している。
【００１７】
トリプトファン−ヒアルロン酸複合体およびトリプトファン高含有ペプチド−ヒアルロン酸複合体の構造は大きく分けて４つの構造体が考えられるが、全ての構造体はトリプトファン２分子に対して１分子のヒアルロン酸が炭素-炭素結合する。ヒアルロン酸はＮ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸の二糖単位で構成されている。１つ目はヒアルロン酸中のＮ−アセチルグルコサミンの１位に結合した複合体である(図１)。２つ目はヒアルロン酸中のグルクロン酸の１位に結合した複合体である(図２)。３つ目はヒアルロン酸中のＮ−アセチルグルコサミンの１位にトリプトファン高含有ペプチド中のトリプトファン残基が結合した複合体である(図３)。４つ目はヒアルロン酸中のグルクロン酸の１位にペプチドが結合した複合体である。これらの組成物は炭素-炭素結合で結合した複合体である。
【００１８】
トリプトファンは肉・魚・豆・種子・ナッツ・豆乳・乳製品などに豊富に含まれるが、例えば、トリプトファンを多く含有すると言われている牛乳の主成分であるカゼインのトリプトファン含量は１３ｍｇ／ｇである。また、特許文献１０で示されている精製カゼイン加水分解物はトリプトファン含有量が低いものとして規定されており、その際にトリプトファンの含有量は４ｍｇ／ｇ以下であることが示されている。さらに、トリプトファン含有量が低いタンパク質として知られているコラーゲンにはトリプトファンがほとんど含まれていない。すなわち、本発明におけるトリプトファン高含有ペプチドの基準としてカゼイン加水分解物を例に考えると、少なくともペプチド中のトリプトファンの含有率が４ｍｇ／ｇ以上として規定する。すなわち、本発明におけるトリプトファン高含有ペプチドとしては、４ｍｇ／ｇ以上のトリプトファン含有ペプチド又はタンパク質であれば、いかなる種類及び化学的修飾物質であっても特に限定されない。
【００１９】
本発明のトリプトファン−ヒアルロン酸複合体やトリプトファン高含有ペプチド−ヒアルロン酸複合体の製造方法は、トリプトファン及び／又はトリプトファン高含有ペプチドをｐＨ２以下の酸性溶液に溶解する工程、ヒアルロン酸を添加・混合し、ｐＨ３以下の条件下で８０℃以上に加熱して１０分間以上反応させて、トリプトファンのインドール環の２位とヒアルロン酸中におけるＮ−アセチルグルコサミン又はグルクロン酸の１位の還元末端を選択的に結合させる工程からなる。
【００２０】
本発明に用いられるヒアルロン酸は、どのような製造方法により得られたヒアルロン酸であってもよく、例えば、動物組織から抽出されたヒアルロン酸、発酵法で得られたヒアルロン酸、化学合成で得られたヒアルロン酸など、その由来は限定されない。ヒアルロン酸の分子量については、平均分子量 １００,０００以下（質量平均分子量）のものが好ましい。それ以上の分子量については、体内への吸収効率が低下すると考えられる。
【００２１】
本発明で使用する酸性溶液とは、ｐＨ２以下の水溶液として用いることができ、例えば、塩酸、クエン酸、リンゴ酸、酢酸、フマル酸、酒石酸、ビタミンＣ等を用いることができる。
【００２２】
トリプトファンやトリプトファン高含有ペプチドを含有する酸性溶液中のトリプトファンあるいはトリプトファン高含有ペプチドの含有量としては、２〜３重量％程度が好ましい。前記トリプトファンとトリプトファン高含有ペプチドとは、混合物として用いても良い。また、ヒアルロン酸は、予め溶解液として前記トリプロファン及び／又はトリプトファン高含有ペプチドを含有する酸性溶液に添加してもよい。前記ヒアルロン酸の溶解液中における含有量としては、２〜1２重量％程度が好ましい。前記トリプトファン及び／又はトリプトファン高含有ペプチドを含有する酸性溶液のｐＨとしては、２以下が好ましい。両液の混合割合は、混合溶液の最終のｐＨが３以下となるように調整されていればよい。前記トリプトファン及び／又はトリプトファン高含有ペプチドを含有する酸とヒアルロン酸の溶解液との混合後、８０℃以上に加熱するが、反応の進行を促進する観点から、９０℃以上に加熱することがより好ましい。反応時間は１０分以上としているが、２０分以上が好ましい。１０分未満の場合、反応が不十分な可能性が大きい。また、本反応では前記トリプトファン及び／又はトリプトファン高含有ペプチドとヒアルロン酸の複合体化に伴い、溶液が褐色へと変化する。そのため、褐色変化の終了を反応終了とする。
【実施例】
【００２３】
次に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明はそれらの実施例のみに限定されるものではない。なお以下の実施例などにおいて、溶液などの濃度を示す％は特にことわらないかぎり重量％である。
【００２４】
（１）原料
トリプトファン
トリプトファンには市販のもの（販売元：協和ウェルネス）を使用した。
ヒアルロン酸
ヒアルロン酸には平均分子量１０，０００〜２０，０００（質量平均分子量）の低分子コラーゲンペプチド（Nutra-HAF: Bioland社）を使用した。
【００２５】
（２）トリプトファン−ヒアルロン酸複合体の調製
トリプトファン−ヒアルロン酸複合体の調製は上記の条件で行った。具体的には、塩酸によりｐＨを２以下に調整したトリプトファンを含有する酸性溶液中における、トリプトファン含有量およびヒアルロン酸溶液中のヒアルロン酸含有量の混合後の終濃度が３％になるように調製し、混合する。その後に９０℃以上になるように加温し、溶液が茶褐色に呈色することを確認し、それをトリプトファン−ヒアルロン酸複合体溶液とした。
【００２６】
（実施例１）
下記の表１に示す処方により各成分を混合して、トリプトファン−ヒアルロン酸複合体を含有する飲料を作成した。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
（試験例１）
実施例１で作製した睡眠改善飲料を１５人の被試験者に１週間、毎日飲用してもらい、それによる睡眠の変化について、自覚症状のアンケート調査を行った。１５人の被試験者を５人ずつＡ、Ｂ、Ｃの３グループに分けて、１週間、毎日飲用してもらった。その結果を表２に示す。
【００２９】
【表２】
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【００３０】
表２に示すように、トリプトファン−ヒアルロン酸複合体を含有する飲料Ａについては睡眠改善効果が見られた。一方、トリプトファン及びヒアルロン酸を複合化せずそれぞれを単体で含有する飲料Ｂについては、飲料Ａ程の効果が見られず、プラセボコントロールとした飲料Ｃでは睡眠改善効果はほとんど見られなかった。これにより、本発明のトリプトファン−ヒアルロン酸食品素材の効果が明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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