(57)【要約】【課題】効率よく、かつ信頼性の高い培養条件の探索を低コストで実現できるマイクロチップを提供する。【解決手段】複数のチャンバー部４が、複数の行および複数の列からなる行列をなすように配列されたマイクロチップ１。列１０Ａ、１０Ｂに属するチャンバー部４の内面が、細胞の接着を促す第１の足場因子８Ａで修飾され、列１０Ｃ、１０Ｄに属するチャンバー部４の内面が、第２の足場因子８Ｂで修飾されている。行９Ａ、９Ｂに属するチャンバー部には、第１の液性因子６ａを含む液を導入する第１導入流路１２Ａが接続され、行９Ｃ、９Ｄに属するチャンバー部には、第２の液性因子６ｂを含む液を導入する第２導入流路１２Ｂが接続されている。【選択図】図８
2011030445.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養用の複数のチャンバー部が形成されたマイクロチップにおいて、
前記複数のチャンバー部が、複数の行および複数の列からなる行列をなすように配列され、
前記複数の列のうち一部の列に属するチャンバー部の内面が、細胞の接着を促す第１の足場因子で修飾され、
それ以外の列のうち少なくとも一部の列に属するチャンバー部の内面が、細胞の接着を促す第２の足場因子で修飾され、
前記複数の行のうち一部の行に属するチャンバー部には、第１の液性因子を含む液を導入する第１導入流路が接続され、
それ以外の行のうち少なくとも一部の行に属するチャンバー部には、第２の液性因子を含む液を導入する第２導入流路が接続されていることを特徴とするマイクロチップ。
【請求項２】
前記チャンバー部となるチャンバー凹部を有する主板部と、前記チャンバー凹部に臨む部分が前記足場因子で修飾される基板部とが重ね合わされることによって構成されることを特徴とする請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項３】
前記第１および第２導入流路が接続されたチャンバー部を含む行以外の行のうち少なくとも一部の行に属するチャンバー部には、前記第１導入流路から分岐された第１分岐流路と、前記第２導入流路から分岐された第２分岐流路とによって供給された前記第１および第２の液性因子を含む液を導入可能であることを特徴とする請求項１または２に記載のマイクロチップ。
【請求項４】
前記第１および第２の液性因子を含む液が導入可能となるチャンバー部を含む行以外の行のうち少なくとも一部の行に属するチャンバー部に、前記第１および第２の液性因子を含まない液が導入可能なブランク用流路が接続されていることを特徴とする請求項３に記載のマイクロチップ。
【請求項５】
前記足場因子は、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ゼラチン、およびポリリジンから選択されたものであることを特徴とする請求項１〜４のうちいずれか１項に記載のマイクロチップ。
【請求項６】
前記液性因子は、活性化因子、抑制因子、成長因子、ホルモン、およびサイトカインから選択されたものであることを特徴とする請求項１〜５のうちいずれか１項に記載のマイクロチップ。
【請求項７】
少なくとも前記足場因子で修飾される面がポリジメチルシロキサンまたはガラスからなることを特徴とする請求項１〜６のうちいずれか１項に記載のマイクロチップ。
【請求項８】
少なくとも前記チャンバー部内面の一部がポリジメチルシロキサンからなることを特徴とする請求項１〜７のうちいずれか１項に記載のマイクロチップ。
【請求項９】
請求項１〜８のうちいずれか１項に記載のマイクロチップを用いて培養条件を探索する方法であって、
前記第１および第２の足場因子で修飾された列に属するチャンバー部に、対象となる細胞を接着させ、
前記第１および第２の導入流路が接続された行に属するチャンバー部に、それぞれ前記第１および第２の液性因子を含む液を導入し、各チャンバー部における細胞の状態を比較することを特徴とする培養条件探索方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養や生化学分析、化学反応などを効率良く行うために用いられる生化学試験用のマイクロチップおよびこれを用いた培養条件探索方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロプレートを用いて行われてきた従来型の細胞アッセイ法は自動化が進められ、それに対応する３８４ウェルや１，５３６ウェルプレートも市販されている。
しかしながら、１，５３６ウェルプレートでは微量液体のハンドリングや、表面からの蒸発の制御が難しく、信頼できる分析を行うためには１プレートあたり３８４ウェルが集積化の限界と言われており、より効率的で信頼性の高い細胞アッセイ法が求められている。
一方、近年の微細加工技術やＬａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ関連の技術の発展に伴い、１枚のチップ上にアレイ状に構成された微細構造の中で細胞を培養、解析、操作することで、様々な細胞アッセイや細胞操作を効率的に行う方法が報告されている。例えば、本発明者による非特許文献１やアメリカのグループによる非特許文献２では、複数の薬剤の細胞毒性を一度に試験することのできるマイクロチップが記載されている。
一方、既報の細胞アッセイ用マイクロチップの多くはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で製作されているが、ＰＤＭＳからなる表面上で培養できる細胞は限られている。様々な細胞に対するアッセイをオンチップで実現するには、個々の細胞に適切な培養環境をマイクロスケールで構築する技術が必要である。
また、生体内における細胞機能の発現には、多くの場合、足場因子や液性因子によって構成される複数の分化誘導因子が協調して働いていることが知られている（非特許文献３、非特許文献４参照）。
一般的に、生体より採取した初代培養細胞を生体外で培養するためには、適切な足場因子や液性因子によって構成される培養環境の中で培養する必要がある。
また、生体外で幹細胞を特定の細胞に分化誘導するには、多数の分化誘導因子を複合的なシステムとして作用させる必要がある。
さらに、ＥＳ細胞の分化誘導能は、細胞株ごとに大きく異なることが報告されている（非特許文献５参照）。
このように、幹細胞の分化誘導プロセスは複雑かつ多様であり、幹細胞を特定の細胞に分化させる最適な培養環境を細胞株ごとに網羅的に探索する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Sugiura S., Edahiro J., Kikuchi K., Sumaru K., and Kanamori T.:Cell Culture Microchamber Array with Independent Perfusion Channel for Parallel Drug Toxicity Assay, The proceedings of microTAS 2007, Chemical and Biological Microsystems Society, pp1321-1323 (2007).
【非特許文献２】Wang Z., Kim M.-C., Marquez M. and Thorsen T.: High-Density Microfluidic Arrays for Cell Cytotoxicity Analysis, Lab Chip, 7, 740-745 (2007).
【非特許文献３】M. A. Schwartz and M. H. Ginsberg, Nat. Cell Biol., 4, E65-E68 (2002).
【非特許文献４】K. M. Yamada and S. Even-Ram, Nat. Cell Biol., 4, E75-E76 (2002).
【非特許文献５】K. Osafune, et al.,Nat. Biotechnol., 26, pp. 313-315, (2008).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述のように、多くの培養細胞では足場因子と液性因子によって構成される培養環境を探索する必要があるが、従来の培養技術を用いて適切な培養環境を網羅的に探索するには、非常に煩雑な手作業や高価なロボットが必要となる。また、煩雑で複数回にわたる試験が必要となることにより信頼性が低下しやすいという問題もある。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、効率よく、かつ信頼性の高い培養条件の探索を低コストで実現できるマイクロチップおよび培養条件探索方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するために、本発明では以下の構成を提供する。
本発明は、細胞培養用の複数のチャンバー部が形成されたマイクロチップにおいて、前記複数のチャンバー部が、複数の行および複数の列からなる行列をなすように配列され、前記複数の列のうち一部の列に属するチャンバー部の内面が、細胞の接着を促す第１の足場因子で修飾され、それ以外の列のうち少なくとも一部の列に属するチャンバー部の内面が、細胞の接着を促す第２の足場因子で修飾され、前記複数の行のうち一部の行に属するチャンバー部には、第１の液性因子を含む液を導入する第１導入流路が接続され、それ以外の行のうち少なくとも一部の行に属するチャンバー部には、第２の液性因子を含む液を導入する第２導入流路が接続されているマイクロチップを提供する。
本発明のマイクロチップは、前記チャンバー部となるチャンバー凹部を有する主板部と、前記チャンバー凹部に臨む部分が前記足場因子で修飾される基板部とが重ね合わされることによって構成される構成とすることができる。
本発明では、前記第１および第２導入流路が接続されたチャンバー部を含む行以外の行のうち少なくとも一部の行に属するチャンバー部には、前記第１導入流路から分岐された第１分岐流路と、前記第２導入流路から分岐された第２分岐流路とによって供給された前記第１および第２の液性因子を含む液を導入可能である構成を採用できる。
本発明では、前記第１および第２の液性因子を含む液が導入可能となるチャンバー部を含む行以外の行のうち少なくとも一部の行に属するチャンバー部に、前記第１および第２の液性因子を含まない液が導入可能なブランク用流路が接続されている構成を採用できる。
前記足場因子としては、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ゼラチン、およびポリリジンから選択されたものが使用できる。
前記液性因子としては、活性化因子、抑制因子、成長因子、ホルモン、およびサイトカインから選択されたものが使用できる。
本発明のマイクロチップは、少なくとも前記足場因子で修飾される面がポリジメチルシロキサンまたはガラスからなることが好ましい。
本発明のマイクロチップは、少なくとも前記チャンバー部内面の一部がポリジメチルシロキサンからなることが好ましい。
【０００６】
本発明の培養条件探索方法は、前記マイクロチップを用いて培養条件を探索する方法であって、前記第１および第２の足場因子で修飾された列に属するチャンバー部に、対象となる細胞を接着させ、前記第１および第２の導入流路が接続された行に属するチャンバー部に、それぞれ前記第１および第２の液性因子を含む液を導入し、各チャンバー部における細胞の状態を比較する培養条件探索方法である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、行列をなすように配列されたチャンバー部が、列ごとに所定の足場因子で修飾され、これらチャンバー部には行ごとに所定の液性因子を導入する導入流路が接続されているので、足場因子と液性因子の多数の組み合わせを一度に試験することができる。
このため、対象となる細胞の培養条件を網羅的に試験することができる。例えば幹細胞を特定の細胞に分化誘導するために最適な環境条件を探索することができる。
多数の組み合わせを一度に実現できるため、効率よく、かつ信頼性の高い条件探索を低コストで実現できる。
細胞の機能は、足場因子と液性因子により構成される外部環境に依存する複雑な細胞内シグナル伝達を経て決定されているため、環境が細胞に及ぼす影響を一元的に把握するのは難しく、足場因子、液性因子の組み合わせについて網羅的な試験が必要となる。
一般に、多数の組み合わせについて網羅的な試験を行うのは手間がかかり、しかも複数の試験が必要となることなどにより信頼性が低下しやすいが、本発明では、多数の組み合わせについて一度に試験ができるため、高効率で信頼性の高い試験が可能となることから、細胞の最適な培養条件の探索における技術的意義は極めて高い。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の第１の例のマイクロチップの全体を示す平面図である。
【図２】マイクロチップの要部を拡大した平面図である。
【図３】マイクロチップの要部を拡大した断面図である。
【図４】マイクロチップの要部を示す平面図である。
【図５】足場因子の修飾部位を示す平面図である。
【図６】足場因子で修飾されたマイクロチップの要部を示す断面図である。
【図７】足場因子で修飾されたマイクロチップを示す平面図である。
【図８】足場因子で修飾されたマイクロチップを示す平面図である。
【図９】本発明の第２の例のマイクロチップの要部を示す平面図である。
【図１０】マイクロチップの要部を拡大した断面図である。
【図１１】マイクロチップの要部を拡大した断面図である。
【図１２】本発明の第３の例のマイクロチップの要部を示す平面図である。
【図１３】本発明の第４の例のマイクロチップの要部を示す平面図である。
【図１４】試験結果を示す写真である。
【図１５】試験結果を示す写真である。
【図１６】試験結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の第１の例であるマイクロチップ１について、図面を参照して説明する。
図１は、マイクロチップ１の全体を示す平面図であり、図２はマイクロチップ１の要部を拡大した平面図であり、図３はマイクロチップ１の要部を拡大した断面図である。
以下の説明において、マイクロチップ１の長手方向（図１における左右方向）を第１方向といい、マイクロチップ１の短手方向（図１における上下方向）を第２方向ということがある。
【００１０】
図２および図３に示すように、マイクロチップ１は、平板状の主板部２と、これに重ね合わされる平板状の基板部３とによって構成することができる。
主板部２の、基板部３に対向する面２ａ（表面２ａ）には、試料液が導入されるチャンバー部４となるチャンバー凹部５が形成されている。
チャンバー凹部５は、平面視円形の主空間凹部５ａと、主空間凹部５ａの外周側に、これを囲んで形成された外周空間凹部５ｂとからなる。外周空間凹部５ｂは、主空間凹部５ａより浅く形成されている。
図３に示すように、チャンバー部４は、主空間凹部５ａ内の空間（主空間部４ａ）と、外周空間凹部５ｂ内の空間（外周空間部４ｂ）とからなる。
【００１１】
図１および図２に示すように、チャンバー部４は、複数の行および複数の列からなる行列をなすように２次元的に配列される。
図示例では、合計６４のチャンバー部４が、８行および８列からなる行列をなすようアレイ状に配列されている。行を構成するチャンバー部４は、第１方向（図１における左右方向）に沿って並び、列を構成するチャンバー部４は、第２方向（図１における上下方向）に沿って並んでいる。各チャンバー部４は、互いに間隔をおいて配列されている。
符号９Ａ〜９Ｈはそれぞれチャンバー部４がなす８つの行を示し、符号１０Ａ〜１０Ｈはそれぞれチャンバー部４がなす８つの列を示す。
なお、図示例では、行と列の形成方向は互いにほぼ垂直であるが、これに限らず、互いに交差する方向であればよい。
【００１２】
主板部２の表面２ａには、チャンバー凹部５（チャンバー部４）に連通する入口流路７と出口流路１５とが形成されている。
入口流路７は、第１方向（図１における左右方向）に沿って形成された送液流路１１と、送液流路１１から分岐して各チャンバー部４に連通する複数の導入流路１２とを有し、これら導入流路１２はそれぞれチャンバー部４に接続されているため、貯留部２１からの試料液を、送液流路１１から導入流路１２を経てチャンバー部４に導入することができる。
【００１３】
図１および図４に示すように、入口流路７は４つ形成され（入口流路７Ａ〜７Ｄという）、それぞれが異なる貯留部２１（貯留部２１Ａ〜２１Ｄという）に接続されている。
入口流路７Ａの送液流路１１Ａは第１行９Ａと第２行９Ｂの間に延在し、入口流路７Ｂの送液流路１１Ｂは第３行９Ｃと第４行９Ｄの間に延在し、入口流路７Ｃの送液流路１１Ｃは第５行９Ｅと第６行９Ｆの間に延在し、入口流路７Ｄの送液流路１１Ｄは第７行９Ｇと第８行９Ｈの間に延在している。
入口流路７Ａの送液流路１１Ａから分岐した第１導入流路１２Ａは第１行９Ａと第２行９Ｂの各チャンバー部４に接続され、入口流路７Ｂの送液流路１１Ｂから分岐した第２導入流路１２Ｂは第３行９Ｃと第４行９Ｄの各チャンバー部４に接続され、入口流路７Ｃの送液流路１１Ｃから分岐した第３導入流路１２Ｃは第５行９Ｅと第６行９Ｆの各チャンバー部４に接続され、入口流路７Ｄの送液流路１１Ｄから分岐した第４導入流路１２Ｄは第７行９Ｇと第８行９Ｈの各チャンバー部４に接続されている。
【００１４】
図４に示すように、マイクロチップ１では、入口流路７Ａ〜７Ｄが上記構成であるため、貯留部２１Ａからの試料液６Ａを入口流路７Ａから第１行９Ａおよび第２行９Ｂのチャンバー部４に導入でき、貯留部２１Ｂからの試料液６Ｂを入口流路７Ｂから第３行９Ｃおよび第４行９Ｄのチャンバー部４に導入でき、貯留部２１Ｃからの試料液６Ｃを第５行９Ｅと第６行９Ｆのチャンバー部４に導入でき、貯留部２１Ｄからの試料液６Ｄを第７行９Ｇと第８行９Ｈのチャンバー部４に導入できる。
なお、本発明では、複数の行のうち一部の行に属するチャンバー部に一の導入流路が接続され、それ以外の行のうち少なくとも一部の行に属するチャンバー部に他の導入流路が接続されていればよい。
【００１５】
図１および図４に示すように、出口流路１５は、各チャンバー部４に連通する複数の導出流路１３と、これら複数の導出流路１３が接続される排出流路１４とを有し、チャンバー部４内の液を導出流路１３から排出流路１４を経て排出部２２に排出することができる。排出流路１４は第１方向（図１における左右方向）に沿って形成されている。
図４に示すように、出口流路１５は、５つ形成され（出口流路１５Ａ〜１５Ｅという）、出口流路１５Ａの排出流路１４Ａは第１行９Ａの外側（図４における上方）に形成され、出口流路１５Ｂの排出流路１４Ｂは第２行９Ｂと第３行９Ｃの間に延在し、出口流路１５Ｃの排出流路１４Ｃは第４行９Ｄと第５行９Ｅの間に延在し、出口流路１５Ｄの排出流路１４Ｄは第６行９Ｆと第７行９Ｇの間に延在し、出口流路１５Ｅの排出流路１４Ｅは第８行９Ｈの外側（図４における下方）に形成されている。
【００１６】
図４に示すように、出口流路１５Ａの導出流路１３Ａは第１行９Ａのチャンバー部４に接続され、出口流路１５Ｂの導出流路１３Ｂは第２行９Ｂと第３行９Ｃのチャンバー部４に接続され、出口流路１５Ｃの導出流路１３Ｃは第４行９Ｄと第５行９Ｅのチャンバー部４に接続され、出口流路１５Ｄの導出流路１３Ｄは第６行９Ｆと第７行９Ｇのチャンバー部４に接続され、出口流路１５Ｅの導出流路１３Ｅは第８行９Ｈのチャンバー部４に接続されている。
【００１７】
導出流路１３は、導入流路１２に比べて断面積を大きくするか導入流路１２より短く形成することによって導入流路１２に比べて流通抵抗を小さくすると、チャンバー部４内の圧力が過度に上昇するのを防ぐことができる。
図示例では、導入流路１２と導出流路１３はチャンバー凹部５の外周空間凹部５ｂに連通している。導入流路１２と導出流路１３の連通箇所は主空間凹部５ａを挟んで向かい合う位置とするのが好ましい。
基板部３の、主板部２に対向する面３ａ（上面３ａ）は平坦であってよい。
【００１８】
主板部２は、レプリカモールディング法によって形成することができる。また、ＲＩＥ（Reactive Ion Etching）、レーザー加工、ＮＣ加工、光造形加工、射出成型加工、ナノインプリント加工などによりチャンバー凹部５、流路７、８等を形成することもできる。
【００１９】
主板部２および基板部３の材料としては、シリコーン系樹脂（例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ））、アクリル系樹脂（例えばポリメタクリル酸メチル）などの樹脂材料、ガラス（例えば石英ガラス）が好適である。
マイクロチップ１は、少なくとも基板部３の上面３ａがＰＤＭＳまたはガラスからなることが好ましい。
本発明のマイクロチップは、少なくともチャンバー部内面の一部がＰＤＭＳからなることが好ましい。例えば主板部２と基板部３の両方がＰＤＭＳで構成されていてもよいし、主板部２がＰＤＭＳ製で基板部３がガラス製であってもよい。
【００２０】
次に、マイクロチップ１の作製および使用方法を説明する。
図５に示すように、チャンバー部４の内面に相当する部分（チャンバー凹部５に臨む部分）の基板部３の上面３ａを、複数種の足場因子８で修飾する。
足場因子８とは、基板部３に対する細胞の接着を促すものであり、例えばコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ゼラチン、およびポリリジンから１または２以上を選択することができる。足場因子８には、細胞を上面３ａに接着させるだけでなく、目的に応じた生理活性が得られる状態にすることも要求される。
【００２１】
図示例では、足場因子８による修飾部位は円形とされ、８行および８列からなる行列をなすように２次元的に配列されている。この修飾部位は、所定のチャンバー部４内面に相当する部分全体であってもよいし、その一部であってもよい。
この例では、第１列１０Ａおよび第２列１０Ｂのチャンバー部４に相当する部分が第１の足場因子８Ａで修飾され、第３列１０Ｃおよび第４列１０Ｄに相当する部分が第２の足場因子８Ｂで修飾され、第５列１０Ｅおよび第６列１０Ｆに相当する部分が第３の足場因子８Ｃで修飾され、第７列１０Ｇおよび第８列１０Ｈに相当する部分が第４の足場因子８Ｄで修飾されている（図１を参照）。足場因子８Ａ〜８Ｄによる修飾部位をそれぞれ符号８ａ〜８ｄで示す。
第１〜第４足場因子８Ａ〜８Ｄは、互いに異なるものである。
なお、本発明では、複数の列のうち一部の列に属するチャンバー部の内面が第１の足場因子で修飾され、それ以外の列のうち少なくとも一部の列に属するチャンバー部の内面が第２の足場因子で修飾されていればよい。
【００２２】
基板部３の上面３ａを足場因子８で修飾する方法としては、例えば基板部３の上面３ａに高分子材料をグラフト結合し、この高分子材料を介して足場因子８を上面３ａに結合させる方法が可能である。
具体的には、例えばアクリル酸を含む液を上面３ａに塗布し、修飾部位８ａ〜８ｄに相当する部位のアクリル酸を、フォトリソグラフィー技術を利用して光重合させることによってこの部位の上面３ａにポリアクリル酸をグラフト結合し、次いでこの部位に足場因子８Ａ〜８Ｄを接触させて足場因子８Ａ〜８Ｄのアミノ基とポリアクリル酸のカルボキシル基とを脱水縮合により結合させる方法を採用できる。
【００２３】
図６および図７に示すように、第１〜第４足場因子８Ａ〜８Ｄで修飾された基板部３と、主板部２とを重ね合わせて接合することによって、マイクロチップ１を得る。
マイクロチップ１は、８つの列１０Ａ〜１０Ｈのうち、第１および第２列１０Ａ、１０Ｂが第１の足場因子８Ａで修飾され、第３および第４列１０Ｃ、１０Ｄが第２の足場因子８Ｂで修飾され、第５および第６列１０Ｅ、１０Ｆが第３の足場因子８Ｃで修飾され、第７および第８列１０Ｇ、１０Ｈが第４の足場因子８Ｄで修飾されたものとなる。
【００２４】
足場因子８Ａ〜８Ｄの修飾部位８ａ〜８ｄには、対象細胞を含む培養液を接触させることにより当該細胞を接着し固定化する。
対象となる細胞は、特に限定されず、目的に応じて、動物由来の細胞（例えばヒト細胞）、植物由来の細胞、微生物由来の細胞等を使用できる。
具体例としては、例えば、造血幹細胞、骨髄系幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞などの体性幹細胞や胚性幹細胞、人工多能性幹細胞がある。また、好中球、好酸球、好塩基球、単球、リンパ球（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞等）等の白血球や、血小板、赤血球、血管内皮細胞、リンパ系幹細胞、赤芽球、骨髄芽球、単芽球、巨核芽球および巨核球等の血液細胞、内皮系細胞、上皮系細胞、肝実質細胞、膵ラ島細胞等が使用できる。
【００２５】
細胞を修飾部位８ａ〜８ｄに接触させるには、例えば出口流路１５の排出流路１４から導出流路１３を通してチャンバー部４に上記培養液を通す方法を採ることができる。
足場因子８Ａ〜８Ｄによって細胞を固定化できるのは、細胞表面の膜タンパク等が足場因子８Ａ〜８Ｄのリガンドに強固に結合するためであると推測することができる。
【００２６】
図８に示すように、４つの貯留部２１Ａ〜２１Ｄには、それぞれ試料液６Ａ〜６Ｄが導入される。
試料液６Ａ〜６Ｄは、それぞれ第１〜第４の液性因子６ａ〜６ｄを含むものである。すなわち、試料液６Ａは第１の液性因子６ａを含み、試料液６Ｂは第２の液性因子６ｂを含み、試料液６Ｃは第３の液性因子６ｃを含み、試料液６Ｄは第４の液性因子６ｄを含む。これら液性因子６ａ〜６ｄは互いに異なるものである。
液性因子６ａ〜６ｄは、例えば活性化因子、抑制因子、成長因子、ホルモン、サイトカインから１または２以上を選択することができる。
液性因子の具体例としては、リン脂質、ステロイド、アリール酢酸系非ステロイド化合物、有機酸を挙げることができ、これらから１または２以上を選択使用することができる。
【００２７】
貯留部２１Ａからの試料液６Ａを入口流路７Ａから第１行９Ａおよび第２行９Ｂのチャンバー部４に導入し、貯留部２１Ｂからの試料液６Ｂを入口流路７Ｂから第３行９Ｃおよび第４行９Ｄのチャンバー部４に導入し、貯留部２１Ｃからの試料液６Ｃを第５行９Ｅと第６行９Ｆのチャンバー部４に導入し、貯留部２１Ｄからの試料液６Ｄを第７行９Ｇと第８行９Ｈのチャンバー部４に導入する。
【００２８】
このように、チャンバー部４には、列ごとに足場因子８Ａ〜８Ｄについて４つの条件のいずれかが与えられ、行ごとに液性因子６ａ〜６ｄについて４つの条件のいずれかが与えられる。
すなわち、第１および第２行９Ａ、９Ｂかつ第１および第２列１０Ａ、１０Ｂのチャンバー部４は、第１足場因子８Ａで修飾され、第１液性因子６ａが導入される。第３および第４行９Ｃ、９Ｄかつ第１および第２列１０Ａ、１０Ｂのチャンバー部４は、第１足場因子８Ａで修飾され、第２液性因子６ｂが導入される。第１および第２行９Ａ、９Ｂかつ第３および第４列１０Ｃ、１０Ｄのチャンバー部４は、第２足場因子８Ｂで修飾され、第１液性因子６ａが導入される。第３および第４行９Ｃ、９Ｄかつ第３および第４列１０Ｃ、１０Ｄのチャンバー部４は、第２足場因子８Ｂで修飾され、第２液性因子６ｂが導入される。
同様にして、４つのチャンバー部４ごとに１通りの足場因子と液性因子の組み合わせが得られ、全体で１６通りの足場因子と液性因子の組み合わせが実現される。
このため、各チャンバー部４における細胞の状態を比較することによって、これら１６通りの足場因子と液性因子の組み合わせが対象細胞に及ぼす影響を互いに比較することができる。
【００２９】
具体的には、例えば幹細胞を特定の細胞に分化誘導するための最適な環境条件の探索を行うことができる。
すなわち、上記１６通りの条件が対象細胞に及ぼす影響を互いに比較することによって、特定の細胞への分化誘導に最も適した足場因子と液性因子の組み合わせを知ることができる。
【００３０】
マイクロチップ１では、行列をなすように２次元的に配列されたチャンバー部４が、列ごとに所定の足場因子８で修飾され、これらチャンバー部４には行ごとに所定の液性因子を導入する導入流路１２が接続されているので、足場因子と液性因子の多数の組み合わせを一度に試験することができる。
このため、対象となる細胞の培養条件を網羅的に試験することができる。例えば幹細胞を特定の細胞に分化誘導するために最適な環境条件を探索することができる。
多数の組み合わせを一度に実現できるため、効率よく、かつ信頼性の高い条件探索を低コストで実現できる。
【００３１】
細胞の機能は、足場因子と液性因子により構成される外部環境に依存する複雑な細胞内シグナル伝達を経て決定されている。
このため、環境が細胞に及ぼす影響を一元的に把握するのは難しく、足場因子、液性因子が単独で細胞に及ぼす影響を調べただけでは最適な組み合わせが明らかになるとは限らず、組み合わせについて網羅的な試験が必要となる。
一般に、多数の組み合わせについて網羅的な試験を行うのは手間がかかり、しかも複数の試験が必要となることなどにより信頼性が低下しやすいが、本発明では、多数の組み合わせについて一度に試験ができるため、高効率で信頼性の高い試験が可能となることから、細胞の最適な培養条件の探索における技術的意義は極めて高い。
【００３２】
次に、本発明の第２の例であるマイクロチップ３１について説明する。
図９は、マイクロチップ３１の要部を示す平面図であり、図１０はマイクロチップ３１の図９におけるＸ−Ｘ’断面を示す図である。図１１はマイクロチップ３１の図９におけるＹ−Ｙ’断面を示す図である。
図９に示すように、マイクロチップ３１には、複数の行および複数の列からなる行列をなすように２次元的に配列されたチャンバー部３４が形成されている。図示例では、チャンバー部３４は４行および４列からなる行列をなす。
符号３２Ａ〜３２Ｄはそれぞれチャンバー部３４がなす４つの行を示し、符号３３Ａ〜３３Ｄはそれぞれチャンバー部３４がなす４つの列を示す。
【００３３】
第２および第３行３２Ｂ、３２Ｃのチャンバー部３４には、液性因子用の入口流路３５Ａ、３５Ｂと、出口流路（図示略）とが連通されている。
第１入口流路３５Ａ（第１導入流路）は第２行３２Ｂに属する各チャンバー部３４に接続され、第２入口流路３５Ｂ（第２導入流路）は第３行３２Ｃに属する各チャンバー部３４に接続されている。
このため、貯留部３７Ａからの試料液３６Ａを第１入口流路３５Ａから第２行３２Ｂのチャンバー部３４に導入でき、貯留部３７Ｂからの試料液３６Ｂを第２入口流路３５Ｂから第３行３２Ｃのチャンバー部３４に導入できる。
試料液３６Ａは第１の液性因子３６ａを含み、試料液３６Ｂは第１の液性因子３６ａとは異なる第２の液性因子３６ｂを含む。
【００３４】
第１行３２Ａのチャンバー部３４には、液性因子用の混合流路３５Ｃ（混合液導入流路）が接続されている。
混合流路３５Ｃには、第１入口流路３５Ａから分岐された第１分岐流路３８Ａと、第２入口流路３５Ｂから分岐された第２分岐流路３８Ｂとが接続されている。
このため、試料液３６Ａと試料液３６Ｂの混合液を第１行３２Ａのチャンバー部３４に導入できる。
【００３５】
図９〜図１１に示すように、分岐流路３８Ａ、３８Ｂは、混合流路３５Ｃとは異なる高さ位置に形成されており、それぞれ連絡流路３９Ａ、３９Ｂを介して混合流路３５Ｃと連通している。
第４行３２Ｄのチャンバー部３４にはブランク用流路３５Ｄが接続されている。ブランク用流路３５Ｄはブランク用貯留部３７Ｄに接続されている。
なお、本発明では、第１および第２の分岐流路３８Ａ、３８Ｂを、直接第１行３２Ａのチャンバー部３４に接続することもできる。
【００３６】
次いで、マイクロチップ３１の使用方法を説明する。
上述の方法に従って、チャンバー部３４の内面を足場因子で修飾する。
例えば、第１列３３Ａのチャンバー部３４内面を第１および第２の足場因子で修飾し、第２列３３Ｂのチャンバー部３４内面を第１の足場因子のみで修飾し、第３列３３Ｃのチャンバー部３４内面を第２の足場因子のみで修飾し、第４列３３Ｄのチャンバー部３４には、足場因子の修飾を行わない。
これによって、第１〜第４列３３Ａ〜３３Ｄのチャンバー部３４の修飾のされ方は、列ごとに互いに異なる４通りとなる。
【００３７】
次いで、これらチャンバー部３４に、次のように試料液を導入する。
貯留部３７Ａからの試料液３６Ａを、入口流路３５Ａを通して第２行３２Ｂのチャンバー部３４に導入するとともに、貯留部３７Ｂからの試料液３６Ｂを、入口流路３５Ｂを通して第３行３２Ｃのチャンバー部３４に導入する。
同様に、試料液３６Ａと試料液３６Ｂの混合液を、混合流路３５Ｃを通して第１行３２Ａのチャンバー部３４に導入する。
ブランク用流路３５Ｄが接続された第４行３２Ｄのチャンバー部３４には、液性因子を含まない試料液が導入される。
第４行３２Ｄかつ第４列３３Ｄであるチャンバー部３４には足場因子および液性因子が導入されないため、足場因子および液性因子のない条件でのブランク試験が可能である。
【００３８】
第１〜第４行３２Ａ〜３２Ｄのチャンバー部３４への液性因子の導入され方は、行ごとに互いに異なる４通りとなる。
すなわち、第１行３２Ａのチャンバー部３４には２つの液性因子３６ａ、３６ｂが導入され、第２行３２Ｂのチャンバー部３４には第１の液性因子３６ａのみが導入され、第３行３２Ｃのチャンバー部３４は第２の液性因子３６ｂが導入され、第４行３２Ｄのチャンバー部３４には液性因子は導入されない。
このように、チャンバー部３４には、列ごとに足場因子について異なる条件が与えられ、行ごとに液性因子について異なる条件が与えられるため、全体で１６通りの足場因子と液性因子の組み合わせが実現される。
【００３９】
マイクロチップ３１では、複数の試料液の混合液を導入できる混合流路３５Ｃが形成されているため、流路の構成を複雑化させることなく、液性因子が複数である場合を含む、より多くの組み合わせを試験することができる。
従って、効率よく、かつ信頼性の高い条件探索を低コストで実現できる。
【００４０】
次に、本発明の第３の例であるマイクロチップ５１について説明する。
図１２は、マイクロチップ５１の要部を示す平面図である。マイクロチップ５１は、足場因子用の流路４５Ａ〜４５Ｄ、４８Ａ、４８Ｂおよび貯留部４７Ａ、４７Ｂ、４７Ｄが設けられている点で、図９に示すマイクロチップ３１と異なる。
【００４１】
第２および第３列３３Ｂ、３３Ｃのチャンバー部３４には、足場因子用の入口流路４５Ａ、４５Ｂ（導入流路）が連通されている。
第１の入口流路４５Ａは第２列３３Ｂのチャンバー部３４に接続され、第２の入口流路４５Ｂは第３列３３Ｃのチャンバー部３４に接続されている。
このため、貯留部４７Ａからの試料液４６Ａを入口流路４５Ａから第２列３３Ｂのチャンバー部３４に導入でき、貯留部４７Ｂからの試料液４６Ｂを入口流路４５Ｂから第３列３３Ｃのチャンバー部３４に導入できる。
試料液４６Ａは第１の足場因子４６ａを含み、試料液４６Ｂは第１の足場因子４６ａとは異なる第２の足場因子４６ｂを含む。
【００４２】
第１列３３Ａのチャンバー部３４には、足場因子用の混合流路４５Ｃ（混合液導入流路）が接続されている。
混合流路４５Ｃには、第１入口流路４５Ａから分岐された第１分岐流路４８Ａと、第２入口流路４５Ｂから分岐された第２分岐流路４８Ｂとが接続されている。
このため、試料液４６Ａと試料液４６Ｂの混合液を第１列３３Ａのチャンバー部３４に導入できる。
【００４３】
分岐流路４８Ａ、４８Ｂは、混合流路４５Ｃとは異なる高さ位置に形成されており、それぞれ連絡流路４９Ａ、４９Ｂを介して混合流路４５Ｃと連通している。
第４列３３Ｄのチャンバー部３４にはブランク用流路４５Ｄが接続されている。ブランク用流路４５Ｄはブランク用貯留部４７Ｄに接続されている。
【００４４】
次に、マイクロチップ５１の使用方法を説明する。
貯留部４７Ａからの試料液４６Ａを、入口流路４５Ａを通して第２列３３Ｂのチャンバー部３４に導入し、その内面を第１の足場因子４６ａで修飾するとともに、貯留部４７Ｂからの試料液４６Ｂを入口流路４５Ｂを通して第３列３３Ｃのチャンバー部３４に導入し、その内面を第２の足場因子４６ｂで修飾する。
同様に、試料液４６Ａと試料液４６Ｂの混合液を、混合流路４５Ｃを通して第１列３３Ａのチャンバー部３４に導入し、その内面を２つの足場因子４６ａ、４６ｂで修飾する。
ブランク用流路４５Ｄが接続された第４列３３Ｄのチャンバー部３４には、足場因子を含まない試料液が導入されるため、足場因子による修飾はされない。
このように、第１〜第４列３３Ａ〜３３Ｄのチャンバー部３４の修飾のされ方は、列ごとに互いに異なる４通りとなる。
【００４５】
次いで、第２の例のマイクロチップ３１と同様にして、液性因子用の流路３５Ａ〜３５Ｄ、３８Ａ、３８Ｂおよび貯留部３７Ａ、３７Ｂ、３７Ｄを用いて、液性因子を含む試料液（または液性因子を含まない試料液）をチャンバー部３４に導入する。
チャンバー部３４には、列ごとに足場因子について異なる条件が与えられ、行ごとに液性因子について異なる条件が与えられるため、全体で１６通りの足場因子と液性因子の組み合わせが実現される。
【００４６】
マイクロチップ５１では、複数の試料液の混合液を導入できる混合流路３５Ｃ、４５Ｃが形成されているため、流路の構成を複雑化させることなく、液性因子および足場因子が各々複数である場合を含む、より多くの組み合わせを試験することができる。
従って、効率よく、かつ信頼性の高い条件探索を低コストで実現できる。
【００４７】
図１３は、さらに多くの組み合わせを実現するべく、第３の例のマイクロチップ５１に比べ流路の数を多くした第４の例のマイクロチップ６１の要部を示す平面図である。以下、マイクロチップ６１の使用方法を説明する。
まず、次のようにして各チャンバー部３４内面を足場因子６６ａ〜６６ｄで修飾する。
貯留部６７Ａからの試料液６６Ａを、入口流路６５Ａ（第１導入流路）を通して第８列３３Ｈのチャンバー部３４に導入し、その内面を第１の足場因子６６ａで修飾する。
貯留部６７Ｂからの試料液６６Ｂを、入口流路６５Ｂ（第２導入流路）を通して第１２列３３Ｌのチャンバー部３４に導入し、その内面を第２の足場因子６６ｂで修飾する。
貯留部６７Ｃからの試料液６６Ｃを、入口流路６５Ｃ（第３導入流路）を通して第１４列３３Ｎのチャンバー部３４に導入し、その内面を第３の足場因子６６ｃで修飾する。
貯留部６７Ｄからの試料液６６Ｄを、入口流路６５Ｄ（第４導入流路）を通して第１５列３３Ｏのチャンバー部３４に導入し、その内面を第４の足場因子６６ｄで修飾する。
【００４８】
試料液６６Ａ、６６Ｂ、６６Ｃ、６６Ｄを、第１〜第４分岐流路６８Ａ、６８Ｂ、６８Ｃ、６８Ｄ、混合流路６９Ａ（混合液導入流路）を通して第１列３３Ａのチャンバー部３４に導入し、その内面を足場因子６６ａ、６６ｂ、６６ｃ、６６ｄで修飾する。
試料液６６Ａ、６６Ｂ、６６Ｃを、分岐流路６８Ａ、６８Ｂ、６８Ｃ、混合流路６９Ｂを通して第２列３３Ｂのチャンバー部３４に導入し、その内面を足場因子６６ａ、６６ｂ、６６ｃで修飾する。
試料液６６Ａ、６６Ｂ、６６Ｄを、分岐流路６８Ａ、６８Ｂ、６８Ｄ、混合流路６９Ｃを通して第３列３３Ｃのチャンバー部３４に導入し、その内面を足場因子６６ａ、６６ｂ、６６ｄで修飾する。
試料液６６Ａ、６６Ｂを、分岐流路６８Ａ、６８Ｂ、混合流路６９Ｄを通して第４列３３Ｄのチャンバー部３４に導入し、その内面を足場因子６６ａ、６６ｂで修飾する。
試料液６６Ａ、６６Ｃ、６６Ｄを、分岐流路６８Ａ、６８Ｃ、６８Ｄ、混合流路６９Ｅを通して第５列３３Ｅのチャンバー部３４に導入し、その内面を足場因子６６ａ、６６ｃ、６６ｄで修飾する。
試料液６６Ａ、６６Ｃを、分岐流路６８Ａ、６８Ｃ、混合流路６９Ｆを通して第６列３３Ｆのチャンバー部３４に導入し、その内面を足場因子６６ａ、６６ｃで修飾する。
試料液６６Ａ、６６Ｄを、分岐流路６８Ａ、６８Ｄ、混合流路６９Ｇを通して第７列３３Ｇのチャンバー部３４に導入し、その内面を足場因子６６ａ、６６ｄで修飾する。
試料液６６Ｂ、６６Ｃ、６６Ｄを、分岐流路６８Ｂ、６８Ｃ、６８Ｄ、混合流路６９Ｉを通して第９列３３Ｉのチャンバー部３４に導入し、その内面を足場因子６６ｂ、６６ｃ、６６ｄで修飾する。
試料液６６Ｂ、６６Ｃを、分岐流路６８Ｂ、６８Ｃ、混合流路６９Ｊを通して第１０列３３Ｊのチャンバー部３４に導入し、その内面を足場因子６６ｂ、６６ｃで修飾する。
試料液６６Ｂ、６６Ｄを、分岐流路６８Ｂ、６８Ｄ、混合流路６９Ｋを通して第１１列３３Ｋのチャンバー部３４に導入し、その内面を足場因子６６ｂ、６６ｄで修飾する。
試料液６６Ｃ、６６Ｄを、分岐流路６８Ｃ、６８Ｄ、混合流路６９Ｍを通して第１３列３３Ｍのチャンバー部３４に導入し、その内面を足場因子６６ｃ、６６ｄで修飾する。
第１６列３３Ｐのチャンバー部３４には、ブランク用貯留部６７Ｅからブランク用流路６５Ｅを通して、足場因子を含まない試料液が導入されるため、足場因子による修飾はされない。
第１〜第１６列３３Ａ〜３３Ｐのチャンバー部３４の修飾のされ方は、列ごとに互いに異なる１６通りとなる。
【００４９】
次に、液性因子を含む試料液（または液性因子を含まない試料液）を、チャンバー部３４に以下のように導入する。
貯留部５７Ａからの試料液５６Ａ（液性因子５６ａ）を、入口流路５５Ａ（第１導入流路）を通して第８行３２Ｈのチャンバー部３４に導入する。
貯留部５７Ｂからの試料液５６Ｂ（液性因子５６ｂ）を、入口流路５５Ｂ（第２導入流路）を通して第１２行３２Ｌのチャンバー部３４に導入する。
貯留部５７Ｃからの試料液５６Ｃ（液性因子５６ｃ）を、入口流路５５Ｃ（第３導入流路）を通して第１４行３２Ｎのチャンバー部３４に導入する。
貯留部５７Ｄからの試料液５６Ｄ（液性因子５６ｄ）を、入口流路５５Ｄ（第４導入流路）を通して第１５行３２Ｏのチャンバー部３４に導入する。
【００５０】
試料液５６Ａ、５６Ｂ、５６Ｃ、５６Ｄを、第１〜第４分岐流路５８Ａ、５８Ｂ、５８Ｃ、５８Ｄ、混合流路５９Ａ（混合液導入流路）を通して第１行３２Ａのチャンバー部３４に導入する。
試料液５６Ａ、５６Ｂ、５６Ｃを、分岐流路５８Ａ、５８Ｂ、５８Ｃ、混合流路５９Ｂを通して第２行３２Ｂのチャンバー部３４に導入する。
試料液５６Ａ、５６Ｂ、５６Ｄを、分岐流路５８Ａ、５８Ｂ、５８Ｄ、混合流路５９Ｃを通して第３行３２Ｃのチャンバー部３４に導入する。
試料液５６Ａ、５６Ｂを、分岐流路５８Ａ、５８Ｂ、混合流路５９Ｄを通して第４行３２Ｄのチャンバー部３４に導入する。
試料液５６Ａ、５６Ｃ、５６Ｄを、分岐流路５８Ａ、５８Ｃ、５８Ｄ、混合流路５９Ｅを通して第５行３２Ｅのチャンバー部３４に導入する。
試料液５６Ａ、５６Ｃを、分岐流路５８Ａ、５８Ｃ、混合流路５９Ｆを通して第６行３２Ｆのチャンバー部３４に導入する。
試料液５６Ａ、５６Ｄを、分岐流路５８Ａ、５８Ｄ、混合流路５９Ｇを通して第７行３２Ｇのチャンバー部３４に導入する。
試料液５６Ｂ、５６Ｃ、５６Ｄを、分岐流路５８Ｂ、５８Ｃ、５８Ｄ、混合流路５９Ｉを通して第９行３２Ｉのチャンバー部３４に導入する。
試料液５６Ｂ、５６Ｃを、分岐流路５８Ｂ、５８Ｃ、混合流路５９Ｊを通して第１０行３２Ｊのチャンバー部３４に導入する。
試料液５６Ｂ、５６Ｄを、分岐流路５８Ｂ、５８Ｄ、混合流路５９Ｋを通して第１１行３２Ｋのチャンバー部３４に導入する。
試料液５６Ｃ、５６Ｄを、分岐流路５８Ｃ、５８Ｄ、混合流路５９Ｍを通して第１３行３２Ｍのチャンバー部３４に導入する。
第１６行３２Ｐのチャンバー部３４には、ブランク用貯留部５７Ｅからブランク用流路５５Ｅを通して、液性因子を含まない試料液が導入される。
第１〜第１６行３２Ａ〜３２Ｐのチャンバー部３４への液性因子の導入され方は、行ごとに互いに異なる１６通りとなる。
第１６行３２Ｐかつ第１６列３３Ｐであるチャンバー部３４には足場因子および液性因子が導入されないため、足場因子および液性因子のない条件でのブランク試験が可能である。
【００５１】
このように、チャンバー部３４には、列ごとに足場因子について１６通りの異なる条件が与えられ、行ごとに液性因子について１６通りの異なる条件が与えられるため、全体で２５６通りの足場因子と液性因子の組み合わせが実現される。
【００５２】
マイクロチップ６１では、流路の構成を複雑化させることなく、液性因子および足場因子が各々複数である場合を含む、より多くの組み合わせを試験することができる。
従って、効率よく、かつ信頼性の高い条件探索を低コストで実現できる。
【００５３】
図１４〜図１６は、ＰＤＭＳからなるマイクロチップを用い、チャンバー部内で２４時間ＣＨＯ細胞の灌流培養を行った結果を示すものである。
図１４は、チャンバー部内面をコラーゲンで修飾した場合のチャンバー部を示す写真であり、図１５は、チャンバー部内面をフィブロネクチンで修飾した場合のチャンバー部を示す写真である。図１６は、足場因子の修飾を行わないこと以外は同様にしてＣＨＯ細胞の灌流培養を行った場合のチャンバー部を示す写真である。
これらの結果より、足場因子によってＣＨＯ細胞の接着性、増殖性について異なる結果が得られ、足場因子としてフィブロネクチンを用いた場合には、ＣＨＯ細胞の接着、増殖が促されたことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明によれば、培養環境を網羅的に解析することで、細胞株ごとに異なる性質を有する幹細胞の分化誘導条件を個別に効率的に探索することが可能となる。
従って、患者由来のｉＰＳ細胞を特定の組織に分化させ、疾患モデル細胞を作成する際の分化誘導プロセスが劇的に効率化する。将来的には、患者ごとに最適な条件で分化誘導された細胞や組織を用いるテーラーメード再生医療の実現につながると考えられる。
また、幹細胞に限らず細胞の機能等は、液性因子と足場因子によって構成される外部環境に依存する複雑な細胞内シグナル伝達を経て決定されている。本発明は、このような複雑な生命システムの動作原理の解明に貢献し得る。
【符号の説明】
【００５５】
１、３１、５１、６１・・・マイクロチップ、４・・・チャンバー部、８Ａ〜８Ｄ、４６ａ、４６ｂ、６６ａ〜６６ｄ・・・足場因子、６ａ〜６ｄ、３６ａ、３６ｂ、５６ａ〜５６ｄ・・・液性因子、４ａ・・・主空間部、４ｂ・・・外周空間部、１２Ａ、３５Ａ、５５Ａ・・・第１導入流路、１２Ｂ、３５Ｂ、５５Ｂ・・・第２導入流路、３５Ｃ、５９Ａ〜５９Ｇ、５９Ｉ〜５９Ｋ、５９Ｍ・・・混合流路（混合液導入流路）、３５Ｄ、５５Ｅ・・・ブランク用流路、３８Ａ、５８Ａ・・・第１分岐流路、３８Ｂ、５８Ｂ・・・第２分岐流路。
【図１】
2011030445.tif 000003
【図２】
2011030445.tif 000004
【図３】
2011030445.tif 000005
【図４】
2011030445.tif 000006
【図５】
2011030445.tif 000007
【図６】
2011030445.tif 000008
【図７】
2011030445.tif 000009
【図８】
2011030445.tif 000010
【図９】
2011030445.tif 000011
【図１０】
2011030445.tif 000012
【図１１】
2011030445.tif 000013
【図１２】
2011030445.tif 000014
【図１３】
2011030445.tif 000015
【図１４】
2011030445.tif 000016
【図１５】
2011030445.tif 000017
【図１６】
2011030445.tif 000018