(57)【要約】【課題】医薬品、工業製品、化粧品、食品等として商業的に一層価値がある高性能な多用途素材となるような新規な中性糖修飾後タンパク質を見出し、見出された新規な中性糖修飾後タンパク質を取得するために利用される方法等の開発が求められていた。【解決手段】酵母内に存在する中性糖被修飾タンパク質遺伝子の発現により産生される中性糖被修飾タンパク質が前記酵母内で中性糖により修飾されて得られる中性糖修飾後タンパク質に含まれる中性糖の含有量を低下させる方法であり、特性（Ａ）及び（Ｂ）を有する中性糖被修飾タンパク質の遺伝子を発現する酵母内にHsp47をコードするポリヌクレオチドを導入する工程、または、Hsp47をコードするポリヌクレオチドを発現する酵母内に特性（Ａ）及び（Ｂ）を有する中性糖被修飾タンパク質の遺伝子を導入する工程のいずれかの一つの工程を含むことを特徴とする方法等。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母内に存在する中性糖被修飾タンパク質遺伝子の発現により産生される中性糖被修飾タンパク質が前記酵母内で中性糖により修飾されて得られる中性糖修飾後タンパク質に含まれる中性糖の含有量を低下させる方法であり、
下記の特性（Ａ）及び（Ｂ）を有する中性糖被修飾タンパク質の遺伝子を発現する酵母内にHsp47をコードするポリヌクレオチドを導入する工程、または、Hsp47をコードするポリヌクレオチドを発現する酵母内に下記の特性（Ａ）及び（Ｂ）を有する中性糖被修飾タンパク質の遺伝子を導入する工程のいずれかの一つの工程を含むことを特徴とする方法。
＜特性（Ａ）＞
中性糖被修飾タンパク質におけるポリペプチド鎖が、連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列を含み、且つ、当該繰り返し配列は下記の結合配列Ｉ乃至Ｖのいずれか１つ以上の結合配列を含む。
Ｉ：Thr-Gly-Xaa-Arg-Gly
ＩＩ：Pro-Gly-Xaa-Arg-Gly
ＩＩＩ：Ser-Gly-Xaa-Arg-Gly
ＩＶ：Val-Gly-Xaa-Arg-Gly
Ｖ：Ala-Gly-Xaa-Arg-Gly
＜特性（Ｂ）＞
中性糖被修飾タンパク質におけるポリペプチド鎖が、３本を一組にした三重螺旋構造を形成する。
【請求項２】
中性糖被修飾タンパク質が、コラーゲンであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記酵母が、プロリン水酸化酵素遺伝子を共発現する酵母であることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
下記の特性を有する中性糖修飾後タンパク質の取得方法であり、
（１）下記の特性（Ａ）及び（Ｂ）を有する中性糖被修飾タンパク質の遺伝子を発現する酵母内にHsp47をコードするポリヌクレオチドを導入する工程、または、Hsp47をコードするポリヌクレオチドを発現する酵母内に下記の特性（Ａ）及び（Ｂ）を有する中性糖被修飾タンパク質の遺伝子を導入する工程のいずれかの一つの第一工程
（２）第一工程により得られる形質転換体を培養することにより、当該形質転換体内に存在する中性糖被修飾タンパク質遺伝子の発現により産生される中性糖被修飾タンパク質が前記形質転換体内で中性糖により修飾されて得られる中性糖修飾後タンパク質を前記形質転換体に製造させる第二工程
（３）第二工程で製造された中性糖修飾後タンパク質を回収する第三工程
を含むことを特徴とする方法。
＜取得される中性糖修飾後タンパク質の特性＞
取得される中性糖修飾後タンパク質は、（a）第一工程において、Hsp47をコードするポリヌクレオチドが導入されていないこと以外は同等な形質転換体、または、（b）第一工程において、Hsp47をコードするポリヌクレオチドを発現しないこと以外は同等な形質転換体のいずれかの一つの形質転換体を培養することにより、当該形質転換体内に存在する中性糖被修飾タンパク質遺伝子の発現により産生される中性糖被修飾タンパク質が前記形質転換体内で中性糖により修飾されて得られる中性糖修飾後タンパク質に含まれる中性糖の含有量よりも低い中性糖の含有量である。
＜特性（Ａ）＞
中性糖被修飾タンパク質におけるポリペプチド鎖が、連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列を含み、且つ、当該繰り返し配列は下記の結合配列Ｉ乃至Ｖのいずれか１つ以上の結合配列を含む。
Ｉ：Thr-Gly-Xaa-Arg-Gly
ＩＩ：Pro-Gly-Xaa-Arg-Gly
ＩＩＩ：Ser-Gly-Xaa-Arg-Gly
ＩＶ：Val-Gly-Xaa-Arg-Gly
Ｖ：Ala-Gly-Xaa-Arg-Gly
＜特性（Ｂ）＞
中性糖被修飾タンパク質におけるポリペプチド鎖が、３本を一組にした三重螺旋構造を形成する。
【請求項５】
中性糖被修飾タンパク質が、コラーゲンであることを特徴とする請求項４記載の取得方法。
【請求項６】
前記酵母が、プロリン水酸化酵素遺伝子を共発現する酵母であることを特徴とする請求項４又は５記載の取得方法。
【請求項７】
請求項４乃至６のいずれかの請求項記載の取得方法により取得された中性糖修飾後タンパク質。
【請求項８】
請求項５又は６記載の取得方法により取得されたコラーゲン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中性糖修飾後タンパク質に含まれる中性糖の含有量を低下させる方法、更に詳しくは、酵母内に存在する中性糖被修飾タンパク質遺伝子の発現により産生される中性糖被修飾タンパク質が前記酵母内で中性糖により修飾されて得られる中性糖修飾後タンパク質に含まれる中性糖の含有量を低下させる方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の対象となるタンパク質（即ち、中性糖被修飾タンパク質、又は、中性糖修飾後タンパク質）の一つであるコラーゲンは、皮下組織、軟骨及び骨等に代表される様々な生体組織中に含まれるタンパク質である。コラーゲンは、引っ張り強度（tensile stress）が高く、それ故に、コラーゲンが含まれる生体組織は、機械的なストレスに対して高い強度を有している。
コラーゲンは、前記のような優れた物理的性質を有すると共に様々な生理活性を有しているので、色々な用途に用いられている。例えば、コラーゲンは、医薬品、工業製品、化粧品又は食品として用いられており、商業的に価値のある多用途素材であるといえる。
コラーゲンは、体内に存在するタンパク質のうちの約３０％を占めており、全ての多細胞動物中に存在している。現在のところ、ヒトを含む高等動物では２７種類以上のタイプの異なるコラーゲンが存在することが知られており、異なるタイプのコラーゲンが異なる生体組織に特異的に含まれていることが知られている（例えば、非特許文献１〜３参照）。
コラーゲンは、３本のポリペプチドからなる三重螺旋構造を有し、イミノ酸（具体的には例えば、プロリン又はヒドロキシプロリン）を含有するタンパク質である。代表的なコラーゲンとしては、例えば、ＴｙｐｅＩコラーゲン、ＴｙｐｅＩＩコラーゲン、及び、ＴｙｐｅＩＩＩコラーゲンを挙げることができる。
ＴｙｐｅＩコラーゲンは、骨、及び、皮膚中に含まれる主要な線維状コラーゲンであり、２つのα１（Ｉ）鎖と１つのα２（Ｉ）鎖とからなるヘテロトリマー分子であることが知られている。
ＴｙｐｅＩＩコラーゲンは、軟骨に含まれるコラーゲンであり、３つの同じα１（ＩＩ）鎖からなるホモトリマー分子であることが知られている。
ＴｙｐｅＩＩＩコラーゲンは、皮膚及び筋肉組織中に含まれるコラーゲンであり、３つの同じα１（ＩＩＩ）鎖からなるホモトリマー分子であることが知られている。
尚、ＴｙｐｅＩコラーゲン、ＴｙｐｅＩＩコラーゲン、ＴｙｐｅＩＩＩコラーゲンは、例えば、非特許文献４、及び、非特許文献５に記載された方法によって、生体組織から精製される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】谷原雅夫監修、コラーゲンの製造と応用展開、ISBN：978-4-7813-0071-3、シーエムシー出版
【非特許文献２】Volume Editors: Brinckmann, J., Notbohm, H., Muller, P.K. Collagen primer in Structure, Processing and Assembly, Topics in Current Chemistry Vol. 247, 2005
【非特許文献３】Gelse, K., Poschl, E., Aigner, T., Collagens−structure, function, and biosynthesis, Advanced Drug Delivery Reviews 55:1531-1546（2003）
【非特許文献４】Miller et al.， Methods In Enzymology, 82:33-64（1982），アカデミックプレス（Academic Press）
【非特許文献５】Byers et al.， Biochemistry 13:5243-5248（1974）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
医薬品、工業製品、化粧品、食品等として商業的に一層価値がある高性能な多用途素材となるような新規な中性糖修飾後タンパク質（具体的には例えば、中性糖被修飾タンパク質が有する親水性に係る物性を低下させ、親油性を高めるような改善を施すことにより、本発明が対象とするタンパク質が本来有する性質を獲得し、その付加価値を向上させること）を見出し、見出された新規な中性糖修飾後タンパク質を取得するために利用される方法等の開発が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、かかる状況のもと鋭意検討した結果、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．酵母内に存在する中性糖被修飾タンパク質遺伝子の発現により産生される中性糖被修飾タンパク質が前記酵母内で中性糖により修飾されて得られる中性糖修飾後タンパク質に含まれる中性糖の含有量を低下させる方法であり、
下記の特性（Ａ）及び（Ｂ）を有する中性糖被修飾タンパク質（以下、本中性糖被修飾タンパク質と記すこともある。）の遺伝子（以下、本中性糖被修飾タンパク質遺伝子と記すこともある。）を発現する酵母内にHsp47をコードするポリヌクレオチドを導入する工程、または、Hsp47をコードするポリヌクレオチドを発現する酵母内に下記の特性（Ａ）及び（Ｂ）を有する中性糖被修飾タンパク質（即ち、本中性糖被修飾タンパク質）の遺伝子（即ち、本中性糖被修飾タンパク質遺伝子）を導入する工程のいずれかの一つの工程を含むことを特徴とする方法（以下、本発明方法と記すこともある。）；
＜特性（Ａ）＞
中性糖被修飾タンパク質におけるポリペプチド鎖が、連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列を含み、且つ、当該繰り返し配列は下記の結合配列Ｉ乃至Ｖのいずれか１つ以上の結合配列を含む。
Ｉ：Thr-Gly-Xaa-Arg-Gly
ＩＩ：Pro-Gly-Xaa-Arg-Gly
ＩＩＩ：Ser-Gly-Xaa-Arg-Gly
ＩＶ：Val-Gly-Xaa-Arg-Gly
Ｖ：Ala-Gly-Xaa-Arg-Gly
＜特性（Ｂ）＞
中性糖被修飾タンパク質におけるポリペプチド鎖が、３本を一組にした三重螺旋構造を形成する。
２．中性糖被修飾タンパク質が、コラーゲンであることを特徴とする前項１記載の方法；
３．前記酵母が、プロリン水酸化酵素遺伝子を共発現する酵母であることを特徴とする前項１又は２記載の方法；
４．下記の特性を有する中性糖修飾後タンパク質（以下、本発明中性糖修飾後タンパク質と記すこともある。）の取得方法（以下、本発明取得方法と記すこともある。）であり、
（１）下記の特性（Ａ）及び（Ｂ）を有する中性糖被修飾タンパク質の遺伝子（即ち、本中性糖被修飾タンパク質遺伝子）を発現する酵母内にHsp47をコードするポリヌクレオチドを導入する工程、または、Hsp47をコードするポリヌクレオチドを発現する酵母内に下記の特性（Ａ）及び（Ｂ）を有する中性糖被修飾タンパク質の遺伝子（即ち、本中性糖被修飾タンパク質遺伝子）を導入する工程のいずれかの一つの第一工程
（２）第一工程により得られる形質転換体（以下、本発明形質転換体と記すこともある。）を培養することにより、当該形質転換体内に存在する中性糖被修飾タンパク質遺伝子の発現により産生される中性糖被修飾タンパク質が前記形質転換体内で中性糖により修飾されて得られる中性糖修飾後タンパク質（即ち、本発明中性糖修飾後タンパク質）を前記形質転換体に製造させる第二工程
（３）第二工程で製造された中性糖修飾後タンパク質（即ち、本発明中性糖修飾後タンパク質）を回収する第三工程
を含むことを特徴とする方法；
＜取得される中性糖修飾後タンパク質の特性＞
取得される中性糖修飾後タンパク質は、（a）第一工程において、Hsp47をコードするポリヌクレオチドが導入されていないこと以外は同等な形質転換体、または、（b）第一工程において、Hsp47をコードするポリヌクレオチドを発現しないこと以外は同等な形質転換体のいずれかの一つの形質転換体を培養することにより、当該形質転換体内に存在する中性糖被修飾タンパク質遺伝子の発現により産生される中性糖被修飾タンパク質が前記形質転換体内で中性糖により修飾されて得られる中性糖修飾後タンパク質に含まれる中性糖の含有量よりも低い中性糖の含有量である。
＜特性（Ａ）＞
中性糖被修飾タンパク質におけるポリペプチド鎖が、連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列を含み、且つ、当該繰り返し配列は下記の結合配列Ｉ乃至Ｖのいずれか１つ以上の結合配列を含む。
Ｉ：Thr-Gly-Xaa-Arg-Gly
ＩＩ：Pro-Gly-Xaa-Arg-Gly
ＩＩＩ：Ser-Gly-Xaa-Arg-Gly
ＩＶ：Val-Gly-Xaa-Arg-Gly
Ｖ：Ala-Gly-Xaa-Arg-Gly
＜特性（Ｂ）＞
中性糖被修飾タンパク質におけるポリペプチド鎖が、３本を一組にした三重螺旋構造を形成する。
５．中性糖被修飾タンパク質が、コラーゲンであることを特徴とする前項４記載の取得方法；
６．前記酵母が、プロリン水酸化酵素遺伝子を共発現する酵母であることを特徴とする前項４又は５記載の取得方法；
７．前項４乃至６のいずれかの前項記載の取得方法により取得された中性糖修飾後タンパク質；
８．前項５又は６記載の取得方法により取得されたコラーゲン；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、医薬品、工業製品、化粧品、食品等として商業的に一層価値がある高性能な多用途素材となるような新規な中性糖修飾後タンパク質を取得するために利用される方法等が提供可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、及び、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット導入プラスミドの作製工程を示すフローチャートである。
【図２】図２は、ヒートショックプロテイン４７（HSP47）発現カセット導入プラスミドの作製工程を示すフローチャートである。
【図３】図３は、ウシコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩα１発現カセット導入プラスミド作製工程を示すフローチャートである。
【図４】図４は、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１発現カセット及びヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２発現カセット導入プラスミド作製工程を示すフローチャートである。
【図５】図５は、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域６０残基、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、並びに、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域６０残基、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット導入プラスミド作製工程を示すフローチャートである。
【図６】図６は、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、並びに、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット導入プラスミド作製工程を示すフローチャートである。
【図７】図７は、プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、及び、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット導入プラスミドの模式図である。
【図８】図８は、HSP47発現カセット導入プラスミドの模式図である。
【図９】図９は、ウシコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩα１発現カセット導入プラスミドの模式図である。
【図１０】図１０は、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１発現カセット及びＴｙｐｅＩα２発現カセット導入プラスミドの模式図である。
【図１１】図１１は、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域６０残基、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、並びに、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域６０残基、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット導入プラスミドの模式図である。
【図１２】図１２は、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、並びに、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット導入プラスミド模式図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本明細書に記載される発明は記載されている特定の方法論、プロトコール、及び、試薬に限定されず、可変であると考えられる。また、本明細書で用いる用語は単に特定の実施形態を記載するためのものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではないと考えられる。
【０００９】
特に断りの無い限り、本明細書で用いる全ての技術用語、及び、化学用語は、本発明が属する技術分野の熟練者に共通に理解されているものと同じ意味を持つ。本発明を実施又は試験する上で、本明細書に記載されているものと同様又は同等の方法、及び、材料のいずれを用いてもよいが、以下、好ましい方法、装置、及び、材料を記載する。
【００１０】
本発明は、酵母内に存在する中性糖被修飾タンパク質遺伝子の発現により産生される中性糖被修飾タンパク質が前記酵母内で中性糖により修飾されて得られる中性糖修飾後タンパク質に含まれる中性糖の含有量を低下させる方法等を含む。
本発明において、「下記の特性（Ａ）及び（Ｂ）を有する中性糖被修飾タンパク質」（即ち、本中性糖被修飾タンパク質）とは、
（１）特性（Ａ）として、
中性糖被修飾タンパク質におけるポリペプチド鎖が、連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列を含み、且つ、当該繰り返し配列は下記の結合配列Ｉ乃至Ｖのいずれか１つ以上の結合配列を含み、
Ｉ：Thr-Gly-Xaa-Arg-Gly
ＩＩ：Pro-Gly-Xaa-Arg-Gly
ＩＩＩ：Ser-Gly-Xaa-Arg-Gly
ＩＶ：Val-Gly-Xaa-Arg-Gly
Ｖ：Ala-Gly-Xaa-Arg-Gly
且つ、
（２）特性（Ｂ）として、
中性糖被修飾タンパク質におけるポリペプチド鎖が、３本を一組にした三重螺旋構造を形成する、
ような特性を有する中性糖被修飾タンパク質を意味するものである。
ここで「中性糖被修飾タンパク質」とは、例えば、本発明方法を施した後に生じる中性糖修飾後タンパク質に含まれる中性糖の含有量よりも低い中性糖の含有量である、本発明方法を施す前の中性糖被修飾タンパク質であり、本中性糖被修飾タンパク質遺伝子（即ち、本中性糖被修飾タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子）の発現により産生される中性糖被修飾タンパク質を意味するものである。例えば、マンノース等の中性糖により修飾される前の状態にあるタンパク質であり、酵母等の生体細胞内に存在する本中性糖被修飾タンパク質遺伝子の発現により産生される、中性糖修飾前タンパク質である。
また、「連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列」の繰り返し回数としては、２５回以上であることが好ましく、より好ましくは２５回以上３６２回以下であることを挙げることができる。
【００１１】
本中性糖被修飾タンパク質の分子量としては、例えば、５０００以上を挙げることができる。また本中性糖被修飾タンパク質は、通常、抗体機能を有していない。
【００１２】
本中性糖被修飾タンパク質としては、具体的には例えば、コラーゲンを挙げることができる。
本発明における「コラーゲン」としては、３本のポリペプチドからなる三重螺旋構造を有し、イミノ酸（具体的には例えば、プロリン又はヒドロキシプロリン）を含有するタンパク質を挙げることができる。例えば、ＴｙｐｅＩコラーゲン〜ＴｙｐｅＸＸＩＸコラーゲンから選択される少なくとも１種類のコラーゲン等を挙げることができる。好ましくは、線維形成型コラーゲン（Fibril-forming collagen：ＴｙｐｅＩコラーゲン、ＴｙｐｅＩＩコラーゲン、ＴｙｐｅＩＩＩコラーゲン、ＴｙｐｅＶコラーゲン、ＴｙｐｅＸＩコラーゲン、ＴｙｐｅＸＸＩＶコラーゲン、ＴｙｐｅＸＸＶＩＩコラーゲン）、より好ましくは、ＴｙｐｅＩコラーゲン、ＴｙｐｅＩＩＩコラーゲン等が挙げられる。また、これらのコラーゲンの部分的な領域からなる中性糖被修飾タンパク質も用いることができる。
また、「コラーゲン」の由来は特に限定されないが、例えば、高等動物由来であることが好ましく、ウシ由来、及び、ヒト由来であることが更に好ましい。
【００１３】
具体的には、前記ＴｙｐｅＩコラーゲンとして、例えば、配列番号７７で示されるアミノ酸配列を有するヒトＴｙｐｅＩα１コラーゲン前駆体（ＨｓＴｙｐｅＩα１）及び配列番号７８で示されるアミノ酸配列を有するヒトＴｙｐｅＩα２コラーゲン前駆体（ＨｓＴｙｐｅＩα２）からなるヒトＴｙｐｅＩ前駆体、配列番号７９で示されるアミノ酸配列を有するウシＴｙｐｅＩα１コラーゲン前駆体（ＢｔＴｙｐｅＩα１）及び配列番号８０で示されるアミノ酸配列を有するウシＴｙｐｅＩα２コラーゲン前駆体（ＢｔＴｙｐｅＩα２）からなるウシＴｙｐｅＩ前駆体、前記ＴｙｐｅＩＩＩコラーゲンとして、例えば、配列番号８１で示されるアミノ酸配列を有するヒトＴｙｐｅＩＩＩα１コラーゲン前駆体（ＨｓＴｙｐｅＩＩＩα１）からなるヒトＴｙｐｅＩＩＩ前駆体、配列番号８２で示されるアミノ酸配列を有するウシＴｙｐｅＩＩＩα１コラーゲン前駆体（ＢｔＴｙｐｅＩＩＩα１）からなるウシＴｙｐｅＩＩＩ前駆体が挙げられる。さらに、これらのアミノ酸配列においてアミノ酸の欠失、置換又は付加がなされたコラーゲン、また、これらのアミノ酸配列と相同性を有するコラーゲン、例えば、異種生物由来のオーソログに由来するアミノ酸配列を有するコラーゲンであっても良い。ヒトＴｙｐｅＩα１、或いは、ウシＴｙｐｅＩα１のオーソログに由来するアミノ酸配列としては、イヌＴｙｐｅＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＰ＿００１００３０９０）、チンパンジーＴｙｐｅＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＰ＿００１１６９３２０）、ラットＴｙｐｅＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＰ＿２１３４４０）、マウスＴｙｐｅＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＰ＿０３１７６８）、ヒトＴｙｐｅＩα２、或いは、ウシＴｙｐｅＩα２のオーソログに由来するアミノ酸配列としては、イヌＴｙｐｅＩα２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＰ＿００１００３１８７）、チンパンジーＴｙｐｅＩα２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＰ＿５１９２０７）、ラットＴｙｐｅＩα２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＰ＿４４５８０８）、マウスＴｙｐｅＩα２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＰ＿０３１７６９）、ヒトＴｙｐｅＩＩＩα１、或いは、ウシＴｙｐｅＩＩＩα１のオーソログに由来するアミノ酸配列としては、イヌＴｙｐｅＩＩＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＰ＿８５１００９）、チンパンジーＴｙｐｅＩＩＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＰ＿００１１６３６６５）、ラットＴｙｐｅＩＩＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＰ＿１１４４７４）、マウスＴｙｐｅＩＩＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＰ＿０３４０６０）、ニワトリＴｙｐｅＩＩＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＰ＿４２１８４７）が挙げられる。さらに、これらのオーソログのアミノ酸配列においてアミノ酸の欠失、置換又は付加がなされたタンパク質であってもよい。
【００１４】
また、前記コラーゲンの部分的な領域からなる中性糖被修飾タンパク質としては、具体的には例えば、配列番号８３で示されるアミノ酸配列を有する、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド（ＨｓＴｙｐｅＩα１Ｎ６０Ｃ１５）前駆体、並びに、配列番号８４で示されるアミノ酸配列を有する、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド（ＨｓＴｙｐｅＩα２Ｎ６０−Ｃ１５）前駆体からなる中性糖被修飾タンパク質、配列番号８５で示されるアミノ酸配列を有する、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド（ＨｓＴｙｐｅＩα１Ｎ２７−Ｍ５２２−Ｃ１５）前駆体、並びに、配列番号８６で示されるアミノ酸配列を有する、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド（ＨｓＴｙｐｅＩα２Ｎ２７−Ｍ５２２−Ｃ１５）前駆体からなる中性糖被修飾タンパク質、配列番号８７で示されるアミノ酸配列を有する、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド（ＨｓＴｙｐｅＩα１Ｎ２７−Ｍ５２２Ｘ２−Ｃ１５）前駆体、並びに、配列番号８８で示されるアミノ酸配列を有する、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド（ＨｓＴｙｐｅＩα２Ｎ２７−Ｍ５２２ｘ２−Ｃ１５）前駆体からなる中性糖被修飾タンパク質が挙げられる。
【００１５】
本中性糖被修飾タンパク質遺伝子（即ち、本中性糖被修飾タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子）は、ポリペプチド鎖のアミノ酸配列中に連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列を含み、且つ、当該繰り返し配列は上記の結合配列Ｉ乃至Ｖのいずれか１つ以上の結合配列を含み、ポリペプチド鎖が３本を一組にした三重螺旋構造を形成することができるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子であれば、本発明に好適に利用できる。例えば、コラーゲンのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を挙げることができ、具体的には例えば、ＴｙｐｅＩコラーゲン〜ＴｙｐｅＸＸＩＸコラーゲンから選択される少なくとも１種類のコラーゲンのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子等を挙げることができる。好ましくは、線維形成型コラーゲン（Fibril-forming collagen：ＴｙｐｅＩコラーゲン、ＴｙｐｅＩＩコラーゲン、ＴｙｐｅＩＩＩコラーゲン、ＴｙｐｅＶコラーゲン、ＴｙｐｅＸＩコラーゲン、ＴｙｐｅＸＸＩＶコラーゲン、ＴｙｐｅＸＸＶＩＩコラーゲン）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子、より好ましくは、ＴｙｐｅＩコラーゲンをコードする塩基配列を有する遺伝子、及び、ＴｙｐｅＩＩＩコラーゲンをコードする塩基配列を有する遺伝子等が挙げられる。
【００１６】
本中性糖被修飾タンパク質遺伝子としては、具体的には例えば、配列番号８９で示される前記ヒトＴｙｐｅＩα１コラーゲン前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子、配列番号９０で示される前記ヒトＴｙｐｅＩα１コラーゲン前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子、配列番号９１で示される前記ウシＴｙｐｅＩα１コラーゲン前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子、配列番号９２で示される前記ヒトＴｙｐｅＩα２コラーゲン前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子、配列番号９３で示される前記ヒトＴｙｐｅＩα２コラーゲン前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子、配列番号９４で示される前記ウシＴｙｐｅＩα２コラーゲン前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子、配列番号９５で示される前記ヒトＴｙｐｅＩＩＩα１コラーゲン前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子、配列番号９６で示される前記ヒトＴｙｐｅＩＩＩα１コラーゲン前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子、配列番号９７で示される前記ウシＴｙｐｅＩＩＩα１コラーゲン前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。また、これらの遺伝子の塩基配列の一部の塩基に欠失、置換又は付加が導入されてなる遺伝子、部分的な塩基配列を有する遺伝子、さらに、これらの遺伝子の塩基配列と相同性を有する塩基配列を有する遺伝子、例えば、異種生物由来のオーソログに由来する塩基配列を有する遺伝子であっても良い。即ち、コラーゲンにおけるポリペプチド鎖のアミノ酸配列中に連続するGly-Xaa-Yaaの繰り返し配列を含み、且つ、当該繰り返し配列は上記の結合配列Ｉ乃至Ｖのいずれか１つ以上の結合配列を含み、コラーゲンにおけるポリペプチド鎖が３本を一組にした三重螺旋構造を形成することができる、ＴｙｐｅＩコラーゲンのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子、及び、ＴｙｐｅＩＩＩコラーゲンのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子であれば、本発明に好適に利用できる。
酵母内で前記コラーゲンが発現され、当該酵母内に共発現されたプロリン水酸化酵素が存在する場合には、当該酵素によって、コラーゲン中のプロリン残基が水酸化されたコラーゲンが産生される。尚、コラーゲン中のプロリン残基の水酸化率は、公知のアミノ酸組成分析法により測定することができる。また、コラーゲンの線維形成能は、例えば、以下のような方法により測定することができる。具体的には例えば、精製したコラーゲンを、塩濃度１×Ｄ−ＰＢＳ（−）、ｐＨ７．３〜７．４に再調整した後、３７℃に保温することにより、コラーゲン分子が再配向して溶液が白濁する。当該白濁現象をコラーゲンの線維形成能とみなすことができる。従って、当該性質を利用して、濃度０．０５％のコラーゲン溶液を、塩濃度１×Ｄ−ＰＢＳ（−）、ｐＨ７．３〜７．４で３７℃に保温し、そのときの吸光度を経時的に測定することにより、線維形成能を測定することができる。
【００１７】
ヒトＴｙｐｅＩα１、或いは、ウシＴｙｐｅＩα１のオーソログに由来する塩基配列としてはイヌＴｙｐｅＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＭ＿００１００３０９０）、チンパンジーＴｙｐｅＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＭ＿００１１６９３２０）、ラットＴｙｐｅＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＭ＿２１３４４０）、マウスＴｙｐｅＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＭ＿００７７４２）、ヒトＴｙｐｅＩα２、或いは、ＴｙｐｅＩα２のオーソログに由来する塩基配列としてはイヌＴｙｐｅＩα２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＭ＿００１００３１８７）、チンパンジーＴｙｐｅＩα２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＭ＿５１９２０７）、ラットＴｙｐｅＩα２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＭ＿０５３３５６）、マウスＴｙｐｅＩα２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＭ＿００７７４３）、ヒトＴｙｐｅＩＩＩα１、或いは、ウシＴｙｐｅＩＩＩα１のオーソログに由来する塩基配列としてはイヌＴｙｐｅＩＩＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＭ＿８４５９１６）、チンパンジーＴｙｐｅＩＩＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＭ＿００１１６３６６５）、ラットＴｙｐｅＩＩＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＭ＿０３２０８５）、マウスＴｙｐｅＩＩＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＰ＿００９９３０）、ニワトリＴｙｐｅＩＩＩα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＭ＿４２１８４７）が挙げられる。さらに、これらのオーソログに由来する塩基配列を有する遺伝子の塩基配列の一部の塩基が欠失、置換又は付加が導入されてなる遺伝子、部分的な塩基配列を有する遺伝子であってもよい。
【００１８】
また、前記コラーゲンの部分的な領域からなる中性糖被修飾タンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子としては、具体的には例えば、配列番号９８で示されるＨｓＴｙｐｅＩα１Ｎ６０Ｃ１５前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子、配列番号９９で示されるＨｓＴｙｐｅＩα２Ｎ６０−Ｃ１５前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子、配列番号１００で示されるＨｓＴｙｐｅＩα１Ｎ２７−Ｍ５２２−Ｃ１５前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子、配列番号１０１で示されるＨｓＴｙｐｅＩα２Ｎ２７−Ｍ５２２−Ｃ１５前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子、配列番号１０２で示されるＨｓＴｙｐｅＩα１Ｎ２７−Ｍ５２２Ｘ２−Ｃ１５前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子、配列番号１０３で示されるＨｓＴｙｐｅＩα２Ｎ２７−Ｍ５２２ｘ２−Ｃ１５前駆体のアミノ酸配列をコードする塩基配列有する遺伝子が挙げられる。
【００１９】
酵母内で本中性糖被修飾タンパク質遺伝子が発現され、当該酵母内に共発現されたプロリン水酸化酵素が存在する場合には、当該酵素によって、中性糖被修飾タンパク質中のプロリン残基が水酸化された中性糖被修飾タンパク質が産生される。尚、本中性糖被修飾タンパク質中のプロリン残基の水酸化率は、公知のアミノ酸組成分析法により測定することができる。
また、コラーゲンの線維形成能は、例えば、以下のような方法により測定することができる。具体的には例えば、精製したコラーゲンを、塩濃度１×Ｄ−ＰＢＳ（−）、ｐＨ７．３〜７．４に再調整した後、３７℃に保温することにより、コラーゲン分子が再配向して溶液が白濁する。当該白濁現象をコラーゲンの線維形成能とみなすことができる。従って、当該性質を利用して、濃度０．０５％のコラーゲン溶液を、塩濃度１×Ｄ−ＰＢＳ（−）、ｐＨ７．３〜７．４で３７℃に保温し、そのときの吸光度を経時的に測定することにより、線維形成能を測定することができる。
【００２０】
本発明において、「Hsp47をコードするポリヌクレオチド」（以下、Hsp47ポリヌクレオチドと記すこともある。）とは、ヒートショックプロテイン４７（Heat shock protein 47）と一般的に呼ばれている、小胞体内腔に局在するストレス応答タンパク質（即ち、「Hsp47」）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを意味するものであり、具体的には例えば、配列番号１０４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１０５で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド等を挙げることができる。このようなHsp47ポリヌクレオチドは、その塩基配列の一部の塩基の欠失、置換又は付加が人為的に導入されてなる遺伝子であってもよく、また、Hsp47のアミノ酸配列に欠失、置換又は付加がなされたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。また、これらのポリヌクレオチドと相同性を有するポリヌクレオチド、例えば、異種生物由来のオーソログに由来する塩基配列を有するポリヌクレオチドであっても良い。ヒトHsp47のオーソログに由来する塩基配列としてはイヌHsp47（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＭ＿５４２３０５）、チンパンジーHsp47（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＭ＿００１１７４９７９）、ウシHsp47（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＭ＿００１０４６０６３）、ラットHsp47（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＭ＿０１７１７３）、マウスHsp47（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＭ＿００９８２５）、ニワトリHsp47（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＭ＿２０５２９１）等を挙げることができる。さらに、これらのオーソログに由来する塩基配列を有するポリヌクレオチドの塩基配列の一部の塩基が欠失、置換又は付加が導入されてなるポリヌクレオチド、部分的な塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。
【００２１】
本発明において使用される「Hsp47」としては、その由来は特に限定されないが、例えば、高等動物由来であることが好ましく、ヒト由来であることが更に好ましい。具体的には例えば、配列番号１０４で示されるアミノ酸配列を有するヒトHsp47を挙げることができる。また、これらのアミノ酸配列にアミノ酸配列の欠失、置換又は付加がなされたタンパク質、これらのアミノ酸配列と相同性を有するタンパク質、例えば、異種生物由来のオーソログに由来するアミノ酸配列を有するタンパク質であっても良い。ヒトHsp47のオーソログに由来するアミノ酸配列としては、イヌHsp47（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＰ＿５４２３０５）、チンパンジーHsp47（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＰ＿００１１７４９７９）、ウシHsp47（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＰ＿００１０３９５２８）、ラットHsp47（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＰ＿０５８８６９）、マウスHsp47（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＰ＿０３３９５５）、ニワトリHsp47（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＰ＿９９０６２２）等を挙げることができる。さらに、これらのオーソログのアミノ酸配列にアミノ酸配列の欠失、置換又は付加がなされたタンパク質であってもよい。
【００２２】
尚、前記のHsp47をコードするポリヌクレオチドは、例えば、酵母由来のプロモーター（具体的には例えば、アルコールオキシダーゼ１プロモーター等）の下流に連結されていることが好ましい。
【００２３】
本発明において、Hsp47をコードするポリヌクレオチドが酵母内で発現していることを確認するには、例えば、下記のようにすればよい。
Hsp47の検出方法としては、例えば、Towbinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76，4350-4354（1979）等において記載されるような免疫検出方法（イムノアッセイ）等を挙げることができる。このような免疫検出方法（イムノアッセイ）としては、具体的には例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、イムノビーズ捕捉アッセイ、ウェスタンブロッティング等が挙げられる。好ましくは、ウェスタンブロッティング等を挙げることができる。
まず、Hsp47のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが発現していることを確認したい酵母から、通常の生化学的手法を用いて、タンパク質成分を含む細胞抽出物、必要に応じて更に精製した精製物、を調製する。得られた細胞抽出物又は精製物等の試料を、免疫複合体の形成が可能な条件下で、抗体と接触させることにより、任意の抗原と抗体との免疫複合体を形成させる。即ち、任意の抗原と抗体とが結合するのに充分な時間、前記抗体と前記試料とをインキュベートする。その後、得られたサンプル中に含まれる、Hsp47に対して特異的に結合した抗体のみを検出すればよい。免疫複合体の検出は、通常、当該技術分野で標準的に使用される、放射活性、蛍光、生物学的若しくは酵素的なタグ・標識を検出することにより行うことができる。
【００２４】
本発明方法に関して説明する。
本発明方法における「ポリヌクレオチドを導入する工程」としては、下記の２つの工程のうち、いずれか１つの工程を選択すればよい。
（ａ）本中性糖被修飾タンパク質遺伝子を発現する酵母内にHsp47ポリヌクレオチドを導入する工程（以下、工程（ａ）と記すこともある。）
（ｂ）Hsp47ポリヌクレオチドを発現する酵母内に本中性糖被修飾タンパク質遺伝子を導入する工程（以下、工程（ｂ）と記すこともある。）
【００２５】
工程（ａ）において、本中性糖被修飾タンパク質遺伝子を発現する酵母内にHsp47ポリヌクレオチドを導入するには、通常の遺伝子工学的手法を用いればよい。
ここで、「本中性糖被修飾タンパク質遺伝子を発現する酵母」とは、本中性糖被修飾タンパク質遺伝子を発現する酵母を意味するものである。このような酵母は、天然に存在するものであってもよいし、また人工的に作製されたものであってもよい。尚、人工的に作製するには、通常の遺伝子工学的手法を用いて、コラーゲン等の本中性糖被修飾タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を導入することにより作製すればよい。
【００２６】
工程（ｂ）において、Hsp47ポリヌクレオチドを発現する酵母内に本中性糖被修飾タンパク質遺伝子を導入するには、通常の遺伝子工学的手法を用いればよい。
「Hsp47ポリヌクレオチドを発現する酵母」としては、人工的に作製されたものを用いればよい。尚、人工的に作製するには、通常の遺伝子工学的手法を用いて、Hsp47のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを導入することにより作製すればよい。
【００２７】
前記の「本中性糖被修飾タンパク質遺伝子を発現する酵母」及び「Hsp47ポリヌクレオチドを発現する酵母」は、更にプロリン水酸化酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子が追加的に導入されて得られるもの、即ち、プロリン水酸化酵素遺伝子を共発現する酵母、であってもよい。このような酵母は、中性糖含有量がより少ない中性糖修飾後タンパク質を効率よく製造する能力を有している。勿論、このような共発現酵母は、プロリン残基が水酸化された安定性の高いコラーゲンを産生することができる。具体的には例えば、プロリン水酸化酵素とＴｙｐｅＩコラーゲンとの両遺伝子を有する形質転換体では、全プロリン残基のうち２０％以上が水酸化されているＴｙｐｅＩコラーゲンを産生することができ、好ましくは全プロリン残基のうち４０％以上が水酸化されているコラーゲンを産生することができ、より好ましくは全プロリン残基のうちの４４％以上が水酸化されているコラーゲンを産生することができる。また、例えば、プロリン水酸化酵素とＴｙｐｅＩＩＩコラーゲンとの両遺伝子を有する形質転換体では、全プロリン残基のうち２０％以上が水酸化されている産生することができ、好ましくは全プロリン残基のうち４０％以上が水酸化されているコラーゲンを産生することができ、より好ましくは全プロリン残基のうち５０％以上が水酸化されたコラーゲンを産生することができる。このような本発明形質転換体を利用することにより、プロリンが高度（例えば、約２０〜６０％程度）に水酸化されたコラーゲンが得られる。
プロリン残基が水酸化されたコラーゲンは、３重ヘリックス構造がより安定化されたコラーゲンであり、このため、医薬品、工業製品、化粧品、食品等として商業的に一層価値がある高性能な多用途素材となるようなコラーゲンということができる。
【００２８】
本発明における「プロリン水酸化酵素」としては、例えば、αサブユニット、及び、βサブユニットからなるプロリル−４−ヒドロキシラーゼを挙げることができる。
ここで「αサブユニット」としては、例えば、α１サブユニット、α２サブユニット、α３サブユニット等が挙げられ、好ましくは、α１サブユニットが挙げられる。
また、「プロリン水酸化酵素」の由来は特に限定されないが、例えば、高等動物由来であることが好ましく、ヒト由来であることが更に好ましい。
プロリル−４−ヒドロキシラーゼは、αサブユニットとβサブユニットとからなる酵素であり、高等動物由来のプロリン水酸化酵素はαサブユニット２個、βサブユニット２個からなるヘテロ４量体酵素である。前記αサブユニットは、プロリン残基の水酸化に関与する触媒部位を含有すサブユニットである。また、前記βサブユニットは、αサブユニットとの複合体の形成及び安定化に必要なサブユニットである。プロリル−４−ヒドロキシラーゼが機能するためには、αサブユニットとβサブユニットとの両方が必要である。
前記プロリル−４−ヒドロキシラーゼαサブユニットとしては、具体的には例えば、配列番号１０６で示されるアミノ酸配列を有するヒトプロリル-4-ヒドロキシラーゼα１サブユニット（Ｐ４Ｈα１）、配列番号１０７で示されるアミノ酸配列を有するヒトプロリル−４−ヒドロキシラーゼα２サブユニット（Ｐ４Ｈα２）、配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有するヒトプロリル−４−ヒドロキシラーゼα３サブユニット（Ｐ４Ｈα３）、また、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット（Ｐ４Ｈβ）としては、具体的には例えば、配列番号１０９で示されるアミノ酸配列を有するヒトＰ４Ｈβを挙げることができる。さらに、これらのアミノ酸配列においてアミノ酸の欠失、置換又は付加がなされたタンパク質、また、これらのアミノ酸配列と相同性を有するタンパク質、例えば、異種生物由来のオーソログに由来するアミノ酸配列を有するタンパク質であっても良い。ヒトＰ４Ｈα１のオーソログ遺伝子に由来するアミノ酸配列としては、イヌＰ４Ｈα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＰ＿８６２２５７）、チンパンジーＰ４Ｈα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＰ＿００１１４１０４３）、ウシＰ４Ｈα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＰ＿００１０６９２３８）、ラットＰ４Ｈα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＰ＿７４２０５９）、マウスＰ４Ｈα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＰ＿０３５１６０）、ニワトリＰ４Ｈα１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＰ＿４２１５８３）、ヒトＰ４Ｈα２のオーソログ遺伝子に由来するアミノ酸配列としては、イヌＰ４Ｈα２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＰ＿８６０６３７）、チンパンジーＰ４Ｈα２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＰ＿００１１６２２２２）、ウシＰ４Ｈα２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＰ＿００１０２９４６５）、ラットＰ４Ｈα２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＰ＿３４０７９９）、マウスＰ４Ｈα２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＰ＿０３５１６１）、ニワトリＰ４Ｈα２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＰ＿００１００６１５５）、ヒトＰ４Ｈα３のオーソログ遺伝子に由来するアミノ酸配列としては、イヌＰ４Ｈα３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＰ＿８５１７１８）、チンパンジーＰ４Ｈα３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＰ＿００１１７４８９６）、ウシＰ４Ｈα３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＰ＿００１００１５９８）、ラットＰ４Ｈα３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＰ＿９４２０７０）、マウスＰ４Ｈα３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＰ＿７９６１３５）、ニワトリＰ４Ｈα３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＰ＿４１７２４８）、ヒトＰ４Ｈβのオーソログ遺伝子に由来するアミノ酸配列としては、イヌＰ４Ｈβ（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＰ＿５４０４８８）、チンパンジーＰ４Ｈβ（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＰ＿００１１６４３９６）、ウシＰ４Ｈβ（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＰ＿７７６５６０）、ラットＰ４Ｈβ（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＰ＿０３７１３０）、マウスＰ４Ｈβ（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＰ＿０３５１６２）、ニワトリＰ４Ｈβ（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＰ＿４２００９５）等を��げることができる。さらに、これらのオーソログのアミノ酸配列においてアミノ酸の欠失、置換又は付加がなされたプロリル−４−ヒドロキシラーゼであってもよい。
プロリル−４−ヒドロキシラーゼは、Gly-Xaa-Yaa繰り返し配列のYaa部位にあるプロリン残基の４位を水酸化し、４−ヒドロキシプロリンにする酵素であるため、コラーゲンの合成過程に重要な酵素の一つである。ヒドロキシプロリンはコラーゲンの３重ラセン構造の安定性を向上させる。Yaa部位にあるプロリン残基が適切に水酸化されることがコラーゲンの３重ラセン構造の安定化に重要である。
【００２９】
本発明における「プロリン水酸化酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子」（即ち、プロリン水酸化酵素遺伝子）としては、プロリル−４−ヒドロキシラーゼαサブユニットをコードする塩基配列を有する遺伝子、及び、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニットをコードする塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。前記プロリル−４−ヒドロキシラーゼαサブユニットをコードする塩基配列を有する遺伝子としては、具体的には例えば、配列番号１１０で示されるヒトＰ４Ｈα１のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子、配列番号１１１で示されるヒトＰ４Ｈα２のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子、配列番号１１２で示されるヒトＰ４Ｈα３のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。また、前記プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニットをコードする塩基配列を有する遺伝子としては、具体的には例えば、配列番号１１３で示されるヒトＰ４Ｈβのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。また、これらの遺伝子の塩基配列の一部の塩基に欠失、置換又は付加が導入されてなる遺伝子、部分的な塩基配列を有する遺伝子、さらに、これらの遺伝子の塩基配列と相同性を有する塩基配列を有する遺伝子、例えば、異種生物由来のオーソログに由来する塩基配列を有する遺伝子であっても良い。ヒトＰ４Ｈα１のオーソログに由来する塩基配列としては、イヌＰ４ＨＡ１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＭ＿８５７１６４）、チンパンジーＰ４ＨＡ１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＭ＿００１１４１０４３）、ウシＰ４ＨＡ１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＭ＿００１０７５７７０）、ラットＰ４ＨＡ１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＭ＿１７２０６２）、マウスＰ４ＨＡ１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＭ＿０１１０３０）、ニワトリＰ４ＨＡ１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＭ＿４２１５８３）、ヒトＰ４Ｈα２のオーソログ遺伝子に由来する塩基配列としては、イヌＰ４ＨＡ２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＭ＿８５５５４４）、チンパンジーＰ４ＨＡ２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＭ＿００１１６２２２２）、ウシＰ４ＨＡ２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＭ＿００１０３４２９３）、ラットＰ４ＨＡ２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＭ＿３４０７９８）、マウスＰ４ＨＡ２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＭ＿０１１０３１）、ニワトリＰ４ＨＡ２（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＭ＿００１００６１５５）、ヒトＰ４Ｈα３のオーソログ遺伝子に由来する塩基配列としては、イヌＰ４ＨＡ３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＭ＿８４６６２５）、チンパンジーＰ４ＨＡ３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＭ＿００１１７４８９６）、ウシＰ４ＨＡ３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＭ＿００１００１５９８）、ラットＰ４ＨＡ３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＭ＿１９８７７５）、マウスＰ４ＨＡ３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＭ＿１７７１６１）、ニワトリＰ４ＨＡ３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＭ＿４１７２４８）、ヒトＰ４Ｈβのオーソログ遺伝子に由来する塩基配列としては、イヌＰ４ＨＢ（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＭ＿５４０４８８）、チンパンジーＰ４ＨＢ（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＭ＿００１１６４３９６）、ウシＰ４ＨＢ（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＭ＿１７４１３５）、ラットＰ４ＨＢ（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＭ＿０１２９９８）、マウスＰ４ＨＢ（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＭ＿０１１０３２）、ニワトリＰ４ＨＢ（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＸＭ＿４２００９５）等を挙げることができる。さらに、これらのオーソログに由来する塩基配列を有する遺伝子の塩基配列の一部の塩基が欠失、置換又は付加が導入されてなる遺伝子、部分的な塩基配列を有する遺伝子であってもよい。
【００３０】
尚、前記のプロリン水酸化酵素遺伝子は、例えば、酵母由来のプロモーター、具体的には例えば、アルコールオキシダーゼ１プロモーター等の下流に連結されていることが好ましい。
【００３１】
本発明において、プロリン水酸化酵素（例えば、プロリル−４−ヒドロキシラーゼ）をコードする塩基配列を有する遺伝子が酵母内で発現していることを確認するには、例えば、下記のようにすればよい。
プロリン水酸化酵素の検出方法としては、例えば、Towbinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76，4350-4354（1979）等において記載されるような免疫検出方法（イムノアッセイ）等を挙げることができる。このような免疫検出方法（イムノアッセイ）としては、具体的には例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、イムノビーズ捕捉アッセイ、ウェスタンブロッティング等が挙げられる。好ましくは、ウェスタンブロッティング等を挙げることができる。
まず、プロリン水酸化酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子が発現していることを確認したい酵母から、通常の生化学的手法を用いて、タンパク質成分を含む細胞抽出物、必要に応じて更に精製した精製物、を調製する。得られた細胞抽出物又は精製物等の試料を、免疫複合体の形成が可能な条件下で、抗体と接触させることにより、任意の抗原と抗体との免疫複合体を形成させる。即ち、任意の抗原と抗体とが結合するのに充分な時間、前記抗体と前記試料とをインキュベートする。その後、得られたサンプル中に含まれる、プロリン水酸化酵素に対して特異的に結合した抗体のみを検出すればよい。免疫複合体の検出は、通常、当該技術分野で標準的に使用される、放射活性、蛍光、生物学的若しくは酵素的なタグ・標識を検出することにより行うことができる。
【００３２】
本発明方法における「ポリヌクレオチドを導入する工程」を経ることにより、本中性糖被修飾タンパク質遺伝子とHsp47ポリヌクレオチドとの両者を発現する形質転換体（即ち、本発明形質転換体）を作製することができる。勿論、作製された形質転換体は、前述のように、更にプロリン水酸化酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子が追加的に導入されて得られるもの、即ち、プロリン水酸化酵素遺伝子を共発現する酵母であってもよい。
尚、作製される形質転換体（即ち、本発明形質転換体）は、例えば、導入する遺伝子又はポリヌクレオチドが、遺伝子導入に通常用いるプラスミドに組み込まれるように、通常の遺伝子工学的手法に従って、遺伝子導入プラスミドを構築し、構築した遺伝子導入プラスミドを用いて宿主の細胞を形質転換することで調製できる。
【００３３】
本発明形質転換体の作製に用いる宿主としては、酵母を挙げることができ、例えば、サッカロマイセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、コマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、カンジダ・ボイディニ（Candida Boidini）、オガタエア・ミヌタ（Ogataea minuta）を挙げることができる。
サッカロマイセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を宿主とする場合のベクターとしては、染色体組み込み型プラスミド（ＹＩｐ型）、酵母内在性プラスミド２μｍ ＤＮＡ複製開始領域を有するプラスミド（ＹＥｐ型）、及び、染色体由来の自己複製領域を有するプラスミド（ＹＣｐ型）を挙げることができ、これらのプラスミドに大腸菌で複製可能な複製起点が組み込まれてシャトルベクターとなったプラスミドを用いることで、前記遺伝子導入プラスミドの構築を効率的に行うことができる。
また、コマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、カンジダ・ボイディニ（Candida Boidini）、オガタエア・ミヌタ（Ogataea minuta）を宿主とする場合のベクターとしては染色体組み込み型プラスミドを挙げることができ、大腸菌で複製可能な複製起点が組み込まれてシャトルベクターとなったプラスミドを用いることで前記遺伝子導入プラスミドの構築を効率的に行うことができる。
本発明形質転換体の作製には、好ましくは、宿主として、メタノール資化性酵母であるコマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、カンジダ・ボイディニ（Candida Boidini）、オガタエア・ミヌタ（Ogataea minuta）、ベクターとして、染色体組み込み型プラスミドを挙げることができ、さらに好ましくは、宿主として、コマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）、ベクターとして、染色体組み込み型プラスミドを挙げることができる。具体的には、宿主としては、コマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）ＰＰＹ１２株、ＧＳ１１５株、ＫＭ７１株等、ベクターとしては、ｐＡＯ８１５、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１等の市販のプラスミド、また、ベクターの構成要素である相同的組換え領域、マーカー、プロモーター、ターミネーター等を組み込んで作製したプラスミドを挙げることができる。
【００３４】
染色体組み込み型のプラスミドは、プラスミド上に宿主の染色体の塩基配列と相同な塩基配列を有する相同的組換え領域を有しており、この領域で宿主の染色体上に組み込まれるため、宿主の細胞内で安定的に保持される。相同的組換え領域としては、特に限定されないが、例えば、アミノ酸合成系遺伝子、核酸合成系遺伝子、ribosome ＤＮＡ、Ｔｙ因子（Transposon of Yeast element）等を挙げることができる。また、形質転換体の選抜に用いるマーカーとしては、宿主の細胞内に導入されることにより形質の変化を引き起こす遺伝子を挙げることができ、例えば、アミノ酸合成系遺伝子、核酸合成系遺伝子、抗生物質耐性遺伝子等を挙げることができる。具体的には、前記アミノ酸合成系遺伝子としては、例えば、ＬＥＵ２、ＨＩＳ４、ＡＲＧ４、ＴＲＰ１、前記核酸合成系遺伝子としては、例えば、ＵＲＡ３、ＡＤＥ２等を挙げることができる。また、抗生物質耐性遺伝子としては、例えば、ゼオシン、ブラストサイジンＳ、ジェネティシン、Ｇ４１８、クロラムフェニコール、ブレオマイシン等の抗生物質に対して耐性を付与する遺伝子を挙げることができる。また、前記アミノ酸合成系遺伝子、前記核酸合成系遺伝子では、アミノ酸合成系遺伝子、核酸合成系遺伝子等が欠損している宿主と組み合わせて宿主の欠損変異を補完することにより、形質転換体を選抜するマーカーとして使用することができる。
【００３５】
本発明において、前記の全てのタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する外来遺伝子を酵母内に導入する方法としては、特に限定されず、例えば、リチウム法、スフェロプラスト法、エレクトロポレーション法等を挙げることができる。
【００３６】
本発明取得方法に関して説明する。
本発明取得方法は、下記の３つの工程を含む。
（１）本中性糖被修飾タンパク質遺伝子を発現する酵母内にHsp47ポリヌクレオチドを導入する工程、または、Hsp47ポリヌクレオチドを発現する酵母内に本糖被修飾タンパク質遺伝子を導入する工程のいずれかの一つの第一工程
（２）第一工程により得られる形質転換体（即ち、本発明形質転換体）を培養することにより、当該形質転換体内に存在する中性糖被修飾タンパク質遺伝子の発現により産生される中性糖被修飾タンパク質が前記形質転換体内で中性糖により修飾されて得られる本発明中性糖修飾後タンパク質を前記形質転換体に製造させる第二工程
（３）第二工程で製造された本発明中性糖修飾後タンパク質を回収する第三工程
【００３７】
第一工程は、本発明方法に関する説明で記載された「ポリヌクレオチドを導入する工程」にある工程（ａ）又は工程（ｂ）と同等な工程であり、前記と同様にして行えばよい。尚、重複記載を避けるために、ここではその詳細な説明を省略する。
【００３８】
第二工程は、第一工程により得られる形質転換体（即ち、本発明形質転換体）を培養することにより、当該形質転換体内に存在する中性糖被修飾タンパク質遺伝子の発現により産生される中性糖被修飾タンパク質が前記形質転換体内で中性糖により修飾されて得られる本発明中性糖修飾後タンパク質を前記形質転換体に製造させればよい。
【００３９】
本発明形質転換体は、既に説明されたように、下記（１）及び（２）、更に必要に応じて（３）、の全てのタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する外来遺伝子が酵母内に導入されて得られる。
（１）本中性糖被修飾タンパク質遺伝子
（２）Hsp47ポリヌクレオチド
（３）プロリン水酸化酵素
尚、前記外来遺伝子を導入する順序は、本発明方法に関する説明及び本発明取得方法での第一工程に関する説明等の如く、特に限定はなく、前記（１）、（２）、（３）のいずれの外来遺伝子からでもよい。また２つ以上の外来遺伝子を同時に導入することもできる。
【００４０】
前記（１）〜（３）の全てのタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する外来遺伝子は発現可能な構成でプロモーターの下流に組み込まれていることが望ましい。前記プロモーターとしては酵母内で機能するプロモーターであれば特に限定はないが、特定の栄養源、基質によりその転写活性が誘導される誘導型プロモーターを好適に利用することができる。外来遺伝子の下流にターミネーターが存在することが好ましい。また、必要に応じて、アミノ末端のシグナル配列を置き換えることができる。尚、前記シグナル配列としては、例えば、酵母αファクターのプレプロ配列、酵母インベルターゼのシグナル配列、酵母酸性フォスファターゼのシグナル配列等を挙げることができる。
【００４１】
前記プロモーターとしては、特に限定されないが、例えば、ガラクトース代謝酵素遺伝子（ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０）、抑制性酸性フォスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ５）、グリセリンアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＴＤ）、フォスフォグリセリン酸キナーゼ遺伝子（ＰＧＫ）、アルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＤＨ１、ＡＯＸ１、ＡＯＸ２、ＭＯＸ、ＡＯＤ１）、ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＦＤＨ１、ＦＭＤ１）、ジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子（ＤＡＳ）、ペルオキシソーム膜タンパク質合成遺伝子（ＰＥＲ３）、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＦＬＤ１）等の遺伝子のプロモーター等を挙げることができる。また前記ターミネーターとしては、転写終結活性を有するターミネーターであれば有効に利用できるが、例えば、アルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ１）、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦＬＤ１）のターミネーターを挙げることができる。
【００４２】
本発明形質転換体内に存在する中性糖被修飾タンパク質遺伝子の発現を確認するには、前記の「本発明において、Hsp47をコードするポリヌクレオチドが酵母内で発現していることを確認する」の欄に記載させるようにすればよい。尚、重複記載を避けるために、ここではその詳細な説明を省略する。
【００４３】
本発明取得方法での第二工程は、通常の微生物学的手法に従って実施すればよい。
第一工程で得られる形質転換体の培養に用いられる培地は、通常、当該技術分野で既知の培地が好適に使用され、培養条件は通常の方法に準じて実施され得る。
前記培地としては、特に限定されず、合成培地及び天然培地のいずれの培地でも用いることができるが、例えば、前記合成培地としては、炭素源（例えば、各種糖類、グリセロール、メタノール）、窒素源（例えば、尿素、アンモニア水、アンモニウム塩又は硝酸塩）の他、無機塩（例えば、Ｍｇ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｍｏ、Ｂ、Ｚｎ、Ｉ又はＣｕ等の無機塩）、微量栄養素（例えば、各種ビタミン、各種アミノ酸、又はヌクレオチド）等を含有するものを用いることができる。また、前記天然培地としては、培地成分として、前記合成培地の成分に加えて、例えば、イーストエキストラクト、ペプトン、カゼイン等を含有する培地を用いることができる。さらに、本発明形質転換体の作製に用いた前記発現カセットに誘導型プロモーターが用いられている場合には、誘導型プロモーターを活性化する栄養源、基質等（例えば、ガラクトース、ラクトース、シュクロース、メタノール等）を培地に添加することでプロモーターを活性化することができる。
【００４４】
本発明形質転換体がメタノール資化性酵母である場合には、メタノール含有培地を用いることで効率的に前記（１）〜（３）の全てのタンパク質を発現させることができる。具体的には、ＭＭ培地（１．３４％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ、４ｘ１０−５％ビオチン、０．５％メタノール）、ＢＭＭ培地（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０、１．３４％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ、４ｘ１０−５％ビオチン、０．５％メタノール）、ＢａｓａｌＳａｌｔ培地（Ｐｉｃｈｉａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ、ＩＳＢＮ：０−８９６０３−４２１−６  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、ＦＭ２２培地（Ｐｉｃｈｉａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ、ＩＳＢＮ：０−８９６０３−４２１−６  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）等を用いることができる。培地のｐＨは、中性若しくは弱塩基性、又は、弱酸性、具体的にはｐＨ３〜８に調製した培地を用いることができ、より好ましくはｐＨ４〜７に調製した培地を用いることができる。
【００４５】
培養形式は液体培養が好ましく、培養温度は１５℃〜４０℃であることが好ましい。培養時間は１〜１０００時間であることが好ましく、また、培養は振盪、又は、攪拌条件下で実施することが好ましく、空気、酸素の通気下において実施することができる。また、培養操作法としては回分培養法、半回分培養法又は連続培養法により実施することが好ましく、また、培養期間中に、必要に応じて、高濃度の培地成分を流加することができる。
尚、必要に応じて、前記培養（本培養）に先立って前培養を行うことができる。前培養用の培地としては、特に限定されないが、例えば、ＹＮＢ培地（０．６７％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ、４ｘ１０−５％ビオチン、２％グルコース）、ＹＰＤ培地（１％イーストエキストラクト、２％ペプトン、２％グルコース）、ＢＭＧＹ培地（１％イーストエキストラクト、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０、１．３４％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ、４ｘ１０−５％ビオチン、１％メタノール）等を用いることができる。前培養の培養条件は特に限定されないが、培養時間は１０〜１００時間、培養温度は１５℃〜４０℃であることが好ましい。前培養は振盪、又は、攪拌条件下で実施することが好ましく、空気、酸素の通気下において実施することがでる。また、培養操作法としては回分培養法が好ましい。
【００４６】
第三工程は、第二工程で製造された本発明中性糖修飾後タンパク質を回収すればよい。ここで回収される本発明中性糖修飾後タンパク質の特性、即ち、「取得される中性糖修飾後タンパク質の特性」は、
（a）第一工程において、Hsp47をコードするポリヌクレオチドが導入されていないこと以外は同等な形質転換体、または、（b）第一工程において、Hsp47をコードするポリヌクレオチドを発現しないこと以外は同等な形質転換体のいずれかの一つの形質転換体を培養することにより、当該形質転換体内に存在する中性糖被修飾タンパク質遺伝子の発現により産生される中性糖被修飾タンパク質が前記形質転換体内で中性糖により修飾されて得られる中性糖修飾後タンパク質に含まれる中性糖の含有量よりも低い中性糖の含有量である。
【００４７】
本発明中性糖修飾後タンパク質を回収する工程は、通常の生化学的手法及びタンパク質工学的手法に従って実施すればよい。
第二工程で製造された本発明中性糖修飾後タンパク質を回収するには、形質転換体が製造した本発明中性糖修飾後タンパク質を含む培養上清又は培養菌体から本発明中性糖修飾後タンパク質を精製すればよい。
前記精製を実施する方法としては、特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、破砕・可溶化する工程と、分画・純化する工程とを組み合わせることで実施することができる。破砕・可溶化する工程としては、例えば、超音波、ガラスビーズなどで物理的に破砕する方法、酵素、酸、アルカリ、界面活性剤等を用いて可溶化する方法、有機溶媒、バッファー等による溶媒抽出法等を挙げることができる。また、分画・純化する工程としては、例えば、塩析、溶媒沈殿、等電点沈殿等による沈殿形成法、イオン交換、ゲル濾過、疎水相互作用、アフィニティ等のカラムクロマトグラフィー、限外濾過、凍結乾燥、結晶化、透析等の方法を挙げることができる。
より簡便な精製方法としては、本発明中性糖修飾後タンパク質が備える特性、つまり三重螺旋構造がタンパク質分解酵素に対して耐性を有することを利用した精製方法を挙げることができる。このような精製方法は、例えば、下記の（ａ）〜（ｅ）の工程を有することが好ましい。
（ａ）形質転換体をｐＨ緩衝溶液中で破砕する工程、
（ｂ）得られた破砕液にタンパク質分解酵素を添加して夾雑物を分解する工程、
（ｃ）分解された破砕液を遠心分離することにより、上清を回収する工程、
（ｄ）回収された上清を種々のｐＨ条件下で塩析する工程、
（ｅ）塩析により回収された沈殿を溶解して脱塩・除粒子する工程、
【００４８】
本発明は、本発明取得方法により取得された中性糖修飾後タンパク質（即ち、本発明中性糖修飾後タンパク質）を含む。
【００４９】
このようにして、本発明が対象とするタンパク質がコラーゲンである場合には、本発明取得方法により、医薬品、工業製品、化粧品、食品等として商業的に一層価値がある高性能な多用途素材となるような新規なコラーゲン（具体的には例えば、中性糖由来の親水性に係る物性を低下させ、タンパク質自体の親油性を高めるような改善を施すことにより、コラーゲンが本来有する性質を獲得し、その付加価値を向上させた新規なコラーゲン）を取得することができる。また、このようなコラーゲンは、例えば、免疫学上での低抗原性誘導という潜在的な可能性等の観点からも好まれるであろう。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例を挙げてさらに詳細に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
遺伝子のクローニング、プラスミドの構築の方法は「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-309-6、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley &amp; Sons, Inc. ISBN O-471-50338-X等に記載されている方法を参考として引用できる。以下に、クローニング等の工程の詳細を説明する。
【００５１】
実施例１  （クローニング）
（１−１）  ヒスチジノールデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡのクローニング（ｐＨＩＳ４−ＴＯＰＯの構築）
下記オリゴヌクレオチド１及び２を合成した。アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）よりコマガタエラ  パストリス（Komagataella ｐａｓｔｏｒｉｓ）  ＮＲＲＬ  Ｙ−１１４３０（ＡＴＣＣ７６２７３）を入手した。下記オリゴヌクレオチド１及び２をプライマーとし、ATCC76273のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ＨＩＳ４）をコードするＤＮＡを増幅した。尚、前記ゲノムＤＮＡはGenomic-tip 100/G（QIAGEN）及びGenomic DNA Buffer Set（QIAGEN）を用いて調製した。
(a)オリゴヌクレオチド１：GATCTCCTGATGACTGACTCACTGATAATA（配列番号１）
(b)オリゴヌクレオチド２：TAATTAAATAAGTCCCAGTTTCTCCATACG（配列番号２）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)ゲノムＤＮＡ溶液（１５ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(c)10×AccuPrime Pfx reaction mix（Invitrogen）  ・・・５μｌ
(d)AccuPrime Pfx DNA polymerase（２．５Ｕ／μｌ、Invitrogen）  ・・・０．５μｌ
(e)滅菌蒸留水  ・・・４０．５μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９５℃にて２分間加熱した後、９５℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて２．５分間の伸長反応からなるサイクルを３５回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約２．６ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約２．６ｋｂのDNAをｐＣＲ‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（One Shot TOP10F’ Chemically Competent E.coli、Invitorgen）を形質転換した。尚、プラスミドへのクローニングにはZero-Blunt TOPO PCR cloning キット（Invitrogen）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からHIS４をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、ｐＨＩＳ４−ＴＯＰＯと記すこともある。）を精製することにより、ｐＨＩＳ４−ＴＯＰＯを得た。
【００５２】
（１−２）  アルギノスクシネートリアーゼをコードするＤＮＡのクローニング（ｐＡＲＧ４−ＴＯＰＯの構築）
下記オリゴヌクレオチド３及び４を合成した。下記オリゴヌクレオチド３及び４をプライマーとし、ATCC76273（実施例１（１−１）参照）のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、アルギノスクシネートリアーゼ（ＡＲＧ４）をコードするＤＮＡを増幅した。尚、前記ゲノムＤＮＡはGenomic-tip 100/G（QIAGEN）及びGenomic DNA Buffer Set（QIAGEN）を用いて調製した。
(a)オリゴヌクレオチド３：ACGAAAATATGGTACCTGCCCTCAC（配列番号３）
(b)オリゴヌクレオチド４：GTTCTATCTACCCGAGGAAACCGATACATA（配列番号４）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)ゲノムＤＮＡ溶液（１５ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(c)10×AccuPrime Pfx reaction mix（Invitrogen）  ・・・５μｌ
(d)AccuPrime Pfx DNA polymerase（２．５Ｕ／μｌ、Invitrogen）  ・・・０．５μｌ
(e)滅菌蒸留水  ・・・４０．５μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９５℃にて２分間加熱した後、９５℃にて１５秒間の変性反応、６５℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて２．５分間の伸長反応からなるサイクルを３５回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約２．２ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約２．２ｋｂのDNAをｐＣＲ‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（One Shot TOP10F’ Chemically Competent E.coli、Invitrogen）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはZero-Blunt TOPO PCR cloning キット（Invitrogen）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からＡＲＧ４をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、ｐＡＲＧ４−ＴＯＰＯと記すこともある。）を精製することにより、ｐＡＲＧ４−ＴＯＰＯを得た。
【００５３】
（１−３）  アルコールデヒドロゲナーゼ１プロモーターのクローニング（ｐＡＯＸ１Ｐｒｏ＋１５ａａ−ＴＯＰＯの構築）
下記オリゴヌクレオチド５及び６を合成した。下記オリゴヌクレオチド５及び６をプライマーとし、ATCC76273（実施例１（１−１）参照）のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、アルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＯＸ１）のプロモーターを増幅した。尚、前記ゲノムＤＮＡはGenomic-tip 100/G（QIAGEN）及びGenomic DNA Buffer Set（QIAGEN）を用いて調製した。
(a)オリゴヌクレオチド５：AGATCTAACATCCAAAGACGAAAGGTT（配列番号５）
(b)オリゴヌクレオチド６：ATCCACCACCTAGAACTAGGATATCAAAC（配列番号６）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)ゲノムＤＮＡ溶液（１５ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(c)10×AccuPrime Pfx reaction mix（Invitrogen）  ・・・５μｌ
(d)AccuPrime Pfx DNA polymerase（２．５Ｕ／μｌ、Invitrogen）  ・・・０．５μｌ
(e)滅菌蒸留水  ・・・４０．５μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９５℃にて２分間加熱した後、９５℃にて１５秒間の変性反応、６２℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて１分間の伸長反応からなるサイクルを３５回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約１．０ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約１．０ｋｂのDNAを、ｐＣＲ‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（One Shot TOP10F’ Chemically Competent E.coli、Invitrogen）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはZero-Blunt TOPO PCR cloning（Invitrogen）キットを用いた。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からＡＯＸ１プロモーターが挿入されたプラスミド（以下、ｐＡＯＸ１Ｐｒｏ＋１５ａａ−ＴＯＰＯと記すこともある。）を精製することにより、ｐＡＯＸ１Ｐｒｏ＋１５ａａ−ＴＯＰＯを得た。
【００５４】
（１−４）  ペルオキシソームマトリクスタンパク質プロモーターのクローニング（ｐＣＲ−ＢＩＩ−ＰＥＲ３  Ｐｒｏ  ＳａｃＩＩ−Ｐｓｐ１４０６Ｉ（＋）の構築）
下記オリゴヌクレオチド７及び８を合成した。下記オリゴヌクレオチド７及び８をプライマーとし、ATCC76273（実施例１（１−１）参照）のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ペルオキシソームマトリクスタンパク質（PER３）のプロモーターを増幅した。尚、前記ゲノムＤＮＡはGenomic-tip 100/G（QIAGEN）及びGenomic DNA Buffer Set（QIAGEN）を用いて調製した。
(a)オリゴヌクレオチド７：CTAAGGGTCTCACTGGTGTTTCAGC（配列番号７）
(b)オリゴヌクレオチド８：AGTTCCTTGCAACTGTAGTGGTCG（配列番号８）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)ゲノムＤＮＡ溶液（１５ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ（１Ｕ）
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて70秒間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを３０回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて70秒間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約１．１ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約１．１ｋｂのDNAを、ｐＣＲ‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Zero-Blunt TOPO PCR cloning キット（Invitrogen）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からＰＥＲ３プロモーターが挿入されたプラスミド（以下、ｐCR-BII-PER３ Ｐｒｏ(+)と記すこともある。）を精製することにより、ｐCR-BII-PER３ Ｐｒｏ(+)を得た。
下記オリゴヌクレオチド９及び１０を合成した。下記オリゴヌクレオチド９及び１０をプライマーとし、ｐCR-BII-PER３ Ｐｒｏ(+)プラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、PER３プロモーターの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド９：AACCGCGGCTCGTCACTATCGTCGTTG（配列番号９）
(b)オリゴヌクレオチド１０：CGAACGTTACCTGAAGATAGGTAAAAAAAAATTGC（配列番号１０）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)プラスミドＤＮＡ溶液（１ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ（１Ｕ）
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて１分間の伸長反応からなるサイクルを５回行い、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて１分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２０回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて１分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約１．０ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約１．０ｋｂのDNAを、ｐＣＲ‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはZero-Blunt TOPO PCR cloning キット（Invitrogen）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からＰＥＲ３プロモーターが挿入されたプラスミド（以下、ｐＣＲ−ＢＩＩ−ＰＥＲ３  Ｐｒｏ  ＳａｃＩＩ−Ｐｓｐ１４０６Ｉ（＋）と記すこともある。）を精製することにより、ｐＣＲ−ＢＩＩ−ＰＥＲ３  Ｐｒｏ  ＳａｃＩＩ−Ｐｓｐ１４０６Ｉ（＋）を得た。
【００５５】
（１−５）  アルコールデヒドロゲナーゼ２プロモーターのクローニング（ｐＣＲ−ＢＩＩ−ＡＯＸ２  Ｐｒｏ  ＳａｃＩＩ−Ｐｓｐ１４０６Ｉ（−）の構築）
下記オリゴヌクレオチド１１及び１２を合成した。下記オリゴヌクレオチド１１及び１２をプライマーとし、ATCC76273（実施例１（１−１）参照）のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、アルコールデヒドロゲナーゼ２（ＡＯＸ２）遺伝子のプロモーターの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。尚、前記ゲノムＤＮＡはGenomic-tip 100/G（QIAGEN）及びGenomic DNA Buffer Set（QIAGEN）を用いて調製した。
(a)オリゴヌクレオチド１１：AACCGCGGCTAGTAGAACTTTGACATCTGCTA（配列番号１１）
(b)オリゴヌクレオチド１２：CGAACGTTTTGATTTGTTTGTGGGGATTTAG（配列番号１２）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)ゲノムＤＮＡ溶液（１５ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ（１Ｕ）
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて７０秒間の伸長反応からなるサイクルを５回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて７０秒間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを３０回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて７０秒間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約１．１ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約１．１ｋｂのDNAを、ｐＣＲ‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはZero-Blunt TOPO PCR cloning キット（Invitrogen）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からＡＯＸ２プロモーターが挿入されたプラスミド（以下、ｐＣＲ−ＢＩＩ−ＡＯＸ２  Ｐｒｏ  ＳａｃＩＩ−Ｐｓｐ１４０６Ｉ（−）と記すこともある。）を精製することにより、ｐＣＲ−ＢＩＩ−ＡＯＸ２  Ｐｒｏ  ＳａｃＩＩ−Ｐｓｐ１４０６Ｉ（−）を得た。
【００５６】
（１−６）  アルコールデヒドロゲナーゼ１ターミネーターのクローニング（ｐＡＯＸ１ｔｅｒｍ−ＴＯＰＯの構築）
下記オリゴヌクレオチド１３及び１４を合成した。下記オリゴヌクレオチド１３及び１４をプライマーとし、ATCC76273（実施例１（１−１）参照）のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、アルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＯＸ１）遺伝子のターミネーターを増幅した。尚、前記ゲノムＤＮＡはGenomic-tip 100/G（QIAGEN）及びGenomic DNA Buffer Set（QIAGEN）を用いて調製した。
(a)オリゴヌクレオチド１３：CCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTC（配列番号１３）
(b)オリゴヌクレオチド１４：GCACAAACGAACGTCTCACTTAAT（配列番号１４）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)ゲノムＤＮＡ溶液（１５ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(c)10×AccuPrime Pfx reaction mix（Invitrogen）  ・・・５μｌ
(d)AccuPrime Pfx DNA polymerase（２．５Ｕ／μｌ、Invitrogen）  ・・・０．５μｌ
(e)滅菌蒸留水  ・・・４０．５μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９５℃にて２分間加熱した後、９５℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて３０秒間の伸長反応からなるサイクルを３５回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約０．３ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約０．３ｋｂのDNAを、ｐＣＲ‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（One Shot TOP10F’ Chemically Cometent E.coli、Invitrogen）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはZero-Blunt TOPO PCR cloning キット（Invitrogen）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からＡＯＸ１ターミネーターが挿入されたプラスミド（以下、ｐＡＯＸ１ｔｅｒｍ−ＴＯＰＯと記すこともある。）を精製することにより、ｐＡＯＸ１ｔｅｒｍ−ＴＯＰＯを得た。
【００５７】
（１−７）  アルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子の３’側下流ノンコーディング領域のクローニング（ｐＡＯＸ１−３‘−TOPOの構造）
下記オリゴヌクレオチド１５及び１６を合成した。下記オリゴヌクレオチド１５及び１６をプライマーとし、ATCC76273（実施例１（１−１）参照）のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、アルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＯＸ１）遺伝子の３’側下流ノンコーディング領域を増幅した。尚、前記ゲノムＤＮＡはGenomic-tip 100/G（QIAGEN）及びGenomic DNA Buffer Set（QIAGEN）を用いて調製した。
(a)オリゴヌクレオチド１５：TCGAGTATCTATGATTGGAAGTATGGGAAT（配列番号１５）
(b)オリゴヌクレオチド１６：GATCTTGAGATAAATTTCACGTTTAAAATC（配列番号１６）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)ゲノムＤＮＡ溶液（１５ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(c)10×AccuPrime Pfx reaction mix（Invitrogen）  ・・・５μｌ
(d)AccuPrime Pfx DNA polymerase（２．５Ｕ／μｌ、Invitrogen）  ・・・０．５μｌ
(e)滅菌蒸留水  ・・・４０．５μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９５℃にて２分間加熱した後、９５℃にて１５秒間の変性反応、５８℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて５０秒間の伸長反応からなるサイクルを３５回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約０．８ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約０．８ｋｂのDNAを、ｐＣＲ‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（One Shot TOP10F’ Chemically Competent E.coli、Invitrogen）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはZero-Blunt TOPO PCR cloning キット（Invitrogen）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からＡＯＸ１  ３’側下流ノンコーディング領域が挿入されたプラスミド（以下、ｐＡＯＸ１−３‘−TOPOと記すこともある。）を精製することにより、ｐＡＯＸ１−３‘−TOPOを得た。
【００５８】
（１−８）  αファクターをコードするＤＮＡのクローニング（ｐαｆａｃｔｏｒ−ＴＯＰＯの構築）
下記オリゴヌクレオチド１７及びオリゴヌクレオチド１８を合成した。製品評価技術基盤機構（NITE）よりサッカロマイセス  セルビシエ（Saccharomyces ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  S288C（NBRC1136）を入手した。下記オリゴヌクレオチド１７及び１８をプライマーとし、NBRC1136のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、αファクターをコードするＤＮＡを増幅した。尚、前記ゲノムＤＮＡはGenomic-tip 100/G（QIAGEN）及びGenomic DNA Buffer Set（QIAGEN）を用いて調製した。
(a)オリゴヌクレオチド１７：TCAAACAAGAAGATTACAAACTATCAATTTCA（配列番号１７）
(b)オリゴヌクレオチド１８：GTACGAGCTAAAAGTACAGTGGGAACAAA（配列番号１８）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)ゲノムＤＮＡ溶液（１５ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ（１Ｕ）
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて１分間の伸長反応からなるサイクルを１０回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて１分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２５回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約０．６ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約０．６ｋｂのDNAを、ｐＣＲ‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（One Shot TOP10F’ Chemically Cometent E.coli、Invitrogen）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはZero-Blunt TOPO PCR cloning キット（Invitrogen）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からαファクターをコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、ｐαｆａｃｔｏｒ−ＴＯＰＯと記すこともある。）を精製することにより、ｐαｆａｃｔｏｒ−ＴＯＰＯを得た。
【００５９】
（１−９）  ウシコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩα１をコードするＤＮＡのクローニング（ｐＢｔＣＯＬ３Ａ１−ＴＯＰＯ（−）の構築）
ウシ肝臓由来のポリA+RNAをBD Clontechより入手した。TｈermoScript RT-PCR System（Invitrogen）を用いcDNAを合成した。下記オリゴヌクレオチド１９及び２０を合成した。下記オリゴヌクレオチド１９及び２０をプライマーとし、前記ｃDNAを鋳型としてＰＣＲを行い、ウシコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩα１ののN末端側の約１１８０残基をコードするＤＮＡを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド１９：GACATGATGAGCTTTGTGCAAAAGG（配列番号１９）
(b)オリゴヌクレオチド２０：CCCTCAGATCCTCTTTCACCTCTG（配列番号２０）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)cＤＮＡ溶液  ・・・１μｌ
(b)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(c)10×AccuPrime Pfx reaction mix（Invitrogen）  ・・・５μｌ
(d)AccuPrime Pfx DNA polymerase（２．５Ｕ／μｌ、Invitrogen）  ・・・０．５μｌ
(e)滅菌蒸留水  ・・・４０．５μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９５℃にて２分間加熱した後、９５℃にて１５秒間の変性反応、６４℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて５分間の伸長反応からなるサイクルを３５回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約３．５ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約３．５ｋｂのDNAを、ｐＣＲ‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（One Shot TOP10F’ Chemically Competent E.coli、Invitrogen）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはZero-Blunt TOPO PCR cloning キット（Invitrogen）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からウシコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩα１のN末端側の約１１８０残基をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、ｐＢｔＣＯＬ３Ａ１ＮＭ−ＴＯＰＯ（−）と記すこともある。）を精製することにより、ｐＢｔＣＯＬ３Ａ１ＮＭ−ＴＯＰＯ（−）を得た。
下記オリゴヌクレオチド２１及び２２を合成した。下記オリゴヌクレオチド２１及び２２をプライマーとし、前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ウシコラーゲンＴｙｐｅIIIα１のC末端側の約６５０残基をコードするＤＮＡを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド２１：GAGCCTGGTGCTAAAGGAGAAAGAG（配列番号２１）
(b)オリゴヌクレオチド２２：GTGTGAAGCTTTTTCTGGGACTTTG（配列番号２２）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)cＤＮＡ溶液  ・・・１μｌ
(b)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(c)10×AccuPrime Pfx reaction mix（Invitrogen）  ・・・５μｌ
(d)AccuPrime Pfx DNA polymerase（２．５Ｕ／μｌ、Invitrogen）  ・・・０．５μｌ
(e)滅菌蒸留水  ・・・４０．５μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９５℃にて２分間加熱した後、９５℃にて１５秒間の変性反応、６４℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて５分間の伸長反応からなるサイクルを３５回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約２．０ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約２．０ｋｂのDNAを、ｐＣＲ‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（One Shot TOP10F’ Chemically Competent E.coli、Invitrogen）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはZero-Blunt TOPO PCR cloning キット（Invitrogen）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からウシコラーゲンＴｙｐｅIIIα１のC末端側の約６５０残基をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、ｐＢｔＣＯＬ３Ａ１Ｃ−ＴＯＰＯ（−）と記すこともある。）を精製することにより、ｐＢｔＣＯＬ３Ａ１Ｃ−ＴＯＰＯ（−）を得た。
ｐＢｔＣＯＬ３Ａ１Ｃ−ＴＯＰＯ（−）プラスミドを制限酵素ＡｇｅＩ及びＸbaＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により、約１．１ｋｂのＤＮＡを分離・精製した。ｐＢｔＣＯＬ３Ａ１ＮＭ−ＴＯＰＯ（−）プラスミドを制限酵素ＡｇｅＩ及びＸｂａＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により、約６．８ｋｂのＤＮＡを分離・精製した。ゲルからのDNAの抽出はMinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いて行った。前記約１．１ｋｂのＤＮＡ及び前記約６．８ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（One Shot TOP10F’ Chemically Competent E.coli、Invitrogen）を形質転換した。尚、上記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からウシコラーゲンＴｙｐｅIIIα１をコードするDNAが挿入されたプラスミド（以下、ｐＢｔＣＯＬ３Ａ１−ＴＯＰＯ（−）と記すこともある。）を精製することにより、ｐＢｔＣＯＬ３Ａ１−ＴＯＰＯ（−）を得た。
【００６０】
（１−１０）  ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１をコードするＤＮＡのクローニング（ｐＢｌｕｅ−ＨｓＣＯＬ１Ａ１の構築）
下記オリゴヌクレオチド２３及び２４を合成した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡）を用いてオリゴヌクレオチドの５’末端にリン酸基を付加した後、下記オリゴヌクレオチド２３及び２４をプライマーとし、Human brain cDNA（東洋紡）を鋳型としてＰＣＲを行い、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１をコードするＤＮＡを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド２３：CAGCCACAAAGAGTCTACATGTCTAGG（配列番号２３）
(b)オリゴヌクレオチド２４：AGGTTGGGATGGAGGGAGTT（配列番号２４）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)ｃDＮＡ溶液  ・・・５μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD -plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水  ・・・２９μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９８℃にて２０秒間の変性反応、５８℃にて１０秒間のアニーリング反応、及び、７４℃にて５分間の伸長反応からなる反応サイクルを３５回行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約４．５ｋｂのＤＮＡをMagExtractor PCR&Gel cleanup（東洋紡）を用いて精製した。
pBluescriptIIKS(+)プラスミド（Stratagene）を制限酵素EcoRVにて切断し、アルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化した後MagExtractor PCR&Gel cleanup（東洋紡）を用いて精製した。
前記約４．５ｋｂのＤＮＡ及び前記プラスミドをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation high（東洋紡）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、MagExtractor plasmid （東洋紡）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、ｐＢｌｕｅ−ＨｓＣＯＬ１Ａ１と記すこともある。）を精製することにより、ｐＢｌｕｅ−ＨｓＣＯＬ１Ａ１を得た。
【００６１】
（１−１１）  ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２をコードするＤＮＡのクローニング（ｐＵＣ１８−ＨｓＣＯＬ１Ａ２の構築）
Human Neonatal Dermal Fibroblasts由来のTotal  RNAをCell Applications, Incより入手した。ReverTra Plus（東洋紡）を用いcDNAを合成した。下記オリゴヌクレオチド２５及び２６を合成した。下記オリゴヌクレオチド２５及び２６をプライマーとし、前記ｃDNAを鋳型としてＰＣＲを行い、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２をコードするＤＮＡを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド２５：GCCAAGCTTGCATGCTCAGCTTTGTGGATACGCGGAC（配列番号２５）
(b)オリゴヌクレオチド２６：CGGTACCCGGGGATCCTTATTTGAAACAGACTGGGCCAATGTCC（配列番号２６）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)ｃDＮＡ溶液  ・・・５μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD -plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水  ・・・２９μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９4℃にて２分間加熱した後、９８℃にて１０秒間の変性反応、６８℃にて６分間のアニーリング及び伸長反応からなる反応サイクルを３０回行った。増幅された約４．１ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分離した後、MagExtractor PCR&Gel cleanup（東洋紡）を用いてゲルから抽出・精製した。得られたDNAを制限酵素SphI及びBａmＨＩで切断した後、MagExtractor PCR&Gel cleanup（東洋紡）を用いて精製した。
pUC１８プラスミド（東洋紡）を制限酵素SphI及びBａmＨＩで切断した後、MagExtractor PCR&Gel cleanup（東洋紡）を用いて精製した。
前記約４．１ｋｂのＤＮＡ及び前記プラスミドをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation high（東洋紡）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、MagExtractor plasmid （東洋紡）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、ｐＵＣ１８−ＨｓＣＯＬ１Ａ２と記すこともある。）を精製することにより、ｐＵＣ１８−ＨｓＣＯＬ１Ａ２を得た。
【００６２】
（１−１２）  ヒトＴｙｐｅＩα１コラーゲンをコードする合成DNAの作製及びクローニング（ｐＵＣ５７−ＹＨｓＣＯＬ１Ａ１の構築）
配列番号８９で示したヒトTypeＩα1コラーゲンをコードする合成DNAを、アッセンブリPCR法で作製した。作製した合成DNAをpＵＣ57プラスミドのEcoRＶサイトにクローニングした。当該プラスミドをｐＵＣ５７−ＹＨｓＣＯＬ１Ａ１と記す。
【００６３】
（１−１３）  ヒトＴｙｐｅＩα２コラーゲンをコードする合成DNAの作製及びクローニング（ｐＵＣ５７−ＹＨｓＣＯＬ１Ａ２の構築）
配列番号９２で示したヒトTypeＩα２コラーゲンをコードする合成DNAを、アッセンブリPCR法で作製した。作製した合成DNAをpＵＣ57プラスミドのEcoRＶサイトにクローニングした。当該プラスミドをｐＵＣ５７−ＹＨｓＣＯＬ１Ａ２と記す。
【００６４】
（１−１4）  ゼオシン耐性カセットの作製及びクローニング（ｐＵＣ５７−ＺｅｏＲの構築）
配列番号１１４で示したゼオシン耐性カセットを、アッセンブリPCR法で作製した。作製したDNAをpＵＣ57プラスミドのEcoRＶサイトにクローニングした。当該プラスミドをｐＵＣ５７−ＺｅｏＲと記す。
【００６５】
実施例２  （発現カセット導入プラスミドの構築）
（２−１）  プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット（Ｐ４Ｈα１）発現カセット、及び、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット（Ｐ４Ｈβ）発現カセット導入プラスミド（ｐＥＸＰ−Ａ−Ｐ４ＨＢｓｉｇ（−）Ａ１ｒｅｖ）の作製
【００６６】
（２−１−１）  pSN003の構築
下記オリゴヌクレオチド２７及び２８を合成した。下記オリゴヌクレオチド２７及び２８をプライマーとし、ｐAOX1Term−TOPO（実施例（１−６）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、AOX１ターミネーターの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド２７：TCGACTAGTTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAA（配列番号２７）
(b)オリゴヌクレオチド２８：AACTGCAGGCACAAACGAACGTCTCACTTA（配列番号２８）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)プラスミドＤＮＡ溶液（１０ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ（１Ｕ）
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて１分間の伸長反応からなるサイクルを２５回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約０．３ｋｂのＤＮＡを制限酵素SpeI及びPstIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
pBluescriptIISK(+)プラスミド（Stratagene）を制限酵素SpeI及びPstIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約０．３ｋｂのＤＮＡ及び前記プラスミドをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からAOX１ターミネーターの両端に制限酵素認識配列が付加されたＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、ｐＳＮ００３と記すこともある。）を精製することにより、ｐＳＮ００３を得た。
【００６７】
（２−１−２）  ｐＳＮ００４の構築
ｐＡＯＸ１ｐｒｏ＋１５ａａ−ＴＯＰＯ（実施例（１−３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、ＡＯＸ１プロモーターを含む約１．０ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐＳＮ００３（実施例（２−１−１）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉにて切断しアルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化したのち、MinElute Reaction Cleanup Kit（QIAGEN）を用いて精製した。
前記約１．０ｋｂのＤＮＡ及び前記プラスミドをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からＡＯＸ１プロモーターを含む約１．０ｋｂのＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、ｐＳＮ００４と記すこともある。）を精製することにより、ｐＳＮ００４を得た。
【００６８】
（２−１−３）  ｐＳＮ００５の構築
オリゴヌクレオチド２９及び３０を合成した。
(a)オリゴヌクレオチド２９：TATTCGAAACGCATATGTGACCGGCAGACTAGTGG（配列番号２９）
(b)オリゴヌクレオチド３０：CCACTAGTCTGCCGGTCACATATGGGTTTCGAATA（配列番号３０）
下記組成の溶液を調製し、当該溶液を９８℃で５分間、５０℃にて５０分間、３７℃にて１時間保持した。
(a)オリゴヌクレオチド２９（５０ｐｍｏｌ／μｌ）  ５μｌ
(b)オリゴヌクレオチド３０（５０ｐｍｏｌ／μｌ）  ５μｌ
(c)Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１００ｍＭ）  １０μｌ
(d)ＭｇＣｌ２      （１００ｍＭ）  １０μｌ
(e)ジチオスレイトール（１０ｍＭ）  １０μｌ
(f)滅菌蒸留水  ６０μｌ
前記オリゴヌクレオチド２９とオリゴヌクレオチド３０とがアニールしたＤＮＡを、制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ及びＳｐｅＩにて切断した。その後、前記混合溶液をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）にて抽出し、次いでエタノール沈殿を行うことによって、ＤＮＡ（リンカー１）を精製した。
また、ｐＳＮ００４（実施例（２−１−２）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ及びＳｐｅＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて約４．３ｋｂのＤＮＡを分離・精製した。
前記ＤＮＡ（リンカー１）及び約４．３ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からＤＮＡ（リンカー１）が挿入されたプラスミド（以下、ｐＳＮ００５と記すこともある。）を精製することにより、ｐＳＮ００５を得た。
【００６９】
（２−１−４）  ｐＳＮ０１５の構築
下記オリゴヌクレオチド３１及び３２を合成した。下記オリゴヌクレオチド３１及び３２をプライマーとし、pαfactor-TOPO（実施例（１−８）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、αファクター遺伝子のシグナル配列及びプロ配列をコードするDNAの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド３１：GGTTCGAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACT（配列番号３１）
(b)オリゴヌクレオチド３２：TCGACTAGTAGCTTCAGCCTCTCTTTTATCC（配列番号３２）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて１分間の伸長反応からなるサイクルを１０回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて１分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを１５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約０．３ｋｂのＤＮＡを制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ及びＳｐｅＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐＳＮ００５（実施例（２−１−３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ及びＳｐｅＩにて切断した後、約４．２ｋｂのDNAをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約０．３ｋｂのＤＮＡ及び前記約４．２ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からαファクター遺伝子のシグナル配列及びプロ配列をコードするDNAの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、ｐＳＮ０１５と記すこともある。）を精製することにより、ｐＳＮ０１５を得た。
【００７０】
（２−１−５）  ｐＳＮ０２０の構築
ヒトプロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット（P4Hβ）のｃＤＮＡクローン(Clone ID:3848651)をInvitrogenより購入した。下記オリゴヌクレオチド３３及び３４を合成した。下記オリゴヌクレオチド３３及び３４をプライマーとし、P4HβのｃDNAクローンを鋳型としてPCRを行い、シグナル配列のないＰ４ＨβをコードするDNAの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド３３：TTACTAGTGACGCCCCCGAGGAGGA（配列番号３３）
(b)オリゴヌクレオチド３４：TTACTAGTTTACAGTTCATCTTTCACAGCTTTCTG（配列番号３４）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて２分間の伸長反応からなるサイクルを１０回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて２分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを１５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約１．５ｋbのＤＮＡを制限酵素ＳｐｅＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐＳＮ０１５（実施例（２−１−４）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素ＳｐｅＩにて切断しアルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化した後、MinElute Reaction Cleanup Kit（QIAGEN）を用いて精製した。
前記約１．５ｋｂのＤＮＡ及び前記プラスミドをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high JM109、東洋紡製）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Ligation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からシグナル配列のないＰ４ＨβをコードするDNAの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、ｐＳＮ０２０と記すこともある。）を精製することにより、ｐＳＮ０２０を得た。
【００７１】
（２−１−６）  ｐＰ４ＨＢｓｉｇ（−）ｒｅｖ−TOPOの構築
下記オリゴヌクレオチド３５及び３６を合成した。下記オリゴヌクレオチド３５及び３６をプライマーとし、ｐＳＮ０２０と命名されたプラスミド（実施例（２−１−５）参照）を鋳型としてPCRを行い、αファクターシグナル及びプロ配列を有するプロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニットの発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド３５：AACCGCGGTCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAA（配列番号３５）
(b)オリゴヌクレオチド３６：AACCCGGGGCACAAACGAACGTCTCACTTAATCTT（配列番号３６）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて３．５分間の伸長反応からなるサイクルを１０回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて３．５分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを１５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約３．０ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約３．０ｋｂのDNAを、ｐＣＲ‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high JM109、東洋紡製）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはZero-Blunt TOPO PCR cloning キット（Invitrogen）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からαファクターシグナル及びプロ配列を有するプロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニットの発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、pP4HBsig(-)rev−TOPOと記すこともある。）を精製することにより、pP4HBsig(-)rev−TOPOを得た。
【００７２】
（２−１−７）  ｐＳＮ００７の構築
オリゴヌクレオチド３７及び３８を合成した。
(a)オリゴヌクレオチド３７：TATTCGAAACGACGCGTGTCAGCTAGCACTAGTGC（配列番号３７）
(b)オリゴヌクレオチド３８：GCACTAGTGCTAGCTGACACGCGTCGTTTCGAATA（配列番号３８）
下記組成の溶液を調製し、当該溶液を９８℃で５分間、５０℃にて５０分間、３７℃にて１時間保持した。
(a)オリゴヌクレオチド３７（５０ｐｍｏｌ／μｌ）  ５μｌ
(b)オリゴヌクレオチド３８（５０ｐｍｏｌ／μｌ）  ５μｌ
(c)Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１００ｍＭ）  １０μｌ
(d)ＭｇＣｌ２      （１００ｍＭ）  １０μｌ
(e)ジチオスレイトール（１０ｍＭ）  １０μｌ
(f)滅菌蒸留水  ６０μｌ
前記オリゴヌクレオチド３７とオリゴヌクレオチド３８とがアニールしたＤＮＡを、制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ及びＳｐｅＩにて切断した。その後、前記混合溶液をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）にて抽出し、次いでエタノール沈殿を行うことによって、ＤＮＡ（リンカー３）を精製した。
また、ｐＳＮ００４（実施例（２−１−２）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ及びＳｐｅＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて約４．２ｋｂのＤＮＡを分離・精製した。
前記ＤＮＡ（リンカー３）及び前記４．２ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からＤＮＡ（リンカー３）が挿入されたプラスミド（以下、ｐＳＮ００７と記すこともある。）を精製することにより、ｐＳＮ００７を得た。
【００７３】
（２−１−８）  ｐＳＮ０１７の構築
ヒトプロリル−4−ヒドロキシラーゼα１サブユニット（Ｐ４Ｈα１）のｃＤＮＡクローン(Clone ID:4797051)をInvitrogenより購入した。下記オリゴヌクレオチド３９及び４０を合成した。下記オリゴヌクレオチド３９及び４０をプライマーとし、P4Hα１のｃDNAクローンを鋳型としてPCRを行い、P4Hα1をコードするDNAの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド３９：TATTCGAAACGATGATCTGGTATATATTAATTATA（配列番号３９）
(b)オリゴヌクレオチド４０：TTGCTAGCTCATTCCAATTCTGACAACGTACAAGG（配列番号４０）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて２分間の伸長反応からなるサイクルを１０回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて２分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを１５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約１．６ｋｂのＤＮＡを制限酵素BspT104I及びＳｐｅＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐＳＮ００７（実施例（２−１−７）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びＳｐｅＩにて切断した後、約４．２ｋｂのDNAをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約１．６ｋｂのＤＮＡ及び前記約４．２ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡製）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Ligation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からP4Hα1をコードするDNAの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、ｐＳＮ０１７と記すこともある。）を精製することにより、ｐＳＮ０１７を得た。
【００７４】
（２−１−９）  pP4HA1−SmaI−TOPOの構築
下記オリゴヌクレオチド４１及び３６を合成した。下記オリゴヌクレオチド４１及び３６をプライマーとし、ｐＳＮ０１７（実施例（２−１−８）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてPCRを行い、プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド４１：AACCCGGGTCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAA（配列番号４１）
(b)オリゴヌクレオチド３６：AACCCGGGGCACAAACGAACGTCTCACTTAATCTT（配列番号３６）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて３．５分間の伸長反応からなるサイクルを１０回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて３．５分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを１５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約２．８ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約２．８ｋｂのDNAを、ｐＣＲ‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high JM109、東洋紡製）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはZero-Blunt TOPO PCR cloning キット（Invitrogen）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からプロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、と記すこともある。）を精製することにより、pP4HA1−SmaI−TOPOを得た。
【００７５】
（２−１−１０）  ｐＳＮ０２３の構築
下記オリゴヌクレオチド４２及び４３を合成した。下記オリゴヌクレオチド４１及び４２をプライマーとし、ｐARG4-TOPO（実施例（１−２）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてPCRを行い、ARG4をコードするDNAの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド４２：AACTCGAGACGAAAATATGGTACCTGCCCT（配列番号４２）
(b)オリゴヌクレオチド４３：CCATCGATACAGAGGTATCATCCAATGATTCC（配列番号４３）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて２分間の伸長反応からなるサイクルを１０回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて２分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを１５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約２．２ｋｂのＤＮＡを制限酵素XhoI及びClaＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
pBluescriptII SK（＋）（Stratagene）プラスミドを制限酵素XhoI及びClaＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約２．２ｋｂのＤＮＡ及び前記プラスミドをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡製）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Ligation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からARG4をコードするDNAの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、ｐＳＮ０２３と記すこともある。）を精製することにより、ｐＳＮ０２３を得た。
【００７６】
（２−１−１１）  ｐＥＸＰ−Ａ−Ｐ４ＨＢｓｉｇ（−）ｒｅｖの構築
ｐＰ４ＨＢｓｉｇ（−）ｒｅｖ−ＴＯＰＯ（実施例（２−１−６）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素ＳａｃＩＩ及びＣｆｒ９Ｉにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約３．０ｋｂのαファクターシグナル及びプロ配列を有するプロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニットの発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐＳＮ０２３と命名されたプラスミドを制限酵素SacI及びCｆｒ9Ｉにて切断した後、約５．２ｋｂのDNAをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約３．０ｋｂのＤＮＡ及び前記約５．２ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high JM109、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からαファクターシグナル及びプロ配列を有するプロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニットの発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、ｐＥＸＰ−Ａ−Ｐ４ＨＢｓｉｇ（−）ｒｅｖと記すこともある。）を精製することにより、ｐＥＸＰ−Ａ−Ｐ４ＨＢｓｉｇ（−）ｒｅｖを得た。
【００７７】
（２−１−１２）  ｐＥＸＰ−Ａ−Ｐ４ＨＢｓｉｇ（−）Ａ１ｒｅｖの構築
ｐＰ４ＨＡ１−ＳｍａＩ−ＴＯＰＯ（実施例（２−１−９）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Ｃｆｒ９Ｉにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約２．８ｋｂのプロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐＥＸＰ−Ａ−Ｐ４ＨＢｓｉｇ（−）ｒｅｖ（実施例（２−１−１１）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Ｃｆｒ９Ｉにて切断し、アルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化した後、MinElute Reaction Cleanup Kit（QIAGEN）を用いて精製した。
前記約３．０ｋｂのＤＮＡ及び前記プラスミドをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high JM109、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からプロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、ｐＥＸＰ−Ａ−Ｐ４ＨＢｓｉｇ（−）Ａ１ｒｅｖと記すこともある。）を精製することにより、ｐＥＸＰ−Ａ−Ｐ４ＨＢｓｉｇ（−）Ａ１ｒｅｖを得た。
【００７８】
（２−２）  ヒートショックプロテイン４７発現カセット導入プラスミドの作製
【００７９】
（２−２−１）  ｐＴＳ０１１の構築
ヒートショックプロテイン４７（Hsp４７）のｃＤＮＡクローン(Clone ID:3030138)をInvitrogenより購入した。下記オリゴヌクレオチド４４及び４５を合成した。下記オリゴヌクレオチド44及び４５をプライマーとし、HSP47のcＤＮＡクローンを鋳型としてＰＣＲを行い、HSP４７をコードするDNAの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド４４：TATTCGAAACGATGCGCTCCCTCCTGCTTCTC（配列番号４４）
(b)オリゴヌクレオチド４５：TTACTAGTTATAACTCGTCTCGCATCTTGTCACC（配列番号４５）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)cDNA溶液（１０ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて１．５分間の伸長反応からなるサイクルを５回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて１．５分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２０回、その後、更に反応溶液を６８℃にて１．５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約１．３ｋｂのＤＮＡを制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ及びＳｐｅＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
pSN００５（実施例（２−１−３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ及びＳｐｅＩにて切断した後、約４．２ｋｂのDNAをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約１．３ｋｂのＤＮＡ及び約４．２ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からHSP４７をコードするDNAの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、pTS０１１と記すこともある。）を精製することにより、pTS０１１を得た。
【００８０】
（２−２−２）  ｐＥＸＰ−Ａ−ＨＳＰ４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌの構築
ｐＴＳ０１１（実施例（２−２−１）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSpeＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約１．３ｋｂのHSP４７をコードするDNAの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐEXP-A-P4HBｓｉｇ(−)ｒｅｖ（実施例（２−１−１１）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT１０４I及びSpeＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により約６．３ｋｂのDNAを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約１．３ｋｂのＤＮＡ及び前記約６．３ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からHSP４７をコードするDNAの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、ｐＥＸＰ−Ａ−HSP４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌと記すこともある。）を精製することにより、ｐＥＸＰ−Ａ−HSP４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌを得た。
【００８１】
（２−２−３）  ｐＥＸＰ−Ａ−ＨＳＰ４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲの構築
下記オリゴヌクレオチド４６及び４７を合成した。下記オリゴヌクレオチド４６及び４７をプライマーとし、ｐＵＣ５７−ＺｅｏＲ（実施例（１−１４）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、ゼオシン耐性カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド４６：TTCCCGGGCCCACACACCATAGCTTCA（配列番号４６）
(b)オリゴヌクレオチド４７：TTATCGATAGCTTGCAAATTAAAGCCT（配列番号４７）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)cDNA溶液（１０ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて１．５分間の伸長反応からなるサイクルを５回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて１．５分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２０回、その後、更に反応溶液を６８℃にて１．５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約１．３ｋｂのＤＮＡを制限酵素Cfr9I及びClaＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により約０．７ｋｂのDNAを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
pEXP−A−HSP４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ（実施例（２−２−２）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Cfr9I及びClaＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により約７．６ｋｂのDNAを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約０．７ｋｂのＤＮＡ及び前記約７．６ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２５μｇ／ｍｌのゼオシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からゼオシン耐性カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、pEXP−A−HSP４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｄZeoRと記すこともある。）を精製することにより、pEXP−A−HSP４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｄZeoRを得た。
【００８２】
（２−２−４）  ｐＴＳ０１２の構築
下記オリゴヌクレオチド４８及び４９を合成した。下記オリゴヌクレオチド４８及び４９をプライマーとし、pTS０１１（実施例（２−２−１）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、シグナル配列のないＨＳＰ４７をコードするＤＮＡを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド４８：GCCGAGGTGAAGAAACCTGC（配列番号４８）
(b)オリゴヌクレオチド４９：AGTTATAACTCGTCTCGCATCTTGTCACC（配列番号４９）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)cDNA溶液（１０ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６８℃にて１．５分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて１．５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約１．２ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離しMinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
下記オリゴヌクレオチド５０及び５１を合成した。下記オリゴヌクレオチド５０及び５１をプライマーとし、pSN０２０（実施例（２−１−５）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、AOX1プロモーター、αファクター遺伝子のシグナル配列、AOX1ターミネーター、及び、ベクタープラスミドからなる領域を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド５０：AGTTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTT（配列番号５０）
(b)オリゴヌクレオチド５１：AGCAGCTAATGCGGAGGATGCT（配列番号５１）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)cDNA溶液（１０ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６８℃にて４．５分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて４．５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約４．２ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離しMinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約１．２ｋｂのＤＮＡ及び前記約４．２ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からシグナル配列のないＨＳＰ４７をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、ｐＴＳ０１２と記すこともある。）を精製することにより、ｐＴＳ０１２を得た。
【００８３】
（２−２−５）  ｐＥＸＰ−Ａ−ＨＳＰ４７ａｌｐｈａ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲの構築
ｐＴＳ０１２（実施例（２−２−４）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びSpeIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約１．２ｋｂのαファクターシグナル配列とシグナル配列のないＨＳＰ４７が融合したポリペプチドをコードするＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐEXP-A-HSP47ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｄZeoR（実施例（２−２−３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT１０４I及びSpeＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により約６．９ｋｂのDNAを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約１．２ｋｂのＤＮＡ及び前記約６．９ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からαファクターシグナル配列とシグナル配列のないＨＳＰ４７が融合したポリペプチドをコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、ｐＥＸＰ−Ａ−HSP４７ａｌｐｈａ  ｓｉｇｎａｌ  dZeoRと記すこともある。）を精製することにより、ｐＥＸＰ−Ａ−HSP４７ａｌｐｈａ  ｓｉｇｎａｌ  dZeoRを得た。
【００８４】
（２−２−６）  ｐＥＸＰ−Ａ−ＰＥＲ３  Ｐｒｏ−ＨＳＰ４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲの構築
ｐCR-BII-PER３ Ｐｒｏ SacII-Psp1406I(+)（実施例（１−４）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Psp1406I及びSacIIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により約１．０ｋｂのPER3プロモーターの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐＥＸＰ−Ａ−ＨＳＰ４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲ（実施例（２−２−３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT１０４I及びSacIIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約７．３ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約１．０ｋｂのＤＮＡ及び前記約７．３ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からPER3プロモーターの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、ｐＥＸＰ−Ａ−ＰＥＲ３  Pro−HSP４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  dZeoRと記すこともある。）を精製することにより、ｐＥＸＰ−Ａ−ＰＥＲ３  Pro−HSP４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  dZeoRを得た。
【００８５】
（２−２−７）  ｐＥＸＰ−Ａ−ＰＥＲ３  Ｐｒｏ−ＨＳＰ４７ａｌｐｈａ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲの構築
ｐCR-BII-PER３ Ｐｒｏ SacII-Psp1406I(+)（実施例（１−４）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Psp1406I及びSacIIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により約１．０ｋｂのPER3プロモーターの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐＥＸＰ−Ａ−ＨＳＰ４７ａｌｐｈａ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲ（実施例（２−２−５）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT１０４I及びSacIIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約７．３ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約１．０ｋｂのＤＮＡ及び前記約７．３ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からPER3プロモーターの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、ｐＥＸＰ−Ａ−ＰＥＲ３  Pro−HSP４７ａｌｐｈａ  ｓｉｇｎａｌ  dZeoRを記すこともある。）を精製することにより、ｐＥＸＰ−Ａ−ＰＥＲ３  Pro−HSP４７ａｌｐｈａ  ｓｉｇｎａｌ  dZeoRを得た。
【００８６】
（２−２−８）  ｐＥＸＰ−Ａ−ＡＯＸ２  Ｐｒｏ−ＨＳＰ４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲの構築
ｐCR-BII-AOX2 Ｐｒｏ SacII-Psp1406I(−) （実施例（１−５）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Psp1406I及びSacIIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により約１．１kbのＡＯＸ２プロモーターの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐＥＸＰ−Ａ−ＨＳＰ４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲ（実施例（２−２−３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT１０４I及びSacIIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約７．３ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約１．１ｋｂのＤＮＡ及び前記約７．３ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からＡＯＸ２プロモーターの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、ｐＥＸＰ−Ａ−ＡＯＸ２  Pro−HSP４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  dZeoRと記すこともある。）を精製することにより、ｐＥＸＰ−Ａ−ＡＯＸ２  Pro−HSP４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  dZeoRを得た。
【００８７】
（２−２−９）  ｐＥＸＰ−Ａ−ＡＯＸ２  Ｐｒｏ−ＨＳＰ４７ａｌｐｈａ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲの構築
ｐCR-BII-ＡＯＸ２ Ｐｒｏ SacII-Psp1406I(−) （実施例（１−５）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Psp1406I及びSacIIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により約１．１ｋｂのＡＯＸ２プロモーターの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐＥＸＰ−Ａ−ＨＳＰ４７ａｌｐｈａ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲ（実施例（２−２−５）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT１０４I及びSacIIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約７．３ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約１．１ｋｂのＤＮＡ及び前記約７．３ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からＡＯＸ２プロモーターの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、ｐＥＸＰ−Ａ−ＡＯＸ２  Pro−HSP４７ａｌｐｈａ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲと記すこともある。）を精製することにより、ｐＥＸＰ−Ａ−ＡＯＸ２  Pro−HSP４７ａｌｐｈａ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲを得た。
【００８８】
（２−３）  ウシコラーゲンTypeIIIα１発現カセット導入プラスミド（ｐＥＸＰ−ＨＡ−ＢｔＣＯＬ３Ａ１）の作製
【００８９】
（２−３−１）  ｐBtCOL3A1  NdeI-SpeIの構築
下記オリゴヌクレオチド５２及び５３を合成した。下記オリゴヌクレオチド５２及び５３をプライマーとし、pＢｔＣＯＬ3A1−TOPO(−) （実施例（１−９）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、ウシコラーゲンTypeIIIα１をコードするＤＮＡの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド５２：CCCATATGATGAGCTTTGTGCAAAAGG（配列番号５２）
(b)オリゴヌクレオチド５３：GGACTAGTTTATAAAAAGCAAACAGGGCCAA（配列番号５３）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、５５℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて４．５分間の伸長反応からなるサイクルを１０回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて４．５分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを１５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約４．５ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約４．５ｋｂのDNAを、ｐＣＲ‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯと命名されたプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡製）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはZero-Blunt TOPO PCR cloning キット（Invitrogen）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からウシコラーゲンTypeIIIα１をコードするＤＮＡの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをpBtCOL3A1  NdeI−SpeIと記す。
【００９０】
（２−３−２）  ｐSN００９の構築
ｐBtCOL３A1 NdeI-SpeI（実施例（２−３−１）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素NdeI及びSpeＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約３．９ｋｂのウシコラーゲンTypeIIIα１のC末端側の約１３１０残基をコードするＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐＳＮ００5（実施例（２−１−３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素NdeI及びSpeＩにて切断しアガロースゲル電気泳動にて、約４．２ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約３．９ｋｂのＤＮＡ及び前記約４．２ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からウシコラーゲンTypeIIIα１の約１３１０残基をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、ｐＳＮ００９と記すこともある。）を精製することにより、ｐＳＮ００９を得た。
【００９１】
（２−３−３）  ｐSN００１の構築
下記オリゴヌクレオチド５４及び５５を合成した。下記オリゴヌクレオチド５４及び５５をプライマーとし、ｐHIS4-TOPO（実施例（１−１）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてPCRを行い、HIS4の両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド５４：GGAAGCTTGATCTCCTGATGACTGACTCACTG（配列番号５４）
(b)オリゴヌクレオチド５５：CCCTGCAGTAATTAAATAAGTCCCAGTTTCTCCA（配列番号５５）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて２分間の伸長反応からなるサイクルを５回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて２分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２０回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約２．６ｋｂのＤＮＡを制限酵素HindIII及びPstＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
pBluescriptII SK（＋）プラスミド（Stratagene）を制限酵素HindIII及びPstＩにて切断した後、約３．０ｋｂのDNAをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約２．６ｋｂのＤＮＡ及び前記約３．０ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡製）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Ligation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からHIS4の両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、ｐＳＮ００１と記すこともある。）を精製することにより、ｐＳＮ００１を得た。
【００９２】
（２−３−４）  ｐSN００２の構築
下記オリゴヌクレオチド５６及び５７を合成した。下記オリゴヌクレオチド５６及び５７をプライマーとし、ｐAOX1-３‘-TOPO（実施例（１−７）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてPCRを行い、ＡＯＸ１３’側下流ノンコーディング領域の両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド５６：GCATCGATTCGAGTATCTATGATTGGAAGTATGG（配列番号５６）
(b)オリゴヌクレオチド５７：AAGGGCCCGATCTTGAGATAAATTTCACGTTTAAA（配列番号５７）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、５５℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて２分間の伸長反応からなるサイクルを５回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて２分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２０回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約０．８ｋｂのＤＮＡを制限酵素ClaI及びApaＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐＳＮ００１（実施例（２−３−３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素ClaI及びApaＩにて切断した後、約５．６ｋｂのDNAをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約０．８ｋｂのＤＮＡ及び前記約５．６ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡製）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Ligation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からＡＯＸ１３’側下流ノンコーディング領域の両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、ｐＳＮ００２と記すこともある。）を精製することにより、ｐＳＮ００２を得た。
【００９３】
（２−３−５）  ｐSN０１０の構築
ｐSN００２（実施例（２−３−４）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素ClaI及びApaＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約０．８ｋｂのＡＯＸ１３’側下流側のノンコーディング領域の両端に制限酵素認識配列が付加されたＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐＳＮ００９（実施例（２−３−２）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素ClaI及びApaＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約８．１ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約０．８ｋｂのＤＮＡ及び前記約８．１ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からＡＯＸ１３’側下流ノンコーディング領域の両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、ｐＳＮ０１０と記すこともある。）を精製することにより、ｐＳＮ０１０を得た。
【００９４】
（２−３−６）  ｐSN０１１の構築
ｐSN００１（実施例（２−３−３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素HindIII及びPstＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約２．６ｋｂのHIS4の両端に制限酵素認識配列が付加されたＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐＳＮ０１０（実施例（２−３−５）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素HindIII及びPstＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約８．９ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約２．６ｋｂのＤＮＡ及び前記約８．９ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からHIS4の両端に制限酵素認識配列が付加されたＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、ｐＳＮ０１１と記すこともある。）を精製することにより、ｐＳＮ０１１を得た。
【００９５】
（２−３−７）  ｐSN００５−BtCOL3A1Nの構築
ｐBtCOL3A1 NdeI-SpeI（実施例（３−３−１）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素NdeIにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約０．５ｋｂのウシコラーゲンTypeIIIα１のN末端側の約１６０残基をコードするＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐＳＮ００５（実施例（２−１−３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素NdeIにて切断しアルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化した後、MinElute Reaction Cleanup Kit（QIAGEN）を用いて精製した。
前記約０．５ｋｂのＤＮＡ及び前記プラスミドをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からウシコラーゲンTypeIIIα１のN末端側の約１６０残基をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、ｐＳＮ００５―BtCOL3A1Nと記すこともある。）を精製することにより、ｐＳＮ００５―BtCOL3A1Nを得た。
【００９６】
（２−３−８）  ｐＳＮ００５−ＢｔＣＯＬ３Ａ１Ｎ  ＢｓｐＴ１０４Ｉの構築
下記オリゴヌクレオチド５８及び２８を合成した。下記オリゴヌクレオチド５８及び２８をプライマーとし、pＳＮ００５−ＢｔＣＯＬ3A1N（実施例（２−３−７）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、ウシコラーゲンTypeIIIα１のN末端側の約１６０残基をコードするＤＮＡに制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド５８：TATTCGAAACGATGATGAGCTTTGTGCAAAAGG（配列番号５８）
(b)オリゴヌクレオチド２８：AACTGCAGGCACAAACGAACGTCTCACTTA（配列番号２８）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて１分間の伸長反応からなるサイクルを５回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて１分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを１５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて１分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約０．８ｋｂのＤＮＡを制限酵素BspT１０４I及びNdeＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により約０．５ｋｂのDNAを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐＳＮ００５（実施例（２−１−３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵BspT１０４I及びNdeＩにて切断した後、約４．２ｋｂのDNAをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約０．５ｋｂのＤＮＡ及び前記約４．２ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡製）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Ligation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からウシコラーゲンTypeIIIα１のN末端側の約１６０残基をコードするＤＮＡに制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、ｐＳＮ００５−ＢｔＣＯＬ３Ａ１Ｎ  ＢｓｐＴ１０４Ｉと記すこともある。）を精製することにより、ｐＳＮ００５−ＢｔＣＯＬ３Ａ１Ｎ  ＢｓｐＴ１０４Ｉを得た。
【００９７】
（２−３−９）  ｐEXP−HA−BtCOL3A1の構築
ｐSN００５−BtCOL3A1N  BspT104I（実施例（２−３−８）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT104I及びNdeIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動にて、約０．５ｋｂのウシコラーゲンTypeIIIα１のN末端側の約１６０残基をコードするＤＮＡに制限酵素認識配列が付加されたＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐＳＮ０１１（実施例（２−３−６）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素BspT１０４I及びNdeIにて切断した後アガロースゲル電気泳動にて、約１１．４ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約０．５ｋｂのＤＮＡ及び前記約１１．４ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からウシコラーゲンTypeIIIα１のN末端側の約１６０残基をコードするＤＮＡに制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、ｐEXP−HA−BtCOL3A1と記すこともある。）を精製することにより、ｐEXP−HA−BtCOL3A1を得た。
【００９８】
（２−４）  ヒトコラーゲンTypeIα１発現カセット、及び、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２発現カセット導入プラスミド（ｐＥＸＰ−ＨＡ−ＹＨｓＣＯＬ１Ａ２−１Ａ１）の作製
【００９９】
（２−４−１）  ｐＳＮ００６の構築
オリゴヌクレオチド５９及び６０を合成した。
(a)オリゴヌクレオチド５９：TATTCGAAACGCATATGGTACCGGCAGACTAGTGG（配列番号５９）
(b)オリゴヌクレオチド６０：CCACTAGTCGCCTAGGCGACATATGGTTTCGAATA（配列番号６０）
下記組成の溶液を調製し、当該溶液を９８℃で５分間、５０℃にて５０分間、３７℃にて１時間保持した。
(a)オリゴヌクレオチド５９（５０ｐｍｏｌ／μｌ）  ５μｌ
(b)オリゴヌクレオチド６０（５０ｐｍｏｌ／μｌ）  ５μｌ
(c)Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１００ｍＭ）  １０μｌ
(d)ＭｇＣｌ２      （１００ｍＭ）  １０μｌ
(e)ジチオスレイトール（１０ｍＭ）  １０μｌ
(f)滅菌蒸留水  ６０μｌ
前記オリゴヌクレオチド５９とオリゴヌクレオチド６０とがアニールしたＤＮＡを、制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ及びＳｐｅＩにて切断した。その後、前記混合溶液をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）にて抽出し、次いでエタノール沈殿を行うことによって、ＤＮＡ（リンカー２）を精製した。
また、ｐＳＮ００４（実施例（２−１−２）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ及びＳｐｅＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて約４．２ｋｂのＤＮＡを分離・精製した。
前記ＤＮＡ（リンカー２）及び前記約４．２ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からＤＮＡ（リンカー２）が挿入されたプラスミド（以下、ｐＳＮ００６と記すこともある。）を精製することにより、ｐＳＮ００６を得た。
【０１００】
（２−４−２）  ｐＥＸＨ００２の構築
ｐＳＮ００６（実施例（２−４−１）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉ及びＰｓｔＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約１．３ｋｂのＡＯＸ１プロモーター及びＡＯＸ１ターミネーターを含むＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐＳＮ００２（実施例（２−３−４）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉ及びＰｓｔＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約６．３ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約１．３ｋｂのＤＮＡ及び前記約６．３ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からＡＯＸ１プロモーター及びＡＯＸ１ターミネーターを含むＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、ｐＥＸＨ００２と記すこともある。）を精製することにより、ｐＥＸＨ００２を得た。
【０１０１】
（２−４−３）  ｐＴＳ００１の構築
ｐＵＣ５７−ＹＨｓＣＯＬ１Ａ１（実施例（１−１２）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ及びＳｐｅＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約４．４ｋｂのヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１をコードするＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐＳＮ００６（実施例（２−４−１）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ及びＳｐｅＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約４．２kbのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約４．４ｋｂのＤＮＡ及び前記約４．２ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、ｐＴＳ００１と記すこともある。）を精製することにより、ｐＴＳ００１を得た。
【０１０２】
（２−４−４）  ｐＥＸＰ−ＨＡ−ＹＨｓＣＯＬ１Ａ１の構築
ｐＴＳ００１（実施例（２−４−３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉ及びＳｐｅＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約５．３ｋｂのAOX1プロモーター、及び、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１をコードするＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐEXH００２（実施例（２−４−２）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉ及びＳｐｅＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約６．６kbのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約５．３ｋｂのＤＮＡ及び前記約６．６ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からAOX1プロモーター、及び、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、ｐＥＸＰ−ＨＡ−ＹＨｓＣＯＬ１Ａ１と記すこともある。）を精製することにより、ｐＥＸＰ−ＨＡ−ＹＨｓＣＯＬ１Ａ１を得た。
【０１０３】
（２−４−５）  ｐＴＳ００２の構築
ｐＵＣ５７−ＹＨｓＣＯＬ１Ａ２（実施例（１−１３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ及びＳｐｅＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約４．１ｋｂのヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２をコードするＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐＳＮ００６（実施例（２−４−１）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ及びＳｐｅＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約４．２kbのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約４．１ｋｂのＤＮＡ及び前記約４．２ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、ｐTS００２と記すこともある。）を精製することにより、ｐTS００２を得た。
【０１０４】
（２−４−６）  ｐＹＨｓＣＯＬ１Ａ２  Ｅｘｐ  ｕｎｉｔ−Ｅｃｏ５２Ｉの構築
下記オリゴヌクレオチド６１及び６２を合成した。下記オリゴヌクレオチド６１及び６２をプライマーとし、ｐＴＳ００２（実施例（２−４−５）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、ヒトコラーゲンTyｐｅIα２発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド６１：AACGGCCGTCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAA（配列番号６１）
(b)オリゴヌクレオチド６２：AACGGCCGGCACAAACGAACGTCTCACTTAATCTT（配列番号６２）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて６分間の伸長反応からなるサイクルを５回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて６分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを１８回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約５．４ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約５．４ｋｂのDNAを、ｐＣＲ‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡製）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはZero-Blunt TOPO PCR cloning キット（Invitrogen）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンTyｐｅIα２発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、pＹＨｓCOL１Ａ２  Ｅｘｐ  ｕｎｉｔ−Ｅｃｏ５２Ｉと記すこともある。）を精製することにより、pＹＨｓCOL１Ａ２  Ｅｘｐ  ｕｎｉｔ−Ｅｃｏ５２Ｉを得た。
【０１０５】
（２−４−７）  ｐＥＸＰ−ＨＡ−ＹＨｓＣＯＬ１Ａ２−１Ａ１の構築
pＹＨｓCOL１Ａ２  Ｅｘｐ  ｕｎｉｔ−Ｅｃｏ５２Ｉ（実施例（２−４−６）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約５．４ｋｂのヒトコラーゲンTyｐｅIα２発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐＥＸＰ−ＨＡ−ＹＨｓＣＯＬ１Ａ１（実施例（２−４−４）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉにて切断し、アルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化した後、MinElute Reaction Cleanup Kit（QIAGEN）を用いて精製した。
前記約５．４ｋｂのＤＮＡ及び前記プラスミドをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンTyｐｅIα２発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、ｐEXP−HA−YＨｓＣＯＬ１Ａ２−１Ａ１と記すこともある。）を精製することにより、ｐEXP−HA−YＨｓＣＯＬ１Ａ２−１Ａ１を得た。
【０１０６】
（２−５）  ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域６０残基、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、並びに、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域６０残基、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット導入プラスミド（ｐＥＸＰ−ＨＡ−YＨｓＣＯＬ１Ａ２−１Ａ１  Ｎ６０Ｃ１５）の作製
【０１０７】
（２−５−１）  ｐＡＴ０２１の構築
下記オリゴヌクレオチド６３及び６４を合成した。下記オリゴヌクレオチド６３及び６４をプライマーとし、pTS００１（実施例（２−４−３）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域６０残基、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域の融合ポリペプチド発現カセット、並びに、ベクタープラスミドを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド６３：CGGCTTACCAGCCTCGC（配列番号６３）
(b)オリゴヌクレオチド６４：GGACCACCAGGGCCGC（配列番号６４）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)cDNA溶液（１０ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６８℃にて６分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて６分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約５．８ｋｂのＤＮＡをMinElute PCR Purification Kit（QIAGEN）を用いて精製した。得られたDNAの５’末端にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオ）を用いてリン酸基を付加した後、アガロースゲル電気泳動により約５．８ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約５．８ｋｂのＤＮＡをセルフライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域６０残基、C末端側ヘリックス領域１５残基発現、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセットを有するプラスミド（以下、ｐAＴ０２１と記すこともある。）を精製することにより、ｐAＴ０２１を得た。
【０１０８】
（２−５−２）  ｐＥＸＰ−ＨＡ−YＨｓＣＯＬ１Ａ１  Ｎ６０Ｃ１５の構築
ｐＡＴ０２１（実施例（２−５−１）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉ及びＳｐｅＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約２．５ｋｂのＡＯＸ１プロモーター、並びに、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域６０残基、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐEXH００２（実施例（２−４−２）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉ及びＳｐｅＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約６．６kbのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約２．５ｋｂのＤＮＡ及び前記約６．６ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からＡＯＸ１プロモーター、並びに、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域６０残基、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、ｐＥＸP−ＨＡ−ＹＨｓＣＯＬ１Ａ１  Ｎ６０Ｃ１５と記すこともある。）を精製することにより、ｐＥＸP−ＨＡ−ＹＨｓＣＯＬ１Ａ１  Ｎ６０Ｃ１５を得た。
【０１０９】
（２−５−３）  ｐＹＨｓＣＯＬ１Ａ２  Ｎ６０Ｃ１５  Ｅｘｐ  ｕｎｉｔ−Ｅｃｏ５２Ｉの構築
下記オリゴヌクレオチド６５及び６６を合成した。下記オリゴヌクレオチド６５及び６６をプライマーとし、pＹＨｓCOL１Ａ２  Ｅｘｐ  ｕｎｉｔ−Ｅｃｏ５２Ｉ（実施例（２−４−６）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域６０残基、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、並びに、ベクタープラスミドを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド６５：GGGTTTACCTGGGTGGCCG（配列番号６５）
(b)オリゴヌクレオチド６６：GGACCTCCTGGCCCACC（配列番号６６）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)cDNA溶液（１０ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６８℃にて６分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて６分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約６．１ｋｂのＤＮＡをMinElute PCR Purification Kit（QIAGEN）を用いて精製した。得られたDNAの５’末端にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオ）を用いてリン酸基を付加した後、アガロースゲル電気泳動により約６．１ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約６．１ｋｂのＤＮＡをセルフライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域６０残基、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセットを有するプラスミド（以下、ｐＹＨｓＣＯＬ１Ａ２  Ｎ６０Ｃ１５  Ｅｘｐ  ｕｎｉｔ−Ｅｃｏ５２Ｉと記すこともある。）を精製することにより、ｐＹＨｓＣＯＬ１Ａ２  Ｎ６０Ｃ１５  Ｅｘｐ  ｕｎｉｔ−Ｅｃｏ５２Ｉを得た。
【０１１０】
（２−５−４）  ｐＥＸＰ−ＨＡ−YＨｓＣＯＬ１Ａ２−１Ａ１  Ｎ６０Ｃ１５の構築
pＹＨｓCOL１Ａ２  Ｎ６０Ｃ１５  Ｅｘｐ  ｕｎｉｔ−Ｅｃｏ５２Ｉ（実施例（２−５−３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約２．３ｋｂのヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域６０残基、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐＥＸＨ−ＨＡ−ＹＨｓＣＯＬ１Ａ１  Ｎ６０Ｃ１５（実施例（２−５−２）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉにて切断し、アルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化した後、MinElute Reaction Cleanup Kit（QIAGEN）を用いて精製した。
前記約２．３ｋｂのＤＮＡ及び前記プラスミドをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域６０残基、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、ｐEXP−HA−YＨｓＣＯＬ１Ａ２−１Ａ１  Ｎ６０Ｃ１５と記すこともある。）を精製することにより、ｐEXP−HA−YＨｓＣＯＬ１Ａ２−１Ａ１  Ｎ６０Ｃ１５を得た。
【０１１１】
（２−６）  ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、並びに、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット導入プラスミド（ｐＥＸＰ−ＨＡ−YＨｓＣＯＬ１Ａ２−１Ａ１  M５００X２）の作製
【０１１２】
（２−６−１）  ｐＡＴ０１７の構築
下記オリゴヌクレオチド６７及び６８を合成した。下記オリゴヌクレオチド６７及び６８をプライマーとし、ｐＴＳ００１（実施例（２−４−３）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１へリックス領域の中央５２２残基をコードするDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド６７：GGTCCACAGGGTCCAGGAG（配列番号６７）
(b)オリゴヌクレオチド６８：ATCAGCTCCTGGTGATCCCTTTTC（配列番号６８）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)cDNA溶液（１０ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６８℃にて１分４０秒間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて１分４０秒間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約１．６ｋｂのＤＮＡをMinElute PCR Purification Kit（QIAGEN）を用いて精製した。得られたDNAの５’末端にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオ）を用いてリン酸基を付加した後、アガロースゲル電気泳動により約１．６ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
下記オリゴヌクレオチド６９及び７０を合成した。下記オリゴヌクレオチド６９及び７０をプライマーとし、ｐＴＳ００１（実施例（２−４−３）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、AOX1プロモーター、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域及びＮ末端側ヘリックス領域２７残基をコードするDNA、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のC末端ノンへリックス領域及びＣ末端側ヘリックス領域１５残基をコードするDNA、ＡＯＸ１ターミネーター、並びに、ベクタープラスミドからなる領域を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド６４：GGACCACCAGGGCCGC（配列番号６４）
(b)オリゴヌクレオチド６９：TGGTGGACCTTGAAAACCCTG（配列番号６９）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)cDNA溶液（１０ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６８℃にて６分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて６分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約５．７ｋｂのＤＮＡをMinElute PCR Purification Kit（QIAGEN）を用いて精製した。得られたDNAはアルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸した後、アガロースゲル電気泳動により約５．７ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約１．６ｋｂのＤＮＡ及び前記約５．７ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１へリックス領域の中央５２２残基をコードするDNAが挿入されたプラスミド（以下、ｐＡＴ０１７と記すこともある。）を精製することにより、ｐＡＴ０１７を得た。
【０１１３】
（２−６−２）  ｐＡＴ０２７の構築
下記オリゴヌクレオチド７０及び７１を合成した。下記オリゴヌクレオチド７０及び７１をプライマーとし、pBlue−HsCOL1A1（実施例（１−１０）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１へリックス領域の中央５２２残基をコードするDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド７０：GGACCCCAGGGCCCCG（配列番号７０）
(b)オリゴヌクレオチド７１：ATCAGCACCAGGGGATCCTTTC（配列番号７１）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)cDNA溶液（１０ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６８℃にて１分４０秒間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて１分４０秒間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約１．６ｋｂのＤＮＡをMinElute PCR Purification Kit（QIAGEN）を用いて精製した。得られたDNAの５’末端にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオ）を用いてリン酸基を付加した後、アガロースゲル電気泳動により約１．６ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
下記オリゴヌクレオチド６８及び６４を合成した。下記オリゴヌクレオチド６８及び６４をプライマーとし、ｐAT０１７（実施例（２−６−１）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、AOX1プロモーター、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域及びＮ末端側ヘリックス領域２７残基をコードするDNA、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のヘリックス領域の中央５２２残基をコードするDNA、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のC末端ノンへリックス領域及びC末端側ヘリックス領域１５残基をコードするDNA、ＡＯＸ１ターミネーター、並びに、ベクタープラスミドからなるＤＮＡを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド６８：ATCAGCTCCTGGTGATCCCTTTTC（配列番号６８）
(b)オリゴヌクレオチド６４：GGACCACCAGGGCCGC（配列番号６４）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)cDNA溶液（１０ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６８℃にて７分４０秒間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて７分４０秒間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約７．３ｋｂのＤＮＡをMinElute PCR Purification Kit（QIAGEN）を用いて精製した。得られたDNAはアルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸した後、アガロースゲル電気泳動により約７．３ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約１．６ｋｂのＤＮＡ及び前記約７．３ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１へリックス領域の中央５２２残基をコードするDNAが挿入されたプラスミド（以下、ｐＡＴ０２７と記すこともある。）を精製することにより、ｐＡＴ０２７を得た。
【０１１４】
（２−６−３）  ｐＥＸＰ−ＨＡ−ＨｓＣＯＬ１Ａ１  Ｍ５００Ｘ２の構築
ｐAT０２７（実施例（２−６−２）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉ及びＳｐｅＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約５．６ｋｂのAOX1プロモーター、並びに、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、へリックス領域の中央５２２残基の２量体、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域の融合ポリペプチドをコードするDNAからなるＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐEXH００２（実施例（２−４−２）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉ及びＳｐｅＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約６．６kbのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約５．６ｋｂのＤＮＡ及び前記約６．６ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からAOX1プロモーター、並びに、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、へリックス領域の中央５２２残基の２量体、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、ｐＥＸＰ−ＨＡ−ＨｓＣＯＬ１Ａ１  Ｍ５００Ｘ２と記すこともある。）を精製することにより、ｐＥＸＰ−ＨＡ−ＨｓＣＯＬ１Ａ１  Ｍ５００Ｘ２を得た。
【０１１５】
（２−６−４）  ｐＡＴ０１８の構築
下記オリゴヌクレオチド７２及び７３を合成した。下記オリゴヌクレオチド７２及び７３をプライマーとし、ｐＴＳ００２（実施例（２−４−５）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２へリックス領域の中央５２２残基をコードするDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド７２：GGGCCAGTTGGCGCAG（配列番号７２）
(b)オリゴヌクレオチド７３：TGCTTCTCCAGATGGTCCTTTCTC（配列番号７３）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)cDNA溶液（１０ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６８℃にて１分４０秒間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて１分４０秒間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約１．６ｋｂのＤＮＡをMinElute PCR Purification Kit（QIAGEN）を用いて精製した。得られたDNAの５’末端にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオ）を用いてリン酸基を付加した後、アガロースゲル電気泳動により約１．６ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
下記オリゴヌクレオチド６６及び７４を合成した。下記オリゴヌクレオチド６６及び７４をプライマーとし、ｐＴＳ００２（実施例（２−４−５）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、AOX1プロモーター、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域及びＮ末端側ヘリックス領域２７残基をコードするDNA、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のC末端ノンへリックス領域及びＣ末端側ヘリックス領域１５残基をコードするDNA、ＡＯＸ１ターミネーター、並びに、ベクタープラスミドからなるＤＮＡを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド６６：GGACCTCCTGGCCCACC（配列番号６６）
(b)オリゴヌクレオチド７４：TGCGGGTCCTTGGAATC（配列番号７４）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)cDNA溶液（１０ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６８℃にて６分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて６分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約５．４ｋｂのＤＮＡをMinElute PCR Purification Kit（QIAGEN）を用いて精製した。得られたDNAはアルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸した後、アガロースゲル電気泳動により約５．４ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約１．６ｋｂのＤＮＡ及び前記約５．４ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２へリックス領域の中央５２２残基をコードするDNAが挿入されたプラスミド（以下、ｐＡＴ０１８と記すこともある。）を精製することにより、ｐＡＴ０１８を得た。
【０１１６】
（２−６−５）  ｐＡＴ０１８−Ｅｃｏ５２Ｉの構築
ｐAT０１８（実施例（２−６−４）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素AccIII及びPmeＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約２．６ｋｂのＡＯＸ１プロモーターの３‘側領域、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域及びＮ末端側ヘリックス領域２７残基をコードするＤＮＡ、並びに、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２へリックス領域の中央５２２残基をコードするＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
pＹＨｓCOL１Ａ２  Ｅｘｐ  ｕｎｉｔ−Ｅｃｏ５２Ｉ（実施例（２−４−６）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素AccIII及びPmeＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約４．９kbのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約２．６ｋｂのＤＮＡ及び前記約４．９ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からＡＯＸ１プロモーターの３‘側領域、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域及びＮ末端側ヘリックス領域２７残基をコードするDNA、並びに、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２へリックス領域の中央５２２残基をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、ｐＡＴ０１８−Eco５２Iと記すこともある。）を精製することにより、ｐＡＴ０１８−Eco５２Iを得る。
【０１１７】
（２−６−６）  ｐＡＴ０２８−Ｅｃｏ５２Ｉの構築
下記オリゴヌクレオチド７５及び７６を合成した。下記オリゴヌクレオチド７５及び７６をプライマーとし、pUC18−HsCOL1A２（実施例（１−１１）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２へリックス領域の中央５２２残基をコードするDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド７５：GGCCCTGTTGGTGCTGC（配列番号７５）
(b)オリゴヌクレオチド７６：AGCCTCTCCAGAGGGACCCTT（配列番号７６）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)cDNA溶液（１０ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６８℃にて１分４０秒間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて１分４０秒間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約１．６ｋｂのＤＮＡをMinElute PCR Purification Kit（QIAGEN）を用いて精製した。得られたDNAの５’末端にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオ）を用いてリン酸基を付加した後、アガロースゲル電気泳動により約１．６ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
下記オリゴヌクレオチド７３及び６６を合成した。下記オリゴヌクレオチド７３及び６６をプライマーとし、ｐAT０１８−Ｅｃｏ５２Ｉ（実施例（２−６−５）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、AOX1プロモーター、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域及びＮ末端側ヘリックス領域２７残基をコードするＤＮＡ、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のヘリックス領域の中央５２２残基をコードするＤＮＡ、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のC末端ノンへリックス領域及びC末端側ヘリックス領域１５残基をコードするＤＮＡ、ＡＯＸ１ターミネーター、並びに、ベクタープラスミドからなるＤＮＡを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド７３：TGCTTCTCCAGATGGTCCTTTCTC（配列番号７３）
(b)オリゴヌクレオチド６６：GGACCTCCTGGCCCACC（配列番号６６）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)cDNA溶液（１０ｎｇ／μｌ）  ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ）  ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）  ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡）  ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡）  ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水  ・・・３３μｌ
ＰＣＲは反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６８℃にて７分４０秒間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを２５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて７分４０秒間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約７．６ｋｂのＤＮＡをMinElute PCR Purification Kit（QIAGEN）を用いて精製した。得られたDNAはアルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸した後、アガロースゲル電気泳動により約７．３ｋｂのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約１．６ｋｂのＤＮＡ及び前記約７．６ｋｂのDNAをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２へリックス領域の中央５２２残基をコードするDNAが挿入されたプラスミド（以下、ｐＡＴ０２８‐Ｅｃｏ５２Ｉと記すこともある。）を精製することにより、ｐＡＴ０２８‐Ｅｃｏ５２Ｉを得た。
【０１１８】
（２−６−７）  ｐＥＸＰ−ＨＡ−ＨｓＣＯＬ１Ａ２−１Ａ１  Ｍ５００Ｘ２の構築
ｐAT０２８−Ｅｃｏ５２Ｉ（実施例（２−６−６）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約５．６ｋｂのヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、へリックス領域の中央５２２残基の２量体、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドの発現カセットを有するDNAを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐＥＸＰ−ＨＡ−ＨｓＣＯＬ１Ａ１  Ｍ５００Ｘ２（実施例（２−６−３）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉにて切断し、アルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化した後、MinElute Reaction Cleanup Kit（QIAGEN）を用いて精製した。
前記約５．６ｋｂのＤＮＡ及び前記プラスミドをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域２７残基、へリックス領域の中央５２２残基の２量体、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドの発現カセットを有するＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、ｐＥＸＰ−ＨＡ−ＨｓＣＯＬ１Ａ２−１Ａ１  Ｍ５００Ｘ２と記すこともある。）を精製することにより、ｐＥＸＰ−ＨＡ−ＨｓＣＯＬ１Ａ２−１Ａ１  Ｍ５００Ｘ２を得た。
【０１１９】
実施例３  （発現カセット導入酵母の作製）
（３−１）  プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、及び、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット導入酵母の作製
【０１２０】
（３−１−１）  酵母の形質転換
アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）よりコマガタエラ  パストリス（Komagataella pastoris）  ＰＰＹ１２株（ＡＴＣＣ２０４１６３）を入手した。
エレクトロポレーション法により、ＰＰＹ１２株を実施例２−１−１２で得られたpEXP−A−P４HBsig（−）Ａ１revで形質転換した。
１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び、２％グルコース）にＰＰＹ１２株を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ６６０）＝約１０となるまで培養した。培養液から菌体を回収し上清を取り除いた後、１ＭソルビトールにOD６６０＝約１５０の濁度で懸濁し、菌体懸濁液を調製した。
１０μｇのｐＥＸＰ−Ａ−Ｐ４ＨＢｓｉｇ（−）Ａ１ｒｅｖ（実施例（２−１−１２）参照）を制限酵素ＡａｔＩＩで切断した。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製した。
前記菌体懸濁液１００μｌと、前記ＤＮＡ溶液５μｌとを混ぜ、混合液を調製した。当該混合液に遺伝子導入装置（ＥＣＭ６３０、ＢＴＸ）を用いてパルスを加えた後、ＭＤ寒天培地（１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０−５％ビオチン、２％グルコース、０．００５％ヒスチジン、２％寒天）上に広げ、３０℃にて４８時間培養した。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換体として単離した。形質転換体として０５０５２５−５−３株を得た。
【０１２１】
（３−１−２）  プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット、及び、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニットの発現検討
０５０５２５−５−３株（実施例（３−１−１）参照）を、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐH６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０−５％ビオチン、１％グリセロール、０．００５％ヒスチジン]に植菌して、３０℃にて２４時間振とう培養した。得られた培養液から菌体を調製し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した５０ｍｌのBMM培地［１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％ イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０−５%ビオチン、０．５％メタノール、０．００５％ヒスチジン］にＯＤ６６０＝約１０の終濃度で植菌し、３０℃にて７２時間振とう培養した。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加した。
前記培養液から菌体を回収して上清を取り除いた後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用い、酵母破砕条件（ガラスビーズ直径０．５ｍｍ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて菌体を破砕した。得られた破砕液を遠心分離して菌体破砕液の上清を回収し、可溶性画分を調製した。
前記可溶性画分をサンプルバッファー（ナカライテスク）と混合し、１００℃で５分間保温した後、SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。電気泳動装置はERICA-MP（DRC）、電子泳動ゲルは５〜１５％グラジェントゲル（XV  PANTERA  MPゲル、DRC）を用い、２００Vで２０分間電気泳動した。電気泳動終了後、得られたアクリルアミドゲルを、ＰＶＤＦメンブレン（イモビロン−Ｐ、ミリポア）にエレクトロブロッティングした。ブロッティング装置はMINICA-MP（DRC）を用い、４０Vで３０分間行った。
得られたメンブランを用いてウェスタンブロッティングを行い、プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニットを検出した。メンブランのブロッキングにはBlocking one（ナカライテスク）、抗体反応にはCan Get Signal（東洋紡）を用い、一次抗体は抗ラットプロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニットマウス抗体（６３１６７、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を２０００倍希釈に、二次抗体は坑マウス IgG-HRP Linked ヒツジ抗体（NA-931、GEヘルスケアバイオサイエンス）を２００００倍希釈に調製して用いた。二次抗体の検出はECL Western Blotting Detection System（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用いて化学発光で行った。化学発光はイメージアナライザー（LAS-3000UVmini、富士フィルム）で検出・定量した。ウェスタンブロティングを行った結果、０５０５２５−５−３株ではプロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニットに相当する分子量の位置にシグナルが検出されたことから、プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニットを産生することが示された。
前記得られたメンブランを用いてウェスタンブロッティングを行い、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニットを検出した。メンブランのブロッキングにはBlocking one（ナカライテスク）、抗体反応にはCan Get Signal（東洋紡）を用い、一次抗体は抗ヒトプロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニットウサギ抗体（ＳＰＡ−８９０、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）を５０００倍希釈に、二次抗体は坑ウサギ IgG-HRP Linked ロバ抗体（NA-934、GEヘルスケアバイオサイエンス）を２００００倍希釈に調製して用いた。二次抗体の検出はECL Western Blotting Detection System（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用いて化学発光で行った。化学発光はイメージアナライザー（LAS-3000UVmini、富士フィルム）で検出・定量した。ウェスタンブロティングを行った結果、０５０５２５−５−３株ではプロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニットに相当する分子量の位置にシグナルが検出されたことから、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニットを産生することが示された。
【０１２２】
（３−２）  ウシコラーゲンＴｙｐｅIIIα１発現カセット導入酵母の作製
【０１２３】
（３−２−１）  酵母の形質転換
エレクトロポレーション法により、ＰＰＹ１２株を実施例２−３−９で得られたpEXP−HA−BtCOL３A１で形質転換した。
１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び、２％グルコース）にＰＰＹ１２株を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ６６０）＝約１０となるまで培養した。培養液から菌体を回収し上清を取り除いた後、１ＭソルビトールにOD６６０＝約１５０の濁度で懸濁し、菌体懸濁液を調製した。
１０μｇのpEXP−HA−BtCOL３A１を制限酵素ＸｂａＩで切断した。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製した。
前記菌体懸濁液１００μｌと、前記ＤＮＡ溶液５μｌとを混ぜ、混合液を調製した。当該混合液にエレクトロポレーション装置（ＥＣＭ６３０、ＢＴＸ）を用いてパルスを加えた後、ＭＤ寒天培地（１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０−５％ビオチン、２％グルコース、０．００５％アルギニン、２％寒天）上に広げ、３０℃にて４８時間培養した。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換体として単離した。形質転換体として０５０６０７−１−２株を得た。
【０１２４】
（３−２−２）  ウシコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩα１の発現検討
０５０６０７−１−２（実施例（３−２−１）参照）株を、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐH６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０−５％ビオチン、１％グリセロール、０．００５％アルギニン]に植菌して、３０℃にて２４時間振とう培養した。得られた培養液から菌体を調製し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した５０ｍｌのBMM培地［１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％ イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０−５%ビオチン、０．５％メタノール、０．００５％アルギニン］にＯＤ６６０＝約１０の終濃度で植菌し、３０℃にて７２時間振とう培養した。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加した。
前記培養液から菌体を回収して上清を取り除いた後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用い、酵母破砕条件（ガラスビーズ直径０．５ｍｍ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて菌体を破砕した。得られた破砕液を遠心分離して菌体破砕液の上清を回収し、可溶性画分を調製した。
前記可溶性画分をサンプルバッファー（ナカライテスク）と混合し、１００℃で５分間保温した後、SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。電気泳動装置はERICA-MP（DRC）、電子泳動ゲルは５〜１５％グラジェントゲル（XV  PANTERA  MPゲル、DRC）を用い、２００Vで２０分間電気泳動した。電気泳動終了後、得られたアクリルアミドゲルを、ＰＶＤＦメンブレン（イモビロン−Ｐ、ミリポア）にエレクトロブロッティングした。ブロッティング装置はMINICA-MP（DRC）を用い、４０Vで３０分間行った。
得られたメンブランを用いてウェスタンブロッティングを行い、ウシコラーゲンTypeIIIα１のプロコラーゲンを検出した。メンブランのブロッキングにはBlocking one（ナカライテスク）、抗体反応にはCan Get Signal（東洋紡）を用い、一次抗体は抗ヒトコラーゲンTypeIIIα１ヤギ抗体（SC-8781、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を１０００倍希釈に、二次抗体は坑ヤギ IgG-HRP Linked ロバ抗体（SC-2020、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を２０００倍希釈に調製して用いた。二次抗体の検出はECL Western Blotting Detection System（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用い化学発光で行った。化学発光はイメージアナライザー（LAS-3000UVmini、富士フィルム）で検出・定量した。ウェスタンブロティングを行った結果、０５０６０７−１−２株ではウシコラーゲンTypeIIIα１のプロコラーゲンに相当する分子量の位置にシグナルが検出されたことから、ウシコラーゲンTypeIIIα１を産生することが示された。
【０１２５】
（３−３）  プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、及び、ウシコラーゲンＴｙｐｅIIIα１発現カセット導入酵母の作製
【０１２６】
（３−３−１）  酵母の形質転換
エレクトロポレーション法により、０５０５２５−５−３株（実施例（３−１−１）参照）を実施例２−３−９で得られたpEXP−HA−BtCOL３A１で形質転換した。
１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び、２％グルコース）に０５０５２５−５−３株（実施例（３−１−１）参照）を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ６６０）＝約１０となるまで培養した。培養液から菌体を回収し上清を取り除いた後、１ＭソルビトールにOD６６０＝約１５０の濁度で懸濁し、菌体懸濁液を調製した。
１０μｇのpEXP−HA−BtCOL３A１（実施例（２−３−９）参照）を制限酵素ＸｂａＩで切断した。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製した。
前記菌体懸濁液１００μｌと、前記ＤＮＡ溶液５μｌとを混ぜ混合液を調製した。当該混合液にエレクトロポレーション装置（ＥＣＭ６３０、ＢＴＸ）を用いてパルスを加えた後、ＭＤ寒天培地（１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０−５％ビオチン、２％グルコース、２％寒天）上に広げ、３０℃にて４８時間培養した。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換体として単離した。形質転換体として０５０８１８−３−１株を得た。
【０１２７】
（３−３−２）  ウシコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩα１の発現検討
０５０８１８−３−１株（実施例（３−３−１）参照）を、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐH６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０−５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌して、３０℃にて２４時間振とう培養した。得られた培養液から菌体を調製し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した５０ｍｌのBMM培地［１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％ イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０−５%ビオチン、０．５％メタノール］にＯＤ６６０＝約１０の終濃度で植菌し、３０℃にて７２時間振とう培養した。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加した。
前記培養液から菌体を回収して上清を取り除いた後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用い、酵母破砕条件（ガラスビーズ直径０．５ｍｍ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて菌体を破砕した。得られた破砕液を遠心分離して菌体破砕液の上清を回収し、可溶性画分を調製した。
前記可溶性画分をサンプルバッファー（ナカライテスク）と混合し、１００℃で５分間保温した後、SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。電気泳動装置はERICA-MP（DRC）、電子泳動ゲルは５〜１５％グラジェントゲル（XV  PANTERA  MPゲル、DRC）を用い、２００Vで２０分間電気泳動した。電気泳動終了後、得られたアクリルアミドゲルはCBB染色液を用いて染色し、タンパク質のバンドを検出した。その結果、０５０８１８−３−１株ではコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩα１のプロコラーゲンに相当する分子量のバンドが検出されたことから、ウシコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩα１を産生することが示された。
【０１２８】
（３−４）  ウシコラーゲンＴｙｐｅIIIα１発現カセット、及び、HSP４７発現カセット導入酵母の作製
【０１２９】
（３−４−１）  酵母の形質転換
エレクトロポレーション法により、０５０６０７−１−２株（実施例（３−２−１）参照）を実施例２−２−９で得られたｐＥＸＰ−A−AOX2  Ｐｒｏ−ＨＳＰ４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲで形質転換する。
１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び、２％グルコース）に０５０６０７−１−２株を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ６６０）＝約１０となるまで培養する。培養液から菌体を回収し上清を取り除いた後、１ＭソルビトールにOD６６０＝約１５０の濁度で懸濁し、菌体懸濁液を調製する。
１０μｇのｐＥＸＰ−A−AOX2  Ｐｒｏ−ＨＳＰ４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲ（実施例（２−２−９）参照）を制限酵素ＡａｔＩＩで切断する。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製する。
前記菌体懸濁液１００μｌと、前記ＤＮＡ溶液５μｌとを混ぜ混合液を調製する。当該混合液にエレクトロポレーション装置（ＥＣＭ６３０、ＢＴＸ）を用いてパルスを加えた後、ＭＤ寒天培地（１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０−５％ビオチン、２％グルコース、２％寒天）上に広げ、３０℃にて４８時間培養する。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換体として単離する。
【０１３０】
（３−４−２）  HSP４７の発現検討
得られた形質転換体を、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐH６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０−５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌して、３０℃にて２４時間振とう培養する。得られた培養液から菌体を調製し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した５０ｍｌのBMM培地［１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％ イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０−５%ビオチン、０．５％メタノール］にＯＤ６６０＝約１０の終濃度で植菌し、３０℃にて７２時間振とう培養する。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加する。
前記培養液から菌体を回収して上清を取り除いた後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用い、酵母破砕条件（ガラスビーズ直径０．５ｍｍ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて菌体を破砕する。得られた破砕液を遠心分離して菌体破砕液の上清を回収し、可溶性画分を調製する。
前記可溶性画分をサンプルバッファー（ナカライテスク）と混合し、１００℃で５分間保温した後、SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動する。電気泳動装置はERICA-MP（DRC）、電子泳動ゲルは５〜１５％グラジェントゲル（XV  PANTERA  MPゲル、DRC）を用い、２００Vで２０分間電気泳動する。電気泳動終了後、得られたアクリルアミドゲルを、ＰＶＤＦメンブレン（イモビロン−Ｐ、ミリポア）にエレクトロブロッティングする。ブロッティング装置はMINICA-MP（DRC）を用い、４０Vで３０分間行う。
得られたメンブランを用いてウェスタンブロッティングを行い、HSP４７を検出する。メンブランのブロッキングにはBlocking one（ナカライテスク）、抗体反応にはCan Get Signal（東洋紡）を用い、一次抗体は抗ヒトHSP４７マウス抗体（ＳＰＡ−４７０、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）を２０００倍希釈に、二次抗体は坑マウス IgG-HRP Linked ヒツジ抗体（NA-931、GEヘルスケアバイオサイエンス）を５０００倍希釈に調製して用いる。二次抗体の検出はECL Western Blotting Detection System（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用い化学発光で行う。化学発光はイメージアナライザー（LAS-3000UVmini、富士フィルム）で検出・定量する。
【０１３１】
（３−５）    プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、ウシコラーゲンＴｙｐｅIIIα１発現カセット、及び、ヒートショックプロテイン４７発現カセット導入酵母の作製
【０１３２】
（３−５−１）  酵母の形質転換
エレクトロポレーション法により、０５０８１８−３−１株（実施例（３−３−１）参照）を実施例２−２で得られたｐＥＸＰ−A−ＨＳＰ４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲ（実施例（２−２−３）参照）、ｐＥＸＰ−A−ＰＥＲ３  Ｐｒｏ−ＨＳＰ４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲ（実施例（２−２−６）参照）、ｐＥＸＰ−A−ＰＥＲ３  Ｐｒｏ−ＨＳＰ４７ａｌｐｈａ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲ（実施例（２−２−７）参照）、ｐＥＸＰ−A−AOX2  Ｐｒｏ−ＨＳＰ４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲ（実施例（２−２−８）参照）、或いは、ｐＥＸＰ−A−AOX2  Ｐｒｏ−ＨＳＰ４７ａｌｐｈａ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲ（実施例（２−２−９）参照）で形質転換した。
１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び、２％グルコース）に０５０８１８−３−１株を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ６６０）＝約１０となるまで培養した。培養液から菌体を回収し上清を取り除いた後、１ＭソルビトールにOD６６０＝約１５０の濁度で懸濁し、菌体懸濁液を調製した。
１０μｇのｐＥＸＰ−A−ＨＳＰ４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲ（実施例（２−２−３）参照）、ｐＥＸＰ−A−ＰＥＲ３  Ｐｒｏ−ＨＳＰ４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲ（実施例（２−２−６）参照、ｐＥＸＰ−A−ＰＥＲ３  Ｐｒｏ−ＨＳＰ４７ａｌｐｈａ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲ（実施例（２−２−７）参照）、ｐＥＸＰ−A−AOX2  Ｐｒｏ−ＨＳＰ４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲ（実施例（２−２−８）参照）、或いは、ｐＥＸＰ−A−AOX2  Ｐｒｏ−ＨＳＰ４７ａｌｐｈａ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲ（実施例（２−２−９）参照）を制限酵素ＡａｔＩＩで切断した。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製した。
前記菌体懸濁液１００μｌと、前記ＤＮＡ溶液５μｌとを混ぜ、混合液を調製した。当該混合液にエレクトロポレーション装置（ＥＣＭ６３０、ＢＴＸ）を用いてパルスを加えた後、ＭＤ寒天培地（１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０−５％ビオチン、２％グルコース、３００μｇ／ｍｌゼオシン、２％寒天）上に広げ、３０℃にて４８時間培養する。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換体として単離した。ｐＥＸＰ−A−ＨＳＰ４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲの形質転換体として０７０６０５−１−１５株、ｐＥＸＰ−A−ＰＥＲ３  Ｐｒｏ−ＨＳＰ４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲの形質転換体として０８０３１１−３−３株、ｐＥＸＰ−A−ＰＥＲ３  Ｐｒｏ−ＨＳＰ４７ａｌｐｈａ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲの形質転換体として０８０３１１−４−２株、ｐＥＸＰ−A−AOX2  Ｐｒｏ−ＨＳＰ４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲの形質転換体として０８０３１１−１−１３株、ｐＥＸＰ−A−AOX2  Ｐｒｏ−ＨＳＰ４７ａｌｐｈａ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲの形質転換体として０８０３１１−２−２株を得た。
【０１３３】
（３−５−２）  HSP４７の発現検討
０７０６０５−１−１５株（実施例（３−５−１）参照）、０８０３１１−３−３株（実施例（３−５−１）参照）、０８０３１１−４−２株（実施例（３−５−１）参照）、０８０３１１−１−１３株（実施例（３−５−１）参照）、及び、０８０３１１−２−２株（実施例（３−５−１）参照）を、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐH６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０−５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌して、３０℃にて２４時間振とう培養した。得られた培養液から菌体を調製し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した５０ｍｌのBMM培地［１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％ イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０−５%ビオチン、０．５％メタノール］にＯＤ６６０＝約１０の終濃度で植菌し、３０℃にて７２時間振とう培養した。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加した。
前記培養液から菌体を回収して上清を取り除いた後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用い、酵母破砕条件（ガラスビーズ直径０．５ｍｍ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて菌体を破砕した。得られた破砕液を遠心分離して菌体破砕液の上清を回収し、可溶性画分を調製した。
前記可溶性画分をサンプルバッファー（ナカライテスク）と混合し、１００℃で５分間保温した後、SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。電気泳動装置はERICA-MP（DRC）、電子泳動ゲルは５〜１５％グラジェントゲル（XV  PANTERA  MPゲル、DRC）を用い、２００Vで２０分間電気泳動した。電気泳動終了後、得られたアクリルアミドゲルを、ＰＶＤＦメンブレン（イモビロン−Ｐ、ミリポア）にエレクトロブロッティングした。ブロッティング装置はMINICA-MP（DRC）を用い、４０Vで３０分間行った。
得られたメンブランを用いてウェスタンブロッティングを行い、HSP４７を検出した。メンブランのブロッキングにはBlocking one（ナカライテスク）、抗体反応にはCan Get Signal（東洋紡）を用い、一次抗体は抗ヒトHSP４７マウス抗体（ＳＰＡ−４７０、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）を２０００倍希釈に、二次抗体は坑マウス IgG-HRP Linked ヒツジ抗体（NA-931、GEヘルスケアバイオサイエンス）を５０００倍希釈に調製して用いた。二次抗体の検出はECL Western Blotting Detection System（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用い化学発光で行った。化学発光はイメージアナライザー（LAS-3000UVmini、富士フィルム）で検出・定量した。ウェスタンブロティングを行った結果、０７０６０５−１−１５株、０８０３１１−３−３株、０８０３１１−４−２株、０８０３１１−１−１３株、及び、０８０３１１−２−２ではＨＳＰ４７に相当する分子量の位置にシグナルが検出されたことから、HSP４７を産生することが示された。
【０１３４】
（３−６）  プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１発現カセット、及び、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２発現カセット導入酵母の作製
【０１３５】
（３−６−１）  酵母の形質転換
エレクトロポレーション法により、０５０５２５−５−３株（実施例（３−１−１）参照）を実施例２−４−７で得られたpEXP−HA−YHsCOL１A２−１A１で形質転換した。
１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び、２％グルコース）に０５０５２５−５−３株を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ６６０）＝約１０となるまで培養した。培養液から菌体を回収し上清を取り除いた後、１ＭソルビトールにOD６６０＝約１５０の濁度で懸濁し、菌体懸濁液を調製した。
１０μｇのpEXP−HA−YHsCOL１A２−１Ａ１（実施例（２−４−７）参照）を制限酵素ＸｂａＩで切断した。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製した。
前記菌体懸濁液１００μｌと、前記ＤＮＡ溶液５μｌとを混ぜ混合液を調製した。当該混合液にエレクトロポレーション装置（ＥＣＭ６３０、ＢＴＸ）を用いてパルスを加えた後、ＭＤ寒天培地（１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０−５％ビオチン、２％グルコース、２％寒天）上に広げ、３０℃にて４８時間培養した。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換体として単離した。形質転換体として０７０３２７−１−１１株を得た。
【０１３６】
（３−６−２）  ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１、及び、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２の発現検討
０７０３２７−１−１１株（実施例（３−６−１）参照）を、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐH６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０−５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌して、３０℃にて２４時間振とう培養した。得られた培養液から菌体を調製し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した５０ｍｌのBMM培地［１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％ イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０−５%ビオチン、０．５％メタノール］にＯＤ６６０＝約１０の終濃度で植菌し、３０℃にて７２時間振とう培養した。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加した。
前記培養液から菌体を回収して上清を取り除いた後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用い、酵母破砕条件（ガラスビーズ直径０．５ｍｍ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて菌体を破砕した。得られた破砕液を遠心分離して菌体破砕液の上清を回収し、可溶性画分を調製した。
前記可溶性画分をサンプルバッファー（ナカライテスク）と混合し、１００℃で５分間保温した後、SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。電気泳動装置はERICA-MP（DRC）、電子泳動ゲルは５〜１５％グラジェントゲル（XV  PANTERA  MPゲル、DRC）を用い、２００Vで２０分間電気泳動した。電気泳動終了後、得られたアクリルアミドゲルはCBB染色液を用いて染色し、タンパク質のバンドを検出した。その結果、０７０３２７−１−１株ではコラーゲンＴｙｐｅＩα１のプロコラーゲンに相当する分子量のバンド、及び、コラーゲンＴｙｐｅＩα２のプロコラーゲンに相当する分子量のバンドが検出されたことから、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１、及び、ヒトコラーゲンTypeIα２を産生することが示された。
【０１３７】
（３−７）  プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域６０残基、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、並びに、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域６０残基、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット導入酵母の作製
【０１３８】
（３−７−１）  酵母の形質転換
エレクトロポレーション法により、０５０５２５−５−３株（実施例（３−１−１）参照）を実施例２−５−４で得られたｐＥＸＰ−ＨＡ−YＨｓＣＯＬ１Ａ２−１Ａ１  Ｎ６０Ｃ１５で形質転換した。
１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び、２％グルコース）に０５０５２５−５−３株を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ６６０）＝約１０となるまで培養した。培養液から菌体を回収し上清を取り除いた後、１ＭソルビトールにOD６６０＝約１５０の濁度で懸濁し、菌体懸濁液を調製した。
１０μｇのｐＥＸＰ−ＨＡ−YＨｓＣＯＬ１Ａ２−１Ａ１  Ｎ６０Ｃ１５（実施例（２−５−４）参照）を制限酵素ＸｂａＩで切断した。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製した。
前記菌体懸濁液１００μｌと、前記ＤＮＡ溶液５μｌとを混ぜ混合液を調製した。当該混合液にエレクトロポレーション装置（ＥＣＭ６３０、ＢＴＸ）を用いてパルスを加えた後、ＭＤ寒天培地（１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０−５％ビオチン、２％グルコース、２％寒天）上に広げ、３０℃にて４８時間培養した。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換体として単離した。形質転換体として０８０１１８−３−３株を得た。
【０１３９】
（３−７−２）  ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド、並びに、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドの発現検討
０８０１１８−３−３株（実施例（３−７−１）参照）を、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐH６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０−５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌して、３０℃にて２４時間振とう培養した。得られた培養液から菌体を調製し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した５０ｍｌのBMM培地［１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％ イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０−５%ビオチン、０．５％メタノール］にＯＤ６６０＝約１０の終濃度で植菌し、３０℃にて７２時間振とう培養した。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加した。
前記培養液から菌体を回収して上清を取り除いた後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用い、酵母破砕条件（ガラスビーズ直径０．５ｍｍ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて菌体を破砕した。得られた破砕液を遠心分離して菌体破砕液の上清を回収し、可溶性画分を調製した。
前記可溶性画分をサンプルバッファー（ナカライテスク）と混合し、１００℃で５分間保温した後、SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。電気泳動装置はERICA-MP（DRC）、電子泳動ゲルは５〜１５％グラジェントゲル（XV  PANTERA  MPゲル、DRC）を用い、２００Vで２０分間電気泳動した。電気泳動終了後、得られたアクリルアミドゲルを、ＰＶＤＦメンブレン（イモビロン−Ｐ、ミリポア）にエレクトロブロッティングした。ブロッティング装置はMINICA-MP（DRC）を用い、４０Vで３０分間行った。
得られたメンブランを用いてウェスタンブロッティングを行い、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドのプロコラーゲンを検出した。メンブランのブロッキングにはBlocking one（ナカライテスク）、抗体反応にはCan Get Signal（東洋紡）を用い、一次抗体は抗ヒトプロコラーゲンTypeIα１ヤギ抗体（SC−８７８２、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を２０００倍希釈に、二次抗体は坑ヤギ IgG-HRP Linked ロバジ抗体（SC-2033、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を２０００倍希釈に調製して用いた。二次抗体の検出はECL Western Blotting Detection System（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用いて化学発光で行った。化学発光はイメージアナライザー（LAS-3000UVmini、富士フィルム）で検出・定量した。ウェスタンブロティングを行った結果、０８０１１８−３−３株ではヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドのプロコラーゲンに相当する分子量の位置にシグナルが検出されたことから、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドを産生することが示された。
前記得られたメンブランを用いてウェスタンブロッティングを行い、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドのプロコラーゲンを検出した。メンブランのブロッキングにはBlocking one（ナカライテスク）、抗体反応にはCan Get Signal（東洋紡）を用い、一次抗体は抗ヒトコラーゲンTypeIウサギ抗体（ａｂ２９２、ａｂｃａｍ）を５０００倍希釈に、二次抗体は坑ウサギ IgG-HRP Linked ロバ抗体（NA-934、GEヘルスケアバイオサイエンス）を１００００倍希釈に調製して用いた。二次抗体の検出はECL Western Blotting Detection System（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用いて化学発光で行った。化学発光はイメージアナライザー（LAS-3000UVmini、富士フィルム）で検出・定量した。ウェスタンブロティングを行った結果、０８０１１８−３−３株（実施例（３−７−１）参照）ではヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドのプロコラーゲンに相当する分子量の位置にシグナルが検出されたことから、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、Ｎ末端側ヘリックス領域６０残基、Ｃ末端側ヘリックス領域１５残基、及び、Ｃ末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドを産生することが示された。
【０１４０】
（３−８）  プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、並びに、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット導入酵母の作製
【０１４１】
（３−８−１）  酵母の形質転換
エレクトロポレーション法により、０５０５２５−５−３株（実施例（３−１−１）参照）を実施例２−６−７で得られたｐＥＸＰ−ＨＡ−ＨｓＣＯＬ１Ａ２−１Ａ１  Ｍ５００Ｘ２で形質転換した。
１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び、２％グルコース）に０５０５２５−５−３株（実施例（３−１−１）参照）を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ６６０）＝約１０となるまで培養した。培養液から菌体を回収し上清を取り除いた後、１ＭソルビトールにOD６６０＝約１５０の濁度で懸濁し、菌体懸濁液を調製した。
１０μｇのｐＥＸＰ−ＨＡ−ＨｓＣＯＬ１Ａ２−１Ａ１  Ｍ５００Ｘ２（実施例（２−６−７）参照）を制限酵素ＸｂａＩで切断した。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製した。
前記菌体懸濁液１００μｌと、前記ＤＮＡ溶液５μｌとを混ぜ混合液を調製した。当該混合液にエレクトロポレーション装置（ＥＣＭ６３０、ＢＴＸ）を用いてパルスを加えた後、ＭＤ寒天培地（１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０−５％ビオチン、２％グルコース、２％寒天）上に広げ、３０℃にて４８時間培養した。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換体として単離した。形質転換体として０８０８０１−２−４株を得た。
【０１４２】
（３−８−２）  ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド、並びに、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドの発現検討
０８０８０１−２−４株（実施例（３−８−１）参照）を、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐH６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０−５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌して、３０℃にて２４時間振とう培養した。得られた培養液から菌体を調製し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した５０ｍｌのBMM培地［１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％ イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０−５%ビオチン、０．５％メタノール］にＯＤ６６０＝約１０の終濃度で植菌し、３０℃にて７２時間振とう培養した。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加した。
前記培養液から菌体を回収して上清を取り除いた後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用い、酵母破砕条件（ガラスビーズ直径０．５ｍｍ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて菌体を破砕した。得られた破砕液を遠心分離して菌体破砕液の上清を回収し、可溶性画分を調製した。
前記可溶性画分をサンプルバッファー（ナカライテスク）と混合し、１００℃で５分間保温した後、SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。電気泳動装置はERICA-MP（DRC）、電子泳動ゲルは５〜１５％グラジェントゲル（XV  PANTERA  MPゲル、DRC）を用い、２００Vで２０分間電気泳動した。電気泳動終了後、得られたアクリルアミドゲルを、ＰＶＤＦメンブレン（イモビロン−Ｐ、ミリポア）にエレクトロブロッティングした。ブロッティング装置はMINICA-MP（DRC）を用い、４０Vで３０分間行った。
得られたメンブランを用いてウェスタンブロッティングを行い、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドのプロコラーゲンを検出した。メンブランのブロッキングにはBlocking one（ナカライテスク）、抗体反応にはCan Get Signal（東洋紡）を用い、一次抗体は抗ヒトプロコラーゲンTypeIα１ヤギ抗体（SC−８７８２、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を２０００倍希釈に、二次抗体は坑ヤギ IgG-HRP Linked ロバジ抗体（SC-2033、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を２０００倍希釈に調製して用いた。二次抗体の検出はECL Western Blotting Detection System（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用いて化学発光で行った。化学発光はイメージアナライザー（LAS-3000UVmini、富士フィルム）で検出・定量した。ウェスタンブロティングを行った結果、０８０８０１−２−４株ではプロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドのプロコラーゲンに相当する分子量の位置にシグナルが検出されたことから、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドを産生することが示された。
前記得られたメンブランを用いてウェスタンブロッティングを行い、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドのプロコラーゲンを検出した。メンブランのブロッキングにはBlocking one（ナカライテスク）、抗体反応にはCan Get Signal（東洋紡）を用い、一次抗体は抗ヒトコラーゲンTypeIウサギ抗体（ａｂ２９２、ａｂｃａｍ）を５０００倍希釈に、二次抗体は坑ウサギ IgG-HRP Linked ロバ抗体（NA-934、GEヘルスケアバイオサイエンス）を１００００倍希釈に調製して用いた。二次抗体の検出はECL Western Blotting Detection System（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用いて化学発光で行った。化学発光はイメージアナライザー（LAS-3000UVmini、富士フィルム）で検出・定量した。ウェスタンブロティングを行った結果、０８０８０１−２−４株ではヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドのプロコラーゲンに相当する分子量の位置にシグナルが検出されたことから、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチドを産生することが示された。
【０１４３】
（３−９）  プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２発現カセット、並びに、HSP４７発現カセット導入酵母の作製
【０１４４】
（３−９−１）  酵母の形質転換
エレクトロポレーション法により、０７０３２７−１−１１株（実施例（３−６−１）参照）を実施例２−２−９で得られたｐＥＸＰ−A−AOX2  Ｐｒｏ−ＨＳＰ４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲで形質転換する。
１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び、２％グルコース）に０７０３２７−１−１１株を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ６６０）＝約１０となるまで培養する。培養液から菌体を回収し上清を取り除いた後、１ＭソルビトールにOD６６０＝約１５０の濁度で懸濁し、菌体懸濁液を調製する。
１０μｇのｐＥＸＰ−A−AOX2  Ｐｒｏ−ＨＳＰ４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲ（実施例（２−２−９）参照）を制限酵素ＡａｔＩＩで切断する。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製する。
前記菌体懸濁液１００μｌと、前記ＤＮＡ溶液５μｌとを混ぜ混合液を調製する。当該混合液にエレクトロポレーション装置（ＥＣＭ６３０、ＢＴＸ）を用いてパルスを加えた後、ＭＤ寒天培地（１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０−５％ビオチン、２％グルコース、３００μｇ／ｍｌゼオシン、２％寒天、）上に広げ、３０℃にて４８時間培養する。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換体として単離する。
【０１４５】
（３−９−２）  HSP４７の発現検討
得られた形質転換体を、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐH６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０−５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌して、３０℃にて２４時間振とう培養する。得られた培養液から菌体を調製し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した５０ｍｌのBMM培地［１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％ イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０−５%ビオチン、０．５％メタノール］にＯＤ６６０＝約１０の終濃度で植菌し、３０℃にて７２時間振とう培養する。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加する。
前記培養液から菌体を回収して上清を取り除いた後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用い、酵母破砕条件（ガラスビーズ直径０．５ｍｍ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて菌体を破砕する。得られた破砕液を遠心分離して菌体破砕液の上清を回収し、可溶性画分を調製する。
前記可溶性画分をサンプルバッファー（ナカライテスク）と混合し、１００℃で５分間保温した後、SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動する。電気泳動装置はERICA-MP（DRC）、電子泳動ゲルは５〜１５％グラジェントゲル（XV  PANTERA  MPゲル、DRC）を用い、２００Vで２０分間電気泳動する。電気泳動終了後、得られたアクリルアミドゲルを、ＰＶＤＦメンブレン（イモビロン−Ｐ、ミリポア）にエレクトロブロッティングする。ブロッティング装置はMINICA-MP（DRC）を用い、４０Vで３０分間行う。
得られたメンブランを用いてウェスタンブロッティングを行い、HSP４７を検出する。メンブランのブロッキングにはBlocking one（ナカライテスク）、抗体反応にはCan Get Signal（東洋紡）を用い、一次抗体は抗ヒトHSP４７マウス抗体（ＳＰＡ−４７０、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）を２０００倍希釈に、二次抗体は坑マウス IgG-HRP Linked ヒツジ抗体（NA-931、GEヘルスケアバイオサイエンス）を５０００倍希釈に調製して用いる。二次抗体の検出はECL Western Blotting Detection System（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用い化学発光で行う。化学発光はイメージアナライザー（LAS-3000UVmini、富士フィルム）で検出・定量する。
【０１４６】
（３−１０）  プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域６０残基、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域６０残基、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、並びに、HSP４７発現カセット導入酵母の作製
【０１４７】
（３−１０−１）  酵母の形質転換
エレクトロポレーション法により、０８０１１８−３−３株（実施例（３−７−１）参照）を実施例２−２−９で得られたｐＥＸＰ−A−AOX2  Ｐｒｏ−ＨＳＰ４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲで形質転換する。
１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び、２％グルコース）に０８０１１８−３−３株を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ６６０）＝約１０となるまで培養する。培養液から菌体を回収し上清を取り除いた後、１ＭソルビトールにOD６６０＝約１５０の濁度で懸濁し、菌体懸濁液を調製する。
１０μｇのｐＥＸＰ−A−AOX2  Ｐｒｏ−ＨＳＰ４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲ（実施例（２−２−９）参照）を制限酵素ＡａｔＩＩで切断する。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製する。
前記菌体懸濁液１００μｌと、前記ＤＮＡ溶液５μｌとを混ぜ混合液を調製する。当該混合液にエレクトロポレーション装置（ＥＣＭ６３０、ＢＴＸ）を用いてパルスを加えた後、ＭＤ寒天培地（１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０−５％ビオチン、２％グルコース、３００μｇ／ｍｌゼオシン、２％寒天、）上に広げ、３０℃にて４８時間培養する。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換体として単離する。
【０１４８】
（３−１０−２）  HSP４７の発現検討
得られた形質転換体を、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐH６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０−５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌して、３０℃にて２４時間振とう培養する。得られた培養液から菌体を調製し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した５０ｍｌのBMM培地［１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％ イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０−５%ビオチン、０．５％メタノール］にＯＤ６６０＝約１０の終濃度で植菌し、３０℃にて７２時間振とう培養する。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加する。
前記培養液から菌体を回収して上清を取り除いた後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用い、酵母破砕条件（ガラスビーズ直径０．５ｍｍ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて菌体を破砕する。得られた破砕液を遠心分離して菌体破砕液の上清を回収し、可溶性画分を調製する。
前記可溶性画分をサンプルバッファー（ナカライテスク）と混合し、１００℃で５分間保温した後、SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動する。電気泳動装置はERICA-MP（DRC）、電子泳動ゲルは５〜１５％グラジェントゲル（XV  PANTERA  MPゲル、DRC）を用い、２００Vで２０分間電気泳動する。電気泳動終了後、得られたアクリルアミドゲルを、ＰＶＤＦメンブレン（イモビロン−Ｐ、ミリポア）にエレクトロブロッティングする。ブロッティング装置はMINICA-MP（DRC）を用い、４０Vで３０分間行う。
得られたメンブランを用いてウェスタンブロッティングを行い、HSP４７を検出する。メンブランのブロッキングにはBlocking one（ナカライテスク）、抗体反応にはCan Get Signal（東洋紡）を用い、一次抗体は抗ヒトHSP４７マウス抗体（ＳＰＡ−４７０、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）を２０００倍希釈に、二次抗体は坑マウス IgG-HRP Linked ヒツジ抗体（NA-931、GEヘルスケアバイオサイエンス）を５０００倍希釈に調製して用いる。二次抗体の検出はECL Western Blotting Detection System（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用い化学発光で行う。化学発光はイメージアナライザー（LAS-3000UVmini、富士フィルム）で検出・定量する。
【０１４９】
（３−１１）  プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、並びに、HSP４７発現カセット導入酵母の作製
【０１５０】
（３−１１−１）  酵母の形質転換
エレクトロポレーション法により、０８０８０１−２−４株（実施例（３−８−１）参照）を実施例２−２−９で得られたｐＥＸＰ−A−AOX2  Ｐｒｏ−ＨＳＰ４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲで形質転換する。
１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び、２％グルコース）に０８０８０１−２−４株を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ６６０）＝約１０となるまで培養する。培養液から菌体を回収し上清を取り除いた後、１ＭソルビトールにOD６６０＝約１５０の濁度で懸濁し、菌体懸濁液を調製する。
１０μｇのｐＥＸＰ−A−AOX2  Ｐｒｏ−ＨＳＰ４７ｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｄＺｅｏＲ（実施例（２−２−９）参照）を制限酵素ＡａｔＩＩで切断する。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製する。
前記菌体懸濁液１００μｌと、前記ＤＮＡ溶液５μｌとを混ぜ混合液を調製する。当該混合液にエレクトロポレーション装置（ＥＣＭ６３０、ＢＴＸ）を用いてパルスを加えた後、ＭＤ寒天培地（１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０−５％ビオチン、２％グルコース、３００μｇ／ｍｌゼオシン、２％寒天、）上に広げ、３０℃にて４８時間培養する。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換体として単離する。
【０１５１】
（３−１１−２）  HSP４７の発現検討
得られた形質転換体を、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐH６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０−５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌して、３０℃にて２４時間振とう培養する。得られた培養液から菌体を調製し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した５０ｍｌのBMM培地［１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％ イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０−５%ビオチン、０．５％メタノール］にＯＤ６６０＝約１０の終濃度で植菌し、３０℃にて７２時間振とう培養する。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加する。
前記培養液から菌体を回収して上清を取り除いた後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用い、酵母破砕条件（ガラスビーズ直径０．５ｍｍ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて菌体を破砕する。得られた破砕液を遠心分離して菌体破砕液の上清を回収し、可溶性画分を調製する。
前記可溶性画分をサンプルバッファー（ナカライテスク）と混合し、１００℃で５分間保温した後、SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動する。電気泳動装置はERICA-MP（DRC）、電子泳動ゲルは５〜１５％グラジェントゲル（XV  PANTERA  MPゲル、DRC）を用い、２００Vで２０分間電気泳動する。電気泳動終了後、得られたアクリルアミドゲルを、ＰＶＤＦメンブレン（イモビロン−Ｐ、ミリポア）にエレクトロブロッティングする。ブロッティング装置はMINICA-MP（DRC）を用い、４０Vで３０分間行う。
得られたメンブランを用いてウェスタンブロッティングを行い、HSP４７を検出する。メンブランのブロッキングにはBlocking one（ナカライテスク）、抗体反応にはCan Get Signal（東洋紡）を用い、一次抗体は抗ヒトHSP４７マウス抗体（ＳＰＡ−４７０、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）を２０００倍希釈に、二次抗体は坑マウス IgG-HRP Linked ヒツジ抗体（NA-931、GEヘルスケアバイオサイエンス）を５０００倍希釈に調製して用いる。二次抗体の検出はECL Western Blotting Detection System（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用い化学発光で行う。化学発光はイメージアナライザー（LAS-3000UVmini、富士フィルム）で検出・定量する。
【０１５２】
実施例４  （コラーゲンの調製）（その１）
（４−１）  酵母の培養及び菌体の調製（その１）
０８０３１１−３−３株（実施例（３−５−１）参照）、０８０３１１−１−１３株（実施例（３−５−１）参照）、及び、０５０８１８−３−１株（実施例（３−３−１）参照）を５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐH６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０−５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌し、３０℃にて振とう培養し、２４時間前培養を行った。
３Ｌ容量のファーメンター（型式：BMS-03P1、エイブル）に０．８ＬのＢａｓａｌ  ｓａｌｔ培地を調製した。前培養液を終濃度ＯＤ６６０＝約１．２５となる様に植菌し、通気攪拌して本培養を開始した。
本培養は、培養温度３０℃、最大通気量を０．８ｖｖｍ（０．８Ｌ）、攪拌速度８００pmに設定して開始した。培地中のグリセロールがすべて消費され、酸素消費量が低下した時点より、約１５g/hの速度でグリセロール流加培地（５０％グリセロール、１．２％PMT１溶液）の流加を開始した。グリセロール流加は培養液のＯＤ６６０＝約１３０となった時点で停止した。その後、メタノール流加培地［９８．６％（Ｗ／Ｖ）メタノール、１．２％ＰＭＴ１溶液］の添加を開始しメタノール流加培養を行った。メタノール流加開始後、培養温度を３２℃に変更し、溶存酸素量を約８ｐｐｍとなるよう制御した。また、培養期間を通じて培養液のｐＨは２８％アンモニア水、及び、４Ｍリン酸を用いてｐＨ＝約５．０に定値制御した。約１３６時間の培養により、０８０３１１−３−３株の培養液が１５７４ｇ、０８０３１１−１−１３株の培養液が１５０２ｇ、０５０８１８−３−１株の培養液が１５１８ｇ得られた。以下に用いた培地の組成を示す。
（Ｂａｓａｌ  ｓａｌｔ培地の組成）
（ａ）８５％Ｈ３ＰＯ４  ・・・２６．７ｍＬ／Ｌ
（ｂ）ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ  ・・・０．９３ｇ／Ｌ
（ｃ）Ｋ２ＳＯ４  ・・・１８．２ｇ／Ｌ
（ｄ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ・・・１４．９ｇ／Ｌ
（ｅ）ＫＯＨ  ・・・４．１３ｇ／Ｌ
（ｆ）グリセロール  ・・・４０ｇ／Ｌ
前記成分を混合後、オートクレーブ滅菌した。２８％アンモニア水でｐＨを５．０に調製した後、ＰＭＴ１溶液を培地１L当り２ｍｌ、消泡剤メタノール溶液（１２．５％アデカノールＬＧ２９５Ｓ）を培地１L当り１ｍ添加した。
（ＰＭＴ１溶液の組成）
（ａ）ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ・・・６．０ｇ／Ｌ
（ｂ）ＫＩ  ・・・０．８ｇ／Ｌ
（ｃ）ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ  ・・・３．０ｇ／Ｌ
（ｄ）Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ・・・０．２ｇ／Ｌ
（ｅ）Ｈ３ＢＯ３  ・・・０．２ｇ
（ｆ）ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ  ・・・０．５ｇ／Ｌ
（ｇ）ＺｎＣｌ２  ・・・２０ｇ／Ｌ
（ｈ）ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ・・・６５ｇ／Ｌ
（ｉ）ビオチン  ・・・０．２ｇ／Ｌ
（ｊ）濃硫酸  ・・・５ｍL／Ｌ
得られた培養液を５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して菌体を回収した。培地成分を取り除くため、得られた菌体をリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）に懸濁した後、懸濁液を遠心分離して菌体を回収した。この作業を合計２回繰り返し、菌体を調製した。０８０３１１−３−３株の菌体が６１８ｇ、０８０３１１−１−１３株の菌体が６１２ｇ、０５０８１８−３−１株の菌体が６００ｇ得られた。
【０１５３】
（４−２）  コラーゲンの抽出・精製（その１）
０８０３１１−３−３株（実施例（４−１）参照）の菌体６００ｇ、０８０３１１−１−１３株（実施例（４−１）参照）の菌体６００ｇ、及び、０５０８１８−３−１株（実施例（４−１）参照）の菌体６００ｇを破砕してコラーゲンを抽出・精製した。菌体の破砕はダイノミル（DYNO-MILL TypeKDL-A、WILLY A.BACHOFEN AG製）を用いて行った。
前記菌体を２０％（W/W）の濃度でリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）に懸濁し、懸濁液を調製した。送液ポンプを用いて、酵母用の条件に設定したダイノミルに前記懸濁液を４０００g／時間の速度で送り込んで懸濁液を破砕した。
リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）を加えて菌体破砕液の濃度を１／２に希釈した。終濃度０．２Nで濃塩酸を用えてｐＨを強酸性（ｐH１．５以下）に調整した。終濃度５ｍｇ／ｍｌとなるようペプシン（Ｐ７０００、SIGMA）を添加した後、前記菌体破砕液を攪拌しながら４℃で保温した。約９６時間後、前記菌体破砕液を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製した。前記上清に１０ＮのＮａＯＨを添加してｐＨを約１０に調整した後、攪拌しながら４℃で保温した。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製した。
前記上清に終濃度０．５Ｍとなるように酢酸を添加し、濃塩酸を用いてｐＨを３．０に調整した後、攪拌しながら４℃で保温した。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製した。得られた上清に終濃度１ＭでＮａＣｌを溶解した後、攪拌しながら４℃に保温した。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を回収した。前記不溶性の画分に０．１NのＨＣｌを添加した後、攪拌しながら４℃で保温して溶解液を調製した。約１６時間後、前記溶解液を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製した。
前記上清に終濃度が０．０５Ｍとなるように１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を添加した後、１０ＮのＮａＯＨを用いてｐＨを約７．４に調整した。終濃度２ＭでＮａＣｌを溶解した後、攪拌しながら４℃で保温した。約１６時間後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離して不溶性の画分を回収した。得られた不溶性の画分に０．１NＨＣｌを添加した後、攪拌しながら４℃で保温して溶解液を調製した。約１６時間後、前記溶解液を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製した。
得られた上清に終濃度が０．５Ｍとなるように酢酸を添加し、濃塩酸を用いてｐＨを約３．０に調整した。前記上清に終濃度１ＭでＮａＣｌを溶解した後、攪拌しながら４℃で保温した。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離して、不溶性の画分を回収した。前記不溶性の画分に０．１ＮのＨＣｌを添加した後、攪拌しながら４℃で保温して溶解液を調製した。約１６時間後、前記溶解液を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製した。
得られた上清を透析チューブ（Spectra/Por  １３２６６５、SPECTUM  LABORATORIES）に入れ、１０倍容量の１ｍＭ  ＨＣｌ溶液に対する透析を３回行なった後、０．２２μｍのフィルター（Millex GP、ミリポア）を用いてろ過した。０８０３１１−３−３株の菌体から１４１．５ｇ、０８０３１１−１−１３株の菌体から１６９．６ｇ、０５０８１８−３−１株の菌体から１８０．９ｇの精製コラーゲン溶液が得られた。
【０１５４】
実施例５  （精製コラーゲン溶液の分析）（その１）
（５−１）  精製コラーゲン溶液のコラーゲンTypeIII濃度測定（その１）
ヒトコラーゲンTypeIIIをFibroGenより入手した。BCAプロテインアッセイキット（Thermo  Fisher  Scientific）を用い、ヒトコラーゲンTypeIIIを標品として精製コラーゲン溶液のウシコラーゲンTypeIII濃度を測定した。０８０３１１−３−３株（実施例（４−１）参照）の菌体から得られた精製コラーゲン溶液のコラーゲンTypeIII濃度は５．２６ｍｇ／ｍｌ、０８０３１１−１−１３株（実施例（４−１）参照）の菌体から得られた精製コラーゲン溶液のコラーゲンTypeIII濃度は５．０２ｍｇ／ｍｌ、０５０８１８−３−１株（実施例（４−１）参照）の菌体から得られた精製コラーゲン溶液のコラーゲンTypeIII濃度は４．２６ｍｇ／ｍｌであった。
【０１５５】
（５−２）  フェノール・硫酸法による中性糖数の定量（その１）
６．２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、２５．０μｇ／ｍｌ、５０．０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌのマンノース水溶液を調製した。ガラス試験管に、０．２ｇの前記マンノース水溶液または精製コラーゲン溶液を分取した。０．２ｍｌの５％（Ｗ／Ｗ）のフェノール水溶液を加えて混合した後、1mlの濃硫酸を滴下した。室温に40分間静置して呈色させた後、吸光度（OD４９０）を測定した。マンノース溶液の吸光度から検量線を作成し、検量線から精製コラーゲン溶液の中性糖濃度をマンノース換算の値として算出した。得られた値から、コラーゲンTypeIII  １分子あたりの中性糖数を算出した。マンノースの分子量は１８０、コラーゲンTypeIIIの分子量は２８５８４０として算出を行った。０８０３１１−３−３株の菌体から得られた精製コラーゲン溶液では中性糖数は１０．８、、０８０３１１−１−１３株の菌体から得られた精製コラーゲン溶液では中性糖数は１０．２、０５０８１８−３−１株の菌体から得られた精製コラーゲン溶液では中性糖数は１２．５であった。
【０１５６】
実施例６  （コラーゲンの調製）（その２）
（６−１）  酵母の培養及び菌体の調製（その２）
０８０３１１−３−３株（実施例（３−５−１）参照）、０８０３１１−４−２株（実施例（３−５−１）参照）、０８０３１１−１−１３株（実施例（３−５−１）参照）、０８０３１１−２−２株（実施例（３−５−１）参照）、０５０８１８−３−１株（実施例（３−３−１）参照）を５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐH６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０−５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌し、３０℃にて振とう培養し、２４時間前培養を行った。
３Ｌ容量のファーメンター（型式：BMS-03P1、エイブル）に０．８ＬのＢａｓａｌ  ｓａｌｔ培地を調製した。前培養液を終濃度ＯＤ６６０＝約１．２５となる様に植菌し、通気攪拌して本培養を開始した。
本培養は、培養温度３０℃、最大通気量を０．８ｖｖｍ（０．８Ｌ）、攪拌速度８００pmに設定して開始した。培地中のグリセロールがすべて消費され、酸素消費量が低下した時点より、約１５g/hの速度でグリセロール流加培地（５０％グリセロール、１．２％PMT１溶液）の流加を開始した。グリセロール流加は培養液のＯＤ６６０＝約１３０となった時点で停止した。その後、メタノール流加培地［９８．６％（Ｗ／Ｖ）メタノール、１．２％ＰＭＴ１溶液］の添加を開始しメタノール流加培養を行った。メタノール流加開始後、培養温度を３２℃に変更し、溶存酸素量を約８ｐｐｍとなるよう制御した。また、培養期間を通じて培養液のｐＨは２８％アンモニア水、及び、４Ｍリン酸を用いてｐＨ＝約５．０に定値制御した。約１３６時間の培養により、０８０３１１−３−３株の培養液が１３５９ｇ、０８０３１１−４−２株の培養液が１４１７ｇ、０８０３１１−１−１３株の培養液が１４４６ｇ、０８０３１１−２−２株の培養液が１４４３ｇ、０５０８１８−３−１株の培養液が１３８５ｇ得られた。以下に用いた培地の組成を示す。
（Ｂａｓａｌ  ｓａｌｔ培地の組成）
（ａ）８５％Ｈ３ＰＯ４  ・・・２６．７ｍＬ／Ｌ
（ｂ）ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ  ・・・０．９３ｇ／Ｌ
（ｃ）Ｋ２ＳＯ４  ・・・１８．２ｇ／Ｌ
（ｄ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ・・・１４．９ｇ／Ｌ
（ｅ）ＫＯＨ  ・・・４．１３ｇ／Ｌ
（ｆ）グリセロール  ・・・４０ｇ／Ｌ
前記成分を混合後、オートクレーブ滅菌した。２８％アンモニア水でｐＨを５．０に調製した後、ＰＭＴ１溶液を培地１L当り２ｍｌ、消泡剤メタノール溶液（１２．５％アデカノールＬＧ２９５Ｓ）を培地１L当り１ｍ添加した。
（ＰＭＴ１溶液の組成）
（ａ）ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ・・・６．０ｇ／Ｌ
（ｂ）ＫＩ  ・・・０．８ｇ／Ｌ
（ｃ）ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ  ・・・３．０ｇ／Ｌ
（ｄ）Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ・・・０．２ｇ／Ｌ
（ｅ）Ｈ３ＢＯ３  ・・・０．２ｇ
（ｆ）ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ  ・・・０．５ｇ／Ｌ
（ｇ）ＺｎＣｌ２  ・・・２０ｇ／Ｌ
（ｈ）ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ・・・６５ｇ／Ｌ
（ｉ）ビオチン  ・・・０．２ｇ／Ｌ
（ｊ）濃硫酸  ・・・５ｍL／Ｌ
得られた培養液を５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して菌体を回収した。培地成分を取り除くため、得られた菌体をリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）に懸濁した後、懸濁液を遠心分離して菌体を回収した。この作業を合計２回繰り返し、菌体を調製した。０８０３１１−３−３株の菌体が５９０ｇ、０８０３１１−４−２株の菌体が５９０ｇ、０８０３１１−１−１３株の菌体が５９３ｇ、０８０３１１−２−２株の菌体が５９５ｇ、０５０８１８−３−１株の菌体が６０２ｇ得られた。
【０１５７】
（６−２）  コラーゲンの抽出・精製（その２）
０８０３１１−３−３株（実施例（６−１）参照）の菌体５９０ｇ、０８０３１１−４−２株（実施例（６−１）参照）の菌体５９０ｇ、０８０３１１−１−１３株（実施例（６−１）参照）の菌体が５９３ｇ、０８０３１１−２−２株（実施例（６−１）参照）の菌体が５９５ｇ、及び、０５０８１８−３−１株（実施例（６−１）参照）の菌体６００ｇを破砕してコラーゲンを抽出・精製した。菌体の破砕はダイノミル（DYNO-MILL TypeKDL-A、WILLY A.BACHOFEN AG製）を用いて行った。
前記菌体を２０％（W/W）の濃度でリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）に懸濁し、懸濁液を調製した。送液ポンプを用いて、酵母用の条件に設定したダイノミルに前記懸濁液を４０００g／時間の速度で送り込んで懸濁液を破砕した。
リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）を加えて菌体破砕液の濃度を１／２に希釈した。終濃度０．２Nで濃塩酸を用えてｐＨを強酸性（ｐH１．５以下）に調整した。終濃度５ｍｇ／ｍｌとなるようペプシン（Ｐ７０００、シグマ）を添加した後、前記菌体破砕液を攪拌しながら４℃で保温した。約９６時間後、前記菌体破砕液を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製した。前記上清に１０ＮのＮａＯＨを添加してｐＨを約１０に調整した後、攪拌しながら４℃で保温した。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製した。
前記上清に終濃度０．５Ｍとなるように酢酸を添加し、濃塩酸を用いてｐＨを３．０に調整した後、攪拌しながら４℃で保温した。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製した。得られた上清に終濃度１ＭでＮａＣｌを溶解した後、攪拌しながら４℃に保温した。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を回収した。前記不溶性の画分に０．１NのＨＣｌを添加した後、攪拌しながら４℃で保温して溶解液を調製した。約１６時間後、前記溶解液を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製した。
前記上清に終濃度が０．０５Ｍとなるように１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を添加した後、１０ＮのＮａＯＨを用いてｐＨを約７．４に調整した。終濃度２ＭでＮａＣｌを溶解した後、攪拌しながら４℃で保温した。約１６時間後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離して不溶性の画分を回収した。得られた不溶性の画分の重量の２．８倍の重量の０．１NＨＣｌを添加した後、攪拌しながら４℃で保温した。約１６時間後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離して不溶性の画分を回収した。得られた不溶性の画分に０．１NのＨＣｌを添加して攪拌しながら４℃で保温して溶解液を調製した。約１６時間後、前記溶解液を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製した。
得られた上清に終濃度が０．５Ｍとなるように酢酸を添加し、濃塩酸を用いてｐＨを約３．０に調整した。前記上清に終濃度１ＭでＮａＣｌを溶解した後、攪拌しながら４℃で保温した。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離して、不溶性の画分を回収した。前記不溶性の画分に０．１Ｎの ＨＣｌを添加した後、攪拌しながら４℃で保温して溶解液を調製した。
得られた溶解液を透析チューブ（Spectra/Por  １３２６６５、SPECTUM  LABORATORIE）に入れ、１０倍量の１ｍＭ  ＨＣｌ溶液に対する透析を３回行なった後、０．２２μｍのフィルター（Millex GP、ミリポア）を用いてろ過した。０８０３１１−３−３株の菌体から１８．９ｇ、０８０３１１−４−２株の菌体から１５．９ｇ、０８０３１１−１−１３株の菌体から２７．４ｇ、０８０３１１−２−２株の菌体から２０．３ｇ、０５０８１８−３−１株の菌体から２４．６ｇの精製コラーゲン溶液が得られた。
【０１５８】
実施例７  （精製コラーゲン溶液の分析）（その２）
（７−１）  精製コラーゲン溶液のコラーゲンTypeIII濃度測定（その２）
ヒトコラーゲンTypeIIIをFibroGenより入手した。BCAプロテインアッセイキット（Thermo  Fisher  Scientific）を用い、ヒトコラーゲンTypeIIIを標品として精製コラーゲン溶液のウシコラーゲンTypeIII濃度を測定した。０８０３１１−３−３株の菌体から得られた精製コラーゲン溶液のコラーゲンTypeIII濃度は６．７０ｍｇ／ｍｌ、０８０３１１−４−２株の菌体から得られた精製コラーゲン溶液のコラーゲンTypeIII濃度は８．２５ｍｇ／ｍｌ、０８０３１１−１−１３株の菌体から得られた精製コラーゲン溶液のコラーゲンTypeIII濃度は７．３３ｍｇ／ｍｌ、０８０３１１−２−２株の菌体から得られた精製コラーゲン溶液のコラーゲンTypeIII濃度は６．８２ｍｇ／ｍｌ、０５０８１８−３−１株（実施例（４−１）参照）の菌体から得られた精製コラーゲン溶液のコラーゲンTypeIII濃度は７．１３ｍｇ／ｍｌであった。
【０１５９】
（７−２）  フェノール・硫酸法による中性糖数の定量（その２）
６．２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、２５．０μｇ／ｍｌ、５０．０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌのマンノース水溶液を調製した。ガラス試験管に、０．２ｇの前記マンノース水溶液または精製コラーゲン溶液を分取した。０．２ｍｌの５％（Ｗ／Ｗ）のフェノール水溶液を加えて混合した後、1mlの濃硫酸を滴下した。室温に40分間静置して呈色させた後、吸光度（OD４９０）を測定した。マンノース溶液の吸光度から検量線を作成し、検量線から精製コラーゲン溶液の中性糖濃度をマンノース換算の値として算出した。得られた値から、コラーゲンTypeIII  １分子あたりの中性糖数を算出した。マンノースの分子量は１８０、コラーゲンTypeIIIの分子量は２８５８４０として算出を行った。０８０３１１−３−３株の菌体から得られた精製コラーゲン溶液では中性糖数は７．４、８０３１１−４−２株の菌体から得られた精製コラーゲン溶液では中性糖数は９．１、０８０３１１−１−１３株の菌体から得られた精製コラーゲン溶液では中性糖数は６．５、０８０３１１−２−２株の菌体から得られた精製コラーゲン溶液では中性糖数は１０．８、０５０８１８−３−１株の菌体から得られた精製コラーゲン溶液では中性糖数は１２．０であった。
【０１６０】
実施例８  （コラーゲンの調製）（その３）
（８−１）  酵母の培養及び菌体の調製（その３）
ウシコラーゲンＴｙｐｅIIIα１発現カセット、及び、HSP４７発現カセット導入酵母（実施例（３−４−１）参照）を５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐH６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０−５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌し、３０℃にて振とう培養し、２４時間前培養を行う。
３Ｌ容量のファーメンター（型式：BMS-03P1、エイブル）に０．８ＬのＢａｓａｌ  ｓａｌｔ培地を調製する。前培養液を終濃度ＯＤ６６０＝約１．２５となる様に植菌し、通気攪拌して本培養を開始する。
本培養は、培養温度３０℃、最大通気量を０．８ｖｖｍ（０．８Ｌ）、攪拌速度８００pmに設定して開始する。培地中のグリセロールがすべて消費され、酸素消費量が低下した時点より、約１５g/hの速度でグリセロール流加培地（５０％グリセロール、１．２％PMT１溶液）の流加を開始する。グリセロール流加は培養液のＯＤ６６０＝約１３０となった時点で停止する。その後、メタノール流加培地［９８．６％（Ｗ／Ｖ）メタノール、１．２％ＰＭＴ１溶液］の添加を開始しメタノール流加培養を行う。メタノール流加開始後、培養温度を２０℃に変更し、溶存酸素量を約８ｐｐｍとなるよう制御する。また、培養期間を通じて培養液のｐＨは２８％アンモニア水、及び、４Ｍリン酸を用いてｐＨ＝約５．０に定値制御する。約１３６時間の培養により、培養液を得る。以下に用いる培地の組成を示す。
（Ｂａｓａｌ  ｓａｌｔ培地の組成）
（ａ）８５％Ｈ３ＰＯ４  ・・・２６．７ｍＬ／Ｌ
（ｂ）ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ  ・・・０．９３ｇ／Ｌ
（ｃ）Ｋ２ＳＯ４  ・・・１８．２ｇ／Ｌ
（ｄ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ・・・１４．９ｇ／Ｌ
（ｅ）ＫＯＨ  ・・・４．１３ｇ／Ｌ
（ｆ）グリセロール  ・・・４０ｇ／Ｌ
前記成分を混合後、オートクレーブ滅菌する。２８％アンモニア水でｐＨを５．０に調製した後、ＰＭＴ１溶液を培地１L当り２ｍｌ、消泡剤メタノール溶液（１２．５％アデカノールＬＧ２９５Ｓ）を培地１L当り１ｍ添加する。
（ＰＭＴ１溶液の組成）
（ａ）ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ・・・６．０ｇ／Ｌ
（ｂ）ＫＩ  ・・・０．８ｇ／Ｌ
（ｃ）ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ  ・・・３．０ｇ／Ｌ
（ｄ）Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ・・・０．２ｇ／Ｌ
（ｅ）Ｈ３ＢＯ３  ・・・０．２ｇ
（ｆ）ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ  ・・・０．５ｇ／Ｌ
（ｇ）ＺｎＣｌ２  ・・・２０ｇ／Ｌ
（ｈ）ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ・・・６５ｇ／Ｌ
（ｉ）ビオチン  ・・・０．２ｇ／Ｌ
（ｊ）濃硫酸  ・・・５ｍL／Ｌ
得られた培養液を５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して菌体を回収する。培地成分を取り除くため、得られた菌体をリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）に懸濁した後、懸濁液を遠心分離して菌体を回収する。この作業を合計２回繰り返し、菌体を調製する。
【０１６１】
（８−２）  コラーゲンの抽出・精製（その３）
ウシコラーゲンＴｙｐｅIIIα１発現カセット、及び、HSP４７発現カセット導入酵母（実施例（８−１）参照）の菌体を破砕してコラーゲンを抽出・精製する。菌体の破砕はダイノミル（DYNO-MILL TypeKDL-A、WILLY A.BACHOFEN AG製）を用いて行う。
前記菌体を２０％（W/W）の濃度でリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）に懸濁し、懸濁液を調製する。送液ポンプを用いて、酵母用の条件に設定したダイノミルに前記懸濁液を４０００g／時間の速度で送り込んで懸濁液を破砕する。
リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）を加えて菌体破砕液の濃度を１／２に希釈する。終濃度０．２Nで濃塩酸を用えてｐＨを強酸性（ｐH１．５以下）に調整する。終濃度５ｍｇ／ｍｌとなるようペプシン（Ｐ７０００、SIGMA）を添加した後、前記菌体破砕液を攪拌しながら４℃で保温する。約９６時間後、前記菌体破砕液を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製する。前記上清に１０ＮのＮａＯＨを添加してｐＨを約１０に調整した後、攪拌しながら４℃で保温する。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製する。
前記上清に終濃度０．５Ｍとなるように酢酸を添加し、濃塩酸を用いてｐＨを３．０に調整した後、攪拌しながら４℃で保温する。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製する。得られた上清に終濃度１ＭでＮａＣｌを溶解した後、攪拌しながら４℃に保温する。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を回収する。前記不溶性の画分に０．１NのＨＣｌを添加した後、攪拌しながら４℃で保温して溶解液を調製する。約１６時間後、前記溶解液を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製する。
前記上清に終濃度が０．０５Ｍとなるように１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を添加した後、１０ＮのＮａＯＨを用いてｐＨを約７．４に調整する。終濃度２ＭでＮａＣｌを溶解した後、攪拌しながら４℃で保温する。約１６時間後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離して不溶性の画分を回収する。得られた不溶性の画分に０．１NＨＣｌを添加した後、攪拌しながら４℃で保温して溶解液を調製する。約１６時間後、前記溶解液を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製する。
得られた上清に終濃度が０．５Ｍとなるように酢酸を添加し、濃塩酸を用いてｐＨを約３．０に調整する。前記上清に終濃度１ＭでＮａＣｌを溶解した後、攪拌しながら４℃で保温する。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離して、不溶性の画分を回収する。前記不溶性の画分に０．１ＮのＨＣｌを添加した後、攪拌しながら４℃で保温して溶解液を調製する。約１６時間後、前記溶解液を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製する。
得られた上清を透析チューブ（Spectra/Por  １３２６６５、SPECTUM  LABORATORIES）に入れ、１０倍容量の１ｍＭ  ＨＣｌ溶液に対する透析を３回行なった後、０．２２μｍのフィルター（Millex GP、ミリポア）を用いてろ過することにより精製コラーゲン溶液を得る。
【０１６２】
実施例９  （精製コラーゲン溶液の分析）（その３）
（９−１）  精製コラーゲン溶液のコラーゲンTypeIII濃度測定（その３）
ヒトコラーゲンTypeIIIをFibroGenより入手する。BCAプロテインアッセイキット（Thermo  Fisher  Scientific）を用い、ヒトコラーゲンTypeIIIを標品として精製コラーゲン溶液のウシコラーゲンTypeIII濃度を測定する。
【０１６３】
（９−２）  フェノール・硫酸法による中性糖数の定量（その３）
６．２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、２５．０μｇ／ｍｌ、５０．０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌのマンノース水溶液を調製する。ガラス試験管に、０．２ｇの前記マンノース水溶液または精製コラーゲン溶液を分取する。０．２ｍｌの５％（Ｗ／Ｗ）のフェノール水溶液を加えて混合した後、1mlの濃硫酸を滴下する。室温に40分間静置して呈色させた後、吸光度（OD４９０）を測定する。マンノース溶液の吸光度から検量線を作成し、検量線から精製コラーゲン溶液の中性糖濃度をマンノース換算の値として算出する。得られた値から、コラーゲン  １分子あたりの中性糖数を算出する。
【０１６４】
実施例１０  （コラーゲンの調製）（その４）
（１０−１）  酵母の培養及び菌体の調製（その４）
プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２発現カセット、並びに、HSP４７発現カセット導入酵母（実施例（３−９−１）参照）、プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域６０残基、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域６０残基、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、並びに、HSP４７発現カセット導入酵母（実施例（３−１０−１）参照）、プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、並びに、HSP４７発現カセット導入酵母（実施例（３−１１−１）参照）をを５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに調製した１００ｍｌのＢＭＧＹ培地[１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐH６．０）、１．３４％イーストナイトロジェンベース（Difco）、４×１０−５％ビオチン、１％グリセロール]に植菌し、３０℃にて振とう培養し、２４時間前培養を行う。
３Ｌ容量のファーメンター（型式：BMS-03P1、エイブル）に０．８ＬのＢａｓａｌ  ｓａｌｔ培地を調製する。前培養液を終濃度ＯＤ６６０＝約１．２５となる様に植菌し、通気攪拌して本培養を開始する。
本培養は、培養温度３０℃、最大通気量を０．８ｖｖｍ（０．８Ｌ）、攪拌速度８００pmに設定して開始する。培地中のグリセロールがすべて消費され、酸素消費量が低下した時点より、約１５g/hの速度でグリセロール流加培地（５０％グリセロール、１．２％PMT１溶液）の流加を開始する。グリセロール流加は培養液のＯＤ６６０＝約１３０となった時点で停止する。その後、メタノール流加培地［９８．６％（Ｗ／Ｖ）メタノール、１．２％ＰＭＴ１溶液］の添加を開始しメタノール流加培養を行う。メタノール流加開始後、培養温度を３２℃に変更し、溶存酸素量を約８ｐｐｍとなるよう制御する。また、培養期間を通じて培養液のｐＨは２８％アンモニア水、及び、４Ｍリン酸を用いてｐＨ＝約５．０に定値制御する。約１３６時間の培養により培養液を得る。以下に用いた培地の組成を示す。
（Ｂａｓａｌ  ｓａｌｔ培地の組成）
（ａ）８５％Ｈ３ＰＯ４  ・・・２６．７ｍＬ／Ｌ
（ｂ）ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ  ・・・０．９３ｇ／Ｌ
（ｃ）Ｋ２ＳＯ４  ・・・１８．２ｇ／Ｌ
（ｄ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ・・・１４．９ｇ／Ｌ
（ｅ）ＫＯＨ  ・・・４．１３ｇ／Ｌ
（ｆ）グリセロール  ・・・４０ｇ／Ｌ
前記成分を混合後、オートクレーブ滅菌する。２８％アンモニア水でｐＨを５．０に調製した後、ＰＭＴ１溶液を培地１L当り２ｍｌ、消泡剤メタノール溶液（１２．５％アデカノールＬＧ２９５Ｓ）を培地１L当り１ｍ添加する。
（ＰＭＴ１溶液の組成）
（ａ）ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ・・・６．０ｇ／Ｌ
（ｂ）ＫＩ  ・・・０．８ｇ／Ｌ
（ｃ）ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ  ・・・３．０ｇ／Ｌ
（ｄ）Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ・・・０．２ｇ／Ｌ
（ｅ）Ｈ３ＢＯ３  ・・・０．２ｇ
（ｆ）ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ  ・・・０．５ｇ／Ｌ
（ｇ）ＺｎＣｌ２  ・・・２０ｇ／Ｌ
（ｈ）ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ・・・６５ｇ／Ｌ
（ｉ）ビオチン  ・・・０．２ｇ／Ｌ
（ｊ）濃硫酸  ・・・５ｍL／Ｌ
得られた培養液を５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して菌体を回収する。培地成分を取り除くため、得られた菌体をリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）に懸濁した後、懸濁液を遠心分離して菌体を回収する。この作業を合計２回繰り返し、０５０８１８−３−１株の菌体を調製する。
【０１６５】
（１０−２）  コラーゲンの抽出・精製（その４）
プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２発現カセット、並びに、HSP４７発現カセット導入酵母（実施例（８−１）参照）の菌体、プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域６０残基、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域６０残基、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、並びに、HSP４７発現カセット導入酵母（実施例（８−１）参照）の菌体、プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現カセット、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のＮ末端ノンへリックス領域、N末端側ヘリックス領域２７残基、ヘリックス領域中央５２２残基２量体、C末端側ヘリックス領域１５残基、及び、C末端ノンへリックス領域からなる融合ポリペプチド発現カセット、並びに、HSP４７発現カセット導入酵母（実施例（８−１）参照）の菌体を破砕してコラーゲンを抽出・精製する。菌体の破砕はダイノミル（DYNO-MILL TypeKDL-A、WILLY A.BACHOFEN AG製）を用いて行う。
前記菌体を２０％（W/W）の濃度でリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）に懸濁し、懸濁液を調製する。送液ポンプを用いて、酵母用の条件に設定したダイノミルに前記懸濁液を４０００g／時間の速度で送り込んで懸濁液を破砕する。
リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）を加えて菌体破砕液の濃度を１／２に希釈する。終濃度０．２Nで濃塩酸を用えてｐＨを強酸性（ｐH１．５以下）に調整する。終濃度５ｍｇ／ｍｌとなるようペプシン（Ｐ７０００、シグマ）を添加した後、前記菌体破砕液を攪拌しながら４℃で保温する。約９６時間後、前記菌体破砕液を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製する。得られた上清に１０ＮのＮａＯＨを添加してｐＨを約１０に調整した後、攪拌しながら４℃で保温する。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製する。
前記上清に終濃度０．５Ｍとなるように酢酸を添加し、濃塩酸を用いてｐＨを３．０に調整した後、攪拌しながら４℃で保温する。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製する。得られた上清に終濃度１ＭでＮａＣｌを溶解した後、攪拌しながら４℃に保温する。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を回収する。前記不溶性の画分に０．１NのＨＣｌを添加した後、攪拌しながら４℃で保温して溶解液を調製する。約１６時間後、前記溶解液を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製する。
前記上清に終濃度が０．０５Ｍとなるように１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を添加した後、１０ＮのＮａＯＨを用いてｐＨを約７．４に調整する。終濃度４ＭでＮａＣｌを溶解した後、攪拌しながら４℃で保温する。約１６時間後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離して不溶性の画分を回収する。得られた不溶性の画分に０．１NＨＣｌを添加した後、攪拌しながら４℃で保温して溶解液を調製する。約１６時間後、前記溶解液を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製する。
得られた上清に終濃度が０．５Ｍとなるように酢酸を添加し、濃塩酸を用いてｐＨを約３．０に調整する。前記上清に終濃度２ＭでＮａＣｌを溶解した後、攪拌しながら４℃で保温する。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離して、不溶性の画分を回収する。前記不溶性の画分に０．１Ｎの ＨＣｌを添加した後、攪拌しながら４℃で保温して溶解液を調製する。
得られた溶解液を透析チューブ（Spectra/Por  １３２６６５、SPECTUM  LABORATORIE）に入れ、１０倍量の１ｍＭ  ＨＣｌ溶液に対する透析を３回行った後、０．２２μｍのフィルター（Millex GP、ミリポア）を用いてろ過することにより精製コラーゲン溶液を得る。
【０１６６】
実施例１１  （精製コラーゲン溶液の分析）（その４）
（１１−１）  精製コラーゲン溶液のコラーゲン濃度測定（その４）
ヒトコラーゲンTypeIをFibroGenより入手する。BCAプロテインアッセイキット（Thermo  Fisher  Scientific）を用い、ヒトコラーゲンTypeIを標品として精製コラーゲン溶液のコラーゲン濃度を測定する。
【０１６７】
（１１−２）  フェノール・硫酸法による中性糖数の定量（その４）
６．２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、２５．０μｇ／ｍｌ、５０．０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌのマンノース水溶液を調製する。ガラス試験管に、０．２ｇの前記マンノース水溶液または精製コラーゲン溶液を分取する。０．２ｍｌの５％（Ｗ／Ｗ）のフェノール水溶液を加えて混合した後、1mlの濃硫酸を滴下する。室温に40分間静置して呈色させた後、吸光度（OD４９０）を測定する。マンノース溶液の吸光度から検量線を作成し、検量線から精製コラーゲン溶液の中性糖濃度をマンノース換算の値として算出する。得られた値から、コラーゲン  １分子あたりの中性糖数を算出する。
【産業上の利用可能性】
【０１６８】
本発明により、医薬品、工業製品、化粧品、食品等として商業的に一層価値がある高性能な多用途素材となるような新規な中性糖修飾後タンパク質を取得するために利用される方法等が提供可能となる。
【配列表フリーテキスト】
【０１６９】
配列番号：１に記載される塩基配列は、his4のクローニングのためのプライマー
配列番号：２に記載される塩基配列は、his4のクローニングのためのプライマー
配列番号：３に記載される塩基配列は、arg4のクローニングのためのプライマー
配列番号：４に記載される塩基配列は、arg4のクローニングのためのプライマー
配列番号：５に記載される塩基配列は、aox1プロモーターのクローニングのためのプライマー
配列番号：６に記載される塩基配列は、aox1プロモーターのクローニングのためのプライマー
配列番号：７に記載される塩基配列は、per3プロモーターのクローニングのためのプライマー
配列番号：８に記載される塩基配列は、per3プロモーターのクローニングのためのプライマー
配列番号：９に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたper3プロモーターのクローニングのためのプライマー
配列番号：１０に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたper3プロモーターのクローニングのためのプライマー
配列番号：１１に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたaox2プロモーターのクローニングのためのプライマー
配列番号：１２に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたaox2プロモーターのクローニングのためのプライマー
配列番号：１３に記載される塩基配列は、aox1ターミネーターのクローニングのためのプライマー
配列番号：１４に記載される塩基配列は、aox1ターミネーターのクローニングのためのプライマー
配列番号：１５に記載される塩基配列は、aox1 3'非コーディング領域のクローニングのためのプライマー
配列番号：１６に記載される塩基配列は、aox1 3'非コーディング領域のクローニングのためのプライマー
配列番号：１７に記載される塩基配列は、αファクターのクローニングのためのプライマー
配列番号：１８に記載される塩基配列は、αファクターのクローニングのためのプライマー
配列番号：１９に記載される塩基配列は、ウシcol3a1第１半領域のクローニングのためのプライマー
配列番号：２０に記載される塩基配列は、ウシcol3a1第１半領域のクローニングのためのプライマー
配列番号：２１に記載される塩基配列は、ウシcol3a1第２半領域のクローニングのためのプライマー
配列番号：２２に記載される塩基配列は、ウシcol3a1第２半領域のクローニングのためのプライマー
配列番号：２３に記載される塩基配列は、ヒトcol1a1のクローニングのためのプライマー
配列番号：２４に記載される塩基配列は、ヒトcol1a1のクローニングのためのプライマー
配列番号：２５に記載される塩基配列は、ヒトcol1a2のクローニングのためのプライマー
配列番号：２６に記載される塩基配列は、ヒトcol1a2のクローニングのためのプライマー
配列番号：２７に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたaox1ターミネーターのクローニングのためのプライマー
配列番号：２８に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたaox1ターミネーターのクローニングのためのプライマー
配列番号：２９に記載される塩基配列は、psn005構築のためのリンカー１
配列番号：３０に記載される塩基配列は、psn005構築のためのリンカー１
配列番号：３１に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたα遺伝子のシグナル配列及びプロ配列をコードするＤＮＡを含有する発現ベクター構築のためのプライマー
配列番号：３２に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたα遺伝子のシグナル配列及びプロ配列をコードするＤＮＡを含有する発現ベクター構築のためのプライマー
配列番号：３３に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたp4hbのクローニングのためのプライマー
配列番号：３４に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたp4hbのクローニングのためのプライマー
配列番号：３５に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加された発現ユニットのクローニングのためのプライマー
配列番号：３６に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加された発現ユニットのクローニングのためのプライマー
配列番号：３７に記載される塩基配列は、psn007構築のためのリンカー３
配列番号：３８に記載される塩基配列は、psn007構築のためのリンカー３
配列番号：３９に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたp4ha1のクローニングのためのプライマー
配列番号：４０に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたp4ha1のクローニングのためのプライマー
配列番号：４１に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加された発現ユニットのクローニングのためのプライマー
配列番号：４２に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加された発現ユニットのクローニングのためのプライマー
配列番号：４３に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたarg4のクローニングのためのプライマー
配列番号：４４に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたarg4のクローニングのためのプライマー
配列番号：４５に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたhsp47遺伝子のクローニングのためのプライマー
配列番号：４６に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたzeor遺伝子のクローニングのためのプライマー
配列番号：４７に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたzeor遺伝子のクローニングのためのプライマー
配列番号：４８に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたzeor遺伝子のクローニングのためのプライマー
配列番号：４９に記載される塩基配列は、α遺伝子のシグナル配列を含有するhsp47発現ユニット構築のためのプライマー
配列番号：５０に記載される塩基配列は、α遺伝子のシグナル配列を含有するhsp47発現ユニット構築のためのプライマー
配列番号：５１に記載される塩基配列は、α遺伝子のシグナル配列を含有するhsp47発現ユニット構築のためのプライマー
配列番号：５２に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたウシcol3a1のクローニングのためのプライマー
配列番号：５３に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加されたウシcol3a1のクローニングのためのプライマー
配列番号：５４に記載される塩基配列は、his4のクローニングのためのプライマー
配列番号：５５に記載される塩基配列は、his4のクローニングのためのプライマー
配列番号：５６に記載される塩基配列は、aox1 3'非コーディング領域のクローニングのためのプライマー
配列番号：５７に記載される塩基配列は、aox1 3'非コーディング領域のクローニングのためのプライマー
配列番号：５８に記載される塩基配列は、ウシcol3a1 5'末端領域のクローニングのためのプライマー
配列番号：５９に記載される塩基配列は、psn006構築のためのリンカー３
配列番号：６０に記載される塩基配列は、psn006構築のためのリンカー３
配列番号：６１に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加された発現ユニットのクローニングのためのプライマー
配列番号：６２に記載される塩基配列は、制限酵素サイトが付加された発現ユニットのクローニングのためのプライマー
配列番号：６３に記載される塩基配列は、ヒトcol1a1のサブクローニングのためのプライマー
配列番号：６４に記載される塩基配列は、ヒトcol1a1のサブクローニングのためのプライマー
配列番号：６５に記載される塩基配列は、ヒトcol1a2のサブクローニングのためのプライマー
配列番号：６６に記載される塩基配列は、ヒトcol1a2のサブクローニングのためのプライマー
配列番号：６７に記載される塩基配列は、ヒトcol1a1のサブクローニングのためのプライマー
配列番号：６８に記載される塩基配列は、ヒトcol1a1のサブクローニングのためのプライマー
配列番号：６９に記載される塩基配列は、ヒトcol1a1のサブクローニングのためのプライマー
配列番号：７０に記載される塩基配列は、ヒトcol1a1のサブクローニングのためのプライマー
配列番号：７１に記載される塩基配列は、ヒトcol1a1のサブクローニングのためのプライマー
配列番号：７２に記載される塩基配列は、ヒトcol1a2のサブクローニングのためのプライマー
配列番号：７３に記載される塩基配列は、ヒトcol1a2のサブクローニングのためのプライマー
配列番号：７４に記載される塩基配列は、ヒトcol1a2のサブクローニングのためのプライマー
配列番号：７５に記載される塩基配列は、ヒトcol1a2のサブクローニングのためのプライマー
配列番号：７６に記載される塩基配列は、ヒトcol1a2のサブクローニングのためのプライマー
配列番号：８９に記載される塩基配列は、酵母最適化コドンを有するヒトコラーゲンType I α 1前駆体におけるＯＲＦの合成ＤＮＡ
配列番号：９２に記載される塩基配列は、酵母最適化コドンを有するヒトコラーゲンType I α 2前駆体におけるＯＲＦの合成ＤＮＡ
配列番号：９５に記載される塩基配列は、酵母最適化コドンを有するヒトコラーゲンType III α 1前駆体におけるＯＲＦの合成ＤＮＡ
配列番号：１１４に記載される塩基配列は、ゼオシン（TM）耐性カセットのための合成ＤＮＡ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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