(57)【要約】【課題】公知のマイクロサテライトマーカーでは識別不可能であったヒカリ新世紀を、正確に他品種と区別可能な識別方法を提供する。【解決手段】前記識別方法では、ヒカリ新世紀のｓｄ１遺伝子のエキソン１の塩基配列における２８１番目の塩基を決定する工程、及びマイクロサテライトマーカーを用いて分析する工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される塩基配列の２８１番目の塩基を決定する工程、及びマイクロサテライトマーカーを用いて分析する工程を含むことを特徴とする、ヒカリ新世紀の識別方法。
【請求項２】
配列番号１で表される塩基配列の２８１番目の塩基を決定する工程、及び／又は、マイクロサテライトマーカーを用いて分析する工程が遺伝子増幅法を使用する、請求項１に記載のヒカリ新世紀の識別方法。
【請求項３】
配列番号１で表される塩基配列の２８１番目の塩基を決定する工程、及びマイクロサテライトマーカーを用いて分析する工程を、遺伝子増幅法を使用して同時に行う、請求項２に記載のヒカリ新世紀の識別方法。
【請求項４】
前記マイクロサテライトマーカーとして、ＭＲＧ４６５３、ＭＲＧ６５４５、ＲＭ１５３、ＲＭ２５３、ＭＲＧ５３７５、ＭＲＧ４９３１、ＲＭ２６４、ＲＭ１４４、ＲＭ７２、及びＲＭ６３３３からなる群から選んだ、少なくとも１つのマイクロサテライトマーカーを使用する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の識別方法。
【請求項５】
配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（２８１番目はｔ）において、２８１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列又はその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（２８１番目はｔ）において、１０〜１００の連続した塩基配列からなり、且つ、その３’末端塩基がｔ（２８１番目のｔに対応）であるポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（２８１番目はｔ）において、１０〜１００の連続した塩基配列の相補的塩基配列からなり、且つ、その３’末端塩基がａ（２８１番目のｔに対応）であるポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一塩基多型（single nucleotide polymorphism；ＳＮＰ）とマイクロサテライトマーカーに基づく、イネ品種のヒカリ新世紀の識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
良食味の品種「コシヒカリ」は、１９５６年に品種登録され、１９７９年以降作付け第１位となり、日本で最も消費需要が高い。しかし、コシヒカリは稈が長くて倒伏しやすいため、収穫を困難にして品質低下を招くことが問題であった。
本発明者は、短稈の在来種「十石」を利用してコシヒカリを短稈化した「ヒカリ新世紀」を開発し、２００４年に品種登録された（水稲品種第１２２７３号）。ヒカリ新世紀は、十石の半矮性遺伝子ｓｄ１を戻し交雑によってコシヒカリに導入したものと考えられている。
【０００３】
半矮性遺伝子ｓｄ１は、イネ（Oryza sativa L）のジベレリンＧＡ１の生合成系におけるＣ２０酸化酵素ＧＡ２０ｏｘ−２の欠損型遺伝子で、イネを短稈化する効果がある。非特許文献１〜３には、各種短稈品種におけるｓｄ１遺伝子の変異に関して、エキソン２における一塩基置換による一アミノ酸置換（Ｌｅｕ（２６６）→Ｐｈｅ；品種Ｃａｌｒｏｓｅ７６）、エキソン１−イントロン１−エキソン２に亘る３８３塩基対の欠失（停止コドンが生じる；品種Dee-Geo-Woo-Gen）、エキソン１における一塩基置換による一アミノ酸置換（Ｇｌｙ（９４）→Ｖａｌ；品種十石）が報告されている。
【０００４】
植物品種の鑑別には、簡易性および正確性の観点から、ＳＮＰよりもマイクロサテライトマーカーを利用することが、本願出願時における本技術分野の技術常識であった。
例えば、コシヒカリとの戻し交配を行ったｓｄ１を持つ品種、例えば、「コシヒカリつくばＳＤ１号」や「佐賀１号（ぴかいち）」であっても、マイクロサテライトマーカーによる識別が可能であった。
従って、十石ｓｄ１のＳＮＰが公知であるにもかかわらず、本願出願以前に、それをイネ品種識別に利用する動機づけは全くなく、また、本発明者の知る限りにおいて、本願出願以前に、十石ｓｄ１のＳＮＰをイネ品種識別に用いた報告はなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Spielmeyer, W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2002, vol. 99, no. 13, p. 9043-9048
【非特許文献２】Monna, L. et al., DNA Res., 2002, vol. 9, p. 11-17
【非特許文献３】Sasaki A. et al., Nature, 2002, vol. 416, p. 701
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、ヒカリ新世紀の識別を目的として、常法に従って、５０種類以上の公知のマイクロサテライトマーカーを評価したが、驚くべきことに、すべてのマイクロサテライトマーカーについてコシヒカリと全く差異が見つからなかった。この結果は、コシヒカリとの戻し交配を行ったｓｄ１を持つ品種であっても、マイクロサテライトマーカーによる識別が可能であったことを考慮すると、本願出願時の本技術分野の当業者にとって、極めて予想外の事実であった。
【０００７】
このような状況下、本発明者は、ヒカリ新世紀が十石ｓｄ１を有すると考えられることに注目し、品種鑑別に一般的には利用されないことが常識となっているＳＮＰ法とマイクロサテライト法をあわせることにより、ヒカリ新世紀の識別が可能であることを見出した。
十石ｓｄ１がＳＮＰを有することが公知であったとしても、イネ品種の識別にＳＮＰを利用することは、先述のとおり、本願出願時の本技術分野の当業者にとって全く意外なアプローチであって、この発想自体は、ヒカリ新世紀の識別がマイクロサテライトマーカーではできないという、本発明者の新規な知見があって初めてもたらされたものである。
従って、本発明は、公知のマイクロサテライトマーカーでは識別不可能であったヒカリ新世紀を正確に区別可能な識別方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、
［１］配列番号１で表される塩基配列の２８１番目の塩基を決定する工程、及びマイクロサテライトマーカーを用いて分析する工程を含むことを特徴とする、ヒカリ新世紀の識別方法、
［２］配列番号１で表される塩基配列の２８１番目の塩基を決定する工程、及び／又は、マイクロサテライトマーカーを用いて分析する工程が遺伝子増幅法を使用する、請求項１に記載のヒカリ新世紀の識別方法、
［３］配列番号１で表される塩基配列の２８１番目の塩基を決定する工程、及びマイクロサテライトマーカーを用いて分析する工程を、遺伝子増幅法を使用して同時に行う、請求項２に記載のヒカリ新世紀の識別方法、
［４］前記マイクロサテライトマーカーとして、ＭＲＧ４６５３、ＭＲＧ６５４５、ＲＭ１５３、ＲＭ２５３、ＭＲＧ５３７５、ＭＲＧ４９３１、ＲＭ２６４、ＲＭ１４４、ＲＭ７２、及びＲＭ６３３３からなる群から選んだ、少なくとも１つのマイクロサテライトマーカーを使用する、［１］〜［３］の識別方法、
［５］配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（２８１番目はｔ）において、２８１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列又はその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチド、
［６］配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（２８１番目はｔ）において、１０〜１００の連続した塩基配列からなり、且つ、その３’末端塩基がｔ（２８１番目のｔに対応）であるポリヌクレオチド、
［７］配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（２８１番目はｔ）において、１０〜１００の連続した塩基配列の相補的塩基配列からなり、且つ、その３’末端塩基がａ（２８１番目のｔに対応）であるポリヌクレオチド
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、公知のマイクロサテライトマーカーでは識別不可能であったヒカリ新世紀を正確に識別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ヒカリ新世紀のｓｄ１遺伝子のエキソン１（枠で囲まれた塩基配列）並びにその５’側領域及び３’側領域の塩基配列（配列番号３）を示す説明図である。
【図２】野生型ＧＡ２０ｏｘ−２エクソン１周辺の塩基配列および設計したプライマー位置を示す説明図である。記号「＊」は、ＧＳ２０ｏｘ−２エクソン１の開始点を示す。
【図３】ＡＳＰ−ＰＣＲ法（プライマーＳＤ１Ｆ３／ＳＤ１ＪＲ）によるＳＤ１領域のＳＮＰ検出の結果を示す電気泳動パターンである。レーン１：ヒカリ新世紀，レーン２：コシヒカリ，（−）：ＤＮＡフリー。
【図４】ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法（上段）及びＡＳＰ−ＰＣＲ法（下段）によるＧＡ２０ｏｘ−２における十石由来の遺伝子型検出結果を比較した電気泳動パターンである。１：愛のゆめ，２：秋の詩，３：吟おうみ，４：ニシホマレ，５：ハナエチゼン，６：はなさつま，７：ヒカリ新世紀，８：ミナミヒカリ，９：ゆめおうみ，１０：レイホウ，１１：サイワイモチ，１２：ヒヨクモチ，１３：アキヒカリ，１４：あきほ，１５：あさひの夢，１６：彩南月，１７：コシヒカリ，１８：ＤＮＡフリー．
【図５】プライマーＳＤ１Ｆ３／ＳＤ１ＪＲを用いたＰＣＲ産物の電気泳動パターンである。
【図６】ＡＳＰ−ＰＣＲとＳＳＲ−ＰＣＲのマルチプレックスＰＣＲの結果を示す電気泳動パターンである。
【図７】プライマーＳＤ１Ｆ３とＳＤ１ＮＲＭを用いたＰＣＲ産物の電気泳動パターンである。
【図８】プライマーＳＤ１Ｆ３、ＳＤ１ＮＲＭ、およびＳＤ１ＪＲを同時に用いたＰＣＲ産物の検出例を示す電気泳動パターンである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の識別方法では、配列番号１で表される塩基配列における２８１番目の塩基を決定すると共に、マイクロサテライトマーカーを用いる解析を行うことにより、ヒカリ新世紀の識別を行う。配列番号１で表される塩基配列は、ヒカリ新世紀のｓｄ１遺伝子（エキソン１〜エキソン３及びイントロン１〜イントロン２からなる）のエキソン１の塩基配列（２８１番目の塩基はｔ）である。ヒカリ新世紀のｓｄ１遺伝子は、その対立遺伝子である、イネのジベレリン（ＧＡ）２０−オキシダーゼ遺伝子（ＯｓＧＡ２０ｏｘ２）のエキソン１の塩基配列（配列番号２；Spielmeyer, W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2002, vol. 99, no. 13, p. 9043-9048）において、２８０〜２８２番目の塩基配列ｇｇｇがｇｔｇに変異（一塩基置換）しており、その結果、９４番目のＧｌｙがＶａｌに変異（一アミノ酸置換）している。
【００１２】
本発明の識別方法では、識別すべきイネ品種から核酸試料を調製し、それ自体公知の遺伝子分析方法を用いて、配列番号１で表される塩基配列（２８１番目の塩基はｔ）における２８１番目の塩基［あるいは、配列番号２で表される塩基配列（２８１番目の塩基はｇ）における２８１番目の塩基］を決定することにより、そのイネが十石ｓｄ１遺伝子を有する品種（例えば、ヒカリ新世紀、佐賀１号（ぴかいち））であるか、あるいは、それ以外の品種（例えば、コシヒカリ）であるかを判定する。本発明の識別方法では、後述するとおり、適当なマイクロサテライトマーカーを用いる解析により、識別すべきイネ品種がヒカリ新世紀又はコシヒカリであるか否か（すなわち、ヒカリ新世紀又はコシヒカリのいずれであるか、あるいは、それら以外の品種であるか）を、予め決定することができる。以下、ヒカリ新世紀又はコシヒカリであることを予め確認済みであることを前提として、本発明の識別方法におけるＳＮＰ分析工程を説明する。前記塩基がｔ（コードするアミノ酸はＶａｌ）であれば、ヒカリ新世紀と判定することができ、前記塩基がｇ（コードするアミノ酸はＧｌｙ）であれば、コシヒカリと判定することができる。なお、前記塩基がｇ及びｔ以外のアミノ酸である場合、すなわち、前記塩基がｃ（コードするアミノ酸は理論上、Ａｌａ）又はａ（コードするアミノ酸は理論上、ｇｌｕ）である場合には、ヒカリ新世紀又はコシヒカリのいずれでもないと判断することができる。
【００１３】
本発明で用いる核酸試料は、分析可能な核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）が含まれる限り、特に限定されるものではなく、イネから単離されるあらゆる細胞又は組織から調製することができる。例えば、種子、葉、根、茎、幼植物（シードリング）から調製することができ、前記種子としては、更に、籾、玄米、精米、米粉を挙げることができる。
【００１４】
本発明で用いることのできる遺伝子分析方法としては、ＳＮＰの分析に用いる各種方法を挙げることができ、例えば、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（restriction fragment length polymorphism）法、ハイブリダイゼーション法、ＡＳＰ（Allele Specific primer）−ＰＣＲ法、ダイレクトシークエンス法などを挙げることができる。
また、ＰＣＲ法と同様な方法として、特異的に目的の遺伝子を増幅することができるものであれば、ＰＣＲ法の替わりに、既知の他の遺伝子増幅法も使用することができる。
【００１５】
前記ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、判定用のＳＮＰ部位を含むＤＮＡ断片を増幅可能なプライマーセットを用いてＰＣＲを行った後、前記ＳＮＰ部位を認識する制限酵素で消化反応を実施し、その反応産物を電気泳動することにより、各ＤＮＡ断片の大きさを解析する方法である。
具体的には、配列番号１で表される塩基配列の２８１番目の塩基を含むＤＮＡ断片を増幅可能なプライマーセットを用いてＰＣＲを行った後、制限酵素ＰｍａＣＩ（認識部位＝ｃａｃ：ｇｔｇ）により切断する。
配列番号１で表される塩基配列の２７７〜２８２番目の塩基配列（またはその対応塩基配列）が、ヒカリ新世紀ではｃａｃｇｔｇであるのに対して、コシヒカリではｃａｃｇｇｇであるため、後述の実施例２に示すように、ヒカリ新世紀では２本のバンドが検出される（すなわち、制限酵素ＰｍａＣＩで切断される）のに対して、コシヒカリでは１本のバンドのみが検出される（すなわち、制限酵素ＰｍａＣＩで切断されない）。
【００１６】
前記ハイブリダイゼーション法は、判定用のＳＮＰ部位を含むＤＮＡ断片を増幅可能なプライマーセットを用いてＰＣＲを行った後、品種識別用のプローブを使用してハイブリダイゼーションを実施し、プローブの結合の有無を解析する方法である。
具体的には、まず、配列番号１で表される塩基配列の２８１番目の塩基を含むＤＮＡ断片を増幅可能なプライマーセットを用いてＰＣＲを行う。
ヒカリ新世紀を識別するプローブとしては、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（２８１番目はｔ）において、２８１番目の塩基を含む１０〜１００（好ましくは１５〜５０、より好ましくは２０〜３０）の連続した塩基配列又はその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。このプローブは、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドのセンス鎖の２８１番目の塩基がｔである場合に、それを鋳型とするＰＣＲ増幅産物とハイブリダイズするのに対して、前記塩基がｔ以外の塩基（特にｇ）である場合には、それを鋳型とするＰＣＲ増幅産物とハイブリダイズしない。従って、前記プローブを適当な手段で標識することにより、プローブのハイブリダイズの有無を容易に解析することができ、その結果に基づいて、ヒカリ新世紀であるか否かを判定することができる。
【００１７】
同様に、コシヒカリを識別するプローブとしては、配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（２８１番目はｇ）［すなわち、配列番号１で表される塩基配列における２８１番目の塩基ｔがｇに置換されていたこと以外は、配列番号１で表される塩基配列と同様の塩基配列からなるポリヌクレオチド（２８１番目はｇ）］において、２８１番目の塩基を含む１０〜１００（好ましくは１５〜５０、より好ましくは２０〜３０）の連続した塩基配列又はその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。このプローブは、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドのセンス鎖の２８１番目の塩基がｇである場合に、それを鋳型とするＰＣＲ増幅産物とハイブリダイズするのに対して、前記塩基がｇ以外の塩基（特にｔ）である場合には、それを鋳型とするＰＣＲ増幅産物とハイブリダイズしない。従って、プローブのハイブリダイズの有無に基づいて、コシヒカリであるか否かを判定することができる。
【００１８】
前記ＡＳＰ−ＰＣＲ法は、ＰＣＲプライマーセットの一方のプライマーとして、その３’末端塩基が判定用ＳＮＰ部位と相補的になるように設計されたプライマーを使用する方法である。ＰＣＲでは、プライマーの３’末端塩基が、鋳型となる塩基配列とミスマッチがあると、ＰＣＲの効率が大幅に低下するが、それを利用した方法である。
【００１９】
具体的には、ヒカリ新世紀で増幅産物が得られるプライマー（以下、ヒカリ新世紀用プライマーと称する）としては、例えば、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（２８１番目はｔ）において、１０〜１００の連続した塩基配列からなり、且つ、その３’末端塩基がｔ（２８１番目のｔに対応）であるポリヌクレオチド（フォワードプライマー）、あるいは、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（２８１番目はｔ）において、１０〜１００の連続した塩基配列の相補的塩基配列からなり、且つ、その３’末端塩基がａ（２８１番目のｔに対応）であるポリヌクレオチド（リバースプライマー）を用いることができる。
一方、コシヒカリで増幅産物が得られるプライマー（以下、コシヒカリ用プライマーと称する）としては、例えば、配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（２８１番目はｇ）において、１０〜１００の連続した塩基配列からなり、且つ、その３’末端塩基がｇ（２８１番目のｇに対応）であるポリヌクレオチド（フォワードプライマー）、あるいは、配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（２８１番目はｇ）において、１０〜１００の連続した塩基配列の相補的塩基配列からなり、且つ、その３’末端塩基がｃ（２８１番目のｇに対応）であるポリヌクレオチド（リバースプライマー）を用いることができる。
各プライマーの塩基長は、１０〜１００である限り、特に限定されるものではないが、好ましくは１５〜５０、より好ましくは２０〜３０である。
【００２０】
ＡＳＰ−ＰＣＲ法で用いることのできるこれらのプライマーとしては、例えば、以下の各種プライマーを挙げることができる。なお、各配列の下線で示す３’末端は、いずれも、配列番号１で表される塩基配列におけるＳＮＰ部位（２８１番目の塩基）に対応する塩基であることを意味する。
ヒカリ新世紀用フォワードプライマーＳＤ１ＪＦ（配列番号８）：
５−ｃｃｇｃｇｔｇｃｇｃｃａｃｇｃａｃｇｔ−３
ヒカリ新世紀用リバースプライマーＳＤ１ＪＲ（配列番号９）：
５−ｃｇｇａｃａｃｃｔｇｇａａｇａａｃａ−３
コシヒカリ用フォワードプライマー（配列番号１０）：
５−ｃｃｇｃｇｔｇｃｇｃｃａｃｇｃａｃｇｇ−３
コシヒカリ用リバースプライマー（配列番号１１）：
５−ｃｇｇａｃａｃｃｔｇｇａａｇａａｃｃ−３
【００２１】
ヒカリ新世紀用フォワードプライマー又はコシヒカリ用フォワードプライマーを用いる場合には、同時に、判定用ＳＮＰ部位から下流の領域を増幅可能なリバースプライマー、例えば、図１に示すリバースプライマーＲ１〜Ｒ５を使用してＰＣＲを実施する。一方、ヒカリ新世紀用リバースプライマー又はコシヒカリ用リバースプライマーを用いる場合には、同時に、判定用ＳＮＰ部位から上流の領域を増幅可能なフォワードプライマー、例えば、図１に示すフォワードプライマーＦ１〜Ｆ４を同時に使用してＰＣＲを実施する。
【００２２】
ヒカリ新世紀用プライマーを用いてＰＣＲを実施すると、識別する品種がヒカリ新世紀である場合には、前記プライマーの３’末端塩基と鋳型ＤＮＡの判定用ＳＮＰ部位とが塩基対を形成できるため、ＰＣＲによる増幅産物が得られるが、識別する品種がコシヒカリである場合には、ミスマッチであるため、ＰＣＲによる増幅産物が得られない。
一方、コシヒカリ用プライマーを用いてＰＣＲを実施すると、識別する品種がコシヒカリである場合には、前記プライマーの３’末端塩基と鋳型ＤＮＡの判定用ＳＮＰ部位とが塩基対を形成できるため、ＰＣＲによる増幅産物が得られるが、識別する品種がヒカリ新世紀である場合には、ミスマッチであるため、ＰＣＲによる増幅産物が得られない。
この場合のＰＣＲ条件は、プライマー配列の３’末端の特異性に依存する方法であるので、一般的な条件で実施することができる。また、検出方法も、ＰＣＲ増幅産物の有無を確認できれば良いため、簡易な検出手段、例えば、３％アガロースゲル電気泳動により充分に検出することができる。
例えば、実施例に示すように、ヒカリ新世紀が有するＳＮＰを判定するためには、フォワードプライマーＦ３（ＳＤ１Ｆ３）及びヒカリ新世紀用リバースプライマー（ＳＤ１ＪＲ）を使用すると、高感度かつ高精度に検出することができるので好ましく、更に、これらのプライマーは、他のマイクロサテライトマーカーを検出するためのマーカーと共存させて行うＰＣＲ（マルチプレックスＰＣＲ）にも使用できるので非常に有用である。
【００２３】
また、ＡＳＰ−ＰＣＲ法では、プライマーの３’末端の塩基に加え、３’末端から３番目の塩基をミスマッチ塩基としておくことにより、よりミスマッチを鋭敏に感知できることが知られている［Theor Appl Genet (2004) 108:1212-1220］。この手法を利用したプライマーとしては、例えば、以下のプライマーを挙げることができる。
ヒカリ新世紀用フォワードプライマー（配列番号１２）：
５−ｃｃｇｃｇｔｇｃｇｃｃａｃｇｃａｄｇｔ−３
ヒカリ新世紀用リバースプライマー（配列番号１３）：
５−ｃｇｇａｃａｃｃｔｇｇａａｇａｂｃａ−３
コシヒカリ用フォワードプライマー（配列番号１４）：
５−ｃｃｇｃｇｔｇｃｇｃｃａｃｇｃａｄｇｇ−３
コシヒカリ用リバースプライマー（配列番号１５）：
５−ｃｇｇａｃａｃｃｔｇｇａａｇａｂｃｃ−３
（配列中、ｄは、ｃ以外の塩基、すなわち、ａ、ｇ、又はｔであり、ｂは、ａ以外の塩基、すなわち、ｇ、ｃ、又はｔである）
また、ＡＳＰ−ＰＣＲにて、ヒカリ新世紀が有するＳＮＰとそれに対応するコシヒカリが有する塩基を同時に検出する場合、上記のプライマーＳＤ１Ｆ３とＳＤ１ＪＲとに加え、コシヒカリ用リバースプライマーを改変して作製したＳＤ１ＮＲＭを組み合わせて使用することができる。前記ＳＤ１ＮＲＭは、コシヒカリ用リバースプライマーのｂをｃとし、ＳＤ１Ｆ３とＳＤ１ＪＲで増幅される塩基配列と容易に見分けられるようにするため、その５’側に３塩基付加したものである。例えば、実施例５に示すように、これらのプライマーを使用してマルチプレックスＰＣＲが行え、簡便かつ正確に、十石型ＳＮＰと野生型配列を識別できるので好ましい。
ＳＤ１ＮＲＭ（配列番号５５）：
５−ｇｃｔｃｇｇａｃａｃｃｔｇｇａａｇａｃｃｃ−３
【００２４】
前記ダイレクトシークエンス法では、判定用ＳＮＰ部位を含む塩基配列を実際にシークエンスすることにより、判定用ＳＮＰ部位がｔである（すなわち、ヒカリ新世紀である）か、ｇである（すなわち、コシヒカリである）かを分析し、品種を識別する。
【００２５】
本発明の識別方法では、特定のＳＮＰとマイクロサテライトを分析することにより、これまで公知のマイクロサテライトマーカーでは区別できなかったヒカリ新世紀を識別することができる。なお、本発明においては、ＳＮＰ分析とマイクロサテライト分析を実施する順序は、特に限定されるものではなく、いずれを先に実施しても、あるいは、両者を同時に実施することができる。例えば、公知のマイクロサテライトマーカーを用いて、識別対象品種が、ヒカリ新世紀又はコシヒカリであるか、あるいは、それ以外の品種であるかを決定し、ヒカリ新世紀又はコシヒカリであることを確認した後に、ＳＮＰによる識別方法を用いることができる。あるいは、ＳＮＰ分析により、十石ｓｄ１を有する品種（ヒカリ新世紀を含む）であるか、それ以外の品種（コシヒカリを含む）であるかを決定した後、マイクロサテライト分析を用いてヒカリ新世紀であるか否かを識別することができる。また、ＳＮＰ分析とマイクロサテライト分析とを同時に実施する場合には、例えば、上記で示したマルチプレックスＰＣＲ法によって、ＳＮＰを解析するＡＳＰ−ＰＣＲとマイクロサテライトマーカーを用いたＰＣＲを同時に実施することができる
【００２６】
本発明で用いるマイクロサテライトマーカーとしては、コシヒカリの同定に使用可能なマイクロサテライトマーカー［例えば、ＲＧＰ（Rice Genome Research Program）データベース（http://rgp.dna.affrc.go.jp/giot/data/SSRAll）、Ｇｒａｍｅｎｅデータベース（http://www.gramene.org/markers/index.html）、特開２００４−６５２５１号公報］を用いることができ、その一例を表１に示す。
表１に示す品種は、コシヒカリを除けば、十石に由来する品種である。表１に示す各マイクロサテライトマーカー毎に使用したプライマーセットの塩基配列を以下に示す。なお、下線で示す配列ｇｔｇｔｃｔｔは、明瞭なバンド（ピーク）を得るために付加したテール配列である。また、付加するテール配列や使用するプライマーの標識の種類は、使用するマイクロサテライトマーカーの組み合わせやプライマーの組み合わせによって、適宜変更することができる。
ＭＲＧ４６５３Ｆ（ＴｅｘａｓＲｅｄ標識）（配列番号１６）：
５−ｔｇａｔｔｔｃｔｃｇｇａｃａａｇｃａｔｇａｔｃｔ−３
ＭＲＧ４６５３Ｒ（配列番号１７）：
５−ｇｔｇｔｃｔｔｃｇａｇｃｔａｃｃａａｃｃｇａｔｇｃａｇａｔ−３
ＭＲＧ６５４５Ｆ（ＴｅｘａｓＲｅｄ標識）（配列番号１８）：
５−ｔｃｃｇｃｔｃｃｇｔｔｔｔｃａｔｃｃｃａａｔａｇ−３
ＭＲＧ６５４５Ｒ２（配列番号１９）：
５−ｇｔｇｔｃｔｔｃａｔｇｇｇａｇｇｇｇｇｇｇｇｔｇｔａｇａａ−３
ＲＭ１５３Ｆ（ＴｅｘａｓＲｅｄ標識）（配列番号２０）：
５−ｇｃｃｔｃｇａｇｃａｔｃａｔｃａｔｃａｇ−３
ＲＭ１５３Ｒ１１（配列番号２１）：
５−ｇｔｇｔｃｔｔｔｇｃｃｇａａｃｔｃｇａｔｃａａｃｃｔｇｃａｃｔｔ−３
ＲＭ２５３Ｆ（ＴｅｘａｓＲｅｄ標識）（配列番号２２）：
５−ｔｃｃｔｔｃａａｇａｇｔｇｃａａａｃｃｔｔａａｔａｃ−３
ＲＭ２５３Ｒ（配列番号２３）：
５−ｇｃａｔｔｇｔｃａｔｇｔｃｇａａｇｃｃｇｔｔｃｔａｃ−３
ＭＲＧ５３７５Ｆ（ＦＩＴＣ標識）（配列番号２４）：
５−ｇａａｔｇｇａａｃｇａｃａａｇａｇａｔｇｃａｃｇｔ−３
ＭＲＧ５３７５Ｒ（配列番号２５）：
５−ｇｔｇｔｃｔｔｇｔｇｃｔｔｔｔｃｇｔａｔｃｃａｃｃｔｔｃｇｇｇ−３
ＭＲＧ４９３１Ｆ２（ＦＩＴＣ標識）（配列番号２６）：
５−ａｃａａａａｇｃｇａａｇｇｇａｇｇｃｇｇｔｇ−３
ＭＲＧ４９３１Ｒ１（配列番号２７）：
５−ｇｔｇｔｃｔｔｔｇｇｔａａｔａｔｇｇｇｃｇｇｃｔｇｔｔｔｔａｇ−３
ＭＲＧ６２８８Ｆ（ＦＩＴＣ標識）（配列番号２８）：
５−ａｃａａｇａｔａａｔａｇａｃａａｃａｔｇｔｃｔｃａａａｔａｃｔ−３
ＭＲＧ６２８８Ｒ（配列番号２９）：
５−ｇｔｇｔｃｔｔｔａｔｇｔｇｇｃａｇｔｔｔａａｇａｇｃｇｔｔｔｃ−３
ＲＭ２２３Ｆ（ＦＩＴＣ標識）（配列番号３０）：
５−ｇａｇｔｇａｇｃｔｔｇｇｇｃｔｇａａａｃ−３
ＲＭ２２３Ｒ（配列番号３１）：
５−ｇａａｇｇｃａａｇｔｃｔｔｇｇｃａｃｔｇ−３
ＲＭ２６４Ｆ（ＦＩＴＣ標識）（配列番号３２）：
５−ｇｔｔｇｃｇｔｃｃｔａｃｔｇｃｔａｃｔｔｃ−３
ＲＭ２６４Ｒ（配列番号３３）：
５−ｇａｔｃｃｇｔｇｔｃｇａｔｇａｔｔａｇｃ−３
ＲＭ１４４Ｆ（ＦＩＴＣ標識）（配列番号３４）：
５−ｔｇｃｃｃｔｇｇｃｇｃａａａｔｔｔｇａｔｃｃ−３
ＲＭ１４４Ｒ２（配列番号３５）：
５−ｇａｃａｔｃａｔｃａｃｔｔｃｔｃｃｔｃｇａ−３
ＲＭ３３６Ｆ（配列番号３６）：
５−ｃｔｔａｃａｇａｇａａａｃｇｇｃａｔｃｇ−３
ＲＭ３３６Ｒ（ＴｅｘａｓＲｅｄ標識）（配列番号３７）：
５−ｇｃｔｇｇｔｔｔｇｔｔｔｃａｇｇｔｔｃｇ−３
ＭＲＧ６２３７Ｆ（ＴｅｘａｓＲｅｄ標識）（配列番号３８）：
５−ａｔｔｔｃｔａｇｃｃｃｃａｃａｇｃｇａａｃｇｔ−３
ＭＲＧ６２３７Ｒ（配列番号３９）：
５−ｇｔｇｔｃｔｔｔｔｃｔａｔｔｇｃｔｇｔｔｔｃｇｇｔｔｔｔｇｃａｃ−３
ＲＭ３３３Ｆ（ＦＩＴＣ標識）（配列番号４０）：
５−ｇａｔｃｇａｃｔａｃｇａｇｔｇｔｃａｃｃａａ−３
ＲＭ３３３Ｒ（配列番号４１）：
５−ｇｔｃｔｔｃｇｃｇａｔｃａｃｔｃｇｃ−３
ＲＭ７２Ｆ（ＦＩＴＣ標識）（配列番号４２）：
５−ｃｃｇｇｃｇａｔａａａａｃａａｔｇａｇ−３
ＲＭ７２Ｒ（配列番号４３）：
５−ｇｃａｔｃｇｇｔｃｃｔａａｃｔａａｇｇｇ−３
ＲＭ６３３３Ｆ（ＦＩＴＣ標識）（配列番号４４）：
５−ａｇａｇａａｇａｃａｃｇｇｔｇｇａｔｇｇ−３
ＲＭ６３３３Ｒ（配列番号４５）：
５−ｇｔｇｔｃｔｔｃａａａｃｔｃｃｔｃａｔｔｔｃｇｃｔｃｃ−３
【００２７】
これらのプライマーセットを用いた場合に増幅されるＤＮＡ断片の塩基長に応じて複数のクラスに分類することができ、その結果（例えば、ミナミヒカリであれば、クラスＡ〜Ｆ）を表１に示す。
また、表１に本発明の判定用ＳＮＰ部位による、十石型のｓｄ１遺伝子型（Ｊ）と野生型ＧＡ２０ｏｘ−２遺伝子型（Ｎ）判定クラスを示す。
【００２８】
【表１】
2011030567.tif 000002
【００２９】
表１に示す入手機関欄の記号（１）〜（７）は、以下のとおりである：
（１）農業生物資源研究所
（２）九州沖縄農業研究センター
（３）佐賀農業試験研究センター
（４）高知県農業技術センター
（５）（株）植物ゲノムセンター
（６）兵庫県農業試験場
（７）鳥取大学
（８）鹿児島農業開発センター
（９）鹿児島農業試験場
【００３０】
表１から明らかなように、ヒカリ新世紀及びコシヒカリを同定するためには、表１に示す全てのマイクロサテライトマーカーを使用する必要はなく、例えば、表１に示す組合せ１〜１０のいずれかの組合せ中のマイクロサテライトマーカー、すなわち、ＭＲＧ４６５３、ＭＲＧ６５４５、ＲＭ１５３、ＲＭ２５３、ＭＲＧ５３７５、ＭＲＧ４９３１、ＲＭ２６４、ＲＭ１４４、ＲＭ７２、ＲＭ６３３３の少なくとも一つ以上を使用することにより、ヒカリ新世紀及びコシヒカリと他の品種とを識別（すなわち、ヒカリ新世紀又はコシヒカリのいずれか一方であるか、あるいは、ヒカリ新世紀及びコシヒカリ以外の品種であるかを決定）することができる。識別すべき品種にあわせて、使用するマイクロサテライトマーカーの種類や数を変更することもできるし、１７０種類を超える品種（具体的には、後述の表２に示す１８８品種）全てと識別するためには、表１に示す組合せ１〜１０のいずれかの組合せを使用することもできる。なお、表１は、十石由来の各品種とヒカリ新世紀及びコシヒカリとが識別可能であることを示しているが、前記組合せは、１８８種類の品種からヒカリ新世紀及びコシヒカリを識別することができる。
【００３１】
本発明では、これらのマイクロサテライトマーカーに対応する各種プライマーセットを用いてＰＣＲを実施することにより、１７０種類を超える品種の中から、識別対象品種が、ヒカリ新世紀又はコシヒカリであるか、あるいは、それ以外の品種であるかを決定することができ、ヒカリ新世紀又はコシヒカリであることを確認すると共に、判定用ＳＮＰ部位の分析を行うことにより、ヒカリ新世紀又はコシヒカリのいずれであるか、すなわち、ヒカリ新世紀であるか否かを決定することができる。
【００３２】
また、本発明では、マイクロサテライト解析用の前記の各種プライマーセットを用いるＰＣＲと、判定用ＳＮＰ部位を分析するＡＳＰ−ＰＣＲとを同時に実施することにより、一度の分析で、１７０種類を超える品種の中からヒカリ新世紀を識別することもできる。例えば、１８８種類の品種からヒカリ新世紀を識別するために使用可能なマイクロサテライトマーカーと十石由来のｓｄ１遺伝子型（ＳＤ１Ｊ）の組み合わせは、１８８種類の品種識別データベースを使用することによって、適宜選択することができる。具体的には、実施例４に示す、ＲＭ１５３、ＲＭ２２３、ＲＭ２５３、ＭＲＧ５３７５、ＳＤ１Ｊを検出するプライマーを使用して、ヒカリ新世紀を容易に識別することができる。また、実施例５に示すように、ＳＤ１Ｊが検出されなかった（すなわち、野生型ＧＡ２０ｏｘ−２遺伝子型である）品種が、本当に野生型ＧＡ２０ｏｘ−２遺伝子型を有するか否かを同時に検証するために、ＳＤ１Ｊ検出用プライマーに加え、野生型ＧＡ２０ｏｘ−２遺伝子型を特異的に検出するプライマーをＡＳＰ−ＰＣＲで使用することで、ＳＤ１Ｊの判定精度を高めることができるので好ましい。
【００３３】
前記ハイブリダイゼーション法において先述した、ヒカリ新世紀を識別するプローブとして用いることのできる、「配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（２８１番目はｔ）において、２８１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列又はその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチド」は、それ自体、新規化合物である。
また、前記ＡＳＰ−ＰＣＲ法においてヒカリ新世紀用プライマーとして用いることのできる、「配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（２８１番目はｔ）において、１０〜１００の連続した塩基配列からなり、且つ、その３’末端塩基がｔ（２８１番目のｔに対応）であるポリヌクレオチド」や、「配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（２８１番目はｔ）において、１０〜１００の連続した塩基配列の相補的塩基配列からなり、且つ、その３’末端塩基がａ（２８１番目のｔに対応）であるポリヌクレオチド」も、それ自体、新規化合物である。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００３５】
《実施例１：ｓｄ１遺伝子（ヒカリ新世紀）及びＧＡ２０ｏｘ２遺伝子（コシヒカリ）の塩基配列決定》
本実施例では、ヒカリ新世紀及びコシヒカリの玄米から、それぞれ、ＤＮＡサンプルを調製し、ｓｄ１遺伝子（ヒカリ新世紀）及びＧＡ２０ｏｘ２遺伝子（コシヒカリ）のエキソン１の塩基配列を決定した。
配列決定のためのイネ品種としては、鳥取大学農学部から入手したヒカリ新世紀（８個体）と、独立行政法人農業生物資源研究所から入手したコシヒカリ（８個体）を使用した。
【００３６】
玄米を１粒ずつ１．５ｍＬチューブにいれ、ジルコニアビーズを４粒加え蓋をして、ミキサーミル［ＭＭ３００；レッチェ（Ｒｅｔｓｃｈ）社］を用いて２５Ｈｚ６分間振とうさせ、玄米を粉砕した。次いで、抽出バッファー（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ，０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ，０．１％ＳＤＳ）９００μＬ、５ｍｏｌ／Ｌ塩酸グアニジン１００μＬ、プロテイナーゼＫ溶液５０μＬを加え、ローテーターで撹拌しながら５６℃で３時間加温した。これを、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心を行って、１．５ｍＬのマイクロチューブに上清を移し、更に、１５，０００ｒｐｍで３分間遠心を行った。ここで得られた上清から、ＤＮＡ精製キット（Wizard Clean-Up system；プロメガ社）によって、イネのゲノムＤＮＡを調製した。
【００３７】
得られた各ＤＮＡサンプルについて、以下の手順で塩基配列を決定した。
まず、下記のフォワードプライマーＦ３とリバースプライマーＲ３、ＬＡ−Ｔａｑ（タカラバイオ社）、ＧＣバッファー（タカラバイオ社）を用いて、９４℃３０秒間、５８℃３０秒間、７２℃１分間からなるサイクルを３５サイクル実施して、エキソン１全領域を含む領域を増幅した（図１参照）。
フォワードプライマーＦ３（配列番号６）：
５−ｇｃｔｃｇｔｃｔｔｃｔｃｃｃｃｔｇｔｔａｃａａａｔａｃｃｃｃ−３
リバースプライマーＲ３（配列番号５）：
５−ｇａｃｇｔｃｇｔｃｃｔｇｇａｇｇａｇｇａｔｇｇｔｇａｇｇｇｃ−３
増幅したＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ社）に連結し、市販の反応液（ABI-Terminator Ready Mix；ＡＢＩ社）で塩基配列決定反応後、ＤＮＡシークエンサー（ABI-Prism；ＡＢＩ社）で解読した。
【００３８】
その結果、いずれの個体からも、ヒカリ新世紀については、配列番号１で表される塩基配列（２８１番目はｔ）が得られた。また、コシヒカリについては、配列番号２で表される塩基配列、すなわち、配列番号１で表される塩基配列における２８１番目の塩基ｔがｇに置換されていたこと以外は、配列番号１で表される塩基配列と同様の塩基配列（２８１番目はｇ）が得られた。
【００３９】
《実施例２：イネ品種の識別（１）》
本実施例では、実施例１で得られたＤＮＡサンプルを用いて、下記手順（ＰＣＲ、制限酵素処理、及び電気泳動）を実施することにより、ヒカリ新世紀とコシヒカリとを視覚的に明確に識別可能であることを確認した。
まず、下記に示す反応条件でＰＣＲを実施した。
反応液組成：
ＤＮＡ（１０ｎｇ）                        １    μＬ
２×ＧＣバッファーＩ（タカラバイオ社）    ５    μＬ
プライマーＨＳＦ３（２．５μｍｏｌ／Ｌ）  ０．１μＬ
プライマーＨＳＲ５（２．５μｍｏｌ／Ｌ）  ０．１μＬ
ｄ−ＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）          １．６μＬ
Ｌａ  Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）                ０．１μＬ
水                                        ２．１μＬ
総量                                    １０    μＬ
ＰＣＲ反応条件：
９４℃    １分間
サイクル（３５サイクル）
９４℃    ３０秒間
６２℃    ３０秒間
７２℃    ３０秒間
７２℃    ２分間
フォワードプライマーＦ３（配列番号６）：
５−ｇｃｔｃｇｔｃｔｔｃｔｃｃｃｃｔｇｔｔａｃａａａｔａｃｃｃｃ−３
リバースプライマーＲ５（配列番号７）:
５−ｃａｃｃａｔｃｇｔｔｔｔａａｔｔａｃｃｃｃａｔｔｇｇｃｇｃｇ−３
【００４０】
続いて、得られたＰＣＲ増幅産物を用いて、下記条件で制限酵素ＰｍａＣＩ（認識部位＝ｃａｃ：ｇｔｇ）による切断を実施した。
反応液組成：
ＰＣＲ増幅産物                      １０μＬ
１０×バッファーＬ（タカラバイオ社）  ２μＬ
ＰｍａＣＩ（１０Ｕ／μＬ）            １μＬ
水                                    ７μＬ
総量                                ２０μＬ
制限酵素反応条件：
３７℃    ９０分間
６５℃      ２分間
８℃  （電気泳動まで静置）
【００４１】
得られた各制限酵素処理物を、マイクロチップ電位泳動装置（MCE-202 MultiNA；島津製作所）を用いて電気泳動したところ、ヒカリ新世紀では２本のバンド（４１７ｂｐ、２９６ｂｐ）が検出されたのに対して、コシヒカリでは１本のバンド（７１３ｂｐ）のみが検出された。この泳動パターンは、配列番号１で表される塩基配列の２７７〜２８２番目の塩基配列（またはその対応塩基配列）が、コシヒカリではｃａｃｇｇｇであるのに対して、ヒカリ新世紀ではｃａｃｇｔｇであることと完全に一致した。
また、フォワードプライマーＦ３及びリバースプライマーＲ５の上記組合せ以外にも、図１に示す各種フォワードプライマーＦ１〜Ｆ４と、各種リバースプライマーＲ１〜Ｒ５との任意の組合せを用いて得られたＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＰｍａＣＩで処理しても、同様の結果が得られた。なお、加工品など、含有する遺伝子が断片化されているようなサンプルの場合は、増幅領域が短い方が好ましく使用できる。
従って、識別すべきイネ品種から、実施例１の手順に従ってＤＮＡサンプルを調製し、続いて、実施例２の手順に従って、ＰＣＲ、制限酵素処理、及び電気泳動を実施することにより、上記サイズの一本のバンドが検出された場合にはコシヒカリと、上記サイズの２本のバンドが検出された場合にはヒカリ新世紀と識別することができる。
【００４２】
《実施例３：イネ品種の識別（２）》
（１）基準品のＤＮＡの抽出
表２に示す基準品種（１８８品種）の種子（玄米）を各１粒用意し、２ｍＬマイクロチューブにジルコニアビーズ５粒と共に入れ、振とう後、抽出バッファー（10 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA-2Na, 0.1% SDS, 5mol/L NaCl 30 mL/L）９００μＬ、５ｍｏｌ／Ｌ塩酸グアニジン１００μＬ、２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ溶液５０μＬを加えた。これをローテーターで撹拌しながら、５５℃で３時間加温した後、マイクロチューブ遠心機を用いて１５，０００ｒｐｍで３分間遠心分離を行った。
分離後、新たな２ｍＬ容量のマイクロチューブに上清各５００μＬを移し取り、市販の核酸精製キット（Wizard DNA Cleanupsystem；プロメガ社製）を用いてＤＮＡの精製を行った。精製は，全てキットに収載のプロトコールに従って行い、個体ごとにＤＮＡ溶液を１．５ｍＬマイクロチューブに得た。コシヒカリ及びヒカリ新世紀については各４個体からＤＮＡを抽出した。
【００４３】
得られた１８８品種のＤＮＡ溶液について、市販のＤＮＡ定量キット（Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit；Molecular Probes社製）を用いて濃度測定を行った。各品種のＤＮＡ溶液は、それぞれ２μＬを分取してＴＥバッファー（10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 1 mmol/L EDTA）９８μＬと混合し、計１００μＬを濃度測定用サンプルとして９６穴マイクロプレートのウェルに分注した。サンプルのほかに、キットに添付のスタンダード溶液（２０００、２００、２０、２ｎｇ／ｍＬ）及びブランク（ＴＥ）についても、各１００μＬを測定に供した。各ウェルにキットに添付の試薬（PicoGreen Reagent）をＴＥバッファーで２００倍希釈したものを１００μＬずつ加え、撹拌後、室温で２〜５分間インキュベーションを行った。このプレートを蛍光プレートリーダーに供して測定を行い（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍ）、スタンダード溶液の測定結果から得られた検量線を用いて、各ＤＮＡ溶液の濃度を算出した。
【００４４】
【表２】
2011030567.tif 000003
【００４５】
（２）イネ品種「十石」に由来するｓｄ１遺伝子型を特異的に検出するＡＳＰ−ＰＣＲ（Allele Specific Primer PCR）法の開発
実施例２で示したようなＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によるＳＮＰの判定は、電気泳動の前に、ＰＣＲ工程および増幅産物の制限酵素処理工程が必要であり、操作が煩雑である。品種識別技術に適用するには、従来のマイクロサテライトマーカーと同様にＰＣＲ工程と電気泳動工程のみで判定できることが望ましい。さらに、適切なプライマーを作製することで、マイクロサテライトマーカーと同一反応系にて検出を行えるマルチプレックスＰＣＲが可能になる。特に、半矮性はイネ育種上重要な表現型であり、戻し交配の繰返しによる育種法が多く用いられ、その結果、育成品種と親品種の遺伝的背景が非常に似ており、従来のマイクロサテライトマーカーだけでは、品種識別が困難となることが予想されるため、表現型に直接関与する遺伝子の塩基配列を簡便に検出する技術が必要である。
【００４６】
そこで、前記（１）において得られたもののうち、「十石」由来の変異型ｓｄ１遺伝子型を有する「ヒカリ新世紀」と、それを有しない野生型の「コシヒカリ」のＤＮＡを用いて、十石由来のｓｄ１遺伝子型に関するＡＳＰ−ＰＣＲ法の開発を実施した。図２は、野生型のＧＡ２０ｏｘ−２遺伝子エクソン１周辺の塩基配列を示したものである。十石では、エクソン１の開始点から２８１番目にＳＮＰがあり、Ｇ（グアニン）がＴ（チミン）に変異している（非特許文献３）。そこで、十石由来のｓｄ１遺伝子型特異的にＰＣＲ増幅産物を得るために、ＳＮＰが存在する箇所の塩基を３’末端とした塩基配列をプライマーとし、ＡＳＰ−ＰＣＲ法に適したプライマーの検討を実施した。検討に用いたプライマー配列を表３に、プライマー位置を図２に示す。プライマー名の最後がＭのものは、３’末端から３塩基目に変異を導入し、ＰＣＲ増幅の特異性の向上（Hayashi, K. et al., (2004) Theor. Appl. Genet., 108: 1212-1220）を図ったものである。
【００４７】
【表３】
2011030567.tif 000004
【００４８】
ＰＣＲの反応は、サーマルサイクラーとしてＶｅｒｉｔｉ（ＡＢＩ社製）を使用し、２０μＬの反応液量で行った。反応液２０μＬは、１μＬの鋳型ＤＮＡ（１０ｎｇ／μＬ）、１ｕｎｉｔのFastStartTaq（キアゲン社製）、４μＬのＧＣ−Ｒｉｃｈソリューション、０．２μｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ、２ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２、フォワードプライマーとリバースプライマーを各々０．２５μｍｏｌ／Ｌを含むよう調製した。ＰＣＲバッファー及びＧＣ−Ｒｉｃｈソリューションは、FastStartTaqに添付のものを用いた。ＰＣＲ温度条件は、９５℃で４分の後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の反応を１サイクルとし、これを４０サイクル繰返し、最後に７２℃を７分とした。ＰＣＲ増幅産物の検出は、マイクロチップ電気泳動装置（MultiNA；島津製作所製）を用い、専用キット（DNA-1000）を用いて、添付の取扱い説明書に収載の通り実施した。将来、十石由来のｓｄ１遺伝子型特異的ＰＣＲとマイクロサテライトマーカーとのマルチプレックスＰＣＲを視野に入れ、ＰＣＲ条件は、なるべく既存のＳＳＲマーカー増幅における最適条件で固定した。
【００４９】
検討したプライマー組み合わせは、フォワードプライマーＳＤ１ＪＦ及びＳＤ１ＪＦＭに対し、リバースプライマーＳＤ１Ｒ１及びＳＤ１Ｒ２及びＳＤ１Ｒ５の組み合わせ（６通り）、あるいは、リバースプライマーＳＤ１ＪＲ及びＳＤ１ＪＲＭに対し、ＳＤ１Ｆ２及びＳＤ１Ｆ３及びＳＤ１Ｆ４及びＳＤ１Ｆ５及びＳＤ１Ｆ６の組み合わせ（１０通り）の１６通りである。鋭意検討の結果、プライマーＳＤ１Ｆ３とＳＤ１ＪＲ、ＳＤ１Ｆ２とＳＤ１ＪＲ、およびＳＤ１Ｆ３とＳＤ１ＪＲＭの組み合わせを用いることで十石由来ｓｄ１を特異的に検出することができた。その中でも特にＳＤ１Ｆ３とＳＤ１ＪＲでは強いシグナルで十石由来ｓｄ１特異的な増幅産物が得られ、この組合せでＰＣＲを実施することで、十石タイプのｓｄ１遺伝子型を検出できることが明らかとなった（図３）。
【００５０】
（３）十石由来のｓｄ１遺伝子型特異的ＰＣＲの検証実験
前記（２）にて構築した、十石由来のｓｄ１遺伝子型に関するＡＳＰ−ＰＣＲ法について、ヒカリ新世紀及びコシヒカリを含む１８８品種について、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法による結果との相関を確認した。その結果、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法により、十石由来のｓｄ１遺伝子型を示したのは、「ニシホマレ」「はなさつま」「ヒカリ新世紀」「ミナミヒカリ」「レイホウ」「サイワイモチ」「ヒヨクモチ」「彩南月」「ユメヒカリ」「夢はやと」であり、十石由来のｓｄ１遺伝子型特異的ＡＳＰ−ＰＣＲ法でも全く同一の結果が得られた。図４に、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法とＡＳＰ−ＰＣＲ法の検出例を示す。これらのことから、プライマーＳＤ１Ｆ３とＳＤ１ＪＲを用いたＡＳＰ−ＰＣＲによって十石由来のｓｄ１遺伝子型を正確に検出できることが明らかになった。
【００５１】
また、3730 DNA analyzer（ＡＢＩ社製）を用いて検出を行う場合は、プライマーＳＤ１ＪＲの５’末端を蛍光色素で標識することで実施することができる。図５は、５’末端を蛍光色素ＶＩＣで標識したプライマーＳＤ１Ｆ３とＳＤ１ＪＲを用いて、コシヒカリ及びヒカリ新世紀各４個体から抽出したＤＮＡを用いたＡＳＰ−ＰＣＲ法の検出結果を示したものである。マイクロチップ電気泳動装置MultiNAによる非標識プライマーを用いたときと同様、十石由来のｓｄ１遺伝子型を持つヒカリ新世紀でのみ特異的に増幅産物が得られた。
【００５２】
《実施例４：イネの品種識別（３）》
ＡＳＰ−ＰＣＲとＳＳＲ−ＰＣＲのマルチプレックスＰＣＲによる品種識別
前記の実施例のように、簡便に両品種を区別することが可能になった。さらに、従来のマイクロサテライトマーカーによる識別法を組み合わせることにより、多くの品種から、ヒカリ新世紀を同定することができる。例えば、１８８品種に対して、特開２００４−６５２５１号公報に記載のようにマイクロサテライトマーカーのデータベースを作成し、前記で構築されたＡＳＰ−ＰＣＲ法で得られた遺伝子型（十石型ｓｄ１あるいは野生型ＳＤ１）から成るデータベースを組み合わせて使用すれば、ヒカリ新世紀とコシヒカリを加えた１８８品種が同定可能になる。そこで、さらに検査工程の簡便化を考慮し、十石由来ｓｄ１遺伝子型に関するＡＳＰ−ＰＣＲとＳＳＲマーカーを組み合わせたマルチプレックスＰＣＲの検討を実施した。
【００５３】
ＰＣＲの反応は、サーマルサイクラーとしてＶｅｒｉｔｉ（ＡＢＩ社製）を使用し、２０μＬの反応液量で行った。反応液２０μＬは、１μＬの鋳型ＤＮＡ（１０ｎｇ／μＬ）、１ｕｎｉｔのFastStartTaq（キアゲン社製）、０．２μｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ、２ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２、プライマーとして、ＲＭ１５３Ｆ（配列番号２０）、ＲＭ１５３Ｒ１１（配列番号２１）、ＲＭ２２３Ｆ（配列番号３０）、ＲＭ２２３Ｒ（配列番号３１）、ＲＭ２５３Ｆ（配列番号２２）、ＲＭ２５３Ｒ（配列番号２３）、ＭＲＧ５３７５Ｆ（配列番号２４）、ＭＲＧ５３７５Ｒ（配列番号２５）、ＳＤ１Ｆ３、ＳＤ１ＪＲを各々０．２５μｍｏｌ／Ｌを含むよう調製した。ＰＣＲバッファー及びＧＣ−Ｒｉｃｈソリューションは、FastStartTaq（キアゲン社製）に添付のものを用いた。プライマーは、ＲＭ１５３Ｆ及びＲＭ２２３Ｆは蛍光色素ＮＥＤ（ＡＢＩ社製）で、ＲＭ２２３Ｆ及びＭＲＧ５３７５Ｆは蛍光色素ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）で、ＳＤ１ＪＲは蛍光色素ＶＩＣ（ＡＢＩ社製）で、それぞれ、５’末端を標識した。ＰＣＲ温度条件は、９５℃で４分の後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の反応を１サイクルとし、これを４０サイクル繰返し、最後に７２℃を７分とした。次に、3730 DNA analyzer（ＡＢＩ社製）を用いて検出を実施した。ＲＭ１５３ＦとＲＭ１５３ＲによってＲＭ１５３を検出し、ＲＭ２２３ＦとＲＭ２２３ＲによってＲＭ２２３を検出し、ＲＭ２５３ＦとＲＭ２５３ＲによってＲＭ２５３を検出し、ＭＲＧ５３７５ＦとＭＲＧ５３７５ＲとによってＭＲＧ５３７５を検出し、ＳＤ１Ｆ３とＳＤ１ＪＲによって十石由来のｓｄ１遺伝子型（ＳＤ１Ｊ）を検出した。その結果、５種類の座位について増幅産物が得られ、これらの品種において、使用したマイクロサテライトマーカーの有無や十石由来のｓｄ１遺伝子型の判定が可能であった（図６）。本５種類のマーカーを用いて、1８８品種識別用データベースを用いることで、表２の１８８品種の中からヒカリ新世紀を同定することができた。
【００５４】
《実施例５：イネの品種識別（４）》
十石由来のｓｄ１遺伝子型に関するＡＳＰ−ＰＣＲ法の精度向上
前記のように、プライマーＳＤ１ＪＲとＳＤ１Ｆ３を用いることで、十石由来のｓｄ１遺伝子型に関するＡＳＰ−ＰＣＲ法を開発した。本発明を用いた遺伝子型の判定は、増幅産物の有無により実施される。つまりＡＳＰ−ＰＣＲは優性マーカーである。優性マーカーを、検査に実用化する場合、一般的に検査精度の維持が難しい。例えば、ＡＳＰ−ＰＣＲで増幅産物が得られなかった場合、その原因としては、ＰＣＲの鋳型としたＤＮＡが十石由来ｓｄ１遺伝子型では無い場合の他にも、テクニカルエラーなどによりＰＣＲ増幅が正常に行われなかった場合も想定される。そこで、本ＡＳＰ−ＰＣＲ法によるマーカーを共優性様にする、つまり十石由来ｓｄ１遺伝子型では無い場合にも区別できる増幅産物が得られるように改良することを試みた。
【００５５】
十石では、図２の５１６番目（ＧＡ２０ｏｘ−２エクソン１の開始点から２８１番目）の塩基がＧ（グアニン）からＴ（チミン）に変異している。前記のように、本塩基がＴであることを検出するＡＳＰ−ＰＣＲ法を作製している。よって、共優性様のマーカーにするためには、同時に５１６番目のＧを検出する検出系を構築する必要がある。まず、プライマーとして、ＳＤ１Ｆ３、ＳＤ１ＮＲ、ＳＤ１ＮＲＭ（表４）を用い、実施例３の（２）に記載の通りの条件で検討を実施した。ＳＤ１ＮＲおよびＳＤ１ＮＲＭは、その５’末端をＦＡＭにて標識して、さらにＳＤ１ＮＲおよびＳＤ１ＮＲＭはＳＤ１ＪＲよりも５’側に３ｂｐ長くし、蛍光の種類および電気泳動での移動度の差異で区別できるように設計した。ＰＣＲ産物の検出は、3730 DNA analyzer（ＡＢＩ社製）にて実施した。鋭意検討の結果、ＳＤ１Ｆ３とＳＤ１ＮＲＭのプライマーを用いた場合、５１６番目がＧである遺伝子型を特異的に増幅することが明らかになった（図７）。
【００５６】
【表４】
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【００５７】
次に、プライマーＳＤＦ３、十石由来遺伝子型（５１６番目がＴ）特異的プライマーＳＤ１ＪＲ（ＶＩＣで標識）、および５１６番目がＧ特異的プライマーＳＤ１ＮＲＭ（ＦＡＭで標識）を同時にＰＣＲ反応液に加え、実施例３の（２）に記載の条件でＰＣＲを実施した。その結果、図８で示したとおり、十石タイプのｓｄ１を持つヒカリ新世紀とヒヨクモチではＶＩＣで標識された増幅産物（黒塗りピーク）が検出され、それ以外ではＦＡＭで標識された増幅産物（白抜きピーク）が検出された。「にこまる」とヒカリ新世紀は、異なるタイプの半矮性遺伝子型（Dee-geo-woo-gen）由来のｓｄ１を有している。図２に示したとおり、それらは、５３２番目から３８３ｂｐの欠失がある（非特許文献３、あるいは、Wolfgang et al., (2002) PNAS, 25, Vol. 99, No. 13, 9043-9048）。したがって、プライマーＳＤＮＲＭの５‘末端の４ｂｐは相補的ではない。しかしながら、野生型と同様に、ＳＤ１ＮＲＭによって増幅産物が得られることが明らかになった（図８）。品種によって、増幅産物に１ｂｐから３ｂｐの差異があった、これは、増幅領域内のＳＳＲに多型がある（M. Tomita, (2009) Field Crops Research, Vol. 114, No. 2, 10 November 2009, 173-181）ことが原因であると思われる、しかしながら、波形ピークの蛍光の種類をみることでどちらのリバースプライマー由来の増幅産物であるかは明確であり、本法により、５１６番目の塩基がＴであるものとＧであるものが効率的かつ高精度にて検出できる。さらに、本法に関しても、ＳＳＲマーカーとのマルチプレックスＰＣＲが可能であり、ヒカリ新世紀の効率的かつ正確な同定法として用いることができる。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明は、イネの品種鑑別に利用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００５９】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Artificial Sequence」の説明を記載する。配列番号４〜５５の配列で表される各塩基配列は、プライマー配列である。
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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