(57)【要約】【課題】本発明は、酵素反応を利用した従来よりも効率的な有機ハロゲン化合物の分解方法およびそれに用いる機器を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、マイクロ波照射下で、脱ハロゲン化酵素を用いて有機ハロゲン化合物の脱ハロゲン化反応を行うことを特徴とする、有機ハロゲン化合物の分解方法である。ここで、有機ハロゲン化合物はハロ酸であり、脱ハロゲン化酵素はハロ酸脱ハロゲン化酵素であることが好ましい。また、脱ハロゲン化反応を非極性溶媒中で行うことが好ましい。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ波照射下で、脱ハロゲン化酵素を用いて有機ハロゲン化合物の脱ハロゲン化反応を行うことを特徴とする、有機ハロゲン化合物の分解方法。
【請求項２】
前記有機ハロゲン化合物がハロ酸であり、前記脱ハロゲン化酵素がハロ酸脱ハロゲン化酵素である、請求項１に記載の有機ハロゲン化合物の分解方法。
【請求項３】
前記脱ハロゲン化反応を非極性溶媒中で行う、請求項１または２に記載の有機ハロゲン化合物の分解方法。
【請求項４】
前記脱ハロゲン化酵素が担体に包括および／または固定化されている、請求項１〜３のいずれかに記載の有機ハロゲン化合物の分解方法。
【請求項５】
３５℃以下の温度で前記脱ハロゲン化反応が行われる、請求項１〜４のいずれかに記載の有機ハロゲン化合物の分解方法。
【請求項６】
出力３〜５Ｗの前記マイクロ波を１５〜２０分間照射する、請求項１〜５のいずれかに記載の有機ハロゲン化合物の分解方法。
【請求項７】
前記マイクロ波が周波数０．１〜１１０ＧＨｚの電磁波である、請求項１〜６のいずれかに記載の有機ハロゲン化合物の分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素反応を利用した有機ハロゲン化合物の分解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２０世紀初頭以来、有機ハロゲン化合物は工業、農業の分野で広範囲で応用されてきた。しかし、その後、その難分解性、高い生物毒性が証明され始め、多くの有機ハロゲン化合物が今日では使用を禁じられている。しかしながら、紙の漂白、水道水の消毒などの過程で副生成物として発生してくる有機ハロゲン化合物が存在し、例えば、水道水の消毒過程ではジクロロ酢酸、ジブロモ酢酸、トリクロロ酢酸などのハロ酢酸類が発生する。これらの化合物は、試験管実験で生殖異常、腫瘍発生などの変異原性を示すことが明らかになっている。そのため、有機ハロゲン化合物が付着・吸着した固体の浄化処理が行われている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、有機ハロゲン化合物が付着・吸着した固体に対し、水とアルカリ物質を添加し、湿潤状態でマイクロ波を照射せしめアルカリ置換反応と酸化分解反応を生じさせる有機ハロゲン化合物の処理方法が記載されている。しかしながら、主としてマイクロ波照射による加熱効果（電子レンジ効果）を利用したものであるため、６００Ｗの高出力マイクロ波で約１５０℃の高温まで加熱する必要があり、さらにアルカリ置換反応用のアルカリ物質が必要になるという問題があった。
【０００４】
一方、有機ハロゲン化合物の微生物分解には脱ハロゲン化酵素が関与しており、有害な有機ハロゲン化合物の分解にこのような酵素を用いる方法が知られている。例えば、Pseudomonas sp. YL株由来のハロ酸脱ハロゲン化酵素（Ｌ−ＤＥＸ  ＹＬ）は、塩素等のハロゲンと水酸基を置換してハロ酸を分解する酵素であり（特許文献２など）、環境浄化技術への応用が期待されている。しかし、これらの脱ハロゲン化酵素を用いた有機ハロゲン化合物の分解は、実用上、分解効率が十分なものとはいえなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−３０５９０３号公報
【特許文献２】特開平５−２６０９６４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記の事情に鑑み、酵素反応を利用した従来よりも効率的な有機ハロゲン化合物の分解方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、マイクロ波照射下で、脱ハロゲン化酵素を用いて有機ハロゲン化合物の脱ハロゲン化反応を行うことを特徴とする、有機ハロゲン化合物の分解方法である。
【０００８】
上記有機ハロゲン化合物はハロ酸であり、上記脱ハロゲン化酵素はハロ酸脱ハロゲン化酵素であることが好ましい。
【０００９】
上記脱ハロゲン化反応を非極性溶媒中で行うことが好ましい。
上記脱ハロゲン化酵素が担体に包括および／または固定化されていることが好ましい。
【００１０】
３５℃以下の温度で上記脱ハロゲン化反応が行われることが好ましい。
出力３〜５Ｗの上記マイクロ波を１５〜２０分間照射することが好ましい。
【００１１】
上記マイクロ波が周波数０．１〜１１０ＧＨｚの電磁波であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明においては、マイクロ波の照射に加えて脱ハロゲン化酵素を用いることにより、その触媒効果によって、低温（低エネルギー）で、有機ハロゲン化合物の分解反応が可能となる。また、脱ハロゲン化酵素のみを用いた場合よりも有機ハロゲン化合物の分解反応を促進することが可能となる。
【００１３】
さらに、反応溶媒として非極性溶媒を使用し、包括および／または固定化された脱ハロゲン化酵素を用いた場合、有機ハロゲン化合物の分解反応を低エネルギーのマイクロ波で効率的に促進することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＭＣＡおよびＣＰＡを基質としてマイクロ波を照射した場合の各酵素量における変換率を示すグラフである。
【図２】マイクロ波の照射時間と変換率の関係を示すグラフである。
【図３】マイクロ波の照射強度と変換率の関係を示すグラフである。
【図４】有機ハロゲン化合物（ＭＣＡ）の濃度と変換率の関係を示すグラフである。
【図５】有機ハロゲン化合物の種類と変換率の関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明において、有機ハロゲン化合物とは、ハロゲンを含有する有機化合物であり、例えば、ハロ酸、ハロアルカン、ＰＣＢ（ポリ塩化ビフェニル）、ダイオキシン類が挙げられるが、好ましくはハロ酸である。ハロ酸としては、例えば、ハロ酢酸類、２−ハロプロピオン酸類、２−ハロ酪酸類が挙げられ、好ましくはハロ酢酸類である。ハロ酢酸類としては、ハロ酢酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸等が挙げられる。また、有機ハロゲン化合物中に含まれるハロゲンは、好ましくは塩素、臭素であり、さらに好ましくは塩素である。なお、有機ハロゲン化合物（基質）は、固体には固定化されていない状態で分解反応（脱ハロゲン化反応）に付されることが好ましい。
【００１６】
本発明で用いる脱ハロゲン化酵素は、有機ハロゲン化合物の分解反応（脱ハロゲン化）を触媒するものであれば特に限定されないが、好ましくはハロゲンと水酸基の置換反応を触媒する酵素であり、さらに好ましくはハロ酸脱ハロゲン化酵素である。
【００１７】
また、脱ハロゲン化酵素は、担体に包括および／または固定化された状態で反応に用いられることが好ましい。担体とは、酵素の包括および／または固定化に用いられる種々公知の担体を用いることができる。また、脱ハロゲン化酵素を担体に包括および／または固定化する方法としても、酵素の包括および／または固定化に用いられる種々公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、アクリルアミド等の熱、電磁波等により硬化する硬化性樹脂の溶液中に、脱ハロゲン化酵素を添加し、撹拌・混合後、樹脂を硬化させることにより、酵素が包括・固定化された樹脂を得る方法が挙げられる。後述のように反応溶媒として非極性溶媒を使用した場合、脱ハロゲン化酵素の種類によっては、酵素が凝集してしまい、脱ハロゲン化反応が進行しない場合があるからである。
【００１８】
脱ハロゲン化酵素量の最大値は、酵素を生産する経済的上限である１５ｍｇあるいは０．５８μｍｏｌ以下である。脱ハロゲン化酵素量が好適範囲内になるように有機ハロゲン化合物の量を選択する。
【００１９】
本発明において脱ハロゲン化反応を行う際の反応系には水やアルカリ物質を添加しないことが好ましく、反応溶媒としては非極性溶媒を用いることが好ましい。非極性溶媒は、水よりも極性（比誘電率）の小さい溶媒であれば特に限定されないが、好ましくは比誘電率５以下の溶媒であり、より好ましくは比誘電率３以下の溶媒、さらに好ましくは比誘電率２．３以下の溶媒である。具体的な誘電率５以下の溶媒としては、ヘキサン（比誘電率：２．１）、ヘプタン（比誘電率：１．９）などの脂肪族炭化水素溶媒、トルエン（比誘電率：２．４）、キシレン（比誘電率：２．４）などの芳香族系炭化水素溶媒、エチルエーテル（比誘電率：４．３）、ジイソプロピルエーテル（比誘電率：３．９）等のエーテル系溶媒等が挙げられる（誘電率の出典：「Organic Solvents 3rd Edition」, J. A. Riddick & W. B. Bunger, WILEY-INTERSCIENCE．）。なお、これらの溶媒の２種以上を混合した溶媒を反応溶媒として用いてもよい。
【００２０】
上記特許文献１に開示される従来技術では、有機ハロゲン化合物が付着・吸着した固体に対し、水とアルカリ物質を添加し、湿潤状態でマイクロ波を照射しているため、出力６００Ｗのマイクロ波を照射して１５０℃の温度で反応を実施しているが、本発明の方法において非極性溶媒を用いることにより、より低出力・低温（３Ｗ、３３℃）で分解反応が実現できる。メカニズムは不明であるが、極性溶媒を用いた場合よりも、マイクロ波を基質（有機ハロゲン化合物）や脱ハロゲン化酵素に対して、より直接的に作用させることができることが理由として考えられる。さらに本発明によって、従来技術では必要であったアルカリ置換反応用のアルカリ物質が不要となり、より低環境負荷な環境浄化技術の提供が可能となる。
【００２１】
非極性溶媒の使用量は、有機ハロゲン化合物１重量部に対して１０重量部以上であることが好ましく、より好ましくは３０重量部以上、さらに好ましくは５０重量部以上である。非極性溶媒の使用量が少なすぎると、有機ハロゲン化合物と脱ハロゲン化酵素との反応効率が低下するためである。上限は特に制限されないが経済性を考えると、１０００重量部以下、好ましくは５００重量部以下である。
【００２２】
本発明の有機ハロゲン化合物の分解方法は、マイクロ波を反応系に照射しながら、上記脱ハロゲン化酵素を用いて有機ハロゲン化合物の脱ハロゲン化反応（分解反応）を行う方法である。本発明においては、従来の脱ハロゲン化酵素の酵素反応による有機ハロゲン化合物の分解に加えて、反応系にマイクロ波を照射することで、変換率（分解率）が向上する効果が得られる。
【００２３】
この脱ハロゲン化反応において、反応系（溶媒）の温度が３５℃以下の温度に維持されるよう、マイクロ波の出力および照射時間が調整させることが好ましい。このために、マイクロ波の出力は３〜５Ｗであることが好ましく、マイクロ波の照射時間は１５〜２０分間であることが好ましい。また、マイクロ波は、周波数０．１〜１１０ＧＨｚの電磁波であることが好ましい。
【００２４】
上述の有機ハロゲン化合物の分解方法に用いるマイクロ波照射装置としては、種々のマイクロ波照射装置を用いることができるが、例えば、アステック社製のマイクロ波フォーカスド化学合成装置（商品名：Ｄｉｓｃｏｖｅｒ）、東京理化機械株式会社（ＥＹＥＬＡ）製のマイクロウェーブ反応装置ＮＷＯ−１０００Ｓ型（商品名：ＷａｖｅＭａｇｉｃ）などの市販の装置を用いることができる。
【００２５】
マイクロ波フォーカスド化学合成装置は、電磁波の周波数制御機構および出力制御機構や、電磁波の照射時間制御機構、被照射物の温度制御機構を備えている。また、マイクロ波フォーカスド化学合成装置は、マイクロ波導波管がマイクロ波照射装置内の被照射物に向かって開口しているため、被照射物が少量の酵素や有機ハロゲン化合物である場合に適している。
【００２６】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
（実施例）
本実施例では、ｎ−ヘプタンを溶媒として有機ハロゲン化合物を溶解させた溶液に、アクリルアミドで包括・固定化したPseudomonas sp. YL株由来のハロ酸脱ハロゲン化酵素（Ｌ−ＤＥＸ  ＹＬ）を加え反応を行った。以下に詳細を説明する。
【００２８】
まず、反応に先立って、包括・固定化したハロ酸脱ハロゲン化酵素を調製した。１．５ｍＬサンプリングチューブの底に穴を開け、その穴をパラフィルムで塞ぐ。チューブ内に１０ｍｇ／ｍＬのＬ−ＤＥＸ（ハロ酸脱ハロゲン化酵素）溶液（溶媒：５０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０）５μＬと１８．７５％（w/v）のアクリルアミド溶液（溶媒：１００ｍＭトリス−硫酸バッファー、ｐＨ９．５）４５μＬとを分注し、ボルテックスミキサーで撹拌・混合する。３５℃のヒートブロックで２０分間インキュベーションする。チューブのキャップを開け、パラフィルムを剥がし、底の穴からエアダスターで空気を送り込んで、酵素が包括・固定化されたＬ−ＤＥＸゲルを取り出す。ゲルの取り出しをこのようにして行うのは、ゲル表面に傷等が付くことで包括・固定化された酵素の反応面積が変化し、再現性が得られなくなる恐れがあるためである。
【００２９】
次に、ｎ−へプタンを溶媒とした有機ハロゲン化合物の溶液を、溶液中の有機ハロゲン化合物（基質）の濃度が１、２、５、１０または２０ｍＭとなるように調製した。
【００３０】
有機ハロゲン化合物としては、塩素系のハロ酢酸として、モノクロロ酢酸（化学式（１）：以下、ＭＣＡと略す）、ジクロロ酢酸（化学式（２）：以下、ＤＣＡと略す）、それ以外のハロ酸（ハロ酢酸類）として、（Ｓ）−２−クロロプロピオン酸（化学式（３）：以下、ＣＰＡと略す）、２，２−ジクロロプロピオン酸（化学式（４）：以下、ＤＣＰＡと略す）、２−クロロ酪酸（化学式（５）：以下、ＣＢＡと略す）の５種類を使用した。
【００３１】
【化１】
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【００３２】
【化２】
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【００３３】
【化３】
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【００３４】
【化４】
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【００３５】
【化５】
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【００３６】
次に、上記各種の有機ハロゲン化合物溶液１ｍＬを専用の試験管に分注し、この試験管中に酵素が包括・固定化されたＬ−ＤＥＸゲルを添加した。その後、この試験管を下記マイクロ波照射装置内に設置し、マイクロ波を照射した。
【００３７】
マイクロ波の照射は、アステック社製のマイクロ波フォーカスド化学合成装置（商品名：Ｄｉｓｃｏｖｅｒ）を使用し、照射強度（３、５、８、１０、１２、１５Ｗ）、照射時間（５、１０、１５、２０、３０分間）を種々変化させて行った。
【００３８】
（比較例）
マイクロ波照射の代わりに水浴中で３３℃、１５分間の反応を行った以外は実施例と同様にして有機ハロゲン化合物の分解を行った。
【００３９】
上記実施例および比較例において、有機ハロゲン化合物中の塩素原子が水酸基に置換された割合（変換率：％）を、反応中に生成する塩素イオン量をチオシアン酸鉄の錯体形成による比色定量法により決定し、それに基づいて算出した。結果を図１〜５に示す。
【００４０】
図１は、有機ハロゲン化合物としてＭＣＡまたはＣＰＡの２０ｍＭの溶液を使用し、５μｇまたは５０μｇの酵素を含むＬ−ＤＥＸゲルを使用して、出力３０Ｗで２０分間のマイクロ波照射を行った実施例の変換率を示す。酵素量を増やすことによって変換率が向上することが分かる。
【００４１】
図２は、有機ハロゲン化合物としてＭＣＡの２０ｍＭの溶液を使用し、５０μｇの酵素を含むＬ−ＤＥＸゲルを使用して、出力５Ｗで５、１０、１５、２０、３０分間のマイクロ波照射を行った実施例の変換率を示す。この場合は、マイクロ波を１５分間照射したときに変換率が最も高くなっている。
【００４２】
図３は、有機ハロゲン化合物としてＭＣＡの２０ｍＭの溶液を使用し、５０μｇの酵素を含むＬ−ＤＥＸゲルを使用して、出力３、５、８、１０、１２、１５Ｗで２０分間のマイクロ波照射を行った実施例の変換率を示す。この場合は、出力３Ｗのマイクロ波を照射したときに変換率が最も高くなっている。
【００４３】
図４は、有機ハロゲン化合物としてＭＣＡの１、２、５、１０、２０ｍＭの溶液を使用し、５０μｇの酵素を含むＬ−ＤＥＸゲルを使用して、出力３Ｗで１５分間のマイクロ波照射を行った実施例の変換率を示す。この場合は、ＭＣＡ溶液の濃度が低いほど変換率は高くなった。
【００４４】
図５は、有機ハロゲン化合物として、ＭＣＡ、ＣＰＡ、ＤＣＰＡ、ＣＢＡ、ＤＣＡの１０ｍＭ溶液を使用し、５０μｇの酵素を含むＬ−ＤＥＸゲルを使用した場合において、出力３Ｗで１５分間のマイクロ波照射を行った実施例と、水浴中で反応を行った比較例と変換率を示す。
【００４５】
ＭＣＡの場合、実施例の変換率は１４．３±１．４％であり、比較例の変換率は４．７±１．６％であった。ＤＣＡの場合、実施例の変換率は８．９±０．９％であり、比較例の変換率は２．６±０．６％であった。ＣＰＡの場合、実施例の変換率は５．４±２．２％であり、比較例の変換率は３．６±０．６％であった。ＤＣＰＡの場合、実施例の変換率は１．８±０．６％であり、比較例の変換率は１．６±０．７％であった。ＣＢＡの場合、実施例の変換率は５．９±１．０％であり、比較例の変換率は２．５±１．２％であった。なお、数値は測定の平均値と標準偏差を表している（各測定回数は、実施例のＭＣＡ、ＣＢＡで５回、ＣＰＡ、ＤＣＰＡで６回、ＤＣＡで４回であり、比較例のＭＣＡ、ＣＰＡ、ＤＣＰＡ、ＣＢＡで６回、ＤＣＡで４回である。）。全体的にマイクロ波を照射した実施例の方が、水浴中で反応を行った比較例よりも変換率が高くなっていることが分かる。特に炭素鎖の短い有機ハロゲン化合物（ＭＣＡ、ＤＣＡ）で差が顕著であった。これらの結果から、脱ハロゲン化酵素（Ｌ−ＤＥＸ  ＹＬ）による脱ハロゲン化反応は、マイクロ波照射によって水浴中よりも効率よく進行することが明らかになった。
【００４６】
今回開示された実施の形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の有機ハロゲン化合物の分解方法は、有機ハロゲン化合物が付着・吸着した固体の浄化処理分野で好適に利用され得るものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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