(57)【要約】      （修正有）【課題】敗血症性ショックおよびＡＲＤＳ（急性呼吸促進症候群）を含めた敗血症を治療するための医薬組成物および方法であって、有効量のＨＭＧ１アンタゴニストを投与することを含む医薬組成物および方法の提供。【解決手段】敗血症または敗血症性ショックの重症度または考え得る致死率をモニタリングするための診断方法であって、敗血症または敗血症性ショック症状を示しているかまたは示す危険性のある患者におけるＨＭＧ１の血清濃度を測定することを含む方法。体重損失をもたらすか、または肥満症を治療するための医薬組成物および方法であって、有効量のＨＭＧ１または治療的活性ＨＭＧ１断片を投与することを含む医薬組成物および方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性サイトカインカスケードの活性化を特徴とする症状（疾患）を治療するための医薬組成物であって、有効量の、ＨＭＧ１のアンタゴニストまたは阻害剤を含む組成物。
【請求項２】
敗血症および関連症状を治療するための医薬組成物であって、有効量のＨＭＧ１アンタゴニストを含む組成物。
【請求項３】
前記ＨＭＧ１アンタゴニストは、ＨＭＧ１と結合する抗体、ＨＭＧ１アンチセンス配列およびＨＭＧ１受容体アンタゴニストから成る群から選択される請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項４】
炎症性サイトカインカスケードの活性化を特徴とする症状の治療方法であって、有効量のＨＭＧ１アンタゴニストを投与することを含む方法。
【請求項５】
炎症性サイトカインカスケード症候群の活性化を伴う敗血症および関連症状の治療方法であって、有効量のＨＭＧ１アンタゴニストを投与することを含む方法。
【請求項６】
前記ＨＭＧ１アンタゴニストと組合せて第二作用物質を投与することをさらに含み、該第二作用物質は、初期敗血症メディエータのアンタゴニストである請求項４または５記載の方法。
【請求項７】
前記第二作用物質は、ＴＮＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１γ、ＭＩＦおよびＩＬ−６から成る群から選択されるサイトカインのアンタゴニストである請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記第二作用物質は、ＴＮＦまたはＭＩＦに対する抗体、あるいはＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）である請求項７記載の方法。
【請求項９】
炎症性カスケードの活性化を特徴とする症状に伴うショック様症状を示しているかまたはその症状を示す危険性のある患者に関する敗血症および関連症状の重症度をモニタリングし、そして起こり得る臨床経過を予測するための診断および予後判定方法であって、試料中のＨＭＧ１の濃度を測定し、該濃度を、同様の試料中のＨＭＧ１の正常濃度範囲を代表するＨＭＧ１に関する標準と比較し、それにより高レベルのＨＭＧ１が、乏しい予後または毒性反応の可能性を示すことを含む方法。
【請求項１０】
前記試料は、血清試料である請求項９記載の診断または予後判定方法。
【請求項１１】
敗血症または敗血症性ショックの重症度の診断またはモニタリングをモニタリングするための診断方法であって、敗血症または敗血症性ショック様症状を示す危険性のあるまたは示している患者におけるＨＭＧ１の血清濃度を測定し、それにより高レベルのＨＭＧ１が敗血症または敗血症性ショックの診断あるいは乏しい予後を示すことを含む方法。
【請求項１２】
体重損失をもたらすか、または肥満症を治療するための医薬組成物であって、有効量の、ＨＭＧ１またはその治療的活性断片を含む組成物。
【請求項１３】
体重損失をもたらすか、または肥満症を治療するための方法であって、有効量のＨＭＧ１またはその治療的活性断片を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、炎症性サイトカインカスケードの活性化を特徴とする、特に敗血症性ショックおよびＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）を含めた敗血症疾患を治療するための医薬組成物および方法であって、高移動度グループ１タンパク質（ＨＭＧ１）に対する有効量のアンタゴニストを投与することを含む組成物および方法を提供する。本発明はさらに、敗血症および関連症状の重症度をモニタリングするための診断方法であって、炎症性サイトカインカスケードの活性化を特徴とする疾患の症状を示している患者におけるＨＭＧ１の血清濃度を測定することを含む方法を提供する。最後に、本発明は、体重損失をもたらすか、または肥満症を治療するための医薬組成物および方法であって、有効量のＨＭＧ１タンパク質またはＨＭＧ１遺伝子の遺伝子産物の治療的活性断片を投与することを含む医薬組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
［発明の背景］
敗血症は、感染または損傷後に発症するしばしば致命的となる臨床症候群である。敗血症は、入院患者における最多死因である。細菌内毒素（リポ多糖、ＬＰＳ）の投与を基礎にしたグラム陰性敗血症の実験モデルは、共通した根元的炎症性サイトカインカスケードの活性化による致死的敗血症および敗血症に関連した症状の病因メカニズムの理解の改良をもたらした。宿主応答性メディエータのこのカスケードは、重症内毒素血症における終局的致死性の急性初期メディエータとして広範に研究されてきたＴＮＦ、ＩＬ−１、ＰＡＦおよびその他のマクロファージ由来因子を含む（Zhang and Tracey, In The Cytokine Handbook, 3rd ed. Ed. Thompson（Academic Press Limited, USA）.515−547, 1998）。
【０００３】
残念ながら、内毒素血症のこれらの個々の「初期」メディエータの阻害を基礎にした療法的アプローチは、ヒト患者における敗血症に対する大規模予測臨床試験における限定成功例にのみ応じただけである。これらの期待はずれの結果から、宿主応答における後期出現因子が、敗血症および関連疾患における病因および／または致死性を決定するのに重要であり得ると推論できる。したがって、特に内毒素血症が臨床的敗血症および関連臨床疾患を代表することから、重症内毒素血症の広範な多系病因の一部または全部に関してあるいは致死性に関して、必要なおよび／または十分なこのような推定「後期」メディエータを発見することが必要である。
【０００４】
ＨＭＧ１は、急に出現する高移動度群（ＨＭＧ）の非ヒストンクロマチン関連タンパク質に属する３０ｋＤａ染色体核タンパク質である。一群として、ＨＭＧタンパク質は、独特のＤＮＡ構造を認識し、ヌクレオソーム構造および安定性の確定を含めた多様な細胞機能に、ならびに転写および／または複製に関連づけられてきた。ＨＭＧタンパク質は、ポリアクリルアミドゲル中での高い電気泳動移動度を有するクロマチン構成成分としてJohnsとGoodwinにより最初に性状解析された（The HMG Chromosomal Proteins, E.W. Johns, Academic Press, London, 1982参照）。高等真核生物は、ＨＭＧタンパク質の３つのファミリー、即ちＨＭＧ−１／−２ファミリー、ＨＭＧ−１４／−１７ファミリーおよびＨＭＧ−１／−Ｙファミリーを示す。ファミリーはサイズおよびＤＮＡ結合特性により区別可能であるが、しかしそれらはその物理的特性において類似する。ＨＭＧタンパク質は、種を通して高度に保存され、遍く分布されて、非常に豊富であり、そして０．３５ＭのＮａＣｌ中のクロマチンから抽出可能であり、５％過塩素酸またはトリクロロ酢酸中に可溶性である。一般に、ＨＭＧタンパク質は、ＤＮＡを折り曲げて、種々の転写因子とそれらのコグネイト配列（例えばプロゲステロン受容体、エストロゲン受容体、ＨＯＸタンパク質、ならびにＯｃｔ１、Ｏｃｔ２およびＯｃｔ６）との結合を促すと考えられる。近年、いくつかの転写因子およびその他のＤＮＡ相互作用タンパク質を含めたタンパク質の大きい非常に多様な群が、ＨＭＧ１に類似した１つまたはそれ以上の領域を含有する、ということが明らかになってきて、この特徴はＨＭＧ１ボックスまたはＨＭＧ１ドメインとして知られるようになった。ＨＭＧ１をコードするｃＤＮＡは、ヒト、ラット、マス、ハムスター、ブタおよび仔ウシ細胞からクローン化されており、ＨＭＧ１はすべての脊椎動物細胞核中に豊富に存在すると考えられる。本タンパク質は、８０％範囲の種間配列同一性で高度に保存されている。クロマチン中では、ＨＭＧ１は、ヌクレオソーム間のリンカーＤＮＡと、そして種々の非β−ＤＮＡ構造、例えばパリンドローム、十字形およびステム−ループ構造、ならびにシスプラチン修飾ＤＮＡと結合する。ＨＭＧ１により結合されるＤＮＡは、一般に、配列非感受性であると考えられる。ＨＭＧ１は洗浄済み核またはクロマチンから最も高頻度に調製されるが、しかし、当該タンパク質はまた細胞質中でも検出されている（Landsman and Bustin, BioEssays 15:539−546, 1993; Baxevams and Landsman, Nucleic Acids Research 23:514−523, 1995で再検討）。今日まで、ＨＭＧタンパク質といずれかの臨床症状または疾患との間に関連は確立されていない。
【０００５】
あるいはＨＭＧ１は、発生中の脳において豊富に発現されるヘパリン結合タンパク質として同定され、その高度な二極性配列のため「アンホテリン」と称されており、これは約８０アミノ酸正荷電ドメイン（ＨＭＧ１ボックス）と一続きの約３０の連続したグルタミン酸またはアスパラギン酸残基を含む酸性Ｃ末端ドメインとの２つの内部反復を有する。アンホテリン／ＨＭＧ１は上皮、特にニューロン細胞の形質膜の外表面に局在化されており、この場合、それは神経細胞のフィリポジア（filipodia）に特異的に局在化されている。アンホテリン／ＨＭＧ１は突起（神経突起）伸長に必要であり、アンホテリン／ＨＭＧ１はまたニューロン−グリア相互作用にも関与し得る、ということを阻害試験は示唆した（Merenmies et al., J. Biol. Chem. 266:16722−16729, 1991; Merenmies et al., J. Biol. Chem. 266:16722−16729, 1991; Milev et al., J. Biol. Chem. 273:6998−7005, 1998;およびSalmivirta et al., Exp. Cell Res. 200:444−451, 1992）。アンホテリン／ＨＭＧ１は、化学誘導物質ヘキサメチレンビスアセトアミドによる刺激後にマウス赤白血病細胞から放出され得る（Melloni et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 210:82−89, 1995）。ＨＭＧ１遺伝子の遺伝子産物は、α−ＰＫＣを刺激することにより分化促進因子として機能する、ということを過去の研究は示唆している（Melloni et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 210:82−89, 1995;およびMelloni et al., FEBS Lett. 368:466−470, 1995）。
【０００６】
ＨＭＧ１遺伝子産物は、プラスミノーゲンおよび組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）と相互作用し、細胞侵襲および組織再造形中の細胞外タンパク質分解に一役を演じることが知られている系である細胞表面でのプラスミン生成を有効に促進する、ということが示されている。アンホテリン／ＨＭＧ１は、進行性グリコシル化最終生成物（ＲＡＧＥ）の受容体と相互作用することも示されている（Mohan et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 182:689−696, 1992; Yamawaki et al., J. Neurosci. Res. 44:586−593, 1996; Salmivirta et al., Exp. Cell Res. 200:444−451, 1992;およびVassalli et al., J. Clin. Invest. 88:1067−1072, 1991）、（Redlitz and Plow, Baillieres Clin. Haematol. 8:313−327, 1995;およびParkkinen et al., J. Biol. Chem. 266:16730−16735, 1991）。
【０００７】
サイトカイン媒介性炎症カスケードを防止し、広範な種々のサイトカイン媒介性炎症性疾患における療法的活性を有し得る改良された作用物質を発見することが当業界では長きに亘って必要とされている。本発明は、敗血症および炎症性サイトカインカスケードの一般的活性化により関連づけられるその他の疾患における毒性、病因および／または致死性を媒介する作用物質を同定するための研究調査の経過中になされた。
【０００８】
炎症性サイトカインカスケードにより媒介される疾患および症状は、多数ある。このような症状としては、以下に群別された疾患カテゴリーが含まれる：
全身性炎症性応答症候群、これには以下が含まれる：
敗血症症候群
グラム陽性敗血症
グラム陰性敗血症
培養陰性敗血症
真菌性敗血症
好中球減少性発熱
尿路性敗血症
髄膜炎菌血症
外傷性出血
唸音
電離放射線曝露
急性膵炎
成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）
再還流傷害、これには以下が含まれる：
後ポンプ症候群
虚血再還流傷害
心臓血管性疾患、これには以下が含まれる：
心臓性昏倒症候群
心筋梗塞
うっ血性心不全
感染性疾患、これには以下が含まれる：
ＨＩＶ感染／ＨＩＶニューロパシー
髄膜炎
肝炎
敗血症性関節炎
腹膜炎
肺炎喉頭蓋炎
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７
溶血性尿毒症症候群／血栓崩壊性血小板減少性紫斑病
マラリア
デング出血熱
リーシュマニア症
らい病
トキシックショック症候群
連鎖球菌性筋炎
ガス壊疸
Mycobacterium結核（ヒト型結核）
Mycobacterium aviun Intracellulare（鳥型結核菌細胞内物質感染）
Pneumocystis Carinii（ニューモシスティスカリニ）肺炎
骨盤炎症性疾患
睾丸炎／精巣上体炎
レジオネラ
ライム病
Ａ型インフルエンザ
エプスタイン−バーウイルス
ウイルス関連血球貪食(hemiaphagocytic)症候群
ウイルス性脳炎／無菌性髄膜炎
産科学／婦人科学的症状、これは以下を含む：
早産
流産
不妊症
炎症性疾患／自己免疫疾患、これには以下が含まれる：
リウマチ性関節炎／セロネガティブ関節症
変形性関節症
炎症性腸疾患
全身性エリトマトーデス
虹彩毛様体炎／ブドウ膜炎視神経炎
特発性肺繊維症
全身性脈管炎／ウェーゲナー肉芽腫症
サルコイドーシス
睾丸炎／精管切除反転術
アレルギー性／アトピー性疾患、これには以下が含まれる：
喘息
アレルギー性鼻炎
湿疹
アレルギー性接触性皮膚炎
アレルギー性結膜炎
過敏性肺炎
悪性疾患、これには以下が含まれる：
ＡＬＬ
ＡＭＬ
ＣＭＬ
ＣＬＬ
ホジキン病、非ホジキンリンパ腫
カポジ肉腫
結腸直腸癌
鼻咽頭癌
悪性組織球増殖症
新生物随伴症候群／悪性疾患の高カルシウム血症
移植片、これは以下を含む：
器官移植片拒絶
移植片対宿主疾患
悪液質
先天性、これは以下を含む：
嚢胞性繊維症
家族性血液食細胞性リンパ組織球増殖症
鎌状赤血球貧血
皮膚科学的、これは以下を含む：
乾癬
脱毛症
神経学的、これは以下を含む：
多発性硬化症
片頭痛
腎臓性、これは以下を含む：
ネフローゼ症候群
血液透析
尿毒症
毒性、これは以下を含む：
ＯＫＴ３療法
抗ＣＤ３療法
サイトカイン療法
化学療法
放射線療法
慢性サリチレート中毒
代謝性／特発性、これは以下を含む：
ウィルソン病
血液色素症
α−１アンチトリプシン欠損症
糖尿病
橋本甲状腺炎
骨粗鬆症
視床下部−下垂体−副腎軸評価
原発性胆汁性肝硬変
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
［発明の概要］
本発明は、炎症性サイトカインカスケードにより媒介される症状（疾患）を治療するための医薬組成物であって、有効量の、ＨＭＧ１のアンタゴニストまたは阻害剤を含む組成物を提供する。好ましくは、ＨＭＧ１アンタゴニストは、ＨＭＧ１タンパク質と結合する抗体、ＨＭＧ１遺伝子アンチセンス配列およびＨＭＧ１受容体アンタゴニストから成る群から選択される。本発明は、炎症性サイトカインカスケードにより媒介される症状の治療方法であって、有効量のＨＭＧ１アンタゴニストを投与することを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明の方法は、ＨＭＧ１アンタゴニストと組合せて第二作用物質を投与することをさらに含み、この場合、第二作用物質は、ＴＮＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＭＩＦまたはＩＬ−６のような初期敗血症メディエータのアンタゴニストである。最も好ましくは、第二作用物質は、ＴＮＦに対する抗体、あるいはＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）である。
【００１０】
本発明はさらに、炎症性カスケードにより媒介される症状に伴うショック様症状を示しているかまたはその症状を示す危険性のある患者に関する敗血症および関連症状の重症度をモニタリングし、そして起こり得る臨床経過を予測するための診断および予後判定方法を提供する。本発明の診断および予後判定方法は、試料中の、好ましくは血清試料中のＨＭＧ１の濃度を測定し、その濃度を、同様の試料中のＨＭＧ１の正常濃度範囲を代表するＨＭＧ１に関する標準と比較し、それにより高レベルのＨＭＧ１が乏しい予後または毒性反応の可能性を示すことを包含する。本診断方法はまた、他の組織、または流体区画、例えば脳脊髄液または尿にも適用され得る。最後に、本発明は、体重損失をもたらすか、または肥満症を治療するための医薬組成物および方法であって、有効量のＨＭＧ１またはその治療的活性断片を投与することを含む医薬組成物および方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】in vitro（図１Ａ）およびin vivo（図１Ｂ）でのＬＰＳによるＨＭＧ１放出の誘導をプロファイルする２つのグラフを示す。特に図１Ａは、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激後のマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞の培養上清中のＨＭＧ１の蓄積を示す。挿入図は、ＴＮＦによる誘導後のＲＡＷ２６４．７細胞からのＨＭＧ１放出の誘導を示すウエスタンブロット（組換え体ＨＭＧ１に対して生じた抗体を使用）である。図１Ｂは、ＬＰＳ処理マウスの血清中のＨＭＧ１の誘導を示す。ＬＰＳ投与後の種々の時点でＢａｌｂ／Ｃマウスからの血清を収集し、組換え体ＨＭＧ１に対して生じた抗体を用いたウエスタンブロットによりＨＭＧ１についてアッセイした。
【図２】ＨＭＧ１が内毒素血症における病因および致死性のメディエータであることを説明する。図２Ａは、マウスに処置したＬＰＳ致死性に対する抗ＨＭＧ１抗体の防御作用を示す。ＬＰＳチャレンジ（０時間）に比して−０．５（１回投与の場合）、−０．５および１２（２回投与の場合）または−０．５、１２および３６（３回投与の場合）時間での指示量の抗ＨＭＧ１抗血清の投与は、ＬＰＳ誘導性致死性に対して防御的であり、反復投与スケジュールは良好な防御を提供した。図２Ｂは、ｒＨＭＧ１が内毒素マウスにおける用量依存性致死性を引き起こしたことを説明する。雄Ｂａｌｂ／Ｃマウス（２０〜２３グラム）を、１０群に無作為に分けて、ＬＰＳ（３．１５ｍｇ／ｋｇ；非致死量）を単独でまたは精製組換え体ＨＭＧ１タンパク質と組合せて投与した。指示用量でのＬＰＳチャレンジ後、２、１６、２８および４０時間目のＨＭＧ１の投与は、根元的内毒素血症の致死性を有意に増大した。図２Ｃは、用量の一関数としてのＨＭＧ１の個々の致死性毒性を説明する。精製ｒＨＭＧ１を、指示用量での１回腹腔内ボーラス投与として、雄Ｂａｌｂ／Ｃマウス（５匹／処置群）に投与した。少なくとも４８時間マウスを観察した結果、５００μｇ／マウスの用量でｒＨＭＧ１で処置したマウスの６０％がｒＨＭＧ１試験の２４時間以内に死亡したが、これは、５００μｇ／マウス未満の１回投与ＬＤ50を示す。
【図３】ＨＭＧ１がin vitro（図３Ａ）およびin vivo（図３Ｂ）の両方でＴＮＦ放出を誘導したことを示す。特に図３Ａは、ＨＭＧ１が用量依存様式でｈｕＰＰＢＭＣｓからのＴＮＦ放出を誘導することを示す。新たに単離したｈｕＰＢＭＣ培養物を指示用量の精製組換え体ＨＭＧ１タンパク質で刺激し、培地を４時間後にサンプリングして、既知の免疫学的方法（ＥＬＩＳＡ）によりＴＮＦに関してアッセイした。図３Ａは、２つの実験（３連）における誘導性ＴＮＦ応答の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。図３Ｂは、ＨＭＧ１の投与が処置マウスの血清中のＴＮＦの蓄積を誘導したことを示す。Ｂａｌｂ／Ｃマウス（２０〜２３グラム）を指示用量の精製組換え体ＨＭＧ１で腹腔内処置して、Ｌ９２９生物アッセイによるＴＮＦアッセイのために、血液試料を２時間後に採取した（ＴＮＦレベルは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表される。Ｎ＝３）。
【図４】ＨＭＧ１がマウスにおける体重損失を引き起こしたことを示す。１００μｇ／マウス／日で３日間、精製ＨＭＧ１をマウスに腹腔内投与して、体重をモニタリングした。図４は、３匹／群のマウスの正味体重変化の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。
【図５】ＨＭＧ１ ｍＲＮＡの組織分布を示す。種々の組織のポリ（Ａ）+ＲＮＡを含有するヒトＲＮＡマスターブロット（Clontech, Palo Alto, CA, USA）を、すべて、当業界で周知の方法にしたがって、ＨＭＧ１ ｃＤＮＡインサートを含有する組換え体プラスミドを用いたＰＣＲにより合成された０．６ｋｂジゴキシゲニン−１ １−ｄＵＴＰ標識化ＨＭＧ１ ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。要するに、１０ｎｇ／ｍｌのプローブ濃度で６５℃１６時間、ハイブリダイゼーション緩衝液（５×ＳＳＣ／２％ブロッキング試薬／０．１％ＳＤＳ／５０％ホルムアミド、Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）中でハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリダイゼーション後、フィルターを室温で、０．５×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで５分間、２回洗浄して、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１０分間、２回洗浄した。標準的方法により、ホスファターゼに結合された抗ジゴキシゲニン抗体と、検出試薬、約４−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）および５−クロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート（ＢＣＩＰ）（Boehringer−Mannheim）を用いて、シグナルを検出した。シルバー画像スキャナー（シルバースキャナーＩＩ、Lacie Limited, Beaverton, OR）でブロットを走査して、相対光学濃度（恣意単位ＡＵで）をＮＩＨ１．５９イメージソフトウエアを用いて定量した。最高レベルは冨マクロファージ組織で観察されたことに留意されたい。
【図６】図６は、正常コントロール被験者の群と比較した場合、敗血症を有する入院ヒト被験者において検出された血清ＨＭＧ１レベルの増大が検出し、この場合、敗血症患者は、患者が死亡したかまたは生存したかに関してさらに分類されたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［発明の詳細な説明］
本発明は、ＬＰＳ、ＴＮＦまたはＩＬ−１による刺激後の培養マウスマクロファージ様細胞（ＲＡＷ２６４．７）により放出され、そしてこの細胞により調整された培地中に蓄積する高誘導性３０ｋＤａタンパク質の発見および単離に基づいている。この単離ポリペプチドの部分的アミノ酸配列は、アンホテリンとしても知られているＨＭＧ１タンパク質の配列と同一であり、このタンパク質はこれまでにいずれもの疾患の病原に連結されていない。この情報を用いてＨＭＧ１をコードするｃＤＮＡをクローン化し、その配列を発現させて、組換え体タンパク質を得て、そのタンパク質を用いて特異的抗ＨＭＧ１抗体を生成した。
【００１３】
一連の予測的in vitroおよびin vivo実験で、治療的および診断的効力を確定した。実験は、実施例の項に詳述する。例えば、マウスへの内毒素（ＬＤ100）の投与後、血清ＨＭＧ１レベルは、敗血症の周知の「初期」メディエータ（例えばＴＮＦおよびＩＬ−１）より遅れて（１６時間で）増大し、ＨＭＧ１のプラトーレベルは１６〜３２時間保持された。致死的敗血症を有する患者は、正常健常有志においては検出されない高血清ＨＭＧ１レベルを有した。さらに、被験動物へのｒＨＭＧ１の急性実験的投与は、単独であっても亜致死量のＬＰＳと組合せても、顕著な病理学的応答を、そして死さえも生じた。より低量のｒＨＭＧ１の更なる分布投与スケジュールは、処置動物における有意の体重損失をもたらした。これらの結果は、既知の「初期」メディエータ、例えばＴＮＦおよびＩＬ−１と対照的に、ＨＭＧ１が内毒素血症のメディエータ、特に後期メディエータであるという証拠を示す。これらのデータはさらに、敗血症および関連症状の重症度または考え得る致死性に対するマーカーとしての血清ＨＭＧ１の重要性を示す。
【００１４】
さらに、抗ＨＭＧ１抗体による治療は、マウスにおけるＬＤ100用量のＬＰＳからの最大限の防御を提供した。ＨＭＧ１はＴＮＦおよびＩＬ−１βによって誘導可能であり、ｈｕＰＢＭＣからのＴＮＦ放出を用量依存的に刺激する。ＴＮＦはマクロファージ活性化のマーカーであり、したがって（暗示されるメカニズムに限定されることなく、または理論に縛られずに）、ＨＭＧ１はサイトカインカスケードの下流再活性化を促し、これが次に、前炎症性サイトカイン応答の活性化を伴う敗血症および関連症状における後期病因および致死性を媒介すると考えられる。したがって、ＨＭＧ１は、感染および損傷に対する炎症性応答を媒介する場合に中心的役割を占め、ＨＭＧ１のアンタゴニストは炎症性カスケード活性化の敗血症および関連症状における治療的利点を有すると思われる。炎症性サイトカインカスケードにおけるＨＭＧ１の出現は、後期の宿主応答を伝播するのに適しており、毒性および致死性に関与する。本明細書中に記載される予測データは、ＨＭＧ１アンタゴニストの治療的効力を支持し、作用メカニズムに関する前記の理論に支持される証拠を提供する。in vivo治療データは、概して炎症性サイトカインカスケードにより媒介される症状を、特に敗血症症状、例えば敗血症ショック、敗血症症候群または炎症性サイトカインにより媒介されるその他の「敗血症様」症状等を治療するための、概してＨＭＧ１アンタゴニストの効力、そして特に抗ＨＭＧ１抗体の効力を示した。さらに、ＨＭＧ１の個々の病原性および毒性／致死性は、ＴＮＦ、ＭＩＦ、ＩＬ−１およびＩＬ−６のような「初期」炎症性メディエータのアンタゴニストと同時投与した場合に、ＨＭＧ１アンタゴニストが特に有効であることを示す。
【００１５】
要するに、１）ＨＭＧ１は細菌毒素による、または前炎症性サイトカイン（ＴＮＦまたはＩＬ−１β）による刺激後にマクロファージおよび下垂体細胞から放出され、２）ＨＭＧ１はＬＰＳに曝露された動物の血清中および敗血症患者中に蓄積し、そして３）ＨＭＧ１特異的抗体は臨床的敗血症および関連症状の予測的致死内毒素血症動物モデルにおける死亡に対して防御することから、ＨＭＧ１は炎症性反応のサイトカインメディエータである。
【００１６】
医薬組成物および投与方法
本発明の医薬組成物または本発明の製剤組合せは、それ自体（複合物または組合せ）で、またはそれが適切な担体および賦形剤と混合される医薬組成物中で、患者に投与され得る。本発明の医薬組成物または本発明の製剤組合せは、非経口的に、例えば静脈内注射または注入、腹腔内注射、皮下注射または筋内注射により投与され得る。本発明の医薬組成物または本発明の製剤組合せは、錠剤、ピル、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー(slurries)、懸濁液等を形成するために担体および賦形剤を用いた適切な処方物により経口的にまたは直腸に投与され得る。本発明の医薬組成物または本発明の製剤組合せは、局所的に、例えば皮膚パッチにより投与されて、活性作用物質の一貫した全身レベルを達成する。本発明の医薬組成物または本発明の製剤組合せは、局所用クリーム、皮膚または粘膜パッチ、皮膚または粘膜表面への局所適用に適した液体またはゲル中に処方され得る。本発明の医薬組成物または本発明の製剤組合せは、局所的または全身的治療のために吸入器により気道に投与され得る。
【００１７】
本発明の医薬組成物または本発明の製剤組合せの用量は、本開示から当業者により確定され得る。上記医薬組成物または本発明の製剤組合せは、有効用量（投与経路および活性作用物質の薬物動態による）の本発明の医薬組成物または製剤組合せならびに、処方物の特定の投与経路（即ち、経口、非経口、局所または吸入による）に適した適切な製剤担体および賦形剤を含有する。活性作用物質は、混合、溶解、造粒、糖衣作製、乳化、カプセル封入、エントラッピングまたは凍結乾燥法によって、製剤処方物に混合される。非経口投与のための製剤処方物としては、活性作用物質の水性溶液または水溶性形態の組合せが挙げられる。さらに、活性作用物質の懸濁液は、油性注射懸濁液として調製されてもよい。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油、例えばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えばエチルオレエートまたはトリグリセリド、あるいはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランのような懸濁液の粘度を増大させる物質を含有してもよい。懸濁液は、安定剤または、活性作用物質の溶解度を増大させる作用物質あるいはそれらの組合せを任意に含有して、より濃縮された溶液にさせてもよい。
【００１８】
経口投与のための製剤処方物は、活性作用物質と、固体賦形剤、例えば糖（例えばラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトール）、セルロース調製物（例えばデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびナトリウムカルボキシメチルセルロース）、ゼラチン、ガムまたはポリビニルピロリドンとを組合せることにより得られ得る。さらに、崩壊剤が付加されてもよく、安定剤が付加されてもよい。
【００１９】
アンチセンスオリゴマー
本発明は、ＨＭＧ１遺伝子またはｍＲＮＡ配列の発現を抑制または遮断するのに有効な配列を有するアンチセンスオリゴマーを提供する。標的遺伝子産物の発現を抑制するための特異的オリゴヌクレオチドを用いるアンチセンス技術は、ヒト疾患のための治療様式として開発中である。アンチセンスオリゴヌクレオチドアンタゴニストの最適化に寄与するいくつかの選別判断基準が利用可能である。例えば、５０％またはそれ以上のＧＣ含量を有する配列を選択するのが得策である。好ましい配列は、標的タンパク質のＡＵＧ開始コドンに及ぶが、しかしコード領域における部位および５’ＵＴＲも等しく十分に成し遂げ得る。このような配列は、一般に約１８〜３０ヌクレオチド長であり、タンパク質発現を抑制するためにＨＭＧ１ ｃＤＮＡ配列からのＡＴＧ開始コドンと重複するよう選択される。より長いオリゴマーがしばしば、より大きい程度に標的を抑制するとわかっているが、これは、アンチセンス試薬として選択される一次オリゴヌクレオチドのための好ましい長さが約２５マーであることを示す。これらの判断基準に関して、典型的には、３つのオリゴヌクレオチド配列が選択され、オリゴヌクレオチド配列、例えば「逆」オリゴヌクレオチドまたは、アンチセンス配列のほぼすべての第四塩基が無作為化されるオリゴヌクレオチドを制御するアンタゴニストの活性に関して比較される。したがって、ＨＭＧ１に対するアンチセンスオリゴマー配列を作製するための好ましい配列は、ＨＭＧ１  ｃＤＮＡ配列からのＡＴＧ開始コドン（下線）を重複するよう選択された２５マー配列：ＧＡＧＧＡＡＡＡＡＴＡＡＣＴＡＡＡＣＡＴＧＧＧＣＡＡＡＧＧＡＧＡＴＣＣＴＡＡＧＡＡＧ［配列番号５］
であり、このような好ましいアンチセンス配列は、ＨＭＧ１のアンタゴニストとしてin vitro比較のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド剤（および適切なコントロール）を構築するために用いられる。これらのin vitroデータは、匹敵する設計のアンチセンス剤を用いたヒト臨床実用性を予測する。
【００２０】
ＨＭＧ１特異的抗体
本明細書中に開示された抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってもよく、多数のヒト、非ヒト真核生物、細胞、真菌または細菌供給源のいずれかからのものであってもよい。抗体は、ゲノムまたはベクター保有コード配列によりコードされてもよく、アジュバントを用いても用いない場合も、生来のまたは組換え体のＨＭＧ１またはその断片に対して引き出されてもよい。抗体の作製方法は、抗体を生成および産生するための当業界で周知の方法および手法である。一般に、ＨＭＧ１に対する中和抗体（即ち、特にその前炎症性サイトカイン様役割に関してＨＭＧ１の生物学的活性を抑制するもの）が、治療的適用のために好ましいが、一方、非中和抗体も診断用途に適切でありうる。このような有用な抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖および種々のヒトまたはヒト化型の抗体、ならびに種々のそれらの断片、例えばＦａｂ断片および特殊化発現系から産生される断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
診断アッセイ
ここで提供される診断アッセイは、ポリクローナル若しくはモノクローナルまたはその両方であり得る抗ＨＭＧ１抗体を使用する。診断手法は、生物学的流体中のＨＭＧ１遺伝子の遺伝子産物の濃度を測定するための標準抗体ベースの技術を利用することができる。好ましい標準診断手法は、ＥＬＩＳＡアッセイおよびウエスタン技法である。
【００２２】
実施例１：内毒素血症の「後期」メディエータとしてのＨＭＧ１の同定
本実施例は、敗血症において、ならびに炎症性サイトカイン活性により特性化される関連症状において一役を演じる後期放出マクロファージ由来因子を同定し、単離するための実験の結果を提供する。本実施例で報告される実験は、ＴＮＦによる培養物の刺激後のマウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞−調整培地を試験した。マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、Rockville, MD, USA）から入手し、１０％ウシ胎仔血清および１％グルタミンを補充したＤＭＥＭ下での培養中で増殖させた。集密性が７０〜８０％に達したら、培地を無血清ＯＰＴ１−ＭＥＭ Ｉ培地に取り換えて、培養物を前炎症性サイトカイン（例えばＴＮＦαまたはＩＬ−１）あるいは細菌内毒素（ＬＰＳ）で刺激した。
【００２３】
前記の刺激化マクロファージ培養物から放出されたタンパク質を測量した。特に、異なる時点で、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）により細胞および細胞調整培地を別々に回収した。１０ｋＤａのＭｒカットオフを用いたアミコン(Amicon)膜（Amicon Inc., Beverly, MA, USA）上での限外濾過により、調整培地中のタンパク質を濃縮し、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分別して、クーマシーブルー（３０％メタノール／１０％酢酸中の１．２５％クーマシーブルーＲ２５０）で染色した。３０％メタノール／７％酢酸で脱色して、対象タンパク質（単数または複数）（即ち、刺激化培養物の調整培地中に優先的に蓄積したもの）をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り取って単離し、Ｎ末端シーケンシング分析（Commonwealth Biotechnologies, Inc., Richmond, VA, USA）を施した。
【００２４】
コントロール（ＴＮＦα刺激なし）対ＴＮＦ刺激化ＲＡＷ２６４．７細胞における蓄積タンパク質のプロフィールのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析の比較で、細胞−調整培地中のその濃度が１６時間の刺激後に有意に増大された強誘導性３０ｋＤａタンパク質が明示された。この単離タンパク質のアミノ酸配列分析は、そのＮ末端配列をＧｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ［配列番号１］として明示した。関連遺伝子データベースの検討は、ＨＭＧ１のＮ末端アミノ酸配列との１００％の同一性が見出された。
【００２５】
これらのデータは、ＨＭＧ１をＬＰＳ刺激化マクロファージ培養物の「後期出現」生成物として、したがって、前炎症性メディエータの候補として同定した。ヒト臨床症状を予測する細胞および動物モデルシステムにおける組換え的生成ＨＭＧ１および／または抗ＨＭＧ１抗体の投与により、この活性を確証した。
【００２６】
実施例２：ＨＭＧ１の細胞性供給源
本実施例は、細胞供給源がＴＮＦ、ＩＬ−１および／またはＬＰＳに応答におけるＨＭＧ１放出能を示す。試験した細胞は、ＧＨ3下垂体細胞、マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞、ヒト一次末梢血単核細胞（ｈｕＰＢＭＣ）、ヒト一次Ｔ細胞、ラット副腎ＰＣ−１２細胞およびラット一次腎臓細胞を含む（表１）。ラット下垂体ＧＨ3細胞株をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、Rockville, MD, USA）から入手して、１０％ウシ胎仔血清および１％グルタミンを補充したＤＥＭＥ中で培養した。ヒトＰＢＭＣおよびＴ細胞を健常ドナーの全血から新たに単離して、前記と同様に１０％ヒト血清を補充したＲＰＭＩ１６４０中で培養した（Zhang et al., J. Exp. Med. 185:1759−1768, 1997）。集密性が７０〜８０％に達したら、培地を無血清ＯＰＴ１−ＭＥＭ Ｉ培地に取り換えて、培養を前炎症性サイトカイン（例えばＴＮＦαまたはＩＬ−１）あるいは細菌内毒素（ＬＰＳ）で刺激した。
【００２７】
ヒトＴ細胞、ラット副腎（ＰＣ−１２）細胞およびラット一次腎細胞は、ＨＭＧ１特異的抗体を用いた全細胞溶解物のウエスタンブロット分析により実証した場合、細胞関連ＨＭＧ１を含有したが、ＨＭＧ１は、ＴＮＦ、ＩＬ−１βまたはＬＰＳで刺激後、これらの培養物の培地中に有意に蓄積しなかった（表１）。
【００２８】
【表１】
2011168593.tif 000002
【００２９】
ＴＮＦ、ＩＬ−１β（各々の最小有効濃度＝５ｎｇ／ｍｌ）および細菌内毒素（ＬＰＳ、最小有効濃度＝１０ｎｇ／ｍｌ）は、時間−および用量−依存性様式でヒトＰＢＭＣからのＨＭＧ１の放出を誘導した（表１）。ＩＦＮ−γ単独（０〜２００Ｕ／ｍｌ）は前記の細胞のいずれからもＨＭＧ１放出を誘導しなかったが、しかし、ＴＮＦまたはＩＬ−１βとの組合せで付加した場合には、ＩＦＮ−γはマクロファージから用量依存的にＨＭＧ１放出を増強し、１００Ｕ／ｍｌの濃度のＩＦＮ−γにより最大３倍増強した。トリパンブルー排除により判定した場合、細胞生存能(viability)はＴＮＦ、ＩＬ−１βまたはＬＰＳによる影響を受けなかったため（コントロールに関しては９０〜９２±５％の生存、これに対して１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ、ＩＬ−１βまたはＬＰＳの存在下では８８〜９５±４％）、ＨＭＧ１の放出は細胞死のためではなかった。ウエスタンブロット分析により確定した場合、下垂体細胞およびマクロファージにより放出されたＨＭＧ１の量は、ＨＭＧ１の細胞内濃度と逆相関したが、これは、放出物質が、一部は、前成形の細胞関連ＨＭＧ１タンパク質に由来することを示す。
【００３０】
種々の正常ヒト組織から調製されたｍＲＮＡに対するＨＭＧ１特異的プローブのハイブリダイゼーション（ブロット基質は商業的供給元から入手可能）により、in vivoでの循環ＨＭＧ１の考え得る供給源を査定した。その結果を図５に要約した。いくつかの冨マクロファージ組織（肺、肝臓、腎臓、膵臓および脾臓）は、最も豊富なＨＭＧ１  ｍＲＮＡ発現を示した。低い発現は、下垂体、骨髄、胸腺、リンパ節および副腎で観察された。ＨＭＧ１発現の相対的組織分布に関する情報を提供する他に、本試験は、組織試料中のＨＭＧ１特異的核酸配列に関するアッセイの実際的可能性および実益を示す。
【００３１】
実施例３：in vitroおよびin vivoでの組換え体ＨＭＧ１投与
本実施例は、周知の組換えＤＮＡ技法によりＨＭＧ１を生成するための手法を詳述する。ＰＣＲによりＨＭＧ１開放読取り枠を増幅し、発現ベクター（ｐＣＡＬ−ｎ）中でサブクローニングした。要するに、以下の配列：５’−ＣＣＣ  ＧＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣＡ  ＴＣＧ  ＡＧＧ  ＧＡＡ  ＧＧＡ  ＴＧＧ  ＧＣＡ  ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＣＴＡ−３’［配列番号２］および５’−ＣＣＣ  ＧＣＡ  ＡＧＣ  ＴＴＡ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＡＴＣ  ＡＴＣ  ＡＴＣ  ＴＴＣ  Ｔ−３’［配列番号３］を含有するプライマーを用いて、５ｎｇラット脳クイッククローンｃＤＮＡ（カタログ番号＃７１５０−１、Clontech, Palo Alto, CA, USA）から、ＨＭＧ１ ｃＤＮＡの６４８ｂｐ開放読取り枠をＰＣＲ増幅した（９４℃１’、５６℃２’、７２℃４５”、３０サイクル）。６８０ｂｐＰＣＲ生成物（４μｇ）をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化して、ｐＣＡＬ−ｎベクター（Stratagene, La Jolla, CA, USA）のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位にクローニングした。組換え体プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Novagen, Madison, WI, USA）にトランスフォームさせ、陽性クローンをスクリーニングして、ＡＢＩ３７３Ａ自動蛍光シーケンサー（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）上でのTag DyeDeoxyターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、両鎖におけるＤＮＡシーケンシングにより確証した。
【００３２】
組換え体ＨＭＧ１を発現するために、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を付加した場合、ＯＤ600が０．６に達するまで激しく振盪しながら（２５０ｒｐｍ）３７℃で陽性クローンを培養した。ＩＰＴＧ誘導の１２時間後、遠心分離（６５００ｒｐｍ、１５分間）により細菌細胞を収穫し、凍結−解凍サイクルで溶解した。水溶性分画を遠心分離（３０分間、１２，０００ｒｐｍ）後に収集し、製造元（Stratagene）の指示通りに、カルモジュリン結合樹脂カラム上で組換え体ＨＭＧ１を精製した。Detoxi−Gel内毒素除去ゲル（Pierce, Rockford, IL, USA、カタログ番号＃２０３４４）を用いて細菌内毒素を組換え体ＨＭＧ１から除去し、リムラス・アメボサイト細胞溶解物試験（ＬＡＬ試験、カタログ番号＃５０−６４８Ｕ、ＱＣＬ−１０００色原性ＬＡＬ、Bio−Whittaker, Inc., Walkersville, MD, USA）により、残留ＬＰＳ含量を確定した。精製組換え体ＨＭＧ１をヒト末梢血単核球（ＨｕＰＢＭＣ）の培養物に付加し、刺激後４時間目にＥＬＩＳＡによりＴＮＦに関して上清をアッセイした。ＬＰＳ−中和剤ポリミキシンＢ（１０μｇ／ｍｌ）を組換え体ＨＭＧ１と同時に付加して、ＴＮＦ放出に及ぼす如何なる夾雑ＬＰＳの作用も排除した。さらに、外因性ＬＰＳの付加的内毒素血症チャレンジを用いてまたは用いずに、組換え的に得られたＨＭＧ１を被験動物に投与して、in vivoでの高レベルのＨＭＧ１の病原可能性を調べた（図２Ｂおよび２Ｃ参照）。いくつかの実験では、本明細書中に詳述したように、ＴＮＦに関してアッセイされるＨＭＧ１処置動物から血清試料を確保した（図１Ｂ参照）。
【００３３】
前記の手法は、ＨＭＧ１ペプチド配列に見合ったアミノ酸末端延長としての３．０ｋＤａカルモジュリン結合ドメインおよびトロンビン切断部位を包含する融合ペプチドとして組換え体ＨＭＧ１を提供する。いくつかの実験では、融合タグを少量の組換え体タンパク質から除去し、完全融合タンパク質の生物活性を切断ＨＭＧ１ペプチドと比較した。生物学的活性の有意差は認められず、付加的実験（特に組換え的産生ＨＭＧ１の動物への投与を要するもの）を、典型的には（非切断）融合タンパク質を用いて実施した。
【００３４】
図３Ａおよび３Ｂで実証したように、組換え的に得られたＨＭＧ１のin vitroまたはin vivo投与は活発なＴＮＦ応答を誘導したが、これは、前炎症性活性を有する後期出現ＬＰＳ誘導性マクロファージ由来内因性メディエータとしてのＨＭＧ１の同一性を確証する。
【００３５】
実施例４：抗ＨＭＧ１抗体および免疫検出
本実施例は、ＨＭＧ１に対するポリクローナル抗体を作出し、使用する実験の結果を提供する。要するに、ＨＭＧ１のＮ末端アミノ酸配列に対応するオリゴペプチドに対する、または精製組換えＨＭＧ１に対するポリクローナル抗体を当業界で周知の標準手法により、ウサギにおいて作出した。要するに、配列ＧＫＧＤＰＫＫＰＲＧＫＭＳＳＣ［配列番号４］を有するオリゴペプチドの８つのコピーを、放射状分枝リシン樹状突起（小免疫原的不活性コア）に固定した。これらの大型高分子物質を、０日目の予備採血後１、２および４週間目に、皮下および皮内（０．５〜１０ｍｇ／注射）の両方でウサギに３回注射した。最終免疫感作後２週間目に、ウサギを採血し、１．０ｍｇの抗原を用いて筋内追加免疫し、その後２週間後に二次採血した。あるいは、組換え体ＨＭＧ１に対するポリクローナル抗体を生成させるために、同様のプロトコールにしたがって、組換え体ＨＭＧ１融合ペプチド（１００μｇ／注射）でウサギを免疫感作した。ＨＭＧ１に対して反応性である（即ち、ＨＭＧ１の生物学的活性を結合し、いくつかの場合には、中和し、または相殺する）モノクローナル抗体は、本明細書中に記載したＨＭＧ１抗原、または免疫原のようなその他のＨＭＧ１ペプチド断片を用いて、当業界で周知の方法により調製するのが便利である。このようなモノクローナル抗体、および／またはそれらを生成するハイブリドーマは、ＨＭＧ１に対して反応性である種々の「ヒト化」抗体（すべて、当業界で既知の方法による）を生成するのに有用であり、このヒト化抗体は本明細書中で教示されるように有用である。
【００３６】
ＨＭＧ１特異的抗体を用いて、ウエスタンブロッティング分析により、ＴＮＦまたはＬＰＳでの処置後のＲＡＷ２６４．７細胞からのＨＭＧ１の誘導性放出を測定した（図１）。要するに、４〜２０％勾配ゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分別し、ＰＶＤＦ膜に移して、Ｎ末端合成ＨＭＧ１抗原に対して、または組換え体ＨＭＧ１に対して生じたウサギ抗血清でブロットした。製造元（Amersham Life Science Inc., Arlington Heights, IL, USA）の指示通りにＥＣＬキットを用いてシグナルを検出し、精製組換え体ＨＭＧ１の標準曲線を基準に、ＮＩＨ１．５９画像ソフトウエアを用いて分析のためにデジタル化したウエスタンブロット上の帯域の光学強度を測定することにより、ＨＭＧ１のレベルを確定した。
【００３７】
ＴＮＦまたはＬＰＳ処置の非存在下では、ＲＡＷ２６４．７細胞−調整培地中にＨＭＧ１タンパク質は検出されなかったが、しかし、ＨＭＧ１は、このような刺激後、高レベルで調整培地中に蓄積し、刺激後８〜２８時間目にプラトーに達した（図１Ａ）。要するに、実施例１、３および図１Ａに示したデータは、マクロファージからのＨＭＧ１の放出は刺激特異的、ならびに時間−および用量−依存性で、最大蓄積は、５ｎｇ／ｍｌという低い濃度でのＴＮＦによる刺激後８時間以内に観察された、ということを示す。敗血症、敗血症ショックおよび関連症状は、この予測モデルに用いられる単一大量致死的ＬＰＳボーラスとは定性的または定量的に異なる刺激に応答するヒトにおいて起こり得る、ということは十分理解される。それにもかかわらず、実験的内毒素血症は、炎症性サイトカインカスケードの重要な構成成分を同定するための、そして予測される臨床的実用性を有する特定のアンタゴニストを同定するための有益且つ予測的モデル系であった。この点で、ＨＭＧ１アンタゴニストはおそらく、内毒素に対する応答におけるＴＮＦに対するＨＭＧ１の後期出現にかんがみて、ＴＮＦアンタゴニストより治療的に魅力的である。
【００３８】
実施例５：in vivo動物モデルにおけるＨＭＧ１の検出
本実施例は、亜致死用量のＬＰＳ（ＬＤ50）の投与後の血清ＨＭＧ１を測定する、齧歯類におけるin vivo実験を説明する。マウスまたはラットをＬＰＳで処置し、異なる時点で血清を収集して、ウエスタンブロッティング分析によりＨＭＧ１のレベルに関してアッセイした。精製ＨＭＧ１の標準曲線を基準に光学帯域強度を測定することにより、ＨＭＧ１の血清濃度を概算した。ＬＰＳ後１６時間までに血清レベルは有意に増大し、少なくとも３２時間、高い値を保持した（図１Ｂ）が、ビヒクル処置コントロール動物においては検出されなかった。これらのデータは、ＨＭＧ１が、炎症性サイトカインカスケードにおける後期出現メディエータであるために、敗血症およびサイトカイン毒性の関連疾患の診断のための、ならびにそれらの病気に対する製剤的介入のための特に魅力的な標的を代表する、ということを示す。
【００３９】
実施例６：ＨＭＧ１に対する防御の利点
本実施例は、敗血症およびサイトカイン媒介性毒性の関連症状の治療に関連したＨＭＧ１のアンタゴニストの治療活性を測定するための予測in vivoアッセイの結果を提供する。本実施例では、ＨＭＧ１アンタゴニストは抗ＨＭＧ１抗体調製物であった。前免疫血清で処置したコントロールは、４８時間以内に嗜眠、立毛、下痢および死亡を生じた。内毒素血症のこれらの臨床的徴候は、抗ＨＭＧ１抗体の投与により有意に防止された。雄Ｂａｌｂ／Ｃマウス（６〜７週、２０〜２３グラム）を無作為に群別し（１０匹／群）、致死用量のＬＰＳ（１ｘＰＢＳ中で５０ｍｇ／ｋｇ）の投与（腹腔内）前３０分に、コントロール（前免疫）または抗ＨＭＧ１血清（実施例４で作製したのと同様）で前処置した。他の実験群には、ＬＰＳ投与後＋１２または＋１２および＋３６時間に、付加的用量の抗ＨＭＧ１血清を投与した。少なくとも２週間、外観および生存に関して、動物を観察した。
【００４０】
組換え体ＨＭＧ１に対するポリクローナル抗体をウサギで作出し、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロッティング手法により特異性および力価に関して抗血清をアッセイした。ポリクローナル抗血清は、例えばウエスタンブロット分析における組換え体ＨＭＧ１を免疫特異的に認識し（結合し）、そして粗製細菌溶解物中のおよびマウス血清中に稀釈されていた精製タンパク質としての双方で、他のタンパク質からｒＨＭＧ１を区別した。ウエスタンブロッティング分析において化学発光増幅検出法を用いて、１：１０００までの稀釈でのポリクローナル抗ＨＭＧ１抗血清は、５０ｐｇという少ないｒＨＭＧ１タンパク質を検出するのに有用であった。ＬＰＳチャレンジ（０時間）に比して、−０．５（１回投与の場合）、−０．５および１２（２回投与の場合）または−０．５、１２および３６（３回投与の場合）時間での指示（図２Ａ）量の抗ＨＭＧ１抗血清の投与は、ＬＰＳ誘導性致死性に対して防御的であり、反復投与スケジュールは良好な防御を提供した。
【００４１】
図２Ｂは、ｒＨＭＧ１が内毒素マウスにおける用量依存性致死性を引き起こしたことを説明する。雄Ｂａｌｂ／Ｃマウス（２０〜２３グラム）を１０群に無作為にわけて、ＬＰＳ（３．１５ｍｇ／ｋｇ；非致死量）を単独でまたは精製組換え体ＨＭＧ１タンパク質と組合せて投与した。指示用量でのＬＰＳ試験後２、１６、２８および４０時間目のＨＭＧ１の投与により、根元的内毒素血症の致死性が有意に増大した。
【００４２】
図２Ｃは、用量の一関数としてのＨＭＧ１の個々の致死性毒性を説明する。精製ｒＨＭＧ１を、指示用量での１回腹腔内ボーラス投与として、雄Ｂａｌｂ／Ｃマウス（５匹／処置群）に投与した。少なくとも４８時間マウスを観察した結果、５００μｇ／マウスの用量でｒＨＭＧ１で処置したマウスの６０％がｒＨＭＧ１試験の２４時間以内に死亡したが、これは、５００μｇ／マウス未満の１回投与ＬＤ50を示す。
【００４３】
ウエスタンブロットでＨＭＧ１に対する免疫特異的反応性を示さなかった前免疫血清の投与は、被験者にＬＰＳ媒介性死亡を被らせなかったため、抗ＨＭＧ１抗体により付与される防御は特異的であった（図２Ａ）。さらに、ＨＭＧ１特異的抗体は他のマクロファージ由来サイトカイン（例えば、ＩＬ−１およびＴＮＦ）と交差反応せず、抗体が結合により防御を付与し、それによりこれらのメディエータを中和するという可能性を排除した。前炎症性サイトカインカスケードの活性化を伴う敗血症、敗血症関連病原および敗血症関連疾患に対する防御は、サイトカインカスケードの１つよりも多い構成成分を標的とする組合せ療法により改良し得る。ＨＭＧ１のアンタゴニストは、この点では、ＴＮＦ、ＩＬ−１，ＭＩＦおよびその他の炎症性メディエータの特異的アンタゴニストと、または炎症性カスケードの多構成成分（例えば、アスピリン、ＮＳＡＩＤＳ、抗炎症性ステロイド等）を抑制する炎症性応答のより広範な活性アンタゴニストと併合されて、より有効な治療様式性を提供する。ＬＰＳ毒性に対する防御は、抗体用量関連性であり、より多量の抗体のよる頻繁な投与は、死亡率を７０％まで下げた（図２Ａ）。すべての実験において少なくとも２週間、マウスを観察した結果、後期死亡は起きなかったが、これは、抗ＨＭＧ１抗体治療がＬＰＳ致死性に対する残りの防御を付与し、死亡の時間をほとんど遅らせないことを示す。
【００４４】
実施例７：ヒト疾患におけるＨＭＧ１
本実施例は、ＨＭＧ１およびヒト敗血症間の関連を確立し、それにより、ヒト敗血症およびサイトカイン毒性の関連症状において一般的にＨＭＧ１アンタゴニストを、特に抗ＨＭＧ１抗体を用いるための指標を支持する、というデータを提供する。ｒＨＭＧ１の標準曲線を基準として、ウエスタンブロットフォーマットで実施例４の場合と同様に生成したポリクローナル抗体を用いて、正常健常個体および重症患者における血清ＨＭＧ１レベルを測定した。ＨＭＧ１は、正常コントロールにおいては観察できなかったが、重症敗血症患者においては高レベルに蓄積した（表２）。
【００４５】
【表２】
2011168593.tif 000003
【００４６】
これらのデータは、敗血症患者において血清ＨＭＧ１レベルの上昇が観察され、血清ＨＭＧ１の最高レベルは致死症例で観察されることを示す（表２）。これらのデータはさらに、敗血症におけるＨＭＧ１アンタゴニストの治療的重要性を示し、ＨＭＧ１の血清濃度を測定することにより敗血症についてのおよび敗血症の重症度（即ち、潜在致死性）についてのアッセイの診断的実用性の証拠も提供する。この診断アッセイは、炎症性サイトカインカスケードの活性化を伴う類似の症状の重症度を診断するためにも有用である。
【００４７】
致死性対非致死性敗血症に関連した血清ＨＭＧ１レベルに関して、さらに被験者をスクリーニングして、図６に記載したような結果（表２と累積的）を得た。図６に要約したデータは、健常被験者８名、ならびにグラム陽性菌［バチルス属のBacillus fragilis（１名）、エンテロコッカス属のEnterococcus facecalis（１名）、連鎖球菌属の肺炎連鎖球菌（４名）、リステリア属のListeria monocytogenes（１名）またはブドウ球菌属の黄色ブドウ球菌（２名）］、グラム陰性菌［大腸菌（７名）、クレブシエラ属の肺炎桿菌（１名）、アシネトバクター属のAcinetobacter calcoaceticus（１名）、シュードモナス属の緑膿菌（１名）、フゾバクテリウム属のFusobacterium nucleatum（１名）、シトロバクター属のCitrobacter freundii（１名）］または非同定病原体（５名）に感染した敗血症患者２５名から得た血清試料を代表するものである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により血清を分別し、正常ヒト血清中に稀釈した精製ｒＨＭＧ１の標準曲線を基準に、ウエスタンブロッティング分析によりＨＭＧ１レベルを確定した。ウエスタンブロッティングによる検出限界は、５０ｐｇである。ＨＭＧ１は正常コントロールにおいては検出されないが、敗血症患者においては有意に増大した、ということに留意されたい。非生存敗血症患者の血清中のＨＭＧ１の平均レベル（Ｎ＝１３患者、平均ＨＭＧ１レベル＝８３．７±２２．３ｎｇ／ｍｌ）は、生存者（Ｎ＝１２、平均ＨＭＧ１レベル＝２５．２±１５．１ｎｇ／ｍｌ、Ｐ＜０．０５）より有意に高い。これらのデータは、敗血症およびサイトカイン活性化の関連疾患の存在の、そしてこのような疾患および症状の重症度およびありそうな臨床的経過の診断および予後指標として、ＨＭＧ１配列（タンパク質または核酸）に対する組織（制限血液または血清なしを含む）試料のスクリーニングの実用性の直接的な証拠を提供する。
【００４８】
実施例８：ＨＭＧ１は前炎症性メディエータおよび重量損失を誘導する
本発明の結果は、ＨＭＧ１が炎症性サイトカインカスケードの後期放出メディエータ因子であるという証拠を提供する。一次ヒト末梢血単核球への組換え体ＨＭＧ１の付加は、刺激後４時間以内のＴＮＦの用量依存性誘導をもたらした（図３Ａ）。ＨｕＰＢＭＣによるＴＮＦ放出の組換え体ＨＭＧ１による刺激は、ｉ）精製組換え体ＨＭＧ１はＬＡＬ内毒素アッセイにより判定した場合、ＬＰＳが夾雑せず、ｉｉ）ＬＰＳ中和剤ポリミキシンＢの付加はＨＭＧ１誘導性ＴＮＦ放出に影響を及ぼさず、そしてｉｉｉ）トリプシンによる組換え体ＨＭＧ１調製物のタンパク質分解的切断はＰＢＭＣ培養物に対するＴＮＦ放出活性を完全に無くしたために、ＬＰＳ夾雑によるものではなかった。ＨＭＧ１刺激はまた、マクロファージを誘導し一酸化窒素（ＮＯ）を放出させた。
【００４９】
ＨＭＧ１がin vivoで血清ＴＮＦ放出を誘導したことを確証するために、精製組換え体ＨＭＧ１をＢａｌｂ／Ｃマウスに腹腔内投与して、血液試料を収集して、Ｌ９２９アッセイによりＴＮＦについてアッセイした。図３Ｂに示したように、ＴＮＦはコントロール動物の血清中では検出可能でなかったが、組換え体ＨＭＧ１タンパク質の投与後２時間目に有意に増大された。
【００５０】
ＨＭＧ１遺伝子の組換え遺伝子産物の反復投与（１００μｇ／マウス／日）は、マウスにおける有意の体重損失を引き起こした（図４）。メカニズムに関する限定を伴わず、理論に縛られずに、これらのデータは、ＨＭＧ１が、in vitroおよびin vivoの両方の条件下で前炎症性カスケードのフィードフォワード刺激物として作用するという仮説と一致する。重量損失の予測モデルにおけるこれらのin vivoデータも、ＨＭＧ１を含有する製剤処方物またはその治療的活性断片が有効な重量損失療法であるという予測的証拠を提供する。
【００５１】
実施例９：ＨＭＧ１のin vivo供給源
前述のようにウエスタンブロット強度の定量により、下垂体切除とコントロールとのラットにおける血清ＨＭＧ１レベルも測定した。コントロール（約２５ｎｇ／ｍｌ）と比較した場合、下垂体切除ラット（約７５ｎｇ／ｍｌ）において、内毒素チャレンジ（１．０ｍｇ／ｋｇでのＬＰＳ）後１２時間以内に有意に高いＨＭＧ１レベルが認められた。これらの結果は、下垂体細胞は血清ＨＭＧ１レベルの主要供給源ではなく、マクロファージが定量的により重要な役割を演じ得る、ということを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【外国語明細書】
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