(57)【要約】【課題】髄膜炎菌類タンパク質ＮＭＢ  １８７０のドメインおよびエピトープを提供すること。【解決手段】「ＮＭＢ１８７０」は、全血清型を通して発現される髄膜炎菌の公知の表面タンパク質である。これは、３つの異なるファミリーを有する。所与のファミリーに対して惹起する血清は、同一ファミリー内で殺菌性を示すが、他の２つのファミリーのうちの１つを発現する株に対して活性を示さない（すなわち、ファミリー内交差防御であるがファミリー間交差防御ではない）。本発明者らは、ＮＭＢ１８７０をドメインに分割することができ、全てのドメインが抗原性に必要であるわけではないことを見出した。抗原ドメインを、３つのＮＭＢ１８７０ファミリーからそれぞれ選び出し、１つのポリペプチド鎖として発現させることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に引用した全書類は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
技術分野
本発明は、免疫化分野、特に、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（髄膜炎菌類（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ））などのナイセリア属の病原性細菌に起因する疾患に対する免疫化分野に属する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
髄膜炎菌は、ヒト集団の約１０％の上気道にコロニー形成するグラム陰性被包性細菌である。多糖類結合型（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ａｎｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）ワクチンは、血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹに利用可能であるが、莢膜多糖類がヒトの自己抗原であるポリシアル酸のポリマーであるので、このアプローチを血清型Ｂに適用することはできない。血清型Ｂに対するワクチンを開発するために、外膜小胞（ＯＭＶ）中に含まれる表面曝露タンパク質が使用されている。これらのワクチンは、血清細菌抗体応答を誘発して疾患から防御するが、交差株防御を誘導することはできない（１）。したがって、ワクチン用の特異的髄膜炎菌類抗原に注目している研究者もいる。
【０００４】
１つのこのような抗原は、「ＮＭＢ１８７０」である。このタンパク質は、最初に、ＭＣ５８株由来のタンパク質「７４１」（参考文献２の配列番号２５３５および２５３６、本明細書中の配列番号１）として開示され、「ＧＮＡ１８７０」（参考文献３および参考文献４）および「ＯＲＦ２０８６」（５，６）とも呼ばれている。このタンパク質は、全髄膜炎菌類血清型を通して発現され、複数の髄膜炎菌類株で見出されている。ＮＭＢ１８７０配列は３つのファミリーに分類され、所与のファミリーに対して惹起する血清は、同一ファミリー内で殺菌性を示すが、他の２つのファミリーのうちの１つを発現する株に対して活性を示さない（すなわち、ファミリー内交差防御であるがファミリー間交差防御ではない）ことが見出されている。
【０００５】
したがって、ＮＭＢ１８７０を使用した交差株防御を達成するために、１つを超えるファミリーを使用する。個別のタンパク質を発現および精製する必要性を回避するために、ハイブリッドタンパク質（１つのポリペプチド鎖中に２つまたは３つのファミリーを含む）として異なるファミリーを発現することが提案されている（７）。いくつかのハイブリッドが試験されており、有望な抗髄膜炎菌類有効性が得られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ＮＭＢ１８７０によって付与される防御のファミリー特異性を克服するためのさらに改良されたアプローチおよび特に血清型Ｂの髄膜炎菌類疾患および／または感染に対する免疫を得るためのこれらのアプローチの使用をさらに提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ＮＭＢ１８７０をドメインに分割することができ、全てのドメインが抗原性に必要であるわけではないことを見出した。抗原ドメインを、３つのＮＭＢ１８７０ファミリーからそれぞれ選び出し、１つのポリペプチド鎖として発現させることができる。このアプローチは、１つのポリペプチド鎖中でＮＭＢ１８７０の末端から末端までの完全な発現よりも簡潔である。
【０００８】
本発明者らは、ＮＭＢ１８７０がαヘリックスの間に存在する表面ループ中のそのエピトープのいくつかを発現することも見出した。一方のファミリー由来のループエピトープから他方のファミリー中のループの位置への置換によって多ファミリー抗原性を有するキメラＮＭＢ１８７０を産生可能である。
【０００９】
したがって、本発明は、異なるファミリー由来のＮＭＢ１８７０の一部を含むキメラＮＭＢ１８７０タンパク質を提供する。各ＮＭＢ１８７０ファミリーが（たとえば、マウス中で）同一のＮＭＢ１８７０ファミリー中の株に対してのみ有効である抗体を誘発することができるのに対して、本発明のキメラポリペプチドは、１つを超えるファミリー由来のＮＭＢ１８７０タンパク質を認識する抗体を誘発することができる。
【００１０】
細菌抗体応答をマウス中で都合良く測定され、これは、ワクチン有効性の標準的な指標である（例えば、参考文献４の巻末の注釈を参照のこと）。キメラタンパク質は、好ましくは、以下の３つの株群のうちの少なくとも２つにそれぞれ由来する少なくとも１つの髄膜炎菌株に対して殺菌性を示す抗体喉頭を誘発することができる。
【００１１】
（Ｉ）ＭＣ５８、ｇｂｌ８５（＝Ｍ０１−２４０１８５）、ｍ４０３０、ｍ２１９７、ｍ２９３７、ｉｓｓ１００１、ＮＺ３９４／９８、６７／００、９３／１１４、ｂｚｌ９８、ｍｌ３９０、ｎｇｅ２８、Ｉｎｐｌ７５９２、００−２４１３４１、ｆ６ｌ２４、２０５９００、ｍ１９８／１７２、ｂｚｌ３３、ｇｂｌ４９（＝Ｍ０１−２４０１４９）、ｎｍ００８、ｎｍ０９２、３０／００、３９／９９、７２／００、９５３３０、ｂｚｌ６９、ｂｚ８３、ｃｕ３８５、ｈ４４／７６、ｍｌ５９０、ｍ２９３４、ｍ２９６９、ｍ３３７０、ｍ４２１５、ｍ４３１８、ｎ４４／８９、１４８４７
（ＩＩ）９６１−５９４５、２９９６、９６２１７、３１２２９４、１１３２７、ａ２２、ｇｂ０１３（＝Ｍ０１−２４００１３）、ｅ３２、ｍｌ０９０、ｍ４２８７、８６０８００、５９９、９５Ｎ４７７、９０−１８３１１、ｃ１１、ｍ９８６、ｍ２６７１、１０００、ｍ１０９６、ｍ３２７９、ｂｚ２３２、ｄｋ３５３、ｍ３６９７、ｎｇｈ３８、Ｌ９３／４２８６
（ＩＩＩ）Ｍ１２３９、１６８８９、ｇｂ３５５（＝Ｍ０１−２４０３５５）、ｍ３３６９、ｍ３８１３、ｎｇｐｌ６５
例えば、キメラポリペプチドは、２つまたはこれを超える血清型Ｂの髄膜炎菌株（ＭＣ５８、９６１−５９４５、およびＭ１２３９）に対して有効な細菌応答を誘発することができる。
【００１２】
キメラポリペプチドは、好ましくは、少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれを超える）の臨床的に関連する髄膜炎菌類血清型Ｂ株に対して殺菌性を示す抗体応答を誘発することができる。キメラポリペプチドは、髄膜炎菌の血清型Ｂ株および血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４）の株に対して殺菌性を示す抗体応答を誘発することができる。キメラポリペプチドは、Ｎ．ゴノコッカス（ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ）株および／またはＮ．シネレア（ｃｉｎｅｒｅａ）株に対して殺菌性を示す抗体応答を誘発することができる。キメラポリペプチドは、参考文献３の図５の樹状図の３つの主な枝のうちの少なくとも２つ由来の株に対して殺菌性を示す抗体応答を誘発することができる。
【００１３】
キメラポリペプチドは、高ビルレント系列ＥＴ−３７、ＥＴ−５、クラスターＡ４、系統３、亜群Ｉ、亜群ＩＩ、および亜群ＩＩＩ、および亜群ＩＶ−１のうちの少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７）の髄膜炎菌に対して殺菌性を示す抗体応答を誘発することができる（８、９）。キメラは、さらに、１つまたは複数の高侵襲性系列に対して殺菌性抗体応答を誘導することができる。
【００１４】
キメラは、以下の多座配列型のうちの少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７）の髄膜炎菌株に対して殺菌性を示す抗体応答を誘発することができる：ＳＴ１、ＳＴ４、ＳＴ５、ＳＴ８、ＳＴ１１、ＳＴ３２、およびＳＴ４１（１０）。キメラはまた、ＳＴ４４株に対して殺菌性を示す抗体応答を誘発することができる。
【００１５】
組成物は、特定の系列またはＭＬＳＴ内のありとあらゆるＭｅｎＢ株に対して殺菌性を示す抗体を誘発する必要はなく、むしろ、特定の高ビルレント系列またはＭＬＳＴ内の４つまたはそれを超える血清型Ｂ髄膜炎菌類株のうちの任意の所与の群に対して誘発し、組成物によって誘発された抗体は、少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超える）の群に対して殺菌性を示す。
【００１６】
株の好ましい群には、以下の国のうちの少なくとも４ヶ国で単離された株が含まれる：ＧＢ、ＡＵ、ＣＡ、ＮＯ、ＩＴ、ＵＳ、ＮＺ、ＮＬ、ＢＲ、およびＣＵ。血清は、好ましくは、少なくとも１０２４（例えば、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、またはそれを超える、好ましくは少なくとも２１４）の殺菌力価を有する（すなわち、参考文献４の巻末の注釈１４に記載のように、血清は、１０２４倍に希釈した場合に特定の株の試験細菌の少なくとも５０％を死滅させることができる）。好ましいキメラポリペプチドは、血清を４０９６倍またはそれを超えて希釈した場合でさえも殺菌性を保持する抗体応答をマウス中で誘発することができる。
ＮＭＢ１８７０ドメイン
配列番号１は、血清型ＢＭＣ５８株由来の全長ファミリーＩ  ＮＭＢ１８７０配列である：
【００１７】
【化２】
2011168611.tif 000002
プロセシングされた成熟リポタンパク質のＮ末端に下線を引いている（Ｃｙｓ−２０）。全長配列を、３つのドメインに分割した（ａａ１〜１１９、１２０〜１８３、および１８４〜２７４）。
【００１８】
【化３】
2011168611.tif 000003
Ｎ末端からＣ末端まで、これらのドメインを、「Ａ」、「Ｂ」、および「Ｃ」と呼ぶ。成熟Ｃ末端システインからのドメイン「Ａ」の成熟形態を、「Ａｍａｔｕｒｅ」と呼ぶ。
【００１９】
ＭＣ５８について、ドメインは以下である：「Ａ」＝配列番号４；「Ｂ」＝配列番号５；「Ｃ」＝配列番号６；および「Ａｍａｔｕｒｅ」＝配列番号１３。複数のＮＭＢ１８７０配列が公知であり（例えば、参考文献３、６、および７を参照のこと）、標準的方法を使用して容易にアラインメントすることができる。このようなアラインメントにより、当業者は、ＭＣ５８配列中の座標との比較によって任意の所与のＮＭＢ１８７０配列中のドメイン「Ａ」（および「Ａｍａｔｕｒｅ」）、「Ｂ」、および「Ｃ」を同定することができる。しかし、参照を容易にするために、ドメインを以下のように定義する。
−所与のＮＭＢ１８７０配列中のドメイン「Ａ」は、対合アラインメントアルゴリズムを使用して配列番号１とアラインメントした場合に配列番号１のＭｅｔ−１とアラインメントしたアミノ酸から開始され、配列番号１のＬｙｓ−１１９とアラインメントしたアミノ酸で終了する前記ＮＭＢ１８７０のフラグメントである。
−所与のＮＭＢ１８７０配列中のドメイン「Ａｍａｔｕｒｅ」は、対合アラインメントアルゴリズムを使用して配列番号１とアラインメントした場合に配列番号１のＣｙｓ−２０とアラインメントしたアミノ酸から開始され、配列番号１のＬｙｓ−１１９とアラインメントしたアミノ酸で終了する前記ＮＭＢ１８７０のフラグメントである。
−所与のＮＭＢ１８７０配列中のドメイン「Ｂ」は、対合アラインメントアルゴリズムを使用して配列番号１とアラインメントした場合に配列番号１のＧｌｎ−１２０とアラインメントしたアミノ酸から開始され、配列番号１のＧｌｙ−１８３とアラインメントしたアミノ酸で終了する前記ＮＭＢ１８７０のフラグメントである。
−所与のＮＭＢ１８７０配列中のドメイン「Ｃ」は、対合アラインメントアルゴリズムを使用して配列番号１とアラインメントした場合に配列番号１のＬｙｓ−１８４とアラインメントしたアミノ酸から開始され、配列番号１のＧｌｎ−２７４とアラインメントしたアミノ酸で終了する前記ＮＭＢ１８７０のフラグメントである。
【００２０】
ドメイン定義のための好ましい対合アルゴリズムは、デフォルトパラメーター（例えば、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を使用したギャップオープニングペナルティ＝１０．０およびギャップ伸長ペナルティ＝０．５）を使用したＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ大域アラインメントアルゴリズム（１１）である。このアルゴリズムは、ＥＭＢＯＳＳパッケージ中のｎｅｅｄｌｅツールで都合良く実行される（１２）。
【００２１】
ＮＭＢ１８７０配列は、本明細書中でファミリーＩ、ＩＩ、およびＩＩＩと呼ばれる３つのファミリーに分類される（３、７）。ファミリーＩ〜ＩＩＩのプロトタイプ配列は、それぞれ配列番号１〜３である。参考文献３の系統樹および樹状図法にしたがって、任意の所与のＮＭＢ１８７０配列のファミリーを容易に決定することができ、３つの各プロトタイプＮＭＢ１８７０配列を使用した対合アラインメントを使用して、最も近いファミリーを見出すことができる。配列は、３つのファミリーに明確に分類され、配列同一性は、ファミリーＩとＩＩとの間で７４．１％であり、ファミリーＩとＩＩＩとの間で６２．８％であり、ファミリーＩＩとＩＩＩとの間で８４．７％であり、各ファミリー内の配列の変動は低い（例えば、最小の同一性は、ファミリーＩ内で９１．６％、ファミリーＩＩ内で９３．４％、およびファミリーＩＩＩ内で９３．２％）。系統発生分析を必要としない配列ファミリーの迅速な決定方法として、配列番号１との配列同一性が少なくとも８５％である場合はファミリーＩに分類することができ、配列番号２との配列同一性が少なくとも８５％である場合はファミリーＩＩに分類することができ、配列番号３との配列同一性が少なくとも８５％である場合はファミリーＩＩＩに分類することができる。
【００２２】
参考文献３の図６中のアラインメントに基づいて、ＮＭＢ１８７０の３つのプロトタイプファミリーについての例示的ドメインＡ、Ｂ、およびＣ（配列番号１〜３）は以下である。
【００２３】
【化４】
2011168611.tif 000004
本発明での使用に好ましいドメインは、（ａ）１つまたは複数の配列番号４〜１２との配列同一性が少なくともｘ％であり、そして／または（ｂ）１つまたは複数の配列番号４〜１２の少なくともｙ個の連続したアミノ酸配列のフラグメントを含むアミノ酸配列を含む。
【００２４】
ｘの値は、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９、またはそれを超える値から選択される。ｙの値は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれを超える値から選択される。異なるファミリー由来のＮＭＢ１８７０配列を含むポリペプチドでは、各ファミリーについてのｘおよびｙの値は、同一でも異なっていてもよい。
【００２５】
ドメイン「Ａ」配列は、好ましくは、ａ１とａ２との間（両値を含む）（ａ１は１１０、１１５、１２０、１２５、および１３０から選択され、ａ２は１１５、１２０、１２５、１３０、および１３５から選択される）のアミノ酸長である。
【００２６】
ドメイン「Ｂ」配列は、好ましくは、ｂ１とｂ２との間（両値を含む）（ｂ１は５５、６０、６５、および７０から選択され、ｂ２は６０、６５、７０、７５から選択される）のアミノ酸長である。
【００２７】
ドメイン「Ｃ」配列は、好ましくは、ｃ１とｃ２との間（両値を含む）（ｃ１は８０、８５、９０、９５、および１００から選択され、ｃ２は８５、９０、９５、１００、および１０５から選択される）のアミノ酸長である。
ＮＭＢ１８７０表面ループ
αヘリックスの間に存在する配列番号１の表面ループは、（１）アミノ酸１３４〜１４１、（２）アミノ酸１６２〜１６８、（３）アミノ酸１８１〜１８２、（４）アミノ酸１９７、（５）アミノ酸２１９〜２２３、（６）アミノ酸２３４〜２３６、（７）アミノ酸２６１〜２６７である。
【００２８】
【化５】
2011168611.tif 000005
配列番号１の任意の他のＮＭＢ１８７０配列とのアラインメントにより、当業者は、この配列中のループ（１）〜（７）の位置を同定することができる。しかし、容易に参照するために、本明細書中では、ループの座標を、対合アラインメントアルゴリズムを使用して配列番号１とアラインメントした場合に配列番号１中の上記定義のループの第１のアミノ酸残基とアラインメントしたアミノ酸から開始され、配列番号１中の上記定義のループの最後のアミノ酸で終了するＮＭＢ１８７０配列中のアミノ酸鎖と定義する。
【００２９】
キメラタンパク質
異種ドメインＢおよびＣの連結
本発明は、（ａ）第１のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメイン「Ｂ」配列および（ｂ）第２のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメイン「Ｃ」配列を含むキメラポリペプチドを提供する。第１のファミリーおよび第２のファミリーは、それぞれＩ、ＩＩ、またはＩＩＩから選択されるが、互いに同一ではない。キメラポリペプチドは、好ましくは、第１のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメイン「Ｃ」配列を含まず、そして／または第２のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメイン「Ｂ」配列を含まない。キメラポリペプチドは、好ましくは、４９５アミノ酸長未満である。
【００３０】
好ましいポリペプチドは、アミノ酸配列−Ｘ１−Ｂ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ３−（式中、−Ｘ１−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｘ２−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｘ３−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｂ−は第１のファミリー中のＮＭＢ１８７０配列由来のドメインＢアミノ酸配列であり、−Ｃ−は第２のファミリー中のＮＭＢ１８７０配列由来のドメインＣアミノ酸配列である）を含む。−Ｂ−は、−Ｃ−ドメインのＣ末端であるが、好ましくは、−Ｃ−ドメインのＮ末端である。
【００３１】
好ましくは、第１のＮＭＢ１８７０ファミリーのドメインＢ配列は、（ｉ）配列番号５、配列番号８、または配列番号１１との配列同一性が少なくともｘ％であり、そして／または配列番号５、配列番号８、または配列番号１１由来の少なくともｙ個連続するアミノ酸配列のフラグメントを含み、（２）第２のＮＭＢ１８７０ファミリーのドメインＣ配列は、（ｉ）配列番号６、配列番号９、または配列番号１２との配列同一性が少なくともｘ％であり、そして／または配列番号６、配列番号９、または配列番号１２由来の少なくともｙ個連続するアミノ酸配列のフラグメントを含み、但し、（１）および（２）のために選択される２つの配列番号は、（ｉ）５および６を同時に選択しないか、（２）８および９を同時に選択しないか、（３）１１および１２を同時に選択しない。したがって、（１）および（２）のために組み合わせるべき適切な配列番号対は、５および９、５および１２、８および６、８および１２、１１および６、ならびに１１および９。
【００３２】
異種ＢＣドメインの連結
発明は、（ａ）第１のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメイン「Ｂ」配列およびドメイン「Ｃ」配列ならびに（ｂ）第２のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメイン「Ｂ」配列およびドメイン「Ｃ」配列を含むキメラポリペプチドを提供する。キメラポリペプチドは、好ましくは、第１のファミリーのドメイン「Ａ」配列を含まず、そして／または第２のファミリーのドメイン「Ａ」配列を含まない。第１のファミリーおよび第２のファミリーは、それぞれＩ、ＩＩ、またはＩＩＩから選択されるが、互いに同一ではない。
【００３３】
第１のファミリー由来のドメイン「Ｂ」および「Ｃ」は、好ましくは、連続している（「ＢＣ」ドメイン）。同様に、第２のファミリー由来のドメイン「Ｂ」および「Ｃ」配列は、好ましくは、連続している。
【００３４】
好ましいポリペプチドは、アミノ酸配列−Ｘ１−Ｂｊ−Ｘ２−Ｃｊ−Ｘ３−Ｂｋ−Ｘ４−Ｃｋ−Ｘ５−（式中、−Ｘ１−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｘ２−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｘ３−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｘ４−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｘ５−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｂｊ−は第１のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメイン「Ｂ」アミノ酸配列であり、−Ｃｊ−は第１のファミリー由来のドメイン「Ｃ」アミノ酸配列であり、−Ｂｋ−は第２のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメイン「Ｂ」アミノ酸配列であり、−Ｃｋ−は第２のファミリー由来のドメイン「Ｃ」アミノ酸配列である）を含む。配列−Ｘ２−および−Ｘ４−は、好ましくは存在しない（すなわち、−Ｘ１−Ｂｊ−Ｃｊ−Ｘ３−Ｂｋ−Ｃｋ−Ｘ５−が得られる）。
【００３５】
−Ｂｋ−ドメインおよび−Ｃｋ−ドメインに対して−Ｂｊ−ドメインおよび−Ｃｊ−ドメインを有することが好ましい。
【００３６】
好ましくは、（１）第１のファミリーのドメインＢ配列は、（ｉ）配列番号Ｊ１との配列同一性が少なくともｘ％であり、そして／または配列番号Ｊ１由来の少なくともｙ個連続するアミノ酸配列のフラグメントを含み、（２）第１のファミリーのドメインＣ配列は、（ｉ）配列番号Ｊ２との配列同一性が少なくともｘ％であり、そして／または配列番号Ｊ２由来の少なくともｙ個連続するアミノ酸配列のフラグメントを含み、（３）第２のファミリーのドメインＢ配列は、（ｉ）配列番号Ｋ１との配列同一性が少なくともｘ％であり、そして／または（ｉｉ）配列番号Ｋ１由来の少なくともｙ個連続するアミノ酸配列のフラグメントを含み、（４）第２のファミリーのドメインＣ配列は、（ｉ）配列番号Ｋ２との配列同一性が少なくともｘ％であり、そして／または（ｉｉ）配列番号Ｋ２由来の少なくともｙ個連続するアミノ酸配列のフラグメントを含み、Ｊ１、Ｊ２、Ｋ１、およびＫ２は、以下のように選択される。
【００３７】
【化６】
2011168611.tif 000006
したがって、上記ポリペプチドは、３つのＮＭＢ１８７０ファミリーの少なくとも２つに由来するＢＣドメインを含む。より好ましくは、ポリペプチドは、３つの各ファミリー由来のＢＣドメインを含む。したがって、本発明は、（ａ）第１のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメイン「Ｂ」配列およびドメイン「Ｃ」配列、（ｂ）第２のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメイン「Ｂ」配列およびドメイン「Ｃ」配列、（ｃ）第３のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメイン「Ｂ」配列およびドメイン「Ｃ」配列を含むキメラポリペプチドを提供する。キメラポリペプチドは、好ましくは、第１のファミリー由来のドメイン「Ａ」配列を含まず、そして／または第２のファミリー由来のドメイン「Ａ」配列を含まず、そして／または第３のファミリー由来のドメイン「Ａ」配列を含まない。
【００３８】
第１のファミリー由来のドメイン「Ｂ」配列およびドメイン「Ｃ」配列は、好ましくは、連続している。同様に、第２のファミリー由来のドメイン「Ｂ」配列およびドメイン「Ｃ」配列は、好ましくは、連続している。同様に、第３のファミリー由来のドメイン「Ｂ」配列およびドメイン「Ｃ」配列は、好ましくは、連続している。
【００３９】
好ましいポリペプチドは、アミノ酸配列−Ｘ１−Ｂｊ−Ｘ２−Ｃｊ−Ｘ３−Ｂｋ−Ｘ４−Ｃｋ−Ｘ５−ＢＬ−Ｘ６−ＣＬ−Ｘ７−（式中、−Ｘ１−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｘ２−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｘ３−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｘ４−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｘ５−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｘ６−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｘ７−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｂｊ−は第１のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメインＢアミノ酸配列であり、−Ｃｊ−は第１のファミリー由来のドメインＣアミノ酸配列であり、−Ｂｋ−は第２のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメインＢアミノ酸配列であり、−Ｃｋ−は第２のファミリー由来のドメインＣアミノ酸配列であり、−ＢＬ−は第３のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメインＢアミノ酸配列であり、−ＣＬ−は第３のファミリー由来のドメインＣアミノ酸配列である）を含む。配列−Ｘ２−、−Ｘ４−および−Ｘ６−は、好ましくは存在しない（すなわち、−Ｘ１−Ｂｊ−Ｃｊ−Ｘ３−Ｂｋ−Ｃｋ−Ｘ５−Ｂｌ−Ｃｌ−Ｘ７−が得られる）。
【００４０】
好ましくは、（１）第１のファミリーのドメインＢ配列は、（ｉ）配列番号Ｊ１との配列同一性が少なくともｘ％であり、そして／または配列番号Ｊ１由来の少なくともｙ個連続するアミノ酸配列のフラグメントを含み、（２）第１のファミリーのドメインＣ配列は、（ｉ）配列番号Ｊ２との配列同一性が少なくともｘ％であり、そして／または配列番号Ｊ２由来の少なくともｙ個連続するアミノ酸配列のフラグメントを含み、（３）第２のファミリーのドメインＢ配列は、（ｉ）配列番号Ｋ１との配列同一性が少なくともｘ％であり、そして／または配列番号Ｋ１由来の少なくともｙ個連続するアミノ酸配列のフラグメントを含み、（４）第２のファミリーのドメインＣ配列は、（ｉ）配列番号Ｋ２との配列同一性が少なくともｘ％であり、そして／または配列番号Ｋ２由来の少なくともｙ個連続するアミノ酸配列のフラグメントを含み、（５）第３のファミリーのドメインＢ配列は、（ｉ）配列番号Ｌ１との配列同一性が少なくともｘ％であり、そして／または配列番号Ｌ１由来の少なくともｙ個連続するアミノ酸配列のフラグメントを含み、（６）第３のファミリーのドメインＣ配列は、（ｉ）配列番号Ｌ２との配列同一性が少なくともｘ％であり、そして／または配列番号Ｌ２由来の少なくともｙ個連続するアミノ酸配列のフラグメントを含み、Ｊ１、Ｊ２、Ｋ１、Ｋ２、Ｌ１、およびＬ２は、以下のように選択される。
【００４１】
【化７】
2011168611.tif 000007
異種ＡＢドメインの連結
発明は、（ａ）第１のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメイン「Ａ」配列およびドメイン「Ｂ」配列ならびに（ｂ）第２のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメイン「Ａ」配列およびドメイン「Ｂ」配列を含むキメラポリペプチドを提供する。キメラポリペプチドは、好ましくは、第１のファミリーのドメイン「Ｃ」配列を含まず、そして／または第２のファミリーのドメイン「Ｃ」配列を含まない。第１のファミリーおよび第２のファミリーは、それぞれＩ、ＩＩ、またはＩＩＩから選択されるが、互いに同一ではない。
【００４２】
第１のファミリー由来のドメイン「Ａ」および「Ｂ」は、好ましくは、連続している。同様に、第２のファミリー由来のドメイン「Ａ」および「Ｂ」配列は、好ましくは、連続している。
【００４３】
好ましいポリペプチドは、アミノ酸配列−Ｘ１−Ａｊ−Ｘ２−Ｂｊ−Ｘ３−Ａｋ−Ｘ４−Ｂｋ−Ｘ５−（式中、−Ｘ１−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｘ２−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｘ３−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｘ４−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｘ５−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ａｊ−は第１のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメインＡアミノ酸配列であり、−Ｂｊ−は第１のファミリー由来のドメインＢアミノ酸配列であり、−Ａｋ−は第２のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメインＡアミノ酸配列であり、−Ｂｋ−は第２のファミリー由来のドメインＢアミノ酸配列である）を含む。配列−Ｘ２−および−Ｘ４−は、好ましくは存在しない（すなわち、−Ｘ１−Ａｊ−Ｂｊ−Ｘ３−Ａｋ−Ｂｋ−Ｘ５−が得られる）。
【００４４】
−Ａｋ−ドメインおよび−Ｂｋ−ドメインに対して−Ａｊ−ドメインおよび−Ｂｊ−ドメインを有することが好ましい。
【００４５】
好ましくは、（１）第１のファミリーのドメインＡ配列は、（ｉ）配列番号Ｊ１との配列同一性が少なくともｘ％であり、そして／または（ｉｉ）配列番号Ｊ１由来の少なくともｙ個連続するアミノ酸配列のフラグメントを含み、（２）第１のファミリーのドメインＢ配列は、（ｉ）配列番号Ｊ２との配列同一性が少なくともｘ％であり、そして／または配列番号Ｊ２由来の少なくともｙ個連続するアミノ酸配列のフラグメントを含み、（３）第２のファミリーのドメインＡ配列は、（ｉ）配列番号Ｋ１との配列同一性が少なくともｘ％であり、そして／または（ｉｉ）配列番号Ｋ１由来の少なくともｙ個連続するアミノ酸配列のフラグメントを含み、（４）第２のファミリーのドメインＢ配列は、（ｉ）配列番号Ｋ２との配列同一性が少なくともｘ％であり、そして／または（ｉｉ）配列番号Ｋ２由来の少なくともｙ個連続するアミノ酸配列のフラグメントを含み、Ｊ１、Ｊ２、Ｋ１、およびＫ２は、以下のように選択される。
【００４６】
【化８】
2011168611.tif 000008
したがって、上記ポリペプチドは、３つのＮＭＢ１８７０ファミリーの少なくとも２つに由来するＡＢドメインを含む。より好ましくは、ポリペプチドは、３つの各ファミリー由来のＡＢドメインを含む。したがって、本発明は、（ａ）第１のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメイン「Ａ」配列およびドメイン「Ｂ」配列、（ｂ）第２のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメイン「Ａ」配列およびドメイン「Ｂ」配列、（ｃ）第３のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメイン「Ａ」配列およびドメイン「Ｂ」配列を含むキメラポリペプチドを提供する。キメラポリペプチドは、好ましくは、第１のファミリー由来のドメイン「Ｃ」配列を含まず、そして／または第２のファミリー由来のドメイン「Ｃ」配列を含まず、そして／または第３のファミリー由来のドメイン「Ｃ」配列を含まない。
【００４７】
第１のファミリー由来のドメイン「Ａ」配列およびドメイン「Ｂ」配列は、好ましくは、連続している。同様に、第２のファミリー由来のドメイン「Ａ」配列およびドメイン「Ｂ」配列は、好ましくは、連続している。同様に、第３のファミリー由来のドメイン「Ａ」配列およびドメイン「Ｂ」配列は、好ましくは、連続している。
【００４８】
好ましいポリペプチドは、アミノ酸配列−Ｘ１−Ａｊ−Ｘ２−Ｂｊ−Ｘ３−Ａｋ−Ｘ４−Ｂｋ−Ｘ５−ＡＬ−Ｘ６−ＢＬ−Ｘ７−（式中、−Ｘ１−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｘ２−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｘ３−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｘ４−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｘ５−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｘ６−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｘ７−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ａｊ−は第１のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメインＡアミノ酸配列であり、−Ｂｊ−は第１のファミリー由来のドメインＢアミノ酸配列であり、−Ａｋ−は第２のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメインＡアミノ酸配列であり、−Ｂｋ−は第２のファミリー由来のドメインＢアミノ酸配列であり、−Ａｌ−は第３のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメインＡアミノ酸配列であり、−Ｂｌ−は第３のファミリー由来のドメインＢアミノ酸配列である）を含む。配列−Ｘ２−、−Ｘ４−および−Ｘ６−は、好ましくは存在しない（すなわち、−Ｘ１−Ａｊ−Ｂｊ−Ｘ３−Ａｋ−Ｂｋ−Ｘ５−Ａｌ−Ｂｌ−Ｘ７−が得られる）。
【００４９】
好ましくは、（１）第１のファミリーのドメインＡ配列は、（ｉ）配列番号Ｊ１との配列同一性が少なくともｘ％であり、そして／または（ｉｉ）配列番号Ｊ１由来の少なくともｙ個連続するアミノ酸配列のフラグメントを含み、（２）第１のファミリーのドメインＢ配列は、（ｉ）配列番号Ｊ２との配列同一性が少なくともｘ％であり、そして／または（ｉｉ）配列番号Ｊ２由来の少なくともｙ個連続するアミノ酸配列のフラグメントを含み、（３）第２のファミリーのドメインＡ配列は、（ｉ）配列番号Ｋ１との配列同一性が少なくともｘ％であり、そして／または（ｉｉ）配列番号Ｋ１由来の少なくともｙ個連続するアミノ酸配列のフラグメントを含み、（４）第２のファミリーのドメインＢ配列は、（ｉ）配列番号Ｋ２との配列同一性が少なくともｘ％であり、そして／または（ｉｉ）配列番号Ｋ２由来の少なくともｙ個連続するアミノ酸配列のフラグメントを含み、（５）第３のファミリーのドメインＡ配列は、（ｉ）配列番号Ｌ１との配列同一性が少なくともｘ％であり、そして／または（ｉｉ）配列番号Ｌ１由来の少なくともｙ個連続するアミノ酸配列のフラグメントを含み、（６）第３のファミリーのドメインＢ配列は、（ｉ）配列番号Ｌ２との配列同一性が少なくともｘ％であり、そして／または（ｉｉ）配列番号Ｌ２由来の少なくともｙ個連続するアミノ酸配列のフラグメントを含み、Ｊ１、Ｊ２、Ｋ１、Ｋ２、Ｌ１、およびＬ２は、以下のように選択される。
【００５０】
【化９】
2011168611.tif 000009
選択可能なＸｎ配列
本発明のポリペプチドは、ＮＭＢ１８７０由来の配列に連結した配列を含むことができ、そして／またはＮＭＢ１８７０に由来しないＮ末端配列およびＣ末端配列を含むことができる。このような配列を、本明細書中で、「Ｘｎ」（Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７など）と指定する。各Ｘｎは、存在しても存在しなくてもよく、各配列は同一であっても同一でなくても良い。
【００５１】
リンカーアミノ酸配列は、典型的には、短い（例えば、２０個またはそれ未満（すなわち、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）のアミノ酸）。例には、クローニングを容易にする短いペプチド配列（ポリグリシンリンカー（すなわち、Ｇｌｙｎ、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える）およびヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓｎ、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える））が含まれる。他の適切なリンカーアミノ酸配列が当業者に明らかである。有用なリンカーはＧＳＧＧＧＧ（配列番号１７）（ＢａｍＨＩ制限部位からＧｌｙ−Ｓｅｒジペプチドが形成される）であり、したがって、クローニングおよび操作に役立ち、別の有用なリンカーはＧＫＧＧＧＧ（配列番号４５）（ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位からＧｌｙ−Ｌｙｓジペプチドが形成される）である。制限部位の後に、典型的なポリグリシンリンカーであるＧｌｙ４テトラペプチド（配列番号１８）が存在する。他の有用なリンカーは、配列番号１９および２０である。
【００５２】
選択可能なＮ末端アミノ酸配列は、典型的には、短い（例えば、４０個またはそれ未満の（すなわち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）アミノ酸）。例には、ポリペプチド輸送を指示するためのリーダー配列またはクローニングまたは精製を容易にする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓｎ、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える））が含まれる。他の適切なＮ末端アミノ酸配列が当業者に明らかである。配列が配列自体のＮ末端メチオニンを欠く場合、有用なＮ末端配列により、翻訳されたポリペプチド中のメチオニン残基（例えば、１つのＭｅｔ残基）などが得られる。
【００５３】
選択可能なＣ末端アミノ酸配列は、典型的には、短い（例えば、４０個またはそれ未満の（すなわち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）アミノ酸）。例には、ポリペプチド輸送を指示するための配列またはクローニングまたは精製を容易にする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓｎ、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える）を含む）またはポリペプチドの安定性を増強する配列が含まれる。他の適切なＣ末端アミノ酸配列が当業者に明らかである。
【００５４】
キメラＮＭＢ１８７０配列の構築
本発明は、（ａ）第１のＮＭＢ１８７０アミノ酸配列と第２のＮＭＢ１８７０アミノ酸配列とをアラインメントしてアラインメント配列対を得る工程と、（ｂ）前記第１のアミノ酸配列のアミノ酸ａ１から開始して前記第１のアミノ酸配列のアミノ酸ｂ１で終了する第１のアミノ酸配列の一部を選択する工程と、（ｃ）前記第２のアミノ酸配列のアミノ酸ａ２から開始して前記第２のアミノ酸配列のアミノ酸ｂ２で終了する第２のアミノ酸配列の一部を選択する工程と、ここで、前記ａ１およびａ２ならびに前記ｂ１およびｂ２がアラインメント配列対にアラインメントされることと、（ｄ）前記第１のアミノ酸配列の一部を前記第２のアミノ酸配列の一部に置換し、それにより、キメラＮＭＢ１８７０アミノ酸配列が得られる工程とを含む、キメラＮＭＢ１８７０アミノ酸配列の産生プロセスを提供する。第１の配列および第２の配列は異なり、好ましくは、異なるＮＭＢ１８７０ファミリーに由来する。
【００５５】
工程（ｂ）から（ｄ）を、工程（ａ）由来の同一のアラインメントのために１回を超えて行うことができる（すなわち、第２の配列から第１の配列への置換を複数回行うことができる）。同様に、工程（ａ）から（ｄ）を、１回を超えて行うことができ、異なる「第２のアミノ酸配列」をその後の工程（ａ）で任意選択的に使用する（すなわち、第１の配列を第２の配列とアラインメントし、置換手順に供し、異なる第２の配列とアラインメントし、さらなる置換などに供することができる）。
【００５６】
したがって本発明は、（ａ）第１のＮＭＢ１８７０アミノ酸配列と第２のＮＭＢ１８７０アミノ酸配列とをアラインメントして第１のアラインメント配列対を得る工程と、（ｂ）前記第１のアミノ酸配列のアミノ酸ａ１から開始して前記第１のアミノ酸配列のアミノ酸ｂ１で終了する第１のアミノ酸配列の一部を選択する工程と、（ｃ）前記第２のアミノ酸配列のアミノ酸ａ２から開始して前記第２のアミノ酸配列のアミノ酸ｂ２で終了する第２のアミノ酸配列の一部を選択する工程と、ここで、前記ａ１およびａ２ならびに前記ｂ１およびｂ２が第１のアラインメント配列対にアラインメントされることと、（ｄ）前記第１のアミノ酸配列の一部を前記第２のアミノ酸配列の一部に置換し、それにより、中間体キメラＮＭＢ１８７０アミノ酸配列が得られる工程と、（ｅ）第１のＮＭＢ１８７０アミノ酸配列または前記中間体キメラ配列と第３のＮＭＢ１８７０アミノ酸配列とをアラインメントして第２のアラインメント配列対を得る工程と、（ｆ）前記中間体キメラ配列得のアミノ酸ａ３から開始して前記中間体キメラ配列のアミノ酸ｂ３で終了する中間体キメラ配列の一部を選択する工程と、（ｇ）前記第３のアミノ酸配列のアミノ酸ａ４から開始して前記第３のアミノ酸配列のアミノ酸ｂ４で終了する第３のアミノ酸配列の一部を選択する工程と、ここで、前記ａ３およびａ４ならびに前記ｂ３およびｂ４が第２のアラインメント配列対にアラインメントされることと、（ｈ）前記中間体キメラ配列の一部を前記第３のアミノ酸配列の一部に置換し、それにより、中間体キメラＮＭＢ１８７０アミノ酸配列が得られる工程とを含む、キメラＮＭＢ１８７０アミノ酸配列の産生プロセスを提供する。
【００５７】
選択された部分は、好ましくは、少なくともｃアミノ酸長（ｃは、３、４、５、６、７、８、９またはこれを超える）である。
【００５８】
置換された配列は、好ましくは、表面ループ配列である。本発明は、１０個まで（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）またはこれを超える置換を含む状況を含む。
【００５９】
本発明はまた、キメラＮＭＢ１８７０アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記キメラＮＭＢ１８７０アミノ酸配列が上記プロセスによって得ることができる、ポリペプチドを提供する。
【００６０】
本発明のプロセスの後に、キメラＮＭＢ１８７０アミノ酸配列を含むポリペプチドのさらなる産生工程（例えば、組換えタンパク質発現）を行うことができる。
【００６１】
本発明は、アミノ酸配列Ｆ１−Ｘ１−Ｆ２（式中、Ｆ１は第１のＮＭＢ１８７０アミノ酸配列のＮ末端フラグメントであり、Ｆ２は第２のＮＭＢ１８７０アミノ酸配列のＣ末端フラグメントであり、−Ｘ１−は選択可能なアミノ酸配列であり、前記第１および第２のＮＭＢ１８７０アミノ酸配列が異なるＮＭＢ１８７０ファミリーに由来し、前記フラグメントＦ１およびＦ２は共に少なくとも１０アミノ酸長であり、前記フラグメントＦ１およびＦ２は組み合わせて少なくともｆｆアミノ酸長を有する）を含むポリペプチドを提供する。ｆｆの値は、２２０、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、または２６０である。−Ｘ１−配列は、好ましくは存在せず、異なるファミリー中のＮＭＢ１８７０タンパク質由来のＮ末端とＣ末端との融合物である配列Ｆ１−Ｆ２が得られる。本発明はまた、前記ポリペプチドの少なくともｇ個連続するアミノ酸のフラグメントを提供し、但し、前記フラグメントは、それぞれのＦ１およびＦ２に由来する少なくとも１つのアミノ酸を含む（すなわち、Ｆ１とＦ２との間を架橋するフラグメント）。ｇの値は、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、またはこれを超える。
【００６２】
本発明は、アミノ酸配列（Ｆｍ−Ｘｍ）ｎ（式中、各ＦｍはｍｔｈＮＭＢ１８７０アミノ酸配列のフラグメントであり、各−Ｘｍ−は選択可能なアミノ酸配列であり、各フラグメントＦｍは少なくともｇアミノ酸長であり、Ｆｍの場合のｎは３つのＮＭＢ１８７０ファミリーＩ、ＩＩ、およびＩＩＩのうちの少なくとも２つ由来のフラグメントを含む）を含むポリペプチドを提供する。ｇの値は、上記で定義する。ｎの値は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０を超える。
【００６３】
本発明は、（ｉ）ファミリーＩ  ＮＭＢ１８７０配列の２４０アミノ酸以下のフラグメントであって、ここで、前記フラグメントが前記ファミリーＩ  ＮＭＢ１８７０配列のエピトープを含む、フラグメント、（ｉｉ）ファミリーＩＩ  ＮＭＢ１８７０配列の２４０アミノ酸以下のフラグメントであって、ここで、前記フラグメントが前記ファミリーＩＩ
ＮＭＢ１８７０配列のエピトープを含む、フラグメント、（ｉｉｉ）ファミリーＩＩＩ
ＮＭＢ１８７０配列の２４０アミノ酸以下のフラグメントであって、ここで、前記フラグメントが前記ファミリーＩＩＩＩ  ＮＭＢ１８７０配列のエピトープを含む、フラグメント、のうちの少なくとも２つを含むポリペプチドを提供する。
【００６４】
ループ置換
本発明者らは、ＮＭＢ１８７０がαヘリックスの間に存在する表面ループ中のそのエピトープのいくつかを曝露することを見出した。一方のファミリー由来のループエピトープから他方のファミリー中のループの位置への置換によって多ファミリー抗原性を有するキメラＮＭＢ１８７０を産生可能である。
【００６５】
本発明は、第１のＮＭＢ１８７０ファミリーの修飾アミノ酸配列を含み、ここで、前記修飾配列が、第１のファミリー由来の表面ループ配列の代わりに少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、または７）の第２のＮＭＢ１８７０ファミリー由来の表面ループ配列を含む、ポリペプチドを提供する。
【００６６】
したがって本発明はまた、アミノ酸配列：
−Ｂ１−Ｌ１−Ｂ２−Ｌ２−Ｂ３−Ｌ３−Ｂ４−Ｌ４−Ｂ５−Ｌ５−Ｂ６−Ｌ６−Ｂ７−Ｌ７−Ｂ８−
（式中、（ａ）Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、およびＢ８は、それぞれ、（ｉ）配列番号Ｍのフラグメント、（ｉｉ）（ｉ）のフラグメントとの配列同一性が少なくともｍ％であり、そして／または（ｉ）のフラグメント由来の少なくともｍｍ個連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列であり、（ｂ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、およびＬ７は、（ｉｉｉ）配列番号１、配列番号２、および／または配列番号３のフラグメント、（ｉｖ）（ｉｉｉ）のフラグメントとの配列同一性が少なくともｎ％であり、そして／または（ｉｉｉ）のフラグメント由来の少なくともｎｎ個連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列であり、但し、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、およびＬ７の少なくとも１つが、配列番号Ｍのフラグメントではない）を含むポリペプチドを提供する。
【００６７】
したがって、ポリペプチドは、８つの部分から構成される基本骨格配列および７つのループ（骨格配列の各連続部分の間に存在する）を含むが、少なくとも１つのループ配列は、基本骨格配列由来の異なるＮＭＢ１８７０ファミリーに由来するＮＭＢ１８７０配列から選択される。１つを超える異なるＮＭＢ１８７０配列由来の表面ループを使用することが好ましく、これらのループを１つの骨格配列に挿入することが可能である。
【００６８】
Ｍの値は、１、２、または３から選択され、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、およびＢ８およびＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、およびＬ７の定義は、Ｍの値によって変化する。
【００６９】
「（ｉ）配列番号Ｍのフラグメント」の意味を以下に示す。
【００７０】
【化１０】
2011168611.tif 000010
同様に、「（ｉｉｉ）配列番号１、配列番号２、および／または配列番号３のフラグメント」の意味を以下のように定義する。
【００７１】
【化１１】
2011168611.tif 000011
例えば、本発明は、アミノ酸配列：
−Ｂ１−Ｌ１−Ｂ２−Ｌ２−Ｂ３−Ｌ３−Ｂ４−Ｌ４−Ｂ５−Ｌ５−Ｂ６−Ｌ６−Ｂ７−Ｌ７−Ｂ８−
（式中、Ｂ１は、配列番号１のアミノ酸１〜１３９またはアミノ酸１〜１３３との配列同一性が少なくともｍ％であり、そして／またはアミノ酸１〜１３３由来の少なくともｍｍ個連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列であり、Ｂ２は、配列番号１のアミノ酸１４２〜１６１またはアミノ酸１４２〜１６１との配列同一性が少なくともｍ％であり、そして／またはアミノ酸１４２〜１６１由来の少なくともｍｍ個連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列であり、．．．Ｂ７は、配列番号１のアミノ酸２６８〜２７４またはアミノ酸２６８〜２７４との配列同一性が少なくともｍ％であり、そして／またはアミノ酸２６８〜２７４由来の少なくともｍｍ個連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列であり、Ｌ１は、配列番号２のアミノ酸１３４〜１４１またはアミノ酸１３４〜１４１との配列同一性が少なくともｎ％であり、そして／またはアミノ酸１３４〜１４１由来の少なくともｎｎ個連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列であり、Ｌ２は、配列番号２のアミノ酸１６２〜１６７またはアミノ酸１６２〜１６７との配列同一性が少なくともｎ％であり、そして／またはアミノ酸１６２〜１６７由来の少なくともｎｎ個連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列であり、．．．Ｌ７は、配列番号３のアミノ酸２６８〜２７４またはアミノ酸２６８〜２７４との配列同一性が少なくともｎ％であり、そして／またはアミノ酸２６８〜２７４由来の少なくともｎｎ個連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列である）を含むペプチドを提供する。
【００７２】
ｍの値は、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９、またはこれを超える値から選択される。ｎの値は、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９、またはこれを超える値から選択される。ｍｍの値は、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、４０、４５、５０、６０、７０、７５、１００、またはこれを超える値から選択される。ｎｎの値は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０から選択される。ｎｎの値は、好ましくは、２０未満である。
【００７３】
本発明はまた、上記定義のキメラアミノ酸配列：
−Ｂ１−Ｌ１−Ｂ２−Ｌ２−Ｂ３−Ｌ３−Ｂ４−Ｌ４−Ｂ５−Ｌ５−Ｂ６−Ｌ６−Ｂ７−Ｌ７−Ｂ８−
を含み、前記キメラ配列（ＮＭＢ１８７０配列）のＮ末端またはＣ末端のいずれかをさらに含むポリペプチドであって、ＮＭＢ１８７０配列が、配列番号Ｍと同一のＮＭＢ１８７０ファミリーに属する、ポリペプチドを提供する。したがって、ポリペプチドは、（ｉ）特定のファミリー由来のＮＭＢ１８７０および（ｉｉ）同一のファミリー由来のＮＭＢ１８７０の両方を含むが、その表面ループの少なくとも１つが異なるＮＭＢ１８７０ファミリーに置換されている。
【００７４】
本発明は、配列番号Ｑに対する配列全体の同一性がｑ％であり、ここで、ｑが少なくともｒであり、配列番号Ｑに対するアミノ酸配列の配列同一性が、配列番号Ｑの骨格領域でｑ％を超え、配列番号Ｑに対するアミノ酸配列の配列同一性が配列番号Ｑのループ領域でｑ％未満であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。ｒの値は、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、および９９．５から選択される。
【００７５】
Ｑの値は、１、２、または３であり、ループ領域および骨格領域の境界線を、上記表にしたがって選択する（Ｌ１〜Ｌ７はループであり、Ｂ１〜Ｂ８は骨格である）。
【００７６】
Ｑが１である場合、ループ領域中のアミノ酸配列は、配列番号２または配列番号３の対応するループ領域に対する配列同一性がｑ％を超え得る。Ｑが２である場合、ループ領域中のアミノ酸配列は、配列番号１または配列番号３の対応するループ領域に対する配列同一性がｑ％を超え得る。Ｑが３である場合、ループ領域中のアミノ酸配列は、配列番号１または配列番号２の対応するループ領域に対する配列同一性がｑ％を超え得る。
ＮＭＢ１８７０フラグメント
本発明は、（ａ）フラグメントがアミノ酸Ａｒｇ−２２３を含み、（ｂ）ポリペプチドが、（ｉ）完全なファミリーＩ  ＮＭＢ１８７０アミノ酸配列および（ｉｉ）完全なファミリーＩ  ？Ｇ−ＮＭＢ１８７０アミノ酸配列のいずれも含まない、ファミリーＩ  ＮＭＢ１８７０配列のフラグメントを含むポリペプチドを提供する。アミノ酸残基の番号づけは、本明細書中の配列番号１の数に従う。フラグメントは、完全なドメインＢおよびＣを含み得る。
【００７７】
ポリペプチドがフラグメントのＮ末端のアミノ酸を含む場合、ポリペプチド中のフラグメントのＮ末端にすぐ接したアミノ酸は、好ましくは、配列番号１中のフラグメントのＮ末端にすぐ接して見出されるアミノ酸と異なる。
【００７８】
同様に、ポリペプチドがフラグメントのＣ末端のアミノ酸を含む場合、ポリペプチド中のフラグメントのＣ末端にすぐ接したアミノ酸は、好ましくは、配列番号１中のフラグメントのＣ末端にすぐ接して見出されるアミノ酸と異なる。
【００７９】
本発明は、アミノ酸配列−Ｚ１−Ａｒｇ−Ｚ２−（式中、
（ａ）−Ｚ１−はｙ１アミノ酸からなるアミノ酸配列であり、ここで、ｙ１は、少なくとも１０（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、またはこれを超える）であり、
（ｂ）−Ｚ２−はｙ２アミノ酸からなるアミノ酸配列であり、ここで、ｙ２は、少なくとも１０（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、またはこれを超える）であり、
（ｃ）−Ｚ１−は配列番号１のアミノ酸Ａｒｇ−２２３のすぐ上流に存在するｙ１アミノ酸との配列同一性が少なくともｘ％であり（上記で定義する）、
（ｄ）−Ｚ２−は配列番号１のアミノ酸Ａｒｇ−２２３のすぐ下流に存在するｙ２アミノ酸との配列同一性が少なくともｘ％である（上記で定義する））を含むポリペプチドを提供する。
【００８０】
ｙ１の値は、好ましくは、２２０未満である。ｙ２の値は、好ましくは、５０未満である。
【００８１】
ポリペプチドが−Ｚ１−の上流のアミノ酸配列を含む場合、配列は、好ましくは、配列番号１のアミノ酸Ａｒｇ−２２３のすぐ上流に存在するｙ１アミノ酸のすぐ上流で見出される配列と異なる。
【００８２】
ポリペプチドが−Ｚ２−の下流のアミノ酸配列を含む場合、配列は、好ましくは、配列番号１のアミノ酸Ａｒｇ−２２３のすぐ下流に存在するｙ２アミノ酸のすぐ下流で見出される配列と異なる。
【００８３】
これらのフラグメントを含む本発明のポリペプチドは、好ましくは、いかなる公知のポリペプチド（例えば、参考文献２、３、６、７に開示のポリペプチドなど）も含まない。
【００８４】
本発明はまた、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む混合物であって、第１のポリペプチドがＮＭＢ１８７０のドメインＢ由来のフラグメントであり、第２のポリペプチドがＮＭＢ１８７０のドメインＣ由来のフラグメントであり、ここで、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを会合して、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド上で見出されないエピトープを産生することができる、混合物を提供する。任意の所与のＮＭＢ１８７０のために、本明細書中に提供された情報を使用して、ドメインＢおよびドメインＣが容易に同定され、個別のドメインの短縮および／または切断ならびにその後の混合を使用して、ポリペプチドが会合するかどうかを調査することができる。高次構造のエピトープの会合および形成を決定するための都合の良いアッセイは、ＮＭＢ１８７０のドメインＢＣフラグメントを認識するが、ドメインＢまたはドメインＣのみを認識しないモノクローナル抗体の使用を含む。このような抗体を、標準的なスクリーニング法によってポリクローナルマウス抗ＮＭＢ１８７０抗血清から単離することができる。
【００８５】
ポリペプチド
本発明は、上記のポリペプチドを提供する。
【００８６】
本発明はまた、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、２３、２４、４３、４４、５２、５３、６１、６２、６３、６４、および６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。本発明はまた、（ａ）配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、２３、２４、４３、４４、５２、５３、６１、６２、６３、６４、および６５からなる群から選択されるアミノ酸配列との配列同一性を有し、そして／または（ｂ）配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、２３、２４、４３、４４、５２、５３、６１、６２、６３、６４、および６５からなる群から選択されるアミノ酸配列のフラグメントを含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。配列同一率は、好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、またはこれを超える）。フラグメントは、好ましくは、開始配列から７個またはこれを超える連続したアミノ酸を含む（例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、７０、８５、９０、９５、１００、またはこれを超える）。
【００８７】
ＮＭＢ１８７０は、天然に、髄膜炎菌のリポタンパク質である。大腸菌中で発現した場合に脂質付加されることも見出されている。本発明の好ましいポリペプチドは、脂質付加することができるＣ末端システイン残基（例えば、パルミトイル基を含む）を有する。
【００８８】
本発明の好ましいポリペプチドの特徴は、宿主動物への投与後に殺菌性抗髄膜炎菌類抗体を誘導する能力である。
【００８９】
本発明のポリペプチドを、種々の手段（例えば化学合成（少なくとも一部）、プロテアーゼを使用したより長いポリペプチドの消化、ＲＮＡからの翻訳、細胞培養物（例えば、組換え発現物または髄膜炎菌培養物）からの精製など）によって調製することができる。大腸菌宿主中での異種発現は、好ましい発現経路である（例えば、ＤＨ５ａ、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬＲなど）。
【００９０】
本発明のポリペプチドを、固体支持体に付着または固定することができる。
【００９１】
本発明のペプチドは、検出可能な標識（例えば、放射性標識、蛍光標識、またはビオチン標識）を含むことができる。これは、免疫アッセイ技術で特に有用である。
【００９２】
ポリペプチドは、種々の形態（例えば、未変性形態、融合物形態、グリコシル化形態、非グリコシル化形態、脂質付加形態、ジスルフィド結合形態）をとることができる。
【００９３】
ポリペプチドを、好ましくは、実質的に純粋であるか実質的に単離された形態（すなわち、他のナイセリアまたは宿主細胞のポリペプチドを実質的に含まない）または実質的に単離された形態で調製する。一般に、ポリペプチドを、天然に存在しない環境で提供する（例えば、ポリペプチドを、その天然に存在する環境から分離する）。一定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、コントロールと比較してポリペプチドが豊富な組成物中に存在する。そのようなものとして、精製ポリペプチドを提供し、精製は、ポリペプチドが他の発現されるポリペプチドを実質的に含まない組成物中に存在することを意味し、実質的に存在しないは、組成物の９０％未満、通常には６０％未満、より通常には５０％未満が他の発現されるポリペプチドから作製されることを意味する。
【００９４】
用語「ポリペプチド」は、任意の長さのアミノ酸ポリマーをいう。ポリマーは、直鎖でも分枝鎖でも良く、修飾アミン酸を含むことができ、非アミノ酸が介在していてもよい。この用語はまた、天然に修飾されているか介在によって修飾されているアミノ酸ポリマーを含むことができる（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾（標識化合物との抱合など））。例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などが含まれる）の１つまたは複数のアナログおよび当該分野で公知の他の修飾を含むポリペプチドも定義内に含まれる。ポリペプチドは単一の鎖または会合した鎖として生じ得る。
【００９５】
核酸
本発明は、上記定義の本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供する。本発明はまた、（ａ）核酸の少なくともｎ個の連続したヌクレオチドのフラグメントであって、ｎは、１０またはこれを超える（例えば、１２、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００、またはこれを超える）、フラグメント、および／または（ｂ）核酸と少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはこれを超える）の配列同一性を有する配列を含む核酸を提供する。
【００９６】
さらに、本発明は、好ましくは、「高ストリンジェンシー」条件下で（例えば、６５℃で０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ溶液）本発明のポリペプチドをコードする核酸に対してキメラであり得る（ｃｈｉｍｅｒｉｃｅｓｅ）核酸を提供する。
【００９７】
本発明の核酸を、ハイブリッド形成反応（例えば、ノーザンブロット、サザンブロット、核酸マイクロアレイ、または「遺伝子チップ」）、増幅反応（例えば、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＳＳＳＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡなど）、および他の核酸技術で使用することができる。
【００９８】
本発明の核酸を、多数の方法（例えば、全部または一部の化学合成（例えば、ＤＮＡのホスホラミダイト合成）、ヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）を使用したより長い核酸の消化、（例えば、リガーゼまたはポリメラーゼを使用した）ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー由来のより短い核酸またはヌクレオチドの連結）で調製することができる。
【００９９】
本発明の核酸は、種々の形態（例えば、一本鎖形態、二本鎖形態、ベクター形態、プライマー形態、プローブ形態、標識形態、非標識形態など）をとることができる。
【０１００】
本発明の核酸は、好ましくは、単離形態または実質的に単離された形態である。
【０１０１】
本発明は、例えば、アンチセンスもしくは探索のためまたはプライマーとして使用するための上記の核酸と相補的な配列を含む核酸を含む。
【０１０２】
用語「核酸」には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、そのアナログ（修飾骨格を含むアナログなど）およびペプチド核酸（ＰＮＡ）なども含まれる。
【０１０３】
本発明の核酸を、例えば、放射性標識または蛍光標識で標識することができる。これは、例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡなどの技術で使用されるプライマーまたはプローブである核酸検出技術で核酸が使用される場合に特に有用である。
【０１０４】
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター（核酸免疫化に適切なベクターなど））およびこのようなベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【０１０５】
免疫化
本発明のポリペプチドを、好ましくは、免疫原性組成物として提供し、本発明は、薬物として使用するための本発明の免疫原性組成物を提供する。
【０１０６】
本発明はまた、本発明の免疫原性組成物を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の抗体応答を惹起する方法を提供する。抗体応答は、好ましくは、防御および／または殺菌性抗体応答である。
【０１０７】
本発明はまた、本発明の免疫原性組成物を哺乳動物に投与する工程を含む、ナイセリア（例えば、髄膜炎菌類）感染から哺乳動物を防御する方法を提供する。
【０１０８】
本発明は、薬物（例えば、免疫原性組成物またはワクチン）または診断薬として使用するための本発明のキメラポリペプチドを提供する。本発明はまた、哺乳動物におけるナイセリア（例えば、髄膜炎菌類）感染の防止のための薬物の製造における本発明の核酸、ポリペプチド、または抗体の使用を提供する。
【０１０９】
哺乳動物は、好ましくはヒトである。ヒトは、成人または好ましくは子供であり得る。ワクチンを予防のために使用する場合、ヒトは、好ましくは子供（よちよち歩きの幼児または乳児）であり、ワクチンを治療のために使用する場合、ヒトは、好ましくは成人である。例えば、安全性、投薬量、免疫原性などを評価するために、子供用のワクチンを、成人に投与することもできる。
【０１１０】
使用および方法は、疾患（髄膜炎（特に、細菌性髄膜炎）および菌血症が含まれるが、これらに限定されない）の防止／治療に特に有用である。
【０１１１】
治療上の処置の有効性を、本発明の組成物の投与後のナイセリア感染のモニタリングによって試験することができる。予防的処置の有効性を、組成物の投与後のＮＭＢ１８７０に対する免疫応答のモニタリングによって試験することができる。本発明の組成物の免疫原性を、試験被験体（例えば、１２〜１６歳の子供または動物モデル（１３））への投与および標準的パラメーター（血清殺菌性抗体（ＳＢＡ）およびＥＬＩＳＡ力価（ＧＭＴ）が含まれる）の決定によって決定することができる。これらの免疫応答を、一般に、組成物の投与から約４週間後に決定し、組成物の投与前に決定した値と比較する。少なくとも４倍または８倍のＳＢＡ増加が好ましい。１回を超えて組成物を投与する場合、１回を超えて投与後に決定することができる。
【０１１２】
本発明の好ましい組成物は、患者に、許容可能な比率のヒト被験体についての各抗原成分に対するセロプロテクション基準より優れている抗体力価を付与することができる。宿主が抗原に対して抗体陽転したと見なされる関連抗体力価を有する抗原が周知であり、このような力価は、ＷＨＯなどの組織が公表している。好ましくは、８０％を超え、より好ましくは、９０％を超え、さらにより好ましくは９３％を超え、最も好ましくは９６〜１００％の被験体の統計的に有意なサンプルが抗体陽転する。
【０１１３】
本発明の組成物を、一般に、患者に直接投与する。非経口注射（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、または組織の間質腔）、直腸、経口、膣内、局所、経皮、鼻腔内、眼内、耳内、肺内、または他の粘膜投与によって直接投与することができる。大腿部または上腕への筋肉内投与が好ましい。ニードル（例えば、皮下注射針）によって注射することができるが、無針注射を代わりに使用することもできる。典型的な筋肉内用量は、０．５ｍｌである。
【０１１４】
本発明を使用して、全身および／または粘膜免疫を誘発することができる。
【０１１５】
投与治療は、単回投与計画または複数回投与計画であり得る。複数回投与を、一次免疫化投与計画および／または追加免疫化投与計画で使用することができる。一次投与計画の後に追加免疫投与計画を行うことができる。初回投与の間（例えば、４〜１６週間）および初回投与と追加免疫との間の適切なタイミングを、日常的に決定することができる。
【０１１６】
本発明の免疫原性組成物は、一般に、薬学的に許容可能なキャリアを含み、これは、それ自体が組成物を投与した患者に有害な抗体の産生を誘導せず、且つ過度の毒性を示さずに投与することができる任意の物質である。適切なキャリアは、巨大なゆっくりと代謝される高分子（タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子など）であり得る。このようなキャリアは、当業者に周知である。薬学的に許容可能なキャリアには、水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノールなどの液体が含まれ得る。賦形剤（湿潤剤または乳化剤およびｐＨ緩衝液など）もこのような賦形剤中に存在し得る。リポソームは、適切なキャリアである。薬学的キャリアの十分な考察は、参考文献１４から得ることができる。
【０１１７】
ナイセリア感染は身体の種々の領域に影響を与えるので、本発明の組成物を種々の形態で調製することができる。例えば、組成物を、注射液（溶液または懸濁液）として調製することができる。溶液または懸濁液（液体賦形剤）に適切な注射前の固体形態も調製することができる。局所投与のために、例えば、軟膏、クリーム、または粉末として組成物を調製することができる。経口投与のために、例えば、錠剤、カプセル、またはシロップ（任意選択的に風味づけした）として組成物を調製することができる。肺投与のために、例えば、微粉または噴霧を使用した吸入薬として組成物を調製することができる。座剤またはペッサリーとして組成物を調製することができる。鼻、耳、または眼への投与のために、例えば、点滴薬として組成物を調製することができる。
【０１１８】
組成物は、好ましくは、無菌である。組成物は、好ましくは、発熱物質を含まない。組成物は、好ましくは、緩衝化されている（例えば、ｐＨ６とｐＨ８との間、一般に、約ｐＨ７）。組成物が水酸化アルミニウム塩を含む場合、ヒスチジン緩衝液を使用することが好ましい（１５）。本発明の組成物は、ヒトに関して等張であり得る。
【０１１９】
免疫原性組成物は、免疫学的有効量の免疫原および必要に応じて任意の他の特定の成分を含む。「免疫学的有効量」は、単回用量または一連の投与の一部のいずれかとしてのこの量の個体への投与により、治療または防止効果があることを意味する。この量は、治療を受ける個体の健康および健康状態、治療を受ける個体の年齢、分類群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、個体の免疫系の抗体を合成する能力、所望の防御の程度、ワクチンの処方、処置する医師の医学的状況の評価、ならびに他の関連する要因によって変化する。この量は、日常的試験によって決定することができる比較的広い範囲の量と予想される。投与治療は、単回投与計画または複数回投与計画（例えば、追加免疫が含まれる）であり得る。組成物を、他の免疫調節薬と組み合わせて投与することができる。
【０１２０】
本発明の組成物中で使用することができるアジュバントには、以下が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２１】
Ａ．ミネラル含有組成物
本発明でアジュバントとしての使用に適切なミネラル含有組成物には、塩（アルミニウム塩およびカルシウム塩など）が含まれる。本発明には、水酸化物（例えば、オキシヒドロキシド）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシリン酸塩、オルソリン酸塩）、硫酸塩などのミネラル塩など（例えば、参考文献１６の第８章および第９章を参照のこと）または異なるミネラル化合物が含まれ、化合物は任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、無定形など）を取り、吸着することが好ましい。ミネラル含有組成物を、金属塩の粒子としても処方することができる（１７）。
【０１２２】
特にインフルエンザ桿菌多糖抗原を含む組成物中にはリン酸アルミニウムが特に好ましく、典型的なアジュバントは、ＰＯ４／Ａｌモル比が０．８４と０．９２との間で０．６ｍｇのＡｌ３＋／ｍｌを含む無定形ヒドロキシリン酸アルミニウムである。低用量のリン酸アルミニウムの吸着作用を使用した（例えば、５０μｇＡｌ３＋／抱合体／用量と１００μｇＡｌ３＋／抱合体／用量との間）。組成物中に１つを超える抱合体が存在する場合、全ての抱合体が吸着する必要はない。
【０１２３】
Ｂ．油性乳濁液
本発明におけるアジュバントとしての使用に適切な油性乳濁液組成物には、スクアレン−水乳濁液（ＭＦ５９（参考文献１６の第１０章、参考文献１８も参照のこと）（５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５、ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒを使用してサブミクロン粒子に配合する）など）が含まれる。フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）も使用することができる。
【０１２４】
Ｃ．サポニン処方物（参考文献１６の第２２章）
サポニン処方物を、本発明でアジュバントとして使用することもできる。サポニンは、広範な植物種の樹皮、葉、幹、根、およびさらに花で見出されるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群である。バラ科キラヤの樹皮由来のサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。スミラックス・オルナタ（Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ）（サルサパリラ）、シュッコンカスミソウ（ブライデスベール（ｂｒｉｄｅｓ  ｖｅｉｌ））、およびサボンソウ（サボンソウ根）由来のサポニンを購入することもできる。サポニンアジュバント処方物には、精製処方物（ＱＳ２１など）および液体処方物（ＩＳＣＯＭなど）が含まれる。ＱＳ２１は、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）として市販されている。
【０１２５】
サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを使用して精製されている。これらの技術を使用して、特定の精製画分（ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ、およびＱＨ−Ｃが含まれる）が同定されている。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の生成方法は、参考文献１９に開示されている。サポニン処方物はまた、ステロール（コレステロールなど）も含むことができる（２０）。
【０１２６】
サポニンとコレステロールとの組み合わせを使用して、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる固有の粒子を形成することができる（参考文献１６の第２３章を参照のこと）。ＩＳＣＯＭには、典型的には、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどのリン脂質が含まれる。任意の公知のサポニンを、ＩＳＣＯＭ中で使用することができる。好ましくは、ＩＳＣＯＭには、１つまたは複数のＱｕｉｌＡ、ＱＨＡ、およびＱＨＣが含まれる。ＩＳＣＯＭは、参考文献２０〜２２にさらに記載されている。任意選択的に、ＩＳＣＯＭはさらなる界面活性剤を欠き得る（２３）。
【０１２７】
サポニンベースのアジュバントの開発についての概説を、参考文献２４および２５に見出すことができる。
【０１２８】
Ｄ．ビロソームおよびウイルス様粒子
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）も本発明でアジュバントとして使用することができる。これらの構造は、一般に、任意選択的にリン脂質と組み合わせるか配合したウイルス由来の１つまたは複数のタンパク質を含む。これらは、一般に、非病原性、非複製性であり、一般に、いかなる天然のウイルスゲノムも含まない。ウイルスタンパク質を組換えによって産生し、ウイルス全体から単離することができる。ビロソームまたはＶＬＰでの使用に適切なこれらのウイルスタンパク質には、インフルエンザウイルス（ＨＡまたはＮＡなど）、Ｂ型肝炎ウイルス（コアタンパク質またはキャプシドタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡ−ファージ、Ｑβ−ファージ（コートタンパク質など）、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１など）由来のタンパク質が含まれる。ＶＬＰは、参考文献２６〜３１でさらに考察されている。ビロソームは、例えば、参考文献３２でさらに考察されている。
【０１２９】
Ｅ．細菌または微生物の誘導体
本発明での使用に適切なアジュバントには、腸内細菌リポ多糖類（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、脂質Ａ誘導体、免疫刺激オリゴヌクレオチド、およびＡＤＰリボシル化毒素、ならびにこれらの解毒誘導体などの細菌または微生物の誘導体が含まれる。
【０１３０】
ＬＰＳの非毒性誘導体には、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）および脱３−Ｏ−アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が含まれる。３ｄＭＰＬは、脱３−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａと４、５、または６つのアシル化鎖との混合物である。脱３−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａの好ましい「小粒子」形態は、参考文献３３に開示されている。このような３ｄＭＰＬの「小粒子」は、０．２２μｍの膜で濾過滅菌するのに十分に小さい（３３）。他の非毒性ＬＰＳ誘導体には、モノホスホリル脂質Ａ模倣物（アミノアルキルグルコサミニドリン酸誘導体（例えば、ＲＣ−５２９）など）が含まれる（３４、３５）。
【０１３１】
脂質Ａ誘導体には、ＯＭ−１７４などの大腸菌由来の脂質Ａの誘導体が含まれる。ＯＭ−１７４は、例えば、参考文献３６および３７に記載されている。
【０１３２】
本発明でのアジュバントとしての使用に適切な免疫刺激オリゴヌクレオチドには、ＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列（グアノシンへのリン酸結合によって連結した非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）が含まれる。回文配列またはポリ（ｄＧ）配列を含む二本鎖ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドも免疫刺激性を示すことが示されている。
【０１３３】
ＣｐＧには、ホスホロチオエート修飾物などのヌクレオチド修飾物／アナログが含まれ、二本鎖または一本鎖であり得る。参考文献３８、３９、および４０は、可能なアナログ置換（グアノシンの２’−デオキシ−７−デアザグアノシンとの置換など）を開示している。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献４１〜４６でさらに考察されている。
【０１３４】
ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９（モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴなど）に指向することができる（４７）。ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘導に特異的であり得るか（ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮ）、Ｂ細胞応答の誘導により特異的であり得る（ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮ）。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、参考文献４８〜５０で考察されている。好ましくは、ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮである。
【０１３５】
好ましくは、５’末端が受容体認識のために利用できるようにＣｐＧオリゴヌクレオチドを構築する。任意選択的に、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を、その３’末端で結合させて「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成することができる（例えば、参考文献４７および５１〜５３を参照のこと）。
【０１３６】
細菌ＡＤＰリボシル化毒素およびこの解毒誘導体を、本発明でアジュバントとして使用することができる。好ましくは、タンパク質は、大腸菌（大腸菌熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ菌（「ＣＴ」）、または百日咳菌（「ＰＴ」）に由来する。解毒ＡＤＰリボシル化毒素の粘膜アジュバントとしての使用は、参考文献５４に記載されており、非経口アジュバントとしての使用は、参考文献５５に記載されている。毒素または類毒素は、好ましくは、ＡサブユニットおよびＢサブユニットの両方を含むホロ毒素の形態である。好ましくは、Ａサブユニットは、解毒変異を含み、好ましくは、Ｂサブユニットは変異されていない。好ましくは、アジュバントは、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴ−Ｇ１９２などの解毒ＬＴ変異体である。ＡＤＰリボシル化毒素およびその解毒誘導体（特に、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２）のアジュバントとしての使用を、参考文献５６〜６３に見出すことができる。アミノ酸置換についての多数の参考文献は、好ましくは、参考文献６４（詳細には、その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載のＡＤＰリボシル化毒素のＡサブユニットおよびＢサブユニットのアラインメントに基づく。
【０１３７】
Ｆ．ヒト免疫調節薬
本発明でアジュバントとして適切なヒト免疫調節薬には、サイトカイン（インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２）（６５）など）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−？）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子が含まれる。
【０１３８】
Ｇ．生体接着剤および粘膜接着剤
生体接着剤および粘膜接着剤を、本発明でアジュバントとして使用することができる。適切な生体接着剤には、ヒアルロン酸ミクロスフェア（６７）またはポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖類、およびカルボキシメチルセルロースなどの粘膜接着剤が含まれる。キトサンおよびその誘導体を、本発明でアジュバントとして使用することもできる（６８）。
【０１３９】
Ｈ．微粒子
微粒子も本発明でアジュバンとして使用することができる。微粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜３０μｍ、最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜約１０μｍ）は、生分解性且つ非毒性の材料（例えば、ポリ（ａ−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルソエステル、ポリアンヒドリド、ポリカプロラクトンなど）から形成され、任意選択的に、負電荷の表面（例えば、ＳＤＳ）または正電荷の表面（例えば、陽イオン性界面活性剤（ＣＴＡＢなど））を有するように処理されたポリ（ラクチド−コ−グリコリド）が好ましい。
【０１４０】
Ｉ．リポソーム（参考文献１６の第１３章および１４章）
アジュバントとしての使用に適切なリポソーム処方物の例は、参考文献６９〜７１に記載されている。
【０１４１】
Ｊ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル処方物
本発明での使用に適切なアジュバントには、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが含まれる（７２）。このような処方には、さらに、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（７３）およびオクトキシノールなどの少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステルが含まれる（７４）。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステオイルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオイルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【０１４２】
Ｋ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）
ＰＣＰＰ処方物は、例えば、参考文献７５および７６に記載されている。
【０１４３】
Ｌ．ムラミルペプチド
本発明でのアジュバントとしての使用に適切なムラミルペプチドの例には、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニンー２−（１’，２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）が含まれる。
【０１４４】
Ｍ．イミダゾキノロン化合物
本発明でのアジュバントとしての使用に適切なイミダゾキノロン化合物の例には、Ｉｍｉｑｕａｍｏｄおよびそのホモログ（例えば、「Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ  ３Ｍ」）が含まれ、参考文献７７および７８にさらに説明されている。
【０１４５】
本発明はまた、上記で同定した１つまたは複数のアジュバントの態様の組み合わせを含むことができる。例えば、以下のアジュバント組成物を本発明で使用することができる：（１）サポニンと水中油滴型乳濁液（７９）、（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）（８０）、（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール、（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（任意選択的に、＋ステロール）（８１）、（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油滴型乳濁液との組み合わせ（８２）、（６）１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０（商標）、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含むＳＡＦ（サブミクロン乳濁液にマイクロフルイド化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｄ）されるか、ボルテックスしてより大きな粒子サイズの粒子にする）、（７）２％スクアラン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、およびモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）（好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標）））からなる群から選択される１つまたは複数の細菌細胞壁成分を含むＲｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）、および（８）１つまたは複数のミネラル塩（アルミニウム塩など）＋ＬＰＳの非毒性誘導体（３ｄＭＰＬなど）。
【０１４６】
免疫刺激薬として作用する他の物質は、参考文献１６の第１７章に開示されている。
【０１４７】
アルミニウム塩（リン酸アルミニウム、特にヒドロキシリン酸塩および／または水酸基、特にオキシ水酸化物）およびＭＦ５９は、非経口免疫化のための好ましいアジュバントである。毒素変異体は、好ましい粘膜アジュバントである。ＱＳ２１は、単独または１つまたは複数のアジュバント（例えば、アルミニウム塩）と組み合わせて使用することができるＮＭＢ１８７０のための別の有用なアジュバントである。
【０１４８】
ムラミルペプチドには、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニルーＬ−アラニン−２−（１’，２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが含まれる。
さらなる抗原性成分
本発明の組成物には、キメラＮＭＢ１８７０ポリペプチドが含まれる。組成物が抗原の複合体または定義されていない混合物を含まないことが特に好ましい（例えば、組成物中に外膜小胞を含まないことが好ましい）。本発明のポリペプチドは、好ましくは、異種宿主中で組換え発現され、精製される。
【０１４９】
本発明の組成物には、キメラＮＭＢ１８７０ポリペプチドが含まれる。細菌あたり１つを超える抗原をターゲティングするワクチンによってエスケープ変異体の選択能力が減少する１つまたは複数のさらなるナイセリア抗原も含まれ得る。組成物への封入のためのナイセリア抗原には、以下を含むタンパク質が含まれる。
（ａ）参考文献８３に開示の４４６の偶数の配列番号（すなわち、２、４、６、．．．、８９０、８９２）
（ｂ）参考文献８４開示の４５の偶数の配列番号（すなわち、２、４、６、．．．、８８、９０）
（ｃ）参考文献２に開示の１６７４の偶数の配列番号２〜３０２０、偶数の配列番号３０４０〜３１１４、および全配列番号３１１５〜３２４１
（ｄ）参考文献４の２１６０のアミノ酸配列ＮＭＢ０００１〜ＮＭＢ２１６０
（ｅ）好ましくは組換え発現された任意のサブタイプの髄膜炎菌類ＰｏｒＡタンパク質
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の変異形、ホモログ、オルソログ、パラログ、変異体など
（ｇ）髄膜炎菌由来の外膜小胞調製物（例えば、参考文献１７７を参照のこと）
ナイセリアタンパク質抗原に加えて、組成物には、他の疾患または感染に対する免疫化のための抗原が含まれ得る。例えば、組成物は、１つまたは複数の以下のさらなる抗原を含み得る。
−髄膜炎菌血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹ由来の糖抗原（血清型Ｃ（参考文献８６も参照のこと）由来の参考文献８５に開示されている少糖または参考文献８７の少糖など）
−肺炎球菌由来の糖抗原（例えば、８８、８９、９０）
−Ａ型肝炎ウイルス（不活性化ウイルスなど）由来の抗原（例えば、９１、９２）
−Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原（表面抗原および／またはコア抗原など）（例えば、９２、９３）
−ジフテリア抗原（ジフテリア類毒素など）（例えば、参考文献９４の第３章）（例えば、ＣＲＭ１９７変異体）（例えば、９５）
−破傷風抗原（破傷風類毒素など）（例えば、参考文献９４の第４章）
−百日咳菌由来の抗原（任意選択的にパータクチンおよび／または凝集源２および３と組み合わせた百日咳菌由来の百日咳ホロ毒素（ＰＴ）および繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）など）（例えば、参考文献９６および９７）
−インフルエンザ桿菌Ｂ型由来の糖抗原（例えば、８６）
−ポリオ抗原（例えば、９８、９９）（ＩＰＶなど）
−麻疹、ムンプス、および／または風疹抗原（例えば、参考文献９４の第９章、第１０章、または第１１章）
−インフルエンザ抗原（例えば、参考文献９４の第１９章）（血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質など）
−カタル球菌由来の抗原（例えば、１００）
−ストレプトコッカス・アガラクチア（ストレプトコッカスＢ群）由来のタンパク質抗原（例えば、１０１、１０２）
−ストレプトコッカス・アガラクチア（ストレプトコッカスＢ群）由来の糖抗原
−化膿性連鎖球菌（ストレプトコッカスＡ群）由来の抗原（例えば、１０２、１０３、１０４）
−黄色ブドウ球菌由来の抗原（例えば、１０５）
組成物は、１つまたは複数のこれらのさらなる抗原を含むことができる。
【０１５０】
必要に応じて、毒性タンパク質抗原を解毒することができる（例えば、化学的および／または遺伝的手段による百日咳毒素の解毒（９７））。
【０１５１】
組成物中にジフテリア抗原を含む場合、破傷風抗原および百日咳抗原を含むことも好ましい。同様に、破傷風抗原を含む場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原を含むことも好ましい。同様に、百日咳抗原を含む場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原を含むことも好ましい。したがって、ＤＴＰ組み合わせが好ましい。
【０１５２】
糖抗原は、好ましくは、抱合体の形態である。抱合体のためのキャリアタンパク質には、髄膜炎菌外膜タンパク質（１０６）、合成ペプチド（１０７、１０８）、熱ショックタンパク質（１０９、１１０）、百日咳タンパク質（１１１、１１２）、インフルエンザ桿菌由来のプロテインＤ（１１３）、サイトカイン（１１４）、リンホカイン（１１４）、ストレプトコッカスタンパク質、ホルモン（１１４）、成長因子（１１４）、Ｃ．ディフィシル由来の毒素ＡおよびＢ（１１５）、鉄取り込みタンパク質（１１６）などが含まれる。好ましいキャリアタンパク質は、ＣＲＭ１９７ジフテリア毒素（１１７）である。
【０１５３】
組成物中の抗原は、典型的には、それぞれ少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般に、任意の所与の抗原の濃度は、抗原に対して免疫応答を誘発するのに十分である。
【０１５４】
本発明の免疫原性組成物を、治療的（すなわち、既存の感染を治療するため）または（）予防的（すなわち、将来的な感染を防止するため）に使用することができる。
【０１５５】
本発明の抗原性組成物中でのタンパク質抗原の別の使用方法として、抗原をコードする核酸（好ましくは、例えば、プラスミドの形態のＤＮＡ）を使用することができる。
【０１５６】
本発明の特に好ましい組成物には、（ａ）髄膜炎菌類血清型Ｙ、Ｗ１３５、Ｃ、および（任意選択的に）Ａ由来の糖抗原、（ｂ）インフルエンザ桿菌Ｂ型由来の糖抗原、および／または（ｃ）肺炎球菌由来の抗原のうちの１つ、２つ、または３つが含まれる。
髄膜炎菌類血清型Ｙ、Ｗ１３５、Ｃ、および（任意選択的に）Ａ
血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹに対する多糖ワクチンは、長く知られている。これらのワクチン（ＭＥＮＣＥＶＡＸ  ＡＣＷＹ（商標）およびＭＥＮＯＭＵＮＥ（商標））は生物の莢膜タンパク質に基づいており、これらは青年および成人に有効であるが、免疫応答が弱く、且つ防御の持続時間が短く、幼児に使用できない。
【０１５７】
これらのワクチン中の非複合多糖抗原と対照的に、最近承認された血清型Ｃワクチン（Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ（商標）（１１８、８５）、Ｍｅｎｉｎｇｉｔｅｃ（商標）、およびＮｅｉｓＶａｃ−Ｃ（商標））は、複合糖質を含む。Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ（商標）およびＭｅｎｉｎｇｉｔｅｃ（商標）は、ＣＲＭ１９７キャリアと抱合した少糖抗原を有するのに対して、ＮｅｉｓＶａｃ−Ｃ（商標）は、破傷風類毒素キャリアと抱合した（脱Ｏ−アセチル化された）完全な多糖類を使用する。Ｍｅｎａｃｔｒａ（商標）ワクチンは、各血清型Ｙ、Ｗ１３５、Ｃ、およびＡ由来の莢膜複合糖抗原を含む。
【０１５８】
本発明の組成物は、好ましくは、抗原がキャリアタンパク質および／または少糖と抱合した１つまたは複数の髄膜炎菌類血清型Ｙ、Ｗ１３５、Ｃ、および（任意選択的に）Ａを含む。例えば、組成物は、血清型Ｃ、血清型ＡおよびＣ、血清型Ａ、Ｃ、およびＷ１３５、血清型Ａ、Ｃ、およびＹ、血清型Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ、または血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹの全てに由来する莢膜糖抗原を含むことができる。
【０１５９】
用量あたりの各髄膜炎菌類糖抗原の典型的な量は、１μｇと２０μｇとの間（約１μｇ、約２．５μｇ、約４μｇ、約５μｇ、または約１０μｇ（糖として示す））である。
【０１６０】
混合物が血清型ＡおよびＣの両方由来の莢膜糖を含む場合、ＭｅｎＡ糖；ＭｅｎＣ糖の比（ｗ／ｗ）は、１を超えてよい（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１、またはそれを超える）。混合物が血清型Ｙおよび血清型ＣとＷ１３５との両方由来の莢膜糖を含む場合、ＭｅｎＹ糖：ＭｅｎＷ１３５糖の比（ｗ／ｗ）は、１を超えてよく（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１、またはこれを超える）、そして／またはＭｅｎＹ糖：ＭｅｎＣ糖の比（ｗ／ｗ）は、１未満であってよい（例えば、１：２、１：３、１：４、１：５、またはこれ未満）。血清型Ａ：Ｃ：Ｗ１３５：Ｙ由来の糖の好ましい比（ｗ／ｗ）は、１：１：１：１、１：１：１：２、２：１：１：１、４：２：１：１、８：４：２：１、４：２：１：２、８：４：１：２、４：２：２：１、２：２：１：１、４：４：２：１、２：２：１：２、４：４：１：２、および２：２：２：１である。血清型Ｃ：Ｗ１３５：Ｙ由来の糖の好ましい比（ｗ／ｗ）は、１：１：１、１：１：２、１：１：１、２：１：１、４：２：１、２：１：２、４：１：２、２：２：１、および２：１：１である。実質的に各糖量が等しいのが好ましい。
【０１６１】
莢膜糖を、一般に、少糖の形態で使用する。これらを、精製莢膜多糖の断片化（例えば、加水分解）および通常は実施するその後の所望のサイズのフラグメントの精製によって都合よく形成する。
【０１６２】
多糖を断片化して少糖の最終平均重合度（ＤＰ）が３０未満（例えば、血清型Ａについては１０と２０との間、好ましくは約１０、血清型Ｗ１３５およびＹについては１５と２５との間、好ましくは約１５〜２０、血清型Ｃについては１２と２２との間など）にすることが好ましい。ＤＰを、イオン交換クロマトグラフィまたは比色法によって都合よく測定することができる（１１９）。
【０１６３】
加水分解を行う場合、一般に、加水分解物をサイズによって分類して、短い少糖を除去する（６８）。種々の方法（限外濾過およびその後のイオン交換クロマトグラフィなど）でこれを行うことができる。血清型Ａについては、重合度が約６以下の少糖を除去することが好ましく、血清型Ｗ１３５およびＹについては、重合度が約４未満の少糖を除去することが好ましい。
【０１６４】
Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ（商標で使用される好ましいＭｅｎＣ糖抗原）は、参考文献１１８に開示されている。
【０１６５】
糖抗原を化学修飾することができる。これは、血清型Ａの加水分解の還元に特に有用である（１２０、以下を参照のこと）。髄膜炎菌類糖を脱Ｏ−アセチル化することができる。少糖について、解重合前後に修飾することができる。
【０１６６】
本発明の組成物がＭｅｎＡ糖抗原を含む場合、抗原は、好ましくは、天然の糖上の１つまたは複数の水酸基が封鎖基と置換されている修飾糖である（１２０）。この修飾により、加水分解耐性が改良される。
【０１６７】
封鎖基を有する単糖単位数は様々であり得る。例えば、全てまたは実質的に全ての単糖単位は、封鎖基を有し得る。あるいは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の単糖単位は、封鎖基を有し得る。少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の単糖単位は、封鎖基を有し得る。
【０１６８】
同様に、単糖単位上の封鎖基数は様々であり得る。例えば、単糖単位上の封鎖基数は、１または２であり得る。封鎖基は、一般に、単糖単位の４位および／または３位に存在する。
【０１６９】
末端単糖単位は、その天然の水酸基の代わりに封鎖基を有しても、有さなくてもよい。末端単糖単位上の遊離アノマー水酸基を保持してさらなる反応物（例えば、抱合体）を得ることが好ましい。アノマー水酸基を、還元的アミノ化（例えば、ＮａＢＨ３ＣＮ／ＮＨ４Ｃｌを使用する）によってアミノ基（−ＮＨ２または−ＮＨ−Ｅ（式中、Ｅは窒素保護基である））に変換し、他の水酸基が封鎖基に変換された後に再生することができる。
【０１７０】
水酸基と置換するための封鎖基は、水酸基の誘導体化反応（すなわち、水酸基の水素原子の別の基との置換）を介して直接接近することができる。封鎖基として作用する水酸基の適切な誘導体は、例えば、カルバメート、スルホネート、カーボネート、エステル、エーテル（例えば、シリルエーテルまたはアルキルエーテル）、およびアセタールである。このような封鎖基のいくつかの特定の例は、アリル、Ａｌｏｃ、ベンジル、ＢＯＭ、ｔ−ブチル、トリブチル、ＴＢＳ、ＴＢＤＰＳ、ＴＥＳ、ＴＭＳ、ＴＩＰＳ、ＰＭＢ、ＭＥＭ、ＭＯＭ、ＭＴＭ、ＴＨＰなどである。直接接近不可能であり、且つ水酸基と完全置換される他の封鎖基には、Ｃ１〜１２アルキル、Ｃ３〜１２アルキル、Ｃ５〜１２アリール、Ｃ５〜１２アリール−Ｃ１〜６アルキル、ＮＲ１Ｒ２（Ｒ１およびＲ２は、以下の段落で定義する）、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２（Ｃ１〜６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ３、ＣＣｌ３などが含まれる。好ましい封鎖基は、電子求引基である。
【０１７１】
好ましい封鎖基は、式−Ｏ−Ｘ−Ｙまたは−ＯＲ３（式中、Ｘは、Ｃ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）、またはＳＯ２であり、Ｙは、Ｃ１〜１２アルキル、Ｃ１〜１２アルコキシ、Ｃ３〜１２シクロアルキル、Ｃ５〜１２アリール、またはＣ５〜１２アリール−Ｃ１〜６アルキルであり、それぞれを、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２（Ｃ１〜６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ３、またはＣＣｌ３から独立して選択される１つ、２つ、または３つの基と任意選択的に置換することができるか、Ｙは、ＮＲ１Ｒ２であり、；Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜１２アルキル、Ｃ３〜１２シクロアルキル、Ｃ５〜１２アリール、Ｃ５〜１２アリール−Ｃ１〜６アルキルから選択されるか、Ｒ１とＲ２を連結して、Ｃ３〜１２飽和複素環基を形成することができ、Ｒ３は、Ｃ１〜１２アルキルまたはＣ３〜１２シクロアルキルであり、それぞれを、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ２（Ｃ１〜６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ３、またはＣＣｌ３から独立して選択される１つ、２つ、または３つの基と任意選択的に置換することができるか、Ｒ３はＣ５〜１２アリールまたはＣ５〜１２アリール−Ｃ１〜６アルキルであり、それぞれを、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２（Ｃ１〜６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ３、またはＣＣｌ３から独立して選択される１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの基と任意選択的に置換することができる）の封鎖基である。Ｒ３がＣ１〜１２アルキルまたはＣ３〜１２シクロアルキルである場合、典型的には、これを、１つ、２つ、または３つの上記定義の基と置換する。Ｒ１とＲ２を連結して、Ｃ３〜１２飽和複素環基を形成する場合、Ｒ１とＲ２は窒素原子と共に３個と１２個との間の任意の炭素原子数（例えば、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２）を含む飽和複素環基を形成する。複素環基は、窒素原子以外の１個または２個のヘテロ原子（Ｎ、Ｏ、またはＳ）を含むことができる。Ｃ３〜１２飽和複素環基の例は、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、イミダゾリジニル、アゼチジニル、およびアジリジニルである。
【０１７２】
封鎖基−Ｏ−Ｘ−Ｙおよび−ＯＲ３を、標準的な誘導体化手順（水酸基とアシルハライド、アルキルハライド、スルホニルハライドなどとの反応など）によって−ＯＨ基から調製することができる。したがって、−Ｏ−Ｘ−Ｙ中の酸素原子は、好ましくは、水酸基中の酸素原子である一方で、−Ｏ−Ｘ−Ｙ中の−Ｘ−Ｙ基は、好ましくは、水酸基の水素原子を置換している。
【０１７３】
あるいは、封鎖基は、置換反応（Ｍｉｔｓｏｎｏｂｕ型置換など）を介して接近可能であり得る。これらおよび他の水酸基からの封鎖基を調製する方法が公知である。
【０１７４】
より好ましくは、封鎖基は、−ＯＣ（Ｏ）ＣＦ３（１２１）またはカルバメート基−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１Ｒ２（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｃ１〜６アルキルから選択される）である。より好ましくは、Ｒ１およびＲ２は共にメチルである（すなわち、封鎖基は、−ＯＣ（Ｏ）ＮＭｅ２である）。カルバメート封鎖基は、グリコシド基に対して安定化効果を有し、穏やかな条件下で調製することができる。
【０１７５】
好ましい修飾ＭｅｎＡ糖は、ｎ個の単糖単位を含み、少なくともｈ％の単糖単位が３位および４位の両方に−ＯＨ基を持たない。ｈの値は、２４またはこれを超え（２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９、または１００）、好ましくは、５０またはこれを超える。上記定義の封鎖基は、−ＯＨ基が存在しないことが好ましい。
【０１７６】
他の好ましい修飾ＭｅｎＡ糖は、単糖単位（少なくともｓの単糖単位が３位に−ＯＨを持たず、且つ４位に−ＯＨを持たない）を含む。ｓの値は、少なくとも１（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０）である。上記定義の封鎖基は、−ＯＨ基が存在しないことが好ましい。
【０１７７】
本発明での使用に適切な修飾ＭｅｎＡ糖は、式：
【０１７８】
【化１２】
2011168611.tif 000012
（式中、
ｎは１〜１００の整数（好ましくは、１５〜２５の整数）であり、
Ｔは式（Ａ）または（Ｂ）：
【０１７９】
【化１３】
2011168611.tif 000013
（式中、
各Ｚ基は、独立して、ＯＨまたは上記定義の封鎖基から選択され、
各Ｑ基は、独立して、ＯＨまたは上記定義の封鎖基から選択され、
Ｙは、ＯＨまたは上記定義の封鎖基から選択され、
Ｅは、Ｈまたは窒素保護基であり、
約７％を超える（例えば、８％、９％、１０％、またはこれを超える）のＱ基が封鎖基である）である）を有する。
【０１８０】
各ｎ＋２個のＺ基は、互いに同一であっても異なっていてもよい。同様に、各ｎ＋２個のＱ基は、互いに同一であっても異なっていてもよい。全Ｚ基はＯＨであってよい。あるいは、少なくとも１０％、２０、３０％、４０％、５０％、または６０％のＺ基がＯＡｃであってよい。好ましくは、約７０％のＺ基がＯＡｃであり、残りのＺ基がＯＨまたは上記定義の封鎖基である。少なくとも約７％のＱ基が封鎖基である。好ましくは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、さらに１００％のＱ基が封鎖基である。
【０１８１】
髄膜炎菌類莢膜多糖を、典型的には、ポリサッカリド沈殿工程（例えば、陽イオン性界面活性を使用する）、エタノール分画、冷フェノール抽出（タンパク質を除去するため）、および限外濾過（ＬＰＳを除去するため）を含むプロセスによって調製する（例えば、参考文献１２２）。しかし、より好ましいプロセス（８７）は、多糖の沈殿およびその後の低級アルコールを使用した沈殿多糖の可溶化を含む。陽イオン性界面活性剤（テトラブチルアンモニウムおよびセチルトリメチルアンモニウム塩（例えば、臭化物塩）、または臭化ヘキサジメスリンおよびミリスチルトリメチルアンモニウム塩など）を使用して、沈殿を行うことができる。臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）が特に好ましい（１２３）。沈殿材料を、メタノール、プロパン−１−オール、プロパン−２−オール、ブタン−１−オール、ブタン−２−オール、２−メチル−プロパン−１−オール、２−メチル−プロパン−２−オール、ジオールなどの低級アルコールを使用して可溶化することができるが、ＣＴＡＢ−多糖複合体の可溶化にはエタノールが特に適切である。好ましくは、エタノールを、沈殿多糖に添加して、５０％と９５％との間の最終濃度（エタノールおよび水の総含有率の基づく）にする。
【０１８２】
再可溶化後、多糖をさらに処理して夾雑物を除去することができる。これは、少量の汚染でさえも許容できない状況（例えば、ヒトワクチン産生）で特に重要である。これは、典型的には、１つまたは複数の濾過工程（例えば、深層濾過（活性炭による濾過を使用することができる）、サイズ濾過、および／または限外濾過）を含む。一旦濾過して夾雑物が除去されると、さらなる処置および／または処理のために多糖を沈殿させることができる。陽イオン交換によって（例えば、カルシウム塩またはナトリウム塩の添加による）これを都合よく行うことができる。
【０１８３】
精製の代替法として、莢膜糖を、全合成または部分合成によって得ることができる（Ｈｉｂ合成は参考文献１２４に開示されており、ＭｅｎＡ合成は参考文献１２５に開示されている）。
【０１８４】
本発明の組成物は、髄膜炎菌の少なくとも２つの血清型由来の莢膜糖を含む。糖を、好ましくは、個別に調製し（任意の断片化、抱合、修飾など）、その後に混合して、本発明の組成物を得る。
【０１８５】
しかし、組成物が血清型Ａ由来の莢膜糖を含む場合、血清型Ａ糖を、加水分解の可能性を最小にするために、使用直前まで他の糖と組み合わせないことが好ましい。血清型Ａ成分（典型的には、適切な賦形剤を含む）を凍結乾燥形態にし、他の血清型成分を液体形態（これも適切な賦形剤を含む）にすることによってこれを都合よく行うことができ、使用時に液体成分を使用して凍結乾燥したＭｅｎＡ成分を再構成する。アルミニウム塩アジュバントを使用する場合、液体ワクチンを含むアジュバントをウイルス中に含め、アジュバントを含まないＭｅｎＡ成分を凍結乾燥することが好ましい。
【０１８６】
したがって、本発明の組成物を、（ａ）凍結乾燥形態の髄膜炎血清型Ａ由来の莢膜糖および（ｂ）液体形態の組成物由来のさらなる抗原を含むキットから調製することができる。本発明はまた、髄膜炎血清型Ａ由来の凍結乾燥した莢膜糖とさらなる抗原（さらなる抗原が液体形態である）とを組み合わせる工程を含む、本発明の組成物の調製方法を提供する。
【０１８７】
本発明はまた、（ａ）２つまたはそれを超える髄膜炎菌血清型Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ由来の莢膜糖（全て凍結乾燥形態）を含む第１の容器と、（ｂ）（ｉ）被験体への投与後に被験体中で２つまたはそれを超える（例えば、２つまたは３つ）髄膜炎菌血清型Ｂの高ビルレント系列Ａ４、ＥＴ−５、および系列３に対して殺菌性を示す抗体応答を誘導することができる組成物、（ｉｉ）無しか１つの髄膜炎菌血清型Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ由来の莢膜糖、および、任意選択的に、（ｉｉｉ）髄膜炎菌類莢膜糖を含まないさらなる抗原（以下を参照のこと）を液体形態で含む第２の容器を含み、コンテナ（ｂ）の内容物によるコンテナ（ａ）の内容物の再構成によって本発明の組成物が得られる、キットを提供する。
【０１８８】
各用量内で、各糖抗原の量は、一般に、１〜５０μｇ（糖の質量として測定）であり、それぞれ約２．５μｇ、５μｇ、または１０μｇが好ましい。したがって、Ａ：Ｃ：Ｗ１３５：Ｙの重量比が、１：１：１：１、１：１：１：２、２：１：１：１、４：２：１：１、８：４：２：１、４：２：１：２、８：４：１：２、４：２：２：１、２：２：１：１、４：４：２：１、２：２：１：２、４：４：１：２、および２：２：２：１である場合、数字１で示す量は、好ましくは、２．５μｇ、５μｇ、または１０μｇである。Ａ：Ｃ：Ｗ：Ｙ比が１：１：１：１である組成物を糖あたり１０μｇ使用する場合、１投与あたり４０μｇの糖が投与される。好ましい組成物は、１投与あたりおよそ以下のμｇの糖を有する。
【０１８９】
【化１４】
2011168611.tif 000014
本発明の好ましい組成物は、１投与あたり５０μｇ未満の髄膜炎菌類糖を含む。他の好ましい組成物は、１投与あたり４０μｇ以下の髄膜炎菌類糖を含む。他の好ましい組成物は、１投与あたり３０μｇ以下の髄膜炎菌類糖を含む。他の好ましい組成物は、１投与あたり２５μｇ以下の髄膜炎菌類糖を含む。他の好ましい組成物は、１投与あたり２０μｇ以下の髄膜炎菌類糖を含む。他の好ましい組成物は、１投与あたり１０μｇ以下の髄膜炎菌類糖を含むが、理想的には、本発明の組成物は、１投与あたり１０μｇの髄膜炎菌類糖を含む。
【０１９０】
Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ（商標）およびＮｅｉｓＶａｃ（商標）抱合体は、水酸化物アジュバントを使用するのに対して、Ｍｅｎｉｎｇｉｔｅｃ（商標）は、リン酸塩を使用する。本発明の組成物中で水酸化アルミニウムにいくつかの抗原を吸着させることが可能であるが、リン酸アルミニウムと組み合わせた他の抗原を有することが可能である。四価の血清型組み合わせについて、例えば、以下の置換が利用可能である。
【０１９１】
【化１５】
2011168611.tif 000015
三価の髄膜炎菌血清型の組み合わせのために、以下の置換が利用可能である。
【０１９２】
【化１６】
2011168611.tif 000016
インフルエンザ桿菌Ｂ型
組成物がインフルエンザ桿菌Ｂ型抗原を含む場合、組成物は、典型的には、Ｈｉｂ莢膜糖抗原である。インフルエンザ桿菌Ｂ型由来の糖抗原は周知である。
【０１９３】
有利には、特に子供における免疫原性を増強するために、Ｈｉｂ糖はキャリアタンパク質に共有結合している。一般に多糖抱合体および特にＨｉｂ莢膜多糖の調製は十分に報告されている（例えば、参考文献１２６〜１３４など）。本発明は、任意の適切なＨｉｂ抱合体を使用することができる。適切なキャリアタンパク質を以下に記載し、Ｈｉｂ糖の好ましいキャリアはＣＲＭ１９７（「ＨｂＯＣ」）、破傷風類毒素（「ＰＲＰ−Ｔ」）、および髄膜炎菌の外膜複合体（「ＰＲＰ−ＯＭＰ」）である。
【０１９４】
抱合体の糖部分は、多糖（例えば、全長ポリリボシルリビトールリン酸（ＰＲＰ））であり得るが、多糖を加水分解して少糖（例えば、分子量約１〜約５ｋＤａ）を形成することが好ましい。
【０１９５】
好ましい抱合体は、アジピン酸リンカーを介してＣＲＭ１９７と共有結合したＨｉｂ少糖を含む（１３５、１３６）。破傷風類毒素もまた、キャリアとして好ましい。
【０１９６】
本発明の組成物は、１つを超えるＨｉｂ抗原を含むことができる。
【０１９７】
組成物がＨｉｂ糖抗原を含む場合、水酸化アルミニウムアジュバントも含まないことが好ましい。組成物がリン酸アルミニウムアジュバントを含む場合、Ｈｉｂ抗原をアジュバントに吸着させても（１３７）、吸着させなくてもよい（１３８）。
【０１９８】
Ｈｉｂ抗原を、例えば、髄膜炎菌類抗原と共に凍結乾燥することができる。
肺炎球菌
組成物が肺炎球菌抗原を含む場合、組成物は、典型的には、キャリアタンパク質に抱合することが好ましい莢膜糖抗原である（例えば、参考文献８８〜９０）。１つを超える肺炎球菌の血清型由来の糖を含むことが好ましい。例えば、２３種の異なる血清型由来の多糖の混合物が広く使用されており、５腫と１１腫との間の異なる血清型由来の多糖を含む抱合体ワクチンも同様である（１３９）。例えば、ＰｒｅｖＮａｒ（商標）（１４０）は、７つの血清型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆ）由来の抗原を含み、各糖は還元的アミノ化によってＣＲＭ１９７に個別に抱合し、各糖は０．５ｍｌの用量で２μｇ存在し（血清型６Ｂは４μｇ）、抱合体はリン酸アルブミンアジュバントに吸着する。本発明の組成物は、好ましくは、少なくとも血清型６Ｂ、１４、１９Ｆ、および２３Ｆを含む。抱合体を、リン酸アルミニウムに吸着させることができる。
【０１９９】
肺炎球菌由来の糖抗原の使用の代替法として、組成物は、１つまたは複数の多糖抗原を含むことができる。いくつかの肺炎球菌類株のゲノム配列を利用可能であり（１４１、１４２）、逆ワクチン学（１４３〜１４６）に供して、適切なポリペプチド抗原を同定することができる（１４７、１４８）。例えば、参考文献１４９に定義するように、組成物は、１つまたは複数の以下の抗原を含むことができる：ＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、およびＳｐ１３０。
【０２００】
いくつかの実施形態では、組成物は、肺炎球菌類由来の糖抗原およびポリペプチド抗原の両方を含むことができる。これらを、簡潔な混合物中で使用することができるか、肺炎球菌類糖抗原を、肺炎球菌類タンパク質に抱合することができる。このような実施形態に適切なキャリアタンパク質は、前の段落に列挙した抗原を含む（１４９）。
【０２０１】
肺炎球菌類抗原を、例えば、髄膜炎菌類抗原および／またはＨｉｂ抗原と共に凍結乾燥することができる。
【０２０２】
共有結合的抱合
本発明の組成物中の莢膜糖を、通常、キャリアタンパク質に抱合する。一般に、抱合により、糖の免疫原性が増強されてＴ独立性抗原からＴ依存性抗原に変換するようになり、それにより、免疫記憶をプライミングすることが可能である。抱合は、小児用ワクチンに特に有用であり、周知の技術である（例えば、参考文献１５０および１２６〜１３４に概説）。
【０２０３】
好ましいキャリアタンパク質は、細菌の毒素または類毒素（ジフテリア類毒素または破傷風類毒素など）である。ＣＲＭ１９７変異ジフテリア毒素（１１７、１５１、１５２）が特に好ましい。他の適切なキャリアタンパク質には、髄膜炎菌外膜タンパク質（１０６）、合成ペプチド（１０７、１０８）、熱ショックタンパク質（１０９、１１０）、百日咳タンパク質（１１１、１１２）、サイトカイン（１１４）、リンホカイン（１１４）、ホルモン（１１４）、成長因子（１１４）、種々の病原体由来抗原に由来する複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（１５３）、インフルエンザ桿菌由来のプロテインＤ（１１３、１５４）、肺炎球菌類表面タンパク質ＰｓｐＡ（１５５）、鉄取り込みタンパク質（１１６）、Ｃ．ディフィシル由来の毒素ＡおよびＢ（１１５）などが含まれる。好ましいキャリアは、ジフテリア類毒素、破傷風類毒素、インフルエンザ桿菌プロテインＤ、およびＣＲＭ１９７である。
【０２０４】
本発明の組成物内で、１つを超えるキャリアタンパク質を使用してキャリア抑制のリスクを軽減することが可能である。したがって、異なるキャリアタンパク質を、異なる血清群のために使用することができる（例えば、血清型Ａ糖を、ＣＲＭ１９７に抱合することができる一方で、血清型Ｃ糖を破傷風類毒素に抱合することができる）。特定の糖抗原のために１つを超えるキャリアタンパク質を使用することも可能である（例えば、血清型Ａ糖は、２つの群に分類することができ、ＣＲＭ１９７に抱合するものもあれば、破傷風類毒素に抱合するものもある）。しかし、一般に、全糖について同一のキャリアタンパク質を使用することが好ましい。
【０２０５】
１つのキャリアタンパク質は、１つを超える糖抗原を含むことができる（１５６）。例えば、１つのキャリアタンパク質を、血清型ＡおよびＣ由来の糖に抱合することができるかもしれない。この目的を達成するために、抱合反応前に糖を混合することができる。しかし、一般に、各血清型のための個別の抱合体を有することが好ましい。
【０２０６】
糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）が１：５（すなわち、タンパク質過剰）と５：１（すなわち、糖過剰）との間の抱合体が好ましい。１：２と５：１との間の比が好ましく、１：１．２５と１：２．５との間の比がより好ましい。ＭｅｎＡおよびＭｅｎＣには過剰なキャリアタンパク質が好ましい。
【０２０７】
抱合体を、遊離キャリアタンパク質と組み合わせて使用することができる（１５７）。所与のキャリアタンパク質が本発明の組成物中に遊離形態および抱合形態で存在する場合、非抱合形態は、好ましくは、全体として組成物中のキャリアタンパク質の総量の５重量％未満、より好ましくは２重量％未満で存在する。
【０２０８】
任意の適切な抱合反応を、必要に応じて任意の適切なリンカーと共に使用することができる。
【０２０９】
糖を、典型的には、抱合前に活性化または官能化する。活性化は、例えば、ＣＤＡＰ（例えば、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（１５８、１５９など））などのシアニル化試薬を含み得る。他の適切な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン（ｎｏｒｂｏｒａｎｅ）、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを含む（参考文献１３２の緒言も参照のこと）。
【０２１０】
任意の公知の手順（例えば、参考文献１６０および１６１に記載の手順）を使用して、リンカー基を介して結合することができる。１つの結合型は、多糖の還元的アミノ化、得られたアミノ基のアジピン酸リンカー基の一方の末端とのカップリング、その後のタンパク質のアジピン酸リンカー基の他方の末端とのカップリングを含む（１３０、１６２、１６３）。他のリンカーには、Ｂ−プロピオンアミド（１６４）、ニトロフェニル−エチルアミン（１６５）、ハロアシルハライド（１６６）、グリコシド結合（１６７）、６−アミノカプロン酸（１６８）、ＡＤＨ（１６９）、Ｃ４〜Ｃ１２部分（１７０）などが含まれる。リンカー使用の代替法として、直接結合を使用することができる。例えば、参考文献１７１および１７２に記載のように、タンパク質への直接結合は、多糖の酸化およびその後のタンパク質との還元的アミノ化を含むことができる。
【０２１１】
糖へのアミノ基の導入（例えば、末端＝Ｏ基の−ＮＨ２への置換による）およびその後のアジピン酸ジエステル（例えば、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステル）での誘導体化およびキャリアタンパク質との反応を含むプロセスが好ましい。別の好ましい反応は、例えば、ＭｅｎＡまたはＭｅｎＣのためのプロテインＤキャリアでのＣＤＡＰ活性化を使用する。
【０２１２】
抱合後、遊離糖および抱合糖を分離することができる。多数の適切な方法（疎水性クロマトグラフィ、タンジェンシャルフロー型限外濾過、ダイアフィルトレーションが含まれる）が存在する（参考文献１７３および１７４も参照のこと）。
【０２１３】
本発明の組成物が抱合少糖を含む場合、抱合の前に少糖を調製することが好ましい。
【０２１４】
外膜小胞
本発明の組成物が抗原の複合体または定義されていない混合物（ＯＭＶの典型的な特徴である）を含まないことが好ましい。しかし、本発明をＯＭＶに適用することができる１つの方法は、複数回投与計画で投与することである。
【０２１５】
１回を超えてＯＭＶを投与する場合、各投与物に、上記定義の第１のタンパク質、第２のタンパク質、または第３のタンパク質のうちの１つを補足することができる（精製タンパク質の添加またはＯＭＶが由来する細菌内でのタンパク質の発現のいずれかによる）。好ましくは、異なる投与物に、異なるＮＭＢ１８７０ファミリーを補足する。３つのＯＭＶ投与計画では、例えば、各投与物は、３つのＯＭＶ投与物の投与後に３つ全てのファミリーが投与されるように、第１のタンパク質、第２のタンパク質、および第３のタンパク質の異なる１種を含むことができる。２つのＯＭＶ投与計画では、ＯＭＶ投与あたり１つのファミリーを使用することができるか（したがって、１つのファミリーが省略される）、３つ全てのファミリーが対象とされるように、一方または両方のＯＭＶ投与物に１つを超えるファミリーを補足することができる。好ましい実施形態では、３つのＯＭＶ投与物が存在し、３つの各ＯＭＶ投与物は、３つのサブタイプをそれぞれ示し、それにより、全部で９つの異なるサブタイプが得られる３つの異なる遺伝子操作された小胞集団を含む。
【０２１６】
一般に、このアプローチを使用して、髄膜炎菌血清型Ｂ微小胞（１７５）、「天然のＯＭＶ」（１７６）、小疱、または外膜小胞の調製物を改良することができる（例えば、参考文献１７７〜１８２など）。これらを、例えば、免疫原性を増加させ（例えば、免疫原を高発現する）、毒性を減少させ、莢膜多糖合成を阻害し、ＰｏｒＡ発現を下方制御するように遺伝子操作した細菌から調製することができる。高小疱形成株からこれらを調製することができる（１８７〜１９０）。非病原性ナイセリア由来の小胞を含めることができる（１９１）。界面活性剤を使用することなくＯＭＶを調製することができる（１９２、１９３）。これらは、その表面上に非ナイセリアタンパク質を発現することができる（１９４）。これらは、ＬＰＳが枯渇し得る。これらを、組換え抗原と混合することができる（１７７、１９５）。異なるクラスＩ外膜タンパク質サブタイプ（例えば、それぞれ３つのサブタイプを示す２つの異なる遺伝子操作された小胞集団を使用する６つの異なるサブタイプまたはそれぞれ３つのサブタイプを示す３つの異なる遺伝子操作された小胞集団を使用する９つの異なるサブタイプなど）を有する細菌由来の小胞を使用することができる。有用なサブタイプには、以下が含まれる：Ｐ１．７，１６；Ｐ１．５−１，２−２；Ｐ１．１９，１５−１；Ｐ１．５−２，１０；Ｐ１．１２−１，１３；Ｐ１．７−２，４；Ｐ１．２２，１４；Ｐ１．７−１，１；Ｐ１．１８−１，３，６。
【０２１７】
勿論、２つまたは３つの異なるファミリーを有する小胞調製物を補足することも可能である。
【０２１８】
モノクローナル抗体
本発明は、髄膜炎菌類ＮＭＢ１８７０タンパク質中のエピトープを認識するモノクローナル抗体であって、エピトープがＮＭＢ１８７０中のドメインＢおよびＣの存在を必要とする、モノクローナル抗体を提供する。したがって、モノクローナル抗体は、個別のドメインＢや個別のドメインＣに結合しないが、ドメインＢとＣとの組み合わせに結合する（全長ＮＭＢ１８７０にも結合する）。したがって、エピトープは、ドメインＢおよびドメインＣの両方のアミノ酸残基から形成された不連続エピトープであり得る。
【０２１９】
用語「モノクローナル抗体」には、任意の種々の利用可能な人工抗体および抗体由来タンパク質（例えば、目的の抗原に結合するヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体、モノクローナルオリゴボディ、二量体もしくは三量体抗体フラグメントもしくは構築物、ミニボディ、またはこれらの機能的フラグメント）が含まれる。抗体は、好ましくは、実質的に単離された形態である。
【０２２０】
天然の抗体分子では、２つの重鎖および２つの軽鎖が存在する。各重鎖および各軽鎖は、そのＮ末端に可変ドメインを有する。各可変ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって変化する４つのフレームワーク領域（ＦＲ）から構成される。可変ドメイン中の残基は、従来より、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８）によって考案されたシステムにしたがって、番号がつけられている。Ｋａｂａｔの残基指定は、アミノ酸残基の直線的に番号づけと常に対応しているわけではなく、直鎖アミノ酸は、厳密なＫａｂａｔ番号づけよりも少ないか多いアミノ酸を含むことができる。これは、構造成分（基本可変ドメイン構造のフレームワークまたはＣＤＲのいずれか）の短縮または挿入に対応し得る。
【０２２１】
ヒトにおける非特異的抗マウス免疫応答を回避するために、非ヒト抗体は、好ましくは、ヒト化抗体またはキメラ抗体である。（例えば、参考文献１９９および２００）。代替法として、完全なヒト抗体を使用することができる。キメラ抗体では、非ヒト定常領域を、ヒト定常領域に置換するが、可変領域は非ヒトのままである。ヒト化抗体を、種々の方法（例えば、（１）非ヒト可変領域由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）のヒトフレームワークへのグラフティング（「ＣＤＲグラフティング」）および任意選択的な非ヒト抗体由来の１つまたは複数のフレームワーク残基のさらなる導入（「ヒト化」）、（２）全非ヒト可変ドメインを移植するが、表面残基の置換（「ベニヤリング」によってこれらをヒト様表面で「クローキング」が含まれる）によって得ることができる。本発明では、ヒト化抗体には、可変領域のＣＤＲグラフティング、ヒト化、およびベニヤリングによって得られたヒト化抗体が含まれる（例えば、参考文献２０１〜２０７）。
【０２２２】
ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作されたトランスジェニック動物を使用して、ヒト化抗体または完全なヒト抗体を産生することもできる。例えば、参考文献２０８は、内因性重鎖および軽鎖の遺伝子座の不活化によって機能的内因性免疫グロブリンを産生しない、ヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック動物を開示している。参考文献２０９はまた、抗体が霊長類定常領域および／または可変領域を有し、内因性免疫グロブリンコード遺伝子座が置換されているか不活化されている、免疫原に対する免疫応答を開始することができるトランスジェニック非霊長類哺乳動物宿主を開示している。参考文献２１０は、哺乳動物中の免疫グロブリン遺伝子座を修飾して（定常領域または可変領域の全部または一部を置換するなど）修飾抗体分子を形成するためのＣｒｅ／Ｌｏｘ系の使用を開示している。参考文献２１１は、不活化内因性Ｉｇ遺伝子座および機能的ヒトＩｇ遺伝子座を有する非ヒト哺乳動物宿主を開示している。参考文献２１２は、マウスが内因性重鎖を欠き、且つ１つまたは複数の外因性定常領域を含む外因性免疫グロブリン遺伝子座を発現するトランスジェニックマウスの作製方法を開示している。
【０２２３】
抗体は、天然に、２つの個別の鎖を有するが、軽鎖および重鎖の可変ドメインがリンカーによって連結されて１つのポリペプチド鎖が得られる単鎖抗体（「ｓＦｖ」）を使用することが好ましい。ｓＦｖの調製用キットが市販されており、抗リガンドｓＦｖは、本発明と共に使用するための好ましい第２の配列である。単ドメイン抗体を、ラクダもしくはサメ（２１３）またはラクダ化（２１４）によって得ることもできる。
【０２２４】
ｓＦｖポリペプチドは、ペプチドコードリンカーによって連結されたＶＨおよびＶＬコード遺伝子を含む遺伝子融合物から発現される共有結合したＶＨ−ＶＬヘテロ二量体である（２１５）。抗体Ｖ領域由来の天然に凝集しているが化学的には分離している軽鎖および重鎖のポリペプチド鎖の抗原結合部位の構造と実質的に類似している三次元構造への変換のための化学構造（リンカー）を識別および構築するための多数の方法が記載されている。例えば、参考文献２１６〜２１８を参照のこと。当該分野で説明されている方法を使用して、ｓＦｖ分子を産生することができる。デザインの基準には、一般に、コイル化せず、二次構造を形成しない小さな親水性アミノ酸残基からリンカーが形成される、一方の鎖のＣ末端と他方の鎖のＮ末端との間の距離をわたすのに適切な長さの決定が含まれる。このような方法は、当該分野で説明されている（例えば、参考文献２１６〜２１８）。適切なリンカーは、一般に、変化するグリシン残基およびセリン残基組のポリペプチド鎖を含み、溶解性を増強するために挿入したグルタミン酸残基およびリジン残基を含むことができる。
【０２２５】
「ミニ抗体」または「ミニボディ」も本発明で適用される。ミニボディは、ヒンジ領域によってｓＦｖから離れた、そのＣ末端にオリゴマー化ドメインを含むｓＦｖポリペプチド鎖である（２１９）。オリゴマー化ドメインは、さらなるジスルフィド結合によってさらに安定化することができる自己結合αヘリックス（例えば、ロイシンジッパー）を含む。オリゴマー化ドメインを、膜を貫通するベクトル折り畳み（ｖｅｃｔｏｒｉａｌ  ｆｏｌｄｉｎｇ）（ポリペプチドの機能的結合タンパク質へのｉｎ  ｖｉｖｏ折り畳みを容易にすると考えられているプロセス）と適合するようにデザインする。一般に、ミニボディを、当該分野で周知の組換え法を使用して産生する。例えば、（２１９）、（２２０）を参照のこと。
【０２２６】
「オリゴボディ」も本発明で適用される。オリゴボディは合成抗体である。これらの試薬の特異性は、ウェスタンブロット分析および免疫組織化学によって証明されている。これらは、いくつかの所望の性質（すなわち、その産生が免疫系と無関係である）を有し、これらは、数日間で調製することができ、精製標的タンパク質が必要ない（２２１）。当該分野で周知の組換え法を使用して、オリゴボディを産生する（２２２）。
【０２２７】
当業者に周知の技術を使用して、抗体を産生する（例えば、参考文献２２３〜２２８）。一般に、モノクローナル抗体を、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）（２２９）の方法またはその修正形態を使用して調製する。典型的には、マウスまたはラットを上記のように免疫化する。ウサギも使用することができる。しかし、血清を抽出するために出血させるよりもむしろ、脾臓（および任意選択的にいくつかの大リンパ節）を取り出し、１つの細胞に引き離す。必要に応じて、脾細胞を、抗原をコーティングしたプレートまたはウェルへの細胞懸濁液の塗布によって（非特異的接着細胞の除去後に）スクリーニングすることができる。抗原に特的な膜結合免疫グロブリンを発現するＢ細胞がプレートに結合し、残りの懸濁液で洗い流されない。次いで、得られたＢ細胞または全ての分離した脾細胞を、骨髄腫細胞と融合するように誘導してハイブリドーマを形成し、選択培地（例えば、「ＨＡＴ」培地）中で培養する。得られたハイブリドーマを、限界希釈によってプレートし、免疫化抗原に特異的に結合する（且つ、無関係の抗原に結合しない）抗体の産生についてアッセイする。次いで、選択されたモノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、組織培養ボトルまたは中空糸反応器）またはｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、マウス腹水中）で培養する。
【０２２８】
本発明はまた、本発明の抗体を発現するハイブリドーマを提供する。このハイブリドーマを、種々の方法（例えば、モノクローナル抗体の供給源としてか、その後の組換え発現のための抗体遺伝子のクローニングのための本発明のモノクローナル抗体をコードする核酸（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）の供給源として）で使用することができる。
【０２２９】
抗体を、任意の適切な手段（例えば、組換え発現）によって産生することができる。組換え供給源からの発現は、Ｂ細胞またはハイブリドーマからの発現よりも薬学的目的（例えば、安定性、再現性、培養の容易さなど）のためにより一般的である。
【０２３０】
ＮＭＢ１８７０を認識する能力を保持する抗体フラグメントも本発明の範囲内に含まれる。インタクトな抗体分子の免疫学的結合特性を示すことができる抗原結合部位を含む多数の抗体フラグメントが当該分野で公知である。例えば、ペプシンを使用して抗体分子から抗原結合を担わない定常領域を切断し、それによってＦ（ａｂ’）２フラグメントを産生することによって、機能的抗体フラグメントを産生することができる。これらのフラグメントは、２つの抗原結合部位を含むが、各重鎖由来の定常領域の一部を欠く。同様に、必要に応じて、例えば、パパインを使用したモノクローナル抗体消化によって、１つの抗原結合部位を含むＦａｂフラグメントを産生することができる。重鎖および軽鎖の可変領域のみを含む機能的フラグメントを、免疫グロブリン分子の組換え産生または優先的タンパク質分解性切断などの標準的技術を使用して産生することもできる。これらのフラグメントは、Ｆｖとして公知である。例えば、（２３０）、（２３１）、および（２３２）を参照のこと。
【０２３１】
従来にない手段を使用して、本発明の抗体を生成および同定することもできる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを、本発明の抗体についてスクリーニングすることができる（２３３〜２３６）。
【０２３２】
本発明の抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ（すなわち、α、γ、またはμ重鎖））であり得るが、好ましくは、ＩｇＧである。ＩｇＧアイソタイプ内で、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブクラスであり得る。本発明の抗体は、κまたはλ軽鎖を有し得る。
【０２３３】
タンパク質発現
細菌発現技術は、当該分野で公知である。細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合し、コード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を阻害することができる任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端の近位に存在する転写開始領域を有する。この転写阻害領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌プロモーターはまた、ＲＮＡ合成が開始される隣接ＲＮＡポリメラーゼ結合部位を重複することができるオペレーターと呼ばれる第２のドメインを有し得る。遺伝子抑制タンパク質がオペレーターに結合し、それにより、特定の遺伝子の転写を阻害することができるので、オペレーターにより、（誘導性）転写を負に調節可能である。オペレーターなどの負の調節エレメントの非存在下で構成性発現が起こり得る。さらに、存在する場合、通常はＲＮＡポリメラーゼ結合配列の近位（５’）に存在する遺伝子活性化因子タンパク質結合配列によって正の調製を得ることができる。遺伝子活性化因子タンパク質の例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のｌａｃオペロンの転写開始を補助する異化産物活性化因子タンパク質（ＣＡＰ）である（Ｒａｉｂａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．７５：１７３）。したがって、調節された発現は正または負のいずれかであり、それにより、転写を増強または減少することができる。
【０２３４】
代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例には、糖代謝酵素（ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ  １９８：１０５６）、およびマルトースなど）由来のプロモーター配列が含まれる。さらなる例には、トリプトファン（ｔｒｐ）などの生合成酵素由来のプロモーター配列が含まれる（Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；ＥＰ−Ａ−００３６７７６号およびＥＰ−Ａ−０１２１７７５号）。β−ラクタマーゼ（ｂｌａ）プロモーター系（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）”Ｔｈｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｍｉｓｔａｋｅｓ．”  Ｉｎ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ
３（ｅｄ．Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ）］、バクテリオファージλＰＬ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ
ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１２８）、およびＴ５（米国特許第４，６８９，４０６号）プロモーター系も有用なプロモーター配列を提供する。目的の別のプロモーターは、誘導性アラビノースプロモーター（ｐＢＡＤ）である。
【０２３５】
さらに、天然に存在しない合成プロモーターも細菌プロモーターとし機能する。例えば、細菌プロモーターまたはバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列を、別の細菌プロモーターまたはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と連結し、合成ハイブリッドプロモーターを作製することができる（米国特許第４，５５１，４３３号）。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｌａｃリプレセッサーによって調節されるｔｒｐプロモーターおよびｌａｃオペロン配列の両方から構成されるハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである（Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｇｅｎｅ  ２５：１６７；ｄｅ
Ｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２１）。さらに、細菌プロモーターには、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合して転写を開始する能力を有する非細菌起源の天然に存在するプロモーターが含まれ得る。非細菌起源の天然に存在するプロモーターを、適合性ＲＮＡポリメラーゼとカップリングして、原核生物中のいくつかの遺伝子を高レベルで発現することもできる。バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、カップリングしたプロモーター系の例である（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；Ｔａｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ８２：１０７４）。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた、バクテリオファージプロモーターおよび大腸菌オペレーター領域から構成され得る（ＥＰＯ−Ａ−Ｏ  ２６７  ８５１）。
【０２３６】
機能的プロモーター配列に加えて、有効なリボゾーム結合部位は、原核生物中の外来遺伝子の発現にも有用である。大腸菌では、リボース結合部位を、シャイン−ダルガルノ（ＳＤ）配列と呼び、開始コドン（ＡＴＧ）および開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に存在する３〜９ヌクレオチド長の配列を含む（Ｓｈｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５４：３４）。ＳＤ配列は、ＳＤ配列と大腸菌１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’との間の塩基対合によってリボースへのｍＲＮＡの結合を促進すると考えられる（Ｓｔｅｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）”Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ．”  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ｅｄ．Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ））。弱いリボゾーム結合部位を有する真核細胞遺伝子および原核生物遺伝子を発現するために（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．”  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）。
【０２３７】
プロモーター配列を、ＤＮＡ分子と直接連結することができ、この場合、Ｎ末端の第１のアミノ酸は、常にＡＴＧ開始コドンによってコードされるメチオニンである。必要に応じて、Ｎ末端のメチオニンを、臭化シアンとのｉｎ  ｖｉｔｒｏインキュベーションまたは細菌メチオニンＮ末端ペプチドとのｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏインキュベーションによってタンパク質から切断することができる（ＥＰ−Ａ−０２１９２３７）。
【０２３８】
通常、細菌によって認識される転写終結配列は、翻訳終始コドンに対して３’に存在し、それにより、プロモーターと共にコード配列に隣接する調節領域である。これらの配列は、ｍＲＮＡの転写を指示し、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドに翻訳することができる。転写終結配列は、頻繁に、転写の終結を補助するステムループ構造を形成することができる約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を含む。例には、強力プロモーターを有する遺伝子（大腸菌中のｔｒｐ遺伝子および他の生合成遺伝子など）に由来する転写終結配列が含まれる。
【０２３９】
通常、プロモーター、シグナル配列（必要に応じて）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む上記成分を発現構築物に合わせる。発現構築物を、しばしば、細菌などの宿主中で安定に維持することができる染色体外エレメント（例えば、プラスミド）などのレプリコン中に維持する。レプリコンは複製系を有するので、発現またはクローニングおよび増幅のいずれかのために原核生物宿主中で維持することが可能である。さらに、レプリコンは、高コピー数または低コピー数のプラスミドのいずれかであり得る。高コピー数のプラスミドは、一般に、約５〜約２００、通常、約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有する。高コピー数のプラスミドを含む宿主は、好ましくは、少なくとも約１０個、より好ましくは少なくとも約２０個のプラスミドを含む。高コピー数または低コピー数のベクターのいずれかを、ベクターの効果および宿主上の外来タンパク質に依存して選択することができる。
【０２４０】
あるいは、発現構築物を、組み込みベクターを使用して、細菌ゲノムに組み込むことができる。組み込みベクターは、通常、ベクターを組み込むことが可能な細菌染色体に相同な少なくとも１つの配列を含む。組み込みは、ベクター中の相同ＤＮＡと細菌染色体との間の組換えに起因するようである。例えば、種々のバチルス株由来のＤＮＡを使用して構築した組み込みベクターは、バチルス染色体に組み込まれる（ＥＰ−Ａ−０１２７３２８）。組み込みベクターはまた、バクテリオファージまたはトランスポゾン配列から構成され得る。
【０２４１】
通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、形質転換された細菌株を選択可能な選択マーカーを含むことができる。選択マーカーを、細菌宿主中で発現することができ、細菌に薬物（アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）、およびテトラサイクリンなど）に対する耐性を付与する遺伝子が含まれる（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３２：４６９）。選択マーカーには、生合成遺伝子（ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシン生合成経路における生合成遺伝子など）も含まれ得る。
【０２４２】
あるいは、上記成分のいくつかを、形質転換ベクターに合わせることができる。上記のように、形質転換ベクターは、通常、レプリコン中に維持されるか、組み込みベクターに進化させる選択マーカーから構成される。
【０２４３】
発現ベクターおよび形質転換ベクター、染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれかは、多数の細菌への形質転換のために開発されている。例えば、とりわけ、以下の細菌のための発現ベクターが開発されている：枯草菌（Ｐａｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７４：５５８２；ＥＰ−Ａ−Ｏ  ０３６  ２５９およびＥＰ−Ａ−Ｏ  ０６３  ９５３；ＷＯ  ８４／０４５４１）、大腸菌（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１２８；Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｇｅｎｅ  ４０：１８３；Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；ＥＰ−Ａ−Ｏ  ０３６  ７７６，ＥＰ−Ａ−Ｏ  １３６  ８２９およびＥＰ−Ａ−Ｏ  １３６  ９０７、ストレプトコッカス・クレモリス（Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５）、  ストレプトコッカス・リビダンス（Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５）、ストレプトマイセス・リビダンス（米国特許第４，７４５，０５６号）。
【０２４４】
細菌宿主への異種ＤＮＡの移入方法は当該分野で周知であり、通常、ＣａＣｌ２または他の薬剤（２価の陽イオンおよびＤＭＳＯなど）で処置した細菌の形質転換を含む。ＤＮＡを、エレクトロポレーションによって細菌細胞に移入することもできる。形質転換手順は、通常、形質転換すべき細菌種によって変化する。例えば、（Ｍａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６０：２７３；Ｐａｌｖａ
ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−Ｏ  ０３６  ２５９  および  ＥＰ−Ａ−Ｏ  ０６３  ９５３；ＷＯ
８４／０４５４１，Ｂａｃｉｌｌｕｓ），（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８５６；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：９４９，Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ），（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９：２１１０；Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６１２１；Ｋｕｓｈｎｅｒ（１９７８）”Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ
ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ＣｏｌＥ１  −ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ｅｄｓ．Ｈ．Ｗ．Ｂｏｙｅｒ  ａｎｄ  Ｓ．Ｎｉｃｏｓｉａ）；Ｍａｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９７０）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．５３：１５９；Ｔａｋｅｔｏ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９４９：３１８；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ），（Ｃｈａｓｓｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４４：１７３  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）；（Ｆｉｅｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １７０：３８，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）；（Ａｕｇｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２０３，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ），（Ｂａｒａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：６９８；Ｈａｒｌａｎｄｅｒ（１９８７）”Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，ｉｎ：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ｅｄ．Ｊ．Ｆｅｒｒｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｒ．Ｃｕｒｔｉｓｓ  ＩＩＩ）；Ｐｅｒｒｙ  ｅｔ
ａｌ．（１９８１）Ｉｎｆｅｃｔ，Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５；Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ
ａｌ．（１９８８）Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５；Ｓｏｍｋｕｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．４ｔｈ  Ｅｖｒ．Ｃｏｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：４１２，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）を参照のこと。
【０２４５】
概要
用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「〜からなる」を含む（例えば、Ｘを「含む」組成物は、排他的にＸからなることができるか、何かを加えて含むことができる（例えば、Ｘ＋Ｙ））。
【０２４６】
数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０２４７】
用語「実質的に」は、「完全に」を排除しない（例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい）。必要に応じて、用語「実質的に」を、本発明の定義から省略することができる。
【０２４８】
「配列同一性」を、好ましくは、パラメーター（ギャップオープンペナルティ＝１２およびギャップ伸長ペナルティ＝１）を使用したアフィンギャップ検索を使用して、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）で実行されるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定する。
【０２４９】
血清型表記の後の髄膜炎菌類分類は、セロタイプ、セロサブタイプ、および免疫型を含み、標準的な命名法により、血清型、セロタイプ、セロサブタイプ、および免疫型をそれぞれコロンで分けて列挙する（例えば、Ｂ：４：Ｐ１．１５：Ｌ３，７，９）。血清型Ｂ内で、いくつかの系列によってしばしば疾患が発症され（高侵襲性）、いくつかの系列によって他の系列よりも重篤な疾患形態を引き起こし（高ビルレント）、その他の系列によって疾患が引き起こされることは稀である。７種の高ビルレント系列が認識されている（すなわち、亜群Ｉ、ＩＩＩ、およびＩＶ−１、ＥＴ−５複合体、ＥＴ−３７複合体、Ａ４クラスター、および系列３）。これらは、多座酵素電気泳動（ＭＬＥＥ）によって定義されているが、多座配列分類（ＭＬＳＴ）も使用して、髄膜炎菌類を分類している（参考文献１０）。４つの主な高ビルレントクラスターは、ＳＴ３２、ＳＴ４４、ＳＴ８、およびＳＴ１１複合体である。
【０２５０】
用語「アルキル」は、直鎖および分岐形態のアルキル基をいう。アルキル基は、−Ｏ−、−ＮＨ−、または−Ｓ−から選択される１つ、２つ、または３つのヘテロ原子が割り込んでいても良い。アルキル基はまた、１つ、２つ、または３つの二重結合および／または三重結合が割り込んでいても良い。しかし、用語「アルキル」は、通常、ヘテロ原子が割り込まれていないか、二重結合や三重結合が割り込まれていないアルキル基をいう。Ｃ１〜１２アルキルを参照例とした場合、これは、アルキル基が１と１２との間の任意の炭素原子数（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２）を含むことができることを意味する。同様にＣ１〜６アルキルを参照例とした場合、これは、アルキル基が１と６との間の任意の炭素原子数（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６）を含むことができることを意味する。
【０２５１】
用語「シクロアルキル」には、シクロアルキル基、ポリシクロアルキル基、およびシクロアルケニル基、ならびにこれらとアルキル基との組み合わせ（シクロアルキルアルキル基など）が含まれる。シクロアルキル基は、−Ｏ−、−ＮＨ−、または−Ｓ−から選択される１つ、２つ、または３つのヘテロ原子が割り込んでいても良い。しかし、用語「シクロアルキル」は、通常、ヘテロ原子の割り込みのないシクロアルキル基をいう。シクロアルキル基の例には、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘキシルメチル、およびアダマンチル基が含まれる。Ｃ３〜１２シクロアルキルを参照例とした場合、これは、シクロアルキル基が３と１２との間の任意の炭素原子数（例えば、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２）を含むことができることを意味する。
【０２５２】
用語「アリール」は、芳香族基（フェニルまたはナフチルなど）をいう。Ｃ５〜１２アリールを参照例とした場合、これは、アリール基が５と１２との間の任意の炭素原子数（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２）を含むことができることを意味する。
【０２５３】
用語「Ｃ５〜１２アリール−Ｃ１〜６アルキル」は、ベンジル、フェニルエチル、およびナフチルメチルなどの基をいう。
【０２５４】
窒素保護基には、シリル基（ＴＭＳ、ＴＥＳ、ＴＢＳ、ＴＩＰＳなど）、アシル誘導体（フタリミド、トリフルオロアセトアミド、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（ＺまたはＣｂｚ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル（Ｔｒｏｃ））、スルホニル誘導体（β−トリメチルシリルエタンスルホニル（ＳＥＳ）、スルフェニル誘導体、Ｃ１〜１２アルキル、ベンジル、ベンズヒドリル、トリチル、９−フェニルフルオレニルなど）が含まれる。好ましい窒素保護基は、Ｆｍｏｃである。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
異なるＮＭＢ１８７０ファミリー由来のＮＭＢ１８７０の一部を含むキメラＮＭＢ１８７０タンパク質。
（項目２）
（ａ）第１のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメイン「Ｂ」配列、（ｂ）第２のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメイン「Ｃ」配列を含み、ここで、前記第１のファミリーおよび第２のファミリーが互いに異なり、ＮＭＢ１８７０のファミリーＩ、ファミリーＩＩ、またはファミリーＩＩＩから選択され、ここで、（ｉ）キメラポリペプチドが前記第１のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメイン「Ｃ」配列を含まず、そして／または（ｉｉ）キメラポリペプチドが前記第２のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメイン「Ｂ」配列を含まず、ここで、（１）ドメイン「Ｂ」が、対合アラインメントアルゴリズムを使用して配列番号１とアラインメントした場合に配列番号１のＧｌｎ−１２０とアラインメントしたアミノ酸から開始され、配列番号１のＧｌｙ−１８３とアラインメントしたアミノ酸で終了する前記ＮＭＢ１８７０のフラグメントであり、（２）ドメイン「Ｃ」が、対合アラインメントアルゴリズムを使用して配列番号１とアラインメントした場合に配列番号１のＬｙｓ−１８４とアラインメントしたアミノ酸から開始され、配列番号１のＧｌｎ−２７４とアラインメントしたアミノ酸で終了する前記ＮＭＢ１８７０のフラグメントである、項目１に記載のキメラポリペプチド。
（項目３）
（ａ）第１のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメイン「Ｂ」配列および（ｂ）第２のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメイン「Ｃ」配列を含み、ここで、前記第１のファミリーおよび第２のファミリーが互いに異なり、ＮＭＢ１８７０のファミリーＩ、ファミリーＩＩ、またはファミリーＩＩＩから選択され、ここで、キメラポリペプチドが４９５アミノ酸長未満である、項目１に記載のキメラポリペプチド。
（項目４）
アミノ酸配列−Ｘ１−Ｂ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ３−（式中、−Ｘ１−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｘ２−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｘ３−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｂ−は第１のファミリー中のＮＭＢ１８７０配列由来のドメインＢアミノ酸配列であり、−Ｃ−は第２のファミリー中のＮＭＢ１８７０配列由来のドメインＣアミノ酸配列であり、ここで、前記第１のファミリーおよび第２のファミリーが互いに異なり、ＮＭＢ１８７０のファミリーＩ、ファミリーＩＩ、またはファミリーＩＩＩから選択される）を含む、項目１に記載のキメラポリペプチド。
（項目５）
（ａ）第１のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメイン「Ｂ」配列およびドメイン「Ｃ」配列ならびに（ｂ）第２のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメイン「Ｂ」配列およびドメイン「Ｃ」配列を含み、ここで、前記第１のファミリーおよび第２のファミリーが互いに異なり、ＮＭＢ１８７０のファミリーＩ、ファミリーＩＩ、またはファミリーＩＩＩから選択され、ここで、キメラポリペプチドが、（ｉ）第１のファミリー由来のドメイン「Ａ」配列を含まず、そして／または（ｉｉ）第２のファミリー由来のドメイン「Ａ」配列を含まない、項目１に記載のキメラポリペプチド。
（項目６）
アミノ酸配列−Ｘ１−Ｂｊ−Ｘ２−Ｃｊ−Ｘ３−Ｂｋ−Ｘ４−Ｃｋ−Ｘ５−（式中、−Ｘ１−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｘ２−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｘ３−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｘ４−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｘ５−は選択可能なアミノ酸配列であり、−Ｂｊ−は第１のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメイン「Ｂ」アミノ酸配列であり、−Ｃｊ−は第１のファミリー由来のドメイン「Ｃ」アミノ酸配列であり、−Ｂｋ−は第２のＮＭＢ１８７０ファミリー由来のドメイン「Ｂ」アミノ酸配列であり、−Ｃｋ−は第２のファミリー由来のドメイン「Ｃ」アミノ酸配列であり、前記第１のファミリーおよび第２のファミリーが互いに異なり、ＮＭＢ１８７０のファミリーＩ、ファミリーＩＩ、またはファミリーＩＩＩから選択される）を含む、項目１に記載のキメラポリペプチド。
（項目７）
（ａ）第１のＮＭＢ１８７０アミノ酸配列と第２のＮＭＢ１８７０アミノ酸配列とをアラインメントしてアラインメント配列対を得る工程と、（ｂ）前記第１のアミノ酸配列のアミノ酸ａ１から開始して前記第１のアミノ酸配列のアミノ酸ｂ１で終了する第１のアミノ酸配列の一部を選択する工程と、（ｃ）前記第２のアミノ酸配列のアミノ酸ａ２から開始して前記第２のアミノ酸配列のアミノ酸ｂ２で終了する第２のアミノ酸配列の一部を選択する工程であって、ここで、残基ａ１およびａ２ならびに残基ｂ１およびｂ２がアラインメント配列対にアラインメントされる、工程と、（ｄ）前記第１のアミノ酸配列の一部を前記第２のアミノ酸配列の一部に置換し、それにより、キメラＮＭＢ１８７０アミノ酸配列を提供する工程とを含む、キメラＮＭＢ１８７０アミノ酸配列の産生プロセス。
（項目８）
前記第１の配列および第２の配列が異なり、且つ異なるＮＭＢ１８７０ファミリーに由来する、項目７に記載のプロセス。
（項目９）
前記第１の配列が、ファミリーＩ  ＮＭＢ１８７０配列である、項目８に記載のプロセス。
（項目１０）
前記選択された部分が、少なくとも３アミノ酸長である、項目７〜項目９のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目１１）
前記部分が表面ループ配列である、項目７〜項目１０のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目１２）
項目７〜項目１１のいずれか１項に記載のプロセスによって得ることができるキメラＮＭＢ１８７０アミノ酸配列を含む、項目１に記載のキメラポリペプチド。
（項目１３）
アミノ酸配列Ｆ１−Ｘ１−Ｆ２（式中、Ｆ１は第１のＮＭＢ１８７０アミノ酸配列のＮ末端フラグメントであり、Ｆ２は第２のＮＭＢ１８７０アミノ酸配列のＣ末端フラグメントであり、−Ｘ１−は選択可能なアミノ酸配列であり、前記第１および第２のＮＭＢ１８７０アミノ酸配列が異なるＮＭＢ１８７０ファミリーに由来し、フラグメントＦ１およびＦ２は共に少なくとも１０アミノ酸長であり、フラグメントＦ１およびＦ２は組み合わせて少なくとも２００アミノ酸長を有する）を含む、項目１に記載のキメラポリペプチド。
（項目１４）
アミノ酸配列（Ｆｍ−Ｘｍ）ｎ（式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、各ＦｍはｍｔｈＮＭＢ１８７０アミノ酸配列のフラグメントであり、各−Ｘｍ−は選択可能なアミノ酸配列であり、各フラグメントＦｍは少なくとも７アミノ酸長であり、Ｆｍの場合のｎは３つのＮＭＢ１８７０ファミリーＩ、ＩＩ、およびＩＩＩのうちの少なくとも２つ由来のフラグメントを含む）を含む、項目１に記載のキメラポリペプチド。
（項目１５）
前記ｎが３であり、アミノ酸配列Ｆ１−Ｘ１−Ｆ２−Ｘ２−Ｆ３−Ｘ３を含む、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目１６）
前記ｎが５であり、アミノ酸配列Ｆ１−Ｘ１−Ｆ２−Ｘ２−Ｆ３−Ｘ３−Ｆ４−Ｘ４−Ｆ５−Ｘ５を含む、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目１７）
（ｉ）ファミリーＩ  ＮＭＢ１８７０配列の２４０アミノ酸以下のフラグメントであって、ここで、前記フラグメントが前記ファミリーＩ  ＮＭＢ１８７０配列のエピトープを含む、フラグメント、（ｉｉ）ファミリーＩＩ  ＮＭＢ１８７０配列の２４０アミノ酸以下のフラグメントであって、ここで、前記フラグメントが前記ファミリーＩＩ  ＮＭＢ１８７０配列のエピトープを含む、フラグメント、（ｉｉｉ）ファミリーＩＩＩ  ＮＭＢ１８７０配列の２４０アミノ酸以下のフラグメントであって、ここで、前記フラグメントが前記ファミリーＩＩＩ  ＮＭＢ１８７０配列のエピトープを含む、フラグメント、のうちの少なくとも２つを含む、項目１に記載のキメラポリペプチド。
（項目１８）
第１のＮＭＢ１８７０ファミリーの修飾アミノ酸配列を含み、ここで、前記修飾配列が、第１のファミリー由来の表面ループ配列の代わりに少なくとも１つの第２のＮＭＢ１８７０ファミリー由来の表面ループ配列を含む、項目１に記載のキメラポリペプチド。
（項目１９）
アミノ酸配列：
【化１】
2011168611.tif 000017
（式中、
（ａ）Ｂ１は配列番号１のアミノ酸１〜１３３であり、Ｂ２は配列番号１のアミノ酸１４２〜１６１であり、Ｂ３は配列番号１のアミノ酸１６９〜１８０であり、Ｂ４は配列番号１のアミノ酸１８３〜１９６であり、Ｂ５は配列番号１のアミノ酸１９８〜２１８であり、Ｂ６は配列番号１のアミノ酸２２４〜２３３であり、Ｂ７は配列番号１のアミノ酸２３７〜２６０であり、Ｂ８は配列番号１のアミノ酸２６８〜２７４であり、
（ｂ）Ｌ１は配列番号２のアミノ酸１３４〜１４１または配列番号３のアミノ酸１４２〜１４９のいずれかであり、Ｌ２は配列番号２のアミノ酸１６２〜１６７または配列番号３のアミノ酸１７０〜１７５のいずれかであり、Ｌ３は配列番号２のアミノ酸１８０〜１８１または配列番号３のアミノ酸１８８〜１８９のいずれかであり、Ｌ４は配列番号２のアミノ酸１９６または配列番号３のアミノ酸２０４のいずれかであり、Ｌ５は配列番号２のアミノ酸２１８〜２２２または配列番号３のアミノ酸２２６〜２３０のいずれかであり、Ｌ６は配列番号２のアミノ酸２３３〜２３５または配列番号３のアミノ酸２４１〜２４３のいずれかであり、Ｌ７は配列番号２のアミノ酸２６０〜２６６または配列番号３のアミノ酸２６８〜２７４のいずれかである）を含む、項目１に記載のキメラポリペプチド。
（項目２０）
配列番号１に対する配列全体の同一性が少なくとも８０％であり、ここで、前記配列番号１に対するアミノ酸配列の配列同一性が、配列番号１の骨格領域で８０％を超え、前記配列番号１に対するアミノ酸配列の配列同一性が配列番号１のループ領域で８０％未満であるアミノ酸配列を含む、項目１に記載のキメラポリペプチド。
（項目２１）
配列番号２に対する配列全体の同一性が少なくとも８０％であり、ここで、前記配列番号２に対するアミノ酸配列の配列同一性が、配列番号２の骨格領域で８０％を超え、前記配列番号２に対するアミノ酸配列の配列同一性が配列番号２のループ領域で８０％未満であるアミノ酸配列を含む、項目１に記載のキメラポリペプチド。
（項目２２）
配列番号３に対する配列全体の同一性が少なくとも８０％であり、ここで、前記配列番号３に対するアミノ酸配列の配列同一性が、配列番号３の骨格領域で８０％を超え、前記配列番号３に対するアミノ酸配列の配列同一性が配列番号３のループ領域で８０％未満であるアミノ酸配列を含む、項目１に記載のキメラポリペプチド。
（項目２３）
（ａ）前記フラグメントがアミノ酸Ａｒｇ−２２３を含み、（ｂ）前記ポリペプチドが、（ｉ）完全なファミリーＩ  ＮＭＢ１８７０アミノ酸配列も（ｉｉ）完全なファミリーＩ？Ｇ−ＮＭＢ１８７０アミノ酸配列も含まない、ファミリーＩ  ＮＭＢ１８７０配列のフラグメントを含むポリペプチド。
（項目２４）
アミノ酸配列−Ｚ１−Ａｒｇ−Ｚ２−（式中、（ａ）−Ｚ１−は少なくとも１００アミノ酸からなるアミノ酸配列であり、（ｂ）−Ｚ２−は少なくとも３０アミノ酸からなるアミノ酸配列であり、（ｃ）−Ｚ１−は配列番号１のアミノ酸Ａｒｇ−２２３のすぐ上流に存在する１００アミノ酸との配列同一性が少なくとも７５％であり、（ｄ）−Ｚ２−は配列番号１のアミノ酸Ａｒｇ−２２３のすぐ下流に存在する３０アミノ酸との配列同一性が少なくとも７５％である）を含むポリペプチド。
（項目２５）
配列番号４、５、６、７、２３、２４、４３、４４、５２、５３、６１、６２、６３、６４、および６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（項目２６）
前記項目のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
（項目２７）
前記項目のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む免疫原性組成物。
（項目２８）
アルミニウム塩アジュバントをさらに含む、項目２７に記載の組成物。
（項目２９）
髄膜炎菌類ＰｏｒＡタンパク質をさらに含む、項目２７または項目２８に記載の組成物。
（項目３０）
髄膜炎菌由来の外膜小胞調製物をさらに含む、項目２７または項目２８に記載の組成物。
（項目３１）
薬物として使用するための、前記項目のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
（項目３２）
項目２７〜項目３０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物における抗体応答を惹起する方法。
【０２５５】
一般に、本発明は、特に参考文献３、５、６、および７に開示されている種々のＮＭＢ１８７０配列を含まないが、これらのＮＭＢ１８７０配列を、例えば、キメラ配列の構築などのために、本発明にしたがって使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０２５６】
【図１】図１〜６は、ＮＭＢ１８７０の三次元モデルを示す。
【図２】図１〜６は、ＮＭＢ１８７０の三次元モデルを示す。
【図３】図１〜６は、ＮＭＢ１８７０の三次元モデルを示す。
【図４】図１〜６は、ＮＭＢ１８７０の三次元モデルを示す。
【図５】図１〜６は、ＮＭＢ１８７０の三次元モデルを示す。
【図６】図１〜６は、ＮＭＢ１８７０の三次元モデルを示す。
【図７】図７は、ＮＭＢ１８７０についての表面ループ導入を示す。
【図８】図８は、ファミリーＩ  ＮＭＢ１８７０タンパク質の１２量体ＰｅｐＳｃａｎエピトープマッピングを示す。上から下の３つのパネルは、ＮＭＢ１８７０ファミリーＩ、ＩＩ、およびＩＩＩに対して生成された抗血清を使用した結果である。結果を、任意の色素単位である。
【図９】図９は、ポリクローナル血清を使用して染色した、ＮＭＢ１８７０フラグメントのウェスタンブロットを示す。
【図１０】図１０は、異なるＮＭＢ１８７０フラグメントに対して惹起された抗血清を使用したＦＡＣＳ分析を示す。
【図１１】図１１は、モノクローナル抗体ｍＡｂ５０２（左のブロット）またはポリクローナル抗ＮＭＢ１８７０血清（右のブロット）のいずれかで染色したＮＭＢ１８７０ファミリーＩ、ＩＩ、またはＩＩＩの染色物のウェスタンブロットを示す。
【図１２】図１２は、ｍＡｂ５０２を使用して染色した、ＮＭＢ１８７０フラグメントのウェスタンブロットを示す。
【図１３】図１３は、ｍＡｂ５０２を使用して染色した、ＮＭＢ１８７０フラグメントのドットブロットを示す。ドメインＡ〜Ｃを、個別に試験した。ＡドメインのＢ−Ｃフラグメントも試験し、ドメインＢとＣとの混合物も試験した。
【図１４】図１４は、細菌のＦＡＣＳ分析を示す。３つの列を異なる抗体で染色した：上＝ｍＡｂ５０２、中央＝ポリクローナル血清、下＝莢膜糖に対するモノクローナル抗体（正のコントロール、ＳＥＡＭ３）。図１４中の３つの列は、全て以下のファミリーＩ株である：ＭＣ５８、Ｍ２９３４、およびＢＺ８３。
【図１５】図１５は、細菌のＦＡＣＳ分析を示す。図１５中の３つの列は、以下のファミリーＩ  ＮＭＢ１８７０を発現しない：ＭＣ５８株の？ＮＭＢ１８７０同質遺伝子ノックアウト、ファミリーＩＩ  ９６１−５９４５株、ファミリーＩＩＩ  Ｍ１２３９株。
【図１６】図１６は、残基１２０〜２７４のＮＭＢ１８７０ＭＣ５８配列（配列番号１）の親水性および二次構造の分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【０２５７】
発明実施の形態
エピトープマッピング
ＮＭＢ１８７０ＭＣ５８の１２量体および１０量体フラグメントを、「ＰｅｐＳｃａｎ」エピトープマッピングのために使用した。フラグメントを、セルロース膜に固定し、以下の３つの各ＮＭＢ１８７０ファミリー由来の１つの株に対して惹起した抗血清と反応させた：（Ｉ）ＭＣ５８、（ＩＩ）２９９６、（ＩＩＩ）Ｍ１２３９。１２量体の分析結果を、図８に示す。
【０２５８】
ＮＭＢ１８７０のおよそ最初の１１０アミノ酸を含む領域は、３つのファミリーに共通の直鎖エピトープを含む。残基１２０〜１８３は、ファミリー特異的エピトープを含む。さらに下流には正のペプチドは認められないことから、これらの配列がタンパク質の三次構造に包埋しているので血清中にいかなる抗体を惹起できないか、エピトープがここで不連続であり、「ＰｅｐＳｃａｎ」分析で認められないことが示唆される。以下のアラインメントは、各抗血清と反応したＮＭＢ１８７０ＭＣ５８配列（配列番号１）の領域を示す。
【０２５９】
【化１７】
2011168611.tif 000018
したがって、３つの全ファミリーの共通のエピトープは、ＤＫＧＬＱＳＬＴＬＤＱＳＶＲ（配列番号２１）およびＦＤＦＩＲＱＩＥＶＤＧＱＬＩ（配列番号２２）である。
【０２６０】
エピトープマッピングの結果に基づいて、ＮＭＢ１８７０配列を、以下の３つの概念的ドメインに分割した：。
（Ａ）抗ＭＣ５８、アミノ酸１〜１１９（配列番号４）
【０２６１】
【化１８】
2011168611.tif 000019
（Ｂ）アミノ酸１２０〜１８４（配列番号５）
【０２６２】
【化１９】
2011168611.tif 000020
（Ｃ）アミノ酸１８５〜２７４（配列番号６）
【０２６３】
【化２０】
2011168611.tif 000021
これらのドメインを、個別に、ドメインＡ、Ｂ、またはＣ（配列番号４〜６）を含むタンパク質として示し、組合わせを、Ａ−Ｂ（配列番号２３）またはＢ−Ｃ（配列番号２４）を含むタンパク質として示す。
【０２６４】
以下のオリゴヌクレオチドプライマーを、これらのタンパク質の構築で使用し、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位を移入した。
【０２６５】
【化２１】
2011168611.tif 000022
標識としてポリクローナル抗ＮＭＢ１８７０ＭＣ５８を使用したドメインＡ（ＶＡＡ．．．から始まるように短縮）、Ｂ、およびＣのウェスタンブロットを、図９に示す。融合物ＡＢおよびＢＣも含む。ブロットの最終レーンは、全長タンパク質を含む。
【０２６６】
各ドメインＡ、Ｂ、およびＣに対する抗血清は、ＦＡＣＳ分析において全細胞に結合することができた（図１０）。ドメインＡおよびＣで蛍光シフトが最も強く、これらがより免疫学的に利用しやすいことが示唆される。抗血清は、？ＮＭＢ１８７０ノックアウト株を認識できなかった。
【０２６７】
アジュバントとしてＣＦＡまたは水酸化アルミニウム（ＡＨ）を使用したタンパク質（およびコントロールタンパク質）に対してマウス中で血清を惹起し、３つの異なる髄膜炎菌類株に対するＳＢＡの結果を以下に示した。
【０２６８】
【化２２】
2011168611.tif 000023
したがって、配列番号１（ＭＣ５８）内で、最も重要な細菌エピトープには、ドメインＢとＣの両方（ドメインＢＣ）の存在が必要である。これにより、タンパク質がこれら２つのドメインの両方由来の配列から作製された不連続なエピトープをふくむことができることが示唆される（参考文献２３７を参照のこと）。
【０２６９】
さらに、髄膜炎菌類感染に対してラットを受動的に防御することができるモノクローナル抗体（Ｊａｒ１、Ｊａｒ３、およびＪａｒ４）は、ＢＣドメインを認識するが、単独のドメインＢまたはＣを認識しない。同様に、Ｊａｒ５は、ＡＢドメインを認識するが、単独のドメインＡまたはＢを認識しない。
【０２７０】
本研究のさらなる詳細を、参考文献２３８に見出すことができる。
キメラタンパク質−ＢＭ１２３９−ＣＭＣ５８
ＢＣドメインによって誘導された高細菌活性を調査するために、ハイブリッドＢＣドメインを、ファミリーＩＩＩドメインＢ（Ｍ１２３９株）およびファミリーＩドメインＣ（ＭＣ５８株）から構築した。ファミリーＩおよびＩＩＩのＢドメインの同一性は、４３．８％である。
【０２７１】
配列番号１は、血清型ＢのＭＣ５８株由来の全長ファミリーＩ  ＮＭＢ１８７０配列である。この配列を、以下の３つに分割した：（Ａ）ａａ１〜１１９、（Ｂ）ａａ１２０〜１８３、（Ｃ）ａａ１８４〜２７４。
【０２７２】
配列番号３は、血清型ＢのＭ１２３９株由来の全長ファミリーＩＩＩ  ＮＭＢ１８７０配列である。この配列を、以下の３つに分割した：（Ａ）ａａ１〜１２７、（Ｂ）ａａ１２８〜１９０、（Ｃ）ａａ１９１〜２８６。
【０２７３】
Ｍ１２３９のＢドメインおよびＭＣ５８のＣドメインをコードするＤＮＡフラグメントを、特異的株由来のテンプレート染色体ＤＮＡおよび以下のプライマーを使用したＰＣＲによって増幅した。
【０２７４】
【化２３】
2011168611.tif 000024
増幅フラグメントを、ＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩフラグメントとしてｐＥＴ２１ｂ＋中で連続的にクローン化した。最後のＢＭ１２３９ＣＭＣ５８配列は配列番号４３であり、ドメインＣＭＣ５８の開始時のＫＬ配列は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位によって得られた。
【０２７５】
タンパク質は、Ｃ末端Ｈｉｓ−タグ融合タンパク質として発現し、精製し、アジュバントとしてＡＨまたはＦＣＡのいずれかを使用してマウスを免疫化するためにこれを使用した。血清を、３つのＮＭＢ１８７０ファミリーを代表する株に対する細菌活性について分析した。力価を以下に示した。
【０２７６】
【化２４】
2011168611.tif 000025
Ｂ（１２３９）−Ｃ（ＭＣ５８）キメラによって誘導された力価は、Ｂ（ＭＣ５５８）−Ｃ（ＭＣ５８）コントロールによって誘導された力価よりＭＣ５８に対して低く、Ｍ１２３９株に対して陰性であった。これらの結果は、Ｂ−Ｃキメラでは、Ｂドメインの配列は細菌抗体の誘導に重要であり、ドメインＢおよびＣは理想的には分離されるべきではないことを示す。
【０２７７】
ファミリーＩタンパク質のみに存在するエピトープを認識するモノクローナルＩｇＧ２ａ抗体（ｍＡｂ５０２）（図１１）は、ウェスタンブロットでいかなる各ドメインＡ、Ｂ、およびＣも認識しなかたが（図１２）、ドメインＢ−Ｃフラグメントを認識した。これらの結果は、各ドメインＡ、Ｂ、およびＣまたはドメインＢ−Ｃフラグメントのドットブロットでも認められた（図１３）。しかし、さらに、抗体は、個別のドメインＢとＣとの混合物を認識し、抗体によって認識されたエピトープをｉｎ  ｖｉｔｒｏで再構築することができ、両ドメインのアミノ酸残基によって形成されていることが示唆された。モノクローナル抗体は、いかなるＰｅｐＳｃａｎフラグメントも認識しなかった。
【０２７８】
ドメインＢとＣとの並列によって高次構造のエピトープを形成することができる。
キメラタンパク質−ＢＣ２９９６−ＢＣＭ１２３９
配列番号２は、血清型Ｂの２９９６株由来の全長ファミリーＩＩ  ＮＭＢ１８７０配列である。この配列を、以下の３つのドメインに分割した：（Ａ）ａａ１〜１１９、（Ｂ）ａａ１２０〜１８２、（Ｃ）ａａ１８３〜２７３。
【０２７９】
グリシンリッチリンカー（配列番号１７、ＢａｍＨＩ制限部位由来のＧＳ、ポリグリシンリンカーとしては配列番号１８）を介して、２９９６株由来のドメインＢおよびＣをＭ１２３９株由来のドメインＢおよびＣと連結して、ＢＣＩＩＢＣＩＩＩキメラを作製した。ドメインをコードするＤＮＡを、特定の株由来のテンプレート染色体ＤＮＡおよび以下のプライマーを使用したＰＣＲによって増幅した。
【０２８０】
【化２５】
2011168611.tif 000026
ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩおよいｂＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩフラグメントとして、ｐＥＴ２１ｂ＋中で配列を連続的クローン化した。タンパク質は、Ｃ末端Ｈｉｓ−タグ融合タンパク質として発現し、これを精製し、マウスの免疫化のために使用した。
【０２８１】
簡単に述べれば、１０匹のメスＣＤ１マウス群を、アルミニウムまたはフロイントアジュバントを使用して、２０μｇのタンパク質で腹腔内に免疫化した。タンパク質を、単独または参考文献２３９の３３頁に開示の「３つのタンパク質」の組み合わせと組み合わせて投与した。３つの免疫化物（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）を投与し、第３の免疫化物の投与から２週間後に血清を採取し、３つのＮＭＢ１８７０ファミリーを代表する株に対する殺菌活性について分析した。各ＮＭＢ１８７０ファミリーについての３つの例示的株に対する力価を以下に示した。
【０２８２】
【化２６】
2011168611.tif 000027
したがって、ファミリーＩＩおよびＩＩＩ由来の融合ＢＣドメインによって良好な抗ＩＩ活性および抗ＩＩＩ活性が得られるが、予想通り、有意な抗Ｉ活性は得られなかった。融合ＢＣドメインは、全長（？Ｇ）ＮＭＢ１８７０配列の融合物よりもＳＢＡ力価が低い。
キメラタンパク質−ＢＣＭＣ５８−ＢＣＭ１２３９−ＢＣ２９９６
類似のアプローチを使用して、３つの全ＮＭＢ１８７０ファミリーのためのＢＣドメインのキメラを構築した。ドメインの増幅のために以下のプライマーを使用した。
【０２８３】
【化２７】
2011168611.tif 000028
最終配列は配列番号５２を有し、配列番号１７（ＢａｍＨＩ制限部位、その後のポリＧｌｙリンカー）によってファミリーＩ配列がファミリーＩＩＩ配列に連結しており、配列番号４５（ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、その後のポリＧｌｙリンカー）によってファミリーＩＩＩ配列がファミリーＩＩ配列に連結している。
【０２８４】
Ｉ−ＩＩＩ−ＩＩよりもむしろＩ−ＩＩ−ＩＩＩの順序のＢＣドメインを含むさらなるキメラを産生した。このキメラを、ファミリーＩＩＩ株に融合したファミリーＩＩ株のＢＣドメインのキメラおよびＳＥＡＭ−３の正のコントロールと共に細菌アッセイで試験した。結果を以下に示した。
【０２８５】
【化２８】
2011168611.tif 000029
したがって、１つ（ＮＧＨ３８）を除く全ての場合、三重キメラによって二重キメラよりも良好な結果が得られた。この所見は、ファミリーＩ株では驚くべき物ではなく、二重キメラがこのファミリーのＮＭＢ１８７０配列を含まないからであった。しかし、ファミリーＩＩおよびＩＩＩについてさえも、結果は改善された。同様に、三重キメラにおける力価が１２８以上のファミリーＩＩ株の数は９／１３であるのに対して、二重キメラについてはたった６／１３であった。
【０２８６】
モノクローナル抗体５０２
殺菌活性を有する抗ＮＭＢ１８７０モノクローナル抗体を選択するために、ＣＤ１マウスを、ファミリーＩ  ＮＭＢ１８７０ＭＣ５８で免疫した。各マウス由来のポリクローナル血清を、ＥＬＩＳＡによって精製タンパク質および全ＭＣ５８細胞に対する抗体結合について評価し、ＭＣ５８に対する殺菌活性を媒介する補体について評価した。これらの結果に基づいて、高応答マウスの脾臓を、骨髄種細胞との融合について選択した。抗体を産生するいくつかのハイブリドーマ細胞株を単離し、精製タンパク質またはＭＣ５８全細菌細胞に対する陽性ＥＬＩＳＡによって選択した。ＭＡｂ５０２（ＭＣ５８株に対して殺菌性を示すＩｇＧ２ａアイソタイプモノクローナル抗体）を、さらなる研究のために選択した。ＥＬＩＳＡによって、抗体は精製タンパク質を認識し、ＭＣ５８株に対するＦＡＣＳ分析において陽性であった。
【０２８７】
３つの各変異形由来のＮＭＢ１８７０に対するウェスタンブロット分析により、ｍＡｂ５０２がファミリーＩ配列のみで存在するエピトープを認識することが確認された。対照的に、ポリクローナル血清は全ての変異形を認識した。モノクローナルｍＡｂ５０２を、多数のファミリーＩ株に対するＦＡＣＳ分析で使用した。いずれの場合も、抗体は細胞表面抗原を認識した（図１４、上の行）。抗ＮＭＢ１８７０ポリクローナル（中央の行）または抗莢膜モノクローナル（下の行）を使用した場合、蛍光シフトはあまり大きくなかったが、結合は特異的であった。対照的に、ｍＡｂ５０２は、？ＮＭＢ１８７０ノックアウト株を認識せず（図１５、左の列）、ファミリーＩＩ株またはファミリーＩＩＩ株を認識しなかった（中央および右の列）。抗莢膜の正のコントロールは、認識されなかった全ての株を認識した（図１５、下の行）。
キメラタンパク質−ＮＭＢ１８７０ＭＣ５８−ＮＭＢ１８７０Ｍ１２３９−ＮＭＢ１８７０２９９６
３つの全ＮＭＢ１８７０ファミリーを含む１つのポリペプチドを提供するための別のアプローチとして、全長タンパク質（わずかなＮ末端短縮を除く、天然のポリＧｌｙ配列（すなわち、？Ｇタンパク質）まで含む）を融合して、三重キメラ配列（配列番号５３）を作製した。配列番号１９（ＢａｍＨＩ制限部位、その後の淋菌類リンカー）によってファミリーＩ配列をファミリーＩＩＩ配列と連結し、配列番号５４（ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、その後の淋菌類リンカー）によってファミリーＩＩＩ配列をファミリーＩＩ配列と連結した。タンパク質を、以下のプライマーを使用した増幅後にＣ末端Ｈｉｓ−タグ融合物として発現された。
【０２８８】
【化２９】
2011168611.tif 000030
３０℃での成長後に、タンパク質を可溶性産物として精製することができる。
【０２８９】
精製三重キメラ（３−Ｃ）タンパク質をマウスに投与し、得られた血清を、水酸化アルミニウム（ＡＨ）またはフロイント完全アジュバントのいずれかを使用した殺菌アッセイで試験した。相同ＮＭＢ１８７０タンパク質に対して惹起した血清（ＡＨで免疫賦活した）も試験した。
【０２９０】
【化３０】
2011168611.tif 000031
したがって、ほとんど全ての場合、三重キメラタンパク質により、各相同タンパク質よりも良好な殺菌性血清が得られた。したがって、三重キメラタンパク質以下の２つの利点を付与する：（１）１つのタンパク質中で全てのＮＭＢ１８７０ファミリーを対象とすること、および（２）１つの相同ＮＭＢ１８７０タンパク質と比較して殺菌応答が増強されること。
【０２９１】
ドメインの免疫原性の比較
ＭＣ５８？Ｇ−ＮＭＢ１８７０配列（ファミリーＩ）のＡ、Ｂ、Ｃドメインを、単一およびＡＢおよびＢＣ融合物として調製し、これらは全てＣ末端Ｈｉｓ−タグを有する。これらを使用して、マウスを免疫化し、各ＮＭＢ１８７０ファミリー由来の株に対する殺菌活性を試験した。比較のために、３つのファミリーの？Ｇ−ＮＭＢ１８７０配列に応答して惹起された血清も試験した。タンパク質を、水酸化アルミニウムまたはＦＣＡで免疫賦活した。結果を以下に示した。
【０２９２】
【化３１】
2011168611.tif 000032
したがって、各ドメインは、特に有効な免疫原ではなく、ＡＢドメインも特に有効ではないが、ＢＣドメインは良好な活性を示す。
ＢＣドメインの三次元モデル
ＢＣドメインの超二次構造を、ＨＭＭＳＴＲ／ＲｏｓｅｔｔａサーバにＭＣ５８配列を提出することによって予想した（２４０）。出力を、図１に示す。
【０２９３】
三次元構造をＶＡＳＴ検索（２４１）に供して、得られたタンパク質構造との類似性を見出し、ループを精密化した。ＶＡＳＴ出力（図２）は、以下であった
【０２９４】
【化３２】
2011168611.tif 000033
ＶＡＳＴ出力を使用して、２２９〜２５９フラグメント（図２の右上）をさらにモデル化し、図２の破線に沿って骨格にターンを導入することによって修飾した。得られたモデルを、エネルギー最小化によって精密化して、図３の最終モデルを得た。
【０２９５】
このモデルの表面ループを強調したモデルを図６に示す。
表面エピトープマッピング
ウェスタンブロットでｍＡｂ５０２を認識した株由来のＮＭＢ１８７０のＢＣドメインの多配列アラインメントにより、種々の配列情報が明らかとなった。抗体に結合した全ての株は残基Ａｒｇ２２３を含むが、この残基は、ブロットで認識されなかった株でＨｉｓである。そうであっても、Ａｒｇ２２３を有する全ての配列が殺菌性血清を産生するわけではなく、それにより、総殺菌性エピトープは、この単一の残基よりも広範なはずである。
【０２９６】
アラインメントにより、特定の殺菌性エピトープの形成に関与し得る以下の他の残基が同定された：Ｐｈｅ１２８（Ｆ）、Ｉｌｅｌ３３（Ｉ）、Ａｓｎ１９７（Ｎ）、Ｇｌｙ２２１７（Ｇ）、Ｌｙｓ２４９（Ｋ）、Ｌｙｓ２６０（Ｋ）、およびＶａｌ２６２（Ｖ）。これらの全アミノ酸（以下の灰色のバックグラウンド）がＥＴ−５株（ＭＣ５８など）間で保存されており、これは、ＢＣＡ陽性であるが、ＢＣＡ陰性株では異なる。
【０２９７】
【化３３】
2011168611.tif 000034
殺菌性ポリクローナル血清と反応する株由来の配列のアラインメントに基づいた同様の研究により、以下の残基が同定された：Ｐｈｅ１２８、Ｉｌｅ１３３、Ａｓｎ１９７、およびＧｌｙ２２１。モノクローナル抗体によって同定された残基Ｌｙｓ２４９、Ｌｙｓ２６０、およびＶａｌ２６２は、これら３つの残基がＢＣＡ陰性株（Ｍ２１９７）のＮＭＢ１８７０配列中に保存されているので、この段階で破棄した。
【０２９８】
ＮＭＢ１８７０の三次元モデルから、Ｐｈｅ１３４およびＩｌｅ１３９は予想されるαヘリックス内に存在するようであるので、抗体に十分に接近できない。他方では、Ａｓｎ１９７およびＧｌｙ２２１は共に表面ループ内に含まれるので、十分に曝露されている。Ｇｌｙ２２１およびＡｓｎ１９７は空間的にＡｒｇ２２３に近く、それにより、同一エピトープの一部であり得る。Ｇｌｙ２２１に注目すると、ＢＣＡ陰性株は、しばしば、ＧｌｕまたはＬｙｓ（共に嵩高く、且つ帯電している）と置換されたこの小さい中性のアミノ酸を有する。この置換により、このエピトープの適切な認識および抗体への結合が損なわれ得る。
【０２９９】
したがって、この分析により、以下の５つの重要なアミノ酸が明らかとなる：Ｐｈｅ１２８、Ｉｌｅ１３３、Ａｓｎ１９７、Ｇｌｙ２２１、およびＡｒｇ２２３。これらの残基を、三次元モデルにマッピングした場合（図４）、これらのうちの３つがタンパク質表面でクラスター化する（図５）。推定二次構造とのアラインメント（図１６）により、Ｉｌｅ１３３、Ａｓｎ１９７、Ｇｌｙ２２１、およびＡｒｇ２２３が親水性領域（すなわち、表面ループ）に存在することも示される。
【０３００】
他の重要な残基は、２１５〜２１６位のジペプチドＡＤであり得る。ＡＤは、ほとんどのＢＣＡ陰性株においてＡＹと置換され、いくつかの弱い反応物でＳＤと置換される。
【０３０１】
アミノ酸１９７、２２１、および２２３を、以下のように変異した。
【０３０２】
【化３４】
2011168611.tif 000035
変異誘発のためにＩｎｖｔｒｏｇｅｎのＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ（商標）ＳＤＭシステムを使用した。コドンが変化した内部プライマーを、説明書に従ってデザインし、以下に示す。
【０３０３】
【化３５】
2011168611.tif 000036
各変異体を生成するために、１００ｎｇのｐＥＴ−？Ｇ７４１（１）−ＨｉｓプラスミドＤＮＡを、メチル化反応のテンプレートとして使用し、１２．５ｎｇのメチル化プラスミドを、以下のプライマー対を使用した変異誘発反応における基質として使用した。
７４１（１）−Ｎ１９７Ｈ  ｆｏｒ／７４１（１）−Ｎ１９７Ｈｒｅｖ
７４１（１）−Ｇ２２１Ｋ  ｆｏｒ／７４１（１）−Ｇ２２１Ｋｒｅｖ
７４１（１）−Ｒ２２３Ｈ  ｆｏｒ／７４１（１）−Ｒ２２３Ｈｒｅｖ
ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ（商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
Ｓｙｓｔｅｍの説明書にしたがってＰＣＲを行った。反応後、１０μｌの産物を、１％アガロースゲルで分析し、次いで、変異誘発反応混合物由来の２μｌを、説明書にしたがって、ＤＨ５ａ（商標）−Ｔ１Ｒ大腸菌株に形質転換した。陽性クローンを、プラスミド単離（ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ（商標））によって分析し、配列決定した。二重変異体（？Ｇ７４１（１）−Ｈｉｓ−Ｎ１９７Ｈ−Ｇ２２１Ｋ）を生成するために、陽性変異体？Ｇ７４１（１）−Ｈｉｓ−Ｇ２２１ＫのＤＮＡを、対応するプライマー対（７４１（１）−Ｎ１９７Ｈ  ｆｏｒ／７４１（１）−Ｎ１９７Ｈｒｅｖ）を使用するつぎの段階のための基質として使用した。
【０３０４】
Ｃ末端−Ｈｉｓ−ｔａｇ融合物としての組換えタンパク質の発現のために、１．５μｌの各構築物を使用して、大腸菌ＢＬ２１−ＤＥ３株を形質転換した。１つの組換えコロニーを、４ｍｌ  ＬＢ＋Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）に接種し、３７℃で一晩インキュベートし、１２５ｍｌフラスコ中の２０ｍｌのＬＢ＋Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）で３０倍に希釈して、０．１と０．２との間のＯＤ６００ｎｍを得た。フラスコを、ＯＤ６００ｎｍが発現の誘導に適切な指数増殖を示すまで（０．４〜０．８のＯＤ値）、３７℃の旋回水浴震盪器中でインキュベートした。１．０ｍＭ  ＩＰＴＧの添加によってタンパク質発現を誘導した。３７℃で３時間のインキュベーション後、ＯＤ６００ｎｍを測定し、発現を試験した。１．０ｍｌの各サンプルを、微量遠心管で遠心分離し、ペレットをＰＢＳに再懸濁し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色によって分析した。野生型と同様に全変異体も発現し、３７℃で可溶性形態として精製した。
ループ置換
三次元モデルおよびエピトープマッピング研究に基づいて、ＮＭＢ１８７０のファミリーＩＩおよびファミリーＩＩＩ由来の表面ループを、ファミリーＩフレームワークに導入した。
【０３０５】
ループ１について、アミノ酸配列は、全てのファミリーＩＩ株およびファミリーＩＩＩ株で１００％保存されている。３つ全てのファミリーでは、ループ１は、ループの正確な曝露／折り畳みに寄与する可能性が高い２つのαヘリックス（配列中に保存されていない）に隣接する。Ｇｌｙ１４０残基はファミリーＩＭ６１９０配列で見出されず、モノクローナルＪａｒ３およびＪａｒ５はファミリーＩ配列に結合する一方でＭ６１９０に結合することができず、このループのエピトープ重要性がさらに確認される。ファミリーＩフレームワークへの挿入のために、ファミリーＩＩ配列を選択した。
【０３０６】
ループ２は、殺菌性エピトープに対応する。ファミリーＩＩとＩＩＩとの間のこの位置でのたった２つの相違は、Ａｓｐ／Ｇｌｙ置換である。ファミリーＩＩ株の間の殺菌応答の分析により、Ａｓｐ残基の極めて重要な役割が示唆され、それにより、ファミリーＩＩ配列を選択した。
【０３０７】
ループ３は、ファミリーＩＩおよびＩＩＩで可変性が高いが、ファミリーＩでは保存されている。ファミリーＩＩでは、大部分の株が配列ＰＮＧを有するが、ファミリーＩＩＩでは、大部分がＡＧＧを有する。このループが防御のために重要でないと思われるが（ＰＮＧ株はファミリーＩＩＩ  ＡＧＧ株から防御することができる）、両方の可能性を対象とするために、ファミリーＩのＡＧ配列をＰＮと置換した。
【０３０８】
ループ４中のＡｓｎ１９７は、ファミリーＩのＢＣＡ陽性株とＢＣＡ陰性株とを区別するための重要な残基として以前に同定され、ＥＴ−５株で常に保存されている。この残基は、全ファミリーＩＩ株およびファミリーＩＩＩ株の亜群でＨｉｓに置換されている。さらに、Ｈｉｓはまた、いくつかのファミリーＩ株に存在する。したがって、Ｈｉｓを、ファミリーＩＩおよびＩＩＩ、さらに、ＭＣ５８によって対象とされていない任意のファミリーＩを対象とするためにこのループ中で使用した。
【０３０９】
ループ５、ループ６、およびループ７は、ファミリーＩＩおよびＩＩＩで同一であるが、ファミリーＩで異なる。これら３つのループのために、ファミリーＩＩ／ＩＩＩ配列を使用した。２９９６株のタンパク質に対して惹起された血清に感受性を示すファミリーＩＩ株がこの位置にＧｌｙ残基を有するので、ループ中の第２の残基は、ＶａｌよりもむしろＧｌｙである。
【０３１０】
配列番号１から配列番号６１に変更するための置換を図７に示す。ループ１、２、および４がファミリーＩＩ配列を受け入れ、ループ３がファミリーＩＩＩ配列を受け入れ、ループ５、６、および７がファミリーＩＩおよびＩＩＩの両方に共通の配列を受け入れた。全部で２７４個（配列番号１）および２７３個（配列番号６１）のアミノ酸のうちの２８個の置換により、表面ループ交換後の全体の同一性は、９０％を超えたままである。
【０３１１】
ループを連続的に置換した。いくつかのタンパク質がこの一連の置換で作製され、？ＧＮＭＢ１８７０ＭＣ５８配列の各ループが順番に置換された。７つの置換タンパク質を、ＬＰ１、ＬＰ２、．．．ＬＰ７と呼んだ。ＬＰ７変異体は、配列番号６１である。
【０３１２】
ＧｅｎＴａｉｌｏｒ（商標）ＳＤＭ系を、本研究（上記）のために使用し、以下のプライマーを使用した。
【０３１３】
【化３６】
2011168611.tif 000037
野生型タンパク質と同様に全タンパク質も発現し、３７℃での成長後に可溶性産物として精製することができる。タンパク質ＬＰ１、ＬＰ２、．．．ＬＰ７を使用して、マウスを免疫化し、得られた血清を、血清型Ｂ髄膜炎菌類の種々の異なる株（各ＮＭＢ１８７０ファミリー由来の少なくとも３種が含まれる）に対して試験した。出発タンパク質（ＬＰ０）も試験した。タンパク質を、水酸化アルミニウム（ＡＨ）アジュバントまたはＦＣＡ（Ｆ）のいずれかで免疫賦活した。以下の表では、各行（下の行を除く）は、９種の例示的株に対して試験した１つの血清についてのＳＢＡを示す。下の行は、相同ＮＭＢ１８７０由来の野生型抗原を使用して得た血清の活性を示す（すなわち、ＭＣ５８に対する抗ＮＭＢ１８７０ＭＣ５８血清の試験）。
【０３１４】
【化３７】
2011168611.tif 000038
ＬＰ０（置換なし；ＮＭＢ１８７０；ファミリーＩ）からのＬＰ１、ＬＰ２を経たＬＰ７への進行により、タンパク質に対して惹起した血清はＮＭＢ１８７０がファミリーＩＩまたはファミリーＩＩＩに存在する株に対してより活性が高くなる。ファミリーＩ配列をファミリーＩＩ／ＩＩＩ配列に置換するにつれて、推測に反して、ファミリーＩ株に対する殺菌応答は増加する傾向がある。
【０３１５】
したがって、配列番号６１は、ファミリーＩエピトープを置換するためのファミリーＩＩおよびＩＩＩ由来の表面エピトープを含む。キメラポリペプチドを使用して、ファミリーＩＩおよびＩＩＩ由来のＮＭＢ１８７０に対する抗体を惹起することができ、通常のファミリーＩ配列と組み合わせて多ファミリー抗原性を得ることができる。組み合わせは、２つの異なるポリペプチドの混合物であり得るか、ハイブリッド（７）の形態であり得る（例えば、ＮＨ２−Ｘ１−配列番号６１−Ｘ２−配列番号１−Ｘ３−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−配列番号１−Ｘ２−配列番号６１−Ｘ３−ＣＯＯＨなど）。
新規のＮＭＢ１８７０配列
ＮＭＢ１８７０についての広範囲の配列情報を利用可能である（例えば、参考文献３、５、６、および７）。さらなる新規のＮＭＢ１８７０配列が見出されている。
【０３１６】
成熟タンパク質のＮ末端システインから開始される４２４３株の配列を、配列番号６２に示す。切断されたリーダーペプチドは、通常のファミリーＩ配列と同一である。
【０３１７】
Ｍ．０１．０２４０３２０株（「ｇｂ３２０」、配列番号６３）およびＳ１００２６株（配列番号６４）でＮＭＢ１８７０の第４のファミリーが認められている。ｍ３８１３由来の配列（参考文献７の配列番号２１、本明細書中の配列番号６５）もファミリーＩＶに分類することができる。
【０３１８】
本発明を例示のみを目的として上で説明しており、本発明の範囲および精神を維持しながら修正することができると理解される。
【０３１９】
【化３８】
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【０３２０】
【表１】
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【０３２１】
【表２】
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【０３２２】
【表３】
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【０３２３】
【表４】
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【０３２４】
【表５】
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【０３２５】
【表６】
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【表１】
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【表２】
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【表３】
2011168611.tif 000048
【表４】
2011168611.tif 000049
【表５】
2011168611.tif 000050
【図６】
2011168611.tif 000051
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2011168611.tif 000066
【配列表】
2011168611000001.app
【外国語明細書】
2011168611000001.pdf