(57)【要約】      （修正有）【課題】患者個々人の包括的なタンパク質発現プロファイルを簡易に取得し、臨床の現場における個別化医療を可能とする組織マイクロアレイを提供する。【解決手段】同一人の同一症例の同一組織の裁断された小薄切組織切片１００をスライドプレート２００に複数配置する組織マイクロアレイ。スライドプレート２００上には、複数の裁断された小薄切組織切片１００に加えて、陽性コントロール１１０、陰性コントロール１２０、及び正常組織１３０が配置されることが可能である。この組織マイクロアレイ９００の裁断された小薄切組織切片１００は、各々、複数の染色マーカーにて染色される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
同一人の同一症例の同一組織の小薄切組織切片をスライドプレートに複数配置することを特徴とする組織マイクロアレイ。
【請求項２】
複数の小薄切組織切片に加えて、各マーカーごと別々の陽性コントロールを前記スライドプレート上に配置することを特徴とする請求項１に記載の組織マイクロアレイ。
【請求項３】
複数の小薄切組織切片に加えて、各マーカーごと別々の陰性コントロールを前記スライドプレート上に配置することを特徴とする請求項１又は２に記載の組織マイクロアレイ。
【請求項４】
複数の小薄切組織切片に加えて、目的組織に対する同一症例又は他症例の正常組織を前記スライドプレート上に配置することを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の組織マイクロアレイ。
【請求項５】
前記スライドプレート上に、前記小薄切組織切片の配置される部位を示す組織切片配置部位が記載されていることを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載の組織マイクロアレイ。
【請求項６】
前記スライドプレートに、前記小薄切組織切片の染色される染色マーカー名が記載されていることを特徴とする請求項１乃至５の何れか１項に記載の組織マイクロアレイ。
【請求項７】
前記スライドプレートに、前記小薄切組織切片の染色される染色マーカーに適した抗原賦活化液の名称が記載されていることを特徴とする請求項１乃至６の何れか１項に記載の組織マイクロアレイ。
【請求項８】
前記スライドプレートに、前記小薄切組織切片の染色される染色マーカーの一次抗体に適した二次抗体の名称が記載されていることを特徴とする請求項１乃至７の何れか１項に記載の組織マイクロアレイ。
【請求項９】
前記組織切片配置部位、前記染色マーカー名、前記抗原賦活化液、又は前記二次抗体の名称の記載は、前記スライドプレートにレーザー刻印により記載されることを特徴とする請求項５乃至８の何れか１項に記載の組織マイクロアレイ。
【請求項１０】
同一人の同一症例の同一組織の小薄切組織切片をスライドプレートに複数配置し、それらの小薄切組織切片を複数の染色マーカーにて各々染色することを特徴とする組織解析方法。
【請求項１１】
前記スライドプレート上に、基材に複数の貫通孔を設けた組織染色用シートを乗せ、前記組織染色用シートの複数の貫通孔に、各々の染色マーカーに適した抗原賦活化液、複数の染色マーカー、及び、各々の染色マーカーの一次抗体に適した二次抗体を各々注入して染色することを特徴とする請求項１０に記載の組織解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療における研究及び病理診断等で使用される組織マイクロアレイ（Tissue Microarray:TMA）、並びにその組織マイクロアレイを使用する組織解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体関連物質を解析するための多くの手法が開発されている。生体関連物質を解析するための手法として、マイクロアレイの手法が良く用いられる。例えば、ＤＮＡマイクロアレイは、スライドグラス等の基板上に、数千個のＤＮＡプローブを固定したものである。蛍光分子等で標識した試料を流し、ＤＮＡプローブとハイブリタイズさせて、蛍光発光の強弱を測定して、試料に含まれる遺伝子の発現量を推定する。
【０００３】
免疫組織化学は、発現したタンパク質を認識する抗体を用い、特定の遺伝子発現タンパク質を解析する方法である。また、in situハイブリダイゼーションは、目的遺伝子の塩基配列に相補なプライマーを用い、組織上で遺伝子発現を解析する方法である。免疫組織化学及びinsituハイブリダイゼーションは、共にパラフィンブロックを用いた解析が可能である。
【０００４】
組織マイクロアレイは、一つのスライドプレート上に多数の組織を載せたものである。スライドプレート上には例えば１００〜１０００個の小組織片が載っており、これらの組織を染色して、分析することが可能である。
【０００５】
免疫組織化学やin situハイブリダイゼーションでは、１枚のスライドに１つの組織切片を載せるものであるが、組織マイクロアレイを使用することにより、１枚のスライドに多数の組織切片を載せることができ、省力化により迅速な分析及び研究が可能となる。
【０００６】
例えば特許文献１には、異なる症例の被検組織をパラフィンブロックから直径０．６〜２ｍｍ大の円筒形状にくりぬき、その円筒形状のくりぬいた被検組織を多数集めて、新たなパラフィンブロックに埋め込み、その後薄切し、組織切片が配置されたシート状の薄片切片試料をスライドグラス上に載せて形成される組織マイクロアレイが記載されている。そして、スライドプレート上の多数の組織切片を単一のマーカーで染色することにより、包括的な解析を行う。
【０００７】
また、例えば特許文献２には、異なる症例の臓器固定パラフィンブロックから筒状刃で被検組織を円筒形状にくりぬき、予め上記筒状刃とほぼ同径の中空穴を複数形成した合成樹脂製のティッシュブロックを用意しておき、くりぬいた被検組織をティッシュブロックの中空穴に埋め込み、包埋皿とティッシュブロックの間にパラフィン液を流し込んで充填・固化させて作製する組織マイクロアレイが記載されている。
【０００８】
また、例えば特許文献３には、複数の孔部を形成したパラフィン支持ブロックを作製し、パラフィン包埋した異種症例の検体組織ブロックから前記孔部の形状に対応した形状の被検組織を採取し、前記支持ブロックの孔部に前記被検組織を挿入するとともに前記支持ブロックを加温してパラフィンを融解させ前記支持ブロックと前記被検組織とを一体になじませた組織マイクロアレイが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２００５−５３０５０４号公報
【特許文献２】特開２００４−２５８０１７号公報
【特許文献３】特開２００６−１６２４８９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、従来の組織マイクロアレイは、異なる患者の異種症例の組織切片をスライドプレート上に多数配置したものであり、その組織マイクロアレイを使用する組織解析はスライドプレート上のこれら組織切片を単一マーカーにて染色するものである。そのため、患者個々人の包括的なタンパク質発現プロファイルは得られず、臨床の現場における個別化医療が極めて困難である。
【００１１】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、患者個々人の包括的なタンパク質発現プロファイルを簡易に取得し、臨床の現場における個別化医療を可能とする組織マイクロアレイ、及び、その組織マイクロアレイを使用する組織解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の第１の観点に係る組織マイクロアレイは、同一人の同一症例の同一組織の小薄切組織切片をスライドプレートに複数配置することを特徴とする。
【００１３】
また、複数の小薄切組織切片に加えて、各マーカーごと別々の陽性コントロールを前記スライドプレート上に配置することが好ましい。
【００１４】
また、複数の小薄切組織切片に加えて、各マーカーごと別々の陰性コントロールを前記スライドプレート上に配置することが好ましい。
【００１５】
また、複数の小薄切組織切片に加えて、目的組織に対する同一症例又は他症例の正常組織を前記スライドプレート上に配置することが好ましい。例えば乳癌組織の場合、同一症例の正常乳腺組織である。
【００１６】
また、前記スライドプレート上に、前記小薄切組織切片が配置される部位を示す組織切片配置部位が記載されていることが好ましい。
【００１７】
また、前記スライドプレートに、前記小薄切組織切片が染色される染色マーカー名が記載されていることが好ましい。
【００１８】
また、前記スライドプレートに、前記小薄切組織切片が染色される染色マーカーに適した抗原賦活化液の名称が記載されていることが好ましい。
【００１９】
また、前記スライドプレートに、前記小薄切組織切片が染色される染色マーカーの一次抗体に適した二次抗体の名称が記載されていることが好ましい。
【００２０】
更に、前記組織切片配置部位、前記染色マーカー名、前記抗原賦活化液、又は前記二次抗体の名称の記載は、前記スライドプレートにレーザー刻印により記載されることが好ましい。
【００２１】
本発明の第２の観点に係る組織解析方法は、同一人の同一症例の同一組織の小薄切組織切片をスライドプレートに複数配置し、それらの小薄切組織切片を複数の染色マーカーにて各々染色することを特徴とする。
【００２２】
また、前記スライドプレート上に、基材に複数の貫通孔を設けた組織染色用シートを乗せ、前記組織染色用シートの複数の貫通孔に、各々の染色マーカーに適した抗原賦活化液、複数の染色マーカー、及び、各々の染色マーカーの一次抗体に適した二次抗体を各々注入して染色することが好ましい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の組織マイクロアレイは、同一人の同一症例の同一組織の小薄切組織切片がスライドプレートに複数配置されており、それらの小薄切組織切片を複数の染色マーカーで各々同時に染色する為、患者個々人の包括的なタンパク質発現プロファイルを簡易に取得でき、臨床の現場における個別化医療（Personalized Medicine）が可能となる。そのため、患者個人の持つ分子・遺伝情報と疾患原因や病態を形成する分子・遺伝子異常に関する情報に基づいて、主作用を最大化しかつ副作用を最小化することにより、患者のQOL（クオリティオブライフ）を最適化するような治療計画を立案及び実行することが可能となる。更に、本発明の組織マイクロアレイを多数の染色マーカーを使用して同時に染色することにより、細胞が外からの刺激を細胞表面のレセプターを介して受け細胞の機能が変化するまでの一連の情報伝達の過程（シグナルトランスダクション）について、臨床的に有効な知見を得ることもできる。更には、インキュベーションの際の抗体量が少量で済む上に、スライドプレートの数量も削減させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本実施形態に係る組織マイクロアレイの斜視外観図である。
【図２】組織切片配置部位及び染色マーカー名が記載されているスライドプレートの斜視外観図である。
【図３】染色マーカー名が組織切片配置部位の中に記載されているスライドプレートの斜視外観図である。
【図４Ａ】組織マイクロアレイの作成において、摘出検体組織を固定する固定工程を説明する図である。
【図４Ｂ】組織マイクロアレイの作成において、パラフィン包埋する包埋工程を説明する図である。
【図４Ｃ】組織マイクロアレイの作成において、薄切して薄切試料を得る薄切工程を説明する図である。
【図４Ｄ】組織マイクロアレイの作成において、40℃〜50℃程度の温水に浮かべ伸展する伸展工程を説明する図である。
【図４Ｅ】組織マイクロアレイの作成において、弾力を有する合成樹脂製のプレート上に薄切試料を掬い取る掬取工程を説明する図である。
【図４Ｆ】組織マイクロアレイの作成において、裁断して小薄切組織切片を得る裁断工程を説明する図である。
【図５】抗原賦活化処理、染色マーカー（一次抗体）、及び二次抗体によるインキュベーションの際に使用する組織染色用多孔シートの斜視外観図である。
【図６】小薄切組織切片に加えて陽性コントロールが配置されている組織マイクロアレイの斜視外観図である。
【図７】小薄切組織切片に加えて、陽性コントロール、陰性コントロール、及び正常組織が配置されている組織マイクロアレイの斜視外観図である。
【図８】２１種類の染色マーカー名が記載されたスライドガラスを示す写真図である。
【図９】スライドガラス上にシリコン性の組織染色用多孔シートを重ねて載せた状態を示す写真図である。
【図１０】組織染色用多孔シートとスライドガラスとの接着性テストの結果を示す写真図である。
【図１１】２１孔の組織染色用多孔シートを使用し、２１個の小薄切組織切片及び陽性コントロールを２１種類の染色マーカーで免疫染色した状態を示す写真図である。
【図１２】targetの小薄切組織切片のbcl-2免疫染色、及び、bcl-2免疫染色の陽性コントロールを示す４０倍拡大写真図である。
【図１３】より多くの小薄切組織切片が配置されている組織マイクロアレイと、その上に載置される組織染色用多孔シートとを使用した免疫染色を示す写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（実施形態１）
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００２６】
図１は、本実施形態にかかる組織マイクロアレイ９００の斜視外観図である。図１に示すように、組織マイクロアレイ９００は、スライドプレート２００の上に、同一人の同一症例の同一組織の裁断された小薄切組織切片１００が複数配置されている。
【００２７】
従来の組織マイクロアレイは、スライドプレート上に異なる患者の異なる症例の組織を多数配置したものであり、それらの組織を単一の染色マーカーにて染色するものであるが、本実施形態に係る組織マイクロアレイ９００は、スライドプレート２００上に同一人の同一症例の同一組織の裁断された小薄切組織切片１００が複数配置されている新規構造の組織マイクロアレイであり、本発明の組織解析方法は、後述するように、それらの裁断された小薄切組織切片１００を複数の染色マーカーにて染色する新規な組織解析方法である。
【００２８】
スライドプレート２００上の各裁断された小薄切組織切片１００は、ホルマリン固定、パラフィン包埋された組織である。各裁断された小薄切組織切片１００の形状は、特に限定されるものではないが、例えば略円形のスポットである。各裁断された小薄切組織切片１００の形状が円形の場合、各スポットの大きさは、特に限定されるものではないが、例えば直径０．２ｍｍから１０．０ｍｍであり、本実施形態では直径２．０ｍｍである。
【００２９】
また、各スポットの数は、検査対象組織、検査対象症例、ガンの進行ステージ、及び検査の精密度等の当業者から選択される種々の事項を適宜考慮して設定され、特に限定されるものではないが、例えば２から２０００である。図１に示される一具体例としての組織マイクロアレイ９００では、裁断された小薄切組織切片１００は２１個配置されている。
【００３０】
図２は、各裁断された小薄切組織切片１００が配置されるスライドプレート２００の斜視外観図である。図２に示すように、スライドプレート２００には、小薄切組織切片１００が配置される組織切片配置部位１０１、及び、小薄切組織切片１００が染色される染色マーカー名が記載される。組織切片配置部位１０１の形状は、例えば略円形である。染色マーカー名は、組織切片配置部位１０１の上部に記載されている。スライドプレート２００は、ガラス又はプラスチック等により形成される。プラスチックにてスライドプレート２００を形成することにより、ガラス担体のものに比べて安価で組織マイクロアレイ９００を提供できる。プラスチック材料としては、表面処理の容易性及び量産性の観点から、熱可塑性樹脂を用いることができる。なお、図１、図２、及び下記図３に記載されている染色マーカー名は一具体例である。
【００３１】
また、スライドプレート２００に、裁断された小薄切組織切片１００の染色される染色マーカーに適した抗原賦活化液の名称を記載することも可能である。ホルマリン等により固定された組織切片を免疫染色する場合、ホルムアルデヒドの架橋形成等のマスキングにより、抗原抗体反応が起こらない又は減弱する場合がある。このため、加熱処理等でアンマスキングすることにより、抗体が抗原を認識できるようにさせる操作が抗原賦活化処理である。染色マーカーが異なると抗原賦活化液も異なる場合がある。しかしながら、スライドプレート２００に抗原賦活化液の名称を記載することにより、抗原賦活化液を取り間違えることなく、一次抗体によるインキュベーション前の抗原賦活化を適切に行うことが可能となる。
【００３２】
また、スライドプレート２００に、裁断された小薄切組織切片１００の染色される染色マーカーの一次抗体に適した二次抗体の名称を記載することも可能である。一次抗体の種類が変わることにより、二次抗体も変わる場合、スライドプレート２００に二次抗体の名称を記載することにより、二次抗体を取り間違えることなく適切に作用させることが可能となるからである。
【００３３】
スライドプレート２００への染色マーカー名の記載方式は、特に限定されるものではないが、例えば乾燥後耐水性、耐溶媒性をもつ水溶性顔料にて記載（印刷）することができる。また、染色マーカー名をスライドプレート２００へ炭酸ガスレーザー等により、レーザー刻印にて記載することも可能である。同様に、組織切片配置部位１０１、抗原賦活化液の名称、及び二次抗体の名称を水溶性顔料又はレーザー刻印にて記載（印刷）することが可能である。
【００３４】
そして、この組織切片配置部位１０１の上に、複数の裁断された小薄切組織切片１００が配置されることにより、図１に示す組織マイクロアレイ９００が形成される。なお、図３に示すように、染色マーカー名は、組織切片配置部位１０１の内部に記載されることも可能である。係る場合は、組織切片配置部位１０１に裁断された小薄切組織切片１００を配置することにより染色マーカー名が多少見えにくくなるが、どの組織切片配置部位１０１にどの染色マーカーを使用するかが直接記載されているため、染色マーカーを間違うことなく適切な位置に注入できる。
【００３５】
次に、組織マイクロアレイ９００の作成工程を説明する。図４Ａ〜図４Ｆは、組織マイクロアレイ９００の作成工程の説明図である。図４Ａは、摘出検体組織を固定する固定工程を説明する図であり、図４Ｂは、パラフィン包埋する包埋工程を説明する図であり、図４Ｃは、薄切して薄切試料を得る薄切工程を説明する図であり、図４Ｄは、40℃〜50℃程度の温水に浮かべ伸展する伸展工程を説明する図であり、図４Ｅは、弾力を有する合成樹脂製のプレート上に伸展した薄切試料を掬い取る掬取工程を説明する図であり、図４Ｆは、裁断して小薄切組織切片を得る裁断工程を説明する図である。
【００３６】
組織マイクロアレイ９００の作成工程は、（Ａ）摘出検体組織を固定する固定工程、（Ｂ）固定した摘出検体組織を脱水し、パラフィン包埋する包埋工程、（Ｃ）包埋試料を薄切して薄切試料を得る薄切工程、（Ｄ）薄切試料を、40℃〜50℃程度の温水に浮かべ伸展する伸展工程、（Ｅ）伸展した薄切試料を、弾力を有する合成樹脂製のプレート上に掬い取る掬取工程、（Ｆ）プレート上の薄切試料を裁断用具にて裁断して、小薄切組織切片を得る裁断工程、及び、（Ｇ）裁断された小薄切組織切片をプレパラート上に配置する配置工程を含む。
【００３７】
まず、固定工程では、図４Ａに示すように、摘出検体組織３００が固定される。即ち、摘出検体組織３００を自己融解や変性による劣化から保護するための化学処理が行われる。固定に使用される試薬は、特に限定されるものではないが、例えば、ホルムアルデヒドやグルタルアルデヒド等を適宜使用することができる。摘出検体組織３００は、生体から摘出された検体組織であり、特に限定されるものではないが、例えば肝臓ガン、大腸ガン、胃ガン等のガン組織である。
【００３８】
そして、包埋工程では、摘出検体組織３００に付着した固定液を十分に洗い流すために水洗し、その後水分を完全に除去するためにアルコールにて脱水する。アルコールは、低濃度からしだいに濃度を上げて無水アルコールまで順次移していき水分を完全に除去する。次にアルコールに溶けないパラフィンを組織に浸透させるため、キシロールやクロロホルム等の媒介剤を用い、更にアルコールをぬく。そして、図４Ｂに示すように、固定した摘出検体組織３００を融解している液状パラフィンの中に入れて充分浸し、その後徐々に冷却して、パラフィン包埋する。バラフィンブロックの形状は、特に限定されるものではないが、例えば図４Ｂに示すように、角柱形状である。
【００３９】
次に、薄切工程では、図４Ｃに示すように、パラフィン包埋した摘出検体組織３００を薄切することにより、複数の薄切試料３１０を得る。薄切の手段は、特に限定されるものではないが、例えばミクロトーム等の公知の薄切手段を使用することができ、ミクロトームを用いた場合、マイクロメートルのオーダーから数十ナノメートルに至る薄さでの均質な切り出しを確実に行うことができる。薄切試料３１０の形状は、特に限定されるものではないが、例えば、パラフィンブロックの形状が角柱形状である場合、図４Ｃに示すように、長方形である。なお、薄切試料３１０には、後述する裁断工程にて得られる小薄切組織切片１００の裁断部位が示される。
【００４０】
ここで、組織マイクロアレイ９００は、同一人の同一症例の同一組織の小薄切組織切片をスライドプレート２００に複数配置するものであるが、「同一組織」とは、図４Ｃに示すように、同一ブロックにおいて、ｘ座標及びｙ座標が同一部位の組織である。
【００４１】
次に、伸展工程では、図４Ｄに示すように、薄切工程で得た薄切試料３１０を、40℃〜50℃程度の温水に浮かべ伸展する。水溶液は、試料を損傷させない溶液であれば、特に限定されないが、例えば、水、生理食塩水、及び、生物試料の取扱い分野で使用される一般的な緩衝液等を使用できる。この伸展工程において、薄切試料３１０を、40℃〜50℃程度の温水に浮かべ伸展することで、薄切試料３１０のしわを除き、また小薄切組織切片１００のスライドガラスへの接着性を増すことができる。
【００４２】
次に、掬取工程では、図４Ｅに示すように、水溶液に浮かべた薄切試料３１０を、弾力を有する合成樹脂製のプレート３２０上に掬い取る。ここで、弾力を有する合成樹脂製のプレート３２０は、ガラス状のような硬質素材ではない合成樹脂を素材とするプレートをいい、例えばカッティングマット等に使用されている材質のプレートを挙げることができ、具体的には、アクリル樹脂、発泡性フッ素樹脂、軟質塩化ビニルや塩化ビニルの他、ポリプロピレン等の軟質オレフィン系樹脂や硬質オレフィン系樹脂等の素材からなるプレートである。
【００４３】
次に、裁断工程では、図４Ｆに示すように、合成樹脂製のプレート３２０上の薄切試料３１０を裁断用具にて裁断して、小薄切組織切片１００を得る。弾力を有する合成樹脂製のプレート３２０上で薄切試料３１０を裁断することで、薄切試料３１０に損傷を与えず裁断できる。なお、裁断用具は、薄切試料３１０を裁断しうる用具であれば特に限定されるものではなく、例えば、皮膚検体採取用の円筒形のカッターや、通常の切り出しナイフ等を使用できる。
【００４４】
最後に、配置工程で、裁断された小薄切組織切片１００をスライドプレート２００上に適宜所望の位置に配置し、図１に示したような所望の裁断された小薄切組織切片１００を組み合わせた組織マイクロアレイ９００が作成される。
【００４５】
次に、このようにして作成した組織マイクロアレイ９００を使用する組織解析方法を説明する。
【００４６】
組織マイクロアレイ９００は、通常の組織スライド標本と同様に、免疫組織化学染色やin-situハイブリダイゼーションにより実施する。免疫組織化学染色は、被検体である組織切片上の対象物（抗原）に対する特異抗体を反応させ、更に抗原抗体反応、或いは化学反応を組み合わせて特異抗体と標識酵素の免疫複合体を形成し、標識酵素の発色反応によって抗原の存在を可視化するものである。insituハイブリダイゼーションは、標識したＤＮＡプローブ或いはＲＮＡプローブを用いて、被検体組織中の目的遺伝子（ｍＲＮＡ）とハイブリッドを形成し、被検体の細胞や組織を染色し、遺伝子（ｍＲＮＡ）の細胞或いは組織での局在を可視化するものである。
【００４７】
まず、染色に先立って、パラフィンで包埋された後、裁断された小薄切組織切片１００から、キシレン等を用いてパラフィンを除去する。
【００４８】
次に、複数種類の染色マーカーを使用して、各裁断された小薄切組織切片１００を染色する。図５は、抗原賦活化処理、染色マーカー（一次抗体）、及び二次抗体によるインキュベーションの際に使用する組織染色用多孔シート４００の斜視外観図である。図５に示すように、組織染色用多孔シート４００は、基材４２０に複数の貫通孔４１０が形成されており、これらの貫通孔４１０は、組織マイクロアレイ９００に配置された複数の裁断された小薄切組織切片１００に各々対応している位置に設けられる。組織染色用多孔シート４００は、透明又は半透明の材質で形成され、特に限定されるものではないが、例えばシリコン、ポリプロピレン、ポリスチレン等により形成される。
【００４９】
抗原賦活化処理、染色マーカー（一次抗体）、及び二次抗体によるインキュベーションでは、各貫通孔４１０と各裁断された小薄切組織切片１００とを対応させた状態で、組織マイクロアレイ９００の上に組織染色用多孔シート４００を載せる。そして、組織染色用多孔シート４００を組織マイクロアレイ９００の上に載せた状態にて、組織染色用多孔シート４００の各貫通孔４１０に、複数種類の各染色マーカーに合った抗原賦活化液、一次抗体液、二次抗体液を各工程ごと順次、各々注入して染色をする。組織染色用多孔シート４００とスライドプレート２００との間には、例えば透明又は半透明の両面テープが介入され、スライドプレート２００＋両面テープ＋組織染色用多孔シート４００となり、両者間の密着性を担保する。なお、両面テープ等の粘着層を間に介在させないで、スライドプレート２００と組織染色用多孔シート４００との間を物理的応力により圧接し、両者間の密着性を担保することも可能である。
【００５０】
インキュベーション中に染色マーカーが乾燥することを防止するために、染色マーカーの量を多くしすぎると、隣接するスポットにオーバーフローする場合がある。しかしながら、上記の組織染色用多孔シート４００を使用することにより、染色マーカーの量を多くしたとしても、各貫通孔４１０は独立した区画を形成しているため、貫通孔４１０内に染色マーカーが溜まり、隣接するスポットにオーバーフローしない。自動化にて賦活化液、一次抗体液、二次抗体液を使用する為に、裁断された小薄切組織切片１００近傍にノズルの先を配置し、インキュベーション中にゆっくりとピペッティングするシステムも可能である。
【００５１】
また、組織染色用多孔シート４００が透明又は半透明である為、その組織染色用多孔シート４００を介して、スライドプレート２００上に記載されている染色マーカー名等を認識することができる。そして、スライドプレート２００には、各組織切片が配置される組織切片配置部位１０１及び各組織切片が染色される染色マーカー名が記載されている為、多数ある染色マーカーを間違うことなく、適切な位置に注入することができる。また、抗原賦活化液の名称や二次抗体の名称がスライドプレート２００に記載されている場合は、組織染色用多孔シート４００を介して、スライドプレート２００上に記載されているそれらを認識できる。
【００５２】
染色マーカーの量は、特に限定されるものではないが、裁断された小薄切組織切片１００のスポットの大きさが例えば直径２．０ｍｍの場合、例えば１０μＬ〜４０μＬであり、本実施形態では２０μＬである。
【００５３】
染色マーカーによる染色操作が終了すると、スライドプレート２００から組織染色用多孔シート４００を取り除くことも可能である。抗原賦活化液や二次抗体がマーカーにより異なる場合は本組織染色用多孔シート４００を取り除かずに行う。このようにして組織解析を行うことにより、患者個々人の包括的なタンパク質発現プロファイルを簡易に取得することができ、臨床現場にて個別化医療が可能となる。そのため、本発明に係る組織マイクロアレイ９００は、個別化医療用組織マイクロアレイ（Tissue simultaneous detection microarray:TSMA）と称される。
【００５４】
（実施形態２）
本発明の組織マイクロアレイ９００は、上述の実施形態に限定されるわけではない。図６は、複数の裁断された小薄切組織切片１００に加えて、各マーカーごと別々の陽性コントロール１１０が配置されている組織マイクロアレイを示す斜視外観図である。図６に示すように、第２実施形態に係る組織マイクロアレイ９００では、各々の組織切片配置部位１０１内に、裁断された小薄切組織切片１００と陽性コントロール１１０とが隣り合って配置されている。
【００５５】
第２実施形態に係る組織マイクロアレイ９００では、上述の複数の裁断された小薄切組織切片１００に加え、スライドプレート２００上に陽性コントロール１１０が配置されているので、陽性コントロール１１０と全く同一の条件にて検査対象の各小薄切組織切片１００の検査結果を検証することができ、正確なプロファイルを取得できる。
【００５６】
また、図７に示すように、各々の組織切片配置部位１０１内に、裁断された小薄切組織切片１００に加えて、陽性コントロール１１０、陰性コントロール１２０、及び正常組織１３０とが隣り合って配置されることも可能である。正常組織１３０は、目的組織に対する同一症例の正常組織であるが、同一症例の正常組織が得難い場合は、他人の正常組織（他症例の正常組織）を乗せることも可能である。複数の裁断された小薄切組織切片１００に加え、スライドプレート２００上に陽性コントロール１１０、陰性コントロール１２０、及び正常組織１３０が配置されているので、陽性コントロール１１０、陰性コントロール１２０及び正常組織１３０と全く同一の条件にて、検査対象の各小薄切組織切片１００の検査結果を検証することができ、極めて正確なプロファイルを取得できる。
【実施例】
【００５７】
〈スライドガラス〉
スライドプレートとして、長さ７６．２ｍｍ×幅２５．４ｍｍ×厚さ１．０ｍｍのＭＡＳコートスライドグラス（松浪硝子工業株式会社）を使用した。水溶性顔料としてPX-Gインク（エプソン社）を使用し、円形の組織切片配置部位を、縦３個×横７個で合計２１個の数だけスライドガラスに直接記載（印刷）した。また、スライドガラス上に記載したそれらの組織切片配置部位よりも上方位置に、染色マーカー名を２１カ所に直接記載（印刷）した。スライドガラス上に記載した染色マーカー名は、EstrogenReceptor（ER）、Progesterone Receptor（PgR）、HER2 receptor（HER2）、Epithelial GrowthFactor Receptor（EGFR）、MIB-1、Cytokeratin5/6（CK5/6）、synaptophysin、chromograninA、 CD56、AndrogeneReceptor（AR）、p53、p21、BRCA1、cyclinD1、E-cadherin、Smad4、Rb、c-Myc、β-catenin、ALK1、及び、bcl-2の２１種類であった。このようにして、図８に示すようなスライドガラスを準備した。
【００５８】
〈組織マイクロアレイ〉
摘出検体組織としての乳ガン組織が、ホルムアルデヒドを使用して固定された。固定された乳ガン組織は十分に水洗され、その後、低濃度アルコールからしだいに濃度を上げて無水アルコールまで順次移していき、十分に脱水された。次にキシロールを用いてアルコールを抜き、固定した乳ガン組織を融解している液状パラフィンの中に入れて充分浸し、その後徐々に冷却して、パラフィン包埋した。次に、パラフィン包埋した乳ガン組織をミクロトームで薄切することにより、同一人の同一症例の同一組織の薄切試料を複数得た。ミクロトームで薄切した薄切試料の厚さは４μｍであった。次に、それらの薄切試料を、40℃〜50℃程度の温水に浮かべ伸展した。次に、40℃〜50℃程度の温水に浮かべた薄切試料を、塩化ビニル製のカッティングマット上に掬い取った。次に、カッティングマット上に掬い取った薄切試料を円筒形のカッターにて裁断して、同一人の同一症例の同一組織の小薄切組織切片を２１個得た。最後に、小薄切組織切片を、上述のスライドガラス上の組織切片配置部位に配置し、更に、組織切片配置部位に各々の陽性コントロール組織から上記同様の方法にて得た小薄切組織切片を配置して組織マイクロアレイを作成した。
【００５９】
〈組織染色用多孔シート〉
インキュベーションの際に使用する組織染色用多孔シートは、スライドガラスとほぼ同じ形状及び大きさであり、スライドガラス上に記載された組織切片配置部位に対応する位置に縦３個×横７個の２１個の貫通孔が形成されていた。図９は、スライドガラス上にシリコン性の組織染色用多孔シートを重ねて載せた状態の写真図である。図９に示すように、組織染色用多孔シートはシリコンで形成された透明材料であり、スライドガラス上に記載された各染色マーカー名は、組織染色用多孔シートを透過して認識することができた。また、図９に示すように、スライドガラス上に記載された２１個の組織切片配置部位と、組織染色用多孔シートの２１個の貫通孔とは完全に一致していた。
【００６０】
この組織染色用多孔シートとスライドガラスとの間に橙色透明の両面テープを介在させて、両者間の密着性を試験した。組織染色用多孔シートの２１個の貫通孔のうち、１１個の貫通孔に着色色素としてのインジゴカルミン（Indigo carmine）を入れ、残りの１０個の貫通孔にＰＢＳを入れ、湿潤箱内にて３７℃条件下にて４０分間インキュベーションした。
【００６１】
図１０は、組織染色用多孔シートとスライドガラスとの接着性テストの結果を示す写真図である。濃青色液はインジゴカルミンであり、透明液はＰＢＳである。図１０に示すように、インキュベーション後において、インジゴカルミン及びＰＢＳは漏出することなく、組織染色用多孔シートの貫通孔内に貯留されていた。なお、９５℃、４０分間のインキュベーションでも漏出することなく、また、over nightでも漏出することはなかった。
【００６２】
〈免疫染色〉
次に、上記の組織染色用多孔シートを使用し、上記の〈組織マイクロアレイ〉で作成した組織マイクロアレイの上に載置して、下記に示すように、２１種類の染色マーカーを使用して免疫染色を行った。即ち、tris-EDTA pH 10にて、１２１℃で１５分抗原賦活化後、過酸化水素メタノール処理を１５分間行い、１０％ヤギ血清によるブロッキングを５分間施行した。両面テープの片面を付着させた２１孔の組織染色用多孔シートを組織マイクロアレイの上に乗せて接着させ、貫通孔にＰＢＳを満たした。その後、ＰＢＳを１個づつ除き、記載されている染色マーカー名と同一の一次抗体を２０μｌづつ注入した。使用した染色マーカーは、EstrogenReceptor（ER）、Progesterone Receptor（PgR）、HER2 receptor（HER2）、Epithelial GrowthFactor Receptor（EGFR）、MIB-1、Cytokeratin5/6（CK5/6）、synaptophysin、chromograninA、CD56、Androgene Receptor（AR）、p53、p21、BRCA1、cyclinD1、E-cadherin、Smad4、Rb、c-Myc、β-catenin、ALK1、及び、bcl-2の２１種類であった。
【００６３】
そして３７℃４０分間のインキュベーションを行った後、ＰＢＳにてリンスし、組織染色用多孔シートを外した。さらに、２次抗体で１０分間インキュベーションを行った。次に、ＰＢＳにてリンスした後、ＨＲＰストレプトアビジン液で１０分間処理を行い、次にＰＢＳにてリンスした後、ＤＡＢにて発色させた。ヘマトキシリンにてカウンターステインした後に、透徹して封入した。
【００６４】
図１１は、２１孔の組織染色用多孔シートを使用し、２１個の組織切片及び陽性コントロールを２１種類の染色マーカーで免疫染色した状態を示す写真図である。図１１において、右側に位置する濃い茶色の組織片が陽性コントロールであり、左側に位置する組織片がtargetである小薄切組織切片である。なお、記載された組織切片配置部位及び染色マーカー名は、脱パラフィン操作や、tris-EDTA溶液による１２１℃１５分の抗原賦活化等、免疫染色の全てのステップにおいて剥げ落ちることはなかった。図１１に示すように、本発明の組織マイクロアレイは、同一人の同一症例の同一組織の小薄切組織切片がスライドプレートに複数配置されており、それらの小薄切組織切片が複数の染色マーカーで各々同時に染色されている為、患者個々人の包括的なタンパク質発現プロファイルが取得でき、個別化医療が可能となる。
【００６５】
図１２は、targetの小薄切組織切片のbcl-2免疫染色、及び、bcl-2免疫染色の陽性コントロールを示す４０倍拡大写真図である。図１２において、右側の染色はbcl-2免疫染色の陽性コントロールであり、左側の染色はtargetの小薄切組織切片のbcl-2免疫染色である。図１２に示されるように、targetの小薄切組織切片と陽性コントロールとが隣接して存在しており、しかも両者が同一条件で染色されている。そのため、左側目的組織（乳癌組織）のbcl-2陰性判定が極めて正確かつ容易である。
【００６６】
図１３は、他の実施例であり、より多くの小薄切組織切片が配置されている組織マイクロアレイと、その上に載置される組織染色用多孔シートを使用した免疫染色を示す写真図である。図１３に示すように、組織マイクロアレイには、３４個の小薄切組織切片が配置され、その上には、縦４個×横９個の３６個の貫通孔が形成されている組織染色用多孔シートが載置された。そして、３４種類の染色マーカーを使用して免疫染色をした。
【００６７】
図１３に示すように、同一人の同一症例の同一組織の小薄切組織切片をスライドプレート上により多数配置することにより、更に詳細な包括的タンパク質発現プロファイルを取得でき、個別化医療をより促進させることが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明に係る組織マイクロアレイは、臨床現場並びに医療及び基礎医学研究等の分野において、個々人の包括的なタンパク質発現プロファイルを取得する際に使用され、特に臨床現場における個別化医療に多大な貢献をする。
【符号の説明】
【００６９】
１００：小薄切組織切片
１０１：組織切片配置部位
１１０：陽性コントロール
１２０：陰性コントロール
１３０：正常組織
２００：スライドプレート
３００：摘出検体組織
３１０：薄切試料
３２０：プレート
４００：組織染色用多孔シート
４１０：貫通孔
４２０：基材
９００：組織マイクロアレイ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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