(57)【要約】【課題】光学活性である化合物やその中間体等を製造する為に工業的に利用される還元酵素による還元反応における、反応時間の短縮および反応効率の向上を図るうえで、熱安定性に優れた還元酵素の開発が切望されている。【解決手段】配列番号１で示されるアミノ酸配列において、５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異を含む１つ以上のアミノ酸変異を有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列を有し、かつ、基質を還元する能力を有することを特徴とする酵素等。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列において、５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異を含む１つ以上のアミノ酸変異を有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列を有し、かつ、基質を還元する能力を有することを特徴とする酵素。
【請求項２】
前記のアミノ酸変異が、１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異を含むことを特徴とする請求項１記載の酵素。
【請求項３】
前記のアミノ酸変異が、２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異を含むことを特徴とする請求項１又は２記載の酵素。
【請求項４】
前記のアミノ酸変異が、４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異を含むことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかの請求項記載の酵素。
【請求項５】
前記のアミノ酸変異が、２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異を含むことを特徴とする請求項１乃至４のいずれかの請求項記載の酵素。
【請求項６】
前記のアミノ酸変異が、下記のアミノ酸変異群から選ばれるアミノ酸変異であることを特徴とする請求項１記載の酵素。
＜アミノ酸変異群＞
１．（ａ）５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と（ｂ）１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異との２つのアミノ酸変異
２．（ａ）５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と（ｂ）２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異との２つのアミノ酸変異
３．（ａ）５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と（ｂ）４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異との２つのアミノ酸変異
４．（ａ）５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と（ｂ）２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異との２つのアミノ酸変異
５．（ａ）５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と（ｂ）１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異と（ｃ）２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異との３つのアミノ酸変異
６．（ａ）５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と（ｂ）１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異と（ｃ）４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異との３つのアミノ酸変異
７．（ａ）５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と（ｂ）１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異と（ｃ）２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異との３つのアミノ酸変異
８．（ａ）５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と（ｂ）２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異と（ｃ）４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異との３つのアミノ酸変異
９．（ａ）５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と（ｂ）２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異と（ｃ）２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異との３つのアミノ酸変異
１０．（ａ）５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と（ｂ）４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異と（ｃ）２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異との３つのアミノ酸変異
１１．（ａ）５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と（ｂ）１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異と（ｃ）２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異と（ｄ）４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異との４つのアミノ酸変異
１２．（ａ）５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と（ｂ）１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異と（ｃ）２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異と（ｄ）２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異との４つのアミノ酸変異
１３．（ａ）５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と（ｂ）１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異と（ｃ）４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異と（ｄ）２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異との４つのアミノ酸変異
１４．（ａ）５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と（ｂ）２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異と（ｃ）４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異と（ｄ）２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異との４つのアミノ酸変異
１５．（ａ）５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と（ｂ）１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異と（ｃ）２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異と（ｄ）４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異と（ｅ）２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異との５つのアミノ酸変異
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかの請求項記載の酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とするベクター。
【請求項９】
酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸又は酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを更に含有することを特徴とする請求項８記載のベクター。
【請求項１０】
請求項７記載のポリヌクレオチド又は請求項８若しくは９記載のベクターを含有することを特徴とする形質転換体。
【請求項１１】
２−オキソ−４−フェニル酪酸エステルに、請求項１０記載の形質転換体又はその処理物を作用させる工程を含むことを特徴とする（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルの製造方法。
【請求項１２】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する酵素の改変方法であり、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、５６番目のグリシンをシステインに置換する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの改変方法であり、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列において、１６６番目から１６８番目までの、グリシンをコードするコドンを、システインをコードするコドンに置換する工程を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型の還元酵素等に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、還元反応、特にαケト酸の還元反応等に利用可能な改変型の還元酵素（即ち、基質を還元する能力を有することを特徴とする酵素）、その遺伝子及びそれらの利用に関するものである。
還元酵素は、基質を還元する能力を有し、近年、例えば、医農薬の有効成分となる化合物やその中間体、特に光学活性である化合物やその中間体等を製造する為の有機合成反応に利用されている。 そして、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、かつ、基質を還元する能力を有する酵素（野生型還元酵素）が知られている（例えば、特許文献１参照）。
このような、光学活性である化合物やその中間体等を製造する為に工業的に利用される還元酵素は、当該酵素による還元反応における反応生成物の光学純度が高いこと、基質の絶対立体配置に対する当該酵素の認識性が高いこと、温度・ｐＨ・溶媒・圧力等の各種反応条件に対する安定性が高いこと等の性能を備えていることが望ましい。中でも温度に対する還元酵素の安定性（即ち、熱安定性）が高いと、反応温度を高くすることが可能となり、反応速度を高めるだけでなく、反応中の還元酵素の失活を軽減することができる（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Applied Microbiology Biotechnology、８０、８０５−８１２（２００８）
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−６８５０３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、反応時間の短縮および反応効率の向上を図るうえで、熱安定性に優れた還元酵素の開発が切望されている。 
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、このような状況下鋭意検討を行った結果、ある種の野生型還元酵素のアミノ酸配列において、特定のアミノ酸が他の特定のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を有する還元酵素（即ち、改変型還元酵素）が優れた熱安定性を示すことを見い出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、 
１）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異を含む１つ以上のアミノ酸変異を有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列を有し、かつ、基質を還元する能力を有することを特徴とする酵素（以下、本発明酵素と記すこともある。）；
２）前記のアミノ酸変異が、１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異を含むことを特徴とする前項１記載の酵素；
３）前記のアミノ酸変異が、２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異を含むことを特徴とする前項１又は２記載の酵素；
４）前記のアミノ酸変異が、４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異を含むことを特徴とする前項１乃至３のいずれかの前項記載の酵素；
５）前記のアミノ酸変異が、２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異を含むことを特徴とする前項１乃至４のいずれかの前項記載の酵素；
６）前記のアミノ酸変異が、下記のアミノ酸変異群から選ばれるアミノ酸変異であることを特徴とする前項１記載の酵素；
＜アミノ酸変異群＞
１．(a)５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異との２つのアミノ酸変異
２．(a)５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異との２つのアミノ酸変異
３．(a)５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異との２つのアミノ酸変異
４．(a)５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異との２つのアミノ酸変異
５．(a)５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異と(c)２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異との３つのアミノ酸変異
６．(a)５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異と(c)４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異との３つのアミノ酸変異
７．(a)５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異と(c)２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異との３つのアミノ酸変異
８．(a)５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異と(c)４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異との３つのアミノ酸変異
９．(a)５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異と(c)２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異との３つのアミノ酸変異
１０．(a)５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異と(c)２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異との３つのアミノ酸変異
１１．(a)５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異と(c)２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異と(d)４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異との４つのアミノ酸変異
１２．(a)５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異と(c)２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異と(d)２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異との４つのアミノ酸変異
１３．(a)５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異と(c)４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異と(d)２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異との４つのアミノ酸変異
１４．(a)５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異と(c)４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異と(d)２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異との４つのアミノ酸変異
１５．(a)５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異と(c)２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異と(d)４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異と(e)２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異との５つのアミノ酸変異；
７）前項１乃至６のいずれかの前項記載の酵素が有するアミノ酸配列をコ−ドする塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド（以下、本発明遺伝子と記すこともある。）；
８）前項７記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とするベクタ−（以下、本発明ベクタ−と記すこともある。）；
９）酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸又は酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコ−ドする塩基配列を有するポリヌクレオチドを更に含有することを特徴とする前項８記載のベクタ−；
１０）前項７記載のポリヌクレオチド又は前項８若しくは９記載のベクタ−を含有することを特徴とする形質転換体（以下、本発明形質転換体と記すこともある。）；
１１）２−オキソ−４−フェニル酪酸エステルに、前項１０記載の形質転換体又はその処理物を作用させる工程を含むことを特徴とする（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルの製造方法（以下、本発明製造方法と記すこともある。）；
１２）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する酵素の改変方法であり、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、５６番目のグリシンをシステインに置換する工程を含むことを特徴とする方法（以下、本発明酵素改変方法と記すこともある。）；
１３）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコ−ドする塩基配列を有するポリヌクレオチドの改変方法であり、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコ−ドする塩基配列において、１６６番目から１６８番目までの、グリシンをコ−ドするコドンを、システインをコ−ドするコドンに置換する工程を含むことを特徴とする方法（以下、本発明遺伝子改変方法と記すこともある。）；
等を提供するものである。 
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、医農薬の有効成分となる化合物やその中間体、特に光学活性である化合物やその中間体等を製造する為の有機合成反応に利用される、熱安定性に優れた還元酵素等が提供可能となる。そして、本発明酵素を利用すれば、反応時間の短縮および反応効率の向上が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本明細書に記載される発明は記載されている特定の方法論、プロトコ−ル、及び、試薬に限定されず、可変であると考えられる。また、本明細書で用いる用語は単に特定の実施形態を記載するためのものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではないと考えられる。
特に断りの無い限り、本明細書で用いる全ての技術用語、及び、化学用語は、本発明が属する技術分野の熟練者に共通に理解されているものと同じ意味を持つ。本発明を実施又は試験する上で、本明細書に記載されているものと同様又は同等の方法、及び、材料のいずれを用いてもよいが、以下、好ましい方法、装置、及び、材料を記載する。
【０００９】
以下、更に詳細に本発明を説明する。
【００１０】
本出願において、例えば「G56C」とは、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、５６番目（「56」：アミノ酸配列のＮ末端からの位置番号）のグリシン（「G」：一文字表記）がシステイン（「C」：一文字表記）に置換されるアミノ酸変異を有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列を有する酵素を意味している。
【００１１】
本発明酵素において「基質を還元する能力」（以下、還元酵素活性と記すこともある。）は、例えば、水の存在下、酵素と、基質となるαケト酸（具体的には例えば、２−オキソ−４−フェニル酪酸エチル）及びＮＡＤＰＨの両者とを混合し、次いで当該混合物を３０℃で保温した後、得られた反応液中で消費されたＮＡＤＰＨの量を、当該反応液の３４０ｎｍにおける吸光度を指標に定量することにより測定することができる。
【００１２】
本発明において「熱安定性」とは、例えば、５０℃で１時間の保温処理を行った後の還元酵素活性の残存率が、同様に処理した野生型還元酵素の還元酵素活性の残存率よりも高いことを意味する。
【００１３】
本発明酵素は、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異を含む１つ以上のアミノ酸変異を有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列を有し、かつ、基質を還元する能力を有する。
尚、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、かつ、基質を還元する能力を有する酵素（野生型還元酵素）は、市販のヤマダジ−マ・ファリノサ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ  ｆａｒｉｎｏｓａ）ＩＦＯ０１９３株（独立行政法人  製品評価技術基盤機構から購入可能）由来の公知の還元酵素である。
【００１４】
本発明酵素のアミノ酸配列をコ−ドする塩基配列を有するポリヌクレオチド（即ち、本発明遺伝子と記すこともある。）を取得するには、例えば、以下の方法を用いればよい。
【００１５】
まず、野生型還元酵素のアミノ酸配列をコ−ドする塩基配列を有するポリヌクレオチド（以下、野生型遺伝子と記すこともある。）を取得する。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；モレキュラ−    クロ−ニング  第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、コ−ルドスプリングハ−バ−    ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）発行、１９８９年、等に記載される通常の遺伝子工学的手法に準じて、ヤマダジ−マ・ファリノサ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ  ｆａｒｉｎｏｓａ）ＩＦＯ０１９３株から取得することができる。具体的には、ヤマダジ−マ・ファリノサ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ  ｆａｒｉｎｏｓａ）ＩＦＯ０１９３株から「新  細胞工学実験プロトコ−ル」（東京大学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、１９９３年）に記載された方法に準じてｃＤＮＡライブラリ−を調製し、調製されたｃＤＮＡライブラリ−を鋳型として、且つ、適切なプライマ−を用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコ−ドする塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコ−ドする塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号２で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号２で示される塩基配列において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するポリヌクレオチド等を増幅することにより、本発明遺伝子を調製する。
ここで、ヤマダジ−マ・ファリノサ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ  ｆａｒｉｎｏｓａ）ＩＦＯ０１９３株由来のｃＤＮＡライブラリ−を鋳型として、且つ、配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマ−として用いてＰＣＲを行えば、配列番号２で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドが増幅される。増幅されたポリヌクレオチドを回収することにより、配列番号２で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（野生型遺伝子）を調製することができる。
【００１６】
次いで、部位特異的変異導入法に基づき、配列番号２で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（野生型遺伝子）に特定の部位特異的変異（尚、本発明での部位特異的変異は、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコ−ドする塩基配列において、１６６番目から１６８番目までの、グリシンをコ−ドするコドンを、システインをコ−ドするコドンに置換するような部位特異的変異を含む。）を導入することにより、本発明遺伝子を調製することができる。
ここで「部位特異的変異導入法」としては、例えば、  Ｏｌｆｅｒｔ  Ｌａｎｄｔ  ら（Ｇｅｎｅ  ９６  １２５−１２８  １９９０）、Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ３  １  Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．ａｎｄ  Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ，Ａ  Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、Ｖｌａｓｕｋら（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｉｎｏｕｙｅ，Ｍ．：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、Ｈｏｓ．Ｎ．Ｈｕｎｔら（Ｇｅｎｅ  ７７  ５１  １９８９）等の方法や、Ｍｕｔａｎ−Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（宝酒造社製）、ＴａＫａＲａ  Ｌａ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＮＥＮ社製）等の市販キットの利用を挙げることができる。 
【００１７】
具体的には例えば、Ｏｌｆｅｒｔ  Ｌａｎｄｔら（Ｇｅｎｅ  ９６  １２５−１２８  １９９０）の方法を用いて、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異を含む１つ以上のアミノ酸変異を有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列をコ−ドするポリヌクレオチドを調製するには、まず、配列番号２で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（野生型遺伝子）が組み込まれたベクタ−（ＤＮＡ）を、例えば、Ｊ．ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；モレキュラ−  クロ−ニング  第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、コ−ルドスプリング  ハ−バ−  ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）発行、１９８９年等に記載される方法に準じて調製する。
次いで、得られたベクタ−（ＤＮＡ）を鋳型にして、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列における５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸配列をコ−ドする塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）を片側のプライマ−として用い、配列番号３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをもう一方の側のプライマ−として用いて、ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅を行う。ここで、ＰＣＲ反応の条件としては、例えば、９４℃にて５分間保温した後、９４℃にて１分間、次いで５０℃にて２分間、更に７５℃にて３分間保温する処理を２０サイクル行い、最後に７５℃で８分間保温する条件を挙げることができる。このようにして増幅されたＤＮＡ断片を精製した後、得られたＤＮＡ断片に、配列番号２で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（野生型遺伝子）が組み込まれたベクタ−（ＤＮＡ）と、配列番号４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマ−とを加え、ＰＣＲ法によりＤＮＡ断片の増幅を行う。増幅されたＤＮＡ断片を、例えば、制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｂａＩで消化し、同様の制限酵素消化を行った配列番号２で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（野生型遺伝子）が組み込まれたベクタ−（ＤＮＡ）とライゲ−ション反応を行うことにより、目的とする本発明遺伝子を得ることができる。
【００１８】
本発明酵素としては、１つ以上のアミノ酸変異（例えば、１以上５以下のアミノ酸変異、好ましくは２以上５以下のアミノ酸変異、より好ましくは３以上５以下のアミノ酸変異、特に好ましくは４以上５以下のアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異）を含むが、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異の他に、他のアミノ酸変異（例えば、１以上４以下の他のアミノ酸変異、好ましくは２以上４以下の他のアミノ酸変異、より好ましくは３以上４以下の他のアミノ酸変異、４つの他のアミノ酸変異）を含むことができる。
【００１９】
前記の「他のアミノ酸変異」としては、例えば、（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異、（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異、（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異、（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異等を挙げることができる。
【００２０】
前記の「１つ以上のアミノ酸変異」としては、例えば、１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異等を挙げることができる。
【００２１】
前記の「１つのアミノ酸変異」としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異を挙げることができる。
【００２２】
前記の「２つのアミノ酸変異」としては、例えば、（１）(a)５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異との２つのアミノ酸変異、（２）(a)５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異との２つのアミノ酸変異、（３）(a)５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異との２つのアミノ酸変異、（４）(a)５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異との２つのアミノ酸変異等を挙げることができる。
【００２３】
前記の「３つのアミノ酸変異」としては、例えば、（１）(a)５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異と(c)２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異との３つのアミノ酸変異、（２）(a)５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異と(c)４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異との３つのアミノ酸変異、（３）(a)５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異と(c)２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異との３つのアミノ酸変異、（４）(a)５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異と(c)４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異との３つのアミノ酸変異、（５）(a)５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異と(c)２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異との３つのアミノ酸変異、（６）(a)５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異と(c)２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異との３つのアミノ酸変異、等を挙げることができる。
【００２４】
前記の「４つのアミノ酸変異」としては、例えば、（１）(a)５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異と(c)２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異と(d)４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異との４つのアミノ酸変異、（２）(a)５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異と(c)２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異と(d)２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異との４つのアミノ酸変異、（３）５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異と(c)４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異と(d)２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異との４つのアミノ酸変異、（４）(a)５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異と(c)４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異と(d)２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異との４つのアミノ酸変異等を挙げることができる。
【００２５】
前記の「５つのアミノ酸変異」としては、例えば、(a)５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と(b)１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異と(c)２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異と(d)４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異と(e)２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異との５つのアミノ酸変異等を挙げることができる。
【００２６】
本発明酵素を取得するには、本発明遺伝子を微生物等の宿主細胞中で発現させることができるベクタ−を調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより形質転換体を作製する。次いで作製された形質転換体を通常の細胞培養方法に従い培養すればよい。このようにして、本発明酵素を大量に製造し、取得することができる。
【００２７】
本発明ベクタ−は、本発明遺伝子を含有する。
本発明ベクタ−の調製は、本発明遺伝子を、本発明遺伝子が導入される宿主細胞において利用可能なベクタ−例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖でき、宿主細胞からの単離、精製が可能であり、検出可能なマ−カ−を持つベクタ−（以下、基本ベクタ−と記すこともある。）に通常の遺伝子工学的手法に準じて、組み込むことにより構築すればよい。
ここで「基本ベクタ−」としては、大腸菌を宿主細胞とする場合には、例えば、ベクタ−ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）、ファ−ジミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等を挙げることができる。また、出芽酵母を宿主細胞とする場合には、例えば、ベクタ−ｐＧＢＴ９、ｐＧＡＤ４２４、ｐＡＣＴ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等を挙げることができる。また、哺乳類動物細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等のベクタ−、ウシパピロ−マウイルスベクタ−ｐＢＰＶ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、ＥＢウイルスベクタ−ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等のウイルス由来の自律複製起点を含むベクタ−、ワクシニアウイルス等のウイルス等を挙げることができる。また、昆虫類動物細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスを挙げることができる。
尚、本発明ベクタ−を、自律複製起点を含むベクタ−（具体的には例えば、酵母用ベクタ−ｐＡＣＴ２、ウシパピロ−マウイルスベクタ−ｐＢＰＶ、ＥＢウイルスベクタ−ｐＣＥＰ４等）を用いて構築すると、当該ベクタ−は宿主細胞に導入された際にエピソ−ムとして細胞内に保持される。
【００２８】
本発明ベクタ−は、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸又は酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコ−ドする塩基配列を有するポリヌクレオチドを更に含有してもよい。このようなベクタ−を用いることにより、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸又は酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコ−ドする塩基配列を有するポリヌクレオチドを更に含有する形質転換体を作製することもできる。 
【００２９】
本発明遺伝子を微生物等の宿主細胞中で発現させることができるベクタ−を、宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより、形質転換体を作製する。次いで作製された形質転換体を通常の細胞培養方法に従い培養することにより、本発明酵素を大量に製造し、取得することができる。
本発明遺伝子を微生物等の宿主細胞中で発現させることができるベクタ−は、本発明遺伝子の上流に、微生物等の宿主細胞で機能可能なプロモ−タ−を機能可能な形で結合させ、これを上記のような基本ベクタ−に組み込むことにより調製すればよい。
ここで、「機能可能な形で結合させ（る）」とは、本発明遺伝子が導入される微生物等の宿主細胞において、プロモ−タ−の制御下に本発明遺伝子が発現されるように、当該プロモ−タ−と本発明遺伝子とを結合させることを意味する。宿主細胞で機能可能なプロモ−タ−としては、導入される宿主細胞内でプロモ−タ−活性を示すＤＮＡを挙げることができる。例えば、宿主細胞が大腸菌である場合には、大腸菌のラクト−スオペロンのプロモ−タ−（ｌａｃＰ）、トリプトファンオペロンのプロモ−タ−（ｔｒｐＰ）、アルギニンオペロンのプロモ−タ−（ａｒｇＰ）、ガラクト−スオペロンのプロモ−タ−（ｇａｌＰ）、ｔａｃプロモ−タ−、Ｔ７プロモ−タ−、Ｔ３プロモ−タ−、λファ−ジのプロモ−タ−（λ−ｐＬ、λ−ｐＲ）等を挙げることができる。また、宿主細胞が動物細胞や分裂酵母である場合には、例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモ−タ−、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモ−タ−、シミアンウイルス（ＳＶ４０）の初期又は後期プロモ−タ−、マウス乳頭腫ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモ−タ−等を挙げることができる。また、宿主細胞が出芽酵母である場合には、例えば、ＡＤＨ１プロモ−タ−（尚、ＡＤＨ１プロモ−タ−は、例えば、ＡＤＨ１プロモ−タ−及び同タ−ミネ−タ−を保持する酵母発現ベクタ−ｐＡＡＨ５  〔Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｕｎｄａｔｉｏｎ  から入手可能、Ａｍｍｅｒｅｒ  ら、Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１  ｐａｒｔ（ｐ．１９２−２０１）〕から通常の遺伝子工学的方法により調製することができる。）等を挙げることができる。
また、宿主細胞において機能するプロモ−タ−を予め保有する基本ベクタ−を使用する場合には、前記プロモ−タ−と本発明遺伝子とが機能可能な形で結合するように、上記のプロモ−タ−の下流に本発明遺伝子を挿入すればよい。例えば、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶ等である場合には、動物細胞で機能可能なプロモ−タ−の下流にクロ−ニング部位が設けられている。当該クロ−ニング部位に本発明遺伝子を挿入することにより得られるベクタ−を動物細胞へ導入することにより、当該動物細胞において本発明遺伝子を発現させることができる。これらのベクタ−には予めＳＶ４０の自律複製起点（ｏｒｉ）が組み込まれているため、ｏｒｉを欠失したＳＶ４０ゲノムで形質転換された培養細胞、例えば、ＣＯＳ細胞等に当該ベクタ−を導入すると、細胞内でベクタ−のコピ−数が非常に増大し、結果として当該ベクタ−に組み込まれた本発明遺伝子を大量発現させることもできる。また上記の酵母用ベクタ−ｐＡＣＴ２はＡＤＨ１プロモ−タ−を有しており、当該ベクタ−又はその誘導体のＡＤＨ１プロモ−タ−の下流に本発明遺伝子を挿入すれば、本発明遺伝子を、例えば、ＣＧ１９４５（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等の出芽酵母内で大量発現させることが可能なベクタ−が構築できる。 
【００３０】
宿主細胞としては、微生物の場合には、例えば、真核生物、原核生物等を挙げることができる。好ましくは、例えば、大腸菌等を挙げることができる。当該宿主細胞に、通常の遺伝子工学的方法により、上記のようなベクタ−を導入することにより、宿主細胞を形質転換することができる。
本発明ベクタ−を宿主細胞へ導入する方法は、宿主細胞に応じた通常の導入方法を適用すればよい。大腸菌を宿主細胞とする場合には、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；「  モレキュラ−・クロ−ニング  第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、コ−ルドスプリングハ−バ−ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ発行、１９８９年）等に記載される塩化カルシウム法、エレクトロポレ−ション法等の通常の方法を挙げることができる。また、哺乳類動物細胞又は昆虫類動物細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレ−ション法、リポフェクション法等の通常の遺伝子導入法を挙げることができる。また、酵母を宿主細胞とする場合には、例えば、Ｙｅａｓｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等で用いられるリチウム法の通常の方法を挙げることができる。尚、ウイルスをベクタ−として用いる場合には、上記のように一般的な遺伝子導入法によりウイルスのゲノムを宿主細胞に導入できるほか、本発明遺伝子の挿入されたウイルスのゲノムを含有するウイルス粒子を、宿主細胞へ感染させることによっても、当該ウイルスのゲノムを宿主細胞に導入することができる。
【００３１】
本発明形質転換体を選抜するには、例えば、本発明ベクタ−と同時にマ−カ−遺伝子が導入された宿主細胞を、マ−カ−遺伝子の性質に応じた方法によって培養すればよい。例えば、マ−カ−遺伝子が、宿主細胞に致死活性を示す選抜薬剤に対する薬剤耐性を付与する遺伝子である場合には、当該選抜薬剤が添加された培地を用いて、本発明ベクタ−が導入された宿主細胞を培養すればよい。薬剤耐性を付与する遺伝子と選抜薬剤との組み合わせとしては、例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子とネオマイシンとの組み合わせ、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子とハイグロマイシンとの組み合わせ、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子とブラストサイジンＳとの組み合わせ等をあげることができる。また、マ−カ−遺伝子が宿主細胞の栄養要求性を相補する遺伝子である場合には、当該栄養要求性に対応する栄養素を含まない最少培地を用いて、本発明ベクタ−が導入された細胞を培養すればよい。また本発明遺伝子を宿主細胞で発現させることが可能な本発明ベクタ−を導入した場合には、本発明酵素の酵素活性に基づく検出方法を用いることもできる。
【００３２】
本発明遺伝子が宿主細胞の染色体内に位置する本発明形質転換体を取得するには、例えば、まず本発明ベクタ−とマ−カ−遺伝子を有するベクタ−とを制限酵素等で消化することにより直鎖状にした後、これらを前述の方法で宿主細胞に導入する。次いで当該細胞を通常数週間培養した後、導入されたマ−カ−遺伝子の発現量に基づき目的とする形質転換体を選抜し取得すればよい。また、例えば、まず上記のような選抜薬剤を付与する遺伝子をマ−カ−遺伝子として有する本発明ベクタ−を前述の方法によって宿主細胞に導入する。次いで当該細胞を選抜薬剤が添加された培地で数週間以上継代培養した後、コロニ−状に生き残った選抜薬剤耐性クロ−ンを純化培養することにより、本発明遺伝子が宿主細胞の染色体に導入されてなる本発明形質転換体を選抜し取得することもできる。導入された本発明遺伝子が宿主細胞の染色体に組み込まれたことを確認するには、当該細胞のゲノムＤＮＡを通常の遺伝子工学的方法に準じて調製し、調製されたゲノムＤＮＡから、導入された本発明遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡをプライマ−やプロ−ブとしたＰＣＲ、サザンハイブリダイゼ−ション等の方法を利用して、前記本発明遺伝子の存在を検出すればよい。当該形質転換体は、凍結保存が可能であり必要に応じて起眠して使用することができるので、実験毎の形質転換体作製の手間を省くことができ、また、あらかじめ性質や取扱い条件の確認された形質転換体を用いて試験を実施することが可能となる。 
【００３３】
本発明遺伝子又は本発明ベクタ−を含有する形質転換体（即ち、本発明形質転換体）の培養は、通常の細胞培養方法によって行えばよい。
本発明形質転換体が微生物である場合には、例えば、当該形質転換体は、一般微生物における通常の培養に使用される炭素源や窒素源、有機ないし無機塩等を適宜含む各種の培地を用いて培養することができる。
【００３４】
炭素源としては、例えば、グルコ−ス、デキストリン、シュ−クロ−ス等の糖類、グリセロ−ル等の糖アルコ−ル、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸、動物油、植物油及び糖蜜が挙げられる。これらの炭素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
【００３５】
窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コ−ン・スティ−プ・リカ−（Corn Steep Liquor）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、アミノ酸類、硝酸ナトリウム等の無機酸のアンモニウム塩、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩及び尿素が挙げられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は多くの場合には炭素源としても使用することができる。これらの窒素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
【００３６】
有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びリン酸塩を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素一カリウム及びリン酸水素二カリウムが挙げられる。これらの有機塩及び／又は無機塩の培地への添加量は培養液に対して通常０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）程度である。
【００３７】
更に、tacプロモ−タ−、trcプロモ−タ−及びlacプロモ−タ−等のアロラクト−スで誘導されるタイプのプロモ−タ−と本発明遺伝子とが機能可能な形で接続されてなる遺伝子が導入されてなる形質転換体の場合には、本発明酵素の生産を誘導するための誘導剤として、例えば、isopropyl thio−β−D−galactoside（IPTG）を培地中に少量加えることもできる。
【００３８】
本発明形質転換体の培養は、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される方法に準じて行えばよい。例えば、試験管振盪式培養、往復式振盪培養、ジャ−ファ−メンタ−（Jar Fermenter）培養、タンク培養等の液体培養及び固体培養が挙げられる。
培養温度は、当該形質転換体が生育可能な範囲で適宜変更できるが、通常約１５℃〜約４０℃である。培地のｐHは約６〜約８の範囲が好ましい。培養時間は、培養条件によって異なるが通常約１日〜約５日が好ましい。
【００３９】
本発明形質転換体の培養物から本発明酵素を精製する方法としては、通常のタンパク質の精製において使用される方法を適用すればよい。例えば、次のような方法を挙げることができる。
【００４０】
まず、形質転換体の培養物から遠心分離等により細胞を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル処理、フレンチプレス処理等の物理的破砕法又は界面活性剤若しくはリゾチ−ム等の溶菌酵素を用いる化学的破砕法等によって破砕する。得られた破砕液から遠心分離、メンブレンフィルタ−濾過等により不純物を除去することにより無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クロマトグラフィ−、陰イオン交換クロマトグラフィ−、疎水クロマトグラフィ−、ゲルろ過クロマトグラフィ−、金属キレ−トクロマトグラフィ−等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって、本発明酵素を精製することができる。
クロマトグラフィ−に使用する担体としては、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、フェニル基若しくはブチル基を導入したセルロ−ス、デキストリン又はアガロ−ス等の不溶性高分子担体が挙げられる。市販の担体充填済カラムを用いることもでき、かかる市販の担体充填済カラムとしては、例えば、Q−Sepharose FF、Phenyl−Sepharose HP（商品名、いずれもアマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（商品名、東ソ−社製）等が挙げられる。
尚、本発明酵素を含む画分を選抜するには、例えば、本発明における還元酵素活性の存在有無又はその程度に基づき選抜すればよい。勿論、基質となるαケト酸（具体的には例えば、２−オキソ−４−フェニル酪酸エチル）を不斉還元して対応するヒドロキシ酸を優先的に生産する能力を測定することにより選抜してもよい。
【００４１】
本発明製造方法は、２−オキソ−４−フェニル酪酸エステルに、本発明形質転換体又はその処理物を作用させる工程を含む。
２−オキソ−４−フェニル酪酸エステルとしては、下記式（１）で示される化合物が例示される。
2011188799.tif 000002
（式中、Ｒ1は、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル等のＣ１−Ｃ８アルキル基を表す。）
２−オキソ−４−フェニル酪酸エステルとしては、具体的には例えば、２−オキソ−４−フェニル酪酸メチル、２−オキソ−４−フェニル酪酸エチル、２−オキソ−４−フェニル酪酸プロピル、２−オキソ−４−フェニル酪酸オクチル等を挙げることができる。これらのエステルは、例えば、Tetrahedron(1985) 41(2) 467−72に記載される方法又はこれに準じて製造すればよい。
（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルとしては、例えば、式（１）で示される化合物の２位のオキソ基が、不斉的に水酸基に還元された（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸のＣ１−Ｃ８アルキルエステル化合物を挙げることができる。
【００４２】
上記方法は、通常、水及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと記すこともある。）、又は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨと記すこともある。）の存在下に行われる。この際に用いられる水は、緩衝水溶液であってもよい。当該緩衝水溶液に用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム等の酢酸アルカリ金属塩及びこれらの混合物を挙げることができる。
【００４３】
上記方法においては、水に加えて有機溶媒を共存させることもできる。共存させることができる有機溶媒としては、例えば、ｔ−ブチルメチルエ−テル、ジイソプロプルエ−テル、テトラヒドロフラン等のエ−テル類、ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル等のエステル類、トルエン、ヘキサン、シクロへヘキサン、ヘプタン、イソオクタン等の炭化水素類、メタノ−ル、エタノ−ル、２−プロパノ−ル、ブタノ−ル、ｔ−ブチルアルコ−ル等のアルコ−ル類、ジメチルスルホキシド等の有機硫黄化合物、アセトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類及びこれらの混合物を挙げることができる。
【００４４】
上記方法における反応は、例えば、水、２−オキソ−４−フェニル酪酸エステル、及び、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨを、本発明酵素或いはそれを産生する形質転換体又はその処理物とともに、必要により更に有機溶媒等を含有した状態で、攪拌、振盪等により混合することにより行われる。
【００４５】
上記方法における反応時のｐＨは適宜選択することができるが、通常ｐＨ３〜１０の範囲である。また反応温度は適宜選択することができるが、原料及び生成物の安定性、反応速度の点から通常０〜６０℃の範囲である。
【００４６】
反応の終点は、例えば、反応液中の２−オキソ−４−フェニル酪酸エステルの量を液体クロマトグラフィ−等により追跡することにより決めることができる。反応時間は適宜選択することができるが、通常０．５時間から１０日間の範囲である。
【００４７】
反応液からの（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルの回収は、一般に知られている任意の方法で行えばよい。
例えば、反応液の有機溶媒抽出操作、濃縮操作等の後処理を、必要によりカラムクロマトグラフィ−、蒸留等を組み合わせて、行うことにより精製する方法を挙げることができる。
【００４８】
本発明酵素、それを産生する形質転換体又はその処理物は種々の形態で上記方法に用いることができる。
【００４９】
具体的な形態としては、例えば、本発明形質転換体の培養物、かかる形質転換体の処理物、無細胞抽出液、粗精製タンパク質、精製タンパク質等及びこれらの固定化物を挙げることができる。ここで、形質転換体の処理物としては、例えば、凍結乾燥形質転換体、有機溶媒処理形質転換体、乾燥形質転換体、形質転換体摩砕物、形質転換体の自己消化物、形質転換体の超音波処理物、形質転換体抽出物、形質転換体のアルカリ処理物を挙げることができる。また、固定化物を得る方法としては、例えば、担体結合法（シリカゲルやセラミック等の無機担体、セルロ−ス、イオン交換樹脂等に本発明酵素等を吸着させる方法）及び包括法（ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギ−ナンゲル）、アルギン酸ゲル、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に本発明酵素等を閉じ込める方法）を挙げることができる。
【００５０】
尚、本発明形質転換体を用いた工業的な生産を考慮すれば、未処理状態の形質転換体を用いる方法よりも当該形質転換体を死滅化させた処理物を用いる方法の方が製造設備の制限が少ないという点では好ましい。そのための死菌化処理方法としては、例えば、物理的殺菌法（加熱、乾燥、冷凍、光線、超音波、濾過、通電）や、化学薬品を用いる殺菌法（アルカリ、酸、ハロゲン、酸化剤、硫黄、ホウ素、砒素、金属、アルコ−ル、フェノ−ル、アミン、サルファイド、エ−テル、アルデヒド、ケトン、シアン、抗生物質）を挙げることができる。一般的には、これらの殺菌法のうちできるだけ本発明酵素の還元酵素活性を失活させず、且つ、反応系への残留、汚染等の影響が少ない処理方法を選択することが望ましい。
【００５１】
また、本発明製造方法は、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの存在下に行われ、２−オキソ−４−フェニル酪酸エステルの不斉還元反応の進行に伴い、当該ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨは、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ+と記す）又は酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰ+と記す）に変換される。変換により生じたＮＡＤ+又はＮＡＤＰ+は、ＮＡＤ+又はＮＡＤＰ+を還元型（ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ）に変換する能力を有するタンパク質により元のＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに戻すことができるので、上記方法の反応系内には、ＮＡＤ+又はＮＡＤＰ+をＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに変換する能力を有するタンパク質を共存させることもできる。
ＮＡＤ+又はＮＡＤＰ+を、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに変換する能力を有するタンパク質としては、例えば、グルコ−ス脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコ−ル脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等を挙げることができる。
また、ＮＡＤ+又はＮＡＤＰ+を、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに変換する能力を有するタンパク質がグルコ−ス脱水素酵素である場合には、反応系内にグルコ−ス等を共存させることにより当該タンパク質の活性が増強される場合もあり、例えば、反応液にこれらを加えてもよい。
また、当該タンパク質は、酵素そのものであってもよいし、また当該酵素を持つ微生物又は該微生物の処理物の形態で反応系内に共存していてもよい。更にまた、ＮＡＤ+又はＮＡＤＰ+を、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコ−ドする塩基配列を有する遺伝子を含む形質転換体又はその処理物であってもよい。ここで処理物とは、前述にある「形質転換体の処理物」と同等なものを意味する。
【００５２】
さらに、本発明の（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルの製造方法では、グルコ−ス脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコ−ル脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素及び有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等のようなＮＡＤ+又はＮＡＤＰ+を、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコ−ドする塩基配列を有する遺伝子を同時に保有する形質転換体を用いて行うこともできる。
この形質転換体において、両者遺伝子を宿主細胞へ導入する方法としては、例えば、単一である、両者遺伝子を含むベクタ−を宿主細胞に導入する方法、複製起源の異なる複数のベクタ−に両者遺伝子を別々に導入した組換ベクタ−により宿主細胞を形質転換する方法等を挙げることができる。更に、一方の遺伝子又は両者遺伝子を宿主細胞の染色体中に導入してもよい。
尚、単一である、両者遺伝子を含むベクタ−を宿主細胞に導入する方法としては、例えば、プロモ−タ−、タ−ミネ−タ−等の発現制御に関わる領域をそれぞれの両者遺伝子に連結して組換ベクタ−を構築したり、ラクト−スオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させるような組換ベクタ−を構築してもよい。
【００５３】
本発明酵素改変方法は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する酵素の改変方法であり、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、５６番目のグリシンをシステインに置換する工程を含む。
本発明酵素改変方法に含まれる工程は、前述の説明（例えば、本発明酵素及び本発明遺伝子の調製に関する説明）及び後述の実施例（例えば、本発明遺伝子の作製：部位特異的変異の導入）と同様な方法に準じて行なえばよい。
【００５４】
本発明遺伝子改変方法は、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコ−ドする塩基配列を有するポリヌクレオチドの改変方法であり、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコ−ドする塩基配列において、１６６番目から１６８番目までの、グリシンをコ−ドするコドンを、システインをコ−ドするコドンに置換する工程を含む。
本発明遺伝子改変方法に含まれる工程は、前述の説明（例えば、本発明酵素及び本発明遺伝子の調製に関する説明）及び後述の実施例（例えば、本発明遺伝子の作製：部位特異的変異の導入）と同様な方法に準じて行なえばよい。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例を挙げて更に詳細に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
遺伝子のクロ−ニング、プラスミドの構築の方法は「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆ａｍｐ；  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  ＩＳＢＮ  Ｏ−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載されている方法を参考として引用できる。以下に、クロ−ニング等の工程の詳細を説明する。
【００５６】
実施例１  （野生型還元酵素の遺伝子（即ち、野生型遺伝子）の調製）
（１−１）染色体ＤＮＡ（Ａ）の調製 
２本の５００ｍｌフラスコに培地（水１００ｍｌにグルコ−ス２ｇ、ポリペプトン０．５ｇ、酵母エキス０．３ｇ及び麦芽エキス０．３ｇを溶解し、２ＮのＨＣｌでｐＨを６に調整したもの）を各々１００ｍｌずつ入れ、１２１℃で１５分間滅菌した。ここに同組成の培地中で培養（３０℃、４８時間、振盪培養）したヤマダジ−マ・ファリノサ（Yamadazyma farinosa）ＩＦＯ１９３株の培養液を各々０．３ｍｌずつ加え、３０℃で７２時間振盪培養した。その後、得られた培養液を遠心分離（８０００rpm、１０分）し、生じた沈殿を集めた。この沈殿を０．８５％食塩水５０ｍｌで洗浄・回収することにより、３．６４ｇの湿菌体を得た。
得られた湿菌体から、QIAprep Genomic−tip System (Qiagen社製)を用いて細胞内ＤＮＡ（以下、染色体ＤＮＡ（Ａ）と記すこともある。）を得た。
【００５７】
（１−２）野生型還元酵素の遺伝子（即ち、野生型遺伝子）を含有するベクタ−の調製（ベクタ−ｐＴｒｃＲｙｆの構築）
（１）本発明ベクタ−の調製
配列番号３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマ−と配列番号４で示されるオリゴヌクレオチドプライマ−とをプライマ−に、前記染色体ＤＮＡ（Ａ）を鋳型にして下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。(ロシュ・ダイアグノスティック社製のExpand High Fidelity PLUS PCR Systemを使用)
【００５８】
［反応液組成］
ｃＤＮＡライブラリ−原液    １μｌ
ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ−ｍｉｘ）    ４μｌ
センスプライマ−（５０ｐｍｏｌ／μｌ）    ０．４μｌ
アンチセンスプライマ−（５０ｐｍｏｌ／μｌ）    ０．４μｌ
５ｘｂｕｆｆｅｒ（ｗｉｔｈ  ＭｇＣｌ）    １０μｌ
Expand High Fidelity PLUS Taq polymerase    ０．５μｌ  （２．５Ｕ）
超純水    ３３．７μｌ
【００５９】
［反応条件］
上記反応液組成の反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ９７００にセットし、９４℃（２分間）に加熱した後、９４℃（０．２５分間）−５５℃（０．５分間）−７２℃（１．５分間）のサイクルを１０回、次いで９４℃（０．２５分間）−５５℃（０．５分間）−７２℃（１．０分間＋５秒／サイクル）のサイクルを２０回行い、更に７２℃で７分間保持した。
【００６０】
得られたＰＣＲ反応液を一部とり、これをアガロ−スゲル電気泳動に供したところ、約１０００ｂｐのＤＮＡ断片のバンドが検出された。
残りのＰＣＲ反応液に２種類の制限酵素（NcoI及びXbaI）を加え、約１０００ｂｐのＤＮＡ断片を２重消化した後、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
一方、ベクタ−ｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia製）を２種類の制限酵素（NcoI及びXbaI）により２重消化した後、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
【００６１】
このようにして精製して得られた２種の酵素消化ＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガ−ゼでライゲ−ションした後、得られたライゲ−ション液でE．coli DH5αを形質転換した。
形質転換処理されたE．coli DH5αを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養した。形成されたコロニ−を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。得られた培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出されたプラスミドの各々の一部をNcoIとXbaIとの２種類の制限酵素により２重消化した後、酵素消化物を電気泳動に供したところ、取り出されたプラスミドには前記約１０００ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。（以下、このプラスミドを「ベクタ−ｐＴｒｃＲＹＦ」と記す。）
【００６２】
実施例２  （補酵素再生酵素の遺伝子の調製）
（２−１）酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコ−ドする塩基配列を有するポリヌクレオチドを調製するための準備
Bacillus megaterium ＩＦＯ１２１０８株を、滅菌したＬＢ培地１００ｍｌ中で培養することにより、菌体０．４ｇを得た。得られた菌体からQiagen Genomic Tip (Qiagen社製)を用い、それに付属のマニュアルに記載された方法に従って染色体ＤＮＡ（以下、染色体ＤＮＡ（Ｂ）と記す。）を精製した。
【００６３】
（２−２）酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコ−ドする塩基配列を有するポリヌクレオチドの調製
The Journal of Biological Chemistry Vol.264, No.11, 6381−6385(1989)に記載されたBacillus megaterium ＩＷＧ３由来のグルコ−ス脱水素酵素のアミノ酸配列をコ−ドする塩基配列を基にして、配列番号６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマ−と配列番号７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマ−とを合成した。
配列番号６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマ−と配列番号７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマ−とをプライマ−とし、且つ、前記染色体ＤＮＡ（Ｂ）を鋳型にして、以下の反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。(ロシュ・ダイアグノスティック社製のExpand High Fidelity PCR Systemを使用)
【００６４】
［反応液組成］
染色体ＤＮＡ原液    １μｌ
ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ−ｍｉｘ）    ０．４μｌ
プライマ−（２０ｐｍｏｌ／μｌ）    各０．７５μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（ｗｉｔｈ  ＭｇＣｌ）    ５μｌ
ｅｎｚ．ｅｘｐａｎｄＨｉＦｉ  （３．５ｘ１０３Ｕ／ｍｌ）    ０．３７５μｌ
超純水    ４１．７２５μｌ
【００６５】
［ＰＣＲ反応条件］
上記反応液組成の反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ    ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ    ＰＣＲ    Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９７℃（２分間）に加熱した後、９７℃（０．２５分間）−５５℃（０．５分間）−７２℃（１．５分間）のサイクルを１０回、次いで９７℃（０．２５分間）−５５℃（０．５分間）−７２℃（２．５分間）のサイクルを２０回、更に７２℃で７分間保持した。
【００６６】
得られたＰＣＲ反応液を一部とり、これをアガロ−スゲル電気泳動に供したところ、約９５０ｂｐのＤＮＡ断片のバンドが検出された。
得られたＰＣＲ反応液とInvitrogen社製TOPOTMTA cloningキットVer.Eとを用いて、ＰＣＲにより得られた約９５０ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐCR2.1−TOPOベクタ−の既存「PCR Product挿入サイト」にライゲ−ションした後、得られたライゲ−ション液でE．coli DH5αを形質転換した。
形質転換処理されたE．coli DH5αを、Ｘ−ｇａｌ４％水溶液３０μｌ及び０．１Ｍ IPTG３０μｌが塗布された、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養した。形成されたコロニ−のうち白いコロニ−を１個とり、このコロニ−を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３０℃、２４時間）。得られた培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出されたプラスミドの一部を制限酵素（EcoRI）で消化した後、酵素消化物を電気泳動に供したところ、取り出されたプラスミドには前記約９５０ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。（以下、このプラスミドを「ベクタ−ｐＳＤＧＤＨ１２」と記す。）
【００６７】
次に、ベクタ−ｐＳＤＧＤＨ１２に挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。その結果を配列番号８に示す。 尚、ベクタ−に挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の解析は、Dye Terminator Cycle sequencing FS ready Reaction Kit（パ−キンエルマ−製）を用いてベクタ−ｐＳＤＧＤＨ１２を鋳型としてシ−クエンス反応を行い、得られたＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシ−ケンサ−373A（パ−キンエルマ−製）で解析することにより行った。
【００６８】
得られたベクタ−ｐＳＤＧＤＨ１２のＤＮＡを２種類の制限酵素（ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ）により２重消化した後、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。一方、ベクタ−ｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia製）を２種類の制限酵素（ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ）により２重消化した後、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
【００６９】
このようにして精製して得られた２種の酵素消化ＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガ−ゼでライゲ−ションした後、得られたライゲ−ション液でE．coli DH5αを形質転換した。
形質転換処理されたE．coli DH5αを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養した。形成されたコロニ−を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。得られた培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出されたプラスミドの各々の一部をＢａｍＨＩとＸｂａＩとの２種類の制限酵素により２重消化した後、酵素消化物を電気泳動に供したところ、取り出されたプラスミドには前記約９５０ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。以下、このプラスミドを「ベクタ−ｐＴｒｃＳＤＧＤＨ１２」と記す。
【００７０】
実施例３  （本発明遺伝子の作製：部位特異的変異の導入）
（３−１）  部位特異的変異導入操作
配列番号２で示される塩基配列を基にして、２５番目のスレオニン、２７番目のトリプトファン、４２番目のヒスチジン、５６番目のグリシン、１１５番目のバリンを、各々２５番目のアミノ酸はセリンに、２７番目のアミノ酸はアルギニンに、４２番目のアミノ酸はロイシンに、５６番目のアミノ酸はシステインに、１１５番目のアミノ酸はイソロイシンに変換するための変異プライマ−として、配列番号５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７に示すように、各アミノ酸に対応する各種合成オリゴヌクレオチド（変異プライマ−）を合成した。アミノ酸置換部位と対応する配列番号及び塩基配列を表１に示す。
【００７１】
【表１】
2011188799.tif 000003
【００７２】
配列番号１４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマ−に用いて、前記（１−２）で精製されたベクタ−ｐＴｒｃＲＹＦを鋳型にして、以下の反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（Ａ）と記す。
【００７３】
［反応液組成］
ｐＴｒｃＲＹＦベクタ−溶液    １．７μｌ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属）    １μｌ
センスプライマ−（５０μＭ）    ０．４μｌ
アンチセンスプライマ−（５０μＭ）    ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属）    ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ  （上記Ｋｉｔに付属）    １μｌ
超純水    ４１．５μｌ
【００７４】
［ＰＣＲ反応条件］
上記反応液組成の反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。
【００７５】
得られたＰＣＲ反応液（Ａ）に、ＤｐｎＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換した。
【００７６】
また、配列番号５と９、配列番号１０と１１、配列番号１２と１３、又は、配列番号１６と１７、とで示される塩基配列を有する２種類のオリゴヌクレオチドの組合せをプライマ−に用いて、上記の反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ反応液の各々に、ＤｐｎＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液の各々を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換した。
【００７７】
（３−２）  変異体の塩基配列決定
（３−１）で得られた形質転換体の各々からベクタ−を抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクタ−（本発明ベクタ−であるＧ５６Ｃ）を含有する形質転換体（即ち、本発明形質転換体）及び他の変異型ベクタ−（Ｔ２５Ｓ、Ｗ２７Ｒ、Ｈ４２Ｌ、Ｖ１１５Ｉ）を含有する形質転換体を取得した。
【００７８】
実施例４  （２重変異型遺伝子の作製）
（４−１）  ２重変異型ベクタ−Ｔ２５ＳＷ２７Ｒ（参考例）の作製
配列番号１８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマ−に用いて、前記（１−２）で精製されたベクタ−ｐＴｒｃＲＹＦを鋳型にして、以下の反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（Ｂ）と記す。
【００７９】
［反応液組成］
鋳型ベクタ−溶液    １．７μｌ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属）    １μｌ
センスプライマ−（５０μＭ）    ０．４μｌ
アンチセンスプライマ−（５０μＭ）    ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属）    ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ  （上記Ｋｉｔに付属）    １μｌ
超純水    ４１．５μｌ
【００８０】
［ＰＣＲ反応条件］
上記反応液組成の反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。
【００８１】
得られたＰＣＲ反応液（Ｂ）に、ＤｐｎＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換した。
【００８２】
（４−２）  変異体の塩基配列決定
（４−１）で得られた形質転換体からベクタ−を抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの変異が導入されていることを確認した。このようにして、２重変異型ベクタ−Ｔ２５ＳＷ２７Ｒ（参考例）を有する形質転換体を取得した。
【００８３】
（４−３）  変異型ベクタ−Ｔ２５ＳＨ４２Ｌ（参考例）の作製
配列番号１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマ−に用いて、前記（３−２）で精製されたベクタ−Ｔ２５Ｓを鋳型にして、以下の反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（Ｃ）と記す。
【００８４】
［反応液組成］
鋳型ベクタ−溶液    １．７μｌ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属）    １μｌ
センスプライマ−（５０μＭ）    ０．４μｌ
アンチセンスプライマ−（５０μＭ）    ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属）    ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ  （上記Ｋｉｔに付属）    １μｌ
超純水    ４１．５μｌ
【００８５】
［ＰＣＲ反応条件］
上記反応液組成の反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。
【００８６】
得られたＰＣＲ反応液（Ｃ）に、ＤｐｎＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換した。
【００８７】
（４−４）  変異体の塩基配列決定
（４−３）で得られた形質転換体からベクタ−を抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの変異が導入されていることを確認した。このようにして、２重変異型ベクタ−Ｔ２５ＳＨ４２Ｌ（参考例）を有する形質転換体を取得した。
【００８８】
（４−５）  ２重変異型ベクタ−（Ｔ２５ＳＧ５６Ｃ（本発明）、Ｗ２７ＲＧ５６Ｃ（本発明）、Ｈ４２ＬＧ５６Ｃ（本発明）、Ｇ５６ＣＶ１１５Ｉ（本発明）、Ｗ２７ＲＨ４２Ｌ（参考例）、Ｈ４２ＬＶ１１５Ｉ（参考例）の作製）
鋳型ベクタ−とプライマ−との組合せを表２に示した。前記（４−３）及び（４−４）と同様な方法で、各々の２重変異型ベクタ−（本発明ベクタ−であるＴ２５ＳＧ５６Ｃ、Ｗ２７ＲＧ５６Ｃ、Ｈ４２ＬＧ５６Ｃ、Ｇ５６ＣＶ１１５Ｉ）を有する形質転換体（即ち、本発明形質転換体）を各々取得した。
【００８９】
【表２】
2011188799.tif 000004
【００９０】
実施例５  （３重変異型遺伝子の作製）
（５−１）  部位特異的変異導入操作
配列番号１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマ−に用いて、前記（４−２）で精製されたベクタ−Ｔ２５ＳＷ２７Ｒを鋳型にして、以下の反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（Ｄ）と記す。
【００９１】
［反応液組成］
鋳型ベクタ−溶液    １．７μｌ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属）    １μｌ
センスプライマ−（５０μＭ）    ０．４μｌ
アンチセンスプライマ−（５０μＭ）    ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属）    ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ  （上記Ｋｉｔに付属）    １μｌ
超純水    ４１．５μｌ
【００９２】
［ＰＣＲ反応条件］
上記反応液組成の反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。
【００９３】
得られたＰＣＲ反応液（Ｄ）に、ＤｐｎＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換した。
【００９４】
（５−２）  変異体の塩基配列決定
（５−１）で得られた形質転換体からベクタ−を抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの変異が導入されていることを確認した。このようにして、３重変異型ベクタ−Ｔ２５ＳＷ２７ＲＨ４２Ｌ（参考例）を有する形質転換体を取得した。
【００９５】
（５−３）  ３重変異型ベクタ−（Ｔ２５ＳＷ２７ＲＧ５６Ｃ（本発明）、Ｔ２５ＳＨ４２ＬＧ５６Ｃ（本発明）、Ｔ２５ＳＧ５６ＣＶ１１５Ｉ（本発明）、Ｗ２７ＲＨ４２ＬＧ５６Ｃ（本発明）、Ｗ２７ＲＧ５６ＣＶ１１５Ｉ（本発明）、Ｈ４２ＬＧ５６ＣＶ１１５Ｉ（本発明））の作製
鋳型ベクタ−とプライマ−との組合せを表３に示した。前記（５−１）及び（５−２）と同様な方法で、各々の３重変異型ベクタ−（本発明ベクタ−であるＴ２５ＳＷ２７ＲＧ５６Ｃ、Ｔ２５ＳＨ４２ＬＧ５６Ｃ、Ｔ２５ＳＧ５６ＣＶ１１５Ｉ、Ｗ２７ＲＨ４２ＬＧ５６Ｃ、Ｗ２７ＲＧ５６ＣＶ１１５Ｉ、Ｈ４２ＬＧ５６ＣＶ１１５Ｉ）を有する形質転換体（即ち、本発明形質転換体）を各々取得した。
【００９６】
【表３】
2011188799.tif 000005
【００９７】
実施例６  （４重変異型遺伝子の作製）
（６−１）  部位特異的変異導入操作
配列番号１４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマ−に用いて、前記（５−２）で精製されたベクタ−Ｔ２５ＳＷ２７ＲＨ４２Ｌを鋳型にして、以下の反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（Ｅ）と記す。
【００９８】
［反応液組成］
鋳型ベクタ−溶液    １．７μｌ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属）    １μｌ
センスプライマ−（５０μＭ）    ０．４μｌ
アンチセンスプライマ−（５０μＭ）    ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属）    ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ  （上記Ｋｉｔに付属）    １μｌ
超純水    ４１．５μｌ  
【００９９】
［ＰＣＲ反応条件］
上記反応液組成の反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。
【０１００】
得られたＰＣＲ反応液（Ｅ）に、ＤｐｎＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換した。
【０１０１】
（６−２）  変異体の塩基配列決定
（６−１）で得られた形質転換体からベクタ−を抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの変異が導入されていることを確認した。このようにして、４重変異型ベクタ−（本発明ベクタ−であるＴ２５ＳＷ２７ＲＨ４２ＬＧ５６Ｃ）を有する形質転換体（即ち、本発明形質転換体）を取得した（表４参照）。
【０１０２】
（６−３）  ４重変異型ベクタ−（Ｔ２５ＳＷ２７ＲＧ５６ＣＶ１１５Ｉ、Ｔ２５ＳＨ４２ＬＧ５６ＣＶ１１５Ｉ、Ｗ２７ＲＨ４２ＬＧ５６ＣＶ１１５Ｉ）の作製
鋳型ベクタ−とプライマ−との組合せを表４に示した。前記（６−１）及び（６−２）と同様な方法で、各々の４重変異型ベクタ−（本発明ベクタ−であるＴ２５ＳＷ２７ＲＧ５６ＣＶ１１５Ｉ、Ｔ２５ＳＨ４２ＬＧ５６ＣＶ１１５Ｉ、Ｗ２７ＲＨ４２ＬＧ５６ＣＶ１１５Ｉ）を有する形質転換体（即ち、本発明形質転換体）を各々取得した（表４参照）。
【０１０３】
【表４】
2011188799.tif 000006
【０１０４】
実施例７  （５重変異型遺伝子の作製）
（７−１）  部位特異的変異導入操作
配列番号１６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマ−に用いて、前記（６−２）で精製されたベクタ−Ｔ２５ＳＷ２７ＲＨ４２ＬＧ５６Ｃを鋳型にして、以下の反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（Ｆ）と記す。
【０１０５】
鋳型ベクタ−溶液    １．７μｌ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属）    １μｌ
センスプライマ−（５０μＭ）    ０．４μｌ
アンチセンスプライマ−（５０μＭ）    ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属）    ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ  （上記Ｋｉｔに付属）    １μｌ
超純水    ４１．５μｌ  
【０１０６】
［ＰＣＲ反応条件］
上記反応液組成の反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。
【０１０７】
得られたＰＣＲ反応液（Ｅ）に、ＤｐｎＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属）を１μｌ添加後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換した。
【０１０８】
（７−２）  変異体の塩基配列決定
（７−１）で得られた形質転換体からベクタ−を抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの変異が導入されていることを確認した。このようにして、５重変異型ベクタ−（本発明ベクタ−であるＴ２５ＳＷ２７ＲＨ４２ＬＧ５６ＣＶ１１５Ｉ）を有する形質転換体（即ち、本発明形質転換体）を取得した。
【０１０９】
実施例８  本発明遺伝子及び補酵素再生酵素遺伝子を含有する形質転換体の調製（ベクタ−（ｐＴｒｃＴ２５ＳＷ２７ＲＧ５６ＣＶ１１５Ｉ／Ｇ（本発明）、ｐＴｒｃＴ２５ＳＨ４２ＬＧ５６ＣＶ１１５Ｉ／Ｇ（本発明）、ｐＴｒｃＷ２７ＲＨ４２ＬＧ５６ＣＶ１１５Ｉ／Ｇ（本発明）、ｐＴｒｃＴ２５ＳＷ２７ＲＨ４２ＬＧ５６ＣＶ１１５Ｉ／Ｇ（本発明））の構築）
【０１１０】
（８−１）  ベクタ−ｐＴｒｃＴ２５ＳＷ２７ＲＧ５６ＣＶ１１５Ｉ／Ｇ（本発明）の調製
配列番号３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ＮｃｏＩ含む）と配列番号２０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ＢａｍＨＩ含む）とをプライマ−に用いて、前記（６−３）で精製された変異型遺伝子を含むベクタ−Ｔ２５ＳＷ２７ＲＧ５６ＣＶ１１５Ｉを鋳型にして、以下の反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。（ロシュ・ダイアグノスティック社製のＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを使用）
【０１１１】
［反応液組成］
鋳型ベクタ−液    １μｌ
ｄＮＴＰ−ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属）    １μｌ
センスプライマ−（５０μＭ）    ０．４μｌ
アンチセンスプライマ−（５０μＭ）    ０．４μｌ
５ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属）    １０μｌ
ｅｎｚ．ｅｘｐａｎｄＨｉＦｉ（上記Ｋｉｔに付属）    ０．５μｌ
超純水    ３６．７μｌ
【０１１２】
［ＰＣＲ反応条件］
上記反応液組成の反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９４℃（２分間）に加熱した後、９４℃（１０秒間）−５５℃（０．５分間）−７２℃（１分間）のサイクルを２５回した後、７２℃で７分間保持した。
【０１１３】
ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を２種類の制限酵素（ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ）により２重消化した後、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。一方、ベクタ−ｐＴｒｃＳＤＧＤＨ１２を２種類の制限酵素（ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ）により２重消化した後、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
【０１１４】
このようにして精製して得られた２種の酵素消化ＤＮＡ断片の各々を、Ｔ４  ＤＮＡリガ−ゼでライゲ−ションした後、得られたライゲ−ション液でE．coli DH5αを形質転換した。
形質転換処理されたE．coli DH5αを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養した。形成されたコロニ−を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、２４時間）。得られた培養菌体の各々からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出されたプラスミドの各々の一部をＮｃｏＩとＢａｍＨＩとの２種類の制限酵素により２重消化した後、酵素消化物を電気泳動に供したところ、取り出されたプラスミドには前記約１０００ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。以下、このベクタ−を「ベクタ−ｐＴｒｃＴ２５ＳＷ２７ＲＧ５６ＣＶ１１５Ｉ／Ｇ」（本発明）と記す。
【０１１５】
（８−２）  ４重変異型ベクタ−（ｐＴｒｃＴ２５ＳＨ４２ＬＧ５６ＣＶ１１５Ｉ／Ｇ（本発明））、４重変異型ベクタ−（ｐＴｒｃＷ２７ＲＨ４２ＬＧ５６ＣＶ１１５Ｉ／Ｇ（本発明））、５重変異型ベクタ−（ｐＴｒｃＴ２５ＳＷ２７ＲＨ４２ＬＧ５６ＣＶ１１５Ｉ／Ｇ（本発明））の調製
鋳型ベクタ−を各々、Ｔ２５ＳＨ４２ＬＧ５６ＣＶ１１５Ｉ、Ｗ２７ＲＨ４２ＬＧ５６ＣＶ１１５Ｉ、Ｔ２５ＳＷ２７ＲＨ４２ＬＧ５６ＣＶ１１５Ｉとし、前記（８−１）と同様な方法で、各々の変異型ベクタ−（本発明ベクタ−であるｐＴｒｃＴ２５ＳＨ４２ＬＧ５６ＣＶ１１５Ｉ／Ｇ、ｐＴｒｃＷ２７ＲＨ４２ＬＧ５６ＣＶ１１５Ｉ／Ｇ、ｐＴｒｃＴ２５ＳＷ２７ＲＨ４２ＬＧ５６ＣＶ１１５Ｉ／Ｇ）を有する形質転換体（即ち、本発明形質転換体）を取得した。
【０１１６】
実施例９  （本発明酵素の熱安定性）
実施例３〜７で得られた１６種類の本発明形質転換体を、０．１ｍＭのＩＰＴＧ及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、これを３７℃で２４時間振盪培養した。培養後、得られた培養液を遠心分離（８０００×ｇ、５分）することにより、沈殿として湿菌体を回収した。回収された湿菌体に１ｍｌの０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えた後、得られた混合物に含まれる菌体をガラスビ−ズを用いて破砕した。得られた破砕液を遠心分離（１２０００×ｇ、１０分）することにより、上清液を粗酵素液として得た。
得られた粗酵素液の還元酵素活性が略同じになるように、粗酵素液を０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈した後、５０℃及び５５℃で１時間保温した後、残存する還元酵素活性を測定した。測定された還元酵素活性の値を、４℃で保存された本発明酵素の還元酵素活性の値（対照）を１００％とした相対値（還元酵素活性の残存率）を算出した。
尚、還元酵素活性の測定方法は、以下のとおりであった。基質として２−オキソ−４−フェニル酪酸エチルを用いた。具体的には、２．７ｍＭの２−オキソ−４−フェニル酪酸エチル液を１５０μｌ、希釈した粗酵素液を１０μｌ、０．５ｍＭのＮＡＤＰＨ液を４０μｌ、を混合した。得られた混合物を３０℃で保温した後、得られた反応液中で消費されたＮＡＤＰＨ量を、当該反応液の３４０ｎｍにおける吸光度を指標に定量することにより測定した。還元酵素活性は１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨを酸化させる酵素量を１ユニットとした。その結果を表５に示す。 
【０１１７】
【表５】
2011188799.tif 000007
【０１１８】
実施例１０  （本発明形質転換体の調製及び還元反応）
実施例８で得られたベクタ−ｐＴｒｃＴ２５ＳＷ２７ＲＧ５６ＣＶ１１５Ｉ／Ｇを含むＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１形質転換体を、０．１ｍＭのＩＰＴＧ及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（１００ｍｌ）に接種し、これを３７℃で２４時間振盪培養した。培養後、得られた培養液を遠心分離（８０００×ｇ、１０分）することにより、沈殿として湿菌体を回収した。回収された湿菌体約０．９ｇを得た。
２−オキソ−４−フェニル酪酸エチルを３．０ｇ、前記湿菌体を０．９ｇ、ＮＡＤＰ＋を３．０ｍｇ、グルコ−スを４．５ｇ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３０ｍｌ及び酢酸ブチルを６．０ｇ、を混合して得られた混合物を、３０℃で９時間攪拌した。尚、攪拌中は前記混合物のｐＨが７．０となるように２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液を徐々に前記混合物に加えた。次いで、前記混合物に酢酸エチルを５０ｍｌ添加した後、これを遠心分離することにより、有機層を得た。この有機層を、硫酸マグネシウムにて脱水した後、酢酸ブチル及び酢酸エチルを留去することにより、２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルを２．５ｇ得た。得られた２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルの光学純度を測定したところ（Ｒ）体が９９ ％ｅ．ｅ．であった。
【０１１９】
（含量分析条件）
カラム：ＤＢ−１（０．５３ｍｍ×３０ｍ、１．５μｍ）（Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）
カラム温度：５０℃（０分）→４℃／分→１７０℃（０分）→３０℃／分→２９０℃（４分）
キャリア−ガス：ヘリウム（カラム流量：１０ｍｌ／分）
検出器：ＦＩＤ
【０１２０】
（光学純度測定条件）
カラム：Ｃｈｉｒａｓｉｌ−Ｄｅｘ−ＣＢ（０．３２ｍｍ×２５ｍ、０．２５μｍ）（アステック社製）
カラム温度：１００℃（０分）→２℃／分→１８０℃（０分）
キャリア−ガス：ヘリウム（圧力５５Ｋｐａ）
検出器：ＦＩＤ
スプリット比：１/５０
尚、生成物の絶対立体配置は（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルの標品と比較することにより決定した。
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
本発明により、医農薬の有効成分となる化合物やその中間体、特に光学活性である化合物やその中間体等を製造する為の有機合成反応に利用される、熱安定性に優れた還元酵素等が提供可能となる。そして、本発明酵素を利用すれば、反応時間の短縮および反応効率の向上が可能となる。
［配列表フリ−テキスト］
【０１２２】
配列番号：３に記載される塩基配列は、野生型遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用プライマ−
配列番号：４に記載される塩基配列は、野生型遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用プライマ−
配列番号：５に記載される塩基配列は、変異型遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用プライマ−
配列番号：６に記載される塩基配列は、補酵素再生酵素の遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用プライマ−
配列番号：７に記載される塩基配列は、補酵素再生酵素の遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用プライマ−
配列番号：９に記載される塩基配列は、変異型遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用プライマ−
配列番号：１０に記載される塩基配列は、変異型遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用プライマ−
配列番号：１１に記載される塩基配列は、変異型遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用プライマ−
配列番号：１２に記載される塩基配列は、変異型遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用プライマ−
配列番号：１３に記載される塩基配列は、変異型遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用プライマ−
配列番号：１４に記載される塩基配列は、変異型遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用プライマ−
配列番号：１５に記載される塩基配列は、変異型遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用プライマ−
配列番号：１６に記載される塩基配列は、変異型遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用プライマ−
配列番号：１７に記載される塩基配列は、変異型遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用プライマ−
配列番号：１８に記載される塩基配列は、変異型遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用プライマ−
配列番号：１９に記載される塩基配列は、変異型遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用プライマ−
配列番号：２０に記載される塩基配列は、変異型遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用プライマ−
【配列表】
2011188799000001.app