(57)【要約】 【課題】  性分化期のとらふぐに食品の作用で、ストレスを与え、温度刺激受容体Transient Receptor Potentialを介して、内在性コルチゾルを増加させ、Ｆｏｘ１２遺伝子発現を抑制、さらにアロマターゼ遺伝子の発現が抑制させ、内在性エストロゲンの産生を減少させ、生殖腺の雄化を高率で誘導させることを目的とする。【解決手段】魚が卵から性決定するまでに、魚にストレス性刺激を与え、生殖腺の雄化を高率で誘導することを特徴とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚が卵から性決定するまでに、ストレスを与える食品を飼育水に一定の濃度で添加することにより魚にストレスを与え、生殖腺の雄化誘導をする方法。
【請求項２】
魚が卵から性決定するまでに、ストレスを与える食品を飼料に一定の濃度で添加することにより魚にストレスを与え、生殖腺の雄化誘導をする方法。
【請求項３】
上記食品がビタミンＫであり、このビタミンＫを１０マイクロｇ/Ｌ前後程の濃度として添加することにより魚にストレスを与え、生殖腺の雄化誘導を特徴とする上記請求項１又は２に記載の魚の雄化誘導方法。
【請求項４】
上記食品が胡椒など由来のピペリンであり、このピペリンを１〜１０マイクロｇ/Ｌ程の濃度として添加することにより魚にストレスを与え、生殖腺の雄化誘導を特徴とする上記請求項１又は２に記載の魚の雄化誘導方法。
【請求項５】
上記食品が唐辛子など由来するカプサイシンであり、このカプサイシンを１０〜１００マイクロｇ/Ｌ程の濃度として添加することにより魚にストレスを与え、
生殖腺の雄化誘導を特徴とする上記請求項１又は２に記載の魚の雄化誘導方法。
【請求項６】
上記食品が野菜など由来のカロテンであり、このカロテンを１マイクロｇ/Ｌ前後程の濃度として添加することにより魚にストレスを与え、生殖腺の雄化誘導を特徴とする上記請求項１又は２に記載の魚の雄化誘導方法。
【請求項７】
魚が卵から性決定するまでに、魚にストレスを与え、温度刺激受容体Transient Receptor Potentialを介して、生体内のコルチゾルを増加させ、Ｆｏｘ１２を抑制、さらにアロマターゼを抑制させることにより、内在性エストロゲンの産生が減少されることによる生殖腺の雄化誘導を特徴とする魚の雄化誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品を飼育水に対して一定の濃度で添加し、又は一定の濃度で飼料に添加し、稚仔魚にストレスを与え飼育し、性分化期におけるそれらの生殖腺を高率で雄化させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
とらふぐは、我が国では北海道南部から鹿児島までの太平洋沿岸、日本海沿岸大陸側ではウラジオストック、朝鮮半島、中国大陸、台湾までの日本海、渤海、黄海、東シナ海に分布している。我が国における主な産卵場としては、不知火海湾口、有明海湾口、福岡湾口、関門海峡一帯、尾道周辺海域、備讃瀬戸、伊勢湾口安乗沖、若狭湾、能登島および秋田・天王町沿岸などが知られている。産卵期は南方が早く北方が遅い傾向にあり、九州西岸は３月下旬〜５月中旬、瀬戸内海では４月下旬〜５月、伊勢湾口部で４月上旬〜下旬、若狭湾で４月〜５月である。九州から伊勢湾口にかけての産卵水温は１４〜１８℃、産卵床は、流速は速く、殻混じりの細砂〜粗れきが含まれる推進１０〜５０ｍの海底に形成される。とらふぐは、雌１尾に対し複数の雄が関与するといった産卵行動を示し、産卵は１
回あるいは極めて短期間に完了し、放卵後雌は産卵場を去るが、雄は産卵場に留まり複数の産卵に関与する。
【０００３】
卵は球形の沈性粘着卵であり、孵化までに７〜１２日を要す。生殖腺原基は孵化後７日後には形成され、卵巣の分化は孵化後４５〜５０日、精巣の分化は孵化後５５日以降に判別できる。仔・稚漁期は、産卵場近くの淡水の影響の強い汽水域に集まり、稚漁期には次第に沖へ行き、それ以降さらに沖合いへ移動する。その後広域の回遊を行い、有明海での標識漂流結果では、当歳魚は越年後には五島灘を経て、玄界灘にまで移動し、一部は日本海を北上し、韓国沿岸域での採補例もあるなど広域的な回遊の実態が確認されている。また、尾道周辺海域を産卵場とする群では、産卵期に放流した成魚が翌年再び同じ産卵場に回帰することが標識放流試験結果により証明されている。
【０００４】
とらふぐは、全ゲノムＤＮＡ配列の解読がされている海産魚としても知られており、バイテク技術が応用可能な魚種とされている。しかし、世代交代の期間が２〜３年必要とされるため、性決定や性分化の機構については不明な点が多い。これまでの研究により、とらふぐの卵に紫外線照射精子を媒精すると、雌性発生半数体が生じるが、これらは奇形で生存できない。そこで、受精後５分あるいは３０分に０℃、４５分間の低温処理あるいは３０℃、５分間の高温処理を卵に加えたところ、生存性の雌性発生二倍体が得られた。これらの魚のアコニット酸ヒドラターゼ（ＡＨ）とイソクエン酸脱水素酵素（ＩＤＨＰ）について電気泳動分析を行ったところ、各酸素支配遺伝子座において二種類のホモ接合遺伝子型の他、遺伝子・動原体間組換えによるヘテロ接合遺伝子型が見られた。よって、得ら
れた雌性発生二倍体は、第二極体放出阻止により倍化したものと判断される。対照の雌雄比がほぼ１：１であるのに対し、雌性発生魚の９３％が雌であったことから、とらふぐは雄性ヘテロ（ＸＸ−ＸＹ）型と考えられている。また、天然でも雌雄同体の個体が採取されているので、他の魚種と同様に環境要因により個体の性が影響を受けることが予想される。ヒラメ・トウゴロウイワシ・シクリッドに温度依存的性決定が見られ、いずれの種でも高温では生まれてくる子の性比が雄に、低温下では雌に偏ることが知られている。しかしながら、とらふぐにおいては２９℃まで温度を上げても性比に偏りは見られず、３２℃まで上げると生殖細胞が死滅し貧弱な生殖腺を持つとらふぐが育つことになった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平５−１１１３７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
とらふぐの性分化期にアロマターゼと呼ばれる女性ホルモン（エストロゲン）合成酵素の阻害剤（ファドロゾール）を添加したエサ（５００から１０００μｇ／ｇ）を給餌すると、卵巣腔の形成が抑制され、結果として雄とおもわれるとらふぐ集団が得られている。ファドロゾールはヒトでは、乳癌細胞の増殖を抑制する薬効を持つ経口投与薬として用いられている。上記の結果からとらふぐでも他魚種と同様に生殖腺の性分化期にエストロゲンの合成が始まっていることが明らかになった。いっぽう、とらふぐを用いた外因性ホルモン（メチルテストステロンあるいはエストロゲン投与実験では、処理した個体はすべて生殖腺のない中間個体になり、生殖腺異状が引き起こされることが報告されている。すなわち、とらふぐでは、外因性ホルモン投与では生殖腺形成が異状となるのに対し、ファド
ロゾール内在性エストロゲンの産制量を抑えることは生殖腺形成には影響がなく高率で生殖腺の雄化を誘導すると考えられる。このように、とらふぐの性分化期におけるアロマターゼの作用は性を決める上で重要な役割を担っている。
【０００７】
とらふぐは、食用とされるフグの中では一番の高級魚であり、漁業・増養殖対象種として重要な魚種の一つで、種苗生産および養殖技術は確立されている。しかし、近年では外国から国産単価よりも安価なとらふぐが輸入され、日本のとらふぐ養殖業者に大きな影響を与えている。そこで、魚そのものに付加価値をつける技術開発が望まれている。特に、本種は精巣（白子）が珍重されるために雌よりも雄の市場価値が高く、とらふぐ全雄化が強く望まれている。
これまで、ティラピアなどでアロマターゼのプロモーター領域にＦｏｘ１２の存在が確認されている。ひいては、Ｆｏｘ１２のプロモーター領域には、コルチゾル受容体の存在が認められている。そして、コルチゾルにより、Ｆｏｘ１２の発現が抑制されることが示唆されている。すなわち、下記性分化期の魚体内でコルチゾルが増加すると、Ｆｏｘ１２遺伝子の発現が抑制、さらにアロマターゼ遺伝子の発現が抑制され、内在性エストロゲンの産生が減少、結果として生殖腺の雄化が誘導されることが考えられる。
そこで本発明では、性分化期のとらふぐに食品の作用で、ストレスを与え、ストレスがトラフグに存在する6種の温度刺激受容体Transient Receptor Potential (TRPV1,TRPV4,TRPM4,TRPM5,TRPM2,TRPA1)を介して脳に伝わり、脳内に存在する副腎皮質刺激ホルモンの作用により、内在性コルチゾルを増加させ、Ｆｏｘ１２遺伝子発現を抑制、さらにアロマターゼ遺伝子の発現が抑制させ、内在性エストロゲンの産生を減少させ、生殖腺の雄化を高率で誘導させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明の魚の雄化誘導方法は、魚が卵から性決定するまでに、魚にストレス性刺激を与え、生殖腺の雄化を高率で誘導することを特徴とする。
【０００９】
同じく、本発明の魚の雄化誘導方法は、魚が卵から性決定するまでに、魚にストレスを与える食品を飼料又は飼育水に一定の濃度で添加し、生殖腺の雄化を高率で誘導することを特徴とする。
【００１０】
上記食品がビタミンＫであり、このビタミンＫを１０マイクロｇ/Ｌ前後程の濃度として添加することにより魚にストレスを与え、生殖腺の雄化を高率で誘導することを特徴とする。
【００１１】
上記食品が胡椒などの由来のピペリンであり、このピペリンを１〜１０マイクロｇ/Ｌ程の濃度として添加することにより魚にストレスを与え、生殖腺の雄化を高率で誘導することを特徴とする。
【００１２】
上記食品が唐辛子などに由来するカプサイシンであり、このカプサイシンを１０〜１００マイクロｇ/Ｌ程の濃度として添加することにより魚にストレスを与え、生殖腺の雄化を高率で誘導することを特徴とする。
【００１３】
上記食品が野菜など由来のカロテンであり、このカロテンを１マイクロｇ/Ｌ前後程の濃度として添加することにより魚にストレスを与え、生殖腺の雄化を高率で誘導することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、魚が卵から性決定するまでに食品を飼育水又は飼料に一定の濃度で添加することにより魚にストレスを与え、高率で生殖腺の雄化誘導することを特徴とする。また、添加するものは食品であり、生殖腺を高い確率で雄化するのに安全かつ容易である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明者および出願人は、これを実証するため、現在日本の広範囲で孵化から生産まで行われている、とらふぐで実験した。
とらふぐは、雄化により白子を持たせること付加価値がつく。さらに、雌より雄は成長の面においても１５％から２０％早く成長する。すなわち、本研究成果はとらふぐ養殖における２つの利点を併せ持つ革新的な技術である。
【００１６】
実験結果を次に示す。
孵化後１ヶ月以内の体長１〜１．５センチのとらふぐ稚仔魚へ、数種類の食品を添加する試験をおこなった。
ビタミンＫ、ピペリン、カプサイシン、カロテンの実験結果を記載する。
各水槽に、種類毎に１マイクロｇ／リットル、１０マイクロｇ／リットル、１００マイクロｇ／リットルを海水に添加し実験した。
それぞれ、３ヶ月間飼育した。以下にその結果を示す。
実験開始時全長1.11±0.17 cm,・体重0.057±0.02 g
卵巣      精巣
コントロール      39%    52%   
*9%不明
種類          １マイクロｇ／L    １０マイクロｇ／L    １００マイクロｇ／L
卵巣      精巣      卵巣      精巣    卵巣      精巣
アリルカラシ      4.2%    95.8%       43.5%    56.5%     死亡    死亡
クルクミン        37%     63%         61%      39%       41%      59%  
リモネン          50 %    50%         38%      62%       31%      56%  
*13%不明
VitK1             7%      80%         33%      61%       26%      74%
*13%不明            *6%不明         
ピペリン          6.3%    81.2%       22.2%    77.8%    36.4%    54.5%
*12.5%不明                                *9.1%不明
カプサイシン     12%      76%        17.4%    82.6%     17.4%    82.6%
*12%不明
カロテン         29%     71%         56%      44%        10%      75%
*15%不明
*なお、本試験ではコントロールと成長差・生存率に認められなかった。
実験開始時全長2.22 ±0.34 cm, 体重0.24 ±0.14 g
卵巣      精巣
コントロール      65.2%    34.8%   
種類          10マイクロｇ／L    35マイクロｇ／L    60マイクロｇ／L
卵巣      精巣      卵巣      精巣    卵巣      精巣
アリルカラシ      35.5%    64.5%      23.5%    76.5%     25%      75%
種類          100マイクロｇ／L    500マイクロｇ／L    1000マイクロｇ／L
卵巣      精巣      卵巣      精巣    卵巣      精巣
リモネン          19.4 %    80.6%     43.3%    56.7%    33.3%      67.7%  
種類            1マイクロｇ／L    １0マイクロｇ／L    100マイクロｇ／L
卵巣      精巣      卵巣      精巣    卵巣      精巣
ルチン           36.7%     60%       38.7%      58.1%    48.5%      51.5% 
*3.3%不明             *3.2%不明
種類            0.1マイクロｇ／L    １マイクロｇ／L    100マイクロｇ／L
卵巣      精巣      卵巣      精巣    卵巣      精巣
カロテン           43.8%     53.1%    39.3%     60.6%    40.6%    59.4%  
*3.1%不明             *0.1%不明
種類              1マイクロｇ／L    １0マイクロｇ／L    100マイクロｇ／Ｌ
卵巣      精巣      卵巣      精巣    卵巣      精巣
ナリジン           29%       71%      34.4%     65.6%    43.8%    56.3%  
種類              0.1マイクロｇ／L    １マイクロｇ／L    10マイクロｇ／L
卵巣      精巣      卵巣      精巣    卵巣      精巣
カプサイシン       27.3%     72.7%    59.4%     37.5%    27.3%   69.7%  
*0.1%不明
種類              100マイクロｇ／L    500マイクロｇ／L    1000マイクロｇ／L
卵巣      精巣      卵巣      精巣    卵巣      精巣
カプサイシン      39.3%     50%       41.9%     54.8%    33.3%    57.6%  
*10.7%不明          *3.3%不明           *10.7%不明
種類              0.1マイクロｇ／L    １マイクロｇ／L    10マイクロｇ／L
卵巣      精巣      卵巣      精巣    卵巣      精巣
ピペリン          59.4%     40.6%     34.4%     65.6%    46.9%   53.1%  
種類              100マイクロｇ／L    500マイクロｇ／L    1000マイクロｇ／L
卵巣      精巣      卵巣      精巣    卵巣      精巣
ピペリン         50%        50%      40.9%     59.1%    36.4%     63.6%  
種類              1マイクロｇ／L    5マイクロｇ／L    10マイクロｇ／L
卵巣      精巣      卵巣      精巣    卵巣      精巣
VITK2             35.3%     58.8%     35.5%     61.3%   42.4%     57.6%  
種類              15マイクロｇ／L    30マイクロｇ／L    45マイクロｇ／L
卵巣      精巣      卵巣      精巣      卵巣      精巣
VITK2             23.3%     76.7%     43.8%    56.3%     31.3%     68.8%  
*なお、本試験ではコントロールと成長差・生存率に認められなかった。
食品の種類と濃度で精巣になる確率が異なるが、ピペリンの１マイクロｇ／Ｌは９２．３％と非常に高い確率で雄になっている。  又、カプサイシンも同様に雄になる。
元々、魚の雌雄の比率は半々とされており、本結果により生殖腺の雄化誘導が高率で認められた。
性が決定される迄の間にこのような、ストレス性刺激を与える事で簡単に、安全に雄化を誘導できる。
ふぐ以外のたとえば高級魚であるハタ類についても同様のことが期待される。
ハタ類は、成長に長い年月がかかるばかりでなく、先に雌として成熟する（雌性先熟）。すなわち、稚仔魚期から雄にすることで、今後短期間で親魚を育成でき、それらを用いた種苗生産技術が確立される可能性がある。
また、ストレス性刺激は、食品などの化学的刺激だけでなく、光・音・波・振度・電気ショックなどの物理的刺激、さらには天敵や毒性生物との共存などによる生物的刺激により、雄化が誘導される可能性を秘めている。