(57)【要約】【課題】  マイクロ流路内での細胞カップリングを簡便かつ迅速に行うことができる細胞カップリングモジュール、その装置及び方法を提供する。【解決手段】  細胞捕捉流路１６に搬送媒体とともに卵子１３及びドナー細胞１５を搬送する第１の導入流路１２と、細胞捕捉流路１６内に搬送媒体を供給する媒体供給路１８と、細胞捕捉流路１６に交流電界を生じさせるための電極対１９と、細胞捕捉流路１６に設けられた誘電体３１、３２の間隙からなり交流電界の作用により生成する電界勾配により卵子１３を捕捉するための捕捉ギャップ３３とを設け、捕捉ギャップ３３の裏面側には、搬送媒体を排出して卵子１３を捕捉ギャップ３３から解放するための排出用流路１７を設ける。卵子１３の捕捉ギャップの位置ｒxまでの誘導は、コントローラ２４によるＰＩＤ制御と、細胞捕捉流路１６の幅方向ｙにおける位置を考慮した制御、及び卵子１３の大きさを考慮した制御により行う。【選択図】  図３
2011188834.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流路内の搬送媒体中を順次搬送される複数の細胞を捕捉してカップリングさせるための細胞捕捉流路を有する細胞カップリングモジュールであって、
前記細胞捕捉流路における上流側から搬送媒体を供給して前記細胞を搬送するための媒体供給路と、
前記細胞捕捉流路に設けられた誘電体の間隙からなり、交流電界の作用により生成する電界勾配により前記細胞を捕捉するための捕捉ギャップと、
前記細胞捕捉流路における前記捕捉ギャップの近傍に前記交流電界を生じさせるための電極対と、
前記捕捉ギャップから前記搬送媒体を排出してカップリング後の前記細胞を前記捕捉ギャップから解放するための排出用流路と
を備えたことを特徴とする細胞カップリングモジュール。
【請求項２】
前記細胞捕捉流路の上流側に、前記搬送媒体とともに前記複数の細胞のうちの一つを前記細胞捕捉流路まで搬送する第１の導入流路を更に備え、前記細胞の前記細胞捕捉流路への搬送に際して、前記第１の導入流路から供給される搬送媒体と、前記媒体供給路から供給される搬送媒体とにより、前記細胞捕捉流路内に二層流が形成されることを特徴とする請求項１に記載の細胞カップリングモジュール。
【請求項３】
前記搬送媒体とともに前記複数の細胞のうちの他の一つを前記細胞捕捉流路まで搬送する第２の導入流路を更に備えている請求項２に記載の細胞カップリングモジュール。
【請求項４】
前記複数の細胞の一つが卵子であり、前記複数の細胞の他の一つがドナー細胞である請求項１乃至３の何れかに記載の細胞カップリングモジュール。
【請求項５】
請求項１乃至４の何れかに記載の細胞カップリングモジュールと、
前記媒体供給路に前記搬送媒体を送出する媒体送出ポンプと、
前記排出用流路に前記搬送媒体を送出する排出用ポンプと、
前記細胞捕捉流路における画像を撮像する画像センサと、
前記細胞捕捉流路の流れ方向ｘにおける前記捕捉ギャップの位置をｒxとし、媒体送出ポンプからの前記搬送媒体の送出量を調整することにより、該捕捉ギャップの位置ｒxと前記画像センサで撮像された画像から求められる細胞の位置ｘとの偏差Δｘ（＝ｘ−ｒx）を用いた位置決め制御により前記細胞を前記捕捉ギャップの位置ｒxに停止させるコントローラと
を備えたことを特徴とする細胞カップリング装置。
【請求項６】
前記コントローラは、前記画像センサで撮像された画像から求められる前記細胞捕捉流路の幅方向ｙにおける前記細胞の位置と、前記細胞捕捉流路の幅方向ｙにおける前記搬送媒体の流速分布とに基づいて、前記幅方向ｙにおける前記細胞の位置に基づく第１の比例ゲインを求めるとともに、前記細胞の断面積に基づく第２の比例ゲインを求め、該第１の比例ゲイン及び該第２の比例ゲインにより前記位置決め制御の演算の出力を調整し、該調整後の出力により前記媒体送出ポンプの前記搬送媒体の送出量を調節して、前記細胞を前記捕捉ギャップの位置ｒxに停止させることを特徴とする請求項５に記載の細胞カップリング装置。
【請求項７】
前記コントローラは、前記電極対に交流を印加して前記捕捉ギャップの近傍に交流電界を生じさせることにより、前記細胞を前記捕捉ギャップに捕捉するように制御を行うことを特徴とする請求項５又は６に記載の細胞カップリング装置。
【請求項８】
前記コントローラは、前記細胞が前記捕捉ギャップに捕捉された後、前記電極対により生じる交流電界を弱め、前記細胞捕捉流路に前記搬送媒体を供給して前記複数の細胞の他の一つを前記細胞捕捉流路の流れ方向ｘにおける捕捉ギャップの位置ｒxまで搬送した後、更に前記捕捉ギャップの近傍に生じている交流電界を強めることにより、前記複数の細胞の他の一つを前記捕捉ギャップに捕捉されている細胞にカップリングさせるように制御を行うことを特徴とする請求項７に記載の細胞カップリング装置。
【請求項９】
前記コントローラは、前記複数の細胞の他の一つが前記捕捉ギャップに捕捉されている細胞に付着した後、前記排出用流路に前記搬送媒体を供給して、前記捕捉ギャップに捕捉されているカップリング後の複数の細胞を前記捕捉ギャップから解放するように制御を行うことを特徴とする請求項８に記載の細胞カップリング装置。
【請求項１０】
前記複数の細胞の一つが卵子であり、前記複数の細胞の他の一つがドナー細胞である請求項５乃至９の何れかに記載の細胞カップリング装置。
【請求項１１】
請求項５乃至１０の何れかに記載の細胞カップリング装置を用いた細胞カップリング方法であって、
前記媒体供給路に前記搬送媒体を送出して前記細胞捕捉流路内の前記複数の細胞のうちの第１の細胞を搬送し、
前記細胞捕捉流路の流れ方向ｘにおける前記捕捉ギャップの位置をｒxとし、媒体送出ポンプからの前記搬送媒体の送出量を調整することにより、該捕捉ギャップの位置ｒxと前記画像センサで撮像された画像から求められる細胞の位置ｘとの偏差Δｘ（＝ｘ−ｒx）を用いた位置決め制御により前記細胞を前記捕捉ギャップの位置ｒxに停止させ、
前記電極対に交流を印加して前記捕捉ギャップの近傍に交流電界を生じさせることにより、前記細胞を前記捕捉ギャップに捕捉し、
前記細胞が前記捕捉ギャップに捕捉された後、前記電極対により生じる交流電界を弱め、
前記細胞捕捉流路に前記搬送媒体を供給して前記複数の細胞の他の一つを前記細胞捕捉流路の流れ方向ｘにおける捕捉ギャップの位置ｒxまで搬送し、
更に前記捕捉ギャップの近傍に生じている交流電界を強めることにより、前記複数の細胞の他の一つを前記捕捉ギャップに捕捉されている細胞にカップリングさせる
ことを特徴とする細胞カップリング方法。
【請求項１２】
前記位置決め制御において、前記画像センサで撮像された画像から求められる前記細胞捕捉流路の幅方向ｙにおける前記細胞の位置と、前記細胞捕捉流路の幅方向ｙにおける前記搬送媒体の流速分布とに基づいて前記幅方向ｙにおける前記細胞の位置に基づく第１の比例ゲインを求めるとともに、前記細胞の断面積に基づく第２の比例ゲインを求め、該第１の比例ゲイン及び該第２の比例ゲインにより前記位置決め制御の演算の出力を調整し、該調整後の出力により前記媒体送出ポンプの前記搬送媒体の送出量を調節して、前記細胞を前記捕捉ギャップの位置ｒxに停止させることを特徴とする請求項１１記載の細胞カップリング方法。
【請求項１３】
前記複数の細胞の他の一つが前記捕捉ギャップに捕捉されている細胞に付着した後、前記捕捉ギャップの近傍の交流電界の生成を止め、更に前記排出用流路に前記搬送媒体を供給して、前記捕捉ギャップに捕捉されているカップリング後の複数の細胞を前記捕捉ギャップから解放することを特徴とする請求項１２に記載の細胞カップリング方法。
【請求項１４】
前記複数の細胞の一つが卵子であり、前記複数の細胞の他の一つがドナー細胞である請求項１１乃至１３の何れかに記載の細胞カップリング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞カップリングモジュール、細胞カップリング装置及び細胞カップリング方法に関し、更に詳細には、クローン胚の作出、細胞融合などに際して、適確かつ迅速に細胞同士をカップリングさせることができる細胞カップリングモジュール、細胞カップリング装置及び細胞カップリング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学の分野を中心に微小流路をガラス基板やプラスチック基板に形成し、その微小閉空間内で化学反応を起こすマイクロ（化学）チップが開発されている。特にＤＮＡのＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応：Polymerase Chain Reaction）法の応用として、従来技術と比較し数倍〜十数倍の高速分離検出を可能とした多くの製品開発がされている（例えば、非特許文献１参照。）。現在その応用先は生化学反応を中心とした分野であり、細胞の分離や加工などの操作における細胞単体の個別搬送、個別加工などの技術は確立されていない。
【０００３】
ところで、クローン技術の確立は今後の医療・化学産業を革新的に変化させると期待される技術である。ファンクショナルジェノミクスの分野では、遺伝子の影響を調べるために特定の遺伝子を持ったマウス（ＫＯマウス）を作成し、様々な創薬や治療の研究に使われている。ＫＯマウスの作成方法では、主として、ＥＳ細胞からキメラマウスを作り、その子孫からＫＯマウスを作成する方法が採られているが、安定したクローン技術により、ＥＳ細胞から直接クローン技術でＫＯマウスを作る方法や、体細胞で遺伝子をノックアウトしてクローンマウスを作る方法が有用となってくる。特に、ＥＳ細胞が樹立されていない動物種やマウスの系統では、体細胞からのクローン体の作成は非常に有効である。一方、現状のクローニングにおける核移植作業は、移植工程中に多くの手作業が含まれており（例えば、非特許文献２参照。）、研究の効率化、妥当な評価の障害になっている。例えば、移植後の卵細胞に対し、添加薬品の効果を比較する場合、手作業による卵子の損傷のばらつきが大きいと、薬品の効果を正確に評価することができない。
【０００４】
このように自動化による研究の省力化と実験条件の安定化はファンクショナルジェノミクスの技術発展に必要不可欠であり、また、今後の産業化を考慮する上でも作業の自動化は重要であることに鑑み、種々の検討が行われている（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】特開２００６−３２５４２９号公報
【非特許文献１】ANDREW J. DEMELLO, “Microfluidics: DNA amplification moves on”, Nature 422, 28-29 (06 March 2003); doi:10.1038/422028a.
【非特許文献２】T. WAKAYAMA, A. C. F. PERRY, M. ZUCCOTTI, K. R. JOHNSON, R. YANAGIMACHI, “Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei”, Nature 394, 369-374 (23 July 1998); doi:10.1038/28615.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の実情から、特願２００８−３０９８０６号に記載されているように、マイクロ流路内で電極間の細胞径より小さいギャップを設け、交流電界により生じる誘電泳動力により細胞を誘導し、保持し、カップリングさせる装置が開発されている。しかしながら、この装置では、以下のような問題がある、即ち、細胞等の微粒子に働く誘電泳動力は（電界強度）2の勾配に比例するため、捕捉ギャップからの距離の増大に伴って著しく小さくなる。また、誘電泳動力は（粒子半径）3に比例するため、小さな細胞に対して働く力は弱くなり、上記とあいまって細胞を捕捉可能な領域はギャップのごく近傍に限られることになる。更に、マイクロ流路を搬送される細胞の大きさが異なると、搬送に要する時間や誘電泳動力も区々となるため、細胞の大きさに適した流速での細胞の搬送が行われず、細胞のカップリングに要する時間も区々となるという問題がある。また、電極間のギャップに生じる交流電界が細胞に与えるダメージも区々であり、場合によっては細胞に致命傷を与えてしまう場合もある。
【０００６】
従って、本発明の目的は、マイクロ流路内での細胞カップリングを適確かつ迅速に行うことができる細胞カップリングモジュール、細胞カップリング装置及び細胞カップリング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の細胞カップリングモジュールは、マイクロ流路内の搬送媒体中を順次搬送される複数の細胞を捕捉してカップリングさせるための細胞捕捉流路を有する細胞カップリングモジュールであって、前記細胞捕捉流路における上流側から搬送媒体を供給して前記細胞を搬送するための媒体供給路と、前記細胞捕捉流路に設けられた誘電体の間隙からなり、交流電界の作用により生成する電界勾配により前記細胞を捕捉するための捕捉ギャップと、前記細胞捕捉流路における前記捕捉ギャップの近傍に前記交流電界を生じさせるための電極対と、前記捕捉ギャップから前記搬送媒体を排出してカップリング後の前記細胞を前記捕捉ギャップから解放するための排出用流路とを備えたことを特徴とする。
【０００８】
本発明の細胞カップリングモジュールにおいては、細胞捕捉流路内の細胞の搬送媒体中に電極対を用いて交流電界を生じさせ、その交流電界中には誘電体の間隙からなる捕捉ギャップが設けられている。細胞捕捉流路内を搬送される細胞は、この捕捉ギャップ近傍で停止し、続いて電極対によって生じる交流電界の作用により、細胞は捕捉ギャップの方向に移動して捕捉ギャップに捕捉されることになる。捕捉ギャップに細胞が捕捉されると、捕捉ギャップにおける電界勾配は変化し、捕捉された細胞の表面を頂点とする電場勾配が新たに生じることとなる。そして、捕捉された細胞に他の細胞が接近すれば、その細胞にも上記新たな電場勾配により誘電泳動力が作用し、先に捕捉されている細胞に付着することとなる。このようにして、細胞のカップリングが成立する。カップリング後の細胞は、捕捉ギャップから細胞捕捉流路に向けて排出される排出用流路からの搬送媒体により、細胞捕捉流路に解放される。
【０００９】
また、本発明の細胞カップリングモジュールは、前記細胞捕捉流路の上流側に、前記搬送媒体とともに前記複数の細胞のうちの一つを前記細胞捕捉流路まで搬送する第１の導入流路を更に備え、前記細胞の前記細胞捕捉流路への搬送に際して、前記第１の導入流路から供給される搬送媒体と、前記媒体供給路から供給される搬送媒体とにより、前記細胞捕捉流路内に二層流が形成されるように構成してもよい。
【００１０】
上記のように、捕捉ギャップには交流電界の集中による電場勾配が生じ、その近傍の細胞は、その電場勾配の方向に誘電泳動力を受けて捕捉ギャップに捕捉されることになる。ここで、誘電泳動力は（電場）2の勾配に比例するため、捕捉ギャップからの距離の増大に伴って著しく小さくなる。そのため、細胞捕捉流路の幅が広く細胞が捕捉ギャップから遠い場所にある場合には、十分な大きさの誘電泳動力が細胞に作用せず、細胞を捕捉できない可能性がある。このような場合、捕捉ギャップからの距離に応じて電極対間の印加電圧を高くする必要があるが、強い電場による細胞損傷の虞があり、また、誘電泳動力以外の力又は流れが発生したり、機器の高出力化による影響が懸念される。本発明では、この点に鑑み、細胞が捕捉ギャップ近傍を通過するように、細胞捕捉流路内に二層流を生じさせて細胞を捕捉ギャップに近づけるための媒体供給路が細胞捕捉流路の上流側に設けられている。
【００１１】
また、本発明の細胞カップリングモジュールは、前記搬送媒体とともに前記複数の細胞のうちの他の一つを前記細胞捕捉流路まで搬送する第２の導入流路を更に備えていてもよい。
【００１２】
上記発明は、前記複数の細胞の一つが卵子であり、前記複数の細胞の他の一つがドナー細胞である場合に好適に使用される。
【００１３】
本発明の細胞カップリング装置は、上記の細胞カップリングモジュールと、前記媒体供給路に前記搬送媒体を送出する媒体送出ポンプと、前記排出用流路に前記搬送媒体を送出する排出用ポンプと、前記細胞捕捉流路における画像を撮像する画像センサと、前記細胞捕捉流路の流れ方向ｘにおける前記捕捉ギャップの位置をｒxとし、媒体送出ポンプからの前記搬送媒体の送出量を調整することにより、該捕捉ギャップの位置ｒxと前記画像センサで撮像された画像から求められる細胞の位置ｘとの偏差Δｘ（＝ｘ−ｒx）を用いた位置決め制御により前記細胞を前記捕捉ギャップの位置ｒxに停止させるコントローラとを備えたことを特徴とする。
【００１４】
本発明では、細胞捕捉流路内での細胞の位置は画像センサで撮像された画像から求められ、その位置に基づく位置決め制御により、細胞の細胞捕捉流路内での搬送が制御されている。具体的には、細胞捕捉流路の流れ方向ｘにおける前記捕捉ギャップの位置をｒxとし、該捕捉ギャップの位置ｒxと前記画像センサで撮像された画像から求められる細胞の位置ｘとの偏差Δｘ（＝ｘ−ｒx）が細胞の流れ方向ｘにおける位置の制御に使用されて、前記媒体供給路からの搬送媒体の供給量が調節される。
【００１５】
また、上記において、前記コントローラは、前記画像センサで撮像された画像から求められる前記細胞捕捉流路の幅方向ｙにおける前記細胞の位置と、前記細胞捕捉流路の幅方向ｙにおける前記搬送媒体の流速分布とに基づいて、前記幅方向ｙにおける前記細胞の位置に基づく第１の比例ゲインを求めるとともに、前記細胞の断面積に基づく第２の比例ゲインを求め、該第１の比例ゲイン及び該第２の比例ゲインにより前記位置決め制御の演算の出力を調整し、該調整後の出力により前記媒体送出ポンプの前記搬送媒体の送出量を調節して、前記細胞を前記捕捉ギャップの位置ｒxに停止させることを特徴とする。
【００１６】
本発明では、位置決め制御の出力に対して更に以下のような補正が加えられる。即ち、細胞捕捉流路内には、図５に示すように、流速分布が存在し、細胞捕捉流路の中央では流速が大きく、壁面に近づくほど小さくなっているので、細胞が幅方向ｙのどの位置を流動するかによって、同じポンプ流量に対する細胞の移動速度が異なることになる。本発明ではこの幅方向ｙの位置に依存する影響を打ち消すための比例ゲインを、以下の考えに基づいて生成している。即ち、細胞捕捉流路の幅方向の位置ｙに細胞が位置しているとすると、微小流路内で搬送媒体は層流をなしていることから、流速分布Ｖ(y)として以下のモデルが考えられる。
【００１７】
【数１】
2011188834.tif 000003
【００１８】
ここで、ｙ0は細胞捕捉流路の中央、ａは細胞捕捉流路の幅の２分の１の寸法、Ｃは定数である。上式の影響を打ち消すため、ゲインＫy(y)は以下のように設定することができる。
【００１９】
【数２】
2011188834.tif 000004
【００２０】
ここで、ｂ及びｃは定数である。ただし、発散しないようにするため、定数ｂ＞ｙ02とする。
【００２１】
また、本発明では、搬送される細胞の大きさにより、細胞が受ける力が異なることを考慮し、以下のようにして、細胞の大きさを考慮した比例ゲインも求められる。即ち、搬送媒体の流れから細胞が受ける加速度ｘ''は、質量ｍと流れから受ける力Ｆにより決まる。ここで、細胞の質量ｍは体積に比例するので、細胞の半径をｒとすると、ｍ∝ｒ3である。また、搬送媒体の流れから受ける力Ｆは断面積に比例するので、Ｆ∝ｒ2である。画像センサで検知した細胞の面積をＡとすると、Ａ∝ｒ2である。よって、細胞が流体中で浮遊していると仮定すると、加速度ｘ”∝Ａ-1/2である。よって、この影響を打ち消すため、ゲインＫA（Ａ）を以下のように設定することができる。
【００２２】
【数３】
2011188834.tif 000005
【００２３】
これらの比例ゲインＫy(y)、ＫA(Ａ)を、上述の位置決め制御の演算の出力に乗算することにより、媒体供給路からの搬送媒体の供給量を調節するための出力が得られる。そして、このような制御により、細胞は最終的に細胞捕捉流路の流れ方向ｘにおける前記捕捉ギャップの幅方向の中心線、即ち捕捉ギャップの位置ｒxに停止することになる。これにより、迅速に細胞を捕捉ギャップの位置ｒxまで移動させることができる。
【００２４】
本発明の細胞カップリング装置では、前記コントローラは、前記電極対に交流を印加して前記捕捉ギャップの近傍に交流電界を生じさせることにより、前記細胞を前記捕捉ギャップに捕捉するように制御を行うよう構成され得る。
【００２５】
また、前記コントローラは、前記細胞が前記捕捉ギャップに捕捉された後、前記電極対により生じる交流電界を弱め、前記細胞捕捉流路に前記搬送媒体を供給して前記複数の細胞の他の一つを前記細胞捕捉流路の流れ方向ｘにおける捕捉ギャップの位置ｒxまで搬送した後、更に前記捕捉ギャップの近傍に生じている交流電界を強めることにより、前記複数の細胞の他の一つを前記捕捉ギャップに捕捉されている細胞にカップリングさせるように制御を行うよう構成され得る。
【００２６】
更に、前記コントローラは、前記複数の細胞の他の一つが前記捕捉ギャップに捕捉されている細胞に付着した後、前記排出用流路に前記搬送媒体を供給して、前記捕捉ギャップに捕捉されているカップリング後の複数の細胞を前記捕捉ギャップから解放するように制御を行うよう構成され得る。
【００２７】
本発明の細胞カップリング装置は、前記複数の細胞の一つが卵子であり、前記複数の細胞の他の一つがドナー細胞である場合に好適に使用され得る。
【００２８】
本発明の細胞カップリング方法は、上記の細胞カップリング装置を用いた細胞カップリング方法であって、前記媒体供給路に前記搬送媒体を送出して前記細胞捕捉流路内の前記複数の細胞のうちの第１の細胞を搬送し、前記細胞捕捉流路の流れ方向ｘにおける前記捕捉ギャップの位置をｒxとし、媒体送出ポンプからの前記搬送媒体の送出量を調整することにより、該捕捉ギャップの位置ｒxと前記画像センサで撮像された画像から求められる細胞の位置ｘとの偏差Δｘ（＝ｘ−ｒx）を用いた位置決め制御により前記細胞を前記捕捉ギャップの位置ｒxに停止させ、前記電極対に交流を印加して前記捕捉ギャップの近傍に交流電界を生じさせることにより、前記細胞を前記捕捉ギャップに捕捉し、前記細胞が前記捕捉ギャップに捕捉された後、前記電極対により生じる交流電界を弱め、前記細胞捕捉流路に前記搬送媒体を供給して前記複数の細胞の他の一つを前記細胞捕捉流路の流れ方向ｘにおける捕捉ギャップの位置ｒxまで搬送し、更に前記捕捉ギャップの近傍に生じている交流電界を強めることにより、前記複数の細胞の他の一つを前記捕捉ギャップに捕捉されている細胞にカップリングさせることを特徴とする。
【００２９】
本発明の細胞カップリング方法においては、捕捉ギャップの位置ｒxと画像センサで撮像された画像から求められる細胞の位置ｘとの偏差Δｘ（＝ｘ−ｒx）を用いた位置決め制御により、細胞を適確に捕捉ギャップの位置まで移動させることができる。
【００３０】
また、上記においては、前記位置決め制御において、前記画像センサで撮像された画像から求められる前記細胞捕捉流路の幅方向ｙにおける前記細胞の位置と、前記細胞捕捉流路の幅方向ｙにおける前記搬送媒体の流速分布とに基づいて前記幅方向ｙにおける前記細胞の位置に基づく第１の比例ゲインを求めるとともに、前記細胞の断面積に基づく第２の比例ゲインを求め、該第１の比例ゲイン及び該第２の比例ゲインにより前記位置決め制御の演算の出力を調整し、該調整後の出力により前記媒体送出ポンプの前記搬送媒体の送出量を調節して、前記細胞を前記捕捉ギャップの位置ｒxに停止させるように構成され得る。
【００３１】
上記の細胞カップリング方法においても、細胞捕捉流路の幅方向ｙにおける細胞の流動位置と搬送される細胞の断面積に基づいた比例ゲインが求められるので、適確かつ迅速に細胞を捕捉ギャップの位置まで移動させることができる。
【００３２】
また、本発明の細胞カップリング方法においては、前記複数の細胞の他の一つが前記捕捉ギャップに捕捉されている細胞に付着した後、前記捕捉ギャップの近傍の交流電界の生成を止め、更に前記排出用流路に前記搬送媒体を供給して、前記捕捉ギャップに捕捉されているカップリング後の複数の細胞を前記捕捉ギャップから解放するように構成し得る。
【００３３】
本発明の細胞カップリング方法も、前記複数の細胞の一つが卵子であり、前記複数の細胞の他の一つがドナー細胞である場合に好適に使用され得る。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の細胞カップリングモジュール、細胞カップリング装置及び細胞カップリング方法を使用すれば、細胞の搬送に際して、通常の位置決め制御に加え、細胞捕捉流路の幅方向ｙにおける位置を考慮した制御、及び細胞の大きさを考慮した制御が行われるので、細胞の大きさのばらつきや、搬送媒体の流れの状態等に依存することなく、所定の時間内に迅速に細胞を捕捉ギャップの位置ｒxまで移動させることができる。また、交流電界に置かれた誘電体の間の捕捉ギャップに形成された電場勾配の作用により、細胞を確実に捕捉ギャップに捕捉するとともに、他の細胞を捕捉した細胞にカップリングさせることができるので、細胞を機械的に把持するような機構は不要となり、人手を介することなく細胞融合操作の自動化を容易に図ることができる。更に、捕捉ギャップから搬送媒体を排出する排出用流路を備えているので、容易にカップリング後の細胞を回収することができる。また、前記細胞捕捉流路内に二層流を形成する構成では、捕捉ギャップに形成された交流電界と二層流との相乗作用により、細胞をより適確かつ確実に捕捉ギャップに捕捉することができる。また、細胞を捕捉ギャップに捕捉した後、交流電界の強度が弱められるので、交流電界により受ける細胞の損傷も最小限に抑制することができる。更に、前記捕捉ギャップから前記搬送媒体を排出する排出用流路を備えた構成では、細胞の解放も確実に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞カップリング装置の概略構成図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る細胞カップリングモジュールの詳細平面図である。
【図３】図２におけるＡ部の拡大平面図である。
【図４】本発明の一実施形態に係る細胞カップリング装置における制御ブロック図である。
【図５】細胞捕捉流路における幅方向の流速分布を表す図である。
【図６】細胞捕捉流路内における捕捉ギャップ近傍に形成される交流電界を解析により求めた平面図である。
【図７】細胞捕捉流路内に卵子が捕捉されている場合における捕捉ギャップ近傍に形成される交流電界を解析により求めた平面図である。
【図８】細胞捕捉流路に導入された細胞が捕捉ギャップの位置ｒxまで移動する様子を表す平面図である。
【図９】捕捉ギャップの位置ｒxで停止した細胞が交流電界の作用により捕捉ギャップに誘導される様子を表す平面図である。
【図１０】捕捉ギャップに細胞が捕捉された状態を表す平面図である。
【図１１】捕捉ギャップに捕捉された卵子にドナー細胞がカップリングされるまでの様子を示す平面図である。
【図１２】卵子を捕捉ギャップに捕捉した後、ドナー細胞が卵子にカップリングするまで、細胞捕捉流路の部分を連続撮影した写真画像を表す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
本発明の実施形態について、図面を参照しながら説明するが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。本実施形態では、卵子からクローン胚を作出する際の操作を例として説明する。クローン胚の作出に際しては、卵子の透明帯が除去された後、卵子が二分割され、分割されたうちの無核卵子（核の無い方）にドナー細胞がカップリングされる。ここで、本明細書におけるカップリングとは、例えば電気融合において電圧を印加する前に、融合すべき細胞同士を接着した状態にすることをいう。
【００３７】
図１は、本発明の一実施形態に係る細胞カップリング装置の概略構成図である。本実施形態の細胞カップリング装置は、マイクロ流路１１を形成したＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）からなる細胞カップリングモジュール１０と、ＺＦＭ（Zimmerman's fusion medium）などの搬送媒体をマイクロ流路１１内に送出する媒体送出ポンプ２３、卵子用送液ポンプ２０、ドナー用送液ポンプ２２、排出用ポンプ２５とを備えている。また、本実施形態の装置は、媒体送出ポンプ２３卵子用送液ポンプ２０、ドナー用送液ポンプ２２及び排出用ポンプ２５の送液量（速度）を制御するコントローラ２４を備え、更にマイクロ流路１１内の画像を撮像する画像センサ２８と、マイクロ流路１１の画像の監視と装置全体の運転状況を表示及び監視するためのモニタ２６とを備えている。
【００３８】
本実施形態における細胞カップリングモジュール１０の詳細を図２に示す。また、細胞のカップリングが行われる図２におけるＡ部の拡大平面図を図３に示す。図２及び図３に示すように、マイクロ流路１１は、無核卵子１３を搬送媒体とともに搬送する第１の導入流路１２と、第１の導入流路１２に続く幅の広くなった細胞捕捉流路１６とを有しており、この細胞捕捉流路１６は、図２に示すように、相対する電極１９ａ及び電極１９ｂからなる電極対１９と、この電極対１９に連なる出口１６ａまでのＰＤＭＳとによって形成されている。電極１９ａ及び電極１９ｂからなる電極対１９は、細胞捕捉流路１６に交流電界を生じさせるために設けられ、電極１９ａ及び電極１９ｂには交流電源装置２９が接続されている。また、マイクロ流路１１は、電極１９ｂの上流側において細胞捕捉流路１６に接続された媒体供給路１８と、卵子にカップリングするためのドナー細胞を搬送媒体とともに細胞捕捉流路１６まで搬送するドナー搬送流路１４と、後述する捕捉ギャップ３３に搬送媒体を供給する排出用流路１７とを有している。更に、本実施形態では、図２に示すように、第１の導入流路１２、ドナー搬送流路１４、排出用流路１７及び媒体供給路１８の端部には、搬送媒体を供給するとともに搬送媒体を供給するためのチューブを接続するための膨らみを持たせたＰＤＭＳの空洞からなる接続ポート１２ａ，１４ａ，１７ａ，１８ａがそれぞれ設けられている。また、細胞捕捉流路１６の端部にも、搬送媒体を排出するための出口１６ａがそれぞれ設けられている。
【００３９】
本実施形態の細胞捕捉流路１６には、図３に示すように、細胞捕捉流路１６の上流側から下流側に延びる突起部３１と、方形部４２及び弧状部４３からなる島状部３２とが設けられ、これらの突起部３１及び島状部３２もＰＤＭＳにより形成されている。そして、突起部３１と島状部３２の方形部４２との間隙が、細胞を捕捉するための捕捉ギャップ３３である。本実施形態の装置では、卵子１３が捕捉ギャップ３３の中央の線上（捕捉ギャップの位置ｒx）まで搬送媒体の流れにより搬送され、その後、電極対１９により生成される交流電界により、捕捉ギャップ３３に捕捉される。突起部３１及び方形部４２は細胞捕捉流路１６の延設方向、即ち搬送媒体の流れの方向に沿って設けられ、従って捕捉ギャップ３３は流れに対して直角の向きに開口するように設けられており、捕捉ギャップ３３の裏面側には、前述の排出用流路１７が接続されている。
【００４０】
本実施形態では、細胞捕捉流路１６の最大幅（電極１９ａ及び電極１９ｂ間の距離）Ｗ1＝４００μｍ、電極１９ｂと方形部４２との距離Ｗ2＝２６０μｍ、突起部３１の先端から電極対１９の端部までの距離Ｗ3＝４００μｍ、捕捉ギャップ３３の間隙Ｗ4＝４０μｍ、弧状部４３の半径Ｒ＝２００μｍ、突起部３１の先端部の幅Ｗ5＝５０μｍである。この捕捉ギャップ３３の間隙Ｗ4は、捕捉すべき卵子１３の直径より小さく、卵子１３の直径の２分の１程度が好ましい。
【００４１】
本実施形態におけるマイクロ流路１１は、以下のようにして作成される。まず、基板上にリソグラフィー用の光硬化剤（レジスト）の塗膜を形成し、次に、フォトマスクを用いてマイクロ流路１１の形状の部分に光照射して硬化させる。更に、未照射の部分を除去することにより、マイクロ流路１１の形状の凸状パターンを基板上に形成する。次に、このパターンを覆って基板上にＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）を塗布し、これを硬化させた後に基板から取り外す。このようにしてマイクロ流路１１を形成したＰＤＭＳをガラス基板上に貼り合わせることにより、マイクロ流路１１が形成された細胞カップリングモジュール１０が得られる。このようにして作成したマイクロ流路１１の断面形状はほぼ矩形であり、その深さは、本実施形態では１２５μｍとなっている。
【００４２】
以上の構成を有する装置を用いた細胞カップリング方法について説明する。まず、卵子用送液ポンプ２０及び／又はドナー用送液ポンプ２２と、媒体送出ポンプ２３から搬送媒体を送出し、マイクロ流路１１のすべてを搬送媒体で満たす。次に、マイクロピペット、ガラス毛細管などを用いて無核卵子１３が接続ポート１２ａを介して投入される。なお、卵子１３及び後述するドナー細胞１５は、接着性を高めるために予めＰＨＡ（Phytohemagglutinin）で処理してある。次に、第１の導入流路１２を介して卵子１３を細胞捕捉流路１６内に導くために卵子用送液ポンプ２０から搬送媒体が送出される。その際、第１の導入流路１２への搬送媒体の供給と同時に、媒体供給路１８にも搬送媒体が送出される。このように、細胞捕捉流路１６では、第１の導入流路１２からの搬送媒体と、媒体供給路１８からの搬送媒体とが合流することになる。このような２つの流れが合流すると、図８の破線３４に示すように、その合流地点から下流には二層流が形成され、第１の導入流路１２からの搬送媒体と媒体供給路１８からの搬送媒体との間に境界面が生じることとなる。このような二層流の形成により、卵子１３は突起部３１の側に押しやられることになる。次に、卵子１３が細胞捕捉流路１６内に導入されると、卵子用送液ポンプ２０の送液を停止し、媒体送出ポンプ２３からのみ搬送媒体が供給される。
【００４３】
本実施形態では、細胞捕捉流路１６内における卵子１３の移動は、画像センサ２８で得られる画像から求めた卵子１３の位置情報に基づいて、図４の制御ブロック図に従って制御される。ここで、搬送媒体が流れる方向をｘ、細胞捕捉流路１６の幅方向をｙとする（図３）。本実施形態では、卵子１３は、上述のように搬送媒体の流れによって捕捉ギャップ３３の中央線上の捕捉ギャップの位置ｒxまで搬送される。卵子１３を捕捉ギャップ３３まで搬送する際の媒体供給路１８からの搬送媒体の流量の制御は、まず、通常のＰＩＤ制御（位置決め制御）によって行われる（図４）。即ち、媒体供給路１８からの搬送媒体の流量の制御は、細胞の位置ｘと捕捉ギャップの位置ｒxとの偏差Δｘ（＝ｘ−ｒx）に基づくＰＩＤ制御により行われる。
【００４４】
しかしながら、幅方向ｙにおいて搬送媒体の流速は一定ではなく、幅方向ｙの位置によって異なっている。また、卵子１３の細胞捕捉流路１６への導入の際の条件により、卵子１３が幅方向ｙのどの位置を移動するか異なっている。従って、卵子１３が移動する幅方向ｙ方向における位置は、卵子１３の移動速度に影響することになる。本実施形態では、上記ＰＩＤ制御に加えて、細胞捕捉流路１６の幅方向ｙにおける卵子１３の移動位置を考慮した比例ゲインが考慮されている。図５は、細胞捕捉流路１６の幅方向ｙと流速との関係を示しており、細胞捕捉流路１６の中心がｙ0、細胞捕捉流路１６の壁面がＡ及びＢで表され、ｙ0から壁面までの距離＝ａで表されている。図５に示すように、搬送媒体の流速は、細胞捕捉流路１６の中心ｙ0で最も大きく、細胞捕捉流路１６の壁面Ａ及びＢで０となっている。このように、細胞捕捉流路１６を流れる搬送媒体には速度分布が存在するため、卵子１３が幅方向ｙのどの位置を移動するかによって、捕捉ギャップ３３に到達するまでの時間が異なることになる。
【００４５】
本実施形態ではこの幅方向ｙの位置に依存する影響を打ち消すための比例ゲインを、以下の考えに基づいて生成している。即ち、細胞捕捉流路の幅方向の位置ｙに細胞が位置しているとすると、図５の流速分布Ｖ(y)として以下のモデルが考えられる。
【００４６】
【数４】
2011188834.tif 000006
【００４７】
ここで、ａは細胞捕捉流路の幅の２分の１の寸法、Ｃは定数である。従って、上式の影響を打ち消すため、ゲインＫy(y)は以下のように設定することができる。
【００４８】
【数５】
2011188834.tif 000007
【００４９】
ｙ0は細胞捕捉流路の幅方向ｙの中央、ｂ及びｃは定数である。ただし、発散しないようにするため、定数ｂ＞ｙ02とする。図４に示すように、この式から求めた比例ゲインＫy(y)が、上述のＰＩＤ演算の出力に乗算されることになる。
【００５０】
また、本実施形態の装置では、搬送される細胞の大きさにより、細胞が受ける力が異なることを考慮し、以下のようにして、細胞のサイズを考慮した比例ゲインも求められる。即ち、搬送媒体の流れから細胞が受ける加速度ｘ''は、質量ｍと搬送媒体の流れから受ける力Ｆとにより決まる。ここで、細胞の質量ｍは体積に比例するので、細胞の半径をｒとすると、ｍ∝ｒ3である。また、搬送媒体の流れから受ける力Ｆは断面積に比例するので、Ｆ∝ｒ2である。画像センサで検知した細胞の面積をＡとすると、Ａ∝ｒ2である。よって、加速度ｘ”∝Ｆ／ｍ∝Ａ-1/2である。従って、この影響を打ち消すため、ゲインＫA(A)を以下のように設定することができる。
【００５１】
【数６】
2011188834.tif 000008
【００５２】
この式から求めた比例ゲインＫA(A)が、図４に示すように、上述のＰＩＤ制御から求めた出力に比例ゲインＫy(y)を乗算したものにさらに乗算されることにより、媒体供給路からの搬送媒体の供給量を調節するための最終的な出力が得られる。そして、このような出力による搬送媒体の供給量の調節により、細胞は最終的に細胞捕捉流路の流れ方向ｘにおける前記捕捉ギャップの幅方向の中心線の位置、即ち捕捉ギャップの位置ｒxに停止することになる。これにより、細胞の大きさや搬送媒体の流れの状態に依存することなく、所定の時間内に迅速に細胞を捕捉ギャップの位置ｒxまで移動させることができる。
【００５３】
次に、捕捉ギャップの位置ｒxで卵子１３が停止すると、コントローラ２４（図１）は、電極１９ａ及び電極１９ｂの間に、３ＭＨｚ、８〜１０Ｖｒｍｓの矩形波の交流を印加し、細胞捕捉流路１６内に交流電界を生じさせる。細胞捕捉流路１６に何も存在しなければ、交流電圧の印加により細胞捕捉流路１６には一様な交流電界が形成されるが、細胞捕捉流路１６内には誘電体（ＰＤＭＳ）からなる突起部３１及び島状部３２が形成されているため、突起部３１及び島状部３２の間の捕捉ギャップ３３近傍では交流電界は一様とはならない。図６は、細胞捕捉流路１６内における捕捉ギャップ３３近傍に形成される交流電界を解析により求めたものである。解析の際の交流は、３ＭＨｚ、１Ｖｒｍｓの正弦波であるが、矩形波の場合や電圧が異なる場合も同様の結果となる。同図に示すように、生成する交流電界は捕捉ギャップ３３近傍では一様とならず、電場勾配を生じている。このような電場勾配が生じている捕捉ギャップ３３の近傍に卵子１３が存在すると、図９に示すように、卵子１３は誘電泳動力により捕捉ギャップ３３の方向へ移動し、図１０に示すように捕捉ギャップ３３に捕捉されることとなる。なお、卵子などの誘電体が電場勾配から何れの方向に誘電泳動力を受けるかは、誘電体の誘電率、交流の周波数などの条件によって決まることが知られている。本実施形態では、卵子１３が捕捉ギャップ３３に引かれるような条件に設定されている。
【００５４】
卵子１３が捕捉ギャップ３３に捕捉されると、次に、コントローラ２４は、交流電界による卵子１３の損傷等が生じるのを避けるため、電極１９ａ及び電極１９ｂ間の交流を３ＭＨｚ、６〜８Ｖｒｍｓの矩形波として交流電界を弱める。
【００５５】
次に、ドナー細胞１５がマイクロピペット、ガラス毛細管などを用い接続ポート１４ａを介して投入される。ドナー用送液ポンプ２２（図１）からの搬送媒体の送出により、ドナー細胞１５はドナー搬送流路１４を介して細胞捕捉流路１６に到達する。ドナー細胞１５の搬送に際しても、前述の卵子１３の場合と同様に二層流を形成するように媒体供給路１８から搬送媒体を送出することが好ましい。細胞捕捉流路１６では、ドナー用送液ポンプ２２の送液は停止され、従ってドナー細胞１５の搬送は媒体供給路１８から搬送媒体の送出のみにより行われる。その際、上述の卵子１３の場合と同様に、ＰＩＤ制御、細胞捕捉流路の幅方向ｙにおける位置を考慮した制御、及びドナー細胞１５の大きさを考慮した制御が行われて、ドナー細胞１５は捕捉ギャップの位置ｒxで停止することになる。
【００５６】
ドナー細胞１５が捕捉ギャップの位置ｒxで停止すると、ドナー細胞１５を捕捉ギャップ３３の方へ移動させるために電極対１９間の交流が３ＭＨｚ、８〜１０Ｖｒｍｓの矩形波に戻される。しかし、既に卵子１３が捕捉ギャップ３３に捕捉されている場合、捕捉ギャップ３３おける交流電界は図６とは異なっている。図７は捕捉ギャップ３３に卵子１３が捕捉されている場合の交流電界を解析により求めたものである。解析の際の交流は、前述と同様に３ＭＨｚ、１Ｖｒｍｓの正弦波であるが、矩形波の場合や電圧が異なる場合も同様の結果となる。卵子１３が捕捉されている場合、同図に示すように、捕捉された卵子１３を頂点とする電場勾配が新たに生じていることがわかる。このような電場勾配が生じている卵子１３の近傍にドナー細胞１５が停止すると、図１１に示すように、その電場勾配によりドナー細胞１５は卵子１３にカップリングされることとなる。図１２は、卵子１３を捕捉ギャップ３３に捕捉した後、ドナー細胞１５が卵子１３にカップリングするまで細胞捕捉流路１６の部分を連続撮影した写真画像を表している。図１２から、ドナー細胞１５は細胞捕捉流路１６内を移動して捕捉ギャップの位置ｒxに到達した後、捕捉ギャップ３３の方向へ移動して卵子１３にカップリングする様子が分かる。
【００５７】
次に、コントローラ２４は、電極１９ａ及び電極１９ｂへの交流電圧の印加を止め、更に排出用流路１７から搬送媒体を送出させることにより、カップリングした卵子１３及びドナー細胞１５は捕捉ギャップ３３から解放されて細胞捕捉流路１６を流動して出口１６ａ（図２）で回収されることとなる。
【００５８】
本実施形態の細胞カップリングモジュールを使用すれば、通常のＰＩＤ制御に加えて、細胞捕捉流路の幅方向ｙにおける位置を考慮した制御、及びドナー細胞１５の大きさを考慮した制御が行われるので、細胞の大きさや搬送媒体の流れの状態に依存することなく、所定の時間内に迅速に細胞を捕捉ギャップの位置ｒxまで移動させることができる。また、交流電界に置かれた誘電体の間の捕捉ギャップ３３に形成された交流電界の作用により、卵子１３を確実に捕捉ギャップ３３に捕捉するとともに、ドナー細胞１５を卵子１３にカップリングさせることができるので、人手を介することなく細胞融合の操作の自動化を容易に図ることができる。更に、捕捉ギャップ３３から搬送媒体を排出する排出用流路１７を備えているので、容易にカップリング後の卵子１３及びドナー細胞１５を回収することができる。
【００５９】
加えて、上記実施形態では、卵子１３の細胞捕捉流路１６への導入、卵子１３の捕捉ギャップの位置ｒxまでの搬送、卵子１３の捕捉ギャップ３３への捕捉、ドナー細胞１５の細胞捕捉流路１６への導入、ドナー細胞１５の捕捉ギャップの位置ｒxまでの搬送、ドナー細胞１５の卵子１３へのカップリング、カップリング後のドナー細胞１５及び卵子１３の搬送及び取り出し等がシーケンシャル制御により行われ、卵子１３の捕捉ギャップの位置ｒxまでの搬送及びドナー細胞１５の捕捉ギャップの位置ｒxまでの搬送がフィードバック制御により行われるので、本実施形態によれば、迅速に細胞融合を行う完全自動化された細胞カップリング装置の提供が可能となる。
【００６０】
なお、上記ではドナー搬送流路１４からドナー細胞１５を供給したが、ドナー搬送流路１４を設けることなく、第１の導入流路１２からドナー細胞１５を供給するように構成してもよい。
【００６１】
また、上記で説明した実施形態では、第１の細胞が分割した卵子であり、第２の細胞がドナー細胞である場合について説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、２つの細胞をカップリングする操作について適用することができる。その場合、第１の細胞及び第２の細胞の大きさに応じて、第１の導入流路１２、ドナー搬送流路１４、媒体供給路１８、細胞捕捉流路１６、捕捉ギャップ３３等の大きさや幅を変更することが好ましい。
【００６２】
更に、本実施形態では、マイクロ流路１１の断面形状が矩形の場合について説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、断面が矩形以外の例えば円形であっても差し支えない。
【００６３】
また、上記では、位置決め制御としてＰＩＤ制御を使用した場合について説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、細胞の位置を安定して定めることができる制御であれば、何れの制御をも使用することができる。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の細胞カップリングモジュール、細胞カップリング装置及び細胞カップリング方法は、細胞融合、クローン家畜生産などに有用なので、バイオ産業、畜産業などにおいて利用可能である。
【符号の説明】
【００６５】
１０  細胞カップリングモジュール
１１  マイクロ流路
１２  第１の導入流路
１２ａ  接続ポート
１３  無核卵子
１４  ドナー搬送流路
１４ａ  接続ポート
１５  ドナー細胞
１６  細胞捕捉流路
１６ａ  出口
１７  排出用流路
１７ａ  接続ポート
１８  媒体供給路
１８ａ  接続ポート
１９  電極対
１９ａ  電極
１９ｂ  電極
２０  卵子用送液ポンプ
２２  ドナー用送液ポンプ
２３  媒体送出ポンプ
２４  コントローラ
２５  排出用ポンプ
２６  モニタ
２８  画像センサ
２９  交流電源装置
３１  突起部
３２  島状部
３３  捕捉ギャップ
４２  方形部
４３  弧状部
【図１】
2011188834.tif 000009
【図２】
2011188834.tif 000010
【図３】
2011188834.tif 000011
【図４】
2011188834.tif 000012
【図５】
2011188834.tif 000013
【図６】
2011188834.tif 000014
【図７】
2011188834.tif 000015
【図８】
2011188834.tif 000016
【図９】
2011188834.tif 000017
【図１０】
2011188834.tif 000018
【図１１】
2011188834.tif 000019
【図１２】
2011188834.tif 000020