(57)【要約】【課題】転移の研究を可能にする信頼性のある動物モデルを提供する。【解決手段】本発明は、腫瘍転移の分析のためのトランスジェニック動物モデルに関する。本発明は、腫瘍転移の研究のための、新規の再現可能なトランスジェニックマウスモデルを提供する。特に、本発明は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ｙｃｎｕｌｌトランスジェニックマウスモデルにおける腫瘍転移の研究に関する。本発明は、腫瘍転移の研究のための方法を提供する。この方法は、トランスジェニック（ノックアウトを含む）げっ歯類（例えば、マウス）モデルにおける、癌の転移の分析を包含する。【選択図】図１Ｂ
2011030570.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の動物モデル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、腫瘍転移の分析のためのトランスジェニック動物モデルに関する。特に、本発明は、腫瘍転移の研究のための方法を提供する。この方法は、トランスジェニック（ノックアウトを含む）げっ歯類（例えば、マウス）モデルにおける、癌の転移の分析を包含する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術）
免疫欠損マウス（例えば、胸腺欠損ヌードマウス、Ｃ．Ｂ−１７／重症複合型免疫不全（ｓｃｉｄ）マウス、およびＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス）は、癌転移研究における動物モデルとして広く使用されている（Ｂｒｕｎｓら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １０：１０２（２）：１０１−８（２００２）；Ｏｈｔａら，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２３：１６６９−７２（１９９６）；Ｊｉｍｅｎｅｚら，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２３１：６４４−５４（２０００））。したがって、このようなマウスモデルは、新規の制癌剤の前臨床試験のため、および転移関連遺伝子の検出のために使用されてきた（Ｂｒｕｎｓら，上述；Ｏｈｔａら，上述；Ｊｉｍｅｎｅｚら，上述；Ｈｏｔｚら，Ｐａｎｃｒｅａｓ  ２６：Ｅ８９−９８（２００３）；Ｔａｒｂｅら，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２１：３２２１−８（２００１））。しかし、ヒト癌細胞の転移を研究するためのこれらのモデルの使用は、従来、主に、レシピエントマウスにおける癌転移の発生の低効率性および所望の結果を達成するために多くの細胞が必要とされることに起因して、限られていた。
【０００３】
最近、異種移植のためのより効率的な動物レシピエントを確立するため、新規の免疫欠損マウス、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃｎｕｌｌ（γｃｎｕｌｌを有するＮＯＤ／ＳｈｉＪｉｃ−ｓｃｉｄ、またはＮＯＧとも称される）が開発された。ＮＯＧトランスジェニックマウスは、ヒト細胞移植のため（Ｉｔｏら，Ｂｌｏｏｄ  １００：３１７５−８２（２００２））、およびＣＤ３４（＋）細胞からのヒトＴ細胞のインビボ発生研究のため（Ｓａｉｔｏら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：１１１３−２４（２００２））の、優れたレシピエントマウスモデルとして記載されている。ヒト臍帯血幹細胞（ＣＢＳＣ）がＮＯＧマウス中に保存されている場合、ＣＢＳＣは、Ｔリンパ球へと分化し、末梢リンパ器官へと移動した（Ｙａｈａｔａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：２０４−９（２００２））。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
転移（肝転移を含む）は、ヒトの癌（膵臓癌（初期段階においてさえ）、消化管の癌（結腸直腸癌および胃腸の癌）、肺癌などが挙げられる）において、多くの場合に観察され、これは癌による死の最もよくある原因の一つである。癌転移を制御するための新しい戦略が必要とされている。そしてこの戦略は、適切かつ有効な動物モデルの利用可能性を必要とする。したがって、転移の研究を可能にする信頼性のある動物モデルに対する未対処の大きな必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
一局面において、本発明は、腫瘍転移を試験するための方法に関する。この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）転移性腫瘍または腫瘍細胞株由来の腫瘍細胞を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃｎｕｌｌ動物（例えば、げっ歯類、好ましくは、マウス）に接種する工程、および
（ｂ）腫瘍転移の発生をモニタリングする工程。
【０００６】
一実施形態において、上記腫瘍は癌であり、例えば、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、胃腸の癌、結腸癌、肺癌、肝細胞癌、頚部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、または脳腫瘍である。
【０００７】
別の実施形態において、上記転移は、肝転移、骨転移、脳転移、または肺転移であり、特に、肝転移である。
【０００８】
なお別の実施形態において、上記腫瘍細胞は転移性腫瘍細胞株由来であり、例えば、高度に転移性であるか、中程度に転移性であるか、または軽度に転移性である腫瘍細胞株であり得る。
【０００９】
本発明に適切な膵臓癌細胞株としては、例えば、ＭＩＡＰａＣａ−２、ＡｓＰＣ−１、ＰＡＮＣ−１、Ｃａｐａｎ−１およびＢｘＰＣ−３が挙げられる。
【００１０】
接種は、例えば、門脈注射によって行われ得る。
【００１１】
一実施形態において、放射線照射またはサイトカイン投薬を含む任意の他の前処置なしに、少なくとも約１×１０２細胞が接種される。
【００１２】
別の実施形態において、少なくとも約１×１０３細胞が接種される。
【００１３】
なお別の実施形態において、少なくとも約１×１０４細胞が接種される。
【００１４】
腫瘍転移の発生は、当該分野で公知の方法によって（例えば、形成された転移小節の様子（ａｐｐｅａｒａｎｃｅ）および数を観察することによって）モニタリングされ得る。
【００１５】
別の局面において、本発明は、候補抗転移化合物を試験するための方法に関する。この方法は、以下を包含する：
（ａ）上記候補化合物を、発生した腫瘍転移を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃｎｕｌｌ動物（例えば、げっ歯類（例えば、マウス））に投与する工程、および
（ｂ）上記腫瘍転移に対する上記候補化合物の効果をモニタリングする工程。
【００１６】
試験化合物は、任意の種類の分子（例えば、ペプチド、ポリペプチド、抗体または非ペプチド低分子が挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。
【００１７】
さらなる局面において、本発明は、以下の方法に関する：
（ａ）ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃｎｕｌｌ動物（マウスのようなげっ歯類）に外来遺伝子を導入する工程、および
（ｂ）上記動物における上記外来遺伝子の発現をモニタリングする工程。
【００１８】
上記外来遺伝子は、任意の遺伝子導入法によって（ウイルスベクターによる方法が挙げられるが、これに限定されない）、動物（例えば、マウス）に導入される。
【００１９】
特定の実施形態において、上記外来遺伝子は、腫瘍転移（例えば、肝転移）において示差的に発現する遺伝子である。
【００２０】
肝転移が、膵臓癌の転移である場合、上記遺伝子は、例えば、以下から選択され得る：ＴＩＳ１  １Ｂタンパク質；前立腺分化因子（ＰＤＦ）；糖タンパク質ホルモンα−サブユニット；トロンボポエチン（ＴＨＰＯ）；ｍａｎｉｃ  ｆｒｉｎｇｅホモロジー（ＭＦＮＧ）；補体成分５（Ｃ５）；ｊａｇｇｅｄホモログ１（ＪＡＧ１）；インターロイキンエンハンサー結合因子（ＩＬＦ）；ＰＣＡＦ関連因子６５α；インターロイキン−１２α−サブユニット（ＩＬ−１２−α）；核内呼吸性因子１（ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  １）（ＮＲＦ１）；幹細胞因子（ＳＣＦ）；転写因子リプレッサータンパク質（ＰＲＤＩ−ＢＦ１）；低分子誘導性サイトカインサブファミリーＡメンバー１（ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ  ｍｅｍｂｅｒ  １）（ＳＣＹＡ１）；トランスデューシンβ２サブユニット；チャイニーズハムスター細胞のＸ線修復性欠損補完性修復１（Ｘ−ｒａｙ  ｒｅｐａｉｒ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｃｅｌｌｓ  １）；推定腎臓有機アニオン輸送体１（ｐｕｔａｔｉｖｅ
ｒｅｎａｌ  ｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｉｏｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  １）；Ｇ１／Ｓ特異的サイクリンＥ（ＣＣＮＥ）；レチノイン酸レセプターγ（ＲＡＲＧ）；Ｓ−１００カルシウム結合タンパク質Ａ１；中性アミノ酸輸送体Ａ（ＳＡＴＴ）；ドーパクロムトートメラーゼ（ｄｏｐａｃｈｒｏｍｅ  ｔａｕｔｏｍｅｒａｓｅ）；ｅｔｓ転写因子（ＮＥＲＦ２）；カルシウム依存性カリウムチャネルβ−サブユニット；ＣＤ２７ＢＰ；ケラチン１０；６−Ｏ−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）；色素性乾皮症Ａ群補完性タンパク質（ＸＰＡ）；ＣＤＣ６関連タンパク質；細胞分裂プロテインキナーゼ４；ノシセプチンレセプター；シトクロムＰ４５０  ＸＸＶＩＩＢ１；Ｎ−ｍｙｃプロトオンコジーン；溶質キャリアーファミリーメンバー１（ＳＬＣ２Ａ１）；膜関連キナーゼｍｙｔ１；カスパー（ｃａｓｐｅｒ）、ＦＡＤＤ関連性かつカスパーゼ関連性のアポトーシス誘発因子（ＦＡＤＤ−ａｎｄ  ｃａｓｐａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｉｎｄｕｃｅｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）；ならびにＣ−ｓｒｃプロトオンコジーン。
【００２１】
特定の実施形態において、腫瘍転移の遺伝子マーカーを保有する動物（例えば、マウス）は、候補抗転移化合物で処置されて、この処置結果としてのその遺伝子マーカーまたはその発現産物の発現レベルがモニターされる。
【００２２】
異なる局面において、本発明はアレイに関する。このアレイは、固体支持体上に固定化された少なくとも一つの遺伝子またはその発現産物を含むアレイであって、この遺伝子は、以下からなる群より選択される：
ＴＩＳ１  １Ｂタンパク質；前立腺分化因子（ＰＤＦ）；糖タンパク質ホルモンα−サブユニット；トロンボポエチン（ＴＨＰＯ）；ｍａｎｉｃ  ｆｒｉｎｇｅホモロジー（ＭＦＮＧ）；補体成分５（Ｃ５）；ｊａｇｇｅｄホモログ１（ＪＡＧ１）；インターロイキンエンハンサー結合因子（ＩＬＦ）；ＰＣＡＦ関連因子６５α；インターロイキン−１２α−サブユニット（ＩＬ−１２−α）；核内呼吸性因子１（ＮＲＦ１）；幹細胞因子（ＳＣＦ）；転写因子リプレッサータンパク質（ＰＲＤＩ−ＢＦ１）；低分子誘導性サイトカインサブファミリーＡメンバー１（ＳＣＹＡ１）；トランスデューシンβ２サブユニット；チャイニーズハムスター細胞のＸ線修復性欠損補完性修復１；推定腎臓有機アニオン輸送体１；Ｇ１／Ｓ特異的サイクリンＥ（ＣＣＮＥ）；レチノイン酸レセプターγ（ＲＡＲＧ）；Ｓ−１００カルシウム結合タンパク質Ａ１；中性アミノ酸輸送体Ａ（ＳＡＴＴ）；ドーパクロムトートメラーゼ；ｅｔｓ転写因子（ＮＥＲＦ２）；カルシウム依存性カリウムチャネルβ−サブユニット；ＣＤ２７ＢＰ；ケラチン１０；６−Ｏ−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）；色素性乾皮症Ａ群補完性タンパク質（ＸＰＡ）；ＣＤＣ６関連タンパク質；細胞分裂プロテインキナーゼ４；ノシセプチンレセプター；シトクロムＰ４５０  ＸＸＶＩＩＢ１；Ｎ−ｍｙｃプロトオンコジーン；溶質キャリアーファミリーメンバー１（ＳＬＣ２Ａ１）；膜関連キナーゼｍｙｔ１；カスパー、ＦＡＤＤ関連性かつカスパーゼ関連性のアポトーシス誘発因子；ならびにＣ−ｓｒｃプロトオンコジーン。
【００２３】
種々の実施形態において、上記アレイは、列記された遺伝子またはその発現産物のうちの少なくとも２個、もしくは少なくとも５個、もしくは少なくとも１０個、もしくは少なくとも１５個、もしくは少なくとも２０個、もしくは少なくとも２５個を提示する。別の実施形態において、腫瘍転移において過剰発現される全ての遺伝子、またはその発現産物が、提示される。
【００２４】
別の実施形態において、腫瘍転移において低く発現される全ての遺伝子、またはその発現産物が提示される。
【００２５】
なお別の局面において、本発明は、被験体における腫瘍転移の可能性を予測するための方法に関する。この方法は、以下を包含する：
（ａ）上記被験体から得られた、癌細胞を含む生物学的サンプルにおいて、１以上のＲＮＡ転写物もしくはそれらの発現産物の発現レベルを決定する工程；および
（ｂ）上記遺伝子の一以上が、対応する同じ細胞型の正常細胞の発現レベルに対して発現レベルの上昇を示す場合に、転移の可能性の増加を予測する工程。
ここで、該ＲＮＡ転写物は、以下からなる群より選択される：
ＴＩＳ１  １Ｂタンパク質；前立腺分化因子（ＰＤＦ）；糖タンパク質ホルモンα−サブユニット；トロンボポエチン（ＴＨＰＯ）；ｍａｎｉｃ  ｆｒｉｎｇｅホモロジー（ＭＦＮＧ）；補体成分５（Ｃ５）；ｊａｇｇｅｄホモログ１（ＪＡＧ１）；インターロイキンエンハンサー結合因子（ＩＬＦ）；ＰＣＡＦ関連因子６５α；インターロイキン−１２α−サブユニット（ＩＬ−１２−α）；核内呼吸性因子１（ＮＲＦ１）；幹細胞因子（ＳＣＦ）；転写因子リプレッサータンパク質（ＰＲＤＩ−ＢＦ１）；低分子誘導性サイトカインサブファミリーＡメンバー１（ＳＣＹＡ１）；トランスデューシンβ２サブユニット；チャイニーズハムスター細胞のＸ線修復性欠損補完性修復１；推定腎臓有機アニオン輸送体１；Ｇ１／Ｓ特異的サイクリンＥ（ＣＣＮＥ）；レチノイン酸レセプターγ（ＲＡＲＧ）；Ｓ−１００カルシウム結合タンパク質Ａ１；中性アミノ酸輸送体Ａ（ＳＡＴＴ）；ドーパクロムトートメラーゼ；ｅｔｓ転写因子（ＮＥＲＦ２）；カルシウム依存性カリウムチャネルβ−サブユニット；ＣＤ２７ＢＰ；ケラチン１０；６−Ｏ−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）；色素性乾皮症Ａ群補完性タンパク質（ＸＰＡ）；ＣＤＣ６関連タンパク質；細胞分裂プロテインキナーゼ４；ノシセプチンレセプター；シトクロムＰ４５０  ＸＸＶＩＩＢ１；Ｎ−ｍｙｃプロトオンコジーン；溶質キャリアーファミリーメンバー１（ＳＬＣ２Ａ１）；膜関連キナーゼｍｙｔ１；カスパー、ＦＡＤＤ関連性かつカスパーゼ関連性のアポトーシス誘発因子；ならびにＣ−ｓｒｃプロトオンコジーン。
【００２６】
上記被験体は、好ましくは、ヒト被験体であり、上記生物学的サンプルは、好ましくは、標準的手順（例えば、生検など）で得られた腫瘍サンプルである。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
腫瘍転移を試験するための方法であって、以下の工程：
（ａ）転移性腫瘍または腫瘍細胞株由来の腫瘍細胞を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃｎｕｌｌ変異を含むげっ歯類に接種する工程、および
（ｂ）腫瘍転移の発生をモニタリングする工程、
を包含する、方法。
（項目２）
項目１に記載の方法であって、上記げっ歯類がＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃｎｕｌｌマウスである、方法。
（項目３）
項目２に記載の方法であって、上記腫瘍が癌である、方法。
（項目４）
項目３に記載の方法であって、上記癌が、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、胃腸の癌、結腸癌、肺癌、肝細胞癌、頚部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、および脳腫瘍からなる群より選択される、方法。
（項目５）
項目４に記載の方法であって、上記転移が、肝転移、骨転移、脳転移、および肺転移からなる群より選択される、方法。
（項目６）
項目５に記載の方法であって、上記転移が肝転移である、方法。
（項目７）
項目６に記載の方法であって、上記癌が、膵臓癌、乳癌、結腸直腸癌、および胃腸の癌からなる群より選択される、方法。
（項目８）
項目７に記載の方法であって、上記腫瘍細胞が、転移性腫瘍細胞株由来である、方法。
（項目９）
項目８に記載の方法であって、上記腫瘍細胞株が、高度に転移性の腫瘍細胞株である、方法。
（項目１０）
項目８に記載の方法であって、上記癌が膵臓癌であり、上記腫瘍細胞株が、ＭＩＡＰａＣａ−２、ＡｓＰＣ−１、ＰＡＮＣ−１、Ｃａｐａｎ−１、およびＢｘＰＣ−３からなる群より選択される、方法。
（項目１１）
項目１０に記載の方法であって、上記腫瘍細胞株が、ＭＩＡ＿ａＣａ−２、ＡｓＰＣ−１、およびＰＡＮＣ−１からなる群より選択される、方法。
（項目１２）
項目２に記載の方法であって、上記腫瘍細胞が、門脈注射によって上記マウスに接種される、方法。
（項目１３）
項目１２に記載の方法であって、少なくとも約１×１０２細胞が接種される、方法。
（項目１４）
項目１２に記載の方法であって、少なくとも約１×１０３細胞が接種される、方法。
（項目１５）
項目１２に記載の方法であって、少なくとも約１×１０４細胞が接種される、方法。
（項目１６）
項目１に記載の方法であって、上記腫瘍転移の発生が、形成された転移小節の様子および数を観察することによってモニタリングされる、方法。
（項目１７）
候補抗転移化合物を試験するための方法であって、以下：
（ａ）該候補化合物を、発生した腫瘍転移を有する、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃｎｕｌｌ変異を含むげっ歯類に投与する工程、および
（ｂ）該腫瘍転移に対する該候補化合物の効果をモニタリングする工程、
を包含する、方法。
（項目１８）
項目１７に記載の方法であって、上記げっ歯類が、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃｎｕｌｌマウスである、方法。
（項目１９）
項目１８に記載の方法であって、上記転移が、肝転移である、方法。
（項目２０）
項目１９に記載の方法であって、上記ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃｎｕｌｌマウスが、転移性癌細胞株を用いた接種の結果として発生した肝転移を有する、方法。
（項目２１）
項目２０に記載の方法であって、上記転移性癌細胞株が、膵臓癌細胞株、前立腺癌細胞株、乳癌細胞株、結腸直腸癌細胞株、胃腸の癌の細胞株、結腸癌細胞株、肺癌細胞株、肝細胞癌細胞株、頚部癌細胞株、卵巣癌細胞株、肝臓癌細胞株、膀胱癌細胞株、尿路の癌の細胞株、甲状腺癌細胞株、腎臓癌細胞株、癌腫細胞株、黒色腫細胞株および脳腫瘍細胞株からなる群より選択される、方法。
（項目２２）
項目２１に記載の方法であって、上記癌細胞株が、転移性膵臓腺癌細胞株である、方法。
（項目２３）
項目２２に記載の方法であって、上記転移性膵臓腺癌細胞株が、ＭＩＡＰａＣａ−２、ＡｓＰＣ−１、ＰＡＮＣ−１、Ｃａｐａｎ−１、およびＢｘＰＣ−３からなる群より選択される、方法。
（項目２４）
項目１８に記載の方法であって、上記試験化合物が、経口投与される、方法。
（項目２５）
項目１８に記載の方法であって、上記試験化合物が、静脈内投与される、方法。
（項目２６）
項目１８に記載の方法であって、上記試験化合物が、ペプチド、ポリペプチド、抗体、および非ペプチド低分子からなる群より選択される、方法。
（項目２７）
方法であって、以下：
（ａ）ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃｎｕｌｌマウスに外来遺伝子を導入する工程、および
（ｂ）該マウスにおける該遺伝子の発現をモニタリングする工程、
を包含する、方法。
（項目２８）
項目２７に記載の方法であって、上記外来遺伝子がウイルスベクターによって導入される、方法。
（項目２９）
項目２７に記載の方法であって、上記外来遺伝子が、腫瘍転移において示差的に発現される遺伝子である、方法。
（項目３０）
項目２９に記載の方法であって、上記腫瘍転移が、肝転移である、方法。
（項目３１）
項目３０に記載の方法であって、上記肝転移が、膵臓癌の転移である、方法。
（項目３２）
項目２９に記載の方法であって、上記外来遺伝子が、ＴＩＳ１  １Ｂタンパク質；前立腺分化因子（ＰＤＦ）；糖タンパク質ホルモンα−サブユニット；トロンボポエチン（ＴＨＰＯ）；ｍａｎｉｃ  ｆｒｉｎｇｅホモロジー（ＭＦＮＧ）；補体成分５（Ｃ５）；ｊａｇｇｅｄホモログ１（ＪＡＧ１）；インターロイキンエンハンサー結合因子（ＩＬＦ）；ＰＣＡＦ関連因子６５α；インターロイキン−１２α−サブユニット（ＩＬ−１２−α）；核内呼吸性因子１（ＮＲＦ１）；幹細胞因子（ＳＣＦ）；転写因子リプレッサータンパク質（ＰＲＤＩ−ＢＦ１）；および低分子誘導性サイトカインサブファミリーＡメンバー１（ＳＣＹＡ１）からなる群より選択される、方法。
（項目３３）
項目３１に記載の方法であって、上記外来遺伝子が、トランスデューシンβ２サブユニット；チャイニーズハムスター細胞のＸ線修復性欠損補完性修復１；推定腎臓有機アニオン輸送体１；Ｇ１／Ｓ特異的サイクリンＥ（ＣＣＮＥ）；レチノイン酸レセプターγ（ＲＡＲＧ）；Ｓ−１００カルシウム結合タンパク質Ａ１；中性アミノ酸輸送体Ａ（ＳＡＴＴ）；ドーパクロムトートメラーゼ；ｅｔｓ転写因子（ＮＥＲＦ２）；カルシウム依存性カリウムチャネルβ−サブユニット；ＣＤ２７ＢＰ；ケラチン１０；６−Ｏ−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）；色素性乾皮症Ａ群補完性タンパク質（ＸＰＡ）；ＣＤＣ６関連タンパク質；細胞分裂プロテインキナーゼ４；ノシセプチンレセプター；シトクロムＰ４５０  ＸＸＶＩＩＢ１；Ｎ−ｍｙｃプロトオンコジーン；溶質キャリアーファミリーメンバー１（ＳＬＣ２Ａ１）；膜関連キナーゼｍｙｔ１；カスパー、ＦＡＤＤ関連性かつカスパーゼ関連性のアポトーシス誘発因子；ならびにＣ−ｓｒｃプロトオンコジーンからなる群より選択される、方法。
（項目３４）
項目２９に記載の方法であって、上記マウスを候補抗転移化合物で処置する工程、および該処置の結果としての上記遺伝子もしくはその発現産物の発現レベルをモニタリングする工程を、さらに包含する、方法。
（項目３５）
項目３２または３３に記載の方法であって、上記マウスを候補抗肝転移化合物で処置する工程、および該処置の結果としての上記遺伝子もしくはその発現産物の発現レベルをモニタリングする工程を、さらに包含する、方法。
（項目３６）
固体支持体上に固定化された少なくとも一つの遺伝子またはその発現産物を含むアレイであって、該遺伝子は、以下：
ＴＩＳ１  １Ｂタンパク質；前立腺分化因子（ＰＤＦ）；糖タンパク質ホルモンα−サブユニット；トロンボポエチン（ＴＨＰＯ）；ｍａｎｉｃ  ｆｒｉｎｇｅホモロジー（ＭＦＮＧ）；補体成分５（Ｃ５）；ｊａｇｇｅｄホモログ１（ＪＡＧ１）；インターロイキンエンハンサー結合因子（ＩＬＦ）；ＰＣＡＦ関連因子６５α；インターロイキン−１２α−サブユニット（ＩＬ−１２−α）；核内呼吸性因子１（ＮＲＦ１）；幹細胞因子（ＳＣＦ）；転写因子リプレッサータンパク質（ＰＲＤＩ−ＢＦ１）；低分子誘導性サイトカインサブファミリーＡメンバー１（ＳＣＹＡ１）；トランスデューシンβ２サブユニット；チャイニーズハムスター細胞のＸ線修復性欠損補完性修復１；推定腎臓有機アニオン輸送体１；Ｇ１／Ｓ特異的サイクリンＥ（ＣＣＮＥ）；レチノイン酸レセプターγ（ＲＡＲＧ）；Ｓ−１００カルシウム結合タンパク質Ａ１；中性アミノ酸輸送体Ａ（ＳＡＴＴ）；ドーパクロムトートメラーゼ；ｅｔｓ転写因子（ＮＥＲＦ２）；カルシウム依存性カリウムチャネルβ−サブユニット；ＣＤ２７ＢＰ；ケラチン１０；６−Ｏ−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）；色素性乾皮症Ａ群補完性タンパク質（ＸＰＡ）；ＣＤＣ６関連タンパク質；細胞分裂プロテインキナーゼ４；ノシセプチンレセプター；シトクロムＰ４５０  ＸＸＶＩＩＢ１；Ｎ−ｍｙｃプロトオンコジーン；溶質キャリアーファミリーメンバー１（ＳＬＣ２Ａ１）；膜関連キナーゼｍｙｔ１；カスパー、ＦＡＤＤ関連性かつカスパーゼ関連性のアポトーシス誘発因子；ならびにＣ−ｓｒｃプロトオンコジーン
からなる群より選択される、アレイ。
（項目３７）
項目３６に記載のアレイであって、以下の遺伝子：
ＴＩＳ１  １Ｂタンパク質；前立腺分化因子（ＰＤＦ）；糖タンパク質ホルモンα−サブユニット；トロンボポエチン（ＴＨＰＯ）；ｍａｎｉｃ  ｆｒｉｎｇｅホモロジー（ＭＦＮＧ）；補体成分５（Ｃ５）；ｊａｇｇｅｄホモログ１（ＪＡＧ１）；インターロイキンエンハンサー結合因子（ＩＬＦ）；ＰＣＡＦ関連因子６５α；インターロイキン−１２α−サブユニット（ＩＬ−１２−α）；核内呼吸性因子１（ＮＲＦ１）；幹細胞因子（ＳＣＦ）；転写因子リプレッサータンパク質（ＰＲＤＩ−ＢＦ１）；低分子誘導性サイトカインサブファミリーＡメンバー１（ＳＣＹＡ１）
の全て、またはそれらの発現産物の全てを含む、アレイ。
（項目３８）
項目３６に記載のアレイであって、以下の遺伝子：
トランスデューシンβ２サブユニット；チャイニーズハムスター細胞のＸ線修復性欠損補完性修復１；推定腎臓有機アニオン輸送体１；Ｇ１／Ｓ特異的サイクリンＥ（ＣＣＮＥ）；レチノイン酸レセプターγ（ＲＡＲＧ）；Ｓ−１００カルシウム結合タンパク質Ａ１；中性アミノ酸輸送体Ａ（ＳＡＴＴ）；ドーパクロムトートメラーゼ；ｅｔｓ転写因子（ＮＥＲＦ２）；カルシウム依存性カリウムチャネルβ−サブユニット；ＣＤ２７ＢＰ；ケラチン１０；６−Ｏ−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）；色素性乾皮症Ａ群補完性タンパク質（ＸＰＡ）；ＣＤＣ６関連タンパク質；細胞分裂プロテインキナーゼ４；ノシセプチンレセプター；シトクロムＰ４５０  ＸＸＶＩＩＢ１；Ｎ−ｍｙｃプロトオンコジーン；溶質キャリアーファミリーメンバー１（ＳＬＣ２Ａ１）；膜関連キナーゼｍｙｔ１；カスパー、ＦＡＤＤ関連性かつカスパーゼ関連性のアポトーシス誘発因子；ならびにＣ−ｓｒｃプロトオンコジーン
の全て、またはそれらの発現産物の全てを含む、アレイ。
（項目３９）
被験体における腫瘍転移の可能性を予測するための方法であって、以下：
（ａ）該被験体から得られた、癌細胞を含む生物学的サンプルにおいて、１以上のＲＮＡ転写物もしくはそれらの発現産物の発現レベルを決定する工程；および
（ｂ）該遺伝子の一以上が、対応する同じ細胞型の正常細胞の発現レベルに対して発現レベルの上昇を示す場合、転移の可能性の増加を予測する工程、
を包含し、ここで、該ＲＮＡ転写物は、以下：
ＴＩＳ１  １Ｂタンパク質；前立腺分化因子（ＰＤＦ）；糖タンパク質ホルモンα−サブユニット；トロンボポエチン（ＴＨＰＯ）；ｍａｎｉｃ  ｆｒｉｎｇｅホモロジー（ＭＦＮＧ）；補体成分５（Ｃ５）；ｊａｇｇｅｄホモログ１（ＪＡＧ１）；インターロイキンエンハンサー結合因子（ＩＬＦ）；ＰＣＡＦ関連因子６５α；インターロイキン−１２α−サブユニット（ＩＬ−１２−α）；核内呼吸性因子１（ＮＲＦ１）；幹細胞因子（ＳＣＦ）；転写因子リプレッサータンパク質（ＰＲＤＩ−ＢＦ１）；低分子誘導性サイトカインサブファミリーＡメンバー１（ＳＣＹＡ１）；トランスデューシンβ２サブユニット；チャイニーズハムスター細胞のＸ線修復性欠損補完性修復１；推定腎臓有機アニオン輸送体１；Ｇ１／Ｓ特異的サイクリンＥ（ＣＣＮＥ）；レチノイン酸レセプターγ（ＲＡＲＧ）；Ｓ−１００カルシウム結合タンパク質Ａ１；中性アミノ酸輸送体Ａ（ＳＡＴＴ）；ドーパクロムトートメラーゼ；ｅｔｓ転写因子（ＮＥＲＦ２）；カルシウム依存性カリウムチャネルβ−サブユニット；ＣＤ２７ＢＰ；ケラチン１０；６−Ｏ−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）；色素性乾皮症Ａ群補完性タンパク質（ＸＰＡ）；ＣＤＣ６関連タンパク質；細胞分裂プロテインキナーゼ４；ノシセプチンレセプター；シトクロムＰ４５０  ＸＸＶＩＩＢ１；Ｎ−ｍｙｃプロトオンコジーン；溶質キャリアーファミリーメンバー１（ＳＬＣ２Ａ１）；膜関連キナーゼｍｙｔ１；カスパー、ＦＡＤＤ関連性かつカスパーゼ関連性のアポトーシス誘発因子；ならびにＣ−ｓｒｃプロトオンコジーン
からなる群より選択される、方法。
（項目４０）
項目３９に記載の方法であって、上記被験体がヒト患者である、方法。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】図１ＡおよびＢは、１×１０４、１×１０３および１×１０２細胞の記載した膵腺腫細胞株（ＭＩＡＰａＣａ−２、ＡｓＰＣ−１、ＰＡＮＣ−１、Ｃａｐａｎ−１およびＢｘＰＣ−３）接種後のＮＯＧマウスにおける、肝転移の発生および肝病巣の数を示す。
【図１Ｂ】図１ＡおよびＢは、１×１０４、１×１０３および１×１０２細胞の記載した膵腺腫細胞株（ＭＩＡＰａＣａ−２、ＡｓＰＣ−１、ＰＡＮＣ−１、Ｃａｐａｎ−１およびＢｘＰＣ−３）接種後のＮＯＧマウスにおける、肝転移の発生および肝病巣の数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（Ａ．定義）
他に定義されない限り、本明細書中で使用される科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第二版，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４）は、当業者に、本出願において使用される用語の多くに対して一般的な指針を提供する。
【００２９】
当業者は、本明細書で記載される方法および材料と類似または等価な、多くの方法および材料を認識し、これらの方法および材料は、本発明の実施において使用される。実際、本発明は、記載される方法および材料に決して限定されない。本発明の目的のため、以下の用語が、下記に定義される。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、用語「腫瘍」とは、（悪性にせよ良性にせよ）あらゆる新生物細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈおよびｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を指し、そしてあらゆる前癌細胞および前癌組織、ならびに癌細胞および癌組織を指す。
【００３１】
用語「癌」および「癌の」とは、制御されない細胞増殖によって代表的に特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を指すか、それを記載する。癌の例としては、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、胃腸の癌、結腸癌、肺癌、肝細胞癌、頚部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿管の癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、および脳腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
用語「転移」は、本明細書中で最も広範な意味で使用され、そして身体の一部分から別の部分への腫瘍（例えば、癌）の広がりをいう。広がった細胞から形成される腫瘍は、二次腫瘍と呼ばれ、そして元々の（一次）腫瘍と同じ細胞の型を含む。したがって、肝臓または骨に転移した前立腺癌は、前立腺癌細胞の位置にかかわらずそれがなお前立腺癌細胞を含むということから、肝臓癌でも骨の癌でもなく、むしろ転移された前立腺癌である。
【００３３】
癌の「病理学」は、患者の健全を危うくする全ての現象を含む。これには、異常な細胞増殖または制御不可能な細胞増殖、転移、隣接細胞の正常機能の干渉、異常なレベルでのサイトカインまたは他の分泌産物の放出、炎症反応または免疫応答の抑制または悪化、新形成、前悪性、悪性、周囲または離れた組織または器官（例えば、リンパ節など）の浸潤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
用語「示差的に発現される遺伝子」、「示差的な遺伝子発現」およびそれらの同義語は、互換可能に使用され、別の細胞もしくは細胞型と比較して１つの細胞もしくは細胞型において、または別の患者もしくは試験被験体と比較して１人の患者もしくは試験被験体において、その発現がより高いレベルまたはより低いレベルである遺伝子をいう。したがって、例えば、示差的な遺伝子発現は、対応する疾患の細胞／組織／患者と比較して、正常な細胞／組織／患者において起こってもよく、発生の異なる段階における異なる細胞型または細胞の間の遺伝子発現パターンの差異を反映してもよい。上記用語はまた、その発現が、同じ疾患の異なる段階でより高いレベルまたはより低いレベルへと活性化される遺伝子を含む。示差的に発現される遺伝子が、核酸レベルもしくはタンパク質レベルで活性化され得るかまたは阻害され得るかのいずれか、あるいは代替的なスプライシングに供されて異なるポリペプチド産物をもたらし得ることはまた、理解される。このような差異は、例えば、ｍＲＮＡレベルの変化、表面発現の変化またはポリペプチドの分泌もしくは他の分配の変化によって、証明され得る。示差的な遺伝子発現は、２つ以上の遺伝子もしくはそれらの遺伝子産物の間の発現の比較、または２つ以上の遺伝子もしくはそれらの遺伝子産物の間の発現率の比較、または同じ遺伝子からの２つの示差的に処理された産物の比較を含み得る。本発明の目的のために、「示差的な遺伝子発現」は、比較されるサンプル間の所与の遺伝子または遺伝子産物の発現の間に、少なくとも約２倍、好ましくは、少なくとも約２．５倍、より好ましくは、少なくとも約４倍、さらにより好ましくは、少なくとも約６倍、最も好ましくは、少なくとも約１０倍の差異が存在する場合に、存在すると考えられる。
【００３５】
用語「マイクロアレイ」とは、ハイブリダイズ可能なアレイ構成要素の基板上の規則的な整列をいう。上記用語としては、特に、ポリヌクレオチドマイクロアレイ（例えば、ｃ
ＤＮＡマイクロアレイおよびオリゴヌクレオチドマイクロアレイ）ならびにプロテインアレイが挙げられる。特定の実施形態において、マイクロアレイは、固体支持体上に既知の順序で固定化された、何千もの個々の遺伝子（ＤＮＡ）配列のアレイである。異なる組織由来のＲＮＡは、上記チップ上で上記ＤＮＡにハイブリダイズされる。ＲＮＡ分子は、そのＲＮＡ分子がそこから発現されたＤＮＡにのみ結合する。結果として、生物学的サンプル（例えば、正常組織および疾患組織、特定の薬物で処置された組織または処置されなかった組織など）中の何千もの遺伝子の相対的な発現は、単一のアレイ上で比較され得る。同様のタンパク質配列は、マイクロアレイチップ上に提示され得、そしてタンパク質−タンパク質相互作用または異なる生物学的サンプル（例えば、組織）におけるタンパク質レベルの差異を研究するために使用され得る。
【００３６】
用語「ポリヌクレオチド」とは、一般的に、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをいい、これらは、未改変ＲＮＡまたは未改変ＤＮＡであっても、改変ＲＮＡまたは改変ＤＮＡであってもよい。したがって、例えば、本明細書中で定義されるポリヌクレオチドとしては、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡならびに一本鎖領域および二本鎖領域を含むＲＮＡ、一本鎖であり得るかまたはより代表的には二本鎖であり得るか、あるいは一本鎖領域および二本鎖領域を含み得る、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられ得るが、これらに限定されない。さらに、本明細書中で使用される場合、上記用語「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を含む。このような領域における鎖は、同じ分子を形成しても異なる分子を形成してもよい。上記用語は、１つ以上の改変された塩基を含むＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）およびＲＮＡを含む。したがって、安定性または他の理由のために改変された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、その用語が本明細書中で意図される場合、「ポリヌクレオチド」である。さらに、通常ではない塩基（例えば、イノシン）または改変された塩基（例えば、トリチウム化塩基）を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書中で定義される場合、上記用語「ポリヌクレオチド」内に含まれる。一般的に、上記用語「ポリヌクレオチド」は、未改変ポリヌクレオチドの全ての化学的、酵素的および／または代謝的に改変された形態ならびにウイルスおよび細胞（単一細胞および複合体細胞を含む）に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を含む。
【００３７】
用語「オリゴヌクレオチド」とは、比較的短いポリヌクレオチドをいい、これらとしては、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖または二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよび二本鎖ＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
用語「トランスジェニック動物」および「トランスジェニックマウス」ならびにそれらの文法的等価物は、別の動物由来の遺伝子を保有するように故意に作製された動物／マウスをいうために使用される。トランスジェニック動物としては、特に、トランスジェニックげっ歯類（例えば、マウス、ラット、モルモットなど）が挙げられる。
【００３９】
用語「異種移植」とは、最も広範な意味で使用され、そして１つの動物種から別の動物種（ヒトを含む）への生きている細胞、組織または器官の移動をいう。
【００４０】
（Ｂ．詳細な説明）
本発明の実施は、別に示されなければ、従来の分子生物学技術（組み換え技術を含む）、微生物学技術、細胞生物学技術および生物化学技術を用い、これらの技術は、当該分野の技術内である。このような技術は、参考文献、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ、編、１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、編、１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、第４版（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ＆  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、１９８７）；「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ、編、１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編、１９８７）；「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｏｕｓｅ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｌｉｆｔｏｎ  Ｎ．Ｊ．、第２０９巻、Ｍ．Ｈ．Ｈｏｆｋｅｒら、編）において完全に説明される。
【００４１】
本発明は、腫瘍転移研究のための感受性かつ信頼性のあるトランスジェニック動物モデルを提供する。特に、本発明は、再現可能な肝転移のマウスモデルを提供し、この肝転移は、哺乳動物（例えば、ヒト）癌細胞をＮＯＧマウスに導入することを含む。
【００４２】
ＮＯＧマウスは、実験動物中央研究所（ＣＩＥＡ、川崎、日本）で開発され、そしてまた、２００１年１０月２５日に出願された、同時係属中の米国出願番号１０／２２１，５４９に記載され、その開示全体が、本明細書により参考として明確に援用される。
【００４３】
簡単に言えば、異種移植のための改善された動物レシピエントを確立するために、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）変異とインターロイキン−２Ｒγ（ＩＬ−２Ｒγ）対立遺伝子変異（γｃｎｕｌｌ）とに対するＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃｎｕｌｌ（ＮＯＧ）マウス二重ホモ接合体を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−γｃｎｕｌｌマウスとＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスとの８回の戻し交配によって作製した。臍帯血液由来のヒトＣＤ３４＋細胞をこの株に移植した場合、その末梢循環、脾臓および骨髄における移植率は、抗アシアロＧＭ１抗体で処理したＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスまたはβ２マクログロブリン欠損ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスよりも有意に高かった。ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／β２ｍｎｕｌｌ）マウスは、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃｎｕｌｌと同様に、完全にＮＫ細胞活性を欠損していた。末梢血液単核細胞が腹腔内に導入された場合、腹水において、ヒト成熟細胞の同様の高い移植率が観察された。上記高い移植率に加えて、複数の系統の細胞分化がまた、観察された。さらに、１×１０（２）ＣＤ３４＋細胞は、この株において増殖および分化し得た。これらの結果に基づいて、上記ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃｎｕｌｌマウスは、異種移植（特に、ヒト幹細胞アッセイ）のための優れた動物レシピエントであると記載された。さらなる詳細のためには、例えば、Ｈｉｒａｍａｔｓｕら、Ｂｌｏｏｄ  １００：３１７５−８２（２００２）を参照のこと。
【００４４】
現在、上記ＮＯＧマウスは、ヒト癌転移研究のための優れたマウスモデルである。したがって、このモデルは、例えば、抗癌薬物候補および抗転移薬物候補をスクリーニングおよび評価するため、ならびに癌転移に関連する遺伝子の検出／スクリーニングのために使用され得、次いで、転移癌および関連状態（転移癌の遺伝子治療処置を含む）の診断および／または処置における有効性を見出している。
【００４５】
本発明のマウスモデルは、任意の種類の転移（肝転移、骨転移、脳転移および肺転移を含む）のモデリングおよび研究のために適切である。転移は、全ての癌の型において生じ、これらの転移としては、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、胃腸の癌、結腸癌、肺癌、肝細胞癌、頚部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫および脳腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。本発明はヒト膵臓癌の肝転移を分析することによって示されるが、それに制限されない。上記ＮＯＧマウスモデルはまた、任意の位置（肝臓、骨、脳および肝臓を含む）における他の型の癌に由来する転移を研究するために使用され得る。
【００４６】
異種移植の方法は、当該分野において周知であり、そして以下の実施例１に示される。代表的には、癌細胞は、あらかじめ免疫抑制（例えば、致死量以下の用量の全身放射線照射および／または免疫抑制剤の投与）をして、またはしないで、尾静脈注射によってマウスに移植される。肝転移研究のために、上記癌細胞は、適切な留置カテーテルを用いて、脾臓内（門脈）注射によって上記動物に導入され得る。肺転移は、例えば、例えばＷｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｋｌｅｉｎｅｒｍａｎ；Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  １７：５０１−６（１９９９）に記載されるようなレシピエント動物への腫瘍細胞の静脈内注射によって、確立され得る。上記腫瘍細胞は、腫瘍（癌）細胞株、およびヒトまたは非ヒト被験体から得られた一次腫瘍（例えば、癌）に由来し得る。
【００４７】
骨転移を研究するために、ヒト胎児骨またはマウス骨の微視的フラグメントをＮＯＧマウスに移植し得る。２〜３週間後、ヒト腫瘍（癌）細胞株または一次腫瘍（癌）の細胞は、静脈内注射され得るか（コロニー形成アッセイ）または上記移植組織フラグメントに直接注射され得るかのいずれかである。腫瘍転移は、当該分野で公知の方法によってモニタリングされ得、これらの方法としては、種々の画像化技術および組織学的検査が挙げられる。
【００４８】
異種腫瘍細胞（細胞株由来かまたは一次腫瘍由来かのいずれか）の異種移植後の薬物スクリーニングのために使用される場合、発達した転移癌を有するＮＯＧマウスは、試験化合物で処置され得、そして薬物処置の結果としてのその転移小節の数、大きさまたは他の特性の任意の変化および上記試験動物の生存可能性は、未処置コントロールおよび／またはポジティブコントロールに対してモニタリングされ、ここで、そのポジティブコントロールは、代表的に、公知の抗転移化合物で処置された動物である。上記試験化合物の投与は、任意の適切な経路（例えば、経口投与、経皮投与、静脈内投与、輸液投与、筋内投与などを含む）によって実施され得る。次いで、このモデルにおいて得られた結果は、追跡的な薬物動態学的、毒物学的、生物化学的および免疫学的な研究、そして最終的にはヒト臨床研究によって、検証され得る。
【００４９】
上記ＮＯＧマウスモデルはまた、例えばレトロウイルスベクターの門脈輸液による、インビボでの転移小節への標的遺伝子送達を研究するために使用され得る。特に、このＮＯＧモデルは、標的腫瘍転移への遺伝子導入の実行可能性を研究するため、その持続時間および遺伝子発現レベルおよび治療効果の程度をモニタリングするため、投与レジメンおよび／または投与様式を最適化するため、上記遺伝子導入ベクターの非標的組織への播種を研究する（これは、毒性の可能性についての情報を提供する）ためなどに、使用され得る。
【００５０】
最も一般的な遺伝子送達は、当該分野で周知の技術により、レトロウイルスベクターを用いて実施される。レトロウイルスは、それらのゲノムとして一本鎖ＲＮＡ分子を含むエンベロープウイルスである。感染後、上記ウイルスゲノムは、二本鎖ＤＮＡへと逆転写され、この二本鎖ＤＮＡは、それが発現される宿主ゲノムに組み込まれる。上記ウイルスゲノムは、少なくとも３つの遺伝子を含む：ｇａｇ（コアタンパク質をコードする）、ｐｏｌ（逆転写酵素をコードする）およびｅｎｖ（上記ウイルスエンベロープたんぱく質をコードする）。上記ゲノムの各末端には長い末端反復（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）（ＬＴＲ）があり、この長い末端反復は、プロモーター／エンハンサー領域およびウイルス組込みに関与する配列を含む。さらに、上記ｅｎｖ遺伝子において、上記ウイルスＤＮＡおよびＲＮＡスプライシング部位をパッケージングするために必要な配列が存在する。マウスモデルにおいて使用されるレトロウイルスベクターは、最も多くの場合、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）に基づく。さらに、レンチウイルスは、例えば、実験動物（例えば、ＮＯＧマウス）への遺伝子導入のために使用され得る。
【００５１】
遺伝子送達はまた、アデノウイルスベクターによって実施され得る。アデノウイルスは、直線状二本鎖ＤＮＡゲノムを有する非エンベロープ化正十二面体ウイルスである。アデノウイルスは、細胞表面レセプターと相互作用することによって非分裂細胞に感染し、そしてエンドサイトーシスによって細胞に侵入する。アデノウイルスゲノムは宿主細胞ゲノムに組み込まれ得ないことから、アデノウイルスベクター由来の発現は、一時的である。
【実施例】
【００５２】
本発明のさらなる詳細は、以下の非限定的実施例によって示される。
【００５３】
（実施例１）
（ヒト膵臓癌の肝転移研究）
（材料および方法）
実験動物中央研究所（ＣＩＥＡ、川崎、日本）から得られた７〜９週齢の雄性ＮＯＧマウスおよびＮＯＤ／ｓｈｉＪｉｃ−ｓｃｉｄマウスを、この研究に使用した。上記動物を、ＣＩＥＡの動物実験の規制のためのガイドライン（ｔｈｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＩＥＡ）にしたがって特定の病原体を含まない条件下で維持した。この研究で使用した全てのヒト膵臓細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）から得られた。ＡｓＰＣ−１およびＣａｐａｎ−１のための培養培地は、それぞれ２０％および１５％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充した、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改変イーグル培地（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）であった。ＭＩＡＰａＣａ−２およびＰＡＮＣ−１を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭの培養物として維持した。ＢｘＰＣ−３、Ｃａｐａｎ−２およびＰＬ４５を、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０（ＳＩＧＭＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ６０４６またはＤ５７９６）の培養物として維持した。これらを、５％ＣＯ２を用いた加湿雰囲気下で、３７℃で維持した。実験的肝転移を、既に記載されているように（Ｋｈａｔｉｂら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：２４２−５０（２００２））、癌細胞の脾臓内／門脈注射によって作製した。上記動物を６〜８週間後に屠殺し、そして事前に固定化することなく、肝転移を直ちに数え上げた。その転移病巣を、以下のスケールで評価した：０＝転移病巣なし；１＝１〜１０の転移病巣；２＝１１〜２０の転移病巣；３＝２１以上の転移病巣。
【００５４】
（結果）
ＮＯＧマウスにおける肝転移の発生率および肝病巣の数は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるよりもはるかに高かった（表１および図１Ａおよび図１Ｂ）。上記マウスに１×１０４細胞を接種し、そして６週間後に屠殺した場合、ＮＯＧマウスにおける肝転移の発生率は、以下のとおりであった：
ＭＩＡＰａＣａ−２、ＡｓＰＣ−１およびＰＡＮＣ−１  １００％；
Ｃａｐａｎ−１                                        ９０％；
ＢｘＰＣ−３                                      １２．５％；および
ＰＬ４５およびＣａｐａｎ−２                            ０％。
【００５５】
さらに、１×１０３のＭＩＡＰａＣａ−２細胞、ＡｓＰＣ−１細胞、ＰＡＮＣ−１細胞およびＣａｐａｎ−１細胞を接種した場合、ＮＯＧマウスの５０％〜８０％で転移が明らかであり、そして１×１０２ＭＩＡＰａＣａ−２癌細胞、ＡｓＰＣ−１癌細胞およびＰＡＮＣ−１癌細胞を接種した場合でさえ、ＮＯＧマウスの３７．５％〜７１．４％が肝転移を示す。これらのデータは、ヒト膵臓癌細胞株を接種されたＮＯＧマウスにおける肝転移病巣は、用量依存的な様式で再現可能に形成されることを示した。
【００５６】
ＮＯＧマウスおよびＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける肝転移の代表的な顕微鏡視野を、図１Ａに示す。ＭＩＡＰａＣａ−２細胞、ＡｓＰＣ−１細胞、ＰＡＮＣ−１細胞、Ｃａｐａｎ−１細胞およびＢｘＰＣ−３細胞を注射されたＮＯＧマウスは、その肝臓において、複数の円形の転移を示した。しかし、これらの細胞株における病巣数は、各細胞株に依存して、広範に異なっていた。７つの膵臓癌細胞株からの５つは、ＮＯＧマウスにおいて転移可能性を示し、対照的に、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、ＡｓＰＣ−１を除いて、同様の条件下では肝転移を示さなかった。図１ＡおよびＢに示されるように、ＡｓＰＣ−１は、両方のマウス系において転移可能性を示したが、ＮＯＧマウスにおける転移の程度は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるよりも重篤であった。
【００５７】
Ｋｕｓａｍａら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２２：３０８−１７（２００２））は、１×１０６のＡｓＰＣ−１細胞を注射された胸腺欠損ヌードマウスの１００％において、転移病巣が明らかであったことを報告した。これらの発見は、ＡｓＰＣ−１が、高い転移可能性を有する細胞のうちの１つであり得る（ここで、この可能性は、注射された細胞数に依存する）ことを示唆する。
【００５８】
Ｃａｐａｎ−１またはＢｘＰＣ−３を接種されたＮＯＧマウスの転移発生率は、接種細胞の数の減少とともに消失した。対照的に、ＮＯＧマウスに１×１０２細胞のみを接種した場合でさえ、ＭＩＡＰａＣａ−２またはＡｓＰＣ−１を接種したＮＯＧマウスの５０％より多くにおいて、転移発生は明らかであった（表１）。これらの発見は、ＮＯＧマウスが、他の免疫欠損マウスモデル、そして特にＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスと比較して、非常に優れた転移モデルであることを明示している。
【００５９】
ヌードマウスを用いたヒト膵臓癌細胞の肝転移に関する以前の刊行物のほとんどは、百万個より多くの癌細胞の脾臓内接種を報告している（Ｓｈｉｓｈｉｄｏら、Ｓｕｒｇ．Ｔｏｄａｙ  ２９（６）：５１９−２５（１９９９）；Ｎｏｍｕｒａら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  １９：３９１−９（２００２）；およびＩｋｅｄａら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８１：９８７−９３（１９９０））。それらの細胞株由来の高転移クローンが確立されているほかは、１００％の転移発生の報告はほとんどない。しかし、百万個より多くの癌細胞が、門脈を介して一気に肝臓に侵入し、そして膵臓癌患者において転移病巣を形成することはありそうになく、したがって、現在の転移動物モデルは、代表的なヒト臨床状態の代表とはなっていない。
【００６０】
対照的に、ＮＯＧマウスは、ヒト膵臓癌の臨床的状態および振舞いを適切に反映する、有効な癌転移モデルを代表する。したがって、ＮＯＧマウスにおいて見られる充分に組織されかつ再現可能な肝転移は、ヒト膵臓癌の肝転移研究において有用であり、そして新規抗転移薬物をスクリーニングし、そして開発するための好ましいモデルとなると予想される。
【００６１】
マウスＮＫ活性は免疫欠損動物（例えば、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウスおよびヌードＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス）において代償的に非常に高く、そして低い速度の腫瘍増殖および癌転移に寄与することが報告された（Ｓｈｐｉｔｚら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１４（５Ａ）：１９２７−３４（１９９４））。対照的に、Ｉｔｏら（Ｂｌｏｏｄ  １００：３２２１−８（２００１））は、ＮＯＧマウスは、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を有さず、そしてマクロファージ機能および樹状細胞機能を減少することを報告した。ＮＯＧマウスを用いた転移モデルにおいて、癌細胞の転移可能性は、その宿主の免疫系、特にＮＫ活性に対して複雑に作用することなく、検出されることが示唆される。
【００６２】
（結論）
提示されたデータは、上記ＮＯＤ／ＳＣＩＤγｃｎｕｌｌマウスモデルが、異種細胞移植に対して高い可能性を有することを実証した。癌細胞の脾臓内（門脈）注射のためにこのモデルを使用すると、ヒト膵臓細胞の信頼性のある肝転移の振舞いが観察された。１×１０４細胞のみを移植後、６週間のＮＯＧマウスにおいて、７つの細胞株のうちの４つが高い転移可能性（＞８０％の発生）を示し、研究した細胞株のうちの３つが低い転移可能性（＜２０％の発生）を示した。さらに、高転移可能性細胞株の１×１０２細胞を接種した場合でさえ、ＮＯＧマウスにおいて肝転移が明らかであった。したがって、癌細胞の転移能力は、３対数オーダーの規模全体に広がる広範囲の接種細胞数で実証された。上記結果はまた、上記ＮＯＧマウスモデルが、癌転移研究のための最適な動物モデルであると現在考えられているＮＯＤ／ＳＣＩＤモデルよりも、明らかに優れていることを示す。
【００６３】
（実施例２）
（ｃＤＮＡマイクロアレイにおける癌転移関連遺伝子の検出）
（材料および方法）
ヒト膵臓腫瘍細胞株であるＭＩＡＰａＣａ−２、Ｐａｎｃ１、Ｃａｐａｎ２およびＰＬ４５（ＡＴＣＣから入手可能）を、実施例１に記載の方法にしたがって培養した。全ＲＮＡを、ＴＲＩＺＯＬ試薬（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いて、コンフルエントなそれらの細胞の培養物から抽出した。Ｃｙ−３標識されたｃＤＮＡプローブを、Ａｔｌａｓ  ｈｕｍａｎ  １Ｋ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ（ＢＤ）、ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（ＢＤ）およびＣｙ−３蛍光色素（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、２０μＧの全ＲＮＡから合成した。次いで、上記プローブを、製造業者の指示書にしたがって、Ａｌｔａｓ  Ｇｌａｓｓ  Ｈｕｍａｎ  １．０  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（ＢＤ）にハイブリダイズした。
【００６４】
上記膵臓腫瘍細胞株のうちの示差的に発現された遺伝子を、Ａｌｔａｓ  Ｇｌａｓｓ  Ｈｕｍａｎ  １．０  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（ＢＤ）を用いて包括的に調査した。上記Ｃｙ−３標識されたシグナルを検出および入手し、そしてａＧＭ４１８アレイスキャナー（Ｔａｋａｒａ）によって対応する画像を分析した。データ処理を、Ｉｍａｇｅｎｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．５ソフトウェアを用いて実行した。この実験において、発明者らは、それらの転移可能性に基づいてヒト膵臓腫瘍細胞株を２つの群に分類した。ＭＩＡＰａＣａ−２細胞株およびＰａｎｃ１細胞株を高転移性群に分類し、他方の細胞株であるＣａｐａｎ２およびＰＬ４５を、非転移性群に分類した。発現プロフィールを比較するために、「高転移性群」アレイからのシグナル値の平均を、「非転移性群」アレイからのシグナル値の平均で割った。生じた値を「遺伝子発現レベル」と呼び、ここで、１０倍の差および１０倍の差より高い値を有意と見なした。
【００６５】
（結果）
各細胞株の遺伝子発現プロフィールを、ＥＸＣＥＬファイル（ＡｒｒａｙＤａｔａ．ｘｃｌ）に記録した。上記非転移性細胞株（Ｃａｐａｎ２およびＰＬ４５）と比較して上記高転移性細胞株（ＭＩＡＰａＣａ−２およびＰａｎｃ１）において過剰発現した遺伝子、ならび上記非転移性細胞株と比較して上記高転移性細胞株において低く発現した遺伝子を、表２に列挙する。例えば、ブチレート応答因子１遺伝子（ＢＲＦ１）は、上記非転移性群の細胞においてよりも、上記高転移性群の癌細胞において１００，０００倍より多く発現した。対照的に、トランスデューシン（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ）β２サブユニット遺伝子の１００，０００倍より多くの過剰発現は、上記非転移性群の細胞において見られた。
【００６６】
表２に示されるように、以下の遺伝子は、非転移性細胞と比較して、高転移性細胞において有意に過剰発現する：ＴＩＳ１  １Ｂタンパク質；前立腺分化因子（ＰＤＦ）；糖タンパク質ホルモンα−サブユニット；トロンボポエチン（ＴＨＰＯ）；ｍａｎｉｃ  ｆｒｉｎｇｅホモロジー（ＭＦＮＧ）；補体成分５（Ｃ５）；ｊａｇｇｅｄホモログ１（ＪＡＧ１）；インターロイキンエンハンサー結合因子（ＩＬＦ）；ＰＣＡＦ関連因子６５α；インターロイキン−１２α−サブユニット（ＩＬ−１２−α）；核内呼吸性因子１（ＮＲＦ１）；幹細胞因子（ＳＣＦ）；転写因子リプレッサータンパク質（ＰＲＤＩ−ＢＦ１）；および低分子誘導性サイトカインサブファミリーＡメンバー１（ＳＣＹＡ１）。
【００６７】
表２に示されるように、以下の遺伝子は、非転移性細胞と比較して、高転移性細胞において有意に低く発現する：トランスデューシンβ２サブユニット；チャイニーズハムスター細胞のＸ線修復性欠損補完性修復１；推定腎臓有機アニオン輸送体１；Ｇ１／Ｓ特異的サイクリンＥ（ＣＣＮＥ）；レチノイン酸レセプターγ（ＲＡＲＧ）；Ｓ−１００カルシウム結合タンパク質Ａ１；中性アミノ酸輸送体Ａ（ＳＡＴＴ）；ドーパクロムトートメラーゼ；ｅｔｓ転写因子（ＮＥＲＦ２）；カルシウム依存性カリウムチャネルβ−サブユニット；ＣＤ２７ＢＰ；ケラチン１０；６−Ｏ−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）；色素性乾皮症Ａ群補完性タンパク質（ＸＰＡ）；ＣＤＣ６関連タンパク質；細胞分裂プロテインキナーゼ４；ノシセプチンレセプター；シトクロムＰ４５０  ＸＸＶＩＩＢ１；Ｎ−ｍｙｃプロトオンコジーン；溶質キャリアーファミリーメンバー１（ＳＬＣ２Ａ１）；膜関連キナーゼｍｙｔ１；カスパー、ＦＡＤＤ関連性かつカスパーゼ関連性のアポトーシス誘発因子；およびＣ−ｓｒｃプロトオンコジーン。
【００６８】
列挙された遺伝子および他の遺伝子の示差的な発現は、例えば、薬物スクリーニングにおいて、抗癌薬物候補および／または抗転移薬物候補を試験するために、そして診断目的および治療目的のために、例えば、遺伝子導入アプローチを用いて使用され得る。
【００６９】
本明細書中に引用される全ての参考文献は、本明細書により、それらの全体が参考として明確に援用される。
【００７０】
本発明は、特定の実施形態によって示されるが、それに限定されない。当業者は、本発明の作用を実質的に変更することなく、種々の改変が可能であることを理解する。したがって、例えば、本明細書中に記載されるマウスモデルは、他の等価な動物モデル（特に、げっ歯類、例えば、ラット）で置換され得る。全てのこのような改変は、本発明の範囲内であることが意図される。
【００７１】
【表１−１】
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【００７２】
【表１−２】
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【００７３】
【表２−１】
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【表２−２】
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【図１Ｂ】
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【図１Ａ】
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