(57)【要約】【課題】糸状菌が含まれるリグノセルロース原料を物質変換の原料や資材等として高濃度に利用する際の粘度の上昇に伴う問題を解決するために原料と水からなるスラリーの粘度を低下させることを目的とした、糸状菌が含まれるリグノセルロース原料の処理方法を開発することを課題とする。【解決手段】糸状菌が含まれるリグノセルロース原料を物質変換の原料や資材等として高濃度に利用する際、原料に多糖類を分解する酵素を少量加えて処理することで、原料と水を混合したスラリーの粘度を顕著に低下させることができる。この酵素としてはセルロース分解活性を有する酵素および真菌類の細胞壁溶解活性を有する酵素のいずれか、あるいは両方を加えると効果的である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状菌が含まれるリグノセルロース原料を物質変換の原料や資材等として高濃度に利用する際、原料に対して多糖類を分解する酵素を少量加えることで、糸状菌が含まれるリグノセルロース原料を含むスラリーの粘度を下げ、流動性を高めることを特徴とする糸状菌が含まれるリグノセルロース原料の処理方法。
【請求項２】
請求項１記載の処理方法において、処理工程中の湿式粉砕等微粉砕処理の前段階あるいは微粉砕処理中に酵素添加することを特徴とする糸状菌が含まれるリグノセルロース原料の処理方法。
【請求項３】
酵素としてセルロース分解活性を有する酵素および真菌類の細胞壁溶解活性を有する酵素のいずれか、あるいは両方を使用することを特徴とする請求項1又は2記載の処理方法。
【請求項４】
セルロース分解活性を有する酵素をろ紙分解活性にして0.10FPU/ｇ原料以上加えることを特徴とする請求項3記載の処理方法。
【請求項５】
真菌類の細胞壁溶解活性を有する酵素がキチナーゼ、キトビアーゼ、キトサナーゼ、β-1,3-グルカナーゼ活性のいずれか、あるいはこれら複数の活性を有する酵素であることを特徴とする請求項3記載の処理方法。
【請求項６】
糸状菌が含まれるリグノセルロース原料がキノコ栽培菌床またはキノコ栽培廃菌床であることを特徴とする請求項1〜5記載の処理方法。
【請求項７】
キノコが、まいたけ、えりんぎまたはぶなしめじのいずれかであることを特徴とする請求項6記載の処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糸状菌が含まれるリグノセルロース原料をエタノールなど有用な物質を得るための物質変換の原料や資材等として利用する際の処理方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
木質バイオマスや草本バイオマス等のセルロースを含む原料は地球上に多く存在する資源であり、近年、地球温暖化対策の一環として、これらの原料からエタノールを製造し、各種燃料や化学原料として利用しようとする試みが広く行われている（非特許文献１）。
【０００３】
稲わら、廃材木、おがくず、バガス、スイッチグラスなど、代表的なバイオマス原料の他に、キノコ栽培菌床やキノコ栽培廃菌床、キノコ栽培原木、バーク堆肥、セルラーゼ等酵素産生のための培養物など糸状菌を含んでいるリグノセルロース原料も各種原料として有望である。また、木材チップや稲わら等を白色腐朽菌で処理した後に物質変換する技術も報告されており（特許文献１）、これも糸状菌を含んでいるリグノセルロース原料である。これら糸状菌を含むリグノセルロース原料の中でもキノコ栽培菌床や廃菌床は、菌床中のリグノセルロースが栽培中に白色腐朽菌処理されており、最もエタノール変換原料として有望であると考えられる。
【０００４】
一般的なリグノセルロース原料と同様に、キノコ廃菌床等糸状菌が含まれるリグノセルロース原料を用いたエタノールの製造は、収集した原料を、糖化工程において糖に分解した後、発酵工程において酵母等の微生物を用いてエタノールに変換することにより行うことができる。これらの試みには原料に含まれるセルロースをグルコースまで分解（糖化）することが重要である。
【０００５】
リグノセルロース原料を糖化する方法として、酸加水分解と酵素糖化が知られている。このうち酸加水分解法は、濃硫酸加水分解法と希硫酸加水分解法に分けられる。濃硫酸加水分解法では高い糖化率が得られる一方で、加水分解後の糖化溶液に高濃度の硫酸が含まれているため、糖化液をエタノール発酵に供するには硫酸を回収する操作が必要である。硫酸を回収する場合、イオン交換樹脂を利用して糖と硫酸の溶出時間の差により回収する方法があるが、回収された硫酸が希釈されているため、濃縮して再利用するのに大きなエネルギーが必要となるという問題がある(非特許文献２)。一方、希硫酸加水分解法では、濃硫酸加水分解に比較してヘミセルロースの糖化率が高く、薬剤の使用量が抑えられるという長所があるが、高温希硫酸の条件下で生成した単糖類が過分解されることにより、エタノール発酵を阻害する物質が生成することや糖収率が低くなることなどの問題がある（非特許文献３）。さらに、酸加水分解法に共通する特徴として、強酸を用いるため装置の腐食を考慮する必要があり、その素材にかける費用やメンテナンスの費用が大きくなるという問題もある（非特許文献４）。
【０００６】
一方、酵素糖化法ではセルロースを分解する酵素であるセルラーゼを用いて原料を糖化する。酸加水分解法とは異なり、強酸を用いる必要がないため、比較的温和な条件で原料からグルコースを得ることができる。
【０００７】
しかしながら、木材中のセルロースはリグニンなどに囲まれていることや、その結晶化度が高いことにより酵素糖化法におけるセルロース分解酵素によるセルロースの分解が困難となっている。このため、リグノセルロース原料の糖化では、原料中のセルロースを酵素が利用しやすい形に変換することを目的として、酸処理、アルカリ処理、蒸煮・爆砕、電子線照射、粉砕や上述したような白色腐朽菌による微生物処理などの前処理法が実施されている（非特許文献４）。加えて、キノコ廃菌床を用いた酵素糖化法においても、アルカリ処理、乾式微粉砕、及び一定期間の保管などの前処理が試みられており、これらのうち最も糖化効率が高いのは、一定期間の保管を行った後乾式微粉砕を行う方法であることがわかっている（特許文献２）。
【０００８】
乾式微粉砕は乾燥試料を機械を用いて衝撃力により微粉末にする方法である。この処理によりセルロース分子の切断や結晶構造の破壊、反応表面積の増大が起こり、酵素糖化性が向上することが知られている（非特許文献５）が、キノコ栽培菌床や廃菌床のように含水率の高い試料では、一度乾燥させてから粉砕処理に供ずる必要があり、使用するエネルギーが大きく実用性が低いという問題がある。
【０００９】
この問題を解決する方策としては、含水率の高い試料でも処理に供ずることのできる湿式粉砕による前処理が挙げられる。この方法は原料を水などの溶媒に分散させて処理を行うことから、試料を乾燥させる必要はなく、乾式粉砕に比べ必要なエネルギーが少ないというメリットがある。
【００１０】
湿式粉砕では適当量の加水を行って試料を水に分散させる必要があるが、この時加える水の量には十分な検討が必要である。粉砕処理を行った処理物は糖化・発酵を経てエタノールに変換され、続く蒸留・精製によりエタノールが回収されるが、処理物の水分が多いとエタノール濃度が低くなるため、蒸留に多くのエネルギーが必要になる（非特許文献６）。よって、湿式粉砕時にスラリーを調製する際には過剰な水の添加はせず、できるだけ原料の濃度を高くして行うのが望ましいが、糸状菌が含まれるリグノセルロース原料の代表である、キノコ菌床や廃菌床等を高濃度に使用した場合には、一般的なリグノセルロース原料よりもスラリーの粘度が高くなるという問題がある。これにより、例えば変換前処理として行う湿式粉砕装置への送り込み時の効率低下や粉砕装置の目詰まり、前処理工程以降でも各種ポンプ等で原料が含まれるスラリーを移送する際の目詰まりや攪拌効率の低下など粘度の上昇に伴う問題を生じるおそれがある。
【００１１】
一般的なリグノセルロース原料では、このような粘度の上昇に伴う問題は、セルラーゼ等の酵素を用いて原料を加水分解し、流動性を向上させることで改善できるとされている（特許文献３）が、この方法では、前もって蒸気爆砕によりリグノセルロースを含む固体画分とヘミセルロースを含む液体画分に原材料を変換する必要があり、特殊な装置が必要とされている。このことは糸状菌が含まれるリグノセルロース原料をエタノールに物質変換するのに必要な工程を増加させてしまうことや、エタノール変換に必要なエネルギーやコストの増大につながることから、望ましいとはいえない。よって、糸状菌が含まれるリグノセルロース原料を物質変換するのに必要なエネルギーやコストを増加させず、また余分な工程を増やすことなく粘度を低下させることのできる方法が必要となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００８−２０６４０１号公報
【特許文献２】特開２００６−２３０３６５号公報
【特許文献３】特表２００８−５０１３３０号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】寺本好邦ら、リグノセルロースからのバイオエタノール製造、伝熱、２００８年、４７号、ｐ5-9
【非特許文献２】佐賀清崇ら、前処理・糖化法の違いを考慮したセルロース系バイオエタノール製造プロセスの比較評価、Journal of Japan Society of Energy and Resources、2009年、2号、p9-14
【非特許文献３】山田富明ら、バイオエタノール製造技術、工業調査会、2007年、ｐ104-118
【非特許文献４】江原克信ら、バイオマス・エネルギー・環境、IPC、２００１年、ｐ251-260
【非特許文献５】東順一ら、酵素系による木材多糖の加水分解、木材研究・資料、１９８３年、１７号、ｐ1-20
【非特許文献６】G. Zacchi、Hydrolysis of Biomass for Fuel Ethanol Production、Baltic Biorefinery Symposium、２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、糸状菌が含まれるリグノセルロース原料を物質変換の原料や資材等として高濃度に利用する際の、変換前処理として行う湿式粉砕装置への送り込み時の効率低下や粉砕装置の目詰まり、前処理工程以降の各種ポンプ等でスラリーを移送する際の目詰まりや攪拌効率の低下など、粘度の上昇に伴う問題を解決することを目的とした糸状菌が含まれるリグノセルロース原料の処理方法を開発することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、糸状菌が含まれるリグノセルロース原料を酵素で糖さらにはエタノール等有用物質に変換する際、又は機械的、化学的処理により糸状菌が含まれるリグノセルロース原料由来の生分解性物質を製造する際の湿式粉砕等前処理の前段階あるいは前処理時に多糖類を分解する酵素で処理することにより、糸状菌が含まれるリグノセルロース原料と水を混合したスラリーの粘度が顕著に低下することを知見した。加えて、酵素としてはセルロース分解活性を有する酵素および真菌類の細胞壁溶解活性を有する酵素のいずれか、あるいは両方を加えると効果的であることを知見し、本発明を完成した。
【００１６】
すなわち本発明は、糸状菌が含まれるリグノセルロース原料を物質変換の原料や資材等として高濃度に利用する際、多糖類を分解する酵素を少量添加して原料を処理することで、原料と水を混合したスラリーの粘度を低下させる方法である。酵素としてはセルロース分解活性を有する酵素および真菌類の細胞壁溶解活性を有する酵素のいずれか、あるいは両方を添加すると効果的である。特にセルロース分解活性を有する酵素はろ紙分解活性（Filter paper unit；FPU）にして0.10FPU/ｇ原料以上加えることで高い効果が得られる。また、真菌類の細胞壁溶解活性を有する酵素としては、キチナーゼ、キトビアーゼ、キトサナーゼ、β-1,3-グルカナーゼ活性のいずれか、又はこれら複数の活性を有する酵素を使用することで高い効果が得られる。以下詳述する。
【００１７】
本発明は、
(1)糸状菌が含まれるリグノセルロース原料を物質変換の原料や資材等として高濃度に利用する際、原料に対して多糖類を分解する酵素を少量加えることで、糸状菌が含まれるリグノセルロース原料を含むスラリーの粘度を下げ、流動性を高めることを特徴とする糸状菌が含まれるリグノセルロース原料の処理方法、
(2)(1)記載の処理方法において、処理工程中の湿式粉砕等微粉砕処理の前段階あるいは微粉砕処理中に酵素添加することを特徴とする糸状菌が含まれるリグノセルロース原料の処理方法、
(3)酵素としてセルロース分解活性を有する酵素および真菌類の細胞壁溶解活性を有する酵素のいずれか、あるいは両方を使用することを特徴とする(1)又は(2)記載の処理方法、
(4)セルロース分解活性を有する酵素をろ紙分解活性にして0.10FPU/ｇ原料以上加えることを特徴とする(3)記載の処理方法、
(5)真菌類の細胞壁溶解活性を有する酵素がキチナーゼ、キトビアーゼ、キトサナーゼ、β-1,3-グルカナーゼ活性のいずれか、あるいはこれら複数の活性を有する酵素であることを特徴とする(3)記載の処理方法、
(6)糸状菌が含まれるリグノセルロース原料がキノコ栽培菌床またはキノコ栽培廃菌床であることを特徴とする(1)〜(5)記載の処理方法、
(7)キノコが、まいたけ、えりんぎまたはぶなしめじのいずれかであることを特徴とする(6)記載の処理方法
に関する。
【００１８】
原料としては、キノコ栽培菌床または廃菌床など、糸状菌が含まれるリグノセルロース原料が利用可能である。
【００１９】
処理に用いる酵素としては、多糖類を分解する酵素が使用可能であるが、このうちセルロース分解活性を有する酵素および真菌類の細胞壁溶解活性を有する酵素のいずれか、あるいは両方を使用すると効果的である。このうち、セルロース分解活性を有する酵素は0.10FPU/ｇ原料  以上加えると有効である。また、真菌類の細胞壁溶解活性を有する酵素としては、キチナーゼ、キトビアーゼ、キトサナーゼ、β-1,3-グルカナーゼ活性のいずれか、あるいはこれら複数の活性を有する酵素を加えると効果的である。なお、これらの酵素は、市販品であっても、糸状菌や酵母等を培養した培養液やそれから精製したものであっても目的に適うものであればよい。これらを混合したものも使用可能である。セルロース分解活性を有する酵素では例えばセルラーゼ（GODO-TCD、合同酒精(株))が利用可能である。また、真菌類の細胞壁溶解活性を有する酵素では、例えばYatalase(タカラバイオ)やLysing enzyme from Trichoderma harzianum(L1412-5Gシグマアルドリッチ)などが利用可能であるが、その他にも細胞壁分解用やプロトプラスト調製用の酵素であれば利用可能である。
【００２０】
使用する酵素の量は、使用する酵素により適宜でよい。また、酵素液を作製する際、水に懸濁して作製しても良いが、酢酸やクエン酸等のバッファーを用いて酵素の至適ｐHに保つのも有効である。
【００２１】
酵素処理する際は何もせずに放置しておいても良いが、攪拌機等で攪拌することにより、酵素と基質の接触度合いが高まる。また、反応は室温でも効果が得られるが、酵素の至適温度に保つことで酵素反応が促進される。
【発明の効果】
【００２２】
本発明のように、糸状菌が含まれるリグノセルロース原料の物質変換、特に酵素を用いた糖やさらに微生物を用いたエタノール等への変換の際、湿式粉砕等前処理の前段階あるいは同時並行で、原料に対して多糖類を分解する酵素を少量加えることで、原料と水を混合したスラリーの粘度を下げ、流動性を高めることができる。酵素としては、セルロース分解活性を有する酵素および真菌類の細胞壁溶解活性を有する酵素のいずれか、あるいは両方を添加すると効果的である。このうちセルロース分解活性を有する酵素は0.10FPU/ｇ原料以上添加すると効果的である。また、真菌類の細胞壁溶解活性を有する酵素として、キチナーゼ、キトビアーゼ、キトサナーゼ、β-1,3-グルカナーゼ活性のいずれか、あるいはこれら複数の活性を有する酵素を加えると効果的である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】セルラーゼ処理が3ヶ月保管まいたけ廃菌床スラリーの粘度に及ぼす影響を示す図。
【図２】Yatalase処理およびLysing Enzymes from Trichoderma harzianum処理が3ヶ月保管まいたけ廃菌床スラリーの粘度に及ぼす影響を示す図。
【図３】Lysing Enzymesとセルラーゼの一方あるいは両方での処理が3ヶ月保管まいたけ廃菌床スラリーの粘度に及ぼす影響を示す図。
【図４】セルラーゼ処理がキノコ栽培廃菌床およびブナオガコスラリーの粘度に及ぼす影響を示す図。
【図５】Lysing Enzymes処理がキノコ栽培廃菌床およびブナオガコスラリーの粘度に及ぼす影響を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明をより具体的に説明するために、以下に実施例を示すが本発明はこれに限定されるものではない。
【００２５】
[実施例１]
酵素処理が3ヶ月保管まいたけ廃菌床スラリーの粘度に及ぼす影響
糸状菌が含まれるリグノセルロース原料として木質系バイオマスであるまいたけ廃菌床を、25℃、72日間保管した後、酵素による粘度低下効果の調査に供した。この廃菌床を乾重量にして15.0 gビーカーにとり、50ｍM酢酸バッファー（pH5.0）およびセルロース分解活性を有する酵素としてセルラーゼ（合同酒精(株)）を0.06、0.08、0.10、0.14、0.16、0.60、1.2、7.1、50FPU/ｇ原料となるように添加し、全容を120mlとした。この試料を室温で、攪拌機（RW14ベーシック、IKA）にて1000rpmで攪拌しながら30分間反応させ、ビスコメーター（VT-04F  リオン株式会社）で粘度を測定したところ、0.10FPU/ｇ原料以上のセルラーゼを添加したすべての試験区で酵素未添加と比較して15％以上の粘度の低下がみられた（図1）。
【００２６】
同様に、真菌類の細胞壁溶解活性を有する酵素であるYatalase（キチナーゼ活性72U/ｇ、キトビアーゼ活性789U/ｇ、キトサナーゼ19 U/ｇ、β-1,3-グルカナーゼ 300 U/ｇ、プロテアーゼ31 U/ｇ、細胞壁溶解活性10,000U/g）を5、10、100mg又はLysing Enzymes from Trichoderma harzianum（キチナーゼ活性163U/ｇ、プロテアーゼ活性22.3U/ｇ、セルラーゼ活性1360U/ｇ、0.03FPU/mg以下）を5、10mg添加して粘度の測定をおこなったところ、酵素添加したものでは、未添加と比較して、Yatalaseでは15％以上の粘度低下が、Lysing Enzymesでは45％以上の粘度低下が見られた（図2）。さらに、LysingEnzymes 5又は10mgにセルラーゼ（Trichoderma reesei由来）1.2FPU/ｇ原料を、添加して粘度の測定をおこなったところ、セルラーゼのみ添加した場合やLysing Enzymesのみ添加した場合に比べ、試料の粘度が低下した（図3）。
【００２７】
[実施例２]
リグノセルロース種が酵素処理によるスラリー粘度低下に及ぼす影響
一般的なリグノセルロース原料として木質系バイオマスであるブナオガコを、糸状菌が含まれるリグノセルロース原料としてまいたけ栽培廃菌床、えりんぎ栽培廃菌床、ぶなしめじ栽培廃菌床を用いて酵素添加による粘度低下を調査した。各廃菌床を乾重量にして15.0ｇビーカーにとり、50mM酢酸バッファー（pH5.0）およびセルロース分解活性を有する酵素としてセルラーゼ（合同酒精(株)）を1.2FPU/ｇ原料となるように添加し、全容を120mlとした。この試料を室温で、攪拌機にて1000rpmで攪拌しながら30分間反応させ、ビスコメーター（LVT、BROOKFIELD）にて粘度を測定したところ、酵素未添加と比較してまいたけ廃菌床で13％、えりんぎ廃菌床で17％、ぶなしめじ廃菌床で6％の粘度低下が見られたが、ブナオガコにおいては粘度低下は3％であった (図4)。また、粘度の低下は、えりんぎ栽培廃菌床＞まいたけ栽培廃菌床＞ぶなしめじ栽培廃菌床の順に大きかった。
【００２８】
また、同様に真菌類の細胞壁溶解活性を有する酵素であるLysing Enzymes from Trichoderma harzianumを1000mg添加したところ、酵素未添加と比較してまいたけ廃菌床で29％、えりんぎ廃菌床で18％、ぶなしめじ廃菌床で27％の粘度低下が見られたが、ブナオガコにおいては粘度の低下は見られなかった(図5)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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