(57)【要約】【課題】有機層を除去する操作を行わなくても、有機層を混入することなく核酸増幅産物を分取することが可能な核酸増幅用の試薬入り反応容器を提供すること。【解決手段】２層以上の水層と、水層をそれぞれ分離するようにその間に形成された１．０より大きい比重を有する有機層とを含む、核酸増幅用の試薬入り反応容器であって、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、マグネシウム化合物、およびｄＮＴＰを含む核酸増幅用試薬を前記水層に分離して含む、反応容器。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２層以上の水層と、水層をそれぞれ分離するようにその間に形成された１．０より大きい比重を有する有機層とを含む、核酸増幅用の試薬入り反応容器であって、
ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、マグネシウム化合物、およびｄＮＴＰを含む核酸増幅用試薬を前記水層に分離して含む、反応容器。
【請求項２】
核酸増幅用試薬としてプライマーを更に含む、請求項１に記載の反応容器。
【請求項３】
第一の水層と、第一の水層の上に形成された１．０より大きい比重を有する有機層と、有機層の上に形成された第二の水層を含む、核酸増幅用の試薬入り反応容器であって、
ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、マグネシウム化合物、およびｄＮＴＰを含む核酸増幅用試薬を、第一の水層および第二の水層に分離して含む、反応容器。
【請求項４】
核酸増幅用試薬としてプライマーを更に含む、請求項３に記載の反応容器。
【請求項５】
ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、マグネシウム化合物、ｄＮＴＰを含む水層と、
前記水層の上に形成された１．０より大きい比重を有する有機層
を含む、核酸増幅用の試薬入り反応容器。
【請求項６】
請求項５に記載の反応容器を用いた核酸増幅方法であって、
請求項５に記載の反応容器に、プライマーおよび鋳型としての核酸検体を含有する溶液を添加し、前記有機層の上に第二の水層を形成する工程と、
前記工程により得られた容器を加熱して核酸増幅反応を行い、有機層の上に配置された水層中の核酸増幅産物を得る工程と
を含む、核酸増幅方法。
【請求項７】
ＤＮＡポリメラーゼを含む第一の水層と、
前記第一の水層の上に形成された１．０より大きい比重を有する有機層と、
前記有機層の上に形成された、緩衝液、マグネシウム化合物、ｄＮＴＰを含む第二の水層と
を含む、核酸増幅用の試薬入り反応容器。
【請求項８】
請求項７に記載の反応容器を用いた核酸増幅方法であって、
請求項７に記載の反応容器に、プライマーおよび鋳型としての核酸検体を添加する工程と、
前記工程により得られた容器を加熱して核酸増幅反応を行い、有機層の上に配置された水層中の核酸増幅産物を得る工程と
を含む、核酸増幅方法。
【請求項９】
プライマーを含む第一の水層と、
ＤＮＡポリメラーゼを含む第二の水層と、
第一の水層と第二の水層の間に形成された１．０より大きい比重を有する有機層
を含む、核酸増幅用の試薬入り反応容器であって、
第一の水層または第二の水層の少なくとも一方に緩衝液、マグネシウム化合物、およびｄＮＴＰを含む、核酸増幅用の試薬入り反応容器。
【請求項１０】
請求項９に記載の反応容器を用いた核酸増幅方法であって、
請求項９に記載の反応容器に、鋳型としての核酸検体を添加する工程と、
前記工程により得られた容器を加熱して核酸増幅反応を行い、有機層の上に配置された水層中の核酸増幅産物を得る工程と
を含む、核酸増幅方法。
【請求項１１】
前記有機層が、３５〜９８℃の融点を有することを特徴とする、請求項１−５、７および９の何れか１項に記載の反応容器。
【請求項１２】
前記有機層が、１００〜３００℃の沸点を有することを特徴とする、請求項１１に記載の反応容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅用の試薬入り反応容器およびかかる容器を用いた核酸増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅用試薬の構成成分を、反応や分解を引き起こすことなくあらかじめ混合した状態で保存するために、試薬の構成成分を２つ以上の水層に分離することが知られている。特許文献１は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試薬について、マグネシウム化合物（MgCl2）とそれ以外の試薬成分を、グリースまたはワックスの層を間に挟むことにより同一容器内で分離する方法を開示する。また、特許文献２は、ワックス担体にＰＣＲ試薬の一部を封入することで、ＰＣＲ試薬の構成成分を分離する方法を開示する。また、ＰＣＲ試薬の構成成分を上層反応液と下層反応液に分離するためのワックス層として、AmpliWax（登録商標）PCR Gem 50（Applied Biosystems社）が販売されている（非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第５４１１８７６号明細書
【特許文献２】米国特許第５５９９６６０号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Takara AmpliWax（登録商標）PCR Gem 50  説明書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記背景技術において、グリースまたはワックスの有機層は、ＰＣＲの最初の熱変性段階で融解し、分離されていた試薬成分は互いに混合される。このとき、グリースまたはワックスの有機層は、水より比重が小さいため水層より上部に位置し、反応液の蒸発を防ぐバリヤとして機能する。このため、ＰＣＲ産物を含む下層の水層をマイクロピペット等で分取する際に有機層に接触してしまい、有機層成分が混入する危険性がある。加えて、ＰＣＲ産物を分取するために上部の有機層を除去しようとすると手間が掛かってしまう。そこで、本発明は、有機層を除去する操作を行わなくても、有機層を混入することなく核酸増幅産物を分取することが可能な核酸増幅用の試薬入り反応容器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、複数の水層を分離するための有機層を、水層の比重より大きい比重とすることにより、核酸増幅反応の加熱による融解後に水層の下に位置するようにし、これにより上記目的を達成し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の手段を提供する。
【０００７】
［１］  ２層以上の水層と、水層をそれぞれ分離するようにその間に形成された１．０より大きい比重を有する有機層とを含む、核酸増幅用の試薬入り反応容器であって、
ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、マグネシウム化合物、およびｄＮＴＰを含む核酸増幅用試薬を前記水層に分離して含む、反応容器。  
［２］  核酸増幅用試薬としてプライマーを更に含む、上記［１］に記載の反応容器。  
［３］  第一の水層と、第一の水層の上に形成された１．０より大きい比重を有する有機層と、有機層の上に形成された第二の水層を含む、核酸増幅用の試薬入り反応容器であって、
ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、マグネシウム化合物、およびｄＮＴＰを含む核酸増幅用試薬を、第一の水層および第二の水層に分離して含む、反応容器。  
［４］  核酸増幅用試薬としてプライマーを更に含む、上記［３］に記載の反応容器。
【０００８】
［５］  ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、マグネシウム化合物、ｄＮＴＰを含む水層と、
前記水層の上に形成された１．０より大きい比重を有する有機層
を含む、核酸増幅用の試薬入り反応容器。  
［６］  上記［５］に記載の反応容器を用いた核酸増幅方法であって、
上記［５］に記載の反応容器に、プライマーおよび鋳型としての核酸検体を含有する溶液を添加し、前記有機層の上に第二の水層を形成する工程と、
前記工程により得られた容器を加熱して核酸増幅反応を行い、有機層の上に配置された水層中の核酸増幅産物を得る工程と
を含む、核酸増幅方法。
【０００９】
［７］  ＤＮＡポリメラーゼを含む第一の水層と、
前記第一の水層の上に形成された１．０より大きい比重を有する有機層と、
前記有機層の上に形成された、緩衝液、マグネシウム化合物、ｄＮＴＰを含む第二の水層と
を含む、核酸増幅用の試薬入り反応容器。  
［８］  上記［７］に記載の反応容器を用いた核酸増幅方法であって、
上記［７］に記載の反応容器に、プライマーおよび鋳型としての核酸検体を添加する工程と、
前記工程により得られた容器を加熱して核酸増幅反応を行い、有機層の上に配置された水層中の核酸増幅産物を得る工程と
を含む、核酸増幅方法。
【００１０】
［９］  プライマーを含む第一の水層と、
ＤＮＡポリメラーゼを含む第二の水層と、
第一の水層と第二の水層の間に形成された１．０より大きい比重を有する有機層
を含む、核酸増幅用の試薬入り反応容器であって、
第一の水層または第二の水層の少なくとも一方に緩衝液、マグネシウム化合物、およびｄＮＴＰを含む、核酸増幅用の試薬入り反応容器。  
［１０］  上記［９］に記載の反応容器を用いた核酸増幅方法であって、
上記［９］に記載の反応容器に、鋳型としての核酸検体を添加する工程と、
前記工程により得られた容器を加熱して核酸増幅反応を行い、有機層の上に配置された水層中の核酸増幅産物を得る工程と
を含む、核酸増幅方法。
【００１１】
［１１］  前記有機層が、３５〜９８℃の融点を有することを特徴とする、上記［１］−［５］、［７］および［９］の何れか１に記載の反応容器。  
［１２］  前記有機層が、１００〜３００℃の沸点を有することを特徴とする、上記［１１］に記載の反応容器。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の容器を用いて核酸増幅反応を行うことにより、有機層を混入させることなく、核酸増幅反応産物を含有する水層を簡単に分取することができる。また、本発明の容器を用いた場合、有機層を除去する手間が不要である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の実施例１を説明するための図。
【図２】本発明の実施例１の結果を示す電気泳動写真。
【図３】本発明の実施例２の結果を示す電気泳動写真。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の「核酸増幅用試薬入り反応容器」は、
２層以上の水層と、水層をそれぞれ分離するようにその間に形成された１．０より大きい比重を有する有機層とを含み、
ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、マグネシウム化合物、およびｄＮＴＰを含む核酸増幅用試薬を前記水層に分離して含む。
【００１５】
核酸増幅用試薬として、プライマーを更に含んでいてもよい。
【００１６】
本発明において、核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）等による核酸増幅を含む。
【００１７】
本発明の「反応容器」は、核酸増幅反応に適した容量を有しており、たとえば200μlのマイクロチューブを使用することができる。反応容器内の総液量、すなわち水層と有機層の総液量は、たとえば20〜100μlとすることができる。水層の総液量は、たとえば10〜90μlとすることができ、有機層の総液量は、たとえば10〜90μlとすることができる。
【００１８】
本発明において「２層以上の水層」とは、たとえば２〜５層の水層、好ましくは２層または３層の水層、最も好ましくは２層の水層である。水層が２層の場合、反応容器は、第一の水層と、第一の水層の上に形成された１．０より大きい比重を有する有機層と、有機層の上に形成された第二の水層を含む。
【００１９】
「１．０より大きい比重を有する有機層」は、水層より比重が大きく、室温（たとえば１５〜２５℃）で固体であり、核酸増幅反応の加熱（熱変性の温度90〜98℃）により溶融するという性質を有する。反応容器内の「１．０より大きい比重を有する有機層」は、核酸増幅反応の加熱によって溶融すると、その比重のため、反応容器の底部に沈降する。このとき、有機層によって分離されていた水層は混合し、ここで核酸増幅反応を行うことができる。核酸増幅反応の終了後、反応容器を室温（たとえば１５〜２５℃）に戻すと、有機層は固化し、固体の有機層の上に液体の水層が形成される。これにより、本発明では、有機層の混入無く、増幅反応産物を含有する上部の水層を分取することが可能である。
【００２０】
上述のとおり、本発明において「有機層」は、反応容器内の２層以上の水層が互いに混合しないように水層の間に位置し、核酸増幅反応の加熱により溶融して、その比重により反応容器の底部に沈降する層である。有機層の比重は、一般に１．０より大きく、３．２以下であり、好ましくは、１．４〜２．２である。有機層は、具体的には、所望の比重を有する、グリース、ワックス、ポリエチレン骨格を主鎖とするハロカーボン類、例えばポリクロロトリフルオロエチレンから構成することができる。有機層は、たとえば、比重約2.0、融点57℃のポリクロロトリフルオロエチレンが挙げられる。有機層の融点は、好ましくは３５〜９８℃、より好ましくは90〜95℃であり、有機層の沸点は、１００℃以上であれば良く、好ましくは１２０〜３００℃程度である。
【００２１】
「核酸増幅用試薬」は、公知の組成を用いることができ、たとえば後述の実施例に記載されるとおり、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、マグネシウム化合物、およびｄＮＴＰを含む水溶液とすることができる。
【００２２】
（a）「ＤＮＡポリメラーゼ」は、一般にＰＣＲに使用される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、たとえばTaqポリメラーゼ（Takara）であり、0.1〜10 units/μlの濃度の酵素液を0.1〜2.0μlの液量で使用し、最終濃度0.02〜0.1 units/μlとすることができる。
【００２３】
（b）「緩衝液」は、たとえば10x Titanium Taq PCR buffer (639141, clontech社)のような市販のPCR bufferを使用することができ、たとえば10×PCR buffer（TaKaRa）を、水層の総液量の1/10の液量で使用することができる。
【００２４】
（c）「マグネシウム化合物」は、核酸増幅用試薬の水溶液中でMg2+を生じるマグネシウム化合物であり、ＭｇＳＯ4、ＭｇＣｌ2などが挙げられ、20〜30ｍＭの濃度のＭｇ2+含有溶液を1.0〜10μlの液量で使用し、最終濃度1.0〜4.0ｍＭとすることができる。
【００２５】
（d）「ｄＮＴＰ」は、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰの混合液であり、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰをそれぞれ1.0〜10ｍＭの濃度で含有するｄＮＴＰ溶液を1.0〜10μlの液量で使用し、最終濃度100〜500μＭとすることができる。「核酸増幅用試薬」は、プライマーを含んでいてもよい。
【００２６】
（e）「プライマー」は、0.1〜5.0μＭのプライマー溶液を0.1〜10μlの液量で使用し、最終濃度0.01〜0.5μＭとすることができる。
【００２７】
本発明において核酸増幅用試薬の各成分は、安定して保存されるために、２層以上の水層に分離して含有される。上述のとおり、核酸増幅用試薬は、（a）酵素（DNAポリメラーゼ）、（b）緩衝液、（c）マグネシウム化合物（たとえばMgSO4）、（d）基質（dNTP）を含み、必要に応じて更にプライマー、鋳型核酸を含んでいてもよい。本発明において「分離して含む」とは、複数の試薬成分を任意の分け方で分離することを意味し、上述の４種類の試薬成分（a）、（b）、（c）、（d）を、試薬成分（a）と試薬成分（b）、（c）、（d）とに分離してもよいし、試薬成分（a）、（b）と試薬成分（c）、（d）とに分離してもよいし、その他の分け方で分離してもよい。たとえば、試薬成分の内、何れか１成分を他の成分と接触しないように分離する状態が望ましく、後述の実施例２に記載されるとおり、マグネシウム化合物（たとえばMgSO4）とそれ以外の試薬成分を分離したり、プライマーとそれ以外の試薬成分を分離したり、または酵素とそれ以外の試薬成分を分離したりすることができる。特に酵素とプライマーを分離しておくことは、非特異反応を抑制できるため好ましい。また一般に、2価の陽イオンMg2+は、核酸の加水分解を促し、且つ酵素活性に必要であることから、非特異反応を抑制するために2価の陽イオンMg2+を分離しておくことも望ましい。2価の陽イオンMg2+を分離する形態は、具体的には、
i) ２層の水層を形成し、第一の水層に2価の陽イオンMg2+を含有し、第二の水層にDNAポリメラーゼを含有し、プライマーを核酸増幅反応の開始時に添加する形態、あるいは
ii) ３層の水層を形成し、2価の陽イオンMg2+とDNAポリメラーゼとプライマーをそれぞれ各水層に分離する形態
とすることができる。
【００２８】
後述の第一および第二の実施の形態は、「核酸増幅用試薬」として、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、マグネシウム化合物、およびｄＮＴＰを含有し、第三の実施の形態は、更にプライマーを含有する。第一の実施の形態では、反応容器に後から添加されるプライマーがその他の成分と接触しないように「核酸増幅用の試薬入り反応容器」は構成されている。また、第二の実施の形態では、容器内でDNAポリメラーゼがその他の成分と接触しないように「核酸増幅用の試薬入り反応容器」は構成されている。また、第三の実施の形態では、容器内で少なくともプライマーとDNAポリメラーゼが接触しないように「核酸増幅用の試薬入り反応容器」は構成されている。
【００２９】
以下、本発明の「核酸増幅用の試薬入り反応容器」の例として第一、第二、第三の実施の形態について述べるが、本発明がこれらに限定されないことはいうまでもない。
【００３０】
［第一の実施の形態］
第一の実施の形態に係る「核酸増幅用の試薬入り反応容器」は、
ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、マグネシウム化合物、ｄＮＴＰを含む水層と、
前記水層の上に形成された１．０より大きい比重を有する有機層
を含む。
【００３１】
第一の実施の形態に係る反応容器を用いた核酸増幅方法は、
第一の実施の形態に係る反応容器に、プライマーおよび鋳型としての核酸検体を含有する溶液を添加し、前記有機層の上に第二の水層を形成する工程と、
前記工程により得られた容器を加熱して核酸増幅反応を行い、有機層の上に配置された水層中の核酸増幅産物を得る工程と
を含む。
【００３２】
本発明の「核酸増幅用の試薬入り反応容器」は、一般に、
下部の水層となる溶液を容器に添加し、遠心した後に凍結させて水層を形成し；
形成された水層の上に有機層を積層し；
有機層の上に上部の水層となる溶液を添加する
ことにより作成することができる。
【００３３】
上述の核酸増幅方法において、「プライマーおよび核酸検体を含有する溶液」として、0.01〜0.5μＭの濃度のプライマーおよび0.1〜100ｎｇ/反応容器の濃度の核酸検体を含有する溶液20〜100μlを使用することができる。
【００３４】
本発明において核酸増幅反応は、公知の手法で行うことができ、たとえば、熱変性（90〜98℃で5〜30秒）→アニーリング（35〜75℃で5〜30秒）→伸長反応（35〜75℃で5〜30秒）のサイクルを、25〜40回繰り返すことにより行うことができる。
【００３５】
核酸増幅反応の加熱により有機層は溶融して沈降するため、有機層の上に、第一の水層と第二の水層が混合した水層が形成され、この水層中の核酸増幅産物は、デカンテーションやピペッティングにより有機層に接触することなく採取することができる。核酸増幅反応後、反応容器を好ましくは1.0〜10℃の温度に置き、有機層を固化させてもよい。
【００３６】
［第二の実施の形態］
第二の実施の形態に係る「核酸増幅用の試薬入り反応容器」は、
ＤＮＡポリメラーゼを含む第一の水層と、
前記第一の水層の上に形成された１．０より大きい比重を有する有機層と、
前記有機層の上に形成された、緩衝液、マグネシウム化合物、ｄＮＴＰを含む第二の水層と
を含む。
【００３７】
第二の実施の形態に係る反応容器を用いた核酸増幅方法は、
第二の実施の形態に係る反応容器に、プライマーおよび鋳型としての核酸検体を添加する工程と、
前記工程により得られた容器を加熱して核酸増幅反応を行い、有機層の上に配置された水層中の核酸増幅産物を得る工程と
を含む。
【００３８】
［第三の実施の形態］
第三の実施の形態は、試薬成分としてプライマーを予め含有する形態であり、第三の実施の形態に係る「核酸増幅用の試薬入り反応容器」は、
プライマーを含む第一の水層と、
ＤＮＡポリメラーゼを含む第二の水層と、
第一の水層と第二の水層の間に形成された１．０より大きい比重を有する有機層
を含む、核酸増幅用の試薬入り反応容器であって、
第一の水層または第二の水層の少なくとも一方に緩衝液、マグネシウム化合物、およびｄＮＴＰを含む。
【００３９】
ここで、緩衝液、マグネシウム化合物、およびｄＮＴＰは、すべて第一の水層に含まれていてもよいし、すべて第二の水層に含まれていてもよいし、第一と第二の水層に分離して含まれていてもよいし、第一と第二の水層の両方に含まれていてもよい。第三の実施の形態では、プライマーとＤＮＡポリメラーゼが互いに接触しないように第一と第二の水層にそれぞれ分離される。
【００４０】
第三の実施の形態に係る反応容器を用いた核酸増幅方法は、
第三の実施の形態に係る反応容器に、鋳型としての核酸検体を添加する工程と、
前記工程により得られた容器を加熱して核酸増幅反応を行い、有機層の上に配置された水層中に核酸増幅産物を得る工程と
を含む。
【実施例】
【００４１】
（実施例１）
以下のとおり核酸増幅用の試薬入り反応容器を調製した。200μlスケールのPCR用マイクロチューブに、Milli-Q水 5.5μl、各10μMに調製したプライマー 1.5μLづつを加え、下層とした。本実施例では、5’- GCTCAGCACTGTGGATGGACCTA -3’（配列番号１）、および5’- GTAAGGGCGGGCCTATG -3’（配列番号２）の配列を有するプライマーを使用した。下層となる溶液を遠心して底面に落とし、-20℃で凍結させた。凍結した水層の上部に、比重約2.0、融点57℃のポリエチレン骨格を主鎖とするハロカーボン類（ポリクロロトリフルオロエチレン（Harocarbon社）を用いて有機層を20μl積層した。次いで有機層の上部に、Milli-Q水 24.8μL、10xPCR buffer 5μL（Cat.No.R001AM,TaKaRa）、25mM MgSO4 2μL、2.5mM dNTPs 5μL（Cat.No.R001AM,TaKaRa）、Taq polymerase (1.0 Unit/μL) 1.2μL（Cat.No.R001AM,TaKaRa）を混合した溶液を積層し、試薬入り反応容器を調製した。この反応容器は、4℃近傍の冷蔵で2週間保存した。
【００４２】
１チューブ内の増幅反応溶液は、総量50μLになるよう調製された。鋳型として、ヒト由来のゲノム核酸検体（提供元：ヒューマンサイエンス振興財団）を50ng/tubeで加えた。一方、ゲノム核酸検体を加える代わりに、Milli-Q水を加えたものをネガティブコントロールとした。調製された増幅反応溶液は、サーマルサイクラー（ABi 9700, Applied Biosystems社）を用いて、熱変性：94℃, 30sec→アニーリング：60℃, 30sec→伸長：72℃, 30secを、32サイクルで増幅反応を行った。反応後の容器は、28℃以下の室温に置いた。増幅した核酸を電気泳動した（A2100 Bioanalyzer, Agilent technologies社）。
【００４３】
増幅反応前後の反応容器の状態を図１に示す。増幅反応前は、有機層が２つの水層を分離している（図１上）。これを加熱すると、有機層が溶融し、上下の水層が混合して、増幅反応が開始される。そのとき、比重の大きい有機層は下層に移動する。有機層の融点は室温より高いので、室温に放置すると下層で固体化する（図１下）。そのため有機層を除去する手間なしに、デカンテーションやピペッティングにより、容易に上部の水層を分取することができる。
【００４４】
得られた増幅反応産物の電気泳動の結果を図２に示す。図２において、レーン左はネガティブコントロールの結果を示し、レーン中央はゲノム検体の結果を示し、レーン右はラダーマーカー（Ladder Marker）の結果を示す。本実施例にて増幅産物を確認することができたことから、本方法は増幅反応を阻害しないことを示している。よって、一般的な増幅反応であれば、本方法を適用することができる。
【００４５】
（実施例２）
実施例１と同様に核酸増幅用の試薬入り反応容器を調製した。本実施例では、実施例１の試薬成分（プライマー、PCR buffer、MgSO4、dNTPs、Taq polymerase）を、表１に記載のとおり２つの水層（上層と下層）に分離して反応容器１〜５を調製した。
【表１】
2011045279.tif 000003
【００４６】
調製された反応容器１〜５は、2〜8℃で2週間冷蔵保存した。
【００４７】
本実施例では、保存した反応容器１〜５に、鋳型となる核酸を加えず、Milli-Q水を加えたネガティブコントロールのみ調製した。調製された増幅反応溶液は、サーマルサイクラー（ABi 9700, Applied Biosystems社）を用いて、熱変性：94℃, 30sec→アニーリング：60℃, 30sec→伸長：72℃, 30secを、32サイクルで増幅反応を行った。反応後のデバイスは、28℃以下の室温に置いた。増幅した核酸を電気泳動した（A2100 Bioanalyzer, Agilent technologies社）。
【００４８】
得られた増幅反応産物の電気泳動の結果を図３に示す。図３は、左のレーンから順に、反応容器１〜５の結果を示す。反応容器１の場合（全組成を下層に混合した場合）、鋳型となる核酸がないにも関わらず、プライマーに由来する非特異産物が発生している。一方、反応容器２〜４の場合（マグネシウム、プライマー、酵素の何れかを下層に分離した場合）、反応容器１に見られるような非特異産物は見られなかった。しかし、反応容器５の場合（酵素およびプライマーを下層に分離した場合）、反応容器１と同様の非特異産物が見られた。以上の結果から、試薬成分の内、何れか１成分を分離した状態が望ましく、特に酵素とプライマーを分離しておくと、非特異反応を抑制できることがわかった。
【図１】
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【図２】
2011045279.tif 000005
【図３】
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【配列表】
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