(57)【要約】【課題】汎用的な光学系を用いて、検出感度の高い分析デバイス並びに分析装置及び簡便かつ低コストの分析デバイスの製造法を提供する。【解決手段】検体液を導入する検体液導入口１０、検体液導入口により導入された検体液を測定する測定部２０及び測定部から排出される検体液を受ける検体液排出口３０を備えた分析デバイス５と、分析デバイス５の測定部２０に検査光を照射する光照射器５０と、分析デバイス５の測定部２０からの測定光を検出する受光器６０とを備えた分析装置１とし、測定部２０が深さｄと幅ｗとのアスペクト比ｄ／ｗが３以上であり、かつ、幅ｗが５０μｍ以下である流路からなり、流路の深さ方向と流路を通過する検査光及び測定光の光路方向とが一致するようにする。【選択図】図１
2011095193.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも、検体液導入口、測定部及び検体液排出口を備える分析デバイスであって、
前記測定部が深さｄと幅ｗとのアスペクト比ｄ／ｗが３以上であり、かつ、幅ｗが５０μｍ以上である流路からなることを特徴とする分析デバイス。
【請求項２】
さらに、検査試薬液導入口を有することを特徴とする請求項１に記載の分析デバイス。
【請求項３】
基板上に膜厚１００μｍ以上の感光性樹脂膜を形成する感光性樹脂膜形成工程と、
前記感光性樹脂膜形成工程で形成された感光性樹脂膜に対して、フォトマスクを介して紫外線を照射して幅５０μｍ以上の鋳型パターンを形成する鋳型パターン形成工程と、
前記鋳型パターン形成工程で形成された鋳型パターンを用いて、前記感光性樹脂膜から離型可能な高分子材料を成型する高分子材料形成工程と、
を含むことを特徴とする分析デバイスの製造方法。
【請求項４】
少なくとも、検体液を導入する検体液導入口、前記検体液導入口により導入された前記検体液を測定する測定部及び前記測定部から排出される前記検体液を受ける検体液排出口を備えた分析デバイスと、前記分析デバイスの測定部に検査光を照射する光照射手段と、前記分析デバイスの測定部からの測定光を検出する受光手段とを備えた分析装置であって、
前記測定部が深さｄと幅ｗとのアスペクト比ｄ／ｗが３以上であり、かつ、幅ｗが５０μｍ以下である流路からなり、
流路の深さ方向と流路を通過する検査光及び測定光の光路方向とが一致することを特徴とする分析装置。
【請求項５】
さらに、検査試薬液を分析デバイスに導入する検査試薬液導入手段を有することを特徴とする請求項４に記載の分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析デバイス、分析デバイスの製造方法及び分析デバイスを用いる分析装置に関するものである。更に詳細には、本発明は、血液、体液、遺伝子等の少量の検体液の光学的分析に用いるマイクロサイズかつ高アスペクト比の流路の分析デバイス、分析デバイスの製造方法及び分析デバイスを用いる分析装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、μＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）といわれる分野で分析システムのダウンサイジングの研究が盛んに行われており、健康診断チップやポータブル環境計測システムへの応用が期待されている。分析システムのダウンサイジングはシリコンやガラスの基板上に微細化された流路（マイクロチャネル）、マイクロバルブ、マイクロポンプ、マイクロミキサーなどのマイクロ流体制御素子や電極、レンズなどの検出部を集積化することにより行われ、このような基板上に集積化されたチップはマイクロチップと呼ばれている。これらの素子や検出部は微細かつ精巧に作られる必要があるため、その加工方法として、微細機械加工技術では微細化に限界があり、リソグラフィーやエッチングといった半導体製造技術が使われている。しかし、年々、更にマイクロチップの構造のアスペクト比の向上、流路の壁面の平滑性、材料由来による検出感度低減の防止を達成する等の新しい技術が提案されている。例えば、シリコン基板をプラズマでエッチングする方法（非特許文献１）では、流路の壁面の平滑性が不充分であり、プラズマ装置が高価で使用に熟練を要するという問題があり、レーザーパルスで化学エッチングを用いる方法（非特許文献２）では、プロセスが複雑なわりに精度が不充分である。
【０００３】
一方、マイクロチップによる分析では扱う検体液の量が非常に少ない、流路が狭いため検体液の濃度もあまり高くできない等のため、高感度な分析が望まれる。しかし、吸光分析、蛍光分析等の光学的分析では、マイクロチップの分析対象を通過する光路長も短くなるため、検出感度を上げるために、流路の上流から下流までの流路全体の情報を同時に検出・積算したり（非特許文献３）、光路が流路を複数回通過するマルチパスシステムとしたり（非特許文献４）、流路の上流(又は下流)から下流(又は上流)へと流路方向に光路を取る（特許文献１）等の光学系の工夫をして、検出感度を高める方法が用いられている。しかし、これらの光学系の工夫をすると専用の光学系を有する分析装置となるため、汎用的な光学系を用いることが可能な、検出感度の高い分析デバイス並びに分析装置が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2009-14636号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Jpn J Appl Phys 2006,45,5597
【非特許文献２】Optics Express 2004,12,2120
【非特許文献３】Electrophoresis 2001,22,230
【非特許文献４】Electrophoresis 2000,21,1291
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、前記の公知分析デバイスとは異なる、汎用的な光学系を用いて、検出感度の高い分析デバイス並びに分析装置及び簡便かつ低コストの分析デバイスの製造法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、特定の構造の分析デバイスを作製するに至り、汎用的な光学系を用いて、検出感度が高まるという知見を得た。
【０００８】
すなわち本発明は、以下のものに関する。
［１］少なくとも、検体液導入口、測定部及び検体液排出口を備える分析デバイスであって、前記測定部が深さｄと幅ｗとのアスペクト比ｄ／ｗが３以上であり、かつ、幅ｗが５０μｍ以上である流路からなることを特徴とする分析デバイス。
［２］さらに、検査試薬液導入口を有することを特徴とする、［１］に記載の分析デバイス。
［３］基板上に膜厚１００μｍ以上の感光性樹脂膜を形成する感光性樹脂膜形成工程と、感光性樹脂膜形成工程で形成された感光性樹脂膜に対して、フォトマスクを介して紫外線を照射して幅５０μｍ以上の鋳型パターンを形成する鋳型パターン形成工程と、鋳型パターン形成工程で形成された鋳型パターンを用いて、前記感光性樹脂膜から離型可能な高分子材料を成型する高分子材料形成工程と、を含むことを特徴とする分析デバイスの製造方法。
［４］少なくとも、検体液を導入する検体液導入口、検体液導入口により導入された検体液を測定する測定部及び測定部から排出される検体液を受ける検体液排出口を備えた分析デバイスと、分析デバイスの測定部に検査光を照射する光照射手段と、分析デバイスの測定部からの測定光を検出する受光手段とを備えた分析装置であって、前記測定部が深さｄと幅ｗとのアスペクト比ｄ／ｗが３以上であり、かつ、幅ｗが５０μｍ以上である流路からなり、流路の深さ方向と流路を通過する検査光及び測定光の光路方向とが一致することを特徴とする分析装置。
［５］さらに、検査試薬液を分析デバイスに導入する検査試薬液導入手段を有することを特徴とする［４］に記載の分析装置。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、高アスペクト比のマイクロ流路からなる分析デバイスを得られることにより、光学的分析において高感度で検出することができる。
また、予め、高アスペクト比の鋳型パターンを作製し、前記鋳型パターンを用いて分析デバイスを作製することから、高アスペクト比のマイクロ流路からなる分析デバイスを容易に設計及び製造することができ、操作の簡便化と低コスト化が達成される。更に、流路の途中で複数の検出を行うことが可能なため、反応速度の観測も可能できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】分析装置１の概略の構成を示す構成図である。
【図２】感光性樹脂膜の作製の概略の工程を示す図である。
【図３】アスペクト比ｗ／ｄが４．２である流路の電子顕微鏡写真である。
【図４】Ｙ字型の流路を有する分析デバイス５の検出限界を示す図である。
【図５】Ｉ字型の流路を有する分析デバイスの検出限界を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に、本発明の実施の形態を図、実施例等を用いて説明する。これらの図、実施例等及び説明は、本発明を例示するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
本発明において「検体液」とは、血液、体液、遺伝子、タンパク質、糖鎖等を分析対象として含む液である。臨床診断、薬剤のスクリーニング等の目的で、血液、体液、遺伝子、タンパク質、糖鎖等の分析対象を、予め、希釈、分離、及び検査試薬と反応等の前処理を経たものも含む。光学的分析に支障のない範囲で、水、生理的食塩水、緩衝液等を含んでもよい。
【００１２】
本発明において「検査試薬液」とは、蛍光ラベル化剤、特定の吸収を持つ色素等の検査試薬を含む液である。
例えば、蛍光色素フルオレセインイソチオシアネート、サンセットイエロー FCF等が挙げられる。
【００１３】
検体液中の分析対象と、検査試薬液中の検査試薬とが、化学反応及び物理吸着等の相互作用により、光学的分析における検出感度が高まる。光学的分析に支障のない範囲で、水、生理的食塩水、緩衝液等を含んでもよい。
【００１４】
本発明において「光学的分析」とは、赤外光、可視光及び紫外光の吸光度及び蛍光強度を用いた分析（測定）を意味する。
本発明の分析デバイス５は、少なくとも、図１に示すように、検体液導入口１０、測定部２０及び検体液排出口３０を備える分析デバイス５であって、前記測定部２０が深さｄと幅ｗとのアスペクト比ｄ／ｗが３以上であり、かつ、幅ｗが５０μｍ以上である流路からなることを特徴とする分析デバイス５である。
【００１５】
「検体液導入口１０」から、前記検査液を本発明の分析デバイス５に取り込むことができる。分析デバイス５に取り込まれた検査液は、「測定部２０」を経て、「検体液排出口３０」に至り、分析デバイス５から排出される。
【００１６】
「測定部２０」は、検体液導入口１０と検体液排出口３０以外の検体の流路であり、光照射器５０から検査光を照射し、照射した検査光を受光器６０で受光することにより、蛍光分析又は吸光分析を行うものである。
【００１７】
具体的には、深さｄと幅ｗとのアスペクト比ｄ／ｗが３以上であり、かつ、幅ｗが５０μｍ以上である流路からなる。流路のアスペクト比は、検出感度を高くする観点から、好ましくは４以上、特に好ましくは５以上である。また、アスペクト比は、分析デバイス５が大きくなりすぎて、少量の検体液の測定に適用できなくなるという理由から、２０以下が好ましく、特に１０以下が好ましい。さらに、流路の幅ｗは、５０μｍ以上であり、少量の検体液の測定に適用するため、好ましくは、７０μｍ以上、特に好ましくは、９０μｍ以上である。また、少量の検体液の測定に適用する理由から、流路の幅は５００μｍ以下が好ましい。
【００１８】
少なくとも、検体液導入口１０、測定部２０及び検体液排出口３０を備える分析デバイス５は、通常、Ｉ字型の流路を有して、Ｉ字型の流路の一方の端が検体液導入口１０、他方の端が検査試薬液導入口４０であり、Ｉ字型の流路の両端以外の部分が測定部２０である。測定部２０の流路は、必ずしもＩ字型に直線的形状である必要はないが、検査液を流しやすくする理由から直線的形状が好ましい。
【００１９】
本発明の分析デバイス５には、さらに、検査試薬液導入口４０を有していてもよい。検体液導入口１０、検査試薬液導入口４０、測定部２０、検体液排出口３０からなる分析デバイス５は、通常、Ｙ字型の流路があり、Ｙ字型の流路のＹ字の上端２つの一方が検体液導入口１０、他方が検査試薬液導入口４０、Ｙ字型の流路のＹ字の下端が検体液排出口３０として、Ｙ字型の流路の三叉路から下方の下端より上方の部分が測定部２０である。測定部２０の流路は、必ずしもＹ字型に直線的形状である必要はないが、検査液を流しやすくする理由から直線的形状が好ましく、Ｙ字のはさみ角度が小さい方が検査液及び検査試薬液を流しやすくする理由から好ましい。
【００２０】
分析デバイス５の内壁に、予め、「検査試薬類似の機能を有する分子」を固定化してもよいが、分析対象と相互作用する前の「検査試薬類似の機能を有する分子」は光学的分析における検出感度がなく、分析対象と相互作用した後に光学的分析における検出感度が高まる分子を選択する必要がある。また、分析対象と検査試薬との相互作用の後、次のステップとして、「検査試薬類似の機能を有する分子」と相互作用をしたり、あるいは、分析対象、検査試薬及び「検査試薬類似の機能を有する分子」の３者が相互作用をしたり、必要に応じて、適切な設計をしてもよい。
【００２１】
検査光を照射する光照射器５０、及び、測定光を受光する受光器６０を、分析デバイス５の前記流路に対して垂直となる同じ光路方向、かつ、互いに対向する位置に配置して分析装置１を組み見立てる。
【００２２】
検査光、測定光（透過光又は蛍光発光等）ともに波長２００〜８００ｎｍの範囲で、分析対象、検査試薬及び検査試薬類似の機能を有する分子等の性質に合わせて、波長を選定する。例えば、核酸（DNA）では230, 260, 280, 320nm、タンパク質では280nmを用いることで、蛍光ラベル化することなく、核酸純度の測定・定量、タンパク質の定量を測定できる。
【００２３】
本発明の分析デバイス５の製造方法は、基板上に膜厚１００μｍ以上の感光性樹脂膜を形成する感光性樹脂膜形成工程、前記工程で形成された感光性樹脂膜に対して、フォトマスクを介して紫外線を照射して幅５０μｍ以上の鋳型パターンを形成する鋳型パターン形成工程、及び前記工程で形成された鋳型パターンを用いて、前記感光性樹脂膜から離型可能な高分子材料を成型する高分子材料形成工程を含むことを特徴とする。
【００２４】
本発明の分析デバイス５の製造方法において、「基板」とは、シリコン基板、ガラス基板等が感光性樹脂膜が付着する基板であれば、特に制限はない。
基板上に膜厚１００μｍ以上の感光性樹脂膜を形成する工程とは、エポキシ樹脂等からなるプレポリマー及び硬化剤、必要に応じて溶媒を混合して、基板上に塗布した後に加熱硬化する方法、又は、予め、硬化、乾燥している感光性樹脂膜（いわゆる、ドライフィルムレジスト）を基板上に重ねて加熱下に圧着して貼り合わせる方法で、感光性樹脂膜を形成する工程である。感光性樹脂膜の膜厚は、前者の方法では塗布する厚みや塗布回数、後者の方法では貼り合わせ回数で、制御することができる。膜厚が１００μｍ以上とするには、後者の方法の方が簡便であり、好ましい。
【００２５】
感光性樹脂として周知の材料から選定して、硬化条件を適切に調整すればよい。
前記工程で形成された感光性樹脂膜に対して、フォトマスクを介して紫外線を照射して幅５０μｍ以上の鋳型パターンを形成する工程とは、幅５０μｍ以上の所望の流路パターンが描かれたフォトマスクを介して、感光性樹脂膜に紫外線を照射し、露光部分を硬化した後、現像液で未硬化部分を剥離して、鋳型パターンを形成する。
【００２６】
前記工程で形成された鋳型パターンを用いて、前記感光性樹脂膜から離型可能な高分子材料を成型する工程とは、前記鋳型パターンの上に、感光性樹脂膜から離型可能な高分子材料を硬化前のプレポリマー、硬化剤及び必要に応じて希釈溶媒と共に塗布した後、加熱硬化する方法、又は、前記鋳型パターン及び他の板材料により鋳型を作り、感光性樹脂膜から離型可能な高分子材料を溶融状態で流し込んで冷却する方法で、前記高分子材料を成型する工程である。
【００２７】
本発明において「感光性樹脂膜から離型可能な高分子材料」とは、ポリジメチルシロキサン（PDSM）、ポリメチルシロキサン等のシリコーン樹脂又はその誘導体、ポリエチレン、ポリプロピレン、飽和環状ポリオレフィン等のオレフィン樹脂等である。特に、測定光を透過し、かつ、感光性樹脂膜から離型性が良く、硬化剤を添加して加熱下で硬化するため取り扱いやすい、ポリジメチルシロキサン（PDSM）、ポリメチルシロキサン等のシリコーン樹脂又はその誘導体が好ましい。
【００２８】
本発明の分析装置１とは、少なくとも、検体液を導入する検体液導入口１０、前記検体液導入口１０により導入された前記検体液を測定する測定部２０及び前記測定部２０から排出される前記検体液を受ける検体液排出口３０を備えた分析デバイス５と、前記分析デバイス５の測定部２０に検査光を照射する光照射器５０と、前記分析デバイス５の測定部２０からの測定光を検出する受光器６０とを備えた分析装置１であって、前記測定部２０が深さｄと幅ｗとのアスペクト比ｄ／ｗが３以上であり、かつ、幅ｗが５０μｍ以上である流路からなり、流路の深さ方向と流路を通過する検査光及び測定光の光路方向とが一致することを特徴とする分析装置１である。前述の分析デバイス５の検体液導入口１０に検体液を分析デバイス５に導入する検体液導入手段を、前述の分析デバイス５の検体液排出口３０に分析デバイス５から排出される検体液を受ける検体液排出手段を、分析デバイス５の測定部２０に検査光を照射する光照射器５０および測定光を検出する受光器６０を配置して、分析装置１とする。
【００２９】
さらに、前述の分析デバイス５の検査試薬液導入口４０に、検査試薬液を分析デバイス５に導入する検査試薬液導入手段を配置してもよい。
［実験例］
本発明を以下に実験例等によって具体的に説明する
（感光性樹脂膜の作製）
図２に示すように、直径３インチの片面研磨のシリコン基板上に、感光性樹脂（ビスフェノールＡノボラック型エポキシ樹脂）製の膜厚５μｍのドライフィルムレジスト（商品名：ＸＰ  ＳＵ−８  ３０００、日本化薬株式会社製）をポリプロピレン製の離型フィルムと共に、シリコン基板にドライフィルムレジストが直接接触するように重ねて置き、ホットプレート上で６５℃に加熱下、離型フィルムの上から柔らかいゴムローラーで３０〜４５秒間圧着して、シリコン基板とドライフィルムレジストを張り合わせて、離型フィルムを剥離した。さらに、貼り合わされたドライフィルムレジストの上に、新たに離型フィルムと共に、ドライフィルムレジスト同士が直接接触するように重ねて置き、同様に、加熱下に離型フィルムの上からゴムローラーで圧着して貼り合わせ、離型フィルムを剥離した。これを繰り返すことによって、シリコン基板上に所望の厚み（５μｍ、２５μｍ、６５μｍ、４２０μｍ）の感光性樹脂膜をそれぞれ作製した。得られた感光性樹脂膜をホットプレートで６５℃１〜２分予備加熱処理した。ドライフィルムレジストを積層して得られた感光性樹脂膜は、各層相互の界面は充分に密着していた。
（鋳型パターンの作製）
露光装置（マスクアライナー：ズース・マイクロテック社製、ｉ線）を用い、流路パターン（幅１００μｍ）が描かれたフォトマスクを介してパターン露光（ソフトコンタクト）を行った。フォトマスクとしては、流路パターン（幅１００μｍ、Ｉ字型の流路）が描かれたフォトマスクを用いた。その後、ホットプレートにより６０℃で２分間、９０℃で６分間加熱処理を行い、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート（ＰＧＭＥＡ）を用いて浸漬法により２５℃で６分間現像処理を行い、１８０℃で１５分間再度加熱処理を行うことでシリコン基板上に硬化した樹脂鋳型パターンを得た。樹脂鋳型パターンの厚みは、前述で得られた感光性樹脂膜の厚み（５μｍ、２５μｍ、６５μｍ、４２０μｍ）を、樹脂鋳型パターンの幅は、フォトマスクに描かれた流路パターンの幅１００μｍを、流路形状は、フォトマスクのＩ字型を保持していた。
（流路を有する分析デバイスの作製）
シリコン基板上に形成されて樹脂鋳型パターン（Ｉ字型）を用いて、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を成型（鋳型上にPDMSのプレポリマーと硬化剤（Sylgard 184 Silicon elastomer, base & curning agent、ダウ・コーニング社製）を10/1で混合したものをキャストし、65 ℃で1時間加熱処理した後、硬化したPDMSをクリーンベンチ内で鋳型から剥がし取る）して、流路が形成されたＰＤＭＳ成型体を得た。ＰＤＭＳ成型体に形成された流路を電子顕微鏡で観察すると、流路の幅ｗ、深さｄのアスペクト比ｗ／ｄが、それぞれ、0.05、0.25、0.65、4.2であった。図３は、アスペクト比ｗ／ｄが４．２である流路の電子顕微鏡写真であり、流路の立ち上がり壁面が垂直であることも確認できた。
【００３０】
得られたＰＤＭＳ成型体と、必要に応じて所望の位置に穴を有する平板状のＰＤＭＳ圧着して貼り合わせて、流路を有する分析デバイス５を得た。
（分析デバイス５の評価）
得られた流路を有する分析デバイス５には、それぞれ、Ｙ字型又はＩ字型の流路があり、Ｙ字型の流路のＹ字の上端２つの一方が検体液導入口１０、他方が検査試薬液導入口４０、Ｙ字型の流路のＹ字の下端が検体液排出口３０、Ｉ字型の流路の一方の端が検体液導入口１０、他方の端が検査試薬液導入口４０として、Ｙ字型の流路の三叉路から下方の下端より上方の部分、並びに、Ｉ字型の流路の両端以外の部分を測定部２０として、分析デバイス評価に用いた。蛍光分析、吸光分析、それぞれの検出限界を確認する目的のため、分析対象を共存させず、それぞれ、蛍光色素、可視光吸収を持つ色素を用いた。
（蛍光分析）
分析デバイス５としてＹ字型の流路を有する分析デバイス５（流路の深さｄは、それぞれ５μｍ、２５μｍ、６５μｍ、４２０μｍ）を、検体液として蛍光色素フルオレセインイソチオシアネート水溶液（濃度1〜100 nM）を用いて、検査光として励起光（488 ｎｍ）を照射する光照射器５０（レーザー、発光ダイオード、高圧水銀ランプ、ハロゲンランプなど）及び測定光として蛍光発光（520 ｎｍ）を受光する受光器６０（フォトマルチプライヤ、CCDなど）を前記流路に対して垂直となる同じ光路方向、かつ、互いに対向する位置に配置して分析装置１を組み、各分析デバイス５の検出限界を確認した（図４、表１参照。）。なお、光路長は流路の深さｄに対応するので、それぞれ、５μｍ、２５μｍ、６５μｍ、４２０μｍであった。
【００３１】
アスペクト比４．２（光路長４２０μｍ）では、検出限界が極めて低濃度となった。
【００３２】
【表１】
2011095193.tif 000003
【００３３】
（吸光分析）
分析デバイスとしてＩ字型の流路を有する分析デバイス（流路の深さｄは、それぞれ２５μｍ、６５μｍ、４２０μｍ）を、検体液としてサンセットイエロー FCF水溶液（濃度0.0001〜1.0 mM）を用いて、検査光（488 ｎｍ）を照射する光照射器５０及び測定光として透過光（同じく488 ｎｍ）を受光する受光器６０を前記流路に対して垂直となる同じ光路方向、かつ、互いに対向する位置に配置して分析装置１を組み、各分析デバイスの検出限界を確認した（図５、表２参照。）。なお、光路長は流路の深さｄに対応するので、それぞれ、２５μｍ、６５μｍ、４２０μｍであった。
【００３４】
アスペクト比４．２（光路長４２０μｍ）では、検出限界が極めて低濃度となった。
【００３５】
【表２】
2011095193.tif 000004
【符号の説明】
【００３６】
１…分析装置、５…分析デバイス、１０…検体液導入口、２０…測定部、３０…形態液排出口、４０…検査試薬液導入口、５０…光照射器、６０…受光器。
【図１】
2011095193.tif 000005
【図２】
2011095193.tif 000006
【図３】
2011095193.tif 000007
【図４】
2011095193.tif 000008
【図５】
2011095193.tif 000009