(57)【要約】【課題】液体試料の観察又は検査を良好に行うことのできる試料保持体、及びそれを用いた検査装置、および検査方法を提供する。【解決手段】試料保持体４０は、開放された第１の面３２ａに液体試料２０が保持される膜３２を有し、該膜３２が２層以上で構成される。また、第２の面３２ｂに接する装置内空間を減圧にし、該減圧空間に設置してある一次線（電子線）照射装置からの一次線を、膜３２を介して液体試料２０に照射することにより、試料を大気圧に保持したまま観察又は検査が可能となっている。膜３２が観察又は検査中にダメージを受けても、該膜を構成する２層以上の膜の内、１層が破れたところを検知した時に装置内空間を大気圧復帰させることで、装置内部の汚染を防止することが可能になる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
外部からアクセス可能なように開放された試料保持面を備える試料保持体における該試料保持面の少なくとも一部が膜により構成され、該膜の第一の面である試料保持面に保持された試料に、該膜の第二の面側から該膜を介して試料観察又は検査のための一次線が照射可能である試料保持体であって、該膜が少なくとも２層からなる積層構造で構成されていることを特徴とする試料保持体。
【請求項２】
密閉された試料保持体の試料保持面の少なくとも一部が膜により構成され、該膜の第一の面である試料保持面に保持された試料に、該膜の第二の面側から該膜を介して試料観察又は検査のための一次線が照射可能である試料保持体であって、該膜が少なくとも２層からなる積層構造で構成されていることを特徴とする試料保持体。
【請求項３】
前記膜を構成する各層を同じ条件で成膜し、各成膜工程の間に一定時間成膜を行わない時間を設け、これにより該膜が形成されていることを特徴とする請求項１又は２記載の試料保持体。
【請求項４】
前記膜は、SiNx（窒化シリコン、xは組成比）からなる層の積層構造により構成されていることを特徴とする請求項１乃至３何れか記載の試料保持体。
【請求項５】
前記膜を構成する各層を異なる条件で成膜し、これにより該膜が形成されていることを特徴とする請求項１乃至３何れか記載の試料保持体。
【請求項６】
前記膜は、SiNx（窒化シリコン、xは組成比）からなる層の積層構造により構成されており、各層を構成するSiNxにおけるｘの差（絶対値）が０．２以上であることを特徴とする請求項５記載の試料保持体。
【請求項７】
前記膜は、SiNxからなる層及びSiOx（酸化シリコン）からなる層の積層構造により構成されていることを特徴とする請求項５記載の試料保持体。
【請求項８】
前記膜を構成する各層において、少なくとも一層が他の層よりも薄いことを特徴とする請求項１乃至７何れか記載の試料保持体。
【請求項９】
前記膜の膜厚が、５０〜２００ｎｍの間にあることを特徴とする請求項１乃至８何れか記載の試料保持体。
【請求項１０】
前記膜を構成する各層において、該膜の露出面を構成する層のうちの少なくとも一層の厚さが１０〜２０ｎｍであることを特徴とする請求項９記載の試料保持体。
【請求項１１】
前記膜を構成する各層は、化学気相成長法により形成されることを特徴とする請求項１乃至１０何れか記載の試料保持体。
【請求項１２】
請求項１乃至１１何れか記載の試料保持体を用いて試料の観察又は検査を行う試料検査装置であって、前記試料保持体が載置される載置手段と、前記試料保持体の前記膜に配置された試料に、該膜を介して一次線を照射する一次線照射手段と、該一次線の照射により該試料から発生する二次的信号を検出する信号検出手段とを備えることを特徴とする試料検査装置。
【請求項１３】
前記膜における試料保持面に対する反対側の面に接する雰囲気を真空雰囲気とするための真空室を備えることを特徴とする請求項１２に記載の試料検査装置。
【請求項１４】
前記一次線は、荷電粒子線又は電子線であり、前記二次的信号は、二次電子、反射電子、吸収電流、カソードルミネッセンス光若しくはＸ線であることを特徴とする請求項１２又は１３記載の試料検査装置。
【請求項１５】
前記試料保持体の膜の試料保持面が該膜の上面となっており、その反対側の面が該膜の下面となっていることを特徴とする請求項１２乃至１４何れか記載の試料検査装置。
【請求項１６】
前記試料保持体の膜の試料保持面に保持された試料の光学像を取得するための光学像取得手段を備えることを特徴とする請求項１２乃至１５何れか記載の試料検査装置。
【請求項１７】
請求項１乃至１１何れか記載の試料保持体の前記試料保持面に試料を載置し、該試料に前記膜を介して一次線を照射し、この一次線の照射により該試料から発生する二次的信号を検出することを特徴とする試料検査方法。
【請求項１８】
前記一次線の照射時には、前記試料保持体の膜における試料保持面の反対側の面が真空雰囲気に接しており、該真空雰囲気を通して一次線が照射されることを特徴とする請求項１７記載の試料検査方法。
【請求項１９】
前記一次線は、荷電粒子線又は電子線であり、前記二次的信号は、二次電子、反射電子、吸収電流、カソードルミネッセンス光若しくはＸ線であることを特徴とする請求項１７又は１８記載の試料検査方法。
【請求項２０】
前記試料保持体の膜の試料保持面が該膜の上面となっており、その反対側の面が該膜の下面となっていることを特徴とする請求項１７乃至１９何れか記載の試料検査方法。
【請求項２１】
前記試料保持体の膜の試料保持面に配置された試料の光学像を取得するための工程を有することを特徴とする請求項１７乃至２０何れか記載の試料検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体試料や培養された細胞等からなる試料の観察又は検査を良好に行うことのできる試料保持体、検査装置、及び検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
我々生物は多細胞動物であり、細胞間の情報伝達が正常に行えなくなる事や、ウイルスや化学物質が細胞に取り付く事によって病気が発症する。このようなことから、分子生物学や、製薬分野では、生体から剥離した細胞をシャーレ（ディッシュ）上で培養し、その細胞に試薬（化学物質や薬等）を与え、その反応を細胞レベルで観察することで研究を行っている。従来、このような観察には光学顕微鏡が用いられていたが、観察すべき重要な箇所は光学顕微鏡では観察不可能な０．１μｍ以下の微小領域であることも多い。例えば、細胞間の物質のやり取りが正常に行えなくなることに起因する病気に高血圧症、尿崩症、不整脈、筋肉疾患、糖尿病、うつ病等がある。この細胞間の物質のやり取りは細胞膜にある１０ｎｍ程度の大きさのイオンチャンネルにより行われる。このようなイオンチャンネルは、光学顕微鏡では観察困難である為、分解能の高い走査型電子顕微鏡（以下、「ＳＥＭ」（Scanning Electron  Microscope）という）を用いた観察が望まれていた。
【０００３】
しかし、ＳＥＭの構成を備える検査装置において、検査対象となる試料は、通常、真空引きにより減圧された試料室内に配置される。そして、このように減圧雰囲気とされた試料室内に配置された試料に電子線（荷電粒子線）が照射され、当該照射により試料から発生する二次電子や反射電子（後方散乱電子）等の二次的信号が検出される。細胞を減圧雰囲気に晒した場合、細胞内部の水分は蒸発し、細胞の構造は破壊される。これを防止するには、通常は脱水、乾燥を含む長大な前処理が必要となる。その為、溶液中の細胞における試薬に対する反応を観察することも当然不可能であった。
【０００４】
すなわち、試料に水分が含まれた状態で検査を行う際には、試料から水分が蒸発しないように、試料を減圧雰囲気に晒されることがないようにする必要がある。このように試料が減圧雰囲気に晒されることなくＳＥＭを用いて検査を行う例の一つとして、膜により開口（アパーチャ）が密封された試料容器（サンプルカプセル、もしくは密封型サンプルカプセル）の内部に試料を配置し、減圧雰囲気とされたＳＥＭの試料室内に、このサンプルカプセルを設置する手法が考えられている。
【０００５】
ここで、試料が配置されるサンプルカプセルの内部は減圧されない。そして、サンプルカプセルに形成された当該開口を覆う膜は、ＳＥＭの試料室内の減圧雰囲気とサンプルカプセル内の減圧されていない雰囲気（例えば、大気圧雰囲気）との間の圧力差に耐えられるとともに、電子線が透過するものとなっている（特許文献１参照）。
【０００６】
試料検査を行う際には、まずサンプルカプセル内に細胞と共に培地（培養液）を入れ、該膜上で細胞を培養させる。その後、減圧雰囲気とされたＳＥＭの試料室内にサンプルカプセルを配置し、サンプルカプセルの当該膜を介して、サンプルカプセルの外部からサンプルカプセル内の試料に電子線を照射する。電子線が照射された試料からは反射電子が発生し、この反射電子はサンプルカプセルの当該膜を通過して、ＳＥＭの試料室内に設けられた反射電子検出器によって検出される。これにより、ＳＥＭによる像（ＳＥＭ画像）が取得されることとなる。
【０００７】
しかしながら、この発明では試料は閉じた空間内に封入させるので、外部からの試薬の投与は不可能であった。さらに、サンプルカプセル内に入れられる培地の量は１５μｌ程度なので培地の蒸発にともなう塩濃度上昇により、細胞培養は困難であり、その細胞を生きた状態で観察・検査をする場合には問題があった。この問題は、サンプルカプセルを大きくし、中に入れられる容量を増加させることで解決可能である。しかし、膜が電子線や機械的な刺激に対し破壊された場合、装置内が大量の培地で汚染されるという新たな問題が発生する。
【０００８】
なお、このように真空と大気圧との圧力差に耐えられる膜を介して試料に電子線を照射し、試料から発生する反射電子を検出してＳＥＭ画像を取得する例は、非特許文献１（当該文献のChapter1 Introduction）にも記載されている。
【０００９】
また、このような膜を対向して設置して一対の膜を構成し、該一対の膜の間に試料を配置して透過型電子顕微鏡による像を取得する例は、特許文献２及び特許文献３に記載されている。特に、特許文献２には、このような一対の膜を利用して、その間に配置された試料のＳＥＭ画像を取得する場合についても述べられている。
【００１０】
上記サンプルカプセルの問題点を解決した発明として特許文献４がある。この発明ではＳＥＭ鏡筒を倒立にし、電子の出る鏡筒先端近傍を膜でシールすることで、真空と大気を完全に隔離する。膜は、試料保持の役目を持ち、又その上部は開放されているため、培地の量を増やして細胞の長期培養も可能である。膜に載せた試料は、膜を介して電子線が照射され、反射電子を検出することで大気圧下においた試料のＳＥＭ像を取得可能である。また、皿状の本体部に膜を配置する構成も検討されている（特許文献５参照）。
【００１１】
しかし、電子線照射によって膜が破壊されると、試料がＳＥＭ鏡筒内部に侵入し、ＳＥＭの使用が不可能になるという問題がある。ここでは、特に膜が破壊された際のＳＥＭ鏡筒汚染を防止させる手段として膜とＳＥＭ−鏡筒間に仕切り弁を設けている。この仕切り弁によって、ＳＥＭ鏡筒が汚染されることを防止する。しかし、膜が破壊した直後に仕切り弁を用いても、仕切り弁動作には時間が必要であるため、完全には汚染を防止することができなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特表２００４−５１５０４９号公報
【特許文献２】特開昭４７−２４９６１号公報
【特許文献３】特開平６−３１８４４５号公報
【特許文献４】特開２００７―２９２７０２号公報
【特許文献５】特開２００８−２１０７６５号公報
【非特許文献１】「Atmospheric scanning electron microscopy」 Green, Evan Drake Harriman, Ph.D., Stanford University, 1993
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
細胞の微小領域を観察するためには光学顕微鏡では分解能不足で、ＳＥＭを用いた観察が必要である。液体を保持したまま細胞をＳＥＭで観察する為には、試料（細胞を含む）をサンプルカプセルに封入し、サンプルカプセルに備えられた膜を介して電子線を試料に照射することで像を得ていた。しかし、サンプルカプセルは狭く閉じた空間である為、外部から試薬の投与が不可能であるという課題があった。さらに、サンプルカプセル内の容量が少ないことから、水分の蒸発に伴う塩濃度上昇により細胞の長時間培養が困難で、細胞の長時間観察には問題があった。
【００１４】
特許文献４及び特許文献５記載の発明では、その問題は解決しているが、膜の完全破壊によって装置内部が試料により汚染されるという問題があった。
【００１５】
本発明は、このような点に鑑みてなされたものであり、試料を保持する膜の完全破壊を防ぐことにより、装置内部の汚染を確実に防止することのできる試料保持体、検査装置、及び検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明に基づく第１の試料保持体は、外部からアクセス可能なように開放された試料保持面を備える試料保持体における該試料保持面の少なくとも一部が膜により構成され、該膜の第一の面である試料保持面に保持された試料に、該膜の第二の面側から該膜を介して試料観察又は検査のための一次線が照射可能である試料保持体であって、該膜が少なくとも２層からなる積層構造で構成されていることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明に基づく第２の試料保持体は、密閉された試料保持体の試料保持面の少なくとも一部が膜により構成され、該膜の第一の面である試料保持面に保持された試料に、該膜の第二の面側から該膜を介して試料観察又は検査のための一次線が照射可能である試料保持体であって、該膜が少なくとも２層からなる積層構造で構成されていることを特徴とする。
【００１８】
前記膜を構成する各層は、全て同じ条件で成膜しても、各層の成膜工程の間に一定時間成膜を行わない時間を設けることによって有効な効果を得られる。また、前記膜を構成する各層を異なる条件で成膜するようにすることもできる。
【００１９】
本発明に基づく試料検査装置は、上記何れかの試料保持体を用いて試料の観察又は検査を行う試料検査装置であって、前記試料保持体が載置される載置手段と、前記試料保持体の前記膜に配置された試料に、該膜を介して一次線を照射する一次線照射手段と、該一次線の照射により該試料から発生する二次的信号を検出する信号検出手段とを備えることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明に基づく試料検査方法は、上記何れかの試料保持体の前記試料保持面に試料を載置し、該試料に前記膜を介して一次線を照射し、この一次線の照射により該試料から発生する二次的信号を検出することを特徴とする。
【００２１】
上記各構成において、前記一次線を、荷電粒子線又は電子線とし、前記二次的信号を、二次電子、反射電子、吸収電流、カソードルミネッセンス光若しくはＸ線とすることができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明においては、外部からアクセス可能なように開放された試料保持面の少なくとも一部が膜により構成され、該膜の第一の面である試料保持面に載置された試料に、該膜を介して試料観察又は検査のための一次線が照射可能である試料保持体、該試料保持体を用いた検査装置、もしくは検査方法に関し、該膜が少なくとも２層からなる積層構造により構成されていることを特徴とする。また外部からアクセス不可能である閉鎖型カプセルの構成とすることもできる。
【００２３】
従来の装置では、電子線照射によって試料保持膜が完全に破壊されると試料が装置内部に拡散し、装置内部が汚染されてしまうという問題があった。
【００２４】
本発明では試料保持膜を少なくとも２層からなる積層構造により構成している。電子線照射によるダメージにより試料保持膜中の１層が破壊されることを確認したら、当該確認に連動して装置の使用を停止（装置内部の昇圧（大気圧復帰）等を含む）することで、装置内部の汚染を防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明における試料検査装置の実施例を示す概略構成図である。
【図２】本発明における試料保持体の構成を示す断面図である。
【図３】本発明における試料保持体を構成する枠状部材の概略図である。
【図４】本発明における試料保持体を構成する枠状部材の作成方法を示す図である。
【図５】本発明における試料検査装置の実施例を示す概略構成図である。
【図６】本発明における試料検査装置の他の実施例を示す概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、図面を参照して、本発明における試料保持体、検査装置、及び検査方法について説明する。
【００２７】
図１は、本発明における試料検査装置の第１実施例を示す概略構成図である。構成の主部分は、光学顕微鏡２７、及び電子線装置部２９（試料保持体４０より下の部分、ＳＥＭ）である。この図において、一次線照射手段である鏡筒１には、電子銃（電子源）２が配置されている。電子銃２から加速された状態で放出された一次線としての電子線（荷電粒子線）７は、集束レンズ（対物レンズ）３により集束される。
【００２８】
これにより集束された電子線７は、試料保持体４０に形成された試料保持膜３２（後述）を介して、試料保持体４０に保持された液状試料２０に照射される。この液状試料２０には、本実施例では細胞と培地が含まれている。
鏡筒１の先端側は真空室１１に接続されている。また、電子銃２が設けられた鏡筒１の基端側は真空室１１の下方に位置している。この構成により、電子銃２から放出された電子線７は、鏡筒１内を上方向に進み、真空室１１内の空間及び試料保持膜３２を通過し、液状試料２０に到達する。
【００２９】
当該照射時において、電子線７は図示しない偏向手段により偏向され、これにより電子線７は液状試料２０を走査する。このときには、液状試料２０に含まれる試料も電子線７により走査される。
【００３０】
このように、この鏡筒１は、一次線照射手段を構成し、本実施例では倒立型鏡筒となっている。真空室１１内であって鏡筒１の先端側には、反射電子検出器４が設けられている。反射電子検出器４は、電子線７が液状試料２０内の試料に照射された際に発生する反射電子を検出するものである。反射電子検出器４は、例えばPN接合を利用した半導体型検出器やYAG結晶を用いたシンチレータ型検出器が用いられる。反射電子検出器４により検出された検出信号は、真空室１１の外部に配置された画像形成装置２２に送られる。画像形成装置２２は、当該検出信号に基づいて、画像データを形成する。この画像データは、ＳＥＭ画像に対応する画像データとなる。当該画像データは、表示装置２３に送られる。表示装置２３は、送られた画像データに基づく画像を表示する。表示された画像は、ＳＥＭ画像となる。また、画像形成装置２２により形成された画像データは、必要に応じてコンピュータ２５に送られる。コンピュータ２５は、画像処理を当該画像データに対して施すとともに、当該画像処理の結果に基づく判定を実行する。
【００３１】
鏡筒１内は排気手段８により真空引きされて、所定の圧力まで減圧される。また、真空室１１内は、排気手段９により真空引きされ、これにより所定の圧力まで減圧される。ここで、真空室１１は、除振装置１３を介して、架台１０に載置されている。
真空室１１の上部には、試料保持体載置部１２が設けられている。試料保持体載置部１２には、電子線７を試料保持膜３２に照射させるための孔が形成されている。この試料保持体載置部１２には、Ｏリング（図示せず）を介して、試料保持体４０が載置されている。これにより、試料保持体４０は真空室１１に着脱自在に支持される。
試料保持体４０は、図２のような構成となっている。試料保持体４０は、直径３５ｍｍ、高さ１３ｍｍの大きさで、これにより培地を２ｍｌ保持可能で、細胞の長期培養も可能になる。この試料保持体４０は、プラスチック又はガラスからなる皿状の本体部３７と、電子線７が透過する試料保持膜３２が設けられた膜保持体（枠状部材）１８とから構成される。本体部３７の内側に位置する凹部の底面は、試料保持面３７ａを構成する。この試料保持面３７ａは、開放されている。その為、外部からの薬の投与が可能である。
本体部３７の試料保持面３７ａの一部（図２の例では中央部）には、貫通孔３７ｂが形成されている。この孔３７ｂの試料保持面３７ａ側には、段差部３７ｃが設けられている。この段差部３７ｃに、膜保持体１８が配置されている。膜保持体１８は試料保持膜３２を備えており、この試料保持膜３２の第１の面３２ａは試料保持面３７ａを構成し、本体部３７の試料保持面３７ａとほぼ面一となっている。これにより、試料保持体４０の試料保持面３７ａの少なくとも一部は試料保持膜３２により構成されている。
また、孔３７ｂの試料保持面３７ａ側の反対側には、テーパ部３７ｄが設けられている。このテーパ部３７ｄは、試料保持面３７ａの反対側の面に向けて広がるように開いているテーパ構造となっており、その開き角度は９０度〜１２０度に設定されている。
さらに、試料保持体４０の下面で真空雰囲気に晒され、電子線７が照射される可能性のある領域には、電子線７の照射に伴う帯電を防止するため導電膜３０１が形成されている。導電膜３０１は膜保持体１８に接しており、電子線７の照射により蓄積された電荷を膜保持体１８（シリコン製）を介して液状試料２０へ逃がすことができる。この導電膜３０１があることにより試料保持体４０の下面での帯電を低減させ、電子線７の軌道変位や、（電子線７が液状試料２０に照射された際に発生する）反射電子の軌道変位により生ずるＳＥＭ画像の歪や輝度斑を防止することができる。また、電荷の蓄積を確実に防止するためには、液状試料２０へのアース線の接続や、導電膜３０１を試料保持体載置部１２と電気的に繋げておくことが有効である。導電膜３０１は、例えばアルミニウムや金、もしくは酸化インジウムスズを蒸着することによって形成させても、銀ペーストで塗りつけてもよい。
膜保持体１８の構成を図３に示す。シリコン基板５０１に試料保持膜３２が形成されており、この試料保持膜３２の第１の面３２ａ（図３では下面、図２では上面）は露出されている。この試料保持膜３２の第１の面（試料保持面）３２ａには、培地等の液体及び試料（細胞）を含む液状試料２０が配置される。第一の面３２ａは大気圧下にあるので、液状試料２０からの水分の蒸発を極力抑えることができる。
【００３２】
また、シリコン基板５０１の中央には開口３４ａ（図３では上面、図１および図２では下面）が形成されており、この開口３４ａは、試料保持膜３２により覆われている。ここで、試料保持膜３２における第２の面３２ｂの中央部は、該開口３４ａを介して真空室１１の内部雰囲気に露出されている。
【００３３】
膜保持体１８の作成方法を、図４を用いて説明する。まず、シリコン基板５０１にＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｖａｐｏｒ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ：化学気相成長法）を用いて窒化シリコン層（窒化シリコン膜）５０２ｂ，５０３ｂを成膜する（図４（a））。これら各層５０２ｂ，５０３ｂの代表的な厚みは８０ｎｍである。その後、当該成膜を中断して（材料ガスの供給を停止する）所定時間放置し、再び同じ条件で材料ガスを供給して、別途窒化シリコン層（窒化シリコン膜）５０２ａ，５０３ａを成膜する（図４（b））。これら各層５０２ａ，５０３ａの代表的な厚みは２０ｎｍである。これにより、層５０２ａ，５０３ａは、それぞれ対応する層５０２ｂ，５０３ｂに積層される。
【００３４】
ここで、層５０２ａと層５０２ｂにおいて、及び層５０３ａと層５０３ｂにおいて、各二つの層は同じ組成からなるが、各成膜工程の間では成膜を中断しており、各層間には膜質の相違や原子配列の位置ずれが境界として存在する。特に、膜質の相違については、第１の層（層５０２ｂ，５０３ｂ）の上に第２の層（５０２ａ，５０３ａ）を成膜する際に、第２の層のうち成膜当初に形成される部分の膜質は、材料ガスの供給（再供給）開始直後に形成される層であるので、第１の層上面部分（所定の安定的に形成された部分）の膜質とは異なることが知られている。
【００３５】
上記により、二層構造からなる試料保持膜３２が形成される。なお、試料保持膜３２の積層構造を二層以上としても良い。
【００３６】
また、第１の層（層５０２ｂ，５０３ｂ）と、その後に形成される第２の層（５０２ａ，５０３ａ）とにおいて、層形成時における成膜条件を変えても良い。例えば、窒化シリコン層を成膜する為には、SiH2Cl2ガスとNH3ガスが使用されるが、成膜時における各ガスの供給比（流量比、濃度比等）を変えれば良い。最適には、窒化シリコン層SiNx（xは組成比）で，各層のxの差（絶対値）が0.2以上であると良い。
【００３７】
それ以外でも試料保持膜３２として用いられる積層構造としては、窒化シリコン層の他に、酸化シリコンSiOx（xは組成比）層、窒化ボロン層、ポリマー層、ポリエチレン層、ポリイミド層、ポリプロピレン層、若しくはカーボン層を用いても良い。この場合、同種の層もしくは異種の層を積層して、当該積層構造とすることができる。ここで、異種の層からなる積層構造の一例としては、窒化シリコンSiNx層と酸化シリコンSiOx層とからなる積層構造が考えられる。
【００３８】
上記同種もしくは異種の層の積層構造において、膜形成時間（成膜時間）等を調整することにより、各層の厚みを設定することができる。試料保持膜３２を構成する積層構造の全層厚（試料保持膜３２の膜厚）としては、５０〜２００ｎｍとすることが好ましい。この程度の厚さであれば、電子線及び反射電子が十分に通過でき、また圧力差に対する耐圧も十分に担保できるからである。
【００３９】
そして、当該積層構造を二層構造とした場合、試料保持膜３２における第一の面（試料保持面）を構成する層、もしくは試料保持膜３２における第二の面を構成する層のうちの何れか一方の層を薄膜化して、該層の厚さを１０〜２０ｎｍとすることができる。この場合、当該二層構造における上記薄膜化された層（一方の層）は、他方の層よりもかなり薄くなっている。
【００４０】
なお、試料保持膜３２を構成する積層構造を三層以上の構成としたときには、試料保持膜３２における第一の面を構成する層及び／又は第二の面を構成する各層の層厚を、１０〜２０ｎｍとすることもできる。
【００４１】
ここで、上記各例において、第一の面及び第二の面は、試料保持膜３２の露出面となっている。
【００４２】
上記のような層（膜）の積層構造を形成した後、窒化シリコン膜５０２a，５０３a上にレジスト５０４，５０５を塗布する（図４（ｃ））。レジスト５０５を、フォトリソグラフィー装置を用いてパターンニングし、レジスト５０５aを残す（図４（ｄ））。レジストパターンをマスクとしてドライエッチングで窒化シリコン膜５０３ａ，５０３ｂを加工し、パターン化された窒化シリコン膜５０３ａ，５０３ｂを残す（図４（e））。このパターンをマスクとしてシリコン基板５０１をＫＯＨでウエットエッチングし、開口５１０を作る（図４（f））。アッシングによりレジスト５０４，５０５aを除去する（図４（g））。
【００４３】
このようにして作成された膜保持体１８においては、窒化シリコン層（窒化シリコン膜）５０２ａ，５０２ｂの積層構造により、試料保持膜３２が構成されている。当該積層構造において、窒化シリコン層５０２ａの表面（窒化シリコン層５０２ｂと接触する面の反対側の面）が、試料保持体３２における試料保持面（第一の面）となる。なお、これとは逆に、当該積層構造における窒化シリコン膜５０２ｂの表面（窒化シリコン膜５０２ａと接触する面の反対側の面）を、試料保持体３２における試料保持面（第一の面）とすることもできる。
【００４４】
これにより、試料保持膜３２は、電子線７が透過するが気体や液体は透過しないものとなる。さらに、膜の両面で少なくとも一気圧の圧力差に耐えられる必要がある。なお、このような試料保持膜３２は、その厚さが薄ければ電子線７の散乱が少なくなるので分解能が向上するが破損しやすくなり、また、その厚さが厚くなれば電子線７の散乱が増加して分解能が低下するが破損しにくくなる。好適な膜厚（各層の和）は、ここの例では窒化シリコン層５０２ａと窒化シリコン層５０２ｂの厚みの和で、５０ｎｍ〜２００ｎｍであると良い。特に、減圧（真空）雰囲気に晒される側の層（試料保持膜３２における試料保持面とは反対側の面である第二の面を構成する層）の厚みは１０〜２０ｎｍにすると良い。
【００４５】
この膜保持体１８を、試料保持体４０を構成する本体部３７に形成された孔３７ｂの上記段差部３７ｃに固着し、これにより試料保持体４０を作成する（図２）。この固着には、エポキシ系、シリコーン系の接着剤等による接着、又は熱、超音波若しくはレーザによる融着によって行うことができる。これにより、膜保持体１８は、本体部３７の試料保持面３７ａにおける孔３７ｂに対応する位置に固着される。
【００４６】
また、本実施例では、本体部３７と膜保持体１８を組み合わせて試料保持体４０を製作したが、本体部３７に試料保持膜３２を直接固着したり、本体部３７と試料保持膜３２を一体的に形成したりするようにしてもよい。さらに、試料保持膜３２の第１の面３２ａを含む試料保持面３７ａに、試料付着用分子としての細胞接着分子（後述）を塗布することができる。
【００４７】
このように本装置は、試料保持膜３２により大気と真空を隔離する。電子線は試料保持膜３２を介して液状試料２０へ照射される。その為、試料保持膜３２は電子線７により完全破壊される可能性がある。試料保持膜３２が完全破壊された場合、真空室１１内へ液状試料２０が入り込み、鏡筒１が汚染される。
【００４８】
これを防止する為に、真空室１１には真空室１１内の圧力を検知する真空計１５、及び鏡筒１先端と試料保持膜３２の間にはシャッター１４（図１は開放の状態）が設置されている。このシャッター１４は、試料保持膜３２が完全破壊され、真空計１５が所定の圧力上昇を検知した際に自動的に図５のように移動（閉鎖）する。
【００４９】
例えば、試料保持膜３２が完全破壊され液状試料２０が真空室１１内に流入することで真空室が１００Ｐａより高い気圧になった場合、シャッター１４を図５のように移動させる。同時に真空室１１及び鏡筒１内を大気圧にすることで、液体試料２０の流入を防止する。
【００５０】
これにより、真空室１１内へ流入した液体試料２０をシャッター１４で受け止めることができ、鏡筒１や反射電子検出器４の汚染を防止する。シャッターには液状試料を受け取る受け皿が備え付けてあると多量の液体試料の流入に対応できる。シャッター１４は、真空室１１を上下２つの空間に完全ではなく、部分的に仕切る。その為、構造が簡単でシャッターの動作も高速にできる。本実施例では真空計１５が圧力上昇を検知して０．１秒でシャッターを動作（図１の状態から図５の状態にする）可能である。
【００５１】
しかし、試料保持膜３２が完全破壊されシャッター１４が閉鎖されるまでのわずかな間に、液体試料２０が装置内に進入することを完全に防止することは困難である。その為、装置が汚染される。液体試料２０が金属を腐食させる性質であれば、装置に重大な被害を与える。
【００５２】
本発明では、試料保持膜３２が完全破壊される前兆を予め捕らえることで、この問題を解決する。解決方法は、試料保持膜３２が二層以上の積層構造で構成されていることに基づく。
【００５３】
例えば、試料保持膜３２が二層構造（窒化シリコン層５０２ａと５０２ｂ）で構成されているときに、真空雰囲気を介した電子線照射により試料保持膜３２がダメージを受けた際、当該二層の内、一方の層が先に破壊されることとなる。特に一方の層を薄くした場合、例えば二層構造の全層厚が１００ｎｍのときに一方の層である窒化シリコン層５０２ａの厚みを２０ｎｍとすると、薄い層のほうが先に破壊される。その破壊は、ＳＥＭ２９により撮像された走査像データにおける輝度ヒストグラムの急峻な変化により、自動的に認識することができる。この変化をコンピュータ２５が認識し、即座に真空室１１を大気圧に復帰させることで、試料保持膜３２の完全破壊を事前に防止することができる。
【００５４】
別の装置構成図６では、シャッター１４の先端に反射電子検出器１４が構成されている。シャッター１４が開放の場合、図７のように反射電子検出器１４が鏡筒１の直上に位置し、反射電子の検出効率が最大となる。このような構成にすることにより、鏡筒１と液状試料２０の間隔（ワーキングディスタンス）を狭め、ＳＥＭ像の分解能を向上できる。この場合、試料保持膜３２の破壊は、検出器の汚染につながる。本発明は、試料保持膜３２の破壊の前兆を検知するもので、装置のメインテナンスが非常に容易になる。
【００５５】
なお、鏡筒１及び真空室１１を備える電子線装置部２９（シャッター１４と真空計１５も含む）は電子線制御部２４により制御される。また、試料保持体載置部１２には、試料の観察をする光学顕微鏡２７が載置されている。これは制御部２８で制御されている。
光学顕微鏡２７と電子線７の光軸は一致しており、もしくは、光学顕微鏡２７とＳＥＭ画像の視野中心は一致しており、光学顕微鏡の観察領域がＳＥＭ画像にほぼ一致させることができる。さらに、ＳＥＭ画像の視野と光学顕微鏡２７の視野調整は、試料保持体４０が搭載されている試料保持体載置部１２を移動させる（移動機構は図示していない）ことによって行う。
【００５６】
本発明における検査装置は、電子線装置部２９、光学顕微鏡２７、電子線制御部２４、制御部２８、画像形成装置２２、及び表示装置２３を備えており、各部とコンピュータ２５が接続され、各部の情報がやり取りされることも可能である。
【００５７】
次に、本発明における検査方法について説明する。まず、図２のように試料保持体４０を用いて、試料となる細胞３８を培地３９中で培養させる。培地の量を２ｍｌにできる為、細胞の長期培養が可能である。なお、細胞によっては試料保持体４０の試料保持面３７ａ、特に電子線による観察領域である試料保持膜３２の第一の面（試料保持面）３２ａに細胞接着分子（試料付着用分子）を塗布しておくと培養が容易になる。細胞接着分子とは、培養のために配置された細胞及び培養により増殖した細胞を試料保持面に吸着させる作用を有し、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン、インテグリン、クローディン、デスモグレイン、ニューロリギン、ニューレキシン、セレクチン、ラミニン、及びポリLリジンである。
【００５８】
試料保持体４０内で細胞が培養された後、試料保持体載置部１２に当該試料保持体４０を載置する。このとき、シャッター１４は閉じられており、図５の状態になっている。続いて、排気手段８，９を用いて真空室１１および鏡筒１内を所定の真空にする。例えば、真空室１１内の圧力は、１Ｐａ以下、鏡筒１１内（特に電子銃２周囲）の圧力は、例えば、電子銃が熱電子放出型の場合１０−４Ｐａ〜１０−５Ｐａ程度に設定される。ショットキー放出型、及び電界放出型の場合は、１０−７Ｐａ〜１０−９Ｐａ程度に設定される。
【００５９】
次に、光学顕微鏡２７で細胞３８を確認する。試料保持体４０は開放されているので、薬の投与が容易である。この状態で、細胞３８に薬の投与を行う。その後の反応を光学顕微鏡２７で観察できる。
【００６０】
分解能の高い像の取得には、電子線装置部２９を用いたＳＥＭ像の取得が可能である。光が試料保持膜３２を介して反射電子検出器４に入射させない為に、光学顕微鏡２７の光の照射を止め、他の外光の遮蔽（図への記載は略）を行う。この遮蔽は、膜保持体１８や液状試料２０に電子線７が照射した際に発生する放射線の防護の役目も果たしている。図１のように鏡筒１から電子線７を液状試料２０（細胞３８を含む）に向けて照射、走査する。電子線７は試料保持体４０の試料保持膜３２を透過して細胞３８に照射され、当該照射に基づいて細胞３８から発生する反射電子（後方散乱電子）は反射電子検出器４で検出される。
【００６１】
このとき、試料保持体４０を構成する本体部３７の孔３７ｂには、上述したテーパ部３７ｄが設けられているので、反射電子が孔３７ｂの内側面に衝突して遮られることを極力防止することができ、反射電子検出器４による反射電子の検出を効率的に行うことができる。
【００６２】
反射電子検出器４からの検出信号は、画像形成装置２２に送られる。画像形成装置２２は、当該検出信号に基づいて、画像データを形成する。この画像データに基づいて、表示装置２３が画像（ＳＥＭ像）を表示する。
【００６３】
上記において、像を形成する電子には反射電子を用いた。反射電子は原子番号に比例した信号強度を持つ。その為、生物試料のようにほぼ全体が低原子番号の物質で構成されている場合、像のコントラストが非常に弱く、分解能を向上させることが困難である。そこで、細胞３８の挙動で注目すべき部位に、金などの重金属を吸着させておくと良い。具体的には、該部位（抗原）に吸着する性質を持つ金粒子を標識した抗体を細胞に散布することで、抗原抗体反応を利用して、その部位（抗原）に該抗体を介して金を吸着させる。また、予め、電子線が照射されると発光する蛍光色素や量子ドット（例えばＳｉのナノ粒子、ＣｄＳｅをＺｎＳでコーティングした１０〜２０ｎｍの粒子）を細胞３８の特定部位に吸着させ発光を光学顕微鏡で観察しても良い。
【００６４】
この場合、通常用いられる金粒子は１０〜３０ｎｍの粒径である。しかし、抗体と金粒子との吸着力が弱く、１０〜３０ｎｍの金粒子を付けられないこともある。その場合には、まず粒径数ｎｍと非常に小さな金（ナノゴールド）を抗体に付ける。このままでは金が小さすぎ、ＳＥＭでの観察は困難であるが、銀増感を利用して該金の周りに銀を吸着させることで、ＳＥＭで検出し易くする方法を用いても良い。
【００６５】
以上のように、本発明を用いて試料保持膜３２を介して液中試料のＳＥＭ観察が可能になった。培地の量を２ｍｌにできる為、細胞の長期培養が可能である。開放された試料室を用いているため、外部から試料へのアクセスが可能で細胞に容易に薬を投与でき、その様子を光学顕微鏡２７、及び電子線装置部（ＳＥＭ）２９で観察可能である。さらに、光学顕微鏡には油浸型を用いることができ、高分解能な光学顕微鏡像の取得が可能になった。
本装置は試料保持膜３２が破壊された場合、液状試料２０が真空室１１もしくは鏡筒１に流入し汚染される。しかし、本発明では、試料保持膜３２の破壊の前兆を検知可能になっている。すなわち、試料保持膜３２は少なくとも２層で形成されており、初めにそのうちの一方が破壊される。その破壊の様子はＳＥＭ２９もしくは光顕２７で容易に観察可能で、即座に装置の停止ができる。
【００６６】
万が一試料保持膜３２が完全に破壊された場合、すなわち真空室１１に液状試料２０が進入してきても、シャッター１４の動作、及び真空室１１及び鏡筒１を大気圧にすることで、鏡筒１の汚染を最小限にすることができる。
【００６７】
なお、上記実施例においては、一次線として電子線を用いたが、試料保持膜３２が他の荷電粒子（ヘリウムイオンビーム等）の照射に対する耐衝撃性及び強度が十分に高ければ、当該他の荷電粒子線を用いた場合でも適用可能である。
【００６８】
また、上記実施例では二次的信号として反射電子を用いたが、それ以外でも二次電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光、及び細胞（試料）３８への吸収電流を検出することにより、細胞３８の情報を得ることが可能である。
【００６９】
なお、本実施例では、試料保持膜の試料保持面が外部からアクセス可能となっているディッシュ状の試料保持体（試料ホルダ）を想定したが、これに限定されることはない。変形例としては、内部が空間的に隔離されており、一部分が試料保持膜３２により構成されている密閉型のカプセルタイプの試料保持体でも同様の効果が得られる。
【００７０】
このように、本発明における第１の試料保持体は、外部からアクセス可能なように開放された試料保持面を備える試料保持体における該試料保持面の少なくとも一部が膜（試料保持膜）により構成され、該膜の第一の面である試料保持面に保持された試料に、該膜の第二の面側から該膜を介して試料観察又は検査のための一次線が照射可能である試料保持体であって、該膜が少なくとも２層からなる積層構造で構成されている（アクセス可能な開放タイプ）。
【００７１】
また、本発明における第２の試料保持体は、密閉された試料保持体の試料保持面の少なくとも一部が膜（試料保持膜）により構成され、該膜の第一の面である試料保持面に保持された試料に、該膜の第二の面側から該膜を介して試料観察又は検査のための一次線が照射可能である試料保持体であって、該膜が少なくとも２層からなる積層構造で構成されている（カプセルタイプ）。
【００７２】
上記において、該膜を構成する各層を同じ条件で成膜し、各成膜工程の間に一定時間成膜を行わない時間を設け、これにより該膜を形成することもできる。該膜は、SiNx（窒化シリコン、ｘは組成比）からなる層の積層構造により構成することもできる。
【００７３】
また、該膜を構成する各層を異なる条件で成膜し、これにより該膜を形成することもできる。該膜は、SiNx（窒化シリコン、ｘは組成比）からなる層の積層構造により構成されており、各層を構成するSiNxにおけるｘの差（絶対値）を０．２以上とすることもできる。また、該膜を、SiNxからなる層及びSiOx（酸化シリコン）からなる層の積層構造により構成することもできる。
【００７４】
上記各例の膜において、少なくとも一層が他の層よりも薄くなっている。また、該膜の膜厚は、５０〜２００ｎｍの間にあると好適である。そして、該膜を構成する各層において、該膜の露出面を構成する層のうちの少なくとも一層の厚さが１０〜２０ｎｍであることが望ましい。なお、上記各例の膜において、該膜を構成する各層は、一例として化学気相成長法により形成される。
【００７５】
さらに、本発明における試料検査装置は、上記何れかの試料保持体を用いて試料の観察又は検査を行う試料検査装置であって、該試料保持体が載置される載置手段と、該試料保持体の該膜に配置された試料に、該膜を介して一次線を照射する一次線照射手段と、該一次線の照射により該試料から発生する二次的信号を検出する信号検出手段とを備えるものである。
【００７６】
そして、本発明における試料検査方法は、上記何れかの試料保持体の前記試料保持面に試料を載置し、該試料に前記膜を介して一次線を照射し、この一次線の照射により該試料から発生する二次的信号を検出することにより実行される。
【００７７】
試料検査装置において、該膜における試料保持面に対する反対側の面に接する雰囲気を真空雰囲気とするための真空室が備えられている。
【００７８】
一次線は、荷電粒子線又は電子線であり、二次的信号は、二次電子、反射電子、吸収電流、カソードルミネッセンス光若しくはＸ線である。該試料保持体の膜の試料保持面が該膜の上面となっており、その反対側の面が該膜の下面となっている。該試料保持体の膜の試料保持面に保持された試料の光学像を取得するための光学像取得手段も備えられている。
【００７９】
本発明では、上記のように試料保持膜を少なくとも２層以上の積層構造で構成している。従って、電子線照射によるダメージにより一つの層の破壊を自動的に確認し、当該確認に連動して装置の停止（装置内部の昇圧（大気圧復帰）等を含む）を行うことにより、装置内部の汚染を確実に防止することができる。
【符号の説明】
【００８０】
１…鏡筒（一次線照射手段）、２…電子銃、３…集束レンズ、４…反射電子検出器（信号検出手段）、７…電子線（一次線）、８…排気手段、９…排気手段、１０…架台、１１…真空室、１２…試料保持体載置部（載置手段）、１３…除震装置、１４…シャッター、１５…真空計、１８…膜保持体（枠状部材）、１９…空間、２０…液状試料、２２…画像形成装置、２３…表示装置、２４…電子線制御部、２５…コンピュータ、２７…光学顕微鏡（光学像取得手段）、２８…制御部、２９…電子線装置部（ＳＥＭ）、３２…試料保持膜（膜）、３２ａ…第１の面（試料保持面）、３２ｂ…第２の面、３４…シリコン基板、３４ａ…開口、３７…本体部、３７ａ…試料保持面、３７ｂ…孔、３７ｃ…段差部、３７ｄ…テーパ部、３８…細胞（試料）、３９…培地、４０…試料保持体、３０１…導電膜、５０１…シリコン基板、５０２ａ…窒化シリコン膜、５０２ｂ…窒化シリコン膜、５０３ａ…窒化シリコン膜、５０３ｂ…窒化シリコン膜、５０４…レジスト、５０５…レジスト、５０５ａ…レジスト、５１０…開口
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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