(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞の生合成機構をより効率的且つ有効に改変、改善する方法を提供する。【解決手段】直交ｔＲＮＡと、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対を含むタンパク質生合成機構の成分を作製するための組成物と方法からなる。組成物は新規直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を含む。新規直交対は非天然アミノ酸をポリペプチドにｉｎ  ｖｉｖｏで組込むために使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）を含む組成物であって、ＲＳがｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、ＲＳが２０種の天然の共通アミノ酸のいずれに対してよりも非天然アミノ酸に対して低いＫｍを示し、かつ２０種の天然の共通アミノ酸のいずれに対してよりも非天然アミノ酸に対して高いＫｃａｔを示す前記組成物。
【請求項２】
ＲＳが配列番号３５〜６４から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＲＳがｔＲＮＡを非天然アミノ酸でｉｎ  ｖｉｖｏアミノアシル化する請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
非天然アミノ酸がＯ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、及びイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニンから構成される群から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
非天然アミノ酸がチロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；スレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケトもしくはアミノ置換アミノ酸又はその任意組合せ；光架橋基をもつアミノ酸；スピンラベル付きアミノ酸；蛍光アミノ酸：新規官能基をもつアミノ酸；別の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；フォトケージドアミノ酸、光異性化可能なアミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸；グリコシル化又は糖鎖修飾アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコールを含むアミノ酸；ポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学分解性又は光分解性アミノ酸；延長側鎖をもつアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖鎖置換アミノ酸；糖鎖置換セリン；炭素結合糖含有アミノ酸；レドックス活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸含有アミノ酸；α，αジ置換アミノ酸；βアミノ酸；及びプロリン以外の環状アミノ酸から構成される群から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
ＲＳが２０種の天然の共通アミノ酸のいずれに対してよりも非天然アミノ酸に対して高いＫｃａｔ／Ｋｍを示す請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含む組成物であって、Ｏ−ｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、Ｏ−ｔＲＮＡが直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼにより非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化され、前記組成物が直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み、Ｏ−ＲＳが２０種の天然の共通アミノ酸のいずれに対してよりも非天然アミノ酸に対して低いＫｍを示し、かつ２０種の天然の共通アミノ酸のいずれに対してよりも非天然アミノ酸に対して高いＫｃａｔを示す前記組成物。
【請求項８】
Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳが相補的である請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳが少なくとも１種の生物に由来する天然ｔＲＮＡ及びＲＳの突然変異により誘導され、少なくとも１種の生物が原核生物である請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
少なくとも１種の生物がＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍから構成される群から選択される請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳが少なくとも１種の生物に由来する天然ｔＲＮＡ及びＲＳの突然変異により誘導され、少なくとも１種の生物が真核生物である請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
少なくとも１種の生物が酵母、哺乳動物、真菌、昆虫、植物及び原生生物から構成される群から選択される請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｏ−ｔＲＮＡが第１の生物に由来する天然ｔＲＮＡの突然変異により誘導され、Ｏ−ＲＳが第２の生物に由来する天然ＲＳの突然変異により誘導される請求項７に記載の組成物。
【請求項１４】
Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳが少なくとも１種の生物から単離され、少なくとも１種の生物が原核生物である請求項７に記載の組成物。
【請求項１５】
少なくとも１種の生物がＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍから構成される群から選択される請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳが少なくとも１種の生物から単離され、少なくとも１種の生物が真核生物である請求項７に記載の組成物。
【請求項１７】
少なくとも１種の生物が酵母、哺乳動物、真菌、昆虫、植物及び原生生物から構成される群から選択される請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
Ｏ−ｔＲＮＡが第１の生物から単離され、Ｏ−ＲＳが第２の生物から単離される請求項７に記載の組成物。
【請求項１９】
Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳの１種以上が１種以上のライブラリーから単離され、１種以上のライブラリーが１種以上の生物に由来するＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳを含む請求項７に記載の組成物。
【請求項２０】
１種以上の生物が原核生物又は真核生物を含む請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
組成物がＯ−ＲＳ及びＯ−ｔＲＮＡを含んだ細胞を含む請求項７に記載の組成物。
【請求項２２】
組成物がｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
（ａ）第1の生物に由来する少なくとも１種のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）から誘導される変異体ＲＳ分子のライブラリを作製する段階と、
（ｂ）非天然アミノ酸又は天然アミノ酸の存在下に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化するメンバーを変異体ＲＳのライブラリから選択又はスクリーニングすることにより、活性ＲＳのプールを提供する段階と、
（ｃ）活性ＲＳのプールから選択又はスクリーニングして非天然アミノ酸の不在下にＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性ＲＳを同定することにより、非天然アミノ酸に特異的なプールの少なくとも１つのメンバーを同定し、少なくとも１種の組換えＯ−ＲＳを提供する段階であって、少なくとも１種の組換えＯ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、Ｏ−ＲＳが、２０種の天然の共通アミノ酸のいずれに対してよりも非天然アミノ酸に対して低いＫｍを示し、かつ２０種の天然の共通アミノ酸のいずれに対してよりも非天然アミノ酸に対して高いＫｃａｔを示すように選択される、前記段階と、
を含む方法により生産された組換えＯ−ＲＳ。
【請求項２４】
前記方法が非天然アミノ酸の不在下にＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するプールのメンバーをネガティブ選択する段階を含む、請求項２３に記載の組換えＯ−ＲＳ。
【請求項２５】
前記方法が非天然アミノ酸の不在下にＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化しないプールのメンバーをポジティブ選択する段階を含む、請求項２３に記載の組換えＯ−ＲＳ。
【請求項２６】
非天然アミノ酸が、Ｏ−アリル−Ｌ−チロシン、パラ−置換Ｌ−チロシン〔置換は飽和又は不飽和炭化水素を含む〕、ＧｌｃＮＡｃ−セリン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモ−フェニルアラニン、3,4−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アセチル−フェニルアラニン、ｍ−アセチル−フェニルアラニン、及び4−(2−オキソ−プロポキシ) −Ｌ−フェニルアラニンから構成される群から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
以下の条件（ａ）〜（ｄ）を満たす対として直交ｔＲＮＡシンテターゼ（ＯＲＳ）及び直交ｔＲＮＡ（ＯｔＲＮＡ）を含む細胞。
（ａ）前記ＯＲＳが前記ＯｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、優先的なアミノアシル化は、前記ＯＲＳが細胞の前記内在ｔＲＮＡの内在ｔＲＮＡシンテターゼのアミノアシル化に比べて低い効率で細胞の内在ｔＲＮＡをアミノアシル化することで定義され；
（ｂ）前記ＯＲＳが任意の天然アミノ酸に比べて前記ＯｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し；
（ｃ）前記ＯｔＲＮＡが前記内在ｔＲＮＡシンテターゼによる内在ｔＲＮＡのアミノアシル化に比べて低い効率で細胞の内在ｔＲＮＡシンテターゼによりアミノアシル化され；
（ｄ）前記ＯｔＲＮＡが前記細胞内のｍＲＮＡのセレクターコドンを認識し；また、非天然アミノ酸を用いたＯＲＳによるＯｔＲＮＡのアミノアシル化のｋｃａｔ／Ｋｍが、天然アミノ酸を用いたＯＲＳによるＯｔＲＮＡのアミノアシル化のｋｃａｔ／Ｋｍより大きいか、又は前記非天然アミノ酸がセレクターコドンに応じて７５％より大きな忠実度で細胞内の成長ポリペプチドに組込まれる。
【請求項２８】
前記非天然アミノ酸がＯ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、及びイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニンから構成される群から選択されるか；
非天然アミノ酸がｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンであるか；
非天然アミノ酸がｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンであるか；
非天然アミノ酸がｍ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンであるか；又は
非天然アミノ酸が４−（２−オキソ−プロポキシ）−Ｌ−フェニルアラニンである請求項２７に記載の細胞。
【請求項２９】
前記細胞が原核細胞であるか、又は大腸菌細胞である請求項２７に記載の細胞。
【請求項３０】
前記セレクターコドンがアンバーコドン又は４塩基コドンである請求項２７に記載の細胞。
【請求項３１】
直交ｔＲＮＡシンテターゼが配列番号６２に記載のアミノ酸配列を含む請求項２７に記載の細胞。
【請求項３２】
直交ｔＲＮＡが配列番号１に記載の配列を含む核酸によりコードされる請求項２７に記載の細胞。
【請求項３３】
以下の条件（ａ．）〜（ｄ．）を満たす対として直交ｔＲＮＡシンテターゼ（ＯＲＳ）及び直交ｔＲＮＡ（ＯｔＲＮＡ）を含む単離又は培養された真核細胞。
（ａ．）前記ＯＲＳが前記ＯｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、優先的なアミノアシル化は、前記ＯＲＳが細胞の前記内在ｔＲＮＡの内在ｔＲＮＡシンテターゼのアミノアシル化に比べて低い効率で細胞の内在ｔＲＮＡをアミノアシル化することで定義され；
（ｂ．）前記ＯＲＳが任意の天然アミノ酸に比べて前記ＯｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し；
（ｃ．）前記ＯｔＲＮＡが前記内在ｔＲＮＡシンテターゼによる内在ｔＲＮＡのアミノアシル化に比べて低い効率で細胞の内在ｔＲＮＡシンテターゼによりアミノアシル化され；
（ｄ．）前記ＯｔＲＮＡが前記細胞内のｍＲＮＡのセレクターコドンを認識し；非天然アミノ酸を用いたＯＲＳによるＯｔＲＮＡのアミノアシル化のｋｃａｔ／Ｋｍが、天然アミノ酸を用いたＯＲＳによるＯｔＲＮＡのアミノアシル化のｋｃａｔ／Ｋｍより大きいか、又は前記非天然アミノ酸がセレクターコドンに応じて７５％より大きな忠実度で細胞内の成長ポリペプチドに組込まれる。
【請求項３４】
前記細胞が酵母細胞である請求項３３に記載の真核細胞。
【請求項３５】
直交ｔＲＮＡシンテターゼ及び直交ｔＲＮＡが原核ｔＲＮＡシンテターゼ及び原核ｔＲＮＡから誘導される請求項３３に記載の真核細胞。
【請求項３６】
前記細胞が細胞培養液中にある請求項３３に記載の真核細胞。
【請求項３７】
ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で特異的にアミノアシル化する突然変異体アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼであって、前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが２０種の共通アミノ酸のいずれよりも非天然アミノ酸に対して選択性である前記突然変異体アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ。
【請求項３８】
前記シンテターゼがｔＲＮＡを非天然アミノ酸でｉｎ  ｖｉｖｏアミノアシル化する請求項３７に記載の突然変異体アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ。
【請求項３９】
Ｋｍ及びＫｃａｔから構成される群から選択された、天然アミノ酸よりも非天然アミノ酸に対して改善又は強化された１以上の酵素特性を有する請求項３７に記載の突然変異体アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ。
【請求項４０】
シンテターゼ及びｔＲＮＡ対を用いる翻訳の忠実度が、非天然アミノ酸を含んだジヒドロ葉酸レダクターゼの分析により決定される場合９９％より大きい請求項３７に記載の突然変異体アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ。
【請求項４１】
非天然アミノ酸が図３０又は３１に記載の非天然アミノ酸の１種である請求項３７に記載の突然変異体アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ。
【請求項４２】
前記シンテターゼがＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  Ｔｙｒシンテターゼのアミノ酸配列のＴｙｒ３２、Ｃｌｕ１０７、Ａｓｐ１５８、Ｉｌｅ１５９又はＬｅｕ１６２から選択されたアミノ酸の突然変異体を含むチロシンシンテターゼである請求項３７に記載の突然変異体アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００１年４月１９日に出願された米国仮特許出願第６０／２８５，０３０号、及び２００２年２月６日に出願された米国特許出願第６０／３５５，５１４号の優先権を主張し、それらの明細書の全体をここで援用する。
【０００２】
連邦政府の後援を受けた研究開発の下で為された発明の権利に関する声明
本発明は、海軍研究事務所からの補助金交付第６５０２５７３号及び国立研究所からの補助金交付第ＧＭ２１５９号の下で米国政府の支援により為された。米国政府はこの発明に一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本発明は翻訳生化学の分野に関する。特に、本発明は突然変異直交ｔＲＮＡ、突然変異直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及びその対の生産方法に関する。本発明は非天然アミノ酸をタンパク質にｉｎｖｉｖｏ組込むために使用する直交対を同定するための方法と関連組成物も提供する。
【背景技術】
【０００４】
タンパク質は光合成からシグナル伝達や免疫応答に至るまでの複雑な生命現象のほぼ全てを行っている。これらの複雑な機能を理解し、制御するためには、タンパク質の構造と機能の関係の理解を深めることが必要である。
【０００５】
化合物の機能特性を変えるためにほぼ任意構造を変化させることができる小有機分子合成と異なり、タンパク質合成は２０種の天然アミノ酸によりコードされる変化に限られる。細菌からヒトに至る全公知生物の遺伝コードは同一の２０種の共通アミノ酸をコードする。これらのアミノ酸はタンパク質の翻訳後修飾（例えばグリコシル化、リン酸化又は酸化）、又は頻度は低いが、例えばセレノシステインの場合のようにアミノアシル化サプレッサーｔＲＮＡの酵素修飾により改変することができる。それにもかかわらず、これらの僅か２０種の単純な構成単位から合成されるポリペプチドが複雑な生命現象の全てを行っている。
【０００６】
部位特異的及びランダム突然変異誘発はタンパク質の特定アミノ酸を他の１９種の共通アミノ酸の任意のもので置換でき、タンパク質の構造と機能の関係を解明するための重要なツールになっている。これらの方法により、安定性、触媒活性及び結合特異性等の特性を強化したタンパク質を作製することが可能になっている。しかし、タンパク質置換は大半が単純な官能基をもつ２０種の共通アミノ酸に限られているＫｎｏｗｌｅｓ，Ｊ．Ｒ．Ｔｉｎｋｅｒｉｎｇｗｉｔｈ ｅｎｚｙｍｅｓ： ｗｈａｔａｒｅ ｗｅ ｌｅａｒｎｉｎｇ？Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３６（４８０６）１２５２−１２５８（１９８７）；及びＺｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏＭ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５４：４６８−５００（１９８３）参照。新規な生物学的、化学的又は物理的特性をもつ付加アミノ酸を含むように遺伝コードを拡張することにより、例えば天然タンパク質のように２０種の共通アミノ酸に含まれるアミノ酸のみから構成されるタンパク質に比較してタンパク質の性質（例えば寸法、酸性度、求核性、水素結合、疎水性）を改変することができる。
【０００７】
非天然アミノ酸をタンパク質に導入するために数種のストラテジーが利用されている。最初の実験はＬｙｓ、Ｃｙｓ及びＴｙｒ等の反応性側鎖をアミノ酸に付加した（例えばリジンを
【数１】
2011030571.tif 000002
アセチル−リジンに変換）。化学合成も非天然アミノ酸を導入する簡単な方法であるが、日常的固相ペプチド合成は一般に１００残基未満の小ペプチド又はタンパク質に限られている。ペプチドフラグメントの酵素ライゲーションと天然化学ライゲーションの最近の開発に伴い、より大きいタンパク質を生産することが可能であるが、方法の大規模化は容易ではない。例えばＰ．Ｅ．ＤａｗｓｏｎとＳ．Ｂ．Ｈ．Ｋｅｎｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６９：９２３（２０００）参照。タンパク質生合成に有用なｉｎｖｉｔｒｏ抽出物に所望非天然アミノ酸で化学的にアシル化したサプレッサーｔＲＮＡを加える一般的なｉｎ ｖｉｔｒｏ生合成法を使用して１００種を上回る非天然アミノ酸がほぼ任意寸法の各種タンパク質に部位特異的に組込まれている。例えばＶ．Ｗ．Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｄ．Ｍｅｎｄｅｌａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，１９９５，３４：６２１（１９９５）；Ｃ．Ｊ．Ｎｏｒｅｎ，Ｓ．Ｊ．Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｍ．Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４ １８２−１８８（１９８９）；及びＪ．Ｄ．Ｂａｉｎ，Ｃ．Ｇ．Ｇｌａｂｅ，Ｔ．Ａ．Ｄｉｘ，Ａ．Ｒ．Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，Ｅ．Ｓ．Ｄｉａｌａ，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｎｔｏａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１ ８０１３−８０１４（１９８９）参照。タンパク質安定性、タンパク質フォールディング、酵素メカニズム及びシグナル伝達の研究のために多様な官能基がタンパク質に導入されている。これらの研究はタンパク質生合成機構が多様なアミノ酸側鎖を許容することを立証しているが、方法は技術的に困難であり、突然変異タンパク質収率は低い。
【０００８】
５０年以上前に天然アミノ酸の多数の類似体は細菌の増殖を阻害することが発見された。これらのアミノ酸類似体の存在下で生産したタンパク質を分析すると、各種程度までその天然対応物を置換していることが分かった。例えば、Ｍ．Ｈ．Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．２６：３９８（１９６２）参照。これは正しいアミノ酸とそのコグネイトｔＲＮＡの結合に関与する酵素であるアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼが類似体を対応する天然アミノ酸から厳密に区別できないためである。例えば、ノルロイシンはメチオニル−ｔＲＮＡシンテターゼにより負荷され、ｐ−フルオロフェニルアラニンはフェニルアラニン−ｔＲＮＡシンテターゼにより負荷される。Ｄ．Ｂ．Ｃｏｗｉｅ，Ｇ．Ｎ．Ｃｏｈｅｎ，Ｅ．Ｔ．Ｂｏｌｔｏｎａｎｄ Ｈ．ＤｅＲｒｏｂｉｎｃｈｏｎ−Ｓｚｕｌｍａｊｓｔ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９５９，３４：３９（１９５９）；及びＲ．ＭｕｎｉｅｒとＧ．Ｎ．Ｃｏｈｅｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９５９，３１：３７８（１９５９）参照。
【０００９】
その後、種々の野生型シンテターゼを利用するために選択圧組込みと呼ばれるｉｎ ｖｉｖｏ方法が開発された。例えばＮ．Ｂｕｄｉｓａ，Ｃ．Ｍｉｎｋｓ，Ｓ．Ａｌｅｆｅｌｄｅｒ，Ｗ．Ｗｅｎｇｅｒ，Ｆ．Ｍ．Ｄｏｎｇ，Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒａｎｄ Ｒ．Ｈｕｂｅｒ，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，１３：４１（１９９９）参照。この方法では特定天然アミノ酸を細胞に供給する該当代謝経路を遮断する栄養要求株を使用し、ターゲット遺伝子の転写を抑制しながら制限濃度の天然アミノ酸を含む最少培地で培養する。定常増殖期が開始したら天然アミノ酸の供給を停止して非天然アミノ酸類似体に交換する。組換えタンパク質の発現を誘導すると、非天然類似体を含むタンパク質が蓄積する。例えば、このストラテジーを使用してｏ、ｍ及びｐ−フルオロフェニルアラニンがタンパク質に組込まれ、紫外線スペクトルで容易に識別可能な２つの特徴的な肩を示しており（例えばＣ．Ｍｉｎｋｓ，Ｒ．Ｈｕｂｅｒ，Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒａｎｄ Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８４：２９（２０００）参照）、また、トリフルオロメチオニンを使用してバクテリオフアージＴ４リゾチームのメチオニンを置換し、キトオリゴ糖リガンドとのその相互作用が19Ｆ ＮＭＲにより試験されており（例えばＨ．Ｄｕｅｗｅｌ，Ｅ．Ｄａｒｂ，Ｖ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎａｎｄ Ｊ．Ｆ．Ｈｏｎｅｋ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：３４０４（１９９７））、更にロイシンの代わりにトリフルオロロイシンを挿入してロイシン−ジッパータンパク質の熱及び化学安定性を高めている。例えばＹ．Ｔａｎｇ，Ｇ．Ｇｈｉｒｌａｎｄａ，Ｗ．Ａ．Ｐｅｔｋａ，Ｔ．Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｗ．Ｆ．ＤｅＧｒａｄｏａｎｄ Ｄ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，４０：１４９４（２００１）参照。更に、セレノメチオニンとテルロメチオニンを各種組換えタンパク質に組込んでＸ線結晶解析で位相決定を容易にしている。例えばＷ．Ａ．Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．Ｈｏｒｔｏｎａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｌｅｍａｓｔｅｒ，ＥＭＢＯ Ｊ．，９：１６６５（１９９０）；Ｊ．Ｏ．Ｂｏｌｅｓ，Ｋ．Ｌｅｗｉｎｓｋｉ，Ｍ．Ｋｕｎｋｌｅ，Ｊ．Ｄ．Ｏｄｏｍ，Ｂ．Ｄｕｎｌａｐ，Ｌ．Ｌｅｂｉｏｄａａｎｄ Ｍ．Ｈａｔａｄａ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１：２８３（１９９４）；Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ，Ｂ．Ｓｔｅｉｐｅ，Ｐ．Ｄｅｍａｎｇｅ，Ｃ．Ｅｃｋｅｒｓｋｏｒｎ，Ｊ．Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎａｎｄ Ｒ．Ｈｕｂｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３０：７８８（１９９５）；及びＮ．Ｂｕｄｉｓａ，Ｗ．Ｋａｒｎｂｒｏｃｋ，Ｓ．Ｓｔｅｉｎｂａｃｈｅｒ，Ａ．Ｈｕｍｍ，Ｌ．Ｐｒａｄｅ，Ｔ．Ｎｅｕｅｆｅｉｎｄ，Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒａｎｄ Ｒ．Ｈｕｂｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７０：６１６（１９９７）参照。アルケン又はアルキン官能基をもつメチオニン類似体も効率的に挿入され、化学的手段によりタンパク質の付加修飾が可能である。例えばＪ．Ｃ．Ｍ．ｖａｎＨｅｓｔとＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４２４：６８（１９９８）；Ｊ．Ｃ．Ｍ．ｖａｎ Ｈｅｓｔ，Ｋ．Ｌ．Ｋｉｉｃｋａｎｄ Ｄ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，���２２：１２８２（２０００）；及びＫ．Ｌ．ＫｉｉｃｋとＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５６：９４８７（２０００）参照。
【００１０】
この方法の成功は一般にタンパク質翻訳の忠実度を確保するためには高い選択性を必要とするアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼによる非天然アミノ酸類似体の認識に依存している。従って、この方法により接近可能な化学官能基の範囲は限られている。例えば、チアプロリンは定量的にタンパク質に組込むことができるが、オキサプロリンやセレノプロリンはできない。Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ，Ｃ．Ｍｉｎｋｓ，Ｆ．Ｊ．Ｍｅｄｒａｎｏ，Ｊ．Ｌｕｔｚ，Ｒ．Ｈｕｂｅｒａｎｄ Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ Ａ．９５：４５５（１９９８）参照。この方法の範囲を拡大する１つの方法はアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの基質特異性を緩和することであり、少数の例で成功している。例えば、大腸菌フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＰｈｅＲＳ）でＡｌａ294をＧｌｙに置換すると、基質結合ポケットの寸法が増し、その結果、ｔＲＮＡＰｈｅはｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン（ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ）によりアシル化される。Ｍ．Ｉｂｂａ，Ｐ．Ｋａｓｔａｎｄ Ｈ．Ｈｅｎｎｅｃｋｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３：７１０７（１９９４）参照。この突然変異体ＰｈｅＲＳを大腸菌株に導入すると、フェニルアラニンの代わりにｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン又はｐ−Ｂｒ−フェニルアラニンを組込むことができる。例えばＭ．ＩｂｂａとＨ．Ｈｅｎｎｅｃｋｅ，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，３６４：２７２（１９９５）；及びＮ．Ｓｈａｒｍａ，Ｒ．Ｆｕｒｔｅｒ，Ｐ．Ｋａｓｔａｎｄ Ｄ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４６７：３７（２０００）参照。同様に、大腸菌チロシル−ｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合部位の近傍の点突然変異Ｐｈｅ１３０Ｓｅｒの結果、アザチロシンをチロシンよりも効率的に組込めることが示されている。Ｆ．Ｈａｍａｎｏ−Ｔａｋａｋｕ，Ｔ．Ｉｗａｍａ，Ｓ．Ｓａｉｔｏ−Ｙａｎｏ，Ｋ．Ｔａｋａｋｕ，Ｙ．Ｍｏｎｄｅｎ，Ｍ．Ｋｉｔａｂａｔａｋｅ，Ｄ．Ｓｏｌｌａｎｄ Ｓ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：４０３２４（２０００）参照。
【００１１】
アミノアシル化の忠実性は非コグネイト中間体及び生成物の基質識別とプルーフリーディングの両レベルで維持される。従って、非天然アミノ酸をタンパク質にｉｎｖｉｖｏ組込む代替ストラテジーはプルーフリーディングメカニズムをもつシンテターゼの改変である。これらのシンテターゼはコグネイト天然アミノ酸に構造的に類似するアミノ酸を識別することができず、従って活性化することができない。このエラーは別部位で修正され、ｔＲＮＡから誤って負荷されたアミノ酸を脱アシル化し、タンパク質翻訳の忠実度を維持する。シンテターゼのプルーフリーディング活性が機能しなくなると、誤って活性化された構造類似体が編集機能から抜け落ちて組込まれる恐れがある。このアプローチはバリル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＶａｌＲＳ）で最近立証されている。Ｖ．Ｄｏｒｉｎｇ，Ｈ．Ｄ．Ｍｏｏｔｚ，Ｌ．Ａ．Ｎａｎｇｌｅ，Ｔ．Ｌ．Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，Ｖ．ｄｅＣｒｅｃｙ−Ｌａｇａｒｄ，Ｐ．Ｓｃｈｉｍｍｅｌ ａｎｄ Ｐ．Ｍａｒｌｉｅｒｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：５０１（２００１）参照。ＶａｌＲＳがｔＲＮＡ ＶａｌをＣｙｓ、Ｔｈｒ又はアミノ酪酸（Ａｂｕ）で誤ってアミノアシル化すると、これらの非コグネイトアミノ酸は編集ドメインにより加水分解される。大腸菌染色体のランダム突然変異誘発後に、ＶａｌＲＳの編集部位に突然変異をもつ突然変異体大腸菌株が選択された。この編集欠損ＶａｌＲＳはｔＲＮＡＶａｌに誤ってＣｙｓを負荷する。ＡｂｕはＣｙｓに立体的に似ている（ＡｂｕではＣｙｓの−ＳＨ基を−ＣＨ３で置換）ので、この突然変異体大腸菌株をＡｂｕの存在下に増殖させると、突然変異体ＶａｌＲＳはＡｂｕもタンパク質に組込む。質量分析によると、天然タンパク質ではバリンの約２４％が各バリン位でＡｂｕにより置換されている。
【００１２】
上記方法の少なくとも１つの重大な欠点は、タンパク質中の特定天然アミノ酸に対応する全部位を置換することである。また、天然及び非天然アミノ酸の組込み度も一定せず、細胞の内側でコグネイト天然アミノ酸を完全に枯渇させることは困難であるので、定量的置換が達成されることは稀である。類似体の多重部位組込みは毒性を生じるので、これらのストラテジーは生きた細胞では突然変異体タンパク質を試験し難いという欠点もある。最後に、ゲノム内の全部位で置換できなければならないという理由から、この方法は一般に共通アミノ酸の近似構造類似体にしか適用できない。
【００１３】
固相合成及び半合成法により新規アミノ酸を含む多数の小タンパク質の合成も行われている。例えば以下の刊行物とその引用文献を参照されたい。Ｃｒｉｃｋ，Ｆ．Ｊ．Ｃ．，Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｌ．Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．Ｗａｔｔｓ−Ｔｏｂｉｎ，Ｒ．Ｇｅｎｅｒａｌｎａｔｕｅ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｆｏｒｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ，１９２：１２２７−１２３２（１９６１）；Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｋ．，Ｂｏｈｎ，Ｈ．Ｓｔｕｄｉｅｓｏｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＸＸＸＶＩ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆｐｙｒａｚｏｌｅ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｓ−ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ａｎ Ｓ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．，５９１４−５９１９（１９６６）；Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，４７−５４（１９８９）；Ｎａｋａｔｓｕｋａ，Ｔ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．，Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓｅｇｍｅｎｔ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｃａｔａｌｙｚｅｄｂｙ ｔｈｅ ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃｅｎｚｙｍｅ ｔｈｉｏｓｕｂｓｔｉｌｉｓｉｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３８０８−３８１０（１９８７）；Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍ．，Ｋｅｎｔ，ＳＢ Ｈ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙ ｄｏｖｅｔａｉｌｉｎｇ ｕｎｐｒｏｔｅｃｔｅｄｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｂａｃｋｂｏｎｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＨＩＶ ｐｒｏｔｅａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２１−２２５（１９９２）；Ｃｈａｉｋｅｎ，Ｉ．Ｍ．Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＣＲＣＣｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５５−３０１（１９８１）；Ｏｆｆｏｒｄ，Ｒ．Ｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｂｙ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅａｎｓ？ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．，１５１−１５７（１９８７）；及びＪａｃｋｓｏｎ，Ｄ．Ｙ．，Ｂｕｒｎｉｅｒ，Ｊ．，Ｑｕａｎ，Ｃ．，Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｍ．，Ｔｏｍ，Ｊ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．ＡＤｅｓｉｇｎｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｇａｓｅｆｏｒ Ｔｏｔａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ａ ｗｉｔｈ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ ＣａｔａｌｙｔｉｃＲｅｓｉｄｕｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３（１９９４）。
【００１４】
補因子、スピンラベル及びオリゴヌクレオチド等の各種非天然側鎖をタンパク質にｉｎ ｖｉｔｒｏ導入するために化学修飾が使用されている。例えばＣｏｒｅｙ，Ｄ．Ｒ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｙｂｒｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８３（４８３２）：１４０１−１４０３（１９８７）；Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．，ＬａｗｒｅｎｃｅＤ．Ｓ．，Ｒｏｋｉｔａ，Ｓ．Ｅ．Ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５４：５６５−５９５（１９８５）；Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｄ．Ｓ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２６（４６７４）５０５−５１１（１９８４）；Ｎｅｅｔ，Ｋ．Ｅ．，ＮａｎｃｉＡ，Ｋｏｓｈｌａｎｄ，Ｄ．Ｅ．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｉｏｌ−ｓｕｂｓｔｉｌｉｓｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３（２４）：６３９２−６４０１（１９６８）；Ｐｏｌｇａｒ，Ｌ．Ｂ．，Ｍ．Ｌ．Ａｎｅｗ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｌｌｙ ｆｏｒｍｅｄａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ．Ｔｈｉｏｌ−ｓｕｂｓｔｉｌｉｓｉｎ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８８：３１５３−３１５４（１９６６）；及びＰｏｌｌａｃｋ，Ｓ．Ｊ．，Ｎａｋａｙａｍａ，Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅｓ ａｎｄｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｓｉｔｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２（４８８１）：１０３８−１０４０（１９８８）参照。
【００１５】
あるいは、数種の生物理学的プローブをｉｎ ｖｉｔｒｏ合成タンパク質に組込むために化学修飾アミノアシル−ｔＲＮＡを利用する生合成法が使用されている。以下の刊行物とその引用文献参照。Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｊ．ＮｅｗＰｈｏｔｏｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，６２：４８３−５１４（１９９３）；及びＫｒｉｅｇ，Ｕ．Ｃ．，Ｗａｌｔｅｒ，Ｐ．，Ｈｏｈｎｓｏｎ，Ａ．Ｅ．Ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇｏｆ ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｎａｓｃｅｎｔ ｐｒｅｐｒｏｌａｃｔｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ５４−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｐａｒｔｉｃｌｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，８３（２２）：８６０４−８６０８（１９８６）。
【００１６】
所望アンバーナンセンス突然変異を含む遺伝子でプログラムされたタンパク質合成反応に化学的にアミノアシル化したサプレッサーｔＲＮＡを加えることにより非天然アミノ酸をタンパク質に部位特異的にｉｎｖｉｔｒｏ組込むことができることは従来示されている。これらのアプローチを使用すると、特定アミノ酸の栄養要求性株を使用して２０種の共通アミノ酸の多数のものを近似構造相同体（例えばフェニルアラニンをフルオロフェニルアラニン）で置換することができる。例えばＮｏｒｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｍ．Ｃ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ａｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１８２−１８８（１９８９）；Ｍ．Ｗ．Ｎｏｗａｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８：４３９−４２（１９９５）；Ｂａｉｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｇｌａｂｅ，Ｃ．Ｇ．，Ｄｉｘ，Ｔ．Ａ．，Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，Ａ．Ｒ．，Ｄｉａｌａ，Ｅ．Ｓ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｎｔｏａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，Ｊ．Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，１１１：８０１３−８０１４（１９８９）；Ｎ．Ｂｕｄｉｓａら，ＦＡＳＥＢＪ．１３：４１−５１（１９９９）；Ｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｍｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｓ．，Ｎｏｒｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚ．，３０１−３３６（１９９２）；及びＭｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｗｉｔｈ ａｎ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２４，４３５−６２（１９９５）参照。
【００１７】
例えば、終止コドンＵＡＧを認識するサプレッサーｔＲＮＡが作製され、非天然アミノ酸で化学的にアミノアシル化された。タンパク質遺伝子の所期部位に終止コドンＴＡＧを導入するために慣用部位特異的突然変異誘発が使用された。例えばＳａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｗ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．５'，３' Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１６（３）：７９１−８０２（１９８８）参照。アシル化サプレッサーｔＲＮＡと突然変異体遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系で組合せると、ＵＡＧコドンに応答して非天然アミノ酸が組込まれ、このアミノ酸を特定位置に含むタンパク質が得られた。[3Ｈ］−Ｐｈｅを使用する実験とα−ヒドロキシ酸を使用する実験によると、所望アミノ酸のみがＵＡＧコドンにより指定される位置に組込まれ、このアミノ酸はタンパク質の他のどの位置にも組込まれないことが判明した。例えばＮｏｒｅｎら，前出；及びＥｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｍｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７−２００（１９９２）参照。
【００１８】
一般に、これらのｉｎ ｖｉｔｒｏアプローチはアミノ酸の部位特異的組込みが困難であることや、アミノ酸が２０種の共通アミノ酸の単純な誘導体でなければならないことや、大きいタンパク質又はペプチドフラグメントの合成に伴う固有の問題などの限界がある。
【００１９】
非天然アミノ酸をタンパク質に組込むためにマイクロインジェクション法も使用されている。例えばＭ．Ｗ．Ｎｏｗａｋ，Ｐ．Ｃ．Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｊ．Ｒ．Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．Ｓａｋｓ，Ｃ．Ｇ．Ｌａｂａｒｃａ，Ｓ．Ｋ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｗ．Ｇ．Ｚｈｏｎｇ，Ｊ．Ｔｈｏｒｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｎ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙａｎｄ Ｈ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：４３９（１９９５）；及びＤ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｃｕｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６４５（２０００）参照。ｉｎｖｉｔｒｏ作製した２種のＲＮＡ種即ち所期アミノ酸位置にＵＡＧ終止コドンをもつターゲットタンパク質をコードするｍＲＮＡと、所望非天然アミノ酸でアミノアシル化したアンバーサプレッサーｔＲＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞に同時に注射している。こうすると、卵母細胞の翻訳機構はＵＡＧにより指定される位置に非天然アミノ酸を挿入する。この方法により一体的膜タンパク質のｉｎｖｉｖｏ構造−機能研究が可能になったが、一般にｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系には応用できない。例えば、蛍光アミノ酸をタキキニンニューロキニン−２受容体に組込んで蛍光共鳴エネルギー移動により距離を測定したり（例えばＧ．Ｔｕｒｃａｔｔｉ，Ｋ．Ｎｅｍｅｔｈ，Ｍ．Ｄ．Ｅｄｇｅｒｔｏｎ，Ｕ．Ｍｅｓｅｔｈ，Ｆ．Ｔａｌａｂｏｔ，Ｍ．Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｈ．Ｖｏｇｅｌａｎｄ Ａ．Ｃｈｏｌｌｅｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１９９９１（１９９６）参照）、ビオチン化アミノ酸を組込んでイオンチャンネルで表面残基を同定したり（例えばＪ．Ｐ．Ｇａｌｌｉｖａｎ，Ｈ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒａｎｄ Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：７３９（１９９７）参照）、ケージドチロシン類似体を使用してイオンチャンネルの共焦点変化をリアルタイムでモニターしたり（例えばＪ．Ｃ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｋ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｍ．Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙａｎｄ Ｈ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ，Ｎｅｕｒｏｎ，２０：６１９（１９９８）参照）、αヒドロキシアミノ酸を使用してイオンチャンネルのバックボーンを改変し、その開閉メカニズムを探索する（例えばＰ．Ｍ．Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙａｎｄ Ｈ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ，Ｃｅｌｌ，９６：８９（１９９９）；及びＴ．Ｌｕ，Ａ．Ｙ．Ｔｉｎｇ，Ｊ．Ｍａｉｎｌａｎｄ，Ｌ．Ｙ．Ｊａｎ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚａｎｄ Ｊ．Ｙａｎｇ，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，４：２３９（２００１）参照）等の方法が挙げられる。
【００２０】
しかし、マイクロインジェクション法には、例えばサプレッサーｔＲＮＡを非天然アミノ酸で化学的にｉｎｖｉｔｒｏアミノアシル化しなければならないことや、アシル化ｔＲＮＡが翻訳中に化学量論的試薬として消費され、再生できないなどの欠点がある。この欠点により、抑圧効率が悪く、タンパク質収率が低いので、電気生理学的測定等の高感度技術で突然変異体タンパク質を定量することが必要である。更に、この方法はマイクロインジェクションが可能な細胞にしか適用できない。
【００２１】
非天然アミノ酸をタンパク質に直接ｉｎ ｖｉｖｏ組込むことができるならば、突然変異体タンパク質の収率が上がり、技術的に容易であり、細胞や場合によっては生きた生物で突然変異体タンパク質を試験することが可能になり、これらの突然変異体タンパク質を治療処置に使用できる等の利点がある。各種寸法、酸性度、求核性、疎水性等の特性をもつ非天然アミノ酸をタンパク質に組込むことができるならば、タンパク質の構造を合理的且つ体系的に操作し、タンパク質機能を探索すると共に新規特性をもつ新規タンパク質又は生物を創製する可能性が著しく広がる。しかし、タンパク質翻訳の忠実度を高くするために必要なｔＲＮＡ−シンテターゼ相互作用の複雑な性質によりその方法は困難である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
従って、細胞の生合成機構をより効率的且つ有効に改変できるように方法を改善することが必要である。以下の開示から自明の通り、本発明はこれらの必要及び他の必要に取組むものである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対と前記対の個々の成分を含むタンパク質生合成機構で使用される成分の組成物を提供する。非天然アミノ酸を使用することができる直交ｔＲＮＡ、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及びその対を作製及び選択するための方法も提供する。本発明の組成物は新規直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対（例えばｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ｍｕｔＴｙｒＲＳ対、ｍｕｔＲＮＡＬｅｕ−ｍｕｔＬｅｕＲＳ対、ｍｕｔＲＮＡＴｈｒ−ｍｕｔＴｈｒＲＳ対、ｍｕｔＲＮＡＧｌｕ−ｍｕｔＧｌｕＲＳ対等）を含む。新規直交対は非天然アミノ酸をポリペプチドにｉｎｖｉｖｏ組込むために使用することができる。本発明の他の態様は直交対の選択を含む。
本発明の組成物は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み、Ｏ−ＲＳは場合によりｉｎｖｉｖｏでにおいて直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。１態様において、Ｏ−ＲＳは配列番号４〜３４（表５参照）及びその相補的ポリヌクレオチド配列から構成される群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む核酸を含む。別の態様において、Ｏ−ＲＳは天然アミノ酸（例えば２０種の公知アミノ酸の１種）よりも非天然アミノ酸に対して改善又は強化された酵素特性をもち、例えばＫmが高いか低く、ｋcat が高いか低く、ｋcat ／Ｋm が高いか低い等である。
【００２４】
本発明の非天然アミノ酸は多様な物質を含む。例えば、場合により（限定しないが）、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、及びイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン等の分子が挙げられる。更に、他の例としては（限定しないが）チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；スレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケトもしくはアミノ置換アミノ酸又はその任意組合せ；光架橋基をもつアミノ酸；スピンラベル付きアミノ酸；蛍光アミノ酸：新規官能基をもつアミノ酸；別の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；フォトケージドアミノ酸；光異性化可能なアミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸；グリコシル化又は糖鎖修飾アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコールを含むアミノ酸；ポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学分解性又は光分解性アミノ酸；延長側鎖をもつアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖鎖置換アミノ酸（例えば糖鎖置換セリン等）；炭素結合糖含有アミノ酸；レドックス活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸含有アミノ酸；α，αジ置換アミノ酸；βアミノ酸；及びプロリン以外の環状アミノ酸が挙げられる。
【００２５】
本発明は配列番号４〜３４（配列については表５参照）から選択されるコーディングポリヌクレオチド配列、配列番号３５〜６６から選択されるポリペプチドをコードするコーディングポリヌクレオチド配列、前記ポリヌクレオチド配列の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、及び前記配列の任意のものの相補的配列から選択されるコーディングポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドも含む。更に、前記ポリペプチドは場合により直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び／又は配列番号３５〜６６から選択されるアミノ酸配列をコードする。
【００２６】
本発明は配列番号１〜３から選択されるポリヌクレオチド配列（又はその相補的ポリヌクレオチド配列）、及び前記ポリヌクレオチド配列の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列から構成される群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む核酸も含む。前記核酸はポリヌクレオチド配列が直交ｔＲＮＡを含むか及び／又はポリヌクレオチド配列が（場合により配列番号３５〜６６の配列をもつものから選択される）直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと相補対を形成する態様も含む。
【００２７】
本発明は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の組成物も含み、Ｏ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、Ｏ−ｔＲＮＡは直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼにより非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化される。１態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号１〜３（表５参照）及びその相補的ポリヌクレオチド配列から構成される群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む核酸を含む。
【００２８】
本発明のセレクターコドンはタンパク質生合成機構の遺伝コドン枠を拡張する。例えば、セレクターコドンとしては例えば（天然又は非天然塩基から構成される）ユニーク３塩基コドン、ナンセンスコドン（例えばアンバーコドン又はオパールコドン等の終止コドン）、非天然コドン、レアコドン、少なくとも４塩基を含むコドン、少なくとも５塩基を含むコドン、少なくとも６塩基を含むコドン等が挙げられる。
【００２９】
１態様において、Ｏ−ｔＲＮＡは（場合により組成物内に）直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含むことができ、例えばＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは相補的である（例えばＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対）。１態様において、対は例えばｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ｍｕｔＴｙｒＲＳ対（例えばｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ＳＳ１２ＴｙｒＲＳ対）、ｍｕｔＲＮＡＬｅｕ−ｍｕｔＬｅｕＲＳ対、ｍｕｔＲＮＡＴｈｒ−ｍｕｔＴｈｒＲＳ対、ｍｕｔＲＮＡＧｌｕ−ｍｕｔＧｌｕＲＳ対等を含む。別の態様において、対は大腸菌由来ｍｕｔＲＮＡＧｌｎ−ｍｕｔＧｌｎＲＳ、酵母由来ｍｕｔＲＮＡＡｓｐ−ｍｕｔＡｓｐＲＳ又は酵母由来ｍｕｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ−ｍｕｔＰｈｅＲＳ以外のものであり、これらの対は本発明の対の特性をもたない。
【００３０】
Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは多様な生物に由来する天然ｔＲＮＡ及びＲＳの突然変異により誘導することができる。１態様では、Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは少なくとも１種の生物に由来し、生物は例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａ．ｐｅｒｎｉｘ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等の原核生物である。場合により、生物は例えば植物（例えば単子葉植物又は双子葉植物等の複雑な植物）、藻類、真菌類（例えば酵母等）、動物（例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等）、昆虫、原生生物等の真核生物である。場合により、Ｏ−ｔＲＮＡは第１の生物に由来する天然ｔＲＮＡの突然変異により誘導され、Ｏ−ＲＳは第２の生物に由来する天然ＲＳの突然変異により誘導される。１態様では、Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは突然変異ｔＲＮＡと突然変異ＲＳから誘導することができる。
【００３１】
Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは場合により多様な生物から単離することもできる。１態様では、Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは少なくとも１種の生物から単離され、生物は例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａ．ｐｅｒｎｉｘ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等の原核生物である。場合により、生物は例えば植物（例えば単子葉植物又は双子葉植物等の複雑な植物）、藻類、真菌類（例えば酵母等）、動物（例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等）、昆虫、原生生物等の真核生物である。場合により、Ｏ−ｔＲＮＡは第１の生物に由来する天然ｔＲＮＡから単離され、Ｏ−ＲＳは第２の生物に由来する天然ＲＳから単離される。１態様では、Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは（場合により（原核生物及び／又は真核生物を含む）１種以上の生物に由来する１種以上のＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳを含む）１種以上のライブラリーから単離することができる。
【００３２】
別の側面では、本発明の組成物は細胞に組込むことができる。場合により、本発明の組成物はｉｎｖｉｔｒｏ翻訳系に組込むことができる。
【００３３】
本発明は非天然アミノ酸を組込むために使用することができるタンパク質生合成機構の成分（例えばＯ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及び直交Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対）の作製方法も提供する。生物のｉｎｖｉｖｏ翻訳系で使用する直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対の選択方法も提供する。前記方法で使用する非天然アミノ酸とセレクターコドンについては上記及び下記に記載する。
【００３４】
少なくとも１種の組換え直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の生産方法は、（ａ）第１の生物（例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａ．ｐｅｒｎｉｘ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等の原核生物）に由来する少なくとも１種のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）から誘導される（場合により突然変異体）ＲＳのライブラリーを作製する段階と、（ｂ）非天然アミノ酸と天然アミノ酸の存在下に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化するメンバーをＲＳ（場合により突然変異体ＲＳ）のライブラリーから選択（及び／又はスクリーニング）することにより活性（場合により突然変異体）ＲＳのプールを提供する段階と、及び／又は（ｃ）非天然アミノ酸の不在下にＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性ＲＳ（例えば突然変異体ＲＳ）のプールを（場合によりネガティブ選択により）選択することにより、Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する少なくとも１種の組換えＯ−ＲＳを提供する段階を含む。前記方法により生産された組換えＯ−ＲＳも本発明に含まれる。
【００３５】
１態様では、ＲＳは不活性ＲＳである。不活性ＲＳは活性ＲＳを突然変異させることにより作製することができる。例えば、不活性ＲＳは少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、又は少なくとも約１０個以上のアミノ酸を別のアミノ酸（例えばアラニン）に突然変異させることにより作製することができる。
【００３６】
突然変異体ＲＳのライブラリーは当分野で公知の種々の突然変異誘発技術を使用して作製することができる。例えば、突然変異体ＲＳは部位特異的突然変異、ランダム突然変異、多様性を生じる組換え突然変異、キメラ構築物及び本明細書に記載するか又は当分野で公知の他の方法により作製することができる。
【００３７】
１態様では、非天然アミノ酸と天然アミノ酸の存在下に活性なメンバー（例えば直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化するメンバー）をＲＳ（場合により突然変異体ＲＳ）のライブラリーから選択（及び／又はスクリーニング）する段階は、少なくとも１個のセレクターコドン（例えばアンバー、オーカー又はオパールコドン）を含むポジティブ選択又はスクリーニングマーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子等）と（場合により突然変異体）ＲＳのライブラリーを複数の細胞に導入し、選択物質の存在下に複数の細胞を増殖させ、ポジティブ選択又はスクリーニングマーカー中で少なくとも１個のセレクターコドンを抑圧することにより選択及び／又はスクリーニング物質の存在下に生存する（か又は特異的応答を示す）細胞を同定し、活性（場合により突然変異体）ＲＳのプールを含むポジティブ選択済み細胞のサブセットを提供することを含む。場合により、選択及び／又はスクリーニング物質濃度を変動させてもよい。
【００３８】
１側面では、ポジティブ選択マーカーはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子であり、少なくとも１個のセレクターコドンはＣＡＴ遺伝子内のアンバー終止コドンである。場合により、ポジティブ選択マーカーはβラクタマーゼ遺伝子であり、少なくとも１個のセレクターコドンはβラクタマーゼ遺伝子内のアンバー終止コドンである。別の側面では、ポジティブスクリーニングマーカーは蛍光もしくは発光スクリーニングマーカー又は親和性に基づくスクリーニングマーカー（例えば細胞表面マーカー）を含む。
【００３９】
１態様では、非天然アミノ酸の不在下にＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性ＲＳ（場合により突然変異体）のプールをネガティブ選択又はスクリーニングする段階は、少なくとも１個のセレクターコドンを含むネガティブ選択又はスクリーニングマーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子）をポジティブ選択又はスクリーニングからの活性（場合により突然変異体）ＲＳのプールと共に第２の生物の複数の細胞に導入し、非天然アミノ酸と選択又はスクリーニング物質を加えた第１の培地で生存するか又は特異的スクリーニング応答を示すが、非天然アミノ酸と選択又はスクリーニング物質を加えない第２の培地では生存するか又は特異的応答を示すことができない細胞を同定することにより、少なくとも１種の組換えＯ−ＲＳをもつ生存細胞又はスクリーニング済み細胞を提供することを含む。例えば、ポジティブ選択及び／又はネガティブスクリーニングとして場合によりＣＡＴ同定プロトコールを使用して適当な組換えＯ−ＲＳを決定する。例えば、場合により１種以上の非天然アミノ酸の存在下又は不在下に（少なくとも１個のセレクターコドンを含む）ＣＡＴを加えた増殖プレートでクローンのプールを複製する。こうして、非天然アミノ酸を加えたプレートでしか増殖しないコロニーが組換えＯ−ＲＳを含むとみなす。１側面では、選択（及び／又はスクリーニング）物質濃度を変動させる。所定側面では、第１の生物と第２の生物は異なる。即ち、第１及び／又は第２の生物は場合により原核生物、真核生物、哺乳動物、大腸菌、真菌、酵母、始原菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物等を含む。別の態様では、スクリーニングマーカーは蛍光もしくは発光スクリーニングマーカー又は親和性に基づくスクリーニングマーカーを含む。
【００４０】
別の態様では、活性（場合により突然変異体）ＲＳのプールをスクリーニング又は選択（例えばネガティブ選択）する段階は、ポジティブ選択段階（ｂ）からの活性突然変異体ＲＳのプールを単離し、少なくとも１個のセレクターコドンを含むネガティブ選択又はスクリーニングマーカー（例えば少なくとも１個のセレクターコドンを含む毒性マーカー遺伝子、例えばリボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子）と活性（場合により突然変異体）ＲＳのプールを第２の生物の複数の細胞に導入し、非天然アミノ酸を加えない第１の培地で生存するか又は特異的スクリーニング応答を示すが、非天然アミノ酸を加えた第２の培地では生存するか又は特異的スクリーニング応答を示すことができない細胞を同定し、非天然アミノ酸に特異的な少なくとも１種の組換えＯ−ＲＳをもつ生存又はスクリーニング済み細胞を提供することを含む。１側面では、少なくとも１個のセレクターコドンは約２個以上のセレクターコドンを含む。このような態様は場合により、少なくとも１個のセレクターコドンが２個以上のセレクターコドンを含み、第１の生物と第２の生物が異なる（例えば各生物が場合により例えば原核生物、真核生物、哺乳動物、大腸菌、真菌、酵母、始原菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物等である）態様を含むことができる。更に、所定側面では、ネガティブ選択マーカーは（少なくとも１個のセレクターコドンを含む）リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子を含む。他の側面では、スクリーニングマーカーは場合により蛍光もしくは発光スクリーニングマーカー又は親和性に基づくスクリーニングマーカーを含む。本明細書に記載する態様では、スクリーニング及び／又は選択は場合によりスクリーニング及び／又は選択ストリンジェンシーの変動を含む。
【００４１】
１態様では、少なくとも１種の組換え直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の生産方法は更に、（ｄ）少なくとも１種の組換えＯ−ＲＳを単離する段階と、（ｅ）少なくとも１種の組換えＯ−ＲＳから誘導される第２組の（場合により突然変異）Ｏ−ＲＳを作製する段階と、（ｆ）Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化することが可能な突然変異Ｏ−ＲＳが得られるまで段階（ｂ）及び（ｃ）を反復する段階を含む。場合により、段階（ｄ）〜（ｆ）を例えば少なくとも約２回反復する。１側面では、少なくとも１種の組換えＯ−ＲＳから誘導される第２組の突然変異Ｏ−ＲＳは突然変異誘発（例えばランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、組換え又はその任意組合せ）により作製することができる。
【００４２】
上記方法における選択／スクリーニング段階（例えばポジティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）、ネガティブ選択／スクリーニング段階（ｃ）又はポジティブ及びネガティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）及び（ｃ）の両方）は、場合により選択／スクリーニングストリンジェンシーの変動を含む。別の態様では、ポジティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）、ネガティブ選択／スクリーニング段階（ｃ）又はポジティブ及びネガティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）及び（ｃ）の両方はレポーターの使用を含み、レポーターは蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）により検出されるか又はレポーターは発光により検出される。場合により、レポーターは細胞表面、ファージディスプレイ等に提示され、非天然アミノ酸又は類似体に対する親和性又は触媒活性に基づいて選択される。１態様では、突然変異シンテーゼは細胞表面、ファージディスプレイ等に提示される。
【００４３】
本明細書に記載する方法は場合により非天然アミノ酸がＯ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、及びイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニンから選択される態様を含む。本明細書に記載する方法により生産された組換えＯ−ＲＳも本発明に含まれる。
【００４４】
組換え直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の生産方法は、（ａ）第１の生物に由来する少なくとも１種のｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）から誘導される突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーを作製する段階と、（ｂ）第１の生物に由来するＲＳの不在下に第２の生物に由来するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される（場合により突然変異体）ｔＲＮＡのライブラリーを選択（例えばネガティブ選択）又はスクリーニングすることによりｔＲＮＡ（場合により突然変異体）のプールを提供する段階と、（ｃ）導入した直交ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーをｔＲＮＡ（場合により突然変異体）のプールから選択又はスクリーニングすることにより、少なくとも１個のセレクターコドンを認識し、第２の生物に由来するＲＳにより効率的に認識されず、Ｏ−ＲＳにより優先的にアミノアシル化される少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡを提供する段階を含む。所定態様では、少なくとも１種のｔＲＮＡはサプレッサーｔＲＮＡであり、及び／又は天然もしくは非天然塩基のユニーク３塩基コドン、ナンセンスコドン、レアコドン、非天然コドン、少なくとも４塩基を含むコドン、アンバーコドン、オーカーコドン又はオパール終止コドンを含む。１態様では、組換えＯ−ｔＲＮＡは改善された直交性をもつ。当然のことながら、所定態様ではＯ−ｔＲＮＡは場合により改変の必要なしに第１の生物から第２の生物に導入される。各種態様において、第１の生物と第２の生物は同一又は異なり、場合により原核生物（例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ等）、真核生物、哺乳動物、真菌、酵母、始原菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物等から選択される。更に、組換えｔＲＮＡは場合により非天然アミノ酸によりアミノアシル化され、非天然アミノ酸は天然又は遺伝子操作によりｉｎｖｉｖｏ生合成される。非天然アミノ酸は場合により少なくとも第１又は第２の生物の増殖培地に添加する。
【００４５】
１側面では、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによりアミノアシル化される（場合により突然変異体）ｔＲＮＡのライブラリーを選択（例えばネガティブ選択）又はスクリーニングする段階（段階（ｂ））は、少なくとも１個のセレクターコドンを含む毒性マーカー遺伝子（又は毒性もしくは静的物質の生産を誘導する遺伝子又は生物に必須の遺伝子であって、少なくとも１個のセレクターコドンを含む遺伝子）と（場合により突然変異体）ｔＲＮＡのライブラリーを第２の生物に由来する複数の細胞に導入し、少なくとも１種の直交ｔＲＮＡ又は非機能的ｔＲＮＡを含む（場合により突然変異体）ｔＲＮＡのプールを含む生存細胞を選択することを含む。例えば、生存細胞は比較比細胞密度アッセイを使用することにより選択することができる。
【００４６】
別の側面では、毒性マーカー遺伝子は２個以上のセレクターコドンを含むことができる。前記方法の別の態様では、毒性マーカー遺伝子はリボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子であり、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子は少なくとも１種のアンバーコドンを含む。場合により、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子は２種以上のアンバーコドンを含むことができる。
【００４７】
１態様では、導入した直交ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーを（場合により突然変異体）ｔＲＮＡのプールから選択又はスクリーニングする段階は、薬剤耐性遺伝子（例えば少なくとも１個のセレクターコドン（例えば少なくとも１個のアンバーコドン）を含むβラクタマーゼ遺伝子）又は生物に必須の遺伝子又は毒性物質の解毒を誘導する遺伝子を含むポジティブ選択又はスクリーニングマーカー遺伝子と、Ｏ−ＲＳと、（場合により突然変異体）ｔＲＮＡのプールを第２の生物に由来する複数の細胞に導入し、選択又はスクリーニング物質（例えば抗生物質）の存在下に増殖した生存又はスクリーニング済み細胞を同定することにより、Ｏ−ＲＳによりアミノアシル化され、少なくとも１個のセレクターコドンに応答してポジティブマーカー遺伝子によりコードされる翻訳産物にアミノ酸を挿入する少なくとも１種の組換えｔＲＮＡをもつ細胞プールを提供することを含む。別の態様では、選択及び／又はスクリーニング物質濃度を変動させる。本発明の方法により生産された組換えＯ−ｔＲＮＡも本発明に含まれる。
【００４８】
特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の生産方法も提供する。本方法は、（ａ）第１の生物に由来する少なくとも１種のｔＲＮＡから誘導されるｔＲＮＡのライブラリーを作製する段階と、（ｂ）第１の生物に由来するＲＳの不在下で第２の生物に由来するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される（場合により突然変異体）ｔＲＮＡのライブラリーをネガティブ選択又はスクリーニングすることにより、（場合により突然変異体）ｔＲＮＡのプールを提供する段階と、（ｃ）導入した直交ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーを（場合により突然変異体）ｔＲＮＡのプールから選択又はスクリーニングすることにより、少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡを提供する段階を含む。少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、第２の生物に由来するＲＳにより効率的に認識されず、Ｏ−ＲＳにより優先的にアミノアシル化される。本方法は更に、（ｄ）第３の生物に由来する少なくとも１種のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）から誘導される（場合により突然変異体）ＲＳのライブラリーを作製する段階と、（ｅ）非天然アミノ酸と天然アミノ酸の存在下に少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するメンバーを突然変異体ＲＳのライブラリーから選択又はスクリーニングすることにより、活性（場合により突然変異体）ＲＳのプールを提供する段階と、（ｆ）非天然アミノ酸の不在下に少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性（場合により突然変異体）ＲＳのプールをネガティブ選択又はスクリーニングすることにより、非天然アミノ酸に特異的な少なくとも１種の組換えＯ−ＲＳと少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡを含む少なくとも１種の特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を提供する段階を含む。前記方法により生産された特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対も本発明に含まれる。例えば、特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対としては、例えばｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ｍｕｔＴｙｒＲＳ対（例えばｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ＳＳ１２ＴｙｒＲＳ対）、ｍｕｔＲＮＡＬｅｕ−ｍｕｔＬｅｕＲＳ対、ｍｕｔＲＮＡＴｈｒ−ｍｕｔＴｈｒＲＳ対、ｍｕｔＲＮＡＧｌｕ−ｍｕｔＧｌｕＲＳ対等を挙げることができる。更に、前記方法は第１の生物と第３の生物が同一である（例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）場合を含む。
【００４９】
第２の生物のｉｎ ｖｉｖｏ翻訳系で使用するための直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対の選択方法も本発明に含まれる。本方法はマーカー遺伝子と、ｔＲＮＡと、第１の生物から単離又は誘導されるアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）を第２の生物に由来する第１組の細胞に導入する段階と、マーカー遺伝子とｔＲＮＡを第２の生物に由来する複製組の細胞に導入する段階と、第１組と複製組の細胞を選択又はスクリーニング物質の存在下に増殖させ、第１組では生存するが、複製組では生存することができない細胞を選択するか、又は第１組では特異的スクリーニング応答を示すが、複製組では特異的スクリーニング応答を示すことができない細胞を選択し、第２の生物のｉｎｖｉｖｏ翻訳系で使用するための直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対を含む生存又はスクリーニング済み細胞を提供する段階を含む。１態様では、比較と選択又はスクリーニングはｉｎｖｉｖｏ相補アッセイを含む。選択又はスクリーニング物質濃度を変動させてもよい。
【００５０】
本発明の生物は多様な生物と多様な組合せを含む。例えば、本発明の方法の第１の生物と第２の生物は同一でも異なっていてもよい。１態様では第１の生物は場合により原核生物（例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａ．ｐｅｒｎｉｘ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等）である。あるいは、第１の生物は場合により例えば植物（例えば単子葉植物又は双子葉植物等の複雑な植物）、藻類、原生生物、真菌類（例えば酵母等）、動物（例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等）等の真核生物でもよい。別の態様では、第２の生物はＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａ．ｐｅｒｎｉｘ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等の原核生物である。あるいは、第２の生物は例えば酵母、動物細胞、植物細胞、真菌、哺乳動物等の真核生物でもよい。各種態様において、第１の生物と第２の生物は異なる。
【００５１】
本発明の（上記）各種方法は場合により選択又はスクリーニングが１種以上のポジティブ又はネガティブ選択又はスクリーニング（例えばアミノ酸透過性の変化、翻訳効率の変化及び翻訳忠実度の変化）を含む態様を含む。更に、１種以上の変化は場合によりタンパク質を生産するために直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対を使用する生物における１個以上の遺伝子の突然変異に基づく。本発明の選択及び／又はスクリーニングは場合により１種以上の選択遺伝子内又は１種以上のスクリーニング遺伝子内で少なくとも２個のセレクターコドンを使用する態様を含む。このような多重セレクターコドンは場合により同一遺伝子内又は異なるスクリーニング／選択遺伝子内に含まれる。更に、場合により使用する多重セレクターコドンは場合により異なるセレクターコドンであるか、又は同一型のセレクターコドンを含む。
【００５２】
本発明の付加特徴はキットである。例えば、キットは１種以上の上記翻訳系（例えば細胞）と、１種以上の非天然アミノ酸と、例えば適当なパッケージング材料と、キットの成分を保持するための容器と、本発明の方法を実施するための説明書及び／又は他の成分を含むことができる。同様に、例えばキットの成分を保持するための容器と、本発明の方法を実施するための説明書及び／又は他の成分を含むキットの形態で翻訳系の生産物（例えば非天然アミノ酸を含むＥＰＯ類似体等のタンパク質）を提供することもできる。
【００５３】
図１は、非天然アミノ酸の部位特異的ｉｎ ｖｉｖｏタンパク質組込みを模式的に示す。直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは直交ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化する。アシル化された直交ｔＲＮＡは所期タンパク質をコードする遺伝子に導入されたセレクターコドン（例えばユニークコドン）により指定される位置に非天然アミノ酸を挿入する。
【００５４】
図２Ａ及びＢは、非天然アミノ酸でアミノアシル化する活性シンテターゼの選択方法の例を模式的に示す。図２Ａは非天然アミノ酸特異性をもつアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの選択／スクリーニングの概要を示す。ポジティブ選択では、天然又は非天然アミノ酸特異性をもつ活性シンテターゼを同定し、ネガティブ選択では、天然アミノ酸特異性をもつシンテターゼを排除する。直交ｔＲＮＡに非天然アミノ酸を負荷するシンテターゼのみが選択／スクリーニング後に生存することができる。図２ＢはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するシンテターゼの選択／スクリーニングの１態様を模式的に示す。例えば、直交サプレッサーｔＲＮＡを含むベクターと突然変異ＲＳのライブラリーのメンバーとセレクターコドン（例えばアンバーコドン）をもつポジティブ選択マーカー（例えばβラクタマーゼ）を含む発現ベクターを生物に導入し、選択物質（例えばアンピシリン）の存在下に増殖させる。ポジティブ選択マーカーが発現すると、細胞は選択物質中で生存することができる。生存細胞は天然又は非天然アミノ酸（ａａ）をＯ−ｔＲＮＡに負荷することが可能なシンテターゼをコードする。発現ベクターの第２の株と、１個以上のセレクターコドン（例えばＴＡＧ）をもち、発現すると細胞を死滅させるネガティブ選択マーカー（例えばバルナーゼ等の毒性遺伝子）を含む発現ベクターに活性シンテターゼを形質転換する。細胞を非天然アミノ酸の不在下に増殖させる。所与シンテターゼがＯ−ｔＲＮＡを天然アミノ酸でアミノアシル化するならば、ネガティブ選択マーカーが発現され、細胞は死滅する。シンテターゼがＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するならば、非天然アミノ酸は存在せず、細胞は生存するのでネガティブ選択マーカーは発現されない。こうして、所望非天然コドンでＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する少なくとも１種の直交シンテターゼが得られる。
【００５５】
図３は、チロシン類似体の特異的ライブラリーを作製するための部位特異的突然変異を示す。
【００５６】
図４は、前記類似体の特異的ライブラリーを作製するためのペンタフルオロフェニルアラニン選択用コンセンサス配列を示す。
【００５７】
図５は、１種の生物（例えば大腸菌）に由来する１個のドメイン（例えばＣＰＩドメイン）を他の生物のシンテターゼ（例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳ）に移植する方法を模式的に示す。
【００５８】
図６は、キメラＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ／大腸菌シンテターゼの構築を模式的に示す。
【００５９】
図７は、キメラシンテターゼ（例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ／大腸菌シンテターゼ）のライブラリーの作製を模式的に示す。
【００６０】
図８は、内在シンテターゼ（例えば大腸菌シンテターゼ）の弱い基質であり、効率的に所期コグネイトシンテターゼにより負荷されるサプレッサーｔＲＮＡの選択の１例を模式的に示す。突然変異ｔＲＮＡライブラリーのメンバーを含む発現ベクターと、１個以上のセレクターコドンをもつネガティブ選択マーカー（例えばバルナーゼ等の毒性遺伝子）を含む別のベクターを生物の細胞に導入する。ネガティブ選択の生存細胞は生物に直交性であるか又は非機能的な突然変異ｔＲＮＡをコードする。生存細胞からのベクターを単離し、セレクターコドンを含むポジティブ選択マーカー（例えばβラクタマーゼ遺伝子）と共に他の細胞に形質転換する。選択物質（例えばアンピシリン）とｔＲＮＡと同一起源の生物（例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）に由来するＲＳの存在下に細胞を増殖させる。この選択の生存細胞は細胞のシンテターゼ（例えば大腸菌シンテターゼ）に直交性であり、ｔＲＮＡと同一起源に由来するＲＳによりアミノアシル化される突然変異体ｔＲＮＡをコードする。
【００６１】
図９Ａ及びＢは突然変異アンチコドンループｔＲＮＡライブラリーを模式的に示す。図９Ａは突然変異全ループライブラリーを示し、図９ＢはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ｔＲＮＡTyrCUAのライブラリーを示す。ランダム突然変異ヌクレオチド（Ｎ）を白抜きで示す。
【００６２】
図１０は、水素結合以外の力により対合する非天然塩基対（ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ，３ＭＮ：３ＭＮ，７ＡＩ：７ＡＩ，Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙ）の構造の例を模式的に示す。
【００６３】
図１１は、サプレッサーｔＲＮＡのネガティブ選択法の結果のグラフであり、所定時間における３種の構築物のうちの１種を含む生存細胞の百分率を示し、ベクター（例えばプラスミドｐＳＣＢ２）により導入したバルナーゼ遺伝子中の２個のアンバーの抑圧に基づいて決定した。このプラスミドは２個のアンバーコドンを含むバルナーゼ遺伝子をコードする。ＧＭＭＬ液体培地で選択を行い、２０ｍＭアラビノースを使用してバルナーゼ発現を誘導する。３種の構築物は以下の通りである。（１）○はサプレッサーｔＲＮＡを含まない対照プラスミドを示す。（２）△はプラスミドｐＡＣ−ＹＹＧ１上のサプレッサーｔＲＮＡを示す。（３）□はプラスミドｐＡＣ−ＪＹ上のサプレッサーｔＲＮＡを示す。
【００６４】
図１２は、βラクタマーゼ遺伝子中のアンバーコドンの抑圧に基づくポジティブ選択を示す増殖ヒストグラム。サプレッサーｔＲＮＡをコードするベクター（例えばｐＡＣプラスミド）とシンテターゼをコードするベクター（例えばｐＢＬＡＭ−ＪＹＲＳ）を生物（例えば大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞）に同時形質転換する。各種濃度（０、１００及び５００μｇ／ｍｌ）のアンピシリンを加えた液体２×ＹＴ培地でシンテターゼと各種ｐＡＣプラスミドを含む細胞を増殖させた結果をＡに示し、図中、ｐＡＣはサプレッサーｔＲＮＡを含まない対照プラスミドであり、ｐＡＣ−ＹＹＧ１はサプレッサーｔＲＮＡを含むプラスミドであり、ｐＡＣ−ＪＹはサプレッサーｔＲＮＡを含むプラスミドである。Ｂは５００μｇ／ｍｌアンピシリンを加えた２×ＹＴ寒天プレートを使用した同一構築物のポジティブ選択を示す。３種の構築物は以下の通りである。（１）○はサプレッサーｔＲＮＡを含まない対照プラスミドを示す。（２）△はプラスミドｐＡＣ−ＹＹＧ１上のサプレッサーｔＲＮＡを示す。（３）□はプラスミドｐＡＣ−ＪＹ上のサプレッサーｔＲＮＡを示す。
【００６５】
図１３は、アンチコドンループ及び全ループライブラリーから選択した突然変異体サプレッサーｔＲＮＡのＤＮＡ配列を示す。ＪＹは野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒＣＵＡを表す。
【００６６】
図１４は、ＴｙｒＲＳの活性部位の立体図を模式的に示す。Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＴｙｒＲＳに由来する残基を示す。Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳからの対応する残基はＴｙｒ32（Ｔｙｒ34）、Ｇｌｕ107（Ａｓｎ123 ）、Ａｓｐ158 （Ａｓｐ176 ）、Ｉｌｅ159 （Ｐｈｅ177）及びＬｅｕ162 （Ｌｅｕ180 ）である（括弧内はＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＴｙｒＲＳ残基を表す）。
【００６７】
図１５は、ＴｙｒＲＳの活性部位を模式的に示す。Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＴｙｒＲＳに由来する残基も示す。Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳからの対応する残基はＴｙｒ32（Ｔｙｒ34）、Ａｓｐ158（Ａｓｐ176 ）、Ｉｌｅ159 （Ｐｈｅ177 ）、Ｌｅｕ162 （Ｌｅｕ180）及びＡｌａ167 （Ｇｌｎ189 ）である（括弧内はＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＴｙｒＲＳ残基を表す）。
【００６８】
図１６Ａ及びＢは、本発明の成分（例えば直交シンテターゼ）を作製するために使用したＦＡＣＳ選択及びスクリーニング法の１例を模式的に示す。図１６Ａは直交シンテターゼライブラリーとＯ−ｔＲＮＡの発現ベクター（ライブラリープラスミド）と、１個以上のセレクターコドン（例えばＴＡＧ）を含むＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／ＧＦＰレポーター系（レポータープラスミド）のベクター（例えばプラスミド）を模式的に示す。図１６Ｂはポジティブ選択／ネガティブスクリーニングスキームを模式的に示し、非天然アミノ酸の存在下と不在下及び選択物質の存在下と不在下で細胞を増殖させ、スクリーニング過程で蛍光細胞は非蛍光細胞をスクリーニングし、「＋」と〇が夫々蛍光細胞と非蛍光細胞に対応する。
【００６９】
図１７Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、増幅性蛍光レポーター系を示す。図１７Ａはスクリーニングに使用することができるベクター（例えばｐＲＥＰ等のプラスミド）を模式的に示し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ転写はａｒａプロモーターにより制御され、タンパク質発現は遺伝子内の各種位置のアンバーコドンの抑圧に依存する。レポーター発現（例えばＧＦＰｕｖ発現）はＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより制御される。レポーターベクター（例えばプラスミドｐＲＥＰ）は直交シンテターゼ／ｔＲＮＡ対の発現用ベクター（例えばＣｏｌＥ１プラスミド）との併用に適合可能である。図１７ＢはｐＲＥＰ（１〜１２）内のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子構築物の組成と蛍光増加を示す。構築物番号を各構築物の左側に示す。蛍光増加は各構築物の右側に示し、ｐＲＥＰ（１〜１２）とｐＱ又はｐＱＤを含む細胞の蛍光をフルオロメトリーにより測定し、細胞濃度補正比として計算した。遺伝子内のアンバー突然変異の位置を示す。図１７ＣはｐＲＥＰ（１０）とｐＱＤ（上段）又はｐＱ（下段）を含む細胞のサイトメトリー分析を示す。図１７ＤはｐＲＥＰ（１０）を含み、各種大腸菌サプレッサーｔＲＮＡを発現する細胞のフルオロメトリー分析を示す。「なし」は細胞がサプレッサーｔＲＮＡを含まないことを示す。
【００７０】
図１８は、表面エピトープへの非天然アミノ酸の組込みのファージ選択を模式的に示す。例えば、突然変異体シンテターゼライブラリーを導入した大腸菌に、表面タンパク質をコードする遺伝子に終止コドンをもつファージを感染させる。活性シンテターゼを含むファージはファージ表面に非天然アミノ酸を提示し、固定化モノクローナル抗体により選択される。
【００７１】
図１９は、非天然アミノ酸特異性をもつ提示されたシンテターゼ（例えばファージに提示されたシンテターゼ）をスクリーニングするために使用する分子（例えばアミノアシルアデニル酸中間体の固定化アミノアルキルアデニル酸類似体）の１例を模式的に示す。
【００７２】
図２０は、各種生物に由来する各種直交対のアンピシリン耐性を示すグラフ。本図はセレクターコドン（例えばアンバーコドン）を含むレポーター遺伝子（例えばβラクタマーゼ遺伝子）と（セレクターアンチコドンを含む）サプレッサーｔＲＮＡを各々含むレポーター構築物を使用した直交対の検出例を示し、サプレッサーｔＲＮＡは各種生物（例えばＡ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ、ＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＮＲＣ−１、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ及びＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）に由来することができる。レポーター構築物と各種生物（例えばＭ．ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａ．ｐｅｒｎｉｘ、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＲＣ−１及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からクローニングしたシンテターゼを細胞に形質転換する。各種濃度の選択物質（例えばアンピシリン）中で細胞を増殖させる。例えばｉｎｖｉｖｏ相補アッセイを使用して直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対をもつ細胞を選択する。本図から明らかなように、２種の系が大腸菌シンテターゼで観察されるよりも有意に高い抑圧レベルを示した。それらはＭ．ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍとＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉである。
【００７３】
図２１Ａ及びＢは、ロイシルｔＲＮＡのアンチコドンループを突然変異（例えばランダム突然変異）させ、例えば選択段階の組合せ（例えばβラクタマーゼに基づく選択とバルナーゼに基づく選択）を使用してセレクターコドン（例えばレポーター遺伝子中のアンバーコドン）のより効率的な抑圧について選択（図２１Ｂ）することにより作製したＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＮＲＣ−１由来突然変異アンバーサプレッサーｔＲＮＡを示す。図２１Ｂは元のアンバー突然変異体、最適化アンチコドンループ及び最適化アクセプターステムの３種の突然変異体ｔＲＮＡ構築物を単独又はＲＳ（例えばＭｔＬＲＳ）と併用した場合のβラクタマーゼアンバー抑圧系のＩＣ５０値（μｇ／ｍｌアンピシリン）を示す。最適化アンチコドンと最適化アクセプターステムはβラクタマーゼ選択段階で最高値を示した。
【００７４】
図２２は、基本コドンのｔＲＮＡサプレッサーを示す。本図に示すｔＲＮＡサプレッサーはＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＮＲＣ−１ ＴＴＧ ｔＲＮＡに由来するライブラリーから単離し、アンチコドンループの８ヌクレオチドランダムを突然変異させ、Ａ１８４部位にＡＧＧＡコドンをもつβラクタマーゼ遺伝子を含むレポーター構築物を用いてアンピシリン選択した。
【００７５】
図２３Ａ〜Ｄは、成功した各進化実験からの優性シンテターゼ変異体の活性を示す。図２３ＡはｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡと指定シンテターゼ変異体を含む細胞を対応する非天然アミノ酸の存在下（＋）又は不在下（−）で増殖させ、長波長紫外線を照射した場合の写真である。図２３ＢはｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡと指定シンテターゼ変異体を含む細胞を対応する非天然アミノ酸の存在下（左）又は不在下（右）で増殖させた場合のフルオロメトリー分析を示す。図２３ＣはｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡと指定シンテターゼ変異体を含む細胞を対応する非天然アミノ酸の存在下又は不在下で増殖させた場合のＣｍＩＣ50分析を示す表である。図２３ＤはｐＢＡＤ／ＪＹＡＭＢ−４ＴＡＧと指定シンテターゼ変異体を含む細胞を対応する非天然アミノ酸の存在下（＋）又は不在下（−）で増殖させた場合のタンパク質発現分析を示す。
【００７６】
図２４は、ネガティブＦＡＣＳスクリーニング（ＯＡＹ−ＲＳ（１，３，５））又はネガティブバルナーゼ選択（ＯＡＹ−ＲＳ（Ｂ））を使用して得られたＯＡＳ−ＲＳ変異体の活性比較を示す。ｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡと指定シンテターゼ変異体を含む細胞を対応する非天然アミノ酸の存在下（立体棒、左）又は不在下（立体棒、右）で増殖させ、フルオロメトリー分析した。非天然アミノ酸の不在下に対して存在下で増殖させた細胞の蛍光の細胞濃度補正比として蛍光増加（背後棒）を計算した。
【００７７】
図２５Ａ〜Ｂは、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳの進化を誘導するための多目的レポータープラスミド系の成分を示す。図２５ＡはプラスミドｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡを示す。プラスミドｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡはプラスミドｐＢＫ及び変異体との併用に適合可能である。図２５ＢはＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉＴｙｒＲＳの進化のターゲットとして使用した非天然アミノ酸の構造を示す。
【００７８】
図２６は、プラスミドｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡを使用してアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを進化させるためのストラテジーを示す。蛍光及び非蛍光細胞を夫々黒とグレーで示す。
【００７９】
図２７は、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するスレオニルｔＲＮＡシンテターゼを示す。
【００８０】
図２８は、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ直交スレオニルｔＲＮＡ／ＲＳのための直交ｔＲＮＡの作製を示す。
【００８１】
図２９は、本発明で利用される典型的非天然アミノ酸を示す。
【００８２】
図３０は、本発明で利用される典型的非天然アミノ酸を示す。
【００８３】
図３１は、本発明で利用される典型的非天然アミノ酸を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８４】
序文
【００８５】
タンパク質は光合成や視覚からシグナル伝達や免疫応答までのほぼ全生物プロセスの岐路に位置する。これらの複雑な機能は規定一次配列に配置された比較的単純な２０個の構成単位から構成されるポリアミド系ポリマーから得られる。
【００８６】
本発明は非天然アミノ酸をタンパク質に部位特異的に直接ｉｎ ｖｉｖｏ組込むのに使用する方法と組成物を含む。重要な点は、非天然アミノ酸を２０種の共通アミノ酸の１種に置換するのでなく遺伝子レパートリーに加えるという点である。本発明は非天然アミノ酸をタンパク質に組込むために生合成機構により使用される成分の作製方法、同定方法及びこれらの成分を含む組成物を提供する。本発明は例えば（ｉ）任意タンパク質の任意所望位置に１種以上の非天然アミノ酸を部位選択的に挿入することができ、（ｉｉ）原核細胞と真核細胞のいずれにも適用可能であり、（ｉｉｉ）大量の精製突然変異体タンパク質の作製に加えて突然変異体タンパク質のｉｎｖｉｖｏ試験が可能であり、（ｉｖ）多様な非天然アミノ酸の任意のものをタンパク質にｉｎ ｖｉｖｏ組込むように応用できる。従って、１つの特定ポリペプチド配列に非天然アミノ酸の多数の異なる部位選択的挿入が可能である。このような挿入は場合により全てが同一型である（例えばポリペプチドの多重点に同一種の複数の非天然アミノ酸を挿入する）か、又は場合により多様な型である（例えばポリペプチドの多重点に異なる非天然アミノ酸種を挿入する）。
【００８７】
定義
【００８８】
本発明を詳細に説明する前に、本発明は特定組成物又は生物系に限定されず、当然のことながら種々に適用できることを理解すべきである。また、本明細書で使用する用語は特定態様のみの説明を目的としており、限定的ではないことも理解すべきである。本明細書と特許請求の範囲に使用する単数形は明示しない限り複数形も含む。従って、例えば「分子」と言う場合には場合により２個以上のこのような分子の組合せ等も含む。
【００８９】
特に記載しない限り、全科学技術用語は本発明が属する分野で通常使用されていると同一の意味をもつものとする。本発明の趣旨では、以下の用語は次のように定義される。
【００９０】
本明細書においてタンパク質及び／又はタンパク質配列は共通の祖先タンパク質又はタンパク質配列から天然又は人工的に誘導される場合に「相同」である。同様に、核酸及び／又は核酸配列は共通の祖先核酸又は核酸配列から天然又は人工的に誘導される場合に相同である。例えば、入手可能な任意突然変異誘発法により任意天然核酸を改変し、１個以上のセレクターコドンを加えることができる。この突然変異誘発した核酸は発現されると、１種以上の非天然アミノ酸を含むポリペプチドをコードする。突然変異法は当然のことながら更に１個以上の標準コドンを変異させ、得られる突然変異体タンパク質の１個以上の標準アミノ酸も変異させることができる。相同性は一般に２種以上の核酸又はタンパク質（又はその配列）間の配列類似度から推定される。相同性の判定に有用な配列間類似度の厳密な百分率は該当核酸及びタンパク質により異なるが、通常は２５％程度の低い配列類似度を使用して相同性を判定する。もっと高いレベルの配列類似度、例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％以上を使用して相同性を判定することもできる。配列類似度百分率の決定方法（例えばデフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＩＮ）は本明細書に記載し、一般に入手可能である。
【００９１】
「優先的にアミノアシル化する」なる用語はＯ−ＲＳが非天然アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率が天然ｔＲＮＡ又はＯ−ｔＲＮＡを作製するために使用する出発材料に比較して例えば約７０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９９％以上であることを意味する。その後、非天然アミノ酸は高い忠実度で成長中のポリペプチド鎖に組込まれ、例えば所与セレクターコドンで約７５％以上、所与セレクターコドンで約８０％以上、所与セレクターコドンで約９０％以上、所与セレクターコドンで約９５％以上、又は所与セレクターコドンで９９％以上の効率である。
【００９２】
「セレクターコドン」なる用語は翻訳プロセスでＯ−ｔＲＮＡにより認識されるが、内在ｔＲＮＡにより認識されないコドンを意味する。Ｏ−ｔＲＮＡアンチコドンループはｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、そのアミノ酸（例えば非天然アミノ酸）をポリペプチド内のこの部位に組込む。セレクターコドンとしては例えばナンセンスコドン（例えばアンバー、オーカー及びオパールコドン等の終止コドン）、４塩基以上のコドン、天然又は非天然塩基対から誘導されるコドン等を挙げることができる。所与系ではセレクターコドンは更に天然３塩基コドンの１種を含むことができ、内在系は前記天然３塩基コドンを使用せず、このような系としては例えば天然３塩基コドンを認識するｔＲＮＡを欠失する系や、天然３塩基コドンがレアコドンである系が挙げられる。
【００９３】
本明細書において「直交」なる用語は所期系（例えば翻訳系、例えば細胞）により低効率で使用される分子（例えば直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及び／又は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ））を意味する。直交とは直交ｔＲＮＡ及び／又は直交ＲＳが所期翻訳系で機能できないか又は効率が低く、例えば２０％未満、１０％未満、５％未満、又は例えば１％未満であることを意味する。例えば、直交ｔＲＮＡが所期翻訳系で所期翻訳系の任意内在ＲＳをアミノアシル化する効率は内在ＲＳによる内在ｔＲＮＡのアミノアシル化に比較して低下するか又はゼロである。別の例では、直交ＲＳが所期翻訳系で任意内在ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率は内在ＲＳによる内在ｔＲＮＡのアミノアシル化に比較して低下するか又はゼロである。「直交性の改善」とは出発材料又は天然ｔＲＮＡもしくはＲＳに比較して直交性が増していることを意味する。
【００９４】
「相補的」なる用語は直交対の成分であるＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳが共同して機能できる（例えばＯ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する）ことを意味する。
【００９５】
「から誘導される」なる用語は生物から単離された成分、単離して改変した成分、又は生物からの成分の情報を使用して作製（例えば化学的に合成）された成分を意味する。
【００９６】
「翻訳系」なる用語は成長中のポリペプチド鎖（タンパク質）に天然アミノ酸を組込むために必要な成分を意味する。例えば、成分としてはリボソーム、ｔＲＮＡ、シンテターゼ、ｍＲＮＡ等を挙げることができる。本発明の成分はｉｎｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでも翻訳系に加えることができる。
【００９７】
「不活性ＲＳ」なる用語はそのコグネイトｔＲＮＡをアミノ酸でアミノアシル化できないように突然変異させたシンテターゼを意味する。
【００９８】
「選択物質」なる用語はこのような物質が存在すると、集団から所定成分を選択できる物質（例えば抗生物質、光波長、抗体、栄養素等）を意味する。選択物質は例えば濃度、強度等を変動させることができる。
【００９９】
「ポジティブ選択マーカー」なる用語はこのような物質が存在する（例えば発現、活性化等される）と、ポジティブ選択マーカーをもたない生物からポジティブ選択マーカーをもつ生物を識別するマーカーを意味する。
【０１００】
「ネガティブ選択マーカー」なる用語はこのような物質が存在する（例えば発現、活性化等される）と、（例えば所望特性をもつ生物から）所望特性をもたない生物を識別できるマーカーを意味する。
【０１０１】
「レポーター」なる用語は本発明に記載する成分を選択するために使用することができる成分を意味する。例えば、レポーターとしてはグリーン蛍光タンパク質、ホタルルシフェラーゼタンパク質、β−ｇａｌ／ｌａｃＺ（βガラクトシダーゼ）、Ａｄｈ（アルコールデヒドロゲナーゼ）等の遺伝子等を挙げることができる。
【０１０２】
「効率的に認識されない」なる用語はある生物からのＲＳがＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率が例えば約１０％未満、約５％未満、又は約１％未満であることを意味する。
【０１０３】
「真核生物」なる用語は系統発生分類の真核生物に属する生物を意味し、例えば動物（例えば哺乳動物、昆虫、爬虫類、鳥類等）、繊毛虫、植物、真菌類（例えば酵母等）、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物等である。更に、「原核生物」なる用語は系統発生分類の真正細菌（例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等）と始原菌（例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａ， ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａ．ｐｅｒｎｉｘ等）に属する非真核生物を意味する。
【０１０４】
「サプレッサーｔＲＮＡ」は所与翻訳系でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の読取りを改変するｔＲＮＡである。サプレッサーｔＲＮＡは例えば終止コドン、４塩基コドン又はレアコドンを介して読み取ることができる。
【０１０５】
詳細な説明
【０１０６】
本発明は非天然アミノ酸をタンパク質にｉｎ ｖｉｖｏ組込むための生合成翻訳機構の新規成分のための方法と組成物に関する。具体的には、直交ｔＲＮＡと、直交ＲＳと、直交ｔＲＮＡ／直交ＲＳ対を含む組成物と作製方法が提供される。これらの成分は、宿主細胞に導入すると、非天然アミノ酸を所期ポリペプチド（タンパク質）にｉｎｖｉｖｏ組込むために細胞の翻訳系で使用することができる。例えば、こうして部位特異的非天然アミノ酸突然変異誘発、又は場合によりランダム非天然アミノ酸突然変異誘発を行うことができる。直交ｔＲＮＡはセレクターコドンに応答して非天然アミノ酸を送達し、直交シンテターゼは直交ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。Ｏ−ＲＳは直交ｔＲＮＡを２０種の共通アミノ酸で効率的にアミノアシル化しない。直交対の作製及び同定方法も提供する。
【０１０７】
非天然アミノ酸の部位特異的ｉｎ ｖｉｖｏタンパク質組込みを図１に示す。セレクターコドン（例えばユニークコドン）を所期遺伝子に導入する。遺伝子はｍＲＮＡに転写され、リボソームで通常の翻訳が開始する。内在シンテターゼはＡＴＰの存在下に内在ｔＲＮＡを天然アミノ酸（ａａ）でアミノアシル化する。直交ｔＲＮＡはＡＴＰの存在下に直交シンテターゼにより非天然アミノ酸で酵素的にアミノアシル化される。リボソームがセレクターコドンにぶつかると、セレクターアンチコドン（例えばユニークアンチコドン）を含むように改変された直交ｔＲＮＡは非天然アミノ酸として突然変異をデコードすることができ、非天然アミノ酸を組込んだ全長産物まで翻訳が進行する。
【０１０８】
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、Ｏ−ＲＳ
【０１０９】
非天然アミノ酸を特異的にｉｎ ｖｉｖｏ組込むためには、２０種の共通アミノ酸ではなく所望非天然アミノ酸のみをｔＲＮＡに負荷するようにシンテターゼの基質特異性を改変する。直交シンテターゼが無差別な場合には、ターゲット位置に天然アミノ酸と非天然アミノ酸の混合物を含む突然変異体タンパク質となる。例えば、ｐ−Ｆ−Ｐｈｅを部位特異的に組込む試みの１つとして、酵母アンバーサプレッサーｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ／フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ対がｐ−Ｆ−Ｐｈｅ耐性Ｐｈｅ栄養要求性大腸菌株で使用された。例えばＲ．Ｆｕｒｔｅｒ，ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ．，７：４１９（１９９８）参照。酵母ＰｈｅＲＳはｐ−Ｆ−Ｐｈｅに対して高い基質特異性をもたないので、増殖培地に過剰のｐ−Ｆ−Ｐｈｅを添加しても突然変異誘発部位はｐ−Ｆ−Ｐｈｅが６４〜７５％で残りはＰｈｅとＬｙｓとして翻訳された。更に、Ｐｈｅコドン位置に７％のｐ−Ｆ−Ｐｈｅが検出され、内在大腸菌ＰｈｅＲＳはＰｈｅ以外にｐ−Ｆ−Ｐｈｅも組込むと考えられた。このアプローチは翻訳忠実度が低いため、一般に他の非天然アミノ酸には適用できない。天然シンテターゼは固有忠実度が高く、非天然アミノ酸は細胞機能に必要ないので、シンテターゼの基質特異性を改変することは困難であると予想された。本発明はこの問題を解決し、非天然アミノ酸等の基質特異性を改変したシンテターゼの組成物とその作製方法を提供する。本発明の成分を使用すると、非天然アミノ酸の組込み効率は約７５％以上、約８５％以上、約９５％以上、又は約９９％以上となる。
【０１１０】
本発明の組成物は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み、Ｏ−ＲＳは場合によりｉｎｖｉｖｏにおいて直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。１態様において、Ｏ−ＲＳは配列番号４〜３４（表５参照）及びその相補的ポリヌクレオチド配列から構成される群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む核酸を含む。別の態様において、Ｏ−ＲＳは天然アミノ酸（例えば２０種の公知アミノ酸の１種）よりも非天然アミノ酸に対して改善又は強化された酵素特性をもち、例えばＫmが低い、ｋcat が高い、ｋcat ／Ｋm が高い等である。典型的Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ分子の配列は実施例１０に記載する。
【０１１１】
Ｏ−ＲＳの生産方法は野生型シンテターゼの骨格から突然変異体シンテターゼのプールを作製した後、２０種の共通アミノ酸に比較した非天然アミノ酸に対する特異性に基づいて突然変異ＲＳを選択することを基本とする。このようなシンテターゼを単離するために、本発明の選択方法は（ｉ）１回目の選択からの所期シンテターゼの活性を低くすることができ、集団を小さくできるので高感度であり、（ｉｉ）各回の選択で選択ストリンジェンシーを変えることが望ましいので「調節可能」であり、（ｉｉｉ）汎用性であるため、種々の非天然アミノ酸に使用できる。
【０１１２】
本発明は例えばシンテターゼの活性部位、シンテターゼの編集メカニズム部位、シンテターゼの種々のドメインを組み合わせることにより種々の部位等でシンテターゼを突然変異させ、選択法を適用することにより直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを作製するための方法を提供する。図２Ａはポジティブ選択後にネガティブ選択を行う組合せに基づくｉｎｖｉｖｏ選択／スクリーニングストラテジーを模式的に示す。ポジティブ選択では、ポジティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンを抑圧し、ポジティブ選択圧下に細胞を生存させる。従って、天然及び非天然アミノ酸両者の存在下で生存する細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡに天然又は非天然アミノ酸を負荷する活性シンテターゼをコードする。ネガティブ選択では、ネガティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンを抑圧し、天然アミノ酸特異性をもつシンテターゼを除去する。ネガティブ選択とポジティブ選択後に生存している細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡを非天然アミノ酸のみでアミノアシル化（負荷）するシンテターゼをコードする。その後、これらのシンテターゼを例えばＤＮＡシャフリング又は他の再帰的突然変異誘発法により更に突然変異誘発することができる。当然のことながら、他の態様では、本発明は場合により例えばＯ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ、対等を同定するために段階の順序を変え、ネガティブ選択／スクリーニング後にポジティブ選択／スクリーニングを行うか、又は逆でも任意組合せが可能である。
【０１１３】
例えば、図２Ｂ参照。図２Ｂではセレクターコドン（例えばＴＡＧ）をもつレポーター遺伝子（例えばβラクタマーゼ等の抗生物質耐性遺伝子）にセレクターコドン（例えばアンバーコドン）を配置する。突然変異ＲＳのライブラリーのメンバーを含む発現ベクターにこのレポーター遺伝子を配置する。この発現ベクターと直交ｔＲＮＡ（例えば直交サプレッサーｔＲＮＡ）を含むベクターを細胞に導入し、選択物質（例えばアンピシリン等の抗生物質培地）の存在下に増殖させる。シンテターゼが所定アミノ酸でサプレッサーｔＲＮＡをアミノアシル化（負荷）できる場合のみにセレクターコドンはデコードされ、細胞は抗生物質培地で生存する。
【０１１４】
非天然アミノ酸の存在下にこの選択を適用し、ある程度のアミノアシル化能をもつシンテターゼをコードするシンテターゼ遺伝子を不活性なシンテターゼ遺伝子から選別する。得られるシンテターゼプールは２０種の天然アミノ酸又は非天然アミノ酸を負荷している可能性がある。非天然アミノ酸のみに負荷するシンテターゼを更に選択するために、第２の選択（例えばネガティブ選択）を適用する。この場合には、ネガティブ選択マーカーとＯ−ｔＲＮＡを含む発現ベクターと、突然変異ＲＳライブラリーのメンバーを含む発現ベクターを使用する。このネガティブ選択マーカーは少なくとも１個のセレクターコドン（例えばＴＡＧ）を含む。これらの発現ベクターを別の細胞に導入し、非天然アミノ酸の不在下で場合により選択物質（例えばテトラサイクリン）の存在下に増殖させる。ネガティブ選択では、天然アミノ酸に特異性をもつシンテターゼが直交ｔＲＮＡに負荷するので、ネガティブマーカーのセレクターコドンが抑圧され、細胞死に至る。非天然アミノ酸を加えないので、非天然アミノ酸に特異性をもつシンテターゼは生存する。例えば、セレクターコドン（例えば終止コドン）をレポーター遺伝子（例えばバルナーゼ等の毒性タンパク質をコードする遺伝子）に導入する。シンテターゼが非天然アミノ酸の不在下でサプレッサーｔＲＮＡに負荷することができるならば、細胞は毒性遺伝子産物を翻訳することにより死滅する。両者の選択／スクリーニングを通過する生存細胞は直交ｔＲＮＡに非天然アミノ酸を特異的に負荷するシンテターゼをコードする。
【０１１５】
１態様では、少なくとも１種の組換え直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の生産方法は、（ａ）第１の生物に由来する少なくとも１種のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）から誘導される突然変異体ＲＳのライブラリーを作製する段階と、（ｂ）非天然アミノ酸と天然アミノ酸の存在下に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化するメンバーを突然変異体ＲＳのライブラリーから選択することにより活性突然変異体ＲＳのプールを提供する段階と、（ｃ）非天然アミノ酸の不在下にＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性突然変異体ＲＳのプールをネガティブ選択することにより、Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する少なくとも１種の組換えＯ−ＲＳを提供する段階を含む。場合により、選択されたシンテターゼ遺伝子に突然変異誘発（例えばランダム突然変異誘発、組換え等）により更に突然変異を導入して第２世代シンテターゼライブラリーを作製し、これを使用して所望活性をもつ突然変異体シンテターゼが得られるまで更に選択する。前記方法により生産された組換えＯ−ＲＳも本発明に含まれる。以下に説明するように、本発明の直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対は場合により第１の生物に由来する成分を第２の生物に導入することによっても作製される。
【０１１６】
１態様では、ＲＳは不活性ＲＳである。不活性ＲＳは活性ＲＳを突然変異させることにより作製することができる。例えば、不活性ＲＳは少なくとも約５個のアミノ酸を別のアミノ酸（例えばアラニン）に突然変異させることにより作製することができる。
【０１１７】
突然変異体ＲＳのライブラリーは当分野で公知の種々の突然変異誘発技術を使用して作製することができる。例えば、突然変異体ＲＳは部位特異的突然変異、ランダム点突然変異、ｉｎｖｉｔｒｏ相同組換え、キメラ構築物等により作製することができる。１態様では、シンテターゼの編集部位に突然変異を導入し、編集メカニズムを妨害及び／又は基質特異性を改変させる。例えば図３及び図４参照。図３はチロシン類似体の特異的ライブラリーを作製するための部位特異的突然変異を示す。図４は前記類似体の特異的ライブラリーを作製するためのペンタフルオロフェニルアラニン選択用コンセンサス配列を示す。突然変異体ＲＳのライブラリーはキメラシンテターゼライブラリー（例えばキメラＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ／大腸菌シンテターゼのライブラリー）も含む。あるシンテターゼのドメインに別のシンテターゼからのドメインを付加又は交換することができる。図５は１種の生物（例えば大腸菌）に由来する１個のドメイン（例えばＣＰＩドメイン）を他の生物のシンテターゼ（例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳ）に移植する方法を模式的に示す。ＣＰＩは大腸菌ＴｙｒＲＳからヒトＴｙｒＲＳに移植することができる。例えばＷａｋａｓｕｇｉ，Ｋ．ら，ＥＭＢＯＪ．１７：２９７−３０５（１９９８）参照。図６はキメラＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ／大腸菌シンテターゼの構築を模式的に示し、図７はキメラシンテターゼ（例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ／大腸菌シンテターゼ）のライブラリーの作製を模式的に示す。例えばＳｉｅｂｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９：４５６−４６０（２００１）参照。キメラライブラリーを各種特性についてスクリーニングし、例えば発現されたインフレームのメンバー、所期シンテターゼの活性をもたないメンバー、及び／又は所期シンテターゼの活性を示すメンバーをスクリーニングする。
【０１１８】
１態様では、ポジティブ選択段階は、少なくとも１個のセレクターコドン（例えばアンバーコドン）を含むポジティブ選択マーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子等）と突然変異体ＲＳのライブラリーを複数の細胞に導入し、選択物質の存在下に複数の細胞を増殖させ、ポジティブ選択マーカー中で少なくとも１個のセレクターコドンを抑圧することにより選択物質の存在下に生存する細胞を選択し、活性突然変異体ＲＳのプールを含むポジティブ選択済み細胞のサブセットを提供することを含む。場合により、選択物質濃度を変動させてもよい。
【０１１９】
１態様では、ネガティブ選択段階は、少なくとも１個のセレクターコドンを含むネガティブ選択マーカー（例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子）をポジティブ選択からの活性突然変異体ＲＳのプールと共に第２の生物の複数の細胞に導入し、非天然アミノ酸と選択物質を加えた第１の培地で生存するが、非天然アミノ酸と選択物質を加えない第２の培地では生存することができない細胞を選択することにより、少なくとも１種の組換えＯ−ＲＳをもつ生存細胞を提供することを含む。場合により、選択物質濃度を変動させる。
【０１２０】
上記第１の培地と第２の培地としては例えば直接レプリカプレート法が挙げられる。例えば、ポジティブ選択を通過した後に、アンピシリン又はクロラムフェニコールの存在下で非天然アミノ酸の不在下に細胞を増殖させる。非天然アミノ酸を加えたレプリカプレートから生存しない細胞を単離する。第２のネガティブ選択株への形質転換は不要であり、表現型が分かる。他の潜在的選択マーカーに比較すると、抗生物質耐性に基づくポジティブ選択は抗生物質濃度を変えることにより選択ストリンジェンシーを調節することができ、細胞が生存可能な最高抗生物質濃度をモニターすることにより抑圧効率を比較することができる。更に、増殖法は集積法である。このため所望表現型を迅速に蓄積することができる。
【０１２１】
別の態様では、活性突然変異体ＲＳのプールをネガティブ選択する段階は、ポジティブ選択段階（ｂ）からの活性突然変異体ＲＳのプールを単離し、少なくとも１個のセレクターコドンを含むネガティブ選択マーカー（例えばリボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子等の毒性マーカー遺伝子）と活性突然変異体ＲＳのプールを第２の生物の複数の細胞に導入し、非天然アミノ酸を加えない第１の培地で生存するが、非天然アミノ酸を加えた第２の培地では生存することができない細胞を選択することにより、非天然アミノ酸に特異的な少なくとも１種の組換えＯ−ＲＳをもつ生存細胞を提供することを含む。場合により、ネガティブ選択マーカーは２個以上のセレクターコドンを含む。
【０１２２】
１側面では、ポジティブ選択はポジティブ選択マーカー（例えばＣＡＴ遺伝子内にセレクターコドン（例えばアンバー終止コドン）を含むクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子）の抑圧に基づくので、クロラムフェニコールをポジティブ選択圧として適用することができる。更に、非天然アミノ酸の存在下と不在下で本明細書に記載するようなポジティブマーカーとネガティブマーカーの両者としてＣＡＴ遺伝子を使用することができる。場合により、セレクターコドンを含むＣＡＴ遺伝子をポジティブ選択に使用しネガティブ選択マーカー（例えば、少なくとも１個以上のセレクターコドンを含むバルナーゼ遺伝子等の毒性マーカー）をネガティブ選択に使用する。
【０１２３】
別の側面では、ポジティブ選択は細胞をアンピシリン耐性にするβ−ラクタマーゼ遺伝子の非必須位置におけるセレクターコドンを抑圧に基づき、ネガティブマーカーとしてリボヌクレアーゼバルナーゼを使用するネガティブ選択を使用する。ペリプラズムに分泌されるβラクタマーゼに対して、ＣＡＴは細胞質に局在し、更にアンピシリンは殺菌性であるが、クロラムフェニコールは静菌性である。
【０１２４】
組換えＯ−ＲＳを更に突然変異させ、選択することができる。１態様では、少なくとも１種の組換え直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の生産方法は更に（ｄ）少なくとも１種の組換えＯ−ＲＳを単離する段階と、（ｅ）少なくとも１種の組換えＯ−ＲＳから誘導される第２組の突然変異Ｏ−ＲＳを作製する段階と、（ｆ）Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化することができる突然変異Ｏ−ＲＳが得られるまで段階（ｂ）及び（ｃ）を反復する段階を含むことができる。場合により、段階（ｄ）〜（ｆ）を例えば少なくとも約２回反復する。１側面では、第２組の突然変異Ｏ−ＲＳは突然変異誘発（例えばランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、組換え又はその組合せ）により作製することができる。
【０１２５】
上記方法における選択段階（例えばポジティブ選択段階（ｂ）、ネガティブ選択段階（ｃ）又はポジティブ選択段階（ｂ）とネガティブ選択段階（ｃ）の両者）のストリンジェンシーは場合により選択ストリンジェンシーの変動を含む。例えば、バルナーゼは極毒性タンパク質であるので、バルナーゼ遺伝子に導入するセレクターコドンの数を変えることによりネガティブセレクターのストリンジェンシーを制御することができる。本発明の１側面では、初期選択で所望活性を低くできるのでストリンジェンシーを変動できる。即ち、初期選択には低ストリンジェンシー選択基準を適用し、後期選択にはよりストリンジェントな基準を適用する。
【０１２６】
本発明では例えばＯ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対に他の型の選択も使用できる。例えば、ポジティブ選択段階（ｂ）、ネガティブ選択段階（ｃ）又はポジティブ選択段階（ｂ）とネガティブ選択段階（ｃ）の両者はレポーターを使用することができ、レポーターは蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）により検出される。例えば、ポジティブ選択マーカー（例えばＣＡＴ遺伝子内にセレクターコドン（例えばアンバー終止コドン）を含むクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子）を使用してまずポジティブ選択を行った後にネガティブ選択スクリーニングを行い、ネガティブマーカー（例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子）内の位置でセレクターコドン（例えば２個以上）を抑圧できないものを選択することができる。１態様では、ポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーを同一ベクター（例えばプラスミド）に配置することができる。ネガティブマーカーの発現はレポーター（例えばグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ））の発現を誘導する。選択とスクリーニングのストリンジェンシーは変動させることができ、例えばレポーターを蛍光発光させるために必要な光強度を変動させることができる。別の態様では、ＦＡＣによりスクリーニングされるポジティブ選択マーカーとしてレポーターを使用してポジティブ選択を行った後にネガティブ選択スクリーニングを行い、ネガティブマーカー（例えばバルナーゼ遺伝子）内の位置でセレクターコドン（例えば２個以上）を抑圧できないものを選択することができる。
【０１２７】
場合により、レポーターを細胞表面、ファージディスプレイ等に提示する。細胞表面提示（例えばＯｍｐＡ細胞表面提示系）は大腸菌細胞表面における特定エピトープ（例えば例えば外膜ポリンＯｍｐＡに融合したポリオウイルスＣペプチド）の発現に依存する。エピトープは翻訳中にタンパク質メッセージ中のセレクターコドンが抑圧されるときのみに細胞表面に提示される。従って、提示されるペプチドはライブラリー内の突然変異体アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの１種により認識されるアミノ酸を含み、特定非天然アミノ酸を含むペプチドに対する抗体を用いて対応するシンテターゼ遺伝子を含む細胞を単離することができる。ＯｍｐＡ細胞表面提示系はファージディスプレイの代用としてＧｅｏｒｇｉｏｕらにより開発され、改良された。Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｊ．Ａ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｒ．，Ｉｖｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．＆Ｇｅｏｒｇｏｉｕ，Ｇ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｓｕｒｆａｃｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ Ａ ９０：１０４４４−８（１９９３）参照。
【０１２８】
本発明の他の態様は、選択段階の１段階以上をｉｎ ｖｉｔｒｏで実施することを含む。その後、選択した成分（例えばシンテターゼ及び／又はｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ組込みに使用する細胞に導入することができる。
【０１２９】
直交ｔＲＮＡ
【０１３０】
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の組成物も本発明の特徴であり、例えばＯ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、Ｏ−ｔＲＮＡは直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼにより非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化される。１態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号４〜３４（表５参照）及びその相補的ポリヌクレオチド配列から構成される群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む核酸を含む。
【０１３１】
本発明は組換え直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の生産方法も提供する。例えば、所望ＲＳに対するその親和性を維持しながらｔＲＮＡの直交性を改善するために、本方法は夫々コグネイトシンテターゼの不在下と存在下で突然変異体サプレッサーｔＲＮＡライブラリーを用いたネガティブ選択とポジティブ選択を組合せる。図８参照。ネガティブ選択ではセレクターコドンをマーカー遺伝子（例えばバルナーゼ遺伝子等の毒性遺伝子）の非必須位置に導入する。例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来する突然変異ｔＲＮＡライブラリーのメンバーが内在宿主（例えば大腸菌）シンテターゼによりアミノアシル化される（即ち宿主、例えば大腸菌シンテターゼに非直交性である）場合には、セレクターコドン（例えばアンバーコドン）が抑圧され、毒性遺伝子産物が生産され、細胞死に至る。直交ｔＲＮＡ又は非機能的ｔＲＮＡをもつ細胞は生存する。次に、セレクターコドン（例えばアンバーコドン）をポジティブマーカー遺伝子（例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子等の薬剤耐性遺伝子）に配置したポジティブ選択で生存細胞を選択する。これらの細胞はコグネイトＲＳをもつ発現ベクターも含む。これらの細胞を選択物質（例えばアンピシリン）の存在下に増殖させる。次に、同時発現したコグネイトシンテターゼによりアミノアシル化され、このセレクターコドンに応答してアミノ酸を挿入することができるｔＲＮＡを選択する。非機能的ｔＲＮＡ又は所期シンテターゼにより認識することができないｔＲＮＡを含む細胞は抗生物質に感受性である。従って、（ｉ）内在宿主（例えば大腸菌）シンテターゼの基質でなく、（ｉｉ）所期シンテターゼによりアミノアシル化することができ、（ｉｉｉ）翻訳能力のあるｔＲＮＡはどちらの選択でも生存する。
【０１３２】
組換えＯ−ｔＲＮＡの生産方法は、（ａ）第１の生物に由来する少なくとも１種のｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）から誘導される突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーを作製する段階と、（ｂ）第１の生物に由来するＲＳの不在下に第２の生物に由来するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーをネガティブ選択することにより突然変異体ｔＲＮＡのプールを提供する段階と、（ｃ）導入した直交ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーを突然変異体ｔＲＮＡのプールから選択することにより、セレクターコドンを認識し、第２の生物に由来するＲＳにより効率的に認識されず、Ｏ−ＲＳにより優先的にアミノアシル化される少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡを提供する段階を含む。１態様では、組換えＯ−ｔＲＮＡは改善された直交性をもつ。
【０１３３】
突然変異ｔＲＮＡのライブラリーを構築する。例えば図９参照。ｔＲＮＡの所望ループ（例えばアンチコドンループ（Ｄアーム、Ｖループ、ＴΨＣアーム）又はループ組合せ又は全ループ）の特定位置（例えば非保存位置又は保存位置）、ランダム位置又は両者の組合せに突然変異を導入することができる。ｔＲＮＡのキメラライブラリーも本発明に含まれる。場合により各種生物（例えば真正細菌又は始原菌等の微生物）に由来するｔＲＮＡシンテターゼのライブラリー（例えば天然ダイバーシティを含むライブラリー）（例えばＳｈｏｒｔらの米国特許第６，２３８，８８４号、Ｓｃｈａｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒらの米国特許第５，７５６，３１６号、Ｐｅｔｅｒｓｅｎらの米国特許第５，７８３，４３１号、Ｔｈｏｍｐｓｏｎらの米国特許第５，８２４，４８５号、及びＳｈｏｒｔらの米国特許第５，９５８，６７２号参照）を構築して直交対をスクリーニングすることに留意されたい。
【０１３４】
１態様では、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによりアミノアシル化される突然変異体ＲＮＡのライブラリーをネガティブ選択する段階（段階（ｂ））は、少なくとも１個のセレクターコドンを含む毒性マーカー遺伝子と突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーを第２の生物に由来する複数の細胞に導入し、少なくとも１種の直交ｔＲＮＡ又は非機能的ｔＲＮＡを含む突然変異体ｔＲＮＡのプールを含む生存細胞を選択することを含む。例えば、毒性マーカー遺伝子は場合によりリボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子であり、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子は少なくとも１個のアンバーコドンを含む。場合により、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子に２個以上のアンバーコドンを含むことができる。生存細胞は例えば比較比細胞密度アッセイを使用することにより選択することができる。
【０１３５】
１態様では、導入した直交ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーを突然変異体ｔＲＮＡのプールから選択する段階は、少なくとも１個のセレクターコドンを含む薬剤耐性遺伝子（例えばβラクタマーゼ遺伝子、例えば少なくとも１個のアンバーコドンを含むβラクタマーゼ遺伝子）を含むポジティブ選択マーカー遺伝子と、Ｏ−ＲＳと、突然変異体ｔＲＮＡのプールを第２の生物に由来する複数の細胞に導入し、選択物質（例えば抗生物質）の存在下に増殖した生存細胞を選択することにより、Ｏ−ＲＳによりアミノアシル化され、少なくとも１個のセレクターコドンに応答してポジティブマーカー遺伝子によりコードされる翻訳産物にアミノ酸を挿入する少なくとも１種の組換えｔＲＮＡをもつ細胞プールを提供することを含む。別の態様では、選択物質濃度を変動させる。本方法により生産された組換えＯ−ｔＲＮＡも本発明に含まれる。
【０１３６】
Ｏ−ＲＳの作製について上述したように、選択段階のストリンジェンシーは変動可能である。更に、本明細書に記載する他の選択／スクリーニング法（例えばＦＡＣＳ、細胞及びファージディスプレイ）も使用できる。
【０１３７】
セレクターコドン
【０１３８】
本発明のセレクターコドンはタンパク質生合成機構の遺伝コドン枠を拡張する。例えば、セレクターコドンとしては例えばユニーク３塩基コドン、ナンセンスコドン、（例えばアンバーコドン又はオパールコドン等の終止コドン）、非天然コドン、４塩基（以上）のコドン等が挙げられる。例えば１個以上、２個以上、３個以上等の多数のセレクターコドンを所望遺伝子に導入することができる。更に、当然のことながら、こうして複数の異なる（又は類似又は同一の）非天然アミノ酸を（即ち複数のセレクターコドンの使用により）アミノ酸に正確に組込むことができる。
【０１３９】
６４種の遺伝コドンは２０種のアミノ酸と３種の終止コドンをコードする。翻訳終結には１個の終止コドンしか必要ないので、他の２個は主に非タンパク生産アミノ酸をコードするために使用することができる。アンバー終止コドンであるＵＡＧはｉｎｖｉｔｒｏ生合成系とアフリカツメガエル卵母細胞で使用して非天然アミノ酸の組込みに成功している。３種の終止コドンのうちでＵＡＧは大腸菌での使用頻度が最も低い終止コドンである。大腸菌株にはＵＡＧを認識して天然アミノ酸を挿入する天然サプレッサーｔＲＮＡを含むものもある。更に、これらのアンバーサプレッサーｔＲＮＡは慣用タンパク質突然変異誘発でも使用されている。各種はその天然アミノ酸の各コドンを優先的に使用するので、本発明のセレクターコドンの設計／選択には場合によりこのような優先性を利用する。
【０１４０】
本明細書では非天然アミノ酸について記載するが、当然のことながら特定セレクターコドンに応答して天然アミノ酸を組込むために同様のストラテジーを使用することもできる。即ち、本明細書全般に記載する非天然アミノ酸の負荷と同様にセレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡに天然アミノ酸を負荷するようにシンテターゼを改変することができる。
【０１４１】
１態様では、本方法は非天然アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ組込みに終止コドンであるセレクターコドンを使用する。例えば、終止コドン（例えばＵＡＧ）を認識するＯ−ｔＲＮＡを作製し、Ｏ−ＲＳにより所望非天然アミノ酸でアミノアシル化する。このＯ−ｔＲＮＡは天然アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼにより認識されない。慣用部位特異的突然変異誘発を使用して終止コドン（例えばＴＡＧ）をタンパク質遺伝子内の所期部位に導入することができる。例えばＳａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｗ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．５'，３' Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ，７９１−８０２（１９８８）参照。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及び突然変異体遺伝子をｉｎｖｉｖｏ融合すると、ＵＡＧコドンに応答して非天然アミノ酸が組込まれ、特定位置に非天然アミノ酸を含むタンパク質が得られる。
【０１４２】
非天然アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ組込みは宿主（例えば大腸菌）にさほど影響を与えずに行うことができる。例えば、ＵＡＧコドンの抑圧効率はＯ−ｔＲＮＡ（例えばアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）と（ＵＡＧコドンに結合してリボソームから増殖ペプチドの放出を開始する）放出因子１（ＲＦ１）の競合に依存するので、抑圧効率は例えばＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の発現レベルを高めるか又はＲＦ１欠損株を使用することにより調節することができる。更に、生物又は生物のゲノムの一部にランダム突然変異誘発を行い、例えば本明細書に記載するレポーター系の１種を使用して適正な選択を実施することにより抑圧効率と非天然アミノ酸取込みを調節することができる。
【０１４３】
非天然アミノ酸はレアコドンでコードすることもできる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成反応でアルギニン濃度を下げると、レアアルギニンコドンＡＧＧはアラニンでアシル化された合成ｔＲＮＡによるＡｌａの挿入に有効であることが分かっている。例えばＣ．Ｈ．Ｍａ，Ｗ．Ｋｕｄｌｉｃｋｉ，Ｏ．Ｗ．Ｏｄｏｍ，Ｇ．Ｋｒａｍｅｒａｎｄ Ｂ．Ｈａｒｄｅｓｔｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：７９３９（１９９３）参照。この場合には、合成ｔＲＮＡは大腸菌に少量種として存在する天然ｔＲＮＡArgと競合する。生物によっては全三重項コドンを使用しないものもある。Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓで割り当てられないコドンＡＧＡがｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳抽出物へのアミノ酸の挿入に使用されている。例えばＡ．Ｋ．ＫｏｗａｌとＪ．Ｓ．Ｏｌｉｖｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２５：４６８５（１９９７）参照。本発明の成分はこれらのレアコドンをｉｎｖｉｖｏ使用するために作製することができる。
【０１４４】
セレクターコドンは更に４塩基以上のコドン（例えば４、５、６、又は７塩基以上のコドン）も含む。４塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵ等が挙げられる。５塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣ等が挙げられる。例えば、突然変異Ｏ−ｔＲＮＡ（例えば特殊フレームシフトサプレッサーｔＲＮＡ）とアンチコドンループ（例えば少なくとも８〜１０ｎｔアンチコドンループ）の存在下では、４塩基以上のコドンは単一アミノ酸として読取られる。他の態様では、アンチコドンループは例えば少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン、又は少なくとも６塩基コドン又はそれ以上をデコードすることができる。４塩基コドンは２５６種が考えられるので、４塩基以上のコドンを使用すると同一細胞で多重非天然アミノ酸をコードすることができる。Ｊ．ＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒＡｎｄｅｒｓｏｎら，Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ Ｃｏｄｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ Ｓｉｚｅ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９，２３７−２４４（２００２）；Ｔｈｏｍａｓ Ｊ．Ｍａｇｌｉｅｒｙ，Ｅｘｐａｎｄｉｎｇｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓｏｆ Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ Ｃｏｄｏｎｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ "Ｓｈｉｆｔｙ" Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ Ｃｏｄｏｎｓｗｉｔｈ ａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７：７５５−７６９（２００１）も参照されたい。
【０１４５】
本発明の方法はフレームシフト抑圧に基づく拡張コドンを使用する。４塩基以上のコドンは例えば１個又は多数の非天然アミノ酸を同一タンパク質に挿入することができる。例えば、ｉｎｖｉｔｒｏ生合成法を使用して非天然アミノ酸をタンパク質に組込むために４塩基コドンが使用されている。例えばＣ．Ｈ．Ｍａ，Ｗ．Ｋｕｄｌｉｃｋｉ，Ｏ．Ｗ．Ｏｄｏｍ，Ｇ．Ｋｒａｍｅｒａｎｄ Ｂ．Ｈａｒｄｅｓｔｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３，３２，７９３９（１９９３）；及びＴ．Ｈｏｈｓａｋａ，Ｄ．Ｋａｊｉｈａｒａ，Ｙ．Ａｓｈｉｚｕｋａ，Ｈ．Ｍｕｒａｋａｍｉａｎｄ Ｍ．Ｓｉｓｉｄｏ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：３４（１９９９）参照。２個の化学的にアシル化したフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを使用して２−ナフチルアラニンとリジンのＮＢＤ誘導体を同時にストレプトアビジンにｉｎｖｉｔｒｏ組込むためにＣＧＧＧとＡＧＧＵが使用されている。例えばＴ．Ｈｏｈｓａｋａ，Ｙ．Ａｓｈｉｚｕｋａ，Ｈ．Ｓａｓａｋｉ，Ｈ．Ｍｕｒａｋａｍｉａｎｄ Ｍ．Ｓｉｓｉｄｏ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１２１９４（１９９９）参照。ｉｎｖｉｖｏ研究では、ＭｏｏｒｅらがＮＣＵＡアンチコドンをもつｔＲＮＡＬｅｕ誘導体がＵＡＧＮコドンを抑圧できるかどうかを試験し（ＮはＵ、Ａ、Ｇ又はＣであり得る）、四重項ＵＡＧＡはＵＣＵＡアンチコドンをもつｔＲＮＡＬｅｕにより１３から２６％の効率でデコードすることができるが、０又は−１フレームでは殆どデコードできないことを見出した。Ｂ．Ｍｏｏｒｅ，Ｂ．Ｃ．Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ｃ．Ｃ．Ｎｅｌｓｏｎ，Ｒ．Ｆ．Ｇｅｓｔｅｌａｎｄａｎｄ Ｊ．Ｆ．Ａｔｋｉｎｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９８：１９５（２０００）参照。１態様では、本発明ではレアコドン又はナンセンスコドンに基づく拡張コドンを使用し、他の望ましくない部位でのミスセンス読み飛ばしとフレームシフト抑圧を減らすことができる。
【０１４６】
翻訳バイパス系を使用して非天然アミノ酸を所望ポリペプチドに組込むこともできる。１翻訳バイパス系では、大きい配列を遺伝子に挿入するが、タンパク質に翻訳しない。この配列はリボソームに配列を飛び越させて挿入の下流の翻訳を再開するための合図として機能する構造を含む。
【０１４７】
非天然アミノ酸をポリペプチドに組込むための他の上記方法の代用又は併用してトランス翻訳系を使用することができる。この系は大腸菌に存在するｔｍＲＮＡと呼ぶ分子を利用する。このＲＮＡ分子はアラニルｔＲＮＡに構造的に近縁であり、アラニルシンテターゼによりアミノアシル化される。ｔｍＲＮＡとｔＲＮＡの相違はアンチコドンループが特殊な大きい配列で置換されていることである。この配列は鋳型としてｔｍＲＮＡ内でコードされるオープンリーディングフレームを使用して停止した配列でリボソームに翻訳を再開させることができる。本発明では、直交シンテターゼで優先的にアミノアシル化して非天然アミノ酸を負荷することができる直交ｔｍＲＮＡを作製することができる。この系を使用する遺伝子を転写することにより、リボソームは特定部位で停止し、非天然アミノ酸はこの部位に導入され、その後、直交ｔｍＲＮＡ内にコードされた配列を使用して翻訳が再開する。
【０１４８】
セレクターコドンは場合により非天然塩基対を含む。これらの非天然塩基対は更に既存遺伝アルファベットを拡張する。塩基対が１個増えると、三重項コドンの数は６４から１２５に増す。３番目の塩基対の性質としては安定的且つ選択的な塩基対合、高い忠実度で効率的なポリメラーゼによるＤＮＡへの酵素組込み、及び新生非天然塩基対の合成後の効率的な連続プライマー伸長が挙げられる。方法と組成物に応用可能な非天然塩基対については、例えばＨｉｒａｏら，Ａｎｕｎｎａｔｕｒａｌ ｂａｓｅ ｐａｉｒｆｏｒ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１７７−１８２（２００２）に記載されている。他の関連文献は以下に挙げる。
【０１４９】
ｉｎ ｖｉｖｏ使用では、非天然ヌクレオシドは膜透過性であり、リン酸化して対応する三リン酸塩を形成する。更に、増加した遺伝情報は安定しており、細胞酵素により破壊されない。Ｂｅｎｎｅｒらによる従来の研究ではカノニカルワトソンクリック対とは異なる水素結合パターンを利用しており、そのうちで最も注目に価する例はイソＣ：イソＧ対である。例えばＣ．Ｓｗｉｔｚｅｒ，Ｓ．Ｅ．Ｍｏｒｏｎｅｙａｎｄ Ｓ．Ａ．Ｂｅｎｎｅｒ，Ｊ．Ａｍ．ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１１：８３２２（１９８９）；Ｊ．Ａ．Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉ，Ｔ，Ｋｒａｕｃｈ，Ｓ．Ｅ．Ｍｏｒｏｎｅｙａｎｄ Ｓ．Ａ．Ｂｅｎｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，３４３：３３（１９９０）；及びＥ．Ｔ．Ｋｏｏｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２（２０００）参照。これらの塩基は一般に天然塩基とある程度ミスペアであり、酵素により複製することができない。Ｋｏｏｌらは水素結合の代わりに塩基間の疎水性充填相互作用により塩基対の形成を誘導できることを示した。Ｅ．Ｔ．Ｋｏｏｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２（２０００）；及びＫ．Ｍ．ＧｕｃｋｉａｎとＥ．Ｔ．Ｋｏｏｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３６，２８２５（１９９８）参照。上記全要件を満足する非天然塩基対を開発する試みとして、Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｒｏｍｅｒｂｅｒｇらは一連の非天然疎水性塩基を体系的に合成し、試験している。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対（図１０参照）が天然塩基対よりも安定であることが判明し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント（ＫＦ）によりＤＮＡに効率的に組込むことができる。例えばＤ．Ｌ．ＭｃＭｉｎｎ，Ａ．Ｋ．Ｏｇａｗａ，Ｙ．Ｑ．Ｗｕ，Ｊ．Ｑ．Ｌｉｕ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚａｎｄ Ｆ．Ｅ．Ｒｏｍｅｒｓｂｅｒｇ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１１５８６（１９９９）；及びＡ．Ｋ．Ｏｇａｗａ，Ｙ．Ｑ．Ｗｕ，Ｋ．Ｌ．ＭｃＭｉｎｎ，Ｊ．Ｑ．Ｌｉｕ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚａｎｄ Ｆ．Ｅ．Ｒｏｍｅｒｓｂｅｒｇ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：３２７４（２０００）参照。生物機能に十分な効率と選択性でＫＦにより３ＭＮ：３ＭＮ自己対を合成することができる。例えばＡ．Ｋ．Ｏｇａｗａ，Ｙ．Ｑ．Ｗｕ，Ｍ．Ｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚａｎｄ Ｆ．Ｅ．Ｒｏｍｅｒｓｂｅｒｇ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：８８０３（２０００）参照。しかし、どちらの塩基も後期複製用チェーンターミネーターとして作用するに止まっている。ＰＩＣＳ自己対を複製するために使用できる突然変異体ＤＮＡポリメラーゼが最近開発された。更に、７ＡＩ自己対も複製できる。例えばＥ．Ｊ．Ｌ．Ｔａｅ，Ｙ．Ｑ．Ｗｕ，Ｇ．Ｘｉａ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚａｎｄ Ｆ．Ｅ．Ｒｏｍｅｒｓｂｅｒｇ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３：７４３９（２００１）参照。Ｃｕ（ＩＩ）と結合すると安定な対を形成する新規メタロ塩基対Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙも開発されている。Ｅ．Ｍｅｇｇｅｒｓ，Ｐ．Ｌ．Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｗ．Ｂ．Ｔｏｌｍａｎ，Ｆ．Ｅ．Ｒｏｍｅｒｓｂｅｒｇａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：１０７１���（２０００）。拡張コドンと非天然コドンは天然コドンに本質的に直交性であるので、本発明の方法はその直交ｔＲＮＡを作製するためにこの性質を利用することができる。
【０１５０】
直交ｔＲＮＡと直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの対
【０１５１】
直交対はＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ、フレームシフトｔＲＮＡ等）とＯ−ＲＳから構成される。Ｏ−ｔＲＮＡは上述のように内在シンテターゼによりアシル化されず、セレクターコドンをデコードすることができる。Ｏ−ＲＳは例えば拡張アンチコドンループでＯ−ｔＲＮＡを認識し、Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。直交対と直交対の組成物の作製方法も本発明に含まれる。多重直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対の開発により、各種コドンを使用して多重非天然アミノ酸を同一ポリペプチド／タンパク質に同時に組込むことが可能になった。
【０１５２】
本発明において、方法と関連組成物は非天然アミノ酸をタンパク質にｉｎ ｖｉｖｏ組込むことができる直交対（Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ）の作製に関する。例えば、本発明のＯ−ｔＲＮＡの組成物は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含むことができる。１態様において、Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは相補的とすることができる（例えば直交Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対）。対の例としてはｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ｍｕｔＴｙｒＲＳ対（例えばｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ＳＳ１２ＴｙｒＲＳ対）、ｍｕｔＲＮＡＬｅｕ−ｍｕｔＬｅｕＲＳ対、ｍｕｔＲＮＡＴｈｒ−ｍｕｔＴｈｒＲＳ対、ｍｕｔＲＮＡＧｌｕ−ｍｕｔＧｌｕＲＳ対等が挙げられる。別の態様において、本発明の直交対は直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対の所望特性を含み、本発明の対の特性をもたない大腸菌由来ｍｕｔＲＮＡＧｌｎ−ｍｕｔＧｌｎＲＳ、酵母由来ｍｕｔＲＮＡＡｓｐ−ｍｕｔＡｓｐＲＳ又は酵母由来ｍｕｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ−ｍｕｔＰｈｅＲＳ以外のものである。
【０１５３】
Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは起源と宿主名で記載されている多様な生物に由来する天然ｔＲＮＡ及び／又はＲＳを突然変異させることにより誘導することができる。１態様において、Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは少なくとも１種の生物に由来する。別の態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは第１の生物に由来する天然に存在するか又は突然変異させた天然ｔＲＮＡを突然変異させることにより誘導し、Ｏ−ＲＳは第２の生物に由来する天然に存在するか又は突然変異させた天然ＲＳを突然変異させることにより誘導する。
【０１５４】
本発明は特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の作製方法も提供する。これらの方法は直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対を作製するために試みられた他のストラテジーについて後述する問題を解決する。具体的には、本発明の方法は、（ａ）第１の生物に由来する少なくとも１種のｔＲＮＡから誘導されるｔＲＮＡのライブラリーを作製する段階と、（ｂ）第１の生物に由来するＲＳの不在下で第２の生物に由来するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーをネガティブ選択することにより、突然変異体ｔＲＮＡのプールを提供する段階と、（ｃ）導入した直交ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーを突然変異体ｔＲＮＡのプールから選択することにより、少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡを提供する段階を含む。少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、第２の生物に由来するＲＳにより効率的に認識されず、Ｏ−ＲＳにより優先的にアミノアシル化される。本方法は更に、（ｄ）第３の生物に由来する少なくとも１種のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）から誘導される少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡＲＳのライブラリーを作製する段階と、（ｅ）非天然アミノ酸と天然アミノ酸の存在下に少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するメンバーを突然変異体ＲＳのライブラリーから選択することにより、活性突然変異体ＲＳのプールを提供する段階と、（ｆ）非天然アミノ酸の不在下に少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性突然変異体ＲＳのプールをネガティブ選択することにより、非天然アミノ酸に特異的な少なくとも１種の組換えＯ−ＲＳと少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡを含む少なくとも１種の特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を提供する段階を含む。本発明の方法により生産された対も本発明に含まれる。
【０１５５】
既存大腸菌ｔＲＮＡ／シンテターゼ対からの直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対の作製は従来試みられている。この方法は他のシンテターゼに対する直交性と翻訳能力を維持しながらｔＲＮＡ−シンテターゼ界面のヌクレオチドを突然変異させることによりそのコグネイトシンテターゼに対するｔＲＮＡの親和性を失わせる。出発鋳型としてコグネイト野生型シンテターゼを使用し、組換え直交ｔＲＮＡのみを認識する突然変異体シンテターゼを得る。ｔＲＮＡＧｌｎ２と複合化した大腸菌グルタミニル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＧｌｎＲＳ）のＸ線結晶構造分析によると、ＧｌｎＲＳと特異的に接触する３個の部位（「ノブ」）がｔＲＮＡＧｌｎ２で同定された。例えばＤ．Ｒ．Ｌｉｕ，Ｔ．Ｊ．Ｍａｇｌｉｅｒｙａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６８５（１９９７）；及びＤ．Ｒ．Ｌｉｕ，Ｔ．Ｊ．Ｍａｇｌｉｅｒｙ，Ｍ．Ｐａｓｔｒｎａｋａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｃ．Ｓｃｉ．ＵＳ Ａ，９４：１００９２（１９９７）参照。これらの部位をｔＲＮＡで突然変異させ、ノブ１、２及び３の可能な全組合せを含む突然変異体サプレッサーｔＲＮＡを作製し、ＧｌｎＲＳによるｉｎｖｉｔｒｏアミノアシル化とコリスミン酸ムターゼのアンバー突然変異体のｉｎ ｖｉｔｒｏ抑圧により個々に試験した。全３個のノブの突然変異をもつ突然変異体ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）は全内在大腸菌シンテターゼと直交性であり、翻訳能力があることが判明した。次に、ＤＮＡシャフリングとオリゴヌクレオチド誘導突然変異誘発を複数回実施して突然変異体ＧｌｎＲＳのライブラリーを作製した。大腸菌株ＢＴ２３５を使用してこれらの突然変異体酵素がＯ−ｔＲＮＡをｉｎｖｉｖｏアシル化する能力について選択した。突然変異体ＧｌｎＲＳがＯ−ｔＲＮＡにグルタミンを負荷する場合のみにｌａｃＺのゲノムアンバーコドンを抑圧することができ、ＢＴ２３５細胞はラクトース最少培地で増殖することができる。各選択後に生存している数個の突然変異体シンテターゼを精製し、ｉｎｖｉｔｒｏアッセイした。野生型（ｗｔ）ｔＲＮＡＧｌｎアシル化と突然変異体シンテターゼによるＯ−ｔＲＮＡアシル化の比は複数回の選択後に有意に低下した。他方、野生型大腸菌ｔＲＮＡＧｌｎ２よりも効率的にＯ−ｔＲＮＡに負荷する突然変異体大腸菌ＧｌｎＲＳは得られなかった。７回のＤＮＡシャフリングと選択後に得られた最良の突然変異体は野生型ｔＲＮＡＧｌｎの９分の１の率でしかＯ−ｔＲＮＡをアシル化しない。しかし、野生型ｔＲＮＡが非天然アミノ酸で誤ってアシル化されると致死性表現型となる可能性があるので、これらの実験は所望特性をもつシンテターゼ候補（例えば野生型ｔＲＮＡをアシル化しないシンテターゼ）を生産することができなかった。更に、ｔＲＮＡ内の突然変異はアミノアシル化と翻訳の両者に関して複雑で非付加的方法で相互作用する。Ｄ．Ｒ．Ｌｉｕ，Ｔ．Ｊ．Ｍａｇｌｉｅｒｙａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６８５（１９９７）参照。従って、所望特性をもつ機能的対を提供するには一般に代替方法が使用されている。
【０１５６】
直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対を作製する第２のストラテジーは別の生物に由来するｔＲＮＡ／シンテターゼ対を大腸菌に導入する。異種シンテターゼ候補の性質としては、例えば大腸菌ｔＲＮＡに負荷しない等が挙げられ、異種ｔＲＮＡ候補の性質としては、例えば大腸菌シンテターゼによりアシル化されない等が挙げられる。更に、異種ｔＲＮＡから誘導されるサプレッサーｔＲＮＡは全大腸菌シンテターゼに直交性である。Ｓｃｈｉｍｍｅｌらは大腸菌ＧｌｎＲＳ（ＥｃＧｌｎＲＳ）がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｔＲＮＡＧｌｎをアシル化しないことを報告した（ＥｃＧｌｎＲＳはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧｌｎＲＳ（ＳｃＧｌｎＲＳ）がもつＮ末端ＲＮＳ結合ドメインをもたない）。Ｅ．Ｆ．ＷｈｅｌｉｈａｎとＰ．Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，ＥＭＢＯＪ．，１６：２９６８（１９９７）参照。その後、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアンバーサプレッサーｔＲＮＡＧｌｎ（ＳｃｔＲＮＡＧｌｎＣＵＡ）を分析し、同様にＥｃＧｌｎＲＳの基質でないか否かを調べた。ｉｎｖｉｔｒｏアミノアシル化アッセイによるとその通りであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ抑圧試験によるとＳｃｔＲＮＡＧｌｎＣＵＡは翻訳能力がある。例えばＤ．Ｒ．ＬｉｕとＰ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ Ａ，９６：４７８０（１９９９）参照。ＳｃＧｌｎＲＳがｉｎ ｖｉｔｒｏで大腸菌ｔＲＮＡをアシル化せず、ＳｃｔＲＮＡＧｌｎＣＵＡのみをアシル化することも判明した。ＳｃＧｌＮＲＳが大腸菌でＳｃｔＲＮＡＧｌｎＣＵＡをアミノアシル化する程度もｉｎｖｉｖｏ相補アッセイにより評価された。アンバーナンセンス突然変異がβラクタマーゼ遺伝子の許容部位に導入された。アンバーサプレッサーｔＲＮＡによる突然変異の抑圧は全長βラクタマーゼを生じ、細胞にアンピシリン耐性を付与するはずである。ＳｃｔＲＮＡＧｌｎＣＵＡのみが発現される場合に細胞は２０μｇ／ｍＬアンピシリンのＩＣ50を示し、内在大腸菌シンテターゼによるアシル化が殆どないことを示し、ＳｃｔＲＮＡＧｌｎＣＵＡがＳｃＧｌｎＲＳと同時発現される場合には細胞は約５００μｇ／ｍＬアンピシリンのＩＣ50を獲得し、ＳｃＧｌｎＲＳが大腸菌でＳｃｔＲＮＡＧｌｎＣＵＡを効率的にアシル化することを示す。Ｄ．Ｒ．ＬｉｕとＰ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ Ａ，９６：４７８０（１９９９）参照。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｔＲＮＡＧｌｎＣＵＡ／ＧｌｎＲＳは大腸菌に直交性である。
【０１５７】
その後、このストラテジーはｔＲＮＡAsp ／ＡｓｐＲＳ系に応用された。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｔＲＮＡAspは大腸菌シンテターゼに直交性であることが知られている。例えばＢ．Ｐ．ＤｏｃｔｏｒとＪ．Ａ．Ｍｕｄｄ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３８：３６７７（１９６３）；及びＹ．ＫｗｏｋとＪ．Ｔ．Ｗｏｎｇ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８：２１３（１９８０）参照。上記ｉｎｖｉｖｏβラクタマーゼアッセイによると、これ（ＳｃｔＲＮＡＡｓｐＣＵＡ）に由来するアンバーサプレッサーｔＲＮＡも大腸菌で直交性であることが分かった。他方、ｔＲＮＡAspのアンチコドンはＡｓｐＲＳの必須認識エレメントであり（例えばＲ．Ｇｉｅｇｅ，Ｃ．Ｆｌｏｒｅｎｔｚ，Ｄ．Ｋｅｒｎ，Ｊ．Ｇａｎｇｌｏｆｆ，Ｇ．Ｅｒｉａｎｉａｎｄ Ｄ．Ｍｏｒａｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７８：６０５（１９９６）参照）、このアンチコドンをＣＵＡに突然変異させるとＡｓｐＲＳに対するサプレッサーの親和性が失われる。大腸菌ＡｓｐＲＳＥ９３Ｋ突然変異体は野生型ＡｓｐＲＳよりもほぼ一桁良好に大腸菌アンバーサプレッサーｔＲＮＡＡｓｐＣＵＡを認識することが判明した。例えばＦ．Ｍａｒｔｉｎ，'Ｔｈｅｓｉｓ' ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｌｏｕｉｓ Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，Ｆｒａｎｃｅ，１９９５参照。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡｓｐＲＳ（Ｅ１８８Ｋ）に関連突然変異を導入するとＳｃｔＲＮＡＡｓｐＣＵＡに対するその親和性は回復すると予想された。ｉｎｖｉｔｒｏアミノアシル化実験によると、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡｓｐＲＳ（Ｅ１８８Ｋ）突然変異体は大腸菌ｔＲＮＡをアシル化しないが、中程度の効率でＳｃｔＲＮＡＡｓｐＣＵＡに負荷することが判明した。例えばＭ．Ｐａｓｔｒｎａｋ，Ｔ．Ｊ．Ｍａｇｌｉｅｒｙａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，８３：２２７７（２０００）参照。ＳｃｔＲＮＡＡｓｐＣＵＡ／ＳｃＡｓｐＲＳ（Ｅ１８８Ｋ）は大腸菌で別の直交対として機能できるが、活性は弱い。
【０１５８】
同様のアプローチとして、直交シンテターゼとして異種シンテターゼを使用するが、直交ｔＲＮＡとしては同一生物又は近縁生物の突然変異体イニシエーターｔＲＮＡを使用する方法がある。ＲａｊＢｈａｎｄａｒｙらはヒトイニシエーターｔＲＮＡｆＭｅｔのアンバー突然変異体がＥｃＧｌＮＲＳを同時発現させる場合のみに大腸菌ＧｌｎＲＳによりアシル化され、酵母細胞でアンバーサプレッサーとして機能することを発見した。Ａ．Ｋ．Ｋｏｗａｌ，Ｃ．Ｋｏｈｒｅｒａｎｄ Ｕ．Ｌ．ＲａｊＢｈａｎｄａｒｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ Ａ，９８：２２６８（２００１）参照。即ち、この対は酵母で使用される直交対である。また、大腸菌シンテターゼに対して不活性な大腸菌イニシエーターｔＲＮＡｆＭｅｔアンバー突然変異体も発見された。この突然変異体ｔＲＮＡに負荷する突然変異体酵母ＴｙｒＲＳを選択し、大腸菌で直交対を得た。Ａ．Ｋ．Ｋｏｗａｌら（２００１）前出参照。
【０１５９】
原核生物と真核生物のｔＲＮＡＴｙｒ／ＴｙｒＲＳ対には有意な差があり、原核ｔＲＮＡＴｙｒのアイデンティティーエレメントは長い可変アームを含むが、真核ｔＲＮＡＴｙｒのアームは短い。更に、真核ｔＲＮＡＴｙｒはＣ１：Ｇ７２ポジティブ認識エレメントを含むが、原核ｔＲＮＡＴｙｒはこのようなコンセンサス塩基対をもたない。ｉｎｖｉｔｒｏ試験によると、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとヒトのｔＲＮＡＴｙｒは細菌シンテターゼによりアミノアシル化することができず、そのＴｙｒＲＳが細菌ｔＲＮＡをアミノアシル化しないことも分かった。例えばＫ．Ｗａｋａｓｕｇｉ，Ｃ．Ｌ．Ｑｕｉｎｎ，Ｎ．Ｔａｏａｎｄ Ｐ．Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，ＥＭＢＯ Ｊ．，１７：２９７（１９９８）；及びＴ．Ａ．Ｋｌｅｅｍａｎ，Ｄ．Ｗｅｉ，Ｋ．Ｌ．Ｓｉｍｐｓｏｎａｎｄ Ｅ．Ａ．Ｆｉｒｓｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１４４２０（１９９７）参照。しかし、これらの直交性の有望な全特徴にも拘わらず、ｉｎｖｉｖｏβラクタマーゼ相補アッセイによると、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとヒトのいずれに由来するアンバーサプレッサーｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡも大腸菌で直交性でないことが判明した。例えばＬ．Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｊ．Ｍａｇｌｉｅｒｙ，Ｄ．Ｒ．Ｌｉｕａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：５０１０（２０００）参照。サプレッサーｔＲＮＡを大腸菌シンテターゼによりアシル化できるか否かはアンチコドンの単一ヌクレオチドの変異（Ｇ３４→Ｃ３４）による。
【０１６０】
本発明の方法を使用して上記所望対及び対の成分を進化させ、所望特性、例えばＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化できるという特性をもつ直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対を作製する。
【０１６１】
資源及び宿主生物
【０１６２】
例えば少なくとも第１の生物又は同一でも異なっていてもよい少なくとも２種の生物に由来する直交ｔＲＮＡ−ＲＳ対は各種宿主生物（例えば第２の生物）で使用することができる。本発明の方法の第１の生物と第２の生物は同一でも異なっていてもよい。１態様では第１の生物は例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａ．ｐｅｒｎｉｘ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等の原核生物である。あるいは、第１の生物は例えば植物（例えば単子葉植物又は双子葉植物等の複雑な植物）、藻類、原生動物、真菌類（例えば酵母等）、動物（例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等）等の真核生物でもよい。別の態様では、第２の生物はＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａ．ｐｅｒｎｉｘ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等の原核生物である。あるいは、第２の生物は例えば植物、真菌類、動物等の真核生物でもよい。
【０１６３】
上述のように、対の各成分は同一生物に由来するものでも異なる生物に由来するものでもよい。例えば、ｔＲＮＡは例えば始原菌（例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＲＣ−１）又は真正細菌（例えば大腸菌）等の原核生物に由来し、シンテターゼは同一又は異なる原核生物（例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ａｒｃｈａｅｒｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａ．ｐｅｒｎｉｘ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ等）に由来するものとすることができる。例えば植物（例えば単子葉植物又は双子葉植物等の複雑な植物）、藻類、原生動物、真菌類（例えば酵母等）、動物（例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等）等の真核源も使用できる。
【０１６４】
第２の生物のｉｎ ｖｉｖｏ翻訳系で使用するための直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対の選択方法も本発明に含まれる。本方法はマーカー遺伝子と、ｔＲＮＡと、第１の生物から単離又は誘導されるアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）を第２の生物に由来する第１組の細胞に導入する段階と、マーカー遺伝子とｔＲＮＡを第２の生物に由来する複製組の細胞に導入する段階と、第１組と複製組の細胞を選択物質の存在下に増殖させ、第１組では生存するが、複製組では生存することができない細胞を選択し、第２の生物のｉｎｖｉｖｏ翻訳系で使用するための直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対を含む生存細胞を提供する段階を含む。１態様では、比較と選択はｉｎｖｉｖｏ相補アッセイを含む。別の態様では選択物質濃度を変動させる。
【０１６５】
例えば、シンテターゼに対するｔＲＮＡの認識部位であるアイデンティティーエレメントが存在する場所に基づいてｔＲＮＡ／シンテターゼ対を選択することができる。例えば、アイデンティティーエレメントがアンチコドンの外側にある場合にｔＲＮＡ／シンテターゼ対を選択する（例えば始原菌Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来するｔＲＮＡＴｙｒ／ＴｙｒＲＳ対）。このＴｙｒＲＳはそのｔＲＮＡＴｙｒのアンチコドンループと結合する非保存ドメインの大半を欠失しているが、Ｇ１：Ｃ７２をもつｔＲＮＡからＣ１：Ｇ７２をもつｔＲＮＡを識別することができる。更に、ＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉＴｙｒＲＳ（ＭｊＴｙｒＲＳ）はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅをアミノアシル化するが、大腸菌天然ｔＲＮＡをアミノアシル化しない。例えばＢ．Ａ．ＳｔｅｅｒとＰ．Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：３５６０１（１９９９）参照。少なくとも１個のセレクターコドンをもつレポーター遺伝子（例えばβラクタマーゼ遺伝子）を含む発現ベクターを使用するｉｎ ｖｉｖｏ相補アッセイによると、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡ（ＭｊｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡ）のみを発現する細胞はＩＣ50＝５５μｇ／ｍＬアンピシリンまで生存し、ＭｊｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡとそのＴｙｒＲＳを同時発現する細胞はＩＣ50＝１２２０μｇ／ｍＬアンピシリンまで生存する。ＭｊｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡは大腸菌でＳｃｔＲＮＡＧｌｎＣＵＡ（ＩＣ50＝２０μｇ／ｍＬ）よりも直交性が低いが、ＭｊＴｙｒＲＳはそのコグネイトアンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシル化活性が高い。例えばＬ．Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｊ．Ｍａｇｌｉｅｒｙ，Ｄ．Ｒ．Ｌｉｕａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：５０１０（２０００）参照。その結果、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ／ＴｙｒＲＳは大腸菌で直交対であるとみなされ、ｉｎ ｖｉｖｏ翻訳系で使用するのに選択することができる。
【０１６６】
非天然アミノ酸
【０１６７】
本発明の方法では多様な非天然アミノ酸を使用することができる。非天然アミノ酸は非天然アミノ酸の所望特性（例えば非天然アミノ酸の機能）に基づいて選択することができ、例えば毒性、生体分布又は半減期、構造的性質、分光学的性質、化学及び／又は光化学的性質、触媒性質、他の分子との（例えば共有又は非共有）反応性等のタンパク質の生物学的性質を改変する機能が挙げられる。
【０１６８】
本明細書において非天然アミノ酸とはセレノシステインと２０種の遺伝的にコードされるαアミノ酸（即ちアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトフアン、チロシン、バリン）以外の任意アミノ酸、改変アミノ酸又はアミノ酸類似体を意味する。αアミノ酸の一般構造は式Ｉ：
【化１】
2011030571.tif 000003
により表される。非天然アミノ酸は一般に式Ｉをもつ任意構造であり、式中、Ｒ基は２０種の天然アミノ酸で使用されている以外の任意置換基である。２０種の天然アミノ酸の構造については、例えばＬ．Ｓｔｒｙｅｒ著Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版，１９８８，Ｆｒｅｅｍａｎａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。本発明の非天然アミノ酸は上記２０種のαアミノ酸以外の天然化合物でもよいことに留意されたい。本発明の非天然アミノ酸は一般に側鎖のみが天然アミノ酸と異なるので、本発明の非天然アミノ酸は天然タンパク質で形成されると同様に他のアミノ酸（例えば天然又は非天然アミノ酸）とアミド結合を形成する。他方、非天然アミノ酸は天然アミノ酸と異なる側鎖基をもつ。例えば、式Ｉ中のＲは場合によりアルキル、アリール、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ、スルホニル、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミノ基等又はその任意組合せを含む。他の該当非天然アミノ酸としては、光架橋基を含むアミノ酸、スピンラベル付きアミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合性アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基をもつアミノ酸、他の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸、フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸、グリコシル化アミノ酸（例えば糖鎖置換セリン）、他の糖鎖修飾アミノ酸、ケト含有アミノ酸、ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学分解性又は光分解性アミノ酸、天然アミノ酸に比較して延長側鎖（例えばポリエーテル又は例えば炭素長が約５もしくは約１０を越える長鎖炭化水素）をもつアミノ酸、炭素結合糖含有アミノ酸、レドックス活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、及び１個以上の毒性部分を含むアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６９】
新規側鎖を含む非天然アミノ酸に加え、非天然アミノ酸は場合により例えば式ＩＩ及びＩＩＩ：
【化２】
2011030571.tif 000004
の構造により表されるような修飾主鎖構造を含み、式中、Ｚは一般にＯＨ、ＮＨ2 、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ' 又はＳ−Ｒ' を含み、ＸとＹは同一でも異なっていてもよく、一般にＳ又はＯであり、ＲとＲ'は場合により同一又は異なり、一般に式Ｉをもつ非天然アミノ酸について上記に記載したＲ基と同一の基及び水素から選択される。例えば、本発明の非天然アミノ酸は場合により式ＩＩ及びＩＩにより表されるようにアミノ又はカルボキシル基に置換を含む。この種の非天然アミノ酸としては、例えば２０種の共通天然アミノ酸に対応する側鎖又は非天然側鎖をもつα−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシレートが挙げられるが、これらに限定されない。更に、α−炭素の置換は場合によりＬ、Ｄ又はα，α−ジ置換アミノ酸（例えばＤ−グルタミン酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、アミノ酪酸等）を含む。他の構造としては環状アミノ酸（例えばプロリン類似体や、３、４、６、７、８及び９員環プロリン類似体）、β及びγアミノ酸（例えば置換β−アラニン及びγ−アミノ酪酸）が挙げられる。
【０１７０】
例えば、多数の非天然アミノ酸は天然アミノ酸（例えばチロシン、グルタミン、フェニルアラニン等）に由来する。チロシン類似体としてはパラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンが挙げられ、置換チロシンはアセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ6−Ｃ20直鎖又は分枝鎖炭化水素、飽和又は不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基等を含む。更に、多重置換アリール環も考えられる。本発明のグルタミン類似体としてはα−ヒドロキシ誘導体、γ置換誘導体、環状誘導体及びアミド置換グルタミン誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。フェニルアラニン類似体の例としてはヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アセチル基等を置換基に含むメタ置換フェニルアラニンか挙げられるが、これらに限定されない。非天然アミノ酸の特定例としてはＯ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、及びイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン等が挙げられるが、これらに限定されない。各種非天然アミノ酸の構造を図（例えば図２９、３０及び３１）に示す。
【０１７１】
一般に、本発明の非天然アミノ酸は２０種の天然アミノ酸では得られない付加特性を提供するように選択又は設計される。例えば、非天然アミノ酸は場合により（例えばこれらのアミノ酸を組込む）タンパク質の生物学的性質を改変するように設計又は選択される。例えば、非天然アミノ酸をタンパク質に組込むことにより、場合により毒性、生体分布、溶解度、安定性（例えば熱、加水分解、酸化、酵素耐性、分解等）、精製と処理し易さ、構造的性質、分光学的性質、化学及び／又は光化学的性質、触媒活性、酸化還元電位、半減期、他の分子との（例えば共有又は非共有）反応性等の性質を改変する。
【０１７２】
非天然アミノ酸の更に詳細な説明は参考資料として本明細書に組込む２００２年４月１９日付け対応出願（発明の名称" Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ"
，代理人整理番号５４−０００１２０ＰＣ／ＵＳ）に記載されている。
【０１７３】
突然変異体ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ及びＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の使用
【０１７４】
本発明の組成物と本発明の方法により生産された組成物は場合により細胞に組込む。その後、本発明のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対又は個々の成分を宿主系の翻訳機構で使用し、非天然アミノ酸をタンパク質に組込むことができる。対応特許出願（発明の名称"Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ" ，代理人整理番号５４−０００１２０ＰＣ／ＵＳ，発明者Ｓｃｈｕｌｔｚら）はこの方法について記載しており、参考資料として本明細書に組込む。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を宿主（例えば大腸菌）に導入すると、対は外部から増殖培地に添加可能な非天然アミノ酸（例えばＯ−メチル−Ｌ−チロシン等の合成アミノ酸）をセレクターコドン（例えばアンバーナンセンスコドン）に応答してタンパク質（例えばジヒドロ葉酸レダクターゼやＥＰＯ等の治療用タンパク質）にｉｎｖｉｖｏ組込むことができる。場合により、本発明の組成物をｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系又はｉｎｖｉｖｏ系に組込むこともできる。
【０１７５】
核酸及びポリペプチド配列変異体
【０１７６】
上記及び下記に記載するように、本発明は核酸ポリヌクレオチド配列及びポリペプチドアミノ酸配列（例えばＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ）と、例えば前記配列を含む組成物と方法を提供する。前記配列（例えばＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ）の例を本明細書に開示する。しかし、当業者に自明の通り、本発明は本明細書（例えば実施例）に開示する配列に限定されない。当業者に自明の通り、本発明は本明細書に記載する機能をもつ（例えば（例えばＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳをコードする））多数の非関連配列も提供する。
【０１７７】
同様に当業者に自明の通り、開示配列の多数の変異体も本発明に含まれる。例えば、機能的に同一配列である開示配列の保存変異も本発明に含まれる。少なくとも１種の開示配列にハイブリダイスする核酸ポリヌクレオチド配列の変異体も本発明に含むものとする。例えば標準配列比較法により本明細書に開示する配列のユニークサブ配列であるとみなされる配列も本発明に含まれる。
【０１７８】
保存変異
【０１７９】
遺伝コードの縮重により、「サイレント置換」（即ちコードされるポリペプチドに変化を生じない核酸配列の置換）はアミノ酸をコードする全核酸配列の暗黙の特徴である。同様に、「保存アミノ酸置換」はアミノ酸配列中の１又は数個のアミノ酸を高度に類似する特性をもつ別のアミノ酸で置換するものであり、このような置換も開示構築物と高度に類似するとは自明である。各開示配列のこのような保存変異は本発明の１つの特徴である。
【０１８０】
特定核酸配列の「保存変異」とは同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味し、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列を意味する。当業者に自明の通り、コードされる配列中の単一アミノ酸又は低百分率（一般に５％未満、より一般には４％、２％又は１％未満）のアミノ酸を置換、付加又は欠失させる個々の置換、欠失又は付加の結果としてアミノ酸１個を欠失するか、アミノ酸１個が付加するか、又はアミノ酸１個が化学的に類似するアミノ酸１個で置換される場合には、これらの改変は「保存改変変異」である。従って、本発明に示すポリペプチド配列の「保存変異」はポリペプチド配列のアミノ酸の低百分率、一般に５％未満、より一般には２％又は１％未満を同一保存置換基の保存可能に選択したアミノ酸で置換する置換を含む。最後に、非機能的配列の付加のように核酸分子のコードされる活性を変えない配列の付加も基本核酸の保存変異である。
【０１８１】
表１ − 保存置換基
2011030571.tif 000005
【０１８２】
核酸ハイブリダイゼーション
【０１８３】
比較ハイブリダイゼーションを使用して（本発明の核酸の保存変異を含む）本発明の核酸を同定することができ、この比較ハイブリダイゼーション法は本発明の核酸を識別する好適な方法である。更に、高、超高及び超々高ストリンジェンシー条件下で配列番号１〜３又は配列番号４〜３４（表５参照）に示す核酸とハイブリダイズするターゲット核酸も本発明の１つの特徴である。このような核酸の例としては所定核酸配列と比較して１又は数個のサイレント又は保存核酸置換をもつものが挙げられる。
【０１８４】
完全にマッチする相補的ターゲットに比較して少なくとも１／２の割合でプローブにハイブリダイズする場合、即ちマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍〜１０倍で完全にマッチするプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合する条件下におけるプローブとターゲットのハイブリダイゼーションに比較してシグナル対ノイズ比が少なくとも１／２である場合に試験核酸はプローブ核酸に特異的にハイブリダイズすると言う。
【０１８５】
核酸は一般に溶液中で会合するときに「ハイブリダイズ」する。核酸は水素結合、溶媒排除、塩基スタッキング等の種々の十分に特性決定された物理化学的力によりハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ− Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓｐａｒｔ Ｉ，ｃｈａｐｔｅｒ ２，"Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ，"
（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）及びＡｕｓｕｂｅｌ，前出に記載されている。
ＨａｍｅｓとＨｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ １ ＩＲＬＰｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，英国（ＨａｍｅｓとＨｉｇｇｉｎｓ １）及びＨａｍｅｓとＨｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ ２ ＩＲＬＰｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，英国（ＨａｍｅｓとＨｉｇｇｉｎｓ ２）はＤＮＡとＲＮＡ（オリゴヌクレオチドを含む）の合成、標識、検出及び定量について詳細に記載している。
【０１８６】
サザン又はノーザンブロットでフィルター上で１００を越える相補的残基をもつ相補的核酸のハイブリダイゼーションを行うためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の１例は、５０％ホルマリンにヘパリン１ｍｇを加え、４２℃で一晩のハイブリダイゼーションである。ストリンジェント洗浄条件の１例は６５℃、０．２×ＳＳＣで１５分間である（ＳＳＣ緩衝液の説明についてはＳａｍｂｒｏｏｋ，前出参照）。多くの場合には高ストリンジェンシー洗浄の前に低ストリンジェンシー洗浄でバックグラウンドプローブシグナルを除去する。低ストリンジェンシー洗浄の１例は４０℃、２×ＳＳＣで１５分間である。一般に、シグナル対ノイズ比が特定ハイブリダイゼーションアッセイで非関連プローブに観測されるよりも５倍（以上）である場合に特異的ハイブリダイゼーションが検出されたとみなす。
【０１８７】
サザン及びノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験に関して「ストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存的であり、種々の環境パラメーターにより異なる。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３），前出やＨａｍｅｓとＨｉｇｇｉｎｓ１及び２に記載されている。ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件は任意試験核酸について経験により容易に決定することができる。例えば、高ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件を決定するには、総合選択基準に合致するまで（例えばハイブリダイゼーション又は洗浄における温度上昇、塩濃度低下、界面活性剤濃度増加及び／又はホルマリン等の有機溶媒濃度増加により）ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を漸増させる。例えば、マッチしないターゲットとプローブのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍でプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合するまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件を漸増させる。
【０１８８】
「超ストリンジェント」条件は特定プローブの熱融点（Ｔm ）に等しくなるように選択する。Ｔm は（規定イオン強度及びｐＨ下で）試験配列の５０％が完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度である。本発明の趣旨では、一般に規定イオン強度及びｐＨで特定配列のＴmよりも約５℃低くなるように「高ストリンジェント」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を選択する。
【０１８９】
「超高ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブを結合させる場合のシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増す条件である。完全にマッチする相補的ターゲットのシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下でプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
【０１９０】
同様に、該当ハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を漸増させることにより更に高いレベルのストリンジェンシーを決定することもできる。例えば、完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブを結合させる場合のシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍又は５００倍以上になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増す。完全にマッチする相補的ターゲットのシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下でプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超々高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
【０１９１】
ストリンジェント条件下で相互にハイブリダイズしない核酸でも、これらの核酸によりコードされるポリペプチドが実質的に同一である場合には実質的に同一である。これは、例えば遺伝コードに許容される最大コドン縮重を使用して核酸のコピーを作製する場合に該当する。
【０１９２】
ユニークサブ配列
【０１９３】
１側面では、本発明は本明細書に開示するＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの配列（例えば配列番号１〜３又は配列番号４〜３４（表５参照））から選択される核酸にユニークサブ配列を含む核酸を提供する。ユニークサブ配列は任意公知Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ核酸配列に対応する核酸に比較してユニークである。例えばデフォルトパラメーターに設定したＢＬＡＳＴを使用してアラインメントを実施することができる。任意ユニークサブ配列は例えば本発明の核酸を同定するためのプローブとして有用である。
【０１９４】
同様に、本発明は本明細書に開示するＯ−ＲＳの配列（例えば配列番号３５〜６６（表５参照））から選択されるポリペプチド中にユニークサブ配列を含むポリペプチドを含む。この場合には、ユニークサブ配列は公知ポリペプチド配列の任意のものに対応するポリペプチドに比較してユニークである。
【０１９５】
本発明はＯ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチド中のユニークサブ配列をコードするユニークコーディングオリゴヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするターゲット核酸も提供し、この場合、ユニークサブ配列は対照ポリペプチド（例えば本発明のシンテターゼを得るために例えば突然変異させた親配列）の任意のものに対応するポリペプチドに比較してユニークである。ユニーク配列は上記のように決定する。
【０１９６】
配列比較、一致度及び相同度
【０１９７】
２種以上の核酸又はポリペプチド配列に関して「一致」又は「一致度」百分率なる用語は２種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、以下に記載する配列比較アルゴリズム（又は当業者に入手可能な他のアルゴリズム）の１種を使用するか又は目視により測定した場合に相互に同一であるか又は同一のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの百分率が特定値であることを意味する。
【０１９８】
２種以上の核酸又はポリペプチド（例えばＯ−ｔＲＮＡもしくはＯ−ＲＳ又はＯ−ＲＳのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ）に関して「実質的に一致」なる用語は２種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、配列比較アルゴリズムを使用するか又は目視により測定した場合にヌクレオチド又はアミノ酸残基一致度が少なくとも約６０％、好ましくは８０％、最も好ましくは９０〜９５％であることを意味する。このような「実質的に一致」する配列は一般に実際の起源が記載されていなくても「相同」であるとみなす。少なくとも約５０残基長の配列の領域にわたって「実質的一致」が存在することが好ましく、少なくとも約１００残基長の配列の領域がより好ましく、少なくとも約１５０残基又は比較する２配列の全長にわたって配列が実質的に一致していることが最も好ましい。
【０１９９】
配列比較及び相同性決定には、一般に一方の配列を参照配列としてこれに試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験配列と参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。こうすると、配列比較アルゴリズムは指定プログラムパラメーターに基づいて参照配列に対して試験配列の配列一致度百分率を計算する。
【０２００】
比較のための最適な配列アラインメントは例えばＳｍｉｔｈ ＆ ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ&apos;
ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似性探索法、これらのアルゴリズムのコンピューターソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ ＳｃｉｅｎｃｅＤｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視（一般にＡｕｓｕｂｅｌら，後出参照）により実施することができる。
【０２０１】
配列一致度及び配列類似度百分率を決定するのに適したアルゴリズムの１例はＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公に入手可能である。このアルゴリズムはデータベース配列中の同一長さの単語と整列した場合に所定の正の閾値スコアＴと一致するか又はこれを満足するクエリー配列中の長さＷの短い単語を識別することによりまず高スコア配列対（ＨＳＰ）を識別する。Ｔを隣接単語スコア閾値と言う（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，前出）。これらの初期隣接単語ヒットをシードとして検索を開始し、これらの単語を含むもっと長いＨＳＰを探索する。次に、累積アラインメントスコアを増加できる限り、単語ヒットを各配列に沿って両方向に延長する。ヌクレオチド配列の場合にはパラメーターＭ（１対のマッチ残基のリウォードスコア、常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基のペナルティースコア、常に＜０）を使用して累積スコアを計算する。アミノ酸配列の場合には、スコアリングマトリクスを使用して累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘだけ低下するか、累積スコアが１カ所以上の負スコア残基アラインメントの累積によりゼロ以下になるか、又はどちらかの配列の末端に達したら各方向の単語ヒットの延長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸはアラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＩＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は語長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列用として、ＢＬＡＳＴＰプログラムは語長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスをデフォルトとして使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５参照）。
【０２０２】
配列一致度百分率の計算に加え、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２配列間の類似性の統計分析も実施する（例えばＫａｒｌｉｎ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ&apos;
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１尺度は２種のヌクレオチド又はアミノ酸配列間に偶然にマッチが起こる確率を示す最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸を参照核酸に比較した場合の最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に核酸は参照核酸に類似しているとみなす。
【０２０３】
免疫反応性によるポリペプチドの特性決定
【０２０４】
本発明のポリペプチドは（例えば本発明の翻訳系で合成されるタンパク質の場合には非天然アミノ酸を含み、例えば本発明の新規シンテターゼの場合には標準アミノ酸の新規配列を含む）種々の新規ポリペプチドを提供するので、ポリペプチドは例えばイムノアッセイで認識することができる新規構造特徴も提供する。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗血清の作製とこのような抗血清と結合するポリペプチドも本発明の特徴の１つである。
【０２０５】
例えば、本発明は配列番号３５〜６６（表５参照）の１種以上から選択されるアミノ酸配列を含む免疫原に対して作製した抗体又は抗血清に特異的に結合するか又は特異的に免疫反応性であるシンテターゼタンパク質を含む。他の相同体との交差反応性をなくすために、野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｍ．ｊａｎａｓｃｈｉｉ）チロシルシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）等の入手可能なシンテターゼ（例えば「コントロール」ポリペプチド）を用いて抗体又は抗血清をサブトラクションする。野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｍ．ｊａｎａｓｃｈｉｉ）チロシルシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）が核酸に対応する場合には、核酸によりコードされるポリペプチドを作製し、抗体／抗血清サブトラクション目的に使用する。
【０２０６】
典型的なフォーマットの１例では、イムノアッセイは配列番号３５〜６６（表５参照）の１種以上に対応する配列の１種以上又はその実質的サブ配列（即ち記載する全長配列の少なくとも約３０％）を含む１種以上のポリペプチドに対して作製したポリクローナル抗血清を使用する。配列番号３５〜６６（表５参照）に由来する潜在的ポリペプチド免疫原群を以下の文中では「免疫原性ポリペプチド」と総称する。得られた抗血清を場合により対照シンテターゼ相同体に対する交差反応性が低くなるように選択し、ポリクローナル抗血清をイムノアッセイで使用する前に例えば対照シンテターゼ相同体の１種以上に免疫吸着させることによりこのような交差反応性を除去する。
【０２０７】
イムノアッセイで使用する抗血清を作製するためには、免疫原性ポリペプチドの１種以上を本明細書に記載するように作製し、精製する。例えば、組換えタンパク質を組換え細胞で生産することができる。標準マウス免疫プロトコールに従って近交系マウス（マウスの仮想遺伝子一致により結果の再現性が高いのでこのアッセイで使用）に標準アジュバント（例えばフロイントアジュバント）と共に免疫原性タンパク質を免疫する（抗体作製、イムノアッセイフォーマット及び特異的免疫反応性を測定するために使用可能な条件の標準解説については、例えばＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照。本明細書に示した他の抗体関連文献もこの場合の免疫反応性によるポリペプチドの特性決定に適用することができる）。あるいは、本明細書に開示する配列から誘導される１種以上の合成又は組換えポリペプチドをキャリヤータンパク質に結合させて免疫原として使用してもよい。
【０２０８】
ポリクローナル血清を収集し、イムノアッセイ（例えば固体支持体に固定化した免疫原性タンパク質の１種以上を使用する固相イムノアッセイ）で免疫原性ポリペプチドに対する力価を測定する。１０6以上の力価をもつポリクローナル抗血清を選択し、プールし、対照シンテターゼポリペプチドでサブトラクションし、高力価ポリクローナル抗血清サブトラクションプールを作製する。
【０２０９】
高力価ポリクローナル抗血清サブトラクションプールを比較イムノアッセイで対照相同体に対する交差反応性について試験する。この比較アッセイでは、高力価ポリクローナル坑血清が免疫原性シンテターゼと結合する場合のシグナル対ノイズ比が対照シンテターゼ相同体と結合する場合の少なくとも約５〜１０倍となるように、サブトラクション高力価ポリクローナル坑血清に差別的な結合条件を決定する。即ち、アルブミン又は脱脂粉乳等の非特異的競合剤を加えるか及び／又は塩条件、温度及び／又はその他を調節することにより結合反応のストリンジェンシーを調整する。これらの結合条件は、試験ポリペプチド（免疫原性ポリペプチド及び／又は対照ポリペプチドに比較するポリペプチド）がサブトラクションポリクローナル坑血清プールに特異的に結合するか否かを調べる後期アッセイで使用される。特に、差別的結合条件下で対照シンテターゼ相同体の少なくとも２〜５倍のシグナル対ノイズ比と、免疫原性ポリペプチドの少なくとも約１．５倍のシグナル対ノイズ比を示す試験ポリペプチドは公知シンテターゼに比較して免疫原ポリペプチドと実質的な構造類似性をもつので、本発明のポリペプチドである。
【０２１０】
別の例では、試験ポリペプチドの検出に競合結合フォーマットのイムノアッセイを使用する。例えば、自明の通り、対照ポリペプチドに免疫吸着させることにより坑血清混合物プールから交差反応性抗体を除去する。次に、免疫原性ポリペプチドを固体支持体に固定化し、支持体をサブトラクション坑血清プールに暴露する。試験タンパク質をアッセイに加え、サブトラクション坑血清プールとの結合を競合させる。試験タンパク質が固定化タンパク質に対してサブトラクション坑血清プールとの結合を競合する能力と、アッセイに加えた免疫原性ポリペプチドが結合を競合する能力とを比較する（免疫原性ポリペプチドは坑血清プールとの結合を固定化免疫原性ポリペプチドと有効に競合する）。標準計算を使用して試験タンパク質の交差反応性百分率を計算する。
【０２１１】
平行アッセイで場合により対照タンパク質がサブトラクション坑血清プールとの結合を競合する能力を免疫原性ポリペプチドが坑血清との結合を競合する能力と比較測定する。この場合も、標準計算を使用して対照ポリペプチドの交差反応性百分率を計算する。試験ポリペプチドの交差反応性百分率が対照ポリペプチドの少なくとも５〜１０倍である場合又は試験ポリペプチドの結合が免疫原性ポリペプチドの結合とほぼ同一範囲である場合に、試験ポリペプチドはサブトラクション坑血清プールに特異的に結合すると言う。
【０２１２】
一般に、本明細書に記載する競合的結合イムノアッセイでは任意試験ポリペプチドを免疫原性及び／又は対照ポリペプチドに比較するために免疫吸着坑血清プールを使用することができる。この比較を行うためには、免疫原性、試験及び対照ポリペプチドを各々広い濃度範囲でアッセイし、サブトラクション坑血清と例えば固定化した対照、試験又は免疫原性タンパク質との結合の５０％を阻害するために必要な各ポリペプチドの量を標準技術により決定する。競合アッセイで結合に必要な試験ポリペプチドの量が免疫原性ポリペプチドの必要量の２倍未満であり、対照ポリペプチドの少なくとも約５〜１０倍である場合には試験ポリペプチドは免疫原性タンパク質に対して作製した抗体に特異的に結合すると言う。
【０２１３】
特異性の付加試験として、得られる免疫原性ポリペプチドサブトラクション坑血清プールと免疫吸着に使用する免疫原性ポリペプチドの結合が殆ど又は全く検出できなくなるまで場合により坑血清プールを（対照ポリペプチドではなく）免疫原性ポリペプチドに完全に免疫吸着させる。この完全に免疫吸着した坑血清を次に試験ポリペプチドとの反応性について試験する。反応性が殆ど又は全く観察されない場合（即ち完全に免疫吸着した坑血清と免疫原性ポリペプチドの結合に観察されるシグナル対ノイズ比の２倍以下）には、試験ポリペプチドは免疫原性タンパク質により誘導される坑血清に特異的に結合する。
【０２１４】
一般技術
【０２１５】
分子生物学技術について記載している一般教科書としてはＢｅｒｇｅｒとＫｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １５２ ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−Ａ ＬａｂｏｒａｇｏｒｙＭａｎｕａｌ（第３版），Ｖｏｌ．１−３，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，２０００（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）；及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，編，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２年補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）が挙げられる。これらの教科書は突然変異誘発、ベクターの使用、プロモーター及び他の多くの関連事項について記載しており、例えば直交ｔＲＮＡ、直交シンテターゼ及びその対の作製について記載している。
【０２１６】
例えば新規シンテターゼ又はｔＲＮＡを生産するために、本発明では各種突然変異誘発を使用する。これらの方法としては部位特異的、ランダム点突然変異誘発、相同組換え（ＤＮＡシャフリング）、ウラシル含有鋳型を使用する突然変異誘発、オリゴヌクレオチド誘導突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップデュプレクスＤＮＡを使用する突然変異誘発等が挙げられるが、これらに限定されない。他の利用可能な方法としては点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用する突然変異誘発、制限−選択及び制限−精製、欠失突然変異誘発、完全遺伝子合成による突然変異誘発、２本鎖切断修復等が挙げられる。例えばキメラ構築物を使用する突然変異誘発も本発明に含まれる。１態様では、天然分子又は改変もしくは突然変異させた天然分子の公知情報（例えば配列、配列比較、物性、結晶構造等）により突然変異誘発を実施することができる。
【０２１７】
本明細書に記載する上記教科書と実施例はこれらの手順について記載している。以下の刊行物とその引用文献にも情報が記載されていれる。Ｓｉｅｂｅｒら，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９：４５６−４６０（２００１）；Ｌｉｎｇら，Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ＤＮＡ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎｏｖｅｒｖｉｅｗ，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４（２）：１５７−１７８（１９９７）；Ｄａｌｅら，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｍｅｔｈｏｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：３６９−３７４（１９９６）；Ｉ．Ａ．Ｌｏｒｉｍｅｒ，Ｉ．Ｐａｓｔａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，３０６７−８（１９９５）；Ｗ．Ｐ．Ｃ．Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ３７０，３８９−９１（１９９４）；Ａｒｎｏｌｄ，Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｆｏｒ ｕｎｕｓｕａｌ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：４５０−４５１（１９９３）；Ｂａｓｓら，Ｍｕｔａｎｔ Ｔｒｐ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ ｗｉｔｈ ｎｅｗ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：２４０−２４５（１９８８）；Ｆｒｉｔｚら，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ａｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｅｎｚｙｍａｔｉｃｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６：６９８７−６９９９（１９８８）；Ｋｒａｍｅｒら，Ｉｍｐｒｏｖｅｄｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ １６：７２０７（１９８８）；Ｓａｋａｍａｒ＆ Ｋｈｏｒａｎａ，Ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ａ−ｓｕｂｕｎｉｔｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｒｏｄ ｏｕｔｅｒ ｓｅｇｍｅｎｔ ｇｕａｎｉｎｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ），Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１４：６３６１−６３７２（１９８８）；Ｓａｙｅｒｓら，Ｙ−ＴＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６：７９１−８０２（１９８８）；Ｓａｙｅｒｓら，Ｓｔｒａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＤＮＡ ｂｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ，（１９８８）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６：８０３−８１４；Ｃａｒｔｅｒ，Ｉｍｐｒｏｖｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａ��ｅｎｅｓｉｓｕｓｉｎｇ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３８２−４０３（１９８７）；Ｋｒａｍｅｒ ＆ Ｆｒｉｔｚ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｖｉａ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘＤＮＡ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３５０−３６７（１９８７）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．ａｎｄ Ｌｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．Ｊ．編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ））（１９８７）；Ｋｕｎｋｅｌら，Ｒａｐｉｄａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３６７−３８２（１９８７）；Ｚｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０（１９８７）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１−７（１９８６）；Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｕｓｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｌａｒｇｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：５１１５（１９８６）；Ｍａｎｄｅｃｋｉ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ ｒｅｐａｉｒｉｎ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ａ ｍｅｔｈｏｄｆｏｒ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：７１７７−７１８１（１９８６）；ＮａｋａｍａｙｅとＥｃｋｓｔｅｉｎ，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｃｏｎｕｃｌｅａｓｅＮｃｉＩ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｇｒｏｕｐｓ ａｎｄｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：９６７９−９６９８（１９８６）；Ｗｅｌｌｓら，Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓｔａｔｅ ｏｆ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ，Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ３１７：４１５−４２３（１９８６）；Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ＆ Ｓｈｏｒｔｌｅ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１１９３−１２０１（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒら，Ｉｍｐｒｏｖｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３（１９８５）；Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｍら，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ '
ｓｈｏｔ−ｇｕｎ' ｇｅｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３３０５−３３１６（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８−４９２（１９８５）；Ｓｍｉｔｈ，Ｉｎｖｉｖｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３−４６２（１９８５）；Ｔａｙｌｏｒら，Ｔｈｅｕｓｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄＤＮＡ ｉｎ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｎｉｃｋｅｄ ＤＮＡ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１３：８７４９−８７６４（１９８５）；Ｔａｙｌｏｒら，Ｔｈｅｒａｐｉｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ ｈｉｇｈ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｕｓｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄＤＮＡ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：８７６５−８７８７（１９８５）；Ｗｅｌｌｓら，Ｃａｓｓｅｔｔｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ ｄｅｆｉｎｅｄ ｓｉｔｅｓ，Ｇｅｎｅ ３４：３１５−３２３（１９８５）；Ｋｒａｍｅｒら，Ｔｈｅ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２：９４４１−９４５６（１９８４）；Ｋｒａｍｅｒら，ＰｏｉｎｔＭｉｓｍａｔｃｈ Ｒｅｐａｉｒ，Ｃｅｌｌ ３８：８７９−８８７（１９８４）；Ｎａｍｂｉａｒら，Ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＳ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：１２９９−１３０１（１９８４）；Ｚｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｆ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ Ｍ１３ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）；及びＺｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３−ｄｅｒｉｖｅｄｖｅｃｔｏｒｓ：ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｎｙ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１０：６４８７−６５００（１９８２）。上記方法の多くに関する更に詳細な説明はＭｅｔｈｏｄｓｉｎ ＥｎｚｏｍｏｌｏｇｙＶｏｌｕｍｅ １５４に記載されており、この文献には各種突然変異誘発法に伴うトラブルシューティング問題の有用な解決方法も記載されている。
【０２１８】
例えば本発明の突然変異誘発（例えばシンテターゼのライブラリーの突然変異又はｔＲＮＡの改変）に使用するオリゴヌクレオチドは一般にＢｅａｕｃａｇｅとＣａｒｕｔｈｅｒｓ，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｓ．２２（２０）：１８５９−１８６２（１９８１）により記載されている固相ホスホロアミダイトトリエステル法に従い、例えばＮｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：６１５９−６１６８（１９８４）に記載されているような自動合成器を使用して化学的に合成される。
【０２１９】
更に、Ｔｈｅ Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（ｍｃｒｃ＠ｏｌｉｇｏｓ．ｃｏｍ）、ＴｈｅＧｒｅａｔ Ａｍｅｒｉｃａｎ ＧｅｎｅＣｏｍｐａｎｙ（ｗｗｗ．ｇｅｎｃｏ．ｃｏｍ）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍ）、ＯｐｅｒｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）、その他多数の各種販売会社からほぼ任意核酸（及び標準又は標準外を問わずほぼ任意標識核酸）をオーダーメード又は標準注文することができる。
【０２２０】
本発明は直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対を介する非天然アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ組込みに用いる宿主細胞及び生物にも関する。例えばクローニングベクター又は発現ベクターとすることができる本発明のベクターで宿主細胞を遺伝子組換え（例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション）する。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。ベクターはエレクトロポレーション（Ｆｒｏｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２，５８２４（１９８５））、ウイルスベクターによる感染、核酸を小ビーズもしくは粒子のマトリックスに埋込むか又は表面に付着させて小粒子形態で高速射入する（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ３２７，７０−７３（１９８７）等の標準方法により細胞及び／又は微生物に導入する。Ｂｅｒｇｅｒ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＡｕｓｕｂｅｌには各種の適当な形質転換法が記載されている。
【０２２１】
組換え宿主細胞は例えばスクリーニング段階、プロモーター活性化又は形質転換細胞選択等の操作に合うように適宜改変した慣用栄養培地で培養することができる。これらの細胞を場合によりトランスジェニック生物で培養することができる。
【０２２２】
（例えば後期核酸分離のための）例えば細胞分離及び培養に関する他の有用な文献としてはＦｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第３版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋとその引用文献；Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；ＧａｍｂｏｒｇとＰｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ＬａｂＭａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；及びＡｔｌａｓとＰａｒｋｓ（編）ＴｈｅＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬが挙げられる。
【０２２３】
ターゲット核酸を宿主細胞に導入する方法としては数種の周知方法が入手可能であり、本発明ではその任意のものを使用することができる。これらの方法としては、ＤＮＡを含む細菌プロトプラストとレシピエント細胞の融合、エレクトロポレーション、遺伝子銃及びウイルスベクターによる感染等が挙げられる。本発明のＤＮＡ構築物を含むプラスミドの数を増幅するためには細菌細胞を使用することができる。対数期まで細菌細胞を増殖させると、細菌内のプラスミドを当分野で公知の各種方法により分離することができる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ参照）。更に、細菌からプラスミドを精製するために多数のキットが市販されている（例えばＥａｓｙＰｒｅｐ（登録商標）、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ（登録商標）（いずれもＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）；ＳｔｒａｔａＣｌｅａｎ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；及びＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ））。分離精製したプラスミドを更に操作して他のプラスミドを作製し、細胞をトランスフェクトするために使用するか又は生物に感染させるために関連ベクターに組込む。典型的ベクターは転写及び翻訳ターミネーターと、転写及び翻訳開始配列と、特定ターゲット核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは場合により少なくとも１個の独立ターミネーター配列と、真核生物又は原核生物又は両者（例えばシャトルベクター）でカセットの複製を可能にする配列と、原核系と真核系の両者の選択マーカーを含む包括的発現カセットを含む。ベクターは原核生物、真核生物、又は好ましくは両者での複製と組込みに適している。Ｇｉｌｉｍａｎ＆ Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．ら，ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６４３５：１０（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｂｅｒｇｅｒ（いずれも前出）参照。クローニングに有用な細菌とバクテリオファージのカタログは例えばＡＴＣＣから入手でき、例えばＡＴＣＣから刊行されたＴｈｅＡＴＣＣ Ｃａｔａｌｏｇｕｅｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（１９９２）Ｇｈｅｒｎａら（編）が挙げられる。その他のシーケンシング、クローニング及び分子生物学の他の側面の基本手順と基礎理論事項もＷａｔｓｏｎら（１９９２）ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ 第２版，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，ＮＹに記載されている。
【０２２４】
以下、実施例により本発明を説明するが、これらの実施例により発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０２２５】
実施例１−Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来ｔＲＮＡの直交性の改善
【０２２６】
タンパク質翻訳の忠実度を高くするために必要なｔＲＮＡ−シンテターゼ相互作用の複雑な性質により、直交ｔＲＮＡ−シンテターゼ対の合理的設計は困難である。本実施例は所定の異種間ｔＲＮＡ−シンテターゼ対の交差認識が弱いことを利用し、高い直交性をもつｔＲＮＡの後期ｉｎ  ｖｉｖｏ進化と組合せる方法に関する。Ｌ．ＷａｎｇとＰ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，８：８８３（２００１）も参照されたい。具体的には、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｔＲＮＡＴｙｒに由来するアンバーサプレッサーｔＲＮＡのライブラリーを作製した。バルナーゼ遺伝子におけるアンバーナンセンス突然変異の抑圧に基づくネガティブ選択により、内在大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの基質であるｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡをプールから除去した。次に、残りのｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡのうちでコグネイトＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）の存在下にβラクタマーゼ遺伝子のアンバーナンセンスコドンを抑圧できるものを選択した。Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡよりも弱い大腸菌シンテターゼの基質であるが、効率的にＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳにより負荷することができる４個の突然変異体サプレッサーｔＲＮＡを選択した。突然変異体サプレッサーｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳと共に非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質組込みに有用な直交ｔＲＮＡ−シンテターゼ対を提供する。
【０２２７】
始原菌であるＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのｔＲＮＡＴｙｒは大腸菌ｔＲＮＡＴｙｒと異なるアイデンティティーエレメントをもつ。特に、大腸菌ｔＲＮＡＴｙｒはアクセプターステムにＧ１Ｃ７２対をもつが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｔＲＮＡＴｙｒはＣ１Ｇ７２対をもつ。Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｔＲＮＡＴｙｒに由来するアンバーサプレッサーｔＲＮＡは効率的に大腸菌シンテターゼによりアミノアシル化されないが、大腸菌でタンパク質翻訳に効率的に機能することが判明した。例えばＬ．Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｊ．Ｍａｇｌｉｅｒｙ，Ｄ．Ｒ．Ｌｉｕ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａ  ｎｅｗ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｔＲＮＡ／ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｐａｉｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：５０１０−５０１１（２０００）参照。更に、最低限のアンチコドン−ループ結合ドメインしかもたないＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳは大腸菌ｔＲＮＡをアミノアシル化しないが、それ自体のサプレッサーｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡを効率的にアミノアシル化する。例えばＢ．Ａ．Ｓｔｅｅｒ，Ｐ．Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，Ｍａｊｏｒ  ａｎｔｉｃｏｄｏｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ｍｉｓｓｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（１９９９）３５６０１−３５６０６；及びＷａｎｇら，（２０００），前出参照。
【０２２８】
大腸菌でこのサプレッサーｔＲＮＡの直交性を試験するために、βラクタマーゼの許容部位（Ａｌａ１８４）にアンバーコドンを導入した。例えばＤ．Ｒ．Ｌｉｕ，Ｐ．Ｇ．  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：４７８０−４７８５（１９９９）参照。大腸菌シンテターゼにより負荷することができるｔＲＮＡはアンバーコドンを抑圧し、アンピシリンの存在下で細胞を生存させる。Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡはＩＣ50値５６μｇ／ｍｌアンピシリンでβラクタマーゼ遺伝子内のアンバーコドンを抑圧する。Ｗａｎｇら，（２０００），前出参照。これに対して、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｔＲＮＡＧｌｎ２に由来する直交ｔＲＮＡＧｌｎＣＵＡを同一アッセイで試験するとＩＣ50は２１μｇ／ｍｌアンピシリンである。Ｌｉｕ  ＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（１９９９），前出参照。サプレッサーｔＲＮＡの不在下の大腸菌のＩＣ50は１０μｇ／ｍｌアンピシリンである。この結果はＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡがｔＲＮＡＧｌｎＣＵＡよりも良好な大腸菌シンテターゼの基質であることを示している。従って、非天然アミノ酸を大腸菌中のタンパク質に送達するためにＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡをｉｎ  ｖｉｖｏ使用するならば、天然アミノ酸も大腸菌シンテターゼにより誤って負荷される可能性があり、異種アミノ酸組込みを生じる恐れがある。
【０２２９】
内在大腸菌シンテターゼによる認識を防ぐために「ネガティブ認識決定基」の導入によりＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡの直交性の改善を行った。これらの突然変異はｔＲＮＡとそのコグネイトＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳ又はリボソームとの相互作用を強く妨害するものであってはならない。Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳはアンチコドン結合ドメインの大半を欠失しているので（例えばＢ．Ａ．Ｓｔｅｅｒ，Ｐ．Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，Ｍａｊｏｒ  ａｎｔｉｃｏｄｏｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ｍｉｓｓｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３５６０１−３５６０６（１９９９）参照）、ｔＲＮＡのアンチコドンループに導入した突然変異はＴｙｒＲＳ認識に最小の影響しかないと予想される。４個のランダム突然変異ヌクレオチドをもつアンチコドンループライブラリーを構築した。図９参照。各種大腸菌ｔＲＮＡのアイデンティティーエレメントの組合せと位置は多様であるので、付加位置に突然変異を導入すると、所望特性をもつ突然変異体ｔＲＮＡをみつける確率を増すことができる。そこで、全ｔＲＮＡループの非保存位置に突然変異を含む第２のライブラリー（全ループライブラリー）も構築した。図９参照。保存ヌクレオチドはランダム突然変異させず、ｔＲＮＡの「Ｌ」字形構造を安定化する三次相互作用を維持した。例えばＧ．Ｄｉｒｈｅｉｍｅｒ，Ｇ．Ｋｅｉｔｈ，Ｐ．Ｄｕｍａｓ，Ｅ．Ｗｅｓｔｈｏｆ，Ｐｒｉｍａｒｙ，ｓｅｃｏｎｄａｒｙ，ａｎｄ  ｔｅｒｔｉａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔＲＮＡｓ，ｉｎ：Ｄ．Ｓｏｌｌ，Ｕ．Ｌ．ＲａｊＢｈａｎｄａｒｙ（編），ｔＲＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，１９９５，ｐｐ．９３−１２６；及びＲ．Ｇｉｅｇｅ，Ｍ．Ｓｉｓｓｌｅｒ，Ｃ．Ｆｌｏｒｅｎｔｚ，Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｒｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｉｄｉｏｓｙｎｃｒａｔｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｔＲＮＡ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：５０１７−５０３５（１９９８）参照。ステムヌクレオチドを１個置換するには補償突然変異が必要であるのでステムヌクレオチドも突然変異させなかった。１１個のヌクレオチド（Ｃ１６，Ｃ１７，Ｕ１７ａ，Ｕ２０，Ｃ３２，Ｇ３７，Ａ３８，Ｕ４５，Ｕ４７，Ａ５９及びＵ６０）をランダム突然変異させた。図９参照。このライブラリーの理論寸法は約４．１９×１０6 であり、突然変異体ライブラリーを完全にカバーするように約１．９３×１０8 コロニー形成単位の寸法のライブラリーを構築した。
【０２３０】
本方法ではＧｉｂｃｏ／ＢＲＬから入手した大腸菌株（例えばＤＨ１０Ｂ）を使用した。サプレッサーｔＲＮＡ発現プラスミドはプラスミド（例えばｐＡＣ１２３）から誘導した。例えばＤ．Ｒ．Ｌｉｕ，Ｔ．Ｊ．Ｍａｇｌｉｅｒｙ，Ｍ．Ｐａｓｔｒｎａｋ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａ  ｔＲＮＡ  ａｎｄ  ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１００９１−１００９７（１９９７）参照。ネガティブ選択用プラスミドは後述するようなプラスミド（例えばｐＢＡＴＳ、ｐＹｓｕｐＡ３８Ｂ２及びｐＹｓｕｐＡ３８Ｂ３）から誘導した。例えばＫ．Ｇａｂｒｉｅｌ，Ｗ．Ｈ．ＭｃＣｌａｉｎ，Ａ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ＲＮＡ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９０（１９９９）３８５−３８９；及びＬｉｕ  ＆  Ｓｈｕｌｔｚ，（１９９９），前出参照。
【０２３１】
直交性が増したＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｔＲＮＡライブラリーのメンバーを選択するために、コグネイトシンテターゼの不在下と存在下のネガティブ選択とポジティブ選択の組合せを使用した。図８参照。ネガティブ選択では、セレクターコドン（例えばアンバーナンセンス）をネガティブマーカー遺伝子（例えば毒性遺伝子）の例えば非必須位置に導入する。突然変異（例えばサプレッサー）ｔＲＮＡライブラリーのメンバーが内在（例えば大腸菌）シンテターゼによりアミノアシル化される（即ち大腸菌シンテターゼに対して直交性でない）ならば、セレクターコドンは抑圧され、毒性遺伝子産物が生産され、細胞死に至る。直交ｔＲＮＡ又は非機能的ｔＲＮＡをもつ細胞のみが生存することができる。その後、全生存細胞をポジティブ選択し、セレクターコドン（例えばアンバーコドン）をポジティブ選択マーカー（例えば薬剤耐性遺伝子）の例えば非必須位置に挿入する。その後、同時発現したコグネイトシンテターゼによりアミノアシル化され、このセレクターコドンに応答してアミノ酸を挿入することができるｔＲＮＡを選択する。非機能的ｔＲＮＡ又は所期シンテターゼにより認識することができないｔＲＮＡを含む細胞は抗生物質に感受性である。従って、（１）内在大腸菌シンテターゼの基質でなく、（２）所期シンテターゼによりアミノアシル化することができ、（３）翻訳能力のあるｔＲＮＡのみが両者選択後に生存している。
【０２３２】
その天然阻害剤であるバルスターの不在下に大腸菌で生産した場合のバルナーゼの毒性を利用したネガティブ選択を採用した。例えばＲ．Ｗ．Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｂａｒｎａｓｅ  ａｎｄ  ｂａｒｓｔａｒ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｃｌｏｎｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐｅｒｍｉｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｌｏｎｅｄ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０２：９１３−９１５（１９８８）参照。バルナーゼの三次元構造の分析に基づいてバルナーゼ遺伝子の非必須位置にアンバーコドンを導入した。例えばＬｉｕ  ＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（１９９９），前出参照。バルナーゼは自家毒性が非常に強いので、バルナーゼを発現するプラスミドに低コピー数ｐＳＣ１０１起点を導入した。更に、選択のストリンジェンシーを調節するためにアンバーコドンの数を変えて試験した。プラスミドｐＳＣＢ２を使用し、Ｇｌｎ２とＡｓｐ４４に２個のアンバー終止コドンをもつバルナーゼ突然変異体を発現させ、プラスミドｐＳＣＢ３には更にＧｌｙ６５にもアンバー終止コドンを付加した。
【０２３３】
ネガティブ選択には、以下のオリゴヌクレオチドＬＷ１１５：５' −ＡＴＧＣＡＴＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡＴＧＡＡＴＣＧＧＣＣＡＡＣＧ−３' 及びＬＷ１１６：５' −ＴＣＣＣＣＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＣＴＴＴＴＣＧＧＧＧ−３' を使用してｐＢＡＴＳからβラクタマーゼ遺伝子とｐＳＣ１０１起点を含むＰＣＲフラグメントを作製した。ＳａｃＩＩとＳｐｈＩで消化することにより夫々ｐＹｓｕｐＡ３８Ｂ２とｐＹｓｕｐＡ３８Ｂ３から２個（残基Ｇｌｎ２及びＡｓｐ４４）又は３個（残基Ｇｌｎ２、Ａｓｐ４４及びＧｌｙ６５）のアンバーコドンを含むバルナーゼをコードするＤＮＡを得た。上記フラグメントをライゲートし、プラスミドｐＳＣＢ２及びｐＳＣＢ３を得た。バルナーゼの発現はアラビノースで誘導した。ｉｎ  ｖｉｖｏ発現のために各種サプレッサーｔＲＮＡをコードする遺伝子を２個のオーバーラップする合成オリゴヌクレオチド（Ｏｐｅｒｏｎ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ，米国）からＫｌｅｎｏｗ伸長により構築し、ｐＡＣ１２３のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ部位間に挿入し、ｌｐｐプロモーターとｒｒｎＣターミネーターの制御下に転写するｐＡＣ−ＹＹＧ１とｐＡＣ−ＪＹを夫々作製した。ｐＡＣ−ＣｍはｔＲＮＡをもたない対照プラスミドである。ネガティブ選択条件を最適化するために、ｐＳＣＢ２又はｐＳＣＢ３を含むコンピテントＤＨ１０Ｂ細胞をエレクトロポレーションによりｐＡＣ−Ｃｍ、ｐＡＣ−ＹＹＧ１及びｐＡＣ−ＪＹで別々に形質転換した。単コロニーを釣菌し、クロラムフェノコール（Ｃｍ，３４μｇ／ｍｌ）とアンピシリン（Ａｍｐ，１００μｇ／ｍｌ）を加えた２×ＹＴで増殖させた。一晩増殖させた細胞培養液を１％グリセロールと０．３ｍＭロイシンを加えた最少培地（ＧＭＭＬ）で２回洗浄し、ＣｍとＡｍｐを加えたＧＭＭＬにＯＤ６００＝０．１まで再懸濁した。３０℃で１０分間再生後に第１の培養液（第１組）に２０ｍＭアラビノースを加えてバルナーゼの発現を誘導し、第２の培養液（第２組）にはアラビノースを加えなかった。各時点で少量の培養液を希釈し、ＣｍとＡｍｐを加えた２×ＹＴ寒天に撒き、細胞密度を測定した。サプレッサーｔＲＮＡライブラリーのネガティブ選択のために、ｐＳＣＢ２を含むＤＨ１０Ｂ細胞にライブラリーを含むｐＡＣプラスミドを形質転換した。ＳＯＣ培地を加えて細胞をクエンチし、３０℃で１時間再生した後、リン酸緩衝液とＧＭＭＬで洗浄し、ＧＭＭＬ１リットル中で培養した。３０℃で３０分間再生後にＣｍ、Ａｍｐ及び２０ｍＭアラビノースを加えた。３６時間後に細胞をペレット化し、ｐＡＣプラスミドを単離し、アガロースゲル電気泳動により精製した。
【０２３４】
選択条件を最適化するために、大腸菌シンテターゼにより正しく認識されることが分かっている２個のサプレッサーｔＲＮＡを使用した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来する突然変異体サプレッサーｔＲＮＡＴｙｒ（ｐＡＣ−ＹＹＧ１で発現させたｓｃ−ｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡ）はβラクタマーゼ遺伝子のアンバーコドン（Ａｌａ１８４ＴＡＧ）を抑圧し、大腸菌細胞のＩＣ50が１２μｇ／ｍｌアンピシリンであり、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来するサプレッサーｔＲＮＡＴｙｒ（ｐＡＣ−ＪＹで発現させたｍｊ−ｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡ）は大腸菌細胞のＩＣ50が５６μｇ／ｍｌである。例えばＷａｎｇら，（２０００），前出参照。これに対して、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｔＲＮＡＧｌｎ２に由来するサプレッサーｔＲＮＡＧｌｎＣＵＡを同一アッセイで試験するとＩＣ50＝２１μｇ／ｍｌアンピシリンであり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで大腸菌シンテターゼに直交性であることが判明した。例えばＬｉｕ  ＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（１９９９），前出参照。従って、ｍｊ−ｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡを発現する細胞を排除し且つｓｃ−ｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡを発現する細胞の増殖を許容するネガティブ選択は非直交サプレッサーｔＲＮＡを排除する。１％グリセロールと０．３ｍＭロイシンを加えた液体最少培地（ＧＭＭＬ）にプラスミドｐＳＣＢ２とｐＡＣプラスミドを維持するのに適した抗生物質を加えて細胞を増殖させた。第１組の細胞（第１組）にはバルナーゼの発現を誘導するためにアラビノースを加え、第２組にはアラビノースを加えなかった。選択後に生存している細胞画分を第１組と第２組の細胞密度の比により決定した。図１１参照。対照プラスミドｐＡＣ−Ｃｍ（サプレッサーｔＲＮＡなし）とプラスミドｐＡＣ−ＹＹＧ１を含む細胞は生存したが、プラスミドｐＡＣ−ＪＹを含む細胞は大半が死滅した。プラスミドｐＳＣＢ３を使用した場合には、プラスミドｐＡＣ−ＪＹを含む細胞は２４時間以内に増殖し始めた。従って、上記ライブラリー選択条件下で２個のアンバーコドンを含むバルナーゼ遺伝子をコードするｐＳＣＢ２を使用してネガティブ選択を実施した。
【０２３５】
ポジティブ選択には、オリゴヌクレオチドＬＷ１０４：５' −ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＴＡＧＧＡＣＧＡＡＴＴＴＧＡＡＡＴＧ−３' 及びＬＷ１０５：５' −ＡＡＡＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＡＡＴＣＴＣＴＴＴＣＴＡＡＴＴＧＧＣＴＣ−３' を使用してｐＢＬＡＭ−ＹＱＲＳのＮｄｅＩ−ＰｓｔＩ部位間にｐＢＳＡ５０からのＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳ遺伝子を挿入することによりプラスミド（例えばｐＢＬＡＭ−ＪＹＲＳ）を構築した。例えばＳｔｅｅｒら，（１９９９），前出、及びＬｉｕ  ＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（１９９９），前出参照。ポジティブ選択条件を最適化するために、ｐＢＬＡＭ−ＪＹＲＳを含むコンピテントＤＨ１０Ｂ細胞をｐＡＣ−Ｃｍ、ｐＡＣ−ＹＹＧ１及びｐＡＣ−ＪＹで別々に形質転換した。単コロニーを釣菌し、Ｃｍとテトラサイクリン（Ｔｅｔ，４０μｇ／ｍｌ）を加えた２×ＹＴで増殖させた。液相選択では、出発時のＯＤ６００が０．１となるようにＣｍとＴｅｔを加えた２×ＹＴで一晩細胞培養液を希釈した。各種濃度のＡｍｐを加え、ＯＤ６００により細胞増殖をモニターした。プレート選択では、ＣｍとＴｅｔと一方の組には５００μｇ／ｍｌＡｍｐも加えた２×ＹＴ寒天プレート２組に細胞約１０３〜１０５個を撒いた。突然変異体ｔＲＮＡライブラリーの選択では、ｐＢＬＡＭ−ＪＹＲＳを含むコンピテントＤＨ１０Ｂ細胞にネガティブ選択からの細胞から単離したｐＡＣプラスミドを形質転換した。細胞を３７℃で４５分間再生させ、Ｃｍ、Ｔｅｔ及び５００μｇ／ｍｌ  Ａｍｐを加えた各２×ＹＴ寒天プレートに細胞約１０５個を撒いた。２４時間後にコロニーを釣菌し、Ｃｍ、Ｔｅｔ及び２００μｇ／ｍｌ  Ａｍｐを加えた２×ＹＴ６ｍｌ中で再増殖させた。ＤＮＡを単離し、アガロースゲル電気泳動により精製した。
【０２３６】
ポジティブ選択はＴＥＭ−１βラクタマーゼ遺伝子のＡｌａ１８４位に導入したアンバー終止コドンの抑圧に基づいて行う。プラスミドｐＢＬＡＭ−ＪＹＲＳはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼの遺伝子とＡｌａ１８４にアンバー突然変異をもつβラクタマーゼをコードする。ネガティブ選択後に生存している細胞から単離したｐＡＣプラスミドをｐＢＬＡＭ−ＪＹＲＳと共に大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞に同時形質転換した。非機能的ｔＲＮＡ又はＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉシンテターゼの弱い基質であるｔＲＮＡを含む細胞は死滅し、シンテターゼにより負荷することができるｔＲＮＡをもつ細胞は生存する。ポジティブ選択の実施可能性を試験するために、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳの存在下に２種のモデルサプレッサーｔＲＮＡを試験した。ｓｃ−ｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡはＧ１：Ｃ７２塩基対をもち、効率的にＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳにより負荷されない。これをＡｌａ１８４アンバーβラクタマーゼ突然変異体と細胞で同時発現させると、細胞はＩＣ50＝１８μｇ／ｍｌアンピシリンまで生存した。他方、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡとコグネイトＴｙｒＲＳを含む細胞はＩＣ50＝１２２０μｇ／ｍｌアンピシリンまで生存した。例えばＷａｎｇら，（２０００），前出参照。モデルポジティブ選択をまず液体２×ＹＴ培地で試した。各種濃度のアンピシリンを加えた液体２×ＹＴ培地でｐＢＬＡＭ−ＪＹＲＳと各種ｐＡＣプラスミドを含む細胞を増殖させた結果を図１２Ａに示す。ｍｊ−ｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡで形質転換した細胞はアンピシリン濃度が高いと速い速度で増殖した。細胞を２４時間以上増殖させると、ｐＡＣ−Ｃｍ又はｐＡＣ−ＹＹＧ１で形質転換した細胞も飽和まで増殖した。従って、ポジティブ選択をプレートで１０３〜１０５／プレートの初期細胞密度で実施した。図１２Ｂ参照。生存率（アンピシリンを加えないプレートに対するアンピシリンを加えたプレートのコロニー数）は初期細胞密度を変えても有意に変化せず、増殖時間を通して安定であった。アンピシリンプレートでのポジティブ選択の結果、ｍｊ−ｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡを発現させた細胞が優先的に増殖した。従って、ライブラリー選択には液体培地でなくプレートでポジティブ選択を行った。
【０２３７】
アンチコドンループライブラリーを構築するために使用した２個のオーバーラップするオリゴヌクレオチド（ｔＲＮＡ配列を下線で示す）：ＬＷ１２５：５' −ＧＧＡＡＴＴＣ−３' 及びＬＷ１２６：５' −ＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧ−３' （配列中、Ｎは等モルのＡ、Ｃ、Ｔ又はＧである）を使用することにより突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーを作製した。全ループライブラリーのオリゴヌクレオチド配列はＬＷ１４５：５' −ＧＧＡＡＴＴＣ−３' 及びＬＷ１４６：５' −ＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧ−３' である。これらの遺伝子を上記と同様にｐＡＣ１２３に挿入し、ｔＲＮＡライブラリーを得た。
【０２３８】
アンチコドンループ及び全ループ両者のライブラリーでネガティブ及びポジティブ選択を上記のようにタンデムで実施した。選択したサプレッサーｔＲＮＡを単離し、ｐＢＬＡＭを含む大腸菌ＤＨ１０Ｂに再形質転換し、大腸菌シンテターゼに対するｔＲＮＡの直交性を試験した。次に、ｐＢＬＡＭ−ＪＹＲＳを含む大腸菌にｔＲＮＡを再形質転換し、ｔＲＮＡがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳによりどの程度の効率で負荷されたかを試験した。アンチコドンループライブラリーの１回のネガティブ及びポジティブ選択から得られたクローンを配列決定した処、３個の独立したｔＲＮＡが単離されたことが分かった。図１３参照。ｐＢＬＡＭと同時形質転換した場合には、ＩＣ50値は全てＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡよりも低く、より弱い大腸菌シンテターゼの基質であることが分かった。
【０２３９】
突然変異体ＡＡ２もＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳに対して親和性が非常に高かった。この突然変異体ｔＲＮＡは大腸菌で安定に維持することができたが、理由は不明であるが増殖速度が低下した。恐らくこのために、いずれもランダム突然変異領域の外側に突然変異をもつ突然変異体ＡＡ３及びＡＡ４が生じた。ＡＡ３又はＡＡ４を含む細胞は正常に増殖した。しかし、ＡＡ３とＡＡ４はＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳの比較的弱い基質であった。
【０２４０】
全ループライブラリーを使用する２回のネガティブ及びポジティブ選択から４個の独立ｔＲＮＡを選択した。図１３参照。いずれも親Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡよりも弱い大腸菌シンテターゼの基質であったが、ｉｎ  ｖｉｖｏβラクタマーゼアッセイによると依然としてＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳにより効率的に負荷された。表２参照。最良突然変異体Ｊ１７を発現する細胞のＩＣ50値は１２μｇ／ｍｌアンピシリンであり、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来する直交ｔＲＮＡＧｌｎＣＵＡを発現させた細胞（２１μｇ／ｍｌアンピシリン）よりも更に低い値であった。Ｊ１７をＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳと同時発現させると、細胞は４３６μｇ／ｍｌアンピシリンのＩＣ50値まで生存し、選択窓（ＴｙｒＲＳの存在下のＩＣ50とＴｙｒＲＳの不在下のＩＣ50の比）は３５倍となった。更に、これらの突然変異体ｔＲＮＡの発現は大腸菌細胞の増殖に影響を与えなかった。
【０２４１】
表２．  選択したサプレッサーｔＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏβラクタマーゼアッ
セイ                                                          
サプレッサーＴｙｒＲＳ          ＩＣ50（μｇ／ｍＬアンピシリン）      
ｐＢＬＡＭと同時        ｐＢＬＡＭ−ＪＹＲＳ
発現                    と同時発現          
ｍｊ−ｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡ    ５６                      １２２０    
ｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡなし      １０                      １０        
アンチコドンループライブラリーから選択した突然変異体ｔＲＮＡ          
ＡＡ２                        ２２                      １４２０    
ＡＡ３                        １０                      １１０      
ＡＡ４                        １２                      １３５      
全ループライブラリーから選択した突然変異体ｔＲＮＡ                    
両者選択後に生存している突然変異体ｔＲＮＡ                            
Ｊ１５                        ３０                      ８４５      
Ｊ１７                        １２                      ４３６      
Ｊ１８                        ２０                      ６３２      
Ｊ２２                        １４                      ４５９      
ネガティブ選択後のみに生存している突然変異体ｔＲＮＡ                  
Ｎ１１                        １１                      １６        
Ｎ１２                        ９                        １８        
Ｎ１３                        １０                      １２        
Ｎ１６                        ９                        ９          
プラスミドｐＢＬＡＭを使用してＡｌａ１８４にアンバーコドンをもつβラクタマーゼ遺伝子を発現させ、プラスミドｐＢＬＡＭ−ＪＹＲＳを使用してアンバー突然変異体とＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのＴｙｒＲＳを発現させた。サプレッサーｔＲＮＡはｐＡＣプラスミドでコードさせ、アッセイでｐＢＬＡＭ又はｐＢＬＡＭ−ＪＹＲＳと同時形質転換した。
【０２４２】
選択したサプレッサーｔＲＮＡの特性を確認するために、クロラムフェノコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子のアンバーコドンの抑圧に基づく別のｉｎ  ｖｉｖｏアッセイで試験した。ペリプラズムに分泌されるβ−ラクタマーゼに対して、ＣＡＴは細胞質に局在する。更にアンピシリンは殺菌性であるが、クロラムフェニコールは静菌性である。下表３に示すように、選択したサプレッサーｔＲＮＡは更にＣＡＴアッセイで直交性であり、ＣＡＴ選択に適していることが判明した。
【０２４３】
表３．  選択したサプレッサーｔＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏクロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼアッセイ                          
サプレッサーＴｙｒＲＳ        ＩＣ50（μｇ／ｍＬクロラムフェニコール）
ｐＹＣ単独        ｐＹＣ＋ｐＢＫ−ＪＹＲＳ
ｍｊ−ｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡ      ２７                    ３０８        
ｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡなし        ３                      ３            
Ｊ１５                          １１                    ２９７        
Ｊ１７                          ４                      ２４０        
Ｊ１８                          ６                      ２８４        
Ｊ２２                          ５                      ２７１        
ｐＹＣプラスミドはＡｓｐ１１２にアンバーコドンをもつクロラムフェノコールアセチルトランスフェラーゼと表の左欄に示した各種サプレッサーｔＲＮＡをコードした。ｐＢＫ−ＪＹＲＳを使用してＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのＴｙｒＲＳを発現させた。
【０２４４】
βラクタマーゼ遺伝子のアンバーコドンの抑圧に基づくｉｎ  ｖｉｖｏ相補アッセイを従来の記載通りに実施した。例えばＬｉｕ  ＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（１９９９），前出；及びＷａｎｇら，（２０００），前出参照。クロラムフェノコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）アッセイではｐＡＣＹＣ１８４のＣＡＴ遺伝子のＡｓｐ１１２をアンバーコドンで置換し、ｐＡＣＭＤ１１２ＴＡＧとした。例えばＭ．Ｐａｓｔｅｒｎａｋ，Ｔ．Ｊ．Ｍａｇｌｉｅｒｙ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａ  ｎｅｗ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｔＲＮＡ／ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｐａｉｒ  ｆｏｒ  ｅｖｏｌｖｉｎｇ  ａｎ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ８３：２２７７−２２８６（２０００）参照。ｌｐｐプロモーターとｒｒｎＣターミネーターの制御下にサプレッサーｔＲＮＡをコードする遺伝子をａＰＣプラスミドからＮｃｏＩとＡｖａＩで切出し、予め消化しておいたｐＡＣＭＤ１１２ＴＡＧに挿入し、夫々プラスミドｐＹＣ−ＪＹ、ｐＹＣ−Ｊ１５、ｐＨＣ−Ｊ１７、ｐＹＣ−Ｊ１８及びｐＹＣ−Ｊ２２を得た。ｐＢＲ３２２の誘導体であるプラスミドｐＢＫ−ＪＹＲＳを使用し、大腸菌ＧｌｎＲＳプロモーター及びターミネーターの制御下にＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳを発現させた。広い濃度範囲のクロラムフェノコールを増殖培地に加えて滴定し、ｐＹＣプラスミド単独又はｐＹＣをｐＢＫ−ＪＹＲＳと同時形質転換した大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞の生存を調べ、曲線からＩＣ50値を補間した。
【０２４５】
比較のために、ネガティブ選択のみを通過した４個のコロニーをランダムに釣菌し、ｉｎ  ｖｉｖｏ相補アッセイを使用してｔＲＮＡを試験した。ｐＢＬＡＭで形質転換した場合にはいずれもＩＣ50値が非常に低く、ネガティブ選択が良好に機能していることが判明した。表２参照。ｐＢＬＡＭ−ＪＹＲＳと同時形質転換した場合にもＩＣ50値は非常に低く、ポジティブ選択がＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳにより負荷できないｔＲＮＡを排除するように機能していることが判明した。
【０２４６】
選択したｔＲＮＡのＤＮＡ配列を分析した処、ヌクレオチド置換の特徴的パターンが明らかになった。図１３参照。ネガティブ選択とポジティブ選択の両者を通過したｔＲＮＡはいずれもＣ３２とＴ６０が不変であり、Ｇ３７がＡに突然変異し、Ｔ１７がＡ又はＧに突然変異していた。半保存変異として、Ａ３８からＣ又はＡへの突然変異、Ｔ４５からＴ又はＡへの突然変異、Ｔ４７からＧ又はＴへの突然変異もあった。他の突然変異には明白な共通パターンがなかった。ネガティブ選択のみを通過した２０個のｔＲＮＡも配列決定した処（そのうちの４個を図１３に示す）、いずれも上記共通突然変異の少なくとも１個を欠いていることが判明した。
【０２４７】
選択した突然変異体サプレッサーｔＲＮＡにおける好適ヌクレオチドは次の役割を果たすことができる。（ｉ）大腸菌シンテターゼによる認識のネガティブ決定基として機能することができる。（ｉｉ）Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳによるアミノアシル化のアイデンティティーエレメントを識別することができる。又は（ｉｉｉ）ｔＲＮＡの抑圧効率を増すようにｔＲＮＡと大腸菌翻訳機構の相互作用を最適化することもできる。アンチコドンループ及び全ループの両ライブラリーから選択したｔＲＮＡにＧ３７Ａ突然変異が認められたことに注目すべきである。この突然変異は３７位のアデニンがアンバー抑圧効率を増すことを示した従来の報告に一致している。例えばＭ．Ｙａｒｕｓ，Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＲＮＡ' ｓ：Ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ａｎｔｉｃｏｄｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１８：６４６−６５２（１９８２）；Ｄ．Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｊ．Ｖ．Ｐａｒｋ，Ｌ．Ｓｏｌｌ，ｔＲＮＡ２Ｇｌｎ  Ｓｕ＋２  ｍｕｔａｎｔｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ａｍｂｅｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｉｏｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４５：７０４−７１２（１９８２）；及びＬ．Ｇ．Ｋｌｅｉｎａ，Ｊ．Ｍａｓｓｏｎ，Ｊ．Ｎｏｒｍａｎｌｙ，Ｊ．Ａｂｅｒｌｓｏｎ，Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｏｎｓｔｒｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｍｂｅｒ  ａｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｔＲＮＡ  ｇｅｎｅｓ．ＩＩ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｔＲＮＡ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１３：７０５−７１７（１９９０）参照。ＦｅｃｈｔｅｒらはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｔＲＮＡＴｙｒの完全なアイデンティティーセットが６ヌクレオチド（Ｃ１Ｇ７２Ａ７３及びアンチコドンＧ３４Ｕ３５Ａ３６）であることを最近報告している。Ｐ．Ｆｅｃｈｔｅｒ，Ｊ．Ｒｕｄｉｎｇｅｒ−Ｔｈｉｒｉｏｎ，Ｍ．Ｔｕｋａｌｏ，Ｒ．Ｇｉｅｇｅ，Ｍａｊｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｔＲＮＡＴｙｒ  ａｒｅ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｂｕｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：７６１−７６７（２００１）参照。従って、選択した全突然変異体サプレッサーにおけるＣ３２とＴ６０の存在はＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳによる認識に必要ない。大腸菌ｔＲＮＡは４個のｔＲＮＡがＣである以外は全てが６０位にＴをもつ。Ｍ．Ｓｐｒｉｎｚｌ，Ｃ．Ｈｏｒｎ，Ｍ．Ｂｒｏｗｎ，Ａ．Ｌｏｕｄｏｖｉｔｃｈ，Ｓ．Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔＲＮＡ  ｇｅｎｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：１４８−１５３（１９９８）参照。酵母ｔＲＮＡＰｈｅの結晶構造によると、ヌクレオチド６０は他のヌクレオチドと相互作用しない。Ｊ．Ｌ．Ｓｕｓｓｍａｎ，Ｓ．Ｒ．Ｈｏｌｂｒｏｏｋ，Ｒ．Ｗ．Ｗａｒｒａｎｔ，Ｇ．Ｍ．Ｃｈｕｒｃｈ，Ｓ．Ｈ．Ｋｉｍ，Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＲＮＡ．１．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２３：６０７−６３０（１９７８）参照。従って、Ｔ６０は大腸菌翻訳機構との生産的相互作用のためにＴＣループの形状を維持すると思われる。ＴＣと保存されたＣ６１の間にヌクレオチドが挿入されるとグリシンｔＲＮＡが読み枠をシフトするので、ＴＣループ構造の変化は翻訳忠実性に影響があると思われる。Ｄ．Ｊ．Ｏ' Ｍａｈｏｎｙ，Ｂ．Ｈ．Ｈｉｍｓ，Ｓ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｇｏｌａ，Ｊ．Ｆ．Ａｔｋｉｎｓ，Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｔＲＮＡ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｔｉｃｏｄｏｎ  ｌｏｏｐ  ｓｉｚｅ  ｃａｕｓｅ  １  ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔｉｎｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７９７９−７９８３（１９８９）参照。Ｃ３２の役割は明らかでないが、大腸菌ｔＲＮＡの３２位はＴ、Ｃ及びＡを含み、２個の大腸菌ｔＲＮＡＴｙｒはＣ３２をもつ。１７ａ位については、ｔＲＮＡＴｈｒのみがこの位置にＡをもつ。
【０２４８】
選択した全サプレッサーｔＲＮＡはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡよりも弱い大腸菌シンテターゼの基質であるので、大腸菌に導入すると負荷の誤りが少なくなる。これらのｔＲＮＡは宿主細胞の増殖に悪影響を与えずに大腸菌で安定に維持することもできる。更に、効率的にＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳにより負荷することができる。これらの全特性により、突然変異体サプレッサーｔＲＮＡはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳと共に非天然アミノ酸の選択的ｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質組込みに使用する堅牢な直交ｔＲＮＡ−シンテターゼ対を形成することができる。Ｊ１７突然変異体サプレッサーｔＲＮＡと組換え突然変異体ＴｙｒＲＳを使用し、２０種の共通アミノ酸に匹敵する忠実度でＴＡＧコドンに応答してＯ−メチル−Ｌ−チロシンが送達された。Ｌ．Ｗａｎｇ，Ａ．Ｂｒｏｃｋ，Ｂ．Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：４９８−５００（２００１）参照。
【実施例２】
【０２４９】
実施例２−ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ／ＣＵＡに非天然アミノ酸Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンを負荷するようにＴｙｒＲＳを突然変異
【０２５０】
遺伝的にコードされるアミノ酸の数を拡大するユニークなトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対が大腸菌で作製されている。この対を大腸菌に導入すると、外部から増殖培地に添加した合成アミノ酸Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンをアンバーナンセンスコドンに応答してタンパク質にｉｎ  ｖｉｖｏ組込むことができる。非天然アミノ酸を含むジヒドロ葉酸レダクターゼの分析によると、翻訳忠実度は９９％を上回る。このアプローチは２０種の共通アミノ酸に存在しない新規な構造的、化学的及び物理的特性をもつ多様なアミノ酸を導入するための生きた細胞の遺伝子レパートリーを増加する一般方法を提供する。
【０２５１】
異種間アミノアシル化が非効率的であり、場合により、アンチコドンループがシンテターゼ認識の主要決定因子ではない場合には、別の生物に由来する対を導入することにより大腸菌で直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対を作製することができる。このような候補対の１例はＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのチロシルｔＲＮＡ／シンテターゼ対であり、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉはｔＲＮＡＴｙｒアイデンティティーエレメントが大腸菌ｔＲＮＡTyr と異なり（特に、アクセプターステムの第１番目の塩基対が大腸菌ではＧＣであるが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉではＣＧである）、チロシルシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）が最低限のアンチコドン−ループ結合ドメインしかもたない始原菌である。例えばＢ．Ａ．Ｓｔｅｅｒ，＆  Ｐ．Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３５６０１−６（１９９９）参照。更に、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳは編集メカニズムをもたない（例えばＪａｋｕｂｏｗｓｋｉ  ＆  Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５６：４１２（１９９２）参照）ので、ｔＲＮＡにライゲートした非天然アミノ酸を校正しないと思われる。Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳはそのコグネイトｔＲＮＡＴｙｒに由来するアンバーサプレッサーｔＲＮＡを効率的にアミノアシル化する（例えばＷａｎｇら，（２０００），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，前出参照）が、大腸菌ｔＲＮＡをアミノアシル化しない（例えばＳｔｅｅｒ  ＆  Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，（１９９９），前出参照）。更に、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｔＲＮＡCUA Tyr は大腸菌シンテターゼの弱い基質であるが、大腸菌でタンパク質翻訳に効率的に機能する。例えばＷａｎｇら，（２０００），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，前出参照。
【０２５２】
大腸菌シンテターゼによる直交ｔＲＮＡ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｔＲＮＡCUA Tyr の認識を更に弱めるために、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳと直接相互作用しないｔＲＮＡの１１個のヌクレオチド（Ｃ１６，Ｃ１７，Ｕ１７ａ，Ｕ２０，Ｃ３２，Ｇ３７，Ａ３８，Ｕ４５，Ｕ４７，Ａ５９及びＵ６０）をランダムに突然変異させ、サプレッサーｔＲＮＡライブラリーを作製した。このｔＲＮＡライブラリーをネガティブ選択（例えばバルナーゼ遺伝子等の毒性レポーター遺伝子におけるアンバー突然変異の抑圧）にかけ、大腸菌シンテターゼによりアミノアシル化されるｔＲＮＡを除去した後、効率的にＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳによりアミノアシル化されるｔＲＮＡをポジティブ選択した（例えばβラクタマーゼ遺伝子等のレポーター遺伝子におけるアンバー突然変異の抑圧）。
【０２５３】
得られたサプレッサーｔＲＮＡの直交性をベクター上のレポーター（例えばプラスミドｐＢＬＡＭに担持したＴＥＭ−１βラクタマーゼ遺伝子）の非必須位置（例えばＡｌａ１８４）のアンバー終止コドンの抑圧に基づくｉｎ  ｖｉｖｏ相補アッセイにより試験した。形質転換したサプレッサーｔＲＮＡが内在大腸菌シンテターゼによりアミノアシル化されると、アンピシリンの存在下で細胞増殖する。Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｔＲＮＡCUA Tyr とレポーター構築物ｐＢＬＡＭで形質転換した大腸菌は５５μｇ／ｍＬアンピシリンの存在下に生存する。ライブラリーから選択した最良突然変異体サプレッサーｔＲＮＡ（ｍｔＲＮＡCUA Tyr ）を発現させると、僅か１２μｇ／ｍＬのアンピシリンでも細胞は生存し、サプレッサーｔＲＮＡの不在下でも同様の結果が得られる。突然変異体サプレッサーｔＲＮＡはヌクレオチド置換Ｃ１７Ａ、Ｕ１７ａＧ、Ｕ２０Ｃ、Ｇ３７Ａ及びＵ４７Ｇを含んでいた。Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳをこのｍｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒと同時発現させると、細胞は４４０μｇ／ｍＬアンピシリンで生存する。従って、ｍｔＲＮＡCUA Tyr はＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｔＲＮＡCUA Tyr よりも弱い内在シンテターゼの基質であるが、効率的にＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳによりアミノアシル化される。
【０２５４】
ｍｔＲＮＡCUA Tyr に所望非天然アミノ酸を負荷するように直交ＴｙｒＲＳのアミノ酸特異性を改変するために、ＴｙｒＲＳ突然変異体のライブラリーを作製し、スクリーニングした。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する相同ＴｙｒＲＳの結晶構造（例えば、Ｐ．Ｂｒｉｃｋ，Ｔ．Ｎ．Ｂｈａｔ，Ｄ．Ｍ．Ｂｌｏｗ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０８：８３（１９８８））に基づき、結合チロシンのアリール環のパラ位から６．５Å以内にあるＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳの活性部位の５個の残基（Ｔｙｒ32、Ｇｌｕ107 、Ａｓｐ158 、Ｉｌｅ159 及びＬｅｕ162 ）を突然変異させた。図１４参照。これらの残基をまず全てアラニンに突然変異させ、得られた不活性Ａｌａ5 ＴｙｒＲＳを鋳型として使用し、オリゴヌクレオチドプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ランダム突然変異誘発を行った。
【０２５５】
例えば、カナマイシン耐性をもつｐＢＲ３２２由来プラスミドであるプラスミドｐＢＫ−ＪＹＲＳで大腸菌ＧｌｎＲＳプロモーター及びターミネーターの制御下にＴｙｒＲＳ遺伝子を発現させた。残基Ｔｙｒ32、Ｇｌｕ107 、Ａｓｐ158 、Ｉｌｅ159 及びＬｅｕ162 を部位特異的突然変異誘発によりＡｌａで置換し、プラスミドｐＢＫ−ＪＹＡ５を得た。突然変異部位にＮＮＫ（Ｎ＝Ａ＋Ｔ＋Ｇ＋Ｃ、Ｋ＝Ｇ＋Ｔ、及びＭ＝Ｃ＋Ａ）をもつ８種のオリゴヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチドＬＷ１５７  ５' −ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＡＣＧＡＡＴＴＴＧＡＡＡＴＧ−３' 、ＬＷ１６４  ５' −ＧＴＡＴＴＴＴＡＣＣＡＣＴＴＧＧＴＴＣＡＡＡＡＣＣＴＡＴＭＮＮＡＧＣＡＧＡＴＴＴＴＴＣＡＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＡＴＣＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＡＣ−３' 、ＬＷ１５９  ５' −ＴＡＧＧＴＴＴＴＧＡＡＣＣＡＡＧＴＧＧＴＡＡＡＡＴＡＣ−３' 、ＬＷ１６５  ５' −ＣＡＴＴＣＡＧＴＧＴＡＴＡＡＴＣＣＴＴＡＴＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＭＮＮＡＣＴＴＣＣＡＴＡＡＡＣＡＴＡＴＴＴＴＧＣＣＴＴＴＡＡＣ−３' 、ＬＷ１６１  ５' −ＴＣＣＡＧＣＴＴＧＡＴＡＡＧＧＡＴＴＡＴＡＣＡＣＴＧＡＡＴＧ−３' 、ＬＷ１６７  ５' −ＣＡＴＣＣＣＴＣＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＡＴＣＡＡＣＧＣＣＭＮＮＡＴＡＡＴＧＭＮＮＭＮＮＡＴＴＡＡＣＣＴＧＣＡＴＴＡＴＴＧＧＡＴＡＧＡＴＡＡＣ−３' 、ＬＷ１６３  ５' −ＧＣＧＴＴＧＡＴＧＴＴＧＣＡＧＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＧ−３' 、及びＬＷ１０５  ５' −ＡＡＡＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＡＡＴＣＴＣＴＴＴＣＴＡＡＴＴＧＧＣＴＣ−３' （Ｏｐｅｒｏｎ，ＣＡ））を使用してＡｌａ5 ＴｙｒＲＳ突然変異体（ｐＢＫ−ＪＹＡ５）のＰＣＲ増幅を行い、ＮｄｅＩ−ＰｓｔＩで消化したｐＢＫ−ＪＹＡ５に再ライゲートしてＴｙｒＲＳライブラリーを得た。ライゲートしたベクターを大腸菌ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞に形質転換し、１．６×１０9 コロニー形成単位（ｃｆｕ）のライブラリーを得た。４０個のランダムに釣菌したコロニーからのＴｙｒＲＳ遺伝子を配列決定した処、ランダムに突然変異させたＮＮＫ位置に塩基置換はなく、他の予想外の突然変異もないことが確認された。ライブラリーをマキシプレップにより増幅し、スーパーコイルＤＮＡを使用して選択株ｐＹＣ−Ｊ１７を形質転換した。
【０２５６】
次に、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の非必須位置（例えばＡｓｐ１１２）のアンバーコドンの抑圧に基づき、突然変異直交ＴｙｒＲＳのライブラリーをポジティブ選択にかけた。例えばＭ．Ｐａｓｔｒｎａｋ，Ｔ．Ｊ．Ｍａｇｌｉｅｒｙ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，８３：２２７７（２０００）参照。突然変異体ＴｙｒＲＳライブラリーとｍｔＲＮＡCUA Tyr 遺伝子で形質転換した細胞を、非天然アミノ酸を加えた培地で細胞を増殖させ、各種濃度のクロラムフェニコールの存在下で生存するものを選択した。突然変異体ＴｙｒＲＳが直交ｍｔＲＮＡCUA Tyr に天然又は非天然アミノ酸を負荷するならば、細胞はＣＡＴを生産し、生存する。次に生存細胞をクロラムフェニコールの存在下で非天然アミノ酸の不在下に増殖させた。非天然アミノ酸を加えたレプリカプレートから生存しなかった細胞（例えば直交ｍｔＲＮＡCUA Tyr に非天然アミノ酸を負荷する突然変異体ＴｙｒＲＳをコードする細胞）を単離した。突然変異体ＴｙｒＲＳ遺伝子をこれらの細胞から単離し、ＤＮＡシャフリングによりｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えし、クロラムフェノコール濃度を増加する後期選択のために大腸菌に再形質転換した。
【０２５７】
パラヒドロキシル基をメトキシ基で置換したチロシン類似体を選択に使用した。場合により、他のチロシン類似体も選択に使用することができ、例えばアリール環のパラ位に各種官能基（アセチル、アミノ、カルボキシル、イソプロピル、メチル、Ｏ−メチル及びニトロ等）をもつチロシン類似体が挙げられる。例えば、Ａｓｐ112 ＴＡＧＣＡＴ突然変異体もコードするｐＡＣＹＣ１８４誘導体であるプラスミドｐＹＣ−Ｊ１７でｌｐｐプロモーターとｒｒｎＣターミネーターの制御下にｍｔＲＮＡCUA Tyr をコードする遺伝子を大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞で発現させた。ｐＹＣ−Ｊ１７を導入した大腸菌ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞にＴｙｒＲＳライブラリーをコードするスーパーコイルＤＮＡを形質転換し、元のライブラリーを完全にカバーする３×１０9 ｃｆｕよりも大きい寸法のライブラリーを得た。次に、１％グリセロールと０．３ｍＭロイシンを含む最少培地（ＧＭＭＬ）プレートに１７μｇ／ｍＬテトラサイクリン（Ｔｅｔ）、２５μｇ／ｍＬカナマイシン（Ｋａｎ）、５０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（Ｃｍ）及び１ｍＭ非天然アミノ酸を加えて細胞を培養した。３７℃で４４時間培養後にＯ−メチル−Ｌ−チロシンを加えたプレート上のコロニーをプールし、プラスミドを単離し、ｐＹＣ−Ｊ１７を導入した大腸菌ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞に再形質転換し、形質転換細胞を５０μｇ／ｍＬ  Ｃｍ上でポジティブ選択した。コロニー（９６）をプレートから個々に釣菌し、液体ＧＭＭＬ培地１００ｍＬで希釈し、各種濃度のＣｍを加えたＫａｎ／Ｔｅｔ  ＧＭＭＬプレート２組に画線した。第１組のプレートはＯ−メチル−Ｌ−チロシンを加えず、Ｃｍ濃度を１０〜２５μｇ／ｍＬとし、第２組のプレートは１ｍＭ  Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンと５０μｇ／ｍＬ  Ｃｍを加えた。第１組のプレートで１５μｇ／ｍＬのＣｍの存在下に増殖しなかったコロニーのレプリカを第２組のプレートから釣菌した。ＴｙｒＲＳ遺伝子を含むプラスミドを精製し、断片化反応のＭｇ２＋を１０ｍＭ  Ｍｎ２＋に代えた以外はＳｔｅｍｍｅｒのプロトコールを使用してＤＮＡシャフリングによりｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えした。Ｗ．Ｐ．Ｃ．Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０，３８９−９１（１９９４）；及びＩ．Ａ．Ｌｏｒｉｍｅｒ，Ｉ．Ｐａｓｔａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，３０６７−８（１９９５）参照。次に、予め消化しておいたｐＢＫ−ＪＹＡ５ベクターにライブラリーを再ライゲートし、典型寸法８×１０8 〜３×１０9 ｃｆｕの第２世代ＴｙｒＲＳライブラリーを得た。ライブラリーからランダムに選択した３０個を配列決定した。ＤＮＡシャフリングにより導入された突然変異誘発率は０．３５％であった。このライブラリーを次回選択用選択株に形質転換した後、シャフリングした。第２組のプレートではポジティブ選択のＣｍ濃度を２回目に８０μｇ／ｍＬ、３回目に１２０μｇ／ｍＬに上げ、第１組のプレートではＣｍ濃度を変えなかった。３回のＤＮＡシャフリング後にコロニーは第１組のプレートではＣｍ濃度２０〜２５μｇ／ｍＬで増殖し始め、ＴｙｒＲＳ突然変異体が天然アミノ酸を基質として受容していることを示した。従って、２回のＤＮＡシャフリング後に選択した最良クローンを���細に特性決定した。
【０２５８】
２回の選択とＤＮＡシャフリングを実施し、クロラムフェニコール中の生存が増殖培地への１ｍＭ  Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン添加に依存するクローンを得た。Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンの不在下では、突然変異体ＴｙｒＲＳを導入した細胞は１％グリセロール、０．３ｍＭロイシンを含む最少培地（ＧＭＭＬ）プレートに１５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを加えると生存できなかった。細胞は１ｍＭ  Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンの存在下では１２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを加えたＧＭＭＬプレートで増殖することができた。液体ＧＭＭＬでも同様の結果が得られた。対照として、ｍｔＲＮＡCUA Tyr と不活性Ａｌａ5 ＴｙｒＲＳを導入した細胞は１ｍＭ  Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンの有無に拘わらず、使用した最低クロラムフェニコール濃度でも生存しなかった。図１４参照。１ｍＭ  Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン自体を加えても大腸菌の増殖率はさほど変わらない。
【０２５９】
ｍｔＲＮＡCUA Tyr にＯ−メチル−Ｌ−チロシンを負荷する突然変異体ＴｙｒＲＳの配列を分析した処、以下の突然変異が判明した。Ｔｙｒ32→Ｇｌｎ32、Ａｓｐ158 →Ａｌａ158 、Ｇｌｕ107 →Ｔｈｒ107 及びＬｅｕ162 →Ｐｒｏ162 。図１４参照。相同Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＴｙｒＲＳのＸ線結晶構造によると、Ｔｙｒ32、Ａｓｐ158 と基質チロシン間の水素結合網が失われるとチロシンと突然変異体ＴｙｒＲＳの結合に不利であると思われる。実際に、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＴｙｒＲＳのＡｓｐ176 （Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのＡｓｐ158 に対応）の突然変異は不活性な酵素を生じる。例えばＧ．Ｄ．Ｐ．Ｇｒａｙ，Ｈ．Ｗ．Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ，Ａ．Ｒ．Ｆｅｒｓｈｔ，ＦＥＢＳ  ３１８：１６７−７１（１９９３）参照。同時に、Ａｓｐ158 →Ａｌａ158 及びＬｅｕ162 →Ｐｒｏ162 突然変異はＯ−メチル−Ｌ−チロシンのメチル基を更に基質結合キャビティに延ばす疎水性ポケットを形成する。アデニル酸のリボース又はリン酸基に結合する活性部位の他の重要な触媒残基は２回のＤＮＡシャフリング後も変化しなかった。
【０２６０】
突然変異体ＴｙｒＲＳを触媒とするＯ−メチル−Ｌ−チロシン及びチロシンとアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のアデニル酸形成の動態を３７℃でピロリン酸交換アッセイによりｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析した。例えば、そのＣ末端に６個のヒスチジンを付けた突然変異体ＴｙｒＲＳをプラスミドｐＱＥ−６０（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）にクローニングし、プラスミドｐＱＥ−ｍＪＹＲＳを作製した。製造業者のプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）に従って固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによりタンパク質を精製した。１００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＫＦ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＡＴＰ、２ｍＭ  ＮａＰＰｉ、０．１ｍｇ．ｍＬウシ血清アルブミン、約０．０１μＣｉ／ｍＬ［32Ｐ］ＮａＰＰｉ及び各種濃度のチロシン又はＯ−メチル−Ｌ−チロシンを含む反応混合物中で３７℃でピロリン酸（ＰＰｉ）交換を行った。精製突然変異体ＴｙｒＲＳを加えて反応を開始し、定期的にアリコートを分取し、０．２Ｍ  ＮａＰＰｉ、７％過塩素酸及び２％活性炭で反応停止した。活性炭を濾過し、１０ｍＭ  ＮａＰＰｉ（ｐＨ２）で洗浄した後、活性炭吸着ＡＴＰの32Ｐ濃度をシンチレーション計数により測定した。非線形回帰分析を使用してミカエリス・メンテンの式の直接フィットによりｋcat 及びＫm 値を計算した。
【０２６１】
チロシンのミカエリス定数（Ｋm ）（５８３３±９０２μＭ）はＯ−メチル−Ｌ−チロシン（４４３±９３μＭ）の約１３倍であり、チロシンの触媒速度定数（ｋcat ）（１．８±０．２×１０-3ｓ-1）はＯ−メチル−Ｌ−チロシン（１４±１×１０-3ｓ-1）の８分の１である。従って、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンに対する突然変異体ＴｙｒＲＳのｋcat ／Ｋm 値はチロシンの約１００倍である。大腸菌におけるチロシンの生理的濃度は約８０μＭであり、突然変異体ＴｙｒＲＳのチロシンに対するＫm 値（５８３３μＭ）よりもはるかに低い。細胞中のＯ−メチル−Ｌ−チロシンの濃度はＫm （４４３μＭ）と同等以上であると予想される。
【０２６２】
本実施例は遺伝的にコードされる付加的アミノ酸を受容するように大腸菌のタンパク質生合成機構を補強できることを示す。新規アミノ酸を直接生きた細胞でタンパク質に導入できると、タンパク質及び細胞機能の研究の新規ツールとなると共に、天然タンパク質に比較して特性を増進したタンパク質を作製することが可能になる。本明細書に記載する方法は新規分光学的、化学的、構造的等の性質をもつ他のアミノ酸にも適用できる。大腸菌リボソームはｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質生合成を使用して多様な側鎖をもつアミノ酸をタンパク質に組込むことができることが示されている。例えば、Ｃ．Ｊ．Ｎｏｒｅｎ，Ｓ．Ｊ．Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｍ．Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４，１８２−８（１９８９）参照。付加的直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対（例えばＤ．Ｒ．Ｌｉｕ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６，４７８０−５（１９９９）；及びＡ．Ｋ．Ｋｏｗａｌ，Ｃ．Ｋｏｈｒｅｒ，Ｕ．Ｌ．，ＲａｊＢｈａｎｄａｒｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９８：２２６８（２００１）参照）、４塩基コドン（例えばＴ．Ｊ．Ｍａｇｌｉｅｒｙ，Ｊ．Ｃ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７：７５５（２００１）；及びＢ．Ｍｏｏｒｅ，Ｂ．Ｃ．Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ｃ．Ｃ．Ｎｅｌｓｏｎ，Ｒ．Ｆ．Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ，Ｊ．Ｆ．Ａｔｋｉｎｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９８：１９５（２０００）参照）及び本明細書に記載する他のセレクターコドンは組込み可能なアミノ酸の数と範囲を更に拡げることができる。真核細胞の直交対も本明細書に記載する方法により作製することができる。
【０２６３】
参考資料として本明細書に組込む対応特許出願（発明の名称" Ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ" ，代理人整理番号５４−０００１２０ＰＣ／ＵＳ）も参照されたい。同出願は上記系を使用してジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）のＯ−メチル−Ｌ−チロシン突然変異体を作製する実施例を記載している。
【実施例３】
【０２６４】
実施例３−ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ／ＣＵＡに非天然アミノ酸Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニンを負荷するようにＴｙｒＲＳを突然変異
【０２６５】
本実施例は第２の非天然アミノ酸Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニンを生物（例えば大腸菌）でタンパク質に組込むために使用可能な別の直交対に関する。この非天然アミノ酸をタンパク質に組込む直交対を作製するために使用する方法を以下に記載する。この非天然アミノ酸のタンパク質組込みに関するより詳細な記載は、参考資料として本明細書に組込む対応特許出願（発明の名称" Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ" ，代理人整理番号５４−０００１２０ＰＣ／ＵＳ）を参照されたい。
【０２６６】
非天然アミノ酸をコードするためにアンバー終止コドンとその対応する直交アンバーサプレッサーｔＲＮＡであるｍｕｔＲＮＡCUA Tyr を選択した。上記及びＷａｎｇ  ＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８：８８３−８９０（２００１）に記載されているように、非天然アミノ酸特異性をもつ直交シンテターゼを生産するための出発点としてＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）を使用した。このＴｙｒＲＳは内在大腸菌ｔＲＮＡをアミノアシル化しない（例えばＳｔｅｅｒ  ＆  Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：３５６０１−３５６０６（１９９９）参照）が、ｍｕｔＲＮＡCUA Tyr をチロシンでアミノアシル化する（例えばＷａｎｇ，Ｍａｇｌｉｅｒｙ，Ｌｉｕ，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：５０１０−５０１１（２０００）参照）。Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニンはチロシンと構造が大きく異なり、新規充填特性をもつ可能性があることからこの試験に選択した。ｍｕｔＲＮＡCUA Tyr に２０種の共通アミノ酸は負荷せずにＬ−３−（２−ナフチル）アラニンを負荷するようにＴｙｒＲＳのアミノ酸特異性を改変するために、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳ突然変異体のライブラリーを作製し、スクリーニングした。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからの相同ＴｙｒＲＳの結晶構造の分析（Ｂｒｉｃｋ，Ｂｈａｔ，Ｂｌｏｗ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０８：８３−９８（１９８９）参照）に基づき、チロシンのアリール環のバラ位から７Å以内にあるＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳの活性部位の５個の残基（Ｔｙｒ32、Ａｓｐ158 、Ｉｌｅ159 、Ｌｅｕ162 及びＡｌａ167 ）を突然変異させた。図１５参照。Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニンに特異的なシンテターゼはＷａｎｇ，Ｂｒｏｃｋ，Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：４９８−５００（２００１）に報告されている突然変異体ＴｙｒＲＳライブラリーから選択しなかった。後期選択における野生型シンテターゼ汚染を減らすために、（Ａｌａ167 を除く）これらの残基をまず全てアラニンに突然変異させた。得られた不活性Ａｌａ5 ＴｙｒＲＳ遺伝子を鋳型として使用し、対応する部位にランダム突然変異をもつオリゴヌクレオチドを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりランダム突然変異誘発を行った。
【０２６７】
突然変異体ＴｙｒＲＳライブラリーをまずクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の非必須位置（Ａｓｐ112 ）のアンバー終止コドンの抑圧に基づくポジティブ選択にかけた。１ｍＭ  Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニンと８０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを加えた最少培地で突然変異体ＴｙｒＲＳライブラリーとｍｕｔＲＮＡCUA Tyr で形質転換した細胞を増殖させた。細胞は突然変異体ＴｙｒＲＳが天然アミノ酸又はＬ−３−（２−ナフチル）アラニンでｍｕｔＲＮＡCUA Tyr をアミノアシル化する場合にしか生存することができない。次に、クロラムフェニコールの存在下で非天然アミノ酸の不在下に生存細胞を増殖させた。生存しなかった細胞はｍｕｔＲＮＡCUA Tyr にＬ−３−（２−ナフチル）アラニンを負荷する突然変異体をコードすると思われるので、非天然アミノ酸を加えたレプリカプレートから釣菌した。３回のポジティブ選択後にネガティブスクリーニングを行った後、ＣＡＴ遺伝子のＡｓｐ112 ＴＡＧコドンの抑圧に基づくｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを使用して４個の突然変異体ＴｙｒＲＳを特性決定した。
【０２６８】
表４．  突然変異体ＴｙｒＲＳのｉｎ  ｖｉｖｏクロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼアッセイa                                 
突然変異体ＴｙｒＲＳ        ＩＣ50（μｇ／ｍＬクロラムフェニコール）  
Ｌ−３−（２−ナフ        Ｌ−３−（２−ナフ
チル）−Ａｌａなし        チル）−Ａｌａ添加
ＴｙｒＲＳなし                  ４                        ４          
野生型ＴｙｒＲＳ                ２４０                    ２４０      
選択後                                                                
Ｓ１−ＴｙｒＲＳ              ３０                      １２０      
Ｓ２−ＴｙｒＲＳ              ３０                      １２０      
Ｓ３−ＴｙｒＲＳ              ２５                      １１０      
Ｓ４−ＴｙｒＲＳ              ３５                      １００      
ＤＮＡシャフリング後                                                  
ＳＳ１２−ＴｙｒＲＳ          ９                        １５０      
a   ｐＹＣ−Ｊ１７プラスミドを使用してｍｕｔＲＮＡCUA Tyr 遺伝子とＡｓｐ１１２にアンバー終止コドンをもつクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を発現させた。ｐＢＫプラスミドを使用してＴｙｒＲＳを発現させ、大腸菌ＤＨ１０ＢにｐＹＣ−Ｊ１７と同時形質転換した。各種濃度のクロラムフェニコールで滴定してＧＭＭＬプレート上の細胞生存を試験した。
【０２６９】
Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニンの不在下では、選択したＴｙｒＲＳとｍｕｔＲＮＡCUA Tyr を発現する細胞は１％グリセロールと０．３ｍＭロイシンを含む最少培地プレート（ＧＭＭＬプレート）で２５〜３５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールの存在下に生存し、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニンの存在下では、細胞はＧＭＭＬプレートで１００〜１２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールの存在下に生存した。ＴｙｒＲＳの不在下のＩＣ50値（４μｇ／ｍＬクロラムフェニコール）に比較してこれらの結果は選択したＴｙｒＲＳがＬ−３−（２−ナフチル）アラニンを受容するが、天然アミノ酸もある程度まで負荷することを示している。上記表４参照。
【０２７０】
天然アミノ酸に対する突然変異体ＴｙｒＲＳの活性を更に弱めるために、上記４種の突然変異体遺伝子を鋳型として使用してＤＮＡシャフリングを１回行った。得られた突然変異体ＴｙｒＲＳライブラリーを更に２回ポジティブ選択とネガティブスクリーニングにかけた。天然アミノ酸に対する活性が大幅に低下し（ＩＣ50＝９μｇ／ｍＬクロラムフェニコール）且つＬ−３−（２−ナフチル）アラニンに対する活性が増加（ＩＣ50＝１５０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール）した１個の突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＳＳ１２−ＴｙｒＲＳ）が得られた。表４参照。
【０２７１】
得られた進化型ＳＳ１２−ＴｙｒＲＳは以下の突然変異をもつ。Ｔｙｒ32→Ｌｅｕ32、Ａｓｐ158 →Ｐｒｏ158 、Ｉｌｅ159 →Ａｌａ159 、Ｌｅｕ162 →Ｇｌｎ162 、及びＡｌａ167 →Ｖａｌ167 。図１５参照。相同Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＴｙｒＲＳの結晶構造によると、Ｔｙｒ32→Ｌｅｕ32とＡｓｐ158 →Ｐｒｏ158 の突然変異はＴｙｒ32、Ａｓｐ158 と天然基質チロシン間の水素結合を失わせる可能性があるのでチロシンとＳＳ１２−ＴｙｒＲＳの結合に不利であると考えられる。殆どの残基はＬ−３−（２−ナフチル）アラニンの結合を助長すると予想される疎水性側鎖をもつアミノ酸に突然変異される。野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳと進化型ＳＳ１２−ＴｙｒＲＳの結晶構造は入手可能な方法により決定することができる。
【０２７２】
本明細書と対応出願（発明の名称" Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ" ，代理人整理番号５４−０００１２０ＰＣ／ＵＳ）に記載した細胞増殖、タンパク質発現及び質量分析実施例によると、ｍｕｔＲＮＡCUA Tyr ／ＳＳ１２−ＴｙｒＲＳ対は天然アミノ酸に匹敵する忠実度でアンバーコドンに応答してＬ−３−（２−ナフチル）アラニンをタンパク質に選択的に挿入することができた。Ｗａｎｇ，Ｂｒｏｃｋ，ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａｄｄｉｎｇ  Ｌ−３−（２−Ｎａｐｈｔｈｙｌ）ａｌａｎｉｎｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，（２００２）１２４（９）：１８３６−７も参照されたい。チロシンと構造的に異なるアミノ酸に関する上記結果は、本明細書に記載する方法が多様な非天然アミノ酸に適用可能であることを裏付けるものである。
【実施例４】
【０２７３】
実施例４−ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ／ＣＵＡに負荷するようにＴｙｒＲＳを突然変異させ、所望特性をもつ突然変異ＴｙｒＲＳを他の方法（例えばＦＡＣＳ及びファージディスプレイ・パンニング）によりスクリーニング
【０２７４】
上記のようなレポーター遺伝子とタンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏ  ＦＡＣＳスクリーニング、抗体検出、ｉｎ  ｖｉｔｒｏファージディスプレイ・パンニング等と併用して直交対を選択することもできる。例えば、Ｗａｎｇ  ＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１：１−１１（２００２）参照。
【０２７５】
例えば、シンテターゼをスクリーニングするために、例えばグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をレポーターとして汎用蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によるスクリーニングが開発されている。図１６Ａ及びＢ参照。シンテターゼ活性はＧＦＰの発現を誘導するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ内のセレクターコドン（例えばアンバー終止コドン（ＴＡＧ））の抑圧により報告される。例えば、本発明の選択／スクリーニング方法の別の例を示す図２６参照。アンバーコドンが抑圧される場合のみに細胞は機能的Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを生産し、ＧＦＰを発現することができるので、細胞は蛍光発光する。ポジティブスクリーニングでは、直交ｔＲＮＡに天然又は非天然アミノ酸を負荷する活性シンテターゼをコードする蛍光細胞を回収する。その後、選択した細胞を希釈し、非天然アミノ酸の不在下で増殖させた後、例えば非天然アミノ酸のみに特異性をもつシンテターゼを発現する非蛍光細胞をＦＡＣＳにより選別する。図１７Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤはグルタミンシンテターゼを使用したセレクターコドン（例えばアンバーコドン）の抑圧を示す。蛍光強度の測定閾値を設定することにより、ポジティブ及びネガティブ両者のスクリーニングのストリンジェンシーを簡便に制御することができる。
【０２７６】
特定非天然アミノ酸に特異的な直接ポジティブ選択法として、ファージ表面に提示される非天然アミノ酸に対するモノクローナル抗体の高親和性を利用した方法も開発されている。図１８参照。Ｍ．ＰａｓｔｒｎａｋとＰ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，９：２３７３（２００１）参照。例えば、ファージ産生がアンバー終止コドンの抑圧を必要とするように、アンバー突然変異をもつＣ３ペプチドをＶＳＣＭ１３ファージコートタンパク質ｐＩＩＩのＮ末端に融合する。直交サプレッサーｔＲＮＡとシンテターゼライブラリーを発現するファージミドを含む細胞にＣ３ＴＡＧファージを感染させる。活性シンテターゼによりＣ３ＴＡＧが抑圧され、そのコグネイトアミノ酸がファージ表面に提示される。その後、ファージプールを非天然アミノ酸に対する固定化モノクローナル抗体と共にインキュベートし、非天然アミノ酸に特異的なシンテターゼをもつファージのみを単離する。模擬選択では、Ａｓｐを含むエピトープに対する抗体を使用してＡｓｎを提示するファージのプールからＡｓｐを提示するファージを３００倍以上に集積した。
【０２７７】
数種のｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング方法も使用することができる。このような方法の１例では、突然変異体シンテターゼのライブラリーをファージに提示し、ファージ粒子をアミノアシルアデニル酸中間体の固定化アミノアルキルアデニル酸類似体に対してパンニングする。図１９参照。例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳをＭ１３ファージのｐＩＩＩコートタンパク質に融合した。このファージはチロシルアデニル酸のアミノアルキルアデニル酸類似体に対してパンニング後に非関連抗体を提示する対照ファージの１０００倍に集積した。出発時のＴｙｒＲＳファージ集団の０．１〜１％しかＴｙｒＲＳタンパク質を提示しないので、実際の集積倍率は１０5 〜１０6 にすることができる。
【実施例５】
【０２７８】
実施例５−始原菌ロイシル−ｔＲＮＡシンテターゼ対の作製
【０２７９】
始原菌Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来ロイシルｔＲＮＡシンテターゼとして、始原菌ロイシルｔＲＮＡに由来するアンバー及びフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡをアミノアシル化することができるが、大腸菌に内在するｔＲＮＡをアミノアシル化しないロイシル−ｔＲＮＡシンテターゼを同定した。本明細書に記載する選択ストラテジーを使用して、このシンテターゼにより選択的に負荷される高度に活性なｔＲＮＡ基質を同定した。突然変異体シンテターゼライブラリーを作製し、非天然アミノ酸を選択的に負荷することが可能な突然変異体シンテターゼを選択することができる。
【０２８０】
アンチコドンをＣＵＡアンチコドンで置換してアンバーサプレッサーｔＲＮＡとした５個の異なる始原菌ロイシルｔＲＮＡに由来するアンバーコドンとサプレッサーｔＲＮＡをシンテターゼもつβラクタマーゼレポーター遺伝子を構築した。７個の異なるロイシルｔＲＮＡをクローニングし、レポーター構築物で同時形質転換した。３個のシンテターゼはシンテターゼをもたない対照よりもシンテターゼの存在下でアンピシリン耐性が高く、これらの系を更に試験した。図２０参照。
【０２８１】
次段階では宿主ｔＲＮＡと相互作用せずにサプレッサーｔＲＮＡに負荷するシンテターゼを決定した。Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍとＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉの２種の系を選択して発現させ、陽性対照としてＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに由来する精製ｔＲＮＡと大腸菌全ｔＲＮＡでｉｎ  ｖｉｔｒｏアミノアシル化を実施した。Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉシンテターゼは大腸菌ｔＲＮＡに有効に負荷することができたが、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍシンテターゼはＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔＲＮＡに特異的であることが判明した。
【０２８２】
抑圧系の効率を高めるように更に改良した。アンチコドンループのＡ37はロイシルｔＲＮＡシンテターゼではＧ37であった。この突然変異は各種真核細胞とＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍで非コグネイトシンテターゼによるアミノアシル化に対するネガティブ決定基であると共に、（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍではそうでないが）酵母でアミノアシル化のポジティブ決定基であることが分かった。Ａ37は効率的抑圧の重要な要件であることも分かった。アンチコドンループをランダムに突然変異誘発し、より効率的な抑圧について選択した。Ｇ37をＡに突然変異させると、より効率的なサプレッサーとなり、突然変異しないものに比較して２０倍の濃度のアンピシリンを抑圧することができた。図２１参照。
【０２８３】
大腸菌で他のシンテターゼにより優先的に負荷されないようにｔＲＮＡを改良するために、ｔＲＮＡのアクセプターステムをランダム突然変異誘発した。ポジティブ／ネガティブ選択を使用してＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＲＳの不在下に負荷されないｔＲＮＡを同定した。
【０２８４】
選択した突然変異ｔＲＮＡを観察した処、ロイシルアミノアシル化の必須ポジティブ決定基であることが先の全系で判明した識別子塩基Ａ37は観察した全突然変異ｔＲＮＡで保存されていた。直交性が改善された全突然変異ｔＲＮＡでＣ3 ：Ｃ70塩基対も保存されていた。観察された最良の突然変異体ｔＲＮＡはシンテターゼの不在下のアミノアシル化が約３分の１となり、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＲＳの存在下の抑圧が実際に増加した。
【０２８５】
例えば３塩基コドンでなく４塩基コドンを抑圧することが可能な変異体も作製した。４塩基コドンは一度に３塩基でなく一度に４塩基の遺伝コードをデコードすることが可能になり、６４種しかアミノ酸をコードできない場合に２５６種をコードできる。４塩基コドンの使用に伴う問題はｔＲＮＡのアンチコドンループの拡張が必要であり、殆どの系が撹乱を受ける可能性があることである。しかし、ロイシル系の初代ＡＧＧＡサプレッサーが同定された。これは８塩基のアンチコドンループをランダム突然変異誘発し、ＡＧＧＡ−βラクタマーゼレポーター系で選択を行うことにより作製した。図２２参照。
【０２８６】
シンテターゼの編集機構も突然変異させ、編集機能を除去した。ロイシル系は他の数種のシンテターゼと同様に（少なくとも）２個の活性部位をもつ。一方の部位はＡＴＰによるアミノ酸の活性化を行い、シンテターゼと共に酵素結合アミノアシルアデニル酸を形成した後、アミノ酸をｔＲＮＡの３' 末端に転移する。他方、第２の部位はロイシン以外のアミノ酸をｔＲＮＡから加水分解することができない。ロイシン系はメチオニンとイソロイシンにこの転移後編集機能を発揮することが知られており、非天然アミノ酸にも同様に機能する場合がある。
【０２８７】
まず、編集ドメインを除去した。編集ドメインを６個のタンデムランダムアミノ酸のライブラリーで置換した。βラクタマーゼ中の終止コドンの抑圧に基づくポジティブ選択を使用した。多数の機能的シンテターゼが得られたが、これらのシンテターゼを精製しようと試みたが、いずれの場合も何も検出することができず、これらの全シンテターゼは温度感受性表現型を示し、編集ドメインの欠失の結果として不安定なタンパク質となったことが示唆された。
【０２８８】
次に、編集ドメインに点突然変異を行った。編集ドメインの触媒コアは種間で十分に保存されており、少なくとも分枝鎖アミノ酸の類では異なるアミノ酸でも保存されている。これらの保存部位の数箇所は従来突然変異されており（例えばＴ→Ｐ）、編集機能を欠損することが分かっている。数種の公知突然変異体に類似するＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＲＳの突然変異体を構築すると共に、Ｔ２１４に由来する２０メンバーＮＮＫライブラリーも作製した。タンパク質を発現させ、ロイシンとメチオニンによるアミノアシル化をｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験した。従来同定されている突然変異のうちで本発明の系に転移可能なものは皆無であったが、Ｔ２１４ライブラリーから望ましい突然変異が同定された。ロイシンを負荷することが可能な２個の突然変異体Ｔ２１４Ｓ及びＴ２１４Ｑが同定された。これらの突然変異体のうちでＴ２１４Ｑのみはメチオニンを負荷することができた。Ｔ２１４Ｓは明らかにメチオニンを削除する機能を維持しているが、Ｇｌｎ突然変異体はこの機能を失っていた。
【０２８９】
次にＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓロイシルシンテターゼについて解明されている結晶構造に基づいてライブラリーを設計した。ロイシンアミノアルキルアデニル酸類似体アデノシンインヒビターのロイシン側鎖を活性部位に結合した。ロイシン側鎖結合ポケットの周囲の６部位をランダムアミノ酸で置換し、より大きいライブラリーを作製した。その後、例えばポジティブ／ネガティブ２段階選択を行うことにより、このライブラリーからのシンテターゼをスクリーニングすると、非天然アミノ酸を選択的に負荷することが可能なシンテターゼを同定することができる。
【実施例６】
【０２９０】
実施例６−４塩基コドンを効率的に抑圧するｔＲＮＡの同定
【０２９１】
４塩基コドンを効率的に抑圧する突然変異ｔＲＮＡを同定するために併用アプローチを使用した。Ｔ．Ｊ．Ｍａｇｌｉｅｒｙ，Ｊ．Ｃ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０７：７５５（２００１）参照。βラクタマーゼ遺伝子のセリンコドンを４個のランダムヌクレオチドで置換したレポーターライブラリーを構築した。次に、アンチコドンループ（７ｎｔ）を８又は９個のランダムヌクレオチドで置換した大腸菌の誘導体から構成される突然変異ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）サプレッサーライブラリーを作製した。これらの２つのライブラリーを交配すると、４塩基配列を単一コドンとしてデコードする適当なフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡが全長βラクタマーゼを翻訳し、細胞はアンピシリン耐性となった。より高いアンピシリン濃度での生存は、対応するｔＲＮＡが４塩基コドンに対してより高い抑圧効率をもつことを意味する。この選択を使用し、天然三重項コドンサプレッサーに近い効率をもつカノニカル４塩基コドンのみをデコードする４種の四重項コドンＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ及びＣＣＣＵとそのコグネイトサプレッサーｔＲＮＡを同定した。このストラテジーを使用して新規５及び６塩基コドンサプレッサーも選択した。Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｍａｇｌｉｅｒｙ，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｌｉｍｉｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｄｏｎ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ  Ｓｉｚｅ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：２３７−２４４（２００２）参照。新規に同定されたものも含めてこれらの拡張コドンは多重非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｔｒｏ組込みとｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質突然変異誘発に有用であると思われる。
【実施例７】
【０２９２】
実施例７−ｐ−アミノフェニルアラニンの直交ｔＲＮＡシンテターゼの作製
【０２９３】
ｐ−アミノフェニルアラニン（ｐＡＦ）の直交シンテターゼを作製するために、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）と突然変異体チロシンアンバーサプレッサーｔＲＮＡ（ＴｙｒＣＵＡｍｕｔＲＮＡ）の対を出発点として使用した。Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｍａｇｌｉｅｒｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｌｉｕ，Ｄ．Ｒ．  ＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ａ  ｎｅｗ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｔＲＮＡ／ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｐａｉｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：５０１０−５０１１（２０００）；及びＷａｎｇ，Ｌ．  ＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｌ．８：８８３（２００１）参照。ｐＡＦを受容し且つ２０種の共通アミノ酸のいずれをも受容しないようにＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳのアミノ酸特異性を改変することによりｐＡＦ特異的シンテターゼ（ｐＡＦＲＳ）を作製した。ポジティブ選択とネガティブスクリーニングの組合せを使用し、５カ所（Ｔｙｒ32、Ｇｌｕ107 、Ａｓｐ158 、Ｉｌｅ159 及びＬｅｕ162 ）にランダムアミノ酸を含むＴｙｒＲＳ変異体１２のライブラリーからｐＡＦＲＳ酵素を同定した。Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．，Ｈｅｒｂｅｒｃｈ，Ｂ．  ＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００（２００１）参照。選択とスクリーニングの両者に単一レポータープラスミドを使用した。例えば、レポータープラスミドはＣＡＴ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＧＦＰ及びTyrCUAｍｕｔＲＮＡの遺伝子とＴｅｔ耐性選択マーカーを含むｐＲＥＰ（２）／ＹＣ−ＪＹＣＵＡである。ＣＡＴ遺伝子はＤ１１２位にＴＡＧコドン置換を含む。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は７アミノ酸Ｎ末端リーダーペプチドを含み、Ｍ１とＱ１０７にＴＡＧ置換を含む。
【０２９４】
ポジティブ選択はｐＡＦ又は内在アミノ酸によるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子内の許容位置のＴＡＧコドンの抑圧に基づいて行う。例えばＷａｎｇ，Ｌ．ら，（２００１）前出；及びＰａｓｔｅｒｎａｋ，Ｍ．，Ｍａｇｌｉｅｒｙ，Ｔ．Ｊ．  ＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ａ  ｎｅｗ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｔＲＮＡ／ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｐａｉｒ  ｆｏｒ  ｅｖｏｌｖｉｎｇ  ａｎ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ．Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｅｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ８３：２２７７（２０００）参照。ｐＡＦを含む液体培地でＴｙｒＲＳライブラリーとレポータープラスミドを含む細胞を増殖させ、クロラムフェニコール（Ｃｍ）の存在下で生存する細胞を選択した。例えば、ポジティブ選択では、３５μｇ／ｍｌ  Ｋｎ、２５μｇ／ｍｌ  Ｔｅｔ、７５μｇ／ｍｌ  Ｃｍ及び１ｍＭ  ｐＡＦ（Ｓｉｇｍａ）を加えたＧＭＭＬ最少培地で細胞を増殖させた。
【０２９５】
ネガティブスクリーニングはｐＡＦの不在下でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子内の許容位置の２個のＴＡＧ終止コドンを抑圧できないことに基づいて行う。全長Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの発現はグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を誘導する。ポジティブ選択からの細胞をｐＡＦとＣｍの不在下で増殖させた後、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して蛍光の欠如をスクリーニングする。例えば、ネガティブスクリーニングでは、３５μｇ／ｍｌ  Ｋｎ、２５μｇ／ｍｌ  Ｔｅｔ及び０．００２％アラビノースを加えたＧＭＭＬ培地で細胞を増殖させた。Ｃｏｈｅｒｅｎｔ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ  ＩＩイオンレーザーでＢＤＩＳ  ＦＡＣＶａｎｔａｇｅ  ＴＳＯ細胞ソーターを使用してＦＡＣＳを実施した。励起波長は３５１ｎｍとし、５７５／２５ｎｍ帯域フィルターで発光を検出した。細胞を集め、ＴｅｔとＫｎを加えたＬＢ少なくとも１０容量で希釈し、飽和まで増殖させた。
【０２９６】
液体培地でのポジティブ選択２回と、ネガティブスクリーニング１回と、更に１回の液体培地でのポジティブ選択と、プレート上でのポジティブ選択１回の後に所望ｐＡＦＲＳが同定された。ｐＡＦＲＳ酵素は野生型ＴｙｒＲＳに対して５個の突然変異を含む（Ｙ３２Ｔ，Ｅ１０７Ｔ，Ｄ１５８Ｐ，Ｉ１５９Ｌ及びＬ１６２Ａ）。ｐＡＦの不在下では、選択したｐＡＦＲＳとレポータープラスミドを発現する細胞のＩＣ50はＧＭＭＬ最少培地プレートで１０μｇ／ｍｌ  Ｃｍであった。１ｍＭ  ｐＡＦの存在下ではＩＣ50は１２０μｇ／ｍｌ  Ｃｍであった。従って、ｐＡＦはＵＡＧコドンを選択的に抑圧している。
【実施例８】
【０２９７】
実施例８−蛍光活性化細胞ソーティングを使用したアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの進化
【０２９８】
ＦＡＣに基づくスクリーニングシステムを使用してアミノ、イソプロピル又はアリル含有チロシン類似体を受容する３種の高度選択性シンテターゼ変異体を迅速に進化させた。このシステムでは多目的レポータープラスミドを使用してポジティブ及びネガティブ両者の選択圧をかけ、シンテターゼ活性を容易且つ定量的に評価した。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）マーカーによりＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）の活性のポジティブ選択を行った。Ｔ７ポリメラーゼ／ＧＦＰレポーター系により、非天然アミノ酸の存在下と不在下で増殖させた細胞内のシンテターゼ活性を評価した。蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して天然アミノ酸を受容するシンテターゼ変異体をスクリーニングし、目視とフルオロメトリー分析によりシンテターゼ活性を夫々定性及び定量的に評価した。
【０２９９】
増幅性蛍光レポーター系の設計。生きた細胞でシンテターゼ活性を評価する汎用スクリーニングシステムを開発する試みは、シンテターゼ変異体集団に適用する選択圧、特にネガティブ選択圧をより精密に制御したいという要望に端を発した。多数のシンテターゼ変異体の活性を評価するためにシステムを使用しなければならないので、高スループットスクリーニングが可能なレポーターが追求された。更に、シンテターゼ活性を容易に定性及び定量評価できるようなレポーターが必要であった。これらの要件を満たすために、蛍光スクリーニングが考案された。このシステムは大腸菌での発現に最適化されたグリーン蛍光タンパク質の変異体であるＧＦＰｕｖのシンテターゼ依存性生産に基づいて考案された（Ｃｒａｍｅｒｉ，Ａ．，Ｗｈｉｔｅｈｏｒｎ，Ｅ．Ａ．，Ｔａｔｅ，Ｅ．＆  Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９６，１４，３１５−３１９参照）。この蛍光体はＦＡＣＳとフルオロメトリーで使用することができ、更に固体培地と液体培地で目視にも利用できる。このシステムはセレクター（例えばアンバーナンセンスコドン）のシンテターゼ依存性抑圧により蛍光シグナルを発生するように設計された。レポーターの感度を最大にするために、他の増幅可能な細胞内レポーター系と同様にＧＦＰｕｖレポーター遺伝子の発現を誘導するように構成されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子内にアンバーコドンを配置することにより増幅可能にした（Ｌｏｒｉｎｃｚ，Ｍ．，Ｒｏｅｄｅｒｅｒ，Ｍ．，Ｄｉｗｕ，Ｚ．，Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．Ａ．，Ｎｏｌａｎ，Ｇ．Ｐ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，１９９６，２４，３２１−３２９；及びＺｌｏｋａｒｎｉｋ，Ｇ．，Ｎｅｇｕｌｅｓｃｕ，Ｐ．Ａ．，Ｋｎａｐｐ，Ｔ．Ｅ．，Ｍｅｒｅ，Ｌ．，Ｂｕｒｒｅｓ，Ｎ．，Ｆｅｎｇ，Ｌ．，Ｗｈｉｔｎｅｙ，Ｍ．，Ｒｏｅｍｅｒ，Ｋ．＆  Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２７９，８４−８８参照）。アンバーコドンを含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼに合うようにＲＮＡ転写産物の生産を容易に最適化できるようにするために、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子をアラビノースプロモーターの制御下においた。
【０３００】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ／ＧＦＰｕｖレポーター系の最適化。アラビノースプロモーターの制御下にアンバーコドンを含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ変異体を発現させると共にＴ７プロモーターの制御下にＧＦＰｕｖ遺伝子を発現させるように中コピーレポータープラスミドｐＲＥＰを設計した（図１７ａ）。シンテターゼ依存性蛍光増加を最適化するように設計した１２種の一連のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ変異体（図１７ｂ）をｐＲＥＰに挿入してプラスミドｐＲＥＰ（１〜１２）を作製した。全変異体は７アミノ酸（ＭＴＭＩＴＶＨ）のＮ末端リーダー配列と１〜３個のアンバー終止コドン（ＴＡＧ）を含んでいた。変異体１〜３はリーダー配列のすぐ下流の１位の元のメチオニン（Ｍ１）を夫々１、２及び３個のアンバー終止コドンで置換していた。変異体４〜９は構造のループ領域に位置すると予想されるＤ１０、Ｒ９６、Ｑ１０７、Ａ１５９、Ｑ１６９又はＱ２３２が夫々アンバーコドンで置換していた（Ｊｅｒｕｚａｌｍｉ，Ｄ．＆  Ｓｔｅｉｚ，Ｔ．Ａ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９８，１７，４１０１−４１１３）。変異体１０〜１２はＭ１位とＱ１０７、Ａ１５９又はＱ２３２位が夫々アンバー終止コドンで置換していた。直交グルタミニル−ｔＲＮＡシンテターゼとＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来グルタミンｔＲＮＡCUA を含む適合可能なプラスミドを使用して生きた細胞のフルオロメトリーとフローサイトメトリーによりプラスミド構築物の蛍光増加を検討した。プラスミドｐＲＥＰ（１〜１２）は各種レベルのシンテターゼ依存性蛍光増加を生じることが判明し、最良構築物ｐＲＥＰ（１０）は不活性突然変異体に比較して野生型シンテターゼを含む細胞でフルオロメトリーにより２２０倍の蛍光（図１７ｃ）を示し、サイトメトリーにより〜４００倍の蛍光中央値（図１７ｄ）を示した。ｐＲＥＰ（１０）内のアンバーコドンに対応する位置の各種官能基を置換した処、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ内の１０７位の許容性が高いことが判明した。
【０３０１】
多目的レポータープラスミドの構築。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳの変異体を選択及びスクリーニングするために使用する多目的プラスミドを構築するために、プラスミドｐＲＥＰ（１０）をプラスミドｐＹＣ−Ｊ１７（Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．，Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９２，４９８−５００参照）と融合し、ｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＵＣＵＡ（図２５ａ）を得た。Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン（ＯＭＹ）の組込みに選択的なＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳの変異体を発現する適合可能なプラスミド（ｐＢＫ−ｍＪＹＲＳ；Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．，Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９２，４９８−５００）を使用してプラスミドｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡの機能をアッセイした。ｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡとｐＢＫ−ｍＪＹＲＳを導入した細胞をＯＭＹの存在下に増殖させた処、プラスミドｐＹＣ−Ｊ１７を使用して得られると同一の１２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Ｃｍ）ＩＣ50値を示し、フルオロメトリーで測定した場合にＯＭＹの存在下に増殖させた細胞の蛍光強度は不在下の３３０倍であった。
【０３０２】
Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼの基質特異性の進化。チロシンのフェノール側鎖以外の化学基を選択的に受容するようにＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳのアミノ酸側鎖結合ポケットを進化させることができることが報告されている（Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．，Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９２，４９８−５００；Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．，＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２，１２４，１８３６−１８３７参照）。本発明者らはｐ−イソプロピルフェニルアラニン（ｐＩＦ）、ｐ−アミノフェニルアラニン（ｐＡＦ）、ｐ−カルボキシルフェニルアラニン（ｐＣＦ）又はＯ−アリルチロシン（ＯＡＴ）の４種の新規官能基（図２５ｂ）を酵素に受容させることによりＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳによる非天然アミノ酸組込みの一般性を更に検討しようと試みた。チロシル環のパラ位に結合ポケットを形成すると考えられる残基であるＹ３２、Ｅ１０７、Ｄ１５８、Ｉ１５９及びＬ１６２位にランダム変異をもつＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳ変異体のライブラリー（Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．，Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９２，４９８−５００）を、プラスミドｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡを含む細胞に導入した。ライブラリーダイバーシティ〜１０9 をもつこれらの細胞を使用してｐＩＦ、ｐＡＦ、ｐＣＦ又はＯＡＴに選択的なシンテターゼ変異体を同定する４種の進化実験を開始した（図２５ｂ）。Ｃｍと４種の非天然アミノ酸の１種の存在下に細胞培養液を飽和まで増殖させることによりポジティブ選択を２サイクル行った。２サイクル目のポジティブ選択後に細胞アリコートを取出し、アミノ酸又はＣｍを加えない新しい培養液に接種するために使用し、培養液を再び飽和まで増殖させた。この時点で蛍光発光する細胞は２０種の天然アミノ酸の１種を受容できるシンテターゼ変異体を含むと思われる。各株から約１０8 個の細胞をＦＡＣＳによるネガティブスクリーニングにかけ、天然アミノ酸を受容するシンテターゼ変異体を排除した。蛍光発光しない細胞を集め、飽和まで増殖させることにより増幅した。これらの増幅細胞を使用して新規培養液に接種し、非天然アミノ酸とＣｍを加えた液体培地で最終サイクルのポジティブ選択にかけた。飽和まで増殖後に０、３０、６０又は１００μｇ／ｍＬＣｍと適当な非天然アミノ酸０又は１ｍＭを加えた培地に各細胞集団を播種した。
【０３０３】
進化シンテターゼ変異体の同定と特性決定。ｐＩＦ、ｐＡＦ及びＯＡＴを加えたＣｍプレートはアミノ酸を加えないプレートの１０〜１００倍の数の蛍光コロニーを生じた。これに対して、ｐＣＦ集団のプレートはｐＣＦ添加の有無に拘わらず同一数の蛍光コロニーを生じた。非天然アミノ酸を加えたプレートからのｐＩＦ、ｐＡＦ及びＯＡＴ集団の各々について大きいほうから１０個の蛍光コロニーを釣菌し、非天然アミノ酸の存在下又は不在下に液体培地で飽和まで増殖させた。携帯長波長紫外線ランプを使用して蛍光発生の定性評価を目視により行った（図２３ａ）。
【０３０４】
蛍光に有意差を生じるクローンに対応するシンテターゼ変異体を配列決定した。ｐＩＦ及びｐＡＦ集団からの全１０個のクローンは同一配列であったが、ＯＡＴ集団からは３種の異なるクローンが同定された。全クローンで５箇所のランダム突然変異部位にアミノ酸置換があり、ｐＩＦ−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｐＩＦ−ＲＳ）変異体には更に２箇所の置換があった。各クローンの活性を定量評価した。非天然アミノ酸の存在下又は不在下に液体培地で増殖させた細胞の蛍光をフルオロメトリーにより測定した（図２３ｂ）。非天然アミノ酸の存在下又は不在下に各種Ｃｍ濃度で細胞をプレート培養することによりＣｍ  ＩＣ50を測定した（図２３ｃ）。
【０３０５】
４位にアンバーコドンを含むミオグロブリン遺伝子を使用して非天然アミノ酸を含むタンパク質の生産を評価した。ｐＩＦ、ｐＡＦ又はＯＡＴの存在下又は不在下にｐＩＦ−ＲＳ、ｐＡＦ−ＲＳ又はＯＭＴ−ＲＳ変異体を夫々使用して遺伝子を細胞で発現させた（図２３ｄ）。タンパク質収率は全３種の変異体で同等であり、非天然アミノ酸含有細胞培養液１リットル当たりタンパク質１〜２ｍｇであった。他方、非天然アミノ酸の不在下に増殖させた培養液ではタンパク質生産はほとんど検出できなかった。タンパク質をエレクトロスプレー質量分析により分析した処、夫々の質量はｐＩＦ含有タンパク質１８４５７．４０±０．８１（予想値１８４５７．２８）、ｐＡＦ含有タンパク質１８４３０．３０±０．２７（予想値１８４３０．２１）であった。Ｃｍ  ＩＣ50、フルオロメトリー及びタンパク質発現分析を使用して得られた活性測定値はよく相関していたが、ｐＩＦ−ＲＳの活性はフルオロメトリーによると多少低いようである。他のアッセイに比較して不釣り合いに低いｐＩＦ−ＲＳ変異体のフルオロメトリー測定値は、レポーター内のアンバー位置の見掛けの許容性にも拘わらずＴ７  ＲＮＡポリメラーゼがｐＩＦ類似体の組込み後に部分的に不安定になる可能性を示している（図１７ｃ参照）。
【０３０６】
多目的レポーター系の有用性。本明細書に記載するレポーター系はポジティブ選択とネガティブスクリーニングの両者に単一の多目的プラスミドを使用できるので、ポジティブ選択とネガティブ選択で交互にプラスミドを交換する必要がなくなる。全体でたった３回のポジティブ選択と１回のネガティブスクリーニングで所望非天然アミノ酸を選択的に受容するシンテターゼ変異体を同定することができた。これらの特徴によりほんの数日間で進化実験を実施することができる。このスクリーニングシステムを使用すると、非天然アミノ酸を加えた寒天プレートを使用して活性シンテターゼ変異体を容易に同定することができ、変異体のアミノ酸特異性を個々にアッセイすることができる。
【０３０７】
上述のように、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ／ＧＦＰ系はシンテターゼ変異体の活性を定量的に比較するために使用することができる。ＣＡＴとバルナーゼに基づくポジティブ／ネガティブ選択を使用して本実施例に記載する３種のＯＡＴ−ＲＳクローンと同一ライブラリーから独立して得られる別のＯＡＴ−ＲＳクローンを入手できるので、各々に由来するシンテターゼ変異体について２種の異なる進化系を比較することが可能になる。この分析によると、ポジティブ選択とネガティブスクリーニング後に得られる３種のクローンはＯＡＴの存在下ではやや低い蛍光レベルを示すが、非天然アミノ酸の不在下では〜１０分の１のバックグラウンドレベルを示す。従って、非天然アミノ酸の不在下に対して存在下で増殖させた細胞の蛍光増加はバルナーゼを使用するポジティブ／ネガティブ選択後に得られるＯＡＴ−ＲＳクローンを発現する細胞に比較して選択とスクリーニング後に得られるＯＡＴ−ＲＳ（１）を発現する細胞が約６倍となる。この例が代表例であるか否かははっきりしないが、これらのデータはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ／ＧＦＰ系が天然アミノ酸基質に対して無差別なシンテターゼ変異体を選択する際にストリンジェンシーを高くできることを示唆している。しかし、非天然アミノ酸は進化型シンテターゼ変異体との結合を競合し、天然アミノ酸の結合が減るので、非天然アミノ酸の不在下に比較して存在下で増殖させた細胞の蛍光が増加するのは非天然アミノ酸組込みの忠実度の限界が低くなることを意味すると予想される。更に、忠実度が高いことは明らかに望ましいが、所望用途に応じて忠実度と総シンテターゼ活性のどちらかをとらなければならないと思われる。
【０３０８】
アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ進化の一般性。従来の報告と本実施例に記載する結果から明らかなように、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳのアミノ酸側鎖結合ポケットは非常に適応性がある。チロシンのフェノール側鎖の代わりに各種官能基を受容するように酵素を進化させることができ、これは高い選択性で可能である。本願では、チロシン環のパラ位にヒドロキシルの代わりにアミン、イソプロピル又はアリルエーテル官能基を受容するように酵素を進化できることが立証された。ｐＣＦ非天然アミノ酸を受容することが可能な酵素変異体を同定することはできなかった。ｐＣＦアミノ酸を受容するようにシンテターゼを進化させる第２の試みも成功しなかった。ＬＣ／ＭＳ分析を使用すると、非天然アミノ酸の存在下に増殖させた大腸菌細胞のトルエン処理後にｐＣＦを検出することができず、ｐＣＦは細胞に輸送されないか又は導入後に代謝されることを示唆している。
【０３０９】
本実施例に記載した３種の進化実験の成功例のうちで２個以上の活性クローンを同定できたのはＯＡＴ−ＲＳの進化のみであった。ＯＡＴ−ＲＳ進化は最高活性シンテターゼ変異体を生じた実験でもあった。これらの結果は、所定のアミノ酸特異性を他よりも選択し易いことを示唆している。これは２０種の天然アミノ酸のコンテキストで各種非天然アミノ酸を選択的に認識するのは比較的困難であることが一因であると思われる。例えば、ｐＡＦは構造的及び電子的にチロシンと似ているためにＯＡＴよりも選択的に認識しにくいと思われる。このために、ｐＡＦ−ＲＳクローンよりも多数のＯＡＴ−ＲＳクローンが同定され、ｐＡＦ−ＲＳクローンが最良のＯＡＴ−ＲＳクローンよりも低活性であるのだと考えられる。
【０３１０】
プラスミド構築。プラスミドｐＲＥＰ（図１７ａ）はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＢａｍＨＩ／ＡｐａＬＩオーバーラップＰＣＲフラグメントをｒｒｎＢ転写終結領域の上流に挿入した後にｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＡプラスミドからのａｒａＣ遺伝子及びａｒａプロモーター領域（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の転写制御用）とＧＦＰｕｖ遺伝子（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｔ７ターミネーター領域の上流でＴ７プロモーターの下流）を含むＡｐａＬＩ／ＡｈｄＩオーバーラップＰＣＲフラグメントをプラスミドｐＡＣＹＣ１７７（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）のＡｈｄＩ／ＢａｍＨＩ部位間に挿入することにより構築した。プラスミドｐＲＥＰ（１〜１２）は記載位置にアンバー突然変異を含むオーバーラップＰＣＲフラグメントでＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのＨｐａＩ／ＡｐａＬＩフラグメントを置換することにより構築した。プラスミドｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡはｐＲＥＰ（１０）からのＡｆｅＩ／ＳａｃＩＩフラグメントとｐＹＣ−Ｊ１７（Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．，Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９２，４９８−５００）からのＥａｒＩ（平滑化）／ＳａｃＩＩフラグメントのライゲーションにより構築した。蛍光スクリーニング用プラスミドｐＱを含む細胞に形質転換後に所望構築物を同定した。
【０３１１】
プラスミドｐＱはｌａｃプロモーター領域の下流で大腸菌ＱＲＳ終結領域の上流にＳｃＱＲＳを含むＡａｔＩＩ／ＳａｌＩオーバーラップＰＣＲフラグメントと、ｌｐｐプロモーター領域の下流でｒｒｎＣ終結領域の上流にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｔＲＮＡ（ＣＵＡ）Gln を含むＳａｌＩ／ＡｖａＩオーバーラップＰＣＲフラグメントと、ｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）のＡｖａＩ／ＡａｔＩＩフラグメントの三重ライゲーションにより構築した。プラスミドｐＱＤはＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩの間のｐＱフラグメントをＳｃＱＲＳ（Ｄ２９１Ａ）突然変異体のＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントで置換することにより構築した。
【０３１２】
プラスミドｐＢＡＤ／ＪＹＡＭＢ−４ＴＡＧはプラスミドｐＹＣ−Ｊ１７（Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．，Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９２，４９８−５００）と、ＭｊＹｔＲＮＡCUA の遺伝子とｐＢＡＤプロモーターと挿入遺伝子のヘテロ発現用クローニング領域を含むｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のハイブリッドであるｐＢＡＤ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡプラスミドにＣ末端６Ｈｉｓタグを含むミオグロブリンのＳ４アンバー突然変異体のＰＣＲフラグメントを挿入することにより構築した。
【０３１３】
フルオロメトリー及びサイトメトリー分析。所望プラスミドを含む単コロニーを使用し、適当な抗体と０．００２％アラビノースと必要に応じて適当な非天然アミノ酸を加えたＧＭＭＬ培養液２ｍＬに接種した。培養液を飽和まで増殖させ、細胞（２００μＬ）をペレット化してリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１ｍＬに再懸濁した。６００ｎｍ吸光度により細胞密度を分析し、ＦｌｕｏｒｏＭａｘ−２フルオロメーターを使用して励起波長３９６ｎｍ、測定波長５０５ｎｍで蛍光強度を測定した。ＰＢＳに懸濁した細胞をサイトメトリーにより分析した。ｐＲＥＰ（１０）のＴ７ポリメラーゼ遺伝子内のアンバー位置の許容性を評価するために、レポータープラスミドを一連のサプレッサー株に形質転換した後、フルオロメトリーにより分析した。
【０３１４】
アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ変異体の進化。Ｙ３２、Ｅ１０７、Ｄ１５８、Ｉ１５９及びＬ１６２位をランダム突然変異させたＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳ変異体（Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．，Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９２，４９８−５００）を、ｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡを含むＤＨ１０Ｂ大腸菌細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換させ、ダイバーシティ〜１０9 のライブラリーを作製した。形質転換細胞をＳＯＣ培地で６０分間３７℃で再生させ、ＬＢ培地で飽和まで増殖させた。１回目のポジティブ選択を開始するために、ライブラリー培養液２ｍＬをペレット化してＧＭＭＬ培地に再懸濁し、２５μｇ／ｍＬテトラサイクリン（Ｔｅｔ）、３５μｇ／ｍＬカナマイシン（Ｋｎ）及び１ｍＭ  ｐＩＦ、ｐＡＦ、ｐＣＦ又はＯＡＹを加えたＧＭＭＬ５００ｍＬに接種した。３７℃で３時間培養後に終濃度７５μｇ／ｍＬとなるようにＣｍを加え、細胞を飽和まで（〜４８時間）増殖させた。２回目のポジティブ選択では、Ｔｅｔ、Ｋｎ、７５μｇ／ｍＬ  Ｃｍ及び１ｍＭ  ｐＩＦ、ｐＡＦ、ｐＣＦ又はＯＡＹを加えたＧＭＭＬ１００ｍＬに１回目のポジティブ選択からの細胞（５００μＬ）を接種し、３７℃で飽和まで（〜２４〜３６時間）増殖させた。ネガティブスクリーニングに備え、Ｔｅｔ、Ｋｎ及び０．０２％アラビノース（Ａｒａ）を加えたＧＭＭＬ培地２５ｍＬに２回目のポジティブ選択からの細胞（１００μＬをペレット化してＧＭＭＬに再懸濁）を接種し、３７℃で飽和まで（〜２４時間）増殖させた。Ａｒａで誘導して非天然アミノ酸の不在下に増殖させた細胞（１ｍＬ）をペレット化し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）３ｍＬに再懸濁した。Ｃｏｈｅｒｅｎｔ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ  ＩＩイオンレーザーを３５１ｎｍで励起し、５７５／２５ｎｍ帯域フィルターで発光を検出することによりＢＤＩＳ  ＦＡＣＶａｎｔａｇｅ  ＴＳＯ細胞ソーターを使用してＧＦＰｕｖを発現しない細胞を選別した。細胞を集め、ＴｅｔとＫｎを加えたＬＢ少なくとも１０容量で希釈し、飽和まで増殖させた。３回目のポジティブ選択を開始するために、ネガティブスクリーニングからの細胞１００μＬをペレット化し、ＧＭＭＬに再懸濁し、Ｔｅｔ、Ｋｎ及び１ｍＭ  ｐＩＦ、ｐＡＦ、ｐＣＦ又はＯＡＹを加えたＧＭＭＬ２５ｍＬに接種した。３時間３７℃で培養後に終濃度７５μｇ／ｍＬとなるようにＣｍを加え、細胞を飽和まで（〜２４時間）増殖させた。３回目のポジティブ選択後に、Ｔｅｔ、Ｋｎ、０．００２％Ａｒａ、０、７５又は１００μｇ／ｍＬ  Ｃｍ、及び０又は１ｍＭｐＩＦ、ｐＡＦ、ｐＣＦ又はＯＡＹを加えたＧＭＭＬ／寒天に細胞を撒き、３７℃で４８時間増殖させた。
【０３１５】
非天然アミノ酸を含有するタンパク質の発現と特性決定。ｐＢＡＤ／ＪＹＡＭＢ−４ＴＡＧと適当なｐＢＫプラスミドで同時形質転換したＤＨ１０Ｂ細胞を使用し、ＫｎとＴｅｔを加えたＧＭＭＬスターター培養液１００ｍＬに接種し、飽和まで増殖させた。Ｋｎ、Ｔｅｔ、０．００２％Ａｒａ、５μＭ  ＦｅＣｌ3 及び所望非天然アミノ酸（又はなし）を加えた培養液５００ｍＬにスターター培養液５０ｍＬを接種し、飽和まで（〜１８時間）増殖させた。培養液をペレット化し、音波処理し、ＱｉａＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（Ｑｉａｇｅｎ）Ｈｉｓ−タグ精製キットのプロトールに従ってミオグロブリンタンパク質を分離した。タンパク質を１２→２０％グラジエントＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動とエレクトロスプレー質量分析により分析した。
【実施例９】
【０３１６】
実施例９−直交ｔＲＮＡ／スレオニルｔＲＮＡシンテターゼ対
【０３１７】
本実施例は直交ｔＲＮＡ／スレオニルｔＲＮＡシンテターゼ対の作製を例証する。図２７はＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するスレオニル−ｔＲＮＡシンテターゼを示す。このシンテターゼは２個のＮ末端編集ドメインと、触媒ドメインと、Ｃ末端アンチコドン結合ドメインをもつ（６５９アミノ酸）。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓシンテターゼに由来する直交シンテターゼを作製するために、編集ドメインと、Ｎ１又はＮ１とＮ２をシンテターゼから除去し、Ｎ短縮Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＴｈｒＲＳ（４７５アミノ酸）を作製した。このシンテターゼは同一触媒活性をもつが、校正活性をもたない。Ｎ短縮シンテターゼの活性をスクリーニングした。Ｎ短縮シンテターゼは大腸菌ｔＲＮＡをアミノアシル化しなかった。
【０３１８】
Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｔＲＮＡＴｈｒは大腸菌スレオニルｔＲＮＡシンテターゼの基質であることが分かったので、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｔＲＮＡＴｈｒを突然変異させて直交対を作製した。図２８はｔＲＮＡに行った突然変異を示す。具体的には、Ｃ２Ｇ７１をＡ２Ｕ７１に突然変異させた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ負荷実験によると、この突然変異体は大腸菌スレオニルｔＲＮＡシンテターゼの基質ではないが、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓスレオニルｔＲＮＡシンテターゼの良好な基質である。アンバーサプレッサーｔＲＮＡを作製するために、突然変異Ｃ２Ｇ７１→Ａ２Ｕ７１及びＧ３４Ｇ３５Ｕ３６→Ｃ３４Ｇ３５Ｕ３６を含む別の突然変異体も構築した。Ｃ２Ｇ７１→Ａ２Ｕ７１に加えてアンチコドンループも変異させた他の突然変異体ｔＲＮＡも作製し、ＴＧＡ、ＡＣＣＡ、ＡＣＡＡ、ＡＧＧＡ、ＣＣＣＴ、ＴＡＧＡ及びＣＴＡＧ等の３及び４塩基コドンを抑圧した。これらの全ｔＲＮＡは（Ａ２Ｕ７１をもつ）野生型ｔＲＮＡＴｈｒほど良好な基質ではなかったが、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓスレオニル−ｔＲＮＡシンテターゼのアンチコドン結合部位を突然変異させることにより改良することができる。
【実施例１０】
【０３１９】
実施例１０−典型的Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの配列
【０３２０】
典型的Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号１〜３及び／又はその相補的ポリヌクレオチド配列から構成される群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む核酸を含む。添付書類１、表５参照。同様に、典型的Ｏ−ＲＳは配列番号３５〜６６から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号４〜３４及びその相補的ポリヌクレオチド配列から構成される群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされるポリペプチトから構成される群から選択されるポリペプチトを含む。
【０３２１】
当然のことながら、本明細書に記載する実施例及び態様は例示の目的に過ぎず、これらの記載に鑑みて種々の変形又は変更が当業者に想到され、このような変形又は変更も本願の精神及び範囲と特許請求の範囲に含む。本明細書に引用した全刊行物、特許及び特許出願は全目的でその開示内容全体を参考資料として本明細書に組込む。
【０３２２】
【表１】
2011030571.tif 000006
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【図面の簡単な説明】
【０３２３】
【図１】非天然アミノ酸の部位特異的ｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質組込みを模式的に示す。
【図２Ａ】非天然アミノ酸でアミノアシル化する活性シンテターゼの選択方法の例を模式的に示す。図２Ａは非天然アミノ酸特異性をもつアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの選択／スクリーニングの概要を示す。
【図２Ｂ】非天然アミノ酸でアミノアシル化する活性シンテターゼの選択方法の例を模式的に示す。図２ＢはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するシンテターゼの選択／スクリーニングの１態様を模式的に示す。
【図３】チロシン類似体の特異的ライブラリーを作製するための部位特異的突然変異を示す。
【図４】前記類似体の特異的ライブラリーを作製するためのペンタフルオロフェニルアラニン選択用コンセンサス配列を示す。
【図５】１種の生物（例えば大腸菌）に由来する１個のドメイン（例えばＣＰＩドメイン）を他の生物のシンテターゼ（例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳ）に移植する方法を模式的に示す。
【図６】キメラＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ／大腸菌シンテターゼの構築を模式的に示す。
【図７】キメラシンテターゼ（例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ／大腸菌シンテターゼ）のライブラリーの作製を模式的に示す。
【図８】内在シンテターゼ（例えば大腸菌シンテターゼ）の弱い基質であり、効率的に所期コグネイトシンテターゼにより負荷されるサプレッサーｔＲＮＡの選択の１例を模式的に示す。
【図９】図９Ａ及びＢは突然変異アンチコドンループｔＲＮＡライブラリーを模式的に示す。図９Ａは突然変異全ループライブラリーを示し、図９ＢはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡのライブラリーを示す。
【図１０】水素結合以外の力により対合する非天然塩基対（ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ，３ＭＮ：３ＭＮ，７ＡＩ：７ＡＩ，Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙ）の構造の例を模式的に示す。
【図１１】サプレッサーｔＲＮＡのネガティブ選択法の結果のグラフであり、所定時間における３種の構築物のうちの１種を含む生存細胞の百分率を示す。
【図１２】βラクタマーゼ遺伝子中のアンバーコドンの抑圧に基づくポジティブ選択を示す増殖ヒストグラム。
【図１３】アンチコドンループ及び全ループライブラリーから選択した突然変異体サプレッサーｔＲＮＡのＤＮＡ配列を示す。
【図１４】ＴｙｒＲＳの活性部位の立体図を模式的に示す。
【図１５】ＴｙｒＲＳの活性部位を模式的に示す。
【図１６】図１６Ａ及びＢは本発明の成分（例えば直交シンテターゼ）を作製するために使用したＦＡＣＳ選択及びスクリーニング法の１例を模式的に示す。図１６Ａは直交シンテターゼライブラリーとＯ−ｔＲＮＡの発現ベクター（ライブラリープラスミド）と、１個以上のセレクターコドン（例えばＴＡＧ）を含むＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／ＧＦＰレポーター系（レポータープラスミド）のベクター（例えばプラスミド）を模式的に示す。図１６Ｂはポジティブ選択／ネガティブスクリーニングスキームを模式的に示す。
【図１７Ａ】増幅性蛍光レポーター系を示す。図１７Ａはスクリーニングに使用することができるベクター（例えば、ｐＲＥＰ等のプラスミド）を模式的に示す。
【図１７Ｂ】増幅性蛍光レポーター系を示す。図１７ＢはｐＲＥＰ（１〜１２）内のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子構築物の組成と蛍光増加を示す。
【図１７Ｃ】増幅性蛍光レポーター系を示す。図１７ＣはｐＲＥＰ（１０）とｐＱＤ（上段）又はｐＱ（下段）を含む細胞のサイトメトリー分析を示す。
【図１７Ｄ】増幅性蛍光レポーター系を示す。図１７ＤはｐＲＥＰ（１０）を含み、各種大腸菌サプレッサーｔＲＮＡを発現する細胞のフルオロメトリー分析を示す。
【図１８】表面エピトープへの非天然アミノ酸の組込みのファージ選択を模式的に示す。
【図１９】非天然アミノ酸特異性をもつ提示されたシンテターゼ（例えばファージに提示されたシンテターゼ）をスクリーニングするために使用する分子（例えばアミノアシルアデニル酸中間体の固定化アミノアルキルアデニル酸類似体）の１例を模式的に示す。
【図２０】各種生物に由来する各種直交対のアンピシリン耐性を示すグラフ。本図はセレクターコドン（例えばアンバーコドン）を含むレポーター遺伝子（例えばβラクタマーゼ遺伝子）と（セレクターアンチコドンを含む）サプレッサーｔＲＮＡを各々含むレポーター構築物を使用した直交対の検出例を示す。
【図２１】図２１Ａ及びＢはロイシルｔＲＮＡのアンチコドンループを突然変異（例えばランダム突然変異）させ、例えば選択段階の組合せ（例えばβラクタマーゼに基づく選択とバルナーゼに基づく選択）を使用してセレクターコドン（例えばレポーター遺伝子中のアンバーコドン）のより効率的な抑圧について選択（図２１Ｂ）することにより作製したＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＮＲＣ−１由来突然変異アンバーサプレッサーｔＲＮＡを示す。
【図２２】基本コドンのｔＲＮＡサプレッサーを示す。
【図２３】図２３Ａ〜Ｄは成功した各進化実験からの優性シンテターゼ変異体の活性を示す。図２３ＡはｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡと指定シンテターゼ変異体を含む細胞を対応する非天然アミノ酸の存在下（＋）又は不在下（−）で増殖させ、長波長紫外線を照射した場合の写真である。図２３ＢはｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡと指定シンテターゼ変異体を含む細胞を対応する非天然アミノ酸の存在下（左）又は不在下（右）で増殖させた場合のフルオロメトリー分析を示す。図２３ＣはｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡと指定シンテターゼ変異体を含む細胞を対応する非天然アミノ酸の存在下又は不在下で増殖させた場合のＣｍ  ＩＣ50分析を示す表である。図２３ＤはｐＢＡＤ／ＪＹＡＭＢ−４ＴＡＧと指定シンテターゼ変異体を含む細胞を対応する非天然アミノ酸の存在下（＋）又は不在下（−）で増殖させた場合のタンパク質発現分析を示す。
【図２４】ネガティブＦＡＣＳスクリーニング（ＯＡＹ−ＲＳ（１，３，５））又はネガティブバルナーゼ選択（ＯＡＹ−ＲＳ（Ｂ））を使用して得られたＯＡＳ−ＲＳ変異体の活性比較を示す。
【図２５】図２５Ａ〜ＢはＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳの進化を誘導するための多目的レポータープラスミド系の成分を示す。図２５ＡはプラスミドｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡを示す。図２５ＢはＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳの進化のターゲットとして使用した非天然アミノ酸の構造を示す。
【図２６】プラスミドｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡを使用してアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを進化させるためのストラテジーを示す。
【図２７】Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するスレオニルｔＲＮＡシンテターゼを示す。
【図２８】Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ直交スレオニルｔＲＮＡ／ＲＳのための直交ｔＲＮＡの作製を示す。
【図２９】本発明で利用される典型的非天然アミノ酸を示す。
【図３０】本発明で利用される典型的非天然アミノ酸を示す。
【図３１】本発明で利用される典型的非天然アミノ酸を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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