(57)【要約】      （修正有）【課題】高含量のナリンゲニンカルコンを含有するトマトを効率的に提供すること。【解決手段】トマト果実の熟度が完熟期、桃熟期および催色期から選択される組み換え遺伝子を含有せず、カルコンシンターゼ相対酵素発現量がカルコンイソメラーゼ相対酵素発現量よりも高い、トマトまたはカルコンシンターゼ含有量がカルコンイソメラーゼ含有量よりも高いトマト組成物を育種選抜することで得られる。またトマトの栽培方法は、トマト栽培で通常用いられる栽培方法であれば特に限定されないが、例えば露地栽培、雨除け土耕栽培、雨除け水耕栽培、およびマルチ土耕栽培などが挙げられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルコンシンターゼ相対酵素発現量がカルコンイソメラーゼ相対酵素発現量よりも高いトマト。
【請求項２】
トマト果実の熟度が完熟期、桃熟期および催色期から選択される、請求項１のトマト。
【請求項３】
カルコンシンターゼ含有量がカルコンイソメラーゼ含有量よりも高いトマト組成物。
【請求項４】
組み換え遺伝子を含有しない、請求項１または２に記載のトマトおよび請求項３に記載のトマト組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トマトに関する。
【背景技術】
【０００２】
トマト果皮には、生体に有益な効能を示すナリンゲニンカルコンなど各種ポリフェノールが豊富に含まれているが、トマトのナリンゲニンカルコン含量は、果実の熟度によって増減し、トマト果実の催色期においてナリンゲニンカルコンの含量は最大値を示した後、完熟期へ移行するに従い漸次減少する（例えば、非特許文献１参照）。また、トマトのナリンゲニンカルコン含量は、天候、生育地域、土壌などの栽培条件に左右される。さらに、トマトのナリンゲニンカルコンの生合成に関わる酵素にカルコンシンターゼおよびカルコンイソメラーゼなどが知られているが、これらの酵素活性と結びつく遺伝子発現量とナリンゲニンカルコン含量の関係は十分に知られていないのが現状である（例えば、非特許文献２〜３参照）。
【０００３】
一般に、トマト果実に含まれる有効成分の含量を高める方法として、遺伝子組み換え技術を用いた方法（例えば、非特許文献３〜４参照）や、トマトの生果実を収穫後に追熟や嫌気処理することで、食味を改善または保持し、有効成分の含量を高める方法が知られている。
例えば、特許文献１には、グルタミン酸の一部をγ−アミノ酪酸にして、γ−アミノ酪酸の含量を高める方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平０４−５１８７８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９，４７０−４７４（２００１）
【非特許文献２】Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１５２，７１−８４（２０１０）
【非特許文献３】Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１４，２５０９−２５２６（２００２）
【非特許文献４】Ｊ．  Ｎｕｔｒ．，１３６，２３３１−２３３７（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ナリゲニンカルコン含量に関していえば、上述の公知文献に記載の方法ではその含量を増加させることは十分ではなく、例えば遺伝子組み換え技術を用いた場合、人体に対する悪影響などの懸念から、食用に供するには受け入れがたいものとなっているのも現状である。
また、育種選抜による方法では多大な労力と時間を要するという欠点があった。
すなわち、高いナリンゲニンカルコン含量を有するトマトを提供する技術が求められている。
本発明が解決しようとする課題は、高含量のナリンゲニンカルコンを含有するトマトを効率的に提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで、本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、トマト果実中のカルコンシンターゼおよびカルコンイソメラーゼの相対酵素発現量を指標にすることで高含量のナリンゲニンカルコンを含有するトマトを提供する方法を見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
［１］
カルコンシンターゼ相対酵素発現量がカルコンイソメラーゼ相対酵素発現量よりも高いトマト。
［２］
トマト果実の熟度が完熟期、桃熟期および催色期から選択される、［１］のトマト。
［３］
カルコンシンターゼ含有量がカルコンイソメラーゼ含有量よりも高いトマト組成物。
［４］
組み換え遺伝子を含有しない、［１］または［２］に記載のトマトおよび［３］に記載のトマト組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、高含量のナリンゲニンカルコンを含有するトマトを効率的に提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明を、発明を実施するための形態により具体的に説明するが、本発明は、以下の発明を実施するための形態に限定されるものではなく、種々変形して実施することができる。
【００１１】
本発明のトマトは、カルコンシンターゼ相対酵素発現量がカルコンイソメラーゼ相対酵素発現量よりも高いトマトである。
本発明において、トマトのナリンゲニンカルコンの生合成に関わる酵素であるカルコンシンターゼおよびカルコンイソメラーゼに着目し、カルコンシンターゼ相対酵素発現量がカルコンイソメラーゼ相対酵素発現量よりも高いトマトであることにより、ナリンゲニンカルコン含量の高いトマトを提供することができる。
本発明において、「カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）」とは、ナリンゲニンカルコンを生合成する酵素を意味し、マロニルＣｏＡと４−クマロイルＣｏＡからナリンゲニンカルコンに変換する酵素である。
カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）発現量とは、ＣＨＳ１ＢとＣＨＳ２の２つの遺伝子の発現量の和を意味する。
ＣＨＳ１ＢとはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ５５１９４（配列番号１）に記載されたＤＮＡ配列と少なくとも８４％以上の相同性を有するＤＮＡ配列を有し、かつ、該ＤＮＡ配列によりコードされたタンパク質がマロニルＣｏＡと４−クマロイルＣｏＡからナリンゲニンカルコンを合成する機能を有する遺伝子を意味する。ＣＨＳ１Ｂの予測されるアミノ酸配列は、ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎによりドメイン検索してＩＰＲ００１０９９  （Ｃｈａｌｃｏｎｅ／ｓｔｉｌｂｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ)、ＩＰＲ０１１１４１  （Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ）、ＩＰＲ０１２３２８（Ｃｈａｌｃｏｎｅ／ｓｔｉｌｂｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）のいずれかのドメインを有することが好ましい。
ＣＨＳ２とは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ５５１９５（配列番号２）に記載されたＤＮＡ配列と少なくとも８４％以上の相同性を有するＤＮＡ配列を有し、かつ、該ＤＮＡ配列によりコードされたタンパク質がマロニルＣｏＡと４−クマロイルＣｏＡからナリンゲニンカルコンを合成する機能を有する遺伝子を意味する。ＣＨＳ２の予測されるアミノ酸配列は、ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎによりドメイン検索してＩＰＲ００１０９９  （Ｃｈａｌｃｏｎｅ／ｓｔｉｌｂｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ)、ＩＰＲ０１１１４１  （Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ）、ＩＰＲ０１２３２８（Ｃｈａｌｃｏｎｅ／ｓｔｉｌｂｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）のいずれかのドメインを有することが好ましい。
【００１２】
本発明において、「カルコンイソメラーゼ（ＣＨＩ）」はナリンゲニンカルコンをナリンゲニンに代謝する酵素を意味し、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｔｏｍａｔｏ  Ｇｅｎｅ  Ｉｎｄｅｘ（ＬｅＧＩ）  ｒｅｌｅａｓｅ１２のＴｅｎｔａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ＴＣ２０５８５０（配列番号３）に記載されたＤＮＡ配列と少なくとも７５％以上の相同性をもつＤＮＡ配列を有し、かつ、該ＤＮＡ配列によりコードされたタンパク質がナリンゲニンカルコンをナリンゲニンに代謝する機能を有する遺伝子を意味する。
カルコンイソメラーゼ（ＣＨＩ）発現量は、ＣＨＩ遺伝子の発現量を意味する。
【００１３】
本発明においては、カルコンシンターゼ相対酵素発現量とカルコンイソメラーゼ相対酵素発現量を指標に、ナリンゲニンカルコン高含有トマトを得ることができるが、Ｍｙｂ１２相対酵素発現量を指標にしてもよい。
Ｍｙｂ１２は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＵ４１９７４８（配列番号４）と類似する配列を有する遺伝子を意味する。
【００１４】
ＧＡＰＤＨとは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＬＥＵ９７２５７（配列番号５）に記載されたＤＮＡ配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するＤＮＡ配列を有し、かつ、該ＤＮＡ配列によりコードされたタンパク質がグリセルアルデヒド３−リン酸から１，３−ビスホスホグリセリン酸を生成する機能を有する遺伝子を意味する。ＧＡＰＤＨの予測されるアミノ酸配列は、タンパク質がグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素タンパク質すなわちＧｅｎＢａｎｋタンパク質ＩＤがＡＡＢ５４００３のタンパク質と類似するアミノ酸配列を有することが好ましい。
ＧＡＰＤＨ発現量は、ＧＡＰＨＤ遺伝子の発現量を意味する。
【００１５】
相対酵素発現量とは、以下の実施例に示す方法によって遺伝子の発現量を定量したときの定量値を指す。
検量線作成に用いた希釈系列と一緒に改めて全サンプルのリアルタイムＰＣＲ反応を実施し、各サンプルにおいて閾値蛍光強度（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：０．０８）に達しているサイクル数を求め、各遺伝子の検量線を用いて希釈系列に準拠したｃＤＮＡ量を推定する。各遺伝子についてのこの推定値を、発現量がほぼ一定と考えられているＧＡＰＤＨについての推定値で割った値を「相対酵素発現量」と定義する。具体的には、カルコンシンターゼ相対酵素発現量とは、カルコンシンターゼ発現量を、ＧＡＰＤＨ発現量で除した値を意味し、カルコンイソメラーゼ相対酵素発現量とは、カルコンイソメラーゼ発現量を、ＧＡＰＤＨ発現量で除した値を意味する。また、Ｍｙｂ１２相対酵素発現量とは、Ｍｙｂ１２発現量を、ＧＡＰＤＨ発現量で除した値を意味する。
カルコンシンターゼ相対酵素発現量とカルコンイソメラーゼ相対酵素発現量を指標に、トマトの選抜、育種、品種改良を行うことで、ナリンゲニンカルコン含有量の高いトマトを選別することができる。すなわち、カルコンシンターゼ相対酵素発現量がカルコンイソメラーゼ相対酵素発現量よりも高いトマトを選別していくことで、ナリンゲニンカルコン高含有トマトを提供することができる。また、斯かる選別を行うことにより、高含量のナリンゲニンカルコンを含有するトマトを効率的に提供することができる。さらに、トマト中におけるカルコンシンターゼ相対酵素発現量とカルコンイソメラーゼ相対酵素発現量を指標にすることで、ナリンゲニンカルコン高含有トマトを提供することできる。
【００１６】
（ナリンゲニンカルコン高含有トマト）
本発明のトマトは、催色期または桃熟期または完熟期におけるカルコンシンターゼの相対酵素発現量がカルコンイソメラーゼの相対酵素発現量よりも大きい。また、本発明のトマトは、トマト１００ｇあたり、ナリンゲニンカルコンが好ましくは１ｍｇ以上、より好ましくは３ｍｇ以上、さらに好ましくは５ｍｇ以上、よりさらに好ましくは１０ｍｇ以上含まれることを特徴とする。
ナリンゲニンカルコン含量が、催色期よりも桃熟期の方が高く、桃熟期よりも完熟期の方が高いことが嗜好性の観点からより好ましい。
【００１７】
本発明のトマトは、高いナリンゲニンカルコン含量を示すトマトであるが、完熟期におけるカルコンシンターゼ相対酵素発現量がカルコンイソメラーゼ相対酵素発現量の１倍より大きいことが好ましく、また、桃熟期におけるカルコンシンターゼ相対酵素発現量がカルコンイソメラーゼ相対酵素発現量よりも１倍より大きいことが好ましく、また、催色期におけるカルコンシンターゼ相対酵素発現量がカルコンイソメラーゼ相対酵素発現量よりも１倍より大きいことが好ましい。カルコンシンターゼ相対酵素発現量が、カルコンイソメラーゼ相対酵素発現量よりも高いとは、トマトの熟度の各期において、カルコンシンターゼ相対酵素発現量がカルコンイソメラーゼ相対酵素発現量よりも１倍より大きいことを意味し、トマト果実の熟度が完熟期、桃熟期または催色期において、カルコンシンターゼ相対酵素発現量がカルコンイソメラーゼ相対酵素発現量よりも１倍より大きいことが好ましく、完熟期、桃熟期、催色期の２つ以上の期において、カルコンシンターゼ相対酵素発現量がカルコンイソメラーゼ相対酵素発現量よりも１倍より大きいことがより好ましく、完熟期、桃熟期、および催色期のすべての期において、カルコンシンターゼ相対酵素発現量がカルコンイソメラーゼ相対酵素発現量よりも１倍より大きいことが好ましい。
【００１８】
完熟期、桃熟期および／または催色期において、カルコンシンターゼ相対酵素発現量がカルコンイソメラーゼ相対酵素発現量の１倍より大きいであることが好ましく、また、高いナリンゲニンカルコン含量を示すトマトとして、具体的には、日本デルモンテ社内で育種されたＤＲ５６００種が挙げられる。ＤＲ５６００種は、完熟期・桃熟期・催色期の全ての期においてカルコンシンターゼ相対酵素発現量がカルコンイソメラーゼ相対酵素発現量の１倍より大きいトマトである。ＤＲ５６００種は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成２１年９月１８日に受領され、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１８５１が付与され、ＦＥＲＭ−Ｐ２１８５１として受託されている。
【００１９】
本発明のトマトは、鮮赤色果色遺伝子（ｏｇ遺伝子）を有する系統に高色素遺伝子（ｈｐ遺伝子）を有する系統を交雑し育種選抜することで得ることができる。具体的には、ｏｇ遺伝子を有する系統にｈｐ遺伝子を有する系統を交雑し、フラボノイドの蓄積性を中心に、収穫性や耐病性に優れる系統の育種選抜を繰り返し行った系統を用いて育種することで得ることができる。
【００２０】
ｏｇ遺伝子を有する系統としては、例えば、ＤＲ７３６ＴＭ、ベルハーベスト２号、なつのしゅん、およびＮＴ６０４からなる群から選ばれる少なくとも一種を交雑して得られる系統が挙げられ、ｈｐ遺伝子を有する系統としては、例えば、盛岡１０号、盛岡１７号（ふりこま）、Ｍａｎａｐａｌ、なつのこま、およびとまと中間母本農１０号からなる群から選ばれる少なくとも一種を交雑して得られる系統が挙げられる。
ナリンゲニンカルコンの含有量が高い種を育種選抜するために、ｏｇ遺伝子を有する系統としてＤＲ７３６ＴＭもしくはベルハーベスト２号またはこれらの群から選ばれる少なくとも一種を交雑して得られる系統を、ｈｐ遺伝子を有する系統として盛岡１０号またはこれを交雑して得られる系統を用いて育種選抜することが好ましい。
【００２１】
育種選抜方法として、両親姉妹系統間において、Ｆ１組み合わせ能力検定を行い、カルコンシンターゼ相対酵素発現量とカルコンイソメラーゼ相対酵素発現量を指標として選別することにより、フラボノイド蓄積性、特にナリンゲニンカルコンの蓄積性が高いトマトを作出することができる。
ＤＲ５６００は、ＤＲ７３６ＴＭから育種選抜した系統に盛岡１０号から育種選抜した系統を交雑した系統を片親とし、ベルハーベスト２号から育種選抜した系統に盛岡１０号から育種選抜した系統を交雑した系統を片親として交雑し、フラボノイドの蓄積性を中心に、収穫性や耐病性に優れる系統の育種選抜を繰り返すことで作出した。
【００２２】
ｏｇ遺伝子とは、リコペンの生合成に関与する遺伝子を意味し、ｈｐ遺伝子とは、カロテノイド、フラボノイドの生合成に関与する遺伝子を意味する。
本発明のトマトには、遺伝子組み換え技術による人工的なｏｇ遺伝子導入トマトや、ｈｐ遺伝子導入トマトは含まれない。本発明のトマトは、交配により育種されて得られるトマトであり、遺伝子組換えトマトでないことが好ましい。
【００２３】
本発明において、遺伝子組替え技術によるトマト（遺伝子組換えトマト）とは、遺伝子組換え技術により、人工的に外来遺伝子を導入したトマトを意味し、交配により育種されるトマトを意味しない。
【００２４】
トマトの交雑方法としては、異なる遺伝子の間で人工交配をして雑種を作る人工交雑などの方法が挙げられる。
【００２５】
育種選抜は、雑種の分離世代（Ｆ２以降）において、つねに個体選抜と選抜個体ごとの系統栽培をくりかえし、系統間の比較によって優劣を判定しながら、選択、固定をはかり純系をつくっていく、系統育種法などの方法により行うことができる。
【００２６】
トマトの栽培方法は、トマト栽培で通常用いられる栽培方法であれば特に限定されないが、例えば露地栽培、雨除け土耕栽培、雨除け水耕栽培、およびマルチ土耕栽培などが挙げられる。
【００２７】
本発明のトマトは、上記のように育種選抜することにより得られるトマトであり、遺伝子組み換え技術を用いることなく、完熟期においてナリンゲニンカルコン含量が高いトマトである。また、本発明は、本発明のトマトを収穫することのできる植物体として、種子、苗木およびカルスなどをも提供するが、受領番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２１８５１として受託されているトマトの種子および苗木であることが好ましい。
【００２８】
（ナリンゲニンカルコン高含有トマト組成物）
本発明のトマト組成物は、カルコンシンターゼ含有量がカルコンイソメラーゼ含有量よりも大きいことを特徴とする。
カルコンシンターゼ含有量が、カルコンイソメラーゼ含有量よりも大きいトマトとは、カルコンシンターゼ相対酵素発現量が、カルコンイソメラーゼ相対酵素発現量よりも高いトマトに由来する組成物であることを意味する。また、トマト組成物において、カルコンシンターゼ相対酵素発現量とカルコンイソメラーゼ相対酵素発現量を測定し、カルコンシンターゼ相対酵素発現量が、カルコンイソメラーゼ相対酵素発現量よりも高いトマト組成物であってもよい。
また、本発明のトマト組成物１００ｇあたり、ナリンゲニンカルコンが好ましくは１ｍｇ以上、より好ましくは３ｍｇ以上、さらに好ましくは５ｍｇ以上、よりさらに好ましくは１０ｍｇ以上含まれることを特徴とする。
【００２９】
本発明のトマト組成物は、トマトだけからなるものであってもよく、トマトに他の成分を混合させたものであってもよい。混合物としての、トマト組成物としては、例えば、ニンジン等の野菜汁を混合させた組成物などが挙げられる。原料としてトマトだけを用いて得られるトマト組成物は、任意の熟度のトマト果実から適宜調製することができる。例えば、破砕、磨砕、搾汁、水抽出、含水エタノール抽出、酵素分解、発酵、酸アルカリ処理などの方法がトマト組成物を得るための処理方法として挙げられ、これらを二つ以上組み合わせた組成物でもよい。任意の熟度の果実を使用することができ、異なる熟度の果実を混合してもよい。また、これらのトマト組成物を調製中に、ナリンゲニンカルコンの分解を抑制する目的で、デキストリンを加えることも適宜選択できる。
トマトおよびニンジン等の野菜汁を混合させたトマト組成物は、上記のトマトのみを原料として用いたトマト組成物とニンジン等の野菜汁などを混合させて調整することができる。
【００３０】
本発明のトマト組成物の製造方法は、次のように行うことができる。
[１]トマトを処理し、溶存酵素を３０時間以内に加熱失活させることで得る方法。
[２]トマトおよびニンジンを含む野菜を処理し、溶存酵素を３０時間以内に加熱失活させることで得る方法。
[３]上記２つの方法で得たトマト組成物を混合することで得る方法。
ここでの処理は、前述の破砕、磨砕、搾汁、水抽出、含水エタノール抽出、酵素分解、発酵、酸アルカリ処理などの方法を指す。また加熱失活で用いる加熱温度は、酵素とくにカルコンシンターゼまたはカルコンイソメラーゼが失活する温度であれば何度でも良く、例えば、常圧下で摂氏７０度（７０℃）以上の温度であり、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上である。加熱時間は、酵素とくにカルコンシンターゼまたはカルコンイソメラーゼが失活する時間であれば何でも良く、例えば９０℃で１分間以上であり、好ましくは９０℃で３分間以上であるが、９０℃で３０分間などの長時間はナリンゲニンカルコンの分解や風味の劣化の点から好ましくない。
【００３１】
（トマトの熟度）
トマトの熟度は、Ａｔｈｅｒｔｏｎらの報告（Ｔｈｅ  Ｔｏｍａｔｏ  Ｃｒｏｐ，２６０，ＴＡＢＬＥ６．５，(１９８６)）に基づき、表１に示すように分類することができる。本発明で用いたトマトの各熟度は、「緑熟期」、「催色前期」、「催色期」、「完熟期」の４段階で採取した。Ａｔｈｅｒｔｏｎらの報告に従えば、「緑熟期」、「催色前期」、「催色期」、「完熟期」は、それぞれ「Ｇｒｅｅｎ」、「Ｂｒｅａｋｅｒ」、「Ｔｕｒｎｉｎｇ」、「Ｒｅｄ」に当たる。採取した果実の表面を水で洗浄し、ピーラーで果皮を剥いた。このときの果皮には果肉も厚さ１ｍｍから５ｍｍ程度含まれている。果皮はすみやかに液体窒素で凍結し、分析まで−８０℃で保管した。
なお、従来知見による分類（例えば、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９，４７０−４７４（２００１）参照）の「Ｇｒｅｅｎ」、「Ｔｕｒｎｉｎｇ」、「Ｒｅｄ」はそれぞれ本発明における「緑熟期」、「催色期」、「完熟期」に相当する。熟度は、通常トマトの草本上での熟度をいうが、任意の熟度のトマトを収穫後に追熟させた後の熟度であっても構わない。例えば、催色期から桃熟期にトマトを収穫し、大気下や低酸素下や無酸素下で、５℃から室温以下で数時間から数日間保管することで、追熟させることができる。
本発明のトマトには、カルコンシンターゼ相対酵素発現量がカルコンイソメラーゼ相対酵素発現量よりも高いトマトであれば、表１における熟度については特に限定されないが、完熟期、桃熟期および／または催色期においてカルコンシンターゼ相対酵素発現量がカルコンイソメラーゼ相対酵素発現量よりも大きいトマトであることが好ましく、該トマトには、トマト草本から収穫した後に追熟することで、カルコンシンターゼ相対酵素発現量がカルコンイソメラーゼ相対酵素発現量よりも大きくなるトマト、カルコンシンターゼ含有量がカルコンイソメラーゼ含有量よりも大きくなるトマトなどが挙げられる。
すなわち、本発明のトマトは、カルコンシンターゼ相対酵素発現量がカルコンイソメラーゼ相対酵素発現量よりも大きいトマトであれば、トマトの熟度が、草本上で至ったものであっても、完熟期に至る前、例えば催色期で収穫し、任意の条件で追熟し完熟させてもよい。
【００３２】
【表１】
2011188778.tif 000002
【００３３】
（ナリンゲニンカルコン）
ナリンゲニンカルコン（２’４’６’４−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙｃｈａｌｃｏｎｅ）は下記構造式（１）に示される物質である。
【００３４】
構造式（１）：
【化１】
2011188778.tif 000003
ナリンゲニンカルコンとしては、例えば、塩の形態であってもよい。
ナリンゲニンカルコンの塩としては、特に限定されないが、例えば、アルカリ金属（ナトリウム、カリウム等）、アルカリ土類金属（マグネシウム、カルシウム等）との塩が挙げられる。また、塩としては、無機酸（塩酸、硫酸、リン酸）や有機酸（マレイン酸、クエン酸、フマル酸等）を付加した酸付加塩、更にはアミンの付加塩、アミノ酸の付加塩等が挙げられる。
ナリンゲニンカルコンとしては、ナリンゲニンカルコンの水和物であってもよく、ナリンゲニンカルコンの塩の水和物であってもよい。
【００３５】
トマト生果実中では大部分がナリンゲニンカルコンの化学構造で存在し、ナリンゲニンはほとんど存在しないが、抽出、加熱、ｐＨ変化、水溶液化など化学的環境が変化すると、分子内閉環反応が起こり、下記構造式（２）で表されるナリンゲニンへと変換される（例えば、特開２００３−２２１３５６号公報参照）。
後述するナリンゲニンカルコンの測定において、ナリンゲニンカルコン含量を測定する際には、ナリンゲニンカルコンが、抽出、測定の工程を経て、ナリンゲニンへと変換されていることを考慮し、本発明においては、トマト果皮に含まれているナリンゲニンカルコンおよびナリンゲニンの和をナリンゲニンカルコン含量とする。
【００３６】
構造式（２）：
【化２】
2011188778.tif 000004
【００３７】
また、γデキストリンを共存させることでナリンゲニンカルコンを安定化した後（例えば、特開２００３−２２１３５６号公報参照）、その含量を測定してもよい。
【００３８】
（ナリンゲニンカルコン含量の測定）
トマト中のナリンゲニンカルコンは、トマト果皮に特に高濃度に含まれている。従って、トマト果皮中のナリンゲニンカルコン含量を測定することができる。
トマト果皮とは、生の状態で果肉の細胞が除かれた厚さ１ミリメートル以下の組織をいい、ナリンゲニンカルコン含量を測定する際には、乾燥させ、トマト果皮の水分含量が１０％以下のものを用いることが好ましい。乾燥させたトマト果皮のナリンゲニンカルコン含量は、常法に従い測定することができる。
該測定方法としては、例えば、乾燥させたトマト果皮を、含水エタノールまたは含水メタノールにより抽出後、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。抽出する際、トマト果皮を粉砕したり還流抽出を行ってもよい。
抽出液中のナリンゲニンカルコン濃度、トマト果実および／またはトマト果皮の重量より、乾燥トマト果皮１ｇあたりのナリンゲニンカルコン含量（ｍｇ）や生のトマト果実１００ｇあたりのナリンゲニンカルコン含量（ｍｇ）を求めることができる。
【００３９】
（ナリンゲニンカルコン高含有トマトの利用）
本発明のトマト、トマト組成物は、さらに破砕、粉砕、磨砕、抽出、溶解、酵素処理、発酵処理、酸アルカリ処理等の加工法を必要に応じて使用することによって各種加工品に利用することができる。
加工品としては、例えば、ジュース、果汁飲料、および清涼飲料水等の飲料、ケチャップおよびトマトソース等の調味料、ホールトマト、カットトマト、トマトペースト、およびスープ等の缶詰ならびにトマト加工品、錠剤およびカプセル等の栄養補助食品、ならびに菓子等が挙げられる。
ナリンゲニンカルコンがトマト果皮に多く含有されていることを考慮し、トマト果実を、全果または果皮が多く残存する搾汁残渣として用いることが望ましい。
【実施例】
【００４０】
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００４１】
（熟度別トマト）
実施例としてＤＲ５６００種（受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１８５１）を、比較例として公知のトマトである桃太郎種を用いた。
トマトは、千葉県農林総合研究センター内の雨除けマルチ土耕による同一条件下で栽培した。
上述の表１記載の熟度判別に従い、第１から第４段目の果房から、各熟度それぞれ６果実を採取した。
【００４２】
（ナリンゲニンカルコン含量の測定）
各熟度におけるナリンゲニンカルコン含量は以下の方法により測定した。
各熟度のトマト果実から果皮をピーラーまたは包丁で剥き取り、水分含量５％以下となるように凍結乾燥させた。凍結乾燥前のトマト果皮の水分含量は３０〜７０％であった。
乾燥果皮０．１０ｇに対し１０ｍＬの６０％エタノールを加え、３０分間還流抽出を行った。
抽出溶液を親水性ＰＴＦＥフィルター（ポアサイズ０．４５μｍ；アドバンテック東洋株式会社製）でろ過後、ＵＶ検出器（ＵＶ９７０型；日本分光株式会社製）を接続した高速液体クロマトグラフィー（ＧＵＬＬＩＶＥＲシリーズＨＰＬＣシステム；日本分光株式会社製）による分析に供し、検出波長３１０ｎｍで検出されたピークを標準品から定量した。
ＨＰＬＣ条件は、移動相：０．１％ギ酸を含む２５％アセトニトリル水溶液、分析カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  ＵＧ１２０（株式会社資生堂社製）  ４．６×１５０ｍｍ  ５μｍ、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、注入量：１０μＬ、カラム温度：室温、検出波長：３１０ｎｍとした。
熟度別の生果実１００ｇあたりのナリンゲニンカルコン含量の平均値を表２に示す。
【００４３】
【表２】
2011188778.tif 000005
【００４４】
表２に示すとおり、桃太郎種では、いずれの熟期においてもナリンゲニンカルコンは定量限界（１ｍｇ／ｇ乾燥果皮）未満であり、桃太郎種のナリンゲニンカルコン含量は、０．０ｍｇ／１００ｇトマト生果実であった。一方、ＤＲ５６００種のナリンゲニンカルコン含量は、熟度の進行と共に蓄積していた。
【００４５】
（トマトの熟度別のＣＨＳとＣＨＩ）
ＤＲ５６００種および桃太郎種を用い、各熟度におけるカルコンシンターゼ（ＣＨＳ）とカルコンイソメラーゼ（ＣＨＩ）を定法に従って、以下のように測定した。
トマト組織からＰｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２２（２）：１６１−１６５  （２００５）に記載された方法により抽出したＲＮＡ抽出物を、ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｓｅｔ(カタログ番号７９２５４、Ｑｉａｇｅｎ社製)を用いて、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ０４／２００６  ７１ページ    Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ｅ：ＤＮａｓｅ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｂｅｆｏｒｅ  ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎｕｐのプロトコールに従ってＤＮａｓｅ処理した。
次いで、エタノール沈澱により、ＲＮＡを濃縮し、濃度を測定し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製２１００）とＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  Ｋｉｔ（カタログ番号５０６７−１５１１、Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて品質評価した。該Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによる分析結果として出力されるＲＮＡ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｎｕｍｂｅｒが８以上の場合ｃＤＮＡ合成へと進めた。
得られたＲＮＡ５μgを鋳型とし、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号１８０８０−０５１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、添付のプロトコールに従って、ｃＤＮＡを合成した。第一鎖合成プライマーとして、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０を用いた
得られたｃＤＮＡ溶液を、滅菌したミリＱ水を用いて、全量が２１μＬになるように調整し、そのうちの５μＬをさらに１／２０倍に希釈して、ｃＤＮＡを含む希釈液２μＬをリアルタイムＰＣＲの鋳型として用いた。
リアルタイムＰＣＲは、下記プライマーおよびリアルタイムＰＣＲキットＤＹＮＡＭＯ  ＨＳ  ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  Ｋｉｔ（カタログ番号Ｆ−４１０Ｌ、ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社製）を用い、サーマルサイクラーＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｏｐｔｉｃｏｎ（登録商標）  ２  Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製（現在はＢｉｏ−Ｒａｄ社に併合））を用いて各遺伝子を増幅した。
ＣＨＳ1Ｂ   Ｆｏｒｗａｒｄ；GGTTGGGCTTACATTCCACTTAC     （配列番号６）
ＣＨＳ１Ｂ  Ｒｅｖｅｒｓｅ；GAGCGATCCAAAATAGAGAGTTCC    （配列番号７）
ＣＨＳ２    Ｆｏｒｗａｒｄ；TCGGGCTACTAGGCAAGTTTTAAG    （配列番号８）
ＣＨＳ２    Ｒｅｖｅｒｓｅ；CTGTGGTACTAAGCCCTTCTTTGG    （配列番号９）
ＣＨＩ      Ｆｏｒｗａｒｄ；TGGAACTAGGGGAGTGTCACC       （配列番号１０）
ＣＨＩ      Ｒｅｖｅｒｓｅ；CATAGGCCAAATACAATAAGCCAAC    （配列番号１１）
なお、Ｍｙｂ１２相対酵素発現量を指標とする場合には、以下のプライマーを用いてＭｙｂ１２相対酵素発現量を測定することができる。
Ｍｙｂ１２  Ｆｏｒｗａｒｄ；GTTTCAGAGAAGAAGTAACGAGCAA    （配列番号１２）
Ｍｙｂ１２  Ｒｅｖｅｒｓｅ；TGTGGCCAACTGGGAAC           （配列番号１３）
ＧＡＰＤＨのプライマーとしては、以下のプライマーを用いた。
ＧＡＰＤＨ  Ｆｏｒｗａｒｄ；GCAATCAAGGAGGAATCAGAGG       （配列番号１４）
ＧＡＰＤＨ  Ｒｅｖｅｒｓｅ；CCAAATCAATCACACGGGAAC        （配列番号１５）
リアルタイムＰＣＲの反応液組成は、２ｘＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  １０μＬ、５０μＭ  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  ０．２μＬ、５０μＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  ０．２μＬ、ミリＱ水  ７．２μＬ、ＲＯＸ(×５０）  ０．４μＬ、ｃＤＮＡを含む希釈液２μＬとした。
リアルタイムＰＣＲの反応サイクルは、最初５０℃／２分、９５℃／１５分の２ステップを経由して、（ｉ）９４℃／１０秒、(ii)６０．４℃／３０秒、(iii)７２℃／３０秒、（iv）蛍光強度測定のサイクル（(i)〜(iv)）を４６サイクル実施し、７２℃／１０分保持したのち、７２℃から９５℃の温度範囲で０．２℃／５秒刻みでメルティングカーブを計測した。
発現量を定量するための検量線は以下のように作成した。各遺伝子について、リアルタイムＰＣＲ解析用ソフトＯｐｔｉｃｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒ  ３．１(Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．１．３２．０）に示されるＱｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎグラフ（サイクル数と蛍光強度の関係）を用いて、最初に閾値蛍光強度（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：０．０８）に達しているサンプルを同定した。同定したｃＤＮＡサンプルの１/８倍、１/２００倍、１/４０００倍、１/８００００倍、１/１６００００倍、１/３２００００倍、１/６４００００倍、１/１２８００００倍という８段階の希釈ｃＤＮＡ系列を用いて、閾値蛍光強度（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：０．０８）に達した時のサイクル数を取得し、このサイクル数と希釈率の間の関係を示す検量線を作成した。
検量線作成に用いた希釈系列と一緒に改めて全サンプルのリアルタイムPCR反応を実施し、各サンプルにおいて閾値蛍光強度（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：０．０８）に達しているサイクル数を求め、ＣＨＳ１Ｂ、ＣＨＳ２、ＣＨＩ、ＧＡＰＤＨの各検量線からｃＤＮＡ量を推定した。
各遺伝子についてのｃＤＮＡ量の推定値をＧＡＰＤＨのｃＤＮＡ量の推定値で割った値を相対酵素発現量とし、ＣＨＳについてはＣＨＳ１ＢとＣＨＳ２の相対酵素発現量の和をＣＨＳの相対酵素発現量とした。結果を表３および表４に示す。
【００４６】
【表３】
2011188778.tif 000006
【００４７】
【表４】
2011188778.tif 000007
【００４８】
ＤＲ５６００種における各熟度別のカルコンシンターゼ（ＣＨＳ）、カルコンイソメラーゼ（ＣＨＩ）の相対酵素発現量は、催色期、桃熟期、完熟期のいずれにおいてもＣＨＩよりもＣＨＳの相対酵素発現量が多い。
一方、従来種である桃太郎種における各熟度別のカルコンシンターゼ（ＣＨＳ）、カルコンイソメラーゼ（ＣＨＩ）の相対酵素発現量は、催色期、桃熟期、完熟期のいずれにおいてもＣＨＩよりもＣＨＳの相対酵素発現量が少ないことがわかる
【００４９】
表２〜４の結果から明らかなように、本発明のトマトは催色期、桃熟期、完熟期において、ＣＨＳ相対酵素発現量がＣＨＩ相対酵素発現量よりも高いことにより、ナリンゲニンカルコンの生合成が活発でナリンゲニンカルコンが蓄積している。一方、従来種である桃太郎種では、いずれの熟度においても、とくに催色期や桃熟期でＣＨＳ相対酵素発現量がＣＨＩ相対酵素発現量よりも小さいため、ナリンゲニンカルコンが蓄積せず、食味に優れる完熟期において、ナリンゲニンカルコンを併せ持たないことがわかる。
【配列表フリーテキスト】
【００５０】
配列番号１は、ＣＨＳ１ＢのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号X55194の塩基配列である。
配列番号２は、ＣＨＳ２のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号X55195の塩基配列である。
配列番号３は、ＣＨＩのＤａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｔｏｍａｔｏ  Ｇｅｎｅ  Ｉｎｄｅｘ(ＬｅＧＩ)  ｒｅｌｅａｓｅ１２のＴｅｎｔａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ＴＣ２０５８５０の塩基配列である。
配列番号４は、Ｍｙｂ１２のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＵ４１９７４８の塩基配列である。
配列番号５は、ＧＡＰＤＨのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＬＥＵ９７２５７の塩基配列である。
配列番号６は、ＣＨＳ１Ｂのプライマーとして用いたＦｏｒｗａｒｄ配列である。
配列番号７は、ＣＨＳ１Ｂのプライマーとして用いたＲｅｖｅｒｓｅ配列である。
配列番号８は、ＣＨＳ２のプライマーとして用いたＦｏｒｗａｒｄ配列である。
配列番号９は、ＣＨＳ２のプライマーとして用いたＲｅｖｅｒｓｅ配列である。
配列番号１０は、ＣＨＩのプライマーとして用いたＦｏｒｗａｒｄ配列である。
配列番号１１は、ＣＨＩのプライマーとして用いたＲｅｖｅｒｓｅ配列である。
配列番号１２は、Ｍｙｂ１２のプライマーとして用いたＦｏｒｗａｒｄ配列である。
配列番号１３は、Ｍｙｂ１２のプライマーとして用いたＲｅｖｅｒｓｅ配列である。
配列番号１４は、ＧＡＰＤＨのプライマーとして用いたＦｏｒｗａｒｄ配列である。
配列番号１５は、ＧＡＰＤＨのプライマーとして用いたＲｅｖｅｒｓｅ配列である。
【配列表】
2011188778000001.app