(57)【要約】【課題】  親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包し、かつ粒径がナノオーダーである高分子微粒子を製造することができる。【解決手段】  本発明のナノスフェアの製造方法は、親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を溶解した溶媒と、両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒と、疎水性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒とを混合し、１次溶液に超音波を照射して１次エマルションを生成し、１次エマルションに、親水性ポリマーを溶解した水系溶媒を添加し、２次溶液を生成し、２次溶液に超音波を照射して２次エマルションを生成する。【選択図】    図１
2011011144.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｗ／Ｏ／Ｗエマルション法を用いた、ナノスフェアの製造方法であって、
親水性物質を溶解した水系溶媒と、両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒と、疎水性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒とを混合し、１次溶液を生成する１次溶液生成ステップと、
前記１次溶液に超音波を照射して１次エマルションを生成する１次エマルション生成ステップと、
前記１次エマルションに、親水性ポリマーを溶解した水系溶媒を添加し、２次溶液を生成する２次溶液生成ステップと、
前記２次溶液に超音波を照射して２次エマルションを生成する２次エマルション生成ステップと、
を含み、
前記ナノスフェアは、親水性物質を内包するナノスフェアの製造方法。
【請求項２】
Ｗ／Ｏ／Ｗエマルション法を用いた、ナノスフェアの製造方法であって、
親水性物質を溶解した水系溶媒と、両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒とを混合し、１次溶液を生成する１次溶液生成ステップと、
前記１次溶液に超音波を照射して１次エマルションを生成する１次エマルション生成ステップと、
前記１次エマルションに、親水性ポリマーを溶解した水系溶媒を添加し、２次溶液を生成する２次溶液生成ステップと、
前記２次溶液に超音波を照射して２次エマルションを生成する２次エマルション生成ステップと、
を含み、
前記ナノスフェアは、親水性物質を内包するナノスフェアの製造方法。
【請求項３】
Ｏ／Ｗエマルション法を用いた、ナノスフェアの製造方法であって、
疎水性物質を溶解した水非混和性有機溶媒と、両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒と、疎水性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒とを混合し、１次溶液を生成する１次溶液生成ステップと、
前記１次溶液に、親水性ポリマーを溶解した水系溶媒を添加し、２次溶液を生成する２次溶液生成ステップと、
前記２次溶液に超音波を照射してエマルションを生成するエマルション生成ステップと、
を含み、
前記ナノスフェアは、疎水性物質を内包するナノスフェアの製造方法。
【請求項４】
Ｏ／Ｗエマルション法を用いた、ナノスフェアの製造方法であって、
疎水性物質を溶解した水非混和性有機溶媒と、両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒とを混合し、１次溶液を生成する１次溶液生成ステップと、
前記１次溶液に、親水性ポリマーを溶解した水系溶媒を添加し、２次溶液を生成する２次溶液生成ステップと、
前記２次溶液に超音波を照射してエマルションを生成するエマルション生成ステップと、
を含み、
前記ナノスフェアは、疎水性物質を内包するナノスフェアの製造方法。
【請求項５】
Ｗ／Ｏ／Ｗエマルション法を用いた、ナノスフェアの製造方法であって、
親水性物質を溶解した水系溶媒と、疎水性物質を溶解した水非混和性有機溶媒と、両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒と、疎水性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒とを混合し、１次溶液を生成する１次溶液生成ステップと、
前記１次溶液に超音波を照射して１次エマルションを生成する１次エマルション生成ステップと、
前記１次エマルションに、親水性ポリマーを溶解した水系溶媒を添加し、２次溶液を生成する２次溶液生成ステップと、
前記２次溶液に超音波を照射して２次エマルションを生成する２次エマルション生成ステップと、
を含み、
前記ナノスフェアは、親水性物質および疎水性物質を内包するナノスフェアの製造方法。
【請求項６】
Ｗ／Ｏ／Ｗエマルション法を用いた、ナノスフェアの製造方法であって、
親水性物質を溶解した水系溶媒と、疎水性物質を溶解した水非混和性有機溶媒と、両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒とを混合し、１次溶液を生成する１次溶液生成ステップと、
前記１次溶液に超音波を照射して１次エマルションを生成する１次エマルション生成ステップと、
前記１次エマルションに、親水性ポリマーを溶解した水系溶媒を添加し、２次溶液を生成する２次溶液生成ステップと、
前記２次溶液に超音波を照射して２次エマルションを生成する２次エマルション生成ステップと、
を含み、
前記ナノスフェアは、親水性物質および疎水性物質を内包するナノスフェアの製造方法。
【請求項７】
前記両親媒性ポリマーは、親水性セグメントと疎水性セグメントとで構成される共重合体であり、
前記親水性セグメントは、電荷を有するアミノ酸を３個以上有するポリペプチド、数平均分子量５００〜１０００００であるポリエチレングリコール、および、多糖、の群から選択される１または複数を含み、
前記疎水性セグメントは、生分解性ポリエステルを含む請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記アミノ酸は、正電荷を有するアミノ酸であるリジン、アルギニンおよびヒスチジンの群および負電荷を有するアミノ酸であるアスパラギン酸およびグルタミン酸の群から選択される１または複数のアミノ酸である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記多糖は、ヒアルロン酸、アミロース、プルラン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、キチン、キトサン、および、βグルカン、の群から選択される１または複数である請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記両親媒性ポリマーにおける前記多糖の含有量が１〜５０質量％である請求項７または５に記載の方法。
【請求項１１】
前記生分解性ポリエステルの構成単位は、乳酸、グリコール酸、および、アミノ酸、の群から選択される１または複数である請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか１項に記載のナノスフェアの製造方法を用いて製造されたナノスフェア。
【請求項１３】
前記親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方として、ステビア発酵エキスまたはスフィンゴミエリンを内包する請求項１２に記載のナノスフェア。
【請求項１４】
請求項１から１１いずれか１項に記載のナノスフェアの製造方法を用いて製造されたナノスフェアを含有する皮膚外用組成物。
【請求項１５】
前記親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方として、ステビア発酵エキスまたはスフィンゴミエリンを含有する請求項１４に記載の皮膚外用組成物。
【請求項１６】
請求項１から１１いずれか１項に記載のナノスフェアの製造方法を用いて製造されたナノスフェアを含有する化粧料。
【請求項１７】
前記親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方として、ステビア発酵エキスまたはスフィンゴミエリンを含有する請求項１６に記載の化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、タンパク質、核酸、薬物、造影剤等の親水性物質、もしくは、脂質、薬物等の疎水性物質のいずれか一方または両方を内包できるナノスフェアの製造方法、ナノスフェア、これを含有する皮膚外用組成物および化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に病気の治療においては、「必要なときに、必要な量の薬物を、必要な病巣に選択的に送り届ける」ことが理想的であると言われている。従来の飲み薬等は、体内の目的場所（病巣）に到達する過程において、ほとんどの成分が変化してしまい、投与量と比較して、目的場所に到達する量はわずかであるという課題があった。
【０００３】
そこで、生分解性ポリマー等で薬物を内包した高分子微粒子を投与することにより、薬物を変化させることなく目的場所に到達させる、所謂ドラッグ・デリバリー・システム（Drug Delivery System:以下単にＤＤＳと称する）が注目を集めている。
【０００４】
さらに、生分解性ポリマー等で薬物を内包した高分子微粒子を投与して、所定量の薬物を長時間にわたって放出させることで、患者のＱＯＬ（Quality Of Life）を高めることができる薬物徐放型ＤＤＳも脚光を浴びている。
【０００５】
薬物徐放型ＤＤＳ製剤に利用される、生分解性ポリマーを用いた高分子微粒子として、粒子径０．１μｍ程度〜数１００μｍと幅広い範囲の粒子径の高分子微粒子（マイクロスフェア、またはマイクロパーティクル）が報告されている。例えば、特許文献１には、ポリ乳酸やポリ乳酸共重合体で酢酸リュープロレリンを内包したマイクロスフェアが開示され、かかる酢酸リュープロレリンを内包したマイクロスフェアは皮下注射用製剤として実用化されている。
【０００６】
一方、近年では、ホルモンや成長因子等のタンパク質やＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、生理活性を有する天然抽出物等の水溶性高分子の薬物としての利用が、ますます重要になっている。そこで、水溶性高分子の薬物を内包する高分子微粒子を利用した薬物徐放型ＤＤＳ製剤が要求されている。
【０００７】
特許文献１に記載のポリ乳酸やポリ乳酸共重合体を用いて水溶性高分子を内包する場合、ポリ乳酸やポリ乳酸共重合体（以下、単に疎水性生分解性ポリマーと称する）は疎水性であるため、Ｗ／Ｏ／Ｗ（Water in Oil in Water）エマルション法等が利用される。しかし、疎水性生分解性ポリマーを用いて水溶性高分子を内包するマイクロスフェアを製造すると、マイクロスフェアの内部における水溶性高分子の分布の均一性が低くなり、薬物徐放型ＤＤＳ製剤とした場合における水溶性高分子の効力持続性（徐放化）が不十分であった。また、水溶性高分子がタンパク質や核酸である場合、マイクロスフェアを製造する過程で、立体構造が維持できなくなったり、変性してしまったりして、失活してしまうこともあった。
【０００８】
そこで、生分解性ポリマーとして両親媒性を有するポリ乳酸グラフト化デキストランを用いることにより、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルション法で、水溶性高分子を内包するマイクロスフェアが製造可能な技術が開示されている（非特許文献１）。非特許文献１に記載のマイクロスフェアは、水溶性高分子としてウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albumin:以下、単にＢＳＡと称する）を内包している。かかるマイクロスフェアは、ＢＳＡがマイクロスフェアの内部で略均一に分布しており、ＢＳＡの高次構造および活性も維持されているため、薬物徐放型ＤＤＳ製剤として十分な徐放化を達成することが可能となる。
【０００９】
しかし、非特許文献１に記載の水溶性高分子を内包する高分子微粒子は、スフェア粒径がマイクロメートルオーダーと大きいため、すなわちマイクロスフェアとなるため、静脈または動脈注射、経皮吸収には適していない。
【００１０】
静脈または動脈注射や経皮吸収に適したナノメートルオーダーの高分子微粒子（ナノスフェア）を製造する技術として、Ｏ／Ｗ（Oil in Water）エマルション法を利用する技術が開示されている。例えば、非特許文献２には、Ｏ／Ｗエマルション法でポリ乳酸グラフト化デキストランを用いてナノスフェアを製造する技術が、非特許文献３には、Ｏ／Ｗエマルション法で両親媒性のブロック共重合体を用いてナノスフェアを製造する技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開平１０−１８２４９６号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ouchi T, Saito T, Kontani T, Ohya Y, Macromol Biosci. 2004 Apr 19;4(4):458-463
【非特許文献２】Nouvel C, Raynaud J, Marie E, Dellacherie E, Six JL, Durand A, J Colloid Interface Sci. 2009 Feb 15; 330(2):337-343
【非特許文献３】Ouchi T, Toyohara M, Arimura H, Ohya Y,Biomacromolecules. 2002 Sep-Oct; 3(5):885-888
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかし、上述した非特許文献２および３に記載された、Ｏ／Ｗエマルション法を利用した場合、ナノスフェアを製造できるものの、疎水性物質しか内包できない、すなわち水溶性高分子を内包することができないといった問題点がある。
【００１４】
上述したように、水溶性高分子の内包と、高分子微粒子の粒径の微細化との両立を成し得た例はなく、水溶性高分子を内包し、かつ、ナノメートルオーダーの高分子微粒子の開発が望まれている。
【００１５】
そこで本発明は、このような課題に鑑み、水溶性高分子等の親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包し、かつ粒径がナノオーダーである高分子微粒子を製造することができるナノスフェアの製造方法、ナノスフェア、これを含有する皮膚外用組成物および化粧料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の一例であるＷ／Ｏ／Ｗエマルション法を用いた、ナノスフェアの製造方法は、親水性物質を溶解した水系溶媒と、両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒と、疎水性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒とを混合し、１次溶液を生成する１次溶液生成ステップと、１次溶液に超音波を照射して１次エマルションを生成する１次エマルション生成ステップと、１次エマルションに、親水性ポリマーを溶解した水系溶媒を添加し、２次溶液を生成する２次溶液生成ステップと、２次溶液に超音波を照射して２次エマルションを生成する２次エマルション生成ステップと、を含む。当該ナノスフェアは親水性物質を内包する。
【００１７】
疎水性ポリマーおよび親水性物質に両親媒性ポリマーを添加した１次溶液に超音波を照射して生成した１次エマルションに親水性ポリマーを添加した２次溶液に、超音波を照射する構成により、凝集を抑制しつつ、親水性物質を内包するＷ／Ｏ／Ｗエマルションの高分子微粒子をナノメートルオーダーで製造することが可能となる。
【００１８】
したがって、両親媒性ポリマー、疎水性ポリマーおよび親水性ポリマーに生分解性ポリマーを用いれば、タンパク質や核酸、生理活性を有する天然抽出物等の水溶性（親水性）高分子の薬物を内包する薬物徐放型ＤＤＳ製剤等の医薬品や親水性の有効物質を内包する徐放型の化粧料を製造することができる。また、親水性物質を内包する高分子微粒子は、ナノメートルオーダーであるため、静脈または動脈注射用の医薬品、経皮吸収用の医薬品や化粧料等の皮膚外用組成物に利用することができ、薬物の全身投与、患部へのターゲッティングおよび皮膚への浸透が可能となる。
【００１９】
他のＷ／Ｏ／Ｗエマルション法を用いた、ナノスフェアの製造方法は、親水性物質を溶解した水系溶媒と、両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒とを混合し、１次溶液を生成する１次溶液生成ステップと、１次溶液に超音波を照射して１次エマルションを生成する１次エマルション生成ステップと、１次エマルションに、親水性ポリマーを溶解した水系溶媒を添加し、２次溶液を生成する２次溶液生成ステップと、２次溶液に超音波を照射して２次エマルションを生成する２次エマルション生成ステップと、を含む。当該ナノスフェアは、親水性物質を内包する。
【００２０】
ここでは、両親媒性ポリマーと親水性物質を含む１次溶液に超音波を照射して生成した１次エマルションに親水性ポリマーを添加した２次溶液に、超音波を照射する構成により、凝集を抑制しつつ、親水性物質を内包するＷ／Ｏ／Ｗエマルションの高分子微粒子をナノメートルオーダーで製造することが可能となる。
【００２１】
したがって、両親媒性ポリマーおよび親水性ポリマーに生分解性ポリマーを用いれば、タンパク質や核酸、生理活性を有する天然抽出物等の水溶性（親水性）高分子の薬物を内包する医薬品や親水性の有効物質を内包する徐放型の化粧料を製造することができる。また、親水性物質を内包する高分子微粒子は、ナノメートルオーダーであるため、静脈または動脈注射用の医薬品、経皮吸収用の医薬品や化粧料等の皮膚外用組成物に利用することができ、薬物の全身投与、患部へのターゲッティングおよび皮膚への浸透が可能となる。
【００２２】
さらに他のＯ／Ｗエマルション法を用いた、ナノスフェアの製造方法は、疎水性物質を溶解した水非混和性有機溶媒と、両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒と、疎水性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒とを混合し、１次溶液を生成する１次溶液生成ステップと、１次溶液に、親水性ポリマーを溶解した水系溶媒を添加し、２次溶液を生成する２次溶液生成ステップと、２次溶液に超音波を照射してエマルションを生成するエマルション生成ステップと、を含む。当該ナノスフェアは、疎水性物質を内包する。
【００２３】
ここでは、疎水性ポリマーおよび疎水性物質に両親媒性ポリマーを添加した１次溶液に親水性ポリマーをさらに添加した２次溶液に、超音波を照射する構成により、凝集を抑制しつつ、疎水性物質を内包する高分子微粒子をナノメートルオーダーで製造することが可能となる。
【００２４】
したがって、両親媒性ポリマー、疎水性ポリマーおよび親水性ポリマーに生分解性ポリマーを用いれば、脂質や、生理活性を有する天然抽出物等の疎水性の高分子の薬物を内包する薬物徐放型ＤＤＳ製剤等の医薬品や疎水性の有効物質を内包する徐放型の化粧料を製造することができる。また、疎水性物質を内包する高分子微粒子は、ナノメートルオーダーであるため、静脈または動脈注射用の医薬品、経皮吸収用の医薬品や化粧料等の皮膚外用組成物に利用することができ、薬物の全身投与、患部へのターゲッティングおよび皮膚への浸透が可能となる。
【００２５】
さらに他のＯ／Ｗエマルション法を用いた、ナノスフェアの製造方法は、疎水性物質を溶解した水非混和性有機溶媒と、両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒とを混合し、１次溶液を生成する１次溶液生成ステップと、１次溶液に、親水性ポリマーを溶解した水系溶媒を添加し、２次溶液を生成する２次溶液生成ステップと、２次溶液に超音波を照射してエマルションを生成するエマルション生成ステップと、を含む。当該ナノスフェアは、疎水性物質を内包する。
【００２６】
ここでは、両親媒性ポリマーと疎水性物質を含む１次溶液に親水性ポリマーをさらに添加した２次溶液に、超音波を照射する構成により、凝集を抑制しつつ、疎水性物質を内包する高分子微粒子をナノメートルオーダーで製造することが可能となる。
【００２７】
したがって、両親媒性ポリマーおよび親水性ポリマーに生分解性ポリマーを用いれば、脂質や、生理活性を有する天然抽出物等の疎水性の高分子の薬物を内包する医薬品や疎水性の有効物質を内包する徐放型の化粧料を製造することができる。また、疎水性物質を内包する高分子微粒子は、ナノメートルオーダーであるため、静脈または動脈注射用の医薬品、経皮吸収用の医薬品や化粧料等の皮膚外用組成物に利用することができ、薬物の全身投与、患部へのターゲッティングおよび皮膚への浸透が可能となる。
【００２８】
さらに他のＷ／Ｏ／Ｗエマルション法を用いた、ナノスフェアの製造方法は、親水性物質を溶解した水系溶媒と、疎水性物質を溶解した水非混和性有機溶媒と、両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒と、疎水性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒とを混合し、１次溶液を生成する１次溶液生成ステップと、１次溶液に超音波を照射して１次エマルションを生成する１次エマルション生成ステップと、１次エマルションに、親水性ポリマーを溶解した水系溶媒を添加し、２次溶液を生成する２次溶液生成ステップと、２次溶液に超音波を照射して２次エマルションを生成する２次エマルション生成ステップと、を含む。当該ナノスフェアは、親水性物質および疎水性物質を内包する。
【００２９】
疎水性ポリマー、親水性物質および疎水性物質に両親媒性ポリマーを添加した１次溶液に超音波を照射して生成した１次エマルションに親水性ポリマーを添加した２次溶液に、超音波を照射する構成により、凝集を抑制しつつ、親水性物質および疎水性物質を内包する高分子微粒子をナノメートルオーダーで製造することが可能となる。
【００３０】
したがって、両親媒性ポリマー、疎水性ポリマーおよび親水性ポリマーに生分解性ポリマーを用いれば、タンパク質や核酸、生理活性を有する天然抽出物等の水溶性（親水性）高分子の薬物、および、脂質や生理活性を有する天然抽出物等の疎水性の高分子を内包する薬物徐放型ＤＤＳ製剤等の医薬品や、親水性および疎水性の有効物質を内包する徐放型の化粧料を製造することができる。また、親水性物質および疎水性物質を内包する高分子微粒子は、ナノメートルオーダーであるため、静脈または動脈注射用の医薬品、経皮吸収用の医薬品や化粧料等の皮膚外用組成物に利用することができ、薬物の全身投与、患部へのターゲッティングおよび皮膚への浸透が可能となる。
【００３１】
さらに他のＷ／Ｏ／Ｗエマルション法を用いた、ナノスフェアの製造方法は、親水性物質を溶解した水系溶媒と、疎水性物質を溶解した水非混和性有機溶媒と、両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒とを混合し、１次溶液を生成する１次溶液生成ステップと、１次溶液に超音波を照射して１次エマルションを生成する１次エマルション生成ステップと、１次エマルションに、親水性ポリマーを溶解した水系溶媒を添加し、２次溶液を生成する２次溶液生成ステップと、２次溶液に超音波を照射して２次エマルションを生成する２次エマルション生成ステップと、を含む。当該ナノスフェアは、親水性物質および疎水性物質を内包する。
【００３２】
ここでは、両親媒性ポリマーと親水性物質および疎水性物質を含む１次溶液に超音波を照射して生成した１次エマルションに親水性ポリマーを添加した２次溶液に、超音波を照射する構成により、凝集を抑制しつつ、親水性物質および疎水性物質を内包する高分子微粒子をナノメートルオーダーで製造することが可能となる。
【００３３】
したがって、両親媒性ポリマーおよび親水性ポリマーに生分解性ポリマーを用いれば、タンパク質や核酸、生理活性を有する天然抽出物等の水溶性（親水性）高分子の薬物、および、脂質や生理活性を有する天然抽出物等の疎水性の高分子を内包する医薬品や、親水性および疎水性の有効物質を内包する徐放型の化粧料を製造することができる。また、親水性物質および疎水性物質を内包する高分子微粒子は、ナノメートルオーダーであるため、静脈または動脈注射用の医薬品、経皮吸収用の医薬品や化粧料等の皮膚外用組成物に利用することができ、薬物の全身投与、患部へのターゲッティングおよび皮膚への浸透が可能となる。
【００３４】
両親媒性ポリマーは、親水性セグメントと疎水性セグメントとで構成される共重合体であり、親水性セグメントは、電荷を有するアミノ酸を３個以上有するポリペプチド、数平均分子量５００〜１０００００であるポリエチレングリコール、および、多糖、の群から選択される１または複数を含み、疎水性セグメントは、生分解性ポリエステルを含んでもよい。
【００３５】
両親媒性ポリマーとして、電荷を有するアミノ酸を３個以上有するポリペプチド、数平均分子量５００〜１０００００であるポリエチレングリコール、および多糖、の群から選択される１または複数と、生分解性ポリエステルとで構成される共重合体を用いることにより、親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包する生分解性のナノスフェアを製造することができる。
【００３６】
ポリペプチドを構成するアミノ酸は、正電荷を有するアミノ酸であるリジン、アルギニンおよびヒスチジンの群および負電荷を有するアミノ酸であるアスパラギン酸およびグルタミン酸の群から選択される１または複数のアミノ酸であってもよい。
【００３７】
両親媒性ポリマーを構成するポリペプチドのアミノ酸を、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸の群から選択される１または複数のアミノ酸といったタンパク質を構成するアミノ酸とする構成により、医薬品や化粧料を製造する際に、生体適合性を向上させることができる。また、両親媒性ポリマーを構成するポリペプチドのアミノ酸を、タンパク質を構成するアミノ酸とすることにより、親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包するナノスフェアを血中に導入した場合に、マクロファージなどの貪食細胞に異物として捕捉される可能性を低減させることができ、血中の循環時間を延長させることが可能となる。
【００３８】
また、両親媒性ポリマーにポリエチレングリコールを含ませる構成により、親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包するナノスフェアを血中に導入した場合に、マクロファージなどの貪食細胞に異物として捕捉される可能性を低減させることができ、血中の循環時間を延長させることが可能となる。
【００３９】
両親媒性ポリマーを構成する多糖は、ヒアルロン酸、アミロース、プルラン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、キチン、キトサン、および、βグルカン、の群から選択される１または複数であってもよい。また、両親媒性ポリマーにおける多糖の含有量が１〜５０質量％であってもよい。
【００４０】
両親媒性ポリマーとして、多糖と、生分解性ポリエステルとで構成される共重合体を用いることにより、親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包する生分解性のナノスフェアを製造することができる。
【００４１】
生分解性ポリエステルの構成単位は、乳酸、グリコール酸、および、アミノ酸、の群から選択される１または複数であってもよい。
【００４２】
生分解性ポリエステルを生体由来材料である乳酸やアミノ酸、またはグリコール酸で構成することにより、医薬品や化粧料を製造する際に、生体適合性を向上させることができる。
【００４３】
上記ナノスフェアの製造方法を用いて製造されるナノスフェアが提供される。ここで、ナノスフェアは、親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方として、ステビア発酵エキスまたはスフィンゴミエリンを内包してもよい。
【００４４】
上記ナノスフェアの製造方法を用いて製造されたナノスフェアを含有する皮膚外用組成物が提供される。ここで、皮膚外用組成物は、ヒトの皮膚に接触させることにより、皮膚外用組成物に含まれる物質を経皮吸収させるものである。
【００４５】
皮膚外用組成物として、上記ナノスフェアの製造方法を用いて製造された親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包するナノスフェアを含有する構成により、塗り薬等の皮膚外用組成物を皮膚表面の微細な凹凸にナノスフェアを略均一に塗布することができる。また、上述したようにナノスフェアを構成するポリマーに生分解性ポリマーを用いる構成により、ナノスフェアに内包させた親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を皮膚表面で好適に徐放させることができ、従来と比較して、皮膚外用組成物の効果を維持しつつ、塗布する回数を減少させることが可能となる。
【００４６】
上記皮膚外用組成物に含有されるナノスフェアは、親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方として、ステビア発酵エキスまたはスフィンゴミエリンを内包してもよい。ステビア発酵エキスおよびスフィンゴミエリンは、保湿効果が高く、荒れ肌を改善したり、かゆみを抑止したり、炎症を抑えたり、抗ヒスタミン作用を有したりする。したがって、ステビア発酵エキスまたはスフィンゴミエリンを内包させたナノスフェアを含有させた皮膚外用組成物とする構成により、皮膚表面の微細な凹凸にステビア発酵エキスまたはスフィンゴミエリンを略均一に行き渡らせることができる。
【００４７】
上記ナノスフェアの製造方法を用いて製造されたナノスフェアを含有する化粧料が提供される。ここで、化粧料は、美化、清潔、保護あるいは、防臭を目的として人体を処置するための組成物である。
【００４８】
化粧料として、上記ナノスフェアの製造方法を用いて製造された親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包するナノスフェアを含有する構成により、化粧料を皮膚表面の微細な凹凸にナノスフェアを略均一に塗布することができる。また、上述したようにナノスフェアを構成するポリマーに生分解性ポリマーを用いる構成により、ナノスフェアに内包させた親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を皮膚表面で好適に徐放させることができ、従来と比較して化粧料の塗布回数を減らしても同程度の効果を得ることが可能となる。
【００４９】
上記化粧料に含有されるナノスフェアは、親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方として、ステビア発酵エキスまたはスフィンゴミエリンを内包してもよい。ステビア発酵エキスおよびスフィンゴミエリンは、保湿効果が高く、荒れ肌を改善したり、かゆみを抑止したり、炎症を抑えたり、抗ヒスタミン作用を有したりする。したがって、ステビア発酵エキスまたはスフィンゴミエリンを内包させたナノスフェアを含有させた化粧料とする構成により、皮膚表面の微細な凹凸にステビア発酵エキスまたはスフィンゴミエリンを略均一に行き渡らせることができる。
【００５０】
上述したナノスフェアの製造方法の技術的思想に基づく構成要素やその説明は、当該ナノスフェア、これを含有する皮膚外用組成物および化粧料にも適用可能である。
【発明の効果】
【００５１】
本発明によれば、水溶性高分子等の親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包し、かつ粒径がナノオーダーである高分子微粒子を製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】実施形態にかかるナノスフェアの製造方法を説明するための説明図である。
【図２】実施例１にかかるＰＬｙｓ＋−ｂ−ＰＬＬＡの合成方法を説明するための説明図である。
【図３】実施例１にかかるＰＬｙｓ＋−ｂ−ＰＬＬＡのミセル状態における分解性を説明するための説明図である。
【図４】実施例１を説明するための説明図である。
【図５】ＢＳＡを内包する生分解性ナノスフェアを、走査型電子顕微鏡で観察した結果を説明するための説明図である。
【図６】実施例における内包率、回収率、収率および内包効率を算出する式を説明するための説明図である。
【図７】実施例２にかかるＰＥＧ３Ｋ−ｂ−ＰＬＬＡの合成方法を説明するための説明図である。
【図８】実施例２を説明するための説明図である。
【図９】スフィンゴミエリンを内包する生分解性ナノスフェアを、走査型電子顕微鏡で観察した結果を説明するための説明図である。
【図１０】実施例３にかかるＤｅｘ−ｇ−ＰＬＬＡの合成方法を説明するための説明図である。
【図１１】実施例３にかかるＤｅｘ−ｇ−ＰＬＬＡの分解性を説明するための説明図である。
【図１２】分解性実験に用いたＤｅｘ−ｇ−ＰＬＬＡを説明するための説明図である。
【図１３】、実施例３を説明するための説明図である。
【図１４】スフィンゴミエリンを内包する生分解性ナノスフェアを、走査型電子顕微鏡で観察した結果を説明するための説明図である。
【図１５】実施例４を説明するための説明図である。
【図１６】ＢＳＡを内包する生分解性ナノスフェアを、走査型電子顕微鏡で観察した結果を説明するための説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
以下に添付図面を参照しながら、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。かかる実施形態に示す寸法、材料、その他具体的な数値などは、発明の理解を容易とするための例示にすぎず、特に断る場合を除き、本発明を限定するものではない。なお、本明細書および図面において、実質的に同一の機能、構成を有する要素については、同一の符号を付することにより重複説明を省略し、また本発明に直接関係のない要素は図示を省略する。
【００５４】
（実施形態）
図１は、実施形態にかかるナノスフェアの製造方法を説明するための説明図である。
【００５５】
まず、内包する物質を溶解した溶媒と、両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒と、疎水性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒とを混合し、１次溶液を生成する（Ｓ１００：１次溶液生成ステップ）。
【００５６】
１次溶液生成ステップＳ１００において、内包する物質を親水性物質とする場合、親水性物質を溶解した水系溶媒を、両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒と疎水性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒とに混合し、１次溶液を生成する。
【００５７】
また、１次溶液生成ステップＳ１００において、内包する物質を親水性物質および疎水性物質とする場合、親水性物質を溶解した水系溶媒および疎水性物質を溶解した水非混和性有機溶媒を、両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒と疎水性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒とに混合し、１次溶液を生成する。
【００５８】
生成した１次溶液に超音波を照射し、逆相エマルション（Ｗ／Ｏエマルション）である１次エマルションを生成する（Ｓ１０２：１次エマルション生成ステップ）。そして、１次エマルションに、親水性ポリマーを溶解した水系溶媒を添加し、２次溶液を生成する（Ｓ１０４：２次溶液生成ステップ）。生成した２次溶液に超音波を照射して２次エマルションを生成し（Ｓ１０６：２次エマルション生成ステップ）、２次エマルションから水非混和性有機溶媒を除去する（Ｓ１０８：有機溶媒除去ステップ）。
【００５９】
また、内包する物質が疎水性物質である場合、１次溶液生成ステップＳ１００において、疎水性物質を溶解した水非混和性有機溶媒を、両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒と疎水性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒とに混合し、１次溶液を生成する。そして、１次エマルション生成ステップＳ１０２を省略し、１次溶液に、親水性ポリマーを溶解した水系溶媒を添加し、２次溶液を生成する（Ｓ１０４：２次溶液生成ステップ）。生成した２次溶液に超音波を照射してエマルション（Ｏ／Ｗエマルション）を生成し（Ｓ１０６：エマルション生成ステップ（２次エマルション生成ステップ））、エマルションから水非混和性有機溶媒を除去する（Ｓ１０８：有機溶媒除去ステップ）。
【００６０】
以下に、各ステップの構成を詳細に説明する。
【００６１】
（１次溶液生成ステップＳ１００）
内包する物質を溶解した溶媒と、両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒と、疎水性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒とを混合し、１次溶液を生成する。
【００６２】
[１次溶液生成ステップＳ１００における両親媒性ポリマー１]
１次溶液生成ステップＳ１００における両親媒性ポリマーは、親水性セグメントと疎水性セグメントとで構成される共重合体であり、親水性セグメントは、電荷を有するアミノ酸を３個以上有するポリペプチドまたは数平均分子量５００〜１０００００であるポリエチレングリコールを含み、疎水性セグメントは生分解性ポリエステルを含んで構成される。
【００６３】
＜両親媒性ポリマーの重合形態＞
ポリペプチドを含む両親媒性ポリマーまたはポリエチレングリコールを含む両親媒性ポリマーの重合形態は、好ましくは、電荷を有するアミノ酸を３個以上有するポリペプチドまたは数平均分子量５００〜１０００００であるポリエチレングリコールと、生分解性ポリエステルとの、ランダム共重合体、交互共重合体、ブロック共重合体、グラフト共重合体であり、より好ましくは、ブロック共重合体またはグラフト共重合体であり、さらに好ましくは、ブロック共重合体である。
【００６４】
＜電荷を有するアミノ酸を３個以上有するポリペプチド＞
両親媒性ポリマーを構成するポリペプチドは、正電荷または負電荷を有していればよく、かかるポリペプチドを構成するアミノ酸は、好ましくは、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸の群から選択される１または複数のアミノ酸であればよく、より好ましくは、リジン、アルギニンまたはヒスチジンの群から選択される１または複数のアミノ酸であり、さらに好ましくはリジンである。
【００６５】
両親媒性ポリマーを構成するポリペプチドのアミノ酸を、タンパク質を構成するアミノ酸とする構成により、かかる両親媒性ポリマーを用いたナノスフェアを利用して薬物徐放型ＤＤＳ製剤等の医薬品や徐放型の皮膚外用組成物、徐放型の化粧料を製造する際に、生体適合性を向上させることができる。また、両親媒性ポリマーを構成するポリペプチドのアミノ酸を、タンパク質を構成するアミノ酸とすることにより、親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包するナノスフェアを血中に導入した場合に、マクロファージなどの貪食細胞に異物として捕捉される可能性を低減させることができ、血中の循環時間を延長させることが可能となる。
【００６６】
＜ポリエチレングリコール＞
両親媒性ポリマーを構成するポリエチレングリコールの数平均分子量は、特に限定されないが、好ましくは、数平均分子量５００〜１０００００であり、より好ましくは、数平均分子量１０００〜５００００であり、さらに好ましくは数平均分子量２０００〜２００００である。
【００６７】
両親媒性ポリマーにポリエチレングリコールを含ませる構成により、親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包するナノスフェアを血中に導入した場合に、マクロファージなどの貪食細胞に異物として捕捉される可能性を低減させることができ、血中の循環時間を延長させることが可能となる。
【００６８】
＜生分解性ポリエステルの構成単位＞
生分解性ポリエステルの構成単位は、重合した場合に生分解性ポリエステルとなるものであり、上記ポリペプチドまたはポリエチレングリコールと共重合体を構成できるものであればよく、好ましくは、乳酸（Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、ＤＬ−乳酸）、グリコール酸（ヒドロキシ酢酸）、アミノ酸、カプロラクトン（α−カプロラクトン、β−カプロラクトン、γ−カプロラクトン、δ−カプロラクトン、ε−カプロラクトン等）、コハク酸とエチレングリコールの混合物、コハク酸とブタンジオール（１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール等）の混合物、からなる群のうち、１または複数、またはこれらのオリゴマーであればよく、より好ましくは、乳酸、グリコール酸およびアミノ酸、の群から選択される１または複数であり、さらに好ましくはＬ−乳酸である。
【００６９】
生分解性ポリエステルは、例えば、ポリ乳酸（ＰＬＡ：Poly Lactic Acid）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ：Poly Glycolic Acid）、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体、ポリデプシペプチド（アミノ酸とヒドロキシ酸の共重合体）を用いることができる。
【００７０】
生分解性ポリエステルを生体由来材料である乳酸やアミノ酸、またはグリコール酸で構成することにより、医薬品や、皮膚外用組成物、化粧料を製造する際に、生体適合性を向上させることができる。
【００７１】
[１次溶液生成ステップＳ１００における両親媒性ポリマー２]
また、１次溶液生成ステップＳ１００における両親媒性ポリマーは、親水性セグメントと疎水性セグメントとで構成される共重合体であり、親水性セグメントは、多糖を含み、疎水性セグメントは生分解性ポリエステルを含んで構成されてもよい。
【００７２】
＜両親媒性ポリマーの重合形態＞
多糖を含む両親媒性ポリマーの重合形態は、多糖と、生分解性ポリエステルとの、ランダム共重合体、交互共重合体、ブロック共重合体、グラフト共重合体であればよく、好ましくは、グラフト共重合体またはブロック共重合体であり、より好ましくは、グラフト共重合体である。また、両親媒性ポリマーは、さらに好ましくは、多糖を主鎖とし、生分解性ポリエステルを側鎖としたグラフト共重合体である。
【００７３】
＜多糖の含有量＞
また、両親媒性ポリマーを構成する多糖の含有量は、特に限定されないが、１〜５０質量％であればよく、好ましくは、１〜３０質量％であり、さらに好ましくは、４〜２５質量％である。
【００７４】
両親媒性ポリマーを構成する多糖の含有量をかかる範囲の含有量とする構成により、親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包するナノスフェアを生体内に留置した場合においても、分解に伴う炎症反応等を生じさせない分解速度であり、かつ、生体内で必要とされる期間の経過後には生体内から消失している分解速度に調節することができる。かかる生体内で必要とされる期間とは、好ましくは１ヶ月〜１０ヶ月、さらに好ましくは、２ヶ月〜１０ヶ月、最も好ましくは２ヶ月〜８ヶ月である。
【００７５】
＜多糖＞
両親媒性ポリマーを構成する多糖は、生体内で安定であればよく、好ましくは、ヒアルロン酸、アミロース、プルラン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、キチン、キトサンおよびβグルカンの群から選択される１または複数であり、より好ましくは、デキストラン、プルランおよびヒアルロン酸の群から選択される１または複数であり、さらに好ましくは、デキストランである。
【００７６】
両親媒性ポリマーにおける多糖をデキストランとする構成により、親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包するナノスフェアを安定して血管内に存在させることができる。
【００７７】
かかる多糖の重量平均分子量は、特に限定されないが、１０００〜１０００００ｇ／ｍｏｌであればよく、好ましくは、５０００〜５００００ｇ／ｍｏｌであり、さらに好ましくは、１００００〜３００００ｇ／ｍｏｌである。
【００７８】
両親媒性ポリマーにおける多糖をかかる範囲の数平均分子量である多糖とする構成により、親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包するナノスフェアが、高い成型性と、柔軟性とを維持しつつ細胞接着性を低下させることができる。
【００７９】
＜生分解性ポリエステルの構成単位＞
生分解性ポリエステルの構成単位は、重合した場合に、生分解性ポリエステルとなるものであり、上記多糖と共重合体を構成できるものであればよく、好ましくは、乳酸（Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、ＤＬ−乳酸）、グリコール酸（ヒドロキシ酢酸）、アミノ酸、カプロラクトン（α−カプロラクトン、β−カプロラクトン、γ−カプロラクトン、δ−カプロラクトン、ε−カプロラクトン等）、コハク酸とエチレングリコールの混合物、コハク酸とブタンジオール（１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール等）の混合物、からなる群のうち、１または複数、またはこれらのオリゴマーであり、より好ましくは、乳酸、グリコール酸およびアミノ酸、の群から選択される１または複数であり、さらに好ましくはＬ−乳酸である。
【００８０】
生分解性ポリエステルは、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体、ポリデプシペプチドを用いることができる。
【００８１】
生分解性ポリエステルを生体由来材料である乳酸やアミノ酸、またはグリコール酸で構成することにより、医薬品や、皮膚外用組成物、化粧料を製造する際に、生体適合性を向上させることができる。
【００８２】
上述した多糖と生分解性ポリエステルとの共重合体である両親媒性ポリマーは、好ましくは、主鎖をデキストランとし、側鎖をＬ−乳酸としたグラフト共重合体である。以下、デキストランを主鎖としＬ−乳酸を側鎖としたグラフト共重合体である両親媒性ポリマーをＤｅｘ−ｇ−ＰＬＬＡ（ポリ乳酸グラフト化デキストラン）と称する。
【００８３】
上記Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＬＡ１分子における乳酸のグラフト本数は、１〜１００本であればよく、好ましくは、１〜５０本であり、さらに好ましくは２〜３０本である。Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＬＡ１分子における乳酸のグラフト本数を上記範囲の本数とする構成により、親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包するナノスフェアの細胞接着性を低減させることが可能となる。
【００８４】
また、上記Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＬＡの数平均分子量は、特に限定されないが、１×１０４〜１００×１０４／ｍｏｌであればよく、好ましくは、５×１０４〜２０×１０４／ｍｏｌであり、さらに好ましくは、１０×１０４〜１３×１０４／ｍｏｌである。
【００８５】
Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＬＡをかかる範囲の数平均分子量とする構成により、親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包するナノスフェアが、高い強度と、柔軟性を維持しつつ細胞接着性を低下させることができる。
【００８６】
１次溶液生成ステップＳ１００において、上記疎水性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒を添加せずともよく、内包する物質を溶解した溶媒と、両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒とを混合し、１次溶液を生成してもよい。
【００８７】
＜疎水性ポリマー＞
疎水性ポリマーの重合形態は、ランダム共重合体、交互共重合体、ブロック共重合体、グラフト共重合体であってもよい。
【００８８】
疎水性ポリマーの構成単位は、重合した場合に、疎水性ポリマーとなるものであればよく、好ましくは乳酸（Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、ＤＬ−乳酸）、グリコール酸（ヒドロキシ酢酸）、アミノ酸、カプロラクトン（α−カプロラクトン、β−カプロラクトン、γ−カプロラクトン、δ−カプロラクトン、ε−カプロラクトン等）、コハク酸とエチレングリコールの混合物、コハク酸とブタンジオール（１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール等）の混合物、からなる群のうち、１または複数、またはこれらのオリゴマーであればよく、より好ましくは、乳酸、グリコール酸およびアミノ酸、の群から選択される１または複数であり、さらに好ましくはＬ−乳酸およびグリコール酸である。
【００８９】
疎水性ポリマーは、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体、ポリデプシペプチドを用いることができる。
【００９０】
本実施形態では、疎水性ポリマーとして、Ｌ−乳酸とグリコール酸とのランダム共重合体を用い、以下、かかるＬ−乳酸とグリコール酸とのランダム共重合体による疎水性ポリマーをＰＬＧＡ（ポリ乳酸−グリコール酸ランダム共重合体）と称する。
【００９１】
ＰＬＧＡの重量平均分子量（Ｍｗ）は、特に限定されないが、５０００〜７５０００であるとよい。
【００９２】
[１次溶液生成ステップＳ１００における内包する物質]
１次溶液生成ステップＳ１００における内包する物質は、親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方であってもよく、親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方としてステビア発酵エキスまたは両親媒性物質であってもよい。また両親媒性物質として、例えば、スフィンゴミエリンを用いることができる。
【００９３】
親水性物質と疎水性物質の混合物であるステビア発酵エキスおよび両親媒性物質であるスフィンゴミエリンは、国際公開番号WO2008/126638A1や「ステビア発酵エキスの抗ヒスタミン作用に関する研究」薬理と治療 vol.36 no.8 2008に記載されているように、保湿効果が高く、荒れ肌を改善したり、かゆみを抑止したり、炎症を抑えたり、抗ヒスタミン作用を有したりする。したがって、ステビア発酵エキスまたはスフィンゴミエリンを内包させたナノスフェアを含有させた皮膚外用組成物や化粧料とする構成により、皮膚表面の微細な凹凸にステビア発酵エキスまたはスフィンゴミエリンを略均一に行き渡らせることができる。
【００９４】
[１次溶液生成ステップＳ１００における水系溶媒]
１次溶液生成ステップＳ１００における水系溶媒は、水または無機塩類、糖類、有機塩類、アミノ酸等を含む水溶液であり、親水性物質または両親媒性物質の親水セグメントが溶解できれば足りる。
【００９５】
[１次溶液生成ステップＳ１００における水非混和性有機溶媒]
１次溶液生成ステップＳ１００における水非混和性有機溶媒は、疎水性ポリマー、両親媒性ポリマーの疎水性セグメント、疎水性物質、または両親媒性物質の疎水性セグメントが可溶であり、かつ両親媒性ポリマーの親水性セグメントが難溶または不溶であるとよいが、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントおよび親水性セグメントの両者が難溶または可溶であってもよい。かかる水非混和性有機溶媒の水への溶解度は、１０ｇ（水非混和性有機溶媒）／１００ｍｌ（水）以下であり、好ましくは、１ｇ（水非混和性有機溶媒）／１００ｍｌ（水）以下であり、さらに好ましくは、０．１ｇ（水非混和性有機溶媒）／１００ｍｌ（水）以下である。水非混和性有機溶媒は、特に限定されないが、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、炭酸ジメチル、炭酸ジエチル、塩化メチレン（ジクロロメタン）、クロロホルム等を好適に利用できる。
【００９６】
[１次溶液生成ステップＳ１００における水系溶媒と水非混和性有機溶媒の比]
上記水系溶媒に対する水非混和性有機溶媒の比は、１：１０００〜１：１であってもよく、好ましくは、１：１００〜１：３、より好ましくは、１：５０〜１：１０である。ここで、水非混和性有機溶媒の量は、ポリペプチドを含む両親媒性ポリマーまたはポリエチレングリコールを含む両親媒性ポリマーを用いる場合、これらの両親媒性ポリマーを溶解する水非混和性有機溶媒と疎水性ポリマーを溶解する水非混和性有機溶媒の合計の量とし、多糖を含む両親媒性ポリマーを用いる場合、多糖を含む両親媒性ポリマーを溶解する水非混和性有機溶媒の量とする。
【００９７】
水非混和性有機溶媒中の両親媒性ポリマーおよび疎水性ポリマーの濃度は、ポリペプチドを含む両親媒性ポリマーまたはポリエチレングリコールを含む両親媒性ポリマーを用いる場合、１〜５００ｍｇ／ｍｌであればよく、好ましくは、１０〜２５０ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは５０〜１００ｍｇ／ｍｌである。この場合、両親媒性ポリマーに対する疎水性ポリマーの比は、１：１０００〜１：１であればよく、好ましくは、１：１００〜１：３、より好ましくは、１：５０〜１：５である。
【００９８】
また、水非混和性有機溶媒中の両親媒性ポリマーの濃度は、多糖を含む両親媒性ポリマーを用いる場合、１〜５００ｍｇ／ｍｌであればよく、好ましくは、１０〜２５０ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは５０〜１００ｍｇ／ｍｌである。
【００９９】
（１次エマルション生成ステップＳ１０２）
生成した１次溶液に超音波を照射し、逆相エマルション（Ｗ／Ｏエマルション）である１次エマルションを生成する。
【０１００】
超音波の照射時間は、０．５〜１５分間であればよく、好ましくは、１〜１０分間であり、より好ましくは、３〜５分間である。
【０１０１】
超音波の照射は、バス型ソニケータを用いても、プローブ型ソニケータを用いてもよく、バス型ソニケータおよびプローブ型ソニケータを用いてもよい。
【０１０２】
また、本実施形態において、生成した１次溶液に超音波を照射することで、逆相エマルションである１次エマルションを生成するが、これに限定されず、マグネチックスターラー等の攪拌装置、タービン型攪拌装置、ホモジナイザー等を用いて１次溶液を攪拌することで１次エマルションを生成してもよい。
【０１０３】
（２次溶液生成ステップＳ１０４）
１次エマルションに、親水性ポリマーを溶解した水系溶媒を添加し、２次溶液を生成する。
【０１０４】
[２次溶液生成ステップＳ１０４における親水性ポリマー]
親水性ポリマーは、上述した両親媒性ポリマーの疎水性セグメントまたは疎水性ポリマーと、化学結合し、または物理的に吸着するものであるとよい。また、親水性ポリマーは、溶媒中における１次エマルションの凝集を防止したり、凝集を遅延させたりするものであるとよい。なお、親水性ポリマーは、２次溶液生成ステップＳ１０４において、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントまたは疎水性ポリマーと、化学結合し、または物理的に吸着するものであってもよく、後述する有機溶媒除去ステップＳ１０８における、溶媒除去時に両親媒性ポリマーの疎水性セグメントまたは疎水性ポリマーと、化学結合し、または物理的に吸着するものであってもよい。
【０１０５】
親水性ポリマーは、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリペプチド、タンパク質または多糖類の群から選択される１または複数であればよく、好ましくは、ポリビニルアルコールである。
【０１０６】
また、親水性ポリマーは、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリペプチド、タンパク質または多糖類の群から選択される１または複数の類縁体であってもよい。
【０１０７】
[２次溶液生成ステップＳ１０４における水系溶媒]
２次溶液生成ステップＳ１００における水系溶媒は、親水性ポリマーを溶解できればよく、例えば、水または無機塩類、糖類、有機塩類、アミノ酸等を含む水溶液である。
【０１０８】
水系溶媒中の親水性ポリマーの濃度は、０．１〜５００ｍｇ／ｍｌであればよく、好ましくは、１０〜２５０ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは５０〜１００ｍｇ／ｍｌである。
【０１０９】
また、１次溶液生成ステップＳ１００における１次溶液に対する、２次溶液生成ステップＳ１００における親水性ポリマーを溶解した水系溶媒比は、１：５００〜１：１０であればよく、好ましくは、１：３００〜１：５０、さらに好ましくは、１：２００〜１：１００である。
【０１１０】
（２次エマルション生成ステップＳ１０６）
生成した２次溶液に超音波を照射して２次エマルションを生成する。
【０１１１】
超音波の照射時間は、０．５〜２０分間であればよく、好ましくは、１〜１５分間であり、さらに好ましくは、３〜７分間である。
【０１１２】
超音波の照射は、バス型ソニケータを用いても、プローブ型ソニケータを用いてもよく、バス型ソニケータおよびプローブ型ソニケータを用いてもよい。
【０１１３】
また、本実施形態において、生成した２次溶液に超音波を照射することで、２次エマルションを生成するが、これに限定されず、マグネチックスターラー等の攪拌装置、タービン型攪拌装置、ホモジナイザー等を用いて２次溶液を攪拌することで２次エマルションを生成してもよい。
【０１１４】
（有機溶媒除去ステップＳ１０８）
２次エマルションから水非混和性有機溶媒を除去する。
【０１１５】
水非混和性有機溶媒を除去する方法としては、液中乾燥、透析、遠心分離、凍結乾燥、濾過、再沈殿等を利用すればよく、好ましくは、液中乾燥、遠心分離、凍結乾燥を利用する。
【０１１６】
また、当該有機溶媒除去ステップＳ１０８を経た後に、２次エマルション（疎水性物質を内包する場合、エマルション）を、水系溶媒に導入し、さらに水非混和性有機溶媒を除去することにより、親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包するナノスフェアの水系溶媒分散体としてもよい。
【０１１７】
以上説明した１次溶液生成ステップＳ１００、１次エマルション生成ステップＳ１０２、２次溶液生成ステップＳ１０４、２次エマルション生成ステップＳ１０６および有機溶媒除去ステップＳ１０８により、親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包するナノスフェアの水系溶媒分散体を得ることができる。なお、両親媒性ポリマー、疎水性ポリマーおよび親水性ポリマーに生分解性ポリマーを用いれば、薬物徐放型ＤＤＳ製剤等の医薬品や有効物質を内包する徐放型の皮膚外用組成物、有効成分を内包する化粧料に好適な、親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包する生分解性ナノスフェアの水系溶媒分散体を得ることが可能となる。
【０１１８】
また、本実施形態により得られた親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包するナノスフェアの水系溶媒分散体から、分散媒を除去することにより、親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包するナノスフェアとすることも可能である。分散媒を除去する方法としては、特に限定されないが、液中乾燥、透析、遠心分離、凍結乾燥、濾過、再沈殿等を利用することができ、好ましくは、液中乾燥、遠心分離、凍結乾燥を利用する。
【０１１９】
以上説明したように、１次エマルション生成ステップＳ１０２において１次エマルションを生成する際に、両親媒性ポリマーを添加する構成により、疎水性ポリマーに親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包させることができる。また、疎水性ポリマーと、親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方とに両親媒性ポリマーを添加した１次溶液に上述した条件で超音波を照射して生成した１次エマルションに親水性ポリマーを添加した２次溶液に、上述した条件で超音波を照射する構成により、凝集を抑制しつつ、親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包する高分子微粒子をナノメートルオーダーで製造することが可能となる。
【０１２０】
また、１次エマルション生成ステップＳ１０２において１次エマルションを生成する際に、両親媒性ポリマーと、親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方と、を含む１次溶液に上述した条件で超音波を照射して生成した１次エマルションに親水性ポリマーを添加した２次溶液に、上述した条件で超音波を照射する構成により、凝集を抑制しつつ、親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包する高分子微粒子をナノメートルオーダーで製造することが可能となる。
【０１２１】
さらに、両親媒性ポリマー、疎水性ポリマーおよび親水性ポリマーに生分解性ポリマーを用いる構成により、タンパク質や核酸、生理活性を有する天然抽出物等の水溶性（親水性）高分子の薬物、および、脂質や、生理活性を有する天然抽出物等の疎水性の高分子の薬物を内包する医薬品や、親水性および疎水性の有効物質を内包する徐放型の化粧料を製造することができる。また、親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包する高分子微粒子は、ナノメートルオーダーであるため、静脈または動脈注射用の医薬品、経皮吸収用の医薬品や化粧料等の皮膚外用組成物に利用することができ、薬物の全身投与、患部へのターゲッティングおよび皮膚への浸透が可能となる。
【０１２２】
皮膚外用組成物として、上記親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包するナノスフェアの製造方法を用いて製造された親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包するナノスフェアを含有する構成により、塗り薬等の皮膚外用組成物を皮膚表面の微細な凹凸にナノスフェアを略均一に塗布することができる。また、上述したようにナノスフェアを構成するポリマーに生分解性ポリマーを用いる構成により、ナノスフェアに内包させた親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を皮膚表面で好適に徐放させることができ、従来と比較して、皮膚外用組成物の効果を維持しつつ、塗布する回数を減少させることが可能となる。
【０１２３】
また、化粧料として、上記親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包するナノスフェアの製造方法を用いて製造された親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包するナノスフェアを含有する構成により、化粧料を皮膚表面の微細な凹凸にナノスフェアを略均一に塗布することができる。また、上述したようにナノスフェアを構成するポリマーに生分解性ポリマーを用いる構成により、ナノスフェアに内包させた親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を皮膚表面で好適に徐放させることができ、従来と比較して化粧料の塗布回数を減らしても同程度の効果を得ることが可能となる。
【０１２４】
例えば、親水性物質と疎水性物質の混合物であるステビア発酵エキスや、親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方の機能を有する両親媒性物質としてのスフィンゴミエリンを内包させたナノスフェアを含有させた皮膚外用組成物や、化粧料を製造することもできる。
【０１２５】
ステビア発酵エキスおよびスフィンゴミエリンは、国際公開番号WO2008/126638A1や「ステビア発酵エキスの抗ヒスタミン作用に関する研究」薬理と治療 vol.36 no.8 2008に記載されているように、保湿効果が高く、荒れ肌を改善したり、かゆみを抑止したり、炎症を抑えたり、抗ヒスタミン作用を有したりする。したがって、ステビア発酵エキスまたはスフィンゴミエリンを内包させたナノスフェアを含有させた皮膚外用組成物や化粧料とする構成により、皮膚表面の微細な凹凸にステビア発酵エキスまたはスフィンゴミエリンを略均一に行き渡らせることができる。
【０１２６】
また本実施形態にかかるステビア発酵エキスもしくはスフィンゴミエリンのいずれか一方または両方を内包させたナノスフェアは、化粧料においては、頭髪用化粧品、整髪料、養毛料、頭皮料、毛髪着色料、洗髪料、ヘアリンス、皮膚用化粧品・化粧水、化粧液、クリーム、乳液、日焼け、日焼け止め、洗浄料、ひげそり、むだ毛そり、フェイシャルリンス、パック、化粧用油、ボディリンス、マッサージ料、仕上用化粧品・ファンデーション、化粧下地、おしろい、口紅、アイメークアップ、頬化粧料、ボディメークアップ、オーデコロン・香水、浴用化粧料、爪化粧料、ボディパウダー等、また、医薬品においては、散剤・細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、桿剤、ペンシル剤、内容液剤、外用液剤、エキス剤、硬膏剤、坐剤、エアゾール、ガス剤、薬品吸着剤、眼科用剤、注射剤、絆創膏剤等幅広く使用可能である。
【０１２７】
以下に、ある実施例の詳細についてさらに説明する。
【０１２８】
（実施例１）
本実施例では、両親媒性ポリマーとしてポリリジンとＬ−乳酸のジブロック共重合体（以下、単に、ＰＬｙｓ＋−ｂ−ＰＬＬＡと称する）を、疎水性ポリマーとして、ＰＬＧＡを、親水性ポリマーとしてポリビニルアルコール（以下、単に、ＰＶＡと称する）を、内包する親水性物質としてＢＳＡを用いた。
【０１２９】
図２は、実施例１にかかるＰＬｙｓ＋−ｂ−ＰＬＬＡの合成方法を説明するための説明図である。
【０１３０】
図２に示すように、まず、２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｏｌのアミノ基をt-ブトキシカルボニル（以下単に、Ｂｏｃと称する）基で保護した。次に、Ｂｏｃ―ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｏｌの末端水酸基をカリウムナフタレンによりアルコキシド化し、これを開始剤としてラクチドの溶液系アニオン開環重合を行った。最後に、得られたポリマーの末端アミノ基の保護基（Ｂｏｃ基）を２５％臭化水素酢酸（２５％ＨＢｒ／ＡｃＯＨ）で除去した後、トリエチルアミン（ＴＥＡ）を用いて脱塩を行い、目的物であるＮＨ２−ＰＬＬＡを得た。
【０１３１】
ＮＨ２−ＰＬＬＡのアミノ基を重合開始点として用い、Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ：N-Carboxy Anhydride）との脱炭酸重合を行った。蒸留したクロロホルムにＮＨ２−ＰＬＬＡを溶解した後、Ｌｙｓ（Ｚ）−ＮＣＡを加え、アルゴン気流下、４０℃で２４時間撹拌した。次に、得られたポリマーを２５％臭化水素酢酸で処理することで側鎖保護基であるベンジルオキシカルボニル基(Ｚ基)の脱保護を行い、目的物であるＰＬｙｓ＋−ｂ−ＰＬＬＡを得た。
【０１３２】
本実施例にかかるＰＬｙｓ＋−ｂ−ＰＬＬＡは、リジンの重合度は１６であり、乳酸の重合度は３９であった。また、本実施例にかかるＰＬｙｓ＋−ｂ−ＰＬＬＡは両親媒性を有するため水中で自己会合してミセルを形成する。
【０１３３】
図３は、実施例１にかかるＰＬｙｓ＋−ｂ−ＰＬＬＡのミセル状態における分解性を説明するための説明図である。ここでは、ＰＬｙｓ＋−ｂ−ＰＬＬＡのミセルを０．５ｍｇ／ｍｌとなるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：Phosphate Buffered Saline）（ｐＨ＝７．４、Ｉ＝０．１４）に分散させ、３７℃でインキュベートし、１日後、３日後、５日後、７日後のＰＬｙｓ＋−ｂ−ＰＬＬＡを、ＧＰＣ（Gel Permeation Chromatography）を用いた分子量分布測定を行い分子量の減少について検討した。
【０１３４】
図３に示すように、１日後においても１％程度しか減少しておらず、３日後においては、１．５％程度、５日後においては、２．５％程度、７日後においては６％程度の減少であった。したがって、両親媒性ポリマーとしてＰＬｙｓ＋−ｂ−ＰＬＬＡを用いた親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包する生分解性ナノスフェアを生体内に留置した場合に、分解に伴う炎症反応等を起こさない分解速度であり、かつ、生体内で必要とされる期間の経過後には生体内から消失している分解速度に調節することができる。
【０１３５】
図４は、実施例１を説明するための説明図である。図４に示すように、試験管に、ＰＬｙｓ＋−ｂ−ＰＬＬＡ２０ｍｇおよび重量平均分子量が５０００〜７５０００であるＰＬＧＡ１８０ｍｇを入れ、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）２．５ｍｌに溶解させた。続いて、親水性物質としてＢＳＡ５ｍｇを溶解したＰＢＳ１００μｌを試験管に加え１次溶液を生成した。次に、１次溶液をスパチュラで激しく撹拌しながらプローブ型ソニケータで３分間超音波を照射し、１次エマルションを調製した。本実施例において、プローブ型ソニケータとして、株式会社トミー精工製  ＵＤ−２００を用い、レベル５〜１０に設定して、超音波を照射した。以下、株式会社トミー精工製  ＵＤ−２００を用いて、レベル５〜１０に設定し超音波を照射することを、単にプローブ型ソニケータで超音波を照射すると称する。
【０１３６】
その後、１次エマルションを、０．１％ＰＶＡを含むＰＢＳ３００ｍｌに加えて２次溶液を調製した。次に、２次溶液にバス型ソニケータで３分間超音波を照射し、９０秒間スパチュラで激しく攪拌し、さらに、プローブ型ソニケータで９０秒間超音波を照射して２次エマルションを調製した。本実施例において、バス型ソニケータとして、株式会社エスエヌディ製  ＵＳ−２を用い、レベル５に設定して超音波を照射した。以下、株式会社エスエヌディ製  ＵＳ−２を用いて、レベル５に設定し超音波を照射することを、単にバス型ソニケータで超音波を照射すると称する。
【０１３７】
そして、２次エマルションを、０．１％ＰＶＡを含むＰＢＳ３００ｍｌにさらに加え、液中乾燥を行うことにより、クロロホルムを除去した懸濁液を得た。その後、懸濁液を２００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＢＳＡを内包する生分解性ナノスフェアを含む沈殿を得た。そして、かかる沈殿を超純水で洗浄した。この、遠心分離および洗浄からなる操作を数回繰り返した後、沈殿を凍結乾燥して水を除去することで、ＢＳＡを内包する生分解性ナノスフェアを得た。
【０１３８】
（評価）
ＢＳＡを内包する生分解性ナノスフェアの形状および粒径を、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ：Scanning Electron Microscope）を用いて検討した。走査型電子顕微鏡試料台にカーボン両面テープを貼り付け、その上に凍結乾燥後のＢＳＡを内包する生分解性ナノスフェアを載置し、２００Åの金蒸着を行うことにより、走査型電子顕微鏡の試料を作成した。ＢＳＡを内包する生分解性ナノスフェア粒径は無作為に選択したＢＳＡを内包する生分解性ナノスフェアの粒径を測定することにより求めた。
【０１３９】
図５は、ＢＳＡを内包する生分解性ナノスフェアを走査型電子顕微鏡で観察した結果を説明するための説明図である。図５に示すように、ＢＳＡを内包する生分解性ナノスフェアの粒径は、約１５０ｎｍ〜約８００ｎｍであった。また、比較的凝集も抑えられており微粒子表面も、平滑なものが得られた。
【０１４０】
ナノスフェアの粒径が約１５０ｎｍ〜約８００ｎｍと小さいため、親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方を内包した生分解性ナノスフェアを、静脈または動脈注射用の医薬品、経皮吸収用の医薬品や化粧料等の皮膚外用組成物に利用することができ、薬物の全身投与、患部へのターゲッティングおよび皮膚への浸透が可能となる。
【０１４１】
次に、生分解性ナノスフェアのＢＳＡ内包率およびＢＳＡの回収率を測定した。まず、サンプル管を６個用意し、そのうち５個のサンプル管には内包物なしの空の生分解性ナノスフェアを、残りの１個のサンプル管には内包率が未知である、ＢＳＡを内包した生分解性ナノスフェアを、それぞれ２０ｍｇ入れた。
【０１４２】
空の生分解性ナノスフェアを入れた５個のサンプル管には、それぞれＢＳＡの濃度が０、０．３、０．５、０．７、０．９ｍｇ／ｍｌとなるように、ＢＳＡ含有１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を３ｍｌずつ入れ、ＢＳＡを内包した生分解性ナノスフェアを入れたサンプル管には、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を３ｍｌ入れた。
【０１４３】
上記６個のサンプル管にキャップをして約２日間スターラーで攪拌した。２日後、溶液が透明になり、生分解性ナノスフェアが分解されたのを目視で確認した後、それぞれの溶液を、ディスポーサブルフィルターを用いて濾過した。ＢＳＡの濃度が０ｍｇ／ｍｌの空の生分解性ナノスフェアを分解した溶液をバックグラウンドとし、波長２９０ｎｍの吸光度を測定して、検量線を作成した。そして、ＢＳＡを内包した生分解性ナノスフェアを分解した溶液の吸光度を測定し、作成した検量線より、生分解性ナノスフェアに内包されたＢＳＡの定量（内包率の測定）を行った。
【０１４４】
図６は、実施例における内包率、回収率、収率および内包効率を算出する式を説明するための説明図である。ここで内包率は、得られた単位重量あたりのナノスフェアに対する内包された物質（本実施例では、親水性物質）の重量の比率（％）であり、回収率は、用いられた内包される物質（本実施例では、親水性物質）に対する回収された内包される物質（本実施例では、親水性物質）の比率（％）であり、収率は、ナノスフェアの構成成分として用いられた内包される物質（本実施例では、親水性物質）、両親媒性ポリマー、疎水性ポリマーおよび親水性ポリマーの重量に対する回収されたナノスフェアの重量の比率（％）であり、内包効率は、用いられた内包される物質（本実施例では、親水性物質）と用いられたポリマーの合計との割合に対する、内包される親水性物質もしくは疎水性物質のいずれか一方または両方と回収したナノスフェア中のポリマーとの割合、の比を百分率（％）で示す。
【０１４５】
図６に示す、内包率を算出する式を用いて、実施例１の生分解性ナノスフェアのＢＳＡの内包率を算出すると、２．９％となった。
【０１４６】
また、懸濁液を２００００ｒｐｍで１０分間遠心分離した結果、得られた上澄におけるＢＳＡの濃度から、図６に示す、回収率を算出する式を用いて、実施例１におけるＢＳＡの回収率を求めた。その結果、実施例１におけるＢＳＡの回収率は、９１．０％となった。
【０１４７】
ＢＳＡの回収率が９０％以上と高いことから、医薬品等の高価な物質を内包させる場合であっても、好適に医薬品等の高価な物質を回収することができる。したがって、回収した物質を再利用することができ、薬価の不要な上昇を抑えることが可能となる。
【０１４８】
（実施例２）
本実施例では、両親媒性ポリマーとして数平均分子量３０００のポリエチレングリコールとＬ−乳酸のジブロック共重合体（以下、単に、ＰＥＧ３Ｋ−ｂ−ＰＬＬＡと称する）を、疎水性ポリマーとして、ＰＬＧＡを、親水性ポリマーとしてＰＶＡを、内包する物質は、親水性物質および疎水性物質の機能を備える両親媒性物質としてスフィンゴミエリンを用いた。
【０１４９】
図７は、実施例２にかかるＰＥＧ３Ｋ−ｂ−ＰＬＬＡの合成方法を説明するための説明図である。
【０１５０】
図７に示すように、まず、Ｌ−ラクチド、ＭｅＯ−ＰＥＧ３Ｋ、２−エチルヘキサン酸スズをそれぞれ秤量し、ナス型フラスコにいれ、攪拌子もいれて減圧乾燥を行った。乾燥後、ナス型フラスコを１５０℃のｏｉｌ  ｂａｔｈに浸漬して内容物を溶融させ、ナス型フラスコを１３０℃のｏｉｌ  ｂａｔｈに１２時間浸漬することで開環重合反応を行った。反応後，反応物を少量のクロロホルムに溶解させ、大量のエーテルにより再沈殿を行った。これを遠心分離にかけ、沈殿物を減圧乾燥することでＰＥＧ３Ｋ−ｂ−ＰＬＬＡを得た。
【０１５１】
図８は、実施例２を説明するための説明図である。図８に示すように、試験管に、ＰＥＧ３Ｋ−ｂ−ＰＬＬＡ２０ｍｇおよび重量平均分子量が５０００〜７５０００であるＰＬＧＡ１８０ｍｇを入れ、クロロホルム２．５ｍｌに溶解させた。続いて、スフィンゴミエリン５ｍｇを試験管に加え１次溶液を生成した。次に、１次溶液をスパチュラで激しく撹拌しながらプローブ型ソニケータで３分間超音波を照射し、１次エマルションを調製した。
【０１５２】
その後、１次エマルションを、０．１％ＰＶＡを含むＰＢＳ３００ｍｌに加えて２次溶液を調製した。次に、２次溶液にバス型ソニケータで３分間超音波を照射し、９０秒間スパチュラで激しく攪拌し、さらに、プローブ型ソニケータで９０秒間超音波を照射して２次エマルションを調製した。
【０１５３】
そして、２次エマルションを、０．１％ＰＶＡを含むＰＢＳ３００ｍｌにさらに加え、液中乾燥を行うことにより、クロロホルムを除去した懸濁液を得た。その後、懸濁液を２００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、両親媒性物質としてのスフィンゴミエリンを内包する生分解性ナノスフェアを含む沈殿を得た。そして、かかる沈殿を超純水で洗浄した。この、遠心分離および洗浄からなる操作を数回繰り返した後、沈殿を凍結乾燥して水を除去することで、スフィンゴミエリンを内包する生分解性ナノスフェアを得た。
【０１５４】
（評価）
スフィンゴミエリンを内包する生分解性ナノスフェアの形状および粒径を、走査型電子顕微鏡を用いて検討した。走査型電子顕微鏡の試料の作成方法は、上述した実施例１の作成方法と同一であるため説明を省略する。
【０１５５】
図９は、スフィンゴミエリンを内包する生分解性ナノスフェアを、走査型電子顕微鏡で観察した結果を説明するための説明図である。図９に示すように、スフィンゴミエリンを内包する生分解性ナノスフェアの粒径は、比較的凝集も抑えられており微粒子表面も、平滑なものが得られた。
【０１５６】
また、懸濁液を２００００ｒｐｍで１０分間遠心分離した結果、得られた上澄におけるスフィンゴミエリンの濃度から、図６に示す、収率を算出する式を用いて、実施例２におけるスフィンゴミエリンの収率を求めた。その結果、実施例２におけるスフィンゴミエリンの収率は、５３．７％となった。
【０１５７】
実施例２において、親水性物質だけでなく、親水性物質および疎水性物質の機能を備える両親媒性物質のスフィンゴミエリンを内包したナノスフェアを製造することができた。したがって、親水性物質だけでなく、親水性物質および疎水性物質を内包するナノスフェアを製造することが可能となった。また、スフィンゴミエリンを内包する高分子微粒子は、ナノメートルオーダーであるため、静脈または動脈注射用の医薬品、経皮吸収用の医薬品や化粧料等の皮膚外用組成物に利用することができ、薬物の全身投与、患部へのターゲッティングおよび皮膚への浸透が可能となる。
【０１５８】
また、スフィンゴミエリンのセラミドに基づく保湿効果により、スフィンゴミエリンを内包するナノスフェアを含有する皮膚外用組成物または化粧料を製造すれば、皮膚外用組成物または化粧料を皮膚表面の微細な凹凸にナノスフェアを略均一に塗布することができるため、皮膚外用組成物または化粧料が有する保湿効果を満遍なく皮膚に与えることが可能となる。また、上述したようにナノスフェアを構成するポリマーに生分解性ポリマーを用いる構成により、スフィンゴミエリンを皮膚表面で好適に徐放させることができ、従来と比較して皮膚外用組成物または化粧料の塗布回数を減らしても同程度の保湿効果を得ることが可能となる。
【０１５９】
（実施例３）
本実施例では、両親媒性ポリマーとしてＤｅｘ−ｇ−ＰＬＬＡを、親水性ポリマーとしてＰＶＡを、内包する物質は、親水性物質および疎水性物質の混合物としてステビア発酵エキス（stevia ferment extract）を用い、疎水性ポリマーは使用しなかった。
【０１６０】
図１０は、実施例３にかかるＤｅｘ−ｇ−ＰＬＬＡの合成方法を説明するための説明図である。
【０１６１】
図１０（ａ）に示すように、まず、トリメチルシリル（ＴＭＳ）化デキストラン（ＴＭＳＤｅｘ）を合成した。合成前日にデキストランの減圧乾燥を行った。アルゴンで満たして常圧に戻し、デキストランを取り出した。デキストランをホルムアミドに溶解させ、８０℃に加熱し、ヘキサメチルジシラザンを攪拌しながら注いだ。
【０１６２】
２時間後分液漏斗を用い抽出し、濃縮して、さらに減圧乾燥した。生成物をクロロホルムに溶解させ、メタノールを貧溶媒とした再沈殿を行い精製した。沈殿物は超遠心分離を行い回収し、減圧乾燥した。
【０１６３】
図１０（ｂ）に示すように、まず、合成前日にＬ−ラクチドと図１０（ａ）で得られたＴＭＳＤｅｘの減圧乾燥をそれぞれ行なった。Ｌ−ラクチドはクライゼンフラスコに秤量し、常温で直引減圧乾燥した。水酸基をカリウムナフタレンによりアルコキシド化し、これを開始剤としてラクチドの溶液系アニオン開環重合を行った。
【０１６４】
次に、ＴＭＳ基の脱保護を行った。ＴＭＳＤｅｘ−ｇ−ＰＬＬＡを、ＤＭＳＯ（Dimethylsulfoxide）を加えてスターラーで攪拌し溶解した。ＴＭＳＤｅｘ−ｇ−ＰＬＬＡが完全に溶解したことを確認してからメタノールを加えた。そして、酢酸を加え４時間攪拌した。４時間後、メタノールを貧溶媒とした再沈殿を行ない、超遠心分離を行い、沈殿を回収し、デシケータ内で減圧乾燥した。さらなる精製は糖含有率により、良溶媒にＤＭＳＯまたはクロロホルム、貧溶媒にメタノールを用いた再沈殿により行なった。これを数回繰り返し、Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＬＡを得た。
【０１６５】
図１１は、実施例３にかかるＤｅｘ−ｇ−ＰＬＬＡの分解性を説明するための説明図であり、図１２は、分解性実験に用いたＤｅｘ−ｇ−ＰＬＬＡを説明するための説明図である。ここでは、クロロホルムを用いたキャスト法で作成したＤｅｘ−ｇ−ＰＬＬＡフィルムおよびＰＬＬＡフィルムの質量を電子天秤で量り、ＰＢＳに浸漬して３７℃でインキュベートし、１日後、２日後、４日後、７日後、１４日後、２８日後に取り出し、水分を減圧乾燥により除去した後の質量を測定した。分解前のフィルムの重さと分解後のフィルムの重さから、図１１（ａ）に示す式を用いてフィルムの重量減少率を求めた。また、取り出したサンプルの一部をＤＭＦで溶解し、ＧＰＣを用いた分子量分布測定を行い数平均分子量の減少について検討した。分解前のＤｅｘ−ｇ−ＰＬＬＡの数平均分子量と分解後のＤｅｘ−ｇ−ＰＬＬＡの数平均分子量から、図１１（ｃ）に示す式を用いてＤｅｘ−ｇ−ＰＬＬＡの分子量減少率を求めた。
【０１６６】
図１１（ｂ）に示すように、ＰＬＬＡと比較して、Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＬＡは、フィルムの重量減少率が高い。また、Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＬＡにおけるＬ−ラクチドの重合度が低い方が、フィルムの重量減少率が高くなった。
【０１６７】
また、図１１（ｄ）に示すように、ＰＬＬＡと比較して、Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＬＡは、分子量減少率が低い。また、Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＬＡにおける糖含有率が高い方が、分子量減少率が高い。したがって、両親媒性ポリマーとして、Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＬＡにおけるＬ−ラクチドの重合度または糖含有率を調節することで、生分解性ナノスフェアを生体内に留置した場合に、分解に伴う炎症反応等を起こさない分解速度であり、かつ、生体内で必要とされる期間の経過後には生体内から消失している生分解速度に調節することができる。
【０１６８】
図１３は、実施例３を説明するための説明図である。図１３に示すように、試験管に、Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＬＡであるＧ４５−１２−２０またはＧ８０−９−１６を、２００ｍｇを入れ、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）２．４ｍｌに溶解させた。続いて、ステビア発酵エキス５ｍｇを試験管に加え１次溶液を生成した。次に、１次溶液をスパチュラで激しく撹拌しながらバス型ソニケータで５分間超音波を照射し、１次エマルションを調製した。
【０１６９】
その後、１次エマルションを、０．１％ＰＶＡを含むＰＢＳ３００ｍｌに加えて２次溶液を調製した。次に、２次溶液にプローブ型ソニケータで３分間超音波を照射して２次エマルションを調製した。
【０１７０】
そして、２次エマルションを、０．１％ＰＶＡを含むＰＢＳ３００ｍｌにさらに加え、液中乾燥を行うことにより、クロロホルムを除去した懸濁液を得た。その後、懸濁液を２００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ステビア発酵エキスを内包する生分解性ナノスフェアを含む沈殿を得た。そして、かかる沈殿を超純水で洗浄した。この、遠心分離および洗浄からなる操作を数回繰り返した後、沈殿を凍結乾燥して水を除去することで、ステビア発酵エキスを内包する生分解性ナノスフェアを得た。
【０１７１】
（評価）
ステビア発酵エキスを内包する生分解性ナノスフェアの形状および粒径を、走査型電子顕微鏡を用いて検討した。走査型電子顕微鏡の試料の作成方法は、上述した実施例１の作成方法と同一であるため説明を省略する。
【０１７２】
図１４は、ステビア発酵エキスを内包する生分解性ナノスフェアを、走査型電子顕微鏡で観察した結果を説明するための説明図である。図１４に示すように、ステビア発酵エキスを内包する生分解性ナノスフェアの粒径は、比較的凝集も抑えられており微粒子表面も、平滑なものが得られた。
【０１７３】
また、懸濁液を２００００ｒｐｍで１０分間遠心分離した結果、得られた上澄におけるステビア発酵エキスの濃度から、図６に示す、収率を算出する式を用いて、実施例３におけるステビア発酵エキスの収率を求めた。その結果、実施例３におけるステビア発酵エキスの収率は、Ｇ４５−１２−２０で６５．８％、Ｇ８０−９−１６で６３．７％となった。
【０１７４】
実施例３において、親水性物質だけでなく、親水性物質および疎水性物質の混合物であるステビア発酵エキスを内包したナノスフェアを製造することができた。したがって、親水性物質だけでなく、親水性物質および疎水性物質の混合物を内包するナノスフェアを製造することが可能となった。また、ステビア発酵エキスを内包する高分子微粒子は、ナノメートルオーダーであるため、静脈または動脈注射用の医薬品、経皮吸収用の医薬品や化粧料等の皮膚外用組成物に利用することができ、薬物の全身投与、患部へのターゲッティングおよび皮膚への浸透が可能となる。
【０１７５】
また、ステビア発酵エキスの回収率が６０％以上と高いことから、医薬品や、皮膚外用組成物、化粧料、に利用される有効物質等の高価な物質を内包させる場合であっても、好適に有効成分等の高価な物質を回収することができる。したがって、回収した物質を再利用することができ、薬価の不要な上昇を抑えることが可能となる。
【０１７６】
また、ステビア発酵エキスは、保湿効果が高く、荒れ肌を改善したり、かゆみを抑止したり、炎症を抑えたり、抗ヒスタミン作用を有したりする。したがって、ステビア発酵エキスを内包するナノスフェアを含有する皮膚外用組成物または化粧料を製造すれば、皮膚表面の微細な凹凸にステビア発酵エキスを略均一に行き渡らせることができ、ステビア発酵エキスの保湿効果、荒れ肌改善効果、かゆみ抑止効果、炎症抑止効果および抗ヒスタミン効果を皮膚表面に満遍なく塗布することが可能となる。
【０１７７】
（実施例４）
本実施例では、両親媒性ポリマーとしてＤｅｘ−ｇ−ＰＬＬＡを、疎水性ポリマーとしてＥｔＯ−ＰＬＬＡを、親水性ポリマーとしてＰＶＡを、内包する親水性物質としてＢＳＡを用いた。
【０１７８】
図１５は、実施例４を説明するための説明図である。図１５に示すように、試験管に、ＥｔＯ−ＰＬＬＡを１７０ｍｇ、Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＬＡであるＧ７１−１３−１３（図１３（ｂ）参照）を、３０ｍｇを入れ、塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）２．４ｍｌに溶解させた。続いて、ＢＳＡ５ｍｇを溶解させたＰＢＳ１００μｌを試験管に加え１次溶液を生成した。次に、１次溶液をスパチュラで激しく撹拌しながら、バス型ソニケータで５分間、プローブ型ソニケータで１．５分間超音波を照射し、１次エマルションを調製した。
【０１７９】
その後、１次エマルション８００μｌを、０．１％ＰＶＡを含むＰＢＳ５ｍｌに加えて２次溶液を調製した。次に、２次溶液にプローブ型ソニケータで１．５分間超音波を照射して２次エマルションを調製した。
【０１８０】
そして、２次エマルションを、０．１％ＰＶＡを含むＰＢＳ２００ｍｌに加え、１時間攪拌し，約４０℃で２時間液中乾燥することにより塩化メチレンを除去した懸濁液を得た。その後、懸濁液を２００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＢＳＡを内包する生分解性ナノスフェアを含む沈殿を得た。かかる沈殿を超純水で洗浄した。この、遠心分離および洗浄からなる操作を数回繰り返した後、沈殿を凍結乾燥して水を除去することで、ＢＳＡを内包する生分解性ナノスフェアを得た。
【０１８１】
（評価）
ＢＳＡを内包する生分解性ナノスフェアの形状および粒径を、走査型電子顕微鏡を用いて検討した。走査型電子顕微鏡の試料の作成方法は、上述した実施例１の作成方法と同一であるため説明を省略する。
【０１８２】
図１６は、ＢＳＡを内包する生分解性ナノスフェアを、走査型電子顕微鏡で観察した結果を説明するための説明図である。図１６に示すように、ＢＳＡを内包する生分解性ナノスフェアの粒径は、約４００ｎｍ〜約６００ｎｍであった。また、比較的凝集も抑えられており微粒子表面も、平滑なものが得られた。
【０１８３】
実施例４におけるナノスフェアの粒径が約４００ｎｍ〜約６００ｎｍと小さいため、親水性物質を内包した生分解性ナノスフェアを、静脈または動脈注射用の医薬品、経皮吸収用の医薬品や化粧料等の皮膚外用組成物に利用することができ、薬物の全身投与、患部へのターゲッティングおよび皮膚への浸透が可能となる。
【０１８４】
次に、生分解性ナノスフェアのＢＳＡ内包率およびＢＳＡの回収率を測定した。まず、サンプル管を６個用意し、そのうち５個のサンプル管には内包物なしの空の生分解性ナノスフェアを、残りの１個のサンプル管には内包率が未知である、ＢＳＡを内包した生分解性ナノスフェアを、それぞれ２０ｍｇ入れた。
【０１８５】
空の生分解性ナノスフェアを入れた５個のサンプル管には、それぞれＢＳＡの濃度が０、０．１、０．１５、０．２３、０．３ｍｇ／ｍｌとなるように、ＢＳＡ含有１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を３ｍｌずつ入れ、ＢＳＡを内包した生分解性ナノスフェアを入れたサンプル管には、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を３ｍｌ入れた。
【０１８６】
上記６個のサンプル管にキャップをして約２日間スターラーで攪拌した。２日後、溶液が透明になり、生分解性ナノスフェアが分解されたのを目視で確認した後、それぞれの溶液を、ディスポーサブルフィルターを用いて濾過した。ＢＳＡの濃度が０ｍｇ／ｍｌの空の生分解性ナノスフェアを分解した溶液をバックグラウンドとし、波長２９１ｎｍの吸光度を測定して、検量線を作成した。そして、ＢＳＡを内包した生分解性ナノスフェアを分解した溶液の吸光度を測定し、作成した検量線より、生分解性ナノスフェアに内包されたＢＳＡの定量（内包率の測定）を行った。
【０１８７】
図６に示す、内包効率を算出する式を用いて、実施例４の生分解性ナノスフェアのＢＳＡの内包効率を算出すると、５２．９％となった。
【０１８８】
また、懸濁液を２００００ｒｐｍで１０分間遠心分離した結果、得られた上澄におけるＢＳＡの濃度から、図６に示す、回収率を算出する式を用いて、実施例４におけるＢＳＡの回収率を求めた。その結果、実施例４におけるＢＳＡの回収率は、８２．７％となった。
【０１８９】
ＢＳＡの回収率が８０％以上と高いことから、医薬品や、皮膚外用組成物、化粧料、に利用される有効成分等の高価な物質を内包させる場合であっても、好適に有効成分等の高価な物質を回収することができる。したがって、回収した物質を再利用することができ、薬価の不要な上昇を抑えることが可能となる。
【０１９０】
以上、添付図面を参照しながら本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明はかかる実施形態に限定されないことは言うまでもない。当業者であれば、特許請求の範囲に記載された範疇内において、各種の変更例または修正例に想到し得ることは明らかであり、それらについても当然に本発明の技術的範囲に属するものと了解される。
【０１９１】
なお、本明細書のナノスフェアの製造方法における各工程は、必ずしもフローチャートとして記載された順序に沿って時系列に処理する必要はなく、並列的あるいはサブルーチンによる処理を含んでもよい。
【産業上の利用可能性】
【０１９２】
本発明は、例えば、タンパク質、核酸、薬物、造影剤等の親水性物質、もしくは、脂質、薬物等の疎水性物質のいずれか一方または両方を内包できるナノスフェアの製造方法、ナノスフェア、これを含有する皮膚外用組成物および化粧料に利用することができる。
【符号の説明】
【０１９３】
Ｓ１００  …１次溶液生成ステップ
Ｓ１０２  …１次エマルション生成ステップ
Ｓ１０４  …２次溶液生成ステップ
Ｓ１０６  …２次エマルション生成ステップ
Ｓ１０８  …有機溶媒除去ステップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図５】
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【図９】
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【図１４】
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【図１６】
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