(57)【要約】【課題】  社会的隔離モデル動物、その作製方法及びそれを用いて医薬品の候補物質をスクリーニングする方法を提供すること。【解決手段】  発達期又はそれ以前の時期にGluR1の細胞内領域が大脳皮質の体性感覚野に遺伝子導入されていることを特徴とする、社会的隔離モデル動物。その作製方法及びそれを用いて医薬品の候補物質をスクリーニングする方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
発達期又はそれ以前の時期にGluR1の細胞内領域が大脳皮質の体性感覚野に遺伝子導入されていることを特徴とする、社会的隔離モデル動物。
【請求項２】
動物がげっ歯類であり、大脳皮質の体性感覚野がバレル皮質である請求項１記載の社会的隔離モデル動物。
【請求項３】
初めて遭遇した同種の動物と過ごす時間と既知の同種の動物と過ごす時間との間に有意差がない請求項１又は２のいずれかに記載の社会的隔離モデル動物。
【請求項４】
動物がラットである請求項１〜３のいずれかに記載の社会的隔離モデル動物。
【請求項５】
発達期又はそれ以前の時期にGluR1の細胞内領域を大脳皮質の体性感覚野に遺伝子導入することを含む、社会的隔離モデル動物の作製方法。
【請求項６】
請求項１記載の社会的隔離モデル動物に被験物質を投与することを含む、社会的隔離によるトラウマに起因する精神疾患の治療に有効な物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、社会的隔離モデル動物に関し、より詳細には、社会的隔離モデル動物、その作製方法及びそれを用いて医薬品の候補物質をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
精神的ストレスは神経系において様々な影響を及ぼしうる。短期的で緩やかなストレスは感情の喚起を引き起こし、学習効果を上昇させる(非特許文献１，２)のに対し、慢性的なストレスはしばしば学習障害や心的外傷後ストレス障害(PTSD)といった神経機能における障害を引き起こす(非特許文献３)。ストレスは複雑に神経機能を調節しているため、ストレスが神経系にどのように影響を及ぼしているかを分子レベルで解明することはストレス性疾患をコントロールするための重要なステップである。
【０００３】
発達早期の社会行動や感覚的な経験が正常な神経系の発達には不可欠であることはよく知られている(非特許文献４)。ネグレクトによる社会的隔離(幼児虐待の一種)は多大なるストレスを与え、鬱、薬物中毒や不安障害など多岐に渡る精神疾患を引き起こす(非特許文献４，５)。しかしながら、社会的隔離がどのようにして脳機能を変化させるかの分子機序はほとんどわかっていない(非特許文献６)。
【０００４】
幼児早期の経験は機能的な皮質回路形成を正常に行うのに重要である(非特許文献７、８)。この期間において、げっ歯類での重要なコミュニケーション手段であるヒゲを介した感覚的経験(非特許文献９，１０)はバレル皮質において興奮性のシナプス伝達を何倍にも増加させる(非特許文献１１)。
【０００５】
中枢神経系における興奮性のシナプス伝達は主にAMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid)型グルタミン酸受容体により仲介される(非特許文献１２、１３、１４)。シナプスでのAMPA受容体の数がシナプス後神経細胞の反応性を規定し、神経機能を調節する(非特許文献１５、１２、１６、１７、１、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、１１、２７)。LTP(long-term potentiation(シナプス長期増強))などの可塑性を誘導する刺激はin vitroの実験系でGluR1を含んだAMPA受容体をシナプスへ移行させる(非特許文献１７、２７)。In vivoの実験系では、発達期のバレル皮質においてヒゲを用いた経験がGluR1を含んだAMPA受容体をシナプスへ移行させる(非特許文献２８、１１)。シナプスでのGluR1を含んだAMPA受容体の増加は、様々な系において行動の変化に影響を及ぼしている(非特許文献１、１９、２５)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、社会的隔離モデル動物、その作製方法及びそれを用いて医薬品の候補物質をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ここで私たちは大脳皮質の成長に対しての社会的隔離の影響を調べた。私たちは発達期のバレル皮質における４層から2/3層へのシナプスに着目した。生後12〜14日の期間、ヒゲを用いた経験によりGluR1を含んだAMPA受容体がシナプスへ移行され、同時にバレル皮質で適切なmapが形成される(Stern et al., 2001; Takahashi et al., 2003)。乳児期の短期間の社会的隔離(単なるヒゲからの感覚入力ではなく)はLTPだけでなく上記の過程も障害する。この結果機能的なヒゲ−バレル皮質のmapの形成とヒゲ依存的な行動に異常を引き起こす。さらには乳児期の社会的隔離の影響はストレスホルモンの一種であるグルココルチコイドにより仲介されるが、感情の喚起により誘導されるAMPA受容体の移行を仲介するノルエピネフリンによっては仲介されない(Hu et al., 2007)。これらの結果は乳児期の社会的隔離による永続的なストレスが、グルココルチコイドによる経験依存的なAMPA受容体のシナプスへの移行が妨げられることで、適切な神経回路の形成を妨害することを示唆する。
【０００８】
幼児早期のストレスフルなイベントは情動や認知行動に長きに渡る深刻な影響を及ぼす。しかしながら、ストレスが乳児期の脳の回路形成にどのように影響を及ぼすのかはほとんどわかっていない。ここで私たちは乳児期の社会的隔離が分子、細胞、神経回路の発達過程を妨げ、行動異常に至ることを明らかにした。この時期の隔離は神経間伝達の長期増強(LTP)及びげっ歯類のバレル皮質での回路形成期間に通常起こる経験依存的なAMPA受容体のシナプスへの移行を妨げる。この現象はストレスホルモンの一種であるグルココルチコイドの増加により仲介され、大脳皮質における感覚野のmapの形成障害が起こる。幼若期のこれらの効果は成長期におけるヒゲ依存的な行動の障害を引き起こす。これらの結果より、乳児期の社会的隔離は神経の可塑性を変化させ、正常な皮質回路の形成の初期段階を妨害し、その結果長期にわたる行動への影響を引き起こしうる。
【０００９】
さらに、私たちは、発達期にGluR1の細胞内領域(GluR1ct)を遺伝子導入したラットが、社会認知試験(social recognition test)で、初めて遭遇したラットと過ごす時間と既知のラットと過ごす時間との間に有意差がないことを確認した。また、同様に、発達期に社会的隔離がなされたラットも、社会認知試験で、初めて遭遇したラットと過ごす時間と既知のラットと過ごす時間との間に有意差がないことを確認した。
【００１０】
本発明は、これらの知見に基づき、完成されたものである。
【００１１】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）発達期又はそれ以前の時期にGluR1の細胞内領域が大脳皮質の体性感覚野に遺伝子導入されていることを特徴とする、社会的隔離モデル動物。
（２）動物がげっ歯類であり、大脳皮質の体性感覚野がバレル皮質である（１）記載の社会的隔離モデル動物。
（３）初めて遭遇した同種の動物と過ごす時間と既知の同種の動物と過ごす時間との間に有意差がない（１）又は（２）のいずれかに記載の社会的隔離モデル動物。
（４）動物がラットである（１）〜（３）のいずれかに記載の社会的隔離モデル動物。
（５）発達期又はそれ以前の時期にGluR1の細胞内領域を大脳皮質の体性感覚野に遺伝子導入することを含む、社会的隔離モデル動物の作製方法。
（６）（１）記載の社会的隔離モデル動物に被験物質を投与することを含む、社会的隔離によるトラウマに起因する精神疾患の治療に有効な物質のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、社会的隔離モデル動物を作製することができるようになった。本発明のモデル動物を用いて、幼児虐待の一種であるネグレクトに代表されるような社会的隔離によるトラウマに起因する鬱、薬物中毒、不安障害などの精神疾患の治療に有効な医薬品の候補物質をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】社会的隔離は発達期のバレル皮質における経験依存的なAMPA受容体のシナプスへの移行を阻害する。(A-C)感染細胞のrectification indexは非感染細胞の値でnormalizeされている。*はstudent Tテストでp値が0.05未満であることを示す。エラーバーは±SEM(A)生後7〜11日の社会的隔離は生後12〜14日の経験依存的なGluR1のシナプスへの移行を阻害した。非隔離の動物数は8匹、隔離したのは9匹。(B)生後7〜11日に母親だけを取り除くことでは生後12〜14日の経験依存的なGluR1のシナプスへの移行を阻害しなかった(8匹)。母親だけを取り除いている期間にヒゲからの入力を遮断してもGluR1の移行は妨げられなかった(5匹)。(C)発達早期の社会的隔離(生後4〜7日)は生後12〜14日の経験依存的なGluR1のシナプスへの移行を妨げた。非隔離の動物数は6匹、隔離したのは5匹。(D)生後14日目のAMPA/NMDA比は生後7〜11日に隔離したラット群で非隔離群に比して低下していた。非隔離の動物数は18匹、隔離したのは18匹。*はstudentTテストでp値が0.05未満であることを示す。エラーバーは±SEM
【図２】社会的隔離は発達期のバレル皮質におけるLTPを阻害する。LTPは90秒間3Hzの刺激とシナプス後細胞を+20mVに脱分極させることで誘導した。記録は導入後最低40分は維持した。EPSCの振幅はLTP誘導前の平均値でnormalizeした。LTP誘導30〜40分後の平均値はLTP誘導前の平均値でnormalizeした。生後4〜7日の社会的隔離(非隔離の動物数は5匹、隔離したのは5匹)(A)でも生後7〜11日の社会的隔離(非隔離の動物数は6匹、隔離したのは6匹)(B)でも生後14日目のLTPは阻害された。*はstudentTテストでp値が0.05未満であることを示す。エラーバーは±SEM
【図３】グルココルチコイドの上昇及びCaMK2の活動減少が社会的隔離によるシナプス可塑性の阻害を仲介している。(A,B)社会的隔離は血中の活性化コルチコステロンを上昇させた。隔離開始後1、6時間後に採血したフリーのコルチコステロンが示された(A:生後4〜7日に隔離を行い、生後4と7日目に測定した。B:生後7〜11日に隔離を行い、生後7と11日目に測定した。それぞれ10匹ずつ)。社会的隔離は血中のフリーのコルチコステロンを上昇させた。*はstudentTテストでp値が0.05未満であることを示す。エラーバーは±SEM（C）感染細胞のrectification indexは非感染細胞の値でnormalizeされている。グルココルチコイド受容体の拮抗薬であるRU486の投与は生後7〜11日の社会的隔離によるGluR1のシナプスへの移行阻害を防いだ(5匹)が、溶媒であるDMSOではその効果は認められなかった(5匹)。*はstudentTテストでp値が0.05未満であることを示す。エラーバーは±SEM(D)感染細胞のrectification indexは非感染細胞の値でnormalizeされている。グルココルチコイド受容体の刺激薬であるHCAの生後7〜11日での投与はGluR1のシナプスへの移行を阻害した(9匹)。*はstudentTテストでp値が0.05未満であることを示す。エラーバーは±SEM(E) 感染細胞のrectification indexは非感染細胞の値でnormalizeされている。グルココルチコイド受容体の刺激薬であるコルチコステロンの生後7〜11日での投与は通常環境下の動物のGluR1のシナプスへの移行を阻害した(8匹)。(F)生後14日目のAMPA/NMDA比は生後7〜11日にコルチコステロンを投与したラット群で非隔離群に比して低下しており、隔離群とは差がなかった。非隔離の動物数は15匹、隔離したのは16匹、コルチコステロンを投与した非隔離の動物数は12匹。(G)LTPは生後7〜11日にコルチコステロンを投与したラット群で減少した。EPSCの振幅はLTP誘導前の平均値でnormalizeした(左)。LTP誘導30〜40分後の平均値はLTP誘導前の平均値でnormalizeした(右)。非隔離の動物数は7匹、コルチコステロンを投与した動物数は8匹。(H)生後11日のラットのバレル皮質を抗グルココルチコイド受容体抗体で免疫染色。2/3層のほとんどの神経細胞がグルココルチコイド受容体を発現していた。スケールバーは表記の通り。(I)隔離３時間時点で非隔離群に比べ核分画には大量のグルココルチコイド受容体が含まれる。隔離群の核分画のグルココルチコイド受容体の量は非隔離群のそれでnormalizeされている。定量分析のため核のCREBの量が参照として使用されている。非隔離の動物数は6匹、隔離したのは6匹。(J)感染細胞のrectification indexは非感染細胞の値でnormalizeされている。隔離中にRU486を局所投与することで隔離によるGluR1の移行阻害を妨げることができた。上は実験方法のスケジュール。隔離しRU486を投与した動物数は9匹、隔離し溶媒を投与した動物数は7匹。(A-J)*はstudent Tテストでp値が0.05未満であることを示す。エラーバーは±SEM(K)隔離は非隔離群に比してsynaptosome分画でのCaMK2のThr286のリン酸化を減少させる。隔離しRU486を投与した群のリン酸化レベルは非隔離群のそれと同程度だった。定量分析のためアクチンの量が参照として使用されている。動物数は各5匹。(L) 隔離は非隔離群に比してsynaptosome分画でのGluR1のSer831のリン酸化を減少させる。隔離しRU486を投与した群のリン酸化レベルは非隔離群のそれと同程度だった。定量分析のためアクチンの量が参照として使用されている。動物数は各12匹。(K,L) *はstudent Tテストで非隔離群に比してp値が0.05未満であることを示す。エラーバーは±SEM(M) GluR1のmutant(831A)を発現している細胞のrectification indexは非感染細胞の値でnormalizeされている。生後12〜14日の正常ラットのバレル皮質4から2/3層へのシナプスでは831Aは移行しなかった。エラーバーは±SEM
【図４】ノルエピネフリンの経路は社会的隔離によるGluR1のシナプスへの移行阻害を仲介しなかった。(A)感染細胞のrectification indexは非感染細胞の値でnormalizeされている。交感神経β受容体の拮抗薬であるプロプラノロールの投与は生後7〜11日の社会的隔離によるGluR1のシナプスへの移行阻害を防がなかった(24匹)。(B)生後14日目のAMPA/NMDA比は生後7〜11日に隔離し、プロプラノロールを投与したラット群で非隔離群に比して低下していた(25匹)。*はstudentTテストでp値が0.05未満であることを示す。エラーバーは±SEM
【図５】社会的隔離は機能的なヒゲ−バレル皮質のmapを障害した。周辺第1(S1)及び第2(S2)のヒゲに対する2/3層での応答(spikeの数)は第一のヒゲにおける応答でnormalizeされている。(A)発達期のバレル皮質にGFP-GluR1ctを発現させることで機能的なヒゲ−バレル皮質のmapが障害された。GFP-GluR1ctを発現したラットではGFPのみを発現した動物に比してS1、S2の値が高値を示し、このことはmapが洗練されていないことを示している(GFP-GluR1ct群は7匹、GFP群は8匹)。*はkruskall-waillisテストでp値が0.05未満であることを示す。(B)社会的隔離により機能的なヒゲ−バレル皮質のmapが障害された。社会的隔離されたラットでは非隔離動物に比してS1、S2の値が高値を示し、このことはmapが洗練されていないことを示している(隔離群は16匹、非隔離群は10匹)。*はkruskall-waillisテストでp値が0.05未満であることを示す。
【図６】社会的隔離はヒゲ-バレル皮質のmap依存的行動を障害した。(A)gap-crossing testの模式図。巾はラットが渡れなくなるまで広げられ(SU)、その後再び渡り始めるまで狭められた(SL)。ΔSはSU-SLの値である。(B)バレル皮質にGFPを発現したラットではバレル皮質にGFP-GluR1ctを発現させたラットに比し小さなΔSを示し、これはGFPを発現したラットはGFP-GluR1ctを発現させたラットに比し距離の弁別能力が優れていることを示す(GFP-GluR1ct群は8匹、GFP群は8匹)。(C)非隔離ラットでは隔離されたラットに比し低いΔSを示し、これは弁別能力が優れていることを示す(非隔離群は9匹、生後4〜7日に隔離した群は10匹、生後7〜11日に隔離した群は7匹)。社会的隔離したラットにRU486を投与すると隔離したのみのラットに比し小さなΔSを示した(、生後4〜7日に隔離した群は9匹、生後7〜11日に隔離した群は8匹)。非隔離ラットと隔離してRU486を投与したラット間でΔS値に違いは認めなかった。
【図７】社会的隔離は他個体の認識を低下させた。(A)バレル皮質にGFP及びGFP-GluR1ctを発現させたラット群間で新しく入れたラットへの探求時間に差はなかった。GFP-GluR1ct発現は38匹、GFP発現は30匹。(B) 隔離及び非隔離したラット群間で新しく入れたラットへの探求時間に差はなかった。非隔離の動物数は12匹、隔離したのは6匹。(C)GFP-GluR1ctをバレル皮質に発現させると他個体の認識(social recognition)が低下した。GFP-GluR1ctを発現させた動物では新しいラットと前回出会っているラットとの間に探索行動の時間的な差はなかったのに対し、GFPのみを発現させた動物では有意に長い時間新規のラットに対し探索行動を示した。GFP発現は20匹、GFP-GluR1ct発現は14匹。(D)社会的隔離により他個体の認識(social recognition)が低下した。生後4-7日に隔離した動物では新しいラットと前回出会っているラットとの間に探索行動の時間的な差はなかったのに対し、非隔離の動物では有意に長い時間新規のラットに対し探索行動を示した。非隔離の動物数は12匹、隔離したのは11匹*はstudent Tテストでp値が0.05未満であることを示す。エラーバーは±SEM
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
本発明は、発達期又はそれ以前の時期にGluR1の細胞内領域が大脳皮質の体性感覚野に遺伝子導入されていることを特徴とする、社会的隔離モデル動物を提供する。
【００１６】
本発明の社会的隔離モデル動物は、ヒト以外の動物であればよく、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サルなどの哺乳動物を挙げることができ、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギなどのげっ歯類が好適である。発達期又はそれ以前の時期にGluR1の細胞内領域(GluR1ct)を大脳皮質の体性感覚野に遺伝子導入することにより、経験依存的AMPA受容体（例えば、GluR1）シナプス移行を阻害することができる。経験依存的AMPA受容体シナプス移行が阻害されているかどうかを検討するためには、ラットのヒゲ−バレル皮質の系を使うと便利であることから、本発明者らはラットを用いて実験を行った（後述の実施例参照）。バレル皮質は直径１００〜４００μ程度の細胞の塊から構成される。それぞれのバレルは１本のヒゲに対応して反応し、ヒゲとバレルとの間には整然としたマップが形成される。ヒゲ−バレル皮質の系は、ヒゲを切ることによって簡単に感覚入力をコントロールすることができる。このようなバレル構造は、ラット、マウス、ハムスター、モルモットなどの多くのげっ歯類に見られる。
【００１７】
本発明において、これらの動物の発達期又はそれ以前の時期にGluR1ctが大脳皮質の体性感覚野（例えば、げっ歯類のバレル皮質）に遺伝子導入がなされる。GluR1ctの遺伝子導入は、発達期、好ましくは、乳児期のような発達早期になされるとよい。GluR1ctの遺伝子導入は、以下のような操作で行うことができる。
【００１８】
GluR1の細胞内領域の塩基配列の上流にGFPの配列を置く。この配列をレンチウイルスベクターに挿入し、ウイルス精製を行う。このウイルスはラットのバレル皮質に頭位固定装置を使用して、microinjectionされる。またバレル皮質全域に発現するように約10か所にわたりinjectionを行った。
【００１９】
GluR1ctの遺伝子導入により、母親や兄弟をはじめとする他の個体からの隔離のような養育環境操作やグルココルチコイドのような薬物投与と同様に、大脳皮質の体性感覚野における経験依存的AMPA受容体シナプス移行を阻害することができる。
【００２０】
養育環境操作は、大脳皮質の体性感覚野における経験依存的AMPA受容体シナプス移行が阻害されるのに適した養育環境操作であればよく、例えば、母親や兄弟をはじめとする他の個体からの隔離（以下、「社会的隔離」と記す）などを挙げることができる。動物がラットである場合、発達期になされる養育環境操作は、生後４〜７日及び／又は生後７〜１１日における社会的隔離であるとよい。生後４〜７日及び／又は生後７〜１１日に１日あたり６時間の社会的隔離により、バレル皮質における経験依存的AMPA受容体シナプス移行の阻害が観察された（後述の実施例参照）ので、社会的隔離は１日あたり６時間以上なされるのがよいであろう。他の動物については、当業者であれば、ラットの場合に準じて、大脳皮質の体性感覚野における経験依存的AMPA受容体シナプス移行が阻害されるのに適した養育環境操作条件を見出すことができるであろう。
【００２１】
薬物投与は、大脳皮質の体性感覚野における経験依存的AMPA受容体シナプス移行を阻害できる薬物の投与であればよい。このような薬物としては、グルココルチコイド（例えば、ハイドロコルチゾン（コルチゾール）、その前駆体であるコルチゾン、コルチコステロン、これらの薬理学的に許容される塩（例えば、ハイドロキシコルチゾンアセテート、コルチゾンアセテート））などのグルココルチコイド受容体のアゴニストを例示することができる。投与方法は、薬物の種類に応じて適宜選択すればよく、例えば、腹腔内注射などを挙げることができる。投与量は、動物及び薬物の種類に応じて適宜調製するとよい。例えば、動物がラットであり、発達期に投与する薬物がハイドロコルチゾン又はその薬理学的に許容される塩である場合、発達期になされる薬物投与は、生後４〜７日及び／又は生後７〜１１日における１日あたり2μg/g体重〜6μg/g体重の投与量でのハイドロコルチゾン又はその薬理学的に許容される塩の投与であるとよい。他の動物又は他の薬物については、当業者であれば、ラットにハイドロコルチゾン又はその薬理学的に許容される塩を投与する場合に準じて、大脳皮質の体性感覚野における経験依存的AMPA受容体シナプス移行が阻害されるのに適した薬物投与操作条件を見出すことができるであろう。
【００２２】
大脳皮質の体性感覚野における経験依存的AMPA受容体シナプス移行が阻害されているかどうかの検討は、Takahashi, T., Svoboda, K., and Malinow, R. (2003). Experience strengthening transmission by driving AMPA receptors into synapses. Science (New York, NY 299, 1585-1588.に記載の方法を用いて行うことができる（後述の実施例参照）。簡単に説明すると、内向き整流を示す組換えAMPA受容体を発現するベクター（例えば、ウイルス）を動物の大脳皮質の体性感覚野（例えば、げっ歯類のバレル皮質）に注入して、発現させ、その後適当な時間（後述の実施例では、２日間）ほどおいてから脳スライスを作製し、そのスライスを用いた電気生理学的解析(Y. Hayashi et al., Science 287, 2262 (Mar 24, 2000).)を行う。もし内向き整流を示す組換えAMPA受容体がシナプスに挿入された場合、挿入されていないシナプスに比べてより内向きの整流を示すようになる。AMPA受容体は、グルタミン酸受容体の１つであり、数種類が存在するが、Ｃ末端の構造により２つのグループに分けられる。GluR1,4は長いＣ末端を有しており、GluR2.3は短いＣ末端を持っている。内向き整流を示す組換えAMPA受容体は、GluR1であることが好ましい。組換えAMPA受容体は、GFP(green fluorescence protein(緑色蛍光タンパク質))などで標識されていることが好ましい。MalinowらはLTPを誘導する刺激によりAMPA受容体がシナプスへ移行し、シナプスにおけるAMPA受容体の数が増えることがシナプス長期増強のメカニズムであるという仮説を立てた。組換えAMPA受容体のシナプスへの移行を調べる方法としてMalinowらは「電気生理学的標識」という方法を開発した( Y. Hayashi et al., Science 287, 2262 (Mar 24, 2000).)。通常の場合、生体内のAMPA受容体は膜電位が負のときも正のときもイオンがチャンネルを通過することができる。したがっていずれの場合もシナプス前神経の刺激に対する反応が観察されるが、組換え受容体は膜電位が負のときのみイオンがチャネルを通過する。これを内向き整流（inward rectification）と言う。もしこの内向き整流を示す組換え受容体がシナプスに挿入された場合、挿入されていないシナプスに比べてより内向きの整流を示すようになる。MalinowらはまずSindbis virusを用いてin vitroの培養海馬スライスに組換えAMPA受容体を発現させ、LTP誘導時にＣ末端が長いAMPA受容体であるGluR1がシナプスへ移行するということを発見した( Y. Hayashi et al., Science 287, 2262 (Mar 24, 2000).; S. Shi, Y. Hayashi, J. A. Esteban, R. Malinow, Cell 105, 331 (May 4, 2001).; S. H. Shi et al., Science 284, 1811 (Jun 11, 1999).)。一方、Ｃ末端が短いAMPA受容体であるGluR2はLTP誘導刺激がない状態においてもconstitutiveにシナプスへ移行するということを見出した( S. Shi, Y. Hayashi, J. A. Esteban, R. Malinow, Cell 105, 331 (May 4, 2001).)。さらにMalinowらはLTP誘導刺激依存的にシナプスへ移行したGluR1がその後GluR2受容体によって置き換わることを見出した( S. Shi, Y. Hayashi, J. A. Esteban, R. Malinow, Cell 105, 331 (May 4, 2001).)。Malinowらはこれらの知見をもとにTwo-pathways モデルを提唱した。このモデルにおいてはまずLTP誘導刺激によりGluR1がシナプスに移行することによってシナプス応答の上昇を引き起こす。その際GluR1がある種のタンパク質をシナプスに運ぶことによってAMPA受容体がシナプスに滞在するためのslotを増やすと考えられる。その後シナプスに移行したGluR1はその他の膜タンパク質同様細胞内に取り込まれていくが、GluR1が消失��たslotにはconstitutiveにシナプスへ移行するGluR2が置き換わって挿入される。GluR2はその後もconstitutiveなturnoverを繰り返し、LTPを維持していく。このモデルは記憶の獲得とその維持を細胞レベルで記述している見事なモデルと言えるだろう( R. Malinow, R. C. Malenka, Annu Rev Neurosci 25, 103 (2002).; J. J. Zhu, J. A. Esteban, Y. Hayashi, R. Malinow, Nat Neurosci 3, 1098 (Nov, 2000).)
本明細書において、「経験依存的AMPA受容体シナプス移行」とは、感覚入力依存的にAMPA受容体がシナプスへ移行する現象のことをいい、その例としては、げっ歯類のヒゲを介した感覚的経験がバレル皮質においてAMPA受容体をシナプスへ移行させることなどが挙げられる。
【００２３】
動物の発達期に養育環境操作及び／又は薬物投与を行い、大脳皮質の体性感覚野における経験依存的AMPA受容体シナプス移行を阻害することにより、シナプス長期刺激が阻害され、大脳皮質の体性感覚野（ラットの場合、バレル皮質）の機能的mapが障害され、さらには、距離の知覚能力が障害されることが確認された（後述の実施例参照）。
【００２４】
また、発達期又はそれ以前の時期にGluR1ctが大脳皮質の体性感覚野に遺伝子導入され、GluR1ctを発現する動物は、社会認知試験で、初めて遭遇した同種の動物と過ごす時間と既知の同種の動物と過ごす時間との間に有意差がないことが確認された（後述の実施例参照）。
【００２５】
また、本発明は、発達期又はそれ以前の時期にGluR1の細胞内領域を大脳皮質の体性感覚野に遺伝子導入することを含む、社会的隔離モデル動物の作製方法も提供する。
【００２６】
さらに、本発明は、発達期又はそれ以前の時期にGluR1の細胞内領域が大脳皮質の体性感覚野に遺伝子導入された社会的隔離モデル動物に被験物質を投与することを含む、社会的隔離によるトラウマに起因する精神疾患の治療に有効な物質のスクリーニング方法を提供する。
【００２７】
被験物質は、いかなる物質であってもよく、例えば、タンパク質、ペプチド、多糖、オリゴ糖、単糖、脂質、低分子化合物、核酸（DNA、RNA、オリゴヌクレオチド、モノヌクレオチド等）などを挙げることができる。これらの物質は、天然物であっても、化学的又は生化学的に合成された物であってもよく、また、遺伝子工学的に生産された物であってもよい。
【００２８】
スクリーニングは、例えば、以下のような手順で行うことができる。発達期又はそれ以前の時期にGluR1の細胞内領域を大脳皮質の体性感覚野に遺伝子導入する操作を終えた後に、モデル動物に被験物質を適当な投与量・投与方法で投与し、モデル動物を母親や兄弟などの他の個体とともに生活させた後、大脳皮質の体性感覚野における経験依存的AMPA受容体シナプス移行が阻害されているか否かを測定する。測定方法は前述の通りである。被験物資を投与しない動物と比較して、大脳皮質の体性感覚野における経験依存的AMPA受容体シナプス移行の阻害が有意に小さければ、社会的隔離によるトラウマに起因する精神疾患の治療に有効な物質であると判定される。あるいは、社会認知試験を行い、被験物資を投与しない動物と比較して、初めて遭遇した同種の動物と過ごす時間が既知の同種の動物と過ごす時間より有意に長ければ、社会的隔離によるトラウマに起因する精神疾患の治療に有効な物質であると判定される。
【実施例】
【００２９】
以下の実施例により、本発明を具体的に説明する。なお、これらの実施例は、説明のためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３０】
〔実施例１〕
Result
社会的隔離はヒゲ経験依存的なGluR1を含んだAMPA受容体のシナプスへの移行を阻害する
受容体の移行における社会的隔離の影響を調べるため、私たちは子ラットを一匹ずつを生後7〜11日にかけて一日6時間、母親や兄弟から隔離した(Zimmerberg et al., 2003)。生後12日目、GFPで標識したGluR1を発現するシンドビスウイルスを隔離した子ラット、隔離していない子ラット双方のバレル皮質に注入した。私たちは毒性を抑えるため低いtiterのウイルスを使用し、感染効率は1000個につき1個程度であった。ウイルスによるGFP-GluR1の過剰発現により、細胞体では4倍、樹状突起では35%の発現増加を認め、つまりほぼ生理的範囲内の増加であったと言える(Kessels et al., 2009)。改変したAMPA受容体はホモ体を形成し、内在性の受容体と比べて正の電位の時にわずかな外向き電流しか示さないため、それらがシナプスに挿入されればAMPA受容体を介した電流での内向き整流性(-60mVでの電流に対する+40mVでの電流の比)が増加する。生後12〜14日は母親、同胞とともに通常の条件に置かれ、生後14日目に急性スライスを作成した。動物は実験期間通して、そのままのヒゲで維持された。私たちは2/3層の感染、また近傍の非感染した錐体細胞にホールセル記録を行い、4層を刺激し、シナプス伝達を誘発した。隔離していない子ラット由来の感染した神経細胞では近傍の非感染細胞に比し整流性の増大を認めた（図1A）。しかしながら隔離された子ラット由来の感染細胞では整流性の増大は認めなかった（図1A）。従ってヒゲ経験依存的なGluR1のシナプスへの移行は発達早期の社会的隔離により妨げられた。生後7〜11日の1時間もしくは生後7日目に6時間だけ隔離することで生後12〜14日の経験依存的なGluR1のシナプス移行は妨げられるが、生後7日目に1時間だけ隔離を行うことでは妨げられなかった。つまりGluR1における隔離の効果は隔離の期間に依存することが分かった。内在性のAMPA受容体のシナプスへの移行も社会的隔離によって妨げられるかを確かめるため、NMDA応答に対するAMPA応答の比(A/N比)を調べた。生後7〜11日目に一日1もしくは6時間隔離された子ラットでは同齢の隔離されていないラットに比べ、低いA/N比を認めた（図1D）。つまりは生後7〜11日目の社会的隔離は内在性のAMPA受容体のシナプスへの移行を妨げた。これらの結果は生後7〜11日に6時間隔離して生後11日で調べたsynaptosome分画で非隔離の動物に比して隔離した動物ではGluR1の量が減ったことと一致した。
【００３１】
離乳はもっと遅い時期なので、生後7〜11日目は母親から栄養供給を受けている。そのため隔離時間は栄養が遮断している。隔離中の栄養不足がGluR1のシナプスへの移行を妨げていないことを確認するため、6匹の子ラットを母親から離し、一緒に6時間生活させた。これらの子ラットは栄養は供給されないが、他の同胞との交わりはある。これらの子ラットでは、感染細胞は内向き整流性の増加を認め、つまりGluR1は正常にシナプスへ移行した（図1B）。またA/N比も母親だけはずされた仔と通常環境の仔で差はなく（図1E）、生後7〜11日に母親だけをはずすことは内在性のAMPA受容体のシナプス移行に影響を及ぼさなかった。この結果より、隔離中に母親から栄養を受けなくとも、他の同胞と交わりが維持されていれば経験依存的にGluR1はシナプスに移行することがわかった。
【００３２】
一日6時間の隔離中、子ラットは他の同胞や母親と交わりがなく、従ってヒゲ経験が減少する可能性がある。隔離中のヒゲ経験の減少によりGluR1のシナプスへの移行を妨げていないことを確認するため、生後7〜11日まで一日6時間ヒゲをマスクすることでヒゲ経験を剥奪した。この方法は生後12〜14日までの２日間継続してマスクすることでヒゲ経験依存的なGluR1のシナプスへの移行を妨げることができたため、ヒゲ経験を剥奪するには有効である。母親がマスクをはがす可能性があるため、マスクした子ラットを他数匹の同胞と共に生活させ、他個体との交わりは維持するようにした。生後12〜14日の間GluR1-GFPをバレル皮質に発現させた。結果、感染細胞では内向き整流性の増加を認めた（図1B）。またA/N比もひげをマスクした仔と通常環境の仔で差はなく（図1E）、生後7〜11日に1日6時間だけひげをマスクしても内在性のAMPA受容体のシナプス移行に影響を及ぼさなかった。この結果は生後7〜11日の間一日6時間ヒゲ経験を剥奪することはヒゲ経験依存的なGluR1のシナプスへの移行には影響を与えないことを示唆している。
【００３３】
以上より、生後7〜11日の社会的隔離はヒゲ経験依存的なGluR1のシナプスへの移行を阻害し、またこの影響は母親からの栄養の遮断や隔離期間の感覚経験の減少によるものではないことがわかった。
【００３４】
発達早期の社会的隔離は発達後期の経験依存的なGluR1のシナプスへの移行を阻害する
私たちは経験依存的なAMPA受容体のシナプスへの移行に対する社会的隔離のより長い影響を調べた。生後4〜7日に一日6時間母親と同胞から隔離し、生後8〜14日は普通の状態に置いた。GFP-GluR1は生後12日にウイルスで遺伝子導入した。生後14日目に隔離した子ラットから急性スライスを作成し、ホールセル記録を行ったところ、感染細胞で内向き整流性の増加は認めなかった（図1C）。この結果と同じく、A/N比も同じ年齢の非隔離動物に比して隔離動物では有意に低下していた（図1F）。これは発達早期の社会的隔離により１週間後のGluR1のシナプスへの移行が阻害されることを示唆している。
【００３５】
社会的隔離は長期増強(LTP)を阻害する
上記の通り、in vivoで社会的隔離は経験依存的なAMPA受容体のシナプスへの移行を阻害することがわかった。これはAMPA受容体の移行に必要な生化学的過程の崩壊に起因するかもしれない。LTPとAMPAのシナプスへの移行は近似した生化学的過程を有するので(Barry and Ziff, 2002; Bredt and Nicoll, 2003; Hayashi et al., 2000; Malinow and Malenka, 2002)、AMPA受容体を移行させる分子機構が障害されることでLTPも障害されるだろう。代わりに隔離を受けたラットは異常な社会行動を示し、結果不適切な感覚刺激が入力し(ひげを介した接触の低下、など)、経験依存的AMPA受容体のシナプスへの移行が妨げられている可能性もある。こうした場合、隔離された子ラットの神経細胞自体はLTPを誘導するに十分な生化学的な経路を内在するかもしれない。この二つの可能性を見極めるため、LTPにおける社会的隔離の効果を検証した。
【００３６】
生後4〜7日及び7〜11日に一日6時間隔離した子ラットから生後14日目に急性スライスを作成した。ホールセル記録は4層を刺激し、2/3層の錐体細胞から行った。LTPはシナプス後膜を脱分極させて、2方向からの刺激を用いた(Hayashi et al., 2000)。隔離されていない子ラットではLTPは正常に誘導されたが、隔離された子ラットでは顕著にLTPが減弱していた(図2A, B)。さらには生後4〜7日の隔離は生後27日目のLTPも減弱させ、乳仔期の社会的隔離の影響は思春期まで持続することがわかった(図2C)。私たちはまた海馬における影響もみた。生後7〜11日の社会的隔離はCA3−CA1間のシナプスにおけるLTPも阻害した(図2D)。これらの結果は社会的隔離によってAMPA受容体の移行に必要な生化学的過程が障害されていることを示唆している。
【００３７】
グルココルチコイドが社会的隔離によるAMPA受容体のシナプスへの移行阻害を仲介している
社会的隔離によるAMPA受容体のシナプスへの移行阻害は何により仲介されているのだろうか？仮に可塑性が全般的に影響を受けているとしたら、私たちはげっ歯類における主要なストレスホルモンであるコルチコステロンに着目した。コルチコステロンの活性体はフリーのコルチコステロン(グロブリンに結合しているものではなく)なので、私たちはフリーの血中濃度を測定した。社会的隔離の間、血中のコルチコステロン濃度は持続的に上昇していた(図3A, B)。
【００３８】
次に私たちはグルココルチコイド受容体の拮抗薬であるRU486を隔離している期間に子ラットに投与した。前述した通り、生後7〜11目に隔離し、12日目にGFP-GluR1を発現したシンドビスウイルスをバレル皮質の2/3層に注入し、生後14日目に急性スライスを作成した。隔離中にRU486(8ug/体重g)を投与したラットでは感染細胞において、感染していない細胞に比し内向き整流性が増加していた。このことはGluR1のシナプスへの移行を正常に戻したことを示唆している(図3C)。またRU486を溶解していたDMSOの投与ではその効果は見られなかった(図3C)。また1日6時間の隔離の際にRU486を投与した動物では、非隔離の動物とA/N比に差がなく(図3D)、つまり隔離中にRU486によりグルココルチコイド受容体をブロックすることで隔離による内在性のAMPA受容体のシナプスへの移行阻害を救うことができた。このRU486の効果は量依存性であり、1.6ug/体重gのRU486ではこの効果は見られなかった。
【００３９】
さらに経験依存的なAMPA受容体における増加したグルココルチコイドの役割を明らかにすべく、私たちはグルココルチコイドの直接投与が社会的隔離の効果を類似できるかを確かめた。通常環境下の子ラットにコルチコステロン(4.17ug/日)を生後7〜11日に投与した。そうして生後12日目にシンドビスウイルスを注入し、生後14日目に急性スライスを作成した。ホールセル記録の結果、これらの子ラットにおいて感染、非感染細胞における内向き整流性には違いを認めなかった(図3E)。さらには隔離せずにコルチコステロンの投与を受けた動物では非隔離、非投与の動物に比してA/N比が有意に低く、隔離動物と同程度であった。これはコルチコステロンの投与により内在的なAMPA受容体のシナプスへの移行が妨げられたことを示す(図3F)。これらの結果と一致して、この量のコルチコステロンを投与することで生後14日目のLTPが減弱した(図3G)。0.83ug/日の量ではこの効果は見られず、コルチコステロンの効果は量依存的であることがわかった。これらの結果はグルココルチコイドの上昇にて、社会的隔離の時のように経験依存的なAMPA受容体のシナプスへの移行を妨げられたことを示唆する。
【００４０】
社会的隔離がバレル皮質のグルココルチコイドシグナルを活性化させ経験依存的なAMPA受容体のシナプスへの移行を阻害しているのかどうかを調べるため、私たちは社会的隔離がバレル皮質におけるグルココルチコイド受容体の核移行(グルココルチコイドシグナルを活性化する機序)を引き起こすか調べた。抗グルココルチコイド受容体抗体による免疫染色では生後11日目のバレル皮質の2/3層にグルココルチコイド受容体が発現していることがわかった(図3H)。生後11日目、隔離をはじめて3時間後には核のグルココルチコイド受容体の量が増加していた(図3I)。これらから社会的隔離がバレル皮質のグルココルチコイド経路を活性化することがわかった。もし隔離によるAMPA受容体のシナプス移行がバレル皮質のグルココルチコイド受容体の活性化によるものであれば、RU486のバレル皮質への局所投与で隔離の効果を妨げることができるはずだろう。これを証明するため、生後12日にGFP-GluR1のウイルスをうつ際に同時にRU486も局所投与した。1時間後これらの仔を6時間隔離した。その後仔ラットは母元に戻され、その27時間後にホールセル記録を行った(図3J)。RU486投与下でGFP-GluR1発現細胞は内向き整流性の増加を示す一方で、RU486がなければ増加は認めず、つまりRU486の局所投与は社会的隔離の効果を妨げた(図3J)。これらの結果はバレル皮質における社会的隔離によるAMPA受容体のシナプスへの移行阻害は局所でのグルココルチコイドシグナルの活性化によるものであることを示唆した。
【００４１】
社会的隔離によるCaMK2活性の減少とGluR1のリン酸化低下がそのシナプス移行に影響を及ぼしている
CaMK2の活性化はAMPA受容体のシナプス移行、LTPそして行動の可塑性に重要である(Lisman et al., 2002)。どのようにして社会的隔離がGluR1のシナプスへの移行を阻害するかのシグナルについて調べるため、私たちはまずCaMK2に対する隔離の影響を調べた。生後7〜11日に1日6時間隔離をし、RU486の投与を行ったもの、行ってないもの及び非隔離の動物のバレル皮質より生後11日目にsynaptosome分画を採取した。そしてCaMK2αの286番目のスレオニンのリン酸化(この活性化の指標となる)をみた。社会的隔離はこのサイトのリン酸化を阻害することが分かり、つまりCaMK2の活性は減弱していることを示した(図3K)。この隔離の効果は8ug/体重gのRU486により阻害された(図3K)。
【００４２】
GluR1の831番目のセリンはCaMK2の標的であり、LTPの際にリン酸化される(Derkach et al., 2007)。次に私たちはこのサイトのリン酸化における社会的隔離の影響を調べた。隔離した動物のバレル皮質のsynaptosome分画では非隔離のそれに比して831番目のセリンのリン酸化が低下していた(図3L)。8ug/体重gのRU486を投与した動物では非隔離の動物と同程度のリン酸化レベルであった(図3L)。
【００４３】
以前の研究でCaMK2が定常的に活性化されている神経細胞においてGluR1の831番目のセリンをアラニンに置換したものではGluR1のシナプス移行が妨げられないという報告があり(Hayashi et al., 2000)、これは831番目のセリンのリン酸化の上昇がこの種の可塑性には必要でないことを示している。これが生体内における経験依存的なGluR1のシナプス移行にも当てはまるかを確認するため、831番目のセリンをアラニンに置換したGluR1(831A)を生後12日目にバレル皮質に発現させ、経験依存的な831Aの移行を調べた。831A発現と非発現細胞では内向き整流性に違いはなく、つまり831Aはシナプスに移行しなかった(図3M)。831番目のセリンは経験依存的なGluR1のシナプスへの移行に必要であった。定常的に活性化されるCaMK2の発現は生体での知覚経験の入力により活性化される機序とは異なる機序を活性化し、831番目のセリンのリン酸化障害を克服した可能性がある。
【００４４】
これらの結果より、社会的隔離はグルココルチコイドを介してCaMK2の活性化を抑え、831番目のセリンのリン酸化を減少させ、その結果GluR1のシナプス移行を減少させていることが分かった。
【００４５】
ノルエピネフリンは社会的隔離によるAMPA受容体のシナプス移行阻害を仲介しない
ノルエピネフリンもまた哺乳類における重要なストレスホルモンの一種である。隔離時のノルエピネフリンの働きを確かめるため、私たちは生後7〜11の隔離期間中にβ受容体の拮抗薬であるプロプラノロールを投与した。前述の通り、ホールセル記録の結果、これらの子ラットにおいて感染、非感染細胞における内向き整流性には違いを認めなかった(図4A)。経験依存的AMPA受容体のシナプスへの移行はプロプラノロール存在下であっても、社会的隔離により阻害された。生後14日でのAMPA/NMDA比もまたプロプラノロール投与下で顕著に低下していた(図4B)。これらの結果は、社会的隔離による発達期のバレル皮質における経験依存的なAMPA受容体のシナプスへの移行阻害はノルエピネフリンのシグナルではなく、グルココルチコイドのシグナル依存的であった。さらにはグルココルチコイドの上昇そのものだけで社会的隔離の効果を類似するに十分であった。
【００４６】
社会的隔離によりヒゲ−バレル皮質の機能的mapが障害される
AMPA受容体のシナプスへの移行阻害はヒゲ−バレル皮質2/3層間の機能的連結を乱すであろう。LTPにおける生後4〜7日の社会的隔離の影響は思春期まで持続している(図2C)ので、私たちは隔離動物におけるヒゲ−バレル皮質の機能的mapを思春期で調べた。
【００４７】
まず私たちは経験依存的なGluR1のシナプスへの移行を阻害することで機能的なヒゲ−バレル皮質のmapが乱れるかどうかを確かめた。私たちはGFPで標識したGluR1の細胞内領域(GFP-GluR1ct)をレンチウイルスを用いてバレル皮質の2/3層に注入した。GFP-GluR1ctは内在的なGluR1が経験依存的にシナプスへ移行するのを阻害することがわかっている(Rumpel
et al., 2005; Takahashi et al., 2003)。私たちは麻酔下のラットに単一のin vivo記録を行い、ヒゲから皮質へのmapの投射を評価した。私たちは生後23日目のラットですべてのヒゲを一本ずつ揺すり、その刺激に反応したスパイクの数を記録した。最も高い反応を示したヒゲが第一のヒゲである。私たちはGFP-GluR1ctをバレル皮質全体で発現しているラットにおいて、正常のラットに比し、第一のヒゲの周囲のヒゲからの反応性が増大していることを認めた。このことはGFP-GluR1ctをバレル皮質全体で発現しているラットにおいてバレル皮質の2/3層の機能的受容野が障害されていることを示唆している(図5A)。
【００４８】
次に社会的隔離をしたラット、していないラットで、この受容野を評価した。生後4〜7日にかけて隔離されているラットにおいて、正常のラットに比し、第一のヒゲの周囲のヒゲからの反応性が増大していることを認めた。このことは隔離を受けたラットにおいて、バレル皮質の2/3層の機能的受容野が障害されていることを示唆している(図5B)。隔離動物のバレル皮質における受容野の障害はより早期の生後14日目にも認められた。したがって、隔離による受容野の機能障害は4から2/3層への入力が減少している時期にも起こっていることになる。これらの結果は社会的隔離が経験依存的なGluR1のシナプスへの移行を阻害した結果バレル皮質において皮質のmap形成に乱れが生じたことを示唆している。
【００４９】
社会的隔離はヒゲ−バレル皮質のmap依存的な行動を障害する
私たちは次に乱れたヒゲ−バレル皮質のmapがどのように行動に影響を及ぼすかを調べた。私たちは乱れたヒゲ−バレル皮質のmapを距離の感知能力をして評価した。評価には機能的なヒゲ−バレル皮質のmap依存的として知られるgap-crossing task (Barneoud et al., 1991; Hutson and Masterton, 1986)の改変版を用いた(図6A)。このtaskではラットはあらかじめレーンの逆側に報酬があることを訓練されている。訓練が終わり、レーンの途中に巾を作り、0.5cmずつ広げていった(図6A左)。ラットが渡れなくなるまで巾は広げられ(図6A中央)、これを上限値(SU)と規定した。続いて巾をラットが再び渡れるまで0.5cmずつ狭めていき(図6A右)、再び渡り始めた巾を下限値(SL)と規定した。このSUとSL(△S)の差を算出した。
【００５０】
シナプス可塑性及び機能的ヒゲ-バレル皮質のmapへの乳仔期の社会的隔離の影響は思春期まで持続するため(図2C)、私たちはこの時期にまずヒゲ−バレル皮質依存的な行動課題を調べた。
【００５１】
私たちはまずGFP-GluR1ctをバレル皮質全体で発現しているラットとGFPのみを発現したラット(いずれも生後4日目にレンチウイルスを用いて遺伝子導入している)で、生後21日目にこのtaskを行った。GFP-GluR1ctを発現したラットにおいてGFPを発現したラットに比し、△Sの増大を認めた。このことはGFP-GluR1ctによるヒゲ−バレル皮質の機能的なmapの乱れが距離の知覚能力を障害したことを示唆している(図6B)。このことからこのgap-crossing taskがAMPA受容体の移行と適切なヒゲ−バレル機能に依存的であることがわかる。
【００５２】
次に生後4〜7日、および7〜11日に1日6時間の社会的隔離を行った動物で、生後21日目の時にgap-crossing taskを行った。結果(図6C)は隔離、非隔離のラットにそれぞれRU486をうったものとうってないものの△Sを示す。Post-hoc解析は非隔離ラットは隔離ラットに比しより小さな△Sを示し、これは非隔離のラットの方が距離知覚の能力が高いことを示す(図6C)。さらに隔離ラットに隔離時期に8ug/体重gのRU486を投与することで△Sの値は低下し、この値は非隔離ラットの値と同じであった。このことは、RU486は隔離の距離知覚能力における影響を正常化したことを示唆している(図6C)。非隔離動物にRU486を投与しても非隔離動物と距離の弁別能力は同じであり、RU486そのものはこの行動課題に影響を及ぼさなかった(図6C)。またgap crossの装置上で隔離と非隔離の動物において動き回る距離に差はなかったため、この課題において隔離の影響は通常の不安によるものではないようだ。さらにエサの摂食量にも差はなく、モチベーションの違いでもないようだ。これらの結果より、乳児期の社会的隔離は距離の知覚能力を障害し、この影響はグルココルチコイドの経路により仲介されていることを示している。
【００５３】
乳仔期の社会的隔離は社会行動を障害する
ヒゲはげっ歯類において社会行動に用いられるため、ラットのバレル皮質において経験依存的なGluR1のシナプス移行及びヒゲ-バレルのmapが障害されると社会行動も減弱するであろう。私たちは生後4日目にGFPまたGFPで標識したGluR1の細胞内領域(GFP-GluR1ct)をレンチウイルスを用いてバレル皮質の2/3層に注入した。生後30日目にこれらのラットを用いてsocial recognition testを行った。まずこれらのラットは新しいラットに触れる。その後いったん相手のラットを取り除き、その後以前接触したラットと新規のラットの両方と同時に接触する。そこでそれぞれの動物に対する接触時間を計測する。通常、既知のラットより新規のラットに長い時間接触する。GFPを発現したラットは既知のラットに比し新規のラットに有意に長い時間接触していた一方で、GFP-GluR1ctを発現した動物は新規及び既知のラットに接触した時間に差はなかった(図7C)。両者間で初めにラットに接触した時間に有意差はなかった(図7A)。これらの結果より、バレル皮質におけるGluR1のシナプス移行阻害は社会行動を減弱させることがわかった。
【００５４】
次に社会的隔離がGFP-GluR1の発現と同じ効果を引き起こすかどうかを検証した。私たちは隔離した動物を用いてsocial recognition testを行った。隔離していないラットは既知のラットに比し新規のラットに有意に長い時間接触していた一方で、隔離をした動物は新規及び既知のラットに接触した時間に差はなかった(図7D)。GFP-GluR1ctの実験と同様、両者間で初めにラットに接触した時間に有意差はなかった(図7B)。つまり、隔離した動物では、GFP-GluR1をバレル皮質に発現させた動物と同様に社会行動の欠如を認めた。
【００５５】
Discussion
多数の論文が神経機能に対する深刻なストレスの影響を明らかにしてきたのに対し、分子、シナプス、神経回路から行動異常までを包括的に扱った仕事はほとんどない(Feder et al., 2009; Kim and Diamond, 2002; Roozendaal et al., 2009)。この研究では乳仔期の社会的隔離によるストレスの影響をAMPA受容体のシナプス移行、皮質の回路形成、体性感覚機能に絡んだ行動そして社会行動という観点で検証した。私たちはバレル皮質が社会的情報の統合に重要な役割を担っているようなので、その部位の可塑性について検証を行った。この領域はヒゲから入力を受ける一次知覚野であり、社会行動に重要である(Ahl, 1986; Strozik and Festing, 1981)。1日6時間、5日間にわたる乳仔期の社会的隔離は続く2日間の経験依存的なシナプス可塑性の著名な減少を引き起こした。これはこの期間にヒゲをマスクしても同様の影響は認められなかったため、ヒゲを使用しなかったことによるものではなさそうだ。一見隔離の影響は全身的であるようだ。確かに私たちは隔離が海馬におけるLTPを障害することをみつけている。さらには4日間の隔離が7日後のシナプス可塑性を低下させた。生後7〜11日の隔離による血中のコルチコステロンの上昇パターンは生後4〜7日のそれとは異なるようだ(図3A, B)が、どちらも生後12〜14日のAMPA受容体のシナプス移行に同様の影響を及ぼしている。生後4〜7日の隔離による上昇した血中のコルチコステロンの総和は生後7〜11日の隔離のそれと同程度であるため、ストレス環境下の上昇したコルチコステロンの総量がAMPA受容体のシナプス移行において重要な要素なのだろう。
【００５６】
社会的隔離またはバレル皮質2/3層におけるGFP-GluR1ctの発現による バレル皮質4から2/3層へのシナプスでのAMPA受容体移行阻害はヒゲ-バレル皮質のmapの機能的な形成に異常を引き起こした。ヒゲ依存的なGluR1のシナプスへの移行はバレル皮質の4から2/3層へのシナプスで起きる(Takahashi et al., 2003)が、水平に走るシナプスでは見られない。第1のヒゲからの入力はそれに対応したバレルカラムの4層から2/3層にいたる(Petersen, 2007)ので、GluR1の移行による選択的な4から2/3層へのシナプスの強化が、2/3層における良好なヒゲ-バレル皮質のmapを形成するのだろう。興味深いことにスパイクのlatecyには差がないが、スパイクの絶対数ではGFP-GluR1をインジェクションしたラットでGFPのラットに比して多かった。さらには隔離されたラットでは非隔離のラットに比してスパイクの絶対数が多かった。GFP-GluR1ctを発現したり、隔離をすることで発達期における第１のヒゲのバレル皮質のカラムで4から2/3層へのシナプス強度の増加が起きず、これにより周囲のヒゲのカラムからのシナプスが消失しにくくなり、その結果周囲のヒゲを動かしたときの第1のヒゲでのスパイクの絶対数が増加しているのかもしれない。
【００５７】
私たちは隔離の影響による可能性あるシグナル機序を研究してきた。隔離により持続的にコルチコステロンのレベルが上昇することがわかった。これがCaMK2の活性を抑え、GluR1の831番目のセリンのリン酸化を抑制し、経験依存的なAMPA受容体のシナプスへの移行を障害した。プロプラノロールでは隔離によるAMPAの移行阻害を妨げられなかったので、ほかの主要なストレスホルモンであるノルエピネフリンは隔離の効果を仲介していないことが分かった。最近のvitroの研究結果で、短時間のコルチコステロンの投与がシナプスでのAMPA受容体を増加するという報告がある(Groc et al., 2008)。隔離での慢性的なコルチコステロンの上昇の影響に対して、低濃度で短時間のコルチコステロンはAMPA受容体のシナプスへの移行を増加させるようで、このことはグルココルチコイドシグナルの逆U字効果がAMPA受容体に対しても存在することを示唆している。どういった分子機序でグルココルチコイドシグナルがCaMK2の活性を変化させるかは不明だ。ひとつの可能性としてカルシニューリンなどのタンパクの脱リン酸化酵素の増加を介してCaMK2の活性が減弱している可能性がある。確かに慢性的なストレスが神経細胞におけるカルシニューリンのレベルを増加させるという報告もある(Gerges et al., 2004)。
【００５８】
私たちは皮質と海馬におけるLTPの減少を観察してきたが、以前には乳仔期の社会的隔離が海馬におけるLTPを増加させたという報告もある(Bronzino et al., 1996; Kehoe and Bronzino, 1999)。そこでは生後2〜9日の1時間の隔離を行い、生後30日目(Bronzino et al., 1996)とアダルト(Kehoe and Bronzino, 1999)でin vivoでの記録を行っている。このプロトコールでは生後12〜14日のバレル皮質におけるGluR1の移行は阻害されない。これと一致して隔離と非隔離で同程度のLTPが生後30日の海馬の急性スライスで観察された。この隔離の年齢の違いがシナプス可塑性において異なる影響を及ぼしたのだろう。彼らのプロトコールに比べ私たちのものが慢性的なストレスの増加を引き起こした可能性があり、これがよりグルココルチコイドを上昇させ、LTPを阻害したかもしれない。そのためAMPA受容体のシナプス移行に対するストレスの影響はストレス強度(そしてグルココルチコイド量)依存性なのかもしれない。確かに私たちはAMPA受容体のシナプス移行に関して隔離およびグルココルチコイドの期間、容量依存性を示している。マイルドなストレスはノルエピネフリンを増加させ、AMPA受容体のシナプス移行とLTPを増加させるようだ(Hu et al., 2007; Wilson et al., 1986)。慢性的なストレスによる過剰なグルココルチコイド経路の活性化はAMPA受容体のシナプス移行を阻害する一方で、マイルドなストレスはノルエピネフリンもしくは低濃度のグルココルチコイド上昇を誘導し、AMPA受容体の移行を促進しているかもしれない。高いレベルでのノルエピネフリンは学習を障害する(Birnbaum et al., 1999)ので、これがAMPA受容体のシナプス移行を阻害するような条件があるのかもしれない。
【００５９】
養育環境は適切な発育に重要な要因である(Francis et al., 1999; Liu et al., 1997)が、私たちの研究では母親だけを取り除いても経験依存的なAMPA受容体のシナプス移行に影響はなかった。これは単に母親だけを取り除く(Enthoven et al., 2008)のより完全に一匹にした方がよりストレスだからかもしれない。
【００６０】
人間の研究で、トラウマにより知覚情報の処理低下が引き起こされるという報告がある(Hendler et al., 2001; Hendler et al., 2003; Pitman et al., 1999; Schmahl et al., 2004)。私たちの見解では社会的隔離などの発達期のトラウマを経験することで、経験依存的にAMPA受容体がシナプスに移行しなくなり、異常な神経回路形成が引き起こされ、行動異常にいたる可能性がある。発達早期の知覚経験の処理異常がどのようにして成長後期の感情障害にいたるのかは興味をひかれるところである。
【００６１】
Experimental Procedures
社会的隔離
各コロニー(集団)は6匹のオスと4匹のメスラットよりなる。2匹のオスの子ラットは母親とその同胞から生後4〜7日もしくは7〜11日目に１日6時間引き離される。その隔離されるオスの子ラットは個別のケージ(壷)に入れられ(一匹にするため)、隔離期間中は35℃の熱パッド上に置かれる。母親を引き離す実験では、3匹のオスと3匹のメスは一緒に母親から生後4〜7日もしくは7〜11日目に１日6時間引き離される。隔離された子ラットは前述のように熱パッド上に置かれる。ヒゲをマスクする実験では、オスのヒゲをスコッチテープで上記の期間中覆う。ヒゲをマスクされた子ラットは5匹の同胞と共に母親から引き離される。子ラットたちは隔離の期間以外は通常通りの環境に置かれる。
【００６２】
In vivoでの新皮質神経細胞への感染
GFP標識されたGluR1、GluR1ct及びシンドビスウイルスは以前報告されたように作成された(Hayashi et al., 2000; Kolleker et al., 2003; Zhu et al., 2000)。すべての手術はCSHL及び横浜市立大学の動物利用指針にのっとって行われた。ウイルスを用いたin vivoの遺伝子導入及びヒゲの抜去は以前報告されたように作成された(Takahashi et al., 2003)。手短にいうと、生後12日目にケタミンとザイラジン(それぞれ0.56mg/体重g、0.003mg/体重g)で麻酔をかけた。頭蓋骨を覆う皮膚を切開した後、前泉門を同定し、そこより2mm後方及び4.5mm側方の点を歯科用ドリルで優しく削開し、改変型シンドビスウイルスをガラスピペットで注入した。
【００６３】
GFP標識されたGluR1ctはPCRで増幅され、EcoR1、BamH1サイトでFUGWベクターに移し替えられた。そしてGFP-GluR1ctを運ぶレンチウイルスは以前報告されたように作成された(Lois et al., 2002)。GFP-GluR1ctもしくはGFPを発現したレンチウイルスは生後4日目に全バレル皮質の2/3層に注入された。それぞれのウイルスが注入された動物の機能的ヒゲ-バレル皮質のmap及び行動は下記を参照。
【００６４】
電気生理学
ウイルスの注入から2日後に、ラットをイソフルレンで麻酔し、急性脳切片を作成し、ホールセル記録を行った(Takahashi et al., 2003)。Rectification実験では、NMDA受容体をブロックするために0.1mM D,L-APVを還流液に加えた。各群間(感染、非感染、通常、ヒゲなし、隔離、非隔離)でinput、series resistanceに違いはなかった。-60mV、+40mVにおけるシナプスのAMPA電流は50〜100回の平均をとり、それらの比はrectification indexとして用いた。AMPA/NMDA比は刺激から50ms後の+40mVの電流に対する-60mVのピーク電流の比を算出した(各電位で40〜50回分の平均をとった)。
【００６５】
薬剤投与
全身投与の薬剤は皮下注で行った。RU486(40ug/体重g、Sigma社)はDMSOに溶解し、隔離の期間中2回注射した。HCA(5ug/体重g、Sigma社)は2%の滅菌したcarboxymethyl cellulose(Sigma社)水溶液に溶解し、生後4〜7もしくは7〜11日の期間に一日一回注射した。Propranolol(3ug/体重g、Sigma社)は生理的食塩水に溶解し、隔離の30分前に一日一回注射した。
【００６６】
コルチコステロンアッセイ
血清コルチコステロンのレベルは同時間に隔離、非隔離のラット群を用いた。ラットは隔離直前もしくは隔離直後に断頭した(非隔離群の断頭は隔離群と同じ時刻に行った)。体幹血はチューブに採取し、氷上に置いた。3,000回転で20分間遠心した後、上清をアッセイのため回収した。血清コルチコステロンの濃度は抗ラットコルチコステロンIgGに対するゴート抗ラビットIgG抗体でコートされた96穴のmicrotiter plateを用い、EIAキット(DSL社)で測定した。吸光度はphotometric microplate reader(BIO-RAD社)を用い450nmで測定した。感度は1.6ng/mlでアッセイ内、アッセイ間のばらつきは2.3〜6.1%。
【００６７】
in vivo記録
生後21日目にラットをウレタンで麻酔した(31.25mg/体重kg)。バレル皮質上の頭蓋骨は前述の通り開放した。求心性の双極電極(Rhodes Medical)を脳表から200〜400umの深さに刺入した。適切に刺入されているかは切片を作り確認した。対側のヒゲ一本をpiezoelectric waferの金属針で刺激した。各刺激時、ヒゲは下に振られた1秒後に振り上げられた。皮膚から1mmのところで0.5mm巾で動かした。ヒゲへの刺激に対する反応はpowerlab 4/25(AD instruments社)で記録した。ヒゲを動かして5〜50ms後のspikeの数を反応の指標として計測した。
【００６８】
Gap crossing test
Gap-crossing taskの改変版で用いた設備は図6Aの通り。プラットホームは地上より1ｍの高さ。実験者はどの群かわからない状況でテストは行った。テストの１日前にラットは24時間絶食した。ラットにはまず走路の端に報酬(ペレット)があることを探させた。トレーニングの後、走路に巾を作り、0.5cm間隔で広げていった。もしラットが巾を渡り、２分以内に餌を得ることが出来れば、成功とした。巾はラットがもはや渡れないまで広げていった。この巾を上限値とした(SU)。続いて巾をラットが再び渡れるまで0.5cm間隔で狭くしていった。この巾を下限値とした(SL)。このSUとSLの差(ΔSと定義)を計算した。このセットを5回行い、平均値を求めた。この値は距離の弁別能力を反映し、GFP-GluR1ctをバレル皮質に発現させヒゲ-バレルのmapを乱すことによってこのΔSが増大することより、ヒゲ-バレル皮質の機能に依存する。
【００６９】
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【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明のモデル動物は、幼児虐待の一種であるネグレクトに代表されるような社会的隔離によるトラウマに起因する鬱、薬物中毒、不安障害などの精神疾患の治療に有効な医薬品の候補物質のスクリーニングに利用することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００７１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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