(57)【要約】【課題】リン酸カルシウム骨用セメントにおいて、良好な生体適合性、高い生体活性および卓越した結合特性を有することに加え、機械的性質を減少させずに、セラミックの脆性の問題を解決する。【解決手段】ポリマーを含有するリン酸カルシウム骨用セメントのための組成物は、（ａ）カルシウム塩、（ｂ）ケイ素化合物、（ｃ）塑性を増すための材料、および（ｄ）塑性を増すための材料の有無にかかわらない薬理学的に許容される溶液、を含む。塑性を増すための材料が、官能基−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＯまたは−ＣＨ3を有するポリマーおよびオリゴマー材料からなる群より選択される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマーを含有するケイ酸カルシウム系骨用セメントを製造する方法であって、
（ａ）カルシウム塩をケイ素化合物と混合し；
（ｂ）工程（ａ）の混合物をゾルゲル法で処理し；
（ｃ）工程（ｂ）の混合物を加熱し；
（ｄ）工程（ｃ）の混合物に、塑性を増すための材料を添加し；
（ｅ）工程（ｄ）の混合物を粉末に粉砕し；
（ｆ）前記塑性を増すための材料と共にまたは該材料はなく、前記粉末を水またはリン酸溶液に添加する、
各工程を有してなり、
前記塑性を増すための材料が、官能基−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＯまたは−ＣＨ3を有するポリマーおよびオリゴマー材料からなる群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記カルシウム塩が、硝酸カルシウム、酸化カルシウム、水酸化カルシウム、酢酸カルシウム、または塩化カルシウムであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ケイ素化合物が、ケイ水素化物、二酸化ケイ素または四酢酸ケイ素であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ケイ素化合物がケイ水素化物であり、該ケイ水素化物が、以下の化学式：
【化１】
2011045473.tif 000006
ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3またはＲ4がＣ1-6アルキルである；
を有することを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記混合物が、１０から０．１に及ぶカルシウムのケイ素に対するモル比を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記カルシウムのケイ素に対するモル比が４から０．２５に及ぶことを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記ポリマーおよびオリゴマー材料が、固相または液相として、ゼラチン、コラーゲン、キトサン、キチン、セルロース、アルギン酸塩、ヒアルロン酸、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、およびポリ（乳酸−グリコール酸）からなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記塑性を増すための材料が、総質量に対して２〜３０質量％の範囲で秤量されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記ゾルゲル法が、
（ｉ）前記工程（ａ）からの混合物を、エタノールおよび硝酸からなる群より選択される希釈溶媒と１〜１２時間に亘り混合し、
（ｉｉ）前記混合物を１〜７日間に亘り２０〜１００℃の温度に配置し、
（ｉｉｉ）前記混合物を−４０〜１５０℃で乾燥させる、
各工程を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記加熱工程が、
（ｉ）前記工程（ｂ）からの混合物を１〜４０℃／分の速度で７００〜１３００℃に加熱し、
（ｉｉ）前記混合物を７００〜１３００℃の定温範囲に維持し、
（ｉｉｉ）前記混合物を、空冷、水冷または高速冷却技法によって室温まで冷却して、ケイ酸カルシウム粉末を得る、
各工程を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記粉砕工程が、
（ｉ）前記塑性を増すための材料を含有する前記ケイ酸カルシウム粉末をアルコールと混合し、
（ｉｉ）前記粉末をボールミル粉砕機で０．５〜３日間に亘り粉砕し、
（ｉｉｉ）前記粉末を−４０〜６０℃で乾燥させる、
各工程を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記粉末の水またはリン酸溶液に対する比が、１ｇ／０．３〜２ｍｌであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記粉末の水またはリン酸溶液に対する比が、１ｇ／０．４〜０．８ｍｌであることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記リン酸溶液が、リン酸イオン（ＰＯ43-）、リン酸水素イオン（ＨＰＯ42-）またはリン酸二水素イオン（Ｈ2ＰＯ4-）から選択される陰イオンを含有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記リン酸溶液が、アンモニウム、またはＩＡ族の元素から選択される陽イオンを含有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１６】
前記陰イオンの濃度が０．１２〜５Ｍであることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
ポリマーを含有するリン酸カルシウム骨用セメントのための組成物であって、
（ａ）カルシウム塩、
（ｂ）ケイ素化合物、
（ｃ）塑性を増すための材料、および
（ｄ）薬理学的に許容される溶液、
を含み、
前記塑性を増すための材料が、官能基−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＯまたは−ＣＨ3を有するポリマーおよびオリゴマー材料からなる群より選択されることを特徴とする組成物。
【請求項１８】
前記薬理学的に許容される溶液が、水、塩化ナトリウム溶液、塩化カルシウム溶液またはリン酸溶液であることを特徴とする請求項１７記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨用セメント、特に、ポリマーおよび／またはオリゴマーを含有するケイ酸カルシウム系の骨用セメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
骨形成の初期段階における重要な微量元素であるケイ素（Ｓｉ）は、比較的低いカルシウム濃度ではカルシウムと共に正比例で増加し、次いで、ハイドロキシアパタイトに近づく組成で検出限界を下回る（非特許文献１）。可溶性形態のケイ素は、ヒト骨芽細胞様細胞における骨芽細胞分化およびＩ型コラーゲンの合成を刺激する（非特許文献２）。ケイ酸塩系材料は、前頭洞と脊椎の再構成、頭蓋骨格欠損と骨粗鬆症に対する増補、歯内治療学、および歯周骨欠損の修復への使用に期待されている。ＣａＳｉＯ3などのケイ酸カルシウム系セラミック（非特許文献３および４）、生体活性ガラス（非特許文献５）、およびミネラルトリオキサイドアグリゲート（ＭＴＡ）（非特許文献６）は、生体活性が優れているので、整形外科および歯科外科における骨欠損の修復のための良好な生体活性材料であった。
【０００３】
ゾルゲル由来のケイ酸カルシウム材料が、張出し台(bulk)または足場(scaffold)に使用するために研究されてきた。Izquierdo-Barba等は、ゾルゲル法によって８０％のＳｉＯ2／２０％のＣａＯ（モル％）の組成を有する生体活性ガラスを合成した（非特許文献７）。同じ研究グループが、擬似体液中に浸したときに、ＳｉＯ2が少ない（５０〜７０モル％）ＳｉＯ2−ＣａＯガラスについてのアパタイトの形成率が、ＳｉＯ2が多い（８０〜９０モル％）ガラスよりも高いことを発見した（非特許文献８）。
【０００４】
自己硬化性セメントは、外科医によってペースト形態で取り扱われ、骨の空洞や欠損部中に注入することができる。そのセメントは硬化して、鉱物基質を形成する。硬化時間は、臨床上最も重要な要因の１つである。硬化時間が長くなると、セメントは、この期間中に形状を維持し、応力を支えることができないので、臨床問題が生じ得る（非特許文献９）。粉末の粒径、焼結温度、液相、および組成、並びに粉末に対する液体の比率が、ペースト材料の硬化時間に重大な役割を果たす。一方で、材料が生きている骨に結合するための必要条件は、骨本体の表面上の、生体活性の指標である「骨状」アパタイト層の形成（生きている組織との化学結合を形成する能力）である。このセメントは、生理溶液に曝露されたときに、セメント表面上の「骨状」ＨＡ層の沈着を促進させなければならない。このことは、生きている組織と一体化する能力を支援するであろう。
【０００５】
ゾルゲル由来のケイ酸カルシウムセメントに関して、Changと共同研究者等は、ゾルゲル法を用いて、ケイ酸二カルシウム粉末およびケイ酸三カルシウム粉末を調製した。ケイ酸二カルシウム粉末について、その粉末を水と混合して、１時間より長い初期硬化時間でケイ酸カルシウムセメントを製造することができるが、その上にアパタイトが沈着するには擬似体液中で数日かかった（非特許文献１０および１１）。ごく最近、本出願人等は、固相としてのゾルゲル由来のケイ酸カルシウム粉末および液相としてのリン酸アンモニウム溶液からなるケイ酸カルシウムセメントの調製を提案した。得られたセメントは、９分以内の速い硬化性、並びに高い生体活性を示しただけでなく、細胞増殖と分化も向上させた（非特許文献１２）。しかしながら、要求される部位に供給することが難しい可能性があり、セラミック系セメントの脆性抵抗が比較的不十分であるために適切に緻密化することが難しい。キトサン、アルギン酸塩、およびゼラチンなどの高分子材料には、その固有の弾性のために、ケイ酸カルシウムセメントの取扱適性を改善する可能性があるはずである。
【０００６】
骨と歯は、有機基質（コラーゲン）および鉱物相（ハイドロキシアパタイト）から主になる複合材料である。骨置換材料の設計をうまくいかせるには、骨の構造を正しく理解する必要がある。それゆえ、良好な生体適合性、高い生体活性および卓越した結合特性を有することに加え、天然の骨の形態学と性質に似た、生体ポリマーとケイ酸カルシウムからなるハイブリッド複合体を使用することが、機械的性質を低下させずにセラミックの脆性の問題を解決する１つの方法であろう。
【０００７】
キトサンは、天然のキチンの脱アセチル化により得られる豊富にある天然に生じる多糖類であり、セルロースのグルコース残基のＣ２位置に遊離アミノ基を有する、多糖類の一種である（非特許文献１３）。その数多くの望ましい性質、例えば、低コスト、無抗原性、化学的不活性、低い毒性、高い親水性、および膜形成特性のために（非特許文献１４および１５）、キトサンは、ミクロスフェア、膜、および足場などの生物医学用途にとって当然選ばれるようになってきた。Liuと同僚等は、キトサン、クエン酸および液相としてのグルコース溶液、並びに固相としてのリン酸三カルシウムからなる注射可能な骨置換材料を開発した（非特許文献１６）。この材料は、混合後のペースト粘稠度のために、成形可能であった。Yokoyama等は、チューインガム状の粘稠度のために、任意の所望の形状に成形できるキトサン含有リン酸カルシウムセメントを開発した（非特許文献１７）。XuおよびSimon等は、新規の移植片の骨芽細胞株および酵素アッセイとの生体適合性を試験するために、キトサンおよび水溶性マンニトールを含ませることによって、強力でマクロ孔質のＣＰＣ足場を開発した（非特許文献１８）。
【０００８】
ゼラチンは天然高分子であり、これは、コラーゲンの熱変性または物理化学的分解によりウシの骨から得られる。ゼラチンは、生体適合性、生分解性および非毒性のために、ヒト組織工学または薬物担体の分野における足場材料として広く用いられてきた（非特許文献１９および２０）。ゼラチンの利点は、異なる電荷での使用性および化学修飾の容易さである。Fujishiroと共同研究者等は、ゼラチンゲルをα−リン酸三カルシウムに付加すると、ゼラチンゲルの含有量を増加させることによりその細孔径が増加した、直径が２０〜１００μｍの細孔を有する多孔質固体が形成されることを発見した（非特許文献２１）。α−リン酸三カルシウムの圧縮強度は、ゼラチンゲルの含有量を５質量％まで増加させることにより、１週間後に９．０から１４．１ＭＰａまで増加し、その後減少した。キトサン繊維およびゼラチンの使用は、ＣＰＣの機械的性質を補強するためである（非特許文献２２）。５％の質量分画のゼラチンおよび３０％の体積分画のキトサン繊維が、この補強態様にとって最適である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Carlisle EM, Silicon: a possible factor in bone calcification. Science 1970;167:279-280
【非特許文献２】Reffitt DM, Ogston N, Jygdaohsingh R. Orthosilicic acid stimulates collagen type I synthesis and osteoblastic differentiation in human osteoblast-like cells in vitro. Bone 2003;32:127-135.
【非特許文献３】Siriphannon P, Kameshima Y, Yasumori A, Okada K, Hayashi S. Influence of preparation conditions on the microstructure and bioactivity of α-CaSiO3 ceramics: formation of hydroxyapatite in simulated body fluid. J Biomed Mater Res 2000;52:30-39
【非特許文献４】Sarmento C, Luklinska ZB, Brown L, Anseau M, De Aza PN, De Aza S. In vitro behavior of osteoblastic cells cultured in the presence of pseudowollastonite ceramic. J Biomed Mater Res 2004;69A:351-358.
【非特許文献５】Saravanapavan P, Jones JR, Pryce RS, Hench LL. Bioactivity of gel-glass powders in the CaO-SiO2 system: A comparison with ternary (CaO-P2O5-SiO2) and quaternary glasses (SiO2-CaO-P2O5-Na2O). J Biomed Mater Res 2003;66A:110-119.
【非特許文献６】Ribeiro DA, Duarte MAH, Matsumoto MA, Marques MEA, Salvadori DMF. Biocompatibility in vitro tests of mineral trioxide aggregate and regular and white Portland cements. J Endod 2005;31:605-607.
【非特許文献７】Izquierdo-Barba I, Salinas AJ, Vallet-Regi M. In vitro calcium phosphate layer formation on sol-gel glasses of the CaO-SiO2 system. J Biomed Mater Res 1999;47:243-250.
【非特許文献８】Martinez A, Izquierdo-Barba I, Vallet-Regi M. Bioactivity of a CaO-SiO2 binary glasses system. Chem Mater 2000;12:3080-3088.
【非特許文献９】Ishikawa K, Miyamoto Y, Takechi M, Toh T, Kon M, Nagayama M, Asaoka K. Non-decay type fast-setting calcium phosphate cement:hydroxyapatite putty containing an increased amount of sodium alginate. J Biomed Mater Res 1997;36:393-399.
【非特許文献１０】Zhao W, Wang J, Zhai W, Wang Z, Chang J. The self-setting properties and in vitro bioactivity of tricalcium silicate. Biomaterials 2005;26:6113-6121
【非特許文献１１】Gou Z, Chang J, Zhai W, Wang J. Study on the self-setting property and the in vitro bioactivity of β-Ca2SiO4. J Biomed Mater Res 2005;73B:244-251.
【非特許文献１２】Ding SJ, Shie MY, Wang CY. Novel fast-setting calcium silicate bone cements with high bioactivity and enhanced osteogenesis in vitro. J Mater Chem. DOI: 10.1039/B819033J, 2009, in press
【非特許文献１３】Francis Suh JK, Matthew HWT. Application of chitosan-based polysaccharide biomaterials in cartilage tissue engineering: a review. Biomaterials 2000;21:2589-2598.
【非特許文献１４】Denkbas EB, Odabasi M. Chitosan microspheres and sponges: preparation and characterization. J Appl Polym Sci 2000;76:1637-1643
【非特許文献１５】VandeVord PJ, Matthew HWT, DeSilva SP, Mayton L, Wu B, Wooley PH. Evaluation of the biocompatibility of a chitosan scaffold in mice. J Biomed Mater Res 2002;59:585-590.
【非特許文献１６】Liu H, Li H, Cheng W, Yang Y, Zhu M, Zhou C. Novel injectable calcium phosphate/chitosan composites for bone substitute materials. Acta Biomater 2006;2:557-565.
【非特許文献１７】Yokoyama A, Yamamoto S, Kawasaki T, Kohgo T, Nakasu M. Development of calcium phosphate cement using chitosan and citric acid for bone substitute materials. Biomaterials 2002;23:1091-1101.
【非特許文献１８】Hockin H.K. Xu, Carl G. Simon Jr. Fast setting calcium phosphate-chitosan scaffold: mechanical properties and biocompatibility. Biomaterials 2005;26:1337-1348.
【非特許文献１９】Olsen D, Yang C, Bodo M, Chang R, Leigh S, Baez J, Carmichael D, Peraelae M, Haemaelaeinen ER, Jarvinen M, Polarek J. Recombinant collagen and gelatin for drug delivery. Adv Drug Delivery Rev 2003;55:1547-1567
【非特許文献２０】Tabata Y, Hong L, Miyamoto S, Miyao M, Hashimoto N, Ikada Y. Bone formation at a rabbit skull defect by autologous bone marrow cells combined with gelatin microspheres containing TGF-β1. J Biomater Sci Polym Edn 2000;11:891-901.
【非特許文献２１】Fujishiro Y, Takahashi K, Sato T. Preparation and compressive strength of α-tricalcium phosphate/gelatin gel composite cement. J Biomed Mater Res 2001;54:525-530.
【非特許文献２２】Pan Z, Jiang P, Fan Q, Ma B, Cai H. Mechanical and biocompatible influences of chitosan fiber and gelatin on calcium phosphate cement. J Biomed Mater Res 2007;82B:246-252.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、機械的性質を減少させずに、セラミックの脆性の問題を解決する、ケイ酸カルシウム系骨用セメントのための組成物およびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ケイ酸カルシウム系骨用セメントを製造する方法であって、（ａ）カルシウム塩をケイ素化合物と混合し；（ｂ）工程（ａ）の混合物をゾルゲル法で処理し；（ｃ）工程（ｂ）の混合物を加熱し；（ｄ）工程（ｃ）の混合物に、塑性を増すための材料を添加し；（ｅ）工程（ｄ）の混合物を粉末に粉砕し；（ｆ）塑性を増すための材料と共にまたはこの材料はなく、粉末を水またはリン酸溶液に添加する各工程を有してなり、塑性を増すための材料が、官能基−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＯまたは−ＣＨ3を有するポリマーおよびオリゴマー材料からなる群より選択される方法を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、（ａ）カルシウム塩、（ｂ）ケイ素化合物、（ｃ）塑性を増すための材料、および（ｄ）薬理学的に許容される溶液を含むポリマー含有リン酸カルシウム骨用セメントのための組成物であって、塑性を増すための材料が、官能基−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＯまたは−ＣＨ3を有するポリマーおよびオリゴマー材料からなる群より選択される組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
実施例により与えられ、本発明をここに記載された実施の形態に限定することを意図したものではない以下の詳細な説明は、添付の図面と併せると最もよく理解されるであろう。
【図１−１】異なる温度での焼結後の（Ａ）Ｓ６０Ｃ４０粉末および（Ｂ）Ｓ５０Ｃ５０粉末に関するＸＲＤパターン
【図１−２】異なる温度での焼結後の（Ｃ）Ｓ４０Ｃ６０粉末および（Ｄ）Ｓ３０Ｃ７０粉末に関するＸＲＤパターン
【図２】粉末が８００℃での焼結により調製され、液相が水であった、５種類のセメントに関するＸＲＤパターン
【図３】（Ａ）ゼラチンまたは（Ｂ）キトサンを含有する５種類のケイ酸カルシウム系セメントに関するＸＲＤパターン
【図４】異なる量のゼラチン（ＧＬＴ）を含有する５種類のケイ酸カルシウム系セメントのＤＴＳ値を示すグラフ。セメント試験体を調製するために、液相として水および５質量％のキトサン（ＣＴＳ）溶液を用いた
【図５】５質量％のゼラチン（ＧＬＴ）を含むものと含まない５種類のケイ酸カルシウム系セメントの硬化時間値を示すグラフ。セメント試験体を調製するために、液相として水および５質量％のキトサン（ＣＴＳ）溶液を用いた
【図６】５質量％のゼラチン（ＧＬＴ）を含むものと含まないＳ５０Ｃ５０セメントの注射可能性を示すグラフ。セメント試験体を調製するために、液相として水および５質量％のキトサン（ＣＴＳ）溶液を用いた
【図７−１】所定の期間に亘る擬似体液中への浸漬の前後の、５質量％のゼラチン（ＧＬＴ）を含むものと含まない（Ａ）Ｓ６０Ｃ４０および（Ｂ）Ｓ５０Ｃ５０セメント試験体のＤＴＳ値を示すグラフ。セメント試験体を調製するために、液相として水および５質量％のキトサン（ＣＴＳ）溶液を用いた
【図７−２】所定の期間に亘る擬似体液中への浸漬の前後の、５質量％のゼラチン（ＧＬＴ）を含むものと含まない（Ｃ）Ｓ４０Ｃ６０および（Ｄ）Ｓ３０Ｃ７０セメント試験体のＤＴＳ値を示すグラフ。セメント試験体を調製するために、液相として水および５質量％のキトサン（ＣＴＳ）溶液を用いた
【図８】擬似体液中の１日間の浸漬後の（Ａ）Ｓ６０Ｃ４０、（Ｂ）Ｓ５０Ｃ５０、（Ｃ）Ｓ４０Ｃ６０および（Ｄ）Ｓ３０Ｃ７０セメント試験体の表面ＳＥＭ顕微鏡写真。セメント試験体を調製するために、液相として水を用いた
【図９】１時間に亘る擬似体液中への浸漬後の、（Ａ）硬化済みＳ５０Ｃ５０セメント試験体、その（Ｂ）ゼラチンを含むもの、（Ｃ）キトサンを含むもの、および（Ｄ）ゼラチンとキトサンを含むものの表面ＳＥＭ顕微鏡写真。セメント試験体を調製するために、液相として水および５質量％のキトサン（ＣＴＳ）溶液を用いた。矢印は、アパタイトの沈着を示す
【図１０】様々な培養期間での５質量％のゼラチン（ＧＬＴ）を含むものと含まないＳ５０Ｃ５０セメント上で培養されたヒト間葉幹細胞の付着と増殖に関するＷＳＴ−１アッセイを示すグラフ。セメント試験体を調製するために、液相として水および５質量％のキトサン（ＣＴＳ）溶液を用いた
【図１１】１日間の（Ａ）硬化済みＳ５０Ｃ５０セメント試験体、その（Ｂ）ゼラチンを含むもの、（Ｃ）キトサンを含むもの、および（Ｄ）ゼラチンとキトサンを含むものの上で培養されたヒト間葉幹細胞のＳＥＭ顕微鏡写真。セメント試験体を調製するために、液相として水および５質量％のキトサン（ＣＴＳ）溶液を用いた
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、ケイ酸カルシウム系骨用セメントを製造する方法であって、
（ａ）カルシウム塩をケイ素化合物と混合し；
（ｂ）工程（ａ）の混合物をゾルゲル法で処理し；
（ｃ）工程（ｂ）の混合物を加熱し；
（ｄ）工程（ｃ）の混合物に、塑性を増すための材料を添加し；
（ｅ）工程（ｄ）の混合物を粉末に粉砕し；
（ｆ）塑性を増すための材料のと共にまたはこの材料はなく、粉末を水またはリン酸溶液に添加する、
各工程を有してなる方法を提供する。
【００１５】
好ましい実施の形態において、塑性を増すための材料は、官能基−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＯまたは−ＣＨ3を有するポリマーおよびオリゴマー材料からなる群より選択される。
【００１６】
好ましい実施の形態において、ポリマーおよびオリゴマー材料は、ゼラチン、コラーゲン、キトサン、キチン、セルロース、アルギン酸塩、ヒアルロン酸、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、およびポリ（乳酸−グリコール酸）からなる群より選択される。固相または液相としての塑性を増すための材料は、１から５０質量％の範囲の量である。塑性を増すための材料の量は、２〜３０質量％であることが好ましい。
【００１７】
好ましい実施の形態において、カルシウム塩は硝酸カルシウムであり、ケイ素化合物は、以下の化学式：
【化１】
2011045473.tif 000002
【００１８】
を有する前記方法によるケイ水素化物であり、ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3またはＲ4はＣ1-6アルキルである。
【００１９】
より好ましい実施の形態において、本発明の方法のケイ水素化物は、以下の化学式：
【化２】
2011045473.tif 000003
【００２０】
を有し、ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3またはＲ4はＣ2Ｈ5である。
【００２１】
好ましい実施の形態において、前記混合物は、１０から０．１までの範囲の、カルシウムのケイ素に対するモル比を有する。より好ましい実施の形態において、その混合物は、４から０．２５までの範囲のカルシウムのケイ素に対するモル比を有する。
【００２２】
前記方法のゾルゲル法は、
（ａ）カルシウム前駆体とケイ素前駆体の混合物を、エタノールおよび硝酸からなる群より選択される希釈溶媒と１〜１２時間に亘り混合し、
（ｂ）１〜７日間に亘りこの混合物を２０〜１００℃の温度に配置し、
（ｃ）この混合物を−４０〜１５０℃で乾燥させる、
各工程を含む。
【００２３】
この方法の加熱工程は、
（ａ）乾燥させた混合物を１〜４０℃／分の速度で７００〜１３００℃に加熱し、
（ｂ）その混合物を７００〜１３００℃の定温範囲に維持し、
（ｃ）その混合物を、空冷、水冷または高速冷却技法によって室温まで冷却して、ケイ酸カルシウム粉末を得る、
各工程を含む。
【００２４】
添加工程は、
（ａ）塑性を増すための材料をケイ酸カルシウム粉末に添加し、
（ｂ）状態調節ミキサを用いて、この粉末を５〜３０分間に亘り混合する、
各工程を含む。
【００２５】
粉砕工程は、
（ａ）塑性を増すための材料を含有するケイ酸カルシウム粉末をアルコールと混合し、
（ｂ）粉末をボールミル粉砕機で０．５〜３日間に亘り粉砕し、
（ｃ）粉末を−４０〜６０℃で乾燥させる、
各工程を含む。
【００２６】
好ましい実施の形態において、粉末の粒径は０．０１から５０マイクロメートルに及ぶ。
【００２７】
好ましい実施の形態において、粉末は１０〜６０秒間で水に加えられ、水に対する粉末の比は、１ｇ／０．３〜２ｍｌである。より好ましい実施の形態において、水に対する粉末の比は、１ｇ／０．４〜０．８ｍｌである。
【００２８】
好ましい実施の形態において、粉末は１０〜６０秒間でリン酸溶液に加えられ、リン酸溶液に対する粉末の比は、１ｇ／０．３〜２ｍｌである。最良の実施の形態において、リン酸溶液に対する粉末の比は、１ｇ／０．４〜０．８ｍｌである。
【００２９】
好ましい実施の形態において、リン酸溶液は、０．１２〜５モル濃度で、リン酸イオン（ＰＯ43-）、リン酸水素イオン（ＨＰＯ42-）またはリン酸二水素イオン（Ｈ2ＰＯ4-）から選択される陰イオンを含有し、またリン酸溶液は、アンモニウム、またはＩＡ族の元素から選択される陽イオンを含有する。
【００３０】
リン酸溶液の陽イオンは、アンモニウム、ナトリウムまたはカリウムであることが好ましい。
【００３１】
本発明はさらに、ポリマー含有リン酸カルシウム骨用セメントのための組成物であって、
（ａ）カルシウム塩、
（ｂ）ケイ素化合物、
（ｃ）塑性を増すための材料、および
（ｄ）薬理学的に許容される溶液、
を含み、
塑性を増すための材料が、官能基−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＯまたは−ＣＨ3を有するポリマーおよびオリゴマー材料からなる群より選択される組成物を提供する。
【００３２】
薬理学的に許容される溶液は、水、塩化ナトリウム溶液、塩化カルシウム溶液またはリン酸溶液である。
【００３３】
さらに、この組成物は、整形外科手術、脊椎固定手術または歯科用途に適用できる。この組成物は、骨や歯の置換材料としての働きをすることもできる。ヒトに適用する場合、この組成物は、経口投与のための賦形剤をさらに含んで差し支えない。
【実施例】
【００３４】
以下の実施例は、非限定的であり、本発明の様々な態様および特徴を単に表すものである。
【００３５】
実施例１
ケイ酸カルシウム粉末の相組成
オルトケイ酸テトラエチル（Ｓｉ（ＯＣ2Ｈ5）4、ＴＥＯＳ）および硝酸カルシウム（Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ）を、それぞれ、ＳｉＯ2およびＣａＯの前駆体として用い、硝酸を触媒として用いた。エタノールを溶媒として用いた。ＳｉＯ2／ＣａＯのモル比は、表１に列記されているように、７／３から３／７の範囲にある。ゾルゲル法によって、様々なケイ酸カルシウム粉末を合成した。加水分解および熟成などのゾルゲル経路の一般手法を採用した。手短に、ＴＥＯＳを、１時間に亘り、２ＮのＨＮＯ3および無水エタノールを別々に撹拌しながら連続して添加して、加水分解した。必要量のＣａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏを上記エタノール溶液に添加し、この混合溶液をさらに１時間に亘り撹拌した。（ＨＮＯ3＋Ｈ2Ｏ）：ＴＥＯＳ：エタノールのモル比は、１０：１：１０であった。ゾル溶液を封止し、１日間に亘り６０℃で熟成させた。
【００３６】
１２０℃のオーブン内で上述した混合溶液の溶媒を蒸発させた後、乾燥したままのゲルを空気中で７００、８００、９００、または１０００℃まで加熱し２時間保持し、次いで、室温まで冷却して、様々なケイ酸カルシウム粉末を生成した。１°／分の走査速度にて、３０ｋＶおよび３０ｍＡで動作するＮｉフィルタを通したＣｕＫα線を用いた島津製作所製のＸＤ−Ｄ１  Ｘ線回折装置（ＸＲＤ）を用いて、位相解析を行った。異なる焼結温度で様々な調製したままの粉末のＸＲＤスペクトルが図１に示されている。２θで２９°と３５°の間の回折最大値は、ウォラストナイトおよびケイ酸二カルシウムなどのケイ酸カルシウムの異なる結晶相によると考えられる。粉末の結晶化度は、焼結温度の上昇と共に増加する。
【表１】
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【００３７】
実施例２
セメントの硬化時間および直径引張強度への焼結温度の影響
オルトケイ酸テトラエチル（Ｓｉ（ＯＣ2Ｈ5）4、ＴＥＯＳ）および硝酸カルシウム（Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ）を、それぞれ、ＳｉＯ2およびＣａＯの前駆体として用い、硝酸を触媒として用いた。エタノールを溶媒として用いた。Ｓ７０Ｃ３０、Ｓ６０Ｃ４０、Ｓ５０Ｃ５０、Ｓ４０Ｃ６０、およびＳ３０Ｃ７０粉末を、ゾルゲル法により合成し、２時間に亘り８００℃、９００℃、または１０００℃の異なる温度で焼結した。その後、焼結したままの粉末を、レッチェ社(Retsch)製の遠心ボールミルＳ１００により、１２時間に亘って、エタノール媒質中に瑪瑙粉砕媒体を含んだ瑪瑙ジャーを用いて、ボールミル粉砕した。乾燥後、セメントを調製するために、０．２ｇの粉末を０．１ｍｌの水または０．５ＭのＮａ2ＨＰＯ4と混合した。水系セメントに関する国際規格ＩＳＯ  ９９１７−１（ＩＳＯ  ９９１７−１、歯科−水系セメント−第1部：粉液（タイプ）酸塩基（反応型）セメント、国際標準化機構、２００３）にしたがって、１ｍｍの直径を有する４００ｇのギルモア針を用いて、セメントの硬化時間をテストした。３カ所の別個の区域において針が深さ１ｍｍの圧痕を形成できなかったときに、硬化時間を記録した。混合後、セメント試料を円筒状のステンレス鋼製金型内に入れて、６ｍｍ（直径）×３ｍｍ（高さ）の寸法の試験体を形成し、これを１日間に亘り１００％の相対湿度および３７℃で恒温器内に貯蔵した。各群から８個の試験体をテストした。セメント試験体の直径引張テストを、０．５ｍｍ／分の荷重速度でＥＺ−Ｔｅｓｔ試験機（島津製作所、日本国京都府所在）を用いて行った。セメント試験体の直径引張強度（ＤＴＳ）値は、関係式ＤＴＳ＝２Ｐ／πｂｗから計算した。ここで、Ｐはピーク荷重（ニュートン）であり、ｂおよびｗは、それぞれ、試験体の直径（ｍｍ）および厚さ（ｍｍ）である。破損時の最大圧縮荷重は、記録した荷重−たわみ曲線から得た。各群で、少なくとも２０個の試験体を用いた。表１は、５種類のケイ酸カルシウムセメント試験体の硬化時間およびＤＴＳ値の結果を示している。水と混合した場合、硬化時間は、使用したケイ酸カルシウム粉末に有意に応じて、４３分から１１分に及んだ。カルシウム成分の濃度が増加すると、セメントの硬化時間は短くなった。６：４から４：６に及ぶＳｉＯ2／ＣａＯモル比を有するセメント試験体は、他の２種類のセメント試験体よりも、強度が高かった。固相の調製に用いた焼結温度は、セメント試験体の硬化時間およびＤＴＳに直接影響しなかった。一方で、液相としての０．５ＭのＮａ2ＨＰＯ4は、水と同様の傾向を示した。
【００３８】
実施例３
水と混合した後のセメント試験体の相組成
オルトケイ酸テトラエチル（Ｓｉ（ＯＣ2Ｈ5）4、ＴＥＯＳ）および硝酸カルシウム（Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ）を、それぞれ、ＳｉＯ2およびＣａＯの前駆体として用い、硝酸を触媒として用いた。エタノールを溶媒として用いた。Ｓ７０Ｃ３０、Ｓ６０Ｃ４０、Ｓ５０Ｃ５０、Ｓ４０Ｃ６０、およびＳ３０Ｃ７０粉末を、ゾルゲル法により合成し、２時間に亘り８００℃で焼結し、次いで、レッチェ社(Retsch)製の遠心ボールミルＳ１００により、１２時間に亘って、エタノール媒質中に瑪瑙粉砕媒体を含んだ瑪瑙ジャーを用いて、ボールミル粉砕した。乾燥後、セメントを調製するために、０．４ｇの粉末を０．２ｍｌの水と混合した。このセメントを１日間に亘り１００％の相対湿度および３７℃で恒温器内に貯蔵した。Ｘ線回折計（ＸＲＤ）を用いて、固化済みセメント試験体の相組成を分析した。水和工程の生成物は、図２に示されるように、２９．３°でのケイ酸カルシウム水和物（ＣａＯ−ＳｉＯ2−Ｈ2Ｏ、Ｃ−Ｓ−Ｈ）並びに不完全に反応した無機成分相であった。
【００３９】
実施例４
前駆体の影響
表２に列記したようなＳｉＯ2およびＣａＯの異なる前駆体を用いた。ケイ素の前駆体は、オルトケイ酸テトラエチル（Ｓｉ（ＯＣ2Ｈ5）4、ＴＥＯＳ）、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）、および四酢酸ケイ素（Ｓｉ（ＣＨ3ＣＯＯ）4）であった。カルシウム前駆体は、硝酸カルシウム（Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ）、酸化カルシウム（ＣａＯ）、水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）2）、酢酸カルシウム（Ｃａ（ＣＨ3ＣＯＯ）2）、および塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）であった。それぞれ、触媒および溶媒として、硝酸およびエタノールを用いた。等モルのＳｉ／Ｃａ比（Ｓ５０Ｃ５０）を有するケイ酸カルシウム粉末をゾルゲル法により合成した。加水分解および熟成などのゾルゲル経路の一般手法を採用した。６０℃での熟成と１２０℃でのオーブン内の溶媒蒸発の後、乾燥させたままのゲルを空気中で９００℃に加熱して２時間保持し、次いで、室温まで冷却して、様々なケイ酸カルシウム粉末を生成した。焼結した粉末を、レッチェ社製の遠心ボールミルＳ１００により、１２時間に亘って、エタノール媒質中に瑪瑙粉砕媒体を含んだ瑪瑙ジャーを用いて、さらにボールミル粉砕した。乾燥後、セメントを調製するために、粉末を（ＮＨ4）2ＨＰＯ4−ＮＨ4Ｈ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ７．４）と混合した。セメントの硬化時間は、水系セメントに関して、国際基準ＩＳＯ  ９９１７−１にしたがって１ｍｍの直径を有する４００ｇのギルモア針を用いてテストした。さらに、セメント試料を円筒状のステンレス鋼製金型内に入れて、６ｍｍ（直径）×３ｍｍ（高さ）の寸法の試験体を形成し、これを１日間に亘り１００％の相対湿度および３７℃で恒温器内に貯蔵した。セメント試験体の直径引張テストを、０．５ｍｍ／分の荷重速度でＥＺ−Ｔｅｓｔ試験機（島津製作所、日本国京都府所在）を用いて行った。各群から１０個の試験体をテストした。表２は、セメント試験体の硬化時間およびＤＴＳ値の結果を示している。硬化時間およびＤＴＳ値は、前駆体の種類にかなり左右された。
【表２】
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【００４０】
実施例５
ゼラチンおよびキトサンを含有するセメント試験体の相組成
ゾルゲル由来のＳ７０Ｃ３０、Ｓ６０Ｃ４０、Ｓ５０Ｃ５０、Ｓ４０Ｃ６０、およびＳ３０Ｃ７０粉末を２時間に亘り８００℃で焼結した。５質量％のゼラチンを焼結粉末に加えた。次いで、ゼラチンを含む混合物と含まないものを、レッチェ社製の遠心ボールミルＳ１００により、１２時間に亘って、エタノール媒質中に瑪瑙粉砕媒体を含んだ瑪瑙ジャーを用いて、ボールミル粉砕した。乾燥後、セメントを調製するために、０．２ｇの粉末を０．１ｍｌの水または５質量％のキトサン溶液と混合した。キトサンオリゴ糖乳酸塩粉末を、キトサン／（キトサン＋水）＝５％の質量分率で蒸留水中に溶解させて、キトサン溶液を調製した。混合後、試験体を１日間に亘り１００％の相対湿度および３７℃で恒温器内に貯蔵した。ＸＲＤを用いて、硬化済みセメント試験体の相組成を分析した。水和工程の生成物は、図３に示されるように、ケイ酸カルシウム水和物ケイ酸カルシウム水和物（ＣａＯ−ＳｉＯ2−Ｈ2Ｏ、Ｃ−Ｓ−Ｈ）ゲルであった。セメント試験体中にキトサンが存在したために、Ｃ−Ｓ−Ｈのピーク強度が減少した（図３Ｂ）。
【００４１】
実施例６
セメントの直径引張強度および硬化時間へのゼラチンおよびキトサンの含有量の影響
ゾルゲル由来のＳ７０Ｃ３０、Ｓ６０Ｃ４０、Ｓ５０Ｃ５０、Ｓ４０Ｃ６０、およびＳ３０Ｃ７０粉末を２時間に亘り８００℃で焼結した。５および１０質量％のゼラチン（ＧＬＴ）を焼結粉末に加えた。次いで、ゼラチンを含む混合物と含まないものを、レッチェ社製の遠心ボールミルＳ１００により、１２時間に亘って、エタノール媒質中に瑪瑙粉砕媒体を含んだ瑪瑙ジャーを用いて、ボールミル粉砕した。乾燥後、セメントを調製するために、０．２ｇの粉末を０．１ｍｌの水またはキトサン（ＣＴＳ）溶液と混合した。キトサンオリゴ糖乳酸塩粉末を、キトサン／（キトサン＋水）＝５または１０％の質量分率で蒸留水中に溶解させて、キトサン溶液を調製した。セメントの硬化時間を、水系セメントに関して、国際基準ＩＳＯ  ９９１７−１にしたがって１ｍｍの直径を有する４００ｇのギルモア針を用いてテストした。３カ所の別個の区域において針が深さ１ｍｍの圧痕を形成できなかったときに、硬化時間を記録した。各群から８個の試験体をテストした。さらに、セメント試料を円筒状のステンレス鋼製金型内に入れて、６ｍｍ（直径）×３ｍｍ（高さ）の寸法の試験体を形成し、これを１日間に亘り１００％の相対湿度および３７℃で恒温器内に貯蔵した。セメント試験体の直径引張テストを、０．５ｍｍ／分の荷重速度でＥＺ−Ｔｅｓｔ試験機（島津製作所、日本国京都府所在）を用いて行った。各群において、少なくとも２０個の試験体を用いた。図４は、様々なセメント試験体の直径引張強度（ＤＴＳ）を示している。ゼラチンまたはキトサンの添加により、セメント試験体のＤＴＳが減少し得た。同様に、それらは、図５に示されるように、硬化時間にも影響を与えるようである。
【００４２】
実施例７
セメントの注射可能性
ゾルゲル由来のＳ５０Ｃ５０粉末を２時間に亘り８００℃で焼結した。５質量％のゼラチン（ＧＬＴ）を焼結粉末に加えた。次いで、ゼラチンを含む混合物と含まないものを、レッチェ社製の遠心ボールミルＳ１００により、１２時間に亘って、エタノール媒質中に瑪瑙粉砕媒体を含んだ瑪瑙ジャーを用いて、ボールミル粉砕した。乾燥後、セメントを調製するために、粉末を水または０．６ｍｌ／ｇの液対粉（Ｌ／Ｐ）比の５質量％のキトサン（ＣＴＳ）溶液と混合した。注射可能性は、ペーストを、２．０ｍｍの開口を有する針を備えた５ｍｌの使捨て注射器に通して押し出すことによって評価した。適量のセメントペーストを用い、「注射可能性」は、ペーストのこの量の、手作業でそのような注射器から押し出せた割合の質量パーセントを意味するものと解釈した。セメントペーストの注射可能性は、粉末と液体の混合を開始してから２分後に決定した。図６は、ゼラチンおよびキトサンを含むＳ５０Ｃ５０セメントと含まないものの注射可能性を示している。ゼラチンとキトサンの両方が、セメント試験体の注射可能性を改善できる。
【００４３】
実施例８
擬似体液中への浸漬後の様々なセメント試験体に関する直径引張強度および形態学
ゾルゲル由来のＳ６０Ｃ４０、Ｓ５０Ｃ５０、Ｓ４０Ｃ６０、およびＳ３０Ｃ７０粉末を２時間に亘り８００℃で焼結した。５質量％のゼラチン（ＧＬＴ）を焼結粉末に加えた。次いで、ゼラチンを含む混合物と含まないものを、レッチェ社製の遠心ボールミルＳ１００により、１２時間に亘って、エタノール媒質中に瑪瑙粉砕媒体を含んだ瑪瑙ジャーを用いて、ボールミル粉砕した。水または５質量％のキトサン（ＣＴＳ）溶液と混合した後、１日間に亘り１００％の相対湿度および３７℃で恒温器内に貯蔵した各固化済み試験体を、３７℃で所定の期間に亘り生理的溶液中に浸漬して、セメントの生体活性を評価した。イオン組成がヒトの血漿のものに似ている擬似体液（ＳＢＦ）を浸漬テストに用いた。ＳＢＦ溶液は、１０００ｍｌの蒸留Ｈ2Ｏ中の７．９９４９ｇのＮａＣｌ、０．３５２８ｇのＮａＨＣＯ3、０．２２３５ｇのＫＣｌ、０．１４７ｇのＫ2ＨＰＯ4、０．３０５ｇのＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．２７７５ｇのＣａＣｌ2、０．０７１ｇのＮａ2ＳＯ4からなり、塩化水素酸（ＨＣｌ）およびトリスヒドロキシメチルアミノメタン（（ＣＨ2ＯＨ）3ＣＮＨ2）によりｐＨ７．４に緩衝した。振盪水浴中の溶液は、毎日は変えなかった。異なる期間に亘るＳＢＦ中の浸漬後、試験体をバイアルから取り出し、ＥＺ−Ｔｅｓｔ試験機を用いて伸張テストを行った。各群から少なくとも１２個の試験体をテストした。ほとんどの浸漬済みセメント試験体のＤＴＳが、固化済みセメントよりも大きい値を有した（図７）。浸漬後、試験体をバイアルから取り出して、ＳＥＭを用いて形態学を観察した。図８および９は、セメント試験体が、アパタイトスフェルライトの形成を誘発し、これは生体活性を表すことを示している。
【００４４】
実施例９
細胞生死判別および形態学
セメントの生体適合性は、継代４でのＯｓｉｒｉｓ（ワージントン・バイオケミカル社(Worthington Biochemical)、ニュージャージー州、レイクウッド所在）から得たヒト骨髄由来の間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）との培養によって評価した。ゾルゲル由来のＳ５０Ｃ５０粉末を２時間に亘り８００℃で焼結した。５質量％のゼラチン（ＧＬＴ）を焼結粉末に加え、１２時間に亘り粉砕した。乾燥後、セメントを調製するために、粉末を水または０．５ｍｌ／ｇの液対粉（Ｌ／Ｐ）比の５質量％のキトサン（ＣＴＳ）溶液と混合した。セメント試験体を、１日間に亘り１００％の相対湿度および３７℃で恒温器内に貯蔵した。細胞培養のために、１日硬化させたセメントディスクを、７５％のエタノール中に浸漬し、２時間に亘り紫外線（ＵＶ）に曝露することによって、殺菌した。ｈＭＳＣ細胞を、２４ウェル・プレート内に５×１０3細胞／ウェルの密度で殺菌済みＳ５０Ｃ５０セメントに接種した。細胞は、１５％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、５８４ｍｇ／ｌのグルタミン、０．１ｍＭのＭＥＭピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｌのアスコルビン酸、０．１ｍＭのＭＥＭ非必須アミノ酸、および１００ｎＭのデキサメタゾン並びに１０ｍＭのβ−グリセロリン酸二ナトリウム塩水和物が補給されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）からなる骨形成誘発培地中で増殖させた。培養液は、異なる期間に亘り５％のＣＯ2雰囲気中３７℃で培養した。培地は３日毎に変えた。細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（ロッシュ・ダイアグノスティクス社(Roche Diagnostics)、独国、マンハイム所在）を用いて、細胞の付着と増殖を評価した。これは、生きている細胞のミトコンドリアデヒドロゲナーゼによるテトラゾリウム塩（ＷＳＴ−１）の開裂に基づく。手短に言えば、培養を終える３時間前に、各ウェルに１００μｌのＷＳＴ−１溶液（シグマ社(Sigma)）および９００μｌの培地を加えた。各ウェル内の２００μｌの溶液を９６ウェルの細胞培養プレートに移した。これらのプレートを、６５０ｎｍの参照波長で、４４０ｎｍでマイクロタイタ・プレート・リーダ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｌｕｓ（商標）マイクロプレート分光光度計）で読んだ。サンプルの分析結果は、４つの別々の実験から三重に得た。細胞培養プレート（ＴＣＰ）上で培養したｈＭＳＣを対照として用いた。図１０において、ＷＳＴ−１アッセイは、生存細胞数は培養期間の増加と共に増加し、良好な生体適合性を表すことを示している。キトサン含有セメント試験体は、キトサンを含まない試験体と比較して、良好な生体適合性を示す。セメント表面の細胞形態学は、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）により調査した。試験体をリン酸緩衝液で３回洗浄し、２時間に亘り４℃で２．５％のグルタルアルデヒドで定着させた。次いで、これらのセメントを、２０分間に亘りエタノール系列中において各濃度で脱水させ、一晩乾燥させた。乾燥した試験体をスタブに取り付け、金の層で被覆した。セメント表面の細胞形態学を、ＪＥＯＬ  ＪＳＭ−６７００Ｆ  ＳＥＭを用いて観察した。ＳＥＭ画像を評価して、細胞は、セメント表面上にしっかりと固定されたようであることを確認した（図１１）。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図１０】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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