(57)【要約】      （修正有）【課題】哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質の提供および該タンパク質を用いる魚類の成熟誘導方法の提供。【解決手段】哺乳類細胞を用いて魚類ＧＴＨタンパク質を発現させることにより、哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質を得た。この哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質は、生体内寿命が延長化された魚類体内において長期間の安定性を有する分解されにくいタンパク質であり、該タンパク質は魚類の成熟誘導が可能であった。該哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質を用い、魚類の成熟誘導を行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質。
【請求項２】
糖鎖結合部位を付加した魚類ＧＴＨを哺乳類細胞によって合成することにより得られる哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質。
【請求項３】
糖鎖結合部位を２つ以上付加した魚類ＧＴＨを合成することにより得られる請求項２に記載の哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質。
【請求項４】
糖鎖結合部位が配列表配列番号１あるいは２で示されるアミノ酸配列またはこれらのアミノ酸配列が保存的修飾された配列からなる部位である請求項１または２に記載の哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質。
【請求項５】
魚類ＧＴＨがウナギ由来のＧＴＨである請求項１〜４のいずれかに記載の哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質を用いる魚類の成熟誘導方法。
【請求項７】
請求項６に記載の魚類の成熟誘導方法によって成熟が誘導された魚類。
【請求項８】
請求項６に記載の魚類の成熟誘導方法によって成熟が誘導されたウナギ。
【請求項９】
請求項８に記載のウナギより得られる精子または卵。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚類ＧＴＨタンパク質および該タンパク質を用いる魚類の成熟誘導方法に関する。さらに詳しくは、哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質、および生体内寿命が延長化された該タンパク質を用いる魚類の成熟誘導方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
魚類の完全養殖のためには人工種苗の生産が不可欠である。しかし、飼育環境下では、ある一定の段階から生殖腺が発達しなくなる成熟停止が起こりやすい。魚種によって成熟停止の段階は異なるが、いずれにおいても、人為催熟を続けるには、成熟停止に至った段階で、外因性の成熟誘導ホルモン（例えば、生殖腺刺激ホルモン  Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ（以下、「ＧＴＨ」とする）等）を投与することが必須となる。
しかし、ＧＴＨは複雑な構造を持つ糖タンパク質ホルモンであるため化学合成が難しく、哺乳類のＧＴＨ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン、Ｈｕｍａｎ  ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ（以下、「ｈＣＧ」とする））や魚のＧＴＨを含む組織抽出物が代用品として用いられているのが現状である。
【０００３】
ウナギ等の卵原細胞から卵黄形成の初期の段階で成熟停止してしまう魚種においては、このような人為催熟によって完全養殖を行うことがかなり難しく、より有効な方法の提供が望まれていた。
そこで、近年、海水養殖池環境中において、養殖関係を構成する水流や温度などの要素を周期的に変動させることによって、外因性の成熟誘導ホルモンを投与することなく、ウナギ雌魚を催熟する方法が開発されている（例えば、特許文献１参照）。
また、ゼブラフィッシュ由来の細胞を用いて、魚類のホルモンを産生する細胞を作製し、この細胞を移植することで、ウナギ等の魚類の成熟を促進する方法が開発されている（例えば、特許文献２参照）。さらに、金魚やウナギ由来の遺伝子からＧＴＨを合成し、これを投与することでウナギの人為催熟を行う方法も検討されている（例えば、非特許文献１，２参照）。しかし、これらの方法においても、ウナギ等の人為催熟が困難な魚類においては、特に成熟誘導率が低い、卵質が不安定、仔魚の生残率が低い等、十分な結果が得られていない。
【０００４】
ヒト、ラット等の哺乳類のホルモン合成において、糖鎖結合部位を付加した各ホルモン遺伝子をチャイニーズハムスター等の哺乳類を由来とする細胞で合成することにより、哺乳類型糖鎖が付加された哺乳類ＧＴＨやエリスロポエチン等を合成する方法が行われている。そして、この方法によって得られたホルモンが、ヒト、ラット等において生体内寿命が延長化され、生物活性が高められたことが確認されている（非特許文献３〜６）。
近年、魚類においても、糖鎖結合部位を付加したＧＴＨ遺伝子をマイクロインジェクション法により導入することで、魚類の成熟を調節する方法や、これを昆虫細胞に発現させて得た昆虫型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨを魚類に導入することで、ウナギ等の人為催熟を行うことが検討されているが、十分な結果は得られておらず、有用な魚類の成熟誘導方法の提供が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−１５４４５９号公報
【特許文献２】特開２００８−５２８２０７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｈａｙａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９
【非特許文献２】Ｋａｚｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８
【非特許文献３】Ｄｅｖｒｏｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４
【非特許文献４】Ｆｕａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２
【非特許文献５】Ｆａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７
【非特許文献６】Ｌａｐｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、魚類ＧＴＨタンパク質の提供および該タンパク質を用いる魚類の成熟誘導方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、哺乳類細胞を用いて魚類ＧＴＨタンパク質を発現させることにより、哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質を得られることを見出した。この哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質は、生体内寿命が延長化された魚類体内において長期間の安定性を有する分解されにくいタンパク質であり、本発明者らはこのタンパク質を用いることによって魚類の成熟誘導が可能であることを見出し、本発明を完成方するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は次の（１）〜（９）の魚類ＧＴＨタンパク質、魚類の成熟誘導方法および成熟が誘導された魚類等に関する。
（１）哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質。
（２）糖鎖結合部位を付加した魚類ＧＴＨを哺乳類細胞によって合成することにより得られる哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質。
（３）糖鎖結合部位を２つ以上付加した魚類ＧＴＨを合成することにより得られる上記（２）に記載の哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質。
（４）糖鎖結合部位が配列表配列番号１あるいは２で示されるアミノ酸配列またはこれらのアミノ酸配列が保存的修飾された配列からなる部位である上記（１）または（２）に記載の哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質。
（５）魚類ＧＴＨがウナギ由来のＧＴＨである上記（１）〜（４）のいずれかに記載の哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質を用いる魚類の成熟誘導方法。
（７）上記（６）に記載の魚類の成熟誘導方法によって成熟が誘導された魚類。
（８）上記（６）に記載の魚類の成熟誘導方法によって成熟が誘導されたウナギ。
（９）上記（８）に記載のウナギより得られる精子または卵。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の魚類ＧＴＨタンパク質は、魚類における生体内寿命が延長化されていることから、安定して魚類の性成熟を誘導することができる。本発明の魚類の成熟誘導方法を用いることにより、ウナギ等の人為催熟が困難であった魚種についても、人工種苗が生産でき、完全養殖を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】組換えＧＴＨの発現を確認した図である（実施例１）。
【図２】精製組換えＧＴＨの糖鎖解析の結果を示した図である（実施例１）。
【図３】精子形成誘導ステロイド産生量を示した図である（実施例２）。
【図４】精巣の組織観察の結果を示した図である（実施例２）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の「哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質」とは、糖鎖結合部位を付加した魚類ＧＴＨを哺乳類細胞によって合成することにより得られる哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質のことをいい、哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質であればいずれのものも含まれる。
ここで、「ＧＴＨタンパク質」には、濾胞刺激ホルモン（Ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ；以下、「ＦＳＨ」とする）、黄体形成ホルモン（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ；以下、「ＬＨ」とする）が挙げられ、これらのホルモンを分泌する魚類であればいずれの魚類由来のＧＴＨタンパク質も含まれる。
また、「哺乳類型糖鎖」としては、哺乳類細胞がタンパク質合成を行う際に、タンパク質に付加する糖鎖であればいずれのものも含まれるが、例えば、マンノース、ガラクトース、Ｎ-アセチルグルコサミンおよびノイラミン酸で構成されるＮ型糖鎖、ガラクトース、Ｎ-アセチルグルコサミン、Ｎ-アセチルガラクトサミンおよびノイラミン酸で構成されるＯ型糖鎖等が挙げられる。
【００１３】
本発明の「哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質」は、糖鎖結合部位を付加した魚類ＧＴＨを哺乳類細胞によって合成することにより得られるものである。
「糖鎖結合部位を付加した魚類ＧＴＨ」とは、タンパク質合成の対象となる魚類ＧＴＨの塩基配列に、糖鎖結合部位の塩基配列を付加したもののことをいう。
「糖鎖結合部位」には、哺乳類細胞が糖鎖を結合し得る部位であればいずれのものも含まれるが、例えば、配列表配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＣａｒｂｏｘｙｌ-ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ  β（ヒト絨毛性生殖腺刺激ホルモンβサブユニットＣ-末端ペプチド、以下「ＣＴＰ」とする）（配列番号３にＣＴＰの塩基配列を示す）や、配列表配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＧｌｙｃｏｓｉｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ  ｐｏｌｙｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ニジマスポリシアロ糖タンパク質糖鎖結合部位）の糖鎖結合部位と推定された部分等が挙げられる。本発明においては、この配列表配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる糖鎖結合部位と推定された部分をＰＳＧＰとする。配列番号４にこのＰＳＧＰの塩基配列を示す。
本発明の「糖鎖結合部位」は、これらの配列表配列番号１または２に示されたアミノ酸配列のみならず、これらの保存的修飾されたアミノ酸配列によって示される、哺乳類細胞が糖鎖を結合し得る部位であってもよい。ここで「保存的修飾されたアミノ酸配列」とは、ＣＴＰまたはＰＳＧＰのアミノ酸配列において１個またはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列修飾を示し、かつ正常に哺乳類型糖鎖が付加されるアミノ酸配列のことをいう。
【００１４】
更に、本発明の「糖鎖結合部位を付加した魚類ＧＴＨ」には、タンパク質合成の対象となる魚類ＧＴＨの塩基配列に、上記の糖鎖結合部位の塩基配列を２種類付加したり、同じ糖鎖結合部位の塩基配列を２つ以上付加したりしたものも含まれる。
【００１５】
「哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質」を合成する「哺乳類細胞」は、「哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質」を合成し得る哺乳類細胞であればいずれの細胞も用いることができる。例えば、ヒト腎臓由来２９３細胞またはチャイニーズハムスター卵巣由来の細胞（ＣＨＯ）等が挙げられ、これらの細胞はさらに大量培養が可能であり好ましい。
【００１６】
哺乳類細胞による「哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質」の合成においては、従来知られているいずれのタンパク質合成方法も用いることができる。
例えば、「糖鎖結合部位を付加した魚類ＧＴＨ」を組み込んだベクターをリポソーマルまたはノンリポソーマルの市販のトランスフェクション試薬を用いる方法やＤＥＡＥ-デキストラン法やリン酸カルシウム沈降法等によって哺乳類細胞に導入し、この哺乳類細胞を培養することで「哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質」を合成する方法などが挙げられる。また、動物細胞のゲノム上に魚類ＧＴＨタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ哺乳類細胞（ステーブルセルライン）を作製し、この細胞によって恒常的に「哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質」を合成させる方法なども挙げられる。
この方法において使用するベクターとしては、哺乳類由来の株化細胞で発現するタンパク質発現ベクターであればいずれのものも用いることができるが、例えば、ｐＣＡＧＧＳベクター（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  １９９１）、ｐｃＤＮＡ６／Ｖ５-Ｈｉｓベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を用いることが好ましい。
【００１７】
本発明の「魚類の成熟誘導方法」は、魚類の性成熟を誘導する方法のことをいい、「哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質」を用いる方法であればいずれの方法も含まれる。本発明の「哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質」を、性成熟の対象とする魚類に投与することで、成熟誘導を行う方法等が挙げられる。
性成熟の対象となる魚種と、「哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質」におけるＧＴＨの由来となる魚種が同一である方が、成熟誘導の効率がよく好ましい。
【００１８】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが，本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１９】
＜哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質の産生＞
１．発現ベクターの構築
１−１：サンプル
愛知県水産試験場より譲渡された実験用の雌ニホンウナギを用いて、サケ脳下垂体抽出液をウナギの体重１ｋｇあたりサケ脳下垂体アセトン乾燥品２０ｍｇの割合で、週１回投与することにより、人為催熟を施した（参考文献１、参照）。人為催熟により成熟期に達したウナギおよび未処理の未熟なウナギから脳下垂体を摘出した。また、前卵黄形成期のニジマスより卵巣を摘出し同様にサンプルとした。
［参考文献１］  Ｏｈｔａ  Ｈ．，  Ｋａｇａｗａ  Ｈ．，  Ｔａｎａｋａ  Ｈ．，  Ｏｋｕｚａｗａ  Ｋ．，  Ｉｉｎｕｍａ  Ｎ．，  Ｈｉｒｏｓｅ  Ｋ．，  Ｆｉｓｈ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １７：１６３−１６９，１９９７
【００２０】
１−２：ＲＮＡの調整
未熟および成熟雌ウナギの脳下垂体、ニジマスの前卵黄形成期の卵巣から、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて全ＲＮＡをそれぞれ抽出した（参考文献２、参照）。
［参考文献２］  Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  Ｐ，  Ｓａｃｃｈｉ  Ｎ．，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １６２：１５６−１５９，１９８７
【００２１】
１−３：ｃＤＮＡライブラリーの作製
ウナギ脳下垂体およびニジマス卵巣から得られた全ＲＮＡから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて逆転写を行い、それぞれのｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【００２２】
１−４：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）によるｃＤＮＡの増幅および発現ベクターの構築
既に単離されている濾胞刺激ホルモンβサブユニット（以下、「ＦＳＨβ」とする：参考文献３、参照）をコードするｃＤＮＡ（配列表配列番号５）を未熟脳下垂体ｃＤＮＡから、黄体形成ホルモンβサブユニット（以下、「ＬＨβ」とする）をコードするｃＤＮＡ（配列表配列番号６）および糖タンパクホルモンαサブユニット（以下、「ＧＰＨα」とする：参考文献４、参照）をコードするｃＤＮＡ（配列表配列番号７）をそれぞれ成熟脳下垂体ｃＤＮＡから、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いたＰＣＲにより増幅した。またＰＣＲの際に、ＧＰＨαに関してはＣ末端に６つのヒスチヂンからなるタグ（Ｈｉｓタグ）を付加した。
【００２３】
増幅されたＦＳＨβをコードするｃＤＮＡまたはＬＨβｃＤＮＡをコードするｃＤＮＡと、ＧＰＨαをコードするｃＤＮＡとをそれぞれ混合して鋳型としたオーバーラッピングＰＣＲ（参考文献５、参照）により、ＦＳＨβをコードするｃＤＮＡまたはＬＨβｃＤＮＡをコードするｃＤＮＡの次にＧＰＨαをコードするｃＤＮＡとなる順番で連結した一本鎖キメラｃＤＮＡを増幅した。
即ち、オーバーラッピングＰＣＲによって、１）ＦＳＨβの配列より設計したフォワードプライマーと、これに連結したいＧｐＨαの上流部分の配列より選択したリバースプライマーを用いてＦＳＨβの最後にＧｐＨαの配列が少し含まれるｃＤＮＡを増幅し、２）ＧｐＨαの前に連結したいＦＳＨβの下流部分の配列より選択したフォワードプライマーと、ＧｐＨαの配列より設計したリバースプライマーを用いてＧｐＨαの最初にＦＳＨβの配列が少し含まれるｃＤＮＡを増幅し、３）これら２種のＰＣＲ産物を混合して、ＦＳＨβの配列のみ設計したフォワードプライマーとＧｐＨαの配列のみで設計リバースプライマーを用いてＰＣＲを行なうことにより、ＦＳＨβをコードするｃＤＮＡの次にＧＰＨαをコードするｃＤＮＡが連結した一本鎖キメラｃＤＮＡを得た。以下、同様に、ＬＨβｃＤＮＡをコードするｃＤＮＡの次にＧＰＨαをコードするｃＤＮＡが連結した一本鎖キメラｃＤＮＡを得た。
これを、それぞれｐＣＡＧＧＳベクター（参考文献６、参照、大阪大学大学院医学系研究科の宮崎純一先生より譲受）に挿入し、魚類ＧＴＨタンパク質を発現するための発現ベクターとした。
【００２４】
また市販のヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）からＣＴＰをコードするｃＤＮＡ断片（配列表配列番号３）を、ニジマス卵巣ｃＤＮＡからはＰＳＧＰ（参考文献７、参照（糖鎖結合部位））をコードするｃＤＮＡ断片（配列表配列番号４）を同様にＰＣＲにより増幅した。
得られたＣＴＰをコードするｃＤＮＡ断片またはＰＳＧＰをコードするｃＤＮＡ断片を、上述のＦＳＨβをコードするｃＤＮＡまたはＬＨβをコードするｃＤＮＡとＧＰＨαをコードするｃＤＮＡとをそれぞれ混合して鋳型としたオーバーラッピングＰＣＲにより、ＦＳＨβをコードするｃＤＮＡとＣＴＰあるいはＰＳＧＰをコードするｃＤＮＡの次にＧＰＨαをコードするｃＤＮＡ、またはＬＨβをコードするｃＤＮＡとＣＴＰあるいはＰＳＧＰをコードするｃＤＮＡの次にＧＰＨαをコードするｃＤＮＡとなる順番で連結した一本鎖キメラｃＤＮＡを増幅した。これを、それぞれｐＣＡＧＧＳベクターに挿入し、哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質を発現するための発現ベクターとした。
［参考文献３］
Ｙｏｓｈｉｕｒａ  Ｙ．，  Ｓｕｅｔａｋｅ  Ｈ．，  Ａｉｄａ  Ｋ．，  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１１４：１２１−１３１，  １９９９
［参考文献４］
Ｎａｇａｅ  Ｍ．，  Ｔｏｄｏ  Ｔ．，  Ｇｅｎ  Ｋ．，  Ｋａｔｏ  Ｙ．，  Ｙｏｕｎｇ  Ｇ．，  Ａｄａｃｈｉ  Ｓ．，  Ｙａｍａｕｃｈｉ  Ｋ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，  １６：１７１−１８１，  １９９６
［参考文献５］
Ｓｕｇａｈａｒａ  Ｔ．，  Ｐｉｘｌｅｙ  ＭＲ．，  Ｍｉｎａｍｉ  Ｓ．，  Ｐｅｒｌａｓ  Ｅ．，  Ｂｅｎ-Ｍｅｎａｈｅｍ  Ｄ．，  Ｈｓｕｅｈ  ＡＪＷ．，  Ｂｏｉｍｅ  Ｉ．，  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ，  ９２：２０４１−２０４５，  １９９５
［参考文献６］
Ｎｉｗａ  Ｈ．，  Ｙａｍａｍｕｒａ  Ｋ．，  Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｊ．，  Ｇｅｎｅ，  １０８：  １９３−２００，  １９９１
［参考文献７］
Ｓｏｒｉｍａｃｈｉ  Ｈ．，  Ｅｍｏｒｉ  Ｙ．，  Ｋａｗａｓａｋｉ  Ｈ．，  Ｋｉｔａｊｉｍａ  Ｋ．，Ｉｎｏｕｅ  Ｓ．，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｋ．，  Ｉｎｏｕｅ  Ｙ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２６３：１７６７８−１７６８４，  １９８８
【００２５】
２．  組換えＧＴＨの発現、精製および性状解析
２−１：哺乳類細胞の培養および発現ベクターの導入
組換えＧＴＨを発現させる細胞としてはヒト腎臓由来２９３Ｆ細胞（２９３細胞：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。細胞は、３７度、８％のＣＯ2存在下、１３０回転毎分で、２-３ｘ１０6細胞／ｍｌ-培養液になるまで懸濁培養し、適宜２-５倍に希釈することで経代を繰り返した。経代培養を５回以上行なった後、１ｘ１０6細胞／ｍｌに希釈した細胞に、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｍａｘ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて構築したウナギＧＴＨの発現ベクターおよびウナギＧＴＨの発現ベクターの発現活性を高めるために哺乳動物発現促進ベクターとしてｐＡｄＶａｎｔａｇｅ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を導入した。遺伝子を導入した細胞を５-６日間懸濁培養した後、遠心操作により細胞と培養液に分離、得られた培養液を組換えＧＴＨの精製のためのサンプルとした。
【００２６】
２−２：組換えＧＴＨの精製
組換えＧＴＨを含む培養液を１０ｋＤａ以下の物質を排除する限外濾過膜により濃縮し、高分子物質のみを含む濃縮培養液を調整した。得られた濃縮液は５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ（ｐＨ８．０）で透析した後、Ｎｉ-ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いた固相化金属アフィニティークロマトグラフィーに供し、組換えＧＴＨを含むＨｉｓタグタンパク質を精製した。更に得られたサンプルを、５０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）、１．５Ｍ  硫酸アンモニウムで透析することにより塩析した。塩析後、析出したタンパク質を遠心分離し、得られた上清をＰＢＳにより再度透析し、精製組換えウナギＧＴＨとした。
【００２７】
２−３：精製組換えＧＴＨの生化学的解析
ＦＳＨβあるいはＬＨβとαサブユニットのみの一本鎖組換えＧＴＨ（ＦＳＨおよびＬＨ）の生化学的解析の結果を一例として示す（図１）。先ず組換えＦＳＨおよびＬＨをＳｏｄｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌ  Ｓｕｌｆａｔｅ-Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｇｅｌ  電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）に供したのち、クマシーブリリアントブルーにより染色した（図１Ａ）。その結果、ＦＳＨ、ＬＨ共に３０-３５ｋＤａ程度のタンパク質が高度に精製されている事が示された。更に、独自に作製したαサブユニットまたは各βサブユニットに対する特異抗体を用いたウェスタンブロット解析を行なった。αサブユニットに対する特異抗体は、大腸菌で発現させた組換えタンパク（ＧｐＨα）を抗原として、各βサブユニットに対する特異抗体は、ショウジョウバエＳ２細胞で発現させた各組換えタンパク（ＦＳＨβ抗体またはＬＨβを抗原として、それぞれ家兎に免疫することにより作製した（参考文献８、参照）。
その結果、ＦＳＨおよびＬＨに共通して含まれるＧＰＨαの抗体に対してはＦＳＨ、ＬＨ共に陽性反応を示した（図１Ｂ）のに対し、各抗β抗体を用いた場合では、それぞれ対応するＧＴＨのみが陽性反応を示した（図１ＣおよびＤ）。以上の事から、組換えＦＳＨおよびＬＨは設計通り正しく発現しており、且つ上述の方法で高度に精製される事が明らかとなった。また、ＣＴＰあるいはＰＳＧＰを各βおよびＧＰＨαの間に挿入したＦＳＨ（ＦＳＨ-ＣＴＰおよびＦＳＨ-ＰＳＧＰ）およびＬＨ（ＬＨ-ＣＴＰおよびＬＨ-ＰＳＧＰ）に関しても同様の解析を行なった結果、糖鎖結合配列を挿入したために分子量が５-１０ｋＤａ程度大きくなるものの、同様の結果が得られた。
［参考文献８］
Ｋａｚｅｔｏ  Ｙ．，  Ｋｏｈａｒａ  Ｍ．，  Ｍｉｕｒａ  Ｔ．，  Ｍｉｕｒａ  Ｃ．，  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｓ．，  Ｔｒａｎｔ  ＪＭ．，  Ａｄａｃｈｉ  Ｓ．，  Ｙａｍａｕｃｈｉ  Ｋ．，  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，  ７９：９３８−９４６，  ２００８
【００２８】
２−４：精製組換えＧＴＨの糖鎖解析
各種組換えＧＴＨをＳＤＳ-ＰＡＧＥに供したのち、ＤＩＧ  Ｇｌｙｃａｎ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いたレクチンブロットを行ない、付加されている糖鎖を解析した（図２）。
ＦＳＨおよびＬＨの糖鎖は、Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ凝集素（ＳＮＡ：下記（１）参照）およびＤａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ凝集素（ＤＳＡ：下記（２）参照）に対し強い陽性反応を示したことから、ガラクトースあるいはＮ-アセチルガラクトサミンを含み、その末端にノイラミン酸が位置する糖鎖およびＮ-アセチルガラクトサミンを含み、その末端にガラクトースが位置する糖鎖など、哺乳類型の糖鎖を多く含むことが明らかとなった。
また、Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ凝集素（ＧＮＡ：下記（３）参照）およびＭａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ凝集素（ＭＡＡ：下記（４）参照）に対しても弱いながら陽性反応を示したことから、無脊椎動物の糖タンパクに典型的なハイマンノース型の糖鎖や、ガラクトースに糖鎖の末端で結合しているノイラミン酸も存在することが示された。
また、ＦＳＨ、ＬＨともに脱ノイラミン酸処理の有無にかかわらずＰｅａｎｕｔ凝集素（ＰＮＡ：下記（５）参照）に対しては陰性であることから、Ｏ-型糖鎖は含んでいないことが明らかとなった。一方、ＦＳＨ-ＣＴＰおよびＬＨ-ＣＴＰでは脱ノイラミン酸処理前はＰＮＡに陰性であったのに対し、ノイラミン酸除去後は非常に強い陽性シグナルが検出された。このことから、挿入したＣＴＰにＮ-アセチルガラクトサミンと結合しているガラクトースの末端にノイラミン酸が存在するＯ-型糖鎖が多量に結合していることが明らかとなった。
＜参考＞各凝集素の結合特異性
（１）ＳＮＡ：ガラクトースあるいはＮ-アセチルガラクトサミンに［２-６］の位置で結合しているノイラミン酸を認識する。
（２）ＤＳＡ：Ｎ-アセチルグルコサミンに［１-４］の位置で結合しているガラクトースを認識する。
（３）ＧＮＡ：ハイマンノース型糖鎖（無脊椎動物の糖タンパク質に典型的）を認識する。
（４）ＭＡＡ：ガラクトースに［２-３］の位置で結合しているノイラミン酸を認識する。
（５）ＰＮＡ：Ｎ-アセチルガラクトサミンとこれに［１-３］の位置で結合しているガラクトース（哺乳類のＯ-型糖鎖の典型的な核の構造）を認識する。
【実施例２】
【００２９】
＜組換えＧＴＨの生物活性の検討＞
３．生体外実験系における生物活性
３−１：未熟ウナギ精巣の培養
未熟なウナギの精巣、約３０ｍｇを、ホルモン未添加（対照群）あるいは様々な濃度の各種組換えＧＴＨ（ＦＳＨ、ＬＨ、ＦＳＨ-ＣＴＰおよびＬＨ-ＣＴＰ）を添加した培養液、Ｌ-１５、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、２５０μｌ中で、２０度、１８時間培養した。
【００３０】
３−２：精子形成誘導ステロイド産生量の測定
培養液中の精子形成誘導ステロイド、１１-ケトテストステロン（１１ＫＴ）量の測定は時間分解蛍光免疫測定法で行なった。その結果、ＦＳＨで２００ｎｇ／ｍＬ、ＬＨで５００ｎｇ／ｍＬ以上の濃度で１１ＫＴ産生が有意に促進された。また、ＣＴＰを挿入したＧＴＨでも有意な１１ＫＴ産生の促進効果が認められ、特にＬＨ-ＣＴＰでは２０ｎｇ／ｍＬの低濃度でも効果が認められると共に、高濃度投与群では１１ＫＴ産生量は対照群に比べ最高で１００倍程度に達した（図３）。
【００３１】
４．生体内実験系における生物活性
４−１：未熟雄ウナギへの組換えＧＴＨの投与
未熟雄ウナギに対して、ＦＳＨ-ＣＴＰを２００μｇ／ｋｇ-体重で週１回、８週間投与した。また、対照群として、ＦＳＨ-ＣＴＰを溶解しているＰＢＳのみの投与も行なった。
【００３２】
４−２：精巣のサンプリング、生殖腺体指数の算出および精巣の組織観察
投与実験終了３日後、実験魚の体重および摘出した精巣の重量を測定、生殖腺体指数（ＧＳＩ：生殖腺重量／体重）を算定した。精巣に関してはブアン氏液により固定したのち常法により組織切片を作製、光学顕微鏡により観察を行なった。その結果、対照群のＧＳＩは約０．２であったのに対し、ＦＳＨ-ＣＴＰを投与した場合、そのＧＳＩは約４．４と非常に高い値を示した。また、組織観察の結果、対照群の精巣では増殖前の精原細胞のみが存在するのに対し、ＦＳＨ-ＣＴＰを投与した個体の精巣では精子を含む様々な発達段階の生殖細胞が観察された（図４）。この結果より、遺伝子工学的手法を用いて作製した魚類自身の組換えＧＴＨがその人為催熟に有効である事が、本発明により初めて示された。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明の魚類の成熟誘導方法を用いることにより、ウナギ等の人為催熟が困難であった魚種についても、人工種苗が生産でき、完全養殖を行うことが可能となる。また、本発明の哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質は、生体内寿命が延長化された効果的なホルモンであることから、魚類の成熟誘導にも有効に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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