(57)【要約】【課題】様々な構造を有する基質の酵素による光学分割反応において、従来の酵素反応に加えてさらに立体選択性を向上させるための方法を提供すること。また、酵素の種類や基質の種類が制限されることなく、様々な酵素および様々な基質に適用することのできる光学分割方法を提供すること。【解決手段】本発明は、光学異性体を含む基質の光学分割方法であって、マイクロ波照射下において、非極性溶媒中での酵素による上記光学異性体を含む基質の反応を行うことを特徴とする光学分割方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学異性体を含む基質の光学分割方法であって、マイクロ波照射下において、非極性溶媒中での酵素による前記光学異性体を含む基質の反応を行うことを特徴とする光学分割方法。
【請求項２】
前記非極性溶媒がヘキサン、ペンタンまたはヘプタンである、請求項１に記載の光学分割方法。
【請求項３】
前記非極性溶媒の温度が６５℃以下に維持される、請求項１または２に記載の光学分割方法。
【請求項４】
前記マイクロ波の出力が６０Ｗ以下であり、照射時間が１００分以下である、請求項１〜３のいずれかに記載の光学分割方法。
【請求項５】
前記マイクロ波が周波数０．１〜１１０ＧＨｚの電磁波である、請求項１〜４のいずれかに記載の光学分割方法。
【請求項６】
前記酵素が加水分解酵素である、請求項１〜５のいずれかに記載の光学分割方法。
【請求項７】
前記加水分解酵素がリパーゼである、請求項１〜６のいずれかに記載の光学分割方法。
【請求項８】
前記光学異性体を含む基質と他の基質との反応を行う、請求項１〜７のいずれかに記載の光学分割方法。
【請求項９】
前記光学異性体を含む基質の分解反応を行う、請求項１〜７のいずれかに記載の光学分割方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素反応を利用した酵素反応を利用した光学異性体の光学分割方法に関する。さらに詳細には、効率的に所望の光学異性体を得るための光学分割方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サリドマイド禍に代表されるように、光学活性体はその光学異性体間で異なる生理活性を示す場合が多いことから、光学異性体の選択的な合成は医薬品、農薬、液晶材料、食品などの幅広い分野でその重要性が認識されている。光学異性体とは、不斉炭素等を有する化合物で生じる異性体で、Ｄ体とＬ体（あるいはＲ体とＳ体）で区別され、化学式（組成式）は同じであるが、その構造が鏡像関係（右手と左手の関係）にある異性体（エナンチオマー）や、非鏡像異性体（ジアステレオマー）である。
【０００３】
ラセミ体などから所望の光学異性体を選択的に得る方法（光学分割方法）としては、古くから行われている再結晶を利用した優先晶出法が一般的な光学分割方法であったが、最近では、クロマトグラフィーを利用した光学分割方法とともに、酵素反応を利用した光学分割方法が多用されるようになっている。
【０００４】
クロマトグラフィーを利用した光学分割方法とは、不斉要素（光学活性な担体）を組み込んだ固定相を用いることにより、クロマトグラフィーにおいて光学異性体の保持時間に差が生じることを利用して、光学異性体の光学分割する方法である。このようなクロマトグラフィー法に用いるカラムとしては、例えば、糖などの誘導体を結合させた各種ＨＰＬＣ用カラムが市販されており、近年の研究によりさらに分離性能が高まっている。ただし、こうしたＨＰＬＣカラムは高価であり、また大量の化合物を光学分割するのは難しいという欠点がある。
【０００５】
一方で、酵素反応を利用した光学分割方法とは、特定の光学異性体のみの反応を触媒する傾向を有する酵素を用いて、ラセミ体等の基質から特定の光学異性体のみの反応生成物を得る方法である。酵素反応を利用した光学分割方法では、比較的大量の化合物を光学分割することが可能であり、操作が簡便であるといった利点を有している。
【０００６】
特許文献１には、酵素反応を利用して光学活性な低分子化合物（β−シアノイソ酪酸）を選択的に製造するための方法が記載されている。しかし、一部の酵素を用いた場合を除き、選択性の高い光学分割は達成されていない。
【０００７】
また、非特許文献１には、乾燥媒体に固定化された酵素（リパーゼ）を用いて、マイクロ波の照射下において、光学異性体を含む基質の酵素触媒反応を行うことにより、光学活性な反応生成物を得る方法が開示されている。ここでは、反応容器に試薬を導入するために溶剤としてエーテルを用いているが、エーテルは沸点が３４℃であるために、反応中にエーテルはすべて揮発してしまい、無溶剤条件での反応となっている。このため、酵素が失活しがちになる、反応物の収率が低下するといった問題がある。
【０００８】
なお、特許文献２には、核酸、タンパク質、多糖類を含む反応系に対する酵素反応や抗体抗原反応等の生体高分子が介在する反応を、マイクロ波を照射することによって、促進する（反応時間を短縮する）方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００７−３１９１６５号公報
【特許文献２】特開２００３−２６５１７５号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】J. Ramon他，”Microwave-Promoted Lipase-Catalyzed Reactions. Resolution of (±)-1-Phenylethanol”，Journal of Organic Chemistry，1996年，61巻，p.7746-7749
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
酵素は本来立体選択的な反応を行う生体触媒として知られているが、医薬品などの合成中間体の立体選択的な合成を視野にいれた場合、様々な構造の人工基質（合成中間体）等を反応させる必要があり、それら各種の基質について使用する酵素の種類を変更するだけで、必ずしも立体選択性の高い酵素反応を行えるとは限らない。そこで、酵素反応を利用した光学分割反応では、使用する酵素の選択以外に立体選択性を向上させるための方法論の開発が望まれていた。
【００１２】
本発明は、様々な構造を有する基質の酵素による光学分割反応において、従来の酵素反応に加えてさらに立体選択性を向上させるための方法を提供することを目的とする。また、本発明の別の目的は、酵素の種類や基質の種類が制限されることなく、様々な酵素および様々な基質に適用することのできる光学分割方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、二級アルコール等の酵素反応による光学分割に関して、従来の酵素反応に加えてさらに立体選択性を向上させる手段を開発するために鋭意検討した結果、酵素反応系にマイクロ波を照射することで、光学分割の立体選択性が向上することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、光学異性体を含む基質の光学分割方法であって、マイクロ波照射下において、非極性溶媒中での酵素による上記光学異性体を含む基質の反応を行うことを特徴とする光学分割方法である。
【００１５】
上記非極性溶媒はヘキサン、ペンタンまたはヘプタンであることが好ましい。また、非極性溶媒の温度は反応中６５℃以下に維持されることが好ましい。
【００１６】
上記マイクロ波の出力は６０Ｗ以下であることが好ましい。照射時間は１００分以下であることが好ましい。また、マイクロ波は周波数０．１〜１１０ＧＨｚの電磁波であることが好ましく、さらに好ましくは２．４〜２．５ＧＨｚである。
【００１７】
上記酵素は加水分解酵素であることが好ましい。また、加水分解酵素はリパーゼであることが好ましい。
【００１８】
本発明の光学分割方法においては、上記光学異性体を含む基質と他の基質との反応を行ってもよく、また、上記光学異性体を含む基質の分解反応を行ってもよい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、従来の酵素反応を用いた光学分割方法に加えて、反応系にマイクロ波を照射することによって、さらに光学分割の立体選択性を向上させることができる。つまり本発明は、従来開発されて来た酵素反応を用いた光学分割方法との相乗効果が期待できることから、工業的価値やその波及効果は極めて大きい。
【００２０】
また、反応溶媒として、非極性溶媒を用いているため、マイクロ波が効率的に基質や酵素に作用し、反応系を比較的低温に維持することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明において用いられる酵素は、光学分割に用いるための不斉反応を触媒する酵素であり、特に限定されるものではないが、好ましくは非極性溶媒中でも活性な酵素である。具体的には、例えば、加水分解酵素、酸化還元酵素、転移酵素、除去付加酵素、異性化酵素、合成酵素が挙げられ、好ましくは、加水分解酵素である。加水分解酵素としては、リパーゼ等のエステル結合の加水分解を触媒するエステラーゼ、ペプチド結合の加水分解を触媒するプロテアーゼ、グリコシド結合の加水分解を触媒するグリコシターゼ、エーテル結合やチオエーテル結合の加水分解を触媒する酵素などが挙げられる。好ましくは、リパーゼ、プロテアーゼが用いられる。
【００２２】
また、酵素としては、いわゆる耐熱性酵素を用いることもできるが、耐熱性酵素以外も使用することができる。本発明においては、非極性溶媒を使用することにより、マイクロ波の照射による溶媒（反応系）の温度上昇が比較的少なく、従来よりも低温で光学分割反応を行うことができるため、より多くの種類の酵素を使用することが可能となる。
【００２３】
本発明の光学分割方法において、酵素は、そのまま反応系に添加して基質と反応させてもよく、樹脂等を用いて包括あるいは固定化して基質と接触するようにしてもよい。
【００２４】
本発明において、光学異性体を含む基質とは、ラセミ体などの少なくとも２種の光学異性体が混在した化合物であり、該化合物としては、例えば、アミノ酸、核酸、糖、アルコール、アミン、カルボン酸などの低分子化合物やタンパク質、ＤＮＡ、糖鎖などの生体高分子が挙げられる。好ましくは、変性や失活の心配がない低分子化合物が用いられる。
【００２５】
光学異性体を含む基質は、極性物質および非極性物質のいずれであってもよいが、極性物質であることが好ましい。理由は明らかではないが、非極性物質よりも極性物質の方が本発明の光学分割方法における選択性が高い傾向がある。例えば、光学異性体を含む基質が二級アルコールである場合、非極性物質である１−フェニルエタノールよりも、極性物質である１−（３−ピリジル）エタノールの方が本発明の光学分割方法における選択性が高い傾向がある。
【００２６】
本発明において、これらの光学異性体を含む基質の反応とは、上記光学異性体を含む基質と他の基質との反応であってもよく、また、分解反応や分子内転位反応等の上記光学異性体を含む基質単独での反応（光学異性体を含むエステルの加水分解反応など）であってもよい。
【００２７】
上記光学異性体を含む基質と他の基質との反応としては、例えば、エステル交換反応等の置換反応、脱水縮合等の縮合反応、付加反応、酸化反応、還元反応、分子間転位反応が挙げられる。ここで用いられる他の基質は、特に限定されるものではないが、光学異性体を含まない基質であることが好ましい。光学異性体を含む基質が二級アルコールのラセミ体等である場合、他の基質としては、例えばビニルアセテート等のアシル供与体を用いることができる。
【００２８】
例えば、光学異性体を含む基質がラセミ体である場合、上記他の基質がラセミ体の一方の光学異性体のみに選択的に反応して光学活性な生成物を生じる。この生成物を分離することで、ラセミ体の他方の光学異性体は未反応の基質として別途分離されることになる。このように、上記光学異性体を含む基質と他の基質とを反応させる光学分割方法においては、反応生成物および未反応の基質の両方が光学活性な化合物として得られる。
【００２９】
本発明において反応溶媒として用いられる溶媒は、酵素を失活させたり基質を分解・劣化等するようなものでなければ特に限定されないが、非極性溶媒を用いることが好ましい。非極性溶媒とは、水よりも極性の低い溶媒であり、好ましくはヘキサン、ペンタン、ヘプタンであり、さらに好ましくはヘキサンである。
【００３０】
ＤＮＡ、タンパク質、糖鎖などの生体高分子を対象とした酵素反応では、酵素やタンパク質の変性・失活等があるために、反応温度を体温程度に抑える必要がある。このような場合に、反応溶媒として極性溶媒（水）を用いると、水分子がマイクロ波によって加熱されやすいため、反応系全体の温度を体温程度に保つためには低出力のマイクロ波しか照射することができない。また、極性溶媒（水）を用いた場合、この低出力のマイクロ波のうち大部分は水分子に吸収されてしまい、直接、酵素や生体高分子に作用するマイクロ波は非常に小さく、十分な作用が得られず、非常に非効率的になってしまう。
【００３１】
これに対して、溶媒として非極性溶媒を使用することで、極性溶媒を使用したときのマイクロ波吸収（酵素や基質に十分なマイクロ波が供給されないこと）を避けることができる。したがって、本発明においては、反応溶媒としてマイクロ波の吸収の少ない非極性溶媒を使用することで、照射したマイクロ波を効率的に酵素や基質に作用させることができ、これによって、メカニズムの詳細は不明であるが、反応温度を高めずとも光学分割反応の選択性を高めることができると考えられる。
【００３２】
本発明においては、上記光学異性体を含む基質の反応がマイクロ波の照射下で行われる。マイクロ波の出力は好ましくは１００Ｗ以下であり、さらに好ましくは６０Ｗ以下である。また、マイクロ波の照射時間は好ましくは１００分以下であり、さらに好ましくは６０分以下である。また、マイクロ波は周波数０．１〜１１０ＧＨｚの電磁波であることが好ましく、さらに好ましくは２．４〜２．５ＧＨｚである。
【００３３】
このような範囲でマイクロ波の照射量を調整することにより、反応系（非極性溶媒）の温度が反応の間、６５℃以下に維持されることが好ましい。
【００３４】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００３５】
［実施例］
リパーゼを触媒として、１−フェニルエタノールまたは１−（３ピリジル）エタノールと、ビニルアセテートとのエステル交換反応（トランスエステル化）をヘキサン溶媒中で行った。以下に、この反応を化学式で示す。
【００３６】
【化１】
2011045327.tif 000002
【００３７】
上記化学式は、ラセミ体原料（１−フェニルエタノールまたは１−（３ピリジル）エタノール）に対して、ビニルアセテートが完全に光学選択性をもって反応した場合を示している。この場合の反応生成物（アシル化化合物）はＲ体のみとなるが、実際には上記化学式で示していないＳ体の反応生成物も合成される。なお、反応生成物のＲ体および未反応基質のＲ体の両者が、ラセミ体基質の光学分割によって得られる目的物となる。以下に、本実施例を詳細に説明する。
【００３８】
まず、光学異性体を含む基質として、１−フェニルエタノール（表中、「Ｐｈ」と略す）または１−（３−ピリジル）エタノール（表中、「Ｐｙ」と略す）のラセミ体７０μｍｏlを試験管中のヘキサン２ｍＬに溶解し、アシル供与体（光学異性体を含まない基質）としてビニルアセテート１００μＬと、表１に示す所定量（２．５〜５０ｍｇ）のリパーゼとを加え、マイクロ波照射装置（Ｄｉｓｃｏｖｅｒ  ＬａｂＭａｔｅ、アステック社製）内に設置した。そして、周波数２．４ＧＨｚのマイクロ波を表１に示す所定の時間（２０分あるいは４０分）照射した。この間、照射するマイクロ波の出力を１Ｗ〜６０Ｗの間で制御し、空冷機構の空冷用空気の流量を制御することによって、試料温度を６０℃に維持した。遠心分離によって酵素を除き、上清を試料とした。
【００３９】
なお、表１に示すように、リパーゼとしては、リパーゼＰＬ（名糖産業株式会社製、Alcaligenes sp.由来）、リパーゼＱＬＭ（名糖産業株式会社製、Alcaligenes sp.由来）、リパーゼＭＹ（名糖産業株式会社製、Candida cylindracea由来）、リパーゼＯＦ（名糖産業株式会社製、Candida cylindracea由来）、リパーゼＡＳ「アマノ」（天野エンザイム株式会社製、Aspergillus niger由来）、リパーゼＡＰ「アマノ」（天野エンザイム株式会社製、Rhizopus oryzae由来）を使用した。
【００４０】
以上のようにして得られた試料（上清）中のアルコールおよびアセテートの濃度をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより定量し、アルコールに対するアセテートの比率（以下、反応率という。単位：重量％）の決定と立体選択性の評価を行った。
【００４１】
それぞれの反応の立体選択性は、酵素の基質選択性を表す指標であるＥ値を用いて評価した。Ｅ値は、反応後における原料と生成物の鏡像体過剰率（ee：enantiomeric excess）から計算される値であり、速度定数の比として、以下の式（１）から計算される値である（C. S. Chen他，「鏡像体の生化学的動力学的分割の定量分析 (Quantitative analyses of biochemical kinetic resolutions of enantiomers)」，Journal of the American Chemical Society，1982年，104巻，p.7294-7299  参照）。
【００４２】
【数１】
2011045327.tif 000003
【００４３】
（式中、ｌｎは自然対数、e.e.（ｓ）は基質の鏡像体過剰率（０〜１）、e.e.（Ｐ）は生成物の鏡像体過剰率（０〜１）を示す。）
Ｅ値が１の場合は両鏡像体が等しく反応生成されることを示し、１より大きくなるにつれて一方の鏡像体が選択的に反応生成されることを示す
なお、鏡像体過剰率（ee）とは、キラルな化合物の光学純度を表す用語であり、通常、光学異性体のうち多い方の物質量から少ない方の物質量を引き、全体の物質量で割った値で表される。本実施例においては、上記化学式に示すＲ体の反応生成物（アシル化化合物）が多い方の光学異性体であり、Ｓ体の反応生成物（化学式は示さず）が少ない方の光学異性体である。
【００４４】
したがって，ラセミ体の光学純度はゼロであり，Ｒ体７０％，Ｓ体３０％からなる物質はＲ体の光学純度４０％e.e．である。完全に光学分割された鏡像異性体は光学純度１００％e.e．である。Ｒ体の光学純度４０％e.e．の基質からＲ体の光学純度９７．５％e.e．の生成物が得られた場合、式（１）によりＥ値を計算すると、Ｅ値は１１７となる。
【００４５】
［比較例］
通常加熱による２級アルコールの光学分割
マイクロ波照射を行わずに、実施例のマイクロ波照射と同じ時間（２０分あるいは４０分）、湯浴中で試料温度を６０℃で維持した以外は、実施例と同様にして、反応率の決定と立体選択性の評価を行った。
【００４６】
［結果］
実施例１および比較例１の結果を表１に示す。なお、表中のｎは各試験を実施した回数（ｎ数）であり、反応率およびＥ値は各ｎ数の平均値（括弧内は標準誤差を示す）である。
【００４７】
【表１】
2011045327.tif 000004
【００４８】
表１に示すように、カビ、酵母、細菌など由来の異なる六種類のリパーゼで比較例に対して実施例で立体選択性（Ｅ値）の向上が見られた。
【００４９】
今回開示された実施の形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。