(57)【要約】 【課題】  短時間にＨＭＧＢ１の測定が可能な抗体、例えばＨＭＧＢ１抗体の組み合わせを明らかにし、免疫学的測定方法及び免疫学的測定キットを提供する。【解決手段】  担体に固相化される第１の抗体と標識物質が修飾される第２の抗体とを下記抗体（Ａ）、抗体（Ｂ）、抗体（Ｃ）及び抗体（Ｄ）の何れかとし、抗体（Ａ）と抗体（Ｂ）と、抗体（Ａ）と抗体（Ｃ）と、抗体（Ｂ）と抗体（Ａ）と、抗体（Ｂ）と抗体（Ｃ）と、抗体（Ｂ）と抗体（Ｄ）、及び抗体（Ｃ）と抗体（Ｂ）との組合せのうちの何れか１つとなる前記第１の抗体と前記第２の抗体との組合せを含むことを特徴とするＨＭＧＢ１の有無または濃度もしくはその両方を測定する免疫学的測定方法及び測定キット。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体に固相化される第１の抗体と標識物質が修飾される第２の抗体とを下記抗体（Ａ）、抗体（Ｂ）、抗体（Ｃ）及び抗体（Ｄ）の何れかとし、抗体（Ａ）と抗体（Ｂ）と、抗体（Ａ）と抗体（Ｃ）と、抗体（Ｂ）と抗体（Ａ）と、抗体（Ｂ）と抗体（Ｃ）と、抗体（Ｂ）と抗体（Ｄ）と、及び抗体（Ｃ）と抗体（Ｂ）との組合せのうちの何れか１つとなる前記第１の抗体と前記第２の抗体との組合せを使用することを特徴とするＨＭＧＢ１の有無または濃度もしくはその両方を測定する免疫学的測定方法。
抗体（Ａ）
GKGDPKKPRGKMSSYA（式Ｉ）
で表されるペプチドにＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）を修飾したタンパク質を免疫原として用い、ウサギに免疫することにより、産生し、取得される、ヒトＨＭＧＢ１に特異的な反応性を有するポリクローナル抗体、
抗体（Ｂ）
MGKGDPKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGETKKKFKDPNAPKRPPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEEEEDEEDEEDEEEEEDEEDEDEEEDDDDE（式ＩＩ）
で表されるタンパク質を免疫原として用い、ウサギに免疫することにより、産生し、取得される、ヒトＨＭＧＢ１に特異的な反応性を有するポリクローナル抗体、
抗体（Ｃ）
MGKGDPKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGETKKKFK（式ＩＩＩ）
で表されるポリペプチドにＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）タグを修飾したタンパク質を免疫原として用い、マウスに免疫することにより、産生し、取得される、ヒトＨＭＧＢ１に特異的な反応性を有するモノクローナル抗体
抗体（Ｄ）
MGKGDPKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGETKKKFKDPNAPKRPPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEEEEDEEDEEDEEEEEDEEDEDEEEDDDDE（式ＩＶ）
で表されるタンパク質にＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）タグで修飾したタンパク質を免疫原として用い、マウスに免疫することにより、産生し、取得される、ヒトＨＭＧＢ１に特異的な反応性を有するモノクローナル抗体。
【請求項２】
担体に固相化される第１の抗体と標識物質が修飾される第２の抗体とを前記抗体（Ａ）、抗体（Ｂ）、抗体（Ｃ）及び抗体（Ｄ）の何れかとし、抗体（Ａ）と抗体（Ｂ）と、抗体（Ａ）と抗体（Ｃ）と、抗体（Ｂ）と抗体（Ａ）と、抗体（Ｂ）と抗体（Ｃ）と、抗体（Ｂ）と抗体（Ｄ）、及び抗体（Ｃ）と抗体（Ｂ）との組合せのうちの何れか１つとなる前記第１の抗体と前記第２の抗体との組合せを含むことを特徴とするＨＭＧＢ１の有無または濃度もしくはその両方を測定する免疫学的測定キット。
抗体（Ａ）
GKGDPKKPRGKMSSYA（式Ｉ）
で表されるペプチドにＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）を修飾したタンパク質を免疫原として用い、ウサギに免疫することにより、産生し、取得される、ヒトＨＭＧＢ１に特異的な反応性を有するポリクローナル抗体、
抗体（Ｂ）
MGKGDPKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGETKKKFKDPNAPKRPPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEEEEDEEDEEDEEEEEDEEDEDEEEDDDDE（式ＩＩ）
で表されるタンパク質を免疫原として用い、ウサギに免疫することにより、産生し、取得される、ヒトＨＭＧＢ１に特異的な反応性を有するポリクローナル抗体、
抗体（Ｃ）
MGKGDPKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGETKKKFK（式ＩＩＩ）
で表されるポリペプチドにＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）タグを修飾したタンパク質を免疫原として用い、マウスに免疫することにより、産生し、取得される、ヒトＨＭＧＢ１に特異的な反応性を有するモノクローナル抗体。
抗体（Ｄ）
MGKGDPKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGETKKKFKDPNAPKRPPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEEEEDEEDEEDEEEEEDEEDEDEEEDDDDE（式ＩＶ）
で表されるタンパク質にＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）タグで修飾したタンパク質を免疫原として用い、マウスに免疫することにより、産生し、取得される、ヒトＨＭＧＢ１に特異的な反応性を有するモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記担体が光導波路として構成されるウェイブガイドであり、前記標識物質が蛍光物質であることを特徴とする請求項２に記載の免疫学的測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、敗血症及び関連症状の重症度をモニタリングするための診断方法であって、敗血症等の疾患のマーカーとなりうるＨＭＧＢ１を短時間に測定するための免疫学的検出方法及びその免疫学的測定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｈｉｇｈ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｂｏｘ  １（以下「ＨＭＧＢ１」と略すことがある）は、非ヒストン核タンパクの主要成分であり、転写調節因子として知られている約３０ｋＤａのタンパク質である。
１９９９年、ＷａｎｇらによりＨＭＧＢ１が敗血症のマーカーとなり得ることが示され、今では敗血症性ショック時の晩期に発現するメディエーターとして注目されるようになった。また、ＨＭＧＢ１は、敗血症時に核外へと遊離された場合には細胞障害性を示すこと、また、従来の炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αやＩＬ−１βよりも遅れて出現することから、敗血症時の致死性に関与する可能性が指摘されている。
【０００３】
これらのことから、ＨＭＧＢ１は敗血症ショック時の臓器障害の重要なメディエーターとしての可能性が高く、敗血症時のあらたな治療目標となる可能性も示唆されている。
これに関連して、特許文献１では、敗血症または敗血症性ショックの重症度または考え得る致死率をモニタリングするための診断方法として、ＨＭＧＢ１の血清濃度を測定する方法を提案している。
【０００４】
また、特許文献２では、ヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体並びにこの抗体を用いるヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定方法及び免疫学的測定キットに関する提案が行われている。さらに、ヒト血清や血漿中のＨＭＧＢ１濃度を測定する研究用試薬、ＨＭＧＢ１  ＥＬＩＳＡ ＫｉｔＩＩ（商品名、株式会社シノテスト）やＨＭＧＢ１（ｈｕｍａｎ）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｅｔ（商品名、Ａｐｏｔｅｃｈ社）も販売されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００３−５２０７６３号公報
【特許文献２】特開２００３−０９６０９９号公報
【０００６】
特許文献１（請求項７）は、炎症性カスケードの活性化を特徴とする症状に伴うショック様症状を示しているか、またはその症状を示す危険性のある患者に関する敗血症及び関連症状の重症度をモニタリングし、そして起こり得る臨床経過を予測するための診断及び予後判定方法に関する提案である。
【０００７】
特許文献２では、GKGDPKKPRGKで表されるアミノ酸配列からなるペプチドを免疫原として調整される抗体に関する発明である。また、GKGDPKKPRGKで表されるアミノ酸配列に、１ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、もしくは付加、または修飾を施したペプチドを免疫原として調整される抗体に関する発明である。さらに、それら抗体を用いるヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定方法及び免疫学的測定キットに関する発明である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
先に述べたように、ＨＭＧＢ１は敗血症性ショック時の晩期に発現するマーカーとしての役割だけでなく、敗血症のあらたな測定目標として注目されつつある。つまり、敗血症の診断及びその経過の評価をくだすために、より短時間にＨＭＧＢ１の測定結果を知ることが重要であると言える。
例えば特許文献１（表２）は、ＨＭＧＢ１の血清濃度と死亡症例との関係を示しており、血清ＨＭＧＢ１が最高レベルに達した患者には、致死症例が観察されたと報告している。
また、特許文献１（[００１２]段落）では、ＨＭＧＢ１の血清レベルは、敗血症の周知の初期メディエーター（例えばＴＮＦ及びＩＬ−１）より１６時間ほど遅れて上昇し、プラトーレベルに達すると報告されている。
【０００９】
つまりＨＭＧＢ１の血清濃度を短時間に測定することが、敗血症及びその重症度を診断する上で重要であると言える。だが、特許文献１に記載の診断アッセイには、測定時間に関する具体的な記載はない。一方、特許文献２に記載の抗体は、ヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合するという目的で調整された抗体であり、短時間にヒトＨＭＧＢ１を測定するという目的で調整された抗体ではない。よって、特許文献１及び特許文献２に記載の抗体は、前記目的で用いられることは困難であった。
【００１０】
また、市販されている研究用試薬、ＨＭＧＢ１  ＥＬＩＳＡ  ＫｉｔＩＩ及びＨＭＧＢ１（ｈｕｍａｎ）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｅｔにおいても、測定結果を得るのに一晩以上の時間を要するため、上記目的での使用は困難であった。
つまり、敗血症及び関連症状の重症度を迅速にモニタリングするためには、ＨＭＧＢ１を短時間に測定することが重要であることは公知の事実と言えるが、これを満たす免疫学的測定方法及び免疫学的測定キットは報告されていなかった。
これに対し本発明の課題は、短時間にＨＭＧＢ１の測定が可能な抗体、例えばＨＭＧＢ１抗体の組み合わせを明らかにし、免疫学的測定方法及び免疫学的測定キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは鋭意に検討した結果、特定の抗体から選んだ、担体に固相化される第１の抗体と標識物質が修飾される第２の抗体との組合せを用いた、ＨＭＧＢ１の有無または濃度もしくはその両方を測定する免疫学的測定方法及びその測定キットを見出した。
【００１２】
試料中に存在するＨＭＧＢ１を測定する本発明の免疫学的測定方法は、担体に固相化される第１の抗体と標識物質が修飾される第２の抗体とを下記抗体（Ａ）、抗体（Ｂ）、抗体（Ｃ）及び抗体（Ｄ）の何れかとし、抗体（Ａ）と抗体（Ｂ）と、抗体（Ａ）と抗体（Ｃ）と、抗体（Ｂ）と抗体（Ａ）と、抗体（Ｂ）と抗体（Ｃ）と、抗体（Ｂ）と抗体（Ｄ）と、及び抗体（Ｃ）と抗体（Ｂ）との組合せのうちの何れか１つとなる前記第１の抗体と前記第２の抗体との組合せを使用することを特徴とする。
【００１３】
抗体（Ａ）：
GKGDPKKPRGKMSSYA（式Ｉ）
で表されるペプチドにＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）で修飾したタンパク質を免疫原として用い、ウサギに免疫することにより、産生し、取得される、ヒトＨＭＧＢ１に特異的な反応性を有するポリクローナル抗体、
【００１４】
抗体（Ｂ）：
MGKGDPKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGETKKKFKDPNAPKRPPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEEEEDEEDEEDEEEEEDEEDEDEEEDDDDE（式ＩＩ）
で表されるタンパク質を免疫原として用い、ウサギに免疫することにより、産生し、取得される、ヒトＨＭＧＢ１に特異的な反応性を有するポリクローナル抗体、
【００１５】
抗体（Ｃ）：
MGKGDPKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGETKKKFK（式ＩＩＩ）
で表されるポリペプチドにＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）タグで修飾したタンパク質を免疫原として用い、マウスに免疫することにより、産生し、取得される、ヒトＨＭＧＢ１に特異的な反応性を有するモノクローナル抗体。
【００１６】
抗体（Ｄ）：
MGKGDPKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGETKKKFKDPNAPKRPPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEEEEDEEDEEDEEEEEDEEDEDEEEDDDDE（式ＩＶ）
で表されるタンパク質にＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）タグで修飾したタンパク質を免疫原として用い、マウスに免疫することにより、産生し、取得される、ヒトＨＭＧＢ１に特異的な反応性を有するモノクローナル抗体。
【００１７】
また、試料中に存在するＨＭＧＢ１を測定する本発明の免疫学的測定キットは、担体に固相化される第１の抗体と標識物質が修飾される第２の抗体とを前記抗体（Ａ）、抗体（Ｂ）抗体（Ｃ）及び抗体（Ｄ）の何れかとし、抗体（Ａ）と抗体（Ｂ）と、抗体（Ａ）と抗体（Ｃ）と、抗体（Ｂ）と抗体（Ａ）と、抗体（Ｂ）と抗体（Ｃ）と、抗体（Ｂ）と抗体（Ｄ）と、及び抗体（Ｃ）と抗体（Ｂ）との組合せのうちの何れか１つとなる前記第１の抗体と前記第２の抗体との組合せを使用することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１８】
本免疫学的測定方法及び本免疫学的測定キットでは、市販されているＨＭＧＢ１抗体の中から、短時間にＨＭＧＢ１の測定が可能な第1の抗体及び第２の抗体を選び抜き、抗体の組み合わせを用いる。それによって、これまで１日近く要していたＨＭＧＢ１の測定時間を、数十分にまで短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の第1の実施例に係る、免疫学的測定方法及び免疫学的測定キットによるＨＭＧＢ１の短時間測定、を説明する図である。
【図２】本発明の第1の実施例に係る、免疫学的測定方法及び免疫学的測定キットによるＨＭＧＢ１の短時間測定、を比較する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、個々に開示する実施形態は、本発明の測定方法及びその測定キットの例であり、これに限定されるものではない。
【００２１】
（第一実施形態）
本発明の第一実施形態は、担体に固相化される第１の抗体と標識物質が修飾される第２の抗体とを下記抗体（Ａ）、抗体（Ｂ）抗体（Ｃ）及び抗体（Ｄ）の何れかとし、抗体（Ａ）と抗体（Ｂ）と、抗体（Ａ）と抗体（Ｃ）と、抗体（Ｂ）と抗体（Ａ）と、抗体（Ｂ）と抗体（Ｃ）と、抗体（Ｂ）と抗体（Ｄ）と、及び抗体（Ｃ）と抗体（Ｂ）との組合せのうちの何れか１つとなる前記第１の抗体と前記第２の抗体との組合せを使用することを特徴とするＨＭＧＢ１の有無または濃度もしくはその両方を測定する免疫学的測定方法である。
【００２２】
抗体（Ａ）：
：GKGDPKKPRGKMSSYA（式Ｉ）
で表されるペプチドにＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）を修飾したタンパク質を免疫原として用い、ウサギに免疫することにより、産生し、取得される、ヒトＨＭＧＢ１に特異的な反応性を有するポリクローナル抗体、
【００２３】
抗体（Ｂ）：
MGKGDPKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGETKKKFKDPNAPKRPPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEEEEDEEDEEDEEEEEDEEDEDEEEDDDDE（式ＩＩ）
で表されるタンパク質を免疫原として用い、ウサギに免疫することにより、産生し、取得される、ヒトＨＭＧＢ１に特異的な反応性を有するポリクローナル抗体、
【００２４】
抗体（Ｃ）：
MGKGDPKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGETKKKFK（式ＩＩＩ）
で表されるポリペプチドにＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）タグを修飾したタンパク質を免疫原として用い、マウスに免疫することにより、産生し、取得される、ヒトＨＭＧＢ１に特異的な反応性を有するモノクローナル抗体
【００２５】
抗体（Ｄ）：
MGKGDPKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGETKKKFKDPNAPKRPPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEEEEDEEDEEDEEEEEDEEDEDEEEDDDDE（式ＩＶ）
で表されるタンパク質にＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）タグで修飾したタンパク質を免疫原として用い、マウスに免疫することにより、産生し、取得される、ヒトＨＭＧＢ１に特異的な反応性を有するモノクローナル抗体。
【００２６】
（第二実施形態）
本発明の第二実施形態は、担体に固相化される第１の抗体と標識物質が修飾される第２の抗体とを前記抗体（Ａ）、抗体（Ｂ）抗体（Ｃ）及び抗体（Ｄ）の何れかとし、抗体（Ａ）と抗体（Ｂ）と、抗体（Ａ）と抗体（Ｃ）と、抗体（Ｂ）と抗体（Ａ）と、抗体（Ｂ）と抗体（Ｃ）と、抗体（Ｂ）と抗体（Ｄ）、及び抗体（Ｃ）と抗体（Ｂ）との組合せのうちの何れか１つとなる前記第１の抗体と前記第２の抗体との組合せを使用することを特徴とするＨＭＧＢ１の有無または濃度もしくはその両方を測定する免疫学的測定キットである。
【００２７】
以下に本発明の第一実施形態及び第二実施形態を詳述する。
（１）免疫学的測定方法について
本発明の免疫学的測定方法とは、試料に含まれるＨＭＧＢ１を、抗原抗体反応を利用して測定を行う免疫学的測定方法において、前記第１の抗体と第２の抗体との組合せが、ＨＭＧＢ１を短時間に測定可能な抗体の組み合わせであることを特徴とする。具体的には、前記抗体（Ａ）と（Ｂ）、抗体（Ａ）と（Ｃ）、抗体（Ｂ）と（Ａ）、抗体（Ｂ）と（Ｃ）、抗体（Ｂ）と（Ｄ）、抗体（Ｃ）と（Ｂ）の６つの組合せのいずれか１つである。
【００２８】
即ち、ＨＭＧＢ１の免疫学的測定方法において、測定対象物質であるヒトＨＭＧＢ１に結合する第１の抗体と第２の抗体との組合せを前記６つの組合せのいずれか１つを使用することを特徴とする測定方法である。これにより、本発明の免疫学的測定方法では、試料に含まれるＨＭＧＢ１を短時間で測定することができるのである。
【００２９】
この免疫学的測定方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、等を挙げることができる。
また、本発明の免疫学的測定方法における測定は、用手法で行ってもよいし、分析装置等の装置を用いて行ってもよい。
【００３０】
また、本発明における免疫学的測定の操作方法は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、担体に固相化された第１の抗体と、試料及び標識物質が修飾されている第２の抗体を、同時または順に反応させる。この反応により、「担体に固相化された第１の抗体−ＨＭＧＢ１−標識物質が修飾されている第２の抗体」の複合体が形成され、この複合体に含まれる標識物質が修飾されている第２の抗体の量から、試料中に含まれるＨＭＧＢ１の量（濃度）を測定することができる。
【００３１】
例えば、酵素免疫測定法の場合は、第１の抗体が固相化されたマイクロプレート、検体希釈液、ＨＲＰ等の酵素が修飾された第２の抗体、洗浄緩衝液、及び基質溶液を用いて行うと良い。また測定は、第２の抗体に修飾されている酵素に、その至適条件下で基質を反応させ、その酵素反応生成物の量を光学的方法等により測定すると良い。
また、蛍光免疫測定法の場合には、第１の抗体が固相化された光導波路、検体希釈液、蛍光物質が修飾された第２の抗体、洗浄緩衝液を用いて行っても良い。また測定は、第２の抗体に修飾されている蛍光物質に励起光を照射し、その蛍光物質が発する蛍光強度を測定すると良い。
【００３２】
さらに放射免疫測定法の場合には、放射性物質による放射線量を測定する。また、発光免疫測定法の場合には、発光反応系による発光量を測定する。
また、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法等の場合には、エンドポイント法またはレート法により透過光や散乱光を測定する。また、イムノクロマトグラフィー法などを目視により測定する場合には、テストライン上に現れる標識物質の色を目視的に測定する。なお、この目視的に測定する代わりに、分析装置等の機器を用いてもよい。
【００３３】
（２）測定試料について
本発明の免疫学的測定方法における試料は、人の血液、血清、血しょう、尿、精液、ずい液、唾液、汗、涙、腹水もしくは羊水などの体液など、ＨＭＧＢ１が含まれる可能性のある生体試料であれば全て対象となる。
【００３４】
（３）抗体について
本発明の免疫学的測定方法及び免疫学的測定キットにおける抗体（Ａ）とは、
GKGDPKKPRGKMSSYA（式Ｉ）
で表されるペプチドにＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）を修飾したタンパク質を免疫原として用い、ウサギに免疫することにより、産生し、取得される、ヒトＨＭＧＢ１に特異的な反応性を有するポリクローナル抗体であればよい。より好ましくは、アブカム株式会社が販売しているＲａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ｔｏ  ＨＭＧＢ１  −  Ａｍｉｎｏｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄ（商品名、Ｃｏｄｅ  ａｂ６７２８１）である。
【００３５】
また、抗体（Ａ）には、式Ｉで表されるアミノ酸配列から1ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、もしくは付加、または修飾を施したペプチドにＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）を修飾したタンパク質を免疫原として用い、ウサギに免疫することにより、産生し、取得される、ヒトＨＭＧＢ１に特異的な反応性を有するポリクローナル抗体も含む。
【００３６】
また、本発明の免疫学的測定方法及び免疫学的測定キットにおける抗体（Ｂ）とは、
MGKGDPKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGETKKKFKDPNAPKRPPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEEEEDEEDEEDEEEEEDEEDEDEEEDDDDE（式ＩＩ）
で表されるタンパク質を免疫原として用い、ウサギに免疫することにより、産生し、取得される、ヒトＨＭＧＢ１に特異的な反応性を有するポリクローナル抗体であればよい。より好ましくは、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐ社が販売しているＡｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ＨＭＧＢ１（商品名、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  １０８２９−１−ＡＰ）である。
【００３７】
抗体（Ｂ）には、式ＩＩで表されるアミノ酸配列から1ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、もしくは付加、または修飾を施したタンパク質を免疫原として用い、ウサギに免疫することにより、産生し、取得される、ヒトＨＭＧＢ１に特異的な反応性を有するポリクローナル抗体も含む。
【００３８】
また、本発明の免疫学的測定方法及び免疫学的測定キットにおける抗体（Ｃ）とは、
MGKGDPKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGETKKKFK（式ＩＩＩ）
で表されるポリペプチドにＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）タグを修飾したタンパク質を免疫原として用い、マウスに免疫することにより、産生し、取得される、ヒトＨＭＧＢ１に特異的な反応性を有するモノクローナル抗体であればよい。より好ましくは、Ａｂｎｏｖａ社が販売しているＨＭＧＢ１  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  （Ｍ０８），Ｃｌｏｎｅ  ２Ｆ６（商品名、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  Ｈ００３１４６−Ｍ０８）である。
【００３９】
また、抗体（Ｃ）には、式ＩＩＩで表されるアミノ酸配列から1ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、もしくは付加、または修飾を施したペプチドにＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）タグを修飾したタンパク質を免疫原として用い、マウスに免疫することにより、産生し、取得される、ヒトＨＭＧＢ１に特異的な反応性を有するモノクローナル抗体も含む。
【００４０】
また、本発明の免疫学的測定方法及び免疫学的測定キットにおける抗体（Ｄ）とは、
MGKGDPKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGETKKKFKDPNAPKRPPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEEEEDEEDEEDEEEEEDEEDEDEEEDDDDE（式ＩＶ）
で表されるタンパク質にＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）タグで修飾したタンパク質を免疫原として用い、マウスに免疫することにより、産生し、取得される、ヒトＨＭＧＢ１に特異的な反応性を有するモノクローナル抗体であれば良い。より好ましくは、Ａｂｎｏｖａ社が販売しているＨＭＧＢ１  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  （Ｍ０２），Ｃｌｏｎｅ  １Ｄ５（商品名、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  Ｈ００３１４６−Ｍ０２）である。
【００４１】
また、抗体（Ｄ）には、式ＩＶで表されるアミノ酸配列から1ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、もしくは付加、または修飾を施したペプチドにＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）タグを修飾したタンパク質を免疫原として用い、マウスに免疫することにより、産生し、取得される、ヒトＨＭＧＢ１に特異的な反応性を有するモノクローナル抗体も含む。
【００４２】
（４）担体に固相化された第１の抗体について
本発明の免疫学的測定方法及び免疫学的測定キットにおける担体に固相化された第１の抗体とは、抗体（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）と、担体とを、物理吸着法、化学的結合法またはこれらの併用等の方法により、吸着、結合させて調整した抗体を意味する。
物理吸着法により抗体を固相化する場合は、公知の方法に従い調整することができる。例えば、抗体と担体を緩衝液などの溶液中で混合し接触させる方法、緩衝液などに溶解した抗体と担体を接触させる方法などが挙げられる。
【００４３】
また、化学的結合法により抗体を固相化する場合も公知の方法に従い調整することができる。例えば、抗体と担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステルまたはマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させて、抗体と担体双方のアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基、または水酸基等と反応させる方法などが挙げられる。
【００４４】
また、非特異的反応や、抗体を固相化させた担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、公知の方法により処理することができる。例えば、抗体を固相化させた担体の表面または内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミンもしくはその塩などのタンパク質、界面活性剤または脱脂粉乳等を接触させ、被覆させる方法などが挙げられる。
【００４５】
（５）標識物質が修飾されている第２の抗体について
本発明の免疫学的測定方法及び免疫学的測定キットにおける標識物質が修飾されている第２の抗体とは、抗体（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、または（Ｄ）と、標識物質とを、物理吸着法、化学的結合法またはこれらの併用等の方法により、吸着、結合させて調整した抗体を意味する。
物理吸着法により抗体に標識物質を結合させる場合は、公知の方法に従い調整することができる。例えば、抗体と標識物質を緩衝液などの溶液中で混合し接触させる方法、緩衝液などに溶解した抗体と標識物質を接触させる方法などが挙げられる。
【００４６】
例えば、標識物質が金コロイドやラテックスである場合は物理吸着法が有効であり、抗体と金コロイドとを緩衝液中で混合し接触させることで、金コロイド標識を有する抗体を得ることができる。
また、化学的結合法により抗体に標識物質を修飾させる場合には、公知の方法に従い調整することができる。例えば、抗体と標識物質をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステルまたはマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させて、抗体と標識物質双方のアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基、または水酸基等と反応させる方法などが挙げられる。例えば、標識物質が蛍光物質や酵素、または化学発光物質である場合、化学結合法が有効である。
【００４７】
また、非特異的反応や、標識物質を修飾させた抗体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、公知の方法により処理することができる。例えば、標識物質を結合させた抗体に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミンもしくはその塩などのタンパク質、界面活性剤または脱脂粉乳等を接触させ、被覆させる方法などが挙げられる。
【００４８】
また標識物質としては、酵素免疫測定法の場合、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素、またはアミラーゼ等を用いることができる。
また、蛍光免疫測定法の場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート、ジクロロトリアジンイソチオシアネート、シアニン、またはメロシアニン等を用いることができる。
また、放射免疫測定法の場合には、トリチウム、ヨウ素１２５またはヨウ素１３１等を用いることができる。
【００４９】
また、発光免疫測定法の場合には、ルミノール系、ルシフェラーゼ系、アクリジニウムエステル系、またはジオキセタン化合物系等を用いることができる。
また、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法の場合には、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸共重合体、ポリアクロレイン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリル酸共重合体、スチレン−ブタジエン酸共重合体、メタクリル酸所オ剛体、アクリル酸重合体、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、金属コロイド、セラミックス、または磁性体等の材質よりなる微粒子を用いることができる。
【００５０】
（６）担体について
本発明の免疫学的測定方法における担体は、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス、または、磁性体等の材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック、メンブレン、または試験片等の形状の固相担体を用いることができる。具体的に本発明の担体が最も好ましくは、光導波路として構成されるウェイブガイドである。
【００５１】
（７）免疫学的測定キットについて
本発明の免疫学的測定キットとは、試料に含まれるＨＭＧＢ１を、抗原抗体反応を利用して測定を行うための免疫学的測定キットにおいて、前記第１及び第２の抗体が、抗体（Ａ）と抗体（Ｂ）、抗体（Ａ）と抗体（Ｃ）、抗体（Ｂ）と抗体（Ａ）、抗体（Ｂ）と抗体（Ｃ）、抗体（Ｂ）と抗体（Ｄ）、抗体（Ｃ）と抗体（Ｂ）の組み合わせのうち、少なくとも１つであることを特徴とするものであり、前述した本発明の免疫学的測定方法に使用することができるものである。従って、本発明の免疫学的測定キットに使用する測定原理等については、前述した免疫学的測定方法と同様である。
【００５２】
（８）その他の試薬成分について
本発明の免疫学的測定キットにおいて、溶媒としては、各種の水系溶媒を用いることができる。この水系溶媒としては、例えば、精製水、生理食塩水、またはトリス緩衝液、リン酸緩衝液もしくはリン酸緩衝液生理食塩水などの各種緩衝液を挙げることができる。この緩衝液のｐＨについては、適宜適当なｐＨを選択して用いればよく、特に限定されることはないが、ｐＨ３〜１２の範囲内のｐＨを選択して用いることが一般的である。
【００５３】
また、本発明の免疫学的測定キットには、前述した担体に固相化された第１の抗体と標識物質が修飾されている第２の抗体の他に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼインもしくはその塩などのタンパク質、各種塩類、各種糖類、脱脂粉乳、正常ウサギ血清などの各種動物血清、アジ化ナトリウムもしくは抗生物質などの各種防腐剤、活性化物質、反応促進物質、ポリエチレングリコールなどの感度増加物質、非特異的反応抑制物質、または非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤もしくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の１種または２種以上を適宜含有させてもよい。そして、これらを測定試薬に含有させる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。
【００５４】
（９）免疫学的測定キットの構成について
本発明の免疫学的測定キットは、前記第１及び第２の抗体が、抗体（Ａ）と抗体（Ｂ）、抗体（Ａ）と抗体（Ｃ）、抗体（Ｂ）と抗体（Ａ）、抗体（Ｂ）と抗体（Ｃ）、抗体（Ｃ）と抗体（Ｂ）のうち、少なくとも1つが含まれている限り、特に限定されるものではない。
さらに本発明の免疫学的測定キットは、上記２つの抗体を含む試薬以外にも、他の試薬と組み合わせて販売してもよい。
【００５５】
前記の他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、標識物質を含有する試薬、発色などのシグナルを生成する物質を含有する試薬、発色などのシグナルの生成に関与する物質を含有する試薬、校正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬、又は精度管理を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。
そして、前記の他の試薬を第１試薬とし、本発明の免疫学的測定試薬を第２試薬としたり、又は本発明の免疫学的測定試薬を第１試薬とし、前記の他の試薬を第２試薬としたりして、適宜様々な組み合わせにて使用、及び販売を行うことができる。
【００５６】
また、本発明の免疫学的測定キットの形態としては特に限定されるものではないが、短時間かつ簡便に測定を行うためには、本発明の免疫学的測定キットの構成成分が一体となった、一体型の診断キットであることが好ましい。上記一体型の診断キットとしては特に限定されるものではないが、例えば、ELISAキット、蛍光免疫測定キット、イムノクロマトキットなどが挙げられる。
例えばＥＬＩＳＡキットの形態としては、第１の抗体が固相化されたマイクロプレート、検体希釈液、HRP等の酵素が修飾された第２の抗体、洗浄緩衝液、及び基質溶液等が含まれる。
【００５７】
また、蛍光免疫測定キットの場合には、第１の抗体が固相化された光導波路、検体希釈液、蛍光物質が修飾された第２の抗体、及び洗浄緩衝液等が含まれる。
またイムノクロマトキットの場合には、反応カセット内にメンブレンが収納されており、そのメンブレン上の一端（下流側）に前記第１の抗体が固相化されている。また、メンブレン上の逆の一端（上流側）には、展開液が装着されており、その近傍の下流側には、上記標識剤の基質が添加されたパッドが配置されており、メンブレンの中間部には前記標識を有する第２の抗体が添加されたパッドが配置されている態様等を挙げることができる。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５９】
（比較例１）
「短時間でＨＭＧＢ１の測定が可能なＨＭＧＢ１抗体の選定（１）」
比較例１では、短時間でＨＭＧＢ１の検出が可能な抗体の組み合わせを選定するために、市販されているＨＭＧＢ１抗体を用いて、蛍光免疫測定法（サンドイッチ法）による測定を行い、検量範囲と検出限界を比較した。
【００６０】
（１）選定に使用したＨＭＧＢ１抗体
選定に使用したＨＭＧＢ１抗体の一部を表１に示した。また、表に示したＨＭＧＢ１抗体は、Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−ＨＭＧＢ１，２  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（商品名、ＳＨＩＮＯ−ＴＥＳＴ社）、ＨＭＧＢ１  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  （Ｍ０８），Ｃｌｏｎｅ  ２Ｆ６（商品名、Ａｂｎｏｖａ社）、ＨＭＧＢ１  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｍ０２），Ｃｌｏｎｅ  １Ｄ５（商品名、Ａｂｎｏｖａ社）、Ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ｔｏ  ＨＭＧＢ１  −  Ａｍｉｎｏｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄ（商品名、Ａｂｃａｍ社）、Ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ｔｏ  ＨＭＧＢ１（商品名、Ａｂｃａｍ社）、Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  [ＨＡＰ４６．５]  ｔｏ  ＨＭＧＢ１（商品名、Ａｂｃａｍ社）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ＨＭＧＢ１（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐ社）、Ｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １  （ｈｕｍａｎ）  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｅｔ（Ａｐｏｔｅｃｈ社）を用いた。
【００６１】
なお、市販抗体の選定に当たっては、N末端側のペプチドを免疫原として用い、種々の動物に免疫することにより産生し、取得された抗体と、全長のリコンビナントＨＭＧＢ１を免疫原として用い、種々の動物に免疫することにより産生し、取得された抗体を中心に選んだ。
また、ＨＭＧＢ１抗原は、ＡＴＧｅｎ社、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐ社、ＳＨＩＮＯ−ＴＥＳＴ社のＨＭＧＢ１を適宜使用した。
【００６２】
【表１】
2011095014.tif 000002
【００６３】
（２）担体への第１の抗体の固相化
表1に示した記号ア〜クのＨＭＧＢ１抗体を用いて下記の操作を行った。
まず、蛍光免疫測定に用いる光導波路であるウェイブガイド（キヤノン化成社製）を用意した。次に、ＨＭＧＢ１抗体をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）で１０μｇ／ｍＬに希釈した後、ウェイブガイド専用ホルダー（キヤノン化成社製）に１００μＬずつ分注し、ウェイブガイドをホルダー内の溶液に浸漬させて４℃で一昼夜静置した。その後、ウェイブガイドを取り出し、表面をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）で洗浄した。次に、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）で５％に希釈したＢＳＡをウェイブガイド専用ホルダーに１００μＬずつ分注し、これにウェイブガイドを浸漬させて、室温で２時間静置した。その後、ウェイブガイドを取り出し、表面をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）で洗浄した。最後にウェイブガイドを乾燥させて４℃で保存した。
【００６４】
（３）第２の抗体への蛍光物質の標識
表１に示した各ＨＭＧＢ１抗体（第２の抗体）への蛍光物質の標識は、
ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒｅ（商標名）  ６４７  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（商品名、ＤＯＪＩＮＤＯ社製）を用いてメーカープロトコール通りに行った。
次に、１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）を用いて、蛍光標識された第２の抗体を５μｇ／ｍＬに調整し、４℃で保存した。
【００６５】
（４）短時間でＨＭＧＢ１の測定が可能なＨＭＧＢ１抗体の組み合わせ選定
短時間でＨＭＧＢ１の測定が可能なＨＭＧＢ１抗体の組み合わせの選定には、蛍光免疫測定装置ＰＲ６１０−２（商品名、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を用いた。
具体的には、ＰＲ６１０−２専用の測定ホルダーに、第１の抗体を固相化したウェイブガイドを挿入し、また、５μｇ／ｍＬの蛍光標識された第２抗体１００μＬを分注した。更に、５％ＢＳＡ含有リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）を用いて、８濃度（１００００、１０００、１００、１０、１、０．１、０．０１、０ｎｇ／ｍＬ）または８濃度（１０００、２５０、６２．５、１５．６、３．９１、０．９８、０．２４、０ｎｇ／ｍＬ）のＨＭＧＢ１抗原溶液を調整し、それぞれを専用ホルダーに１００μＬずつ分注した。
【００６６】
本比較例では、短時間にＨＭＧＢ１の測定が可能な抗体の組み合わせを選定するために、第１の抗体を固相化したウェイブガイドとＨＭＧＢ１抗原との反応時間を１０分間とし、また、蛍光標識された第２の抗体との反応時間を５分間に設定した。
また抗体選定の評価基準としては、前記８濃度のＨＭＧＢ１を測定し、得られた検量線が検量範囲１〜１００ｎｇ／ｍＬを包括する抗体の組み合わせを合格とした。
表２の評価１の欄に、ＨＭＧＢ１抗体の組み合わせの選定結果を示した。その結果、Ｎｏ．１１、１２、１４、１６、１９、２２、４３の７通りの抗体の組み合わせが選定基準に合格した。そして、この７種類の抗体の組み合わせは、４つの抗体（記号イ、ウ、エ、キ）から選択される２つの組み合わせであることが分った。
【００６７】
【表２】
2011095014.tif 000003
【００６８】
（比較例２）
「短時間でＨＭＧＢ１の測定が可能なＨＭＧＢ１抗体の選定（２）」
比較例２では、比較例１で選定した７通りの抗体の組み合わせ（Ｎｏ．１１、Ｎｏ．１２、Ｎｏ．１４、Ｎｏ．１６、Ｎｏ．１９、Ｎｏ．２２、Ｎｏ．４３）を用いて、ＨＭＧＢ２との交差性について調べた。
【００６９】
（１）選定に使用したＨＭＧＢ１抗体
選定には、ＨＭＧＢ１  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  （Ｍ０８），Ｃｌｏｎｅ  ２Ｆ６（記号イ）、Ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ｔｏ  ＨＭＧＢ１  −  Ａｍｉｎｏｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄ（記号エ）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ＨＭＧＢ１（記号キ）の３種類の抗体を第１の抗体としてそれぞれ使用した。また、ＨＭＧＢ１  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  （Ｍ０８），Ｃｌｏｎｅ  ２Ｆ６（記号イ）、ＨＭＧＢ１  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  （Ｍ０２），Ｃｌｏｎｅ  １Ｄ５（記号ウ）、Ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ｔｏ  ＨＭＧＢ１  −  Ａｍｉｎｏｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄ（記号エ）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ＨＭＧＢ１（記号キ）の４種類の抗体を第２の抗体としてそれぞれ使用した。またＨＭＧＢ２抗原は、和光純薬工業社のＨＭＧ−１，−２Ｍｉｘｔｕｒｅ（商品名）からＨＭＧＢ２を精製して使用した。
【００７０】
（２）担体への第１の抗体の固相化
記号イ、エ、キの3種のＨＭＧＢ１抗体を、それぞれリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）で１０μｇ／ｍＬに希釈した後、ウェイブガイド専用ホルダーに１００μＬずつ分注した。
次に、ウェイブガイドを各ＨＭＧＢ１抗体溶液に浸漬させて４℃で一昼夜静置した。その後、ウェイブガイドを取り出し、表面をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）で洗浄した。次に、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）で５％に希釈したＢＳＡをウェイブガイド専用ホルダーに１００μＬずつ分注し、これにウェイブガイドを浸漬させて室温で２時間静置した。その後、ウェイブガイドを取り出し、表面をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）で洗浄した。最後にウェイブガイドを乾燥させて、４℃で保存した。
【００７１】
（３）第２の抗体への蛍光物質の標識
記号イ、ウ、エ、キの４種のHMGB1抗体への蛍光物質の標識は、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ（商標名）  ６４７  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（商品名、ＤＯＪＩＮＤＯ社製）を用いてプロトコール通りに行った。次に、１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）を用いて、蛍光標識された第２の抗体を５μｇ／ｍＬに調整し、４℃で保存した。
【００７２】
（４）ＨＭＧＢ２との交差性の確認
ＨＭＧＢ２との交差性の確認には、蛍光免疫測定装置ＰＲ６１０−２を用いた。
具体的には、ＰＲ６１０−２専用の測定ホルダーに、第１の抗体を固相化したウェイブガイドを挿入し、また、５μｇ／ｍＬの蛍光標識された第２抗体１００μＬを分注した。更に、５％ＢＳＡ含有リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）を用いて、８濃度（１０００、２５０、６２．５、１５．６、３．９１、０．９８、０．２４、０ｎｇ／ｍＬ）のＨＭＧＢ２抗原溶液を調整し、それぞれを専用ホルダーに１００μＬずつ分注した。
本比較例では、第１の抗体を固相化したウェイブガイドとＨＭＧＢ２抗原との反応時間を１０分間とし、また、蛍光標識された第２の抗体との反応時間を５分間に設定した。また抗体選定の評価基準としては、前記８濃度のＨＭＧＢ２を測定し、何れの濃度においても信号が得られない抗体の組み合わせを合格とした。
【００７３】
表２の評価２の欄に、ＨＭＧＢ２との交差性について検討した結果を示した。Ｎｏ．１１、１２、１４、１６、１９、２２、４３の７通りの組み合わせを検討したところ、Ｎｏ.１２に明らかなＨＭＧＢ２との交差性が認められた。
以上のことから、Ｎｏ．１１、Ｎｏ．１４、Ｎｏ．１６、Ｎｏ．１９、Ｎｏ．２２、Ｎｏ．４３の抗体の組み合わせは、ＨＭＧＢ２との交差性を有することなく、ＨＭＧＢ１を短時間に測定可能であることが分った。
【００７４】
（実施例１）
「本発明の免疫学的測定方法及び免疫学的測定キットによるＨＭＧＢ１の短時間測定」
比較例１及び２で選定したＨＭＧＢ１抗体の組み合わせのうち、結果が良好であった抗体の組み合わせ（Ｎｏ.１１、１９）を用いて、ＨＭＧＢ１の短時間測定を行った。
【００７５】
（１）担体への第１の抗体の固相化
記号エ及びキで示したＨＭＧＢ１抗体を、それぞれリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）で１０μｇ／ｍＬに希釈した後、ウェイブガイド専用ホルダーに１００μＬずつ分注した。次に、ウェイブガイドを各ＨＭＧＢ１抗体溶液に浸漬させて４℃で一昼夜静置した。その後、ウェイブガイドを取り出し、表面をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）で洗浄した。次に、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）で５％に希釈したＢＳＡをウェイブガイド専用ホルダーに１００μＬずつ分注し、これにウェイブガイドを浸漬させて室温で２時間静置した。その後、ウェイブガイドを取り出し、表面をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）で洗浄した。最後にウェイブガイドを乾燥させて４℃で保存した。
【００７６】
（２）第２の抗体への蛍光物質の標識
記号エ及びキで示したＨＭＧＢ１抗体への蛍光物質の標識は、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ（商標名）  ６４７  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（商品名、ＤＯＪＩＮＤＯ社製）を用いてプロトコール通りに行った。
次に、１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）を用いて、蛍光標識された第２の抗体を５μｇ／ｍＬに調整し、４℃で保存した。
【００７７】
（３）本発明の免疫学的測定方法及び免疫学的測定キットによるＨＭＧＢ１の短時間測定
本発明の免疫学的測定方法及び免疫学的測定キットによるHMGB1の短時間測定には、蛍光免疫測定装置ＰＲ６１０−２を用いた。
具体的には、ＰＲ６１０−２専用の測定ホルダーに、記号エまたはキのＨＭＧＢ１抗体を固相化したウェイブガイドを挿入し、また、５μｇ／ｍＬの蛍光標識された記号キまたはエのＨＭＧＢ１抗体１００μＬを分注した。更に、５％ＢＳＡ含有リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）を用いて、１２濃度（１０μｇ／ｍＬ−１ｐｇ／ｍＬ）のＨＭＧＢ１抗原溶液（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐ社）を調整し、それぞれを専用ホルダーに１００μＬずつ分注した。
【００７８】
本実施例では、第１の抗体を固相化したウェイブガイドとＨＭＧＢ１抗原との反応時間を１０分間とし、また、蛍光標識された第２の抗体との反応時間を５分間に設定した。さらに、各濃度のＨＭＧＢ１抗原を４回ずつ測定した。
図１にＨＭＧＢ１抗体の組み合わせ（Ｎｏ.１１、１９）の検量線を示した。Ｎｏ.１１及びＮｏ.１９の検量線は、検量範囲１〜１００ｎｇ／ｍＬを包括していた。また、測定時間はＨＭＧＢ１抗原との反応時間が１０分、蛍光標識された第２の抗体との反応時間が５分であり、蛍光免疫測定装置の洗浄操作時間を加えても、約２０分でＨＭＧＢ１の測定結果を得ることができた。
これらの結果は、従来の測定キットと比較し、非常に短時間であった。
【００７９】
（４）組み合わせの評価
図２に、本発明のＨＭＧＢ１抗体の組み合わせ（Ｎｏ．１１、Ｎｏ．１２、Ｎｏ．１４、Ｎｏ．１６、Ｎｏ．１９、Ｎｏ．２２、Ｎｏ．４３）と、それ以外の組み合わせ（Ｎｏ.８、Ｎｏ.１３、Ｎｏ.１８）を比較したデータを示した。
本発明のＨＭＧＢ１抗体の組み合わせは、それ以外の組み合わせに対して検量範囲１〜１００ｎｇ／ｍＬでの濃度変化に対する感度が顕著であり、迅速且つ高感度な検出が可能であることがわかる。
【図１】
2011095014.tif 000004
【図２】
2011095014.tif 000005
【配列表】
2011095014000001.app