(57)【要約】      （修正有）【課題】遠心分離を行わずにウイルスを安全に効率よく濃縮可能なウイルスの濃縮方法を提供する。【解決手段】糖鎖固定化金属ナノ粒子が第一の磁性体に結合した構造を有する糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子よりも平均粒子径が大きい第二の磁性体と、検体とを含有する混和物に磁力を加える工程を含み、上記糖鎖固定化金属ナノ粒子は、リガンド複合体が、硫黄原子によって金属ナノ粒子と結合した構造を有し、上記リガンド複合体は、リンカー化合物のアミノ基に、還元末端を有する糖鎖が結合した構造を有し、上記リンカー化合物は、分子内にアミノ基と、硫黄原子と、主鎖に炭素−窒素結合を有する炭化水素鎖とを備える化合物である。【選択図】図１
2011045358.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖鎖固定化金属ナノ粒子が第一の磁性体に結合した構造を有する糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子よりも平均粒子径が大きい第二の磁性体と、検体とを含有する混和物に磁力を加える工程を含み、
上記糖鎖固定化金属ナノ粒子は、リガンド複合体が、硫黄原子によって金属ナノ粒子と結合した構造を有し、上記リガンド複合体は、リンカー化合物のアミノ基に、還元末端を有する糖鎖が結合した構造を有し、上記リンカー化合物は、分子内にアミノ基と、硫黄原子と、主鎖に炭素−窒素結合を有する炭化水素鎖とを備える化合物であることを特徴とするウイルスの濃縮方法。
【請求項２】
上記混和物は、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の糖鎖に検体を接触させて得られた検体接触磁性金属ナノ粒子に上記第二の磁性体を混和することによって得られることを特徴とする請求項１に記載のウイルスの濃縮方法。
【請求項３】
上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の平均粒子径が１ｎｍ以上１００ｎｍ未満であり、上記第二の磁性体の平均粒子径が１００ｎｍ以上１００μｍ以下であることを特徴とする請求項１または２に記載のウイルスの濃縮方法。
【請求項４】
上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と上記第二の磁性体との重量比は、１：１×１０３〜１：１×１０１１であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載のウイルスの濃縮方法。
【請求項５】
上記第一の磁性体および上記第二の磁性体は、それぞれ独立して、酸化鉄、マグネタイトまたはフェライトであることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載のウイルスの濃縮方法。
【請求項６】
糖鎖固定化金属ナノ粒子が第一の磁性体に結合した構造を有する糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子よりも平均粒子径が大きい第二の磁性体と、を含有する磁性体組成物であって、
上記糖鎖固定化金属ナノ粒子は、リガンド複合体が、硫黄原子によって金属ナノ粒子と結合した構造を有し、上記リガンド複合体は、リンカー化合物のアミノ基に、還元末端を有する糖鎖が結合した構造を有し、上記リンカー化合物は、分子内にアミノ基と、硫黄原子と、主鎖に炭素−窒素結合を有する炭化水素鎖とを備える化合物であることを特徴とする磁性体組成物。
【請求項７】
少なくとも、請求項６に記載の磁性体組成物と、磁石とを備えることを特徴とする濃縮装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なウイルスの濃縮方法および磁性体組成物に関し、より具体的には、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と、該粒子よりも粒径が大きい磁性粒子とを含有する磁性体組成物を用いることにより、遠心分離を行わずにウイルスを安全に効率よく濃縮可能なウイルスの濃縮方法および上記磁性体組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
我々の細胞の表面は殆ど糖鎖で覆われている。ウイルスは、細胞表層に存在する糖鎖を認識し、細胞に感染することが知られている。ウイルスが高等な動植物へ感染し、動植物に生じる病気として感染症がある。この感染症は、同じ動植物種であると伝染してしまう例が多い。例えばヒトであればインフルエンザウイルスによる流行により健康被害が生じ、また家畜や農作物、観賞用動植物の場合は、それぞれの動植物に感染する微生物であれば同じく伝染し生産被害を及ぼすこともある。そのため動植物等に感染するウイルスを同定することは、感染症の早期診断、また治療や予防指針を決定するための必要な情報である。
【０００３】
本発明者はこれまでに、多くの成分が含まれる検体から目的のウイルス等を濃縮する方法、並びに上記濃縮されたウイルス等の同定を短時間で行う方法を提供することを目的として、糖鎖を、所定の構造を持つリンカー化合物に結合させたリガンド複合体を金属に固定することによって調製した糖鎖固定化金属ナノ粒子等を用い、ウイルス等の糖鎖結合性を利用してウイルス等を濃縮する方法を開発することに成功している（特許文献１）。
【０００４】
ウイルスの大きさは１００ｎｍ程度であり、一般的には超遠心などの遠心分離を用いてウイルスの回収および濃縮が行われる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−１４８２４６号公報（２００９年７月９日公開）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上述のように遠心分離によってウイルスの回収、濃縮を行う場合、サンプルに対し非常に大きな重力を加えることになるため、サンプル間の重量バランスの不均衡などに起因して、遠心分離機の運転中にサンプルが飛散するなどの危険性がつきまとう。濃縮されたウイルスの飛散は避けなければならないため、遠心分離を用いずにウイルスの濃縮を行うための方法が求められていた。
【０００７】
本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、遠心分離を行わずにウイルスを安全に効率よく濃縮可能なウイルスの濃縮方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、遠心分離に代わる方法について鋭意検討し、上記糖鎖固定化金属ナノ粒子に磁性を付与し、ウイルスが結合した上記糖鎖固定化金属ナノ粒子を磁力によって回収することにより、遠心分離を用いた場合に匹敵する回収効率を実現し、しかも安全にウイルスを濃縮できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明にかかるウイルスの濃縮方法は、糖鎖固定化金属ナノ粒子が第一の磁性体に結合した構造を有する糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子よりも平均粒子径が大きい第二の磁性体と、検体とを含有する混和物に磁力を加える工程を含み、上記糖鎖固定化金属ナノ粒子は、リガンド複合体が、硫黄原子によって金属ナノ粒子と結合した構造を有し、上記リガンド複合体は、リンカー化合物のアミノ基に、還元末端を有する糖鎖が結合した構造を有し、上記リンカー化合物は、分子内にアミノ基と、硫黄原子と、主鎖に炭素−窒素結合を有する炭化水素鎖とを備える化合物であることを特徴としている。
【００１０】
本発明者は、糖鎖固定化金属ナノ粒子に磁性を付与した糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子であって、ライフサイエンス、医療診断、バイオテクノロジーなどの様々な分野への利用に適した、粒径が均一で高い水分散性を有し、かつ容易に糖鎖を固定化することができる安定な糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を製造している。この糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子は、糖鎖固定化金属ナノ粒子が第一の磁性体に結合した構造を有する糖鎖固定化磁性ナノ粒子に相当するが、該粒子に磁力を加えた場合、ウイルスを十分に濃縮することが困難であった。
【００１１】
そこで本発明者は、試行錯誤の結果、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子とともに、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子よりも平均粒子径が大きい第二の磁性体を併用することによって、短時間で、遠心分離を用いた場合に匹敵する十分量のウイルスを安全に濃縮することができることを見出した。
【００１２】
このように、上記構成によれば、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子よりも平均粒子径が大きい第二の磁性体とを用いているため、短時間で、遠心分離を用いた場合に匹敵する十分量のウイルスを濃縮することができる。それゆえ、安全かつ効率的に目的とするウイルスの濃縮を行うことができ、ウイルスの検出や同定を迅速、簡便かつ高感度に行うことができる。
【００１３】
本発明にかかるウイルスの濃縮方法では、上記混和物は、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の糖鎖に検体を接触させて得られた検体接触磁性金属ナノ粒子に上記第二の磁性体を混和することによって得られることが好ましい。
【００１４】
検体中にウイルスが存在する場合は、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と、上記第二の磁性体と、検体とが混和されることによって、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子が有する糖鎖をウイルスが認識し、上記糖鎖にウイルスが特異的に結合する。第二の磁性体にはウイルスは結合しないため、上記糖鎖へのウイルスの結合は、上記第二の磁性体の存在下で行われても構わないが、上記糖鎖とウイルスとをまず結合させ、その後に第二の磁性体を混和する方が、上記糖鎖とウイルスとの結合をより効率よく短時間で行うことができるため好ましい。
【００１５】
本発明にかかるウイルスの濃縮方法は、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の平均粒子径が１ｎｍ以上１００ｎｍ未満であり、上記第二の磁性体の平均粒子径が１００ｎｍ以上１００μｍ以下であることが好ましい。
【００１６】
上記構成によれば、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子および上記第二の磁性体の平均粒子径がウイルスの大きさに対して最適となるため、ウイルスが結合した上記混和物の磁力による捕集をより容易に行うことができる。そのため、ウイルスの検出や同定をより迅速、簡便かつ高感度に行うことができる。
【００１７】
本発明にかかるウイルスの濃縮方法は、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と上記第二の磁性体との重量比が、１：１×１０３〜１：１×１０１１であることが好ましい。
【００１８】
上記構成によれば、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と上記第二の磁性体との使用量の比が、ウイルスが結合した上記混和物の磁力による捕集に対して最適となる。そのため、ウイルスの検出や同定をより迅速、簡便かつ高感度に行うことができる。
【００１９】
本発明にかかるウイルスの濃縮方法は、上記第一の磁性体および上記第二の磁性体が、それぞれ独立して、酸化鉄、マグネタイトまたはフェライトであることが好ましい。
【００２０】
上記構成によれば、酸化鉄、マグネタイトおよびフェライトは表面に容易に金属を析出させることができるため、糖鎖固定化金属ナノ粒子を表面に強固にかつ簡単に結合させることができる。つまり、リンカー化合物を介して糖鎖分子を表面に強固にかつ簡単に結合させることができる。よって、磁力を加えることにより、上記糖鎖分子に結合したウイルスを効率よく濃縮することができる。
【００２１】
本発明にかかる磁性体組成物は、糖鎖固定化金属ナノ粒子が第一の磁性体に結合した構造を有する糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子よりも平均粒子径が大きい第二の磁性体と、を含有する磁性体組成物であって、上記糖鎖固定化金属ナノ粒子は、リガンド複合体が、硫黄原子によって金属ナノ粒子と結合した構造を有し、上記リガンド複合体は、リンカー化合物のアミノ基に、還元末端を有する糖鎖が結合した構造を有し、上記リンカー化合物は、分子内にアミノ基と、硫黄原子と、主鎖に炭素−窒素結合を有する炭化水素鎖とを備える化合物であることを特徴としている。
【００２２】
上記磁性体組成物は、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子よりも平均粒子径が大きい第二の磁性体を含有しているため、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子のみを用いる場合よりも、磁力による捕集が容易な構成となっている。そのため、上記磁性体組成物に含まれる糖鎖にウイルスを結合させた後で磁力を加えることにより、短時間で、遠心分離を用いた場合に匹敵する十分量のウイルスを濃縮することができる。それゆえ、安全かつ効率的に目的とするウイルスを濃縮するために好適に用いることができる。
【００２３】
本発明にかかる濃縮装置は、少なくとも、本発明にかかる磁性体組成物と、磁石とを備えることを特徴としている。
【００２４】
上記構成によれば、濃縮対象のウイルス等を上記装置に供給して上記磁性体組成物に結合させ、上記磁石によって磁力を加えることによって、上記ウイルス等の濃縮を行うことができ、上記濃縮を自動で行うことができる。それゆえ、ウイルス等の検出や同定を迅速、簡便かつ高感度に行うことができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明にかかるウイルスの濃縮方法は、糖鎖固定化金属ナノ粒子が第一の磁性体に結合した構造を有する糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子よりも平均粒子径が大きい第二の磁性体と、検体とを含有する混和物に磁力を加える工程を含み、上記糖鎖固定化金属ナノ粒子は、リガンド複合体が、硫黄原子によって金属ナノ粒子と結合した構造を有し、上記リガンド複合体は、リンカー化合物のアミノ基に、還元末端を有する糖鎖が結合した構造を有し、上記リンカー化合物は、分子内にアミノ基と、硫黄原子と、主鎖に炭素−窒素結合を有する炭化水素鎖とを備える化合物であるという構成である。それゆえ、ウイルスの検出や同定を迅速、簡便かつ高感度に行うことができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】後述する実施例１において、溶液２の調製からリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに供する上清の調製までの工程を示すフローチャートである。
【図２】ヘパリンを固定化した糖鎖固定化磁性金ナノ粒子と、第二の磁性体と、インフルエンザウイルスとを含有する混和物に磁力を加える様子を示す図である。
【図３】粗α−グルコース固定化磁性金ナノ粒子のコロイド溶液の透過型電子顕微鏡画像を示す図である。
【図４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質の精製過程を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明について詳しく説明する。なお、本明細書において、範囲を示す「Ａ〜Ｂ」は、Ａ以上Ｂ以下であることを表す。また、本明細書中に記載された非特許文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【００２８】
（１．ウイルスの濃縮方法）
本発明にかかるウイルスの濃縮方法は、糖鎖固定化金属ナノ粒子が第一の磁性体に結合した構造を有する糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子よりも平均粒子径が大きい第二の磁性体と、検体とを含有する混和物に磁力を加える工程を含み、上記糖鎖固定化金属ナノ粒子は、リガンド複合体が、硫黄原子によって金属ナノ粒子と結合した構造を有し、上記リガンド複合体は、リンカー化合物のアミノ基に、還元末端を有する糖鎖が結合した構造を有し、上記リンカー化合物は、分子内にアミノ基と、硫黄原子と、主鎖に炭素−窒素結合を有する炭化水素鎖とを備える化合物である。
【００２９】
本明細書において、「糖鎖固定化金属ナノ粒子」とは、リガンド複合体が、硫黄原子によって金属ナノ粒子と結合した構造を有する粒子をいう。また、糖鎖固定化金属ナノ粒子が第一の磁性体に結合した構造を有する粒子を、「糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子」という。
【００３０】
本明細書において、「リガンド複合体」とは、任意の金属と結合することのできる上記リンカー化合物と、ウイルス中のタンパク質などと特異的に相互作用することのできる糖鎖とから構成される化合物であり、上記リンカー化合物のアミノ基に、還元末端を有する糖鎖が結合した構造を有する化合物をいう。そのため、上記リガンド複合体は、タンパク質等の物質と、非特異的な疎水性に基づく相互作用を起こさないものであることが必要とされる。
【００３１】
リガンド複合体に含まれる上記リンカー化合物は分子内に硫黄原子を有するため、この硫黄原子によって、金属との間に金属−硫黄結合（例えば、Ａｕ−Ｓ結合）を形成し、金属に強固に結合することができる。これにより、リガンド複合体に含まれる糖鎖が、リンカー化合物を通して間接的に金属に固定される。
【００３２】
上記リンカー化合物は、分子内にアミノ基を有し、主鎖に炭素−窒素結合を有する。上記リンカー化合物のアミノ基には還元末端を有する糖鎖が結合し、硫黄原子は金属ナノ粒子と結合するので、金属ナノ粒子上に糖鎖分子を集合化して配列することができる。また、上記アミノ基には、還元末端を有する糖鎖とアミノ基との間の還元アミノ化反応によって、上記糖鎖を簡便に導入することができる。
【００３３】
上記金属ナノ粒子とは、平均粒子径が好ましくは１ｎｍ以上１００ｎｍ未満であるコロイド状の金属粒子を意味する。平均粒子径が１ｎｍ未満ではナノ粒子が作製し難く、平均粒子径が１００ｎｍ以上の場合は、コロイドそのものが沈降してしまい、ウイルスとの反応がおこらない恐れがある。また、ウイルスの大きさが１００ｎｍ程度であることから、ウイルスより大きな粒子を用いるとウイルスへの結合効率が低下する恐れがある。平均粒子径の算出方法等については後述する。
【００３４】
上記金属としては、金、銀、銅、アルミニウム、白金、酸化アルミニウム、ＳｒＴｉＯ３、ＬａＡｌＯ３、ＮｄＧａＯ３、ＺｒＯ２等を用いることができる。中でも金であることがより好ましい。金としては、入手の容易性に鑑みると、塩化金酸およびその塩類であることが好ましく、塩化金酸であることが特に好ましい。上記金属ナノ粒子を得る方法としては、特に限定されず、例えば、従来公知の方法を用いて、塩化金属酸およびその塩類をメタノール、水またはこれらの混合溶媒等に溶解させ、クエン酸等で還元させて金属イオン（例えば金イオン）を金属（例えば金）へ導くことで得ることができる。上記塩化金属酸およびその塩類の具体例としては、例えば塩化金（III）ナトリウムを挙げることができる。
【００３５】
上記リガンド複合体には、上記リンカー化合物のアミノ基に、還元末端を有する糖鎖が導入されている。言い換えれば、上記リガンド複合体は、上記リンカー化合物と、還元末端を有する糖鎖とが、アミノ基を介して結合している構造を有している。この糖鎖の導入は、例えば、上記リンカー化合物のアミノ基（−ＮＨ２基）と糖との還元アミノ化反応によって行うことができる。つまり、糖鎖中の平衡によって生じるアルデヒド基（−ＣＨＯ基）またはケトン基（−ＣＲＯ基、Ｒは炭化水素基）と、上記リンカー化合物が有するアミノ基とが反応する。そして、この反応によって形成されたシッフ塩基を引き続き還元することによって、アミノ基に容易に糖鎖を導入することができる。
【００３６】
上記リガンド複合体を調製するためには、上記リンカー化合物と上記糖鎖とをモル比１：１〜５０：１で混和することが好ましい。
【００３７】
なお、上記「還元末端を有する糖鎖」とは、アノマー炭素原子が置換を受けていない単糖鎖、オリゴ糖鎖、または多糖鎖である。つまり、上記「還元末端を有する糖鎖」とは、還元糖鎖である。上記還元末端を有する糖鎖としては、市販のものであっても天然のものであってもよく、合成して調製したものや、市販および天然の多糖鎖を分解して調製したものを用いることもできる。
【００３８】
上記還元末端を有する糖鎖としてより具体的には、グルコース、ガラクトース、マンノース、マルトース、イソマルトース、ラクトース、パノース、セロビオース、メリビオース、マンノオリゴ糖、キトオリゴ糖、ラミナリオリゴ糖、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルクロン酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸などが挙げられる。また、これらの糖鎖を含む糖鎖も挙げられるが、これに限定されることはなく、濃縮対象のウイルスが認識する糖鎖を適宜選択し、上記リンカー化合物に導入すればよい。
【００３９】
上記リンカー化合物は、分子内にアミノ基と、硫黄原子と、主鎖に炭素−窒素結合を有する炭化水素鎖とを備える化合物であれば、特に限定されるものではなく、従来公知のリンカー化合物、例えば、本発明者らがこれまでに開発したリンカー化合物を好適に用いることができる。
【００４０】
上記炭化水素鎖は、主鎖が炭素−窒素結合を少なくとも１つ有していればよく、さらに、一部の炭素および／または水素が他の原子や置換基に置換されていてもよい。例えば、炭素−炭素結合（Ｃ−Ｃ結合）の少なくとも1つが炭素−窒素結合（Ｃ−Ｎ結合）に置換されている炭化水素鎖の他、炭素−炭素結合の一部がさらに炭素−窒素結合、炭素−酸素結合（Ｃ−Ｏ結合）、アミド結合（ＣＯ−ＮＨ結合）等に置換されている炭化水素鎖であってもよい。上記アミノ基は糖鎖を結合するために用いられ、上記硫黄原子は金属と結合するために用いられる。
【００４１】
上記アミノ基は、糖鎖を結合しやすくするため、上記炭化水素鎖の末端に位置することが好ましい。上記アミノ基は、修飾されたアミノ基であってもよい。例えば、アセチル基、メチル基、ホルミル基等で修飾されたアミノ基や、芳香族アミノ基を挙げることができる。もちろん、未修飾のアミノ基であってもよい。中でも、芳香族アミノ基であることが好ましい。還元アミノ化反応の最適条件であるｐＨ３〜４の条件下においては、アミノ基がプロトン化されないことが必要である。そのため、芳香族との共役によって、ｐＨ３〜４の条件下でも非共有電子対が窒素原子上に存在しうるアミノ基である芳香族アミノ基であることが好ましい。
【００４２】
上記硫黄原子は、上記炭化水素鎖の一部の炭素が硫黄に置換された状態で存在し、金属−硫黄結合を容易に形成することができるため、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）またはチオール基（ＳＨ基）として、上記炭化水素鎖中に含まれることが好ましい。上記炭化水素鎖において、硫黄原子を含む炭化水素構造は、例えば後述する一般式（１）〜（４）、（６）で表される化合物のように、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）を含む五員環の環状構造であってもよく、例えば一般式（５）で表される化合物のように鎖状構造であってもよい。また、鎖状構造の場合は、直鎖構造であっても枝分かれ構造であってもよい。
【００４３】
リンカー化合物としては、例えばＷＯ２００５／０７７９６５号公報、米国特許公報７３２０８６７Ｂ２に記載の、下記のリンカー化合物を用いることができる。
【００４４】
一般式（１）
【００４５】
【化１】
2011045358.tif 000003
【００４６】
（式中、ｍ１、ｍ２、ｍ３はそれぞれ独立して０以上６以下の整数、ｎ１は１以上６以下の整数）
で表される構造を有する化合物。
【００４７】
一般式（２）
【００４８】
【化２】
2011045358.tif 000004
【００４９】
（式中、ｍ４、ｍ５はそれぞれ独立して０以上６以下の整数、ｎ１は１以上６以下の整数）
で表される構造を有する化合物。
【００５０】
一般式（３）
【００５１】
【化３】
2011045358.tif 000005
【００５２】
（式中、ｎ１、ｑはそれぞれ独立して０以上６以下の整数）
で表される構造を有する化合物。
【００５３】
一般式（４）
【００５４】
【化４】
2011045358.tif 000006
【００５５】
（式中、ｎ２は１以上６以下の整数）
で表される構造を有する化合物。
【００５６】
一般式（５）
【００５７】
【化５】
2011045358.tif 000007
【００５８】
（式中、ｎ１は１以上６以下の整数）
で表される構造を有する化合物。
【００５９】
一般式（６）
【００６０】
【化６】
2011045358.tif 000008
【００６１】
（式中、ｎ１は１以上６以下の整数）
で表される構造を有し、Ｘが以下の一般式（７）で表される構造を有する化合物。
【００６２】
【化７】
2011045358.tif 000009
【００６３】
（式中、ｍ４、ｍ５、ｍ６、ｍ７、Ｐ１、Ｐ２はそれぞれ独立して１以上６以下の整数）
で表される構造を有する化合物。
【００６４】
これらの化合物の中では、特に限定されるものではないが、例えば一般式（１）においてｍ１、ｍ２、ｍ３がそれぞれ１であり、ｎ１が１である化合物、一般式（２）においてｍ４、ｍ５がそれぞれ２であり、ｎ１が１である化合物、一般式（３）においてｎ１およびｑがゼロである化合物、一般式（４）においてｎ２が４である化合物、一般式（５）においてｎ１が３である化合物が好適に用いられる。
【００６５】
リンカー化合物は例えばＷＯ２００５／０７７９６５号公報、米国特許公報７３２０８６７Ｂ２などに記載された従来公知の方法によって製造することができる。例えば、上記一般式（１）、（２）、（３）、（６）で表されるリンカー化合物は、チオクト酸と、芳香族アミノ基末端が保護基によって保護されたアミン化合物との縮合反応を行い、上記芳香族アミノ基末端の保護基を脱保護することによって製造することができる。また、上記一般式（５）で表されるリンカー化合物は、γ−メルカプト酪酸の２量体と、２分子の芳香族アミノ基末端が保護基によって保護されたアミン化合物との縮合反応を行い、上記芳香族アミノ基末端の保護基を脱保護することによって製造することができる。
【００６６】
上記糖鎖固定化金属ナノ粒子は、上記リガンド複合体と上記金属を含む溶液とを混和するだけで製造することができるので、非常に容易に糖鎖を固定化することができる。
【００６７】
本発明にかかるウイルスの濃縮方法においては、糖鎖固定化金属ナノ粒子が第一の磁性体に結合した構造を有する糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を用いる。本明細書において「第一の磁性体」とは、糖鎖固定化金属ナノ粒子が有する金属が結合する磁性体をいう。
【００６８】
磁性体としては特に限定されるものではなく、従来公知の磁性体を用いることができる。例えば、酸化鉄、マグネタイト、酸化クロム、コバルト、フェライト、ニッケル、ガドリニウムなどを挙げることができる。中でも、表面に容易に金属を析出させることができるため、上記第一の磁性体および上記第二の磁性体は、それぞれ独立して、酸化鉄、マグネタイトまたはフェライトであることが好ましい。なお、本明細書においては、酸化鉄とは三価の鉄の酸化物を指すものとする。マグネタイトとは二価および三価の鉄の酸化物（Ｆｅ2＋Ｆｅ3＋2Ｏ4）である。第一の磁性体と第二の磁性体とは、それぞれ異なる磁性体であってもよいが、同一の磁性体であることが好ましい。例えば、第一の磁性体および第二の磁性体が共にマグネタイトであることが好ましい。
【００６９】
「糖鎖固定化金属ナノ粒子が第一の磁性体に結合した構造」とは、糖鎖固定化金属ナノ粒子が有する金属が、第一の磁性体に結合した構造をいう。上記結合の態様としては、特に限定されるものではなく、例えば上記金属が第一の磁性体の表面に金属結合あるいは非特異的吸着によって析出する態様を挙げることができる。
【００７０】
前述のように、本明細書では、糖鎖固定化金属ナノ粒子が第一の磁性体に結合した構造を有する粒子を、「糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子」と称する。糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を調製する方法は特に限定されるものではない。例えば、リガンド複合体の硫黄原子に結合させたい金属のイオンと、上記第一の磁性体とを溶媒中で混和することによって、上記第一の磁性体の表面に上記金属を析出させ、次に上記リガンド複合体を混和し、還元処理することによって得ることができる。これにより、リガンド複合体にＳ−Ｓ結合などの形で含まれる硫黄原子が、例えばＡｕ−Ｓ結合などの金属−硫黄結合により、上記金属に固定されるので、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を調製することができる。
【００７１】
上記溶媒としては特に限定されるものではないが、例えば、水、メタノール、水およびメタノールの混合溶媒などを挙げることができる。また、上記還元処理に用いる還元剤も特に限定されるものではない。例えば、水素化ホウ素ナトリウム、クエン酸およびその塩類、アスコルビン酸およびその塩類、リン、タンニン酸およびその塩類、エタノール、ヒドラジン等を用いることができる。
【００７２】
上記金属のイオンと、上記第一の磁性体と、上記リガンド複合体と、上記還元剤とが混和された溶液において、上記金属が塩化金酸およびその塩類である場合、上記溶液中において、塩化金酸およびその塩類の最終濃度は０．５ｍＭ〜３０ｍＭであることが好ましく、１ｍＭ〜１０ｍＭであることがさらに好ましい。上記還元剤は、上記溶液中の最終濃度が金イオンのモル濃度の３〜２０倍モル濃度であることが好ましく、５〜１０倍モル濃度であることがさらに好ましい。上記リガンド複合体は上記溶液中の最終濃度が０．１ｍＭ〜１００ｍＭであることが好ましく、１ｍＭ〜１０ｍＭであることがさらに好ましい。上記第一の磁性体は、上記溶液中の最終濃度がＦe濃度として０．５ｍＭ〜１０ｍＭであることが好ましく、１ｍＭ〜５ｍＭであることがさらに好ましい。
【００７３】
上記リガンド複合体は、タンパク質と非特異的な相互作用を起こすことによる影響をほぼ無視することができる。それゆえ、上記リガンド複合体を用いることにより、上記糖鎖とウイルスのタンパク質との相互作用を再現性良く評価することが可能である。
【００７４】
得られた上記糖鎖固定化金属ナノ粒子は、磁力を加えることにより、低分子の塩などの非磁性体成分を除くことによって、溶液状態でより安定な状態にすることができる。
【００７５】
上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の平均粒子径の範囲は、ナノスケール（ゼロｎｍより大きく１μｍ未満）であって、後述する第二の磁性体の平均粒子径より小さければ特に限定されるものではないが、１ｎｍ以上１００ｎｍ未満であることが好ましく、２ｎｍ以上５０ｎｍ以下であることがより好ましい。
【００７６】
上記第一の磁性体の平均粒子径は、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の平均粒子径を、ナノスケール（ゼロｎｍより大きく１μｍ未満）であって、第二の磁性体の平均粒子径よりも小さい平均粒子径にすることができる大きさであれば特に限定されるものではないが、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の平均粒子径を１ｎｍ以上１００ｎｍ未満にすることができる大きさであることが好ましく、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の平均粒子径を２ｎｍ以上５０ｎｍ以下とすることができる大きさであることがより好ましい。
【００７７】
また、上記第二の磁性体の平均粒子径の範囲は、平均粒子径の上限が１００μｍであり、かつ、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の平均粒子径より大きければ特に限定されるものではないが、１００ｎｍ以上１００μｍ以下であることが好ましく、１００ｎｍ以上５００００ｎｍ以下であることがより好ましく、１０００ｎｍ以上１００００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。
【００７８】
本発明者らが確認したところ、上記第二の磁性体を使用せず、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子のみを使用した場合は、磁力のみを加えることによっては、遠心分離を用いた場合に匹敵する濃縮効率を得ることはできなかった（後述する実施例１で用いた対照を参照）。次に、本発明者らは、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の粒子径を大きくすることによりこの問題を解決できないか検討したが、やはり遠心分離を用いた場合に匹敵する濃縮効率を得ることはできなかった（後述する比較例１を参照）。
【００７９】
そこで、本発明者らは鋭意検討の結果、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と共に、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子よりも平均粒子径が大きい第二の磁性体を用いることによって、遠心分離を用いた場合に匹敵する濃縮効率を得ることができることを見出した。
【００８０】
そして、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の平均粒子径を上記範囲とし、第二の磁性体の平均粒子径を上記範囲のように調整することにより、両者の平均粒子径が最適化されると推測され、糖鎖固定化磁性ナノ粒子と、上記第二の磁性体と、検体とを含有する混和物に磁力を加えることによって、検体にウイルスが含有されている場合、検体中の微量のウイルスを、遠心分離を用いることなく、より効率よく、簡便かつ安全に濃縮することができる。
【００８１】
上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子はウイルスと一体化しやすいが、磁力が小さいため、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を用いるのみでは、ブラウン運動が障害となって、外部からの磁界によって磁力を加えても有効にウイルスを濃縮することが困難であると推測される。一方、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と共に、上記第二の磁性体を用いると、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と、上記第二の磁性体と、検体とを含有する混和物がブラウン運動に打ち勝つだけの磁力を備えるようになり、その結果、外部からの磁界によって磁力を加えることによって、ウイルスを効果的に濃縮することができるものと推測される。
【００８２】
本明細書において「粒子径」とは、粒子を透過型電子顕微鏡で観察した場合の、粒子の二次元形状に対する最大内接円の直径が意図される。例えば、粒子の二次元形状が実質的に円形状である場合はその円の直径が意図され、実質的に楕円形状である場合はその楕円の短径が意図され、実質的に正方形状である場合はその正方形の辺の長さが意図され、実質的に長方形状である場合はその長方形の短辺の長さが意図される。「平均粒子径」とは、複数個の粒子の上記粒子径の平均値をいう。本明細書において、平均粒子径が所定の範囲の値を有するか否かは、２０個の粒子を透過型電子顕微鏡で観察して、各粒子の上記粒子径を測定し、２０個の粒子の上記粒子径の平均値を求めることによって確認した。
【００８３】
本発明にかかる方法では、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子よりも平均粒子径が大きい第二の磁性体と、検体とを含有する混和物に磁力を加える。上記検体中にウイルスが含有されている場合、ウイルスは糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の糖鎖に結合する。検体としては、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と接触させることができるものであれば特に限定されるものではない。例えば、唾液、鼻粘膜、植物や動物の体液等を挙げることができる。これらはそれ自体を検体として用いてもよいし、例えばＭＥＭ培地や生理食塩水等に添加して調製した液体として用いることもできる。このような検体を、例えば糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を水、生理食塩水またはリン酸緩衝液等に添加して調製した溶液と混和することにより、検体と糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子との接触を行うことができる。
【００８４】
ウイルスは糖鎖を認識する性質を有するため、濃縮対象のウイルスが認識する糖鎖を用いて糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を調製し、検体と接触させることにより、検体中にウイルスが含まれていればウイルスと上記糖鎖とが特異的に結合することになる。
【００８５】
濃縮対象のウイルスとしては、特に限定されるものではない。例えば、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、性病ヘルペスウイルス、エイズウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、水疱瘡ウイルス（ＶＺＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、成人Ｔ細胞白血病ウイルス（HTLV-1）、レンチウイルス、コイヘルペスウイルス、アデノウイルス、ノロウイルス、ロタウイルス等を挙げることができる。
【００８６】
インフルエンザウイルスが特異的に認識する糖鎖としては、例えば、ヘパリン、ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβＧｌｃ、ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβＧｌｃ、ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβＧｌｃ、ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβＧｌｃがある。これらの糖鎖の中から何れかの糖鎖を選択して糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を調製し、検体と接触させることにより、検体中にウイルスが含まれていればウイルスと上記糖鎖とが特異的に結合することになる。
【００８７】
単純ヘルペスウイルス、性病ウイルス、水疱瘡ウイルス（ＶＺＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レンチウイルス、コイヘルペスウイルス、アデノウイルスが特異的に認識する糖鎖としては、例えばヘパリン、ヘパラン硫酸、ヘパラン硫酸を構成する二糖構造、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸を構成する二糖構造を挙げることができる。
【００８８】
また、エイズウイルス、成人Ｔ細胞白血病ウイルスが特異的に認識する糖鎖としては、例えばヘパリン、ヘパラン硫酸、ヘパラン硫酸を構成する二糖構造を挙げることができ、ノロウイルスが特異的に認識する糖鎖としては、例えばフコース、Ｎ−アセチルガラクトサミンを挙げることができる。ロタウイルスが特異的に認識する糖鎖としては、例えばラクトースを挙げることができる。
【００８９】
上記インフルエンザウイルスは、検体中に１×１０−６ヘマグルチニン単位（ＨＡＵ）程度含まれていれば、本発明にかかる方法によって遠心分離を用いることなく、短時間で簡便かつ安全に濃縮することができるため、例えばリアルタイムＰＣＲに供することにより十分に検体中におけるウイルスの存在を検出することができる。
【００９０】
上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と上記第二の磁性体との重量比は、１：１×１０３〜１：１×１０１１であることが好ましい。平均粒子径が上述のような関係にある糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と、第二の磁性体との使用量の比をかかる範囲に調整することによって、濃縮効率をより向上させることができる。
【００９１】
上記「磁力を加える」について、磁力の加え方は特に限定されるものではない。例えば、従来公知の電磁石や棒磁石などの永久磁石を、上記混和物を入れた容器の外壁に当接させることなどによって、上記混和物に磁力を加えることができる。磁力の強さとしては、遠心分離を用いた場合と同等の濃縮効率を得るためには、１００〜５００ミリステラであることが好ましい。
【００９２】
また、上記混和物に磁力を加える工程の終了時期は、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子が液中に分散していることによって呈する着色が、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子が第二の磁性体に吸着されることで薄くなる現象を基準にして判断すればよい。
【００９３】
磁力を加えることによって、ウイルスが結合した糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と、第二磁性体とが磁力により集積される。この集積物からウイルス遺伝子を回収する方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法によることができる。例えば、上記集積物を滅菌水または蒸留水で水洗後、適宜ピペッティングを行い、上記集積物を含む滅菌水または蒸留水を１００℃で加熱することによって、上清にウイルス遺伝子を回収することができる。
【００９４】
上記混和物は、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の糖鎖に検体を接触させて得られた検体接触磁性金属ナノ粒子に上記第二の磁性体を混和することによって得ることが好ましい。これにより、検体中にウイルスが存在している場合には、上記糖鎖をウイルスが認識し、結合し、その後で上記第二の磁性体を混和するので、ウイルスと糖鎖との結合がより迅速に行われるという利点がある。上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と検体との接触は、例えば、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を水、生理食塩水、またはリン酸緩衝液などに添加して調製した溶液と、検体とを混和することにより行うことができる。混和後には、例えばピペッティングなどの手法によって攪拌することにより、ウイルスと糖鎖との結合をより確実に行うことができ、ウイルスと糖鎖との結合に要する時間を短縮することができる。
【００９５】
なお、上記「認識」とは、ウイルスの表面タンパク質が分子内に有する糖結合部位（糖鎖認識部位）によって糖鎖に結合することをいう。上記結合としては、水素結合、イオン結合、静電気的相互作用による結合、ファンデルワールス力による結合等を挙げることができる。
【００９６】
本発明にかかる方法によるウイルスの濃縮結果を確認する方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。例えば、回収したウイルスをＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロッティング、イムノクロマトグラフィー、ＥＬＩＳＡなどに供することによって確認することができる。中でも迅速に遺伝子の定量を行うことができるため、リアルタイムＰＣＲを用いることが好ましい。リアルタイムＰＣＲを用いる場合、濃縮前のＣｔ（Threshold Cycle）値から濃縮後のＣｔ値を差し引いた差分を求め、本発明にかかる方法により濃縮した場合の該差分が、遠心分離によって濃縮した場合の該差分と同等であれば、本発明の課題を解決できたということができる。
【００９７】
（２．磁性体組成物および濃縮装置）
本発明にかかる磁性体組成物は、糖鎖固定化金属ナノ粒子が第一の磁性体に結合した構造を有する糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子よりも平均粒子径が大きい第二の磁性体と、を含有する磁性体組成物であって、上記糖鎖固定化金属ナノ粒子は、リガンド複合体が、硫黄原子によって金属ナノ粒子と結合した構造を有し、上記リガンド複合体は、リンカー化合物のアミノ基に、還元末端を有する糖鎖が結合した構造を有し、上記リンカー化合物は、分子内にアミノ基と、硫黄原子と、主鎖に炭素−窒素結合を有する炭化水素鎖とを備える化合物である。
【００９８】
上記「糖鎖固定化金属ナノ粒子」、「第一の磁性体」、「糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子」、「第二の磁性体」については既に説明したとおりである。上記磁性体組成物は、検体と混和することによって、検体中にウイルスが含まれている場合、該ウイルスが糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の糖鎖に結合する。そして上記第二の磁性体を含んでいるため、該ウイルスを糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の糖鎖に結合させた後に、上記磁性体組成物に磁力を加えることにより、ウイルスの濃縮を行うことができる。
【００９９】
上記磁性体組成物は、例えば、上述のように調製した糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の溶液に上記第二の磁性体を混和することによって調製することができる。この際、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と上記第二の磁性体との重量比が、１：１×１０３〜１：１×１０１１となるように混和することが好ましい。
【０１００】
本発明にかかる濃縮装置は、少なくとも、本発明にかかる上記磁性体組成物と、磁石とを含む。上記装置は、他に、検体、上記磁性体組成物、バッファーなどをそれぞれ貯留しておく貯留部や、これら貯留部から検体、上記磁性体組成物、バッファーなどを吸引するためのポンプ、上記吸引を行う際に吸引量を調整するための電磁弁、検体、上記磁性体組成物、バッファーなどを混合するためのチャンバー等を備えていてもよい。
【０１０１】
例えば、検体と上記磁性体組成物とが混合された後、混合物に対し、磁石によって磁力を加えることにより、ウイルスが結合した上記磁性体組成物を沈殿させることができる。上記沈殿からウイルスを回収する方法については上述のとおりである。なお、上記濃縮装置は、ウイルスの濃縮装置として用いることができることはもちろんであるが、例えば糖鎖を認識する性質を有するバクテリア等を濃縮対象とし、該バクテリア等の濃縮装置として用いることも可能である。
【０１０２】
（３．糖鎖‐タンパク質相互作用の測定方法）
糖鎖固定化金属ナノ粒子が第一の磁性体に結合した構造を有する糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を含む溶液と、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の末端に位置する糖鎖を認識するタンパク質とを混和することによって、糖鎖とタンパク質とを相互作用させ、糖鎖−タンパク質相互作用体を生成させることにより、糖鎖−タンパク質相互作用を測定することができる。以下、糖鎖−タンパク質相互作用を測定する方法を「糖鎖‐タンパク質相互作用の測定方法」という。
【０１０３】
上記「糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を含む溶液」とは、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子が液体に分散したものとの意味である。上記溶液には、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子が含まれていれば、他に塩などが含まれていてもよい。上記液体としては、例えば水や緩衝液等を用いることができる。
【０１０４】
上記タンパク質としては特に限定されるものではなく、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の末端に位置する糖鎖を認識することができるものであればよい。例えば、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の末端に位置する糖鎖がグルコースの場合は、グルコースを認識することができるタンパク質であるコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、レンチルレクチン（ＬＣＡ）、ピーナッツレクチン（ＰＳＡ）等を用いることができる。
【０１０５】
同様に、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の末端に位置する糖鎖がガラクトースである場合は、ガラクトースを認識するタンパク質であるヒマメレクチン（ＲＣＡ１２０）等を用いることができる。また、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の末端に位置する糖鎖がＮ−アセチルグルコサミンである場合は、Ｎ−アセチルグルコサミンを認識するタンパク質である小麦胚芽レクチンなどを用いることができる。
【０１０６】
上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を含む溶液と、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の末端に位置する糖鎖を認識するタンパク質とを混和する方法は特に限定されるものではなく、糖鎖とタンパク質とを相互作用させることができるものであればよい。例えば、マイクロプレートやエッペンドルフチューブなどにタンパク質の希釈系列を作成し、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を含む溶液を添加して放置することにより混和を行うことができる。
【０１０７】
糖鎖とタンパク質との相互作用（以下、「糖鎖−タンパク質相互作用」と称する）としては、水素結合、イオン結合、静電気的相互作用、ファンデルワールス力などを挙げることができる。すなわち、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の末端に位置する糖鎖をタンパク質が認識し、その結果、水素結合等の糖鎖−タンパク質相互作用が生じる。
【０１０８】
上記「糖鎖−タンパク質相互作用体」とは、糖鎖とタンパク質とが相互作用して特異的に結合し、その結果生成される凝集物を意味する。糖鎖−タンパク質相互作用は、糖鎖−タンパク質相互作用体の生成として目視で確認することができる。糖鎖とタンパク質とが相互作用しない場合は、糖鎖−タンパク質相互作用体は形成されない。
【０１０９】
ここで、凝集反応を確認することによって物質間の相互作用を測定する方法としては、例えば抗原抗体反応を用いたラテックス凝集法等を挙げることができる（「バイオ診断薬の開発・評価と企業」、ＣＭＣテクニカルライブラリー１４６、シーエムシー出版、Ｐ９２−９７，Ｐ１０９−１１３）。上記ラテックス凝集法は、ラテックス表面に抗体を固定化させておき、96穴のマイクロプレートを用いて試料抗原の希釈系列を作り、凝集を生じる最大希釈倍率を求め標準溶液と比較して測定するという方法である。結果は一定波長の光で吸光度として測定される。
【０１１０】
しかしながら、コロイドについて凝集反応を確認することによって物質間の相互作用を測定する方法としては、比較的小さな粒子の呈する赤色と比較的大きな粒子の呈する紫色をもって結果を判断するという手法が知られているのみである。したがって、コロイドにおいても糖鎖とタンパク質とを相互作用させて凝集物を生成させ、当該凝集物の生成を確認することによって結果を判定することができる上記「糖鎖‐タンパク質相互作用の測定方法」は、従来の方法よりも非常に簡便であり、有用な方法であるということができる。
【０１１１】
上記「糖鎖‐タンパク質相互作用の測定方法」は、糖鎖−タンパク質相互作用を非標識で測定することができるので、標識を要する方法のように前処理を必要としない点で簡便である。さらに、標識効果が測定のばらつきに大きく影響するという問題も存在せず、再現性のよい測定を行うことができる。また、糖鎖−タンパク質相互作用を目視で確認することができるので、特別な装置も必要なく、非常に安価かつ容易に糖−タンパク質相互作用を測定することができる。
【０１１２】
したがって、上記「糖鎖‐タンパク質相互作用の測定方法」は、糖鎖やタンパク質の機能解析や、検査・診断などに用いることが可能である。
【０１１３】
なお、上記「糖鎖‐タンパク質相互作用の測定方法」は、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を含む溶液と、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の末端に位置する糖鎖を認識するタンパク質とを混和することによって、糖鎖とタンパク質とを相互作用させ、糖鎖−タンパク質相互作用体を生成させる工程を含んでいればよい。したがって、例えば上述のように糖鎖−タンパク質相互作用体の生成を目視で確認するだけでもよいし、より詳細な測定を行いたい場合は、一定波長の紫外可視吸光スペクトルを測定する工程を含んでいてもよい。
【０１１４】
（４．糖鎖−タンパク質相互作用体からタンパク質を回収する方法
一実施形態において、上記糖鎖−タンパク質相互作用体からタンパク質を回収する方法は、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を含む溶液と、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の末端に位置する糖鎖を認識するタンパク質とを混和して糖鎖とタンパク質とを相互作用させ、糖鎖−タンパク質相互作用体を生成させる工程と、当該糖鎖−タンパク質相互作用体と水とを混和した混和液のｐＨを５以下とする工程と、を含んでいる。
【０１１５】
上記「糖鎖−タンパク質相互作用体と水とを混和した混和液のｐＨを５以下とする工程」は、糖鎖とタンパク質との相互作用の結果生成した上記糖鎖−タンパク質相互作用体の磁気等による分離を行う工程と、上記糖鎖−タンパク質相互作用体と水とを混和した混和液のｐＨを５以下とする工程を含んでいる。上記酸としては、上記混和液の液性を酸性にすることができるものであれば特に限定されるものではないが、例えば塩酸、シナピン酸、硝酸、硫酸等を用いることができる。
【０１１６】
上記混和液のｐＨを５以下にすることにより、液性が酸性となるため、糖鎖−タンパク質相互作用体の糖鎖部分からタンパク質を解離させることができる。または、上記混和液のｐＨを５以下にすることにより、糖鎖−タンパク質相互作用体を構成するタンパク質の構造が変性し、糖鎖のタンパク質認識能が低下するため、糖鎖−タンパク質相互作用体からタンパク質を完全に解離させることができる。
【０１１７】
糖鎖−タンパク質相互作用体から解離したタンパク質は、後述する実施例に示すように糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子からも明確に解離し、簡単に回収することができる。また、解離したタンパク質は、アクリルアミド電気泳動、タンパク質定量、質量分析等の方法を用いて同定することが可能である。上記質量分析は、マトリックス支援型レーザ脱離／飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）などの従来公知の質量分析計を使用し、従来公知の方法に従って実施すればよい。
【０１１８】
一実施形態において、糖鎖−タンパク質相互作用体からタンパク質を回収する方法は、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を含む溶液と、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の末端に位置する糖鎖を認識するタンパク質とを混和して糖鎖とタンパク質とを相互作用させ、糖鎖−タンパク質相互作用体を生成させる工程と、当該糖鎖−タンパク質相互作用体の磁気等による分離を行う工程と、当該糖鎖−タンパク質相互作用体と上記タンパク質が認識可能な糖鎖とを混和する工程と、を含んでいる。
【０１１９】
当該糖鎖−タンパク質相互作用体と上記タンパク質が認識可能な糖鎖とを混和する工程では、糖鎖とタンパク質との相互作用の結果生成した上記糖鎖−タンパク質相互作用体を遠心分離などの方法によって回収し、回収した上記糖鎖−タンパク質相互作用体に、上記糖鎖−タンパク質相互作用体を構成するタンパク質が認識可能な糖鎖を添加して混和する。
【０１２０】
その結果、上記糖鎖−タンパク質相互作用体を構成するタンパク質と、上記タンパク質が認識可能な糖鎖との間に置換反応が生じるため、上記糖鎖−タンパク質相互作用体からタンパク質が解離するものと考えられる。
【０１２１】
なお「当該糖鎖−タンパク質相互作用体と上記タンパク質が認識可能な糖鎖とを混和する工程」における混和の方法は特に限定されるものではなく、攪拌は行ってもよいし、行わなくてもよい。また、上記工程は糖鎖−タンパク質相互作用体を構成する糖鎖と、上記タンパク質が認識可能な糖鎖との親和置換を伴う工程であるため、上記タンパク質が認識可能な糖鎖は過剰量添加することが好ましい。
【０１２２】
解離したタンパク質は、アクリルアミド電気泳動、タンパク質定量、質量分析等の方法を用いて同定することが可能である。
【０１２３】
また、タンパク質と糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子とを反応させる際に予めタンパク質が認識可能な様々な糖鎖を添加しておくことにより、糖鎖−タンパク質相互作用に起因する凝集を阻害することができれば、より詳しくタンパク質の機能を解析することができる。例えば、タンパク質に対してどの糖鎖がより強固に結合するかということ等の機能解析が可能になると考えられる。
【０１２４】
また、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子は、糖鎖とタンパク質との相互作用を検出する相互作用検出剤、ウイルス濃縮剤、細胞標識剤、磁気ハイパーサーミア発熱剤、ＭＲＩ造影剤、磁化検出器により磁化を検出する診断剤などに利用することもできる。
【０１２５】
なお、本発明は以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲内で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１２６】
本発明について、実施例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【０１２７】
〔実施例１：本発明にかかる方法によるインフルエンザウイルスの濃縮〕
５０ｍＭの塩化鉄（ＩＩ）水溶液５０μｌと５０ｍＭの塩化鉄（ＩＩＩ）水溶液２５μｌとを混合し、撹拌下、１Ｍのアンモニア水２５０μlを添加して、第一の磁性体である酸化鉄磁性ナノ粒子を含有する溶液を調製した。
【０１２８】
次に、５０ｍＭの塩化金酸（ＩＩＩ）水溶液７５μｌ、５ｍｇの「ヘパリンを含むリガンド複合体」を滅菌水に添加して１５０μｌとした水溶液、および１２５ｍＭの水素化ホウ素ナトリウム水溶液３００μｌを、上記酸化鉄磁性ナノ粒子を含有する溶液に添加し、撹拌して、ヘパリンを固定化した糖鎖固定化磁性金ナノ粒子（以下、「ヘパリン固定化磁性金ナノ粒子」とも言う。平均粒子径３３ｎｍ）の溶液１を調製した。
【０１２９】
なお、上記「ヘパリンを含むリガンド複合体」は、ヘパリンの水溶液と、上記一般式（３）で示されるリンカー化合物（ｎ１＝０、ｑ＝０）のＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）溶液（以下、単に「ＤＭＡＣ溶液」と略記する）とに酢酸を添加した後、ヘパリンと、上記リンカー化合物と、ＮaＢＨ３ＣＮとのモル比が１：１：１０となるように、酢酸を添加した上記ヘパリン水溶液と、酢酸を添加したＤＭＡＣ溶液と、ＮaＢＨ３ＣＮとを混合し、３７℃で３日間攪拌することによって調製した。
【０１３０】
Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ＯＫＵＤＡ／１９５７、Ｈ２Ｎ２）をＰＢＳで希釈し、０．５ＨＡＵ／ｍｌとしたインフルエンザウイルス希釈液４９０μｌに、上記溶液１を１０μｌ添加した溶液２を得て、室温（２５．５℃）で３０分静置した。
【０１３１】
次に、上記第二の磁性体として、平均粒子径２．８μｍの Dynabeads M-270 30mg/ml（以下、単にDynabeads M-270と記載、Invitrogen Dynal 製、品番；DB14305）１０μｌを、３０分間静置した上記溶液２に添加した。対照として、上記第二の磁性体を添加せずに、上記溶液２を以下の処理に供した試験区も設けた。なお、本明細書において、滅菌水はイオン交換水をオートクレーブ滅菌して調製したものを用いた。
【０１３２】
上記 Dynabeads M-270はフェライトであり、上記 Dynabeads M-270 30mg/ml とは、Dynabeads M-270が添加されている液体中において、Dynabeads M-270の濃度が30mg/mlという意味である。
【０１３３】
図２は、第二の磁性体を加えた溶液２に磁力を加える様子を示すものである。磁石（株式会社サンギョウサプライ  ネオジウム磁石  表面磁束密度；１５０ミリテスラ、８０×１５×３ｍｍ）を、上記溶液２が入っている容器を挟むように設置し、１往復／２ｓのスピードで上記容器を３０回上下させることにより（つまり３０往復、計１分間）、ヘパリンを固定化した糖鎖固定化磁性金ナノ粒子と、第二の磁性体と、インフルエンザウイルスとを含有する混和物に磁力を加えた。最後に２分間、容器の底部に上記磁石を設置して上記混和物を完全に沈降させ、上清と沈殿とを得た。当該沈殿に超純水１０μｌを加え、１００℃で５分間加熱した後、上記磁石を容器の底部の側面に設置して２分間磁力を加え、上清を得た。
【０１３４】
上記第二の磁性体を添加しなかった試験区では、溶液２に第二の磁性体を加えないこと以外は、第二の磁性体を加える場合と同様の方法で磁力を加え、上清と沈殿とを得た。また、上記第二の磁性体を添加しなかった試験区では、磁力を加える代わりに、上記溶液２に対して１００００ｇで１０分間遠心分離を行う試験区も設け、上清と沈殿とを得た。これらの沈殿に超純水１０μｌを加え、１００℃で５分間加熱した後、１００００ｇで１０分間遠心分離を行い、上清を得た。
【０１３５】
図１は、上記溶液２の調製からリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに供する上清の調製までの工程を示すフローチャートである。
【０１３６】
これらの上清２μｌを、表１に示す各試薬を表１に示す量で混合したＰＣＲ用試薬２０μｌに添加し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに供した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ装置としては、ライトサイクラー（登録商標、型番３５０Ｓ、Roche製）を用い、蛍光色素としてSYBR Greenを用いた。プライマーとしては、感染症研究所発行の病原体検査マニュアル「高病原性鳥インフルエンザ（２００６年６月改定）」中のTypeA/M遺伝子検出用プライマーであるTypeA/M30F   TTCTAACCGAGGTCGAAACG  (20bp、配列番号１、日本遺伝子研究所製)およびTypeA/M264R2  ACAAAGCGTCTACGCTGCAG  (20bp、配列番号２、日本遺伝子研究所製)を用い、上記Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡのＭプロテイン領域２３４ｂｐを増幅させた。ＲＴ−ＰＣＲの条件は、逆転写反応を４５℃２分、初期熱変性処理を９５℃１分、ＰＣＲサイクルは９５℃１秒、６０℃１秒、７２℃５秒を１サイクルとして設定し、４０サイクル行った。
【０１３７】
なお、表１中、１０×ＦＢＩはバッファーであり、最終濃度の欄における「１×」は、１０×ＦＢＩを、最終濃度の欄における「１×」になるように、１０倍希釈して使用することを意味している。また、SYBR Greenの濃度の欄における「1/2000」および最終濃度の欄における「1/20000」は、TaKaRa 50513の原液を滅菌水で２０００倍希釈したものを、最終濃度が２００００倍希釈となるように用いることを意味している。また、Prime Script、SpeedSTARはいずれもＰＣＲ用の酵素である。
【０１３８】
【表１】
2011045358.tif 000010
【０１３９】
０．５ＨＡＵ／ｍｌのＡ型インフルエンザウイルス希釈液のＣｔ値（表２において「濃縮前のＣｔ値」と記載）と、上記上清のＣｔ値（表２において「濃縮後のＣｔ値」と記載）とを測定し、その差分を求めた。この差分が大きいほど濃縮効率がよいことになる。結果を表２に示す。
【０１４０】
【表２】
2011045358.tif 000011
【０１４１】
表２において「第二の磁性体不使用／磁石」と記載した試験区は、上記第二の磁性体を添加せずに、上記溶液２を磁石を用いた濃縮に供した試験区であり、「第二の磁性体不使用／遠心」と記載した試験区は、上記第二の磁性体を添加せずに、上記溶液２を遠心分離による濃縮に供した試験区である。表２に示すように、上記第二の磁性体を用いない場合、遠心分離を用いた濃縮では、濃縮前のＣｔ値と、濃縮後のＣｔ値との差分が２．９５であったのに対し、磁石のみを用いた濃縮では１．６８であり、遠心分離を用いた場合と比べて濃縮効率は劣っていた。また、ヘパリンを固定化した糖鎖固定化磁性金ナノ粒子と、インフルエンザウイルスとを含有する混和物に磁力を加えてから沈殿を得るまでには、約３０分という長い時間が必要であった。一方、上記第二の磁性体としてDynabeads M-270を用いた場合は、上記差分が３．０７となり、遠心分離を用いた場合に匹敵する濃縮効率が得られた。
【０１４２】
〔実施例２：第二の磁性体の検討〕
次に、第二の磁性体として使用可能な磁性体の探索を行った。供試した磁性体を表３に示す。
【０１４３】
０９８１Ｓ２４５３ ＴＳ‐３（パウダーテック（株）製、表３および以下において「ＴＳ−３」と記載）は、マグネタイトに対してＭｎを添加して調製されたＭｎ系フェライトと呼ばれるものである。
【０１４４】
Dynabeads M-270については実施例１で説明したとおりである。
【０１４５】
Dynabeads MyOne10mg/ml（表３および以下において、単にDynabeads MyOneと記載、Invitrogen Dynal 製、品番；DB65001）は、Dynabeads MyOneを0.01%Tween-20と0.09% NaN3とを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）に添加したときのDynabeads MyOneの濃度が１０ｍｇ／ｍｌという意味である。Dynabeads MyOneは、酸化鉄とマグネタイトとの混合物である。
【０１４６】
ProMag  3series COOH Surfactant Free (PMC3N)（表３および以下において、単にProMag  3seriesと記載、Bangs Laboratories,Inc.製、品番；PMC3N）は、Dynabeads M-270に類似する磁性体（フェライト）であり、界面活性剤を含まない磁性体である。ProMag  3seriesは、ProMag  3seriesを、イオン交換水に１．９ｇ／ｍｌとなるように加えた懸濁液として用いた。
【０１４７】
【表３】
2011045358.tif 000012
【０１４８】
Ａ型インフルエンザウィルス（Ａ／ＯＫＵＤＡ／１９５７、Ｈ２Ｎ２）をＰＢＳで希釈し、０．１ＨＡＵ／ｍｌとしたインフルエンザウイルス希釈液４９０μｌに、実施例１で用いた溶液１を１０μｌ添加した溶液２´を得た。室温（２５．５℃）において、溶液２´（５００μｌ）に対して１回／秒の割合で１０回ピペッティングを行った後、さらに１回／秒の割合で５分間ピペッティングを行った。ピペッティングを行うことにより、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の糖鎖へのウイルスの結合が促進される。
【０１４９】
次に、ＴＳ−３ ２０ｍｇを滅菌水２ｍｌに懸濁させた液体１０μｌ、Dynabeads M-270  １０μｌ、Dynabeads MyOne  １０μｌまたはProMag  3series  １０μｌを、上記溶液２´（５００μｌ）に添加し、１回／秒の割合で１０回ピペッティングを行った。
【０１５０】
続いて、磁石（株式会社サンギョウサプライ  ネオジウム磁石  表面磁束密度；１５０ミリテスラ、８０×１５×３ｍｍ）を、図２に示すように、表３に示す磁性体を加えた溶液２´が入っている容器を挟むように設置した。上記容器を１往復／２ｓのスピードで３０回上下させ（つまり３０往復、計１分間）、ヘパリンを固定したヘパリン固定化磁性金ナノ粒子と、表３に示す磁性体と、インフルエンザウイルスとを含有する混和物に磁力を加え、最後に１分間、容器の底部に上記磁石を設置して上記混和物を完全に沈降させ、上清と沈殿とを得た。
【０１５１】
得られた沈殿に滅菌水１０μｌを添加してピペッティングを１０回行い、１００℃で２分間加熱した後、磁石で２分間磁力を加え、上清を得た。これらの上清２μｌを、実施例１と同じ条件でリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに供し、０．１ＨＡＵ／ｍｌのＡ型インフルエンザウィルス希釈液のＣｔ値（表３において「濃縮前のＣｔ値」と記載）と、上記上清のＣｔ値（表３において「濃縮後のＣｔ値」と記載）とを測定し、その差分を求めた。
【０１５２】
表３に示すように、Dynabeads M-270を用いた場合、上記差分が５．２２であった。つまり、０．１ＨＡＵ／ｍｌのＡ型インフルエンザウィルス（Ａ／ＯＫＵＤＡ／１９５７、Ｈ２Ｎ２）希釈液を濃縮せずにＲＴ−ＰＣＲに供した場合と比較して５．２２サイクル早くウイルスを検出でき、濃縮効率は２の５．２２乗＝３７倍向上した。後述する比較例１では、ヘパリン固定化金ナノ粒子（平均粒子径；１５ｎｍ）のコロイド溶液（１０μｌ）を上記インフルエンザウイルス希釈液（４９０μｌ）に混合し、遠心分離（１００００ｇ、１０分）を行って得られた沈殿に超純水１０μｌを加え、１００℃で５分間加熱した後、１００００ｇで１０分間遠心分離を行い得られた上清のＣｔ値と、０．１ＨＡＵ／ｍｌのＡ型インフルエンザウィルス希釈液のＣｔ値との差分を求めている（５．３７）。Dynabeads M-270を用いた場合の上記５．２２はこれに匹敵するものであるため、遠心分離を用いて濃縮する場合と同等の濃縮効率が得られたことが分かる。
【０１５３】
また、ＴＳ−３、Dynabeads My OneまたはPro Mag 3seriesを用いた場合は、Dynabeads M-270を用いた場合より濃縮効率は劣っていたが、表３に示すように、上記Ａ型インフルエンザウィルス希釈液を濃縮せずにＲＴ−ＰＣＲに供した場合と比較して１０倍以上の濃縮効率が得られていた。この結果は、後述する比較例１において、第二の磁性体を用いずに、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子のみを用いて０．１ＨＡＵ／ｍｌのＡ型インフルエンザウィルスを濃縮した場合の濃縮効率（後述する表４に示す２倍および８倍）よりも優れていた。よって、ＴＳ−３、Dynabeads My OneまたはPro Mag 3seriesを用いた場合も、遠心分離により濃縮する場合に生じうるサンプル飛散等の危険を回避しつつ、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子のみを用いる場合よりも濃縮効率を向上させることができるため、有用であるといえる。
【０１５４】
〔実施例３：α−グルコース固定化磁性金属ナノ粒子の調製〕
５０ｍＭの塩化鉄（ＩＩ）水溶液５０μｌに５０ｍＭの塩化鉄（ＩＩＩ）水溶液２５μｌを加えて混合し、攪拌下、１Ｍのアンモニア水２５０μｌを添加して、第一の磁性体である酸化鉄磁性ナノ粒子を含有する溶液を調製した。次に、５０ｍＭの塩化金酸（ＩＩＩ）水溶液７５μｌ、リガンド複合体の水溶液（濃度１０ｍＭ）１５０μｌおよび１２５ｍＭの水素化ホウ素ナトリウム３００μｌを添加し、攪拌して、粗α−グルコース固定化磁性金ナノ粒子のコロイド溶液を調製した。なお、上記リガンド複合体は、マルトース２０ｍｇと、上記一般式（３）で示されるリンカー化合物（ｎ１＝０、ｑ＝０）１９ｍｇとを、水：Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド：酢酸（１０：１０：１）５．５ｍｌに溶解した後、還元アミノ化を行うことによって調製した。
【０１５５】
次に、上記粗α−グルコース固定化磁性金ナノ粒子のコロイド溶液を超遠心分離（５万Ｇ、２０分）とネオジウム磁石を用いた磁気分離とによって精製し、α−グルコース固定化磁性金ナノ粒子のコロイド溶液を得た。なお、「ネオジウム磁石を用いた磁気分離」とは、磁石（ケニス株式会社  高磁力マグネットバー  表面磁束密度：最大１．２テスラ、２５φ×１００ｍｍ）を粗α−グルコース固定化磁性金ナノ粒子のコロイド溶液の入った容器の底部に接触させ、上澄みを除くことによって粗α−グルコース固定化磁性金ナノ粒子を精製し、α−グルコース固定化磁性金ナノ粒子のコロイド溶液とすることを示す。
【０１５６】
図３に、調製した粗α−グルコース固定化磁性金ナノ粒子のコロイド溶液の透過型電子顕微鏡画像を示す。
【０１５７】
〔実施例４：糖鎖−タンパク質相互作用体からのＣｏｎＡの回収〕
エッペンドルフチューブに、ＰＢＳ−Ｔに対して１．２４ｍｇ／ｍｌとなるように溶解させたＣｏｎＡを１００μｌ、ＰＢＳ−Ｔに対して１．０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解させたＢＳＡを１００μｌ分注し、実施例３で調製したα−グルコース固定化磁性金ナノ粒子のコロイド溶液を１００μｌ添加してボルテックスミキサーを用いて１０秒以上攪拌した。なお、上記ＰＢＳ−Ｔとは、リン酸緩衝液に０．０５％のデタージェントであるＴｗｅｅｎ２０を加えた溶液である。約２時間放置した後、実施例３と同様のネオジウム磁石を用いた磁気分離にて糖鎖−タンパク質相互作用体を沈殿させ、上清を回収した後、当該糖鎖−タンパク質相互作用体をＰＢＳ−Ｔおよび水で数回洗浄した。当該洗浄後、４ｍｇ／ｍｌのグルコース溶液を１００μｌ添加し、約１時間放置した。結果は、当該糖鎖−タンパク質相互作用体から解離したＣｏｎＡを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって評価した。
【０１５８】
図４の写真は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によるタンパク質の精製過程を示すものであり、左側よりマーカータンパク質、α−グルコース固定化磁性金ナノ粒子添加前の溶液、α−グルコース固定化磁性金ナノ粒子添加後の上澄み液、糖鎖−タンパク質相互作用体解離後の溶液を示す。
【０１５９】
〔比較例１〕
実施例１に示したように、第二の磁性体を使用せず、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子のみを使用した場合は、磁力のみを加えることによっては、遠心分離を用いた場合に匹敵する濃縮効率を得ることはできなかった。そこで、第二の磁性体を使用せず、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の粒子径を大きくすることによりこの問題を解決できないか検討した。
【０１６０】
糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子として、金酸化鉄磁性複合ナノ粒子（アクトノンパレル社製、ＬｏｔＮｏ：０９０７１１Ｒｖ）を用いた。上記金酸化鉄磁性複合ナノ粒子は、平均粒子径３０ｎｍの酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）を核とするナノ粒子で、表面はＰＶＰ（ポリビニルピロリドン、水溶性ポリマー）でコーティングされており、Ｆｅ３Ｏ４を３．６２ｍｇ/ｍｌ、Ａｕを２．２４ｍｇ/ｍｌ含有する。上記金酸化鉄磁性複合ナノ粒子は、金イオン、ＰＶＰを含む水溶液に酸化鉄を分散させた分散液に電子線を照射することによって合成されたものである。
【０１６１】
上記金酸化鉄磁性複合ナノ粒子は、透過型電子顕微鏡により観察したところ、長軸が約２００ｎｍ、短軸が約５０ｎｍの不定形粒子であった。よって、上記金酸化鉄磁性複合ナノ粒子の平均粒子径は、実施例１で用いたヘパリン固定化磁性金ナノ粒子（平均粒子径３３ｎｍ）よりも大きいものであるといえる。
【０１６２】
この金酸化鉄磁性複合ナノ粒子を６ｍｇ／ｍｌとなるように水に添加して得られた液体２５０μｌに、ヘパリンを含むリガンド複合体（１００ｍｇ／ｍｌ）の水溶液を２４５μｌ混合することによって、ヘパリン固定化金酸化鉄磁性複合ナノ粒子のコロイド溶液を作製した。上記「ヘパリンを含むリガンド複合体」は、実施例１と同様の方法によって調製した。
【０１６３】
Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ＯＫＵＤＡ／１９５７、Ｈ２Ｎ２）をＰＢＳで希釈し、０．１ＨＡＵ／ｍｌとしたインフルエンザウイルス希釈液（４９０μｌ）に、ヘパリン固定化金酸化鉄磁性複合ナノ粒子のコロイド溶液（１０μｌ）を混合し、４℃で３０分間攪拌して溶液を得た。得られた溶液が入ったチューブの下に磁石（株式会社サンギョウサプライ  ネオジウム磁石  表面磁束密度；１５０ミリテスラ、８０×１５×３ｍｍ）を設置して１０秒間または３０秒間磁力を加え、ヘパリン固定化金酸化鉄磁性複合ナノ粒子と上記ウイルスとの複合体を沈殿させた。上清を取り除き、上記複合体の沈殿に超純水１０μｌを加え、１００℃で１０分間加熱した後、上記磁石を容器の底部に設置して２分間磁力を加え、上清を得た。
【０１６４】
対照として、上記ヘパリン固定化金酸化鉄磁性複合ナノ粒子のコロイド溶液の代わりにヘパリン固定化金ナノ粒子（平均粒子径；１５ｎｍ）のコロイド溶液（１０μｌ）を上記インフルエンザウイルス希釈液（４９０μｌ）に混合し、遠心分離（１００００ｇ、１０分）を行い、上清と沈殿とを得た。当該沈殿に超純水１０μｌを加え、１００℃で５分間加熱した後、１００００ｇで１０分間遠心分離を行い、上清を得た。
【０１６５】
なお、上記ヘパリン固定化金ナノ粒子のコロイド溶液は、終濃度１ｍＭの塩化金（ＩＩＩ）ナトリウム水溶液、終濃度８．１ｍＭのクエン酸三ナトリウム二水和物水溶液、終濃度２００〜２０００ｍｇ／ｍｌの、上記「ヘパリンを含むリガンド複合体」を混合し、１００℃、１０分攪拌することによって調製した。
【０１６６】
これらの上清２μｌを、ＰＣＲ用試薬２３μｌに添加し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに供した。試薬としては、One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit ＩＩ（タカラバイオ、製品コードRR086A）を使用した。１反応あたりの試薬は、2×One Step SYBR RT-PCR Buffer 4 を１２．５μｌ、PrimeScript 1 step Enzyme Mix 2 を１μｌ、PCR Forward Primer (10 μM)を１μｌ、PCR Reverse Primer (10 μM)を１μｌ、RNase Free 蒸留水を７．５μｌ混合したものを使用した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ装置としては、Thermal Cycler Dice Real Time System（型番TP800、タカラバイオ製）を用い、蛍光色素としてSYBR Greenを用いた。プライマーとしては、インフルエンザのTypeA/M遺伝子（J. Clin Microbiol. 2005 43No.2:589-95.）検出用プライマーであるTypeA/MP gene (217-236) Forward GGACTGCAGCGTAGACGCTT  (20bp、配列番号３、つくばオリゴサービス株式会社)およびTypeA/ MP gene (382-405) Reverse CATYCTGTTGTATATGAGGCCCAT (24bp、配列番号４、つくばオリゴサービス株式会社)を用い、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡのＭプロテイン領域１８８ｂｐを増幅させた。ＲＴ−ＰＣＲの条件は、逆転写反応を４５℃５分、初期熱変性処理を９５℃１０秒、ＰＣＲサイクルは９５℃５秒、６０℃３０秒、を１サイクルとして設定し、４０サイクル行った。
【０１６７】
そして、上記０．１ＨＡＵ／ｍｌのＡ型インフルエンザウィルス希釈液のＣｔ値（表４において「濃縮前のＣｔ値」と記載）と、上記上清のＣｔ値（表４において「濃縮後のＣｔ値」と記載）とを測定し、その差分を求めた。結果を表４に示す。
【０１６８】
【表４】
2011045358.tif 000013
【０１６９】
表４において、「磁石１０秒接触」とあるのは、ヘパリン固定化金酸化鉄磁性複合ナノ粒子のコロイド溶液を用い、上記チューブの下に上記ネオジウム磁石を設置して１０秒間磁力を加えた試験区から得られた上清を用いた場合の結果を示し、「磁石３０秒接触」とあるのは、ヘパリン固定化金酸化鉄磁性複合ナノ粒子のコロイド溶液を用い、上記チューブの下に上記ネオジウム磁石を設置して３０秒間磁力を加えた試験区から得られた上清を用いた場合の結果を示す。「遠心分離（１００００ｇ）とあるのは、ヘパリン固定化金ナノ粒子（平均粒子径；１５ｎｍ）のコロイド溶液を用いた場合に得られた上清を用いた場合の結果を示す。
【０１７０】
その結果、ヘパリン固定化金ナノ粒子のコロイド溶液を用いた場合、上記差分が５．３７であった。つまり、０．１ＨＡＵ／ｍｌのＡ型インフルエンザウィルス希釈液を濃縮せずにＲＴ−ＰＣＲに供した場合と比較して５．３７サイクル早くウイルスを検出でき、濃縮効率は２の５．３７乗＝４１倍向上した。
【０１７１】
一方、ヘパリン固定化金酸化鉄磁性複合ナノ粒子のコロイド溶液を用いた場合、磁力によるヘパリン固定化金酸化鉄磁性複合ナノ粒子と上記ウイルスとの複合体の沈殿は１分以内に行うことができたが、「磁石１０秒接触」の場合の上記差分は１．２２であり、「磁石３０秒接触」の上記差分は２．９２であった。つまり、０．１ＨＡＵ／ｍｌのＡ型インフルエンザウィルス希釈液を濃縮せずにＲＴ−ＰＣＲに供した場合と比較して、それぞれ１．２２サイクル、２．９２サイクル早くウイルスを検出できたにとどまり、濃縮効率はそれぞれ２倍、８倍の向上にとどまった。このように、第二の磁性体を用いずに、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の粒子径を大きくすることによっては、遠心分離を用いた場合に匹敵する濃縮効率を得ることはできなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１７２】
動植物に感染するウイルスを同定・定量することは、感染症の診断や予防指針の決定に必須である。しかし、生体（体液中）、食品、飲料水、河川水などに存在するウイルスは極微量であり、従来の技術では検出できない場合がある。例えば、感染初期の場合、感染者から放出されるウイルスは、従来の簡易検査キットやＰＣＲ法では検出限界以下の量であることが多く、そのためウイルスの早期検出が困難であった。
【０１７３】
本発明は、ウイルスの糖鎖結合性を利用し、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と、第二の磁性体とを併用することにより、危険性を伴う遠心分離を行わずに、ウイルスを安全にかつ効率よく濃縮することを可能とする。そのため、本発明は、糖鎖やタンパク質の機能解析や、ウイルスの超高感度検査に応用することが可能であり、医薬品開発や生命現象の解明に寄与することができる。また、家畜や農産物などに感染しているウイルスの濃縮を行うこともできるため、ウイルスが家畜・農産物などの生産物に与える経済的損害を予見することもできる。このように、本発明は医薬、バイオ産業などにおいて広く利用することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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