(57)【要約】【課題】  背面照射系で高感度な蛍光検出が可能なマイクロプレート及びその製造方法を提供すること。【解決手段】  マイクロプレート（４）は、  表面に周期構造を有するベース基板（５）と、  周期構造の上に形成された金属層（６）と、  金属層の上に形成された消光抑制層（７）とを備え、  金属層が、表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、  ベース基板側から光が入射されて、表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させ、  発生した電場を蛍光分子の励起場として増強蛍光が消光抑制層側またはベース基板側から検出され、  屈折率が１．４５より大きく２以下であり、入射される光及び増強蛍光に対して透過性を有する物質で、ベース基板が形成され、  表面プラズモン共鳴の共鳴角が４度以上４５度以下になるように、周期構造のピッチが形成されている。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光顕微鏡または蛍光マイクロプレートリーダーにおいて使用され、観測対象の試料を搭載するためのマイクロプレートであって、
表面に周期構造を有するベース基板と、
前記周期構造の上に形成された金属層と、
前記金属層の上に形成された消光抑制層とを備え、
前記金属層が、表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、
前記ベース基板側から光が入射されて、表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させ、
発生した前記電場を蛍光分子の励起場として増強蛍光が前記消光抑制層側または前記ベース基板側から検出され、
屈折率が１．４５より大きく２以下であり、入射される前記光及び前記増強蛍光に対して透過性を有する物質で、前記ベース基板が形成され、
表面プラズモン共鳴の共鳴角が４度以上４５度以下になるように、前記周期構造のピッチが形成されていることを特徴とするマイクロプレート。
【請求項２】
表面プラズモン共鳴の共鳴角が４度以上２０度以下になるように、前記周期構造のピッチが形成されていることを特徴とする請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項３】
前記ベース基板が、ポリメタクリレート、ポリカーボネート、又はポリウレタンで形成されていることを特徴とする請求項１又は２に記載のマイクロプレート。
【請求項４】
前記屈折率が１．９５以下であり、
屈折率及びピッチを軸とする平面上で、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，６００）、（１．４９，５４０）、（１．５９，４８０）、（１．８５，３８０）及び（１．９５，３７０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第１の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３１０）、（１．４９，３００）、（１．５９，２９０）、（１．８５，２６０）及び（１．９５，２３０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第２の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，４２０）、（１．４９，４００）、（１．５９，３７０）、（１．８５，３１０）及び（１．９５，２９０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第３の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３９０）、（１．４９，３８０）、（１．５９，３５０）、（１．８５，３００）及び（１．９５，２８０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第４の線とした場合に、
前記ベース基板の前記屈折率及び前記ピッチをプロットした点が、前記第１〜第４の線の何れかの上、前記第１の線と前記第３の線との間、または、前記第２の線と前記第４の線との間に位置し、
入射する前記光の波長が６１３ｎｍ以上６５３ｎｍ以下で使用されることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載のマイクロプレート。
【請求項５】
前記屈折率が１．９５以下であり、
屈折率及びピッチを軸とする平面上で、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，４８０）、（１．４９，４５０）、（１．５９，
４１０）、（１．８５，３４０）及び（１．９５，３２０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第５の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３６０）、（１．４９，３４０）、（１．５９，３２０）、（１．８５，２８０）及び（１．９５，２６０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第６の線とした場合に、
前記ベース基板の前記屈折率及び前記ピッチをプロットした点が、前記第３〜第６の線の何れかの上、前記第３の線と前記第５の線との間、または、前記第４の線と前記第６の線との間に位置し、
入射する前記光の波長が６１３ｎｍ以上６５３ｎｍ以下で使用されることを特徴とする請求項４に記載のマイクロプレート。
【請求項６】
前記屈折率が１．９５以下であり、
屈折率及びピッチを軸とする平面上で、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，６４０）、（１．４９，５７５）、（１．５９，５１５）、（１．８５，４１０）及び（１．９５，４００）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第１の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３３０）、（１．４９，３２０）、（１．５９，３１０）、（１．８５，２８０）及び（１．９５，２４５）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第２の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，４４５）、（１．４９，４２５）、（１．５９，３９５）、（１．８５，３３０）及び（１．９５，３１０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第３の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，４１０）、（１．４９，４０５）、（１．５９，３７０）、（１．８５，３２０）及び（１．９５，３００）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第４の線とした場合に、
前記ベース基板の前記屈折率及び前記ピッチをプロットした点が、前記第１〜第４の線の何れかの上、前記第１の線と前記第３の線との間、または、前記第２の線と前記第４の線との間に位置し、
入射する前記光の波長が６４０ｎｍ以上６８０ｎｍ以下で使用されることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載のマイクロプレート。
【請求項７】
前記屈折率が１．９５以下であり、
屈折率及びピッチを軸とする平面上で、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，５６０）、（１．４９，５０５）、（１．５９，４４５）、（１．８５，３５０）及び（１．９５，３４０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第１の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，２９０）、（１．４９，２８０）、（１．５９，２７０）、（１．８５，２４０）及び（１．９５，２１５）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第２の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３９５）、（１．４９，３７５）、（１．５９，３４５）、（１．８５，２９０）及び（１．９５，２７０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第３の
線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３７０）、（１．４９，３５５）、（１．５９，３３０）、（１．８５，２８０）及び（１．９５，２６０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第４の線とした場合に、
前記ベース基板の前記屈折率及び前記ピッチをプロットした点が、前記第１〜第４の線の何れかの上、前記第１の線と前記第３の線との間、または、前記第２の線と前記第４の線との間に位置し、
入射する前記光の波長が５８０ｎｍ以上６２０ｎｍ以下で使用されることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載のマイクロプレート。
【請求項８】
前記屈折率が１．９５以下であり、
屈折率及びピッチを軸とする平面上で、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，５２０）、（１．４９，４７５）、（１．５９，４１５）、（１．８５，３２５）及び（１．９５，３１５）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第１の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，２７５）、（１．４９，２６５）、（１．５９，２５５）、（１．８５，２２５）及び（１．９５，２００）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第２の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３７０）、（１．４９，３５０）、（１．５９，３３０）、（１．８５，２７０）及び（１．９５，２５５）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第３の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３５０）、（１．４９，３３０）、（１．５９，３１０）、（１．８５，２６０）及び（１．９５，２４５）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第４の線とした場合に、
前記ベース基板の前記屈折率及び前記ピッチをプロットした点が、前記第１〜第４の線の何れかの上、前記第１の線と前記第３の線との間、または、前記第２の線と前記第４の線との間に位置し、
入射する前記光の波長が５５０ｎｍ以上５９０ｎｍ以下で使用されることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載のマイクロプレート。
【請求項９】
前記屈折率が１．９５以下であり、
屈折率及びピッチを軸とする平面上で、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，４７０）、（１．４９，４３０）、（１．５９，３７０）、（１．８５，２９０）及び（１．９５，２８０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第１の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，２５０）、（１．４９，２４０）、（１．５９，２３０）、（１．８５，２１０）及び（１．９５，１８０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第２の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３４０）、（１．４９，３２０）、（１．５９，２９０）、（１．８５，２４０）及び（１．９５，２３０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第３の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３２０）、（１．４９，３００）、（１．５９，
２８０）、（１．８５，２３０）及び（１．９５，２２０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第４の線とした場合に、
前記ベース基板の前記屈折率及び前記ピッチをプロットした点が、前記第１〜第４の線の何れかの上、前記第１の線と前記第３の線との間、または、前記第２の線と前記第４の線との間に位置し、
入射する前記光の波長が５１０ｎｍ以上５５０ｎｍ以下で使用されることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載のマイクロプレート。
【請求項１０】
前記屈折率が１．９５以下であり、
屈折率及びピッチを軸とする平面上で、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，４２０）、（１．４９，３９０）、（１．５９，３３０）、（１．８５，２５５）及び（１．９５，２４０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第１の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，２３０）、（１．４９，２２０）、（１．５９，２１０）、（１．８５，１９０）及び（１．９５，１６０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第２の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３１０）、（１．４９，２９０）、（１．５９，２６０）、（１．８５，２１０）及び（１．９５，１９５）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第３の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，２９０）、（１．４９，２７５）、（１．５９，２５０）、（１．８５，２００）及び（１．９５，１９０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第４の線とした場合に、
前記ベース基板の前記屈折率及び前記ピッチをプロットした点が、前記第１〜第４の線の何れかの上、前記第１の線と前記第３の線との間、または、前記第２の線と前記第４の線との間に位置し、
入射する前記光の波長が４８０ｎｍ以上５２０ｎｍ以下で使用されることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載のマイクロプレート。
【請求項１１】
前記屈折率が１．９５以下であり、
屈折率及びピッチを軸とする平面上で、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３７５）、（１．４９，３５０）、（１．５９，２９５）、（１．８５，２１０）及び（１．９５，２００）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第１の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，２１０）、（１．４９，２００）、（１．５９，１９０）、（１．８５，１６５）及び（１．９５，１４０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第２の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，２８０）、（１．４９，２６５）、（１．５９，２３５）、（１．８５，１８５）及び（１．９５，１６５）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第３の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，２６０）、（１．４９，２５０）、（１．５９，２２５）、（１．８５，１７５）及び（１．９５，１６０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第４の
線とした場合に、
前記ベース基板の前記屈折率及び前記ピッチをプロットした点が、前記第１〜第４の線の何れかの上、前記第１の線と前記第３の線との間、または、前記第２の線と前記第４の線との間に位置し、
入射する前記光の波長が４５０ｎｍ以上４９０ｎｍ以下で使用されることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載のマイクロプレート。
【請求項１２】
前記屈折率が１．９５以下であり、
屈折率及びピッチを軸とする平面上で、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３３０）、（１．４９，３１０）、（１．５９，２６０）、（１．８５，１８０）及び（１．９５，１６０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第１の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，１９０）、（１．４９，１８５）、（１．５９，１７０）、（１．８５，１４０）及び（１．９５，１２０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第２の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，２５０）、（１．４９，２４０）、（１．５９，２１０）、（１．８５，１５５）及び（１．９５，１３５）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第３の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，２３０）、（１．４９，２２５）、（１．５９，２００）、（１．８５，１５０）及び（１．９５，１３０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第４の線とした場合に、
前記ベース基板の前記屈折率及び前記ピッチをプロットした点が、前記第１〜第４の線の何れかの上、前記第１の線と前記第３の線との間、または、前記第２の線と前記第４の線との間に位置し、
入射する前記光の波長が４２０ｎｍ以上４６０ｎｍ以下で使用されることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載のマイクロプレート。
【請求項１３】
ベース基板、金属層及び消光抑制層を有し、蛍光顕微鏡または蛍光マイクロプレートリーダーにおいて使用され、観測対象の試料を搭載するためのマイクロプレートを製造する方法であって、
周期構造を表面に有する型を用い、前記型の前記周期構造に樹脂を押圧して、周期構造を有する前記ベース基板を形成する第１ステップと、
前記ベース基板の前記周期構造の上に、表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で前記金属層を形成する第２ステップと、
前記金属層の上に前記消光抑制層を形成する第３ステップとを含み、
前記マイクロプレートが、前記ベース基板側から光が入射されて、表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させ、
前記樹脂が、屈折率が１．４５より大きく２以下であり、入射される前記光及び前記増強蛍光に対して透過性を有し、
表面プラズモン共鳴の共鳴角が４度以上４５度以下になるように、前記型の周期構造のピッチが形成されていることを特徴とするマイクロプレートの製造方法。
【請求項１４】
表面プラズモン共鳴の共鳴角が４度以上２０度以下になるように、前記型の前記周期構造のピッチが形成されていることを特徴とする請求項１３に記載のマイクロプレートの製造方法。
【請求項１５】
前記樹脂が、ポリメタクリレート、ポリカーボネート、又はポリウレタンであることを特徴とする請求項１３又は１４に記載のマイクロプレートの製造方法。
【請求項１６】
前記屈折率が１．９５以下であり、
屈折率及びピッチを軸とする平面上で、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，６００）、（１．４９，５４０）、（１．５９，４８０）、（１．８５，３８０）及び（１．９５，３７０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第１の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３１０）、（１．４９，３００）、（１．５９，２９０）、（１．８５，２６０）及び（１．９５，２３０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第２の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，４２０）、（１．４９，４００）、（１．５９，３７０）、（１．８５，３１０）及び（１．９５，２９０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第３の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３９０）、（１．４９，３８０）、（１．５９，３５０）、（１．８５，３００）及び（１．９５，２８０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第４の線とした場合に、
前記ベース基板の前記屈折率及び前記ピッチをプロットした点が、前記第１〜第４の線の何れかの上、前記第１の線と前記第３の線との間、または、前記第２の線と前記第４の線との間に位置し、
入射する前記光の波長が６１３ｎｍ以上６５３ｎｍ以下で使用されることを特徴とする請求項１３〜１５の何れか１項に記載のマイクロプレートの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance、以下ＳＰＲとも記す）
によって発生する表面プラズモン共鳴光により、蛍光物質を励起して蛍光を発生させる表面プラズモン励起増強蛍光（Surface Plasmon Fluorescence）を用いた高感度蛍光顕微鏡およびマイクロプレートリーダーに使用されるマイクロプレート及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
表面プラズモン共鳴顕微鏡に関して、種々の論文や特許出願（下記特許文献１〜５参照）がなされており、装置として市販もされている。しかし、特許文献１〜５に開示されている基本光学系を応用して、蛍光顕微鏡であるＳＰＦＭ（Surface Plasmon Fluorescence
Microscopy）を実現することは現状では不可能である。その理由は、市販の表面プラズ
モン共鳴顕微鏡では、入射光学系に高屈折率対物レンズを用いており、この対物レンズの屈折率の制限によって使用可能な光の波長が近赤外領域に制限されることになり、一般的な蛍光分子の励起光として用いることができないからである。
【０００３】
これに対し、下記特許文献６、７には、プリズムを用いた光学系をもつ表面プラズモン共鳴顕微鏡からＳＰＦＭへの展開が開示されている。
【０００４】
しかし、上記したように、高感度・高分解能蛍光検出が可能な顕微鏡として、全反射顕微鏡、あるいは共焦点顕微鏡があるが、高出力レーザー等を装備していることが多く、光学系が複雑なシステムであり、そのため操作が複雑であり、且つ高価格であるという問題がある。上記した特許文献６、７に開示されたＳＰＦＭに関しても、図２３に示すクレッチマン型の配置を採用しているために光学系が複雑であり、操作が複雑である問題がある。一方、蛍光を観測するための別の装置として、マイクロプレートリーダーがある。従来のマイクロプレートリーダーで蛍光検出する場合、十分な強度の蛍光を発生させるためには、高濃度でかつ微量とは言えない程度の試料を準備する必要がある問題がある。
【０００５】
基板の前面、即ち試料を搭載した面から光を照射する場合に、これらの問題を解決できる、周期構造を有するマイクロプレートを用いた表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡および表面プラズモン励起増強蛍光マイクロプレートリーダーが、下記特許文献８、下記非特許文献１に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−２４２０７１号公報
【特許文献２】特開２００１−２５５２６７号公報
【特許文献３】特開２００３−８３８８６号公報
【特許文献４】特開２００４−１１７１８１号公報
【特許文献５】特開２００６−３２８２号公報
【特許文献６】特開平１０−３０７１４１号公報
【特許文献７】特開２００６−２０８２９４号公報
【特許文献８】特開２００８−２８６７７８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Keiko Tawa, et al., “Optical microscopic observation of fluorescence enhanced by grating-coupled surface plasmon resonance”, Optics Express, Vol. 16, Issue 13, pp. 9781-9790 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
バイオセンシングやバイオイメージングにおいて、上記した表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡が使用される。しかし、試料を搭載した基板の背面（試料を搭載した面の裏側の面）から光を照射する場合に、高感度な蛍光検出を実現することができる周期構造を有するマイクロプレートの材質について、さらには材質と周期構造との関係などについては十分な検討が成されていなかった。
【０００９】
本発明は、上記の課題を解決すべく、背面照射系で、表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡や表面プラズモン励起増強蛍光マイクロプレートリーダーに適用した場合に、高感度な蛍光検出を実現することができるマイクロプレート及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者は、上記の課題を解決するために鋭意研究した結果、周期構造のピッチが小さい場合、表面プラズモン共鳴による電場増強はより大きくなり、高感度検出に有効であることを見出した。さらに、周期構造を有するマイクロプレートの材質を適切に選択し、その材質に応じた周期構造を形成することによって、背面照射系において高感度な蛍光検出を実現できることを見出した。
【００１１】
即ち、本発明に係る第１のマイクロプレートは、蛍光顕微鏡または蛍光マイクロプレートリーダーにおいて使用され、観測対象の試料を搭載するためのマイクロプレートであって、
表面に周期構造を有するベース基板と、
前記周期構造の上に形成された金属層と、
前記金属層の上に形成された消光抑制層とを備え、
前記金属層が、表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、
前記ベース基板側から光が入射されて、表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させ、
発生した前記電場を蛍光分子の励起場として増強蛍光が前記消光抑制層側または前記ベース基板側から検出され、
屈折率が１．４５より大きく２以下であり、入射される前記光及び前記増強蛍光に対して透過性を有する物質で、前記ベース基板が形成され、
表面プラズモン共鳴の共鳴角が４度以上４５度以下になるように、前記周期構造のピッチが形成されていることを特徴としている。
【００１２】
また、本発明に係る第２のマイクロプレートは、上記の第１のマイクロプレートにおいて、
表面プラズモン共鳴の共鳴角が４度以上２０度以下になるように、前記周期構造のピッチが形成されていることを特徴としている。
【００１３】
また、本発明に係る第３のマイクロプレートは、上記の第１又は第２のマイクロプレートにおいて、
前記ベース基板が、ポリメタクリレート、ポリカーボネート、又はポリウレタンで形成されていることを特徴としている。
【００１４】
また、本発明に係る第４のマイクロプレートは、上記の第１〜第３のマイクロプレートの何れかにおいて、
前記屈折率が１．９５以下であり、
屈折率及びピッチを軸とする平面上で、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，６００）、（１．４９，５４０）、（１．５９，４８０）、（１．８５，３８０）及び（１．９５，３７０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第１の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３１０）、（１．４９，３００）、（１．５９，２９０）、（１．８５，２６０）及び（１．９５，２３０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第２の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，４２０）、（１．４９，４００）、（１．５９，３７０）、（１．８５，３１０）及び（１．９５，２９０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第３の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３９０）、（１．４９，３８０）、（１．５９，３５０）、（１．８５，３００）及び（１．９５，２８０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第４の線とした場合に、
前記ベース基板の前記屈折率及び前記ピッチをプロットした点が、前記第１〜第４の線の何れかの上、前記第１の線と前記第３の線との間、または、前記第２の線と前記第４の線との間に位置し、
入射する前記光の波長が６１３ｎｍ以上６５３ｎｍ以下で使用されることを特徴としている。
【００１５】
また、本発明に係る第５のマイクロプレートは、上記の第４のマイクロプレートにおいて、
前記屈折率が１．９５以下であり、
屈折率及びピッチを軸とする平面上で、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，４８０）、（１．４９，４５０）、（１．５９，４１０）、（１．８５，３４０）及び（１．９５，３２０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第５の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３６０）、（１．４９，３４０）、（１．５９，３２０）、（１．８５，２８０）及び（１．９５，２６０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第６の線とした場合に、
前記ベース基板の前記屈折率及び前記ピッチをプロットした点が、前記第３〜第６の線の何れかの上、前記第３の線と前記第５の線との間、または、前記第４の線と前記第６の線との間に位置し、
入射する前記光の波長が６１３ｎｍ以上６５３ｎｍ以下で使用されることを特徴としている。
【００１６】
また、本発明に係る第６のマイクロプレートは、上記の第１〜第３のマイクロプレートの何れかにおいて、
前記屈折率が１．９５以下であり、
屈折率及びピッチを軸とする平面上で、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，６４０）、（１．４９，５７５）、（１．５９，５１５）、（１．８５，４１０）及び（１．９５，４００）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第１の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３３０）、（１．４９，３２０）、（１．５９，３１０）、（１．８５，２８０）及び（１．９５，２４５）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第２の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，４４５）、（１．４９，４２５）、（１．５９，３９５）、（１．８５，３３０）及び（１．９５，３１０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第３の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，４１０）、（１．４９，４０５）、（１．５９，３７０）、（１．８５，３２０）及び（１．９５，３００）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第４の線とした場合に、
前記ベース基板の前記屈折率及び前記ピッチをプロットした点が、前記第１〜第４の線の何れかの上、前記第１の線と前記第３の線との間、または、前記第２の線と前記第４の線との間に位置し、
入射する前記光の波長が６４０ｎｍ以上６８０ｎｍ以下で使用されることを特徴としている。
【００１７】
また、本発明に係る第７のマイクロプレートは、上記の第１〜第３のマイクロプレートの何れかにおいて、
前記屈折率が１．９５以下であり、
屈折率及びピッチを軸とする平面上で、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，５６０）、（１．４９，５０５）、（１．５９，４４５）、（１．８５，３５０）及び（１．９５，３４０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第１の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，２９０）、（１．４９，２８０）、（１．５９，２７０）、（１．８５，２４０）及び（１．９５，２１５）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第２の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３９５）、（１．４９，３７５）、（１．５９，３４５）、（１．８５，２９０）及び（１．９５，２７０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第３の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３７０）、（１．４９，３５５）、（１．５９，３３０）、（１．８５，２８０）及び（１．９５，２６０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第４の線とした場合に、
前記ベース基板の前記屈折率及び前記ピッチをプロットした点が、前記第１〜第４の線の何れかの上、前記第１の線と前記第３の線との間、または、前記第２の線と前記第４の線との間に位置し、
入射する前記光の波長が５８０ｎｍ以上６２０ｎｍ以下で使用されることを特徴としている。
【００１８】
また、本発明に係る第８のマイクロプレートは、上記の第１〜第３のマイクロプレートの何れかにおいて、
前記屈折率が１．９５以下であり、
屈折率及びピッチを軸とする平面上で、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，５２０）、（１．４９，４７５）、（１．５９，４１５）、（１．８５，３２５）及び（１．９５，３１５）の点を、直線で接続または屈
折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第１の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，２７５）、（１．４９，２６５）、（１．５９，２５５）、（１．８５，２２５）及び（１．９５，２００）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第２の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３７０）、（１．４９，３５０）、（１．５９，３３０）、（１．８５，２７０）及び（１．９５，２５５）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第３の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３５０）、（１．４９，３３０）、（１．５９，３１０）、（１．８５，２６０）及び（１．９５，２４５）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第４の線とした場合に、
前記ベース基板の前記屈折率及び前記ピッチをプロットした点が、前記第１〜第４の線の何れかの上、前記第１の線と前記第３の線との間、または、前記第２の線と前記第４の線との間に位置し、
入射する前記光の波長が５５０ｎｍ以上５９０ｎｍ以下で使用されることを特徴としている。
【００１９】
また、本発明に係る第９のマイクロプレートは、上記の第１〜第３のマイクロプレートの何れかにおいて、
前記屈折率が１．９５以下であり、
屈折率及びピッチを軸とする平面上で、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，４７０）、（１．４９，４３０）、（１．５９，３７０）、（１．８５，２９０）及び（１．９５，２８０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第１の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，２５０）、（１．４９，２４０）、（１．５９，２３０）、（１．８５，２１０）及び（１．９５，１８０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第２の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３４０）、（１．４９，３２０）、（１．５９，２９０）、（１．８５，２４０）及び（１．９５，２３０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第３の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３２０）、（１．４９，３００）、（１．５９，２８０）、（１．８５，２３０）及び（１．９５，２２０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第４の線とした場合に、
前記ベース基板の前記屈折率及び前記ピッチをプロットした点が、前記第１〜第４の線の何れかの上、前記第１の線と前記第３の線との間、または、前記第２の線と前記第４の線との間に位置し、
入射する前記光の波長が５１０ｎｍ以上５５０ｎｍ以下で使用されることを特徴としている。
【００２０】
また、本発明に係る第１０のマイクロプレートは、上記の第１〜第３のマイクロプレートの何れかにおいて、
前記屈折率が１．９５以下であり、
屈折率及びピッチを軸とする平面上で、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，４２０）、（１．４９，３９０）、（１．５９，３３０）、（１．８５，２５５）及び（１．９５，２４０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第１の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，２３０）、（１．４９，２２０）、（１．５９，２１０）、（１．８５，１９０）及び（１．９５，１６０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第２の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３１０）、（１．４９，２９０）、（１．５９，２６０）、（１．８５，２１０）及び（１．９５，１９５）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第３の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，２９０）、（１．４９，２７５）、（１．５９，２５０）、（１．８５，２００）及び（１．９５，１９０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第４の線とした場合に、
前記ベース基板の前記屈折率及び前記ピッチをプロットした点が、前記第１〜第４の線の何れかの上、前記第１の線と前記第３の線との間、または、前記第２の線と前記第４の線との間に位置し、
入射する前記光の波長が４８０ｎｍ以上５２０ｎｍ以下で使用されることを特徴としている。
【００２１】
また、本発明に係る第１１のマイクロプレートは、上記の第１〜第３のマイクロプレートの何れかにおいて、
前記屈折率が１．９５以下であり、
屈折率及びピッチを軸とする平面上で、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３７５）、（１．４９，３５０）、（１．５９，２９５）、（１．８５，２１０）及び（１．９５，２００）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第１の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，２１０）、（１．４９，２００）、（１．５９，１９０）、（１．８５，１６５）及び（１．９５，１４０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第２の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，２８０）、（１．４９，２６５）、（１．５９，２３５）、（１．８５，１８５）及び（１．９５，１６５）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第３の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，２６０）、（１．４９，２５０）、（１．５９，２２５）、（１．８５，１７５）及び（１．９５，１６０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第４の線とした場合に、
前記ベース基板の前記屈折率及び前記ピッチをプロットした点が、前記第１〜第４の線の何れかの上、前記第１の線と前記第３の線との間、または、前記第２の線と前記第４の線との間に位置し、
入射する前記光の波長が４５０ｎｍ以上４９０ｎｍ以下で使用されることを特徴としている。
【００２２】
また、本発明に係る第１２のマイクロプレートは、上記の第１〜第３のマイクロプレートの何れかにおいて、
前記屈折率が１．９５以下であり、
屈折率及びピッチを軸とする平面上で、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３３０）、（１．４９，３１０）、（１．５９，２６０）、（１．８５，１８０）及び（１．９５，１６０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第１の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，１９０）、（１．４９，１８５）、（１．５９，１７０）、（１．８５，１４０）及び（１．９５，１２０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第２の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，２５０）、（１．４９，２４０）、（１．５９，２１０）、（１．８５，１５５）及び（１．９５，１３５）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第３の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，２３０）、（１．４９，２２５）、（１．５９，２００）、（１．８５，１５０）及び（１．９５，１３０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第４の線とした場合に、
前記ベース基板の前記屈折率及び前記ピッチをプロットした点が、前記第１〜第４の線の何れかの上、前記第１の線と前記第３の線との間、または、前記第２の線と前記第４の線との間に位置し、
入射する前記光の波長が４２０ｎｍ以上４６０ｎｍ以下で使用されることを特徴としている。
【００２３】
本発明に係る第１のマイクロプレートの製造方法は、
ベース基板、金属層及び消光抑制層を有し、蛍光顕微鏡または蛍光マイクロプレートリーダーにおいて使用され、観測対象の試料を搭載するためのマイクロプレートを製造する方法であって、
周期構造を表面に有する型を用い、前記型の前記周期構造に樹脂を押圧して、周期構造を有する前記ベース基板を形成する第１ステップと、
前記ベース基板の前記周期構造の上に、表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で前記金属層を形成する第２ステップと、
前記金属層の上に前記消光抑制層を形成する第３ステップとを含み、
前記マイクロプレートが、前記ベース基板側から光が入射されて、表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させ、
前記樹脂が、屈折率が１．４５より大きく２以下であり、入射される前記光及び前記増強蛍光に対して透過性を有し、
表面プラズモン共鳴の共鳴角が４度以上４５度以下になるように、前記型の周期構造のピッチが形成されていることを特徴としている。
【００２４】
また、本発明に係る第２のマイクロプレートの製造方法は、上記の第１のマイクロプレートの製造方法において、
表面プラズモン共鳴の共鳴角が４度以上２０度以下になるように、前記型の前記周期構造のピッチが形成されていることを特徴としている。
【００２５】
また、本発明に係る第３のマイクロプレートの製造方法は、上記の第１又は第２のマイクロプレートの製造方法において、
前記樹脂が、ポリメタクリレート、ポリカーボネート、又はポリウレタンであることを特徴としている。
【００２６】
また、本発明に係る第４のマイクロプレートの製造方法は、上記の第１〜第３のマイクロプレートの製造方法の何れかにおいて、
前記屈折率が１．９５以下であり、
屈折率及びピッチを軸とする平面上で、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，６００）、（１．４９，５４０）、（１．５９，４８０）、（１．８５，３８０）及び（１．９５，３７０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第１の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３１０）、（１．４９，３００）、（１．５９，２９０）、（１．８５，２６０）及び（１．９５，２３０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第２の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，４２０）、（１．４９，４００）、（１．５９，３７０）、（１．８５，３１０）及び（１．９５，２９０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第３の線とし、
（屈折率，ピッチ）が、（１．４５，３９０）、（１．４９，３８０）、（１．５９，３５０）、（１．８５，３００）及び（１．９５，２８０）の点を、直線で接続または屈折率の増加に伴ってピッチが単調に減少する曲線で滑らかに接続して得られる線を第４の線とした場合に、
前記ベース基板の前記屈折率及び前記ピッチをプロットした点が、前記第１〜第４の線の何れかの上、前記第１の線と前記第３の線との間、または、前記第２の線と前記第４の線との間に位置し、
入射する前記光の波長が６１３ｎｍ以上６５３ｎｍ以下で使用されることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、背面照射系においてマイクロプレートに入射する光の波長及びベース基板の屈折率に応じて、共鳴角が４〜４５度、さらには４〜２０度になるように、ベース基板の周期構造のピッチが決定されているので、表面プラズモン共鳴による電場による蛍光を増強することができる。従って、高感度のバイオセンシングやバイオイメージングか可能になる。
【００２８】
また、ベース基板の材料として樹脂を使用することによって、特に、ポリメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、又はポリウレタン（ＰＵ）などを使用することによって、周期構造を、型を用いて精度よく容易に形成することができ、比較的安価に量産することができる。従って、バイオセンシングやバイオイメージング技術の普及に資する。
【００２９】
また、ベース基板としてＰＣを使用したマイクロプレートは、薄板であっても耐衝撃性が高いので、バイオセンシングあるいはバイオイメージングにおいて倒立型蛍光顕微鏡（高倍率観察においては対物レンズの作動距離が小さく、薄板であることが必要であり、薄板でも衝撃性に強いことが要求される）での使用に適している。また、ベース基板としてＰＣを使用したマイクロプレートは、１２０℃での耐熱性に優れているので、オートクレーブなどの加熱滅菌処理を適用可能である。
【００３０】
また、ＰＣは屈折率が１．５４と比較的高く、背面照射系では屈折率が高い基材を用いることで、よりピッチの小さい周期構造でも、格子結合型の表面プラズモンカップリングの条件を満たすことができる。例えば照射光の波長が６３３ｎｍのとき、基材がガラス（屈折率１．４５）であればピッチ３６０〜５００ｎｍが共鳴角２０度以下の条件を満たし
ているが、ＰＣを基材とすると、ピッチが３００〜４２０ｎｍで共鳴角が２０度以下になる。ピッチが小さくなれば、同じ照射面積中に結合している蛍光分子からの増強蛍光強度は大きくなることが期待できるので、より高感度計測につながる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】蛍光顕微鏡における、照明光の入射方向と蛍光の観測方向との可能な組み合わせを示す図である。
【図２】本発明の実施の形態に係るマイクロプレートを使用した表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡の光学配置の一例を示す図である。
【図３】本発明の実施の形態に係るマイクロプレートの構成を示す断面図である。
【図４】ベース基板表面の周期構造を示す断面図である。
【図５】スロープを有する周期構造を示す断面図である。
【図６】入射光の偏光方向と格子の方向との関係を示す図である。
【図７】入射光の偏光方向と格子の方向との関係を示す図であり、マイクロプレートが図６の状態から９０度回転されて配置されている。
【図８】図５に示すようなベース基板及び金属層の構造を想定し、厳密結合波解析法（ＲＣＷＡ法）を用いてシミュレーションした結果を示すグラフである。
【図９】波長６３３ｎｍの条件でＲＣＷＡ法を用いて計算した結果を示したグラフである。
【図１０】波長６３３ｎｍに関して、望ましい条件を示すグラフである。
【図１１】図８のグラフの一部を示すグラフである。
【図１２】波長５３０ｎｍに関して、図８と同様にシミュレーションした結果を示すグラフである。
【図１３】波長４４０ｎｍに関して、図８と同様にシミュレーションした結果を示すグラフである。
【図１４】図１０と同様に、波長６６０ｎｍでの望ましい条件を示すグラフである。
【図１５】図１０と同様に、波長６００ｎｍでの望ましい条件を示すグラフである。
【図１６】図１０と同様に、波長５７０ｎｍでの望ましい条件を示すグラフである。
【図１７】図１０と同様に、波長５３０ｎｍでの望ましい条件を示すグラフである。
【図１８】図１０と同様に、波長５００ｎｍでの望ましい条件を示すグラフである。
【図１９】図１０と同様に、波長４７０ｎｍでの望ましい条件を示すグラフである。
【図２０】図１０と同様に、波長４４０ｎｍでの望ましい条件を示すグラフである。
【図２１】２次元周期構造を示す平面図である。
【図２２】蛍光マイクロプレートリーダー用のマイクロプレートの構成を示す断面図および平面図である。
【図２３】クレッチマン型の光学配置を示す断面図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下に、添付の図面を参照して本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００３３】
まず、蛍光顕微鏡には、図１に示したように、観測対象Ａに対する照明光Ｌiの入射方
向および蛍光Ｌpの観測方向の組み合わせに応じて４種類がある。具体的には、次の通り
である。
落射型正立顕微鏡の場合、照明光の入射方向がＩＮ1であり、観測方向がＴである
落射型倒立顕微鏡の場合、照明光の入射方向がＩＮ2であり、観測方向がＢである。
透過型正立顕微鏡の場合、照明光の入射方向がＩＮ2であり、観測方向がＴである。
透過型倒立顕微鏡の場合、照明光の入射方向がＩＮ1であり、観測方向がＢである。
本発明はこれらのうち、照明光の入射方向がＩＮ2である透過型正立顕微鏡または落射型
倒立顕微鏡で使用されるマイクロプレートを対象とする。
【００３４】
図２は、本発明の実施の形態に係る周期構造を有するマイクロプレートを使用して表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡（以下、ＳＰＦＭという）の一例を示す図である。図２に示したＳＰＦＭ１は、顕微鏡本体（以下、本体という）２と、顕微鏡ステージ（以下、ステージという）３の上に搭載される周期構造を有するマイクロプレート４とを備えている。図２では、マイクロプレート４の上に試料Ａが搭載され、照明光Ｌiが下から入射し、
観測光（プラズモン励起増強蛍光）Ｌpが上から観測される様子を示している。即ち、図
２のＳＰＦＭ１は、透過型正立顕微鏡に分類される。
【００３５】
本実施の形態では、マイクロプレート４に特徴を有し、それ以外の蛍光顕微鏡として機能する上で必要な、本体２の構成要素は従来の蛍光顕微鏡と同じである。即ち、本体２の構成要素である光源、対物レンズ、接眼レンズ、干渉ミラー（ダイクロイックミラー）、干渉フィルター（励起フィルター）、蛍光フィルターなどは、公知の蛍光顕微鏡と同じものを使用する。従って、それらに関する説明を省略する。
【００３６】
図３は、本実施の形態に係るマイクロプレート４の構成を示す断面図である。マイクロプレート４は、ベース基板５と、ベース基板５の表面に形成された金属層６および消光抑制層７とを備えて構成されている。なお、図３では省略しているが、ベース基板５と金属層６との間、金属層６と消光抑制層７との間には、それぞれ、隣接する２つの層を接着するための層（以下、接着層という）を備えていることが好ましい。
【００３７】
ベース基板５は、表面に周期的構造である格子が形成されている。ベース基板５は、入射光Ｌiおよび観測光Ｌpに対して透明な材質（例えばガラス、プラスチックなど）で形成されている。材質に関する詳細は後述する。
【００３８】
周期構造は、例えば一方向に沿ってほぼ等間隔に配置された複数の溝を有する形状であり、溝は、例えば鋸歯状溝、正弦波状溝、矩形状溝である。図４は、周期構造の一例を示す断面図であり、矩形の周期構造が示されている。周期構造の周期（ピッチとも記す）、即ち隣接する溝の間隔（Ｍ1＋Ｖ1）は、観察に使用する波長以下、例えば１０〜１０００ｎｍ（ナノメートル）であり、好ましくは１００〜６００ｎｍである。周期構造の高さ（溝の深さ）は４〜４００ｎｍ、アスペクト比は０．００５〜１０である。なお、周期に対する凸部の長さＭ1、周期に対する凹部の長さＶ1を用いて、デューティ比（duty ratio）をＭ1／（Ｍ1＋Ｖ1）で定義する。
【００３９】
また、図５は、図４に示した周期構造のベース基板の上に金属層が形成された構造を模式的に示す断面図である。図５に示したように、金属層の表面には、周期構造の山Ｍ2、
谷Ｖ2、スロープＳＬが形成される。
【００４０】
金属層６は、金、銀、銅、プラチナ、ニッケルなどの遷移金属であることが好ましい。金属層６の膜厚は、１０〜５００ｎｍが好ましく、より好ましくは５０〜２００ｎｍである。しかし、金属層６は、遷移金属に限定されず、表面プラズモンを発生可能な金属であればよく、その場合にも膜厚は１０〜５００ｎｍが好ましく、より好ましくは５０〜２００ｎｍである。
【００４１】
消光抑制層７には、ポリカーボネートやポリメタクリル酸メチルのような有機高分子やシリカ（ＳｉＯ2）など、観察に用いる入射光や発生する蛍光の波長領域で吸収のない（
若しくは吸収の少ない）透明な薄膜を用いる。表面プラズモン励起増強蛍光法の特徴である増強蛍光は、蛍光分子と金属との距離が近いと、強い励起場で励起された蛍光も金属表面にエネルギー移動して消光されてしまう。従って、試料を金属層６から所定距離だけ離隔させて消光を抑制することが必要である。また、表面プラズモン共鳴による励起場は近接場であるために、金属表面から離れるにしたがってその電場強度は減衰するため、金属
表面からおよそ１００ｎｍ以内に存在する蛍光分子のみが効率よく励起される。そのために、消光抑制層７の膜厚は、約１０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲で金属層６の種類に応じて決定される。たとえば、膜厚の最適値は、金属層６が銀の場合１０〜５０ｎｍであり、より好ましくは２０〜５０ｎｍである。金の場合、膜厚の最適値は１０〜７０ｎｍであり、より好ましくは４０〜７０ｎｍである。
【００４２】
試料を含む水溶液（燐酸緩衝液など）をマイクロプレート４上に搭載して観測する場合が想定される。従って、金属層６に銀を使用する場合には、水中で非常に不安定な銀を保護するために、ベース基板５と銀との間および銀と消光抑制層７（例えば、ＳｉＯ2）と
の間に、酸化を防止する層（以下、酸化防止層という）を形成することが望ましい。なお、酸化防止層は、少なくとも銀と消光抑制層７との間にあればよい。例えば、ベース基板５と銀との間に接着層として機能する第１層を形成し、銀と消光抑制層７との間に接着および酸化防止層として機能する第２層を形成する。例えば、第１層および第２層は、それぞれ膜厚０．１〜３ｎｍの薄膜として形成される。第２層は、銀を保護できる材質の層であればよく、例えばクロム（Ｃｒ）、アルミニウム、チタン、パラジウムで形成される。なお、第２層は消光抑制層７の接着性を高める役割をもする材質が望ましく、この意味でもクロム（Ｃｒ）が適している。
【００４３】
次に、図６を参照して、入射光の偏光方向と周期構造の方向との関係について説明する。図６は、周期構造が形成された平面の一方から光が入射することを示しており、消光抑制層の側から入射する場合も、ベース基板側から入射する場合も同様である。表面プラズモン共鳴光の発生には、ｐ偏光の光が必要である。また、周期構造の配置との関係では、ｐ偏光が、周期構造の方向（格子の溝に垂直な方向）の成分を含んでいることが必要である。
【００４４】
図６の（ａ）は、マイクロプレート４に光が入射する状態を示す斜視図であり、（ｂ）はその平面図である。平面Ｕ1、Ｕ2は、マイクロプレート４の表面に垂直であり、且つマイクロプレート４表面に形成された格子８の方向（格子の溝に垂直な方向）Ｖ1と平行な
平面Ｕ1と、それに直交する平面Ｕ2である。入射光Ｌ1、Ｌ2は、光源から出力され、対物レンズによって円錐形に集光されてマイクロプレート４に入射する光のうち、それぞれ平面Ｕ1内、Ｕ2内を進行する光である。ここで、入射光Ｌ1、Ｌ2は、偏光フィルターなどによる偏光を受けていない光であるとする。従って、マイクロプレート４に対する入射光Ｌ1、Ｌ2のｐ偏光成分Ｖ2、Ｖ3の成分のうちＶ1と平行な成分によって表面プラズモン共鳴
光が発生する。このように、マイクロプレート４への入射光が偏光していない場合、マイクロプレート４の表面に形成された格子８の方向Ｖ1に平行な成分をもつ入射光のｐ偏光
によって表面プラズモン共鳴光が発生する。
【００４５】
その一方、入射光が偏光フィルターなどによって所定の方向に偏光されている場合、マイクロプレート４の配置によっては、表面プラズモン共鳴光がほとんど発生しない場合がある。図７は、図６と同様の斜視図であるが、マイクロプレート４が図６の状態から９０度回転されて配置されている。また、図７では、偏光フィルターなどによって偏光軸Ｓの入射光が対物レンズによって円錐形に集光されているが、平面Ｕ1およびＵ2内を伝播する光Ｌ1、Ｌ2に対しては、平面Ｕ1の面内方向と、平面Ｕ2に対する法線方向にそれぞれ偏光（Ｖ2とＶ4）されることとなる。この場合、ｐ偏光成分Ｖ2が格子の方向Ｖ1と直交しており、Ｖ4はマイクロプレート４に対してｓ偏光になるため、光Ｌ1、Ｌ2の何れによっても
表面プラズモン共鳴光が発生しない。Ｌ1、Ｌ2以外の入射光に対してもｐ偏光性とＶ1と
の平行性が低いために効率よく表面プラズモン共鳴光は発生しない。よって、図５のような偏光軸の入射光と格子の配置では、明るい蛍光画像は得られない。
【００４６】
従来の蛍光顕微鏡において、偏光子を挿入しなくとも、通常組み込まれているフィルタ
ーセットの中に偏光依存性のある素子（ダイクロイックミラーなど）が含まれている場合、上記したように表面プラズモン共鳴光が効率よく発生するように、マイクロプレート４の配置、即ち格子の方向を調節することが必要である。
【００４７】
以上、本発明の周期構造を有するマイクロプレートの概要と、そのマイクロプレートの表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡での使用方法について説明した。以下においては、本発明に係る周期構造を有するマイクロプレートについてより詳細に説明する。本発明のマイクロプレートは、透明な材質で形成されたベース基板５が、所定の屈折率を有すること、さらに、周期構造のピッチがベース基板５の屈折率に応じたピッチを有することを特徴としている。
【００４８】
図５に示すようなベース基板５及び金属層６の構造を想定し、ベース基板の屈折率ｎとピッチとの関係を、計算した結果の一例を図８に示す。図８は、入射光の波長６３３ｎｍ、金属層の厚さ４０ｎｍ、周期構造の溝の深さ３０ｎｍ、デューティ比０．５として、ピッチ［ｎｍ］及び屈折率ｎに応じた共鳴角［度(deg)］を厳密結合波解析法（ＲＣＷＡ法
）で計算した結果と一致する曲線である。グラフは、屈折率ｎが１．４５、１．４９、１．５９、１．８５、１．９５の場合の計算結果である。各グラフを区別するために、対応する屈折率ｎをグラフの近傍に付記している。光の入射面と一次格子ベクトルとのなす角（角度φ：基板法線方向を回転軸として）は０度である。
【００４９】
共鳴条件式は、ｋspp＝ｋphsinθ±ｍｋg  で表される。ここで、ｋは波数ベクトルで
あり、添え字に関しては、sppはプラズマポラリトンを、ｐｈは入射光を、ｇは格子をそ
れぞれ意味する。θは入射角、ｍは０以上の整数である。計算では、ｍ＝１まで考慮した。ｍが２以上の場合に関しては、実際にはｍ＝１の場合ほど増強度が大きくないので、省略した。
【００５０】
図８から分かるように、ベース基板の屈折率及びピッチに応じて、共鳴角が大きく変化する。マイクロプレートのベース基板側から光を入射する場合（背面照射系）には、共鳴角が約４５度以下であることが望ましいので、背面照射系において望ましい屈折率及びピッチが存在することがわかった。
【００５１】
図９は、横軸を屈折率にして、波長６３３ｎｍでの計算結果を示したグラフである。一例としてピッチが、４８０ｎｍ、４００ｎｍ、３４０ｎｍ、３３０ｎｍ、３２０ｎｍ、３００ｎｍ、２９０ｎｍの場合を示している。
【００５２】
図９において、共鳴角が４度未満の領域（斜線を施した領域）は、実際には共鳴が起こらない領域である。０度の入射角ではプラズマポラリトンと共鳴できるｐ偏光成分がないので、プラズモン共鳴は起こらない（上記の図６の説明参照）。また、４度の入射角でもそのｐ偏光成分はわずかであり、現実には周期構造に不均一性があるために、光と結合する（即ち共鳴する）ことが難しくなる。つまり、図９の斜線領域では、実際には共鳴は見られず、共鳴角の基板の屈折率依存は不連続になる。従って、望ましい条件としては、例えば、ピッチ３００ｎｍの場合、屈折率ｎが１．５９〜２、共鳴角θが４〜４５度の範囲である。より望ましい条件としては、屈折率ｎが１．７３〜２、共鳴角θが４〜２０度の範囲（太枠の長方形領域）である。
【００５３】
例えば、屈折率ｎ＝１．５９ならば、ピッチ３５０〜３２５ｎｍが最も望ましいが、３２５〜２９５ｎｍでも共鳴角が望ましい範囲になるようにすることができる。ｎ＝１．７ならば、３４０〜３１０ｎｍが最も望ましいが、３１０〜２８０ｎｍでも共鳴角が望ましい範囲になるようにすることができる。
【００５４】
図１０は、図８、９と同様の計算結果から、波長６３３ｎｍに関して望ましい条件を示すグラフである。図１０に示した６本の折れ線は、屈折率が１．４５、１．４９、１．５９、１．８５、１．９５の場合に、共鳴角が４５度、２０度、４度になるピッチに対応する点を直線で結んだものである。即ち、最も上及び最も下の折れ線が、共鳴角が４５度の場合、上から２番目及び下から２番目の折れ線が、共鳴角が２０度の場合、上から３番目及び下から３番目の折れ線が、共鳴角が４度の場合に該当する。
【００５５】
従って、図１０において、共鳴角が４度以上４５度以下となる範囲である、最も上に位置する折れ線と上から３番目の折れ線との間の領域（右上り及び右下りの斜線領域）、及び、最も下に位置する折れ線と下から３番目の折れ線との間の領域（右上り及び右下りの斜線領域）が、望ましい範囲である。そして、共鳴角が４度以上２０度以下となる範囲である、上から２番目の折れ線と上から３番目の折れ線との間の領域（右下りの斜線領域）、及び、下から２番目の折れ線と下から３番目の折れ線との間の領域（右下りの斜線領域）が、より望ましい範囲である。周期構造のピッチが小さい方が表面プラズモン共鳴による電場増強はより大きくなることを考慮すると、最も上に位置する折れ線と上から３番目の折れ線との間の領域よりも、最も下に位置する折れ線と下から３番目の折れ線との間の領域の方が望ましい。同様に、上から２番目の折れ線と上から３番目の折れ線との間の領域よりも、下から２番目の折れ線と下から３番目の折れ線との間の領域の方が望ましい。上から３番目の折れ線と下から３番目の折れ線との間の領域（黒塗り領域）は、共鳴が生じない範囲であり、例えば図９の斜線領域に対応する。
【００５６】
具体的に示せば、共鳴角θ[deg]が４≦θ≦４５となる条件は、
ｎ＝1.35の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が340≦ｐ≦420又は450≦ｐ≦640、
ｎ＝1.45の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が310≦ｐ≦390又は420≦ｐ≦600、
ｎ＝1.49の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が300≦ｐ≦380又は400≦ｐ≦540、
ｎ＝1.59の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が290≦ｐ≦350又は370≦ｐ≦480、
ｎ＝1.85の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が260≦ｐ≦300又は310≦ｐ≦380、
ｎ＝1.95の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が230≦ｐ≦280又は290≦ｐ≦370
である。
【００５７】
また、共鳴角θ[deg]が４≦θ≦２０となる条件は、
ｎ＝1.35の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が370≦ｐ≦420又は450≦ｐ≦510、
ｎ＝1.45の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が360≦ｐ≦390又は420≦ｐ≦480、
ｎ＝1.49の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が340≦ｐ≦380又は400≦ｐ≦450、
ｎ＝1.59の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が320≦ｐ≦350又は370≦ｐ≦410、
ｎ＝1.85の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が280≦ｐ≦300又は310≦ｐ≦340、
ｎ＝1.95の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が260≦ｐ≦280又は290≦ｐ≦320
である。
【００５８】
即ち、波長が６３３ｎｍの光を使用する場合、ベース基板の屈折率ｎに応じて、上記した条件を満たすようにベース基板のピッチｐを形成すれば、背面照射系での使用に適したマイクロプレートを実現することができる。
【００５９】
さらに波長の依存性を検討するために、上記と同じ屈折率（ｎ＝１．４５、１．４９、１．５９、１．８５、１．９５）で、異なる波長について上記と同様にシミュレーションを行った。その結果を、図１１〜１３に示す。図１１は、図８の一部（共鳴角が０〜４５度の範囲）を表示したものである。図１２、図１３はそれぞれ、波長５３０ｎｍ、４４０ｎｍの計算結果である。図１２及び図１３においては、屈折率ｎを付記していないが、グラフの順序は図１１と同じであるので各グラフを区別できる（例えば、共鳴角＝０の軸上の点の順序は、図１１〜１３で同じである）。
【００６０】
図１１〜１３から分かるように、銀（金属）の複素誘電率が波長依存性をもつために、波長が６３３ｎｍの場合に上記で定めた望ましい条件を、異なる波長にそのまま適用することはできない。ベース基板の屈折率にも依存するが、波長が１００ｎｍ変化すると、最適なピッチが６０〜９０ｎｍシフトしている。誤差範囲を考えると、６３３ｎｍの波長に関して上記した条件は、６３３±１５ｎｍ（６１８〜６４８ｎｍ）の範囲の波長について有効であると考えられる。また、それより広く、±２０ｎｍ（６１３〜６５３ｎｍ）の範囲まで適用可能であると考えられる。
【００６１】
なお、上記では、望ましい範囲を定める境界線を折れ線で定義したが、曲線で定義してもよい。境界線を曲線で定義する場合、例えば、上記で各折れ線を定義した点を通り、屈折率の増加に伴って単調に減少する滑らかな曲線（１階微分係数が連続である曲線）を境界線とすることができる。
【００６２】
さらに、上記以外の波長において望ましい条件を特定するために、６６０〜４４０ｎｍの範囲で波長を変化させてシミュレーションを行い、図１０と同様のグラフを作成した。その結果を図１４〜２０に示す。図１４〜２０はそれぞれ、波長が６６０ｎｍ、６００ｎｍ、５７０ｎｍ、５３０ｎｍ、５００ｎｍ、４７０ｎｍ、４４０ｎｍに関する結果である。各図において、６本の折れ線は、図１０と同様にして描画されたものであり、各波長を使用する場合に、望ましいピッチ範囲（共鳴角が２０〜４５度）およびより望ましいピッチ範囲（共鳴角が２０〜４度）を定めるものである。
【００６３】
具体的に示せば、波長が６６０±１５ｎｍ（６４５〜６７５ｎｍ）（図１４）の場合、共鳴角θ[deg]が４≦θ≦４５となる条件は、
ｎ＝1.45の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が330≦ｐ≦410又は445≦ｐ≦640、
ｎ＝1.49の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が320≦ｐ≦405又は425≦ｐ≦575、
ｎ＝1.59の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が310≦ｐ≦370又は395≦ｐ≦515、
ｎ＝1.85の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が280≦ｐ≦320又は330≦ｐ≦410、
ｎ＝1.95の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が245≦ｐ≦300又は310≦ｐ≦400
であり、
共鳴角θ[deg]が４≦θ≦２０となる条件は、
ｎ＝1.45の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が380≦ｐ≦410又は445≦ｐ≦510、
ｎ＝1.49の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が360≦ｐ≦405又は425≦ｐ≦480、
ｎ＝1.59の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が340≦ｐ≦370又は395≦ｐ≦435、
ｎ＝1.85の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が300≦ｐ≦320又は330≦ｐ≦365、
ｎ＝1.95の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が280≦ｐ≦300又は310≦ｐ≦340
である。
【００６４】
なお、上記の値は、波長が６６０±２０ｎｍ（６４０〜６８０ｎｍ）である場合にも有効である。
【００６５】
また、波長が６００±１５ｎｍ（５８５〜６１５ｎｍ）（図１５）の場合、
共鳴角θ[deg]が４≦θ≦４５となる条件は、
ｎ＝1.45の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が290≦ｐ≦370又は395≦ｐ≦560、
ｎ＝1.49の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が280≦ｐ≦355又は375≦ｐ≦505、
ｎ＝1.59の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が270≦ｐ≦330又は345≦ｐ≦445、
ｎ＝1.85の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が240≦ｐ≦280又は290≦ｐ≦350、
ｎ＝1.95の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が215≦ｐ≦260又は270≦ｐ≦340
であり、
共鳴角θ[deg]が４≦θ≦２０となる条件は、
ｎ＝1.45の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が340≦ｐ≦370又は395≦ｐ≦450、
ｎ＝1.49の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が320≦ｐ≦355又は375≦ｐ≦420、
ｎ＝1.59の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が300≦ｐ≦330又は345≦ｐ≦385、
ｎ＝1.85の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が260≦ｐ≦280又は290≦ｐ≦315、
ｎ＝1.95の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が240≦ｐ≦260又は270≦ｐ≦300
である。
【００６６】
なお、上記の値は、波長が６００±２０ｎｍ（５８０〜６２０ｎｍ）である場合にも有効である。
【００６７】
また、波長が５７０±１５ｎｍ（５５５〜５８５ｎｍ）（図１６）の場合、
共鳴角θ[deg]が４≦θ≦４５となる条件は、
ｎ＝1.45の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が275≦ｐ≦350又は370≦ｐ≦520、
ｎ＝1.49の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が265≦ｐ≦330又は350≦ｐ≦475、
ｎ＝1.59の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が255≦ｐ≦310又は330≦ｐ≦415、
ｎ＝1.85の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が225≦ｐ≦260又は270≦ｐ≦325、
ｎ＝1.95の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が200≦ｐ≦245又は255≦ｐ≦315
であり、
共鳴角θ[deg]が４≦θ≦２０となる条件は、
ｎ＝1.45の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が320≦ｐ≦350又は370≦ｐ≦420、
ｎ＝1.49の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が300≦ｐ≦330又は350≦ｐ≦395、
ｎ＝1.59の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が285≦ｐ≦310又は330≦ｐ≦360、
ｎ＝1.85の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が245≦ｐ≦260又は270≦ｐ≦290、
ｎ＝1.95の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が225≦ｐ≦245又は255≦ｐ≦280
である。
【００６８】
なお、上記の値は、波長が５７０±２０ｎｍ（５５０〜５９０ｎｍ）である場合にも有効である。
【００６９】
また、波長が５３０±１５ｎｍ（５１５〜５４５ｎｍ）（図１７）の場合、
共鳴角θ[deg]が４≦θ≦４５となる条件は、
ｎ＝1.45の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が250≦ｐ≦320又は340≦ｐ≦470、
ｎ＝1.49の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が240≦ｐ≦300又は320≦ｐ≦430、
ｎ＝1.59の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が230≦ｐ≦280又は290≦ｐ≦370、
ｎ＝1.85の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が210≦ｐ≦230又は240≦ｐ≦290、
ｎ＝1.95の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が180≦ｐ≦220又は230≦ｐ≦280
であり、
共鳴角θ[deg]が４≦θ≦２０となる条件は、
ｎ＝1.45の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が290≦ｐ≦320又は340≦ｐ≦380、
ｎ＝1.49の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が270≦ｐ≦300又は320≦ｐ≦360、
ｎ＝1.59の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が260≦ｐ≦280又は290≦ｐ≦330、
ｎ＝1.85の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が220≦ｐ≦230又は240≦ｐ≦260、
ｎ＝1.95の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が200≦ｐ≦220又は230≦ｐ≦250
である。
【００７０】
なお、上記の値は、波長が５３０±２０ｎｍ（５１０〜５５０ｎｍ）である場合にも有効である。
【００７１】
また、波長が５００±１５ｎｍ（４８５〜５１５ｎｍ）（図１８）の場合、
共鳴角θ[deg]が４≦θ≦４５となる条件は、
ｎ＝1.45の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が230≦ｐ≦290又は310≦ｐ≦420、
ｎ＝1.49の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が220≦ｐ≦275又は290≦ｐ≦390、
ｎ＝1.59の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が210≦ｐ≦250又は260≦ｐ≦330、
ｎ＝1.85の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が190≦ｐ≦200又は210≦ｐ≦255、
ｎ＝1.95の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が160≦ｐ≦190又は195≦ｐ≦240
であり、
共鳴角θ[deg]が４≦θ≦２０となる条件は、
ｎ＝1.45の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が265≦ｐ≦290又は310≦ｐ≦340、
ｎ＝1.49の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が245≦ｐ≦275又は290≦ｐ≦325、
ｎ＝1.59の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が235≦ｐ≦250又は260≦ｐ≦300、
ｎ＝1.85の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が195≦ｐ≦200又は210≦ｐ≦225、
ｎ＝1.95の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が175≦ｐ≦190又は195≦ｐ≦215
である。
【００７２】
なお、上記の値は、波長が５００±２０ｎｍ（４８０〜５２０ｎｍ）である場合にも有効である。
【００７３】
また、波長が４７０±１５ｎｍ（４５５〜４８５ｎｍ）（図１９）の場合、
共鳴角θ[deg]が４≦θ≦４５となる条件は、
ｎ＝1.45の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が210≦ｐ≦260又は280≦ｐ≦375、
ｎ＝1.49の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が200≦ｐ≦250又は265≦ｐ≦350、
ｎ＝1.59の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が190≦ｐ≦225又は235≦ｐ≦295、
ｎ＝1.85の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が165≦ｐ≦175又は185≦ｐ≦210、
ｎ＝1.95の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が140≦ｐ≦160又は165≦ｐ≦200
であり、
共鳴角θ[deg]が４≦θ≦２０となる条件は、
ｎ＝1.45の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が240≦ｐ≦260又は280≦ｐ≦305、
ｎ＝1.49の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が225≦ｐ≦250又は265≦ｐ≦295、
ｎ＝1.59の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が210≦ｐ≦225又は235≦ｐ≦265、
ｎ＝1.85の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が170≦ｐ≦175又は185≦ｐ≦190、
ｎ＝1.95の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が150≦ｐ≦160又は165≦ｐ≦180
である。
【００７４】
なお、上記の値は、波長が４７０±２０ｎｍ（４５０〜４９０ｎｍ）である場合にも有効である。
【００７５】
また、波長が４４０±１５ｎｍ（４２５〜４５５ｎｍ）（図２０）の場合、
共鳴角θ[deg]が４≦θ≦４５となる条件は、
ｎ＝1.45の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が190≦ｐ≦230又は250≦ｐ≦330、
ｎ＝1.49の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が185≦ｐ≦225又は240≦ｐ≦310、
ｎ＝1.59の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が170≦ｐ≦200又は210≦ｐ≦260、
ｎ＝1.85の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が140≦ｐ≦150又は155≦ｐ≦180、
ｎ＝1.95の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が120≦ｐ≦130又は135≦ｐ≦160
であり、
共鳴角θ[deg]が４≦θ≦２０となる条件は、
ｎ＝1.45の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が215≦ｐ≦230又は250≦ｐ≦270、
ｎ＝1.49の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が205≦ｐ≦225又は240≦ｐ≦265、
ｎ＝1.59の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が185≦ｐ≦200又は210≦ｐ≦230、
ｎ＝1.85の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が145≦ｐ≦150又は155≦ｐ≦160、
ｎ＝1.95の場合、ピッチｐ[ｎｍ]が125≦ｐ≦130又は135≦ｐ≦140
である。
【００７６】
なお、上記の値は、波長が４４０±２０ｎｍ（４２０〜４６０ｎｍ）である場合にも有効である。
【００７７】
本発明に係るマイクロプレート用のベース基板の材料としては、透明のガラスやプラスチックを使用することができる。プラスチックを使用する場合の製造方法には、スタンパー（型）を用いた射出成型法、それに類似したモールド（型）を用いた熱ナノインプリント法、あるいはモールドを用いた光硬化性樹脂による光ナノインプリント法など、公知の方法を利用すればよい。
【００７８】
背面照射系での使用に適したマイクロプレートを製造するためには、ベース基板の屈折率および使用する入射光の波長に応じて、ベース基板上に、上記したピッチの周期構造を形成することが必要であるので、スタンパーやモールドなどの型を使用する場合には、表面に上記したピッチの周期構造が形成された型を用いることが必要である。スタンパーは高精度に製造することが必要であるので、例えば、鏡面研磨したガラス板にポジ型感光性樹脂を塗布し、レーザービームレコーダで所定ピッチのパターンを焼付けした後、現像液で感光部分を溶解し、これを用いてニッケルで電鋳（電気鋳造）して作製するのが望ましい。
【００７９】
ベース基板の材料としては、例えば、ポリメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリウレタン（ＰＵ）などの、コンタクトレンズ、メガネレンズ、カメラレンズ、ＣＤ、ＤＶＤなどに広く一般的に使用されている材料を使用することができる。ベース基板にＰＭＭＡ、ＰＣ、またはＰＵを採用する場合、それぞれの屈折率は１．４９、１．５９、１．７０であるので、それぞれの屈折率および入射光の波長に応じて、上記したピッチで周期構造を形成すれば、ＳＰＦＭに適したマイクロプレートを製造することができる。
【００８０】
例えば、ポリカーボネートを用いる場合、ポリカーボネートペレットを過熱し、融けたポリカーボネートを上記したスタンパーを含む型内に射出し、加圧しながら冷却することによって、所定の周期構造を有するベース基板を作製することができる。その後、ベース基板の周期構造の上に、金属層、消光抑制層、必要に応じて酸化防止層を形成して、本発明のマイクロプレートが作製される。
【００８１】
以上のように、ベース基板にプラスチックを使用することによって、ガラスを使用する場合よりも、本発明のマイクロプレートを安価且つ効率的に量産することができる。
【００８２】
以上、本発明の実施の形態を、蛍光顕微鏡に適用する場合について説明したが、本発明は上記の実施の形態に限定されず、種々変更して実施することができる。特に、本発明のマイクロプレートは、蛍光マイクロプレートリーダーに対しても同様に適用可能である。
【００８３】
また、周期構造の形状は、上記した一方向に溝を有する形状に限定されず、図２１に示すような、ベース基板５’の表面に交差する２方向に溝を形成した２次元周期構造や円形（フレネル）の周期構造であってもよい。図２１は、２次元周期構造が形成されたベース基板５’の平面図である。ベース基板５’の表面には、複数の溝部９が直交する２方向に、即ち凸部１０が直交する２方向に配列している。なお、溝９を形成する２方向は、直交していなくてもよく、斜めであってもよい。
【００８４】
２次元周期構造が形成されたベース基板を用いる場合、偏光した入射光を使用する場合にも、マイクロプレートの配置による蛍光強度への影響を小さくすることができる。また
、偏光していない光を使用する場合、入射光の利用効率が高くなり、より明るい蛍光を観測することができる。
【００８５】
蛍光マイクロプレートリーダーに使用する本発明に係るマイクロプレートに関しては、図２２（上側は縦断面図、下側は平面図）に示したように、ベース基板５表面上の、アレイ状に配置された複数の領域１１に周期構造を形成した後、ベース基板５の上に金属層６、消光抑制層７を順に形成すればよい。このとき、全ての領域１１において周期構造の溝を同じ方向になるように形成することが望ましい。蛍光マイクロプレートリーダーで観測する場合、これらの複数の領域１１の上に微量の試料をスポッティングして観測する。
【００８６】
また、図２２では、ベース基板５の表面全体に金属層６および消光抑制層７を形成しているが、これに限定されず、少なくとも周期構造が形成された領域１１の上に金属層６および消光抑制層７が形成されていればよい。また、各領域１１に、図２１に示した２次元周期構造を形成してもよい。
【符号の説明】
【００８７】
１    表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡（ＳＰＦＭ）
２    本体
３    ステージ
４    マイクロプレート
５、５’  ベース基板
６    金属層
７    消光抑制層
８    周期構造
９    溝部
１０  凸部
ＩＮ１  消光抑制層側からの光の入射
ＩＮ２  ベース基板側からの光の入射
Ｔ    消光抑制層側からの蛍光の検出
Ｂ    ベース基板側からの蛍光の検出
Ａ    試料
Ｌｉ  照明光
Ｌｐ  観測光（プラズモン励起増強蛍光）
Ｌ１、Ｌ２    入射光
Ｖ１  格子の方向
Ｖ２、Ｖ３  入射光のｐ偏光成分
Ｖ４  入射光のｓ偏光成分
θ    入射角度
Ｕ１、Ｕ２    入射平面
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図１】
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【図２】
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