(57)【要約】      （修正有）【課題】幹細胞や前駆細胞を効率的に増殖させるための培養方法を提供する。【解決手段】造血因子（トロンボポエチンを除く）、インターロイキン、コロニー刺激因子から選択される少なくとも１種のサイトカインを含む無血清培地を用いて培養を行うに際し、下記の一般式（１）で表されるアルカロイド化合物を添加することを特徴とする。2011045269.tif 000015〔式中、Ｒ１は特定の構造を有する置換基を示す〕【選択図】図１
2011045269.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞および／または前駆細胞の培養方法であって、造血因子（トロンボポエチンを除く）、インターロイキン、コロニー刺激因子から選択される少なくとも１種のサイトカインを含む無血清培地を用いて培養を行うに際し、下記の一般式（１）で表されるアルカロイド化合物を添加することを特徴とする方法。
【化１】
2011045269.tif 000011
〔式中、Ｒ１は下記の一般式（２）で表される置換基を示す〕
【化２】
2011045269.tif 000012
〔式中、Ｒ２は炭素数が１〜６のアルキル基、炭素数が１〜６のアルコキシ基、水酸基、ニトロ基、トリフルオロメチル基のいずれかを示す。ｍは０〜３の整数を示す。ｎは０または１の整数を示す〕
【請求項２】
幹細胞および／または前駆細胞が造血幹細胞および／または造血前駆細胞であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
造血因子がエリスロポエチンおよび／またはステムセルファクターであることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
コロニー刺激因子が顆粒球コロニー刺激因子および／または顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
下記の一般式（１）で表されるアルカロイド化合物を有効成分とすることを特徴とする幹細胞および／または前駆細胞の増殖促進剤。
【化３】
2011045269.tif 000013
〔式中、Ｒ１は下記の一般式（２）で表される置換基を示す〕
【化４】
2011045269.tif 000014
〔式中、Ｒ２は炭素数が１〜６のアルキル基、炭素数が１〜６のアルコキシ基、水酸基、ニトロ基、トリフルオロメチル基のいずれかを示す。ｍは０〜３の整数を示す。ｎは０または１の整数を示す〕
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞や前駆細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臓器や組織の再生医療や白血病などの治療に幹細胞や前駆細胞が有効に機能することは、今や当業者のみならず一般にもよく知られている事実であり、これらの細胞に関して様々な臨床的利用や研究開発が精力的に行われている。しかしながら、幹細胞や前駆細胞の供給は容易なことではないことから、これらの細胞を効率的に増殖させるための培養方法についても種々の検討が行われているところであるが（例えば特許文献１など）、残念ながら今なお有効な培養方法が確立されるには至っていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平１１−２２１０７４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明は、幹細胞や前駆細胞を効率的に増殖させるための培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ところで、本発明者らは、これまでトリカブト由来のアルカロイドやその誘導体が細胞増殖に関してどのような作用を有しているのかについて研究を行ってきており、一群の化合物が腫瘍細胞に対する細胞増殖抑制作用に加え、造血前駆細胞に対する細胞増殖抑制作用を有することを特開２００７−２１７３８９号公報において報告している。今般、本発明者らは、この報告で取り上げた一群の化合物の細胞増殖に関する作用をさらに精査したところ、トロンボポエチンを除くサイトカインを含む無血清培地を用いて造血前駆細胞を培養する際、ある種の化合物を添加すると、驚くべきことに造血前駆細胞の増殖が促進されることを見出した。
【０００６】
上記の知見に基づいてなされた本発明の幹細胞および／または前駆細胞の培養方法は、請求項１記載の通り、造血因子（トロンボポエチンを除く）、インターロイキン、コロニー刺激因子から選択される少なくとも１種のサイトカインを含む無血清培地を用いて培養を行うに際し、下記の一般式（１）で表されるアルカロイド化合物を添加することを特徴とする。
【化１】
2011045269.tif 000003
〔式中、Ｒ１は下記の一般式（２）で表される置換基を示す〕
【化２】
2011045269.tif 000004
〔式中、Ｒ２は炭素数が１〜６のアルキル基、炭素数が１〜６のアルコキシ基、水酸基、ニトロ基、トリフルオロメチル基のいずれかを示す。ｍは０〜３の整数を示す。ｎは０または１の整数を示す〕
また、請求項２記載の方法は、請求項１記載の方法において、幹細胞および／または前駆細胞が造血幹細胞および／または造血前駆細胞であることを特徴とする。
また、請求項３記載の方法は、請求項１または２記載の方法において、造血因子がエリスロポエチンおよび／またはステムセルファクターであることを特徴とする。
また、請求項４記載の方法は、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法において、コロニー刺激因子が顆粒球コロニー刺激因子および／または顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子であることを特徴とする。
また、本発明の幹細胞および／または前駆細胞の増殖促進剤は、請求項５記載の通り、下記の一般式（１）で表されるアルカロイド化合物を有効成分とすることを特徴とする。
【化３】
2011045269.tif 000005
〔式中、Ｒ１は下記の一般式（２）で表される置換基を示す〕
【化４】
2011045269.tif 000006
〔式中、Ｒ２は炭素数が１〜６のアルキル基、炭素数が１〜６のアルコキシ基、水酸基、ニトロ基、トリフルオロメチル基のいずれかを示す。ｍは０〜３の整数を示す。ｎは０または１の整数を示す〕
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、幹細胞や前駆細胞を効率的に増殖させるための培養方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例における８種類のアルカロイド化合物のヒト造血前駆細胞に対する細胞増殖促進作用を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の幹細胞および／または前駆細胞の培養方法は、造血因子（トロンボポエチンを除く）、インターロイキン、コロニー刺激因子から選択される少なくとも１種のサイトカインを含む無血清培地を用いて培養を行うに際し、下記の一般式（１）で表されるアルカロイド化合物を添加することを特徴とするものである。
【化５】
2011045269.tif 000007
〔式中、Ｒ１は下記の一般式（２）で表される置換基を示す〕
【化６】
2011045269.tif 000008
〔式中、Ｒ２は炭素数が１〜６のアルキル基、炭素数が１〜６のアルコキシ基、水酸基、ニトロ基、トリフルオロメチル基のいずれかを示す。ｍは０〜３の整数を示す。ｎは０または１の整数を示す〕
【００１０】
上記の一般式（１）で表されるアルカロイド化合物が有する一般式（２）で表される置換基におけるＲ２のうち、炭素数が１〜６のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基などが挙げられる。また、炭素数が１〜６のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉｓｏ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基などが挙げられる。
【００１１】
本発明の適用対象となる幹細胞とは、自己複製能と多分化能を有する未分化細胞を意味し、前駆細胞とは、自己複製能と多分化能を有するが、最終的に分化する細胞の種類が既に決定している未分化細胞を意味する。その具体例としては、ヒトをはじめとする哺乳動物由来の造血幹細胞や造血前駆細胞が挙げられる。ここで造血幹細胞は、白血球、赤血球、血小板の全ての血球に分化することが可能な細胞と定義付けられ、造血前駆細胞は、分化能力が特定の血球に限定された細胞と定義付けられるが、いずれもＣＤ３４陽性細胞として認識される。また、本発明の適用対象となる幹細胞および前駆細胞は、神経細胞に分化することが可能な神経幹細胞や神経前駆細胞の他、間葉系幹細胞、皮膚幹細胞、肝幹細胞、胚性幹細胞などであってもよい。
【００１２】
本発明において用いる無血清培地としては、イスコフ改変ダルベッコ培地、イスコフ培地、ＲＰＭＩ培地、ダルベッコＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、Ｆ１２培地などを基礎培地とし、ここに造血因子（トロンボポエチンを除く）、インターロイキン、コロニー刺激因子から選択される少なくとも１種のサイトカイン（生体調節機構に関与する細胞間相互作用を担う分泌蛋白質と定義付けられる）を添加して調製したものが例示される。造血因子としてはエリスロポエチンやステムセルファクターなどが挙げられる。インターロイキンとしてはインターロイキン３などが挙げられる。コロニー刺激因子としては顆粒球コロニー刺激因子や顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子などが挙げられる。好適には、エリスロポエチン、ステムセルファクター、インターロイキン３、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子の５種類のサイトカインのカクテルが挙げられる。これらのサイトカインは、例えばヒト由来の天然体であってもよいし遺伝子工学的手法による産生体であってもよい。無血清培地中の各サイトカインの濃度は、通常、１ｎｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬおよび／または０．１Ｕ／ｍＬ〜１００Ｕ／ｍＬとすればよい。なお、無血清培地には抗生物質やミネラルなどの各種の添加成分が含まれてもよい。
【００１３】
無血清培地に対する上記の一般式（１）で表されるアルカロイド化合物の添加は、無血清培地中の濃度が０．０１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬとなるように行うことが望ましく、０．１μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬとなるように行うことがより望ましい。濃度が０．０１μｇ／ｍＬ未満であると期待する細胞増殖促進作用が得られない恐れがある一方、１００μｇ／ｍＬを超えると逆に細胞増殖に悪影響を及ぼす恐れがある。
【００１４】
幹細胞や前駆細胞の培養条件は、当業者に知られている一般的なものであってよく、例えば５％ＣＯ２インキュベータ内において３７℃で培養する方法が挙げられる。所定の培養期間が経過した後の培地からの細胞の取得は、当業者に知られている一般的な方法で行えばよい。このようにして取得された幹細胞や前駆細胞は、臓器や組織の再生医療や白血病などの治療に利用することができる他、各種の生化学試験の被験サンプルなどとして利用することもできる。
【実施例】
【００１５】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００１６】
実施例：無血清培地を用いたヒト造血前駆細胞の培養実験
（実験方法）
ヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性造血前駆細胞（国立大学法人弘前大学医学部倫理委員会の承認を受けて採取した臍帯血から磁気ビーズ法により分離したもの）を２４穴プレートに５００ｃｅｌｌｓ／５００μＬ／ｗｅｌｌになるように播種した。用いる無血清培地は、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＢＩＴ９５００−ＩＭＤＭ）を基礎培地とし、ここにエリスロポエチン（４Ｕ／ｍＬ）、ステムセルファクター（１００ｎｇ／ｍＬ）、インターロイキン３（１００ｎｇ／ｍＬ）、顆粒球コロニー刺激因子（１０ｎｇ／ｍＬ）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（１０ｎｇ／ｍＬ）の５種類のサイトカイン（いずれもヒト遺伝子組換体であって市販のもの）をそれぞれ培地中の濃度がかっこ内に示した数値となるように添加し、さらに下記のＮｏ．１〜Ｎｏ．８の８種類のアルカロイド化合物のいずれかを培地中の濃度が２μｇ／ｍＬとなるように添加して調製した。なお、それぞれのアルカロイド化合物は、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｖｏｌ．７０，Ｎｏ．１２，１８５４−１８５８（２００７）に記載の方法に従ってトリカブトから調製し、その添加は、ＤＭＳＯ溶液を培地に０．５％（Ｖ／Ｖ）の割合で添加することにより行った。
５％ＣＯ２インキュベータ内において３７℃で細胞を８日間〜１０日間培養した後、トリパンブルー法によって生細胞数を計数し、それぞれのアルカロイド化合物の溶解溶媒として用いた容量のＤＭＳＯと同量のＤＭＳＯを添加した５種類のサイトカインを含む無血清培地を用いて細胞を同様にして培養した際の生細胞数を１として、その相対比（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｖａｌｕｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ）をもとにそれぞれのアルカロイド化合物のヒト造血前駆細胞に対する細胞増殖促進作用を評価した（ｎ＝５）。
【化７】
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【００１７】
【表１】
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【００１８】
（実験結果）
結果を図１に示す。図１から明らかなように、本発明のアルカロイド化合物に属するＮｏ．１〜Ｎｏ．４の化合物は、ヒト造血前駆細胞に対する細胞増殖促進作用を有していたが、本発明のアルカロイド化合物に属しないＮｏ．５〜Ｎｏ．８の化合物は、細胞増殖促進作用を有しておらず、細胞増殖抑制作用を有していた。以上の結果から、同種の置換基を有するアルカロイド化合物であっても、置換位置の僅かな相違で作用が全く異なることがわかった。なお、本発明のアルカロイド化合物に属するＮｏ．１〜Ｎｏ．４の化合物は、特開２００７−２１７３８９号公報において取り上げたＮｏ．６，Ｎｏ．８，Ｎｏ．１１，Ｎｏ．１３の化合物にそれぞれ相当し、いずれの化合物も、造血因子としてトロンボポエチンを含む無血清培地に添加してヒト造血前駆細胞を培養した際、細胞増殖促進作用も細胞増殖抑制作用もほとんど有しないという実験結果を得ているが、この実験結果と今回の実験結果との相違は、本発明において用いるサイトカインは白血球や赤血球の前駆細胞に作用するが、トロンボポエチンは巨核球由来のコロニーしか形成しないという相違に基づくことによるものと推察された。
【産業上の利用可能性】
【００１９】
本発明は、幹細胞や前駆細胞を効率的に増殖させるための培養方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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